(57)【要約】Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）と主要組織適合複合体（ＭＨＣ）抗原とを含む免疫複合体を調節する化合物の同定方法が開示されている。本発明は免疫応答を調節する成分を検出するための高速大量処理スクリーニングアッセイ法の提供など、多くの有用な応用性を有する。
2004501364.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ−細胞レセプター（ＴＣＲ）と主要組織適合複合体（ＭＨＣ）抗原とを含有してなる免疫複合体を調節する化合物の同定方法であって、
ａ）少なくとも１種の試験化合物の存在下または非存在下に、第一のＴＣＲ分子とＭＨＣ抗原分子とを、ＴＣＲおよびＭＨＣ抗原分子が特異的に免疫複合体として結合するのに十分な条件下で接触させること；
ｂ）該試験化合物の存在下および非存在下に免疫複合体の存在を検出すること；
ｃ）ＴＣＲとＭＨＣ抗原分子との間の特異的な結合を変化させる試験化合物を選択すること；および
ｄ）免疫複合体を調節するものとして当該選択化合物を同定すること；
を含んでなることを特徴とする方法。
【請求項２】
該ＭＨＣ抗原が、ＭＨＣ／ペプチド複合体、ＭＨＣ／スーパー抗原複合体、ＭＨＣ／脂質（または糖脂質）複合体、または異質反応性もしくは異種反応性ＭＨＣ分子を含有してなるＭＨＣに基づく分子である請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＴＣＲまたはＭＨＣ成分の少なくとも一方がヘテロ二量体である請求項１および２記載の方法。
【請求項４】
該ヘテロ二量体が天然産または組換え体である請求項３記載の方法。
【請求項５】
該ＴＣＲ分子が組換え一本鎖（ｓｃ−）分子である請求項１ないし４に記載の方法。
【請求項６】
該ＴＣＲ分子が完全可溶性である請求項１ないし５に記載の方法。
【請求項７】
該ＴＣＲ分子が表面分子として細胞により発現されるものである請求項１ないし５に記載の方法。
【請求項８】
該ＴＲＣ分子が膜貫通型ドメインを含有してなる請求項７記載の方法。
【請求項９】
該ＴＣＲ分子が多価性である請求項１ないし８に記載の方法。
【請求項１０】
該ＴＣＲ分子が少なくとも哺乳動物の免疫グロブリン分子の一部を含有してなる請求項１ないし９に記載の方法。
【請求項１１】
該融合免疫グロブリン分子が定常ドメインまたはその機能的フラグメントを含有してなる請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該定常ドメインが少なくともκまたはλ軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）の一部を含有してなる請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
該定常ドメインが重鎖定常ドメインである請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
該免疫グロブリン分子がＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡまたはキメライソタイプを有する請求項１０ないし１３に記載の方法。
【請求項１５】
該哺乳動物重鎖がＩｇＧイソタイプを有し、少なくともＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含有してなる請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
該哺乳動物のＩｇＧ重鎖がＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含有してなる請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
該哺乳動物重鎖がＩｇＭイソタイプを有し、ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４ドメインを含有してなる請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
該哺乳動物の免疫グロブリン分子がマウスまたはヒトの配列を含有してなるか、または該配列からなるものである請求項１０記載の方法。
【請求項１９】
該ＴＣＲ分子がさらに２個以上のＴＣＲ分子を結合させるための少なくとも１個のタグ標識を含有してなる請求項９ないし１８に記載の方法。
【請求項２０】
該ＴＣＲ分子が二量体、三量体、四量体またはより高次の複合体を形成し得るものである請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
該ＴＣＲ分子が少なくとも融合した哺乳動物のＣＤ３ζ配列の一部を含有してなる請求項１ないし２０に記載の方法。
【請求項２２】
該融合した哺乳動物のＣＤ３ζ配列が膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインまたはその機能的フラグメントを含有してなる請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該ＭＨＣ抗原のＭＨＣ成分がクラスＩ、クラスＩＩ、またはその組み合わせである請求項１ないし２２に記載の方法。
【請求項２４】
該ＭＨＣ抗原のＭＨＣ成分がヘテロ二量体であるか、または組換え一本鎖分子である請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
該ＭＨＣ抗原分子がＭＨＣ／ペプチド複合体であり、各ＭＨＣ抗原分子が融合した提示ペプチドを含有してなる請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
該ＭＨＣ抗原分子がＭＨＣ／ペプチド複合体であり、該方法がさらに該ＭＨＣ成分に適切な提示ペプチドを負荷することを含んでなるものである請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
該提示ペプチドの負荷を接触工程に先立ち、またはその間に実施する請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
該ＭＨＣ抗原分子が完全可溶性である請求項１ないし２７に記載の方法。
【請求項２９】
該ＭＨＣ抗原分子が表面分子として細胞により発現されるものである請求項１ないし２８に記載の方法。
【請求項３０】
該ＭＨＣ抗原分子が少なくとも膜貫通ドメインの一部を含有してなる請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
該ＭＨＣ抗原分子が多価性である請求項１ないし３０に記載の方法。
【請求項３２】
該ＭＨＣ抗原分子が少なくとも融合した哺乳動物の免疫グロブリン分子の一部を含有してなる請求項１ないし３１に記載の方法。
【請求項３３】
該ＭＨＣ抗原分子の融合した免疫グロブリン分子が定常ドメインまたはその機能的フラグメントを含有してなる請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
該定常ドメインが少なくともκまたはλ軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）の一部を含有してなる請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
該定常ドメインが重鎖定常ドメインである請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
該免疫グロブリン分子がＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡまたはキメライソタイプを有するものである請求項３２ないし３５に記載の方法。
【請求項３７】
該哺乳動物の重鎖がＩｇＧイソタイプを有し、少なくともＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含有してなる請求項３２ないし３６に記載の方法。
【請求項３８】
該哺乳動物のＩｇＧ重鎖がＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含有してなる請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
該哺乳動物の重鎖がＩｇＭイソタイプを有し、ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４ドメインを含有してなる請求項３２ないし３６に記載の方法。
【請求項４０】
該哺乳動物の免疫グロブリン分子がマウスまたはヒトの配列を含有してなるか、または該配列からなるものである請求項３２記載の方法。
【請求項４１】
該ＭＨＣ抗原分子がさらに２個以上のＭＨＣ抗原分子を結合させるための少なくとも１個のタグ標識を含有してなる請求項３１ないし４０に記載の方法。
【請求項４２】
該ＭＨＣ抗原分子が二量体、三量体、四量体またはより高次の複合体を形成し得るものである請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
該ＭＨＣ抗原分子が少なくとも融合した哺乳動物のＣＤ３ζ配列の一部を含有してなる請求項１ないし４２に記載の方法。
【請求項４４】
該融合した哺乳動物のＣＤ３ζ配列が膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインまたはその機能的フラグメントを含有してなる請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
該ＴＣＲ分子が少なくとも１個の膜貫通ドメインまたはその機能的フラグメントを含有してなる表面分子として細胞により発現されるものである請求項１ないし５、および７ないし４４に記載の方法。
【請求項４６】
該同族体ＭＨＣ抗原分子が固形支持体に結合している請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
該ＭＨＣ抗原分子が少なくとも１個の膜貫通ドメインを含有してなる表面分子として細胞により発現されるものである請求項１ないし２７、および２９ないし４６に記載の方法。
【請求項４８】
該ＴＣＲ分子が固形支持体に結合している請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
該結合したＭＨＣ抗原またはＴＣＲ分子の少なくとも一方が少なくとも１個のデンドリマー、合成または半合成ポリマーに結合している請求項４６または４８記載の方法。
【請求項５０】
該固形支持体が組織培養ウエルもしくはプレート、テストストリップ、クロマトグラフィーマトリックス、電気泳動マトリックス、またはビーズである請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
該ビーズが磁性である請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
該検出工程がさらにＴＣＲ分子を発現する細胞、ＭＨＣ抗原分子を発現する細胞、またはその両方からの少なくとも１つの応答を検出することを含んでなり、該応答が免疫複合体の安定な形成から生じるものである請求項４５および４７記載の方法。
【請求項５３】
当該方法により検出される細胞応答が、細胞接着、膜電位、細胞内もしくは細胞外イオン濃度、細胞内キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、細胞内タンパク質輸送、内在性もしくは異種遺伝子発現、少なくとも１種のサイトカイン産生を含むタンパク質産生もしくは分泌、細胞増殖、アポトーシス、ＲＮＡ合成、またはＤＮＡ合成の内の少なくとも１つである請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
該方法がさらにＴＣＲ分子を発現する細胞による少なくとも１種のサイトカインの産生を測定することを含んでなる請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
該発現細胞により産生されるサイトカインがインターロイキン−２（ＩＬ−２）である請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
サイトカインと、該サイトカインに特異的に結合し得る第一抗体とを接触させ、該第一抗体とサイトカインとを含有してなる複合体を形成させることにより当該産生を測定することからなる請求項５４ないし５５に記載の方法。
【請求項５７】
該第一抗体が固形支持体に結合している請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
該複合体と、サイトカインに特異的に結合し得る検出可能に標識した第二抗体とを接触させることにより、該サイトカインの産生をさらに測定することからなる請求項５６ないし５７に記載の方法。
【請求項５９】
検出可能に標識した第二抗体の存在が、試験化合物の存在および非存在下に形成される免疫複合体の指標である請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
検出された細胞応答がＴ細胞の活性化または増殖である請求項５３記載の方法。
【請求項６１】
該Ｔ細胞の活性化を標準的Ｔ細胞活性化アッセイにより測定する請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
該ＴＣＲ発現細胞が少なくとも１種の他のタイプの細胞表面ＴＣＲ分子を発現するものである請求項４５記載の方法。
【請求項６３】
当該他のタイプの細胞表面ＴＣＲ分子が、第一ＴＣＲ分子とは異なるＭＨＣ抗原結合特異性を有する第二ＴＣＲ分子を含有してなるか、または該第二ＴＣＲ分子からなるものである請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
該第二細胞表面ＴＣＲ分子を該方法においてコントロールとして使用する請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
該第二ＴＣＲ分子が発現細胞内在性の天然産ＴＣＲレセプターである請求項６２ないし６４に記載の方法。
【請求項６６】
該第二ＴＣＲ分子が組換えへテロ二量体または一本鎖（ｓｃ−）分子である請求項６２ないし６４に記載の方法。
【請求項６７】
該試験化合物の、第二ＴＣＲ分子とその同族体ＭＨＣ抗原を含有してなるコントロール免疫複合体の形成を調節する能力が無視し得るものである請求項６２ないし６６に記載の方法。
【請求項６８】
該試験化合物の、第二ＴＣＲ分子とその同族体ＭＨＣ抗原を含有してなるコントロール免疫複合体の安定性を調節する能力が無視し得るものである請求項６２ないし６７に記載の方法。
【請求項６９】
該方法がさらにＴＣＲ分子（類）と少なくとも１種の分化クラスター（ＣＤ）分子とを同時に発現することを含んでなる請求項４５ないし６８に記載の方法。
【請求項７０】
該ＣＤ分子が少なくとも１種の細胞応答を増強し得るものである請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
該ＣＤ分子が組換え体である請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
該細胞により同時発現される組換えＣＤ分子がＣＤ４である請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
該Ｔ細胞がＴ細胞ハイブリドーマである請求項１ないし７２記載の方法。
【請求項７４】
該Ｔ細胞ハイブリドーマが少なくとも１種のサイトカインを産生し得るものである請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
該サイトカインがインターロイキン−２（ＩＬ−２）である請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
該タグ標識が少なくとも１個のビオチンリガーゼ標的配列を含有してなるアミノ酸配列を含有してなる請求項１９ないし２０および４１ないし４２に記載の方法。
【請求項７７】
該ビオチンリガーゼ標的配列が少なくともＢｉｒＡ配列を含有してなる請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
該ＴＣＲまたはＭＨＣ抗原分子の少なくとも一方が検出可能に標識されたものである請求項１ないし７７記載の方法。
【請求項７９】
該標識が直接的または間接的に検出可能なものである請求項１ないし７８記載の方法。
【請求項８０】
該標識が直接的に検出可能であり、蛍光、りん光、発光、色素原もしくは化学発光標識またはその前駆体である請求項７９記載の方法。
【請求項８１】
該標識が放射性核種である請求項７９記載の方法。
【請求項８２】
該標識が間接的に検出可能であり、タグ標識または酵素の少なくとも一方である請求項７９記載の方法。
【請求項８３】
該タグ標識が抗体、細胞レセプター、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン、ストレプトアビジンまたはその機能的フラグメントに特異的に結合するか、またはタンパク質分解酵素、プロテインキナーゼ、ビオチンリガーゼまたはその機能的フラグメントによる特異的改変の標的である請求項８２記載の方法。
【請求項８４】
該酵素が西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ベータ−ガラクトシダーゼ（ｂ−ｇａｌ）、またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）である請求項８２記載の方法。
【請求項８５】
該検出がＥＬＩＳＡ検出フォーマットを用いることにより実施するものである請求項７８ないし８４記載の方法。
【請求項８６】
該選択工程がさらに試験化合物についてコントロール免疫複合体の形成を調節する能力を殆ど無視し得ると確認することを含んでなる請求項１ないし８５に記載の方法。
【請求項８７】
該選択工程がさらに試験化合物についてコントロール免疫複合体の安定性を調節する能力を殆ど無視し得ると確認することを含んでなる請求項１ないし８６に記載の方法。
【請求項８８】
該コントロール免疫複合体が、第一ＴＣＲと該第一ＴＣＲに特異的に結合し得る抗体を含有してなる請求項８６または８７に記載の方法。
【請求項８９】
該コントロール免疫複合体が、ＣＤ３分子とＣＤ３タンパク質に特異的に結合し得る抗体を含有してなる請求項８６または８７に記載の方法。
【請求項９０】
該コントロール免疫複合体が、第二ＴＣＲとその同族体ＭＨＣ抗原分子を含有してなる請求項８６または８７に記載の方法。
【請求項９１】
該第二ＴＣＲ分子が第一ＴＣＲ分子とは異なるＭＨＣ抗原結合特異性を有するものである請求項９０記載の方法。
【請求項９２】
該第二ＴＣＲ分子とその同族体ＭＨＣ抗原分子が天然産であるか、または組換え分子である請求項９０および９１に記載の方法。
【請求項９３】
該コントロール免疫複合体の形成または安定性が、ＴＣＲ分子またはＣＤ３分子を発現する細胞により少なくとも１種のサイトカインの産生を測定することにより検出するものである請求項８６ないし９２に記載の方法。
【請求項９４】
該ＭＨＣ抗原分子のＭＨＣ成分がｓｃ−ＭＨＣもしくはＨＬＡ分子またはＭＨＣもしくはＨＬＡヘテロ二量体である請求項１ないし９３に記載の方法。
【請求項９５】
該ＭＨＣ抗原が、Ｍ１ｓ抗原、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ＳＰＥ−Ａ、ＳＰＥＣ、ＥｘＦＴまたはＴＳＳＴスーパー抗原を含有してなるスーパー抗原−ＭＨＣ複合体である請求項１ないし９４に記載の方法。
【請求項９６】
Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）と主要組織適合複合体（ＭＨＣ）抗原とを含有してなる免疫複合体を調節する化合物の同定方法であって、
ａ）試験化合物の存在下または非存在下に、第一のＴＣＲ分子を発現する細胞と、固形支持体に結合したＭＨＣ抗原分子とを、ＴＣＲおよび結合したＭＨＣ抗原分子が特異的に免疫複合体として結合するのに十分な条件下で接触させること；
ｂ）該試験化合物の存在下または非存在下に、少なくとも１つの該細胞からの応答を測定することにより免疫複合体の存在を検出すること；
ｃ）第一ＴＣＲと、結合したＭＨＣ抗原分子との間の特異的な結合を変化させる試験化合物を選択すること；および
ｄ）免疫複合体を調節するものとして当該選択化合物を同定すること；
を含んでなることを特徴とする方法。
【請求項９７】
検出工程において測定される細胞応答がサイトカインの産生またはＴ細胞増殖である請求項９６記載の方法。
【請求項９８】
測定された細胞応答がサイトカイン・インターロイキン−２（ＩＬ−２）の産生である請求項９７記載の方法。
【請求項９９】
該方法がさらにＩＬ−２に特異的に結合し、かつ抗体複合体を形成し得る第一抗体またはその機能的フラグメントを固形支持体に結合することを含んでなる請求項９８記載の方法。
【請求項１００】
該方法がさらに該抗体複合体と、ＩＬ−２に特異的に結合し得る検出可能に標識した抗体またはその機能的フラグメントとを接触させることを含んでなる請求項９５記載の方法。
【請求項１０１】
該方法がさらに検出可能な標識を直接または間接に定量することを含んでなる請求項１００記載の方法。
【請求項１０２】
該方法がＥＬＩＳＡ検出フォーマットを含んでなる請求項１０１記載の方法。
【請求項１０３】
該ＴＣＲ分子の発現細胞がさらに第二（コントロール）ＴＣＲ分子またはＣＤタンパク質の少なくとも一方を発現する請求項９６ないし１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
該ＣＤタンパク質がＣＤ４である請求項１０３記載の方法。
【請求項１０５】
該選択工程がさらに試験化合物について、第一ＴＣＲとＭＨＣ抗原分子間の免疫複合体形成を低減または除去し得るものと同定することを含んでなる請求項９６ないし１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
該選択工程がさらに試験化合物について、第二ＴＣＲ分子とその同族体ＭＨＣ抗原とを含有してなるコントロール免疫複合体の形成を調節する能力を殆ど無視し得るものと確認することを含んでなる請求項９６ないし１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
該Ｔ細胞が多発性硬化症（ＭＳ）ＴＣＲ分子を発現し、該同族体ＭＨＣ抗原分子がミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）ペプチドを含有してなるＭＨＣ／ペプチド複合体である請求項９６ないし１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
該ＭＳ ＴＣＲ分子がＭＢＰ−制限ＭＳ Ｔ細胞株からのＴＣＲアルファ鎖およびベータ鎖を含有してなる請求項１０７記載の方法。
【請求項１０９】
該ＭＳ ＴＣＲがヘテロ二量体または組換え一本鎖分子である請求項１０８記載の方法。
【請求項１１０】
該ＭＳ Ｔ細胞株がＥ１１である請求項１０８ないし１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
該ＭＳ Ｔ細胞分子が共有結合したＣＤ３ζ配列またはその機能的フラグメントを含有してなる請求項９６ないし１１０記載の方法。
【請求項１１２】
該同族体ＭＨＣ抗原分子が一本鎖（ｓｃ−）ＤＲ２／ＭＢＰタンパク質またはその機能的フラグメントである請求項９６ないし１１１記載の方法。
【請求項１１３】
該ＭＨＣ抗原分子のＭＨＣ成分がエンプティＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲ２（ＤＲＢ１＊１５０１）またはその機能的フラグメントである請求項９６ないし１１２記載の方法。
【請求項１１４】
該方法がさらにＭＨＣ成分とＭＢＰ（アミノ酸８３〜１０２）ペプチドとを接触させ、ＭＨＣ成分にＭＢＰペプチドを負荷し、ＭＨＣ抗原分子を形成させることを含んでなる請求項１１３記載の方法。
【請求項１１５】
該負荷工程を、固形支持体への結合前、後、またはそれと同時に実施するものである請求項１１４記載の方法。
【請求項１１６】
該ＭＨＣ抗原分子が融合ＭＢＰ（アミノ酸８３〜１０２）ペプチドを含有してなるＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲ２（ＤＲＢ１＊１５０１）複合体である請求項９６ないし１１３に記載の方法。
【請求項１１７】
該ＤＲ２／ＭＢＰタンパク質がさらに共有結合したＩｇＧ重鎖定常ドメインまたはその機能的フラグメントを含有してなる請求項１１２ないし１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
該ＤＲ２／ＭＢＰ分子のＭＨＣ成分がヘテロ二量体または組換え一本鎖である請求項１１３ないし１１６に記載の方法。
【請求項１１９】
ＴＣＲとＭＨＣ分子が特異的に結合するのに十分な条件が、適切な増殖培地中、３７℃で約８時間、約１０％の二酸化炭素雰囲気下でインキュベーションすることである請求項９６ないし１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
該試験化合物を適切な溶媒に溶解する請求項１ないし１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
該溶媒が、水、生理塩溶液、組織培養培地、約２．５％のジメチルスルホキシド、または生理的に許容し得る緩衝液または担体の少なくとも１種である請求項１２０記載の方法。
【請求項１２２】
該ＴＣＲまたはＭＨＣ分子が多価性であり、かつ融合免疫グロブリンドメインを含有してなる請求項１ないし１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
該融合ＣＤ３ζ鎖がマウスまたはヒトの配列を含有してなる請求項２１、２２、４３、４４および１１１に記載の方法。
【請求項１２４】
該第一ＴＣＲ分子が完全可溶性であり、ＭＨＣ抗原分子がＭＨＣ／ペプチド複合体である請求項１記載の方法。
【請求項１２５】
第一ＴＣＲ分子が組換え一本鎖（ｓｃ−）ＴＣＲ分子であり、ＭＨＣ抗原がクラスＩ重鎖およびベータ−２ミクログロブリンを含有してなる組換えクラスＩ／ペプチド複合体である請求項１２４記載の方法。
【請求項１２６】
該第一ＴＣＲ分子が固形支持体に結合している請求項１２４ないし１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
該ＭＨＣ抗原分子が固形支持体に結合している請求項１２４ないし１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
該第一ＴＣＲ分子とＭＨＣ抗原分子が固形支持体に結合している請求項１２４ないし１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
ＴＣＲまたはＭＨＣ抗原分子の少なくとも一方を固形支持体に結合する前に、またはその間に、またはその後に、または同時に該固形支持体を試験化合物と接触させる請求項４６ないし１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
ＴＣＲまたはＭＨＣ分子の少なくとも一方を検出可能に標識する請求項１２４ないし１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
検出可能な標識がビオチンである請求項１３０記載の方法。
【請求項１３２】
該方法がさらに該固形支持体と、ビオチンに特異的に結合し、ビオチンを含有してなる複合体を形成し得るストレプトアビジンまたはアビジンとを接触させることを含んでなる請求項１３１記載の方法。
【請求項１３３】
該複合体の形成について、該複合体と特異的に結合し得る検出可能に標識した抗体と該複合体とを接触させることにより検出する請求項１３２記載の方法。
【請求項１３４】
当該検出をＥＬＩＳＡフォーマットの使用により実施する請求項１３０ないし１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
当該検出を均一系アッセイフォーマットの使用により実施する請求項１ないし１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
当該検出を光学、蛍光、または発光測定手段により実施する請求項１ないし１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
該試験化合物の、ＴＣＲ分子および以下のａ）またはｂ）と特異的に結合し得る抗体を含有してなるコントロール免疫複合体の形成を調節する能力が無視し得るものである請求項１ないし１３６に記載の方法：
ａ）ＴＣＲ分子上のエピトープであって、ＭＨＣ抗原分子に特異的に結合しないエピトープ（抗−ＴＣＲ抗体）；または
ｂ）細胞膜においてＴＣＲ分子と会合したクラスター分化（ＣＤ）タンパク質。
【請求項１３８】
該ＣＤタンパク質がＣＤ３であり、抗体がＴＣＲ分子と会合したＣＤ３と特異的に結合し得るものである（抗−ＣＤ３抗体）請求項１３７記載の方法。
【請求項１３９】
第一ＴＣＲとＭＨＣ抗原分子とを接触させる前に、またはその間に、またはその後に、または同時に第一ＴＣＲまたはＭＨＣ抗原分子の少なくとも一方を試験化合物と接触させる請求項１ないし１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
請求項１ないし１３９に記載の方法のいずれか一つにより同定される試験化合物。
【請求項１４１】
該試験化合物がＴＣＲ分子とその同族体ＭＨＣ抗原分子間の免疫複合体形成を調節し得るものである請求項１４０記載の試験化合物。
【請求項１４２】
該試験化合物がＴＣＲ分子とＭＨＣ抗原分子間の免疫複合体形成速度を減速または加速し得るものである請求項１４０ないし１４１に記載の試験化合物。
【請求項１４３】
該試験化合物がＴＣＲ分子とＭＨＣ抗原分子間の会合率を減少または増加させ得るものである請求項１４０ないし１４１に記載の試験化合物。
【請求項１４４】
該試験化合物がＴＣＲ分子とＭＨＣ抗原分子間の免疫複合体の結合活性を低下または増大させ得るものである請求項１４０ないし１４３に記載の試験化合物。
【請求項１４５】
該試験化合物がＴＣＲ分子とＭＨＣ抗原分子間の免疫複合体の多量体化を減少または増大させ得るものである請求項１４０ないし１４４に記載の試験化合物。
【請求項１４６】
該試験化合物が適切なコントロールに対して少なくとも１種の細胞応答を約１．５倍ないし約１００倍低下または上昇させるものである請求項１４０ないし１４５に記載の試験化合物。
【請求項１４７】
該細胞応答がサイトカインの産生である請求項１４０記載の試験化合物。
【請求項１４８】
産生されるサイトカインがインターロイキン−２（ＩＬ−２）である請求項１４７記載の試験化合物。
【請求項１４９】
適切なコントロールが、抗−ＴＣＲまたは抗−ＣＤ３抗体の存在下に産生されるサイトカインである請求項１４６ないし１４８に記載の試験化合物。
【請求項１５０】
請求項１４０ないし１４９に記載の化合物の少なくとも１種を含有してなる医薬組成物。
【請求項１５１】
哺乳動物における免疫応答を阻害する方法であって、請求項１５０に記載の医薬化合物の治療有効量を投与することを特徴とする方法。
【請求項１５２】
哺乳動物における免疫応答を促進する方法であって、請求項１５０に記載の医薬化合物の治療有効量を投与することを特徴とする方法。
【請求項１５３】
請求項１ないし１３９、１５１および１５２に記載の方法の少なくとも一つを実施するためのキット。
【請求項１５４】
哺乳動物のＣＤ３ζ配列またはその機能的フラグメントを含有してなる組換えＴＣＲ分子。
【請求項１５５】
該ＣＤ３ζ配列またはその機能的フラグメントがマウスまたはヒトの配列を含有してなる請求項１５４に記載の組換えＴＣＲ分子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は２０００年５月２５日出願の米国仮特許出願番号第０６／２０６、９２０の一部継続出願であり、当該出願の開示内容は参照により本件の開示に含まれる。
【０００２】
（技術分野）
本発明はＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）と主要組織適合複合体（ＭＨＣ）抗原との間の相互作用を調節する化合物に関する。一側面において、本発明は試験化合物を同定する方法を特徴とする。他の側面において、本発明は当該方法により検出同定される試験化合物、該化合物を含有する医薬製剤、並びにこれらの化合物を治療に使用する方法を提供する。本発明は多くの重要な適用に、例えば、有害な免疫応答を減少または除去し得る化合物、または有益な免疫応答を増強または開始させ得る化合物選択のための高速大量処理スクリーニングフォーマットに使用し得る。
【０００３】
（背景技術）
抗原特異Ｔ細胞は主要組織適合複合体（ＭＨＣ、例えば、ＨＬＡとして既知のヒトＭＨＣ）の結合溝または間隙に結合する特異ペプチドを認識し、それに応答する。ＭＨＣ分子によるペプチドの提示および抗原特異Ｔ細胞による認識は外来性抗原を同定し、それに応答する重要な免疫監視システムの代表である。抗原ペプチドは、ＭＨＣタンパク質の結合溝の多形残基により構成される特定の「結合ポケット」に非共有結合により結合する。ＭＨＣ結合抗原ペプチドはＴ細胞表面のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）と相互作用し、免疫応答を調節する。全般的参照文献：Ｆｏｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （基礎免疫学） ３ｒｄ Ｅｄ．， Ｗ． Ｐａｕｌ Ｅｄ． Ｒｓｅｎ Ｐｒｅｓｓ ＬＴＤ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９３）。
ローデ（Ｒｈｏｄｅ， Ｐ．）ら、米国特許５，８６９，２７０（スノル・モレキュラー・コーポレーション（Ｓｕｎｏｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））も参照。
【０００４】
ＭＨＣ分子はα鎖とβ鎖をもつ膜結合へテロ二量体糖タンパク質である。クラスＩＩ ＭＨＣ分子では、α１とβ１ドメインが会合してペプチド結合溝を形成する。抗原性ペプチドは、ペプチド上のアンカーアミノ酸と、α１とβ１ドメインが形成する結合ポケット間の相互作用を介してＭＨＣ分子に結合する。インフルエンザウイルスのペプチドと複合体形成したヒトのクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲ１のＸ線結晶構造は、該ペプチドとＭＨＣ分子間の相互作用を原子単位で詳細に示す。参照文献：Ｂｒｏｗｎ， Ｊ．Ｈ． ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６４： ３３−３９； Ｓｔｅｒｎ， Ｌ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｎａｔｕｒｅ ３６８： ２１５−２２１； ａｎｄ Ｇａｒｂｏｃｚｉ， Ｄ．Ｎ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０： １−７。
【０００５】
ＭＨＣクラスＩ分子はＭＨＣクラスＩＩ分子とは異なるドメイン機構をもつ。クラスＩ ＭＨＣ分子においては、α１およびα２ドメインが会合してペプチド結合溝を形成する。しかし、ＭＨＣ分子は両クラスとも全体としては類似の構造を有し、膜ドメインに対し遠位置にペプチド結合部位または溝をもつ。参照文献：Ｒｕｄｅｎｓｋｙ， Ａ．Ｙ． ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５３： ６２２−６２６。ＭＨＣ分子の考察については米国特許５，２８４，９３５；５，２６０，４２２；５，１９４，４２５；５，１３０，２９７；およびＷＯ９２／１８１５０；ＷＯ９３／１０２２０も参照。
【０００６】
Ｔ−細胞応答は抗原がＴ−細胞レセプター（ＴＣＲ）に結合することにより調節する。ＴＣＲの一つの型はα鎖およびβ鎖からなる膜に結合したヘテロ二量体である。このＴＣＲは免疫グロブリンの可変（Ｖ）領域および定常（Ｃ）領域に類似すると考えられる。ＴＣＲα鎖は共有結合したＶ−αおよびＣ−α鎖を含有しており、一方β鎖はＣ−β鎖に共有結合したＶ−β鎖を含む。Ｖ−αおよびＶ−β鎖はＭＨＣ分子との関連でスーパー抗原またはペプチド抗原に、または異質反応性ＭＨＣ分子に結合し得るポケットまたは間隙を形成する。一般的な参照文献：上記の Ｐａｕｌ， Ｗ． 参照。
【０００７】
報告によると、もしＴＣＲαおよびβ鎖が、特定のクラスター分化（ＣＤ）タンパク質を包含する複合体、すなわち、γ、δ、ε、およびζ鎖を含んでなるＣＤ３複合体に組み込まれなければ、ＴＣＲは分解される。参照文献例：Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９： １９０１。
【０００８】
抗原性ペプチドと複合体形成したＭＨＣ分子は幾つかの異なるメカニズムで選択的な免疫抑制を誘発し得るという認識がある。参照文献例：Ｇｕｅｒｙ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３（３／４）： １９５−２０６。
【０００９】
より具体的な報告によると、抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面上のペプチド−ＭＨＣ複合体は、もし抗原提示細胞が同時刺激シグナルをも送達するなら、ＭＨＣ結合ペプチドに特異的なＴ細胞株のクローン増殖を誘発するのみである。提案された一方法は、Ｔ細胞活性化のこの要件を利用するものであり、同時刺激シグナルがない状態でＭＨＣ分子に結合した抗原ペプチドとの相互作用によりＴ細胞の発生を阻害する。参照文献：Ｎｉｃｏｌｌｅ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． （１９９４） ９３： １３６１−１３６９； ａｎｄ Ｓｈａｒｍａ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９９１） ８８： １１４６５−１１４６９。
【００１０】
ＴＣＲとその適合性（同族体）ＭＨＣとの間に形成される免疫複合体を理解するために弛まぬ努力が重ねられている。その一手法が原子レベルで該複合体を研究するためのＸ線結晶学の利用である。参照文献：Ｇａｒｂｏｃｚｉ， Ｄ．Ｎ．， ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ ３８４： １３４−１４１； Ｇａｒｃｉａ， Ｋ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９： １１６６−１１７２； Ｄｉｎｇ， Ｙ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８： ４０３−４１１； ａｎｄ Ｒｅｉｎｈｅｒｚ， Ｅ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６： １９１３−１９２１。この手法を用い、異なるＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド免疫複合体は同様の結合相互作用を特徴付けると報告している。これらの報告は突然変異誘発の研究によって支持された。参照文献：Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊ．Ｄ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５： １２５−１３５； Ｌｙｏｎｓ Ｄ．Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５： ５３−６１； Ｂｒａｗｌｅｙ Ｊ．Ｖ． ＆ Ｃｏｎｃａｎｎｏｎ Ｐ． （１９９９） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６３： ４９４６−４９５２； Ｈｏｒｎｅｌｌ Ｔ．Ｍ．Ｃ． ｅｔ ａｌ， （１９９９） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６３： ３２１７−３２２５。
【００１１】
これまでの努力により、さらに抗原性ペプチドまたはＭＨＣ分子のいずれかにおけるアミノ酸変化が僅かであれば、ＭＨＣ／ペプチド複合体を産生し得るが、それはＴ細胞応答を最適に刺激するものではないことがわかった。。例えば、かかる複合体はＴ細胞アンタゴニストであり、弱いアゴニストであることが報告されている。抗原性ペプチドの変化がＭＨＣ／ペプチド複合体の生成に至らしめ、それがＴ細胞スーパーアゴニストとして作用するというケースもある。
【００１２】
ＴＣＲとその同族体ＭＨＣ／ペプチド間の相互作用およびＴ細胞応答を促進する免疫複合体の形成理解に向けての努力が重ねられている。例えば、ＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド免疫複合体の安定性は最適なＴ細胞応答にとって重要である。多重ＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド免疫複合体のオリゴマー形成もまた最適な応答に重要である。参照文献：Ｌｙｏｎｓ Ｄ．Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５： ５３−６１； Ｃｏｃｈｒａｎ， Ｊ．Ｒ． ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １２： ２４１−２５０。
【００１３】
細胞に基づくプロトコールおよびタンパク質に基づくプロトコールを用いて、化合物の検出を行う効率的なスクリーニング方法の開発に向けてもも努力がなされている。例えば、これら幾つかの選抜法によって、タンパク質：タンパク質相互作用を阻害する化合物を同定したとの報告もある。参照文献：Ｔｉａｎ， Ｓ．Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１： ２５７−２５９； Ｋｅｌｌｙ Ｔ．Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６３： ５１７３−５１７７， Ｊｅｎｈ， Ｃ．Ｈ． ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５６： ４７−５５。
【００１４】
ＴＣＲとその同族体ＭＨＣ間の相互作用を調節する化合物が嘱望されている。さらに、広範な高速大量処理スクリーニングの模範となる、化合物の効率的検出方法も望まれている。
【００１５】
（発明の要旨）
本発明はＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）と主要組織適合複合体（ＭＨＣ；ヒトのＨＬＡを含む）抗原の相互作用を調節する化合物に関する。また、本発明はＴＣＲとその同族体ＭＨＣ抗原分子の相互作用を調節する化合物を同定する方法を提示する。
【００１６】
より詳しくは、本発明者らはＴＣＲ：ＭＨＣ抗原相互作用を調節する化合物を、特にかかる分子間に形成される免疫複合体を増大または減少させることによって検出する方法を開発した。本発明方法に関する用語「調節する／変調させる（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」は、検出された化合物が免疫複合体のアゴニストまたはアンタゴニストとして好適に作用すること、より包括的にはＴＣＲ：ＭＨＣ抗原複合体それ自体のモジュレーターとして作用することを意味する。
【００１７】
「ＭＨＣ抗原」または「ＭＨＣ抗原分子」という用語は、ＴＣＲに特異的に結合するＭＨＣベースの分子に関して用いる。ＭＨＣ抗原のＭＨＣ成分は古典的なまたは非古典的なＭＨＣクラスＩａ、クラスＩｂまたはクラスＩＩ分子、またはＭＨＣ相同体から成るが、これらに限定されるものではない（参照：Ｍａｅｎａｋａ， Ｋ． ＆ Ｊｏｎｅｓ， Ｅ．Ｙ． １９９９． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ９： ７４５−７５３）。該ＭＨＣ抗原はＭＨＣ／ペプチド複合体、ＭＨＣ／スーパー抗原複合体、ＭＨＣ／脂質（または糖脂質）複合体または異質反応性（異種反応性）ＭＨＣ分子から成るが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
本発明方法は、（上記定義の通り）広義に於いて、好ましくは、少なくとも一つ以上の試験化合物の存在下または非存在下に、少なくとも一つ以上のＴＣＲ分子と少なくとも一つ以上の同族体ＭＨＣ抗原とを接触させることからなる。「同族体（ｃｏｇｎａｔｅ）」という用語は、特定のＴＣＲまたはＭＨＣ抗原分子を参照するために用い、もう一方の分子に対して特異結合パートナーとして作用する分子を意味する。多くの態様において、該方法では約１個のＴＣＲ分子と約１個の同族体ＭＨＣ抗原分子を包含する。典型的な分子間の接触は、通常、ＴＣＲとＭＨＣ抗原分子間の特異結合を促進する予め定められた条件下に実施する。このような特異的結合は一般的に免疫複合体の形成を助長し、その複合体の安定化を助けになり得る。検出された試験化合物は、少なくとも一つのコントロールに関してその特異結合を著しく増大または減少させるが、該コントロールは試験化合物を検出する際に、同時に実施してもよく、また異なる時点で実施してもよい。所望の活性または１つ以上のかかる活性を有する化合物は、免疫複合体の形成を調節する該方法により同定される。このように同定された化合物はさらに本発明に従って選択することができる。かかる同定・選択された化合物は、インビボおよびインビトロで広範な免疫応答を調節する（増大または低下させる）薬剤として使用する等、多くの重要な適用がある。かかる免疫応答の具体例として、免疫監視、自己免疫疾患、感染症、癌などの増殖性疾患、移植片受容などが挙げられる。
【００１９】
本発明の実施は従来のスクリーニング試行を考慮した場合、特に多くの利点を提供する。例えば、本発明方法は広範なＴＣＲおよびＭＨＣ抗原分子に完全に適合する。本発明のこの特徴は、試験化合物を検出するためのプローブフォーマットのレパートリーを広げる意味で重要である。一例として、本発明方法は完全可溶性のＴＣＲおよびＭＨＣ抗原分子並びに細胞表面に発現された分子など、可溶性の低い分子にも適応させることができる。従って、本発明は非常に融通性があり、多種多様な試験フォーマット、例えば、完全可溶性タンパク質、細胞発現膜タンパク質、またはその組み合わせ、例えば、分子の１個が完全可溶性であり、他が所望の細胞により発現される分子のスクリーニング計画などの試験フォーマットに使用することができる。顕著な差異は、従来のスクリーニング試行では一種または二三種の分子型にしか使用出来ない、より制限されたスクリーニングフォーマットが採用されてきたことである。
【００２０】
他の利点も本発明により提供される。本発明の実施に際して、例えば少なくとも１つのクラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣ抗原分子を使用する特定の方法を用いる態様において、予め密結合ペプチドを負荷したＭＨＣ分子を抗原提示細胞（ＡＰＣ）から精製する必要がなくなった。従来のスクリーニング試行では、困難で時間のかかる精製工程により調製したＭＨＣ分子の使用が報告されているが、本発明方法では調製および使用が遥かに容易な幅広いクラスＩまたはクラスＩＩのＭＨＣ抗原分子を使用することができる。参照文献例：米国特許５，８６９，２７０（ローデ（Ｒｈｏｄｅ， Ｐ．）ら）；本開示は本明細書中に参考として援用される。
【００２１】
さらに本方法の多くの態様が従来のスクリーニング試行で報告されているよりもより高い敏感度を与える。例えば、ＭＨＣ抗原複合体の多価配列は、ある種のＴＣＲ発現細胞を刺激するために必要であることが開示されている。すなわち、一価のＭＨＣ抗原複合体は多くのスクリーニング試行において良好なプローブとして作用しないことが報告された。顕著な差異は、本発明方法では、試験化合物検出に一価および多価分子を含む一連のクラスＩまたはクラスＩＩのＭＨＣ抗原分子を用いることができることである。かかる分子の調製および使用に関する開示は下記考察参照；参照文献：米国特許５，８６９，２７０。
【００２２】
さらに、従来のスクリーニング試行では、しばしば細胞の発現したＴＣＲヘテロ二量体がプローブとして注目を集めていた。このフォーマットは必要以上に制限的であり、場合によってはスクリーニングの結果に強く否定的な影響を与える可能性が有るとされている。それと対照的に本発明方法は、特定のＴＣＲ分子または試験フォーマットに限定されることなく広い範囲のＴＣＲ分子、例えば、これらに限定されるものではないが、天然産ＴＣＲ類、組換え一本鎖構築物を含む完全可溶性ＴＣＲ分子、並びに細胞固着一本鎖およびヘテロ二量体ＴＣＲ分子などに完全に適合する。
【００２３】
本発明のさらなる適応性は、広い範囲のＭＨＣ抗原分子、例えば、天然産ＭＨＣ分子、一本鎖構築物（これらに限定されるものではないが）を含む完全可溶ＭＨＣ分子、並びに細胞表面分子として細胞が発現する構築物などを用いても良いことからわかる。さらに、「エンプティ」ＭＨＣ分子として本明細書中に言及されているものも、使用することができる。
【００２４】
従って、本発明の実施は試験可能なＴＣＲおよびＭＨＣ抗原プローブ分子のプールを実質的に増大させることができる。この相当なプールサイズも試験可能な免疫複合体数を増加させ、それによって本発明により検出、同定および選択し得る試験化合物の範囲が拡張される。それと対照的に、従来のスクリーニング試行では１種または僅かに２〜３種のプローブ型、通常ＴＣＲとＭＨＣヘテロ二量体に限られていた。こうした欠陥は多くのアッセイの設定において、検出される化合物の可能数を実質的に減じるものである。
【００２５】
なおさらに、従来のスクリーニング試行では、一つまたは２〜３の制限された方法を使用するためにＴＣＲ：ＭＨＣ−ペプチド相互作用を検出するには限界があった。典型的なかかる方法では細胞顆粒化の測定の感度が低く、不正確であることが多かった。顕著な差異は、本発明に於いて試験化合物の存在および非存在下に免疫複合体をモニターすることにより、これらの相互作用を検出するための多様な方法が提供されることである。より特異的な検出法は、より感度の高い、また信頼性の高いＴＣＲ：ＭＨＣ抗原相互作用の指標を提供するもので、直接または間接技法を用いて実施することができる。
【００２６】
とりわけ、多様な免疫複合体検出方法を適応させることができる本発明の受容能力は顕著な利点を提供する。その一つの利点はかかる方法が本発明をさらに適応性のあるもとし、広範で多様なスクリーニングに適合させ得ることである。
【００２７】
例えば、免疫複合体の高感度検出が望まれる態様において、本発明は間接的な検出方法、例えば、ＴＣＲ：ＭＨＣ抗原相互作用に典型的な微弱なまたは間欠性のシグナルを増幅するために使用することができる。逆に、免疫複合体の存在がはっきり認識される態様においては、本発明は免疫複合体、そのＴＣＲおよび／またはＭＨＣ抗原成分、または試験化合物の直接検出を伴う方法に於いて用いることができる。かかる態様は試験化合物の迅速スクリーニングが必要とされる設定において非常に実用的である。対照的に、報告されているＴＣＲ：ＭＨＣ−ペプチド相互作用を検出する従来のスクリーニング法は、今まで非常に限定的かつ一般に感度が低く、多くの有用な試験化合物の検出機会を低下させたか、または失わせた。
【００２８】
さらなる利点が本発明により提供される。
例えば、本発明の幾つかの態様において、対象の免疫複合体を調節する１種以上の試験化合物の受容能力は様々なコントロールと比較することが可能である。模範となるコントロールは試験化合物非在下での免疫複合体の検出である。しかし、免疫複合体に非特異的に影響する試験化合物に対しては、場合によってより純化されたコントロールを選択することが望ましい。殊に本発明は、主題のＴＣＲ：ＭＨＣ抗原相互作用を特異的に調節する能力をもつ試験化合物検出の一助となる様々な所謂「内部コントロール」なるものを提供する。
【００２９】
一態様において、かかる内部コントロールは主題の（第一）ＴＣＲまたはＭＨＣ抗原分子と少なくとも一つのＴＣＲまたはＭＨＣ抗原分子に特異的に結合する抗体、通常モノクローナル抗体、を包含する。関心の特定の抗体は一般に免疫複合体の特異結合と形成に関与する領域外でＴＣＲまたはＭＨＣ抗原分子に結合する。他の特定の抗体は、通常特異的に、ＴＣＲ分子が細胞発現する態様において典型的に、ＴＣＲ分子に密接に関与するＣＤタンパク質に適切に結合する。
【００３０】
本発明の前記例示において、抗体とＴＣＲまたはＭＨＣ抗原分子で形成される複合体は、本明細書において「コントロール免疫複合体」または同様の語句にて言及する。本発明に適うコントロール免疫複合体の形成は、細胞応答（これに限定されるものではないが）等に於ける検出可能な応答を円滑にする。かかる応答は（実験的）免疫複合体、すなわち、対象となる主題（第一）のＴＣＲおよびＭＨＣ抗原分子間の相互作用により形成される複合体とは別に、あるいはそれと一緒に、直接または間接に測定し得る。特定の試験化合物は、望ましくは、実験免疫複合体の形成を調節するが、コントロール免疫複合体に与える影響はほんの僅かであるか、好ましくは全くない。
【００３１】
他の一態様において、コントロール免疫複合体は第二ＴＣＲ分子とその同族体ＭＨＣ抗原分子を含み、好ましくはその場合の第二ＴＣＲ分子は第一ＴＣＲ分子とは異なる結合特異性を有する。本発明のこの例では、対象となる特定の試験化合物は主題の（第一）ＴＣＲとその同族体ＭＨＣ抗原分子間で形成される免疫複合体を調節する。しかし、該試験化合物は第二ＴＣＲ分子とその同族体ＭＨＣ抗原分子とのコントロール免疫複合体には僅かしか、好ましくは全く影響を与えないものである。
【００３２】
考察したように、開示した特定のコントロール免疫複合体を含む免疫複合体の存在は、多様な検出フォーマット、例えば、直接または間接技法に基づくフォーマットを用いて検出することができる。１種以上の内部コントロールの実施は試験化合物のスクリーニングの前、その間、またはその後に実施することができる。
【００３３】
１種以上の前記コントロールを使用することが好ましい本発明の態様において、実質的な便益性を実現することができる。例えば、かかるコントロールを用いる方法は、遥かに良好な敏感度、選択性および／または信頼性を提供することができる。すなわち、考察した内部コントロールなどの少なくとも１種のコントロールを使用する態様において、コントロールの存在は、例えば、ＴＣＲ：ＭＨＣ抗原相互作用を非特異的に阻害する化合物を同定することにより、試験化合物の検出と選択を容易にする一助となる。本発明のこの特徴は、しばしば対象となる免疫複合体を特異的に調節する試験化合物の選抜を改善することができる。それと対照的に、従来のスクリーニング試行は常に良好なコントロールを提供するものではないので、かかる試行が敏感度が高く信頼性のある結果を出せるか否か定かではない。
【００３４】
従って、本発明は非常に適応性に富み、多様な試験化合物の選抜に適合する。本発明に好適な試験化合物は、主題のＴＣＲ：ＭＨＣ抗原相互作用を調節する能力を含む１種以上の所望の活性を提示する。
【００３５】
例えば、本方法がアンタゴニストの検出に適合する態様において、適切な試験化合物は少なくとも１種の適切なコントロールに対して、該免疫複合体の存在下に、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約７５％ないし約１００％の低下を示す。考察したように、この免疫複合体は主題のＴＣＲとその同族体ＭＨＣ抗原分子との間に形成される。さらに考察したように、該免疫複合体の存在は種々の直接または間接技法を用いて容易に検出することができる。実例となるコントロールは試験化合物非存在下でのアッセイ実施に関与する。あるいは、またはさらに、該コントロールは一つ以上の前述の内部コントロールであってもよいし、以下に考察する内部コントロールであってもよい。
【００３６】
しかし、本発明をアゴニストの検出に使用する態様において、用いる該アッセイ法は、好ましくは該免疫複合体の存在下に、少なくとも１種の適切なコントロールに対して、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約７５％ないし約１００％、ないしは約５００％ないし約１０００％までの増加を示す。
【００３７】
指摘したように、本発明は広範なフォーマットで使用することができる。例えば、本発明は「高速大量処理」または「超高速大量処理」型スクリーニング法として知られる方法に採用することができる。この態様において、本発明は該免疫複合体を調節する能力をもつ特定化合物について、試験化合物の大型プール、例えば、同様のライブラリーのスクリーニングに特に有用である。
【００３８】
さらに、本発明方法は１種以上のインビボ・スクリーニング処方と組み合わせて使用し、主題のＴＣＲ：ＭＨＣ−ペプチド相互作用を調節する検出された試験化合物の受容能力をより正確に決定することができる。例えば、一態様において、本発明は、免疫監視、自己免疫疾患、感染症、癌などの増殖性疾患、および／または移植片受容に影響を与える化合物の同定に使用される動物モデルに認知されている哺乳動物で用いるに当たって、適切な試験化合物を予め選抜（または同時選抜）するために使用することができる。該動物でのモニター機能は既存の、例えば、遺伝的性向であってもよく、または例えば、化学的または外科的に誘発してもよい。
【００３９】
注目すべきは、本発明が多重検出フォーマット（例えば、インビトロおよびインビボアッセイの組み合わせ）として、ＴＣＲ：ＭＨＣ抗原相互作用を調節する非常に有用な試験化合物の検出、特に所望の免疫複合体の存在の検出を容易にし得ると期待されることである。本発明のこの特徴は本発明の適用範囲を大きく広げ、有用な試験化合物のより特異的な選択と同定とを可能とする。
【００４０】
かかる多様なインビトロおよび／またはインビボによる試験法は、さらなる便益性を提供する。このように、例えば、本方法の多くが多重分析の実施に使用可能であり、それによって主題の免疫複合体を特異的に調節し、実質的な治療能力を示す試験化合物を同定する効率と確率とを上昇させることができる。本発明のこの特徴は、高速大量処理または超高速大量処理方法が使用される、大量の化合物を試験する必要のある場合にとりわけ有用である。例えば、試験化合物のライブラリーは標準的な合成方法、例えば、コンビナトリアル型の化学操作により作製可能であり、次いで本発明により試験することができる。あるいは、本発明方法はすでに入手可能な試験化合物、例えば、市販品として入手し得る化学ライブラリー中に存在する化合物を含め、小型分子、大型分子などについて使用することができる。
【００４１】
従って、一側面において、本発明はＴＣＲ：ＭＨＣ抗原相互作用を調節する化合物の同定方法を特徴とする。一態様において、本方法は少なくとも以下の工程の１工程、好ましくは全ての工程を含む：
ａ）少なくとも１種の試験化合物の存在下または非存在下に、第一のＴＣＲ分子とクラスＩまたはクラスＩＩのＭＨＣ抗原分子とを、ＴＣＲおよびＭＨＣ抗原分子が特異的に免疫複合体として結合するのに十分な条件下で接触させること；
ｂ）該試験化合物の存在下および非存在下に免疫複合体の存在を検出すること；および
ｃ）ＴＣＲとＭＨＣ抗原分子との間の特異的な結合を変化させる試験化合物を選択すること。好ましくは、本方法はさらに、免疫複合体を調節するものとして当該選択化合物を同定することを包含する。
【００４２】
本方法の特定の態様において、本発明はＴＣＲとその同族体ＭＨＣ抗原を含む免疫複合体を調節する試験化合物の同定選抜法を提供する。より具体的な態様において、本方法は少なくとも以下の工程の１工程、好ましくは全ての工程を含む：
ａ）試験化合物の存在下または非存在下に、Ｔ細胞ハイブリドーマなどの第一ＴＣＲ分子を発現する細胞と、固形支持体に結合したクラスＩまたはクラスＩＩのＭＨＣ抗原分子とを、ＴＣＲおよび結合したＭＨＣ抗原分子が特異的に免疫複合体として結合するのに十分な条件下で接触させること；
ｂ）該試験化合物の存在下または非存在下に、該細胞からの細胞応答を測定することにより免疫複合体の存在を検出すること；および
ｃ）第一ＴＣＲと、結合したＭＨＣ抗原分子との間の特異的な結合を変化させる試験化合物を選択すること。好ましくは、本方法はさらに、免疫複合体を調節するものとして当該選択化合物を同定することを包含する。
【００４３】
考察したように、本発明方法は一つの方策またはその組み合わせを用いて、所望の試験化合物の選抜に使用することができる。さらに考察したように、コントロールとして、試験化合物の非存在下に免疫複合体を検出する１工程以上の工程を含めることが多くの場合非常に有用である。しかし、免疫複合体の存在が特定のアッセイフォーマットにおいてすでに理解されている態様においては、必要であればかかる工程を省略することができる。
【００４４】
他の態様において、該コントロールは、試験化合物なしで免疫複合体を検出する代わりに、またはそれに加えて、少なくとも１種の適切な内部コントロールを含んでいてもよい。少なくとも１種の内部コントロールの使用が望ましい態様において、該方法は試験化合物の存在および非存在下にコントロール免疫複合体の存在を検出するための工程を一般に包含する。前記コントロールを含めるかどうかの選択は、使用されるＴＣＲとＭＨＣ抗原分子、選択されたアッセイフォーマット、および必要な敏感度などが判明しているパラメータに基づいて進める。
【００４５】
他のもう一つの側面において、本発明は本方法により検出され、同定される化合物の少なくとも１種を好適に含有する医薬組成物を提供する。かかる組成物は単独の治療剤として該化合物を含有するか、または１種以上の他の認知された薬剤、例えば、免疫系機能に対する作用の認められた医薬と組み合わせてもよい。
【００４６】
本発明はまた哺乳動物の免疫応答を阻害する方法を提供する。一態様において、該方法はここで提供される少なくとも１種の治療有効量の医薬化合物を投与することからなる。該方法とは少なくとも１種の医薬化合物を単独活性剤として投与することであるが、これに限定されるものではない。他のもう一つの態様において、該方法は少なくとも１種の該医薬化合物を、少なくとも１種の他の認知された薬剤、例えば、免疫系に対する作用の認められた医薬などと組み合わせて投与することを可能とする。
【００４７】
もう一つの他の側面において、本発明は本明細書に開示した方法を実施するためのキット、特に診断用キットまたは研究用キットを提供する。本発明の特定のキットは、好ましくはパッケージの組み合わせとして、少なくとも１種のＴＣＲ分子またはその機能的フラグメントを収容する第一容器および少なくとも１種のＭＨＣ抗原分子またはその機能的フラグメントを収容する第二容器からなる。選択肢として、該キットはさらに本方法を遂行するための１種以上の緩衝液、並びに該キット使用のための説明書を包含していてもよい。さらに選択肢として、該キットは本明細書に記載の１種以上のコントロールを包含していてもよい。一態様において、当該コントロールは同定されたＴＣＲ分子および同定されたＭＨＣ抗原分子またはその機能的フラグメント間の特異的結合を調節すると判断された受容能力をもつ少なくとも１種の天然産、合成または半合成化合物である。好ましくは、該化合物は特異結合を低下させる。
【００４８】
本発明によりさらに提供されるのは、哺乳動物のＣＤ３ζ（ゼータ）配列またはその機能的フラグメントを含有する組換えＴＣＲ分子である。かかる分子は、一態様において、細胞膜に機能的に位置することの可能な一本鎖構築物である。
【００４９】
（発明を実施するための最良の形態）
上記考察の通り、本発明はＴＣＲとその同族体ＭＨＣ抗原分子間の相互作用を調節する化合物の検出方法を特徴とする。特に、本発明は該化合物を検出・同定する極めて有用なスクリーニング方法を提供する。さらに提供されるのは、当該方法により同定・選択される化合物、選択した試験化合物の少なくとも１種を含む医薬化合物または製剤、並びにヒト患者における免疫疾患を治療するためのこれら製剤の使用方法である。
【００５０】
さらに考察したように、本発明は「高速大量処理」または「超高速大量処理」スクリーニングの代表例と言われるスクリーニングに広く適用し得る。本発明のこの態様はＴＣＲとＭＨＣ抗原との相互作用を調節する良好な受容能力をもつ化合物について、大量の試験化合物のプールを処理、試験するのに殊に有用である。本発明方法により同定されたより特定の化合物は、不所望のＴＣＲとＭＨＣ抗原の相互作用が引き金となる有害な免疫応答を低下させるか、または除去することができる。あるいは、かかる医薬化合物は患者の免疫疾患の重篤度を除去し、緩和し、またはその発症を遅延させる一助として予防的に使用するこができる。特定の患者は、免疫疾患、例えば、かかる疾患の予め判定された遺伝的性向をもつ患者など、該疾患を発症する「危険のある」患者をも含め、該疾患に罹患しているか、またはその疑いがある。
【００５１】
ＭＨＣ分子またはその抗原性（提示）ペプチド内での僅かなアミノ酸変化が、それが同類アミノ酸の変化であっても、Ｔ細胞応答刺激に関して、不活性であるか、またはアンタゴニスト、弱いアンタゴニスト、またはスーパーアゴニストとして作用するＭＨＣ／ペプチド複合体を提供し得る。ＴＣＲにおける同様の僅かなアミノ酸変化もペプチドとＭＨＣに対するＴ細胞特異性を変化させることが示されている。参照例：Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊ．Ｄ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５： １２５−１３５； Ｂｒａｗｌｅｙ Ｊ．Ｖ． ＆ Ｃｏｎｃａｎｎｏｎ Ｐ． （１９９９） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６３： ４９４６−４９５２； Ｈｏｒｎｅｌｌ Ｔ．Ｍ．Ｃ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６３： ３２１７−３２２５。ＭＨＣ抗原複合体と相互作用し得る化学化合物またはＴＣＲは同族体レセプターとの相互作用を変化させ、Ｔ細胞アンタゴニストまたはアゴニストとして同様に作用し得る。
【００５２】
さらに、利用可能なＸ線結晶学の検討では、ＴＣＲとＭＨＣ上の同類または多形性側鎖間に顕著なアミノ酸相互作用の存在することを示唆している。さらにこれらの研究はＴＣＲと該ペプチドの側鎖、およびＭＨＣとペプチド両者のペプチド主鎖間に相互作用の存在することを示唆している。理論に拘束されることは意図しないが、本発明はこれらの相互作用に影響を与え、相互作用を遮断、または上昇させることができる化合物の検出に非常に適していると思われる。より好ましくは、かかる化合物はインビトロおよびインビボでＴＣＲとＭＨＣ抗原間で形成される免疫複合体の特異的アンタゴニストまたはアゴニストとして作用し得る。
【００５３】
説明のためであって制限するものではないが、図１Ａ〜Ｂはある重要なＴＣＲ−ペプチド／ＭＨＣ相互作用を示す。これら相互作用の多くはＴＣＲとＭＨＣ抗原分子間の比較的低親和性結合の例証となる。とりわけ、図１Ａは１個の全ＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド複合体の全体にわたるペプチド主鎖構造（右パネル）、およびＴＣＲのＣＤＲ（番号付与）とのペプチド／ＭＨＣ結合部位をＭＨＣ／ペプチド構造に重ねて見た様子（左パネル）を示す（参照文献：Ｇａｒｂｏｃｚｉ， Ｄ．Ｎ．， ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ ３８４： １３４−１４１； Ｇａｒｃｉａ， Ｋ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９： １１６６−１１７２）。図１Ｂは異なる同族体ＴＣＲが接触した保存および可変ＭＨＣ残基を示す（参照文献：Ｇａｒｂｏｃｚｉ， Ｄ．Ｎ． ＆ Ｂｉｄｄｉｓｏｎ， Ｗ．Ｅ． （１９９９） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０： １−７）。理論に拘束されることは意図しないが、本発明では、ＴＣＲとＭＨＣ抗原分子間のこれらの、また他の低親和性相互作用を調節する受容能力をもつ試験化合物を検出する際に、これらの相互作用が有利となる。
【００５４】
図１Ａ〜Ｂが提供する情報はＴＣＲ：ＭＨＣ抗原複合体内の多重標的についての理解を容易にした。この理解はこれらの標的を調節する試験化合物の検出・同定のための本発明実行の一助となった。本方法により検出される化合物の多くは極めて特異的に作用し得るが、例えば、ペプチド特異的、ＭＨＣアルレ特異的、ＭＨＣファミリー特異的、またはＭＨＣクラス特異的様式で作用する。
【００５５】
さらに、ＴＣＲ：ＭＨＣ抗原複合体と相互作用する化合物は、該複合体の安定性または多量体化する複合体の能力を変化させることが可能である。これらの化合物はＴ細胞アンタゴニストまたはアゴニストとして作用し得る。
【００５６】
すでに述べたように、一態様において、本発明では、例えば、特異的ＭＨＣアルレまたはＭＨＣファミリーによるＴ細胞活性化に拮抗する化合物を検出することができる。本発明のこの特徴は広範な治療対策の開発と実行のために道を開くなどの重要な便益を与えることができる。かかる手法は、例えば、自己免疫疾患と認知されたような免疫疾患の治療を最適化する方法を包含する。重要なことは、多くの自己免疫疾患が特異的ＭＨＣアルレおよび／またはＭＨＣファミリーと強い遺伝的関連性をもつことが認知されていることである。このように本発明のもうひとつの目的は、特定の患者または患者群に適合させ得る方法を提供し、ＭＨＣアルレおよび／またはＭＨＣファミリーに特異的な様式でＴＣＲとＭＨＣ相互作用を調節（例えば、緩和または遮断）する試験化合物を検出することである。
【００５７】
上述のごとく、免疫複合体の形成はＴＣＲとＭＨＣ抗原分子間の低親和性であるが特異的な相互作用の複合体配列により例示される。これらのファクターおよび他のファクターは高親和性レセプター−リガンド相互作用の検討、およびＴＣＲ：ＭＨＣ抗原複合体形成の評価を行う方法の使用を制限することができる。これらの制限は感度の欠如、相互作用の特異性決定の難しさ、および高いアッセイ変動などである。本発明の多くの特徴はこれらの制限を処理するものである。以下により詳細に記載するように、本発明では適切なタンパク質および細胞に基づく試薬を採用し、免疫複合体の形成を検出するためのアッセイの感度を上昇させ、変動を低下させる。特定の態様において、本発明はまた適切な内部コントロールの使用を包含する。下記および実施例に示すように、非同族体ＴＣＲまたはＭＨＣ抗原を使用する内部コントロールは特に同族体ＴＣＲ：ＭＨＣ抗原相互作用の特異性を評価するのに有用である。本発明の他の内部コントロールの使用は、ＴＣＲとＭＨＣ抗原分子間の相互作用を特異的に調節する試験化合物の検出に有利である。
【００５８】
以下により詳細に説明するように、本方法は多様なＴＣＲとＭＨＣ抗原分子に適応させ得る。一般に言われるように、適切な分子は天然産または組換え体であり、一連の完全可溶性または細胞固着（膜結合）分子を有効に包含する。強調すべきことは、本発明の特徴が、例えば、多くの異なる有用なスクリーニングフォーマットの設計と実施のための骨組みを提供するものとして非常に重要であるということである。この特徴は重要な治療活性をもつ試験化合物の検出機会を広げる一助となる。かかるフォーマットの例示としては、すでに述べたアッセイ並びに以下に記載するアッセイ等、タンパク質に基づくか、または細胞に基づくスクリーニングアッセイである。
【００５９】
「ＴＣＲ分子」という用語または関連語句は、その用語の複数形を含め、本発明のスクリーニング方法に使用される分子を記述するために使用されるものであり、天然産または組換え分子を意味し、少なくともＴＣＲ Ｖ−αおよびＶ−β鎖、またはＴＣＲ Ｖ−γおよびＶ−δ鎖の一部を含む分子、および各鎖の全長、またはそれを含む分子である。好適な鎖長は、ＭＨＣ分子に関連するスーパー抗原またはより好適には抗原に特異的に結合し得るか、または異質反応性ＭＨＣ分子に結合し得るポケットまたは溝を形成するのに十分な長さである。殆どの場合、ＴＣＲ分子は複数の非共有結合を介してＭＨＣ抗原分子に結合する。適切なＴＣＲ分子は特定のアッセイフォーマットに必要とされる一価または多価である。かかるＴＣＲ分子を同定する方法は既知であり、以下に記載のような標準的ＴＣＲ結合試験を包含する。
【００６０】
本発明にて使用し得るＴＣＲ分子の例は以下に開示されている。米国特許出願番号０８／９４３，００６（発明の名称：Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ （可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプター）；１９９７年１０月２日出願）；および出願番号０８／８１３，７３１（発明の名称：Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｃｏａｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ａ Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ （バクテリオファージコートタンパク質と一本鎖Ｔ細胞レセプターからなる融合タンパク質）；１９９７年３月７日出願）；これらの開示は本明細書中に参考として援用される。
【００６１】
Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／９４３，００６および０８／８１３，７３１の各出願は、本方法での使用に適した多様なＴＣＲ分子およびその機能的フラグメントを記載している。例えば、適切なｓｃ−ＴＣＲ分子は適切なペプチドリンカー配列を介して共有結合したＶ−αおよびＶ−β鎖を含んでいる。特に、Ｖ−α鎖はＶ−α鎖のＣ−末端とＶ−β鎖のＮ−末端に融合した適切なペプチドリンカー配列を介してＶ−β鎖に共有結合することができる。ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質のＶ−αとＶ−β鎖は一般に約２００〜４００のアミノ酸長、好ましくは約３００〜３５０のアミノ酸長があり、天然産のＴＣＲのＶ−αおよびＶ−β鎖に少なくとも９０％、好ましくは１００％一致している。「一致」という用語はＶ−αまたはＶ−β鎖のアミノ酸が、対応する天然産のＴＣＲ Ｖ−αまたはＶ−β鎖に１００％相同であることを意味する。
【００６２】
Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／９４３，００６および０８／８１３，７３１の出願に開示されているように、ｓｃ−ＴＣＲ分子のＶ−β鎖は、所望により、さらにＶ−β鎖のＣ−末端に融合したＣ−β鎖またはそのフラグメントを含むことができる。さらに、Ｖ−α鎖はＶ−α鎖のＣ−末端とペプチドリンカー配列のＮ−末端に融合したＣ−α鎖またはそのフラグメントを含むことができる。一般に、Ｃ−β鎖フラグメントを含むこれら融合タンパク質では、該フラグメントが約５０ないし１２６個のアミノ酸長を有し、通常、１２７位置に最末端システイン残基を含まない。Ｃ−α鎖からなるこれらの融合タンパク質では、その長さが約１〜９０個のアミノ酸の間で変わり得る（すなわち、Ｃ−α鎖は末端システインまでであるが、それは含まない）。例えば、一態様において、融合タンパク質は１ないし７２のアミノ酸から始まる約１ないし７２のアミノ酸間にＣ−α鎖フラグメントを含む。もう一つの他の態様において、Ｃ−α鎖フラグメントは、最初のアミノ酸から２２番目（ロイシン）に始まる約１ないし２２のアミノ酸の間にある。Ｃ−α鎖フラグメントは一般にシステイン残基を含まないが、例外的にＣ∝９０変異体は２個のシステイン残基を含む。
【００６３】
Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／９４３，００６および０８／８１３，７３１の出願に記載されているように、完全可溶性の機能性タンパク質の発現を容易にするには、Ｉｇ−ＣＬ鎖または適当なＩｇ−ＣＬフラグメントをｓｃ−ＴＣＲ分子に、例えば、Ｖ−β鎖またはＣ−βフラグメントのＣ−末端に共有結合させる。一般に好ましくはないが、Ｉｇ−ＣＬまたはそのフラグメントをＶ−α鎖のＮ−末端に共有結合させることは可能である。殆どの場合に、Ｃα鎖とＣβ鎖の長さの選定は数種のパラメータ、例えば、選択した特定のＶ鎖、および可溶性融合分子の意図する用途により進める。
【００６４】
本発明のさらなるｓｃ−ＴＣＲタンパク質は、これらに限定されるものではないが、２つのペプチドリンカー配列を有するものであって、その第一ペプチドリンカー配列がＶ−α鎖のＣ−末端とＶ−β鎖のＮ−末端との間に融合したものである。Ｖ−β鎖のＣ−末端はＣ−β鎖フラグメントのＮ−末端に融合することができる。第二ペプチドリンカーは次いでＶ−β鎖またはＣ−β鎖フラグメントのＣ−末端、および、例えば、Ｉｇ−ＣＬ鎖またはＩｇ−ＣＬ鎖フラグメントのＮ−末端、またはエフェクターまたはタグ標識分子に融合する。
【００６５】
他の例示態様において、ｓｃ−ＴＣＲタンパク質はＶ−β鎖を適切なペプチドリンカーを介してＶ−α鎖に融合することにより調製し得るが、その際、Ｖ−β鎖またはそのＣ−β鎖フラグメントのＣ−末端およびＶ−α鎖のＮ−末端が共有結合する。Ｉｇ−ＣＬ鎖またはフラグメントは所望する分子のＣ−またはＮ−末端に共有結合させることができるが、一般にはＣ−末端での結合が好ましい。
【００６６】
ｓｃ−ＴＣＲタンパク質のペプチドリンカー配列は一般にｓｃ−ＴＣＲ分子が天然産のＴＣＲ Ｖ−αおよびＶ−β鎖に類似する結合部位を形成するように選択する。Ｖ−αおよびＶ−β鎖は未誘発Ｔ−細胞から誘導し得るが、殆どの場合、Ｖ鎖は病状、例えば、免疫障害または疾患と関連したものである。
具体的に好適なリンカー配列はＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／９４３，００６および０８／８１３，７３１の出願全般に開示されている。
【００６７】
一つの例示としては、Ｖα，β鎖を隔てるペプチドリンカー配列は、所望するＭＨＣ抗原などのリガンドに特異的に結合し得るポケットにＶ−鎖を柔軟に位置づける。例えば、ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質に結合するリガンドは、上記参照のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／９４３，００６および０８／８１３，７３１の出願に記載されたアッセイにより測定されたＴ−細胞活性を調節するのに使用することができる。Ｉｇ−ＣＬ鎖またはＩｇ−ＣＬ鎖フラグメントとｓｃ−ＴＣＲ分子との融合はある設定において、例えば、ｓｃ−ＴＣＲの可溶性発現を容易にし、細胞媒体などの水溶液にｓｃ−ＴＣＲの整合性を維持することにより、アッセイの性能を上昇させることができる。
【００６８】
上記およびＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／９４３，００６および０８／８１３，７３１の出願で考察したように、本発明のｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質は、所望により、例えば、ｓｃ−ＴＣＲ分子のＣ−末端に共有結合したＩｇ−ＣＬ鎖または適切なＩｇ−ＣＬ鎖フラグメントを含有し得る。一態様において、ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質は、融合した哺乳動物Ｉｇ−ＣＬ鎖、好ましくは完全長のマウスまたはヒトのＩｇ−ＣＬ鎖、例えば、Ｃκ鎖を含む。数種のＩｇ−ＣＬ鎖の核酸およびタンパク質配列は文献開示されている。参照例：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （基礎免疫学）（１９９３） ３ｒｄ Ｅｄ．， Ｗ． Ｐａｕｌ Ｅｄ． Ｒｓｅｎ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； ａｎｄ Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（免疫学の対象となるタンパク質の配列）（５ｔｈ Ｅｄ．） Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ。
【００６９】
Ｉｇ−ＣＬ鎖という用語は免疫グロブリンの軽鎖定常領域を含み、該領域は開示された完全長配列から１個以上のアミノ酸の置換または付加により変化する。例えば、１個のアミノ酸は開示されたＩｇ−ＣＬ鎖配列に、その鎖の一端または両端で、例えば、常套の組換え法により付加することができる。さらに、組換え法は鎖の所定のアミノ酸を置換することにも使用し得る。一般にアミノ酸の付加は約１〜３０個の中性または親水性アミノ酸、好ましくは約１〜１０個のそのようなアミノ酸で行う。Ｉｇ−ＣＬ鎖で別のアミノ酸と置換されるアミノ酸は同類または非同類アミノ酸置換である。従って、Ｉｇ−ＣＬ鎖配列のチロシンアミノ酸がフェニルアラニンと置換されたのは同類アミノ酸置換の例であり、一方、アラニンと置換されたアルギニンは非同類アミノ酸置換の代表例であろう。Ｉｇ−ＣＬ鎖フラグメントについて以下に指摘するように、融合Ｉｇ−ＣＬ鎖からなるｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質は完全溶解性であり、機能的である。
【００７０】
本方法の一部態様においては、Ｉｇ−ＣＬ鎖フラグメント、例えば、マウスまたはヒトのＣκ鎖フラグメントを使用することが有用である。例えば、適切なＩｇ−ＣＬ鎖フラグメントは、融合タンパク質の分子量を最小化することが望ましい場合、ｓｃ−ＴＣＲ分子に融合することができる。「適切なＩｇ−ＣＬ鎖フラグメント」という語句または関連用語は、所望のｓｃ−ＴＣＲ分子に融合したときに、下記定義の完全可溶性の機能的ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質を形成するＩｇ−ＣＬフラグメントを意味する。所望のＩｇ−ＣＬ鎖フラグメント（ＣκおよびＣλ型の両者）は標準的な組換え方法に従い、例えば、マウスまたはヒトのＣκまたはＣλ鎖フラグメントのＰＣＲ増幅と、引き続きＰＣＲ産物を所望のｓｃ−ＴＣＲ分子をエンコードするＤＮＡセグメントまたはベクターへ連結することにより調製することができる。以下に示すように、ＰＣＲ産物はクローニングを容易にするために、制限酵素の切断部位を含むように操作することができる。一般に、適切なマウスまたはヒトのＣκ鎖フラグメントは、そのアミノ酸の長さが、約７０〜１５０、好ましくは約９０〜１２０、より好ましくは約１００〜１１０個である。適切なマウスまたはヒトのＣκ鎖ＤＮＡ配列を下記に開示する。下記実施例５、６および７参照。
【００７１】
Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／９４３，００６および０８／８１３，７３１の出願に開示された好適なｓｃ−ＴＣＲタンパク質は完全に機能的、かつ可溶性である。「完全に機能的」という用語は、融合タンパク質がリガンド、特にＭＨＣ抗原に特異的に結合することを意味する。かかる特異的結合を検出するアッセイが本明細書に開示されており、ウエスタン・ブロッティングなどの標準的免疫ブロット技法を包含する。
【００７２】
「特異的に結合」または同様の用語は、本明細書では、抗体と抗原間の結合を記載するために使用する。抗体（好ましくはモノクローナル抗体）は抗原に結合して特異な結合対を形成する。一般に、該抗体はウエスタン・ブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ゲル移動度変異分析、酵素免疫アッセイ、競合アッセイ、飽和分析法または他の適切なタンパク質結合アッセイにより測定した場合、他の分子は認識せず、結合しない。
【００７３】
「特異免疫複合体」という用語または同様の用語は、本明細書では、特異的ＴＣＲ分子とその同族体ＭＨＣ抗原分子とを含む結合対に言及するのに使用する。特異的免疫複合体は一つの型の抗原または一つ以上の型のものを含み得るが、ただし各抗原分子は特異結合対の形成を容易にする（すなわち、ＴＣＲ：抗原：ＭＨＣ分子）。
【００７４】
特異免疫複合体の検出法は既知であり、本発明の意図した用途に応じて変化する。例えば、スクリーニングを実質的に無細胞フォーマットにて実施する態様において（すなわち、タンパク質−タンパク質に基づき）、好適な方法はウエスタン・ブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ゲル移動度変異分析、酵素免疫アッセイ、競合アッセイ、飽和分析法または他の適切なタンパク質結合アッセイである。１種以上の細胞応答を候補化合物の同定に使用する選抜法など、本発明の細胞に基づく態様において、これら応答の検出は特異的免疫複合体の形成を指標として実施する。適切な細胞応答の例は以下に示すが、サイトカインの産生、特にＴ細胞からの産生を含む。
【００７５】
Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／９４３，００６および０８／８１３，７３１の出願に開示されたｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質はＶα，β鎖からなり、この鎖については実質的に完全長のコーディング配列が容易に入手し得る。細胞起源からの完全長ＴＣＲ Ｖ鎖配列の取得方法は既知である。別法として、Ｖα，β鎖領域は公的に入手可能なＶα，β鎖のＰＣＲ増幅により取得し得るが、該鎖については少なくとも配列の一部が既知である。典型的なＶβ遺伝子配列は、Ｖβ８．１、Ｖβ６．１、Ｖβ５．１、Ｖβ５．２、Ｖβ５．３、Ｖβ２．１、およびＶβ２．３遺伝子配列を含む。参照文献：Ａｂｅ ｅｔ ａｌ． （１９９２） ＰＮＡＳ （ＵＳＡ） ８９： ４０６６； Ｗａｎｇ， ｅｔ ａｌ． （１９９３）； ＰＮＡＳ （ＵＳＡ） ９０： １８８； Ｌａｈｅｓｍａ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０： ４１２５； Ｋｏｔｚｉｎ， ｅｔ ａｌ．， （１９９１） ＰＮＡＳ （ＵＳＡ） ８８： ９１６１； Ｕｅｍａｔｓｕ， ｅｔ ａｌ． （１９９１） ＰＮＡＳ （ＵＳＡ） ８８： ８５３４。追加のＴＣＲ Ｖ鎖配列については Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ．， ｅｔ ａｌ． ｓｕｐｒａ ａｎｄ Ｃｈｏｔｉａ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．， （１９８８） ＥＭＢＯ Ｊ． ７： ３７４５ も参照。
【００７６】
特に、ＵＳＳＮ０８／９４３，０６６出願の実施例３および図７と８は種々のＶ−α鎖およびＶ−β鎖を増幅するＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドプライマーを提供している。
【００７７】
ＵＳＳＮ０８／９４３，０６６出願に特定して開示されているように、典型的なｓｃＴＣＲ融合タンパク質は一般に共有結合により配列に組み込まれたＤＮＡセグメントによりエンコードされる：プロモーター／リーダー配列／Ｖ−α鎖／一本鎖リンカー配列／Ｖ−β鎖／Ｃκ鎖；プロモーター／リーダー配列／Ｖ−α鎖／一本鎖リンカー配列／Ｖ−β鎖、Ｃ−β鎖フラグメント／Ｃκ鎖；プロモーター／リーダー配列／Ｖ−α鎖、Ｃ−α鎖／一本鎖リンカー配列／Ｖ−β鎖／Ｃκ鎖；またはプロモーター／リーダー配列／Ｖ−α鎖、Ｃ−α鎖フラグメント／一本鎖リンカー配列／Ｖ−β鎖、Ｃ−β鎖フラグメント／Ｃκ鎖。典型的なｓｃ−ＴＣＲ分子は上記のとおりであるが、例外としてＣκ鎖はＤＮＡセグメントによりエンコードされない。ｓｃ−ＴＣＲタンパク質をエンコードするＤＮＡベクターは融合タンパク質の可溶性発現のために所望の細胞、例えば、本明細書に開示の特異的発現系に導入される。
【００７８】
ｓｃＴＣＲ分子を調製し、それを使用するためのより具体的なベクターについてはＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／９４３，００６および０８／８１３，７３１の出願全般に教示されている。
【００７９】
本発明方法はヘテロ二量体フォーマットにおいてこれらを含む他のＴＣＲ分子の使用にも適合する。かかる分子の例は免疫グロブリン定常領域に共有結合したＴＣＲ Ｖ鎖である。参照例：Ｇｒｅｇｏｉｒｅ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ． （１９９１） ＰＮＡＳ， ８８， ８０７７（カッパ軽鎖（Ｃκ）のＣ領域に結合したＣα、Ｖα配列を含むヘテロ二量体αβＴＣＲ鎖の調製法および使用法についての報告）。本文献はＶβＣβＣκ配列も開示した。参照文献：Ｗｅｂｅｒ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｎａｔｕｒｅ， ３５６： ７９３。
【００８０】
本発明で使用する他のｓｃＴＣＲ分子の調製法および使用法についての例は以下の文献参照：Ｎｏｖｏｔｎｙ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ （ＵＳＡ） ８８， ８６４６ （１９９１）； Ｓｏｏ Ｈｏｏ， Ｗ．Ｆ． ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ （ＵＳＡ） ８９， ４７５９ （１９９２）； Ｗｕｌｆｉｎｇ， Ｃ． ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ａ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４２， ６５５ （１９９４）； Ｋｕｒｕｃｚ， Ｉ． ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ （ＵＳＡ） ９０， ３８３０（１９９３）； ＰＣＴ ＷＯ９６／１３５９３； Ｗａｒｄ， Ｅ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４， ８８５， （１９９２）； Ｓｃｈｌｕｅｔｅｒ， Ｃ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２５６， ８５９ （１９９６）； Ｍａｒｉｕｚｚａ， Ｒ．Ａ． ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ．， （１９８９） ２６４： ７３１０； Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ， Ｎ．Ｒ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ （ＵＳＡ）（１９８７）， ８４： ２９３６。
【００８１】
本発明に従い使用し得る好適なＴＣＲ分子はＴＣＲとＭＨＣ抗原との特異的結合を可能とする十分なサイズのものである。ＭＨＣ抗原がペプチド−ＭＨＣ分子である場合の態様において、ＴＣＲ分子はＭＨＣ−ペプチド結合ポケットを形成するＣＤＲ結合ループを少なくとも含んでいる。ＭＨＣ−ペプチド結合ポケットを含む有用なα／βＴＣＲ分子は、好ましくは、少なくともα鎖可変ドメイン（α鎖ＣＤＲの長さに応じてアミノ酸１近辺からアミノ酸１１０ないし約１３０近辺）とβ鎖可変ドメイン（β鎖ＣＤＲの長さに応じてアミノ酸１近辺からアミノ酸１１０ないし約１３０近辺）からなる。
【００８２】
本発明に従い使用し得るより好適なＴＣＲ分子は、標準的なＴＣＲ結合試験において、有意な結合活性を示す。好ましくは、ＴＣＲ分子はその同族体ＭＨＣ抗原分子に、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは適切なコントロールと同程度の少なくとも約９０％ないし９９％のレベルで特異的に結合する。適切なコントロールの例は天然に存在するＴＣＲ分子（すなわち、野生型へテロ二量体として）または組換えＴＣＲとして存在する。殆どの場合に、該コントロールは完全溶解組換えＴＣＲ、好ましくは可溶性一本鎖ＴＣＲである。
【００８３】
かかるアッセイにおいて、固相化ＭＨＣ抗原とＴＣＲの相互作用はＢＩＡコア２０００システム（ＢＩＡコア・インク）による表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によりモニターする。一般に、約５００〜５０００共鳴単位（ＲＵ）のＭＨＣ抗原が、標準的ＮＨＳ／ＥＤＣカップリング化学によりＢＩＡコアＣＭ５チップに結合する。主題のＴＣＲとコントロールＴＣＲ（ＰＢＳ中）は別個に１０〜５０μｌ／分の流速でＭＨＣ抗原表面に注入する。多重注入は各ＴＣＲ濃度を２μＭないし２０μＭの範囲として実施する。ＳＰＲの結合曲線に基づき、ＢＩＡエバリュエーション２．１ソフトウエア（ＢＩＡコア・インク）を用いて速度定数分析を実施する。会合・解離速度定数、親和定数、およびコントロールＴＣＲ：ＭＨＣ抗原相互作用の半減期の計算値を１００％とする。
【００８４】
「ＭＨＣ抗原」という用語または関連語句は本発明のスクリーニング方法に使用される複数の形状を含み、ＴＣＲに特異的に結合するＭＨＣに基づく分子に関連して使用する。ＭＨＣ抗原は、これらに限定されるものではないが、ＭＨＣ／ペプチド複合体、ＭＨＣ／スーパー抗原複合体、ＭＨＣ／脂質（または糖脂質）複合体または異質反応性（異種反応性）ＭＨＣ分子からなり得る。ＭＨＣ抗原のＭＨＣ成分は、これらに限定されるものではないが、古典的または非古典的ＭＨＣクラスＩａ、クラスＩｂまたはクラスＩＩ分子、またはＭＨＣ相同体からなり得る（ヒトＨＬＡ分子を含む）（参照文献：Ｍａｅｎａｋａ， Ｋ ＆ Ｊｏｎｅｓ， Ｅ．Ｙ． １９９９． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ９： ７４５−７５３）。本発明のスクリーニング法に使用されるＭＨＣ成分は天然産または組換え分子を意味し、少なくとも各鎖の全長までの、そしてそれを含むＭＨＣ鎖の一部を含む。一態様において、これらの鎖は提示ペプチド（または脂質）に特異的に結合し得るペプチド（または脂質）結合溝または間隙を形成するのに十分なものである。本発明によると、提示ペプチドは「エンプティ」ＭＨＣ成分のペプチド結合溝に安定な水素結合を介して非共有結合し得る。かかる複合体はしばしば「負荷される」という。また、本発明によると、ＭＨＣ抗原分子は米国特許５，８６９，２７０に開示されたクラスＩおよびクラスＩＩ分子などの共有結合（すなわち、融合）した提示ペプチドを包含する；該米国特許の開示は本明細書中に参考として援用される。本発明にて使用し得る適切なＭＨＣ抗原分子は以下に記載するように、一価ないし多価であってもよい。該ＭＨＣ抗原分子が天然産または組換えのクラスＩ分子である態様において、ＭＨＣ抗原分子はさらに天然産または組換えのβ２−ミクログロブリン分子を含んでもよい。
【００８５】
もう一つの態様において、ＭＨＣ抗原分子は少なくとも各鎖の全長までの、そしてそれを含むＭＨＣ鎖の一部およびスーパー抗原鎖を含む天然産または組換え分子からなり得る。これらの鎖はＭＨＣ／スーパー抗原複合体を形成するのに充分なものである。スーパー抗原はＴＣＲの他の部分の性質に関係なく、特定のＶ遺伝子セグメントを利用してＴＣＲに結合し得るタンパク質である。参照文献：Ｋｏｔｚｉｎ， Ｂ．Ｌ． ｅｔ ａｌ （１９９３） Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５４： ９９−１６６。本発明の好適なスーパー抗原はＭｌｓ抗原、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ＳＰＥ−Ａ、ＳＰＥ−Ｂ、ＳＰＥＣ、ＥｘＦＴおよびＴＳＳＴである。
【００８６】
もう一つの態様において、ＭＨＣ抗原分子は少なくとも各鎖の全長までの、そしてそれを含む異質反応性（異種反応性）ＭＨＣ鎖の一部を含む天然産または組換え分子からなり得る。これらの鎖は異質反応性ＭＨＣ複合体を形成するために充分なものである。異質反応性ＭＨＣ分子は（自己）Ｔ細胞により外来分子と認識される非自己ＭＨＣ分子である。ＴＣＲの異質反応性ＭＨＣ分子への結合は、ＭＨＣ分子に結合する特定のペプチド抗原に依存していても、していなくともよい。参照文献：Ｏｂｓｔ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９１： ８０５−８１２。
【００８７】
クラスＩ分子は内在性膜タンパク質であり、３つの細胞外ドメイン（すなわち、α１、α２およびα３）を有する糖タンパク質重鎖、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含んでなる。該重鎖は非共有結合により可溶性サブユニットβ２−ミクログロブリンと会合している。重鎖のα１およびα２ドメインは折りたたまれてペプチド結合溝を形成する。重鎖とβ２−ミクログロブリン間の会合はペプチド結合溝を安定化する働きをする。ＭＨＣ成分がクラスＩ分子である態様において、該ＭＨＣ成分は天然産または組換えクラスＩ重鎖（またはそのフラグメント）および天然産または組換えβ２−ミクログロブリン分子（またはそのフラグメント）の組み合わせから成り立ち得る。他の態様において、ＭＨＣ成分はクラスＩ重鎖の一本鎖構築物（またはそのフラグメント）およびβ２−ミクログロブリン分子（またはそのフラグメント）から成り立ち得る。本発明のＭＨＣ成分はクラスＩ重鎖のいずれかのフラグメント（いずれかの分子配列において）および／またはβ２−ミクログロブリンからなり、機能的ＭＨＣ抗原の形成を可能とするために充分なものである（すなわち、ＴＣＲとの特異的相互作用を可能とするＭＨＣ抗原）。本発明のＭＨＣ成分はまたクラスＩＩ鎖のいずれかのフラグメント（いずれかの分子配列において）、クラスＩ重鎖および／またはβ２−ミクログロブリンのキメラ分子からなり、機能的ＭＨＣ抗原の形成を可能とするために充分なものである。
【００８８】
本発明での使用に適したさらなるＭＨＣ抗原分子は、米国特許出願番号０８／７７６，０８４（発明の名称：ＭＨＣ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ （ＭＨＣ複合体およびその用途）；１９９７年１月１７日出願；この出願はＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６に基づくものであり、１９９５年２月１日に出願された米国特許出願番号０８／３８２，４５４の継続出願であり、後者の出願は１９９４年７月２９日に出願された米国特許出願番号０８／２８３，３０２の継続出願である；本出願の開示は本明細書中に参考として援用される。
【００８９】
特に、当該０８／７７６，０８４、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６、０８／３８２，４５４、および０８／２８３，３０２の特許出願に開示されたものは、本発明での使用に適した多様なヘテロ二量体ＭＨＣ分子（クラスＩおよびクラスＩＩ）である。参照文献：ＭｃＣｌｕｓｋｅｙ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４１： １４５１； ＰＣＴ／ＵＳ９２／１００３０；および米国特許５，８２０，８６６（ｔｏ Ｋａｐｐｌｅｒ ａｎｄ Ｍａｒｒａｃｋ）（さらなるクラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子を開示）；これらの開示は本明細書中に参考として援用される。
【００９０】
さらに適切なＭＨＣ抗原分子は米国特許出願番号０８／９６０，１９０（発明の名称：Ｓｏｌｕｂｌｅ ＭＨＣ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｕｓｅ Ｔｈｅｒｅｏｆ （可溶性ＭＨＣ複合体およびその使用方法）；１９９７年１０月２９日出願）；ＰＣＴ：ＷＯ９６／０４３１４；およびＰＣＴ９７／２８１９１；これらの開示は本明細書中に参考として援用される。
【００９１】
簡単に説明すると、該出願は本発明での使用に適した極めて有用な一本鎖（「ｓｃ−」）ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ複合体を開示している。特定して開示されているのは、ｓｃ−ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ複合体であって、組換えにより融合した提示ペプチド（ｓｃ−ＭＨＣペプチド融合分子という）、エンプティｓｃ−ＭＨＣ分子（組換えにより融合した提示ペプチドを有しないという）、および負荷されたｓｃ−ＭＨＣ複合体（非共有結合により付加した提示ペプチドと含むという）などを有するものである。
【００９２】
より詳しくは、修飾クラスＩＩβ２鎖および／または融合Ｉｇ−ＣＬ鎖もしくは規定どおりの適当なＩｇ−ＣＬ鎖フラグメントをもつ様々なｓｃ−ＭＨＣ分子の調製法および使用法が０８／９６０，１９０；ＰＣＴ：ＷＯ９６／０４３１４；およびＰＣＴ９７／２８１９１の出願に開示されている。また、修飾クラスＩＩβ２鎖および／または融合Ｉｇ−ＣＬ鎖もしくはＩｇ−ＣＬ鎖フラグメントを有するか、または有しない「多特異性」ＭＨＣ複合体と言われる複合体も報告されている。
【００９３】
参照：米国特許５，８６９，２７０（Ｒｈｏｄｅ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．に付与）（本発明にて使用し得るさらに好適なｓｃ−ＭＨＣ分子を開示）；この開示はすでに本明細書中に参考として援用されている。
【００９４】
本発明より使用し得る特定のＭＨＣ抗原分子は、ＭＨＣ抗原がＴＣＲに特異的に結合することの可能な十分なサイズのＭＨＣ成分を含む。ＭＨＣ抗原がペプチド−ＭＨＣ分子である態様において、ＭＨＣ成分は少なくともペプチドが結合する溝を有している。ペプチド結合溝を有する有用なクラスＩＩ ＭＨＣ成分は、少なくともクラスＩＩα１ドメイン（α鎖のアミノ酸１の近辺からアミノ酸８４の近辺）およびβ１ドメイン（β鎖のアミノ酸１の近辺からアミノ酸９５の近辺）からなる。ペプチド結合溝を有する有用なクラスＩ ＭＨＣ成分は、少なくともクラスＩα１およびα２ドメイン（重鎖のアミノ酸１の近辺からアミノ酸１８２の近辺）からなる。ＭＨＣ抗原が異質反応性ＭＨＣ分子である態様において、ＭＨＣ成分は少なくとも異質反応性ＭＨＣ決定基を含み、異質反応性がペプチドに依存する場合には、ペプチド結合溝を有する。異質反応性ＭＨＣ決定基の性質とペプチドへの依存性はＴＣＲの特異性により変わり、実験的に決定することができる。参照：Ｏｂｓｔ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９１： ８０５−８１２。ＭＨＣ抗原がスーパー抗原−ＭＨＣ複合体である態様において、ＭＨＣ成分は少なくともスーパー抗原結合部位を有している。ＭＨＣ成分上のスーパー抗原結合部位はペプチド−結合溝の外側にあり、スーパー抗原成分によって変化する。参照文献：Ｋｏｔｚｉｎ， Ｂ．Ｌ． ｅｔ ａｌ （１９９３） Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５４： ９９−１６６。適切なＭＨＣ抗原分子を同定する方法は下記の標準的なＭＨＣ抗原結合試験である。
【００９５】
本発明に従い使用し得るより好適なＭＨＣ抗原分子は、標準的なＭＨＣ抗原結合試験と言われる方法において、有意な結合活性を示す。好ましくは、ＭＨＣ抗原分子はその同族体ＴＣＲ分子に対して、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは適切なコントロールと同程度の少なくとも約９０％ないし９９％のレベルで特異的に結合する。適切なコントロールの例は天然に存在するＭＨＣ分子（すなわち、野生型へテロ二量体として）または組換えＭＨＣ抗原分子として存在する。殆どの場合に、該コントロールは完全溶解組換えＭＨＣ抗原分子、好ましくは可溶性一本鎖ＭＨＣ抗原分子である。かかる分子の調製法および使用法については米国特許５，８６９，２７０を含む上記文献に詳細に記載されている。
【００９６】
かかるアッセイにおいて、固相化ＴＣＲとＭＨＣ抗原との相互作用はＢＩＡコア２０００システム（ＢＩＡコア・インク）による表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によりモニターする。一般に、約５００〜５０００共鳴単位（ＲＵ）のＴＣＲが、標準的ＮＨＳ／ＥＤＣカップリング化学によりＢＩＡコアＣＭ５チップに結合する。主題のＭＨＣ抗原とコントロールＭＨＣ抗原（ＰＢＳ中）は別個に１０〜５０μｌ／分の流速でＴＣＲ表面に注入する。多重注入は各ＭＨＣ抗原濃度を２μＭないし２０μＭの範囲として実施する。ＳＰＲの結合曲線に基づき、ＢＩＡエバリュエーション２．１ソフトウエア（ＢＩＡコア・インク）を用いて速度定数分析を実施する。会合・解離速度定数、親和定数、およびコントロールＴＣＲ：ＭＨＣ抗原相互作用の半減期の計算値を１００％とする。
【００９７】
考察したように、一定の発明の態様においては、脂質、糖脂質、異質反応性、異種反応性および／またはスーパー抗原成分を含むＭＨＣ分子を使用することが有用である。
【００９８】
ＭＨＣ／脂質および糖脂質分子が対象となる態様においては、本発明で使用し得るＭＨＣクラスＩ−様ファミリーの分子が存在する。当該ファミリーの好適なメンバーはＣＤ１ファミリーとして知られる。この特異的なファミリーは細菌性脂質抗原をＴ細胞に提示することができると判明している。これら複合体の具体例はＣＤ１ｃ／ヘキソシル−１−ホスホイソプレノイド、ＣＤ１ｃ／マンノシル−ベータ１−ホスホドリコール、ＣＤ１ｂ／リポアラビノマンナン、ＣＤ１ｂ／ミコール酸脂質などである。参照一般文献：Ｍｏｏｄｙ ＤＢ， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ． １７２： ２８５−９６ 並びにそこに開示された文献。
【００９９】
本発明により使用し得る特定の異質反応性ＭＨＣ分子は、臓器または組織移植片中に存在する殆どのヒトＭＨＣ分子を包含し得る。好ましくは、当該分子は宿主が共有しない（宿主−対−移植片Ｔ細胞応答に導く）か、または移植片が共有しない宿主に存在するどのＭＨＣ分子も共有しない（移植片−対−宿主Ｔ細胞応答に導く）。一般に、移植片の生存はＭＨＣクラスＩＩ抗原に対する異質反応応答の低下にもっとも依存する。より特異的な異質反応性ＭＨＣ分子は白人種集団に優位に存在する分子であり、例えば、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ２、ＨＬＡ−ＤＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ５、ＨＬＡ−ＤＲ６、ＨＬＡ−ＤＲ７、ＨＬＡ−ＤＱ６、ＨＬＡ−ＤＱ７およびＨＬＡ−ＤＱ８を包含する。参照一般文献：Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３ｒｄ Ｅｄ． Ａｂｂａｓ， Ｌｉｃｈｔｍａｎ， Ｐｏｂｅｒ， Ａｂｂａｓ ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｔｔ， Ｗ．Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， １９９７。
【０１００】
さらに、異種移植片ＭＨＣ分子などの多くの異種反応性ＭＨＣ分子を本発明で使用することが可能である。より具体的な例はブタの異種移植片臓器移植におけるブタのＭＨＣ分子、異種移植片Ｔ細胞に反応性のヒトＭＨＣ分子などである。好適なヒトＭＨＣ分子は上記掲載のものである。好適なブタＭＨＣ分子はＳＬＡ−１ないし６、ＳＬＡ−ＤＲ、およびＳＬＡ−ＤＱ分子である。参照一般文献：Ｃｈａｒｄｏｎ Ｐ， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ． １６７： １７９−９２ およびそこに開示の文献。
【０１０１】
本発明にて使用し得るさらに有用なＴＣＲ分子およびＭＨＣ抗原分子は下記実施例の項に開示する。
【０１０２】
もう一つの側面において、本発明は本明細書に開示した方法により検出・同定される適切な試験化合物を提供する。
【０１０３】
考察したように、本発明の実施により、タンパク質：タンパク質、タンパク質：細胞、または細胞：細胞のアッセイフォーマットにおいて、ＴＣＲとＭＨＣ抗原分子間の相互作用を調節する試験化合物の検出が可能となる。さらに考察したように、関連のＴＣＲとＭＨＣ抗原相互作用は、一般には得られる免疫複合体を介して検出されるが、必要に応じて直接または間接に測定することができる。
【０１０４】
本発明の特定の方法はＴＣＲ分子と相互作用する（例えば、結合する）試験化合物を検出・同定するように設計する。用語「相互作用する」はＴＣＲ分子の細胞外ドメイン（ＥＣＤ−ＴＣＲ）または細胞質ドメイン（ＣＤ−ＴＣＲ）を包含することを意味するが、これのみに限定されるものではない。好適な相互作用は同族体ＭＨＣ抗原分子に対する特異的結合を受け容れる結合部位、ポケットまたは溝において、またはその近傍で起こる。このように特別に興味のある試験化合物は、適切なＭＨＣ分子の環境にあるスーパー抗原またはペプチド抗原に、または異質反応性ＭＨＣ分子に結合し得るＴＣＲポケットまたは溝と相互作用する。
【０１０５】
さらなる方法はＭＨＣ抗原分子と相互作用する（例えば、結合する）化合物を同定するために設計する。このように、ＭＨＣ抗原分子の環境において「相互作用する」という用語は、これらに限定されるものではないが、ＭＨＣ分子の細胞外ドメイン（ＥＣＤ−ＭＨＣ）または細胞質ドメイン（ＣＤ−ＭＨＣ）、ペプチド抗原またはスーパー抗原を包含する。好適な相互作用はＴＣＲ分子との特異的結合に影響するＭＨＣペプチド（または脂質）結合溝および他の部位において、またはその近傍で起こる。より特殊の化合物はＭＨＣペプチド結合溝と、またはその溝の近傍でしばしば相互作用する。
【０１０６】
さらなる方法はＴＣＲ：ＭＨＣ抗原複合体と相互作用する（例えば、結合する）化合物を同定するために設計する。このように、ＴＣＲ：ＭＨＣ抗原複合体の環境において「相互作用する」という用語は、これらに限定されるものではないが、ＥＣＤ−ＴＣＲ、ＣＤ−ＴＣＲ、ＥＣＤ−ＭＨＣ、ＣＤ−ＭＨＣ、ペプチド抗原またはスーパー抗原を包含する。好適な相互作用は該複合体の安定性に影響を与える部位、またはその近傍で、または多量体を形成する複合体の能力に影響する部位、またはその近傍で起こる。
【０１０７】
本発明のスクリーニング方法に従って使用し得る適切な試験化合物は、これらに限定されるものではないが、ペプチド、ポリペプチド、抗体およびそのフラグメント、およびＴＣＲ分子、ＭＨＣ抗原分子およびその双方に結合する他の有機化合物（例えば、ペプチド模倣体および非ペプチド模倣体）を包含する；またＴＣＲとＭＨＣ抗原分子間の特異結合が引き金となる活性を模倣するか（すなわち、アゴニスト化合物）、あるいは引き金となる活性を阻害する（すなわち、アンタゴニスト化合物）；同様に、ペプチド、抗体またはそのフラグメント、および他の有機もしくは無機化合物であって、所望のＴＣＲ分子とその同族体ＭＨＣ抗原分子間の特異的結合を上昇または低下させ得る化合物である。
【０１０８】
かかる化合物は特に、これらに限定されるものではないが、ペプチド、例えば、可溶性ペプチドとして、これらに限定されるものではないが、ランダム・ペプチド・ライブラリー（参照例：Ｌａｍ， Ｋ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４； Ｈｏｕｇｈｔｅｎ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４； ８４−８６）、およびコンビナトリアル化学誘導分子ライブラリーであって、Ｄ−および／またはＬ−配置アミノ酸、ホスホペプチド（これらに限定されるものではないが、ランダムまたは部分的に変性した定方向ホスホペプチド・ライブラリー；参照例：Ｓｏｎｇｙａｎｇ， Ｚ． ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｃｅｌｌ ７２： ７６７−７７８）により調製されたものである。また期待されるのは、抗体、並びに小型、中型および大型の有機または無機分子を含むか、またはそれらから構成される化合物である（該抗体は、これらに限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラまたは一本鎖抗体、およびＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂ発現ライブラリーフラグメント、およびそのエピトープ結合フラグメントを包含する）。参照例：米国特許５，９８０，８９２。
【０１０９】
本発明の使用に適する種々の分子ライブラリーの調製および使用に関係するより具体的な開示については、米国特許６，００１，５７９（タグ標識エンコード・コンビナトリアルライブラリー）、５，５７３，９０５（エンコード・コンビナトリアルライブラリー）、５，６３９，６０３（多様な分子ライブラリー）、および５，８８０，９７２（コンビナトリアル化学ライブラリーを調製する方法および装置）を参照；これらの開示は本明細書中に参考として援用される。追加参照文献：Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１５： ９８１２； Ｂｒｅｎｎｅｒ， Ｓ． ａｎｄ Ｒ． Ｌｅｒｎｅｒ （１９９２） ＰＮＡＳ （ＵＳＡ） ８９： ５３８１−５３８３； ａｎｄ Ｐｉｎｅｌｌａ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １３： ９０１。ＥＰＯ公開番号０ ４３２ ６９１  Ａ１（ＭＨＣ分子に結合するある種のペプチドを開示）も参照。
【０１１０】
別法として、またはさらに、多くの有用な化学ライブラリーは市場供給メーカー、例えば、ケムブリッジ（Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ）、アルクレ（ＡｒＱｕｌｅ）、コンビケム（ＣｏｍｂｉＣｈｅｍ）、ファーマコピア（Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）、トレガバイオファーマシューティカル（Ｔｒｅｇａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、およびトリポス（Ｔｒｉｐｏｓ）などから入手し得る。
【０１１１】
しかし、ある幾つかの例では、試験化合物についてより焦点を絞った選抜が望ましい。これら事例の多くで、標準的コンピューターおよび検索技術が候補化合物の予備同定並びに以前に同定された化合物の取り扱いを可能にする。かかる化合物はこのように所定のＴＣＲおよびＭＨＣ抗原分子間の相互作用を調節する受容能力について「予備スクリーニング」することができる。かかる候補化合物の「予備スクリーニング」は以下の一般的工程を実施することにより遂行することができる：
【０１１２】
１．例えば、かかるＴＣＲとＭＨＣ抗原分子が特異的に相互作用して免疫複合体を形成することを見出すことで、その活性部位または領域を同定する。かかる活性部位は一般にリガンド結合部位、例えば、ＴＣＲ分子、ＭＨＣ抗原分子、またはその両方の分子の相互作用ドメインであり得る。活性部位は標準的な方法、例えば、ＴＣＲまたはＭＨＣ抗原ポリペプチド鎖のアミノ酸配列の確認から、またはＴＣＲとその同族体ＭＨＣ抗原との複合体の研究から同定することができる。前者の場合、他のＴＣＲまたはＭＨＣ抗原分子上の既知活性部位と配列相同性を比較することにより、その活性部位を見出すことができる。後者の場合には、突然変異性、化学的またはＸ−線結晶学的方法を用いて、ＴＣＲまたはＭＨＣ抗原上、何処に同族体リガンドが見出せるかを見出し、それを見出すことにより活性部位を見出すことができる。
【０１１３】
２．次に、活性部位の３次元幾何学的構造を決定する。この決定は既知方法、例えば、Ｘ−線結晶学により実施可能であり、原子レベルでのほぼ完全な分子構造を決定することができる。他方、固相または液相ＮＭＲを用い、一定の分子内距離を決定することができる。他の実験的構造決定方法を使用して、部分的または完全な幾何学的構造を得ることもできる。幾何学的構造は複合体化した天然または人工的リガンドについて測定し得るが、それによって決定した活性部位構造の精度を上昇させることができる。
【０１１４】
もし決定された構造の正確さが不完全または不十分であるならば、コンピューターに基づく数値モデル化の方法を用いて、構造を完全なものとするか、またはその精度を向上させることができる。モデル化方法の殆ど、例えば、タンパク質または核酸などの特定の生体高分子に特異的なパラメータ化モデル、コンピューターによる分子運動に基づく分子の動的モデル、熱集団に基づく統計力学モデル、または組み合わせモデルなどが使用し得る。殆どの型のモデルにおいて、構成する原子および基間の力を表す標準的分子力の場がしばしば必要であり、物理化学において既知の力の場から選択することができる。不完全なまたは精度の低い実験構造は、これらのモデル化方法によりコンピューター解析された完全なより精度の高い構造に対し、制約として働き得る。
【０１１５】
３．最後に、実験的に、モデル化することにより、またはその組み合わせにより活性部位の構造を決定したことにより、候補調節化合物は、化合物についてそれらの分子構造に関する情報を一緒に含むデータベースを検索し、同定することができる。かかる検索は決定された活性部位構造に適合し、かつ活性部位を規定する基と相互作用する構造の化合物を探索する。かかる検索は手作業でもよいが、好ましくはコンピューターの助けを借りる。この検索から見出された化合物は、ＴＣＲ：ＭＨＣ抗原相互作用を調節する能力をもつ化合物と見なすことができる。
【０１１６】
あるいは、これらの方法は既知の調節化合物から改良した調節化合物を同定するために使用することができる。既知化合物の組成は改変することが可能であり、改変の構造に与える影響は、新しい組成に適用される上記の実験的およびコンピューター改変方法を使用して決定することができる。変更された構造は次いで該化合物の活性部位構造に比較し、改善されたものが適切であるか、または相互作用が生じるか判断することができる。このような方法で、組成中の系統的な変更、例えば、側基（例えば、メチル、ヒドロキシル、カルボニル、カルボキシル、水素など）を変えることによるなどの変更を迅速に評価し、改変された調節化合物または特異性もしくは活性の改善されたリガンドを得ることができる。
【０１１７】
分子モデル化システムの例は、チャーム（ＣＨＡＲＭＭ）およびクァンタ（ＱＵＡＮＴＡ）プログラム（ポリジェン・コーポレーション（Ｐｏｌｙｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）；ウオルサム（Ｗａｌｔｈａｍ）、マサチューセッツ）であるが、これらに限定されるものではない。チャームはエネルギーの最小化および分子力学関数を遂行する。クァンタは分子構造の構築、グラフモデル化、および分析を遂行する。クァンタは相互作用の構築、改変、可視化、および分子同士の行動様式の分析を可能にする。特異タンパク質と相互作用する薬物などの化合物のコンピューターモデル化に関する全般的な開示については以下の文献を参照：Ｒｏｔｉｖｉｎｅｎ， ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｅｎｎｉｃａ ９７： １５９−１６６； Ｒｉｐｋａ， Ｎｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ ５４−５７ （Ｊｕｎ． １６， １９８８）； ＭｃＫｉｎａｌｙ ａｎｄ Ｒｏｓｓｍａｎｎ， １９８９， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｉｏｌ． ２９： １１１−１２２； Ｐｅｒｒｙ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ， ＯＳＡＲ： Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ （薬物設計における定量的構造−活性相関） ｐｐ． １８９−１９３ （Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． １９８９）； ａｎｄ Ｌｅｗｉｓ ａｎｄ Ｄｅａｎ， １９８９ Ｐｒｏｃ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄ． ２３６： １２５−１４０ ａｎｄ １４１−１６２。
【０１１８】
化学物質を選抜し、図式化して描く他のコンピュータープログラムは、バイオデザイン・インク（ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ， Ｉｎｃ．）（パサデナ、カリフォルニア）、アレリックス・インク（Ａｌｌｅｌｉｘ， Ｉｎｃ．）（ミシソーガ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ）、オンタリオ、カナダ）、およびハイパーキューブ・インク（Ｈｙｐｅｒｃｕｂｅ， Ｉｎｃ．）（ケンブリッジ、オンタリオ）などの企業から入手し得る。これらは主として特定のタンパク質に特異的な薬物に適応するように設計されるが、それらは原理的にＴＣＲとＭＨＣ抗原の相互作用を調節する薬物の設計に適合させ得るはずである。かかる薬物は本発明の方法に従ってさらに選抜することができる。
【０１１９】
上記のコンピューター支援法は本発明の一部態様において、候補化合物を「予備スクリーニング」するために使用し得るが、候補化合物の既知ライブラリーについて本方法を使用するのが多くの場合より望ましい。あるいは、極めて有用な化学ライブラリーを確立された手法に従い調製し、使用することができる。かかるライブラリーは、制限なく、天然物または合成化学物質、および生物学的に活性な物質、例えば、アミノ酸（修飾アミノ酸を含む）、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質などである。かかるライブラリーはＴＣＲおよびＭＨＣ抗原分子間の相互作用のアンタゴニストまたはアゴニストとして作用する化合物を同定するために選択し得る豊富な候補化合物源として役立つ。一般参照文献：Ｄｒｅｗｓ Ｊ． （２０００） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７： １９６０−１９６４； Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ Ｓ．Ｌ． （２０００） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７： １９６４−１９６９。
【０１２０】
本発明の最適実施は許容し得るインビトロ検出フォーマットを使用することであるが、該フォーマットは、すでに考察したように、必要に応じて直接的または間接的であってもよい。好適な検出フォーマットは主題のＴＣＲ分子、ＭＨＣ抗原分子、またはその両方と相互作用する（例えば、結合する）化合物を検出するように設計する。かかる検出フォーマットは試験化合物の存在および非存在下に免疫複合体の存在を有益にモニターし、好適に定量する。
【０１２１】
既述のように、本発明は免疫複合体検出用フォーマットの一つまたは組み合わせと合致する。例えば、免疫複合体の存在（またはコントロール免疫複合体の一つでもよい）は確立された直接または間接検出原理に従って実現し得る。本発明分野の当業者は本明細書に提供した指針およびある場合には通常の実験の平均的レベルによって、ＴＣＲとＭＨＣ抗原分子の特定の組み合わせに対する操作可能な最適のアッセイ条件を決定することができるであろう。
【０１２２】
特定のフォーマットに関して、免疫複合体の存在を検出する一つの方法は、該複合体に特異的に結合し得る抗体を検出可能に標識することである。標識の一例は抗体を、通常はモノクローナル抗体を酵素に結合し、検出可能に標識した抗体を酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）に使用することである。参照文献：Ｖｏｌｌｅｒ， Ａ．，“Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ （ＥＬＩＳＡ）”（酵素結合免疫吸着検定法）１９７８， Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｈｏｒｉｚｏｎｓ（診断への展望）２： １−７， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， Ｍｄ．； Ｖｏｌｌｅｒ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， １９７８， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈｏｌ． ３１： ５０７−５２０； Ｂｕｔｌｅｒ， Ｊ．Ｅ．， １９８１， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ７３： ４８２−５２３； Ｍａｇｇｉｏ， Ｅ．（ｅｄ．）， １９８０， Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌａ．，； Ｉｓｈｉｋａｗａ， Ｅ． ｅｔ ａｌ， （ｅｄｓ．）， １９８１， Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（酵素免疫測定法）， Ｋｇａｋｕ Ｓｈｏｉｎ， Ｔｏｋｙｏ）。
【０１２３】
参照文献：Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （ｅｄｓ．） ｉｎ： Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（抗体：実験室マニュアル）１９８８， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； ａｎｄ Ｂｉｓｈｏｐ， Ｇ．Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２： ３２６−３３０（細胞表面物質検出用細胞性ＥＬＩＳＡを開示）；ａｎｄ Ｋｅｌｌｙ， Ｔ．Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５１７３−５１７７； これらの開示を本明細書中に参考として援用する。
【０１２４】
当該検出法のこの態様において、抗体に結合する酵素は、例えば、分光光度法、蛍光法により、または目視手段により検出し得る化学的部分を生じるような方式で適切な基質と、好ましくは色素原基質と反応する。抗体を検出可能に標識するのに使用し得る酵素は、これらに限定されるものではないが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファグリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼなどである。検出は酵素用色素原基質を使用する比色法により実施することができる。検出はまた基質の酵素反応の程度を、同様に調製した標準との比較により、目視比較することによっても実施し得る。
【０１２５】
良好な検出は他の様々なイムノアッセイ法を使用しても達成し得る。例えば、免疫複合体に特異的に結合し得る抗体または抗体フラグメントを放射活性標識することによって、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の使用により、本発明方法でのＴＣＲ：ＭＨＣ抗原相互作用を検出することが可能である（参照例：Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ， Ｂ．， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ， Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｎ Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ラジオイムノアッセイの原理；第７回放射リガンド検定技法訓練コース）、Ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ， Ｍａｒｃｈ， １９８６；本文献を本明細書中に参考として援用する）。放射活性同位体はガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターなどの使用により、またはオートラジオグラフィーにより検出することができる。
【０１２６】
蛍光化合物により抗体またはそのフラグメントを標識することも可能である。蛍光体により標識された抗体またはそのフラグメントが適切な波長の光に露光すると、その存在を蛍光により検出し得る。もっとも共通に使用される蛍光標識化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド、およびフルオレスカミンである。
【０１２７】
さらに、該抗体またはそのフラグメントは１５２Ｅｕなどの蛍光放出金属またはその他のランタニド系を使用して検出可能に標識することもできる。これらの金属はジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート群を用いて抗体に結合することができる。
【０１２８】
例えば、パッカード・インストルーメント・カンパニー（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）が供給するユーロピウムを用いるアッセイの開発および高速大量処理スクリーニング用のＨＴＲＦ（均一系時間分解蛍光）抗体試薬参照。参照文献：米国特許４，５６８，６４９；ＥＰＯ０１５４７３４；および日本国特許出願番号８４−５２４５２；これらの開示を本明細書中に参考として援用する。
【０１２９】
抗体またはフラグメントを検出可能に標識する他の方法はこの分野での当業者に周知である。例えば、抗体は化学発光化合物に結合させることにより検出可能に標識することができる。化学発光タグ標識抗体の存在は、次いで化学反応の途上で生じる発光の存在を検出することにより判定することができる。とりわけ有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、サロマティック・アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、アダマンチルジオキセタマー、チオキセン誘導体、およびシュウ酸エステルなどである。さらに、抗体またはフラグメントは光増感剤化合物を用いて検出可能に標識することができる。参照文献例：米国特許５，８０７，６７５およびそこに開示された文献。
【０１３０】
さらに想定されるのは、一部または全体として、分子のビオチニル化に基づき、かつビオチニル化分子を可視化するストレプトアビジンまたはその接合体を用いる検出フォーマットである。このフォーマットのより具体的な例は以下の実施例で提供する。
【０１３１】
同様に、生物発光化合物を使用して、免疫複合体の存在を検出するために使用する抗体またはフラグメントを検出可能に標識することもできる。生物発光は生物系に見出される化学発光の一種であって、触媒のタンパク質が化学発光反応の効率を高める。生物発光タンパク質の存在は発光の存在を検出することにより測定される。標識目的のための重要な生物発光化合物はルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【０１３２】
抗体またはそのフラグメントは蛍光性を有するタンパク質で標識することもできる。かかるタンパク質の例は緑色蛍光タンパク質およびその誘導体である。
【０１３３】
さらに、バイオエフェクター・タグ標識を用いて、免疫複合体の存在を検出するために使用する抗体またはフラグメントを検出可能に標識することができる。バイオエフェクター・タグ標識は測定可能な生物応答、すなわち、インビトロで検出される細胞応答に影響し得る化合物である。有用なバイオエフェクター・タグ標識の例は、細胞性レセプターを標的とする天然または人工のリガンドまたは抗体（またはそのフラグメント）である。特に有用なバイオエフェクター・タグ標識はＩＬ−２などのサイトカイン類である。
【０１３４】
他の適切なタンパク質（および非タンパク質）タグ標識の例は、１９９７年３月７日出願の米国特許出願番号０８／８１３，７８１、並びに１９９９年１０月２１日出願の米国特許出願番号０９／４２２，３７５に開示されている；これら出願の開示を本明細書中に参考として援用する。かかるプローブの特定の例はＥＥ、ｍｙｃ、６Ｘｈｉｓである。さらに好適なのは、抗体、細胞レセプター、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン、ストレプトアビジン、またはその機能的フラグメントなどのタンパク質が特異的に結合するタグ標識である。さらに有用なタグ標識は、１種またはそれ以上のタンパク質分解酵素、プロテインキナーゼ、ビオチンリガーゼ、またはその機能的フラグメントにより直接または間接に修飾し得る標識である。
【０１３５】
あるいは、免疫複合体を直接標識することは一部の態様において有用であり得る。これは種々の方法、例えば、ＴＣＲ分子、ＭＨＣ抗原分子、または試験化合物の少なくとも一つを適切に標識することによって達成し得る。標識すべき分子がタンパク質である場合、抗体の標識について本明細書に記載したいずれかの方法がＴＣＲおよび／またはＭＨＣ抗原分子を標識するために同様に使用し得る。ヨウ素、例えば、１２５Ｉまたは１３１Ｉなどの放射性核種（放射活性同位体）の使用も提案し得る。試験化合物を検出可能に標識する態様において、適切な放射性核種の選定は、試験化合物の化学的性質および必要とする感度の度合いに左右される。かかる放射性核種は３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐなどである。
【０１３６】
ＭＨＣペプチドを標識する特定の方法はＥＰＯ０ ４３２ ６９１　Ａ１に開示されている。追加のペプチドも開示されている。参照文献：Ｈｅｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３６３１−３６３６ および米国特許５，６１４，１９２（治療用Ｔ細胞レセプターペプチドを開示）。
【０１３７】
さらに特異的な検出フォーマットは本発明での使用によくマッチしている。
さらに特定の検出フォーマットは、例えば、少なくとも一つの細胞応答をモニターし、多くの場合定量することにより、免疫複合体の存在を検出することからなる。かかる細胞応答が免疫複合体の存在により影響を受けているかどうかを予め測定する。このように、本発明の多くの態様において、ある方法での細胞応答の検出を免疫複合体の存在の指標として採用する。適切な細胞応答の例は、細胞接着、膜電位、細胞内または細胞外イオン濃度、細胞内キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、細胞内タンパク質輸送、内在性または異種遺伝子発現、少なくとも１種のサイトカインの産生を含むタンパク質の産生または分泌、細胞増殖、アポトーシス、ＲＮＡ合成、またはＤＮＡ合成の中の少なくとも一つを増大または減少させることである。一般参照文献：Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（細胞および分子免疫学）３ｒｄ Ｅｄ． Ａｂｂａｓ， Ｌｉｃｈｔｍａｎ， Ｐｏｂｅｒ Ａｂｂａｓ ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｔｔ， Ｗ．Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， １９９７。
【０１３８】
勿論、タンパク質：タンパク質スクリーニング法を採用する本発明の態様においては、免疫複合体の形成をすでに考察した線に沿って直接または間接にモニターすることはより有益であり得る。
【０１３９】
しかし、ＴＣＲまたはＭＨＣ抗原分子の少なくとも一方を細胞に基づくフォーマットにおいて操作する態様において、ある場合には、免疫複合体の指標であるとして細胞応答の少なくとも一つを検出することがより有用である。一態様において、ＴＣＲ分子を発現する細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｔ細胞ハイブリドーマまたは組換えＴＣＲを発現する細胞は、細胞応答の少なくとも一つの発現についてモニターする。
【０１４０】
実例として、細胞がＴＣＲ分子を発現している態様において、検出される細胞応答の少なくとも一つは、少なくとも１種のサイトカイン、例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）の細胞介在合成および分泌でもよい。本発明のこの例において、サイトカイン（または１種以上のサイトカイン）の産生は、１種以上の適切なコントロールと比較して、生産的ＴＣＲ：ＭＨＣ抗原相互作用の指標、より具体的には免疫複合体の存在の指標として採用する。上に考察した方法を含む異なる対策の一つまたは組み合わせを用いて、特定のアッセイフォーマットにおいてサイトカインの存在を検出することができる。より特定した例では、サイトカインの検出は抗体「サンドイッチ」型アッセイで行うが、そこでは第一抗体（通常モノクローナル抗体）を固相支持体に被覆し、そこでそれが特異的にサイトカインに結合し、また第二抗体（通常これもモノクローナル抗体）が第一抗体とは異なる部位で固定化されたサイトカインに結合する。多くの態様において、少なくとも第二抗体を検出可能に標識するのが一般に好適である。
サイトカインに関する考察についての参照文献：Ｓｃｈｗａｒｚ， Ｍ．Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） ｉｎ Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． ｉｎ Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ３： ４０７−４１７。
【０１４１】
さらなる態様において、ＴＣＲ：ＭＨＣ抗原免疫複合体の形成から生じる細胞応答は遺伝子発現の変化として検出し得る。遺伝子発現の変化は種々の方法、例えば、誘発性または抑制性遺伝子の転写活性またはメッセンジャーＲＮＡレベルの測定などによって、測定することができる。さらに、プロモーター活性の変化は内在性または外来性「レポーター」遺伝子を用い試験することができる。例えば、レポーター構築物は、ＩＬ−２プロモーターなどのＴＣＲ応答性プロモーター要素をホタル・ルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質などの検出可能なタンパク質のためのレポーター遺伝子に結合させ、生成させることができる。該構築物は次いで細胞表面にＴＣＲを発現する細胞株に安定的に導入することができる。これらの細胞において、レポーター遺伝子転写の誘発および生じるルシフェラーゼ活性の増加は、１種以上の適切なコントロールと比較して、生産的ＴＣＲ：ＭＨＣ抗原相互作用の指標、より具体的には免疫複合体の存在の指標として採用する。ルシフェラーゼ活性はルシフェリン基質のルシフェラーゼ依存性酸化による生物発光を検出するための標準的方法により測定することができる。例えば、高速大量処理スクリーニングフォーマットにてルシフェラーゼ活性を測定するために特別に設計されたアッセイ試薬（ステディ−グロＴＭ（Ｓｔｅａｄｙ−ＧｌｏＴＭ））は、プロメガ・コープ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）から入手し得る。
【０１４２】
なおさらなる態様において、ＴＣＲ：ＭＨＣ抗原免疫複合体の形成から生じる細胞応答は、細胞内イオン濃度の変化として検出し得る。例えば、ＴＣＲ：ＭＨＣ抗原複合体の形成は細胞内カルシウムイオン濃度の上昇とＴ細胞の酸性化に至らしめる。これら応答のレベルは、アゴニスト、部分的アゴニストおよびアンタゴニストとして作用するＭＨＣ抗原の能力と相関する（参照文献：Ｗｕｌｆｉｎｇ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． １９９７， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８５： １８１５−１８２５）。本発明のこの例で、細胞内イオン濃度の変化は、１種以上の適切なコントロールと比較して、生産的ＴＣＲ：ＭＨＣ抗原相互作用の指標、より具体的には免疫複合体の存在の指標として採用する。異なる対策の一つまたは組み合わせにより、特定のアッセイフォーマットにおいて細胞内イオン濃度の変化を検出することができる。より特定した例では、細胞内カルシウムイオンの動態化はフルオ−３ＡＭなどのフルオレセインに基づく試薬を用いて検出するが、これはその蛍光強度をＣａ２＋の結合により約１００倍に上昇させる。フルオ−３ＡＭ試薬と蛍光測定画像処理プレートリーダーを用いて細胞内カルシウム動態化を検出するための高速大量処理スクリーニング法（参照例：Ｊｕｒｅｗｉｃｚ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｇｅｎｅｔ． Ｅｎｇ． Ｎｅｗｓ １９， ４４）は、生産的ＴＣＲ：ＭＨＣ抗原複合体形成が介在するＴ細胞における細胞応答の研究に使用し得る。
【０１４３】
この特定分野の当業者にはすぐに明らかとなるように、特定の検出フォーマットの選定は、認知されたパラメータ、例えば、対象のＴＣＲとＭＨＣ分子、これら分子相互の親和性および／または親和性、および試験化合物の最適な検出に要求されるアッセイの特異性の度合いなどにより導かれる。
【０１４４】
特定の態様において、特定免疫複合体の特異的検出のために本発明を実施するには、適当な内部コントロールを含めることが一助となる。かかる内部コントロールはＴＣＲと非同族体ＭＨＣ抗原分子間、またはＭＨＣ抗原と非同族体ＴＣＲ間で形成されるコントロール複合体である。一般的に述べたように、適当な非同族体分子は天然産または組換え体であり、また有益には一連の完全溶解性または細胞固着（膜結合）分子である。形成されるコントロール複合体の量は、ＴＣＲ（またはＭＨＣ抗原）とその非同族体対との間の非特異的会合の度合いを表すものであり、ＴＣＲと同族体ＭＨＣ抗原分子間の特異的相互作用を評価する場合のバックグランドコントロール値として使用することができる。
【０１４５】
「高速大量処理」または「超高速大量処理」スクリーニング法と言われている方法が望ましい態様においては、特定の検出フォーマットが極めて有用である。かかるフォーマットの例は、これらに限定されるものではないが、完全可溶性ＴＣＲとＭＨＣ分子を用いる本発明のこれらの態様などの無細胞系である。かかるフォーマットのより具体的な例は、これらに限定されるものではないが、光学的、蛍光もしくは発光強度に基づく無細胞アッセイ法、時間分解蛍光法、近接性に基づくエネルギー転移（蛍光共鳴エネルギー転移アッセイ、シンチレーション近接アッセイおよび発光近接アッセイを含む）、蛍光偏光分光測定法、および蛍光相関分光法などである。参照文献例：Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． ｉｎ Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２： ３９７−４０３。
【０１４６】
様々な細胞に基づく検出フォーマットが本発明により使用し得るものとして開示されている。かかるフォーマットは、より具体的には、これらに限定されるものではないが、細胞に基づくアッセイ法として、例えば、光学的、蛍光もしくは発光強度に基づくアッセイ法、蛍光共鳴エネルギー転移、時間分解蛍光法、発光およびシンチレーション近接アッセイ、および２−ハイブリッドおよび３−ハイブリッド系として知られる方法などである。参照文献例：Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ， Ｐ．Ｂ． （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． ｉｎ Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２： ５９７−６０３； Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ｊ．Ｅ． ａｎｄ Ｎｅｇｕｌｅｓｃｕ， Ｐ．Ａ． （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． ｉｎ Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ９： ６２４−６３１； Ｊｅｎｈ， Ｃ−Ｈ． （１９９８） Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５６： ４７−５５； Ｗｕ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４９： ２９−３６。
【０１４７】
細胞に基づくフォーマットを使用する態様において特にさらに適切な検出方法は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）技法である。参照文献例：Ａｌｔｍａｎ， Ｊ．Ｄ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４： ９４−９６。
【０１４８】
本方法により検出および同定される化合物は、例えば、ＴＣＲとＭＨＣ抗原分子を含む免疫複合体の形成を減少または増加させること；免疫複合体の安定性を低下または上昇させること；またはＴＣＲもしくはＭＨＣ抗原分子の他方に対する結合活性を低下または上昇させることなどに有用である。検出化合物の他の用途はインビボでのＴＣＲ類およびＭＨＣ抗原分子のモジュレーションに使用することなどである。より具体的なインビボ法、例えば、インビボでの免疫応答をモジュレーションする方法については以下に考察する。
【０１４９】
特定の検出フォーマット（またはフォーマット群）を一旦選択した場合、本発明方法を実施する際に考慮すべき重要なことは、少なくとも一つのＴＣＲ分子と少なくとも一つの対象ＭＨＣ抗原分子を含む少なくとも一つの反応混合物を適切に調製することである。一態様において、ＭＨＣ抗原分子は共有結合した（すなわち、融合した）提示ペプチドを有するＭＨＣ化合物から構成される。しかし、他の態様においては、認知された方法によりＭＨＣ分子に当該ペプチドを負荷することでペプチド−ＭＨＣ複合体を生成させることがより有用である。他の態様において、ＭＨＣ成分は共有結合したスーパー抗原を含み得る。あるいは、ＭＨＣ成分は認知された方法によりスーパー抗原鎖に複合体形成させてもよい。少なくとも一つの試験化合物をこの混合物に加え、ＴＣＲとＭＨＣ抗原分子が相互作用し得るのに十分な条件下で該混合物を処理する。好ましくは、またＴＣＲ：ＭＨＣ抗原相互作用に拮抗する試験化合物の非存在下に、ＴＣＲとＭＨＣ抗原分子は免疫複合体の形成を容易にする複数の特異的非共有結合を形成する。所望であれば、かかる免疫複合体は反応混合物から取り出し、例えば、すでに考察した方法により分析することができる。所望であれば、この免疫複合体は沈降遠心分離、電気泳動、濾過、クロマトグラフィーまたは関連の分子サイズ決定技法を用いて検出することができる。
【０１５０】
本発明方法に採用される特定のＴＣＲとＭＨＣ抗原分子は、認知されたパラメータ、例えば、スクリーニング検定の目標とするもの、所望の感度、試験化合物プールの大きさ、および完全可溶性または細胞に基づくスクリーニングフォーマットのいずれを選択したかによって変化する。
【０１５１】
例えば、多くの態様において、後記実施例に提供した特異細胞を使用する細胞に基づく方法によってＴＣＲ分子を発現させることは有用である。本発明のこの例において、ＭＨＣ抗原分子は、適当なＡＰＣまたは必要とされる他の細胞により発現され得るものであるが、完全可溶性であり得る。ＴＣＲ分子および／またはＭＨＣ抗原分子が完全長またはほぼ完全長の鎖からなる態様において、該免疫複合体の検出は、ＴＣＲ分子、ＭＨＣ抗原分子、またはその両者を、例えば、すでに説明した直接または間接的検出フォーマットを用いて検出することにより容易になる。
【０１５２】
本発明のより特定の方法は、特異的な反応フォーマットの一つまたは組み合わせを用いて使用することができる。該方法の一態様において、適切なＭＨＣ抗原分子は固形支持体または固相に固定化する。固定化されたＭＨＣ抗原分子は次いで適切なＴＣＲ分子、通常その同族体と接触させるが、要すれば検出可能に標識することができる。少なくとも一つの試験化合物をＴＣＲおよびＭＨＣ抗原分子と次いで接触させるが、場合によってはＴＣＲ分子を添加する前に、例えば、ＭＨＣ抗原分子を固相に固定化する前に、試験化合物を添加することが有益であることもある。あるいは、試験化合物を免疫複合体の形成後に添加することができる。コントロールとして、ＴＣＲ分子は、ＭＨＣ抗原分子が同一のまたは同様の固形支持体に結合させるもう一つの反応チャンバーに加える。しかし、試験化合物を添加する代わりに、水、緩衝液などの適当なブランク溶液の分割量を実験反応に使用される量と同容量で通常添加する。次に、免疫複合体を実験反応におけると同様に検出する。本発明方法のこれらの態様において、免疫複合体の検出は必要に応じて直接または間接の検出フォーマットを用い達成することができる。例えば、ＴＣＲ分子、ＭＨＣ抗原分子、試験化合物、またはこれら３種の分子すべてを直接または間接的に標識して免疫複合体の良好な検出を容易にすることもできる。次いで、上で考察した基準に従い、例えば、免疫複合体の形成および／または安定性を上昇または低下させる受容能力により試験化合物を選択する。
【０１５３】
「固形支持体」または「固相」という語句は、ＴＣＲまたはＭＨＣ抗原分子に結合し得る何らかの支持体を殆どの場合、意味する。周知の支持体または担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改変セルロース、ポリアクリルアミド、斑レイ岩、磁鉄鉱、デンドリマー、およびシリコンウエーファなどである。担体の性質は本発明の目的にとってある程度可溶性でもよく、不溶性であってもよい。支持体材料は結合する分子が抗原または抗体に結合し得る限り、実質的に可能などのような構造的立体配置を有していてもよい。このように、支持体の立体配置はビーズなどの球体状、試験管の内面のような円筒状、または棒状の外面であってもよい。あるいは、該表面はシート、テストストリップのように平坦であってもよい。好適な支持体はポリスチレンビーズである。ビーズに基づく試薬は多様なフォーマットで市販品として入手可能であり、組換えタンパク質を結合／捕捉する高い受容能力、効率的な検出、および異なる分離と均一系アッセイ法の使用を可能とする。多くの高速大量処理スクリーニング法で、ビーズに基づく試薬が有利である。本発明分野の当業者はＴＣＲとＭＨＣ抗原分子に結合させる多くの他の適当な担体について知悉していようし、また日常の実験に使用することでそれを確認することもできよう。
【０１５４】
本発明の実例は図２に概略図で示してある。図２では、小型の分子インヒビターがＡＰＣのペプチド−ＭＨＣリガンドからなるＭＨＣ抗原と適切な細胞が発現するＴＣＲとの間の相互作用を実質的に遮断する。この態様において、ＴＣＲ：ＭＨＣ抗原相互作用はＣＤ分子などのもう一つのレセプターにより援助されている。小型の分子インヒビターが存在すると問題の免疫応答が遮断される。しかし、小型の分子インヒビターが存在しなければ、かかる免疫応答が発揮される。
【０１５５】
本発明のもう一つの態様を図３に示す。この例では、主題のＴＣＲ分子が検出可能に標識されており、試験分子は「高速大量処理」または「超高速大量処理」スクリーニングフォーマットとして反応に添加される。しかし、強調すべきことは、本発明を実施するためにかかる高容量スクリーニングは必要でないが、大量の試験化合物のプールの分析を助け得るということである。本発明のこの例では、複数の反応チャンバーをしばしば使用し、そこでは各反応チャンバーには検出可能に標識したＴＣＲ分子、固定化したＭＨＣ抗原分子、および反応チャンバー当たり少なくとも一つの、好ましくは約一つの試験分子を容れる。この態様に従って検出される試験化合物は、該試験化合物存在下に免疫複合体が存在すると、それに対応して減少するシグナルの有意な低下が容易に示される。一部の態様において、化合物のプールはプール内の各化合物の濃度がアッセイの検出限界を超える場合に使用することができる。
【０１５６】
別法として、図３に示した特定のスクリーニング法を適合させ、結果としてＭＨＣ抗原分子が検出可能に標識され、ＴＣＲ分子が固形支持体または固相に固定化されるようにすることができる。もう一つの態様において、ＴＣＲ分子および／またはＭＨＣ抗原分子の代わりに、またはそれに加えて試験化合物を検出可能に標識することができる。特定のスクリーニングの代表例を選択するには、スクリーニング検定の目標と必要とされる感度レベルなど、すでに考察したパラメータに従う。
【０１５７】
例えば、図３に説明した選抜は具体的な自己免疫疾患のアンタゴニストを検出するために容易に適合させることができた。この態様において、選抜に採用したＴＣＲとＭＨＣ抗原分子は、免疫疾患に関与していると認知されているもの、または関与している疑いのあるものから構成されるように予め選択される。かかるＴＣＲとＭＨＣ抗原分子の例は本明細書において、以下に示す実施例と考察にて提供する。
【０１５８】
強調すべきことは、ＴＣＲ分子、ＭＨＣ抗原分子、または試験化合物を本発明に従い取り扱う厳密な順序は、所望のスクリーニング結果を容易に満たす限りに、通常重要ではないということである。すなわち、免疫複合体の形成を調節する受容能力について化合物を試験することが望ましい場合、これらの化合物をＴＣＲおよびＭＨＣ抗原分子の添加前に、またはその間に添加することがしばしば極めて有用である。しかし、すでに形成された免疫複合体を調節する試験化合物を検出するようにスクリーニング方法を設計する態様において、試験化合物はＴＣＲおよびＭＨＣ抗原分子を要求どおりに組み合わせる前に、またはその間に、またはその後に添加することができる。このように、特定アッセイの設定における成分添加の順序は、実施するスクリーニングフォーマットの具体的目標など、認知されたパラメータにより導かれる。
【０１５９】
多くの場合に、本分野で「タイター」または「マイクロタイター」プレートと言われるものは、固相として簡便に利用し得る。
９６穴マイクロタイタープレートは多くの場合に好適ではあるが、より多くのウエルをもつプレートも広範囲のスクリーニング例にとって必要とされる。固着成分は一般に認められた手法に従って、非共有結合または共有結合により固定化し得る。例えば、非共有結合による付着は、単純に固形表面をＴＣＲまたはＭＨＣ抗原分子の溶液により、このものを固相に結合させるのに必要な時間、コーティングすることにより実施し得る。あるいは、固定化すべきタンパク質に特異的な固定化した抗体、好ましくはモノクローナル抗体を用いて該タンパク質を固体表面に固着させることができる。表面は前もって調製し、要すれば保存する。
【０１６０】
より具体的には、本発明の実施は非固定化化合物を、固着成分（ＴＣＲ分子またはＭＨＣ抗原分子でもよい）含有の被覆表面に加えることからなる。反応終了後、形成された複合体が固形表面に固定したままで残るように未反応成分を（例えば、洗浄により）除去する。固形表面に固着した複合体の検出は、直接または間接の検出フォーマットを必要とする多くの方法により実施し得る。予め固定化していない成分を事前に標識化する場合、表面上に固定化した標識が検出されることは、ＴＣＲおよびＭＨＣ抗原分子間の免疫複合体が生産的であったことを物語る。予め固定化していない成分を事前に標識化しない場合、間接的標識を用いて、表面上に固着した複合体を検出することができる；例えば、予め固定化していない成分に特異的な標識化抗体を使用する（該抗体もまた直接標識するか、または標識した抗−Ｉｇ抗体で間接的に標識し得る）。
【０１６１】
本発明のもう一つの態様において、適切なＭＨＣ抗原分子は、９６穴マイクロタイタープレートなどの適当な固相上に固定化する。この例で、ＭＨＣ抗原分子は、共有結合により融合した提示ペプチドを担持するＭＨＣ成分からなる。あるいは、ＭＨＣ抗原分子は、提示ペプチドがさらなる操作を実施する前にＭＨＣ成分上に好適に負荷されている場合の複合体からなり得る。他の態様において、ＭＨＣ抗原は共有結合した、または結合していないスーパー抗原と複合体形成したＭＨＣ成分からなり得る。固定化を最大化するために約１２時間ないし約４８時間インキュベーションした後、ＭＨＣ抗原分子をプレートから除去し、そのウエルを適当な細胞培養培地、例えば、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭなどで満たす。次に、同族体ＴＣＲ分子を発現する細胞の添加前にまたは添加の際に、各ウエルに試験化合物を添加する。次いで、結合したＭＨＣ抗原分子に応答するのに十分な時間、一般には約２〜３時間から約３日以上までの間、細胞をインキュベートする。免疫複合体の存在を検出するための好適な細胞応答はサイトカインの産生であり、好ましくはＩＬ−２の産生である。
【０１６２】
例えば、図４はすでに説明したマルチウエルプレートなどの固形支持体上に固定化した所望のＭＨＣ抗原分子を示す。この態様において、ＭＨＣ抗原分子は共有結合した提示ペプチドであるＭＨＣ成分からなる。しかし、すでに述べたように、エンプティＭＨＣ分子はこの方法において、提示ペプチドでの負荷が好ましい態様において使用し得る。他の態様において、ＭＨＣ抗原は共有結合したまたは未結合のスーパー抗原と複合体形成したＭＨＣ成分からなり得る。本発明のこの例において、所望のＴＣＲ分子を発現する適切な細胞、例えば、天然産Ｔ細胞または組換えＴ細胞ハイブリドーマなどは、固定化したＭＨＣ抗原分子に接触させる。少なくとも１種以上の試験化合物が所望のフォーマットに従って、好ましくはすでに考察した「高速大量処理」または「超高速大量処理」の一つにより選抜され得る。試験化合物はアッセイのほぼいずれの時点でも、例えば、細胞をウエルに添加すること、またはこれらウエルにＭＨＣ抗原分子を固定化することの前、その間、またはその後に添加することができる。本発明のこの例示において、モニターする細胞応答はＩＬ−２の産生である。図４にも見られるように、適切な試験化合物の存在しない場合、ＴＣＲとＭＨＣ抗原分子間の特異的結合は生産的であり、免疫複合体の形成に至らしめる。かかる免疫複合体はＴ細胞の活性化とＩＬ−２サイトカインの産生の引き金を引く。しかし、免疫複合体形成のアンタゴニストなどの適切な試験化合物の結合は、細胞応答とＴ細胞から得られるＩＬ−２産生を低下させる。試験化合物を次いで検出し、サイトカイン産生の減少を観察することにより他の化合物から選択する。
【０１６３】
さらに特定の態様において、細胞が産生し、培地中に分泌したサイトカインは、サイトカインに特異的な抗体を被覆したウエルに培地を移すことで検出する。サイトカインが固定化した抗体に結合するのに適当な培養時間（すなわち、２５℃で２時間）の後、各ウエル中の培地を除き（ＰＢＳでの洗浄により）、サイトカイン分子に好適に結合する検出可能に標識した抗体をウエルに添加する。標識した抗体は、例えば、約２〜３時間ないし１日程度インキュベートした後、サイトカイン分子に結合した標識抗体を可視化するために適した異なる試薬の１種または組み合わせによりウエルを処理する。条件に合致する多くの可視化フォーマットはすでに言及したように、例えば、色素原の生成に関与するものなどである。すでに言及したように、一つのサイトカインはインターロイキン−２（ＩＬ−２）であるが、本発明のスクリーニング法は他の検出可能な分子の検出にも互換性があり、該分子は他のサイトカインを含む細胞応答の指標となる。
【０１６４】
本発明のもう一つの態様は、「原理の証明」の一例であることを意図する。これは図５Ａに概略図として示す。この例では、ＤＯ１１．１０Ｔ細胞レセプターを発現するＴ細胞ハイブリドーマが使用される。ＭＨＣ抗原分子は、例えば、マルチウエルプレートのウエルに結合するが、この例ではＤＯ１１．１０ＴＣＲと特異的に相互作用する（ｓｃ−）ＩＡｄ／ＯＶＡタンパク質である。適切な試験化合物は、例えば、「高速大量処理」または「超高速大量処理」フォーマットで提供され、組換えＴ細胞の添加前、その間、またはその後に添加される。この例示でモニターする細胞応答はＩＬ−２の産生である。
【０１６５】
図５Ａにも見られるように、適切な試験化合物の存在下、ＤＯ１１．１０ＴＣＲとｓｃ−ＩＡｄ／ＯＶＡＭＨＣ抗原分子との間の特異的結合が遮断され、それによって免疫複合体の形成が防止される。充分な免疫複合体が存在しない場合、Ｔ細胞の活性化およびＩＬ−２サイトカインの産生は減少するか起こらない。ＩＬ−２サイトカイン量の減少は種々の直接または間接フォーマットを使用して容易に検出することが可能である。
【０１６６】
図５Ａに示したスクリーニング法のもう一つの態様は図５Ｂに概略図として示す。本発明のこの例は時に「二重」アッセイフォーマットと言われ、１個または２〜３個のウエルでＴ細胞の刺激を実施し、Ｔ細胞応答を測定する方法の受容能力を表す。例えば、さらに特定の態様において、精製したｓｃ−ＩＡｄ／ＯＶＡなどの適切なＭＨＣ抗原分子は、適当量の抗−ＩＬ−２モノクローナル抗体（すなわち、捕捉抗体）とともにマルチウエル培養プレートに固定化する。プレートの各ウエルは少なくとも１種の試験化合物および一般的にはかかる化合物の約一つを収容している。次いで、ＤＯ１１．１０ＴＣＲを発現するＴ細胞を各ウエルに加え、充分なインキュベーション時間を取った後に、洗い流す。次に、各ウエルにおけるＩＬ−２の産生を、捕捉抗体により固定化したＩＬ−２に特異的に結合し得る検出可能に標識した抗体の適当量を添加することにより測定する。一般に、ＥＬＩＳＡ検出フォーマットが好適であるが、特別の試験フォーマットを必要とする場合には、他の免疫学的検出フォーマットを使用してもよい。図５Ｂから分かるように、アンタゴニストとして作用する阻害化合物は光吸収測定により容易に同定される。
【０１６７】
前記選抜のさらに具体的な例については下記実施例１０にて考察する。本発明のこの例示では、約２０００種の小型分子が市販品として入手可能な化学ライブラリーから選抜された。注目すべきことは、実施例１０では３０種の化合物が検出され、それらが非常に低いＩＬ−２の吸光度読み値を示したこと、すなわち、これらの化合物がＤＯ１１．１０ＴＣＲとｓｃ−ＩＡｄ／ＯＶＡタンパク質の間で形成される免疫複合体の形成および／または安定性を低下させたことである。
【０１６８】
もう一つの態様において、所望のＭＨＣ抗原分子は細胞膜と会合する。この態様において、ＭＨＣ抗原分子は提示ペプチドに共有結合したＭＨＣ成分から成り立ち得る。しかし、ＭＨＣ分子はこの方法では、提示ペプチドによる負荷が好適である態様において使用することができる。他の態様において、ＭＨＣ抗原は共有結合した、または未結合のスーパー抗原と複合体形成したＭＨＣ成分から成り立ち得る。例えば、ＭＨＣ抗原は特定のペプチドでパルスしたＡＰＣ上に存在するＭＨＣ／ペプチド複合体から成り立ち得る。適当なペプチドを調製し、それをパルスする方法はこの分野では既知である。参照文献例：Ｓｅｔｔｅ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｎａｔｕｒｅ ３２８： ３９５−３９９ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４５： ５４０−５４８。本発明のこの例では、天然のＴ細胞または組換えＴ細胞ハイブリドーマなどの所望のＴＣＲ分子を発現する適切な細胞は、ＭＨＣ抗原分子に接触させる。少なくとも一つの試験化合物を所望のフォーマットに従い選抜することができる。試験化合物は細胞をウエルに加える前、その間、またはその後と、アッセイのほとんどいずれの時点でも加えることができる。本発明のこの例示では、モニターする細胞応答はＩＬ−２の産生である。適切な試験化合物が存在しなければ、ＴＣＲとＭＨＣ抗原分子との間の特異結合が生産的となり、免疫複合体の形成に至る。かかる免疫複合体はＴ細胞の活性化とＩＬ−２サイトカインの産生の引き金となる。しかし、免疫複合体形成のアンタゴニストなどの適切な試験化合物の結合は、細胞応答を低下させ、その結果としてＴ細胞から得られるＩＬ−２産生を減少させる。試験化合物を次いで検出し、サイトカイン産生の減少を観察することにより他の化合物から選択する。
【０１６９】
下記実施例１０は、本発明のこの態様におけるより具体的な例示である。この実施例では、Ａ２０ＡＰＣ，ＯＶＡペプチドおよびＤＯ１１．１０Ｔ細胞を混合して、Ａ２０細胞上にＯＶＡペプチドとＩＡｄ分子間の複合体を形成させ、ＩＡｄ／ＯＶＡ複合体によってＤＯ１１．１０Ｔ細胞を刺激させる。この例では、ＤＯ１１．１０Ｔ細胞の刺激を以下に記載するようにＩＬ−２サイトカインの産生により測定する。試験化合物はＯＶＡパルスＡ２０：ＤＯ１１．１０Ｔ細胞混合物に添加し、免疫複合体の形成とサイトカイン産生に影響する試験化合物の能力を評価した。注目すべきことは、実施例１０では４種の化合物が検出され、それらが非常に低いＩＬ−２の吸光度読み値を示したこと、すなわち、これらの化合物がＤＯ１１．１０ＴＣＲとＩＡｄ／ＯＶＡ複合体の間で形成される免疫複合体の形成および／または安定性を低下させたことである。
【０１７０】
すでに考察したように、本発明の目的は多数の試験化合物の検出を容易にし得る高効率のスクリーニング法を提供することにある。好ましくは、試験された試験化合物は同族体ＴＣＲとＭＨＣ抗原対との間に形成される免疫複合体を特異的に調節する。
【０１７１】
この目標に従って、本発明は、例えば、細胞からのＩＬ−２産生に影響を与えることによって非特異的に細胞を変調させ得る試験化合物に対し、選択するための対策を提供する。この態様において、前記のいずれかの方法を繰り返し、検出化合物の非特異的Ｔ細胞刺激に対する影響をアッセイすることができる。
【０１７２】
例えば、非特異的Ｔ細胞刺激についての一つのアッセイ方法は、ＣＤ３などの分化クラスター（ＣＤ）タンパク質に結合し得る方法において抗体を使用することによる。すでに考察したように、ＣＤ３タンパク質は多くのＴＣＲと密接に会合すると報告されている。本発明のこの例では、該抗体はＴＣＲまたはＭＨＣ抗原分子の添加前、添加途上、または添加後にウエルに固定化することができる。固定化された抗体が存在すると、一般にＴ細胞を活性化し、刺激してＩＬ−２などのサイトカインを産生させる。このように、Ｔ細胞の抗体介在活性化を阻害する試験化合物は、ＴＣＲとＭＨＣ抗原分子との間に形成される免疫複合体を特異的に変調しないものとして設計する。このような試験化合物は場合によって興味の対象となり得るが、本発明のより好適な試験化合物は、免疫複合体の存在または非存在下に検出されるように、ＴＣＲ：ＭＨＣ抗原相互作用を特異的に調節する。
【０１７３】
再度、図５Ｂに戻ると、この特定の選抜の一態様は抗−ＣＤ３抗体をコントロールとして使用する場合を示している。すでに考察したように、ある場合には、このコントロールは、「コントロール免疫複合体」、「内部コントロール」または類似の成句で言及される。
【０１７４】
本発明の重要な目標は、要すれば、Ｔ細胞のＭＨＣ抗原依存性刺激を特異的に調節するが、ＴＣＲ／ＣＤ３などのＴＣＲ／ＣＤ複合体を介しての刺激に応答するこれら細胞の能力には全く影響しないか、または影響のすくない試験化合物を検出するために、それに適合し得る方法を提供することである。コントロール免疫複合体のより具体的な例示は下記実施例１０にて考察する。ここで、対象となる特異的試験化合物は、ＴＣＲ細胞のＭＨＣ抗原介在刺激を調節し、抗−ＣＤ３抗体が介在するＩＬ−２産生について些細な、極僅かな阻害を示す。
【０１７５】
所望により、本方法はすでに言及したＴＣＲ／ＣＤ３複合体などのコントロール免疫複合体の一つとともに、または組み合わせて使用することができる。すでに考察したように、試験化合物の存在下または非存在下でのかかるコントロール免疫複合体の分析は特定の選抜を精緻なものとする一助となり（改善が必要であるとして）、免疫複合体を特異的に調節する化合物の検出を容易にする。例えば、本発明での使用に旨く適合するもう一つのコントロール免疫複合体は、抗−ＴＣＲ抗体、通常抗−ＴＣＲモノクローナル抗体を含んでなる。この態様において、抗−ＴＣＲ抗体は、好ましくは、レセプター結合部位外のＴＣＲエピトープに特異的に結合する；すなわち、常套のタンパク質：タンパク質結合実験で測定した場合、ＴＣＲとその同族体ＭＨＣ抗原分子との間の結合を妨げない。かかるモノクローナル抗体の例はこの分野で既知である。参照文献例：Ｈａｓｋｉｎｓ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １５７： １１４９−１１６９； Ｋｕｂｏ， Ｒ．Ｔ． ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４２： ２７３６−２７４２； ａｎｄ Ｂｒｅｎｎｅｒ， Ｍ．Ｂ． ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｊ Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６０： ５４１−５５１。コントロール免疫複合体としての抗−ＴＣＲ抗体の好適な使用は下記実施例１１にて考察する。
【０１７６】
所望の試験化合物が所定のアッセイ設定において特定のＴＣＲとＭＨＣ抗原相互作用を僅かにしか変調させないようなような場合は、かかるアッセイの感度を増幅することが極めて有用である。かかる増強は常套の方法を用いて免疫応答の直接または間接の検出を上昇させることなど、異なる対策の一つ、または組み合わせにより達成することができる。あるいは、かかる感度の増強は、多価複合体としてこれらの分子を提供することによるなど、ＴＣＲおよび／またはＭＨＣ抗原分子を操作することにより達成することができる。実施例１５はこの技法の特定の例を示す。
【０１７７】
一態様において、アッセイ感度は免疫複合体からの刺激に応答する細胞の能力を増すことにより上昇させることができる。とりわけ、この分野では、Ｔ細胞表面上の特定のＣＤ分子など共刺激性レセプターとその同族体リガンド間の相互作用が、ＴＣＲ：ＭＨＣ抗原相互作用の介在する分子内シグナルの開始と増幅を促進し得るという認識がある。かくして、本発明のさらなる目的は、所望のＴＣＲまたはＭＨＣ抗原分子を発現する天然産または組換え細胞を提供することであり、当該細胞はさらに少なくとも一つの適当な共刺激性レセプター、例えば、ＣＤ２８またはＬＦＡを発現する。本発明のこの態様において、共刺激性レセプターとＴＣＲおよび／またはＭＨＣ抗原分子との同時発現は、好適なアッセイ条件下で、免疫複合体に対する細胞性応答を上昇させることができ、それによってアッセイの感度と信頼性を増幅させることができる。好適なアッセイ条件は、これらに限定されるものではないが、共刺激性レセプターに結合し得る同族体リガンドまたは抗体（またはそのフラグメント）を添加することであり、その場合、同族体リガンドまたは抗体は可溶性、固定化または細胞会合分子として添加する。
【０１７８】
アッセイ感度を増幅するもう一つの方法は免疫複合体の良好な存在を提供することである。とりわけ、この分野では、特定のＣＤタンパク質がＭＨＣ抗原分子との相互作用を容易にし得るという認識がある。かくして、本発明のさらなる目的は、所望のＴＣＲまたはＭＨＣ抗原分子を発現する天然産または組換え細胞を提供することであり、当該細胞は少なくとも一種の適切なＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ４またはＣＤ８をさらに発現する。本発明のこの態様において、ＣＤタンパク質とＴＣＲおよび／またはＭＨＣ抗原分子との同時発現は免疫複合体の形成を容易にし、それによってアッセイ感度と信頼性を増幅することができる。
【０１７９】
本方法の特定の態様において、細胞は所望のＴＣＲ分子、例えば、ｓｃ−ＴＣＲ融合分子、および細胞表面上のＣＤ４タンパク質またはそのフラグメントを発現するように設計調製する。もう一つの態様において、所望のＴＣＲ分子はｓｃ−ＴＣＲ融合分子として提供するが、当該分子は融合タンパク質の一部として、少なくともＣＤ３ζまたはその機能的フラグメントなど他のＣＤ分子の一部を包含するように設計調製する。さらにもう一つの態様において、ｓｃ−ＴＣＲ−ＣＤ３ζ構築物はＣＤ分子と、通常はＣＤ４またはＣＤ８と同時発現される。多くの場合、ＴＣＲ分子とＣＤタンパク質（類）との同時発現は、ＭＨＣ抗原分子による刺激に対しより敏感であることを可能とする。この例では、ＭＨＣ抗原分子は必要に応じて完全可溶性タンパク質として、または細胞に基づくフォーマットで提供し得る。
【０１８０】
下記実施例１２は本発明のこの態様のより具体的な例示である。ここで、ＤＯ１１．１０ＴＣＲは、組換えＣＤ４タンパク質をも細胞表面上に発現する細胞により発現されるｓｃ−ＣＤ３ζ融合タンパク質として存在する。同族体ＭＨＣ抗原分子、ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡは適切なマルチウエルプレート上に適切な抗−ＩＬ−２抗体、通常はモノクローナル抗体とともに、一般に約１２〜４８時間固定化する。当該抗体はＭＨＣ抗原分子の固定化の前に、その間に、またはそれとともに添加し得る。次いで、一本鎖ＴＣＲとＣＤ４タンパク質を同時発現する組換え細胞をウエルに加え、数時間ないし２〜３日以上培養する。該細胞によるＩＬ−２産生はすでに記載した線に沿って測定する。
【０１８１】
本方法の態様において、ＭＨＣ抗原構築物はＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡなどの免疫グロブリンフラグメント、並びにその機能的フラグメントに共有結合させ得る。要すれば、コントロールのウエルを調製し、そこでの細胞刺激を異なるＭＨＣ抗原にて測定する。この場合にも要すれば、さらなるコントロールを、実施例に具体的に記載したものも含め、上記の内部コントロールの少なくとも一つを用い実施する。本発明のこの態様において、組換え細胞の刺激を調節する試験化合物の受容能力は、該細胞が産生するサイトカイン量の対応する増減として測定する。ＭＨＣ抗原によるＴ細胞の刺激を阻害するが、抗−ＴＣＲ抗体による刺激は阻害しない試験化合物は、先導化合物として追求することができる。
【０１８２】
この方法の具体例を図６Ａに概略図として示す。ここで、採用されるＴＣＲとＭＨＣ抗原プローブは多発性硬化症（ＭＳ）に関係している；ＭＳは共通のヒト自己免疫疾患であり、重篤な軸策脱髄に至る。図６ＡはＭＳ ＴＣＲおよびＭＨＣ抗原プローブとの相互作用を調節する化合物について、試験化合物を選抜する方法の一態様を示す。Ｔ細胞は、好ましくは、ヒトＭＳ患者から得られるＴ細胞から誘導する。示したように、代わりとなる細胞（すなわち、組換えＭＳ ＴＣＲ細胞）は、本明細書に示したものなど、ＴＣＲクローニングおよび発現工程により調製する。組換えＭＳ ＴＣＲ細胞は、次いで、前記の線に沿って、マルチウエルプレート（ＭＨＣ抗原分子が結合している）に加える。この例示では、少なくとも１種の試験化合物、通常は約一種類の試験化合物を、組換えＭＳ ＴＣＲ細胞の添加前、その間、またはその後にウエルに添加する。好ましくは、この方法は高速大量処理スクリーニングフォーマットで実施する。本発明のこの例では試験化合物を、少なくとも一種の適切なコントロールとみなされるＭＳ ＴＣＲ細胞によって産生されたＩＬ−２量、例えば、試験化合物の非存在下で細胞から産生されるＩＬ−２量を、削減または除去により検出する。
【０１８３】
図６Ｂに示したように、精製したｓｃ−ＤＲ２／ＭＢＰ（ペプチドを提示する融合ＭＢＰを有する一本鎖クラスＩＩ ＭＨＣ）をマルチウエル細胞培養プレートに固定化する。適切には、該プレートは化学ライブラリーを収容するが、それぞれのウエルは、好ましくは少なくとも一種の、通常は約一種の試験化合物を収容する。次に、関連ＴＣＲを発現するＴ細胞を、ＭＳに罹患している、またはその疑いのある、または罹患する恐れのある患者から常套の手段で入手する。しかし、殆どの場合、患者は認知されたパラメータで診断した場合、ＭＳに罹患している。代わりのものとして、関連ＴＣＲを発現する組換え細胞を生成させ得る。Ｔ細胞の適量を次いで各ウエルに加え、上述の線に沿って選抜を行う。この態様において、細胞応答は化学ライブラリーからの試験化合物の存在および非存在下に測定する；この応答は既述のようにサイトカイン産生である。
【０１８４】
勿論、ＭＳ免疫複合体を調節する試験化合物の前記特異的検出方法は、対象とする他のＴＣＲおよびＭＨＣ抗原分子の選抜に容易に適合させることができる。
【０１８５】
前記スクリーニング方法のより具体的な例は、下記実施例１３に示す。本発明のこの例においては、適当なＴ細胞Ｖ−αおよびＶ−β鎖がミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）について制限された特異ヒトＭＳ Ｔ細胞株から得られる。当該鎖をエンコードする核酸は、要すればヒトＣＤ３ζ配列またはその配列の機能的フラグメントに融合することができる。得られる構築物はその結果適当な細胞および特に不死化Ｔ細胞中で発現される。このような形質導入細胞は次いですでに考察した線に沿って操作する。すなわち、不死化Ｔ細胞をマルチウエルプレートに加えるが、各ウエルは固定化または細胞発現同族体ＭＨＣ抗原、例えば、ＭＢＰペプチド−負荷ＤＲ２＋ＡＰＣを収容している。別法として、ＭＨＣ抗原分子は、本明細書および米国特許５，８６９，２７０に開示されているように、提示ペプチドをＭＨＣに共有結合させて生成させてもよい。このように、本発明の態様における検出フォーマットは、すべて細胞に基づくものである。
【０１８６】
より詳しくは、実施例１３では、ＭＳ制限ＴＣＲが細胞に基づくものであり、同族体ＭＨＣ抗原分子（ｓｃ−ＤＲ２＋／ＭＢＰ）がウエルに固定化されている検出フォーマットを提供する。本発明のこの例では、ＭＨＣ抗原タンパク質をＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡなどの受容可能な免疫グロブリン分子またはそのフラグメントに融合させることができる。ｓｃＤＲ２／ＭＢＰ分子を２〜３時間ないし１日程掛けてウエルに固定化した後、組換えＴ細胞を培地中ウエルに加え、２〜３時間ないし２〜３日培養する。各ウエルには少なくとも一種の、また多くの場合一種の試験化合物を適当な溶媒に溶かして容れる。該試験化合物はアッセイのいずれの時点で加えてもよい；例えば、Ｔ細胞の添加またはＭＨＣ抗原分子の固定化の前、その間、またはその後のいずれでもよい。しかし、試験化合物はＴ細胞とともに添加することが本発明のこの例では一般に好適である。ＭＨＣ抗原とＴＣＲ分子間の相互作用を調節する化合物の受容能力は、すでに記載したように直接または間接にモニターすることができる。また、この例では、ＩＬ−２の産生をすでに考察した線に沿って測定する。所望により、この特定方法には、試験化合物なしでの組換え細胞培養など、一つ以上のコントロールを含めることができる。さらに採用し得るコントロールは、初めに記載したこれらコントロール免疫複合体である。本方法により検出される特定の試験化合物は、有意にＴＣＲとＭＨＣ抗原分子間の相互作用を調節するが、上記の抗−ＴＣＲまたは抗−ＣＤ３抗体による刺激を調節するものではない。このアッセイ法において好適なのは、実質的なアンタゴニスト作用を示す試験化合物である。
【０１８７】
もう一つの態様において、本発明は細胞に基づくスクリーニング法を提供するが、この方法では少なくとも２種の異なる抗原特異ＴＣＲが細胞表面上で発現されるように細胞を設計する。本発明ではこの特定の例が有利となる。例えば、多くの場合、この方法は異なるＴＣＲに向け明確な作用を示す試験化合物に対し、より高感度となる。この例示におけるように、試験化合物はＴＣＲ分子の一つを変調させるが、他のものについては余り、または全く変調させないという受容能力を発揮する。
【０１８８】
本態様の例示として、不死化Ｔ細胞などの適切な細胞は、本明細書で「コントロール」または「第二」ＴＣＲ分子と称する分子とともに、所望の（第一）ＴＣＲ分子を発現するように設計調製する。かかる細胞は従ってすでに考察した線に沿って、例えば、対象のＭＨＣ抗原分子を発現するＡＰＣとともに、または固定化したＭＨＣ抗原分子とともに使用することが可能であった。ＭＨＣ抗原と第一ＴＣＲ分子との間の相互作用を調節する化合物の受容能力は、すでに記載したように直接または間接にモニターすることができる。かかる相互作用は次いで第二ＴＣＲ分子とその同族体ＭＨＣ抗原との間の特異的相互作用を調節する化合物の受容能力と比較することができる。多くの場合、すでに概説した方法に従い、細胞によるＩＬ−２の分泌など、サイトカイン産生を測定することが望ましい。対象となる特定の化合物は第一ＴＣＲとその同族体ＭＨＣ抗原との間の相互作用を調節するが、第二ＴＣＲ分子とその同族体ＭＨＣ抗原との間の調節は殆どないか、または全くないであろう。
【０１８９】
従って、本発明の目的は、必要に応じて少なくとも一つの適切な内部コントロールを含む方法を提供することにある。かくして、前記方法の一つは少なくとも以下の工程の一つを含むことができる：
１）主題のＴＣＲ分子、例えば、第一ＴＣＲ分子と、好ましくはＭＨＣ抗原分子が結合した部位以外の一つ以上のエピトープにてＴＣＲと特異的に結合し得る少なくとも一つの抗体、好ましくはモノクローナル抗体とを接触させる工程であって、該接触を試験化合物の存在下または非存在下に、またＴＣＲとコントロール免疫複合体としての抗体とが結合するのに十分な条件下で実施すること；
２）該試験化合物の存在下および非存在下にコントロール免疫複合体の存在を検出すること；および
３）ＴＣＲと抗体との間の特異的な結合を検出可能に変化（増加または減少）させない試験化合物を選択すること。
【０１９０】
もう一つの態様において、該方法は必要に応じて少なくとも以下の工程の一つを含むことができる：
１）第二ＴＣＲ分子とその同族体ＭＨＣ抗原分子とを接触させる工程であって、該接触を該試験化合物の存在下または非存在下に、また第二ＴＣＲとコントロール免疫複合体としてのＭＨＣ抗原とが結合するのに十分な条件下で実施すること；
２）該試験化合物の存在下および非存在下にコントロール免疫複合体の存在を検出すること；および
３）第二ＴＣＲとＭＨＣ抗原分子との間の特異的な結合を検出可能に変化（増加または減少）させない試験化合物を選択すること。好ましくは、当該第二ＴＣＲは、上に示した主題の（第一）ＴＣＲ分子とは異なるＭＨＣ抗原結合特異性を有する。
【０１９１】
考察したように、一つ以上の内部コントロールを含めるか否かの選択は一般に認知されたパラメータ、例えば、選抜すべき試験化合物および必要な敏感度と選択性の程度などによって導かれる。
【０１９２】
下記実施例１４は、特に内部コントロールを含めることに関して、本発明のもう一つの具体例を提供する。この実施例では、第一ＴＣＲ分子が一本鎖Ｄ０１１．１０ＴＣＲ分子であり、第二ＴＣＲ分子が内在性ＴＣＲである。この細胞の第一および第二ＴＣＲ分子を介しての刺激に対する応答性を評価するために、適当なコントロールＭＨＣ抗原分子を容れた適切なマルチウエルプレート中で細胞を培養する。例えば、適当なコントロールＭＨＣ抗原は、特定のペプチドによりパルスした適切なＡＰＣ上に存在するＭＨＣ／ペプチド複合体から成り立ち得る。適当なペプチドを調製し、パルスする方法はこの分野で既知である。参照文献例：Ｓｅｔｔｅ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｎａｔｕｒｅ ３２８： ３９５−３９９； Ｍａｒｔｉｎ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４５： ５４０−５４８。好ましくは、かかるペプチドは、ＡＰＣとの関連で提示された場合、第一ＴＣＲではなく第二ＴＣＲを優先的に刺激する。第一ＴＣＲに対する同族体ＭＨＣ抗原分子は、すでに概説したように、通常ウエルに固定化する。ＭＨＣ抗原分子は融合提示ペプチドを担持するか、または所望のペプチドを負荷したＭＨＣ成分から成り立ち得る。かかるペプチドは、好ましくは、第一ＴＣＲ分子に特異的であるが、第二ＴＣＲ分子には特異的でない。他の態様において、ＭＨＣ抗原は共有結合しているか、または未結合のスーパー抗原と複合体形成したＭＨＣ成分から成り立ち得る。かかるスーパー抗原は、好ましくは、第一ＴＣＲ分子に特異的であるが、第二ＴＣＲ分子には特異的でない。
【０１９３】
本発明のこの例では、少なくとも一つの試験化合物は、すでに考察した線に沿って、ＡＰＣの添加またはＭＨＣ抗原分子の固定化の前、その間、またはその後にウエルに添加することができる。例示のように、試験化合物はＭＨＣ抗原分子の固定化後、かつＴＣＲ分子を発現する細胞の添加前に添加することができる。好適な細胞応答はサイトカイン産生、とりわけＩＬ−２産生であるが、ある場合には本明細書で言及した他の細胞応答をモニターすることも有益である。この態様において、対象となる特定試験化合物は第一ＴＣＲとそのＭＨＣ抗原間の相互作用を調節するが、一方、第二ＴＣＲとそのＭＨＣ抗原間の相互作用はあまり変調節させないか、または全く変調させない。対象となる、より特定の試験化合物は第一ＴＣＲとその同族体ＭＨＣ抗原間の相互作用を良好に阻害するが、第二ＴＣＲとその同族体ＭＨＣ抗原間の相互作用に関しては同様の阻害作用を示さない。
【０１９４】
より具体的な態様において、本発明は、好ましくは、異なるＭＨＣ抗原により制限された少なくとも２種類のＴＣＲ分子により再構築された細胞株を利用するスクリーニング方法を包含する。本発明のこの特徴はアッセイの多様性を最小化するなど、多くの利点を提供する。
【０１９５】
下記の多くの例は、とりわけさらなる内部コントロールを包含することに関して、本発明のもう一つの具体例を提供する。例えば、内部コントロールはＴＣＲと非同族体ＭＨＣ抗原分子間、またはＭＨＣ抗原と非同族体ＴＣＲ間に形成されるコントロール複合体を含み得る。記載したように、これらのコントロール複合体はＴＣＲ（またはＭＨＣ抗原）とその非同族体対間の非特異的会合を代表し、ＴＣＲと同族体ＭＨＣ抗原分子間の特異的相互作用のレベルを評価するための陰性コントロールとして有用であり得る。例えば、実施例３、５、１１、１２、１４、１５および１６に説明した特定の態様は、ＴＣＲと非同族体ＭＨＣ抗原分子間の非特異的会合を確立するために、適当なＭＨＣ抗原分子を利用する。これら実施例の各々で、非同族体ＭＨＣ抗原はＴＣＲにより特異的に認識される同族体ペプチドとは異なるペプチドを担持するペプチド−ＭＨＣ複合体である。実施例１１、１４および１５に説明した他の態様では、ＭＨＣ抗原分子と非同族体ＴＣＲ間の非特異的会合を確立するために適当なＴＣＲを利用する。
【０１９６】
本発明の実施は、とりわけ従来の細胞に基づくスクリーニング試行に照らして特に多くの利点を提供する（参照：すなわち、ＷＯ９６／３６８８１）。例えば、本発明の方法は広範囲のＴＣＲとＭＨＣ抗原分子と完全に互換性がある。本発明のこの特徴は試験化合物を検出するための細胞およびタンパク質に基づくアッセイフォーマットのレパートリーが拡大するにつれて重要となる。従来のスクリーニング試行と対照的に、本発明方法は細胞応答を非特異的に調節する試験化合物に対して選択する数多くの内部コントロールをも提供する。すでに記載したように、一般に細胞に基づくスクリーニングアッセイでの主な制限の一つは、非特異的または間接的に測定された細胞性応答を調節する「擬陽性」化合物の検出であった。本発明を好適に使用することで、擬陽性または判断を誤らせる試験結果が実質的に減少し、ある場合には除去される。
【０１９７】
すでに考察したように、本発明の感度を増幅または上昇させる一つの方法は、多価複合体として主題のＴＣＲ分子および／またはＭＨＣ抗原分子を提供することである。この態様において、本発明は顕著な利点を提供し得る。例えば、この分野で認知されていることは、多価ＭＨＣ抗原分子がＴ細胞の応答を、単量体ＭＨＣ抗原分子よりもより大きな度合いまで、ある場合には遥かに大きな度合いまで刺激することができることである。参照例：Ａｂａｓｔａｄｏ， Ｊ． （１９９５） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８２： ４３９−４４７ ａｎｄ Ｈａｍａｄ， Ａ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．  （１９９８） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８８： １６３３−１６４０。
【０１９８】
例えば、多価ＴＣＲおよび／またはＭＨＣ抗原分子による方法の実施では、相互作用の弱いＴＣＲ：ＭＨＣ抗原分子の結合活性を望みどおりに上昇させることができる。この結果を達成する一つの方法は、少なくとも１個の「アダプター」または「タグ標識」分子を、ＴＣＲ分子、ＭＨＣ抗原分子、または両分子に共有結合させること、あるいは融合させることである。これらのアダプターまたはタグ標識は直接または間接に多価複合体の形成を促進するように働く。例示としてのアダプターまたはタグ標識は、ビオチン、ストレプトアビジン、および免疫グロブリン可変および／または定常ドメイン、例えば、ＩｇＧおよびＩｇＭ重鎖、κおよびλ鎖などの免疫グロブリン分子、またはその機能的フラグメントなどである。対象となる特定のアダプターは、もう一つの分子、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、ビオチン、ストレプトアビジン、またはモノクローナル抗体などの抗体が特異的に結合し得るものである。該抗体は必要に応じて検出可能に標識してもよいし、しなくてもよい。対象となる他のアダプターはロイシンジッパードメインなど、会合して多量体複合体を形成し得るタンパク質ドメインである。ＭＨＣ抗原とＴＣＲ分子の多価形状は、当該分子を直接または間接的に、化学的に架橋結合させることにより生成させることもできる。本発明におけるＭＨＣ抗原分子の多価形状についてのさらなる記載は米国特許出願０８／９６０，１９０に見出し得る。
【０１９９】
本発明ＴＣＲの多価形状についてのさらなる記載は米国特許出願０９／４２２，３７５（発明の名称：Ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ（多重特異的結合分子とその用途；１９９９年１０月２１日出願）に見出し得る；本出願の開示は参照としてすでに本明細書中に援用されている。
【０２００】
他のＭＨＣ抗原分子とＴＣＲ分子に関して、かかる分子の多価形状など、本発明での使用について開示する参照文献：米国特許出願０９／４２２，３７５に見出し得る。
【０２０１】
例えば、一態様において、主題のＭＨＣ抗原分子は標準的な方法により、適切なアダプターまたはタグ標識分子、例えば、ＩｇＧまたはその機能的フラグメントなどの免疫グロブリン定常ドメインに融合することができる。特定の例において、ＭＨＣ抗原分子は融合した提示ペプチドとアダプターとを含む一本鎖ＭＨＣ構築物として構成される。通常、アダプターまたはタグ標識は一本鎖構築物のＣ−末端に融合させるが、Ｎ−末端に融合させるなど、他の配列も、ある適用では示し得る。特定の多価複合体は一般に約２〜約１０単位、好ましくは約２〜５単位を有するが、多くの適用に有用なのは約４単位（すなわち、四量体）である。
【０２０２】
下記実施例３および５は、免疫複合体の形成を検出するアッセイの感度を上昇させるために多価複合体を使用する本発明のより具体的な方法を記載する。これらの実施例においては、多価ＭＨＣ抗原を生成させ、固形支持体、すなわち、すでに記載したマルチウエルプレートに固定化する。この態様において、ＭＨＣ抗原分子は提示ペプチドに共有結合するＭＨＣ成分である。しかし、エンプティＭＨＣ分子は、この方法においては提示ペプチドでの負荷が好ましい態様において使用し得る。他の態様において、ＭＨＣ抗原は、共有結合した、または未結合のスーパー抗原と複合体形成したＭＨＣ成分から成立し得る。記載したごとき多価複合体を生成させるには、異なる方法を使用することができる。実施例３では、ＭＨＣ抗原分子、ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡをＩｇＧ重鎖とκ鎖の免疫グロブリン定常ドメインに融合させた。実施例４では、ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ分子をＩｇＭ重鎖の免疫グロブリン定常ドメインに融合させた。両方の実施例においてｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ分子の多量体化は免疫グロブリン骨格を仲介とした。本発明のこの態様においては、ＤＯ１１．１０ＴＣＲを発現する細胞をウエルに加え、数時間ないし２〜３日以上培養する。細胞によるＩＬ−２産生は、前記記載の線に沿って測定する。下記実施例３および５に記載したように、アッセイ感度の有意な上昇（２ないし１０倍）が多価複合体の使用により達成される。
【０２０３】
多価ＭＨＣ抗原分子を使用する他の態様において、同族体ＴＣＲ分子を発現する細胞は、少なくとも１種の完全可溶性多価ＭＨＣ抗原分子と、一般的には一夜のインキュベーションで接触させる。試験化合物はすでに考察した線に沿って、細胞または多価ＭＨＣ抗原分子の添加前、その間、またはその後にウエルに添加することができる。引き続いて、細胞を洗浄し、多価ＭＨＣ抗原分子（今は細胞に結合）に特異的に結合し得る検出可能に標識化した抗体と接触させる。次いで、検出可能な標識が存在するか、存在しないかについて細胞を分析する。検出可能な標識の存在をＴＣＲ：ＭＨＣ抗原複合体形成の指標とする。対象となる特定試験化合物は、本明細書にて言及した１種以上のコントロールと比較して、免疫複合体の形成を調節する能力を示す化合物である。
【０２０４】
本方法のより具体的な例は下記実施例１５に記載のプレートに基づくアッセイフォーマットである。本発明のこの例示において、ＭＨＣ抗原分子はｓｃ−ＩＡｄ／ＧＤ−Ｉｇ融合タンパク質であり、細胞はＤＯ１１．１０またはＧＤ１２ＴＣＲを発現するＴ細胞ハイブリドーマである。多価ＭＨＣ抗原分子は、本方法においてビオチンで検出可能に標識した抗−Ｉｇモノクローナル抗体とのインキュベーションにより調製する。かかるビオチンはそれ自体シトクロムに結合したストレプトアビジンとさらにインキュベーションすることによりタグ標識する。本発明の特定の例において実施されるコントロールは、多価ＭＨＣ抗原とＤＯ１１．１０Ｔ細胞発現細胞との同時インキュベーションである。実施例１５で説明するように、染色した細胞のフローサイトメトリー（すなわち、ＦＡＣＳ）では、ｓｃＩＡｄ／ＧＤ−Ｉｇ分子がＧＤ１２Ｔ細胞ハイブリドーマを染色するが、ＤＯ１１．１０細胞発現細胞は染色し得ないことを示した。
【０２０５】
実施例１５に例示した発明の態様は、上記の高速大量処理アッセイまたは超高速大量処理アッセイなどの様々なスクリーニングフォーマットにおいて、また下記実施例において試験化合物を選抜するために適合させることができる。一般に、試験化合物はＧＤ１２Ｔ細胞ハイブリドーマとその同族体多価ＭＨＣ抗原分子との間の相互作用を特異的に調節する受容能力について同定し、選択する。対象となる特定の試験化合物は、細胞シグナルにおける容易に検出し得る変化（増減）を明らかに示す。この特異的アッセイ法は他のＴＣＲ：ＭＨＣ抗原対の選抜にさらに適合し、要すれば、ＤＯ１１．１０細胞はＴＣＲ：ＭＨＣ抗原相互作用を非特異的に調節する試験化合物について有用なコントロールとして採用することができる。
【０２０６】
もう一つの態様において、本発明は完全可溶性ＴＣＲおよびＭＨＣ抗原分子などの可溶性分子を利用する方法を提供する。一態様において、本発明はとりわけＴＣＲ：ＭＨＣ抗原相互作用を調節する試験化合物を検出するタンパク質に基づくスクリーニング方法を提供する。本発明のこの特徴は、一部の事例において細胞応答に対する非特異作用から生じる「擬陽性」シグナルを減少させるか、または除去するなどの重要な利点を提供し得る。一般的に、ＥＬＩＳＡ、蛍光に基づく均一アッセイフォーマットなどの方法が好適であるが、他の直接または間接的検出フォーマットも特定のスクリーニング例ではより有用であり得る。
【０２０７】
本発明のＥＬＩＳＡに基づくフォーマットの特定例において、当該選抜には３つの有用な成分を要する：１：同族体ＭＨＣ抗原分子を認識する可溶性ＴＣＲ；２：可溶性同族体ＭＨＣ抗原分子；および３：ＴＣＲとＭＨＣ抗原分子との間の特異的相互作用を遮断する阻害化合物。本アッセイではこの例のために形式を整え、ＴＣＲ（１）がマイクロタイタープレートに固定化し、次いでＭＨＣ抗原分子（２）と阻害化合物（３）を加えてＴＣＲ（１）に結合させ、次いでＭＨＣ抗原を認識して化学反応（標識＝西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ））によるか、または直接の測定（標識＝放射活性同位体または蛍光化合物）による読み取り値を与える標識抗体または他の試薬を添加することにより結合の度合いが明らかとなるようにする。
【０２０８】
例えば、一つの方法において、組換え細胞は、例えば、組換え一本鎖フォーマットにおいて可溶性の主題ＴＣＲを発現するように調製する。ｓｃ−ＴＣＲの適量を精製し、次いでマルチウエルプレートなどの固形支持体または固相に、通常２〜３時間ないし約２４時間までの時間あるいはそれ以上、固定化する。一般に、プレートの各ウエルには固定化ＴＣＲ分子を容れる。引き続き、適量の検出可能に標識したＭＨＣ抗原分子を各ウエルに加える。一態様において、検出可能な標識はＭＨＣ抗原分子の多量体化に備えて選択するが、他の態様においての標識は多量体化に備える必要はない。必要に応じて、ＭＨＣ抗原分子は融合した提示ペプチドを担持するＭＨＣ成分から成り立ち得る。あるいは、ＭＨＣ分子はエンプティであってもよく、その場合、該分子は確立された手法に従って提示ペプチドを負荷することができる。他の態様においては、ＭＨＣ抗原は共有結合した、または未結合のスーパー抗原と複合体形成したＭＨＣ成分から成り立ち得る。しかし、多量体ＭＨＣ抗原分子を使用する場合には、相互作用の弱い複合体の結合活性を増幅することが多くの場合可能である。このように、本発明のこの態様は、主題の免疫複合体について相互作用の弱いことが分かっているか、またはその疑いのある場合に好適である。
【０２０９】
この例において、試験化合物はすでに考察した線に沿って、ＴＣＲまたはＭＨＣ抗原分子の添加前、その間、またはその後にウエルに添加することができる。対象となる特定の試験化合物は所望どおりにＴＣＲ分子と多量体化または単量体化ＭＨＣ抗原分子間の特異結合を調節する。
【０２１０】
この態様の特定例は、下記実施例１６に提供する。この態様において、スクリーニング方法は２６４ＴＣＲとその同族体ＭＨＣ抗原、ｐ５３ヒト腫瘍サプレッサータンパク質のペプチド２６４〜２７２フラグメントを負荷したＨＬＡ−Ａ２クラスＩ分子との間に形成される免疫複合体を変調し得る試験化合物を検出するように設計する。
【０２１１】
この態様のもう一つの特定例は、下記実施例１７に提供する。この態様において、スクリーニング法はＭＳ患者から誘導される一本鎖ＴＣＲとその同族体ＭＨＣ抗原、ＭＢＰペプチドに共有結合した一本鎖ＨＬＡ−ＤＲ２分子との間で形成される自己免疫の免疫複合体を調節する試験化合物を検出するように設計する。
【０２１２】
このアッセイのフォーマットは多様である。例えば、ＭＨＣ抗原はプレート上に固定し、可溶性の一価または多価のＴＣＲでプローブする。あるいは、該反応は溶液中で実施するようにフォーマット化するが、そのために該試薬の一方または他方をビーズまたはデンドリマーに固定し、溶液の化学、捕捉または検出が容易となるようにする。
【０２１３】
より具体的な例示において、選抜は以下のようにフォーマット化する：ＭＨＣ抗原をプレートに付着させ、そのプレートを洗浄し、ブロックし、可溶性ＴＣＲを加えて室温で１時間インキュベートするようにする。プレートを洗浄し、酵素またはビオチン結合抗体を加え、ＴＣＲ複合体と３０分ないし１時間相互作用させる。このプレートを洗浄し、（要すれば）酵素結合アビジンで再プローブし、洗浄する。色素原酵素基質を加え、酵素が基質を発色団産物に変換させるようにする。反応を止め、プレートリーダー上、発色団産物に適した波長で吸光度を測定し、結果を集める。ＭＨＣ抗原がペプチド−ＭＨＣ複合体からなる場合、ＭＨＣ抗原に対するＴＣＲの全体としての結合活性は、ペプチドを持たないか、または無関係のペプチドをもつＭＨＣに対するＴＣＲの親和性の総計（Ｒｅｉｃｈ ａｔ ａｌ． （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８７： ６１７−６２０； 測定されたこの相互作用のＫｄは２Ｂ４ＴＣＲおよびエンプティＩＥｋに対し＞２ｍＭである）、適切なペプチドを負荷したＭＨＣに対するＴＣＲの親和性（Ｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ． ｉｂｉｄ． −Ｋｄ ｏｆ ２Ｂ４ ｆｏｒ ＩＥｋ／ＭＣＣ ｐｅｐｔｉｄｅ ＝ ５０−９０ｍＭ； Ｓｅｉｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８５： １９１９−１９２７ −Ｋｄ ｏｆ ＤＯ１１ ｆｏｒ ＩＡｄ／ＯＶＡ ｐｅｐｔｉｄｅ ＝ ３１ｍＭ）、およびオリゴマー形成により提供されるさらなる安定性（Ｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．）である。使用されるＴＣＲの原子価は全体のアッセイ条件に影響し（Ｏ’Ｈｅｒｒｉｎ Ｓ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６： １３３３−１３４５： 二価対一価のＴＣＲを使用した場合の約５０倍高い親和性を示した）、改善を必要とする変数の一つである。
【０２１４】
もう一つの態様において、アッセイは均一系アッセイとしてフォーマット化し、サンプルの移動と洗浄工程関連の問題を回避するのがよい。均一系アッセイは高速大量処理および超高速大量処理スクリーニングにとって好適である。特に好ましい均一系アッセイは免疫複合体形成について蛍光または発光プローブに依存するアッセイ法である。かかるフォーマットのより具体的な例は、これらに限定されるものではないが、光学的、蛍光もしくは発光強度に基づくアッセイ法、時間分解蛍光法、近接性に基づくエネルギー転移（蛍光共鳴エネルギー転移アッセイ、シンチレーション近接アッセイおよび発光近接アッセイを含む）、蛍光偏光分光測定法、および蛍光相関分光法などである。
【０２１５】
下記実施例１８はこの態様の特定例を提供する。この実施例において、スクリーニング法はＭＳ患者から誘導される一本鎖ＴＣＲとその同族体ＭＨＣ抗原、ＭＢＰペプチドに共有結合した一本鎖ＨＬＡ−ＤＲ２分子との間で形成される自己免疫の免疫複合体を変調させうる試験化合物を検出するように設計する。精製したＭＳｓｃ−ＴＣＲおよびｓｃ−ＤＲ２／ＭＢＰタンパク質は、供与および受容ビーズにそれぞれ固定化する。受容ビーズは固定化ＴＣＲとＭＨＣ抗原分子間の相互作用により接近したときに、化学発光シグナルを放出するように設計する。ＴＣＲ−およびＭＨＣ抗原−被覆ビーズはマイクロタイターのウエルに添加し、免疫複合体の生産的形成から生じる発光シグナルを時間分解モードで測定する。試験化合物は以前に考察した線に沿って、ＴＣＲまたはＭＨＣ抗原分子の添加前、その間、またはその後にウエルに添加することができる。対象となる特定の試験化合物は、所望どおりにＴＣＲ分子とＭＨＣ抗原分子間の特異結合を調節する。
【０２１６】
以前のスクリーニング方法は、Ｔ細胞応答を阻害または刺激する化合物を検出するのに使用していた。一つの方法では、エンプティＭＨＣ分子のペプチド結合溝に結合したときに、他のペプチド抗原を提示するＭＨＣ分子の能力を遮断し得るペプチドまたはペプチド模倣体について選抜していた（参照文献：Ｌａｍｏｎｔ Ａ．Ｇ． ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４４： ２４９３−２４９８； Ｆａｌｃｉｏｎｉ Ｆ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １７： ５６２−５６７）。すでに開示したように、この方法では機能的なＭＨＣ抗原分子の形成を遮断する化合物（すなわち、ＭＨＣアンタゴニスト）を同定した。もう一つの方法ではエンプティＭＨＣ分子のペプチド結合溝に結合したときに、ＴＣＲアンタゴニストまたはアゴニストとして作用し得るＭＨＣ−ペプチド複合体の形成に至らしめるペプチドについて選抜していた（参照文献：Ｄｅ Ｍａｇｉｓｔｒｉｓ Ｍ．Ｔ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｃｅｌｌ ６８： ６２５−６３４； Ｓｅｔｔｅ Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２： ４１３−４１３； Ｗｉｌｓｏｎ Ｄ．Ｂ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６３： ６４２４−６４３４； Ｈｉｅｍｓｔｒａ， Ｈ．Ｓ． ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２： ８０−８４； Ａｂｒａｍｓ Ｓ．Ｉ． ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２： ８５−９１）。すでに報告されているように、この方法では、ペプチド抗原および抗原模倣体（アゴニスト）またはいわゆる変更したペプチドリガンド（アンタゴニスト）としてＭＨＣとの関連で作用する化合物を同定していた。
【０２１７】
本発明は前項に記載した特定の選抜法などの上記の方法とは異なるスクリーニング法を特徴とする。例示のように、本発明は（予め形成された）同族体ペプチド−ＭＨＣ複合体など、ＴＣＲとその同族体ＭＨＣ抗原間の相互作用を調節する化合物を検出・同定する方法を特徴とする。本発明の方法はエンプティＭＨＣ分子のペプチド結合溝に結合する化合物を同定することに拘束されるものではない。かくして、本発明の方法はＴＣＲとＭＨＣ抗原分子間の相互作用を調節する広く多様な（または広範な）化合物を検出する上での便益性を提供する。さらに、本発明はＴＣＲおよび／またはＭＨＣ抗原分子と相互作用する化合物を検出する上での特別の利点を提供する。すでに教示したように、本発明方法により同定される化合物は上記の方法で同定された化合物とは異なる性質（すなわち、結合特異性、成分、薬理作用）を有すると期待される。
【０２１８】
強調されることは、上で考察した具体例にもかかわらず、本発明は完全可溶性分子、細胞に基づくフォーマット、およびその組み合わせの使用（例えば、一つの完全可溶性分子および一つの細胞発現分子）などの異なるスクリーニングフォーマットの一つまたは組み合わせの使用に対して、またＴＣＲ：ＭＨＣ抗原相互作用が役割を演じる何らかの疾患に対して極めて柔軟であり、かつ適応性に富むことである。
【０２１９】
本発明の多くの適用にとって、特異的選抜の成分は、可溶性一本鎖ＴＣＲ、遺伝的に結合したペプチドまたはスーパー抗原をもつかまたはもたない可溶性一本鎖ＭＨＣ、小型分子または他の潜在的に可能なアゴニストまたはアンタゴニスト作用因子のライブラリー、および検出可能なシグナルを生成するのに必要な他の化合物などである。アンタゴニスト化合物はＴＣＲとＭＨＣ抗原との相互作用を特異的に遮断する化合物を同定するために選抜する。ＭＨＣ抗原がペプチド−ＭＨＣ複合体である場合、スクリーニング法ではＭＨＣ分子が提示するペプチドとのＴＣＲ相互作用を遮断するアンタゴニスト化合物、並びにＭＨＣ成分または特異的ＭＨＣファミリーとの相互作用を一般的に阻害する化合物を同定する。ＭＨＣ抗原がスーパー抗原−ＭＨＣ複合体である場合、スクリーニング法ではＭＨＣ分子が結合したスーパー抗原とのＴＣＲ相互作用を遮断するアンタゴニスト化合物、並びにＭＨＣ成分との相互作用を一般的に阻害する化合物を同定する。ＭＨＣ抗原が異質反応性（異種反応性）ＭＨＣ分子である場合、スクリーニング法では異質反応性（異種反応性）ＭＨＣ成分とのＴＣＲ相互作用を遮断するアンタゴニスト化合物を同定する。
【０２２０】
この態様において、本方法はさらに利点を提供し得る。すでに考察したように、該選抜はＴＣＲとユニークペプチドを担持するＭＨＣ分子との相互作用を特異的に阻害する試験化合物または特定ＭＨＣファミリーとの相互作用を阻害する試験化合物を効率的に選抜し得る。この化合物は従って抗原提示細胞（ＭＨＣと会合するペプチドを担持）とＴ細胞（ＴＣＲ担持）との相互作用が引き金となる自己免疫疾患またはアレルギー症状を抑制するために使用し得る。これらの阻害化合物は、該疾患に対し特異的な反応を阻害するが、他の免疫応答は損なうことがなく、全体としての免疫応答を抑制する治療法をしのぐ有意な利点を提供する。
【０２２１】
もう一つの態様において、該選抜法はＴＣＲとスーパー抗原を担持するＭＨＣ分子との相互作用を特異的に阻害する試験化合物を効率的に選択し得る。この化合物は従ってＴ細胞（ＴＣＲ担持）と抗原提示細胞（ＭＨＣと会合したスーパー抗原担持）との相互作用が引き金となる疾病または疾患の症状を抑制するために使用することができる。再度、これらの阻害化合物は、疾患に特異的な反応を阻害するが、他の免疫応答は損なうことがなく、全体としての免疫応答を抑制する治療法をしのぐ有意な利点を提供する。
【０２２２】
さらにもう一つの態様において、該選抜法はＴＣＲと異質反応性（異種反応性）ＭＨＣ分子との相互作用を特異的に阻害する試験化合物を効率的に選抜することができる。この化合物は従ってＴ細胞（ＴＣＲ担持）と抗原提示細胞（異質反応性または異種反応性ＭＨＣ担持）との相互作用が引き金となる組織移植と関連する免疫応答を抑制するために使用することができる。再度、これらの阻害化合物は、疾患に特異的な反応を阻害するが、他の免疫応答は損なうことがなく、全体としての免疫応答を抑制する治療法をしのぐ有意な利点を提供する。
【０２２３】
他の態様において、アゴニスト化合物はＴＣＲとＭＨＣ抗原との相互作用を特異的に増大する化合物を同定するために選抜する。ＭＨＣ抗原がペプチド−ＭＨＣ複合体である場合、スクリーニングはＭＨＣ分子が提示するペプチドとのＴＣＲ相互作用を増大するアゴニスト化合物、並びにＭＨＣ成分または特異的ＭＨＣファミリーとの相互作用を一般的に増大する化合物を同定する。ＭＨＣ抗原がスーパー抗原−ＭＨＣ複合体である場合、スクリーニングはＭＨＣ分子が結合するスーパー抗原とのＴＣＲ相互作用を増大するアゴニスト化合物、並びにＭＨＣ成分との相互作用を一般的に増大する化合物を同定する。ＭＨＣ抗原が異質反応性ＭＨＣ分子である場合、スクリーニングは異質反応性ＭＨＣ成分とＴＣＲとの相互作用を増大するアゴニスト化合物を同定する。
【０２２４】
この態様において、本方法はさらなる利点を提供し得る。考察したように、該選抜はＴＣＲとユニークペプチドを担持するＭＨＣ分子との相互作用を特異的に増大する試験化合物または特定ＭＨＣファミリーとの相互作用を増大する試験化合物を効率的に選抜し得る。この化合物は従って抗原提示細胞（ＭＨＣと会合するペプチドを担持）とＴ細胞（ＴＣＲ担持）との相互作用が引き金となる免疫応答を刺激するために使用し得る。かかる化合物は感染性作用因子および癌の治療に有用である。これらのアゴニスト化合物は該疾患に特異的な免疫反応を刺激するユニークな方法を提供することにより、有意な利点を提供する。これらの化合物はワクチンなど伝統的な免疫刺激療法と関連して有用である。
【０２２５】
他の態様において、該アゴニスト化合物は自己免疫疾患およびアレルギーなどの免疫異常の治療に有用である。かかる化合物の使用は有害な免疫応答をダウンレギュレーションまたは抑制し得る免疫応答の免疫変更または誘導に導き得る。
【０２２６】
すでに考察したように、ＴＣＲは、例えば、アッセイの条件に左右される可溶性分子の幾つかの形状の一つであり得る。前掲の考察と以下の例示は、これら可溶性ＴＣＲ分子の多くを提供する。例えば、当該分子は３つのドメインをもつ一本鎖形状（ｓｃＴＣＲ）として発現される；すなわち、アルファ可変ドメイン（Ｖα）はベータ可変ドメイン（Ｖβ）とベータ定常ドメイン（Ｖβ）とに、２０個のアミノ酸グリシン−セリン・リンカー（［Ｇ４Ｓ］４）を介して融合している。その単量体形状において、ＴＣＲは可溶性一本鎖として、またはカッパ定常領域に融合して発現され得る。ＴＣＲの多量体複合体は多くの方法により、例えば、Ｉｇ定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）に遺伝的に融合させ二量体を産生すること、細胞においてｓｃＴＣＲ−ＩｇＧカッパ鎖とｓｃＴＣＲ−ＩｇＧ重鎖を同時発現して四量体複合体を産生すること、並びに本明細書に記載の他の方法などにより調製し得る。
【０２２７】
該スクリーニング法は他のＴＣＲ分子にも適合し得る。例えば、高次多量体はＩｇＧをＩｇＡまたはＩｇＭに変換することにより調製し得る。機能的多量体もまたｓｃＴＣＲを化学的に架橋し、デンドリマーなどの可溶性固形支持体の形状とすることができる。多量体ＴＣＲ分子の形状と他の用途に関する記載は別に特許出願の予定である。米国特許出願０９／４２２，３７５も参照。ＴＣＲ分子の別の形状はコレセプターＣＤ４またはＣＤ８のＭＨＣ結合領域を含むようにも産生し得る。
【０２２８】
当該選抜に採用されるＭＨＣ抗原分子は遺伝的に繋いだ（提示）ペプチドを含んでいてもよく、アッセイの条件次第で可溶性分子の幾つかの形状の一つであってもよい。この特定のＭＨＣ抗原分子の可溶性形状についての記載は、例えば、米国特許出願０８／５９６，３８７および米国特許出願０８／９６０，１９０に見出し得る。ＭＨＣ抗原の多量体形状は、ＴＣＲについて記載したのと同様、要すればアッセイのために産生させてもよい。
【０２２９】
考察したように、本スクリーニング方法は、例えば、主題のＴＣＲ／ＭＨＣ抗原分子および所望の結果により、異なる試験化合物を検出し、同定、選択するように調整することができる。
【０２３０】
例えば、特定の免疫複合体のアンタゴニストとして挙動する試験化合物を検出することが多くの場合好ましい。この態様において、採用される特定の試験方法では、ここで提供される適当なコントロールの少なくとも一つに比較して、主題の免疫複合体の形成および／または安定性が少なくとも約１０％低下して示される。
【０２３１】
さらに好適な試験化合物は、もし該試験方法において、ここで提供される適当なコントロールの少なくとも一つに比較して、免疫複合体の形成および／または安定性が少なくとも約１０％上昇して示されるならば、該免疫複合体のアゴニストであり得るとみなす。
【０２３２】
より具体的に好適な試験化合物は、主題の免疫複合体の形成を阻害または除去し得る。さらに好適な試験化合物は免疫複合体の親和性定数［ＫＡ］を増加または低下させ得る。
【０２３３】
親和性定数を測定する方法はこの分野で既知であり、通常の熱力学的測定値である。参照文献例：Ａｌａｍ， ＳＭ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０： ２２７−２３７。より具体的には、仮に［ＴＣＲ］を未結合ＴＣＲ分子のモル濃度とし、［ＭＨＣ抗原］を未結合ＭＨＣ抗原分子のモル濃度とし、かつ［ＴＣＲ／ＭＨＣ抗原］を免疫複合体のモル濃度するなら、ＫＡはほぼ平衡状態での免疫複合体量を測定することにより容易に決定することができる。アンタゴニストとしての試験化合物の検出を示す態様において、かかる化合物は、好ましくは、試験化合物の存在しない場合のＫＡなど、ここで準備した適当なコントロールの少なくとも一つに比較して、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約７５％ないし１００％の親和性定数の低下を示す。
【０２３４】
しかし、主題の免疫複合体のアゴニストについて選抜するために検出方法を最適化する他の態様においては、好適な試験化合物はコントロールに比較して、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約７５％ないし１００％から５００％ないし約１０００％までの親和性定数ＫＡの上昇を示す。
【０２３５】
さらに好適な試験化合物は免疫複合体の形成速度を加速または減速させると思われる化合物である。
【０２３６】
免疫複合体の形成速度は通常の熱力学的方法により確認することができる。参照文献例：Ａｌａｍ， ＳＭ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０： ２２７−２３７。とりわけ、免疫複合体の形成速度［ｋ１］および解離速度［ｋ−１］はかかる方法と関連の技法を用いて容易に確認することができる。一般に、形成速度と解離速度を決めるためには、特定のＴＣＲとＭＨＣ抗原分子との間の主題の免疫複合体の形成を、試験化合物の存在および非存在下に、経時的（例えば、２〜３秒ないし数分以上まで）にモニターする。当該試験化合物がアンタゴニストであると思われる態様において、かかる化合物は、好ましくは、ここで考察した適当なコントロールの少なくとも一つ、例えば、試験化合物が存在しない場合の免疫複合体の形成速度に比較して、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約７５％ないし１００％の免疫複合体形成速度［ｋ１］の低下を示す。
【０２３７】
あるいは、試験化合物が免疫複合体を不安定化し、かつ解離速度を上昇させると思われる態様において、かかる化合物は、好ましくは、コントロールに比較して、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約７５％ないし１００％から５００％ないし約１０００％までの解離速度［ｋ−１］の上昇を示す。
【０２３８】
試験化合物が免疫複合体の解離速度を上昇させるこれらの態様において、試験化合物は場合によりＴＣＲ／ＭＨＣ抗原の相互作用を不安定化するか、および／または免疫複合体を不安定化するとここで言及することができる。
【０２３９】
さらに好適な試験化合物は免疫複合体の結合活性を調節する受容能力を示す化合物である。結合活性は要すれば以下に記載する方法など、免疫学的技法の一つまたは組み合わせにより観察し、定量化することができる。特定の試験化合物がＴＣＲとＭＨＣ抗原分子の結合活性を低下させる態様において、かかる化合物は、好ましくは、ここで提供した適当なコントロールの少なくとも一つ、例えば、試験化合物が存在しない場合の結合活性などと比較して、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約７５％ないし１００％の結合活性の低下を示す。しかし、試験化合物がアゴニストであると思われるもう一つの態様において、かかる化合物は、好ましくは、コントロールに比較して、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約７５％ないし１００％から５００％ないし１０００％までの結合活性の増大を示す。
【０２４０】
さらに好ましい試験化合物は免疫複合体の多量体化を調節する受容能力を示す化合物である。多量体化は技法の一つまたは組み合わせにより観察し、定量化することができる。参照文献例：Ａｌａｍ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０： ２２７−２３７； Ｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８７： ６１７−６２０。特定の試験化合物はＴＣＲとＭＨＣ抗原分子の多量体化を減ずる態様においては、かかる化合物は、好ましくは、ここで提供した適当なコントロールの少なくとも一つ、例えば、試験化合物が存在しない場合のかかる多量体化と比較して、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約７５％ないし１００％の結合活性の低下を示す。しかし、試験化合物がアゴニストであると思われるもう一つの態様において、かかる化合物は、好ましくは、コントロールに比較して、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約７５％ないし１００％から５００％ないし約１０００％までの多量体化の増大を示す。
【０２４１】
さらに好ましい試験化合物は、少なくとも一つの細胞応答、典型的にはＴ細胞またはＴ細胞ハイブリドーマの応答を調節する化合物、すなわち、適当なコントロールに比較して約１．５ないし約１００倍増減させる化合物である。ここに開示した方法の特定態様において、好適な応答はサイトカインの産生、特にＩＬ−２サイトカインの産生である。
【０２４２】
本発明のさらに適当な試験化合物は、好ましくは、コントロール免疫複合体の形成を調節する能力が無視しうるものである。一態様において、かかるコントロール免疫複合体はＴＣＲ分子およびＴＣＲ分子上のエピトープに特異的に結合する抗体であって、ペプチド結合ＭＨＣ分子などの特定のＭＨＣ抗原分子が特異的に結合していないもの（抗−ＴＣＲ抗体）である。あるいは、コントロールの免疫複合体は、例えば、細胞膜中でＴＣＲと会合した少なくとも一種の分化クラスター（ＣＤ）タンパク質である。好ましくは、ＣＤタンパク質はＣＤ３であり、抗体はＴＣＲ分子と会合したＣＤ３に特異的に結合し得るものである（抗−ＣＤ３抗体）。
【０２４３】
考察したように、本発明の目的は本方法により検出される試験化合物の少なくとも一つを含む有用な医薬組成物を提供することである。かかる組成物は数種のいずれかの方法で被験者に投与することができる。例えば、所定の試験化合物または組み合わせた試験化合物は、標的とする免疫症状の発症を予防するか、またはその重篤度を緩和するために予防薬として投与することができる。あるいは、かかる試験化合物または医薬組成物は、標的とする症状の進行前、その間、またはその後に投与することができる。
【０２４４】
本発明の医薬化合物は場合により治療化合物とも呼称するが、被験者に対し、単独で、または１種以上の治療薬との組み合わせで、通常の添加剤、すなわち、医薬的に許容し得る有機または無機の担体物質であって、活性化合物と有害な反応をせず、またその受容者に有害とならない、非経口、経腸または鼻腔内投与に適したものと混合した医薬組成物として投与することができる。適当な医薬的に許容し得る担体とは、これらに限定されるものではないが、水、塩溶液、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、芳香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、石油エーテル脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどである。医薬製剤は無菌化可能であり、要すれば、補助薬、例えば、滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、懸濁剤、浸透圧に影響する塩、緩衝剤、着色剤、風味剤および／または芳香物質など、活性化合物と有害に反応しないものと混合することができる。
【０２４５】
かかる組成物は、非経口投与用には、特に液状の溶液または懸濁液の形状で、経口投与用には、特に錠剤またはカプセル剤の形状で、鼻腔内用には、特に粉末、鼻腔滴剤、またはエアゾールの形状で、膣用、局所用には、例えば、クリームの形状で、直腸用には、例えば、座剤などとして調製することができる。
【０２４６】
医薬製剤は単位投与量の形状で簡便に投与することが可能であり、製剤技術上周知の方法で調製し得る；記載文献例：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（レミントンの薬学）（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ． Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９８０）。非経口用の製剤は一般的な添加剤、例えば、無菌水または生理塩溶液、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物起源の油、水素化ナフタレンなどを含んでもよい。とりわけ、生体適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーなどが本発明の方法により同定された特定試験化合物の放出制御のために有用な添加剤である。
【０２４７】
他の潜在的に有用な非経口送達システムはエチレン−ビニル酢酸コポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能注入システム、およびリポソームなどである。吸入投与用製剤は添加剤として、例えば、ラクトースを含んでいてもよく、または例えば、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリコール酸塩およびデオキシコール酸塩を含む水溶液であっても、あるいは鼻腔滴剤の形状で投与するための油溶液であってもよいし、または鼻腔内に適用するゲル剤としてもよい。非経口用製剤は口腔内投与用のグリコール酸塩、直腸投与用のメトキシサリチル酸塩、または膣投与用クエン酸であってもよい。他の送達システムでは身体の対象部位に直接治療剤を投与する。
【０２４８】
本発明の医薬組成物は現在の治療方法に唯一の活性医薬製剤として採用することが可能であり、あるいは免疫調整作用の認められた既知薬剤を含む他の活性成分と組み合わせて使用することもできる。かかる薬剤の例は、これらに限定されるものではないが、サイクロスポリン、ある種の細胞毒性薬剤、リンパ球免疫グロブリン、副腎皮質ステロイド、スルファサラジン、ＦＫ−５０６、メトキサレン、ラパマイシン、およびサリドマイドなどである。これらの薬剤および他の有用な薬剤に関係する開示についての参照文献例：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ （８ｔｈ ｅｄ．） Ｇｉｌｍａｎ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．） ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ， ｐｐ． １２６４−１２７６ （１９９３）。
【０２４９】
治療用組成物における一種以上の治療化合物の濃度は、多くの因子、例えば、投与すべき特定製剤の投与用量、採用する組成物の化学的特性（例えば、疎水性）、および意図する投与様式と経路などにより変化する。一般的に言って、一種以上の検出された試験化合物は、約０．１ないし１０％ｗ／ｖの非経口投与用化合物を含む水性生理的緩衝液として提供し得る。
【０２５０】
所定の治療法にて使用される活性化合物の実際の好適な量が、例えば、利用される具体的な化合物、製剤化される特定の組成物、投与様式および被験者の特徴、例えば、被験者の人種、性別、体重、全身の健康状態、年齢などによって変わるということは認識しなければならない。所定の投与プロトコールについての最適投与率は、当業者が前記のガイドラインに照らして実施する通常の投与用量決定試験に従い、容易に確認することができる。適当な用量範囲は体重１ｋｇ当たり１日量、約１μｇないし約１００ｍｇである。
【０２５１】
本発明の治療用化合物は、プロトン化された水溶性形状で、例えば、医薬的に許容し得る塩、代表的には無機酸付加塩などの酸付加塩、例えば、塩酸塩、硫酸塩、またはリン酸塩、あるいは有機酸付加塩、例えば、酢酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、酒石酸塩、またはクエン酸塩などの形状で適切に投与される。本発明の治療用化合物の医薬的に許容し得る塩は、金属塩、とりわけナトリウム塩またはカリウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩またはカルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩またはテトラメチルアンモニウム塩などのアンモニウム塩、またはリジン、グリシンまたはフェニルアラニン塩などのアミノ酸付加塩などでもよい。
【０２５２】
本発明の多くの適用にとって、特に完全可溶性分子を使用する態様においては、実質的に純粋なＴＣＲとＭＨＣ抗原分子を使用することが役に立つ。好ましくは、かかる分子は本来それを伴う細胞代替物から単離されており、結果として融合タンパク質は少なくとも９０〜９５％の相同性（ｗ／ｗ）で存在する。少なくとも９８〜９９％の相同性（ｗ／ｗ）を有する組換え融合タンパク質を含むＴＣＲとＭＨＣ抗原分子は、本発明の多くの適用、例えば、医薬、臨床および研究用途などに最も好適である。一旦、実質的に精製される限り、該分子はかかる適用のために実質的に汚染物質を含まないはずである。一旦、部分的にまたは実質的純度まで精製される限り、該分子は治療的に、または本明細書に開示したインビトロまたはインビボのアッセイを実施する際に使用することができる。実質的な純度は、クロマトグラフィーおよびゲル電気泳動などの様々な標準的技法により決定することができる。これら標準的方法の多くに関して考察する一般的文献：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング：実験室マニュアル）（２ｄ ｅｄ． １９８９）； ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９８９）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における最新のプロトコール）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；これらの開示を本明細書中に参考として援用する。
【０２５３】
すでに考察したように、ＴＣＲとＭＨＣ抗原分子は既知の技法を適切に組み合わせることにより分取・精製することができる。これらの方法は、例えば、塩沈殿および溶媒沈殿などの溶解性を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの分子量の差を利用する方法、イオン交換カラムクロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティクロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、および等電点電気泳動、Ｎｉ−ＮＴＡなどの金属アフィニティカラムなどの等電点ｐＨの差を利用する方法などである。これらの方法に関する開示は、上記一般的文献：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．
【０２５４】
「完全可溶性」または同様の用語は、主題のＴＣＲまたはＭＨＣ抗原分子が低Ｇ力遠心分離（例えば、標準の遠心分離において約３０，０００回転／分未満）の下で、水性緩衝液、例えば、細胞培地から容易には沈降しないことを意味する。さらに、融合分子は約５〜３７℃以上の温度で、かつアニオン性または非イオン性界面活性剤が低濃度で存在するか、存在しない条件下、ｐＨ中性又はその近辺で水溶液のままであるならば可溶性である。これらの条件下、可溶性タンパク質は多くの場合低沈降値を有し、例えば、約１０〜５０スベドベリ単位未満である。
【０２５５】
本明細書にて使用される場合、ＴＣＲ分子に関連して使用される用語「フラグメント」または「機能的フラグメント」は、かかる分子の一部であって（ヘテロ二量体または本質的に完全長のＶ鎖を含んでなる一本鎖構築物）、対応する完全長の分子と比較した場合、特定ＭＨＣ抗原分子の少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９５％から１００％以上までに特異的に結合し得る分子を意味する。例示のように、完全長ｓｃ−ＴＣＲとは完全長Ｖ−αおよびＶ−β鎖をもつ分子と定義される。同様に、完全長ＴＣＲヘテロ二量体は完全長α鎖およびβ鎖を有する分子、特に対応する膜貫通細胞質ドメインをもつ分子と定義される。
【０２５６】
本明細書に開示されるＭＨＣ抗原分子に関連して使用される場合、用語「フラグメント」または「機能的フラグメント」は、かかる分子の一部であって（ヘテロ二量体または本質的に完全長の鎖を含んでなる一本鎖構築物）、対応する完全長の分子と比較した場合、特定ＴＣＲ分子の少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９５％から１００％以上までに特異的に結合し得る分子を意味する。例示のように、完全長ｓｃ−ＭＨＣとは完全長αおよびβ鎖をもつ分子と定義される。同様に、完全長ＭＨＣまたはＨＬＡヘテロ二量体は、完全長α鎖およびβ鎖を有する分子、特に対応する膜貫通細胞質ドメインをもつ分子と定義される。
【０２５７】
特定のＣＤ３ζ配列と関連して使用される場合、用語「フラグメント」または「機能的フラグメント」は、本発明の細胞性応答を誘発し得る完全長配列の一部を意味する。好適なフラグメントは、対応する完全長の分子と比較した場合、特定細胞性応答の少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９５％から１００％以上までを結合し得るフラグメントである。
【０２５８】
開示したフラグメントまたは機能的フラグメントの特異的結合を検出するアッセイ法について本明細書にて考察するが、そのアッセイ法の具体例はフローサイトメトリーとＢＩＡコアアッセイである。
【０２５９】
実施例１：一価一本鎖ＭＨＣ／ペプチド複合体の生成
Ａ．特異提示ペプチドを有する可溶性一本鎖ＩＥｋＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するベクターの構築
これらの研究の目標は、ＭＨＣ／ペプチド複合体などのＭＨＣ抗原分子とＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）間の相互作用のアゴニストおよびアンタゴニストを検出するスクリーニング法の開発にあった。以前に証明されているように、ＭＨＣクラスＩＩ／ペプチド複合体は、ＴＣＲとの相互作用能力を保持してＴ細胞応答を刺激する組換え一本鎖分子として生成させることができる（Ｒｈｏｄｅ ｅｔ ａｌ． １９９６． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７： ４８８５； ＷＯ９９／２１５７２；ＵＳＳＮ０９／２０４，９７９）。一本鎖（ｓｃ）マウスＩＡｄ／ペプチドとヒトＨＬＡ−ＤＲ２／ペプチド複合体の生成はすでに記載されている（ＷＯ９９／２１５７２；ＵＳＳＮ０９／２０４，９７９）。ｓｃ−クラスＩＩ分子はβ１−β２フラグメントとα１−α２フラグメントとの間の柔軟なペプチドリンカーを介する融合体から成り立つ。さらに、抗原性ペプチド配列はペプチドリンカーを介してβ１ドメインのアミノ末端に結合していた。例えば、ニワトリのオボアルブミン・ペプチドＯＶＡ３２３−３３９（ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ）またはＨＳＶ−１糖タンパク質ＤペプチドＧＤ２４６−２６１（ＡＰＹＴＳＴＬＬＰＰＥＬＳＥＴＰ）をエンコードする配列を、ｓｃＩＡｄ遺伝子融合体のβ１遺伝子フラグメントに結合し、ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡおよびｓｃＩＡｄ／ＧＤ分子をそれぞれ創生した。抗原性ペプチドは適切に折りたたまれたα１とβ１ドメインにより形成されるペプチド結合溝に結合し得るように配置した。これらの分子はインビトロでＴ細胞応答を特異的に刺激し得ることを示した。例えば、ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡタンパク質は、組織培養プレート上に固定化した場合、ＤＯ１１．１０Ｔ細胞ハイブリドーマからのＩＬ−２放出を刺激し得たが、一方、ｓｃＩＡｄ／ＧＤタンパク質はＧＤ１２Ｔ細胞ハイブリドーマからのＩＬ−２放出を刺激した（Ｒｈｏｄｅ ｅｔ ａｌ． １９９６． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７： ４８８５）。下記例に記載したように、これらのＴ細胞アッセイはＴ細胞応答を刺激するｓｃ−ＭＨＣ／ペプチド分子の能力を阻害する化合物を同定するように改変した。これらインヒビターのＭＨＣ特異性のためのコントロールとして、異なるマウスｓｃ−クラスＩＩ／ペプチド複合体を用いる、特異的な刺激を関与させるＴ細胞アッセイ法を開発した。このマウスｓｃ−クラスＩＩ／ペプチド分子の生成はＰＣＣ８８−１０４に結合した一本鎖ＩＥｋ（ｓｃＩＥｋ／ＰＣＣ）であり、以下のように記載する。
【０２６０】
ｓｃＩＥｋ／ＰＣＣ構築物に使用するＭＨＣクラスＩＩ遺伝子は、適切なＡＰＣ、ＣＨ１２細胞から生成するｃＤＮＡのＰＣＲ増幅により単離した。ＩＥｋαおよびβ鎖の遺伝子フラグメントの改変版は、鋳型ＤＮＡとしてクローン化遺伝子を用い、ＰＣＲ増幅により生成させた。これらのフラグメントは図面の説明の項の図７Ａ〜Ｃに示したクローニング図式のように組み立て、一本鎖ＩＥｋ分子に結合した抗原ペプチドＰＣＣ８８−１０４をエンコードするキメラ遺伝子とする。
【０２６１】
個々のαおよびβ鎖フラグメントを含む種々の遺伝子構築物の開発について、以下の項に記載する。α１−α２遺伝子フラグメント第一鎖ｃＤＮＡは、プライマーＶＷ４８７（４７０）およびＶＷ４８９（４７７）を用いてＰＣＲ増幅のための鋳型として役立つ。クローニングに使用するオリゴヌクレオチドの配列を表１に示す。このフラグメントはＶＷ４８７（４７０）とＶＷ４８５（４７１）により再増幅することにより３′側にて伸張し、結果としてアミノ酸配列ＭＳＧＧＧＧＣが続くＩＡｄ膜貫通「ヒンジ」領域で終結するαフラグメントに至る。このフラグメントはｐＧＥＭ Ｔイージイ（Ｅａｓｙ）（クロンテック（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、パロアルト、カリフォルニア）にクローン化し、プラスミドｐＴＶＷ４０６とする。引き続き、このα鎖挿入物をプライマーＶＷ４８７（４７０）およびＶＷ４９０により増幅し、３′側にインビトロ・ビオチニル化のための「ｂｉｒＡ」部位を含む、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩが両側を接するフラグメントを得た。このフラグメントはｐＧＥＭ Ｔ−イージイにクローン化し、プラスミドｐＴＶＷ４２０−８を得た。Ｃ−末端およびＢｉｒＡ末端フラグメントは共に５′側にＸｈｏＩ制限部位を、また３′側にＥｃｏＲＩ制限部位を含む。β１−β２遺伝子フラグメント第一鎖ｃＤＮＡはプライマーＶＷ４８６（４６９）およびＶＷ４８８（４７２）を用い、ＰＣＲ増幅用の鋳型として役立つ。このフラグメントは５′側でＶＷ４８４（４６８）およびＶＷ４８６（４６９）での再増幅により伸張させ、ＬＳＳＡＳで始まるβ−フラグメントに至るが、この場合、ＬＳに対するコドンはＡｆｌＩＩ制限部位を表し、ＡＳに対するコドンはＮｈｅＩ制限部位を表す。このフラグメントをｐＧＥＭ Ｔイージイ（Ｅａｓｙ）（クロンテック（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、パロアルト、カリフォルニア）にクローン化し、プラスミドｐＴＶＷ４０７−１および−３とする。得られた構築物は成熟β鎖の最初のアミノ酸に先行して１３個のアミノ酸を有していた（ＬＳ（ＡｆｌＩＩ）Ｓ ＡＳ（ＮｈｅＩ）ＧＧＧＧＳＧＧＧ）。ＰＣＣペプチド（ＫＡＥＲＡＤＬＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ）をエンコードし、ＡｆｌＩＩおよびＮｈｅＩによる消化により残された部分に適合する付着末端をぶら下げたオリゴヌクレオチドプライマーＶＷ４８２（４６６）およびＶＷ４８３（４６７）を、予めＡｆｌＩＩ＋ＮｈｅＩで消化したｐＴＶＷ４０７−３にアニールし、クローン化してプラスミドｐＴＶＷ４１０−３５とした。
【０２６２】
ｓｃＩＥｋの構築に関する記載は以下のとおりである。ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ融合遺伝子を含むｐＧＥＭ Ｔイージイベクターを構築し、ｓｃＩＥｋ遺伝子のクローニング鋳型として使用した。ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ融合遺伝子を含むプラスミドＳＳＣ１（ＷＯ９９／２１５７２およびＵＳＳＮ０９／２０４，９７９参照）からのＮｃｏＩからＥｃｏＲＩのフラグメントを、同じ制限酵素で切断したｐＧＥＭ Ｔイージイに基づくベクター（ｐＴＶＷ４０６）に導入した。ここに得られるクローニング鋳型（ｐＴＶＷ４０８）は、β鎖リーダー配列、制限部位ＡｆｌＩＩ＋ＳｐｅＩにより隣接させた結合ペプチドを有するβ鎖、２０個のアミノ酸リンカー配列（Ｇ４Ｓ）４、および制限部位ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩが隣接したα鎖を含む。ｐＶＷ４０６−２から誘導されるカルボキシル末端Ｃを有するアルファ鎖配列は、制限フラグメントとしてｐＴＶＷ４０８に導入し、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩにより結合し、ＩＡｄβ鎖およびＩＥｋα鎖を含むベクター４０６＋４０８を得た。結合したＰＣＣペプチドまたは単一セリンを含むＩＥｋβ鎖フラグメント（ｐＴＶＷ４０７−３および４１０−３５からそれぞれ誘導）を、ＡｆｌＩＩおよびＳｐｅＩによる消化後のこのプラスミドの主鎖にクローン化し、それぞれプラスミドｐＴＶＷ４１７−６およびｐＴＶＷ４１６−６とした。これら構築物のβ鎖はアミノ酸３８がアスパラギン（Ｎ）からセリン（Ｓ）に換わった突然変異を含んでいた。これはｐＴＶＷ４１７−６とｐＴＶＷ４１６−６のＨｉｎｄＩＩＩからＳｐｅＩまでのフラグメントをｐＴＶＷ４０７−１（是正したβ鎖配列を含有）からの一つと置き換えることにより是正し、プラスミドｐＴＶＷ４２２−１（ＰＣＣペプチド含有）およびｐＴＶＷ４２３−２（セリン含有）とした。得られたｓｃＩＥｋ遺伝子融合物をＡｆｌＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとしてプラスミドＳＳＣ１にクローン化して戻し、プラスミドｐＴＶＷ４２４−１（ＰＣＣ）およびｐＴＶＷ４２５−２（Ｓ）とした。これは効率的な翻訳のために重要な配列を取り込ませるために実施した（すなわち、コザック配列）。ｂｉｒＡ部位をエンコードする配列は、ＸｈｏＩからＥｃｏＲＩのフラグメントをｐＴＶＷ４２０−８からｐＴＶＷ４２３−２へクローニングすることにより一本鎖構築物に付加し、プラスミドｐＴＶＷ４２７−３とした。
【０２６３】
ｓｃＩＥｋ遺伝子を含む昆虫細胞発現ベクターをプラスミドｐＢｌｕＢａｃ４．５（インビトロゲン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ））に組み込み、βとα鎖の以下の組み合わせのそれぞれをエンコードさせた；αに結合し、カルボキシル末端システインをもつＰＣＣペプチドが先行するβ（ＰＣＣ／Ｃ）；αに結合し、カルボキシル末端システインをもつセリン（「ブランク」形状）が先行するβ（Ｓ／Ｃ）；αに結合し、カルボキシル末端ｂｉｒＡ配列をもつＰＣＣペプチドが先行するβ（ＰＣＣ／ｂｉｒＡ）；およびαに結合し、カルボキシル末端ｂｉｒＡをもつセリン（「ブランク」形状）が先行するβ（Ｓ／ｂｉｒＡ）。該ベクターのＰＣＣ／ＣおよびＳ／Ｃ形状はＸｍａＩからＥｃｏＲＩのフラグメントをそれぞれｐＴＶＷ４２４−１およびｐＴＶＷ４２５−２から同じ酵素で切断したｐＢｌｕｅＢａｃ４．５にクローニングすることで構築し、それぞれプラスミドｐＴＶＷ４２９−２およびｐＴＶＷ４２８−１とした。これらベクターのｂｉｒＡ形状はＳｐｅＩからＥｃｏＲＩまでのフラグメントをｐＴＶＷ４２７−３からｐＴＶＷ４２９−２およびｐＴＶＷ４２８−１へとクローニングし、ｐＴＶＷ４３１−１（ＰＣＣ／ｂｉｒＡ）およびｐＴＶＷ４３０−１（Ｓ／ｂｉｒＡ）を得た。
【０２６４】
【表１】
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【０２６５】
Ｂ．昆虫細胞における可溶性ｓｃＩＥｋ／ＰＣＣ分子の産生
精製したプラスミドｐＴＶＷ４２９−２、ｐＴＶＷ４３０−１およびｐＴＶＷ４０１−１を用い、Ｂａｃ−Ｎ−ＢｌｕｅＤＮＡ（インビトロゲン）を同時形質導入し、組換えウイルスを単離して、インビトロゲンのＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅとランスフェクションキット・マニュアル（バージョンＦ）の記載どおりに濃厚化した。ＳＦ９細胞を全工程で使用した。
【０２６６】
プレートまたは生産フラスコからの上清サンプルについて、ＥＬＩＳＡにより組換え産物（ｓｃＩＥｋ）が存在するかどうか試験した。ＥＬＩＳＡはヌンク・マキシソープ（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ）プレートのウエルに１００ｎｇの１４−４−４Ｓ（ファーミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ））抗−ＩＥｋ抗体を１００μｌのＰＢＳ（リン酸緩衝塩溶液）中、４℃で一夜、被覆したもので行った。ブロッキングは２００μｌの１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）ＰＢＳにより少なくとも１時間３７℃で行い、プレートは洗浄用バッファー（トリス緩衝塩溶液（ＴＢＳ）−０．１％トゥイーン２０）で３回洗浄した。サンプルを１００μｌ／ウエル加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを次いで２００μｌの洗浄バッファーで４回洗い、５０ｎｇのビオチニル化抗体１７−７−３（ファーミンゲン）を１００μｌの１０％ＦＢＳ−ＰＢＳ液として加え、室温で１時間インキュベーションした。プレートを洗浄バッファーで５回洗い、１００μｌの１００ｎｇ／ｍｌニュウトラアビジン（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ）西洋わさびペルオキシダーゼ接合体（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ））を加えた。室温で１時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄バッファーで５回洗浄し、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）試薬（バイオＦＸラボラトリーズ）１００μｌをウエルごとに加えた。１００μｌの０．１８Ｍ−Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を止め、４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。
【０２６７】
同時形質導入混合物をインビトロゲンのマニュアル概説どおりに個々のプラークに塗布した。分離したブループラークを用い、ウイルス保存液として使用するために小規模プレート溶菌液を調製し、上記のＥＬＩＳＡによりＩＥｋ反応性について試験した。ｐＴＶＷ４３１−１（ＰＣＣ／ｂｉｒＡ）での同時形質導入から得られた５つのプラークからの上清についてのＡ４５０値の例を表２に示す。シグナルの特異性はＳＦ９細胞により培養上清中に分泌されたｓｃＩＥｋ／ＰＣＣによるものである。
【０２６８】
【表２】
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【０２６９】
高タイターウイルス保存液を小規模プレート溶菌液から調製し、それを用いて１×１０６細胞／ｍｌまで増殖したＳＦ９細胞培養液１リットルに感染させた。これら感染液からの上清を用いて下記のｓｃＩＥｋを精製した。結合したＰＣＣペプチドをもつ精製ｓｃＩＥｋは、下記２Ｂ４Ｔ細胞ハイブリドーマの活性化を調節する能力についてアッセイした。
【０２７０】
Ｃ．昆虫細胞において発現されたｓｃＩＥｋ／ＰＣＣ分子の精製
ｓｃＩＥｋ／ＰＣＣタンパク質を発現する組換えバキュロウイルスを感染させたＳＦ９細胞から、その上清を感染５日後に取得した。培地から９，５００×ｇ、４℃、１０分間の遠心分離により細胞を除去した。澄明となった上清のｐＨを８に調整すると濁った白色の沈殿を生じた。この沈殿を１２，０００×ｇ、４℃、３０分ないし２時間の遠心分離により除去した。この遠沈からの上清は、免疫アフィニティクロマトグラフィー調製品用の０．２μフィルターで濾過した。
【０２７１】
免疫アフィニティクロマトグラフィーは、ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）細胞株ＨＢ２２５が産生する抗−ＩＡおよびＩＥ抗体、Ｎ２２を架橋したセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂ（ファルマシア）のカラムに、上記のように調製したサンプルを加えることにより実施した。カラムを２０ｍＭトリスｐＨ８．０で平衡化し、Ａ２８０ｎｍのベースラインに達するまでこのバッファーで洗浄した。次いで、抗体カラムを１Ｍ−ＮａＣｌ含有の同じバッファーで洗浄して非特異結合タンパク質を除去した。ＩＥｋタンパク質はＰＢＳを適用し、次いで５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ１１）を適用して溶出した。タンパク質は２本のピーク（Ａ２８０にてモニター）として、第一ピークはＰＢＳで、第二ピークはｐＨ１１で溶出された。ｐＨ１１で溶出されたピークは直ちにＨＣｌにてｐＨ７〜８に調整した。次いで、各ピークからのサンプルを濃縮し、バッファーは限外濾過によりＰＢＳに換えた。ＩＥｋサンプルの純度と機能性はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびＴ細胞活性化アッセイ（下記参照）によりそれぞれ試験した。この調製物からの精製ｓｃＩＥｋ／ＰＣＣはクマシー染色ポリアクリルアミドゲル上にバンドの汚染はなく、吸光度で検定した総タンパク質濃度は０．３７ｍｇ／ｍｌであった。
【０２７２】
Ｄ．ｓｃＩＥｋ／ＰＣＣ複合体によるＴ細胞の活性化
Ｔ細胞ハイブリドーマ２Ｂ４はＩＬ−２を産生することによって、ＩＥｋクラスＩＩ ＭＨＣ分子との関連でＰＣＣペプチドに応答する。ＩＬ−２の産生は、以下の項に記載するように実施した活性化アッセイにより検定した。ヌンク・マキシソープ（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ）プレートの個々のウエルを、１００μｌのＰＢＳ中に懸濁したｓｃＩＥｋ／ＰＣＣと抗−マウスＩＬ−２抗体（ファーミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、１８１６１Ｄ）の混合物で被覆し、ｓｃＩＥｋ分子が４００〜１２．５ｎｇ／ウエルの濃度で存在し、抗−ＩＬ−２抗体が１００ｎｇ／ウエルで存在するようにした。一夜４℃で被覆した後、溶液をプレートから除去し、１ウエル当たり１×１０５個の２Ｂ４細胞となるよう１０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭ１００μｌを加えた。プレートを８時間３７℃で１０％ＣＯ２中インキュベートし、次いで、洗浄バッファー（０．１％トゥイーン２０含有ＴＢＳ）で３回洗浄した。ビオチン標識抗−マウスＩＬ−２抗体（ファーミンゲン、１８１７２Ｄ）を１０％ＦＢＳ−ＰＢＳ溶液として加え、４℃で一夜インキュベートした。次いで、プレートを洗浄バッファーで３回洗い、１００ｎｇ／ｍｌのニュウトラアビジン（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ）西洋わさびペルオキシダーゼ接合体（ピアース）１００μｌを加え、室温で１５分ないし１時間インキュベートした。このインキュベーションに続き、洗浄バッファーで３回洗浄し、ＴＭＢ基質１００μｌを加えて発色させた。１００μｌの０．１８Ｍ−Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を止め、４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。ｓｃＩＥｋ／ＰＣＣが２Ｂ４細胞を活性化することを示した１アッセイの結果を表３に示す。刺激のピークは、プレートに固定化したｓｃＩＥｋ／ＰＣＣ１００〜２００ｎｇで生じ、吸光度値はより高濃度および低濃度で減少した。
【０２７３】
【表３】
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【０２７４】
実施例２：多価一本鎖ＩＡｄ／ペプチド−ビオチン／アビジン複合体の生成
Ａ．ｓｃＩＡｄ／ペプチド−ＢｉｒＡ複合体発現用ベクターの構築
実施例１はＴ細胞応答を刺激するに際しての一価ｓｃ−クラスＩＩ／ペプチド分子の生成と使用について記載する。ＭＨＣ抗原−ＴＣＲ相互作用に対するプローブとしての一価複合体の限界の一つは、ＭＨＣ抗原分子とＴＣＲ間の固有の低い親和性である。この問題は多価ＭＨＣ抗原複合体の形成によって克服し得る。これらの多価複合体は、ＭＨＣ抗原−ＴＣＲ相互作用のインヒビターを検出するためのスクリーニング方法（下記実施例に記載）の開発に多くの用途をもつ。本実施例および実施例３〜５に記載した方法は多価一本鎖ＭＨＣ抗原複合体を生成させる方法である。
【０２７５】
多価ＭＨＣ／ペプチド複合体などの多価ＭＨＣ抗原を生成させる一つの方法はＭＨＣ／ペプチド分子をビオチン化し、このビオチン化分子を４個まで１個のアビジン分子に結合させることである。ビオチンリガーゼ酵素に対し標的配列として働く特異的ペプチド配列は、ＭＨＣ／ペプチド分子に付加させることができる。これらの配列はＭＨＣ／ペプチド分子ごとに単一ビオチン部分の酵素付加を可能とする。このビオチン化ＭＨＣ／ペプチド分子は従ってビオチンとアビジンの高いアフィニティ相互作用を介して多価複合体（二量体ないし四量体）を形成することができる。
【０２７６】
例えば、ビオチンリガーゼＢｉｒＡ標的配列、ＧＧＧＳＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ、でタグ標識したＩＡｄα１−α２フラグメントをエンコードするＤＮＡ配列は、ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてのｐＴＶＷ４２１−４１からｐＴＶＷ４０８−１へ形質導入し、ｐＭＢＢｉｒ１を創生した。このベクターはＳａｌＩで切断し、突き出した制限部位を消化して平滑末端とした。このベクターを次いでＮｃｏＩで切断し、ＤＮＡ挿入フラグメントを精製した。ＢｌｕＢａｃＩＩＩベクター（インビトロゲン・パーツ番号１２０４１５）ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、突き出した制限部位を消化して平滑末端とした。このベクターを次いでＮｃｏＩで切断し、ベクターの主鎖フラグメントを精製し、挿入フラグメントに連結した。得られるＢｌｕＢａｃＩＩＩベクター、ｐＭＢ０３３はｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ｂｉｒＡ挿入片を担持している。
【０２７７】
Ｂ．昆虫細胞における可溶性ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＢｉｒＡ分子の産生
ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＢｉｒＡを担持するＢｌｕＢａｃＩＩＩベクターを同時形質導入に使用し、野生型ＡｃＭＮＰｖからプラーク精製により組換えウイルスを濃厚化した（参照文献：Ｄ．Ｒ． Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ． Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．（バキュロウイルス発現ベクター；実験室マニュアル） Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９２）；およびインビトロゲンＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ形質導入キットの操作マニュアル・バージョンＧカタログ＃Ｋ８５５−０１）。全工程でＳＦ９細胞を使用した。
【０２７８】
昆虫細胞はＴＮＭＦＨ昆虫細胞倍地（ＪＲＨバイオサイエンス・パーツ番号５１９４２−７９Ｐ）中、１０％ウシ胎児血清（ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）ＳＨ３００７１．０３）により高感染多重度（ｍｏｉ）で感染させ、組換えｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＢｉｒＡタンパク質を産生させた。感染の約９６時間後に、感染上清のｐＨを１０Ｎ−ＮａＯＨで８．０に調整し、高速遠心分離（１０，０００×ｇ以上）して粒子状物質を除去し、０．２μｍで濾過した。処理した上清をすでに記載したようにＩＡ−特異ＥＬＩＳＡで試験した（Ｒｈｏｄｅ ｅｔ ａｌ． １９９６． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７： ４８８５）。
【０２７９】
Ｃ．ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＢｉｒＡ分子の精製と多量体化
ｐＨ８．０で濾過した感染上清を、抗−ＩＡｄモノクローナル抗体、Ｍ５を架橋したプロテインＡセファロースのカラムに負荷した。サンプルの負荷に続いて、この免疫アフィニティカラムを２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）でＡ２８０ｎｍのベースラインに達するまで洗浄した。次いで抗体カラムを１Ｍ−ＮａＣｌ含有の同じバッファーで上記のように洗浄し、非特異的に結合したタンパク質を除去した。ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＢｉｒＡタンパク質は、次いで５０ｍＭグリシンＮａＯＨ（ｐＨ１１）にて溶出した。溶出したピークタンパク質（Ａ２８０ｎｍにてモニター）を直ちに２Ｍグリシン（ｐＨ２．０）でｐＨ８．０に調整し、濃縮して、バッファーを限外濾過によりＰＢＳに変換した。精製サンプルは４〜８℃にて保存した。ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＢｉｒＡサンプルの純度と機能性は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により試験した。
【０２８０】
ＢｉｒＡタグ標識のリジンのビオチン化は、大腸菌ビオチンリガーゼ酵素（アビディティＢＩＲＡ５００）およびビオミックスバッファーＡおよびＢ（アビディティ、ビオチンリガーゼとともに供給）を加えることにより達成した。ビオチン化したタンパク質はアビジンとインキュベートしてｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＢｉｒＡの複合体を形成した。ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＢｉｒＡ：アビジンの比４：１で、約８０％のｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＢｉｒＡ分子が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで見られるように、単量体よりも大きい多量体複合体を形成した。
【０２８１】
Ｄ．多価ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＢｉｒＡ複合体によるＴ細胞の活性化
これら多量体の活性を試験するために、多量体またな単量体（アビジンなし）のいずれかをヌンク・タイタープレートのウエルに被覆し、ＤＯ１１．１０細胞を加えて、２４時間後に上清を取得し、相対的ＩＬ−２レベルを前記のようにＥＬＩＳＡで定量した（Ｒｈｏｄｅ ｅｔ ａｌ． １９９６． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７： ４８８５）。代表的な実験での吸光度値を表４に示す。
【０２８２】
【表４】
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【０２８３】
ここで示されたことは、ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＢｉｒＡ分子をビオチン化し得たこと、１個のアビジン分子が１個以上のビオチン化ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＢｉｒＡに結合し得たこと、また多量体が単量体よりも遥かに強力なＩＬ−２の刺激剤であることである。
【０２８４】
実施例３：多価一本鎖ＩＡｄ／ペプチド−ＩｇＧ複合体の生成
Ａ．ｓｃＩＡｄ／ペプチド−ＩｇＧ複合体を発現するベクターの構築
多価ＭＨＣ抗原複合体を創生する第二の対策は、免疫グロブリンの定常ドメインを分子骨格として使用することであった。この方法において、発現ベクターは、ＩｇＧ重鎖および軽鎖の定常ドメインに融合させたものとして一本鎖ＭＨＣ／ペプチド分子をエンコードするように構築した。免疫グロブリンＣκドメインに融合したペプチド−結合一本鎖ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するＤＮＡ構築物の生成は、すでに以前に記載がある（ＷＯ９９／２１５７２）。ｐＩＡＤＫベクターは、マウスＩｇＧＣκドメインに融合したｓｃＩＡｄに結合してＯＶＡ３２３−３３９ペプチドをエンコードする発現カセットを含んでいる。ｐＤＲＨＫベクターは、ヒトＩｇＧＣκドメインに融合したｓｃＤＲ２（１５０１）に結合してヒトＭＢＰ８４−１０２ペプチドをエンコードする発現カセットを含んでいる。これらベクターの組み立てについてはすでに以前に詳細な記載がある（ＷＯ９９／２１５７２）。これらのベクターはブダペスト条約に従って、ＡＴＣＣに寄託されている。ＤＮＡベクターは１９９７年９月１７日に寄託され、寄託番号２０９２７４（ｐＤＲＨＫ）および２０９２７５（ｐＩＡＤＫ）を付されている。これらのベクターおよびその構築中間体は下記および実施例４に記載したベクターの構築用原材料として役立つ。
【０２８５】
さらに一つのベクターをｓｃＩＡｄ／ＧＤ−マウスＩｇＧＣκ融合物の哺乳動物での発現用に構築した。このベクターを構築するために、ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ構築物を含む細菌シャトルベクターｐＪＡ（ＷＯ９９／２１５７１）をＥｃｏＲＶおよびＮｈｅＩで消化し、ＯＶＡペプチドをエンコードする配列を除去する。ｇＤ２４６−２６１ペプチドをエンコードするアニールしたオリゴヌクレオチド（ＯＰＲ２２５／ＯＰＲ２２６−オリゴヌクレオチドを表５に掲載する）を、消化したｐＪＡベクターにサブクローン化し、ｐＩＡＧＫシャトルベクターとした。ｐＩＡＧＫベクターは次いでＥｃｏＲＶおよびＢｓｔＢＩで消化した。ｓｃＩＡｄ／ＧＤ遺伝子を含むフラグメントを精製し、ＥｃｏＲＶ／ＢｓｔＢＩ消化したｐＩＡＤＫベクターにサブクローン化し、ｐＩＡＧＭＫ発現ベクターとした。このベクターは哺乳動物細胞においてｓｃＩＡｄ／ＧＤ−Ｃκ融合体を発現し得る。
【０２８６】
ｓｃＩＡｄ／ペプチド分子とマウスＩｇＧ２ｂ重鎖のＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン間の融合体を発現し得るベクターはすでに構築されている。ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ構築物に対して、ｐＩＡＤＫはオリゴヌクレオチドプライマーＯＰＲ２３７およびＯＰＲ２３９を使用するＰＣＲ増幅用鋳型ＤＮＡとして役立った。ｓｃＩＡｄ／ＧＤ構築物にとって、ｐＩＡＧＭＫはオリゴヌクレオチドプライマーＯＰＲ２３８およびＯＰＲ２３９を使用するＰＣＲ増幅用鋳型ＤＮＡとして役立った。得られるＰＣＲ産物は哺乳動物発現ベクターｐＳＵＮ７へのクローニングに必要な５′ＮｒｕＩ部位および３′ＥｃｏＲＩ部位を担持するｓｃＩＡｄ／ＯＶＡまたはｓｃＩＡｄ／ＧＤ遺伝子融合物を担持する。このｐＣＤＮＡ３に基づくベクターは、免疫グロブリンリーダー配列とマウスＩｇＧ２ｂのＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインをエンコードする発現カセットを担持する。このベクターにおいて、ＮｒｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位はリーダー配列の３′末端およびＣＨ１ドメインの開始点（５′側）近傍にそれぞれ位置する。ＰＣＲ産物は、ｓｃＩＡｄ／ＧＤ構築物用のｐＧＥＭ−ＧＤ７ベクターとｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ構築物用のｐＧＥＭ−ＯＶＡ３とを生成するｐＧＥＭ−Ｔイージイ（Ｅａｓｙ）にクローン化した。配列の確認に続き、ｓｃＩＡｄ／ＧＤおよびｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ遺伝子フラグメントを単離し、ＮｒｕＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。精製したフラグメントをＮｒｕＩ／ＥｃｏＲＩ−切断したｐＳＵＮ７にサブクローン化し、それぞれｓｃＩＡｄ／ＧＤ−ＩｇＧ重鎖融合物およびｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＩｇＧ重鎖融合物用のｐＪＡ−ＩｇＧ２ｂ／ＧＤおよびｐＪＡ−ＩｇＧ２ｂ／ＯＶＡ発現ベクターとした。
【０２８７】
【表５】
2004501364.tif 000007
【０２８８】
Ｂ．多量体ｓｃＩＡｄ／ペプチドＩｇＧ融合物の哺乳動物細胞での産生および精製
ｓｃＩＡｄ／ＧＤ−ＩｇＧ分子を発現させるために、哺乳動物細胞に、ｐＩＡＧＭＫとｐＪＡ−ＩｇＧ２ｂ／ＧＤのベクター、およびピューロマイシン抵抗性付与遺伝子を含有するベクターｐＰＵＲ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を形質導入した。簡単に説明すると、ＣＨＯ細胞を線状化プラスミドＤＮＡと混合し、製造業者の指示書（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））に従いスーパーフェクト（Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ）形質導入試薬を用いて形質導入した。形質導入した細胞を非選択的ＩＭＤＭ培地中で一夜増殖した。ピューロマイシン選択培地（ＩＭＤＭ培地、２０μｇ／ｍｌピューロマイシン）を次いで加え、細胞を９６穴平底組織培養プレートに移した。該ベクターを同時形質導入した細胞のコロニーが、１４〜２１日後に明瞭となった。ｓｃＩＡｄ／ＧＤ−ＣκとｓｃＩＡｄ／ＧＤ−Ｉｇ重鎖ベクターの両方を担持する形質導入体を拡げ、ＩｇＧ２ｂ重鎖／κ鎖多量体に特異的なＥＬＩＳＡにより可溶性ｓｃＩＡｄ−Ｉｇ融合分子の発現を選抜した。簡単に説明すると、ＥＬＩＳＡは１００ｎｇのヤギ抗−マウスＩｇＧ２ｂ（サザン・バイオテクノロジー・アソシエーツ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ））をヌンク・マキシソープ（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ）プレートのウエルに１００μｌのＰＢＳ（リン酸緩衝塩溶液）中４℃で一夜被覆することで行う。コーティング溶液を除去し、２００μｌの１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）ＰＢＳを各ウエルに加え、室温で２〜３時間ウエルをブロックした。ブロック溶液を除去し、サンプルを１００μｌ／ウエルあて加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを２００μｌの洗浄バッファーと１００μｌのヤギ抗−マウスカッパ鎖−ＨＲＰ（サザン・バイオテクノロジー・アソシエーツ；サンプル希釈剤で１／１０００に希釈した保存液）で４回洗い、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで６回洗浄し、ＴＭＢ１００μｌを加えた。発色後に、１００μｌの０．１８Ｍ−Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を止め、４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。陽性のウエルを前記のＩＡ−特異ＥＬＩＳＡ（ＷＯ９９／２１５７２；ＵＳＳＮ０９／２０４，９７９）によりさらに選抜した。これらアッセイの結果に基づき、陽性形質導入体を選択し、前記の限界希釈クローニングによりクローン化した（ＵＳＳＮ０９／２０４，９７９）。クローン化した形質導入体を広げ、複数のＴ１７５組織培養フラスコ中で２〜３週間増殖させ、ｓｃＩＡｄ／ＧＤ−ＩｇＧ多重体を含む培地２〜４Ｌを得た。同様の作業を実施して、ｐＩＡＤＫとｐＪＡ−ＩｇＧ２ｂ／ＯＶＡベクターを同時に形質導入したＣＨＯ細胞株を生成させた。これらの形質導入体をＴ１７５フラスコに広げ、ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＩｇＧ多重体を含む培地２〜４Ｌを産生させた。
【０２８９】
ｓｃ−クラスＩＩ−ＩｇＧ融合分子は、標準的な方法論によるプロテインＡ−セファロースを用いるアフィニティクロマトグラフィーにて精製した（ＵＳＳＮ０９／２０４，９７９）。場合によっては、さらに抗−牛ＩｇＧＡｂカラムを用いるクロマトグラフィーの工程を加えて、残余のウシ血清免疫グロブリンを除去した。精製したｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＩｇおよびｓｃＩＡｄ／ＧＤ−Ｉｇ分子のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図８に示す。
【０２９０】
Ｃ．多価ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＩｇＧ複合体によるＴ細胞の活性化
精製したｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＩｇＧとｓｃＩＡｄ／ＧＤ−ＩｇＧとの複合体については、ＩＬ−２産生により測定した場合の、ペプチド特異的Ｔ細胞ハイブリドーマを活性化する能力を試験した。この方法はｓｃＩＡｄ／ペプチド−ＩｇＧタンパク質およびラット抗−マウスＩＬ−２モノクローナル抗体（ファーミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）パーツ番号１８１６１Ｄ）をマキシソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）ウエル（ヌンク（ＮＵＮＣ）パーツ番号４６９９４９）に、ＰＢＳ中、４℃一夜、被覆したもので行う。コーティング溶液を除き、１ウエルにつき１×１０５個のＴ細胞（ＤＯ１１．１０またはＧＤ１２）を１０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭ（メディアテック・セルグロ（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ Ｃｅｌｌｇｒｏ）パーツ番号１５−０１６−ＣＶ）２００μｌに加えた。保湿インキュベーター中、１０％ＣＯ２下、３７℃にて８時間インキュベーションした後、プレートを３回洗浄バッファーで洗い、ビオチンに接合した抗−ＩＬ−２抗体（ファーミゲンパーツ番号１８１７２Ｄ）を１００ｎｇ／ウエルあて１０％ＦＢＳ−ＰＢＳ１００μｌに加えた。４℃で一夜インキュベーションした後、ウエルを洗浄バッファーで３回洗い、１０％ＦＢＳ−ＰＢＳ１００μｌ中の２５０ｎｇアビジンペルオキシダーゼ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）パーツ番号Ａ３１５１）をウエルごとに加えた。３７℃にて３０分間インキュベーションした後、ウエルを洗浄バッファーにて５回洗い、１００μｌのＡＢＴＳ基質（カークガード・アンド・ペリー（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ）パーツ番号５０６０−００）をウエルごとに加えた。４０５ｎｍでの吸光度を測定した。ＤＯ１１．１０細胞を用いる活性化アッセイの結果を表６に示し、ＧＤ１２細胞を用いての結果を表７に示す。ｓｃＩＡｄ−ＩｇＧ構築物の抗原性ペプチドをＯＶＡからＧＤに変換したことで、一本鎖分子がＤＯ１１．１０細胞によるＩＬ−２産生を刺激するその能力は除かれたが、一方、逆の特異性がＧＤ１２細胞について見られた。Ｔ細胞応答を活性化するｓｃＩＡｄ／ペプチド−ＩｇＧタンパク質の能力については、Ｔ細胞活性化アッセイにより一価のｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ分子と比較することによりさらに評価した。これらのアッセイでは、固定化したｓｃＩＡｄ／ペプチド−ＩｇＧ分子のＴ細胞応答の刺激が、ｓｃＩＡｄ／ペプチド単量体の２〜８倍であった。
【０２９１】
【表６】
2004501364.tif 000008
【０２９２】
【表７】
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【０２９３】
実施例４：多価一本鎖ＤＲ２／ＭＢＰ−ＩｇＧ複合体の生成
Ａ．多量体一本鎖ＤＲ２／ＭＢＰ−ＩｇＧ複合体を発現するベクターの構築
ｓｃＤＲ２／ＭＢＰ−ＩｇＧ重鎖融合体を発現するベクターの構築は以下のように実施した。ｐＤＲＨＫベクターは、オリゴヌクレオチドプライマーＯＰＲ２５４およびＯＰＲ２５７を使用するＰＣＲ増幅のための鋳型ＤＮＡとしての役目を果たした（表８参照）。得られるＰＣＲ産物は、ｓｃＤＲ２／ＭＢＰ遺伝子融合体および哺乳動物発現ベクターｐＪＲＳ３５５へのクローニングに必要な５′ＢｓｉＷＩ部位と３’ＥｃｏＲＩ部位とを担持している。このｐＣＤＮＡ３に基づくベクターは、免疫グロブリンリーダー配列とヒトＩｇＧ１ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインをエンコードする発現カセットを担持している。このベクターにおいて、ＢｓｉＷＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位は、それぞれ、リーダー配列の３′端近傍とＣＨ１ドメインの開始点（５’側）近傍に位置している。ＰＣＲ産物はＪＡ−ＤＲ２−３ベクターを生成するｐＧＥＭ−Ｔにクローン化した。配列の確認の後、ｓｃＤＲ２／ＭＢＰ遺伝子フラグメントはＢｓｉＷＩおよびＥｃｏＲＩで消化した後に、ＪＡ−ＤＲ２−３から単離した。精製したフラグメントをＢｓｉＷＩ／ＥｃｏＲＩ切断したｐＪＲＳ３５５にサブクローン化し、ｐＤ２ＭＩｇＨ発現ベクターとした。
【０２９４】
【表８】
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【０２９５】
Ｂ．多量体ｓｃＤＲ２／ＭＢＰ−ＩｇＧ融合体の哺乳動物細胞での産生と精製
多量体ｓｃＤＲ２／ＭＢＰ−ＩｇＧ分子を発現する細胞株を生成させるために、以前にｐＤＲＫＨ発現ベクターを形質導入したＣＨＯ細胞株を使用した。これらの細胞については、ＵＳＳＮ０９／２０４，９７９に詳細に記載されている。ｐＤＲＫＨ形質導入ＣＨＯ細胞を、線状化したｐＤ２ＭＩｇＨおよび超らせんｐＭＡＣＳプラスミドＤＮＡと混合し、ジーン・パルサー（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ）（バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ））を用いてエレクトロポレーションした。ｐＭＡＣＳベクターは膜結合ＣＤ４タンパク質の一過性発現を可能とする。同時形質導入した細胞は、すでに記載されているように、細胞表面ＣＤ４発現のために選択された（ＵＳＳＮ０９／２０４，９７９）。該細胞は９６穴平底組織培養プレートにて非選択的ＩＭＤＭ培地中で増殖した。該ベクターを形質動入した細胞のコロニーは１４〜２１日後に明瞭となった。ｓｃＤＲ２／ＭＢＰ−ＣκとｓｃＤＲ２／ＭＢＰ−Ｉｇの両重鎖ベクターを担持する形質導入体を広げ、重鎖−ＨＬＡ−ＤＲ融合体に特異的なＥＬＩＳＡにより可溶性ｓｃＤＲ２−Ｉｇ融合分子の発現について選抜した。簡単に説明すると、ＥＬＩＳＡはヌンク・マキシソープ（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ）プレートのウエルにヒツジ抗−Ｆｄ抗血清（ザ・バインディング・サイト（Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ））１μｇを、ＰＢＳ（リン酸緩衝塩溶液）１００μｌで一夜４℃にて被覆することにより行う。コーティング液を除き、３００μｌの１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）ＰＢＳを各ウエルに加えて、室温で２〜３時間、ウエルをブロックした。ブロッキング液を除去し、サンプルを１００μｌ／ウエルの量で加え、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄バッファー２００μｌと１００μｌの抗−ＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体Ｌ２４３−ＨＲＰ（サンプル希釈剤で１／１０００に希釈した保存液）で４回洗浄し、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで６回洗い、１００μｌのＴＭＢを加えた。発色させた後、１００μｌの０．１８Ｍ−Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を止め、４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。陽性の形質導入体は、すでに記載されているＤＲ特異ＥＬＩＳＡにより選抜した（ＷＯ９９／２１５７２；ＵＳＳＮ０９／２０４，９７９）。これらアッセイの結果に基づき、陽性の形質導入体は、すでに記載されている限界希釈クローニングによりクローン化した（ＵＳＳＮ０９／２０４，９７９）。クローン化した形質導入体を広げて、複数のＴ１５７組織培養フラスコ中、２〜３週間増殖させ、ｓｃＤＲ２／ＭＢＰ−ＩｇＧ多量体含有培地２〜４Ｌを製造した。
【０２９６】
実施例５：多価ｓｃＩＡｄ／ペプチド−ＩｇＭ分子の生成
Ａ．昆虫細胞における可溶性ｓｃＩＡｄ／ペプチド−ＩｇＭ融合分子を発現するベクターの構築
Ｉｇ骨格を用いて多価複合体を形成するもう一つの方法として、一本鎖ＭＨＣ／ペプチド分子をエンコードする発現ベクターをＩｇＭのＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４ドメインへの融合体として構築した。ヒトＩｇＭ重鎖のＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４部分は、ヒトＢリンパ腫細胞株ＲＬ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２２６１）からＲＴ／ＰＣＲを用いて増幅した。全ＲＮＡはキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）全ＲＮＡキット（パーツ番号１４１６２）を用いて調製し、ｃＤＮＡはプライマーＭＢｉｍｒ（５’−ＧＧＧ ＧＧＧ ＣＣＡ ＴＧＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＣＡ ＧＴＡ ＧＣＡ ＧＧＴ ＧＣＣ ＡＧＣ ＴＧ−３′）を使用して産生させた。ｃＤＮＡはＭＢｉｍｒおよびＭＢｉｍｆ（５’−ＧＧＧＧ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＴＧ ＡＴＴ ＧＣＴ ＧＡＧ ＣＴＧ ＣＣＴ ＣＣ−３’）を使用してなされたＰＣＲ増幅用の鋳型としての役目を果たした。増幅した遺伝子フラグメントは配列確認のために、インビトロゲン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）ｐＧＥＭ Ｔ−イージイベクター（パーツ番号Ａ１３６０）に連結し、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩフラグメントとしてＰＳＬ１１９０ベクター（ファルマシア）に移行させた。
【０２９７】
ｐＭＢＳＣ２．１（ＵＳＳＮ５，８６９，２７０）として記載されているｓｃＩＡｄ融合体に遺伝的に結合したＯＶＡ３２３−３３９またはＨＳＶ２４６−２６１抗原性ペプチドのいずれかを含有する遺伝子フラグメントは、プライマーＭＢ１０１（５’−ＧＧＧ ＣＣＡ ＴＧＧ ＣＴＣ ＴＧＣ ＡＧＡ ＴＣＣ ＣＣＡ ＧＣＣ−３’）およびＭＢ１００（５’−ＧＧＧ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＣＴ ＡＧＣ ＣＣＧ ＧＧＡ ＣＣＡ ＧＴＧ−３’）を用い、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物をＮｃｏＩとＢａｍＨＩで消化し、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩで切断したＩｇＭ−ＰＳＬ１１９０ベクターに移入し、ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＩｇＭ構築物を担持するｐＭＢ０６２およびｓｃＩＡｄ／ＧＤ−ＩｇＭ構築物を担持するｐＭＢ０６３とした。全遺伝子融合体はＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてインビトロゲンからのｐＢｌｕｂａｃＩＩＩベクター（パーツ番号１２０４１５）に移入し、ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＩｇＭ構築物を担持するｐＭＢ０６０およびｓｃＩＡｄ／ＧＤ−ＩｇＭ構築物を担持するｐＭＢ０６１とした。
【０２９８】
Ｂ．昆虫細胞における可溶性ｓｃＩＡｄ／ペプチド−ＩｇＭ融合分子の産生
挿入物を有するベクターｐＭＢ０６０およびｐＭＢ０６１をそれぞれ同時形質導入に使用し、組換えウイルスを野生型ＡｃＭＮＰｖからプラーク精製により濃厚化した（参照文献：Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ． Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（バキュロウイルス発現ベクター：実験室マニュアル）；Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９２） ａｎｄ ｔｈｅ ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ Ｖｅｒｓｉｏｎ Ｇ（インビトロゲンＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ形質導入キット指示書版Ｇ）カタログ＃Ｋ８５５−０１）。全工程にわたりＳＦ９細胞を使用した。
【０２９９】
１０％ウシ胎児血清（ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）ＳＨ３００７１．０３）含有ＴＮＭＦＨ昆虫細胞培地（ＪＲＨバイオサイエンス・パーツ番号５１９４２−７９Ｐ）にて、昆虫細胞を高感染効率（ｍｏｉ）で感染させ、組換えｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＩｇＭタンパク質を産生させた。感染の約９６時間後、感染上清のｐＨを１０Ｎ−ＮａＯＨで８．０に調整し、高速遠心（１０，０００×ｇ以上）して粒状物を除き、０．２μｍで濾過した。処理した上清をＥＬＩＳＡにより試験し、可溶性融合タンパク質を同定した。ＥＬＩＳＡは５０μｌのＰＢＳ中、９６穴マイクロタイタープレートのウエルに１００ｎｇのＭ５／１１４（ＡＴＣＣ ＴＩＢ１２０）抗−ＩＡｄを被覆して実施した。１２５μｌの１０％ＦＢＳ−ＰＢＳにより高タンパク質洗浄処理を行い、未結合抗体を除去した。サンプルを１０％ＦＢＳ−ＰＢＳに希釈し、１００μｌ／ウエルとして添加した。３７℃、１時間後、洗浄バッファー（０．０５％トゥイーン２０含有ＰＢＳ）３７５μｌで３回洗った。ビオチン化ヤギ抗−ヒトＩｇＭ（シグマ・パーツ番号Ｂ−１２６５）を１００μｌの１０％ＦＢＳ−ＰＢＳ １０％ＦＢＳ中に１：４０００希釈して加えた。３７℃で１時間後、プレートを洗浄バッファーにて３回洗浄した。アビジンペルオキシダーゼ（シグマ・パーツ番号Ａ３１５１）を１００μｌの１０％ＦＢＳ−ＰＢＳ中、２５０ｎｇ／ウエルで添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、プレートを３７５μｌの洗浄バッファーで５回洗浄し、１００μｌのＡＢＴＳ基質（カークガード・アンド・ペリー（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ）パーツ番号５０６０−００）をウエルごとに加えた。４０５ｎｍでの吸光度を測定した。
【０３００】
感染処理は１個の精製プラークを、ＳＦ９細胞を高生存度で含有する増殖培地５０ｍｌに添加することにより実施した。７２時間後、５０ｍｌ感染物のうちの１０ｍｌをウイルス保存液として用い、４００ｍｌのＳＦ９細胞に感染させた。９６時間後、４００ｍｌ感染物からの上清について、上記のようにＥＬＩＳＡを実施した。二重測定したウエルの平均吸光度を下記表９に示す。観察されたシグナルの特異性は、ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＩｇＭがＳＦ９により感染物上清に分泌されたことを示している。
【０３０１】
【表９】
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【０３０２】
サンプル希釈剤を含む陰性コントロール（Ａ４０５＝０．１７１）およびＩｇＭ尾部をもたないｓｃＩＡｄ／ＯＶＡを産生する昆虫細胞（Ａ４０５＝０．１７５）は、このアッセイでバックグランドレベルの結合を示した。
【０３０３】
ｓｃＩＡｄ／ＧＤ−ＩｇＭ発現カセットを担持するバキュロウイルスで感染した昆虫細胞からの上清は、このＥＬＩＳＡにより同様のｓｃＩＡｄ／ＧＤ−ＩｇＭ分子の産生を示した。
【０３０４】
Ｃ．ｓｃＩＡｄ／ペプチド−ＩｇＭ融合分子の精製
ｐＨ８．０で濾過した感染物上清を、抗−ＩＡｄモノクローナル抗体Ｍ５を架橋したプロテインＡセファロースのカラムに付加した。サンプルを付加した後の免疫アフィニティカラムを２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）により、Ａ２８０ｎｍのベースラインに達するまで洗浄した。次いで、抗体カラムを１Ｍ−ＮａＣｌを含有する上記と同じバッファーにて洗浄し、非特異的に結合したタンパク質を除去した。次いで、ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＩｇＭタンパク質を５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ１１）にて溶出した。溶出したピークタンパク質（Ａ２８０ｎｍにてモニター）を直ちに２Ｍグリシン（ｐＨ２．０）でｐＨ８．０に調整し、濃縮後、バッファーを限外濾過によりＰＢＳに取り替えた。精製サンプルは４〜８℃に保存した。ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＩｇＭサンプルの純度と機能性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＴ細胞活性化によりそれぞれ試験した。この調製物から精製したｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＩｇＭは、クマシー染色ポリアクリルアミドゲル上に汚染物のバンドを示さなかった。全タンパク質は、全タンパク質アッセイにより６０ｍｇ／ｍｌであった。鎖間ジスルフィド結合を還元せずに分析した場合、ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＩｇＭタンパク質は、高次（三量体以上）の多量体からなるものとして検出される。同様の精製方法を用いて、感染昆虫細胞培養上清からｓｃＩＡｄ／ＧＤ−ＩｇＭタンパク質を生成させた。
【０３０５】
Ｄ．Ｔ細胞応答刺激におけるｓｃＩＡｄ／ペプチド−ＩｇＭ複合体の活性
精製したｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＩｇＭ複合体について、ＯＶＡ特異ＤＯ１１．１０Ｔ細胞ハイブリドーマを活性化するか否か、ＩＬ−２の産生測定により試験した。この方法では、ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＩｇＭタンパク質（またはコントロールとしてｓｃＩＡｄ／ＧＤ−ＩｇＭタンパク質）およびラット抗−マウスＩＬ−２モノクローナル抗体（ファーミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）パーツ番号１８１６１Ｄ）をマキシソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）ウエル（ヌンク（ＮＵＮＣ）パーツ番号４６９９４９）にＰＢＳ中、４℃で一夜被覆することで行った。コーティング溶液を除去し、１ウエル当たり１×１０５個のＤＯ１１．１０細胞を、１０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭ（メディアテック・セルグロ（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ Ｃｅｌｌｇｒｏ）パーツ番号１５−０１６−ＣＶ）２００μｌに加えた。保湿インキュベーター中、１０％ＣＯ２下、３７℃にて８時間インキュベーションした後、プレートを３回洗浄バッファーで洗い、ビオチンに接合した抗−ＩＬ−２抗体（ファーミゲンパーツ番号１８１７２Ｄ）を１００ｎｇ／ウエルあて１０％ＦＢＳ−ＰＢＳ１００μｌに加えた。４℃で一夜インキュベーションした後、ウエルを洗浄バッファーで３回洗い、１０％ＦＢＳ−ＰＢＳ１００μｌ中の２５０ｎｇアビジンペルオキシダーゼ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）パーツ番号Ａ３１５１）をウエルごとに加えた。３７℃にて３０分間インキュベーションした後、ウエルを洗浄バッファーにて５回洗い、１００μｌのＡＢＴＳ基質（カークガード・アンド・ペリー（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ）パーツ番号５０６０−００）をウエルごとに加えた。４０５ｎｍでの吸光度を測定した。一つの活性化アッセイの結果を下記表１０に示す。ｓｃＩＡｄ−ＩｇＭ構築物の抗原性ペプチドをＯＶＡからＧＤに変換したことで、一本鎖分子がＤＯ１１．１０細胞によるＩＬ−２産生を刺激するその能力は除かれた。固定化した抗−ＩＬ−２抗体のみを有するＤＯ１１．１０細胞も、ｓｃＩＡｄ／ＧＤ−ＩｇＭと抗−ＩＬ−２抗体を有するＤＯ１１．１０細胞も、ＩＬ−２の分泌には至らなかった。
【０３０６】
【表１０】
2004501364.tif 000012
【０３０７】
Ｔ細胞応答を活性化するｓｃＩＡｄ／ペプチド−ＩｇＭタンパク質の能力をさらに評価するために、上記のＴ細胞活性化アッセイにより、多価ｓｃＩＡｄ／ペプチド−ＩｇＭ分子を一価ｓｃＩＡｄ／ペプチド分子と直接比較した。ＤＯ１１．１０およびＧＤ１２Ｔ細胞を用いるアッセイ結果をそれぞれ表１１および１２に示す。これらのアッセイが示したことは、固定化したｓｃＩＡｄ／ペプチド−ＩｇＭ分子が、Ｔ細胞応答刺激において、ｓｃＩＡｄ／ペプチド単量体の５〜１０倍活性であったことである。応答のペプチド特異性は、単量体および多量体ｓｃＩＡｄ／ペプチド分子の両方に観察された。
【０３０８】
【表１１】
2004501364.tif 000013
【０３０９】
【表１２】
2004501364.tif 000014
【０３１０】
実施例２、３および５からの結果は、ｓｃＩＡｄ／ペプチド複合体の多価形状が、Ｔ細胞応答の刺激において一価の形状よりもより強力であることを明瞭に示している。これらの複合体は、ＭＨＣ／ペプチドに対するＴ細胞応答がＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド相互作用の閾値の上昇を必要とする場合のスクリーニング方法に好適である。組換えｓｃＴＣＲ−ＣＤ３ζ融合体を発現するＴ細胞を使用して実施するかかるスクリーニング方法について下記実施例１１〜１４に記載する。多価ＭＨＣ／ペプチド複合体もまた、ＭＨＣ／ペプチド複合体および膜結合ＴＣＲ（実施例１５参照）または精製ＴＣＲ（実施例１６および１７）間の相互作用の検出に依存するスクリーニング方法において好ましい。
【０３１１】
実施例６：多価ＤＯ１１．１０一本鎖Ｔ細胞レセプター複合体の生成
Ａ．ＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ／マウスＩｇＧ２ｂ融合分子を発現するベクターの構築
上記のように、ＭＨＣ抗原分子とＴＣＲ間の相互作用を検出するスクリーニング方法の開発は、一価の、また好ましくは多価のＭＨＣ抗原複合体とＴＣＲ試薬が入手し得ることで非常に容易となり得る。一価および多価一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）分子を生成させる方法は、すでに記載がある（Ｗｅｉｄａｎｚ， ｅｔ ａｌ． １９９８． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２１： ５９；米国特許出願番号０８／８１３，７３１および０８／９４３，０８６）。この例は、実施例１６および１７に記載された方法などへの適用をスクリーニングするための多価ＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ分子を創生するために、これらの方法の使用について記載する。
【０３１２】
ＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲのクローニングについては、係属中の米国特許出願番号０８／８１３，７３１（「バクテリオファージコートタンパク質および一本鎖Ｔ細胞レセプターからなる融合タンパク質」）および０８／９４３，０８６（「一本鎖Ｔ細胞レセプターおよび免疫グロブリン軽鎖定常領域からなる融合タンパク質」）に記載されている。
【０３１３】
哺乳動物ＩｇＧ２ｂ発現ベクターｐＳＵＮ７については、最新のＴＣＲ特許出願に記載されている（「多特異結合分子およびその用途；文献番号４８，５３１−Ｐ）。
【０３１４】
ＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ／マウスＩｇＧ２ｂ融合分子の構築のために、ｐＳＵＮ７発現ベクターをＮｒｕＩおよびＥｃｏＲＩにより消化した（最初にベクターにクローン化したｓｃＦｖを脱落させる）。ＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲは特異的プライマーＫＣ２６７（５′ＮｒｕＩ）およびＫＣ２６８（３′ＥｃｏＲＩ）を用いてｐＳＵＮ２３から再増幅した（表１３参照）。ＰＣＲ産物は配列決定のためにｐＧＥＭ−Ｔイージイベクターにクローン化した。正しいＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲフラグメントを制限消化／ゲル精製により単離し、次いで、ＮｒｕＩ／ＥｃｏＲＩ消化したｐＳＵＮ７発現ベクターに連結し、最終のＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ／マウスＩｇＧ２ｂ発現ベクターを創生した。
【０３１５】
【表１３】
2004501364.tif 000015
【０３１６】
Ｂ．ＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ／マウスＩｇＧ２ｂ融合分子の哺乳動物での発現
ＣＨＯ細胞を冷ＤＰＢＳで洗浄し、形質導入用に準備した。大よそ１０７個の細胞をＤＰＢＳに再懸濁し、２０μｇのＰｖｕＩ−線状化ＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ／マウスＩｇＧ２ｂＤＮＡと混合した。氷上、５分後、細胞はジーン・パルサー（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ）（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ））セットを用いて、１パルス２５０ボルト、０．２５μＦｄとして送達し、エレクトロポレーションを行った。パルス細胞を５分間氷上に放置した。細胞を１０ｍｌのＩＭＤＭ（１０％ＦＢＳ含有）に希釈し、Ｔ−２５ｃｍ２フラスコ中で３７℃一夜、５％ＣＯ２下で増殖した。
【０３１７】
形質導入した細胞を１：２００に希釈し、翌日、９６穴プレート中の選択培地（すなわち、０．７５ｍｇ／ｍｌのＧ−４１８硫酸塩含有１０％ＦＢＳ−ＩＭＤＭ）に塗布した。
【０３１８】
約２週間後、タンパク質の発現についてＥＬＩＳＡによりコロニーを試験した。９６穴プレート（ヌンク・マキシソープ）にＰＢＳ中、ＫＪ−１ｍＡｂ（本ｍＡｂは正しく折りたたまれたＤＯ１１．１０ＴＣＲを認識する）を４℃で一夜被覆した。１０％ＦＢＳ−ＰＢＳにより１時間ブロックした後、コロニー上清を加え、室温で３０分間インキュベートした。洗浄後、抗−マウスＩｇＧ２ｂ−ＨＲＰ接合ポリクローナル抗体（カルタグ（Ｃａｌｔａｇ））を加えて３０分間放置した。ＥＬＩＳＡはＴＭＢ基質により発色し、０．１Ｎ硫酸で反応停止した。４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
【０３１９】
試験したコロニーの僅か１０％のみがＥＬＩＳＡ陽性であった。３つの候補化合物を展開し、限界希釈により一次クローニングするために選定した。
【０３２０】
約１０日後、一次クローンをＥＬＩＳＡにより試験し、タンパク質高生産性細胞株を選択した。ＥＬＩＳＡはＫＪ−１ｍＡｂの代わりにＦ２３．１ｍＡｂ（このｍＡｂはＴＣＲ Ｖベータ８鎖の一部を検出する）を使用した以外、上記のアッセイと同様であった。４つの候補化合物を展開させ、最高のＴＣＲ発現レベル（＃１３−１）をもつクローンをさらに特性研究するために選定した。
【０３２１】
Ｃ．多価ＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ融合分子の生成
哺乳動物細胞中でのＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ／マウスＩｇＧ２ｂ融合分子の発現は、図９に示すようにＴＣＲの単量体と二量体を産生する。ＩｇＧ２ｂ重鎖融合体を補完するカッパ鎖融合体を加えると、四量体分子の形成に導くことができた。この仮説を試験するために、先ず必要なことは、ＴＣＲ／ＩｇＧ２ｂ融合分子がｓｃＴＣＲ／カッパ融合分子と有効に対形成し得ることを確立することであった。
【０３２２】
ＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ／マウスカッパ融合分子のクローニングについては、係属中の米国特許出願番号０８／９４３，０８６に記載されている。重鎖／カッパ鎖対形成を証明するために、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）の、接着性細胞の一過性形質導入用のスーパーフェクト（Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ）トランスフェクション試薬プロトコールに従い、一過性形質導入実験を設定した。簡単に説明すると、２．５×１０５個のＣｏｓ−７細胞を６穴プレート（のウエルごと）に播種した。翌日、２μｇのＤＮＡ（１μｇのＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ／カッパ＋１μｇのＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ２ｂ）を１００μｌのＩＭＤＭ培地に加えた。スーパーフェクト試薬（キアゲン）１０μｌを加え、撹拌した。室温、１０分間インキュベーションしてＤＮＡ／デンドリマーを形成させた後、１０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭ６００μｌを複合体に加えた。ＣＯＳ細胞をＤＰＢＳで洗浄し、複合体をピペットで細胞上に移した。３７℃で２時間後、細胞を再洗浄し、新たな１０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭをウエルに加えた。形質導入体はアッセイの前に、５％ＣＯ２下、３７℃で３日間インキュベートした。
【０３２３】
一過性形質導入体の上清につき、ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ２ｂ融合分子とＴＣＲ／カッパ融合分子との対が形成されているか、ＥＬＩＳＡにより試験した。９６穴プレート（ヌンク・マキシソープ）に、ＰＢＳ中、ヤギ抗−マウスカッパポリクローナル抗体（サザン・バイオテック（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ））を４℃で一夜被覆した。１０％ＦＢＳ−ＰＢＳにより１時間ブロックした後、一過性上清を添加して室温で３０分間インキュベートした。洗浄後、抗−マウスＩｇＧ２ｂ−ＨＲＰ接合ポリクローナル抗体（カルタグ（Ｃａｌｔａｇ））を加えて３０分間放置した。ＥＬＩＳＡはＴＭＢ基質により発色し、０．１Ｎ硫酸で反応停止した。（４５０ｎｍで読み取った）吸光度は陰性コントロールよりも４０倍大きく、ｓｃＴＣＲ／カッパとｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ２ｂの対形成が成功であったことを示した。
【０３２４】
以下の実施例は組換えＴ細胞レセプターを発現する細胞株の生成について記載する。
実施例７：組換えＴ細胞レセプターを担持するマウスＴ細胞ハイブリドーマの生成
ＭＨＣ抗原分子とＴＣＲ間の相互作用を検出する細胞に基づくスクリーニング方法の開発は、適切なＴＣＲを発現する不死化Ｔ細胞株が入手可能であることで非常に容易になり得る。分離Ｔ細胞と胸腺腫細胞（すなわち、ＢＷ５１４７）間の融合は、マウスＴ細胞ハイブリドーマを生成させることで達成されている。しかし、不死化ヒトＴ細胞株の生成には、同じ方法を容易に適用することができない。より一般化された方法として、不死化Ｔ細胞株は形質導入により生成させ、その細胞表面に組換えＴＣＲを発現させている（参照文献：Ｅｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ． １９９２． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６： １３１８； Ｈａｓｔｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．１９９６． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７： ３４６０； Ｂｒａｗｌｅｙ， Ｊ．Ｖ． ａｎｄ Ｐ． Ｃｏｎｃａｎｎｏｎ． １９９９． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６３： ４９４６）。同様の方法を本実施例と次の２つの実施例に記載する。各場合において、融合はＴＣＲの細胞外抗原認識ドメインとＣＤ３−ζ鎖の細胞内シグナル伝達ドメイン間で実施された。Ｔ細胞に形質導入した場合、融合分子はＭＨＣ−ペプチド複合体での刺激により機能的活性を示した。この実施例において、形質転換に使用したＴ細胞株は、その表面に内在性ＴＣＲを発現するハイブリドーマであった。実施例８および９において、用いたＴ細胞株はその表面に機能的内在性ＴＣＲを発現しない。
【０３２５】
Ａ．ＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ／ＣＤ３ζ融合分子の構築
ＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲのクローニングについては、係属中の米国特許出願番号０８／８１３，７３１（「バクテリオファージコートタンパク質および一本鎖Ｔ細胞レセプターからなる融合タンパク質」）および０８／９４３，０８６（「一本鎖Ｔ細胞レセプターおよび免疫グロブリン軽鎖定常領域からなる融合タンパク質」）に記載されている。
【０３２６】
最新の特許出願（「多特異結合分子およびその用途；文献番号４８，５３１−Ｐ）に、ｐＧＥＭＴ−イージイに基づく「シャトルベクター」について、その構築が記載された。当該ベクターはｐＧＥＭＴ−イージイベクターにクローン化された５′ＡｇｅＩ−３′ＨｐａＩ／ＢｓｐＥＩ／ＮｒｕＩ／ＣｌａＩ ＤＮＡフラグメントとして増幅されたｓｃＴＣＲから成り立っていた。従って、３′端はリンカーｓｃＦｖ付加用のポリリンカー領域として、また二面特異分子を創生する精製タグ標識として作用する。
【０３２７】
ＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ／ＣＤ３ζ融合分子の構築のために、ＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ／リンカー／ｓｃＦｖ／タグ／ｐＧＥＭ−Ｔイージイ「シャトルベクター」をＨｐａＩおよびＣｌａＩで消化してポリリンカー領域を除去し、ｐＧＥＭ−Ｔイージイにおける５′ＡｇｅＩ−３′ＨｐａＩフラグメントとしてＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲのみを残した。
【０３２８】
ＣＤ３ζ鎖はマウス特異プライマーＫＣ３１２（５′ＨｐａＩ）およびＫＣ３０４（３′ＣｌａＩ）またはヒト特異プライマーＫＣ３０３（５′ＨｐａＩ）およびＫＣ３０４を使用して、ｃＤＮＡ（マウスｃＤＮＡは２Ｂ４Ｔ細胞ハイブリドーマＲＮＡから作製した；ヒトＣＤ３ζｃＤＮＡはリンダ・シャーマン（Ｌｉｎｄａ Ｓｈｅｒｍａｎ）博士の研究室から恵与頂いた）から増幅した。ＫＣ３０４プライマーはまた５′停止コドンとスプライス部位をエンコードしていた。ＰＣＲ産物は配列決定のためにｐＧＥＭベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）からのオリジナルベクター）にクローン化した。正しいＣＤ３ζフラグメントを制限消化／ゲル精製により分離し、次いで、ＨｐａＩ／ＣｌａＩ消化ＤＯ１１．１０／ｐＧＥＭベクター（上記）に連結して、図１０に示すように、ｐＧＥＭ−ＴイージイにおけるＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ／マウスＣＤ３ζまたはＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ／ヒトＣＤ３ζ融合構築物を創生した。
【０３２９】
哺乳動物ＩｇＧカッパベクターｐＳＵＮ９（係属中米国特許出願番号０８／９４３，０８６に記載）は、ｓｃＴＣＲ／ＣＤ３ζ融合分子の発現用に選択した。発現ベクターおよび融合構築物（ｐＧＥＭ−Ｔイージイ内）は共にＡｇｅＩおよびＣｌａＩにて消化した。ｓｃＴＣＲ／ＣＤ３ζＤＮＡフラグメントを単離し、切断したｐＳＵＮ９ベクターに連結し、最終的哺乳動物細胞発現ベクターＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ／マウスＣＤ３ζおよびＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ／ヒトＣＤ３ζを創生した。
【０３３０】
Ｂ．膜結合ＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ／マウスＣＤ３ζ融合分子を発現する２Ｂ４細胞の生成
２Ｂ４Ｔ細胞ハイブリドーマはＢＷ５１４７細胞株をもつＢ１０．ＡマウスからのＴ細胞の融合産物である。２Ｂ４細胞は、ＩＥｋとの関連で提示された場合、ハト・シトクロムＣ（ＰＣＣ）を認識する。
【０３３１】
２Ｂ４細胞は冷ＤＰＢＳで洗浄することにより形質導入用に準備した。大よそ１０７個の細胞をＤＰＢＳに再懸濁し、２０μｇのＰｖｕＩ−線状化ＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ／マウスＣＤ３ζＤＮＡと混合した。氷上、５分後、細胞はジーン・パルサー（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ）（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ））セットを用いて、１パルス２５０ボルト、９６０μＦｄとして送達し、エレクトロポレーションを行った。パルス細胞を５分間氷上に放置した。細胞を１０ｍｌの１０％ＩＭＤＭに希釈し、Ｔ−２５ｃｍ２フラスコ中で３７℃一夜、５％ＣＯ２下で増殖した。
【０３３２】
２４時間後、細胞をＴ−７５ｃｍ２フラスコに移し、選択培地（すなわち、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８含有１０％ＦＢＳ−ＩＭＤＭ）４０ｍｌを加えた。３日後に、「バルク」２Ｂ４形質導入体を９６穴プレートに、選択培地中、１ウエル当たり、１０、１００または１０００個の細胞として塗布した。およそ２週間後、塗布した形質導入体をフローサイトメトリーによりＤＯ１１．１０の発現について選抜した。この細胞を、氷上、ビオチン化Ｆ２３．１ｍＡｂにより３０分間染色した。Ｆ２３．１ｍＡｂはＴＣＲ Ｖベータ８鎖の一部を検出する；従って、ＤＯ１１．１０ＴＣＲには結合するが、２Ｂ４ＴＣＲには結合しない。細胞を緩やかに回転し、上清を吸引して、ストレプトアビジン標識サイクローム（ＣｙＣｈｒｏｍｅ）を加えた。氷上１５分後、細胞を１％ＦＢＳ／ＤＰＢＳで２回洗浄し、再懸濁した。細胞染色の結果は、ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）ＦＡＣＳスキャン（ＦＡＣＳｃａｎ）装置により取得した。
【０３３３】
大よそ９０％の試験コロニーがＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ発現陽性であった。２つの候補化合物を限界希釈により一次クローニング用に選択した。
【０３３４】
２週間後、前記のようにフローサイトメトリーにより一次クローンを選抜した。ＣＤ４およびＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ発現レベルの様々な６つのクローンをさらなる評価研究のために選択した。組換えｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ複合体によるＴ細胞活性化の研究においてのこれらクローンの使用については、実施例１１に記載する。
【０３３５】
実施例８：組換えＴ細胞レセプターおよび組換えＣＤ４分子を担持するマウスＴ細胞株の生成
Ａ．膜結合ＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ／ＣＤ３ζ融合分子を発現するＢＷ５１４７細胞の生成
ＢＷ５１４７（ＢＷ）細胞株は、ＴＣＲアルファおよびベータ鎖の表面発現を欠失するマウス胸腺腫である（この細胞株は多くの場合、Ｔ細胞ハイブリドーマを生成するＴ細胞との融合パートナーとして使用する）。
【０３３６】
ＢＷ細胞は冷ＤＰＢＳで洗浄することにより形質導入用に準備した。大よそ１０７個の細胞をＤＰＢＳに再懸濁し、２０μｇのＰｖｕＩ−線状化ＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ／マウスＣＤ３ζＤＮＡと混合した。別のチューブでは、１０７個の細胞を２０μｇのＰｖｕＩ−線状化ＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ／ヒトＣＤ３ζＤＮＡと混合した。氷上、５分後、細胞はジーン・パルサー（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ）（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ））セットを用いて、１パルス２５０ボルト、９６０μＦｄとして送達し、エレクトロポレーションを行った。パルス細胞を５分間氷上に放置した。細胞を１０ｍｌの１０％ＩＭＤＭに希釈し、Ｔ−２５ｃｍ２フラスコ中で３７℃一夜、５％ＣＯ２下で増殖した。
【０３３７】
２４時間後、細胞をＴ−７５ｃｍ２フラスコに移し、選択培地（すなわち、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８含有１０％ＦＢＳ−ＩＭＤＭ）４０ｍｌをそれぞれに加えた。３日後に、「バルク」ＢＷ形質導入体を９６穴プレートに、選択培地中、１ウエル当たり、１０、１００または１０００個の細胞として塗布した。「バルク」形質導入した培養物についてもそれぞれ維持した。
【０３３８】
大よそ２週間後、「バルク」形質導入した培養物をフローサイトメトリーにより陽性の形質導入体について選抜した。この細胞を、氷上、ＦＩＴＣ−接合Ｈ５７−５９７ｍＡｂにより３０分間染色した。Ｈ５７−５９７ｍＡｂはＴＣＲ Ｃβ鎖の線状エピトープを検出する。細胞を１％ＦＢＳ／ＤＰＢＳで２回洗浄した後、同じバッファーに再懸濁した。細胞染色の結果は、ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）ＦＡＣＳスキャン（ＦＡＣＳｃａｎ）装置により得た。「バルク」形質導入した培養物は、図１１に示すように、広範なＴＣＲ発現を示した。
【０３３９】
「バルク」形質導入した培養物は、固定化Ｈ５７−５９７ｍＡｂを用いて、活性化アッセイにより試験した。９６穴プレートを３００ｎｇ／ウエルのｍＡｂで一夜被覆した。翌日、１０５個の細胞を各ウエルに加え、５％ＣＯ２下、３７℃で一夜インキュベートすることによりアッセイした。アッセイからの上清を前記のようにマウスＩＬ−２サンドイッチＥＬＩＳＡにより試験した（ＷＯ９９／２１５７２；ＵＳＳＮ０９／２０４，９７９）。「バルク」形質導入した培養物は特異的に刺激を受け、本アッセイに基づくＩＬ−２を産生した。
【０３４０】
１０００細胞／ウエルプレート上で増殖した形質導入体は、実施例７に記載のように、ＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ／マウスＣＤ３ζ分子の発現について、フローサイトメトリーにより選抜した。試験した候補化合物の１／３ないし２／３が、ＴＣＲ発現陽性であった。発現レベルの最も高いＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ／マウスＣＤ３ζ形質導入体（ＢＷ／Ｄ−Ｚ＃８）を一次クローン化し、展開して、さらに評価した。
【０３４１】
ＢＷ／Ｄ−Ｚ＃８からの一次クローンをフローサイトメトリーにより選抜した。一つのクローン（＃８−３９）を最良の細胞株として選択し、さらに特性を検討するために使用した。
【０３４２】
ＢＷ／Ｄ−Ｚ細胞株は、ｓｃＴＣＲ遺伝子をクローン化した当初のＴ細胞ハイブリドーマＤＯ１１．１０に比較することとした。２つの細胞株を並べて染色すると、形質導入したＢＷ細胞上のＴＣＲ発現レベルが、Ｈ５７−５９７ｍＡｂにより染め出された本来のＴ細胞ハイブリドーマにおけるよりも高いことが明瞭であった。両細胞株を刺激して、ＯＶＡペプチドを負荷したＡＰＣ（Ａ２０細胞）の存在下にＩＬ−２を産生させた。しかし、精製一本鎖ＩＡｄ／ＯＶＡをプレートに固定化した場合、ＤＯ１１．１０Ｔ細胞ハイブリドーマは活性化されたが、ＢＷ／Ｄ−Ｚ細胞株は検出し得るレベルのＩＬ−２を産生し得なかった。これは、ＭＨＣ抗原／ＴＣＲ相互作用の安定化に関与するアクセサリー分子が、活性化アッセイにおいて欠失成分となっていると信じられた。ＣＤ４分子は最も理に適った選択であったが、その理由は、それがＭＨＣ分子に結合するＴＣＲに直接関与し、ＢＷ／Ｄ−Ｚ細胞はその表面にＣＤ４を発現しないからである。
【０３４３】
Ｂ．膜結合ＣＤ４レセプター発現用ベクターの構築
この構築に使用するＣＤ４レセプターは、当初、マウスＴ細胞ハイブリドーマＧＤ１２から生成したｃＤＮＡのＰＣＲ増幅により分離した（Ｇｒａｍｍｅｒ， Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４５： ２４９ （１９９０））。
【０３４４】
２つの異なるＣＤ４レセプターを構築した：細胞外、膜貫通（ＴＭ）および細胞質（ＣＭ）ドメインを含む完全長遺伝子、並びに細胞質ドメインを欠失する端部切断レセプター。後者の構築物は、ＣＤ４細胞外レセプタードメインのＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド相互作用に対する寄与、およびその細胞質ドメインを介するこの相互作用の増幅への寄与を解明するために着想したものである。
２つのＣＤ４レセプター遺伝子はＰＣＲにより生成させ、発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１：Ｈｙｇｒｏ＋にクローン化した。
【０３４５】
完全長ＣＤ４遺伝子を生成させるために、２種のオリゴヌクレオチドプライマー（表１４参照）を設計し、ＣＤ４レセプター遺伝子の全オープンリーディングフレームと１６９ｂｐの上流配列を含む１５５０ｂｐのＰＣＲフラグメントを増幅した。オリゴヌクレオチドＣＤＦ１およびＣＤＦ３をＰＣＲに用いて、完全長ＣＤ４遺伝子を増幅し、一方、ＣＤＦ１およびＣＤＦ４を用いてＣＤ４デルタＣＭ遺伝子を増幅した。両ＤＮＡフラグメントは近接するＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ制限部位をもつように構築した。ＸｈｏＩ部位はＣＤ４の開始メチオニンの９５ｂｐ上流に存在するので、完全長遺伝子をクローン化するために、１４８０ｂｐのＸｈｏＩフラグメントを生成させ、ＸｈｏＩ消化ｐＣＤＮＡ３．１Ｈｙｇｒｏ＋ベクター（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））に連結した。得られるプラスミドをＢｇｌＩＩで線状化し、（実施例７に記載したように）ＢＷ／Ｄ−Ｚ細胞に形質導入するために使用した。
【０３４６】
末端切除ＣＤ４遺伝子を生成させるために、同様の戦略を考案した。オリゴヌクレオチドプライマーＣＤＦ１およびＣＤＦ４を用い、細胞質ドメインを欠失するＣＤ４レセプター遺伝子のオープンリーディングフレームと１６９ｂｐの上流配列を含む１４９７ｂｐのＰＣＲフラグメントを増幅した。このフラグメントはＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ制限部位が隣接していた。ＸｈｏＩ部位は開始メチオニンの９５ｂｐ上流に存在する。１４２７ｂｐのＸｈｏＩフラグメントはＸｈｏＩ消化ｐＣＤＮＡ３．１Ｈｙｇｒｏ＋ベクター（クロンテック）に連結し、得られるプラスミドをＢｇｌＩＩで線状化し、ＢＷ／Ｄ−Ｚ細胞に形質導入するために使用した。
【０３４７】
【表１４】
2004501364.tif 000016
【０３４８】
Ｃ．膜結合ＣＤ４レセプターを発現するＢＷ：Ｄ−Ｚ細胞の生成
完全長または末端切除したＣＤ４遺伝子で形質導入したＢＷ／Ｄ−Ｚ細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含有するＩＭＤＭ培地中で増殖させた。耐性コロニーを限界希釈によりクローン化し、ＣＤ４レセプターの表面発現についてＦＡＣＳ分析により試験した。約１０５個の細胞をＦＩＴＣ標識ラット抗マウスＣＤ４抗体（ファーミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ））と、１％血清含有ＰＢＳ５０μｌ中、混合した。組換えＣＤ４レセプターの細胞表面発現について、図１２Ａに示すように、フローサイトメトリーにより分析した。
【０３４９】
陽性クローンはＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲの膜結合発現について、ＦＡＣＳ分析により試験した。約１０５個の細胞を抗−ＴＣＲベータ鎖ビオチン化抗体Ｈ５７と混合した。細胞を洗い、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣと混合し、図１２Ｂに示すように、フローサイトメトリーにより分析した。試験した二重陽性細胞株の中、ＢＷＤＺ：ＣＤ４＋（２Ｅ１１）およびＢＷＤＺ：デルタＣＭ（Ｄ６）を、同族体ＯＶＡ−ペプチド提示細胞（ＡＰＣ）を用いるさらなるＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド相互作用研究のために選択した。実施例１２に記載した固定化組換えｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ分子による刺激の検討に、同じＴ細胞株を使用した。
【０３５０】
Ｄ．ペプチド負荷ＡＰＣによるＢＷＤＺ：ＣＤ４＋Ｔ細胞の刺激
ＢＷＤＺ：ＣＤ４＋細胞が同族体ＡＰＣにより刺激を受けることを証明するために、Ａ２０細胞をＯＶＡペプチドと混合した。ＡＰＣを二倍段階希釈し、１０５個のＴ細胞と混合した。細胞混合物を１０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭ培地２００μｌ中、３７℃で一夜インキュベートした。培地中のＩＬ−２産生を、前記のＩＬ−２特異ＥＬＩＳＡにより定量した。ＩＬ−２の産生は、図１３に示すように、Ｔ細胞刺激の程度を示す。ＤＯ１１．１０細胞は陽性コントロールとして用い、ＢＷ細胞は陰性コントロールとして用いた。ＣＤ４を発現する２種の細胞株のＩＬ−２産生を、２Ｂ４／ＤＺと比較した。完全長ＣＤ４アクセサリー分子を付加すると、ＢＷ／ＤＺ細胞のＩＬ−２産生はＤＯ１１．１０細胞の７５％〜８０％まで回復した。細胞質ドメインを欠失する末端切除ＣＤ４分子は、比較すると、僅かに１０％の回復であった。予測されるとおり、ＣＤ４細胞質ドメインは、ｌｃｋ５６のリクルートを介してＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド相互作用の増幅において主たる役割を演じる。
【０３５１】
実施例９：組換えヒトＴ細胞レセプターを発現するヒトＴ細胞株の生成
Ａ．ヒトＭＢＰ反応性細胞株Ｅ１１からＴＣＲαおよびβ鎖のｃＤＮＡクローンを含有するベクターの構築
ヒトＴ細胞株Ｅ１１はヒトＭＨＣＩＩタンパク質ＨＬＡ−ＤＲ２（ＤＲＢ１＊１５０１）との関連で、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ８３−１０２、ＹＤＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴＰＰ）からのペプチドを認識し、かつそれと反応する。このものは当初、多発性硬化症の患者から単離されたものであり、コリキサ・コープ（Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐ．）が凍結細胞ペレットとして我々に提供した。
【０３５２】
全ＲＮＡはキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）からのＲＮイージイ（ＲＮｅａｓｙ）キットを用い、１×１０８個の細胞から調製した。ＲＬＴ（溶菌）バッファーに希釈した後、調製物をさらに処理加工するために、１×１０７個の細胞に等量分割した。最終ＲＮＡ濃度は分光測光法により定量した。第一鎖ｃＤＮＡは、５′ＲＡＣＥｃＤＮＡ合成プライマーおよびＳＭＡＲＴＩＩオリゴ（クロンテック（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、メンローパーク（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ）、カリフォルニア）を用い、業者の使用者マニュアル（ＰＴ３２６９−１、１９９９年３月）にある説明どおりに調製した。使用したオリゴヌクレオチドを表１５に掲載する。第一鎖（ＲＡＣＥ）のＰＣＲ増幅は、次の場合を除き、指示どおりに実施した：反応容量は二倍の１００μｌとし、ＥｘＴａｑ酵素とバッファー（パンベラ・コープ（Ｐａｎｖｅｒａ Ｃｏｒｐ．））を用いた。この反応に使用する遺伝子特異プライマーは、αおよびβ鎖の定常領域、可変領域（「Ｎ末端」）に密接して、または末端（「Ｃ末端」）位もしくはその近傍に準備した。ＲＡＣＥ反応は４つすべての組み合わせに対して期待通りのサイズの産物を生じ、これらの産物は、次いで配列分析のためにｐＧＥＭ−Ｔイージイ（プロメガ・コープ、マジソン、ウィスコンシン）にクローン化した。１２種のβ鎖候補化合物を分析して、２つの可変領域遺伝子配列を得た；１２のクローンの中、１１種はＴＲＶＢ１２−４であり、１２クローンの中の一つはＴＲＶＢ１４であった（ＩＧＭＴ命名法については、インムノジーンティック（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）データベース参照：ｈｔｔｐ；／／ｉｍｇｔ．ｃｎｕｓｃ．ｆｒ：８１０４）。１４種のα鎖を分析して、ほぼ等しい頻度で２つの配列を得た；１４種のクローンの中、５種はＴＲＡＶ９ｓ１であり、１４クローンの中、７種はＴＲＡＶ２２ｓ１であり、残りの２種はＴＲＡＶ１ｓ３とＴＲＡＶ４ｓ１であった（ＩＧＭＴ命名法）。
【０３５３】
【表１５】
2004501364.tif 000017
【０３５４】
Ｂ．ヒトＣＤ３ζへの融合体としてＴＣＲαおよびβ鎖のｃＤＮＡクローン含有哺乳動物発現ベクターのヒトＭＢＰ反応性細胞株Ｅ１１からの構築並びに哺乳動物細胞の形質導入
ＴＣＲαまたはβ鎖を含むキメラ分子を、ヒトＣＤ３ζの膜貫通および細胞質ドメインに遺伝子的に融合したＥ１１細胞株から構築した。インゲル（Ｅｎｇｅｌ）、オッテンホッフ（Ｏｔｔｅｎｈｏｆｆ）およびクラウスナー（Ｋｌａｕｓｎｅｒ）（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６： １３１８−１３２１， １９９２）は、ヒトについて下に記載したと同様に、マウスの構築物が、ラットの好塩基球白血病細胞株にて発現したとき、特異ＭＨＣ抗原分子によって活性化された細胞を生じることを証明した。
【０３５５】
β鎖ＴＲＶＢ１２−４とα鎖ＴＲＶＡ２２ｓ１と９ｓ１の可変領域およびその対応する定常領域を含むＥ１１クローンは、開始メチオニンの５′および膜貫通領域前の定常ドメインの末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を導入するためのプライマーでの増幅用鋳型として役立つ。増幅に使用するα鎖クローンはｐＴＶＷ４４３−１および−７（それぞれ、α９ｓ１および２２ｓ１）であり、それらを増幅するために使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、表１６に掲載する。簡単に説明すると、５′プライマーは制限部位ＳａｌＩとＫｐｎＩを含んでいた。３′プライマーは消化と連結によるヒトＣＤ３ζフラグメントとのインフレーム融合を可能とするＨｐａＩ制限部位を含んでいる（すなわち、実施例７に記載したＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ／ヒトＣＤ３ζｐＧＥＭ−Ｔイージイベクターにおいて）。増幅に用いるβ鎖クローンはｐＴＶＷ４４１−２（β１２−４）であった。この構築物の５′プライマーは、制限部位ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを含んでおり、３′プライマーはヒトＣＤ３ζに対するインフレーム融合のためのＨｐａＩ部位を含んでいた。記載のオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによる増幅は適切なフラグメントを生成するが、これらのフラグメントは次いでｐＧＥＭ−Ｔイージイにクローン化し、プラスミドｐＴＶＷ４５０−１、ｐＴＶＷ４５１−１およびｐＴＶＷ４４９−１（それぞれ、α９ｓ１、α２２ｓ１およびβ１２−４をエンコードするフラグメントを含む）とした。これらのプラスミドはＳａｌＩおよびＨｐａＩで消化し、同じ酵素で切断したＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ／ヒトＣＤ３ζｐＧＥＭ−Ｔイージイベクターにクローニングするために必要なフラグメントとした。得られるプラスミド、ｐＴＶＷ４５５−１、ｐＴＶＷ４５４−１およびｐＴＶＷ４５３−１（それぞれ、α９ｓ１、α２２ｓ１およびβ１２−４をエンコードする）は、ヒトＣＤ３ζ膜貫通および細胞質ドメインとインフレーム融合したＴＣＲαまたはβ鎖の細胞外ドメインを含んでいた。これらの融合フラグメントは、次いで、哺乳動物細胞での発現用のインビトロゲン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）（カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、カリフォルニア）のベクター、すなわち、β鎖用のｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｇ４１８選択）またはα鎖用のｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ハイグロ（ハイグロマイシン抗生物質耐性）に移入した。交互薬物耐性マーカーは、形質導入哺乳動物細胞において両プラスミド存在下での選択を可能とした。α９ｓ１／ｈＣＤ３ζフラグメントは、ＫｐｎＩからＮｏｔＩまでのフラグメントとしてｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ハイグロにクローン化した。α２２ｓ１／ｈＣＤ３ζフラグメントは、制限酵素ＳａｌＩで切断し、酵素Ｔ４ポリメラーゼで補完することにより形成した平滑断端とＮｏｔＩ末端を含むフラグメントとしてｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ハイグロにクローン化した。対応するｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ハイグロベクターは、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで補完し、次いでＮｏｔＩで切断することにより調製した。β１２−４／ｈＣＤ３ｚフラグメントは、ＨｉｎｄＩＩＩからＮｏｔＩまでのフラグメントとしてｐｃＤＮＡ３．１（＋）にクローン化した。これら��クローニング工程から得られるベクターは、ｐＴＶＷ４５６−１、ｐＴＶＷ４５９−１およびｐＴＶＷ４５７−１と指定し、それぞれα９ｓ１／ｈＣＤ３ζ、α２２ｓ１／ｈＣＤ３ζおよびβ１２−４／ｈＣＤ３ζを含んでいる。
【０３５６】
【表１６】
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【０３５７】
ヒトＴ細胞株Ｊ．ＲＴ３（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−１５３）は、ＴＣＲ−ｈＣＤ３ζ融合体を形質導入するために選択したものであり、ＴＣＲβ鎖を発現しないジャーカットリンパ芽球株の誘導体である。これらの細胞はエレクトロポレーションにより、プラスミドｐＴＶＷ４５６−１、ｐＴＶＷ４５９−１およびｐＴＶＷ４５７−１単独で、またはα鎖＋β鎖の対、すなわち、ｐＴＶＷ４５６−１＋ｐＴＶＷ４５７−１またはｐＴＶＷ４５９−１＋ｐＴＶＷ４５７−１として形質導入した。形質導入体の選択は適切な抗生物質、Ｇ４１８またはハイグロマイシンまたはその両方を用いて実施した。二重の選択（両抗生物質使用）は２段階で実施した。細胞は形質導入し、抗生物質不含培地で１〜２日間増殖した。次いで、形質導入体の増殖をＧ４１８含有培地にて選択した。７日後に、ハイグロマイシンを増殖培地に添加した。ＴＣＲ融合分子の発現は、抗体で染色した細胞のＦＡＣＳ分析により評価した。該抗体はＴ−細胞レセプター複合体のヒトα／β鎖の単形性決定基（クローンＢＭＡ０３１、ベックマン・クールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、マイアミ、フロリダ）または該複合体の特異的β鎖可変領域（クローン５６Ｃ５、ベックマン・クールター）を検出するものである。これらの細胞はＤＲ２制限抗原提示細胞ＤＯ２０８９１５（ジョン・ホプキンス・ラボラトリーズ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ボルチモア、メリーランド）により活性化されるかをアッセイするものであり、該細胞はアミノ酸残基８３〜１０２個を含むヒトＭＢＰペプチド（アミノ酸配列：ＹＤＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴＰＰ）でパルスし、α鎖とβ鎖の組み合わせが機能的ＴＣＲを生じることを確認してあった。スクリーニングアッセイに組換えＴ細胞を使用することについては、実施例１３に記載する。
【０３５８】
以下の実施例はＭＨＣ／ペプチド複合体からなるＭＨＣ抗原を用いての本発明の種々のスクリーニング方法論に関する。
【０３５９】
実施例１０：細胞に基づくＴ細胞活性化アッセイの使用によるＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド相互作用を阻害する化合物の同定
Ｔ細胞に基づくスクリーニングアッセイは、ＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド相互作用のインヒビターを検出するために開発した。通常、Ｔ細胞は、それらの表面に特異的ＭＨＣ／ペプチド複合体を担持する抗原提示細胞（ＡＰＣ）と接触させたときに活性化される。例えば、ＯＶＡペプチドでパルスしたＩＡｄ−陽性Ａ２０ＡＰＣとインキュベーションすると、ＤＯ１１．１０Ｔ細胞は活性化されて、ＩＬ−２を産生する。多くの異なる細胞表面レセプター間の相互作用はＴ細胞応答のレベルに関係するが、ＤＯ１１．１０ＴＣＲとＯＶＡ／ＩＡｄ複合体間の特異的相互作用は応答開始のために必要とされる。ＴＣＲとＭＨＣ／ペプチド複合体間の相互作用のみによる応答を他の表面レセプターが関係する応答と区別するために、精製組換え一本鎖ＭＨＣ／ペプチド複合体によりＴ細胞応答を刺激するアッセイ方法を開発した。この方法は、以前に記載されている異なるＭＨＣ／ペプチド複合体に応答するＴ細胞の能力をモニターするために使用することができる（ＵＳＳＮ０９／２０４，９７９）。この方法は、ＭＨＣ／ペプチド複合体に応答するＴ細胞の能力を阻害または刺激する化合物を検出するのに特に有用である。
【０３６０】
とりわけ興味深いのは、低分子量化合物、例えば、ＭＨＣ／ペプチド複合体に応答するＴ細胞を阻害またはそれに拮抗する有機化合物、ペプチドおよび核酸類の検出である。より具体的には、ＴＣＲとＭＨＣ／ペプチド複合体間の相互作用に拮抗する低分子化合物の検出に大きな関心がある。かかる化合物は、免疫疾患治療のための免疫抑制剤候補の開発に有益である。ＭＨＣ／ペプチド複合体に応答するＴ細胞の能力を刺激する化合物は、ワクチン対策の展開に有益である。
【０３６１】
膨大な数の化合物の分析を容易にするために、「二重」アッセイフォーマットを開発したが、このフォーマットでは、Ｔ細胞の刺激とＴ細胞応答の測定の両方を、図５Ｂに示すように、マイクロタイタープレートの単一のウエルで実施することができる。このアッセイでは、抗−サイトカインｍＡｂと刺激性ｓｃ−ＭＨＣ／ペプチド複合体をウエルに固定化する。ＭＨＣ／ペプチド−制限Ｔ細胞は、可溶性試験化合物または化合物の希釈物とともにこのウエルに加える。活性化Ｔ細胞により産生されたサイトカインは、抗−サイトカイン抗体が捕捉する。一定時間インキュベーションした後、Ｔ細胞と化合物を除き、ウエルを洗浄して二次抗−サイトカインｍＡｂを加えて、Ｔ細胞が産生したサイトカイン量を検出するようにする。固定化ｓｃ−ＭＨＣ／ペプチド複合体によるＴ細胞刺激を阻害する化合物は、希釈した化合物を容れたウエルで観察されるよりも、サイトカインの産生を低下させる。
【０３６２】
例えば、精製したｓｃＩＡｄ／ＯＶＡタンパク質５０ｎｇとラット抗−マウスＩＬ−２ｍＡｂ（ファーミンゲン・パーツ番号１８１６１Ｄ）１００ｎｇとを、同時に、９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク・マキシソープ）のウエルにＰＢＳ（セルグロ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）カタログ番号２１−０３１−ｃｖ）５０μｌ中で被覆した。２４時間後に、被覆溶液を除き、ウエルに２．５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；シグマ・パーツ番号２６５０）含有培地（１０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭ）１００μｌまたは２．５％ＤＭＳＯ中に試験化合物を含む培地１００μｌを容れた。次いで、ＤＯ１１．１０Ｔ細胞（培地１００μｌ中１×１０５細胞）を加えた。１０％ＣＯ２下、３７℃で８時間インキュベーションした後、細胞を除き、ウエルを１％トリトンＸ−１００含有トリス緩衝塩溶液で洗浄した。ビオチン化抗−ＩＬ−２ｍＡｂ（ファーミンゲン・パーツ番号１８１７２Ｄ）（１０％ＦＢＳ含有ＰＢＳ１００μｌ中１００ｎｇ）を各ウエルに加えた。４℃で一夜インキュベーションした後、ウエルを洗浄し、１０％ＦＢＳ−ＰＢＳ１００μｌ中のアビジンペルオキシダーゼ（シグマ・パーツ番号Ａ３１５１）２５０ｎｇを各ウエルに加えた。３７℃３０分後、ウエルを洗い、ＴＭＢ基質（バイオＦＸラボラトリーズ・カタログ番号ＴＭＢＷ−０１００−０１）１００μｌを加えた。基質反応を１Ｍ硫酸で停止させ、ＴＭＢ発色団産物の吸光度を４５０ｎｍで読み取った。このアッセイにおいて、吸光度の読み取り値は、細胞が産生したＩＬ−２量と相関する。
【０３６３】
各アッセイ成分を滴定することにより、シグナル／ノイズ比５以上を達成した。化学ライブラリーからの小型分子２０００種につき、上記アッセイフォーマットでＩＬ−２産生を阻害するか、試験した。各プレートの複数ウエルに希釈化合物（ＤＭＳＯ）を容れ、ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ刺激ＤＯ１１．１０Ｔ細胞が産生するＩＬ−２量を確定した。ＩＬ−２産生量を有意に低下させた化合物、すなわち、本アッセイで標準偏差が３を超えるＩＬ−２吸光度読み取り値が、希釈剤ウエルで観察されるよりも低い値を示した化合物について、さらに評価した。
【０３６４】
例えば、アッセイプレート５−２において、ＤＯ１１．１０Ｔ細胞刺激は、コントロール化合物の希釈剤としてＤＭＳＯを用い、上記のように８個のウエルでアッセイした。これらウエルでの平均ＩＬ−２吸光度読み取り値は２．１９８であり、標準偏差は０．２４８であった。４０種の化合物につき、このマイクロタイタープレート上で二重測定を実施した。２種の化合物（５Ｅ１１および５Ｆ６）が、コントロール（平均値−３ＳＤ＝１．４５４）よりも有意に低いＩＬ−２吸光度読み取り値（それぞれ、１．２５６および０．１３６）を示し、これらの化合物がｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ刺激ＤＯ１１．１０Ｔ細胞によるＩＬ−２産生を阻害することを示している。他の３８種の化合物を収容したウエルの平均ＩＬ−２吸光度読み取り値は、１．４５４未満となることはなく、これが阻害応答の範囲を示している。試験した２０００種の化合物の中、４６種がこのアッセイフォーマットにおいてｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ刺激ＤＯ１１．１０Ｔ細胞によるＩＬ−２産生を阻害することが、繰り返し認められた。
【０３６５】
阻害作用がｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ：ＤＯ１１．１０ＴＣＲ相互作用の特異的干渉によるかどうか、また他の非特異的阻害起源によるものではないのかを決めるために、抗−ＣＤ３ｍＡｂによるＴ細胞刺激に対する阻害化合物の影響を評価した。抗−ＣＤ３抗体は、ＭＨＣ／ペプチド複合体が認識する部位とは異なる部位でＴＣＲ／ＣＤ３複合体に結合することができる。この抗体をウエルに固定化した場合、ＤＯ１１．１０Ｔ細胞によるＩＬ−２産生を刺激することができる。このアッセイのために、抗−ＣＤ３抗体（ファーミンゲン・パーツ番号０１５１１Ｄ）２５ｎｇおよびラット抗−マウスＩＬ−２ｍＡｂ１００ｎｇを９６穴マイクロタイタープレートのウエルにＰＢＳ５０μｌ中で同時に被覆した。２４時間後、被覆溶液を除き、ウエルに２．５％ジメチルスルホキシド含有培地（１０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭ）１００μｌまたは２．５％ＤＭＳＯ中に試験化合物を含む培地１００μｌを容れた。次いで、ＤＯ１１．１０Ｔ細胞（培地１００μｌ中１×１０５細胞）を加えた。１０％ＣＯ２下、３７℃で８時間インキュベーションした後、細胞を除き、ウエルを１％トリトンＸ−１００含有トリス緩衝塩溶液で洗浄した。ビオチン化抗−ＩＬ−２ｍＡｂ（１０％ＦＢＳ含有ＰＢＳ１００μｌ中１００ｎｇ）を各ウエルに加えた。４℃で一夜インキュベーションした後、ウエルを洗浄し、１０％ＦＢＳ−ＰＢＳ１００μｌ中のアビジンペルオキシダーゼ２５０ｎｇを各ウエルに加えた。３７℃３０分後、ウエルを洗い、ＴＭＢ基質１００μｌを加えた。基質反応を１Ｍ硫酸で停止させ、ＴＭＢ産物の吸光度を４５０ｎｍで読み取った。代表的なアッセイ結果を図１４に示す。ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ介在刺激を阻害した３０種の化合物は、抗−ＣＤ３アッセイにおいて、微々たるＩＬ−２産生阻害しか示さないことが判明した。これらの結果は、これらの化合物が、ＭＨＣ／ペプチド依存性刺激を阻害するにもかかわらず、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介する刺激に対して応答するＴ細胞の能力には影響しないことを示している。従って、これらの化合物は、ＩＬ−２の産生または放出に導く細胞間メカニズムの阻害を介して作用するとは思われない。
【０３６６】
この３０種の阻害化合物について、次いで、ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡおよび抗−ＣＤ３Ａｂアッセイにおいて滴定し、ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ介在刺激を用量依存的に阻害することを示した。これら滴定曲線の例を図１５Ａおよび１５Ｂに示し、３０種の阻害化合物の中の代表的なものを図１６に示す。
【０３６７】
阻害作用がｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ複合体中のＯＶＡペプチドとの相互作用に特異的なものであったのかどうかを決定するために、ｓｃＩＡｄ／ＧＤによるＴ細胞刺激に対する阻害化合物の影響を評価した。固定化したｓｃＩＡｄ／ＧＤがＧＤ１２Ｔ細胞ハイブリドーマを刺激してＩＬ−２を産生させることは、以前に示されている。当該阻害化合物もまたＧＤ１２細胞に影響を与えるかどうかを試験するために、精製したｓｃＩＡｄ／ＧＤタンパク質１００ｎｇとラット抗−マウスＩＬ−２ｍＡｂ１００ｎｇとを、同時に、９６穴マイクロタイタープレートのウエルにＰＢＳ５０μｌ中で被覆した。２４時間後に、被覆溶液を除き、ウエルに２．５％ジメチルスルホキシド含有培地（１０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭ）１００μｌまたは２．５％ＤＭＳＯ中に試験化合物を含む培地１００μｌを容れた。次いで、ＧＤ１２Ｔ細胞（培地１００μｌ中１×１０５細胞）を加えた。１０％ＣＯ２下、３７℃で８時間インキュベーションした後、細胞を除き、ウエルを１％トリトンＸ−１００含有トリス緩衝塩溶液で洗浄した。ビオチン化抗−ＩＬ−２ｍＡｂ（１０％ＦＢＳ含有ＰＢＳ１００μｌ中１００ｎｇ）を各ウエルに加えた。４℃で一夜インキュベーションした後、ウエルを洗浄し、１０％ＦＢＳ−ＰＢＳ１００μｌ中のアビジンペルオキシダーゼ２５０ｎｇを各ウエルに加えた。３７℃３０分後、ウエルを洗い、ＴＭＢ基質１００μｌを加えた。基質反応を１Ｍ硫酸で停止させ、ＴＭＢ産物の吸光度を４５０ｎｍで読み取った。ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ介在ＤＯ１１．１０刺激を阻害した化合物はすべてｓｃＩＡｄ／ＧＤ刺激ＧＤ１２細胞によるＩＬ−２産生をも阻害し、当該化合物がペプチドに特異的な様式で刺激を阻害するのではないことを示した。
【０３６８】
阻害化合物の特異性について、異なるＭＨＣ／ペプチド：Ｔ細胞の組み合わせによりさらに検討した。実施例１に記載したように、ＩＥｋ／ＰＣＣを一本鎖ＭＨＣクラスＩＩ分子として構築し、それが２Ｂ４Ｔ細胞を活性化してＩＬ−２を分泌させることを見出した。二重フォーマットアッセイ法を２Ｂ４細胞とｓｃＩＥｋ／ＰＣＣタンパク質を用いて上記のように開発した。このアッセイでは、精製したｓｃＩＥｋ／ＰＣＣタンパク質２００ｎｇとラット抗−マウスＩＬ−２ｍＡｂ１００ｎｇとを、同時に、９６穴マイクロタイタープレートのウエルにＰＢＳ５０μｌ中で被覆した。２４時間後に、被覆溶液を除き、ウエルに２．５％ジメチルスルホキシド含有培地（１０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭ）１００μｌまたは２．５％ＤＭＳＯ中に試験化合物を含む培地１００μｌを容れた。次いで、２Ｂ４Ｔ細胞（培地１００μｌ中１×１０５細胞）を加えた。１０％ＣＯ２下、３７℃で８時間インキュベーションした後、細胞を除き、ウエルを１％トリトンＸ−１００含有トリス緩衝塩溶液で洗浄した。ビオチン化抗−ＩＬ−２ｍＡｂ（１０％ＦＢＳ含有ＰＢＳ１００μｌ中１００ｎｇ）を各ウエルに加えた。４℃で一夜インキュベーションした後、ウエルを洗浄し、１０％ＦＢＳ−ＰＢＳ１００μｌ中のアビジンペルオキシダーゼ２５０ｎｇを各ウエルに加えた。３７℃３０分後、ウエルを洗い、ＴＭＢ基質１００μｌを加えた。基質反応を１Ｍ硫酸で停止させ、ＴＭＢ産物の吸光度を４５０ｎｍで読み取った。抗−ＣＤ３Ａｂに比較して、固定化ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡでのＩＬ−２分泌により強い阻害を示した２２種の小型分子について、ｓｃＩＥｋ／ＰＣＣ：２Ｂ４アッセイにより試験した。一つの小型分子（４２７−Ｆ８）は、ＩＬ−２の分泌で測定した場合、ｓｃＩＥｋ／ＰＣＣ：２Ｂ４Ｔ細胞相互作用よりもｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ：ＤＯ１１．１０Ｔ細胞相互作用のより強い阻害作用を示した。両方のアッセイにおいて、４２７−Ｆ８を多数回投与したときの阻害率を示す典型的な滴定曲線を表１７に示す。３回の別々のアッセイにおいて同様の結果を観察した。この結果は、試験化合物がＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド相互作用の阻害に対しある程度の特異性を示し得ることを示唆している。
【０３６９】
【表１７】
2004501364.tif 000019
【０３７０】
阻害化合物の活性はさらに刺激アッセイにより検討したが、当該アッセイでは、表面に適切なＭＨＣを担持する抗原提示細胞（ＡＰＣ）に外来性ペプチドを負荷し、それを用いてインビトロでＴ細胞応答を刺激する。このアッセイにおいては、抗−ＩＬ−２抗体１００ｎｇを９６穴マイクロタイタープレートのウエルに被覆した。２４時間後に、被覆溶液を除き、ウエルに、培地（１０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭ）１００μｌ中２×１０５個のＡ２０細胞（ＩＡｄ分子担持ＡＰＣ）、培地１０μｌ中ＯＶＡペプチド５μｇ、培地１００μｌ中１×１０５個のＤＯ１１．１０Ｔ細胞、およびＰＢＳ中の試験化合物５μｌを容れた。１０％ＣＯ２下、３７℃で３時間インキュベーションした後、細胞を除き、ウエルを１％トリトンＸ−１００含有トリス緩衝塩溶液で洗浄した。ビオチン化抗−ＩＬ−２ｍＡｂ（ファーミンゲン・パーツ番号１８１７２Ｄ）（１０％ＦＢＳ含有ＰＢＳ１００μｌ中１００ｎｇ）を各ウエルに加えた。３７℃で１時間経過後、ウエルを洗浄し、１０％ＦＢＳ−ＰＢＳ１００μｌ中のアビジンペルオキシダーゼ（シグマ・パーツ番号Ａ３１５１）２５０ｎｇを各ウエルに加えた。３７℃３０分後、ウエルを洗い、ＡＢＴＳ基質（バイオＦＸラボラトリーズ）１００μｌを加えた。基質反応を発色させ、４０５ｎｍで吸光度を読み取った。吸光度の読み取り値は、ＤＯ１１．１０ＴＣＲと相互作用し、ＩＬ−２産生を刺激するＡ２０細胞上のＯＶＡペプチド−負荷ＩＡｄ分子の能力と相関する。ＭＨＣ／ペプチド複合体とＴＣＲ間の相互作用と拮抗する化合物の能力は、４０５ｎｍでの吸光度読み取り値の低下として測定する。候補阻害化合物についてのこれらの典型的な研究結果を表１８に示すが、これらの結果は、該化合物がペプチド負荷ＡＰＣの能力を遮断し、Ｔ細胞応答を刺激し得ることを示している。
【０３７１】
【表１８】
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【０３７２】
要約すると、ＴＣＲ：ＭＨＣ抗原相互作用を妨害する物質を選抜する実用的な方法が開発された。
【０３７３】
実施例１１：表面ＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ−ＣＤ３ζ融合タンパク質を発現するように設計調製したＴ細胞ハイブリドーマを使用するスクリーニングアッセイの開発
目標は、ＴＣＲとＭＨＣ抗原分子間の相互作用に干渉し得るアゴニストおよびアンタゴニストを同定するための細胞−タンパク質に基づく方法を開発することであった。本実施例に記載するように、組換え一本鎖Ｔ細胞レセプターを発現する不死化Ｔ細胞株を用いて、アッセイフォーマットを開発した。この方法の利点は、膨大な数の試験化合物をスクリーニングするために、十分な量の細胞を生成させることができるということである。実施例７に記載したように、２Ｂ４マウスＴ細胞ハイブリドーマを用いて、３ドメインｓｃＴＣＲ−ＣＤ３ζ融合タンパク質としてＤＯ１１．１０ＴＣＲをその表面に発現する新規な細胞株を創生した。ＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ−ＣＤ３ζをエンコードするＤＮＡで形質導入した２Ｂ４Ｔ細胞では、図１７Ａに示すように、ＯＶＡペプチドでパルスしたＡ２０細胞とともに細胞をインキュベートすると、特異的な刺激が観察された。さらに、これらの同じ細胞は、ＧＤペプチドでパルスしたＡ２０細胞に露呈しても刺激されなかった。表面結合ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡを発現するＮＳＯミエローマ細胞（ＮＤＯ細胞）を使用するもう一つの実験では、図１８に示すように、ＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ形質導入Ｔハイブリドーマ細胞の刺激が観察された。ＮＤＯ細胞の存在下にインキュベートした（表面に２Ｂ４ＴＣＲを発現する）野生型２Ｂ４Ｔ細胞は非応答性であった。これらのデータは、ｓｃＴＣＲ−ＣＤ３ζ融合物が新しい抗原特異性をもつＴ細胞を再構築するために使用し得るという主張を支持するものである。
【０３７４】
上に考察したように、化学ライブラリーをスクリーニングする理想的な方法は、精製した組換えＭＨＣ／ペプチド複合体が刺激し得る細胞株を開発することであろう。表面ｓｃＴＣＲ−ＣＤ３ζ融合タンパク質を発現するように設計調製したＴ細胞株を刺激するために精製したＭＨＣ／ペプチド分子を使用するという概念を試験するために、１０００または１６０ｎｇのｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＩｇＭ融合タンパク質でウエルを被覆し、適切なＴ細胞を添加した。細胞刺激は培養上清に分泌されたＩＬ−２タンパク質をアッセイすることにより測定した。ＩＬ−２の検出はファーミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）から購入した１組の抗−マウスＩＬ−２抗体を用いて実施し、すでに記載されているサンドイッチＥＬＩＳＡフォーマットに使用した（Ｒｈｏｄｅ ｅｔ ａｌ． １９９６． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７： ４８８５）。コントロールウエルには組換えｓｃＩＡｄ／ＧＤ−ＩｇＭタンパク質を使用した以外、タンパク質を同じ濃度で被覆した。１０５個の２Ｂ４細胞または２Ｂ４形質導入体を、ウエル中、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で１４時間インキュベートした後、上清１００μｌを集め、ＩＬ−２についてアッセイした。図１９は１実験からの結果を示す。予期どおりに、ｓｃＩＡｄ／ｇＤ−ＩｇＭを被覆したコントロールウエルは、ＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ２Ｂ４形質導入体も野生型２Ｂ４Ｔ細胞をも刺激し得なかった。さらに重要なことは、形質導入体のみが固定化ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＩｇＭタンパク質で提示した場合にＩＬ−２を産生し、対照的に、同一のタンパク質は野生型の２Ｂ４Ｔ細胞を刺激しなかったことである。これらの結果は、組換えＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ−ＣＤ３ζをその表面に発現するＴ細胞は、固定化ＩＡｄ／ＯＶＡ複合体の存在下で効率的に刺激され得るが、ｓｃＩＡｄ／ＧＤ−ＩｇＭ複合体では刺激されないことを示す。
【０３７５】
形質導入細胞株を使用するスクリーニングアッセイ法をさらに開発するために、種々濃度の固定化ｓｃＩＡｄ分子を用いて、二重フォーマットアッセイ法を設定した。アッセイ条件は実施例１０に記載の条件と同じとした。このアッセイ結果を表１９に示す。これらの結果は、ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡおよびｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＩｇＭの両方がＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ形質導入体を刺激し得ることを示している。以前に観察したように、固定化したｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＩｇＭ分子は応答刺激において、固定化したｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ分子よりもより強力であった。形質導入体のペプチド特異性も観察された。ＭＨＣ抗原複合体に対しＩｇＭフォーマットを使用すると、多価フォーマットの使用がどの程度アッセイの感度を上昇させるかが分かる。
【０３７６】
【表１９】
2004501364.tif 000021
【０３７７】
上に示した結果に基づき、ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞株と固定化ＭＨＣ抗原分子を用いて、スクリーニング方法を開発することができた。例えば、精製したｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＩｇＭタンパク質とラット抗−マウスＩＬ−２ｍＡｂを５０μｌのＰＢＳ中、９６穴マイクロタイターのウエルに同時に被覆した。２４時間後に、被覆溶液を除き、ウエルに２．５％ジメチルスルホキシド含有培地（１０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭ）１００μｌまたは２．５％ＤＭＳＯ中に試験化合物を含む培地１００μｌを容れた。次いで、ＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ２Ｂ４形質導入体（培地１００μｌ中１×１０５細胞）を加えた。１０％ＣＯ２下、３７℃で８時間インキュベーションした後、細胞を除き、ウエルを１％トリトンＸ−１００含有トリス緩衝塩溶液で洗浄した。ビオチン化抗−ＩＬ−２ｍＡｂ（１０％ＦＢＳ含有ＰＢＳ１００μｌ中１００ｎｇ）を各ウエルに加えた。４℃で一夜インキュベーションした後、ウエルを洗浄し、１０％ＦＢＳ−ＰＢＳ１００μｌ中のアビジンペルオキシダーゼ２５０ｎｇを各ウエルに加えた。３７℃３０分後、ウエルを洗い、ＴＭＢ基質１００μｌを加えた。基質反応を０．１８Ｍ硫酸で停止させ、反応産物の吸光度を４５０ｎｍで読み取った。ＭＨＣ／ペプチド複合体と組換えＴＣＲ間の相互作用に拮抗する化合物の能力は、Ｔ細胞形質導入体が培地に分泌したサイトカイン量の低下として測定する。Ｔ細胞を刺激するＭＨＣ／ペプチド複合体の代わりに抗−ＴＣＲ Ａｂを用いるアッセイは、阻害性化合物がＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド複合体の相互作用に拮抗することにより作用するのか、または異なるメカニズムにより作用するのかを決定するために実施する。ＭＨＣ／ペプチド複合体によるＴ細胞刺激を阻害するが、抗−ＴＣＲ抗体による刺激を阻害しない化合物は、リード（手掛かりとなる）化合物として追求し得る。
【０３７８】
実施例１２：表面ＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ−ＣＤ３ζ融合タンパク質と組換えＣＤ４レセプターを発現するように設計調製したＴ細胞ハイブリドーマを使用するスクリーニングアッセイの開発
次の目標は、細胞に基づくスクリーニング方法をさらに精緻なものとすることであった。組換えＴ細胞は一本鎖ＴＣＲ−ＣＤ３ζ融合物とＣＤ４レセプターを細胞表面に発現するように設計調製した。これらの操作は、これらの細胞がＭＨＣ／ペプチド複合体により刺激を受けるようにすることができる。この手法の利点は、細胞を特定のアッセイパラメータに適するように設計し、最適化し得ることである。例えば、高レベルの組換えｓｃＴＣＲおよび／またはＣＤ４レセプターを発現する細胞は、ＭＨＣ／ペプチド複合体による刺激に、より高い感度を示し得る。実施例８に記載したように、安定なＢＷＤＺ−ＣＤ４＋Ｔ細胞形質導入体は、ＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ−ＣＤ３ζ融合タンパク質および組換えＣＤ４レセプター両方を細胞膜上に発現するように生成した。ＢＷＤＺ：ＣＤ４＋Ｔ細胞株の刺激に関わる精製ＭＨＣ／ペプチド分子を使用するという概念を試験するために、種々濃度のｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＩｇＭ融合タンパク質をウエルに被覆した。実施例１０に記載したように、ラット抗−マウスＩＬ−２抗体をウエルに被覆した。次いで、ＢＷＤＺ：ＣＤ４＋Ｔ細胞を添加し、Ｔ細胞の刺激は、実施例１０に記載したように、培養上清に分泌されたＩＬ−２をアッセイすることにより測定した。コントロールウエルは、組換えｓｃＩＡｄ／ＧＤ−ＩｇＭタンパク質を使用したこと以外、同じ濃度のタンパク質で被覆した。かかるアッセイの結果を表２０に示す。結果は、固定化したｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＩｇＭが特異的に表面ＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲおよびＣＤ４レセプターを発現する組換えＢＷＤＺ：ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激し得ること、また組換えＴ細胞株および固定化ＭＨＣ／ペプチド分子を用いるスクリーニング方法を開発し得たことを示している。
【０３７９】
【表２０】
2004501364.tif 000022
【０３８０】
例えば、精製したｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＩｇＭタンパク質およびラット抗−マウスＩＬ−２ｍＡｂを５０μｌのＰＢＳ中、９６穴マイクロタイターのウエルに同時に被覆した。２４時間後に、被覆溶液を除き、ウエルに２．５％ジメチルスルホキシド含有培地（１０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭ）１００μｌまたは２．５％ＤＭＳＯ中に試験化合物を含む培地１００μｌを容れた。次いで、ＢＷＤＺ：ＣＤ４＋形質導入体（培地１００μｌ中１×１０５細胞）を加えた。１０％ＣＯ２下、３７℃で８時間インキュベーションした後、細胞を除き、ウエルを１％トリトンＸ−１００含有トリス緩衝塩溶液で洗浄した。ビオチン化抗−ＩＬ−２ｍＡｂ（１０％ＦＢＳ含有ＰＢＳ１００μｌ中１００ｎｇ）を各ウエルに加えた。４℃で一夜インキュベーションした後、ウエルを洗浄し、１０％ＦＢＳ−ＰＢＳ１００μｌ中のアビジンペルオキシダーゼ２５０ｎｇを各ウエルに加えた。３７℃３０分後、ウエルを洗い、ＴＭＢ基質１００μｌを加えた。基質反応を０．１８Ｍ硫酸で停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。ＭＨＣ／ペプチド複合体と組換えＴＣＲ間の相互作用に拮抗する化合物の能力は、Ｔ細胞形質導入体が培地に分泌したサイトカイン量の低下として測定する。Ｔ細胞を刺激するＭＨＣ／ペプチド複合体の代わりに抗−ＴＣＲ Ａｂを用いるアッセイは、阻害性化合物がＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド複合体の相互作用に拮抗することにより作用するのか、または異なるメカニズムにより作用するのかを決定するために実施する。ＭＨＣ／ペプチド複合体によるＴ細胞刺激を阻害するが、抗−ＴＣＲ抗体による刺激を阻害しない化合物は、リード（手掛かりとなる）化合物として追求し得る。
【０３８１】
実施例１３：自己免疫ＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド相互作用のインヒビターを検出するための細胞に基づくスクリーニングアッセイ法の開発
我々の目標は、ヒト自己免疫疾患と関係するＴＣＲとＭＨＣ抗原分子間の相互作用に干渉し得るアンタゴニストを同定するための細胞−タンパク質に基づく方法をさらに開発することにあった。本実施例に記載するように、多発性硬化症の患者から分離したＴ細胞より誘導される組換えＴ細胞レセプターを発現する不死化Ｔ細胞株を用いて、アッセイフォーマットを考案した。ヒトＴ細胞株またはクローンを培養により大量に増殖させることは非常に困難であり、増殖を拡張した後では多くの場合、その抗原に対する特異性を失ってしまう。組換えＴ細胞を用いる手法の利点は、膨大な数の試験化合物をスクリーニングするために、十分な量の細胞を生成させることができるということである。実施例９に記載したように、ＴＣＲα鎖およびβ鎖は、ＭＢＰ制限ヒトＭＳ Ｔ細胞株Ｅ１１からクローン化した。ヒトＣＤ３ζ膜貫通および細胞質ドメインと枠内融合したＴＣＲα鎖およびβ鎖の細胞外ドメインを発現し得る発現ベクターを生成させ、不死化Ｔ細胞に形質導入した。形質導入した細胞はＭＢＰペプチド負荷ＤＲ２＋ＡＰＣによる刺激アッセイに使用する。Ｅ１１ ＴＣＲ形質導入細胞株を用い、その結果として、固定化したｓｃＤＲ２／ＭＢＰタンパク質によるスクリーニングアッセイ法を開発することができる。
【０３８２】
例えば、精製したｓｃＤＲ２／ＭＢＰ−ＩｇＧタンパク質（実施例４参照）および抗−ヒトＩＬ−２ｍＡｂを５０μｌのＰＢＳ中、９６穴マイクロタイターのウエルに同時に被覆した。組換えＴ細胞から直線的応答を引き出すために必要なｓｃＤＲ２／ＭＢＰ−ＩｇＧの量は実験的に決定する。２４時間後に、被覆溶液を除き、ウエルに２．５％ジメチルスルホキシド含有培地（１０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭ）１００μｌまたは２．５％ＤＭＳＯ中に試験化合物を含む培地１００μｌを容れた。次いで、Ｅ１１ ＴＣＲ Ｔ細胞形質導入体（培地１００μｌ中１×１０５細胞）を加えた。１０％ＣＯ２下、３７℃で８時間インキュベーションした後、細胞を除き、ウエルを１％トリトンＸ−１００含有トリス緩衝塩溶液で洗浄した。ビオチン化抗−ＩＬ−２ｍＡｂ（１０％ＦＢＳ含有ＰＢＳ１００μｌ中１００ｎｇ）を各ウエルに加えた。４℃で一夜インキュベーションした後、ウエルを洗浄し、１０％ＦＢＳ−ＰＢＳ１００μｌ中のアビジンペルオキシダーゼ２５０ｎｇを各ウエルに加えた。３７℃３０分後、ウエルを洗い、ＴＭＢ基質１００μｌを加えた。基質反応を０．１８Ｍ硫酸で停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。ＭＨＣ／ペプチド複合体と組換えＴＣＲ間の相互作用に拮抗する化合物の能力は、Ｔ細胞形質導入体が培地に分泌したサイトカイン量の低下として測定する。Ｔ細胞を刺激するＭＨＣ／ペプチド複合体の代わりに抗−ＴＣＲ Ａｂを用いるアッセイは、阻害性化合物がＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド複合体の相互作用に拮抗することにより作用するのか、または異なるメカニズムにより作用するのか、を決定するために実施する。ＭＨＣ／ペプチド複合体によるＴ細胞刺激は阻害するが、抗−ＴＣＲ抗体による刺激は阻害しない化合物は、リード（手掛かりとなる）化合物として追求し得る。
【０３８３】
実施例１４：ＴＣＲ：ＭＨＣ抗原相互作用を調節する化合物を同定するためのモデル細胞に基づくスクリーニング法の開発
本実施例では、ＴＣＲとＭＨＣ抗原分子との相互作用を特異的に調節するアゴニストおよびアンタゴニストについて化学ライブラリーをスクリーニングするための、細胞に基づくモデルとなるスクリーニングシステムにつき記載する。このモデルは２種以上の異なる抗原特異Ｔ細胞レセプターをその表面に発現する不死化Ｔ細胞株（例えば、Ｔ細胞ハイブリドーマ）に基づいている。例えば、当該Ｔ細胞はその内在性ＴＣＲおよびユニーク抗原特異性をもつ組換え一本鎖ＴＣＲをも発現し得た。スクリーニングアッセイの目標は、ＴＣＲの一つについて、他のＴＣＲと比較して、ＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド相互作用を増強（アゴニスト）するか、または減弱（アンタゴニスト）する際に分別作用を示す化合物を同定することである。これらの細胞は、上記の固定化ＭＨＣ／ペプチド分子（例えば、一本鎖単量体、ＩｇＧまたはＩｇＭ）を予め被覆したウエルによるプレートアッセイに使用する。ＭＨＣ／ペプチドはＴ細胞によるＩＬ−２分泌を刺激する。化合物は、Ｔ細胞によるＩＬ−２分泌を増強するか、または阻害するその能力について選抜する。ＴＣＲとＭＨＣ／ペプチド複合体との間の相互作用は一般に弱く、またＩＬ−２の産生／分泌過程には多くのステップがあるために、多くの化合物の同定は、ＩＬ−２産生の低下により証明されるように、Ｔ細胞刺激に（特異的に、また非特異的に）干渉する化合物について予測する。ユニーク標的に特異的な２つのＴＣＲを発現するＴ細胞の使用は、非特異的（ＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチドとは関係のない）メカニズムによりＴ細胞刺激を阻害する化合物に対し内部コントロールを提供することにより、スクリーニング過程を容易なものとする。例えば、選抜すべき化合物の多くは、必ずしもＴＣＲとＭＨＣ／ペプチドとの相互作用の時点ではなく、恐らくＴＣＲが引き金を引いた後のシグナル伝達経路に沿う時点で、ＩＬ−２産生を遮断する。一般的な細胞毒性の影響をもつ化合物もまたＩＬ−２産生を遮断する。異なるＭＨＣ／ペプチド複合体での刺激の試験によると、二重のＴＣＲ細胞株は、阻害化合物がＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド相互作用に干渉することで作用するのか、またはＩＬ−２産生／分泌過程のある他の時点で作用するのかを決定する上で非常に有用である。
【０３８４】
この実施例のために、内在性２Ｂ４ＴＣＲおよび組換えＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲを発現するモデル細胞株を実施例７記載のように生成させた。２Ｂ４およびＤＯ１１．１０ＴＣＲを介しての刺激に対するＴ細胞株の応答性を評価するために、該細胞を、ペプチドパルスした抗原提示細胞（ＡＰＣ）を収容するウエル中でインキュベートした。例えば、２Ｂ４形質導入体をＯＶＡまたはＰＣＣでパルスしたＡ２０（ＩＡｄ）細胞とともに、またはＯＶＡまたはＰＣＣでパルスしたＣＨ１２（ＩＥｋ）細胞とともにインキュベートした。これらの実験結果（図１７Ａおよび図１７Ｂ）は、２Ｂ４形質導入体と野生型２Ｂ４細胞がＰＣＣでパルスしたＣＨ１２細胞には応答するが、ＯＶＡでパルスしたＣＨ１２細胞またはＰＣＣでパルスしたＡ２０には応答しないことを示した。しかし、ＯＶＡでパルスしたＡ２０細胞の存在下では、２Ｂ４形質導入体が応答し、ＩＬ−２を産生したが、野生型の２Ｂ４細胞は非応答性であった。これらのデータが示唆することは、Ｔ細胞は少なくとも２種類の機能的に識別可能な抗原特異ＴＣＲを発現するように設計調製することができるということである。次の実験は、これらの２Ｂ４形質導入体が固定化したＭＨＣ／ペプチド分子に応答性を示すか、試験することであった。これらの検討を進める理論的根拠は実施例１０で説明し、その結果を実施例１１に示す。
【０３８５】
モデルアッセイシステムは、ＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲと固定化したｓｃＩＡｄ／ＯＶＡとの相互作用を遮断する化合物を同定するために開発する。ＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ２Ｂ４形質導入体を用いるアッセイは、実施例１１に記載のように実施する。ＤＯ１１．１０ＴＣＲとＩＡｄ／ＯＶＡとの相互作用を遮断することにより細胞の刺激を阻害することのできる化合物は、従って、同じＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ２Ｂ４形質導入体と固定化したｓｃＩＥｋ／ＰＣＣを用いて刺激アッセイにより選抜する。２Ｂ４ＴＣＲとｓｃＩＥｋ／ＰＣＣとの連結が細胞刺激に至る場合には、インヒビター化合物は恐らくＤＯ１１．１０ＴＣＲとｓｃＩＡｄ／ＯＶＡとの相互作用の特異的遮断を標的とすることにより作用する。しかし、細胞刺激の阻害が、使用したＭＨＣ／ペプチド複合体とは無関係であることが判明した場合には、当該化合物は恐らくＴ細胞刺激の非特異的インヒビターとして分類されよう。
【０３８６】
長期目標は、異なるＭＨＣファミリーにより限定される２種以上のＴＣＲで再構築した一つの細胞株を創生することである。この手法の利点は、各スクリーニング実験内で複数の細胞株を取り扱い、処理する煩雑さが除かれるということである。
【０３８７】
実施例１５：ＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド相互作用のインヒビター同定用細胞表面レセプターに基づく検出アッセイ法の開発
多価ＭＨＣ／ペプチド複合体とＴＣＲを用い、その表面に同族体レセプターを担持する細胞を蛍光染色した（Ａｌｔｍａｎ Ｊ．Ｄ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４： ９４−９６）。例えば、Ｔ細胞ハイブリドーマは多量体ｓｃ−クラスＩＩ−Ｉｇ分子を用いて特異的に染色することができる。本研究において、ＧＤ１２またはＤＯ１１．１０Ｔ細胞ハイブリドーマ（５×１０５細胞／ウエル）を１０μｇ／ウエルのｓｃＩＡｄ／ＧＤ−Ｉｇ分子とともに３７℃で一夜インキュベートした。ＧＤ１２ＴＣＲはＩＡｄとの関連でｇＤ２４６−２６１ペプチドに特異的であり、一方、ＤＯ１１．１０ＴＣＲはＩＡｄとの関連でＯＶＡ３２３−３３９ペプチドに特異的である。一夜インキュベーションした後、細胞をＰＢＳで洗い、抗−マウスＩｇＧ２ｂｍＡｂ−ビオチンおよびストレプトアビジン−サイクローム（Ｃｙｃｈｒｏｍｅ）と４℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳ、１％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳ、およびＰＢＳで洗浄した。染色した細胞のフローサイトメトリーは、ｓｃＩＡｄ／ＧＤ−Ｉｇ分子がＧＤ１２Ｔ細胞ハイブリドーマを特異的に染色すること、しかし、ＤＯ１１．１０Ｔ細胞は染色し得なかったことを示した（図２０）。抗−マウスＩｇＧ２ｂｍＡｂ−ビオチンおよびストレプトアビジン−サイクロームのみとインキュベートしたＧＤ１２Ｔ細胞では、細胞染色を観察しなかった。これらの結果は、本アッセイが多価ＭＨＣ／ペプチド複合体をプローブとして使用して、細胞表面ＴＣＲを検出し得ることを証明している。
【０３８８】
Ｔ細胞表面上の抗原を検出するための単一プレート基準細胞ＥＬＩＳＡについては、文献にも記載されている（参照：Ｇｒｕｎｏｗ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １７１： ９３−１０２）。これらのアッセイ法ではモノクローナル抗体の結合を検出したが、同様のアッセイフォーマットを、多価ＭＨＣ／ペプチド複合体と細胞表面ＴＣＲとの相互作用を阻害する化合物を検出するために開発し得た。例えば、ＧＤ１２Ｔ細胞をポリリジン被覆９６穴マイクロタイタープレートの増殖培地に加える。プレートを１０％ＣＯ２下に３７℃でインキュベートし、Ｔ細胞ハイブリドーマが被覆ウエルに接着するようにする。多価ｓｃＩＡｄ／ＧＤ−Ｉｇ分子を試験化合物（またはコントロールとしての希釈化合物）とともに細胞に加える。インキュベーション後、未結合ｓｃＩＡｄ／ＧＤ−Ｉｇ分子を除き、接着細胞を洗浄する。様々な市販入手可能なプローブ、例えば、酵素結合および蛍光色素結合抗体などを使用し、ｓｃＩＡｄ／ＧＤ−Ｉｇ分子とＧＤ１２ＴＣＲ間の相互作用を示すことが可能であった。例えば、抗−ＩｇＧ２ｂｍＡｂ−ＨＰＲプローブを添加して、ＴＣＲ−結合ｓｃＩＡｄ／ＧＤ−Ｉｇ分子を検出することができる。未結合の抗体を除去し、ウエルをＴＭＢ基質とインキュベートし、ＴＣＲ：ｓｃＩＡｄ／ＧＤ−Ｉｇ：抗−ＩｇＧ２ｂｍＡｂ−ＨＰＲ複合体を検出する。発色後、１Ｍ硫酸で反応を停止し、４５０ｎｍでの吸光度を測定する。最初の検討では、Ｔ細胞の適当な数、およびＭＨＣ／ペプチド−ＴＣＲ相互作用の良好な感度の直線性検出に必要な多価ｓｃ−クラスＩＩ−Ｉｇ分子の量と開示抗体プローブの量を決定する。コントロール実験は、異なるＭＨＣ多量体、例えば、ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ−ＩｇなどをｓｃＩＡｄ／ＧＤ−Ｉｇの代わりに加え、アッセイのバックグランドを確立する。特異的ＭＨＣ／ペプチド−ＴＣＲ相互作用を阻害する試験化合物の能力はシグナルの減損として測定する。例えば、細胞表面ＧＤ１２ＴＣＲとｓｃＩＡｄ／ＧＤ−Ｉｇ多量体間の相互作用を阻害する試験化合物は、希釈化合物と当該細胞とＭＨＣ／ペプチドプローブとを含むコントロールウエルにて観察されるよりも、吸光度の読み取り値が低くなる。阻害化合物の特異性は、従って、異なるＴＣＲとその対応する多価ＭＨＣ／ペプチドプローブを担持する細胞を用いて、他の細胞に基づくＥＬＩＳＡにて検討することができた。
【０３８９】
実施例１６：ＴＣＲ：ＭＨＣ抗原相互作用を増強および阻害する化合物を同定するためのタンパク質に基づくスクリーニング方法の開発
本実施例の目標は、組換えＴＣＲとＭＨＣ抗原試薬を用いて、タンパク質−タンパク質結合アッセイ法を開発することであった。タンパク質に基づくアッセイ法を確立することによって、高速大量処理スクリーニング法が開発され、標的のＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド相互作用を直接増強または低下させる化合物の同定が可能となった。かかるスクリーニングアッセイ法の利点は、細胞に基づくアッセイ法に比べて、細胞毒性であるか、または非特異的細胞性応答に影響するものとして検出される「擬陽性」化合物の数を減少させることである。ここで採られる手法は、精製組換えＴＣＲとＭＨＣ抗原複合体を用いて、ＥＬＩＳＡフォーマットを確立するためのものであった。
【０３９０】
簡単に説明すると、２６４ＴＣＲ（野生型ヒト腫瘍サプレッサータンパク質ｐ５３から分離され、ＨＬＡ−２によって制限されているペプチドフラグメント２６４〜２７２）をエンコードするｃＤＮＡはリンダ・シャーマン（Ｌｉｎｄａ Ｓｈｅｒｍａｎ）博士（スクリップス（Ｓｃｒｉｐｐｓ）研究所、ラホーラ、カリフォルニア）から提供頂いた。Ｖα３．１およびＶβ３．０遺伝子の増幅は、係属中の米国特許出願番号０８／８１３，７３１（バクテリオファージコートタンパク質および一本鎖Ｔ細胞レセプターを含んでなる融合タンパク質）および０８／９４３，０８６（一本鎖Ｔ細胞レセプターおよび免疫グロブリン軽鎖定常領域を含んでなる融合タンパク質）に記載のとおりに実施したが、使用したオリゴヌクレオチドは２６４ＴＣＲに特異的なものであった。３−ドメインｓｃＴＣＲ−Ｃカッパ融合タンパク質としての２６４ＴＣＲのクローニングは、ＤＯ１１．１０ＴＣＲについて記載されている方法と同様に実施した（上記係属中の米国特許出願参照）。２６４ｓｃＴＣＲカッパ融合ベクターは、培地中可溶性タンパク質発現用ＣＨＯ細胞に形質導入した。次いで、２６４ｓｃＴＣＲタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により確認しながら、アフィニティカラム上均一となるまで精製した。
【０３９１】
別に、ＨＬＡ−Ａ２およびベータ−２−ミクログロブリン分子の調製に使用するベクターシステムは、ジョン・アルトマン（Ｊｏｈｎ Ａｌｔｍａｎ）博士（エモリー大学、アトランタ、ジョージア）に提供頂いたが、これらについてはアルトマンらが記載している（Ａｌｔｍａｎ， Ｊ．Ｄ．， Ｐ．Ａ．Ｈ． Ｍｏｓｓ， Ｐ．Ｊ．Ｒ． Ｇｏｕｌｄｅｒ， Ｄ．Ｈ． Ｂａｒｏｕｃｈ， Ｍ．Ｇ． ＭｃＨｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｊ．Ｉ． Ｂｅｌｌ， Ａ．Ｊ． ＭｃＭｉｃｈａｅｌ ＆ Ｍ．Ｍ． Ｄａｖｉｓ． １９９６． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４： ９４−９６）。対象となるペプチドを負荷したＨＬＡ−Ａ２分子を調製するために、マーク・デービス（Ｍａｒｋ Ｄａｖｉｓ）博士（スタンフォード大学、パロアルト、カリフォルニア）によるプロトコールに従い、機能的分子を形成した（参照文献：Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ． １９９６． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４： ９４−９６）。正しく折りたたまれたペプチド／ＨＬＡ−Ａ２複合体を、５０ｋＤに移動した単一ピークとしてセファデックス−２００サイズ排除カラムにより単離した。次いで、このタンパク質複合体をビオチンリガーゼ（アビディティ（Ａｖｉｄｉｔｙ）、デンバー、コロラド）によりビオチン化し、Ｃ−末端ＢｉｒＡ配列に１個のビオチン部分を付着させた。ビオチン化Ａ２複合体はストレプトアビジンにより多量体化したが、ストレプトアビジンは１分子当たり４個までのビオチン残基を結合させることのできるビオチン特異タンパク質である。ＨＬＡ−Ａ２とストレプトアビジンタンパク質をそれぞれ４：１のモル比で用いて、四量体のＨＬＡ−Ａ２／ペプチド複合体を生成させた。（単量体に比較して）四量体を使用することの利点は、ＴＣＲとの相互作用に際して四量体が発揮する結合活性がより大きいことである。この事実を支持するものとして、ＢＩＡコア装置を用いてのタンパク質結合の研究は、可溶性四量体ＨＬＡ−Ａ２／２６４ペプチド複合体が、単量体ＨＬＡ−Ａ２／２６４ペプチド複合体よりも、相当に強く、固定化２６４ｓｃＴＣＲ−Ｃカッパ融合タンパク質に結合することを示した。
【０３９２】
これらの知見に基づき、ＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド相互作用を証明するために、ＨＬＡ−Ａ２／２６４ペプチド四量体技法を用いてＥＬＩＳＡを開発した。このアッセイでは、２６４ｓｃＴＣＲ−Ｃカッパ融合タンパク質を、２、１および０．５μｇ／ウエルの量で９６穴プレートに被覆した。次いで、プレートを洗浄し、２６４／ＨＬＡ−Ａ２四量体でプローブした。結果を図２１に示すが、この結果は、２６４ペプチドを含むが、１４９ペプチドは含まないＨＬＡ−Ａ２四量体が、ペプチドに特異的な様式で、固定化した２６４ｓｃＴＣＲ−Ｃカッパタンパク質に結合したことを示唆している。この研究は、ＴＣＲとＭＨＣ／ペプチド分子の相互作用を検出するために、タンパク質に基づくＥＬＩＳＡを使用するための「原理の証明」を立証している。ここに記載した結果は、このアッセイフォーマットを他のＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド対に適用して、高速大量処理スクリーニング方法によるアゴニストおよびアンタゴニスト化合物を同定するタンパク質に基づくアッセイ手技を確立し得ることを示唆している。
【０３９３】
例えば、精製した２６４ｓｃＴＣＲ−Ｃカッパ融合タンパク質を、５０μｌのＰＢＳ中、９６穴マイクロタイターのウエルに被覆する。直線的応答を引き出すために必要な２６４ｓｃＴＣＲ−Ｃカッパ融合タンパク質の量は実験的に決定する。２４時間後に、被覆溶液を除き、ウエルに２．５％ジメチルスルホキシド含有培地（１０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭ）５０μｌまたは２．５％ＤＭＳＯ中に試験化合物を含む培地５０μｌを容れる。次いで、ＨＬＡ−Ａ２／２６４四量体（５０μｌ培地中）を加える。室温で３０分間インキュベーションした後、タンパク質溶液を除き、ウエルを１％トリトンＸ−１００含有トリス緩衝塩溶液で洗浄する。ウサギ抗−ストレプトアビジン抗血清を各ウエルに加える。室温で２０分間インキュベーションした後、ウエルを洗浄し、ＨＲＰに接合したヤギ抗−ウサギＩｇ抗血清を加える。室温３０分後、ウエルを洗浄し、ＡＢＴＳ基質を加える。基質反応を発色させ、４０５ｎｍでの吸光度を読み取る。吸光度読み取り値は２６４ｓｃＴＣＲ被覆ウエルに結合したＨＬＡ−Ａ２／２６４ペプチド四量体の量と相関する。
【０３９４】
ＭＨＣ／ペプチド複合体と組換えＴＣＲ間の相互作用に拮抗する化合物の能力は、４０５ｎｍでの吸光度の読み取り値の低下として測定する。ＭＨＣ／ペプチド複合体の代わりに抗−ＴＣＲ Ａｂを用いたときのアッセイは、阻害化合物がＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド複合体相互作用に拮抗することにより作用するのか、またはタンパク質：タンパク質相互作用の一般的な阻害を介して作用するのかを決定するために実施する。ＭＨＣ／ペプチド複合体の結合を阻害するが、抗−ＴＣＲ抗体の結合は変えない化合物は、リード（手掛かりとなる）化合物として追求し得る。ＴＣＲとＭＨＣ／ペプチド分子の他の対を用いるアッセイは、阻害化合物の特異性を決定するために実施する。
【０３９５】
ＭＨＣ／ペプチド複合体と組換えＴＣＲ間の相互作用を増大させる化合物の能力は、４０５ｎｍでの吸光度読み取り値の増加として測定する。上記のように、ＴＣＲとＭＨＣ／ペプチド分子又は抗−ＴＣＲ抗体の他の対を用いるアッセイは、刺激性化合物の特異性を決定するために実施する。ＨＬＡ−Ａ２／ｐ５３ ２６４−２７２ペプチド複合体は腫瘍抗原でもあるので、ＴＣＲとこの抗原との相互作用を特異的に刺激する化合物は、治療用抗癌剤の開発に有用であることが分かる。当該ペプチドが感染性病原から誘導したものである場合に、ＴＣＲとＭＨＣ抗原複合体間の特異的相互作用を刺激する化合物を同定するために、同様のスクリーニング方法を開発することができた。かかる方法の最終ゴールは、抗感染剤を単離することである。
【０３９６】
実施例１７：ヒト自己免疫疾患と関連するＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド相互作用を阻害する化合物を同定するためのタンパク質に基づくスクリーニング方法の開発
本実施例の目標は、ヒト自己免疫疾患と関連する組換えヒトＴＣＲおよびヒトＭＨＣ抗原試薬を用いて、タンパク質−タンパク質結合アッセイ法を開発することであった。タンパク質に基づくアッセイ法を確立することによって、自己免疫ＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド相互作用に直接拮抗する化合物を同定するために、高速大量処理選抜法を開発することができた。これらの化合物は潜在的に選択的免疫抑制剤の開発につながる可能性を秘めている。
【０３９７】
Ｅ１１ヒトＴ細胞クローンから誘導されるＴＣＲは、哺乳動物細胞において組換え３−ドメイン一本鎖可溶性ＴＣＲとして発現される。適切な発現ベクターの構築、哺乳動物細胞の形質導入と選択、およびｓｃＴＣＲの産生と精製に使用する方法については、実施例６および以下の文献に記載されている：Ｗｅｉｄａｎｚ， ｅｔ ａｌ． １９９８． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２１： ５９； 米国特許出願番号０８／８１３，７３１および０８／９４３，０８６。
【０３９８】
自己免疫ＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド相互作用を証明するために、Ｅ１１ｓｃＴＣＲとｓｃＤＲ２／ＭＢＰ−Ｉｇ（実施例４参照）を用い、ＥＬＩＳＡを開発することができた。このアッセイ法においては、Ｅ１１ｓｃＴＣＲタンパク質を９６穴プレートに被覆する。次いで、プレートを洗浄し、ｓｃＤＲ２／ＭＢＰ−Ｉｇでプローブする。洗浄工程に続いて、結合したｓｃＤＲ２／ＭＢＰ−Ｉｇをヤギ抗−ヒトＩｇＧ−ＨＲＰでプローブし、ＴＭＢ基質での発色により検出する。４５０ｎｍでの吸光度にて、Ｅ１１ｓｃＴＣＲ被覆ウエルに結合したｓｃＤＲ２／ＭＢＰ−Ｉｇの量を決定する。本研究は自己免疫ＴＣＲとＭＨＣ／ペプチドの相互作用を検出するために、タンパク質に基づくＥＬＩＳＡを使用することについて「原理の証明」を立証しており、高速大量処理スクリーニング方法によるアンタゴニスト化合物を同定するタンパク質に基づくアッセイ手技を確立する。
【０３９９】
例えば、精製したＥ１１ｓｃＴＣＲタンパク質を５０μｌのＰＢＳ中、９６穴マイクロタイターのウエルに被覆する。直線的応答を引き起こすために必要なＥ１１ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の量は実験的に決定する。２４時間後に、被覆溶液を除き、ウエルに２．５％ジメチルスルホキシド含有培地（１０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭ）５０μｌまたは２．５％ＤＭＳＯ中に試験化合物を含む培地５０μｌを容れる。次いで、ｓｃＤＲ２／ＭＢＰ−Ｉｇ（５０μｌ培地中）を加える。室温でインキュベーションした後、タンパク質溶液を除き、ウエルを１％トリトンＸ−１００含有トリス緩衝塩溶液で洗浄する。ＨＲＰに接合したヤギ抗−ヒトＩｇ抗血清を加える。室温３０分後、ウエルを洗浄し、ＴＭＢ基質を加える。基質反応を０．１８Ｍ硫酸で停止させ、４５０ｎｍでの吸光度を読み取る。吸光度読み取り値は、Ｅ１１ｓｃＴＣＲ被覆ウエルに結合したｓｃＤＲ２／ＭＢＰ−Ｉｇの量と相関する。
【０４００】
ＭＨＣ／ペプチド複合体と組換えＴＣＲ間の相互作用に拮抗する化合物の能力は、４５０ｎｍでの吸光度読み取り値の低下として測定する。ＭＨＣ／ペプチド複合体の代わりに抗−ＴＣＲ Ａｂを用いたときのアッセイは、阻害化合物がＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド複合体相互作用に拮抗することにより作用するのか、またはタンパク質：タンパク質相互作用の一般的な阻害を介して作用するのかを決定するために実施する。ＭＨＣ／ペプチド複合体の結合を阻害するが、抗−ＴＣＲ抗体の結合は変えない化合物はリード（手掛かりとなる）化合物として追求し得る。ＴＣＲとＭＨＣ／ペプチド分子の他の対を用いるアッセイは、阻害化合物の特異性を決定するために実施する。自己免疫ＴＣＲとその同族体ＭＨＣ／ペプチド複合体との相互作用を特異的に阻害する化合物は、治療用免疫抑制剤の開発に有用であることが分かる。
【０４０１】
実施例１８：ヒト自己免疫疾患と関連するＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド相互作用を阻害する化合物を同定するための均一系スクリーニング方法の開発
本実施例の目標は、ヒト自己免疫疾患と関連する組換えヒトＴＣＲおよびヒトＭＨＣ／ペプチド試薬を用いて、タンパク質−タンパク質結合均一系アッセイ法を開発することにあった。均一系アッセイが有利な点は、未結合成分の分離を要しないこと、あるいは洗浄工程を必要としないことである。数多くの異なるシステムが均一系アッセイを、細胞に基づくアッセイまたはタンパク質に基づくアッセイとして実施することを可能にしている。
【０４０２】
本実施例に記載したアッセイフォーマットでは、特殊化したビーズまたは微粒子を採用する。ビーズに基づく試薬は広範なフォーマットで市販品として入手可能であり、例えば、組換えタンパク質の高い受容能力をもつ結合／捕捉、効率的な検出、および異なる分離法と均一系アッセイ方法の使用が可能となる。多くの高速大量処理スクリーニング方法にとって、ビーズに基づく試薬は有利である。
【０４０３】
例えば、アルファスクリーン試薬（パッカード（Ｐａｃｋａｒｄ）バイオサイエンス）に基づく均一系発光近接アッセイは、自己免疫ＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド相互作用を証明するために、Ｅ１１ＴＣＲおよびＤＲ２／ＭＢＰ分子を用いて開発することができる。このアッセイフォーマットにおいては、２個の小ビーズをＴＣＲとＭＨＣ／ペプチド複合体で標識し、ＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド相互作用により接近させる。レーザー光励起により、「ドナー（供与体）」ビーズが化学信号を発するが、これは「アクセプター（受容体）」ビーズが密に接近しなければ検出されない。ＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド相互作用がビーズを会合させると、化学反応のカスケードが作用して著しく増幅されたシグナルを発生させる。このＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド相互作用がシグナルを発生させる能力を調節（増減）する能力について、化合物を試験することができる。
【０４０４】
Ｅ１１ヒトＴ細胞クローンから誘導したＴＣＲは、記載のように、哺乳動物細胞において組換え３−ドメイン一本鎖可溶性ＴＣＲとして発現される。実施例１および２に記載した方法を用いて、Ｅ１１ｓｃＴＣＲのＣ末端にｂｉｒＡ標的配列を包含させる。精製したＥ１１ｓｃＴＣＲタンパク質は、実施例１および２に記載のように、ビオチンリガーゼでビオチン化する。
【０４０５】
このアッセイ法では、Ｅ１１ｓｃＴＣＲ−ビオチンタンパク質をストレプトアビジン被覆ドナービーズに結合させる。ｓｃＤＲ２／ＭＢＰ−Ｉｇ（実施例４参照）は抗−ヒトＩｇＧ被覆アクセプタービーズに結合する。ビーズを混合し、Ｅ１１ｓｃＴＣＲタンパク質とｓｃＤＲ２／ＭＢＰ複合体間で会合させる。この相互作用はドナービーズとアクセプタービーズとを接近させ（＜２００ｎｍ）、光誘発化学反応を起こし、検出可能なシグナルを生成させる。ドナービーズとアクセプタービーズを最適に被覆し、タンパク質被覆ビーズ間の相互作用を可能とするのに必要な条件は、実験的に決定する。ドナービーズでの化学反応を６８０ｎｍの光で誘発する。近接アクセプタービーズへのエネルギー転移に続いて、発生するシグナルは５２０〜６２０ｎｍで測定可能である。この測定は時間分解モードで実施し、アッセイにおける蛍光化合物のバックグランドの影響を最小とすることができる。本研究は自己免疫ＴＣＲとＭＨＣ／ペプチドの相互作用を検出するために、均一系タンパク質に基づく均一アッセイを使用することについて「原理の証明」を立証しており、高速大量処理スクリーニング方法によるアンタゴニスト化合物を同定するための均一系アッセイ手技を確立する。
【０４０６】
例えば、Ｅ１１ｓｃＴＣＲドナービーズとｓｃＤＲ２／ＭＢＰアクセプタービーズとをマイクロタイターウエル中で混合し、検出可能なシグナルを発生させる。直線的応答を生じさせるために必要な反応条件は実験的に決定する。２．５％ジメチルスルホキシド含有媒体または２．５％ＤＭＳＯ中の試験化合物を含有する媒体をウエルに加える。６８０ｎｍでのレーザー励起に続いて、蛍光シグナルはアルファクエスト（ＡｌｐｈａＱｕｅｓｔ）ＨＳＴマイクロプレート・アナライザー（パッカード）を用い、時間分解モード（２０ｍ秒遅延）、５５０ｎｍで検出する。蛍光シグナルはＥ１１ｓｃＴＣＲドナービーズに結合したｓｃＤＲ２／ＭＢＰアクセプタービーズの量と相関する。
【０４０７】
ＭＨＣ／ペプチド複合体とＴＣＲとの相互作用に拮抗する化合物の能力は、５５０ｎｍでの蛍光シグナル量の減少として測定する。ＭＨＣ／ペプチド複合体の代わりに抗−ＴＣＲ Ａｂを用いたときのアッセイは、阻害化合物がＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド複合体相互作用に拮抗することにより作用するのか、またはタンパク質：タンパク質相互作用の一般的な阻害を介して作用するのかを決定するために実施する。ＭＨＣ／ペプチド複合体の結合を阻害するが、抗−ＴＣＲ抗体の結合は変えない化合物はリード（手掛かりとなる）化合物として追求し得る。ＴＣＲとＭＨＣ／ペプチド分子の他の対を用いるアッセイは、阻害化合物の特異性を決定するために実施する。自己免疫ＴＣＲとその同族体ＭＨＣ／ペプチド複合体との相互作用を特異的に阻害する化合物は、治療用免疫抑制剤の開発に有用であることが分かる。
【０４０８】
実施例１９：ＴＣＲ：ＭＨＣ抗原相互作用を増強および阻害する化合物を同定するためのタンパク質に基づくスクリーニング方法の開発
本実施例の目標は、組換えＴＣＲとＭＨＣ抗原試薬を用いて、タンパク質−タンパク質結合アッセイ法を開発することであった。タンパク質に基づくアッセイ法を確立することによって、高速大量処理スクリーニング法が開発され、標的のＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド相互作用を直接増強または低下させる化合物の同定が可能となった。かかるスクリーニングアッセイ法の利点は、細胞に基づくアッセイ法に比べて、細胞毒性であるか、または非特異的に細胞性応答に影響するものとして検出される「擬陽性」化合物の数を減少させることである。ここで採られる手法は、精製組換えＴＣＲとＭＨＣ抗原複合体を用いて、ＥＬＩＳＡフォーマットを確立するためのものであった。
【０４０９】
簡単に説明すると、２６４ＴＣＲ（野生型ヒト腫瘍サプレッサータンパク質ｐ５３から分離され、ＨＬＡ−Ａ２によって制限されているペプチドフラグメント２６４〜２７２）をエンコードするｃＤＮＡはリンダ・シャーマン（Ｌｉｎｄａ Ｓｈｅｒｍａｎ）博士（スクリップス（Ｓｃｒｉｐｐｓ）研究所、ラホーラ、カリフォルニア）から提供頂いた。Ｖα３．１およびＶβ３．０遺伝子の増幅は、係属中の米国特許出願番号０８／８１３，７３１（バクテリオファージコートタンパク質および一本鎖Ｔ細胞レセプターを含んでなる融合タンパク質）および０８／９４３，０８６（一本鎖Ｔ細胞レセプターおよび免疫グロブリン軽鎖定常領域を含んでなる融合タンパク質）に記載のとおりに実施したが、使用したオリゴヌクレオチドは２６４ＴＣＲに特異的なものであった。３−ドメインｓｃＴＣＲ−Ｃカッパ融合タンパク質としての２６４ＴＣＲのクローニングは、ＤＯ１１．１０ＴＣＲについて記載されている方法と同様に実施した（上記係属中の米国特許出願参照）。２６４ｓｃＴＣＲカッパ融合ベクターは、培地中可溶性タンパク質発現用ＣＨＯ細胞に形質導入した。次いで、２６４ｓｃＴＣＲタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により確認しながら、アフィニティカラム上均一となるまで精製した。
【０４１０】
別に、ＨＬＡ−Ａ２およびベータ−２−ミクログロブリン分子の調製に使用するベクターシステムは、ジョン・アルトマン（Ｊｏｈｎ Ａｌｔｍａｎ）博士（エモリー大学、アトランタ、ジョージア）に提供頂いたが、これらについてはアルトマンらが記載している（Ａｌｔｍａｎ， Ｊ．Ｄ．， Ｐ．Ａ．Ｈ． Ｍｏｓｓ， Ｐ．Ｊ．Ｒ． Ｇｏｕｌｄｅｒ， Ｄ．Ｈ． Ｂａｒｏｕｃｈ，Ｍ．Ｇ． ＭｃＨｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｊ．Ｉ． Ｂｅｌｌ， Ａ．Ｊ． ＭｃＭｉｃｈａｅｌ ＆ Ｍ．Ｍ． Ｄａｖｉｓ． １９９６． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４： ９４−９６）。対象となるペプチドを負荷したＨＬＡ−Ａ２分子を調製するために、マーク・デービス（Ｍａｒｋ Ｄａｖｉｓ）博士（スタンフォード大学、パロアルト、カリフォルニア）によるプロトコールに従い、機能的分子を形成した（参照文献：Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ． １９９６． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４： ９４−９６）。正しく折りたたまれたペプチド／ＨＬＡ−Ａ２複合体を、５０ｋＤに移動した単一ピークとしてセファデックス−２００サイズ排除カラムにより単離した。次いで、このタンパク質複合体をビオチンリガーゼ（アビディティ、デンバー、コロラド）によりビオチン化し、Ｃ−末端ＢｉｒＡ配列に１個のビオチン部分を付着させた。ビオチン化Ａ２複合体はストレプトアビジンにより多量体化したが、ストレプトアビジンは１分子当たり４個までのビオチン残基を結合させることのできるビオチン特異タンパク質である。ＨＬＡ−Ａ２とストレプトアビジンタンパク質をそれぞれ４：１のモル比で用いて、四量体のＨＬＡ−Ａ２／ペプチド複合体を生成させた。（単量体に比較して）四量体を使用することの利点は、ＴＣＲとの相互作用に際して四量体が発揮する結合活性がより大きいことである。この事実を支持するものとして、ＢＩＡコア装置を用いてのタンパク質結合の研究は、可溶性四量体ＨＬＡ−Ａ２／２６４ペプチド複合体が、単量体ＨＬＡ−Ａ２／２６４ペプチド複合体よりも、相当に強く、固定化２６４ｓｃＴＣＲ−Ｃカッパ融合タンパク質に結合することを示した。
【０４１１】
これらの知見に基づき、ＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド相互作用を証明するために、ＨＬＡ−Ａ２／２６４四量体技法を用いてＥＬＩＳＡを開発した。このアッセイでは、２６４ｓｃＴＣＲ−Ｃカッパ融合タンパク質を、２、１および０．５μｇ／ウエルの量で９６穴プレートに被覆した。次いで、プレートを洗浄し、２６４／ＨＬＡ−Ａ２四量体でプローブした。結果を図２１に示すが、この結果は、２６４ペプチドを含むが、１４９ペプチドは含まないＨＬＡ−Ａ２四量体が、ペプチドに特異的な様式で、固定化した２６４ｓｃＴＣＲ−Ｃカッパタンパク質に結合したことを示唆している。
【０４１２】
第二のＥＬＩＳＡはＨＬＡ−Ａ２／２６４またはＨＬＡ−Ａ２／１４９四量体技法を用いて開発した。本アッセイのために、四量体は上記のように調製したが、ただし、ビオチン化ＨＬＡ−Ａ２複合体はストレプトアビジンペルオキシダーゼ（カークガード・アンド・ペリー（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ）ラボラトリーズ）を用いて多量体化し、ＨＬＡ−Ａ２／２６４−ＨＲＰまたはＨＬＡ−Ａ２／１４９−ＨＲＰ四量体を形成した。次いで、標識した四量体をプローブとして用い、プレート結合ＴＣＲを検出した。ＴＣＲを固定化するために、抗−ＴＣＲベータ定常ドメイン特異抗体Ｈ５７（ＢＤファーミンゲン）を５０μｌのＰＢＳ中、２５０ｎｇ／ウエルの量で、４℃で一夜のインキュベーションにより９６穴マイクロタイタープレートのウエルに被覆した。抗体を除去し、ウエルをＰＢＳ中１０％の血清で１時間ブロックした。ウエルを１％トリトンＸ−１００含有トリス緩衝塩溶液２００μｌで３回洗浄した。精製した２６４ｓｃＴＣＲ−Ｃカッパ融合タンパク質を１％血清含有ＰＢＳ５０μｌに加えた。室温で１時間後、ウエルを洗浄し、ＨＬＡ−Ａ２／２６４−ＨＲＰ（またはコントロールＨＬＡ−Ａ２／１４９−ＨＲＰ）四量体を１％血清含有ＰＢＳ５０μｌに加えた。室温で２時間後、ウエルを洗浄し、ＡＢＴＳ基質１００μｌを加え、２０分間発色させた。基質反応は４０５ｎｍの吸光度で読み取ったが、これはＴＣＲ融合タンパク質が結合した標識ＭＨＣ／ペプチドの量を表す。これらの検討結果は、２６４ｓｃＴＣＲとＨＬＡ−Ａ２／２６４−ＨＲＰプローブとの間に特異的相互作用のあることを示したが、２６４ＴＣＲとコントロールＨＬＡ−Ａ２／１４９−ＨＲＰプローブとの間には相互作用がなかった（図２２Ａおよび２２Ｂ）。直線応答を生じるために必要な２６４ｓｃＴＣＲ−Ｃカッパ融合タンパク質およびＨＬＡ−Ａ２．２６４−ＨＲＰプローブの量は、実験的に決定した。上昇する２６４ｓｃＴＣＲ濃度対上昇するＨＬＡ−Ａ２／２６４−ＨＲＰ濃度のマトリックス検討も実施し、応答の直線性範囲を決定した（図２３Ａおよび２３Ｂ）。もう一つの検討では、精製した２６４ｓｃＴＣＲ−ＩｇＧ１融合タンパク質と２６４ｓｃＴＣＲ−Ｃカッパ融合タンパク質との間の比較を行った。両方のタンパク質がその能力において同等であり、ＨＬＡ−Ａ２／２６４−ＨＲＰプローブと相互作用することが判明した（図２４Ａ〜Ｄ）。
【０４１３】
これらの研究は、ＴＣＲおよびＭＨＣ／ペプチド分子の相互作用を検出するために、タンパク質に基づくＥＬＩＳＡを使用するための「原理の証明」を立証している。ここに記載したこれらの結果は、このアッセイフォーマットを他のＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド対に適用してタンパク質に基づくアッセイ手法を確立し、高速大量処理スクリーニング方法により、アゴニストおよびアンタゴニスト化合物を同定し得ることを示唆している。
【０４１４】
例えば、上記の２６４ｓｃＴＣＲ−Ｃカッパ：ＨＬＡ−Ａ２／２６４−ＨＲＰ  ＥＬＩＳＡは、ＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド相互作用を阻害する化合物用に、化学ライブラリーを選抜するために使用した。この実験においては、ＨＬＡ−Ａ２／２６４−ＨＲＰプローブを２６４ｓｃＴＣＲ被覆ウエルに加えることにより、８０種の異なる化合物を５０μＭの濃度で個々に試験した。ＥＬＩＳＡは上に記載のとおりに実施した。ＥＬＩＳＡ反応を阻害する各化合物の能力を測定した。一つの化合物が基質反応を５０μＭで８０％まで阻害し、そのＩＤ５０が２μＭであることが判明した。これらの結果は、ＴＣＲとＭＨＣ抗原間の相互作用に拮抗する化合物の同定に、かかるタンパク質に基づくアッセイを用いる可能性を示している。
【０４１５】
もう一つの例において、精製した２６４ｓｃＴＣＲ−Ｃカッパ融合タンパク質は、ＰＢＳ５０μｌ中、９６穴マイクロタイターのウエルに被覆する。直線的応答を引き出すために必要な２６４ｓｃＴＣＲ−Ｃカッパ融合タンパク質の量は実験的に決定する。２４時間後に、被覆溶液を除き、ウエルに２．５％ジメチルスルホキシド含有培地（１０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭ）５０μｌまたは２．５％ＤＭＳＯ中に試験化合物を含む培地５０μｌを容れる。次いで、ＨＬＡ−Ａ２／２６４四量体（５０μｌ培地中）を加える。室温で３０分間インキュベーションした後、タンパク質溶液を除き、ウエルを１％トリトンＸ−１００含有トリス緩衝塩溶液で洗浄する。ウサギ抗−ストレプトアビジン抗血清を各ウエルに加える。室温で２０分間インキュベーションした後、ウエルを洗浄し、ＨＲＰに接合したヤギ抗−ウサギＩｇ抗血清を加える。室温３０分後、ウエルを洗浄し、ＡＢＴＳ基質を加える。基質反応を発色させ、４０５ｎｍでの吸光度を読み取る。吸光度読み取り値は、２６４ｓｃＴＣＲ被覆ウエルに結合したＨＬＡ−Ａ２／２６４四量体の量と相関する。
【０４１６】
ＭＨＣ／ペプチド複合体と組換えＴＣＲとの相互作用に拮抗する化合物の能力は、４０５ｎｍでの吸光度読み取り値の減少として測定する。ＭＨＣ／ペプチド複合体の代わりに抗−ＴＣＲ Ａｂを用いたときのアッセイは、阻害化合物がＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド複合体相互作用に拮抗することにより作用するのか、またはタンパク質：タンパク質相互作用の一般的な阻害を介して作用するのかを決定するために実施する。ＭＨＣ／ペプチド複合体の結合を阻害するが、抗−ＴＣＲ抗体の結合は変えない化合物はリード（手掛かりとなる）化合物として追求し得る。ＴＣＲとＭＨＣ／ペプチド分子の他の対を用いるアッセイは、阻害化合物の特異性を決定するために実施する。
【０４１７】
ＭＨＣ／ペプチド複合体と組換えＴＣＲとの相互作用を増大させる化合物の能力は、４０５ｎｍでの吸光度読み取り値の増加として測定する。上記のように、ＴＣＲおよびＭＨＣ／ペプチド分子または抗−ＴＣＲ抗体の他の対を使用するアッセイは、刺激性化合物の特異性を決定するために実施する。ＨＬＡ−Ａ２／ｐ５３ ２６４−２７２ペプチド複合体は腫瘍抗原でもあるので、ＴＣＲとこの抗原との相互作用を特異的に刺激する化合物は、治療用抗癌剤の開発に有用であることが分かる。当該ペプチドが感染性病原から誘導したものである場合のＴＣＲとＭＨＣ抗原複合体間の特異的相互作用を刺激する化合物を同定するために、同様のスクリーニング方法を開発することができた。かかる方法の最終ゴールは、抗感染剤を単離することである。
【０４１８】
本明細書に開示した文献はすべて本明細書中に参考として援用される。
本発明について具体的な態様に関連させて記載したが、本発明の改変および変動は、例えば、上記特許請求の範囲に定義した本発明の範囲から逸脱することなく構築することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａ〜Ｂは種々のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）と同族体主要組織適合（ＭＨＣ）ペプチド複合体との間の相互作用を示す図面である。
【図２】
図２は試験化合物検出のための本発明の一方法を示す概略図である。この例では、小分子インヒビターがＴＲＣ／ＭＨＣ抗原相互作用を阻害し、不所望の免疫応答を遮断する一助となる。
【図３】
図３は自己免疫疾患を遮断する試験化合物検出のための特定タンパク質に基づく方法を示す概略図である。
【図４】
図４は自己免疫応答を遮断する試験化合物検出のための特定細胞に基づく方法を示す概略図である。
【図５】
図５ＡはＤＯ１１．１０ＴＣＲおよびｓｃ−ＩＡｄ／ＯＶＡ相互作用のインヒビターについて化学ライブラリーをスクリーニングする際の本発明の「原理証明」例を示す概略図である。
図５Ｂは高速大量処理スクリーニングフォーマットを使用してＤＯ１１．１０ＴＣＲおよびｓｃ−ＩＡｄ／ＯＶＡ相互作用のインヒビターを検出する際の、別の本発明「原理証明」例を示す概略図である。検出されるインヒビターは、内部コントロールと比較した吸光度の差により同定される。
【図６】
図６Ａは多発性硬化症（ＭＳ）を阻害する試験化合物を検出する方法の具体例を示す概略図である。
図６Ｂは高速大量処理スクリーニングを使用する試験化合物の具体的検出法を示す概略図である。この図において、該方法は多発性硬化症（ＭＳ）を阻害する分子の検出のために最適化される。
【図７】
図７Ａ〜ＣはＩＥｋクローニングのために実施した工程を示す図面である。図７Ａ：種々のαおよびβ鎖フラグメントを含む遺伝的構築物。図７Ｂ：一本鎖ＩＥｋ分子の結合したペプチドとの構築。図７Ｃ：ＩＥｋ一本鎖を含む昆虫細胞発現ベクター。各図に使用した略号は図７Ｃに定義する。
【図８】
図８はｓｃ−ＩＡｄ−ＩｇＧ分子を還元型（レーン１〜２）および非還元型（レーン３〜４）で示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。レーン５はタンパク質のサイズマーカーを示す。レーン番号は左から右への順で示す。
【図９】
図９はＤＯ１１．１０ｓｃ−ＴＣＲ−ＩｇＧ２ｂ融合を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。レーン１は抗体コントロールを示し、レーン２はＤＯ１１．１０ｓｃ−ＴＣＲ−ＩｇＧ２ｂ融合タンパク質を示す。
【図１０】
図１０は本発明の種々のＴＣＲ−ＣＤ３ζ融合構築物を示す概略図である。
【図１１】
図１１は蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）実験の結果を示すグラフであり、種々のＤＯ１１．ｓｃＴＣＲ−ＣＤ３ζ融合構築物を発現するＢＷ５１４７形質移入体は抗−ＴＣＲ抗体プローブで染色した。
【図１２】
図１２Ａおよび１２ＢはＢＷＤＺ：ＣＤ４＋形質移入体のＦＡＣＳ特性を示す。図１２Ａ：ＦＡＣＳによる表面ＣＤ４発現の検出。図１２Ｂ：ＦＡＣＳによる表面ＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ発現の検出。
【図１３】
図１３はペプチド−パルス抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＢＷＤＺ：ＣＤ４＋細胞の刺激結果を示すグラフである。
【図１４】
図１４はＤＯ１１．１０Ｔ細胞刺激アッセイにおけるＩＬ−２産生阻害の結果を示すグラフである。
【図１５】
図１５Ａおよび１５Ｂは２種類の検出された試験化合物１８０Ｂ１０（図１５Ａ）および２９Ｄ１１（図１５Ｂ）の滴定結果を示すグラフである。
【図１６】
図１６は例示となる阻害化合物を示す図面である。
【図１７】
図１７Ａおよび１７Ｂはペプチド−パルスＡＰＣによるＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ２Ｂ４形質移入体刺激の結果を示すグラフである。図１７ＡはＯＶＡペプチド負荷Ａ２０ＡＰＣを用いるＴ細胞刺激アッセイを示す。図１７ＢはＰＣＣペプチド負荷ＣＨ１２細胞を用いるＴ細胞刺激アッセイを示す。
【図１８】
図１８はＮＤＯＡＰＣによるＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ２Ｂ４形質移入体刺激の結果を示すグラフである。
【図１９】
図１９はＤＯ１１．１０ｓｃＴＣＲ−ＣＤ３ζ融合移入２Ｂ４ Ｔ細胞ハイブリドーマの刺激結果を示すグラフである。
【図２０】
図２０は多価ＭＨＣ／ペプチド分子を用いるＴ細胞染色を説明するグラフである。
【図２１】
図２１はＨＬＡ−Ａ２／２６４ペプチドと２６４ｓｃ−ＴＣＲ−カッパの相互作用に対するＥＬＩＳＡ値を示すグラフである。
【図２２】
図２２Ａはタンパク質に基づくＥＬＩＳＡアッセイの応答特異性を示す表である。この情報をグラフ化して図２２Ｂに示す。
【図２３】
図２３Ａはタンパク質ＥＬＩＳＡにおける濃度依存性を示す表である。この情報をグラフ化して図２３Ｂに示す。
【図２４】
図２４Ａおよび２４Ｂは、タンパク質ＥＬＩＳＡにおいて異なるＴＣＲ試薬の比較を示すグラフである。グラフ中の情報を図２４Ｃおよび２４Ｄにそれぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004501364.tif 000260
2004501364.tif 000261
【国際調査報告】
2004501364.tif 000262
2004501364.tif 000263
2004501364.tif 000264
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