(57)【要約】本発明は、ビタミンＥ又はビタミンＥ誘導体又はビタミンＥ類似体並びにセレン又はセレン塩又はセレン誘導体を、複合又は非複合形態で使用する哺乳類の前立腺ガンの予防又は治療のための組成物及び方法を提供する。更に、本発明は、ビタミンＥ又はビタミンＥ誘導体又はビタミンＥ類似体並びにセレン又はセレン塩又はセレン誘導体を、複合又は非複合形態での使用それ自身、又は、p21及び／又はp27の細胞内のレベルを増加するための伝統的な治療法と組み合わせた、哺乳類の前立腺ガンの予防又は治療のための組成物及び方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンＥ、ビタミンＥ誘導体又はビタミンＥ類似体並びにセレン又はセレン塩又はセレン誘導体を、複合又は非複合形態で含むことを特徴とする、前立腺ガンの発生を予防し、又は前立腺ガンの治療を補助する組成物。
【請求項２】
ビタミンＥ又はビタミンＥ誘導体又はビタミンＥ類似体が、トコフェロール又はトコフェロール誘導体若しくは類似体、又はトコトリエノール又はその誘導体若しくは類似体、及びこれらの混合物の形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
セレン又はセレン塩又はセレン誘導体が、亜セレン酸塩、セレノメチオニン、セレニウムイースト、酸化セレン又はセレン酸及びこれらの混合物の形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
組成物が、経口的、非経口的、腹腔内、静脈内、直腸、胸膜内、くも膜下腔内、エアロゾルによる、又は経皮的な投与に適した形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
組成物が、ビタミンＥ又はビタミンＥ誘導体又はビタミンＥ類似体並びにセレン又はセレン塩又はセレン誘導体の混合物を組み合わせる剤形、又はビタミンＥ又はビタミンＥ誘導体又はビタミンＥ類似体並びにセレン又はセレン塩又はセレン誘導体が別々に投与され得る剤形である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、ビタミンＥ又はビタミンＥ誘導体又はビタミンＥ類似体並びにセレン又はセレン塩又はセレン誘導体を一緒に又は別々に含む形態で投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
経口投与形態が、食品添加物の形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
組成物が、注射可能な形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
被験者の哺乳類前立腺ガンを予防し又は治療する方法であって、そのような予防及び治療の必要がある被験者に、ビタミンＥ又はビタミンＥ誘導体又はビタミンＥ類似体並びにセレン又はセレン塩又はセレン誘導体を複合又は非複合形態で含む栄養サプリメント組成物の効果的量を投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
ビタミンＥ又はビタミンＥ誘導体又はビタミンＥ類似体が、トコフェロール又はトコフェロール誘導体若しくは類似体、又はトコトリエノール又はその誘導体若しくは類似体の形態である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記セレン又はセレン塩又はセレン誘導体が、亜セレン酸塩、セレノメチオニン、セレニウムイースト、酸化セレン又はセレン酸及びこれらの混合物の形態である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記投与される組成物が、経口的、非経口的、腹腔内、静脈内、直腸、胸膜内、くも膜下腔内、エアロゾルによる、又は経皮的な投与に適した形態である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記投与される組成物が、食品添加物の形態である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記投与される組成物が、注射可能な形態である、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
組成物が、ビタミンＥ又はビタミンＥ誘導体又はビタミンＥ類似体並びにセレン又はセレン塩又はセレン誘導体の混合物を含む剤形、又はビタミンＥ又はビタミンＥ誘導体又はビタミンＥ類似体並びにセレン又はセレン塩又はセレン誘導体が別々に投与され得る剤形である、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
投与が、ビタミンＥ又はビタミンＥ誘導体又はビタミンＥ類似体並びにセレン又はセレン塩又はセレン誘導体を一緒に又は別々に投与することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
ビタミンＥ、ビタミンＥ誘導体又はビタミンＥ類似体並びにセレン又はセレン塩又はセレン誘導体の組み合わせを、複合又は非複合形態で含み、p21及び／又はp27の細胞内のレベルを増加するのに効果的である、前立腺ガンの発生を予防し、又は前立腺ガンの治療を補助するのに有用な組成物。
【請求項１８】
ビタミンＥ、ビタミンＥ誘導体又はビタミンＥ類似体が、トコフェロール又はトコフェロール誘導体若しくは類似体、又はトコトリエノール又はその誘導体若しくは類似体、及びこれらの混合物の形態である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
セレン又はセレン塩又はセレン誘導体が、亜セレン酸塩、セレノメチオニン、セレニウムイースト、酸化セレン又はセレン酸及びこれらの混合物の形態である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
組成物が、経口的、非経口的、静脈内、腹腔内、直腸、胸膜内、くも膜下腔内、エアロゾルによる、又は経皮的な投与に適した形態である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２１】
組成物が、ビタミンＥ又はビタミンＥ誘導体又はビタミンＥ類似体並びにセレン又はセレン塩又はセレン誘導体の混合物を組み合わせる剤形、又はビタミンＥ又はビタミンＥ誘導体又はビタミンＥ類似体並びにセレン又はセレン塩又はセレン誘導体が別々に投与され得る剤形である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２２】
投与が、ビタミンＥ又はビタミンＥ誘導体又はビタミンＥ類似体並びにセレン又はセレン塩又はセレン誘導体を一緒に又は別々に投与することを含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２３】
前記組成物が、食品添加物の形態である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２４】
前記組成物が、注射可能な形態である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２５】
p21及び／又はp27の細胞内レベルを増加することによって被験者の哺乳類前立腺ガンを予防し又は治療する方法であって、そのような予防及び治療の必要がある被験者に、効果的な量の組成物を投与することを含み、前記組成物が、ビタミンＥ又はビタミンＥ誘導体又はビタミンＥ類似体並びにセレン又はセレン塩又はセレン誘導体の組み合わせを複合又は非複合形態で含み、前記組成物が、p21及び／又はp27の細胞内レベルを増加するのに効果的であることを特徴とする方法。
【請求項２６】
ビタミンＥ、ビタミンＥ誘導体又はビタミンＥ類似体が、トコフェロール又はトコフェロール誘導体若しくは類似体、又はトコトリエノール又はその誘導体若しくは類似体並びにその混合物の形態である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
セレン又はセレン塩又はセレン誘導体が、亜セレン酸塩、セレノメチオニン、セレニウムイースト、酸化セレン又はセレン酸及びこれらの混合物の形態である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
組成物が、経口的、非経口的、静脈内、腹腔内、直腸、胸膜内、くも膜下腔内、エアロゾルによる、又は経皮的な投与に適した形態である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
組成物が、ビタミンＥ又はビタミンＥ誘導体又はビタミンＥ類似体並びにセレン又はセレン塩又はセレン誘導体の混合物を組み合わせる剤形、又はビタミンＥ又はビタミンＥ誘導体又はビタミンＥ類似体並びにセレン又はセレン塩又はセレン誘導体が別々に投与され得る剤形である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
投与が、ビタミンＥ又はビタミンＥ誘導体又はビタミンＥ類似体並びにセレン又はセレン塩又はセレン誘導体を一緒に又は別々に投与することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記投与される組成物が、食品添加物の形態である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記投与される組成物が、注射可能な形態である、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
(本発明の分野)
本発明は、哺乳類の前立腺ガンの治療又は予防のための伝統的な治療法に対する方法及び補助又は捕捉組成物に関し、並びに、哺乳類における前立腺ガンの発生の予防に有用な方法及び組成物に関する。本発明の組成物は、ビタミンＥ又はビタミンＥ誘導体とセレンとの組み合わせで、複合若しくは非複合形態で、哺乳類前立腺ガンに予防及び治療的効果を提供する量で含有する。
【０００２】
(本発明の背景)
前立腺ガンは、哺乳類、特に北米のヒトの男性の間で最も一般的なガンであり、西部の国々において２番目に主要な男性のガン死の事例である。Parker SIら、"Cancer Statistics 1997" CA Cancer J Clin (1997) 47: 5-27を参照のこと。種々の要因、例えば、未知の病因学、不定な病理学、内分泌因子に対する複雑な関係、及び未分化発達は、この疾病の複雑さに寄与する。
免疫学的、臨床的及び研究室での研究からの証拠は、宿主抗酸化防御システムと食餌性抗酸化物との間の複雑な相互作用が、前立腺ガン並びにガンの他の形態の起源及び発達に関与し得るとの考えを支持する。例えば、抗酸化ビタミンＥの追加の消費は、前立腺ガンによる死亡率の約１／３の減少に結びつく。Fleshner NE "Vitamin E Inhibits the High-Fat Diet Promoted Growth of Established Human Prostate LNCaP Tumors in Nude Mice" J Urol (1999) 161: 1651-1654を参照のこと。考慮すべき興味は、さらに、ガン予防及び治療における微量成分の可能性ある役割において生み出される。ヒト環境における生物利用可能なセレンのレベルと、ガン死亡率との間の間接的相関関係もレポートされている。Hunter DJ, Morris JS, Stampfer MJら、"A Prospective Study of Selenium Status and Breast Cancer Risk" JAMA (1990) 264: 1128-1131；Van den Brandt PA, Goldbohn RA, Bode Pら、"A prospective Study on Toenail Selenium Levels and Risk of Gastrointestinal Cnacer"、J Nathl Cancer Inst (1993) 85: 224-229；Van den Brandt PA, Goldbohn RA, Bode Pら、"A prospective Study On Selenium Status And The Risk Of Lung Cancer"、Cancer Res (1993) 53: 4860-4865；Helzlsouer KJ, Comstock GW, Morris JSら、"Selenium, Lycopene, A-Tocopherol, B-Carotene, Retinol and Subsequent Bladder Cancer" Cancer Res (1989) 49: 6144-6148；Willett We, Polk BF, Morris JSら、"Prediagnostic Serum Selenium and Risk of Cancer" Lancet (1983) 2: 130-134；Levander OA, "Scientific Rationale for the 1989 Recommended Dietary Allowance for Selenium", Perspect Pract (1991) 91: 1572-1576を参照のこと。蓄積する証拠は、試験的な発ガンの多くのモデルにおいて、亜セレン酸ナトリウムを有する食餌の補充は、化学的発ガン物質誘導癌腫の発生率を減少することになる。Heinonen OPら、"Prostate Cancer and Supplementation with Alpha-Tocopherol and Beta-Carotene: Incidence and Mortality in a Controlled Trial" J Nathl Cancer Inst. (1998) 90: 440-446を参照のこと。
【０００３】
免疫学的なデータ及び先行調査は、従って、微量栄養素摂取及び食餌が、前立腺ガン発生に中心的役割を演ずることを示唆する。アンドロゲンは、さらに、前立腺ガン発生に寄与することが示されている。Ripple MOら、"Prooxidant-Antioxidant Shift Induced by Androgen Treatment of Human Prostate Carcinoma Cells"、J Natl Cancer Inst. (1997) 89: 40-48を参照のこと。食餌とアンドロゲンとのリンクは、酸化的ストレスにあるかもしれない。このプロセスは、発ガンを開始させ得る反応性酸素種の宿主によって引き起こされる。先行調査は、外来性のアンドロゲンが、ヒト前立腺ガン細胞株における酸化的ストレスを増加することを見出している。Fleshner, J Urol. (1995) 161: 1651-1654を参照のこと。
【０００４】
細胞サイクルクロックは、細胞の発達を、成長及び分化サイクルを介して調整する。従って、これは、細胞がその増殖を続けるか、又は中止して停止状態に入るかを決定する。従って、DNA複製及び有糸分裂は、それぞれSフェーズ-及びMフェーズ-特異的サイクリン依存タンパク質キナーゼ(CDK)の活性化によってコントロールされる。このCDKの触媒的なサブユニットは、これら特定の調節サブユニット、サイクリンと名付けられるものによって合成される場合にのみ活性である。このCDKは、種々の細胞プロセスを細胞内で適当な基質のリン酸化を通してコントロールする。Solomon MJ, "Activation of the Various Cyclin/cdk2 Proteins" Curr. Opin. Cell Biol. (1993) 5: 180-186を参照のこと。このサイクリンは、細胞サイクルの種々のフェーズの間、CDKを適当な基質に導き、結合し、方向付けし、それによってこれら基質がリン酸化される場所及び時期が決定される。Hartwell L、"Defects in a Cell Cycle Checkpoint May Be Responsible for the Genomic Instability of Cancer Cells" Cell (1992) 71: 543-546を参照のこと。他の重要な成分は、CDK阻害剤(CKI)であり、例えば、p21及びp27にあり、これは、特定のサイクリン-CDK複合体の活動をブロックする。これは、細胞増殖を抑制するので、これがG0フェーズと呼ばれる停止状態になるよう強制する。Sherr CJら、Genes Dev. (1999) 13: 1501-1502を参照のこと。
【０００５】
非コントロール細胞増殖は、ガンの特徴である。腫瘍細胞は、その細胞サイクルを直接制御する破損した遺伝子を含む又は取得する。他のタイプのガンのように、前立腺ガンは、細胞サイクルコントロールの損失を伴い、無秩序な細胞成長になる。これが起きる正確なメカニズムはまだわかっていない。La Thangue NB, "Introduction: Cell Cycle Regulation and Cancer," Seminars in Cancer Biol. (1995) 6: 61-62を参照のこと。細胞サイクル停止(arrest)は、CKIのp27及びp21によって媒介される。Tslhlias Jら、"Involvement of p27Kipl in G1Arrest by High-Dose 5α-Dihydrotestosterone in LNCaP Human Prostate Cancer Cells," Oncogenes (2000) 19: 670-679を参照のこと。
【０００６】
細胞サイクロコントロールの仕組みの基本は、基質を細胞サイクル特異的様式でリン酸化する触媒的セリン／スレオニンCDKサブユニットに複合する制御サイクリンサブユニットを含む。例えば、Morgan DO, "Cyclin-Dependent Kinases: Engines, Clocks and Microprocessors" Ann. Rev. Dev. Biol. (1997) 13: 261-291を参照のこと。G1制限点で／その近くのレイト(late)G1におけるサイクリンＥによる、及びG1-Sフェーズ転移でのサイクリンＡによるCDK2の活性化、及びG2/Mフェーズ転移でのCDK2のサイクリンＢ活性化は、特定の細胞サイクル制御チェックポイントでのこれらサイクリン-CDK複合体の介入を示唆する。即ち、p21、つまりサイクリン依存キナーゼ阻害剤は、細胞サイクルを、G1及び／又はG2において、キナーゼ活性を阻害することによって停止させ得ることが知られている。従って、p27は、多くの分裂及び成長阻害サイトキナーゼによって、及び接触阻害によって制御されている。Polyak Cら、"p27Kipl, a Cyclin-cdk Inhibitor, Links Transforming Growth Factor-β and Contact Inhibition to Cell Cycle Arrest," Genes Dev. (1994) 8: 9-22を参照のこと。成長停止は、増加したp27タンパク質レベルと常に関連するわけではないが、即ち、G1停止の重要な媒介物である。これは、細胞サイクルのG0及び早いG1フェーズの間に働き、サイクリンD1-CDK4及びサイクリンE-CDK2複合体を阻害するだからである。Pagano Mら、"Role of Ubiquitin-Proteasome Pathway in Regulating Abundance of the Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p27," Science (1995) 269: 682-685を参照のこと。
【０００７】
ビタミンＥ及びセレンの抗ガン効果が注目され及び研究されているが、これら２つの物質を使用して、哺乳類癌腫の予防及び／又は治療することは発表されていない。さらに、腫瘍の化学療法に利用できる他の薬剤、及び、前立腺ガンに対して存在する他の侵入性治療オプション、例えば、ガン性の前立腺の除去又は腫瘍を収縮させるようにデザインされた放射性種の配置がある一方、これは、患者に低毒性の伝統的な治療に対する、抗ガン剤として供給する補助剤又は補足剤として有用な組成物を提供するのにより望ましい。これとは別に、p21及び／又はp27のレベルを増加する組成物、並びに哺乳類の前立腺ガンを予防し及び治療するための他のCDK阻害剤を提供することが望ましい。
【０００８】
(発明の概要)
本発明の目的は、哺乳類の前立腺ガンを治療し又は予防するために使用され得る組成物及び方法を提供することにある。
更に、本発明の目的は、ビタミンＥ又はビタミンＥ誘導体又はビタミンＥ類似体並びにセレン又はセレン塩又はセレン誘導体を、複合又は非複合形態で含む組成物であって、この組成物が、特に哺乳類の前立腺ガンの予防又は治療に対して、強化された抗ガン特性を示すものを提供することにある。
他の本発明の目的は、哺乳類における前立腺ガンの発生の予防又は治療のための伝統的な治療に対する方法及び補助又は補足組成物を提供することにある。
更に、本発明の目的は、サイクリン-CDKタンパク質複合体の形成を、p21又はp27上方制御を介して阻害し、哺乳類前立腺ガンの予防及び治療をする方法及び組成物を提供することにある。
【０００９】
(本発明の詳細な説明)
本発明の方法は、ビタミンＥ又はビタミンＥ誘導体若しくは類似体と、セレン又はセレン塩並びにセレン誘導体を、複合又は非複合形態で含有する組成物の、消費者に対して低毒レベルで、哺乳類前立腺ガンと診断された哺乳類又はこのようなガンを予防したいと願う哺乳類に対して送達することに関する。これとは別に、本発明の方法は、サイクリン-CDKタンパク質複合体の形成を、p21又はp27上方制御を介して阻害し、哺乳類の前立腺ガンを予防及び治療する薬剤の混合物の組成物の送達に関する。
【００１０】
(ビタミンＥ及びセレンの抗ガン作用の実験室での研究及びメカニズム)
研究は、抗酸化剤様ビタミンＥ及び生物が利用可能なセレンが、ヒト前立腺ガン細胞株におけるG1/Sフェーズでの細胞サイクル停止を、CDK阻害剤の調節を介して引き起こすことによって、その効果を媒介しているかどうかを決定するために行われた。
【００１１】
(実験的方法)
２つの確立されたヒト前立腺ガン細胞株、LNCaP(アンドロゲン応答性)及びPC3(アンドロゲン非依存性)を、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ロックビル、メリーランド州(American Type Culture Collection, (Rockville, MD))から入手した。LNCaP細胞をRPMI 1640培地(ギブコBRL、グランドアイランド、ニューヨーク州(Gibco BRL, Grand Island, NY))に、１０％ウシ胎児血清(FBS)及び１００IU/mlペニシリン及び１００μg/mlストレプトマイシンを、３７℃、空気中５％ＣＯ2の加湿雰囲気中で補充して培養した。PC3細胞を１０％FBS及び抗生物質を含むDMEM/F12培地中で培養した。細胞培養の双方のセットを１０ｃｍ組織培養プレート中、８０％集密するまで成長させ、１：８に分けた。
LNCaP及びPC3細胞培養物の一つのセットをビタミンＥ［９５％エタノールで元に戻したα−トコフェロールスクシネート］で処理し、及び２０μg/mlの濃度で培養物に加えた。LNCaP及びPC3細胞培養物の第２のセットを、セレン［0.005NのHClで元に戻したL-セレノメチオニン］で処理し、及び３０μg/mlの濃度で培養物に加えた。コントロールは、ビヒクルだけを受け取った。処理を付着の４８時間後に開始した。実験計画は、培養中、フローサイトメトリー及びタンパク質分析のために回収する前、７２時間までであった。
【００１２】
細胞を１０ｍＭブロモデオキシウリジン(BrdU)で２時間、非同期的成長細胞に対するビタミンＥ又はセレンの前処理をして又はせずに、パルスラベルした。その後、細胞を収穫し、７０％エタノールで固定し、０．１％HClで処理し、及び１０分間９０℃で加熱してラベルしたDNAを曝露した。細胞を抗BrdU結合FITC(ベクトンディッキンソン(Becton Dickinson))で染色し、ヨウ化プロピジウムで対比染色した。細胞サイクル分析を、ベクトン−ディッキンソンFACScanで、Lysis IIソフトウエアを使用して行った。
【００１３】
その後、細胞を氷冷NP-40溶解緩衝液(０．１％NP-40、５０nmトリスｐH7.5、１５０mMのNaCl、１mMのフッ化フェニルメチルスルフォニル、及び０．０２mg/mlの各アプロチニン、ロイペプシン及びペプスタチン)中で溶解した。可溶化液を超音波処理し、遠心分離によって浄化した。タンパク質をブラッドフォード(Bradford)分析によって定量化し、及びレーン当たり２０〜１００μｇタンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS-PAGE)によって分離した。転移及びブロットを行い、タンパク質を電気化学ルミネッセンス(ECL)によって検出した。濃度測定を、分子力学イメーｘジングシステム(Molecular Dynamics Imaging system)及びイメージクワント(Image Quant)ソフトウエアを使用して行い、ウエスタンブロットで検出されたp27タンパク質の相対的な量を定量化した。サイクリンＥ関連タンパク質の免疫沈降−ウエスタンブロット分析(IP-Western)による検出のために、サイクリンＥを２００μｇのタンパク質可溶化液から免疫沈降し、複合体を分離し、ブロットし、及びブロットを、サイクリンＥ、CDK2、p21及びp27抗体と反応させた。p27の免疫消耗(immunodepletion)のため、p27を２００μｇのタンパク質可溶化液から連続的に免疫沈降し(３回)、その後、サイクリンＥをp27消耗可溶化液から免疫沈降した。免疫沈降性サイクリンＥタンパク質の量は、p27免疫消耗の前後でCDK2及びp27タンパク質と関連し、IP-ウエスタンブロットを使用して比較した。
【００１４】
免疫ブロット実験において使用される抗体は；シグマラボラトリーズ(Sigma Laboratories)からのβ−アクチンマウスモノクローナル；Ｅハーロウ(マスジェネラル、マサチューセッツ州(E Harlow(Mass General, MA))からのサイクリンＥマウスモノクローナルE172(免疫沈降用)及びE12(免疫ブロット用)；Ｓ．リード(ザスクリプスリサーチインスティテュート、カリフォルニア州)(S. Reed(The Scripps Research Institute, CA))から贈られたCDK2マウスモノクローナルPSTAIRE抗体；トランスダクションラボラトリーズ(レキシントン、ケンタッキー州)(Transduction Laboratories(Lexington, KY))からのp27マウスモノクローナル抗体；サンタクルズバイオテクノロジー、シーダーレーン、カリフォルニア州からのp21ラビットポリクローナル抗体、αBrdu-FITS結合体である。
【００１５】
(ビタミンＥが引き起こすLNCaPにおけるG1停止及びPC3におけるG2/M)
この実験結果は、３／４の細胞培地において細胞サイクル停止を生じた。非同期的成長LNCaP及びPC3細胞をビタミンＥで７２時間まで処理すると、LNCaPのG1停止及びPC3のG2/M停止を、フローサイトメトリー研究からのDNA含量ヒストグラムによって示されたような処理の後、２４時間の早期で引き起こした。ビタミンＥの処理の２４〜７２時間、G2/Mフェーズにおける著しく増加した細胞個体数は、PC3で観察されるようなSフェーズにおける減少した細胞数を伴う。２４時間後、Sフェーズにおける細胞のパーセント減少は、LNCaP及びPC3において、それぞれ、４９．５％(図１ａ)及び３７．３％(図１ｂ)である。細胞停止は、ビタミンＥを補充した培地中で７２時間持続し、Sフェーズの細胞を、LNCaP及びPC3において、それぞれ最大６９．６％及び９５％まで減少した(表１)。
これらの形態学的な外見から見られるような細胞障害性は存在しなかった。ビヒクルのみで処理されたコントロールにおいて、成長停止は観察されなかった。
表１
2004527526.tif 000002
【００１６】
(ビタミンＥ誘導細胞停止の間のp21及びp27の変化)
p21、つまりサイクリン依存キナーゼ阻害剤は、G2/Mフェーズ停止に含まれるようになることが知られている。フローサイトメトリーデータ(図１ｂ)は、ビタミンＥは、双方の細胞株を停止するが、これは、PC3のG2/Mフェーズでそのようになることを示す。従って、p21も、前立腺ガン細胞成長のビタミンＥ誘導阻害に関係するか否かをさらに調査するため、p21レベルをLNCaP及びPC3の細胞の双方において試験し、続いてビタミンＥに暴露した。LNCaPにおけるp21のレベルの重要な変化はないが(図２ａ)、p21レベルは、PC3においてかなり上方制御された(図２ｂ)。P21のレベルにおけるこの上昇は、処理の２４時間の早期に見られた。
サイクリンE/CDK2活性の阻害は、ビタミンＥで処理した後、２４時間以内に観察された。P27における増加がサイクリンE/cdk2をターゲットし、及び細胞サイクル停止を誘導するのに十分か否かを測定するために、p27を、３つの連続した免疫沈降によって、コントロール及びビタミンＥで処理したLNCaP細胞可溶化液から免疫消耗した。サイクリンＥ免疫複合体をp27免疫消耗の前及び後に試験した。P27免疫消耗は、サイクリンE及びcdk2タンパク質における減少を引き起こした(図５)。これは、細胞サイクルのG1フェーズにおける、細胞の実質的な割合を示す。
【００１７】
LNCaP及びPC3細胞株は、特徴的なベル型成長曲線をビタミンＥに対して示す。(図６ａ及び６ｂ)。本研究は、p27の増加したレベル及びサイクリンE/cdk2のその結合並びに阻害は、ビタミンＥに対するLNCaP細胞のG1停止に寄与することを示唆する。サイクリンE/CDK2の阻害のメカニズムを調べるために、これら複合体をサイクリンＥの免疫沈降によって試験し、その後、ウエスタンブロッティングによって関連タンパク質を検出した(図３ａ及び４ａ)。ビタミンＥで処理した細胞培養において、サイクリンＥ関連p27のLNCaP中の量は、濃度測定によって３〜４倍に増加し(図３ｂ)、それにつれて細胞がG1停止に入った。類似の増加がPC3で見られ、及びp27の検出可能なレベルが処理後４８時間で見られた(図４ｂ)。報告は、そのようなp27における増加は、サイクリンE/CDK2を飽和することで示されることを示唆する。
【００１８】
（セレンが引き起こす、PC3に影響なきLNCaPのG1停止）
非同期的成長LNCaP及びPC3細胞を３０μｇ／ｍｌのセレンで７２時間まで処理すると、LNCaPの停止を、フローサイトメトリー研究からのDNA含量ヒストグラムによって証明されたような処理の後、２４時間の早期で引き起こした(図7a)。Sフェーズにおける細胞のパーセント減少は、２４時間の処理によって５８．１％であった。細胞停止は、セレンで補充された培地中で７２時間持続し、Sフェーズの細胞を最大８０．３％まで減少した (表２)。その形態学的な外見に見られるような細胞障害性はなかった。ビヒクルのみで処理したコントロールにおいて、成長停止は観察されなかった。対照的に、PC3の処理は、Sフェーズの細胞のメンバーにおいて、７２時間の処理後であっても重要な変化を示さず、従って、成長停止がない(８．４％)ことを示す(図７ｂ)(表２)。
表２
2004527526.tif 000003
【００１９】
(セレン誘導細胞停止の間のp21及びp27レベルの変化)
p21、つまりサイクリン依存キナーゼ阻害剤は、G2/Mフェーズ停止に含まれるようになることが知られている。G2/Mフェーズにおいて細胞の数の倍増があるので、本研究は、p21も、前立腺ガン細胞成長のセレン誘導阻害に関係するか否かを調査する。p21レベルをLNCaP及びPC3の細胞の双方において試験し、続いてセレンに暴露した。p21レベルは、LNCaPにおいてかなり上方制御された(図８ａ)。p21のレベルの上昇は、処理の２４時間の早期に見られた。セレンで処理されたPC3細胞中のp21のレベルにおいて変化はなかった(図８ｂ)。
サイクリンE/cdk2活性の阻害は、LNCaP及びPC3において、セレン処理後２４時間以内に観察された。サイクリンE/cdk2の阻害のメカニズムを評価するために、これらの複合体をサイクリンＥの免疫沈降、続いてウエスタンブロッティングによって試験し、関連するタンパク質を検出した（図９及び図１０）。LNCaPにおけるサイクリンＥ関連ｐ２７の量が、濃度計で測定して25％増加し(図９ｂ)、これにつれて細胞はG1停止に入った。対照的に、セレンで処理されたPC3細胞は、LNCaPとは、サイクリンＥのレベルが、７２時間まで増加する点において大きく異なる挙動を示した。
【００２０】
結果は、ビタミンＥとセレン処理細胞培養とでは、異なっていた。これらの培養において、LNCaP中のサイクリンＥ関連ｐ２７の量が、濃度計で測定して２５％増加すると、細胞がG1停止に入った。対照的に、サイクリンＥのレベルは、PC3細胞培養において、７２時間まで増加した。PC3細胞培養は、処理期間の終わりまで、p27の検出可能レベルを示さないが、SDS-PAGE上のCDK2の２つの異なるバンドは、７２時間まででのみ見られた。
従って、増加したp21及びp27、及びこれらサイクリンＥ/CDK2の結合及び阻害は、再生前立腺組織が分化を起こすにつれ、細胞増殖の阻害において役割を果たすことが想定される。
従って、研究は、p27の増加したレベルが、ビタミンＥに対応してLNCaPヒト前立腺ガン細胞のG1停止に寄与し、及び、p21の増加したレベルは、ビタミンＥに反応してPC3前立腺ガン細胞のG2/M停止に寄与することを示唆する。この２つの細胞株におけるセレンの抗増殖効果は、異なっており：アンドロゲン依存性LNCaPのSフェーズにおけるｐ２１の増加したレベルに起因する顕著な減少と比べて、アンドロゲン非依存性PC3において成長抑制は存在しない。これは、セレンは、この効果をアンドロゲンレセプターを通して媒介し、細胞増殖速度の為ではないという事実に起因し得る。アンドロゲンレセプターが、さらに細胞サイクル気孔の成分に直接結合するか否か、及びどうやってそのような相互作用が前立腺ガンにおけるレセプターのトランス活性的活性を調節できるのかについてほとんど知られていないが、エストロゲン及びアンドロゲンは、CDKの活性を、サイクリン又はCDK阻害剤の発現を調節することによって制御し、これによって細胞サイクルのG1-S転移を通した進行を促進する。
【００２１】
（ビタミンＥ及びセレンを使用する向上した効果の証明）
図１１及び図１２は、ビタミンＥ及びセレンを組み合わせて使用する相乗的な細胞サイクル効果を示す。LNCaP細胞をビタミンＥ及びセレンの組み合わせで処理した場合、細胞サイクルをいずれかの剤のみよりも有意に停止した。４８時間及び７２時間において、Ｓフェーズは、それぞれ４％及び１％に減少し、同時にG1及びG2/M成分において増加した。これは、Ｓフェーズで、２４、４８及び７２時間において、コントロールと比べて、それぞれ６３．１、８４．２および９４．７％の減少になる(表３)。このデータは、これらの薬剤が作用することによる抗ガン特性は十分に異なるので、双方が細胞にあれば相乗効果は実現されるを示唆する。
表３
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【００２２】
ビタミンＥは、穀物及び葉菜中に見られる脂溶性ビタミンであり、これは、ここでリストした抗ガン特性に加え、さらに細胞膜のような部位における不飽和脂肪酸の酸化を妨げ、それによって、その構造を維持する一助となる。これは、α−トコフェロール又はα−トコフェロールエステル、例えば、コハク酸トコフェロールのいずれかとして摂取されてもよい。セレンは、セレン酸ナトリウム又はセレノメチオニンとしての形態で摂取されてもよい微量元素である。
【００２３】
組成物は、経口的に、カプセル、食品添加物として、又は双方の成分が豊富な食事として摂取されてもよい。これとは別に、これら抗ガン剤は、皮下注射によって血流中に導入されてもよい。
組成物の成分は、一緒に又は別々に投与され得る。組成物の投与は、非経口的、経口的、静脈内、直腸、胸膜内、くも膜下腔内、腹腔内、エアロゾルによる、又は経皮的な投与で、所望の予防的又は治療的効果を達成してもよい。経口的に投与する場合、組成物は、タブレット(単数又は複数、被覆又は非被覆)、カプセル、又は糖衣錠の形であってもよい。これら経口製剤は、固体賦形剤、例えば、ラクトース、スクロース、デンプン、微結晶性セルロース、マグネシウムステレート、又はタルクと混合されてもよい。非経口的投与が示されてもよい場合、薬剤の水性溶液又は油性製剤を使用してもよい。水性溶液は、水、生理食塩水、またはリンガー液中、緩衝液とともに又はなしで調製され得る。油性製剤は、例えば、天然油(ピーナッツオイル又はオリーブオイル)中、又はベンジルベンゾエート中で製造されてもよい。
【００２４】
投与される実際の投与量は、身体的及び生理的要因、例えば、使用する具体的な化合物の活性；年齢、体重、身体全体の健康(general health)、食餌、投与時間、投与ルート、排泄率、可能性ある薬の組み合わせ、及び患者又は消費者のコンディションの特発性並びに重大性によって決定され得る。発明が関連する化合物に対する臨床的に安全で効果的な投与量は、当業界の行政当局によって要求されるような臨床試験によって決定されるだろう。
さらに、p21及びp27の細胞内のレベルを増加し、それによって、サイクリンCDK複合体の阻害を増加する、ヒト消費に対して安全な他の化学的化合物は、抗ガン剤として使用され得る。
ビタミンＥは単一の構成要素ではない。トコフェロール及びトコトリエノールと呼ばれる関連化合物の群を記述する語である。Brigelius-Flohe R, Traber MG, "Vitamin E: Function and Metabolism", FASEB (1999) 13:1145-1155を参照のこと。４つのトコフェロールと４つのトコトリエノール：それぞれα、β、γ、及びδがある(図１３)。α−トコフェロールは、ビタミンＥの最も大量の天然形態であり、ほとんどの哺乳類組織においてトコフェロールの約９０％を示す。最も高い生物学的活性を有し及びヒトにおけるビタミンＥ欠乏症を覆す。Traber MG, Arai H, "Molecular Mechanisms of Vitamin E Transport," Annu Rev Nutr (1999) 19:343-55を参照のこと。
【００２５】
トコフェロールの群には、その立体特異性を決定する３つのキラル中心がある。天然形態の(主に植物由来の)α−トコフェロールは、もっぱら全て右旋性(RRR)異性体である。ビタミンＥサプリメントは、しかしながら、天然のRRR(d-α−トコフェロール)又は合成のビタミンＥのいずれかを含み得る。合成形態のビタミンＥは、オールラック(all rac)α−トコフェロール(又は、dl−α−トコフェロール)としても知られ、全部で８つの可能性ある立体異性体を含む。Brigelius-Flohe R, Traber MG, "Vitamin E: Function and Metabolism", FASEB (1999) 13:1145-1155を参照のこと。３つの化合物の生物活性は、同一ではない。一般的原則として、合成dl−α−トコフェロールを標準として使用すると、ｄ− α−トコフェロール(天然形態)は、その生物活性の１．４９倍を有する。Pryor WA, "Vitamin E and Heart Disease: Basic Science to Clinical Intervention Trials," Free Radic Biol Med (2000年１月１日) 28(1):141-64を参照のこと。
【００２６】
市場で入手可能なビタミンＥは、エステル化及び非エステル化形態のいずれかをとる。天然ビタミンＥのすべてのエステル化形態は、類似の生物活性を有する。ミリグラムから国際単位への変換は、ビタミンＥの製剤による。一般に、１IUは、１ｍｇのdl-α−トコフェロールアセテート(即ち、合成形態)の活性に等しい。以下を含む、種々の形態のビタミンＥの生物活性におけるバリエーションを説明する種々の理由が存在する：(１)異性体それ自身の異なる生物学的な活性；Brigelius-Flohe R, Traber MG, "Vitamin E: Function and Metabolism", FASEB (1999) 13:1145-1155を参照のこと；(２)輸送における異なる速度及び方法；(３)RRR-α−トコフェロールに対する特定の輸送メカニズムの存在；Traber MG, Arai H, "Molecular Mechanisms of Vitamin E Transport," Annu Rev Nutr (1999) 19:343-55を参照のこと；及び(４)レセプターを有する種々の異性体の分子メカニズム；Traber MG, Arai H, "Molecular Mechanisms of Vitamin E Transport," Annu Rev Nutr (1999) 19:343-55を参照のこと。
ビタミンＥは、食品又は栄養サプリメントのいずれかを経由して経口的に摂取される。ビタミンＥの良好な食餌源は、以下：アボカド、ナッツ、卵、ピーナッツ、バター、大豆及びインスタント穀物朝食シリアルを含む、植物由来の油に富む食品を示す傾向にある。食用油は、食餌中のビタミンＥの最大の源である傾向にある。Rao AV, Fleshner N, Agarwal S. Rao AV, Fleshner N, Agarwal S., Nutr Cancer (1999) 33(2):159-64を参照のこと。
【００２７】
ビタミンＥの推奨される毎日の許容度は、１０mg／日である。この量は、健康な食餌を消費する人々の食餌源によって通常達成される。しかしながら、食餌だけでは、慢性病を予防するために要求される量を供給しないだろう。これは、もし低脂肪食餌プランが望まれる場合は特にあてはまる。ビタミンＥが豊富な食事は、問題を引き起こす。ビタミンＥは、脂溶性であるため、脂肪中に見出されるからである。そこで、理想的に、ビタミンＥ摂取の増加は、補充を介して最も良く達成される。
一旦摂取されると、ビタミンＥは、腸リンパ腺を経由して、中鎖脂肪酸と共に吸収される。その後、カイロミクロン中に充填され、肝臓に輸送される。一旦肝臓を通過すると、α−トコフェロールが血漿中に優先的に分泌されるようになる。α−トコフェロール輸送タンパク質(α−ＴＴＰ)は、特定の肝臓タンパク質であり、この優先度の原因となる。Azzi A, Breyer I, Feher M, Pastori M, Ricciarelli R, Spycher S, Staffieri M, Stocker A, Zimmer S, Zingg JM, "Specific Cellular Responses to Alpha-Tocopherol," J Nutr (2000年７月) 130(7):1649-52を参照のこと。β−、δ−及びγ−トコフェロール形態は、胆汁中にほとんど分泌され、便を介して排泄される。ビタミンＥの血漿レベルは、８０μＭのレベルで飽和性になり；８０μＭを超えるレベルは、ビタミンＥ大量投与では達成できない。１日約800IUは、血液中の飽和レベルを達成するために要求される。Brigelius-Flohe R, Traber MG, "Vitamin E Function and Metabolism", FASEB (1999) 13:1145-1155を参照のこと。
【００２８】
特に定義しない限り、ここで使用するすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。記載されたものと類似の又は均等な、すべての方法及び材料は、本発明を試験の実行に使用され得、好ましい方法及び材料は、ここで記述される。本発明で参照したすべての刊行物及び特許文献は、その全てをここで参考として取り入れ、各及びすべての刊行物及び特許文献を、そっくりそのまま参考として取り入れることと同様とする。
本発明は、本発明の一つの様相の説明を意図する全ての記載された態様によってその範囲を限定されるものではなく、本発明の範囲と機能的に均等なすべての方法によって限定されるものでもない。確かに、ここで示しかつ記載したものに加え、本発明の種々の改良は、当業者が上記記載から明らかにするだろう。このような改良は、添付した特許請求の範囲内に含まれることを意図するものである。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１ａ−１ｂ】２０μｇ／ｍｌのビタミンＥで処理されたLNCaP(a)及びPC3(b)のFACS分析：細胞を、ビタミンＥを培地に添加後、一定の時間間隔でFACS分析のために収穫し準備した。G1停止は、LNCaPで見られ、G2/M停止は、PC3で見られた。
【図２ａ−２ｂ】ビタミンＥによる停止の間の細胞サイクル制御因子：細胞を、ビタミンＥを培地に添加した後に表示した時間間隔で収穫した。可溶化液をSDS-PAGE(a) LNCaP(b) PC3を使用して調製し、溶解した。タンパク質を指示抗体でイムノブロットすることによって決定した。
【図３ａ−３ｂ】(a)サイクリンＥ免疫複合体(LNCaP)：細胞を種々の時間間隔で、ビタミンＥを培地に添加した後に収穫した。サイクリンＥを免疫沈降し、SDS-PAGE及びイムノブロットによって溶解した複合体を抗体と反応させて関連タンパク質を検出した。(b)サイクリンＥ関連p27を上記(a)のブロットから濃度測定によって定量した。LNCaP細胞は、サイクリンＥ結合p27の３倍増加を示した。
【図４ａ−４ｂ】(a)サイクリンＥ免疫複合体(PC3)：細胞を間隔を置いてビタミンＥを培地に添加した後に回収した。サイクリンＥを免疫沈降し、SDS-PAGE及びイムノブロットによって溶解した複合体を抗体と反応させて関連タンパク質を検出した。(b)サイクリンＥ関連p27を上記(a)のブロットから濃度測定によって定量した。PC3細胞は、サイクリンＥ結合p27の６倍増加を示した。
【図５】ビタミンＥが、ターゲットサイクリンＥ/cdk2を飽和するp27のレベルを増加する：ｐ２７を、４８時間で収集したLNCaP細胞可溶化液から連続的に免疫消耗(immunodeplete)し、ここで、最大の阻害がビタミンＥの添加の後に観察された。サイクリンＥ関連タンパク質を０〜４８時間の試料からのp27免疫消耗の前及び後に評価した。
【図６】(a)LANCaP及びPC3の非同期的成長におけるBrdU及びPIの取り込みを示すドットプロット。(b)ビタミンＥ20μｇ／ｍｌで７２時間処理した後のDNA合成の停止を示す減少したBrdU取り込み。
【図７ａ−７ｂ】３０μｇのセレンで処理したLNCaP(a)及びPC3(b)のFACS分析：細胞を、FACS分析のために、種々の時間間隔で、セレンを培地に添加した後に収穫し及び準備した。G1停止は、LNCaP中で見られた。
【図８ａ−８ｂ】セレンによって停止している間の細胞サイクル制御因子：細胞を、表示した時間間隔で、セレンを培地に添加した後に収穫した。可溶化液をSDS-PAGE(a) LNCaP(b) PC3を使用して調製し、溶解した。タンパク質を指示抗体でイムノブロットすることによって決定した。
【図９ａ−９ｂ】(a)サイクリンＥ免疫複合体(LNCaP)：細胞を、種々の時間間隔で、セレンを培地に添加した後に回収した。サイクリンＥを免疫沈降し、SDS-PAGE及びイムノブロットによって溶解した複合体を抗体と反応させて関連タンパク質を検出した。(b)サイクリンＥ関連p27を上記(a)のブロットから濃度測定によって定量した。LNCaP細胞は、サイクリンＥ結合p27の増加を示した。
【図１０ａ−１０ｂ】(a)サイクリンＥ免疫複合体(PC3)：細胞を種々の時間間隔をおいてセレンを培地に添加した後に回収した。サイクリンＥを免疫沈降し、SDS-PAGE及びイムノブロットによって溶解した複合体を抗体と反応させて関連タンパク質を検出した。(b)サイクリンＥ関連p27を上記(a)のブロットから濃度測定によって定量した。PC3細胞は、処理後７２時間まで、サイクリンＥ結合p27の検出可能なレベルを示さなかった。
【図１１】２０μｇ／ｍｌのビタミンＥ及び３０μｇ／ｍｌのセレンで処理したLNCaP細胞のFACS分析：細胞を、FACS分析のために、種々の時間間隔で、微量栄養素を培地に添加した後に収穫し及び準備した。相乗効果は、７２時間でバーチャル細胞サイクル停止を示した。
【図１２】LNCaP細胞中のビタミンＥ及びセレンの組み合わせによる停止中の細胞サイクル制御因子：細胞を、種々の時間間隔で、曝露した後に収穫した。可溶化液をSDS-PAGEによって調製し、溶解した。タンパク質を指示抗体でイムノブロットすることによって測定した。p27上方制御が示された。
【図１３】例証となるビタミンＥ誘導体の化学構造を示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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