(57)【要約】本発明はポリヌクレオチド試料から生成される複数のポリヌクレオチドを生成するための新規な方法及びそうして製造される複数のポリヌクレオチドを提供する。１つの具体例において、複数のポリヌクレオチドは試験及び参照ポリヌクレオチド試料間の刪減ハイブリダイゼーションにより製造され、そして参照ポリヌクレオチド試料中に存在しないか又は試験ポリヌクレオチド試料中に存在するよりも実質的に低い濃度で参照ポリヌクレオチド試料中に存在するシーケンスに実質的に富む。複数のポリヌクレオチドも、試験ポリヌクレオチド試料と比較して実質的に低存在量シーケンスに富む。本方法は、本方法において及びそれにより製造されるポリヌクレオチドを使用するためのキットの提供もする。ポリヌクレオチドはクローニング、発現及びハイブリダイゼーション研究のような広範囲の適用に有用である。
2004512027.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
参照試料中には存在しないか、又は低い存在量である試験試料中の１種又はそれ以上のポリヌクレオチドを同定するための刪減ハイブリダイゼーション方法であって、
ａ）試験又は参照ポリヌクレオチド試料とそれぞれ比較して高存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富む試験又は参照ポリヌクレオチドのプールの又はそれから製造される高存在量富化ポリヌクレオチド鎖を提供し；
ｂ）高存在量富化ポリヌクレオチド鎖を試験ポリヌクレオチド試料の又はそれから製造される試験ポリヌクレオチド鎖と、第一ハイブリダイゼーション混合物を形成させるためのハイブリダイゼーション条件下にて接触させ、それにより試験ポリヌクレオチド試料と比較して低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富むハイブリダイズしていない試験ポリヌクレオチド鎖を生成させ；
ｃ）ハイブリダイズされていない試験ポリヌクレオチド鎖からポリヌクレオチド鎖を合成し、それにより低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖を生成させ、
ｄ）参照ポリヌクレオチド試料と比較して低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富むポリヌクレオチドの参照プールの、又はそれから製造される低存在量富化参照ポリヌクレオチド鎖を提供し、
ｅ）低存在量富化参照ポリヌクレオチド鎖を、低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖と、第二ハイブリダイゼーション混合物を形成させるためのハイブリダイゼーション条件下で接触させ、それによりハイブリッド二本鎖、ハイブリダイズされない低存在量富化参照ポリヌクレオチド鎖及びハイブリダイズしていない低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖を生成させ；
ｆ）ハイブリッド二本鎖を除去又は消化し、；そして
ｇ）ハイブリダイズしていない低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖から試験特異的な二本鎖を生成させる、
ことを含む該方法。
【請求項２】
高存在量富化ポリヌクレオチド鎖が、試験ポリヌクレオチド試料と比較して高存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富む試験ポリヌクレオチドプールのものであるか又はそれから製造される請求項１の方法。
【請求項３】
（ａ）の高存在量富化ポリヌクレオチド鎖が高存在量富化アンチセンスポリヌクレオチド鎖を含み；
（ｂ）の試験ポリヌクレオチド鎖がセンス試験ポリヌクレオチド鎖を含み；
（ｃ）の低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖がアンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖を含み；そして
（ｄ）の低存在量富化参照ポリヌクレオチド鎖がセンス参照ポリヌクレオチド鎖を含む、
請求項１の方法。
【請求項４】
アンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖が、ハイブリダイズしていないセンス試験ポリヌクレオチド鎖から第一アンチセンスプライマー又は第一アンチセンスプライマー複合物を使用して合成される請求項３の方法であって、前記第一アンチセンスプライマー複合物は第一ＲＮＡプロモーターシーケンスに操作可能にリンクする第一アンチセンスプライマーを含み、ここで第一ＲＮＡプロモーターシーケンスが第一アンチセンスプライマーの５’ である該方法。
【請求項５】
第一アンチセンスプライマー又は第一アンチセンスプライマー複合物が：
ａ）ハイブリダイズしていないセンス試験ポリヌクレオチド鎖におけるプライマーサイトと結合するシーケンス；
ｂ）（ａ）のシーケンスの第一制限サイト５’、ここで第一制限サイトは二本鎖ポリヌクレオチドを開裂するが、一本鎖ポリヌクレオチドを実質的に完全なままにする制限エンドヌクレアーゼにより開裂される；及び
ｃ）（ｂ）の制限サイトの第一ユニバーサルプライマーサイト５’ 、
を含む請求項４の方法。
【請求項６】
アンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖が、ハイブリダイズしていないセンス試験ポリヌクレオチド鎖から第一アンチセンスプライマーを使用して合成される請求項５の方法であって、（ｃ）の第一ユニバーサルプライマーサイトが第二制限サイトを含み、該第二制限サイトが前記第一制限サイトとは異なる該方法。
【請求項７】
センス参照ポリヌクレオチド鎖が該センス参照ポリヌクレオチド鎖の５’ 末端に前もって加えられた第三制限サイトを含み、該第三制限サイトが、二本鎖ポリヌクレオチドを開裂するが一本鎖ポリヌクレオチドを実質的に完全なままにする制限エンドヌクレアーゼにより開裂される請求項５の方法。
【請求項８】
ハイブリッド二本鎖が少なくとも１種の酵素を用いて消化される請求項１の方法。
【請求項９】
酵素が制限エンドヌクレアーゼである請求項８の方法。
【請求項１０】
（ｆ）のハイブリッド二本鎖の除去又は消化が：
ｉ）第二ハイブリダイゼーション混合物を、ハイブリッド二本鎖の一本鎖部分を二本鎖にし、それにより二本鎖第一、第二及び第三制限サイトをハイブリッド二本鎖内に生成させる酵素で処理し；
ｉｉ）第二ハイブリダイゼーション混合物中のポリヌクレオチド鎖の３’ 末端へ第二ユニバーサルプライマーサイトを加え；及び
ｉｉｉ）第二ハイブリダイゼーション混合物を、１種又はそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで処理する、ここで該制限エンドヌクレアーゼはハイブリッド二本鎖を二本鎖第一及び第三制限サイトにて開裂させるが、アンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖及びセンス参照ポリヌクレオチド鎖を実質的に完全なままにする、ことを含む請求項７の方法。
【請求項１１】
試験特異的な二本鎖が、増幅によりハイブリダイズしていないアンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖から生成される請求項１０の方法。
【請求項１２】
試験特異的な二本鎖が、第一ユニバーサルプライマーサイトへ３’ プライマーとしてハイブリダイズする第一ユニバーサルプライマー並びに５’ プライマーとして第二ユニバーサルプライマーへハイブリダイズする第二ユニバーサルプライマーを使用して、ハイブリダイズしていないアンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖から合成される請求項１１の方法。
【請求項１３】
該増幅が、促進されたポリメラーゼ鎖反応により行われる請求項１１の方法。
【請求項１４】
第一ハイブリダイゼーション混合物中における高存在量富化ポリヌクレオチド鎖の試験ポリヌクレオチド鎖に対するモル比が約１〜約１００：１である請求項１の方法。
【請求項１５】
第二ハイブリダイゼーション混合物中における低存在量富化参照ポリヌクレオチド鎖の低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖に対するモル比が約１〜約１００：１である請求項１の方法。
【請求項１６】
試験及び参照ポリヌクレオチド試料がｍＲＮＡ試料である請求項１の方法。
【請求項１７】
高存在量富化アンチセンスポリヌクレオチド鎖がアンチセンスＲＮＡ分子である請求項３の方法。
【請求項１８】
センス試験ポリヌクレオチド鎖がｍＲＮＡ分子である請求項３の方法。
【請求項１９】
アンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖がアンチセンスｃＤＮＡ分子である請求項３の方法。
【請求項２０】
センス参照ポリヌクレオチド鎖がセンスｃＤＮＡ分子である請求項３の方法。
【請求項２１】
アンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖の合成がオリゴヌクレオチド−ｄＴプライミングを使用してプライムされる請求項３の方法。
【請求項２２】
試験及び参照ポリヌクレオチド試料が試験及び参照ｍＲＮＡ試料であり、そして高存在量富化アンチセンスポリヌクレオチド鎖が：
ａ）試験又は参照ｍＲＮＡ試料から、第二ＲＮＡプロモーターシーケンスに操作可能にリンクする第二アンチセンスプライマーを含む第二アンチセンスプライマー複合物を使用して、第一アンチセンスｃＤＮＡ鎖を合成する、ここで第二ＲＮＡプロモーターシーケンスは第二アンチセンスプライマーの５’ である；
ｂ）第三ユニバーサルプライマーサイトを、第一アンチセンスｃＤＮＡ鎖の３’ 末端に加える；
ｃ）第一アンチセンスｃＤＮＡ鎖を希釈し、少なくとも数種の低存在量アンチセンスアンチセンスｃＤＮＡ鎖を実質的に除去する；
ｄ）残留する第一アンチセンスｃＤＮＡ鎖から第一の二本鎖ｃＤＮＡ分子を生成させ、ここで第一の二本鎖ｃＤＮＡ分子は出発ｍＲＮＡ試料と比較して高存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富む；
ｅ）二本鎖ｃＤＮＡ分子から高存在量富化アンチセンスＲＮＡ分子を合成する、ことを含む方法により製造される試験又は参照アンチセンスＲＮＡ分子である請求項５の方法。
【請求項２３】
センス参照ポリヌクレオチドが：
ａ）参照ポリヌクレオチド試料と比較して高存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富む参照ポリヌクレオチドのプールの又はそれから製造される高存在量富化アンチセンスＲＮＡ分子を提供し；
ｂ）高存在量富化アンチセンスＲＮＡ分子をハイブリダイゼーション混合物を形成させるハイブリダイゼーション条件下で参照ｍＲＮＡ試料と接触させ、それにより参照ｍＲＮＡ試料と比較して低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富むハイブリダイズしていないｍＲＮＡ分子を生成させる；
ｃ）ハイブリダイズしていないｍＲＮＡ分子から第三アンチセンスプライマー又は第三アンチセンスプライマー複合物を使用して第二アンチセンスｃＤＮＡ鎖を合成し、第三アンチセンスプライマー複合物は第三ＲＮＡプロモーターシーケンスに操作可能にリンクする第三アンチセンスプライマーを含み、第三ＲＮＡプロモーターシーケンスは第三アンチセンスプライマーの５’ である；
ｄ）第四ユニバーサルプライマーサイトを第二アンチセンスｃＤＮＡ鎖の３’ 末端に加え；
ｅ）第二アンチセンスｃＤＮＡ鎖から第二の二本鎖ｃＤＮＡ分子を生成させ；
ｆ）第二の二本鎖ｃＤＮＡ分子から第二アンチセンスＲＮＡ分子を合成し；及び
ｇ）第二アンチセンスＲＮＡ分子から第一センスｃＤＮＡ鎖を合成する、
することを含む方法により製造されるセンスｃＤＮＡ鎖である請求項２２の方法。
【請求項２４】
さらに、少なくとも１種の試験特異的な二本鎖をベクター内にクローニングすることを含む請求項１の方法。
【請求項２５】
さらに前記試験特異的な二本鎖からポリヌクレオチドライブラリーを生成することを含む請求項２４の方法。
【請求項２６】
クローン化された試験特異的な二本鎖がポリペプチドを符号化し、そしてベクターが発現ベクターである請求項２４の方法。
【請求項２７】
さらに発現ベクターをホスト細胞内へ誘導し、そしてクローン化試験特異的な二本鎖により符号化されるタンパク質を発現させることを含む請求項２６の方法。
【請求項２８】
試験特異的な二本鎖が、ハイブリダイズしていないアンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖から、第一アンチセンスプライマー複合物を使用して合成される請求項４の方法であって、前記方法がさらに１種又はそれ以上のアンチセンスＲＮＡ分子を試験特異的な二本鎖から合成することを含む合成することを含む該方法。
【請求項２９】
さらに試験特異的な二本鎖から合成される１種又はそれ以上のアンチセンスＲＮＡ分子を細胞内へ誘導することを含む請求項２８の方法。
【請求項３０】
細胞がインビトロである請求項２９の方法。
【請求項３１】
１種又はそれ以上の試験特異的な二本鎖或いはそれらから直接的又は間接的に生成される１種又はそれ以上のポリヌクレオチドを、ハイブリダイゼーション反応において使用することを含む請求項１の方法。
【請求項３２】
試験特異的な二本鎖又はそれらから生成されるポリヌクレオチドの少なくとも１種が検出可能なラベルによりラベルされる請求項３１の方法。
【請求項３３】
さらに複数の試験特異的な二本鎖又はそれらから生成されるポリヌクレオチドをサブストレートに結合させ、ポリヌクレオチドアレイを生成させる請求項１の方法。
【請求項３４】
１種又はそれ以上の試験特異的な二本鎖の増幅させることをさらに含む請求項１の方法。
【請求項３５】
前記１種又はそれ以上の試験特異的な二本鎖を、１種又はそれ以上の遺伝子特異的なプライマーを使用して増幅する請求項３４の方法。
【請求項３６】
試験及び参照ポリヌクレオチド試料が異なる試料である請求項１の方法。
【請求項３７】
試験及び参照ポリヌクレオチド試料が以下：
第一の細胞又は組織からのｍＲＮＡ及び第二の異なる細胞又は組織からのｍＲＮＡ；
分化又は成長の第１段階における細胞又は組織からのｍＲＮＡ及び分化又は成長の第二の異なる段階における細胞又は組織からのｍＲＮＡ；
活性化試薬で処理された細胞又は組織からのｍＲＮＡ及び第二の異なる活性化試薬で処理されていない若しくは処理された細胞又は組織からのｍＲＮＡ；
正常な細胞又は組織からのｍＲＮＡ及び疾患細胞又は組織からのｍＲＮＡ、
の１つから選択される請求項３６の方法。
【請求項３８】
試験及び参照ポリヌクレオチド試料が正常な細胞又は組織からのｍＲＮＡ及び疾患細胞又は組織からのｍＲＮＡであって、疾患が感染症又は癌である請求項３７の方法。
【請求項３９】
一本鎖及び二本鎖ポリヌクレオチドの混合物中の一本鎖ポリヌクレオチドを機能的に単離する方法であって、前記一本鎖及び二本鎖ポリヌクレオチドの混合物を、１種又はそれ以上の制限エンドヌクレアーゼと、一本鎖ポリヌクレオチドを鋳型として使用するヌクレオチド合成反応用の鋳型として使用できない形態に二本鎖ポリヌクレオチドを消化させるのに十分な条件下で接触させることを含む該方法。
【請求項４０】
前記制限エンドヌクレアーゼが前記混合物中の二本鎖ポリヌクレオチドからのプライマーサイトを開裂する請求項３９の方法。
【請求項４１】
開裂していない一本鎖ポリヌクレオチドが、増幅により二本鎖ポリヌクレオチドに変換される請求項４０の方法。
【請求項４２】
請求項１の方法に従って試験及び参照ポリヌクレオチド試料間の刪減ハイブリダイゼーションにより製造される複数のポリヌクレオチドであって、少なくとも１０３ 種の異なるポリヌクレオチドを含み、及び：
参照ポリヌクレオチド試料中に存在しないか又は試験ポリヌクレオチド試料中に存在するよりも実質的に低い濃度で参照ポリヌクレオチド試料中に存在し；並びに、
試験ポリヌクレオチド試料と比較して低存在量のシーケンス、
であるシーケンスに実質的に富む該複数のポリヌクレオチド。
【請求項４３】
各ポリヌクレオチドがＲＮＡプロモーターシーケンス及びユニバーサルプライマーサイトを含む請求項４２の複数のポリヌクレオチド。
【請求項４４】
ポリヌクレオチドが二本鎖ｃＤＮＡ分子である請求項４２の複数のポリヌクレオチド。
【請求項４５】
ポリヌクレオチドがアンチセンスＲＮＡ分子である請求項４２の複数のポリヌクレオチド。
【請求項４６】
ａ）
ｉ）ハイブリダイズしていないセンス試験ポリヌクレオチド鎖中のプライマーサイトに結合するシーケンス；
ｉｉ）（ｉ）のシーケンスの第一制限サイト５’ であって、第一制限サイトが二本鎖ポリヌクレオチドを開裂するが、一本鎖ポリヌクレオチドを実質的に完全なままにする制限エンドヌクレアーゼにより開裂される該第一制限サイト５’ ；
ｉｉｉ）（ｉｉｉ）の制限サイトの第一ユニバーサルプライマーサイト５’ 、
を含むアンチセンスプライマー又はアンチセンスプライマー複合物；並びに
ｂ）請求項３の方法を行うための指示、を含むキット。
【請求項４７】
ａ）請求項４２の複数のポリヌクレオチド；
ｂ）ＲＮＡプロモーターシーケンスと操作可能にリンクするアンチセンスプライマーを含むアンチセンスプライマー複合物であって、ＲＮＡプロモーターシーケンスがアンチセンスプライマーの５’ である該アンチセンスプライマー複合物；及び
ｃ）センスプライマー、
を含むキット。
【請求項４８】
ａ）請求項４２の複数のポリヌクレオチド；及び
ｂ）複数のポリヌクレオチドからアンチセンスＲＮＡを転写することができるＲＮＡポリメラーゼ、
を含むキット。
【請求項４９】
ポリヌクレオチド試料から選択されたポリヌクレオチドプールを製造する方法であって、
ａ）第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖を、ポリヌクレオチド試料の又はそれから製造されたセンスポリヌクレオチドから、ＲＮＡプロモーターシーケンスに操作可能にリンクするアンチセンスプライマーを含み、ＲＮＡプロモーターシーケンスはアンチセンスプライマーの５’ であるアンチセンスプライマー複合物を使用して合成し；
ｂ）ユニバーサルプライマーサイトを第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖の３’ 末端に加え；
ｃ）第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖を希釈し、少なくとも数種の低存在量第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖を実質的に除去し；
ｄ）残留する第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖から、ポリヌクレオチド試料と比較して高存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富む第一の二本鎖ポリヌクレオチドを生成させる、
ことを含む該方法。
【請求項５０】
ポリヌクレオチド試料がｍＲＮＡ試料であって、第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖が第一アンチセンスｃＤＮＡ鎖であって、及び第一の二本鎖ポリヌクレオチドが第一の二本鎖ｃＤＮＡ分子である請求項４９の方法。
【請求項５１】
第一アンチセンスｃＤＮＡ鎖の合成がランダムプライマー又はオリゴヌクレオチドｄＴ−プライマーを使用してプライムされる請求項５０の方法。
【請求項５２】
ユニバーサルプライマーサイトが第一アンチセンスｃＤＮＡ鎖の３’ 末端へ、鋳型交換、オリゴヌクレオチド配列化又はライゲーションにより加えられる請求項５０の方法。
【請求項５３】
ＲＮＡプロモーターシーケンスが、Ｔ７、Ｔ３及びＳＰ６からなる群より選択されるバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼにより認識されるＲＮＡプロモーターシーケンスである請求項４９の方法。
【請求項５４】
第一の二本鎖ポリヌクレオチドが、残留する第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖を増幅することにより生成され、そして該増幅が５’ プライマーとしてユニバーサルプライマーサイトに対しハイブリダイズするユニバーサルプライマー及び３’ プライマーとしてのアンチセンスプライマー複合物を使用して行われる、請求項４９の方法。
【請求項５５】
該増幅が、促進されたポリメラーゼ鎖反応により行われる請求項５４の方法。
【請求項５６】
第一の二本鎖ポリヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ及びＲＮａｓｅを含む酵素混合物を使用して生成される請求項４９の方法。
【請求項５７】
第一の二本鎖ポリヌクレオチドから第一アンチセンスＲＮＡ分子を合成することをさらに含む請求項４９の方法。
【請求項５８】
ａ）第一アンチセンスＲＮＡ分子を、ポリヌクレオチド試料の又はそれから製造されるセンスポリヌクレオチド鎖と、ハイブリダイゼーション混合物を形成させるためのハイブリダイゼーション条件下で接触させ、それによりポリヌクレオチド試料と比較して低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富むハイブリダイズしていないセンスポリヌクレオチド鎖を生成させ；
ｂ）アンチセンスプライマー又はアンチセンスプライマー複合物を使用してハイブリダイズしていないセンスポリヌクレオチド鎖から第二アンチセンスポリヌクレオチドを合成する、ここで前記アンチセンスプライマー複合物はＲＮＡプロモーターシーケンスに操作可能にリンクするアンチセンスプライマーを含み、ＲＮＡプロモーターシーケンスはアンチセンスプライマーの５’ である；
ｃ）ユニバーサルプライマーサイトを第二アンチセンスポリヌクレオチド鎖の３’ 末端へ加え；及び
ｄ）第二アンチセンスポリヌクレオチド鎖から第二の二本鎖ポリヌクレオチドを生成させる、
ことをさらに含む請求項５７の方法。
【請求項５９】
ハイブリダイゼーション混合物中において第一アンチセンスＲＮＡ分子の他のポリヌクレオチドに対するモル比が約１〜約１００：１である請求項５８の方法。
【請求項６０】
ポリヌクレオチド試料がｍＲＮＡ試料であって、センスポリヌクレオチド鎖がｍＲＮＡ試料中のｍＲＮＡ分子であって、第二アンチセンスポリヌクレオチド鎖が第二アンチセンスｃＤＮＡ鎖であって、及び第二の二本鎖ポリヌクレオチドが第二の二本鎖ｃＤＮＡ分子である請求項５８の方法。
【請求項６１】
第二アンチセンスｃＤＮＡ鎖の合成がオリゴヌクレオチドｄＴ−プライミングを使用してプライムされる請求項６０の方法。
【請求項６２】
ユニバーサルプライマーサイトが第二アンチセンスｃＤＮＡ鎖の３’ 末端へ、鋳型交換、オリゴヌクレオチド配列化又はライゲーションにより加えられる請求項６０の方法。
【請求項６３】
第二アンチセンスポリヌクレオチド鎖が、ハイブリダイズしていないセンスポリヌクレオチド鎖からアンチセンスプライマー複合物を使用して合成され、（ｂ）のＲＮＡプロモーターシーケンスがＴ７、Ｔ３及びＳＰ６からなる群より選択されるＲＮＡポリメラーゼについてのＲＮＡプロモーターシーケンスを含む請求項５８の方法。
【請求項６４】
第二の二本鎖ポリヌクレオチドが、第二アンチセンスポリヌクレオチド鎖を増幅することにより生成され、そして該増幅が５’ プライマーとしてユニバーサルプライマーサイトに対しハイブリダイズするユニバーサルプライマー及び３’ プライマーとしてのアンチセンスプライマー又はアンチセンスプライマー複合物を使用して行われる、請求項５８の方法。
【請求項６５】
該増幅が、促進されたポリメラーゼ鎖反応により行われる請求項６４の方法。
【請求項６６】
第二の二本鎖ポリヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ及びＲＮａｓｅを含む酵素混合物を使用して生成される請求項５８の方法。
【請求項６７】
ユニバーサルプライマー及び／又はアンチセンスプライマー若しくはアンチセンスプライマー複合物の各々が制限サイトを含む請求項５８の方法。
【請求項６８】
第二アンチセンスポリヌクレオチド鎖がアンチセンスプライマー複合物を使用してハイブリダイズしていないセンスポリヌクレオチド鎖から合成される請求項５８の方法であって、さらに第二の二本鎖ポリヌクレオチドからアンチセンスＲＮＡ分子を合成することを含む該方法。
【請求項６９】
第二の二本鎖ポリヌクレオチド、又はハイブリダイゼーション反応において、それらから直接的に又は間接的に生成されるポリヌクレオチドを使用することを含む請求項５８の方法。
【請求項７０】
ポリヌクレオチド試料から選択されたポリヌクレオチドプールを製造する方法であって、
ａ）第一ポリヌクレオチド試料から製造される第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖を第二ポリヌクレオチド試料の又はそれから製造されるセンスポリヌクレオチド鎖に対してハイブリダイズし、ここで第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖は第一ポリヌクレオチド試料と比較して高存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富み、それにより第二ポリヌクレオチド試料と比較して低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富むハイブリダイズしていないセンスポリヌクレオチド鎖を生成させる；
ｂ）ハイブリダイズしていないセンスポリヌクレオチド鎖から、アンチセンスプライマー又はアンチセンスプライマー複合物を使用して、第二アンチセンスポリヌクレオチド鎖を合成する、ここで、該アンチセンスプライマー複合物はＲＮＡプロモーターシーケンスと操作可能にリンクするアンチセンスプライマーを含み、ＲＮＡプロモーターシーケンスがアンチセンスプライマーの５’ である；
ｃ）ユニバーサルプライマーサイトを第二アンチセンスポリヌクレオチド鎖の３’ 末端へ加える；
ｄ）第二アンチセンスポリヌクレオチド鎖から二本鎖ポリヌクレオチドを生成させる、
ことを含む該方法。
【請求項７１】
ハイブリダイゼーション混合物中の他のポリヌクレオチドに対する第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖のモル比が約１〜約１００：１である請求項７０の方法。
【請求項７２】
第一及び第二ポリヌクレオチド鎖がｍＲＮＡ試料であり、センスポリヌクレオチド鎖がｍＲＮＡ分子であり、第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖がアンチセンスＲＮＡであり、第二アンチセンスポリヌクレオチド鎖がアンチセンスｃＤＮＡ鎖であり、そして二本鎖ポリヌクレオチドが二本鎖ｃＤＮＡ分子である請求項７０の方法。
【請求項７３】
二本鎖ポリヌクレオチドが、第二アンチセンスポリヌクレオチド鎖を増幅することにより生成され、そして該増幅が５’ プライマーとしてユニバーサルプライマーサイトに対しハイブリダイズするユニバーサルプライマー及び３’ プライマーとしてのアンチセンスプライマー又はアンチセンスプライマー複合物を使用して行われる、請求項７０の方法。
【請求項７４】
ユニバーサルプライマー及び／又はアンチセンスプライマー若しくはアンチセンスプライマー複合物が、各々制限サイトを含む請求項７０の方法。
【請求項７５】
さらに少なくとも１種の二本鎖ポリヌクレオチドをベクター内へクローニングすることを含む請求項７０の方法。
【請求項７６】
クローン化されたポリヌクレオチドがポリペプチドを符号化し、そしてベクターが発現ベクターである請求項７５の方法。
【請求項７７】
さらに発現ベクターをホスト細胞内に誘導し、そしてクローン化された二本鎖ポリヌクレオチドにより符号化されるタンパク質を発現することを含む請求項７６の方法。
【請求項７８】
第二アンチセンスポリヌクレオチド鎖がアンチセンスプライマー複合物を使用してハイブリダイズしていないセンスポリヌクレオチド鎖から合成され、さらに二本鎖ポリヌクレオチドからアンチセンスＲＮＡ分子を合成することを含む請求項７０の方法。
【請求項７９】
１種又はそれ以上の二本鎖ポリヌクレオチド、又はハイブリダイゼーション反応においてそれらから直接的に又は間接的に生成されるポリヌクレオチドを使用することを含む請求項７９の方法。
【請求項８０】
少なくとも１種の二本鎖ポリヌクレオチド又はそれらから生成されるポリヌクレオチドが検出可能なラベルを用いてラベルされる請求項７９の方法。
【請求項８１】
複数の二本鎖ポリヌクレオチド又はそれらから生成されるポリヌクレオチドがサブストレートに対して付加しポリヌクレオチドアレイを生成することをさらに含む請求項７０の方法。
【請求項８２】
さらに少なくとも１種の二本鎖ポリヌクレオチドを増幅することを含む請求項７０の方法。
【請求項８３】
１種又はそれ以上の二本鎖ポリヌクレオチドが１種又はそれ以上の遺伝子特異的なプライマーを使用して増幅される請求項８２の方法。
【請求項８４】
第一及び第二ポリヌクレオチド試料が異なる試料である請求項７０の方法。
【請求項８５】
ポリヌクレオチド試料から製造される複数のポリヌクレオチドであって、少なくとも１０３ 種の異なるポリヌクレオチドを含み、そしてポリヌクレオチド試料と比較して高存在量ポリヌクレオチドシーケンスに実質的に富み、ポリヌクレオチドの各々がＲＮＡプロモーターシーケンス及びユニバーサルプライマーサイトを含む該複数のポリヌクレオチド。
【請求項８６】
ポリヌクレオチド試料から製造される複数のポリヌクレオチドであって、少なくとも１０３ 種の異なるポリヌクレオチドを含み、そしてポリヌクレオチド試料と比較して低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに実質的に富む該複数のポリヌクレオチド。
【請求項８７】
ポリヌクレオチドの各々がＲＮＡプロモーターシーケンス及びユニバーサルプライマーサイトを含む請求項８６の複数のポリヌクレオチド。
【請求項８８】
ポリヌクレオチドが二本鎖ｃＤＮＡである請求項８６の複数のポリヌクレオチド。
【請求項８９】
ポリヌクレオチドがアンチセンスＲＮＡである請求項８６の複数のポリヌクレオチド。
【請求項９０】
ａ）ＲＮＡプロモーターシーケンスに操作可能にリンクするアンチセンスプライマーを含むアンチセンスプライマー複合物であって、ＲＮＡプロモーターシーケンスがアンチセンスプライマーの５’ である該アンチセンスプライマー複合物；
ｂ）センスプライマー；及び
ｃ）請求項４９の方法を行うための指示、
を含むキット。
【請求項９１】
ａ）ＲＮＡプロモーターシーケンスに操作可能にリンクするアンチセンスプライマーを含むアンチセンスプライマー複合物であって、ＲＮＡプロモーターシーケンスがアンチセンスプライマーの５’ である該アンチセンスプライマー複合物；
ｂ）センスプライマー；及び
ｃ）請求項７０の方法を行うための指示、
を含むキット。
【請求項９２】
ａ）請求項８６の複数のポリヌクレオチド；
ｂ）ＲＮＡプロモーターシーケンスに操作可能にリンクするアンチセンスプライマーを含むアンチセンスプライマー複合物であって、ＲＮＡプロモーターシーケンスがアンチセンスプライマーの５’ である該アンチセンスプライマー複合物；及び
ｃ）センスプライマー、
を含むキット。
【請求項９３】
ａ）請求項８６の複数のポリヌクレオチド；及び
ｂ）複数のポリヌクレオチドからアンチセンスＲＮＡを転写することができるＲＮＡポリメラーゼ、
を含むキット。
【請求項９４】
ポリヌクレオチド試料から選択されたポリヌクレオチドプールを製造する方法であって、
ａ）ポリヌクレオチド試料の又はそれから製造されるセンスポリヌクレオチドから第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖を合成し；
ｂ）第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖を希釈し、少なくとも数種の低存在量第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖を実質的に除去し；及び
ｃ）ポリヌクレオチド試料と比較して高存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富む第一の二本鎖ポリヌクレオチドを、残留する第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖から合成し；
ｄ）第一の二本鎖ポリヌクレオチドから第二アンチセンスポリヌクレオチド鎖を生成させ；
ｅ）第二アンチセンスポリヌクレオチド鎖を、ポリヌクレオチド試料の又はそれから製造されるセンスポリヌクレオチド鎖と、ハイブリダイゼーション混合物を形成させるためのハイブリダイゼーション条件下にて接触させ、それによりポリヌクレオチド試料と比較して低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富むハイブリダイズしていないセンスポリヌクレオチド鎖を生成させ；
ｆ）ハイブリダイズしていないセンスポリヌクレオチド鎖から第三アンチセンスポリヌクレオチド鎖を合成し；
ｇ）第三アンチセンスポリヌクレオチド鎖から第二の二本鎖ポリヌクレオチドを生成させる、
ことを含む該方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願情報
この出願は出願第０９／６３２，８９８号（２０００年８月７日出願）の一部継続出願であり、そして出願第０６／２８８，７７７号（２００１年５月４日出願）の一部継続出願であり、それらの両方が本明細書中に完全に参照として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、試料からポリヌクレオチドプールを選択する方法及びキット、及びそれにより製造される選択されたポリヌクレオチドプールに関する。特に本発明は、試料に比べて高存在量（ｈｉｇｈ−ａｂｕｎｄａｎｃｅ）シーケンスに富むポリヌクレオチドプールを製造する方法、及びそのようなポリヌクレオチドプールを使用して低存在量（ｌｏｗ−ａｂｕｎｄａｎｃｅ）シーケンスに富むポリヌクレオチドプールを製造する刪減ハイブリダイゼーション（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）反応を提供する。本発明は、さらに刪減されるポリヌクレオチドプールを試験及び参照ポリヌクレオチド試料から製造する一般的な刪減ハイブリダイゼーション方法をも提供する。
【０００３】
発明の背景
生物学的に活性なタンパク質は、治療、診断及び他の適用の候補として熱烈な調査の対象である。これらの試みにおける最初の段階は、典型的にはタンパク質を符号化する遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）からのクローニングである。ヒト及び他の哺乳動物細胞のｍＲＮＡは、３種の頻度クラス（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｃｌａｓｓ）：（１）全ｍＲＮＡ個体数の約１０〜２０％を表す高存在量シーケンス（２）ｍＲＮＡの約４０〜４５％を表す中程度の存在量シーケンス（３）ｍＲＮＡの他の４０〜４５％を表す低存在量シーケンス、に分割できる。ホルモンやそれらのレセプターのような、重要な調節機能を有するタンパク質を符号化する遺伝子は低いレベルで発現され、そして対応する転写物はシーケンスの低存在量クラスに分類される。
【０００４】
低存在量シーケンスをクローン化する試みは、ライブラリー中の全てのクローンの頻度が非常に狭い範囲内にある標準化ｃＤＮＡライブラリーを使用してきた。しかし、このアプローチはｃＤＮＡライブラリーを発生させるプロセスにおける低存在量シーケンスのロスを処理せず、それはより短いシーケンスと同様に高存在量及び中程度の存在量シーケンスを優先的にクローン化する。クローニングに伴うロスなしで、ｍＲＮＡ分布からプール低存在量ポリヌクレオチドの選択を容易化する方法及び多量のこのようなシーケンスを提供する手段を備えた方法は、重要な調節タンパク質を特定することにて意図される調査を大いに容易化する。
【０００５】
特に興味深いのは、２種の試料間で異なって発現される低存在量ポリヌクレオチドの同定を容易化する方法である。このようなポリヌクレオチドを同定する試みは、一般的に刪減ハイブリダイゼーションの数種のバリエーションを使用してきた。この技術において、この２種の試料は典型的には２種のｍＲＮＡ試料であり、それは重要な写しを含む“試験” 試料と表される試料と、重要な写しを欠く“参照” 試料又は“ドライバー” と呼ばれる試料とを有する。例えば、この試験試料は組織細胞からのｍＲＮＡからなり、そして参照試料は正常細胞からのｍＲＮＡからなる。両方の試料は、最初にｃＤＮＡに変換され、それからハイブリダイズされる。両方の試料に共通のポリヌクレオチドは、ハイブリッドを形成し、それは数種の様式で除去され、２種の試料間で異なる一本鎖化されたポリヌクレオチドを残す。伝統的な刪減ハイブリダイゼーション技術は数種の場合において成功したが、これらの技術の２つの主要な欠点は、稀有のｍＲＮＡを特定するためには好適でなく、及びそれらは完全長の転写物を産するものではないことである。完全長の転写物は、符号化されたタンパク質を発現し及び機能的な研究において実行するために必須である。
【０００６】
伝統的な刪減ハイブリダイゼーション技術において、ｍＲＮＡ試料はｃＤＮＡに変換され、そしてそれから頻繁に切断する制限酵素を用いて消化され、各ｃＤＮＡ分子が“接着末端化される（ｓｔｉｃｋｙ　ｅｎｄｅｄ）” ことを確保する。アダプターが接着末端上にライゲートされ、そしてフラグメントがベクター内にクローン化される。頻繁に切断する制限酵素を用いた消化は、生じたｃＤＮＡライブラリーがオリジナルのｍＲＮＡを可能な限り表すものであることを確保する必要があるが、切って短くされたｃＤＮＡクローンを生成するという所望でない効果を有する。このようなクローンは、完全長のクローンを得るための試みにおいて、さらなるライブラリをプローブするために使用でき、そしてこれは良くても困難であり、及び全ての適用可能なライブラリーにおいて典型的には不十分に表示されるか又は存在しない低存在量の転写物の場合にはしばしば無駄である。
【０００７】
理想的には、特に試料間で異なる低存在量ポリヌクレオチドを同定することを意図する方法は、前もってベクター内へクローニングすることなく及びシーケンスの情報を必要とすることなく、広範囲の複写物を複製することができる。好ましくは、このような方法により提供される低存在量ポリヌクレオチドは、完全長の複写物（例えば完全長ｃＤＮＡクローン）を表す。最終的には、２種の試料間で異なる低存在量ポリヌクレオチドの同定を容易化する方法が特に興味深い。
【０００８】
発明の要約
本発明は、参照試料中には無いか又は低存在量である試験試料中の１種又はそれ以上のポリヌクレオチドを同定するための刪減ハイブリダイゼーションを提供する。本方法は、特に異なる試料間で異なって発現する低存在量シーケンスを同定するために有用である。好適な具体例において、試験及び参照ポリヌクレオチド試料は、以下の１つから選択される：
（ａ）　第一の細胞又は組織からのｍＲＮＡ及び第二の異なる細胞又は組織からのｍＲＮＡ、
（ｂ）　分化又は成長の第一段階におけるｍＲＮＡ及び分化又は成長の第二の異なる段階におけるｍＲＮＡ、
（ｃ）　活性試薬を用いて処理された細胞又は組織からのｍＲＮＡ及び第二の異なる活性試薬用いて処理されない或いは処理されるｍＲＮＡ、及び
（ｄ）　正常細胞又は組織からのｍＲＮＡ及び疾患細胞又は組織からのｍＲＮＡ、疾患は例えば感染症又は癌である。
【０００９】
本方法は、ハイブリダイゼーション混合物から高存在量シーケンスを除去するための第一刪減ハイブリダイゼーション反応における“ドライバー” として、試験又は参照ポリヌクレオチド試料と比較して、高存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富む試験又は参照ポリヌクレオチドのプールの又はそれらから製造される高存在量富化ポリヌクレオチド鎖を使用する。１つの具体例において、高存在量富化ポリヌクレオチド鎖は、試験ポリヌクレオチドのプールのものであるか又はそれらから製造されるものである。好ましくは、高存在量富化ポリヌクレオチド鎖は、高存在量富化アンチセンスポリヌクレオチド鎖である。例えば、試験又は参照ポリヌクレオチド試料がｍＲＮＡ試料である場合は、高存在量富化アンチセンスポリヌクレオチド鎖は好ましくはアンチセンスＲＮＡ分子である。
【００１０】
この第一刪減ハイブリダイゼーションは、高存在量富化ポリヌクレオチド鎖を試験ポリヌクレオチド試料の又はそれから製造される試験ポリヌクレオチド鎖と、第一ハイブリダイゼーション混合物を形成するための条件下で接触させることを必要とする。試験ポリヌクレオチド鎖は、好ましくは、ｍＲＮＡ分子のようなセンス試験ポリヌクレオチド鎖である。この反応は、試験ポリヌクレオチド試料と比較して低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富むハイブリダイズしていない（ｕｎｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ）試験ポリヌクレオチドを生成する。
【００１１】
第二刪減ハイブリダイゼーション反応における使用のためのポリヌクレオチド鎖は、その後ハイブリダイズしていない試験ポリヌクレオチド鎖から合成され、それにより低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖を生成する。これらの低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖は、好ましくはアンチセンスｃＤＮＡ鎖のようなアンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖である。この第二刪減ハイブリダイゼーション反応用のドライバーは、参照ポリヌクレオチド試料と比較して低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富むポリヌクレオチドの参照プールであるか又はそれから製造される低存在量富化参照ポリヌクレオチド鎖である。低存在量富化参照ポリヌクレオチド鎖は、好ましくはセンス参照ポリヌクレオチド鎖、例えばセンスｃＤＮＡ鎖である。
【００１２】
この第二ハイブリダイゼーション反応は、両方の試料中に（おおよそ同じ量で）存在する“シーケンス” を除去し、異なって発現されるハイブリダイズしていないシーケンスを残す。その反応は、低存在量富化参照ポリヌクレオチド鎖を低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖と、第二ハイブリダイゼーション混合物を形成するためのハイブリダイゼーション条件下で接触させることにより行われ、それにより、ハイブリッド二本鎖、ハイブリダイズしていない低存在量富化参照ポリヌクレオチド鎖及び低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖を生成する。
【００１３】
共通のシーケンスを表すハイブリッド二本鎖は除去又は消化され、そして“試験特異的な二本鎖” がハイブリダイズしていない低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖から生成される。好ましくは、ハイブリッド二本鎖は少なくとも１種の酵素、例えば制限エンドヌクレアーゼを用いて消化され、そして試験特異的な二本鎖はハイブリダイズしていないアンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖から増幅により製造される。
【００１４】
好適な具体例において、アンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖は、第一アンチセンスプライマー又は第一アンチセンスプライマー複合物を使用して、ハイブリダイズしていないセンス試験ポリヌクレオチド鎖から合成される。この具体例のバリエーションにおいて、第一アンチセンスプライマー又は第一アンチセンスプライマー複合物は：（ａ）　ハイブリダイズしていないセンス試験ポリヌクレオチド鎖中のプライマーサイトに結合するシーケンス；（ｂ）　（ａ）のシーケンスの第一制限サイト５’ 、ここで第一制限サイトは、二本鎖ポリヌクレオチドを開裂するが、一本鎖ポリヌクレオチドを実質的に完全のままにする制限エンドヌクレアーゼにより開裂される；並びに（ｃ）　（ｂ）の制限サイトの第一ユニバーサルプライマーサイト５’ 、を含む。本発明のこのバリエーションにおいて、アンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖は、好ましくはハイブリダイズしていないセンス試験ポリヌクレオチド鎖から、第一アンチセンスプライマー及び第二制限サイトを含む（ｃ）の第一ユニバーサルプライマーサイトを使用して合成され、ここで該第二制限サイトは第一制限サイトとは異なる。さらに、センス参照ポリヌクレオチド鎖は、好ましくは、先にセンス参照ポリヌクレオチド鎖の５’ 末端に加えられる第三制限サイトを含む、ここで第三制限サイトは二本鎖ポリヌクレオチドを開裂するが一本鎖ポリヌクレオチドを実質的に完全のままにする制限エンドヌクレアーゼにより開裂される。
【００１５】
ハイブリッド二本鎖を形成するポリヌクレオチド鎖内に好適な制限サイトを導入した後、ハイブリッド二本鎖の消化は、
（ａ）　第二ハイブリダイゼーション混合物を、ハイブリッド二本鎖の一本鎖部分を二本鎖化する酵素を用いて処理し、それによりハイブリッド二本鎖内に二本鎖第一、第二及び第三制限サイトを生成させ；
（ｂ）第二ハイブリダイゼーション混合物内のポリヌクレオチド鎖の３’ 末端に第二ユニバーサルプライマーサイトを加え；そして
（ｃ）第二ハイブリダイゼーション混合物を１種又はそれ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて処理する、ここで制限エンドヌクレアーゼはハイブリッド二本鎖を二本鎖第一及び第三制限サイトにて開裂するが、アンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖及びセンス参照ポリヌクレオチド鎖を実質的に完全なままにする、
ことにより便利に達成される。
【００１６】
本発明の方法は、一般的に、１種又はそれ以上の試験特異的な二本鎖をベクター内へクローニングすることを含む。特に、このような方法は、“試験特異的な” ｃＤＮＡライブラリーの構成を与える。このライブラリーは、他の刪減ハイブリダイゼーション技術により作成されるライブラリーよりも、通常、慣用技術を用いて失われる低存在量シーケンスを含む点で優れている。この具体例の好ましいバリエーションにおいて、クローン化された試験特異的な二本鎖はポリペプチドを符号化し、そしてベクターは発現ベクターである。本発明の方法は、さらに発現ベクターをホスト細胞に導入し、そして試験特異的な二本鎖により符号化されるタンパク質を発現させることを含む。
【００１７】
１つの具体例において、試験特異的な二本鎖はハイブリダイズしていないアンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖から、第一アンチセンスプライマー複合物を使用して合成され、本方法はさらに試験特異的な二本鎖から１種又はそれ以上のアンチセンスＲＮＡ分子を合成することを含む。この様式で生成されるアンチセンスＲＮＡ分子は、調査又は治療の目的のために細胞内に導入できる。
【００１８】
本発明の方法に従って生成される試験特異的な二本鎖、又はそれらから直接若しくは間接的に生成されるポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション反応に使用することもできる。このようなポリヌクレオチドは検出可能なラベルでラベルされることができ及び／又はサブストレートに対して付加されポリヌクレオチドアレイを生成することができる。所望であれば、１種又はそれ以上の試験特異的な二本鎖は増幅され得る。好適な具体例において、この増幅は１種又はそれ以上の遺伝子特異的プライマーを使用して実行される。従って、本発明の方法は試験特異的な二本鎖のこれらの適用の各々を含む。
【００１９】
他の具体例において、本発明は一本鎖及び二本鎖ポリヌクレオチドの混合物中の一本鎖ポリヌクレオチドを機能的に単離する方法を提供する。この方法は、一本鎖及び二本鎖ポリヌクレオチドの混合物を、１種又はそれ以上の制限エンドヌクレアーゼと、二本鎖ポリヌクレオチドを消化させるに十分な条件下で接触させることが必要であり、鋳型として一本鎖ポリヌクレオチドを使用するヌクレオチド合成反応について、鋳型として使用することができないものを形成する。好ましくは、制限エンドヌクレアーゼは前記混合物中の二本鎖ポリヌクレオチドからプライマーサイトを開裂する。制限消化後、混合物中の開裂されない一本鎖ポリヌクレオチドは好ましくは増幅により二本鎖ポリヌクレオチドへ変換される。
【００２０】
本発明の別の態様は、試験及び参照ポリヌクレオチド試料間の刪減ハイブリダイゼーションにより製造される複数のポリヌクレオチドであり、ここで複数のポリヌクレオチドは少なくとも１０３ 種の異なるポリヌクレオチドを含む。複数のポリヌクレオチドは実質的には：
（ａ）参照ポリヌクレオチド試料中に存在しないか、又は参照ポリヌクレオチド試料中に試験ポリヌクレオチド試料中よりも実質的に低い濃度で存在するかのいずれかであり、並びに
（ｂ）試験ポリヌクレオチド試料と比較して、低存在量である、
シーケンスに富む。複数のポリヌクレオチドにおける各ポリヌクレオチドはＲＮＡプロモーターシーケンス及びユニバーサルプライマーサイトを含むことができる。好ましい具合例において、これらのポリヌクレオチドは二本鎖ｃＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡである。
【００２１】
本発明は、本発明の方法を行い及び／又は本発明の複数のポリヌクレオチドを使用するに有用であるキットも提供する。第一のキットはアンチセンスプライマー又はアンチセンスプライマー複合物及び本発明の一般的な刪減ハイブリダイゼーション方法を行うための指示を含む。該アンチセンスプライマー又はアンチセンスプライマー複合物は：
（ａ）　プライマーサイトに結合するシーケンス；
（ｂ）　（ａ）のシーケンスの第一制限サイト５’ 、ここで第一制限サイトは二本鎖ポリヌクレオチドを開裂するが、一本鎖ポリヌクレオチドを実質的に完全なままにする制限エンドヌクレアーゼにより開裂される；及び、
（ｃ）　（ｂ）の制限サイトの第一ユニバーサルプライマーサイト５’
を含む。
【００２２】
第二のキットは：本発明の複数のポリヌクレオチド；ＲＮＡプロモーターシーケンスと操作可能にリンクするアンチセンスプライマーを含むアンチセンスプライマー複合物、ここでＲＮＡプロモーターシーケンスはアンチセンスプライマーの５’ である；及びセンスプライマーを含む。第三のキットは：本発明の複数のポリヌクレオチド、及び複数のポリヌクレオチドからアンチセンスＲＮＡを転写できるＲＮＡポリメラーゼを含む。
【００２３】
本発明は、ポリヌクレオチド試料から選択されたポリヌクレオチドプールを製造する方法も提供する。好適な具体例において、選択されたポリヌクレオチドプールはポリヌクレオチド試料と比較して１種又はそれ以上の高存在量のポリヌクレオチドに富む。本方法は、第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖を、ポリヌクレオチド試料の又はそれから製造されたセンスポリヌクレオチドから、アンチセンスプライマー複合物を使用して合成することが必要である。アンチセンスプライマー複合物は、ＲＮＡプロモーターシーケンスに操作可能にリンクするアンチセンスプライマーを含み、ＲＮＡプロモーターシーケンスはアンチセンスプライマーの５’ である。次にユニバーサルプライマーサイトが第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖の３’ 末端に加えられる。結果物の第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖はそれから希釈され、少なくとも数種の低存在量第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖を実質的に除去する。希釈後、第一の二本鎖ポリヌクレオチドは残留する第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖から生成される。第一の二本鎖ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド試料と比較して高存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富む。
【００２４】
本方法の好適な具体例において、ポリヌクレオチド試料はｍＲＮＡ試料であり、第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖は第一アンチセンスｃＤＮＡ鎖であり、そして第一の二本鎖ポリヌクレオチドは第一の二本鎖ｃＤＮＡ分子である。第一アンチセンスｃＤＮＡ鎖の合成は、ランダムなプライマー又はオリゴヌクレオチド−ｄＴプライマーを使用してプライムされ得る。ユニバーサルプライマーサイトは鋳型交換、オリゴヌクレオチド配列化又はライゲーションにより第一アンチセンスｃＤＮＡ鎖の３’ 末端に加えられることができる。ＲＮＡプロモーターシーケンスは便利にはＴ７、Ｔ３又はＳＰ６ポリメラーゼのようなバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼにより認識されるものである。
【００２５】
好ましくは、第一の二本鎖ポリヌクレオチドは、希釈後に残留する第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖を増幅することにより生成される、そして増幅は、５’ プライマーとしてユニバーサルプライマーサイトへハイブリダイズするユニバーサルプライマーを使用して、及び３’ プライマーとしてアンチセンスプライマー複合物を使用して行われる。最も好ましくは、増幅は促進されたポリメラーゼ鎖反応により行われる。この反応は、オリジナルのポリヌクレオチド試料と比較して高存在量シーケンスに富む二本鎖ポリヌクレオチドのプールを生成する。本方法は、随意に第一アンチセンスＲＮＡ分子を第一の二本鎖ポリヌクレオチドから合成することを含む。アンチセンスＲＮＡ分子のプールは、高存在量シーケンスに富み、及びそれゆえ刪減ハイブリダイゼーションにおいて“ドライバー”として使用できる。
【００２６】
本発明はアンチセンスポリヌクレオチド鎖、好ましくは上述のように製造された高存在量富化アンチセンスＲＮＡ分子を使用する方法も提供し、ポリヌクレオチド試料から選択されたポリヌクレオチドプールを生成する。好ましい具体例において、選択されたポリヌクレオチドプールは、ポリヌクレオチド試料と比較して１種又はそれ以上の低存在量ポリヌクレオチドに富む。本方法は、第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖を、ハイブリダイゼーション条件において、ポリヌクレオチド試料又はそれから製造されるセンスポリヌクレオチド鎖に対してハイブリダイズすることが必要である。好ましくは、第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖のハイブリダイゼーション混合物中の他のポリヌクレオチドに対するモル比は、約１〜約１００：１である。
【００２７】
結果として生じるハイブリダイゼーション混合物は、ポリヌクレオチド試料と比較して低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富むハイブリダイズしていないセンスポリヌクレオチド鎖を含む。第二アンチセンスポリヌクレオチド鎖は、アンチセンスプライマー又はアンチセンスプライマー複合物を使用して、ハイブリダイズしていないセンスポリヌクレオチド鎖から合成される。アンチセンスプライマー複合物は、ＲＮＡプロモーターシーケンスに操作可能にリンクするアンチセンスプライマーを含み、ＲＮＡプロモーターシーケンスはアンチセンスプライマーの５’ である。アンチセンスプライマー複合物は、それぞれがＲＮＡプロモーターを含む選択されたポリヌクレオチドのプールを生成し、選択されたポリヌクレオチドからのアンチセンスＲＮＡの合成を容易化することが所望な場合に、使用されることが好ましい。
【００２８】
さらに、ユニバーサルプライマーサイトは、第二アンチセンスポリヌクレオチド鎖の３’ 末端に加えられる。第二の二本鎖ポリヌクレオチドは、それから第二アンチセンスポリヌクレオチド鎖から生成される。このポリヌクレオチドのプールは、ポリヌクレオチド試料と比較して低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富む。
【００２９】
本方法の好適な具体例において、ポリヌクレオチド試料はｍＲＮＡ試料であり、センスポリヌクレオチド鎖はｍＲＮＡ分子であり、第二アンチセンスポリヌクレオチド鎖は第二アンチセンスｃＤＮＡ鎖であり、そして第二の二本鎖ポリヌクレオチドは第二の二本鎖ｃＤＮＡ分子である。第二アンチセンスｃＤＮＡ鎖の合成は、オリゴヌクレオチド−ｄＴプライマーを使用してプライムできる。ユニバーサルプライマーサイトは鋳型交換、オリゴヌクレオチド配列化又はライゲーションにより第二アンチセンスｃＤＮＡ鎖の３’ 末端に加えられることができる。アンチセンスプライマー複合物が使用される場合は、ＲＮＡプロモーターシーケンスは便利にはＴ７、Ｔ３又はＳＰ６ポリメラーゼのようなバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼにより認識されるものである。
【００３０】
好ましくは、第二の二本鎖ポリヌクレオチドは第二アンチセンスポリヌクレオチド鎖を増幅することにより製造され、そして該増幅は５’ プライマーとしてユニバーサルプライマーサイトに対してハイブリダイズするユニバーサルプライマーを使用することにより及び３’ プライマーとしてアンチセンスプライマー又はアンチセンスプライマー複合物を使用することにより実行される。最も好ましくは、該増幅は促進されたポリメラーゼ鎖反応により行われる。この反応は、オリジナルのポリヌクレオチド試料と比較して低存在量のシーケンスに富む二本鎖ポリヌクレオチドのプールを生成する。アンチセンスプライマー複合物が使用され第二の二本鎖ポリヌクレオチドが生成する場合は、これらのポリヌクレオチドはＲＮＡプロモーターを含む。この場合、本方法は随意に。第二の二本鎖ポリヌクレオチドからアンチセンスＲＮＡ分子を合成することを含むことができる。
【００３１】
本発明の方法の好適な具体例において、ユニバーサルプライマー及び／又はアンチセンスプライマー若しくはアンチセンスプライマー複合物は、それぞれが制限サイトを含む。本発明の方法は、１種又はそれ以上の第二の二本鎖（低存在量富化）ポリヌクレオチドをベクター内にクローニングすることを随意に含むことができる。特にそのような方法は、“標準化された”ｃＤＮＡライブラリーの構成を認める。このライブラリーは他の技術により製造された標準化ライブラリーよりも、ライブラリー中のｃＤＮＡの複製数が、オリジナルのポリヌクレオチド試料のものよりも非常に少なく変化する点で優れている；例えばｃＤＮＡ複製数は１桁より大きくないオーダーで変化する高度な表示（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ）ｃＤＮＡライブラリーが製造される。この具体例の好適なバリエーションにおいて、クローン化された二本鎖ポリヌクレオチドはポリペプチドを符号化し、ベクターは発現ベクターである。本発明の方法は、さらに発現ベクターをホスト細胞内に導入し、クローン化された二本鎖ポリヌクレオチドにより符号化されるタンパク質を発現させることを含む。
【００３２】
本発明に方法に従って生成される二本鎖ポリヌクレオチド、又はそれらから直接的又は間接的に製造されるポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション反応においても使用できる。このようなポリヌクレオチドは、検出可能なラベルを用いてラベルされることができ及び／又はサブストレートに付着させることができ、ポリヌクレオチドアレイを生成する。所望であれば、１種又はそれ以上の第二の二本鎖ポリヌクレオチドが増幅され得る。好適な具体例において、この増幅は１種又はそれ以上の遺伝子特異的プライマーを使用して行われる。従って、本発明の方法は、これらのポリヌクレオチドのこれらの適用の各々を包含する。
【００３３】
代わりの具体例において、ポリヌクレオチド試料から選択されたポリヌクレオチドプールを製造する方法は、ポリヌクレオチド試料の又はそれから製造されるセンスポリヌクレオチドから第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖を合成し、そして第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖を希釈し、少なくとも数種の低存在量第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖を実質的に除去することにより行われる。第一の二本鎖ポリヌクレオチドは、そのあと、残留する第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖から生成される。これらの第一の二本鎖ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド試料に比べ、高存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富む。それらは第二アンチセンスポリヌクレオチド鎖を製造することに使用され、それらはそれからポリヌクレオチド試料の又はそれから製造されるセンスポリヌクレオチドとハイブリダイゼーション条件下で接触させる。結果として生じるハイブリダイゼーション混合物は、ポリヌクレオチド試料に比べて低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富むハイブリダイズしていないセンスポリヌクレオチド鎖を含む。第三アンチセンスポリヌクレオチド鎖は、ハイブリダイズしていないセンスポリヌクレオチド鎖から合成され、第二の二本鎖ポリヌクレオチドは、第三アンチセンスポリヌクレオチド鎖から生成される。これらの第二の二本鎖ポリヌクレオチドは、低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富む選択されたポリヌクレオチドプールを利用する。
【００３４】
本発明の別の態様は、ポリヌクレオチド試料から製造される複数のポリヌクレオチドである、ここで複数のポリヌクレオチドは少なくとも１０３ 種の異なるポリヌクレオチドを含み、それぞれがポリヌクレオチド試料に比べて高存在量ポリヌクレオチドシーケンスに実質的に富むか、ポリヌクレオチド試料に比べて低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富むかのいずれかである。複数のポリヌクレオチド中の各ポリヌクレオチドは、好ましくは、ＲＮＡプロモーターシーケンス及びユニバーサルプライマーサイトを含む。好適な具体例において、これらのポリヌクレオチドは二本鎖ｃＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡである。
【００３５】
本発明は本発明の方法を行うために有用なキット及び／又は本発明の複数のポリヌクレオチドを使用するために有用なキットを提供する。第一のキットは：ＲＮＡプロモーターシーケンスと操作可能にリンクするアンチセンスプライマーを含むアンチセンスプライマー複合物であって、該ＲＮＡプロモーターシーケンスがアンチセンスプライマーの５’ である該複合物；センスプライマー；及び上記本発明の方法の少なくとも１種を行うための指示、を含む。第二のキットは：本発明の複数のポリヌクレオチド；ＲＮＡプロモーターシーケンスと操作可能にリンクするアンチセンスプライマーを含むアンチセンスプライマー複合物であって、該ＲＮＡプロモーターシーケンスがアンチセンスプライマーの５’ である該複合物；及びセンスプライマー、を含む。第三のキットは：本発明の複数のポリヌクレオチド、及び複数のポリヌクレオチドからアンチセンスＲＮＡを転写することができるＲＮＡポリメラーゼ、を含む。
【００３６】
図面の簡単な説明
図１Ａ−１Ｂは、ポリヌクレオチド試料に比べて高存在量シーケンスに富むポリヌクレオチドのプールを製造するために有用である本発明の選択方法の好適な具体例の概略図を表す。例４に詳細に説明されるこの具体例は、本発明の一般的な刪減ハイブリダイゼーション方法の第一刪減ハイブリダイゼーション反応において使用するための高存在量富化アンチセンスＲＮＡドライバーを製造することに使用できる。
【００３７】
図２Ａ−２Ｃは、本発明の第二の選択方法の好適な具体例の概略図を表し、ポリヌクレオチド試料に比べて低存在量シーケンスに富むポリヌクレオチドのプールを製造するために有用である。例４に詳細に説明されるこの具体例は、本発明の一般的な刪減ハイブリダイゼーション方法の第二刪減ハイブリダイゼーション反応において使用するための低高存在量富化センスｃＤＮＡドライバーを製造するために使用できる。
【００３８】
図３Ａ−３Ｄは、本発明の一般的な刪減ハイブリダイゼーション方法の好適な具体例の概略図である。この具体例の段階は例４Ｃに詳細に説明される。
【００３９】
詳細な説明
本発明は、あるポリヌクレオチド試料中に存在するが第二のポリヌクレオチド試料中には存在しない（又は実質的に減少している）低存在量ポリヌクレオチドを同定することができる新規な刪減ハイブリダイゼーション方法を含む。この方法は、２種の刪減ハイブリダイゼーション反応に依る。最初に、試験又は参照ポリヌクレオチド試料からの過剰の高存在量ポリヌクレオチド鎖を試験試料からのポリヌクレオチド鎖と接触させ、それにより高存在量ポリヌクレオチドシーケンスを除去する。結果として生じる混合物は、試験試料に相当する低存在量富化ポリヌクレオチド鎖を生成することに使用される。第二ハイブリダイゼーション反応において、試験試料から誘導される低存在量富化ポリヌクレオチド鎖を参照試料からの過剰の低存在量ポリヌクレオチド鎖と接触させ、両方の試料中に存在するこれらの低存在量ポリヌクレオチドシーケンスをブロックする。試験試料に対して独特な残留一本鎖低存在量ポリヌクレオチドは、それから二本鎖を再現し、典型的にはベクター内にクローンニングした後に、後続の分析又は操作のために使用できる。この方法は、例えば慣用の刪減ハイブリダイゼーション技術を使用して同定することが困難な低存在量疾患関連遺伝子を同定することを意図する研究において特に有用である。
【００４０】
この方法は、誘導されるポリヌクレオチド試料に比べて（すなわち“出発ポリヌクレオチド試料” に比べて）、高及び低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富むポリヌクレオチドのプールの有用性に依存する。好適な具体例は、このようなポリヌクレオチドプールを発生させるための新規な方法を使用する。特に高存在量ポリヌクレオチドは、希釈において発生する低存在量ポリヌクレオチドのロスを利用することにより選択される。低存在量ポリヌクレオチドは、それから高存在量ポリヌクレオチド富化プール及び試料ポリヌクレオチド間の刪減ハイブリダイゼーションにより選択できる。
【００４１】
本明細書中に記載される方法は、予めベクター内にクローニングすることなく及びシーケンス情報無しで、広範囲のポリヌクレオチドを複製することに使用できる。所望である場合は、完全長ｍＲＮＡ転写物を表すポリヌクレオチドを生成できる。本方法により生成されるポリヌクレオチドは、クローニング、発現及びハイブリダイゼーション研究のような広範囲の適用において有用である。
【００４２】
Ｉ．　定義
用語“ポリヌクレオチド” とは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを意味する、そして他に制限が無い限り、天然に発生するヌクレオチドに類似する様式で機能できる公知の天然ヌクレオチド類似体を含む。
【００４３】
用語“ポリヌクレオチド” とは、例えばゲノムＤＮＡ；メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の逆転写又は増幅により通常得られる、ｍＲＮＡのＤＮＡ表現である相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）；合成的又は増幅によりに生成されるＤＮＡ分子；及びｍＲＮＡ、を含むＤＮＡ又はＲＮＡの任意の形態を意味する。
【００４４】
用語“ポリヌクレオチド” とは、一本鎖分子と同様に二本鎖ポリヌクレオチドを包含する。タンパク質を符号化する二本鎖ポリヌクレオチドは、“アンチセンス” ポリヌクレオチド鎖に水素結合する“センス” ポリヌクレオチド鎖を包含する。センスポリヌクレオチド鎖は、翻訳されたときに、そのヌクレオチドシーケンスが符号化されたタンパク質のアミノ酸シーケンスを提供する鎖である。用語“センスポリヌクレオチド鎖” とは、例えばｍＲＮＡと同様に、二本鎖ＤＮＡ分子のセンス鎖を意味する。アンチセンスポリヌクレオチド鎖は、センスポリヌクレオチド鎖に対して相補的である。アンチセンスポリヌクレオチド鎖の例は、二本鎖ＤＮＡ分子のアンチセンス鎖（例えばアンチセンスｃＤＮＡ鎖）及びアンチセンスＲＮＡ分子を含む。二本鎖ポリヌクレオチドにおいて、ポリヌクレオチド鎖は、同一の広がりを有する（ｃｏｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）ものでなくてもよい（すなわち、二本鎖ポリヌクレオチドは両方の鎖の全長に沿って二本鎖である必要はない）。
【００４５】
本明細書中で使用される用語“二本鎖” とは、二本鎖ヌクレオチドを意味する。“ハイブリッド二本鎖” とは、刪減ハイブリダイゼーション反応における２つのポリヌクレオチド間で形成される二本鎖であり、各鎖は異なるポリヌクレオチド試料から誘導される。
【００４６】
本明細書中で使用される用語“相補的” とは、２種のヌクレオチド間で正確な対になるための能力を意味する。すなわち、ポリヌクレオチドの与えられた位置におけるヌクレオチドは、他のポリヌクレオチドと水素結合することができ、それから２種のポリヌクレオチドはその位置において互いに相補的になるものと認められる。用語“実質的に相補的” とは、互いに十分に相補的であり、厳しいハイブリダイゼーション条件下において特定のハイブリダイゼーションをさせるシーケンスを説明する。
【００４７】
“厳しいハイブリダイゼーション条件” というフレーズは、一般的には規定されたイオン強度及びｐＨにおいて、特定のシーケンスについて融点（Ｔｍ ）よりも約５℃低い温度を意味する。ほとんどのシーケンスの特定のハイブリダイゼーションを達成するために好適である厳しい条件の例は、少なくとも約６０度の温度及びｐＨ７において約０．２モル（ｍｏｌａｒ）の塩濃度である。
【００４８】
“特異的なハイブリダイゼーション” とは、規定された厳しい条件下で、ハイブリダイゼーション混合物中に存在する他のヌクレオチドシーケンスに対する実質的な結合の不存在下において、ターゲットヌクレオチドシーケンスに対するポリヌクレオチドの結合を意味する。当業者は、ハイブリダイゼーション条件の厳しさを緩和することがシーケンス不一致を容認することであることが理解できるであろう。
【００４９】
ハイブリダイゼーションは一本鎖ポリヌクレオチドを二本鎖ポリヌクレオチドへ変換し、それは先に一本鎖ポリヌクレオチドがハイブリダイゼーション用のターゲットとして又はさらなるポリヌクレオチド鎖合成用の鋳型として働くことから妨げることができる。従ってハイブリダイゼーションは、前もって一本鎖ポリヌクレオチドを“ブロック” するといわれる。
【００５０】
ポリヌクレオチド鎖に関して使用される場合、用語“ハイブリダイズしていない” とは、少なくとも数種のポリヌクレオチド鎖がハイブリダイズし、二本鎖ポリヌクレオチドを形成する条件下でのハイブリダイゼーション反応後に、一本鎖のままであるポリヌクレオチドを意味する。
【００５１】
本明細書中で使用される用語“ドライバー” とは、刪減ハイブリダイゼーション反応に加えられ、反応混合物中に存在する相補的シーケンスをブロックする特別な型のポリヌクレオチド鎖を意味する。通常は、ドライバーは反応混合物中に過剰モルで加えられ、ハイブリダイゼーションをドライブする。
【００５２】
用語“オリゴヌクレオチド” は比較的短い、通常は２００ヌクレオチドよりも短い、特に１００ヌクレオチドよりも短い、とりわけ５０ヌクレオチドよりも短いポリヌクレオチドを意味することに使用される。典型的には、オリゴヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡ分子である。
【００５３】
用語“選択されたポリヌクレオチドプール” とは、選択されたポリヌクレオチドプールを生成するために使用されるポリヌクレオチド試料内に存在するポリヌクレオチドのサブセットを表すポリヌクレオチドの集合を説明するために使用される。本明細書中で使用されるときは、この用語は希釈及び希釈後の刪減ハイブリダイゼーションによりそれぞれ製造される高−及び低−存在量プールを説明する。
【００５４】
用語“刪減されたポリヌクレオチドプール” とは、本明細書中において２種の異なる試料から誘導されるポリヌクレオチド間の（例えば本発明の一般的な刪減ハイブリダイゼーション方法を用いる）刪減ハイブリダイゼーションにより生成されるポリヌクレオチドプールを意味するために使用される。それゆえ、“刪減されたポリヌクレオチドプール” は一方の試料内に存在し、他の試料内に存在しない（又は実質的に減少した）ポリヌクレオチドを含む。参照ポリヌクレオチドが試験ポリヌクレオチドから刪減される場合は、刪減されたポリヌクレオチドプールのポリヌクレオチドは“試験特異的” と呼ばれ、試験試料中のそれらの存在及び参照試料中の実質的な不存在を示す。本発明の一般的な刪減ハイブリダイゼーション方法により生成される刪減ポリヌクレオチドプールは、典型的にはベクター内にクローン化されるポリヌクレオチドのライブラリー（すなわちポリヌクレオチドクローンのライブラリー）として、典型的に生成される。
【００５５】
用語“プライマー” とは、ポリヌクレオチドを用いてハイブリダイズすることができ（“アニーリング”とも呼ばれる）、そしてヌクレオチド（ＲＮＡ又はＤＮＡ）ポリマー化のための出発サイトとして働くことができるオリゴヌクレオチドを意味する。
【００５６】
“アンチセンスプライマー” とは、センスポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチドシーケンスを用いてハイブリダイズし、そしてアンチセンスポリヌクレオチドの合成のための出発サイトとして作用できるプライマーである。
“センスプライマー” とは、アンチセンスポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチドシーケンスを用いてハイブリダイズし、そしてセンスポリヌクレオチドの合成のための出発サイトとして作用できるプライマーである。本明細書中で使用される場合、センスプライマーはそれがアンチセンスプライマー又はアンチセンスプライマー複合物を使用して１種又はそれ以上のターゲットポリヌクレオチドシーケンスを増幅することができるようにするシーケンスを有する。
【００５７】
“ユニバーサルプライマー” とは、ヌクレオチドポリマー化のための鋳型分子として働くことを意図された実質的に全てのポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチドシーケンスとハイブリダイズできるものである。
【００５８】
“遺伝子特異的プライマー”とは、ユニークな発現シーケンス中に存在し又はそれをフランクするヌクレオチドシーケンスとハイブリダイズするものであり、ユニークな発現シーケンス又はそれらの一部を、他のシーケンスを実質的に増幅させることなく増幅させる。
【００５９】
用語“プライマーサイト” は、プライマーを用いてハイブリダイズし、そしてヌクレオチド（ＲＮＡ又はＤＮＡ）ポリマー化のための出発サイトとして作用することができるポリヌクレオチドの領域を意味する。
【００６０】
“ユニバーサルプライマーサイト” とは、ヌクレオチドポリマー化のための鋳型分子として作用することを意図する実質的に全てのポリヌクレオチド中に存在するプライマーサイトである。
【００６１】
用語“アンチセンスプライマー複合物” は、本明細書中では、“ＲＮＡプロモーターシーケンス” を含むオリゴヌクレオチドと操作可能にリンクするアンチセンスプライマーを示すために使用される。後者のシーケンスは、正確な方向にてプロモーターを提供し、ＲＮＡポリマー化用の出発サイトとして働くものである。
【００６２】
本明細書中で使用されるとき、用語“操作可能にリンクする” とは、コントロールシーケンス（典型的にはプロモーター）及び連結シーケンス間の機能的な連結を意味する。
【００６３】
用語“存在量” とは、ポリヌクレオチド試料中のポリヌクレオチドの複製数を説明するために使用される。試料のポリヌクレオチドについて、中程度の数の複製物より多い数で試料中に存在するポリヌクレオチドは、“高存在量” ポリヌクレオチドと呼ばれる。中程度の数よりも少なく試料中に存在するポリヌクレオチドは、“低存在量ポリヌクレオチド” と呼ばれる。高及び低存在量シーケンスの複製物の絶対数は、ポリヌクレオチド試料に依存して変化する。ｍＲＮＡ試料において、高存在量シーケンスはいわゆる“ハウスキーピング遺伝子” から転写されるｍＲＮＡを含み、低存在量シーケンスはホルモン、レセプター又は他の信号及びコントロール分子のような調整タンパク質を符号化するものを含む。本発明の方法により選択され得る低存在量ｍＲＮＡは、典型的には細胞中に存在するＲＮＡの約１％未満、約０．１％未満、約０．０１％未満又は約０．００１％未満を占める。本発明の方法は、細胞中に約０．００００００１％のみのオーダーで占める最も希有のｍＲＮＡを選択することにも使用できる。ｍＲＮＡ度数は、関心があるｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズするプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより典型的に評価される。ライブラリー中のクローンの全数によって割られ、１００％を掛けられたポジティブなクローンの数は、ライブラリー内のシーケンスの表示を与え、ライブラリーが生成される細胞中のｍＲＮＡの度数の評価を生成する。
【００６４】
ポリヌクレオチド試料中に高存在量で存在するポリヌクレオチドは、試料中で“高度に表わされる（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｅｄ）” と言う。
【００６５】
ポリヌクレオチドのプールは、ポリヌクレオチド試料と比較して与えられた型のポリヌクレオチドが試料中よりもプール中に高濃度で存在する場合は、ポリヌクレオチド試料と比較して与えられた型のポリヌクレオチドに“富む” と言われる。この用語は、本明細書中では以下のような刪減ハイブリダイゼーション反応の生成物を説明するために使用される。例えば刪減ハイブリダイゼーション反応が、試料から選択される高存在量富化ポリヌクレオチド鎖のプールを、同じ試料の（富まない）ポリヌクレオチド鎖を用いてハイブリダイズすることが必要な場合、高存在量シーケンスはハイブリダイズする。試料中に存在する低存在量シーケンスは、ハイブリダイズしていないままである。それゆえ刪減ハイブリダイゼーション反応は、ポリヌクレオチド試料と比較して低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに“富む” ハイブリダイズしていないポリヌクレオチド鎖を生成する。当業者は、反応混合物中に存在する低存在量ポリヌクレオチドシーケンスの濃度が、反応後に反応前と同じであることを理解する。しかし、低存在量シーケンスの濃度は、試料のポリヌクレオチド鎖内のものよりもハイブリダイズしていないポリヌクレオチド鎖のプール内の方が高い。
【００６６】
“高存在量富化ポリヌクレオチド鎖” のフレーズは、ポリヌクレオチド試料と比較して高存在量ポリヌクレオチドに富むポリヌクレオチド鎖の集合を意味する。
【００６７】
“低存在量富化ポリヌクレオチド鎖” のフレーズは、ポリヌクレオチド試料と比較して低存在量ポリヌクレオチドに富むポリヌクレオチド鎖の集合を意味する。
【００６８】
本明細書中で使用されるとき、“実質的に富む” とは、約１００倍の富化（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を意味する；すなわち、複数の高又は低存在量シーケンスの濃度が少なくとも選択されたポリヌクレオチドプール内で、プールが誘導されるオリジナルのポリヌクレオチド試料と比較して、少なくとも約１００倍高い場合に、選択されたポリヌクレオチドプールは高又は低存在量シーケンスに実質的に富む。この目的のために、富化はラベルされたプローブをポリヌクレオチド試料及び選択されたポリヌクレオチドプールへハイブリダイズし、各々について観察されるハイブリダイゼーション信号を比較することにより評価される。例えば、ノーザン・ブロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ）がポリヌクレオチド試料及び選択されたポリヌクレオチドプールから作成でき、そして放射的にラベルされたプローブを用いてハイブリダイズされ、つづけてＸ線撮影を行う。自動Ｘ線撮影はレーザー濃度計を用いてスキャンされ、ハイブリダイゼーション信号を定量することができる。ハイブリダイゼーション信号の強度を測定するための他の方法、例えばアレイベース（ａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ）方法、は公知であり、そして本発明のポリヌクレオチドシーケンスの富化を評価することに使用できる。“ホールドエンリッチメント” は選択されたポリヌクレオチドプールについて観察されるハイブリダイゼーション信号を、プールが選択されたポリヌクレオチド試料について観察されるハイブリダイゼーション信号により割ることにより計算される。
【００６９】
特定の型のポリヌクレオチド（例えば低存在量ポリヌクレオチド）は、ポリヌクレオチドのプール内のこのようなポリヌクレオチドの濃度が十分に減少し、そのようなポリヌクレオチドの存在が望ましくない適用のためにそのポリヌクレオチドのプールが使用できる場合に“実質的に除去された” という。
【００７０】
参照試料中のポリヌクレオチドの存在量が試験試料中のものよりも少なくとも約１００倍少ない場合に、ポリヌクレオチドは、“試験ポリヌクレオチド試料中よりも実質的に低い濃度で参照試料中に存在する” と言う。存在量における差異は、約１０３ 、約１０４ 、約１０５ 及び約１０６ 又はそれ以上のオーダーでもよい。
【００７１】
“ポリヌクレオチド試料のポリヌクレオチド” のフレーズは、試料ポリヌクレオチドを意味する。“ポリヌクレオチド試料から製造されたポリヌクレオチド” の句は、試料ポリヌクレオチドからＲＮＡ又はＤＮＡポリマー化により製造される（例えば逆転写、増幅、アンチセンスＲＮＡの合成等）ポリヌクレオチドを意味する。ポリヌクレオチドは、試料ポリヌクレオチドがＲＮＡ又はＤＮＡポリマー化用の鋳型として働く場合は、試料ポリヌクレオチドから“直接的に製造される” 。１種より多くのポリマー化の段階を行う場合は、ポリヌクレオチドは試料ポリヌクレオチドから“間接的に製造される” 。試料の又は試料から製造され及び本発明の選択又は刪減方法のいずれかにおいて、出発物質として使用されるポリヌクレオチドは、“出発ポリヌクレオチド” と呼ばれる。
【００７２】
本明細書中で使用される場合、用語“促進されたポリメラーゼ鎖反応” 又は“促進されたＰＣＲ” は、少なくとも１０キロベース（ｋｂ）の長さのポリヌクレオチドシーケンスを増幅できるポリメラーゼ鎖反応を意味する。
【００７３】
用語“ベクター” は、本明細書中においてポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構造を説明するために使用される。このようなベクターは、ホスト細胞中で安定に又は一時的に増殖する。このベクターは、例えばプラスミド、ウイルスベクター、又は単純に潜在的なゲノム挿入物であることができる。一旦好適なホスト内へ導入されると、ベクターはホストゲノムから独立して複写及び機能することができ、ある例においてはホストゲノム中へ統合できる。
【００７４】
“発現ベクター” は、好適なホスト中でポリヌクレオチドの発現をもたらし得るコントロールシーケンスと操作可能にリンクするポリヌクレオチド分子を含むＤＮＡ構造を意味する。コントロールシーケンスの例は、転写をもたらすためのプロモーター、転写を調節するための随意のオペレーターシーケンス、好適なｍＲＮＡリボゾーム結合サイトを符号化するシーケンス、並びに転写及び翻訳の終結をコントロールするシーケンスを含む。
【００７５】
用語“ホスト細胞” は、一時的に又は安定してベクターを維持することができる細胞を意味する。本発明のホスト細胞は、限定するものではないが、バクテリア細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞及び哺乳動物細胞を含む。他の公知な又は知られることとなるホスト細胞は、本発明における使用に適する。
【００７６】
用語“アレイ” はエレメントの集合を意味し、ここでエレメントはユニークに同定可能である。例えば、この用語は、各エレメントが他の全てのエレメントの位置と異なるサブストレート表面の物理的位置を有するように、エレメントの配列を産するサブストレートを意味する。そのようなアレイにおいて、各エレメントは、その方向により単純に同定可能である。用語“アレイ” はエレメントの任意の配列を含み、平面同様に非平面上に配列されたエレメントを含むことができるが、この型の典型的なアレイは、線状に配列した又は二次元マトリックス中のエレメントを含む。非平面アレイは、アレイを形成するために例えばビード、ピン又は繊維を配列することにより作成できる。用語“アレイ” は、互いの固定された関係を有さないエレメントの集合を含み得る。例えば、各ビードが特性を同定することを有するビードの集合は、アレイを構成することができる。
【００７７】
アレイのエレメントは“ターゲットエレメント” と呼ばれる。
【００７８】
“ターゲットエレメント” に関して本明細書中で使用される場合は、用語“異なる位置” とは、各エレメントが全ての他のターゲットエレメントから、ターゲットエレメントに結合するラベルされた分子からの信号（例えば蛍光信号）が、そのターゲットエレメントにおける結合にユニークに寄与するように物理的に分離されることをいう。
【００７９】
“マイクロアレイ” とは、サブストレート表面におけるターゲットエレメントの密度が少なくとも約１００／ｃｍ２ のアレイである。
【００８０】
本明細書中で使用される用語“活性試薬” は、例えば細胞又は組織培養物に加えられた場合に、インビボ又はインビトロにおける生物学的応答を顕在化させる任意の試薬である。
【００８１】
“正常な” 細胞又は組織は、重要な特定の生理学的な無秩序がないものである。それゆえ、ある観点において、正常な細胞は“異常” でありうる、しかし本発明の目的については、未だ“正常な” 細胞であり得る。
【００８２】
“疾患” 細胞又は組織は、重要な特定の生理学的な無秩序に苦しめられるものである。
【００８３】
二本鎖及び一本鎖ポリヌクレオチドを含む混合物において、一本鎖ポリヌクレオチドがさらなるポリヌクレオチド鎖の合成のための鋳型として好適に使用される場合、一本鎖ポリヌクレオチドは二本鎖ポリヌクレオチドから“機能的に単離される” といわれる。例えば、一本鎖ポリヌクレオチドは酵素を用いて二本鎖ポリヌクレオチドを好適に消化することにより、二本鎖ポリヌクレオチドから機能的に単離できる。
【００８４】
ＩＩ．　一般的な刪減ハイブリダイゼーション方法
Ａ．　一般的
本発明は、参照ポリヌクレオチドが存在しない又はより少ない存在量である試験ポリヌクレオチド試料中の１種又はそれ以上のポリヌクレオチドの同定を容易化する一般的な刪減ハイブリダイゼーション方法を提供する。この方法は高存在量ポリヌクレオチドシーケンスをブロックするために第一刪減ハイブリダイゼーション反応を必要とし、低存在量シーケンスについて富む試験ポリヌクレオチド鎖を残す。第二刪減ハイブリダイゼーション反応において、両方の試料中に存在する低存在量富化ポリヌクレオチドシーケンスが除去され、そして試験特異的な二本鎖が生成する。
【００８５】
より特定的には、本方法は、試験又は参照ポリヌクレオチドのいずれかと比較して低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに実質的に富むドライバーポリヌクレオチド鎖を使用する。本方法は高存在量富化ドライバーポリヌクレオチド鎖を、試験試料の又はそれから製造されるポリヌクレオチド鎖と、第一ハイブリダイゼーション混合物を形成させ、それにより高存在量ポリヌクレオチドシーケンスをブロックするための条件下で、接触させることを必要とする。この反応は、試験試料と比較して低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富むハイブリダイズしていないポリヌクレオチド鎖を、試験試料から生成する。
【００８６】
ハイブリダイズしていない試験ポリヌクレオチド鎖は、それから低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖を合成するための鋳型として働く。後者は、それからハイブリダイゼーション条件下で、参照試料と比較して低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富む参照ポリヌクレオチド鎖からなるドライバーと接触する。この第二ハイブリダイゼーションは、両方の試料により分けられたシーケンスに相当するハイブリッド二本鎖、及び試料間で異なるシーケンスに相当するハイブリダイズしていない低存在量富化ポリヌクレオチド鎖を生成する。ハイブリッド二本鎖は除去又は消化され、ハイブリダイズしていない低存在量富化ポリヌクレオチド鎖を機能的に単離し、試験試料に対応するものは二本鎖に翻訳される。結果として生じる二本鎖は、参照試料に存在しない又は実質的に減少した量の低存在量ポリヌクレオチドシーケンスである。この様式において、試験試料特異的な又は異なって発現させる遺伝子が、たとえそれらの対応する転写物が試験試料中において低存在量であっても、同定できる。本方法のプロトコルの例は、例４に与えられる。
【００８７】
上述のように、第一ハイブリダイゼーション反応用のドライバーは、試験又は参照試料から誘導できる。本方法を、本明細書中において、ドライバーが高存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖からなる好適な具体例を参照して説明する。特に好適な具体例において、高存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖は高存在量富化アンチセンスポリヌクレオチド鎖であり、それは第一ハイブリダイゼーション混合物中の試験ポリヌクレオチド鎖を転写（ｓｅｎｓｅ）するためにハイブリダイズする。しかし、当業者であれば、このようなハイブリダイゼーション反応のポリヌクレオチド成分の転写は逆転することができ、例えば高存在量富化センス試験ポリヌクレオチド鎖はアンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖を用いたハイブリダイゼーションにおいてドライバーとして使用できることが理解できる。
【００８８】
高存在量富化ポリヌクレオチド鎖がアンチセンスポリヌクレオチド鎖である場合は、センス試験ポリヌクレオチド鎖を用いたハイブリダイゼーションは、試験ポリヌクレオチド試料と比較して低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富むハイブリダイズしていないセンス試験ポリヌクレオチド鎖を生成する。これらのハイブリダイズしていないセンス試験ポリヌクレオチド鎖は、それから低存在量富化アンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖を合成するための鋳型として働く。後者は、それからハイブリダイゼーション条件下で、参照試料と比較して低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富むセンス参照ポリヌクレオチド鎖と接触する。結果として生じるハイブリッド二本鎖は、除去又は消化され、ハイブリダイズしていない低存在量富化アンチセンスポリヌクレオチドを機能的に単離し、これらの試験試料に対応するものは好ましくは選択的な増幅により二本鎖化される。この段階は、さらなる分析のために一般的にクローン化される低存在量“試験特異的な” 二本鎖を生成する。
【００８９】
本発明の一般的な刪減ハイブリダイゼーションにおいて有用な出発ポリヌクレオチドは、任意のソースから得られる。特に、本発明において有用なＤＮＡ又はＲＮＡは、植物及び動物のような高度な有機体はもちろん、バクテリア、酵母、ウイルス、細胞小器官、を含む任意のソースから抽出及び／又は増幅されることができ、哺乳動物を使用することが好ましく、ヒトが最も好ましい。出発ポリヌクレオチドは、細胞、肉体中の流体（例えば血液）又は組織試料から、種々の標準技術により抽出又は増幅もできる。本発明中で有用な出発ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、コスミド、ＹＡＣ又はＢＡＣライブラリー等を含むポリヌクレオチドライブラリーから誘導することもできる；しかし、このようなライブラリーの使用は好ましくない、なぜなら重要な多くの低存在量シーケンスがこのようなライブラリー中に存在しないからである。
【００９０】
出発ポリヌクレオチドは純粋な形態である必要はないが、しかしハイブリダイゼーション及び行われる刪減ハイブリダイゼーションの合成反応を行わせるに十分に純粋でなければならない。
【００９１】
好適な具体例において、試験及び参照ポリヌクレオチド鎖は、異なるポリヌクレオチド試料から得られる。例えば、試験及び参照ポリヌクレオチド試料は：第一細胞又は組織及び第二の異なる細胞又は組織；分化又は発育の第一段階における細胞又は組織及び分化又は発育の第二段階における同じ型の細胞又は組織；活性試薬で処理された細胞又は組織或いは第二の異なる活性試薬で処理されない又は処理された細胞又は組織、正常細胞又は組織或いは疾患細胞又は組織から誘導される。後者の好適な例は、限定するものではないが、感染症、炎症性疾患、血管疾患、癌及び／又は遺伝疾患を含む。
【００９２】
刪減ハイブリダイゼーション方法は任意の型のポリヌクレオチド試料に適用できるが、ｍＲＮＡ試料は好ましくは２種の試料間の遺伝子発現の差の研究（すなわち発現モニタリング）に使用される。当業者が評価するときは、ｍＲＮＡはｃＤＮＡに変換されることができ、それは随意にクローン化され、ポリヌクレオチドライブラリーを生成できる。同様に、細胞中に存在するｍＲＮＡの増幅されたＤＮＡ表示が、本発明の使用のために生成される。しかし、上述のように、このような操作はポリヌクレオチドシーケンス、特に低存在量シーケンスのロスを生じる、そしてそれゆえ、このさらなる理由のためにｍＲＮＡ試料の使用が好ましい。
【００９３】
Ｂ．　高存在量ポリヌクレオチドをブロックするための第一刪減ハイブリダイゼーション
本発明の一般的ハイブリダイゼーション反応における第一刪減ハイブリダイゼーション反応において、高存在量富化ドライバーは、試験ポリヌクレオチド鎖に対してハイブリダイズされ、高存在量ポリヌクレオチドシーケンスをブロックする。ドライバーは、通常、試験又は参照ポリヌクレオチドと比較してそれぞれ高存在量ポリヌクレオチドに富む試験又は参照ポリヌクレオチドのプールである又はそれから製造される高存在量富化ポリヌクレオチド鎖からなる。高存在量富化参照ポリヌクレオチド鎖がドライバーとして使用される場合、第一刪減ハイブリダイゼーション反応は、試験又は参照ポリヌクレオチド試料中で高度に表わされるそれらのポリヌクレオチドシーケンスをブロックする。高存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖がドライバーとして使用される場合、第一刪減ハイブリダイゼーション反応は、試験ポリヌクレオチド試料中で高度に表わされるそれらのポリヌクレオチドシーケンス（参照ポリヌクレオチド試料中で高度に表わされるものとはちょうど同じものではない）をブロックする。好ましくは、ドライバーは試験試料中に存在する高存在量シーケンスの最も高い濃度を有する試料から製造でき、多くの場合、それは試験試料自身である。
【００９４】
好適な具体例において、高存在量富化ポリヌクレオチド鎖はアンチセンスポリヌクレオチド鎖である。本発明の刪減ハイブリダイゼーション方法において使用するためのアンチセンスポリヌクレオチド鎖は、当業者に公知の任意の手段によりポリヌクレオチド試料から製造できる。例えば、誘導されるポリヌクレオチド試料と比較して高存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富むアンチセンスポリヌクレオチド鎖は、高存在量及び低存在量のシーケンスの間の再結合（ｒｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）動力学の差異を利用することにより製造できる。ポリヌクレオチドが変性され及び再結合される場合は、高度の複製数で試料中に存在するシーケンスは、低度の複製数のものより前に再結合する。それゆえ、比較的早く二本鎖になるシーケンスは（例えば、Ｃｏｔ＝５．５又はそれ未満、ここでＣｏは１リットル当りのヌクレオチドのモルである及びｔは秒である）、高存在量ポリヌクレオチドシーケンスを表す。これらの二本鎖シーケンスは再結合混合物から回収でき、及び本発明の一般的な刪減ハイブリダイゼーションにおける使用のためのアンチセンスポリヌクレオチドを製造することに使用できる。好適な具体例において、高存在量富化アンチセンスポリヌクレオチド鎖は、下記“選択されたポリヌクレオチドプールを製造する方法” のタイトルのセクションにおいて説明されるように製造される。
【００９５】
刪減ハイブリダイゼーションのために、高存在量富化ポリヌクレオチド鎖は、試験ポリヌクレオチド鎖と、少なくとも数種のポリヌクレオチドが互いに特異的にハイブリダイズする条件下で接触させられる。好適な具体例において、高存在量富化アンチセンスポリヌクレオチド鎖はセンス試験ポリヌクレオチド鎖と接触させられる。好ましくは、アンチセンスポリヌクレオチド鎖はアンチセンスＲＮＡ分子であり、そしてセンス試験ポリヌクレオチド鎖はｍＲＮＡ分子である。
【００９６】
本方法には必要ではないが、アンチセンスポリヌクレオチド鎖は、通常は過剰にハイブリダイゼーション反応に加えられハイブリダイゼーションをドライブする（そしてそれゆえドライバーと呼ばれる）。ほとんどの適用について、アンチセンスポリヌクレオチドの反応混合物中の他のポリヌクレオチドに対するモル比は、約１：１〜約８００：１、好ましくは約１：１〜約２００：１、より好ましくは約１：１〜約１００：１であるが、他の比も可能である。
【００９７】
ハイブリダイゼーション反応は高温、通常は約６０〜７０℃で行われ、比較的特異的なハイブリダイゼーションを達成する。さらに、使用されるバッファー及び塩濃度が調節され、当業者に公知の技術を用いて必要な厳格さを達成する。典型的には公正に高度な厳格性が好ましい。ハイブリダイゼーションアッセイを行うために受け入れられる方法は公知である、そして当該技術の一般的な概観は：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ．　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　Ｅｄ．　Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．　ａｎｄ　Ｈｉｇｇｉｎｓ，　Ｓ．Ｊ．，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，　１９８５；Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｏｎ　Ｓｏｌｉｄ　Ｓｕｐｐｏｒｔｓ，　Ｍｅｉｎｋｏｔｈ，　Ｊ．ａｎｄ　Ｗａｈｌ，　Ｇ．；Ａｎａｔｙｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２３８：２６７−２８４，　１９８４中に見出される。刪減ハイブリダイゼーション技術も特に、米国特許第５，５８９，３３９号（１９９６年１２月３１日発行、Ｈａｍｐｓｏｎ等）、米国特許第５，９３５，７８８号（１９９９年８月１０日発行、Ｂｕｒｍｅｒ等）、及び米国特許第５，９５８，７３８号（１９９９年９月２８日発行、Ｌｉｎｄｍａｎｎ等）に記載される。
【００９８】
高存在量富化ポリヌクレオチド鎖が例えばポリ−Ｕ又はポリ−Ｔシーケンスを含む場合及び試験ポリヌクレオチド鎖が例えばポリ−Ａシーケンスを含む場合或いはその逆の場合は、全ての高存在量富化ポリヌクレオチド鎖は、全ての試験ポリヌクレオチド鎖へハイブリダイズすることが予想され、刪減は起こらない。この型の“非特異的な” ハイブリダイゼーションを妨げるために、ブロッキングオリゴヌクレオチド（すなわちポリ−Ａ、ポリ−Ｕ及び／又はポリ−Ｔ）が、通常は過剰にハイブリダイゼーション混合物中に含まれることができる。好ましくは、ブロッキングオリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーション混合物中で、約１：１〜約８００：１のブロッキングオリゴヌクレオチド：ポリヌクレオチドの比で使用される。より好ましくは、ブロッキングオリゴヌクレオチドの他のポリヌクレオチドに対する比は、約１：１〜約２００：１、より好ましくは約１：１〜約１００：１であるが、他の比も可能である。その代わりに、刪減ハイブリダイゼーション反応混合物中で使用されるポリヌクレオチド鎖は、非特異的なハイブリダイゼーションを生じるシーケンスを含まないように製造されるか、このようなシーケンスが好適な酵素を用いて部分的に消化され得るかのいずれかである。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ　エクソヌクレアーゼ　Ｉを用いた部分的な消化は、ｃＤＮＡの３’ 末端からポリ−Ａ配列を除去するために使用できる。
【００９９】
ハイブリダイゼーションは、高存在量ポリヌクレオチドシーケンスに相当する二本鎖ポリヌクレオチド、及び試験ポリヌクレオチド試料と比較して低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富むハイブリダイズしていない試験ポリヌクレオチドを生成する。ハイブリダイゼーションのために使用される高存在量富化ポリヌクレオチド鎖が試験試料よりも参照試料から誘導される場合、反応混合物は一般的にハイブリダイズしていない高存在量富化参照ポリヌクレオチド鎖も含む。
【０１００】
Ｃ．　低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖の生成
本発明の一般的な刪減ハイブリダイゼーション方法の次の段階は、第一ハイブリダイゼーション反応において製造されるハイブリダイズしていない低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖を鋳型として使用し、相補的な低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖を製造することである。
【０１０１】
１．　低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖の合成
好ましい具体例において、ハイブリダイズしていない低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖は、オリジナルの試験ポリヌクレオチド試料と比較して同じく低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富むアンチセンスポリヌクレオチド試験鎖を合成するための鋳型として働くセンス鎖である。この目的のために任意の鎖技術が使用できるが、特に好適な具体例においては、アンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖の合成はアンチセンスプライマーを用いてプライムされる。
【０１０２】
アンチセンスプライマーは、センス試験ポリヌクレオチド鎖内に存在するアンチセンスプライマーサイトを用いてハイブリダイズする。このアンチセンスプライマーサイトは、センスポリヌクレオチド鎖（例えばｍＲＮＡのポリＡ配列）の３’ 末端に位置することができ、それは完全長のアンチセンスポリヌクレオチド鎖を生成する。その代わりに、アンチセンスプライマーサイトは、アンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖がセンス試験ポリヌクレオチド鎖の一部のみについて合成されるように位置することができる。後者の具体例において、ポリヌクレオチド鎖におけるランダムなサイトにおいて、ランダムなプライマーはプライムし、典型的には内部プライミングを生じ、切り取られたポリヌクレオチド鎖を生成する。
【０１０３】
アンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖の合成は、アンチセンスプライマー又は随意にアンチセンスプライマー複合物を使用してプライムされることが好ましい。アンチセンスプライマー複合物は２種の成分を有する：（１）アンチセンスプライマー及び（２）特異的な起源のＲＮＡポリメラーゼプロモーターシーケンス。アンチセンスプライマー複合物は、例えば本発明の一般的な刪減ハイブリダイゼーション方法を使用して得られる試験特異的な二本鎖からのアンチセンスＲＮＡの生成を容易化する場合に、所望である。
【０１０４】
アンチセンスプライマーは、プライマー拡張に好適な条件下、すなわち好適な反応条件下における適切なヌクレオチド及び複製試薬（例えばＤＮＡポリメラーゼ）の存在下に置かれた場合、ポリヌクレオチド合成、典型的にはＤＮＡ複製の出発点として作用でき、それは当業界で公知である。プライマーは好ましくは一本鎖オリゴヌクレオチドであり、最も好ましくはオリゴデオキシヌクレオチドである。プライマーは十分に長くなくてはならない、及びセンス試験ポリヌクレオチド鎖を用いて十分に安定な二本鎖を形成させ、複製試薬の存在下で拡張生成物の合成を許容する。プライマーの正確な長さと使用される量は、ハイブリダイゼーション温度、イオン条件、ホモロジーの程度、及び当業者に公知の他の要件を含む多くの因子に依存する。特異的なシーケンスモチーフへハイブリダイズするためにデザインされたプライマーは、典型的には約１０〜約５０個のヌクレオチド、及び好ましくは約１５〜約２５個又はそれ以上のヌクレオチドを含むが、プライマーは、例えばシーケンスモチーフに依存してより少ないヌクレオチドを含むことができる。他の適用について、オリゴヌクレオチドプライマーは、必要ではないが、典型的により短く、例えば約７〜約１５個のヌクレオチドである。当業者がすでに評価しているように、このような短いプライマー分子は、鋳型ポリヌクレオチドを用いて十分に安定なハイブリッド複合物を形成させるために、一般的に、より低いハイブリダイゼーション温度が必要である。
【０１０５】
アンチセンスプライマーは任意の適用可能な方法により生成される。オリゴヌクレオチドプライマーは、便利には例えば公知のホスホトリエステル及びホスホジエステル方法、特にそれらの自動化バージョンにより合成される。標準的な自動化方法は、出発材料としてジエチルホスファアミダイト（ｄｉｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ）を使用し、それは市販入手でき又はＢｅａｕｃａｇｅ等によるＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２：１８５９−１９６２（１９８１）又は米国特許第４，４５８，０６６号に記載されるように合成できる。生物学的ソースから単離されたプライマーを使用することもできる（例えば制限エンドヌクレアーゼ消化又は増幅を経由する）。
【０１０６】
本発明の方法に有用なアンチセンスプライマーは、センスポリヌクレオチド鎖におけるアンチセンスプライマーサイトに対し相補的である。それゆえ、与えられたアンチセンスプライマーシーケンスは、ハイブリダイズするアンチセンスプライマーサイトの正確な捕体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）である必要はない。プライマーシーケンスがアンチセンスプライマーサイトとの十分な相補性を有し、ハイブリダイゼーション及びポリヌクレオチド延長をさせる場合には、非相補的な塩基又はより長いシーケンスがプライマー内に存在することができる。
【０１０７】
上述のように、好ましい態様において、アンチセンスプライマーはｍＲＮＡ分子のような低存在量富化センス試験ポリヌクレオチド鎖に対しハイブリダイズする。この場合、アンチセンスプライマーは便利にはポリ−Ｔ（オリゴヌクレオチド−ｄＴ又はオリゴ−ｄＴとも呼ばれる）シーケンスを含む。このシーケンスは、通常、約５〜約５０、好ましくは約５〜約２０、より好ましくは約１０〜約１５個のＴ残渣を含み、これは各ハイブリダイズしていないｍＲＮＡ分子の３’ 末端に存在するポリ−Ａ配列とハイブリダイズする。そのかわりに、共通のヌクレオチドシーケンスモチーフを分けるＲＮＡのみが増幅される場合、それからアンチセンスプライマーは実質的にこのシーケンスモチーフに対して相補的である。
【０１０８】
アンチセンスプライマー複合物の第二成分は、ＲＮＡプロモーターシーケンスである。このようなシーケンスはＲＮＡポリメラーゼを結び付け、そして転写出発サイトを含むことができる。アンチセンスプライマー複合物中で使用されるＲＮＡプロモーターシーケンスは、一本鎖又は二本鎖であることができる。プロモーターシーケンスは、通常、天然に発生するＲＮＡポリメラーゼプロモーターからの約１５〜約２５０個のヌクレオチド、好ましくは約２５〜約６０個のヌクレオチド、コンセンサスプロモーターシーケンス（Ａｌｂｅｒｔｓ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅｌｌ， 第二版、Ｇａｒｌａｎｄ，　Ｎ．Ｙ．（１９８９））、又はそれらの変更バージョンを含む。
【０１０９】
同種のプロモーターについての特異性を示す多種のプロモーター及びポリメラーゼは公知である。一般的には、真核生物プロモーターより原核生物プロモーターが好ましく、ファージ又はウイルスプロモーターが最も好ましい。特に好ましいものは、Ｔ３、Ｔ７及びＳＰ６ファージプロモーター／ポリメラーゼ系である。おそらく最も研究されたものは、Ｅ．ｃｏｌｉファージＴ７である。Ｔ７は１７レートＴ７プロモーターについて高度に特異的な全く新しいポリメラーゼを作成する。Ｅ．ｃｏｌｉプロモーターのような二本の分離した高度に維持される領域よりも、レートＴ７プロモーターはＲＮＡ出発サイトと比較して−１７〜＋６の単一の高度に維持されるシーケンスを有する。サルモネラファージＳＰ６はＴ７と非常に類似する。ほとんどのＲＮＡポリメラーゼは二本鎖プロモーターを認識するが、Ｅ．ｃｏｌｉファージＮ４は、ネイティブ一本鎖Ｎ４ＤＮＡにおいて、Ｎ４プロモーターを早く認識するＲＮＡポリメラーゼを作成する。プロモーターの転写及びＤＮＡ鋳型上でのＲＮＡ合成は、Ｗａｔｓｏｎ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ，　第４版，　１３−１５節，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．，Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ、中に見出せる。好適なプロモーターシーケンスはＴ７ファージからのシーケンスであり、そのＲＮＡサイトポリメラーゼ結合サイト（５’ −ＡＡＴ　ＴＣＴ　ＡＡＴ　ＡＣＧ　ＡＣＴ　ＣＡＣ　ＴＡＴ　ＡＧＧ　Ｇ−３’ ；シーケンスＩＤ　ＮＯ：１）に相当する該シーケンスである。
【０１１０】
ＲＮＡプロモーターシーケンスは、アンチセンスプライマーとリンクし、好適な条件下でのリボヌクレオチド及びＲＮＡポリメラーゼの存在下での転写を容易化する。プライマー及びプロモーター成分はアンチセンスプライマーの上流（５’ ）のＲＮＡプロモーターと、プライマーに対して相補的であるポリヌクレオチドストランドの転写を許容する方向で、すなわち（以下に記載されるように）アンチセンスＲＮＡ転写が一般的にプライマー延長と同じ方向になるようにリンクする。この基準に見合う任意の型の結合が使用されるが、ヌクレオチド結合が好ましい。存在する場合は、成分間のリンカーオリゴヌクレオチドは、典型的には約５〜約２０個の塩基を含むが、所望よりも少なくとも多くとも良い。
【０１１１】
さらに、アンチセンスプライマー及びアンチセンスプライマー複合物は、好ましくは少なくとも１種の（第一）制限サイトを含み、及びより好ましくは少なくとも２種の制限サイトを含む。第一制限サイトは、典型的には鋳型と結合するアンチセンスプライマー中のシーケンスの５’ 並びに増幅のためのプライマーサイトとして働くことができるアンチセンスプライマー中のさらなるシーケンス３’ である。従って、第一制限サイトは、新規な選択的制限開裂方法（下記）において使用することができ、それにより一本鎖ポリヌクレオチドは完全なままであるが、ハイブリッド二本鎖は、増幅プライマーサイトを除去するための制限的な消化により増幅できなくなる。この具体例において、制限サイトは一本鎖ではなく二本鎖ＤＮＡを切断する制限酵素により開裂されるものである。例としては、ＡｌｕＩ、ＢｂｖＩ、ＤｐｎＩ、ＦｎｕＤＩＩ、ＦｏｋＩ、ＨｐａＩＩ、ＨｐｈＩ、ＭｂｏＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｓｐＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＳｆａＮＩ等である。
【０１１２】
存在する場合、第二制限サイトは、通常は第一の５’ である。第二制限サイトは本発明の一般的な刪減ハイブリダイゼーション方法により生成される試験特異的な二本鎖のクローニングを容易化することに使用され得る。それゆえこのサイトは、好ましくはＤＮＡを比較的稀に切断し、クローン化される試験特異的な二本鎖内の望まない内部開裂の見込みを減じる制限酵素により認識される。このような酵素は当業界で公知である。例４で説明されるように、第二制限サイトは増幅プライマーサイトとしても働き得る。この例において、アンチセンスプライマーは（３’ 〜５’ ）ポリ−Ｔシーケンスを含み、それはＡｌｕ　Ｉサイト（第一制限サイト）にリンクするｍＲＮＡのポリ−Ａ配列に対しハイブリダイズし、それはＳｆｉ　Ｉサイト（第二制限サイト）へリンクする。
【０１１３】
場合によっては操作可能にリンクするプロモーター領域を有するアンチセンスプライマーが、センス試験ポリヌクレオチドとハイブリダイズすると、アンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖が合成される。センスポリヌクレオチドがｍＲＮＡの場合は、ｃＤＮＡの第一の鎖は逆転写プロセスを通じて便利に生成される、ここでＤＮＡはＲＮＡから作成され、標準的な技術による逆転写を利用する。全てのレトロウイルス（例えば鳥類ミエロブラストーマウイルス）中に存在するこの酵素は、デオキシリボ核酸をプライマーの３’ 末端に加える（Ｖａｒｍｕｓ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４０：１４２７−１４３５　（１９８８））。逆転写は低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖としてアンチセンスｃＤＮＡ鎖を生成する。
【０１１４】
２．　低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖の単離
低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖の合成のすぐ後に、反応混合物はさらに鋳型ポリヌクレオチド鎖を含んだ。新しく合成される鎖が本発明の一般的な刪減ハイブリダイゼーション反応の第二刪減ハイブリダイゼーション反応において使用できるように、通常は、新しく合成されたポリヌクレオチド鎖は鋳型から分離されることが望ましい。
【０１１５】
好ましくは、新規に合成された鎖はアンチセンス鎖、より好ましくはアンチセンスｃＤＮＡ鎖であり、そして鋳型はセンスポリヌクレオチド鎖、より好ましくはｍＲＮＡ鎖からなる。ＲＮＡは任意の種々の慣用方法により選択的に分解され、混合物中のＤＮＡは完全なままにすることができる。例中に表されるように、水酸化ナトリウムを用いた混合物の処理はＲＮＡを除去するための１つの便利な方法である。水酸化ナトリウム処理は、ＤＮＡが実質的には分解せず、刪減ハイブリダイゼーションに使用できるような条件で行われる。この目的のために、低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖を単離する他の方法は、本発明の一般的な刪減ハイブリダイゼーションの異なる適用のために当業者により直ちに考案され得る。
【０１１６】
Ｄ．　試験及び参照試料中に存在する低存在量ポリヌクレオチドをブロックするための刪減ハイブリダイゼーション
新規に合成された低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖は、それから第二刪減ハイブリダイゼーション反応において使用される。第二刪減ハイブリダイゼーション反応も、参照ポリヌクレオチド試料と比較して低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富むポリヌクレオチドの参照プールの、又はそれから製造される低存在量富化ポリヌクレオチド鎖を含む。低存在量富化参照ポリヌクレオチド鎖はドライバーとして働き、それは両方の試料中に存在する低存在量ポリヌクレオチドをブロックする。
【０１１７】
新規に合成されたポリヌクレオチド鎖がアンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖である場合は、低存在量富化参照ポリヌクレオチド鎖はセンス参照ポリヌクレオチド鎖である。低存在量富化センス参照ポリヌクレオチド鎖は、当業者に公知の任意の手段によりポリヌクレオチド試料から製造され得る。例えば、誘導されるポリヌクレオチド試料と比較して低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富むセンスポリヌクレオチド鎖は、上述のように高存在量及び低存在量シーケンス間の再結合動力学（ｒｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｋｉｎｅｔｉｃｓ）の差異を利用することにより製造できる。比較的早く二本鎖になるシーケンス（例えば、Ｃｏｔ＝５．５又はそれ未満、ここでＣｏは１リットル当りのヌクレオチドのモルでありそしてｔは秒である）は、高存在量ポリヌクレオチドシーケンスを表す。これらの二本鎖シーケンスは、当業界で公知の方法により再集合混合物から除去され（ヒドロキシアパタイト結合）、低存在量富化ポリヌクレオチドを残し、それは刪減ハイブリダイゼーションにて使用するための対応するセンスポリヌクレオチドを製造することに使用できる。好ましい具体例において、低存在量富化アンチセンスポリヌクレオチド鎖は、以下の“選択されたポリヌクレオチドプールの製造方法” のタイトルのセクションにおいて説明されるように製造される。
【０１１８】
刪減ハイブリダイゼーションについて、低存在量富化参照ポリヌクレオチド鎖は低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖と、少なくとも数種のポリヌクレオチドが互いに特異的にハイブリダイズする条件において接触される。好適な具体例において、低存在量富化センス参照ポリヌクレオチド鎖は低存在量アンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖と接触される。特に好適な具体例において、センス参照ポリヌクレオチド鎖はセンスｃＤＮＡ鎖であり、そしてアンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖はアンチセンス試験ｃＤＮＡ鎖である。
【０１１９】
低存在量富化参照ポリヌクレオチド鎖は、ハイブリダイゼーションをドライブするために、通常はハイブリダイゼーション反応に過剰に加えられるが、これは本発明に必要ではない。ほとんどの適用について、低存在量富化参照ポリヌクレオチド鎖の反応混合物中の他のポリヌクレオチドに対するモル比は、約１：１〜約８００：１、好ましくは約１：１〜約２００：１、より好ましくは約１：１〜約１００：１であるが、他の比も可能である。
【０１２０】
ハイブリダイゼーション反応は高温、通常は６０−７０℃で行われ、比較的特異的なハイブリダイゼーションを達成する。第一刪減ハイブリダイゼーション反応について上述したように、使用されるバッファー及び塩濃度が調節でき、当業者に公知の技術を用いて必要な厳格さを達成する。典型的には公正に高度な厳格性が好ましい。
【０１２１】
低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖が例えばポリ−Ｕ又はポリ−Ｔシーケンスを含み及び低存在量富化参照ポリヌクレオチド鎖がポリ−Ａシーケンスを含む場合、又はその逆の場合は、全ての高存在量富化ポリヌクレオチド鎖は全ての試験ポリヌクレオチド鎖に対しハイブリダイズしかつ刪減が起こらないことが予想される。所望であれば、ブロッキングオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション混合物中に加えられ、例えばポリヌクレオチド鎖のある集合内のポリ−Ａシーケンス間のハイブリダイゼーションを、ポリヌクレオチド鎖の他の集合におけるポリ−Ｕ又はポリ−Ｔシーケンスとのハイブリダイジングから防ぐことができる。
【０１２２】
その代わりに、非特異的ハイブリダイゼーションを促進するシーケンスは、ポリヌクレオチド鎖の少なくとも１種の集合から除去され得る。例えば、好適な具体例において、低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖は、アンチセンスｃＤＮＡであり、低存在量富化参照ポリヌクレオチド鎖は、センスｃＤＮＡである。後者は、ポリ−Ａ配列を含み、それは例えばセンスｃＤＮＡ鎖を３’ エキソヌクレアーゼを用いて、ポリ−Ａ配列を除去するためにコントロールされた条件下で処理することにより除去できる。例４を参照されたい、（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓから市販入手できる）Ｅ．ｃｏｌｉ　エキソヌクレアーゼＩがセンス参照ｃＤＮＡ鎖からポリ−Ａ配列を除去することに使用される。
【０１２３】
最終的には、ポリヌクレオチド鎖の少なくとも１種の集合が、非特異的ハイブリダイゼーションを促進するシーケンスを除去する様式で生成され得る。例えば、好適な具体例において、センス参照ｃＤＮＡ鎖はアンチセンス試験ｃＤＮＡ鎖を用いた刪減ハイブリダイゼーションのために、アンチセンス参照ＲＮＡから生成される。アンチセンス参照ＲＮＡがポリ−Ｕ配列を含む場合は、このＲＮＡから製造されるセンス参照ｃＤＮＡ鎖は対応するポリ−Ａ伸張を含む。ポリ−Ｕ配列は、（７２℃で約６０分又は９０℃で約５分）加熱してポリ−Ｕ配列を分解させることによりアンチセンス参照ＲＮＡから除去される。この“ポリ−Ｕ−除去” アンチセンスＲＮＡは、対応するポリ−Ａ伸張を欠くセンス参照ｃＤＮＡ鎖を合成することに使用される。
【０１２４】
ハイブリダイゼーションは、試験及び参照試料の両方に存在する低存在量ポリヌクレオチドシーケンス、ハイブリダイズしていない低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖、及びハイブリダイズしていない低存在量富化参照ポリヌクレオチド鎖に対応するハイブリッド二本鎖を生成する。
【０１２５】
Ｅ．　ハイブリッド二本鎖の除去
本発明の一般的な刪減ハイブリダイゼーション方法は、試験特異的なポリヌクレオチドを単離することに指図されるので、共通のシーケンスを表すハイブリッド二本鎖は、好ましくは除去又は消化される。二本鎖及び一本鎖ポリヌクレオチドを分離する方法は公知であり、任意の適用可能な方法が本発明中で使用できる。代わりに、二本鎖ポリヌクレオチドはヌクレアーゼ消化により選択的に分解される。二本鎖ポリヌクレオチドを選択的に消化するヌクレアーゼは公知であり、そして例えばラムダヌクレアーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ヌクレアーゼ　ＩＩＩ等を含む。二本鎖ポリヌクレオチドの消化に適したバッファー、時間及び温度は当業界で公知である。
【０１２６】
さらに、上述のように、多くの制限酵素は二本鎖ポリヌクレオチドのみを開裂する。従って本発明は、一本鎖及び二本鎖ポリヌクレオチドの混合物中の一本鎖ポリヌクレオチドのみを機能的に単離する新規な選択的制限開裂方法を提供する。この方法は、ポリヌクレオチド混合物を、１種又はそれ以上の制限酵素と、二本鎖ポリヌクレオチドを消化してヌクレオチド合成のための鋳型として働くことができないものを形成させるに十分な条件にて接触させることを必要とする。ある具体例において、制限酵素、好ましくは４塩基長認識サイトを有するようなフリークエントカッター（ｆｒｅｑｕｅｎｔ　ｃｕｔｔｅｒ）は、二本鎖ポリヌクレオチドをより小さな断片に切断することに使用できる。結果において、この開裂は１本鎖ポリヌクレオチドを機能的に単離し１本鎖ポリヌクレオチドに対応するポリヌクレオチド製造物の選択的な合成を許容する。バッファー、時間及び温度のような、二本鎖ポリヌクレオチドを消化するための反応条件は、本発明に使用するために好適な種々の制限酵素について公知である。
【０１２７】
好適な具体例において、ハイブリダイゼーション反応において使用される低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖及び／又は低存在量富化参照ポリヌクレオチド鎖は、それぞれが５’ 末端近くに制限サイトを有する。これらのポリヌクレオチド鎖の各々のうちの１つがハイブリダイズする場合、制限サイトは生じたハイブリッド二本鎖の一端又は両端に生成される。
【０１２８】
典型的には、この具体例において、低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖が低存在量富化参照ポリヌクレオチド鎖を用いてハイブリダイズする場合に生じたハイブリッド二本鎖は、５’ 制限サイトにおける二本鎖ではない。従って、標準的な“充填” 反応が行われ、これらのサイトにおける分子は二本鎖化された分子を翻訳する。この充填反応に有用な酵素は、他の情況において充填反応として使用されるものと異なるものではない。例えば、例４において、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼが便利に使用され、５’ 突出部に充填される。このような酵素に適したバッファー及び反応条件は公知である。
【０１２９】
低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖がアンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖である場合は、制限サイトは、アンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖の合成に使用されるアンチセンスプライマー及びアンチセンスプライマー複合物へ導入され得る。上述のように、プライマー又はプライマー複合物は、制限サイトがその後の増幅反応において下流プライマーサイトとして働くシーケンスの３’ となるように、デザインされ得る。この具体例において、二本鎖ポリヌクレオチドにおける制限サイトにおける開裂は、プライマーサイトをポリヌクレオチドの残渣から分離する。開裂は二本鎖ポリヌクレオチドを増幅のための鋳型として働くことができない形態へ変換する。それゆえ、制限酵素消化は、一本鎖ポリヌクレオチドを機能的に単離し、アンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖の選択的なヌクレオチド合成、例えば増幅をさせる。
【０１３０】
類似の制限サイトは、下記の“低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富むポリヌクレオチドプールの製造” のタイトルのセクションにおいて説明されるように、これらの鎖が製造される場合に、低存在量富化センス参照ポリヌクレオチド鎖に導入されることができる。これらの制限サイトは、増幅のための上流プライマーサイトとして働くシーケンスの３’ であることもできる。従って、このサイトにおける開裂は、プライマーサイトをポリヌクレオチドの残りからの分離も行い、それにより増幅を防ぐ。
【０１３１】
代わりの具体例において、３’ ユニバーサルプライマーサイトは、充填反応後及び制限酵素消化前に、ハイブリダイゼーション反応混合物中の分子の両端に加えられることができる。例４を参照されたい。ユニバーサルプライマーサイトは、試験ポリヌクレオチド鎖にライゲート又は別な方法でリンクするオリゴヌクレオチド内に、典型的に存在する。オリゴヌクレオチドはオリゴデオキシヌクレオチド、オリゴリボデオキシヌクレオチド、又はデオキシヌクレオチド及びリボデオキシヌクレオチドを含むハイブリッド分子であることができる。ユニバーサルプライマーサイトはユニバーサルプライマーに対してハイブリダイズするために好適な長さ及びシーケンスを有しなければならない。好ましい具体例において、ユニバーサルプライマーサイトは増幅反応のための“アンカー（ａｎｃｈｏｒ）” として働き、それは便利にはポリメラーゼ鎖反応（“ＰＣＲ”）を使用して行われる。好適なユニバーサルプライマーサイトシーケンスを選択するための研究は、当業界で公知である。このようなシーケンスについての通常の及び好ましい長さは、上記アンチセンスプライマーについて与えられたものと同じである。
【０１３２】
ユニバーサルプライマーサイトは任意の便利な方法、例えば“オリゴヌクレオチド配列化” 又はライゲーションのような任意の便利な方法によりポリヌクレオチド鎖の３’ 末端に加えられることができる。
【０１３３】
オリゴヌクレオチド配列化（“ホモポリマー配列化” とも呼ばれる）において、特定の型のデオキシヌクレオチド、すなわちｄＡ、ｄＴ、ｄＧ又はｄＣは、末端トランスフェラーゼを使用して、ＤＮＡ鎖の３’ 末端に加えられる。この反応は、オリゴヌクレオチド−ｄＴ、−ｄＡ、ｄＣ又はｄＧプライマー用のユニバーサルプライマーとしてそれぞれ働くことができるオリゴヌクレオチド−ｄＡ、−ｄＴ、ｄＧ又はｄＣ配列を有するＤＮＡ鎖を生成する。
【０１３４】
ユニバーサルプライマーサイトは、例えばＡｋｏｗｉｔｚ，Ｇｅｎｅ　８１：２９５−３０６（１９８９）に記載されるように、アンチセンスポリヌクレオチド鎖の３’ 末端にライゲートすることにより加えられることもできる。
【０１３５】
好適な具体例において、充填反応後、オリゴヌクレオチド配列化が行われ、オリゴヌクレオチド配列が加えられ、それは適切なホモポリマープライマー用のプライマーサイトとして働くことができる。好適な制限酵素を用いた後に続く消化は、ハイブリッド二本鎖からオリゴヌクレオチド配列を除去するが、１本鎖化ポリヌクレオチドからは除去しない、それはそれから増幅のための鋳型として働く。
【０１３６】
Ｆ．　ハイブリダイズしていない低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖からの試験特異的な二本鎖の生成
第二刪減ハイブリダイゼーション反応において生成されるハイブリッド二本鎖の除去又は消化は、低存在量富化試験又は参照ポリヌクレオチド鎖を実質的に完全なままにする。試験又は参照ポリヌクレオチド鎖は、反対の転写（ｓｅｎｓｅ）を有する。好適な具体例において、参照ポリヌクレオチド鎖はセンス参照ポリヌクレオチド鎖であり、試験ポリヌクレオチド鎖はアンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖である。
【０１３７】
本方法は、低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖が二本鎖化されることが必要であり、それにより低存在量富化試験特異的な二本鎖を生成する。低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖の試験特異的な二本鎖への選択的な変換は、低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖が５’ アンチセンスプライマーサイトを有し及び３’ ユニバーサルプライマーサイトを有するアンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖である具体例を参照して本明細書中で例証される。好ましくは、第二ハイブリダイゼーションにおいて使用される低存在量富化参照ポリヌクレオチド鎖は、これらのエレメントを持たないか、又はこれらのエレメントが存在する場合は、これらのヌクレオチドシーケンスは、アンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖が選択的に増幅され得るアンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖中のものとは十分に異なる。その代わりに、例４に記載される好適な具体例においては、参照ポリヌクレオチド鎖は自己アニール可能な５’ プライマーサイト及び３’ プライマーサイトを含み、それは増幅を防ぐ。例４において、５’ ポリ−Ｇシーケンスは３’ ポリ−Ｃシーケンスとアニールする。低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖を試験特異的な二本鎖への変換をさせる他の方法は、本明細書中のガイダンスを考慮して当業者によりデザインされることができる、そしてそれゆえ、本発明の範囲内である。
【０１３８】
ある具体例において、アンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖は増幅反応を使用して二本鎖化される。好ましくは、増幅はＰＣＲにより行われ、より好ましくは促進されたＰＣＲにより行われ、それらの両方が当業者に公知である。ＰＣＲは、ＳａｉｋｉによるＳｃｉｅｎｃｅ　２３０：１３５０（１９８５）と同様に、米国特許第４，６８３，２０２号、第４，６８３，１９５号、第４，８００，１５９号及び第４，９６５，１８８号に記載される。ＰＣＲは２種のプライマーをポリヌクレオチド内のターゲットシーケンスをフランクする実質的に相補的なシーケンスに対してハイブリダイズすることが必要である。鋳型変性、プライマーアニーリング、及びＤＮＡポリメラーゼによりアニールされたプライマーの延長を含む反応段階の一連の繰返しは、末端がプライマーの５’ 末端により規定されるターゲットシーケンスの幾何的集合を生じる。ほとんどのＤＮＡポリメラーゼを変性させる温度（例えば約９３−９５℃）で変性が典型的に行われるときは、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、又はＴｈｅｒｍｕｓ　ｆｌａｖｕｓから誘導されるような熱安定性ポリメラーゼが典型的には延長するために使用され、各延長サイクルのためにさらなるポリメラーゼを加える必要性を防ぐ。
【０１３９】
好ましい具体例において、アンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖は促進されたＰＣＲを用いて増幅される。促進されたＰＣＲは、例えば米国特許第５，４３６，１４９号（Ｂａｒｎｅｓ等、１９９５年７月２５日発行）に記載されるように行うことができ、３’ −エキソヌクレアーゼ活性を欠く異なるＴａｑ又はＴｈｅｒｍｕｓ　ｆｌａｖｕｓ　ＤＮＡポリメラーゼ及びより少量のそのような活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含むポリメラーゼの組合せの使用を開示する。本方法中で使用されることもできる類似のポリメラーゼの組合せは、米国特許第５，５１２，４６２号（Ｃｈｅｎｇ等、１９９６年４月３０日発行）に記載される。ＰＣＲプライマーの選択及び増幅条件に影響する考察は公知であり、当業者は直ちに本発明の方法の特定の適用について好適なプライマー及び条件を決定できる。
【０１４０】
５’ アンチセンスプライマーサイト及び３’ ユニバーサルプライマーサイトを有するアンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖のＰＣＲ増幅は、例えば５’ プライマーとしてユニバーサルプライマーサイトに対してハイブリダイズするユニバーサルプライマーを使用し並びに３’ プライマーとしてアンチセンスプライマー又はアンチセンスプライマー複合物を使用することにより便利に達成される。それゆえ、このようなプライマーは、効率的かつ十分な特異的なＰＣＲ増幅用のアンカーとして働くために、選択されることが好ましい。
【０１４１】
例４に表される好ましい具体例において、アンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖は、上記選択的制限開裂方法におけるオリゴヌクレオチド配列化により加えられる５’ ポリ−Ｔシーケンス及びポリ−Ｃ配列を含むアンチセンスｃＤＮＡ鎖である。ハイブリダイゼーション反応混合物は、ポリ−Ｃ配列を含むセンス参照ポリヌクレオチド鎖も含むが、ポリ−Ｔシーケンスは含まない。アンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖は、それゆえ５’ プライマーとしてポリ−Ｇプライマーを使用し、そして３’ プライマーとしてポリ−Ａプライマーを使用して選択的に増幅され得る。
【０１４２】
この具体例の特に好ましいバリエーションにおいて、試験特異的な二本鎖のクローニングを容易化する制限サイトは、増幅中に導入される。それゆえ、例４に記載されるように、５’ プライマーはＮｏｔ　Ｉのような制限サイトを含み、それはポリ−Ｇプライマーシーケンスの５’ 末端にリンクする。３’ プライマーとしてポリ−Ａプライマーを使用する代わりに、Ｓｆｉ　Ｉサイトを含むプライマーが使用される。Ｓｆｉ　Ｉプライマーは、アンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖の５’ 末端においてＳｆｉ　Ｉサイトへハイブリダイズする。それゆえ、増幅は５’ Ｎｏｔ　Ｉサイト及び３’ Ｓｆｉ　Ｉサイトを有する二本鎖を生成し、それは試験特異的な二本鎖を選択物のベクター内にクローン化することに使用できる。上述のように、一般的には、ＤＮＡ中にサイトがめったに現れず、試験特異的な二本鎖内の切断を減少させる酵素用の制限サイトを導入することが望ましい。当業者が直ちに認識できるように、各末端に異なる制限サイトを有する試験二本鎖が指向性クローニング用に好ましいが、各末端に同じ制限サイトを有する試験二本鎖も生成できる
【０１４３】
増幅後、“アンチセンス試験ポリヌクレオチド鎖” から製造される試験特異的な二本鎖は、典型的には標準的なＤＮＡ組換え技術を使用して、ベクター内へクローン化される、それは以下の“ポリヌクレオチドプールの使用” のタイトルのセクションにて説明する。このクローニング段階は、増幅反応混合物中の他の全てのシーケンスから試験特異的なシーケンスを単離する単純な方法を表す。生じたポリヌクレオチドライブラリーは、“刪減されたポリヌクレオチドプール” を表わし、それは参照ポリヌクレオチド試料中に存在しない、又は参照ポリヌクレオチド試料中に試験ポリヌクレオチド試料よりも実質的に低い濃度で存在する低存在量ポリヌクレオチドシーケンスを含む。
【０１４４】
ＩＩＩ．　選択されたポリヌクレオチドプールの製造方法
本発明は、ポリヌクレオチド試料からポリヌクレオチドプールを選択する方法も提供する。これらのポリヌクレオチドプールは、上記第一及び第二刪減ハイブリダイゼーション反応用のドライバーを生成するために使用することができる。そのようなプールのための他の適用を、以下に詳細に記載する。
【０１４５】
１つの選択方法は、希釈中に低存在量シーケンスのロスを活用し、ポリヌクレオチド試料と比較して高存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富むポリヌクレオチドプールを生成する。この方法は、例えば、試験又は参照ポリヌクレオチド試料それぞれと比較して高存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富む試験又は参照ポリヌクレオチドのプールを得るために使用できる。このようなプールは、上記第一刪減ハイブリダイゼーション反応において、ドライバーとして使用できる。
【０１４６】
第二の選択方法は、本発明又は他の希釈方法により生成される高存在量ポリヌクレオチドプールを用いて出発する。この方法は、高存在量ポリヌクレオチドプールを用いた刪減ハイブリダイゼーションに依存し、低存在量富化ポリヌクレオチドプールを生成する。この選択方法は、参照ポリヌクレオチド試料と比較して低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富む参照ポリヌクレオチド鎖のプールを得るために使用できる。低存在量富化参照ポリヌクレオチドプールは、例えば上記の第二刪減ハイブリダイゼーション反応におけるドライバーとして使用できる。
【０１４７】
選択されたポリヌクレオチドプールを製造するための両方の方法が、出願第０９／６３２／８９８号（２０００年８月７日出願）に記載され、それは本明細書中に参照として明確に記載される。
【０１４８】
Ａ．　高存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富むポリヌクレオチドプールの製造
１．　ポリヌクレオチド試料からの第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖の合成
高存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富むポリヌクレオチドプールを製造するために、第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖が、ポリヌクレオチド試料のセンスポリヌクレオチド鎖又はポリヌクレオチド試料から製造されたセンスポリヌクレオチド鎖から合成できる。
【０１４９】
必然的に、任意のポリヌクレオチドは、それらがそれぞれアンチセンスプライマーに対して実質的に相補的なヌクレオチドシーケンスを含む場合は、高存在量富化ポリヌクレオチドプールの製造のための出発ポリヌクレオチドとして使用できる。このアンチセンスプライマーサイトはセンスポリヌクレオチド鎖の３’ 末端（例えばｍＲＮＡ分子のポリ−Ａ配列）に位置することができ、それは完全長アンチセンスポリヌクレオチド鎖を生成する。その替わりに、アンチセンスプライマーサイトは、（ランダムプライマー混合物が使用された場合のように）アンチセンスポリヌクレオチド鎖がセンスポリヌクレオチド鎖の一部のみのために合成されるように位置することができる。
【０１５０】
本発明の選択方法において有用な出発ポリヌクレオチドは、一般的な刪減ハイブリダイゼーション方法において有用なものについて上述するように、任意のソースから得ることができる。出発ポリヌクレオチドは、最初には純粋な形態で存在する必要はない：混合物中の他の成分が第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖の合成を実質的に妨げないものである場合は、それらは複合混合物中でマイナーなフラクションであることができる。
【０１５１】
好適な具体例において、第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖の合成は、アンチセンスプライマー複合物を使用してプライムされる。上述のように、アンチセンスプライマー複合物は：（１）アンチセンスプライマー及び（２）特異的に適応されるＲＮＡポリメラーゼプロモーターシーケンスを含む。アンチセンスプライマー複合物は、制限エンドヌクレアーゼサイト（制限サイト）であるシーケンスを含むこともでき、それは選択的制限開裂（ 上記参照） 又は本発明の方法に従って製造されるポリヌクレオチドプールのクローニングを容易化する。
【０１５２】
本発明の選択方法において有用なアンチセンスプライマーについての研究は、本発明の一般的な刪減ハイブリダイゼーション方法において有用なアンチセンスプライマーに関する上述のものと同じである。簡単には、プライマーは好ましくは一本鎖オリゴヌクレオチドであり、最も好ましくはオリゴデオキシヌクレオチドである。特異的なシーケンスモチーフに対してハイブリダイズするためにデザインされたプライマーは、典型的には約１０〜約５０個のヌクレオチドを含み、そして好ましくは約１５〜約２５個のヌクレオチドを含むが、プライマーは例えばシーケンスモチーフに依存してより少ないヌクレオチドを含むことができる。他の適用のために、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、必要ではないが、より短い例えば約７〜約１５個のヌクレオチドである。
【０１５３】
アンチセンスプライマー複合物の第二の成分は、ＲＮＡプロモーターシーケンスである。本発明の方法において有用なＲＮＡプロモーターシーケンスは、一般的な刪減ハイブリダイゼーション方法に関連して上述したとおりである。従って、プロモーターシーケンスは、天然発生ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、コンセンサスプロモーターシーケンス（Ａｌｂｅｒｔｓ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅｌｌ、第２版、Ｇａｒｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、又はそれらの修飾バージョンから発生する通常、約１５〜約２５０個のヌクレオチドを含み、そして好ましくは約２５〜約６０個のヌクレオチドを含む。本発明の選択方法において、使用されるために特に好適なものは、Ｔ３、Ｔ７及びＳＰ６ファージプロモーター／ポリメラーゼシステムである。
【０１５４】
ＲＮＡプロモーターシーケンスはアンチセンスプライマーとリンクし、好適な条件下でのリボヌクレオチド及びＲＮＡポリメラーゼの存在下で転写を容易化する。プライマー及びプロモーター成分は、プライマーに対して相補的であるポリヌクレオチド鎖の転写を許容する方向において、すなわちアンチセンスＲＮＡ転写がプライマー延長と同じ方向であるようにアンチセンスプライマーの上流（５’ ）のＲＮＡプロモーターとリンクする。この基準に見合う任意の型の結合が使用されることができるが、ヌクレオチド結合が好ましい。成分間のリンカーオリゴヌクレオチドは、存在する場合には典型的には約５〜約２０個の塩基を含むが、所望より少なくとも多くとも良い。
【０１５５】
好適な具体例において、選択されたポリヌクレオチドプールはＲＮＡから生成される。全ＲＮＡを使用することができるが、ほとんどの適用においてポリ−Ａ　ＲＮＡ（すなわちｍＲＮＡ）が好ましい。各場合において、ランダムシーケンスのアンチセンスプライマー（すなわちランダムプライマー）を含む複数のアンチセンスプライマー複合物が使用できる。試料中に存在するｍＲＮＡから選択されたポリヌクレオチドプールを生成するために、アンチセンスプライマーはオリゴ−ｄＴシーケンス（例えば約５〜約５０、好ましくは約５〜約２０、より好ましくは約１０〜約１５個のＴ残渣）を含むことができる。共通のヌクレオチドシーケンスモチーフを分けるＲＮＡのみが増幅される場合は、それからプライマーはこのシーケンスモチーフに対して実質的に相補的である。上記第一刪減ハイブリダイゼーション反応においてドライバーとして使用されるための高存在量富化ポリヌクレオチドプールが製造される場合、出発ポリヌクレオチドは、好ましくはｍＲＮＡであり、アンチセンスプライマー複合物は、好ましくはランダムプライマーを含む。
【０１５６】
試料中のアンチセンスプライマー及びセンスポリヌクレオチドに対して操作可能にリンクしたプロモーター領域のハイブリダイゼーションの後に、第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖が合成される。センスポリヌクレオチドがｍＲＮＡである場合は、上述のように第一アンチセンスｃＤＮＡ鎖が逆転写の方法を通じて便利に生成される。
【０１５７】
２．　ユニバーサルプライマーサイトの添加
ポリヌクレオチド試料の及びそれから製造されるセンスポリヌクレオチド鎖からの第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖の合成の後に、上述のように第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖の３’ 末端へのユニバーサルプライマーサイトの添加が続くことが好ましい。ユニバーサルプライマーサイトは、ユニバーサルプライマーに対してハイブリダイズするために好適な長さ及びシーケンスを有しなければならない、そして好ましくはＰＣＲのような増幅反応用のアンカーとして働くためにデザインされる。ユニバーサルプライマーサイトは、随意に制限サイトを含み、本発明の選択的制限開裂及びポリヌクレオチドプールのクローニングを容易化する。ユニバーサルプライマーサイトは、上述のように“鋳型交換” と同様にオリゴヌクレオチド配列化、及びライゲーションを含む任意の便利な方法により第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖へ加えられることができる。
【０１５８】
センスポリヌクレオチド鎖がｍＲＮＡであり、そして第一アンチセンス鎖がｃＤＮＡである場合は、鋳型交換は以下のように行われる。鋳型交換オリゴヌクレオチドが逆転写の間に含まれるときは、それはｍＲＮＡ−アンチセンスｃＤＮＡハイブリッドを生成する。鋳型交換オリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ鎖の５’ 末端におけるＣＡＰサイトに対してハイブリダイズし、そしてアンチセンスｃＤＮＡ鎖の３’ 末端のＣＡＰ依存延長のための短く延長された鋳型として働く。鋳型交換オリゴヌクレオチドは、典型的には少量のリボヌクレオチドを３’ 末端に必要とし、ＣＡＰ依存延長を促進する。それゆえ、鋳型交換オリゴヌクレオチドは、通常、約１〜約５個のリボヌクレオチドを、それらの３’ 末端に含む。
【０１５９】
３．　第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖の希釈
好ましくはユニバーサルプライマーサイトを含む第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖の生成後、反応混合物は希釈され、少なくとも数種の低存在量アンチセンスポリヌクレオチド鎖を実質的に除去する。連続希釈は典型的にこの目的のために行われ、そして希釈の程度は所望の存在量限界に依存する。多量の希釈では多数の複製数にて存在するポリヌクレオチド鎖を除去するのに対し、最小限希釈は混合物中の最も稀なポリヌクレオチドを除去する。本方法の標準的な適用において有用な希釈は、約１０−１、約１０−２、約１０−３、約１０−４、約１０−５、約１０−６、約１０−７、約１０−８、約１０−９、約１０−１０ 、約１０−１１ 、約１０−１２ からの範囲であるが、特定の適用においてはより高い又は低い希釈が所望であり得る。連続的な希釈は、反応混合物の等分を除去し、所望の希釈程度を提供する水溶液へ等分を移すことにより行われる。所望であれば、複数の移送が使用され、所望の程度の希釈を生じる段階的な希釈を達成する。希釈に用いられる水溶液は、好ましくは本方法の次の段階において使用される酵素と相溶性であり、希釈後に存在する第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖から二本鎖ポリヌクレオチドを生成する。
【０１６０】
４．　残留第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖からの第一の二本鎖ポリヌクレオチドの生成
第一の二本鎖ポリヌクレオチドは、任意の数の適用可能な方法による希釈後に残留する第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖から生成され得る。第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖が第一アンチセンスｃＤＮＡ鎖である場合は、第二鎖ｃＤＮＡは、随意にＤＮＡリガーゼを含むＲＮａｓｅ　Ｈ及びＥ．ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼを使用して合成される。ＲＮａｓｅはＲＮＡ／第一鎖ｃＤＮＡハイブリッドを壊すことを助け、そしてＤＮＡポリメラーゼは鋳型として第一鎖ｃＤＮＡを用いて相補的なＤＮＡ鎖を合成する。第二鎖は、成長する鎖の３’ 末端に加えられるデオキシヌクレオチドとして発生する．第一アンチセンスｃＤＮＡが５’ 末端にてＲＮＡプロモーターシーケンスを含む場合、一本鎖プロモーターシーケンスは所望の方向にて二本鎖プロモーター領域内に複製される。
【０１６１】
好ましい具体例において、第一の二本鎖ポリヌクレオチドは増幅により生成される。第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖がＲＮＡ／第一鎖ｃＤＮＡハイブリッド内のｃＤＮＡ分子である場合は、ＲＮＡが分解する条件下で増幅が行われる。その代わりに、ＲＮＡは、例えば水酸化ナトリウムを用いる処理のような任意の好適な技術により増幅される前に除去できる。増幅は好ましくはＰＣＲにより行われ、より好ましくは促進されたＰＣＲにより行われる。３’ ユニバーサルプライマーサイトを有する第一アンチセンスポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅は、例えば５’ プライマーとしてユニバーサルプライマーサイトにハイブリダイズするユニバーサルプライマーを使用して、及び３’ プライマーとしてアンチセンスプライマー複合物を使用することにより、便利に達成される。それゆえ、そのようなプライマーは効率的かつ十分に特異的なＰＣＲ増幅用のアンカーとして働くために、選択されることが好ましい。
【０１６２】
第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖が、ランダムプライマーを含むアンチセンスプライマー複合混合物を使用して発生される場合は、ＲＮＡプロモーターシーケンスにリンクするランダムシーケンスは、アンチセンスポリヌクレオチド鎖へ導入される。この具体例において、ＲＮＡプロモーターシーケンスは増幅のためのプライマーサイトとして働くことができる。従って、増幅反応は各アンチセンスポリヌクレオチド鎖の５’ 末端において、ＲＮＡプロモーターシーケンスと結合する３’ プライマーを含むことができる。
【０１６３】
第一アンチセンスポリヌクレオチド鎖から生成されるポリヌクレオチドのプールは、出発ポリヌクレオチド試料と比較して高存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富み、そして例えば刪減ハイブリダイゼーション反応において使用され、以下に詳しく説明されるように出発ポリヌクレオチド試料と比較して低存在量ポリヌクレオチドに富む選択されたポリヌクレオチドプールを生成する。
明確化のため、高存在量富化ポリヌクレオチドは“第一の二本鎖ポリヌクレオチド”と呼ばれ、そして下記低存在量富化ポリヌクレオチドは“第二の二本鎖ポリヌクレオチド”と呼ぶ。
【０１６４】
ポリヌクレオチド試料がｍＲＮＡ試料である場合は、第一の二本鎖ポリヌクレオチドは“ｃＤＮＡ” 分子と呼ばれる。好適な具体例において、第一の二本鎖ポリヌクレオチドは、（センス鎖と比べ）５’ 末端においてユニバーサルプライマーサイトを、及び（センス鎖と比べ）３’ 末端において機能的ＲＮＡポリメラーゼを保有する。
【０１６５】
５．　第一の二本鎖ポリヌクレオチドからのアンチセンスＲＮＡの合成
アンチセンスＲＮＡは、ＲＮＡプロモーターを含む第一の二本鎖ポリヌクレオチドから、ポリヌクレオチドをＲＮＡ合成に好適な条件下で、ＲＮＡプロモーター領域に結合可能なＲＮＡポリメラーゼと接触させることにより合成できる。センス鎖は、アンチセンスＲＮＡに転写される。増幅は、ポリメラーゼが繰り返し鋳型上にリサイクルされるために起こる（すなわちプロモーター領域からの転写を再開（ｒｅｉｎｔｉａｔｅ）する）。この技術は、ベクター内にクローニングする必要無く、広範囲のポリヌクレオチドを複写させる。さらに、同じ鋳型上におけるポリメラーゼのリサイクルは、間違った伝達を防ぐ。
【０１６６】
転写に使用されるＲＮＡポリメラーゼは、上述のアンチセンスプライマー複合物において使用される特定のプロモーター領域に操作可能にリンクできなければならない。実質的には、任意のポリメラーゼ／プロモーターの組合せが使用できる；しかしバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ、特にＴ３、Ｔ７及びＳＰ６ファージからのものが好ましい。最も好ましいポリメラーゼはＴ７　ＲＮＡポリメラーゼである。Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼにより表されるそのプロモーターサイトについての特に高度の特異性（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ等、ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ，ｅｄ．Ｐ．Ｂｏｙｅｒ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）８７−１０８頁（１９８２））は、この酵素を、プローブとして使用するための（Ｍｅｌｔｏｎ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１２：７０３５−７０５６（１９８４））、インビトロ翻訳研究について（Ｋｒｉｅｇ等、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１２：７０５７−７０７０（１９８４））及び合成オリゴリボヌクレオチドの製造における使用について（Ｍｉｌｌｉｇａｎ等、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１５：８７８３−８７９８（１９８７））プロモーターサイトを含むプラスミドからのインビトロＲＮＡ合成を含む種々の組換えＤＮＡ技術において有用な試薬にする。Ｔ７ポリメラーゼについての有効な末端信号の欠如も、この酵素がほとんど任意のＤＮＡシーケンスの転写をすることを可能にする（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等、Ｇｅｎｅ５６：１２５−１３５（ １９８７） 参照）。最終的には、Ｔ７ポリメラーゼは、Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，又は濃縮形態（１０００単位／・ｌ）でＥｐｉｃｅｎｔｅｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓのような多数の市販ソースから入手可能である。Ｅ．ｃｏｌｉ　ＲＮＡポリメラーゼは適切なＥ．ｃｏｌｉ　ＲＮＡポリメラーゼプロモーター領域とともに使用できる。
【０１６７】
転写反応混合物は必要なヌクレオチドトリホスフェートを含み、それはアンチセンスＲＮＡの最終的な使用に依存して修飾されることができる。例えば、アンチセンスがＲＮＡ核酸ハイブリダイゼーションプローブとしての使用を意図する場合、１種又はそれ以上のヌクレオチドは以下に詳細に記載されるようにラベルされることができる。
【０１６８】
Ｂ．　低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富むポリヌクレオチドプールの製造
１．　高存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富むアンチセンスポリヌクレオチド鎖を用いたポリヌクレオチド試料の刪減ハイブリダイゼーション
高存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富むアンチセンスポリヌクレオチド鎖は、本発明の一般的な刪減ハイブリダイゼーション方法に関連して上述したものを含む任意の便利な方法によりポリヌクレオチド試料から製造され得る。好ましい具体例において、高存在量富化ポリヌクレオチド鎖は、上述のような第一の二本鎖ポリヌクレオチドから転写されたアンチセンスＲＮＡである。アンチセンスＲＮＡはポリヌクレオチド試料の又はそれから製造されるセンスポリヌクレオチドを用いてハイブリダイズされる。このハイブリダイゼーション反応は二本鎖ポリヌクレオチド及びハイブリダイズしていないセンスポリヌクレオチドを生成する。アンチセンスＲＮＡは高存在量シーケンスに富むので、高存在量シーケンスは二本鎖になり、そしてハイブリダイズしていないセンスポリヌクレオチドはポリヌクレオチド試料と比較して低存在量シーケンスに富む。
【０１６９】
刪減ハイブリダイゼーション反応において使用されるアンチセンスポリヌクレオチド鎖及びセンスポリヌクレオチド鎖は、同じポリヌクレオチド試料から誘導されることが好ましい。それゆえ、上述の一般的な刪減ハイブリダイゼーションの第二ハイブリダイゼーション反応における使用のための低存在量シーケンスに富むポリヌクレオチドの参照プールを生成するために、アンチセンス参照ポリヌクレオチド鎖は、センス参照ポリヌクレオチド鎖を用いてハイブリダイズされることが好ましい。しかし、本発明の選択方法は、１種のポリヌクレオチド試料並びに異なるポリヌクレオチド試料の又はそれらから製造されるセンスポリヌクレオチド鎖から誘導されるアンチセンスポリヌクレオチド鎖の刪減ハイブリダイゼーションを含む。この場合において、刪減ハイブリダイゼーションは、２種の試料により分けられる高存在量シーケンスをブロックする。
【０１７０】
アンチセンスポリヌクレオチド鎖は、通常は過剰にハイブリダイゼーション反応に加えられハイブリダイゼーションをドライブするが、これは本方法の必要なことではない。ほとんどの適用において、反応混合物中のアンチセンスポリヌクレオチドの他のポリヌクレオチドに対するモル比は、約１：１〜約８００：１、好ましくは約１：１〜約２００：１、及びより好ましくは約１：１〜約１００：１であるが、他の比でも良い。刪減ハイブリダイゼーションは、本発明の一般的な刪減ハイブリダイゼーション方法の第一及び第二刪減ハイブリダイゼーション反応について上述されたように行われる。
【０１７１】
好ましい具体例において、アンチセンスポリヌクレオチド鎖は、高存在量富化ポリヌクレオチドのプール（例えば高存在量富化参照ポリヌクレオチド）の及びそれから製造されるアンチセンスＲＮＡ分子であり、そしてセンスポリヌクレオチド鎖は同じ試料からのｍＲＮＡ分子である。この場合、刪減ハイブリダイゼーションは、試料と比較して、ハイブリダイズしていないセンスポリヌクレオチド鎖として、低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富むハイブリダイズしていないｍＲＮＡ分子を生成する。
【０１７２】
２．　ハイブリダイズしていないセンスポリヌクレオチド鎖からの第二アンチセンスポリヌクレオチド鎖の合成
刪減ハイブリダイゼーション反応からのハイブリダイズしていないセンスポリヌクレオチド鎖は、所望ならば、それからアンチセンスポリヌクレオチド鎖の他のセットの合成用の鋳型として使用できる。この目的のために任意の標準的な鎖技術を使用し得るが、好適な具体例において、このアンチセンスポリヌクレオチド鎖の第二のセットは、上述のようにアンチセンスプライマー又はアンチセンスプライマー複合物を使用して合成される。アンチセンスプライマー複合物が使用される場合、アンチセンスポリヌクレオチド鎖は、５’ 末端にプライマーサイト及びＲＮＡプロモーターシーケンスを含む。それゆえ、所望の場合にはアンチセンスプライマー複合物が使用され、それぞれがＲＮＡプロモーターを含む選択されたポリヌクレオチドからのアンチセンスＲＮＡの合成を容易化する選択されたポリヌクレオチドのプールを生成することが好ましい。プライマーサイト及び／又はＲＮＡプロモーターシーケンスが使用され、プライマーサイト及び／又はプロモーターシーケンスをも有する所望でないポリヌクレオチドを含み得る反応混合物中におけるヌクレオチド合成を開始する場合、プライマーサイト及び／又はプロモーターシーケンスは所望のポリヌクレオチドからの特異的なヌクレオチド合成をさせるために十分に異なることが好ましい（例えば例４を参照されたい、Ｂ．２．で使用されるプライマー及びＲＮＡプロモーターシーケンスは、Ａ．１．で使用されるものと異なり、そしてプライマーサイトはＣ．２．で使用されるものとは異なる）。使用される方法にかかわらず、ハイブリダイズしていないセンスポリヌクレオチド鎖から生成される第二のアンチセンスポリヌクレオチド鎖は、ポリヌクレオチド試料と比較して低存在量シーケンスに富む。
【０１７３】
ハイブリダイズしていないセンスポリヌクレオチドがｍＲＮＡ分子である場合は、ｍＲＮＡは便利に逆転写され、第二アンチセンスポリヌクレオチド鎖として第二アンチセンスｃＤＮＡ鎖を生成する。
【０１７４】
３．　ユニバーサルプライマーサイトの添加
本発明の好ましい具体例において、ユニバーサルプライマーサイトは、上述のように第二アンチセンスポリヌクレオチド鎖の３’ 末端へ添加され、低存在量シーケンスに富む第二の二本鎖ポリヌクレオチドの同時合成及び増幅を容易化する。ユニバーサルプライマーサイトは、鋳型交換、オリゴヌクレオチド配列化又はライゲーションにより加えられる。プライマーサイトが、ユニバーサルプライマーサイトも有する所望でないポリヌクレオチドを含み得る反応混合物中においてヌクレオチド合成を開始させることに使用されるものである場合、第二アンチセンスポリヌクレオチド鎖へ導入されるプライマーサイトは特異的なヌクレオチド合成させるために、所望のポリヌクレオチドとは十分異なることが好ましい（例えば例４を参照されたい、Ｂ．３．で使用されるユニバーサルプライマーサイトはＡ．２．で使用されるものとは異なる）。
【０１７５】
４．　第二アンチセンスポリヌクレオチド鎖からの第二の二本鎖ポリヌクレオチドの生成
第二の二本鎖ポリヌクレオチドは、上述のように第二アンチセンスポリヌクレオチド鎖から生成できる。３’ ユニバーサルプライマーサイトがアンチセンスポリヌクレオチド鎖へ加えられた場合は、ポリヌクレオチド鎖は、好ましくはＰＣＲを使用して増幅され、より好ましくは促進されたＰＣＲを使用して増幅される。この増幅は、５’ プライマーとしてユニバーサルプライマーサイトへハイブリダイズするユニバーサルプライマーを使用して、及び３’ プライマーとしてアンチセンスプライマー又はアンチセンスプライマー複合物を使用して、便利に行われる。これらのプライマーは、所望であれば、制限サイトを含み、本発明の選択的な制限開裂又はポリヌクレオチドプールのクローニングを容易化する。結果物であるポリヌクレオチドのプールは、出発ポリヌクレオチド試料と比較して低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富む。
【０１７６】
第二アンチセンスポリヌクレオチド鎖がＲＮＡ／第一鎖ｃＤＮＡハイブリッド中のｃＤＮＡ鎖である場合は、ＲＮＡシーケンスは好ましくは、例えば水酸化ナトリウムを用いた処理のような任意の好適な技術による増幅の前に除去される。それから増幅は二本鎖ｃＤＮＡ分子を生成する。
【０１７７】
ＩＶ．　ポリヌクレオチドプール
Ａ．　一般
本発明は本発明の方法を使用して製造され得るポリヌクレオチドプールを提供する。このようなプールは、複数の異なるポリヌクレオチドシーケンスを含み、通常は少なくとも約１０２ 、少なくとも約１０３ 、少なくとも約１０４ 、少なくとも約１０５ 、少なくとも約１０６ 又は少なくとも約１０７ 種の異なるポリヌクレオチドシーケンスを含む。好ましい具体例において、各ポリヌクレオチドはＲＮＡプロモーターシーケンス及びユニバーサルプライマーサイトを含む。ポリヌクレオチドは任意の形体のＤＮＡ又はＲＮＡで良く、そして一本鎖又は二本鎖である。好ましくは、ポリヌクレオチドは二本鎖又は一本鎖ｃＤＮＡ又はアンチセンスＤＮＡである。
【０１７８】
１つの具体例において、本発明は、上述の一般的な刪減ハイブリダイゼーション方法にあるように、試験及び参照ポリヌクレオチド試料間の刪減ハイブリダイゼーションにより製造される刪減ポリヌクレオチドを提供する。通常は、刪減ポリヌクレオチドプールはポリヌクレオチドクローンのライブラリーを含む。刪減ポリヌクレオチドプールは、参照ポリヌクレオチド試料中には存在せず又は参照ポリヌクレオチド試料中に試験試料よりも実質的に低い濃度で存在するポリヌクレオチドシーケンスに実質的に富む。好ましい態様において、富化（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）は約１０３ 、約１０４ 、約１０５ 、約１０６ 又は約１０７ 倍のオーダーである。刪減ポリヌクレオチドプールも、試験ポリヌクレオチド試料と比較して実質的に低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに富む。好ましくは、低存在量ポリヌクレオチドは約１０３ 、約１０４ 、約１０５ 、約１０６ 又は約１０７ 倍富む。本発明の刪減ポリヌクレオチドプールは、典型的にはベクター内にクローン化されるポリヌクレオチドのライブラリーとして生成される。
【０１７９】
本発明の選択方法から生じる選択されたポリヌクレオチドプールは、ポリヌクレオチド試料と比較して高又は低存在量ポリヌクレオチドシーケンスに実質的に富むポリヌクレオチド試料から製造される複数のポリヌクレオチドを含む。選択されたポリヌクレオチドプールは、ポリヌクレオチドクローンのライブラリー又はクローン化されないポリヌクレオチドのプールを含むことができる。好ましい態様においては、ポリヌクレオチドヌクレオチドと比較して高又は低存在量ポリヌクレオチドシーケンスは約１０３ 、約１０４ 、約１０５ 、約１０６ 又は約１０７ 倍富む。
【０１８０】
本発明のポリヌクレオチドは多彩な適用に有用である。以下の記載はプールの使用を議論するが、ポリヌクレオチドプールから個々のポリヌクレオチドが選択され、そしてプールについて記載したように必須に使用されることは、当業者には理解できるであろう。
【０１８１】
Ｂ．　ポリヌクレオチドプールの使用
１．　ヌクレオチド合成
本発明に従って製造されるポリヌクレオチドプールは、ｃＤＮＡ合成用の鋳型として使用されることができ及び／又は１種又はそれ以上の所望のシーケンスをさらに拡張するために増幅を受けることができる。増幅は、好ましくはＰＣＲにより行われ、そしてより好ましくは促進されたＰＣＲにより行われる。好ましくは適切なアンチセンスプライマー又はアンチセンスプライマー複合物及びユニバーサルプライマーを使用してプール全体が増幅されることができ、或いはプールのサブセットが増幅されることができる。興味深い個々のシーケンスは、少なくとも１種の、及び好ましくは２種の、遺伝子特異的プライマーを使用して増幅され得る。その代わりに、アンチセンスＲＮＡは上述のようにポリヌクレオチドプールから合成され得る。
【０１８２】
２．　ハイブリダイゼーション
ポリヌクレオチドプール又は（アンチセンスＲＮＡのように）それらから製造されるポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションにおいて使用できる。所望の場合は、プール又はそれらから製造されるポリヌクレオチドは、検出可能なラベルでラベルされる。広範囲のラベリング技術は当業者に公知であり、そして標準的な手順（米国特許第４，７５５，６１９号）に従い本発明のラベルされたポリヌクレオチドを生成するために使用できる。ラベリング段階は、上記反応の１つに導入でき、上記方法はラベルされたポリヌクレオチドプールを生成する。例えば、１種又はそれ以上のヌクレオチドトリホスフェートが反応混合物中に含まれることができる。好適なラベルは公知であり、例えば３２Ｓ、３２Ｐ、 ３Ｈ等のような放射性ラベル、又は蛍光ラベルのような非放射性ラベルを含む。ラベリングは直接でも間接でもよい。後者の例において、１種又はそれ以上のビオチニル化ヌクレオチドは、ビオチニル化ポリヌクレオチドを合成することに使用される（Ｓｉｖｅ　及びＳｔ．Ｊｏｈｎ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１６：１０９３７（１９８８）及びＤｕｇｕｉｄ等．，Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ８５：５７３８−５７４２（１９８８）参照）。ビオチニル化ポリヌクレオチドはラベル化アビジンと結合することにより検出され得る。
【０１８３】
３．　刪減ハイブリダイゼーションにおけるドライバー
他の適用において、本発明のポリヌクレオチドプールは、刪減ハイブリダイゼーションプロトコルにおけるドライバーとしての使用について意図するポリヌクレオチドを生成するために特に有用である。そのようなプロトコルは、典型的には大量のドライバー（通常は１０μｇ）が必要である。この要求は少量の供給にて利用可能な生物学的材料中に存在するｍＲＮＡの異なる発現を検査することを困難にする。この困難性は、刪減の前に興味深いポリヌクレオチド集合物をクローニングすることにより処理でき、クローニングベクターはハイブリダイゼーションに利用可能な量のポリヌクレオチドを増幅できる。しかし、刪減は前もってのクローニングを必要とするので、それは複雑化され、混合された分布の成長速度の差に依存して過少及び過剰のシーケンスの表示（ｕｎｄｅｒ−　ａｎｄ　ｏｖｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を被り、そして混合分布の伝播の中のシーケンス間の再結合の危険があり得る。
【０１８４】
本発明の方法は、これらの問題を、限定量のポリヌクレオチドから大量のアンチセンスＲＮＡを生成させることにより、前もってのクローニングをすることなく回避する。これらの方法はＰＣＲより優れており、それは刪減ハイブリダイゼーションにおける使用前に分離されなければならないセンス及びアンチセンス鎖の両方を製造する。上述のように生成された高又は低存在量アンチセンスＲＮＡは、検出の方法において及び異なる分布間の存在量で変化するポリヌクレオチドを単離する方法において使用でき、例えばｍＲＮＡ発現が、生理学的状態に関して異なる組織間で又は同じ組織内で比較されることを許容する。
【０１８５】
好ましい具体例において、試験又は参照ｍＲＮＡ試料から誘導される高存在量富化ポリヌクレオチドのプールから合成されるアンチセンスＲＮＡは、本発明の一般的な刪減ハイブリダイゼーション方法の第一刪減ハイブリダイゼーション反応において使用される。アンチセンスＲＮＡは、試験ｍＲＮＡにおける高存在量ポリヌクレオチドシーケンスをブロックし、低存在量富化ｍＲＮＡ鎖をヌクレオチド合成用の鋳型として働かせるためにフリーなままにする。
【０１８６】
他の好ましい具体例において、参照ｍＲＮＡ試料から誘導される低存在量富化ポリヌクレオチドのプールから合成されるアンチセンスＲＮＡは、一般的な刪減ハイブリダイゼーション方法の第二刪減ハイブリダイゼーション反応において使用される。より特定的には、低存在量富化アンチセンス参照ＲＮＡは低存在量富化センス参照ｃＤＮＡ鎖を合成するための鋳型として使用される。例４はこの適用の好ましい具体例を例証し、そこでｃＤＮＡ合成は５’ 末端に制限サイトを含むユニバーサルを使用してプライムされる。合成されるｃＤＮＡ鎖は５’ 制限サイト、ユニバーサルプライマーサイト、ポリ−Ａシーケンス及び３’ プロモーターシーケンスを有する。後者の２種のエレメントは、Ｅ．Ｃｏｌｉ　エキソヌクレアーゼ　Ｉのようなエキソヌクレアーゼを用いた部分的な消化により除去されることが好ましい。生じた低存在量富化センス参照ｃＤＮＡ鎖は、ポリ−Ｔ含有分子を用いて“非特異的に” ハイブリダイズするポリ−Ａシーケンスを欠く。これらのセンス参照ｃＤＮＡ鎖は、便利には刪減ハイブリダイゼーション反応におけるドライバーとして使用され、参照及び試験ポリヌクレオチド試料中の両方に存在する低存在量ポリヌクレオチドシーケンスをブロックし、低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖が、参照試料中に存在しないか又はより少ない量で存在するままにする。例４を参照されたい、ブロックされない低存在量富化試験ポリヌクレオチド鎖は、ヌクレオチド合成用の鋳型として働き、二本鎖ポリヌクレオチドを生成する。
【０１８７】
４．　ヌクレオチドアレイ
本発明のポリヌクレオチドプール又はそれらから生成されたポリヌクレオチドは、所望であれば１種又はそれ以上のサブストレートに付着させ、ポリヌクレオチドアレイを生成する、それはハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用できる。好ましい具体例において、ポリヌクレオチドの各型は、アレイにおける異なるターゲットエレメントを構成する。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドプールはＤＮＡマイクロアッセイを生成するために使用される。
【０１８８】
本発明のポリヌクレオチドのアレイは、ＤＮＡアレイ作成のため慣用技術に従って生成できる。例えば、正確に位置付けられ得る装置に取り付けられた試料ディスペンサーは、サブストレート上に試料をスポットするために使用できる。米国特許第５，８０７，５２２号（Ｂｒｏｗｎ及びＳｈａｌｏｎ、１９９８年９月１５日発行）は、５０−２００ミクロン又はそれ未満の距離で分けられ多数のミクロサイズ化アッセイ領域及びアレイの各領域に連結する良好に規定された量（典型的にはピコモル単位で）のアナライトにより特徴付けられるマイクロアレイの質量構成（ｍａｓｓ　ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ）を容易化する装置を記載する。
【０１８９】
ロボットのスポッティングに対する別のアプローチは、ウェル、例えば試料のアレイをサブストレート上に移すためのミクロ滴定プレートの９６ウェル内に沈められるピン又はキャピラリ−ディスペンサーのアレイを使用する。アレイは、試料とともにビーズ又は光学ファイバーのようなエレメントをコーティングし、ターゲットエレメントを形成させることにより容易化することもできる。米国特許第５，８３０，６４５号（Ｐｉｎｋｅｌ等、１９９８年１１月３日発行）はポリヌクレオチドアレイを生成するためのビーズの使用を記載し、そして米国特許第５，６９０，８９４号（Ｐｉｎｋｅｌ等、１９９７年１１月２５日発行）は、光学繊維から作成されたポリヌクレオチドアレイを開示する。
【０１９０】
５．　クローニング
上記方法により製造されるポリヌクレオチドプールは、標準的なクローニング技術を使用してベクター中にクローン化され、ポリヌクレオチドライブラリーを生成する。このようなライブラリーは、必然的に任意の細胞又は細胞分布における遺伝子発現の調査を容易化する。対象細胞は血液（例えばＴ又はＢ細胞のような白血球）又は脳、脾臓、骨、心臓、管、肺、腎臓、肝臓、下垂体、内分泌腺、リンパ節、分散原始細胞、腫瘍細胞等のような他の組織から得られる。神経調査のエリアにおいて、例えば覚醒状態、行動、医薬治療、及び改善の機能として変化するｍＲＮＡの特定は、小脳細胞核からｃＤＮＡライブラリーを構成させることの困難性により妨げられてきた。個々の脳細胞核からｃＤＮＡライブラリーを構成させるための本発明のポリヌクレオチドプールの使用は、全体の脳ｃＤＮＡライブラリーにおけるこれらの表示と比べ、これらの組織からの低存在量ｍＲＮＡのより大きな表示のために提供され、重要な低存在量メッセージのクローニングを容易化する。
【０１９１】
クローニングに使用するための好適なベクターは、抗生物質耐性遺伝子のような選択可能なマーカーを符号化するシーケンスと同様に、好適なホスト細胞（すなわち複製の起源）におけるベクターの複製を行うことができる複製シーケンスを含む。好適なホストへのベクターの導入において、ベクターは複製可能で、そしてホストゲノムから独立して機能するか又はホストゲノム内に統合する。他の事項中でのベクターのデザインは、ベクターについて意図する使用及びホスト細胞に依存し、そして特定の使用及びホスト細胞についての本発明のベクターのデザインは、当業者の水準内である。
【０１９２】
好適な具体例において、本発明のポリヌクレオチドはポリペプチドを符号化し、そして発現ベクター中にクローン化される。発現ベクターは、シーケンスを符号化する操作可能にリンクされたタンパク質の発現を行い及び／又は促進することができる１種又はそれ以上のコントロールシーケンスを含む。原核生物内での発現に適したコントロールシーケンスは、例えばプロモーターシーケンス、オペレーターシーケンス及びリボゾーム結合サイトを含む。真核生物内での発現のためのコントロールシーケンスは、プロモーター、エンハンサー、及び転写終結シーケンスを含む（すなわちポリアデニル化信号を含む）。本発明の方法において有用な発現ベクターは、例えば信号シーケンス又は増幅可能な遺伝子を符号化するシーケンスのような、他のシーケンスも含む。信号シーケンスは、タンパク質を発現させる細胞からそれらへ融合されるポリペプチドの分泌物を方向付ける。選択されたホスト細胞中における栄養要求性の欠乏を相補する遺伝子のベクター内の含有物は、ベクターを用いて変形するホスト細胞の選択を見込む。。
【０１９３】
本発明のベクターは、典型的には便利な制限サイトにおけるライゲーションにより所望のエレメントをリンクさせることにより生成される。クローニングは、本発明のポリヌクレオチドを発生させるために使用されるアンチセンスプライマー又はアンチセンスプライマー複合物及びユニバーサルプライマーサイトが制限サイトを含む場合に、単純化され得る。プライマー又はプライマー複合物及びユニバーサルプライマーサイト内の異なる制限サイトの含有物は、指向性（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ）クローニングを容易化する。好ましくは、使用される制限サイトは、オリジナル試料のポリヌクレオチド内に頻繁に発生し、本発明のポリヌクレオチドの内部切断を最少化する。好適なサイトの例はＳｆｉＩ及びＮｏｔＩにより認識されるものを含む。
【０１９４】
クローン化されたポリヌクレオチドを含むベクターは、ホスト細胞に導入できる。多種のホスト細胞がベクターの伝搬及び／又は発現に利用できる。（Ｅ．ｃｏｌｉ及びＢａｃｉｌｌｕｓの菌株、シュードモナス、並びに他のバクテリアのような）原核生物の例としては、（ヒト未発達腎臓細胞又は他の哺乳動物細胞のような）高度な真核細胞と同様に、酵母又は（Ｓ．ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅ及びＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓを含む）他の菌細胞、昆虫細胞及び植物細胞も含む。本発明のホスト細胞は、倍地中の細胞及び（遺伝子導入植物又は動物のような）生きている有機体中に存在する細胞を含む。
【０１９５】
ベクターは任意の便利な方法によりホスト細胞中に導入され、それは使用されるベクター−ホストシステムに依存して変化する。通常は、ベクターは形質転換（トランスフェクションとして公知である）又はベクターを産するウイルス（例えばファージ）を用いた感染により細胞中へ導入される。ホスト細胞が原核生物（又は細胞壁を有する他の細胞）ならば、便利な形質転換方法は、Ｃｏｈｅｎ等による（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９：２１１０−１４に記載されるカルシウム処理法を含む。原核生物がホストとして使用され及びベクターがファージミドベクターである場合は、ベクターは感染によりホスト細胞中に導入され得る。酵母細胞は、例えばＨｉｎｎｅｎ（１９７８）によるＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，７５：１９２９−３３に教示されるように、ポリエチレングリコールを用いて形質転換される。哺乳動物細胞は、便利には、Ｇｒａｈａｍ等（１９７８）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：５４６及びＧｏｒｍａｎ等（１９９０）ＤＮＡ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｔｅｃｈ．，２：３−１０に記載されるカルシウムホスフェート沈殿方法を使用して形質転換される。しかし、核注入、エレクトロポレ−ション及びプロトプラスト融合のような、ホスト細胞中にＤＮＡを導入するための他の公知の方法も本発明での使用のために許容される。
【０１９６】
６．　符号化されたポリぺプチドの発現
発現ベクターを用いて形質転換されるホスト細胞は、本発明のクローン化ポリヌクレオチドにより符号化されるポリぺプチドを発現させるために使用できる。発現は、細胞成長及び発現並びに細胞溶解物からの発現ポリペプチドの回収、或いはポリペプチドが分泌される場合は培地から回収するに適した条件下でホスト細胞を培養することが必要である。特に、培地は使用される細胞のための適切な栄養分と成長因子を含む。多くの場合、栄養分と成長因子は公知であり、特に当業者により直ちに決定し得る。哺乳動物ホスト細胞用に好適な培養条件は、例えばＭａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｍａｔｈｅｒ　ｅｄ．，　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ　１９８４）及びＢａｒｎｅｓ　ａｎｄ　Ｓａｔｏ（１９８０）Ｃｅｌｌ　２２：６４９に記載される。
【０１９７】
さらに、培養条件は転写、翻訳及び細胞区画間のタンパク質輸送を許容しなければならない。これらのプロセスに影響を与える因子は公知であり、そして例えばＤＮＡ／ＲＮＡ複製数；ＤＮＡを安定化する因子；培地中に存在する栄養分、供給物及び転写促進剤又は抑制剤；培養温度、ｐＨ及びオスモル濃度（ｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ）；及び細胞密度を含む。特定のベクター−ホスト細胞システムにおける発現を促進するためのこれらの因子の調節は、当業者の水準内である。インビトロでの哺乳動物細胞培養の生産性を最大化するための原理及び実際の技術は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｂｕｔｌｅｒ　ｅｄ．，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ（１９９１））中に見出すことができる。
【０１９８】
大規模又は小規模なタンパク質製造用の任意の数の公知技術が、本発明のポリペプチドを発現させることに使用できる。これらは、限定するものではないが、振盪フラスコ、流動床バイオリアクター、ローラーボトル培養システム、及び攪拌タンクバイオリアクターシステムの使用を含む。細胞培養はバッチ、供給バッチ又は連続様式で行うことができる。
【０１９９】
上述のように生成する組換えタンパク質の回収方法は公知であり、そして使用される発現システムに依存して変化する。信号シーケンスを含むポリペプチドは、培地又は原形質から回収できる。ポリペプチドは細胞内で発現され、そして細胞溶解物にから回収できる。
【０２００】
発現されたポリペプチドは、培地又は細胞溶解物から、ホスト細胞又は培地の１種以上の成分からポリペプチドを分離できる任意の方法により精製できる。典型的には、ポリペプチドはポリペプチドの意図する使用を妨げるホスト細胞及び／又は培地成分から分離される。第一段階として、培地又は細胞溶解物は遠心分離又は濾過され、細胞残骸を除去する。上澄みは、典型的には所望の体積まで濃縮又は希釈され或いは好適な緩衝液中へダイア濾過（ｄｉａｆｉｌｔｅｒ）し、さらなる精製用の調製を必要とする。
【０２０１】
それからポリペプチドは公知の技術を使用してさらに精製できる。選択される技術は、発現されるポリペプチドの特性に依存して変わる。例えば、ポリペプチドが親和領域を含む融合タンパク質として発現される場合は、精製は典型的には、同属の結合パートナーを含む親和カラムの使用を含む。例えば、ヘキサヒスチジン又は類似の金属親和標識と融合したポリペプチドは、固定金属親和カラム上での分画より精製できる。
【０２０２】
７．　他の調査及び治療学的使用
本発明のポリヌクレオチドプールも、調査及び治療の両方において広範囲の使用を有する。アンチセンスＲＮＡは、例えば種々の原核生物システムにおいて、遺伝子発現を調節するために機能する。同様に、アンチセンスＲＮＡは、多くの原核生物遺伝子の発現を調節できる。これは、機能を特定することを意図する研究において、所望でない遺伝子の発現又は非公知の遺伝子の発現をブロックすることを可能にする。
【０２０３】
本発明のポリヌクレオチドの調査及び治療学的使用は、例えば後に続く細胞又は対象物への導入を用いて、ポリヌクレオチドのインビトロの生成を含むことができる（一般的には、Ｍｅｌｔｏｎ、Ａｎｔｉｓｅｎｃｅ　ＲＮＡ　ａｎｄ　ＤＮＡ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ（１９８８）を参照されたい）。ポリヌクレオチドは二本鎖又は一本鎖であることができ、そして一本鎖ポリヌクレオチドはセンス又はアンチセンスであることができる。ポリヌクレオチドのフラグメントも使用できる。転写を抑制しかつそれにより遺伝子発現をブロックするためのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの使用は公知であり、そして当業者は直ちに本発明のポリヌクレオチドに基づきアンチセンスオリゴヌクレオチドをデザインできる。例えば、Ｒｅｅｄｅｒ等　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５８：３７１９−２６（１９９８）を参照されたい。さらに、一本鎖センス又は二本鎖ポリヌクレオチドはＲＮＡ干渉による遺伝子発現を防ぐことに使用することができ、それはターゲット化ｍＲＮＡ分解（共抑制（ｃｏ−ｓｕｐｒｅｓｓｉｏｎ）又はクエリング（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）とも呼ばれる）を必要とする。Ｆｉｒｅ等．，Ｎａｔｕｒｅ　３９１：８０６−８１１（１９９８）；Ｓｈａｒｐ　ａｎｄ　Ｚａｍｏｒｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８７：２４３１（２０００）；　及びＭａｒｘ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８８：１３７０（２０００）を参照されたい。
【０２０４】
調査及び治療学的適用のために、ポリヌクレオチドは典型的には生理学的に許容できるキャリア、賦形剤及び／又は安定化剤、及び／又は細胞内へのポリヌクレオチドの導入を容易化する成分と組み合わされる。生理学的に許容できるキャリア、賦形剤及び安定化剤は、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８０）１６版　Ｏｓｏｌ　ｅｄ．，（１９８０）に記載される。本発明における使用のために生理学的に許容できるキャリア、賦形剤及び安定化剤は、使用される用量において細胞又は対象物に対して無毒であり、そしてそれは（ホスフェートバッファー、クエン酸塩バッファー、又は他の有機酸から作られるバッファーのような）バッファー、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸）、低分子量（約１０個未満の残基の）ポリペプチド、（血清アルブミン、ゼラチン及び免疫グロブリンのような）タンパク質、（ポリビニルピロリドンのような）タンパク質、親水性ポリマー、（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン及びリジンのような）アミノ酸、単糖、二糖、及び他の炭水化物（グルコース、マノース及びデキストリンを含む）、キレート試薬（例えばエチレンジアミン四酢酸［ＥＤＴＡ］）、（マニトール及びソルビトールのような）糖アルコール、塩形成対イオン（例えばナトリウム）、及び／又は（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）及びＰＥＧのような）アニオン性界面活性剤を含むことができる。１つの具体例において、生理学的に許容できるキャリアは、水性ｐＨ−緩衝化（ｐＨ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ）溶液である。
【０２０５】
ポリヌクレオチドの細胞間デリバリーを容易化する成分は公知であり、そして例えば脂質、リポソーム、水−油エマルジョン、ポリエチレンイミン及びデンドリマーを含み、それらのうち任意のものが本発明の組成物において使用できる。脂質はこの型の最も広く使用される成分中であり、そして入手可能な脂質又は脂質配合物のうち任意のものが、本発明のポリヌクレオチドとともに使用できる。典型的にはカチオン性脂質が好ましい。好ましいカチオン性脂質は、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイロキシ）プロピル］−ｎ，ｎ，ｎ，−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、ジオレイルホスフォチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及び／又はジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）を含む。
【０２０６】
他の具体例において、リポソームエントラップされた（ｌｏｐｏｓｏｍａｌｌｙ　ｅｎｔｒａｐｐｅｄ）ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドを細胞に運ぶことに使用できる。リポソームは種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤より構成される。これらの成分は、典型的には生物学的な膜の脂質配列に類似する二層配合物中に配列される。ポリヌクレオチドを含むリポソームは、例えばＥｐｓｔｅｉｎ等のＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８２：３６８８−９２（１９８５）及びＨｗａｎｇ等のＰＮＡＳ　ＵＳＡ　７７：４０３０−３４（１９８０）に記載されるような公知の方法により製造される。通常は、このような製造におけるリポソームは、小さい（約２００−８００Å）一層タイプであり、脂質含有率は約３０モル％コレステロール以上であり、最適な治療を提供するために特定の割合に調節される。有用なリポソームは、例えばホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を使用して逆相蒸発方法により発生できる。所望であれば、リポソームは特定の径のリポソームを産するために規定された孔径の濾紙を通して押し出される。
【０２０７】
ポリヌクレオチドはデンドリマーへ複合されることができ、それは細胞をトランスフェクトすることに使用できる。デンドリマーポリカチオンは３次元で、典型的にはコア分子又は明確な開始剤上において、オリゴマー又はポリマーを加える反復反応シーケンスにより形成される高度に整列したオリゴマー又はポリマー化合物であり、そしてそれは正に帯電した外表面を提供する。好適なデンドリマーは、限定するものではないが、“スターバースト” デンドリマー及び種々のデンドリマーポリカチオンを含む。
【０２０８】
デンドリマーポリカチオンは、好ましくは本発明のポリヌクレオチドと非共有結合する。これは、一旦細胞内に運ばれた場合に容易な分解及び解離を許容する。本明細書中で好適に使用される典型的なデンドリマーポリカチオンは、約２，０００〜１，０００，０００Ｄａ、より好ましくは約５，０００〜５００，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。しかし他の分子量も使用できる。好適なデンドリマーポリカチオンは約１１〜６０Å、及びより好ましくは約１５〜５５Åの流体力学的半径を有する。しかし、本発明における使用では他のサイズも好適である。ポリヌクレオチドを細胞内にインビボで誘導するためのデンドリマーの製造方法及び使用方法は当業者に公知であり、ＰＣＴ／ＵＳ８３／０２０５２、及び米国特許第４，５０７，４６６号；第４，５５８，１２０号；第４，５６８，７３７号；第４，５８７，３２９号；第４，６３１，３３７号；第４，６９４，０６４号；第４，７１３，９７５号；第４，７３７，５５０号；第４，８７１，７７９号；第４，８５７，５９９号；及び第５，６６１，０２５号に詳細に記載される。
【０２０９】
予防又は治療の使用のために、本発明のポリヌクレオチドは特定の適応に適する様式で配合される。Ｂｅｎｎｅｔｔ等の米国特許第６，００１，６５１は、オリゴヌクレオチドを用いた使用に適する多数の医薬組成物及び配合物を、そのようなオリゴヌクレオチドを投与する方法と同様に、記載する。好ましい具体例において、本発明の予防又は治療組成物は、上述のように脂質と結合したポリヌクレオチドを含む。
【０２１０】
本発明の組成物は、例えば水溶液又は凍結乾燥ケーキを含む任意の標準的な形態で保存できる。このような組成物は、細胞や受容者に投与される場合には、典型的には無菌である。水溶液の無菌化は、無菌化濾過膜を通す濾過により直ちに達成できる。組成物が凍結乾燥形態で保存される場合は、組成物は凍結乾燥及び再構成の前又は後で濾過できる。
【０２１１】
数種の適用において、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドを安定化させ、そして特定の適用のためにそれらをよりよく適用するため修飾されたポリヌクレオチドを製造することが有利である。このため、本発明のポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキル又はシクロアルキル糖間結合又は短鎖ヘテロ原子又複素環式糖間結合（ｉｎｔｅｒｓｕｇａｒ　ｌｉｎｋａｇｅ）（“バックボーン” ）を含む。最も好ましいものはホスホロチオエート及びＣＨ２ ―ＮＨ―Ｏ―ＣＨ２ 、ＣＨ２ ―Ｎ（ＣＨ３ ）―Ｏ―ＣＨ２ （メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩバックボーンとして公知）、ＣＨ２ ―Ｏ―Ｎ（ＣＨ３ ）―ＣＨ２ 、ＣＨ２ ―Ｎ（ＣＨ３ ）―Ｎ（ＣＨ３ ）―ＣＨ２ 及び、Ｏ―Ｎ（ＣＨ３ ）―ＣＨ２ ―ＣＨバックボーン（ここでホスホジエステルはＯ―Ｐ―Ｏ―ＣＨ２ ）を有するものである。生態学的バックボーン構造を有するポリヌクレオチドも好ましい。Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．Ｅ．及びＷｅｌｌｅｒ，Ｄ．Ｄ．，　米国特許第５，０３４，５０６号。他の好ましい具体例は、タンパク質−核酸又はペプチド−核酸（ＰＮＡ）バックボーンを使用し、ポリヌクレオチドのホスホジエステルバックボーンはポリアミドバックボーンを用いて置きかえられ、塩基はポリアミドバックボーンのアザ窒素原子へ直接的に又は間接的に結合する。Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，　Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ，　Ｒ．Ｈ．Ｂｅｒｇ，　Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９９１、２５４，１４９７。本発明のポリヌクレオチドは、アルキル又はハロゲン置換糖部位を有し、及び／又はペントフラノシル基に替わってシクロブチルのような糖類似物を有することができる。他の好適な具体例において、ポリヌクレオチドは、少なくとも１種の修飾された塩基形態又はイノシンのような“ユニバーサル塩基” を含み得る。所望であれば、ポリヌクレオチドはＲＮＡ開裂基、コレステリル基、レポーター基、インターカレーター（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）、ポリヌクレオチドの薬物動力学特性を改良する基、及び／又はポリヌクレオチドの薬力学特性を改良する基を含むことができる。
【０２１２】
Ｖ．　キット
本発明の方法における使用のための材料は、理想的には公知の手順に従って製造されるキットの製造に適する。１つの具体例において、本発明のキットは：（１）ＲＮＡプロモーターシーケンスにリンクするアンチセンスプライマーを含むアンチセンスプライマー複合物であって、ＲＮＡプロモーターシーケンスがアンチセンスプライマーの５’ である該複合物；（２）センスプライマー；及び（３）本発明の方法を行うための指示、を含む。指示材料は記載又は印刷された材料であるが、それらに限定されるものではない。それらの指示を保存しかつ末端ユーザーへ伝達できる任意の媒体が本発明により企図される。このような媒体は、限定されるものではないが、電気記録媒体（例えば磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えばＣＤ−ＲＯＭ）等を含む。このような媒体は、このような指示材料を提供するインターネットサイトへのアドレスを含み得る。好ましいキットは、本発明において利用される種々の試薬の１種又はそれ以上を（典型的には濃縮形態で）含み、それは例えば１種又はそれ以上のバッファー、適切なヌクレオチドトリホスフェート（例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ；又はｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ及びＵＴＰ）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮＡポリメラーゼを含む。
【０２１３】
他の具体例において、本発明のキットは：（１）本発明のポリヌクレオチドプール、（２）上述のようなアンチセンスプライマー複合物及び（３）センスプライマー、を含む。このキットは、選択されたポリヌクレオチドプールから増幅されたＤＮＡを製造するために有用である。好適なキットは１種又はそれ以上のコンテナを含み、それぞれがＤＮＡ増幅用の試薬、例えばバッファー、ヌクレオチドトリホスフェート及び／又はＤＮＡポリメラーゼ、の１種又はそれ以上を含む。
【０２１４】
さらに別の具体例において、キットは：（１）本発明のポリヌクレオチドプール、及び（２）選択されたポリヌクレオチドプールからアンチセンスＲＮＡを転写することができるＲＮＡポリメラーゼ、を含む。好適なキットは１種又はそれ以上のコンテナを含み、それぞれがアンチセンスＲＮＡ生成用の試薬、例えばバッファー及び／又はヌクレオチドトリホスフェートの１種又はそれ以上を含む。
【０２１５】
本明細書中に引用された全ての刊行物は、参考として明確に引用される。
【０２１６】
例
例証のために以下の例を表す、しかし特許請求の範囲の発明に限定されるものではない。
【０２１７】
例１
ヒト胎盤ｍＲＮＡからの低存在量シーケンスに富むｃＤＮＡの生成
Ａ．　第一鎖ｃＤＮＡ及びＰＣＲ
１．　鋳型交換により加えられるユニバーサルＰＣＲアンカー
Ｔ７プロモーターシーケンスにリンクするランダムプライマー（ランダム−Ｔ７プライマー）を使用して、第一鎖ｃＤＮＡをヒト胎盤ポリＡ＋ＲＮＡから合成した：５’ −ＡＡＴ−ＴＣＴ−ＡＡＴ−ＡＣＧ−ＡＣＴ−ＣＡＣ−ＴＡＴ−ＡＧＧ−ＧＮＮ−ＮＮ−ＮＮ−３’ （Ｎ＝Ａ，Ｔ，Ｃ又はＧ；シーケンスＩＤ　ＮＯ：２）。短く言えば、１μｌのヒト胎盤ポリＡ＋ＲＮＡ（１μｇ）、１μｌのランダム−Ｔ７プライマー（２０μＭ）、１μｌのＰＣＲアンカーオリゴ（鋳型交換オリゴとも呼ばれる：
【表１】
2004512027.tif 000003
（太字で示される３’“ＧＧＧ” はリボヌクレオチドである；シーケンスＩＤ　ＮＯ：３）、及び２μｌの脱イオン化Ｈ２ Ｏを含む５μｌのｃＤＮＡ合成混合物であった。該混合物を７２℃で２分間及びそれから３７℃で２分間インキュベートした。それから体積を以下の試薬を用いて１０μｌに調節した：２μｌの５Ｘ第一鎖合成バッファー（２５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３；３０ｍＭのＭｇＣｌ２ ；及び３７５ｍＭのＫＣｌ）、０．５μｌのジチオトレイトール（ＤＴＴ；５０ｍＭ）、１μｌのｄＮＴＰ混合物（１０ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、０．５μｌのＲｎａｓｉｎ（２０単位、プロメガ）、１μｌ（２００単位）のＭＭＬＶ逆転写酵素（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（登録商標）、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。逆転写を４２℃にて９０分間行った。反応は氷上にチューブを静置することにより終了させた。
【０２１８】
第一鎖ｃＤＮＡを約１ｐｇ／μｌ（約１×１０−６）まで希釈し、希有の転写物を除去し、続けてＰＣＲを、４０ｍＭ　Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ、ｐＨ９．２；１５ｍＭ　ＫＯＡｃ；３．５ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）２；及び０．２μＭの５’ −アンカープライマー（５’ −ＴＧＣ−ＴＧＣ−ＧＡＧ−ＡＡＧ−ＡＣＧ−ＡＣＡ−ＧＡＡ−３’ ）；０．２μＭのランダム−Ｔ７プライマー；０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ；及び２μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ｃＤＮＡポリメラーゼ混合物（５０Ｘ；ＫｌｅｎＴａｑ−１及びＤｅｅｐ　Ｖｅｎｔポリメラーゼ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈを含む）を含む１００μｌ反応中で行った。ＰＣＲを以下の循環条件を使用して、ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　４８０（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で行った：９５℃で１分間；９５℃で１５秒間、３０−３５サイクル；６２℃で３０秒；及び７２℃で６分間。
【０２１９】
ＰＣＲ後、二本鎖ｃＤＮＡをＳ−２００スピンカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を通すことにより精製した。アンチセンスＲＮＡドライバー合成の前に、二本鎖ｃＤＮＡを、グルコース３−ホスフェート脱水素酵素（Ｇ３ＰＤＨ）及びｃ−ｍｙｃ遺伝子の増幅について試験した。ＰＣＲ増幅の２５サイクル後、Ｇ３ＰＤＨをエチジウムブロマイドを用いて染色された１．１％アガロースゲル上の濃い色のバンドとして視覚化した。ｃ−ｍｙｃは増幅の３５サイクル後でさえ、エチジウムブロマイド染色ゲル上で視覚化されなかった。
【０２２０】
２．　ホモポリマー配列化により加えられるユニバーサルＰＣＲアンカー
第一鎖ｃＤＮＡを、方法１のランダム−Ｔ７プライマーを使用してヒト胎盤ポリＡ＋ＲＮＡ上で合成した。短く言えば、１μｌのヒト胎盤ポリＡ＋ＲＮＡ（１μｇ）、１μｌのランダム−Ｔ７プライマー（２０μＭ）、及び３μｌの脱イオン化Ｈ２ Ｏを含む５μｌのｃＤＮＡ合成混合物を、７２℃で２分間及びそれから３７℃で２分間インキュベートした。体積を以下の試薬を用いて１０μｌに調節した：２μｌの５Ｘ第一鎖合成バッファー（２５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３；３０ｍＭのＭｇＣｌ２ ；及び３７５ｍＭのＫＣｌ）、０．５μｌのＤＴＴ（５０ｍＭ）、１μｌのｄＮＴＰ混合物（１０ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、０．５μｌのＲｎａｓｉｎ（２０単位、プロメガ）、１μｌ（２００単位）のＭＭＬＶ逆転写酵素（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（登録商標）、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。逆転写を４２℃にて９０分間行った。反応を氷上にチューブを静置することにより終了させた。
【０２２１】
ホモポリマー配列化は以下の改変を伴って、先に報告されたように（Ｄ．Ｊ．Ｂｅｒｔｉｏｌｉ等．，　ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９４）行った。２０μｌの脱イオン化Ｈ２ Ｏを第一鎖ｃＤＮＡ混合物へ添加した。希釈した第一鎖混合物を、ＣＨＲＯＭＡ　ＳＰＩＮ−１００カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して精製し、小さなｃＤＮＡフラグメント同様にプライマー及びｄＮＴＰを除去した。オリゴ−ｄＣ配列化を以下を混合することにより行った：３０μｌの精製第一鎖ｃＤＮＡ；１μｌの５Ｘ配列化バッファー（０．５Ｍカリウムカコジレート、ｐＨ７．２、１０ｍＭ　ＣｏＣｌ２ 、１ｍＭ　ＤＴＴ）、１μｌの１ｍＭ　ｄＣＴＰ、１μｌの末端トランスフェラーゼ（１５単位／μｌ；Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ）、８μｌの脱イオン化Ｈ２ Ｏ（最終体積は５０μｌ）。反応混合物を３７℃で１時間インキュベートし、続けてフェノール／クロロホルム抽出及び析出を行った。
【０２２２】
オリゴ−ｄＣ−配列化ｃＤＮＡを約１０ｐｇ／μｌ（約１×１０−５）まで希釈し、希有な転写物を除去し、続けてＰＣＲを、４０ｍＭ　Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ、ｐＨ９．２；１５ｍＭ　ＫＯＡｃ；３．５ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）２；及び０．２μＭの５’ −ｄＧ１２プライマー（５’ −ｄ（Ｇ）１２ −ＶＮ−３’ 、Ｎ＝Ａ、Ｇ，Ｃ又はＴ；Ｖ＝Ａ、Ｇ又はＣ）；０．２μＭのランダム−Ｔ７プライマー；０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ；２μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ｃＤＮＡポリメラーゼ混合物（５０Ｘ；ＫｌｅｎＴａｑ−１及びＤｅｅｐ　Ｖｅｎｔポリメラーゼ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含む１００μｌ反応中で行った。ＰＣＲを以下の循環条件を使用して、ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　４８０（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で行った：９５℃で１分間；９５℃で１５秒間　３０−３５サイクル；５２℃で３０秒；及び７２℃で６分間。
【０２２３】
ＰＣＲ後、二本鎖ｃＤＮＡをＳ−２００スピンカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を通すことにより精製した。アンチセンスＲＮＡドライバー合成の前に、二本鎖ｃＤＮＡを（Ｇ３ＰＤＨ）及びｃ−ｍｙｃ遺伝子の増幅について試験した。ＰＣＲ増幅の２５サイクル後、Ｇ３ＰＤＨをエチジウムブロマイドを用いて染色された１．１％アガロースゲル上の濃い色のバンドとして視覚化した。ｃ−ｍｙｃは増幅の３５サイクル後でさえ、エチジウムブロマイド染色ゲル上で視覚化できなかった。
【０２２４】
Ｂ．　アンチセンスＲＮＡ合成
アンチセンスＲＮＡを以下を混合することにより合成した：上記二本鎖ｃＤＮＡ（１μｇ）；５ＸＲＮＡ翻訳バッファー（２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５；６０ｍＭのＭｇＣｌ２ ；及び３５０ｍＭのＫＣｌ；２５ｍＭのＤＴＴ；２．５ｍＭのＩＴＰ；７．５ｍＭのＧＴＰ；１０ｍＭのＡＴＰ；１０ｍＭのＵＴＰ；１０ｍＭのＣＴＰ）そして、それから４０単位のＲＮａｓｉｎ（プロメガ）及び８０単位のＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を加えた。Ｈ２ Ｏを体積５０μｌの最終反応物に加えた。混合物を、４１℃で９０分間インキュベートした。それから１０単位のＤＮａｓｅ　Ｉ（ＲＮａｓｅフリー；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を加えた。この反応物を３７℃で１５分間インキュベートし、続けてフェノール／クロロホルム抽出及び析出を行った。
【０２２５】
Ｃ．　刪減ハイブリダイゼーション
刪減ハイブリダイゼーションを（高存在量シーケンスに富む）ヒト胎盤アンチセンスＲＮＡをドライバーとして使用して、並びに正常なヒト胎盤ｍＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡと同起源）を“テスター”として使用して行った、第１表に、各混合物中のアンチセンスＲＮＡと胎盤ｍＲＮＡの種々の量を列挙する。
【０２２６】
2004512027.tif 000004
混合後、チューブをＰＥ９６００　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ中で６８℃で２０分インキュベートした。それから温度を１６ｈインキュベーション中に４５℃まで上昇させた。
【０２２７】
Ｄ．　ｃＤＮＡ合成
（上記）試料Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを、オリゴｄ（Ｔ）３０ プライマー（５’ −ｄ（Ｔ）３０ −ＶＮ−３’ 、Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴ；Ｖ＝Ａ、Ｇ又はＣ）を第一鎖ｃＤＮＡ合成用の鋳型として使用した。短く言えば、２μｌの１０ｍＭ　オリゴｄ（Ｔ）３０ を、各試料に加え、続けて７２℃で２分間インキュベートした。それから反応混合物を即座に氷浴に２分間移した。体積を以下の試薬を用いて１０μｌに調節した：２μｌの５Ｘ第一鎖合成バッファー（２５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３；３０ｍＭのＭｇＣｌ２ ；及び３７５ｍＭのＫＣｌ）、０．５μｌのＤＴＴ（５０ｍＭ）、１μｌのｄＮＴＰ混合物（１０ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、０．５μｌのＲｎａｓｉｎ（２０単位、プロメガ）、１μｌ（２００単位）のＭＭＬＶ逆転写酵素（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（登録商標）、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。逆転写を４２℃にて９０分間行った。反応を、氷上にチューブを静置することにより終了させた。
【０２２８】
Ｅ．　オリゴ−ｄＧ配列化
第一鎖合成後、ＲＮＡを１００ｍＭ　１μｌのＮａＯＨを各第一鎖合成混合物に加え及び６８℃で３０分間インキュベートすることにより分解した。それから１９μｌの脱イオン化Ｈ２ Ｏを各第一鎖混合物へ加え、そしてＤＮＡをＣｈｒｏｍａ　Ｓｐｉｎ　１００（登録商標）カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して精製した。オリゴ−ｄＧ配列化を以下のものを混合することにより行った：３０μｌの精製第一鎖ｃＤＮＡ；１μｌの５Ｘ配列化バッファー（０．５Ｍカリウムカコジレート、ｐＨ７．２、１０ｍＭ　ＣｏＣｌ２ 、１ｍＭ　ＤＴＴ）、１μｌの１ｍＭ　ｄＧＴＰ、１μｌの末端トランスフェラーゼ（１５単位／μｌ；Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ）、８μｌの脱イオン化Ｈ２ Ｏ（最終体積は５０μｌ）。反応混合物を３７℃で１時間インキュベートし、続けてフェノール／クロロホルム抽出及び析出を行った。
【０２２９】
Ｆ．　低サイクルＰＣＲによる二本鎖ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ生成物の分析
１．　０．９ｋｂ胎盤転写物：
試料Ａ−Ｄにおける低存在量シーケンスの刪減を、０．９ｋｂ胎盤“ハウスキーピング” 転写物に相当するｃＤＮＡのレベルを検査することにより行った。低サイクルＰＣＲ増幅を、先の段階で得られたペレットを、４０ｍＭ　Ｔｒｉｃｉｎｃ−ＫＯＨ、ｐＨ９．２；１５ｍＭ　ＫＯＡｃ；３．５ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）２；及び０．２μＭの５’ −ｄＣ１２プライマー（５’ −ｄ（Ｃ）１２ −ＶＮ−３’ 、Ｎ＝Ａ、Ｇ，Ｃ又はＴ；Ｖ＝Ａ、Ｇ又はＣ）；０．２μＭのオリゴｄ（Ｔ）３０ プライマー；０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ；２μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ｃＤＮＡポリメラーゼ混合物（５０Ｘ；ＫｌｅｎＴａｑ−１及びＤｅｅｐ　Ｖｅｎｔポリメラーゼ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈを含む）を含む１００μｌ反応物中に溶解させることにより行った。ＰＣＲを以下の循環条件を使用して、ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　４８０（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で行った：９５℃で１分間；９５℃で１５秒間　８サイクル；５２℃で３０秒；及び７２℃で６分間。
【０２３０】
試料Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤからのＰＣＲ生成物を、２００ｎｇ　１ｋｂ　ＤＮＡラダー（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともに、１．１％アガロースゲル（５μｌ／ウェル）上に充填した。エチジウムブロマイドを用いた染色は、胎盤ｍＲＮＡに対するアンチセンスｍＲＮＡドライバーの比とともにバンディングプロファイル（ｂａｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｆｉｌｅ）が変化したことを表した。特に、ヒト胎盤ハウスキーピング遺伝子に相当する０．９ｋｂにおけるバンドの強度は、アンチセンスＲＮＡ／ｍＲＮＡの比の増加とともに減少し、試料Ｄにおいてはほとんど検出できなかった、それはアンチセンスＲＮＡドライバーが高存在量ＲＮＡシーケンスに対してハイブリダイズし、そしてそれらを刪減することを示す。
【０２３１】
２．　グルコース３−ホスフェート脱水素酵素（Ｇ３ＰＨＤ）：
試料Ａ−Ｄ中の高存在量シーケンスの刪減も、ハウスキーピング遺伝子Ｇ３ＰＨＤに相当するｃＤＮＡのレベルを検査することにより行った。試料Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを、４０ｍＭ　Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ、ｐＨ９．２；１５ｍＭ　ＫＯＡｃ；３．５ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）２；及び０．２μＭの５’ 及び３’ Ｇ３ＰＨＤ　Ａｍｐｌｉｍｅｒセット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ；２μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ｃＤＮＡポリメラーゼ混合物（５０Ｘ；ＫｌｅｎＴａｑ−１及びＤｅｅｐ　Ｖｅｎｔポリメラーゼ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈを含む）を含む５０μｌの反応混合物中でＰＣＲ増幅した。ＰＣＲを以下の循環条件を使用して、ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　４８０（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で行った：９５℃で１分間；９５℃で１５秒間　２５サイクル；６８℃で２分間。
【０２３２】
試料Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤからのＰＣＲ生成物を、２００ｎｇ　１ｋｂ　ＤＮＡラダー（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともに、１．１％アガロースゲル（５μｌ／ウェル）上に充填した。エチジウムブロマイドを用いた染色は、ハウスキーピング遺伝子Ｇ３ＰＨＤに相当するバンドの濃い色がアンチセンスＲＮＡ／ｍＲＮＡの比の増加とともに減少し、試料Ｄにおいてはほとんど検出できず、それはアンチセンスＲＮＡが高存在量ｍＲＮＡシーケンスを刪減することが確認される。
【０２３３】
３．　ｃ−ｍｙｃ：
ｃ−ｍｙｃ遺伝子をマーカーとして使用し、試料Ａ−Ｄにおける低存在量シーケンスの富化をアッセイした。各試料をＧ３ＰＨＤの研究で記載したようにＰＣＲ増幅したが、５’ 及び３’ ｃ−ｍｙｃ　Ａｍｐｌｉｍｅｒセット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をプライマーとして使用し、そして以下の循環条件を使用してＰＣＲを行った：９５℃で１分間；９５℃で１５秒間　３０サイクル；６８℃で２分間。
【０２３４】
試料Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤからのＰＣＲ生成物を、２００ｎｇ　１ｋｂ　ＤＮＡラダー（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともに、１．１％アガロースゲル（５μｌ／ウェル）上に充填した。エチジウムブロマイドを用いた染色は、ｃ−ｍｙｃ表示の濃い色がアンチセンスＲＮＡ／ｍＲＮＡの比の増加とともに減少することを表した。この結果はｃ−ｍｙｃが正常なヒト胎盤ＲＮＡ中に存在するが、アンチセンスＲＮＡドライバー中には存在しないことを示す、そして刪減ハイブリダイゼーション、後に続く増幅はｃ−ｍｙｃのような低存在量シーケンスに富むポリヌクレオチドプールを生成する。
【０２３５】
例２
種々の組織から製造されるｍＲＮＡからの低存在量シーケンスに富むｃＤＮＡの製造
本発明の方法の再現性を試験するために、アンチセンスＲＮＡドライバーを、ヒト脳、胎児脳、肝臓及び腎臓ｍＲＮＡから、例１に記載されるように生成させた。各組織からのｍＲＮＡ試料は、同じ組織（Ａ群）から製造されるアンチセンスＲＮＡドライバーを用いた刪減ハイブリダイゼーションを受けた。ネガティブコントロール（すなわちアンチセンスＲＮＡで処理されない）が各試料（Ｂ群）について含まれた。刪減後、低サイクルＰＣＲを行い、ハイブリダイズしていないｍＲＮＡシーケンスに相当する二本鎖ｃＤＮＡが発生させた。
【０２３６】
Ｐ５０遺伝子をマーカーとして使用し、低存在量シーケンスの富化をアッセイした。各試料を４０ｍＭ　Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ、ｐＨ９．２；１５ｍＭ　ＫＯＡｃ；３．５ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）２；及び０．２μＭの５’ 及び３’ Ｐ５０　Ａｍｐｌｉｍｅｒセット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ；２μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ｃＤＮＡポリメラーゼ混合物（５０Ｘ；ＫｌｅｎＴａｑ−１及びＤｅｅｐ　Ｖｅｎｔポリメラーゼ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈを含む）を含む５０μｌの反応物中で増幅した。ＰＣＲを以下の循環条件を使用して、ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　４８０（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で行った：９５℃で１分間；９５℃で１５秒間　３０サイクル；６８℃で２分間。
【０２３７】
ＰＣＲ生成物の分析を、１．１％アガロースゲル（５μｌ／ウェル）上における電気泳動により行い、続けてエチジウムブロマイドを用いた染色によりＡ群試料（低存在量シーケンスに富む）がＰ５０シーケンスを含むことを表したが、Ｂ群試料（ネガティブコントロール）は検出可能なＰ５０シーケンスを示さなかった。結果は本発明の方法が組織の型にかかわらず選択されたポリヌクレオチドプールを製造するために効果的であることを示す。
【０２３８】
例３
ヒト睾丸ｍＲＮＡから製造される変化する長さの低存在量シーケンスに富むｃＤＮＡの生成
変化する長さの低存在量シーケンスの富化について試験するために、アンチセンスＲＮＡドライバーをヒト睾丸ｍＲＮＡから例１に記載されるように生成させた。ヒト睾丸ｍＲＮＡ試料は、アンチセンスＲＮＡドライバーを用いた刪減ハイブリダイゼーションを受け（Ａ群試料を発生させ）た。ネガティブコントロール（すなわちアンチセンスＲＮＡで処理されない）を含んだ（Ｂ群試料を発生させた）。刪減後、低サイクルＰＣＲを行い、ハイブリダイズしていないｍＲＮＡシーケンスに相当する二本鎖ｃＤＮＡを生成した。
【０２３９】
インターロイキン−６（ＩＬ６、０．６ｋｂ　ＯＲＦフラグメント）、Ｐ５０（２．８ｋｂ　ＯＲＦ）及びインスリン成長因子レセプター（ＩＧＦＲ；４．８ｋｂ　ＯＲＦフラグメント）をマーカーとして使用し、低存在量遺伝子富化及びサイズ表示をチェックした。Ａ及びＢ試料を、４０ｍＭ　Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ、ｐＨ９．２；１５ｍＭ　ＫＯＡｃ；３．５ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）２；及び０．２μＭの５’ 及び３’ ＩＬ６−，Ｐ５０又はＩＧＦＲ特異的プライマーセット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ；２μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ｃＤＮＡポリメラーゼ混合物（５０Ｘ；ＫｌｅｎＴａｑ−Ｉ及びＤｅｅｐ　Ｖｅｎｔポリメラーゼ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈを含む）を含む５０μｌの反応物中でＰＣＲ増幅した。ＰＣＲを以下の循環条件を使用して、ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　４８０（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で行った：９５℃で１分間；９５℃で１５秒間　３０サイクル；６８℃で５分間。
【０２４０】
ＰＣＲ生成物の分析を、１．１％アガロースゲル（５μｌ／ウェル）上で電気泳動させることにより行い、続けてエチジウムブロマイドを用いた染色によりＡ群試料（低存在量シーケンスに富む）がＩＬ６、Ｐ５０又はＩＧＦＲシーケンスに相当するバンドを含むことを表したが、Ｂ群試料（ネガティブコントロール）はこれらのシーケンスに相当する検出可能なバンドを示さなかった。結果は本発明の方法が変化するサイズの低存在量転写物について富化することをを示す。
【０２４１】
例４
試験及び参照試料間で異なる低存在量ポリヌクレオチドを同定するための好適な刪減ハイブリダイゼーション方法
この例は、本発明の一般的な刪減ハイブリダイゼーション方法の好適な具体例についてのプロトコルを提供する。この具体例は、高存在量富化試験ポリヌクレオチドプール及び低存在量富化参照ポリヌクレオチドプールを使用し、それらは本発明の例示的な選択方法により生成される。
【０２４２】
Ａ．　高存在量シーケンスに富むアンチセンス試験ＲＮＡプールの製造
高存在量富化アンチセンスＲＮＡプールを、図１に示し及び以下に記載するように試験ＲＮＡ試料から製造する。
１．　第一鎖（アンチセンス）試験ｃＤＮＡを、逆転写酵素及びアンチセンスプライマー複合物の混合物を使用して試験ＲＮＡ試料から合成する。各アンチセンスプライマー複合物はランダムシーケンスを含み、それはアンチセンスプライマーとして働く。Ｔ７　ＲＮＡプロモーターシーケンスをランダムシーケンスの５’ 末端にリンクさせる。
２．　ユニバーサルプライマーサイトをオリゴヌクレオチド配列化によりアンチセンス試験ｃＤＮＡ鎖の３’ 末端に加える。この例において、ｄＧ配列化をポリ−Ｇ配列を製造するために使用する。
３．　段階２の反応混合物を連続的に希釈し、低存在量シーケンスを除去する。このようなシーケンスの除去を上述の例のようにＰＣＲによりモニターする。
４．　それから希釈した反応混合物を、新たに合成されるアンチセンス試験ｃＤＮＡ鎖の３’ ユニバーサルプライマーサイトに対してハイブリダイズする５’ ユニバーサルプライマーを使用して、それからＰＣＲを受けさせる。図１Ｂ（４）に表されるように、３’ プライマーはアンチセンス試験ｃＤＮＡ鎖の５’ 末端においてＴ７　ＲＮＡプロモーターシーケンスに対してハイブリダイズするものである。ＰＣＲは高存在量シーケンスに富む二本鎖試験ｃＤＮＡ分子のプールを生成する。
５．　アンチセンス試験ＲＮＡを、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを使用して高存在量シーケンスに富むｃＤＮＡ分子から合成し、手順Ｃ（段階Ｃ．１、以下）の第一刪減ハイブリダイゼーションにおける使用のためのドライバーを生成させる。このドライバーは高存在量試験ＲＮＡシーケンスに富む。
【０２４３】
Ｂ．　低存在量シーケンスに富むセンス参照ｃＤＮＡ鎖のプールの製造
アンチセンス参照ＲＮＡを、Ａ．５（上記）においてアンチセンス試験ＲＮＡについて記載されたように製造する。高存在量シーケンスに富むアンチセンス参照ＲＮＡは、図２に示し及び以下説明するように、センス参照ｃＤＮＡ鎖の低存在量富化プールを生成することに使用される。
１．　アンチセンス参照ＲＮＡを、参照ｍＲＮＡを用いる刪減ハイブリダイゼーション反応におけるドライバーとして使用し、高存在量ｍＲＮＡをブロックし、低存在量参照ｍＲＮＡ分子をフリーなままにし、第一鎖ｃＤＮＡ合成のための鋳型として働かせる。第一鎖（アンチセンス）参照ｃＤＮＡは、逆転写酵素及び５’ 末端においてＳＰ６　ＲＮＡプロモーターシーケンスに対してリンクするオリゴ−ｄＴシーケンスを含むアンチセンスプライマー複合物を使用して合成する。（これらのプライマー及びプロモーターシーケンスは上記Ａ．１．において使用されるものと異ならなければならない。）
２．　ユニバーサルプライマーサイトをオリゴヌクレオチド配列化によりアンチセンス参照ｃＤＮＡ鎖の３’ 末端に加える。ユニバーサルプライマーサイトは上記Ａ．２．にてアンチセンス試験ｃＤＮＡ鎖に加えられるものとは異ならなくてはならない、及びそれゆえｄＣ配列化はポリｄＣ配列を生成するために使用される。
３．　それからＢ．２．の反応混合物を、１００ｍＭのＮａＯＨを用いて６８℃、６０分間処理し、参照ｍＲＮＡを分解する。低存在量富化アンチセンス参照ｃＤＮＡ鎖を残す。
４．　それからアンチセンス参照ｃＤＮＡ鎖を、３’ ユニバーサルプライマーサイトに対してハイブリダイズする５’ ユニバーサルプライマー（ここではポリ−Ｇ）、並びにＳＰ６プロモーターシーケンスにリンクするアンチセンス参照ｃＤＮＡ（ここではポリ−Ａ）の５’ アンチセンスプライマーサイトに対してハイブリダイズする３’ アンチセンスプライマーを使用してＰＣＲを受けさせる。ＰＣＲは、低存在量シーケンスに富む二本鎖参照ｃＤＮＡ分子のプールを生成する。
５．　アンチセンス参照ＲＮＡを、低存在量富化参照ｃＤＮＡ分子から、ＳＰ６ポリメラーゼを使用して合成する。
６．　センス参照ｃＤＮＡ鎖を、アンチセンス参照ＲＮＡから、逆転写酵素及び５’ 末端に制限サイト（例えばポリ−ＧにリンクするＡｌｕ　Ｉ）を含む５’ ユニバーサルプライマーを使用して合成する。この制限サイトは、二本鎖ＤＮＡに特異的な酵素により開裂されるものである。この態様は（以下の）Ｃの一般的ハイブリダイゼーション方法の第二ハイブリダイゼーション反応後にハイブリダイズされたシーケンスの選択的な開裂を容易化する。
７．　それからＢ．６の反応混合物を１００ｍＭのＮａＯＨを使用して、６８℃で６０分間処理し、アンチセンス参照ＲＮＡを分解し、センス参照ｃＤＮＡを残す。
８．　結果として生じる参照ｃＤＮＡ鎖は低存在量シーケンスに富み、Ｃの一般的な刪減ハイブリダイゼーション方法の第二刪減ハイブリダイゼーションにて使用できる。ポリ−Ａ及びポリ−Ｔシーケンス間の非特異的ハイブリダイゼーションを減少させるために、センス参照ｃＤＮＡ鎖のポリ−Ａ配列を、本発明の第二刪減ハイブリダイゼーション反応にて使用する前に、Ｅ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩを用いた部分消化により除去する。好適な反応条件を、（例えば約５〜約３分の複数の反応を設定し、そしてオリゴヌクレオチド−ｄＴプライマーを使用して増幅することによりポリ−Ａ除去をモニタリングすることを使用することによって）経験的に決定する。
【０２４４】
Ｃ．　試験及び参照ポリヌクレオチド間の一般的な刪減ハイブリダイゼーション
１．　試験ｍＲＮＡを用いた第一刪減ハイブリダイゼーション反応において、Ａ．５．のアンチセンス試験ＲＮＡをドライバーとして使用し、高存在量試験ｍＲＮＡ分子をブロックし、第一鎖ｃＤＮＡ合成用の鋳型として働かせるために、低存在量試験ｍＲＮＡ分子をフリーなままにしておく。低存在量富化第一鎖（アンチセンス）試験ｃＤＮＡを、ハイブリダイズしていない試験ｍＲＮＡ分子から、逆転写酵素並びにオリゴｄＴシーケンスとオリゴｄＴシーケンスの２種の制限サイト５’ とを含むアンチセンスプライマーを使用して、合成する（プライマーシーケンスはＢ．２．にて使用されるものとは異なるものでなければならないが、Ａ．１．にて使用されるものとは同じか又は異なるものであることができる）。１つの制限サイト（例えばＡｌｕ　Ｉ）は二本鎖ＤＮＡについて特異的な酵素により開裂される。この態様は、（下記）方法Ｃの一般的なハイブリダイゼーションの第二ハイブリダイゼーション反応後に、ハイブリダイズされるシーケンスの選択的な開裂を容易化するために使用する。他の制限サイトは、試験特異的ポリヌクレオチドを第二ハイブリダイゼーション反応後にクローニングベクター内へクローン化するために使用する。
２．　それからＣ．２．の反応混合物を、１００ｍＭのＮａＯＨを用いて６８℃、６０分間処理し、試験ｍＲＮＡを分解する。低存在量富化アンチセンス試験ｃＤＮＡ鎖を残す。
３．　Ｂ．７．のセンス参照ｃＤＮＡを、段階３のアンチセンス試験ｃＤＮＡ鎖を用いた刪減ハイブリダイゼーション反応におけるドライバーとして使用し、試験及び参照試料の両方において存在するポリヌクレオチドシーケンスに相当するアンチセンス試験ｃＤＮＡ鎖をブロックする。この第二ハイブリダイゼーション反応は、二本鎖ｃＤＮＡ分子、ハイブリダイズしていない低存在量富化アンチセンス試験ｃＤＮＡ鎖及びハイブリダイズしていない低存在量富化センス参照ｃＤＮＡ鎖（すなわちドライバー）を生成する。ハイブリダイズしていないアンチセンス試験ｃＤＮＡ鎖は試験特異的なシーケンスに相当するが、ハイブリッド二本鎖は、試験及び参照試料の両方において存在するシーケンスに相当する。
４．　ハイブリッド二本鎖の“粘着末端” を、Ｔａｑポリメラーゼを使用して充填し、二本鎖Ａｌｕ　Ｉ制限サイトを発生させる。
５．　オリゴヌクレオチド配列化をｄＣを使用して実行し、反応混合物中の全ての分子にポリ−Ｃ配列を加える。
６．　ハイブリッド二本鎖をＡｌｕ　Ｉを用いて消化し、それは二本鎖の両方の末端において３’ ポリ−Ｃ配列を開裂する。この反応はハイブリダイズしていない低存在量富化アンチセンス試験ｃＤＮＡ鎖、及びハイブリダイズしていない低存在量富化センス参照ｃＤＮＡ鎖（すなわちドライバー）を完全なまま残す。しかし、ドライバーは自己アニールする５’ ポリ−Ｇ及び３’ ポリ−Ｃシーケンスを有し、増幅を妨げる。
７．　低存在量富化アンチセンス試験ｃＤＮＡ鎖を、好適なプライマーを使用する選択的なＰＣＲにより二本鎖試験ｃＤＮＡ分子に変換する。この例において、５’ プライマーはポリ−Ｇを含み、３’ プライマーはアンチセンス試験ｃＤＮＡ鎖の５’ 末端にてＳｆｉ　Ｉシーケンスと結合するＳｆｉ　Ｉシーケンスを含む。５’ プライマーも５’ 末端に制限サイトを含む（ここではＮｏｔ　Ｉ）。ＰＣＲは低存在量試験シーケンス並びに出発試験及び参照ＲＮＡ試料間の異なるシーケンスに富む刪減ｃＤＮＡ分子のプールを生成する。各二本鎖分子は５’ 末端においてＮｏｔ　Ｉ制限サイトを有し、そして３’ 末端においてＳｆｉ　Ｉ制限サイトを有する。
８．　７の混合物をＳｆｉ　Ｉ及びＮｏｔ　Ｉを使用して消化させ、好適なベクター内へライゲートし、低存在量富化の試験特異的なクローンのライブラリーを生成する。Ｓｆｉ　Ｉ及びＮｏｔ　Ｉは“インフリークエントカッター（ｉｎｆｒｅｑｕｅｎｔ　ｃｕｔｔｅ）” であり、ほとんど全ての試験特異的なシーケンスを完全なままにし、それゆえ完全長ｃＤＮＡの回収を高める。この手順における２種の異なる制限サイトの使用は、発現ベクターへ指向的なクローニングを容易化し、続けて発現された遺伝子の迅速な分析を容易化する。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】ポリヌクレオチド試料に比べて高存在量シーケンスに富むポリヌクレオチドのプールを製造するために有用である本発明の選択方法の好適な具体例の概略図である。
【図１Ｂ】ポリヌクレオチド試料に比べて高存在量シーケンスに富むポリヌクレオチドのプールを製造するために有用である本発明の選択方法の好適な具体例の概略図である。
【図２Ａ】本発明の第二の選択方法の好適な具体例の概略図である。
【図２Ｂ】本発明の第二の選択方法の好適な具体例の概略図である。
【図２Ｃ】本発明の第二の選択方法の好適な具体例の概略図である。
【図３Ａ】本発明の一般的刪減ハイブリダイゼーション方法の好適な具体例の概略図である。
【図３Ｂ】本発明の一般的刪減ハイブリダイゼーション方法の好適な具体例の概略図である。
【図３Ｃ】本発明の一般的刪減ハイブリダイゼーション方法の好適な具体例の概略図である。
【図３Ｄ】本発明の一般的刪減ハイブリダイゼーション方法の好適な具体例の概略図である。
【図１Ａ】
2004512027.tif 000005
【図１Ｂ】
2004512027.tif 000006
【図２Ａ】
2004512027.tif 000007
【図２Ｂ】
2004512027.tif 000008
【図２Ｃ】
2004512027.tif 000009
【図３Ａ】
2004512027.tif 000010
【図３Ｂ】
2004512027.tif 000011
【図３Ｃ】
2004512027.tif 000012
【図３Ｄ】
2004512027.tif 000013
【国際公開パンフレット】
2004512027.tif 000014
2004512027.tif 000015
2004512027.tif 000016
2004512027.tif 000017
2004512027.tif 000018
2004512027.tif 000019
2004512027.tif 000020
2004512027.tif 000021
2004512027.tif 000022
2004512027.tif 000023
2004512027.tif 000024
2004512027.tif 000025
2004512027.tif 000026
2004512027.tif 000027
2004512027.tif 000028
2004512027.tif 000029
2004512027.tif 000030
2004512027.tif 000031
2004512027.tif 000032
2004512027.tif 000033
2004512027.tif 000034
2004512027.tif 000035
2004512027.tif 000036
2004512027.tif 000037
2004512027.tif 000038
2004512027.tif 000039
2004512027.tif 000040
2004512027.tif 000041
2004512027.tif 000042
2004512027.tif 000043
2004512027.tif 000044
2004512027.tif 000045
2004512027.tif 000046
2004512027.tif 000047
2004512027.tif 000048
2004512027.tif 000049
2004512027.tif 000050
2004512027.tif 000051
2004512027.tif 000052
2004512027.tif 000053
2004512027.tif 000054
2004512027.tif 000055
2004512027.tif 000056
2004512027.tif 000057
2004512027.tif 000058
2004512027.tif 000059
2004512027.tif 000060
2004512027.tif 000061
2004512027.tif 000062
2004512027.tif 000063
2004512027.tif 000064
2004512027.tif 000065
2004512027.tif 000066
2004512027.tif 000067
2004512027.tif 000068
2004512027.tif 000069
2004512027.tif 000070
2004512027.tif 000071
2004512027.tif 000072
2004512027.tif 000073
2004512027.tif 000074
2004512027.tif 000075
2004512027.tif 000076
2004512027.tif 000077
2004512027.tif 000078
2004512027.tif 000079
2004512027.tif 000080
2004512027.tif 000081
2004512027.tif 000082
2004512027.tif 000083
2004512027.tif 000084
2004512027.tif 000085
2004512027.tif 000086
2004512027.tif 000087
2004512027.tif 000088
2004512027.tif 000089
2004512027.tif 000090
2004512027.tif 000091
2004512027.tif 000092
2004512027.tif 000093
2004512027.tif 000094
2004512027.tif 000095
2004512027.tif 000096
2004512027.tif 000097
2004512027.tif 000098
2004512027.tif 000099
2004512027.tif 000100
2004512027.tif 000101
2004512027.tif 000102
2004512027.tif 000103
2004512027.tif 000104
2004512027.tif 000105
2004512027.tif 000106
2004512027.tif 000107
2004512027.tif 000108
2004512027.tif 000109
2004512027.tif 000110
2004512027.tif 000111
2004512027.tif 000112