(57)【要約】本発明は、冠動脈性心臓病、特に安定狭心症および不安定狭心症、急性心筋梗塞、心筋梗塞予防、突然心臓死、心不全および高血圧、並びにアテローム性動脈硬化症によって引き起こされる状態の治療および／または予防のための医薬の製造のためのＡＰＪ受容体アゴニストの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
冠動脈性心臓病、高血圧、アテローム性動脈硬化症の合併症の処置および／または予防のための医薬の製造のためのＡＰＪ受容体アゴニストの使用。
【請求項２】
冠動脈性心臓病が、安定狭心症および不安定狭心症、急性心筋梗塞、心筋梗塞予防、突然心臓死および心不全である、請求項１記載の使用。
【請求項３】
ＡＰＪ受容体アゴニストのＥＣ５０が１μＭ未満である、請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
ＡＰＪ受容体アゴニストのＥＣ５０が１００ｎＭ未満である、請求項１または２記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、冠動脈性心臓病、特に安定狭心症および不安定狭心症、急性心筋梗塞、心筋梗塞予防、突然心臓死および心不全、高血圧、並びにアテローム性動脈硬化症の合併症の治療および／または予防のための医薬の製造のためのＡＰＪ受容体アゴニストの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
絶え間なく働く中空の筋肉として、心臓は、そのエネルギー需要をカバーするために、とりわけ集中的な酸素の供給を必要とする。したがって、供給の障害は酸素輸送に第一に関係し、血流の適応能力が減少すれば酸素の輸送が不十分になりうる。酸素消費の増大は、心臓への血流の増大によってのみカバーすることができる。
【０００３】
安定狭心症および不安定狭心症などの冠動脈性心臓病、心不全、心筋梗塞、突然心臓死およびアテローム性動脈硬化症の合併症においては、心臓組織の部分への適当な血流はもはや確保されず、組織の虚血が起こり、傷害を受けた領域の壊死とアポトーシスにつながる。これは、心不全にも進展しうる心筋梗塞をもたらす。
【０００４】
冠血流、したがって酸素の供給を改善する一方、酸素消費を減少させる治療法および活性成分は、上記の障害の症状の処置に適当である。
【０００５】
これらには、大きい冠動脈の拡張、冠動脈の抵抗性の血管外要素の減少、心筋内壁張力の減少、大循環における細動脈抵抗性血管の拡張が含まれる。
【０００６】
心臓の冠血流の増大および／または血圧の減少につながる物質および方法は、治療に利用することができる (Forth, Henschler, Rummel; Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie; Urban & Fischer Verlag (2001), Munich)。
【０００７】
上記の効果は、Ｇタンパク質共役型受容体の刺激により調節することができる。Gタンパク質共役型受容体は、その活性化が種々のＧタンパク質の活性化につながる、７回膜貫通ドメインタンパク質である。活性化されたＧタンパク質は、種々の他のシグナル伝達系を活性化または不活性化することができ、上記のメカニズムの誘発につながる。Ｇタンパク質は、Ｇαs(アデニリルサイクラーゼ活性化)、Ｇαi (アデニリルサイクラーゼ阻害)およびＧαq（ＩＰ３の増大）に分類することができる。
【０００８】
ヒトＡＰＪ受容体をコードするＤＮＡ配列を、配列表の配列番号１に示す。ヒトＡＰＪ受容体のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示す。ＡＰＪ受容体は、Ｇαｉ共役型受容体であり(O'Dowd et al., Gene, 136 (1993) 355-360)、とりわけ、その天然のリガンドであるアペリンによって活性化される (Tatemoto et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 251 (1998) 471-476)。この受容体は、ＡＴ１（アンジオテンシン）受容体と３０％相同であるが、アンジオテンシンによって活性化されない。
【０００９】
ラット（ＷＯ００６８２５０に記載）およびマウス(ＷＯ００６８２４４に記載）のＡＰＪ受容体は、脳およびその他の組織の多くの領域に偏在的に発現する（Hosoya et al., The Journal of Biological Chemistry, 275 (2000) 21061-21067; O'Carroll et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1492 (2000) 72-80）。ヒトにおいては、この受容体の発現は、脾臓、胸腺、前立腺、精巣および消化管では減少している (Edinger et al., Journal of Virology, 72 (1998) 7934-7940)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
意外にも、ヒトＡＰＪ受容体ｍＲＮＡ発現の定量的分析において、この受容体の発現が数少ない組織に限定されること、ヒトの心臓におけるこの受容体の発現が顕著であることを見出した（図１）。さらに、ＡＰＪ受容体が、健常者とＤＣＭ（ＤＣＭ＝拡張型心筋症)の心臓の両方でみられることが分かった（図２）。疾患を有する心臓におけるヒトＡＰＪ受容体の発現は、冠動脈性心臓病を有する患者においてこの受容体を刺激する活性成分を使用するための条件であるので、この結果は新しい治療方法の基礎を作る。受容体発現の減少は、例えば、心不全におけるβ１アドレナリン受容体について知られているように(Chakraborti et al., Cellular Signaling, 12 (2000) 499 513)、その治療的刺激の可能性が除外されることを意味している。
【００１１】
天然のリガンドであるアペリンのラットにおける全身投与は、心拍数の変化なしに血圧を低下させることが知られている（Lee et al., Journal of Neurochemistry, 74 (2000) 34-41; Tatemoto et al., Regulatory Peptides 99 (2001) 87-92)。このリガンドのラットの脳への直接の投与は、脱水（dehydrogenated）ラットにおいて、血圧に対する影響なしに水取り込みの阻害をもたらす (Reaux et al., Journal of Neurochemistry, 77 (2001) 1085-1096)。したがって、この血圧の減少は、血管の受容体の直接的な刺激によって誘導されるようである。
【００１２】
意外にも、アペリンの全身投与は、イヌにおいて、ボーラスおよび継続的注入の両方で、心拍数の変化を引き起こすことなく、濃度依存的で非常に顕著な冠血流の増大をもたらす（図３、４）。冠血流におけるこの増大は、同様に観察される血圧の反映された減少程度を超えている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
この新たな結果を基礎として、我々は、ＡＰＪ受容体を刺激する物質は、それによってもたらされる冠血流の増大のために、ヒトにおける、安定狭心症および不安定狭心症、急性心筋梗塞、心筋梗塞予防、心不全、突然心臓死、および高血圧並びにアテローム性硬化症の合併症の処置および／または予防に用いることができると結論付けた。
【００１４】
したがって、本発明は、上記の疾患の処置および／または予防のための医薬の製造のためのＡＰＪ受容体アゴニストの使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明が目的とするアゴニストは、本受容体の生物学的活性の刺激をもたらす全ての物質である。特に好ましいアゴニストは、固定された（locked）核酸、ペプチド核酸および「スピーゲルマー（spiegelmer）」を含む、核酸、抗体を含むタンパク質および低分子量の物質であり、とりわけ好ましいアゴニストは低分子量の物質である。
【００１６】
刺激は、例えば、以下に記載するＡＰＪ刺激試験において測定することができる。これに関連して、アデニル酸サイクラーゼの刺激によって上昇するｃＡＭＰレベルにおいて少なくとも１０％の減少がこの試験で測定されれば、ＡＰＪ受容体の刺激が存在し、とりわけフォルスコリンまたはアドレナリン受容体を介して刺激を引き起こすことができる。
【００１７】
ＡＰＪ受容体アゴニストは、ヒトＡＰＪ受容体を含む組換え細胞系に対して試験することができる。
【００１８】
これに関連して好ましいＡＰＪアゴニストは、以下に記載するＡＰＪ刺激試験においてＥＣ５0１μＭ、好ましくは０．１μＭ未満で活性化するものである。
【００１９】
本発明のＡＰＪ受容体アゴニストは、好ましくは血液／脳関門を通過することができず、全身に作用するが脳には作用しない。
【００２０】
ＡＰＪ刺激試験
アペリンおよび他の可能なＡＰＪアゴニストの効果を、ヒト受容体遺伝子の完全なオープンリーディングフレームを組み換えタンパク質として安定して発現するＣＨＯ細胞系に対して試験する。この細胞系はフォルスコリンにより活性化されると、内因的ｃＡＭＰレベルが増大する。この増大は、組換えにより発現したＡＰＪ受容体の刺激を介するアペリンの同時または事前投与および、アデニル酸サイクラーゼの、それによりもたらされる阻害によって、阻止することができる。
【００２１】
１５００個のＣＨＯ細胞／ウェルを、10％ FCS (ウシ胎児血清, Gibco)を加えたＤＭＥＭ培地（Gibco）中で３８４ウェルのプレート(Greiner)に加え、３７℃、５％ＣＯ2にて２日間培養する。細胞をアペリン希釈液（典型的に１０-10〜１０-13Ｍの連続希釈）とインキュベーションした後、１０-５Ｍフォルスコリンで刺激する。ｃＡＭＰレベルをｃＡＭＰスクリーンキット（Tropix (PE Biosystems)）を用いて、説明書に従って測定し、アペリンの影響を、フォルスコリンによる刺激後の最大のｃＡＭＰ上昇の阻害の百分率で表示する。アペリンの効果のＥＣ５0は、フォルスコリンシグナルの５０％が阻害される値である。
【００２２】
１０-１１ＭのＥＣ５0をアペリンに対して測定する。
【００２３】
ヒトにおけるＡＰＪ受容体発現の試験
ヒト組織におけるＡＰＪ受容体の相対的発現は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応 (いわゆる、TaqMan-PCR, Heid et al., Genome Res 6 (10), 986-994) によりｍＲＮＡを定量することにより測定する。慣用のＰＣＲと比較して、リアルタイムＰＣＲは、さらなる蛍光標識されたオリゴヌクレオチドの導入により、定量がより正確であるという利点を有する。このいわゆるプローブは、蛍光色素であるＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレセイン)を５'末端に、蛍光クエンチャーTAMRA (６−カルボキシ−テトラメチルローダミン）を３'末端に有する。TaqMan PCRでのポリメラーゼ連鎖反応の間、蛍光色素のFAMは、Taqポリメラーゼの５'−エキソヌクレアーゼ活性によりプローブを切断し、その前にクエンチされた蛍光シグナルが残存する。蛍光強度がバックグラウンドの蛍光に対して約１０の標準偏差であるサイクル数をいわゆる閾値 [閾値サイクル数(Ct)]として記録する。
【００２４】
ＰＣＲに用いる出発物質は、商業的に入手した(Clontechより入手)細胞ＲＮＡである。ヒトの心臓の場合、外殖片心臓の小片(約０．５ｇ)を拡張型心筋症の患者から単離し（Deutsches Herzzentrum Berlinから入手）、全ＲＮＡを、説明書にしたがってRNaseyカラム（Qiagenから入手）を用いてそこから単離する。各場合において、各組織由来のＲＮＡの合計１μgを１単位のDNaseＩ（Gibcoより入手)と室温で１５分間反応させて、ゲノムＤＮＡコンタミネーションを取り除く。Dnase I は、１μLのEDTA (25 mM)を添加した後、６５℃（１０分間）に加熱することにより不活化する。
【００２５】
次いで、ｃＤＮＡ合成を、「SUPERSCRIPT-II RT cDNA 合成キット」(Gibcoより入手)の説明書にしたがって同じ反応混合物において行い、蒸留水で反応溶液の体積を２００μLにする。ＰＣＲについて、プライマーとプローブの混合物７．５μL、12.5 μLのTaqMan 反応溶液[Universal Master Mix (Applied Biosytemsより入手）]を、希釈したｃＤＮＡ溶液の一部5μLに加える。各場合におけるプライマーの終濃度は３００ｎＭであり、プローブの終濃度は１５０ｎＭである。ＡＰＪ受容体に対するフォワードおよびリバースプライマーの配列は、５’−ＴＣＣＣＡＧＧＡＧＴＡＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣ−３’および５’−ＣＣＴＴＣＡＡＧＧＧＴＣＣＴＧＴＣＡＧＣ−３’であり、蛍光プローブの配列は、５’−６ＦＡＭ−ＡＧＡＧＧＴＴＧＴＴＴＴＴＧＣＣＡＡＧＡＡＴＣＡＣＡＧＡＡＴＧＴＴＡ−ＴＡＭＲＡ−３’である。ＰＣＲは、ＡＢＩプリズムＳＤＳ７７００装置(Applied Biosystemsより入手)にて、製造業者の説明書に従って行なう。４０サイクルを行う。各組織についてＡＰＪ受容体について得られたＣｔ(上記参照)は、遊離したプローブの蛍光強度がバックグラウンドシグナルの１０倍に達するサイクルに対応する。したがって、低いＣｔは、複製の早いスタート、即ち最初のサンプルにより多くのｍＲＮＡが存在していることを意味する。ｃＤＮＡ合成の可能性のある変化を補正するためにさらに、いわゆる「ハウスキーピング遺伝子」の発現を、試験した全ての組織において解析する。この遺伝子の発現は、全ての組織においてほぼ同じである。ＡＰＪ受容体発現の標準化のために、β−アクチンを用いる。β−アクチンについてのフォワードおよびリバースプライマーは、５’−ＴＣＣＡＣＣＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＴＧＴＧ−３’、および５’−ＣＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣ−３’であり、プローブの配列は、５’−６ＦＡＭ−ＡＴＣＡＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＡＧＴＡＴＧＡＣＧＡＧＴＣＣＧ−ＴＡＭＲＡ−３’である。データは、ＡＢＩプリズムＳＤＳ７７００装置(Applied Biosystemsより入手)の説明書に従って、いわゆるｄＣｔ法により解析する。ＡＰＪ受容体の組織分布をグラフで示すために、最も低い相対的発現を有する組織を１とし（図１）、全ての他の組織をそれに対して標準化する。Ctが３５を超える組織は示さない。心臓におけるＡＰＪ受容体の発現を解析するために、健常な対照の心臓の平均相対的発現を１とし、ＤＣＭ心臓の平均と比較する（図２）。
【００２６】
ヒトＡＰＪ受容体発現のデータは、心臓においてこの受容体が３１．６４のＣｔを有し、心臓におけるこの受容体の平均発現に対応することを示している。健常組織およびＤＣＭ組織におけるｍＲＮＡの量の比較は、ＤＣＭ心臓における受容体発現に有意の減少が見られなかったことを示し、アゴニストによる受容体の刺激もまた、冠動脈性心臓病を有する患者に対して治療的に用いることができることを示している。
【００２７】
アペリンによるＡＰＪ受容体の刺激のインビボ実験
まず、FBI (Foxhound-Beagle-Irish-Setter)の成犬(20〜30ｋg)をチオペンタールＮａ (Trapanal, Byk-Gulden) 20〜30ｍg／ｋg（i.v.）で麻酔する。塩化アルクロニウム (Alloferin, Roche) 0.1 mg/kg を最初に静脈内投与して筋肉を弛緩させる。動物に挿管し、Engstroem呼吸ポンプを用いて、15〜18回／分にて1/3 O2／Ｎ2Ｏ混合物18〜24 ml/ｋgを呼吸させる。動脈のＣＯ2分圧にしたがって呼吸を自動的に設定し、平均ｐＣＯ￥2を35〜45 mmHgに維持する。イソフルラン(Baxter)１．５〜３％を用いて維持麻酔を行なう。体温を３８℃±０．１℃に維持する。動脈血圧を大腿動脈内でカテーテルにより測定する。左側の第５肋骨間隙にて開胸を行なう。肺を縮めて固定し、心膜を切除する。第一対角枝から遠位のLAD (左冠動脈)の近接部を露出させ、校正済みの電磁血流プローブ (Gould Statham, model SP7515) を血管の周囲に配置し、血流計(Statham, model SP-2202)と接続する。閉塞機構を、血流プローブと閉塞機構との間に分岐が存在しないように、血流プローブの遠位に取り付ける。
【００２８】
血液を採取し、物質を大腿静脈のカテーテルから投与する。末梢ＥＣＧを皮下に固定した針で記録する。マイクロチップ血圧計 (Millar モデルPC-350)が左心房を介して押され左心室の圧が測定される。心拍数の測定は、ＥＣＧのＲ波によって制御する。実験の間、血流力学的パラメータおよび冠血流をマルチチャンネルのレコーダで測定する。
【００２９】
実験は１時間の安定化期間の後に開始する。生理食塩水中の１０μg／ｋgアペリンを静脈内へボーラス投与するか、または種々のアペリン濃度(1、3、5、10μg／ｋg／分)を１０分間かけて注入する。心拍数、血圧および冠血流を記録し、解析する。
【００３０】
アペリンのボーラス投与および注入の両方とも、血圧が減少するにもかかわらず、イヌにおいて冠血流の有意の増大をもたらす(図３)。アペリン注入は、冠血流の用量依存的な増大を示し、最大で３μg／ｋg／分に達する（図４）。
【００３１】
ＡＰＪ受容体アゴニスト製剤
ＡＰＪ受容体アゴニストは、周知の方法により、不活性な、非毒性の、製薬的に適当な担体または溶媒を用いて、錠剤、被覆錠剤、丸剤、顆粒、エアロゾル、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、および溶液剤等の慣用的な製剤にすることができる。これらの場合では、治療的に活性な化合物は、完全な混合物の０．５〜９０重量％の濃度、即ち、所定の投与量範囲に達するに十分な量で存在することができる。
【００３２】
製剤は、例えば、乳化剤および／または分散剤を適当に用いて、活性成分を溶媒および／または担体で希釈することにより、製造し、例えば水を希釈剤として用いる場合、有機溶媒を補助的な溶媒として用いることができる。
【００３３】
投与は、慣用の方法、例えば、経口、経皮、静脈内、または非経口、特に経口または静脈内で行なう。但し、例えばスプレーにより口または鼻を介する吸入、または皮膚を介して局所的に投与することもできる。
【００３４】
一般に、効果的な結果を達成するために、約０．００１〜１０ｍg／ｋgの量、経口投与では好ましくは約０．００５〜３ｍg／ｋg体重で投与することが有用であることが分かっている。
【００３５】
しかしながら、特に、体重または投与形態、医薬に対する人の行動、その製剤の性質、投与を行なう時間または間隔に応じて、規定の量を逸脱することが適当な場合も必要であるかもしれない。したがって、ある場合では、上記の最低量よりも少ない量で十分であるかもしれないし、別の場合では規定した上限の量を上回るかもしれない。大量を投与する場合は、１回量を１日に数回に分割することが望ましいかもしれない。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ヒト組織におけるヒトＡＰＪ受容体の相対的発現。
【図２】健常およびＤＣＭ（拡張型心筋症）の心臓組織におけるヒトＡＰＪ受容体の相対的発現の比較。
【図３】イヌにおける血圧（ＢＰ）、心拍数（ＨＲ）および冠血流に対するアペリンのインビボのボーラス投与の効果。
【図４】イヌにおける血圧（ＢＰ）、心拍数（ＨＲ）、および冠血流に対する、種々のアペリン濃度の１０分間注入の効果。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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2004537582.tif 000037
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