(57)【要約】腫瘍を持つ被験者治療の改善法であって、前記被験者に２から５の剤の組み合わせを投与することを含んでなる前記方法を開示する。剤は、樹状細胞を動員する剤、腫瘍細胞のアポトーシスおよび／または壊死を引き起こす剤、化学誘引剤、樹状細胞の成熟を刺激する剤、並びにＴ細胞の抗腫瘍反応を増進する剤であることが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍を持つ被験者を治療する方法であって：
（ａ）樹状細胞動員因子の療法的有効量を被験者に投与し；そして
（ｂ）樹状細胞の成熟を刺激する腫瘍殺傷剤の療法的有効量を被験者に投与する工程を含んでなる、前記方法。
【請求項２】
樹状細胞動員因子がＦｌｔ３Ｌであり、そして樹状細胞の成熟を刺激する腫瘍殺傷剤がＣＤ４０Ｌである、請求項１の方法。
【請求項３】
腫瘍を持つ被験者を治療する方法であって：
（ａ）樹状細胞動員因子の療法的有効量を被験者に投与し；
（ｂ）腫瘍殺傷剤の療法的有効量を被験者に投与し；そして
（ｃ）樹状細胞成熟剤の療法的有効量を被験者に投与する
工程を含んでなる、前記方法。
【請求項４】
樹状細胞動員因子がＦｌｔ３Ｌであり、そして樹状細胞成熟剤がＣＤ４０Ｌである、請求項１の方法。
【請求項５】
樹状細胞成熟剤と組み合わせて、Ｔ細胞増進因子を投与する、請求項１から４のいずれか１つの方法。
【請求項６】
Ｔ細胞増進因子がインターロイキン−１５である、請求項５の方法。
【請求項７】
Ｔ細胞増進因子が：
（ａ）Ｏｘ４０アゴニスト；
（ｂ）４−１ＢＢアゴニスト；および
（ｃ）Ｏｘ４０アゴニストおよび４−１ＢＢアゴニストの組み合わせ
からなる群より選択される、請求項５の方法。
【請求項８】
腫瘍を持つ被験者を治療する方法であって：
（ａ）樹状細胞動員因子の療法的有効量を被験者に投与し；そして
（ｂ）凍結療法で被験者を治療する
工程を含んでなる、前記方法。
【請求項９】
樹状細胞動員因子がＦｌｔ３Ｌである、請求項８の方法。
【請求項１０】
腫瘍を持つ被験者に樹状細胞成熟剤を投与する、請求項８または９の方法。
【請求項１１】
Ｔ細胞増進因子を樹状細胞成熟因子５と組み合わせて投与する、請求項１０の方法。
【請求項１２】
樹状細胞成熟剤がＣＤ４０Ｌであり、そしてＴ細胞増進因子が：
（ａ）Ｏｘ４０アゴニスト；
（ｂ）４−１ＢＢアゴニスト；
（ｃ）Ｏｘ４０アゴニストおよび４−１ＢＢアゴニストの組み合わせ；および
（ｄ）インターロイキン−１５
からなる群より選択される、請求項１１の方法。
【請求項１３】
樹状細胞誘引剤を投与して、腫瘍部位に樹状細胞を誘引する、請求項１から１２のいずれか１つの方法。
【請求項１４】
Ｔ細胞誘引剤を投与して、腫瘍部位にＴ細胞を誘引する、請求項１から１２のいずれか１つの方法。
【請求項１５】
腫瘍を持つ被験者を治療する方法であって：
（ａ）樹状細胞動員因子の療法的有効量を被験者に投与し；
（ｂ）個体から樹状細胞を得て、そしてｅｘ  ｖｉｖｏで該樹状細胞を培養し；
（ｃ）腫瘍殺傷剤を個体に投与し；そして
（ｄ）樹状細胞を個体に投与する
工程を含んでなる、前記方法。
【請求項１６】
ｅｘ  ｖｉｖｏで樹状細胞を樹状細胞成熟剤と接触させる、請求項１５の方法。
【請求項１７】
樹状細胞を樹状細胞成熟剤と接触させる前に、抗原と接触させる、請求項１６の方法。
【請求項１８】
樹状細胞を樹状細胞成熟剤と接触させた後に、抗原と接触させる、請求項１６の方法。
【請求項１９】
樹状細胞動員因子がＦｌｔ３Ｌであり、そして樹状細胞成熟剤がＣＤ４０Ｌである、請求項１６から１８のいずれか１つの方法。
【請求項２０】
腫瘍を持つ被験者を治療する方法であって：
（ｅ）樹状細胞動員因子の療法的有効量を被験者に投与し；
（ｆ）個体から樹状細胞を得て、そしてｅｘ  ｖｉｖｏで該樹状細胞を培養し；
（ｇ）樹状細胞を成熟させそして活性化させ、そして抗原を発現させ；
（ｈ）個体からＴ細胞を得て；
（ｉ）ｅｘ  ｖｉｖｏで、成熟し活性である抗原発現樹状細胞と該Ｔ細胞を接触させて、活性化された抗原特異的Ｔ細胞を得て；そして
（ｊ）活性化された抗原特異的Ｔ細胞を個体に投与する
工程を含んでなる、前記方法。
【請求項２１】
Ｔ細胞を個体から得る前に、Ｔ細胞増進剤を個体に投与する、請求項２０の方法。
【請求項２２】
活性化された抗原特異的Ｔ細胞と組み合わせて、Ｔ細胞増進剤を個体に投与する、請求項２０または請求項２１の方法。
【請求項２３】
Ｔ細胞増進因子が：
（ａ）Ｏｘ４０アゴニスト；
（ｂ）４−１ＢＢアゴニスト；
（ｃ）Ｏｘ４０アゴニストおよび４−１ＢＢアゴニストの組み合わせ；および
（ｄ）インターロイキン−１５
からなる群より選択される、請求項２２の方法。
【請求項２４】
Ｔ細胞誘引剤を投与して、腫瘍部位にＴ細胞を誘引する、請求項２０から２３のいずれか１つの方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、腫瘍学療法に関し、そしてより詳細には、集合的に樹状細胞を増加させ、樹状細胞の成熟を刺激し、そして樹状細胞にＴ細胞へ抗原提示させ、そしてＴ細胞を刺激する剤の併用で、腫瘍を持つ被験者を治療することを伴う併用療法に関する。
【０００２】
関連技術の説明
用語、癌は、正常な細胞増殖が乱されている、非常に多様な疾患状態を含む。癌の治療において、多くの進歩があったが、いくつかの型は、他のものより治療しにくいままである。治療における難問の１つは、正常細胞の多様な種類から派生する、多くの種類の癌があることから生じる。一般的に、疾患への進行は、異常な細胞が免疫系を回避して、そして制御不能に増殖するために起こると考えられる。したがって、免疫系の回避は、すべてでないとしても大部分の癌に共通であるようである。
【０００３】
免疫系が癌の発展に重大な役割を果たすことが理解されたため、免疫系を刺激して、癌性細胞を認識させ、そしてこれらの細胞を除去する、多様な手段に関して、多大な関心が生じてきた。抗癌療法使用のため、インターロイキン２、４、および６、並びに他のサイトカインを含め、多様な生物学的反応修飾因子（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）が調べられてきている。各因子は、ある患者では、効力を明示することが可能であるが、広く有効であることが示されたものはない。さらに、いくつかのこうした因子は、用量を制限する毒性効果を有することが見出されてきている。したがって、研究者は、最小限の有害な効果で、免疫反応が有効な抗腫瘍活性を発展させるのを可能にするであろう多様な因子の組み合わせを探してきている。しかし、本発明以前に、最適な種類の組み合わせは知られていない。
【０００４】
発明の概要
本発明は：（ａ）ＤＣ動員因子（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）を投与し；（ｂ）腫瘍殺傷剤を投与し；そして（ｃ）ＤＣ成熟剤を投与することによって、腫瘍を持つ被験者を治療する方法を提供する。本発明の１つの態様において、腫瘍殺傷剤は、樹状細胞の成熟を刺激する剤（ＤＣ成熟剤）と同一の剤である。本明細書に記載する方法は、所望により、１又はそれより多くのＴリンパ球増進剤を投与し、そして／または化学誘引剤を投与して、動員した樹状細胞および／またはＴ細胞を腫瘍部位などの特定の部位に誘引する工程をさらに含む。所望により、該方法は、腫瘍抗原（類）を被験者に投与することをさらに含んでもよい。
【０００５】
１つの態様において、本発明の方法は、直前に記載した剤（ＤＣ動員因子、ＤＣ成熟剤、腫瘍殺傷剤、Ｔリンパ球増進剤、および化学誘引剤）を、局所（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、皮下、静脈内、腫瘍内、節内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌ）または筋内投与、徐放または持続放出処方の型での投与、経口投与、あるいは当該技術分野の日常的な技術を持つ当業者に知られる他の経路いずれかの使用を含む、適切な方法いずれかによって、腫瘍を持つ被験者に投与する、ｉｎ  ｖｉｖｏ併用免疫療法である。さらに、例えば、手術、レーザー治療、放射療法、腫瘍のウイルス感染または他の腫瘍切除療法中に、またはそれらの直後に、限局持続放出処方を適用することによって、あるいは当該技術分野に知られる、単数または複数の剤を腫瘍部位に搬送する、他の方法を使用することによって、多様な剤を腫瘍部位内または近傍に、限局（ｌｏｃａｌｌｙ）投与することが可能である。
【０００６】
別の態様において、本発明の方法は、１又はそれより多くの上述の投与工程をｅｘ  ｖｉｖｏで行う、併用免疫療法である。例えば、本発明は、（ａ）腫瘍を持つ被験者にＤＣ動員因子の療法的有効量を投与し；（ｂ）ＤＣ動員因子を投与した、腫瘍を持つ被験者から樹状細胞を得て；（ｃ）ｅｘ  ｖｉｖｏ培養において、腫瘍を持つ被験者から得た樹状細胞を培養し；そして（ｄ）腫瘍を持つ被験者に、培養した樹状細胞を投与することを含む、併用療法を提供する。好ましくは、抗腫瘍療法が、投与しようとする樹状細胞に不都合な影響を与えないであろう時点で、樹状細胞を投与する。
【０００７】
所望により、本発明のｅｘ  ｖｉｖｏ併用免疫療法は、細胞が他の免疫細胞に腫瘍抗原を提示することが可能な方式で、培養した樹状細胞を腫瘍抗原と接触させる工程をさらに含む。さらに、ｅｘ  ｖｉｖｏ法は、抗原提示を促進するため、樹状細胞の活性化および／または成熟を刺激する剤で、培養した樹状細胞を処理する工程を含んでもよい。樹状細胞の活性化および／または成熟を刺激する剤で、培養した樹状細胞を処理する工程は、抗原がプロセシングを必要とするか否かに応じて、培養した樹状細胞を抗原と接触させる前または後に行うことが可能である。典型的には、抗原が樹状細胞によるプロセシングを要するならば、培養した樹状細胞の処理は、樹状細胞が抗原をプロセシングした後に行う。抗原が、培養した樹状細胞によるプロセシングを必要としないならば、樹状細胞の活性化および／または成熟を刺激する剤で、培養した樹状細胞を処理する工程は、培養した樹状細胞を抗原と接触させる前に行う。
【０００８】
さらに別の態様において、本発明は、樹状細胞に特定のサイトカインを分泌させることをさらに含む。ｅｘ  ｖｉｖｏ法において、これは、サイトカイン発現を誘導する１又はそれより多くの剤と樹状細胞を接触させることによって、またはサイトカインをコードする遺伝子で樹状細胞をトランスフェクションすることによって、達成することが可能である。
【０００９】
腫瘍を持つ個体に、培養した樹状細胞を投与するのと同時に、本発明は、培養した樹状細胞または成熟した抗原提示樹状細胞を、単独で、またはＴ細胞増進剤（類）と併用して投与することをさらに含む。別のアプローチにおいて、本発明の方法は、培養した樹状細胞を用いて、ｅｘ  ｖｉｖｏで腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を生成し、そして生成した腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を、腫瘍を持つ被験者に投与することを含む。Ｔ細胞増進剤は、Ｔ細胞を得る前に、腫瘍を持つ被験者に投与することが可能であるし；あるいはまたはさらに、Ｔ細胞増進剤は、ｅｘ  ｖｉｖｏで生成した腫瘍特異的Ｔ細胞と組み合わせて、被験者に投与することが可能である。
【００１０】
本発明の方法は、化学誘引剤を投与して、動員した樹状細胞および／またはＴ細胞、ＮＫ細胞または他の免疫細胞を腫瘍部位または別の部位に誘引する（すなわち抗原運搬ＤＣをＴ細胞リッチリンパ節に誘引する）ことをさらに含む。
【００１１】
多くの癌が免疫抑制効果を有するため、本明細書に記載する併用免疫療法は、化学療法または放射療法を受けているか、あるいは癌性細胞を有する個体で起こる可能性がある免疫抑制を患う個体を治療するのに有用である。本発明の免疫療法は、抗腫瘍反応を刺激し、そして抗腫瘍療法の副作用からの免疫系の回復を促進する。
【００１２】
多くのＤＣ動員因子は、腫瘍を持つ被験者において、骨髄前駆細胞集団を増進する。望ましい場合、本発明の方法は、免疫措置の一部として用いて、腫瘍を持つ被験者において、望ましい抗原に対する有効な免疫反応を生成することが可能である。
【００１３】
本発明の方法を用いて：（ａ）ＤＣ動員因子の療法的有効量を被験者に投与し；（ｂ）個体から樹状細胞を得て；（ｃ）ｅｘ  ｖｉｖｏで該樹状細胞を培養し；そして（ｄ）抗腫瘍療法が、投与しようとする樹状細胞に不都合に影響を与えないであろう時点で、個体に該樹状細胞を投与することによって、ｅｘ  ｖｉｖｏで、腫瘍を持つ被験者において、免疫反応を生成するか、または再生成することが可能である。
【００１４】
本ｅｘ  ｖｉｖｏ療法のさらに別の側面において、腫瘍抗原に関して上述したのと類似の方式で、免疫反応を生成することが望ましい抗原で、樹状細胞を処理する。したがって、樹状細胞には、また、特定の望ましい免疫学的に活性である剤を分泌させることも可能であり；これらを、単独で、あるいは抗原に対する細胞傷害性Ｔリンパ球もしくはヘルパー細胞反応を増進する剤、またはＴ細胞の増殖を刺激するＴ細胞増殖因子と併用して、投与することが可能である。あるいは、該樹状細胞を用いて、ｅｘ  ｖｉｖｏで、抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞またはヘルパー細胞を生成し、これらを、その後、腫瘍を持つ被験者に投与することが可能である。本発明のこれらのおよび他の側面は、一般の当業者に明らかであろう。
【００１５】
本発明はまた、抗腫瘍療法の結果として、または腫瘍自体の影響として生じる免疫抑制からの、腫瘍を持つ個体の回復を促進するのにも有用であろう。ＤＣ数を増加させる剤を投与し、そしてＤＣを得て、そして個体への続く再投与用に保存することが可能である。ＤＣをｅｘ  ｖｉｖｏで処理して、より有効に他の免疫細胞に抗原を提示させることが可能であり；さらに、ｅｘ  ｖｉｖｏ技術はまた、特定の病原性または日和見性生物に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞などの抗原特異的エフェクター細胞を得るのに適用することも可能である。
【００１６】
腫瘍を持つ被験者はまた、免疫抑制を誘導する治療が完了した後に、本発明の併用療法で治療して、免疫抑制誘導治療の結果、腫瘍を持つ被験者の免疫反応が減少する時間の長さを減じることが可能である。こうした併用療法は、個体が、免疫抑制誘導治療の結果、感染性疾患に屈服するであろうリスクを減じるであろう。
【００１７】
発明の詳細な説明
好適には、本発明の方法は、死につつある腫瘍細胞近傍の部位に、または死につつある腫瘍細胞が排出される部位に、より多くの非常に利用可能な腫瘍抗原を提供する。該方法はさらに、活性化し、そして成熟させるため、樹状細胞（ＤＣ）集団を増加させ、そして樹状細胞が腫瘍抗原をプロセシングし、そしてＴ細胞に提示する能力を増進する。本発明の方法にしたがって処理した際、これらの腫瘍抗原を持つＤＣは、腫瘍に特異的な強力なメモリーまたは一次Ｔリンパ球反応を誘導する。Ｔ細胞増殖因子（活性化ＤＣによって内因性に提供されるか、または外因性に添加されるもの）は、腫瘍特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞集団をさらに拡大し、この集団がその後、残った腫瘍負荷の根絶を促進する。
【００１８】
本発明の方法には、免疫に基づく腫瘍療法における剤の併用が含まれる。剤の併用には、剤の別個の、連続した、または同時投与が含まれる。本発明で使用するのに適した剤には、ＤＣ動員因子；腫瘍細胞アポトーシス剤および／または壊死剤（腫瘍殺傷剤）；ＤＣ成熟剤；Ｔ細胞増進剤；および化学誘引剤が含まれる。本明細書に記載する方法には、個体に直接これらの剤を投与することを含むｉｎ  ｖｉｖｏ工程および／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ操作で細胞を接触させることを伴うｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｔｒｏ工程の併用が含まれる。
【００１９】
１つの態様において、本発明は、個体に：少なくとも１つのＤＣ動員因子；少なくとも１つの腫瘍殺傷剤；および少なくとも１つのＤＣ成熟剤を投与することによって、腫瘍を持つ個体を治療する方法を提供する。別の態様において、本発明の方法には、少なくとも１つのＴ細胞増進剤を個体に投与することがさらに含まれる。さらなる態様には、個体に腫瘍抗原（類）を投与することがさらに含まれる。
【００２０】
ＤＣ動員因子は、ＤＣの数を増加させるか、またはＤＣ集団を増加させるよう作用する。適切な樹状細胞動員因子（または剤）には、限定されるわけではないが、Ｆｌｔ３Ｌ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＣＤ４０Ｌおよびインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）が含まれる。異なるＤＣ動員因子は、ヒトにおいて、ＤＣの別個のサブセットを動員する。Ｆｌｔ３Ｌは、ＣＤ１１ｃ＋およびＣＤ１１ｃ−ＩＬ−３Ｒ＋サブセット両方を増加させ；前者のサブセットは４０から５０倍の間で増加し、そして後者は１０から１５倍の間で増加する（Ｐｕｌｅｎｄｒａｎら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６５：５６６，  ２０００；Ｍａｒａｓｋｏｖｓｋｙら，  Ｂｌｏｏｄ  ９６：８７８，  ２０００）。対照的に、Ｇ−ＣＳＦは、ＣＤ１１ｃ−サブセットのみを増加させ、そしてこれは約７倍である（Ｐｕｌｅｎｄｒａｎら、上記）。ＤＣのこの２つのサブセットは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞において異なるサイトカインプロフィールを引き出すため、異なるＤＣ動員因子を用いて、他のものよりある種類の免疫反応を優先的に増進することが可能である（すなわちＴＨ１様反応対ＴＨ２様反応）。
【００２１】
Ｆｌｔ３Ｌは、細胞表面チロシンキナーゼ受容体Ｆｌｔ３に結合し、そしてそれによって前駆細胞および幹細胞の増殖および分化を調節するポリペプチドを指す。米国特許第５，５５４，５１２号、１９９６年９月１０日発行（本明細書に援用）は、Ｆｌｔ３ＬをコードするｃＤＮＡの単離、および末梢幹細胞移植法におけるこの分子の使用を記載する。ヒトおよびネズミＦｌｔ３Ｌ両方、融合タンパク質および突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ）を含む、Ｆｌｔ３Ｌの多様な型が該特許に記載される。好ましいＦｌｔ３Ｌポリペプチドは、ヒトＦｌｔ３Ｌ（配列番号１）のアミノ酸２８から１６０、アミノ酸２８から１８２、またはアミノ酸２８から２３５、およびその断片を含んでなる。特に好ましいＦｌｔ３Ｌポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２８から１７９またはアミノ酸２６から１７９を含んでなる。
【００２２】
本発明で使用するのに適した他のＦｌｔ３Ｌ関連樹状細胞動員剤には、Ｆｌｔ３に結合し、そしてシグナルを伝達する剤が含まれる。こうしたＦｌｔ３結合タンパク質は、モノクローナル抗体およびヒト化抗体を含むアゴニスト性抗体、並びに少なくとも１つの適切な抗原結合ドメインを有し、そしてＦｌｔ３シグナルを伝達するアゴニスト性抗体由来の、組換え的に調製した剤を含む。
【００２３】
ＧＭ−ＣＳＦは、増殖、並びに前駆細胞から顆粒球およびマクロファージへの分化を誘導するリンホカインである。米国特許第５，１６２，１１１号、１９９２年１１月１０日発行は、ヒトおよびネズミＧＭ−ＣＳＦ両方のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を開示し、そして細菌疾患を治療する際のこのリンホカインの使用を記載する。ＧＭ−ＣＳＦおよびインターロイキン−３を含んでなる融合タンパク質（米国特許第５，１０８，９１０号、１９９２年４月２８日発行に記載）、ＧＭ−ＣＳＦの突然変異タンパク質（米国特許第５，３９１，４８５号、１９９５年２月２１日発行に開示）、およびＧＭ−ＣＳＦを含んでなる持続放出組成物（米国特許第５，９４２，２５３号、１９９９年８月２４日発行に記載）を含む、他の型のＧＭ−ＣＳＦもまた、本発明で有用であろう。上に引用する特許の関連する開示を、特に本明細書に援用する。
【００２４】
ＩＬ−１５は、前駆タンパク質として産生され、そして切断されて活性型になる、分泌サイトカインである。成熟ＩＬ−１５は、前駆Ｔ細胞または成熟Ｔ細胞の増殖および／または分化をシグナル伝達することが可能であり、そしてしたがって、（ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで）Ｔ細胞免疫反応を制御するのに使用可能である。上皮由来Ｔ細胞因子と呼ばれていたＩＬ−１５は、米国特許第５，５７４，１３８号、１９９６年１１月１２日発行（本明細書に援用）に記載される。ＩＬ−１５の好ましい型は、成熟ＩＬ−１５ポリペプチドを含んでなる（非切断前駆タンパク質のアミノ酸４９から１６２；配列番号２）。
【００２５】
腫瘍殺傷剤には、アポトーシス誘導剤および壊死誘導剤両方が含まれ、これらには、例えば、放射療法、化学療法、超音波、光線力学的療法、熱または非常な低温への曝露、抗体療法、ウイルスでの感染、選択したタンパク質をコードするウイルスベクターでの形質導入、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーの多様なメンバー（ＴＮＦ、リンホトキシンアルファおよびベータ、ＣＤ４０Ｌ、およびＴＮＦ関連アポトーシス誘導またはＴＲＡＩＬを含む）が含まれる。放射および／または化学療法は、多様な型の癌または前癌性状態を治療するのに、癌学者が用いるツールの１つである。好ましい治療様式は、他の要因の中でも、治療しようとする癌の特定の種類、疾患の段階、および患者の状態に応じるであろう。癌および前癌性状態を治療する当業者は、使用可能な多様な治療措置を認識し、そしてその技術を適用して、各個体の状況の知識に基づいて、好ましい措置を決定するであろう。措置を選択する際、当業者を手助けするのに、いくつかの教科書が有用であり、これらには、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  第５版（Ｄｅ  Ｖｉｔａ，  ＨｅｌｌｍａｎおよびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ監修；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  １９９７）、およびＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  第３版（ＰｅｒｅｚおよびＢｒａｄｙ監修；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  １９９７）が含まれる。
【００２６】
多様なコンピューターおよびインターネットに基づく情報源が、アポトーシス剤およびアポトーシス様式決定の補助に利用可能である。典型的なウェブサイトは、米国保健研究所の米国癌研究所によって維持されるものである（ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｎｅｔ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。該ウェブサイトは、多様な種類の癌、治療オプション、実施中の多様な臨床試験、癌のリスク要因、および他の有用な情報源に関する情報を含有する。
【００２７】
いくつかの抗体療法は、本発明を実施する際に適した腫瘍殺傷療法である。リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）（登録商標）（リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）；ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、カリフォルニア州サンディエゴ、およびＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ、カリフォルニア州サンフランシスコ）は、ＣＤ２０発現細胞の補体依存細胞溶解および抗体依存細胞傷害性を仲介する、細胞表面マーカーＣＤ２０に対するキメラモノクローナル抗体である。これはまた、化学耐性ヒトリンパ腫細胞株を感作し、そしてアポトーシスを誘導することも示されてきている。リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）（登録商標）は、ＣＤ２０陽性リンパ腫の治療に、臨床的に有意な効果を有することが示されてきている（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  １６：２８２５；１９９８）。
【００２８】
ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（登録商標）（トラスツズマブ（Ｔｒａｎｓｔｕｚｕｍａｂ）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）は、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）の細胞外ドメインに高い親和性および特異性で結合する、ヒト化モノクローナル免疫グロブリンＧ１カッパ抗体である。前臨床研究によって、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（を単独で、あるいはパクリタキセルまたはカルボプラチンと併用して投与すると、ＨＥＲ２遺伝子産物を過剰発現する、乳腺腫瘍由来細胞株の増殖が有意に阻害されることが示されてきている。ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（（登録商標）の説明は、米国特許第６，０５４，２９７号、２０００年４月２５日発行に提供され、該特許の開示は本明細書に援用される。
【００２９】
ＩＭＣ−Ｃ２２５は、多様な腫瘍細胞上に見られる増殖因子受容体を遮断する別の抗体である。ＩＭＣ−Ｃ２２５は、ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ニューヨーク州ニューヨーク）によって開発され、そして生産されるキメラ抗体であり、そしてＯｖｅｒｈｏｌｓｅｒら（Ｃａｎｃｅｒ  ８９：７４；２０００）に記載される。該抗体は、増殖因子受容体を遮断し、そして腫瘍細胞が細胞死シグナルを回避するのを妨げることによって、作用する。
【００３０】
別の有用な抗体は、ヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦｒ）に高い親和性で結合する、トランスジェニックマウスで生成したヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体、ＡＢＸ−ＥＧＦである（Ｙａｎｇら，  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｌ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ３８：１７，  ２００１）。ＡＢＸ−ＥＧＦは、ＥＧＦｒ発現ヒト癌腫細胞株へのＥＧＦおよびトランスフォーミング増殖因子−アルファ（ＴＧＦ−アルファ）両方の結合を遮断し、そしてＥＧＦ依存腫瘍細胞活性化を阻害する。完全なヒト抗体であるため、ＡＢＸ−ＥＧＦは、ヒト患者において、長い血清半減期および最小免疫原性を示すであろう。
【００３１】
腫瘍殺傷剤には、限定されるわけではないがＴＲＡＩＬを含む、特定の標的細胞のアポトーシスを誘導するポリペプチドが含まれる。ＴＲＡＩＬは、癌細胞およびウイルス感染細胞のアポトーシスを誘導する。ＴＲＡＩＬのクローニングおよび性質決定は、米国特許第５，７６３，２２３号、１９９８年６月９日発行に記載される。該特許に開示されるように、ＴＲＡＩＬは、Ｎ末端細胞質ドメイン、膜貫通領域および細胞外ドメインを含んでなる。本発明において有用なＴＲＡＩＬの可溶性型には、ＴＲＡＩＬの細胞外ドメイン、または標的細胞に結合し、そしてアポトーシスを誘導する能力を保持する、細胞外ドメインの断片が含まれる。可溶性ＴＲＡＩＬの好ましい型は、米国特許第５，７６３，２２３号に開示されるような、ヒトＴＲＡＩＬ（配列番号５）のアミノ酸９５から２８１を含んでなる。
【００３２】
ＴＲＡＩＬのオリゴマー型もまた有用であり；好ましい型は、三量体化を促進するペプチドに融合したＴＲＡＩＬの細胞外ドメインを含んでなる。天然存在三量体タンパク質由来のペプチドまたはオリゴマー化を促進する合成ペプチドが使用可能である。特に有用なペプチドは、ロイシンジッパー（ジッパードメインまたはロイシンジッパー部分）と称されるものである。特定の態様において、ロイシンジッパー中のロイシン残基を、イソロイシン残基と交換する。イソロイシンを含んでなるこうしたペプチドは、イソロイシンジッパーと称することが可能であるが、本明細書で使用するような用語「ロイシンジッパー」に含まれる。
【００３３】
１つの例は、Ｈｏｐｐｅら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４４：１９１，  １９９４）および米国特許第５，７１６，８０５号に記載されるような、アミノ酸Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎを含んでなる、肺界面活性物質プロテインＤ（ＳＰＤ）由来のロイシンジッパーである。三量体化を促進するロイシンジッパーの別の例は、配列番号４に示すジッパーペプチドである。別の態様において、該ペプチドは、Ｎ末端Ａｒｇ残基を欠く。別の態様において、Ｎ末端Ａｓｐ残基が付加される。適切なロイシンジッパーペプチドのさらに別の例は、アミノ酸配列Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕを含んでなる。別のペプチドでは、前述の配列のロイシン残基が、イソロイシン残基で交換される。オリゴマー化を促進する特性を保持する、前述のジッパーペプチドの断片もまた、使用可能である。こうした断片の例には、限定されるわけではないが、前述のアミノ酸配列に示すＮ末端またはＣ末端残基の１または２残基を欠くペプチドが含まれる。
【００３４】
本発明を実施するのに有用な、適切なＤＣ成熟剤には、ＣＤ４０ＬおよびＣＤ４０シグナル伝達のアゴニスト、ＲＡＮＫＬ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＣｐＧリッチＤＮＡ配列（ＩＳＳ、または免疫刺激配列）、リポ多糖（ＬＰＳ）、および単球馴化培地（Ｒｅｄｄｙら，  Ｂｌｏｏｄ  ９０：３６４０；１９９７）が含まれる。これらの剤は、有効で、特異的な抗腫瘍細胞傷害性反応を刺激するその能力を増進することによって、ＤＣに作用する。したがって、例えば、ＣＤ４０Ｌを投与するかまたはＤＣをＣＤ４０Ｌと接触させることによって、ＤＣ上に発現されるＣＤ４０の連結が引き起こされ、これが次に、ＤＣ表面上のＭＨＣ分子数の増加を刺激する。これは、ＤＣの抗原提示能を増加させる。成熟剤を投与するかまたはＤＣを成熟剤と接触させることによって、抗腫瘍反応を増大させるよう作用することが可能な、多様な免疫調節サイトカイン（例えばＩＬ−１２）の分泌もまた増進される。ＤＣはまた、ＤＣが活性化されたことを示すサイトカインの分泌を刺激する剤（ＤＣ活性化因子）と接触させてもよい。したがって、例えば、ＤＣをＣＤ４０ＬおよびＩＦＮ−γと（同時に、連続してまたは別個に）接触させて、ＤＣの成熟および活性化を刺激することが可能である。
【００３５】
ＣＤ４０に結合し、そしてそれによってシグナルを伝達することが可能なＣＤ４０Ｌポリペプチドは、本発明において有用である。ＣＤ４０ＬをコードするｃＤＮＡが、米国特許第５，９６１，９７４号、第５，９６２，４０６号および第５，９８１，７２４号（以後、Ａｒｍｉｔａｇｅ特許）に記載される。特に有用な成熟剤であるＣＤ４０Ｌの型には、ＣＤ４０Ｌの細胞外部分、およびＣＤ４０に結合し、そしてシグナルを伝達する細胞外部分の断片が含まれる。特に、Ａｒｍｉｔａｇｅ特許に開示されるような、配列番号３のアミノ酸４７−２６１を含むポリペプチド、配列番号３のアミノ酸１１３−２６１を含むポリペプチド、配列番号３のアミノ酸５１−２６１を含むポリペプチドおよびこれらのポリペプチドのオリゴマー型が、本発明で使用可能である。好ましいＣＤ４０Ｌは、ヒトＣＤ４０Ｌのシステインアミノ酸１９４がトリプトファンで置換されているものである。ＣＤ４０Ｌの最も好ましい型は、Ａｒｍｉｔａｇｅ特許で三量体ＣＤ４０Ｌと称される可溶性ＣＤ４０Ｌ融合タンパク質である。三量体ＣＤ４０Ｌは、三量体化を促進するジッパードメインに融合したＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインの断片を含んでなる（配列番号４）。
【００３６】
さらに適切な樹状細胞成熟剤には、ＣＤ４０に結合し、そしてシグナルを伝達する化合物が含まれる。これらの中に、モノクローナル抗体ＨｕＣＤ４０−Ｍ２（ＡＴＣＣ  ＨＢ１１４５９）などのＣＤ４０に対するアゴニスト性抗体と共に、抗体ＨｕＣＤ４０Ｍ２由来の抗原結合ドメインを含んでなる、ヒト化抗体または他の組換え的に得られる分子がある。
【００３７】
ＲＡＮＫＬは、ＣＤ４０Ｌ同様、２型膜貫通タンパク質であり、約５０アミノ酸未満の細胞内ドメイン、約２４０から２５０アミノ酸の膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを持つ（配列番号６）。ＲＡＮＫＬは、ＵＳＳＮ  ０８／９９５，６５９、１９９７年１２月２２日出願（ＰＣＴ／ＵＳ９７／２３７７５）に記載される。属するＴＮＦファミリーの他のメンバー同様、ＲＡＮＫＬは、膜貫通ドメインおよび受容体結合ドメインの間に、受容体結合に必要でない、スペーサー領域を有する。したがって、ＲＡＮＫＬの可溶性型は、全細胞外ドメイン、または受容体結合領域を含むその断片を含んでなることが可能である。
【００３８】
ＣＤ４０Ｌ同様、ＲＡＮＫに結合し、そしてシグナルを伝達する他の化合物は、有用な成熟剤であり、そしてこれらには、ＲＡＮＫに対するアゴニスト性抗体と共に、ＲＡＮＫに結合する抗体由来の抗原結合ドメインを含んでなる、ヒト化抗体または他の組換え的に得られる分子が含まれる。ＴＮＦスーパーファミリーのいくつかの他のメンバーもまた、本発明の多様な側面に使用を有するであろう。これらには、リンホトキシンアルファおよびベータ、Ｆａｓリガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ４０リガンド、４−１ＢＢリガンド、ＯＸ４０リガンド、ＴＲＡＩＬおよびＲＡＮＫＬが含まれる。
【００３９】
ＤＣはまた、Ｆｌｔ３Ｌ、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、シクロホスファミドまたはＣＤ３４＋細胞を動員することが知られる他の剤での動員後、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させることも可能である。こうして得たＤＣは、Ｆｌｔ３Ｌ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）またはＮＦ−カッパＢの受容体活性化因子のリガンド（ＲＡＮＫＬ）などの剤を用いて、培養してもよい。あるいは、ＤＣは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、ＧＭ−ＣＳＦおよびインターロイキン−４（ＩＬ−４）を用いて生成することが可能である。培養ＤＣは、上述のように、ｅｘ  ｖｉｖｏでさらに処理して成熟および／または活性化を刺激してもよい。これらの方法によって、ｅｘ  ｖｉｖｏで生成したＤＣは、腫瘍内に限局投与、血流内または排出リンパ節内に全身投与することが可能である。
【００４０】
ＴＮＦは、炎症および免疫防御でもまた中心的な役割を果たす樹状細胞成熟剤であり、そして悪液質、敗血症ショックおよび自己免疫を含む、いくつかの発病過程に関与する。免疫系の細胞に対するその強力な効果のため、ＴＮＦはｉｎ  ｖｉｔｒｏで有用である（例えば、細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ生成、増殖および／または活性化、並びに／あるいはＤＣの成熟）。さらに、多様な技術、例えば本明細書に論じるような遺伝子療法あるいは腫瘍部位内またはその近傍での限局投与における使用を用いて、全身性の影響を最小限にすることが可能である。
【００４１】
別の樹状細胞成熟剤であるリポ多糖（ＬＰＳ）は、グラム陰性細菌の細胞壁構成要素である。ＬＰＳは、脂質コア（脂質Ａ）および付着する多糖部分からなり；脂質Ａは（いくつかの結合する多糖と共に）、毒性ショック症候群（敗血症ショックまたは内毒血症）を含む、グラム陰性菌血症の毒性効果の大部分に関与すると考えられる。ＬＰＳをｅｘ  ｖｉｖｏで使用して成熟ＤＣを生成することが可能であるし；あるいは本明細書に記載する多様な技術を適用して、腫瘍を持つ被験者へのＬＰＳの限局投与を可能にすることが可能である。
【００４２】
さらなる適切な樹状細胞成熟剤には、適切なＴ細胞増進剤でもある剤が含まれる。こうした剤には、インターロイキン２、１５、７および１２（それぞれＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、およびＩＬ−１２）並びにインターフェロン−ガンマおよびアルファ（ＩＦＮ−γおよびＩＦＮ−α）、並びにＯＸ４０および４−１ＢＢアゴニストが含まれる。これらの剤、および本発明の併用療法に有用性を有する多くの他の剤は、Ｔｈｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（第３版；Ａｎｇｕｓ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ監修；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９８）に記載される。
【００４３】
Ｔ細胞増殖因子として最初に同定されたインターロイキン−２（ＩＬ−２）はまた、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、単球、マクロファージおよびオリゴデンドロサイトにも影響を与えることが知られる。米国特許第６，０６０，０６８号、２０００年５月９日発行は、ＩＬ−２およびワクチンアジュバントとしてのその使用を記載する。遺伝子療法におけるＩＬ−２が、米国特許第６，０６６，６２４号、２０００年５月２３日発行に記載される。腫瘍性疾患の予防および治療のための熱ショックタンパク質／抗原性ペプチド複合体と組み合わせたＩＬ−２の使用が、米国特許第６，０１７，５４０号、２０００年１月２５日発行に記載される。
【００４４】
別の樹状細胞成熟剤およびＴ細胞増進剤である、インターロイキン−７（ＩＬ−７）は、免疫および非免疫細胞両方から分泌される約２５ｋＤａのサイトカインであり、そして免疫系の発展および細胞性免疫反応の生成に関与する。米国特許第５，３２８，９８８号、１９９４年７月１２日発行は、ヒトＩＬ−７の同定および単離を記載する。ＩＬ−７は、Ｔリンパ球の免疫エフェクター細胞機能を増進するため、ＣＴＬ反応を増大する能力において、Ｔ細胞増進剤として、本発明の実施に有用である。ＩＬ−７はまた、増殖因子としても作用し、そして骨髄移植または高用量化学療法後の免疫細胞増殖を刺激するのにも用いられてきている。したがって、ＩＬ−７はまた、腫瘍細胞死誘導前に免疫細胞を動員するかまたは免疫細胞増殖を刺激する剤としても、本発明において有用である。
【００４５】
インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、インターロイキン−６（ＩＬ−６）受容体およびＧ−ＣＳＦ受容体に構造的類似性を持つ重鎖（ｐ４０）、並びにＩＬ−６およびＧ−ＣＳＦと似た軽鎖（ｐ３５）を有する、ヘテロ二量体タンパク質である。ＴＨ１免疫反応の優先的な発展を促進する能力があるため、ＩＬ−１２は、感染性疾患設定と共に、腫瘍モデルで使用されてきている。ＩＬ−１２は、有用なＴ細胞増進剤であり、そして本発明の方法において、増進した抗腫瘍ＣＴＬ活性を提供する。ＩＬ−１２を投与すると、腫瘍細胞アポトーシスが誘導可能であり、そしてしたがって、ＩＬ−１２は、本発明において、アポトーシス剤として有用である。さらに、ＩＬ−１２  ＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法で、例えば腫瘍細胞または樹状細胞がＩＬ−１２を発現するように形質導入し、そして該細胞を腫瘍内に投与することによって使用可能である。
【００４６】
インターフェロンは、構造的相同性を示し、そして同一の祖先遺伝子に由来すると考えられるＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−ω、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−τ）、および他のインターフェロンと相同性を示さないが、いくつかの生物学的活性を共有するＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−γ）と称される、２つのカテゴリーに属する。どちらの種類のインターフェロンも、Ｔ細胞の細胞溶解活性を増大するＭＨＣ分子の発現を増進し、したがって、インターフェロンは有用なＴ細胞増進剤となっている。インターフェロンはまた、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびマクロファージも活性化し、これらはどちらも、腫瘍細胞を殺傷するのにより有効になる。さらに、いくつかの腫瘍細胞は、インターフェロンによって直接影響を受け、その成長または増殖が遅延される可能性がある。多くの特許が多様なインターフェロンの産生および使用を記載する。例えば、米国特許第５，５４０，９２３号は、Ｉ型およびＩＩ型インターフェロン両方を単離する方法を記載し、そして米国特許第５，３７６，５６７号および第４，８８９，８０３号は、ＩＦＮ−γの組換え発現に関する。アクティミューン（Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ）ＴＭとして知られるＩＦＮ−γ  １ｂの型が、ＩｎｔｅｒＭｕｎｅ、カリフォルニア州パロアルトに製造される。低用量のＩＦＮ−αが、慢性骨髄白血病（Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄら，  Ａｎｎ．  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｍｅｄ．  １２１：７３６；１９９４）および癌の他の型の治療に用いられてきている。ＩＦＮ−αの組換え型、イントロナ（Ｉｎｔｒｏｎａ）（登録商標）は、多様な抗ウイルスおよび抗癌適応症のため、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈによって販売されている。
【００４７】
タンパク質のＴＮＦ受容体スーパーファミリーの多様なメンバーに作用する他の剤もまた、本明細書において有用性を有するであろう。典型的な剤には、ヒト化またはその一本鎖型を含む、アゴニスト性抗体が含まれる。例えばＭｅｌｅｒｏらは、４−１ＢＢに対するモノクローナル抗体が、マウスにおいて、巨大な、免疫原性の劣った腫瘍の根絶を導くことが可能であることを示した（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  ３：６８２；１９９７）。Ｍｅｌｅｒｏらによると、アゴニスト性４−１ＢＢ抗体は、腫瘍特異的ＣＴＬ活性を増大させる。したがって、こうした抗体（または４−１ＢＢリガンド）は、本発明の方法において、ＣＴＬ活性を上方制御するのに使用を有する可能性があり；これらはまた、腫瘍細胞死を引き起こすことによって、利用可能な腫瘍抗原の量を増加させるよう機能する可能性もある。米国特許第５，６７４，７０４号、１９９７年１０月７日発行は、細胞質ドメイン、膜貫通領域および細胞外ドメインを含んでなる４−１ＢＢのリガンドを開示する。細胞外ドメインを含んでなる４−１ＢＢリガンドの可溶性型もまた開示され；細胞外ドメインに多量体形成ペプチド（Ｆｃ分子またはジッパーペプチドなど）を付加することによって、さらなる多量体型を調製する。特に有用なアゴニスト性モノクローナル抗体は、４−１ＢＢｍ６（バージニア州マナサスのアメリカンタイプ組織コレクションに、＿＿＿に寄託し、そして寄託番号＿＿＿を与えられた）である。ネズミ抗体のヒト化型、一本鎖抗体、およびヒト抗体遺伝子を提示し、そしてしたがって抗原に対するヒト抗体を作成するトランスジェニックマウスで生成する、モノクローナル抗体を含む、４−１ＢＢｍ６と同一のエピトープに結合する抗体の他の型もまた、有用であろう。
【００４８】
同様に、ＯＸ４０のアゴニスト（アゴニスト性抗体およびＯＸ４０リガンドを含めて、ＯＸ４０に結合し、そしてそれによってシグナルを伝達する分子）は、腫瘍拒絶を導くことが可能な、ＣＤ８＋  Ｔ細胞反応を促進する。米国特許第５，４５７，０３５号、１９９５年１０月１０日発行は、ＯＸ４０のリガンドを開示し；Ｍｉｕｒａら（Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １１：１３１３；１９９１）は、彼らがｇｐ３４と称する、ネズミＯＸ４０Ｌのヒト相同体を開示する。ＴＮＦスーパーファミリーの他のメンバー同様、ＯＸ４０Ｌは、ＩＩ型膜貫通タンパク質であり；ＯＸ４０Ｌの可溶性型は、細胞外ドメインから作成する。ＯＸ４０Ｌの多量体型は、標準的な組換えＤＮＡ技術を用い、免疫グロブリンＦｃまたはオリゴマー化ジッパーなどの多量体形成ペプチドを、ＯＸ４０ＬをコードするＤＮＡに付加して、調製する。好ましいアゴニスト性モノクローナル抗体は、Ｏｘ４０ｍ５（バージニア州マナサスのアメリカンタイプ組織コレクションに、＿＿＿に寄託し、そして寄託番号＿＿＿を与えられた）である。ネズミ抗体のヒト化型、一本鎖抗体、およびヒト抗体遺伝子を提示し、そしてしたがって抗原に対するヒト抗体を作成するトランスジェニックマウスで生成された、モノクローナル抗体を含む、Ｏｘ４０ｍ５と同一のエピトープに結合する抗体の他の型もまた、有用であろう。
【００４９】
当業者は、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）を含む、Ｔ細胞に影響を与えるいくつかの他の因子もまた認識するであろう。このサイトカインは、未成熟リンパ球の成長を増進し、Ｔ細胞のアポトーシスを阻害し、そしてリンパ球に対する強力な免疫抑制効果を有する。したがって、ＴＧＦ−βまたはその阻害剤（ＴＧＦ−βに結合し、そして細胞結合ＴＧＦ−β受容体への結合を妨げる抗体、ＴＧＦ−β受容体の可溶性型、またはＴＧＦ−βがその受容体に結合するかまたはそれによってシグナルを伝達する能力に干渉する他の分子など）もまた、本発明において有用であろう。当業者は、日常的な実験を適用することによって、望ましい影響に応じて、使用に適した型を選択することが可能であろう。
【００５０】
インターロイキン４、５および１０を含む他の分子もまた、免疫反応の発展に重大であることが知られ、そしてＴＨ２様である（すなわち細胞傷害性Ｔ細胞の生成をほとんどまたはまったく伴わず、抗体産生細胞が優勢である）免疫反応を優先的に増進するようである。これらの分子のアンタゴニストは、ＴＨ２様免疫反応を妨げるかまたは減少させるのに有用であろうし；本発明の他の側面と組み合わせて、こうしたアンタゴニストは、個体において、腫瘍細胞を除去するのにより有効である可能性があるＴＨ１様反応に向かう免疫反応の操作を容易にする。アンタゴニストには、これらの分子の１つに結合し、そしてしたがって細胞結合受容体への結合を妨げる抗体、受容体の可溶性型、あるいは分子がその受容体に結合するかまたはそれによってシグナルを伝達する能力に干渉する他の分子が含まれる。米国特許第５，５９９，９０５号、１９９７年２月４日発行は、可溶性ＩＬ−４受容体の有用な型を開示する。
【００５１】
ケモカインは、多様な種類の免疫系細胞に走化活性を示す、基本的な小タンパク質である。タンパク質のこのファミリーのメンバーは、ほぼ機能と相関する、システイン残基間のジスルフィド結合の形成およびシステイン残基間の介在アミノ酸の存在または非存在に基づいて、おおまかに、４つのグループに分類可能である。したがって、ＣＸＣサブグループのメンバーは、最初の２つの特徴的なシステイン残基間に介在するアミノ酸を示し、そして主に好中球を誘引し、そして活性化する傾向がある。ＣＣケモカインは、介在アミノ酸を持たず、そして樹状細胞、リンパ球および単核細胞に走化活性を示す。ケモカインの第三のサブクラスは、Ｃファミリーであり、４つのシステインのうち２つを欠く；これは、ＮＫおよびＣＤ４  Ｔ細胞を腫瘍部位に誘引することが示されている、リンパ特異的誘引剤、リンホタクチンに代表される。介在する３つのアミノ酸を持つ第四の型のケモカイン（ＣＸ３Ｃ）もまた同定されており；このサブファミリーの代表的な分子であるフラクタルカインは、白血球接着および血管外遊走に関与している可能性がある。
【００５２】
したがって、ケモカインは、本発明において、特定の種類の細胞を腫瘍部位に誘引するのに使用を見出すであろう。例えば、ＭＣＰ１−５、ＭＩＰ−１アルファまたはベータ、ＲＡＮＴＥＳまたはエオタキシンの１つなどのＣＣケモカインは、当該技術分野に知られ、そして本明細書に論じる技術いずれかによって（すなわちタンパク質またはそれをコードするＤＮＡの腫瘍内注射によって、あるいは腫瘍部位の細胞によるケモカイン分泌を誘導する遺伝子療法技術の使用を通じて）、腫瘍部位に、限局投与して、動員した樹状細胞を該部位に誘引することが可能である。用いるケモカインは、日常的な実験を適用することによって、誘引しようとする細胞の種類に応じて、選択可能である。
【００５３】
さらなる有用な剤が、ＵＳＳＮ  ６０／２４９，５２４、２０００年１１月１７日出願に開示され、該出願の開示は本明細書に援用される。特に、ケモカイン、ＭＩＰ−３アルファ、ＭＩＰ−３ベータ、ＭＩＰ−５、ＭＤＣ、ＳＤＦ−１、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＥＣＫ、およびＳＤＦ−１は、樹状細胞限局因子として作用する、有用なケモカインである。さらに、ＩＬ−１、ＴＮＦ−アルファおよびＩＬ−１０などのサイトカインもまた、局在化因子（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）として作用することが可能である。ソマトスタチン細胞表面受容体ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ４およびＳＳＴＲ５あるいはその相同体または相同分子種（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）の１又はそれより多くのメンバーに結合し、そして該メンバーを活性化する化合物もまた、本発明において有用であろう。これらには、ソマトスタチンおよびコルチスタチン、並びにソマトスタチンペプチドＳＳＴ−１４、ＳＳＴ−２８、並びにコルチスタチンペプチドＣＳＴ−１７およびＣＳＴ−２９を含む、ソマトスタチン受容体の天然存在リガンドが含まれる。ＳＳＴＲの他の既知のペプチドアゴニストには、オクレオチド（ｏｃｒｅｏｔｉｄｅ）、ランレオチド（ｌａｎｒｅｏｔｉｄｅ）、バプレオチド（ｖａｐｒｅｏｔｉｄｅ）、セグリチド（ｓｅｇｌｉｔｉｄｅ）、ＢＩＭ２３２６８、ＮＣ８−１２、ＢＩＭ２３１９７、ＣＤ２７５およびＳＳＴＲに高親和性を有することが見出された他のものが含まれる。これらの化合物いずれかの誘導体、類似体および擬似体（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）もまた、本発明において有用であろう。
【００５４】
当業者は、本明細書に開示する多様な剤および／または因子が、細胞表面受容体に結合し、そしてそれによって細胞にシグナルを伝達することによって作用することを理解する。他の剤もまた、これらの特性を示す可能性があることもまた理解する（すなわち既定の受容体に対するアゴニスト性抗体）。したがって、本発明の方法は、具体的に上に開示する因子で生じる、細胞へのシグナル伝達を模倣する他の分子の使用を含む。こうした分子には、アゴニスト性モノクローナル抗体およびそれに由来する組換えタンパク質と共に、小分子ライブラリーのスクリーニングによって、または合理的薬剤設計を通じて単離される、リガンド擬似体が含まれる。
【００５５】
当業者はまた、有用な組換えタンパク質を、対応する天然タンパク質と異なる型で発現してもよいことも理解する。例えば、タンパク質のＴＮＦファミリーの特定のメンバーは、三量体型で存在すると考えられる（ＢｅｕｔｌｅｒおよびＨｕｆｆｅｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：６６７，  １９９４；Ｂａｎｎｅｒら，  Ｃｅｌｌ  ７３：４３１，  １９９３）。ＴＮＦファミリーメンバーの好ましい型は、ＣＤ４０ＬまたはＴＲＡＩＬに関して本明細書に記載するように、三量体化（または他の多量体化）を促進するペプチドを含んでなることが可能である。
【００５６】
腫瘍細胞死を刺激する剤の投与
腫瘍細胞死を誘導する多様な手段が当該技術分野に知られる；投与の正確な方法は、他の要因の中でも、治療しようとする癌の種類、癌の段階および患者の健康状態に応じるであろう。当業者は、これらの要因に基づいて、適切な投与法を選択可能であろう。一般的に、因子が化学療法剤（またはその組み合わせ）、または生物学的剤である場合、生理学的に許容しうるキャリアー、賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ）または希釈剤と組み合わせて精製化合物を含んでなる薬剤組成物の形で投与されるであろう。こうしたキャリアーは、使用する投薬量および濃度で、被験者に非毒性である。
【００５７】
通常、こうした組成物の調製は、化合物を、緩衝剤、アスコルビン酸などの酸化防止剤、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロースまたはデキストラン類を含む炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、グルタチオン並びに他の安定化剤および賦形剤と合わせることを含む。中性緩衝生理食塩水または同種の血清アルブミンと混合した生理食塩水は、典型的な適切な希釈剤である。さらに、多様な型の徐放技術が使用可能である；米国特許第５，９４２，２５３号は、ＧＭ−ＣＳＦを含んでなる持続放出組成物を開示する。こうした組成物および一般の当業者が調製可能な他のもの（例えば本明細書に開示するようなヒドロゲルの使用）もまた、本発明において有用であろう。使用する特定の療法的有効量は、本発明にとって重要でなく、そして選択する特定の因子、治療しようとする疾患または状態と共に、被験者の年齢、体重および性別に応じて多様であろう。
【００５８】
化学療法剤は、癌細胞に作用して増殖を阻害する；化学療法の多くの副作用は、これらの剤が、正常な、迅速に分裂している細胞に引き起こす損傷のためである。癌に罹患した患者は、化学療法によって、単独で、または他の抗癌治療と併用して、治療することが可能である。多くの化学療法剤が知られ；いくつかは多くの種類の腫瘍に対して有効であり、そして多くの異なる種類の癌を治療するのに用いるが、他のものは１または２種類の癌のみに関して、最も有効である。化学療法剤は、静脈内、経口、注射によって投与するか、あるいは皮膚に適用することが可能である。したがって、化学療法を用いるかどうか、そしてどの剤またはその組み合わせを投与すべきであるかは、他の要因の中でも、癌の種類、腫瘍の位置、および患者の健康状態に応じる。
【００５９】
腫瘍細胞死を引き起こすのに用いられている治療の別の型は、凍結手術（または凍結療法）であり、これは非常な低温を癌細胞に適用し、細胞死を引き起こすものである。凍結手術は、最も頻繁には、腫瘍に直接液体窒素を適用することによって、皮膚腫瘍（または他の外部腫瘍）を治療するのに用いられてきている。しかし、内部腫瘍を治療する際の極端な低温の使用を可能にする技術が開発されてきている。例えば、超音波を用いて、取り巻く正常細胞への損傷を最小限にしつつ、腫瘍細胞への液体窒素の適用を監視し、そして導き、凍結短針（ｃｒｙｏｐｒｏｂｅ）を通じて液体窒素を循環させることが可能である。凍結手術は、多様な種類の皮膚癌、網膜芽細胞腫、前立腺癌、肝癌、骨、脳および脊髄の腫瘍、並びに食道で形成される腫瘍を治療するのに用いられてきているか、またはそれに関して調べられている；凍結手術はまた、光線性角化症および子宮頚上皮内腫瘍などの前癌性状態にも用いられる。さらに、凍結療法は、いぼ（ある場合では、癌性または前癌性状態である可能性があるもの）および伝染性軟属腫の治療に用いて成功してきている；本明細書に開示する併用療法の使用もまた、こうした状態で有益であることが立証される可能性がある。
【００６０】
高温（高体温）もまた、通常、他の種類の療法と併用して、癌細胞を根絶する試みの中で用いられてきている。限局（ｌｏｃａｌ）高体温では、体外の装置、滅菌プローブ（細い、加熱した針金または温水で満たした中空管）、移植したマイクロ波アンテナ；または高周波電極から腫瘍に向けた高周波を用いて、熱を腫瘍に適用する。肢または器官もまた、局所的高体温と称する方法で加熱可能である。この技術では、磁石または高エネルギーを産生する装置を、加熱しようとする領域上に置くか、あるいは肢または器官を灌流（患者血液のある程度を除去し、該血液を加熱し、そして該血液を器官または肢に戻す）によって加熱する。全身加熱は、温水ブランケット、ホットワックス、誘導、または熱チャンバーの使用を通じて、転移性癌を治療するのに使用可能である。
【００６１】
放射療法は、細胞の遺伝子成分を損傷するのに、電離（ｉｏｎｉｚｉｎｇ）放射線を利用する；正常および癌性細胞両方が損傷を受ける可能性があるが、正常細胞は損傷を修復する能力を保持し、一方、この能力は癌細胞で減少する。限局された固形腫瘍は、しばしば、放射療法を用いて治療する；白血病およびリンパ腫もまた、放射療法で治療可能である。Ｘ線およびガンマ線を含む、いくつかの種類の電離放射線が使用可能である。放射療法は、放射線を腫瘍上に集中させる機械を用いて、あるいは腫瘍内に直接、または近傍の体腔に、放射性移植物を置くことによって、適用可能である。さらに、放射標識抗体を用いて、腫瘍細胞をターゲティングすることが可能である。科学者はまた、術中照射、および粒子ビーム照射と共に、腫瘍細胞を放射線により感受性にする放射感作剤（熱を含む）、または正常細胞を保護する放射保護剤を含む、他の放射療法技術も研究している。
【００６２】
癌療法の別の種類、光線力学的療法（ＰＤＴ）は、光エネルギーを利用して癌細胞を殺す。ＰＤＴでは、光感作剤を患者に投与して、患者を続いて光に曝露する（通常、罹患した体領域のみ）。光感作剤の多様な投与様式が当該技術分野に知られ、そして本発明において有用であろう。例えば、光感作剤を経口、局所、非経口、または限局（すなわち腫瘍または前癌性領域中に直接またはその近傍に）投与することが可能である。光感作剤はまた、リン脂質小胞または油エマルジョンなどのビヒクルを用いても搬送可能である。脂質に基づく搬送ビヒクルを使用した結果、腫瘍性細胞における光感作剤の集積が増進する可能性がある。やはり本発明に含まれる搬送の代替法には、微小球体、あるいは腫瘍性細胞表面上に位置するタンパク質（またはタンパク質類）に特異的に結合する、モノクローナル抗体、または他のタンパク質の使用が含まれる。
【００６３】
使用する特定の光感作剤は、本発明に重要でない。本発明において有用な光感作剤の例には、ヘマトポルフィリン、ウロポルフィリン、フタロシアニン、プルプリン、アクリジン色素、バクテリオクロロフィル、バクテリオクロリンが含まれ、そして他のものが本明細書に開示される。使用される好ましい光感作剤は、フォトフリン（Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ）（登録商標）（ＱＬＴ、カナダ・バンクーバー）であり；さらなる例が本明細書に開示され、そしてＤｏｕｇｈｅｒｔｙらと共に、本明細書に開示する多様な他の情報源に論じられる。光感作剤のさらなる例は、米国特許出願２００１００２２９７０として公表された、ＵＳＳＮ  ０９／７９９，７８５、２００１年３月６日出願に論じられる。化学療法剤に関して言えるように、投与する光感作剤の量は、使用する特定の光感作剤、被験者の年齢、体重および性別、並びに投与様式と共に、腫瘍の種類、大きさおよび位置に応じて多様であろう。
【００６４】
さらに、被験者を曝露する光の波長は、使用する光感作剤、並びに腫瘍または前癌性細胞の位置および深さに応じて多様であろう。一般的に、被験者は、フォトフリン（Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ）（登録商標）に関して、約６００から９００ｎｍ、好ましくは約６００から約６４０ｎｍの波長を有する光に曝露されるであろう。いくつかの他の光感作剤は、約６５０から８５０ｎｍの、より高い波長で、より強い吸光を有し、これは、より長い波長の光が組織にさらに浸透する傾向があるため、より深部の腫瘍に有益である可能性がある。逆に、約４１０ｎｍの波長は、浅い浸透が望ましい場合、より優れた結果を提供する可能性があり；こうした用量もまた、本発明の範囲内に属する。
【００６５】
被験者を曝露する光の用量は、使用する光感作剤に応じて多様であろう。一般的に、被験者は、フォトフリンに関して、赤い光、約５０から５００Ｊ／ｃｍ２の光用量に曝露されるであろう。他の感作剤がより効率的であり、そしてそれにより、典型的には約１０Ｊ／ｃｍ２の、より小さいフルエンスしか要しない可能性がある。より高いフルエンスでは、高体温が起こる可能性があり、これがＰＤＴを増進する可能性がある；さらに、高体温およびＰＤＴは相乗的に作用する可能性がある。よって、本明細書中に記載の内容を包含する。いくつかの異なる光供給源が当該技術分野に知られ；本発明の方法において、選択した波長の適切な用量を搬送することが可能な、いかなる適切な光供給源を使用してもよい。
【００６６】
光曝露のタイミングは、使用する光感作剤、腫瘍または前癌性細胞の性質および位置、並びに投与法に応じるであろう。典型的には、光曝露は、光感作剤投与の約１時間から４日後に起こる。さらに、やはり、光感作剤、並びに腫瘍の性質および位置に応じて、より短い期間を用いてもよい。例えば、光感作剤の局所投与後の光曝露は、投与後、約１０分後程度に早いか、または約３時間で起こってもよい（本明細書にその全体を援用する、米国特許第６，０１１，５６３号を参照されたい）。
【００６７】
腫瘍細胞死を誘導するさらに別の方法は、遺伝子療法技術の適用を伴う。米国特許第６，０６６，６２４号、２０００年５月２３日発行は、腫瘍細胞に「自殺遺伝子」を導入することによって、限局された腫瘍を治療する方法を記載する。この技術では、自殺遺伝子を含んでなる組換えアデノウイルスベクターを腫瘍に搬送する。その後、自殺遺伝子にコードされるタンパク質によって作用し、腫瘍細胞死を生じるプロドラッグを、患者に投与する。さらに、こうした技術を用いて、サイトカイン遺伝子を腫瘍細胞内に導入することもまた可能である；サイトカインは、腫瘍をより免疫原性にするよう作用することが可能である。ウイルスベクターもまた、正常腫瘍抑制遺伝子または発癌遺伝子阻害剤を腫瘍細胞に搬送するのに使用可能である。したがって、例えば、ｐ５３の突然変異体型を発現する腫瘍は、腫瘍細胞の増殖抑止を導く、野生型ｐ５３でトランスフェクションすることが可能である。受容体様プロテインチロシンホスファターゼであるＣＤ１４８は、いくつかの癌細胞で下方調節されているようであるタンパク質である（Ａｕｔｓｃｈｂａｃｈら，  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ５４：４８５；１９９９）；癌性細胞へのＣＤ１４８をコードするＤＮＡの導入は、その増殖抑止を導く可能性がある。
【００６８】
限局投与は、全身使用が望ましくない腫瘍殺傷剤（例えばＴＮＦ、ＦａｓＬ、または非常に高用量のＣＤ４０Ｌ）の使用を可能にする可能性があり、そしてこれを用いると、全身投与を用いて安全に達成可能であるよりも、腫瘍部位での多様な剤のより高い濃度が達成可能である。タンパク質の腫瘍内注射、腫瘍内または近傍での組換えタンパク質の発現を誘導する遺伝子療法技術の使用、および部位特異的および／または徐放技術の使用を含む、多様な手段を用いて、限局投与を達成可能である。さらに、生の（ｒａｗ）ＤＮＡは、哺乳動物に注射すると、しばしば細胞に取り込まれ、そして発現されることが見出されてきている。したがって、望ましい因子をコードするＤＮＡを腫瘍部位内またはその近傍に注射して、そして該ＤＮＡが近傍細胞に取り込まれると、コードされる因子の限局発現が生じるであろう。
【００６９】
限局投与に有用である可能性がある技術の１つの種類は、ヒドロゲル素材、例えば光重合可能ヒドロゲル（Ｓａｗｈｎｅｙら，  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２６：５８１；１９９３）を利用して、望ましい因子または因子類の持続放出を達成するものである。同様のヒドロゲルが、術後癒着形成を防止し（Ｈｉｌｌ−Ｗｅｓｔら，  Ｏｂｓｔｅｔ．  Ｇｙｎｅｃｏｌ．  ８３：５９；１９９４）、そして血管傷害後の血栓症および血管狭窄を防止する（Ｈｉｌｌ−Ｗｅｓｔら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：５９６７；１９９４）のに用いられてきている。タンパク質を、こうしたヒドロゲルに取り込み、活性剤の持続した限局放出を提供することが可能である（ＷｅｓｔおよびＨｕｂｂｅｌｌ，  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２５：１３９；１９９５；Ｈｉｌｌ−Ｗｅｓｔら，  Ｊ．  Ｓｕｒｇ．  Ｒｅｓ．  ５８：７５９；１９９５）。
【００７０】
したがって、本明細書に開示する多様な因子はまた、限局投与が望ましい組織への適用のため、ヒドロゲルに取り込むことも可能である。例えば、腫瘍殺傷剤、ＤＣ誘引剤、ＤＣ成熟因子、またはＣＴＬ増進因子、あるいはこうした多様な因子の組み合わせを取り込んだヒドロゲルを、腫瘍の外科的除去または減少後に、組織に適用することが可能である。さらに、こうしたヒドロゲルに基づく処方は、当該技術分野に知られる他の方法によって、例えばカテーテルを用いて、血管系の望ましい位置でヒドロゲルを適用して、または腫瘍内投与が達成可能な他の手段いずれかによって、投与することが可能である。一般的な当業者は、例えばＷｅｓｔおよびＨｕｂｂｅｌｌ、上記に論じられるように、標準的な薬物動態学的研究を適用することによって、適切なヒドロゲルを処方することが可能であろう。
【００７１】
抗腫瘍反応を制御する因子の投与
ＤＣ動員因子、ＤＣ成熟因子、ＤＣ誘引因子およびＴ細胞増進因子は、適切な希釈剤またはキャリアー中で、被験者、好ましくはヒトに投与可能である。したがって、例えば、これらの因子のいずれか１つまたはすべてを、多量（ｂｏｌｕｓ）注射、連続注入、移植物からの持続放出、または他の適切な技術によって、投与することが可能である。さらに、因子は、限局投与（すなわち腫瘍内投与）するか、または遺伝子療法技術を用いることによって投与することが可能である。例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、またはＩＬ−１５などのＣＴＬ増進因子をコードする遺伝子で腫瘍細胞をトランスフェクションしてもよい。トランスフェクションされた腫瘍細胞を個体に投与して（例えば腫瘍内）、抗原に対して、より強く、そして改善された免疫反応を提供する。当業者は、動物モデルまたは他のモデリング系を用いて日常的な実験を行って、好ましい投与経路および搬送する多様な因子の量を決定することが可能であろう（例えば投薬量計算および動物モデルに関する、米国特許第６，０１７，５４０号、２０００年１月２５日発行の議論を参照されたい）。
【００７２】
典型的には、因子は、生理学的に許容しうるキャリアー、賦形剤または希釈剤と組み合わせて精製化合物を含んでなる薬剤組成物の型で投与されるであろう。こうしたキャリアーは、使用する投薬量および濃度で、被験者に非毒性である。通常、こうした組成物の調製は、化合物を、緩衝剤、アスコルビン酸などの酸化防止剤、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロースまたはデキストラン類を含む炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、グルタチオン並びに他の安定化剤および賦形剤と合わせることを含む。中性緩衝生理食塩水または同種の血清アルブミンと混合した生理食塩水は、典型的な適切な希釈剤である。
【００７３】
使用する特定の療法的有効量は、本発明には重大でなく、そして選択される特定の因子、治療しようとする疾患または状態と共に、被験者の年齢、体重および性別に応じて多様であろう。さらに、既定の因子を投与する時点は、投与する個々の因子およびその活性に応じるであろう。典型的には、ＤＣ動員因子は、腫瘍細胞死を誘導する剤の投与の１０から１５日前に投与し、そして腫瘍殺傷剤の投与後、５から１０日間、続けることが可能である。ＤＣ成熟因子は、腫瘍細胞死誘導の２４から４８時間後に投与し；Ｔ細胞増進剤は、ほぼ同じ時点で投与する。
【００７４】
腫瘍細胞死を引き起こす剤を、延長された期間投与する場合（特定の化学療法および放射措置におけるように）、ＤＣ動員および成熟因子、並びにＴ細胞増進剤を投与する措置を設計する際には、樹状細胞およびＴ細胞に対する連続療法の影響を考慮しなければならない。例えば連続療法の結果、動員されそして／または活性化されたＤＣおよび／またはＣＴＬが死ぬ場合、ＤＣ成熟およびＴ細胞増進因子は、連続療法が完了するまで、または連続腫瘍殺傷措置において、エフェクター細胞が連続腫瘍殺傷療法によって負に影響を受ける可能性がより低い段階まで、抗腫瘍免疫反応が成熟する時間が十分にあるであろう時点まで、投与しない。
【００７５】
多様な因子の典型的な療法的有効投薬量およびこれらを投与する典型的な間隔を、以下の表１に示す。当業者は、日常的な実験を適用することによって、これらおよび他の因子の投薬量および投与経路を最適化することが可能である。
【００７６】
表１：典型的な療法的投薬量
【００７７】
【表１】
2004529102.tif 000002
【００７８】
ＤＣ動員または成熟因子あるいはＴ細胞増進因子を限局剤（ｌｏｃａｌ  ａｇｅｎｔ）として、腫瘍内にまたは近傍に投与すると、全身使用に望ましくない剤（例えばＴＮＦ）の使用が可能になる可能性があり、そしてこれを用いると、全身投与を用いて安全に達成可能であるよりも、腫瘍部位での多様な剤のより高い濃度が達成可能である。同様に、ＤＣまたはＣＴＬの誘引剤として作用する剤もまた、腫瘍部位内またはその近傍の投与に有用であろう。こうした限局投与は、全身性の影響を最小限にしつつ、腫瘍部位でのエフェクター細胞の濃縮を可能にする。
【００７９】
タンパク質の腫瘍内注射、腫瘍内または近傍での組換えタンパク質の発現を誘導する遺伝子療法技術の使用、および部位特異的および／または徐放技術の使用を含む、多様な手段を用いて、限局投与を達成可能である。さらに、生のＤＮＡは、哺乳動物に注射すると、しばしば細胞に取り込まれ、そして発現されることが見出されてきている。したがって、望ましい因子をコードするＤＮＡを腫瘍部位内またはその近傍に注射して、そして該ＤＮＡが近傍細胞に取り込まれると、コードされる因子の局在化された発現が生じるであろう。
【００８０】
限局投与に有用である可能性がある技術の１つの種類は、ヒドロゲル素材、例えば光重合可能ヒドロゲル（Ｓａｗｈｎｅｙら，  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２６：５８１；１９９３）を利用して、望ましい因子または因子類の持続放出を達成するものである。同様のヒドロゲルが、術後癒着形成を防止し（Ｈｉｌｌ−Ｗｅｓｔら，  Ｏｂｓｔｅｔ．  Ｇｙｎｅｃｏｌ．  ８３：５９；１９９４）、そして血管傷害後の血栓症および血管狭窄を防止する（Ｈｉｌｌ−Ｗｅｓｔら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：５９６７；１９９４）のに用いられてきている。タンパク質を、こうしたヒドロゲルに取り込み、活性剤の持続した限局放出を提供することが可能である（ＷｅｓｔおよびＨｕｂｂｅｌｌ，  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２５：１３９；１９９５；Ｈｉｌｌ−Ｗｅｓｔら，  Ｊ．  Ｓｕｒｇ．  Ｒｅｓ．  ５８：７５９；１９９５）。
【００８１】
したがって、本明細書に開示する多様な因子はまた、限局投与が望ましい組織への適用のため、ヒドロゲルに取り込むことも可能である。例えば、ＤＣ誘引剤、ＤＣ成熟因子、またはＣＴＬ増進因子、あるいはこうした多様な因子の組み合わせを取り込んだヒドロゲルを、腫瘍の外科的除去または減少後に、組織に適用することが可能である。さらに、こうしたヒドロゲルに基づく処方は、当該技術分野に知られる他の方法によって、例えばカテーテルを用いて、血管系の望ましい位置でヒドロゲルを適用して、または腫瘍内投与が達成可能な他の手段いずれかによって、投与することが可能である。一般的な当業者は、例えばＷｅｓｔおよびＨｕｂｂｅｌｌ、上記に論じられるように、標準的な薬物動態学的研究を適用することによって、適切なヒドロゲルを処方することが可能であろう。
【００８２】
ＤＣおよび／またはＣＴＬのｅｘ  ｖｉｖｏ培養
当業者はまた、多様なｅｘ  ｖｉｖｏ培養技術もまた、本発明において使用可能であることも認識するであろう。造血幹細胞および前駆細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増殖法は、本明細書に援用される米国特許第５，１９９，９４２号に記載される。米国特許第６，０１７，５２７号は、ＤＣを培養し、そして活性化する方法を記載する；他の適切な方法が当該技術分野に知られる。本発明の１つの側面において、ｅｘ  ｖｉｖｏ培養および増殖は：（１）末梢血採取物または骨髄外植片から、患者由来のＣＤ３４＋造血幹細胞および前駆細胞を収集し；そして（２）こうした細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させることを含んでなる。特許第５，１９９，９４２号に記載される細胞増殖因子に加え、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＲＡＮＫＬおよびｃ−ｋｉｔリガンドなどの他の因子も使用可能である。
【００８３】
ＣＤ３４マーカーを有する幹細胞または前駆細胞は、骨髄中の単核細胞の約１％から３％しか構成しない。末梢血中のＣＤ３４＋幹細胞または前駆細胞の量は、骨髄よりもおよそ１０−１００倍少ない。本発明において、Ｆｌｔ３Ｌ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ４０ＬおよびＩＬ−１５などのサイトカインを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏで、幹細胞数を増加させるかまたは動員することが可能である。その後、当該技術分野に知られる方法を用いて、こうした細胞を得て、そして培養する（例えば米国特許第５，１９９，９４２号および第６，０１７，５２７号を参照されたい）。
【００８４】
凍結保護剤としてジメチルスルホキシドを用いて、単離した幹細胞を管理下速度凍結装置（例えばＣｒｙｏ−Ｍｅｄ、ミシガン州マウントクレメンス）中で凍結し、その後、液体窒素の気相に保存することが可能である；この技術は、例えば特定の化学療法措置に関するように、時間に渡って腫瘍細胞死を誘導する剤を投与する際に、特に有用であろう。樹状細胞（新鮮または凍結）の増殖および培養には、血清枯渇または血清に基づく培地を含む、多様な増殖用および培養用培地が使用可能である。有用な増殖用培地には、ＲＰＭＩ、ＴＣ  １９９、イスコーブ修飾ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅら，  Ｆ．Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １４７：９２３（１９７８））、ＤＭＥＭ、フィッシャー培地、アルファ培地、ＮＣＴＣ、Ｆ−１０、リーボビッツのＬ−１５、ＭＥＭおよびマッコイ培地が含まれる。
【００８５】
収集したＣＤ３４＋細胞を、例えば本明細書に、そして前述の特許に記載されるように、適切なサイトカインと培養する。その後、ＣＤ３４＋細胞を分化させ、そして樹状細胞系譜の細胞に関係付ける（ｃｏｍｍｉｔ）。その後、これらの細胞は、ＣＤ１ａ、ＨＬＡ  ＤＲ、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６などの樹状細胞に特徴的なマーカーを用いて、フローサイトメトリーまたは同様の手段によってさらに精製する。精製樹状細胞を望ましい抗原（例えば問題の腫瘍に特異的な精製抗原、未精製腫瘍抗原調製、あるいは腫瘍抗原または抗原類をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ）でパルス処理して（該抗原に曝露して）、免疫系の他の細胞への提示に適した方式で、抗原を取り込むのを可能にすることが可能である。
【００８６】
抗原は、古典的には、プロセシングされ、そして２つの経路を通じて提示される。細胞質ゾル区画中のタンパク質由来のペプチドは、クラスＩ  ＭＨＣ分子の背景で提示され、一方、エンドサイトーシス経路で見られるタンパク質由来のペプチドは、クラスＩＩ  ＭＨＣの背景で提示される。しかし、当業者は、例外があることを認識する；例えば、ＭＨＣ  クラスＩ上に発現する外因性腫瘍抗原を認識する、ＣＤ８＋腫瘍特異的Ｔ細胞の反応である。ＭＨＣ依存抗原プロセシングおよびペプチド提示の概説は、Ｇｅｒｍａｉｎ，  Ｒ．Ｎ．，  Ｃｅｌｌ  ７６：２８７（１９９４）に見られる。
【００８７】
抗原で樹状細胞をパルス処理する多くの方法が知られ；当業者は、選択した抗原に適した方法の発展を日常的な実験とみなす。一般的に、細胞の生存性を促進する条件下で、培養した樹状細胞に抗原を添加して、そしてその後、約２４時間（約１８から約３０時間、好ましくは２４時間）の期間、細胞が抗原を取り込みそしてプロセシングし、そしてクラスＩまたはクラスＩＩ  ＭＨＣいずれかと結合して細胞表面上に抗原ペプチドを発現するかまたは提示するのに十分な時間を許容する。樹状細胞はまた、抗原をコードするＤＮＡでトランスフェクションすることによって、抗原に曝露することも可能である。ＤＮＡが発現され、そして抗原はおそらく、細胞質ゾル／クラスＩ経路を介してプロセシングされる。さらに、例えばＢｏｃｚｋｏｗｓｋｉら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６０：１０２８，  ２０００に記載されるように、腫瘍細胞から増幅したｍＲＮＡとＤＣを接触させることによって、腫瘍抗原を提示するよう誘導することが可能である。
【００８８】
抗原をプロセシングした後、ＤＣをＣＤ４０ＬなどのＤＣ成熟因子と接触させる。ＣＤ４０Ｌおよび他のＤＣ成熟因子は、ＤＣ表面上のＭＨＣ分子（並びにＣＤ８０およびＣＤ８３などの共刺激分子）の数を増加させ、それによってその抗原提示能を増進させる。さらに、成熟因子に曝露されたＤＣは、活性化の示標となるサイトカイン（例えばＩＬ−１２、ＩＬ−１５）を分泌する。成熟した活性化ＤＣによって抗原を提示されたＣＤ４＋細胞は、Ｔ細胞増殖因子として作用する、ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＦＮ−γを発現するであろう。したがって、成熟した活性化ＤＣは、有効な腫瘍特異的免疫反応を刺激することが可能である。
【００８９】
ペプチドなどのより小さい抗原は、樹状細胞によるプロセシングを必要としないが、ペプチドへのＤＣの曝露に際して、適切なＭＨＣ分子に結合する。ペプチド抗原を用いた場合、利用可能なＭＨＣ分子数を増加させ、そしてそれによって抗原運搬能を増加させるため、ペプチド抗原への曝露前に、ＤＣの成熟を刺激するのが好適である。より大きいタンパク質抗原をプロセシングし終えた、ＤＣの成熟を刺激するのに有用である同一のＤＣ成熟因子はまた、ＤＣがより小さいペプチド抗原を提示する能力を増大するのにも有用であろう。
【００９０】
その後、抗原特異的免疫反応を刺激するため、活性化された抗原運搬ＤＣを個体に投与する。ＤＣは全身投与することが可能であるし、あるいは腫瘍内または近傍に限局投与することが可能である。望ましい場合、ＣＴＬ増進因子などのさらなる剤を個体に投与して、免疫反応をさらに増進することが可能である。ＤＣは、さらなる剤の投与前に、投与と同時に、または投与後に、投与可能である。あるいは、Ｔ細胞もまた、個体から収集して、そして活性化された抗原運搬樹状細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで曝露して、ｅｘ  ｖｉｖｏで抗原特異的Ｔ細胞の発展を刺激して、これをその後、個体に投与することも可能である。Ｔ細胞は、全身投与することが可能であるし、あるいは腫瘍内または近傍に限局投与することが可能である。望ましい場合、Ｔ細胞増進因子を個体に投与して、免疫反応をさらに増進することが可能である。Ｔ細胞は、さらなる剤の投与前に、投与と同時に、または投与後に、投与可能である。
【００９１】
疾患の予防または治療
本明細書に提示するこれらの結果は、併用療法が、多様な腫瘍の治療において、重要な臨床的使用のものである可能性があることを示す。用語、治療は、当該技術分野に一般的に理解されるように、臨床的症状または疾患の徴候が観察された後の療法開始を指す。しかし、癌にはしばしば、厳密には悪性と性質決定することが不可能な細胞の異常増殖が先行する。例えば、細胞は、数が増加するが、同一組織起源の正常細胞と有意には異ならない、過形成を示す可能性がある。上皮または結合組織細胞は転移性になる可能性があり、これは、完全に分化した細胞の１種類を別のものに置換することを意味する。細胞が均一性および構築的配向を失い、そして他の異常な特徴を示す、異形成（ｄｙｓｐｌａｓｉａ）が、しばしば癌に先行する。したがって、本発明は、潜在的な免疫反応を最大化することによって、前癌性状態（例えば子宮頚上皮内腫瘍）の治療、転移性疾患の予防または減少、および癌の再発または再発生の予防に有用であろう。この方式で使用すると、本明細書に記載する本発明の方法は、罹患した個体の厳密に定義された治療よりむしろ、予防的処置と考えることが可能である。
【００９２】
本明細書に引用するすべての参考文献の関連する開示は、特に本明細書に援用される。以下の実施例は、特定の態様を例示することを意図し、そして本発明の範囲を限定することを意図しない。一般の当業者は、さらなる態様が本発明に含まれることを容易に認識するであろう。
【００９３】
【実施例】
実施例１
本実施例は、腫瘍細胞を接種されたマウスの平均および中央値生存時間に対する、Ｆｌｔ３ＬおよびＣＤ４０Ｌと併用した放射療法の効果を記載する。６から８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、約１ｘ１０５の非常に転移性であり免疫原性が劣ったルイス肺癌腫（３ＬＬ／Ｄ１２２）細胞を、実質的にＣｈａｋｒａｖａｒｔｙら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５９：６０２８；１９９９）に記載されるように、足に皮下接種した。接種３週間後、すべてのマウスは、肺の出現前（ｐｒｅ−ｅｍｅｒｇｅｎｔ）微小転移病巣と共に、原発足蹠腫瘍を発展させた。
【００９４】
体を鉛で保護して、マウスをルサイトジグ（ｌｕｃｉｔｅ  ｊｉｇ）に入れることによって、コナル（ｃｏｎａｌ）放射に供した。４０ＭＣＧ  Ｐｈｉｌｉｐｓ電圧装置を３２０ｋＶｐ、５ｍＡおよび０．５ｍｍ  Ｃｕろ過で操作して用い、足蹠領域を限局照射した。照射を行った時点を第０日と称した。マウスの１つのサブセットに、Ｆｌｔ３Ｌを投与し（第１日から第１２日まで、各日、マウスあたり１０μｇを腹腔内投与）；１つのサブセットにＣＤ４０Ｌを投与し（第８日から第１２日まで、各日、マウスあたり１０μｇを腹腔内投与）、そして１つのサブセットに第１日から第１２日までＦｌｔ−３Ｌ、そして第８日から第１２日までＣＤ４０Ｌを投与した（先に示したのと同一投薬量）。結果を下の表２に示す。
【００９５】
表２：併用療法で処置したマウスの生存
【００９６】
【表２】
2004529102.tif 000003
【００９７】
これらの結果は、ＤＣ動員因子およびＤＣ成熟因子の併用が、放射療法に供した哺乳動物の抗腫瘍反応を増大させることを示す。したがって、このおよび同様の技術はまた、ｅｘ  ｖｉｖｏでも使用を見出すであろう。ＤＣは、以下に記載するように、腫瘍を持つ被験者から得て、そして腫瘍抗原（例えば、腫瘍切除中に除去した照射腫瘍細胞、または腫瘍抗原の他の型いずれか）に曝露することが可能である。ＤＣをプロセシング前（ペプチド抗原）または後（プロセシングを要する大きなまたは複雑な抗原）いずれかに、成熟剤または因子（すなわちＣＤ４０Ｌ）に曝露して、ＭＨＣおよび共刺激分子数を増加させ、そして抗原提示を増進する。
【００９８】
抗原提示ＤＣは、腫瘍を持つ個体に、単独で、またはＴ細胞増殖因子と併用して投与して、残った腫瘍細胞（手術または腫瘍除去の他の伝統的な手段で接近不能な転移または腫瘍病巣を含む）を除去する能力増加を生じることが可能である。あるいは、またはさらに、腫瘍特異的Ｔ細胞は、以下に記載するように、ｅｘ  ｖｉｖｏで得て、そしてＤＣおよび／またはＴ細胞増殖因子と共に、腫瘍を持つ被験者に投与することが可能である。
【００９９】
実施例２
本実施例は、ｅｘ  ｖｉｖｏで、精製樹状細胞を生成する方法を記載する。ヒト骨髄を得て、そしてＣＤ３４＋表現型を有する細胞を単離して、そして適切な培地、例えば樹状細胞の増殖を促進するサイトカイン（すなわち各２０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−ａ、あるいは１００ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３Ｌまたはｃ−ｋｉｔリガンド、あるいはその組み合わせ）を含有する、マッコイの強化培地中で培養する。培養は、湿った空気中、１０％  ＣＯ２中で、３７℃でおよそ２週間続ける。その後、ＣＤ１ａ＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋およびＣＤ８６＋に対する抗体を用いたフローサイトメトリーによって、細胞を分別する。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αの併用は、培養２週間後に得られる細胞数の６から７倍の増加を生じることが可能であり、このうち５０−８０％の細胞がＣＤ１ａ＋ＨＬＡ−ＤＲ＋ＣＤ８６＋である。Ｆｌｔ３Ｌおよび／またはｃ−ｋｉｔリガンドの添加は、総細胞の増殖、そしてしたがって樹状細胞の増殖をさらに増進する。これらの条件下で単離し、そして培養した細胞の表現型解析は、調べたすべての因子の組み合わせで、細胞の６０−７０％の間がＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ８６＋であり、細胞の４０−５０％がＣＤ１ａを発現することを示す。
【０１００】
実施例３
本実施例は、腫瘍に罹患した個体から樹状細胞を収集し、そして増殖させる方法を記載する。細胞収集前に、Ｆｌｔ３Ｌを、単独で、またはサーグラモスティム（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ）（ＧＭ−ＣＳＦ；リューカイン（Ｌｅｕｋｉｎｅ）、Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ワシントン州シアトル）と併用して個体に投与し、循環ＰＢＰＣおよびＰＢＳＣを動員するか、またはその数を増加させる。ＣＳＦ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ｃ−ｋｉｔリガンド、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合タンパク質、ＬＩＦ、ＦＧＦなどの他の増殖因子およびその組み合わせは、同様に、Ｆｌｔ３Ｌと別個に、連続して、または同時に投与することが可能である。
【０１０１】
動員ＰＢＰＣおよびＰＢＳＣは、当該技術分野に知られるアフェレーシス法を用いて収集する。例えば、Ｂｉｓｈｏｐら，  Ｂｌｏｏｄ，  ｖｏｌ．８３，  Ｎｏ．２，  ｐｐ．６１０−６１６（１９９４）を参照されたい。簡潔には、ＰＢＰＣおよびＰＢＳＣは、慣用的な装置、例えばＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓモデルＶ５０アフェレーシス装置（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ、マサチューセッツ州ブレインツリー）を用いて収集する。およそ６．５ｘ１０８単核細胞（ＭＮＣ）／ｋｇ個体が収集されるまで、典型的には週５回を超えないように、４時間の収集を行う。
【０１０２】
収集したＰＢＰＣおよびＰＢＳＣのアリコットを顆粒球−マクロファージコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）含量に関してアッセイする。簡潔には、ＭＮＣ（およそ３００，０００）を単離し、修飾マッコイ５Ａ培地、０．３％寒天、２００Ｕ／ｍｌ組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ、２００Ｕ／ｍｌ組換えヒトＩＬ−３、および２００Ｕ／ｍｌ組換えヒトＧ−ＣＳＦ中、完全に加湿した空気中、５％ＣＯ２中で、３７℃で約２週間培養する。Ｆｌｔ３ＬまたはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合分子（ＰＩＸＹ３２１）を含む他のサイトカインを培養に添加してもよい。これらの培養をライト染色で染色し、そして解剖顕微鏡を用いて、ＣＦＵ−ＧＭコロニーを記録する（Ｗａｒｄら，  Ｅｘｐ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．，  １６：３５８（１９８８））。あるいは、ＣＦＵ−ＧＭコロニーは、Ｓｉｅｎａら，  Ｂｌｏｏｄ，  Ｖｏｌ．７７，  Ｎｏ．２，  ｐｐ４００−４０９（１９９１）のＣＤ３４／ＣＤ３３フローサイトメトリー法、または当該技術分野に知られる他のいずれかの方法を用いてアッセイすることが可能である。
【０１０３】
ＣＦＵ−ＧＭ含有培養は、管理下速度凍結装置（例えばＣｒｙｏ−Ｍｅｄ、ミシガン州マウントクレメンス）中で凍結し、その後、液体窒素の気相に保存する。１０パーセントのジメチルスルホキシドを凍結保護剤として使用することが可能である。個体からのすべての収集が終了した後、ＣＦＵ−ＧＭ含有培養を融解して、そしてプールし、その後、Ｆｌｔ３Ｌと、単独で接触させるか、ＣＦＵ−ＧＭを樹状細胞系譜に駆動する、上に列挙した他のサイトカインを、Ｆｌｔ３Ｌと連続して併用するか、または同時に併用して接触させる。樹状細胞を培養し、そして上述のように選択したマーカーを示す細胞の割合に関して解析する。
【０１０４】
実施例４
本実施例は、樹状細胞がＴ細胞の抗原特異的増殖を刺激する能力を例示する。細胞は、実質的に実施例２および／または３に記載するように、腫瘍に罹患した個体から得る。樹状細胞を単離し、そして選択したサイトカインの存在下で２週間培養する。腫瘍抗原調製を作成し、そして樹状細胞を抗原と共に提供し、そして樹状細胞が抗原をプロセシングするのを可能にする。樹状細胞増殖を補助するサイトカインを含有するマッコイの強化培地中、ＣＤ４０Ｌ（１μｇ／ｍｌ）の可溶性三量体型の存在下または非存在下で、抗原でパルス処理した樹状細胞をさらに２４時間培養し、その後、３７℃で１０％ＣＯ２大気中、腫瘍抗原（Ｍｏｄｙら，  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  １７８：８０３；１９９８）で２４時間パルス処理する。あるいは、腫瘍抗原が樹状細胞によるプロセシングを必要としない小ペプチドである場合、樹状細胞は、抗原曝露前にＣＤ４０Ｌと培養する。これは、樹状細胞表面上のＨＬＡ分子数を増加させ、そしてその抗原提示能を増進するであろう。
【０１０５】
自己腫瘍反応性Ｔ細胞は、個体由来のＣＤ３４−細胞を、腫瘍抗原および低濃度のＩＬ−２および／またはＩＬ−７および／またはＩＬ−１５（２ｎｇ／ｍｌから５ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、約２週間培養することによって得る。ＣＤ３４−集団は、そのうち一部が腫瘍に対して反応性である、ある割合のＴ細胞（約５％）と共に、抗原提示細胞として作用する他の細胞種を含有する。第２週までに、細胞集団は、約９０％のＴ細胞を含んでなるであろうし、その大部分は、腫瘍特異的であり、Ｔ細胞活性化マーカーは低レベルであろう。
【０１０６】
抗原特異的Ｔ細胞増殖アッセイは、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＲＰＭＩ中、抗原でパルス処理した樹状細胞の存在下、３７℃１０％ＣＯ２大気中、腫瘍特異的Ｔ細胞を用いて行う。ウェルあたりおよそ１ｘ１０５  Ｔ細胞を、力価測定した（ｔｉｔｒａｔｅｄ）数の樹状細胞の存在下、丸底９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中、三つ組で５日間培養する。細胞は、培養の最後の４から８時間、トリチウム標識チミジン（２５Ｃｉ／ｎｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、イリノイ州アーリントンハイツ）１ｍＣｉ／ウェルでパルス処理する。自動化細胞採取装置で、ガラスファイバーディスク上に細胞を採取し、そして取り込まれたｃｐｍを液体シンチレーション分光測定によって測定した。
【０１０７】
実施例５
本実施例は、実質的にＬｙｎｃｈら，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２１：１４０３（１９９１）に記載されるような線維肉腫のネズミモデルにおいて、マウスが線維肉腫細胞のチャレンジを拒絶する能力に対する、Ｆｌｔ３Ｌを伴うまたは伴わない、抗体Ｏｘ４０ｍ５の影響を記載する。６から８週齢のＣ５７ＢＬ／１０Ｊ（Ｂ１０）マウスに、約１ｘ１０５のＢ１０線維肉腫細胞を、足に皮下接種した。Ｆｌｔ３Ｌ（第１０日から第２９日まで、各日、マウスあたり１０μｇを腹腔内投与）、Ｏｘ４０ｍ５（第１０日から第２７日まで、３日ごとに、マウスあたり１０μｇを腹腔内投与）、または両方いずれかでの療法を、接種１０日後に開始した。すべての対照マウスは、腫瘍を発展させ、Ｆｌｔ３Ｌのみを投与したマウスの８０％も同様であったが、Ｏｘ４０ｍ５で処置したマウスの３０％、およびＯｘ４０ｍ５に加えてＦｌｔ３Ｌで処置したマウスの５０％は、腫瘍を拒絶した。
【０１０８】
Ｃ３Ｈマウスにおいて、Ｏｘ４０ｍ５の２つの異なる用量（マウスあたり１００μｇまたはマウスあたり５００μｇいずれか）を第５日、第９日、第１１日および第１３日に投与して、８７と称される別の線維肉腫で同様の実験を行った。より高い用量（マウスあたり５００μｇ）では、４０％のマウスが腫瘍を拒絶し、一方、より低い用量を投与したマウスの３０％が腫瘍を拒絶した。実質的に同一のパラメーターを用いて、４−１ＢＢｍ６と併用してＯｘ４０ｍ５を投与した場合、両抗体を投与したマウスの１００％が腫瘍を拒絶し、一方、４−１ＢＢｍ６のみを投与したマウスの６０％が腫瘍チャレンジを拒絶した。
【０１０９】
Ｏｘ４０ｍ５および４−１ＢＢｍ６の併用はまた、腎細胞癌腫モデルでも調べた。この併用は、単独でまたはＦｌｔ３Ｌの添加を伴っても、腫瘍チャレンジからの有意な保護を生じなかった（マウスの１０％しか、腫瘍チャレンジを拒絶しなかった）が、Ｏｘ４０ｍ５および４−１ＢＢｍ６またはＯｘ４０ｍ５、４−１ＢＢｍ６およびＦｌｔ３Ｌいずれかで処置した動物において、腫瘍増殖は遅くなった。用いた腎癌腫細胞は、迅速に増殖する腫瘍を生成することが知られ；したがって、Ｏｘ４０ｍ５および４−１ＢＢｍ６の組み合わせは、腫瘍の増殖に影響を与える他の療法と併用して投与すると、腫瘍が非常に侵襲性であることが知られる場合であっても、有用であることが立証される可能性がある。
【０１１０】
実施例６
本実施例は、ＯＸ４０アゴニスト、Ｏｘ４０ｍ５が、樹状細胞に誘導されるＣＤ８  Ｔ細胞活性化を増加させる能力を例示する。ＯＶＡ特異的ＣＤ８トランスジェニックマウス（ＯＴ．Ｉ）由来の、少数だが検出可能な数の未処置細胞を、未処置レシピエントの静脈内に移植した。移植１日後、クラスＩ  ＯＶＡペプチドでパルス処理した３ｘ１０５成熟樹状細胞（Ｆｌｔ３Ｌ処置した野生型またはＭＨＣクラスＩＩノックアウト動物由来）で、後足蹠において、動物を皮下的に免疫した。同じ日、動物にまた、Ｏｘ４０ｍ５（１００μｇ）または対照モノクローナル抗体を腹腔内注射した。排出リンパ節中のＴ細胞増殖は、免疫５日後、ＦＡＣＳによって監視した。
【０１１１】
Ｏｘ４０ｍ５およびＯＶＡペプチドパルス処理野生型樹状細胞の同時注射は、ＣＤ８  Ｔ細胞増殖を強く増進した（が、クラスＩノックアウトマウス由来の樹状細胞の場合はしなかった）。これらの免疫動物由来のリンパ節細胞もまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、該抗原で再刺激した。これらの培養由来の上清をＩＦＮ−γ産生に関して評価した。野生型樹状細胞およびＯｘ４０ｍ５で同時免疫すると、樹状細胞のみで免疫したのに比較して、ＩＦＮ−γの産生が増進された。クラスＩノックアウト樹状細胞で免疫したマウス由来のリンパ節細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの再刺激に際して、低レベルのＩＦＮ−γを産生し、そしてＯｘ４０ｍ５の同時注射は、この産生を増進しなかった。これらのデータは、ＯＸ４０アゴニストが、ｉｎ  ｖｉｖｏで、ＣＤ８  Ｔ細胞増殖および活性化を増進し、そしてしたがって、抗原特異的エフェクターＴ細胞反応を増進することを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の方法（類）における多様な工程を示すフローチャートである。ｉｎ  ｖｉｖｏで行わなければならない工程は、フローチャートの左側に列挙し、一方、ｅｘ  ｖｉｖｏで行うことが可能な工程は、右側に示す。工程は、通常行われるであろう、一般的な順序で示しているが、当業者は、日常的な実験によって、工程の順序および／またはタイミングと共に、投薬量および投与経路を最適化することが可能である。したがって、例えば、腫瘍殺傷剤は、本明細書に開示するいかなる手段によって投与してもよいし；樹状細胞（ＤＣ）成熟剤および／または培養したＤＣ（未成熟または活性化した成熟ＤＣ）を投与するのに最適な時間は、腫瘍殺傷剤の性質、およびあるとすればＤＣに対するその影響に応じるであろう。同様に、本明細書に詳細に記載するように、成熟した活性化抗原運搬ＤＣをｅｘ  ｖｉｖｏで調製する際、当業者は、ｅｘ  ｖｉｖｏで行う工程を調整して、活性化および抗原提示能を最適化するであろう（すなわち、一般的に、ペプチド抗原では、成熟後にＤＣをペプチドと接触させるが、一方、プロセシングを要する、より大きい抗原では、通常、成熟前にＤＣを抗原と接触させ、そしてプロセシングを可能にする）。さらに、当業者は化学誘引を利用して、ケモカインまたはケモカイン誘導剤の限局投与（本明細書に記載する方法いずれかによって達成する）によって、特定の部位への細胞の輸送を増進することが可能であり、例えばＤＣを誘引するケモカイン（またはケモカイン誘導剤）を腫瘍内に投与して、腫瘍抗原を取り込むＤＣの数を増加させるか、またはケモカイン（またはケモカイン誘導剤）をリンパ節内に投与して、抗原運搬ＤＣのＴ細胞リッチ領域への輸送を促進する。さらに、ｅｘ  ｖｉｖｏ培養用にＴ細胞を得る前に、腫瘍を持つ被験者に循環Ｔ細胞数を増進する剤を投与することが可能である。増殖させたＴ細胞を被験者に投与する際、同じ剤（または別のＴ細胞増進剤）を投与することが可能である。
【図２】図２は、ヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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