(57)【要約】高分子の露出された位置（１ｃ）を優先的に観察するための方法。サンプルは、第１のプロトン（１）を有する高分子（１ａ）および第２のプロトン（２）を有する第２の分子（２ａ）を有する工程；次いで、該サンプルに磁場（４）を適用し、該サンプルを、該第２のプロトン（２）と比較して、該高分子（１，３）のプロトンを優先的に消磁するパルスシーケンス（５）で照射する工程；該第２のプロトン（２）を該高分子の露出されたプロトン（１）と交換（１６）させる工程；および該相対的に磁化された第２のプロトン（２）（これは、ここで、該高分子の露出された位置（１ｃ）に結合されている）から該磁化を検出する工程によって、得られる。本発明はまた、リガンドと結合する高分子における位置を観察するための方法を提供する。
2004516476.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子の露出された位置を優先的に観察するための方法であって、該方法は以下：
（ａ）高分子および第２の分子を含むサンプルを得る工程であって、ここで、該高分子が３５ｋＤａより大きく、該第２の分子に対して露出された位置を有し、ここで、第１のプロトンが、該高分子の露出された位置に結合され、第２のプロトンが、該第２の分子に結合され、そして該第１のプロトンが該第２のプロトンと交換され得る、工程；
（ｂ）該サンプルに磁場を適用し、それによって該第１のプロトンおよび該第２のプロトンを磁化する工程；
（ｃ）該サンプルを、該第２のプロトンに対して該高分子のプロトンを優先的に消磁するパルスシーケンスで照射する工程；
（ｄ）該第２のプロトンを該第１のプロトンと交換させ、それによって、該相対的に磁化された第２のプロトンが、該高分子の露出された位置に結合する、工程；および
（ｅ）該第２のプロトンから該磁化を検出する工程；
を包含し、これによって、該高分子の該露出された位置が、優先的に観察される、方法。
【請求項２】
前記高分子が、ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記高分子が、約５０ｋＤａより大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記高分子が、約７５ｋＤａより大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記高分子が、約１００ｋＤａより大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドの構造が、ＮＭＲ技術によって完全に決定されない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質のアミノ酸の５％未満についての共鳴が、ＮＭＲ技術によって割り当てられる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質のアミノ酸の１０％未満についての共鳴が、ＮＭＲ技術によって割り当てられる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質のアミノ酸の５０％未満についての共鳴が、ＮＭＲ技術によって割り当てられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質のアミノ酸の７５％未満についての共鳴が、ＮＭＲ技術によって割り当てられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の分子が、プロトン性溶媒である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２の分子が、水である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２の分子に露出される前記高分子上の位置が、１５Ｎを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記パルスシーケンスが、１５Ｎフィルターを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記パルスシーケンスが、ＳＥＡパルスシーケンスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記工程（ｃ）が、１５Ｎ、１Ｈ  ＴＲＯＳＹをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記パルスシーケンスが、ＳＥＡ−ＴＲＯＳＹパルスシーケンスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記工程（ｄ）が、予め決定された混合時間の間に起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記混合時間が、２５ｍｓと３００ｍｓとの間である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記混合時間が、５０ｍｓと１５０ｍｓとの間である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記混合時間が、８０ｍｓと１２０ｍｓとの間である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の方法であって、該方法は、以下：
（ｆ）前記サンプルについて異核相関測定値を決定する工程であって、ここで、該相関された核の一方が、１Ｈである、工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項２３】
前記相関測定値が、１５Ｎ−１Ｈ相関測定値である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項２２に記載の方法であって、該方法が、以下：
（ｇ）前記相関された核と第３の核との間の第２の異核相関測定値を決定する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項２５】
前記工程（ｇ）が、ＨＮＣＡ測定値を取り込む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記工程（ｇ）が、ＨＮＣＡＣＢ測定値を取り込む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ＮＯＥＳＹ測定値をさらに取り込む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記高分子が、前記露出された位置と異なる位置に結合されたリガンドを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２の分子がリガンドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記リガンドが、前記高分子の天然リガンドである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記リガンドが、前記高分子の天然リガンドの模倣物である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
請求項２９に記載の方法であって、前記サンプルが、溶媒中に存在し、該方法が、該溶媒のプロトンを優先的に消磁するパルスシーケンスで該サンプルを照射する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３３】
リガンドと結合する高分子における露出された位置を観察するための方法であって、
ここで、該高分子は、３５ｋＤａより大きく；該第２の分子に対して露出された該高分子上の位置に結合された複数のプロトンを有し；そして該露出されたプロトンが、該第２の分子のプロトンと交換され得、該方法が、以下：
（ａ）該高分子および第２の分子を含む第１のサンプルに対して、請求項１に記載の方法を実施する工程、
（ｂ）該高分子および該第２の分子を含む第２のサンプルに対して、請求項１に記載の方法を実施する工程であって、ここで、該高分子がリガンドと結合される、工程、および
（ｃ）該第１のサンプルと比較して、該第２のサンプルにおける摂動を検出する工程、
を包含し、これによって、該リガンドと結合する該高分子における該露出された位置を観察する、方法。
【請求項３４】
前記摂動が、化学シフト変化である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記摂動が、シグナル強度の減少である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記摂動が、前記第１のサンプルと前記第２のサンプルとの間の差次的プロトン交換である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
第２のリガンドが、前記第１のリガンドの結合位置と異なる位置で、前記第１のサンプル中の高分子に結合される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
リガンドと結合する高分子における露出された位置を観察するための方法であって、
ここで、該高分子が３５ｋＤａより大きく；該第２の分子に対して露出された該高分子上の位置に結合された複数のプロトンを有し；そして該露出されたプロトンが、該第２の分子のプロトンと交換し得、該方法が、以下：
（ａ）該高分子および第２の分子を含む第１のサンプルに対して、請求項１に記載の方法を実施する工程、
（ｂ）該高分子、該第２の分子およびリガンドを含む第２のサンプルに対して、請求項１に記載の方法を実施する工程であって、ここで、該第２の分子およびリガンドが、二者択一的に、該高分子と会合し、そして該高分子から解離する、工程；および
（ｃ）該第１のサンプルと比較して、該第２のサンプルにおける摂動を検出する工程、
を包含し、これによって、該リガンドに結合する該高分子における露出された位置を観察する、方法。
【請求項３９】
前記リガンドが前記高分子と会合する速度が、該高分子の該露出されたプロトンが該第２の分子のプロトンと交換する速度より、１０倍以下高い、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記摂動が、化学シフト変化である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記摂動が、シグナル強度の減少である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記摂動が、前記第１のサンプルと前記第２のサンプルとの間の差次的なプロトン交換である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
第２のリガンドが、前記第１のリガンドの結合位置と異なる位置で前記第１のサンプル中の前記高分子に結合される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
２個のリガンドに対して差次的に露出された、高分子における位置を観察するための方法であって、
ここで、該高分子が３５ｋＤａより大きく；該第２の分子に対して露出された該高分子上の位置に結合された複数のプロトンを有し；そして該露出されたプロトンが、該第２の分子のプロトンと交換し得、該方法が、以下：
（ａ）該高分子、該第２の分子および第１のリガンドを含む第１のサンプルに対して、請求項１に記載の方法を実施する工程であって、ここで、該第２の分子および第１のリガンドが、二者択一的に、該高分子と会合し、そして該高分子から解離する、工程；
（ｂ）該高分子、該第２の分子および第２のリガンドを含む第２のサンプルに対して、請求項１に記載の方法を実施する工程であって、ここで、該第２の分子および第２のリガンドが、二者択一的に、該高分子と会合し、そして該高分子から解離する、工程；および
（ｃ）該第１のサンプルと比較して、該第２のサンプルにおける摂動を検出する工程、
を包含し、これによって、該第２のリガンドと比較して、該第１のリガンドの存在下で差次的に露出された該高分子における位置を観察する、方法。
【請求項４５】
前記リガンドが前記高分子と会合する速度が、該高分子の該露出されたプロトンが該第２の分子のプロトンと交換する速度より、１０倍以下高い、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記摂動が、化学シフト変化である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記摂動が、シグナル強度の減少である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記摂動が、前記第１のサンプルと第２のサンプルとの間の差次的なプロトン交換である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
第２のリガンドが、前記第１のリガンドの結合位置と異なる位置で前記第１のサンプル中の前記高分子に結合される、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、大まかには高分子の構造に関し、そしてより詳細には、高分子の露出される位置を優先的に観測するための核磁気共鳴（ＮＭＲ）法に関する。
【０００２】
タンパク質のような高分子の３次元構造は、正常細胞および異常細胞におけるその機能についての洞察を与え得る。例えば、ある化合物または「リガンド」が、タンパク質に結合する場合、タンパク質の３−Ｄ構造は、タンパク質におけるリガンドの結合部位を同定する手助けとなり得る。原子分解能での構造は、リガンドと高分子との間の相互作用についての理解ならびに、治療薬として役立ち得る新しいリガンドの設計および選択を研究者に与え得る。
【０００３】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法は、多くのタンパク質の構造を原子分解能で決定してきた。それにも関わらず、タンパク質の構造を決定するための現在のＮＭＲ法は、数千もの個々の原子の位置についての綿密な推論を必要とするため、極端に時間を消費する。より大きくそしてより複雑なタンパク質に注目が集まり、そして原子数が増加すると、ＮＭＲ法により生成されるデータは、圧倒的になり得、事実上タンパク質の構造を決定することが不可能となる。
【０００４】
従って、リガンドの結合についての理解のために有用な様式で、大きな高分子の構造についての情報を提供し得る方法が、必要とされている。本発明は、この要求を満たし、さらに関連する利点を提供する。
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、高分子の露出される位置を優先的に観測するための方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）高分子および第２の分子を含むサンプルを得る工程であって、ここで高分子は３５キロダルトンより大きく、かつ第２の分子に対し露出される位置を有し、ここで第１の水素は、高分子の露出される位置に結合され、第２の水素は第２の分子に結合され、そして第１の水素は第２の水素と交換し得る、工程；（ｂ）サンプルに磁場を適用し、それによって第１の水素および第２の水素を磁化する工程；（ｃ）第２の水素と比較して高分子の水素を優先的に消磁するパルス系列でサンプルを照射する工程；（ｄ）第２の水素を第１の水素と交換させ、これによって相対的に磁化された第２の水素を高分子の露出した位置に結合させる工程；および（ｅ）第２の水素からの磁化を検出する工程；この結果高分子の露出される部位は、優先的に観測される。
【０００６】
本発明は、さらにリガンドを結合する高分子中の露出される位置を観測するための方法を提供し、ここで高分子は、３５キロダルトンより大きく；第２の分子に対して露出される高分子上の位置に結合する多数の水素を有し；そして、露出される水素は、第２の分子の水素と交換され得る。この方法は、以下の工程を含む：（ａ）高分子および第２の分子を含む第１のサンプルを用いて、上記に記載の方法を実行する工程；（ｂ）高分子および第２の分子を含む第２のサンプルを用いて、上記に記載の方法を実行する工程であって、ここで高分子は、リガンドに結合する工程；および（ｃ）第１のサンプルとの比較によって、第２のサンプルにおける摂動を検出する工程；この結果、リガンドが結合する高分子中の露出される位置を観測する。
【０００７】
リガンドが結合する高分子中の露出される位置を観測するための本発明の方法は、高分子および第２の分子を含有する第１のサンプル、ならびに高分子、第２の分子およびリガンドを含有する第２のサンプルを２者択一的に含み得、ここで、第２の分子およびリガンドは、交互に高分子と会合し、そして高分子から解離する。別の実施形態において、この方法は、高分子、第２の分子および第１のリガンドを含有する第１のサンプルを含有し得、ここで第２の分子および第１のリガンドは、交互に高分子と会合し、そして高分子から解離し、そして第２のサンプルは、高分子、第２の分子および第２のリガンドを含有し、ここで第２の分子および第１のリガンドは、交互に高分子に会合し、高分子から解離する。リガンドが結合するか、または２つのリガンドが違いをもって相互作用する高分子中の露出される位置は、第１のサンプルと比較して第２のサンプルにおいて検出される摂動に基づいて、同定され得るか、または特徴付けられる。
【０００８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、高分子１ａのある水素を優先的に観測するための方法を提供する。
【０００９】
本明細書中で使用される場合、用語「高分子」は、ポリマー分子または溶液中で会合したポリマー分子の複合体を意味し、生物学的ポリマーおよび合成ポリマーを含む。タンパク質および他のポリペプチドは、特に有用な生物学的ポリマーである。他の有用な生物学的ポリマーとして、多糖類およびポリヌクレオチドが挙げられる。合成ポリマーとしては、プラスチックおよびタンパク質−核酸のような生物学的ポリマーの模倣物が挙げられる。
【００１０】
この方法は、２５キロダルトン（ｋＤａ）かそれより小さい分子量を有する高分子のような、比較的小さな高分子、および３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａまたは５０ｋＤａより大きい分子量を有する高分子のような、より大きなタンパク質に適用され得る。この方法は、７５ｋＤａ、１００ｋＤａ、１２５ｋＤａ、１５０ｋＤａまたは２００ｋＤａより大きい分子量を有するタンパク質が挙げられる、非常に大きなタンパク質に適用される場合、特に有用である。本明細書中で使用される場合、用語「分子量」および個々の記載される分子量は、溶液中で存在する場合の高分子の分子量をいうことが意図される。高分子が、１つより多くの分子の複合体として存在する場合、この用語は複合体の分子量のことをいう。
【００１１】
本発明の方法はまた、Ｘ線結晶学またはＮＭＲ技術などによっても、高分子の構造が十分には決定されない場合、有用である。例えば、この方法は、高分子のモノマー単位（例えば、アミノ酸、ヌクレオチドまたは糖類の単位）の５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％または７５％未満に対する共鳴が、ＮＭＲによって帰属された高分子に適用され得る。それにもかかわらず、完全にまたは８０％〜９０％〜９９％決定された高分子構造に適用される場合、この方法はまた、構造の特徴付けおよび個々の原子間の機能の識別のために有用であり得る。
【００１２】
高分子の源は、天然、組換えまたは合成であり得る。例えば、これらは、自然に高分子を産生する、生物学的細胞または生物学的組織からか、あるいは高分子を発現するために改変された組換え細胞から得られ得る。
【００１３】
天然の高分子は、当該分野公知の方法によって種々の源から単離され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ（２００１）およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ（１９９２）、およびＡｕｓｅｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ（２０００）に記載される方法に従って単離され得る。細胞および組織からポリペプチドおよびタンパク質を単離する方法は、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＮＹ（１９９４）；Ｄｕｅｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ（１９９０）；およびＣｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  ＭＤ（２０００）に記載される。組換え体発現系および組換え体発現法はまた、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ（１９９０）；Ｗｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ（１９９３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出（２００１）、およびＡｕｓｅｂｅｌら、前出（２０００）に記載される。
【００１４】
ポリマー性高分子は、周知の合成方法により産生され得る。ポリペプチドまたはタンパク質は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成、ｔ−Ｂｏｃを基礎にした合成、Ｆｍｏｃ合成およびこれら技法に基づく改変を含む合成方法により産生され得る。ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、ホスホルアミダイト化学を取り込む方法のような周知の合成方法を用いて産生され得る。
【００１５】
特に有用な高分子は、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎまたはこれら同位元素の任意の組合せを用いて同位元素で標識され得る。例えば、タンパク質またはポリペプチドは、Ｖｅｎｔｅｒｓら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ  ５：３３９−３４４（１９９５）に記載のような、タンパク質またはポリペプチドを産生する細胞または組織の培養培地にアミノ酸のような代謝産物を添加することにより同位元素で標識され得る。同位元素標識は、他の標準的な合成条件の下、同位元素で標識された反応物を用いて合成高分子中に取り込まれ得る。
【００１６】
本明細書で用いる用語「高分子のプロトン」または「第１のプロトン」１は、高分子の別の原子に結合されるプロトンを意味する。本明細書で用いる用語「結合される」は、２つの原子が、イオン結合によるか、共有結合によるか、または水素結合によりのいずれかで直接相互作用することをいう。このプロトン（単数または複数）は、高分子の任意の原子に結合され得るが、代表的には、酸素、窒素または硫黄を含む、電気的陰性荷電または極性を有する原子に結合される。この相互作用は、それが原子核間の磁気的カップリングを検出するために十分な時間の間維持される限り、安定または一時的であり得る。従って、高分子に結合するプロトンは、永久的に結合する必要はなく、解離され得る。プロトンは、それらが、時間、分、秒、マイクロ秒またはマイクロ秒より速い時間フレームで溶媒と交換するとき解離され得る。
【００１７】
本明細書で用いる用語「第２の分子」２ａは、高分子ではないが、交換され得る少なくとも１つの結合プロトン２を有する任意の分子を意味する。第２の分子の結合プロトンは、高分子に結合される第１のプロトンからそれを区別するために、「第２のプロトン」と称される。
【００１８】
有用な第２の分子は溶媒分子である。本明細書で用いる用語「溶媒」またはバルク溶媒は、高分子を溶媒和し、そしてこの高分子の表面と一時的に相互作用する分子を意味する。本明細書で用いる用語「プロトン性溶媒」は、溶媒分子の残りに結合するプロトンを有するか、または高分子以外のサンプルの成分により溶媒和される溶媒を意味する。プロトン性溶媒は、極性Ｘ−Ｈ結合であって、Ｘが、Ｎ、ＯまたはＳのような孤立電子対を有するヘテロ原子である結合を含み得る。代表的には、この溶媒は、高分子の表面を取り囲むが、膜タンパク質が脂質二重層内に完全または部分的にあるときのように、高分子の小領域とまた相互作用し得る。
【００１９】
本明細書で用いる用語「露出される」は、第２の分子と直接相互作用し得る高分子上のプロトンまたは位置を意味することが理解される。高分子の露出された位置は、高分子の外表面上であるか、または、その位置が第２の分子と直接接触し得る限り、チャネル、空洞またはポケットのような内表面内の１つ以上の原子であり得る。さらに、高分子が、マルチマー複合体として存在し得るとき、個々のサブユニットは、モノマーであるときに露出されるが、複合体であるときに相対的により少なく露出される位置または露出されない位置を有し得る。対照的に、露出されない原子３は、例えば、高分子の水素結合または高分子の疎水性領域内の位置におけるような２つの原子間の共有された結合によって課された立体的拘束に起因して、第２の分子と接触することから制限される。従って、第２の分子が、即時接触ではなく、高分子上の位置に向かって移動し、そしてそれと相互作用する場合でさえ、この位置は露出されており；相互作用は一定または永久的である必要はない。
【００２０】
高分子上の露出された位置はバルク溶媒に露出される。このような溶媒に露出される位置は、本発明の方法で特に有用であり得る。なぜなら、代表的には、リガンドが、高分子の溶媒に露出される位置と接触するからである。従って、溶媒に露出される位置は、高分子の結合する位置の候補である可能性があり、ここに、天然リガンドまたは非天然リガンド模倣物が結合し得る。高分子の溶媒に露出される位置がリガンド−高分子相互作用の研究者に特に興味深くあり得る。
【００２１】
本発明は、このような露出される位置にある高分子の位置を優先的に観察するためのＮＭＲ法を提供する。従前のＮＭＲ法が、巨大な高分子に適用されたとき、それらは、高分子中の潜在的にすべての原子に対応する共鳴を検出した。得られるスペクトルは、重複する共鳴の総数が、解釈するために、数ヶ月、数年さえ要するように、圧倒的に複雑であった。多くの場合、完全な解釈は不可能である。皮肉にも、高分子とリガンドとの間の相互作用を理解することを試みる研究者にとって、原子の大多数はほとんど興味がない。露出される位置に焦点をあてることにより、本発明は、研究者を、高分子上のリガンド結合位置であるらしい位置に集中させることを可能にする。
【００２２】
図１ａに示されるように、本発明の方法は、高分子１ａおよび第２分子２ａを有するサンプルで開始される。この高分子は、第２の分子に露出される位置１ｃに結合するプロトンまたは「第１のプロトン」１を有する。この高分子は、同様に、露出されていない位置３ｃに結合する、他のプロトン３を有する。第２の分子は、第１のプロトン１と交換し得るプロトンまたは「第２のプロトン」２を有する。
【００２３】
図１ｂでは、第１のプロトン１、第２のプロトン２、および露出されていないプロトン３を含む、サンプル中のプロトンを磁化するために、磁場４が付与される。図１ｃに示されるように、次いでサンプルは、第２のプロトン２と比較して、高分子１、３のプロトンを優先的に消磁するパルスシーケンス５を照射される。混合時間またはτｍと呼ばれる持続時間を経過させて、図１ｄに示されるように、その間に、相対的に磁化された第２のプロトン２が、第１のプロトン１と交換６する。
【００２４】
本明細書で、第１のプロトンおよび第２のプロトンに適用されるとき、用語「交換」は、第１のプロトンが、第２の分子のプロトンにより置換されることを意味する。従って、第１のプロトンは、高分子の露出される位置から解離し、そして第２の分子と会合し；同様に、第２のプロトンは、第２の分子から解離し、そして高分子と会合する。従って、用語「交換されるプロトン」は、先には１つの分子と会合していたが、今は異なる分子と会合しているプロトンを意味する。
【００２５】
プロトン交換の結果として、第２のプロトン２は、露出される位置１ｃで高分子に結合するようになる。第２のプロトンが相対的に磁化され、そして今や高分子の露出される位置１ｃに結合しているので、この露出される位置が、ＮＭＲ法を用いて優先的に観察され得る。比較すると、露出されていない高分子のプロトン３は、消磁パルスシーケンスに起因して相対的により少なく磁化され、そしてＮＭＲ法によって検出される可能性がより少ない。図１ｅに示されるように、この結果は、溶媒に露出される位置１ｃにある高分子の位置を優先的に観察する能力である。
【００２６】
巨大高分子中のすべての原子の複雑な共鳴を検出するよりむしろ、露出される領域の外側の原子から生じる共鳴を除去し得、それによって、スペクトル中のピークの重複を最小にする。結果として、本発明は、リガンド結合を理解するために特に興味のある高分子の領域からの共鳴の増加した識別を提供する。
【００２７】
（ＮＭＲ法）
これらのＮＭＲ法は、付与される磁場と整列される核が、誘導されてエネルギーを吸収し、そして付与される磁場に対してスピンの配向を変化するときに起こる核磁気共鳴の現象を使用する。この配向変化が起こるときのエネルギーが、核に対する共鳴エネルギーである。
【００２８】
本明細書で用いる用語「共鳴」は、磁場中の原子が高周波照射を吸収するとき生じるシグナルを意味する。このようなシグナルは、ＮＭＲ実験中に高分子について測定されるスペクトルのピークまたはその他の成分として示され得る。特定の原子について、この共鳴エネルギーは、原子およびその核の物理的性質、例えば、その角モーメントに対するその磁気モーメントの比または磁気回転比、および核によって経験される磁場の強さの関数である。従って、付与される磁場中の遮蔽されない核は、この場の強度およびその磁気回転比によって規定されるＬａｒｍｏｒ周波数における共鳴エネルギーを有する。一般に、分子中の原子は、分子中の他の原子からの周囲電子に起因して、付与される磁場から遮蔽されるそれらの核を有する。結果として、この遮蔽される核は、付与される場とは異なる局所磁場環境を経験し、そしてその共鳴は、そのＬａｒｍｏｒ周波数からシフトされる。
【００２９】
ＮＭＲスペクトル法を用い、分子の個々の原子から生じるシグナルのスペクトルが得られ得る。一般に、Ｌａｒｍｏｒ周波数からのシフトは、分子中の個々の原子の相対的位置を決定するために用いられ得る。このらの相対的位置は、分子の構造を決定するために用いられ得る。しかし、高分子のような大きな分子は、すべてがＬａｒｍｏｒ周波数の周りの小スペクトル領域内に共鳴を有する、多くの原子を含む。このような高分子は、解像することが困難である重複シグナルをもつ複雑なスペクトルを生成し得る。従って、これら原子のサブセットに対する限定検出は、巨大高分子の解釈スペクトルのための利点を提供し得る。
【００３０】
ＮＭＲによって測定される共鳴を参照して本明細書で用いられる用語「割り当てられる」は、この共鳴に対応する高分子の配列または構造中の１つ以上の原子の位置の同定を意味する。１つ以上の原子は、アミノ酸の構造またはこの構造の一部分のような、高分子の一部分の構造に対して高分子の構造中に位置決めされ得る。
【００３１】
奇数の質量もしくは奇数の原子番号のいずれか、またはを両方もつ任意の原子核は、磁気モーメントを有し、そしてＮＭＲ法により検出可能であり、これには１Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１９Ｆおよび３１Ｐが含まれる。本発明の方法は、消磁されたプロトンを、溶媒のような第２の分子からの磁化プロトンと交換する任意のＮＭＲ検出可能な原子を優先的に観察するために用いられ得る。生理学的範囲にあるｐＨを有する溶媒中の生物学的高分子については、第２のプロトンと交換し得るＮＭＲ検出可能原子は１５Ｎである。タンパク質は、アミノ末端、骨格アミド、リジンε−アミン、ヒスチジンイミダゾール、アルギニングアニジニウム、トリプトファンまたはアスパラギンまたはグルタミンのアミドを含む多くの位置で交換可能プロトンとともに１５Ｎ原子を含み得る。
【００３２】
本明細書で用いられる用語「磁化された」は、磁場に対して整列された磁気モーメントを有する核の状態を意味する。この用語は、適用磁場の方向に沿ってまたは磁場の方向に反して整列された磁気モーメントを有する、適用磁場での原子核を含むことが意図される。適用磁場における原子核群は、磁場の方向に沿ってならびに磁場の方向に反しての両方に整列されたメンバーを有する。
【００３３】
本発明の方法において、プロトンを磁化する磁場は、この磁場に沿って整列するためのプロトンの磁気双極子を与えるのに十分に任意な強さであり得る。本発明の方法において有用な磁場の強度は、比較的低く（６０ＭＨｚ〜１００ＭＨｚ）あり得る。この方法はまた、より高い磁界の強度（少なくとも約４００ＭＨｚ、約５００ＭＨｚ、約６００ＭＨｚ、約７５０ＭＨｚ、約８００ＭＨｚ、約９００ＭＨｚまたはこれより高い値）において利用可能な高い分解能を開発し得る。当業者は、記載される当該分野で公知の方法（例えば、ＦｕｋｕｓｈｉｍａおよびＲｏｅｄｅｒ、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｕｌｓｅ  ＮＭＲ」Ａｄａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｅｓｌｅｙ（１９８１））を用いて、極性磁場を産生する方法を知っており、また、これを決定し得る。
【００３４】
本発明の方法において使用されるサンプルは、交換可能な第２プロトンと比較して、高分子の原子に結合するプロトンを優先的に消磁させる、種々の磁場のパルスシーケンス５で照射され得る。
【００３５】
本明細書中で用いられる用語「パルスシーケンス」は、定義された、持続時間、強度、振動数、および／または相対的な分極の１以上の高周波照射の時間的な系列、ならびに／あるいは定義された、持続時間、磁界の強さ、および相対的な配向の１以上の磁場勾配の時間的な系列を意味する。
【００３６】
本明細書中で用いられる用語「消磁させる」は、原子核を照射し、その結果第２照射からのエネルギーの正味の吸収または発光が、減少するかまたは検出不可能となる工程または効果を意味する。この用語は、ＮＭＲスペクトルから減少するか、または除去される原子核からのシグナルを生じる、任意の振動数、持続時間、強度または分極化の照射を包含することが意図される。この用語は、１０〜１０００ＭＨｚまたは１０７〜１０９／秒の範囲における振動数で、電位、電流または磁場を変動させることを含む、高周波照射を包含する。選択された振動数は、磁界の強さおよびその磁界の強さでの目的の核の対応するラーモア振動数に依存する。
【００３７】
水プロトンと比較して、窒素と結合するプロトンを優先的に消磁し得るパルスシーケンスの例は、実施例１に記載され、図２に示される、ＳＥＡパルスシーケンスの１５Ｎ二重フィルターである。当業者は、パルスシーケンスが、水プロトンと比較して窒素と結合するプロトンを、優先的に消磁する限り、ＳＥＡパルスシーケンスの１５Ｎ二重フィルターで、改良がなされ得ることを認識している。この改良としては、パルスされた領域勾配の持続時間または強さ；パルスの強度、相、持続時間または配列；あるいはパルス間の遅延τの持続時間が挙げられる。さらに、水プロトンと比較して窒素と結合するプロトンを優先的に消磁する他のパルスシーケンスは、１５Ｎフィルターを含むＳＥＡパルスシーケンス中で用いら得る（Ｂｒｅｅｚｅ「Ｐｒｏｇ．ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒ．」３６：３２３−３７２（２０００）ならびにＯｔｔｉｎｇおよびＷｕｔｈｒｉｃｈ「Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．」２３：３９−９６（１９９０）に記載されている）。
【００３８】
パルスシーケンスで照射されたサンプルから生じるシグナルは、混合時間の終わりに検出される。本明細書中で用いられる用語「混合時間」またはτｍは、分子のある部位に結合する不均衡のプロトンが、第２プロトンと交換されるために十分に長い時間であるが分子の第２部位に結合する不均衡のプロトンが、第２プロトンと交換されるためには不十分であることを意味する。例えば、この用語は、高分子のある部位に結合する不均衡のプロトンが、第２プロトンと交換されるために十分に長い時間であるが、高分子の第２部位に結合する不均衡なプロトンが、溶媒プロトンと交換されるためには不十分であることを言い得る。この用語は、第２プロトンが、高分子の埋もれたプロトンと比較して、高分子の露出したプロトンと優先的に交換される間の時間を含み得る。この用語はまた、磁化した第２プロトンと、高分子に結合した、埋もれたプロトンの交換と比較して、磁化した第２プロトンと高分子の原子に結合した、露出したプロトンの優先的な交換を生じる時間を含み得る。
【００３９】
混合時間は、分子の露出部位に結合する消磁プロトンが、磁化された第２プロトンと交換されるために十分であり、同分子の内部の原子に結合する消磁プロトンが、消磁された第２プロトンと交換されるために不十分である、任意の時間であり得る。τｍにおける、高分子から生じるシグナルの測定値は、高分子の内部に埋もれた高分子の原子は検出されないが、第２の分子からの磁化プロトンが獲得される露出部位を優先的に検出する。
【００４０】
露出部位の優先的な検出を提供する混合時間は、約２５〜５００ｍｓｅｃの範囲であり得る。本発明の消磁パルスシーケンスの後に検出され得るシグナル数は、混合時間に比例し、その結果混合時間が短いほど、高分子のより少数の原子が磁化第２プロトンを獲得し、これにより、より少数の検出シグナルを生ずる。このように、本発明は、約２５ｍｓｅｃ〜約５０、１００、または１５０ｍｓｅｃまでの範囲における短い混合時間で用いられ得る。類似した関係が検出シグナルの強度と混合時間との間に存在する。これによって増加した混合時間は、サンプル中のより多くの高分子が特定の原子における磁化第２プロトンを獲得するのを、許容し、これによりその特定の原子に対するシグナルを増加する。従って、本発明は、約１５０ｍｓｅｃ〜約２００、３００、４００または５００ｍｓｅｃまでの範囲における長い混合時間で用いられ得る。
【００４１】
本発明の方法は、十分なシグナル検出特性（スペクトルのシグナル解像度、シグナル強度またはシグナル数）を達成するための混合時間を決定するために、反復様式で施行され得る。特に、この方法は、上記に記載される範囲における初期τｍを用いて施行され得、そして生じたシグナルまたはスペクトルは、所望のシグナル検出特性について評価され得る。次いで、この方法は、十分な、または所望の特性が達成されるまで、τｍを規則的に変化させながら反復的に繰り返され得る。
【００４２】
さらに、理論的に評価されたプロトン交換速度または目的の高分子中でのプロトン交換における経験速度に基づいて、混合時間が決定され得る。適切なτｍは、以下の関係に準じてプロトン交換速度定数ｋｅｘから決定され得る：
Ｉ＝Ｉ∞（１−ｅ−ｋｅｘ＊τｍ）
ここで、Ｉは、検出されたシグナルの強度であり、およびＩ∞は、無限混合時間における強度である。予め割り当てられた共鳴を有する原子におけるプロトン交換速度を決定するためのＮＭＲに基づく方法が、公知であり、そしてＧｅｍｍｅｃｋｅｒら「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」１１５：１１６２０−１１６２１（１９９３）およびＢａｉら、「Ｐｒｏｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃ．Ｇｅｎ．」１７：７５−８６（１９９３）に記載されている。このような方法により決定されたプロトン交換速度またはプロトン交換速度定数は、これらの原子を含むサブセットのような、高分子中の原子のサブセットを選択的に観察するための、適切なτｍを決定するために用いられ得る。
【００４３】
高分子の原子に結合する交換プロトンからの磁化は、ＮＭＲ分光法の分野で公知の方法を用いて検出され得る。磁化プロトンと結合原子または隣接原子との二極性またはスカラーなカップリングを決定するための任意の方法が、本発明において用いられ得る。従って、本方法は、種々のパルスシーケンスまたは異核フィルターとの組み合わせにおいて施行され得る。当業者は、Ｃａｖａｎａｕｇｈら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ（１９９６）に記載された方法を含む、本発明の方法において使用するための、適切なパルスシーケンスまたはフィルターを決定することを知っているか、またはこれを決定することが可能である。
【００４４】
本発明のさらなる利点は、この方法が、構造解析において適切な高分子の範囲を増大させるために、当該分野で公知である種々の高解像ＮＭＲ技術を組み合わせて用いられ得ることである。
【００４５】
本発明の方法は、さらにサンプルに対する異核の相関測定値を決定する工程を組込み得、ここで、相関される原子核の１つは、１Ｈ（例えば、１５Ｎ−１Ｈ相関測定値）である。１５Ｎ−１Ｈ相関に起因するシグナルまたはスペクトルを測定するための任意の方法が、２次元方法（例えば、ＣＯＳＹ技術、ＮＯＥＳＹ技術、またはＴＲＯＳＹ技術）を含む本発明において使用され得る。これらの方法は、特定の共鳴シグナルを選択するフィルター（例えば、Ｃａｖａｎａｕｇｈら、前出（１９９６）に記載されるような、１５Ｎ付着プロトンを選択する［１Ｈ−１Ｈ］ＮＯＥＳＹにおいて使用され得る１５Ｎフィルター）を用い得る。これらの１５Ｎ−１Ｈ相関技術についてのパルスシーケンスは、以下にさらに記載されるような本発明の方法において用いられ得る。
【００４６】
ＣＯＳＹは、相関分光法をいい、そして１つまたは２つの他の原子を介して共有結合される磁化された水素原子間の連結に起因するシグナルを生じる方法を含む。ＣＯＳＹパルスシーケンスおよびＣＯＳＹ方法は、Ｃａｖａｎａｕｇｈら、前出（１９９６）に記載されるように当該分野において公知である。当業者は、ＳＥＡパルスシーケンスをＴＲＯＳＹパルスシーケンスと併用することについての実施例１において例示される方法に従って、ＣＯＳＹパルスシーケンスを本発明のパルスシーケンスと併用することによって、ＣＯＳＹパルスシーケンスと組合せて本発明の方法を実行し得る。本発明の方法は、高分子の２次元ＣＯＳＹスペクトルに存在するピークの数を減少するために、ＣＯＳＹ技術と組み合わせて有利に用いられ得、これによって、高分子の構造または機能の解像度の向上および割当の増強を提供する。
【００４７】
ＴＲＯＳＹは、横緩和最適化分光光度法をいい、これは、２つの連結したスピン１／２原子核を有する分子のスペクトルにおいて、２つのスピン１／２原子核の両性結合間の相互関連によって緩和効果を無効にする化学シフトの異方性を用いることによって、横緩和（Ｔ２）に起因して、系の拡大を減少する方法である。ＴＲＯＳＹは、標準相関スペクトルと比較してシグナルの重複を最小化する１５Ｎ−１Ｈ相関技術を提供する。
【００４８】
ＴＲＯＳＹと本発明の方法との組合せは、ＴＲＯＳＹを用いて達成されるスペクトルにおける減少されたピークの拡大と本発明の方法を用いて達成されるスペクトル中に存在するシグナルの数の減少を組み合わせる相乗効果に起因して、特定の効果を提供し得る。詳細には、この相乗は、大きい高分子のスペクトルを単純化し、単離におけるいずれかの方法の使用と比較して向上した解像度を提供し得る。ＴＲＯＳＹ技術および関連するパルスシーケンスが、米国特許第６，１３３，７３６号；ＷｉｄｅｒおよびＷｕｔｈｒｉｃｈ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９：５９４〜６０１（１９９９）；ならびにＰｅｒｖｕｓｈｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１２３６６〜１２３７１（１９９７）に記載される。当業者は、ＴＲＯＳＹパルスシーケンスが、記載されるパルスシーケンスの改良型を含み得、そしてそれによってＴＲＯＳＹパルスシーケンスを認識し得ることを知る。
【００４９】
ＮＯＥＳＹすなわち核オーバーハウザー効果分光法とは、空間を通して、近接する核間の相互作用（核オーバーハウザー効果と呼称される）に従って、分子内の原子の近さを決定するために使用され得る方法をいい、この核オーバーハウザー効果は、近接する核の間の磁化の特徴を生じる。２次元ＮＯＥＳＹスペクトルは、ＮＯＥ相互作用を有するのに十分に近いプロトンについて交差ピークを含む。ＮＯＥＳＹスペクトルを決定するための、技術およびパルス系列は、Ｃａｖａｎａｕｇｈら（前出）（１９９６）に記載されるように当該分野で公知である。ＮＯＥは、空間的な近接によって生じ、化学結合を介した単なる結合によっては生じないので、分子間の距離を決定するのに特に有用である。本発明の方法は、ＮＯＥＳＹ技術によって生じたスペクトルを簡素化するのに特に有用であり、そして、他の方法ではＮＯＥＳＹスペクトル単独において分離することが困難であるかまたは不可能である、高分子内の近接核から生じるシグナルまたは高分子とリガンドとの間の近隣核から生じるシグナルの同定を改善するという利点を提供する。
【００５０】
本発明はまた、３核間のＮＭＲ相関を決定するための方法を提供する。この方法はさらに、これらの相関した核と第３の核との間の第２の相関測定値（ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）を決定する工程を包含する。
【００５１】
本発明の１つの実施形態において、分子内の原子のサブセットの選択的な観測が、多次元ＮＭＲ技術と共に使用され得る。多次元ＮＭＲ技術は、当該分野で公知であり、そして、含まれる次元の数と等価である多くの異なる異核間の相関を測定するのに使用され得る。例えば、３次元ＮＭＲスペクトルを使用して、３つの異なる異核（例えば、１Ｈ、１５Ｎ、および１３Ｃ）の間の異核ＮＭＲ相関を決定し得る。
【００５２】
１次元技術および２次元技術から得られるスペクトルと同様に、高分子の３次元スペクトルは、頻繁にオーバーラップして、検出されるシグナルの多さに起因して複雑であり得る、乏しいシグナル分解能を生じ得る。分子内の原子のサブセットの選択的な観測は、シグナルのオーバーラップを低減することによって、３次元スペクトルを簡素化し得る。例えば、３−Ｄ  ＮＭＲ技術を使用する高分子の露出した位置の選択的な観測は、埋没した原子から生じたオーバーラップシグナルを除去することによって、露出した原子から生じた３次元スペクトルにおけるピークを分離し得る。
【００５３】
本発明の方法は、交換された磁化プロトンと、このプロトンが結合している原子と、任意の第３の、磁気的に活性な異核（１３Ｃを含む）との相関の決定を包含する。１５Ｎまたは１Ｈのいずれかの選択、他の２つの原子とのその後の相関もまた、包含される。種々の周知の三重共鳴法を使用して、交換した磁化プロトンと、このプロトンが結合している原子と、１３Ｃとの間の相関を決定し得る。このような方法として、ＨＮＣＡ、ＨＮＣＡＣＢ、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨおよびＨＮＣＯが挙げられる。これらの方法は、Ｃａｖａｎａｕｇｈら（前出）（１９９６）に記載され、そしてＳＥＡエレメントを用いて選択され得る１Ｈおよび１５Ｎの次元を有するという共通した特徴を共有する。第３の次元は、しばしば、１３Ｃであり、α炭素（ＣαまたＣＡ）またはカルボニル炭素（ＣＯ）のような異なった原子型である。本発明の方法を使用して簡素化され得る別の三重線共鳴実験は、１５Ｎ標識（ｅｄｉｔｅｄ）ＮＯＥＳＹである。
【００５４】
高分子内の露出した原子の選択的な観測の例は、実施例２において提供され、この実施例は、３Ｄ  ＳＥＡ−ＨＮＣＡ−ＴＲＯＳＹパルス系列を用いて得たスペクトルを使用して、巨大なタンパク質中の特定領域に対するＮＭＲシグナルの帰属を記載する。３Ｄ  ＳＥＡ−ＨＮＣＡ−ＴＲＯＳＹスペクトルは、実施例ＩＩで例示されるように、タンパク質の露出したループ領域について主鎖の共鳴帰属を決定するのに特に有用であり得る。
【００５５】
従って、本発明の方法を使用して、プロトン交換速度における差異に基づき、任意の高分子において原子を選択的に検出する。具体的には、結合したプロトンを交換していないこの分子中の別の原子と比較して、規定された時間区切りにおいて第２のプロトンとプロトンを交換した位置にある原子のサブセットを選択的に検出するために、本方法が使用され得る。
【００５６】
故に、本方法を使用して、以下のような因子に従って、原子または原子のサブセットを選択的に検出し得る：溶媒または第２の分子に対する原子の空間的な露出度、その原子−水素間結合の熱力学安定性、その原子のｐＫａ、または化学的環境。第２の分子に対する原子の空間的な露出度に従って選択的に検出され得る分子の原子のサブセットは、同じ分子の内部における位置と比較して選択的に検出され得る分子の表面上の位置を含む。原子の特定のサブセットは、炭素に結合したプロトンのようなより安定な他のものと比較して、１〜１０００ミリ秒の時間スケールで交換する原子を含む。その方法はまた、第２の原子との水素結合相互作用または局所的な極性、疎水性もしくは親水性の差に起因する他の原子−プロトン結合よりも安定なプロトン結合を有する原子を検出するために使用され得る。特に、タンパク質中に存在するアミド窒素は、種々の局所的なタンパク質環境下に存在することに起因して異なる安定性を有し得、そして、α−ヘリックス構造またはβ−シート構造中の水素結合相互作用に関与する能力を有し得る。従って、本発明の方法によるアミドシグナルの好ましい観察は、タンパク質の構造的な特徴付けおよび機能的な特徴付けに有用であり得る。
【００５７】
本発明はまた、分子の原子に影響する外因性因子に従う検出を提供する。具体的には、異なる原子または異なる原子サブセットが、ｐＨ、温度、極性またはリガンドの存在のような異なる条件下で本発明の方法を実施することによって優先的に検出され得る。
【００５８】
その方法は、優先的に検出される異なる原子または異なる原子サブセットを選択するために外因性因子における変化と結びつけて使用され得る。例えば、サンプルのｐＨを変化させることによって、異なる原子サブセットが、分子中の原子のｐＫａの差に従って検出され得る。生じたスペクトルの組合せは、単一のスペクトルと比較してより多数の分解されたシグナルを提供し得、それによって分子の構造決定のために使用され得る分解されたシグナルの数が増加し得る。さらに、異なる条件下で生じるシグナルまたはシグナルのサブセットの比較は、分子の動力学または機能を決定するのに使用され得る。
【００５９】
（リガンド法）
リガンドの使用は、本発明の方法に可能な用途を拡大する。例えば、第２の分子は、バルク溶媒におけるリガンドのようなリガンド（図５ａおよび５ｃ）であるかまたは脂質２重層（図５ｃ）に存在し得る。そのサンプルにおける高分子はまた、露出される位置（図５ｄ）であろうと、露出されていない位置であろうと、リガンド９に結合され得る。
【００６０】
本発明はさらにリガンドに結合する高分子における露出された位置の同定方法を提供し、ここでこの高分子は、第２の分子に対して露出されたその高分子上の位置に結合した複数のプロトンを有し、そしてその露出されたプロトンは、第２の分子のプロトンと交換し得る。その方法は、リガンド８に対して結合した高分子（図５ｂ）および結合していない高分子（図５ａ）のサンプルを使用して上記の方法を実施する工程を包含する。次いで、化学シフト摂動が、結合されないサンプルと比較して結合サンプルにおいて検出される。化学シフト摂動に加えて、測定され得る他の変化は、サンプル間の減少したシグナル強度または差次的プロトン変化が挙げられる。結果的に、その方法は、リガンドに結合する高分子における露出された位置を同定する。
【００６１】
高分子のリガンド結合部位は、迅速に交換するプロトンに結合した原子を一般的に含有し、そしてそのリガンド結合部位は露出される領域にしばしば位置し、それゆえ、高分子の内側に埋没した原子または水素結合に関与する原子は、リガンドと相互作用する可能性が低い。例えば、タンパク質のループ領域は、しばしばタンパク質結合部位領域の主要な成分である。タンパク質ループ領域に位置する原子の大部分は、典型的には水素結合または２次構造相互作用に関与せず、そして従って第２のプロトンと迅速に交換する傾向がある。従って、本発明の方法を使用するタンパク質中の露出された原子の選択的な観察は、リガンドと相互作用するこれらの原子の選択的な観察を提供し得る。
【００６２】
本発明の方法は、リガンドに結合する高分子中の露出された位置を観察するのに使用され得、ここでこの高分子は、第２の分子に対して露出された高分子上の位置に結合した複数のプロトンを有し、そしてその露出されたプロトンは、第２の分子のプロトンと交換し得る。その方法は、リガンドの存在下および非存在下において高分子のサンプルを使用して上記の方法を実施する工程を包含し、ここで、第２の分子およびリガンドは、交互に、高分子と会合し、そして、高分子から解離する。その露出された位置は、リガンドの非存在下と比較して、リガンドの存在下における摂動に従って同定され得るかまたは特徴づけられ得る。同様に、その方法は、第１のリガンドの存在下における高分子の第１のリガンド、および第２のリガンドの存在下における高分子の第２のサンプルを使用してその方法を実施する工程を含有し得、ここでこのリガンドの各々は、第２の分子と交互にその高分子に結合し得、そして解離し得る。その露出された位置は、第２のリガンドの存在下と比較して、第１のリガンドの存在下における摂動に従って同定され得るかまたは特徴づけられ得る。
【００６３】
本明細書で使用される場合、用語「摂動」は、変化している作用または変化されている状態を意味する。その用語は、原子核の磁化または消磁の作用または生じる核の磁化状態である、ＮＭＲ摂動を包含し得る。その用語はまた、別個であるが、実質的に同様の実験におけるサンプル摂動を包含し得、そのサンプル摂動は、別のサンプルと比較したサンプル変化するある作用であるか、または他のサンプルと比較されるそのようなサンプルの状態であり得る。そのようなサンプルにおいて生じる変化は、検出される摂動として観察され得、そしてその変化は、そのサンプルの他方と比較されるひとつのサンプルに関するＮＭＲ測定またはＮＭＲスペクトルの有意な差異を包含する。
【００６４】
本発明は、その方法が、リガンドと相互作用しない傾向があるより遅く交換する原子から生じるシグナルが、リガンド結合部位に位置する原子から生じるシグナルとの潜在的なオーバーラップを最小化するために除去され得、スペクトルを生じ得るという点で、高分子−リガンドの相互作用の測定のための利点を提供する。したがって、その方法は、結合部位原子の選択的な観察無しに可能である大きな高分子に対するタンパク質−リガンドの相互作用の高分解能特徴づけを可能にし得る。
【００６５】
本発明は、ＮＭＲ実験の時間枠中で十分な安定性が観察される、高分子と相互作用する任意のリガンドとともに使用され得、これらのリガンドとしては、化学分子または生物学的分子（例えば、単一の有機分子または錯体の有機分子、金属含有化合物、炭水化物、ペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質および核酸）を含む。従って、タンパク質またはタンパク質のサブユニットの間の相互作用は、高分子リガンド結合相互作用として考えられ得、ここで、タンパク質またはサブユニットの１つは、他のタンパク質またはサブユニットのためのリガンドと考えられる。この方法は、ＮＭＲ方法によって観察可能な種々の範囲における高分子に対して親和性を有するリガンドの相互作用を観察するために使用され得る。このサンプルの組成は、高分子とのリガンドの会合速度または解離速度を変更するために操作され得る。操作され得る因子としては、用いられるリガンドの型、サンプルのｐＨ、リガンドもしくは高分子の濃度または温度が挙げられる。このような操作を用いて、当業者は、リガンドが高分子と会合する速度が、高分子の露出されたプロトンが第２の分子のプロトンと交換される速度よりも遅いかまたは匹敵する条件を提供し得る。従って、リガンドが高分子と会合する速度が、高分子の露出されたプロトンが第２の分子のプロトンと交換される速度よりも、多くても１０倍、１００倍または１０００倍高い条件が、提供され得る。前述のように、プロトン交換が起こることを可能にする時間はまた、特定のリガンドならびにその解離速度および会合速度に適合するように調節され得る。
【００６６】
本明細書中で使用される用語「リガンド」は、高分子に特異的に結合し得る分子を意味する。「特異的な結合」は、結合が、当該分野において周知の定量化可能なアッセイにより非特異的相互作用を超えて検出可能であることを意味する。リガンドは、本質的には、タンパク質、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、アミノ酸、ヌクレオチドまたは任意の有機誘導体化化合物を含む、任意の型の天然分子または合成分子であり得る。この用語はまた、結合ポリペプチドによる触媒性変換に不活性な、酵素活性または基質を有するポリペプチドの補因子または基質を包含する。
【００６７】
１つの実施形態において、本発明の方法は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド関連分子を含むヌクレオチド誘導体であるリガンドと共に用いられ得る。本発明の方法において使用され得る、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド関連（ＮＡＤ関連）分子は、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸塩（ＮＡＤＰ＋）および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸塩（ＮＡＤＰＨ）を含む。
【００６８】
高分子に天然に結合するリガンドが用いられ得るが、リガンド模倣物もまた、天然のリガンドの代わりに使用され得る。模倣物は、第２の分子の機能と実質的に同じである、少なくとも１つの機能を有する分子である。リガンドの模倣物は、リガンドとして高分子上の同じ部位に結合するその能力に従って同定され得る。例えば、模倣物は、リガンドおよび模倣物を用いる結合競合アッセイによって同定され得る。模倣物の構造は、２つの分子が高分子上の同じ結合部位領域に結合する限り、模倣されるリガンドの構造と比較して類似するか、または異なり得る。この用語は、構造または機能の点において、リガンドの対応する部分に類似する部分を有する分子を包含し得る。
【００６９】
シバクロンブルーを含む、リガンドＮＡＤＨに対する模倣物の例は、Ｄｙｅ−Ｌｉｇａｎｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ  ＭＡ（１９８０）に記載される。このような模倣物を得るための有用な改変を含む、ＮＡＤＨ模倣物の多数の他の例は、Ｅｖｅｒｓｅら、Ｔｈｅ  Ｐｙｒｉｄｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｃｏｅｎｚｙｍｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＮＹ（１９８２）に記載される。特定のアナログとしては、ニコチンアミド２−アミノプリンジヌクレオチド、ニコチンアミド８−アジドアデニンジヌクレオチド、ニコチンアミド１−デアザプリンジヌクレオチド、３−アミノピリジンアデニンジヌクレオチド、３−アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド、チアゾールアミドアデニンジヌクレオチド、３−ジアゾアセチルピリジンアデニンジヌクレオチドおよび５−アミノニコチンアミドアデニンジヌクレオチドが挙げられる。特定の模倣物は、リガンド置換アッセイによって、例えば、既知のリガンドを用いる競合結合アッセイを用いて、同定および選択され得る。模倣物候補物質はまた、リガンドまたは模倣物との構造的類似性について、化合物のデータベースを検索することによって同定され得る。
【００７０】
別の実施形態において、本発明の方法は、アデノシンリン酸関連分子であるリガンドと共に使用され得る。アデノシンリン酸関連分子は、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン１リン酸（ＡＭＰ）および環式アデノシン１リン酸（ｃＡＭＰ）からなる群から選択され得る。アデノシンリン酸関連分子はまた、これらの分子の模倣物であり得る。アデノシンリン酸関連分子の模倣物は、ケルセチン、アデニルイミド２リン酸（ＡＭＰ−ＰＮＰ）またはオロモウシン（ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ）を含む。
【００７１】
本発明の方法における有用なリガンドは、補因子、補酵素、または、上記のようなＮＡＤ、ＮＡＤＰもしくはＡＴＰを含むビタミンであり得る。他の例としては、チアミン（ビタミンＢ１）、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ピリドキシミン（ビタミンＢ６）、コバラミン（ビタミンＢ１２）、ピロリン酸塩、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、ピリドキサルリン酸塩、補酵素Ａ、アスコルビン酸塩（ビタミンＣ）、ナイアシン、ビオチン、ヘム、ポルフィリン、葉酸塩、テトラヒドロ葉酸塩、ヌクレオチド（例えば、グアノシン３リン酸、シチジン３リン酸、チミジン３リン酸、ウリジン３リン酸）、レチノール（ビタミンＡ）、カルシフェロール（ビタミンＤ２）、ユビキノン、ユビキチン、ａ−トコフェロール（ビタミンＥ）、ファルネシル、ゲラニルゲラニル、プテリン、プテリジンおよびＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）が挙げられる。
【００７２】
タンパク質またはポリペプチドは、本発明においてリガンドとして用いられ得る。タンパク質リガンドおよびポリペプチドリガンドの例としては、天然に存在するポリペプチドリガンド（例えば、ユビキチンまたは、インスリン、ヒト成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、副甲状腺ホルモン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、黄体化ホルモン、ヒト繊毛性性腺刺激ホルモン、上皮増殖因子および神経増殖因子を含む、ポリペプチドホルモン）が挙げられる。加えて、本発明の方法において有用なリガンドは、結合活性を有する、天然に存在しないタンパク質またはポリペプチドであり得る。このようなリガンドは、合成ポリペプチドライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリーまたは以下に示されるようなコンビナトリアルポリペプチドライブラリー）をスクリーニングすることによって同定され得る。タンパク質リガンドまたはポリペプチドリガンドはまた、以下に記載されるようなアミノ酸アナログまたはアミノ酸誘導体を含み得る。タンパク質リガンドまたはポリペプチドリガンドの単離の方法は、当該分野において周知であり、そしてＳｃｏｐｅｓ、前出；Ｄｕｅｔｓｃｈｅｒ、前出；およびＣｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ（２０００）に記載される。
【００７３】
核酸はまた、本発明におけるリガンドとして用いられ得る。本発明において有用な核酸リガンドの例としては、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ）またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡもしくはｔＲＮＡ）が挙げられる。核酸リガンドはまた、合成オリゴヌクレオチドであり得る。このようなリガンドは、以下に記載されるようなリガンド結合活性についてランダムオリゴヌレオチドライブラリーをスクリーニングすることによって同定され得る。核酸リガンドはまた、天然の供給源から単離され得るか、またはＳａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ａｕｓｕｂｅｌら、前出に記載される方法を含む、当該分野において周知の方法を用いて、組換え系において生成され得る。
【００７４】
本発明において用いられるリガンドは、アミノ酸、アミノ酸アナログまたは誘導体化アミノ酸であり得る。アミノ酸リガンドは、２０の必須アミノ酸または天然の供給源から単離された任意の他のアミノ酸の１つであり得る。本発明において有用なアミノ酸アナログとしては、神経伝達物質（例えば、γ−アミノ酪酸、セロトニン、ドーパミンもしくはノルエピネフリン）またはホルモン（例えば、チロキシン、エピネフリン、もしくはメラトニン）が挙げられる。合成アミノ酸またはアナログがまた、本発明において用いられ得る。合成アミノ酸は、アミノ酸を誘導体化するアミノ酸の化学的改変（例えば、アルキル化、アシル化、カルバミル化、ヨウ素化、または任意の改変）を含み得る。このような誘導体化分子は、塩酸アミン、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシル基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成するために遊離アミノ酸が誘導体化される分子を含む。遊離のカルボキシル基は、塩、メチルエステルおよびエチルエステルもしくは他の型のエステルまたはヒドラジドを形成するために誘導体化され得る。遊離のヒドロキシル基は、Ｏ−アシル誘導体またはＯ−アルキル誘導頼を形成するために誘導体化され得る。ヒスチジンのイミダゾール窒素が、Ｎ−ベンジルヒスチジンを形成するために誘導体化され得る。２０の標準アミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体はまた、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリジン、３−メチルヒスチジン、ホモセリン、オルニチンおよびカルボキシルグルタミン酸を含む、結合構造のクラスター中に含まれ得る。
【００７５】
脂質リガンドもまた、本発明において用いられ得る。脂質リガンドの例としては、トリグリセリド、リン脂質、糖脂質またはステロイドが挙げられる。本発明において有用なステロイドとしては、糖質コルチコイド、鉱質コルチコイド、アンドロゲン、エステロゲンおよびプロゲスチンが挙げられる。
【００７６】
本発明において用いられ得る別の型のリガンドは、炭水化物である。炭水化物リガンドは、単糖（例えば、グルコース、フルクトース、リボース、グリセルアルデヒドおよびエリトロース）；二糖（例えば、ラクトース、スクロースまたはマルトース）；オリゴ糖（例えば、レクチン（例えば、凝集素、ピーナッツレクチンまたは植物性凝集素）によって認識されるオリゴ糖）あるいは多糖（例えば、セルロース、キチンまたはグリコーゲン）であり得る。
【００７７】
リガンドに結合する高分子中の原子は、リガンドの存在下および非存在下において、原子でのプロトンの示差交換に従って、本発明の方法を用いて同定され得る。詳細には、高分子中の原子は、リガンドが存在しない場合よりも大きな程度、リガンドが存在する第２の分子から磁化されたプロトンを取得することから保護される場合、リガンドと相互作用するものとして同定され得る。例えば、リガンドの存在下および非存在下で高分子について得られたＳＥＡ−ＴＲＯＳＹ  ＮＭＲスペクトルが、比較され得る。２つのスペクトル間の強度または化学的シフトを変化させるＮＭＲ交差ピークが、リガンドと相互作用する原子に対応するものとして同定され得る。向上したシグナル解像度およびリガンド結合に関与する原子のサブセットの選択的観察に起因するスペクトルの単純化は、リガンド結合に関与しない原子から生じる潜在的な重複シグナルの除去に起因して、大きな高分子についての強度または化学的シフトにおける変化の向上した検出を提供し得る。
【００７８】
この方法はまた、リガンド結合部位の構造および動力学を測定するために用いられ得る。上記のような３次元ＮＭＲ技術は、結合部位領域またはループに構造を帰属させる高分子中の原子のサブセットの選択的観察と組み合わせて用いられ得る。例えば、ＳＥＡ−ＨＮＣＡ−ＴＲＯＳＹまたはＳＥＡ−ＨＮＣＡＣＢ−ＴＲＯＳＹスペクトルは、リガンドと相互作用する高分子の原子を同定し、そしてその構造を帰属させるリガンドの存在下および非存在下で、高分子について得られ得る。これらの実験は、特に魅力的である。なぜならば、１３Ｃαおよび１３Ｃβ化学的シフトは、Ｃａｖａｎａｕｇｈら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ（１９９６）に記載されるように、特定のアミノ酸型に特徴的であり、そして帰属プロセスを容易にし得るからである。これは、分子のループ領域、従って結合領域の大部分について完全な骨格および１３Ｃβ共鳴帰属を提供し得る。リガンド結合部位領域についての構造決定を提供することに加えて、この方法は、結合部位の動力学を決定するために用いられ得る。例えば、１５Ｎスピン緩和測定は、Ｃａｖａｎａｕｇｈら、前出に記載されるように、結合部位ループの内部動力学における情報を得るために用いられ得る。ＳＥＡ−ＴＲＯＳＹと１５Ｎスピン緩和測定との組合せは、ＴＲＯＳＹのみを用いた１５Ｎスピン緩和測定を用いて利用可能な決定よりも、大きな高分子に関するこのような決定を提供し得る。
【００７９】
本方法はまた、高分子の同じ結合部位領域またはループで、異なるリガンドの結合を媒介する相互作用における差異を同定するために使用され得る。これらの差異は、リガンドの存在下および非存在下における高分子を比較するための、上述の方法に類似の方法を使用して、同定し得る。但し、これらの方法は、高分子を用いて第１のリガンドおよび第２のリガンドの存在下および非存在下で行われ、そして、それぞれのスペクトルが比較される。それら２つのリガンドによる、第２の分子の交換から特異的に保護される原子は、第２のリガンドより第１のリガンドと強い相互作用を有していると同定され得る。例えば、第２のリガンド存在下でのシグナルと比較する場合に、第１のリガンドの存在下での磁化プロトンの獲得によって、より強いシグナルを有する原子は、第２のリガンドによって、より大きな程度で、第２の分子から保護されると同定され得る。従って、この原子は、第１のリガンドより第２のリガンドとより強い相互作用をする原子として同定され得る。リガンドの存在によって、結合部位の共鳴が完全に消失することが引き起こされない場合、化学シフト摂動が検出され得る。より具体的には、第２のスペクトルに比べて、第１のスペクトルにおける化学シフトの摂動された交差ピークは、結合部位残基または結合部位残基の構造的特性および機能的特性を同定するために使用され得る。
【００８０】
以下の実施例は、本発明を例示することは意図されるが、限定することは意図されない。
【００８１】
（実施例Ｉ：ＳＥＡ−ＴＲＯＳＹを用いた溶媒露出アミドの検出）
この実施例は、タンパク質上の溶媒露出１５Ｎ原子の選択的な観測による、巨大タンパク質のＮＭＲスペクトルの簡素化を例示する。ＳＥＡ−ＴＲＯＳＹ（Ｓｏｌｖｅｎｔ−Ｅｘｐｏｓｅｄ  Ａｍｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ＴＲＯＳＹ）スペクトルを、ラット肝臓由来の酵素シトクロムＰ４５０レダクターゼ（Ｐ４５０Ｒ）の、一様に１５Ｎ／２Ｈ標識化された触媒部分で決定した。参考として、Ｐ４５０Ｒに対する１５Ｎ，１Ｈ  ＴＲＯＳＹスペクトルもまた決定した。
【００８２】
Ｐ４５０Ｒは、ラットタンパク質の残基５６〜６７８からなり、７１ｋＤａの分子量を有する。１５Ｎ／２Ｈ標識化Ｐ４５０Ｒタンパク質を、ｂｉｏｆｌｏ発酵槽（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｉｓｏｎ  ＮＪ）中で、Ｄ２Ｏ中の、１５Ｎ−塩化アンモニウム含有Ｃｅｌｌｔｏｎｅ（Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｃｏｌｕｍｂｉａ  ＭＤ）補充Ｍ９最小培地で、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現した。この１５Ｎ／２Ｈ標識化Ｐ４５０Ｒタンパク質を、Ｓｈｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：７５８４−７５８９（１９８９）に記載されるように、アニオン交換クロマトグラフィーおよび２’，５’−ＡＤＰ親和性クロマトグラフィーを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の可溶性画分から単離した。１５Ｎ／２Ｈ標識化Ｐ４５０Ｒタンパク質を、アミドおよびヒドロキシルが交換され他の全ての非交換位が重水素化されたままでプロトン化されるように、Ｈ２Ｏ中に保存した。ｐＨ７．５で、２００μｌの０．５ｍＭ濃度の１５Ｎ／２Ｈ標識化Ｐ４５０Ｒタンパク質を含むサンプルを、以下に記載されるように、ＮＭＲ分光学測定に使用した。
【００８３】
ＳＥＡ−ＴＲＯＳＹスペクトルを、１００ｍｓのτｍで、図２ａに示されるパルス系列を用いて得た。ＴＲＯＳＹスペクトルを、破線の枠で示されるＳＥＡエレメントを使用せずに、図２ａに示されるパルス系列を用いて得た。図２に示されるパルス系列について、細い棒および広い棒は、それぞれ９０°無線周波数（ｒｆ）パルスおよび１８０°無線周波数パルスを表す。明記されない限り、パルスの位相はｘ軸に沿う。パルスフィールド勾配は、ｇ１＝２０Ｇ／ｃｍ、ｇ２＝３０Ｇ／ｃｍ、ｇ３＝４０Ｇ／ｃｍ、ｇ４＝１５Ｇ／ｃｍ、ｇ５＝５５Ｇ／ｃｍの強度で、５００μｓの持続時間であった。遅延（時間）τを２．７ｍｓにセットした。位相サイクルは、φ１＝ｙ，−ｙ，−ｘ，ｘ；φ２＝ｙ；φ３＝ｘ；Ψｒｅｃ＝ｘ，−ｘ，−ｙ，ｙであった。１５Ｎ次元の位相敏感スペクトルを、φ１＝−ｙ，ｙ，−ｘ，ｘ；φ２＝−ｙ；φ３＝−ｘを使用し、各々のｔ２値に対する第２ＦＩＤを記録することによって得、Ｐｅｒｖｕｓｈｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ  １２：３４５−３４８（１９９８）に記載されるように、このデータを処理した。残存水サプレッションを、Ｓｋｌｅｎａｒら、Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．１０２：２４１−２４４（１９９３）に記載されるように、３−９−１９複合パルスを使用して実行されるＷＡＴＥＲＧＡＴＥ系列を使用して得た。図２ａで示されるパルス系列において、τｍの前に起こる系列部分は、１５Ｎダブルフィルターである。
【００８４】
スペクトルを、３０３°Ｋで、７００ＭＨｚ  １Ｈ周波数作動し、４つのｒｆチャネル、遮蔽された３重線グラジエントコイルを有する３重線共鳴プローブ、および重水素デカップリングのための重水素スイッチボックスを備える、Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ７００（Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＧ  Ｆａｌｌａｎｄｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で記録した。各々のスペクトルに対して、１２８（ｔｌ）×１０２４（ｔ２）複合点を記録した。スペクトルを獲得し、ＸＷＩＮＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＧ）を用いて処理した。スペクトルを、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ  ５：１−１０（１９９５）に記載されるように、ＸＥＡＳＹを使用して解析した。
【００８５】
図３左側のＴＲＯＳＹパネルに示されるように、６３０個の期待される交差ピークのうち約４００個のみが、スペクトル中で分離され得る。ほとんどのスペクトルは、共鳴帰属を妨げる、ひどい共鳴重なりによって特徴付けられる。
【００８６】
それとは対照的に、図３右側のパネルに示されるように、１００ｍｓの混合時間でのＳＥＡ−ＴＲＯＳＹスペクトルは、共鳴重なりを有意に減少することによって、劇的に簡素化される。スペクトルの複雑さのレベルおよびスペクトル中に観測される共鳴重なりの量が、混合時間τｍと共に変化することが見出され、それ故、増やされた混合時間は、複雑さおよび共鳴重なりの増加を導く。
【００８７】
（実施例ＩＩ：ＳＥＡエレメントと他のＮＭＲパルス系列の組合せ）
この実施例は、ＳＥＡパルス系列と他のＮＭＲパルス系列の組合せを用いて得られるスペクトルを使用する、巨大タンパク質構造中の特定の領域に対するＮＭＲシグナルの帰属を例示する。三次元ＳＥＡ−ＨＮＣＡ−ＴＲＯＳＹスペクトルを、１５Ｎ／１３Ｃ／２Ｈ標識化Ｐ４５０Ｒに対して獲得した。このスペクトルを図４ａ〜図４ｃに示す。三次元ＨＮＣＡ−ＴＲＯＳＹスペクトルは、Ｓａｌｚｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３５８５−１３５９０（１９９８）に記載されるように、タンパク質骨格中の１３Ｃα原子間の結合性を決定するために使用され得る。
【００８８】
この１５Ｎ／１３Ｃ／２Ｈ  Ｐ４５０Ｒを、実施例Ｉに記載されるように、発現し、単離した。但し、１３Ｃを、（Ｕ−１３Ｃ）グルコースの形状で、生育培地に加えた。ｐＨ７．５で、２００μｌの０．５ｍＭ濃度の１５Ｎ／１３Ｃ／２Ｈ標識化Ｐ４５０Ｒを含むサンプルを、以下に記載のように、ＮＭＲ分光学測定に使用した。
【００８９】
スペクトルを、実施例Ｉに記載されるように、図２ｂに示されるパルス系列を使用して、獲得し、処理し、そして解析した。ＳＥＡエレメントを、三次元ＨＮＣＡ−ＴＲＯＳＹパルススキーム（Ｓａｌｔｚｍａｎら、上述（１９９８））と結合し、図２ｂに示される三次元ＳＥＡ−ＨＮＣＡ−ＴＲＯＳＹパルススキームを作成した。１３Ｃα１８０°パルスは、ＧｒｅｅｎおよびＦｒｅｅｍａｎ、Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．９３：９３−９６（１９９１）に記載されるように、帯域選択性ＲＥＢＵＲＰパルスである。ＲＥＢＵＲＰパルスは、５３ｐｐｍに中心を有し、２５０μｓの持続時間を有する。このパルスは、１３ＣＯ領域（約１７７ｐｐｍ）を励起せずに、１３Ｃα領域を選択的に励起するように設計される。これは、１５Ｎ−１３ＣＯの１Ｊカップリング定数（約１５Ｈｚ）による磁化の損失を避けるために行われる。１３ＣＯデカップリングパルスはオフレゾナンスで、１２０μｓの持続時間のガウス関数形状パルスは、１７７ｐｐｍにシフトした。この遅延は、τ＝２．７ｍｓ；Ｔ＝１１ｍｓであった。位相サイクルは、φ１＝４（ｘ）、４（−ｘ）；φ２＝ｙ，−ｙ，−ｘ，ｘ；φ３＝ｙ；φ４＝ｘ；Ψｒｅｃ＝ｘ，−ｘ，−ｙ，ｙ，−ｘ，ｘ，ｙ，−ｙであった。１５Ｎ次元の位相敏感スペクトルを使用し、各々のｔ２値に対する第２ＦＩＤを記録することによって得、ここで、φ２＝２（ｘ），２（−ｘ）；φ３＝ｘ，−ｘであり、そして、Ｐｅｒｖｕｓｈｉｎら（前述）に記載されるように、このデータを処理した。１３Ｃα次元のＳｔａｔｅｓ−ＴＰＰＩ矩象（ｑｕａｄｒａｔｕｒｅ）検出を、Ｍａｒｉｏｎら、Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．８５：３９３−３９９（１９８９）で記載されるように、φ１のインクリメントによって達成した。パルスフィールド勾配は、ｇ１＝２０Ｇ／ｃｍ、ｇ２＝３０Ｇ／ｃｍ、ｇ３＝４０Ｇ／ｃｍ、ｇ４＝１５Ｇ／ｃｍ、ｇ５＝４０Ｇ／ｃｍ、ｇ６＝１５Ｇ／ｃｍ、ｇ７＝５５Ｇ／ｃｍの強度で、５００μｓの持続時間であった。１３Ｃα展開の間の２Ｈデカップリングを、Ｓｈａｋａら、Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．５２：３３５−３３８（１９８３）に記載されるように、２．５ｋＨｚのフィールド強度で、ＷＡＬＴＺ−１６複合パルスを用いて達成した。残存水（シグナル）サプレッションを、Ｓｋｌｅｎａｒら、（上述）に記載されるように、３−９−１９複合パルスを用いてＷＡＴＥＲＧＡＴＥ系列を使用して、達成した。
【００９０】
ＳＥＡエレメントと三次元ＨＮＣＡ−ＴＲＯＳＹエレメントとの組合せは、ＳＥＡエレメントを使用せずに獲得された同じスペクトルに比べて簡素化された、三次元ＳＥＡ−ＨＮＣＡ−ＴＲＯＳＹを提供した。図４ａ〜図４ｃに示されるように、この簡素化されたスペクトルを、Ｐ４５０Ｒのいくつかのループ領域での共鳴を帰属するために使用し得る。残基Ａｌａ２３５〜Ｇｌｕ２３８からなるループのストレッチは、図４ａで破線で示される一連の１３Ｃα（ｉ）／１３Ｃα（ｉ−１）結合性およびＰ４５０Ｒの一次構造に対する、このストレッチの残基に独特の化学シフトパターンによって得られ得る。類似するアプローチを使用して、Ａｌａ５００〜Ａｓｎ５０３およびＡｓｐ６３２〜Ａｌａ６３３からなるループを、図４ｂおよび図４ｃに示されるように連続的に帰属した。
【００９１】
溶媒に露出された残基は、しばしばループに位置するので、これら残基は、Ｃａｖａｎａｕｇｈら（上述）のように、１３Ｃαによって容易に帰属され得る。Ｐ４５０Ｒのいくつかの溶媒に露出されたループは、その機能に関与した。上記記載の方法を使用する、これらのループに対する化学シフトの帰属は、Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９４：８４１１−８４１６（１９９７）に記載される機能を含んだ、この遍在性タンパク質の複雑な機能を決定する、タンパク質触媒、タンパク質−タンパク質相互作用およびアロステリック調節への、これらのループの関連を特徴付けるのに使用され得る。例えば、残基Ｇｌｙ６３１〜Ａｌａ６３３の小ループは、特に重要である。なぜなら、そのループは、触媒残基Ｃｙｓ６３０に隣接しており、Ｗａｎｇら（上述）およびＳｈｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：５３９１−５３９８（１９９９）に記載されるように、おそらく第３の補因子ＮＡＤＰと接触する。
【００９２】
本明細書中に引用された刊行物は、参考として本明細書で援用される。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書中で、限定を設定しないことが意図され、列挙される要素を含むだけでなく、さらに任意の追加の要素を包含する。
【００９３】
本発明は、上記に提供される実施例を参照して記載されたが、種々の改変が、本発明の精神から逸脱することなくなされ得ることが理解される。従って、本発明は、特許請求の範囲によってのみ制限される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１ａから図１ｅは、本発明のある工程を模式的に描く。以下に示す参照番号が、これらの図の中で使用される：
【図２】
図２ａは、ＳＥＡ−ＴＲＯＳＹ  ＮＭＲパルス系列を示す。図２ｂは、ＳＥＡ−ＨＮＣＡ−ＴＲＯＳＹパルス系列を示す。ＳＥＡエレメントを、両方の図において破線の長方形で囲む。
【図３】
図３は、交換可能位置に選択的に存在する水素をもつ、一様に１５Ｎ／２Ｈ標識されたシトクロムＰ４５０レダクターゼの触媒部位について得られたＮＭＲスペクトルを示す。ＴＲＯＳＹパルス系列は、図の左側で使用された。右側は、τｍを１００ｍｓとしたＳＥＡ−ＴＲＯＳＹパルス系列を使用する対応するスペクトルである。
【図４】
図４ａから４ｃは、１５Ｎ／２Ｈ／１３Ｃ標識したシトクロムＰ４５０レダクターゼ触媒部位の０．５ｍＭサンプルについての３Ｄ  ＳＥＡ−ＨＮＣＡ−ＴＲＯＳＹから得た代表的なω１（１３Ｃα）−ω３（１ＨＮ）ストリップを示す。残基Ａｌａ２３５〜Ｇｌｕ２３８のループ（図４ａ）、残基Ａｌａ５００〜Ａｓｎ５０３のループ（図４ｂ）、および残基Ａｓｐ６３２〜Ａｌａ６３３のループ（図４ｃ）についての帰属を、点線で示される連続した１３Ｃα（ｉ）／１３Ｃα（ｉ−１）の連続性を用いて示す。
【図５】
図５ａ〜５ｄは、本発明の方法の種々の実施形態を示す。
【符号の説明】
１ａ  高分子
１  第１の水素
１ｃ  露出される位置
３ｃ  露出されない位置
３  露出されない位置に結合した水素
２ａ  第２の分子
２  第２の水素
４  磁場
５  パルス系列
６  水素の交換
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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