(57)【要約】本発明は百日咳及びパラ百日咳に対するワクチンで使用するためのポリペプチドを開示している。本発明のポリペプチドは百日咳菌パータクチンから誘導されるものである。好ましくは、本発明によるポリペプチドはパータクチンの領域１からの配列を含んでおり、特に１つ以上のＧＧＦＧＰあるいはＧＧＡＶＰ反復部分を含んでいる。あるいは本発明によるこれらポリペプチドは領域１又は２の一部あるいはすべてが欠失したパータクチン配列を含んでいる。本発明によるこれらポリペプチド類はヒト及び獣医学目的に有用な組成物内に組み入れられる。本発明はさらに本発明によるパータクチン誘導ポリペプチドに対する抗体を開示している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
百日咳菌パータクチンの「領域１」のアミノ酸配列の６−４０個の範囲の連続アミノ酸を含むポリペプチド、あるいは上記ポリペプチドの類縁体。
【請求項２】
前記ポリペプチドが百日咳菌パータクチンの「領域１」のアミノ酸配列の１０−１５個の範囲の連続アミノ酸残基か、上記ポリペプチドの類縁体で構成されていることを特徴とする請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
上記ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列の６−３６個の範囲の連続アミノ酸残基か、あるいは上記ポリペプチドの類縁体で構成されることを特徴とする請求項１記載のポリペプチド。
【請求項４】
上記ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列の１０−１５個の連続アミノ酸残基か、あるいは上記ポリペプチドの類縁体で構成されることを特徴とする請求項３記載のポリペプチド。
【請求項５】
そうした反復部分の総数が２−１０個の範囲である１つ以上の反復部分ＧＧＦＧＰ、あるいは１つの反復部分ＧＧＡＶＰの構成されているか、あるいは上記ポリペプチドの類縁体で構成されていることを特徴とする先行請求項のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項６】
上記ポリペプチドが、百日咳菌、パラ百日咳菌、あるいはその両方に対して、配列番号５のポリペプチドあるいはその類縁体によって提供される防御の少なくとも１０％に相当する防御を提供することを特徴とする先行請求項のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項７】
上記ポリペプチドが配列番号５のアミノ酸配列あるいはその類縁体で構成されていることを特徴とする先行請求項のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項８】
上記ポリペプチドが６−１００個の範囲のアミノ酸の長さを有していることを特徴とする先行請求項のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項９】
上記ポリペプチドが「領域１」又は「領域２」の一部である１つ以上のアミノ酸が取り除かれていることを特徴とするパータクチンのアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項１０】
上記ポリペプチドが「領域１」又は「領域２」が基本的に完全に取り除かれていることを特徴とする請求項９記載のポリペプチド。
【請求項１１】
上記ポリペプチドが配列番号５のアミノ酸配列、あるいは天然あるいは合成されたその類縁体あるいは変異体のアミノ酸配列を有しており、上記ポリペプチドがさらに、
（ａ）  ２６６−２９０の位置のアミノ酸残基のうちの少なくとも５つが除去されており、あるいは
（ｂ）  ５６９−６０３の位置のアミノ酸残基の少なくとも３つが除去されている
ことを特徴とする請求項９記載のポリペプチド。
【請求項１２】
上記ポリペプチドが、
（ａ）  ２６６−２９０の位置のアミノ酸残基のすべてが除去されているか、あるいは
（ｂ）  ５６９−６０３の位置のアミノ酸残基のすべてが除去されている
ことを特徴とするポリペプチド。
【請求項１３】
上記ポリペプチドが、
（ａ）  配列番号６の位置２６０と位置２９０の間のアミノ酸配列から、少なくとも１つの「ＧＧＡＶＰ」あるいは「ＧＧＦＧＰ」反復部分が序供されているか、あるいは
（ｂ）  配列番号６の位置５６９と位置６０３の間のアミノ酸配列から、少なくとも１つの「ＰＱＰ」モチーフが除去されている
ことを特徴とする請求項１１記載のポリペプチド。
【請求項１４】
上記ポリペプチドが、
（ａ）  すべての「ＧＧＡＶＰ」又は「ＧＧＦＧＰ」反復部分が除去されているか、あるいは
（ｂ）  すべての「ＰＱＰ」モチーフが除去されている
ことを特徴とする請求項１３記載のポリペプチド。
【請求項１５】
上記ポリペプチドが
（ａ）  位置２６６から位置２９０の配列；
（ｂ）  位置２７０から位置２８５の配列；
（ｃ）  位置５６９から位置６０３の配列；
（ｄ）  位置５７２から位置５９９の配列；
（ｅ）  位置５７５から位置５９６の配列；
（ｆ）  位置５７８から位置５９４の配列；
（ｇ）  位置５８１から位置５９１の配列；
（ｈ）  位置５８４から位置５８８の配列
で構成される群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つを欠失していることを特徴とする請求項１１記載のポリペプチド。
【請求項１６】
先行請求項のいずれか１項において定義されているポリペプチドを含む組成物において、それによって上記組成物が、
（ａ）  薬学的に許容される担体あるいは賦形剤と；
（ｂ）  免疫アジュバントと；
（ｃ）  さらに別の百日咳あるいはパラ百日咳抗原と；そして
（ｄ）  ヒトに投与されると、百日咳以外の１つ以上の感染性疾患からヒト又は動物を護る抗原
から構成される群から選択される１つ以上の成分を含んでいることを特徴とする組成物。
【請求項１７】
百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支腐敗菌、あるいはそれらと１つ以上のさらに別の哺乳動物感染症との組み合わせに対するワクチンの製造における請求項１−１５のいずれか１項によるポリペプチドの利用。
【請求項１８】
請求項１−１５のいずれか１項によるポリペプチドに対して発生される抗体。
【請求項１９】
請求項１に定義されている抗体を含み、それによって、上記組成物が
（ａ）  薬学的に許容される担体あるいは賦形剤と；
（ｂ）  免疫アジュバントと；
（ｃ）  さらに別の百日咳あるいはパラ百日咳抗原と；そして
（ｄ）  ヒトに投与されると、百日咳以外の１つ以上の感染症からヒトあるいは動物を防御する抗原
によって構成される群から選択される１つ以上の成分をさらに含んでいることを特徴とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、薬学及び／又は獣医学的目的のため、そして特に百日咳菌およびパラ（ｐａｒａ）百日咳菌（以下（パラ）百日咳菌と総称する）に対するワクチン調製に使用できるペプチド及びポリペプチド類に関するものである。本発明は又、そうしたペプチド類を含むワクチンと、ワクチン調製におけるそれらペプチド類の使用に関している。本発明はさらに、これらのペプチド類に対して発生する抗体とそれら抗体を含む医薬品組成物に関するものである。
【０００２】
（発明の背景）
百日咳（「ゼーゼーいう咳」）に対する従来のワクチンは百日咳菌の全細胞に基づいている。近年、これらのいわゆる「全細胞ワクチン」あるいは「ＷＣＶ」とは別に、線毛、線維状血球凝集素、百日咳毒素及び／又は「パータクチン」と呼ばれる百日咳菌の表面結合蛋白質などの百日咳菌から誘導される特殊な抗原を含むワクチンが開発されている。これらのいわゆる「無細胞ワクチン」あるいは「ＡＣＶ」はすでにいくつかの国では導入されている。
【０００３】
百日咳菌パータクチンの配列はすでに出版物で明らかにされている。（特にＣｈａｒｌｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９８９ Ｍａｙ， ８６（１０）： ３５５４−８及び以下に記載するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６参照）。パータクチンは約９２６のアミノ酸残基で構成される６９ｋＤの蛋白質であり、これはＸ線データからその蛋白質の生物学的活性に関係する配列モチーフを含むいくつかの突出ループを有するらせん構造を形成していることが知られている（Ｅｍｓｌｅｙ ａｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （１９９６） ３８１：９０−９２）。これらはホスト組織への癒着に関与するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）トリペプチド・モチーフ（アミノ酸２６０−２６２）を含むループと、主要免疫防御エピトープを含むカルボキシ末端近くの（ＰＱＰ）５モチーフを有するループを含んでいる（Ｃｈａｒｌｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９９１）２１：１１４７−１１５３）。
【０００４】
パータクチンが「ｐｒｎ」と呼ばれる遺伝子によってコードされる前駆体から形成されることも知られている。図１に図式的に示すこの遺伝子は「領域１」及び「領域２」と呼ばれる２つの領域で構成されている。（Ｍｏｏｉ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． （１９９８） ６６：６７０−６７５参照）。これらのうち、領域１はＲＧＤモチーフを側鎖しており、多数のＧＧｘｘＰ反復を含んでいるのに対して、領域２の方は上に述べた反復ＰＱＰモチーフを含んでいる。
【０００５】
ＷＣＶは百日咳菌感染防御において大きな成功を収め、現在でも有効であるが、米国、オランダ、カナダ、及びオーストラリアなど百日咳ワクチン接種の長い伝統を有する西側諸国でも百日咳再流行の兆しがある（Ｍｏｏｉ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． （１９９９）６７：３１３３−３１３４）。本発明者らはすでにこの現象に関する１つの説明として、特にパータクチンに関して、ワクチン菌株と広がっている菌株の間の抗原性の相違という説を提出している。
【０００６】
この説明を裏付けるものとして、本発明者らは、パータクチン前駆体をコードするｐｒｎ遺伝子が多形性であることも示している。現在までのところ、世界で広がっている百日咳菌で９つもの異なったパータクチン・タイプが確認されている。さらに、これらパータクチン・タイプ間の差は主に領域１に限定されており、領域１のＧＧｘｘＰ反復単位の欠失あるいは挿入をその内容としていることも示された。これについてもＭｏｏｉ ｅｔ ａｌ． （１９９８， １９９９、上記）及びＭａｓｔｒａｎｔｏｎｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ （１９９９） １４５：２０６９参照。
【０００７】
百日咳菌の他に、百日咳症例の約１−５パーセントはパラ百日咳菌（の菌株）によって起こされている。しかしながら、この点に関して、完全な百日咳菌パータクチンに基づくＡＣＶを含む百日咳菌抗原に基づくＡＣＶはパラ百日咳菌（の菌株）に対して十分な防御を与えない場合があることを示す一定の証拠がある。例えば、マウス・モデルでのテストは完全な百日咳菌パータクチンを用いた免疫化がパラ百日咳菌に対する防御とならないことを示している（Ｋｈｅｌｅｆ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． １９９３； ６１（２）； ４８６−９０）。従って、この新しい世代のＡＣＶの導入は将来パラ百日咳菌によって起こされる百日咳の相対的増加をもたらすかもしれない。現在用いられている百日咳ワクチンは広がりつつある異なった株の百日咳菌に対する防御を提供する上で等しく有効ではないかもしれない可能性があり、さらにパラ百日咳菌（の菌株）に対する防御を提供する上で有効ではない可能性があるので、百日咳ワクチンの長期間の有効性を保証するために、（パラ）百日咳菌に対する新しいワクチンとそうしたワクチンの調製に用いることができる抗原の開発に現在関心が集まっている。
【０００８】
（発明の説明）
従って、本発明の一般的な目的は、基本的にはすべての株の百日咳菌に対して、あるいは少なくとも基本的に、上に述べた国々、そして特に欧州で現在広がりつつあることが知られているすべての株の百日咳菌に対して免疫性を提供するために用いることができるワクチンを利用できるようにすることである。しかしながら、それらのワクチンが現在まで確認されていない及び／又は将来発生するかもしれない株なども含む（すべての）他の株の百日咳菌に対しても防御できるようにすることが好ましいであろう。最も好ましくは、そうしたワクチンはパラ百日咳菌（の株）に対しても防御を提供し、あるいは少なくとも百日咳菌抗原に基づく現世代のＡＣＶによって提供される防御よりは優れたパラ百日咳菌（の株）に対しての一定程度の防御となるようにすべきであろう。
【０００９】
具体的には、本発明の目的は、ヒト、好ましくは幼児、あるいはその他の哺乳動物に投与した場合に、例えば該ヒトあるいは哺乳動物において感染防御応答を発生させることによって（パラ）百日咳菌に対する防御を提供することができる医薬品及び／又は動物薬成分を提供することである。当業者には明らかなように、そうした成分は「ＤＴＰ」ワクチンなど周知の組み合わせワクチンなどを含む、ヒト及び動物の両方への適用のための、百日咳に対するワクチンの調製／製剤における抗原性成分として用いることができるであろう。
【００１０】
驚くべきことに、上記の目的が百日咳菌パータクチンの「領域１」から誘導されるペプチドを使用すること、そして具体的には、以下に述べるような「本発明によるペプチド」の使用によって達成できることが見出された。この発見が特に驚くべきであるのは、（例えば、ＷＣＶにおいては百日咳菌細胞上に存在しているような、あるいはＡＣＶで抗原として用いられているような）完全なパータクチン蛋白質の使用は実際には異なった株の百日咳菌に対して等しく有効であるようなワクチンはもたらさないのに対して、前記パータクチンから誘導される小さな蛋白質に基づくワクチンを用いるとそうした交差免疫が得られることが分かったからである。また、百日咳菌のパータクチンとパラ百日咳菌のパータクチンには違いがあるにも拘わらず、例えば本発明によるワクチンは現在の世代のＡＣＶによって提供される防御より優れた、パラ百日咳菌（の株）に対する少なくとも一定程度の防御を提供してくれることが期待される。
【００１１】
上に述べたように、これらの株の百日咳菌はその表面に発現されるような個々のパータクチン・タイプにおいて違っており、そしてこれら識別可能なタイプ間での相違は「領域１」、つまり、本発明で用いられるペプチド（類）が誘導される同じアミノ酸配列／エピトープに限定されているので、この発見は一層驚くべきことである。
【００１２】
感染やワクチン接種がパータクチンの立体配座に対して向けられた抗体の誘発をもたらしている可能性が考えられる。これとの関係で、領域１の立体配座に対して向けられたモノクローナル抗体がタイプ固有であるのに対して、線形エピトープを識別するモノクローナル抗体がすべての百日咳菌パータクチン変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）に結合したことは示唆的である。従って、交差免疫を防ぐために、バクテリアは立体配座エピトープにたいして免疫応答を示すメカニズムを進化させたのかも知れない。こうした理由説明を拡大すると、領域１から誘導されたペプチドをもちいてワクチン接種すると、それらは線形エピトープに向けられているので、交差防御性抗体を誘発するのかもしれないということも考えられる。あるいは又、百日咳菌パータクチンの立体配座エピトープに対して発生されるコンピュータとは対照的に、百日咳菌パータクチンの線形エピトープはパラ百日咳菌パータクチンに結合できるのかもしれない。
【００１３】
しかしながら、本発明は以下に説明するようなペプチドの有効性、あるいはこれらのペプチドがそれらの好適な交差免疫を提供する方法に関するいずれの説明付けあるいはいずれのメカニズムにも限定されない。
【００１４】
従って、第１の形態で、本発明は
（ａ）  百日咳菌の「領域１」のアミノ酸配列からの６−４０個の範囲、特に１０−１５個の範囲の連続アミノ酸残基を含み、そして
（ｂ）  ６−１００個の範囲のアミノ酸残基、好ましくは６−５０個の範囲のアミノ酸残基、そしてより好ましくは１０−４０個のアミノ酸残基を含む
ペプチドに関するものである。
【００１５】
具体的には、本発明は
（ａ）  配列番号１：
ＴＩＲＲＧＤＡＰＡＧＧＡＶＰＧＧＡＶＰＧＧＡＶＰＧＧＦＧＰＧＧＦＧＰＶＬ  （配列番号１）
のアミノ酸配列からの６−３６個の範囲、特に１０−１５個の範囲の連続アミノ酸残基で構成され、そして、
（ｂ）  全部で６−１００個の範囲のアミノ酸残基、好ましくは６−５０個の範囲のアミノ酸残基、より好ましくは１０−５０個の範囲のアミノ酸残基を含む
ペプチドに関するものである。
【００１６】
上記のペプチド類は以下において「本発明のペプチド類」とも呼ばれる。本明細書に具体的に記載されている上記およびその他のアミノ酸残基は標準的な「一文字アミノ酸コード」で記載されている。
【００１７】
通常、本発明のペプチド類は基本的には百日咳菌パータクチンの領域１のアミノ酸残基から誘導された／対応するアミノ酸残基だけで構成されており、従って、全部で６−４０個の範囲、好ましくは１０−１５個の範囲のアミノ酸残基を含んでいる。しかしながら、上の定義、及び以下の記述からも明らかなように、一定の範囲の追加的アミノ酸残基、例えば全部で１００個のアミノ酸残基、好ましくは５０個のアミノ酸残基の存在の可能性は排除されない。
【００１８】
これらの追加的アミノ酸残基は、例えば、領域１「外」に存在するパータクチンの配列の１つ以上のアミノ酸残基に対応しているかもしれない。例えば、これらはパータクチンの配列内で領域１（の配列）に隣接して存在しているアミノ酸残基、例えば、領域１（の配列）の直前及び／又は直後に存在する最初の２０個、より好ましくは１０個のアミノ酸残基であってもよい。
【００１９】
しかしながら、本発明は最も広い意味では、本明細書に述べられているさらなる必要条件が満たされる限り、存在していてもよい（つまり、領域１のアミノ酸に加えて）さらに別のアミノ酸残基に限定されるものではない。さらに、上に概述したように、内部に１つ以上のアミノ酸残基が挿入されているもの、あるいは１つ以上のアミノ酸残基が付加されているものなど本発明のペプチド類の「類縁体（ａｎａｌｏｇｕｅｓ）」も用いることができる。さらに、以下に述べるように、本発明のペプチド類はそれが天然に置いては（つまり、（ａ）天然のパータクチンにおいては）結合されない少なくとも１つのアミノ酸残基との蛋白質融合体として提供／使用することができる。
【００２０】
本発明は又、オプションとして少なくとも１つの薬学的に受け入れ可能な担体、賦形剤、あるいはアジュバントと組み合わせられた少なくとも１つの本発明による１つのペプチドで構成される組成物、好ましくは医薬品組成物、そして特にワクチンに関係している。そうしたワクチンは本明細書では「本発明のワクチン」とも呼ばれる。
【００２１】
別の形態で、本発明はワクチン製造、特に（パラ）百日咳菌に対する、そしてオプションとしては、ジフテリア、破傷風、ポリオ及び／又はヘモフィルス・インフルエンザｂ（「Ｈｉｂ」）などを含むヒトの１つ以上の感染性疾病に対するワクチン製造における本発明のペプチドの利用に関係している。
【００２２】
本発明は又、本発明のペプチドに対して固有の、あるいはそれに対して発生される抗体と、少なくとも１つのそうした抗体を含む、そしてオプションとしては少なくとも１つの薬学的に許容される担体、賦形剤、あるいはアジュバントと組み合わされた医薬品組成物に関するものである。
【００２３】
さらに別の形態で、本発明は少なくとも１つの本発明のペプチドを含む蛋白質融合体と、オプションとしては少なくとも１つの薬学的に許容される担体、賦形剤、あるいはアジュバントと組み合わされた少なくとも１つのそうした蛋白質融合体を含む医薬品組成物に関するものである。
【００２４】
好ましくは、本発明のペプチドは（以下に述べるような）適切な方法と適切な量でヒトに投与されると、前記ヒトの体内で免疫応答を誘発させることができる。より好ましくは、本発明のペプチドは、適切な方法と適切な量でヒトに投与されると、前記ヒトの体内で防御性免疫応答、特に前記ヒトを百日咳菌の感染、そして好ましくは（パラ）百日咳菌による感染から防御する免疫応答を引き出すことができる。さらに又、本発明のペプチドは好ましくは、適切な方法と適切な量でヒトに投与されると、前記ヒトの体内で「検出可能な免疫応答」を引き出すことができるようになっており、この場合「検出可能な免疫応答」とは通常少なくとも１つの検出可能な生物学的変化、特に前記ヒトの体内での少なくとも１つの検出可能な免疫性変化をもたらす免疫応答を意味する。例えば、そうした検出可能な免疫応答とは本発明のペプチド、（基本的には完全な）パータクチン、及び／又は（パラ）百日咳菌の（全細胞）に対する抗体の発生、あるいはその他の検出可能な及び／又は測定可能な免疫応答を含んでいる。本発明によるペプチドがそうした「防御的免疫応答」及び／又はそうした「検出可能な免疫応答」を提供できるかどうかは当業者には周知であり、以下の実施例で述べられる方法と基本的には同じ、あるいは基本的に類似したものである。例えば、そうした技術は、基本的に実施例のセクション２ｃで述べられているように、マウスやその他の適切な（哺乳）動物を本発明のペプチドで免疫化させて、そして次にそのペプチドに対して抗体が発生するかどうかを判定するステップを含むことができる。あるいは、本発明のペプチドによって免疫化された動物を成長可能な（パラ）百日咳菌細胞に露出させて、その後、例えば、基本的には実施例セクション２Ｄで述べるような方法で、気管及び／又は肺のコロニー化の程度を判定することで、その感染し易さを免疫化されなかった動物のそれと比較するようにしてもよい。特に好ましいのは、そうしたテストで、例えば、（例えば実施例のセクション２ｃで基本的に述べられているような方法で判定されるなど）発生された抗体の力価によって、及び／又は（実施例のセクション２Ｄに基本的に述べられているような方法で判定するなど）与えられた感染に対する防御の程度によって判定した場合に、上に述べた配列番号５によって提供される防御の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、そしてさらに好ましくは少なくとも７０％を提供できるような本発明のペプチド類である。
【００２５】
本発明のペプチド類は通常１つ以上のＧＧＦＧＰ及び／又は１つ以上のＧＧＡＶＰ反復部分を含んでおり、そうした反復部分の総数は２−１０個の範囲である。例えば、そうした本発明の好ましいペプチド類は以下のようなものなどである。
−ＧＧＦＧＰ−ＧＧＦＧＰ                （配列番号２）
−ＧＧＡＶＰ−ＧＧＡＶＰ                （配列番号３）
−ＧＧＡＶＰ−ＧＧＡＶＰ−ＧＧＦＧＰ−ＧＧＦＧＰ  （配列番号４）
本発明において最も好ましいのは配列番号５のペプチド：
−ＧＧＡＶＰＧＧＦＧＰＧＧＦＧＰ            （配列番号５）
である。
【００２６】
上に述べた本発明のペプチドの他に、本発明はそうしたペプチド類の類縁体（の利用）もその内容としており、それは、上に述べたような、最大で８個、好ましくは最大で４個、より好ましくは最大で２個、そしてさらに好ましくは唯１つのアミノ酸残基が欠失、取替え、付加及び／又は置換されている本発明のペプチドを意味している。そうした類縁体でのアミノ酸置換は好ましくは同類アミノ酸置換である。同類アミノ酸置換とは同様の側鎖を有する残基の互換性を意味している。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸グループはグリシン、アラニン、バリン、ロイキン、そしてイソロイキンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸グループはセリン及びトレオニンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸グループはフェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸グループはリシン、アルギニン、及びヒスチジンであり；そして硫黄含有側鎖を有するアミノ酸グループはシステイン及びメチオニンである。従って、同類アミノ酸置換とは任意のグループのアミノ酸が同じグループの別のアミノ酸によって置き換えられる置換である。好ましい同類アミノ酸置換は：バリン−ロイキン−イソロイキン、エニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、そしてアスパラギン−グルタミンである。
【００２７】
好ましくは、上記類縁体は、適切な方法及び適切な量でヒトに投与されると、前記ヒトの体内で免疫応答を発生／誘発できるようなものである。より好ましくは、上記類縁体は、適切な方法及び適切な量でヒトに投与されると、上に述べたような技術の１つあるいは複数のものを用いて判定した場合に上記ヒトの体内で防御性免疫応答、特に百日咳菌による感染症、そして好ましくはパラ百日咳菌による感染症に対してもそのヒトを防御する免疫応答を誘発することができるようなものである。また、上記類縁体は好ましくは、適切な方法及び適切な量でヒトに投与されると、前記ヒトの体内で、上に述べた１つあるいは複数の手法を用いて判定した場合に、使用される特定の類縁体に対する抗体に対する発生も含めて「検出可能な免疫応答」を発生させる。具体的に好ましいのは上に述べた本発明のペプチド類の類縁体である。特に好ましいのは配列番号５のペプチドの類縁体である。以下にさらに詳しく述べるように、上に定義した類縁体は特に注記がない場合、「本発明のペプチド類」の範囲に含まれるものとみなされる。また、本発明のペプチド類及び／又はその類縁体は薬学的に許容される塩の形態で（用いることが可能で）あり、そして、そうした塩も本明細書で以下に用いられる「本発明のペプチド類」の範囲に含まれるものとみなされる。
【００２８】
本発明によるペプチドは周知の方法で提供することができ、例えば、保護アミノ酸、カルボイミド化学及び／又は自動装置を用いて行われるＦｍｏｃ化学の使用を伴うペプチド合成技術を介して周知の方法で製造することができる。その他の技術としては、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８５，２１４９ （１９６３）に述べられているような固相ペプチド合成などがある。これら及びその他の技術は当業者には周知であろうし及び／又は、標準的な手引書にも述べられている。
【００２９】
本発明のペプチド類は医薬品組成物、そして特にワクチンの製造に用いることができる。より具体的には、本発明のペプチドは（パラ）百日咳菌による感染からヒトを防御することを意図したワクチンの製造に使用することができる。これらは百日咳だけを防御するように意図されたワクチン（つまり、いわゆる「一価」あるいは「一成分」ワクチン）であってもよいし、百日咳と、ジフテリア、破傷風、ポリオ及び／又はＥｉｂなどを含む百日咳以外の少なくとも１つの感染症から護るように意図された組み合わせワクチン（つまり、いわゆる「多価」あるいは「多成分」ワクチン）であってもよい。そうした「組み合わせワクチン」の実例は当業者に明らかであり、例えば、ＤＴＰａワクチンなどを含んでいる。（そうした（組み合わせ）ワクチンが幼児及び児童を免疫化／護るためにしばしば用いられることも当業者には明らかであろう。従って、本明細書で用いられる場合、「ヒト」とは特定の年齢層に限定されている訳ではないが、特に幼児と児童を含んでいる。
【００３０】
本発明のペプチド類あるいはワクチンは一般的にはヒトにおいて免疫応答、好ましくは上に述べたような検出可能は免疫応答、そして最も好ましくは防御性免疫応答を誘発する量と処方に従って投与される。そうした処方は、１回の投与あるいは２回以上の投与、例えば１回以上のプライミング予防接種とそれに続いて行われる１回以上のブースター接種のステップを含むことができる。適切な処方は当業者には明らかであり、基本的には百日咳に対する公知のワクチンで、及び／又は周知の組み合わせワクチンで現在用いられている処方と同じであってよい。通常、本発明のペプチドは１回の投与あたり１−１００μｇの範囲の量、さらに好ましくは４−２０μｇの量で投与される。従って、適切な処方は、例えば、１回あたり本発明のペプチド１０μｇを用いてプライミング接種、それに続いて２、３、４及び１１ヶ月後に同じ用量で行われるさらなるプライミング予防接種、そして４年後に行われる同じ用量を用いてブースター投与のステップを含んでいる。本発明のペプチド類、あるいはワクチンは周知のいずれの適切な方法、例えば、経口投与、皮下、筋肉内、腹膜内、静脈注射、あるいは呼吸器系を通じて投与することができ、当業者によく知られているように、筋肉内注射が特に好ましい。
【００３１】
本発明によるワクチンは通常意図されている投与ルートに依存するいずれかの周知の方法で、オプションとしては１つ以上の薬学的に受け入れ可能な担体、賦形剤あるいはアジュバントを用いて製剤することができる。通常、本発明のワクチンは上記ペプチド（類）の水あるいは生理学的に受け入れ可能な緩衝液又は溶液内での溶液あるいは懸濁液など、注射用に意図された及び／又はそれに適した形状で製剤化することができる。この点で、本発明のペプチド類の利用はそうしたワクチンを、例えば、乾燥あるいは冷凍乾燥した粉末の形状で、例えば水や生理学的に受け入れ可能な緩衝液又は溶液で再構成して注射に適した製剤を提供するために用いることもできる。
【００３２】
本発明のワクチンは、アンプル、ビン又はフラスコなどの適切な保持装置あるいは容器内、オプションとしては製品情報を含むリーフレットと組み合わせで適切に封入することができる。一般的には、本発明のワクチンは本発明のペプチド（類）を１μｇ−１００μｇの量、そして好ましくは４μｇ−２０μｇの量で、通常単位用量の形状で含んでいる。本発明のワクチンはリン酸アルミニウム及び／又は水酸化アルミニウムなど、ワクチン内での使用に許容される１つ以上の免疫アジュバントも含んでいる。これらは周知の適切な量、例えば、周知のＡＣＶ製剤で知られている量で用いることができる。又、本発明のペプチドはマルトース結合蛋白質、破傷風トキソイド、あるいはその他の担体や免疫調節及び／又は免疫刺激基などの機能性残基に接合、（供給結合で）結合、あるいはその他の方法で取り付けることができる。さらに、本発明のワクチンは百日咳トキソイド、線維状血球凝集素、血清型２線毛及び／又は血清型２線毛を、例えば、無細胞ワクチンなどに対して知られている量で含んでいてもよい。またさらに、上に述べたような組み合わせワクチンを提供するために、本発明のワクチンは適切な量でヒトに投与されると、百日咳以外の、例えばジフテリア、破傷風、ポリオ及び／又はヘモフィルス・インフルエンザｂなどの少なくとも１つの（感染性）疾患に対して前記ヒトを防御することができる１つ以上のさらに別の薬学的に許容される成分を含んでいてもよい。通常、そうした成分は例えば：
−ジフテリア・トキソイドなどのジフテリアに対する防御を提供する抗原；
−百日咳トキソイドなど破傷風に対する防御を提供する抗原；
−非活性化されたポリオ・ウィルスに対する防御を提供する抗原；
−ヘモフィルス・インフルエンザｂに対する防御を提供する抗原；
あるいはそれらの適切な組み合わせなどを含む周知の適切な抗原である。しかしながら、現在の適用の優先日後に利用できるようになるいずれの適切な抗原（類）も用いることができる。そうした別の抗原は通常、（例えば本発明のワクチンに関して上に述べたような）適切な処方に従ってヒトに投与すると、前記ヒトの体内で免疫応答、特に意図された疾病に対する防御性免疫応答及び／又は検出可能な免疫応答を発生／誘発させる量で用いられる。各具体的抗原の対する適切な量は当業者には明らかであり、通常、周知のワクチンで通常用いられる量に対応する。いくつかの好ましい、しかし非限定的な本発明の組み合わせワクチンは、例えば、２つ異常の以下の成分を示されている量で含んでいる。
−本発明のペプチド                    ４μｇ−２０μｇの範囲
−破傷風トキソイド                    ５μｇ−５０μｇ
−線維状血球凝集素                    ５μｇ−５０μｇ
−血清型２線毛                        ２．５μｇ−５０μｇ
−血清型３線毛                        ２．５μｇ−５０μｇ
−ジフテリア・トキソイド              ５μｇ−５０μｇ
−破傷風トキソイド                    ５μｇ−５０μｇ、及び／又は
−Ｈｉｂ（ヘモフィルス・インフルエンザ・タイプｂ）
２μｇ−１０μｇ多糖類
（ＲＰＲ：ポリ−リボシル・リビトイル・ホスフェート）
この場合も、本発明のこうした組み合わせワクチンは上に述べたような周知の方法で製剤あるいは投与することができる。より具体的には、本発明によるペプチド（類）は知られているＷＣＶ内の全細胞百日咳菌と置換するために、及び／又は周知のＡＣＶ内で現在用いられている（基本的に）完全なパータクチンなどを含む百日咳抗原の一部あるいは百日咳と置換するために用いることができる。しかしながら、本発明の小さな抗原性ペプチドが新しいタイプの百日咳ワクチン及び／又は百日咳ワクチンの製剤及び／又は投与のための新しい方法をもたらすことも考えられる。
【００３３】
上に述べたように、本発明によるペプチド類あるいはワクチンは現在利用されている百日咳抗原及びワクチンと比較して、それらが、以下の実施例で用いられる百日咳菌の（少なくとも）異なった菌株に対する免疫性を、前記菌株の表面に結合したパータクチン蛋白質間の違いにもかかわらず、つまり、前記菌株間でのペタ・コードｐｒｎ遺伝子多形性によって提供することができるという利点を有している。より広い意味では、本発明のペプチド類は現在広がりつつある百日咳菌のすべての（他の）菌株、および未だ識別されていない及び／又は将来発生してくる可能性があるいずれの菌株に対する免疫を提供するために用いることができ、そしてパラ百日咳菌（の菌株）に対する防御も提供してくれる可能性がある。さらに、小さな抗原性ペプチドの利用は、現在利用されている全細胞及び／又は抗原性成分の利用と比較して、ワクチンのより増強された安定性も提供してくれる可能性がある。
本発明のペプチド類のその他の可能な利用方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ及び／又は生物学的アッセイでの利用などがある。
【００３４】
さらに別の形態で、本発明は本発明のペプチドが天然のパータクチンで自然に結合している（あるいは結合することができる）アミノ酸配列とは違った少なくとも１つの別のアミノ酸配列に結語した少なくとも１つの本発明のペプチドを含んだ（蛋白質）融合体に関している。こうした別の蛋白質配列はオプションとして抗原性のものであってよいし、及び／又は（パラ）百日咳菌及び／又は別の感染性疾病に対する（防御的）免疫性を提供するために１つ以上の別の（抗原性）エピトープを含んでいてもよく、さらには免疫調節性及び／又は免疫刺激性アミノ酸配列であってもよい。
【００３５】
こうした融合体は、例えば用いられる宿主生物内で操作可能な適切なプロモータの制御下で、その適切な宿主生物内でそうした融合体をコードするヌクレオチド配列を発現させ、次に、上記宿主生物及び／又は培地からその融合体を単離／精製するなどの周知の方法で提供することができる。宿主生物内でそれを（非相同）発現するためにそうした融合体をコードするヌクレオチド配列、（大腸菌や（パラ）百日咳菌など）適切な宿主生物及びその内部で操作可能な（ＲＮＡポリメラーゼ・プロモータ、ｌａｃプロモータ、あるいはＯｍｐ又は線維状血球凝集素用のプロモータなどの（パラ）百日咳菌から誘導されたプロモータなどの）プロモータを提供する技術、及び上記のように発現された融合体を単離する技術は当業者には明らかであろう。好ましくは、そうした融合体は適切な方法と適切な量でヒトに投与されると、前記ヒトの体内で（百日咳菌、そして好ましくはパラ百日咳菌による感染に対しても）防御的な免疫応答及び／又は上に述べたような検出可能な免疫応答を発生／誘発させることができるものである。
上に述べた融合体は医薬品組成物、として特に、（パラ）百日咳菌に対するワクチンの製造において、特に本発明のペプチド類に関して上に述べたのと基本的に同様の方法で用いることができる。
【００３６】
別の形態で、本発明は本発明のペプチドに向けられた／あるいはそれに対して発生された抗体に関している。本明細書で用いられる場合、抗体という用語は特にポリクローナル、モノクローナル、キメラ性及び単鎖抗体、及びフラグメント（Ｆａｂ、Ｆｖ、及びＦａ）と、Ｆａｂ発現ライブラリなどを含んでいる。さらに、例えばＷＯ９８／４９３０６で述べられているように「ヒト化された」抗体を用いることもできる。こうした抗体はＷＯ９５／３２７３４、ＷＯ９６／２３８８２、ＷＯ９８／０２４５６、ＷＯ９８／４１６３３及び／又はＷＯ９８／４９３０６で述べられているような周知の方法で入手することができる。例えば、ポリクローナル抗体はヤギ、ウサギ、ヒツジ、ラット、ブタ、マウスあるいはヒトなどの適切な宿主を本発明のペプチドで、オプションとしては（ウシ血清アルブミンあるいはキーホール・リンペット・ヘモシアニンなどの）免疫源担体及び／又はフロインド、サポニン、ＩＳＣＯＭ、水酸化アルミニウム又は同様の鉱物ゲル、あるいはキーホール・リンペット・ヘモシアニン又は同様の表面活性剤などのアジュバントを用いて免疫化することによって得ることができる。本発明のペプチドに対する免疫応答が発生した後（通常は１−７日以内）、上記の抗体を周知の方法で免疫化された動物から取り出した血液あるいは血清から周知の方法で単離することができ、その方法はオプションとして、これも例えばＷＯ９７／２３８８２に記載されている周知の免疫アッセイを用いて、望ましい特殊性あるいは親和性など望ましい性質を有する抗体をスクリーニングするステップを含んでいてもよい。
【００３７】
モノクローナル抗体はハイブリドーマ及び同様の技術を含む培養で連続継代細胞系を用いて、これも上記の引例に述べられているような技術を用いてつくりだすことができる。Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ′及びＦａｂフラグメントなどのＦａｂ−フラグメントはペプシンあるいはその他のプロテアーゼで抗体を消化し、ジスルフィド結合を還元して、パパインと還元剤をそれぞれ用いた処理を行うことで得ることができる。
【００３８】
本発明のペプチド類に対して発生された抗体は薬学的及び／又は診断目的のために使用することができる。例えば、そうした抗体を、例えばその抗体を周知の適切な方法、例えば静脈注射、筋肉内注射、鼻腔経由などの方法で、そして、体重１Ｋｇあたり２５−１５００ｍｇ／Ｋｇの範囲などの適切な量で（パラ）百日咳菌に感染しているヒトあるいはその危険性のあるヒトに投与することで、（パラ）百日咳菌による感染を予防及び／又は治療するために用いることができる。この目的のために、上記抗体は通常本発明のペプチドに対して発生された、オプションとしては少なくとも１つの薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／又はアジュバントなどと組み合わされた少なくとも１つの抗体を含む医薬品組成物として製剤され、そうした組成物も本発明の１つの形態を形成する。特に、そうした組成物は注射及び／又は注入に適した組成物の形状をしており、その抗体を水や適切な物理的緩衝液あるいは溶液内に溶かしたり懸濁させた溶液／懸濁液で構成されている。本発明のペプチド類に対して発生された抗体のその他の利用法には、周知の他のいずれの薬学的及び／又は診断的応用方法も含まれる。
【００３９】
さらに別の形態で、本発明はパータクチンのアミノ酸配列を有するポリペプチドにおいて、前記パータクチンの配列と比較して、それから
−いわゆる「領域１」を形成するアミノ酸残基が少なくとも部分的に、そして好ましくはほぼ完全に取り除かれていると同時に、さらに
−いわゆる「領域２」を形成するアミノ酸残基が少なくとも部分的に、そして好ましくはほぼ完全に取り除かれている
ことを特徴とするポリペプチドに関している。
【００４０】
それから領域１（の少なくとも一部）及び領域２（の少なくとも一部）が取り除かれているそうしたパータクチンは以下で「欠失パータクチン」とも表記される。この形態で、「パータクチンの配列」は自然発生（タイプの）百日咳菌パータクチンであってもよく、あるいはその合成類縁体あるいは変異体などを含めその類縁体あるいは変異体であってもよい。特に、本発明のこの形態はそうした「欠失パータクチン」に関しており、この「欠失パータクチン」は配列番号６に示されているようなパータクチンのアミノ酸配列、あるいはその自然発生的又は合成された類縁体あるいは変異体のアミノ酸配列において、それから
−位置２６６−２９０の範囲で、少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、そして最大の場合そのすべてのアミノ酸残基が取り除かれており、
−位置５６９−６０３の範囲で、少なくとも３、好ましくは少なくとも１０、そして最大の場合そのすべてのアミノ酸残基が取り除かれている
ことを特徴としている。
【００４１】
さらに好ましくは、本発明のこの形態は、配列番号６に示されているようなパータクチンのアミノ酸配列、あるいはその自然発生的あるいは合成された類縁体あるいは変異体のアミノ酸配列を有する欠失パータクチンに関しており、その欠失パータクチンからは１つ以上のアミノ酸残基が（上に述べたように）取り除かれており、従って、
−配列番号６の位置２６０−２９０の範囲のアミノ酸残基から、少なくとも１つの反復部分「ＧＧＡＶＰ」及び／又は少なくとも１つの反復部分「ＧＧＦＧＰ」が取り除かれ、そして位置２６０−２９０の範囲に存在するすべてのそうした反復部分「ＧＧＡＶＰ」及び／又は「ＧＧＦＧＰ」のすべてが取り除かれている。
好ましくは、全部で２、３、４あるいは５つの反復部分「ＧＧＡＶＰ」及び／又は「ＧＧＦＧＰ」が取り除かれており、オプションとしては、位置２６０−２９０の範囲に１つ以上の別のアミノ酸残基が、例えばアミノ酸残基の連続配列の形状で存在しており、従って、
−配列番号６の位置５６９−６０３の範囲のアミノ酸残基から、少なくとも１つのモチーフ「ＰＱＰ」が取り除かれており、そして位置５６０−６０３の範囲に存在しているすべてのモチーフ「ＰＱＰ」が取り除かれている。
好ましくは、１、２、３、４又は５個のモチーフＰＱＰが取り除かれており、オプションとして、１つ以上の別のアミノ酸残基が位置５６９−６０３の範囲に、例えば前記ＰＱＰモチーフを構成するアミノ酸残基の連続配列の形状で存在している。
【００４２】
最も好ましくは、上記欠失パータクチンは配列番号６に示されるパータクチンのアミノ酸配列、あるいはその自然発生的あるいは合成された類縁体及び／又は変異体のアミノ酸配列を有しており、そのアミノ酸配列からは以下のものが取り除かれており、
−位置２６６のＧｌｙから位置２９０のＰｒｏまでの残基；あるいは
−位置２７０のＧｌｙから位置２８５のＰｒｏまでの残基；
そしてさらに、以下のアミノ酸残基のいずれかが取り除かれている。
−位置５６９のＡｌａから位置６０３のＡｌａまでの残基；あるいは
−位置５７２のＰｒｏから位置５９９のＧｌｎまでの残基；あるいは
−位置５７５のＰｒｏから位置５９６のＰｒｏまでの残基；あるいは
−位置５７８のＡｌａから位置５９４のＧｌｕまでの残基；あるいは
−位置５８１のＰｒｏから位置５９１のＰｒｏまでの残基；あるいは
−位置５８４のＧｌｎから位置５８８のＰｒｏまでの残基。
【００４３】
上に述べた領域１及び／又は領域２からの１つ以上のアミノ酸残基に加えて、領域１及び／又は２から側鎖している１つ以上のアミノ酸残基（も）取り除かれていてもよく、例えば位置２０６のＴｈｒから位置３４０のＨｉｓまで；及び／又は位置５６９のＡｓｎから位置６５３のＧｌｙまでのアミノ酸残基が取り除かれていてもよい。上に述べたように、欠失パータクチンは配列番号６から誘導されたものであってもよいし、あるいは自然発生的及び／又は合成されたその類縁体あるいは変異体、つまり、１つ以上のアミノ酸残基が挿入されたり、欠失されたり、（好ましくは「同類」置換として）置換されたり、あるいは付加されている類縁体や変異体であってもよい。好ましくは、そうした類縁体や変異体は３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、そしてさらに好ましくは８０％以上、そして最も好ましくは９０％以上の割合のアミノ酸配列相同性、あるいはアミノ酸配列同一性を有している。
【００４４】
先行技術で知られているように、「アミノ酸配列同一性」とは２つ以上のポリペプチド配列との間でそれら配列を比較して判定されるような関係である。先行技術においては、「同一性」とはそれら配列のストリング間の一致によって判定されたポリペプチド配列間の配列関連性の程度も意味している。２つのポリペプチド間の「類似性」とは、１つのポリペプチドのアミノ酸配列とその保存アミノ酸置換基を第２のポリペプチドの配列と比較することによって判定される。「同一性」と「類似性」はＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， Ａ． Ｍ． ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８； Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ． Ｗ．， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３； Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ １， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ． Ｍ．， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｈ． Ｇ．， ｅｄ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， １９９４； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｄｓ．， Ｍ． Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１； ａｎｄ Ｃａｒｉｌｌｏ， Ｈ．， ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｄ．， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ ＭＡｔｈ．， ４８：１０７３ （１９８８）などに述べられているものなどを含む周知の方法で簡単に計算することができる。同一性を判定する好ましい方法はテストされる配列間の最大の一致度をもたらすように考案されている。同一性と類似性を判定する方法は一般に利用できるコンピュータ・プログラムにコードされている。２つの配列間の同一性及び類似性を判定するための好ましいコンピュータ・プログラム法はＧＣＧプログラム・パッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｔ． ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）： ３７７ （１９８４）， ＢｅｓｔＦｉｔ， ＢＬＡＳＴＰ， ＢＬＡＳＴＮ ａｎｄ ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０ （１９９０））などである。ＢＬＡＳＴ ＸプログラムはＮＣＢＩ及びその他のところ（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ， Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．， ｅｔ． ａｌ．， ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ ２０８９４； Ａｌｓｃｈｕｌ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０ （１９９０））から容易に入手することができる。同一性を判定するためにはよく知られているスミス・ウォーターマン・アルゴリズムも用いることもできる。ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータはＨｎｅｔｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９：１０９１５−１０９１９ （１９９２） Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ： １２ ａｎｄ Ｇａ�� Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｅｎａｌｔｙ： ４からの１） Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ： Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３−４５３ （１９７０） Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｍａｔｒｉｘ： ＢＬＯＳＳＵＭ６２に含まれている。これらのパラメータで有効なプログラムはＭａｄｉｓｏｎ， ＷＩにあるＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐから「Ｏｇａｐ」として市販されている。上に述べたパラメータは（末端ギャップに対するペナルティなしの）ペプチド比較用デフォールト・パラメータである。
【００４５】
従って、上に述べたような「欠失パータクチン」とは１つのパータクチンの１つ以上の部分、あるいはフラグメントで構成されたり、あるいはそれらから誘導されるものであってよいが、好ましくは得られた欠失パータクチンが依然として上に述べた配列同一性に関する条件を満たしている場合に限る。好ましくは、そうした欠失パータクチンは少なくとも２００個のアミノ酸、好ましくは少なくとも４００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも６００個のアミノ酸、そしてさらに好ましくは少なくとも８００個のアミノ酸を含んでいる。
【００４６】
また、本発明のこの形態による欠失パータクチンを提供するために、上に述べたような欠失パータクチンを提供するために欠失されたアミノ酸のうちの１つ以上を１つ以上の他のアミノ酸残基と置き換えることも可能であろうが、しかし最も好ましくは、欠失アミノ酸残基と置き換えられるアミノ酸残基が、例えば免疫に関してなど、欠失されたアミノ酸残基と基本的に同じ生物学的効果を（オプションとしてはそのパータクチンの残りのアミノ酸残基と結合して）提供するようなものでない方が良い。この場合も、好ましくは、そうしたポリペプチドは上に述べた配列同一性に関する条件を満たしていなければならず、この場合、欠失パータクチンを提供するためにそれらアミノ酸残基と置換されるアミノ酸残基は考慮に入れない。
【００４７】
好ましくは、上に述べたような「欠失パータクチン」のすべては、適切な方法と適切な量でヒトに投与された場合、そのヒトの体内で免疫応答を誘発させることができる。より好ましくは、そうした欠失パータクチンのすべては、適切な方法と適切な量でヒトに投与された場合、そのヒトの体内で防御性免疫応答、そして特に前記ヒトを百日咳菌による感染から護り、そして好ましくは上に述べた技術の１つ以上を用いて判定した場合に、パラ百日咳菌による感染にも防御性を発揮するような免疫応答を誘発させることができる。さらに、そうした欠失パータクチンのすべては、好ましくは、適切な方法と適切な量でヒトに投与された場合、そのヒトの体内で「検出可能な免疫応答」を誘発させることができるものでなければならず、この場合も、類縁体に関しては、用いられる具体的な類縁体に対する抗体に対する免疫応答の発生も含まれ、これも同様に上に述べた技術の１つ以上を用いて判定することができる。
【００４８】
上にのべたような欠失パータクチンは、例えば、用いられる宿主生物体内で操作可能な適切なプロモータの制御下で、その適切な宿主生物の体内にそうした欠失パータクチンをコードするヌクレオチド配列を発現させ、次いで、その融合体を上記宿主生物及び／又は培地から単離し、及び／又はさらに精製するなど、周知の方法で提供することができる。この場合も、そうした欠失パータクチンをコードするヌクレオチド配列を提供するのに適した技術、宿主生物体内でそれを（非相同的に）発現させるために技術、（大腸菌や（パラ）百日咳菌などの）適切な宿主生物、そしてその内部で操作可能なプロモータ（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ・プロモータ、ｌａｃプロモータ、あるいはＯｍｐ又は線維状血球凝集素に対するプロモータなど、（パラ）百日咳菌から誘導されるプロモータなど）、そしてそれら欠失パータクチンを単離するための技術は当業者には明らかであろう。
【００４９】
上に述べた欠失パータクチンも医薬品組成物を提供／製剤する際、そして特に例えば（パラ）百日咳菌に対するワクチンの提供／製剤の際に、基本的には本発明によるペプチド類に関して上に述べたのと同じ方法で使用するための抗原性成分として用いることができる。こうした適用例の場合、上記欠失パータクチンは本発明のペプチド類（を含んだワクチン）に関して上に述べたのと同じ利点を提供することができる。特に、本発明のペプチド類の場合と同様、本発明による欠失パータクチンは配座可変エピトープに対する免疫応答を起こさせるようにそのバクテリアによって展開されるメカニズムを抑制し、その結果として（パラ）百日咳菌（の菌株）に対しても交差免疫性を提供することができる。
【００５０】
本発明は上に述べたような欠失パータクチンに対して発生される抗体、及びそうした抗体を含む医薬品組成物にも関している。そうした抗体及びそうした組成物は基本的に本発明のペプチド類に対する抗体に関して上に述べたのと同様に入手及び／又は使用することができる。
【００５１】
さらに別の形態で、本発明は医薬品組成物に関しており、特に、少なくとも１つの上に述べたような欠失パータクチンと組み合わせて本発明のペプチドを少なくとも１つ含んでいる、例えば（パラ）百日咳菌に対するワクチンに関している。そうした医薬品組成物／ワクチンは一価及び／又は多価ワクチンを提供するために、例えば本発明のワクチンに関して上に述べたような、１つ以上のさらに別の成分を含むこともできる。
【００５２】
本発明を主にヒトへの適用に関連して上に説明したが、本発明の別の形態で、本発明のペプチド類、本発明の欠失パータクチン及び／又は上に述べた抗体は獣医学的目的（に適した、及び／又はそのために意図された組成物を提供するため）で、そして特にネコ、イヌ、ブタ、ウシなどの哺乳動物におけるパラ百日咳菌及び気管支腐敗菌（Ｂ．Ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）による感染症に対する動物用ワクチンを提供するために使用することができる。この場合も一価あるいは多価ワクチンであるそうしたワクチンの製造と使用は、本明細書の以下の開示も考慮に入れて、当業者には明らかであろう。
本発明について以下の非限定的実施例によって示す。
【００５３】
（実施例）
実施例１
１．方法
１Ａ．バクテリア株及びプラスミド：
この研究で用いられた百日咳菌、パラ百日咳菌、及び気管支腐敗菌株を表Ｉに示す。これらの菌株を１％グリセロル及び１５％ヒツジ血液で補強されたＢｏｒｄｅｒ−Ｇｅｎｇｏｕ（ＢＧ）寒天培地（Ｄｉｆｃｏ Ｃａｔａｌｏｇ ｎｏ．００４８−１７−５， Ｄｅｔｒｏｉｔ， ＵＳＡ）上で３５℃の温度下で３日間成長させた。プラスミド伝播のために大腸菌株ＤＨ５α及びＢＬ２１（ＤＥ３）を用いた。大腸菌株は抗生剤で補強したＬ−ブロス内、又はＬ−寒天上で通常の方法で成長させた。ｐＭＡＬ−ｃ２ベクターはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ， ＵＳＡから購入した。
【００５４】
１Ｂ．ＤＮＡ配列：
この研究で用いられたすべての菌株のパータクチン遺伝子をこの研究を開始する以前、あるいは研究中に配列決定した（特に、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．； Ｍａｓｔｒａｎｔｏｎｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｏｉ ｅｔ ａｌ （１９９８） ａｎｄ Ｍｏｏｉ ｅｔ ａｌ． （１９９９）， さらに表Ｉ参照）。ＤＮＡは標準的な手順を用いて単離された。ＤＮＡ配列決定をＰＣＲ生成物の直接配列決定で行われた。配列決定はＡＢＩプリズム染料ターミネータ・サイクル配列決定簡便キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｆ．， ＵＳＡ）を用いて行い、生成物は３７３ＡＢＩ  ＤＮＡシーケンサ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で分析した。
【００５５】
１Ｃ．パータクチン多型性領域１を含むマルトース結合蛋白質の構成：　以下の配列番号１
ＴＩＲＲＧＤＡＰＡＧＧＡＶＰＧＧＡＶＰＧＧＡＶＰＧＧＰＧＰＧＧＦＧＰＶＬ  （配列番号１）
のアミノ酸配列をコードするｐｒｎ１遺伝子の開放読み取りフレームの一部を、対応するパータクチンＤＮＡ配列をｐＭＡＬ−ｃベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｒｖｅｒｌｙ， ＵＳＡ）内でクローニングすることでマルトース結合蛋白質との融合体として大腸菌内で発現した。このパータクチン配列は以下の２つのプライマ：
2004501933.tif 000002
と、百日咳菌株Ｂ５のクロモソームＤＮＡを用いて得られたものである。これらのプライマでクローニングを簡単に行わせるために導入されたＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ制限サイトに下線を付し、パータクチン誘導配列は太字で示してある。ｐｒｎ２、ｐｒｎ３、ｐｒｎ４、及びｐｒｎ５から誘導されたＰＣＲ生成物はそれぞれ適切な菌株；Ｂ３９４、Ｂ３６５、Ｂ７０５、あるいはＢ１１４８を用いて得られたものである（表Ｉ）。ゲル精製ＰＣＲ生成物はＢａｍＨＩとＸｂａＩと用いて消化してから、ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ消化ｐＭＡＬ−ｃ２に結さつされた。すべてのプラスミド構成物をＤＮＡ配列決定を行ったチェックした。
【００５６】
１Ｄ．マルトース結合蛋白質−パータクチン融合蛋白質の精製：　ｐＭＡＬ−ｃ２誘導体を含んでいる５００ｍｌの大腸菌培養体（ＢＬ２１）をアンピリシン（２００μｇ／ｍｌ）と１％アガロースを含むＬ−ブロス培地で３７℃の温度下で成長させた。ＯＤ６００＝０．５として、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度を０．３ｍＭとなるように加えて、ＭＢＰ−融合体蛋白質を誘発させた。誘発後、成長を２時間継続して、１３０００ｘｇで２０分間遠心分離を行うことで細胞を取り出した。そのペレットを溶解緩衝剤（１０ｍＭ ＮａＰＯ４，  ｐＨ ７．２、０．５Ｍ  ＢａＣｌ，  ０．２５％Ｔｗｅｅｎ ２０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ）内に再懸濁させて、−２０℃の温度下で一昼夜保存した。解凍後、この細胞懸濁液を氷内で２０分間の間隔で４ｘ３０秒で超音波処理にかけた（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ２５０、通常チップ、５０％出力）。抽出物をカラム緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，  ２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で１００ｍｌに希釈させて、５ｍｌアミロース・カラムにかけた。緩衝液Ａで十分に洗浄した後、結合された蛋白質を１０ｍＭマルトースで補強した緩衝液Ａで溶出させて、１ｍｌの画分を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次にＣｏｏｍａｓｉｅ Ｂｒｉｌｌａｎｔ Ｂｌｕｅ（Ｓｅｒｖｅ）染色を行って推定した純度は９９％以上であった。
【００５７】
１Ｅ．ポリクローナル及びモノクローナル抗体の生成：　Ｃｈｉｒｏｎ−Ｂｉｏｃｉｎｅ ＳｐＡ （Ｓｕｅｎａ， Ｉｔａｌｙ）からご提供いただいた５μｇ  Ｐｒｎ１パータクチンを０．３５％対するポリクローナル抗血清をアルヒドロゲルに溶かしたものをＰＢＳ内に溶解したものＢＡＬＢ／ｃマウスに繰り返し注射することで、パータクチンに対するポリクローナル抗血清をつくった。マウスを４２日目に出血させた。Ｓｐｅｃｏ１と混合した精製パータクチンを３回皮下注射することで、モノクローナル抗体ＰｅＭ１、ＰｅＭ２、ＰｅＭ３、ＰｅＭ４、ＰｅＭ５、ＰｅＭ６、及びＰｅＭ７が発生した。ＰｅＭ７０、ＰｅＭ７１及びＰｅＭ７２も同様に発生されたが、この場合Ｐｒｎ１に代えて、ＭＢＰ−Ｐｒｎ１が抗原として用いられた。ＰｅＭ６８を生成するために、マウスにはＭＢＰ−Ｐｒｎ５を注射した。Ｐｒｎ５を用いて、ＰｅＭ８０、ＰｅＭ８４及びＰｅＭ８５が発生された。融合を行うより３日前に、マウスを静脈注射で栄養補給した。脾臓細胞を５０％ＰＥＧ１５００（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ， Ｍａｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてマウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０と融合させた。ＥＬＩＳＡでパータクチンに対するハイブリドーマ分泌抗体を選択して、限定希釈で２度クローニングした。モノクローナル抗体は蛋白質Ｇ親和性クロマトグラフィ（Ｐｈａｒｍａｃｈｉａ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）によって精製した。
【００５８】
１Ｆ．ペプチドの合成：　Ｂｒｕｇｇｈｅ ｅｔ ａｌ．， （１９９４）， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ４３： １６６−１７２に述べられている手順に従って、４８カラム反応ブロック（ＡＭＳ ４２２， ＡＢＩＭＥＤ Ａｎａｌｙｓｅｎ−Ｔｅｃｈｎｉｋ Ｇｍｂｈ， Ｌａｎｇｅｎｆｅｌｄ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えた自動多重ペプチド・シンセザイザを用いてペプチドをつくった。エピトープ・マッピングに用いられたペプチドはＮ末端アセチル化多重（つまり、８量体）抗原性ペプチド（ＭＡＰ）で、これは以前（Ｒｏｕｐｐｅ ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｏｏｒｔ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． （１９９７）１７：１３９−１４８）で述べられているように調製した。パータクチン領域１固有ペプチドのアミノ酸配列を図２ａに示す。免疫化に用いられたぺプチドは同じアミノ酸配列を含んでいたが、単量体であった。これらのペプチドをＳ−アセチルメルカプトアセチル基（Ｄｒｉｊｆｈｏｕｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． （１９９０） １８７：３４９−３５４）でＮ末端延長し、破傷風トキソイドに接合させた（Ｂｒｕｇｇｈｅ ｅｔ ａｌ．， （１９９４）， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ４３： １６６−１７２； ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． （１９９１） ５９：２９６３−２９７１）。免疫化に用いられた比較対象のペプチド−破傷風トキソイド接合体は髄膜炎ＰｏｒＡから誘導されたものであった。
【００５９】
１Ｇ．免疫ブロッティング：　百日咳菌（株Ｂ３９１、Ｂ５９６、Ｂ６４７、Ｂ７０５、Ｂ９３５、Ｂ１１２０、Ｂ１４及びＢ２４）からの無細胞抽出物、あるいは精製されたＭＢＰ融合蛋白質をＬａｅｍｍｌｉ， Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄ．） （１９７０） ２２７：６８０に述べられている手順に従って、硫酸ナトリウム・ドデシル−ポリアクリルアミド（１０％）ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分析した。蛋白質を５ｍＡ／ｃｍ２を用いて３０分間電気ブロッティング（Ｂｉｏｍｅｔｒａ準乾燥ブロッテイング）を行ってニトロセルロース・フィルターに移した。０．５％プロティファー（ｐｒｏｔｉｆａｒ）非脂肪ドライ・ミルク、０．１％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０ＰＢＳ溶解液でブロッキングした後、抗血清又はモノクローナル抗体を用いて、それらのフィルターを２時間培養し、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合されたヤギ抗ウサギ全ＩｇＧのＰＢＳ溶解液を用いて１時間培養した。１％Ｔｗｅｅｎ２０補強ＰＢＳ内で１０分間づつ２度洗浄した後、ＰＢＳで１０分間洗浄して、フィルターをＥＣＬ基質（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で培養して、結合したＨＲＰをオートラジオグラフィ・フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ−ＥＣＬ）に露出させて視覚化した。
【００６０】
１Ｈ．エピトープ・マッピング：　ポリスチレン９６−ウェル・プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＥＬＩＳＡ）を３７℃の温度下で２時間かけて１００μｌ／ウェル多量体ペプチド（２μｇ／ｍｌ）ＰＢＳ溶解液で被覆した。その後、プレートをＴｉｔｅｒｔｅｋＰｌｕｓ Ｍ９６Ｖ洗浄器を用いて１ウェルあたり０．０５％Ｔｗｅｅｎ２２０で補強した２００μｌＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で４回洗浄し、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）で補強したＰＢＳＴで室温下で２時間培養した。０．５％ＢＳＡ  ＰＢＳＴ溶解液内に希釈したモノクローナル抗体（マウスから採取）をウェルに加えて、３７℃の温度で２時間培養した後、上に述べた手順で４回洗浄した。結合した抗体をＨＲＰ−接合抗マウス全ＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ， Ｏｒｇａｎｏｎｎ Ｔｅｃｈｎｉｃａ）を用いて検出した。マウスＩｇＧはマウス・モノクローナル抗体アイソタイピング・キット（Ｉｓｏｓｔｒｉｐ， Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用いて判定した。消滅（ＯＤ４５０）はＢｉｏ Ｔｅｃｋプレート・リーダー（ＥＬ３１２ｅ、ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒ．）を用いて測定した。
【００６１】
１Ｉ．マウスの免疫化及び刺激：　百日咳菌株Ｂ２１３（Ｔｏｈａｍａ）（ｐｒｎ１）、Ｂ１２９８、（ｐｒｎ２）又はＢ１４００（ｐｒｎ３）をストレプトマイシン（３０μｇ／ｍｌ）で補強したＢＧ寒天培地上で３５℃の温度下で３日間成長させた。その後、それらのバクテリアをストレプトマイシンを含まないＢＧ寒天プレート上に置いた。３日後、バクテリアを取り出して、Ｖｅｅｒｗｅｙ培養液（Ｖｅｒｗｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． （１９４９） ５０：１２７−１３４）に５ｘ１０８バクテリア／ｍｌの濃度で再懸濁させた。最終的懸濁液の１アリコットを希釈、プレートして、刺激接種材料のＣＦＵを判定した。免疫化には８匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（ＲＩＶＭ又はＨａｒｌａｎ）を用いた。受動的免疫化を行うため、２５０μｇの精製されたモノクローナル抗体を生後４週間のマウスに静脈注射した。それらのマウスは２４時後に感染された。能動的免疫化を行うために、生後３週間のマウスを皮下注射し、さらに０日目、１４日目、そして２８日目に２０μｇ  Ｑｕｉｌ Ａ（Ｓｐｉｋｏｓｉｄｅ， Ｉｓｏｔｅｃ ＡＢ， Ｌｕｌｅａ， Ｓｗｅｄｅｎ）及び５０μｇ破傷風接合ペプチドを用いて免疫化させた。７種類のペプチド混合物を用いた場合、１２．５０μｇが存在していたペプチド４の場合を除いて、すべてのペプチドが等しい量（つまり、６．２５μｇ）で存在していた。マウスを最後の免疫化から１４日後に感染させた。感染させるために、マウスにエーテルで軽い麻酔をかけ、２０μｌの液滴を各鼻口に置いて、動物が吸入できるようにした。マウスを全部で２ｘ１０７個の百日咳菌細胞で感染させるようにした。感染から３日後にマウスを過量のバルビツレート（Ｎｅｍｂｕｔａｌ， Ｓａｎｏｆｉ／Ａｌｇｉｎ）の腹膜内注射で致死させて、肺、気管、及び血液を採取した。バクテリアのコロニー化を判定するために、肺を携帯ホモジェナイザ（Ｐｒｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ｐｒｏ２００）を用いて９００μｌ Ｖｅｒｗａｙ培養液内で２０，０００ｒｐｍの回転速度で１０秒間ホモジェナイズさせた。気管は抽出して、２００μｌ Ｖｅｒｗａｙ培養液内で５個のガラス・ビーズ（直径３ｍｍ）を入れて３０秒間攪拌した。ホモジェネートを適当に希釈したものをストレプトマイシン（３０μｇ／ｍｌ）で補強されたＢＧ寒天プレート上に置いた。ＣＦＵの数を３０℃の温度で培養して４日目に数えた。ワクチン接種のために用いられた抗原に向けられた血清抗体のレベルは上に述べた手順でＥＬＩＳＡによって判定された。プレートを破傷風トキソイド（２μｇ／ｍｌ）あるいはＰｒｎ１（２μｇ／ｍｌ）を用いて被覆した。消滅はＢｉｏ Ｔｅｃｋプレート・リーダー（ＥＬ３１２ｅ、ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒ．）を用いて測定し、力価はＫｉｎｅｔｉｃａｌｃ（ＫＣ４， ＢｉｏＬｙｓｅ）を用いて計算した。
【００６２】
１Ｊ．ブロッキングＥＬＩＳＡ：　ブロッキングＥＬＩＳＡを基本的にはＢｅｒｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， （１９９３） Ｊ． ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４２： １５５−１６８に述べられている手順で行った。プレートを上に述べたようにＰｒｎ１（２μｇ／ｍｌ）を用いて被覆した。洗浄及びブロッキング後に、ウェルを０．５％ＢＳＡのＰＢＳＴ溶解液内で２倍に希釈させたヒト血清を１００μｌ入れて、２２℃の温度で２時間培養した。ヒトの血清は２つの供給源から得られた。１つの血清は百日咳に感染されたばかりのワクチン接種を受けた子どもからのものであった。血清サンプルは疾病の発症から４７日後に得られたものであった。第２の血清サンプルは最近百日咳にかかったばかりの十分なワクチン接種を受けた複数の患者から得られた血清の混合物で形成されていた。プレート洗浄後、パータクチン固有マウス・モノクローナル抗体ＰｅＭ７， ＰｅＭ２、ＰｅＭ５あるいはＰｅＭ６を加えて、それらのプレートを２２℃の温度下で２時間培養させた。プレートを十分に洗浄した後、それらを展開させて、上に述べた手順で読み取りを行った。
【００６３】
２．結果
２Ａ．パータクチンに対するモノクローナル抗体の特徴付け：
従来、ヨーロッパで広がっている百日咳菌株には６つの異なったパータクチン・タイプが確認されている（特に、Ｍａｓｔｒａｔｏｎｉｏ ｅｔ ａｌ．； Ｍｏｏｉ ｅｔ ａｌ． （１９９８） ａｎｄ Ｍｏｏｉ ｅｔ ａｌ． （１９９）参照）。これらのパータクチン・タイプの間の違いは主に領域１に限定されており、反復単位ＧＧｘｘＰが挿入されているか欠失しているかがその内容である（図１）。この場合、領域１の多型性が抗体の結合、つまり示される抗原性の変差に影響を及ぼしているのかどうかについての調査が行われた。この目的のために、いくつかのモノクローナル抗体及び個々の異なったパータクチン変異体から誘導された領域１を有するＭＢＰ融合蛋白質を用いて、パータクチン変異体を用いて発生させた。
【００６４】
６つの百日咳菌パータクチン・タイプ及び緊密な関係を有する気管支腐敗菌及びパラ百日咳菌から得られた相同性蛋白質に対するモノクローナル抗体の結合を免疫ブロッティングで結合した。ゲル上に負荷されたパータクチンの量は、Ｔａｍ及びＺａｖａｌａ（１９９８；Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． １２４： ５３−６１）に述べられている一般的な方法で、パータクチンの保存部分（つまり、領域２に近い位置に存在しているＡＰＱＰＰＡＧＲ）に対して向けられたモノクローナル抗体Ｅ４Ｄ７を用いて標準化された。用いられたすべての菌株のパータクチン遺伝子を完全に配列決定して、領域１外の多型性について確認した。ｐｒｎ１と比較して、気管支腐敗菌とパラ百日咳菌パータクチン遺伝子はその遺伝子の全長にわたってアミノ酸置換を示していた（図示せず）。しかしながら、百日咳菌内では、ｐｒｎ６だけが領域１外で多型性を示し、ｐｒｎ１とは違って、ｐｒｎ６はアミノ酸位置１０２、３３７、５３２、８５３に４つのアミノ酸置換基を含んでいると同時に、領域２での３つのアミノ酸の欠失が認められた（図１）。テストされた１４のモノクローナル抗体のうちで、７つが気管支腐敗菌及びパラ百日咳菌から誘導されたパータクチンとの相互作用を示した（表２）。
【００６５】
上記１４のモノクローナル抗体のうちで、２つ（ＰｅＭ５及びＰｅＭ７）が百日咳菌パータクチンに対して異なった結合形態を示した（図３、表２）。ＰｅＭ５はＰｒｎ１及びＰｒｎ６に対してそれぞれ最も高い結合度と最も低い結合度を示した。Ｐｒｎ２−５の場合は中間程度の結合度が見られた。このことは、ＰｅＭ５が領域１外の部分で構成されているエピトープを識別することを示唆している。領域１で、Ｐｒｎ１とＰｒｎ６は位置２６８の１つのアミノ酸が違っており（図１）、このことはこの残基がＰｅＭ５エピトープの構造の一部であることを示唆している。
【００６６】
ＰｅＭ７は、Ｐｒｎ１で発生されるが、Ｐｒｎ１と比較してはるかに強いＰｒｎ６との反応を示した。Ｐｒｎ２−５では弱い結合度が認められた（図３）。Ｐｒｎ６を例外として、異なったパータクチンたちは領域１外では変わらず、モノクローナル抗体の異なった結合は領域１をまたがっているエピトープの識別によるものである。ＰｅＭ５及びＰｅＭ７は気管支腐敗菌及びパラ百日咳菌からのパータクチンには結合しなかった（図３）。これらのことを考え合わせると、これらの結果は領域１での変差が抗体結合に影響を及ぼすことを示唆している。
【００６７】
モノクローナル抗体の領域１に結合する能力についても、Ｐｒｎ１−５までのパータクチン変異体から誘導された領域１を有するＭＢＰ−融合体蛋白質を用いて研究が行われた。結合は免疫ブロッティングで評価された。テストされた１４のモノクローナル抗体のうちで、７つ（ＰｅＭ３、ＰｅＭ４、ＰｅＭ６８、ＰｅＭ７０、ＰｅＭ７１、ＰｅＭ７２、及びＦ６Ｅ５）が融合蛋白質には結合したが、ＭＢＰには結合しなかった（表２）。ＭＢＰ融合蛋白質に対する結合に関しては、これら７つのモノクローナル抗体間に量的な違いは認められなかった。ＭＢＰ融合蛋白質に結合しなかったモノクローナル抗体は領域１外部に位置するエピトープを識別しているのかもしれない。これらのモノクローナル抗体がパータクチンと比較してＭＢＰ融合蛋白質内で異なった折り重なりを示す領域１を取り囲んでいる立体配座エピトープを識別している可能性もある。実際、それらモノクローナル抗体のタイプ固有性がパータクチンの領域１に結合することを示唆しているにもかかわらずＭＢＰ融合蛋白質に結合しないＰｅＭ５及びＰｅＭ７の場合は、こうした機序が働いているのかもしれない。興味深いのは、これらのデータが完全なパータクチンに対して発生されたすべて（１４の）モノクローナル抗体のうちの多数（８）が領域１に向けられたものであることを示しており、このことはそれがマウスにおける免疫優勢領域であることを示唆している。
【００６８】
２Ｂ．エピトープ・マッピング
上に述べたモノクローナル抗体によって識別されるエピトープの輪郭を示すために、領域１に対応する１つの重複ペプチド（ＰｅＭ１からＰｅＭ１０）を用いた（図２ａ）。これらの融合蛋白質に結合した７つのモノクローナル抗体（Ｆ６Ｅ５、ＰｅＭ３、ＰｅＭ４、ＰｅＭ６８、ＰｅＭ７０、ＰｅＭ７１及びＰｅＭ７２）はペプチドにも結合した（図２ａ）。モノクローナル抗体Ｆ６Ｅ５はＲＧＤ及びＧＧｘｘＰ反復部分を取り囲んでいる１２８個のアミノ酸のパータクチン・ペプチドに結合することがこれまでにも報告されている（Ｃｈａｒｌｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｆｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９９１）， ２１： １１４７−１１５３）。この場合、Ｆ６Ｅ５が配列ＧＧＦＧＰＶＬＤＧＷをそのエピトープとして範囲決定しているペプチド６及び７だけに結合することが示されている。これらのペプチドに対するその異なった結合に基づいて、他のモノクローナル抗体のエピトープについてもその概要が明らかにされ、図２ｂに示してある。ＧＧＦＧＰＧＧＦＧＰ及びＧＧＦＧＰによって構成されるこれらのエピトープはそれぞれ２つのモノクローナル抗体、つまりＰｅＭ３とＰｅＭ４、及びＰｅＭ７１とＰｅＭ７２によってそれぞれ識別された。ＰｅＭ６８とＰｅＭ７０に対するエピトープはそれぞれＧＤＡＰＡＧＧＡＶＰとＡＴＩＲＲとして確認された。ＰｅＭ５とＰｅＭ７はこれらのペプチドには結合せず、このことはそれらが立体配座エピトープを識別するという仮定との一貫性を示している。
【００６９】
２Ｃ．領域１に対する抗体がマウス及びヒトで誘発される
抗体がパータクチンの領域１に対して誘発されることをさらに確認するために、マウスをＰｒｎ１によって免疫化して、得られた抗血清を免疫ブロッティング及びＥＬＩＳＡでテストした（図４）。パータクチン変異体Ｐｒｎ１−５からの領域１を保有するＭＢＰ−融合蛋白質を抗原として用いた。免疫ブロッティングはすべてのＭＢＰ融合蛋白質に対するマウス交代を検出したが、ＭＢＰは検出せず、このことは領域１に対する抗体の存在を示唆している（図４ａ）。異なったパータクチン領域１配列に対する抗体力価をＥＬＩＳＡで評価した（図４ｂ）。これらの結果は、この血清がＰｒｎ１蛋白質に対しては発生されるにもかかわらず、最も高い結合度はＭＢＰ−Ｐｒｎ２に対して観察され、最も低い結合度がＭＢＰ−Ｐｒｎ１及びＭＢＰ−Ｐｒｎ４に対して認められることを示している。ＭＢＰ−Ｐｒｎ３及びＭＢＰ−Ｐｒｎ５に関しては中間程度の結合レベルが認められた。結合レベルはＧＧＦＧＰ反復部分の数と最もよく相関しており（図４ｂ）、このことはＰｒｎ１による免疫化後、領域１内の線形エピトープを識別する抗体のかなりの部分がこのエピトープに向けられたものであることを示唆している。
【００７０】
ヒト血清はＭＢＰと交差反応を示したので、領域１に対する抗体を検出するためにＭＢＰ融合体を用いることは可能ではなかった。従って、ヒト血清における領域１固有抗体の存在をブロッキングＥＬＩＳＡを用いて調べた。このアッセイで、ヒト抗体の領域１に結合するモノクローナル抗体ＰｅＭ７（上記参照）と競合する能力についての評価を行った。この血清サンプルは百日咳に感染したばかりの子供からのものであった。同様の結果が数人の子供から誘導されたプールされた血清からえも得られた（図示せず）。ＰｅＭ７のＰｒｎ１に対する結合は、投与量に比例して抑制され（図５）、このことは領域１に対して向けられたヒト抗体の存在を示唆している。すべてのテストされたパータクチン変異体に存在しているエピトープを識別するＰｅＭ２の結合は、ヒト抗体によっては抑制されなかった（図５）。モノクローナル抗体ＰｅＭ５はこれもヒト抗体と競合する領域１を取り囲む立体配座エピトープに結合する点でＰｅＭ７と類似している。興味深いことは、領域１内の線形エピトープ（例えばＰｅＭ４及びＦ６Ｅ５）を識別するモノクローナル抗体はパータクチンに対する結合に関してヒトの血清と競合することはできなかった（図示せず）。これらの結果は、その天然の状態で、領域１がマウス及びヒトにおいて抗体を誘発させることを示している。
【００７１】
２Ｄ．パータクチン領域１から誘導されたペプチド類は防御的免疫性を誘発させる
領域１が防御的免疫応答を誘発することができるかどうかを判定するために、マウスを領域１から誘導された７つの重複するペプチド（ｐｅｐ１−ｐｅｐ７、図２ａ）で免疫化させた。比較グループのマウスは髄膜炎菌ペプチドあるいはＰＢＳで免疫化させた（図２ａ）。Ｐｒｎ１による免疫化はポジティブ・コントロールとして寄与した。パータクチン・ペプチドとモノクローナル・ペプチドの両方とも破傷風トキソイドに接合された。免疫化されたマウスと感染されたマウスからの血清サンプルの分析は、それらペプチドで免疫化された両方のグループで破傷風トキソイドに対する高い抗体力価が観察されるのに対して（図６ａ）、パータクチン・ペプチド、あるいは完全なパータクチンで免疫化されたマウスだけが抗パータクチン力価を示した（図６ｂ）。パータクチン・ペプチドで免疫化されたマウスは髄膜炎菌ペプチドで免疫化されたグループと比較してそれらの肺でのバクテリアの量が最大で３５分の１以下であった（Ｐ＝０．０００９、図６ｃ）。パータクチン・ペプチドによって誘発された防御レベルは完全なパータクチンによって達成されたレベルの６分の１以下であった（Ｐ＝０．２９６８）。パータクチン・ペプチドによる免疫化は髄膜炎菌ペプチドで免疫化されたマウスと比較して気管支でのコロニー化を１６分の１以下に減少させた（Ｐ＝０．００３７、図６ｄ）。肺で観察されたのと同様に、パータクチン・ペプチドによる免疫化の有効性は、自然のパータクチンによる免疫化と比較して多少低かった（３分の１）（Ｐ＝０．５２７８、図６ｂ）。結論的に、気管と肺の両方で、領域１から誘導されたペプチドは防御的免疫性を誘発することができた。
【００７２】
２Ｅ．領域１に対するモノクローナル抗体による受動的免疫化は防御性を示す
領域１に向けられたモノクローナル抗体が感染を防御することもできるかどうかについて調べた。領域１内のＧＧＦＧＰＧＧＦＧＰ配列に結合するＰｅＭ４を刺激を与える２４時間前に静脈注射で投与した。比較対象のマウスには流行性耳下腺炎ウイルスあるいはＰＢＳに対して向けられたモノクローナル抗体が注射された。ＰｅＭ４を注射されたマウスは、ＰＢＳを注射されたマウスと比較して、百日咳菌による肺のコロニー化が１０分の１以下であった（Ｐ＜０．０００１）（図７）。流行性耳下腺炎ウイルスによる受動的免疫化は、肺での百日咳菌コロニー化を低減させることができず、ＰＢＳによる比較対象と同様であった。気管支では、ＰｅＭ４によるコロニー化の減少はそれほどはっきりとは示されず、いくつかの実験で２分の１程度の低下（Ｐ＝０．００６８）が認められたのに対して、他ではコロニー化の大幅な低下は観察されなかった（図示せず）。これらを考え合わせると、これらの結果は、パータクチン領域１に向けられた免疫応答が肺の防御に寄与することを裏付けている。
【００７３】
２Ｆ．領域１の保存線形エピトープに対するモノクローナル抗体は異なったパータクチン変異体を有する菌株に対して交差的防御性を示す
モノクローナル抗体ＰｅＭ４はパータクチンのすべての知られている百日咳菌変異体内に存在するエピトープを識別するので、ＰｅＭ４が発現されているパータクチンのタイプが違っている菌株に対して防御性を示すことができるかどうかについての判定が行われた。マウスを百日咳菌株Ｂ２１３（Ｐｒｎ１）、Ｂ１２９６（Ｐｒｎ２）、あるいはＢ１４００（Ｐｒｎ３）でテストするより２４時間前にＰｅＭ４で受動的に免疫化させた。比較対象のマウスには、テスト前にＰＢＳを注射した。ＰｅＭ４はＰＢＳを用いた比較対象とくらべて、肺内部でＰｒｎ１、Ｐｒｎ２、及びＰｒｎ３を発現する百日咳菌株のコロニー化をかなり（Ｐ＜０．００１５）減少させ（図８）、このことは異なったパータクチン変異体を発現する菌株に対して同様の防御性を示す混合体を誘発することができることを示している。
【００７４】
実施例２
ペプチドＧＧＡＶＰ−ＧＧＦＧＰ−ＧＧＦＧＰによるマウスの免疫化
今日まで確認されているすべてのパータクチン変異体の領域１で配列ＧＧＡＶＰ−ＧＧＦＧＰ−ＧＧＦＧＰが見つけられている。それが百日咳菌に対する防御性を示すかどうかを調べるために、このペプチドを用いてマウスを免疫化した。図に示すように、配列ＧＧＡＶＰ−ＧＧＦＧＰ−ＧＧＦＧＰで免疫化されたマウスでは、比較対象（髄膜炎菌）ペプチドでワクチン接種されたマウスと比較して、肺でのコロニー化の程度がかなり低かった（Ｐ＝０．００２７）。オランダ、フィンランド、及びイタリアで２優勢パータクチン・タイプの領域１で見つけられた第２ペプチド（ＧＧＦＧＰ−ＧＧＦＧＰ−ＧＧＦＧＰ）も比較対象ペプチドと比べてかなりの防御性を示した（Ｐ＝０．００２３）。これらの結果は、領域１からの保存配列が交差防御的抗体を誘発させることができることをさらに裏付けるものである。
【００７５】
表１：　この適用例で用いられた百日咳菌
2004501933.tif 000003
ａ： ＭＢＰ−融合蛋白質の構成のために使用
ｂ： 免疫ブロッティングのために使用
ｃ： 刺激実験のために使用
ｄ： 別の菌株からの同じ、前に提出された配列に対するアクセス番号
【００７６】
表２：  パータクチン変異体あるいは領域１を含むＭＢＰ−パータクチン融合蛋白質とモノクローナル抗体の反応性
2004501933.tif 000004
ａ： ＭＢＰ−Ｐｒｎ１からＭＢＰ−Ｐｒｎ５で同じ結果が得られた。
【００７７】
2004501933.tif 000005
2004501933.tif 000006
2004501933.tif 000007
2004501933.tif 000008
2004501933.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【図１】
パータクチン遺伝子の構造と多型性サイトを示す説明図である。蛋白質分解切断サイトを＊印で示し、生成物Ｐ．６９及びＰ．３０で得られた遺伝子のいくつかの部分が示されレイル。宿主受容体への付着に関与するＲＧＤ配列は影を付けて示してある。領域１に３つのタイプの反復部分、ＧｇａｖＰ、ＧＧｆｇＰ及びＧＧｇｖＰが存在していることに注目されたい。破線は一致度を増大させるためい導入された配列におけるギャップを示している。番号は未処理分子のＮ末端を基準としたＰｒｎ１におけるアミノ酸の位置を示している。
【図２】
エピトープ・マッピング及びワクチン接種に用いられるペプチド類のアミノ酸配列を示す表である。（Ａ）パータクチンの領域１に固有のモノクローナル抗体のエピトープ・マッピング。各個別ペプチドの配列を示し、付着に関与するＲＧＤモーティブに影をつけて示してある。ペプチド類へのモノクローナル抗体の結合は「−」（結合なし）及び「＋」（結合）で示してある。ワクチン接種のために用いられるペプチドは破傷風トキソイドに接合された。このワクチン接種実験で髄膜炎菌ペプチドをネガティブ・コントロールとして用いた。（Ｂ）モノクローナル抗体によって結合されたエピトープ。領域１配列の影を付けた部分は各個別モノクローナル抗体によって結合されたエピトープを示す。
【図３】
モノクローナル抗体の異なったパータクチン・タイプへの差別的結合を示す免疫ブロッティング・ゲルを示している。（Ｐｒｎ１−６を発現する）百日咳菌株から、気管支腐敗菌（Ｂｂ）及びパラ百日咳菌（Ｂｐｐ）からの細胞溶解物を抗モノクローナル抗体ＰｅＭ５（パネルＡ）及びＰｅＭ７（パネルＢ）を用いた免疫ブロッティングで分析した。それぞれのレーンの上の番号はパータクチン・タイプを示す。分子量マークの位置を示してある。
【図４】
Ａは免疫ブロッティング・ゲルを示しており、ｂはグラフで、パータクチンの領域１がマウスで免疫源性であることを示している。マウスはＰｒｎ１で免疫化して、Ｐｒｎ１からＰｒｎ６の範囲から誘導された領域１を有するＭＢＰ融合体蛋白質に結合するこの抗血清の能力の評価を行った。（Ａ）抗Ｐｒｎ１マウス血清による免疫ブロット。ＭＢＰ−Ｐｒｎ１で得られた結果だけを示してある。ＭＢＰ−Ｐｒｎ２からＰｒｎ５を用いても同じ結果が得られた。等しい量のＭＢＰ及びＭＢＰ−Ｐｒｎ１をゲル上に負荷した。パータクチン及びＭＢＰ−Ｐｒｎ１の位置を示してある。（Ｂ）抗Ｐｒｎ１マウス血清を用いたＥＬＩＳＡ。ＭＢＰ融合体蛋白質に対する血清内での抗体力価とＭＢＰに融合されたパータクチン領域の配列を示している。
【図５】
百日咳患者から採取した血清が領域１に対する抗体を保有していることを示すグラフである。ＥＬＩＳＡプレートをＰｒｎ１で被覆した。ヒト血清を二倍に希釈したもので予備培養した後、モノクローナル抗体ＰｅＭ７（領域１に向けられたもの）あるいはＰｅＭ２（すべてのパータクチン変異体に存在するエピトープに向けられたもの）による結合を行わせた。ヒト血清は一人の百日咳患者から採取されたもので、別の百日咳患者からの血清のプールで得られたのと同様の結果が得られた。
【図６】
パータクチン領域１から得られたペプチドによる免疫が鼻腔内での百日咳菌感染を防御することを示すグラフである。マウスをＰＢＳ、髄膜炎菌ペプチド、領域１から又はパータクチン（Ｐｒｎ１）で誘導されたペプチドの混合物によって免疫化した。ペプチドは破傷風テキソイドに接合された。免疫化後、マウスを鼻腔経由でＰｒｎ１を発現する百日咳菌株Ｂ２１３によって感染させた。肺と器官内のバクテリアの量と抗体力価を感染後３日目に判定した。（Ａ）抗破傷風トキソイドＩｇＧ力価。（Ｂ）抗Ｐｒｎ１ ＩｇＧ力価。（Ｃ）肺内部のＣＦＵ。（Ｄ）気管内のＣＦＵ。細い線は平均値を示す。これらの実験を３回行って、その代表的な結果を示してある。
【図７】
パータクチンの領域１に向けられたモノクローナル抗体による百日咳菌感染に対する受動的防御を示すグラフである。マウスをＰｅＭ４、流行性耳下腺炎、あるいはＰＢＳでそれそれ受動的に感染させた。免疫後、マウスを百日咳菌株Ｂ２１３（Ｐｒｎ１）で鼻腔内感染させた。肺と器官内のバクテリアの量と抗体力価を感染後３日目に判定した。細い線は平均値を示す。Ｐ値が示されている。これらの実験を３回行って、その代表的な結果を示してある。
【図８】
領域１内に保存されていエピトープに対するモノクローナル抗体（ＰｅＭ４）が異なったパータクチン変異体を有する百日咳菌株に対して交差免疫を発生させることを示すグラフである。これらの実験を２回行って、その代表的な結果を示してある。実験の詳細に関しては図７に対する記号一覧参照。
【図９】
図９はパータクチン領域１から誘導したペプチドを用いての免疫化による鼻腔内百日咳菌感染に対する防御を示すグラフである。マウスをＰＢＳ、髄膜炎菌ペプチド（比較用）、ペプチドＧＧＦＧＰ−ＧＧＦＧＰ−ＧＧＦＧＰ、ペプチドＧＧＡＶＰ−ＧＧＦＧＰ−ＧＧＦＧＰ、あるいはパータクチン（Ｐｒｎ１）を用いて免疫化させた。ペプチドは破傷風トキソイドに結合された。免疫後、マウスをＰｒｎ１を発現する百日咳菌株Ｂ２１３で鼻腔内感染させた。肺と器官内のバクテリアの量と抗体力価を感染後３日目に判定した。
【図１】
2004501933.tif 000010
【図２】
2004501933.tif 000011
【図３】
2004501933.tif 000012
【図４】
2004501933.tif 000013
【図５】
2004501933.tif 000014
【図６】
2004501933.tif 000015
2004501933.tif 000016
【図７】
2004501933.tif 000017
【図８】
2004501933.tif 000018
【図９】
2004501933.tif 000019
【国際公開パンフレット】
2004501933.tif 000020
2004501933.tif 000021
2004501933.tif 000022
2004501933.tif 000023
2004501933.tif 000024
2004501933.tif 000025
2004501933.tif 000026
2004501933.tif 000027
2004501933.tif 000028
2004501933.tif 000029
2004501933.tif 000030
2004501933.tif 000031
2004501933.tif 000032
2004501933.tif 000033
2004501933.tif 000034
2004501933.tif 000035
2004501933.tif 000036
2004501933.tif 000037
2004501933.tif 000038
2004501933.tif 000039
2004501933.tif 000040
2004501933.tif 000041
2004501933.tif 000042
2004501933.tif 000043
2004501933.tif 000044
2004501933.tif 000045
2004501933.tif 000046
2004501933.tif 000047
2004501933.tif 000048
2004501933.tif 000049
2004501933.tif 000050
2004501933.tif 000051
2004501933.tif 000052
2004501933.tif 000053
2004501933.tif 000054
2004501933.tif 000055
2004501933.tif 000056
2004501933.tif 000057
2004501933.tif 000058
2004501933.tif 000059
2004501933.tif 000060
2004501933.tif 000061
2004501933.tif 000062
2004501933.tif 000063
2004501933.tif 000064
2004501933.tif 000065
2004501933.tif 000066
2004501933.tif 000067
2004501933.tif 000068
2004501933.tif 000069
2004501933.tif 000070
2004501933.tif 000071
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004501933.tif 000072
【手続補正書】
【提出日】平成14年9月23日(2002.9.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
百日咳菌パータクチンの「領域１」のアミノ酸配列の６〜４０個の連続するアミノ酸からなるペプチド、又は当該ペプチドの類縁体。
【請求項２】
ペプチドが百日咳菌パータクチンの「領域１」のアミノ酸配列からの１０〜１５個の連続するアミノ酸残基からなる請求項１記載のペプチド、又は当該ペプチドの類縁体。
【請求項３】
ペプチドが配列番号１のアミノ酸配列からの６〜３６個の連続するアミノ酸残基からなる請求項１記載のペプチド、又は当該ペプチドの類縁体。
【請求項４】
ペプチドが配列番号１のアミノ酸配列からの１０〜１５個の連続するアミノ酸残基からなる請求項３記載のポリペプチド、又は当該ペプチドの類縁体。
【請求項５】
１以上の反復部分ＧＧＦＧＰまたは１以上の反復部分ＧＧＡＶＰからなり、当該反復部分の総数が２〜１０個であるペプチド、又は当該ペプチドの類縁体。
【請求項６】
ペプチドは、百日咳菌、パラ百日咳菌、またはその両方に対して防御を提供することを特徴とし、配列番号５のポリペプチドよって提供される防御の少なくとも１０％である請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド、又は当該ペプチドの類縁体。
【請求項７】
ペプチドが配列番号５のアミノ酸配列を含む請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチド、又は当該ペプチドの類縁体。
【請求項８】
ペプチドが６〜１００個のアミノ酸の長さを有する請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項９】
ペプチドのアミノ酸配列が、当該アミノ酸配列とは異なりかつペプチドが天然に存在するパータクチンにおいて生来関連する少なくとも１つのさらなるアミノ酸配列に連結する、請求項１〜８のいずれか一項に定義されるペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項１０】
ポリペプチドは、「領域１」又は「領域２」の一部である１以上のアミノ酸が除去されていることを特徴とする、パータクチンのアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項１１】
ポリペプチドは、「領域１」又は「領域２」が基本的に完全に除去されていることを特徴とする請求項１０記載のポリペプチド。
【請求項１２】
ポリペプチドが配列番号６のアミノ酸配列、又は天然に存在するもしくは合成された類縁体もしくはその変異体のアミノ酸配列を有しており、ポリペプチドはさらに、
ａ）２６６−２９０の位置のアミノ酸残基の少なくとも５つが除去されている、又は
ｂ）５６９−６０３の位置のアミノ酸残基の少なくとも３つが除去されている、
ことを特徴とする請求項１０記載のポリペプチド。
【請求項１３】
ポリペプチドは、
ａ）２６６−２９０の位置のアミノ酸残基のすべてが除去されている、又は
ｂ）５６９−６０３の位置のアミノ酸残基のすべてが除去されている、
ことを特徴とする請求項１２記載のポリペプチド。
【請求項１４】
ポリペプチドは、
ａ）配列番号６の位置２６０と位置２９０との間のアミノ酸配列から、少なくとも１つの「ＧＧＡＶＰ」又は「ＧＧＦＧＰ」の反復部分が除去されている、又は
ｂ）配列番号６の位置５６９と位置６０３との間のアミノ酸配列から、少なくとも１つの「ＰＱＰ」モチーフが除去されている、
ことを特徴とする請求項１２記載のポリペプチド。
【請求項１５】
ポリペプチドは、
ａ）すべての「ＧＧＡＶＰ」又は「ＧＧＦＧＰ」の反復部分が除去されている、又は
ｂ）すべての「ＰＱＰ」モチーフが除去されている、
ことを特徴とする請求項１４記載のポリペプチド。
【請求項１６】
ポリペプチドは、
ａ）位置２６６から位置２９０の配列、
ｂ）位置２７０から位置２８５の配列、
ｃ）位置５６９から位置６０３の配列、
ｄ）位置５７２から位置５９９の配列、
ｅ）位置５７５から位置５９６の配列、
ｆ）位置５７８から位置５９４の配列、
ｇ）位置５８１から位置５９１の配列、及び
ｈ）位置５８４から位置５８８の配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つを欠失していることを特徴とする請求項１２記載のポリペプチド。
【請求項１７】
ａ）薬学的に許容される担体又は賦形剤、
ｂ）免疫アジュバント、
ｃ）さらなる百日咳又はパラ百日咳抗原、及び
ｄ）ヒトに投与されると、百日咳以外の１以上の感染性疾患からヒト又は動物を防御する抗原、
からなる群から選択される１以上の成分をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に定義されるペプチドまたはポリペプチドを含む組成物。
【請求項１８】
百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支腐敗菌、又はそれらの１以上のさらなる哺乳動物感染性疾患との組合せに対するワクチンの製造における請求項１〜１６のいずれか一項に記載のペプチド又はポリペプチドの使用。
【請求項１９】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のペプチド又はポリペプチドに対して発生する抗体。
【請求項２０】
ａ）薬学的に許容される担体又は賦形剤、
ｂ）免疫アジュバント、
ｃ）さらなる百日咳又はパラ百日咳抗原、及び
ｄ）ヒトに投与されると、百日咳以外の１以上の感染性疾患からヒト又は動物を防御する抗原、
からなる群から選択される１以上の成分をさらに含む、請求項１９に定義される抗体を含む組成物。
【国際調査報告】
2004501933.tif 000073
2004501933.tif 000074
2004501933.tif 000075
2004501933.tif 000076
2004501933.tif 000077
2004501933.tif 000078