(57)【要約】本発明はハンゲショウより分離したアリストラクタム系アルカロイド誘導体を含有する退行性脳神経系疾患の予防および治療用薬剤学的製剤に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハンゲショウを有機溶媒を用いて抽出し、溶媒を除去して得られた退行性脳神経系疾患の予防および治療用のハンゲショウエキス。
【請求項２】
有効成分としてのハンゲショウエキスを薬剤学的製剤の製造のため担体と一緒に含む退行性脳神経系疾患の予防および治療用薬剤学的製剤。
【請求項３】
次の一般式（Ｉ）の化合物の退行性脳神経系疾患の予防および治療剤としての用途；
2004511525.tif 000015
式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ水素原子、炭素数１〜４の低級アルキル基または
2004511525.tif 000016
（式中、
Ｒ５は水素原子または炭素数１〜４の低級アルキル基であり、Ｒ６は水素原子、水酸基または炭素数１〜４の低級アルキル基である。）であって、Ｒ３は水素原子または炭素数１〜４の低級アルキルである。
【請求項４】
有効成分としての一般式（Ｉ）の化合物を薬剤学的製剤の製造のため担体と一緒に含む退行性脳神経系疾患の予防および治療用の薬剤学的製剤；
2004511525.tif 000017
式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ水素原子、炭素数１〜４の低級アルキル基または
2004511525.tif 000018
（式中、
Ｒ５は水素原子または炭素数１〜４の低級アルキル基でり、Ｒ６は水素原子、水酸基または炭素数１〜４の低級アルキル基である。）であって、Ｒ３は水素原子または炭素数１〜４の低級アルキルである。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は退行性脳神経系疾患の予防および治療効果を有するハンゲショウ抽出物（Ｓａｕｒｕｒｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｅｘｔｒａｃｔ）および該抽出物を活性成分として含有する薬学的製剤に関する。
【０００２】
さらに、本発明は、退行性脳神経系疾患の予防および治療効果を有する次の一般式（Ｉ）で示される化合物の用途に関する。
【０００３】
2004511525.tif 000003
【０００４】
式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ水素原子、炭素数１〜４の低級アルキル基または
【０００５】
2004511525.tif 000004
【０００６】
（式中、
Ｒ５は水素原子または炭素数１〜４の低級アルキル基でり、Ｒ６は水素原子、水酸基または炭素数１〜４の低級アルキル基である。）であって、Ｒ３は水素原子または炭素数１〜４の低級アルキルである。
【０００７】
（背景技術）
最近、高齢者の増加につれ退行性脳神経系疾患の患者が急増している。代表的に退行性脳神経系疾患による老人性痴呆が挙げられる。老人性痴呆は記憶力の喪失、学習能力の低下が主な症状の疾患で患者は無論その家族にも大きな苦労を与え社会的な問題に発展し、その予防および治療に対する関心は高まる一方である。さらに、生命科学と科学技術の急速な発達で人々の生活は質的に向上したが、これによる成人病の発病率もまた高くなり二次的な症状による退行性脳神経系疾患、たとえば脳卒中の発病率もまた高まりつつある。このように退行性脳神経系疾患の発病は様々な原因によって継続的に増加しているものの、未だこれら疾患の効果的な予防および治療可能な医薬品は開発されていないと言っても過言ではない。
【０００８】
退行性脳神経系疾患は脳震盪や老化による脳神経系の構造的な退化、循環器障害など他の成人病に起因する二次的症状、あるいは交通事故、労働災害、一酸化炭素中毒など多様な物理的、機械的要因によって脳が損傷を受けると起り得る疾患である。（Ｒｏｔｈｍａｎ ＳＭ．（１９８４）Ｓｙｂａｐｔｉｃ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ ｍｅｄｉａｔｅｓ ａｎｏｘｉｃ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｅａｔｈ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ４： １８８４−１８９１； およびＷｅｉｌｏｃｈ， Ｔ． （１９８５）Ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄａｍａｇｅ ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ ｂｙ ａｎ ＮＭＤＡ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０： ６８１−６８３）．
【０００９】
前記の理由によって脳への血流量が減少するか、脳への血液の供給が遮断され脳組織が低酸素、低ブドウ糖状態になると、脳は正常代謝ができなくなり結局は回復不可能な損傷を受けるが、かかるケースは脳卒中、トラウマ、虚血性損傷及び退行性脳神経系疾患でよく見られる。（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｅ， Ｈ．， Ｄｒｅｊｅｒ， Ｊ．， Ｓｃｈｏｕｓｂｏｅ， Ａ． および Ｄｉｅｍｅｒ， Ｎ． Ｈ． （１９８４） Ｅｌｅｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ａｎｄ ａｓｐａｒｔａｔｅ ｉｎ ｒａｔ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ ｂｙ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ４３： １３６９−１３７４； およびＨａｇｂｅｒｇ， Ｈ．， Ｌｅｈｍａｎｎ， Ａ．， Ｓａｕｃｂｅｒｇ， Ｍ．， Ｎｙｓｔｒｏｍ， Ｂ．， Ｊａｃｏｂｓｏｎ， Ｉ． およびＨａｍｂｅｒｇｅｒ， Ａ． （１９８５） Ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｈｉｆｔ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｎｄ ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｆｒｏｍ ｉｎｔｒａ− ｔｏ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ． Ｊ． Ｃｅｒｅｂ． Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ ＆ Ｍｅｔａｂ． ５： ４１３−４１９）。
【００１０】
脳組織の損傷は大きく２種類のメカニズムに大別できる。一つは細胞膜の電圧の変化による興奮性アミノ酸遊離の増加によるものと、二つは直接的な酸化的ストレスによるものである。（Ｃｈｏｉ， Ｄ． Ｗ． （１９８８） Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ． Ｎｅｕｒｏｎ １： ６２３−６３４； およびＣｏｙｌｅ， Ｊ． Ｔ． およびＰｕｒｒｆａｒｃｋｅｎ， Ｐ． （１９９３）． Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ， ｇｌｕｔａｍａｔｅ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２： ６８９−６９５）最近の研究によると、グルタミン酸塩は筋収縮性の受容体を活性化することによって酸化的ストレスを引き起こす主な原因物質として考えられ、グルタミン酸塩は発作、外傷および虚血性損傷の発病原因として考えられている。（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ， Ｂ およびＧｕｔｔｅｒｉｄｇｅ Ｊ． Ｍ． （１９８５ａ） Ｏｘｙｇｅｎ ｒａｄｉｃａｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ５： ２２−２６； およびＨａｌｌｉｗｅｌｌ， Ｂ およびＧｕｔｔｅｒｉｄｇｅ Ｊ． Ｍ． （１９８５ｂ） ．Ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌｓ ａｎｄ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ． Ｍｏｌ． Ａｓｐｅｃｔｓ Ｍｅｄ． ８： ８９−１９３）。脳の血流量が減少すると、神経接合部でグルタミン酸塩の遊離が増加し、神経細胞内への流入が減少して細胞外のグルタミン酸塩の濃度が急速に増加しながら毒性を誘発し結局は神経細胞は死滅する。（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｅ， Ｈ．， Ｄｒｅｊｅｒ， Ｊ．， Ｓｃｈｏｕｓｂｏｅ， Ａ． およびＤｉｅｍｅｒ， Ｎ． Ｈ． （１９８４） Ｅｌｅｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ａｎｄ ａｓｐａｒｔａｔｅ ｉｎ ｒａｔ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ ｂｙ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ４３： １３６９−１３７４； およびＨａｇｂｅｒｇ， Ｈ．， Ｌｅｈｍａｎｎ， Ａ．， Ｓａｕｃｂｅｒｇ， Ｍ．， Ｎｙｓｔｒｏｍ， Ｂ．， Ｊａｃｏｂｓｏｎ， Ｉ． およびＨａｍｂｅｒｇｅｒ， Ａ． （１９８５） Ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｈｉｆｔ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｎｄ ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｆｒｏｍ ｉｎｔｒａ− ｔｏ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ． Ｊ． Ｃｅｒｅｂ． Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ ＆ Ｍｅｔａｂ． ５： ４１３−４１９）。かかるグルタミン酸塩による神経毒性は極めて協力且つ迅速に発現する“急性毒性”と低濃度のグルタミン酸塩に露出したか、高濃度のグルタミン酸塩に短時間に露出した場合に発現する“慢性毒性”に分かれる。（Ｃｈｏｉ， Ｄ． Ｗ． （１９８８） Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ． Ｎｅｕｒｏｎ １： ６２３−６３４）。急性毒性は��胞外に存在するＣａ２＋が細胞内に過量に流入して始まり、細胞の浸透圧維持のために続けてＮａ＋、Ｋ ＋　およびＣｌ−などのイオンが流入することによって細胞は膨張し結局死に至る形態に示される。（Ｋａｕｐｐｉｓｅｎ， Ｒ． Ａ．， ＭｃＭａｈｏｎｍ， Ｈ． Ｔ．およびＮｉｃｈｏｌｌｓ， Ｄ． Ｇ． （１９８８） Ｃａ２＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ Ｃａ２＋−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｒｅｌｅａｓｅ， ｅｎｅｒｇｙ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｆｒｅｅ Ｃａ２＋ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｎｅｒｖｅ ｔｅｒｍｉｎａｌｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ： Ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｔｏ ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉａ ａｎｄ ａｎｏｘｉａ， Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２７： １７５−１８２；およびＧａｒｔｈｗａｉｔｅ， Ｇ． およびＧａｒｔｈｗａｉｔｅ， Ｊ． （１９８８） Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １７： ７５５−７６７）。
【００１１】
グルタミン酸塩による慢性毒性はグルタミン酸受容体のＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体と非ＮＭＤＡ受容体が活性化しＣａ２＋が細胞内に流入することによって始まり、これによってＣａ２＋依存性酵素が活性化し結局は細胞が死滅する。（Ｃｏｙｌｅ， Ｊ． Ｔ． およびＰｕｒｒｆａｒｃｋｅｎ， Ｐ． （１９９３） Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ， ｇｌｕｔａｍａｔｅ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２： ６８９−６９５．）。すなわち、グルタミン酸塩によってＮＭＤＡおよび非−ＮＭＤＡ受容体が活性化しＣａ２＋が細胞内に流入して細胞内カルシウム依存性酵素のホスホリパーゼＡ２が非正常的に活性化すると多重の不飽和遊離脂肪酸の生成が増加し、活性酸素基および活性過酸化水素基のような遊離基が過多に生成し、細胞の過酸化を促進し結局は細胞が死滅する慢性毒性が起こる。（Ｃｏｙｌｅ， Ｊ． Ｔ． およびＰｕｒｒｆａｒｃｋｅｎ， Ｐ． （１９９３） Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ， ｇｌｕｔａｍａｔｅ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２： ６８９−６９５； Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ， Ｂ および Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ Ｊ． Ｍ． （１９８５ａ） Ｏｘｙｇｅｎ ｒａｄｉｃａｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ５： ２２−２６； Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ， Ｂ および Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ Ｊ． Ｍ． （１９８５ｂ） Ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌｓ ａｎｄ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ． Ｍｏｌ． Ａｓｐｅｃｔｓ Ｍｅｄ． ８： ８９−１９３； Ｓｉｅｓｊｏ， Ｂ． Ｋ． および Ｗｉｅｌｏｃｈ， Ｊ． （１９８５） Ｃｅｒｅｂｒａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｉｓｃｈａｅｍｉａ： ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｂｒ． Ｊ． Ａｎａｅｓｔｈ． ４７： ４７−６２； Ｓｌａｄｅｃｚｅｋ， Ｆ．， Ｐｉｎ， Ｊ． Ｐ．， Ｒｅｃａｓｅｎｓ， Ｍ．， Ｂｏｋａｅｒｋ， Ｊ． ａｎｄ Ｗｅｉｓｓ， Ｓ． （１９８５） Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｔｒｉａｔａｌ ｎｅｕｒｏｎｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ ３１７： ７１７−７１９； および Ｃｈｏｉ， Ｄ． Ｗ． および Ｋｏｈ， Ｊ． （１９８７） Ｉｏｎｉｃ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ７： ３６９−３７９）。ＮＭＤＡ受容体が活性化すると、一酸化窒素合成酵素の活性度もさらに増大して一酸化窒素が過大に生成し細胞の過酸化を促進する（Ｓｔｒｉｊｂｏｓ， Ｐ． Ｊ． Ｌ． Ｍ． Ｌｅａｃｈ， Ｍ． Ｊ． および Ｇａｒｔｈｗａｉｔｅ， Ｊ． （１９９６） Ｖｉｃｉｏｕｓ ｃｙｃｌｅ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ Ｎａ＋ ｃｈａｎｎｅｌｓ， ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｒｅｌｅａｓｅ ａｎｄ ＮＭＤＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｄｅｌａｙｅｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １６： ５００４−５０１３）。グルタミン酸塩による神経毒性はグルタミン酸塩の拮抗物質、ナトリウム−またはカルシウム−チャンネル遮断剤、抗酸化剤、遊離基遮断剤およびザンチン脱水素酵素よりザンチン酸化酵素への転換を抑制する酵素の抗蛋白質酵素などによって防ぐことができるが、特にＮＭＤＡ受容体に対する拮抗物質が効果的である。（Ｃｈｏｉ， Ｄ． Ｗ．， Ｋｏｈ， Ｊ． および Ｐｅｔｅｒｓ， Ｓ． （１９８８） Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ： ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ ｂｙ ＮＭＤＡ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ８： １８５−１９６； ａｎｄ Ｏｌｎｅｙ， Ｊ． Ｗ． および Ｓｈａｒｐｅ， Ｉ． Ｇ． （１９６９） Ｂｒａｉｎ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ａｎ ｉｎｆａｎｔ ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ ｇｌｕｔａｍａｔｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １６６： ３６８−３８８）
【００１２】
一方、老人性痴呆を引き起こす主原因の疾患であるアルツハイマーの治療剤を開発するための研究の相反する二つの方向から進められている。グルタミン酸性神経の研究においては、その機能を亢進する面（効能剤の利用）と抑制する面（拮抗剤の利用）が共に進められている。すなわち、グルタミン酸性神経が損傷しグルタミン酸塩の量が減少すると記憶力と学習能力が低下する。退行性脳神経系疾患のアルツハイマー患者の場合はグルタミン酸受容体のＮＭＤＡ受容体数が７５−８７％、非−ＮＭＤＡ受容体数が４５−６９％と減少する。（Ｃｏｗｂｕｒｎ， Ｒ．， Ｈａｒｄｙ， Ｊ．， Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｐ． および Ｂｒｉｇｇｓ， Ｒ． （１９８８） Ｒｅｇｉｏｎａｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｅ− ａｎｄ ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ ｇｌｕｔａｍａｔｅｒｇｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ４５２： ４０３−４０７； Ｇｒｅｅｎａｍｙｒｅ， Ｊ． Ｔ．， Ｐｅｎｎｅｙ， Ｊ． Ｂ．， Ｄ’Ａｍａｔｏ， Ｃ． Ｊ． および Ｙｏｕｎｇ Ａ． Ｂ． （１９８７） Ｄｅｍｅｎｔｉａ ｏｆ ｔｈｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｔｙｐｅ： Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ Ｌ−［３Ｈ］ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ，． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ４８： ５４３−５５１； および Ｃｈａｌｍｅｒｓ， Ｄ． Ｔ．， Ｄｅｗａｒ， Ｄ．， Ｇｒａｈａｍ， Ｄ． Ｉ．， Ｂｒｏｏｋｓ， Ｄ． Ｎ． および ＭｃＣｕｌｌｏｃｈ， Ｊ． （１９９０） Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｇｌｕｔａｍａｔｅｒｇｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｓｅｎｉｌｅ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｏｆ ｔｈｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｔｙｐｅ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７： １３５２−１３５６）。さらに、グルタミン酸受容体は記憶力と学習能力に関与すると知られている脳の部位に集中的に分布し、アルツハイマー病での記憶力喪失と学習能力低下はグルタミン酸受容体の異常によって大きく影響を受けるものと考えられる。（Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ， Ｉ． （１９９１） Ｒｏｌｅ ｏｆ ＮＭＤＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｍｅｍｏｒｙ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． １２： ２６０− ２６５）。記憶と学習の際、細胞内カルシウムイオンが増加して蛋白質分解酵素が活性化し、グルタミン酸受容体が増加し結果的にシナプシスで長時間にわたって構造および化学的な変化が起こることによって記憶と学習ができるようになるのが最も可能性の高い仮説となっている。（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｒ． Ｆ． （１９８６） Ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３： ９４１− ９４７）。アルツハイマーは記憶力喪失が代表的に認知されている疾患でグルタミン酸効能剤もまた学習力と記憶力に重大な役割を行うものと知られているため、効能剤を投与して記憶力喪失の治療剤として用いる可能性について研究しつつ、数々の効能剤が効果を示すものと知られている。（Ｗｉｌｌｅｔｔｓ， Ｊ．， Ｂａｌｓｔｅｒ， Ｒ． Ｌ．， Ｌｅａｎｄｅｒ， Ｊ． Ｄ． （１９９０） Ｔｈｅ ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ＮＭＤＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ １１： ４２３−４２８）。しかしながら、アルツハイマー患者では大脳皮質と海馬のグルタミン性神経のシナプシス前末端（ｐｒｅ−ｅｎｄ ｏｆ ｓｙｎａｐｓｉｓ）でのグルタミン酸塩の再吸収に異常が起こり、グルタミン酸塩を代謝してＧＡＢＡを合成する酵素のグルタミン酸脱炭酸酵素の量が減少し結果的にはシナプシスでのグルタミン酸の量が増加する結果を招くものとなった。（Ｗｉｌｌｅｔｔｓ， Ｊ．， Ｂａｌｓｔｅｒ， Ｒ． Ｌ．， Ｌｅａｎｄｅｒ， Ｊ． Ｄ． （１９９０） Ｔｈｅ ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ＮＭＤＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ １１： ４２３−４２８）
【００１３】
本発明者らは前記の文献的考察に基づき古くから健忘や脳卒中などの退行性神経系疾患に有効と知られ、民間や伝承医薬で用いられてきた漢方薬や生薬を中心に一次培養したマウスの大脳皮質細胞で脳神経系に及ぼす影響を検索した。すなわち、一次培養したマウスの大脳皮質細胞に生薬の総メタノール抽出物を投与した後、多量のグルタミン酸塩を作用し誘発する神経細胞の死滅にどのような影響を及ぼすかを調べた結果、ハンゲショウ（Ｓａｕｒｕｒｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）の総メタノール抽出物が顕著な脳神経細胞保護活性を有するものと確認した。さらにハンゲショウより分離したアリストラクタム系アルカロイドが有意的に脳神経系細胞保護活性を有するものと確認した。
【００１４】
ハンゲショウはドクダミ科に属する多年草で民間では草全体または根や葉が利尿、水腫、淋疾、肝炎、肺炎および高血圧などの治療に用いられてきた。
ハンゲショウの化学成分に対する研究は今まで葉や茎（地上部）のフラボノイド、アルカロイド、アミノ酸、脂肪酸、キノンおよび精油成分について進められた。精油成分としてはメチル−ｎ−ノニル−ケトンが主成分として報告され、他にもα−ピネン、カンフェン、サフロール、β−カロフィレン、リナルール、フムレンなどが報告されている。（Ｃｈｏｅ， Ｋ． Ｈ．， Ｙｏｏｎ， Ｃ． Ｈ． および Ｋｗｏｎ， Ｓ． Ｊ． （１９８８ｂ） 、Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｕｒｕｒａｃｅａｅ ｇｒｏｗｉｎｇ ｉｎ Ｋｏｒｅａ − ｏｎ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ｏｆ Ｓａｕｒｕｒｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｂｙ ＧＣ／ＭＳ． Ｐｕｎｓｏｋ ｋｗａｈａｋ １： ２５９−２６２； および Ｃｈｏｅ， Ｋ． Ｈ．， Ｋｗｏｎ， Ｓ． Ｊ． および Ｌｅｅ Ｋ． Ｃ． （１９８９） 、Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｕｒｕｒａｃｅａｅ ｇｒｏｗｉｎｇ ｉｎ Ｋｏｒｅａ − ｏｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｏｆ Ｈｏｕｔｔｕｙｎｉａ ｃｏｒｄａｔａ ａｎｄ Ｓａｕｒｕｒｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ． Ｐｕｎｓｏｋ ｋｗａｈａｋ ２： ２８５−２８８）。ハンゲショウの葉や茎（地上部）の主成分のフラボノイドはヒペリン、ケルセチン、イソケルシトリンおよびケルシトリンなどが報告され、（Ｃｈｏｅ， Ｋ． Ｈ．， Ｙｏｏｎ， Ｃ． Ｈ． および Ｋｗｏｎ， Ｓ． Ｊ． （１９９４）、 Ａ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ｏｆ Ｓａｕｒｕｒａｃｅａｅ ｇｒｏｗｉｎｇ ｉｎ Ｋｏｒｅａ − ｏｎ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ｏｆ Ｓａｕｒｕｒｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ． Ａｎａｌ． Ｓｃｉ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． ７： １１−１５； Ｓｕｎｇ， Ｓ． Ｈ．， Ｋｗｏｎ， Ｓ． Ｈ．， Ｃｈｏ， Ｎ． Ｊ． および Ｋｉｍ， Ｙ． Ｃ． （１９９７），Ｈｅｐａｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｆｌａｖｏｎｏｌｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ ｏｆ Ｓａｕｒｕｒｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｈｅｒｂｓ． Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ Ｒｅｓ． １１： ５００−５０３； および Ｗａｎｇ， Ｅ． Ｃ．， Ｓｈｉｈ， Ｍ． Ｈ．， Ｌｉｕ， Ｍ． Ｃ．， Ｃｈｅｎ， Ｍ． Ｔ． および Ｌｅｅ， Ｇ． Ｈ． （１９９６） Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ｏｆ Ｓａｕｒｕｒｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ． Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ ４３： ９６９−９７２）。エモジン、フィスシオンなどのキノン系列成分とカルパノン（ｃａｒｐａｎｏｎｅ）系列のリグナンも報告されている。（Ｃｒｏｈａｒｅ， Ｒ．， Ｐｒｉｅｓｔａｐ， Ｈ． Ａ．， Ｆａｒｉｎａ， Ｍ．， Ｃｅｄｏｌａ， Ｍ． および Ｒｕｖｅｄａ， Ｅ． Ａ． （１９６２）， Ａｒｉｓｔｏｌａｃｔａｍｓ ｏｆ Ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉａ Ａｒｇｅｎｔｉｎａ． Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３： １９５７−１９６０）。さらに、アリストラクタム系列のアルカロイドのサウロラクタムがハンゲショウの細胞毒性成分に分けられ、（Ｐｒｉｅｓｔａｐ， Ｈ． Ａ． （１９８９） １３Ｃ−ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ａｒｉｓｔｏｌａｃｔａｍｓ． Ｍａｇｎ． Ｒｅｓｏｎ． Ｃｈｅｍ． ２７： ４６０−４６５��、同じ系列のアルカロイドのアリストラクタムも報告されている。（Ｃｒｏｈａｒｅ， Ｒ．， Ｐｒｉｅｓｔａｐ， Ｈ． Ａ．， Ｆａｒｉｎａ， Ｍ．， Ｃｅｄｏｌａ， Ｍ． および Ｒｕｖｅｄａ， Ｅ． Ａ． （１９６２）， Ａｒｉｓｔｏｌａｃｔａｍｓ ｏｆ Ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉａ Ａｒｇｅｎｔｉｎａ． Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３： １９５７−１９６０）．。
【００１５】
一方、クプリン酸、リノール酸およびラウリン酸の脂肪酸とアラニン、バリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、ロイシン、イソロイシンおよびフロリンのアミノ酸の存在も確認した。（Ｐｒｉｅｓｔａｐ， Ｈ． Ａ． （１９８５ａ） Ｓｅｖｅｎ ａｒｉｓｔｏｌａｃｔａｍｓ ｆｒｏｍ Ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉａ Ａｒｇｅｎｔｉｎａ． Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｓｔｒｙ ２４： ８４９−８５２）． ）
【００１６】
（発明が解決しようとする課題）
本発明者らはハンゲショウおよびハンゲショウ根の抽出物、ハンゲショウより分離した単一物質を研究し、次のような事実を究明した。
【００１７】
本発明の目的は退行性脳神経系疾患の予防および治療効果を有するハンゲショウエキスを有効成分として含有する薬剤学的製剤を提供することである。
【００１８】
本発明の他の目的はハンゲショウより分離した上記一般式（Ｉ）のアリストラクタム系アルカロイド誘導体の退行性脳神経系疾患の予防および治療剤としての用途を提供することである。
【００１９】
本発明の更なる他の目的はハンゲショウより分離した上記一般式（Ｉ）のアリストラクタム系アルカロイド誘導体を含有する退行性脳神経系疾患の予防および治療用薬剤学的製剤を提供することである。
【００２０】
（発明の構成）
以下、本発明の構成および作用効果を次の通り詳細に説明する。
【００２１】
ハンゲショウの抽出はメタノール、エタノールまたはプロパノールのような低級アルカノール、メチレンクロライドまたはクロロホルムのような塩素化炭化水素、ヘキサンまたはヘプタンのような炭化水素類、ベンゼン、トルエンなどのような芳香族炭化水素、またはこれらの混合溶媒中で行われる。
【００２２】
次に実施例および実験例で本発明をより詳細に説明する。
【００２３】
実施例１
乾燥ハンゲショウ１０ｋｇをクロロホルムとメタノール（１：１）の混合溶媒を用い還流装置内で３回抽出して溶媒を真空で除去し、三百草の総抽出物１．８ｋｇを得た。ハンゲショウエキス（１．８ｋｇ）を蒸留水に懸濁した後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出しＣＨ２Ｃｌ２−抽出物を真空乾燥して蒸発した。得られたＣＨ２Ｃｌ２画分をさらに９０％メタノールに懸濁した後、ｎ−ヘキサンで抽出した。ｎ−ヘキサン抽出物と残留９０％メタノール懸濁液を真空乾燥し、９０％メタノール画分（１２０ｇ）とｎ−ヘキサン画分（６０ｇ）を得た。
【００２４】
実施例２
化合物１の分離および同定
ｎ−ヘキサン画分（６０ｇ）をｎ−ヘキサン：酢酸エチルの混合溶媒（１００：１）で段階的濃度勾配で溶離し、シリカゲルカラム上でクロマトグラフィーして２０個の小画分に分けた。このうち、６番小画分（６００ｍｇ）をセファデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーを行い、アルカロイド粗画分（２００ｍｇ）を得た。化合物１（Ｒｔ　１４．１５ｍｉｎ）を逆相ＨＰＬＣにより分離した。化合物１をメタノールを用いて再結晶し化合物１（１００ｍｇ）を得た。
【００２５】
化合物１の同定
淡黄色粉末
ＵＶ （ＣＨＣｌ３） λｍａｘ （ｌｏｇ ε）： ３８８．１０ （３．８８）， ３１４．２０ （３．９４）， ２８７．２０ （４．４５）， ２７６．５０ （４．４２）， ２６２．１０ （４．４２）， ２３５．５０ （４．５６） ｎｍ
ＩＲ （ＫＢｒ） νｍａｘ： ３２２０， １７０１， １６４８， １４２７， １３１９， １２５７， １０３１， ９７２， ８３５， ７３７， ６０４ ｃｍ−１
ＥＩＭＳ （ｍ／ｚ） （ｒｅｌ． ｉｎｔ．）： ２７９ ［Ｍ＋］ （１００）， ２６４ （３１）， ２３６ （２５）， １９４ （６１）
１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ １０．３２ （ＯＨ）， ９．１０ （１ Ｈ， ｄｄ， Ｊ ＝ ８．８５， ２．５０ Ｈｚ， Ｈ−５）， ７．９４ （１ Ｈ， ｄｄ， Ｊ ＝ ８．１６， ２．２５ Ｈｚ， Ｈ−８）， ７．６２ （１ Ｈ， ｓ， Ｈ−２）， ７．５８ （２ Ｈ， ｔｄ， Ｊ ＝ ７．００， ７．２５ Ｈｚ， Ｈ−６ ａｎｄ Ｈ−７）， ７．２８ （１ Ｈ， ｓ， Ｈ−９）， ４．０１ （３ Ｈ， ｓ， ＯＣＨ３）， ３．３８ （３ Ｈ， ｓ， ＮＣＨ３） ｐｐｍ
１３Ｃ ＮＭＲ （１００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ １６６．７９ （Ｃ−１）， １５２．１７ （Ｃ−３）， １４８．８１ （Ｃ−４）， １３６．９３ （Ｃ−９ａ）， １３４．６４ （Ｃ−４ａ）， １２９．０１ （Ｃ−８）， １２７．４４ （Ｃ−６）， １２６．８６ （Ｃ−５）， １２６．３０ （Ｃ−８ａ）， １２５．５７ （Ｃ−７）， １２０．９６ （Ｃ−１ａ ａｎｄ １ｂ）， １２０．１４ （Ｃ−５ａ）， １１３．６０ （Ｃ−２）， １０３．４８ （Ｃ−９）， ５９．５２ （ＯＣＨ３）， ２６．１７ （ＮＣＨ３） ｐｐｍ
【００２６】
以上の理化学的および分光学的結果に基づき化合物１を１０−アミノメチル−４−メトキシ−３−ヒドロキシ−フェナントレン−１−カルボン酸ラクタムのサウロラクタムと同定した。（Ｃｒｏｈａｒｅ， Ｒ．， Ｐｒｉｅｓｔａｐ， Ｈ． Ａ．， Ｆａｒｉｎａ， Ｍ．， Ｃｅｄｏｌａ， Ｍ． およびＲｕｖｅｄａ， Ｅ． Ａ． （１９６２）， Ａｒｉｓｔｏｌａｃｔａｍｓ ｏｆ Ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉａ Ａｒｇｅｎｔｉｎａ． Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３： １９５７−１９６０； Ｐｒｉｅｓｔａｐ， Ｈ． Ａ． （１９８９） １３Ｃ−ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ａｒｉｓｔｏｌａｃｔａｍｓ． Ｍａｇｎ． Ｒｅｓｏｎ． Ｃｈｅｍ． ２７： ４６０−４６５； および Ｐｒｉｅｓｔａｐ， Ｈ． Ａ． （１９８５ａ） Ｓｅｖｅｎ ａｒｉｓｔｏｌａｃｔａｍｓ ｆｒｏｍ Ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉａ Ａｒｇｅｎｔｉｎａ． Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｓｔｒｙ ２４： ８４９−８５２）．
【００２７】
実施例３
化合物２の分離および同定
化合物１の分離過程中、未完成分離用ＨＰＬＣでＲｔ　１５．９０ｍｉｎのパークを分取し、化合物１と同じ方法で化合物２（１０ｍｇ）を得た。
【００２８】
化合物２の同定
淡黄色の粉末
ＵＶ （ＣＨＣｌ３） λｍａｘ （ｌｏｇ ε）： ３８０．００ （３．７４）， ３１４．２０ （３．７８）， ２８５．２０ （４．３３）， ２７５．００ （４．３５）， ２６１．２０ （４．２７）， ２３０．００ （４．４１） ｎｍ
ＩＲ （ＫＢｒ） νｍａｘ： ３２２０， １７０１， １６４８， １４２７， １３１９， １２５７， １０３１， ９７２， ８３５， ７３７， ６０４ ｃｍ−１
ＥＩＭＳ （ｍ／ｚ） （ｒｅｌ． ｉｎｔ．）： ２７９ ［Ｍ＋］ （１００）， ２６４ （５９）， ２３６ （６６）
１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ １０．８５ （ＮＨ）， ９．１２　（１ Ｈ， ｄｄ， Ｊ ＝ ８．３２， ２．０１ Ｈｚ， Ｈ−５）， ７．９４ （１ Ｈ， ｄｄ， Ｊ ＝ ８．３２， ２．０１ Ｈｚ， Ｈ−８）， ７．８５ （１ Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ２．０１ Ｈｚ， Ｈ−３）， ７．５７ （２ Ｈ， ｍ， Ｈ−６ ａｎｄ Ｈ−７）， ７．１４ （１ Ｈ， ｓ， Ｈ−９）， ４．１０ （３ Ｈ， ｓ， ＯＣＨ３）， ４．０１ （３ Ｈ， ｓ， ＯＣＨ３） ｐｐｍ
１３Ｃ ＮＭＲ （１００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ １６８．８５ （Ｃ−１）， １５４．７１ （Ｃ−３）， １５０．８６ （Ｃ−４）， １３５．８０ （Ｃ−９ａ）， １３５．３０ （Ｃ−４ａ）， １２９．５１ （Ｃ−８）， １２７．９５ （Ｃ−６）， １２７．３０ （Ｃ−５）， １２６．３８ （Ｃ−８ａ）， １２５．９６ （Ｃ−７）， １２３．７８ （Ｃ−１ａ）， １２２．６０ （Ｃ−１ｂ）， １２０．７５ （Ｃ−５ａ）， １１０．３７ （Ｃ−２）， １０５．０７ （Ｃ−９）， ６０．３９ （ＯＣＨ３）， ５７．４０ （ＯＣＨ３） ｐｐｍ
【００２９】
以上の理化学的および分光学的結果に基づき化合物１を１０−アミノ−３、４−メトキシ−３−ヒドロキシ−フェナントレン−１−カルボン酸ラクタムのアリストラクタムＢＩＩと同定した。（Ｃｒｏｈａｒｅ， Ｒ．， Ｐｒｉｅｓｔａｐ， Ｈ． Ａ．， Ｆａｒｉｎａ， Ｍ．， Ｃｅｄｏｌａ， Ｍ． および Ｒｕｖｅｄａ， Ｅ． Ａ． （１９６２）， Ａｒｉｓｔｏｌａｃｔａｍｓ ｏｆ Ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉａ Ａｒｇｅｎｔｉｎａ． Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３： １９５７−１９６０； Ｐｒｉｅｓｔａｐ， Ｈ． Ａ． （１９８９）， １３Ｃ−ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ａｒｉｓｔｏｌａｃｔａｍｓ． Ｍａｇｎ． Ｒｅｓｏｎ． Ｃｈｅｍ． ２７： ４６０−４６５； および Ｐｒｉｅｓｔａｐ， Ｈ． Ａ． （１９８５ａ）， Ｓｅｖｅｎ ａｒｉｓｔｏｌａｃｔａｍｓ ｆｒｏｍ Ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉａ ａｒｇｅｎｔｉｎａ． Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｓｔｒｙ ２４： ８４９−８５２）
【００３０】
実施例４
化合物３の合成および同定
ハンゲショウより分離したサウロラクタムとＥ−ｐ−ケイ皮酸メトキシをエステル化して化合物３を合成した。
サウロラクタム（１０ｍｇ）およびＥ−ｐ−ケイ皮酸メトキシを無水トルエン内に溶かした後、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよび４−ジメチルアミノピリジンを加えアルゴン気流下、油槽内で７０℃まで加温し攪拌した。１８時間反応した後、溶液を濾過して反応中に生成された尿素を除去した。濾液を濃縮しｎ−ヘキサン：塩素化炭化水素：メタノール濃度勾配でシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーを行い、化合物３を分離した。
【００３１】
化合物３の同定
黄色の粉末
ＥＩＭＳ （ｍ／ｚ） （ｒｅｌ． ｉｎｔ．）： ４０９ （１７） ［Ｍ＋］， ２９３ （１６）， ２７９ （１４） ［Ｍ＋−ｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ］， ２２４ （９） １７８ （１００）， １６４ （７２）， １３１（５６）
１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ９．１０ （１ Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ８．３２ Ｈｚ， Ｈ−５）， ８．００ （１ Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ １５．９０ Ｈｚ， Ｈ−７’）， ７．９２ （１Ｈ， ｓ， Ｈ−２）， ７．８７ （１ Ｈ， ｍ， Ｈ−８）， ７．６９ − ７．５５ （４ Ｈ， ｍ， Ｈ−２’， ３’， ５’， ６’）， ７．４５ （２ Ｈ， ｍ， Ｈ−６ ａｎｄ Ｈ−７）， ７．１０ （１ Ｈ， ｓ， Ｈ−９）， ６．７５（１Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ １５．９０ Ｈｚ， Ｈ−８’）， ４．０１ （３ Ｈ， ｓ， ＯＣＨ３）， ３．５０ （３ Ｈ， ｓ， ＮＣＨ３） ｐｐｍ
【００３２】
以上の理化学的および分光学的結果に基づき化合物３をサウロラクタム−３−Ｏ−Ｅ−ｐ−ケイ皮酸メトキシと同定した。
ＥＩＭＳ （ｍ／ｚ） （ｒｅｌ． ｉｎｔ．）： ４０９ （１７） ［Ｍ＋］， ２９３ （１６）， ２７９ （１４） ［Ｍ＋−ｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ］， ２２４ （９） １７８ （１００）， １６４ （７２）， １３１（５６）
１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ９．１０ （１ Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ８．３２ Ｈｚ， Ｈ−５）， ８．００ （１ Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ １５．９０ Ｈｚ， Ｈ−７’）， ７．９２ （１Ｈ， ｓ， Ｈ−２）， ７．８７ （１ Ｈ， ｍ， Ｈ−８）， ７．６９ − ７．５５ （４ Ｈ， ｍ， Ｈ−２’， ３’， ５’， ６’）， ７．４５ （２ Ｈ， ｍ， Ｈ−６ ａｎｄ Ｈ−７）， ７．１０ （１ Ｈ， ｓ， Ｈ−９）， ６．７５（１Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ １５．９０ Ｈｚ， Ｈ−８’）， ４．０１ （３ Ｈ， ｓ， ＯＣＨ３）， ３．５０ （３ Ｈ， ｓ， ＮＣＨ３） ｐｐｍ
【００３３】
実験例
実験方法
１．実験動物
大韓民国ソウル大学校動物飼育場から供与されたスピローグ−ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）系マウスをソウル大学薬学大実験動物室で飼育した。飼育場の環境は室内温度を２２±５℃に維持して照明時間を朝７時〜夜７時に固定し、飼料は粗蛋白２３．２％、粗脂肪４．０％、粗繊維６．０％、粗灰分１０．０％、粗カルシウム０．６％、粗リン０．４％などを含有した固形飼料（ソウル、三養社）を用いた。
【００３４】
２．皮質細胞の培養
ニューロンおよびグリアを共に含有する混合大脳皮質細胞の一次培養物を先行技術文献に開示のラット胎児より製造した。（ Ｋｉｍ ＹＣ， Ｋｉｍ ＳＲ， Ｍａｒｋｅｌｏｎｉｓ ＧＪおよびＯｈ ＴＨ （１９９８）， Ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅｓ Ｒｂ１ ａｎｄ Ｒｇ３ ｐｒｏｔｅｃｔ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｒａｔ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｇｌｕｔａｍａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｒｅｓ． ５３： ４２６−４３２）．
分離した大脳皮質細胞を１．０×１０６　ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようコラーゲンで塗布した培養容器に移植した。培養液は熱不活性化された１０％仔牛胎児血清を含有するＤＭＥＭに１ｍＭピルビン酸ナトリウム、ペニシリン１００　ＩＵ／ｍｌおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを加え、３７℃で湿度を保った空気９５％／ＣＯ２５％の雰囲気下にて用いた。実験に用いる前２週間培養した。
【００３５】
３．ハンゲショウ抽出物の投与
ハンゲショウの総抽出物、画分および分離した化合物はＤＭＳＯ（最終培養濃度０．１％以内）に溶解した後、蒸留水で希釈しミリポアメンブレイン（０．２２μｍ，　Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ，　Ｕ．Ｓ．Ａ．）を通過させて無菌状態とした。該溶液を濃度を異にし培養し、ニューロン細胞に投与した。
【００３６】
１）ＭＴＴ検定法
培養中の大脳皮質細胞の培養液にＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）を培養液の１０％になるよう加え、続けてさらに３時間培養し生成されたホルマザンをＤＭＳＯで溶解した後、５４０ｎｍで吸光度を測定した。（Ｍｏｓｍａｎｎ Ｔ （１９８３） Ｒａｐｉｄ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙｓ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５： ５５−６１）
【００３７】
２）一酸化窒素の定量
一次培養した大脳皮質細胞より培養液中に遊離される一酸化窒素の量はグリース試薬を用いてドーソンらの方法で測定した。（Ｄａｗｓｏｎ ＶＬ， Ｂｒａｈｂｈａｔｔ ＨＰ， Ｍｏｎｇ ＪＡ ａｎｄ Ｄａｗｓｏｎ ＴＭ （１９９４） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｃａｕｓｅｓ ｄｅｌａｙｅｄ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｎｅｕｒｏｎａｌ−ｇｌｉａｌ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ． Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３３： １４２５−１４３０）
【００３８】
３）細胞内Ｃａ２＋濃度測定
一次培養した大脳皮質細胞内のＣａ２＋濃度は活性を測定しようとする化合物を投与し１時間後にグルタミン酸塩で神経毒性を誘導した後、Ｆｕｒａ−２　ＡＭを用いて測定した。（Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ Ｇ， Ｐｏｅｎｉｅ ＭおよびＴｓｉｅｎ ＲＹ （１９８５）　 Ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｇｒｅａｔｌｙ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０： ３４４０−３４５０）
【００３９】
４）結果および考察
本発明者らはインビトロ検定システムでラットの大脳皮質細胞の一次培養液を用いグルタミン酸−誘導された神経毒性に対抗する神経保護化合物を天然物より分離した（Ｋｉｍ　など、１９９８）。本培養液でグルタミン酸−誘導された損傷に対し、保護効果を有する天然供給源をスクリーニングする過程で本発明者らはハンゲショウの根よりのＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ抽出物が有意的な神経保護活性を示すものと明らかになった（表１）。化合物１および２をセファデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーと未完成分離用ＨＰＬＣによって分離し、次の構造式を有するサウロラクタムおよびアリストラクタムで同定した。
【００４０】
2004511525.tif 000005
【００４１】
ハンゲショウの総抽出物のバイオ検定による分画の結果、ｎ−ヘキサン分画が最も活性のものと明らかになった。（１０ｇ／ｍｌ、ｐ＜０．００１でグルタミン酸−誘導された毒性に対し、５０．６％保護率）（表１）。数回のクロマトグラフィーによってｎ−ヘキサン画分をさらに分画および分離し、二つの化合物１および２を得た。化合物１および２は１０−アミノメチル−４−メトキシ−３−ヒドロキシ−フェナントレン−１−カルボン酸ラクタムのサウロラクタムおよび１０−アミノ−３，４−メトキシ−３−ヒドロキシ−フェナントレン−１−カルボン酸ラクタムのアリストラクタムＢＩＩで同定した（Ｃｒｏｈａｒｅなど、１９６２、Ｐｒｉｅｓｔａｐなど、１９８５ａ Ｐｒｉｅｓｔａｐ、１９８５）。分離したアリストラクタム系アルカロイドの脳神経細胞保護活性を本培養システムで検索した。アルカロイド存在下、ＤＭＥＭ内で２４時間インキュベーションした後、培養液を神経損傷程度に対し検索した（全体処理）。サウロラクタムおよびアリストラクタムＢＩＩを１．０Ｍ〜１０．０Ｍの濃度範囲で全体処理で顕著な脳神経細胞保護活性を示した（表２）。
【００４２】
グルタミン酸塩−誘導された毒性に対するこれら二つのアリストラクタムアルカロイドの脳神経保護活性は興奮毒性の前後に一定時間の間隔で露出し、初期に評価した。一部培養液はグルタミン酸塩に（３０分間）曝す１時間前からアルカロイドで前処理し、洗浄してＤＭＥＭ内で２４時間にわたってアルカロイド不在下で維持した（前処理群）（表３）。さらに、培養液を３０分間グルタミン酸に最初曝し、洗浄してアルカロイド存在下で２４時間にわたってＤＭＥＭ内で維持した（後処理群）（表４）。
【００４３】
表４に示したよう、これらアルカロイドは１．０Ｍ〜１０．０Ｍの濃度範囲で後処理群でグルタミン酸塩によって誘導された神経毒性を顕著に抑制した。しかし、サウロラクタムおよびアリストラクタムＢＩＩは前処理群ではグルタミン酸−誘導された神経毒性培養の皮質細胞をあまり顕著に保護することができなかった（表３）。これらの結果よりアリストラクタムアルカロイドはグルタミン酸の受容体結合またはグルタミン酸受容体−媒介された細胞反応に初期段階で直接的に拮抗作用するものではなくグルタミン酸受容体の過剰活性後に起こる一連の反応過程中に作用して発現するものとまずは推定することができた。サウロラクタムおよびアリストラクタムＢＩＩが過量のグルタミン酸による毒性誘発の初期段階で細胞内へ多量に流入されるＣａ２＋の量をあまり顕著には減少し得ないという実験結果がかかる推定を裏付けると言えよう（実験結果未提示）。過多な細胞内ニューロン性Ｃａ２＋濃度は一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）、プロテインキナーゼＣ、ホスホリパーゼおよびプロテアーゼを含む一連の酵素を活性化することができる。ＮＯＳが活性化されると過度なＮＯが生成される。ＮＯはグルタミン酸神経毒性に伴うものと知られている（Ｍａｓａｎｏｒｉなど、１９９８）。ＮＯは超酸化物アニオンと反応してペルオキシ亜硝酸ラジカルを形成し、これは用量−依存的神経損傷を誘発する（Ａｌｍｅｉｄａなど、１９９８）。したがって、さらに強力な脳保護活性アルカロイドのアリストラクタムＢＩＩの培養液内のＮＯ含量に対する効果を測定した（表５）。
【００４４】
グルタミン酸のみで処理した皮質細胞培養液はＮＯ形成が増加する反面、グルタミン酸およびアリストラクタムＢＩＩで処理した培養液内の含量はわずかの増加と示された（表５）。この結果はアリストラクタムＢＩＩがペルオキシ亜硝酸ラジカルの過多生産またはＮＯＳの過度生産を阻害することを示す。
【００４５】
グルタミン酸受容体活性化はホスホリパーゼＡ２も刺激する（ＬｉｐｔｏｎおよびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ、１９９４ ）。ホスホリパーゼＡ２の活性化はその代謝物のアラキドン酸の生成を誘発する。アラキドン酸はＮＭＤＡ−誘導された電流を強化しグルタミン酸塩が星状細胞およびニューロン内へ再吸収されることを阻害する（Ｍｉｌｌｅｒなど、１９９２）。酸素遊離ラジカルはアラキドン酸代謝中に生成することがあって、追加のホスホリパーゼＡ２活性化を誘発する（Ｌａｆｏｎ−Ｃａｚａｌなど、１９９３）。ＣＮＳニューロンは高い酸素消費速度および神経システムの細胞内ポリ不飽和脂肪酸の高い含量により酸化的ストレスに非常に鋭敏である（Ｃｈｏｉ， １９８８ ＣｏｙｌｅおよびＰｕｔｔｆａｒｃｋｅｎ， １９９３）。それにもかかわらず、脳は高い水準のいくつかの抗酸化化合物（たとえばＧＳＨ）およびいくつかの抗酸化酵素（たとえばカタラーゼ、ＳＯＤ、ＧＳＨ−ｐｘおよびＧＳＳＧ−Ｒ）を含む細胞防御システムを有する（Ｂｕｃｋｍａｎｎなど、１９９３）。本発明者らはアリストラクタムＢＩＩが抗酸化酵素の活性に効果があるとみなした。しかし、アリストラクタムＢＩＩはカタラーゼ、ＳＯＤおよびＧＳＨ−ｐｘの活性にはあまり顕著な保護効果を示していない（データ未提示）。したがって、アリストラクタムＢＩＩはＮＯＳに直接作用することによってグルタミン酸塩−誘導された神経毒性培養の皮質ニューロンを保護する。しかしこの仮説的メカニズムを確立するためには更なる実験を行わなければならない。
【００４６】
一方、本研究室では１次培養したマウスの大脳皮質細胞を用い（Ｅ）−ｐ−ケイ皮酸メトキシの脳神経細胞保護活性を確認し、これを特許出願した（韓国特許出願番号第９８−２８１８９号）。これに本研究ではアリストラクタムアルカロイドの脳神経細胞保護活性増大を目的にサウロラクタムの酸化水素基に（Ｅ）−ｐ−ケイ皮酸メトキシを結合したサウロラクタム−３−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ケイ皮酸メトキシ（Ｓ−ＭＣＡ）を合成した。Ｓ−ＭＣＡの脳神経細胞保護活性はインビトロ培養システムを用い評価した（表６および７）。Ｓ−ＭＣＡは前処理した場合も後処理した場合も、両方とも顕著な脳神経細胞保護活性を示した。すなわち、かかるＳ−ＭＣＡの脳神経細胞保護活性は（Ｅ）−ｐ−ケイ皮酸メトキシを後処理した場合に脳神経保護活性が減少することと、アリストラクタムアルカロイドを前処理した場合に脳神経細胞保護活性が弱くなることを共に改善した結果と言えよう。すなわち、Ｓ−ＭＣＡは（Ｅ）−ｐ−ケイ皮酸メトキシの神経細胞死滅遮断効果とアリストラクタムアルカロイドの神経毒性誘発後の生存率改善効果の二つの長所を有するため、退行性脳神経系疾患の予防や治療剤として開発できる可能性が一層高まったと考えられる。
【００４７】
かかるＳ−ＭＣＡの脳神経細胞保護活性は一次培養したマウスの大脳皮質細胞を用いる様々な実験を通じて立証することができる。Ｓ−ＭＣＡは過度なグルタミン酸によって誘導された細胞内Ｃａ２＋増加をうまく遮断した。（表８）さらに、Ｓ−ＭＣＡは前処理または後処理共に細胞内Ｃａ２＋増加を首尾良く遮断した結果としてＮＯ合成を顕著に減少させた（表９）。Ｓ−ＭＣＡはさらにグルタミン酸によって損傷された皮質ニューロンで細胞内ペルオキシドの量を減少した。
【００４８】
５）グルタミン酸塩による神経毒性誘導
ラット胎児より直接分離した皮質細胞を１４日間培養した。テストサンプルを相異する濃度で培養細胞に処理した。１時間後、１００μＭグルタミン酸塩で処理し、神経毒性を誘導した。２４時間後に生存細胞率をＭＴＴ検定法で測定し、サンプルの脳保護活性を決定した。
【００４９】
６．統計分析
統計的有意性研究は各テスト群に対し、３個（ｎ＝３）で行われた。データは分析偏差を用い統計的有意性に対して評価した（ＡＮＯＶＡテスト）。統計的有意性に対する信頼水準は５％の確立で設定された。
【００５０】
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【００５１】
コントロールは一次培養したラットの大脳皮質細胞のＭＴＴ数値で１．０３±０．０８の光学密度（ＯＤ）を有する。グルタミン酸処理群はグルタミン酸塩で３０分間毒性を受けたラットの大脳皮質細胞のＭＴＴ数値で０．５８±０．０２の光学密度（ＯＤ）を有する。
【００５２】
生存率は次のよう計算した。１００×（試料処理群の吸光度値−グルタミン酸塩処理群の光学密度）／（正常対照群の光学密度−グルタミン酸塩処理群の光学密度）試料処理群の結果はグルタミン酸塩処理群の差は統計的に有意性がある；
＊：ｐ＜０．０５、＊＊： ｐ＜０．０１、＊＊：ｐ＜０．００１。
【００５３】
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【００５４】
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【００５５】
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【００５６】
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【００５７】
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【００５８】
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【００５９】
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【００６０】
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【００６１】
本発明の一般式（Ｉ）の化合物は１日１ｍｇ〜２００ｍｇを１〜３回投与することができる。本発明のハンゲショウエキスおよび化合物は患者の体重、性別、年齢および疾病の程度によってその使用量を増減することができる。
【００６２】
本発明のハンゲショウエキスおよび化合物は通常薬剤学的に許容される賦形剤と共に薬剤学的に通常的に許容される薬学的製剤、たとえば注射剤、液剤、シロップ剤、錠剤、カプセル剤などに製剤化して薬学的製剤を製造することができる。
【００６３】
次の製剤実施例より本発明をさらに詳細に説明する。
【００６４】
製剤実施例１
ハンゲショウエキス　　　　　　　１００ｍｇ
注射用滅菌蒸留水　　　　　　　　　　　適量
ｐＨ調節剤　　　　　　　　　　　　　　適量
ハンゲショウエキスを注射用蒸留水に溶解し、ｐＨ調節剤でｐＨ約７．６に調節した後、全体を２ｍｌにした後、２ｍｌ用量のアンプルに充填して滅菌し注射剤を製造する。
【００６５】
製剤実施例２
化合物１　　　　　　　　　　　　　　２ｍｇ
注射用滅菌蒸留水　　　　　　　　　　　適量
ｐＨ調節剤　　　　　　　　　　　　　　適量
化合物１を注射用蒸留水に溶解し、ｐＨ調節剤でｐＨ約７．２に調節して全体を２ｍｌにした後、２ｍｌ用量のアンプルに充填して滅菌し注射剤を製造する。
【００６６】
製剤実施例３
ハンゲショウエキス　　　　　　　１００ｍｇ
乳糖　　　　　　　　　　　　　　１００ｍｇ
澱粉　　　　　　　　　　　　　　１００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム　　　　　　　適量
前記の成分を混合し、通常錠剤の製造方法に従って打錠し錠剤を製造する。
【００６７】
製剤実施例４
化合物２　　　　　　　　　　　　　１０ｍｇ
乳糖　　　　　　　　　　　　　　１００ｍｇ
澱粉　　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム　　　　　　　適量
前記の成分を混合し、通常錠剤の製造方法に従って打錠し錠剤を製造する。
【００６８】
製剤実施例５
ハンゲショウエキス　　　　　　　　　５ｍｇ
乳糖　　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｇ
澱粉　　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｇ
タルク　　　　　　　　　　　　　　　２ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム　　　　　　　適量
前記の成分を混合し、通常カプセル剤の製造方法に従ってゼラチンカプセルに充填しカプセル剤を製造する。
【００６９】
製剤実施例６
化合物１　　　　　　　　　　　　　　５ｍｇ
乳糖　　　　　　　　　　　　　　１００ｍｇ
澱粉　　　　　　　　　　　　　　　９３ｍｇ
タルク　　　　　　　　　　　　　　　２ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム　　　　　　　適量
前記の成分を混合し、通常カプセル剤の製造方法に従ってゼラチンカプセルに充填しカプセル剤を製造する。
【００７０】
製剤実施例７
ハンゲショウエキス　　　　　　　　５０ｍｇ
砂糖　　　　　　　　　　　　　　　　２０ｇ
異性化糖　　　　　　　　　　　　　　２０ｇ
レモン香　　　　　　　　　　　　　　　適量
精製水　　　　　　　　　　全体　１００ｍｌ
前記の成分を通常液剤の製造方法に従って混合し、１００ｍｌの褐色ボトルに充填して滅菌し液剤を製造する。
【００７１】
製剤実施例８
化合物３　　　　　　　　　　　　　５０ｍｇ
砂糖　　　　　　　　　　　　　　　　２０ｇ
異性化糖　　　　　　　　　　　　　　２０ｇ
レモン香　　　　　　　　　　　　　　　適量
精製水　　　　　　　　　　全体　１００ｍｌ
前記の成分を通常液剤の製造方法に従って混合し、１００ｍｌの褐色ボトルに充填して滅菌し液剤を製造する。
【００７２】
（産業上の利用可能性）
上記の実験結果でハンゲショウの総抽出物、塩素化炭化水素画分、ｎ−ヘキサン画分およびアリストラクタム系列アルカロイドとこれのケイ皮酸誘導体は脳卒中および痴呆のような退行性脳神経系疾患の予防や治療剤として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】前処理および後処理でグルタミン酸塩を投与したマウス大脳皮質細胞のペルオキシド含量に対するＳ−ＭＣＡの効果を示したグラフである。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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