(57)【要約】ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼを調節する試薬、およびヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼ遺伝子産物と結合する試薬は、癌、ＣＮＳ障害、糖尿病、喘息、およびＣＯＰＤ（これらに制限される訳ではない）を含む機能障害又は疾患を、予防し、回復させ、又は治す働きがあり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、
ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列；および配列番号２に示すアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号１に記載の配列を含むポリヌクレオチド；
ｃ）（ａ）および（ｂ）に明記するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
ｄ）遺伝コードの縮重のため、その配列が（ａ）〜（ｃ）に明記するポリヌクレオチド配列から逸脱しているポリヌクレオチド；並びに
ｅ）（ａ）〜（ｄ）に明記するポリヌクレオチド配列の断片、誘導体またはアレル変異体を表すポリヌクレオチド、
から成る群より選択されるポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項３】
請求項２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４】
請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされている、実質上精製されたセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチド。
【請求項５】
ａ）請求項３に記載の宿主細胞を、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドの発現に好適な条件下で培養する工程；および、
ｂ）該宿主細胞培養からセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチド
を回収する工程、
を含む、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドを産生する方法。
【請求項６】
ａ）請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドを生物試料の核酸材料とハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成させる工程；および、
ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程、
を含む、生物試料中のセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するための方法。
【請求項７】
ハイブリダイゼーション前に、生物試料の核酸材料を増幅させる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
生物試料を、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載のセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドと特異的に相互作用する試薬と接触させる工程を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載のセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドを検出するための方法。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれかに記載の方法を実施するための診断キット。
【請求項１０】
被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドによってコードされている任意のセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドと接触させる工程；
該セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドに対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含むセリン−スレオニンプロテインキナーゼの活性を低下させる物質をスクリーニングする方法であって、該ポリペプチドと結合する被験化合物を、セリン−スレオニンプロテインキナーゼの活性を低下させる可能性のある治療物質として同定する方法。
【請求項１１】
被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドによってコードされるセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドと接触させる工程；および、
該ポリペプチドのセリン−スレオニンプロテインキナーゼ活性を検出する工程、
を含むセリン−スレオニンプロテインキナーゼの活性を調節する物質をスクリーニングする方法であって、セリン−スレオニンプロテインキナーゼ活性を増大させる被験化合物をセリン−スレオニンプロテインキナーゼの活性を増大させる可能性のある治療物質として同定し、そして該ポリペプチドのセリン−スレオニンプロテインキナーゼ活性を減少させる被験化合物をセリン−スレオニンプロテインキナーゼの活性を減少させる可能性のある治療物質として同定する方法。
【請求項１２】
被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドと接触させ、該ポリヌクレオチドに対する被験化合物の結合を検出する工程を含む、セリン−スレオニンプロテインキナーゼの活性を減少させる物質をスクリーニングする方法であって、該ポリヌクレオチドに結合する被験化合物をセリン−スレオニンプロテインキナーゼの活性を減少させる可能性のある治療物質として同定する方法。
【請求項１３】
細胞を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載の任意のセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドと特異的に結合する試薬と接触させ、それによりセリン−スレオニンプロテインキナーゼの活性を減少させる工程を含む、セリン−スレオニンプロテインキナーゼの活性を減少させる方法。
【請求項１４】
請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法によって同定される、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を調整する試薬。
【請求項１５】
請求項２に記載の発現ベクターまたは請求項１４に記載の試薬および製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
【請求項１６】
疾患においてセリン−スレオニンプロテインキナーゼの活性を調整するための医薬を製造するための、請求項２に記載の発現ベクターまたは請求項１４に記載の試薬の使用。
【請求項１７】
該疾患が、癌、ＣＮＳ障害、糖尿病、喘息若しくはＣＯＰＤである、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡ。
【請求項１９】
配列番号１を含む、請求項１８に記載のｃＤＮＡ。
【請求項２０】
配列番号１から成る、請求項１８に記載のｃＤＮＡ。
【請求項２１】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２２】
該ポリヌクレオチドが配列番号１から成る、請求項２１に記載の発現ベクター。
【請求項２３】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２４】
該ポリヌクレオチドが配列番号１から成る、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号２に示すアミノ酸配列から成る、請求項２５に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項２８】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする発現ベクターを含む宿主細胞を、該ポリペプチドが発現される条件下で培養し；そして該ポリペプチドを単離する工程を含む、該ポリペプチドを産生する方法。
【請求項２９】
該発現ベクターが配列番号１を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
配列番号１に記載の１１個の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを、生物試料の核酸材料とハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成させ；そして、該ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程を含む、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドのコード配列を検出する方法。
【請求項３１】
ハイブリダイズさせる工程の前に、該核酸材料を増幅させる工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
配列番号１に記載の１１個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；および、
請求項３０に記載の方法についての説明書、
を含む、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドのコード配列を検出するためのキット。
【請求項３３】
生物試料を、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する試薬と接触させて、試薬−ポリペプチド複合体を形成させる工程；および、
該試薬−ポリペプチド複合体を検出する工程、
を含む、該ポリペプチドを検出する方法。
【請求項３４】
該試薬が抗体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する抗体；および
請求項３３に記載の方法についての説明書、
を含む、該ポリペプチドを検出するためのキット。
【請求項３６】
被験化合物を、（１）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列、および（２）配列番号２に示すアミノ酸配列、から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させる工程；および
該ポリペプチドに対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含むヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼの活性を調整することができる物質をスクリーニングする方法であって、該ポリペプチドに結合する被験化合物をヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼの活性を調節する可能性のある物質として同定する方法。
【請求項３７】
接触させる工程が細胞においてである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
細胞がインビトロである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
接触させる工程が無細胞系においてである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
該ポリペプチドが検出可能な標識を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
被験化合物が検出可能な標識を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
被験化合物が該ポリペプチドと結合している標識化リガンドに取って代わる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
該ポリペプチドが固体支持体と結合している、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
被験化合物が固体支持体と結合している、請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
被験化合物を、（１）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列、および、（２）配列番号２に示すアミノ酸配列、から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させる工程；および
該ポリペプチドの活性を検出する工程、
を含むヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼの活性を調整する物質をスクリーニングする方法であって、該ポリペプチドの活性を増大させる被験化合物をヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼの活性を増大させる可能性のある物質として同定し、該ポリペプチドの活性を減少させる被験化合物をヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼの活性を減少させる可能性のある物質として同定する方法。
【請求項４６】
接触させる工程が細胞においてである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
細胞がインビトロである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
接触させる工程が無細胞系においてである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
被験化合物を、配列番号１に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる産物と接触させる工程；および
該産物に対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含むヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼの活性を調整する物質をスクリーニングする方法であって、該産物に結合する被験化合物をヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼの活性を調節する可能性のある物質として同定する方法。
【請求項５０】
該産物がポリペプチドである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
該産物がＲＮＡである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
細胞を、配列番号１に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる産物と特異的に結合する試薬と接触させ、それによりヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼの活性を減少させる工程を含む、ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼの活性を減少させる方法。
【請求項５３】
該産物がポリペプチドである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
該試薬が抗体である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
該産物がＲＮＡである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
該試薬がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
該試薬がリボザイムである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
細胞がインビトロである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
細胞がインビボである、請求項５２に記載の方法。
【請求項６０】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する試薬；および製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
【請求項６１】
該試薬が抗体である、請求項６０に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
配列番号１に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの産物と特異的に結合する試薬；および製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
【請求項６３】
該試薬がリボザイムである、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
該試薬がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
該試薬が抗体である、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする発現ベクター；および製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
【請求項６７】
該発現ベクターが配列番号１を含む、請求項６６に記載の医薬組成物。
【請求項６８】
癌、ＣＮＳ障害、糖尿病、喘息若しくはＣＯＰＤより選択されるセリン−スレオニンプロテインキナーゼ機能障害関連疾患を処置する方法であって、それを必要とする患者に、ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼの機能を調整する試薬の治療的有効量を投与し、それによりセリン−スレオニンプロテインキナーゼ機能障害関連疾患の症状を回復させる工程を含む方法。
【請求項６９】
該試薬が請求項３６に記載の方法によって同定される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
該試薬が請求項４５に記載の方法によって同定される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
該試薬が請求項４９に記載の方法によって同定される、請求項６８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は酵素調節の分野に関する。より具体的には、本発明はヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼの調節に関する。
【０００２】
発明の背景
セリン−スレオニンキナーゼタンパク質によって媒介される細胞間シグナル伝達は種々の重要な生物学的機能を調節する（Ｌｅｔｗｉｎら、ＥＭＢＯ Ｊ． １１（１０），３５２１−３１，１９９２；Ｊｏｈｎｓｏｎら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４３０（１−２），１−１１，１９９８）。例えばβ型トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−β）は、セリン／スレオニンキナーゼ活性を有する細胞表面受容体に結合しその受容体を活性化して、様々な細胞タイプの増殖および分化を調節する。Ａｔｆｉら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２，１２１１０−０４，１９９５）は、ＴＧＦ−βが７８ｋＤａタンパク質（ｐ７８）セリン／スレオニンキナーゼを活性化すること、そしてこのｐ７８キナーゼはＴＧＦ−βが成長阻害因子として作用する細胞でのみ活性化されることを明らかにした。ｐ７８などのキナーゼは重要な機能を持つので、当技術分野では、新しいキナーゼを同定すること、および治療効果を得るためにこれらの新しいキナーゼを調節する方法を見いだすことが必要とされている。
【０００３】
発明の要旨
本発明の課題は、ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼを調節する試薬および方法を提供することである。本発明のこの課題および他の課題は、以下に記載の１またはそれ以上の態様によって提供される。
【０００４】
本発明の一態様は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドである：
配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約５０％の同一性を有するアミノ酸配列；ならびに、
配列番号２に示されるアミノ酸配列。
【０００５】
本発明のさらに別の態様は、細胞外基質分解を減少させる物質のスクリーニング方法である。試験（被験）化合物を、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドと接触させる：
配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約５０％の同一性を有するアミノ酸配列；ならびに、
配列番号２に示されるアミノ酸配列。
【０００６】
試験化合物およびセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチド間の結合を検出する。セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドと結合する試験化合物は、これにより、細胞外基質分解を減少させるのに有望な物質として同定される。この物質はセリン−スレオニンプロテインキナーゼの活性を減少させることによって機能し得る。
【０００７】
本発明の別の態様は、細胞外基質分解を減少させる物質のスクリーニング方法である。試験化合物を、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと接触させる：
配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約５０％の同一性を有するヌクレオチド配列；ならびに、
配列番号１に示されるヌクレオチド配列。
【０００８】
このポリヌクレオチドに対する試験化合物の結合を検出する。このポリヌクレオチドと結合する試験化合物は、細胞外基質分解を減少させるのに有望な物質として同定される。この物質はセリン−スレオニンプロテインキナーゼｍＲＮＡと相互作用することを介し、セリン−スレオニンプロテインキナーゼの量を減少させることによって機能し得る。
【０００９】
本発明の別の態様は、細胞外基質分解を調節する物質をスクリーニングする方法である。試験化合物を、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドと接触させる：
配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約５０％の同一性を有するアミノ酸配列；ならびに、
配列番号２に示されるアミノ酸配列。
【００１０】
ポリペプチドのセリン−スレオニンプロテインキナーゼ活性を検出する。このポリペプチドのセリン−スレオニンプロテインキナーゼ活性を、試験化合物の不存在下におけるセリン−スレオニンプロテインキナーゼ活性と比較して増大させる試験化合物は、これにより、細胞外基質分解の増大に関して有望な物質として同定される。このポリペプチドのセリン−スレオニンプロテインキナーゼ活性を、試験化合物の不存在下におけるセリン−スレオニンプロテインキナーゼ活性と比較して減少させる試験化合物は、これにより、細胞外基質分解の減少に関して有望な物質として同定される。
【００１１】
本発明のさらに別の態様は、細胞外基質分解を減少させる物質のスクリーニング方法である。試験化合物を、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドのセリン−スレオニンプロテインキナーゼ産物と接触させる：
配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約５０％の同一性を有するヌクレオチド配列；ならびに、
配列番号１に示されるヌクレオチド配列。
【００１２】
セリン−スレオニンプロテインキナーゼ産物に対する試験化合物の結合を検出する。セリン−スレオニンプロテインキナーゼ産物と結合する試験化合物は、これにより、細胞外基質分解の減少に関して有望な物質として同定される。
【００１３】
本発明のさらに別の態様は、細胞外基質分解を減少させる方法である。細胞を、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはこのポリヌクレオチドによってコードされる産物と特異的に結合する試薬と接触させる：
配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約５０％の同一性を有するヌクレオチド配列；ならびに、
配列番号１に示されるヌクレオチド配列。
【００１４】
細胞内のセリン−スレオニンプロテインキナーゼ活性はこれにより減少する。
【００１５】
したがって本発明は、例えばこの酵素の活性部位におけるアクチベーターまたはインヒビターとして作用し得る試験化合物を同定するのに使用可能なヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼを提供する。ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼおよびその断片はまた、この酵素をブロックし、効率的にその活性を減少させることができる特異的抗体を生じさせるのに有用である。
。
【００１６】
本発明の詳しい説明
本発明は、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、
ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列；および配列番号２に示すアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号１の配列を含むポリヌクレオチド；
ｃ）（ａ）および（ｂ）に明記するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
ｄ）遺伝コードの縮重のため、その配列が（ａ）〜（ｃ）に明記するポリヌクレオチド配列から逸脱しているポリヌクレオチド；ならびに、
ｅ）（ａ）〜（ｄ）に明記するポリヌクレオチド配列の断片、誘導体またはアレル変異体を表すポリヌクレオチド、
から成る群より選択されるポリヌクレオチドに関する。
【００１７】
さらに、新規セリン−スレオニンプロテインキナーゼ、特にヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼが本発明の発見であることが本出願人により発見された。ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼは、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む。ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼのコード配列を配列番号１に示す。関連するＥＳＴ（配列番号４および５）は脳、血液、卵巣、胸腺、肺、および胎盤で発現している。
【００１８】
ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼは、「染色体ＩＩＩ中の推定セリン／スレオニンプロテインキナーゼＤ１０４４．３」という注釈が付された、受入れ番号第Ｐ４１９５１号によって同定されるシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）タンパク質に似ている（図６）。
【００１９】
ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼは以下の共通パターンを含む：
［ＬＩＶＭＦＹＣ］−ｘ−［ＨＹ］−ｘ−Ｄ−［ＬＩＶＭＦＹ］−［ＲＳＴＡＣ］−ｘ（２）−Ｎ−［ＬＩＶＭＦＹＣ］（Ｄは活性部位残基である）。図１ではこのパターンに下線を引く。活性化セグメントの内部にある認識モチーフ［Ｈｙｄ］−ｘ−Ｒ−ｘ−ｘ−［ＳＴ］−ｘ−ｘ−ｘ−｛Ｈｙｄ］（Ｈｙｄは疎水性残基である）にも下線を引く。Ｐｆａｍ検索により、残基７７〜２２５にプロテインキナーゼドメイン領域が同定された。
【００２０】
ヒトセリン−スレオニンキナーゼの三次元構造は、１Ａ０６における残基７７から２３５までの明瞭な相同性によって推論される。
【００２１】
本発明のヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼは、今までに同定されたセリン−スレオニンキナーゼ酵素と同じ目的に有用であると予想される。ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼは癌、ＣＮＳ障害、糖尿病、喘息および、ＣＯＰＤなどの障害を処置するための治療方法に有用であると考えられる。また、ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼは、ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼアクチベーターおよびインヒビターをスクリーニングするのに用いることもできる。
【００２２】
ポリペプチド
本発明に係るヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドには、配列番号２に示すアミノ酸配列、または以下定義による生物学的に活性なその変異体より選択される、少なくとも６、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、または２６１個の連続アミノ酸が含まれる。したがって、本発明のセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドは、セリン−スレオニンプロテインキナーゼタンパク質の一部、完全長のセリン−スレオニンプロテインキナーゼタンパク質、又はセリン−スレオニンプロテインキナーゼタンパク質の全部または一部を含む融合タンパク質であり得る。
【００２３】
生物学的に活性な変異体
生物学的活性がある、例えばキナーゼ活性を保持しているヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチド変異体もまた、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドである。天然または非天然セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチド変異体は、配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５または７０％、好ましくは、約７５、８０、８５、９０、９６、９６または９８％一致するアミノ酸配列またはその断片を有することが好ましい。推定されるセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチド変異体と配列番号２に記載のアミノ酸配列との間の一致（同一性）パーセントは、Ｂｌａｓｔ２整列（アライメント）プログラム（Ｂｌｏｓｕｍ６２， Ｅｘｐｅｃｔ １０， ｓｔａｎｄａｒｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅｓ）を用いて決定される。
【００２４】
一致パーセントの変異は、例えばアミノ酸置換、挿入または欠失に起因し得る。アミノ酸置換は１対１のアミノ酸の置き換えとして定義される。置換されたアミノ酸が類似の構造的および／または化学的性質を有する場合、置換は事実上保存的である。保存的置換の例は、イソロイシンまたはバリンによるロイシンの置換、グルタメートによるアスパルテートの置換、またはセリンによるスレオニンの置換である。
【００２５】
アミノ酸挿入または欠失はアミノ酸配列への、またはその内部での変化である。これらは典型的には約１〜５アミノ酸の範囲で起こる。セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドの生物学的または免疫学的活性を破壊することなく、どのアミノ酸残基が置換、挿入または欠失できるかを決定する際の指針は、当分野で周知のコンピュータープログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを用いて見出すことができる。あるアミノ酸変化が生物学的に活性なセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをもたらすか否かは、例えば実施例４に記載のように、キナーゼ活性を検定することにより容易に決定できる。
【００２６】
融合タンパク質
融合タンパク質は、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドアミノ酸配列に対する抗体の作製に、そして様々な検定系での使用に有用である。例えば、融合タンパク質は、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドの一部と相互作用するタンパク質の同定に使用できる。タンパク質親和クロマトグラフィーまたはタンパク質−タンパク質相互作用のためのライブラリーに基づく検定、例えば酵母２−ハイブリッドまたはファージディスプレイ系をこの目的のために使用できる。このような方法は当分野で周知であり、薬物スクリーニングとしても使用できる。
【００２７】
セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチド融合タンパク質は、ペプチド結合により互いに融合した二つのポリペプチドセグメントを含んでいる。第一のポリペプチドセグメントは、配列番号２または上記のような生物学的に活性な変異体の少なくとも６、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、または２６１個の連続アミノ酸を含む。第一のポリペプチドセグメントはまた、完全長セリン−スレオニンプロテインキナーゼタンパク質を含み得る。
【００２８】
第二のポリペプチドセグメントは完全長タンパク質またはタンパク質断片であってよい。融合タンパク質の構築に一般的に使用するタンパク質は、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、自己蛍光タンパク質（青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を包含する）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を包含する。さらに、融合タンパク質の構築には、ヒスチジン（Ｈｉｓ）標識、ＦＬＡＧ標識、インフルエンザへマグルチニン（ＨＡ）標識、Ｍｙｃ標識、ＶＳＶ−Ｇ標識、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）標識を包含するエピトープ標識を使用する。その他の融合構築は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−標識、Ｌｅｘ ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合物、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物を包含する。また、融合タンパク質はさらに、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドコード配列と非相同タンパク質配列の間に位置する開裂部位を含むよう組み立てることができ、その結果、このセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドは、開裂され、非相同部分を無くすように精製できる。
【００２９】
融合タンパク質は当分野で周知のように化学合成できる。好ましくは、融合タンパク質は二つのポリペプチドセグメントを共有結合で連結することにより、または分子生物学分野で標準的な方法により調製する。例えば、当分野で知られているように、第二のポリペプチドセグメントをコードしているヌクレオチドを有する適切なリーディングフレームに配列番号１より選ばれるコード配列を含むＤＮＡ構築物を作製し、このＤＮＡ構築物を宿主細胞で発現させることによる組換えＤＮＡ法を用いて、融合タンパク質を調製できる。融合タンパク質構築用の多くのキットが、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ＣＡ）、ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ； Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ， ＭＡ）、およびＱｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ， Ｃａｎａｄａ； １−８８８−ＤＮＡ−ＫＩＴＳ）といった企業から入手できる。
【００３０】
種相同体の同定
セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドのポリヌクレオチド（下記）を使用して他の種、例えばマウス、サル、または酵母由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングするために好適なプローブまたはプライマーを作製し、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドの相同体をコードしているｃＤＮＡを同定し、そして当分野で周知のようにこのｃＤＮＡを発現させて、ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドの種相同体を得ることができる。
【００３１】
ポリヌクレオチド
セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であってよく、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドのコード配列又はその相補物を含む。ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼのコード配列を、配列番号１に示す。
【００３２】
ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードしている縮重ヌクレオチド配列、および、配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、好ましくは約７５、９０、９６または９８％一致するホモローガスなヌクレオチド配列またはその相補物もまた、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドである。二つのポリヌクレオチド配列間の配列一致パーセントは、ＡＬＩＧＮのようなコンピュータープログラムを用いて決定するが、これは、ギャップオープンペナルティー−１２およびギャップエクステンションペナルティー−２によるアフィンギャップ検索を用いるＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用するものである。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子、種相同体および生物学的に活性なセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードしているセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドの変異体もやはりセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドである。
【００３３】
ポリヌクレオチド変異体および相同体の同定
上記のセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチド変異体および相同体もまたセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドである。典型的には、相同セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチド配列は、当分野で周知のように、ストリンジェントな条件下で候補ポリヌクレオチドを既知のセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドにハイブリダイズさせることにより同定できる。例えば、以下の洗浄条件 −− ２Ｘ ＳＳＣ（０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１％ＳＤＳ、室温 ２回、各々３０分間；次いで２× ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０μＣ １回、３０分間；次いで２× ＳＳＣ、室温 ２回、各々１０分間 −− を使用して、最大約２５−３０％の塩基対ミスマッチ（不対合）を含む相同配列を同定できる。より好ましくは、相同核酸鎖は１５−２５％の塩基対ミスマッチを、さらに好ましくは５−１５％の塩基対ミスマッチを含む。
【００３４】
本明細書に開示するセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドの種相同体はさらに、適当なプローブまたはプライマーを作製し、他の種、例えばマウス、サル、または酵母由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることによって同定できる。セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドのヒト変異体は、例えばヒトｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることにより同定できる。二本鎖ＤＮＡのＴｍは相同性が１％低下する毎に１−１．５℃低下することがよく知られている（Ｂｏｎｎｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ８１，１２３（１９７３））。故にヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドの変異体または他の種のセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドは、推定の相同セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドを、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはその相補物とハイブリダイズさせて被験ハイブリッドを作製することによって同定できる。被験ハイブリッドの融解温度を完全に相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むハイブリッドの融解温度と比較し、被験ハイブリッド中の塩基対ミスマッチの数またはパーセントを算出する。
【００３５】
ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件に従いセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドまたはその相補物とハイブリダイズするヌクレオチド配列もまたセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドである。ストリンジェントな洗浄条件は当分野で周知且つ理解されており、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， ２ｄ ｅｄ．， １９８９， ９．５０−９．５１頁に開示されている。
【００３６】
典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のためには、温度と塩濃度の組み合わせを、検討中のハイブリッドの理論的Ｔｍよりおよそ１２−２０℃低くなるよう選択すべきである。配列番号１に示すヌクレオチド配列を有するセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドまたはその相補物と、それらのヌクレオチド配列のいずれか１つと少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、好ましくは約７５、９０、９６、または９８％一致するポリヌクレオチド配列とのハイブリッドのＴｍは、例えばＢｏｌｔｏｎおよびＭｃＣａｒｔｈｙ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ４８，１３９０（１９６２）の式：
Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／ｌ）、
［式中、ｌ＝塩基対で表したハイブリッドの長さ］
を用いて算出できる。
【００３７】
ストリンジェントな洗浄条件としては例えば、４× ＳＳＣ（６５℃）、または５０％ホルムアミド、４× ＳＳＣ（４２℃）、または０．５× ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（６５℃）が挙げられる。高度ストリンジェントな洗浄条件は、例えば０．２× ＳＳＣ（６５℃）などである。
【００３８】
ポリヌクレオチドの調製
セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドは、膜構成成分、タンパク質および脂質といった他の細胞成分を含まないよう単離できる。ポリヌクレオチドは、細胞に産生させて標準的核酸精製技術を用いて単離するか、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅技術を用いて、若しくは自動合成機を用いて合成することができる。ポリヌクレオチドを単離する方法は機械的であり、当分野で知られている。ポリヌクレオチドを取得するためのこのような任意の技術を用いて、単離されたセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドを得ることができる。例えば、制限酵素およびプローブを用いてセリン−スレオニンキナーゼヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド断片を単離できる。単離したポリヌクレオチドは他の分子を含まないか、あるいは少なくとも７０、８０、または９０％含まない調製物である。
【００３９】
ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼｃＤＮＡ分子は、セリン−スレオニンプロテインキナーゼｍＲＮＡを鋳型に用いて標準的分子生物学技術にて調製できる。その後ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼｃＤＮＡ分子は、当分野で周知でありＳａｍｂｒｏｏｋら．（１９８９）のようなマニュアルに開示される分子生物学技術を用いて複製できる。ヒトゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれかを鋳型として使用して本発明に係るポリヌクレオチドのさらなるコピーを得るため、ＰＣＲのような増幅技術を用いることができる。
【００４０】
別法として、合成化学技術を用いてセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドを合成することもできる。遺伝コードの縮重により、例えば配列番号２に示すアミノ酸配列を有するセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドまたはその生物学的に活性な変異体をコードする別のヌクレオチド配列の合成が可能になる。
【００４１】
ポリヌクレオチド伸長
本明細書に開示する部分配列を使って、その部分配列の由来となった対応する完全長遺伝子を同定することができる。部分配列にはニックトランスレーションを行なうか、または当業者に知られている標識方法により、ポリヌクレオチドキナーゼを使って、３２Ｐによる末端標識を行なうことができる（ＢＡＳＩＣ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｄａｖｉｓら編，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）。ヒト組織から作製したラムダライブラリーを、興味ある標識配列で直接スクリーニングするか、または細菌コロニースクリーニングが容易になるように、そのライブラリー全体をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．９２０３７）に変換することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９，１．２０頁参照）。
【００４２】
どちらの方法も当技術分野ではよく知られている。簡単に述べると、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに組み込まれたライブラリーを含む細菌コロニーまたはラムダプラークを含む細菌層を持つフィルターを変性し、ＤＮＡをそのフィルターに固定する。そのフィルターを、Ｄａｖｉｓら（１９８６）に記載のハイブリダイゼーション条件を用いて、標識プローブとハイブリダイズさせる。ラムダまたはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングした部分配列を陽性対照として使用することにより、バックグラウンド結合を評価し、正確なクローン同定に必要なハイブリダイゼーションストリンジェンシーおよび洗浄ストリンジェンシーを調節することができる。得られたオートラジオグラムをコロニーまたはプラークの複製プレートと比較する。感光した各スポットは陽性コロニーまたは陽性プラークに相当する。コロニーまたはプラークを選択し、拡大し、さらに解析および配列決定を行なうために、それらのコロニーからＤＮＡを単離する。
【００４３】
部分配列由来のプライマーとベクター由来のプライマーとを用いるＰＣＲを使って、陽性ｃＤＮＡクローンを解析することにより、それらが含んでいる追加配列の量を決定する。元の部分配列より大きいベクターインサートＰＣＲ産物を持つクローンを制限酵素消化およびＤＮＡｆ配列決定によって解析して、それらがノーザンブロット解析から決定されるｍＲＮＡサイズと同じサイズまたはよく似たサイズのインサートを含むかどうかを決定する。
【００４４】
１つまたはそれ以上のオーバーラップするｃＤＮＡクローンが同定されたら、例えばエキソヌクレアーゼＩＩＩ消化などを経て、そのクローンの完全配列を決定することができる（ＭｃＣｏｍｂｉｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３，３３−４０，１９９１）。一連の欠失クローンを作製し、そのそれぞれを配列決定する。得られたオーバーラップする配列を高い冗長性（通常、各ヌクレオチド位置に３〜５つのオーバーラップする配列）を持つ一つの連続した配列にアセンブルして、非常に正確な最終配列を得る。
【００４５】
ＰＣＲに基づく様々な方法を用いて、本明細書中に開示した核酸配列を伸長させ、プロモーターおよび調節要素といった上流配列を検出することができる。例えば制限部位ＰＣＲは、既知の座に隣接する未知配列を検索するため、ユニバーサルプライマーを使用する（Ｓａｒｋａｒ， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． ２，３１８−３２２，１９９３）。まず、ゲノムＤＮＡを、リンカー配列に対するプライマーと既知領域に特異的なプライマーの存在下で増幅する。次に、増幅させた配列を、同じリンカープライマーと最初のものの内部にある別の特異的プライマーを用いて、二回目のＰＣＲにかける。各回のＰＣＲ産物を適当なＲＮＡポリメラーゼで転写し、かつ逆転写酵素を用いて配列決定する。
【００４６】
既知領域に基づく異なる（ディバージェント）プライマーを用いて配列を増幅または伸長するために、逆ＰＣＲを使用することもできる（Ｔｒｉｇｌｉａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６，８１８６，１９８８）。ＯＬＩＧＯ ４．０６ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ， Ｍｉｎｎ．）のような市販ソフトウェアを用いて、長さ２２−３０ヌクレオチド長、５０％またはそれ以上のＧＣ含有量を持ち、約６８−７２℃の温度で標的配列とアニーリングするプライマーを設計できる。この方法は、幾つかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知領域に適当な断片を作り出せる。次いでこの断片を分子内ライゲーションにより環化し、ＰＣＲ鋳型として使用する。
【００４７】
使用できるもう一つの方法は、ヒトおよび酵母人工染色体ＤＮＡ中の既知配列に隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を含む、捕捉ＰＣＲである（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． １，１１１−１１９，１９９１）。この方法では、作製した二本鎖配列を、ＰＣＲの実施前に当該ＤＮＡ分子の未知断片中に入れるため、さらに複数の制限酵素消化とライゲーションを行うことができる。
【００４８】
未知配列を回収するために使用できるもう一つの方法はＰａｒｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９，３０５５−３０６０，１９９１の方法である。さらに、ＰＣＲ、ネスティド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマー、およびＰＲＯＭＯＴＥＲＦＩＮＤＥＲライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆ．）を用いてゲノムＤＮＡ歩行を行なうことができる（ＣＬＯＮＴＥＣＨ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆ．）。このプロセスはライブラリーをスクリーニングする必要性を排除し、イントロン／エクソン接合点の発見に有用である。
【００４９】
スクリーニングで完全長ｃＤＮＡを求める場合、より大きなｃＤＮＡを含むようサイズ選択したライブラリーを使用するのが望ましい。遺伝子の５’領域を含む配列をより多く含んでいるという点で、無作為プライミングしたライブラリーが好ましい。無作為プライミングしたライブラリーの使用は、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーが完全長ｃＤＮＡを産生しない状況で特に好ましいであろう。ゲノムライブラリーは、配列を５’非転写調節領域へと伸長させるのに有用な場合がある。
【００５０】
市販品が入手可能な毛細管電気泳動系を用いて、ＰＣＲまたは配列決定産物のサイズを分析、またはヌクレオチド配列を確認することができる。例えば、毛細管配列決定は、電気泳動分離用の流動性ポリマー、レーザー励起する４種の異なる蛍光色素（各ヌクレオチドにつき１種ずつ）、および電荷結合素子カメラによる放射された波長の検出を利用することができる。出力／光強度は適当なソフトウェア（例えばＧＥＮＯＴＹＰＥＲおよびＳｅｑｕｅｎｃｅ ＮＡＶＩＧＡＴＯＲ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて電気信号に変換でき、試料のロードからコンピューター分析および電子的データ表示に至る全プロセスをコンピューター管理することができる。毛細管電気泳動は、特定の試料中に限られた量で存在するかも知れないＤＮＡの小片を配列決定するのに特に好ましい。
【００５１】
ポリペプチドの取得
ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドは、例えばヒト細胞からの精製によって、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドの発現によって、または直接的化学合成によって取得できる。
【００５２】
タンパク質精製
ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドを、その酵素を発現する任意の細胞（セリン−スレオニンプロテインキナーゼ発現構築物でトランスフェクトした宿主細胞を含む）から精製することができる。精製セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドは、当分野で周知の方法を用いて、細胞内でセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドと通常会合している他の化合物、例えば特定のタンパク質、炭水化物または脂質から分離される。そのような方法には、サイズ排除クロマトフラフィー、硫酸アンモニウム分画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび調製用ゲル電気泳動が挙げられるが、これらに制限されない。精製セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドの調製物は、少なくとも８０％純粋であり、９０％、９５％または９９％純粋な調製物であることが好ましい。調製物の純度は当分野で周知の任意の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって評価できる。
【００５３】
ポリヌクレオチドの発現
セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドを発現させるため、挿入されたコード配列の転写と翻訳に必要な要素を含む発現ベクター中にそのポリヌクレオチドを挿入することができる。当業者に周知の方法を利用して、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードしている配列および適当な転写および翻訳調節要素を含む発現ベクターを構築できる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えがある。このような技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．， １９８９に記載されている。
【００５４】
様々な発現ベクター／宿主系を利用して、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードしている配列を組込み、そして発現させることができる。これらには、微生物、例えば組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌；酵母発現ベクターにより形質転換された酵母、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）により感染を受けた昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）、若しくは細菌発現ベクター（例えばＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）により形質転換された植物細胞系、または動物細胞系が包含されるがこれらに限定される訳ではない。
【００５５】
調節要素または調節配列は、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写と翻訳を実行するベクターの非翻訳領域−エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域−である。かかる要素はその強さと特異性において異なっている。利用するベクター系および宿主に応じて、構成的および誘導的プロモーターを包含する、多数の好適な転写および翻訳要素を使用できる。例えば、細菌系でクローニングを行う場合、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等のハイブリッドｌａｃＺプロモーターのような誘導的プロモーターを使用できる。バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターは昆虫細胞に使用できる。植物細胞のゲノムから誘導したプロモーターまたはエンハンサー（例えば熱ショック、ＲＵＢＩＳＣＯ、および貯蔵タンパク質遺伝子）、または植物ウイルスから誘導したプロモーターまたはエンハンサー（例えば、ウイルスプロモーターまたはリーダー配列）を該ベクター中にクローニングすることができる。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子由来の、または哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが好ましい。セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を複数コピー含む細胞系を作製する必要がある場合は、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターを適当な選択マーカーと共に使用することができる。
【００５６】
細菌および酵母発現系
細菌系では、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドに対して意図する用途に応じて幾つかの発現ベクターを選択できる。例えば、抗体の誘導のため、大量のセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドが必要である場合は、容易に精製できる融合タンパク質の高レベル発現を指令するベクターが使用できる。このようなベクターは、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のような多機能Ｅ．ｃｏｌｉクローニングおよび発現ベクターを包含するが、これに限定される訳ではない。ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴベクターにおいては、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードしている配列を、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔとこれに続く７残基の配列と共にフレーム内で該ベクター中にライゲーションすることができ、その結果ハイブリッドタンパク質が産生される。ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６４，５５０３−５５０９，１９８９）またはｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）もまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を伴う融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるのに使用できる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、その後遊離グルタチオンの存在下で溶離することにより、溶菌させた細胞から容易に精製できる。このような系で調製したタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、または第Ｘａ因子プロテアーゼ開裂部位を含むよう設計でき、その結果、目的とするクローンポリペプチドをＧＳＴ部分から随意に解放することができる。
【００５７】
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいては、α因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨのような構成的または誘導的プロモーターを含む幾つかのベクターが使用できる。総説としてＡｕｓｕｂｅｌら（１９８９）およびＧｒａｎｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３，５１６−５４４，１９８７を参照されたい。
【００５８】
植物および昆虫発現系
植物発現ベクターを使用する場合、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードしている配列の発現は、幾つかのプロモーターのうち任意のものにより駆動できる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターのようなウイルスプロモーターを、単独で、またはＴＭＶ由来のオメガリーダー配列と組み合わせて使用できる（Ｔａｋａｍａｔｓｕ， ＥＭＢＯ Ｊ． ６，３０７−３１１，１９８７）。別法として、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットのような植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを使用することもできる（Ｃｏｒｕｚｚｉら、ＥＭＢＯ Ｊ． ３，１６７１−１６８０，１９８４；Ｂｒｏｇｌｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４，８３８−８４３，１９８４；Ｗｉｎｔｅｒら、Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． １７，８５−１０５，１９９１）。これらの構築物は、直接ＤＮＡ形質転換または病原体媒介トランスフェクションにより植物細胞中に導入できる。このような技術は、幾つかの一般に入手可能な総説に記載されている（例えば、ＨｏｂｂｓまたはＭｕｒｒａｙ、ＭＣＧＲＡＷ ＨＩＬＬ ＹＥＡＲＢＯＯＫ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ， ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｐｐ１９１−１９６，１９９２）。
【００５９】
昆虫系もまたセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドの発現に使用できる。例えば、かかる系の１つでは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａの幼虫で外来遺伝子を発現させるベクターとして使用する。セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードしている配列を、ポリヘドリン遺伝子のような該ウイルスの非必須領域中にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの調節下に置くことができる。セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをうまく挿入すると、ポリヘドリン遺伝子は不活性化し、コートタンパク質を欠く組換えウイルスが生成する。次いでこの組換えウイルスをＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａの幼虫への感染に使用し、そこでセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドを発現させることができる（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ９１，３２２４−３２２７，１９９４）。
【００６０】
哺乳動物発現系
ウイルスに基づく多くの発現系を用いて哺乳動物宿主細胞でセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドを発現させることができる。例えば、発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードしている配列は、後期プロモーターおよび３部に分かれたリーダー配列を含むアデノウイルス転写／翻訳複合体中にライゲーションできる。該ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域における挿入を用いて、感染宿主細胞においてセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドを発現できる生存ウイルスを取得できる（Ｌｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８１，３６５５−３６５９，１９８４）。所望によりラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーのような転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞での発現を増大させることができる。
【００６１】
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）もまた、プラスミドが内包し発現するＤＮＡ断片よりも大きなＤＮＡ断片の運搬に使用できる。６Ｍから１０ＭのＨＡＣを組み立て、常套的送達法により細胞に到達させる（例えば、リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、または小胞）。
【００６２】
さらに、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードしている配列のより効率的な翻訳を達成するために、特異的開始シグナルを使用できる。かかるシグナルはＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を包含する。セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードしている配列、その開始コドン、および上流配列を適当な発現ベクター中に挿入した場合、さらなる転写または翻訳調節シグナルは必要ないであろう。しかしながら、コード配列またはその断片のみを挿入した場合は、外因性の翻訳調節シグナル（ＡＴＧ開始コドンを包含する）を供給すべきである。開始コドンは挿入物全体を確実に翻訳させるために、正しいリーディングフレームになければならない。外因性翻訳要素および開始コドンは天然および合成両者の様々な起源であってよい。発現の効率は、使用する特定の細胞系に対し適切なエンハンサーを存在させることにより増強できる（Ｓｃｈａｒｆら、Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０，１２５−１６２，１９９４）。
【００６３】
宿主細胞
宿主細胞菌株は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現されたセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドを所望の方法で処理できる能力を目的として選択できる。該ポリペプチドのこのような修飾には、アセチル化、カルボキシ化、グリコシル化、燐酸化、脂質化、およびアシル化が包含されるがこれらに限定されない。該ポリペプチドの「プレプロ」型を開裂する翻訳後プロセシングもまた、正しい挿入、折り畳み、および／または機能を促進するために使用できる。翻訳後活性のための特異的な細胞機構および特徴的メカニズムを持つ異なる宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３およびＷＩ３８）が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９）から入手でき、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実とするために選択できる。
【００６４】
組換えタンパク質の長期高収量産生のために、安定な発現が好ましい。例えば、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドを安定に発現する細胞系を、ウイルス複製起点および／または内因性発現要素、および同じまたは別のベクター上にある選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて形質転換することができる。該ベクターの導入に続いて、細胞を強化培地で１−２日間生育させた後、培地を選択培地に交換することができる。選択マーカーの目的は選択に対する抵抗性を付与することであり、その存在が、導入されたセリン−スレオニンプロテインキナーゼ配列をうまく発現する細胞の生育と回収を可能にする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型にとって適当な組織培養技術を用いて増殖させることができる。例えば、ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ， Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６を参照されたい。
【００６５】
幾つかの選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収できる。これらには、それぞれｔｋ−またはａｐｒｔ−細胞で使用できる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１，２２３−３２，１９７７）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ ２２，８１７−２３，１９８０）遺伝子が包含されるが、これらに限定される訳ではない。さらに、代謝拮抗物質、抗生物質、または除草剤耐性を選択の基準に用いることができる。例えば、ｄｈｆｒはメソトレキサートに対する耐性を付与し（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ７７，３５６７−７０，１９８０）、ｎｐｔはアミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を付与し（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０，１０１４，１９８１）、そしてａｌｓおよびｐａｔはそれぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与する（Ｍｕｒｒａｙ， １９９２，上記）。さらなる選択遺伝子が記載されている。例えば、ｔｒｐＢは細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用するようにさせ、ｈｉｓＤは細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用するようにさせる（Ｈａｒｔｍａｎ ＆ Ｍｕｌｌｉｇａｎ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８５，８０４７−５１，１９８８）。アントシアニンのような可視マーカー、β−グルクロニダーゼとその基質ＧＵＳ、およびルシフェラーゼとその基質ルシフェリンは、形質転換体を同定し、特異的ベクター系に帰すことのできる一過性または安定なタンパク質発現の量を定量するために使用できる（Ｒｈｏｄｅｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ５５，１２１−１３１，１９９５）。
【００６６】
発現の検出
マーカー遺伝子発現の存在はセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドも存在することを示唆しているが、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドの存在と発現は確認する必要があるかもしれない。例えば、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードしている配列がマーカー遺伝子配列内部に挿入されている場合、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードする配列を含んでいる形質転換細胞は、マーカー遺伝子機能の欠如によって同定することができる。別法として、単一のプロモーターの制御下に、マーカー遺伝子と、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードしている配列とを、タンデムに置くこともできる。誘導または選択に応答して起こるマーカー遺伝子の発現は、通常、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドの発現を示す。
【００６７】
これとは別に、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドを含み、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドを発現する宿主細胞は、当業者に知られる様々な方法によって同定できる。これらの方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびタンパク質バイオアッセイまたはイムノアッセイ技術（核酸またはタンパク質の検出および／または定量のための膜、溶液、またはチップに基づく技術を包含する）が包含されるがこれらに限定されない。例えば、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列の存在は、プローブまたは断片またはセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの断片を使用するＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたは増幅によって検出できる。核酸増幅に基づく検定は、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドを含む形質転換体を検出するための、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードしている配列から選択されるオリゴヌクレオチドの使用を含む。
【００６８】
セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドに対し特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかを使用して該ポリペプチドの発現を検出および測定するための様々なプロトコルが当分野で知られている。例として、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）がある。セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチド上の２個の非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる、２部位のモノクローナルに基づくイムノアッセイが使用でき、または、競合的結合検定を使用することができる。これらのおよびその他の検定はＨａｍｐｔｏｍら、ＳＥＲＯＬＯＧＩＣＡＬ ＭＥＴＨＯＤＳ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ， Ｓｔ．Ｐａｕｌ， Ｍｉｎｎ．， １９９０およびＭａｄｄｏｘら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １５８，１２１１−１２１６，１９８３に記載されている。
【００６９】
多岐にわたる標識およびコンジュゲーション技術が当業者に知られており、様々な核酸およびアミノ酸検定に使用できる。セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識化ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを調製する手段は、標識したヌクレオチドを使用する、オリゴ標識化、ニック翻訳、末端標識化、またはＰＣＲ増幅を包含する。これとは別に、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードしている配列を、ｍＲＮＡプローブの産生のためのベクター中にクローニングすることもできる。このようなベクターは当分野で既知であり、市販品が入手でき、標識化ヌクレオチドおよび適当なＲＮＡポリメラーゼ、例えばＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６を添加することによりインビトロでのＲＮＡプローブの合成に使用することができる。これらの方法は、市販の様々なキットを用いて実施できる（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、 Ｐｒｏｍｅｇａ、およびＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）。検出を容易にするために使用できる適当なリポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、および蛍光、化学ルミネセント、または色素生成物質、ならびに基質、補助因子、インヒビター、磁性粒子などが包含される。
【００７０】
ポリペプチドの発現および精製
セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列で形質転換させた宿主細胞は、発現と、細胞培養からのタンパク質の回収に適した条件下で培養できる。形質転換細胞により産生されたポリペプチドは、その配列および／または使用したベクターに応じて分泌されまたは細胞内に貯留され得る。当業者には理解できるであろうが、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核または真核細胞膜を通った可溶性セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドの分泌を指令する、または膜結合セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドの膜挿入を指令する、シグナル配列を含むよう設計できる。
【００７１】
上に論じたように、他の構築物を用いて、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードしている配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードしているヌクレオチド配列と結合させることができる。このような精製促進ドメインには、金属キレート化ペプチド、例えば固定化金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするタンパク質Ａドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／親和精製系で利用するドメインが包含されるが、これらに限定されない（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ．， Ｓｅａｔｔｌｅ， Ｗａｓｈ．）。精製ドメインとセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドとの間に開裂可能リンカー配列、例えば第Ｘａ因子またはエンテロキナーゼに特異的なリンカー配列を入れること（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）もまた、精製を促進するために利用できる。このような発現ベクターの１つは、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドと、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ開裂部位に先立つ６個のヒスチジン残基とを含む融合タンパク質の発現を提供する。このヒスチジン残基はＩＭＡＣ（Ｐｏｒａｔｈら、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ． ３，２６３−２８１，１９９２に記載の固定化金属イオン親和クロマトグラフィー）による精製を促進し、一方エンテロキナーゼ開裂部位は融合タンパク質からのセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドの精製手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターはＫｒｏｌｌら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２，４４１−４５３，１９９３に開示されている。
【００７２】
化学合成
セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードしている配列は、その全体または一部を、当分野で周知の化学的方法を用いて合成できる（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ． ２１５−２２３，１９８０；Ｈｏｒｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ． ２２５−２３２，１９８０）。これとは別に、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチド自身を、そのアミノ酸配列を合成するための化学的方法、例えば固相技術を用いる直接ペプチド合成を用いて調製できる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． ８５，２１４９−２１５４，１９６３；Ｒｏｂｅｒｇｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９，２０２−２０４，１９９５）。タンパク質合成は手動技術またはオートメーションを用いて実施できる。自動化合成は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａペプチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて達成できる。所望により、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドの断片を別々に合成し、化学的方法を用いて合して完全長の分子を調製することもできる。
【００７３】
新たに合成したペプチドは、調製用高速液体クロマトグラフイー（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， ＰＲＯＴＥＩＮＳ： ＳＴＲＵＣＴＵＲＥＳ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９８３）により実質的に精製できる。合成セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドの組成はアミノ酸分析または配列決定により確認できる（例えばエドマン分解法；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、上記を参照されたい）。さらに、直接合成中にセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドのアミノ酸配列の任意の部分を改変させ、そして／または化学的方法を用いて他のタンパク質由来の配列と合して、変異体ポリペプチドまたは融合タンパク質を調製することができる。
【００７４】
改変ポリペプチドの調製
当業者には理解できるであろうが、天然に存在しないコドンを有するセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドコード化ヌクレオチド配列を調製することは有利であり得る。例えば、特定の原核または真核宿主が好むコドンを選択して、タンパク質発現の速度を増大させ、または所望の性質、例えば天然に存在する配列から産み出される転写物の半減期より長い半減期を持つＲＮＡ転写物を調製することができる。
【００７５】
本明細書に開示するヌクレオチド配列は、当分野で一般的に知られる方法を用いて、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドまたはｍＲＮＡ産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を修飾する改変を包含する（但しこれらに限定される訳ではない）様々な理由で、該ポリペプチドコード配列を改変させるように設計できる。無作為断片化によるＤＮＡシャフリングと遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再集合を用いてヌクレオチド配列を設計できる。例えば、位置指定突然変異誘発を用いて、新たな制限部位を挿入し、グリコシル化パターンを変え、コドンの優先性を変え、スプライス変異体を調製し、突然変異を導入する等を実施できる。
【００７６】
抗体
当分野で知られているいかなる型の抗体も、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドのエピトープに特異的に結合するよう作製できる。本明細書で使用する「抗体」とは、無傷の免疫グロブリン分子、およびその断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖを包含し、これらはセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドのエピトープに結合できる。典型的には、エピトープを形成するためには少なくとも６、８、１０、または１２の連続するアミノ酸が必要である。しかしながら、非連続アミノ酸を含むエピトープはより多くの、例えば少なくとも１５、２５、または５０のアミノ酸を必要とするかも知れない。
【００７７】
セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドのエピトープに特異的に結合する抗体は治療に使用でき、そして免疫化学検定、例えばウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学検定、免疫沈降、またはその他の当分野で既知の免疫化学的検定に使用できる。所望の特異性を有する抗体の同定のため、様々なイムノアッセイが使用できる。競合的結合または免疫放射検定のための多数のプロトコルが当分野でよく知られている。このようなイムノアッセイは典型的には、免疫原と、その免疫原に特異結合する抗体との間の複合体形成の測定を含んでいる。
【００７８】
典型的には、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドに特異的に結合する抗体は、免疫化学検定に使用する時、他のタンパク質が提供する検出シグナルより少なくとも５、１０、または２０倍高い検出シグナルを提供する。好ましくは、セリン−スレオニンキナーゼポリペプチドに特異結合する抗体は、免疫化学検定で他のタンパク質を検出せず、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドを溶液から免疫沈降させることができる。
【００７９】
ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドは、哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、またはヒトを免疫してポリクローナル抗体を産生させるのに使用できる。所望により、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドは、担体タンパク質、例えば牛血清アルブミン、チログロブリン、およびスカシガイヘモシアニンとコンジュゲートさせることができる。宿主の種に応じて、免疫学的反応を増大させるために種々のアジュバントを使用できる。このようなアジュバントは、フロイントアジュバント、鉱物性ゲル（例えば水酸化アルミニウム）、および界面活性物質（例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、スカシガイヘモシアニン、およびジニトロフェノール）を包含するがこれらに限定されない。ヒトに使用するアジュバントの中ではＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｉ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍが特に有用である。
【００８０】
セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体は、培養中の連続的細胞系により抗体分子の産生を提供する任意の技術を用いて調製できる。これらの技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術があるがこれらに限定されない（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７，１９８５； Ｋｏｚｂｏｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１，３１−４２，１９８５； Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８０，２０２６−２０３０，１９８３； Ｃｏｌｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６２，１０９−１２０，１９８４）。
【００８１】
さらに、マウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子にスプライシングして適当な抗原特異性と生物活性を持つ分子を得る、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術が利用できる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８１，６８５１−６８５５，１９８４； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２，６０４−６０８，１９８４； Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４，４５２−４５４，１９８５）。モノクローナルおよびその他の抗体はまた、これを治療に使用した場合に患者が該抗体に対する免疫反応を起こすのを防ぐため、「ヒト化」することができる。このような抗体は、治療に直接使用できるほど配列が充分ヒトに類似しているかも知れず、または幾つかの重要残基の変更を必要とするかも知れない。齧歯類の抗体とヒト配列の間の配列相違は、個々の残基の位置指定突然変異誘発により、または相補性決定領域全体の格子により、ヒト配列内の残基と相違する残基を置き換えることによって最小化することができる。別法として、ヒト化抗体はＧＢ２１８８６３８Ｂに記載のように組換え法を用いて調製できる。セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドに特異的に結合する抗体は、Ｕ．Ｓ．５５６５３３２に開示のように、部分的または完全にヒト化した抗原結合部位を含むことができる。
【００８２】
これに代わり、当分野で既知の方法を用いて、一本鎖抗体の調製のために記載した技術を適合させ、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドに特異結合する一本鎖抗体を調製することができる。関連する特異性を持つが別個のイディオタイプ組成を有する抗体を、無作為組み合わせ免疫グロブリンライブラリーから鎖シャフリングによって調製することができる（Ｂｕｒｔｏｎ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８８，１１１２０−２３，１９９１）。
【００８３】
一本鎖抗体はまた、ハイブリドーマｃＤＮＡを鋳型に用いて、ＰＣＲのようなＤＮＡ増幅法を用いて組み立てることができる（Ｔｈｉｒｉｏｎら、１９９６， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ． ５，５０７−１１）。一本鎖抗体は単一または二重特異性であり得、また、二価または四価であり得る。四価二重特異性一本鎖抗体の組み立ては例えばＣｏｌｏｍａ ＆ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， １９９７， Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５，１５９−６３に教示されている。二価二重特異性一本鎖抗体の組み立てはＭａｌｌｅｎｄｅｒ ＆ Ｖｏｓｓ， １９９４， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６９，１９９−２０６に教示されている。
【００８４】
下記のように、一本鎖抗体をコードしているヌクレオチド配列を手動または自動ヌクレオチド合成を用いて組み立て、標準的組換えＤＮＡ法を用いて発現構築物中にクローニングし、そして細胞中に導入してコード配列を発現させることができる。別法として、一本鎖抗体を、例えば糸状ファージ技術を用いて直接調製することもできる（Ｖｅｒｈａａｒら、１９９５， Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６１，４９７−５０１； Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、１９９３， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ． １６５，８１−９１）。
【００８５】
セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドに特異結合する抗体はまた、リンパ球集団においてインビボ産生を誘導することによって、または、文献に開示されている極めて特異的な結合試薬のパネルまたは免疫グロブリンライブラリーをスクリーニングすることによって調製することもできる（Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８６，３８３３−３８３７，１９８９； Ｗｉｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３４９，２９３−２９９，１９９１）。
【００８６】
その他の型の抗体を、本発明方法において組み立て、治療に使用することができる。例えば、ＷＯ９３／０３１５１に開示のように、キメラ抗体を組み立てることができる。免疫グロブリンから誘導され多価且つ多重特異的である結合タンパク質、例えばＷＯ９４／１３８０４に記載の「ｄｉａｂｏｄｉｅｓ」もまた調製できる。
【００８７】
本発明に係る抗体は当分野で周知の方法により精製できる。例えば、抗体は、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドが結合しているカラムを通過させることにより親和精製できる。次いで、結合した抗体を、高い塩濃度の緩衝液を用いてカラムから溶出することができる。
【００８８】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に対し相補的なヌクレオチド配列である。いったん細胞中に導入されるとこの相補的ヌクレオチドは、該細胞が産生した天然配列と結合して複合体を形成し、転写または翻訳のいずれかを遮断する。好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも１１ヌクレオチド長であるが、少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、若しくは５０またはそれ以上のヌクレオチド長であってもよい。より長い配列もまた使用できる。アンチセンスオリゴヌクレオチド分子をＤＮＡ構築物に提供し、上記のように細胞中に導入して、その細胞におけるセリン−スレオニンプロテインキナーゼ遺伝子産物のレベルを低下させることができる。
【００８９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはこの両者の組み合わせであってよい。オリゴヌクレオチドは、１つのヌクレオチドの５’末端を、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロアミデート、燐酸エステル、カルバメート、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、カルボネート、および燐酸トリエステルといった非ホスホジエステルヌクレオチド間結合で、別のヌクレオチドの３’末端と共有結合させることにより、手動で、または自動合成機によって合成できる。Ｂｒｏｗｎ， Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０，１−８，１９９４； Ｓｏｎｖｅａｕｘ， Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２６，１−７２，１９９４； Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ． ９０，５４３−５８３，１９９０を参照されたい。
【００９０】
セリン−スレオニンプロテインキナーゼ遺伝子の制御、５’、または調節領域と二本鎖を形成するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することにより、セリン−スレオニンプロテインキナーゼ遺伝子発現の修飾が得られる。転写開始部位、例えば開始部位から−１０および＋１０位の間から誘導されるオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、「三重らせん」塩基対合法を用いて阻害を達成できる。三重らせん対合は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子またはシャペロンの結合に対して十分に開くという能力の阻害を引き起こすため、有用である。三本鎖ＤＮＡを用いる治療上の進歩が文献に記載されている（例えばＧｅｅら、Ｈｕｂｅｒ ＆ Ｃａｒｒ， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＡＮＤ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣ ＡＰＰＲＯＡＣＨＥＳ， Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｍｔ．Ｋｉｓｃｏ， Ｎ．Ｙ．， １９９４）。転写物がリボソームに結合するのを防ぐことによりｍＲＮＡの翻訳を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた設計できる。
【００９１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドの相補配列との間に好結果の複合体を形成させるためには、正確な相補性は必要ない。例えばセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドに対し正確に相補的な連続するヌクレオチドからなる２、３、４、若しくは５つまたはそれ以上の区間（ストレッチ）を含み、その各々が、隣接するセリン−スレオニンプロテインキナーゼヌクレオチドとは相補的ではない連続するヌクレオチドからなる１区間（ストレッチ）によって隔てられているアンチセンスオリゴヌクレオチドは、セリン−スレオニンプロテインキナーゼｍＲＮＡに対して充分な標的化特異性を提供できる。好ましくは、相補的な連続ヌクレオチドの各区間（ストレッチ）は少なくとも４、５、６、７若しくは８ヌクレオチド長またはそれ以上である。非相補的な介在配列は、好ましくは１、２、３、または４ヌクレオチド長である。当業者は、アンチセンス−センスの対の算出融点を容易に使用して、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドと特定のセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチド配列間で寛容されるミスマッチの程度を決定できるであろう。
【００９２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドとハイブリダイズする能力に影響を及ぼすことなく修飾できる。これらの修飾は該アンチセンス分子の内部、または一端若しくは両端である。例えば、ヌクレオシド間の燐酸結合は、アミノ基と末端リボースの間にいろいろな数の炭素残基を有するコレステリルまたはジアミン部分を加えることによって修飾できる。修飾された塩基および／または糖、例えばリボースの代わりのアラビノース、または３’ヒドロキシ基または５’燐酸基が置換されている３’，５’−置換オリゴヌクレオチドもまた修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドに使用できる。これらの修飾オリゴヌクレオチドは当分野で周知の方法により調製できる。例えば、Ａｇｒａｗａｌら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０，１５２−１５８，１９９２； Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ． ９０，５４３−５８４，１９９０； Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ． ２１５，３５３９−３５４２，１９８７を参照されたい。
【００９３】
リボザイム
リボザイムは触媒活性を有するＲＮＡ分子である。例えば、Ｃｅｃｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６，１５３２−１５３９； １９８７； Ｃｅｃｈ， Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５９，５４３−５６８； １９９０， Ｃｅｃｈ， Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ． ２，６０５−６０９； １９９２， Ｃｏｕｔｕｒｅ ＆ Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １２，５１０−５１５， １９９６を参照されたい。当分野で知られるように、リボザイムは、ＲＮＡ配列を開裂することにより遺伝子機能を阻害するのに使用できる（例えば、Ｈａｓｅｌｏｆｆら、米国特許５６４１６７３）。リボザイムの作用機構は、相補的標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、その後のエンドヌクレオ分解的な（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）開裂を含む。例には、特異的ヌクレオチド配列のエンドヌクレオ分解的な開裂を特異的且つ効果的に触媒できる、設計されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子がある。
【００９４】
セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドのコード配列を用いて、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドから転写されたｍＲＮＡに特異結合するリボザイムを作製できる。他のトランスのＲＮＡ分子を極めて配列特異的に開裂できるリボザイムを設計し組み立てる方法が開発され、当分野で記載されている（Ｈａｓｅｌｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４，５８５−５９１，１９８８）。例えば、リボザイムの開裂活性は、別個の「ハイブリダイゼーション」領域を該リボザイム中に組み入れることによって、特定のＲＮＡを標的とさせることができる。このハイブリダイゼーション領域は標的ＲＮＡに対し相補的な配列を含んでおり、したがってその標的と特異的にハイブリダイズする（例えばＧｅｒｌａｃｈら、ＥＰ３２１２０１を参照されたい）。
【００９５】
セリン−スレオニンプロテインキナーゼＲＮＡ標的内部の特異的リボザイム開裂部位は、この標的分子を、以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣを包含するリボザイム開裂部位についてスキャンすることにより同定できる。同定できたならば、該開裂部位を含む標的ＲＮＡの領域に対応する、１５および２０の間のリボヌクレオチドを有する短いＲＮＡ配列を、標的を非機能的にし得る二次構造の特徴について評価できる。さらに、候補のセリン−スレオニンプロテインキナーゼＲＮＡ標的の適合性を、リボヌクレアーゼ防護検定を用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対する利用可能性を試験することによって評価できる。より長い相補配列を用いて、標的に対するハイブリダイゼーション配列の親和性を増大させることができる。リボザイムのハイブリダイズおよび開裂する領域は、相補領域を介して標的ＲＮＡにハイブリダイズする時、リボザイムの触媒領域が標的を開裂し得るといったように、完全に相関している。
【００９６】
リボザイムはＤＮＡ構築物の一部として細胞内に導入できる。マイクロ注入、リポソーム媒介トランスフェクション、電気穿孔、または燐酸カルシウム沈殿といった機械的方法を用いて、セリン−スレオニンプロテインキナーゼ発現の低下が望まれる細胞中にリボザイム含有ＤＮＡ構築物を導入することができる。これとは別に、細胞がＤＮＡ構築物を安定的に保持することが望まれる場合は、該構築物をプラスミド上で供給し、当分野で知られるように、別個の要素として維持するか、または細胞のゲノム中に組み込むことができる。リボザイムコード化ＤＮＡ構築物は、細胞中のリボザイムの転写を調節するために、プロモーター要素、エンハンサーまたはＵＡＳ要素、および転写ターミネーターシグナルといった転写調節要素を含み得る。
【００９７】
Ｈａｓｅｌｏｆｆら、米国特許５６４１６７３に教示のように、リボザイムは、標的遺伝子の発現を誘導する因子に応答してリボザイムの発現が起こるように設計することができる。リボザイムはまた、追加レベルの調節を提供するよう設計でき、その結果、ｍＲＮＡの破壊はリボザイムと標的遺伝子の両者が細胞に誘導された時にのみ起こる。
【００９８】
差次的発現遺伝子
本明細書には、ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼと相互作用する産物を持つ遺伝子の同定方法を記載する。そのような遺伝子は、例えば癌、ＣＮＳ障害、糖尿病、喘息、およびＣＯＰＤなど（ただしこれらに限らない）の障害に際して差次的に発現する遺伝子に相当するかもしれない。さらにそのような遺伝子は、そのような疾患の進行または処置に関係する操作に応答して差次的に調節される遺伝子に相当するかもしれない。また、そのような遺伝子の発現は時間的調整を受け、組織発生または生物発生の様々な段階で増減するかもしれない。差次的に発現する遺伝子は、対照条件下と実験条件下とでは、その発現が調整されるかもしれない。また、ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼ遺伝子または遺伝子産物そのものを差次的発現について調べてもよい。
【００９９】
正常状態と疾患状態とを比較した場合の発現差の度合いは、標準的なキャラクタリゼーション技術、例えばディファレンシャルディスプレイ法などによって視覚化するのに十分な大きさでさえあればよい。発現差を視覚化する手段になりうる標準的キャラクタリゼーション技術は、他にも、例えば定量的ＲＴ（逆転写酵素）、ＰＣＲ、およびノーザン解析などがあるが、これらに限るわけではない。
【０１００】
差次的発現遺伝子の同定
差次的発現遺伝子を同定するには、全ＲＮＡか、好ましくはｍＲＮＡを、関心ある組織から単離する。例えば、実験被験体の組織と、対照被験体の対応する組織とから、ＲＮＡ試料を得る。そのようなＲＮＡ試料の精製には、ｍＲＮＡの単離を妨げるような選択をしない任意のＲＮＡ単離技術を利用してよい。例えばＡｕｓｕｂｅｌら編「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク，１９８７−１９９３）を参照されたい。当業者に周知の技術、例えばＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉの米国特許第４，８４３，１５５号の一段階ＲＮＡ単離法などを使って、多数の組織試料を容易に処理することができる。
【０１０１】
収集したＲＮＡ試料のうち、差次的発現遺伝子が産生するＲＮＡに相当する転写物は、当業者に周知の方法によって同定される。そのような方法には、例えばディファレンシャルスクリーニング（Ｔｅｄｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５，２０８−１２，１９８８）、サブトラクティブハイブリダイゼーション（Ｈｅｄｒｉｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ ３０８，１４９−５３； Ｌｅｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８８，２８２５，１９８４）、そして好ましくはディファレンシャルディスプレイ（Ｌｉａｎｇ ＆ Ｐａｒｄｅｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７，９６７−７１，１９９２；米国特許第５，２６２，３１１号）などがある。
【０１０２】
差次的発現情報そのものからは、ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼが関与する障害を処置するための関連方法が示唆されるかもしれない。例えば、処置には、差次的発現遺伝子および／またはヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼをコードする遺伝子の発現の調整が含まれるかもしれない。差次的発現情報により、差次的に発現する遺伝子もしくは遺伝子産物またはヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼ遺伝子もしくは遺伝子産物の発現または活性がアップレギュレートされるかダウンレギュレートされるかが、わかるかもしない。
【０１０３】
スクリーニング方法
本発明は、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドまたはセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドに結合する、またはその活性を調節する、被験化合物をスクリーニングするための検定を提供する。好ましくは、被験化合物はセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する。より好ましくは、被験化合物は、活性を、被験化合物の不在時に比較して少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％低下または増大させる。
【０１０４】
被験化合物
被験化合物は当分野で既知の薬理学的物質であってよく、または薬理活性を持っていることが前もって分かっていない化合物であってよい。この化合物は天然に存在する、または実験室で設計されたものであってよい。これらは、微生物、動物、または植物から単離されたものであってよく、そして組換え的に調製され、または当分野で既知の化学的方法により合成されたものであってよい。所望により被験化合物は、生物学的ライブラリー、空間的アドレス特定可能な並行固相または液相ライブラリー、デコンボルーションを要する合成ライブラリー法、「一ビーズ一化合物」ライブラリー法、および親和クロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を包含する（但しこれらに限定される訳ではない）当分野で既知の数多くの組み合わせライブラリー法のいずれかを用いて取得できる。生物学的ライブラリーアプローチはポリペプチドライブラリーに限定されているが、他の４種のアプローチはポリペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーに適用できる。Ｌａｍ， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． １２，１４５，１９９７を参照されたい。
【０１０５】
分子ライブラリーの合成法は当分野でよく知られている（例えば、ＤｅＷｉｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０，６９０９，１９９３； Ｅｒｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９１，１１４２２，１９９４； Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． ３７，２６７８，１９９４； Ｃｈｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１，１３０３，１９９３； Ｃａｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ． ３３，２０５９，１９９４； Ｃａｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ． ３３，２０６１； Ｇａｌｌｏｐら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． ３７，１２３３，１９９４を参照されたい）。化合物のライブラリーは溶液で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３，４１２−４２１，１９９２）、またはビーズ（Ｌａｍ， Ｎａｔｕｒｅ ３５４，８２−８４，１９９１）、チップ（Ｆｏｄｏｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３６４，５５５−５５６，１９９３）、細菌または胞子（Ｌａｄｎｅｒ、米国特許５２２３４０９）、プラスミド（Ｃｕｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９，１８６５−１８６９，１９９２）、またはファージ（Ｓｃｏｔｔ ＆ Ｓｍｉｔｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，３８６−３９０， １９９０； Ｄｅｖｌｉｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，４０４−４０６，１９９０）；Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７，６３７８−６３８２，１９９０； Ｆｅｌｉｃｉ， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２２２，３０１−３１０，１９９１； およびＬａｄｎｅｒ、米国特許５２２３４０９）上に提供できる。
【０１０６】
ハイスループットスクリーニング
被験化合物は、高（ハイ）スループットスクリーニングを用いて、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する能力、またはセリン−スレオニンプロテインキナーゼ活性若しくはセリン−スレオニンプロテインキナーゼ遺伝子発現に影響を及ぼす能力についてスクリーニングできる。ハイスループットスクリーニングを使用して、多くの個別的化合物を並行して試験でき、その結果多数の被験化合物を迅速にスクリーニングできる。最も広範に確立されている技術は９６ウェル微量定量プレートを利用するものである。この微量定量プレートのウェルは、典型的には５０から５００μｌの範囲の検定容量を必要とする。このプレートに加えて、９６ウェルフォーマットに適合させた多くの機器、材料、ピペット、ロボット、プレート洗浄機、およびプレート読み取り機が市販されている。
【０１０７】
別法として、「自由フォーマット検定」、または試料間に物理的障壁を持たない検定が使用できる。例えば、組み合わせペプチドライブラリーのための、単純な均質検定で色素細胞（メラノサイト）を用いる検定が、Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． １９，１６１４−１８（１９９４）に記載されている。ペトリ皿中のアガロースの下にこの細胞を入れ、次いで組み合わせ化合物を伴っているビーズをアガロースの表面に載せる。組み合わせ化合物はこのビーズから化合物を部分的に放出する。化合物がゲルマトリックス中へと局所的に拡散するにつれて活性化合物が細胞の色の変化を惹起するため、活性化合物を暗色色素領域として視覚化することができる。
【０１０８】
自由フォーマット検定のもう一つの例は、生体分子スクリーニング学会第１回年次総会（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．、１９９５年１１月７−１０日）で報告されたＣｈｅｌｓｋｙ、「組み合わせライブラリーのスクリーニングのための戦略：新規な、そして伝統的なアプローチ」により記載されている。Ｃｈｅｌｓｋｙは、カルボニックアンヒドラーゼのための単純な均質酵素検定をアガロースゲルの内部に入れ、その結果ゲル中の酵素がゲル全体に色の変化を惹起するようにさせた。その後、光リンカーを介して組み合わせ化合物を持つビーズをゲル内部に入れ、すると該化合物はＵＶ光により部分的に放出された。酵素を阻害する化合物は、色の変化がより少ない局所阻害領域として観察された。
【０１０９】
さらに別の例がＳａｌｍｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ２，５７−６３（１９９６）に記載されている。この例では、組み合わせライブラリーを、寒天中で生育する癌細胞への細胞毒性効果を有する化合物についてスクリーニングした。
【０１１０】
もう一つのハイスループットスクリーニング法がＢｅｕｔｅｌら、米国特許５９７６８１３に記載されている。この方法では、被験試料を多孔性マトリックスに入れる。次に１またはそれ以上の検定成分を、マトリックス、例えばゲル、プラスチックシート、フィルター、またはその他の形の容易に操作できる固体担体の内部、上、または底に入れる。試料がこの多孔性マトリックスに導入されるとこれらは充分ゆっくりと拡散し、その結果、被験試料が混ざらずに検定が遂行できる。
【０１１１】
結合検定
結合検定について、被験化合物は、例えばセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドの活性部位に結合してこれを占有する結果、正常な生物活性を妨げるような、小分子であることが好ましい。このような小分子の例は、小ペプチドまたはペプチド様分子を包含するが、これらに限定される訳ではない。
【０１１２】
結合検定では、被験化合物またはセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドのいずれかが検出可能な標識、例えば蛍光、放射性同位元素、化学ルミネセント、または酵素標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼ）を含むことができる。そこで、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドに結合している被験化合物の検出は、例えば放射能の放出を直接計数することにより、またはシンチレーション計数により、または検出可能産物への適当な基質の変換を測定することにより、達成できる。
【０１１３】
別法として、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドへの被験化合物の結合を、反応体のいずれをも標識せずに測定することができる。例えば、マイクロフィジオメーターを用いて、被験化合物とセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドとの結合を検出できる。マイクロフィジオメーター（例えばサイトセンサーＴＭ）とは、細胞がその環境を酸性化する速度を光アドレッサブル電位差センサー（ＬＡＰＳ）を用いて測定する分析機器である。この酸性化速度の変化は、被験化合物とセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドの相互作用の指標として使用できる（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７，１９０６−１９１２，１９９２）。
【０１１４】
被験化合物がセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドに結合する能力の測定はまた、実時間Ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＩＡ）のような技術を用いて達成できる（Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ ＆ Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ， Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ． ６３，２３３８−２３４５，１９９１、およびＳｚａｂｏら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ． ５，６９９−７０５，１９９５）。ＢＩＡは、いかなる反応体をも標識せずに、生体特異的相互作用を実時間で研究するための技術である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））。光学的現象表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の変化を、生体分子間の実時間反応の指標に使用できる。
【０１１５】
本発明のさらに別の態様では、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドを二ハイブリッド検定または三ハイブリッド検定（例えば、米国特許５２８３３１７； Ｚｅｒｖｏｓら、Ｃｅｌｌ ７２，２２３−２３２，１９９３； Ｍａｄｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８，１２０４６−１２０５４，１９９３； Ｂａｒｔｅｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４，９２０−９２４，１９９３； Ｉｗａｂｕｃｈｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８，１６９３−１６９６，１９９３； およびＢｒｅｎｔ ＷＯ９４／１０３００）における「おとりタンパク質」として使用し、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドに結合またはこれと相互作用してその活性を調節する他のタンパク質を同定することができる。
【０１１６】
二ハイブリッド系は殆どの転写因子のモジュール的性格に基づくものであり、それは、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインから成っている。簡潔に述べると、この検定は二種の異なるＤＮＡ構築物を利用する。例えば、一方の構築物においては、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが、既知の転写因子のＤＮＡ結合ドメインをコードしているポリヌクレオチドに融合できる（例えばＧＡＬ−４）。別の構築物においては、未同定タンパク質（「餌」または「試料」）をコードしているＤＮＡ配列が、既知の転写因子の活性化ドメインをコードしているポリヌクレオチドに融合できる。もし「おとり」および「餌」タンパク質がインビボで相互作用してタンパク質依存複合体を形成できたならば、該転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインは極めて近位に招来される。この近位性が、転写因子に応答する転写調節部位と機能的に結合しているリポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写を可能にする。リポーター遺伝子の発現が検出でき、機能的転写因子を含む細胞コロニーを単離し、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドと相互作用するタンパク質をコードしているＤＮＡ配列取得に使用することができる。
【０１１７】
反応体の一方または両方の非結合型からの結合型の分離を促進するため、そして検定の自動化の便宜を図るため、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物のいずれかを固定化することが望ましいかも知れない。したがって、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物のいずれかを固体支持体に結合させることができる。好適な固体支持体は、ガラスまたはプラスチックスライド、組織培養プレート、微量定量ウェル、管、シリコンチップ、またはビーズ（ラテックス、ポリスチレン、またはガラスビーズを包含するがこれらに限定されない）のような粒子を包含するがこれらに限定されない。共有および非共有結合、受動吸収、またはそれぞれポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物に付着させた結合部分と固体支持体の対、の使用を包含する、当分野で既知の任意の方法を用いて酵素ポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物を固体支持体に付着させることができる。被験化合物は好ましくは整列して固体支持体に結合させ、その結果個々の被験化合物の位置を追跡することができる。セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチド（またはポリヌクレオチド）への被験化合物の結合は、反応体を入れるのに適した任意の容器で達成できる。かかる容器の例には微量定量プレート、試験管、および微量遠沈管がある。
【０１１８】
一つの態様において、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドは、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドを固体支持体に結合させるドメインを含む融合タンパク質である。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）上またはグルタチオン誘導体化微量定量プレート上に吸着させ、次いでこれを被験化合物または被験化合物および非吸着セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドに合し；次にこの混合物を複合体形成が行われる条件下でインキュベートする（例えば、塩およびｐＨに関して生理的条件）。インキュベーションの後、ビーズまたは微量定量プレートのウェルを洗浄して未結合成分を除去する。反応体の結合は上記のように直接的または間接的に測定できる。別法として、複合体を固体支持体から解離させた後に結合を測定することもできる。
【０１１９】
本発明に係るスクリーニング検定には、タンパク質またはポリヌクレオチドを固体支持体上に固定化するためのその他の技術を使用することもできる。例えば、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物のいずれかを、ビオチンとストレプトアビジンのコンジュゲーションを利用して固定化できる。当分野で周知の技術（例えばビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）を用いて、ビオチニル化したセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物をビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジン被覆した９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定化できる。別法として、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチド、ポリヌクレオチド、または被験化合物に特異的に結合するが、所望の結合部位、例えばセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドの活性部位に干渉しない抗体をプレートのウェルに誘導体化することができる。未結合の標的またはタンパク質が抗体コンジュゲーションによりウェル中に捕捉できる。
【０１２０】
ＧＳＴ−固定化複合体について上に記載した方法に加え、このような複合体を検出する方法には、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドまたは被験化合物に特異結合する抗体を用いる、複合体の免疫検出、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドの活性検出に依拠する酵素結合検定、および非還元条件下でのＳＤＳゲル電気泳動がある。
【０１２１】
セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する被験化合物を求めるスクリーニングは、無傷の細胞で実施することもできる。セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む任意の細胞が、細胞に基づく検定系で使用できる。セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドは細胞中に天然に存在し、または上記のような技術を用いて導入できる。セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する被験化合物の結合は、上記のように測定する。
【０１２２】
酵素検定
ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドのキナーゼ活性を増大または低下させる能力について、被験化合物を試験できる。キナーゼ活性は、例えば実施例４に記載のように測定できる。
【０１２３】
酵素検定は、精製セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチド、細胞膜調製物または無傷の細胞と、被験化合物とを接触させた後に実施できる。セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドのキナーゼ活性を少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０または１００％低下させる被験化合物を、セリン−スレオニンプロテインキナーゼ活性を低下させる可能性のある治療物質として同定する。ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドのキナーゼ活性を少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０または１００％増大させる被験化合物を、ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼ活性を増大させる可能性のある治療物質として同定する。
【０１２４】
遺伝子発現
別の態様では、セリン−スレオニンプロテインキナーゼ遺伝子の発現を増大または減少させる被験化合物を同定する。セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドを被験化合物と接触させ、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドのＲＮＡ産物またはポリペプチド産物の発現を測定する。被験化合物存在下での適当なｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルを、該被験化合物不在下でのｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルと比較する。すると被験化合物が、この比較に基づく発現のモジュレーターとして同定できる。例えば、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、被験化合物の不在時よりも存在時により大きい場合は、この被験化合物を、該ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現の刺激物質または増強物質と同定する。そうではなく、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、被験化合物の不在時よりも存在時により小さい場合は、この被験化合物を、該ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現のインヒビターと同定する。
【０１２５】
細胞におけるセリン−スレオニンプロテインキナーゼｍＲＮＡまたはポリペプチド発現のレベルは、ｍＲＮＡまたはポリペプチドを検出するための当分野で周知の方法により決定できる。定性または定量的方法のいずれかが使用できる。セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドのポリペプチド産物の存在は、例えばラジオイムノアッセイのような免疫化学的方法、ウエスタンブロッティング、および免疫組織化学を包含する、当分野で周知の様々な技術を用いて決定できる。別法として、ポリペプチド合成は、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチド内への標識アミノ酸の取り込みを検出することにより、インビボで、細胞培養で、またはインビトロ翻訳系で決定できる。
【０１２６】
このようなスクリーニングは、無細胞検定系または無傷の細胞のいずれかで実施できる。セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドを発現するいかなる細胞も細胞に基づく検定系で使用できる。セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチドは細胞内に天然に存在するか、または上記のような技術を用いて導入することができる。一次培養または確立された細胞系、例えばＣＨＯまたはヒト胚性腎２９３細胞のいずれかを使用できる。
【０１２７】
医薬組成物
本発明はさらに、治療効果を達成するために患者に投与できる医薬組成物を提供する。本発明に係る医薬組成物は、例えばセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチド、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリヌクレオチド、リボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドに特異的に結合する抗体、またはセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチド活性のミメティック（模倣体）、アクチベーター、インヒビター、又はインヒビターを含み得る。この組成物は単独で、または少なくとも１種類の他の物質、例えば安定化化合物と組み合わせて投与でき、これは、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、および水を包含する（但しこれらに限定されない）任意の無菌で生物学的適合性のある製薬的担体中で投与できる。この組成物は単独で、または他の物質、薬物またはホルモンと組み合わせて患者に投与できる。
【０１２８】
活性成分に加えてこれらの医薬組成物は、賦形剤および補助物質を含む適当な製薬的に許容し得る担体を含有でき、これらは、製薬的に使用できる調製物への活性化合物の処理を促進する。本発明に係る医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、非経口、局所、舌下、または直腸手段を包含する（但しこれらに限定されない）多くの経路により投与できる。経口投与用医薬組成物は、当分野で既知の製薬的に許容し得る担体を用いて経口投与に適した用量に調合できる。このような担体により、該医薬組成物を、患者が内服するための錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などに調合できる。
【０１２９】
経口使用のための医薬製剤は、活性化合物を、固体賦形剤と合し、得られた混合物を所望により粉砕し、そしてこの顆粒混合物を、所望ならば適当な補助物質を加えた後に、錠剤または糖衣錠核が得られるように加工することによって得ることができる。好適な賦形剤は炭水化物またはタンパク質増量剤、例えば乳糖、シュクロース、マンニトール、またはソルビトールを包含する糖；トウモロコシ、小麦、米、馬鈴薯、またはその他の植物由来の澱粉；セルロース、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム；アラビアゴムおよびトラガカントゴムを包含するゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質である。所望により崩壊剤または可溶化剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを添加できる。
【０１３０】
糖衣剤核は、濃縮糖溶液のような適当な被覆剤と共に使用でき、これはさらに、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ｃａｒｂｏｐｏｌゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含むことができる。製品の同定のためまたは活性化合物の量、即ち用量をあらわすために染料または色素を錠剤または糖衣被覆剤に添加できる。
【０１３１】
経口的に使用できる医薬調合物は、ゼラチン製の押してはめ込むカプセル剤、ならびに、ゼラチンおよび被覆剤、例えばグリセロールまたはソルビトールでできた軟封入カプセル剤を包含する。押してはめ込むカプセル剤は、活性成分を、乳糖または澱粉のような増量剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および所望により安定剤と混合して含有できる。軟カプセル剤では、活性化合物を、安定剤を加えたまたは加えない適当な液体、例えば脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコールに溶解または懸濁できる。
【０１３２】
非経口投与に好適な医薬製剤は、水溶液、好ましくは生理学的適合性の緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的に緩衝化した食塩水中で調合できる。水性注射用懸濁剤は、該懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有できる。さらに、活性化合物の懸濁剤は適当な油性注射用懸濁剤として調製できる。好適な親油性溶媒または媒質は、胡麻油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを包含する。非脂質ポリカチオンアミノポリマーもまた送達に使用できる。所望により懸濁剤は、化合物の溶解性を増し高濃縮溶液の調製を可能にするような適当な安定剤または物質を含むことができる。局所または鼻腔投与のためには、透過すべき特定の障壁に対し適当な浸透剤を製剤に使用する。このような浸透剤は当分野で一般に知られている。
【０１３３】
本発明に係る医薬組成物は当分野で既知の方法で、例えば常套的混合、溶解、顆粒化、糖衣剤製造、すりつぶし、乳化、カプセル化、捕捉、または凍結乾燥プロセスによって製造できる。この医薬組成物は塩として提供でき、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、琥珀酸などを包含する（但しこれらに限定されない）多くの酸を用いて調製できる。塩は、水性または他のプロトン性溶媒において、対応する遊離塩基型よりもより可溶性の傾向がある。別の場合には、好ましい調製物は、ｐＨ範囲４．５から５．５において以下のもの：１−５０ｍＭヒスチジン、０．１％−２％シュクロース、および２−７％マンニトール、の全てまたは任意のものを含有できる凍結乾燥粉末であってよく、これを使用前に緩衝液と合する。
【０１３４】
調合と投与のための技術のさらなる詳細は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ）の最新版に見出すことができる。医薬組成物を製造した後、これらを適当な容器に入れ、適応状態の治療のためにラベルを貼る。このようなラベル表示は、投与の量、頻度、および投与方法を包含する。
【０１３５】
治療上の適応および方法
本明細書に開示するヒトセリン−スレオニンキナーゼは、過去に同定されたセリン−スレオニンキナーゼと同じ目的に、おそらく役立つだろう。例えば、β型トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−β）は、セリン／スレオニンキナーゼ活性を有する細胞表面受容体に結合しその受容体を活性化して、様々な細胞タイプの増殖および分化を調節する。Ａｔｆｉら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ９２，１２１１０−０４，１９９５）は、ＴＧＦ−βが７８ｋＤａタンパク質（ｐ７８）セリン／スレオニンキナーゼを活性化すること、そしてこのｐ７８キナーゼはＴＧＦ−βが成長阻害因子として作用する細胞でのみ活性化されることを明らかにした。本明細書に開示するヒトセリン−スレオニンキナーゼも、そのようなシグナル伝達に関与するかもしれない。したがって、その活性の調節は、そのようなシグナル伝達に欠陥を持つ障害の処置に使用することができる。
【０１３６】
ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼを調節して癌を処置することができる。癌は、基本的に発癌性細胞形質転換によって発症する疾患である。形質転換細胞をそれらの正常な対応物から区別し、かつ癌の病態生理の基礎をなす形質転換細胞の特徴は幾つかある。それらには、非制御型細胞性増殖、通常の死誘導シグナルに対する不応答（不死化）、増大した細胞運動性及び侵襲性、新たな血管新生の誘導を通じた血液供給を補充するための増大した能力（血管新生）、遺伝子の不安定性、並びに調節不全遺伝子発現が挙げられる。薬剤耐性の獲得とともに、これらの異常な生理機能の種々の組み合わせにより、最終的に臓器不全および患者の死となる難治性疾患状態に頻繁に陥る。
【０１３７】
最も一般的な癌治療は、細胞増殖を標的とし、形質転換細胞と正常細胞との増殖能の差に頼ってその効力を発揮する。このアプローチは、幾つかの重要な正常細胞タイプもまた高増殖であり、かつ癌細胞が高頻度にこれらの物質に対して耐性となるという現実により妨げられている。従って、従来の抗癌治療についての治療指数が２．０を超えることはまれである。
【０１３８】
ゲノミクス主導型（ｇｅｎｏｍｉｃｓ−ｄｒｉｖｅｎ）の分子標的同定の出現により、癌患者に安全で、かつより効率的な処置を提供できる治療介入のための新たな癌特異的標的が同定される可能性が開けた。従って、新たに発見される腫瘍関連遺伝子及びその産物を疾患におけるそれらの機能（群）について試験でき、そして革新的な治療を発見し、かつ開発するために道具として用いることができる。以上に概説した生理学的プロセスのいずれかに重要な働きがある遺伝子は、癌標的として特徴付けることができる。
【０１３９】
ゲノミクスを通じて同定される遺伝子又は遺伝子断片は、すぐに１つ又はそれ以上の非相同（ヘテローガス）発現系において発現させ、機能性組換えタンパク質を産生させることができる。このタンパク質は、その生物学的機能についてインビトロで特徴付けられ、その後その生化学活性の化学修飾因子（モジュレーター）を同定するため、ハイスループット分子スクリーニングプログラムにおける道具として用いられる。標的タンパク質活性のアクチベーター及び／又はインヒビターをこの様式で同定し、次いで、細胞およびインビボ疾患モデルにて抗癌活性について試験する。生物学的モデルにおける反復試験や、詳細な薬物動態力学的分析及び中毒学的分析を用いたリード化合物の最適化により、薬物開発及び次のヒトでの試験についての基礎を形成する。
【０１４０】
ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼを調節して糖尿病を処置することができる。糖尿病は、血中グルコースの異常な上昇、脂質の変化および心血管系、眼、腎臓および神経系の異常（合併症）を特徴とする一般的な代謝障害である。糖尿病は２つの独立した疾患、すなわち、インスリンを産生し分泌する細胞の喪失に起因する１型糖尿病（若年発症型）と、インスリン分泌の欠陥およびインスリン作用の欠陥によって起こる２型糖尿病（成人発症型）とに分類される。
【０１４１】
１型糖尿病は、膵島のインスリン分泌細胞（β細胞）を攻撃する自己免疫反応によって惹起される。この反応が起こるのを防ぐ物質、またはβ細胞の破壊が完了してしまう前にこの反応を停止させる物質は、この疾患の治療法になる可能性がある。β細胞の増殖および再生を誘導する他の物質も治療法になる可能性がある。
【０１４２】
ＩＩ型糖尿病は２つの糖尿病状態のうち最も一般的である（人口の６％）。インスリン分泌の欠陥は糖尿病状態の重要な原因であり、これはβ細胞が、血中グルコースレベルの上昇を適切に検出し、その上昇に、インシュリンの放出によって応答することができないために起こる。グルコースに対するβ細胞の応答を増大させる治療法は、この疾患の重要な新しい処置方法になるだろう。
【０１４３】
ＩＩ型糖尿病患者におけるインスリン作用の欠陥は、治療的介入のもう一つの標的である。筋肉、肝臓および脂肪におけるインスリン受容体の活性を増加させる物質は、血中グルコースの低下と、血漿脂質の正常化とをもたらすだろう。受容体活性は、受容体を直接刺激する物質によって、または受容体からの細胞内シグナルを増加させる物質によって、増加させることができる。他の治療法では、細胞側のプロセス、すなわちグルコース輸送または種々の酵素系を直接活性化してインスリン様の効果を生じ、よって有益な結果を得ることができる。過体重者はＩＩ型糖尿病にかかりやすいので、体重を減少させる物質はいずれも考え得る治療法である。
【０１４４】
Ｉ型およびＩＩ型糖尿病はどちらも、インスリン作用を模倣する物質、または血中グルコースレベルを低下させることによって糖尿病合併症を処置する物質で、処置することができる。また、新しい血管の成長を減少させる物質は、両疾患で発症する眼合併症の処置に使用することができる。
【０１４５】
ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼを調節してＣＮＳ障害を処置することができる。処置できるＣＮＳ障害には、例えば脳損傷、脳血管疾患およびその帰結、パーキンソン病、大脳皮質基底核変性症、運動ニューロン疾患、ＡＬＳを含む痴呆、多発性硬化症、外傷性脳損傷、脳卒中、脳卒中後、外傷後脳損傷、および小血管脳血管疾患などが含まれる。また、アルツハイマー病、血管性痴呆、レビ小体を伴う痴呆、１７番染色体に連鎖する前頭側頭型痴呆およびパーキンソニズム、ピック病を含む前頭側頭型痴呆、進行性核性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ハンチントン病、視床変性症、クロイツフェルトヤコブ病、ＨＩＶ痴呆、痴呆を伴う精神分裂病、およびコルサコフ精神病などの痴呆も処置することができる。同様に、ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼの活性を調節することにより、例えば軽度認知障害、加齢性記憶障害、加齢性認知低下、血管性認知障害、注意欠陥障害、注意欠陥多動障害、および学習障害を伴う小児における記憶障害などの認識関連障害を処置することもできるかもしれない。
【０１４６】
ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼを調節して喘息および他のアレルギーを処置することができる。アレルギーは環境抗原が臨床的に有害な反応を誘発する複雑なプロセスである。アレルゲンと呼ばれる誘発抗原は、通例、特異的ＩｇＥ応答を引き起こす。ほとんどの場合、アレルゲンそのものには固有の毒性はほとんどまたは全くないが、ＩｇＥ応答が結果としてＩｇＥ依存性またはＴ細胞依存性の過敏反応を引き起こすと、病的異常が誘発される。過敏反応は局所的である場合も全身的である場合もあり、以前アレルゲンに感作したことのある個体がアレルゲンに曝露すると数分以内に起こる。マスト細胞、好塩基球または好酸球などのエフェクター細胞の表面にある特異的受容体に結合したＩｇＥ抗体によってアレルゲンが認識され、それがエフェクター細胞の活性化ならびに過敏反応の急性の徴候および症状をもたらす媒介物質の放出を引き起こすと、アレルギーの過敏反応が発生する。アレルギー疾患には、喘息、アレルギー性鼻炎（枯草熱）、アトピー性皮膚炎、およびアナフィラキシーが包含される。
【０１４７】
喘息は、複数の遺伝的要因と環境要因との相互作用の結果として生じると考えられ、３つの主特徴、すなわち１）気管支収縮、粘液産生量の増加、および気道の狭窄につながる気道壁の肥厚によって起こる間欠的で可逆的な気道閉塞、２）気道径制御の低下によって起こる気道反応性亢進、ならびに３）気道炎症を特徴とする。喘息の炎症反応にはいくつかの細胞が重要であるが、それらには、Ｔ細胞および抗原提示細胞、ＩｇＥを産生するＢ細胞、およびマスト細胞、好塩基球、好酸球、およびＩｇＥを結合する他の細胞が含まれる。これらのエフェクター細胞は、気道のアレルギー反応部位に蓄積して毒性産物を放出し、それが急性病状の一因となり、最終的にはこの障害に関連する組織破壊の一因となる。喘息を持つ個体では他の常在細胞、例えば平滑筋細胞、肺上皮細胞、粘液産生細胞、および神経細胞なども異常である可能性があり、それらも病状の一因となりうる。臨床的には間欠的な喘鳴および息切れとして現れる喘息の気道閉塞は、一般に、迅速な処置を要する最も切迫したこの疾患の症状であり、この疾患に付随する炎症および組織破壊が不可逆的な変化をもたらして、ついには、喘息を長期管理が必要な慢性障害にしてしまう場合もある。
【０１４８】
喘息の病態生理に関する我々の理解には最近大きな進歩があったにもかかわらず、この疾患の有病率と重症度は増加しつつあるようである（ＧｅｒｇｅｎおよびＷｅｉｓｓ， Ａｍ． Ｒｅｖ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｄｉｓ． １４６，８２３−２４，１９９２）。人口の３０〜４０％はアトピー性アレルギーを患っており、小児人口の１５％および成人人口の５％は喘息を患っていると推定されている（Ｇｅｒｇｅｎ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓ，１９９２）。したがって我々の保健医療財源には非常に大きい負担がかかっている。しかし喘息は診断も処置も困難である。肺組織炎症の重症度は測定するのが容易でなく、この疾患の症状は呼吸器感染症、慢性呼吸器炎症性障害、アレルギー性鼻炎、または他の呼吸器障害の症状と区別できないことも多い。誘発アレルゲンを決定できないために、原因環境物質の除去が困難である場合も多い。現在の薬物処置にはそれぞれに欠点がある。よく使用されるβアゴニストなどの治療薬は、症状緩和剤として作用して肺機能を一過性に改善することはできるが、根底にある炎症には影響を及ぼさない。根底にある炎症を減少させることができる抗炎症性ステロイドなどの物質は、免疫抑制から骨量減少までに及ぶ重大な欠点を持ちうる（Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣ ＢＡＳＩＳ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ， Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， ＮＹ， ＵＳＡ， １９８５）。また、吸入コルチコステロイドなどの現行治療法の多くは持効性に乏しく、不便であり、定期的に（時には一生）使用しなければならないことも多いため、患者がその処置を遵守しないことが大きな問題となり、それが処置としての有効性を減じている。
【０１４９】
従来の治療法には種々の問題があるため代替処置法の評価が行なわれている。グリコホリンＡ（Ｃｈｕ ａｎｄ Ｓｈａｒｏｍ， Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４５，２２３−３９，１９９２）、シクロスポリン（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ ３３９，３２４−２８，１９９２）およびＩＬ−２のノナペプチド断片（Ｚａｖ’ｙａｌｏｖら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ． ３１，２８５−８８，１９９２）はいずれもインターロイキン２依存性Ｔリンパ球増殖を阻害するが、これらは他にも多くの効果を持つことが知られている。例えばシクロスポリンは免疫抑制剤として臓器移植後に使用される。これらの物質は喘息患者の処置においてステロイドの代替物となりうるが、これらはインターロイキン２依存性Ｔリンパ球増殖を阻害し、ホメオスタシスに関係する重要な免疫機能を抑制する可能性がある。最近、気管支収縮の媒介物質の放出または活性を遮断する他の処置、例えばクロモン類または抗ロイコトリエン類などが、軽度喘息の処置に導入されたが、これらは高価であり、全ての患者に有効なわけではなく、これらが喘息性炎症に伴う慢性的変化に効果があるかどうかははっきりしない。当技術分野で必要とされているのは、喘息の発症に不可欠な経路で作用することができ、この障害の挿間的発作を遮断すると共に、患者の免疫機能を損なわずに、異常に亢進したアレルギー免疫応答を優先的に抑制する処置を同定することである。
【０１５０】
ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼを調節してＣＯＰＤを処置することができる。慢性閉塞性肺（または気道）疾患（ＣＯＰＤ）は、生理学的には、一般に慢性気管支炎による肺気腫と末梢気道閉塞とが混合した状態に起因する気流閉塞であると定義される（Ｓｅｎｉｏｒ ＆ Ｓｈａｐｉｒｏ， Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ， ３ｄ ｅｄ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， １９９８， ｐｐ． ６５９− ６８１，１９９８； Ｂａｒｎｅｓ， Ｃｈｅｓｔ １１７， １０Ｓ−１４Ｓ， ２０００）。肺気腫は、肺の気腔の異常な拡大をもたらす肺胞壁の破壊を特徴とする。慢性気管支炎は、臨床的には、２年連続して毎年３ヶ月にわたって慢性的湿性咳があることと定義される。ＣＯＰＤでは、気流閉塞は通常、進行性であり、部分的にしか可逆ではない。ＣＯＰＤの発症に関して明らかに一番重要な危険因子は喫煙であるが、この疾患は非喫煙者でも起こる。
【０１５１】
気道の慢性炎症はＣＯＰＤの重要な病理学的特徴である（Ｓｅｎｉｏｒ ＆ Ｓｈａｐｉｒｏ，１９９８）。炎症細胞集団には、数の増加したマクロファージ、好中球およびＣＤ８＋リンパ球が含まれる。タバコの煙などの刺激物を吸入すると、呼吸路に常在するマクロファージおよび上皮細胞が活性化されて、ケモカイン（例えばインターロイキン８）および他の走化性因子の放出が起こる。これらの走化性因子は血液から肺組織および気道への好中球／単球輸送量を増加させる働きをする。気道に動員された好中球と単球は、潜在的に有害な種々の媒介物質、例えばタンパク質分解酵素および反応性酸素種などを放出することができる。マトリックス分解および肺気腫は、気道壁の肥厚、サーファクタント機能不全および粘液分泌過多と共に、いずれも、気流およびガス交換の障害につながるこの炎症応答の続発症となる可能性がある。
【０１５２】
本発明は、上記のスクリーニング検定によって同定される新規物質の使用にさらに関する。従って、本明細書に記載するように同定される被験化合物を適当な動物モデルに使用することは、本発明の範囲内にある。例えば、本明細書に記載するように同定される物質（例えば、調整物質、アンチセンス核酸分子、特異的な抗体、リボザイム又はセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチド結合分子）を、そのような物質を用いた処置の効果、毒性又は副作用を決定するために、動物モデルに用いることがある。あるいは、本明細書に記載するように同定された物質を、該物質の作用機構を決定するために、動物モデルに使用する場合がある。さらに、本発明は、本明細書に記載の処置に対する上記スクリーニング検定によって同定される新規物質の使用に関する。
【０１５３】
セリン−スレオニンプロテインキナーゼ活性に影響を及ぼす試薬を、セリン−スレオニンプロテインキナーゼ活性を低下させるために、インビトロ又はインビボのいずれかにおいてヒト細胞に投与することができる。試薬は、ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼ遺伝子の発現産物と結合することが好ましい。その発現産物がタンパク質である場合、試薬は抗体であることが好ましい。エックスビボにおけるヒト細胞の処置については、抗体を、人体から取り出しておいた幹細胞の調製物に添加することができる。その後、その細胞を、当分野で周知のように、クローン増殖させるか、又はさせずに同じ又は別の人体に移すことができる。
【０１５４】
１つの態様においては、試薬を、リポソームを用いて送達する。リポソームは、投与した動物中にて、少なくとも約３０分間、より好ましくは少なくとも約１時間、さらにより好ましくは少なくとも約２４時間安定であることが好ましい。リポソームは、試薬、特にポリヌクレオチドを、動物（例えばヒト）の特定の部位に標的化することができる脂質組成物を含む。リポソームの脂質組成物は、動物の特有の器官、例えば肺、肝臓、脾臓、心臓、脳、リンパ節及び皮膚を標的化できることが好ましい。
【０１５５】
本発明に有用なリポソームは、標的化した細胞の原形質膜と融合でき、その内容物を細胞に送達できる脂質組成物を含む。好ましくは、リポソームのトランスフェクション効率は約１０６細胞に送達されるリポソーム１６ｎｍｏｌ当たりＤＮＡ約０．５μｇであり、より好ましくは約１０６細胞に送達されるリポソーム１６ｎｍｏｌ当たりＤＮＡ約１．０μｇであり、さらにより好ましくは約１０６細胞に送達されるリポソーム１６ｎｍｏｌ当たりＤＮＡ約２．０μｇである。好ましくは、リポソームは直径が、約１００〜５００ｎｍであり、より好ましくは約１５０〜４５０ｎｍであり、さらにより好ましくは約２００〜４００ｎｍである。
【０１５６】
本発明に用いるに適したリポソームは、例えば当業者に知られる遺伝子送達法に標準的に用いられるリポソームを含む。より好ましいリポソームは、ポリカチオン脂質組成物を有するリポソームおよび／またはポリエチレングリコールと連結されたコレステロールバックボーン（骨格鎖）を有するリポソームを含む。あるいは、リポソームは特定の細胞タイプを標的化できる化合物、例えばリポソームの外側表面に曝される細胞特異的リガンドを包含する。
【０１５７】
リポソームを、試薬、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムと複合化させることは、当分野で標準的な方法 （例えば、米国特許５，７０５，１５１を参照のこと） を用いて達成することができる。好ましくは、ポリヌクレオチド約０．１μｇ〜約１０μｇをリポソーム約８ｎｍｏｌと複合化する、より好ましくはポリヌクレオチド約０．５μｇ〜約５μｇをリポソーム約８ｎｍｏｌと複合化する、さらにより好ましくはポリヌクレオチド約１．０μｇをリポソーム約８ｎｍｏｌと複合化する。
【０１５８】
別の態様においては、抗体を、受容体媒介性標的化送達を用いて、インビボにて特定の組織に送達することができる。受容体媒介性ＤＮＡ送達技術は、例えばＦｉｎｄｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １１， ２０２−０５ （１９９３）； Ｃｈｉｏｕら、ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＤＩＲＥＣＴ ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ （Ｊ． Ａ． Ｗｏｌｆｆら、） （１９９４）； Ｗｕ ＆ Ｗｕ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３， ６２１−２４ （１９８８）； Ｗｕら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９， ５４２−４６ （１９９４）； Ｚｅｎｋｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８７， ３６５５−５９ （１９９０）； Ｗｕら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６， ３３８−４２ （１９９１） にて教示されている。
【０１５９】
治療的有効量の決定
治療的有効量の決定は、充分当業者の能力の範囲内にある。治療的有効量とは、治療的有効量の不在下で起こるセリン−スレオニンプロテインキナーゼ活性に比較してセリン−スレオニンプロテインキナーゼ活性を増大させまたは低下させる活性成分の量を指す。
【０１６０】
いかなる化合物に関しても、治療的有効量は最初に細胞培養検定で、または動物モデル、通常マウス、ウサギ、イヌ、またはブタで見積もることができる。動物モデルは適当な濃度範囲および投与経路の決定にも使用できる。次にこのような情報を用いて人間での有用な用量と投与経路を決定できる。
【０１６１】
治療的有効性および毒性、例えばＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％で致死的な用量）は、細胞培養または実験動物における標準的薬学的方法により決定できる。治療効果に対する毒性効果の用量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０で表すことができる。
【０１６２】
大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養検定および動物研究から得られるデータを、人間への使用のための用量範囲を処方する際に使用する。かかる組成物に含まれる用量は、好ましくは殆どまたは全く毒性を持たないＥＤ５０を包含する循環濃度の範囲内である。この用量は、使用する剤形、患者の感受性、および投与経路に応じてこの範囲内で変わる。
【０１６３】
正確な用量は、治療を必要とする対象に関連する因子に照らして医師が決定する。用量および投与は、充分なレベルの活性成分を提供するよう、または所望の効果を維持するよう、調節する。考慮できる因子は、疾病状態の重篤度、対象の全身健康状態、年齢、体重、および対象の性別、食餌、投与の時間および頻度、薬物の組み合わせ、反応の感受性、および療法に対する寛容／応答を包含する。長時間作用性医薬組成物は、その製剤の半減期およびクリアランス率に応じて３から４日毎、毎週、または２週間に１回投与することができる。
【０１６４】
標準的な用量は投与経路に応じて０．１から１０００００マイクログラムまで変えることができ、約１ｇまでの総用量とすることができる。特定の用量および送達方法についての指針は文献に提供されており、一般に当分野の医師が入手できる。当業者は、ヌクレオチド用にはタンパク質またはそれらのインヒビター用のものとは異なる製剤を使用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は特定の細胞、状態、場所などに特異的である。
【０１６５】
この試薬が一本鎖抗体である場合、この抗体をコードしているポリヌクレオチドを組み立て、トランスフェリン−ポリカチオン−媒介ＤＮＡ転移、裸のまたはカプセル内核酸を用いるトランスフェクション、リポソームの媒介する細胞融合、ＤＮＡ被覆ラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、電気穿孔、「遺伝子銃」、およびＤＥＡＥ−または燐酸カルシウム−媒介トランスフェクションを包含する（但しこれらに限定される訳ではない）充分確立した技術を用いて、ｅｘ ｖｉｖｏまたはインビボで細胞内に導入できる。
【０１６６】
抗体の有効なインビボ用量は、約５μｇから約５０μｇ／ｋｇ、約５０μｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇから約５００μｇ／ｋｇ（患者の体重）、および約２００から約２５０μｇ／ｋｇ（患者の体重）の範囲である。一本鎖抗体をコードしているポリヌクレオチドの投与のためには、有効なインビボ用量は、約１００ｎｇから約２００ｎｇ、５００ｎｇから約５０ｍｇ、約１μｇから約２ｍｇ、約５μｇから約５００μｇ、および約２０μｇから約１００μｇのＤＮＡの範囲である。
【０１６７】
発現産物がｍＲＮＡである場合、試薬は好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムである。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを発現するポリヌクレオチドは、上記のように多岐にわたる方法によって細胞中に導入できる。
【０１６８】
好ましくは、試薬は、セリン−スレオニンプロテインキナーゼ遺伝子の発現またはセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドの活性を、該試薬の不在時と比較して少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％低下させる。セリン−スレオニンプロテインキナーゼ遺伝子の発現レベルまたはセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドの活性を低下させるよう選択した機構の有効性は、当分野で周知の方法、例えばセリン−スレオニンプロテインキナーゼ特異的ｍＲＮＡへのヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドの免疫学的検出、またはセリン−スレオニンプロテインキナーゼ活性の測定を用いて評価できる。
【０１６９】
上記のいずれの態様においても、本発明に係る任意の医薬組成物は他の適当な治療薬と組み合わせて投与できる。併用療法に使用するための適当な物質の選択は、常套的製薬原理に従い、当業者により実施することができる。治療薬の組み合わせは、相乗的に働いて、上記の様々な疾患の治療または予防を奏効させる。このアプローチを用いて、より低い各物質の用量で治療効果を達成することができ、したがって有害な副作用の可能性を低減することができる。
【０１７０】
上記の治療方法のいずれも、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も好ましくはヒトといった哺乳動物を包含する、このような治療を必要とする任意の対象に適用することができる。
【０１７１】
診断方法
ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼはさらに、この酵素をコードしている核酸配列における突然変異の存在に関連する疾病および異常、または疾病および異常に対する感受性を検出する診断検定に使用できる。例えば、疾患に罹患している個体と正常な個体とにおけるセリン−スレオニンプロテインキナーゼをコードするｃＤＮＡまたはゲノム配列の間の差異を決定できる。もし、罹患している個体の幾つかまたは全てに突然変異が観察され、正常な個体で観察されないならば、その突然変異がその疾患の原因物質である可能性がある。
【０１７２】
レファレンス遺伝子および突然変異を有する遺伝子の間の配列相違は、直接ＤＮＡ配列決定法によって明らかにできる。加えて、クローニングしたＤＮＡセグメントを、特定のＤＮＡセグメントを検出するためのプローブとして使用できる。この方法の感受性はＰＣＲと組み合わせる時極めて増強される。例えば、二本鎖ＰＣＲ産物または修飾ＰＣＲにより調製された一本鎖テンプレート分子と共に、配列決定プライマーを使用することができる。配列決定は、放射標識したヌクレオチドを用いる常套的方法によって、または蛍光標識を使用する自動配列決定法によって実施する。
【０１７３】
ＤＮＡ配列相違に基づく遺伝子試験は、変性させる物質を含むまたは含まないゲル中のＤＮＡ断片の電気泳動移動度の変化を検出することにより実施できる。小配列の欠失および挿入は、例えば高分解能ゲル電気泳動によって視覚化できる。異なる配列のＤＮＡ断片は変性させるホルムアミド勾配ゲル上で識別でき、ここでは、異なるＤＮＡ断片の移動度が、それらの特異的融解温度または部分的融解温度に従って、ゲル中の異なる位置で遅延する（例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，１２４２，１９８５を参照されたい）。特定の位置での配列改変もまたヌクレアーゼ保護検定、例えばＲＮアーゼおよびＳ１保護または化学的開裂法によって明らかにすることができる（例えば、Ｃｏｔｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，４３９７−４４０１，１９８５）。即ち特異的ＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保護、化学的開裂、直接ＤＮＡ配列決定といった方法によって、または制限酵素とゲノムＤＮＡのサザンブロッティングを使用することによって実施できる。ゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定のような直接法に加えて、突然変異はｉｎ ｓｉｔｕ分析により検出することもできる。
【０１７４】
セリン−スレオニンプロテインキナーゼレベルの変化もまた種々の組織で検出できる。血液または組織生検のように、宿主から誘導した身体試料中の受容体ポリペプチドのレベルを検出するために用いる検定は、当業者に周知であり、ラジオイムノアッセイ、競合的結合検定、ウェスタンブロット分析、およびＥＬＩＳＡ検定を包含する。
【０１７５】
本明細書に引用する全ての特許および特許出願は、引用により特に本明細書の一部とする。上記の内容は本発明を一般的に記載するものである。より完全な理解は以下の具体的実施例を参照することによって得られ、それらの実施例は例示のみの目的で提供するものであり、本発明の範囲を限定する意図は無い。
【０１７６】
実施例１
セリン−スレオニンプロテインキナーゼ活性の検出
ＦＬＡＧ標識セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドを高レベルに発現させるために、リン酸カルシウム法により、発現ベクターセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチド（配列番号１のＤＮＡ配列を発現させるもの）をＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトする。５時間後に、それらの細胞を、組換えワクシニアウイルスｖＴＦ７−３（１０プラーク形成単位／細胞）に感染させる。感染の２０時間後に細胞を収集し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、０．５ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、１０μｇ／ｍｌアプロチニン中で溶解する。抗ＦＬＡＧ抗体を使ってセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドを溶解液から免疫沈降させる。免疫沈降したＦＬＡＧ−セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドを使って、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール中、４０μｌの液量で、インビトロキナーゼ検定およびホスホアミノ酸分析を行なう。５μＣｉの（−３２Ｐ）ＡＴＰを補足した１ｍＭ ＡＴＰを４μｌ添加することによって反応を開始し、３７℃で３０分間インキュベートする。その後、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、リン酸化されたタンパク質をオートラジオグラフィーによって検出する。ＩＩＩ−Ｓ型ヒストン、カゼイン、ウシ血清アルブミン、またはミエリン塩基性タンパク質を基質として使用する。配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドはセリン−スレオニンプロテインキナーゼ活性を持つことがわかる。
【０１７７】
実施例２
組換えヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼの発現
ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現ベクターｐＰＩＣＺＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ） を用いて、大量の組換えヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドを酵母中に生産させる。セリン−スレオニンプロテインキナーゼコード化ＤＮＡ配列は配列番号１から誘導する。ベクターｐＰＩＣＺＢ中に挿入する前に、ＤＮＡ配列を、その５’端に開始コドン、及び３’端にエンテロキナーゼ開列部位、Ｈｉｓ６レポータータグや終止コドンを含ませるといった周知の方法によって修飾する。さらに、その両末端に制限エンドヌクレアーゼの認識配列を加え、対応する制限酵素を用いてｐＰＩＣＺＢのマルチクローニングサイトを消化した後に、修飾ＤＮＡ配列をｐＰＩＣＺＢ中にライゲートする。この発現ベクターは、ピキア パストリスにて酵母プロモーターにより誘導される誘導性発現用に設計する。得られたｐＰＩＣＺ／ｍｄ−Ｈｉｓ６ベクターを用いて、酵母を形質転換する。
【０１７８】
この酵母を、５リッター攪拌フラスコ中で通常の条件下にて培養し、組換え産物タンパク質を、８Ｍウレアの存在下で親和性クロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡ−樹脂）により培養物から単離する。結合したポリペプチドを、ｐＨ３．５の緩衝液を用いて溶出し、中性化する。Ｈｉｓ６レポータータグからのポリペプチドの分離は、製造元の指示に従い、エンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を用いる部位特異的タンパク質分解により行なう。精製ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドを得る。
【０１７９】
実施例３
セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドと結合する被験化合物の同定
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質を含み９６ウェル マイクロタイタープレートのグルタチオン誘導化ウェルに吸着させた精製セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドを、生理緩衝溶液ｐＨ７．０の小分子ライブラリー由来の被験化合物と接触させる。ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む。被験化合物は蛍光標識を含む。この試料を５分間〜１時間インキュベートする。コントロール試料は、被験化合物の非存在下にてインキュベートする。
【０１８０】
被験化合物を含む緩衝液を、ウェルから洗い出す。セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドに対する被験化合物の結合を、ウェル内容物の蛍光測定により検出する。被験化合物をインキュベートしていないウェルの蛍光と比較して少なくとも１５％ウェルの蛍光を増大させる被験化合物を、セリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドと結合する化合物と同定する。
【０１８１】
実施例４
セリン−スレオニンプロテインキナーゼ遺伝子発現を低下させる被験化合物の同定
被験化合物を、セリン−スレオニンプロテインキナーゼ発現構築物でトランスフェクトしたヒト細胞培養に投与し、３７℃で１０〜４５分間、インキュベートする。トランスフェクトしていない同じタイプの細胞培養を、被験化合物を加えず、同じ時間インキュベートし、ネガティブコントロールとする。
【０１８２】
ＲＮＡを、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８， ５２９４−９９，１９７９に記載のように２つの培養物から単離する。ノーザンブロットを全ＲＮＡ２０〜３０μｇを用いて調製し、エクスプレスハイブ（Ｅｘｐｒｅｓｓｈｙｂ）（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）中６５℃にて、３２Ｐ−標識化セリン−スレオニンプロテインキナーゼ特異的プローブを用いてハイブリダイズさせる。このプローブは配列番号１の相補物より選ばれる少なくとも１１個の連続ヌクレオチドを包含する。被験化合物の非存在下にて得られるシグナルと比較して、セリン−スレオニンプロテインキナーゼ特異的シグナルを低下させる被験化合物を、セリン−スレオニンプロテインキナーゼ遺伝子発現のインヒビターとして同定する。
【０１８３】
実施例５
ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼ活性を低下させる被験化合物の同定　ヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６から得た細胞抽出物を、小分子ライブラリー由来の被験化合物と接触させ、ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼ活性について検定する。被験化合物が存在しないコントロール抽出物も検定する。キナーゼ活性は、例えばＴｒｏｓｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７５，７３７３−７７，２０００；Ｈａｙａｓｈｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． ２６４，４４９−５６，１９９９；Ｍａｓｕｒｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６５，３５３−６０，１９９９；およびＭｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８１，６６１５−２２，１９９９に教示されているように測定することができる。
【０１８４】
コントロール抽出物と比較してセリン−スレオニンプロテインキナーゼ活性をすくなくとも２０％低下させる被験化合物を、セリン−スレオニンプロテインキナーゼインヒビターとして同定する。
【０１８５】
実施例６
ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼ遺伝子産物と特異的に結合する試薬を用いた喘息の処置
配列番号１および９の相補物より選択される少なくとも１１個の連続ヌクレオチドを含むアンチセンスヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼオリゴヌクレオチドの合成は、ホスホロアミダイト手順を用いて、ファルマシア ジーン アセンブリー シリーズ シンセサイザー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｇｅｎｅ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ ｓｅｒｉｅｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）にて実施する（Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９０， ５３４−８３， １９９０を参照のこと）。アセンブリーおよび脱保護に続き、オリゴヌクレオチドを２度エタノール沈殿させ、乾燥させ、そしてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に所望の濃度に懸濁する。これらのオリゴヌクレオチドの純度は、キャピラリーゲル電気泳動及びイオン交換ＨＰＬＣにより試験する。オリゴヌクレオチド調製のエンドトキシンレベルは、リムルスアメーバ様検定（Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ａｓｓａｙ）（Ｂａｎｇ， Ｂｉｏｌ． Ｂｕｌｌ． （Ｗｏｏｄｓ Ｈｏｌｅ， Ｍａｓｓ．） １０５， ３６１−３６２， １９５３） を用いて決定する。
【０１８６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む水性組成物を吸入によって患者に投与する。
【０１８７】
患者の喘息症状の変化に注目するか、肺機能を測定するか、または肺炎症のマーカー、例えば気管支肺胞洗浄によって患者の肺から採取した液体中の炎症細胞の数または炎症媒介物質の濃度の変化を測定することにより、喘息の重症度を数日または数週間にわたってモニターする。ヒトセリン−スレオニンプロテインキナーゼ活性の低下により、喘息の重症度が低下する。
【０１８８】
実施例７
喘息：新規化合物のインビボ検証
１．Ｔ細胞の活性に関する試験を使って、共刺激分子−サイトカイン、サイトカイン受容体、シグナル伝達分子、またはＴ細胞活性化に関与する他の分子の発現または活性を調整する物質を評価する。
【０１８９】
マウス抗ＣＤ３誘発性サイトカイン産生モデル：
ＢＡＬＢ／ｃマウスに１０μｇの１４５−２Ｃ１１（精製ハムスター抗マウスＣＤ３モノクローナル抗体、ＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮ）を１回静脈内注射する。抗ＣＤ３ ｍＡｂ注射の６０分前に化合物を腹腔内投与する。抗体注射の９０分後に採血する。３０００ｒ．ｐ．ｍで１０分間の遠心分離によって血清を得る。ＩＬ−２およびＩＬ−４などのサイトカインまたは他の分泌分子の血清レベルをＥＬＩＳＡによって決定する。このモデルではＣＤ３下流シグナル伝達を調節するタンパク質を評価することができる。
【０１９０】
２．Ｂ細胞の活性に関する試験を使って、Ｂ細胞受容体、シグナル伝達分子、またはＢ細胞活性化／免疫グロブリンクラススイッチに関与する他の分子の発現または活性を調整する物質を評価する。
【０１９１】
マウス抗ＩｇＤ誘発性ＩｇＥ産生モデル
ＢＡＬＢ／ｃマウスに０．８ｍｇの精製ヤギ抗マウスＩｇＤ抗体またはＰＢＳを静脈内注射する（これを０日目とする）。０日目から６日目まで化合物を腹腔内投与する。７日目に採血し、３０００ｒ．ｐ．ｍで１０分間の遠心分離によって血清を得る。総ＩｇＥの血清レベルはヤマサＥＬＩＳＡキットによって決定し、他のＩｇサブタイプはＩｇ ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｕｇｉｅｒ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ’ｓ， Ｍｏｎｔｒｅａｌ， Ｃａｎａｄａ）によって測定する。ＩｇＤ下流シグナル伝達およびＩｇクラススイッチを調節するタンパク質を評価することができる。
【０１９２】
３．単球／マクロファージの活性に関する試験を使って、シグナル伝達分子、転写因子の発現または活性を調整する物質を評価する。
【０１９３】
マウスＬＰＳ誘発性ＴＮＦ−α産生モデル：
腹腔内注射によってＢＡＬＢ／ｃマウスに化合物を投与し、１時間後に腹腔内注射によってＬＰＳ（２００μｇ／マウス）を投与する。ＬＰＳ注射の９０分後に採血し、血漿を得る。ＥＬＩＳＡキットを使って試料中のＴＮＦ−α濃度を決定する。ＬＰＳ刺激の下流効果、例えばＮＦ−κＢ活性化などを調節するタンパク質を評価することができる。
【０１９４】
４．好酸球の活性に関する試験を使って、エオタキシン受容体、シグナル伝達分子、細胞骨格分子もしくは接着分子の発現または活性を調整する物質を評価する。
【０１９５】
マウスエオタキシン誘発性好酸球増加症モデル：
−６日目および−３日目に、ＢＡＬＢ／ｃマウスに２．５ｍｌの空気を皮内注射して、空気嚢を作る。０日目に化合物を腹腔内投与し、３０分後にＩＬ−５（３００ｎｇ／マウス）を静脈内注射する。さらに３０分経ってから、エオタキシンを注射（３μｇ／マウス、ｉ．ｄ．）する。エオタキシン注射の４時間後に空気嚢中の白血球を収集し、総細胞数を数える。メイ−グリュンワルド・ギムザ溶液での染色によって滲出物中の細胞分画を行なう。エオタキシン受容体によるシグナル伝達を調節するタンパク質または好酸球輸送を調節するタンパク質を評価することができる。
【０１９６】
５．ラットにおける受身皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）試験
６週齢の雄ウィスターラットを、浅麻酔下に、５０μｌの０．１μｇ／ｍｌマウス抗ＤＮＰ ＩｇＥモノクローナル抗体（ＳＰＥ−７）で、剃毛した背部の皮内（ｉ．ｄ．）に感作する。２４時間後に、０．６ｍｇのＤＮＰ−ＢＳＡ（３０）（ＬＳＬ ＣＯ．， ＬＴＤ）および０．００５ｇのエバンスブルーを含む食塩水１ｍｌを、ラットの静脈内に抗原投与する。抗原注射の０．５時間前に化合物を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射する。感作、抗原投与および化合物処置を受けていないラットをコントロールとして使用し、感作、抗原投与および賦形剤処置を受けたラットを使って、阻害がない場合の値を決定する。抗原投与の３０分後にラットを屠殺し、背部の皮膚を採取する。皮膚中のエバンスブルー色素をホルムアミド中に６３℃で一晩抽出する。次に６２０ｎｍでの吸光度を測定して、漏出した色素の光学密度を得る。
【０１９７】
化合物によるＰＣＡの阻害百分率は以下のように計算する：
阻害率（％）＝｛（平均賦形剤値−試料値）／（平均賦形剤値−平均コントロール値）｝×１００。
【０１９８】
マスト細胞脱顆粒、血管透過性、またはヒスタミン受容体、セロトニン受容体もしくはシステイニルロイコトリエン受容体に対する受容体アンタゴニストを調節するタンパク質を評価することができる。
【０１９９】
６．ラットにおけるアナフィラキシー性気管支収縮
６週齢の雄ウィスターラットを、１０μｇのマウス抗ＤＮＰ ＩｇＥ、ＳＰＥ−７で、静脈内に感作し、１日後に、ウレタン（１０００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）とガラミン（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）とによる麻酔下に、１．５ｍｇ ＤＮＰ−ＢＳＡ（３０）を含む０．３ｍｌを、静脈内に抗原投与する。気管に人工呼吸（２ｍｌ／ストローク、７０ストローク／分）用のカニューレを挿入する。肺膨張圧（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｉｎｆｌａｔｉｏｎ ｐｒｅｓｓｕｒｅ， ＰＩＰ）を圧力変換器に接続したカニューレのサイドアームによって記録する。ＰＩＰの変化は肺の抵抗とコンプライアンスの両方の変化を反映する。ある化合物を評価するには、その化合物を抗原投与の５分前にｉ．ｖ．投与する。
【０２００】
マスト細胞脱顆粒、血管透過性、またはヒスタミン受容体、セロトニン受容体もしくはシステイニルロイコトリエン受容体に対する受容体アンタゴニストを調節するタンパク質を評価することができる。平滑筋の収縮を調節するタンパク質も評価することができる。
【０２０１】
７．平滑筋細胞または内皮細胞へのＴ細胞接着
フィコール密度遠心分離後に、ナイロンウールカラムで分離し、ヒツジ赤血球とロゼットを形成させるか、抗体で被覆した磁気ビーズを用いることによって、精製Ｔ細胞集団を調製する。それらのＴ細胞を有糸分裂促進物質で３６〜４２時間活性化し、活性化の最後の１６時間は３Ｈ−チミジンで標識する。気道平滑筋細胞または気管支微小血管内皮細胞を、肺移植組織から、癌患者から得た気管支切除片から、もしくは死体から、または市販の細胞株として入手する。新鮮な組織を細胞源として使用する場合は、切除後に１．７ｍＭエチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、６４０Ｕ／ｍｌコラーゲナーゼ、１０ｍｇ／ｍｌ大豆トリプシンインヒビターおよび１０Ｕ／ｍｌエラスターゼを含む溶液中で３０〜６０分間消化することによって、平滑筋細胞および内皮細胞を組織から単離することができる。平滑筋細胞または内皮細胞を２４穴組織培養皿でコンフルエントまで生育した後、被験化合物およびＴＮＦ−αなどの炎症媒介物質で２４時間処理する。接着を測定するために、６×１０５個のＴ細胞を各ウェルに加え、３７℃で１時間接着させる。培地で穏やかに６回洗浄することによって非接着細胞を除去する。最後に、ＰＢＳ中の１％トリトンＸ１００を各ウェルに３００μｌずつ添加することによって、残留した接着細胞を溶解し、シンチレーションカウンターで放射能を定量する。結合百分率は、接着細胞から回収されたカウント数／総投入カウント数×１００％として計算する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図２】図２は図１のＤＮＡ配列から推論されるアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】図３は受入れ番号第Ｐ４１９５１号によって同定されるシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。
【図４】図４はセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号４）を示す。
【図５】図５はセリン−スレオニンプロテインキナーゼポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号５）を示す。
【図６】図６はｐｆａｍ｜ｈｍｍ｜ｐｋｉｎａｓｅに対する２６８＿ジーンワイズ（ｇｅｎｅｗｉｓｅ）（配列番号２）のＨＭＭＰＦＡＭアラインメントを示す。
【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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