(57)【要約】カルシニューリンまたはそのサブユニットのイソ型および／またはスプライスバリアントの検出方法が確立される。本発明の方法は、カルシニューリンの様々なイソ型を区別するために特に有用である。ここで、哺乳動物組織の核酸のポリメラーゼチェーン反応が行われ、対応する産物が評価される。逆転写ポリメラーゼチェーン反応が特に好ましい。ポリメラーゼチェーン反応のために、カルシニューリンのイソ型および／またはスプライスバリアントのためのプライマーが使用される。好ましい態様において、触媒サブユニットカルシニューリンＡのイソ型および／またはスプライスバリアントが検出される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物組織の核酸のＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン反応）、特にＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）を行うこと、および、ＰＣＲ産物を評価することを特徴とする、カルシニューリンまたはそのサブユニットのイソ型および／またはスプライスバリアントの検出方法。
【請求項２】
イソ型および／またはスプライスバリアントのためのプライマーが、ＰＣＲのために使用されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
触媒サブユニットカルシニューリン−Ａ（ＣＮ−Ａ）のイソ型および／またはスプライスバリアントが検出されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
イソ型ＣＮ−Ａα、ＣＮ−Ａβ、および／もしくはＣＮ−Ａγ、ならびに／または、それらのスプライスバリアントが検出されることを特徴とする、請求項１〜３の１項に記載の方法。
【請求項５】
前記プライマーが、
【化１】
2004537309.tif 000007
のためのものであることを特徴とする、請求項２〜４の１項に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物組織が、神経組織、特に中枢神経組織、好ましくは脳組織であることを特徴とする、請求項１〜５の１項に記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳動物組織が、心組織であることを特徴とする、請求項１〜５の１項に記載の方法。
【請求項８】
ＰＣＲ産物が分離され、および／または、特に染色によって、好ましくは臭化エチジウム染色によって、可視化することを特徴とする、請求項１〜７の１項に記載の方法。
【請求項９】
評価が、内部標準、特にアクチンとの比較によって行われることを特徴とする、請求項１〜８の１項に記載の方法。
【請求項１０】
ＰＣＲ産物が、少なくとも部分的に配列決定されることを特徴とする、請求項１〜９の１項に記載の方法。
【請求項１１】
以下の配列（配列番号１）を有するＰＣＲのためのプライマー。
【化２】
2004537309.tif 000008
【請求項１２】
以下の配列（配列番号２）を有するＰＣＲのためのプライマー。
【化３】
2004537309.tif 000009
【請求項１３】
以下の配列（配列番号３）を有するＰＣＲのためのプライマー。
【化４】
2004537309.tif 000010
【請求項１４】
以下の配列（配列番号４）を有するＰＣＲのためのプライマー。
【化５】
2004537309.tif 000011
【請求項１５】
以下の配列（配列番号５）を有するＰＣＲのためのプライマー。
【化６】
2004537309.tif 000012
【請求項１６】
特に、請求項１〜１０の１項に記載の方法を行うためのキットであって、
−カルシニューリンのサブユニット、特に触媒サブユニットのイソ型および／またはスプライスバリアントのためのプライマー、ならびに、好ましくは、
−ＲＮＡの抽出のための試薬、および／または、
−ｃＤＮＡを作るためのプライマー、および／または、
−内部標準、特にアクチンのためのプライマー、および／または、
−ＰＣＲを行うための試薬、
を含むことを特徴とするキット。
【請求項１７】
請求項１１〜１５に記載のプライマーを少なくとも１つ含むことを特徴とする、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
カルシニューリンまたはそのサブユニットのイソ型および／またはスプライスバリアントの検出方法のための、請求項１１〜１５の１項に記載の少なくとも１つのプライマーの使用。
【請求項１９】
前記プライマーがＤＮＡチップ上に配置されることを特徴とする、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
カルシニューリンまたはそのサブユニットのイソ型および／またはスプライスバリアントの検出方法のための、請求項１１〜１５の１項に記載の少なくとも１つのプライマーを使用するポリメラーゼチェーン反応から得られる少なくとも１つのＰＣＲ産物の使用。
【請求項２１】
前記ＰＣＲ産物がＤＮＡチップ上に配置されることを特徴とする、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
哺乳動物組織の核酸のＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン反応）、特にＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）が行われること、および、ＰＣＲ産物が評価されることを特徴とする、カルシニューリンが関連する病気の診断および／または潜在的な病気の早期認識のための方法。
【請求項２３】
病気が心疾患、てんかん、および／または神経変性病であることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項２〜１０の１項に記載の少なくとも１つの方法が行われることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルシニューリンイソ型および／またはそのスプライスバリアント(splice variants)の検出および分析方法、ならびに、診断方法に関する。
【０００２】
カルシニューリン(E.C 3.1.3.16)は、セリン／スレオニンホスホプロテインホスファターゼ(phospo-protein phosphatase)であり、触媒サブユニット（カルシニューリンＡ）と制御サブユニット（カルシニューリンＢ）とからなる。触媒サブユニットは、約６０、制御サブユニットは、約１８ｋＤａである。カルシニューリンは、カルシウムおよびカルモデュリンの制御下にあることが知られている唯一のプロテインホスファターゼである。酵素活性のためには、カルシウムとカルモデュリンとの結合が必要である。カルモデュリンは触媒サブユニットと結合するのに対し、制御サブユニットは、４つのカルシウム結合部位を有する。
【０００３】
カルシニューリンは、様々な文献において論じられている。例えば、カルシニューリンは、神経シグナル経路と関連付けられているが（リー(Klee)ら、1988；ジャケル(Jakel)、1997）、神経機能はほとんど理解されていない（グェリニ(Guerini)、1997）。更に、カルシニューリンは、免疫抑制との関連で議論されており、そこでは、カルシニューリンは、Ｔ細胞応答において、転写因子ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因子；Nuclear factor of activated T-cells）を介して作用する。
【０００４】
これらの例に加えて、カルシニューリンが様々な病気と関連していることが知られている。よって、心不全(例えば、フォース(Force)ら、1999；イズモ(Izumo)およびアオキ(Aoki)、1998；リム(Lim)およびモルケンチン(Molkentin)、1999)、および卒中(モリオカ(Morioka)ら、1999)において、カルシニューリンが重要な役割を果たすことが示されている。更に、カルシニューリンは、筋萎縮性側索硬化症(フェリ(Ferri)ら、2000)、骨格筋疾病(シン(Chin)ら、1998)、およびてんかん(リー(Lie)ら、1998)の発生と関連付けられている。
【０００５】
前述のように、カルシニューリンは、２つのサブユニットによって形成されている。両サブユニット、触媒サブユニット（カルシニューリンＡ）および制御サブユニット（カルシニューリンＢ）は、異なる遺伝子によってコードされる異なるイソ型において生じる。哺乳動物では、触媒サブユニットに対する３つの異なる遺伝子（Ａ−α、Ａ−β、Ａ−γ）が特徴付けられており、それらはそれぞれ、選択的スプライシングを経て更なる変異体をもたらし得る。特に、これらのイソ型は、上記の病気と関連付けられる。しかし、現在まで、前記病気の進行および持続における異なるイソ型の特異的な役割は知られていない。いずれにせよ、カルシニューリンイソ型の検出および分析は、例えば、異なる心疾患、てんかん、および神経変性病の診断のための非常に有用なターゲットである。更に、カルシニューリンイソ型のための信頼できる検出および分析方法は、これらの分野および他の分野における更なる研究のための必要条件(prerequisite)である。また、例えば、卒中および軽症の(minor)心臓麻痺は、初期には気付かないことがあるので、バイオマーカーは、適切な時期に治療を開始し、かつ、病気の予後を評価するためにも、非常に重要である。
【０００６】
カルシニューリンイソ型の検出のための現行の方法は、免疫ブロッティング技術に基づいている。これらの方法は、時間も費用もかかるため、研究、および、特に診断のためにはあまり適当ではない。そこで、本発明は、カルシニューリンイソ型の検出および分析のための新たな方法を提供することを目的とする。そのような方法を使用することによって、カルシニューリンの異なるイソ型と関連していることが知られている異なる病気の進行および持続を見抜く(get insight into)ことが可能になるであろう。更に、その方法は、診断における、特に、異なる病気のきわめて初期の診断における、有用なツール(tool)を提供するであろう。
【０００７】
この目的は、請求項１に記載の方法によって解決される。本発明の方法の好ましい態様を、従属項である請求項２〜１０に記載する。本発明の方法の実施に適したプライマーおよびキットを、請求項１１〜１７に記載する。請求項１８〜２１は、前記プライマーに関し、請求項２２〜２４は、診断方法に関する。これにより、すべての請求項の文言は、本明細書に参照として含まれる(The wording of all claims is hereby made to the content of the specification by reference)。
【０００８】
カルシニューリンまたはそのサブユニットのイソ型および／またはスプライスバリアントの検出および分析のための本発明の方法において、ポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）が行われる。この段階のために、哺乳動物組織の核酸が使用され、特別なセグメントがＰＣＲ産物として増幅され、これら産物が評価される。本発明の方法は、カルシニューリンの様々なイソ型を区別するために、特に有用である。
【０００９】
ＰＣＲは、好ましくは、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）である。これは、組織のＲＮＡ、特に、全ＲＮＡが抽出されることを意味する。このＲＮＡは、標準的なプロトコルに従って、オリゴ（ｄＴ）プライマーの使用によって、ｃＤＮＡに逆転写される。このｃＤＮＡは、カルシニューリンに特異的なプライマーによる、その後のＰＣＲのための鋳型である。ＲＮＡが、細胞および組織のそれぞれの実際の状態を反映するので、ＲＴ−ＰＣＲは特に好ましい。ＤＮＡレベルでは、カルシニューリンの異なるイソ型のためのすべての遺伝子が存在する。それは、ＤＮＡのＲＮＡへの転写であり、それにより、どのイソ型が細胞または組織において発現されるかが決定される。更に、カルシニューリンの異なるスプライスバリアントをもたらすスプライシングが、ＲＮＡのレベルで起こる。よって、本発明の方法のために、ＲＮＡは特に興味深い。
【００１０】
ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写段階後、カルシニューリンに特異的なプライマーによるＰＣＲが行われる。この段階によって、カルシニューリンの異なるイソ型および／またはスプライスバリアントが増幅される。
【００１１】
好ましくは、ＰＣＲのために使用されるイソ型および／またはスプライスバリアントのための前記プライマーは、１つの種類のカルシニューリンイソ型に完全に特異的ではないが、カルシニューリンイソ型に本質的に特異的である。前記の本質的に特異的なプライマーは、異なる種類のカルシニューリンの増幅に有用である。これらのプライマーの使用によって、本発明の方法は、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ等のような異なる種のカルシニューリンの分析に適する。本発明の方法の特に好ましい態様において、その方法は、何らかの哺乳動物組織のカルシニューリンの分析に使用される。
【００１２】
触媒サブユニットカルシニューリン−Ａ（ＣＮ−Ａ）のイソ型および／またはスプライスバリアントのためのプライマーが、特に好ましい。本発明の方法におけるこれらプライマーの使用によって、カルシニューリンの前記イソ型および／またはスプライスバリアントが分析される。好ましくは、これらイソ型は、ＣＮ−Ａα、ＣＮ−Ａβ、および／もしくはＣＮ−Ａγ、ならびに／またはそれらのスプライスバリアントである。先に略述したように、特に、これらのイソ型は、臨床的に関連があることが示されている。いずれにせよ、本発明は、制御サブユニットのこれらの型を分析するためにも、制御サブユニットのイソ型および／またはスプライスバリアントに特異的なプライマーの使用を含む。
【００１３】
本発明のプライマーが、関連する配列の３’−領域に対するものであることが有利である。なぜなら、この領域は、５’−領域よりも、生物学的に利用しやすいからである。好ましくは、プライマー対は、イソ型の潜在的なスプライスバリアントの領域を含む。プライマーがイソ型の領域に対するものであって、特にイソ型が異なることが、特に好ましい。
【００１４】
本発明の方法の好ましい態様において、触媒サブユニットのイソ型およびそれらのスプライスバリアントのための、以下のプライマーが使用される。
ＣＮ−Ａαのためのプライマーは：
【化１】
2004537309.tif 000002
【００１５】
ＣＮ−Ａβのためのプライマーは：
【化２】
2004537309.tif 000003
【００１６】
ＣＮ−Ａγのためのプライマーは：
【化３】
2004537309.tif 000004
【００１７】
プライマーのリストにおいて、プライマーは、５’−３’方向に記載されている。“ａ”はアデニンを意味し、“ｔ”はチミンを意味し、“ｇ”はグアニンを意味し、“ｃ”はシトシンを意味する。“ｒ”は“ａ”および“ｇ”を意味する。プライマーＣＮ−Ａα−アンチセンス１とＣＮ−Ａγ−アンチセンスとは同一である。
【００１８】
先に略述したように、いくつかの病気に特異的なカルシニューリンの異なるイソ型および／またはスプライスバリアントは、特に神経組織中に存在する。よって、本発明の方法の好ましい態様において、核酸の供給源としての哺乳動物組織は、神経組織、特に、中枢神経組織である。扁桃、前頭皮質、海馬、梨状皮質、線条体および／または脊髄のような脳組織を使用することが好ましい。別々のアプローチにおける脳の両半球の組織の分析が、特に好ましい。
【００１９】
本発明の別の好ましい態様において、前記哺乳動物組織は、心組織である。なぜなら、カルシニューリンイソ型は、例えば心不全において、重要な役割を果たすからである。
【００２０】
本発明により、ＰＣＲ産物が評価される。これは、当業者に知られている一般的な方法によって行うことができた。本発明の方法の好ましい態様において、ＰＣＲ産物は、電気泳動によって分離され、臭化エチジウム染色によって可視化される。明らかに、他の分離方法および染色方法も可能である。本発明の方法の別の態様において、ＰＣＲ産物は、メンブレン上で分離されてブロットされる(blotted)。これらのブロットされたＰＣＲ産物は、標識化プローブによって、例えば、放射性標識化プローブによって検出される。
【００２１】
分子量の違いによってカルシニューリンのイソ型を区別するために、ＰＣＲ産物の分離は、特に好ましい。
【００２２】
本発明の別の好ましい態様において、ＰＣＲ産物は、それら産物を分離することなく検出される。これは、例えば、ＰＣＲ産物を対応する標識化プローブとともに含む溶液の処理および適当な方法によるＰＣＲ産物とプローブとの相互作用の分析によって行われる。この態様では、分離段階は行われず(spared)、これは、全工程の自動化という点で、特に有利である。
【００２３】
本発明の方法の好ましい態様において、ＰＣＲ産物の評価は、内部標準との比較によって行われる。適当な内部標準は、常に同じ量で発現され、かつ、細胞または組織の異なる条件による影響を受けない。適当な内部標準の一例は、アクチンである。本発明の方法により、アクチンに特異的なプライマー対を用いて、別の(separate)ＰＣＲが行われる。得られたＰＣＲ産物は、カルシニューリンのＰＣＲ産物と並行して分析され、異なる産物の量が比較される。それにより、カルシニューリンの異なるイソ型および／またはスプライスバリアントの発現に関する定量的な主張(assertions)を行うことができる。
【００２４】
本発明の方法の好ましい態様において、得られたＰＣＲ産物は、少なくとも部分的に配列決定される。これは、ＰＣＲ産物を同定し、それらをカルシニューリンの特定のイソ型および／またはスプライスバリアントと関連付けるために、特に好ましい。好ましくは、ＰＣＲ産物の配列決定は、当業者に知られている標準的なプロトコルによって行われる。
【００２５】
更に、本発明は、以下の配列を有するＰＣＲのためのプライマーを含む：
【化４】
2004537309.tif 000005
【００２６】
カルシニューリンの触媒サブユニットの異なるイソ型および／またはスプライスバリアントの増幅物を得るためのＰＣＲを行うために、これらのプライマーは特に有用である。プライマー１および２の使用によって、ＣＮ−Ａαが得られる。プライマー３および４の使用によって、ＣＮ−Ａβが得られる。プライマー５および２の使用によって、ＣＮ−Ａγが得られる。
【００２７】
これらのプライマー対を使用するＰＣＲのための鋳型としては、いずれかの組織から抽出された一般的な核酸が適当である。哺乳動物組織から得られた鋳型が、特に好ましい。
【００２８】
更に、本発明は、カルシニューリンまたはそのサブニユットのイソ型および／またはスプライスバリアントの分析のための方法を行うためのキットを含む。前記キットの最も重要な要素は、カルシニューリンのサブユニット、特に触媒サブユニットのイソ型および／またはスプライスバリアントのためのプライマーである。本発明のキットの好ましい態様において、そのキットは、ＰＣＲおよび／またはＲＴ−ＰＣＲを行うための異なる成分を含む。好ましくは、これらの成分は、ＲＮＡの抽出のための試薬、ならびに／または、ｃＤＮＡを作るためのプライマー、ならびに／または、内部標準、特にアクチンのためのプライマー、ならびに／または、ＰＣＲを行うための試薬、例えば、バッファー、塩溶液、ヌクレオチドおよび水、である。カルシニューリンのイソ型および／またはスプライスバリアントに特異的なプライマーについては、上記の説明を参照のこと。
【００２９】
更に、本発明は、カルシニューリンまたはそのサブユニットのイソ型および／またはスプライスバリアントの検出および分析方法のための、上記プライマーの少なくとも１つの使用を含む。この態様では、プライマーがＤＮＡチップ上に配置されることが特に好ましい。なぜなら、そのようなチップは、自動化された工程における使用に特に適しているからである。更に、本発明は、上記のプライマーの少なくとも１つを使用するポリメラーゼチェーン反応から得られる、少なくとも１つのＰＣＲ産物の使用を含む。これらのＰＣＲ産物は、カルシニューリンまたはそのサブユニットのイソ型および／またはスプライスバリアントの検出および分析方法において有用である。カルシニューリンのそれぞれの型を検出するために、ハイブリダイズプローブとして、プライマーおよび／またはＰＣＲ産物を使用することが有利である。
【００３０】
最後に、本発明は、カルシニューリンが関連する病気の診断および／または潜在的な病気の早期認識のための方法を含む。好ましくは、これらの病気は、心疾患、てんかん、および／または神経変性病である。この本発明の方法は、哺乳動物組織の核酸のＰＣＲ、特にＲＴ−ＰＣＲを行うこと、更に、得られたＰＣＲ産物を評価することを特徴とする。本方法の更なる特徴については、上記の説明を参照のこと。
【００３１】
本発明の記載した特徴および更なる特徴は、以下の実施例、図面、および従属項からより詳細にわかる。様々な特徴は、単独で、またはお互いに組み合わせて理解されるであろう。
【００３２】
図面では、以下のことが示される：
図１：ヒト脳におけるＣＮ−Ａイソ型の発現（ヒト線条体ｃＤＮＡライブラリ）。カルシニューリン−Ａαは、３４１ｂｐおよび３１１ｂｐスプライスバリアントを含む、３つの異なるバンドを示した。カルシニューリン−Ａβイソ型は、３４１ｂｐスプライスバリアントとしてのみ検出された。カルシニューリン−Ａγイソ型から、３３６ｂｐおよび３０６ｂｐスプライスバリアントを含む、３つの異なるＰＣＲフラグメントが得られた。
【００３３】
図２：神経変性病のためのトランスジェニックマウスモデルにおけるカルシニューリンイソ型の発現（筋萎縮性側索硬化症、ＡＬＳ）。ＴＧ：トランスジェニック（ＡＬＳ）、ＷＴ：野生型対照（病気なし）。
【００３４】
図３：てんかんのためのモデルにおけるカルシニューリン−Ａαイソ型発現（キンドルド(kindled)ラット）。上方のパネルには、扁桃における発現が示されているのに対し、下方のパネルには、梨状皮質中の状態における観察(insights)が示されている。両パネルは、キンドルドアニマルにおける異なる発現のための典型例を示す。レーンを、以下のように名づけた：
キンドリング(kindling)：ラットに電極を移植して刺激した。
電極：電極による偽の操作を行ったが(sham operated)、刺激しなかった。
対照：移植なしに偽の操作を行った。
【００３５】
図４：心疾患のためのモデルにおけるカルシニューリン−Aイソ型の発現（低酸素のネズミ脳組織スライス）。低酸素のネズミ皮質において、ＣＮ−Ａα、ＣＮ−Ａβ、およびＣＮ−Ａγを誘発した（上方の写真）。低酸素のネズミ海馬において、ＣＮ−ＡαおよびＣＮ−Ａβを誘発した。２０〜６０ｍＭの範囲の３ＮＰＡ−処理において、ＣＮ−Ａγレベルは一定である（下方の写真）。
【００３６】
実施例
トリゾール(Trizol)（商標）試薬（ギブコ(GIBCO)、ペーズリー（Paisley）、USA）を用いて、ＲＮＡの抽出を行った。標準的なプロトコルに従って、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて、１μｇの全ＲＮＡを逆転写した。この反応から、標準化のために、β−アクチンＰＣＲにおいて、２０〜１００ｎｇのｃＤＮＡを使用した。ヒトｃＤＮＡは、ストラタジーン(Stratagene)（サンディエゴ(San Diego)、USA）から供給された。β−アクチン−プライマー対は、プロメガ(Promega)（ハイデルベルグ(Heidelberg)、ドイツ）から供給された。５μｌの１０×ＰＣＲバッファー(500 mM KCl、100 mM Tris HCl pH 9.0、1%トリトン(Triton) X-100)、3μl 25 mM MgCl2、1μl 10mM dNTPs、2.5 μl ベータ−アクチンセンスプライマー、および2.5 μl ベータ−アクチンアンチセンスプライマー、0.5から2μlの希釈したcDNA (20〜100ng)、ならびにＲＮＡを含まない水を更に(ad）50μlを含む、５０μｌ容量において、β−アクチンＰＣＲを行った。
【００３７】
９４℃での１分間の第一加熱段階後、２．５単位のＴａｑポリメラーゼを添加して、“ホットスタート(hot start)”ＰＣＲを行った。増幅条件は、９４℃での３０秒の変性、５５℃での１分のアニーリング、および、６８℃での２分の伸長の２５サイクルであった。６８℃での１０分間の延長(extension)段階によって、ＰＣＲを終了させた。反応の５分の１を、ストラタジーン(Stratagene)からの臭化エチジウム染色ビジゲル(visigel)分離マトリックスにおける電気泳動によって分析した。バイオラド(Biodad)（ミュンヘン、ドイツ）からのマルチアナリストソフトウェア(Multi-Analyst Software)を用いて、カルシニューリンの強度を等量のｃＤＮＡを含むベータ−アクチン対照と比較することによって、ＤＮＡバンドの定量を行った。カルシニューリンイソ型の増幅のために、前述のプライマー対を使用した。
【００３８】
５０μｌ容量中で、カルシニューリンＰＣＲを行った。それらは、５μｌの１０×ＰＣＲバッファー（500 mM KCl, 100 mM Tris HCl pH 9.0, 1%トリトン(Triton) X-100）、3μl 25 mM MgCl2、1μl 10 mM dNTP-ミックス、2.5μlのセンスプライマー、2.5μlのアンチセンスプライマー、算出された量の希釈したcDNA (0.5〜100ng)、および、更に５０μｌのＲＮＡを含まない水を含んでいた。９４℃での１分間の第一加熱段階後、２．５単位のＴａｑポリメラーゼを添加することによって、“ホットスタート”ＰＣＲを行った。プライマーの組み合わせおよび増幅条件は、以下の通りであった：
【００３９】
カルシニューリンＡα：プライマー１および２、９４℃３０秒、６０℃１分、および７２℃２分の２５サイクル、次いで７２℃１０分の最終延長段階。
【００４０】
カルシニューリンＡβ：プライマー３および４、９４℃３０秒、５５℃１分、および７２℃２分の３０サイクル、次いで７２℃１０分の最終延長段階。
【００４１】
カルシニューリンＡγ：プライマー５および２、９４℃３０秒、５５℃１分、および７２℃２分の３０サイクル、次いで７２℃１０分の最終延長段階。
【００４２】
反応の５分の１を、臭化エチジウム染色ビジゲル(visigel)分離マトリックス（ストラタジーン(Stratagene)）における電気泳動によって分析した。バイオラド(Biorad)からのマルチアナリストソフトウェア(Multi-Analyst Software)を用いて、バンド強度の定量を行った。すべてのカルシニューリンバンドを配列決定し、プライマーセットの特異性を確認した。
【００４３】
家族性筋萎縮性側索硬化症に関連する突然変異スーパーオキシド・ジスムターゼ(superoxide dismutase)１遺伝子のために組み換えられたマウスを育てた。断頭および調製後、液体窒素中で組織を直ちに凍結した。ギブコ（GIBCO）からのトリゾール(Trizol)（商標）試薬を使用して、凍結組織から、ＲＮＡを調製した。
【００４４】
低酸素のマウスおよび各対照を、ブカナー(Buechner)ら(1999)、Neuroscience Letters 276：131−134に記載されているように処理した。断頭後、脳スライスを液体窒素中で直ちに凍結した。トランスジェニックマウスのプロトコルに従って、ＲＮＡを調製した。
【００４５】
ロシャー(Loescher)ら(1998)、Exp. Neurol. 154：551−559に公表されているように、キンドルドラットを処理して調製した。
【００４６】
３種の異なる哺乳動物、即ち、マウス、ラット、およびヒト、ならびに６種の異なる組織、即ち、扁桃、前頭皮質、海馬、梨状皮質、線条体および脊髄において、カルシニューリンＡイソ型の発現をアッセイするために、上記の方法を使用した。図２に示すように、得られたバンドは、２つのカルシニューリンＡαスプライスバリアントについて、３４１ｂｐおよび３１１ｂｐの予想されるサイズを示し（すべての種）、２つのカルシニューリンＡβスプライスバリアントについて、３４４ｂｐおよび３１４ｂｐ（ラットおよびマウス；ヒトに対して３４１／３１１ｂｐ）、カルシニューリン−Ａγスプライスバリアントについて、３３３ｂｐおよび３０３ｂｐ（マウスおよびラット；ヒトに対して３３６／３０６ｂｐ）、ならびに、β−アクチンについて２８５ｂｐ（すべての種、示さず）の予想されるサイズを示した。
【００４７】
神経変性病の例として、筋萎縮性側索硬化症のためのモデルを分析した。家族性筋萎縮性側索硬化症に関連する突然変異スーパーオキシド・ジスムターゼ１遺伝子のために組み換えられたマウスにおいて、カルシニューリンの異なる発現をアッセイした（図２）。トランスジェニックマウス（ｎ＝６）は、何らかの病的変化が明らかに進行している時点（４５日）で、ＣＮ−Ａα、ＣＮ−Ａβ、およびＣＮ−Ａγの発現は、対照動物（ｎ＝６）より低いことを示した。７３日目に（ほぼ、ミトコンドリアの分解および周核体の空胞形成のような最初の病的変化が観察され得るとき）、ＣＮ−Ａα発現は、野生型におけるよりも強いのに対し、ＣＮ−Ａβおよびγの発現は、野生型に匹敵するレベルを示す。１１５日目、病的変化が見られるがまだ不全麻痺の発症する前に、ＣＮ−Ａα発現は、対照よりわずかに低いのに対し、ＣＮ−ＡβおよびＣＮ−ＡγｍＲＮＡレベルは、依然として野生型に匹敵するものであった。
【００４８】
てんかんの例として、キンドルドラットを分析した。キンドルドラットにおけるカルシニューリンイソ型の分析により、偽の操作を行った対照（電極移植、刺激なし；典型例を図３に示す）と比べた場合、左扁桃および梨状皮質の左部におけるＣＮ−Ａαの発現の顕著な違いが示された。１４４個の例、即ち、各脳組織、各半球、および各処理グループ（キンドリング、電極対照、未処理対照）のための６つの動物、をすべて一緒に調べた。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
心疾患の例として、低酸素のマウスを分析した。低酸素のマウスの脳において、すべてのカルシニューリン−Ａイソ型が検出された（図４）。すべてのカルシニューリン−Ａイソ型、即ち、ＣＮ−Ａα、ＣＮ−Ａβ、およびＣＮ−Ａγ、が、低酸素のネズミの皮質において誘発された。低酸素のネズミの海馬では、ＣＮ−ＡαおよびＣＮ−Ａβだけが誘発されたのに対し、０〜３０ｍＭの範囲の３ＮＰＡにおいて、ＣＮ−Ａγレベルは一定であった。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ヒト脳におけるＣＮ−Ａイソ型の発現（ヒト線条体ｃＤＮＡライブラリ）。
【図２】神経変性病のためのトランスジェニックマウスモデルにおけるカルシニューリンイソ型の発現（筋萎縮性側索硬化症、ＡＬＳ）。
【図３】てんかんのためのモデルにおけるカルシニューリン−Ａαイソ型発現（キンドルドラット）。
【図４】心疾患のためのモデルにおけるカルシニューリン−Aイソ型の発現（低酸素のネズミ脳組織スライス）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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