(57)【要約】本発明は、バクテリオファージＰ１のリコンビナーゼＣｒｅの変異体をコードするＤＮＡ配列であって、その中の特定の潜在的スプライシング部位が、Ｃｒｅ蛋白質配列を改変する塩基変位によって無機能化されている前記ＤＮＡ配列に関する。本発明は更に、上記Ｃｒｅ変異体と受容体蛋白質のリガンド結合ドメインとに由来する融合蛋白質をコードするＤＮＡ配列に関する。本発明は更に、上記ＤＮＡ配列を含有するベクター、微生物及びトランスジェニック生物、並に上記ＤＮＡ配列によってコードされているＣｒｅ変異体及びＣｒｅ融合蛋白質に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バクテリオファージＰ１リコンビナーゼＣｒｅの変異体をコードするＤＮＡ配列であって、配列番号１に示す野生型配列の位置１００３〜１０１１に対応する配列ＡＴＧ ＧＴＧ ＣＧＣに存在する潜在的スプライシング部位を、そのＣｒｅ蛋白質配列を改変する塩基変異によって無機能化した、前記ＤＮＡ配列。
【請求項２】
前記スプライシング部位配列中のコドンＧＴＧがコドンＸＹＺによって置換されており、ここでＸ， Ｙ及びＺは、独立にヌクレオチドＡ， Ｔ， Ｃ又はＧであり、但しＸ＝Ｇの場合にはＹ≠Ｔである、請求項１に記載のＤＮＡ配列。
【請求項３】
コドンＸＹＺが中性アミノ酸をコードする、特にはＡｌａをコードするコドンであるＧＣＧである、請求項２に記載のＤＮＡ配列。
【請求項４】
野生型配列中に存在する他の潜在的スプライシング部位を、サイレント変異によって、及び／又はそのＣｒｅ蛋白質配列を改変する塩基変異によって無機能化した、請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ配列。
【請求項５】
野生型Ｃｒｅ配列における５’末端が短縮されている、特には、野生型の位置１〜５４に対応するヌクレオチドが欠失している、請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡ配列。
【請求項６】
野生型Ｃｒｅ配列中に存在しない付加アミノ酸をコードするヌクレオチドを５’末端に有している、請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡ配列。
【請求項７】
前記の付加ヌクレオチドが中性アミノ酸、特にＭｅｔ， Ｇｌｙ， Ｖａｌ及びＡｌａをコードする、請求項６に記載のＤＮＡ配列。
【請求項８】
野生型配列における３’末端が短縮されている、請求項１〜７のいずれかに記載のＤＮＡ配列。
【請求項９】
配列番号５，７又は９のヌクレオチド１〜９８４を含有する、請求項１に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１０】
バクテリオファージＰ１リコンビナーゼＣｒｅと別の機能蛋白質とに由来する融合蛋白質をコードするＤＮＡ配列であって、そのバクテリオファージＰ１リコンビナーゼＣｒｅをコードする配列が、請求項１〜９のいずれかに記載の配列である、前記ＤＮＡ配列。
【請求項１１】
前記の機能蛋白質が、受容体蛋白質のリガンド結合ドメインであり、その受容体が特にはステロイド受容体であり、好ましくはプロゲステロン、エストロゲン又はグルココルチコイド受容体である、請求項１０に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１２】
前記受容体がプロゲステロン受容体であり、特には配列番号３のヌクレオチド１９４８〜２７４２を含んで成るプロゲステロン受容体である、請求項１１に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１３】
前記リガンド結合ドメインをコードする配列内の潜在的スプライシング部位を、サイレント変異によって、又はそのリガンド結合ドメインの蛋白質配列を改変する塩基変異によって無機能化した、請求項１０〜１２のいずれかに記載のＤＮＡ配列。
【請求項１４】
配列番号５，７又は９に示す配列を有する、請求項１０ に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載のＤＮＡ配列を含有するベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクター及び／又は請求項１〜１４のいずれかに記載のＤＮＡ配列を含有する微生物又はトランスジェニック生物。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれかに記載のＤＮＡ配列によってコードされているＣｒｅ変異体又はＣｒｅ融合蛋白質。
【請求項１８】
請求項１７に記載のＣｒｅ変異体又はＣｒｅ融合蛋白質を製造する方法であって、請求項１５に記載のベクターによって形質転換された、又はそのベクターをトランスフェクションした微生物又は培養細胞を培養することを含んで成る、前記方法。
【請求項１９】
生物個体内におけるｌｏｘＰ部位を含有する標的配列の変異誘発及び／又は組み換えのための、請求項１１〜１４のいずれかに記載のＤＮＡ配列の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、バクテリオファージＰ１のリコンビナーゼＣｒｅの変異体をコードするＤＮＡ配列であって、Ｃｒｅ蛋白質の配列を改変する塩基変異によって特定の潜在的スプライシング部位が機能しなくなった前記ＤＮＡ配列、並にそのＣｒｅ変異体と受容体のリガンド結合ドメインとに由来する融合蛋白質をコードするＤＮＡ配列に関する。本発明は、更に、上記ＤＮＡ配列を含有するベクター、微生物及びトランスジェニック生物、並に上記ＤＮＡ配列によってコードされるＣｒｅ変異体又はＣｒｅ融合蛋白質に関する。
【０００２】
発明の背景
部位特異的なリコンビナーゼを用いることによって、哺乳動物のゲノム内の目的部位に変異を導入することができる。バクテリオファージＰ１のリコンビナーゼであるＣｒｅは、特異的な塩基配列（ｌｏｘＰ部位）を認識し、そしてゲノム内の複数のｌｏｘＰ部位の位置と組合せに応じて、遺伝子を欠失させ、反転させ、転位させ、その他希望通りに変異させることができる（研究のために；Ｒａｊｅｗｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９８， ５１−５３ （１９９６））。マウス内の選択した組織又は細胞種において希望した時期に変異を誘発するために、特に、翻訳後にＣｒｅ活性をオンにするスイッチが開発されてきた（Ｓｃｈｗｅｎｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２６， １４２７−１４３２ （１９９８））。これらは、Ｃｒｅとステロイド受容体（例えばプロゲステロン受容体、エステロゲン受容体、又はグルココルチコイド受容体）のリガンド結合ドメイン（以後ＬＢＤと称する）とに由来する融合蛋白質である。この様なＣｒｅ−ＬＢＤ融合蛋白質では、Ｃｒｅのリコンビナーゼ機能は不活性であるが、対応するリガンドを（翻訳後に）添加することにより活性化することができる。培養細胞及びトランスジェニック動物において、Ｃｒｅの活性化が内因性ホルモンによって誘発されないように、天然のリガンドよりも合成リガンドを優先するＬＢＤの変異体が検査された。
【０００３】
普遍的に活性を有するプロモーター及び細胞種特異的なプロモーターの両方を用いたトランスジェニックマウスにおいて上記技術の適用が報告されている（例えばＳｃｈｗｅｎｋ ｅｔ ａｌ． （１９９８）； Ｋｅｌｌｅｎｄｏｎｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２８５， １７５−１８２ （１９９９））。これらの研究では、ＬＢＤを介したＣｒｅの翻訳後の活性化が原理的に機能することが示されているが、この系には２つの決定的な下記の欠点がある。
１）Ｃｒｅ−ＬＢＤの活性が、非融合のＣｒｅに比べて低いこと；
２）Ｃｒｅ−ＬＢＤのバックグラウンド活性、即ちリガンドの非存在時でもＣｒｅリコンビナーゼ活性が存在すること。
【０００４】
バックグラウンド活性は、インビボでの適用において、特に組み換えが発生のかなり初期に生じる時に、問題であることが分かった。これによってモザイク動物が生じ、その動物内では、一部の細胞において既に組み換えが起きている一方で、残りの細胞においては翻訳後の制御がなお可能である。（測定しうる程度の）バックグラウンド活性が存在せずに、より良好に制御されるＣｒｅ制御系が望まれている。本発明はこれを扱うものである。
【０００５】
バックグラウンド活性の可能性のある原因は、
１）Ｃｒｅ−ＬＢＤをコードするｍＲＮＡの潜在的なスプライシングにより、制御されないＣｒｅ活性を有する短縮型の残存蛋白質が翻訳されうること；
２）例えば内在性プロテアーゼによる翻訳後の分解により、制御されないＣｒｅが生じること、
である。
【０００６】
発明の要旨
驚くことに、Ｃｒｅコード配列内に、例えばＣｒｅ−ＬＢＤコード配列内に、下記の特異的な改変を導入すると、上記の望ましくない事象を解消できることが分かった。
１）決定的なスプライシング現象を排除するためにＣｒｅコード配列を最適化すること；
２）プロテアーゼが、ＣｒｅとＬＢＤとの間のリンカー領域に接近することをより困難にするために、この領域に変異を加え、又はこの領域を短縮化すること。
【０００７】
従って、本発明は、
（１）バクテリオファージＰ１リコンビナーゼＣｒｅの変異体をコードするＤＮＡ配列であって、配列番号１に示す野生型配列の位置１００３〜１０１１に相当するＡＴＧ ＧＴＧ ＣＧＣ内の潜在的スプライシング部位を、そのＣｒｅ蛋白質配列を改変する塩基変異によって無機能化した、前記ＤＮＡ配列；
（２）バクテリオファージＰ１リコンビナーゼＣｒｅと別の機能蛋白質とに由来する融合蛋白質をコードするＤＮＡ配列であって、そのバクテリオファージＰ１リコンビナーゼＣｒｅをコードする配列が（１）に記載の通りである、前記ＤＮＡ配列；
（３）好ましい態様として、前記の別の機能蛋白質が受容体蛋白質のリガンド結合ドメインである、（２）に記載のＤＮＡ配列；
（４）（１）、（２）及び／又は（３）に記載のＤＮＡ配列を含有するベクター；
（５）（４）記載のベクター、及び／又は（１）、（２）及び／又は（３）に記載のＤＮＡ配列を含有する微生物又はトランスジェニック生物；
（６）（１）、（２）及び／又は（３）に記載のＤＮＡ配列によってコードされるＣｒｅ変異体又はＣｒｅ融合蛋白質；
（７）（６）に記載のＣｒｅ変異体又はＣｒｅ融合蛋白質を調製する方法であって、（４）記載のベクターによって形質転換された、又は（４）記載のベクターをトランスフェクションした微生物又は培養細胞を培養することを含んで成る、前記方法；及び
（８）生物個体内のｌｏｘＰ部位を含有する標的配列を変異誘発するため、及び／又は組み換えするための、（２）又は（３）に記載のＤＮＡ配列の使用；
に関する。
【０００８】
本発明の詳細な説明
Ｃｒｅ融合蛋白質における潜在的なスプライシングの程度を評価するために、コンピュータ分析により、潜在的なスプライシング部位のパターンを決定した（図１）。バクテリオファージＰ１（以下簡単にＰ１と称する）のＣｒｅコード配列内には、５’末端に比較的強い受容部位が１つ存在し、そして３’側に中位の強さの供与部位が５つ存在する（図１Ａ）。プロゲステロン受容体のＬＢＤコード配列（野生型受容体のアミノ酸６５０〜９１４をコードする配列番号３のヌクレオチド１９４８〜２７４２；以下ＰＲと称する）内には、中位の強さの受容部位が２つと、非常に強いＳＡが１つ存在する（図１Ａ〜Ｂ）。対応するエストロゲン受容体配列（以下ＥＲと称する）には、分析の結果、中位の強さのＳＡが２つだけ存在した（図１Ｄ）。Ｐ１Ｃｒｅの３’末端に位置する１又は複数の供与配列は、ＰＲ又はＥＲ内の受容部位のいずれか１つと共にイントロンを形成することができた。このイントロンがスプライシングされることにより、読み枠のシフトが起こり、成熟前に翻訳停止することがある。その結果、ＬＢＤの制御部分を含まない短縮された、そしておそらく構成的に活性なＣｒｅ蛋白質が生じる。ＲＴ−ＰＣＲにより、真核細胞において実際にこの様な潜在的なスプライシングが起きることを証明することができた（図２参照）。Ｂａｌｌｅｉｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄ． Ｍｅｔａ． ８４， １３７０−１３７７ （１９９９）には、生理学的な意味において、ＰＲ内のＳＡ（１１．２）の機能が報告されている。
【０００９】
この文献には、ヒトプロゲステロン受容体の選択的スプライシング転写物が乳癌に集積して存在することが記載されている。一般的には、潜在的なスプライシングによる非常に少ない割合のトランスジェニック転写物は、さほど重要ではない。しかし、Ｃｒｅ−ＬＢＤ転写物の場合、わずかな量の潜在的スプライシングによる生成物によっても、Ｃｒｅのバックグラウンド活性が発生することが認められる。
【００１０】
多数の潜在的スプライシング部位がサイレント変異によって機能しなくなるので、コドン使用頻度を同化することによって、先の点に関してＣｒｅ配列は改良される（図１Ａ及びＢ）（Ｆ． Ｓｔｅｗａｒｔ， 未公開データ）。しかし、３’末端に直に位置するスプライシング供与部位は除去されず、反対にコドンの最適化によってむしろ強化される（図１ＢにおけるＳＤ （８．９））。この位置に該塩基配列が認められる場合（図３）、サイレント変異によりこのＳＤを無機能化できないことは明かである。野生型のアミノ酸の位置３３６に存在するバリンをコードするコドン（ＧＴＮ）は、スプライシングに重要な２つの塩基ＧＴを含んでいる。この重要なＧＴ配列を破壊する変異（ＧＴＧからＧＣＧへ；野生型Ｃｒｅ配列のコード塩基配列上１００７番の塩基の置換；Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９８６参照）を導入した。これにより、バリンからアラニンへの保存的なアミノ酸置換を生じた。この変異を、Ｐ１−Ｃｒｅ（図３Ｃ）及びｈＣｒｅ（図３Ｄ）の両方に導入した。従ってｈＣｒｅＶ３３６Ａでは、３’末端の全ての潜在的ＳＤ部位が存在しなくなり（図３Ｄ）、一方Ｐ１−ＣｒｅＶ３３６Ａでは、依然として１つのＳＤが存在している（図３Ｃ）。
【００１１】
ｌｏｘＰ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−ｌａｃＺを含有するリポーター細胞株（Ｋｅｌｌｅｎｄｏｎｋ ｅｔ ａｌ．， １９９９）を用いて、上記構成体を、誘発剤の非存在下に、誘発性、特にＣｒｅ活性に関して定量的に調べた（図４）。Ｖ３３６Ａ変異によって最適化したｈＣｒｅ−ＰＲをコードする構成体（図４Ｃ）では、実際にそのバックグラウンドは、もはや殆ど測定することができず、非変異の構成体（図４Ｂ）に比べて約１０倍低い。従って誘発性は、約１０〜１５倍から７６〜１６５倍に向上する。Ｐ１−Ｃｒｅ配列に変異Ｖ３３６Ａを導入すると、そのバックグラウンド活性（図５Ｂ）は、変異ｈＣｒｅ構成体の場合（図５Ｃ）と未変異のＰ１−Ｃｒｅの場合（図５Ａ）との間になった。これは、Ｐ１−Ｃｒｅに基づくこの構成体内に存在する別の潜在的スプライシング部位が寄与したためであろう（図６Ｃ参照）。バックグラウンドが最も低下したものは、最少数の潜在的供与部位を有する構成体、即ちｈＣｒｅＶ３３６Ａ−ＰＲである（図６Ｄ）。
【００１２】
最大活性に関してもう１つの改良が得られた。図４に示すＣｒｅ−ＰＲ融合蛋白質は、構成的に活性な非融合のＣｒｅと比べて、３０〜４０％の最大活性を示すだけである。本発明者の以前の研究から、Ｃｒｅ−ＰＲの他の変種（例えばＣｒｅ−ＰＲ６５０−９１４）は、Ｃｒｅの値の約５０％以下で、明らかにより高い活性を示すことが分かっていた。しかし、これらの構成体も常に非常に高いバックグラウンドを有し（図５Ｄ参照）、従ってトランスジェニック動物における使用にはほどんど適さない。このＣｒｅ変種に上記の変異Ｖ３３６Ａを導入することにより、約４０％ほどの高い活性を維持しながら、望ましくないバックグラウンドを、殆ど測定できないレベルにまで下げることができる（図５Ｅ）。
【００１３】
本発明の基礎となる構成体ｈＣｒｅＶ３３６Ａ−ＰＲ６５０−９１４（以下Ｃｒｅ＊ＰＲと称する）を、以前に報告された、やはり最適化された構成体ＣｒｅＰＲ１ （Ｋｅｌｌｅｎｄｏｎｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ２４， １４０４−１４１１ （１９９６））と、同一実験条件下で直接比較した。その結果、Ｃｒｅ＊ＰＲは、ＣｒｅＰＲ１に比べて５０倍低いバックグラウンドを示すと共に、非常に高い誘発性を有する（図７Ａ）。更に、用量−効果の分析から、Ｃｒｅ＊ＰＲは、以前に用いたＣｒｅＰＲ１に比べて有意に低い濃度のＲＵ４８６に応答することが示された（図７Ｂ）。
【００１４】
本発明のＤＮＡ配列（上記（１）に記載）において、そのＣｒｅ蛋白質配列を改変し、かつＣｒｅのＤＮＡ配列中の潜在的スプライシング部位を無機能化する塩基変異は、好ましくは、上記（１）に記載の潜在的スプライシング部位配列中のコドンＧＴＧを、コドンＸＹＺによって塩基置換するものである。ただし、Ｘ， Ｙ及びＺは、Ｘ＝Ｇならば、Ｙ≠Ｔである（即ちＹ＝Ｔならば、Ｘ≠Ｇである）限り、独立にヌクレオチドＡ， Ｔ， Ｃ又はＧである。これは、この位置に、スプライシングにとって重要である配列ＧＴを含んでいない任意の配列が好適であることを意味する。特に、生成する蛋白質配列において保存的アミノ酸置換を生じる上記塩基配列が好ましい。配列ＧＴＧはＶａｌをコードするので、このことは、脂肪族アミノ酸、例えばアラニン（ＸＹＺがＧＣＮである）、ロイシン（ＸＹＺがＣＴＮ， ＴＴＡ， ＴＴＧである）及びＩｌｅ（ＸＹＺがＡＴＡ， ＡＴＣ又はＡＴＴである）をコードする配列が特に好ましいことを意味する。好ましいＤＮＡ配列は、配列番号１３及び１４に示す部分配列を含有する。
【００１５】
更に、本発明のＤＮＡ配列において、野生型配列に存在する他の潜在的スプライシング部位を、サイレント変異によって、そして／又はＣｒｅ蛋白質配列を改変する塩基変異によって無機能化してもよい。この様な変異に適する位置は、図１及び６から分かる。
【００１６】
本発明の好ましい態様では、この様なＣｒｅ変異をコードするＤＮＡ配列は、更に、野生型Ｃｒｅ配列の５’末端において短縮化される。生成するＣｒｅ蛋白質の機能に影響を与えない任意の短縮化が適当である。しかし、野生型における位置１〜５４、好ましくは位置１〜１５に対応するヌクレオチドの欠失が好ましい。
【００１７】
本発明の別の好ましい態様では、このＣｒｅ変異体をコードするＤＮＡ配列は、更に、その５’末端で修飾される。本発明において、「修飾」とは、短縮化されていない配列の５’末端に、及び上記の短縮化されたＣｒｅのＤＮＡ配列の５’末端に、更なるヌクレオチドを付加することを意味する。これらの付加ヌクレオチドは、いわゆるＮ末端ルール（Ｌｅｖｙ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３， ４９０７−４９１２ （１９９６））に従って、蛋白質全体に安定化効果を与えると考えられるアミノ酸をコードするコドンである。この様な安定化アミノ酸配列は本質的に中性アミノ酸、好ましくはＭｅｔ， Ｇｌｙ， Ｖａｌ及びＡｌａから成る。これらのアミノ酸の組合せを有する配列、及びこれらのアミノ酸のいずれか１種の均質な配列の両方が可能である。この安定化アミノ酸配列の長さは、好ましくは１〜１０アミノ酸（３〜３０ヌクレオチドに相当する）、特には１〜３アミノ酸である。特に好ましい態様では、このＤＮＡ配列は、翻訳開始部位から直ぐに始まる配列ＡＴＧ ＧＧＣ ＧＣＣ（Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｌａをコードする）を含有する。
【００１８】
好ましい態様では、本発明のＤＮＡ配列は、配列番号５，７又は９のヌクレオチド１〜９８４を含有する。
別の好ましい態様では、このＤＮＡ配列は、野生型配列の３’末端において短縮化される。本発明では、配列番号１に示す野生型配列に基づいて１〜２４ヌクレオチドが欠失されうる（即ち、位置１００６〜１００８に存在するＣｒｅ蛋白質配列を改変する変異の下流の短縮化）。本発明では、コドン１００６〜１００８の下流の単一コドンの欠失も可能である。
【００１９】
融合蛋白質をコードするＤＮＡ配列において、機能蛋白質は、酵素、ペプチドホルモン、生理活性ペプチド、及び構造蛋白質から成る蛋白質群から選択される。機能蛋白質をコードするＤＮＡ配列は、Ｃｒｅ変異体をコードするＤＮＡ配列の下流又は上流に配置されうる。しかし、本発明のＣｒｅ変異体配列の安定化効果は、機能蛋白質をコードするＤＮＡ配列が、ＣｒｅのＤＮＡ配列の下流に位置する場合、即ちＣｒｅのＤＮＡ配列の３’末端に連結される場合に、特に明白である。
【００２０】
好ましくは、機能蛋白質は、受容体蛋白質のリガンド結合ドメイン、特にステロイド受容体の、例えばプロゲステロン、エストロゲン又はグルココルチコイド受容体のリガンド結合ドメインである。これらのＤＮＡ配列は、任意の哺乳動物、好ましくはヒト、マウス又はラットに由来するものでよい。ステロイド受容体のリガンド結合ドメイン、特に配列番号３に示すヒト配列のヌクレオチド１９４８〜２７４２を含んで成るものがより好ましい。
【００２１】
上記の融合蛋白質をコードする好適なＤＮＡ配列は、更なる融合相手（機能蛋白質をコードするＤＮＡ配列）、例えばより容易な精製を可能にするもの（例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼＧＳＴ又はマルトース結合蛋白質ＭＢＰ）、より容易な検出を可能にするもの（例えば緑色蛍光蛋白質ＧＦＰ）又はより容易なトランスダクションを可能にするもの（例えばＨＩＶ−ＴＡＴ又はＶＰ２２のトランスダクションドメイン）を含有しうる。更に、本発明は、本発明のＣｒｅ配列及び上記の更なる融合相手を含んで成る融合蛋白質をコードするＤＮＡ配列にも関する。
【００２２】
更に、上記融合蛋白質において、Ｃｒｅドメインと、機能蛋白質、特にリガンド結合ドメインをコードするＤＮＡ配列との間に存在するリンカー配列は、プロテアーゼのアクセスを抑制するために、できるだけ短く、そして／又は変異していることが好ましい。このことは、これらの融合蛋白質をコードするＤＮＡ配列において、機能蛋白質（即ちリガンド結合ドメイン）をコードするＤＮＡがＣｒｅのＤＮＡ配列の下流にある場合には、変異した潜在的スプライシング部位（野生型配列に基づいて１００６〜１００８の位置）からＣｒｅ配列の末端までの、又は上記リガンド結合ドメインの機能上の開始部位までの領域は、全部分又は部分的に、欠失及び／又は変異していてもよいことを意味する。用語「変異している」とは、基礎となるＤＮＡ配列が、中性アミノ酸、例えばＧｌｙ， Ａｌａ， Ｖａｌ， Ｐｒｏ又はＩｌｅ、特にＧｌｙ及びＰｒｏから本質的に成るアミノ酸配列をコードする短いＤＮＡ配列によって置換されることをも包含する。特に、このアミノ酸配列の長さは、１〜１０、好ましくは１〜５アミノ酸の範囲内である。
【００２３】
好ましくは、リガンド結合ドメインをコードする配列内に存在するスプライシング部位もまた、サイレント変異により、又はリガンド結合ドメインの蛋白質配列を改変する塩基変異により無機能化される。より好ましい配列は、配列番号５，７及び９に示すＤＮＡ配列である。
【００２４】
上記（３）に記載の本発明のベクターは、上記の（１）及び／又は（２）記載のＤＮＡ配列に加えて、追加の機能配列、例えば、上記の精製、検出又はトランスダクションを可能にする配列を含んでよい。更に、これは、発現を可能にする、例えば細菌や酵母や鱗翅類の細胞における発現を可能にする、又は上記のトランスジェニック生物における発現を可能にするプロモーターを含んでもよい。更に、このベクターは、複製起点、選択マーカー、マルチクローニング部位などを含んでもよい。
【００２５】
本発明の微生物又はトランスジェニック生物は、双方とも、上記の本発明のベクターによって形質転換され、それらの染色体内に組み込まれた形で本発明のＤＮＡ配列を保有しうる。本発明の「微生物」は、原核生物及び真核生物の双方を包含する。本発明の「生物」は、脊椎動物、特に哺乳類（例えばヒト及び非ヒト哺乳類、より詳しくは齧歯類、例えばマウス又はラット）又は魚類、あるいは無脊椎動物、例えば虫（ｗｏｒｍｓ）又は飛ぶ昆虫（ｆｌｉｅｓ）を包含する。
【００２６】
上記配列に加えて、本発明のＣｒｅ変異体又は本発明のＣｒｅ融合蛋白質はまた、他の蛋白質構造を含んでもよく、又は非蛋白質構造に連結されてもよい。
本発明のＣｒｅ変異体又はＣｒｅ融合蛋白質を調製する方法は、上記の通り、適切なベクターによって形質転換された微生物を培養することによって実行することができる。そしてその培養物から、当業者に周知の方法により目的蛋白質を単離及び精製することができる。
【００２７】
本発明は、遺伝子の条件付発現に関係する（インビボ及びインビトロの）実験において非常に重要である。本発明の配列は、誘発産物のバックグラウンド活性が許容されない場合に、特に有用である。例えば、従来のＣｒｅ−ＬＢＤ系を適用する際に、リポーター遺伝子の誘発的発現が、自発的発現によって制限されることが報告されている。このバックグラウンド活性は、リガンドとは無関係のＣｒｅ−ＬＢＤのリコンビナーゼ活性によって説明される（Ｆｕｈｒｍａｎｎ−Ｂｅｎｚａｋｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８， ｅ９９ （２０００））。本発明の構成体を適用することによって、この様な制限を克服することができる。Ｃｒｅ＊ＰＲトランスジェニックマウスの作成及び分析は現在研究中である。
【００２８】
更に本発明は、誘発条件付遺伝子ターゲティングの更なる進展にとって特に重要である。「条件付遺伝子ターゲティング」とは、自由に選択した細胞種又は組織における遺伝子の選択的変異誘発を意味する。また、この変異誘発は、場合により、誘発系を用いて所望の任意の時期に行うこともできる。古典的な遺伝子ターゲティングのこの様な改変は、生殖細胞内で既に発生している当該変異が望ましくない副作用を示す場合に、特に重要である。本発明を用いて、翻訳後に誘発性のＣｒｅ融合蛋白質を発現するトランスジェニック動物、好ましくはトランスジェニックマウスを調製することができる。ｌｏｘＰを含有する標的配列を保有するマウス株と交配する際に、そのゲノム内の選択した変異、例えば欠失、反転又は転位を、所望の任意の時期に、誘発剤の添加によって起こすことができる。
【００２９】
本発明の１つの特定の利点は、誘発剤の添加前には広く上記Ｃｒｅリコンビナーゼ活性が低いことである。従ってトランスジェニック動物において、該遺伝子型の望ましくない（即ち誘発剤の添加前に発生する）改変は考えられない。これまで、この様なＣｒｅのバックグラウンド活性のために、誘発の前後に、該遺伝子型を明白に確立することが困難であった。このトランス遺伝子に用いているプロモーターの特異性に応じて、誘発性Ｃｒｅの発現を、細胞種又は組織特異的に、あるいは普遍的に起こすことができる。後者の場合、全ての種類の組織又は細胞において変異誘発を時間的に調節することができるトランスジェニック動物が得られる。時間的かつ空間的な調節は、細胞種特異的なプロモーターを用いることによって可能となる。この様なトランスジェニック構成体を、トランスジェニック株を作成するために微小注入法によって使用することも、あるいは相同組み換えによってゲノム内の選択した領域に組み込むこともできる。
【００３０】
以下の実施例によってより詳細に本発明を説明する。
実施例
以下の実施例では、以下のプライマーと鋳型を用いた。
プライマー：
2004502455.tif 000002
　鋳型：
2004502455.tif 000003
【００３１】
実施例１：クローニング過程１：ｐＮＮ内のＬＢＤ
最初のクローニング過程では、様々な長さのＰＲ及びＥＲのＬＢＤを、ｐＮＮ２６５Ｅ−ｂｐＡ（ドイツ国、ケルン大学、遺伝研究所から入手した）にクローン化した。このクローニングを、上記ベクターを一カ所だけ切断する制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＶを用いて、そしてＰＣＲによる増幅産物内にもこれらの制限酵素部位を導入することによって行った。
【００３２】
５’末端と３’末端の短縮によって種々の長さのＰＲのＬＢＤを作成した。５’末端の短縮により、ＰＲはアミノ酸６５０， ６７６及び６７８から始まった。ＰＲのＬＢＤがＬｅｕ６５０から始まることにより、ＬＢＤのＤドメインは１０アミノ酸短くなる。このＮ末端は、以前の実験（Ｋｅｌｌｅｎｄｏｎｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ２４， １４０４−１４１１ （１９９６））から分かる通り、この様な構成体においてＣｒｅの活性が高いことから、選択された。
２番目のＮ末端短縮は、ＰＲのＳｅｒ６７６まで行われた。これは、Ｋｅｌｌｅｎｄｏｎｋ ｅｔ ａｌ． （１９９６）によって見出された結果及びその考察に基づいたものである。ＣｒｅとＬＢＤとの間のリンカーとしてのＰＲのＤドメインのアミノ酸が少ないほど、融合蛋白質のバックグラウンド活性は低い。特に、ＬＢＤ の開始点としてアミノ酸６４１， ６７２及び６８７が検査された（Ｋｅｌｌｅｎｄｏｎｋ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。ＰＲ６４１では、Ｃｒｅの活性は高かったが、バックグラウンドも高かった。逆に、ＰＲ６７２では、ＰＲ６４１に比べて活性は少し低く、そしてまたバックグラウンドも低かった。ＰＲ６８７は、殆ど活性を示さなかった。
【００３３】
従ってＣｒｅの活性が高く維持され、またバックグラウンドは許容できる低レベルで維持されることを期待して、アミノ酸６７２と６８７との間で、Ｓｅｒ６７６を開始点とする構成体を選択した。更にＳｅｒ６７６構成体では、Ｌｅｕ６５０に比べて、潜在的なスプライシングを可能にする２つの強いスプライシング受容部位（ＳＡ）が配列上で改変されている。１つ目のＳＡは、配列の欠失により除去されている。２つ目のＳＡは、構成体中で高Ｃ／Ｔ含有配列領域が欠失するようにコンセンサス配列上で改変されている。またリンカー領域で、潜在的なプロテアーゼ認識アミノ酸、例えばＡｒｇ， Ｌｙｓが欠失する様に配慮した。
３番目の５’末端短縮変種Ｇｌｙ６７８では、Ｓｅｒ６７６では依然として存在する２つめのＳＡの残存配列を除去した。この様な構成体のＣｒｅ活性が、リンカーの短縮によって更に制限されないように、そしてまたリンカーの柔軟性を増すためにも、２つのグリシンによりＳｅｒ６７６及びＰｒｏ６７７を置換した。
【００３４】
実施例２：ＬＢＤのＮ末端又はＣ末端へのＣｒｅ１９のクローニング
制限部位ＫａｓＩを介して、Ｃｒｅ１９をＬＢＤのＮ末端に無方向性にクローン化した。鋳型ｐＧＫＣｒｅｂｐＡ上で増幅した挿入配列をＫａｓＩにより切断し、そしてＫａｓＩにより切断して脱リン酸化した、ＬＢＤを有するｐＮＮベクターに連結した。更に、ＰＲ及びＥＲの種々のＬＢＤを有するｐＮＮベクターの制限部位ＢｓｉＷＩを介して、ＬＢＤのＣ末端に無方向性にクローン化した。従って表１に示すプライマーを用いて、鋳型ｐＧＫＣｒｅｂｐＡ上でＣｒｅ１９配列をＰＣＲにより増幅し、ＢｓｉＷＩにより制限切断し、そしてＢｓｉＷＩにより制限切断して脱リン酸化したｐＮＮベクターに連結した。
表１：使用したプライマー配列
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【００３５】
実施例３：ＰＲ６７６−９１４のＮ末端へのｈＣｒｅのクローニング
Ｃｒｅはファージ蛋白質であり、故にその配列は原核生物の翻訳機構に適しているので、真核生物の発現系に最適化するように試みた。従ってＲ． Ｓｐｒｅｎｇｅｌは、Ｆ． Ｓｔｅｗａｒｔと協力してＣｒｅ配列を最適化し、その結果、翻訳効率を向上させた。彼は、この様に改変したＣｒｅ配列を「ヒト化Ｃｒｅ （ｈＣｒｅ）」と称した（Ｆ． Ｓｔｅｗａｒｔ， 未公開データ）。細胞培養において、構成体ｐＮＮＣｒｅ１９ＰＲ６７６−９１４が、これまでで最高のＣｒｅ活性を示すことを見出した後、正常なＣｒｅ１９に代えて、この構成体にｈＣｒｅを挿入した。
ｈＣｒｅ２配列及びｈＣｒｅ１９配列を各々ＰＲ６７６−９１４のＮ末端にクローン化した。表２に示すプライマーを用いて、鋳型ｐＢｌｕｅｈＣｒｅ上でｈＣｒｅ２及びｈＣｒｅ１９のＰＣＲを行った。増幅産物をＢａｍＨＩ／ＫａｓＩによって制限切断し、そしてＢａｍＨＩ／ＫａｓＩによって制限切断したｐＮＮＣｒｅ１９ＰＲ６７６−９１４に連結した。
表２：使用したプライマー配列
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【００３６】
実施例４：Ｃｒｅ１９Ｖ３３６Ａのクローニング
ファージのＣｒｅ１９配列に変異Ｖ３３６Ａを導入した。従ってこの変異を有するＣｒｅ配列（以下Ｃｒｅ１９Ｖ３３６Ａと称する）をＰＲ６７６−９１４のＮ末端にクローン化した。
変異Ｖ３３６Ａを、表３に示す３’プライマーを介してＣｒｅ１９配列に導入した。鋳型ｐＮＮＣｒｅ１９ＰＲ６７６−９１４上で増幅した産物を、制限部位ＳｆｏＩを介して無方向性に、ＳｆｏＩにより制限切断して脱リン酸化したｐＮＮＣｒｅ１９ＰＲ６７６−９１４にクローン化した。ＢａｍＨＩによる切断によって、ベクター内のＣｒｅ１９Ｖ３３６Ａが正しい方向であることが示された。配列決定によりこの変異を検出した。
表３：使用したプライマー配列
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【００３７】
実施例５：ｈＣｒｅ１９Ｖ３３６Ａのクローニング
変異Ｖ３３６Ａを、表４に示す３’プライマーを介してｈＣｒｅ１９配列に導入した。ＰＣＲにより鋳型ｐＮＮｈＣｒｅ１９ＰＲ６７６−９１４中に導入したＢａｍＨＩ及びＳｆｏＩクローニング部位を介して、ｈＣｒｅ１９Ｖ３３６Ａを、ＢａｍＨＩ／ＳｆｏＩにより制限切断したｐＮＮＣｒｅ１９ＰＲ６７６−９１４にクローン化した。配列決定によりこの変異を検出した。
表４：使用したプライマー配列
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【００３８】
実施例６：Ｃｒｅ１９−ＰＲ６７６−９１４， ｈＣｒｅ１−ＰＲ６７６−９１４及びｈＣｒｅ１９−Ｖ３３６Ａ−ＰＲ６７６−９１４の活性試験
前日に６ウエルプレートに播いたＣＶ１−５Ｂ細胞（トランスフェクション当たり８ ｘ １０４ 細胞／６ウエル）に、３つ１組で、１ μｇの各融合蛋白質プラスミド及び１ μｇのｐＨＤ２−ＡＰをトランスフェクションした。トランスフェクションの１２時間後に、トリプシン処理により細胞を剥がし、１２ウエルプレートの２つのウエルに等量ずつ分けた。一方のウエルには培地中に１００ ｎＭのＲＵ４８６ （Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ， Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を加え、他方のウエルには培地のみを加えた。トランスフェクションの３日後、細胞を固定し、βガラクトシダーゼ及びアルカリホスファターゼ（トランスフェクション効率に関して標準化を行うためのもの）に対して染色を行った。平行してトランスフェクションしたｐＮＮ−ＣＭＶ−Ｃｒｅ（Ｃｒｅを有するが、融合相手を有しない同一ベクター）に対するパーセントで比較を行った。従って、ＣＭＶ−Ｃｒｅの平均値を１００ ％として、融合蛋白質の平均値をこれと比較した。結果を図４に示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１：選択したＣｒｅ−ＬＢＤ構成体のスプライシングパターン。
Ａ）〜Ｄ）潜在的なスプライシング供与部位（ＳＤ）及びスプライシング受容部位（ＳＡ）を有する選択したＣｒｅ−ＬＢＤ構成体のプレｍＲＮＡを示す。括弧内の数値は、これらの部位の相対的使用確率（スコア）を表す。このスコアは、スプライシング部位が、共通配列（Ｅ）に対してどの程度類似しているかを測定した値である。ＳＡに対して１００％相同である場合のスコアは１４．２であり、構成エキソンにおける平均値は７．９である。ＳＤに対して１００％相同である場合のスコアは１２．６であり、構成エキソンにおける平均値は８．１である。スコアが４超のＳＤ及びＳＡのみ図示している。スコアは、コンピュータプログラム”ｓｐｌｉｃｅ ｓｉｔｅ ｓｃｏｒｅ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ”（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｉｍｃｂ．ｏｓａｋａ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓｐｌｉｃｅ／ｓｃｏｒｅ．ｈｔｍｌ）により計算した。
使用した略号：
ＳＳ：合成スプライシング基質（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １１， ３０７０−３０７４ （１９９１））；
Ｃｒｅ１９：アミノ酸１９から始まるＣｒｅ；
ｈＣｒｅ２：アミノ酸２から始まるヒト化したＣｒｅ；
ＰＲ及びＥＲ：プロゲステロン及びエストロゲン受容体のＬＢＤであり、数字はアミノ酸の位置を示す；
ＥＲＴ２：アミノ酸置換Ｇ４００Ｖ， Ｍ５４３Ａ， Ｌ５４４Ａを有するエストロゲン受容体のＬＢＤ （Ｆｅｉｌ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２３７， ７５２−７５７ （１９９７））；
ｂｐＡ：ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル；
Ｙ：Ｃ又はＴのいずれか。
【図２】
図２：Ｐ１ＣｒｅＰＲ６５０−９１４をコードする構成体の潜在的なスプライシング現象のＲＴ−ＰＣＲによる検出。
Ｃｒｅ１９ＰＲ６５０−９１４の融合領域を示す。
Ａ）潜在的にスプライシングされた配列（上）とそれに対応するスプライシングされていない配列（下）との配列比較。
Ｂ）潜在的なスプライシング現象の概略図。この領域の重要なアミノ酸を図示する。矢印はＰＣＲの範囲を示す。ＲＴ反応の後、５’プライマーと外側の３’プライマーとを用いて配列の増幅を行った。アガロースゲルから単離した後、５’プライマーと内側の３’プライマーとを用いて反ネスト式ＰＣＲを行った。
【図３】
図３：種々のＣｒｅコード配列の３’末端配列と、スプライシング供与部位の共通配列との配列比較。
Ｃｒｅコード配列の３’末端配列を構成する部分：
Ａ） Ｐ１−Ｃｒｅ
Ｂ） ｈＣｒｅ
Ｃ） Ｐ１−ＣｒｅＶ３３６Ａ；及び
Ｄ） ｈＣｒｅＶ３３６Ａ。
Ｃｒｅ配列上でアミノ酸置換を導入した部分を示す。Ｐ１−ＣｒｅにおけるＶ３３６周辺の塩基配列は、図示したスプライシング供与部位の共通配列に対して相同性が高い。ｈＣｒｅでも相同性はなお高い。従って、この部位において潜在的なスプライシングの危険性はより高い。Ｐ１−Ｃｒｅ及びｈＣｒｅの変異配列では、コドン３３６（配列番号１に示す野生型配列に基づく残基番号）を、ＧＴＧ （Ｖａｌ）からＧＣＧ （Ａｌａ）に変更した。配列ＧＴＮが必須であることから、この置換によりスプライシングの可能性はもはや存在しない。野生型Ｃｒｅの塩基配列（配列番号１；Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９８６による）に基づいて、位置１００７でＴからＣへ塩基置換されている。
【図４】
図４：実施例６に記載のＣｒｅ１９ＰＲ６７６−９１４、ｈＣｒｅ１９ＰＲ６７６−９１４及びｈＣｒｅ１９Ｖ３３６ＡＰＲ６７６−９１４の活性試験。
棒グラフは、３つの異なるトランスフェクションに基づく平均値を標準偏差と共に示す。白棒は、未変異のＣｒｅ１９ＰＲ６７６−９１４又はｈＣｒｅ１９ＰＲ６７６−９１４の％活性を、そして黒棒は、変異したｈＣｒｅ１９Ｖ３３６ＡＰＲ６７６−９１４のものを示す。棒内の数値は、対応する構成体の誘発性を示す。これを、誘発状態の％活性をバックグラウンド活性で除すことにより計算した。「＋」は培地中に１００ ｎＭ ＲＵ４８６が存在すること、「−」は培地中に誘発剤が存在しないことを示す。
【図５】
図５：ＰＲとの融合体におけるＰ１−Ｃｒｅ変異体とｈＣｒｅ変異体との活性検査の比較。
実施例６の記載通りに実験を行った。２回の独立したトランスフェクションの結果を示す。棒グラフは、各々３つの異なるトランスフェクションに基づく平均値を標準偏差と共に示す。白棒は、ＣＭＶ−Ｃｒｅに対するＣｒｅ１９−ＬＢＤ構成体 の％活性を示し、灰棒は、Ｃｒｅ１９Ｖ３３６ＡＰＲ６７６−９１４の場合、黒棒は、ｈＣｒｅ１９Ｖ３３６Ａ−ＬＢＤ構成体の場合を示す。「＋」は培地中に１００ ｎＭ ＲＵ４８６が存在すること、「−」は培地中に誘発剤が存在しないことを示す。
【図６】
図６：使用したＣｒｅ配列の潜在的スプライシングパターン、及び誘発剤非存在下のＣｒｅ活性に対する効果の比較図。
記載した％値は、非融合のＣｒｅ （＝１００％）に対する、図示したＣｒｅとＰＲ６７６−９１４との融合構成体の比較値を表す。
【図７】
図７：本発明の基礎となるＣｒｅ＊ＰＲ（即ちｈＣｒｅＶ３３６Ａ−ＰＲ６５０−９１４）と、以前に公開されているＣｒｅＰＲ１ （Ｋｅｌｌｅｎｄｏｎｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ２４， １４０４−１４１１ （１９９６））とにおける誘発性Ｃｒｅ活性の比較分析。
Ａ）実施例６の記載通りに実験を行った。３つの異なるトランスフェクションに基づく平均値を標準偏差と共に示す。
Ｂ）用量−効果分析。図示した構成体をリポーター細胞にトランスフェクションし、それを種々の濃度のＲＵ４８６の存在下に培養した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年5月31日(2002.5.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バクテリオファージＰ１リコンビナーゼＣｒｅの変異体をコードするＤＮＡ配列であって、配列番号１に示す野生型配列の位置１００３〜１０１１に対応する配列ＡＴＧ ＧＴＧ ＣＧＣに存在する潜在的スプライシング部位を、そのＣｒｅ蛋白質配列を改変する塩基変位によって、無機能化するために、そのスプライシング部位配列中のコドンＧＴＧをコドンＸＹＺによって置換した、但しＸ， Ｙ及びＺは、独立にヌクレオチドＡ， Ｔ， Ｃ又はＧであり、但しＸ＝Ｇの場合にはＹ≠Ｔである、前記ＤＮＡ配列。
【請求項２】
コドンＸＹＺが中性アミノ酸をコードする、請求項１に記載のＤＮＡ配列。
【請求項３】
ＸＹＺがＡｌａをコードするコドンであるＧＣＧである、請求項２に記載のＤＮＡ配列。
【請求項４】
野生型配列中に存在する他の潜在的スプライシング部位を、サイレント変異によって、及び／又はそのＣｒｅ蛋白質配列を改変する塩基変位によって無機能化した、請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ配列。
【請求項５】
野生型Ｃｒｅ配列における５’末端が短縮されている、特には、野生型の位置１〜５４に対応するヌクレオチドが欠失している、請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡ配列。
【請求項６】
野生型Ｃｒｅ配列中に存在しない付加アミノ酸をコードするヌクレオチドを５’末端に有している、請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡ配列。
【請求項７】
前記の付加ヌクレオチドが中性アミノ酸、特にＭｅｔ， Ｇｌｙ， Ｖａｌ及びＡｌａをコードする、請求項６に記載のＤＮＡ配列。
【請求項８】
野生型配列における３’末端が短縮されている、請求項１〜７のいずれかに記載のＤＮＡ配列。
【請求項９】
配列番号５，７又は９のヌクレオチド１〜９８４を含有する、請求項１に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１０】
バクテリオファージＰ１リコンビナーゼＣｒｅと別の機能蛋白質とに由来する融合蛋白質をコードするＤＮＡ配列であって、そのバクテリオファージＰ１リコンビナーゼＣｒｅをコードする配列が、請求項１〜９のいずれかに記載の配列である、前記ＤＮＡ配列。
【請求項１１】
前記の機能蛋白質が、受容体蛋白質のリガンド結合ドメインであり、その受容体が特にはステロイド受容体であり、好ましくはプロゲステロン、エストロゲン又はグルココルチコイド受容体である、請求項１０に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１２】
前記受容体がプロゲステロン受容体であり、特には配列番号３のヌクレオチド１９４８〜２７４２を含んで成るプロゲステロン受容体である、請求項１１に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１３】
前記リガンド結合ドメインをコードする配列内の潜在的スプライシング部位を、サイレント変異によって、又はそのリガンド結合ドメインの蛋白質配列を改変する塩基変位によって無機能化した、請求項１０〜１２のいずれかに記載のＤＮＡ配列。
【請求項１４】
配列番号５，７又は９に示す配列を有する、請求項１０ に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載のＤＮＡ配列を含有するベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクター及び／又は請求項１〜１４のいずれかに記載のＤＮＡ配列を含有する微生物又はトランスジェニック生物。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれかに記載のＤＮＡ配列によってコードされているＣｒｅ変異体又はＣｒｅ融合蛋白質。
【請求項１８】
請求項１７に記載のＣｒｅ変異体又はＣｒｅ融合蛋白質を製造する方法であって、請求項１５に記載のベクターによって形質転換された、又はそのベクターをトランスフェクションした微生物又は培養細胞を培養することを含んで成る、前記方法。
【請求項１９】
生物個体内におけるｌｏｘＰ部位を含有する標的配列の変異誘発及び／又は組み換えのための、請求項１１〜１４のいずれかに記載のＤＮＡ配列の使用。
【国際調査報告】
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