(57)【要約】本発明は、生物におけるＣＯＸ-2阻害法に関する。好ましくは、本方法は特に、生物におけるＣＯＸ-2選択的阻害法に関する。本方法は、抽出物がＣＯＸ-2を阻害する植物からの有機抽出物を生物に投与することを含む。ＣＯＸ-2阻害およびＣＯＸ-2選択的阻害を示す組成物の有機抽出物からの精製法もまた提供する。さらに、生物におけるＣＯＸ-2により仲介される炎症または炎症性疾患の治療法または予防法を提供する。
2004529079.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物におけるＣＯＸ−2活性の阻害法であって、生物に治療的あるいは予防的有効量の植物有機抽出物を含む組成物を投与するステップを含む方法であり、ここで該植物が、Agavales目、リンドウ目(Apocynales)、サトイモ目(Arales)、キク目(Asterales)、Basidiomycetae目、フウチョウソウ目(Brassicales)、ナデシコ目(Caryophyllales)、ソテツ目(Cycadales)、カキ目(Ebenales)、トウダイグサ目(Euphorbiales)、ブナ目(Fagales)、トチカガミ目(Hydrocharitales)、シソ目(Lamiales)、ユリ目(Liliales)、Loasales目、アオイ目(Malvales)、フトモモ目(Myrtales)、ヤシ目(Palmales)、タコノキ目(Pandanales)、ケシ目(Papaverales)、コショウ目(Piperales)、Polemoniales目、ヒメハギ目(Polygalales)、サクラソウ目(Primulales)、キンポウゲ目(Ranales)、クロウメモドキ目(Rhamnales)、バラ目(Rosales)、アカネ目(Rubiales)、ミカン目(Rutales)、ビャクダン目(Santalales)、ムクロジ目(Sapindales)、ゴマノハグサ目(Scrophulariales)、セリ目(Umbellales)、イラクサ目(Urticales)、およびスミレ目(Violales)からなる目から選択される方法。
【請求項２】
抽出物のＣＯＸ−2活性に対する阻害作用が抽出物のＣＯＸ−1活性に対する阻害作用の約2倍以上である請求項1に記載の方法。
【請求項３】
抽出物のＣＯＸ−2活性に対する阻害作用が抽出物のＣＯＸ−1活性に対する阻害作用の約10倍以上である請求項1に記載の方法。
【請求項４】
Agavales目の抽出物がリュウゼツラン科(Agavaceae)からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項５】
リュウゼツラン科(Agavaceae)の抽出物がプレオメレ属(Pleomele)からのものである請求項4に記載の方法。
【請求項６】
リンドウ目(Apocynales)の抽出物がキョウチクトウ科(Apocynaceae)およびガガイモ科(Asclepiadaceae)からなる科から選択される科からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項７】
キョウチクトウ科(Apocynaceae)の抽出物がキョウチクトウ属(Bleekeria)およびストロファンツス属(Strophanthus)からなる属から選択される属からのものである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ガガイモ科(Asclepiadaceae)の抽出物がトウワタ属(Asclepias)からのものである請求項6に記載の方法。
【請求項９】
サトイモ目(Arales)の抽出物がサトイモ科(Araceae)からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
サトイモ科(Araceae)の抽出物がコンニャク属(Amorphophallus)、アンスリウム属(Anthurium)、およびハンゲ属(Pinellia)からなる属から選択される属からのものである請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
キク目(Asterales)の抽出物がキク科(Asteraceae)からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
キク科(Asteraceae)の抽出物がヴェルノニア属(Vernonia)、ハマグルマ属(Wedelia)、およびオナモミ属(Xanthium)からなる属から選択される属からのものである請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
Basidiomycetae目の抽出物がタコウキン科(Polyporaceae)からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
タコウキン科(Polyporaceae)の抽出物がマイタケ属(Glifola)からのものである請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
フウチョウソウ目(Brassicales)の抽出物がアブラナ科(Brassicaceae)からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
アブラナ科(Brassicaceae)の抽出物がアブラナ属(Brassica)およびラファヌス属(Raphanus)からのものである請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
ナデシコ目(Caryophyllales)の抽出物がナデシコ科(Caryophyllaceae)、アカザ科（Chenopodiaceae)、オシロイバナ科(Nyctaginaceae)、ヤマゴボウ科(Phytolaccaceae)、およびタデ科(Polygonaceae)からなる科から選択される属からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
ナデシコ科（Caryophyllaceae)の抽出物がサポナリア属(Saponaria)からのものである請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
アカザ科(Chenopodiaceae)の抽出物がフダンソウ属(Beta)からのものである請求項17に記載の方法。
【請求項２０】
オシロイバナ科(Nyctaginaceae)の抽出物がピソニア属(Pisonia)からのものである請求項17に記載の方法。
【請求項２１】
ヤマゴボウ科(Phytolaccaceae)の抽出物がトリコスチグマ属(Trichostigma)からのものである請求項17に記載の方法。
【請求項２２】
タデ科(Polygonaceae)の抽出物がコリザンテ属(Chorizanthe)およびギシギシ属（Rumex)からのものである請求項17に記載の方法。
【請求項２３】
ソテツ目(Cycadales)の抽出物がソテツ科（Cycadaceae)からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項２４】
ソテツ科（Cycadaceae)の抽出物がザミア属(Zamia)からのものである請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
カキ目(Ebenales)の抽出物がカキノキ科(Ebenaceae)からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項２６】
カキノキ科(Ebenaceae)の抽出物がカキノキ属(Diospyros)からのものである請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
トウダイグサ目(Euphorbiales)の抽出物がトウダイグサ科(Euphorabiaceae)からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項２８】
トウダイグサ科(Euphorabiaceae)の抽出物がクロトン属(Croton)、ギムナンテス属(Gymnanthes)、マカランガ属(Macaranga)、イモノキ属(Manihot)、オストデス属(Ostodes)、フィランツス属(Phyllanthus)、およびリキノデンドロン属(Ricinodendron)からなる属から選択される属からのものである請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
ブナ目(Fagales)の抽出物がブナ科(Fagaceae)からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項３０】
ブナ科（Fagaceae)の抽出物がシイノキ属(Castanopsis)からのものである請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
トチカガミ目(Hydrocharitales)の抽出物がトチカガミ科(Hydrocharitaceae)からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項３２】
トチカガミ科(Hydrocharitaceae)の抽出物がコカナダモ属(Elodea)からのものである請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
シソ目(Lamiales)の抽出物がクマツヅラ科(Verbenaceae)からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項３４】
クマツヅラ科(Verbenaceae)の抽出物がムラサキシキブ属(Callacarpa)およびクサギ属(Clerodendron)からのものである請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
ユリ目(Liliales)の抽出物がツユクサ科(Commelinaceae)およびユリ科(Liliaceae)からなる科から選択される科からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項３６】
ツユクサ科(Commelicaceae)の抽出物がムラサキオモト属(Tradescantia)からのものである請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
ユリ科(Liliaceae)の抽出物がユリ属(Lilium)およびシオデ属(Smilax)からなる属からのものである請求項35に記載の方法。
【請求項３８】
Loasales目の抽出物がシレンゲ科(Loasaceae)からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項３９】
シレンゲ科(Loasaceae)の抽出物がメントゼリア属(Mentzelia)からのものである請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
アオイ目(Malvales)の抽出物がキワタ科(Bombaceae)、ホルトノキ科(Elaeocarpaceae)、およびアオギリ科(Steruliaceae)からなる科からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項４１】
キワタ科(Bombaceae)の抽出物がQuararibeae属からのものである請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
ホルトノキ科(Elaeocarpaceae)の抽出物がホルトノキ属(Elaeocarpus)からのものである請求項40に記載の方法。
【請求項４３】
アオギリ科(Sterculiaceae)の抽出物がグアズマ属(Guazuma)、ヘリクテレス属(Helicteres)、およびノジアオイ属(Melochia)からなる属からのものである請求項40に記載の方法。
【請求項４４】
フトモモ目(Myrtales)の抽出物がフトモモ科(Myrtaceae)からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項４５】
フトモモ科(Myrtaceae)の抽出物がミルキア属(Myrcia)およびフトモモ属(Syzygium)からのものである請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
生物におけるCOX-2活性阻害法であって、生物に治療的および予防的有効量の植物有機抽出物を含む組成物を投与するステップを含む方法であり、ここで該植物がイグチ科(Boletaceae)およびイグチ属(Boletus)からのものである方法。
【請求項４７】
生物におけるCOX-2活性阻害法であって、生物に治療的および予防的有効量の植物有機抽出物を含む組成物を投与するステップを含む方法であり、ここで該植物がヘゴ科(Cyatheaceae)およびCyatheae属からのものである方法。
【請求項４８】
生物におけるCOX-2活性阻害法であって、生物に治療的および予防的有効量の植物有機抽出物を含む組成物を投与するステップを含む方法であり、ここで該植物がイワタケ科(Umbilicariacae)およびイワタケ属(Umbilicaria)からのものである方法。
【請求項４９】
ヤシ目(Palmales)の抽出物がヤシ科(Arecaceae)からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項５０】
ヤシ科(Arecaceae)からの抽出物がクジャクヤシ属(Caryota)、ココスリナックス属(Coccothrinax)、およびシーリア属(Scheelea)からのものである請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
タコノキ目(Pandanales)の抽出物がミクリ科(Sparganiaceae)からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項５２】
ミクリ科(Sparganiaceae)の抽出物がミクリ属(Sparganium)からのものである請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
ケシ目(Papaverales)の抽出物がケシ科(Papaveraceae)からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項５４】
ケシ科(Papaveraceae)の抽出物がアザミゲシ属(Bocconia）からのものである請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
コショウ目(Piperales)の抽出物がセンリョウ科(Chloranthaceae)およびコショウ科(Piperaceae)から選択される科からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項５６】
センリョウ科(Chloranthaceae)の抽出物がヘジョスマム属(Hedyosmum)からのものである請求項55に記載の方法。
【請求項５７】
コショウ科（Piperaceae)の抽出物がペペロミア属(Peperomia)およびコショウ属(Piper)からなる属から選択される属からのものである請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
Polemonialesの抽出物がムラサキ科（Boraginaceae)およびナス科(Solanaceae)から選択される科からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項５９】
ムラサキ科(Boraginaceae)の抽出物がコーディア属(Cordia)およびムラサキ属(Lithospermum)から選択される属からのものである請求項58に記載の方法。
【請求項６０】
ナス科(Solanaceae)の抽出物がトウガラシ属(Capsicum)およびナス属(Solanum)からなる属から選択される属からのものである請求項58に記載の方法。
【請求項６１】
ヒメハギ目(Polygalales)の抽出物がヒメハギ科（Polygalaceae)からなる科から選択される科からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項６２】
ヒメハギ科（Polygalaceae)の抽出物がヒメハギ属(Polygala)からなる属から選択される属からのものである請求項61に記載の方法。
【請求項６３】
サクラソウ科(Primulales)の抽出物がヤブコウジ科（Myrsinaceae)およびテオフラスタ科(Theophrastaceae)からなる科から選択される科のものである請求項1に記載の方法。
【請求項６４】
ヤブコウジ科（Myrsinaceae)の抽出物がツルアカミノキ属(Myrsine)からのものである請求項63に記載の方法。
【請求項６５】
テオフラスタ科(Theophrastaceae)の抽出物がジャキニア属(Jacquinia)からのものである請求項63に記載の方法。
【請求項６６】
キンポウゲ目(Ranales)の抽出物がクスノキ科(Lauraceae)およびキンポウゲ科(Ranunculaceae)からなる科からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項６７】
クスノキ科(Lauraceae)の抽出物がクスノキ属(Cinnamonum)からのものである請求項66に記載の方法。
【請求項６８】
キンポウゲ科(Ranunculaceae)の抽出物がボタン属(Paenia)からのものである請求項66に記載の方法。
【請求項６９】
クロウメモドキ目(Rhamnales)の抽出物がクロウメモドキ科(Rhamnaceae)からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項７０】
クロウメモドキ科(Rhamnaceae)の抽出物がナツメ属(Ziziphus)からのものである請求項69に記載の方法。
【請求項７１】
バラ目(Rosales)の抽出物がマメ科（Fabaceae)、バラ科(Rosaceae)およびユキノシタ科(Saxifragaceae)からなる科から選択される科からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項７２】
マメ科（Fabaeae)の抽出物がアデナンテラ属(Adenanthera)、ネムノキ属(Albizzia)、カワラケツメイ属(Cassia)、デイコ属(Erythrina)、アカシア属(Inga)、ナツフジ属(Milletia)およびセンダイハギ属(Tephrosia)からなる属から選択される属からのものである請求項71に記載の方法。
【請求項７３】
バラ科(Rosaceae)の抽出物がビワ属(Eriobotorya)からのものである請求項71に記載の方法。
【請求項７４】
ユキノシタ科(Saxifragaceae)の抽出物がチャルメルソウ属(Mitella)からのものである請求項71に記載の方法。
【請求項７５】
アカネ目(Rubiales)の抽出物がアカネ科(Rubiaceae)からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項７６】
アカネ科(Rubiaceae)の抽出物がベレリア属(Berreria)、Genipa属、ハメリア属(Hamelia)、ナウクレア属(Nauclea)、ボチョウジ属(Psychotria)からのものである請求項75に記載の方法。
【請求項７７】
ミカン目(Rutales)の抽出物がセンダン科(Meliaceae)、ミカン科(Rutaceae)、およびニガキ科(Simaroubaceae)から選択される科からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項７８】
センダン科(Meliaceae)の抽出物がディソキシルム属(Dysoxylum)、スキンダプサス属(Scindapsus)、およびトリチリア属(Trichilia)からなる属から選択される属からのものである請求項77に記載の方法。
【請求項７９】
ミカン科(Rutaceae)の抽出物がワンピ属(Clausena)およびサンショウ属(Zanthoxylum)からなる属から選択される属のものである請求項77に記載の方法。
【請求項８０】
ニガキ科(Simaroubaceae)の抽出物がブルセア属(Brucea)およびピクラムニア属(Picramnia)からなる属から選択される属からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項８１】
ビャクダン目(Santalales)の抽出物がヤドリギ科(Loranthaceae)からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項８２】
ヤドリギ科(Loranthaceae)の抽出物がホラデンドロン属(Phoradendron)からのものである請求項81に記載の方法。
【請求項８３】
ムクロジ目(Sapindales)の抽出物がウルシ科(Anacardiaceae)およびクロタキカズラ科(Icacinaceae)からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項８４】
ウルシ科(Anacardiaceae)の抽出物がドラコントメロン属(Dracontomelon)からのものである請求項83に記載の方法。
【請求項８５】
クロタキカズラ科(Icacinaceae)の抽出物がピレナカンタ属(Pyrenacantha)からのものである請求項83に記載の方法。
【請求項８６】
ゴマノハグサ目（Scrophulariales)の抽出物がノウゼンカズラ科(Bignoniaceae)およびイワタバコ科(Gesneriaceae)からなる科から選択される科からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項８７】
ノウゼンカズラ科(Bignoniaceae)の抽出物がマクファディエナ属(Macfadyena)からのものである請求項86に記載の方法。
【請求項８８】
イワタバコ科(Gesneriaceae)の抽出物ミズビワソウ属(Cyrtandra)からのものである請求項86に記載の方法。
【請求項８９】
セリ目（Umbellales)の抽出物がセリ科(Apiaceae)およびウコギ科(Araliaceae)から選択される科からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項９０】
セリ科(Apiaceae)の抽出物がオランダミツバ属(Apium)からのものである請求項89に記載の方法。
【請求項９１】
ウコギ科(Araliaceae)の抽出物がアルトフィラム属(Arthophyllum)およびブラサイオプシス属(Brassaiopsis)からのものである請求項89に記載の方法。
【請求項９２】
イラクサ目(Urticales)の抽出物がクワ科(Moraceae)およびニレ科(Ulmaceae)からなる科から選択される科からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項９３】
クワ科(Moraceae)の抽出物がドルステニア属(Dorstenia)、イチジク属(Ficus)およびストレブラス属(Streblus)からなる属から選択される属のものである請求項92に記載の方法。
【請求項９４】
ニレ科(Ulmaceae)の抽出物がエノキ属(Celtis)からのものである請求項92に記載の方法。
【請求項９５】
スミレ目(Violales)の抽出物がイイギリ科(Flacourtiaceae)からのものである請求項1に記載の方法。
【請求項９６】
イイギリ科(Flacourtiaceae)の抽出物がパンギウム属(Pangium)およびリパロサ属(Ryparosa)からのものである請求項95に記載の方法。
【請求項９７】
有機抽出物が以下を含む方法で得られる精製組成物である請求項1に記載の方法：
(a) 植物を有機溶媒と接触させて、植物から抽出物を抽出すること[ここで、該抽出物はCOX-2活性を阻害する]；そして
(b)COX-2阻害活性を有する該抽出物を分離すること。
【請求項９８】
抽出物がCOX-2活性を選択的に阻害する請求項97に記載の方法。
【請求項９９】
ステップ(a)が以下をさらに含む、請求項97に記載の方法：
植物を有機溶媒と混合し、得られた混合物を約25℃から前記の溶媒の沸点の間の温度で少なくとも1分間撹拌すること。
【請求項１００】
有機溶媒が、炭化水素溶媒、エーテル類、塩素化溶媒、アセトン、酢酸エチル、ブタノール、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコールおよびそれらの混合物からなる群から選択される請求項97に記載の方法。
【請求項１０１】
有機溶媒が非極性である請求項97に記載の方法。
【請求項１０２】
非極性溶媒がジクロロメタンまたはヘキサンである請求項101に記載の方法。
【請求項１０３】
ステップ(b)がさらに以下を含む請求項97に記載の方法：
有機抽出物から溶媒を溜去することにより溶媒を除くこと。
【請求項１０４】
生物におけるCOX-2により仲介される炎症または炎症性疾患の治療または予防法であって、治療的あるいは予防的有効量の請求項97に記載の精製組成物を含む組成物を生物に投与することを含む方法。
【請求項１０５】
炎症性疾患が関節炎である請求項104に記載の方法。
【請求項１０６】
炎症性疾患が疼痛である請求項104に記載の方法。
【請求項１０７】
炎症性疾患が発熱である請求項104に記載の方法。
【請求項１０８】
癌の治療または予防における使用のための請求項104に記載の方法。
【請求項１０９】
癌が上皮細胞癌である請求項108に記載の方法。
【請求項１１０】
上皮細胞癌が結腸癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌または肺癌である請求項109に記載の方法。
【請求項１１１】
中枢神経系疾患の治療または予防における使用のための請求項104に記載の方法。
【請求項１１２】
中枢神経系疾患がアルツハイマー病である請求項111に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、シクロオキシゲナーゼ-2(ＣＯＸ-2)を阻害する能力を有する非ステロイド性抗炎症剤である栄養補助食品に関する。本発明は、植物から分離したＣＯＸ-2阻害活性を有する有機抽出物を生物に投与することによる、生物におけるＣＯＸ-2阻害法あるいはＣＯＸ-2選択的阻害法に関する。本発明はまた、植物有機抽出物の精製組成物に関する。さらに本発明は、生物におけるＣＯＸ-2により仲介される炎症あるいは炎症性疾患の治療法および/または予防法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロスタグランジンは、炎症反応において重要な役割を果たす生物活性脂質誘導体の強力な種類である。炎症反応は、疼痛、熱、赤みおよび腫れを特徴とする損傷または他の外傷に対する局所組織反応である。プロスタグランジンはこの反応を、血小板凝集阻害、血管透過性亢進、血管拡張、平滑筋収縮の誘起および好中球走化性の誘起により調節する。炎症反応の調節において中心的な役割を果たしているため、プロスタグランジンの生合成を阻害する能力を有する組成物の解明にむけて多くの努力がなされてきた。
【０００３】
この目的のために、プロスタグランジンの生合成は広範に解明されてきた。プロスタグランジンは、一般的にアラキドン酸より誘導される酸化脂肪酸のグループである。アラキドン酸からのプロスタグランジンの生合成は以下の3段階工程によって行なわれる：1)ホスホリパーゼＡ2によって触媒されるリン脂質前駆体からのアラキドン酸の加水分解；2)シクロオキシゲナーゼ("ＣＯＸ")によって触媒されるアラキドン酸のプロスタグランジンＧ2("ＰＧＧ2")への酸化（このＣＯＸ触媒反応がプロスタグランジン合成における最初でかつ律速段階の反応である)；そして３）一連のシンターゼおよびレダクターゼによって触媒されるプロスタグランジンＧ2からの生物活性最終生成物であるプロスタグランジンへの変換(この合成の後、プロスタグランジンは細胞を出てＧタンパク質連結膜受容体を介して標的細胞に影響することによりホルモン様作用を発揮する)。
【０００４】
ＣＯＸ酵素の不活性化は、プロスタグランジン生合成経路におけるこの酵素の重要な役割に基づくプロスタグランジン産生を阻害するための天然の標的である。現在では、ＣＯＸ-1およびＣＯＸ-2と呼ばれるＣＯＸ酵素活性を有する2つの遺伝子産物が発現されていることが知られている。ＣＯＸ-1は、最初に発見されたアイソフォームであり、ほとんどの組織型で構成的に発現されている。構成的に発現されているため、COX-1は速い生理的応答を必要とする活性に関与することができ、"ハウスキーピング"機能に関連するプロスタグランジン産生を引き起こす。例えば、ＣＯＸ-1は、血管恒常性を調節し、消化管統合性を維持し、腎機能を維持する急性のプロスタグランジン産生を引き起こす。このように、ＣＯＸ-1活性は様々な細胞型の維持に必要なプロスタグランジン合成を担っている。
【０００５】
これに引き換え、ＣＯＸ-2は、細菌リポ多糖、増殖因子、サイトカイン、およびホルボールエステルなどの多くの刺激に応答して誘導的に発現される最近発見されたアイソフォームである。さらに、ＣＯＸ-2は、単球、マクロファージ、好中球、線維芽細胞および内皮細胞を含む、限られた数の細胞型においてのみ発現される。ＣＯＸ-2の発現は、ＣＯＸ-1の発現とは異なり、リウマチ滑膜組織において増加することが示されている。これとは対照的に、ＣＯＸ-2発現はグルココルチコイドへの応答および抗炎症性サイトカインにより阻害される。従って、これらの観察に基づき、ＣＯＸ-2は炎症反応および炎症関連疾患に関与するプロスタグランジン産生の調節を担うアイソフォームであることが示されている。さらに、ＣＯＸ-2は特定の癌、アルツハイマー病、アテローム性硬化症、ならびに、脳卒中、虚血および外傷によって起こる中枢神経系損傷に関与することが示されている。
【０００６】
コルチコステロイドは、炎症反応の影響を軽減するための一つの手段を提供する。この強力な抗炎症剤は、種々のメカニズムにより免疫系細胞の数と活性の減少を引き起こすことにより効果を発揮する。しかしながらコルチコステロイドの長期投与は激しい副作用をもたらし、このことがこの種類の抗炎症剤の治療的価値を制限している。
【０００７】
非ステロイド性抗炎症剤(ＮＳＡＩＤ)もまた炎症反応の影響を軽減する手段として用いられている。ＮＳＡＩＤの主な医薬効果は、ＣＯＸ活性を阻害することによりプロスタグランジン合成を阻害することができることに起因する。ＮＳＡＩＤによるプロスタグランジン合成阻害により、解熱作用、鎮痛作用、抗炎症作用、抗血栓作用がもたらされる。しかしながら、ＮＳＡＩＤの投与はまた、消化管出血、潰瘍および腎障害の悪化などの重篤な副作用の原因となる。ＮＳＡＩＤはまたＣＯＸアイソフォームを様々な程度に阻害する。例えば、最もよく知られたＮＳＡＩＤであるアスピリン(サリチル酸のアセチル化誘導体)は、アラキドン酸結合ドメインに位置するセリン残基をアセチル化することによりＣＯＸ-1およびＣＯＸ-2の両方を不可逆的に不活性化することによりプロスタグランジン生合成を阻害する。アスピリンは両方のアイソフォームを阻害するが、ＣＯＸ-2に比べてＣＯＸ-1を10-100倍効果的に不活性化する。
【０００８】
ＣＯＸ-2の選択的阻害により、胃および腎臓に関連した毒性問題を伴うことなく抗炎症作用および鎮痛作用が発揮されることが明らかにされている。この現象は、ＣＯＸ-1（消化管統合性および腎機能の両方を維持するプロスタグランジン産生を担っている)を阻害することなくＣＯＸ-2(炎症反応を調節するプロスタグランジン産生を担っている)を阻害することができるＮＳＡＩＤの発見により明らかとなった。従って、ＣＯＸ-2選択的阻害剤の開発により、ＮＳＡＩＤの有益な効果をその激しい副作用から分離することが可能となる。
【０００９】
その目的のためにプロスタグランジン合成のＣＯＸ-2選択的阻害剤であるいくつかの薬剤が開発されてきた。最も広範に解明の進んだＣＯＸ-2選択的阻害剤の種類は、最近承認された薬剤であるセレコキシブおよびロフェコキシブを含むジアリールへテロ環類である。しかしながら、他の種類にも、酸性スルホンアミド類、インドメタシン類似体、ゾメピラック類似体、およびジ-ｔ-ブチルフェノール類が含まれるがこれに限定されない。例えば、米国特許第5，380，738号はＣＯＸ-2を選択的に阻害するオキサゾール類を記載し、米国特許第5，344，991号はＣＯＸ-2を選択的に阻害するシクロペンテン類を記載し、米国特許第5，393，790号はＣＯＸ-2を選択的に阻害するスピロ化合物を記載し、ＷＯ94/15932はＣＯＸ-2を選択的に阻害するチオフェンおよびフラン誘導体を記載し、そしてＷＯ95/15316はＣＯＸ-2を選択的に阻害するピラゾリルスルホンアミド誘導体を記載している。
【００１０】
選択的ＣＯＸ-2阻害薬物療法の代替手段を提供するためには、ＣＯＸ-2を阻害する栄養補助食品を提供すること、あるいはさらに好ましくは、ＣＯＸ-2を選択的に阻害する栄養補助食品を提供することは、大変に有益であると思われる。ここでは、栄養補助食品はＣＯＸ-2阻害活性を有する食品あるいはその抽出物を指す。特に、このような植物起源の食品あるいは抽出物を得ることは、比較的安い費用で植物からの多量の食品または抽出物を得ることができるため、大変に有益である。これらの栄養補助剤は、"健康な"生理状態を維持するために、食餌療法において予防的に使用することができる。これらの栄養補助剤はまた、既存の炎症関連疾患の処置、治療あるいは緩和の手段として、単独で、あるいは併用療法の一部として他の化合物と共に用いることができる。
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
従って数ある側面の中で、本発明はとりわけ生物におけるＣＯＸ-2活性の阻害法を提供し、該方法が治療的あるいは予防的有効量の植物有機抽出物を生物に投与するステップを含む方法であり、ここで該植物が、Agavales、リンドウ目(Apocynales)、サトイモ目(Arales)、キク目(Asterales)、Basidiomycetae、フウチョウソウ目(Brassicales)、ナデシコ目(Caryophyllales)、ソテツ目(Cycadales)、カキ目(Ebenales)、トウダイグサ目(Euphorbiales)、ブナ目(Fagales)、トチカガミ目(Hydrocharitales)、シソ目(Lamiales)、ユリ目(Liliales)、Loasales、アオイ目(Malvales)、フトモモ目(Myrtales)、ヤシ目(Palmales)、タコノキ目(Pandanales)、ケシ目(Papaverales)、コショウ目(Piperales)、 Polemoniales、ヒメハギ目(Polygalales)、サクラソウ目(Primulales)、キンポウゲ目(Ranales)、クロウメモドキ目(Rhamnales)、バラ目(Rosales)、アカネ目(Rubiales)、ミカン目(Rutales)、ビャクダン目(Santalales)、ムクロジ目(Sapindales)、ゴマノハグサ目(Scrophulariales)、セリ目(Umbellales)、イラクサ目(Urticales)、およびスミレ目(Violales)からなる目から選択される方法を提供する。
【００１２】
本発明のもう一つの側面は、生物におけるＣＯＸ-2活性の阻害法であって、該方法が治療的あるいは予防的有効量の植物有機抽出物を生物に投与するステップを含む方法であり、ここで該植物がAgavales、リンドウ目(Apocynales)、サトイモ目(Arales)、キク目(Asterales)、Basidiomycetae、フウチョウソウ目(Brassicales)、ナデシコ目(Caryophyllales)、ソテツ目(Cycadales)、カキ目(Ebenales)、トウダイグサ目(Euphorbiales)、ブナ目(Fagales)、トチカガミ目(Hydrocharitales)、シソ目(Lamiales)、ユリ目(Liliales)、Loasales、アオイ目(Malvales)、フトモモ目(Myrtales)、ヤシ目(Palmales)、タコノキ目(Pandanales)、ケシ目(Papaverales)、コショウ目(Piperales)、 Polemoniales、ヒメハギ目(Polygalales)、サクラソウ目(Primulales)、キンポウゲ目(Ranales)、クロウメモドキ目(Rhamnales)、バラ目(Rosales)、アカネ目(Rubiales)、ミカン目(Rutales)、ビャクダン目(Santalales)、ムクロジ目(Sapindales)、ゴマノハグサ目(Scrophulariales)、セリ目(Umbellales)、イラクサ目(Urticales)、およびスミレ目(Violales)からなる目から選択され、ここで該有機抽出物が、抽出物がＣＯＸ-2阻害活性を有する植物から抽出物を取り出すために植物を有機溶媒と接触させ、次いでＣＯＸ-2阻害活性を有する抽出物を分離することを含む方法により得られる精製組成物である方法である。
【００１３】
さらにもう一つの側面は生物においてＣＯＸ-2炎症または炎症性疾患を治療または予防する方法を提供し、該方法が治療的あるいは予防的有効量の植物有機抽出物の精製組成物を生物に投与するステップを含む方法であり、ここで、抽出物がＣＯＸ-2活性を阻害する植物から抽出物を取り出すために植物を有機溶媒と接触させ、次いでＣＯＸ-2阻害活性を有する抽出物を分離することを含む方法により該精製組成物が得られる方法を提供する。
【００１４】
本発明の他の特徴は、一部分は当業者に明らかであり、一部分は以下に記載する発明の詳細な説明において指摘する。
【００１５】
略語および定義
本発明の理解を容易にするために、本明細書に用いるいくつかの用語および略語を以下に定義する。
"精製された"は部分精製されたおよび/または完全精製されたことを意味する。従って、"精製組成物"は、部分精製されたあるいは完全精製されたもののいずれかを意味する。
"抽出物"は粗抽出物、精製抽出物、および抽出物の精製により得られた精製組成物を意味する。
【００１６】
"ＣＯＸ活性"はアラキドン酸からＰＧＧ2への酸化反応を触媒する、ＣＯＸ-1またはＣＯＸ-2のいずれかのＣＯＸアイソフォームの能力を意味する。
"ＣＯＸ阻害剤あるいはＣＯＸ阻害"は、、ＣＯＸ-1またはＣＯＸ-2のいずれかのＣＯＸアイソフォームがアラキドン酸からＰＧＧ2への酸化反応を全部あるいは部分的のいずれかに触媒することを阻害する、精製されたあるいは未精製の組成物、薬剤または抽出物を意味する。
【００１７】
"選択的ＣＯＸ-2阻害"は、本明細書に特記しない限り、ＣＯＸ-2阻害率をＣＯＸ-1阻害率で割った比により測定されるＣＯＸ-1活性以上にＣＯＸ-2活性を選択的に阻害する、精製されたあるいは未精製の組成物、薬剤、あるいは抽出物を意味する。
【００１８】
"ＩＣ50"は、特定の反応を元の値の50％に抑える濃度(モルＬ-1)を意味する。本明細書で用いる時、この値はＰＧＥ2産生を50％阻害する組成物、薬剤あるいは抽出物の量(μg抽出物／ｍｌ溶媒)を意味する。本明細書に具体的に述べる様に、ＩＣ50値はＣＯＸ−2選択性を測定することに用いることができる。
【００１９】
"植物あるいはその器官"は、全植物、あるいは地上部、果実、葉、茎または根などの植物の任意の器官およびそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味する。
"目"は、本明細書で用いるとき、いくつかの類似の科からなるカテゴリーに属する関連生物の分類カテゴリーである。
【００２０】
"科"は、本明細書で用いるとき、目より下のそして属より上の階級に属する関連生物の分類カテゴリーである。
"種"は、本明細書で用いるとき、属より下の階級に属しそして近縁の個体のグループからなる基本の分類カテゴリーである。
ＣＯＸ＝シクロオキシゲナーゼ酵素
ＣＯＸ−1＝シクロオキシゲナーゼ−1アイソフォーム
ＣＯＸ−2＝シクロオキシゲナーゼ−2アイソフォーム
ＮＳＡＩＤ＝非ステロイド性抗炎症剤
ＰＧＥ2＝プロスタグランジンＥ2
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
好ましい態様の説明
本出願人は、特定の植物あるいはその器官の有機抽出物がＣＯＸ−2活性を阻害することを見出した。本出願人はまた、特定の植物あるいはその器官の有機抽出物がＣＯＸ−2活性を選択的に阻害することを見出した。ＣＯＸ−1の阻害よりもＣＯＸ−2の阻害のほうが強力であるため阻害作用は選択的である。従って、かかる植物あるいはその器官の有機抽出物は、生物において、ＣＯＸ−1活性を等しく阻害することなくＣＯＸ−2活性を選択的に阻害することに用いることができる。幸便なことに、これらの有機抽出物は栄養補助食品であり、安全に摂取することができ、ＣＯＸ−2阻害のための従来の薬物療法の代替療法を提供できる。
【００２２】
従って、本発明の抽出物は、ＣＯＸ−1活性より以上にＣＯＸ−2活性を好ましく阻害する。好ましくは、植物抽出物のＣＯＸ−2阻害作用はＣＯＸ−1阻害作用の少なくとも2倍以上である。さらに好ましくは、ＣＯＸ−2阻害作用はＣＯＸ−1阻害作用の少なくとも10倍以上である。ＣＯＸ酵素阻害作用および選択性は、以下にさらに詳細に述べる様に、当業者に公知の任意の方法に基づき測定することができる。
【００２３】
ＣＯＸ−2阻害に加えて、本発明の有機抽出物は食用あるいは非食用植物から分離することができる。一般的に言って、栄養物以外の目的で利用する場合に植物は非食用と分類され、栄養物の目的で摂取する場合は食用に分類される。例えば、薬用植物は、疾患の症状を治す目的で摂取し、日常的に摂取するためには強力すぎると考えられるため非食用と考えられている。従って、食用対非食用の植物分類は、以下の参考文献を含む当業者に公知の参考文献を利用して達成することができる： NAPRALERT；Tyozaburo Tanaka, (Sasuke Nakao監修) Tanaka's Cyclopedia of Edible Plants of the World, Keigaku Publishing Co.  日本、東京(1976年)； Stephen Facciola, Cornucopia IT ： A Source Book of Edible Plants, Kampong Publications, カリフォルニア州ビスタ (1998年) ； James A. Duke, Database of Phytochemical Constituents of GRAS Herbs and Other Economic Plants, CRC Press, フロリダ州ボーカラトーン (1992年)；そして、George Macdonald Hocking, Dictionaryof Natural Products, Plexus Publishing, Inc., ニュージャージー州メドフォード(1997年)。これらの参考文献の全体を本願に参照として包含する。
【００２４】
特に好ましい実施態様において、有機抽出物は、以下の植物目の植物から分離する： Agavales、リンドウ目(Apocynales)、サトイモ目(Arales)、キク目(Asterales)、Basidiomycetae、フウチョウソウ目(Brassicales)、ナデシコ目(Caryophyllales)、ソテツ目(Cycadales)、カキ目(Ebenales)、トウダイグサ目(Euphorbiales)、ブナ目(Fagales)、トチカガミ目(Hydrocharitales)、シソ目(Lamiales)、ユリ目(Liliales)、Loasales、アオイ目(Malvales)、フトモモ目(Myrtales)、ヤシ目(Palmales)、タコノキ目(Pandanales)、ケシ目(Papaverales)、コショウ目(Piperales)、Polemoniales、ヒメハギ目(Polygalales)、サクラソウ目(Primulales)、キンポウゲ目(Ranales)、クロウメモドキ目(Rhamnales)、バラ目(Rosales)、アカネ目(Rubiales)、ミカン目(Rutales)、ビャクダン目(Santalales)、ムクロジ目(Sapindales)、ゴマノハグサ目(Scrophulariales)、セリ目(Umbellales)、イラクサ目(Urticales)、およびスミレ目(Violales)。これらの特定の目の植物から分離した抽出物のＣＯＸ−2を阻害する能力、ＣＯＸ−2を選択的に阻害する能力およびその使用を以下の表1−2に示す。
【００２５】
本発明抽出物を製造するために、植物あるいはその器官を微粉末にひき、得られた粉末を溶媒で抽出し、そして抽出物から溶媒を除く。植物全体を用いることもできるし、あるいは地上部、果実、葉、茎または根およびそれらの任意の組み合わせを含む植物の器官を用いることもできる。所望であれば、得られた抽出物をさらに精製して、精製抽出物あるいは1以上の精製組成物を得ることもできる。粉末化ステップは、植物材料を粉末化するための任意の慣用法により達成することができる。例えば、植物あるいはその器官は、グラインダーを通過させて微細粉末とすることができる。
【００２６】
植物あるいはその器官を微細粉末にひいた後、それらを抽出溶媒と混合する。次いでその溶液を所望のＣＯＸ−2活性阻害作用を得るために効果のある温度と時間で撹拌する。この溶液は、加熱しすぎると抽出物中のタンパク質を分解および／または変性させる恐れがあるため、加熱しすぎないのが好ましい。溶液は室温(25℃)付近から抽出溶媒の沸点の間の温度で撹拌することができる。好ましくは、溶液は室温付近で撹拌する。
【００２７】
植物粉末を抽出溶媒にさらす時間の長さは重要ではない。ある点までは、植物粉末を抽出溶媒にさらす時間が長いほど回収される抽出物の量は多くなる。好ましくは、少なくとも1分間、さらに好ましくは少なくとも15分間、そして最も好ましくは少なくとも60分間撹拌する。
【００２８】
本発明の抽出法は、好ましくは有機溶媒あるいは有機溶媒の混合物を用いて行なう。本発明の抽出法に用いることのできる有機溶媒は、炭化水素溶媒、エーテル溶媒、塩素化溶媒、アセトン、酢酸エチル、ブタノール、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコールおよびその混合物を含むがこれに限定されない。本発明に使用できる炭化水素溶媒は、ヘプタン、ヘキサンおよびペンタンを含む。本発明に使用できるエーテル溶媒は、ジエチルエーテルを含む。本発明に使用できる塩素化溶媒は、ジクロロメタンおよびクロロホルムを含む。好ましくは、かかる抽出に用いる溶媒はジクロロメタンまたはヘキサンなどの非極性有機溶媒である。
【００２９】
本抽出法に用いる溶媒の相対量は、用いる特定の溶媒によって、かなり変化させることができる。一般的に、抽出する植物粉末各100gに対して、約500mlの抽出溶媒を用いる。抽出物からの有機溶媒は、例えばロータリーエバポレーターを用いるなどの化学界に公知の所望の生成物から有機溶媒を除去する任意の方法を用いて有機溶媒を除去することができる。
【００３０】
本発明の植物抽出物のCOX−2活性阻害作用は、抽出物中の1以上の化合物の存在に起因すると考えられる。抽出物中に存在し、COX−2を阻害する化合物は、当業界に公知の慣用法を用いて分離し精製することができる。例えば、本発明の植物抽出物から純粋化合物を得るためにカラムクロマトグラフィーおよび分別蒸留を用いることができる。
【００３１】
本発明の有機植物抽出物からの特定の化合物の分離および精製は、 Resch, et al., J. Nat. Prod., 61, 347-350 (1998) に記載の方法で行なうことができ、その全部を本明細書に参照として包含する。この参考文献に開示されている方法は、COX−2を阻害する組成物の分離および精製に使用できる。
【００３２】
特定の有機化合物のCOX−1またはCOX−2阻害能力は、好ましくは、組換えCOX−1およびCOX−2を用いるCOX活性アッセイを行なうことにより測定される。COX−1およびCOX−2遺伝子は、種々の生物からサブクローニングすることができるが、好ましい実施態様において、例えば、当業者に公知の種々の方法および Sambrook et al., Molecular Cloning,  A Laboratory Manual,(第二版), Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) および Ausabel et al., Short Protocols in Molecular Biology, (第三版), John Wiley & Sons (1995). に記載の方法を用いて、ヒトまたはマウスの供給源からかかる遺伝子が分離される。さらに、特定のCOX遺伝子のサブクローニング部分を種々の方法を用いてベクターに挿入することができる。好ましい方法において、当業者に公知の方法および例えばSambrook et al., Molecular Cloning,  A Laboratory Manual,(第二版), Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) および Ausabel et al., Short Protocols in Molecular Biology, (第三版), John Wiley & Sons (1995). に記載の方法を用いてバキュロウイルストランスファーベクターpVL1393の適切な制限エンドヌクレアーゼ器官に該配列を挿入することができる。
【００３３】
組換えバキュロウイルスは、線状化バキュロウイルスプラスミドＤＮＡを用いて、リン酸カルシウム法あるいは当業者に公知の他の任意の方法により、十分な量のＳＦ9昆虫細胞に適当量のバキュロウイルストランスファーベクターＤＮＡをトランスフェクトすることにより分離することができる(M. D. Summers and G. E. Smith, A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agric. Exp. Station Bull. 1555 (1987) を参照のこと)。組換えウイルスは、3回のプラーク精製により精製することができ、高力価(107-108pfu/ml)のウイルスストックを調整できる。
【００３４】
好ましくは、大量生産のために、細胞を、約10リットルのファーメンター(0．5Ｘ106/ｍｌ)において感染多重度を約0．1以上の条件で組換えウイルスストックを用いてインフェクトすることができる。数時間後、該細胞を遠心分離し、細胞ペレットをトリス/ショ糖(50ｍM/25％、pH8．0)などの適切な緩衝液中でホモジェナイズする。次いで、このホモジネートを適切な速度および適切な時間(例えば10，000XGで30分間)で遠心分離し、ホモジネートをペレットおよび上澄み分画に分ける。得られた上澄み分画は所望の生成物を含み使用するまで-80℃で保存することができる。
【００３５】
有機抽出物のＣＯＸ-2阻害および選択性を試験するために、当業者に公知のＥＬＩＳＡ法を用いる標準的なＣＯＸ-1およびＣＯＸ-2アッセイを用いることができる。かかる試験法において、アラキドン酸から合成されたＰＧＥ2量を検出するＥＬＩＳＡを用いて、生成ＰＧＥ2/μgタンパク質/時間としてＣＯＸ-1およびＣＯＸ-2活性を検定する。PGE2生成は、PGE2特異抗体を用いて測定することができる。非特異的COX-2/COX-1阻害剤であるインドメタシンを陽性対照として用いることができる。特定の濃度における種々の有機抽出物のCOX-1あるいはCOX-2の相対阻害能力を、PGE2産生の50％阻害をもたらすμg抽出物/ml溶媒として表すIC50値を比較することにより測定することができる。次いで、COX-2選択的阻害を、COX-1/COX-2のIC50の比により測定することができる。さらに、当業者に公知のCOX阻害測定法であればいずれも用いることができる。
【００３６】
本発明の抽出物は、COX-2により全体的にあるいは部分的に仲介される症状を有するあるいは発症する危険のある生物の管理、予防および/あるいは治療に用いることができる。従って、COX-2の阻害あるいはCOX-2の選択的阻害により利益を得る症状は、生物における炎症および他の炎症性疾患を含み、例えば疼痛および頭痛における鎮痛剤としてあるいは発熱の治療のための解熱剤として有用であるがこれに限定されない。例えば、本発明の抽出物は関節炎の治療に有用であり、リウマチ様関節炎、脊椎関節症、通風性関節炎、変形性関節症、全身性エリスマトーデス、および若年性関節炎を含むがこれに限定されない。かかる本発明の抽出物は、喘息、気管支炎、生理痛、腱炎、滑液包炎、皮膚関連症状(皮膚、乾癬、湿疹および皮膚炎など)ならびに白内障手術および屈折矯正手術などの眼手術を含む術後炎症の治療に有用である。本発明の抽出物はまた炎症性腸疾患、クローン病、胃炎、過敏性腸症候群および潰瘍性大腸炎などの消化器症状の治療に、ならびに結腸癌、乳癌、前立腺癌または肺癌などのタイプの癌を含む癌の治療にも有用であるがこれに限定されない。さらにもう一つの好ましい使用において、本発明の抽出物はまた、化学予防剤としても用いることができる。本発明の抽出物はまた、血管疾患、偏頭痛、結節性動脈周囲炎、甲状腺炎、再生不良性貧血、ホジキン病、強皮症、リュウマチ熱、Ｉ型糖尿病、重症筋無力症を含む神経筋接合部疾患、多発性硬化症を含む白質疾患、サルコイドーシス、ネフローゼ症候群、ベーチェット症候群、多発性筋炎、歯肉炎、腎炎、過敏症、損傷後に生じる腫れ、心筋虚血などの疾患における炎症の治療に有用である。本発明の抽出物はまた、網膜炎、網膜症、ブドウ膜炎、しゅう明、および眼組織への急性損傷などの眼疾患の治療に有用である。該抽出物はまた、ウイルス感染および嚢胞性線維症に伴う肺の炎症の治療に有用である。さらに、該抽出物は、アルツハイマー病を含む皮質痴呆などの中枢神経系疾患の治療に有用である。本発明の抽出物は、有害な副作用が大変に少ないというさらなる利点を有する、関節炎治療などのための抗炎症剤として有用である。これらの抽出物はまた、アレルギー性鼻炎、呼吸窮迫症候群、内毒素性ショック症候群、アテローム性硬化症、ならびに脳卒中、虚血および外傷に起因する中枢神経系損傷の治療に有用である。さらに該抽出物は、術後疼痛、歯痛、筋肉痛、および癌に起因する疼痛などの疼痛を含む治療に有用であるがこれに限定されない。
【００３７】
本抽出物はまた、単独での、あるいは従来の抗炎症剤を部分的にあるいは完全に換えて用いる併用療法の一部分として他の化合物との併用でのいずれかで使用することができる。例えば、ステロイド、NSAID、5-リポキシゲナーゼ阻害剤、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト、ＬＴＡ4ヒドロラーゼ阻害剤、およびLTC4シンターゼ阻害剤などと併用することができる。好ましくは、併用療法において、典型的には、単数あるいは複数の薬剤と本発明の植物抽出物などの栄養補助食品とを、薬剤と栄養補助食品が同一の疾患を標的とするが異なる作用メカニズムを有する方法で併用する。例えば、関節炎治療のための併用療法に使用する薬剤の標準的な選択において、選択的COX-2阻害作用を有する本発明の植物抽出物を、異なるメカニズムで関節炎に伴う炎症を抑えることが知られている他の薬剤と共に用いることができる。
【００３８】
医薬製剤の製造業者は、公知の医薬品添加物(例えば生理食塩水、グルコース、デンプンなど）を用いて植物抽出物を有する医薬組成物を容易に製剤化することができる。同様に、栄養製剤製造業者は、植物抽出物を含む栄養組成物を容易に製剤化することができる。そして、食品あるいは食品成分製剤業者は、植物抽出物を含む食品成分組成物を容易に製剤化することができる。
【００３９】
さらに、当業者は、経口、非経口、経直腸および他の投与剤形において所望の治療あるいは予防効果を得るために必要な適切な投与量を容易に決定することができる。標準的には、in vivo モデル(即ち、実験哺乳動物）を、炎症性症状の緩和を所望な程度に得るために必要な適切な血漿濃度を決定するために使用する。
【００４０】
前記で記載した炎症性疾患の治療および/または予防のために、本発明の抽出物を多くの生物において使用することができる。ヒトの治療に有用なことに加えて、これらの抽出物はまた、哺乳動物、げっ歯動物、鳥類などを含むペット動物、外来動物、および農園動物の獣医治療に有用である。さらに好ましい動物は、ウマ、イヌ、ネコ、ヒツジ、およびブタを含む。
【００４１】
前記で述べた詳細な説明は、本発明を実施する当業者を支援するために提供するものである。しかしながら、この詳細な説明は、本発明に記載の実施例における修飾および変形が、本発明の発見の精神および範囲から外れることなく当業者に行なうことができるので、本発明を不当に制限するものであると解釈してはならない。
【００４２】
本出願に引用した全ての出版物、特許、特許出願および他の引用文献は、各出版物、特許、特許出願および他の引用文献を具体的にかつ個別的に参照として援用するために示したと同様にその全体を本明細書に参照として援用する。
【００４３】
さらに推敲せずとも、当業者は、前記の記載を用いて、本発明を完全に利用できると考えられる。従って、以下の好ましい具体的な実施例は単に説明として解釈されるべきで、たとえどんな形であっても、本開示の残りの部分を限定するものと解釈してはならない。
【実施例】
【００４４】
試料調製
植物またはその器官を乾燥し、薄切りにした("試料")。有機抽出物試料は表1に記載した植物より調整した。種々の試料を調整した植物の目および科は表1に示してある。さらに、これらのうち、一部の植物の用途に関する詳細は表2に示してある。次いで、コーヒーグラインダーを用いて特定の試料を微細粉末にした。約100ｇの得られた粉末に約500ｍｌのジクロロメタンを加え、室温で約1時間撹拌した。次いで、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除き、数グラムの特定の抽出物を得た。
【００４５】
種々の植物有機抽出物のＣＯＸ-1およびＣＯＸ-2活性に対する阻害作用
前記の試料調整法により得られた特定の抽出物のそれぞれのＣＯＸ-1およびＣＯＸ-2阻害作用を評価した。ＣＯＸ-1およびＣＯＸ-2阻害活性をin vitro で Gierse et al., J. Biochem., 305,479-484 (1995) の方法に従って測定した。この方法を以下に要約する。
【００４６】
組換えＣＯＸバキュロウイルスの作製
D. R. O'Reilly et al., Baculoviruses Expression Vectors: A Laboratory Manual (1992) の方法に従って、ヒトまたはマウスのＣＯＸ-1コード領域を有する2，0ｋｂの断片を、バキュロウイルストランスファーベクター pVL1393 (Invitrogen) のBamH1器官にクローニングしてCOX-1のバキュロウイルストランスファーベクターを得ることにより組換えＣＯＸ-1バキュロウイルスを作製した。
【００４７】
次いで、リン酸カルシウム法により、(2 x 108) SF9 昆虫細胞に、200 μｇの線状化バキュロウイルスプラスミドDNAと共に4μｇのバキュロウイルストランスファーベクターDNAをトランスフェクトして組換えバキュロウイルスを分離した (M. D. Summers and G. E. Smith, A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agric. Exp. Station Bull. 1555 (1987)を参照のこと) .。3回のプラーク精製により組換えウイルスを精製し、高力価(107-108pfu/ml)のウイルスストックを作製した。
【００４８】
大量生産のために、10リットルファーメンター (0.5 x 106/ml) 中で、感染多重度0．1の条件でＳＦ9昆虫細胞を組換えバキュロウイルスストックで感染させた。72時間後、細胞を遠心分離し得られた細胞ペレットを1％の3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-l-プロパンスルホナート(CHAPS).を含有するトリス/ショ糖(50 mM/25%、pH 8.0)中でホモジナイズした。次いでホモジネートを10，000ＸGで30分間遠心分離し、得られた上澄みを使用するまで-80℃で保存した。
【００４９】
前述のCOX-1の場合と同一の方法に基づき、ヒトまたはマウスCOX-2のコード領域を含む2．0kbの断片をクローニングすることにより、組換えCOX-2を作製した。
【００５０】
COX-1およびCOX-2活性アッセイ
アラキドン酸から合成されるPGE2を検出するELISAを用いて、生成プロスタグランジンE2(PGE2)/μgタンパク質/時間としてCOX-1およびCOX-2活性を検定した。組換えCOX-1またはCOX-2酵素を含むCHAPS可溶化昆虫細胞膜を、エピネフリン、フェノール、およびヘムを含有するリン酸カリウム緩衝液(50mM、pH8．0)中でインキュベートした。化合物を適切な酵素と共に約10-20分間プレインキュベートした。次いでこの混合物にアラキドン酸(10μM)を加え、室温で(25℃）10分間反応させた。
【００５１】
10分後、40μlの反応混合物を160μlのELISA緩衝液および25μMのインドメタシンに加えアラキドン酸と酵素の間の全ての反応を停止した。非選択的COX-2/COX-1阻害剤であるインドメタシンを陽性対照として用いた。PGE2(Cayman Chemical)特異抗体を用いる標準的ELISA技術により、生成したPGE2を測定した。
【００５２】
各抽出物のCOX-1およびCOX-2阻害作用を測定するバイオアッセイのために、前記の試料調整法により得た各抽出物の約200ｍｇを、それぞれ2mlのジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解した。PGE2産生の50％阻害をもたらすμg抽出物/ml溶媒で表されるIC50値により効力を測定した。COX-2の選択的阻害をCOX-1/COX-2のIC50比により測定した。記載した植物群から分離した抽出物を用いて行なったこれらのバイオアッセイの結果を以下の表1および図1-7に示す。
【００５３】
記載した目、科、属、および種から分離した植物抽出物のスクリーニング結果を以下の表1に示す。一次スクリーニング(表1において、1°アッセイとして表示)は、10μg/mlの濃度においてCOX-2を阻害する特定の抽出物を測定するために行なった。次いで、異なる3つの濃度(10μg/ml、3．3μg/mlおよび1．1μg/ml)におけるCOX-2阻害強度を測定するために抽出物の確認スクリーニングを行なった。ついで10μg/mlの濃度における抽出物のCOX-1阻害力を測定した。、それぞれの縦の段にCOX阻害比率をパーセント表示で示すが、ここで、高い比率は高い程度のCOX阻害を示す。さらに、表1に記載するように、特定の抽出物のCOX-1およびCOX-2のIC50値を測定した。次に、前記のように、COX-1/COX-2のIC50比によりこれらの抽出物の選択性を決定した。IC50値を測定しなかった抽出物のCOX-2選択性は、COX-1阻害パーセント(10μg/mlの濃度)をCOX-2阻害パーセント(10μg/mlの濃度)で割ることにより計算できる。
【００５４】
【表１】
2004529079.tif 000003
【００５５】
【表２】
2004529079.tif 000004
【００５６】
【表３】
2004529079.tif 000005
【００５７】
【表４】
2004529079.tif 000006
【００５８】
*一次スクリーニングは３種濃度で行った。一回のCOX-2確認アッセイ中で試料の反復はしなかった。
**アッセイエラーによりデータなし。
***試験せず。
1BrassicalesはSapindales又はRutalesとしても分類される。
2BrassicaceaeはCruciferaeとしても分類される。
5ApiaceaeはUmbelliferaeとしても分類される。
6BoraginaceaeeはCordiaceae又はEhretiaceaeとしても分類される。
7PolemonialesはSolanalesとしても分類される。
8BombaceaeはBombacaceaeとしても分類される。
9PandanalesはArales又はAlismatalesとしても分類される。
【００５９】
各植物抽出物の目、科、属、および種を示した。
表1のデータに示すように、記載した植物目から分離した有機抽出物はＣＯＸ-2を阻害する。実際、抽出物のいくつかはＣＯＸ-1に対してＣＯＸ-2を10倍以上選択的に阻害する。
【００６０】
以下の表2に、表1に述べた様にCOX-2阻害作用を試験した一部の植物抽出物の特定の用途を説明した。さらに、当業界に公知の参考文献の総合目録を記載した。
【００６１】
【表５】
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【００６２】
【表６】
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【００６３】
【表７】
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【００６４】
【表８】
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【００６５】
【表９】
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【００６６】
【表１０】
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【００６７】
【表１１】
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【００６８】
【表１２】
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【００６９】
【表１３】
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【００７０】
【表１４】
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【００７１】
【表１５】
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【表１６】
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【００７３】
【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【００７７】
【表２１】
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【００７８】
参考文献
1． NAPRALERT (NATural Products ALERT)
1650Ａ．Ｄ．から現在までの116，000以上の科学研究論文および本からの抽出情報を現在収納している。NAPRALERTデータベースは、Department of Medicinal Chemistry and Pharmacognosy (PCRPS) (College of Pharmacy of the University of Illinois at Chicago, 833 South Wood Street (M/C 877) 米国イリノイ州シカゴ60612）により収納し保存されている。
2．. Tyozaburo Tanaka, (Sasuke Nakao監修) Tanaka's Cyclopedia of Edible Plants of the World, Keigaku Publishing Co.  日本、東京(1976年)
世界の重要な野生種を含む11，000種の植物の概説である。この本は、世界の食用植物に関する主要な参考文献の一つと考えられる。
3. Stephen Facciola, Cornucopia II ： A Source Book of Edible Plants, Kampong Publications, カリフォルニア州ビスタ (1998年)
この本は米国および米国以外の国で得られる3，000種以上を記載している。
4. James A. Duke, Database of Phytochemical Constituents of GRAS Herbs and Other Economic Plants, CRC Press, フロリダ州ボーカラトーン (1992年)
約1000種の植物と約3000種の化合物のデータベース。
5. George Macdonald Hocking, Dictionaryof Natural Products, Plexus Publishing, Inc., ニュージャージー州メドフォード(1997年)
"天然の医学薬学物質とその起源となる植物、動物および鉱物に関する生薬学の領域の用語"。この文献は、18，000以上の項目を有する。
6. Enrique Sanchez-Monge, Flora Agricola ： Taxonomia de las Magnoliofitas (Angiospermas) de interes agricola, con excepcion de las de aprovechamiento exclusivamente ornamental o forestall, Ministerio de Agriculture, Pesca y Alimentacion, スペイン・マドリッド(出版年不明).
植物と多言語における一般名と世界の農業生物の商業用途を記載したスペイン語で書かれた優れた参考文献。
7. Anthony R. Torkelson, The Cross Name Index to Medicinal Plants, Volumes !-IV, CRC Press, フロリダ州ボーカラトーン (1998-1999).
8. Umberto Quattrocchi, CRC World Dictionary of Plant Names ： Common Names, Scientific Names, Eponyms, Synonyms, and Etymology (Volumes 1-4), CRC Press, フロリダ州ボーカラトーン (2000).
9. W3TROPICOS   Missouri Botanical Garden's VAST (VAScular Tropicos) の命名データベースおよび関連出典ファイルへのアクセスを提供するウェブサイト。
10. Webster's Ninth New Collegiate Dictionary, Merriam-Webster Inc., マサチューセッツ州スプリングフィールド (1983).
表1で特定した群から分離した特定の抽出物のＣＯＸ-2選択的阻害能力を、表3-9でさらに例をあげる。種々の抽出物を用いて全部で6つの異なる濃度でＣＯＸ-1およびＣＯＸ-2の両方の阻害能力を試験した。ＣＯＸ-1およびＣＯＸ-2のＩＣ50値も決定し、次いで前記のように選択比を計算した。図1-7は表3-9に示したデータをグラフで示したものである。
【００７９】
【表２２】
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【００８０】
【表２３】
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【００８１】
【表２４】
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【００８２】
【表２５】
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【００８３】
これらのデータに例証されるように、記載した植物から分離した有機抽出物は、ＣＯＸ−2を阻害する。実際、全ての抽出物はＣＯＸ−1に対してＣＯＸ−2を10倍以上選択的に阻害した。前記を考慮すれば、本発明のいくつかの目的が達成され、かつ他の好都合な結果が達成されていることが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】トリチリア・ヒルタ(Trichilia hirta)から分離した植物抽出物によるＣＯＸ-2＞ＣＯＸ-1阻害を示す。
【図２】カプシクム・フルテスケンス(Capsicum frutescens)から分離した植物抽出物によるＣＯＸ-2＞ＣＯＸ-1阻害を示す。
【図３】トラデスカンチア・バージニアナ(Tradescantia virginiana)から分離した植物抽出物によるＣＯＸ-2＞ＣＯＸ-1阻害を示す。
【図４】テフロシア・プルプレア(Tephrosia purpurea)から分離した植物抽出物によるＣＯＸ-2＞ＣＯＸ-1阻害を示す。
【図５】ドラコントメロン・マンギフェルム(Dracontomelon mangiferum)から分離した植物抽出物によるＣＯＸ-2＞ＣＯＸ-1阻害を示す。
【図６】エリスリナ・ルブリネルビア(Erythrina rubrinervia)から分離した植物抽出物によるＣＯＸ-2＞ＣＯＸ-1阻害を示す。
【図７】ピソニア・アクレアタ(Pisonia aculeata)から分離した植物抽出物によるＣＯＸ-2＞ＣＯＸ-1阻害を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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