(57)【要約】【解決手段】下記工程を含む低親和性結合リガンド検出のためのスクリーニング方法を提供する：ａ）異なるリガンドのライブラリを準備する工程；ｂ）固体担体上に前記リガンドを固定することにより、前記担体上の前記リガンドを含む結合複合体を形成する工程；ｃ）目的のターゲットと前記結合複合体とを接触する工程；ｄ）前記結合複合体に含まれる各種のリガンドに対する前記リガンド／ターゲット相互作用の結合価を並行して決定する工程；ｅ）固定した状態で、所定の閾値を超える前記ターゲットに対する結合価のリガンドを選別する工程；ｆ）非固定状態で、前記ターゲットに対する前記工程（ｅ）において選別した各リガンドの親和性を評価する工程；ｇ）前記工程（ｆ）の少なくとも一つのリガンドを低親和性結合リガンドとして同定する工程。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を含む低親和性結合リガンド検出のためのスクリーニング方法：
ａ）異なるリガンドのライブラリを準備する工程；
ｂ）固体担体上に前記リガンドを固定することにより、前記担体上の前記リガンドを含む結合複合体を形成する工程；
ｃ）目的のターゲットと前記結合複合体とを接触する工程；
ｄ）前記結合複合体に含まれる各種のリガンドに対する前記リガンド／ターゲット相互作用の結合価を並行して決定する工程；
ｅ）固定した状態で、所定の閾値を超える前記ターゲットに対する結合価のリガンドを選別する工程；
ｆ）非固定状態で、前記ターゲットに対する前記工程（ｅ）において選別した各リガンドの親和性を評価する工程；
ｇ）前記工程（ｆ）の少なくとも一つのリガンドを低親和性結合リガンドとして同定する工程。
【請求項２】
前記工程（ａ）のリガンドが、４００ｇ／ｍｏｌ未満の数平均分子量である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ｂ）の結合複合体が、アンカー構造を介して前記固体担体に固定されたリガンドを含み、前記アンカー構造が、前記担体上で自己集合単層を形成可能な請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記結合複合体を、活性化頭基提示アンカー構造（anchor structures presenting an activated head group）の固定を経て準備し、続いて、これらの頭基との反応を介して前記リガンドと前記アンカーとが共有結合する請求項３記載の方法。
【請求項５】
下記構造（６）のリガンドタグをもちいて、前記リガンドが前記アンカーと結合する請求項４記載の方法。
Ｚ−Ａ−Ｙ      （６）
前記式中、
Ａは、化学結合または２〜５０の炭素原子鎖であって、好ましくは５〜３０の炭素原子鎖であって、ヘテロ原子、アミド結合またはエステル結合が挿入されていてもよく、
Ｙは、前記リガンドと反応する官能基であって、
Ｚは、対応するアンカー分子の頭基と反応することができる官能基である。
【請求項６】
さらに、前記工程（ｂ）の結合複合体が、希釈化合物を含む請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ａ）のライブラリのリガンドが、２組の組み合わせ合成を介して合成され、２組の反応物から開始される請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記工程（ｅ）の選別が、前記工程ｄ）で得られた結合価を処理して可視化する工程ｅ１）を実行するシステムにより支持されている請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記結合価が、ｘ、ｙ−座標で可視化されている請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記ｘ−座標が、前記工程ｂ）で固定したリガンドの前記２組の組み合わせ合成に使用した第１の試薬を表し、前記ｙ−座標が、前記工程ｂ）で固定したリガンドの前記２組の組み合わせ合成に使用した第２の試薬を表す請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記ｘ、ｙ−座標の各セルが、前記工程ｂ）で固定したリガンドの一つを示し、前記ターゲットに対するリガンドの結合価が、色素解像方法により可視化されている請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
前記プログラムをコンピュータ上で実行する場合、請求項８〜１１のいずれかに記載の前記工程ｅ１）を実行するためのプログラムコードを含むコンピュータプログラム。
【請求項１３】
前記プログラムをコンピュータ上で実行する場合、請求項８〜１１のいずれかに記載の前記工程ｅ１）を実行するためにコピュータが読み取り可能な媒体に保存したプログラムコードを含むコンピュータプログラム製品。
【請求項１４】
下記構造のリガンド−タグ。
Ｚ−Ａ−Ｙ    （６）
前記式中、
Ｚは、チオール基、カルボキシル基またはアミノ基であり、
Ａは、化学結合または２〜５０の炭素原子鎖であって、好ましくは５〜３０の炭素原子鎖であって、ヘテロ原子、アミド結合またはエステル結合が挿入されていてもよく、
Ｙは、第１級アミノ基、第２級アミノ基、カルボン酸基、ヒドロキシル基、ヒドロキシルアミノ基、エステル基またはアルデヒド基である。
【請求項１５】
固相スクリーニング方法において試験したリガンドと、請求項１４記載のリガンド−タグのＹ基とを共有結合することにより得られるリガンド／リガンド−タグ接合体。
【請求項１６】
下記構造を持つ請求項１５記載のリガンド／リガンド−タグ接合体。
Ｚ−Ａ−Ｙ’−Ｌ      （８）
前記式において、ＺおよびＡは、請求項１４の式（６）に定義した通りであって、Ｙ’は、請求項１４記載の式（６）のＹ基と前記リガンドの対応する官能基との反応から得られるアミド結合またはエステル結合であり、Ｌは、アルコール、第１級アミン、第２級アミン、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルデヒドまたは別のカルボニル化合物と請求項１４記載の式（６）のリガンドタグとの反応により得られるリガンド構造である。
【請求項１７】
下記構造を持つ請求項１６記載のリガンド／リガンド−タグ接合体。
Ｚ−Ａ−ＨＮＣ（Ｏ）−Ｌ2−Ｌ1      （９）
前記式において
Ｚは、チオール基、カルボキシル基またはアミノ基であり、
Ａは、化学結合または２〜５０の炭素原子鎖であって、好ましくは５〜３０の炭素原子鎖であって、ヘテロ原子、アミド結合またはエステル結合が挿入されていてもよく、
Ｌ2は、そのアミノ官能基を用いて、Ｌ1とアミド結合またはスルホンアミド結合を形成し、そのカルボキシル官能基を用いて、Ｚ−Ａ−ＨＮ構造とアミド結合を形成するアミノ酸残基であり、
Ｌ1は、その官能基を用いて、前記アミド結合またはスルホンアミド結合を完成するカルボン酸化合物またはスルホン酸化合物である。
【請求項１８】
固相スクリーニング方法に使用するライブラリであって、請求項１５〜１７のいずれかに記載の複数の異なるリガンド／リガンド−タグ接合体により形成されるライブラリ。
【請求項１９】
固相スクリーニング方法に使用するアレイであって、固体担体に固定された請求項１８記載の複数のライブラリを含むアレイ。
【請求項２０】
請求項１９記載のアレイを含むスクリーニングチップ。
【請求項２１】
固体担体上でのスクリーニング工程において使用する結合複合体を準備する方法であって、以下の工程を含む方法。
ａ）請求項１４記載の前記リガンドタグの前記官能基Ｙと、スクリーニングする前記リガンドとを共有結合し、リガンド／リガンド−タグ接合体を形成する工程；
ｂ）自己集合単層を形成可能で、請求項１４記載のリガンド−タグの官能基Ｚと反応可能な活性化頭基をもつアンカー構造を前記担体上に固定する工程；
ｃ）前記リガンド／リガンド−タグと、前記担体上に固定したアンカーとを共有結合させる工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親和性結合相手の検出を可能にする固体担体上での並行ハイスループットスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
通常、医薬品開発の過程には、可能性のある薬剤を同定することを目的とした多くの化合物を分析する工程が含まれている。この目的のために、ターゲット−リガンドシステムによる化合物の生体高分子相互作用が研究されており、前記ターゲットは、例えば、生体高分子（例えば、タンパク質）であり、前記リガンドは、「プローブ」、すなわち、通常低分子量分子（例えば、ペプチド、オリゴヌクレオチド、または小有機分子）である。かかるリガンドは、特異的な構造特性を示し、ターゲットが対応する構造要素を持つ場合、前記ターゲットと相互作用することができる。
【０００３】
化合物ライブラリに含まれている数百または数千の化合物を分析するために、スクリーニング分析は、通常マイクロプレートシステムまたは液体ハンドリングロボットに基づくハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に適合していなければならない。しかしながら、従来のＨＴＳ法は、通常、ターゲットが有効とされ、機能的に特徴付けられる場合にのみ適用することができる。多くの場合、リガンドまたは基質が、前記ターゲットとして知られている。これらのＨＴＳ法は、多くの場合、高い親和性で結合する分子の検出し、スクリーニングされた複合体分子に偏り、通常、その的中率は低い。たとえ、これらの技術的障害が解決されたとしても、その結果の分析はしばしば退屈であり、従来のＨＴＳシステムは、経験的人為的結果のため、または分析システムの要素と化合物の相互作用であるため、しばしば誤った独り善がりの結果となる。
【０００４】
ＨＴＳは、溶液中または固相上で行うことができる。固相スクリーニングの主な利点としては、その試験装置を小型化するという内在的な可能性がある点である。もう一つの利点は、前記固体担体と、スクリーニングのために固定した相互作用相手とを、一旦最初のスクリーニングで結合させた構造を除去することで、例えば、洗浄工程により、再利用する可能性があることである。固相スクリーニングとしては、主として巨大分子ターゲットまたは結合分子ターゲット候補、すなわち、リガンドを固定することができる。最初の選択肢が、高親和性結合相手の検出に使用されると、第２の選択肢である固定したリガンドは、相互作用するターゲットの架空の立体障害のため、スクリーニングに不適当だとみなされる（例えば、非特許文献1参照。）。
【０００５】
ＨＴＳスクリーニングのもう一つの重要な側面は、単位あたり時間に多くの化合物をスクリーニングできるために、スクリーニング工程を並行化することである。この方法により、検出システムには、複数の試料を記録することができるもの、例えば、ＣＣＤカメラを利用した撮像システム等といった検出システムを使用することができる。
【０００６】
このようなＨＴＳ方法を使用することで、化合物ライブラリに含まれる種々の可能性のある薬剤候補について、ターゲットと相互作用する可能性を試験することができる。しかしながら、利用できる試薬のパレットが莫大なため、理論上利用可能な化合物のライブラリの大きさを非常に増加させる。ヒトゲノム計画の結果として、Ｘ線結晶解析、核磁気共鳴またはほかの高解像度生物物理学的手法により研究できるものよりも、より多くのターゲットを利用できる。また、スクリーニング方法に適した化合物ライブラリを提供するのは難しく、特に、特に機能がわかりにくい複数のターゲットを調査することは難しい。よって、多くの場合、利用可能な機能的データが全くない多くのターゲットを、リガンド候補の好ましい構造的特徴に関する適当な情報もなく研究する必要がある。
【０００７】
未知の構造のターゲットに対するリガンドを特定するためのいかなる試みも、影響する可能性がある化合物の非常に大きな集合体の中の代表的な一部分を形成する分子のライブラリを必要とする。これらの部分では、できる限り構造的に多様でなければならない。多様性の基準としては、例えば、原子結合、物理的性質、コンピュータ測定、または生物学的活性があげられる。より大きな母集団に存在するあらゆる化学的多様性を最もよくあらわす化合物の一部分を選択する利点としては、重複する化合物の合成とスクリーニングとにかかる時間ならびに経費を回避する点である。
【０００８】
結果として、極めて大きなライブラリは、合成およびスクリーニング設備の現時点での限界に適応するためにより小さい部分集合にしなくてはならず、全ライブラリの最も代表的な化合物の組に選択する必要がある。化合物選別の工程、すなわち「ライブラリ設計」は、無作為に行われ、医薬化学またはコンピュータ支援により誘導することができる。
【０００９】
前述のように、ライブラリ設計のための重要な基準は、ライブラリの大きさおよび多様性である。より最近では、「薬剤様」に関わる分子特性が、医薬品開発の後の工程における失敗の確率が高い化合物を削減するために、重要な役割を担っている。薬剤様特性は、いわゆるＡＤＭＥＴ（吸収、分布、代謝、排出、毒性）規則に広く関係している。これらは、既知の薬剤特性に基づく「5つの規則」を用いて最も一般的に定義されている（例えば、非特許文献２参照。）。
【００１０】
最近では、薬剤の代わりに、同定したリード化合物の特性に基づく、ライブラリの設計の異なる取り組みが紹介されている。リード化合物は、出発分子としてみなし、次に同定する薬剤のための類似化合物を作成することができる。ある群のリード化合物は、Ｔｅａｇｕｅ等により、低親和性（＞0.1μｍ）、低分子量（＜350）および低ｃｌｏｇＰ（（n-オクタノール／水分配）の対数に符号をつけたもの）に分類されている。しかしながら、Ｔｅａｇｕｅ等によるこの新たな方法案の完成には、低親和性化合物のための効果的なスクリーニング方法が必要である。かかるリード様化合物は、薬剤様化合物または古典的なスクリーニングライブラリにしばしば見られるようなより大きな物質よりはるかに優れている。この理由は、リード最適化位相にある。比較的小さいサイズの分子に対して十分な親和性を持つとして検出したもの（リード様化合物またはリードという）を修飾し、同定した化合物の組み合わせによるか、または組み合わせ化学および医化学の方法によりさらに官能基を導入することによりそれらの親和性を増大させ、最終的には、前記ターゲットに対する高い親和性を有する薬剤様化合物を得ることができる。この方法では、前記場合と違って、大きく、複雑ではあるが、よい結合剤を、関連し、必然的に保持していなければならない親和性という機能について理解することなく修正しなければならない。
【００１１】
ライブラリ設計の適当な方法を見出すことに加えて、この複数の化合物（ライブラリ）をいかに最良に得ることができるかという問題、例えば、市販されていない化合物を選択するための合成経路等を解決しなければならない。
【００１２】
コンビナトリアル・ケミストリは、非常に多様なライブラリ合成のための最もよい手段を提供する。コンビナトリアル・ケミストリの利点、特に自動並行合成の有効性は、極めて短い期間で、何百何千という化合物を生み出す能力にある。コンビナトリアル・ケミストリによって生成された非常に多くの化合物をスクリーニングするために、生物学的アッセイを、ＨＴＳに適合させる。
【００１３】
薬剤様化合物のライブラリと比較して、コンビナトリアル・ケミストリに使用されるライブラリの化合物の１つは、通常、より小さい分子量の複雑でない構造を示す。組み合わせライブラリ、例えば、特異的な化学的機能または特異的な立体構造を持つ１組の分子は、異なる基礎単位（Ｒ-基もしくはモノマーと呼ばれているか、または試薬として残りの分子とまだ結合していない形状）を含む。ある方法では、これらの基礎単位を共通の骨格と組み合わせて結合させることであって、基礎単位を直接結合させる場合、前記骨格は、それらの反応に応じてそれらの間に形成した結合に変換してもよい。前記方法は、計算的な対処が容易であるため、直積空間における操作が、ライブラリの性質をよりよく網羅すると予測される。それらの分子特性に基づく生成物の選択（cherry-picking）は、通常、組み合わせプレートの割合に対して粗末な効果を生じる。ハイブリッド法は、同時ではあるが、直積空間の操作が、合成の簡素化を保つように調整できる点、すなわち、限られた数のモノマーを合成に使用する点が有利である（例えば、非特許文献４、非特許文献５参照。）。
【００１４】
組み合わせライブラリの種類の区別は、大きさおよび使用した骨格および基礎単位の複雑さにより行なわれる。大きく複雑な骨格では、前記基礎単位はあまり本質的な情報ではないため、「装飾」とみなすことができ、前記骨格と前記基礎単位との相互作用は、大部分は、ターゲットの親和性に対する関連した構造的特徴を提供するものである。一方、直接結合する基礎単位を含むライブラリは、「豊富な情報」すなわち、前記ターゲットに対する特定の親和性の可能性をすでにもつ関連した複雑な基礎単位で構築されていなければならない。それらを、部位別の分子の種類を示すリガンド断片としてみなすことができ、最終的には、スクリーニングの結果として想定することができる。この場合、前記基礎単位自身の特性に基づく試薬選択の見解が、重要な役割を占める。もちろん、これらの２つの見本となるライブラリコンセプトは、多くの可能な設計における両極端である。
【００１５】
観念または実験技法として、例えば、“ＳＡＲ  ｂｙ  ＮＭＲ”（非特許文献６参照。）、“ＳＨＡＰＥＳ”（非特許文献７参照。）、ＲＥＣＡＰ（非特許文献８参照。）のような特権基礎単位の確認（the identification of privileged building blocks）が報告されている。コンピュータ支援（新規の）医薬品設計法（非特許文献９参照。）は、同様の推論にしたがって、まず断片を発見し、ついでより強力な化合物に組み合わせる。これらの手法に用いられる断片は、非常に分子量が小さいため、通常、それらは、そのターゲットに低親和性だけで結合し、比較的時間のかかる実験方法にのみ利用可能で、通常ターゲットの構造に関する非常に多くの情報と相当な量の試験物質を必要とする。よって、スクリーニング法は、低分子量のリガンドまたは断片を同定するために、低親和性の結合相手の検出を容易にする必要がある。かかる方法は、前記合成断片に基づく手法およびＴｅａｇｕｅ等による前記「薬剤様発見」方法のどちらの場合にも適用できる。
【００１６】
親和性結合相手の検出用ＨＴＳとして適当なスクリーニング方法は、下記の基準を満たす必要があり、すなわち、並行検出方法による固体担体上のスクリーニングを可能にする必要がある。しかしながら、低親和性結合相互作用の検出を可能にするために、前記担体と前記ターゲットの非特異的な結合または前記リガンド構造と前記ターゲットとの非特異的な結合により生じるバックグラウンドを、非常に低くする必要がある。
【００１７】
数種の親和性に基づく方法が開発されているが、それらの方法は、低親和性スクリーニングを可能とするが、ＨＴＳに適応せず、かつ上記残りの基準を満たさない。特許文献３〜５には、核磁気共鳴（ＮＭＲ）に基づくターゲット分子に対するリガンドの設計と同定方法が記載されている。１５Ｎ−と標識されたターゲット分子を単独のリガンドまたはリガンドの混合物と培養する。蛋白質への結合部位およびリガンドの結合定数は、ＮＭＲスペクトル観測により評価することができる。この方法を用いることにより、低親和性で結合するリガンドを同定することができる。ストロメリシンリガンドの結合定数は、非常に低い（１７ｍＭ〜０．０２ｍＭ）（非特許文献１０参照。）。この低親和性結合リガンドの架橋は、高親和性で結合するリガンドを生ずる（非特許文献６および１０参照。）。しかしながら、ＮＭＲ法の感度が低いために、多量の１５Ｎ−標識蛋白質が必要なる。その方法のすべての利点を利用するために、完璧な構造分析をスクリーニングに先んじて行わなければならない。その方法の欠点は、比較的小さな蛋白質（＜４０ｋＤａ）にのみ適用できる点である。
【００１８】
いくつかのグループが、化合物の混合物中でタンパク質を培養し、ついで、質量分析を用いて精製した後、前記リガンドを同定する方法を確立した。
Ｋａｕｒ  Ｓ等は（非特許文献１１参照。）、リガンド混合物と培養した後、前記ターゲット−リガンド複合体の精製にサイズ排除クロマトグラフィーを用いる方法を発展させた。ついで、前記リガンドは、逆相クロマトグラフィーで分離され、ＭＳ／ＭＳで同定される。ライブラリに基づくより大きな分子量のスクリーニングに適した同様の方法が、Ｌｅｎｚ  Ｇ．Ｒ．等（例えば、非特許文献１２参照。）に記載されている。
どちらの方法も、複合体がサイズ排除クロマトグラフィーの間に分離されないために非常に安定でなければならないという事実によって用途が制限されている。サイズ排除クロマトグラフィーとキャピラリー電気泳動法とを二者択一的に用いることができると特許文献６に記載されている。特許文献７では、可能性のあるダイマーのライブラリ合成のために基礎単位として使用される低親和性リガンドの検出方法を開示している。欠点としては、非常に高濃度のリガンドを使用するため（タンパク質に対して１００〜１０００倍過剰）、非特異的な結合の機会が増加することである（例えば、非特許文献１３参照。）。
３次元創薬（ｗｗｗ．３ｄｐ．ｃｏｍ／ｘ１３ＨｉｇｈＴｈｒｏｕｇｈｐｕｔ．ｈｔｍ）では、スクリーニング方法としての使用に走査熱量を適応させた。欠点としては、多量の試料を必要とする点である。
特許文献１および特許文献２では、リガンドの結合により起こる配座転移を検出するスクリーニング方法が記載されている。欠点としては、各ターゲットタンパク質のために新たなアッセイを開発しなければならず、一週間あたりの処理能力が、５０００化合物と比較的少ない点である。
【００１９】
これらのスクリーニング方法の全ては、固相スクリーニングに適しないという共通の欠点を持っている。すなわち、それらは、並行および小型化を実現することがほとんど不可能である。
【００２０】
一方、固相担体上での並行スクリーニング方法は、ハイスループットスクリーニングに適しているとされている。しかしながら、これらは、低親和性結合相手の検出を効果的に行うために必要な感度を持っていない。
Ｇ．ＭｃＢｅａｔｈおよびＳ．Ｌ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒは、ＤＮＡマイクロアレイを加工するために設計された高精密ロボットを用いて、チオール含有小分子をマレイミド誘導スライドガラス上に高空間濃度（１６００ｓｐｏｔ／ｃｍ2）に液滴することを行っている（例えば、非特許文献１４および１５参照。）。ついで、各スライドを異なる標識の蛋白質で精査することができ、結合は、蛍光連鎖分析によって検出する。
このマイクロアレイは、一回の実験でかつ一枚のスライドガラス上で、三つの異なる蛋白質を含む約１００００の結合を測定するのに用いられる。しかしながら、その提案されたシステムでは、親和性相互作用をナノモーラーからマイクロモーラーの範囲のＫD値で検出するだけである。
Ｐ．Ｊ．Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ等は、同じ方法を使用して、スライドガラス上にアルコール含有小分子を固定する（例えば、非特許文献１６参照。）。このアレイは、８０の化合物を含む化合物ライブラリから既知のリガンドを検出することができる。欠点は、水酸基を介して前記リガンドが固定されることである。アルコールを含むリガンドはいくつかの水酸基を含むため、前記反応を部位選択的に行えず、結果として前記リガンドの異なる発現を生じていた。
さらには、ＭｃＢｅａｔｈ等およびＨｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ等により記載されているマイクロアレイは、規則正しい自己集合単層（ＳＡＭ）の形成をさせないアミノプロピル−シラン処理した表面を用いる（例えば、非特許文献１７参照。）。これは、非前記ターゲットとの特異的な結合相互作用に好都合であるため、それによって偽陽性ヒットの数を増加させる（例えば、非特許文献１８参照。）。
加えて、リガンド密度が両実験とも非常に高く、ターゲットのリガンドクラスターへの非特異的な結合を増加させ、それにより前記バックグラウンドが増加する。このように、高いバックグラウンドおよび高いリガンド濃度のために、これらの方法での低親和性リガンドの検出は不可能である。
【００２１】
Ｓｃｈａｒｎ等は、１，３，５−トリアジンのような膜結合小有機分子の合成とスクリーニングとの並列方法を記載している（例えば、非特許文献１９参照。）。この方法によりつくられるアレイは、８０００サンプルまで含むことができる。リガンド−ターゲット相互作用は、酵素結合アッセイにより検出される。Ｓｃｈａｒｎ等により記載されているマイクロアレイの欠点としては、セルロース膜のみが、制限されたコンビナトリアル・ケミストリーを可能にする点である（例えば、非特許文献１９参照。）。さらに、担体として使用したセルロース膜は、比較的高いバックグラウンドを生む。加えて、セルロース基質は、表面だけでなくゲル内部にもリガンドを含むハイドロゲルを形成する。このことは、高度に水和した有機基質の中のターゲットと固定されたリガンドの間との相互作用の拡散限界を生む。さらに、前記セルロース基質上でのリガンドの共有結合は無作為に起こり、反応パラメータを最適化することは不可能である。
【００２２】
【特許文献１】
米国特許第５,５８５,２７７号
【特許文献２】
米国特許第５,６７９,５８２号
【特許文献３】
ＷＯ９８／４８２６４
【特許文献４】
ＷＯ９７／１８４６９
【特許文献５】
ＷＯ９７／１８４７１
【特許文献６】
ＷＯ９９／３４２０３
【特許文献７】
ＷＯ００／００８２３
【非特許文献１】
Ｇｏｒｄｏｎ  Ｅ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｋｅｒｗｉｎ  Ｊ．Ｆ．，  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｌｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ  １９９８，ｐ．４２４−４２５
【非特許文献２】
Ｌｉｐｉｎｓｋｉ，Ｃ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．  １９９７，２３：３−２５
【非特許文献３】
Ｔｅａｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  １９９９，３８：３７４３−４８
【非特許文献４】
Ｐｅａｌｍａｎ  Ｒ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  Ｋ．Ｍ．，  Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ  １９９８  ２３：８８５−８９５
【非特許文献５】
Ｊａｍｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ２０００，４０：６３−７０
【非特許文献６】
Ｓｈｕｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９６，２７４：１５３１−１５３４
【非特許文献７】
Ｆｅｊｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９９，６：７５５−７６９
【非特許文献８】
Ｌｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｆ．  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｓｃｉ．  １９９８，３８：５１１−５２２
【非特許文献９】
Ｊｏｓｅｐｈ−ＭｃＣａｒｔｈｙ  Ｄ．，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  １９９９，８４：１７９−１９１；３０５−３５４
【非特許文献１０】
Ｈａｄｊｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９７，２７８：４９７−４９９
【非特許文献１１】
Ｋａｕｒ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．  １９９７，１６；５０５−１１
【非特許文献１２】
Ｌｅｎｚ  Ｇ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＤＤＴ  ２０００，５：１４５−１５６
【非特許文献１３】
Ｅ．Ｍ．Ｇｏｒｄｏｎ  ａｔ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｌｙ  Ｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅｓ
【非特許文献１４】
Ｇ．Ｍｃｂｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００，２８９：１７６０−６３
【非特許文献１５】
Ｇ．Ｍｃｂｅａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １９９９，１２１：７９６７−６８
【非特許文献１６】
Ｐ．Ｊ．Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２０００，１２２：７８４９−５０
【非特許文献１７】
Ｍ．Ｇｒｕｎｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  １９９６，５８：４３−６７
【非特許文献１８】
Ｔuｎｎｅｍａｎｎ  Ｒ．  ２０００，  ｉｎ  “Ｓｙｎｔｈｅｓｅ  ｕｎｄ  ｓｐｅｋｔｒｏｓｋｏｐｉｓｃｅ  Ｕｎｔｅｒｓｃｈｕｎｇ  Ｓｉｌｉｃａ−Ｇｅｂｕｎｄｅｎｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｕｎｄ  ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｂｉｎｄｕｎｇｅｎ  ｕｎｄ  ｄｅｒｅｎ  Ａｎｗｅｎｄｕｎｇ  ｉｎ  ｄｅｒ  Ｓｅｎｓｏｒｉｋ”，  Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ  ｄｅｒ  Ｆａｋｕｌｔaｔ  ｆuｒ  Ｃｈｅｍｉｅ  ｕｎｄ  Ｐｈａｒｍａｚｉｅ  ｄｅｒ  Ｅｂｅｒｈａｒｄ−Ｋａｒｌｓ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔaｔ  Ｔuｂｉｎｇｅｎ  ｐ．４４−４６
【非特許文献１９】
Ｓｃｈａｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｏｍｂ．  Ｃｈｅｍ．  ２０００，２：３６１−３６９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
したがって、本発明の目的は、ターゲットに対するリガンドの親和性が低い場合でも、目的のターゲットに結合するために、固体担体に固定された化合物（リガンドと呼ばれる）の能力を決定する方法を提供することである。本発明の方法は、特に分子サイズの小さいリガンドおよび／または低分子量のリガンドの同定に有用であり、ハイスループットスクリーニングに適している。そのようなスクリーニング方法は、事前の低親和性リガンドの同定を必要とせず、機能的情報からの特徴づけが十分でないターゲットの調査に特に適している。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
すなわち、本発明の方法は、下記工程を含む低親和性結合リガンド検出のためのスクリーニング方法である。
ａ）異なるリガンドのライブラリを準備する工程；
ｂ）固体担体上に前記リガンドを固定することにより、前記担体上の前記リガンドを含む結合複合体を形成する工程；
ｃ）目的のターゲットと前記結合複合体とを接触する工程；
ｄ）前記結合複合体に含まれる各種のリガンドに対する前記リガンド／ターゲット相互作用の結合価を並行して決定する工程；
ｅ）固定した状態で、所定の閾値を超える前記ターゲットに対する結合価のリガンドを選別する工程；
ｆ）非固定状態で、前記ターゲットに対する前記工程（ｅ）において選別した各リガンドの親和性を評価する工程；
ｇ）前記工程（ｆ）の少なくとも一つのリガンドを低親和性結合リガンドとして同定する工程。
【００２５】
もちろん、複数の化合物を持つ所定のライブラリをはじめとし、１度、前記工程ｂ）で前記化合物の一部分のみを固定し、全化合物ライブラリが、スクリーニング工程を行うまで前記工程ｂ）からｄ）を繰り返すことにより、本発明の方法を行うこともできることを理解すべきである。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の方法において、先行技術の先入観に反して、固相スクリーニングによる低親和性結合相手を検出することが可能であることを見出した。本発明において開示されたスクリーニング方法は、低親和性検出方法の全ての基準を満たし、前記方法とは、リガンド／ターゲット間の相互作用を、直接結合アッセイを介して検出し、前記並行検出方法は、ハイスループットを容易にする。前記ターゲットが通常固定されている標準的な固相スクリーニング方法とは違って、本発明においては、前記リガンドが前記固体担体上に固定されている。これは、以下のような利点があり、その利点とは、一度固定したリガンドは、洗浄し、何らかの結合したターゲットを除去することができ、ついで別のターゲットの選別に再利用することができることである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
第一段階として、異なる可能性のある低親和性リガンドのライブラリを、当業者に既知のライブラリ基準、例えば、多様性、薬剤類似物またはリード類似物ならびに、特に、使用する基礎単位の大きさを用いて、選択してもよい。主に低分子量分子のライブラリを使用することが好ましく、例えば、４００ｇ／ｍｏｌ未満の数平均分子量であって、好ましくは＜３８０ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは＜３７０ｇ／ｍｏｌ、最も好ましくは＜３５０ｇ／ｍｏｌであり、この場合、リガンドとして、低親和性リガンドとしてみなすことができ、具体的には、個々のリガンドが、特異的に高い分子量を持つことができればよく、好ましくは８００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量、より好ましくは７００ｇ／ｍｏｌ未満である。しかしながら、十分な相互作用を可能にするために、分子量の下限値としては、例えば、４０ｇ／ｍｏｌ、好ましくは５０ｇ／ｍｏｌ、ある場合では６０または７５ｇ／ｍｏｌである。このように、本発明は、以下の点で、当業者に知られているスクリーニング法とは基本的に異なる。化合物を、前記工程ａ）のライブラリの準備に使用し、それらの低分子量または低い複雑性（例えば、それらの立体構造に関して）により、前記ターゲットに対して低い親和性しか持たない固体担体上に固定することができる点である。
【００２８】
これらのリガンドは、固体担体上に固定されており、本発明において、「結合複合体」という用語は、通常そのような単体に固定された複数の異なるリガンドを含む表面のことを言う。固相スクリーニングと並行検出法とに必要なことは、固体担体としてマイクロアレイを使用することであって、さらに、前記リガンドが、前記マイクロアレイ上で規則正しいパターンを形成していることが特に好ましい。個々のリガンドは、通常グループ化し、その目的配列は、多くの領域を含み、それぞれの領域は、隣接する領域により表されるリガンドとは異なるリガンドのタイプを示す。既知の異なる領域でのリガンドのタイプで、それぞれの種のリガンドが、そのようなアレイ中で別々に配置することが可能となる。
【００２９】
前記リガンドを前記担体上に直接固定せず、いわゆるアンカー分子を介して固定することが好ましく、前記アンカー分子は、前記担体表面上で自己集合単層(ＳＡＭ)を形成する。かかるＳＡＭは、非特異的なターゲット吸着が起きにくく、前記バックグラウンドを積極的に減少させる。これは、低親和性結合リガンドの検出を行うにあたって重要である。
【００３０】
結合価決定に負の影響、例えば、結合したターゲット間またはターゲットとリガンドとの間に立体障害をもつ可能性のある立体効果、および、ターゲットとリガンドクラスターとの間の非特異的な結合の結果生じる偽の信号は、特別な界面活性剤を使用することにより回避することが好ましい。この方法を適用する場合、「希釈要素」、すなわちリガンドとして作用しない構造は、担体上に存在していることが好ましい。かかる希釈要素が、前記結合複合体内で構造を示すと、立体的または電子的複雑度の欠如により、目的のターゲットへの結合を予測することができなくなる。むしろ、これらの要素は、前記リガンドを空間的に分離することに専ら役立つ。この場合、特に、ＨＴＳにおける前記ターゲットに示される機能的表面を構築し、管理されたリガンドの密度とともにリガンドの凝集およびリガンド−リガンド間の相互作用を回避することに役立つ。さらに、この結合複合体を形成する分子の秩序構造は、前記ターゲットと前記担体または前記ターゲットと前記リガンド間の非特異的な結合から生じるバックグラウンドの信号を大きく減少する。
【００３１】
前述のような固定に続いて、前記リガンドを目的のターゲットの溶液または懸濁液と接触させる。本発明の方法に特に有用な適当なターゲットは、高分子、特に生体高分子、例えば、タンパク質、酵素等である。
【００３２】
リガンド／ターゲット相互作用は、例えば、電気化学的方法、放射化学的方法、質量検出方法または光学的方法、具体的には、蛍光または発光測定等を用いて検出してもよい。もちろん、適当な画像化システム、例えば、ＣＣＤカメラ等により並行検出させる方法により行うことが好ましい。特に好ましくは、非標識検出方法、例えば、表面プラズモン共鳴である。
【００３３】
ターゲットに結合する可能性については、組み合わせライブラリの化合物をスクリーニングした後、目的リガンドを前記スクリーニング工程でえられた結合価の特定の閾値を決定することにより選択する。観測できる結合価は、検出方法に依存しているため、より多くのターゲット分子があるタイプのリガンドに結合すると、そのタイプのリガンドの結合価がより高くなる。本発明の方法において、ヒットは、それらの結合価に準じて分子を評価することにより選択されることが好ましく、本発明に基づく方法の工程（ｅ）の閾値を、次の工程（ｆ）の評価において選別されたリガンドのある部分を含むように意図的に選択してもよい。この選択工程を支持するソフトウェアプログラム（Ｊａｒｒａｙ）は、本発明で開示されている。
【００３４】
前記結合価とは、固定された目的リガンドと前記ターゲットとの間の結合強度に関する値をしめし、それらの相互親和性の最初の評価となる。しかしながら、結合価は、選択した検出方法の種類のための特性である。一方それらの活性に関わらない多くの化合物の実際の並行定数を決定するために、多くの時間がかかる。すなわち、本発明の方法によると、可能性のある低親和性リガンドが、まず、工程(ｅ)において選択される。得られた結果を比較可能にし、遊離した状態でのスクリーニングされたリガンドが、固定された状態で同様の結果をもたらすということを立証するために、ついで、工程（ｆ）において親和性決定による評価を行う。この工程おいて、前記リガンドの前記ターゲットに対する親和性の絶対値、例えば、解離定数KD、会合定数ＫA、またはリガンドの阻害定数Ｋi、またはＩＣ50値は、遊離した状態、すなわち非結合状態のリガンドで、溶液中で測定する。かかる値は、一般的な方法、例えば、一方は、遊離したリガンドとターゲット、もう一方は、リガンドーターゲット複合体との間の溶液中の平衡から得られ、選択されたリガンドのインビボ効果特性の指標となる。
【００３５】
前記スクリーニング工程で得られた情報により示される親和性に基づく評価は、一つのまたはより多くの低親和性結合リガンドの同定する結果を招く。前記工程（ｆ）で同定される適当な低親和性リガンドは、薬剤または薬剤の構造単位を形成し、ターゲットの結合を阻害する最も可能性が高いものである。通常、低親和性リガンド間の親和性としては、元の全く絞られていないライブラリから見ると、比較的強い前記ターゲットに対する親和性が選択される。しかしながら、目的の低親和性リガンドは、前記スクリーニングされたリガンドに対してもっと高い親和性を必要としているわけではない。例えば、「Ｊａｒｒａｙ」といった適当な評価方法を選択することによって、スクリーニングされたリガンド内の構造サブユニットで前記リガンドの全体としての親和性増加の大いなる一因となりうる構造サブユニットを同定し、かかる構造サブユニットを持つリガンドを、工程（ｆ）で同定、選択する可能性があるため、絞られたライブラリに含まれることが多い。最終的には、別の要素、例えば、生産コストまたは前記問題は、特異的リガンド構造がその分野においてすでに知られてようがなかろうが、適当な低親和性リガンドが同定されると、特定のリガンドの絶対的親和性とみなされる。
同定されたヒットの分析によって得られた構造情報を用いて、より限定したサイズ、スクリーニング工程で回収されたリガンドと構造的に類似したリガンドのライブラリ、すなわち、絞られたライブラリの設計を行うことができる。もちろん、本発明の方法で同定したリガンドは、組み合わせ合成のさらなる工程において基礎単位または反応物として使用してもよく、すなわち、それらは、互いにまたは異なる種のリガンド構造と結合して、より大きな分子量およびより機能的に複雑なリガンドを形成してもよい。同様にして、元のライブラリから同定され、特に活性があると証明されたリガンドの部分構造を、互いにまたは新たな構造の基礎単位でそれらを組み合わせることにより新たなリガンドの条件での基礎単位として用いてもよい。後者の場合、元のスクリーニングによる構造を変化させるが、工程（ｆ）で元来同定されたものに基づく新たなリガンドの分子量を増加させる必要はなく、少し減少させるだけでよい。
【００３６】
このように、元の小分子のリガンドを、特定のターゲットに対する、より高い親和性の可能性を持つ付加的な官能基を導入することにより、より高い親和性へと変更することができる。この結合により、得られたリガンドの数を再び減らして本発明のスクリーニング方法により最も強力な代表を選択することで、最終的な薬剤構造へと進めることができる。ライブラリのメンバーがこれらの方法で到達可能な程度のある複雑さに到達すると、従来のスクリーニング法または生物学的試験を単独若しくは並行して使用することができる。
【００３７】
本発明の方法は、工程（ａ）〜（ｇ）と異なる工程（ａ’）〜（ｇ’）を含んでいてもよく、前記工程(ａ’)で最初に使用するライブラリは、前記工程(ｇ)で同定したものから誘導したリガンドを含む。前記工程(ｆ’)で決定した親和性は、少なくとも、同一レベルであって、前記工程(ｆ)で決定されたものよりも高いことが好ましい。
【００３８】
本発明の方法は、選択したターゲットとともに５μＭより大きいＫDの複合体を形成する低親和性リガンドの同定を可能にする。通常の測定条件下では、１０を超える値、また５０または１００μＭを超える値が、前記スクリーニング工程で選択されたリガンドから得られる。すなわち、本発明の方法は、従来の薬剤様化合物のライブラリと比較して明らかに減少した複雑さをもつ化合物のライブラリから、有望なリガンドを選択することを可能にすると理解するべきである。本発明のスクリーニング工程の感度によると、例えば、組み合わせの合成のごく初期の段階で、関連する化合物の結合価が、一般的なアッセイにより分類するには低すぎる場合、薬剤を得るために適当な構造モチーフを同定できる。結果として、合成努力ならびにコストおよび時間がより集約された生物学的アッセイを、ある程度まですでに効果が得られているリガンドまたは機能的サブユニットに集約することができる。さらには、より複雑な薬剤様分子の構造サブユニットに適当な構造から得られた親和性データは、かかる分子の活性を評価するために使用する計算方法の基準として使用することができる。
【００３９】
以下に、本発明の目的に使用するスクリーニング工程の好ましい構造的要件および実施形態を示す。
【００４０】
リガンドの固定に使用する担体は、基質を含み、前記基質は、好ましくは金属元素、より好ましくは貴金属元素（銀、パラジウム、白金；特に金）または少なくともそのような金属の層で表面を部分的に覆われた基質剤により形成されている。特に金の表面が好適である。その使用する原料は検出法に依存する。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）のような反射光学法であれば、薄い金のフィルムで覆われたガラスまたは光透過高分子の基質剤を使用することが好ましい。
【００４１】
好ましくは、前記固定したリガンドを２次元のアレイに配置することであって、すなわち、不連続な領域を含むマイクロアレイ上に、容易に同定およびアドレスできるような空間配置で配置することである。アレイの各位置は、既知の原型からおよび既知の構造である種のリガンドを伴っている。本発明の目的に適当なマイクロアレイは、スクリーニングを目的とし、例えば、２次元の平面固体担体であって、それは、小型の試料を固定するための複数の位置−アドレス可能な反応エリアを持つものであって、好ましくは通常のパターンで直径約２．５ｍｍ以下の試料を固定するものであって、より好ましくは直径１ｍｍ以下の試料を固定するものであって、さらに好ましくは直径０．５ｍｍの試料を固定するためのものである。
【００４２】
マイクロアレイを固体担体として使用する場合、ターゲット結合分子候補の最初のライブラリ中の異なる化合物の数と、前記アレイ中の反応区画の数とを対応させることが好ましい。本発明としては、ライブラリは、例えば、少なくとも約１５３６の異なる化合物を含み、好ましくは３０７２または４６０８以上、より好ましくは９２１６以上である。
【００４３】
本発明の結合複合体に到達するために、いくつかのアプローチが可能である。前記リガンドの構造およびそれらが持つ官能基により、前記リガンドは、前記固体担体上に直接付着させて、結合複合体を得てもよい。しかしながら、本発明の目的に関して、前記リガンドは、アンカー分子を介して前記担体に固定されていることが好ましく、前記アンカー分子は、少なくとも二つの官能基を前記アンカーの反対端に含み、１つは、前記担体の表面に結合させ、一方は、前記リガンドを結合する。かかるアンカーは、前記担体表面に自己集合単層(ＳＡＭ)を形成できることが好ましい。適当なアンカーは、例えば、WO00/73796およびDE 100 27 397.1等に記載されており、その中でも、チオール官能基を持ち、前記固体担体と相互作用するものが本発明としては好ましい。DE 199 24 608.8またはWO00/73796に記載されているＳＡＭ形成を指示する適当な構造要素は、同時に、担体とリガンドとの間の距離を調節する。前記文献では、そのようなアンカーおよびそれらに含まれる適当な結合複合体合成方法の詳細な説明を、それらに結合するリガンドと合わせて示している。
【００４４】
前記リガンドは、前記担体上に固定される前に、前記アンカー構造と共有結合することが好ましい。この場合、完全なリガンド−アンカー−接合体（ＬＡＣ）は、WO00/73796に記載されている担体と接触し結合する。
しかしながら、本発明では、DE 100 27 397.1に記載されている方法、すなわち、アンカー分子が、活性化された状態で前記担体上に固定化され、ついで前記リガンドと結合する方法であって、前記方法は、特に有効であることが証明されている。この方法において、アンカー構造は、反応性「頭基」、すなわち、前記リガンドとこの活性化アンカーとの反応が選択的に、かつ定量的に行なわれる基を持つように合成される。この頭基は、アンカーが固定された担体からみてアンカー構造の末端部分である。前記頭基の化学的特性により、この方法は、前記活性化アンカーの頭基と反応することができる特異的な官能基を持つように前記リガンドの化学的修飾を必要とすることがある。一旦前記担体の表面を前記アンカー構造で覆い、前記チオール−機能化リガンドを、前記メルカプトフィリック頭基と反応させて、前記単体上に固定したリガンド−アンカー−接合体を得る。この反応は、過剰なリガンド／修飾リガンドで行なわれ、前記アンカー分子の反応性「頭基」の好ましい定量的変換をはかる。この方法の利点は、表面のリガンド濃度が唯一アンカー分子の濃度によって決定し、加えられた溶液のリガンドの濃度によらないことである。これは、例えば、組み合わせ合成で得られ、不明確な濃度で存在する多くのリガンドを並行して分析しなければならない場合に特に有利である。さらに、異なる測定法の再現性と比較可能性とを改善できる。DE 100 27 397.1に記載されているリガンドと共有結合するメルカプトフィリック頭基が、本発明に適当である。その中でも、チオールを含むリガンドと、頭基としてマレイミド基を持つ結合アンカーとを反応させることにより結合複合体を得る方法が、特に有効であることが証明されている。この場合、チオール官能基は、合成の間もしくは合成後にスクリーニングされるリガンドに導入される。一旦、前記担体の表面をアンカー構造で覆い、前記チオール官能化リガンドを前記メルカプトフィリック頭基と反応させ、前記担体上に固定したリガンド−アンカー−接合体を得る。
【００４５】
したがって、本発明のアンカー分子は、下記一般構造式（１）を含み、DE 100 27 397.1に記載されている特に好ましい実施形態を含むように、定義され、合成されることが好ましく、Ｒは、直鎖または分岐鎖で、置換されていてもよく、飽和または不飽和の炭化水素鎖であって、前記炭化水素鎖は、ヘテロ原子、芳香性化合物および複素環式化合物を含んでいてもよい。
ＨＳ−Ｒ−Ｍ                  （１）
前記式（１）において、Ｒは５〜２０００の原子で構成され、ヘテロ原子を含む。具体的には、前記式（１）のＲは構造的サブユニットＲaとＲbの一つまたは両方から構成され、Ｒaがチオール基に隣接して位置することが好ましい。
【００４６】
前記Ｒaは、二価の基であり、ＳＡＭを形成することが好ましく、さらに、大部分が疎水性であることが好ましい。前記Ｒaは、５〜５０の炭素原子の分岐または直鎖の炭化水素鎖を含み、完全に飽和または部分的に不飽和であってもよく、芳香性化合物、複素環式化合物またはヘテロ原子により中断されていてもよく、ヘテロ原子を含まない完全な飽和炭化水素鎖であることが好ましい。好ましくは、前記Ｒaは、一般式−（ＣＨ2）n−を持ち、ここでｎは、５〜５０の整数であり、好ましくは５〜２５、特に好ましくは５〜１８、最も好ましくは８〜１２である。前記Ｒbは、一様に二価であり、第一の好ましい具体例は、一般式−（ＯＡｌｋ）y−のオリゴエーテルであり、ここでｙは整数で、Ａｌｋはアルキレンである。ここでｙの範囲は、１〜１００の間であり、好ましくは１〜２０の間、最も好ましくは２〜１０の間である構造が好ましい。アルキレンの炭素原子数は、好ましくは１〜２０、より好ましくは２〜１０、特に好ましくは２〜５を示し、−（ＯＣ2Ｈ4）y−であることが最も好ましい。
【００４７】
第二の好ましい実施形態では、Ｒbは、ジカルボン酸とジアミンおよび／またはアミノカルボン酸で形成されたオリゴアミンであり、ここで独立してアミンの炭素原子数は１〜２０、特に好ましくは１〜１０をであり、ヘテロ原子、特には酸素原子で中断されていてもよい。カルボン酸モノマーは、独立して、好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜１０の炭素原子を持ち、ヘテロ原子、特には酸素原子で中断されていてもよい。
【００４８】
アンカー構造中のＲaが単独で、またはＲaとＲbが一緒に、前記式（１）中のＨＳおよびＭと結合することがより好ましい。
【００４９】
特に好ましくは、Ｒの一般式は、下記式（２）である。
−（ＣＨ2）a−Ｑ1−（ＣＨ2）b−｛［Ｑ2−（ＣＨ2）c−［Ｏ−（ＣＨ2）d］e−Ｏ−（ＣＨ2）f］g−［Ｑ3−（ＣＨ2）d'］−Ｏ−（ＣＨ2）f'｝h｝i−Ｑ4−（ＣＨ2）j−Ｑ5−（ＣＨ2）k−      （２）
前記式（２）において、変数は、独立して以下のように定義され、数値範囲は、それらの個々の制限値およびその間の全ての整数値を含む。
Ｑ1、Ｑ5 は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−または結合であり；
Ｑ2、Ｑ3、Ｑ4は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であり；
Ａは、５〜２０、好ましくは８〜１２、より好ましくは１０であり；
ｂは、Ｑ1が結合である場合には０〜５、好ましくは０であって、その他すべての場合において１〜１０、好ましくは２〜７、特に好ましくは３〜５であり；
ｃ、ｃ'は、１〜５、好ましくは１〜３、特に好ましくは１であり；
ｄ、ｄ'は、１〜５、好ましくは１〜３、特に好ましくは２であり；
ｅ、ｅ'は、１〜５、好ましくは１〜３、特に好ましくは２であり；
ｆ、ｆ'は、１〜５、好ましくは１〜３、特に好ましくは１であり；
ｇ、ｈは、０〜３でg＋h≧１、好ましくはg＋h＝２であり；
ｉは、１〜３、好ましくは１〜２、特に好ましくは１であり；
ｊは、０〜５、好ましくは１〜３、特に好ましくは２であって；
ｋは、０〜５である。
【００５０】
メルカプトフィリック頭基Ｍは、例えば、ヨウ素、アセトアミドまたは臭素アセトアミド、ピリジルジチオ化合物、一般的なマイケルアクセプタ、エステルのようなアクリル酸誘導体、アミド、ラクトンまたはラクタム、メチレン−ジフルオロシクロプロパンジェミナル、α，β−不飽和アルデヒドまたはケトンおよびα，β−不飽和スルホンまたはスルホンアミドである。
【００５１】
好ましい頭基Ｍは、下記一般式（３）である。
【化１】
2004531700.tif 000002
前記式中
Ｒ1およびＲ2は、独立して、水素またはC1-C5アルキルであって、好ましくはメチル基、エチル基またはノルマルプロピル基であり、
Ｒ3およびＲ4は、独立して、水素またはC1-C5アルキルであって、好ましくはメチル基、エチル基またはノルマルプロピル基であるか、またはＲ3とＲ4あわせて＝Ｏであり
他のアンカーとの結合は、窒素原子を介してもたらされる。
【００５２】
好ましくは、Ｒ3およびＲ4がともに＝Ｏであり、最も好ましくは、その頭基は、マレイミジル基である。
【００５３】
最終結合複合体では、希釈成分は、隣接したリガンドとの距離を制御するために、前記固定されたリガンドとともにその表面に存在することが好ましい。これらの希釈成分は、それらの固定を可能にさせるリガンドまたは活性化された基を含まない。むしろ、それらは、前記ターゲットと何らかの相互作用を示さないような結合複合体を化学的に単純な構造とする一因となる。前記リガンドの希釈は、前記ターゲットとの相互作用に影響を与える共同の相互作用の発生を防ぐ。同時に、結合したターゲットの相互作用は、共役部位としてのリガンドの空間的な間隙の発生を防ぐ。しかしながら、希釈成分は、前記ターゲットと固定したリガンドの相互作用に影響を及ぼすべきではない。特に、前記ターゲットと前記希釈成分との結合は、起こらないはずである。したがって、前記希釈成分は、前記ターゲット、例えば、蛋白質に対して高い吸着抵抗を持つはずである。すなわち、適当な希釈成分は、立体的にかつ電気的に単純な構造、例えば、前記担体上に固定させる単純な官能基が提供される炭化水素鎖に基づく。
【００５４】
特に、固相スクリーニングに適当な官能化表面は、前記希釈成分と前記リガンドまたはリガンド運搬構造とが１：２〜１：１００００、好ましくは１：１０〜１：１０００または１：１０〜１：１００の割合で使用した場合得られる。均質官能化表面は、担体に接触するリガンドと希釈成分との両方を充分に混合した溶液とすることにより、最もよく得られる。
【００５５】
アンカー構造を前記リガンドの固定に使用する場合、前記希釈成分の全体の長さは、アンカー分子より若干短くなる。一方、前記アンカー分子と前記希釈成分とは、前記固相表面上での均一配合を確実にし、充分に構築されたＳＡＭｓを形成させるために大きな構造的類似を持つことが好ましい。例えば、これらの規準を満たす希釈成分は、下記式（４）の一般式を持つ。
ＨＳ−Ｒ−Ｘ        （４）
前記変数は、DE 100 27 397.1に定義されている通りであって、それを本発明に使用することが好ましい。このように、Ｒは、前記アンカー構造として独立して定義され、Ｘは、非メルカプトフィリック頭基であり、好ましくは分子量６０、５０、または４０ｇ／ｍｏｌ未満の分子量をもつ小分子から誘導される。しばしば、C1-C4のアルコキシ基またはアシルアミド基が用いられ、メトキシ基ならびにアセトアミド基が特に好ましく用いられる。ここで、前記希釈成分と前記アンカー分子とは、好ましくは１：２〜１：１００００、より好ましくは１：１０〜１：１０００、特に好ましくは１：１０〜１：１００の範囲の割合で用いられる。さらに、均一に機能的にした表面は、アンカーと希釈成分との両方を、前記担体と接触するようによく混合した溶液より最もよく得られ、詳細な方法については、DE 100 27 397.1に記載されている。この工程後、前記リガンドを前記アンカー構造に結合させてもよい。あるいは、WO00/73796号に記載されているような完全なリガンド−アンカー−接合体を使用して、前記結合複合体を形成する場合に、かかる好ましい希釈成分を使用してもよい。ここで、前記希釈成分とリガンド−アンカー−接合体とを含む混合溶液を、前記担体と接触させる。
【００５６】
リガンドを運搬するために、さらに修飾した適当なアンカー構造、リガンド−アンカー−接合体および希釈成分は、固相合成により得ることが好ましく、ついで、ＨＴＳにおいて合成および使用した固体担体と接触させる間に、前記アンカーまたは完全なリガンド−アンカー−接合体を、使用した前記固体基質から開裂する。
【００５７】
前記工程（ａ）において、本発明の方法でスクリーニングされるリガンドの好適なライブラリは、Ｔｅａｇｕｅ等によって作られたリード類似物の分類中の広い範囲にわたるリガンドに対して設計される。そのような最初のライブラリ中の分子は、例えば、４００ｇ／ｍｏｌ未満の数平均分子量であって、好ましくは＜３８０ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは＜３７０ｇ／ｍｏｌ、最も好ましくは＜３５０ｇ／ｍｏｌであり、また個々のリガンドが、特異的に高い分子量を持つことができればよく、好ましくは８００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量、より好ましくは７００ｇ／ｍｏｌ未満である。ライブラリ中の前記リガンドの数平均分子量とは、前記リガンドの分子量の合計をリガンドの数で割ったものである。そのような好適なライブラリの分子量分布の一つの例を図４に示す。小さな一般的なコアサイズを共有するリガンドを含むライブラリもまた好適である。特に、例えば、組み合わせの合成の段階で基礎単位として直接結合する二組の反応物から二つを組み合わせることで形成することにより得られるリガンドは、好適である。その結果、前記反応物より形成される基礎単位は、５０または７５〜２５０、好ましくは１００〜１５０または２００、特に好ましくは１５０〜２００ｇ／ｍｏｌの平均分子量範囲をもつ。
【００５８】
本発明において、“基礎単位”という語は、単独反応で、好ましくは組み合わせ合成の単独工程においてリガンド構造全体に導くリガンドの基礎構造を意味する。リガンド形成において使用する“反応物”という語は、まだ前記リガンドの一部となっていない分子であって、基礎単位を得るために用いる分子を意味する。
【００５９】
前記分子基準に加えて、基礎単位の有効性ならびに合成実現可能性および効率は、スクリーニング用ライブラリ設計を設計するにあたって考慮する点である。マイクロモーラーレベルで親和性をもつ小分子をスクリーニングできることは、多様空間（言い換えれば、基本的機能性サブユニットの差異によって利用できる分子の数）がより小さいため、基礎単位の選択を容易にする。
【００６０】
ライブラリ設計のための計算方法（Pearlman and Smith, 1998; Jamois et al. 2000参照。）は、コンビナトリアル・ケミストリにより合成され、超ハイスループット技術によるスクリーニング容量を超えた多くの可能性ある化合物の処理に役立つ。化合物コレクションの複雑な特性、例えば、分子多様性または薬剤モチーフに偏った構造等を表現するために、種々の分子暗号化スキームが開発され、電子保存および処理に使用することができる。分子の記述子は、単純な分子特性（分子量、ｃｌｏｇＰ、分極率）から原子結合性に代表される二次元記述子（構造的鍵、フィンガープリント）または三次元情報を捕らえる方法（薬を運ぶフィンガープリント）までにおよぶ。概念的に、分子は、高次元に一組の記述子で定義されるいわゆる多様空間に分配されている。化合物選択のための一般的な数学的手法は、分子間距離とクラスタリングアルゴリズムの両方に基づく。あるいは、次元の事前の削減を必要とする細胞に基づく区分化方法を適用する（Gorse D. and Lahana R., Current Opinion Chemical Biology 2000,4:287-294; Van Drie J.H. and Lajiness M.S., Drug Discover Today 1998,3:274-283参照。）。
【００６１】
本発明で使用するリガンドは、下記式（５）の一般式の構造を含むことが好ましい。
Ｌ1−Ｌ2        （５）
前記式（５）において、Ｌ1およびＬ2は、前記基礎単位を示し、独立して、アミン、アルコール、カルボン酸またはアミノ酸により形成され、化学結合を直接形成させる補助的な化学官能基をもつＬ1およびＬ2をもたらす反応物等から選択される。本発明の方法としては、前記リガンドが、同一のリガンドにおいて２つの天然アミノ酸から形成されず、一つのアミノ酸のα−アミノ基と第２のアミノ酸のα―カルボキシル基とを縮合反応させることにより結合させることが好ましい。これらのジペプチドに基づくリガンドは、本発明のスクリーニング法の間に酵素的分解されうる。これらのジペプチドをもと開発された薬剤は、酵素的分解されるために生体内寿命が半分までに短くなると考えられる。
前記リガンドは、各々、対応するＬ1およびＬ2がもたらす二つの反応物Ｌr1およびＬr2（二つの異なる反応物ライブラリに属することが好ましい）から合成される。それらは、リガンドの組み合わせライブラリの組み立てに適した少なくとも一つの官能基を含み、Ｌr2は、前記固体担体表面上に、直接またはアンカー分子を介して間接的にリガンドを固定することに適した少なくとも一つの付加的な官能基を含む。組み合わせを要するＬr1およびＬr2の官能基は、独立して、アミン基、アルコール基、チオール基、カルボキシル基またはスルホン基であってもよく、例えば、Ｌr1およびＬr2が、化学結合を直接形成するような補助的な化学官能基性を有するように選択される。補助的な化学相関性の例としては、カルボキシル基とアミンとの組み合わせ、カルボキシル基とアルコールとの組み合わせ、スルホン基とアミンとの組み合わせ等があげられるが、これに限定されるものではない。かかる官能基を直接または活性型で使用することは、当業者において周知である（例えば、酸ハロゲン化物、無水物、カルボン酸とカルボジイミドとの反応生成物またはエステルとカルボン酸基の代わりのＮ−ハイドロスクシイミドとの反応生成物）。
【００６２】
前記リガンドの前記固体担体表面上への固定を必要とするＬ2の官能基は、アミノ基、ヒドロキシル基、チオール基、カルボン酸残基またはスルホン酸残基であってもよい。アンカー分子を使用して前記リガンドに好ましい共有形態で結合させる場合、別の官能基性の化学成分であって、対応する補助的な官能基性と共有結合を形成できる化学成分を付加的に使用してもよい。
【００６３】
前記リガンドの合成と前記固体担体表面への前記リガンドの固定に必要な官能基に加えて、Ｌr1およびＬr2の反応物は、前記リガンドの合成の間の副反応を避けるために、保護基を導入した追加の官能基を含んでいてもよい。そのような官能基は、前記ターゲットとの相互作用のための候補部位となる。前記官能基例としては、例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、−Ｓ−Ｃｌ−４−アルキル、−Ｃｌ、−Ｆ、−Ｂｒ、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ−Ｃｌ−４−アルキル、−Ｃｌ−４−アルキルオキシ、−ＮＯ2、−ＮＨ2、−ＮＨ−Ｃｌ−４−アルキル、−ＣＯＮＨ2、−ＣＯＨＮ−Ｃｌ−４−アルキル、−ＣＯＮ−（Ｃｌ−４−アルキル）2、−ＮＨＣＯ−Ｃｌ−４−アルキル、アリール、ヘテロアリール等があげられるが、これに限定されない。
【００６４】
本発明のスクリーニング法は、Ｌr1およびＬr2のライブラリを使用することが好ましく、すなわち得られるリガンドのライブラリは、Ｌ1−Ｌ2という構造を含み、Ｔｅａｇｕｅ等の、幅広い範囲の小分子を使用した先の研究におけるリード類似物の基準を満たし、前記小分子は、４００ｇ／ｍｏｌ未満、好ましくは３８０ｇ／ｍｏｌ未満、より好ましくは３７０ｇ／ｍｏｌ未満、特に好ましくは３５０ｇ／ｍｏｌ未満の数平均分子量（Ｍｎ）をもつ。
【００６５】
本発明のスクリーニング方法は、広範囲の異なるターゲットを使用することができるが、その中でも、このスクリーニング方法は、酵素のスクリーニングに使用することが好ましく、プロテアーゼのスクリーニングに特に有用である。プロテアーゼは、ペプチド結合の開裂を触媒する。アミノ酸、カルボン酸またはスルホン酸から合成されるリガンドは、天然由来のペプチドと共通した特定の分子要素を持つ。すなわち、それらは、特にプロテアーゼの活性部位に結合することができ、さらに、それらは、天然由来のペプチドであるプロテアーゼにより、少しも開裂することないかまたは同一の反応速度で開裂しないと考えられる。本発明のスクリーニング方法に適当なリガンドは、誤った結果を回避するために、スクリーニング工程の間に、前記ターゲットにより開裂されないものである。すなわち、より好ましい具体例としては、前記Ｌr1は、カルボン酸基またはスルホン酸基を含む反応物である。Ｌr2は、アミノ酸または適当な部位に保護基を持つアミノ酸であって、前記固定は、前記アミノ酸のカルボン酸官能基により行なわれる。
【００６６】
以下に、Ｌr2の好ましい例をあげるが、これに限定されるものではない：Ｆｍｏｃ−Ｌ−アラニン、Ｆｍｏｃ−Ｌ−ロイシン、Ｆｍｏｃ−Ｌ−メチオニン、Ｆｍｏｃ−Ｌ−アスパラギン（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−プロリン、Ｆｍｏｃ−Ｌ−グルタミン（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−アルギニン（Ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−セリン（、ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−バリン、Ｆｍｏｃ−Ｌ−トリプトファン（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−システイン（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｄ−フェニルアラニン、Ｆｍｏｃ−Ｌ−アスパラギン酸（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｄ−プロリン、Ｆｍｏｃ−Ｄ−グルタミン（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−グルタミン酸（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−メチオニン（Ｏ２）、Ｆｍｏｃ−β−アラニン、Ｆｍｏｃ−Ｌ−フェニルグリシン、Ｆｍｏｃ−Ｌ−リシン（Ｄｄｅ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−シクロへキシルアラニン、Ｆｍｏｃ−Ｌ−フェニルアラニン、Ｆｍｏｃ−Ｌ−メチオニンスルホキシド、Ｆｍｏｃ−Ｌ−シトルリン、Ｆｍｏｃ−Ｌ−ホスホチロシン、Ｆｍｏｃ−Ｌ−グリシン、Ｆｍｏｃ−Ｌ−ベンゾイルフェニルアラニン、Ｆｍｏｃ−Ｌ−ジアミノプロピオン酸（ｉｖＤｄｅ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−テトラヒドロイソキノリンカルボン酸、Ｆｍｏｃ−Ｌ−ヒスチジン（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−３−チエニルアラニン、Ｆｍｏｃ−Ｌ−４−チアゾリルアラニン、Ｆｍｏｃ−Ｌ−アルギニン（ＮＯ２）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−イソロイシン、Ｆｍｏｃ−イソニぺコチン酸、Ｆｍｏｃ−Ｌ−シクロへキシルグリシン、Ｆｍｏｃ−Ｌ−リシン（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−１−ナフチルアラニン、Ｆｍｏｃ−Ｌ−３−ベンゾチエニルアラニン、Ｆｍｏｃ−Ｄ−１，２，３，４−テトラヒドロノルハルマン−３−カルボン酸、Ｆｍｏｃ−４−（アミノメチル）安息香酸、Ｆｍｏｃ−Ｌ−チロシン（ｂｕｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−アルギニン（Ｔｏｓ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−ハイドロキシプロリン（ｂｕｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−オルニチン（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−インドリン−２−カルボン酸、Ｆｍｏｃ−Ｄ−アラニン、Ｆｍｏｃ−Ｌ−グルタミン酸（ＯＢｚｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−リシン（Ｚ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−セリン（Ｂｚｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｄ−グルタミン酸（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｄ−メチオニン、Ｆｍｏｃ−Ｄ−チロシン（ｂｕｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｄ−トリプトファン（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｄ−ヒスチジン（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｄ−グルタミン酸−ＯｔＢｕ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−グルタミン酸−γ−シクロヘキシルエステル、Ｆｍｏｃ−Ｄ−ロイシン、Ｆｍｏｃ−Ｌ−チロシン（２，６−Ｃｌ2−Ｂｚｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｄ−アルギニン（Ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−チロシン（Ｂｚｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｄ−シクロへキシルアラニン、Ｆｍｏｃ−Ｌ−アスパラギン酸（ＯＣＨｘ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−スレオニン（Ｂｚｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−ピペコリン酸、Ｆｍｏｃ−Ｄ−４−チアゾリルアラニン、Ｆｍｏｃ−Ｌ−ジアミノ酪酸（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｄ−リシン（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−システイン（Ａｃｍ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−ハイドロキシプロリン（Ｂｚｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｄ−アルギニン（Ｍｔｓ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−チロシン（２−Ｂｒ−Ｚ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−チロシン（３−ｉ）、Ｆｍｏｃ−Ｄ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリンカ��ボン酸、Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチル-L-セリン（Ｂｚｌ）、Ｆｍｏｃ−Δ−１，２，３，４−フェニルアラニン、Ｆｍｏｃ−Ｄ−４−ベンゾイルフェニルアラニン、Ｆｍｏｃ−３−（１−ナフチル）−Ｄ−アラニン、Ｆｍｏｃ−Ｌ−フェニルアラニン（４−グアニジノ−Ｂｏｃ２）、Ｆｍｏｃ−Ｄ−チロシン（Ｂｚｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−システイン（ｂｕｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−システイン（４−ｍｅｔｈｙｌ−Ｂｚｌ）、Ｆｍｏｃ−３−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニン、Ｆｍｏｃ−Ｄ−チアゾリジン−４−カルボン酸、Ｆｍｏｃ−Ｄ−アスパラギン（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−フェニルアラニン（３，４−Ｃｌ2）、Ｆｍｏｃ−Ｄ−システイン（Ａｃｍ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−チロシン（３，５−Ｉ2）、Ｆｍｏｃ−Ｄ−ピペコリン酸、Ｆｍｏｃ−Ｌ−フェニルアラニン（４−ＮＨ−Ｂｏｃ）、Ｂｏｃ−Ｄ−フェニルアラニン（４−ＮＨ−Ｆｍｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−オクタハイドロインドール−２−カルボン酸、Ｆｍｏｃ−Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−チロシン（３−ＮＯ２）、Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチルグリシン、Ｆｍｏｃ−Ｌ−ヒスチジン（Ｔｏｓ）、Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｎ−β−アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）−Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸、４−Ｆｍｏｃ−ピペラジン−Ｌ−イル酢酸水和物、Ｆｍｏｃ−Ｌ−グルタミン酸（メチルエステル、Ｏｍｅ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−チロシン（Ｍｅ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−チロシン（アリルエーテル、Ａｌｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−グルタミン酸（アリルエステル、ＯＡｌｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−チロシン（３，５−Ｂｒ2）、Ｆｍｏｃ−Ｄ−オルニチン（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−（３−アミノメチル）安息香酸、Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−アミノインダン−２−カルボン酸、Ｆｍｏｃ−Ｌ−２−ピリジルアラニン、Ｆｍｏｃ−Ｌ−リシン（ｉｖＤｄｅ）、Ｆｍｏｃ−Ｄ−４−ヨードフェニルアラニン、Ｆｍｏｃ−ｃｉｓ−２−アミノ−４−シクロへキセン−１−カルボン酸（ラセミ体）、Ｆｍｏｃ−ｃｉｓ−２−アミノ−１−シクロペンタンカルボン酸（ラセミ体）、Ｆｍｏｃ−（＋−）−バクロフェン、Ｆｍｏｃ−１−アミノシクロペンタン−１−カルボン酸、Ｆｍｏｃ−６，７−ジメトキシ−１，２，３，４−テトラヒドロ−１−イソキノリン酢酸（ラセミ体）、Ｆｍｏｃ−ニペコチン（ラセミ体）、Ｆｍｏｃ−ｃｉｓ−２−アミノシクロヘキサンカルボン酸（ラセミ体）、Ｆｍｏｃ−Ｎ−（Ｂｏｃ4−ピペリジル）グリシン、（２Ｓ，４Ｓ）−Ｂｏｃ−４−アミノ−１−Ｆｍｏｃ−ピロリジン−２−カルボン酸、（Ｒ，Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ'−Ｂｏｃ−イミダゾリン−２−カルボン酸、Ｆｍｏｃ−Ｌ−システイン（Ｂｏｃ−３−アミノプロピル）−ＯＨ等である。
以下に、Lr1の好ましい例をあげるが、これに限定されるものではない：モノメチル−ｃｉｓ−５−ノルボルネン−エンド−２，３−ジカルボキシレート（ラセミ体）、４−（１，１−ジオキソ−１−λ−６−４−チアジナン−４−イル）ベンゼンカルボン酸、５，７−ジメチルピラゾロ［５，４−ａ］ピリミジン−３−カルボン酸、（−）−ｃｉｓ−イソケトピニック（isoketopinic）酸、（−）−メトキシ酢酸、（＋／−）−ピノリック（pinoric）酸、（１，２−ジヒドロ−１−オキソフタラジン−４−イル）酢酸、（１Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−イル）酢酸、（１Ｒ）−（＋）−カンファン酸、（２，４−ジオキソ−１，３−チアゾリジン−３−イル）酢酸、（２−ベンゾチアゾ−ル−２−イルスルファニル）酢酸、（２−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−１−イル）酢酸、（２−ベンゾチアゾ−ル−２−イルスルファニル）酢酸、(２−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−１−イル)酢酸、（２−メチル−１−オキソ−１，２−ジヒドロ-イソキノリン−４−イル）酢酸、（３−エチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロフタラジン−１−イル）酢酸、（３−メトキシフェノキシ）酢酸、（３Ｓ）−２−（２−メトキシフェニル）−５−オキソテトラヒドロフラン−３−カルボン酸、（４−クロロフェニルチオ）酢酸、（４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イルスルファニル）酢酸、（５−メチル−２−フェニルオキサゾ−ル−４−イル）酢酸、（Ｅ）−２−フェニル−３−（２−チエニル）−２−アクリル酸、（Ｅ）−５−（２−カルボキシビニル）−２，４−ジメトキシピリミジン、（キノリン−２−イルスルファニル）酢酸、（Ｒ）−（−）−シトロネリック酸、（S）−（＋）−Ｏ−アセチルマンデル酸、［（１−シクロへキシル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）スルファニル］酢酸、［（４−メチルキノリン−２−イル）スルファニル］酢酸、１−（２，４−ジクロロフェニル）シクロプロパンカルボン酸、１−（２−カルボキシエチル）−３−メチルベンズイミダゾール−２−（１Ｈ）−チオン、１−（２−クロロベンジル）−６−オキソ−１，６−ジヒドロ−３−ピリジンカルボン酸（ラセミ体）、１−（２−ピリミジニル）−４−ピペリジンカルボン酸、１−（３−カルボキシプロピオニル）インドリン、１−（４−クロロフェニル）−１−シクロペンタンカルボン酸、１−（４−メトキシフェニル）エチルイミノ酢酸、１−（６−クロロ−３−ピリダジニル）−４−ピペリジンカルボン酸、１−（カルボキシメチル）ベンズイミダゾール、１，２，３−トリメチル−１Ｈ−インドール−５−カルボン酸、１，２−ジヒドロ−３−メチル−２−オキソ−４−キノリンカルボン酸、１，４−ベンゾジオキサン−２−カルボン酸（ラセミ体）、１，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸、１，６−ナフチリジン−２−カルボン酸、１−アセチルピペリジン−４−カルボン酸、１−アダマンタン酢酸、１−シクロウンデセン−１−カルボン酸、１−メチル−２−アミノテレフタレート、１−メチル−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸、１−メチル−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸、１−ナフタレンスルホニルク��リド、１−フェニル−１−シクロペンタンカルボン酸、１−フェニル−５−Ｎ−プロピルピラゾール−４−カルボン酸、２−（１，１−ジオキソ−１−λ〜６〜,４−チアジナン−４−イル）ベンゼンカルボン酸、２−（２−ナフトキシ）プロピオン酸、２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−メトキシイミノ酢酸、２−（１−クロロアセトアミド）−４−チアゾール酢酸、２−（２−フリル）−４−キノリンカルボン酸、２−（２−ニトロベンジルチオ）酢酸、２−（２−フェニル−１，３−チアゾール−５−イル）酢酸、２−(２−チエニル)−１，３−チアゾール−４−カルボン酸、２−（４−（ｔｅｒｔ−ブチル）フェノキシ）ニコチン酸、２−（４，６−ジメチルピリミジン−２−イルチオ）酢酸、２−（４−クロロフェノキシ）ニコチン酸、２−（４−クロロフェニル）−１，３−チアゾール−４−カルボン酸、２−（４−クロロフェニル）−４−キノリンカルボン酸、２−（４−シアノフェノキシ）プロピオン酸、２−（４−フルオロフェノキシ）ピリジン−３−カルボン酸、２−（４−ヒドロキシフェノキシ）プロピオン酸（ラセミ体）、２−（４−メチルフェノキシ）ニコチン酸、２−（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシ）酢酸、２−（ベンジルスルファニル）ベンゼンカルボン酸、２−（メチルスルホニル）ベンゼンカルボン酸、２−（ｏ−クロロフェノキシ）−２−メチル-プロピオン酸、２−（フェニルチオ）酢酸、２−（フェニルチオ）ニコチン酸、２−（トリフルオロメチル）フェニル酢酸、２，２，５，７−テトラメチルインダン−１−オン−４−カルボン酸、２，２−ジクロロ−１−メチル-シクロプロパンカルボン酸（ラセミ体）、２，２−ジフェニルプロピオン酸、２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル酢酸、２，３−ジクロロ−４−（エチルスルフォニル）ベンゼンカルボン酸、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ｂ］キノリン−９−カルボン酸、２，３−ジヒドロ−３−オキソピリダジン−６−カルボン酸、２，３−ジヒドロベンゾ［ｂ］フラン−５−カルボン酸、２，４，６−トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、２，５−ジクロロ安息香酸、２，５−ジメトキシフェニル酢酸、２，６−ジクロロ−５−フルオロ−３−ピリジンカルボン酸、２，６−ジクロロニコチン酸、２，６−ジクロロフェニル酢酸、２，６−ジクロロピリジン−４−カルボン酸、２，６−ジメトキシニコチン酸、２−［（2,6−ジクロロピリジン−４−イル）チオ］酢酸、２−［４−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル］チオ］酢酸、２−［１−（３−クロロベンジル）−１Ｈ−インドール−３−イル］酢酸、２−［１−（６−クロロ−３−ピリダジニル）−１Ｈ−インドール−３−イル］酢酸、２−［１−（６−クロロピリダジン−３−イル）−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−５−メトキシ安息香酸、２−アミノ−６−クロロ−９Ｈ−プリン−９−酢酸、２−アミノベンゾフェノン−２'−カルボン酸、２−アミノニコチン酸、２−ベンゾフランカルボン酸、２−ベンジルアミノ安息香酸、２−ビスベンジルカルボン酸、２−ブロモ−５−メトキシ安息香酸、２−ブロモ安息香酸、２−カルボキシメチル−２Ｈ−ベンゾトリアゾール、２−カルボキシメチル−４−メチル−１−（２Ｈ）−フタラジノン、２−クロロ−５−（メチルチオ）安息香酸、２−クロロ−６−（２−メトキシフェニル）ニコチン酸、２−クロロ−６−［４−（メチルスルファニル）フェニル］ニコチン酸、２−クロロ−６−フルオロフェニル酢酸、２−クロロ−６−メトキシイソニコチン酸、２−クロロ−６−メチルニコチン酸、２−クロロ−６−チエノ−２−イルニコチン酸、２−クロロケイ皮酸、２−クロロ馬尿酸、２−クロロイソニコチン酸、２−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）安息香酸、２−ヒドロキシル−６−（トリフルオロメチル）ニコチン酸、２−ヨードフルオレン−５−カルボン酸、２−メトキシフェノキシ酢酸、２−メチル−１，８−ナフチリジン−３−カルボン酸、２−メチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）プロパン酸、２−メチル−２−（７−メチルインダン−４−イルオキシ）プロパン酸、２−メチル−３−インドール酢酸、２−メチル−５−（トリフルオロメチル）オキサゾール−４−カルボン酸、２−メチル−５−フェニルフラン−３−カルボン酸、２−メチルスルホニル安息香酸、２−ナフタレンスルホニルクロリド、２−ナフチル酢酸、２−ニトロ−５−チオシアナト安息香酸、２−ニトロ−α, α, α−トリフルオロ−ｐ−トルイル酸、２−ニトロフェニルピルビン酸、２−ノルボルナン酢酸（エキソ、エンド、ラセミ体）、２−オキソ−６−ペンチル−２Ｈ−ピラン−３−カルボン酸、２−フェニル−１，３−チアゾール−４−カルボン酸、２−チオフェン−２−イル−キノリン−４−カルボン酸、３−（１，３−ベンゾキサゾール−２−イルスルファニル）プロパン酸、３−（１Ｈ−１，２，３−ベンゾチアゾール−１−イル）プロパン酸、３−（１Ｈ−インダゾール−１−イル）プロピオン酸、３−（１Ｈ−テトラゾール−１−イル）安息香酸、３−（２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−６−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボン酸、３−（２，４−ジメチルベンゾイル）プロピオン酸、３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸、３−（２−クロロフェニル−５−イソオキサゾールカルボン酸、３−（２−クロロフェニル）−５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸、３−（２−フリル）アクリル酸、３−（２−メトキシフェニル）−３−メチル酪酸、３−（２−チエノイル）プロピオン酸、３−（２−チオキソベンゾオキサゾール−３−イル）プロピオン酸、３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）プロピオン酸、３−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）プロパン酸、３−（３−メチルインドール−１−イル）プロピオン酸、３−（４−ブロモ−３，５−ジメチルピラゾール−１−イルメチル）安息香酸、３−（４−クロロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボン酸、３−（４−クロロフェニル）−５−イソキサゾールカルボン酸、３−（４−エトキシベンゾイル）プロピオン酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、３−（４−メチルスルホニルベンゾイル）プロピオン酸、３−（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）アクリル酸、３−（５−ブロモ−２−エトキシフェニル）アクリル酸、３−（シクロ��ンチルオキシ）−４−メトキシ安息香酸、３−（メトキシカルボニル）−２，２，３−トリメチルシクロペンタン−１−カルボン酸（ラセミ体）、３−（メチルスルホニル）安息香酸、３−（トリフルオロメチルチオ）安息香酸、３，４，５−トリメトキシ安息香酸、３，４，５−トリメトキシフェニル酢酸、３，４−ジクロロ−α−メトキシフェニル酢酸（ラセミ体）、３，４−ジクロロ安息香酸、３，４−ジクロロフェニル酢酸、３，４−ジフルオロヒドロキシケイ皮酸、３，４−ジヒドロキシヒドロケイ皮酸、３，４−ジメトキシベンゼンスルホニルクロリド、３，５−ジアミノ安息香酸、３，５−ジブロモ安息香酸、３，５−ジクロロ−２，６−ジメトキシ安息香酸、３，５−ジクロロ安息香酸、３，５−ジヨード−４−ピリジン−１−酢酸、３，５−ジメトキシ安息香酸、３，５−ジメチルイソキサゾール−４−カルボン酸、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル安息香酸、３，６−ジクロロベンゾ［ｂ］チオフェン−２−カルボン酸、３−［（４−クロロベンジル）オキシ］−２−チオフェンカルボン酸、３−［１，２−ジヒドロ−２−オキソ−５−（トリフルオロメチル）−ピリド−１−イル］プロピオン酸、３−［２，３−ジヒドロ−１−（１Ｈ）−インドール］プロパン酸、３−［３，４−（トリエチレンジオキシ）ベンゾイル］プロピオン酸、３−アセトアミド−ｐ−トルイル酸、３−アセトキシケイ皮酸、３−ベンゾイル−２−ピリジンカルボン酸、３−ブロモ−４−メチル安息香酸、３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−クロロ−６−フルオロベンゾ［ｂ］チオフェン−２−カルボン酸、３−クロロベンゾ［ｂ］チオフェン−２−カルボン酸、３−クロロケイ皮酸、３−ヒドロキシ−２−メチル−４−キノリンカルボン酸、３−ヒドロキシアダマンタン−１−カルボン酸、３−イミダゾール−１−イル-プロピオン酸、３−インドリル酢酸、３−メトキシ−４−ニトロ安息香酸、３−フェノキシ安息香酸、３−フェノキシフェニル酢酸、３−フェニル−５−イソキサゾールカルボン酸、３−フェニルプロピオン酸、３−フタルイミドプロピオン酸、３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−メチルピラゾール−５−カルボン酸、３−ｔｅｒｔ−ブチル−６−メチルサリチル酸、３−チオフェン酢酸、４−（１Ｈ−テトラゾール−１−イル）安息香酸、４−（３，４−エチレンジオキシフェニル）酪酸、４−（４−ヒドロキシフェニル）安息香酸、４−（４−メトキシフェニル）チオフェン−２−カルボン酸、４−（４−メチルピペリジン−１−スルフォニル）安息香酸、４−（ジフルオロメトキシ）安息香酸、４−（エチルチオ）安息香酸、４−（メチルスルホニル）安息香酸、４−（モルホリン−４−イルメチル）安息香酸、４−（フェニルチオ）安息香酸、４−（トリフルオロアセチル）安息香酸、４−（トリフルオロメチル）ヒドロケイ皮酸、４−（トリフルオロメチル）フェニル酢酸、４，７−ジメチルピアゾロ（１，５−ａ）ピリミジン−３−カルボン酸、４−［（４−ヒドロキシフェニル）スルホニル］安息香酸、４−アセトアミドベンゼンスルホニルクロリド、４−アセトアミドケイ皮酸、４−アミノ−５−カルボキシ−２−エチルメルカプトピリミジン、４−アミノ−５−クロロ−２−メトロキシ安��香酸、４−アミノ安息香酸、４−ビフェニル酢酸、４−ブロモ−３，５−ジヒドロキシ安息香酸、４−ブロモケイ皮酸、４−ブロモマンデル酸（ラセミ体）、４−ブロモフェニル酢酸、４−ブトキシフェニル酢酸、４−カルボキシ−１−（４−クロロベンジル）ピロリジン−２−オン（ラセミ体）、４−カルボキシベンゼンスルホンアミド、４−カルボキシ−Ｎ−（ファー（ｆｕｒ）−２−イルメチル）ピロリジン−２−オン（ラセミ体）、４−クロロ−２−ニトロ安息香酸、４−クロロ−３−エチル−２−メチルキノリン−６−カルボン酸、４−クロロ−ｏ−アニス酸、４−クロロフェノキシ酢酸、４−クロロフェニル酢酸、４−シアノ−３，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸、４−シアノ安息香酸、４−ジメチルアミノ安息香酸、４−フルオロ−１−ナフトエ酸、４−ヘキサ−５−エニロキシ（enyloxy）−安息香酸、４−メトキシベンジリデンシアノ酢酸、４−メチル−１，２，３−チアジアゾール−５−カルボン酸、４−メトキシ−２−（２−ピリジニル）−１，３−チアゾール−５−カルボン酸、４−メチル−２−（２−チエニル）−１，３−チアゾール−５−カルボン酸、４−メチル−２−（３−ピリジニル）−１，３−チアゾール−５−カルボン酸、４−メチル−２−フェニル−１，２，３−トリアゾール−５−カルボン酸、４−ニトロフェニル酢酸、４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジンイル酢酸、４−オキソ−３，４−ジヒドロ-フタラジン−１−カルボン酸、４−オキソ−４−（４−プロポキシフェニル）酪酸、４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］フラン−３−カルボン酸、４−フェニル−１，２，３−チアジアゾール−５−カルボン酸、４−ｔｅｒｔ−ブチルベンゼンスルホニルクロリド、４−ビニル安息香酸、５−（２−ヒドロキシエチル）−２−チオフェンカルボン酸、５−（２−チエノイル）酪酸、５−（３−ニトロフェニル）−２−フロン酸、５−（４−クロロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸、５−（４−クロロフェニル）−２−フロン酸、５−（４−メトキシフェニル）−２−チオフェンカルボン酸、５−（メチルチオ）サリチル酸、５，６−ジクロロニコチン酸、５−ベンジルオキシインドール−３−酢酸、５−ブロモ−２−フラン酸、５−ブロモニコチン酸、５−ブロモチオフェン−２−カルボン酸、５−エチル−２−インドールカルボン酸、５−フルオロインドール−３−酢酸、５−ヘキサ−１−イニルニコチン酸、５−ヒドロキシ−２，３−ノルボルナンジカルボン酸−γ−ラクトン（ラセミ体）、５−ヒドロキシニコチン酸、５−メトキシ−１−インダノン−３−酢酸（ラセミ体）、５−メトキシ−２−メチル−３−インドール酢酸、５−メチル−１−フェニルピラゾール−４−カルボン酸、５−メチル−３−フェニルイソキサゾール−４−カルボン酸、５−メチル−４−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イルメチル）−２−フラン酸、５−メチル−４−（モルホリン−４−イルメチル）−２−フラン酸、６−（１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ニコチン酸、６−（４−モルホリニル）−２−ピラジンカルボン酸、６−（ベンジルスルファニル）−２−ピラジンカルボン酸、６−（エチルスルファニル）−２−ピラジンカル���ン酸、６−ブロモクマリン−３−カルボン酸、６−ブロモピコリン酸、６−クロロ−(２Ｈ)−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸、６−ヒドロキシ２−メチルキノリン−４−カルボン酸、６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、６−メチルクロモン−２−カルボン酸、６−Ｎ−ブチル−２−（３，４−ジメトキシフェニル）−８−メチルキノリン−４−カルボン酸、６−オキソ−１，４，５，６−テトラヒドロピリダジン−３−カルボン酸、６−オキソ−１−［４−（トリフルオロメチル）ベンジル］−１，６−ジヒドロ−３−ピリジンカルボン酸、６−フェニルヘキサン酸、７−カルボキシメトキシ−４−メチルクマリン、７−クロロキヌレン酸、７−エトキシベンゾフラン−２−カルボン酸、７−メトキシベンゾフラン−２−カルボン酸、８−メトキシ−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−２−カルボン酸（ラセミ体）、９−フルオレン−４−カルボン酸、アセメタシン、酢酸、α−（ｏ−トリル）−シクロヘキサン酢酸（ラセミ体）、ベンゼンスルホニルクロリド、ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−酢酸、ベンゾ［ｃ］フラン−２−カルボン酸、安息香酸、ベンゾイル−ＤＬ−ロイシン、β−（ナフチルメルカプト）酢酸、Ｂｏｃ−Ｌ−ヒドロキシプロリン、ブネタミド、クロランベン、ｃｉｓ−ピノニック（pinonic）酸（ラセミ体）、クマル酸、クマリン−３−カルボン酸、シクロへプタンカルボン酸、シクロヘキサンプロピオン酸、シクロへキシリデンシアノ酢酸、シクロペンタンカルボン酸、Ｄ−カンファ−１０−スルホニルクロリド、ＤＬ−３，４−ジヒドロマンデル酸、ＤＬ−インドール−３−乳酸、ＤＬ−チオクト酸、フェンブフェン、フルフェナム酸、フルオレン−９−酢酸、ヒダントイン酸、イミダゾ［２，１−ｂ］ベンゾチアゾールカルボン酸、インドール−３−グリオキシル酸、インドール−６−カルボン酸、インドメタシン、インドプロフェン（ラセミ体）、イソキノリン−３−カルボン酸水和物、キヌレン酸、１，２−オキソチアゾリジン−４−カルボン酸、レブリン酸、マレアミン酸、Ｎ−（２−シアノアセチル）アントラニル酸、Ｎ−（３−メトキシフェニル）マレアミン酸、Ｎ，Ｎ−ジエチル−３，６−ジフルオロフタルアミド酸、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、ナプロキセン、Ｎ−ベンゾイル−Ｄ−アラニン、Ｎ−カルバミル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−ホルミル−２−フェニルアラニン、Ｎ−ホルミル−ＤＬ−フェニルアラニン、ニコチン酸、ニフルム酸、Ｎ−フェンチルマレアミン酸、Ｎ−フタロイル−ＤＬ−α−アミノ酪酸（ラセミ体）、Ｎ−トシル−３−ピロールカルボン酸、ｏ−（３−カルボキシベンジル）−４−クロロアセトフェノンオキシム、ｏ−ベンズアミドグリコール酸、フタリド−３−酢酸（ラセミ体）、ピラジンカルボン酸、キノリン−３−カルボン酸、キノリン−６−カルボン酸、Ｓ−（−）−２−［（フェニルアミノ）カルボニルオキシ］プロピオン酸、Ｓ−（＋）−イブプロフェン、Ｓ−（チオベンゾイル）チオグリコール酸、Ｓ−ベンジルチオグリコール酸、スプロフェン（ラセミ体）、テトラヒドロ−２−フロン酸（ラセミ体）、チミン−１−酢酸、ｔｒａｎｓ−１−メチル−４−カルボキシ−５−（３−ピリジル）−２−ピロリジノン、ｔｒａｎｓ−２，���−ジフルオロケイ皮酸、ｔｒａｎｓ−２−フェニルシクロプロパン−１−カルボン酸（ラセミ体）、ｔｒａｎｓ−３，４−メチレンジオキシケイ皮酸、ｔｒａｎｓ−４−クロロ−３−ニトロケイ皮酸、キサンテン−９−カルボン酸、Ｚ−β−アラニン等である。
【００６７】
Ｌr2およびＬr1の例の前記リストの中で用いたペプチド合成の保護基の略記号は、以下のとおりである。
２−Ｂｒｚ                 2-ブルモベンジルオキシカルボニル
２，６−Ｃｌ２−Ｂｚｌ     2,6-ジクロロベンジル
４−ｍｅｔｙｌ−Ｂｚｌ     4-メチルベンジル
Ａｃｍ                     アセトアミドメチル
Ａｌｌ                     アリルエーテル
Ａｌｌｏｃ                 アリルオキシカルボニル
Ｂｚｌ                     ベンジル
Ｂｏｃ                     ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
Ｄｄｅ                     ４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−
イリデン）−エチル
Ｆｍｏｃ                   ９−フルオネニルメチルオキシカルボニル
ｉｖＤｄｅ                 ４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−
イリデン）−３−メチルブチル
Ｍｔｓ                     メシチレン-2-スルホニル
ＮＯ２                     ニトロ
Ｏ２                       スルホン
ＯＡｌｌ                   アリルエステル
ＯＢｚｌ                   ベンジルエステル
ＯＣＨｘ                   アルキルエステル
ＯＭｅ                     メチルエステル
ＯｔＢｕ                   ｔｅｒｔ−ブチルエステル
Ｐｂｆ                     ペンタフルオロフェニル
ｔＢｕ                     ｔｅｒｔ−ブチル
Ｔｏｓ                     ｐ−トリオールスルホニル
Ｔｒｔ                     トリフェニルメチル／トリチル
Ｚ                         ベンジルオキシカルボニル
前記式（５）のリガンドの合成としては固相合成方法が好ましい。ここで、合成中の前記化合物は、固相合成を通じて不溶性の固体担体に共有結合する。好ましくは、前記合成相とリガンドとの結合は、所望の化合物を得るための適当な試薬と一定の穏やかな条件とで開裂させることができるリンカーを介して行なわれる
【００６８】
さらに、前記ライブラリを形成する前記リガンドは、組み合わせた方法によって得ることが好ましい。結果として、固相組み合わせ合成は、これらの化合物の調製には特に好ましい。
【００６９】
この合成方法の一つの実施形態において、最初の反応物（例えば、Ｌr2）を合成に使用した前記固相に、例えば、共有結合基（リンカー）を介して結合させる。第２の反応物（例えば、Ｌr1）を結合させた後、適当な試薬での穏やかな条件下で、前記リンカーにより前記リガンドを前記固相から開裂させる。開裂後、前記リンカーは、その全体若しくは一部として前記リガンドに結合した状態であってもよく、前記リガンドは、下記式（５ａ）の構造を含む：
Ｌ1―Ｌ2―Ｌｎ          （５ａ）
前記式（５ａ）において、Ｌ1およびＬ2は、前記したとおりであり、任意の基Ｌｎは、前記固相からの開裂の後、前記リガンドに結合した状態の前記リンカーの一部である。前記開裂反応の間に、前記リンカーまたはその一部分は、化学的に修飾されたと理解してもよい。適当なリンカーと同様にそれらの開裂および得られた基Ｌｎの反応は、固相合成の分野において充分に確立されている。本発明ののリガンドの合成にも適用できる適当な例としては、例えば、WO 00/73796に記載されているようにように、アンカーとリガンド−アンカー接合体との固相合成である。例えば、前記リガンドＬ1−Ｌ2が、前記スクリーニング工程で使用する前記担体に前記リガンドＬ1−Ｌ2を固定するために必要とされるＬ2の非保護官能基または前記スクリーニング工程で使用する前記担体に前記リガンドＬ1−Ｌ2−Ｌｎを固定するために必要とされるＬｎの非保護官能基で解離されるよう、前記リンカーおよび前記開裂反応は選択される。
【００７０】
したがって、前記リガンドの固相合成の工程は、以下の工程を含むことが好ましい。：
ａ）リンカーを固相に共有結合させる工程、ついで
ｂ）第１の反応物Ｌr2として保護アミノ酸基をもつアミノ酸を前記リンカーと結合させ、前記リンカーと結合した前記基礎単位Ｌ2を得る工程、
ｃ）前記Ｌ2のアミノ基の保護基を選択的に除去する工程、
ｄ）第２の反応物Ｌr1としてカルボン酸またはスルホン酸を、アミド結合またはスルホンアミド結合を形成して、前記アミノ基Ｌ2に結合させる工程、
ｅ）前記リンカー−リガンド接合体または前記リガンドを、前記固相から開裂し、前記リガンドまたは前記リガンド−リンカー接合体を解離する工程。
【００７１】
前記工程ｂ）でリンカーと結合した基礎単位は、リガンド、リガンド−タグまたはリガンド−アンカー接合体の合成に必要であれば、付加的な保護単位を含んでいてもよい。官能基の保護基および当業者に知られているそれらの用途は、下記のような異なる作用を満たすことを目的として、固相合成における好ましい処理に使用してもよい：
−前記工程ｂ）の間の副反応を回避し、かつ前記工程ｃ）において除去されるＬ２のアミノ基の一時的な保護基として、
−本発明のスクリーニング法の前記工程（ｃ）の後および前記工程（ｃ）の前に（所定のターゲットと前記結合複合体とを接触させる工程）、除去する直交側鎖保護基として、
−少しも除去されることなく導入された前記基礎単位Ｌ１および／またはＬ２の不可欠な部分として。
保護基の種類とその用途に関する情報は、例えば、Protective Groups in Organic Synthesis, Theodra W.Greene and Peter G.M.Wutz, third Edition, Wiley Interscienceに記載されている。好ましくは、Ｆｍｏｃ基が、この工程のＬ2のアミノ基のための保護基として用いられる。
【００７２】
前記リガンドの保護基は、前記工程ｅ）で除去されてもよい。加えて、スクリーニングに使用した前記担体上へのリガンドの固定の工程の前に、保護基を除去してもよい。
【００７３】
前記式（５）または（５ａ）の構造を含むリガンドは、直接またはアンカーを介して、空間的にアドレス可能なスクリーニングアレイ上に固定されていることが好ましく、ゆえに、各アレイフィールドは、前記リガンドＬ1−Ｌ2における別の固定されていないＬr1およびＬr2の組み合わせを示し、すなわち、前記反応物は、直接結合され、前記リガンドを得るのである。前記リガンドが、活性化アンカー、例えば、前記式（１）のアンカーに結合し、スクリーニングに使用する前記担体にすでに固定されている場合、それらの合成の間、適当な官能基（例えば、チオール基）を導入するように注意すべきである。
【００７４】
アンカー分子、特にスクリーニングに使用する担体に既に固定された活性化アンカー分子（例えば、前記式（１））に前記リガンドを結合するために、前記リガンドは、特有の構造（“リガンド−タグ”）を持つことが好ましい。
【００７５】
かかるリガンド−タグの構造は、例えば、下記式（６）で表される：
Ｚ−Ａ−Ｙ            （６）
前記式（６）において、
Ａは、化学結合または炭素原子数２〜５０、好ましくは５〜３０の炭化水素鎖で、ヘテロ原子、アミド結合またはエステル結合によって中断されていてもよく、
Ｙは、リガンドと反応するための官能基であり、そして
Ｚは、対応するアンカー分子の頭基と反応できる官能基であって、好ましくはチオール、カルボキシルまたはアミノ基である。この中でも、特に好ましくは前記のアンカー分子のメルカプトフィリック頭基と反応できる、チオールである。
【００７６】
好ましくは、Ａは、非分枝鎖であって、“リガンド−タグ”とターゲットとの非特異的な相互作用を最小限にするものである。Ａに好適なヘテロ原子としては、Ｏ原子、Ｎ原子、Ｓ原子、Ｓｉ原子、Ｐ原子、Ｂ原子が含まれる。
【００７７】
Ａは、下記一般式（７）であることが好ましい：
−（ＣＨ2）l−Ｑ6−［（ＣＨ2）m−Ｑ7］n−（ＣＨ2）o−Ｑ8−［（ＣＨ2）m'−Ｑ9］n'−（ＣＨ2）o'−Ｑ10−（ＣＨ2）p'−      （７）
前記式（７）において、変数は、独立して、以下に定義され、数的範囲は、個々の制限値およびその間の整数値を含む：
Ｑ6からＱ10は、独立して−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＨＮ−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、ヘテロ原子または結合で表され；
ｌ、ｐ、ｐ'は、独立して０〜５の整数、好ましくは０〜３の整数であり；
ｍ、ｍ'、ｏ、ｏ'は、独立して１〜５の整数、好ましくは１〜３の整数、特に好ましくは２であり；
ｎ、ｎ'は、独立して０〜２０の整数、好ましくは２〜１５の整数、特に好ましくは３〜１０の整数であって、ただし、ｎまたはｎ'の少なくとも一つは０ではない。
【００７８】
より好ましくは、Ａは、少なくとも１つのアミド結合と少なくとも４つのヘテロ原子とを含む。特に好ましくは、Ａは２つのアミド結合と４つの酸素原子とを含む。
【００７９】
Ｙの例としては、第一級および第二級アミノ基、カルボン酸基、水酸基、ヒドロキシルアミノ基、エステル、アルデヒドおよび他のカルボニルの半分である。好ましくは、Ｙは−ＮＨ2、−ＮＨＲ5、−ＮＲ5ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ5、または−Ｃ（Ｏ）ＯＨであり、ここでＲ5は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル等のような炭素原子数１〜６のアルキル基があげられる。Ｙは第一級アミノ基であることが好ましい。しかしながら、前述の例に限られず、多くの化学反応が、リガンドへのおよびアンカー分子へのリガンド−タグＺ−Ａ−Ｙの結合に用いることができる。当業者は、例のリストを広げることができ、リガンドの所望の化学結合へと導く付加反応、置換反応および縮合反応のような化学反応を知っている。
【００８０】
本発明の方法に最適なリガンド−タグは、以下のような前記リガンド−タグの能力により選択する。
（ａ）前記ターゲットの前記リガンド−タグへの非特異的な結合を最小限にし、
（ｂ）前記ＳＡＭから前記ターゲットまでの適当な距離に前記リガンドがあるため、前記ＳＡＭと前記ターゲットとの間の立体反発を回避し、
（ｃ）適当な結合能力のために前記リガンドの高い移動度を与える。
前記リガンド−タグは、また、前記ターゲットの大きさおよび化学的特徴により選択する。かかるターゲットを使用した場合、前記ターゲットは、合成の間に前記リガンドに直接結合するか、または前記アンカー分子との結合の前にすぐに前記リガンドに直接結合する。好ましい実施形態において、固定されたリガンドは、それぞれ同一のリガンド−タグを持つ。
【００８１】
前記リガンド−タグの官能基Ｙに共有結合するリガンドとしては、スクリーニングに使用する担体上に固定されていてもよいリガンド／リガンド−タグ接合体があげられる。直接固定することが可能であれば、前記リガンド／リガンド−タグ接合体が、適当な官能基Ｚを持つように選択することが好ましく、前記官能基Ｚは、各々の担体上に存在しているアンカー構造の活性化した頭基と共有結合を形成する。リガンド／リガンド−タグ接合体の構造としては、下記式（８）であることが好ましい。
Ｚ−Ａ−Ｙ'−Ｌ            （８）
前記式（８）において、ＺとＡは、前記式（６）で定義した通りであって、Ｙ'は、例えば、前記Ｙ基の前記リガンドの対応する官能基との反応の結果得られるアミド結合またはエステル結合である。例えば、Ｙ'は、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＯＣ（Ｏ）−でがあげられる。
前記リガンドＬの構造は、前記ターゲットの構造によって異なる。しかしながら、前記リガンド−タグと前記結合Ｙ'とを形成可能とするために、Ｌは、前記リガンド−タグのＹと反応できる少なくとも一つの官能基を持つ分子により得ることが好ましく、アルコール、第一級または第二級アミン、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルデヒドまたは他のカルボニル化合物等があげられる。この官能基除いて、前記リガンドの構造は、前述の基準に従って選択する。
【００８２】
好ましい実施形態によると、本発明に使用する前記リガンドおよび前記リガンド−タグは定義されている通りであって、本発明のリガンド／リガンド−タグ接合体としては、下記式（９）であることが特に好ましい。
Ｚ−Ａ−ＨＮＣ（Ｏ）−Ｌ2−Ｌ1            （９）
前記式（９）において、ＺとＡは、前記式（６）で定義した通りであって、
Ｌ2は、前記式（５）の好ましい実施形態に定義されているアミノ酸残基であって、そのカルボキシル基を前記リガンド−タグとのアミド結合を形成するために用い、そのアミノ基を前記Ｌ1とのアミド結合またはスルホンアミド結合を形成するために用い、
Ｌ1は、カルボン酸基またはスルホン酸基を持つ基礎単位であって、前記アミド結合またはスルホンアミド結合を達成するためにその官能基を使用し、前記Ｌ1は、前記式（５）の好ましい実施形態に定義されているものに等しい。
【００８３】
前述のように、前記リガンドがアレイフォーマットの中に集合し、大複数のリガンドがチップに固定されていることが利点である。よって、好ましい実施形態としては、本発明は、スクリーニングに用使用する前記固体担体にアレイの形式で固定した大複数のリガンド／リガンド−タグ接合体に関し、前記アレイが、少なくとも１５３６、３０７２、４６０８または９２１６の異なる種のリガンドを含むことが好ましい。
【００８４】
さらに、本発明は、前記アレイを含むスクリーニングチップ（結合複合体）に関し、ここで、前記リガンドは、自己集合単層を形成するアンカー分子を介して固定されることが好ましく、なお、前記自己集合単層は付加的な希釈分子を含むことが好ましい。
【００８５】
前記リガンド、リガンド／リガンド−タグ接合体は、組み合わせ固相合成により合成されることが好ましい。リガンド−タグを持つ前記リガンドの固相合成において、まず、前記リガンド−タグを前記固体担体上に結合し、ついで、最初にＬ2を、つぎにＬ1を前記リガンドタグに結合させることが好ましい。当然のように、前記リガンド−タグは、前述のように、Ｌ2およびＬ1を含む実際のリガンド構造の組み合わせ合成に続いて、直接固相上で合成できる。どちらの場合も、前記リガンド−タグは、前記固相と直接もしくはリンカーを介して共有結合していてもよい。リガンド／リガンド−タグの固相合成に適当なリンカーについては、前述のように、前記リガンドのみの固相合成で得られた情報を適応する。
【００８６】
前記リガンド−タグと前記リガンドとを結合するために、前述のように前記式（６）の官能基ＹをＬr2の適当な官能基と、好ましくはそのうちの１つと反応させ、スクリーニングに使用する前記固体担体上への前記リガンドの固定を助ける。前記官能基としては、例えば、アミノ基、ヒドロキシル基、チオール基、カルボン酸基、スルホン酸基等があげられる。
【００８７】
前記固相に結合させる前に、前記リンカーと前記リンカー−タグとを結合させ、下記式（１０）のリンカー／リガンド−タグ接合体を得る：
Ｌｎ−Ｚ−Ａ−Ｙ            （１０）
保護基を持つマスクされたＹは、固相にその接合体が共有的に結合している間、副反応を回避することに有用である。前記保護基は、前記リガンド構造の合成が開始する前に除去する。
【００８８】
本明細書中に記載する固相合成方法のために好ましいリンカーとしては、３−（４−（ジフェニルメチルーフェノキシ）−酪酸であって、これは、以下の実施例において、リガンド−タグ／リンカー接合体Ｌｎ−Ｚ−Ａ−Ｙ−Ｆｍｏｃの合成における工程７に３−（４−（ジフェニルメチルーフェノキシ）−酪酸として紹介されており、ここで、Ｙは、Ｆｍｏｃ−保護基を有する保護アミノ基である。
好ましいリガンド−タグの例としては、図１ａに示されている通りであって、Ｌｉｇａｎｄ−Ｔａｇ１が最も好ましい。前記Ｌｉｇａｎｄ−Ｔａｇ１は、下記の実施例中に記載したリガンド−タグ／リンカー接合体Ｘ−ＺＡ−Ｙ−Ｆｍｏｃの合成における工程６の反応生成物から合成することができる。Ｌｉｇａｎｄ−Ｔａｇ２は、下記の実施例中に記載したリガンド−タグ／リンカー接合体Ｘ−ＺＡ−Ｙ−Ｆｍｏｃの合成における工程７の反応生成物を脱保護することにより合成することができる。
【００８９】
リガンド−タグに結合したリガンドの例を、図１ｂに示す。
【００９０】
Ｆｍｏｃ保護基（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）をもつＹ―マスクリガンド−タグＺ−Ａ−Ｙ−Ｆｍｏｃの好ましい例を、図１ｃに示す。
【００９１】
Ｆｍ保護基（９−フルオレニルメチルエステル）をカルボキシル基のために持つＹ―マスクリガンド−タグＺ−Ａ−Ｙ−Ｆｍの好ましい例を、図１ｄに示す。
【００９２】
前記Ｆｍｏｃ−保護基で保護されたＹを持つリガンド−タグ／リンカー接合体Ｌｎ−Ｚ−Ａ−Ｙ−Ｆｍｏｃの好ましい例を、図１ｅに示す。
【００９３】
好ましい実施形態としては、本発明によるアレイおよびスクリーニングチップ（結合複合体）は、リガンド−タグＺ−Ａ−Ｙ（６）に結合したリガンドＬ1−Ｌ2を含むことであって、より好ましくは、式Ｚ−Ａ−ＨＮ−Ｌ1−Ｌ2で示される前記リガンド／リガンド−タグ接合体であって、個々でＺ、ＡおよびＹは、前述のとおりである。
【００９４】
したがって、前記リガンドの固相合成の工程は、以下の工程を含むことが好ましい。：
ａ）リンカーを固相に共有結合させる工程、ついで
ｂ）第１の反応物Ｌr2として保護アミノ酸基をもつアミノ酸を前記リンカーと結合させ、前記リンカーと結合した前記基礎単位Ｌ2を得る工程、
ｃ）前記Ｌ2のアミノ基の保護基を選択的に除去する工程、
ｄ）第２の反応物Ｌr1としてカルボン酸またはスルホン酸を、アミド結合またはスルホンアミド結合を形成して、前記アミノ基Ｌ2に結合させる工程、
ｅ）前記リンカー−リガンド接合体または前記リガンドを、前記固相から開裂し、前記リガンドまたは前記リガンド−リンカー接合体を解離する工程。
【００９５】
前記工程ｂ）でリンカーと結合した基礎単位は、リガンド、リガンド−タグまたはリガンド−アンカー接合体の合成に必要であれば、付加的な保護単位を含んでいてもよい。官能基の保護基および当業者に知られているそれらの用途は、下記のような異なる作用を満たすことを目的として、固相合成における好ましい処理に使用してもよい：
−前記工程ｂ）の間の副反応を回避し、かつ前記工程ｃ）において除去されるＬ２のアミノ基の一時的な保護基として、
−本発明のスクリーニング法の前記工程（ｃ）の後および前記工程（ｃ）の前に（所定のターゲットと前記結合複合体とを接触させる工程）、除去する直交側鎖保護基として、
−少しも除去されることなく導入された前記基礎単位Ｌ1および／またはＬ2の不可欠な部分として。
保護基の種類とその用途に関する情報は、例えば、Protective Groups in Organic Synthesis, Theodra W.Greene and Peter G.M.Wutz, third Edition, Wiley Interscienceに記載されている。好ましくは、Ｆｍｏｃ基が、この工程のＬ2のアミノ基のための保護基として用いられる。
【００９６】
前記リガンドの保護基は、前記工程ｅ）で除去されてもよい。加えて、スクリーニングに使用した前記担体上へのリガンドの固定の工程の前に、保護基を除去してもよい。
【００９７】
最終的なリガンド／リガンド−タグ接合体は、前記合成担体から開裂され、前記スクリーニング工程で使用した固体担体上に固定されることが好ましい。これは、１つの合成用プレート（合成用担体）からの化合物が、１０００以下のスクリーニングプレート（前記スクリーニングに使用した固体担体）に使用できる点がさらなる利点である。前記リガンド／リガンド−タグ接合体は、スクリーニングに使用した担体上に固定されている活性化アンカーと結合しており、前記リガンド−タグの官能基Ｙを前記アンカーの頭基と結合させ、共有結合を形成させることが好ましい。
【００９８】
必要に応じて、市販のリガンド−アンカー接合体が固定されていて、本発明の方法の前記結合複合体が完全に形成されているならば、前述と類似した工程を同様に適用できる。この場合、リガンド−アンカー接合体の好ましい合成は、以下の工程を含む：
ａ'）リンカー構造と固相構造とを共有結合させ、前記リンカーに結合したアンカー構造を合成する工程、ついで
ｂ'）第１の反応物Ｌr2として保護アミノ酸基をもつアミノ酸を前記リンカーと結合させて、Ｌ2を得る工程、
ｃ'） 前記Ｌ2のアミノ基の保護基を選択的に除去し、
第２の反応物Ｌr1としてカルボン酸またはスルホン酸を、アミド結合またはスルホンアミド結合を形成して、前記アミノ基Ｌ2に結合させる工程
ｄ’）前記リガンド−アンカー接合体の開裂、好ましくは、前記固相から前記工程（a）で使用したリンカー部分を担持して前記アンカー接合体または前記リガンド−リンカー接合体の解離する工程
【００９９】
前記ａ'）で使用する好ましい条件と試薬は、WO 00/73796に記載されている。しかしながら、前記の理由のために、アンカーとリガンドまたはリガンド／リガンド−タグ接合体との段階的固定が、本発明に好ましい。
【０１００】
前記ターゲット分子をもつターゲット結合分子の候補のライブラリの並行ハイスループットスクリーニングは、リガンドの部分集合を同定することから行なってもよい。好ましいターゲットとしては、例えば、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、補欠分子族、ビタミン、リピド、オリゴ糖類、多糖類等があげられ、融合蛋白質または合成プライマーのような合成分子もまた好ましい。特に好ましくはプロテアーゼのような蛋白質である。
【０１０１】
検出方式の選択は、結合相互作用のスクリーニングのための表面性技術の中の重要な要素である。固相表面のターゲット−リガンド相互作用の検出のための好ましい標識方法は、比率−免疫学的検定法および光学的方法、例えば、蛍光または発光測定（特に酵素アッセイ）である。好ましい実施形態としては、いわゆるＥＬＩＳＡ技術（enzyme-linked immunosorbent assay、酵素結合免疫吸着検査法）、固相の免疫学的検定法を使用する。ここで、前記固体担体は、一つの相互作用相手の固定に単独で使用する。
【０１０２】
しかしながら、これらの研究法に用いられる標識は、特定の結合相互作用に影響する欠点を持つ。加えて、標識付けは、余分な合成と単離工程を必要とする。多くの新たなタンパク質がヒト遺伝子の単離または発現を誘導するまたは誘導するであろうことを考えると、少量のタンパク質試料との相互作用を標識なく検出できることが望まれる（Haake et al.(2000),J. Anal. Chem. 366, 576-585参照。）。ターゲット−リガンド相互作用の標識なく検出するための好ましい方法は、反射光学技術である。反射光学法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および反射干渉分光法（ＲＩｆＳ）を含む。これらの方法では、前記固体担体は、センサシステムの不可欠な部分である
【０１０３】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、調査中の結合現象の間のトランスデューサー表面で起こる屈折率の変化を検出する。この方法では、光学的担体（好ましくはプリズム）は、薄い金属フィルムで覆われ、リガンド−ターゲット結合により起こる前記プリズムでの反射光の強度の変化を波長関数または調節角の関数として測定する。ＳＰＲ法は、様々な分野で非常に有用であることが証明され、現在確立されている技術である。よって、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）のような新しい分野への適用も探索できるはずである。
【０１０４】
反射干渉分光法（ＲＩｆＳ）は、層の厚さの変化を検出するために、界面での光の部分反射を使用することができる。結合相手（リガンド）への生体分子の付着により、波長の関数としての強度プロフィルのシフトを引き起こす。検出曲線のシフトは、層の厚さの変化に比例する。
【０１０５】
他の標識なく検出する方法としては、水晶微量天秤に基くバイオセンサである。ターゲットとリガンドとの結合を、振動している水晶結晶の振動数の影響による重量増加によって測定する（Ebara and Okahata,JACS 2000,116:11209-12参照。）。
しかしながら、好ましい実施形態にとしては、本発明の方法の間のリガンド−ターゲット相互作用を検出する方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【０１０６】
（蛋白質）ターゲットに対する親和性に関する組み合わせライブラリをスクリーニングした後、「ヒット」、すなわち、ターゲットに結合する分子を選別するための一定の閾値を定義しなければならない。好ましい実施形態としては、ヒットは、それらの結合価にしたがう分子の順位付けにより選択される。それぞれのヒットは、非特異的なリガンド−ターゲット相互作用の平均結合価（ノイズレベル）より有意に高い結合価を示す（好ましくは２倍、より好ましくは４倍、特に好ましくは１０倍）。ヒットの同定と選択は、計算方法の適用によるノイズレベルを確定し、可視化できるソフトウエアプログラム（例えばＪａｒｒａｙ）で対応できる。
【０１０７】
Ｊａｒｒａｙは、データベースからのデータ、特に、本発明のスクリーニング方法の工程（ｄ）における個々のリガンドの結合価より得られるデータを処理し、可視化するためのＪａｖａ（登録商標）に基づくソフトウェアプログラムであって、特異的な結合分子の部分集合の同定または選択する機能を有する。
【０１０８】
Ｊａｒｒａｙは、複数の記録が保存されたデータベース、主な処理システム、ユーザー入力装置ならびにディスプレイを含む。データベースからのデータは、ｘ、ｙ軸または他の適当な手段で可視化される。
【０１０９】
Ｊａｒｒａｙを使用した場合、本発明の方法の前記工程ａ）でライブラリを形成するリガンドは、好ましくは二組の反応物から開始する二次元の組合せ合成を介して形成される。前記式（５）の構造を含むリガンドが、特に好ましい。そのｘ座標（行）は、例えば、Ｌ2のような二つの組合せの合成のための一組目の基礎単位を表し、ｙ座標（列）は、例えば、Ｌ1のような二つの組合せの合成のための二組目の基礎単位を表す。
【０１１０】
このように、表のそれぞれのセル（ｘ、ｙ座標）は、本発明の方法によりスクリーニングされたライブラリの構成化合物を表す。前記工程（ｄ）における各リガンドの結合価を、色素解像法で可視化、例えば、より高い結合価をより暗い影で表した場合、特定の影の行または列から、特に活性化した開始基質／分子サブユニットが、前記ライブラリのリガンドに含まれているという結論が得られる。同時に、使用した２組の試薬に含まれる試薬間での前記ターゲットについての相乗効果または拮抗効果を、行または列の特別に淡くまたは暗く色づいたセルにより可視化する。なお、前記セルは、他の場合では、比較できる程度に均一な状態である。
【０１１１】
多くの薬剤開発は、薬剤候補のための一組の予め決められた規準に対処するために焦点をあわせたスクリーニングの一連の最適化サイクルを通して遂行される。最初のライブラリのスクリーニングによるデータの解釈は、新しい（第二、第三等）ライブラリの設計を誘導し、組み合わせライブラリ合成および生物学的評価の反復サイクルを創る。あるリード最適化の挑戦は、データを捕捉し、構造−活性相関（ＳＡＲ）モデルおよび定量的構造−活性相関（ＱＳＡＲ）モデルとを組み立てることである。
【０１１２】
同定したヒットの分析により得られた構造情報を使用して、元のリード構造と密接な構造類似性を持つより限定した大きさのライブラリを設計する（集束型ライブラリと呼ぶ）。焦点をあわせたスクリーニングのためのライブラリは、好ましくは１０以上の、特に好ましくは１００以上の、さらに特に好ましくは１０００以上の化合物を含む。
【０１１３】
ある手法は、構造モチーフの使用を必要とし、同定したヒットに反復して現れているもの、いわゆる「特定構造」でそれ自身を見分ける方法であって、前記特定構造は、強調表示された行または列のため、Ｊａｒｒａｙにより容易に同定することができる（前記参照）。別の手法は、ターゲット結合のための重要な識別要素（薬物特性を示すパターン(pharmacophoric patterns)）を組み込んでいるものであり、前記結合とは、開発中の特定のターゲットに関する。
【０１１４】
別の計算方法論は、そのような焦点を合わせたライブラリの設計に有用である。セルベース法は、例えば、Ｔｒｉｐｏｓ（Ｐearlman and Smith, 1998）に記載されている多溶液法の成功に示されるように、大規模な多様性問題に非常に効果的であることがわかっている。
単量体に焦点をあてた方法は、ライブラリのスクリーニングで得られたヒットに基く特権基礎単位を同定する。別の方法としては、単量体頻度カウント（Zheng W. et al., J. Chem. Inf. Compt. Sci. 1998, 38: 251-258）またはルールに基く単量体選択（Bravi G. et al., J. Chem. inf. Compt. Sci. 2000, 40: 1441-1448）等として紹介されている。それぞれの場合で、新しいライブラリは、同定された単量体の新しい組み合わせの再利用により組み立てられる。
【０１１５】
最近、組み合わせのライブラリの設計と適用で人気を得た人口神経回路網および進化的な方法、例えば、ジェネティックアルゴリズム等は、将来成長することが期待されている（Weber L., Drug Discoverly Today 1998, 3: 379-385;Zupan J. and Gasteiger J., 1999, `Neural networks in chemistry and drug design', Wiley-VCH; Bohm H.J. and Schneider G., 2000, `Virtual screening for bioactive molecules', Wiley-VCH参照。）。これらの自己学習技術は、適合関数から導かれるトレーニングデータセットに基づき、前記自己学習技術を用いて、アルゴリズムを目的の設計に誘導していくのである。構造に基づく場合、構造特性と化合物の生物活性の実験データとに着目したものを使用して、適合性の定義を確立する。
【０１１６】
我々のスクリーニング法は、同一条件下で、高いダイナミックレンジの親和性をカバーすることで、前述のようなデータを得ることができる。さらに、親和性に基くスクリーニングは、単一の基礎的な特性、言い換えればターゲットへの結合に基いて化合物を選択する。このように、組み合わせのライブラリの親和性に基くスクリーニングの成果は、前記の計算用ツールを用いることで得られる。
【０１１７】
最終工程は、ターゲット分子を阻害または活性化する薬剤リード化合物を同定する目的で、固相スクリーニングにより検出された見込みのあるヒットの生物学的評価である。多くの特異的な生物アッセイは、前記目的のために開発されている(Hill D. C., Current Opinion in Drug Discovery and Development 1998, 1: 92-97; Nakayama G. R, Current Opinion in Drug Discovery and Development 1998, 1: 85-91)。薬剤様分子のライブラリによるスクリーニング法は、溶液でのインビトロ試験、例えば、機能的アッセイ試験に好ましい。薬剤様化合物が、マイクロモーラー以下のＫDでターゲット分子の活性部位に結合することが好ましい。
【実施例１】
【０１１８】
リガンド−タグ／リンカー接合体の合成：
リガンド−タグ／リンカー接合体Ｘ−Ｚ−Ａ−Ｆｍの合成であって、ＹはＦｍ保護基で保護されたカルボキシル基である：
工程１
【化２】
2004531700.tif 000003
１００ｍｌのＤＣＭ（ジクロロメタン）中に２１．５ｇの３，６−ジオキサオクタンジカルボン酸（１２１ｍｍｏｌ）溶液に、１５ｍｇのＤＭＡＰ（ジメチルアミノピリジン）を触媒として加え、その混合物を−１０℃に冷却した。ついで、ＤＣＭに溶解させた９．３ｇのＤＣＣ（ジシクロへキシルカルボジイミド）（４６ｍｍｏｌ）を加え、その溶液を２０分間攪拌した。ついで、２６．２２ｇのＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）（２３０ｍｍｏｌ）と７．９６ｇの９−フルオレニルメタノール（４１ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液を加え、その反応混合物を一晩攪拌した。その沈殿物を濾過により除去し、その濾液を減圧下でエバポレートした。その残渣を酢酸エチルに溶解し、１Ｍの塩酸で３回洗浄した。その有機相を硫酸ナトリウムで一晩乾燥させ、ついでその溶媒を減圧下でエバポレートし、黄色がかった油状物質を得た（１３．５ｇ；収率＝９３．４％）。
工程２
【化３】
2004531700.tif 000004
１００ｍｌのＤＣＭに溶解した１９．６ｇのジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジカーボネイト（９０ｍｍｏｌ）溶液を、ＤＣＭ２００ｍｌ中の４０．０ｇの１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン（２７０ｍｍｏｌ）溶液にゆっくり加えた。その反応混合物を一晩攪拌した後、その溶媒を減圧下でエバポレートした。その残渣を酢酸エチルに溶解し、１０％の炭酸ナトリウム溶液で３回洗浄した。ついで、その溶媒を減圧下でエバポレートした。その固体残渣（１９．３ｇ；収率＝８６．４％、（ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジカーボネイトに対する収率））をさらに生成することなく次工程に使用した。
工程３
【化４】
2004531700.tif 000005
前記工程１の生成物１３．５ｇ（３８ｍｍｏｌ）と４．６ｍｇのＤＭＡＰを８０ｍｌのＤＣＭに溶解した溶液を−１０℃に冷却した。この温度で８．６ｇのＤＣＣ（４２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液をゆっくり加えた。２０分間攪拌した後、前記工程２の生成物１０．３ｇ（４２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液をゆっくり加えた。得られた混合物を一晩攪拌した。その沈殿物を濾過により回収し、濾液からＤＣＭを除去した。その濾液の残渣を酢酸エチルで溶解し、１Ｍの塩酸で２回洗浄した。その有機相を硫酸ナトリウムで一晩乾燥させ、その溶媒を減圧下でエバポレートした。得られた生成物（１９．０ｇ；収率＝８５％）を３００ｇのシリカと下記の溶出剤を用いたシリカクロマトグラフィーカラムで精製した：ａ）２．０ｌの酢酸エチル；ｂ）１．５ｌの酢酸エチル／メタノール（９０：１０）；１．５ｌの酢酸エチル／メタノール（８０：２０）；ｃ）１．５ｌの酢酸エチル／メタノール（５０：５０）。精製後の生成物の収量は、６．１ｇ、収率＝２７．６％であった。
工程４
【化５】
2004531700.tif 000006
６．１ｇの前記工程３の生成物（１０．４ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液に、ジオキサン中の４M塩酸を加え、その反応を薄層クロマトグラフィーで観測した。その反応の終了後、その溶媒を減圧下で除去し、６．７ｇの白色固体を得た（収率＝９９％）。
工程５
【化６】
2004531700.tif 000007
２００ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に、２７．８ｍｇのトリフェニルメチルクロリド（１００ｍｍｏｌ）と１２．７ｇの３−メルカプトプロピオン酸（１２ｍｍｏｌ）とを溶解した。ついで、４０ｍｌのピリジン（５００ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、その反応混合物を一晩攪拌した。ついで、その溶媒を減圧下で除去した。その生成物を酢酸エチルに溶解し、１Mの塩酸で２回洗浄した。その有機相を硫酸ナトリウムで一晩乾燥した。その溶媒を乾燥し、酢酸エチルとメタノールとの溶液により結晶化し、２２．９ｇの白色の非結晶性粉末を得た（収率＝６６％）。
工程６
【化７】
2004531700.tif 000008
４．５ｇの前記工程５の生成物（１３ｍｍｏｌ）を１５０ｍｌのＴＨＦ（テトラヒドロフラン）に溶解した。ついで、２．６ｇの１，１−カルボニルジイミダゾール（１６ｍｍｏｌ）をその混合物に少量ずつ加え、その混合物を１時間以上攪拌した。ついで、まず、６．７ｇの前記工程４の生成物（１３ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのＴＨＦに溶解することにより調製した溶液に、１．７ｇのジイソプロピルエチルアミン（１３ｍｍｏｌ）を加え、その溶液を前記反応混合物に加えた。ついで、その反応混合物を一晩攪拌した。ついで、その溶媒を減圧下で除去した。その残渣を酢酸エチルに溶解し、１Mの塩酸で２回洗浄した。その有機相を硫酸ナトリウムで一晩乾燥した。その溶媒を減圧下で除去した。粗生成物（６．９ｇ；収率＝６５．８％）をさらに精製することなく次工程に用いた。
工程７
【化８】
2004531700.tif 000009
３０ｍｌのＤＣＭ中の、６．９ｇの前記工程６の生成物（８．４ｍｍｏｌ）と３．５ｍｌのトリエチルシラン（２１．４ｍｍｏｌ）溶液を激しく攪拌しながら、１０ｍｌのトリフルオロ酢酸を滴下した。その反応をＬＣ／ＭＳにより観測した。その反応が完了した後、その反応混合物をＤＣＭで希釈し、１Mの塩酸で２回洗浄した。その有機相を硫酸ナトリウムで一晩乾燥した。ついで、その溶媒をエバポレートした。その残渣を２５０ｇのシリカと下記の溶出剤を連続的に使用するシリカカラムクロマトグラフィーで精製した：ａ）２．０ｌの酢酸エチル；ｂ）１．５ｌの酢酸エチル／メタノール（９０：１０）；２．０ｌの酢酸エチル／メタノール（８０：２０）。精製後の生成物の収量は、２．８ｇ、収率＝５７．７％であった。
工程８
【化９】
2004531700.tif 000010
２．６５ｇの３−（４−（ジフェニルヒドロキシメチル−フェノキシ−）酪酸ジシクロへキシルアミン塩を１Mの塩酸と酢酸エチルとの混合物中に分散させた。その水相を酢酸エチルで２回洗浄した。そのあわせた酢酸エチル相を硫酸ナトリウムで乾燥した。ついで、その溶媒を減圧下で除去し、その残渣をＤＣＭに溶解した。ついで、前記工程７の生成物２．８ｇ（５ｍｍｏｌ）をその溶液に加え、その混合物を１０分間攪拌した。ついで、その反応の間に赤くなったその反応混合物に５ｍｌのトリフルオロ酢酸を滴下した。その反応をＬＣ／ＭＳにより観測した。その反応の終了後、その反応混合物をＤＣＭで希釈し、１Mの塩酸で２回洗浄した。その有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、その溶媒を減圧下で除去した。その生成物を３００ｇのシリカと下記の溶出剤を使用するシリカカラムクロマトグラフィーで精製した：ａ）２．０ｌの酢酸エチル；ｂ）１．５ｌの酢酸エチル／メタノール（９０：１０）；１．０ｌの酢酸エチル／メタノール（８５：１５）；ｃ）２．０ｌの酢酸エチル／メタノール（８０：２０）。精製後、純粋な分画２．５ｇ（収率＝５３．９％）と不純物を含む分画１．３ｇ（収率＝２８．０％）とを分離できた。
【０１１９】
リガンド−タグ／リンカー接合体Ｘ−Ｚ−Ａ−Ｙ−Ｆｍｏｃの合成であって、Ｙは、Ｆｍｏｃ保護基で保護されたアミノ基である：
工程１
【化１０】
2004531700.tif 000011
１．６８ｇのＦｍｏｃ−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（５．０ｍｍｏｌ）を３０ｍｌのＤＣＭに溶解させた溶液を激しく攪拌させたリガンド−タグ／リンカー接合体Ｘ−Ｚ−Ａ−Ｙ−Ｆｍの合成の前記工程２の生成物１．３０ｇ（５．２ｍｍｏｌ）と０．９ｍｌのＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）（５．２ｍｍｏｌ）の溶液に滴下で加えた。その反応混合物を一晩攪拌し、ついでその溶媒を減圧下で除去した。その残渣を酢酸エチルに溶解し、１Mの塩酸で２回洗浄した。その有機相を硫酸ナトリウムで一晩乾燥した。ついで、その溶媒を減圧下でエバポレートした。得られた粗生成物（２．２７ｇ；収率＝９２％）をさらに精製することなく次の製造工程で使用した。
工程２
【化１１】
2004531700.tif 000012
ジオキサン中の４Mの塩酸を前記工程１の生成物２．２７ｇ（４．８ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液に加え、その反応を薄層クロマトグラフィーにより観測した。その反応終了後、その溶媒を減圧下で除去し、１．８ｇの白色の非結晶性固体（収率＝９２％）を得た。
工程３
【化１２】
2004531700.tif 000013
３５０ｍｌのＤＣＭに、２０．０ｇのトリフェニルメタノール（７７ｍｍｏｌ）と１３．１ｇのシステアミン塩酸塩（１１５ｍｍｏｌ）を分散させた分散液を激しく攪拌しながら２３ｍｌのトリフルオロ酢酸を滴下した。滴下後、黄色透明溶液に変わったその反応混合物をさらに２時間攪拌した。ついで、その溶媒を減圧下で除去した。その生成物を酢酸エチルに溶解し、炭酸ナトリウムの１０％水溶液で３回洗浄した。その有機相を硫酸ナトリウムで一晩乾燥させた。その溶媒を乾燥し、粗生成物（２３．０ｇ；収率＝９３％）を酢酸エチルにより結晶化した。
工程４
【化１３】
2004531700.tif 000014
１０．２ｇのカルボニルジイミダゾール（６３ｍｍｏｌ）を１５０ｍｌのＴＨＦに溶解させた溶液を、３８．０ｇの３，６，９−トリオキサウンデカンジカルボン酸（１７１ｍｍｏｌ）を２５０ｍｌのＴＨＦに溶解させた溶液にゆっくり加えた。ついで、６０ｍｌのＴＨＦ中の４９ｍｌＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）（２８５ｍｍｏｌ）（混合物）を加える前にその混合物を１時間攪拌した。ついで、前記工程３の生成物１８．２ｇ（５７ｍｍｏｌ）を３００ｍｌのＴＨＦに溶解したものをゆっくり加えた。その溶媒を減圧下でエバポレートする前にその反応混合物を一晩攪拌した。その生成物を酢酸エチルに溶解し、１Mの塩酸で３回洗浄した。その有機相を硫酸ナトリウムで一晩乾燥した。その溶媒を減圧下でエバポレートした。その生成物を３００ｇのシリカと下記の溶出剤を連続的に用いたシリカカラムクロマトグラフィーで精製した：ａ）１．５ｌのトリクロロメタン；ｂ）１．５ｌのトリクロロメタン／メタノール（９０：１０）；１．０ｌのトリクロロメタン／メタノール（８０：２０）；ｃ）１．５ｌのトリクロロメタン／メタノール（５０：５０）とｄ）１．５ｌのメタノール／ｌ％蟻酸。精製後の生成物の収量は、１４．０ｇで、前記生成物は、白色粉末であった（収率＝４７．０％）。
工程５
【化１４】
2004531700.tif 000015
３．４５ｇのカルボニルジイミダゾール（２１．０ｍｍｏｌ）を、１０．０ｇの前記工程４の生成物（１９．１ｍｍｏｌ）を１５０ｍｌのＴＨＦに溶解させた溶液に少量ずつ加えた。ついで、７．７５ｇの前記工程２の生成物（１９．１ｍｍｏｌ）を３．３ｍｌのＤＩＥＡ（１９．１ｍｍｏｌ）に溶解し、その混合物にＴＨＦを加えた。一晩攪拌した後、その溶媒を減圧下でエバポレートした。その残渣を酢酸エチルに溶解し、飽和食塩水中の１Mの塩酸で２回洗浄し、飽和食塩水中の１０％炭酸ナトリウムで２回洗浄した。その有機相を硫酸ナトリウムで一晩乾燥させた。その溶媒を減圧下でエバポレートした。その粗生成物（１４．２ｇ；収率＝８５％）をさらに精製することなく次工程に使用した。
工程６
【化１５】
2004531700.tif 000016
激しく攪拌した１４．２ｇの前記工程５の生成物（１６．２ｍｍｏｌ）と８．５ｍｌのトリエチルシラン（５０．３ｍｍｏｌ）とを３０ｍｌのＤＣＭに溶解させた溶液に１０ｍｌのトリフルオロ酢酸を滴下した。その反応をＬＣ／ＭＳにより観測した。その反応が完了した後、その反応混合物をＤＣＭで希釈し、１Mの塩酸で２回洗浄した。その有機相を硫酸ナトリウムで一晩乾燥した。その溶媒を乾燥した。その粗生成物を２５０ｇのシリカと下記の溶出剤を連続的に用いたシリカカラムクロマトグラフィーで精製した：ａ）１．５ｌの酢酸エチル；ｂ）１．５ｌの酢酸エチル／メタノール（９０：１０）；２．０ｌの酢酸エチル／メタノール（８０：２０）。
その精製された生成物の収量は、８．４ｇ（収率＝５７．７％）であった。
工程７
【化１６】
2004531700.tif 000017
５．７６ｇの３−（４−（ジフェニルヒドロキシメチル−フェノキシ−）酪酸ジシクロへキシルアミン塩（１０．６ｍｍｏｌ）を１Mの塩酸と酢酸エチルの混合物との間に分散させた。その水相を酢酸エチルで２回洗浄した。そのあわせた酢酸エチル相を硫酸ナトリウムで乾燥した。ついで、その溶媒を減圧下で除去し、その残渣をＤＣＭに溶解した。ついで、前記工程６の生成物８．４ｇ（１３．３ｍｍｏｌ）をその溶液に加え、その混合物を１０分間攪拌した。ついで、その反応で赤くなったその反応混合物に６ｍｌのトリフルオロ酢酸を滴下で加えた。その反応をＬＣ／ＭＳにより観測した。その反応が終わったとき、その反応混合物をＤＣＭで希釈し、１Mの塩酸で２回洗浄した。その有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、その溶媒を減圧下で除去した。その生成物を３００ｇのシリカと下記の溶出剤を使用するシリカカラムクロマトグラフィーで精製した：ａ）１．０ｌの酢酸エチル；ｂ）１．０ｌの酢酸エチル／メタノール（９７５：２５）ｃ）１．０ｌの酢酸エチル／メタノール（９５０：５０）；ｄ）１．０ｌの酢酸エチル／メタノール（９０：１０）とｅ）１．０ｌの酢酸エチル／メタノール（８０：２０）。
精製後、純分画５．０ｇ（収率＝４８％）と不純物を含む分画４．０ｇ（収率＝３８．０％）とに分離できた。
【０１２０】
固相合成
９２１６の化合物ライブラリ
DE 101 08 892.2に記載されているアミノ基で官能化し、固定したポリプロピレン膜スポット（３ｍｍ2）を持つポリプロピレン製の３８４ウエルマイクロタイタープレート（ウェルナー社製）２４組を用いた。その膜をＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）で２回、ついでＤＣＭで２回洗浄し、２μｌのＤＭＦ中に５５ｍｍｏｌのＦｍｏｃ保護基で保護された“リガンド−タグ”、５５ｍｍｏｌのＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム−ヘキサフルオロリン酸）、１１ｍｍｏｌのＤｉＥＡを含む溶液がピペットロボット（Ｃｙｂｉｏ  ＡＧ社製、ドイツ）を介して移した。その反応時間は１時間とした。その膜をＤＭＦで６回、ＤＣＭで２回洗浄し、ついで風乾した。ＤＭＦ中に２５％のピペリジンを含む溶液１５μｌでＦｍｏｃ保護基を除去した。その開裂反応を２０分間行い、ついで過剰なピペリジンを除去した。その膜をＤＭＦで６回、ＤＣＭで２回洗浄し、ついで風乾した。
９６組のＦｍｏｃ保護基で保護されたアミノ酸の結合のために３μｌのＤＭＦ中に０．１５Ｍのそれぞれのアミノ酸、０．１５ＭのＨＯＢＴ、０．１６ＭのＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）を含む溶液３μｌをその膜の上にピペットで移した。１時間インキュベーションした後、その膜をＤＭＦで６回、ＤＣＭで２回洗浄し、ついで風乾した。前記の方法でＦｍｏｃ保護基を除去した。その膜をＤＭＦで６回、ＤＣＭで２回洗浄し、ついで風乾した。
次の結合のために、８８組のカルボン酸と８組の塩化スルホニルとを使用した。そのカルボン酸は、０．１５ＭのＨＯＢＴと０．１６ＭのＤＩＣとを含むＤＭＦ中の０．１５Ｍ溶液中で反応させた。
その塩化スルホニルを、１．１Ｍの過剰なＤＩＥＡ（Ｎ−エチルジイソプロピルアミン）を含むＤＭＦ中の０．１２５Ｍ溶液で反応させた。そのカルボン酸は１時間、塩化スルホニルは１／２時間結合させた。その膜をＤＭＦで６回、ＤＣＭで２回洗浄し、ついで風乾した。
【０１２１】
リガンド−タグ接合体のその膜からの開裂と保護基の除去
８０％のＴＦＡ、１０％のＤＣＥ（ジクロロエタン）、５％のＥｔ3ＳｉＨと１０％の水を含む溶液をその膜にピペットで移した。１時間のインキュベーション期間の後、真空下でその溶液を除去した。保存と更なる使用のために、リガンド−タグ接合体を０．１％のＴＦＡを含む７０％のＡＣＮと３０％の水との混合物に溶解した。そのリガンドを運ぶリガンド−タグは、下記一般式１を持つ。
【化１７】
2004531700.tif 000018
【０１２２】
マレイミド−チオールで覆われたプレート
エチレングリコール中のマレイミド−チオールアンカー分子下記式（２）と希釈化合物下記式（３）の１：２５の混合物と１％のＴＦＡ（全体からみた濃度は１．０ｍM）で金のチップ（５×５ｃｍ）をインキュベートした。そのアンカー分子と希釈化合物３とをDE 100 27 397.1に記載の実施例１および２の方法で合成した。そのチップをメタノール／１％ＴＦＡ混合物で数回洗浄し、水（ｐＨ  ７．０）で１回洗浄した。ついで、そのチップを窒素下で乾燥した。
【化１８】
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【化１９】
2004531700.tif 000020
図４に示す分子量を持つ９２１６のリガンド−タグ接合体（リガンドを運ぶリガンド−タグ）のライブラリを、ピンを介してチップの上に配置し、その際０．５７５ｍｍの点の間隔で９６×９６の配列を形成した。そのリガンド−タグ接合体を０．２Mのリン酸緩衝液（ｐｉ）、５ｍMのＥＤＴＡならびに１０％（ｖ／ｖ）エチレングリコール（ｐH  ７．０）で希釈して最終濃度を４０μＭとした。その量は、ほぼ１０ｎｌであり、それぞれの配置は表面境界のマレイミド基と比べて過剰のリガンド−タグ接合体を含む。よって、マレイミド基の完全な反応が得られる。マレイミド基に占められていない空間は、そのチップが０．２Mのｐｉ（ｐＨ  ７．０）に３０分間抱かれることにより浸される。
そのチップをついでウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む停止溶液（５０ｍMのＴｒｉｓ／塩酸、１５０ｍMの塩化ナトリウム、５ｇ／ｌのＢＳＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０、ｐH  ７．３）で一晩処理した。ターゲット蛋白質トロンビンの潜在的結合相手の分析は、免疫学的アッセイにより見出される：よって、そのチップを、遮断溶液中の１０ｎＭのトロンビン中で４時間インキュベートした。停止溶液中で２分間洗浄した後、そのチップを、ポリクローナル抗トロンビン抗体（１：１０００希釈）で２時間インキュベートした。遮断溶液中で２回洗浄した後、そのチップを、抗ラビット抗体−ＰＯＤ接合体にインキュベートした。最後に、そのチップをＴＢＳＴ（トリスバッファ塩にトゥィーンを混ぜたもの）の中で２回洗浄し、Ｌｕｍｉ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｒｏｃｈｅ社製）を介してその化学発光反応を検出した。トロンビン結合が明るいスポットを示した。第二のチップは、トロンビンにインキュベートしたことを除いて、全く同様に処理した。このチップは、トロンビンの結合のために起こるのではなく、第一のまたは第二の抗体の結合のために起こる結合相互作用を区別するために、負の対照で取り扱った。その負の対照は、ノイズレベル以上の信号を示さなかった。その配列上のそれぞれの化合物に符合する空間座標として、そのスポットである化学構造を決定できる。
図２に正の対照（１０ｎＭのトロンビン）の化学発光反応のＪａｒｒａｙプロットを示す。分離した輝度がある場所に認められる。これは、その物質がこの場所でトロンビンに結合し、固定されたことを明らかにする。最も強烈なスポットが黒で彩色されている。
【０１２３】
阻害定数の決定
前記直接結合アッセイで同定した基質の阻害特性を、トロンビンアッセイにより後で分析した（前記阻害定数Ｋiの決定）。対応する基質は、合成した固相から解離し、全ての化学構造に共通したアミド基を形成した。前記トロンビン活性は、２０℃、ｐＨ７．４で蛍光基質Ｔｏｓ−ＧＰＲ−ＡＭＣ（Ｂａｃｈｅｍ社製、１３６５、λｅｘｃ．＝３７０ｎｍ、λｅｍ．＝４５０ｎｍ）を用いて決定した。前記反応は、２０μＭ基質、０．１〜１００μｍ阻害剤および１００ｐＭヒトトロンビンを含む全体積２００μｌＨＢＳ（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で行った。
前記反応は、前記酵素と阻害剤との５分間のプレインキュベーションの後、基質の添加により開始する。その蛍光強度を、１分間隔で１０分間測定する。競合的阻害剤のＫi値は、以下のようにして計算する。
ｖ0／ｖi＝１＋Ｉ／Ｋｉ
ｖ0＝その反応の初速度
ｖi＝阻害剤存在下でのその反応の初速度
Ｉ＝阻害剤濃度
結合リガンドの低親和性は、以下のとおり同定した：

2004531700.tif 000021
対応する構造を図３に示す。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図４】本発明におけるリガンドのライブラリの化合物の分子量分布の一例を示すグラフである。
【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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