(57)【要約】細胞毒性剤の投与と続く熱ショックタンパク質９０インヒビター（アンサマイシンなど）の投与は、細胞の成長阻害に相乗効果を及ぼす。この相乗作用は、各細胞毒性剤が通常最小の細胞の成長阻害を引き起こすだけの用量で生じる。したがって、そのような併用療法は、細胞毒性剤の成長阻害効果を弱めることなく患者に対する細胞毒性剤のそれぞれの毒性を回避または減少させるように、より低用量の細胞毒性剤の使用を可能にする。したがって、それらの組合せは細胞増殖性障害を有する動物、好ましくは哺乳動物（細胞が野生型Ｒｂを有するか、Ｒｂ欠乏性もしくはＲｂ陰性であるかにかかわらず）の治療のために使用され得る。細胞増殖性傷害を治療することに関連するそのような方法の１つは、治療上有効量の細胞毒性剤を投与する工程と、続く治療上有効量の熱ショックタンパク質９０インヒビターを投与する工程とを含む。細胞毒性剤は、微小管作用剤、トポイソメラーゼＩＩインヒビター、プラチナ錯体、パクリタキセルまたはパクリタキセル誘導体であり得る。ＨＳＰ９０インヒビターは、アンサマイシン、ラディシコール、またはＨＳＰ９０のＡＴＰ結合部位に結合する合成化合物であり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型Ｒｂを有する細胞を破壊する方法であって、以下の工程
（ａ）該細胞に細胞毒性剤を投与する工程と、
（ｂ）ＨＳＰ９０機能を阻害することができる化合物を投与する工程と
を含み、該細胞毒性剤がＧ２／Ｍ作用剤である場合、該Ｇ２／Ｍ作用剤はＨＳＰ９０インヒビターの前に投与される方法。
【請求項２】
前記細胞毒性剤は、微小管作用剤（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、ＤＮＡ架橋剤、およびトポイソメラーゼＩＩインヒビターからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微小管作用剤は、ビンカアルカロイドおよびタキサンからなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記タキサンは、パクリタキセルまたはその誘導体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記トポイソメラーゼＩＩインヒビターは、ドキソルビシンである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡ架橋剤は、シスプラチンである、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記ＨＳＰ９０インヒビターは、アンサマイシン、ラディシコール（ｒａｄｉｃｉｃｏｌ）、およびＨＳＰ９０のＡＴＰ結合部位に結合する合成化合物からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記アンサマイシンは、１７−ＡＡＧまたはその誘導体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
網膜芽細胞腫遺伝子産物が欠乏している細胞を破壊する方法であって、以下の工程
（ａ）該細胞にＨＳＰ９０機能を阻害することができる化合物を投与する工程と、
（ｂ）該細胞に細胞毒性剤を投与する工程とを含む方法。
【請求項１０】
前記細胞毒性剤は、微小管作用剤、ＤＮＡ架橋剤、およびトポイソメラーゼＩＩインヒビターからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記微小管作用剤は、パクリタキセルまたはその誘導体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記トポイソメラーゼＩＩインヒビターは、ドキソルビシンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＤＮＡ架橋剤は、シスプラチンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＨＳＰ９０インヒビターは、アンサマイシン、ラディシコール、およびＨＳＰ９０のＡＴＰ結合部位に結合する合成化合物からなる群より選択される、請求項９〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記アンサマイシンが１７−ＡＡＧまたはその誘導体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
そのような治療を必要としている動物において、Ｒｂ陰性または欠乏性細胞を伴う細胞増殖性障害を治療する方法であって、治療上有効量のＨＳＰ９０インヒビターを別の細胞毒性剤と組み合わせて投与することを含む方法。
【請求項１７】
前記動物は、哺乳動物である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記哺乳動物は、ヒトである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞増殖性障害は、小細胞肺癌である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＨＳＰ９０インヒビターおよび細胞毒性剤は、他の既知の治療と組み合わせて与えられる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞毒性剤は、微小管作用剤、ＤＮＡ架橋剤、およびトポイソメラーゼＩＩインヒビターからなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記微小管作用剤は、パクリタキセルまたはその誘導体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記トポイソメラーゼＩＩインヒビターは、ドキソルビシンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＤＮＡ架橋剤は、シスプラチンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＨＳＰ９０インヒビターは、アンサマイシン、ラディシコール、およびＨＳＰ９０のＡＴＰ結合部位に結合する合成化合物からなる群より選択される、請求項１６〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記アンサマイシンは、１７−ＡＡＧまたはその誘導体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
そのような治療を必要としている動物において、野生型Ｒｂ細胞を伴う細胞増殖性障害を治療する方法であって、以下の工程
（ａ）該細胞に細胞毒性剤を投与する工程と、
（ｂ）ＨＳＰ９０機能を阻害し得る化合物を投与する工程と
を含み、該細胞毒性剤がＧ２／Ｍ作用剤である場合、該Ｇ２／Ｍ作用剤はＨＳＰ９０インヒビターの前に投与される方法。
【請求項２８】
前記細胞毒性剤は、微小管作用剤、ＤＮＡ架橋剤、およびトポイソメラーゼＩＩインヒビターからなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記微小管作用剤は、ビンカアルカロイドおよびタキサンからなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記タキサンは、パクリタキセルまたはその誘導体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記トポイソメラーゼＩＩインヒビターは、ドキソルビシンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＤＮＡ架橋剤は、シスプラチンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＨＳＰ９０インヒビターは、アンサマイシン、ラディシコール、およびＨＳＰ９０のＡＴＰ結合部位に結合する合成化合物からなる群より選択される、請求項２７〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記アンサマイシンは、１７−ＡＡＧまたはその誘導体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記動物は、哺乳動物である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記哺乳動物は、ヒトである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞増殖性障害は、乳癌である、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、細胞毒性剤の効力を増強させるための熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）インヒビターの使用に関する。
【０００２】
［発明の分野］
本出願は、２０００年１１月２日に出願された米国仮出願６０／２４５，７３５号の利益を主張するものであり、これは本明細書中で参照により援用される。
【０００３】
［発明の背景］
細胞増殖性疾患の現在の治療として、手術、細胞毒性剤での処置、放射線、および蒸気の組合せが挙げられる。細胞毒性剤での処置はまた、本明細書全体にわたり抗腫瘍剤または化学療法剤を指し、しばしば正常細胞の破壊を含む顕著な毒性の副作用をもたらす。十分に特性決定された毒性として、悪心および嘔吐、骨髄抑制、脱毛症、ならびに粘膜炎が挙げられる。重篤な心臓の問題もまた、細胞毒性剤（例えばドキソルビシンおよびパクリタキセル）の特定の組合せに伴うが、それほど一般的ではない。
【０００４】
細胞毒性剤のクラスの例として、例えば、アントラサイクリンファミリーの薬、ビンカアルカロイド、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞毒性ヌクレオシド、タキサン、エポシロン、ディスコデルモリド、プテリジンファミリーの薬、ジインエン（ｄｉｙｎｅｎｅｓ）、およびポドフィロトキシンが挙げられる。これらのクラスの成員として、例えば、ドキソルビシン、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン、アミノプテリン、メトトレキセート、メトプテリン、ジクロロメトトレキセート、マイトマイシンＣ、ポルフィロマイシン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド、ポドフィロトキシンまたはポドフィロトキシン誘導体（エトポシド、リン酸エトポシド、またはテニポシドなど）、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ロイロシジン（ｌｅｕｒｏｓｉｄｉｎｅ）、ビンデシン、ロイロシン（ｌｅｕｒｏｓｉｎｅ）、パクリタキセルなどが挙げられる。他の有用な抗腫瘍剤として、エストラムスチン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔｉｂｉｎｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メルファラン、ヘキサメチルメラミン、チオテパ、シタラビン、イダトレキセート（ｉｄａｔｒｅｘａｔｅ）、トリメトレキセート、ダカルバジン、Ｌ−アスパラギナーゼ、カンプトテシン、ＣＰＴ−１１、トポテカン、ａｒａ−Ｃ、ビカルタミド、フルタミド、ロイプロリド、ピリドベンゾインドール誘導体、インターフェロン、およびインターロイキンが挙げられる。
【０００５】
タキサンおよびビンカアルカロイド薬は、微小管作用剤である。タキサンおよびビンカアルカロイドの両方が、植物由来の天然に存在する化合物に基づいている。タキサンは、ヨーロッパイチイの針および小枝、またはセイヨウイチイ（Ｐａｃｉｆｉｃ ｙｅｗ）の樹皮に由来する。ビンカアルカロイドは、ツルニチニチソウ植物に由来する。
【０００６】
タキサンの例は、複合ジテルペンのタキソール（Ｔａｘｏｌ）（登録商標）（以下、「タキソール（登録商標）」と称す）（パクリタキセル）である。研究は、パクリタキセルが細胞周期のＧ２期の細胞をブロックおよび／または延長させることを示している。パクリタキセルで処置した細胞が細胞周期のＧ２を通過できないことは、パクリタキセルが微小管に結合して安定化させることから生じ得る（Ｓｃｈｉｆｆ， Ｐ． Ｂ． ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ， Ｓ． Ｂ．， １９８０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７： １５６１−１５６５）。微小管の安定化は、間期および分裂機能に必要な微小管の通常の再編成を阻止する（Ｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９７１， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ９３，２３２５− ２３２７； Ｓｃｈｉｆｆ， Ｐ． Ｂ．， 前出）。タキソール（登録商標）はまた、培養中の細胞の遊走挙動をブロックする（参照）。
【０００７】
パクリタキセルは、特定の癌（他の癌治療により効果的に治療されないものを含む）に対して細胞毒性および抗腫瘍活性を有することが示されている。さらに、パクリタキセルは、ＦＤＡにより、１９９２年には進行卵巣癌の治療に、そして１９９４年には乳癌の治療に承認された。パクリタキセルは現在、肺癌を含む他の癌の治療のための臨床試験中である。さらに、パクリタキセルは、電離放射線の影響に対する細胞の感受性を増加させることが報告されている（米国特許第６，０８０，７７７号を参照）。
【０００８】
抗腫瘍剤の別のクラスは、プラチナ錯体である。そのような錯体の例は、シスプラチンおよびカルボプラチンである。プラチナ錯体は、ＤＮＡに結合することによりＤＮＡ機能を破壊すると考えられる。例えば、シスプラチンは、共有結合、鎖間、または鎖内ＤＮＡ付加物の形成を介して、腫瘍細胞を死滅させる（Ｓｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．， ８７，１１５３−８１）。
【０００９】
プラチナ錯体は、しばしば副作用を伴う。例えば、シスプラチン処置は、腎毒性をもたらし得る。さらに、カルボプラチン処置は、しばしば血液毒性をもたらす。シスプラチンおよびカルボプラチンの両方が、神経毒性効果、および胃腸管障害（悪心および嘔吐など）を引き起こし得る。
【００１０】
さらに別のクラスの抗腫瘍剤は、トポイソメラーゼＩＩインヒビターである。現在、ＦＤＡはトポイソメラーゼＩＩを阻害する抗腫瘍剤を６種承認している。これらの薬は、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、エトポシド、およびテニポシドを含む。ドキソルビシン、イダルビシン、およびダウノルビシンは、アントラサイクリンとして知られるトポイソメラーゼインヒビターのクラスに属する。ミトキサントロンは、アントラキノンとして知られるクラスに属する。エトポシドおよびテニポシドは、ポドフィロトキシンとして知られる化合物のクラスに属する。
【００１１】
アントラサイクリン系抗生物質は、最初に、ストレプトミセス・ピウセチウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ ｐｅｕｃｅｔｕｓ）の発酵産物から単離された。最も広く使用されるアントラサイクリンは、ドキソルビシンである。これは、リンパ腫、乳癌、肉腫、カポジ肉腫、および白血病を含む広範な癌において使用される。これは、乳癌および軟部組織肉腫の治療のために使用される主要な薬の１つである。
【００１２】
ドキソルビシンは、白血球および血小板形成の抑制を含む重篤な副作用を有する。ドキソルビシンはまた、心筋細胞を破壊するフリーラジカル中間体の形成による心臓障害を引き起こし得る。ドキソルビシンを投与された患者は全て脱毛症を患う。
【００１３】
別のクラスの抗腫瘍薬は、アンサマイシンである。アンサマイシン系抗生物質は、ストレプトミセス・ヒグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）由来の天然物で、真核生物細胞に著しい影響を及ぼす。アンサマイシンは、最初に、ｖ−ｓｒｃ形質転換繊維芽細胞を回復させるそれらの能力に基づいて単離された（Ｕｅｈａｒａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ７６： ６７２−６７５）。続いて、それらは多数の発癌遺伝子、特にチロシンキナーゼをコードするもので形質転換された細胞に抗増殖性効果を及ぼすことが示された（Ｕｅｈａｒａ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １６４： ２９４−９８）。細胞成長の阻害は、アポトーシスを、および特定の細胞系において分化の誘導を伴う（Ｖａｓｉｌｅｖｓｋａｙａ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５９： ３９３５−４０）。アンサマイシン誘導体である１７−アリルアミノ１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＡＡＧ）は、現在臨床試験第一相にある。アンサマイシンの抗癌剤としての使用は、米国特許第４，２６１，９８９号、第５，３８７，５８４号、および第５，９３２，５６６号に記載される。アンサマイシン、ゲルダナマイシンの調製は、米国特許第３，５９５，９５５号に記載される（本明細書中で参照により援用される）。
【００１４】
真核生物の熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）は、ＡＴＰに結合して加水分解する、遍在性シャペロンタンパク質である。ＨＳＰ９０の細胞機能における役割は、完全には理解されていないが、最近の研究は、ＨＳＰ９０が広範なタンパク質（シグナル伝達、細胞周期制御、および転写調節に関係する重要なタンパク質を含む）のフォールディング、活性化、およびアセンブリに関係していることを示している。例えば、研究者等は、ＨＳＰ９０シャペロンタンパク質がステロイドホルモン受容体およびプロテインキナーゼのような重要なシグナル伝達タンパク質（腫瘍形成に関係した多くのもの、例えばＲａｆ−１、ＥＧＦＲ、ｖ−Ｓｒｃファミリーキナーゼ、Ｃｄｋ４、およびＥｒｂＢ−２を含む）に関連するを報告している（Ｂｕｃｈｎｅｒ Ｊ．， １９９９， ＴＩＢＳ， ２４： １３６−１４１； Ｓｔｅｐａｎｏｖａ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １０： １４９１−５０２； Ｄａｉ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： ２２０３０−４）。
【００１５】
ｉｎ　ｖｉｖｏおよびｉｎ　ｖｉｔｒｏ研究は、コシャペロン（ｃｏ−ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）の補助なしでは、ＨＳＰ９０はタンパク質をフォールディングまたは活性化できないことを示している。ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのステロイド受容体立体配座および会合のため、ＨＳＰ９０はＨｓｐ７０およびｐ６０／Ｈｏｐ／Ｓｔｉ１を必要とする（Ｃａｐｌａｎ， Ａ．， １９９９， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ９： ２６２−６８）。ｉｎ　ｖｉｖｏＨＳＰ９０は、ＨＳＰ７０およびそのコシャペロンと相互作用し得る。高等真核生物におけるＨＳＰ９０に伴う他のコシャペロンとして、Ｈｉｐ、Ｂａｇｌ、ＨＳＰ４０／Ｈｄｊ２／Ｈｓｊ１、イムノフィリン、ｐ２３、およびｐ５０が挙げられる（Ｃａｐｌａｎ， Ａ．、前出）。
【００１６】
多くのアンサマイシン（ハービマイシンＡ（ＨＡ）およびゲルダナマイシン（ＧＭ）など）は、ＨＳＰ９０のポケットに密接に結合する（Ｓｔｅｂｂｉｎｓ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｃｅｌｌ， ８９： ２３９−２５０）。アンサマイシンのＨＳＰ９０への結合は、タンパク質リフォールディングを阻害すること、および細胞タンパク質の選択群のプロテアソーム依存性分解を引き起こすことが報告されている（Ｓｅｐｐ−Ｌｏｒｅｎｚｉｎｏ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０： １６５８０−１６５８７； Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１ ： ８３２４−８３２８）。
【００１７】
Ｈｓｐ９０のＮ末端におけるアンサマイシン結合ポケットは、非常に保存されており、ＤＮＡジャイレースのＡＴＰ結合部位と弱い相同性を有する（Ｓｔｅｂｂｉｎｓ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．， 前出； Ｇｒｅｎｅｒｔ， Ｊ． Ｐ． ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２： ２３８４３−５０）。このポケットは、低い親和性でＡＴＰおよびＡＤＰに結合すること、および弱いＡＴＰ分解酵素活性を有することが報告されている（Ｐｒｏｒｏｍｏｕ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｃｅｌｌ， ９０： ６５−７５； Ｐａｎａｒｅｔｏｕ， Ｂ． ｅｔ ａｌ．， １９９８， ＥＭＢＯ Ｊ， １７： ４８２９−３６）。ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏ研究は、アンサマイシンによるポケットの占有が、ＨＳＰ９０機能を変更し、かつタンパク質リフォールディングを阻害することを示している。高濃度において、アンサマイシンはタンパク質基質のＨＳＰ９０への結合を阻止することが報告されている（Ｓｃｈｅｉｂｅｌ，Ｔ．， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６： １２９７−３０２； Ｓｃｈｕｌｔｅ， Ｔ． Ｗ． ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： ２４５８５−８； Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： ８３２４−８３２８）。あるいは、それらはまた、シャペロンに関連したタンパク質基質のＡＴＰ依存性放出を阻害することも報告されている（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｃ．， Ｌ． ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９３ ： １４５３６−４１； Ｓｅｐｐ−Ｌｏｒｅｎｚｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： １６５８０−１６５８７）。両方のモデルにおいて、フォールディングされていない基質はプロテアソームのユビキチン依存性プロセスにより分解される（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｃ．， Ｌ．， 前出； Ｓｅｐｐ−Ｌｏｒｅｎｚｉｎｏ，前出）。したがって、アンサマイシンは、ＨＳＰ９０機能の全般的なインヒビターとして、あるいはポケットに結合する内因性リガンドの調節効果を模倣するかまたはこれと拮抗する薬剤として作用する。
【００１８】
腫瘍細胞および形質転換されていない細胞の両方において、アンサマイシンのＨＳＰ９０への結合は、シグナル伝達制御因子のサブセットの分解をもたらすことが報告されている。これらは、Ｒａｆ（Ｓｃｈｕｌｔｅ， Ｔ． Ｗ． ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２３９： ６５５− ９； Ｓｃｈｕｌｔｅ， Ｔ． Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： ２４５８５−８）、核ステロイド受容体（Ｓｅｇｎｉｔｚ， Ｂ．， ａｎｄ Ｕ． Ｇｅｈｒｉｎｇ． １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２： １８６９４−１８７０１； Ｓｍｉｔｈ， Ｄ． Ｆ． ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １５： ６８０４−１２）、ｖ−ｓｒｃ（Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１： ８３２４−８３２８）、ならびにＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）およびＨｅｒ２／Ｎｅｕ（Ｈａｒｔｍａｎｎ， Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７０： ２２１−９； Ｍｉｌｌｅｒ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５４： ２７２４−２７３０； Ｍｉｍｎａｕｇｈ， Ｅ． Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： ２２７９６−８０１； Ｓｃｈｎｕｒ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３８： ３８０６−３８１２）などの特定の膜貫通チロシンキナーゼ（Ｓｅｐｐ− Ｌｏｒｅｎｚｉｎｏ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．，． １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： １６５８０−１６５８７）を含む。これらのタンパク質のアンサマイシン誘導性損失は、特定の調節経路の選択的破壊を導き、かつ細胞周期の特定の期での成長停止をもたらすといわれる（Ｍｕｉｓｅ−Ｈｅｉｍｅｒｉｃｋｓ， Ｒ． Ｃ． ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３： ２９８６４−７２）。
【００１９】
特定の癌の治療のために１７−ＡＡＧを利用する併用療法が議論されてきた。例えば、Ｎｇｕｙｅｎ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｊｏｕｒｎａｌ Ｔｈｏｒａｃｉｃ ａｎｄ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｕｒｇｅｒｙ， １１８： ９０８−９１５は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの非小細胞肺癌細胞の１７−ＡＡＧおよびタキソール（登録商標）での同時処置は、パクリタキセルの毒性を増強させることを報告している。
【００２０】
Ｃｄｋ４またはＣｄｋ６との複合体のサイクリンＤ、およびサイクリンＥ−Ｃｄｋ２は、網膜芽細胞腫遺伝子、Ｒｂのタンパク質産物をリン酸化する。研究者等は、Ｒｂ遺伝子のタンパク質産物が核リンタンパク質（これは、Ｇ１からＳ期への移行に関係する遺伝子の転写を抑圧することにより、細胞周期のＧ１期の間の細胞を停止させる）であることを報告している（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ， Ｒ． Ａ．， １９９５， Ｃｅｌｌ， ８１： ３２３−３３０）。脱リン酸化Ｒｂは、Ｅ２Ｆ転写ファミリーの成員（これはＥ２Ｆ標的遺伝子の転写を最終的に抑圧する）とのその相互作用によって、後期Ｇ１を通した進行をある程度阻害する（Ｄｙｓｏｎ， Ｎ．， １９９８， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， １２： ２２４５−２２６２）。中〜後期Ｇ１におけるサイクリン依存性キナーゼによるＲｂの進行性リン酸化は、Ｒｂ−Ｅ２Ｆ複合体からのＲｂの解離を導き、Ｅ２Ｆ標的遺伝子の発現およびＳ期への進入を可能にする。
【００２１】
網膜芽細胞腫遺伝子産物は、網膜芽細胞腫、骨肉腫、および小細胞肺癌などの複数の腫瘍型において突然変異している。研究はまた、多くのさらなるヒト癌において、Ｒｂの機能が、結合タンパク質（例えば、子宮頸癌のヒトパピローマウイルス−Ｅ７タンパク質；Ｉｓｈｉｊｉ， Ｔ， ２０００， Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．， ２７： ７３−８６）による中和、またはそのリン酸化の最終的な原因である経路の調節解除を通じて破壊されることを示している。Ｒｂ経路の不活性化は、しばしば、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、サイクリンＤ１、およびＣｄｋ４の撹乱から生じる。
【００２２】
大部分の癌治療は、全ての型の癌について成功していない。例えば、固形腫瘍型は、最終的には放射線または化学療法に反応しなくなるため、特定の癌型を標的とする癌治療が依然として必要である。さらに、癌および他の細胞増殖性疾患の治療は、通常重篤な副作用を有する細胞毒性剤の使用を必要とする。したがって、より効果的な治療、とりわけ現在利用可能であるものよりも副作用が少ないものに対する要求が存在する。本発明は、これらの要求を満たし、かつ関連した利点をも提供する。本発明は、細胞毒性剤と組み合わせたアンサマイシンの使用による、細胞増殖性障害を治療するための新規方法を提供する。
【００２３】
［発明の概要］
驚くことに、細胞毒性剤の投与に続く熱ショックタンパク質９０インヒビター（アンサマイシンなど）の投与が、細胞の成長阻害に相乗効果を及ぼすことが発見された。この相乗作用は、各細胞毒性剤が通常最小の細胞の成長阻害を引き起こすだけの用量で生じる。したがって、そのような併用療法は、細胞毒性剤の成長阻害効果を弱めることなく患者に対する細胞毒性剤のそれぞれの毒性を回避または減少させるように、より低用量の細胞毒性剤の使用を可能にする。
【００２４】
本発明の１つの態様は、細胞増殖性障害を有する、動物、好ましくは哺乳動物の治療に有用な方法に関する。そのような方法の１つは、野生型Ｒｂ細胞に伴う細胞増殖性障害の治療に関連し、治療上有効量の細胞毒性剤の投与と続く治療上有効量の熱ショックタンパク質９０インヒビターの投与を含む。好ましくは、細胞毒性剤は、微小管作用剤、トポイソメラーゼＩＩインヒビター、またはプラチナ錯体である。より好ましくは、細胞毒性剤は、パクリタキセル、またはパクリタキセル誘導体である。好適な実施形態において、ＨＳＰ９０インヒビターは、アンサマイシン、ラディシコール、またはＨＳＰ９０のＡＴＰ結合部位に結合する合成化合物である。特に好適な実施形態において、アンサマイシンは、１７−ＡＡＧ（ＣＮＦ−１０１）またはその誘導体である。細胞毒性剤がドキソルビシンである場合、投与はスケジュールに依存しない、すなわち、ドキソルビシンは、ＨＳＰ９０インヒビターの前に、同時に、または後に投与され得る。
【００２５】
本発明はまた、Ｒｂ欠乏性またはＲｂ陰性である細胞を伴う細胞増殖性障害を有する、動物、好ましくは哺乳動物の治療に有用な方法に関する。そのような方法の１つは、細胞毒性剤の投与前または後に、治療上有効量のＨＳＰ９０インヒビターを投与することを含む。好ましくは、細胞毒性剤は、微小管作用剤、プラチナ錯体またはトポイソメラーゼＩＩインヒビターである。より好ましくは、細胞毒性剤は、パクリタキセル、パクリタキセル誘導体、またはドキソルビシンもしくはドキソルビシン誘導体である。好適な実施形態において、ＨＳＰ９０インヒビターは、アンサマイシン、ラディシコール、またはＨＳＰ９０のＡＴＰ結合部位に結合する合成化合物である。特に好適な実施形態において、アンサマイシンは、ＣＮＦ−１０１またはその誘導体である。
【００２６】
本発明はさらに、野生型Ｒｂを有する細胞を破壊する方法を提供する。そのような実施形態の１つにおいて、本方法は、適切な細胞に有効量の細胞毒性剤を投与することと、続く有効量のＨＳＰ９０インヒビターを投与することとを含む。１つの実施形態において、ＨＳＰ９０インヒビターは、アンサマイシン、ラディシコール、またはＨＳＰ９０のＡＴＰ結合部位に結合する合成化合物である。特に好適な実施形態において、アンサマイシンは、ＣＮＦ−１０１またはその誘導体である。特別に好適な実施形態において、アンサマイシンは、パクリタキセル、パクリタキセル誘導体、ドキソルビシン、またはドキソルビシン誘導体と共同して与えられる。細胞毒性剤がドキソルビシンである場合、投与はスケジュールに依存しない、すなわち、ドキソルビシンは、ＨＳＰ９０インヒビターの前に、同時に、または後に投与され得る。
【００２７】
別の実施形態において、本発明は網膜芽細胞腫陰性または欠乏性細胞である細胞を破壊する方法であり、治療上有効量のＨＳＰ９０インヒビターおよび細胞毒性剤を投与することを含む。好ましくは、細胞毒性剤は、微小管作用剤、プラチナ錯体またはトポイソメラーゼＩＩインヒビターである。より好ましくは、細胞毒性剤は、パクリタキセル、パクリタキセル誘導体、またはドキソルビシンである。特に好適な実施形態において、ＨＳＰ９０インヒビターは、アンサマイシン、ラディシコール、またはＨＳＰ９０のＡＴＰ結合部位に結合する合成化合物である。特別に好適な実施形態において、アンサマイシンは、ＣＮＦ−１０１またはその誘導体である。
【００２８】
好適な実施形態において、本発明は、乳癌または小細胞肺癌のような細胞増殖性疾患を治療する方法を提供する。
【００２９】
本方法はさらに、他の治療と組み合わせて哺乳動物を治療することを含み得る。他のそのような治療として、手術、他の細胞毒性剤での処置、および放射線治療が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
本発明により、細胞毒性剤の効力を増強させる方法が提供される。本発明はまた、細胞増殖性障害および網膜芽細胞腫陰性または欠乏性細胞を伴う他の状態を治療するための新規方法も提供する。本発明のこれらおよび他の利点は、以下に記載される詳細な説明および実施例から理解されるだろう。詳細な説明および実施例は本発明の理解を向上させるが、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００３１】
［発明の詳細な説明］
本発明は、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）インヒビターと細胞毒性剤との特定の組合せが細胞の成長阻害に相乗効果を及ぼすという驚くべき発見に関する。この相乗作用は、各細胞毒性剤が通常最小の細胞の成長阻害を引き起こすだけの用量で生じる。この発見は、細胞増殖性障害の治療の助けとなるだろう。
【００３２】
本明細書中で使用されるとおり、「ＨＳＰ９０」はタンパク質のＨＳＰ９０ファミリーを示し、ＨＳＰ９０αおよびβ、Ｇｒｐ９４、およびＴｒａｐ−１を含むが、これらに限定されない。
【００３３】
本発明の目的のため、併用レジメンが、最適または最大許容量で単独で投与された各薬剤の治療効果よりも良い治療効果をもたらす場合に、２種の薬が治療上相乗的であるとみなされる。
【００３４】
用語「細胞毒性剤」は、任意の機構（アポトーシス、代謝またはＤＮＡ合成の阻害、細胞骨格組織化への干渉、ＤＮＡの不安定化または化学修飾などを含むが、これらに限定されない）により細胞死を媒介する任意の化合物を示す。
【００３５】
「細胞増殖性障害」は、多細胞生物において１つまたは複数の細胞サブセットの望ましくない細胞増殖が生じて害（例えば、痛みまたは生物の平均余命の減少）をもたらす障害を示す。細胞増殖性障害は、腫瘍、良性腫瘍、血管増殖性障害、自己免疫障害、および線維性障害を含むが、これらに限定されない。
【００３６】
本発明の方法がＲｂ欠乏性またはＲｂ陰性細胞を伴う細胞増殖性障害に関連して使用される場合、ＨＳＰ９０インヒビターによる増強はスケジュールに依存しない、すなわち、ＨＳＰ９０インヒビターは、細胞毒性剤の前に、同時に、または後に与えられ得る。本発明の方法が野生型Ｒｂ細胞を伴う細胞増殖性障害を治療するために使用される場合、ＨＳＰ９０インヒビターによる増強はスケジュールに依存する、すなわち、ＨＳＰ９０インヒビターは、細胞毒性剤の後に、好ましくは１〜４時間後に、より好ましくは６〜１２時間後に、さらにより好ましくは１２〜１８時間後に与えられる。Ｇ２／Ｍ作用薬ではない細胞毒性剤の場合、ＨＳＰ９０インヒビターによる増強は、細胞が、野生型Ｒｂを有するか、またはＲｂ欠乏性もしくはＲｂ陰性であるかにかかわらず、スケジュールに依存しない。
【００３７】
Ｇ２／Ｍ作用薬である細胞毒性剤の例として、ブレオマイシン（ある細胞において）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン）、タキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
Ｓ期で作用する細胞毒性剤の例として、代謝拮抗剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、トポイソメラーゼインヒビター（例えば、シタラビン、ドキソルビシン、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、ヒドロキシウレア、プレドニゾン、プロカルバジン）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｇ１期細胞毒性剤として、アスパラギナーゼ、ジグリコアルデヒド（ｄｉｇｌｙｃｏａｌｄｅｈｙｄｅ）、およびコルチコステロイドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
用語「Ｒｂ欠乏性またはＲｂ陰性」は、複数の型の細胞を示す。第一に、機能性Ｒｂ遺伝子を含まない細胞。第二に、Ｒｂタンパク質をコードし得るが、そのタンパク質が適切に機能しないか、または正常より低いレベルで産生される細胞。第三に、Ｒｂ欠乏性表現型はまた、最終的にＲｂタンパク質のリン酸化をもたらす、経路の撹乱（例えば、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、サイクリンＤ１、またはＣｄｋ４の撹乱）により生じ得る。
【００４０】
本明細書中で使用される用語「有効量」は、治療効果を提供する能力のある、本発明の方法において利用される化合物の量を意味する。治療効果および／または予防効果を得るために本発明に従って投与される化合物の特定の用量は、もちろん、病状を取り巻く特定の状況（例えば、投与される化合物、投与経路、治療される状態、および治療される個体が挙げられる）により決定されるだろう。典型的な一日量（単回または分割量で投与される）は、体重の約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの投薬レベルの本発明の活性化合物を含むだろう。好適な一日量は、一般に約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、理想的には約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇだろう。
【００４１】
細胞増殖性障害に関する、本発明の方法の好適な治療効果は、細胞増殖性障害を引き起こすかまたはそれに寄与する細胞の成長の、ある程度までの阻害である。治療効果は、細胞増殖性障害の１つまたは複数の症状をある程度まで軽減する。癌の治療に関して、治療効果は、以下：１）癌細胞数の減少；２）腫瘍の大きさの減少；３）末梢器官への癌細胞浸潤の阻害（すなわち、ある程度までの減速、好ましくは停止）；３）腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度までの減速、好ましくは停止）；４）腫瘍成長のある程度までの阻害；および／または５）障害に伴う１つまたは複数の症状のある程度までの軽減、の１つまたは複数を指す。
【００４２】
癌以外の細胞増殖性障害の治療に関して、治療効果は、以下：１）障害を引き起こす細胞の成長のある程度までの阻害；２）障害を引き起こす因子（例えば、成長因子）の生成のある程度までの阻害；および／または３）障害に伴う１つまたは複数の症状のある程度までの軽減、のいずれかを指す。
【００４３】
本発明の方法は、Ｒｂ陰性またはＲｂ欠乏性細胞（例えば、網膜芽細胞腫、骨肉腫、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、腎細胞癌、ウイルス感染に伴う癌（ヒトパピローマウイルスに伴う子宮頸癌など）、および小細胞肺癌）を伴う細胞増殖性疾患を阻害するのに有用である。
【００４４】
本発明の方法は、動物に使用してもよく、好ましくは上述の動物は哺乳動物であり、より好ましくは上述の哺乳動物はヒトである。
【００４５】
本発明の方法は、単独で、または特定の細胞増殖性障害を治療するのに有用な他の治療もしくは方法と組み合わせて使用され得る。
【００４６】
本発明の使用は、細胞増殖性障害にＲｂ遺伝子産物の変化した発現を含む細胞が伴うのかどうかを同定することにより促進される。いったんそのような障害が同定されると、そのような障害を患う患者は、医師に既知の手順によるそれらの症状の分析により同定され得る。次いでそのような患者は、本明細書に記載されるように治療され得る。
【００４７】
細胞増殖障害がＲｂ遺伝子産物の変化した発現を伴うかどうかの決定は、まず、細胞増殖性障害またはウイルス感染を有する疑いのある哺乳動物から単離された適切な細胞におけるＲｂのタンパク質発現を決定することにより行われ得る。例えば、小細胞肺癌の場合、小細胞肺癌を有する疑いのある哺乳動物から単離された細胞から決定されたＲｂのタンパク質発現は、疾患のない哺乳動物から単離された適切な細胞と比較され得る。Ｒｂの発現および／または突然変異は、当該技術分野で既知の方法（免疫組織化学、サザンブロット分析、およびノーザンブロット分析を含むが、これらに限定されない）を使用して測定され得る。Ｒｂ発現を測定するための免疫組織化学（例えば、ウエスタンブロット分析）の使用は、Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍ Ｍ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ５１： ５４４−５１、およびＫｏｈｎ Ｇ． Ｊ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． Ｈｅｐａｔｏｌ．， １２： １９８−２０３に記載され、これらの参照の両方がその全体の参照により本明細書中に援用される。Ｒｂ遺伝子の欠陥を測定するためのサザンブロット分析の使用は、Ｐｒｅｓｔｉ Ｊ． Ｃ． Ｊｒ． ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， １６： ５４９−５６により実証され、これはその全体の参照により本明細書中に援用される。ノーザンブロット分析を使用するＲｂｍＲＮＡの決定は、Ｒｙｇａａｒｄ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５０： ５３１２−７により実証され、これはその全体の参照により本明細書中で援用される。変化したＲｂ発現が存在することを分析が示唆する場合、患者は本明細書中に記載される方法を使用する治療の候補である。
【００４８】
非癌細胞の望ましくない増殖により生じる細胞増殖性障害の場合、Ｒｂ遺伝子産物のレベルは、一般集団に見られるレベル（例えば、細胞増殖性障害を患うヒトまたは動物を除くヒトまたは動物の一般集団に見られる平均レベル）と比較される。望ましくない細胞増殖障害が一般集団に見られるよりも異常なレベルのＲｂにより特性決定される場合、障害は本明細書中に記載される方法を使用する治療の候補である。
【００４９】
細胞増殖性障害は、上記に列挙されるものを含む。これらの障害は、必ずしも独立したものではない。例えば、線維性障害は、血管障害と関連した、または重なり合ったものであり得る。例えば、粥状動脈硬化（これは本明細書中で血管障害として特徴づけられる）は線維性組織の異常形成を伴う。
【００５０】
癌細胞は様々な型の悪性新生物を指し、それらの大部分は周辺組織に侵入することができ、種々の部位へ転移し得ると、Ｓｔｅｄｍａｎ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ２５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｈｅｎｓｙｌ ｅｄ． １９９０）により定義される。
【００５１】
血管の形成および延展、または血管形成および血管新生は、それぞれ、胚発生、創傷治癒、および器官再生などの様々な生理学的プロセスにおいて、重要な役割を果たす。それらはまた、癌発達においても役割を果たす。血管増殖障害は、一般に血管の異常増殖をもたらす血管新生障害および血管性障害を指す。そのような障害の例として、再狭窄、網膜症、および粥状動脈硬化が挙げられる。
【００５２】
上記のように、他のそのような増殖性疾患が、標準技法により、かつ本明細書中に記載される化合物の作用効力の決定により、同定され得る。
【００５３】
Ａ．乳癌細胞における従来の化学療法薬と組み合わせたＣＮＦ−１０１の相乗効果：ＳＫＢＲ−３における抗増殖活性、アポトーシス、および細胞周期遮断に対する投与量、スケジュール、およびＲｂ状態の効果
本明細書中および以下の実施例において記載されるとおり、培養乳癌細胞へのＣＮＦ−１０１添加は、複数の化学療法薬（ＤＮＡ挿入抗生物質ドキソルビシン（トポイソメラーゼＩＩインヒビター）、微小管に影響を与えるパクリタキセル、およびＤＮＡ架橋剤シスプラチンを含む）により引き起こされる成長阻害を増強した。これらの研究は、潜在的な相加または相乗効果を実証するために、各薬単独の最小の成長阻害を引き起こす用量で行われた。なぜなら、各薬のより高い用量はＣＮＦ−１０１または細胞毒性薬により誘導される完全な成長阻害をもたらしたからである。ＳＫＢｒ−３乳癌細胞における１〜１０ｎＭのシスプラチン添加は相加性の成長阻害を引き起こした。対照的に、ＳＫＢｒ−３乳癌細胞のＣＮＦ−１０１とタキソール（登録商標）またはドキソルビシンとでの処置は、相乗性成長阻害効果を引き起こした（図１Ａ〜図１Ｃ）。
【００５４】
タキソール（登録商標）とＣＮＦ−１０１との相乗効果はアポトーシス誘導の増強による。細胞をＣＮＦ−１０１単独に曝すと、ＣＮＦ−１０１とタキソール（登録商標）またはドキソルビシンのいずれかとで処置された細胞と比較して、アポトーシス核の数の比較的少ない増加をもたらした。
【００５５】
ＳＫＢＲ−３細胞の核断片化（アポトーシスのマーカー）および紡錘体形成に対する、タキソール（登録商標）、ＣＮＦ−１０１、および２種の薬剤の組合せの効果は、タキソール（登録商標）が、紡錘体形成を破壊することにより作用することを実証した。しかしながら、ＣＮＦ−１０１は紡錘体形成に効果を及ぼさず、代わりに紡錘体破壊に対する細胞アポトーシス反応を増強する（図４）。
【００５６】
ＣＮＦ−１０１とタキソール（登録商標）との相乗効果は、野生型Ｒｂを有する細胞においてスケジュールに依存することが見いだされた。相乗作用は、細胞が最初にタキソール（登録商標）で処置され、続いてＣＮＦ−１０１で処置された場合に生じた。特定の理論に結びつけられることを望まないが、ＣＮＦ−１０１と細胞毒性剤との間の相乗作用のスケジュール依存性は、細胞周期のＧ２／Ｍに作用する細胞毒性剤（タキソール（登録商標）など）にのみ適用された。例えば、ＣＮＦ−１０１がドキソルビシンのようなＤＮＡ損傷剤と組み合わせられた場合、相乗作用は投薬の順番に関わりなく見られた。Ｒｂ陰性または欠乏性細胞において同様に、ＣＮＦ−１０１と細胞毒性剤との間の相乗作用はスケジュールに依存しなかった。
【００５７】
Ｂ．投与および薬学的組成物
本発明の方法において利用される化合物は、標準薬務に従って、薬学的組成物中、単独で、または好ましくは、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または希釈剤と組み合わせて投与され得る。化合物は、経口または非経口（投与の静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、直腸、および局所的経路を含む）で投与され得る。
【００５８】
本発明の方法において使用される薬学的組成物は、有効成分を、経口使用に適した形態（例えば錠剤（ｔａｂｌｅｔｓ）、トローチ（ｔｒｏｃｈｅｓ）、ロゼンジ（ｌｏｚｅｎｇｅｓ）、水性または油性懸濁液、分散性粉末もしくは顆粒、乳濁液、硬質もしくは軟質カプセル、またはシロップもしくはエリキシル剤として）で含み得る。経口使用を意図した組成物は、薬学的組成物の製造のための当該技術分野で既知の任意の方法に従って調製され得、そのような組成物は、薬学的に洗練されかつ口に合う製剤を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤、および保存剤からなる群より選択される薬剤を１つまたは複数含有し得る。錠剤は、有効成分を無毒性の薬学的に許容可能な賦形剤（これは錠剤の製造に適している）との混合物で含有する。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤（炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウムなど）；顆粒化剤および崩壊剤（例えば、微結晶性セルロース、クロスカルメロースナトリウム、コーンスターチ、またはアルギン酸）；結合剤（例えば、デンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、またはアラビアゴム）、および潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルク）であり得る。錠剤は、コーティングされていなくてもよく、または、薬の不快な味をマスキングするためもしくは胃腸管での分解および吸収を遅らせ、それによりより長い期間にわたり持続した作用を提供するために、既知の方法によりコーティングされていてもよい。例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはヒドロキシプロピルセルロースなどの水溶性味マスキング材料、またはエチルセルロース、セルロースアセテートブチレートなどの時間遅延材料が用いられ得る。
【００５９】
経口使用のための配合物はまた、硬質ゼラチンカプセル（有効成分は、不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、またはカオリンと混合される）、または軟質ゼラチンカプセル（有効成分は、ポリエチレングリコールまたは油性媒質（例えばピーナッツ油、流動パラフィン、またはオリーブ油）のような水溶性担体と混合される）として存在してもよい。
【００６０】
水性懸濁液は、有効材料を、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合して含有する。そのような賦形剤は、懸濁剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、およびアラビアゴム）であり、分散または湿潤剤は、天然に存在するホスファチド（例えばレシチン）、またはアルキレンオキシドの脂肪酸との縮合生成物（例えばステアリン酸ポリオキシエチレン）、またはエチレンオキシドの長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えばヘプタデカエチレン−シセタノール）、またはエチレンオキシドの脂肪酸およびヘキシトール由来の部分エステルとの縮合生成物オレイン酸ポリオキシエチレンソルビトールなど）、またはエチレンオキシドの脂肪酸およびヘキシトール無水物由来の部分エステルとの縮合生成物（例えばモノオレイン酸ポリエチレンソルビタン）であってもよい。水性懸濁液はまた、１種またはそれより多い保存剤（例えば、エチルまたはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸）、１種またはそれより多い着色剤、１種またはそれより多い香味剤、および１種またはそれより多い甘味剤（スクロース、サッカリン、またはアスパルテームなど）を含んでもよい。
【００６１】
油性懸濁液は、有効成分を、植物油（例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油、またはココナッツ油）中に、または鉱物油（流動パラフィンなど）中に懸濁させることにより配合され得る。油性懸濁液は、増粘剤（例えばミツロウ、固形パラフィン、またはセチルアルコール）を含んでいてもよい。上記のような甘味剤、および香味剤は、口に合う経口製剤を提供するために添加されてもよい。これらの組成物は、抗酸化剤（ブチル化ヒドロキシアニソールまたはα−トコフェロールなど）の添加により保存され得る。
【００６２】
水の添加により水性懸濁液を調製するのに適した分散性粉末および顆粒は、分散または湿潤剤、懸濁剤、および１種またはそれより多い保存剤との混合物で有効成分を提供する。適した分散または湿潤剤および懸濁剤は、上記で既に記載されたものにより例示される。さらなる賦形剤、例えば甘味剤、香味剤、および着色剤もまた、存在してもよい。これらの組成物は、抗酸化剤（アスコルビン酸など）の添加により保存され得る。
【００６３】
本発明の方法において使用される薬学的組成物はまた、水中油乳濁液の形態であってもよい。油相は、植物油（例えば、オリーブ油またはラッカセイ油）または鉱物油（例えば流動パラフィン）またはそれらの混合物であってもよい。適した乳化剤は、天然に存在するホスファチド（例えば大豆レシチン）、および脂肪酸およびヘキシトール無水物由来のエステルまたは部分エステル（例えばモノオレイン酸ソルビタン）、および上述の部分エステルのエチレンオキシドとの縮合生成物（例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）であり得る。乳濁液はまた、甘味剤、香味剤、保存剤、および抗酸化剤も含み得る。
【００６４】
シロップおよびエリキシル剤は、甘味剤（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、またはスクロース）と配合され得る。そのような配合物はまた、粘滑薬、保存剤、香味および着色剤、および抗酸化剤も含み得る。
【００６５】
薬学的組成物は、滅菌注射用水溶液の形態であってもよい。許容可能なビヒクルおよび溶媒の中で、用いられ得るものは、水、リンゲル溶液、および等張性塩化ナトリウム溶液である。
【００６６】
滅菌注射用製剤はまた、滅菌注射用水中油マイクロエマルション（有効成分が油相に溶解している）であってもよい。例えば、有効成分は、最初に大豆油およびレシチンの混合物に溶解され得る。次いで、油溶液は水とグリセロールとの混合物中に導入され、処理されてマイクロエマルションを形成する。
【００６７】
注射用溶液またはマイクロエマルションは、局所ボーラス注射により患者の血流中へ導入され得る。あるいは、当該化合物の一定した循環濃度を維持するような方法で、溶液またはマイクロエマルションを投与することが有利であり得る。そのような一定した濃度を維持するために、静脈内連続送達デバイスが利用され得る。そのようなデバイスの例としてデルテック　カド−プラス（Ｄｅｌｔｅｃ　ＣＡＤＤ−ＰＬＵＳ）（商標）モデル５４００静脈内ポンプがある。
【００６８】
薬学的組成物は、筋肉内および皮下投与のための滅菌注射用水性または油脂性懸濁液の形態であってもよい。この懸濁液は、上記のこれらの適した分散または湿潤剤および懸濁剤を使用して既知の技術に従って配合され得る。滅菌注射用製剤はまた、無毒性非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒の滅菌注射用溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオールの溶液として）であり得る。さらに、滅菌、不揮発性油が、溶媒または懸濁媒質として、従来的に用いられる。この目的のため、任意の無刺激不揮発性油（合成されたモノまたはジグリセリドを含む）が用いられ得る。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が、注射用製剤に使用されることがわかる。
【００６９】
本発明の方法に使用されるＨＳＰ９０インヒビターおよび細胞毒性剤はまた、薬の直腸投与のための坐剤の形態で投与され得る。これらの組成物は、インヒビターを適した非刺激性賦形剤（これは通常温度で固体であるが直腸温度では液体であり、したがって直腸で融けて薬を放出する）と混合することにより調製され得る。そのような材料は、カカオバター、グリセリンゼラチン、水素化植物油、様々な分子量のポリエチレングリコールの混合物、およびポリエチレングリコールの脂肪酸エステルを含む。
【００７０】
局所的使用のため、ＨＳＰ９０インヒビターまたは細胞毒性剤を含む、クリーム、軟膏、ゼリー、溶液、または懸濁液などが使用され得る。（本明細書中で使用されるとおり、局所的適用は、口腔洗浄液およびうがい薬を含み得る。）
【００７１】
本発明の方法に使用される化合物は、適した鼻腔内ビヒクルおよび送達デバイスの局所的使用を介して鼻腔内形態で、または当業者に既知の経皮性皮膚パッチの形態を使用して経皮経路を介して、投与され得る。経皮送達系の形態で投与されるために、用法・用量は、もちろん、投薬レジメンにわたり断続的ではなく連続している。
【００７２】
本発明の方法はまた、血管新生を阻害し、それにより腫瘍細胞の成長および侵襲性を阻害する他の薬剤（ＶＥＧＦ受容体インヒビター、アンジオスタチン、およびエンドスタチンを含むが、これらに限定されない）と合わせて有用であり得る。
【００７３】
本発明の方法に使用される化合物がヒト被験者に投与される場合、１日の投与量は、通常、一般に個々の患者の年齢、体重、および反応性、ならびに患者の症状の重篤度により変化する投与量で、処方する医師により決定される。
【００７４】
１つの適用例において、適した量のＨＳＰ９０インヒビターおよび細胞毒性剤が、癌の治療を受けている哺乳動物に投与される。投与は、各型のインヒビターの、１日あたり約０．１ｍｇ／体重ｋｇ〜約６０ｍｇ／体重ｋｇの量、好ましくは１日あたり０．５ｍｇ／体重ｋｇ〜約４０ｍｇ／体重ｋｇの量で行われる。本組成物を含む特定の治療投薬量は、約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇのＨＳＰ９０インヒビターまたは細胞毒性剤を含む。好ましくは、投薬量は、約１ｍｇ〜約１０００ｍｇのＨＳＰ９０インヒビターまたは細胞毒性剤を含む。
【００７５】
本発明の方法と組み合わせて使用され得る細胞毒性剤の例として、一般に、微小管作用剤（パクリタキセル（タキソール（登録商標）としても知られる）、ドセタキセル（タキソテール（ｔａｘｏｔｅｒｅ）（登録商標）（以下「タキソテール」（登録商標）と称す）としても知られる）、またはそれらの誘導体など）；アルキル化剤、代謝拮抗剤；エピドフィロトキシン（ｅｐｉｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）；抗腫瘍酵素；トポイソメラーゼインヒビター；プロカルバジン；ミトキサントロン；プラチナ錯体；生体応答修飾因子および成長抑制物質；ホルモン／抗ホルモン治療薬、および造血性成長因子が挙げられる。
【００７６】
細胞毒性剤のクラスの例として、例えば、アントラサイクリンファミリーの薬、ビンカ薬、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞毒性ヌクレオシド、タキサン、エポシロン、ディスコデルモリド、プテリジンファミリーの薬、ジインエン、およびポドフィロトキシンが挙げられる。これらのクラスで特に有用な成員は、例えば、ドキソルビシン、カルミノマイシン、ダウノルビシン、アミノプテリン、メトトレキセート、メトプテリン、ジクロロメトトレキセート、マイトマイシンＣ、ポルフィロマイシン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド、ポドフィロトキシンまたはポドフィロトキシン誘導体（エトポシド、リン酸エトポシド、またはテニポシドなど）、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ロイロシジン、ビンデシン、ロイロシン、パクリタキセルなどが挙げられる。他の有用な抗腫瘍薬として、エストラムスチン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、ゲムシタビン、イホスファミド、メルファラン、ヘキサメチルメラミン、チオテパ、シタラビン、イダトレキセート、トリメトレキセート、ダカルバジン、Ｌ−アスパラギナーゼ、カンプトテシン、ＣＰＴ−１１、トポテカン、ａｒａ−Ｃ、ビカルタミド、フルタミド、ロイプロリド、ピリドベンゾインドール誘導体、インターフェロン、およびインターロイキンが挙げられる。
【００７７】
本発明において有用な微小管作用剤は、当業者に既知であり、アロコルヒチン（ａｌｌｏｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、ハリコンドリンＢ、コルヒチン、コルヒチン誘導体、ドラスタチン１０、マイタンシン、リゾキシン、パクリタキセル（タキソール（登録商標））、タキソール（登録商標）誘導体、チオコルヒチン（ｔｈｉｏｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、トリチルシステイン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、エポシロンＡ、エポシロン、およびジスコデルモリド、エストラムシンテ（ｅｓｔｒａｍｕｓｉｎｔｅ）、ノコダゾールなどが挙げられるが、これらに限定されない。そのような化合物の例は、米国特許第６，１００，４１１号、および米国特許第６，０９６，７５７号に記載され、学術文献にも記載される（例えば、Ｂｕｌｉｎｓｋｉ （１９９７） Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １１０： ３０５５−３０６４； Ｐａｎｄａ （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４： １０５６０−１０５６４； Ｍｕｈｌｒａｄｔ （１９９７） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７： ３３４４−３３４６； Ｎｉｃｏｌａｏｕ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８７： ２６８−２７２； Ｖａｓｑｕｅｚ （１９９７） Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ ８： ９７３−９８５； Ｐａｎｄａ （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： ２９８０７−２９８１２を参照）。
【００７８】
特に好適な微小管作用剤は、パクリタキセル様活性を有するものである。これらは、パクリタキセルおよびパクリタキセル誘導体（パクリタキセル様化合物）および類似体を含むが、これらに限定されない。パクリタキセルおよびその誘導体は市販されている。さらに、パクリタキセルおよびパクリタキセル誘導体および類似体を作成する方法が、当業者に既知である（例えば、米国特許第５，５６９，７２９号；第５，５６５，４７７８号；第５，５３０，０２０号；第５，５２７，９２４号；第５，５０８，４４７号；第５，４８９，５８９号；第５，４８８，１１６号；第５，４８４，８０９号；第５，４７８，８５４号；第５，４７８，７３６号；第５，４７５，１２０号；第５，４６８，７６９号；第５，４６１，１６９号；第５，４４０，０５７号；第５，４２２，３６４号；第５，４１１，９８４号；第５，４０５，９７２号；および第５，２９６，５０６号を参照。
【００７９】
タキソール（登録商標）およびタキソール（登録商標）誘導体の薬学的組成物は当業者に既知であり、例えば、タキソール（登録商標）またはタキソール（登録商標）誘導体の薬学的組成物は、以下の米国特許第６，０９０，９５５号；第６，０９０，８４４号；第５，６４８，０９０号；および第５，４１５，８６９号に記載される。
【００８０】
本発明の方法で使用され得るＨＳＰ９０インヒビターの例として、キノンアンサマイシン系抗生物質（マクベシン（ｍａｃｂｅｃｉｎｓ）など）、ゲルダナマイシン（１７−ＡＡＧなどのゲルダナマイシン誘導体を含む）、ハービマイシンＡ、ラディシコール、およびＨＳＰ９０のＡＴＰ結合部位に結合し得る合成化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
これらの細胞毒性剤の大部分の安全かつ効果的な投与方法は、当業者に既知である。さらに、それらの投与は、標準文献に記載される。例えば、本明細書中に列挙される細胞毒性剤の多くの投与は、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅの例えば２０００年版（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｍｏｎｔｖａｌｅ， Ｎ． Ｊ． ０７６４５−１７４２， ＵＳＡ）に記載され、これは本明細書中で参照により援用される。
【００８２】
好ましくは、薬学的製剤は、単位投与形態である。そのような形態において、製剤は、適切な量、例えば所望の目的を達成するための有効量の有効成分を含有する単位用量に細分されている。
【００８３】
製剤の単位用量中の活性化合物の量は、特定の適用に従って、約０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは約１ｍｇ〜３００ｍｇ、より好ましくは１０ｍｇ〜２００ｍｇで、変更または調節され得る。
【００８４】
用いられる実際の投薬量は、患者の要求および治療される状態の重篤度に依存して変化し得る。特定の状況のための適切な投薬量の決定は、当該技術分野内である。一般に、治療は、化合物の最適用量未満のより少ない投薬量で開始される。その後、投薬量は、その状況下での最適効果に達するまで、少量ずつ増加される。便宜上、一日の総投薬量は、所望であれば、一日のうちで分割されて投与され得る。
【００８５】
本発明の方法において使用される化合物の投与量および頻度、ならびにもし応用可能であれば他の化学療法薬および／または放射線治療が、患者の年齢、状態、および体型、ならびに治療される疾患の重篤度のような因子を考慮して、主治臨床医（医師）の判断に従って、調節されるだろう。ＨＳＰ９０インヒビターまたは細胞毒性剤の投薬レジメンは、腫瘍成長を阻止するために、２〜４（好ましくは２）分割量での、１０ｍｇ〜２０００ｍｇ／日、好ましくは１０〜１０００ｍｇ／日、より好ましくは５０〜６００ｍｇ／日の経口投与であり得る。
【００８６】
さらに、本発明の方法は、他の化学療法薬または放射線治療と組み合わせて使用され得る。化学療法薬および／または放射線治療は、当該技術分野で既知の治療プロトコルに従って投与され得る。化学療法薬および／または放射線治療の投与が治療される疾患およびその疾患に対する化学療法薬および／または放射線治療の既知の効果に依存して変化し得ることは、当業者に明らかであるだろう。また、熟練臨床医の知見に従って、治療プロトコル（例えば、投薬量および投与の回数）が、投与された治療薬（すなわち、抗腫瘍薬または放射線）の患者において観測される効果に鑑みて、および投与された治療薬に対して観測される疾患の応答に鑑みて、変更され得る。
【００８７】
本発明の方法において、ＨＳＰ９０インヒビターは、細胞毒性剤と組み合わせて細胞に投与される。さらに、野生型Ｒｂ細胞を伴う細胞増殖性障害の治療のためにＨＳＰ９０インヒビターが微小管作用剤と組み合わせて使用される場合、微小管作用剤が最初に与えられ、続いてＨＳＰ９０インヒビターが与えられる。Ｒｂ陰性または欠乏性細胞を伴う細胞障害において、ＨＳＰ９０インヒビターおよび細胞毒性剤の投与は、スケジュールに依存しない。さらに、ＨＳＰ９０インヒビターが、野生型Ｒｂ細胞またはＲｂ陰性もしくは欠乏性細胞のいずれかに、トポイソメラーゼＩＩインヒビター（ドキソルビシンなど）と組み合わせて使用される場合、ドキソルビシンはＨＳＰ９０インヒビター投与の前または後に与えられ得る。
【００８８】
ＨＳＰ９０インヒビターは、経口投与されてその良好な血液レベルを生成および維持し得るが、化学療法薬は静脈内へ投与され得る。投与様式および投与の妥当性の決定は、可能な場合、同じ薬学的組成物において、十分熟練臨床医の知見内にある。初期投与は、当該技術分野で既知の確立されたプロトコルに従ってなすことができ、次いで観測された効果に基づいて、投薬量、投与様式、および投与回数が、熟練臨床医により変更され得る。
【００８９】
ＨＳＰ９０インヒビター、および細胞毒性剤の詳細な選択は、主治医の診断および患者の状態についての彼らの判断ならびに適切な治療プロトコルに依存するだろう。
【００９０】
ＨＳＰ９０インヒビター、および細胞毒性剤は、増殖性疾患の性質、治療される状態に伴う細胞のＲｂ状態、患者の状態、およびＨＳＰ９０インヒビターと組み合わせて投与されるべき細胞毒性剤の実際の選択に応じて、並行して（例えば、同時に、基本的に同時に、または同じ治療プロトコル内で）または、順次に投与され得る。したがって、ＨＳＰ９０インヒビターが最初に投与され、続いて細胞毒性剤が投与されてもよく、または細胞毒性剤が最初に投与され、続いてＨＳＰ９０インヒビターが投与されてもよい。治療プロトコルの間の、投与の順序および各治療薬の投与の反復回数の決定は、治療される疾患および患者の状態を見積もった後、本明細書内に包含される開示および熟練臨床医の知見を用いて決定され得る。
【００９１】
主治医は、投与された投薬量で治療が効果的かどうかを判断する際に、患者の一般的な容態ならびにより具体的な徴候（疾患関連症状の軽減、腫瘍成長の阻害、腫瘍の実質的な縮小、または転移の阻害など）を考慮するだろう。腫瘍の大きさは、放射線学的研究、例えばＣＡＴまたはＭＲＩスキャンなどの標準方法により測定することができ、腫瘍の成長が遅延、さらには逆転したかどうかを判断するために、連続測定が使用され得る。痛みなどの疾患関連症状の軽減、および全体的な状態の改善もまた、治療の有効性を判断する助けとして使用され得る。
【００９２】
以下の実施例は、本発明の様々な態様および特徴を制限するのではなく、単に代表するに過ぎない。上記および以下で示される参照文献の全ては、本明細書中で参照により援用される。
【００９３】
実施例
実施例１：１７−ＡＡＧと細胞毒性剤との組合せによる成長阻害
Ａ．一般法：
細胞培養：
ヒト乳癌細胞系ＳＫＢｒ−３およびＢＴ−５４９を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）から入手した。細胞系を、１０％熱失活ウシ胎児血清（ＢＲＬ）、２ｍＭ　グルタミン、および各５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ２／１培地に維持した。全細胞を５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。
【００９４】
細胞系の薬処置：
細胞を、２×１０６の密度で４８時間、１００ｍｍ組織培養プレート上に蒔き、次いで、ＣＮＦ−１０１（１７−ＡＡＧ）、タキソール（登録商標）、ドキソルビシン、シスプラチン、またはＣＮＦ−１０１とタキソール（登録商標）、ドキソルビシン、またはシスプラチンとの組合せ、あるいは等濃度のビヒクルで処置した（図１Ａ〜図１Ｃ）。薬曝露時間をより長くするため、薬またはビヒクルを入れた培地を、４８時間ごとに交換した。相乗効果を、ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙにより開発されたとおり、およびＣｈｏｕ Ｔ． Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．， ８６： １５１７−２４に記載されるとおり、アイソボログラム分析により確認した。
【００９５】
抗増殖性指標：
細胞（２×１０５）を、６ウェル皿に蒔き、そして示された薬（複数可）またはＤＭＳＯビヒクルで９６時間処置した（図１Ａ〜図１Ｃ）。薬および培地を４８時間ごとに交換した。９６時間後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、収集した。細胞をクールター計数器（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ）で計数した。用量曲線を、細胞数対濃度の対数関数としてプロットした。
【００９６】
Ｂ．結果：
培養乳癌細胞へのＣＮＦ−１０１添加は、複数の化学療法薬により引き起こされる成長阻害を増強した。これらは、ＤＮＡ挿入抗生物質ドキソルビシン、微小管作用剤パクリタキセル、およびＤＮＡ架橋剤シスプラチンを含む。これらの研究は、潜在的な相加または相乗効果を実証するために、各薬単独の最小の成長阻害を引き起こす用量で行われた。なぜなら、各薬のより高い用量はＣＮＦ−１０１または細胞毒性薬により誘導される完全な成長阻害を生成したからである。ＳＫＢｒ−３乳癌細胞における１〜１０ｎＭのシスプラチン添加は相加性の成長阻害を引き起こした。対照的に、ＳＫＢｒ−３乳癌細胞の、ＣＮＦ−１０１とタキソール（登録商標）またはドキソルビシンとでの処置は、相乗性成長阻害効果を引き起こした（図１Ａ〜図１Ｃ）。
【００９７】
高ＨＥＲ２含有細胞において、これらの効果はより明白である。アイソボログラムによる数学的分析は相乗効果を確認した。
【００９８】
実施例２：
タキソール（登録商標）とＣＮＦ−１０１（１７−ＡＡＧ）との相乗効果は、アポトーシスの誘導の増強による
Ａ．一般法：
アポトーシス採点法：
本明細書中に記載されるとおりに、薬で処置した後、アポトーシスを、核クロマチン凝縮およびＤＮＡ断片化の存在により採点し、蛍光顕微鏡で評価した。細胞を収集し、１００％ＥＴＯＨ中で−２０℃で１０分間固定した。ＰＢＳで２回洗浄後、核を２μｇ／ｍｌの染料三塩酸ビスベンズイミド（ｂｉｓ−ｂｅｎｚｉｍｉｄｅ ｔｒｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（Ｈｏｅｃｈｓｔ ＃３３２５８）および抗チューブリン抗体（緑色蛍光）で二重染色した。抗チューブリン抗体は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＩ）から購入した。５つの異なる場における各実験について２００の細胞を計数し、アポトーシススコア（アポトーシス核／全核×１００％）を評価した（図２〜図４および図６〜図８を参照）。各実験を３回繰り返した。
【００９９】
Ｒｂ＋またはＲｂ−細胞のスケジュール依存性
無傷のＲｂ（ＳＫＢＲ−３）、または突然変異した不活性Ｒｂ（ＢＴ−５４９）を有する乳癌細胞を、ビヒクルまたは１０ｎＭ　タキソール（登録商標）で４時間、続いて５０ｎＭ　ＣＮＦ−１０１またはビヒクルでさらに１２〜２４時間処置した。あるいは、２種の薬の与えられる順番を逆転させた。アポトーシスを上記のように測定し、結果を図６および図７に示す。
【０１００】
ＣＮＦ−１０１とＤＮＡ損傷剤、ドキソルビシンとの間の相乗作用のスケジュール依存性もまた測定された（図８）。ＳＫＢＲ−３細胞を、ビヒクル、１００ｎＭまたは２００ｎＭ　ドキソルビシン、続いて５０ｎＭ　ＣＮＦ−１０１またはビヒクルでさらに１２時間処置した。あるいは、２種の薬の与えられる順番を逆転させた。
【０１０１】
Ｂ．結果：
成長阻害効果の増強がアポトーシスの増加によるものかどうかを決定するために、ＣＮＦ−１０１またはパクリタキセルあるいは両薬剤の組合せのいずれかにより誘導されたアポトーシスの程度を、経時的に測定した。ＣＮＦ−１０１単独に対する連続曝露は、アポトーシス核の数の比較的少ない増加を示した（未処置の細胞の２％から５．１％へと比較して、２．７５％から９％へ）が、パクリタキセル（ＩＣ５０）単独によるアポトーシスは２％から２７．５％へ劇的に増加した。両薬剤の組合せはさらにアポトーシスのこの程度を３％から４２．５％へ増加させた。いずれかの薬剤単独と比較した組合せの効果は、１２時間目および２４時間目で最も明らかであった。４時間目でのアポトーシスの評価は、アポトーシスへの最小の効果を示した（図２）。アポトーシスの割合もまた、５０ｎＭのＣＮＦ−１０１の存在下または非存在下でのタキソール（登録商標）の濃度の増加について、または１０ｎＭのタキソール（登録商標）の存在下または非存在下でのＣＮＦ−１０１の濃度の増加について測定された。（図３）。
【０１０２】
実施例３：ＳＫＢＲ−３細胞の紡錘体形成およびアポトーシスに対する、タキソール（登録商標）、ＣＮＦ−１０１（１７−ＡＡＧ）、および両薬剤の組合せの差動効果。
ＳＫＢＲ−３細胞の核断片化（アポトーシスのマーカー）および紡錘体形成における、タキソール（登録商標）、ＣＮＦ−１０１（１７−ＡＡＧ）、および両薬剤の組合せの効果を評価した。結果は図４に示される。
【０１０３】
１０ｎＭタキソール（登録商標）で４時間、続いて５０ｎＭＣＮＦ−１０１またはビヒクルで処置され、そしてＨｏｅｃｈｓｔ（ＤＡＰＩ、青色染色）および抗チューブリン抗体（緑色蛍光）で二重染色されたＳＫＢＲ−３細胞の共焦点顕微鏡による分析は、どちらの薬でも処置されていない、またはＣＮＦ−１０１単独で処置された細胞が、１２時間で明らかなアポトーシスを表さなかったことを示した（図４）。これらのセクションにおいて、細胞の４％は有糸分裂を行っているところであり、分裂細胞は正常なようであった。対照的に、タキソール（登録商標）単独での処置は、紡錘体に障害を有するらしい分裂細胞全てで分裂指数の増加を引き起こしたが、アポトーシス核断片化の証拠はほとんど見られなかった。両薬剤で処置された細胞において、有糸分裂はタキソール（登録商標）単独でのものと類似した程度に落ちていたが、加えて、右下パネルの青色染色された断片により示されるように、顕著なレベルの核崩壊が観測された。したがって、これらの結果は、タキソール（登録商標）が紡錘体形成を破壊することにより作用することを示した。さらに、ＣＮＦ−１０１は、紡錘体に影響を及ぼさないが、代わりに紡錘体破壊に対する細胞アポトーシス応答を増強させる。
【０１０４】
実施例４：ＳＫＢＲ−３乳癌細胞の細胞周期を通った進行に対する、ＣＮＦ−１０１（１７−ＡＡＧ）、タキソール（登録商標）、および両薬剤の組合せの効果の比較。ＣＮＦ−１０１およびタキソール（登録商標）の投与順序の効果
Ａ．一般法：
ＳＫＢＲ−３細胞を、ビヒクルまたは１０ｎＭ　タキソール（登録商標）で４時間、続いて５０ｎＭＣＮＦ−１０１でさらに１２〜２４時間処置した。スケジューリングの効果を測定するために、２種の薬の与えられる順番を逆転させた。細胞をトリプシン処理し、蛍光染色およびＦＡＣＳ分析によりＤＮＡ含有量（細胞周期状態の指標）で分析した。細胞周期分布を、Ｎｕｓｓｅ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ， １１： ８１３に従って、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ 蛍光活性化細胞選別機でアッセイし、細胞周期マルチサイクルシステム（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｆｌｏｗ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）により分析した。
【０１０５】
Ｂ．結果：
ビヒクルのみで処置された細胞（図５左上パネル）は、主に細胞周期のＧ１期にあった。ＣＮＦ−１０１単独での処置は、Ｇ１画分をわずかに増強させた（図５右上パネル）。対照的に、タキソール（登録商標）処置は、この薬剤について予期されるように、紡錘体障害により誘導される分裂ブロックの特徴である大量のＧ２−Ｍ停止を引き起こした（図５左下）。ＣＮＦ−１０１がタキソール（登録商標）後に与えられる場合、細胞はＧ２−Ｍでブロックされた。しかしながら、ＣＮＦ−１０１が最初に与えられた場合、タキソール（登録商標）Ｇ２−Ｍブロックは、ＣＮＦ−１０１誘導Ｇ１ブロックにより取って代わられた（図５右下パネル）。
【０１０６】
実施例５：Ｒｂ＋およびＲｂ細胞における細胞毒性剤により誘導されるアポトーシスのスケジュール依存性
Ａ．一般法：
無傷のＲｂ（ＳＫＢＲ−３）、または突然変異した不活性Ｒｂ（ＢＴ−５４９）を有する乳癌細胞を、ビヒクルまたは１０ｎＭ　タキソール（登録商標）で４時間、続いて５０ｎＭ　ＣＮＦ−１０１またはビヒクルでさらに１２〜２４時間（タキソール（登録商標）→ＣＮＦ−１０１）処置した。あるいは、２種の薬の与えられる順番を逆転させた（ＣＮＦ−１０１→タキソール（登録商標））。
【０１０７】
Ｂ．結果：
図６に示されるとおり、Ｒｂ＋系ＳＫＢＲ−３を使用して、タキソール（登録商標）にＣＮＦ−１０１が続いた場合、アポトーシスの顕著な増強が見られた。対照的に、薬の投与順序の逆転は、低濃度のタキソール（登録商標）でタキソール（登録商標）活性の増加をもたらさず、実際には２０ｎＭ　タキソール（登録商標）でタキソール（登録商標）による死滅の損失を引き起こした。
【０１０８】
Ｒｂ陰性ＢＴ−４９細胞系が試験された場合に、きわめて異なる結果が見られた。この場合、ＣＮＦ−１０１は、それがタキソール（登録商標）の前に与えられたか後に与えられたにかかわらず、タキソール（登録商標）活性を顕著に増強した。これらの実験結果は、図７に示される。
【０１０９】
ＣＮＦ−１０１と細胞毒性剤との間の相乗作用のスケジュール依存性は、Ｇ２−Ｍ作用薬（タキソール（登録商標）など）に対してのみ適用された。ＣＮＦ−１０１がＤＮＡ障害剤、ドキソルビシンと組み合わせられた場合、Ｒｂ＋細胞においてさえも、投薬の効果または順序は見られなかった。これらのデータは図８に示される。
【０１１０】
本明細書中に記述される全ての特許および文献は、本発明が関係する当業者の能力のレベルを示す。本開示に引用する全ての参照文献は、各参照文献が個別に全文を参照により援用される場合と同じ程度に参照により援用される。どの参照も先行技術であると認められない。
【０１１１】
当業者は、本発明が、目的を実行しかつ記述される結果および利点ならびに本明細書中に内在するものを得るために、十分改造されるということを、容易に理解するだろう。好適な実施形態の現在の代表として本明細書中に記述される方法および組成物は、例示であり、本発明の範囲を制限することを意図しない。本発明の精神内に包含され、特許請求の範囲により定義されるその中の変更および他の使用を当業者は思いつくであろう。
【０１１２】
様々な置換および年功が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書中に開示される本発明になされ得るということが、当業者に容易に明らかになるだろう。故に、そのようなさらなる実施形態は本発明および併記の特許請求の範囲内にある。
【０１１３】
本明細書中で例示的に記載された本発明は、本明細書中で詳細に記載されなかった任意の要素（単数または複数）、制限（単数または複数）の非存在下でも、適切に実行され得る。故に、例えば、本明細書の各例において、用語「含む」「本質的に〜からなる」および「〜からなる」のいずれも、その他の２語のいずれかで置き換えられ得る。用いられた用語および表現は、記述用語として使用され、制限用語ではなく、そのような用語および表現の使用には、図示および記述される特徴またはその一部の任意の等価物を排除する意図はなく、様々な変更が特許請求される本発明の範囲内で可能であることが認識される。故に、本発明は好適な実施形態により詳細に記述されてはいるが、本明細書中に開示される概念の随意の特徴、変更、および改変が当業者により手段として取られ得ること、およびそのような修飾および改変が、記述および併記の特許請求の範囲により定義されるように、本発明の範囲内にあるとみなされることが、理解されるはずである。
【０１１４】
さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュグループまたは代替物の他のグループ分けによって記載される場合、当業者は、本発明がまたマーカッシュグループまたは他のグループの任意の個々の成員または成員のサブグループによって記載されることを理解するだろう。
【０１１５】
他の実施形態が併記の特許請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ〜図１Ｃ】
ＳＫＢＲ３乳癌細胞の成長に対する、濃度の増加する（Ａ）シスプラチン、（Ｂ）ドキソルビシン、または（Ｃ）タキソール（登録商標）と組み合わせた、３種の濃度のＣＮＦ−１０１（１７−ＡＡＧ）の効果を示す。
【図２】
ＳＫＢＲ−３乳癌細胞において、低濃度のＣＮＦ−１０１（１７−ＡＡＧ）、タキソール（登録商標）、または両者の組合せにより誘導される、アポトーシスの時間経過を示す。
【図３Ａおよび図３Ｂ】
ＳＫＢＲ−３乳癌細胞において、低濃度のＣＮＦ−１０１（１７−ＡＡＧ）、タキソール（登録商標）、または両者の組合せにより誘導される、アポトーシスの用量依存性を示す。図３Ａは、５０ｎＭの１７−ＡＡＧの存在下または非存在下でのタキソール（登録商標）の濃度の増加を示す。図３Ｂは、１０ｎＭのタキソール（登録商標）存在下または非存在下でのＣＮＦ−１０１（１７−ＡＡＧ）の濃度の増加を示す。
【図４】
ＳＫＢＲ−３細胞の紡錘体形成およびアポトーシスに対する、タキソール（登録商標）、ＣＮＦ−１０１（１７−ＡＡＧ）、および両方の薬剤の組合せの異なる効果を示す。
【図５】
タキソール（登録商標）と続くＣＮＦ−１０１（１７−ＡＡＧ）、またはＣＮＦ−１０１（１７−ＡＡＧ）と続くタキソール（登録商標）で処置した細胞の細胞周期分析を示す。
【図６】
ＲＢ陽性細胞におけるＣＮＦ−１０１（１７−ＡＡＧ）投与のスケジュール依存性を示す。
【図７】
ＣＮＦ−１０１（１７−ＡＡＧ）およびタキソール（登録商標）の投与がＲＢ陰性細胞においてスケジュールに依存しないことを示す。
【図８】
ＣＮＦ−１０１（１７−ＡＡＧ）およびドキソルビシンの投与がスケジュールまたはＲＢに依存しないことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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