(57)【要約】被検試料における特定の遺伝子の発現レベルを測定すること又は当該特定の遺伝子のいずれかを含む遺伝子群の発現プロファイルを決定することにより虚血状態を検査することを特徴とする虚血状態の検査方法。
2004512014.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料における特定の遺伝子の発現レベルを測定すること又は該試料における当該特定の遺伝子から選択される複数の遺伝子を含む遺伝子群の発現プロファイルを決定することにより虚血状態を検査することを特徴とする虚血状態の検査方法。
【請求項２】
特定の遺伝子が、
（ａ）配列番号１〜配列番号１０６６に示す塩基配列のいずれかを有する遺伝子、若しくは配列番号１〜配列番号１０６６に示すアミノ酸配列のいずれかをコードする遺伝子、又は
（ｂ）上記塩基配列のいずれかを有する遺伝子と機能的に等価な遺伝子、若しくは上記アミノ酸配列のいずれかをコードする遺伝子と機能的に等価な遺伝子、
である請求項１記載の方法。
【請求項３】
発現レベルの測定又は発現プロファイルの決定を、ＤＮＡチップで行なうことを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
ＤＮＡチップが、合成型ＤＮＡチップである請求項３記載の方法。
【請求項５】
虚血状態が、圧迫性虚血、閉塞性虚血及び痙攣性虚血からなる群から選択される少なくとも１つである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
以下の（ａ）又は（ｂ）の遺伝子：
（ａ）配列番号１〜配列番号１０６６に示す塩基配列のいずれかを有する遺伝子、若しくは配列番号１〜配列番号１０６６に示すアミノ酸配列のいずれかをコードする遺伝子、又は
（ｂ）上記塩基配列のいずれかを有する遺伝子と機能的に等価な遺伝子、若しくは上記アミノ酸配列のいずれかをコードする遺伝子と機能的に等価な遺伝子、
の一部又は全部をその表面上に固定化した虚血状態検査用ＤＮＡチップ。
【請求項７】
虚血状態が、圧迫性虚血、閉塞性虚血及び痙攣性虚血からなる群から選択される少なくとも１つである請求項６記載のＤＮＡチップ。
【請求項８】
虚血状態改善薬又は虚血性疾患治療薬のスクリーニング方法であって、試験動物又は試験細胞に薬剤を投与することにより、
（ａ）虚血状態において発現レベルの変動する特定の遺伝子の発現レベルが正常な発現レベルに復帰するか否か、又は
（ｂ）当該特定の遺伝子の複数を含む遺伝子群の発現プロファイルが正常な発現プロファイルに復帰するか否か、
を指標として候補薬剤を選択することを含み、正常な発現レベル又は正常な発現プロファイルへの復帰は上記薬剤が候補薬剤であることを示すものである、上記方法。
【請求項９】
虚血状態において発現レベルの変動する特定の遺伝子が、
（ａ）配列番号１〜配列番号１０６６に示す塩基配列のいずれかを有する遺伝子、若しくは配列番号１〜配列番号１０６６に示すアミノ酸配列のいずれかをコードする遺伝子、又は
（ｂ）上記塩基配列のいずれかを有する遺伝子と機能的に等価な遺伝子、若しくは上記アミノ酸配列のいずれかをコードする遺伝子と機能的に等価な遺伝子、
である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
虚血状態が、圧迫性虚血、閉塞性虚血及び痙攣性虚血からなる群から選択される少なくとも１つである請求項８又は９記載の方法。
【請求項１１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のデータ：
（ａ）虚血状態において発現レベルの変動する遺伝子の発現レベルデータ、又は
（ｂ）当該遺伝子から選択される複数の遺伝子を含む遺伝子群の発現プロファイルデータ、
を記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【請求項１２】
虚血状態において発現レベルの変動する遺伝子が、
（ａ）配列番号１〜配列番号１０６６に示す塩基配列のいずれかを有する遺伝子、若しくは配列番号１〜配列番号１０６６に示すアミノ酸配列のいずれかをコードする遺伝子、又は
（ｂ）上記塩基配列のいずれかを有する遺伝子と機能的に等価な遺伝子、若しくは上記アミノ酸配列のいずれかをコードする遺伝子と機能的に等価な遺伝子、
である請求項１１記載の記録媒体。
【請求項１３】
虚血状態が、圧迫性虚血、閉塞性虚血及び痙攣性虚血からなる群から選択される少なくとも１つである請求項１１又は１２記載の記録媒体。
【請求項１４】
以下の手順：
（ａ）被検試料における特定の遺伝子の発現レベルデータ又は発現プロファイルデータを入力させる手順、
（ｂ）入力されたデータを記録させる手順、
（ｃ）記録されたデータと既に記録されている虚血状態における上記遺伝子の発現レベルデータ又は発現プロファイルデータとを照合させる手順、
（ｄ）（ｃ）の照合結果に基づいて被検試料が虚血状態にあるか否かを判定する手順、並びに
（ｅ）被検サンプルが虚血状態にある場合に、（ｃ）の照合結果に基づいて被検試料の虚血状態の臨床ステージを同定させる手順、
をコンピューターに実行させるプログラムを記録した、コンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【請求項１５】
遺伝子が、以下の（ａ）又は（ｂ）：
（ａ）配列番号１〜配列番号１０６６に示す塩基配列のいずれかを有する遺伝子、若しくは配列番号１〜配列番号１０６６に示すアミノ酸配列のいずれかをコードする遺伝子、又は
（ｂ）上記塩基配列のいずれかを有する遺伝子と機能的に等価な遺伝子、若しくは上記アミノ酸配列のいずれかをコードする遺伝子と機能的に等価な遺伝子、
である請求項１４記載の記録媒体。
【請求項１６】
虚血状態が、圧迫性虚血、閉塞性虚血及び痙攣性虚血からなる群から選択される少なくとも１つである請求項１４又は１５記載の記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、被検試料における特定の遺伝子の発現レベルを測定することにより又は該試料における当該特定の遺伝子から選択される複数の遺伝子を含む遺伝子群の発現プロファイルを決定することにより虚血状態を検査することを特徴とする虚血状態の検査方法に関する。
【０００２】
背景技術
ガン、脳卒中及び心臓病は三大成人病と呼ばれ、これら３つで日本人の死因の約６０％を占めている。そのうち脳卒中及び心臓病は、虚血が原因で生じる場合が多い。従って、虚血状態を早期に検出することで、前記疾患を未然に防ぐことが可能となる。虚血は、局所性の貧血であり、その発生機序から、腫瘍など外部からの圧迫による動脈壁の狭窄又は閉塞によって生じる圧迫性虚血、血栓・動脈硬化症のように血管内又は血管自体の変化による閉塞性虚血、及び脳貧血・狭心症などのように血管攣縮による痙攣性虚血などに分けることができる。脳における虚血は脳梗塞などの虚血性脳卒中の、そして心臓における虚血は心筋梗塞などの虚血性心疾患の引き金となる。従って、前記疾患の予防には、何よりもまず第一に、虚血状態をできるだけ早く発見し、適切な処置を施すことが重要である。
【０００３】
従来、虚血状態を検査する方法として、心臓壁運動異常を指標にする方法（例えば、心室形態・超音波像の定量的解析、組織収縮速度低下の検出など）、血行動態異常を指標にする方法（例えば、左心室流入速度パターンの解析、核医学検査法など）が知られていた。それらの中でも、核医学検査法は、虚血状態を精密に検査できる方法である。しかしながら、放射線被爆、検査時間の長いこと及び費用が高額なことなど被験者には不都合な点が多かった。そこで、被験者への負担が少なく、健康診断の一部として日常的に行うことのできる、簡便な虚血状態の検査方法が望まれていた。
【０００４】
発明の開示
本発明は、被検試料における特定の遺伝子の発現レベル又は当該特定の遺伝子から選択される複数の遺伝子を含む遺伝子群の発現プロファイルを測定することにより虚血状態を簡便に検査することを特徴とする虚血状態の検査方法を提供することを目的とする。
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、虚血状態において発現される遺伝子を同定し、遺伝子発現プロファイルを明らかにすることに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、被検試料における特定の遺伝子の発現レベルを測定すること又は該試料における当該特定の遺伝子から選択される複数の遺伝子を含む遺伝子群の発現プロファイルを決定することにより虚血状態を検査することを特徴とする虚血状態の検査方法である。ここで、前記特定の遺伝子としては、（ａ）配列番号１〜配列番号１０６６に示す塩基配列のいずれかを有する遺伝子、若しくは配列番号１〜配列番号１０６６に示すアミノ酸配列のいずれかをコードする遺伝子、又は（ｂ）上記塩基配列のいずれかを有する遺伝子と機能的に等価な遺伝子、若しくは上記アミノ酸配列のいずれかをコードする遺伝子と機能的に等価な遺伝子、が挙げられる。発現レベルの測定又は発現プロファイルの決定は、ＤＮＡチップ（例えば、合成型ＤＮＡチップ）で行なうことができる。虚血としては、圧迫性虚血、閉塞性虚血及び痙攣性虚血等が挙げられる。
【０００７】
さらに、本発明は、（ａ）配列番号１〜配列番号１０６６に示す塩基配列のいずれかを有する遺伝子、若しくは配列番号１〜配列番号１０６６に示すアミノ酸配列のいずれかをコードする遺伝子、又は（ｂ）上記塩基配列のいずれかを有する遺伝子と機能的に等価な遺伝子、若しくは上記アミノ酸配列のいずれかをコードする遺伝子と機能的に等価な遺伝子、の一部又は全部をその表面上に固定化した虚血状態検査用ＤＮＡチップである。虚血状態としては、圧迫性虚血、閉塞性虚血及び痙攣性虚血等が挙げられる。
【０００８】
さらに、本発明は、虚血状態改善薬又は虚血性疾患治療薬のスクリーニング方法であり、該方法は、試験動物又は試験細胞に薬剤を投与することにより、（ａ）虚血状態において発現レベルの変動する特定の遺伝子の発現レベルが正常な発現レベルに復帰するか否か、又は（ｂ）当該特定の遺伝子の複数を含む遺伝子群の発現プロファイルが正常な発現プロファイルに復帰するか否か、を指標として候補薬剤を選択することを特徴とするものであり、正常な発現レベル又は正常な発現プロファイルへの復帰は上記薬剤が候補薬剤であることを示すものである。ここで、前記特定の遺伝子としては、（ａ）配列番号１〜配列番号１０６６に示す塩基配列のいずれかを有する遺伝子、若しくは配列番号１〜配列番号１０６６に示すアミノ酸配列のいずれかをコードする遺伝子、又は（ｂ）上記塩基配列のいずれかを有する遺伝子と機能的に等価な遺伝子、若しくは上記アミノ酸配列のいずれかをコードする遺伝子と機能的に等価な遺伝子、が挙げられる。虚血状態としては、圧迫性虚血、閉塞性虚血及び痙攣性虚血等が挙げられる。
【０００９】
さらに、本発明は、（ｉ）虚血状態において発現レベルの変動する特定の遺伝子の発現レベルデータ、又は（ｉｉ）上記特定の遺伝子から選択される複数の遺伝子を含む遺伝子群の発現プロファイルデータ、を記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体である。ここで、前記特定の遺伝子としては、（ａ）配列番号１〜配列番号１０６６に示す塩基配列のいずれかを有する遺伝子、若しくは配列番号１〜配列番号１０６６に示すアミノ酸配列のいずれかをコードする遺伝子、又は（ｂ）上記塩基配列のいずれかを有する遺伝子と機能的に等価な遺伝子、若しくは上記アミノ酸配列のいずれかをコードする遺伝子と機能的に等価な遺伝子、が挙げられる。虚血状態としては、圧迫性虚血、閉塞性虚血及び痙攣性虚血等が挙げられる。
【００１０】
さらに、本発明は、（ａ）被検試料における特定の遺伝子の発現レベルデータ又は発現プロファイルデータを入力させる手順、（ｂ）入力されたデータを記録させる手順、（ｃ）記録されたデータと既に記録されている虚血状態における上記遺伝子の発現レベルデータ又は発現プロファイルデータとを照合させる手順、（ｄ）（ｃ）の照合結果に基づいて被検試料が虚血状態にあるか否かを判定する手順、並びに（ｅ）被検サンプルが虚血状態にある場合に、（ｃ）の照合結果に基づいて被検試料の虚血状態の臨床ステージを同定させる手順、をコンピューターに実行させるプログラムを記録した、コンピュータ読み取り可能な記録媒体である。ここで、前記特定の遺伝子としては、（ａ）配列番号１〜配列番号１０６６に示す塩基配列のいずれかを有する遺伝子、若しくは配列番号１〜配列番号１０６６に示すアミノ酸配列のいずれかをコードする遺伝子、又は（ｂ）上記塩基配列のいずれかを有する遺伝子と機能的に等価な遺伝子、若しくは上記アミノ酸配列のいずれかをコードする遺伝子と機能的に等価な遺伝子、が挙げられる。虚血としては、圧迫性虚血、閉塞性虚血及び痙攣性虚血等が挙げられる。
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本願は、日本国特許出願第２０００−１４５９７７号の優先権を主張するものであり、当該出願の明細書及び図面の内容を本明細書に包含する。
【００１３】
本発明は、従来の虚血検査方法と異なり、特定の遺伝子の発現レベル又は特定の遺伝子群の発現プロファイルを指標として、虚血状態を検査することを特徴とする虚血状態検査方法に関する。ここで、「発現レベル」とは、特定の遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）の絶対量又は相対量、あるいは特定の遺伝子の翻訳産物（タンパク質）の絶対量又は相対量をいう。「発現プロファイル」とは、複数の遺伝子の発現レベルを表やグラフ等にまとめたものをいう。
【００１４】
１．虚血状態において発現レベルが変動する遺伝子の同定
虚血状態において発現レベルが変動する遺伝子は、例えばディファレンシャルＲＮＡディスプレイ法［Ｌｉａｎｇ， Ｐ ｅｔ ａｌ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５７：９６７−９７１（１９９２）］、ハイブリッドサブトラクション法、ＤＮＡチップを用いる方法等によって同定することができる。例えば、ＤＮＡチップにより前記遺伝子を同定する方法は図１に示すように行うことができる。すなわち、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列又はＥＳＴ配列などが記録されたデータベースから複数のＤＮＡ情報（ｃＤＮＡ／ＥＳＴ／オリゴＤＮＡコレクション）を入手し、塩基配列の明らかな多種類の遺伝子をＤＮＡチップ上に固定する。その後、上記ＤＮＡチップに、虚血状態の生体試料由来のｍＲＮＡに基づいて調製した標識ＤＮＡ又はＲＮＡをハイブリダイズさせる。その後、得られたハイブリダイズパターンの各スポットにおけるハイブリダイゼーション強度を測定することによって各遺伝子の発現レベルを測定し、発現プロファイルを得る。以下に、ＤＮＡチップを用いる方法をより詳細に説明する。
【００１５】
（１） 被検試料からのｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡの調製
ＤＮＡチップによって、生体試料中の或る遺伝子の発現レベルを調べるには、まず、組織又は細胞等の被検試料からｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡを調製する必要がある。なお、虚血状態において発現レベルの変動する遺伝子を同定するための、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡ調製用の被検試料の具体例としては、人為的に虚血状態を誘導した実験動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ）又は虚血状態のヒト由来の生体組織（例えば、血液組織、脳組織、心臓組織、腎臓組織）が挙げられる。なお、脳では、生体内で発現し得る遺伝子の約８０％が発現していると言われる。そのため、虚血状態において脳で発現レベルの変動する遺伝子を調べることにより、脳以外の組織において虚血状態において発現レベルの変動する遺伝子を包括的に同定することが可能である。ｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡ調製用の試料としては、前記マウス由来の海馬を使用することができる。海馬中には、脳毛細血管が存在するため、赤血球、白血球、血小板等の血液細胞が混在している。従って、海馬組織から抽出したｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡ中には、種々の血液細胞由来のｍＲＮＡが混在し得る。
【００１６】
ｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡの調製は、グアニジンチオシアネート−塩化セシウム法［Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）］、グアニジンチオシアネート−トリフルオロ酢酸セシウム法［Ｈ． Ｏｋａｙａｍａ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １５４：３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）］、グアニジンチオシアネート−フェノール−クロロホルム法［Ｐ． Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２：１５６（１９８７）］、フェノール−ＳＤＳ法［Ｒ．Ｄ．Ｐａｌｍｉｔｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １３：３６０６（１９７４）］等の方法により全ＲＮＡを取得後、得られた全ＲＮＡをオリゴｄＴセルロースやポリＵセファロースカラムに供試し、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡを特異的に吸着後、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡをカラムから溶出させることによって得ることができる。特に、被検試料として組織を用いる場合には、全ＲＮＡ又はｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡの精製状態がｃＤＮＡの収率等に大きな影響を及ぼすため、精製過程は正確に行うことが重要である。
【００１７】
例えば、グアニジンチオシアネート−塩化セシウム法によりｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡを調製する場合、まず組織サンプルに適当量（例えば５倍量）のグアニジンチオシアネート溶液を加える。次いで、ポリトロン等のホモジナイザーにより組織サンプルを破砕後、所望の濃度（例えば０．５％）になるようにＮ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウムを添加し攪拌する。得られたサンプルを遠心分離（例えば、５０００×ｇ、１０分間）し、上清を塩化セシウム−ＥＤＴＡのクッションを入れた遠心管に重層後、超遠心分離（例えば、１００，０００×ｇ、１２時間）する。沈殿物を７０％エタノールでリンス後、ＴＥ緩衝液に溶解することによって全ＲＮＡを得る。得られた全ＲＮＡを、さらにオリゴｄＴセルロースカラムに供試することによってｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡを得ることができる。
【００１８】
また、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡの調製は、市販のキットを用いて行うことも可能である。全ＲＮＡの調製用キットの具体例としては、ＲＮｅａｓｙ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）が挙げられる。また、全ＲＮＡ からのｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡ単離用キットの具体例としては、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ Ｄｉｒｅｃｔ ｍＲＮＡ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ ｍＲＮＡ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）等が挙げられる。
【００１９】
（２） 逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成
次いで、上記（１）において得られたｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、Ｇｕｂｌｅｒらの方法［Ｕ． Ｇｕｂｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ２５：２６３（１９８７）］に従って行うことができる。すなわち、まずｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡ溶液にｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８を加え、加熱後急冷する。次いでこの溶液に、一本鎖ｃＤＮＡ合成用緩衝液、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ混合）溶液、リボヌクレアーゼ阻害剤溶液、ジチオスレイトール溶液等を添加・混合後、この混合液に逆転写酵素（例えば、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＲＴ（ＢＲＬ社製））を添加し、一定時間インキュベートすることによって、一本鎖ｃＤＮＡを得ることができる。さらに必要に応じて、得られた一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、二本鎖ｃＤＮＡを合成することができる。すなわち、一本鎖ｃＤＮＡ溶液にｃＤＮＡ合成用緩衝液、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ混合）溶液、ジチオスレイトール溶液等を添加・混合後、この混合物にＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴ４ＤＮＡポリメラーゼ）を添加し、一定時間インキュベートすることによって、二本鎖ｃＤＮＡを得ることができる。なお、一本鎖又は二本鎖ｃＤＮＡの合成において、標識化ｄＮＴＰ（例えばビオチン標識化ｄＮＴＰ等）を用いることにより、標識されたｃＤＮＡを得ることができる。
【００２０】
（３） 標識ｃＲＮＡ断片の調製
本発明の方法において、ＤＮＡプローブとしてオリグヌクレオチドを固定したＤＮＡチップを使用する場合には、必要に応じて、上記（２）において得られたｃＤＮＡを鋳型として、さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により標識ｃＲＮＡを調製する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写による標識ｃＲＮＡの調製は、Ｋｒｅｉｇらの方法［Ｋｒｅｉｇ， Ｐ． Ａ． ，ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １５５：３９７−４１５（１９８７）］に従って行うことができる。なお、得られた標識ｃＲＮＡ分子は使用前に低分子化（断片化）しておく必要がある。低分子化は、Ｍｇ２＋存在下での加熱（例えば、９４℃、３分）、ＤＮａｓｅ処理によって行うことができる。
【００２１】
また、上述のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写は、市販のキットを用いて行うことも可能である。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写用キットとしては、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔＴＭ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ（Ａｍｂｉｏｎ社製）等が挙げられる。
【００２２】
（４） ＤＮＡチップ上でのハイブリダイゼーション
次いで、上記（２）又は（３）において得られた標識ヌクレオチド試料をＤＮＡチップに注入することによって、ハイブリダイゼーション反応を行う。本発明の方法において有用なＤＮＡチップの具体例としては、基板上で直接オリゴＤＮＡを合成することにより作製されたオリゴＤＮＡマイクロアレイ（合成型ＤＮＡチップともいう）、予め調製したＤＮＡを基板上に固定したＤＮＡマイクロアレイ（貼り付け型ＤＮＡチップともいう）が挙げられる。本発明においては、虚血状態において発現レベルの変動する遺伝子を同定するために、高い検出感度・精度・再現性の得られる合成型ＤＮＡチップ、例えばオリゴＤＮＡマイクロアレイ（アフィメトリックス社製、ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ）を用いることが好ましい。
【００２３】
遺伝子の発現を調べる場合には、非特異的な結合を抑えるため、ハイブリダイゼーションはストリンジェンシーの高い条件下で行うことが重要である。ここで「ストリンジェンシーの高い条件」とは、９０％以上の相同性を有するヌクレオチド鎖間でのみハイブリダイゼーションが生じる条件をいう。ストリンジェンシーの高低は、塩濃度（例えばＮａＣｌ、クエン酸３ナトリウムの濃度など）、及び／又は温度を変更することによって調節することができ、塩濃度が低いほどまた温度が高いほどストリンジェンシーは高くなる。或る温度及び或る塩濃度条件は、使用するＤＮＡチップの種類及び他の要因により、ストリンジェンシーの高い条件としても、ストリンジェンシーの低い条件としても作用し得る。従って、如何なる条件がストリンジェンシーの高い条件であり、同様に如何なる条件がストリンジェンシーの低い条件であるかは、用いるチップごとに決定されるべきものである。本発明において使用したＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ Ｍｕ６５００では、ストリンジェンシーの高い条件とは、温度４３〜６５℃、好ましくは４５℃、Ｎａ＋濃度５００〜１０００ｍＭ、好ましくは１０００ｍＭの条件をいう。
【００２４】
（５） 検出及びデータ解析
ハイブリダーゼーションの結果、マイクロアレイ上に形成された二本鎖は、蛍光イメージスキャナー等で解析する。マイクロアレイ上の蛍光強度は、蛍光レーザー顕微鏡とＣＣＤカメラ及びコンピュータを連結したシステムで自動的に測定することができる。スキャナーは、スポットの大きさが数十μｍで、スポット間の距離が約１０μｍ程度のスポットを定量的に識別できるものが好ましい。さらに、スキャナーは、複数種の標識に対応できること、広範囲を高速でスキャンできること、基板のミクロな歪みに対応可能なオートフォーカス機能を有するものであることが好ましい。このような機能を備えたスキャナーとしては、例えばＧＭＳ ４１８ Ａｒｒａｙ Ｒｅａｄｅｒ（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）などが挙げられる。また、データの解析に用いるソフトウエアは、変異や多型の解析のように、部分的に重複した配列のオリゴヌクレオチドが多数含まれる複雑な解析にも対応できるものが好ましい。
【００２５】
また、本発明においては、ＤＮＡチップによる遺伝子解析に必要な構成要素を一式組み込んだ市販のシステムを用いることが可能である。このような構成要素としては、（ｉ）ＤＮＡチップ、（ｉｉ）ハイブリダイゼーション後のＤＮＡチップを自動的に洗浄・染色する装置、（ｉｉｉ）蛍光発光を読み取るスキャナー、及び（ｉｖ）読み取った情報を処理解析するワークステーション、等が挙げられる。そのようなシステムの具体例として、アフィーメトリックス社製のＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ解析システムが挙げられる。ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析システムには、得られた遺伝子データを効率的に利用するためのバイオインフォーマティクスツールとして、ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩＭＳＴＭ）及びＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ Ｔｏｏｌ（ＥＤＭＴＴＭ）が併設されており、得られたデータを遺伝子関連解析技術の標準化のためのオープンコンソーシアム（ＧＡＴＣ）によって定められた形式のＳＱＬ対応データベースへ出力し、このシステムインターネットウェブ上の公開遺伝子情報データベースとリンクすることを可能にしている。当該解析システムを利用することによって、より効率的且つ広範囲にデータ解析が可能である。
【００２６】
配列番号１〜配列番号１０６６に、本発明によって、マウス中で虚血状態において発現レベルの変動することが明らかにされた遺伝子の塩基配列、及び当該遺伝子のコードするアミノ酸配列を示した。マウスはヒトと同じ哺乳類に属するため、遺伝的に類似性が高く、配列番号１〜配列番号１０６６に示される塩基配列を有する遺伝子又は配列番号１〜配列番号１０６６に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子と機能的に等価な遺伝子が、ヒトの細胞中にも存在し得る。従って、それらのヒトの遺伝子の発現レベルを測定することによって、ヒト由来の試料について、虚血状態の検査を行うことができる。ここで、「機能的に等価な遺伝子」とは、配列番号１〜配列番号１０６６に示される塩基配列を有する遺伝子又は配列番号１〜配列番号１０６６に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子の他、これらの遺伝子と相同性を有し、生体内でこれらの遺伝子と同一又は類似の役割を果たしている遺伝子を含む。なお、マウス由来の遺伝子と機能的に等価な、ヒト細胞中に存在する遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列等の情報は、ＧｅｎＢａｎｋなどの公知の遺伝子データベースから、目的とする塩基配列の一部、アミノ酸配列の一部、遺伝子産物名等をキーワードとする検索により入手することが可能である。
【００２７】
虚血状態において発現レベルの変動することが明らかにされた遺伝子について、さらに別の疾患時における発現レベルを調べることによって、虚血状態において特異的に発現レベルの変動する虚血マーカー遺伝子を同定することが可能である。
【００２８】
２．虚血状態検査用ＤＮＡチップ
上記第１節において同定された遺伝子の一部又は全部を、ＤＮＡプローブとして基板上に固定したＤＮＡチップは、虚血検査用ＤＮＡチップとして用いることができる。特に、図２のように、３群の遺伝子（すなわち、虚血状態において高い発現レベルを示す遺伝子、中程度の発現レベルを示す遺伝子、低い発現レベルを示す遺伝子）を分けて配置したＤＮＡチップは、虚血状態の進行度を評価することのできるＤＮＡチップとして用いることができる。当該ＤＮＡチップには２種類ある。１つは予め調製したＤＮＡプローブを基板上に固定することにより製造される貼り付け型ＤＮＡチップと、もう１つは基板上で直接ＤＮＡプローブを合成することにより製造される合成型ＤＮＡチップである。ここで、「ＤＮＡプローブ」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡ鎖を有する遺伝子を検出するために、ＤＮＡチップ基板上に固定されているＤＮＡ鎖をいう。それぞれの形式のＤＮＡチップの製造方法について、以下に具体的に説明する。
【００２９】
（１） 貼り付け型ＤＮＡチップの製造方法
まず、ＤＮＡプローブ用に、上記第１節において同定された虚血状態において発現レベルの変動する遺伝子の一部または全部を、ＰＣＲや化学的合成法によって調製する。なお、ＤＮＡプローブは、該プローブの配列と相補的な配列を有する検出対象ヌクレオチド鎖がそのＤＮＡプローブと接近したときに、そのヌクレオチド鎖とハイブリダイゼーションを起こすことができるように、ＤＮＡチップ基板上に一本鎖ＤＮＡとして存在する必要がある。従って、ＤＮＡプローブの設計に当っては、検出対象ヌクレオチド鎖とのハイブリダイゼーションを阻害する二次構造の形成が極力起こらないように配列を選択することが好ましい。ここで、「二次構造」とは、ＤＮＡプローブが折りたたまれて、プローブの一部が同じプローブの他の部分にハイブリダイズして生じるステムループ構造又はヘアピン構造などをいう。目的の配列が二次構造を形成するか否かは、市販の遺伝子解析ソフト（例えば、日立ソフトウエアエンジニアリング社製ＤＮＡＳＩＳなど）を用いて、解析することができる。
【００３０】
ＰＣＲによるＤＮＡプローブの調製は、検査対象生物由来のゲノムＤＮＡ、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡを鋳型として、常法［例えばＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照のこと］により行うことができる。例えば、配列番号１００６に示す塩基配列からなる遺伝子は、虚血状態において顕著に発現が増大するために虚血検査用のマーカーとして使用することが可能である。当該遺伝子検出用のＤＮＡプローブは、センスプライマー５’−ａｔｇｃｔｃｔｔｃｃｇａｇｃｔｇｔｇｃｔ−３’（配列番号１０６７）、アンチセンスプライマー５’−ｃａｇｃｔｃａｇｔｔｇａａｃｇｃｃｔｔｔ−３’（配列番号１０６８）を用い、虚血状態のマウス海馬由来のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲによって得ることができる。ＰＣＲによって得られた増幅断片が目的の断片であるか否かの確認は、増幅断片をｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＳＫ（＋） （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等の適切なベクターにサブクローニング後、塩基配列を決定することにより行うことができる。塩基配列の決定はマキサム−ギルバートの化学修飾法、又はＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定機（例えばＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製３７３Ａ ＤＮＡシークエンサー等）を用いて行なうことができる。
【００３１】
一方、化学合成法によるＤＮＡプローブの調製は、ホスホロアミダイト法、ホスホネート法等の当該技術分野で用いられる通常のＤＮＡ合成法によって行うことができる。例えば、ホスホロアミダイト法によってＤＮＡプローブを合成する場合、３’糖水酸基に３価のホスホロアミダイト残基を導入したヌクレオシド誘導体を合成ユニットとして用いる。まず、このアミダイトユニットを、１Ｈ−テトラゾールで活性化し、固相上のＤＮＡ鎖の５’末端水酸基と反応させ（工程１）、三価の亜リン酸エステルを得る。次いで、酸化反応（工程２）、キャッピング反応（工程３）、水素添加（工程４）を経て、得られた三価の亜リン酸エステルを五価のリン酸トリエステルへと導く。その後は、工程１〜４を繰り返し、最後に所望の塩基配列を有するのオリゴマーブロックを固相から切り離し、脱保護することによって目的のＤＮＡ鎖を得ることができる。
【００３２】
次いで、上記ＤＮＡプローブをＤＮＡチップ基板に固定する。固定基板の具体例としては、ガラス板、石英板、シリコンウエハーなどが挙げられる。基板の大きさとしては、例えば３．５ｍｍ×５．５ｍｍ、１８ｍｍ×１８ｍｍ、２２ｍｍ×７５ｍｍなどが用いられるが、これは基板上のＤＮＡプローブのスポット数やそのスポットの大きさなどに応じて様々に設定することができる。ＤＮＡの固定方法としては、ＤＮＡの荷電を利用して、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミンなどのポリ陽イオンで表面処理した固相担体に静電結合させたり、あるいは、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基などの官能基を導入した固相表面に、アミノ基、アルデヒド基、ＳＨ基、ビオチンなどの官能基を導入したＤＮＡプローブを共有結合させることにより固定することもできる。
【００３３】
ＤＮＡプローブの基板へのスポットは、数十μｍ〜数百μｍのサイズで定められた位置に定量的にＤＮＡプローブをスポットすることができるアレイヤーを用いて行うことができる。スポット方式としては、ピン先端の固相への機械的な接触によるピン方式、インクジュエットプリンターの原理を利用したインクジェット方式、毛細管によるキャピラリー方式などが挙げられる。
【００３４】
（２） 合成型ＤＮＡチップの製造方法
基板上で直接ＤＮＡプローブを合成する方法としては、光リソグラフィー技術と固相ＤＮＡ合成技術とを組み合わせたＦｏｄｏｒらの方法［Ｆｏｄｏｒ， Ｓ．Ｐ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５１：７６７−７７３（１９９１）］を使用することができる。すなわち、まず光化学反応により除去することができる保護基を有する合成リンカーを基板上に結合させ、マスクと呼ばれる遮断物質を通してこの基板に光を照射することにより、特定の領域の保護基だけを脱離させておく。次いで、基板を水酸基が保護されたヌクレオチドと反応させると、保護基が脱離している部分でのみ重合反応が起こる。さらに、別のマスクを用いて基板上に光を照射し、ヌクレオチドの重合反応を繰り返す。このようにして、種々のマスクを用いながら異なるヌクレオチド前駆体とのカップリング反応を繰り返すことによりＤＮＡチップ基板上の特定の領域に所望の配列のＤＮＡプローブを合成することができる。長さＮｍｅｒのオリゴヌクレオチドは、Ｎ×４サイクルの反応で合成され、従って、２５ｍｅｒの塩基長のＤＮＡプローブは２５×４＝１００サイクルの反応で合成することができる。なお、本発明の虚血検査用ＤＮＡチップ上のＤＮＡプローブの塩基長は、１０〜３０ｍｅｒ、好ましくは１５〜２５ｍｅｒである。
【００３５】
なお、この形式のＤＮＡチップは、通常ＤＮＡプローブの塩基長が短いために、チップ上のハイブリダイゼーションの特異性が問題となり得る。この問題は、以下に記載のようにして解決することができる。すなわち、１つの特定の遺伝子の発現を検出するために、標的とするその遺伝子の複数の箇所（通常は、十数か所）にそれぞれ完全一致（ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈ；ＰＭ）する（すなわち完全に相補的な）オリゴヌクレオチドＤＮＡプローブと１塩基（通常は、中央の塩基又はその付近の塩基）に変異を入れたミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ；ＭＭ）のオリゴヌクレオチドＤＮＡプローブを同数で基板上に配置する（図３）。続いて、基板上でハイブリダイゼーションを行い、ＭＭプローブをハイブリダイゼーションの特異性の指標として用いる。すなわち、ＰＭプローブとＭＭプローブとのシグナル比を算出し、偽陽性シグナルを排除することにより解決することができる。
【００３６】
３．本発明の虚血状態の検査方法
本発明において明らかにされた虚血状態において発現レベルの変動する遺伝子の、被検試料中での発現レベルを測定することによって虚血状態を検査することができる。あるいは、当該遺伝子から選択される複数を含む遺伝子群の発現プロファイルを決定することによって虚血状態を検査することができる。ここで、「遺伝子群の発現プロファイルを決定する」とは、遺伝子群を構成する個々の遺伝子の発現レベルを測定し、得られた結果を表やグラフ等にまとめることをいう。前記虚血状態の具体例としては、圧迫性虚血、閉塞性虚血、痙攣性虚血などが挙げられる。
【００３７】
上記第１節において同定された虚血状態において発現レベルの変動する遺伝子について、被検試料中での発現レベルを測定することによって、被検試料が虚血状態にあるか否かを検査することができる。すなわち、被検試料中での前記遺伝子の発現レベルが、本発明により明らかにされた虚血状態における変動レベルと同程度に変動していれば、被検試料は虚血状態にあると評価することができる。例えば、配列番号９６０〜配列番号１０３７、配列番号１０６５及び配列番号１０６６で表される塩基配列を有する遺伝子、又は配列番号９６０〜配列番号１０３７、配列番号１０６５及び配列番号１０６６で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子は、虚血状態において発現レベルが１０倍以上増大する。従って、被検試料中でこれらの遺伝子の発現レベルが、１０倍以上増大していれば、被検試料は虚血状態にあると評価することができる。
【００３８】
さらに、上記第１節において同定された遺伝子のうち、他の疾患では発現レベルの変動が殆ど又は／全く検出されない遺伝子、すなわち虚血マーカー遺伝子の発現レベルを測定することによって、より正確に被検試料が虚血状態にあるか否かを検査することができる。すなわち、被検試料における上記マーカー遺伝子の発現レベルの変動が、本発明において検出された遺伝子の発現レベルの変動と同程度であれは、被検試料は虚血状態にあると評価することができる。
【００３９】
なお、前記遺伝子の発現レベルは、測定する遺伝子の種類が少ない場合には、例えばドットハイブリダイゼーション、スロットハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション又は定量的ＰＣＲ等により測定することができ、測定する遺伝子の種類が多い場合には、ＤＮＡチップを用いて測定することができる。
【００４０】
さらに、上記第１節において虚血状態において発現レベルの変動する遺伝子から選択される複数の遺伝子を含む遺伝子群の被検試料における発現プロファイルを決定し、この得られるプロファイルと虚血状態ではない正常試料の発現プロファイルと比較することによって、被検試料が虚血状態にあるか否かをより高い精度で検査することができる。遺伝子群の発現プロファイルの測定は、ＤＮＡチップを用いることによって、より迅速且つ簡便に行うことができる。また、後述するクラスター分析を使用して発現プロファイルを分類してもよい。ＤＮＡチップとしては、精度、感度、再現性等の点から、合成型ＤＮＡチップを用いることが好ましい。また、上記第２節において製造した本発明のＤＮＡチップを用いて、虚血状態を検査することができる。例えば、図２Ａに示すように、ハイブリダイゼーション用ＤＮＡチップに、低発現レベル遺伝子群、中発現レベル遺伝子群及び高発現レベル遺伝子群に遺伝子を分類し、各群に属する遺伝子をＤＮＡチップ上に別々に固定する。低発現レベル遺伝子とは、０時間における転写レベルを１としたときに、２４時間以内に転写レベルがｎ倍（ここでｎは２以上５未満の範囲）で増大した遺伝子である。中発現レベル遺伝子とは、転写レベルがｎ倍（ここでｎは５以上１０未満の範囲）で増大した遺伝子である。高発現レベル遺伝子とは、転写レベルが１０倍以上で増大した遺伝子である。
【００４１】
虚血状態において発現レベルの変動する遺伝子を固定したＤＮＡチップを用い、配列番号１〜配列番号１０６６で表される塩基配列を有する遺伝子、又は配列番号１〜配列番号１０６６で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子から、低発現レベルの遺伝子を例えば３００個以上、中発現レベルの遺伝子を例えば１００〜３００個、高発現レベルの遺伝子を例えば３０〜１００個選択して固定する。そして、対照である非虚血患者由来の遺伝子発現プロファイルと比較して、高発現レベルの遺伝子である３０〜１００個の遺伝子の発現レベルが変動していれば、初期の虚血状態であると判断することができる（図２Ｂ）。また、高発現レベルの遺伝子のみならず、１００〜３００個の中発現レベル遺伝子の発現レベルが変動していれば、中期の虚血状態であると判断することができる（図２Ｃ）。さらに、上記高発現及び中発現レベル遺伝子のほか、３００個以上の低発現レベル遺伝子の発現レベルが変動していれば、虚血状態は後期であると評価することができる（図２Ｄ）。
【００４２】
なお、発現レベルの変動には、正常レベルと比較して、増加する側への変動と減少する側への変動とがある。しかしながら、配列番号１〜配列番号１０６６で表される塩基配列を有する遺伝子、又は配列番号１〜配列番号１０６６で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子は、虚血状態において、いずれも増加する側への変動を示すため、前記遺伝子の発現レベルの変動を指標とする虚血状態の検査においては、発現レベルが増加した場合のみ、発現レベルが変動した遺伝子としてカウントするものとする。
【００４３】
さらに、虚血状態において発現レベルの変動しないことが示された遺伝子についても、発現レベルを測定し、虚血状態の検査に活用することが可能である。すなわち、前記発現レベルの測定により、虚血であると評価された試料について、虚血状態において発現レベルの変動しないことが示されている遺伝子について、発現レベルを測定し、その発現レベルに変動が認められなければ、被検試料が虚血状態にあるという前記評価の信頼性を、より高めることができる。
【００４４】
４．虚血状態における遺伝子発現データ及び虚血状態同定プログラムを含有するコンピュータ読み取り可能な記録媒体、並びに虚血状態同定プログラム
本発明によって明らかとなった虚血状態において発現レベルが変動する遺伝子の発現レベルデータ、又は当該遺伝子から選択される複数の遺伝子を含む遺伝子群の発現プロファイルデータは、適当な媒体に記録し、虚血状態の検査のデータ解析において比較データとして用いることができる。記録する記録媒体としては、磁気テープ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＩＣカード、ＲＡＭなどのあらゆるタイプの記録媒体が挙げれる。具体的には、虚血状態において顕著に発現レベルの変動する遺伝子の、被検試料における発現レベルの変動度を調べ、記録媒体に記録された発現レベルと同等であれば、被検試料（すなわち、被検試料の由来生物）は、虚血状態にあると評価することができる。また、虚血状態において発現レベルが変動する遺伝子群の各遺伝子の発現レベルデータから作成された記録されている遺伝子発現プロファイルと、被検試料中の該当する遺伝子の遺伝子発現プロファイルとを比較することにより、より正確な虚血状態の評価が可能となる。すなわち、被検試料において、虚血時に発現レベルの変動する複数の特定の遺伝子の発現パターンが、上記のような記録媒体に記録された該当遺伝子の発現パターンと類似していれば、被検試料は、より高い確率で虚血状態にあると評価することができる。
【００４５】
以下の手順をコンピュータに実行させるプログラムを記録させた記録媒体は、虚血状態同定プログラムを含む記録媒体として有用である。ここで、虚血状態同定プログラムとは、被検試料が虚血状態にあることが疑われる又は虚血状態と評価された場合に、その虚血状態の段階（すなわち、虚血の初期の状態、中期の状態又は後期の状態）を同定することができるプログラムである。当該プログラムは、（ａ）被検試料の遺伝子発現レベルデータ又は遺伝子発現プロファイルデータを入力させる手順、（ｂ）入力されたデータを記録させる手順、（ｃ）記録されたデータと既に記録されている虚血時の発現レベルデータ又は遺伝子発現プロファイルデータとを照合させる手順、（ｄ）（ｃ）の照合結果に基づいて被検試料が虚血状態にあるか否かを判定する手順、並びに（ｅ被検サンプルが虚血状態にある場合に、（ｃ）の照合結果に基づいて被検試料の虚血状態の臨床ステージを同定させる手順、を含む。被検試料の遺伝子発現データを、上記プログラムがインストールされたコンピュータを用いて解析することにより、虚血状態を同定することができる。
【００４６】
本発明の虚血状態同定プログラムは、（ａ）被検細胞から単離された遺伝子の発現レベルを解析する手段と、（ｂ）（ａ）で得られる解析結果を指標として個々の被検試料が虚血状態にあるか否かを予測する手段とを含む。上記（ａ）の解析手段は、ある被検細胞又は被検組織における複数の遺伝子について、それぞれの遺伝子の発現レベルをそれぞれ検出する手段（「検出エンジン」ともいう）、並びに得られる検出値を分析する手段（「分析エンジン」ともいう）により構成される。
【００４７】
（１） 遺伝子発現の検出エンジン
本発明において、遺伝子発現の検出は、得られた検出データをデジタル化し、そのデジタル情報を使用することができる。デジタル化は、例えばＤＮＡチップ上で検出された蛍光強度等を数値化することにより行われる。
【００４８】
（２） 分析エンジン
分析エンジンは、検出エンジンにより得られたデータ（すなわち遺伝子発現量）に基づいて、クラスター分析処理などの多変量解析処理によって分析処理を行う手段である。クラスター分析とは、多変量解析の分野において多数の観測対象（すなわちサンプル）に対して、特定の計算基準（評価基準）により、「類似する対象」を集めて分類する手法を意味する。すなわち、クラスター分析は、観測された多数のサンプルに対して、類似するもの同士を同一グループに単に「分類」するものをいう。
【００４９】
得られた検出データに基づいてクラスター分析を行うには、サンプル間の類似度を表す「距離行列」を作成する。距離としてはユークリッド距離、重み付きユークリッド距離、標準ユークリッド距離、ピアソン積率相関係数等を計算する。これらの距離の概念は公知であり、クラスター分析の目的に応じて適宜選択することができる。上記の距離の概念を基にして、クラスターとクラスターとの間の距離、又はクラスターと個体間との距離を計算し、クラスターを統合する（２つのクラスターを連結する）。統合するための方法は公知であり、例えば最近隣法、最遠隣法、重心間距離法、ウォード法などがある。
【００５０】
上記分類手法により、「最短距離」の関係にあるクラスターを「類似する」クラスターとして、これを統合して新たな上位の階層のクラスターとする。一つの階層のクラスターが作成された後は、再びクラスター間の距離を計算し、距離行列を作成し、最短距離にある２つのクラスターを求めてさらに一つ上の階層のクラスターを作成する。このようにして、最終的に樹形図（デンドログラム）を作成する。
【００５１】
樹形図において所定の階層で統合されたクラスター内のサンプルは、何らかの類似関係にあるものである。その類似関係にあるサンプルは、共通してある性質を有しているということができ、その性質を明らかにすることによりそのクラスターの集団の特性を明らかにすることができる。従って、この分析処理によれば、発現量が高い遺伝子の群及び発現量が低い遺伝子の群に分類することができる。例えば、虚血状態の進行度を指標として虚血状態が高度か低度かに注目すると、一のクラスターに属するサンプルの虚血状態は高度であり、他のクラスターに属するサンプルの虚血状態は低度である、という特性を明らかにすることができる。
【００５２】
ここで、本発明の同定システムの一実施形態を示すブロック図を示す（図５）。
図５に示す同定システムは、ＣＰＵ５０１、ＲＯＭ５０２、ＲＡＭ５０３、入力部５０４、送信／受信部５０５、出力部５０６、ハードディスクドライブ（ＨＤＤ）５０７及びＣＤ−ＲＯＭドライブ５０８を備える。
【００５３】
ＣＰＵ５０１は、ＲＯＭ５０２、ＲＡＭ５０３又はＨＤＤ５０７に記憶されているプログラムに従って、虚血状態同定システム全体を制御し、後述する検査処理を実行する。ＲＯＭ５０２は、同定システムの動作に必要な処理を命令するプログラム等を格納する。ＲＡＭ５０３は、検査処理を実行する上で必要なデータを格納する。入力部５０４は、キーボードやマウス等であり、検査処理を実行する上で必要な条件を入力するとき等に操作される。送信／受信部５０５は、ＣＰＵ５０１の命令に基づいて、通信回線を介してデータベース５１０等との間でデータの送受信処理を実行する。出力部５０６は、入力部５０４から入力された各種条件、発現遺伝子の検出データ等を、ＣＰＵ５０１からの命令に基づいて表示処理を実行する。なお、出力部５０６としては、コンピュータのディスプレイ又はプリンターなどが例示される。ＨＤＤ５０７は、細胞又は組織における各種遺伝子の発現パターン情報を格納し、ＣＰＵ５０１の命令に基づいて、格納しているプログラム又はデータ等を読み出し、例えばＲＡＭ５０３に格納する。ＣＤ−ＲＯＭドライブ５０８は、ＣＰＵ５０１の指示に基づいて、ＣＤ−ＲＯＭ５０９に格納されている同定プログラムから、プログラム又はデータ等を読み出し、例えばＲＡＭ５０３に格納する。
【００５４】
ＣＰＵ５０１は、入力部などから受け取ったデータを出力部５０６に供給するとともに、データベースから受け取ったデータに基づいて、被検試料が虚血状態にあるか否かの予測を実行する。データベース（ＤＢ）とは、前記の通り得られた遺伝子の発現量（絶対量及び相対量の両者を含む）の情報を蓄積したものをいう。
【００５５】
図６は、上述した同定プログラムにより同定処理を行ったときの例を示すフローチャートである。被検試料における遺伝子の発現パターンを解析し、個々の試料が虚血状態にあるか否かを同定する。
【００５６】
図６において、クラスター分析装置６０１を例に同定処理を説明する。クラスター分析装置６０１は、上記同定処理を行うためのクラスター生成を行う。まず、外部データベース検索入力手段６０２により、遺伝子発現データを入力する。データ入力が確定するまでは、上記データの入力作業を繰り返す。なお、データの入力により、それぞれの組織又は細胞から得られた情報は、サンプルデータ記憶手段６０３に記憶され、クラスター分析に供され、又はデータベースに登録されるものとする。
【００５７】
次に、データ最適化手段６０４は、上記サンプルデータ記憶手段６０３からサンプルデータを入力し、データをクラスター分析のために最適化する。データ最適化には、中央値による標準化、ｚ−スコアによる標準化、最大値と最小値の設定、対数変換などの方法の中から使用するサンプルに最適なものを使って行う。
【００５８】
変量一覧出力手段６０５は、クラスター分析等が行われるサンプルデータの変量を一覧表示する。
【００５９】
次に、ユーザーは、変量一覧出力手段６０５によって一覧表示された変量から、変量選択手段６０６の機能により変量を選択する。
【００６０】
変量選択手段６０６による変量の選択は、単数又は複数の特定の変量を自由に選択できるようにする。通常は、変量の候補は多数であるため、ユーザーはそれら変量から任意のものを選択することができるようにする。
【００６１】
ユーザーにより特定の変量が選択されると、この情報はサンプルデータとともに同定用サンプルデータファイル生成手段６０７に入力され、同定用サンプルデータファイル生成手段６０７により同定用サンプルのデータファイルが生成される。
【００６２】
次に、得られたクラスターのデータファイルは、同定手段６０８に送られ、同定手段６０８によってクラスター分離度が評価される。クラスター分離度を評価する評価式は、種々の形で定義することができる。
【００６３】
上記同定手段６０８によるクラスター分離度の評価の結果は、クラスター分類手段６０９に渡される。クラスター分類手段６０９は、同定手段６０８による同定結果を入力し、同定条件設定手段６１２に設定されている同定条件を参照し、最適なクラスター分類を決定する。クラスター分類の継続停止条件が設定されている場合には、クラスター分類手段６０９がクラスター分類の継続と停止を判断する。クラスター分類の継続停止条件が設定されていない場合には、クラスター分類手段６０９はユーザーにクラスター分類の継続と停止を判断させる。クラスター分類手段６０９は、クラスター分類の継続を決定した場合は、その回の処理で得られた最適なクラスター分類と、クラスター分類を継続する旨の信号を出力する。このクラスター分類を継続する旨の信号は、後に樹形図編集手段６１１の処理後に変量一覧出力手段６０５の処理に戻す命令となる。
【００６４】
一方、クラスター分類手段６０９がクラスター分類の停止を決定した場合は、その段階で最適なクラスター分類を特定し、クラスター分類を中止する旨の信号を出力する。このクラスター分類を中止する旨の信号は、後に樹形図編集手段６１１の処理後にクラスター分類の処理を終了する命令となる。
【００６５】
クラスター分類手段６０９の処理が終了すると、次に、樹形図生成手段６１０の処理が開始される。樹形図生成手段６１０は、クラスター分類手段６０９によって決定されたクラスター分類を入力し、当該クラスター分類に基づく樹形図と、各クラスター分類に係る変量の属性とを表示する。樹形図生成手段６１０によってクラスター分類樹形図が生成されることにより、ユーザーは現在のクラスター分類の状態を視覚的に把握できる。樹形図生成手段６１０においては、樹形図の作成に合わせて、その作成のもとになった遺伝子発現量が表示されるため、ユーザーはその量を視覚的に把握することができる。次に、樹形図編集手段６１１は、ユーザーに樹形図生成手段６１０によって生成されたクラスター分類樹形図に対して表示装置画面上でクラスター分類の編集（すなわち追加、変更又は削除）をさせる。クラスター分類の追加、変更又は削除は、画面上でユーザーが処理命令入力装置を用いて行う。例えば、所定のクラスターを指定して、その下位にさらに分類すべきクラスターの変量を指定したり、複数のクラスターを統合したり、あるいは、所定のクラスター分類の枝を削除するなどである。樹形図編集手段６１１は、画面上のユーザーの編集作業を支援する種々のツールを提供するとともに、ユーザーによるクラスター分類の編集作業の意味を読み取り、それに応じて各クラスターのデータファイルを自動修正する。また、好ましくは樹形図編集手段６１１は、クラスター分類手段６０９によるクラスター分類の継続停止の判断を提示し、ユーザーに最終判断を入力させる。
【００６６】
この結果、クラスター分類の繰返し処理を継続することが決定された場合には、処理は変量一覧出力手段６０５に戻され、上述した変量一覧出力手段６０５から樹形図編集手段６１１までの処理が繰り返される。
【００６７】
以上のように解析されたデータから、被検対象の試料が虚血状態のクラスター及び正常のクラスターのうちどのクラスターに分類されたかを調べ、被検試料が虚血状態にあるか否かを判断することができる。
【００６８】
５．虚血状態改善薬又は虚血性疾患治療薬のスクリーニング方法
本発明において明らかにされた、虚血状態において発現レベルの増大する遺伝子の発現レベルを指標として、虚血状態改善薬又は虚血性疾患治療薬をスクリーニングすることが可能である。すなわち、試験動物又は試験細胞に薬剤を投与することにより、（ａ）上記遺伝子の発現レベルが正常組織における発現レベルに復帰するか否か、又は（ｂ）当該遺伝子の複数を含む遺伝子群の発現プロファイルが正常組織における正常な発現プロファイルに復帰するか否か、を調べる。或る薬剤を投与した結果、前記遺伝子の発現レベルが正常組織中の発現レベルに復帰すれば、前記薬剤は、虚血状態改善薬又は虚血性疾患治療薬の候補物質と評価することができる。
【００６９】
発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明を実施例を示して具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００７０】
〔実施例１〕　ＤＮＡチップによる虚血状態時に発現する遺伝子の同定
ＧｅｎｅＣｈｉｐ ＳｙｓｔｅｍＴＭ（アフィメトリックス社製）を用い、図４に示す手順で虚血状態時に発現する遺伝子を同定した。すなわち、まず、８〜１０週齢のｂｃｌ ＢＬＡＣＫマウスをインフレインで麻酔し、両側頚動脈を露出させ２０分間結紮することによって、血流を遮断し、マウスを虚血状態にした。その後、血流を回復してから、血流回復の０、２、６、１２及び２４時間後に屠殺して両側海馬を取り出し、直ちに凍結保存した。次いで、凍結サンプル１ｇからｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡ約２μｇを抽出した。次いで、逆転写酵素によってｃＤＮＡを合成した。さらに、このｃＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によってビオチン標識されたｃＲＮＡを調製した。標識ｃＲＮＡをＭｇ２＋存在下で熱処理することによって約５０ｍｅｒのサイズに断片化した。内部標準を標識後、試料に添加し、この試料をＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ Ｍｕ６５００（アフィーメトリックス社製）に注入した。オーブン中でハイブリダイゼーション後、チップをＦｌｕｉｄｉｃステーション中で洗浄した。ＧｅｎｅＡｒｒａｙスキャナーでチップの情報を取り込んだ。得られたデータをバイオインフォーマティクスのシステムを用いて処理・解析を行った。結果を表１〜表３に示した。表１は、０時間における転写レベルを１としたときに、２４時間以内に転写レベルがｎ倍（ｎは２以上５未満の範囲）で増大した遺伝子である。同様に、表２は、転写レベルがｎ倍（ｎは５以上１０未満の範囲）で増大した遺伝子である。表３は、転写レベルが１０倍以上で増大した遺伝子である。なお、アクセッション番号（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＮＯ．）は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号である。
【００７１】
【表１】
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【００７２】
【表２】
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【００７３】
【表３】
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【００７４】
本明細書中引用した文献、特許及び特許出願は全て参照によりその全体を本明細書に組み入れるものとする。
【００７５】
産業上の利用可能性
被検試料中の遺伝子発現を解析することにより、虚血状態が検査される。このような解析は、虚血の予防及び治療への応用が期待される。また、虚血状態に特異的に発現される遺伝子の発現レベルを指標とする、新規な虚血予防薬及び治療薬のスクリーニング方法が提供される。
【００７６】
配列表フリーテキスト
配列番号１０６７：合成ＤＮＡ
配列番号１０６８：合成ＤＮＡ
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＤＮＡチップを用いて、虚血状態において発現レベルの変動する遺伝子を同定する手順を示した図である。
【図２】
図２は、本発明の虚血状態検査用ＤＮＡチップの一態様及び当該ＤＮＡチップを用いて被検患者由来の試料をハイブリズさせたときに予想される結果を示した図である。
【図３】
図３は、合成型ＤＮＡチップの一態様及び当該ＤＮＡチップを用いて被検試料中の遺伝子を検出する手順を示した図である。
【図４】
図４は、ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭを用いて遺伝子発現レベルを測定する場合の手順を示した図である。
【図５】
図５は、虚血状態同定システムのブロック図である。
【図６】
図６は、虚血状態同定プログラムによる処理例を示すフローチャートの図である。
【符号の説明】
５０１：ＣＰＵ、 ５０２：ＲＯＭ、　５０３：ＲＡＭ、　５０４：入力部、　５０５：送信／受信部、　５０６：出力部、　５０７：ＨＤＤ、　５０８：ＣＤ−ＲＯＭドライブ、　５０９：ＣＤ−ＲＯＭ、　５１０：データベース　６０１：クラスター分析装置、　６０２：外部データベース検索入力手段、　６０３：サンプルデータ記憶手段、　６０４：データ最適化手段、　 ６０５：変量一覧出力手段、　６０６：変量選択手段、　６０７：評価用サンプルデータファイル生成手段、　６０８：評価手段、　６０９：クラスター分類手段、　６１０：樹形図生成手段、　６１１：樹形図編集手段、　６１２：評価条件設定手段
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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