(57)【要約】皮膚の皮内層へのワクチンおよび遺伝子治療剤を投与する方法および装置。
2004531578.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類にワクチンを送達する方法であって、前記方法が、０と１ｍｍとの間の露出高さを持った出口を有する少なくとも１つの中空針を通してワクチンを皮内投与することを含み、前記出口が、皮膚に０．５ｍｍと２ｍｍとの間の深さに挿入される方法。
【請求項２】
ワクチンが、
ワクチンを貯蔵する事前に充てん可能な貯蔵器に取付け可能であるハブ部分と、
前記ハブ部分により支持され、前記ハブ部分から離れるように延びる前方先端部を有する少なくとも１つの中空マイクロニードルと、
前記１または複数のマイクロニードルを囲み、前記ハブ部分から前記１または複数のマイクロニードルの前記前方先端部に向かって離れるように延びるリミッター部分を含む装置であり、前記リミッターが、前記１または複数のマイクロニードルの軸に概ね垂直な面内に延びる、概ね平らな皮膚係合面を含み、ワクチンの皮内注射を行うために哺乳類の皮膚に対して受け入れられるように適合されており、前記１または複数のマイクロニードルの１または複数の前方先端部が前記皮膚係合面を超えて約０．５ｍｍから２．０ｍｍの距離延びており、前記リミッター部分が哺乳類の皮膚の真皮層内へのマイクロニードルの貫通を制限している装置で投与されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ワクチンの送達が哺乳類の皮膚内の０．０２５ｍｍと２．５ｍｍとの間の深さで起こることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
送達されるワクチンが、皮下または筋肉内注射による同じ量のワクチンの送達の後の応答と等しいかまたはそれより大きい、哺乳類における免疫応答を誘発することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
送達されるワクチンが、皮下または筋肉内注射によるより多量のワクチンの送達の後の応答と等しいかまたはそれより大きい、哺乳類における免疫応答を誘発することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
針が約３１から５０ゲージのマイクロニードルであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
針が２０°と９０°との間の傾斜角度を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
針が２５°と４０°との間の傾斜角度を有することを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
皮膚に挿入される針の長さが約０．５ｍｍ〜約１．７ｍｍの深さまでであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
マイクロニードルがマイクロニードルのアレイ中にあることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
ワクチンが弱毒化生ウイルスを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ワクチンが弱毒化生細菌を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ワクチンが不活化または殺滅ウイルスを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ワクチンがさらにアジュバントを含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ワクチンがインフルエンザワクチンであることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ワクチンが不活化または殺滅細菌を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ワクチンが核酸を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
核酸によりコードされるペプチドまたはタンパク質が哺乳類において発現されることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ワクチンがアジュバントをさらに含むことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ワクチンがインフルエンザワクチンであることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
ワクチンが非弱毒化生細菌またはウイルスを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
ワクチンが哺乳類細胞またはその成分を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
ワクチンが多糖または多糖複合体を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
ワクチンがタンパク質またはペプチドを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
１または複数の針が皮膚に実質的に垂直に挿入されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
さらに第２のワクチンが筋肉内、皮下、粘膜、腹腔内、静脈内、局所または表皮に投与されることを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
第２のワクチンが前記ワクチンと同じ組成であることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
第２のワクチンが前記ワクチンと異なる組成であることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
第２のワクチンが前記ワクチンと異なるワクチンのクラスであることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記第２ワクチンが前記ワクチンと同時に投与されることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２ワクチンが前記ワクチンに対して逐次的に投与されることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
０と１ｍｍとの間の露出高さを持つ出口を有する少なくとも１つの中空針を介して第２のワクチンを投与することをさらに含み、前記出口が０．５ｍｍと２ｍｍとの間の深さまで皮膚に挿入されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
第２のワクチンの送達が哺乳類の皮膚内の０．０２５ｍｍと２．５ｍｍとの間の深さで起こることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
第２のワクチンが前記ワクチンと同時に投与されることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
第２のワクチンが前記ワクチンに対して逐次的に投与されることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
第２のワクチンが前記ワクチンの１日から６週間後に投与されることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
第２のワクチンが前記ワクチンと異なるワクチンのクラスであることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
第２のワクチンが前記ワクチンと同じ組成であることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
第２のワクチンが前記ワクチンと異なる組成であることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
ワクチンを哺乳類に送達する方法であって、前記方法が、
ａ）０．０２５ｍｍと２．５ｍｍとの間の深さで皮膚の真皮空間をワクチンで正確に標的設定するための真皮アクセス手段を有する装置と哺乳類の皮膚を接触させることと、
ｂ）真皮空間にワクチンを送達すること
とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４１】
送達されるワクチンが、皮下または筋肉内注射による同じ量のワクチンの送達後の応答と等じかまたはそれより大きい、哺乳類における免疫応答を誘発することを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
送達されるワクチンが、皮下または筋肉内注射によるより多量のワクチンの送達後の応答と等じかまたはそれより大きい、哺乳類における免疫応答を誘発することを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
遺伝子治療剤を哺乳類に送達する方法であって、前記方法が露出高さが０と１ｍｍとの間の露出高さを持つ出口を有する少なくとも１つの小ゲージ中空針を介して遺伝子治療剤を投与することを含み、前記出口が０．５ｍｍと２ｍｍとの間の深さまで皮膚に挿入される方法。
【請求項４４】
治療剤の送達が哺乳類の皮膚内の０．０２５ｍｍと２．５ｍｍとの間の深さで起こることを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
遺伝子治療剤によりコードされるペプチドまたはタンパク質が哺乳類において発現されることを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
発現が哺乳類の皮膚細胞内で起こることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
針が３１から５０ゲージのマイクロニードルであることを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
針が２０°と９０°との間の傾斜角度を有することを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
針が２５°と４０°との間の傾斜角度を有することを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
針が約０．５ｍｍから約１．７ｍｍの長さを有することを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項５１】
マイクロニードルがマイクロニードルのアレイ中に含まれることを特徴とする請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
遺伝子治療剤が核酸を含むことを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項５３】
１または複数の針が皮膚に実質的に垂直に挿入されることを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項５４】
物質を０．０２５ｍｍと２．５ｍｍとの間の深さに皮内送達するように設計された少なくとも１つの中空針を有する送達装置を含むキットであって、前記送達装置は、遺伝子治療剤またはワクチンを含む貯蔵器を受け入れるのに適しており、マイクロニードルが貯蔵器と連通するようになっているキット。
【請求項５５】
有効な用量のワクチンまたは遺伝子治療剤をさらに含むことを特徴とする請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
用量が、送達装置の一体部分である貯蔵器内、または、送達装置に機能し得るように取り付けることができる貯蔵器内に含められていることを特徴とする請求項５５に記載のキット。
【請求項５７】
中空マイクロニードルが約３１から５０ゲージであることを特徴とする請求項５４に記載のキット。
【請求項５８】
装置がマイクロニードルのアレイを含むことを特徴とする請求項５４に記載のキット。
【請求項５９】
装置が、
ワクチンを貯蔵する事前に充てん可能な貯蔵器に取付け可能であるハブ部分と、
前記ハブ部分により支持され、前記ハブ部分から離れるように延びる前方先端部を有する少なくとも１つの中空マイクロニードルと、
前記マイクロニードルを囲み、前記ハブ部分から前記マイクロニードルの前方先端部に向かって離れるように延びるリミッター部分を含み、前記リミッターが前記マイクロニードルの軸に概ね垂直な面内に延びる、概ね平らな皮膚係合面を含み、ワクチンの皮内注射を行うために哺乳類の皮膚に対して受け入れられるように適合されており、前記マイクロニードル前方先端部が前記皮膚係合面を超えて約０．５ｍｍから２．０ｍｍの距離延びており、前記リミッター部分が哺乳類の皮膚の真皮層内へのマイクロニードルの貫通を制限していることを特徴とする請求項５４に記載のキット。
【請求項６０】
物質を０．０２５ｍｍと２．５ｍｍとの間の深さに皮内送達するように設計された真皮アクセス手段を含むキットであって、前記真皮アクセス手段が、遺伝子治療剤またはワクチンを含む貯蔵器を受け入れるのに適しており、該真皮アクセス手段が該貯蔵器と連通するようになっているキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚の皮内層へのワクチンおよび遺伝子治療剤を投与する方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
予防、診断または治療の目的で薬剤物質を効果的かつ安全に投与することが重要であることは長年にわたり認識されている。通常の針の使用は、長期にわたり、ヒトおよび動物に皮膚を介して投与することにより薬剤物質を送達するための１つのアプローチを提供している。注射の容易さを改善し、通常の針に関連する患者の不安および／または疼痛を低減しつつ、皮膚を経ての再現性のある効果的な送達を実現する相当な努力がなされてきた。さらに、ある種の送達システムは、針を全く使用せず、イオン導入電流またはエレクトロポレーションまたはサーマルポレーションまたは超音波導入法のような化学メディエータまたは外的推進力に依拠して、皮膚の最外層である角質層を破り、皮膚の表面を通して物質を送達する。しかし、そのような送達システムは、再現性よく、皮膚障壁を破ることがなく、あるいは薬剤物質を皮膚の表面下のある所定の深さに送達せず、臨床的結果は定まらないものとなり得る。したがって、針を用いるような角質層を機械的に破ることは、皮膚の表面を通しての物質の最も再現性のよい投与方法を提供し、投与される物質の配置が制御され、信頼できるものとなると考えられる。
【０００３】
皮膚の表面下に物質を送達する方法は、ほぼもっぱら経皮投与、すなわち、皮膚を通しての皮膚下部への物質の送達を含む。経皮投与としては、皮下、筋肉内または静脈内投与経路などがあり、そのうち、筋肉内（ＩＭ）および皮下（ＳＣ）注射が最も一般的に用いられてきた。
【０００４】
解剖学的には、身体の外表面は、一緒に皮膚を構成している２つの主要な組織層、すなわち、外側の表皮と下にある真皮とからなっている（レビューについては、非特許文献１参照）。表皮は、全体の厚さが７５〜１５０μｍである５層に分けられる。表皮の下に真皮があり、これは２つの層を含み、外側の部分は真皮乳頭と称され、より深い層は網様真皮と称される。真皮乳頭は、多くの微小循環血液とリンパ叢を含む。これに対して、網様真皮は、比較的に無細胞性かつ無血管性であり、高密度のコラーゲン組織と弾性のある結合組織とからなっている。表皮および真皮の下には皮下組織があり、これは、ヒポデルミスとも称され、結合組織と脂肪組織とからなっている。筋組織が皮下組織の下にある。
【０００５】
上記のように、皮下組織と筋組織は、両方とも、一般的に薬剤物質の投与部位として用いられてきた。しかし、真皮は物質の投与部位として標的にされたことはほとんどなく、これは、少なくとも一部は、針を皮内空間に正確に位置決めすることが困難であるためである。さらに、真皮であっても、特に、真皮乳頭は高程度の血管分布を有することが知られており、皮下投与と比べて投与した物質の改善された吸収プロファイルを得るために、この高程度の血管分布を利用することはこれまでに認識されていなかった。これは、小さい薬物分子は、真皮よりも標的を定めることがはるかに容易で、予想することができた皮下組織への投与後に一般的に速やかに吸収されるためである。他方で、タンパク質のような巨大分子は一般的に血管分布の程度に無関係に毛細血管上皮を経て十分に吸収されないので、巨大分子についても、皮内投与を実現することがより困難であることにより、皮下投与よりも有意な吸収の優位性を達成することを予想できなかったのであろう。
【０００６】
皮膚表面下および皮内空間の領域への投与の一手法は、マントーツベルクリン試験に常用されている。この方法では、精製タンパク質誘導体を２７または３０ゲージ針および標準の注射器を用いて皮膚表面に対して浅い角度で注射する（非特許文献２）。マントー技法では、針を側方から皮膚に挿入し、次いで、針をさらに皮内組織内に「くねりつつ進める」ことが含まれる。この手法は、実施するのがかなり困難で、特殊な訓練を必要とすることが知られている。注射の位置の不正確さの程度によっては、かなりの数の偽陰性試験結果が得られる。さらに、この試験は注射部位の反応を誘発するために局部的注射を必要とするものであり、マントー法は物質の全身投与のための皮内注射の使用につながらなかった。
【０００７】
他のグループは、皮内薬物送達装置と記載されたものについて報告した（特許文献１）。注射は低速度であることが示されており、注射部位は表皮の下のある領域、すなわち、表皮と真皮との界面または真皮の内部または皮下組織であることが意図されていた。しかし、この参考文献には真皮内への選択的投与を示唆するような教示が記載されておらず、ワクチンまたは遺伝子治療剤をこの方法で送達することができることも示唆されてもいない。
【０００８】
今日まで、多数の治療用タンパク質および低分子量化合物が皮内に送達され、薬理学的に有用な反応を効果的に惹起するために使用されていた。これらの化合物の大部分（例えば、インスリン、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ、ｈＧＨ、カルシトニン）は、ホルモンタンパク質であって、工学技術で作成された受容体や抗体でない。今日まで、すべての投与されたタンパク質は、取り込みおよび分布のより速やかな開始（対ＳＣ）、ならびに、ある場合には生物学的利用能の増加を含めたＩＤ投与に伴ういくつかの効果を示した。
【０００９】
皮膚組織は、ワクチンおよび遺伝子治療剤の送達の魅力的な標的部位の代表である。ワクチン（遺伝子および従来型）の場合、皮膚は、高濃度の抗原提示細胞（ＡＰＣ）およびＡＰＣ前駆体がこの組織内、特に、表皮ランゲルハンス細胞および皮膚樹状細胞に見出されるため、魅力的な標的部位である。いくつかの遺伝子治療剤が、皮膚障害、皮膚疾患および皮膚癌の治療のために設計されている。そのような場合、罹患した皮膚組織に治療剤を直接送達することが望ましい。さらに、皮膚細胞は、そのコードされる１種のタンパク質または複数のタンパク質が皮膚から離れた部位において活性である遺伝子治療剤の魅力的な標的である。そのような場合、皮膚細胞（例えば、ケラチノサイト）は、真皮乳頭を介して全身循環に速やかに吸収させることができる治療用タンパク質を産生する「バイオリアクター」として機能する。他の場合として、皮膚から離れた部位の障害の治療のために、ワクチンまたは治療剤を全身循環に直接アクセスすることが望ましいこともある。このような場合、真皮乳頭層を介して全身への分配を実現することができる。
【００１０】
しかし、上記のように、標準的な針と注射器を用いた皮内（ＩＤ）注射は、実施するのが技術的に非常に困難であり、疼痛性である。従来技術は、ＤＮＡベースおよび従来型のワクチンおよび治療剤のＩＤ送達に関するいくつかの参考文献を含むが、少なくとも一部は、既存の技術ではＩＤ組織に正確に標的を定めることが困難であるため、結果は一致したものではなかった。
【００１１】
現在上市されている実際上すべてのヒトワクチンは、ＩＭまたはＳＣ経路により投与されている。４つの主要な世界的ワクチン製造業者（Ａｖｅｎｔｉｓ−Ｐａｓｔｅｕｒ、ＧＬａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、Ｍｅｒｃｋ、Ｗｙｅｔｈ）により２００１年に製造された３２種のワクチンのうち、２種のみがＩＤ用に承認された（２００１年医家向け医薬品便覧）。実際、これらの３２種のワクチンのうちの６種の添付文書に、ＩＤ経路を用いないことと述べられている。様々な公表前臨および初期臨床試験が、ＩＤ送達はＩＭまたはＳＣ注射よりも強い免疫応答を誘発し得ることによって、または、ＩＭまたはＳＣで与えられる投与量に比べて低い用量でそれらに匹敵する免疫応答を誘発することによって、ワクチンを改善することを示唆しているにもかかわらず、このようになっている（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）。幾つかの場合には、ＩＤ送達後のワクチンの有効性の改善が認められたが、他の場合には、そのような利点が認められなかった（非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４）。
【００１２】
ＩＤ送達経路の広範な使用を阻み、上記の矛盾した結果をもたらした主要な因子は、表皮および真皮層への再現性のある送達を達成するのに適切な装置がないことである。ワクチンを注射するのに一般的に用いられている標準針は、皮膚に挿入したときに、これらの組織に正確に標的を定めるには大きすぎる。最も一般的な送達方法は、標準針および注射を用いるマントー型の注射を介するものである。この方法は、実施するのが困難で、信頼できず、対象にとって疼痛性である。したがって、皮膚の皮内層への、ワクチンおよび遺伝子治療剤の効率的で、正確かつ再現性のある送達を可能にする装置と方法が必要である。
【００１３】
【特許文献１】
米国特許第５９９７５０１号
【特許文献２】
欧州特許出願公開第１０９２４４４  Ａ１号
【特許文献３】
２０００年６月２９日出願の米国特許出願第６０６９０９号
【特許文献４】
１９９９年１０月１４日出願の米国特許出願第４１７６７１号
【特許文献５】
米国特許第５５８９４６６号
【特許文献６】
米国特許第５５９３９７２号
【特許文献７】
米国特許第５７０３０５５号
【特許文献８】
２００２年５月１３日出願の米国特許出願第１０／１４２９６６号
【特許文献９】
米国特許第５５４７９３２号
【特許文献１０】
欧州特許出願公開第１０９２４４４号
【非特許文献１】
Physiology, Biochemistry, and Molecular Biology of the Skin, Second Edition, L. A. Goldsmith, Ed., Oxford University Press, New York, 1991
【非特許文献２】
Flynn et al, Chest 106: 1463-5, 1994
【非特許文献３】
Playford, E. G. et al, Infect, Control Hosp. Epidemiol. 23: 87, 2002
【非特許文献４】
Kerr, C. Trends Microbiol, 9: 415, 2001
【非特許文献５】
Rahman, F. et al., Hepatology 31: 521, 2000
【非特許文献６】
Carlsson, U. et al., Scan J. Infect. Dis. 28: 435 1996
【非特許文献７】
Propst, T. et al., Amer. J. Kidney Dis. 32: 1041, 1998
【非特許文献８】
Nagafuchi, S. et al., Rev Med Virol, 8: 97, 1998
【非特許文献９】
Henderson, E. A., et al., Infect.Control Hosp Epidemiol. 21: 264, 2000
【非特許文献１０】
Crowe, Am. J. Med. Tech. 31: 387-396, 1965
【非特許文献１１】
Letter to British Medical Journal 29/10/77, p.1152
【非特許文献１２】
Brown et al., J. Infect. Dis. 136: 466-471, 1977
【非特許文献１３】
Herbert & Larke, J. Infect. Dis. 140: 234-238, 1979
【非特許文献１４】
Ropac et al. Periodicum Biologorum 103: 39-43, 2001
【非特許文献１５】
Immunology Today, Apr 21 (4): 163-165, 2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、ヒトまたは動物へのワクチンおよび遺伝子治療剤のＩＤ送達の臨床的有用性を改善する。方法は、皮内空間に直接標的を定め、物質をボーラスとして、または注入により皮内空間に送達するための装置を用いるものである。物質を真皮内に入れることにより、ワクチンおよび遺伝子治療剤に対する効果的応答および／または改善された応答がもたらされることが発見された。この装置は、物質の皮膚からの漏れを防ぎ、皮内空間内の吸収または細胞による取り込みを改善するように設計されている。本発明の方法によるワクチン送達に対する免疫応答は、ワクチンの通常のＩＭ送達と同等またはそれより改善されていることが見出され、本発明の方法によるＩＤ投与は、ＩＤ送達の他の利点に加えて、多くの場合に臨床結果の改善をもたらすことがわかった。
【００１５】
本発明はまた、皮膚空間を直接標的とすることを基盤とした、個体にワクチンまたは遺伝物質を送達する方法および装置に関し、そのような方法によりワクチンまたは遺伝物質の送達の改善および／またはそれに対する応答の改善が可能となる。直接皮内（ＩＤ）投与手段（以後、真皮アクセス手段と称する）、例えば、マイクロニードルによる注射および注入システム、または皮内空間に正確に標的を定める他の方法を用いることにより、ワクチンおよび遺伝子治療剤を含む多くの物質の有効性を、皮下および筋肉内送達などの伝統的な非経口投与経路と比べて改善することができる。
【００１６】
したがって、免疫および治療応答をもたらすための遺伝物質を含むワクチンまたは医薬品をＩＤ組織に正確に標的を定めて送達する方法を提供することが本発明の１つの目的である。
【００１７】
ＩＤ組織に正確に標的を定めることによりワクチン（従来型のまたは遺伝子的なもの）または遺伝物質を含む医薬品に対する全身性免疫または治療応答を改善する方法を提供することが本発明のさらなる目的である。
【００１８】
ワクチンに対する抗原特異的免疫応答を有効にするために、ＩＤ組織に正確に標的を定めることにより皮膚に存在するＡＰＣに対するワクチン（従来型のまたは遺伝子的なもの）の利用性を改善する方法を提供することが本発明の他の目的である。これにより、多くの場合に、より少量の物質をＩＤ経路により投与することが可能となる。
【００１９】
ＩＤ組織に正確に標的を定めることにより皮膚疾患、遺伝的皮膚障害または皮膚癌の治療のための遺伝物質を含む医薬品の送達を改善する方法を提供することが本発明の他の目的である。結果としての遺伝物質はその後、標的としたＩＤ組織内の細胞により発現される。
【００２０】
ＩＤ組織に正確に標的を定めることにより皮膚から離れた組織を冒す疾患、遺伝的障害または癌の治療のための遺伝物質を含む医薬品の送達を改善する方法を提供することが本発明の他の目的である。結果としての遺伝物質はその後、標的としたＩＤ組織、それから離れた組織または両方の内部の細胞により発現される。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明のこれらおよび他の利点は、特定の治療または予防薬についての好ましい深さに物質の送達の標的を直接定めることにより実現される。本発明者らは、皮内空間に物質の送達の標的を明確に定めることにより、ワクチンおよび遺伝子治療剤に対する応答を思いがけず改善することができ、多くの状況では、得られる臨床的な利点と共に変化させることができることを見出した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本明細書で用いているように、「皮内」（ＩＤ）は、物質を、速やかに全身に吸収させることができるか、または、ワクチン（従来型のまたは遺伝子的なもの）若しくは遺伝子治療剤の場合には、皮膚の細胞により直接吸収する豊富に血管化された真皮乳頭に物質が容易に到達するような方法で物質を真皮内に投与することを意味する。遺伝子ワクチンの場合、所期の標的細胞は、ＡＰＣ（表皮ランゲルハンス細胞および真皮樹状細胞を含む）を含む。皮膚から離れている組織を冒す疾患、遺伝的障害または癌の遺伝子治療剤の場合、所期の標的細胞は、治療用タンパク質を発現することができるケラチノサイトまたは他の皮膚細胞を含む。皮膚を冒す疾患、遺伝的障害または癌の遺伝子治療剤の場合、所期の標的細胞は、疾患、遺伝的障害または癌により冒されている皮膚細胞を含む。
【００２３】
本明細書で用いているように、「標的送達」は、標的深さへの物質の送達を意味し、治療を受ける個体における同じ応答をもたらすが、別の受け入れられている送達手段（例えば、局所、皮下または筋肉内）と比較して、疼痛が少なく、再現性が大きく、または他の利点をもたらす送達を含む。
【００２４】
本明細書で用いているように、「応答の改善」は、投与した低減された量の化合物と同等の応答、または別の送達手段により投与された同じ量の化合物に対して増加した応答、または他の治療上または免疫学的利点を含む。
【００２５】
本明細書で用いている「針」または「複数の針」という用語は、そのようなすべての針様構造を含むことを意図するものである。マイクロカニューレまたはマイクロニードルという用語は、本明細書で用いているように、そのような構造が円筒形の場合、約３１ゲージ、一般的に３１〜５０ゲージより小さい構造を含むことを意図するものである。マイクロニードルという用語に含まれる非円筒形構造は、同等の直径のもので、角錐形、矩形、八角形、くさび形および他の幾何学的形状を含む。
【００２６】
本明細書で用いているように、「ボーラス」という用語は、１０分未満の時間内に送達される量を意味する。「急速ボーラス」は、１分未満の時間内に送達される量を意味する。「注入」は、１０分間を超える時間にわたる物質の送達を意味する。
【００２７】
「核酸」という用語は、１本鎖または２本鎖の形態の複数のヌクレオチドのポリヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含み、本発明の方法を用いて配合し、送達することができるあらゆるサイズのものであってよい。核酸は、「アンチセンス」型であってよい。「核酸由来のもの（ｅｎｔｉｔｙ）」は、全部または一部が核酸により構成されているものを意味する。
【００２８】
「遺伝子治療剤」は、遺伝物質の取り込みおよび発現のために、治療を受ける個体の細胞に送達されるか、またはその細胞により取り込まれることができることを意図されている薬剤を意味する。遺伝子治療剤は通常、発現に必要な任意の更なる核酸配列にいつでも使えるように連絡されているベクターまたはプラスミドに任意に含まる、問題のペプチド、ポリペプチド、タンパク質または糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００２９】
ワクチンまたは遺伝子治療剤の投与に言及するとき、「同時に」という語は同じ２４時間以内の２回の投与を意味するのに対して、「逐次的に」または「引き続いて」は投与が２４時間以上離れていることを意味する。同時投与は、同じ医療訪問時に行われる投与を指すのに対して、引き続いてまたは逐次的には、個々のワクチンまたは遺伝子療法の効果に応じて、数日間、数週間、数カ月間、場合により数年間隔たっている投与を指すことは、当業者は認識するであろう。１つの好ましい実施形態において、「逐次」または「引き続く」は、１日から６週間隔たっている投与を指す。
【００３０】
所望の治療または免疫応答は、ＩＤ標的深さに直接に関連する。これらの結果は、真皮の上部領域、すなわち乳頭真皮、もしくは物質が容易に乳頭真皮に拡散するような比較的血管が少ない網様真皮の上の部分への物質の配置により、得ることができる。主として少なくとも約０．０２５ｍｍから約２．５ｍｍの深さでの物質の配置が好ましい。
【００３１】
特にワクチンについては、送達が角質層の直下で、且つ表皮および上部真皮を含む標的深さ（約０．０２５ｍｍから約２．５ｍｍ）で行われることが好ましい。皮膚の細胞を標的とする治療剤の場合には、好ましい標的深さは標的とする個々の細胞に依存する。例えば、ランゲルハンス細胞を標的とする治療剤の場合、送達は、一般的にヒトでは約０．０２５ｍｍから約０．２ｍｍの範囲の表皮組織深さを、少なくとも一部には、含む必要があろう。全身循環を必要とする治療剤の場合、好ましい標的深さは、少なくとも約０．４ｍｍ、最も好ましくは少なくとも約０．５ｍｍから約２．５ｍｍ以下、より好ましくは約２．０ｍｍ以下、最も好ましくは約１．７ｍｍ以下までの間であり、所望の真皮層への物質の送達をもたらす。主としてより大きい深さおよび／または下部網様真皮への物質の配置は、通常あまり望ましくないと考えられる。
【００３２】
本発明によるＩＤ投与に用いる真皮アクセス手段は、物質の標的送達深さを得るのに必要な対象の皮膚への挿入深さを提供する限り、重要ではない。ほとんどの場合、装置は皮膚に約０．５〜２ｍｍの深さに貫通する。真皮アクセス手段は、単独で、または複数の針の配置で用いられるすべての既知の種類の通常の注射針、カテーテル、マイクロカニューレまたはマイクロニードルを含んでいてもよい。
【００３３】
真皮アクセス手段により物質の送達の標的深さを変化させることにより、薬剤または物質の挙動を、個々の患者の状態に最も適切な所望の臨床適用に適応させることができる。真皮アクセス手段による物質の送達の標的深さは、専門家が手で、所望の深さに到達したときを示すインジケータ手段の補助を用い、あるいは用いずに調節することができる。しかし、装置は皮内空間内の所望の深さへの皮膚貫通を調節する手段を有することが好ましい。これは、一般には、針が取り付けられている裏打ち構造またはプラットフォームの形をとり得る真皮アクセス手段に関連する拡大部分またはハブにより達成される。真皮アクセス手段としてのマイクロニードルの長さは、製造過程中に容易に変化させることができ、日常的に製造されるマイクロニードルはまた、注射または注入時の疼痛または他の感覚をさらに少なくするために、非常に鋭利で、非常に小さいゲージサイズのものである。それらは、個別の単一内腔マイクロニードルとして本発明に用いることができ、あるいは、送達の速度、すなわち、所定の時間内に送達される物質の量を増加させるために、複数のマイクロニードルの直線状アレイまたは２次元アレイを用いることができる。１つまたは複数の側穴を有するマイクロニードルも真皮アクセス手段として含まれる。マイクロニードルは、貫通の深さを制限する働きもするホルダーおよびハウジングのような様々な装置に組み込むことができる。本発明の真皮アクセス手段は、送達前の物質を含む貯蔵器もしくは圧力下の薬剤または他の物質を送達するためのポンプまたは他の手段を含んでいてもよい。あるいは、真皮アクセス手段を収納する装置にそのような追加の構成要素を外付けしてもよい。真皮アクセス手段は、偶発的損傷を予防または低減するための受動的または能動的安全装備を含んでいてもよい。
【００３４】
本発明の１つの実施形態において、皮膚表面に垂直に挿入した１つまたは複数の細いゲージのマイクロカニューレを用いてＩＤ注射を再現性よく実施することができる。この送達方法（「微小皮膚送達」すなわち「ＭＤＤ」）は、標準的なマントー方式の注射よりも実施するのが容易で、皮膚への貫通の深さが制限され、制御されるため、侵襲性および疼痛性が少ない。さらに、本発明では遺伝子発現および免疫応答により測定する、標準針と比較して同様または大きい生物学的応答をＭＤＤ装置を用いて得ることができる。所与の動物種における所与の物質の最適投与深さは、当業者が過度の実験をすることなく、決定することができる。
【００３５】
真皮アクセス手段を皮内の適切な深さに入れ、液体の送達量および速度を制御し、物質を漏洩することなく所望の位置に正確に送達することを可能にする送達装置が最も好ましい。マイクロカニューレおよびマイクロニードルを用いる方法論および装置は、特許文献２および特許文献３に記載されている。標準的な鋼製カニューレも、その内容のそれぞれが参照により本明細書に組み込まれている特許文献４に記載されている装置および方法を用いる皮内送達に用いることができる。これらの方法および装置としては、カニューレの全長または深さを制限する装備を超えて露出されているカニューレの全長により定義される貫通深さ制限付きの、より細いゲージの（約３０Ｇ）「マイクロカニューレ」による物質の送達などが挙げられる。これらの方法および装置は３０または３１ゲージカニューレによる物質の送達のためのものであるが、本発明は、所望ならば貫通手段の深さの制限または制御を含む３４Ｇまたはより細い「マイクロカニューレ」も用いる。物質の標的送達は、単一マイクロカニューレまたはマイクロカニューレのアレイ（または「マイクロニードル」）を介して、例えば、投与する物質が含まれている貯蔵器を含むか、あるいは貯蔵器に取り付けることができる注入装置に装着された３〜６本のマイクロニードルを介して達成することができることは、本発明の範囲内である。
【００３６】
本発明の方法を用いて、ワクチンおよび遺伝子治療剤をボーラスとして、もしくは注入により投与することができる。ボーラス投与または送達を、速度調節手段、例えば、ポンプにより、もしくは特定の速度調節手段のない、例えば、使用者の自己注射により行うことができることは理解される。上記の利点は、表皮を含む皮膚組織コンパートメントへの物質の標的を定めた正確な直接送達により最もよく認識される。これは、例えば、外径が約２５０ミクロン未満で、露出長が２ｍｍ未満のマイクロニードルシステムを用いて達成される。「露出長」とは、患者の皮膚に貫通させるために利用可能な細い中空カニューレまたは針の長さを意味する。そのようなシステムは、鋼鉄、ケイ素、セラミックおよび他の金属、プラスチック、ポリマー、糖、生物学的および／または生分解性材料および／またはそれらの組合せなどの様々な材料に対する既知の方法を用いて構築することができる。
【００３７】
皮内投与方法の一定の特徴が最も効果的な結果をもたらすことが見出された。例えば、針出口を皮膚内に入れることが、ワクチンまたは遺伝子治療剤の送達に対する臨床的応答に有意に影響することが判明した。１５度以下の角度で切断された傾斜角度を有する従来型または標準ゲージ針の出口は、比較的大きい「露出高さ」を有する。本明細書で用いているように、露出高さという用語は、傾斜切断に起因するカニューレの軸方向の開口部の長さを指す。標準針を皮内空間内の所望の深さに（皮膚に対して約９０度で）入れるとき、これらの針の出口の露出高さが大きいため、皮膚自体によってかけられる背圧、もしくは注射または注入により蓄積しつつある液体により増加した圧力により物質が通常皮膚から流出する。一般的に、本発明の露出高さは０〜約１ｍｍである。０ｍｍの露出高さを有する針の出口は、傾斜の切断がなく（すなわち、傾斜角度９０度）、この出口は針の先端にある。この場合には、出口の深さが針の貫通の深さと同じである。傾斜切断または針の側面の開口により形成された針の出口は、測定可能な露出高さを有する。傾斜を有する針では、針出口の露出高さは、針の直径と一次傾斜切断の角度（「傾斜角度」）により決定される。一般的に、２０°を超える傾斜角度が好ましく、より好ましくは２５°から４０°の間である。単一針は皮膚空間への物質の送達に適する複数の開口部または出口を有していてよいことが理解される。
【００３８】
したがって、露出高さ、および側面に開口部を有するカニューレの場合には、カニューレの軸に沿うその位置は、物質が送達される深さと特定性に寄与する。送達速度および送達される液体の総容積のようなカニューレ単独またはカニューレと組み合わせて考慮される他の因子は、物質の標的送達に寄与し、結果を最適化するためにそのようなパラメーターを変化することは本発明の範囲内にある。
【００３９】
注射または注入の圧力を制御することにより、ＩＤ投与中に高い背圧がかかるのを回避することができることも見出されている。液体界面に一定の圧力を直接かけることにより、吸収を最適化し、送達されるワクチンまたは治療剤の用量に対する改善された応答を得ることができる、より一定の送達速度を達成することができる。送達速度および容積は、送達部位における膨疹を防ぎ、背圧により真皮アクセス手段が皮膚から押し出されることを防ぐためにも制御することができる。選択する物質についてこれらの効果を得るための適切な送達速度および容積は、通常の技術を用い、過度の実験を行わずに実験的に決定することができる。複数の針の間の間隔を増加させることにより、より広い液体分布と送達速度の増加またはより大きい液体の容積が可能になる。
【００４０】
一実施形態において、物質を送達するために、真皮アクセス手段を対象の皮膚に隣接させて置き、皮内空間内に直接に標的を定めたアクセスを行い、１つの物質または複数の物質を、それらが局所的に作用するか、または血流により吸収されて、全身に分布することができる皮内空間に送達または投与する。他の実施形態において、真皮アクセス手段を皮膚表面に実質的に垂直に置いて、１つまたは複数のカニューレを垂直に挿入する。真皮アクセス手段は、送達する１つの物質または複数の物質を含む貯蔵器に接続することができる。送達または投与する１つの物質または複数の物質の形態は、薬学的に許容できる希釈剤または溶媒中その溶液、乳剤、懸濁剤、ゲル、懸濁または分散されたミクロ粒子およびナノ粒子のような粒子ならびに上記のｉｎ  ｓｉｔｕ形成ビヒクルなどである。貯蔵器から皮内空間への送達は、送達する１つの物質または複数の物質に対して外圧または他の駆動手段を加えずに受動的に、および／または圧力または他の駆動手段を加えて能動的に起こり得る。好ましい圧力発生手段の例としては、ポンプ、注射器、弾性膜、気体圧力、圧電性、起電性、電磁気的ポンプ作用、つる巻きばねまたはさらばねまたは座金もしくはそれらの組合せなどがある。所望ならば、物質の送達の速度を圧力発生手段により様々に制御することができる。その結果、物質が皮内空間に入り、臨床的に有効な結果を得るのに十分な量および速度で吸収される。
【００４１】
本発明の方法により送達させることができる物質には、担体、アジュバントおよびビヒクルを含むかまたは含まないワクチンが含まれ、これらには予防および治療用抗原が含まれ、これらには以下のものが含まれるがこれに限定されない：サブユニットタンパク質、ペプチドおよび多糖、多糖複合体、トキソイド、遺伝子ベースのワクチン、弱毒化生細菌またはウイルス、突然変異細菌またはウイルス、再構築細菌またはウイルス、不活化細菌またはウイルス、全細胞またはその成分（例えば、哺乳類細胞）、細胞ワクチン（例えば、自己由来樹状細胞）またはその成分（例えば、エキソソーム、デキソソーム、膜断片または小胞）、生ウイルス、生菌、以下のものに関連するアデノウイルス、レトロウイルス、アルファウイルス、フラビウイルスおよびワクシニアウイルスに由来するものを含むウイルスおよび菌ベクター：依存症（例えば、コカイン依存症）、悪性膿疱、関節炎、コレラ、ジフテリア、デング、破傷風、狼瘡、多発性硬化症、寄生虫症、乾癬、ライム病、髄膜炎菌症、はしか、流行性耳下腺炎、風疹、水疱、黄熱、ＲＳウイルス、ダニ媒介日本脳炎、肺炎球菌、天然痘、レンサ球菌、ブドウ球菌、腸チフス、インフルエンザ、Ａ、Ｂ、ＣおよびＥ型肝炎を含む肝炎、中耳炎、狂犬病、ポリオ、ＨＩＶ、パラインフルエンザ、ロタウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ＣＭＶ、クラミジア、不定型ヘモフィルス、ヘモフィルスインフルエンザＢ（ＨＩＢ）、モラキセラカタラーリス、ヒト乳頭腫ウイルス、ＢＣＧを含む結核、淋病、喘息、アテローム硬化症、マラリア、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、アルツハイマー病、ピロリ菌（Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉ）、サルモネラ、糖尿病、癌、単純ヘルペス、ヒト乳頭腫、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、旅行者の疾患、西ナイル脳炎、カンピロバクター（Ｃａｍｐｌｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウムディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）。遺伝子免疫法用の適切な例としての組成物は、例えば、特許文献５、特許文献６および特許文献７に記載されている。
【００４２】
本発明の方法により誘導することができる特に好ましい物質には、疾患の予防、診断、緩和、治療または治療薬に用いる核酸、核酸由来物質および遺伝子治療剤等が含まれる。ワクチンに含める適切なアジュバントは、当業者に知られている。本発明に用いることができる免疫応答を増強するための追加の物質は、参照により本明細書に組み込まれている特許文献８に記載されている。
【００４３】
特に好ましい遺伝子治療剤には、メラノーマ、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、カポシ肉腫、皮膚扁平細胞癌および基底細胞癌を含むが、これらに限定されない癌、アデノシンデアミナーゼ欠乏症、乾癬を含むがこれに限定されない過増殖性皮膚疾患、表皮剥離性角化症、表皮水疱症、層状魚鱗癬およびＸ染色体性魚鱗癬を含むがこれらに限定されない遺伝性皮膚疾患、血友病、のう胞性線維症、成長障害、ヒト成長ホルモン欠損症を含むがこれに限定されないホルモン欠損症、アテローム硬化症、トランスフェリン欠乏の治療に適応とされているもの、ならびに創傷治癒および組織再生に適応とされている遺伝子治療剤が含まれる。適切な遺伝子治療剤用の適切な例としての組成物は、例えば、特許文献９に記載されている。
【００４４】
物質は、薬学的に許容できる形態で皮膚内に送達することができる。本発明の方法に用いることができるワクチンは、当業者に知られているような、特定の製剤に適したアジュバントおよび担体またはビヒクルを含んでいてよい。
【００４５】
アレルゲン組成物の製剤を含む本発明用の薬学的に許容できるペプチドおよびポリペプチド製剤も当技術分野でよく知られている。本発明の方法において使用する核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡもしくはその組合せであってよい。それらは、ＩＤ投与ならびに細胞による取り込みおよび発現に適するあらゆる物理的形態であってよい。ＤＮＡおよび／またはＲＮＡは、ウイルスベクターまたはリポソームに含まれていてよく、あるいは、当技術分野で知られているプラスミドのような遊離ポリヌクレオチドとして送達してもよい。核酸は、一般的に核酸と適合性のある液剤、ゲル剤または懸濁剤のような薬学的に許容できる処方剤として調合される。
【００４６】
一般的に、ワクチンまたは他の薬剤を投与するために専門家はセプタムで密封したバイアルから注射器を用いて適切な容量を取り出すであろう。次に、この同じ注射器を用いて患者にワクチンを投与する。しかし、一般的に長さが０．１〜２ｍｍのマイクロニードルまたはマイクロカニューレは、セプタムに完全に貫通させるのに長さがやや不適切であることに加えて、患者にその後に用いるために十分な鋭利さとまっすぐな形状を維持しつつ薬剤を抽出するためにバイアルのセプタムを穿刺するには一般的に脆弱すぎる。セプタムを穿刺するのにそのような微小装置を用いることで、針の内腔の詰まりをきたす場合もある。さらに、細いゲージ、一般的に３１〜５０ゲージのマイクロカニューレは、例えば、針から注射器に移すことができる容量を著しく減少させる。これは、通常の器具を用いてバイアルから液体を速やかに移すことに慣れているほとんどの専門家にとって不便であり、専門家が患者に費やす時間が著しく増加するであろう。微小装置の広範にわたる使用に際して考慮すべき追加の因子には、微小装置により使用されるかまたは送達される低減された総容積（１０〜１００μｌ）に適応するように、ほとんどの薬剤およびワクチンを処方しなおす必要があることが含まれる。したがって、送達する物質と組み合わせた装置、またはそれに組み込むのに適した装置を含むキットを提供することが望ましいであろう。
【００４７】
投与器具と治療用組成物を含むキット等は、当技術分野でよく知られている。しかし、薬剤およびワクチンの送達のための侵襲が最小限のＩＤ微小装置の適用は、免疫応答および治療応答を可能にするための処方剤を投与することに関して安全で、有効的でかつ一貫性のある手段を提供するための、処方剤と装置の結びつけの直接的な必要性を明確に示している。
【００４８】
本発明により提供されるキットは、物質を０．０２５〜２ｍｍの深さに皮内送達するように設計された少なくとも１つの中空マイクロニードルを有し、マイクロニードルが、ワクチンまたは遺伝子治療薬の所定用量を含むようになされた貯蔵器と流体で連通するか、または流体連結することができるように配置された送達装置を含む。好ましい実施形態において、キットは、送達装置の一体部分であるか、または、それに機能的に取り付けることができる貯蔵器に任意に含まれている、有効量のワクチンまたは遺伝子治療薬も含有する。中空マイクロニードルは、好ましくは約３１〜５０ゲージであり、例えば、３〜６本のマイクロニードルのアレイの一部であってよい。
【００４９】
特に好ましい実施形態において、本発明のキットは、ワクチンを貯蔵する事前に充てん可能な貯蔵器に取付け可能であるハブ部分と、
前記ハブ部分により支持され、前記ハブ部分から離れるように延びる前方先端部を有する少なくとも１つの中空マイクロニードルと、
前記マイクロニードルを囲み、前記ハブ部分から前記マイクロニードルの前方先端部に向かって離れるように延びるリミッター部分を含み、前記リミッターが前記マイクロニードルの軸に概ね垂直な面内に延びる概ね平らな皮膚係合面を含み、ワクチンの皮内注射を行うために哺乳類の皮膚に受け入れられるのに適しており、前記１または複数のマイクロニードルの１または複数の前方先端部が前記皮膚係合面を約０．５から２．０ｍｍの距離超えて延びており、前記リミッター部分が哺乳類の皮膚の真皮層内へのマイクロニードルの貫通を制限している。
【００５０】
本発明により想定されるようにキットを使用するために、専門家は、密封シールを破って、微小装置、ならびに場合によりワクチンまたは免疫原性若しくは治療用組成物へのアクセスを可能にするであろう。組成物は、ゲル、ペースト、油状、乳状、粒子、ナノ粒子、マイクロ粒子、懸濁または液状（但しこれらに限定されない）を含めた任意の形態で微小装置内にあらかじめ充てんすることができる。組成物は、キットパッケージ、例えば、貯蔵器、バイアル、チューブ、ブリスター、ポーチ内等に別個に包装されていてよい。処方剤の１つまたは複数の構成成分は凍結乾燥、乾燥、噴霧乾燥されているか、または他の任意の再構成可能な形態であってよい。所望ならば、様々な再構成媒体、洗浄または消毒剤もしくは局所滅菌剤（アルコールワイプ、ヨウ素）をさらに供給することができる。専門家は、必要な場合、物質を装置に充てんまたは組み込み、次いでＩＤ注射微小装置を用いて患者に処方剤を投与するであろう。
【００５１】
本発明を一般的に記述したが、以下の具体的であるが、限定的でない実施例および図を参照して、本発明を実施するために種々の例を示す。
【００５２】
単一針を含む真皮アクセス微小装置（ＭＤＤ装置）の代表的サンプルを３４ゲージのスチールストック（ＭｉｃｒｏＧｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｄｗａｙ、ＭＡ）から調製し、単一の２８°傾斜を８００グリットカーボランダム研削ホイールを用いて研削した。針をアセトンおよび蒸留水中での逐次的に超音波処理により清浄にし、蒸留水を用いて流出をチェックした。マイクロニードルを紫外線硬化性エポキシ樹脂を用いて小ゲージカテーテルチューブ（Ｍａｅｒｓｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ）に固定した。針の長さを機械的割出しプレートを用いて設定し、カテーテルチューブのハブを深さ制限調節具として機能させ、光学顕微鏡により確認した。露出した針の長さを割出しプレートを用いて１ｍｍに調節した。注射器との接続は、カテーテルの入り口で一体型ルアーアダプターを介して行った。注射の間に、針は皮膚表面に垂直に挿入され、ボーラス送達のために手で緩やかに押すことにより所定の位置に保持した。注射の直前と直後に装置の機能と液体の流れを点検した。特許文献１０に記載されているように深さ制限ハブにより制御されている１．５ｍｍ露出長を有する３０／３１ゲージ皮内針装置もいくつかの実施例で用いた。
【実施例１】
【００５３】
モデル遺伝子治療剤／予防剤のＩＤ送達および発現、モルモットモデル
細胞によるｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＮＡの取り込みと発現は、有効な遺伝子治療および遺伝的免疫化に重要である。リポーター遺伝子ホタルルシフェラーゼをコードするプラスミドＤＮＡをモデル遺伝子治療剤（Ａｌｄｅｖｒｏｎ、Ｆａｒｇｏ、ＮＤ）として用いた。ＤＮＡをＨａｒｔｌｅｙモルモット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）に標準３０Ｇ針を用いてマントー法により皮内（ＩＤ）投与（ＩＤ−マントー）するか、またはほぼ垂直に挿入した長さが１ｍｍの３４Ｇ鋼製マイクロカニューレ（ＭＤＤ装置）を用いてＭＤＤによりＩＤ送達した（ＩＤ−ＭＤＤ）。剃毛した皮膚にプラスミドＤＮＡを陰性対照として局所適用した（プラスミドの大きさが大きすぎて、皮膚への受動取り込みができない）。総投与量は動物当たり１００μｇであり、４０μｌ  ＰＢＳの総投与容量で１ｃｃ注射器を用いて急速ボーラス注射（１分未満）として送達した。投与部位の全層皮膚生検試料を送達の２４時間後に収集し、ホモジナイズし、市販のアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いてルシフェラーゼ活性を測定するためにさらに処理した。ルシフェラーゼ活性は、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）により測定した組織試料中の総タンパク質含量に対して標準化し、総タンパク質１ｍｇ当たりの相対光単位（ＲＬＵ）として表す（マントーおよび陰性対照については群当たりｎ＝３、ＭＤＤ装置についてはｎ＝６）。
【００５４】
結果（図１）は、両ＩＤ注射群における強いルシフェラーゼ発現を示している。ＭＤＤおよびマントー群における平均ルシフェラーゼ活性は、陰性対照よりそれぞれ２４０および２２０倍高かった。局所対照におけるルシフェラーゼ発現レベルは、無処置皮膚部位よりも有意に大きくなかった（データは示さず）。これらの結果は、ＭＤＤ装置を用いた本発明の方法は、ＩＤ組織への遺伝物質の送達に関してマントー法と少なくとも同様に有効であり、皮膚細胞によるｉｎ  ｖｉｖｏでの有意なレベルの局在化遺伝子発現をもたらすことを示している。
【実施例２】
【００５５】
モデル遺伝子治療剤／予防剤のＩＤ送達および発現、ラットモデル
複数の動物種にわたるこのプラットフォームの有用性を評価するために、上の実施例１に記載したのと同様の（マントー対照を用いない）実験をＢｒｏｗｎ−Ｎｏｒｗａｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）において実施した。総プラスミドＤＮＡの供給を５０μｌの容量のＰＢＳ中５０μｇに減少させたことを除いて、実施例１と同じプロトコールを用いた。さらに、ＩＤ注射した（ＭＤＤ装置を用いて）無関係のプラスミドＤＮＡ（ｂ−ガラクトシダーゼをコードする）を陰性対照として用いた（群当たり動物ｎ＝４）。皮膚におけるルシフェラーゼ活性を上の実施例１に記載したように測定した。
【００５６】
図２に示す結果は、ＭＤＤ装置によるＩＤ送達後の非常に有意な遺伝子発現を示している。回収された皮膚部位におけるルシフェラーゼ活性は、陰性対照より３０００倍を超えて大きかった。これらの結果は、皮膚による高レベルの遺伝子発現をもたらす、遺伝子ベースのものをｉｎ  ｖｉｖｏで送達する際の、本発明の方法の有用性をさらに示している。
【実施例３】
【００５７】
モデル遺伝子治療剤／予防剤のＩＤ送達および発現、ブタモデル
ブタは、皮膚を用いる送達試験の好ましい動物モデルとして長年にわたり認識されている。ブタ皮膚は、全層および毛嚢密度についてげっ歯類皮膚よりもヒト皮膚に類似している。したがって、ブタモデル（ヨークシャー種ブタ、Ａｒｃｈｅｒ  Ｆａｒｍｓ、Ｂｅｌｃａｍｐ、ＭＤ）をヒトにおけるこのシステムの有用性を予測する手段として用いた。実験は、異なるリポーター遺伝子系β−ガラクトシダーゼ（Ａｌｄｅｖｒｏｎ、Ｆａｒｇｏ、ＮＤ）を用いたことを除いて、上の実施例１および２と同様に実施した。総送達用量は、５０μｌ容量中５０μｇであった。ＤＮＡは次の方法を用いて注射した。すなわち、ｉ）３０Ｇ針および注射器を用いてマントー法により、ｉｉ）針貫通深さを１．５ｍｍに制限する装備を装着した３０／３１Ｇ針を用いて皮膚への垂直挿入によるＩＤ送達により、ｉｉｉ）針貫通深さを１．０ｍｍに制限する装備を装着した３４Ｇ針を用いて皮膚への垂直挿入によるＩＤ送達（ＭＤＤ装置）により注射した。陰性対照群は、ホタルルシフェラーゼをコードする無関係のプラスミドＤＮＡのｉ〜ｉｉｉによるＩＤ送達からなっていた。（ＩＤマントー群の４匹のブタの皮膚部位ｎ＝１１；ＩＤ、３０／３１Ｇ、１．５ｍｍ装置の４匹のブタの皮膚部位ｎ＝１１；ＩＤ、３４Ｇ、１ｍｍ装置の４匹のブタの皮膚部位ｎ＝１０；陰性対照の４匹のブタの皮膚部位ｎ＝１９）陰性対照については、３つの方法すべてが同等の結果をもたらしたので、３つのＩＤ送達法からのすべてのデータを併合した。
【００５８】
組織中のリポーター遺伝子活性は、ルシフェラーゼアッセイの代わりにｂ−ガラクトシダーゼ検出アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いたことを除いて、本質的に、実施例１に記載した通りに測定した。
【００５９】
図３に示される結果は、３種すべてのＩＤ送達の後の皮膚における強いリポーター遺伝子発現を示している。ＩＤマントー群における応答がバックグラウンドの１００倍であったのに対して、ＩＤ、３４Ｇ、１ｍｍ（ＭＤＤ）群ではバックグラウンドより３００倍増加し、ＩＤ、３０Ｇ、１．５ｍｍ（３０ｇ、１．５ｍｍ）群ではバックグラウンドより２０倍増加した。摘出した皮膚組織生検により回収したリポーター遺伝子の平均活性により測定した、皮膚細胞による総リポーター遺伝子発現は、ＩＤ、３４Ｇ、１ｍｍ（ＭＤＤ）群で５６３，５２３ＲＬＵと最も強かったのに対して、３０Ｇマントー群では２００，７８８ＲＬＵ／ｍｇ、ＩＤ（３０ｇ、１．５ｍｍ）群では４２，４７０ＲＬＵ／ｍｇ、陰性対照では１，８６９ＲＬＵ／ｍｇであった。したがって、３４Ｇ、１．０ｍｍ針（ＭＤＤ）の垂直挿入によるＩＤ送達は、標準マントー方式注射、またはより長く（１．５ｍｍ）、より太い（３０Ｇ）針を用いた同様の垂直針挿入および送達と比較して、皮膚細胞によるＤＮＡの優れた取り込みおよび発現をもたらす。これらの３種の装置および方法を用いた可視色素を送達する同様の試験においても、３４Ｇ、１．０ｍｍ針が、他の２つの針／方法よりもＩＤ組織への一貫性のある送達をもたらし、皮下（ＳＣ）組織への投与量の「あふれ出し」が少ないことが示されている。
【００６０】
３種の装置および方法のすべてが理論的に同じ組織空間を標的としているので、これらの差は予想されなかった。しかし、深さ制限ハブによりカニューレの長さを制御することにより実現される実質的に垂直な挿入技法と比較して、側方挿入（マントー）法を用いて送達の深さを制御することははるかに困難である。さらに、針挿入深さおよび針出口の露出高さは、ＳＣ「あふれ出し」または皮膚表面上の漏れを伴うことのない再現性のよいＩＤ送達に関連する重要な特徴である。
【００６１】
これらの結果はさらに、皮膚細胞による高いレベルの遺伝子発現ををもたらす、遺伝子ベースのもののより大型哺乳類におけるｉｎ  ｖｉｖｏ送達に関する本発明の方法の有用性を示している。さらに、ブタとヒトとの皮膚組成が類似していることから、ヒトにおいて同等の臨床的改善が得られるはずである。
【実施例４】
【００６２】
ＩＤ送達後の限局性組織損傷の間接的測定
上の実施例３に示した結果は、標準針を用いたマントー法により達成される有効性と比較してＭＤＤを用いるＩＤ送達により達成される有効性の予想されない改善があるということを示唆する。さらに、ＭＤＤカニューレは、標準針と比べて挿入深さが浅く、マントー方式の注射のようにＩＤ組織に側方から「くねって進める」ことがないため、機械的に破壊する組織の全範囲はより小さい。組織損傷および炎症は、数種の炎症性タンパク質、ケモカイン、サイトカインおよび他の炎症メディエータの放出をもたらす。
【００６３】
したがって、回収された皮膚部位の総タンパク質含量は、２種の送達法により引き起こされる組織損傷および限局性炎症の間接的尺度として用いることができる。総タンパク質のレベルは、上の実施例３で示したブタサンプル（３０ｇ、１．５ｍｍを除く）からの回収皮膚生検試料についてＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて測定した。図４に示すように、両送達法は無処置皮膚と比べて総タンパク質含量の増加を誘発した。しかし、ＩＤマントー群の回収皮膚生検試料中の総タンパク質濃度は、ＭＤＤ群における対応する値よりも有意に（ｐ＝０．０１、ｔ検定）大きかった（２．４ｍｇ／ｍｌ対１．５ｍｇ／ｍｌ）。これらの結果は、本発明の方法による送達により引き起こされる組織の機械的損傷がマントー方式のＩＤ注射により引き起こされる対応する損傷よりも少ないことを強く示唆する間接的証拠を提供している。
【実施例５】
【００６４】
ラットにおけるＩＤ送達後のインフルエンザＤＮＡワクチンに対する免疫応答の誘導
上に示した実施例で、細いゲージのマイクロカニューレを用いてモデル核酸ベースの化合物を皮膚に効果的に送達することができ、皮膚細胞による高いレベルの遺伝子発現がもたらされることが示されている。本発明の方法によるＤＮＡワクチンの送達の有用性を検討するために、ラットをＡ／ＰＲ／８／３４株からのインフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）をコードするプラスミドＤＮＡで免疫化した（プラスミドはＤｒ．Ｈａｒｒｉｅｔ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡにより提供された）。Ｂｒｏｗｎ−Ｎｏｒｗａｙラット（群当たりｎ＝３）を、実施例２に記載するようにＭＤＤ装置を用いたＩＤまたは従来の３０Ｇ針および１ｃｃ注射器を用いた四頭筋へのＩＭによりＰＢＳ溶液中のプラスミドＤＮＡ（５０μｌの容量でラット１匹当たり５０μｇが急速ボーラス注射により送達される）で３回（０、２１および４２日目）免疫化した。陰性対照として、ＤＮＡを無処置皮膚に局所的に適用した。血清を３、５、８および１１週目に収集し、インフルエンザ特異的抗体の存在についてＥＬＩＳＡにより分析した。簡単に述べると、マイクロタイターウエル（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を０．１μｇの全不活化ウイルス（Ａ／ＰＲ／８／３４、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＳＰＡＦＡＳ、Ｎｏｒｔｈ  Ｆｒａｎｋｌｉｎ、ＣＴ）で４℃で一夜被覆した。ＰＢＳ＋５％スキムミルク中３７℃で１時間ブロックした後、プレートを試験血清の連続希釈物と共に３７℃で１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ＩｇＧ、Ｈ＋Ｌ鎖（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）と共に３７℃でさらに３０分間インキュベートし、次いで、ＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて展開した。吸光度測定値（Ａ４５０）をＴｅｃａｎ  Ｓｕｎｒｉｓｅ（商標）プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、ＲＴＰ、ＮＣ）で読み取った。
【００６５】
結果（図５）は、添加アジュバントの非存在下での遺伝子インフルエンザワクチンの本発明の方法による送達により、強いインフルエンザ特異的血清抗体応答が誘導されることを示している。この応答の大きさは、すべての測定時点においてＩＭ注射により誘導された応答と同等であった。局所対照では検出可能な応答は認められなかった。したがって、本発明の方法による遺伝子ワクチンの送達は、通常のＩＭ注射経路により誘導されるものと少なくとも同程度の強さの免疫応答を誘導する。
【００６６】
アジュバント添加遺伝子ワクチンの本発明の方法による送達をさらに検討するために、上記のインフルエンザＨＡをコードするプラスミドＤＮＡを製造業者の手引書に従ってＭＰＬ＋ＴＤＭ  Ｒｉｂｉアジュバントシステム（ＲＩＢＩ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）を用いて調製した。上記のように、ラット（群当たりｎ＝３）を免疫化し、インフルエンザ特異的血清抗体について分析した。ＩＤ送達群における力価は、１回目および２回目免疫化後においてはＩＭと同等であった（３〜５週目、図６）。しかし、３回目の投与後には、ＩＤ誘導力価はＩＭ注射により誘導された対応する力価よりも有意に大きかった（ｐ＝０．０３、ｔ検定による）（図６）。１１週目には、平均ＩＤ誘導力価は、ＩＭ注射により達成されるわずか４，６００に比較して、４２，０００であった。局所対照は、インフルエンザ特異的応答を示さなかった。したがって、アジュバントの存在下での遺伝子ワクチンの本発明の方法による送達は、通常のＩＭ注射経路により誘導されるものよりも強い免疫応答を誘導する。
【実施例６】
【００６７】
ラットにおけるＩＤ送達後のインフルエンザＤＮＡ／ウイルス「初回抗原刺激−追加免疫」に対する免疫応答の誘導
ＨＩＶを含む多数の疾患に対する最近開発されたワクチン接種手法は、最初の「初回抗原刺激」免疫化と２回目の「追加免疫」で異なるワクチンのクラスを用いるいわゆる「初回抗原刺激−追加免疫」手法である（非特許文献１５）。例えば、プラスミドＤＮＡワクチンで初回抗原刺激した後、サブユニットタンパク質、不活化ウイルスまたはベクター化ＤＮＡ調製物で追加免疫した。これらのタイプのワクチン接種法の本発明の方法による送達を検討するために、実施例５の最初の実験をさらに６週間継続した。１１週目に、ＤＮＡで初回抗原刺激したラットに全不活化インフルエンザウイルスを追加免疫した（Ａ／ＰＲ／８／３４、急速ボーラス注射により５０μｌの容量のＰＢＳ中１００μｇ）。ウイルスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＳＰＡＦＡＳ（Ｎｏｒｔｈ  Ｆｒａｎｋｌｉｎ、ＣＴ）から入手した。インフルエンザ特異的血清抗体力価は、１３および１７週目に上記のようにＥＬＩＳＡにより測定した。ＩＤ送達およびＩＭ注射の両方により強い追加免疫効果が誘発された（図７）。１７週目の平均インフルエンザ特異的抗体力価は、両送達法で同等であり（力価＝５４０，０００）、単独局所送達後に認められた非常に弱い力価（力価＝３２００）よりも有意に大きかった。したがって、本発明の方法による送達は、「初回抗原刺激−追加免疫」免疫法に適しており、通常のＩＭ注射経路により誘導されたものと少なくとも同程度の強さの免疫応答を誘導する。
【００６８】
「初回抗原刺激−追加免疫」応答に対するアジュバントの効果を評価するために、実施例５に記載した第２の実験をさらに６週間継続した。１１週目に、ＤＮＡで初回抗原刺激したラットに全不活化インフルエンザウイルスを追加免疫した（Ａ／ＰＲ／８／３４、上記のように急速ボーラス注射により容量５０μｌ中１００μｇ）。インフルエンザ特異的血清抗体力価は、１３および１７週目に上記のようにＥＬＩＳＡにより測定した。ＩＤ送達およびＩＭ注射の両方により強い追加免疫効果が誘発された（図８）。ＩＤ送達群における平均力価は、ウイルス追加免疫後にＩＭ注射によるものよりも大きく、１３週目におけるＩＤ−ＭＤＤ（ＭＤＤ）平均力価は、ＩＭ注射での２４０，０００、単独局所適用での３，２００と比較して、５４０，０００であった。したがって、本発明の方法による送達は、アジュバントを含めた「初回抗原刺激−追加免疫」免疫法に適しており、通常のＩＭ注射経路により誘導されたものよりも強い免疫応答を誘導する。
【実施例７】
【００６９】
ラットにおけるＩＤ送達後のインフルエンザウイルスワクチンに対する免疫応答の誘導
本発明の方法による通常のワクチンの送達の有用性を検討するために、ラットをＩＤ送達、または標準針および注射器を用いた筋肉内（ＩＭ）注射により実施例６に記載したように不活化インフルエンザウイルス調製物で免疫化した。陰性対照として、ワクチン溶液を無処置皮膚に局所適用した。不活化インフルエンザウイルスの分子量が大きいため、受動局所吸収による有効な免疫化が妨げられる。上記のように、ワクチンの用量は、動物１匹当たり容量５０μｌ中１００μｇ総タンパク質であり、急速ボーラス注射（１分以内）により送達された。ラットを３回（０、２１および４２日目）免疫化し、２１、３５、５６日目に血清を収集し、上記のようにＥＬＩＳＡによりインフルエンザ特異的抗体について分析した。群当たりｎ＝４ラット。
【００７０】
図９に示す結果は、ＩＤ送達が強い抗原特異的免疫応答を誘導することを示している。２注射経路、ＩＭとＩＤにより同様なレベルの抗体が誘導された。ピーク幾何平均力価は、ＩＭ注射での１０２，４００に比較して、ＩＤ−ＭＤＤ（ＭＤＤ）群ではいくぶん高い１４７，２００であった。ワクチンの局所適用は、非常に弱い応答を刺激したにすぎなかった（最大平均力価＝５００）。したがって、高用量の通常のワクチンのＩＤ送達は、通常のＩＭ注射経路により誘導されたものと少なくとも同程度の強さの免疫応答を誘導する。
【実施例８】
【００７１】
ブタにおけるＩＤ送達後のインフルエンザワクチンに対する免疫応答の誘導
上記のように、ブタはヒト皮膚に極めてよく類似した魅力的な皮膚モデルを提示している。ワクチン送達におけるＩＤ送達装置を試験するために、ヨークシャーブタを上記のように不活化インフルエンザワクチンで免疫化し、ＩＤ送達とＩＭ注射とを比較した。ブタを０、２１および４９日目に免疫化し、１４、３６、４９および６０日目に上記のように血清を収集し、ＥＬＩＳＡによりインフルエンザ特異的抗体について分析した。ブタ特異的第２次抗体は、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＴＸ）から入手した。
【００７２】
結果（図１０）は、ＩＤ送達が、強い抗原特異的免疫応答を誘導することを示している。２注射経路、ＩＭとＩＤにより同様なレベルの抗体が誘導された。ピーク幾何平均力価は、ＩＭ注射での６６７に比較して、ＭＤＤ群でわずかに高い１，３３３であった。したがって、高用量の通常のワクチンのＩＤ送達は、通常のＩＭ注射経路により誘導されたものと少なくとも同程度の強さの免疫応答を誘導する。
【実施例９】
【００７３】
低用量のインフルエンザワクチンのＩＤ送達
実施例７では、ラットをＩＤ注射、または通常の針および注射器を用いたＩＭにより１００μｇの不活化インフルエンザウイルスで免疫化した。そのような高い用量では、最後の時点ではＩＤ誘導力価がＩＭ誘導力価よりもわずかに高かったが、両送達法は同様なレベルの血清抗体を誘導した。
【００７４】
送達の方法と用量レベルとの間の関係をさらに試験するために、上記のＩＤおよびＩＭ投与経路を用いて、ラットを動物当たり１μｇから０．０１μｇの範囲の低くした用量の不活化インフルエンザウイルスで免疫化した。ラットを３回（０、２１および４２日目）免疫化し、２１、３５、５６日目に血清を収集し、血清抗インフルエンザ抗体について分析した（群当たりｎ＝４ラット）。２１日目および３５日目に同様な傾向が観測されたが、図１１に示すデータは５６日目の力価を反映している。ＩＤ送達（ＭＤＤ）は、試験した３用量で大きさが有意には異ならない、有意な抗体応答をもたらした。すなわち、０．０１μｇ（１０ｎｇ）と同程度の低い用量の送達は、１００倍多いワクチン（１μｇ）を用いて観測される力価に匹敵する力価を誘導した。対照的に、ＩＭ用量を１μｇから０．１μｇに減量したとき、用量をさらに０．０１μｇに減量したときもまた、力価の有意な低下が認められた。さらに、ＩＤ送達により誘導された力価の変動はＩＭと比較してかなり低かった。特に、ＩＤ投与部位に目に見える副作用（皮膚における有害効果）は観測されなかった。
【００７５】
結果は、本発明の方法によるＩＤ送達はＩＭ注射と比較してワクチンの用量の有意な（少なくとも１００倍）減量を可能とすることを強く示している。ナノグラム量のワクチンを用いて有意な免疫応答が認められた。臨床段階で同様な利点が予想されよう。
【００７６】
本明細書に記載した結果は、ワクチンおよび遺伝物質のＩＤ注射は本発明の方法を再現性よく達成することができることを示している。この送達方法は、標準マントー方式注射またはＩＭよりも遂行するのが容易であり、一実施形態において、皮膚への貫通深さを制限し、制御することにより、侵襲性および疼痛性が少ない。さらに、この方法は、通常の針を用いるマントー方式注射よりも再現性のよいＩＤ送達を可能にし、上記のような結果として得られる利点を伴った皮膚細胞への標的設定の改善をもたらす。
【００７７】
さらに、この方法は、全不活化ウイルスワクチンおよびＤＮＡプラスミドと適合性があり、ウイルス粒子またはプラスミドＤＮＡがｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＤ送達に伴う比較的高い圧力でマイクロカニューレを通過するときに、ウイルス粒子またはプラスミドＤＮＡがせん断または分解される場合に起こるような生物学的有効性における関連した任意の低下がない。本明細書に詳述した結果は、より強い免疫応答が、ＩＤ送達により、特に低いワクチン用量で誘導され、したがって、ヒトにおける有意な用量の減量および混合ワクチン（combination vaccines）を潜在的に可能にすることを示している。
【００７８】
上に示した結果は、通常の針および注射器を用いる標準筋肉内（ＩＭ）注射と比較して、上記のような装置を用いたＩＤ送達による改善された免疫化を示している。用量減量試験（実施例９）は、ＩＤ送達がＩＭ注射で必要とされるワクチンよりも少なくとも１００倍少ないワクチンを用いてラットにおけるインフルエンザワクチンに対する血清抗体応答を誘導することを示している。臨床段階で適用可能ならば、そのような用量の減量は全世界で共通のインフルエンザワクチンの不足の問題の軽減または解消につながるであろう。さらに、そのような用量の減量の可能性は、単回投与量でより多数のワクチン抗原の送達を可能とし、したがって、混合ワクチンを可能とする。このアプローチは、防御免疫を誘導するために数種の遺伝的変異体／亜株で同時に免疫化する必要があると考えられるＨＩＶワクチンに特に適切なものである。
【００７９】
本発明の方法および装置を用いる免疫系の標的設定の改善により、他の種類の予防および治療ワクチン、免疫治療薬および細胞ベースのものについて同様の利点が予想される。
【００８０】
他の実施形態において、免疫学的または治療応答の改善をもたらすために、本発明のＩＤ送達を、伝統的な投与方法、例えば、ＩＰ、ＩＭ、鼻腔内若しくは他の粘膜経路、またはＳＱ注射、局所、または皮膚擦過法と組み合わせることは、本発明の範囲内である。これは、同じまたは異なるクラスのワクチンおよび／または治療剤、ならびに同時または逐次投与を含むであろう。
【００８１】
本明細書で引用したすべての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれている。本明細書における参考文献の考察はそれらの著者によって行われた主張を単に要約することを意図したものであり、どの参考文献も特許性に関連する従来技術を構成することについて承認を行わない。出願者らは、引用した参考文献の正確さおよび適切性を吟味する権利を保有する。
【００８２】
本明細書で例示し、考察した実施形態は、発明者らに知られている発明を行い、使用する最良の方法を当業者に教示することのみを意図したものであり、本発明の範囲を限定するものとみなすべきでない。本発明の典型的具体例としての実施形態は、上の教示事項に照らして当業者により了解されるように、本発明から逸脱することなく、修正または変更し、要素を加えまたは省略することができる。したがって、特許請求の範囲またはそれらの同等事項の範囲内で、本発明は、具体的に記載した以外の別の方法で実施することができることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】ホタルルシフェラーゼをコードするプラスミドＤＮＡの送達後のモルモット皮膚におけるリポーター遺伝子活性を示す。結果は、マントー法による皮内送達、本発明の送達方法、および剃毛した皮膚にプラスミドＤＮＡの局所適用を行った対照群について、相対光単位（ＲＬＵ）／ｍｇタンパク質として示す。
【図２】ホタルルシフェラーゼをコードするプラスミドＤＮＡの送達後のラット皮膚におけるリポーター遺伝子活性を示す。結果は、微小皮膚送達法（本発明の一実施形態、ＭＤＤ）による皮内送達、および無関係のプラスミドＤＮＡを注射した対照群について、ＲＬＵ／ｍｇタンパク質として示す。
【図３】β−ガラクトシダーゼをコードするプラスミドＤＮＡの送達後のブタ皮膚におけるリポーター遺伝子活性を示す。結果は、マントー法による、それぞれ１ｍｍおよび１．５ｍｍの深さへのＭＤＤ装置（３４ｇ）または３０ｇ針を用いた皮膚への垂直挿入によるＩＤ送達による皮内送達、および陰性対照について、ＲＬＵ／ｍｇタンパク質として示す。
【図４】リポータープラスミドＤＮＡのマントーＩＤおよびＭＤＤ送達後のブタの回収された皮膚部位における総タンパク質含量を示す。対照（「陰性」）は、無処理皮膚である。
【図５】添加アジュバントの非存在下でのインフルエンザウイルスヘマグルチニンをコードするプラスミドＤＮＡの送達後のラットにおけるインフルエンザ特異的血清抗体応答を示す。プラスミドＤＮＡは、ＭＤＤ装置を用いたＩＤ送達、または標準針および注射器を用いた筋肉内（ＩＭ）注射により投与した。「局所」は、該調製物を局所適用した対照群を示す。
【図６】アジュバントの存在下でのインフルエンザウイルスヘマグルチニンをコードするプラスミドＤＮＡの送達後のラットにおけるインフルエンザ特異的血清抗体応答を示す。プラスミドＤＮＡは、ＭＤＤ装置を用いたＩＤ送達により、または標準針および注射器を用いた筋肉内（ＩＭ）注射により投与した。「局所」は、該調製物を局所適用した対照群を示す。
【図７】添加アジュバントの非存在下でプラスミドＤＮＡで「初回抗原刺激」し、続いて添加アジュバントの非存在下で全不活化インフルエンザウイルスで「追加免疫」した後のラットにおけるインフルエンザ特異的血清抗体応答を示す。プラスミドＤＮＡまたは全不活化インフルエンザウイルスは、ＭＤＤ装置を用いたＩＤ送達、または標準針および注射器を用いた筋肉内（ＩＭ）注射により投与した。「局所」は、該調製物を局所適用した対照群を示す。
【図８】添加アジュバントの存在下でプラスミドＤＮＡで「初回抗原刺激」し、続いて添加アジュバントの非存在下で全不活化インフルエンザウイルスで「追加免疫」した後のラットにおけるインフルエンザ特異的血清抗体応答を示す。プラスミドＤＮＡまたは全不活化インフルエンザウイルスは、ＭＤＤ装置を用いたＩＤ送達、または標準針および注射器を用いた筋肉内（ＩＭ）注射により投与した。「局所」は、該調製物を局所適用した対照群を示す。
【図９】ＭＤＤ装置を用いたＩＤ送達、または標準針および注射器を用いた筋肉内（ＩＭ）注射により投与した全不活化インフルエンザウイルスに対するラットにおけるインフルエンザ特異的血清抗体応答を示す。「局所」は、該調製物を局所適用した対照群を示す。
【図１０】ＭＤＤ装置を用いたＩＤ送達、または標準針および注射器を用いた筋肉内（ＩＭ）注射により投与した全不活化インフルエンザウイルスに対するブタにおけるインフルエンザ特異的血清抗体応答を示す。
【図１１】ＭＤＤ装置を用いたＩＤ送達、または標準針および注射器を用いた筋肉内（ＩＭ）注射により投与した低い用量の全不活化インフルエンザウイルスに対するラットにおけるインフルエンザ特異的血清抗体応答を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004531578.tif 000060
2004531578.tif 000061
【国際調査報告】
2004531578.tif 000062