(57)【要約】本発明は、過形成組織、腫瘍組織、または癌性病巣を、好ましくは原子が無秩序に形成されており、好ましくはナノ結晶形態である、1種または複数の抗菌性金属と接触させることによって、ヒトまたは動物の疾患状態において、アポトーシスを誘導し、マトリックスメタロプロテイナーゼを阻害するための方法に関する。選択したナノ結晶抗菌性金属は、1種または複数の抗菌性金属のナノ結晶コーティング、1種または複数の抗菌性金属のナノ結晶性粉末、あるいは1種または複数の抗菌性金属のナノ結晶性粉末またはコーティングからの溶解種を含む溶液の形で使用することができる。
2004529929.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
過形成組織、腫瘍組織、または癌性病巣中のアポトーシスを誘導するための、結晶形態の治療上有効な量の1種または複数の抗菌性金属の使用であって、金属がアルコールまたは水系電解液と接触すると、少なくとも1種の抗菌性金属の原子、イオン、分子またはクラスターを局所的なアポトーシス促進作用をもたらすのに充分な濃度で放出するように、1種または複数の抗菌性金属が充分な原子の無秩序を特徴とする使用。
【請求項２】
1種または複数の抗菌性金属が、1種または複数のマトリックスメタロプロテイナーゼをさらに阻害するか、あるいは1種または複数のマトリックスメタロプロテイナーゼの生成を調節する、請求項1に記載の使用。
【請求項３】
抗菌性金属が銀、金、白金およびパラジウムからなる群から選択される、請求項2に記載の使用。
【請求項４】
抗菌性金属がナノ結晶性であり、アルコールまたは水系電解液と接触すると、抗菌性金属のイオン、原子、分子またはクラスターを持続的に放出するように、抗菌性金属が充分な原子の無秩序を有して形成されている、請求項3に記載の使用。
【請求項５】
腫瘍組織が悪性である、請求項4に記載の使用。
【請求項６】
腫瘍組織または癌性病巣が皮膚癌である、請求項4に記載の使用。
【請求項７】
皮膚癌がメラノーマである、請求項6に記載の使用。
【請求項８】
過形成組織、腫瘍組織、または癌性病巣が肺中に存在する、請求項4に記載の使用。
【請求項９】
過形成組織、腫瘍組織、または癌性病巣が肝臓中に存在する、請求項4に記載の使用。
【請求項１０】
1種または複数のマトリックスメタロプロテイナーゼが、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメリシン、およびストロメリシン様マトリックスメタロプロテイナーゼからなる群から選択される、請求項4に記載の使用。
【請求項１１】
抗菌性金属がナノ結晶性の銀である、請求項4に記載の使用。
【請求項１２】
抗菌性金属が酸素との複合体として形成された銀である、請求項4に記載の使用。
【請求項１３】
抗菌性金属がナノ結晶性の金である、請求項4に記載の使用。
【請求項１４】
抗菌性金属が酸素との複合体として形成された金である、請求項4に記載の使用。
【請求項１５】
抗菌性金属がナノ結晶性の白金である、請求項4に記載の使用。
【請求項１６】
抗菌性金属が酸素との複合体として形成された白金である、請求項4に記載の使用。
【請求項１７】
1種または複数の抗菌性金属が、包帯または湿性包帯上のコーティング、またはその中の充填物として、あるいは局所施用に適した、薬剤および外皮用薬として許容可能な1種または複数の担体、希釈剤、または賦形剤を含む薬剤組成物中に与えられる、請求項4に記載の使用。
【請求項１８】
薬剤組成物が、1種または複数の抗菌性金属のナノ結晶性粉末、あるいは1種または複数の抗菌性金属のナノ結晶性粉末またはコーティングからの溶解種を含んだ溶液を含む、請求項17に記載の使用。
【請求項１９】
薬剤組成物が、0.01〜10重量%の量の抗菌性金属の粉末を含む、ゲル、クリーム、ローション、ペーストまたは軟膏、あるいは0.001〜10重量%の抗菌性金属を含む、局所用溶液、スプレー剤、ミスト、滴剤、注入液および滴下剤として調合した液体である、請求項18に記載の使用。
【請求項２０】
抗菌性金属がナノ結晶性の銀である、請求項19に記載の使用。
【請求項２１】
抗菌性金属が酸素との複合体として形成された銀である、請求項19に記載の使用。
【請求項２２】
抗菌性金属がナノ結晶性の金である、請求項19に記載の使用。
【請求項２３】
抗菌性金属が酸素との複合体として形成された金である、請求項19に記載の使用。
【請求項２４】
抗菌性金属がナノ結晶性の白金である、請求項19に記載の使用。
【請求項２５】
抗菌性金属が酸素との複合体として形成された白金である、請求項19に記載の使用。
【請求項２６】
抗菌性金属が粉末形態であり、過形成組織、腫瘍組織、または癌性病巣の部位に直接送達される、請求項18に記載の使用。
【請求項２７】
粉末を2μm以下の粒子に大きさを合わせる、請求項26に記載の使用。
【請求項２８】
粉末を1μm以下の粒子に大きさを合わせる、請求項27に記載の使用。
【請求項２９】
抗菌性金属がナノ結晶性の銀である、請求項28に記載の使用。
【請求項３０】
抗菌性金属が酸素との複合体として形成されたナノ結晶性の銀である、請求項28に記載の使用。
【請求項３１】
抗菌性金属がナノ結晶性の金である、請求項28に記載の使用。
【請求項３２】
抗菌性金属が酸素との複合体として形成された金である、請求項28に記載の使用。
【請求項３３】
抗菌性金属がナノ結晶性の白金である、請求項28に記載の使用。
【請求項３４】
抗菌性金属が酸素との複合体として形成された白金である、請求項28に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、過形成組織、腫瘍組織、または癌性病巣と抗菌性金属を接触させることによって、ヒトまたは動物の疾患状態において、アポトーシスを誘導するため、疾患状態のマトリックスメタロプロテイナーゼを阻害するための方法、抗菌性金属を調製するための方法、抗菌性金属を含む薬剤組成物、およびその使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスおよびマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)は、癌などの多くの病原性疾患と関連してきている。アポトーシス、すなわちプログラムされた細胞の死は、不必要な、加齢の、あるいは損傷を受けた細胞を除去するシステムである。アポトーシスは、胎児の指および足指、および脳中のニューロン間のシナプスの正確な形成を確実にするために分化中に起こり、ウイルス感染細胞、不必要な免疫細胞、DNA損傷を受けた細胞、および癌細胞を根絶するために働く。アポトーシスの低下は分化中の奇形、癌および自己免疫性疾患と関連があり、一方アポトーシスの進行は、アルツハイマー病、AIDS痴呆、およびハンチントン病などの変性疾患と関連がある。
【０００３】
カスパーゼはプロテアーゼの1ファミリーであり、アポトーシス中のタンパク質分解を制御する、開始(アクチベーター)およびエフェクター(実行)プロテアーゼ型を含む。アポトーシスは、細胞に対して内的または外的なシグナルによって引き起こされる。健康な細胞中では、タンパク質Bal-2がその表面上で発現されており、タンパク質Apaf-1に結合する。細胞中の内的損傷は、Bal-2にApaf-1を放出させ、シトクロムcがミトコンドリアから漏れないように保つことはできない。放出されたシトクロムcおよびApaf-1は、カスパーゼ9の分子に結合する。生成したシトクロムc、Apaf-1、カスパーゼ9およびATPの複合体は、サイトゾル中で凝集する。タンパク質を切断する際に、カスパーゼ9は他のカスパーゼを活性化させ、細胞質上の構造タンパク質の消化、染色体DNAの分解、細胞の食作用をもたらす。外的なシグナルに関しては(たとえば、ウイルス感染細胞中でアポトーシスを誘導する細胞傷害性T細胞)、標的細胞の表面上での、死の活性化物質(FasLおよびTNF)のFasおよびTNF受容体タンパク質への結合によってカスパーゼ8が活性化され、これが標的細胞の食作用をもたらす他のカスパーゼを活性化させる。
【０００４】
癌細胞は、アポトーシスを回避するための機構を有している可能性がある。たとえば、いくつかのB白血病細胞およびリンパ腫は高レベルのBal-2を発現し、これによって、それらが受け取る可能性があるアポトーシスシグナルを遮断する。メラノーマ細胞は、Apaf-1をコードする遺伝子の発現を阻害することによって、アポトーシスを回避する。肺および結腸癌細胞は、FasLに結合する分子を分泌し、Fasへのその結合を阻害する。現在、いくつかの型の癌細胞において、アポトーシスを誘導するために放射線および標準的化学療法剤が使用されているが、しかしながら、このような治療には望ましくない副作用があり、いくつかの癌はこのような療法に耐性があり、このような副作用がなく、正常な細胞機能の最小限の阻害を示す、有効な手法を提供する必要性が存在する。
【０００５】
癌組織は、MMPの阻害剤を用いて治療することもできる。MMPは、細胞外マトリックスの過剰な分解、腫瘍の侵襲および転移などと関連がある疾患、関節疾患(慢性関節リウマチおよび骨関節症)、骨吸収疾患(骨粗しょう症など)、糖尿病と関連した多量のコラーゲン破壊、歯周疾患、角膜の潰瘍形成、および皮膚の潰瘍形成と関連してきている。MMPは、結合組織、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、および細胞外マトリックスの他の成分などの分解と関連がある、少なくとも20の酵素(プロテアーゼ)の1ファミリーである。このような成分は、関節の内側、間質性結合組織、基底膜、および軟骨中に存在する。MMPは、結合組織中に存在するかあるいはそれと関連がある、さまざまな細胞型中、繊維芽細胞、単球、マクロファージ、内皮細胞、および侵襲性または転移性腫瘍細胞などに存在する。MMPの発現は、成長因子、サイトカイン、化学物質、物理的ストレス、細胞-マトリックス相互作用、細胞-細胞相互作用および発癌性形質転換を含めた、さまざまな要因によって誘導される可能性がある。
【０００６】
MMPファミリーには、以下のようにコラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメリシンおよびストロメリシン様プロテアーゼがある。
i)コラゲナーゼには、MMP-1(間質性)、MMP-8(好中性)、およびMMP-13があり、これらは元のコラーゲンI、II、III型の最初の分解を触媒する。コラーゲンは、軟骨、骨、腱および皮膚などの組織の、細胞外マトリックスの必須成分である。MMP-13は、骨関節症、潰瘍および悪性腫瘍の侵襲と関連がある。
ii)ゼラチナーゼには、MMP-2(繊維芽細胞および非常にさまざまな他の細胞型によって分泌される)およびMMP-9(単核食細胞、好中球、角膜上皮細胞、腫瘍細胞、細胞栄養芽層およびケラチン生成細胞によって放出される)がある。ゼラチナーゼは、ゼラチン(変性コラーゲン)およびコラーゲンIV型(基底膜)を分解する。
iii)ストロメリシンには、MMP-3、MMP-10およびMMP-11がある。MMP-3およびMMP-10は、上皮細胞および癌腫によって発現され、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、およびコラーゲンIVおよびIX型を含めた、広範囲の細胞外マトリックス基質を分解する。MMP-11は繊維芽細胞によって発現され、セリンプロテアーゼ阻害剤を切断する。
iv)ストロメリシン様MMPには、MMP-12およびMMP-7がある。MMP-12はマクロファージおよび間質細胞によって発現され、エラスチンを分解する。MMP-7またはマトリリシンは、単核食細胞によって、時折腫瘍中で発現され、プロテオグリカン、ゼラチン、フィブロネクチン、エラスチンおよびラミニンを含めた、広範囲のマトリックス基質を分解する。
【０００７】
MMPの阻害剤は、潜在的治療剤として働くことができる。しかしながら、コラゲナーゼ阻害剤として示唆されてきている、いくつかのヒドロキサム酸およびその誘導体は、そのヒドロキサム成分のために潜在的に毒性であるようである。したがって、MMPを阻害するための非毒性で有効な治療に関する必要性が存在する。
【０００８】
二重の手法、すなわち特定細胞のアポトーシスの誘導およびMMPの阻害をもたらすことによって、癌細胞を根絶し、腫瘍の侵襲および転移を促進する組織の損傷を減少させる治療が望ましいであろう。現在、シスプラチンおよびその変形体が、アポトーシス促進(pro-apoptotic)用抗癌剤として使用されている。なぜなら白金錯体は、腫瘍細胞のDNAを攻撃し、これによってRNA合成を害するからである。しかしながらシスプラチンは、血液から腎臓を通過し直ちに排出され、腫瘍細胞に達する前にタンパク質に結合し不活性になり、あるいは腫瘍ではない細胞を攻撃する可能性がある。長期の使用によって急性毒性が生じる恐れがあるので、シスプラチンは短期の多用量に限られる。抗癌剤の治療の有効性および非毒性を保つために、徐放性のものが望ましい。
【０００９】
本特許出願は、硝酸銀、ハロゲン化銀またはスルファジアン銀などの金属銀または銀の塩は有用な抗菌剤の範疇にあることを報告するが、本発明者の知るところでは、これらがアポトーシスを誘導すること、および/またはMMPを阻害することは知られておらず採用されていない。腫瘍組織および癌性病巣に関しては、細胞のアポトーシスの進行およびMMPのレベルの低下に関する利点がある可能性がある。たとえば、アポトーシスの誘導により、腫瘍細胞を根絶し、MMPの阻害を介して腫瘍の侵襲および転移の機会を減らすことによって、腫瘍の抑制を促進することができる。癌細胞に影響を与えることに加えて、このような治療は、異常な増殖、または正常な組織または器官中の正常な配置である細胞の数の増加が生じた過形成組織中などで、過剰な正常細胞を根絶する際に有益であろう。
【非特許文献１】
R.P.Andres他、「Research Opportunities on Cluster and Cluster-Assembled Materials」、J.Mater.Res.Vol.4、No.3、1989、p.704
【特許文献１】
1998年9月24日に公開された、発明者名R.E.BurrellおよびR.J.Prechtの従来の特許出願WO98/41095
【特許文献２】
両方共にBurrell他が発明者名である、従来の特許出願、1993年11月25日に公開されたWO93/23092、および1995年5月26日に公開されたWO95/13704
【特許文献３】
1998年9月24日に公開されたWO98/41095
【非特許文献２】
J.A.Thornton、「Influence of Apparatus Geometry and Deposition Conditions on the Structure and Topography of Thick Sputtered Coatings」J.Vac.Sci.Technol.、11(4)、666〜670、1974
【非特許文献３】
Merck Index,Merck & Co.,Rahway,N.J.およびGilman他、(eds)(1996)Goodman and GilmanのThe Pharmacological Bases of Therapeutics、8th Ed.、Pergamon Press
【非特許文献４】
Physicians Desk Reference(1997 Edition);およびU.S.Pharmacopeia National Formulary(1995)United States Pharmacopeial Convention Inc.、Rockville、Maryland
【非特許文献５】
Desmouliere,A.、Badid,C.、Bochaton-Piallat,M.and Gabbiani,G.(1997)Apoptosis during wound healing,fibrocontractive diseases and vascular wall injury.Int.J.Biochem.Cell Biol.29:19〜30
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者は、原子が無秩序で、好ましくはナノ結晶形態で形成された抗菌性金属は、アポトーシスを誘導しMMPを阻害することを確立した。したがって、アポトーシス促進作用および抗MMP効果を有する抗菌性金属を用いた過形成組織、腫瘍組織、または癌性病巣の治療が示される。この新しい治療は、アポトーシス促進およびMMPの阻害剤という、二重の利点を有するであろう。本発明の方法および調合物には、ヒトと動物の両方に対する適用例がある。
【００１１】
1種または複数の銀、金、白金およびパラジウムから選択される抗菌性金属は、原子が無秩序で形成され、したがって金属のイオン、クラスター、原子または分子が、局所的なアポトーシス促進作用および抗MMP効果をもたらすのに充分な濃度で放出される。抗菌性金属はナノ結晶形態であり、持続的にこのような効果をもたらすのに充分な、原子の無秩序を含むことが最も好ましい。
【００１２】
同じことによって縛られることなく、原子が無秩序で形成されたナノ結晶抗菌性金属は、銀の塩(たとえば硝酸銀)、Ag+のみを放出する銀ゼオライト、または非常にわずかな可溶性を有する金属銀および酸化銀などの、他の知られている抗菌剤と比較して、粘膜の治療における驚くほど高い抗菌活性、および驚くべき抗炎症活性の存在の原因である、抗菌性金属の非常に活性があるクラスター(Ag0またはAg+/Ag0という例示的クラスター)を放出することができると考えられる。R.P.Andres他、「Research Opportunities on Cluster and Cluster-Assembled Materials」、J.Mater.Res.Vol.4、No.3、1989、p.704によって記載されたように、クラスターは、原子、イオンなどの小さな群であることが知られている。銀に関しては、クラスターは、正常な面心立方結晶格子形の銀の14個未満の原子を含むと考えられている。
【００１３】
結晶形態のこれらの抗菌性金属を、任意の以下の形態で使用し、またはそれから調合することができる。
i)医療用支持体、たとえばポリエチレン、高密度ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ラテックス、シリコーン、コットン、レーヨン、ポリエステル、ナイロン、セルロース、酢酸塩、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、キチン質、キトサンおよびハイドロファイバーから構成される材料からの、包帯、パッキング、メッシュ、フィルム、濾過表面、フィルター、注入器、ファイバー、容器またはバイアル上の抗菌性金属のコーティング;
ii)粉末、好ましくは抗菌性金属のナノ結晶性粉末として、あるいは粉末形の生体適合性支持体、好ましくは生体吸収性および/または吸湿性支持体上の抗菌性金属のナノ結晶コーティングとして調製された粉末、合成生体吸収性ポリマーなど、たとえばポリエステル/ポリアクトン、ポリグリコール酸、グリコリド、乳酸、ラクチド、ジオキサノン、トリメチレンカルボネートなどのポリマーなど、ポリ無水物、ポリエステルアミド、ポリオルテオエステル、ポリホスファゼン、およびこれらのコポリマー、および関連ポリマーまたはモノマー、または
天然由来のポリマー:
タンパク質:アルブミン、フィブリン、コラーゲン、エラスチン;
多糖類:キトサン、アルギン酸塩、ヒアルロン酸;および
生合成ポリエステル:3-ヒドロキシブチレートポリマー;
iii)密封または湿性(hydrated)包帯、この包帯には、抗菌性金属の粉末または溶液を含ませるか、あるいは抗菌性金属の局所用調合物が共に使用され、このような包帯はたとえば親水コロイド、ヒドロゲル、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリビニリデン、シロキサンまたはシリコーン包帯である;
iv)抗菌性金属のナノ結晶粉末または溶液、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、キチン質、キトサンおよびハイドロファイバーなどの物質、および防腐剤、ペクチンおよび増粘剤などの成分を用いて調合したゲル;
v)抗菌性金属のナノ結晶粉末または溶液を用いて、たとえばエマルジョンとして、または乾燥緩和剤を用いて調合したクリーム、ローション、ペーストおよび軟膏、;および
vi)抗菌性金属のナノ結晶コーティングまたは粉末を溶かすことによって、溶液として、たとえば膀胱、前立腺、肺、および肝臓などの体腔用の、局所用溶液、エアロゾル、ミスト、スプレー剤、滴剤(drops)、注入および滴下(instillation)溶液として調合した液体。
【００１４】
抗菌性金属の溶液は、熟成と共にいくらか活性を失い、したがって投与用に安定化させるかあるいは新鮮に生成させる。あるいは抗菌性金属を、好都合な溶液生成のために、たとえばティーバッグ型浸出器などの事前膜中に包むことができる。他の2部または2相系を使用することができ、この中で、たとえばキット形式で、抗菌性金属は水または電解質溶媒から分離され、抗菌性金属はバイアルまたは容器の内側、包帯などの支持体のコーティングとして溶解カプセル中に与えられ、穴をあけることができる膜によって分離されるか、担体から別の容器中、ティーバッグ型浸出器中などに分離される。
【００１５】
前述の形態では、ナノ結晶抗菌性金属のナノ結晶コーティングまたはナノ結晶粉末から、あるいはその中にナノ結晶コーティングまたは粉末を溶かすことによって調製した溶液から、ナノ結晶抗菌性金属を調合する。この調合物は治療上有効量のコーティングまたは粉末を、最も好ましくは以下の量で含む:
コーティング用:支持体に関しては150〜3000nmの厚さのコーティング、あるいは粉末を形成するためにはさらに厚いコーティング(このようなコーティングを使用して、0.001〜10重量%の溶液を生成させることができる)
ゲル、クリームなど用:0.01〜30重量%、より好ましくは0.01〜10重量%、最も好ましくは0.1〜5重量%の抗菌性金属または貴金属粉末
液体用:0.001〜10%重量%、より好ましくは0.01〜5重量%、最も好ましくは0.1〜1重量%の抗菌性金属または貴金属粉末(コーティング、薄片、粉末を含めた、任意の形態から生成する)。
【００１６】
溶液中の抗菌性金属または貴金属種の濃度は、適用例、調合物および対象に従って変わるであろうが、一般的には1〜5000μg/ml、より好ましくは20〜3000μg/ml、より好ましくは40〜800μg/ml、最も好ましくは50〜500μg/mlの範囲であろう。
【００１７】
抗菌性金属のナノ結晶コーティングは、包帯などの支持体、たとえば医療用包帯材料の非コーティング層と貼り合わせることができる、1層または複数層の医療用包帯の材料上に蒸着させることが最も好ましい。コーティングは、ナノ結晶コーティングを作製するための知られている技法によって作製することができるが、原子の無秩序を生み出す条件下での物理的真空蒸着によって作製することが最も好ましい。1998年9月24日に公開された、発明者名R.E.BurrellおよびR.J.Prechtの従来の特許出願WO98/41095中に記載されたように、ナノ結晶コーティングを作製して、指標を与えるように干渉色を生み出すことができる。
【００１８】
抗菌性金属のナノ結晶性粉末は、キチン質などの粉末状支持体上の、好ましくは前述の厚さのナノ結晶コーティングとして作製することができ、あるいはシリコンウエハなどの支持体上のナノ結晶コーティングとして作製し、次いでナノ結晶性粉末としてこすり取ることができる。あるいは、両方共にBurrell他が発明者名である、従来の特許出願、1993年11月25日に公開されたWO93/23092、および1995年5月26日に公開されたWO95/13704中に教示されたように、抗菌性金属の細粒度またはナノ結晶粉末を冷間加工して、原子の無秩序を与えることができる。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
したがって、本発明は広義には、ヒトまたは動物において疾患状態でのアポトーシスを誘導する方法であって、以下のことを含む方法を提供する:
過形成組織、腫瘍組織、または癌性病巣を治療上有効量の結晶形態の抗菌性金属と接触させて、局所的なアポトーシス促進作用をもたらすことであって、金属がアルコールまたは水系電解液と接触して、少なくとも1種の抗菌性金属の原子、イオン、分子またはクラスターを、局所的なアポトーシス促進作用をもたらすのに充分な濃度で放出するのに充分な、原子の無秩序によって抗菌性金属が特徴付けられること。抗菌性金属は、1種または複数のマトリックスメタロプロテイナーゼをさらに阻害するか、あるいは1種または複数のマトリックスメタロプロテイナーゼの生成を調節する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本明細書および特許請求の範囲中で使用するように、以下に述べる用語および語句は、以下の意味を有するものとする。
【００２１】
「アポトーシス」は、不必要な、加齢の、または損傷を受けた細胞を除去する、プログラムされた細胞死を意味する。
【００２２】
「アポトーシス促進作用」は、抗菌性金属または貴金属の原子、イオン、分子またはクラスターが放出されて、アポトーシスを誘導するのに充分な濃度で、ヒトまたは動物の細胞に接触することを意味する。
【００２３】
「抗MMP効果」は、抗菌性金属または貴金属の原子、イオン、分子またはクラスターが放出されて、1種または複数のマトリックスメタロプロテイナーゼを阻害するか、あるいは1種または複数のマトリックスメタロプロテイナーゼの生成を調節するのに充分な濃度で、ヒトまたは動物の細胞に接触することを意味する。
【００２４】
「マトリックスメタロプロテイナーゼ」は、結合組織、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、および細胞外マトリックスの他の成分などの分解と関連があり、細胞外マトリックスの過剰な分解が起こる状況、腫瘍の侵襲および転移などと関連がある、MMPのファミリーの任意のプロテアーゼを指すことを意味する。
【００２５】
「ゼラチナーゼ」は、MMP-2(繊維芽細胞および非常にさまざまな他の細胞型によって分泌される)およびMAP-9(単核食細胞、好中球、角膜上皮細胞、腫瘍細胞、細胞栄養芽層およびケラチン生成細胞によって放出される)を指すことを意味する。ゼラチナーゼは、ゼラチン(変性コラーゲン)およびコラーゲンIV型(基底膜)を分解する。
【００２６】
「繊維芽細胞」は、平らで円形の胞核を有するそれぞれの端に、細胞質突起を有する平らに延びた細胞である、結合組織細胞を意味する。軟骨芽細胞、コラーゲン芽細胞、および骨芽細胞に分化する繊維芽細胞は、身体、腱、腱膜中で繊維組織を形成し、あらゆる種類の組織を支え、それに結合する。
【００２７】
「好中球」は、骨髄から生じ、循環系中に放出されるときに完全に成熟している顆粒球を意味する。好中球は、主に食作用中の細胞防御において機能する。
【００２８】
「多核白血球」は、好中球を指すことを意味する。この名称は、成熟好中球の核の多数の小葉に由来する。
【００２９】
「過形成」は、正常な組織または器官中の正常な配置である細胞の数の、異常な増殖または増加を意味する。
【００３０】
「腫瘍」は、細胞の増殖が異常、制御不能および進行性である、組織の自発的増殖を意味する。腫瘍が有用な機能を果たすことはなく、健康な生物を犠牲にして増殖する。
【００３１】
「悪性」は、退形成、侵襲、および転移の諸性質を有する腫瘍を意味する。
【００３２】
「良性」は、悪性、再発性、侵襲性、または進行性ではない腫瘍を意味する。良性である腫瘍または増殖体は、非癌性である。
【００３３】
「癌性病巣」は、周辺組織を侵潤し転移を生じさせる傾向がある、上皮組織の腫瘍、または上皮細胞で構成された悪性の新しい増殖体を意味する。皮膚に関して使用する場合、癌性病巣は、原発性癌、または局所的腫瘍からあるいは遠方部位の腫瘍からのその部位への転移の結果である可能性がある、病巣を意味する。癌性病巣は腔、皮膚の表面上の開放領域、皮膚結節、または皮膚の表面から延びた結節増殖体の形をとることができる。
【００３４】
「転移」は、血流、またはリンパ系による1つの器官または組織から他の器官または組織への、癌細胞の移動または広がりを意味する。
【００３５】
「金属」または「金属類」は、実質的に純粋な金属、合金、または酸化物、窒化物、ホウ化物、硫化物、ハロゲン化物または水素化物などの化合物の形であれ、1種または複数の金属を含む。
【００３６】
「抗菌性金属」は銀、金、白金、パラジウム、イリジウム、亜鉛、銅、スズ、アンチモン、ビスマス、またはこれらの金属と同じまたは他の金属の混合物であり、銀、金、白金およびパラジウムが好ましく、銀が最も好ましい。
【００３７】
「貴金属」は銀、金、白金およびパラジウム、またはこれらの金属と同じまたは他の金属の混合物であり、金属銀が最も好ましい。
【００３８】
「抗菌効果」は、抗菌性金属または貴金属の原子、イオン、分子またはクラスターが電解質中に放出され、電解質にコーティングが、コーティング上または付近の微生物の増殖を阻害するのに充分な濃度で接触することを意味する。抗菌効果を測定する最も一般的な方法は、阻止帯試験(これによって静菌性であれ殺菌性であれ阻害効果が示される)または対数減少試験(これによって殺菌性効果が示される)である。阻止帯試験(ZOI)では、試験する物質を細菌叢(または他の微生物種の叢)上に置き、インキュベートする。ZOIの値が比較的小さいかあるいは存在しないこと(たとえば1mm未満)によって、有用ではない抗菌効果が示されるが、一方大きなZOIの値(たとえば5mmを超える)によって、非常に有用な抗菌効果が示される。ZOIの値は、一般的には補正された阻止帯(CZOI)として報告され、試験サンプルの大きさをその領域から差し引く。生命力のある細菌における対数減少試験は、抗菌性治療の有効性の定量的測定である。たとえば51ogの減少は、100,000倍微生物の数が減少することを意味する(たとえば、生成物が100,000の当該の微生物を含む場合、51ogの減少によって当該の微生物の数が1に減少すると思われる)。一般に、31ogの減少が殺菌性を表す。対数減少試験は、接種原と試験治療剤を組み合わせること、接種原と試験治療剤をインキュベートすること、細菌または他の微生物種を回収すること、一連の希釈を使用して細菌または他の微生物種を計数することを含む。これらの試験の例は、以下に続く実施例中で述べる。
【００３９】
「生体適合性」は、目的とする利用に関して、いかなる顕著な望ましくない宿主の応答も生み出さないことを意味する。生体適合性物質は、目的とする利用に関して非毒性であることが最も好ましい。したがって、ヒトでの利用に関しては、生体適合性は、ヒトまたはヒト組織に対して非毒性であることが最も好ましい。
【００４０】
「徐放性」または「持続的に」を使用して、長時間続き数時間または数日間測定される、抗菌性金属の原子、イオン、分子またはクラスターの放出が定義され、したがってこのような金属種と、治療上有効であるには低すぎる速度および濃度でこのような種を放出する塊状金属、およびアルコールまたは電解質と接触すると連続的にではないがほぼ即座に銀イオンを放出する、硝酸銀などの抗菌性金属の可溶性が高い塩の放出が区別される。
【００４１】
「原子の無秩序」は、その正常な整然とした結晶状態に対して、1種または複数の高度の:結晶格子の点欠陥、空位、転位などの線欠陥、自己格子間原子、非晶質領域、結晶および亜結晶粒界などを含む。原子の無秩序は、表面形状の異常、ナノメートル規模での構造中のおよび不均一性をもたらす。
【００４２】
「正常な整然とした結晶状態」は、キャスト品、錬鉄または板金製品として形成された、塊状金属材料、合金または化合物において通常見られる、結晶性を意味する。このような材料は、非常に低度の空位、結晶粒界および転位などの原子の欠陥を含む。
【００４３】
「拡散」は、原子の無秩序、すなわち凍結状態の原子の無秩序を生み出し保持するためのプロセスにおいて、拡散を制限する状態を記載するために使用するとき、形成される物質の表面上あるいはマトリックス中の、原子(吸着原子の拡散)および/または分子の拡散を意味する。
【００４４】
「アルコールまたは水系電解液」は、本発明の抗菌性物質が接触して、それを活性化させることができる(すなわち、抗菌性金属の種の放出を引き起こす)、任意のアルコールまたは水系電解液を含むことを意味する。この語は、アルコール(短鎖(C6あるいはそれ未満)、および好ましくはC4あるいはそれ未満)、水、ゲル、流体、溶媒、および体液(たとえば血液、尿、または唾液)、および身体組織(たとえば皮膚)を含めた、水または水系電解液を含み、分泌し、あるいは滲出させる組織を含むことを意味する。
【００４５】
本明細書に関して使用する「生体吸収性」は、医療用デバイス中で有用な基質、すなわち生体適合性であり、個々の適用例に応じて、数時間から数年間の範囲の期間で生体内に吸収することができる基質を含む。
【００４６】
「生体内吸収」は、分散したポリマー分子の分解と共に、あるいは分解なしで、身体中(ヒトまたは哺乳動物)の最初に施用した部位から物質が消失することを意味する。
【００４７】
「光の変化」は、単色光下での光の強度の変化、および2つ以上の波長を含む白色光からの色相の変化を含むことを意味する。
【００４８】
「干渉色」は、相殺的干渉によって除去される光の波長と妥当な関係がある距離だけ隔たっている、2つ以上の部分的に反射性である表面に、光が衝突すると生じる。
【００４９】
「部分的に反射性である」は、基層または上部層物質を記載するために使用するとき、入射光の一部を反射するが、入射光の一部を透過もさせる表面を、その物質が有することを意味する。入射光線が、2つの媒質間の屈折率の変化を特徴とする境界または界面に達すると、反射が起こる。本発明の抗菌性物質の上部層に関しては、その界面は空気である。基層に関しては、その界面は上部層である。基層と上部層の反射は、干渉色を生み出すように釣り合いがとれている。
【００５０】
「部分的に光透過性である」は、上部層物質の薄膜を記載するために使用するとき、その薄膜が入射可視光の少なくとも一部を薄膜を介して透過させることができることを意味する。
【００５１】
「検出可能である」は、色の変化を記載するために使用するとき、その変化が分光計などの機器によって検出されるものであれ、ヒトの眼によって検出されるものであれ、反射光の主要な波長の観察可能な推移を意味する。主要な波長は、観察される色の原因である波長である。
【００５２】
本明細書で使用する「冷間加工」は、ミリング、グラインディング、つち打ち、モーターおよび乳棒または圧縮などによって、その物質の再結晶温度より低い温度で、物質が機械的に加工されていることを示す。これにより、加工によって与えられた原子の無秩序が物質中で保たれる。
【００５３】
「薬剤としてあるいは治療上許容可能である」は、活性成分の有効性または生物学的活性(アポトーシス促進および抗MMP性)を著しく害することがなく、それを投与する宿主に関して許容可能な毒性概略を有する物質を示すために、本明細書で使用する。
【００５４】
「治療上有効な量」は、冒された領域に施用すると、アポトーシス促進作用および抗MMP効果の片方または両方を示すであろう、抗菌性金属または貴金属の調合物の任意の量を示すために、本明細書で使用する。本発明の調合物の1回の施用は充分なものであり、あるいは調合物をある期間にわたって、数日または数週間にわたって1日数回など、繰り返し施用することができる。コーティング、粉末または液体溶液中に溶けた形の抗菌性金属または貴金属である、活性成分の量は、治療する状態、その状態の進行の段階、宿主の年齢および型、および施用する調合物の型および濃度と共に変わるであろう。任意の所与の例における適量は、当業者には容易に明らかであり、あるいは通常の実験によって決定することができるであろう。
【００５５】
「担体」は、領域に投与するのに適した、1種または複数の固体、半固体または液体である、希釈液、賦形剤または被包性物質を含む、適切な媒体を意味する。
【００５６】
「ナノ結晶性」は、その粒径が、少なくとも1つの寸法が約100ナノメートル未満、より好ましくは50ナノメートル未満、より好ましくは40ナノメートル未満、より好ましくは30ナノメートル未満、最も好ましくは25ナノメートル未満である、単相または多相の多結晶を示すために、本明細書で使用する。抗菌性金属または貴金属のコーティング、粉末または薄片の、結晶格子中の結晶または粒径に適用するこの語は、粉末形に使用するとき、物質の粒子径を制限することを意味するわけではない。
【００５７】
「粉末」は、ナノ結晶(100nm未満)からサブミクロンの大きさの粉末〜薄片までの範囲の、抗菌性金属または貴金属の粒子を含ませるために、本明細書で使用する。本発明で使用する抗菌性金属または貴金属の粉末は、100μm未満、より好ましくは40μm未満、最も好ましくは10μm未満に、大きさを合わせることが好ましい。
【００５８】
「粒径」または「結晶径」は、抗菌性金属コーティングまたは粉末中の結晶の、最大寸法の大きさを意味する。
【００５９】
「親水コロイド」は、水およびポリオール(膨潤剤)の存在下で増粘性ゲルを形成することができる、合成的に調製されたかあるいは天然に存在するポリマーを意味する。膨潤剤は選択した親水コロイドを膨潤させて、ゲル相を形成することができなければならない。
【００６０】
「ヒドロゲル」は、湿気または水分を吸収または保持するために使用される、水または他の親水性の液体で膨潤させた親水コロイドを意味する。
【００６１】
「ゲル」は、このような目的に適した粘度である組成物、たとえば皮膚に施し保持することができる粘度である組成物を意味する。
【００６２】
本明細書および特許請求の範囲で使用すると、「ナノ結晶抗菌性金属」という語、および「ナノ結晶コーティングまたは粉末」などの類似の用語は、原子が無秩序で形成されナノ結晶の粒径を有する、抗菌性金属を指すことを意味する。
【００６３】
結晶形態の抗菌性金属Ag、Au、Pt、およびPdは、コーティングまたは粉末として調製することができ、あるいはコーティングまたは粉末を溶かすことによって溶液として調製することができる。結晶コーティングまたは粉末は、Burrell他の従来の特許出願中に公開された技法に従って、原子が無秩序で形成されることが最も好ましい。たとえば1993年11月25日に公開されたWO93/23092、1995年5月26日に公開されたWO95/13704、および1998年9月24日に公開されたWO98/41095を参照のこと。
【００６４】
過形成組織、腫瘍組織、または癌性病巣を治療するための薬剤調合物は、粉末、コーティングまたは溶液の形の、抗菌性金属または貴金属を使用する。粉末またはコーティングとしての抗菌性金属または貴金属の作製は、以下のA項で述べ、調合物の形態はB項で述べ、滅菌はC項、および調合、用量および治療はD項で述べる。
【００６５】
A.原子が無秩序である結晶形態の抗菌性金属の作製
a)包帯または他の支持体上の抗菌性金属のコーティング
包帯、またはパッキング、バイアル、織物、またはファイバーなどの他の支持体を、原子が無秩序で形成された抗菌性コーティングで覆うことができる。以下の記載は包帯材料のコーティングを対象とするものであるが、そのコーティング技法は、他の支持体上のコーティングに同様に適用される。本発明に従って抗菌性金属でコーティングされた包帯は、医療用包帯材料の1種または複数の層を含む。低温熱融合、スティッチ溶着、あるいは最も好ましくは超音波溶接などの知られている手段によって、多層を1つに貼り合わせることができる。
【００６６】
包帯を形成して、粘着テープまたはポリウレタンフィルムなどの密封または半密封層を含ませて、包帯を適切な位置で固定し、抗菌性金属(本明細書では以後は抗菌性金属種)のイオン、原子、分子またはクラスターを放出させるために湿気を保持させることができる。
【００６７】
包帯層の好ましい代替的な組成物、および好ましいナノ結晶抗菌性金属コーティングは、以下でさらに詳細に述べる。
【００６８】
i)包帯材料
流体をその中の一方向または両方向に浸透または拡散させることができる、穿孔材料、好ましくは非粘着性材料で、包帯を形成する。穿孔材料は、織布または不織布、好ましくは不織布、コットン、ガーゼなどの織物、ポリエチレン、ナイロン、ポリプロピレンまたはポリエステルなどのポリマー製ネットまたはメッシュ、ポリウレタンまたはポリブタジエンエラストマーなどのエラストマー、または連続気泡ポリウレタンフォームなどのフォームで形成することができる。包帯に有用な、例示的な穿孔非粘着性材料には、押し出し、エンボス加工、および延伸法を使用して、Applied Extrusion Technologies,Inc.of Middletown、Delaware、USAによって製造された、高密度ポリエチレンで形成された不織布ベールであるDELNETTM(商標)P530などの不織布メッシュがある。これと同じ製品が、Frass Survival Systems,Inc.、Bronx、New York、USAから、その会社のWound Dressing Roll(Non-Adherent)製品のサブセットとして、Exu-Dry CONFORMANT2(商標)Wound Veilとして入手可能である。他の有用な不織布メッシュには、Carolina Formed Fabrics Corp.から入手可能なCARELLE(商標)またはNYLON90(商標)、Winfield Laboratories,Inc.,of Richardson、Texas、USAから入手可能なN-TERFACE(商標)がある。例示的な織布メッシュは、繊維ガラスまたはアセテート、またはコットンガーゼから形成することができる。例示的な親水性ポリウレタンフォームは、W.R.Grace & Co.、New York、USAから入手可能なHYPOL(商標)である。
【００６９】
積層のための超音波溶接を容易にするために、少なくとも1つの包帯層は、超音波溶接しやすい、すなわち局所的な熱を加えると溶解し、次いで多層が冷却によって1つに融合する、ポリマー材料から形成されることが好ましい。
【００７０】
望むならば、冒された領域の隣に充分な水分を保持するために、吸収性材料から第2の吸収性層を形成して、抗菌性金属コーティングを活性化させる、すなわち抗菌性金属のイオン、分子、原子またはクラスターの放出を引き起こして、アポトーシス促進作用および抗MMP効果を引き起こせる。好ましくは、吸収性材料は、SONTARA(商標)8411、Dupont Canada、Mississauga、Ontario、Canadaから市販されている70/30レーヨン/ポリエステル配合物などの、吸収性の針で穴を開けた不織布レーヨン/ポリエステル心材である。この製品は、National Patent Medicalによって、American White Cross滅菌ガーゼパッドとして販売されている。しかしながら、他の適切な吸収性材料には、織布または不織布材料があり、レーヨン、ポリエステル、レーヨン/ポリエステル、ポリエステル/コットン、コットンおよびセルロースファイバーなどの繊維からできている不織布材料が好ましい。例示的なものは、クレープ状のセルロース製詰め綿、エアーレイドパルプ繊維のエアーフェルト、コットン、ガーゼ、および医療用包帯に適した他のよく知られている吸収性材料である。
【００７１】
包帯の第3の層を使用する場合は、第1の層に使用したのと同様の穿孔非粘着性材料で形成することが好ましい。滅菌水などの水分を浸透させることができ、これを加えて抗菌性金属コーティングを活性化させる。
【００７２】
医療用包帯ではよく知られているように、追加の層を第1、第2および第3の層の間または上に含ませることができる。コーティングした包帯層は、よく知られている方法で粘着層と組み合わせることができる。
【００７３】
包帯は単層として使用することができ、あるいは超音波溶接によって、包帯中の断続的な空間的位置で1つに貼り合わせた多層として使用することができる。超音波溶接は、キルティング分野では知られている技法である。簡潔に言うと、熱(超音波によって生じる)および圧力を、超音波ホーンを介して包帯の片側の局所に加えて、少なくとも1つのプラスチック材料を第1および第2の層に流れさせ、次に冷却によって層を1つに結合させる。溶接物は局所の円形スポットに現れ、直径0.5cm未満であることが好ましい。
【００７４】
空間的位置で層の超音波溶接を使用することは、包帯の適合性を保ちながら、包帯層の吸水性および水分浸透性を保つ利点がある。端部のシーミング、スティッチ溶着および接着は、包帯の1種または複数のこれらの望ましい性質を害する欠点がある。さらに、包帯中の断続的な位置で溶接物を配置することによって、層間剥離を引き起こすことなく、必要に応じて、包帯をさらに小さな大きさに切断することができる。溶接物間の約2.5cmという好ましい空間によって、貼り合わせた層を1つに保持するために少なくとも1つの溶接物を保ちながら、包帯を約2.5cmの大きさに切断することができる。
【００７５】
ii)抗菌性金属のナノ結晶コーティング
コーティングされた支持体、たとえば包帯は、1種または複数の抗菌性金属のナノ結晶コーティングを含むことが好ましい。コーティングは1種または複数の包帯層に施すが、少なくとも皮膚の対向層に施すことが最も好ましい。
【００７６】
ナノ結晶コーティングは、前述の手順に従って、以下に述べるWO93/23092、WO95/13704、およびW099/41095中に記載されたのと同様に、原子が無秩序で形成されることが最も好ましい。干渉色を生み出すために、以下に述べるように上部層および基層を有する、抗菌性金属の多層コーティングとして、コーティングが形成されることが最も好ましい。このようにして、コーティングは過形成組織、腫瘍組織、または癌性病巣を治療するための活性成分を与えるだけでなく、包帯の活性化の指標として作用もする。コーティングの上部層を、滅菌水またはエタノールなどの、アルコールまたは水系電解液で活性化させると、抗菌性金属がわずかなに溶解しただけでも検出可能な色の変化がもたらされ、コーティングが活性化されたことが示される。色の変化がない場合は、色の変化が検出されるまで、水を加えることによって追加的な水分を包帯に与えることができる。ひとたび活性化されると、必要な場合はたとえば滅菌水を加えることによって、包帯は湿気のある状態に保たれるはずである。
【００７７】
iii)干渉色を有する抗菌性金属の多層ナノ結晶コーティング
コーティングされた支持体、たとえば包帯は、その教示を参照によって本明細書に取り込んだW098/41095中に述べられたように、干渉色を生み出すように、少なくとも2つの金属層、基層、および基層の上にある上部層で形成された、抗菌性金属のコーティングを含むことができる。指標色は、水またはアルコール系電解質と接触すると、指標として機能することができる。なぜなら、コーティングが色を変えるからである。青い干渉色を有する例示的な銀の多層ナノ結晶コーティングを、実施例1で述べる。
【００７８】
iv)原子の無秩序を含む、抗菌性金属のナノ結晶コーティング
本発明のコーティングは、原子の無秩序を有する1種または複数の抗菌性金属から、結晶形態で形成されている。物理的真空蒸着技法による原子の無秩序の生成は、WO93/23092およびWO95/13704中に記載されており、以下で概説する。
【００７９】
抗菌性金属は、真空蒸着技法によって、包帯の1種または複数の表面上に薄い金属フィルムとして蒸着させる。当分野でよく知られている物理的真空蒸着技法はすべて、一般に支持体表面上の原子ごとに、蒸気から金属を蒸着させる。これらの技法は、真空またはアーク蒸着、スパッタリング、マグネトロンスパッタリング、およびイオンプレーティングを含む。前に定義したように、コーティング中に原子の無秩序を生み出すような方法で、蒸着を行う。原子の無秩序を生み出す原因である、さまざまな条件が有用である。一般にこれらの条件は、薄層フィルムの蒸着技法においては回避するように教示されている条件である。なぜなら、大部分の薄層フィルムの蒸着の目的は、欠陥のない、滑らかで高密度のフィルムを作製することだからである(たとえばJ.A.Thornton、「Influence of Apparatus Geometry and Deposition Conditions on the Structure and Topography of Thick Sputtered Coatings」J.Vac.Sci.Technol.、11(4)、666〜670、1974を参照のこと)。
【００８０】
蒸着プロセス中に原子の無秩序を生み出すために使用する、好ましい条件は以下のものを含む:
低い支持体温度、すなわち、支持体温度と金属の融点(絶対温度)の比が約0.5未満、より好ましくは約0.35未満、最も好ましくは約0.3未満であるような温度に、コーティングする表面を保つこと、場合によっては以下の片方または両方:
通常の操作ガス圧(すなわち操作ガスを使用しない蒸着における周囲圧力)より高い圧力、すなわち、真空蒸着:e-ビームまたはアーク蒸着に関しては0.001Pa(0.01mT)より大きく、ガス散乱蒸着(圧力プレーティング)または反応性アーク蒸着に関しては2.67Pa(20mT)より大きく、スパッタリングに関しては10Pa(75mT)より大きく、マグネトロンスパッタリングに関しては約1.33Pa(10mT)より大きく、およびイオンプレーティングに関しては約26.67Pa(200mT)より大きい;および
コーティングする表面のコーティングフラックスの入射角が、約75°未満、好ましくは約30°未満に保たれること。
【００８１】
経済的な理由のために、薄い金属フィルムは、適切な期間にわたって抗菌性金属種の持続的な放出をもたらし、望ましい干渉色を生み出すのに必要な厚さを超えない厚さを有している。前述の好ましい厚さの範囲内で、コーティング中の個々の金属(溶解度および耐磨耗性が異なる)、およびコーティング中の原子の無秩序の程度(したがってコーティングの溶解度)によって、厚さは変わるであろう。その目的とする利用に関して、コーティングがデバイスの寸法公差または柔軟性を害することがないほど、厚さは充分薄いであろう。
【００８２】
このようにして生成された物質の治療効果は、コーティングをアルコールまたは水系電解液と接触させ、これによって金属イオン、原子、分子またはクラスターを放出させると得られる。治療効果を生み出すのに必要とされる金属種の濃度は、金属ごとに変わるであろう。
【００８３】
コーティングから持続的に金属原子、イオン、分子またはクラスターの放出を得るための能力は、組成、構造、溶解度および厚さなどのコーティング特性、およびデバイスを使用する環境の質を含めた、いくつかの要因によって決定される。原子の無秩序のレベルが増大すると、単位時間当たりに放出される金属種の量が増大する。たとえば、マグネトロンスパッタリングによって、T/Tm0.5未満、操作ガス圧約0.93Pa(7mT)で蒸着させた金属銀フィルムは、類似条件下ではあるが、4Pa(30mT)で蒸着させたフィルムが、10日間にわたって放出すると思われる銀イオンの約1/3を放出する。中間構造(たとえば、低い圧力、小さな入射角など)で作製されたフィルムは、バイオアッセイによって決定される値の中間のAg放出値を有する。したがってこれによって、制御型放出金属コーティングを製造するための方法が提供される。徐放性コーティングは無秩序の度合いが低いように作製し、一方速放性コーティングは無秩序の度合いが高いように作製する。
【００８４】
連続的で均一なコーティングに関しては、完全に溶解するのに必要な時間は、フィルムの厚さとコーティングが曝される環境の質の関数であろう。厚さに関する関係はほぼ直線的であり、すなわちフィルムの厚さが2倍に増大すると、寿命の約2倍の増大がもたらされるであろう。
【００８５】
調節された構造を有する薄いフィルムコーティングを形成することによって、コーティングからの金属の放出を制御することも可能である。たとえば、蒸着時間の50%は操作ガス圧が低く(たとえば2Paすなわち15mT)、残りの時間は高い(たとえば4Paすなわち30mTorr)ように、マグネトロンスパッタリングによって蒸着させたコーティングでは、迅速な最初の金属イオンの放出、次に長期の徐放がある。この型のコーティングは、直接的抗菌性濃度、次に数週間にわたり金属イオンの濃度を維持するための低い放出速度を得るために、最初の迅速な放出が必要とされる、尿道カテーテルなどのデバイス上で非常に有効である。
【００８６】
真空蒸着中に使用する支持体温度は、コーティングの焼きなましまたは再結晶化が起こるほど低くてはならない。なぜならコーティングが、周囲温度、またはそれが使用される温度(たとえば体温)に温まるからである。この許容可能なΔT、蒸着中の支持体温度と使用する最終温度の間の差である温度は、金属ごとに変わるであろう。最も好ましい金属、Agに関しては、-20〜200℃の好ましい支持体温度、より好ましくは-10℃〜100℃を使用する。
【００８７】
抗菌性金属と異なる原子または分子を含む金属マトリックス中に、複合金属材料、すなわち1種または複数の抗菌性金属を含む材料を作製することによって、基層および上部層の片方または両方で、原子配列を得ることもできる。
【００８８】
複合材料を作製するための好ましい技法は、抗菌性金属と、Ta、Ti、Nb、Zn、V、Hf、Mo、Si、Alから選択される1種または複数の他の不活性、生体適合性金属、およびこれらの金属の合金、または他の金属元素、典型的には他の遷移金属の同時または一連の蒸着である。このような不活性金属は、抗菌性金属のそれと異なる原子半径を有しており、これが蒸着中に原子の無秩序をもたらす。この種の合金は、原子の拡散を減らすため働くこともでき、したがって無秩序構造を安定化させることもできる。それぞれの抗菌性金属および生体適合性金属用に配置するための、標的が多数である薄いフィルムの蒸着用装置を使用することが好ましい。層を連続的に蒸着させるとき、生体適合性金属の層は、たとえば抗菌性金属マトリックス中の集合体と同様に、不連続であるはずである。抗菌性金属と生体適合性金属の最終的な重量比は、約0.2より大きくなくてはならない。最も好ましい生体適合性金属は、Ti、Ta、ZnおよびNbである。1種または複数の抗菌性金属および/または1種または複数の生体適合性金属の酸化物、炭化物、窒化物、硫化物、ホウ化物、ハロゲン化物または水素化物から、抗菌性コーティングを形成して、望ましい原子の無秩序を得ることも可能である。
【００８９】
他の複合材料を、反応による同時または一連の蒸着よって、反応させる物質を抗菌性金属の薄いフィルムに蒸着させる、物理的真空蒸着技法よって、形成することができる。反応させる物質は、抗菌性金属および/または生体適合性金属の酸化物、窒化物、炭化物、ホウ化物、硫化物、水素化物またはハロゲン化物であり、適切な反応体、またはそれを含む気体(たとえば空気、酸素、水、窒素、水素、ホウ素、イオウ、ハロゲン)を蒸着チャンバーに注入することによって、in situで形成される。これらの気体の原子または分子を、金属フィルム中に吸収または捕獲して、原子の無秩序を生み出すこともできる。反応体は同時蒸着用に蒸着中に連続的に供給することができ、あるいは一連の蒸着をもたらすためにそれを律動的に送ることができる。反応生成物と抗菌性金属の最終的な重量比は、約0.05より大きくなくてはならない。空気、酸素、窒素および水素が特に好ましい反応体であり、酸素が最も好ましい。
【００９０】
複合コーティングを作製するための前述の蒸着技法は、前に論じた低い支持体温度、高い操作ガス圧および小さな入射角という条件と共に、あるいはこれらなしで使用することができる。コーティング中で生み出される原子の無秩序の量を保ち増大させるために、1種または複数のこれらの条件が好ましい。
【００９１】
最も好ましい複合コーティングは、前述の条件下、酸素を含む雰囲気中で銀をスパッタリングして形成し、酸素との複合コーティングとして銀のコーティングを形成する。
【００９２】
本発明の抗菌性コーティングで被覆した包帯は、以下に述べる方法で滅菌することができる。
【００９３】
b)原子的に無秩序である抗菌性金属の粉末
結晶粉末形の抗菌性金属または貴金属(Ag、Au、Pt、およびPdが特に好ましい)を、粉末状の支持体をコーティングすることによって、あるいは支持体上のコーティングから、自然放置粉末として作製することができ、次いでこれらをたとえばこすり取ることによって回収し、大きさを合わせる。粉末は真空蒸着、機械的操作、または圧縮によって、純粋な金属、金属合金、または金属酸化物または金属塩などの化合物として作製して、原子の無秩序を与えることができる。前述の技法に従って、Burrell他の従来の特許出願中に公開されたように、結晶粉末は原子が無秩序で形成される。たとえば1993年11月25日に公開されたWO93/23092、および1995年5月26日に公開されたWO95/13704を参照のこと。原子の無秩序は、コーティングに関して前述したように物理的真空蒸着中に金属粉末中で形成されるか、あるいは低温(すなわち、物質が再結晶化する温度より低い温度)条件下で、ミリング、グラインディング、つち打ち、モーターおよび乳棒または圧縮などによって無秩序を機械的に与えて、焼きなましまたは再結晶化が起こらないことを確実にすることが最も典型的であろう。
【００９４】
あるいは、不活性ガスを凝縮する技法によって粉末を形成することができ、Burrell他へのWO95/13704中に教示されたように、これを修正して生成する粉末中に原子の無秩序を与える。
【００９５】
抗菌性金属または貴金属の粉末は、コールドフィンガー、シリコンウエハ、固体プレート、回転シリンダ、ロールコーター中の連続ベルトなどの支持体への、あるいは知られているPVDコーター中のスチールコレクター上での、物理的真空蒸着(PVD)によって形成することが好ましい。ロールコーター中の連続ベルト、または他のいくつか他の移動または回転する支持体表面上でのスパッタリングによる、本発明の粉末の作製は非常に利点がある。なぜならこれによって、比較的低いコストで、比較的多量の自然放置粉末を早急かつ容易に与えることができるからである。ステンレス鋼ベルトはロールコーティング法において使用することができ、支持体に追加的な冷却を与える必要はない。したがって粉末またはコーティングをこすり取って粉末を形成し、過度に大きな粒子を回避するために大きさを合わせることができる。粉末はスクレーパーを用いて移動表面からこすり取り、コーティングを薄片または粉末の形で除去するのに充分な角度で、スクレーパーを移動表面に接触させる。コーティングは、移動表面からコーティングを順方向で切断するために角度調節したスクレーパーを用いて、あるいは表面上での逆方向の引っ張り作用により移動表面からコーティングを除去するスクレーパーを用いて、こすり取ることができる。スクレーパーはベルト上に吊るすか、あるいは重みを加えるかばねで止めて、移動表面からコーティングを除去するのに充分な圧力を加えることができる。連続ベルトと共に、スクレーパーをエンドローラー上に好都合に配置して、ベルトがエンドローラーを回り込むときに、逆方向の引っ張り作用によってコーティングを除去することができる。
【００９６】
あるいは、抗菌性金属または貴金属の粉末は、生体適合性であるか、あるいはそれ以外の場合は粉末の最終用途に適合した、粉末状支持体上で形成することができる。特に好ましい粉末状支持体は、親水コロイド、特にキチン質などの生体吸収性および/または吸湿性粉末である親水コロイドである。例示的な生体吸収性および/または吸湿性粉末は、以下のものから構成される:
合成生体吸収性ポリマー:たとえばポリエステル/ポリアクトン、ポリグリコール酸、グリコリド、乳酸、ラクチド、ジオキサノン、トリメチレンカルボネートなどのポリマーなど、ポリ無水物、ポリエステルアミド、ポリオルテオエステル、ポリホスファゼン、およびこれらのコポリマー、および関連ポリマーまたはモノマー。
天然由来のポリマー:
タンパク質:アルブミン、フィブリン、コラーゲン、エラスチン;
多糖類:キトサン、アルギン酸塩、ヒアルロン酸;および
生合成ポリエステル:3-ヒドロキシブチレートポリマー。
【００９７】
当分野で知られている任意の方法によって、医療用包帯または薬剤調合物中またはその上に、粉末を取り込ませることができる。たとえば、粉末を支持体(包帯または粉末)上で層状にする、包帯の繊維中に機械的に固定する、物理的な吹込みによって包帯に充満させる、あるいは局所用薬剤成分に加えることができる。
【００９８】
本発明の粉末は、100μm未満、より好ましくは40μm未満、最も好ましくは約3〜5μmの大きさに大きさを合わせることが好ましい。過形成組織、腫瘍組織、または癌性病巣の場所に直接施用するために、粉末は2μm未満、より好ましくは1μm未満に大きさを合わせることが好ましい。
【００９９】
B.投与用調合物
1.原子が無秩序で形成された抗菌性金属でコーティングされた被覆支持体は、前で充分に記載した。これらの技法を使用して、包帯、メッシュ、フィルム、濾過表面、フィルター、パッキングファイバー、バイアルまたは容器の内側などをコーティングすることができる。たとえば包帯の形である被覆支持体は、冒された領域に直接使用することができ、あるいはこれらを使用して、以下に述べるように、粉末、液体または他の調合物を生成させることができる。
【０１００】
2.原子が無秩序で形成された抗菌性金属の粉末は前で述べており、冒された領域に直接使用する形で、あるいは包帯、密封包帯、クリーム、液体などの他の調合物中に使用することができる。あるいは、溶解した抗菌性金属種を包む液体を生成させるために、フィルター、メッシュなどの液体用事前膜、ティーバッグ用浸出器などの内部中で、粉末を調合することができる。
【０１０１】
3.密封包帯は、たとえば治療する皮膚癌などの領域の外側を覆うシーリング材料を有する、湿性包帯を含んでよい。湿性包帯という語は、アルコールまたは水系電解液と接触すると抱水状態になる、非湿性包帯を含むことを意味する。密封包帯は、領域からの治療剤の損失を妨げ、領域の抱水を助長し、領域の温度を上昇させる。湿性包帯の例には、親水コロイド、ヒドロゲル、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリビニリデン、およびシロキサンまたはシリコーン包帯がある。湿性包帯は、本発明の抗菌性金属の溶液または粉末を充満させることができるか、あるいは本発明の抗菌性金属の局所用調合物と共に使用することができる。
【０１０２】
例示的な密封包帯は、銀を充満させた親水コロイド包帯である。あるいは、非充満状態の親水コロイド包帯を使用して、問題のある領域に置くナノ結晶銀を含むゲルを密封することができる。親水コロイドは、水およびポリオール(膨潤剤)の存在下で増粘性ゲルを形成することができる、合成的に作製されたかあるいは天然に存在するポリマーである。膨潤剤は、選択した親水コロイドを膨潤させてゲル相を形成することができる、親水性の液体である。親水コロイドは、以下のものを含む群から選択することができる:
i  代表的な天然の多糖類または合成的に改変された多糖類(たとえばセルロース、またはカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースなどのその誘導体、澱粉、グリコーゲン、ゼラチン、ペクチン、キトサンおよびキチン質;および
ii  藻類抽出物、種子抽出物、または植物滲出物からの代表的なゴム(たとえば、アラビアゴム、ローカストビーンゴム、カラヤゴム、トラガカントゴム、ガティゴム、アガーアガー、カラゲーニン、アルギン酸塩、イナゴマメゴム、グアーゴム、キサンタンゴム);および
iii  線状であるかあるいは架橋していてよい合成ポリマー(たとえば、N-ビニルラクタム、たとえばN-ビニル-2-ピロリドン、5-メチル-N-ビニル-2-ピロリドンから調製したポリマー)。
【０１０３】
親水コロイドは約0.1%〜20重量%、好ましくは1%〜10重量%の量で存在する。親水コロイドは、たとえば組成物の合計重量の1〜10%の範囲であってよい。あるいは親水コロイドは、その平均粒径が100μm未満、好ましくは50未満である、粉末の形であってよい。
【０１０４】
膨潤剤は非揮発性であり、使用中にゲルをゲルとして保ち、したがって親水コロイドの膨潤状態を保存することができなければならない。さまざまな非揮発性膨潤剤には、室温で液体であるポリオール(多価アルコールを含む)、グリセロールなど;室温で固体であるポリオール(多価アルコールを含む)、ソルビトール、エリトリトール、トレイトール、リボトール、アラビニトール、キシリトール、アリトール、タリトール、マニトール、グルシトール、グラクチトール、イジトール、ペンタエリトリトール、ヘプチトール、オクチトール、ノニトール、デシトール、およびドデシトールなど、室温で液体であるポリオールと配合させたもの;モノアンヒドロアルジトール(ストリルアクチノール、ポリアリトール、D-フルクトース、1,4アンヒドロ-D-マニトール、および1,4アンヒドロ-D-グルシトールなど)、室温で液体であるポリオールと配合させたもの;単糖類(ペントース、ヘクソース、およびヘプトースなど)、室温で液体であるポリオールと配合させたもの;および室温で液体であるポリオールと配合させたエーテルアルコールがある。
【０１０５】
親水コロイド包帯は、ポリウレタンフィルムの薄層、および親水コロイド組成物を含み包帯を領域に固定する接着性の接触層から構成されるウエハを含むことが多く、このポリウレタンフィルムは水および微生物は通さない。親水コロイド包帯は、膨潤剤を含む親水コロイドのゲルの形の組成物を、強力な感圧性接着剤に分散させることによって作製することができる。あるいは、ゲルと接着剤をラテックス溶液中で混合させることができる。あるいは代表的な製品、たとえばDuoDERM(商標)(ConvaTec Canada、555、Dr.Frederik Philips、Suite110、St-Laurent、Quebec、H4M 2×4);およびTegasorb(商標)(3MHealth Care、300 Tartan Drive、London、Ontario、Canada、N5V 4M9)が市販されている。親水コロイド包帯は、親水コロイド包帯の製造中に抗菌性金属の溶液または粉末を液体相に配合することによって、または抗菌性金属の粉末を散在させ、次いで親水コロイド包帯の表面に押し込めることによって、抗菌性金属の溶液または粉末で充満させることができる。さらに、親水コロイド包帯は、本発明の抗菌性金属の局所用調合物と共に使用することができる。施用時に、包帯の表面は、領域、たとえば皮膚からの水分または滲出物と、絶えず接触することによってゲル化する。銀などの抗菌性金属を取り込むことによって(0.01〜10重量%、好ましくは0.1〜1重量%)、水および微生物は通さないこと、および抗菌性金属によって仲介される抗菌性および抗炎症効果を示すことにおいて、包帯は有利である。
【０１０６】
4.粉末形の親水コロイドおよびヒドロゲルなどの、ゲル-ナノ結晶ゲルを、ゲル化剤と混合させたナノ結晶金属粉末から形成することができる。例示的なゲル化剤にはカルボキシメチルセルロース(CMC)、ポリビニルアルコール(PVA)、コラーゲン、ペクチン、ゼラチン、アガロース、キチン質、キトサン、およびアルギン酸塩があり、ゲル化剤は約0.01〜20%w/vの間で含まれる。
【０１０７】
5.クリーム、ローション、ペースト、軟膏、フォーム-抗菌性金属は、抗菌性金属のナノ結晶性粉末または溶液を用いて、たとえばエマルジョンとして調合したクリーム、ローション、ペースト、軟膏、またはフォーム中に、あるいは乾燥緩和剤と共に取り込ませることができる。軟膏およびクリームは、適切な増粘剤および/またはゲル化剤を加えることによって、水性または油性成分を用いて調合することができる。このような成分には水、および/または液体パラフィンなどの油、またはピーナッツ油またはヒマシ油などの植物油がある。例示的な成分は水である。成分の性質に従って使用することができる増粘剤には、ステアリン酸アルミニウム、硬化ラノリンなどがある。さらに、ローションは水性成分を用いて調合することができ、一般に以下の安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、着色剤、香料などの1種または複数も含むであろう。軟膏およびクリームは、賦形剤、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、およびタルクなど、またはこれらの混合物を含むこともできる。ローションは水性または油性成分を用いて調合することができ、一般に以下の安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、着色剤、香料などの1種または複数も含むであろう。フォームは、知られている発泡剤または界面活性剤を用いて形成することができる。
【０１０８】
6.液体-結晶形態の抗菌性金属は、抗菌性金属のナノ結晶コーティングまたは粉末を溶かすことによって、溶液、分散液または懸濁液として、たとえば膀胱、前立腺、肺、および肝臓などの体腔用の、局所用溶液、エアロゾル、ミスト、スプレー剤、滴下剤、および注入溶液として調合した液体中に、取り込ませることができる。抗菌性金属の皮膚への局所投与は、噴霧器によって生成させることができるエアロゾルによって、あるいは注入によって行うことができる。抗菌性金属は単独で、あるいは生理食塩水溶液、アルコール、水、またはDMSOなどの担体と共に投与することができる。抗菌性金属の有効な1日当たりの量は、対象によって変わるであろうが、治療効果を依然として与えながらの毒性未満の量であろう。
【０１０９】
抗菌性金属の溶液および調合物は、熟成と共にいくらか活性を失う可能性があり、したがって投与用に安定化させるか、あるいは新鮮に生成させる。あるいは、好都合な溶液生成用に、たとえばティーバッグ用浸出器として、抗菌性金属をパッケージすることができる。ナノ結晶金属が水またはアルコール系電解質と隔てられている、他の2部または2相系を、たとえば本明細書で述べる多成分キットの形で使用することができる。
【０１１０】
溶液中の抗菌性金属種の濃度は、適用例、調合物および対象によって変わるであろうが、一般には1〜5000μg/ml、より好ましくは20〜3000μg/ml、より好ましくは40〜800μg/ml、最も好ましくは50〜500μg/mlの範囲であろう。pH制御によって抗菌性金属の濃度が適切である液体を生成させる方法を、以下に述べる。
【０１１１】
7.経皮パッチ
経皮パッチによって、抗菌性金属の領域への制御された送達をもたらすことができる。たとえば、接着性パッチまたは接着性マトリックスパッチを、裏当て材、アクリレート接着剤などの接着剤から作製することができる。抗菌性金属の粉末または溶液を接着性キャスティング溶液に調合して、完全に混合させることができる。溶液は裏当て材に直接キャストし、キャスティング溶媒はオーブン中で蒸発させ、接着性フィルムは放置する。あるいは、ポリウレタンマトリックスパッチを使用して、抗菌性金属を領域に送達させることができる。このパッチの層は、裏当て材、ポリウレタン成分/相乗剤マトリックス、膜、接着剤、および剥離ライナーを含む。ポリウレタンマトリックスは、室温で硬化するポリウレタンプレポリマーを使用して作製する。水、アルコール、および薬剤をプレポリマーに加えることによって、裏当て材に直接キャストすることができる、粘着性である頑丈なエラストマーの形成がもたらされる。
【０１１２】
C.滅菌
原子が無秩序で形成された抗菌性金属のナノ結晶コーティングを有する包帯は、原子の無秩序を元の状態にし、それによって抗菌性金属種の有用な放出を低下させるかあるいは失くす可能性がある、過剰な熱エネルギーを加えずに、滅菌することが好ましい。WO95/13704で論じられたように、ガンマ線はこのような包帯を滅菌するのに好ましい。電子ビームおよびエチレンオキシド滅菌技法も、使用することができる。
【０１１３】
原子が無秩序である抗菌性金属から形成されたナノ結晶コーティングを有する、包帯の層を貼り合わせるために、超音波溶接を使用することが有利であることは理解されるはずである。なぜなら、それによって局所での結合が得られ、包帯のいかなる重要な部分にも熱を加えることが避けられ、したがって、原子の無秩序をアニーリングで消失させることによって、抗菌性金属の溶解度の有意な低下も避けられるからである。
【０１１４】
滅菌包帯、コーティング、粉末または調合物は、水分および光の浸透を制限するパッケージ、容器、またはキット中に密封して、抗菌性金属のさらなる酸化または還元を避けなければならない。ポリエステル製の可剥性小袋が好ましい。このように密封されたコーティングまたは粉末の貯蔵寿命は、1年を超える。
【０１１５】
D.調合、用量および処理
典型的には、ナノ結晶抗菌性金属は、活性成分、すなわち抗菌性金属のナノ結晶粉末またはコーティング、またはこのような粉末またはコーティングからの溶解種から、前述の1種または複数の形態で調合されるであろう。ナノ結晶抗菌性金属の包帯または粉末は、過形成組織、腫瘍組織、または癌性病巣に直接施すことができ、あるいはこれらは以下に述べるように調合することができる。個々の適用例および投与形に応じて、粉末の大きさは2μm未満、より好ましくは1μm未満に制御することができる。
【０１１６】
薬剤組成物中では、ナノ結晶金属粉末の量は、おおまかには約0.001重量%〜約30重量%の範囲であってよいが、より好ましくは約0.01〜10重量%の範囲、最も好ましくは約0.1〜5重量%の範囲に入るであろう。典型的なコーティングの厚さは、厚さ150〜3000nmの範囲である。厚さ10,000nmまでの厚いコーティングを使用して、抗菌性金属の粉末を生成させることができる。ナノ結晶抗菌性金属のコーティングは、患者に施用する所望の期間に応じて、非常に薄いか、あるいは厚くてよい。液体調合物に関しては、溶けている抗菌性金属の量は、典型的には約0.001〜10重量%、より好ましくは0.01〜1重量%の範囲であろう。
【０１１７】
活性成分以外に、薬剤組成物は、よく知られているように、局所的な施用に適した、非毒性で薬剤として許容可能な担体、希釈剤および賦形剤も含んでよい。たとえばMerck Index,Merck & Co.、Rahway、N.J.およびGilman他、(eds)(1996)Goodman and GilmanのThe Pharmacological Bases of Therapeutics、8th Ed.、Pergamon Pressを参照のこと。従来的な薬物の標準的な用量に関しては、たとえばPhysicians Desk Reference(1997 Edition);およびU.S.Pharmacopeia National Formulary(1995)United States Pharmacopeial Convention Inc.、Rockville、Marylandを参照のこと。
【０１１８】
ナノ結晶抗菌性金属の組成物を局所投与するための剤形には、局所に施用することができ、皮膚表面への分散および吸収さえも可能である、さまざまな混合物および組み合わせがある。この例には、スプレー剤、ミスト、エアロゾル、ローション、クリーム、溶液、ゲル、軟膏、ペースト、エマルジョン、フォームおよび懸濁液がある。活性化合物は、必要とされる可能性がある、薬剤として許容可能な担体、および任意の防腐剤、緩衝液、または推進剤と、滅菌条件下で混合させることができる。局所用調製物は、局所用の乾燥、液体クリームおよびエアロゾル調合物に一般的に使用される従来の薬剤として許容可能な担体を、抗菌性金属の粉末を組み合わせることによって調製することができる。軟膏およびクリームは、たとえば適切な増粘剤および/またはゲル化剤を加えることによって、水性または油性成分を用いて調合することができる。例示的な成分は水である。増粘剤は、成分の性質に従って使用することができる。ローションは水性成分を用いて調合することができ、一般に以下の安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、着色剤、香料などの1種または複数も含むであろう。粉末は、任意の適切な粉末成分、たとえばタルク、ラクトース澱粉などによって形成することができる。滴下剤は、水性成分または非水性成分を用いて調合することができ、1種または複数の分散剤、懸濁剤、可溶化剤、界面活性剤などを含むこともできる。
【０１１９】
軟膏、ペースト、クリームおよびゲルも、賦形剤、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、およびタルクなど、またはこれらの混合物を含むことができる。粉末およびスプレー剤も、賦形剤、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、およびケイ酸カルシウムなど、またはこれらの物質の混合物を含むことができる。ナノ結晶抗菌性金属の溶液は、エアロゾル薬剤を作製するために通常使用される任意の知られている手段によって、エアロゾルまたはスプレー剤に転換することができる。一般に、このような方法は、加圧すること、または通常は不活性担体ガスを用いて、溶液の容器を加圧するための手段を提供すること、および加圧したガスを小さなオリフィスに通すことを含む。スプレー剤は、窒素、二酸化炭素、アルゴンまたはネオンなどの不活性ガスなどの、通常の推進剤をさらに含むことができる。
【０１２０】
多数の不活性成分は、化粧的許容性を改善するために局所用調合物中に一般的に取り込まれており、これらは調合物中の任意選択の成分である。これらの成分は、治療上許容される形および量のみで含まれる。成分の例は、乳化剤、緩和剤、増粘剤、溶媒、水和または膨潤剤、香料、甘味剤、界面活性剤、着色剤、消泡剤であり、防腐剤、芳香剤、および充填剤、たとえばメチルパラベンおよびプロピルパラベンなどの防腐剤、粘着防止剤、シックナー、ヘパリンなどの抗凝結剤、β-グルカン、ホルモン、ヒアルロン酸なども、当分野でよく知られるように加えることができる。ポリビニルアルコールは特に好ましいゲル化ポリマーであり、粘着防止剤としても働き、メチルまたはプロピルパラベンは特に好ましい防腐剤である。これらの他の物質は、0.1〜5重量%の範囲の量で含まれてよい。
【０１２１】
界面活性剤または発泡剤を調合物に加えることができ、エアロゾルまたはフォームで施用するための液体調合物に加えて、皮膚上の皮膚病巣を治療するためなどに施用するためのフォーム、または呼吸器障害に施用するエアロゾルを形成するのに、非常に有利である。使用するために選択した界面活性剤は、ナノ結晶抗菌性金属のアポトーシス促進作用および抗MMP効果を実質的に害することがあってはならない。
【０１２２】
すべての作用物質は、意図する目的に関して非毒性であり生理学的に許容可能でなければならず、ナノ結晶抗菌性金属の活性を実質的に害して、アポトーシス促進作用および抗MMP効果に有害に影響を与えることがあってはならない。したがって成分は、治療上許容される量のみで含まれる。本発明の調合物中には、一般的に回避するか、少なくとも0.01重量%を超える量で制限するべき成分は、グリセリン、グリセロール、塩化物塩、アルデヒド、ケトン、長鎖アルコール、およびトリエタノールアミンである。
【０１２３】
活性成分の用量は、当業者によく知られている多くの要因、たとえば活性成分の個々の形、治療を行う条件、レシピエントである患者の年齢、体重、および臨床的条件、および治療を施す臨床医または開業医の経験および判断に依存する。治療上有効量のナノ結晶抗菌性金属によって、症状の主観的な軽減、または臨床医または他の資格者によって示される、客観的に認識可能な改善がもたらされる。用量範囲は、使用する金属、その形、投与の経路、および個々の化合物の強度と共に変わる。
【０１２４】
調合物が包帯の形であるとき、包帯を冒された領域(たとえば、皮膚上の皮膚病巣)上に置き、膜の水分の度合いに応じて、滅菌水、水道水、滲出物などの体液、またはたとえば70%エタノールの滴でさらに湿らせて、抗菌性金属または貴金属種を放出させるために、コーティングを活性化させることができる。次いで包帯を、粘着テープまたはポリウレタンフィルムなどの密封または半密封層を用いて、正しい位置に固定することができ、これによって包帯が湿った環境に保たれる。使用の際には、相対湿度100%で包帯を湿った状態に保つ。最初に滅菌水を加えて、抗菌性金属または貴金属コーティングを活性化させることが必要であり、次いで必要に応じて包帯を湿った状態に保つ。観察およびクリーニング用に、必要に応じて包帯を変えることができる。包帯は1日ごとに変えるのが好ましいが、さらに長く、3日間など放置することができると思われ、さらに長期間治療効果をもたらすことができる。
【０１２５】
他の形の調合物、密封包帯、ゲル、ペースト、軟膏、クリーム、エマルジョン、フォームおよび液体などを、安定した形に調製することができ、あるいはより好ましくは、たとえば多成分キットの形の1種または複数の相から新鮮に調製して、熟成を避け、抗菌性金属成分の治療上の有効性を最大にする。調合物は、相と組み合わせた約30日後以内に使用するのが最適である。使用時まで調合物の相を別々に保つための、適切なキットまたは容器はよく知られている。たとえば、粉末またはコーティングされた支持体の形である抗菌性金属は、使用時に混合するために、治療上許容可能な担体、およびおそらく他の成分と別々にパッケージすることができる。別のコーティングされた支持体は直接施用するための包帯またはパッチの形であってよく、あるいはバイアルまたは容器内部表面、メッシュ、またはフィルムのコーティングなどの、液体調合物などを生成させるための他の適切な形をとってよい。たとえば抗菌性金属は、使用時に液体調合物を生成させるために、「ティーバッグ」用浸出器または小袋中に供給することができる。ティーバッグ用浸出器は、呼吸器障害用のエアロゾルなどのいくつかの適用例に関する投与に有害である可能性がある、粉末の小さな粒子用のフィルターとして、小袋が働くことができる点で有利である。包帯、コーティングされた支持体、または粉末を含むキットは、水(および他の成分)などの滅菌担体を、別の容器中に投与に特異的な量で与えることができる。本明細書で使用するように、「キット」という語は、成分が別の容器中にあろうと混合されていようと、パッケージされた調合物を指すことを意味するものであり、したがって、たとえばすべての成分が混合されているチューブ中のゲル、または成分が互いに別々である任意の調合物も含むことができる。
【０１２６】
呼吸器障害用の調合物は、乾燥粉末吸入器中に乾燥粉末として送達することができ、あるいは定量噴霧式吸入器中に送達するための液体調合物、エアロゾル、ミストまたはスプレー剤の形に調合することができる。
【０１２７】
液体調合物に関しては、溶液中に溶ける抗菌性金属または貴金属の量を増大させるために、溶解中の溶液のpHを、二酸化炭素などの酸性化剤を用いて(これによって溶液中に炭酸が生じる)、pH6.5未満、より好ましくは3.5〜6.5の範囲に低下させることができる。このpH範囲は、原子の無秩序である銀から、85μg/ml〜370μg/mlという銀の濃度を典型的には生み出し、異なる所望の濃度に調整することができる。抗菌性金属の溶解によって、pHは典型的には6.5〜7.0に上昇するであろう。
【０１２８】
エアロゾルとしての投与によって、好ましくは大きさ10μm未満、より好ましくは大きさ5μm未満、最も好ましくは大きさ1〜3μm未満の飛沫が生成する。飛沫の大きさを制御することは、送達する用量を制御するため、および標的組織への送達を向上させるために重要であり、たとえばエアロゾルを口を通して吸入させる場合、約10μmの大きな飛沫は咽頭部に留まる傾向があるが、一方で小さな滴(たとえば、約1〜3μm)は、肺の肺胞領域に移動する傾向がある。したがって、必要とされる用量および標的組織に応じて、エアロゾルの飛沫の大きさを制御することが、重要である可能性がある。この点において、エアロゾルを生成させるために使用する機械的ミスト生成装置によって、少なくともある程度は、飛沫の大きさを制御することができることが見出されている。さらに、エアロゾルの飛沫の大きさは、溶液の表面張力を変えることによって、少なくともある程度は調整することができる。より詳細には、抗菌性金属の溶液は、典型的にはその溶媒として水を有しており、水は比較的大きな表面張力を有しているので、比較的小さな飛沫の大きさを有するエアロゾルを作製することは比較的容易である。界面活性剤を溶液に加えて、溶液の表面張力を低下させ、比較的大きな飛沫の大きさを有するエアロゾルを作製することができる。たとえば、このような界面活性剤は、アルキル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、リン脂質、たとえばレシチン、スフィンゴミエリンなどを含むことができる。
【０１２９】
適用例に応じて、抗菌性金属の粉末から作製した溶液は、有害な免疫応答または毒性効果を避けるために、2μmより大きい、より好ましくはlμm未満の(すなわちサブミクロン)粒子を含むことは避けなければならない。大きな粒子は、たとえば濾過によって除去することができる。粒子は液体中で形成することができ、たとえば濾過によって除去することができる。たとえば炭酸銀は、溶液を酸性化するために使用する炭酸との反応によって形成することができる。溶液に炭酸を希釈させることによって、粒子の生成を制限することもできる。
【０１３０】
エアロゾルは、抗菌性金属の液体溶液を機械的ミスト生成装置(たとえば噴霧器)に通過させることによって作製することができ、加圧パックによって(たとえば、バルブ測定した用量の二酸化炭素または他のガスなどの推進剤を用いて、手動式吸入器を介して)、あるいは、いくつか他の送達系(たとえば酸素テントなど)によって、直接施用することができる。
【０１３１】
本発明は、治療上有効量のナノ結晶抗菌性金属または貴金属粉末、またはナノ結晶抗菌性金属または貴金属に由来する溶液を、局所的に冒された領域、たとえば過形成組織、腫瘍組織、または癌性病巣に施す、局所用調合物として、あるいは医療用包帯のコーティングとして投与することによる、治療法を提供する。治療上有効な量は、in vitroまたはin vivoでの試験により、ナノ結晶抗菌性金属または貴金属を含む調合物を試験することによって、決定することができる。調合物は、1日に1回または複数回施用することができる。ナノ結晶抗菌性金属または貴金属でコーティングした包帯は、1日ごと、あるいはさらに頻繁に変えることができ、ナノ結晶金属のイオン、原子、分子またはクラスターを持続的に放出させるために、生理食塩水、アルコール、またはより好ましくは滅菌水を加えることによって、湿った状態に保たなければならない。
【０１３２】
したがって、過形成組織、腫瘍組織、または癌性病巣は、治療上有効なナノ結晶抗菌性金属または貴金属に由来する溶液を冒された領域に、たとえば吸入物または注入物として、体腔、たとえば膀胱に投与して、溶液を膀胱壁に直接接触させることによって、治療することができる。ナノ結晶抗菌性金属でコーティングした包帯または経皮パッチは、過形成組織、腫瘍組織、または癌性病巣と直接接触させて内的に、かつ皮膚病巣、たとえばメラノーマなどの皮膚癌に外的に施用することができる。
【実施例１】
【０１３３】
包帯上のナノ結晶性銀コーティングの作製
この実施例は、包帯材料上の二層のナノ結晶銀コーティングの作製を示す。高密度ポリエチレン包帯、DELNET(商標)またはCONFORMANT2(商標)を、銀系の層および銀/酸化物の上部層でコーティングして、指標値を有する着色抗菌性コーティングを生成させた。コーティング層は、表1に述べる条件下において、マグネトロンスパッタリングによって形成した。
【０１３４】
【表１】
2004529929.tif 000003
【０１３５】
生成したコーティングは、外見が青色であった。指先での接触は、黄色への色の変化を引き起こすのに充分であった。基層は厚さ約900nmであり、一方、上部層は厚さ約100nmであった。
【０１３６】
銀種がコーティング包帯から放出されたことを確証するために、阻止帯試験を行った。Mueller Hinton寒天をペトリ皿に分配した。Staphylococcus aureus ATCC No.25923の叢を接種する前に、寒天プレートは表面を乾燥させた。接種原は、Bactrol Discs(Difco,M.)から作製し、これは製造者の指示に従って再構築した。接種直後に、試験したコーティング材料を、寒天の表面上に置いた。これらの皿は、37℃で24時間インキュベートした。このインキュベーション時間の後に、阻止帯を計算した(補正された阻止帯=阻止帯-寒天と接している試験材料の直径)。この結果によって、約10mmという補正されたZOIが示され、銀種の充分な放出が実証された。
【０１３７】
コーティングを硝酸消化および原子吸収分析によって分析すると、高密度ポリエチレン1mg当たり0.24+/-0.04mgの銀を含んでいた。このコーティングは、二次イオン質量分光法に基づくと、無視できる程度の汚染物質を含む銀(＞97%)と酸素の二次合金であった。このコーティングは、SEMによって見られたように、非常に多孔質であり、10nmの平均粒径を有する目の粗い円柱形構造に編成された、等軸ナノ結晶からなっていた。水中での銀の放出試験によって、塊状の銀金属(溶解度1mg/L以下)から予想されるレベルより50〜100倍高いレベルである、約66mg/Lという平衡濃度(原子の吸収によって決定した)に達するまで、銀がコーティングから連続的に放出されたことが実証された。
【０１３８】
上部層に関するコーティング条件を変えてスパッタリング時間を2分15秒に延ばすことによって、黄色いコーティングが生成した。上部層は約140nmの厚さを有しており、指先での接触によって紫に色が変わった。同様に、スパッタリング時間を1分に短縮して、上部層の厚さを約65nmにすることによって、紫色のコーティングを生成させた。指先での接触によって、黄色への色の変化を引き起こした。
【０１３９】
三層の包帯を形成するために、このコーティングされた包帯材料の二層を、針で穴を開けたレーヨン/ポリエステル(SONTARA(商標)8411)から形成した、吸収コア材料の上または下に置いた。第1および第3の層上の銀コーティングに関しては、皮膚対向位置の青色コーティング側または銀側のいずれかで、包帯を使用することができる。指標値に関しては、青色コーティングを目に見える状態にすることが好ましいと思われる。3つの層を超音波溶接によって1つに貼り合わせて、包帯中に約2.5cm間隔で配置しているすべての3層の間に、溶接物を生成させた。これによって包帯を、少なくとも1つの溶接物を包帯の断片中に保ちながら、より小さな包帯に必要とされる約2.5cmという大きさの断片に切断することができた。
【０１４０】
コーティングされた包帯は、ガンマ線および25kGyの滅菌線量を使用して滅菌した。完成品である包帯は、密封されたポリエステル製の可剥性小袋中に個別にパッケージし、この形で1年を超える貯蔵寿命を示した。パッケージング前に、コーティングされた包帯を容易に切断して、5.1×10.2cm細片などの大きさのものを使用することができる。あるいは、患者または臨床医の指示によって、包帯をパッケージして、包帯をその大きさに切断することができる。
【０１４１】
追加的な銀コーティング包帯を、前述したものと同じ性質を有するコーティングを与えるための条件下において、完全規模のロールコーター中で作製した。それは以下の通りである:
i  包帯材料は、STRATEX,AET,8.0NP2-A/QWに貼り合わせた、前述の銀コーティングしたDELNETの第1の層を含んでおり、これはポリウレタンフィルム上の100%レーヨンの層である。
ii  銀フォーム包帯-前述のように作製した、高密度ポリエチレンでコーティングした銀の三層、二層はRynel Ltd.、Bootbay、Maine、USAから入手可能なポリウレタンフォーム、L-00562-6 Medical Foamに変えた。
【実施例２】
【０１４２】
原子の無秩序なナノ結晶性銀粉末の作製
ナノ結晶銀コーティングを、マグネトロンスパッタリング用ロールコーターのエンドレスステンレス鋼ベルト上に直接、またはベルト上のシリコンウエハ上に、酸素含有雰囲気中で銀をスパッタリングすることによって作製した。ベルトを冷却する必要はなかった。コーティングは、ベルトがエンドローラーを回り込むときに、吊るした金属スクレーパーを用いてベルトからこすり取った。コーティングされたシリコンウエハに関しては、ナイフの端でコーティングをこすり取った。スパッタリング条件は以下の通りであった:
【０１４３】
【表２】
2004529929.tif 000004
【０１４４】
粉末は2μm〜100μmの範囲の粒径、8〜10nm(すなわち、ナノ結晶)の粒子または結晶の大きさを有しており、正の浸漬電位が実証された。
【０１４５】
類似の原子の無秩序なナノ結晶銀粉末を、以前のBurrell他の特許中で教示された原子の無秩序を生み出すための条件下において、マグネトロンスパッタリングによって冷却したスチールコレクター上で、本明細書で前述したように形成した。
【実施例３】
【０１４６】
ゲルの作製
No.1
市販のカルボキシメチルセルロース/ペクチンゲルDuoDERM(商標)(ConvaTec Canada、555、Dr.Frederik Philips、Suite110、St-Laurent、Quebec、H4M 2×4)を、実施例3で述べたように作製したナノ結晶銀粉末と組み合わせて、0.1%の銀を含むゲルを作製した。Pseudomonas aeruginosaを使用して、ゲル中において以下のように、対数減少試験を行った。1つの環状細菌生物を5mLのトリプチカーゼ大豆寒天培地中に置き、それを3〜4時間インキュベートすることによって、接種原を作製した。次いで接種原(0.1mL)を0.1mLのゲルに加え、攪拌した(三連サンプル)。この混合物を1.5時間インキュベートした。次いで1.8mLのチオグリコール酸ナトリウム-生理食塩水(STS)溶液を試験管に加え、攪拌した。10-1〜10-7の一連の希釈液を作製した。それぞれの希釈液のアリコート0.1mLを、Mueller-Hinton寒天を含むペトリ皿に同様にプレーティングした。このプレートを48時間インキュベートし、次いでコロニーを計数した。生物の生存数を決定し、最初の接種原と比較した対数減少を計算した。この混合物の対数減少値は6.2であり、顕著な殺菌効果が示された。
【０１４７】
No.2
実施例1で述べたものと類似のマグネトロンスパッタリング条件を使用して、カルボキシメチルセルロース(CMC)繊維を直接コーティングして、原子の無秩序なナノ結晶銀コーティングを生成させた。次いでCMCを、2.9gを100mL体積に加えることによって、水中でゲル化させた。No.1の方法を使用して、この物質を試験した。この物質は、Pseudomonas aeruginosaの5.2という対数減少値を生み出し、このゲルに顕著な殺菌効果があったことが実証された。
【０１４８】
No.3
実施例1で述べたものと類似のマグネトロンスパッタリング条件を使用して、アルギン酸塩繊維状支持体を、原子の無秩序なナノ結晶銀コーティングで直接コーティングした。アルギン酸塩(5.7g)を100mL体積の水に加えて、ゲルを作製した。No.1の方法を使用して、この物質を試験した。この物質は、Pseudomonas aeruginosaの5.2という対数減少値を生み出し、このゲルに顕著な殺菌効果があったことが実証された。
【０１４９】
No.4
CMCおよびアルギン酸塩を含む市販のゲル(Purilinゲル、Coloplast)を、原子の無秩序なナノ結晶銀の粉末と混合させて、0.1%の銀を含む生成物を得た。これを前と同様に、Pseudomonas aeruginosaとStaphylococcus aureusの両方に関して試験した。このゲルに関する阻止帯のデータも、以下のように得た。接種原(Pseudomonas aeruginosaおよびStaphylococcus aureus)をNo.1と同様に調製し、この0.1mLをペトリ皿中のMueller-Hinton寒天培地の表面上に広げた。次いでペトリ皿の中心において寒天培地に6mmの穴をあけ、除去した。ウエルは0.1mLの銀含有ゲル、ムピロシン含有クリーム、またはムピロシン含有軟膏で満たした。次いでペトリ皿プレートを24時間インキュベートし、阻止帯の直径を測定し記録した。
【０１５０】
銀含有ゲルによって、Pseudomonas aeruginosaとStaphylococcus aureusの両方に対して9mmの阻止帯が生成し、一方ムピロシンクリームおよび軟膏によって、Staphylococcus aureusに対して42および48mmの領域、およびPseudomonas aeruginosaに対して0mmの領域が生成した。
【０１５１】
銀含有ゲルは、Pseudomonas aeruginosaおよびStaphylococcus aureusの性質を、それぞれ4.4および0.6という対数減少値だけ低下させ、優れた殺菌活性が示された。ムピロシンクリームおよび軟膏によって、Staphylococcus aureusおよびPseudomonas aeruginosaに対して、それぞれ0.4と0.8、および0.8と1.6という対数減少値が生じた。銀のゲルは、ムピロシン含有製品よりも優れた、殺菌効果と活性のスペクトルの両方を有していた。
【０１５２】
Nos.5〜10
Nos.5〜10に関する調合物を、表7に要約する。阻止帯はNo.4と同様に決定し、対数減少値はNo.1と同様に決定した。
【０１５３】
すべての調合物が、ムピロシン含有クリームまたは軟膏の形よりも、広範囲の活性のスペクトルおよび優れた殺菌効果を与えた。ムピロシンクリームによって、Staphylococcus aureusおよびPseudomonas aeruginosaに対して、それぞれ42および0という阻止帯、および0.4および0.8という対数減少値が生じた。
【０１５４】
【表３】
2004529929.tif 000005
【０１５５】
No.11
市販のゲル(グリセリルポリメタクリレート)を、実施例3のナノ結晶銀粉末と配合して、銀含有率が0.1%であるゲルを生成させた。このゲルをNos.5〜10と同様に試験し、Staphylococcus aureusとPseudoinonas aeruginosaの両方に対して、15mmという領域が生じることを見出した。1.7、および5を超える対数減少値が、Staphylococcus aureusおよびPseudonzonas aeruginosaに対して生じた。このゲル製品は、ムピロシンクリームまたは軟膏よりも、広範囲の活性のスペクトルを有していた。
【０１５６】
抗菌性効果に関する前述の調製物の試験を行って、これらのゲル中のナノ結晶銀などの抗菌性金属が、効果的に放出されることを確かめた。
【実施例４】
【０１５７】
ブタモデルにおける、抗菌性銀のアポトーシスおよびマトリックスメタロプロテイナーゼに対する影響
ブタモデルを使用して、原子が無秩序で形成された抗菌性金属、好ましくは銀の、アポトーシスおよびマトリックスメタロプロテイナーゼに対する影響を調べた。若くて商業用に生産された、特定の病原体を含まない飼育用のブタ(20〜25kg)を、これらの試験では使用した。任意の実験操作の前に、動物施設において1週間、これらの動物を条件付けした。典型的には、3匹の動物をそれぞれの実験で使用した。これらの動物には、抗生物質を自由に与えることなく、水およびブタ用のエサ(Unifeed(商標)、Calgary、Alberta)を与え、懸垂型のステンレス鋼製ケージ(5フィート×6フィート)中にそれぞれ収容し、1日12時間光を与える制御した環境中に保った。この試験はUniversity of Calgary Animal Care Committeeによって承認されたものであり、Canadian Council on Animal Careにより確立された指針に従って行った。
【０１５８】
抗菌性銀金属は、包帯の形態で投与した。この包帯は以下のものを含んでいた:
i)AB-ナノ結晶銀コーティングした包帯(実施例1で述べた、非フォーム、三層包帯)、吸収レーヨン/ポリエステル心材のいずれかの側に結合した、銀コーティングした高密度ポリエチレン(HDPE)の二層を含む;
ii)AgHDPE-AB包帯の吸収心材から感染予防的に離した、ナノ結晶銀コーティングしたHDPE層;
iii)対照-HDPEがナノ結晶銀でコーティングされていないこと以外は、AB包帯と同じ構造;
iv)ガーゼ-AB包帯の吸収レーヨン/ポリエステル心材;
v)cHDPE-対照包帯の吸収コアから感染予防的に除去した、非コーティング状態のHDPE;および
vi)SN-24μgの銀/1平方インチ(硝酸銀からのもの)を加えた、ガーゼ包帯の滅菌片。原子の吸収分析によって決定されたように、この銀の量は、24時間血清中に浸した1平方インチのAB包帯から放出される銀の量に等しい。
包帯(i)〜(iii)は、使用前にガンマ滅菌(25kGy)した。すべての包帯は、傷口に施用する前に滅菌水で湿らせた。いくつかの場合は、傷口を密封ポリウレタン(Tegaderm(商標)、3M Corp.、Minneapolis、MN)の層で覆った。
【０１５９】
Pseudomonas aeruginosa、Fusobacteriuna sp.、およびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌(CNS)(Culture Collection、University of Calgary、Calgary、Alberta)を含めた、細菌の3つの分離株を接種原に使用した。これらの細菌株を、手術の日の前に、適切な条件下で一晩増殖させた。手術の日の朝に、これらの生物を滅菌水で洗浄し、約107CFU/mLの最終濃度に再懸濁させた。水中で1:0.5:1(Pseudomonas:CNS:Fusobacterium)という比で、細菌を1つに混合した。それぞれの実験で作製した傷口を湿らせるために、充分な接種原を調製した。この手順によって、約8×104CFU/cm2で、最初に均一に傷口が汚染される結果となった。
【０１６０】
治療前に、10mg/kgのケタミン(Ketalean(商標)、MTC Pharmaceuticals、Cambridge、ON)および0.2mg/kgのアセプロマジン(Atravet(商標)、Ayerst Laboratories)の混合物を筋肉内注射することによって、動物に鎮静剤を与え、次に完全な麻酔をかけ、これは1〜2%のハロタン(MTC Pharmaceuticals)のマスク吸入によって誘導した。麻酔を誘導した後、それぞれの動物の上面および側面胸部および腹部を、#40 Oslerブレードを使用して留め、後に皮膚を非抗生物質石鹸でこすり、切開前に乾燥させた。
【０１６１】
典型的には動物に20個の全層性の傷口を与え、上面胸部の両側に10個与えた。これらの傷口は、2cm径のトレフィンを使用して作製した。次いでエピネリフィン溶液を傷口に施して、接種前に完全な恒常性を与えた。傷口は、細菌接種原に浸したガーゼスポンジでそれらを覆うことによって、汚染させた。湿ったスポンジは密封層で覆い、15分間放置した。いくつかの場合、次いで傷口をサンプル採取して、最初の接種原を決定した。任意の必要なサンプル採取の後に、接種原を適切な包帯で巻き、Elastoplast(商標)テープ(Smith & Nephew、Lachine、QC)で固定した密封層で覆った。必要に応じて、すべての動物に、麻酔による痛み用の薬剤(Torbugesic(商標)、Ayerst Laboratories、Montreal、QC、0.2mg/kg)を与えた。
【０１６２】
実験および対照群を、表4に要約する:
【０１６３】
【表４】
2004529929.tif 000006
【０１６４】
2cm径の円形である適切な包帯を、それぞれの傷口に施した。ブタ1に関しては、左側の傷口を硝酸銀で湿らせた(SN)ガーゼで巻き、一方、右側の対照の傷口には、水で湿らせたガーゼ包帯を与えた。ブタ2に関しては、左側の傷口を銀コーティングしたHDPE(AgHDPE)で巻き、一方、右側の対照の傷口には、非コーティングHDPE(cHDPE)を与えた。ブタ3に関しては、左側の傷口をAB包帯で巻き、一方、右側の対照の傷口には、賦形薬対照を与えた。これらの実験では、それぞれの傷口は、密封フィルム包帯(Tegadernm(商標)、3M Corp.、Minneapolis、MN)で個別に覆った。
【０１６５】
切開後のそれぞれの日に(5日まで)、それぞれの実験および対照群からの包帯材料を回収し、それぞれの群に集めた。次いでこれらの包帯材料を、グラスウールを含む円錐形の遠心分離チューブ中に置いた。チューブおよび中身を遠心分離にかけて、包帯からすべての液体を除去した。次いで、グラスウールを5-mLシリンジ中に置き、加圧して、6つのサンプルセットそれぞれから傷口からの体液を回収した。毎回本来の包帯の形式と同じ方法で、傷口を再度包帯した。密封包帯の下で回収した傷口からの体液も吸引し、分析用に保存した。それぞれの傷口から回収したのが少量であったために、同じ型の包帯を巻いた10個の傷口それぞれから回収した、体液を集めることが必要であった。傷口からの体液はすべて、分析するまで-80℃で保存した。
【０１６６】
酵素のザイモグラフィまたは活性アッセイの前に、傷口からの体液サンプルのタンパク質濃度を比較して、それぞれのサンプル中のタンパク質レベルが同等であることを確かめた。これらのサンプルを水に1:100で希釈し、BCA Protein Assay System(商標)(Pierce Chemical、Rockford、EL)を使用してアッセイした。標準曲線を、ウシ血清アルブミンの希釈液を使用して同時に作製した。傷口からの体液を水に希釈し、次いで等量のサンプル緩衝液(0.06MのTris-HCl、pH6.8;12%のSDS;10%のグリセロール;0.005%のブロモフェノールブルー)と混合させた。次いでサンプルを、0.1%のゼラチンを含む10%ポリアクリルアミド(BioRad、Mississauga、ON)ゲル上で、電気泳動にかけた。次いでタンパク質を、再生用緩衝液(2.5%Triton(商標)X-100)中で、37℃で90分間インキュベートした。酵素再生の後に、10mMの1,10フェナントロリンありまたは無しで、基質緩衝液(50mMのTri-HCl、pH7.8;5mMのCaCl2;200mMのNaCl;0.02%のBrij-35)中において、ゲルを一晩インキュベートした。その後ゲルを標準的なクーマシーブルー染色によって染色し、メタノール/酢酸中で脱色した。他に指示しない限り、化学物質はすべて、Sigma-Aldrich(Oakville、ON)から得たものである。
【０１６７】
傷口からの体液サンプルを、存在するタンパク質の合計量に関してアッセイした。これらの値は、30〜80mg/mLの間であった。個々の動物からのサンプルは非常に類似しており、集めた傷口からの体液中で10〜20mg/mLしか変わらなかった。
【０１６８】
i)全MMPの活性に関するアッセイ
傷口からの体液サンプルの全MMP活性を、希釈した傷口からの体液を、急冷した発光フルオレセイン結合基質(Enz,Chek DQ gelatin(商標)、Molecular Probes、Eugene、OR)と共に、約20時間インキュベートすることによって決定した。インキュベーションの後に、蛍光光度計中でサンプルを読み取った(励起l=480nm;発光l=520nm)。活性をコラゲナーゼ標準と、および実験した体液と対照の傷口からの体液と比較した。
【０１６９】
図1は、5日間にわたり異なる処理をした傷口部位からの、全MMPの活性の変化を示す。銀コーティングしたHDPE(AgHDPE)の結果は、銀コーティングした包帯(AB)を使用して得た結果とほぼ同じであった。同様に、ガーゼ、非コーティングHDPE(cHDPE)、および対照包帯によって、互いにほぼ同じ結果、傷口からの体液をそこから回収した密封下での未処理の傷口とほぼ同じ結果がもたらされた。対照、銀コーティングした包帯(AB)、銀コーティングしたHDPE(AgHDPE)、および硝酸銀で湿らせたガーゼ(SN)からの結果のみを、したがって示す。対照包帯からの傷口からの体液サンプルの全MMP活性は、最初の数日間は低かったが、その後劇的に上昇し、実験の間中は高く保たれた。同様に、硝酸銀で湿らせたガーゼ(SN)は、全MMP活性のほぼ同じパターンを示した。銀コーティングした包帯(AB)からの結果は、劇的に異なる結果をもたらした。MMP活性のレベルは実験の間中は安定して保たれ、高いレベルに上昇することはなかった。そうではなくて、そのレベルは、対照または硝酸銀で湿らせたガーゼ(SN)中で達した活性の最高レベルより約60%低いレベルに保たれた。
【０１７０】
ii)ゼラチナーゼの活性に関するアッセイ
ゼラチナーゼには、MMP-2(繊維芽細胞および非常にさまざまな他の細胞型によって分泌される)およびMAP-9(単核食細胞、好中球、角膜上皮細胞、腫瘍細胞、細胞栄養芽層およびケラチン生成細胞によって放出される)がある。ゼラチナーゼは、ゼラチン(変性コラーゲン)およびコラーゲンIV型(基底膜)を分解する。ザイモグラムを用いて、実験の間中MMP-9とMMP-2のレベルおよび活性の変化を調べた。
【０１７１】
対照および硝酸銀で湿らせたガーゼ(SN)に関するザイモグラムの結果は、同一であったようである。MMP-9のレベル、特に活性形MMP-9のレベルは、実験期間中低下した。銀コーティングした包帯(AB)は、対照より高い活性MMP-9のレベルを示した。第2日には、銀コーティングした包帯(AB)は、対照中より低い活性MMP-9のレベルを示した。第4日には、銀コーティングした包帯(AB)は、活性MMP-9をほとんど示さなかった。対照中では、潜在酵素の量は低下しているようであったが、一方で活性形MMP-9は、特に第4日までは増加した。
【０１７２】
実験の間中に、銀コーティングした包帯(AB)に関するMMP-2活性のレベルの、それほどの違いはなかった。しかしながら、第5日までに対照包帯中で、活性MMP-2のレベルの増大があった。いくつか他の同定されていないゼラチン分解酵素のレベルも、対照と比較して銀コーティングした包帯(AB)中で低下したことも観察された。
【０１７３】
iii)全プロテアーゼ活性のアッセイ
MMPにはタンパク質分解活性があるので、傷口からの体液サンプル中の全プロテアーゼ活性は、3mg/mLのアゾカゼインと共にサンプルを、0.05MのTris-HCl、pH7.5中において37℃24時間、インキュベートすることによって評価した。次いで未消化基質を、20%トリクロロ酢酸を加えることによって沈殿させた。次いで上澄みの吸光度を、分光光度計を使用して評価した。l=400nm。この吸光度を、ウシ膵臓トリプシンに関して作成した標準曲線と比較した。
【０１７４】
これらの結果は、前述の全MMPアッセイで得られた結果と並行する。対照および硝酸銀で湿らせたガーゼ(SN)に関する傷口からの体液サンプルは、第2日以降に活性の顕著な増大を示した(図2)。硝酸銀で湿らせたガーゼ(SN)からの傷口からの体液も、対照包帯の傷口からの体液と比較して、全プロテアーゼ活性の著しい増大を示した(図1)。しかしながら、銀コーティングした包帯(AB)の傷口からの体液中の、全プロテアーゼ活性は、実験期間中一定に保たれた。
【０１７５】
したがって抗菌性の銀は、全MMP活性の調節において有効であることが実証された。しかしながら硝酸銀は、施用の間の同じ時間(24時間)で銀コーティングした包帯(AB)から放出されると予想されたレベルと、Ag+濃度がほぼ同じレベルであるにもかかわらず、MMP活性の調節において有効ではなかった。この効果の違いの理由は、2つの銀調合物の固有の性質と関連がある可能性がある。硝酸銀の場合、銀を加えて、銀コーティングした包帯(AB)から放出されると予想されたのと同等なAg+の最終濃度がもたらされたが、Ag+イオンは一度に加えられた。したがって、傷口からの体液中の血清タンパク質および塩化物が、大部分のAg+を早急に不活性化させたであろうと予想される。銀コーティングした包帯(AB)の場合、安定状態の平衡を保つために銀が連続的に放出され、傷口中の銀の有効なレベルが長期間保たれる。
【０１７６】
iv)アポトーシス
細胞のアポトーシスの組織学的評価を行って、銀コーティングした包帯(AB)が、傷口中のアポトーシスに影響を与えたかどうかを決定した。
【０１７７】
ブタ組織の組織観察
傷口からの組織のサンプルを、第1日以外実験の間中毎日回収し、アポトーシスの証拠に関して調べた。サンプルはホルムアルデヒドが3.7%であるPBS中で24時間固定し、パラフィンで包埋し、厚さ5mmの切片に切断した。次いでサンプルをClearing Solvent(商標)(Stephan's Scientific、Riverdale、NJ)で脱蝋し、エタノール:水希釈系によって再水和した。これらの切片は、室温で30分間、10mMのTris-HCl(pH7.4)中で20mg/mLのプロテイナーゼK(Qiagen、Germantown、MD)を用いて処理した。
【０１７８】
末端デオキシヌクレオチジル転移酵素による、ニック端標識(TUNEL染色)を、In Situ Cell Death Detection POD Kit(商標)(Boehringer Mannheim、Indianapolis、IN)を使用して行った。この技法を使用すると、茶色に染まる細胞がアポトーシスによって除去される細胞である。内生ペルオキシダーゼを、過酸化水素が3%であるメタノールで、室温において10分間阻害し、次いで細胞を氷上で2分間、0.1%Triton(商標)X-100(0.1%クエン酸ナトリウムを溶かしたもの)で浸透処理した。浸透処理の後、サンプルを末端トランスフェラーゼ酵素溶液で処理し、加湿チャンバー中において37℃で60分間インキュベートした。標識後にサンプルを、1.0%Triton(商標)X-100で1回、PBSで2回洗浄した。切片を、加湿チャンバー中において37℃で30分間Converter-POD(商標)(Boehringer Mannheim、Indianapolis、IN)と共にインキュベートし、1.0%Triton(商標)X-100およびPBSによる洗浄を繰り返した。その後、サンプルを、DAB基質(Vector Laboratory Inc.、Burlingame、CA)と共に、室温で10分間インキュベートし、1.0%Triton(商標)X-100およびPBSで洗浄した。ヘマトキシリンによる核の対比染色液(Vector Laboratory Inc.、Burlingame、CA)を用いて10秒間、切片を対比染色することも必要であった。
【０１７９】
次いで作製したサンプルを、アポトーシスの証拠に関して光学顕微鏡によって観察する用意をした。陽性対照に関しては、浸透処理した切片を、DnaseIが100mg/mLであるPBSを用いて室温で10分間処理して、DNA鎖の断裂を誘導した。陰性対照に関しては、末端トランスフェラーゼ酵素、PODまたはDABをそれぞれの標識ステップの間に除去した。
【０１８０】
調べたすべてのサンプルにおいて、対照と硝酸銀で湿らせたガーゼ(SN)の間に、ほとんど違いはなかった。しかしながら、銀コーティングした包帯(AB)をした傷口では、細胞個体群の有意なアポトーシスが観察された。対照の傷口には、多数の多核白血球(PMN)および少数の繊維芽細胞が存在し、一方で銀コーティングした包帯(AB)をした傷口には、有意に増加した繊維芽細胞および少数のPMNが存在した。
【０１８１】
ブタ組織の組織病理採点
第1、4および7日に、前に記載したように動物に麻酔をかけた。傷口中央の生検試料を、滅菌した4mmの生検試料パンチによって回収した。組織を10%中性緩衝ホルマリン中に固定し、メタクリレート中に包埋し、切片状にした(厚さ2〜5mm)。これらの切片をLeeのメチレンブルーおよび塩基性フスシンで染色して、細胞の編成状態および細菌を示した。これらの処理を盲目生検した病理学者は、繊維芽細胞、PMNおよび細菌の存在に基づいて、以下のように切片を採点した:0=不在;+=少量、高出力の1視野当たり1〜5;++=適度、高出力の1視野当たり6〜20;+++=多量、高出力の1視野当たり21〜50;++++=非常に多量、高出力の1視野当たり50を超える(表5)。
【０１８２】
【表５】
2004529929.tif 000007
【０１８３】
生検サンプルを顕微鏡で観察することによって、湿潤した細胞型は対照と銀コーティングした包帯(AB)の間で著しく異なっていたことが明らかになった。対照の傷口は多数のPMNを特徴とし、一方で銀コーティングした包帯(AB)は多数の繊維芽細胞および単球を示した。銀コーティングした包帯(AB)をした傷口の繊維芽細胞の相対的な豊富さは、PMNおよび単球によって大部分が占められていた状態であった対照の傷口と比較して、第7日まで徐々に明白になった。この染色法によって、対照の傷口中では豊富であったが、銀コーティングした包帯(AB)をした傷口中には概して存在しなかった細菌も、染色することができた。
【０１８４】
したがって、ナノ結晶の抗菌性の銀で治療した傷口は、対照または硝酸銀包帯のいずれかで治療した傷口からの細胞より、広範囲のアポトーシスを示した。最初の2日間中、切開の後に、アポトーシスの最も顕著な増大を示した細胞型は、好中球であった。これによって、適度な好中球の存在、およびその結果MMPレベルが調節されることに関する理由の一部は、好中球のアポトーシスによるものであったことが示唆される。傷口が閉じるとアポトーシス細胞の数が増大すること、および、これは成熟した瘢痕組織の細胞充実度の低下と関連がある機構の、一部であることが示されている(Desmouliere,A.、Badid,C.、Bochaton-Piallat,M.andGabbiani,G.(1997)Apoptosis during wound healing,fibrocontractive diseases and vascular wall injury.Int.J.Biochem.Cell Biol.29:19〜30)。これらの結果によって、発生期の皮膚および表皮組織の成熟も、ナノ結晶抗菌性金属の存在によって加速される可能性があることが示唆される。これらの発見によって、ナノ結晶抗菌性金属によって誘導される治癒の促進は、局所的なMMP活性の低下、および傷口中の細胞のアポトーシスの発生率の増大と関連があることが示された。
【０１８５】
本明細書中で述べた刊行物はすべて、本発明が関係する当分野の技術者の技術の程度を示すものである。刊行物はすべて、それぞれ個々の刊行物が、参照によって取り込まれていることが具体的かつ個別に示されるのと同程度で、参照によって本明細書に取り込んである。
【０１８６】
本明細書中の用語および表現は、本明細書中で他に特に具体的に定義しなかった限りは、制限的ではなく記述的な用語として使用した。このような用語および表現を使用する際に、例示および記載した特徴の均等物を排除する意図はなく、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によってのみ定義され制限されることは理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１】銀コーティングした包帯(AB)、硝酸銀で湿らせたガーゼ(SN)、銀コーティングしたAgHDPE、および対照の包帯を巻いた傷口から回収した、傷口体液の切開後の各日のMMP活性を示すグラフである。
【図２】銀コーティングした包帯(AB)、硝酸銀で湿らせたガーゼ(SN包帯)、銀コーティングしたAgHDPE、および対照の包帯から回収した、傷口体液の5日間にわたる全プロテアーゼ活性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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