(57)【要約】本発明は、鉄を実質上含まないリセドロン酸ナトリウムを調製するための方法であって、当該方法は、特に機械撹拌を伴い、リセドロン酸、ナトリウム塩基、特に水酸化ナトリウム、及び鉄を減らす量のEDTAの液体（例えば、水、低級アルカノール、特に低級アルカノールと水の混合物）における組み合わせを還流し；当該組み合わせから鉄を実質上含まないリセドロン酸ナトリウムを単離する段階を含んで成る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
鉄を実質上含まないリセドロン酸ナトリウムを調製するための方法であって：
リセドロン酸、ナトリウム塩基、及び鉄を減らす量のEDTAを液体において含んで成る組み合わせを還流させ；そして
当該組み合わせから鉄を実質上含まないリセドロン酸ナトリウムを単離すること、
を含んで成る方法。
【請求項２】
前記ナトリウム塩基が水酸化ナトリウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組み合わせにおけるナトリウム塩基の量は、ナトリウム塩基のモル数：リセドロン酸のモル数が組み合わせ中、約１:０.８〜約１:１.２であるような量である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ナトリウム塩基のモル：リセドロン酸のモルの比が約１：１〜約１：１．２である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
鉄を減らす量のEDTAは、リセドロン酸の乾燥重量に基づいて約５％〜約５０％である、請求項１、２、３又は４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記鉄を減らす量のEDTAが、リセドロン酸の乾燥重量に基づいて約５％〜約２０％である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記液体が、水、低級アルカノール、及び低級アルカノールと水の混合物から選択されている、請求項１、２、３、４、５又は６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記液体が、水中約４０％〜約６０％（v/v）の低級アルカノールである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記液体が、水中約５０％（v/v）の低級アルカノールである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組み合わせをpHが約４〜５になる迄還流している、請求項１、２、３、４、５、６、７、８又は９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記組み合わせを、pHが約４．２〜約４．７になる迄還流している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記還流段階の間に、前記組み合わせをせん断力に委ねている、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１のいずれか１項に記載の方法。 
【請求項１３】
前記還流段階の間に前記組み合わせを機械撹拌に委ねている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記還流段階の後に還流した組み合わせを更に冷却することを含んで成る、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
還流した組み合わせを約０℃〜約３０℃の温度に冷却している、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
単離したリセドロン酸ナトリウム中の金属の量が、金属を減らす量のEDTAを使用せずに請求項１に記載の方法によって調製したリセドロン酸ナトリウム中の金属の量よりも約３０％〜５０％以上少ない、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記液体がエタノールと水の混合物であり、そして獲得したリセドロン酸ナトリウムが結晶質形態Bである、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又は１７のいずれか１項に記載の方法によって調製したリセドロン酸ナトリウム。
【請求項１９】
請求項１８に記載のリセドロン酸ナトリウムを含んで成る医薬製剤を投与することを含んで成る骨量の減少を治療する方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載のリセドロン酸ナトリウム及び医薬的に許容できる賦形剤を１種以上含んで成る医薬組成物。
【請求項２１】
鉄を実質上含まないリセドロン酸ナトリウム。
【請求項２２】
鉄を約５０ppm未満含むリセドロン酸ナトリウム。
【請求項２３】
リセドロン酸ナトリウムが形態Bである、請求項１８、２１又は２２のいずれか１項に記載のリセドロン酸ナトリウム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国特許出願６０/４４１,０６２（２００３年７月１７日に提出した）及び米国仮特許出願６０/４４５,１３９（２００３年７月５日に提出した）の優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
リセドロン酸ナトリウム[１−ヒドロキシ−３−(３−ピリジニル)エチリデン-ビスフォスホン酸ナトリウム塩]は、骨粗鬆症など、進行性の骨鉱物の減少及び骨組織の構造的劣化を特徴とする疾患の治療において有用であることが知られている。本発明者は、リセドロン酸ナトリウムが、金属、特に鉄を合成の間に吸収又は維持しそして集成（work-up）する傾向があることが確認している。
【０００３】
フォスホン酸塩、即ち、構造CP(O)(OH)２の基を１又は複数含む化合物は、キレート剤として働く。キレート剤は、多座配位子である。それは、中心金属イオンの配位圏における２以上の位置に同時に結合する。任意の理論にとらわれることなく、本発明者は、リセドロン酸ナトリウムが、金属、特に鉄を集めて維持することに貢献するキレート剤として働くと考えている。
【０００４】
残留鉄は不必要であり且つリセドロン酸ナトリウムの薬理効果に貢献しない。残留鉄は、製品の医薬化合物における不都合な品質である黄色化を伴う。残留鉄の含量が非常に低く且つ対応する優れた色合いを有するリセドロン酸ナトリウムを獲得するための方法の必要性が明らかにある。
【０００５】
リセドロン酸ナトリウムは、いくつかの多形又は擬多形形態で存在することもできる。多形及び擬多形は、塩が固体形態で獲得される条件を調節するによって、例えば、結晶化の条件を調節することによって影響を受けうる。ある多形態（又は擬多形態）からある多形態（擬多形態）に至り異なる固体状態の物理特性としては、例えば、粉砕された固体の流動性が挙げられる。流動性は、物質を医薬製品へと加工する間取り扱いの容易さに影響を及ぼす。粉末状化合物の粒子が互いに容易に流れない場合、調剤の専門家は、錠剤又はカプセル製剤開発においてその事実を考慮しなければならならず、その際はコロイド状二酸化ケイ素、タルク、デンプン、三塩基性リン酸カルシウムなどの流動促進剤の使用が必要になりうる。明らかに、新たな多形又は擬多型及び多形形態のコントロールを発見することが望まれている。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要 
一つの観点において、本発明は、実質上鉄イオンを含まないリセドロン酸ナトリウムを調製する方法に関連し、当該方法は、特に機械撹拌を伴い、リセドロン酸、ナトリウム塩基（特に水酸化ナトリウム）、及び鉄を減らす量のEDTAを液体（水、低級アルカノール、特に低級アルカノールと水の混合物である）において還流させ；そして実質上鉄を含まないリセドロン酸ナトリウムを当該組み合わせから単離する段階を伴う。
【０００７】
他の観点において、本発明は、実質上鉄を含まないリセドロン酸ナトリウム形態Bを調製するための方法に関連し、当該方法は、特に機械撹拌を伴い、リセドロン酸、ナトリウム塩基（特に水酸化ナトリウム）、及び鉄を減らす量のEDTA（特に、リセドロン酸ナトリウムの乾燥重量に基づいて（dry per weight basis）約５％及び約２０％）を液体（水、低級アルカノール、特に低級アルカノールと水の混合物、又は最も特に水中５０％（v/v）の低級アルカノールの混合物）において還流させ；そして実質上鉄を含まないリセドロン酸ナトリウムを当該組み合わせから単離する段階を伴う。
【０００８】
更に他の観点において、本発明は、本発明の方法によって調製したリセドロン酸ナトリウムに関連し、当該方法は、特に機械撹拌を伴い、リセドロン酸、ナトリウム塩基（特に水酸化ナトリウム）、及び鉄を減らす量のEDTA（特に、リセドロン酸ナトリウムの乾燥重量に基づいて約５％及び約２０％）を液体（水、低級アルカノール、特に低級アルカノールと水の混合物、又は最も特に水中５０％（v/v）の低級アルカノールの混合物）において還流させ；そして実質上鉄を含まないリセドロン酸ナトリウム形態Bを当該組み合わせから単離する段階を伴う。
【０００９】
他の観点において、本発明は、本発明の方法によって調製したリセドロン酸ナトリウムを含む医薬製剤を投与することによって骨量の減少を治療するための方法に関連する。
【００１０】
他の観点において、本発明は、実質上鉄を含まないリセドロン酸ナトリウムに関連する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本明細書中で使用した場合、リセンドロ酸ナトリウムとは、リセドロン酸の一ナトリウム塩、即ち、１−ヒドロキシ−２(３−ピリジニル)エチリデンビスフォスホン酸一ナトリウム塩である。リセドロン酸ナトリウムは実験式C7H1ONO7P2Naを有する。
【００１２】
背景により要求がない場合は、本明細書中で使用した場合、リセドロン酸ナトリウムとは、全ての多形又は擬多形形態、並びに非晶質形態におけるリセドロン酸ナトリウムを意味する。
【００１３】
本明細書中で、測定した量との関係において記載されている場合、用語「約」とは、測定又は特定し且つあるレベルの介護を行う当業者によって予測されるだろう測定量の変動（測定の対称及び使用する測定装置の正確さに対応する）を意味する。
【００１４】
本明細書中で使用した場合、リセドロン酸ナトリウム形態Bとは、形態Bの特徴を少なくとも１つ有するリセドロン酸ナトリウムを意味する。形態Bは、米国特許出願１０/３３７,６７６（２００３年１月６日に提出済み）に記載のとおり、そのX線回折パターン又はそのFTIRスペクトルによって特性決定されて良い。
【００１５】
本明細書中で使用されている場合、「残留鉄」とは、リセドロン酸ナトリウムに不要であり、リセドロン酸ナトリウムの薬理効果に貢献しない鉄イオンを意味する。
【００１６】
本明細書中で使用した場合、用語、低級アルカノールとは、一般式ROHの化合物（式中、Rは最大６個の炭素原子を有する直線状又は枝分かれしたアルキル基である）を意味する。メタノール、エタノール、及びイソプロパノールが好適な低級アルカノールである。エタノールが、本発明の実施において使用するための特に好適な低級アルカノールである。
【００１７】
本明細書中、混合物である液体との関係において使用した場合、v/v及び体積/体積とは、液体を作るために結合させた、液体(例えば、アルコール及び水)の体積比を意味する。従って、５０/５０、v/vとは、およそ等しい体積の２つの液体を組み合わせることによって調製した混合物を意味する。
【００１８】
本明細書中、ナトリウム塩基とは、陽イオンとしてナトリウムを有する、水酸化ナトリウムなどの塩基を意味する。多くのかかる塩基が当業者に公知である。水酸化ナトリウムが、本発明の実施において使用するための好適なナトリウム塩基である。
【００１９】
本明細書中に記載のリセドロン酸ナトリウムの鉄含有量を、誘導結合プラズマ原子分光発光（本明細書中以降「AES」と命名する）ことによって測定している。
【００２０】
本明細書中で使用した場合、「実質上鉄を含まない」とは、実施例２、調製物Bの方法など、鉄を減らす量のEDTAを伴わないが、同方法及び同出発物質を使用することによって調製したリセドロン酸ナトリウムよりも、鉄を実質上約３０％以上少なく含むような実質上鉄を含まないリセドロン酸ナトリウムを意味する。好適に、鉄を含まないリセドロン酸ナトリウムは、例えば、実施例２、方法Bなど同方法及び同出発物質を使用するが鉄を減らす量のEDTAを伴わずに調製したリセドロン酸ナトリウムよりも約３０％〜約５０％以上少なく鉄を含む。
【００２１】
実質上鉄を含まないリセドロン酸ナトリウムは、AESによって測定した場合、鉄を約５０百万分率(ppm)未満で含む。
【００２２】
１つの実施態様において、本発明は、実質上鉄を含まないリセドロン酸ナトリウムを調製する方法に関連し、当該方法は、リセドロン酸、ナトリウム塩基、及び鉄を減らす量のエデト酸(エチレンジアミン四酢酸, EDTA)を液体（水、低級アルカノール、又は好適には水と低級アルカノールの混合物である）中で還流する段階を伴う。好適な液体は、水中約４０%〜約６０%（v/v）の低級アルカノールからなる。好適な液体は、水中約５０%（v/v）の低級アルカノールからなる。
【００２３】
リセドロン酸のモル数：ナトリウム塩基のモル数の比は約１:０．８〜約１：１．２、好適には約１：１〜約１：１．２である。当業者は、もし、多価ナトリウム塩基を使用していれば、この比を変化させること(即ち、１モル超の酸と反応できるナトリウム塩基)を知るだろう。好適に、ナトリウム塩基の全体量が一度に加えられてはいない。むしろ、それは還流において、小分けに（例えば、滴下して）して、好適には、機械撹拌を伴い、リセドロン酸、鉄を減らす量のEDTA、液体（水、低級アルカノール又は水と低級アルコールであって良い）における溶液として還流において加えられて良い。液体の組成物及び温度に依存して、より多い又はより少ないEDTAが溶かされて良い。もしナトリウム塩基が溶かされている液体が、還流においてリセドロン酸が懸濁している液体とほぼ同じ組成であることが好都合であるが、必須ではない。
【００２４】
EDTAは、鉄を減らす量で使用されており、その量とは、実質上鉄を含まないリセンドロ酸ナトリウムが前記方法から獲得されるような量である。鉄を減らす量とは、鉄を実質上含まないリセドロン酸ナトリウムが、実施例２、調製Bなどのように、同方法によって且つ同じ出発物質を使用するが、鉄を減らす量のEDTAを伴わずに調製したリセドロン酸ナトリウムよりも約３０％以上少なく鉄を含むようなリセドロン酸ナトリウムが実質上鉄を含まない量である。特に、鉄を減らす量とは、実質上鉄を含まないリセドロン酸ナトリウムが鉄を５０ppm未満で含むような量である。使用されるEDTAの量は、使用されるリセドロン酸の乾燥重量に基づいて、一般に約５%〜約５０%、一層好適には、約５%〜２０%である。当業者は、鉄の量（それは当業者に周知の技術によって特定されるだろう）に依存し、慣用の実験を介してこの値を調節するだろう。
【００２５】
リセドロン酸、ナトリウム塩基、及びEDTAの組み合わせは、リセドロン酸ナトリウムの良好な収率を確保するために十分な時間に渡り還流において維持される。好適、この組み合わせは、pHが約４〜約５、好適には約４.２〜約４.７になる迄維持されている。組み合わせは、還流中、撹拌又は機械撹拌によって、せん断力に委ねられる。機械撹拌は、２つ挙げるなら、オーバーヘッドパドル型撹拌又は電磁撹拌である。
【００２６】
還流後、前記混合物冷却し、リセドロン酸ナトリウムを獲得する。好適には、冷却により、約０℃〜約３０℃の温度にする。冷却後、実質上鉄を含まないリセドロン酸ナトリウムは当業者に公知の任意の方法、例えば２つ挙げるなら、ろ過（重力又は吸引）又は遠心によって単離されている。
【００２７】
単離後、獲得した産物は水、低級アルカノール、又は水と低級アルカノールの混合物で洗浄されて良い。洗浄液体の組成は、還流液体と同じであるか又は異っていて良い。産物は更に低級アルコール、好適にはエタノールで洗浄されて良い。
【００２８】
本発明の実施により獲得されたリセドロン酸ナトリウムは、実質上鉄イオンを含まず且つ優れた色を有する。リセドロン酸ナトリウムの色は、当業者に公知の方法、例えば、APHA比色試験によって評価されて良い。
【００２９】
好適な実施態様において、特に液体が最大５０%（v/v）の水中エタノールからできている場合、実質上鉄を含まないリセドロン酸ナトリウムは、リセド酸ナトリウム形態Bであり、それは、約６.０、１４.４、１９.６、２４.９及び２５.４±０.２度２θにおけるX線回折ピーク（反射）値、又は約６２４、９５１、７９６、９１２、９３１、１０４６、１１０５、１１２３、１３２３、及び１６４１cm-１におけるFTIR吸収バンドを特徴とする。形態Bは、単一結晶X線解析によって証明されたように、一水和物である。
【００３０】
本発明のリセドロン酸ナトリウムは、医薬組成物の形態において使用されて良く、それは、希釈剤又は賦形剤の例えば、担体、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、錠剤分解促進剤、界面活性剤、潤滑剤などを使用することによって調製されて良い。医薬組成物について、様々な種類の単位投与形態が治療目的に依存して選択されて良く、形態は、例えば、錠剤、ピル、粉末、液体、懸濁、エマルション、顆粒、カプセル、座薬、 注射調製物(溶液及び懸濁)などであって良い。当業界で共通して知られており且つ幅広く使用されている全ての賦形剤が医薬組成物中で使用されて良い。担体としては、限定されないが、ラクトース、白糖、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶性セルロース、及び珪酸が挙げられる。結合剤としては、限定されないが、水、エタノール、プロパノール、シンプルシロップ、グルコース溶液、デンプン溶液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、シェラク、メチルセルロース、リン酸カリウム、及びポリビニルピロリドンが挙げられる。 錠剤分解促進剤としては、限定されないが、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、アガー粉末、ラミナリア昆布属物質の粉末（laminalia powder）、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸のモノグリセリド、デンプン、及びラクトースが挙げられる。錠剤分解促進剤としては、限定されないが、白糖、ステアリン、子ココナッツバター、及び水素化油が挙げられる。吸収促進剤としては、限定されないが、第四アンモニウム塩基及びラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。湿潤剤としては、限定されないが、グリセリン及びデンプンが挙げられる。吸収剤としては、限定されないが、デンプン、ラクトース、カオリン、ベントナイト及びコロイド状珪酸が挙げられる。潤滑剤としては、限定されないが、精製されたタルク、ステアリン酸塩、ホウ酸粉末、及びオポリエチレングリコールが挙げられる。錠剤は、更に、公知のコーティング物質でコーティングされて良く、それは例えば、糖でコーティングした錠剤、ゼラチン膜コーティングした錠剤、腸溶性コーティングした錠剤、膜で覆った錠剤、二層錠剤、及び多層錠剤が挙げられる。
【００３１】
医薬組成物の形をピル形態へと変える場合、当業界で使用されている共通に知られている全ての賦形剤が使用されて良い。例えば担体としては、限定されないが、ラクトース、デンプン、ココナッツバター、硬化植物油、カオリン、及びタルクが挙げられる。結合剤としては、限定されないが、アラビアガム粉末、トラガカントガム粉末、ゼラチン、及びエタノールが挙げられる。錠剤分解促進剤としては、限定されないが、アガー、及びコンブ属の物質が挙げられる。
【００３２】
医薬組成物の形を座薬形態へと変える場合、当業界で使用されている共通に知られている全ての賦形剤が使用されて良い。例えば、賦形剤としては、限定されないが、ポリエチレングリコール、ココナッツバター、高級アルコール、高級アルコールのエステル、ゼラチン、及び半合成グリセリドが挙げられる。
【００３３】
注射可能医薬組成物を調製する場合、溶液及び懸濁は滅菌されそして好適に血液に対して等張であるように調製される。注射調製物は、当業界で共通して知られている担体を使用して良い。例えば、注射可能調製物のための担体としては、限定されないが、水、エチルアルコール、プロピレングリコール、エトキシ化されたステアリルアルコール、ポリオキシ化されたイソステアリルアルコール、ポリオキシ化されたイソステアリルアルコール、及びポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸エステルが挙げられる。当業者は、実験を殆どせずとも、注射可能調製等張物を調製するために必要な塩化ナトリウム、グルコース、又はグリセリンの量を決定することができる。更なる成分の例えば、可溶化剤、緩衝剤、及び鎮痛剤も加えられて良い。もし必要なら、着色剤、防腐剤、香料、調味料、甘味料及び他の医薬も所望の調製物に対して加えられて良い。
【００３４】
医薬組成物中に含まれるリセドロン酸ナトリウムの量は、特に制限されているわけではないが、骨量の減少に伴う症状を治療、改善、又は減らすために十分な量であるべきだ。
【００３５】
骨量の減少を治療するための本発明の医薬組成物を投与する方法は、特に限定されておらず、患者の年齢、性別、及び症状に依存して様々な調製物において投与されて良い。例えば、錠剤、ピル、溶液、懸濁、エマルション、顆粒及びカプセルは経口的に投与されて良い。注射調製物は、経口的に又はグルコース溶液及びアミノ酸溶液などの注射注入剤と混合されて静脈内に投与されて良い。もし必要であれば、注射調製物は、単独で筋内、皮内、皮下又は腹腔内に投与されている。座薬は、直腸内に投与されて良い。
【００３６】
本発明の骨減少を治療するための医薬組成物の投与量は、患者の年齢、性別、及び症状に依存するだろう。
【００３７】
本発明は、次のような限定を意味していない例により更に説明されるだろう。
【実施例】
【００３８】
実施例１
水/エタノールの混合物(５０%(v/v))中の水酸化ナトリウム(７.４g、１当量)の溶液(１５０ml)を、還流温度において、水/エタノール(５０%(v/v))の混合物(８５０ml)中のリセドロン酸(５０g)及び５gのEDTA(それぞれ乾燥重量で１０%)の懸濁に対して滴下して加えた。この反応混合物を還流温度で、pHが４．２〜４．７で安定になる迄撹拌した。この反応混合物を約５０℃の温度に冷却した。次いで、沈殿物をろ過し、水/エタノール(５０%(v/v))の混合物で２度、次いでエタノール(１x５０ml)で洗浄し、そして５０℃で一晩乾燥させ、４８.５g(８５%)の形態Bのリセドロン酸ナトリウム白色結晶物質(熱重量分析による含水率は５.５%〜７.５%であった)を獲得した。AESにより産物中、鉄を５０ppm未満で発見した。
【００３９】
実施例２
実施例１の一般手順の後に、還流溶媒(水/エタノール、５０/５０(v/v))中のリセドロン酸及び水酸化ナトリウムからリセドロン酸ナトリウムの２同型調製を行った。１つの調製(A)において、EDTAを含ませた(リセドロン酸の乾燥重量に基づいて１５%)。他の調製(B)では、EDTAを使用しなかった。反応、単離、及び集成は例１に記載の通りである。産物の残留金属濃度をAESによって分析しており表１にまとめた。
【００４０】
実施例３
水/エタノールの混合物(５０%(v/v))中の水酸化ナトリウム(７.４g、１当量)の溶液(１５０ml)を、還流温度において、水/エタノール(５０%(v/v))の混合物(８５０ml)中のリセドロン酸(５０g)及び５gのEDTA(それぞれ乾燥重量で１０%)の懸濁に対して滴下して加えた。この反応混合物を還流温度で、pHが４．２〜４．７で安定になる迄撹拌した。この反応混合物を約２２℃の温度に冷却した。次いで、沈殿物をろ過し、５０mlの水/エタノール(５０%(v/v))の混合物で２度、次いでエタノール(１x５０ml)洗浄し、そして５０℃で一晩乾燥させ、４８.５g(８５%)の形態Bのリセドロン酸ナトリウム白色結晶物質(熱重量分析による含水率は５.５%〜７.５%であった)を獲得した。AESにより産物中、鉄を５０ppm未満で発見した。
【００４１】
実施例４
実施例１の一般手順の後に、還流溶媒(水/エタノール、５０/５０(v/v))中のリセドロン酸及び水酸化ナトリウムからリセドロン酸ナトリウムの２同型調製を行った。１つの調製(A)において、EDTAを含ませた(リセドロン酸の乾燥重量に基づいて１０%)。他の調製(B)では、EDTAを使用しなかった。反応、単離、及び集成は例１に記載の通りである。産物の残留金属濃度をAESによって分析しており表１にまとめた。
【００４２】
【表１】
2006515867.tif 000002
【国際調査報告】
2006515867.tif 000003
2006515867.tif 000004
2006515867.tif 000005