(57)【要約】本発明は、clk1ホモ接合変異胚の生存を可能にする化合物をスクリーニングする方法；mclk1ホモ接合細胞株の変異表現型のレスキューに適切な化合物をスクリーニングする方法；内因性のユビキノンの部分的なまたは完全な機能的置換に適切な化合物をスクリーニングする方法；デメトキシユビキノンからユビキノンを作るために必要とされるclk-1の活性および/または他の過程を阻害できる化合物をスクリーニングする方法；非ユビキノン産生マウス；mclk1の改変を包含するDNA構築物；非ユビキノン産生ES細胞株；非ユビキノン産生coq-3変異体；ユビキノンまたはデメトキシユビキノンの完全なまたは部分的な機能的置換に適切な化合物をスクリーニングする方法；多細胞被験体においてユビキノンレベルを減少および/または増加させる方法；clk-1の遺伝的抑制因子をスクリーニングする方法；およびcoq-3の遺伝的抑制因子をスクリーニングする方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
clk1ホモ接合変異脊椎動物胚の生存を可能にする化合物をスクリーニングする方法であって、clk1ヘテロ接合被験体を交配させてclk1ホモ接合変異胚を得るステップと、clk1ホモ接合胚の生存能力を測定するステップとを含み；ここで、上記ヘテロ接合被験体の少なくとも１つを、交配の前に化合物で処理し；且つ、生存可能な胚を、clk1ホモ接合胚の生存を可能にする化合物の指標とすることを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
胚がマウスの胚である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記化合物が内因性のユビキノンの部分的なまたは完全な機能的置換に適切なものである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
上記化合物が、経口投与、筋内投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、局所性投与、皮内投与および経皮投与からなる群より選択される、少なくとも１つの経路で投与されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
mclk1ホモ接合細胞株の変異表現型のレスキューに適切な化合物をスクリーニングする方法であって、mclk1ノックアウト細胞株での変異表現型を測定するステップを含み、ここで、細胞株を上記測定の前に化合物で処理し、且つ、上記表現型のレベルをレスキューに適切な化合物の指標とすることを特徴とする、上記方法。
【請求項６】
内因性のユビキノンの部分的なまたは完全な機能的置換に適切な化合物をスクリーニングする方法であって、mclk1ノックアウトホモ接合ES細胞株での変異表現型を測定するステップを含み；ここで、該細胞株を測定の前に化合物で処理し；且つ、上記表現型のレベルをユビキノンの部分的なまたは完全な機能的置換に適切な化合物の指標とすることを特徴とする、上記方法。
【請求項７】
表現型が細胞の呼吸および/または増殖速度である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
被験体中のユビキノンの部分的または完全な機能的置換に適切な化合物をスクリーニングする方法であって、coq-3ホモ接合変異線虫の、生存能力、繁殖能力および変異表現型の全部または部分的欠如からなる群より選択される少なくとも１つの表現型を評価するステップを含み；ここで、該線虫を上記評価の前に化合物で処理し；且つ、生存能力、繁殖能力および変異表現型の全部または部分的欠如からなる群より選択される少なくとも１つの表現型を、上記被験体中のユビキノンの部分的または完全な機能的置換に適した化合物の指標とすることを特徴とする、上記方法。
【請求項９】
化合物が該被験体のミトコンドリアに到達可能なものである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
被験体中のユビキノンの部分的または完全な機能的置換に適切な化合物をスクリーニングする方法であって、ユビキノンの枯渇した基質上で成長させたclk-1ホモ接合変異線虫の、生存能力、繁殖能力およびClk-1表現型の全部または部分的欠如からなる群より選択される少なくとも１つの表現型を評価するステップを含み；ここで、該線虫を上記評価の前に化合物で処理し；且つ、生存能力、繁殖能力および上記Clk-1表現型の全部または部分的欠如からなる群より選択される少なくとも１つの上記表現型を、上記被験体中のユビキノンの部分的または完全な機能的置換に適した化合物の指標とすることを特徴とする、上記方法。
【請求項１１】
上記のユビキノンの枯渇した基質が非ユビキノン産生バクテリアである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
上記のユビキノンの枯渇した基質が、８イソプレン単位より短い側鎖を持つユビキノンを産生するバクテリアである、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
化合物が該被験体内のユビキノンを必要とする少なくとも非ミトコンドリア部位に到達可能なものである、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
上記バクテリアがRKP1452、AN66、IS-16、DM123、GD1、DC349、JC349、JC7623、JF496、KO229（pSN18）、KO229（Y37A/Y38A）、KO229（R321V）およびKO229（Y37A/R321V）からなる群より選択される、請求項１０または１３記載の方法。
【請求項１５】
上記バクテリアがubiCA、ubiD、ubiX、ubiB、ubiG、ubiH、ubiE、ubiFおよびispBからなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つに変異を有するものである、請求項１０、１３および１４のいずれか1項記載の方法。
【請求項１６】
上記バクテリアがpSN18、Y37A/Y38A、R321V、Y37A/R321Vからなる群より選択されるプラスミドの少なくとも１つを有するものである、請求項１０、１３〜１５のいずれか1項記載の方法。
【請求項１７】
上記のユビキノンの機能的置換がCLK-1のコファクターとしてのユビキノンの機能に関するものである、請求項１０〜１６のいずれか1項記載の方法。
【請求項１８】
被験体内においてデメトキシユビキノンからユビキノンを生成するために必要とされるclk-1の活性および/または他の過程を阻害可能な化合物をスクリーニングする方法であって、ユビキノンの枯渇した基質上における野生型線虫の、成長、繁殖能力およびClk-1表現型の全部または部分的欠如からなる群より選択される少なくとも１つの表現型を測定するステップを含み；ここで、該線虫を上記測定の前に化合物で処理し；且つ、成長の全部または部分的欠如、繁殖能力の欠如および上記Clk-1表現型の全部または部分的欠如からなる群より選択される少なくとも１つの表現型を、被験体内においてデメトキシユビキノンからユビキノンを生成するのに必要とされるclk-1の活性および/または他の過程を阻害可能な化合物の指標とすることを特徴とする、上記方法。
【請求項１９】
上記のユビキノンの枯渇した基質が非ユビキノン産生バクテリアである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
上記のユビキノンの枯渇した基質が、８イソプレン単位より短い側鎖を持つユビキノンを産生するバクテリアである、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
上記バクテリアがRKP1452、AN66、IS-16、DM123、GD1、DC349、JC349、JC7623、JF496からなる群より選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
上記バクテリアがubiCA、ubiD、ubiX、ubiB、ubiG、ubiH、ubiEおよびubiFからなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つに変異を有する、請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
上記バクテリアがpSN18、Y37A/Y38A、R321V、Y37A/R321Vからなる群より選択されるプラスミドの少なくとも１つを有する、請求項１８または２２に記載の方法。
【請求項２４】
ユビキノンの完全なまたは部分的な機能的置換に適切な化合物をスクリーニングする方法であって、mclk1および/もしくは既知のユビキノン生合成酵素遺伝子を欠失している、ならびに/または改変された場合にユビキノンの欠如もしくは減少を引き起こす他の遺伝子が改変されている被験体の変異表現型を測定するステップを含み；ここで、上記被験体を上記測定の前に化合物で処理し；且つ、表現型のレベルをユビキノンの完全なまたは部分的な機能的置換に適切な化合物の指標とすることを特徴とする、上記方法。
【請求項２５】
該被験体が、mclk1の欠失、または既知のユビキノン生合成酵素遺伝子の欠失、および/または改変された場合にユビキノンの欠如もしくは減少を引き起こす遺伝子の改変を有する、マウス、ES細胞株または他の細胞株である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
ユビキノンの欠如およびデメトキシユビキノンの存在に関連する表現型を発現する、ユビキノンを産生できない、mclk1の遺伝子ノックアウトを含有するマウス。
【請求項２７】
請求項２６のmclk1ノックアウト系統マウスを作製する手段となる、mclk1の改変を含有するDNA構築物。
【請求項２８】
ユビキノンの欠如およびデメトキシユビキノンの存在に関連する表現型を発現する、ユビキノンを産生できない、mclk1遺伝子ノックアウトを含有するES細胞株。
【請求項２９】
coq-3の欠失、または、ユビキノン生合成酵素および/または改変された場合にユビキノンの欠如もしくは減少を引き起こす他の遺伝子の欠失である変異を有する、ユビキノンを産生できないcoq-3変異体。
【請求項３０】
線虫である、請求項２９記載の変異体。
【請求項３１】
上記変異体が、SHP1772、SHP1773、SHP1774、SHP1775、SHP1840およびSHP1865からなる群より選択されるPCRプライマーを用いて同定される線虫の群より選択されることを特徴とする、請求項３０記載の変異体。
【請求項３２】
ユビキノンまたはデメトキシユビキノンの完全なまたは部分的な機能的置換に適切な化合物をスクリーニングする方法であって、ユビキノン生合成酵素遺伝子、および/またはその改変によってユビキノンもしくはデメトキシユビキノンの欠如もしくは減少を引き起こす遺伝子が改変された被験体の変異表現型を測定するステップを含み；ここで、上記被験体を上記測定の前に化合物で処理し；且つ、表現型のレベルをユビキノンまたはデメトキシユビキノンの完全なもしくは部分的な機能的置換に適切な化合物の指標とすることを特徴とする、上記方法。
【請求項３３】
上記被験体が線虫である、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
被験体内のcoq-3をターゲッティングするステップを含む、多細胞性被験体のユビキノンレベルを減少および/または増加させる方法。
【請求項３５】
clk-1の遺伝的抑制因子をスクリーニングする方法であって、ユビキノンの枯渇した基質上で成長させたclk-1変異線虫の生存能力、繁殖能力およびClk-1表現型の全部または部分的欠如からなる群より選択される少なくとも１つの表現型を測定するステップを含み；ここで、上記線虫は上記測定の前に遺伝的抑制因子を有し；且つ、生存能力、繁殖能力および上記Clk-1変異表現型の全部または部分的欠如からなる群より選択される少なくとも１つの上記表現型をclk-1の遺伝的抑制因子の指標とすることを特徴とする、上記方法。
【請求項３６】
上記バクテリアがRKP1452、AN66、IS-16、DM123、GD1、DC349、JC349、JC7623、JF496、KO229（pSN18）、KO229（Y37A/Y38A）、KO229（R321V）およびKO229（Y37A/R321V）からなる群より選択される、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
上記バクテリアがubiCA、ubiD、ubiX、ubiB、ubiG、ubiH、ubiE、ubiFおよびispBからなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つに変異を有する、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
上記バクテリアがpSN18、Y37A/Y38A、R321VおよびY37A/R321Vからなる群より選択されるプラスミドの少なくとも１つを含有する、請求項３５記載の方法。
【請求項３９】
coq-3の遺伝的抑制因子をスクリーニングする方法であって、生存能力、繁殖能力およびcoq-3変異線虫の変異表現型の全部または部分的欠如からなる群より選択される少なくとも１つの表現型を測定するステップを含み；ここで、上記線虫は上記測定の前に遺伝的抑制因子を有し；且つ、生存能力、繁殖能力および上記変異表現型の全部または部分的欠如からなる群より選択される少なくとも１つの上記表現型をcoq-3の遺伝的抑制因子の指標となることを特徴とする、上記方法。
【請求項４０】
ユビキノンの完全なまたは部分的な機能的置換に適切な化合物をスクリーニングする方法であって、mclk1が細胞および/または生活環の期間の一部でのみ欠失する被験体の変異表現型を測定するステップを含み；ここで、上記被験体を上記測定の前に化合物で処理し；且つ、上記表現型のレベルをユビキノンの完全なまたは部分的な機能的置換に適切な化合物の指標とすることを特徴とする、上記方法。
【請求項４１】
上記化合物が、活性酸素種（ROS）関連疾患、糖尿病、低酸素症/再酸素飽和傷害、パーキンソン病、アテローム性動脈硬化症およびアルツハイマー病からなる群より選択される疾患の治療に有用であることを特徴とする、請求項１〜２５、３２および３５〜４０のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はユビキノン欠損の表現型効果およびそのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ユビキノン（UQ）およびその還元型のユビキノールはプレニル化ベンゾキノン/オール脂質であり、活性酸素種（ROS）の主要な産生部位である。それは複合体Iおよび複合体IIの活性によって還元され、複合体IIIの活性によって酸化される、ミトコンドリア呼吸鎖のコファクターである。これらの過程において、不安定でスーパーオキシドを発生させるユビセミキノン種が形成される。更に、ユビキノン/ユビキノールは、例えばリソソームおよびペルオキシソームの電子伝達系だけでなく原形質膜NAD(P)Hオキシドレダクターゼのような、ROSを産生する他の酵素系のレドックス活性コファクターである。これらの場所すべてにおいて、ROSはユビキノン/ユビキノールを必要とするレドックス反応の間に産生され得る。
【０００３】
また、ユビキノンは遍在する天然の抗酸化剤であり、その生体膜内での存在は内因性の過程または毒物もしくは放射線によって産生されるROSの解毒を助ける。残念なことに、食餌性のユビキノンは、細胞、特に細胞内小器官への非常に低い透過性しか持たない。
【０００４】
活性酸素種は、糖尿病（Nishikawaら、(2000). Nature, 404, 787-790; Brownlee (2001). Nature, 414, 813-820）、低酸素症/再酸素飽和傷害（Liら、(2002). Am J Physiol Cell Physiol 282, C227-C241; Lesnefsyら、(2001). J. Mol Cell Cardiol 33, 1065-1089; Cuzzocreaら、(2001). Pharmacological Reviews 53, 1, 135-159）、パーキンソン病（Betarbetら、(2002). Bioessays 24, 308-318）、アテローム性動脈硬化症（Lusis, (2000). Nature, 407, 233-241）およびアルツハイマー病（Butterfieldら、(2001). Trends in Molecular Medicine, 7, 12, 548-554; Tabnerら、(2002) Free Radical Biology & Medicine, 32, 11, 1076-1083, 2002）を含むがそれに限定されない、多数のヒト疾患に関与している。
【０００５】
線虫（Caenorhabditis elegans）の遺伝子clk-1は、胚発生および後胚発生、周期的行動、繁殖ならびに寿命を含む、多くの生理的速度に影響を及ぼす。clk-1は、ミトコンドリアに局在し、UQ生合成に必要であることが示されている酵母のタンパク質Coq7pと相同な、187アミノ酸のタンパク質をコードする。clk-1変異体から精製されたミトコンドリアではUQ9が完全に欠如していることから（Miyadera, H.ら、(2001). J Biol Chem 276, 7713-6）（下付き文字はイソプレノイド側鎖の長さを表す）、clk-1もまた、UQ生合成に必要であることが示されている（Jonassen, T.ら、(2001). Proc Natl Acad Sci USA 98, 421-6.; Miyadera, H.ら、(2001). J Biol Chem 276, 7713-6）。実際、これらのミトコンドリアは、UQ9の合成の中間体であるデメトキシユビキノン（DMQ9）を蓄積する（Miyadera, H.ら、(2001). J Biol Chem 276, 7713-6）。最近の証拠はclk-1がDMQヒドロキシラーゼをコードすることを示唆する（Stenmark, P.ら、(2001). J Biol Chem 2, 2）。大腸菌では、DMQ8はUQ8より低速度であるが単離された膜での呼吸を維持できる。同様に、clk-1変異体由来の精製されたミトコンドリア（Felkai, S.ら、(1999). Embo J 18, 1783-92）およびミトコンドリア酵素（Miyadera, H.ら、(2001). J Biol Chem 276, 7713-6）の機能は野生型と比較してほぼ完全であることから、DMQ9は真核生物のミトコンドリアでの電子伝達を可能にする。更に、合成DMQ2は、複合体IIからの電子伝達はずっと低いが、複合体Iからの電子伝達のコファクターとして機能し得る（Miyadera, H.ら、(2001). J Biol Chem 276, 7713-6）。興味深いことに、３つのclk-1対立遺伝子すべてにおいて、それらの生理的速度への影響の強度に関係なくDMQ9のみが存在しており、UQの欠如だけではClk-1表現型を説明できないことを示唆する（Miyadera, H.ら、(2001). J Biol Chem 276, 7713-6）。
【０００６】
最近、clk-1変異体はDMQ9の存在および活性に関係なく、UQ欠損バクテリア菌株上では成長できないことが見いだされた（Jonassen, T.ら、(2001). Proc Natl Acad Sci USA 98, 421-6）。一般的に食餌性のUQはミトコンドリアに到達できないが、これは、DMQ9が正常なミトコンドリアの機能にとって不十分であり、食餌性のバクテリアUQ8がミトコンドリアに到達でき、微量でそこで機能し得ることを示唆すると解釈される（Jonassen, T.ら、(2001). Proc Natl Acad Sci USA 98, 421-6）。
【０００７】
UQ欠損の表現効果の解析、ならびに多細胞生物においてclk-1の活性に影響し得るおよび/またはUQ欠損をレスキューし得る化合物のスクリーニング方法の提供は、非常に望ましいであろう。
【発明の開示】
【０００８】
本発明に従って、clk1ヘテロ接合被験体を交配させてclk1ホモ接合変異胚を得るステップと、clk1ホモ接合胚の生存能力を測定するステップを含む、clk1ホモ接合変異脊椎動物胚の生存を可能にする化合物をスクリーニングする方法を提供する。ここで、上記ヘテロ接合被験体の少なくとも１つを交配の前に化合物で処理し、生存可能な胚をclk1ホモ接合胚の生存を可能にする化合物の指標とする。
【０００９】
本発明の好ましい実施形態の方法では、被験体がマウスである。
【００１０】
本発明の好ましい実施形態の方法では、化合物が内因性のユビキノンの部分的なまたは完全な機能的置換に適切なものである。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態の方法では、化合物が、経口投与、筋内投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、局所性投与、皮内投与および経皮投与からなる群より選択される少なくとも１つの経路で投与される。
【００１２】
本発明によると、mclk1ノックアウト細胞株での変異表現型を測定するステップを含む、mclk1ホモ接合細胞株の変異表現型のレスキューに適切な化合物をスクリーニングする方法が提供される。ここでは、細胞株を測定の前に化合物で処理し、表現型のレベルをレスキューに適切な化合物の指標とする。
【００１３】
本発明によると、mclk1ノックアウトホモ接合ES細胞株での変異表現型を測定するステップを含む、内因性のユビキノンの部分的なまたは完全な機能的置換に適切な化合物をスクリーニングする方法が提供される。ここでは、細胞株を測定の前に化合物で処理し、表現型のレベルをユビキノンの部分的なまたは完全な機能的置換に適切な化合物の指標とする。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態の方法では、表現型が細胞の呼吸および/または増殖速度である。
【００１５】
本発明によると、coq-3ホモ接合変異線虫の、生存能力、繁殖能力および変異表現型の全部または部分的欠如からなる群より選択される少なくとも１つの表現型を評価するステップを含む、被験体中のユビキノンの部分的または完全な機能的置換に適切な化合物をスクリーニングする方法が提供される。ここでは、線虫を評価の前に化合物で処理し、生存能力、繁殖能力および変異表現型の全部または部分的欠如からなる群より選択される少なくとも１つの表現型を、被験体中でのユビキノンの部分的または完全な機能的置換に適した化合物の指標とする。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態の方法では、化合物が被験体のミトコンドリアに到達可能なものである。
【００１７】
本発明によると、ユビキノンの枯渇した基質上で成長させたclk-1ホモ接合変異線虫の、生存能力、繁殖能力およびClk-1表現型の全部または部分的欠如からなる群より選択される少なくとも１つの表現型を評価するステップを含む、被験体中でのユビキノンの部分的または完全な機能的置換に適切な化合物をスクリーニングする方法が提供される。ここでは、線虫を上記評価の前に化合物で処理し、生存能力、繁殖能力および上記Clk-1表現型の全部または部分的欠如からなる群より選択される少なくとも１つの表現型を、上記被験体中のユビキノンの部分的または完全な機能的置換に適した化合物の指標とする。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態の方法では、ユビキノンの枯渇した基質が非ユビキノン産生バクテリアである。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態の方法では、ユビキノンの枯渇した基質が、８イソプレン単位より短い側鎖を持つユビキノンを産生するバクテリアである。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態の方法では、化合物が、被験体内のユビキノンを必要とする少なくとも非ミトコンドリア部位に到達可能なものである。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態の方法では、上記バクテリアがRKP1452、AN66、IS-16、DM123、GD1、DC349、JC349、JC7623、JF496、KO229（pSN18）、KO229（Y37A/Y38A）、KO229（R321V）およびKO229（Y37A/R321V）からなる群より選択される。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態の方法では、上記バクテリアがubiCA、ubiD、ubiX、ubiB、ubiG、ubiH、ubiE、ubiFおよびispBからなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つに変異を有する。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態の方法では、バクテリアがpSN18、Y37A/Y38A、R321V、Y37A/R321Vからなる群より選択されるプラスミドの少なくとも１つを有する。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態の方法では、ユビキノンの機能的置換がCLK-1のコファクターとしてのユビキノンの機能に関するものである。
【００２５】
本発明によると、ユビキノンの枯渇した基質上での野生型線虫の、成長、繁殖能力およびClk-1表現型の全部または部分的欠如からなる群より選択される少なくとも１つの表現型を測定するステップを含む、被験体内においてデメトキシユビキノンからユビキノンを生成するために必要とされるclk-1の活性および/または他の過程を阻害可能な化合物をスクリーニングする方法が提供される。ここでは、線虫を測定の前に化合物で処理し、成長の全部または部分的欠如、繁殖能力の欠如および上記Clk-1表現型の全部または部分的欠如からなる群より選択される少なくとも１つの表現型を、被験体でデメトキシユビキノンからユビキノンを生成するために必要とされるclk-1の活性および/または他の過程を阻害可能な化合物の指標とすることを特徴とする。
【００２６】
本発明によると、mclk1および/もしくは既知のユビキノン生合成酵素遺伝子を欠失している、ならびに/または、改変された場合にユビキノンの欠如もしくは減少を引き起こす他の遺伝子を欠失している被験体の変異表現型を測定するステップを含む、ユビキノンの完全なまたは部分的な機能的置換に適切な化合物をスクリーニングする方法が提供される。ここでは、被験体を測定の前に化合物で処理し、表現型のレベルをユビキノンの完全なまたは部分的な機能的置換に適切な化合物の指標とする。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態の方法では、被験体が、mclk1の欠失、または既知のユビキノン生合成酵素遺伝子の欠失、および/または改変された場合にユビキノンの欠如もしくは減少を引き起こす遺伝子の改変を有する、マウス、ES細胞株または他の細胞株である。
【００２８】
本発明によると、マウスがユビキノンの欠如およびデメトキシユビキノンの存在に関連する表現型を発現する、ユビキノンを産生できない、mclk1の遺伝子ノックアウトを包含するマウスが提供される。
【００２９】
本発明によると、本発明のmclk1ノックアウト系統マウスを作製する手段となる、mclk1の改変を包含するDNA構築物が提供される。
【００３０】
本発明によると、ユビキノンの欠如およびデメトキシユビキノンの存在に関連する表現型を発現する、ユビキノンを産生できない、mclk1遺伝子ノックアウトを包含するES細胞株が提供される。
【００３１】
本発明によると、coq-3の欠失、または、ユビキノン生合成酵素および/または改変された場合にユビキノンの欠如もしくは減少を引き起こす他の任意の遺伝子の欠失である変異を有する、ユビキノンを産生できないcoq-3変異体が提供される。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態の変異体は、線虫である。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態の変異体は、SHP1772、SHP1773、SHP1774、SHP1775、SHP1840およびSHP1865からなる群より選択されるPCRプライマーを用いて同定される線虫の群より選択される。
【００３４】
本発明によると、ユビキノン生合成酵素遺伝子、および/またはその改変によってユビキノンもしくはデメトキシユビキノンの欠如もしくは減少を引き起こす遺伝子が改変された被験体の変異表現型を測定するステップを含む、ユビキノンまたはデメトキシユビキノンの完全なまたは部分的な機能的置換に適切な化合物をスクリーニングする方法が提供される。ここでは、被験体を測定の前に化合物で処理し、表現型のレベルをユビキノンまたはデメトキシユビキノンの完全なまたは部分的な機能的置換に適切な化合物の指標とする。
【００３５】
本発明によると、被験体内のcoq-3をターゲッティングするステップを含む、多細胞性被験体のユビキノンレベルを減少および/または増加させる方法が提供される。
【００３６】
本発明によると、ユビキノンの枯渇した基質上で成長させたclk-1変異線虫の生存能力、繁殖能力およびClk-1表現型の全部または部分的欠如からなる群より選択される少なくとも１つの表現型を測定するステップを含む、clk-1の遺伝的抑制因子をスクリーニングする方法が提供される。ここでは、線虫は上記測定の前に遺伝的抑制因子を有し、生存能力、繁殖能力および上記Clk-1変異表現型の全部または部分的欠如からなる群より選択される少なくとも１つの上記表現型をclk-1の遺伝的抑制因子の指標とする。
【００３７】
本発明によると、生存能力、繁殖能力およびcoq-3変異線虫の変異表現型の全部または部分的欠如からなる群より選択される少なくとも１つの表現型を測定するステップを含む、coq-3の遺伝的抑制因子をスクリーニングする方法が提供される。ここでは、線虫は上記測定の前に遺伝的抑制因子を有し、生存能力、繁殖能力および上記変異表現型の全部または部分的欠如からなる群より選択される少なくとも１つの上記表現型をcoq-3の遺伝的抑制因子の指標とする。
【００３８】
本発明によると、mclk1が細胞および/または生活環の期間の一部でのみ欠失する被験体の変異表現型を測定するステップを含む、ユビキノンの完全なまたは部分的な機能的置換に適切な化合物をスクリーニングする方法が提供される。ここでは、被験体を上記測定の前に化合物で処理し、表現型のレベルをユビキノンの完全なまたは部分的な機能的置換に適切な化合物の指標とする。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態の方法では、上記化合物が、活性酸素種（ROS）関連疾患、糖尿病、低酸素症/再酸素飽和傷害、パーキンソン病、アテローム性動脈硬化症およびアルツハイマー病からなる群より選択される疾患の治療に有用である。
【００４０】
本出願において、「ユビキノンの枯渇した基質」という用語は、ユビキノンを産生しない、または、効果を示すには短すぎる側鎖を持つユビキノンを産生する基質を意味することを意図する。効果を示すには短すぎる側鎖を持つユビキノンと見なされる例は、８イソプレン単位より短い側鎖を持つユビキノンであり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
本発明によって、多細胞生物におけるユビキノン欠損の表現効果の解析が提供される。
【００４２】
ユビキノンは、線虫（C. elegans）の発生および繁殖能力のために必要である
ユビキノン（UQ）を産生しないubiG 大腸菌（E. coli）変異株で飼育された時、clk-1変異体は発生を完了することができない（Jonassen, T.ら、(2001). Proc Natl Acad Sci USA 98, 421-6）。ubiG遺伝子産物はUQ生合成経路の2つの段階で必要であり、ubiG変異体は全くUQを産生しない。この成長表現型がclk-1変異体に対するubiG株（GD1）の特異的な毒性から生じるのか、または、UQの欠如から生じるのかどうかを検証するために、試験を行った。この目的のために、UQ生合成に欠陥のある様々な大腸菌変異体（ubi変異体）上でのclk-1変異体線虫の成長の体系的な分析を実施した。UQ生合成に関与するものとして9つの大腸菌酵素が記載されている。それらは、最初の酵素ubiC、すなわち可溶性のコリスミン酸リアーゼを除いて、すべて膜結合性である。その経路の次の酵素は、キノン環にイソプレノイド側鎖を付加するプレニルトランスフェラーゼubiAである（大腸菌では8つのサブユニット）。他の酵素は、３つのカテゴリーすなわち、デカルボキシラーゼ（ubiD、ubiX）、モノオキシゲナーゼ（ubiB、ubiH、ubiF）およびメチルトランスフェラーゼ（ubiG、ubiE）に分類される。UQ欠損株の復帰突然変異を最小にするためにNGMプレートが0.5%ブドウ糖を含むことを除いては、バクテリアおよび線虫培養は標準的な手法を用いた。様々なバクテリア株上での線虫の発生を評価するために、雌雄同体の成虫が選抜され、標準的な方法に従ってテストバクテリアを含むプレート上に撒いた（bleach）。この処置は、テストプレート上にOP50バクテリアの混入がないことを確実にする。撒かれた卵から孵化したL1幼虫を新しいプレートへ移し、線虫の成長を調べた。用いられたバクテリア株の遺伝子型を、表１に記載する。これら各々の遺伝子に対するバクテリア変異株上で３つのclk-1変異系統の成長を調べた（表１）。3つのclk-1変異対立遺伝子が同定されている。すなわち、ヌル(null)と推定されるqm30およびqm51、ならびにclk-1遺伝子中に点突発変異を持ち比較的穏やかな表現型を示すe2519である。
【表１】
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【００４３】
検査したすべてのバクテリアubi-（変異）株上で、野生型系統N2のL1幼虫は成虫への発生を完了することができ、これらの成虫は、ubi+バクテリア（OP50）上でのそれらの一腹卵数サイズと同様の、約320の一腹卵数サイズを持つことが見いだされた（表２）。これは、食餌性のUQを必要とせず、内因的に合成されたUQで野生型の表現型を維持するために十分であることを示す。長寿命の変異体（daf-2および完全には解析されていないClk-1様の表現型を示す多くの系統）を含む、UQ合成に関与することが知られていない多数の線虫変異体（dpy-9、eat-2、mau-2）を調べた。あらゆる場合において、ubi-バクテリア上でその変異体の成長は損なわれなかった。対照的に、3つのclk-1変異体はすべて検査されたほとんどのubi-菌株上で同様にふるまう。すなわち、それらは非常にゆっくり成長する、または全く成長せず、子孫を生じない（表２）。しかし、clk-1変異体は、（野生型の15%程度の）ユビキノンの残存量を生じる点変異体であるubiD、ubiXおよびubiH変異株上で成長することができ、いくらかの子孫を生ずることができる。従って、バクテリアUQ8は比較的低レベルで、clk-1変異体の成長を可能にするのに十分である。
【表２】
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【００４４】
線虫は、ユビキノンの側鎖長に感受性がある
ユビキノン（UQ）はキノン環および長さが種特異的であるイソプレノイド鎖で構成されている。線虫には９個、大腸菌には８個、酵母（S. cerevisiae）には６個のイソプレン反復がある。哺乳類では、UQ9とUQ10との両方が検出されている（下付き文字はイソプレノイド側鎖の長さを表す）。UQ10はヒトに存在する主要なUQ種であり、一方、UQ9はマウスおよびラットにおいて支配的である（Dallner, G.およびSindelar, P. J. (2000). Free Radic Biol Med 29, 285-94）。UQ9およびUQ10の組織分布の差異は、表３に示される（Dallner, G.およびSindelar, P. J. (2000). Free Radic Biol Med 29, 285-94）。
【表３】
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【００４５】
UQ側鎖の長さはポリプレニル二リン酸合成酵素によって制御される。これらの酵素は必須遺伝子によってコードされており、酵母（coq1：ヘキサプレニル二リン酸合成酵素）、大腸菌（ispB：オクタプレニル二リン酸合成酵素）およびロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）（sdsA：ソラネシル二リン酸合成酵素）を含む多くの生物でクローニングされている。
【００４６】
線虫を用いた、UQの側鎖長の重要性の評価。線虫に与えられる外因性のUQは、本来のispB遺伝子がノックアウトされ、レスキュープラスミドに含まれる異なる種類のispBと置換された大腸菌突然変異株に線虫を曝すことによって処置された。ispBの種類は、バクテリアで産生されるUQの側鎖長を決定する。N2（Bristol）を野生型系統として用い、clk-1（qm30）、clk-1（qm51）、clk-1（e2519）およびdaf-2（e1370）変異体系統を解析した。使用されたバクテリア株の遺伝子型は表４に記載される。変異型のispBをコードしているプラスミドは表５に記載される。表６は、一腹卵数サイズの測定から得られた結果を示している。10個体の線虫のすべての子孫を数えた。実験は２回行った。
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【００４７】
様々なバクテリア株上での成長速度
様々なバクテリア株上での線虫の後胚発生を定性評価した。N2およびdaf-2変異体はすべてのバクテリア株上において同様の速度で成長することが観察された。しかし、clk-1（qm30）変異体は、OP50およびKO229（pSN18）上で同様の成長速度を有していたが、他の株上では3〜5日遅れた。また、clk-1（e2519）変異体の後胚発生は、KO229（R321）変異体上でOP50と比較して約１日遅れた。KO229（Y37A/Y38A）上でのそれらの成長はそれほど重度の影響を受けない。最後に、clk-1（e2519）の産卵の開始は、KO229（Y37A/Y38A）上で1日、KO229（R321A）およびKO229（Y37A/R321A）上で3日遅れた。
【００４８】
従って、これらの実験は、短鎖ユビキノンを生じるバクテリア株上でのclk-1変異体の挙動によって示されるように、線虫におけるユビキノンの側鎖長に感受性のプロセスを明らかにした。不適当な鎖長はqm30における発生および繁殖能力を激しく変化させ、e2519では穏やかに変化、または全く変化させなかった。
【００４９】
検出可能なユビキノンを産生しないことが知られているという事実にも関わらず、clk-1（e2519）変異体がほとんど影響を受けないという知見は、CLK-1がユビキノン合成とは異なる過程に関与することを示す。また、e2519変異がこの付加的な機能またはCLK-1の機能にさほど影響を及ぼさないと推測することもできる。しかし、clk-1（e2519）変異体は完全なユビキノン非存在下では発生できないので、これらの過程はユビキノン依存性である。例えば、ユビキノンはこれらの過程におけるレドックスコファクターとして作用する可能性がある。
【００５０】
線虫の発生および繁殖能力のために内因性のユビキノンが必要である
食餌性のUQが線虫の発生に十分であるかどうかを調べるために、線虫遺伝子coq-3のノックアウト変異体が作製された（配列番号１）。coq-3はメチルトランスフェラーゼ（配列番号２）をコードし、そのホモログ（Coq3pおよびUbiG）は酵母および大腸菌それぞれで詳細に解析されている。その酵素はQ合成の2つの異なる段階で作用し、酵母およびバクテリアの変異体ではUQとDMQとのいずれも産生されない。線虫のCOQ-3タンパク質は、酵母のCoq3pと29%、大腸菌のUbiGと28%一致する（図５および配列番号３〜６）。coq-3の欠失を同定するために、標準的な手法を応用して、ランダム突然変異導入およびPCRに基づくスクリーニングの方法が用いられた。coq-3遺伝子は線虫の第４染色体上に位置し、図１に示すように、gdi-1遺伝子およびNADH-ユビキノン酸化還元酵素遺伝子を包含するオペロンの一部である。coq-3は、5つの予測エキソンを含む。coq-3（qm188）における欠損は、2456bp（配列番号７）が失われ、従ってエキソン３および４（配列番号１および８）を欠如し、如何なる機能的なタンパク質の産生をも妨げる。coq-3の遺伝子型を確認するためにPCR解析を行い、プライミング領域がcoq-3遺伝子の外側、または、qm188変異体で得られる欠失に対応した領域の内側のいずれかであるプライマーのセットを用いた。coq-3遺伝子の欠失の存在を確認するために、単独の線虫由来のゲノムDNAを用いてPCR解析を行った。各DNA調製品を、同時に、coq-3遺伝子の外側（SHP 1772（5'-CTGATTTCTTCCAGAGCTCTCTTGCCGCAC3'）（配列番号９）、SHP 1773（5'-AGCATTCCCGAGATGATGCACTCCTTGAGG-3'）（配列番号１０）、SHP 1774 （5'-TAGCGACTCTCAGCGACAAGCTTAACC-3'）（配列番号１１）およびSHP 1775 （5'-GAGGCCGGTTCCGAGACGATGGCATCG-3'）（配列番号１２））、または、得られた欠失の内側（SHP 1840 （5'-CCTCCTCGCGCACTACACACCATC-3'）（配列番号１３）およびSHP 1865（5'-CGAAGCGACGACTGCATCGTAGGC-3'）（配列番号１４））のいずれかの配列を認識するプライマーによって検査した。図１はプライマーの位置を表示する。coq-3遺伝子全体を増幅するプライマーを用いた時、野生型の線虫では4.3kbのバンドが得られた。一方、変異体のバンドは、coq-3/coq-3の線虫から1.8kbで増幅された。欠失領域にアニーリングするプライマーを用いた時、野生型およびヘテロ接合体線虫は両者とも1.1kbのPCR産物を生じた一方、coq-3/coq-3ホモ接合体線虫から検出されるバンドはなく、coq-3/coq-3変異体のホモ接合体の性質が確認された。
【００５１】
PCRで確認されるように、coq-3(qm188)/+両性個体の自家受精は1/4のホモ接合coq-3(qm188)/coq-3(qm188)の子孫を生じる。これらのcoq-3ホモ接合体は発生が遅く、野生型の線虫より相当小さい。大部分は不妊だが、約25%（n= 31）はいくらかの子孫（5〜10の卵）を生じ、それはL1期で成長を停止し、その後直ちに死亡する。一腹卵数サイズ測定のために、全部で20個体の線虫の子孫が数えられた。第一世代のホモ接合体の表現型（成虫への遅い成長）は第二世代のホモ接合体の表現型（L1期での停止）ほど重篤ではないので、観察はヘテロ接合型の母親によるcoq-3ホモ接合体の部分的な母性レスキュー効果を示唆する。母親によって胚に供給される、または、coq-3 mRNAもしくはタンパク質の母性貯蔵物に供給されるUQは、母性効果を提供することができる。
【００５２】
また、ヘテロ接合coq-3/dpy-4線虫の一腹卵数サイズが大きく減少すること（185±64; n=20）が観察され、このことは、coq-3発現のレベルがUQ生合成を制限し得、線虫の繁殖能力が内因性UQ生合成のレベルの減少に非常に敏感なことを示唆している。
【００５３】
観察された表現型がcoq-3遺伝子の突然変異だけに起因することを確かめるために、rol-6形質転換マーカーを用い、生殖細胞系列の形質転換によって、野生型のcoq-3遺伝子に対応するゲノム断片をcoq-3/+ヘテロ接合体に導入した。標準的な染色体外配列の作製に続いてマイクロインジェクション処置を行った。レスキューを検定するために、coq-3ゲノム配列を包含するPCR断片（50 ng/μL）を注入した。トランスジェニック線虫をスクリーニングするための共注入マーカーとして、pRF4プラスミド（120 ng/μL）を使用した。coq-3ホモ接合体は致死であるため、インジェクションのためにcoq3/dpy-4線虫を用いた。それらの子孫においてDpy表現型の欠如を確認することによって、ホモ接合型のレスキューされた系統を選抜し、PCR解析によってその遺伝子型を確認した。
【００５４】
ホモ接合coq-3トランスジェニック動物（マーカー表現型はRolを示す）は正常に発生し、且つ繁殖能力があるので、観察された表現型は実際にcoq-3欠失に起因することが示される。しかし、coq-3およびrol-6配列を持つ染色体外配列は、強い母性効果を生じ得ない。実際、その配列を有する母親（表現型はRol）から直接生じた、該配列を有していないホモ接合動物（表現型は非Rol）は、L2期より先へは発達しなかった。染色体外配列由来の遺伝子の発現は時に抑制されることがあり、線虫生殖細胞系列ではわずかである。母性効果の知見は、母親から卵母細胞に必須の産物を蓄積させること（UQおよび/またはcoq-3のmRNA）を示す。いずれにせよ、生殖細胞系列でのcoq-3の適切な発現は、この効果に必要である。
【００５５】
coq-3変異体の致死の表現型は、食餌性のUQが線虫の成長および発生に十分でないことを示唆する。これは、食餌性のUQがミトコンドリア区画に到達できない、または、非常に少量に過ぎないことを示唆する他の系での発見と一致する。ubi +バクテリア上で育てられたclk-1変異体の生存能力のある表現型、およびubi-変異体バクテリア上で育てられた際のそれらの致死性の表現型を説明するために、食餌性のUQが線虫にとって十分であり得るという可能性が示された。しかし、coq-3変異体の表現型は、食餌性のバクテリアUQ8の存在下であっても、（coq-3変異体における）内因性UQ9およびDMQ9の完全な欠如が（clk-1変異体における）内因性DMQ9による内因性UQ9の代替と同等でないことを明示している。
【００５６】
これに関連して、clk-1変異体がubiF変異体の摂食によって生育できないことは非常に興味深い。実際、ubiF変異体におけるUQ生合成はclk-1変異体と同じレベルで遮断され、従ってubiFバクテリアはDMQ8を産生する。DMQ9はミトコンドリアの呼吸鎖で効率的に機能するので（Miyaderaら2001）、我々の発見は、UQを必要とする非ミトコンドリア部位で内因性および食餌性のDMQはともにUQと置換できないことを実証する。
【００５７】
ユビキノンはミトコンドリアおよび非ミトコンドリア部位で必要である
ここに示す結果は、異なる細胞内区画でUQが線虫の成長および発生のために必要であることを実証する。第一に、ミトコンドリアにおいて、内因性DMQ9は機能的に内因性UQ9と置換できる。実際、clk-1変異体のミトコンドリアはUQ9を含まないが、機能的に能力があり（Miyadera, H.ら、(2001). J Biol Chem 276, 7713-6）、UQ9とDMO9のいずれをも産生しないcoq-3変異体の表現型はclk-1変異体のそれより更に重篤である。第二に、非ミトコンドリア部位では、内因性のDMQ9、食餌性のDMQ8、または、8イソプレン単位より短い側鎖長を持つUQは、機能的に内因性UQ9と置換できないが、一方で食餌性のUQ8はそうすることができる。事実、機能的なミトコンドリアを有しDMQ9を産生するclk-1変異体は、ubiFバクテリア由来の食餌性DMQ8または短い側鎖を有する食餌性UQの存在下であっても、食餌性のUQ8なしでは発生および成長ができない。
【００５８】
これは、齧歯類などの他の系におけるUQ取り込みおよび代謝に関する数多くの研究による発見と一致している（Dallner, G.およびSindelar, P. J. (2000). Free Radic Biol Med 29, 285-94）。これらの実験において食餌性のUQは不完全に（初めに摂取されたUQの2-3%）しか取り込まれず、その後、大部分は細胞膜、リソソーム、ゴルジに分布されると考えられ、ミトコンドリアには存在するとしても微量である。すべての細胞が内因的にUQを産生することを考えれば、このかなり複雑な脂質を吸収するための能動的な取り込みシステムは同定されていない。
【００５９】
これらの研究は、線虫の生物学における内因性および食餌性のUQの役割を明らかにする。また、非ミトコンドリア領域における生物の生存または繁殖能力に対するUQの機能の重要性を初めて実証した。非ミトコンドリア部位における食餌性UQの作用は、ミトコンドリア病の患者に対する食餌性UQの有益効果の基礎となり得る（Dallner, G.およびSindelar, P. J. (2000). Free Radic Biol Med 29, 285-94）。例えば、UQは細胞膜において細胞のレドックス状態を制御する反応に関与することが見いだされている。不完全なミトコンドリアに起因する病状は細胞の酸性ストレスを増加させることがしばしば見いだされ、食餌性UQは細胞膜での保護機能を促進し得る。更に、バクテリアでは、キノンは細胞のレドックス状態の一次シグナルとして作用することが発見されている。大腸菌では、UQは遺伝子発現の重要且つ広範な調節因子であるArcBのリン酸化状態および機能を負に調節する。
【００６０】
coq-3およびclk-1変異系統は、ミトコンドリアおよび/または非ミトコンドリア部位で選択的にユビキノンに代わる化合物を同定するための遺伝学的システムを提供する。このような化合物の選抜は、UQ欠損バクテリア上で成長するもしくは成長しないcoq-3またはclk-1変異体の表現型を選択的にレスキューする、それらの能力に基づくことができる。例えば、ミトコンドリアに到達できる化合物はcoq-3変異体の表現型をレスキューするはずである。一方、ミトコンドリアの外側の部位に選択的な化合物は、UQ欠損バクテリア上で成長させたclk-1線虫の表現型をレスキューするが、野生型バクテリア上で成長させたcoq-3動物の致死表現型をレスキューしないはずである。このような生体で利用可能なユビキノン模倣物は、大きな医学的関心が持たれる。
【００６１】
Mus musculusのmclk-1遺伝子破壊の表現効果に関する研究
相同組換えによってマウスの胚性幹（ES）細胞でのmclk1遺伝子座を破壊し、標準的な方法を用いてヘテロ接合およびホモ接合マウスを作製した。129/SvJマウス系統のDNA由来のIFIX IIゲノムライブラリー（Stratagene）をゲノムmclk1断片を用いてスクリーニングし、６つの重複するゲノムクローンを得た。２つのクローンからのゲノムDNA断片をBluescript SKにサブクローニングし、詳細に解析した。mclk1プロモーターの一部ならびにエクソンI、IIおよびIIIを含む7kbのNotI-BamHI断片をBluescript SKにサブクローニングした（pL5）。StuI/BamHI消化によってエクソンIIの一部およびエクソンIIIを含む1.6kbの断片をpL5から除去し、pL5+Neoを作製するために、pMC1Neo polyA由来の1.1kbの平滑化XhoI-BamHI断片から成るネオマイシンカセットに置換した。イントロンIVおよびVならびに5'UTR領域からの500bpを含む2.8kbのPstI-SacIゲノム断片をBluescriptにサブクローニングした（pL15）。最終的な置換ターゲッティングベクターpL17を作製するために、pL15からの2.5kbのEcoRV-XhoI断片をpL5+NeoのSmaI-XhoI部位に挿入した。ターゲッティングベクターからのKpnI断片を単離し、R1胚性幹細胞（ES）にエレクトロポレーションを行った。サザンブロット解析によってターゲッティングに成功したクローンを同定した。ゲノムDNAをBglIIによって消化し、その後、ターゲッティングベクターの3'領域に隣接する3'外部のプローブ（SacI-XhoI断片）を用いてハイブリダイズした。ゲノムへのランダムな組込みを検出するためにネオマイシンプローブを使用した。ESクローンをCD-1マウスの胚盤胞に注入し、生殖細胞系列への伝達を獲得した。解析された2000のG418耐性クローンのうち、４つが相同組換え体であった。正しい核型を持つ２つの独立にターゲッティングされたES細胞クローンを用いて、ホモ接合（-/-）mclk1マウスを作製した。図2A、CおよびDは、野生型mclk1遺伝子座およびターゲッティングベクターの地図を表し、黒いボックスはエクソンを示す。ターゲッティングベクターは、図2で白いボックスとして示されたネオマイシン遺伝子による、エクソンIIの一部ならびにエクソンIIIおよびIVの置換で構成されている。示された制限酵素部位は、BamHI; B, BglII; E, EcoRI; K, KpnI; R, EcoRV; S, SacI; X, XhoIである。Mus musculusの野生型mclk-1遺伝子座およびmclk-1の変異型ノックアウト対立遺伝子のゲノム配列は、それぞれ図6A-G（配列番号１５）および図7A-G（配列番号１６）に示される。
【００６２】
遺伝子型決定のために、成体マウスの尾または胚の卵黄嚢からDNAを調製した。上述のようにサザンブロット解析を行った。PCRは30サイクル（95℃, 30秒; 58℃, 30秒; 72℃, 30秒）で行った。野生型mclk1対立遺伝子を検出するために用いられたプライマーは以下のとおり、すなわち、フォワード（KO5）5'- ggt gaa gtc ttt tgg gtt tga gca t-3'（配列番号１７）; リバース（KO6）5'- tgt cta agg tca tcc ccg aac tgt g-3'（配列番号１８）である。それらは302bpのバンドを増幅させる。プライマーKO7（5'- gcc agc gat atg act cag tgg gta a-3'）（配列番号１９）およびKO8（5'- cac ctt aat atg cga agt gga cct g-3'）（配列番号２０）を用いて、ターゲッティングされたmclk1対立遺伝子を検出し、それは397bpの産物を生じる。図2EはPCR解析を示す。
【００６３】
ヘテロ接合（+/-）マウスは生存能力および繁殖能力がある。それらは明白な解剖学上のまたは行動上の欠陥を示さない。しかし、ヘテロ接合型のオスおよびメスのマウスを交配した後、81匹以上の仔の中で新生（-/-）マウスは観察されず（表７）、mclk1のホモ接合型破壊は胚性致死を引き起こすことを示した。致死性の性質を決定するために、ヘテロ接合体間の交配による胚を妊娠期間の様々な日に解析した（表７）。mclk1（-/-）の胚はE8.5には予想されるメンデル頻度で出現した。しかし、E13.5までには、検出されたすべてのmclk1（-/-）の胚は吸収される過程にあった。ホモ接合型の胚はまた、交配後9.5日（E9.5）までに明らかに見られる発生の遅延を示した（図３）。突然変異体は野生型の同腹子と比較して著しく小さい。
【表７】
2004537322.tif 000008
【００６４】
全E11.5胚のRNAのノーザンブロット解析は、mclk1 mRNA量が正常の胚と比較してヘテロ接合型の胚において約50%まで減少し、mclk1（-/-）の胚では検出できないことを示した。図2Bは、mclk1 +/+および+/-マウスの組織ならびにE11.5のmclk1 +/+、+/-および-/-の同腹子からの全RNAレベルのノーザンブロット解析を示す。ミトコンドリアにコードされるチトクロームオキシダーゼ（複合体IV）のサブユニットであるcox1の発現レベルは、対照の１つとして示される。cox1の発現レベルは、与えられた組織における酸化的リン酸化能力の良い指標を提供する。プローブとして全長のマウスmclk1 cDNAを用いて、ノーザンブロットを行った。ホモ接合型の胚で観察されるレベルの減少は、吸収過程の開始によるものと思われる。野生型の同腹子と比較して、44日齢のmclk1 （+/-）マウスの肝臓、心臓、腎臓、筋肉、胃および小脳では、mclk1 転写産物の約50%の減少が観察された。ポリクローナル抗体を用いた免疫ブロッティングは、（+/+）および（+/-）マウスの肝臓および心臓抽出液で約21kDaのバンドを示した。このシグナルは（+/+）マウスと比較して（+/-）マウスにおいて約50%まで減少した。この結果はmclk1変異がヌル変異であることを確認し、（+/-）マウスにおけるタンパク質減少の遺伝子量効果を実証した。mCLK1ならびに対照のCOX1およびポーリンに対する抗体によって、2日齢マウスの肝臓および心臓由来の全タンパク質抽出液を検査した。ポーリンは核にコードされるミトコンドリア外膜のタンパク質である。Molecular ProbesからのチトクロームオキシダーゼサブユニットI（1D6-E1A8）およびIV（20E8-C12）に対するモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロットを行い、ヒトポーリン31HLに対するモノクローナル抗体はCalbiochemから購入された。
【００６５】
mclk1 （+/+）、（+/-）および（-/-）の胚のホモジェネート中のユビキノン-9（UQ9）ならびにユビキノン-10（UQ10）の量をHPLCによって測定した。キノンの解析および酵素活性の測定のための無細胞抽出液は、以下のように調製した。サンプルを50mMリン酸カリウムバッファー（pH7.4）でホモジェナイズし、1,000 x gで5分間4℃で遠心分離した。上清をキノン含量の決定および酵素活性の測定に用いた。標準としてウシ血清アルブミンを用いてタンパク質濃度を測定した。わずかな修正を加えて、記載のとおりに（Miyadera, H. ら、 (2001). J Biol Chem 276, 7713-6）キノンを抽出した。簡潔に述べると、n-ヘキサン/EtOHに抽出されたキノンを窒素ガス雰囲気下で乾燥させ、アセトンに溶解して、-80℃に置いた。30分後、サンプルを17,000 x gで15分間4℃で遠心分離し、上清を窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。残留物をEtOHに溶解し、2分間ボルテックスし、ガードカラムおよび分析カラム（CSC 80 a, ODS2, C-18, 5 μm, 4.6 x 250mm）を装備したHPLC（Model 100A, Beckman）に適用した。移動相は流速2ml/minのメタノール/エタノール（70/30, v/v）であった。溶出は波長検出器（165 variable wavelength detector, Beckman）によって275nmで観測された。記述されたように（Miyadera, H. ら、 (2001). J Biol Chem 276, 7713-6）分光光度法でキノンの濃度を測定する。
【００６６】
mclk1 +/+の胚では、主要なピークは11.9分で溶出し、溶出時間は標準UQと同一である。約17.3分のより小さいピークはUQ10に相当する。ヘテロ接合mclk1（+/-）の胚のキノンプロフィールは野生型のそれと同等である。野生型およびヘテロ接合型の胚において、UQ9およびUQ10の量は同じであった（表８）。しかし、mclk1（-/-）の胚では、UQ9およびUQ10のいずれの存在も観察されなかった（表８）。これらの突然変異の胚は、代わりに、UQ9より0.46分早く溶出する主要なピークを示し、これはDMQ9であるための基準に適合する。
【表８】
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【００６７】
mclk1（+/+）、（+/-）および（-/-）のES細胞株は、標準的な手順によってヘテロ接合体の交配から得られたE3.5胚盤胞に由来していた。これらの株で観察されたキノンプロフィールは、濃度を含めて、同等の突然変異の胚から得られたものと同一のパターンをたどる（表８）。特に、mclk1（-/-）のES細胞株（ES7）では、DMQ9のみが検出された。
【００６８】
線虫のclk-1変異体の場合のように、mclk1変異体で産生されるDMQは比較的高レベルの酸素消費（野生型の62%）の維持に十分であると考えられる。この程度のレベルのミトコンドリア機能が胚形成を行うのに不十分であることは意外である。しかし、多数の因子が表現型の重度に関与することもあり得る。また、UQはほとんどすべての生体膜で見いだされ、脱共役タンパク質（UCP）の透過性の移行孔を調節するコファクターであることや、細胞膜およびリソソームの酸化還元酵素系における機能が知られている。DMQは呼吸鎖において部分的にUQと置換できるが、UQの他の機能のいくつかに対して、DMQはUQアナログとしての効率が低く、その結果生じる欠陥が表現型の重度に関与するのかもしれない。最後に、最近、バクテリアにおいてキノンが酸素の利用性に応答した成長の調節のための一次シグナルであることが発見された。環境シグナルを感知する重要な分子機構（例えば、PASドメインタンパク質）の原核生物と真核生物との間の保存性を考慮すると、mclk1変異体の完全なUQの欠損は胚発生の調節に直接影響を及ぼす。
【００６９】
mclk1遺伝子の組織特異的および時期制御型ノックアウトの研究
更に、Mus musculus においてmclk1遺伝子の組織特異的および時期制御型ノックアウトの研究に着手した。以下のように、mclk1flox対立遺伝子を作製し、キメラマウスを作製した。特定の細胞におけるmCLK1タンパク質の機能的役割を研究するために、Cre-loxPを介した組換えによる条件付き遺伝子不活性化の技術が用いられた。Cre組換えによって改変され得るmclk1対立遺伝子を作出するために、両側をloxP部位に挟まれた選択カセットをエクソン4の下流に導入した、エクソン2の上流に第３のloxP部位を持つ約7.5kbのmclk1ゲノムDNAを含むターゲッティングベクターを構築した（図4A-Cおよび図8A-H（配列番号２１）参照）。図4A-Cにおいて、横線はclk1ゲノムDNAを表す。エクソンは白抜きの囲みによって表される。灰色の囲みはneo-TK発現カセットを表し、neoおよびTK発現の方向は矢印によって示される。黒い矢頭はloxP部位を表す。制限酵素部位は、BglII (B), BspeI (P), EcoRI (E), HindIII (H), SacI (S), SwaI (W), XhoI (X)である。ES細胞のトランスフェクション後に、サザンブロット解析によって相同組換えを同定した。ゲノムDNAをBglIIによって消化し、その後、ターゲッティングベクターの3'領域に隣接する3'外部のプローブ（SacI-XhoI断片）を用いてハイブリダイズした。大規模なサザンブロットによって、期待されるネオマイシン耐性クローンを解析した後、３つのクローン（30、48および84）が正しい相同組換えを示した（図4）。図4Aはmclk1遺伝子座およびターゲッティングベクターの概略図を示す。サザンブロットに用いられた異なるプローブが描かれている。図4Bは異なる酵素による消化の際、予想される断片サイズを示す。図4Cは、異なるプローブを用いてBglIIまたはEcoRIで消化されたDNAについてサザンブロットが行われたことを示す。エクソン2の上流に第３のloxP部位の挿入を持たずに、エクソン4の下流に両側をloxP部位に挟まれた選択カセットの挿入がある場合、9kbのバンドが得られ、図4C内の＊によって示される。
【００７０】
mclk1flox対立遺伝子の作製の詳述は次の通りである。129/SvJ系統マウスのライブラリー（Stratagene）からmclk1ゲノムDNAを単離し、エクソン2、3、4、5および6を含む約7.5kbのHindIII-XhoI断片をpBluescriptにサブクローニングした。loxP部位を含むプライマー（3'-CCG GAG CTA GCG AGC TCG GAA TAA CTT CGT ATA ATG TAT GCT ATA CGA AGT TAT GGC GAA TT-5'）（配列番号１１）をエクソン2の上流のBsepI部位に導入した。ターゲッティング置換ベクターpL75を作製するために、２つのloxP部位に挟まれたneorおよびHSV-tk遺伝子を含むカセットをイントロン4内のSwaI部位に挿入した。このカセット、4.3kb のXhoI/NotI断片はプラスミドCDLNTKL（配列番号１２）から単離され、3'陥凹末端はクレノー酵素によって埋め込まれた。
【００７１】
相同組換え体を作出するために、129/SvJマウスに由来するR1 ES細胞（継代12回で）にHindII-XhoIターゲッティングベクター断片をエレクトロポレーションした。サザンブロットハイブリダイゼーションによって相同組換え体を同定した。ゲノムDNAをBglIIで消化し、その後、ターゲッティングベクターの3'領域に隣接する3'外部のプローブ（SacI-XhoI断片）を用いてハイブリダイズした。他のプローブはゲノムへのランダムな挿入を検出するために用いられた。65℃で16時間、6×SSC、5×Denhart、0.5% SDS中でハイブリダイゼーションを行った。ブロットを3×SSC、0.1% SDSで20分間づつ２回、その後、1×SSC、0.1% SDSで２回洗浄した。
【００７２】
I型およびII型の欠損を作製するために、5×106の相同組換え細胞に25μgのcre-リコンビナーゼを包含するpBS185をエレクトロポレーションし、培養し、48時間後に2μMガンシクロビルによって選択した。生存クローンをサザンブロットによって解析した。ゲノムDNAをSacIIによって消化し、その後、ターゲッティングベクターの3'領域に隣接する3'外部のプローブ（SacI-XhoI断片）を用いてハイブリダイズした。
【００７３】
本発明はその特定の実施形態に関連して記述されているが、更なる改変が可能であり、本出願は、一般に、本発明の原理に従う、ならびに、本発明の属する技術分野の既知の事実または慣例の中に含まれ、以上に示した本質的特徴に適用されうる、および添付の請求項の範囲に従うような、本開示からの発展を含む、任意の変化、用途または適応を網羅することを目的とすることが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１はcoq-3遺伝子およびcoq-3（qm188）におけるその欠失を示す。
【図２Ａ】図２Ａはマウスmclk1遺伝子のターゲッティング破壊を示す。
【図２Ｂ−Ｅ】図２Ｂ-Ｅはマウスmclk1遺伝子のターゲッティング破壊を示す。
【図３】図３はmclk1変異胚における重度の発生遅延を示す。
【図４Ａ】図４Ａはmclk1flox対立遺伝子の作製をを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂはネオマイシン耐性クローンに対するサザンブロットによる解析断片を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃはネオマイシン耐性クローンに対するサザンブロットによる解析結果である。
【図５Ａ】図５は異なる種に由来するCOQ-3タンパク質（配列番号３〜６）の比較を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは図５Ａの続きである。
【図６Ａ】図６Ａ-ＧはMus musculusのmclk-1ゲノム配列を示す（エクソンは太字体である）（配列番号１５）。
【図６Ｂ】図６Ｂは図６Ａの続きである。
【図６Ｃ】図６Ｃは図６Ｂの続きである。
【図６Ｄ】図６Ｄは図６Ｃの続きである。
【図６Ｅ】図６Ｅは図６Ｄの続きである。
【図６Ｆ】図６Ｆは図６Ｅの続きである。
【図６Ｇ】図６Ｇは図６Ｆの続きである。
【図７Ａ】図７Ａ-ＧはMus musculusのmclk-1の変異ノックアウト対立遺伝子ゲノム配列を示す（エクソンは太字体、ネオマイシンカセットは小文字である）（配列番号１６）。
【図７Ｂ】図７Ｂは図７Ａの続きである。
【図７Ｃ】図７Ｃは図７Ｂの続きである。
【図７Ｄ】図７Ｄは図７Ｃの続きである。
【図７Ｅ】図７Ｅは図７Ｄの続きである。
【図７Ｆ】図７Ｆは図７Ｅの続きである。
【図７Ｇ】図７Ｇは図７Ｆの続きである。
【図８Ａ】図８Ａ-Ｈはmclk1flox対立遺伝子の配列を示す（エクソンは太字体、loxp配列はイタリック、挿入されたDNA断片は下線で示される）（配列番号２１）。
【図８Ｂ】図８Ｂは図８Ａの続きである。
【図８Ｃ】図８Ｃは図８Ｂの続きである。
【図８Ｄ】図８Ｄは図８Ｃの続きである。
【図８Ｅ】図８Ｅは図８Ｄの続きである。
【図８Ｆ】図８Ｆは図８Ｅの続きである。
【図８Ｇ】図８Ｇは図８Ｆの続きである。
【図８Ｈ】図８Ｈは図８Ｇの続きである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ−Ｅ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004537322.tif 000149
【国際調査報告】
2004537322.tif 000150
2004537322.tif 000151
2004537322.tif 000152
2004537322.tif 000153
2004537322.tif 000154