(57)【要約】神経保護のための製剤の製造のためのNMDA拮抗活性を有するGABAA-受容体モジュレーターの使用、ならびにNMDA拮抗作用を有するGABAA-受容体モジュレーターおよびα-リポ酸またはジヒドロ-α-リポ酸の組合せが記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
中枢および末梢神経系の神経変性疾患の神経保護治療のための製剤の製造のためのNMDA-拮抗性活性を有するGABAA-受容体モジュレーターの使用。
【請求項２】
中枢神経系の疾患の神経保護治療のための請求項1記載の使用。
【請求項３】
多発性硬化症、感染誘発性脳症またはクロイツフェルト-ヤコブ病の治療のための請求項1または2記載の使用。
【請求項４】
下記式I:
【化１】
2004537567.tif 000003
(式中、R1は、水素または-O-R5であり;
R3は、水素またはC1-4-アルキルであり;
R4は、水素、C1-4-アルキルまたは-CH2-O-CH3であり;
nは、1または2であり;
R5は、水素、フェニル、ベンジル、またはC1で置換されるフェニルである)
のβ-カルボリンまたはその生理学的適合性塩の、請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用。
【請求項５】
6-ベンジルオキシ-4-メトキシメチル-β-カルボリン-3-カルボン酸イソプロピルエステルの、請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用。
【請求項６】
卒中、脳虚血および頭蓋-脳外傷から成る群から選択される神経変性疾患の神経保護治療のための製剤の製造のための6-ベンジルオキシ-4-メトキシメチル-β-カルボリン-3-カルボン酸イソプロピルエステルの使用。
【請求項７】
(1)NMDA-拮抗性活性を有するGABAA-受容体モジュレーター、および(2)α-リポ酸またはジヒドロ-α-リポ酸を含む活性成分組合せ。
【請求項８】
(1)6-ベンジルオキシ-4-メトキシメチル-β-カルボリン-3-カルボン酸イソプロピルエステル、および(2)α-リポ酸またはジヒドロ-α-リポ酸から成る請求項7記載の活性成分組合せ。
【請求項９】
中枢および末梢神経系の神経変性疾患の神経保護治療のための請求項7または8記載の活性成分組合せ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許仮出願第60/313,019号(2001年8月20日提出)の提出日の利益を主張する。
本発明は、神経保護のための製剤の製造のためのNMDA拮抗活性を有するGABAA-受容体モジュレーターの使用、ならびにNMDA拮抗作用を有するGABAA-受容体モジュレーターおよびα-リポ酸またはジヒドロ-α-リポ酸の組合せに関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタミン酸塩は、ヒトおよび哺乳類身体中の必須興奮伝達物質である。グルタミン酸塩レベル増大は、神経組織の重篤な損害をもたらし、これが神経変性を生じ得る。グルタミン酸塩受容体内では、NMDA(N-メチル-D-アスパルテート)受容体は、病理学的に最も重要な役割を演じる。NMDA受容体は、ストレスおよびリガンド依存的方法で同時的に作用する。-60 mVのニューロンの正常静止電位では、受容体のイオンチャンネルはMg2+イオンにより封鎖され(Mayer, M.L. et al., Nature 1984; 309 (5965))、そしてリガンドは受容体を活性化できない。
【０００３】
しかしながら膜が脱分極されると、Mg2+はイオンチャンネルを出て、そして受容体がリガンドにより活性化され、これがCa2+およびNa+の流入、ならびにK+の流出を生じる。非NMDA受容体は、Ca2+に対してほとんど不透性である。NMDA受容体の過剰活性化は、Ca2+流入増強を生じ、これは細胞傷害作用を有する。ついには細胞死をもたらすアポトーシス過程(Riveros, N. et al., Neuroscience 1986; 17 (3) 541-6)および後期壊死過程は、Ca2+流入が引き金となる。
【０００４】
神経変性疾患の進行段階では、NMDA受容体に関与する細胞は好ましくは壊死を受け、これにより、NMDA受容体アンタゴニストが常により多くの有効性を失って、神経変性進行を伴うということが生じる。しかしながらGABA受容体を保有する細胞は、この伝達物質(GABA)の抑制作用により保護され、そして進行神経変性の状態における薬理学的作用にも到達可能である。
【０００５】
細胞内Ca2+レベル増大は、前記のNMDA受容体過剰活性化により引き起こされ得る。後者はしばしば、例えばアラキドン酸の放出またはキサンチン-デヒドロゲナーゼのキサンチン-オキシダーゼへの転化により、フリーラジカルのイメージング強化を生じる。多量のCa2+がミトコンドリアに取り込まれると、ミトコンドリアはヒドロキシルおよび有機ラジカルを生じ得る(Packer, L. et al., Free Radio Biol Med 1997; 22 (1-2): 359-78)。
【０００６】
NMDA受容体の活性化強化は細胞内酸化窒素レベル増大をもたらし、これがスーパーオキシドを用いてペルオキシニトライトに改質され得るし、そして細胞傷害性でもある。NMDA受容体拮抗作用を有する物質と酸化防止剤との同時使用は、相乗的方法で神経変性損害を防止するのに適している。神経変性罹患哺乳類の細胞中のグルタチオンレベル低減を検出することが出来た。グルタチオンを補充することが望ましいが、しかし栄養素または経口的投入物からのグルタチオンの有意の吸収は起こらない。しかしながらα-リポ酸の経口投入は、細胞グルタチオンレベルのかなりの増大を生じる。
【０００７】
神経保護療法として、ニューロン細胞の損害または死の低減または防止を生じる治療の形態が参照される。これは、グルタミン酸塩レベル増大の作用の低減により、例えば細胞中へのCa2+流入を遮断することにより、ならびにグルタミン酸塩の放出低減により、実行され得る。
【０００８】
NMDA受容体アンタゴニストの投与は神経保護目的のためには全く望ましいが、しかしほとんど常に、重篤な副作用、例えばいわゆる細胞の空胞化が臨床試験において伴い(Fritz, K.I. et al., Brain Res. 1999; 816 (2): 438-45)、これが最終的に臨床的導入を不可能にさせた。さらにほとんど全てのNMDA受容体アンタゴニストは、中等度重症〜重症の精神医学的副作用を示す。GABA受容体ポテンシャル化およびNMDA受容体拮抗化活性成分の同時使用を用いた場合、空胞化は観察されない(Olney, J.W. et al., Science 1991; 254 (5037): 1515-8)。
【０００９】
GABA(ガンマ-アミノ-酪酸)は、グルタミン酸塩代謝内で産生される天然化合物であり、哺乳類の最も重要な抑制性伝達物質を代表する。GABAの欠乏またはGABA作動性系の抑制は、ほとんどの場合、細胞死まで痙攣および癲癇発作を生じる。
【００１０】
1,4-ベンゾジアゼピンは、最も広範なGABAA受容体モジュレーターに属する。これらの物質群から成る化合物、例えばミダゾラムおよびフルニトラゼパムは、ベンゾジアゼピン受容体であるベンゾジアゼピンに対する特定結合部位に対する強力な親和性を有する。後者は、GABAA受容体の一部である。GABAがGABAA受容体と結合する場合、これは塩化物流入物を溶解する。ベンゾジアゼピンがベンゾジアゼピン受容体に同時に結合する場合、この塩化物流入物が増強される。細胞の過分極増強は、これに起因する。このためのメカニズムとして、塩化物チャンネルの開放確率増大が予測される。ベンゾジアゼピンとベンゾジアゼピン受容体との結合は、GABAに対するGABAA受容体の親和性を増強し、その逆もある。
【００１１】
ベンゾジアゼピンは、癲癇、不安症状、痙攣および睡眠障害の治療に広範な全身性用途を見出す。存在するGABAの量によりそれらの有効性が限定されるため、危険な状態のそれらの毒性能力は相対的に低い。さらにより選択的なベンゾジアゼピン-受容体-アンタゴニストであるフルマゼニルが存在し、これを用いて任意の過剰投薬が直ちに拮抗され得る。さらにバルビツール酸誘導体、例えばフェノバルビタールはGABA塩化物イオンチャンネルの開放を可能にする。
【００１２】
ベンゾジアゼピン受容体に対する親和性を有し、そしてベンゾジアゼピンにより既知の特性における化合物の構造に基づいた拮抗的な、逆作動的なおよび作動的な作用を発揮する、ということがβ-カルボリンについて知られている。この物質クラスからの多数の化合物は、GABAA受容体の一部であるベンゾジアゼピンに関する特異的結合部位に対する強力な親和性のみを示す;多数のβ-カルボリンは他の神経伝達物質に対する受容体と同時に結合する;そして多数のβ-カルボリンは他の神経伝達物質に対する受容体とだけ結合し、そしてベンゾジアゼピン受容体に対する親和性を示さない。したがって、ある種のβ-カルボリンはキスカレート受容体の調整部位に及ぼす影響を有し、そしてこの受容体の病理学的変更形態を補正する。
【００１３】
電気生理学的観点から、GABA作動性系の増強は細胞の過分極を生じる。これは脱分極および作用能力の普及をより難しくする。NMDA受容体はその場合、細胞膜が脱分極されるとCa2+に関して透過性であるに過ぎないため、GABA増強化剤の投与はNMDA受容体の抑制を生じる。しかしながら細胞膜の過分極により、それは、ストレス依存性Ca2+チャンネルが活性化されるということを同時に防止する。これらのチャンネルは、純粋NMDA-受容体アンタゴニストにより検出されない。
【００１４】
GABAA-受容体モジュレーターは受容体上のGABAの親和性または有効性を変える;GABAの非存在下では、それらは効果がない。したがって、アゴニストは、存在する神経伝達物質の量に関係なく、投与濃度増大に伴ってだんだん強くなる作用を有するため、GABAA-受容体モジュレーターの投与はアンタゴニストの場合よりかなり低有害性である。GABAA-受容体モジュレーターの投与はしたがって、GABAアゴニストと比較して、かなり低い毒性危険性を有する。
【００１５】
したがって当該目的は、NMDAアンタゴニストおよびGABAアゴニストにより既知である副作用を低減するかまたは排除し得る利用可能な化合物を製造することである。
【００１６】
本発明によれば、式I:
【化１】
2004537567.tif 000002
【００１７】
(式中、R1は、水素または-O-R5であり;
R3は、水素またはC1-4-アルキルであり;
R4は、水素、C1-4-アルキルまたは-CH2-O-CH3であり;
nは、1または2であり;
R5は、水素、フェニル、ベンジル、またはC1で置換されるフェニルである)
のβ-カルボリンおよびその生理学的適合性塩が適している。
【００１８】
各々の場合、アルキルとは、直鎖または分枝鎖アルキル、例えばメチル、エチル、イソプロピル、n-プロピル、n-ブチル、イソブチル、tert-ブチルまたはsec-ブチルを意味する。
R3は、好ましくはイソプロピルを意味する。置換基R1は、好ましくは5-または6位置における1箇所に、または6-、7位置における2箇所に置かれる。特に好ましい実施態様は、5-(4-シクロフェノキシ)-4-メトキシメチル-β-カルボリン-3-カルボン酸イソプロピルエステル、および特に6-ベンジルオキシ-4-メトキシメチル-β-カルボリン-3-カルボン酸イソプロピルエステル(アベカミル)である。
式Iの化合物およびその生理学的適合性塩の製造は、例えばEP 54507A、EP 239667AおよびEP 234173に記載された方法にしたがって、または既知の方法と同様に実行される。
【００１９】
本発明により適切である、そしてそれらのGABA-受容体-調整作用のほかにNMDA-受容体-調整作用を有するGABAA-受容体モジュレーターは、例えば卒中、頭蓋-脳外傷および脳虚血後の神経変性疾患の神経保護療法に適している。さらにそれらの化合物は、中枢および末梢神経系のその他の疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、老年性痴呆、多発脳梗塞性痴呆;ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、不穏下肢症候群、癲癇、低血糖症による細胞損害、低酸素症および虚血;
【００２０】
非制御運動により引き起こされるニューロン損害;仮死ならびに精神病、精神分裂病、不安症状、疼痛発作、片頭痛および嘔吐;機能性障害、例えば記憶障害(健忘症)、学習障害、耽溺性作用物質、例えばベンゾジアゼピン、幻覚剤、アルコール、コカインまたはアヘンの慢性摂取後の覚醒症状および剥奪症状;ならびに多発性硬化症;エイズ誘発性脳症および風疹ウイルス、ヘルペスウイルス、ボレリアにより並びに未知の作因により引き起こされるその他の感染誘発性脳症;クロイツフェルト-ヤコブ病、ならびに末梢神経系の神経変性病、例えば多発性神経障害および多発性神経炎に適している。
【００２１】
図1は、アベカルニルの神経保護特性の試験の範囲内で得られた結果を示す。ラットの皮質ニューロンの一次細胞培養で測定を実施した。細胞が培養中で増殖した後、下記の試験を実施した:
グルコースおよび酸素を、培養溶液から同時に除去した。このモデルは、明確に丈夫なモデルであって、これは非常に重篤で且つ非常に広範な卒中の間の症状をシミュレートする。ゼロ比較では、培養用液は交換しないままであった(BSS=平衡塩溶液)。対照においては、酸素およびグルコースを除去した(OGD=酸素およびグルコース剥奪);試験群では、アベカルニルを酸素およびグルコース除去と同時に付加した。
【００２２】
ニューロンに関する損害パラメーターとして、溶液中のLDH(ラクテート-デヒドロゲナーゼ)レベルを細胞で測定した。LDHは、細胞に関する明確に信頼可能なストレスパラメーターである。ニューロンストレスが強いほど、またはすでに破滅した細胞が多いほど、培地中のLDHレベルは増大する。神経保護作用を有する製剤から、それは培地中のLDHレベルを低減することが予測される。
図1に、このような測定値を示した。LDHレベルがOGD25.1より低い場合、それらは、0.1 μmのアベカルニルでは11.0;1 μmのアベカルニルでは6.2;10 μmのアベカルニルでは14.9;そして100 μmのアベカルニルでは15であった(24時間後)。アベカルニル濃度が1μmの場合、これは何と75%を上回るLDH低減に対応する。
【００２３】
OGDモデルにおけるこのような強度のLDH低減はアベカルニルの神経保護特性を、したがって虚血および神経変性疾患、例えば卒中を治療するための作用物質としてのその適合性を強調する。
本発明により適切であるβ-カルボリン、例えばアベカルニルは、2つの受容体系を介して作用する:一方では、それらはベンゾジアゼピン受容体に及ぼす正の調整作用を有し、したがってGABAの抑制作用を増強するが、しかしそれらは同時に、NMDA-受容体-拮抗作用も有し、即ちそれらはグルタメートの有害作用を低減する。ともに一緒に、純粋GABAA-受容体モジュレーターを用いた場合よりさらに広範な神経保護を生じる。
【００２４】
本発明は、中枢または末梢神経系の前記の疾患の対症的または予防的処置のための製剤の製造のための式Iの化合物の使用にも関する。
本発明は、NMDA拮抗作用を有するGABAA-受容体モジュレーターとα-リポ酸またはジヒドロ-α-リポ酸の組合せも含む。その還元形態、ジヒドロリポ酸(DHP)と一緒に、α-リポ酸(1,2-ジチオラン-3-吉草酸)はレドックス系を構成する。このレドックス系は、哺乳類生物体において非常に強い抗酸化作用を発揮する。さらにα-リポ酸は、フリーラジカルを結合し、金属をキレートかし、そして重要な細胞酸化防止剤およびラジカルトラップ、例えばグルタチオン、ビタミンCおよびEを再活性化する。
【００２５】
組合せ治療は神経保護作用を増強し、そして増強化Ca2+流入の細胞傷害性損害を低減する。
本発明の製剤または組成物は、一般的に用いられる固体または液体ビヒクルまたは希釈剤、ならびに所望の投与型に対応する一般的二用いられる製薬的および技術的アジュバントを、当業界で既知である意味において適切な投与量で用いて製造される。好ましい調製物は、経口、経腸または非経口投与、例えばi.p.(腹腔内)、i.v.(静脈内)、i.m.(筋肉内)または経皮投与に適した調剤のための形態からなる。調剤のためのこのような形態は、例えば錠剤、フィルム錠剤、コーテッド錠剤、ピル、カプセル、粉剤、クリーム、軟膏、ローション、液体、例えばシロップ、ゲル、例えばi.p.、i.v.、i.m.または経皮注射用の注射液等である。さらにデポー剤形態、例えば移植可能調製物、ならびに座薬も適している。この場合、個々の調製物は、それらの種類によって、漸次方式で本発明のベンズイミダゾール誘導体を、または短時間で全量を、身体に送達する。
【００２６】
経口投与のためには、カプセル、ピル、錠剤、コーテッド錠剤および液体または調剤のためのその他の既知の経口形態が製剤調製物として用いられ得る。この場合、製剤は、それらが短時間で活性成分を放出し、そしてそれらを身体に送達するような方法で処方されるか、あるいはそれらは身体への活性成分の長期持続性低速供給が達成されるよう、デポー剤作用を有する。少なくとも1つのベンズイミダゾール誘導体のほかに、投薬単位は、1つまたはそれ以上の製薬的適合性ビヒクル、例えば製剤のレオロジーを調整するための物質、界面活性剤、可溶化剤、マイクロカプセル、微小粒子、顆粒、希釈剤、結合剤、例えばデンプン、糖、ソルビトールおよびゼラチン、さらに充填剤、例えばケイ酸およびタルク、滑剤、染料、香料ならびにその他の物質も含有する。
【００２７】
対応する錠剤は、例えば活性成分を既知のアジュバント、例えば不活性希釈剤、例えばデキストロース、糖、ソルビトール、マンニトール、ポリビニルピロリドン、explosives、例えばコーンスターチまたはアルギン酸、結合剤、例えばデンプンまたはゼラチン、滑剤、例えばカルボキシポリメチレン、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタラートまたはポリビニルアセテートと混合することにより得られる。錠剤はさらに、数個の層からなる。
【００２８】
したがってコーテッド錠剤は、錠剤コーティングに一般的に用いられる作用物質、例えばポリビニル-ピロリドンあるいはシェラック、アラビアゴム、タルク、酸化チタンまたは糖を用いた錠剤と同様に生成されるコアをコーティングすることにより生成され得る。この場合、コーテッド錠剤外皮はいくつかの層からなり、それにより錠剤の場合の前記のアジュバントが用いられ得る。
活性成分を含有するカプセルは、例えば活性成分が、不活性ビヒクル、例えばラクトースまたはソルビトールと混合され、そしてゼラチンカプセル中に封入されることにより生成され得る。
【００２９】
活性成分は溶液の形態でも処方され得るが、これは経口投与用に意図されており、そして活性ベンズイミダゾール誘導体のほかに、構成成分として製薬上適合可能な油および/または製薬上適合可能な親油性界面活性剤および/または製薬上適合可能な親水性界面活性剤および/または製薬上適合可能な水混和性溶媒を含有する。
本発明の活性成分のより良好な生物利用能を達成するために、当該化合物は、シクロデキストリン包接体として処方され得る。この目的のために、当該化合物をα-、β-またはγ-シクロデキストリンあるいはその誘導体と反応させる。
【００３０】
クリーム、軟膏、ローションおよび外用され得る液体が用いられる場合、後者は、本発明の化合物が十分量で身体に供給されるように構成されねばならない。調剤のためのこれらの形態には、アジュバント、例えば製剤のレオロジーを調整するための物質、界面活性剤、防腐剤、可溶化剤、希釈剤、皮膚を通した本発明のベンズイミダゾール誘導体に関する透過性を増大するための物質、染料、香料および皮膚保護剤、例えばコンディショナーおよびモイスチャライザーが含入される。
【００３１】
本発明の化合物と一緒に、その他の活性成分も製剤中に含入され得る(Ulmanns Enzyklopadie der technischen Chemie [Ullmanns' Encyclopedia of Technical Chemistry], Volume 4 (1953), pages 1-39; J. Pharm. Sci., 52, 918 ff. (1963); issued by Czetsch-Lindenwald, Hilfsstoffe fur Pharmazie und angrenzende Gebiete [Adjuvants for Pharmaceutics and Related Fields]; Pharm. Ind., 2, 72 ff (1961); Dr. H.P. Fiedler, Lexikon der Hilfsstoffe fur Pharmazie, Kosmetik und angrnzende Gebiete [Dictionary of Adjuvants for Pharmaceutics, Cosmetics and Related Fields], Cantor AG, Aulenorf/Wurtt., 1971)。
【００３２】
活性成分は、適切な溶液、例えば生理学的一般塩溶液中に、例えば注入または注射溶液中にも用いられ得る。非経口投与のために、活性成分は生理学的適合性希釈剤中に溶解または懸濁され得る。希釈剤としては、特に油状溶液、例えばゴマ油、ヒマシ油および綿実油中の溶液が適切である。溶解度を増大するために、可溶化剤、例えばベンジル安息香酸塩またはベンジルアルコールが付加され得る。
注射用調製物を処方するためには、本発明の化合物が溶解され、または乳化される任意の液体ビヒクルが用いられ得る。これらの液体はしばしば、粘度を調節する物質、界面活性剤、防腐剤、可溶化剤、希釈剤および溶液が等張に調整されるその他の添加剤も含有する。
【００３３】
経皮系中に活性成分を混入することも、そしてそれ故にそれらを経皮的に投与することも可能である。このような調製物は、活性成分の遅延放出が可能にされるように処方され得る。この目的のために、既知の技法、例えば溶解し、あるいは膜とともに作働するデポー剤が用いられ得る。移植片は、不活性物質として、例えば生分解性ポリマー、あるいは合成シリコーン、例えばシリコーンゴムを含有し得る。
【００３４】
活性成分の投薬量は、適用の種類、患者の年齢および体重、治療される疾患の種類および重症度、ならびに同様の因子によって変わり得る。1日用量は、一度に投与される単一用量として、あるいは2回またはそれ以上の1日用量に分けて与えられ得る。化合物は、生理学的適合性ビヒクル中に活性成分0.05〜100 mgの投薬量単位で導入される。概して、0.1〜500 mg/日、好ましくは0.1〜50 mg/日の用量が用いられる。
【００３５】
本発明の組合せ調製物では、活性成分は、一処方物中に、そうでなければそれぞれ別個の処方物中に存在し、それにより全用量が一度にまたは数回用量に分けて投与される。
組合せ調製物中の活性成分の1日用量は、β-カルボリン誘導体に関しては0.1 mg〜500 mg、そしてα-リポ酸またはジヒドロ-α-リポ酸に関しては10 mg〜1000 mgであり、特に適切なのは600 mgの用量である。
同時にNMDA-受容体-拮抗作用も有するGABAA-受容体モジュレーターの有効性は、下記の試験により確定した:
【００３６】
妊娠18日目のウィスター胚の培養ニューロンに関して、測定値を得た。調製後、ニューロンを小プレート上で成長させた。この目的のために、直径12 mmの顕微鏡プレパラート用の小カバーガラス(補助物)を用いた。各々の場合、小カバーガラスのうちの4枚を小プラスチック皿(Nuncion)に移した。
【００３７】
調製培養液として、以下の溶液を用いた:10 mmolのHEPES(N-2-ヒドロキシエチル-ピペラジン-N-2-エタンスルホン酸)を補足し、NaOH(Sigma)でpH7.3に調整したGBSS(グレイの緩衝化塩溶液、Sigma)。培地として、以下のものを用いた:DMEM(Sigma)、グルコース含有ウマ血清10%(Sigma)およびグルタミン。細胞は一般的に、培養開始時に50,000細胞/小プレートが存在するように、分けた。24時間後に調製法にしたがって培養液を取り換えて、その後、各場合、3日後に取り換えた。シナプス自発的活動は、一般にin vitroでは10日目から開始して発生した。
【００３８】
細胞外測定溶液は、以下の組成物(mmol)を有した:NaCl 140;KCl 5.4;CaCl2 2;HEPES 10;MgCl 1;グルコース 25。pHはNaOHで7.4に調整した。1,2,3,4-テトラヒドロ-6-ニトロ-2,3-ジ-オキソ-ベンゾ-キノキサリン-7-スルホンアミド(NBQX10 μm)およびDL-2-アミノ-5-ホスホノ吉草酸(±-APV30 μm)を付加することにより、IPSCを単離した。ビククリン(10 μm)およびピクロトキシン(20 μm)を付加することにより、EPSCを単離した。EPSCの実験では、MgCl2を含有しないリンガー液を用いた。ピペット溶液は、以下の組成物(mmol)を有した:KCl 120;MgCl2 2;CaCl2 1;HEPES 10;EGTA 11;グルコース 20;pHは7.2であった。
【００３９】
測定は室温で実行した。参照として、銀-銀塩化物ペレットを用いた。-60 mVを保持電位として選択した。増感剤から生じて、信号は中間体増感剤の助けにより再び強められ、1 kHzで低域通過濾過される。このように調整された信号を、ストレージオシロスコープにより可視化し、サーマルプロッターで記録した。同時に、デジタル-アナログ変換器により信号を検出し、ビデオテープで記録した。保存データを後日再生して、再びデジタル化し、次にPCで「オフライン」で評価した。評価のために、TIDAプログラム(HEKA, Germany)およびJ. Dempster(University of Strathclyde, UK)のプログラム組を用いた。
【００４０】
グルタミン酸受容体アンタゴニストNBQX(10 μm;AMPA受容体に対して)およびAPV(30 μm;NMDA受容体に対して)を付加することにより、抑制性シナプス後電流(IPSC)を単離した。グルタミン酸受容体アンタゴニストを付加後、ニューロン自発的活動はほぼ完全に消失した。1 mmolの4-アミノ-ピリジン(4-AP)を付加することにより、活動を再び刺激し得た。ビククリン(20 μm)およびピクロトキシン(10 μm)を付加後に完全に消失し、したがって純粋にGABA受容体媒介性であるシナプス事象がここに示された。
【００４１】
さらに、知覚鈍麻の現象に不可欠であるため、抑制性シナプス後電流(IPSC)の減衰動態に及ぼす薬理学的作用をここで調べた。
IPSCの振幅は二指数関数的動態において減少し、即ち2つの構成成分の重ね合わせが見出され、それにより一回目定数はIPSCの急速低減部分を表し、したがってτ短時または短時定数と呼ばれるが、一方、二回目定数はIPSCのより低速な実行部分を説明し、したがってτ低速または低速時間定数と呼ばれる。高速構成成分τ高速の平均減衰時間は6.9±4.8 msであり、そして低速部分τ低速は34.1±12.5 msであった。これらの値は、全ての対照測定値の平均を表す。
【００４２】
アベカルニルの作用はベンゾジアゼピン、例えばミダゾラムの作用と非常によく似ていた(n=10)。したがって周波数は出発値の33.8±24.7%に低減された(P＜0.05);振幅は同時的に増大された(129.2±26.9%;P＜0.05)。平均化IPSCの即時定数は値増大傾向を示した(143.9±51.0%)が、しかしこれらの作用は統計学的有意に達しなかった。しかしながら低速時間定数は有意に、即ち出発値の289.7±180.9%に増大された(P＜0.05)。
【００４３】
興奮性シナプス後電流(EPSC)は、GABAA-受容体アンタゴニストビククリン(20 μm)およびアロステリック作用を有するGABAA-受容体アンタゴニストピクロトキシン(10 μm)を付加することにより、単離した。4-APの付加は、ここでも、ニューロン活動の増大を生じた。ここで検出され得る純EPSCは、10 μmのNBQXおよび30 μmのAPVを付加することにより完全に遮断され、したがって純粋にグルタミン酸作動性である。
【００４４】
EPSCの周波数は、アベカミルにより出発値の32.6±19.8%に低減され(P＜0.05)、そして振幅は同時的に低減され、即ち、81.2±17.8%に低減された(P＜0.05)。いくつかの細胞では、周波数作用は弱く読み取られただけであったが、しかしいくつかの細胞では、活性は完全に遮断された。
【００４５】
この最初の非常に意外な作用を詳細に研究するために、以下の試験を実施した。さらに30 μmのAPVを分離EPSCに適用して、NMDA制御部分を抑制して、AMPA作動性活性を分離されたものとみなした。この活性において、アベカルニルは作用を有さなかった(n=3)。10 μmのNBQXを適用して、分離EPSCとは逆に、AMPA作動性部分を抑制し、NMDA部分を目立たせ、そして次に1 μmのアベカルニルを適用した場合、この活性はアベカルニルにより完全に遮断された(n=7)。したがってアベカルニルは有意のNMDA-拮抗特性を有することが示され得た。
【００４６】
包括的にまたは特定的に説明された反応体および/または本発明の操作条件を先行実施例で用いられたものの代わりに置き換えることにより、先行実施例を同様に首尾よく反復し得る。
前記および下記に引用された全ての出願、特許および出版物の、ならびに対応する独国出願第101 36 842.9号(2001年7月23日提出)の全開示内容は、参照により本明細書中に含まれる。
前記の説明から、当業者は、本発明の不可欠な特質を容易に確認し得るし、そして本発明の精神および範囲を逸脱しない限り、本発明の種々の変更および修正をなして、それを種々の用途および条件に適合し得る。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
（原文記載なし）
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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