(57)【要約】本発明は、外因性のＰＥＤＦを組織を付随する細胞に提供することにより、組織中の新脈管形成を阻害する方法を提供する。外因性ＰＥＤＦの存在は、部分的には血管内皮細胞が組織中に広がる能力を妨害することにより、組織中の新脈管形成を阻害する。また本発明は、腫瘍中のＰＥＤＦの存在をアッセイすることにより腫瘍の重篤度を測定する方法を提供する。さらに本発明は、内皮細胞の移動を阻害する方法、哺乳動物の毛髪の成長を刺激する方法、腫瘍の増殖を抑制する方法、神経芽腫細胞の分化を誘導する方法、神経芽腫細胞の成長を遅くする方法、および哺乳動物の虚血性網膜症を処置する方法を提供する。本発明を実施するために、本発明はＰＥＤＦ源を含む医薬組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経芽腫細胞の分化を誘導する方法であって、ＰＥＤＦを該細胞に投与し、これにより該細胞の分化を誘導することを含んで成る上記方法。
【請求項２】
神経芽腫細胞の成長を遅らせる方法であって、ＰＥＤＦを該細胞に投与し、これにより該細胞の成長を遅らせることを含んで成る方法。
【請求項３】
哺乳動物の虚血性網膜症の処置法であって、外因性のＰＥＤＦを該哺乳動物の目に付随する内皮細胞に、該ＰＥＤＦが該目の新脈管形成を阻害するために十分な条件下で提供し、これにより該虚血性網膜症を処置することを含んで成る上記方法。
【請求項４】
哺乳動物の組織中の新脈管形成を阻害する方法であって、外因性ＰＥＤＦを該ＰＥＤＦが該組織中の新脈管形成を阻害するために十分な条件下で該哺乳動物に全身的に提供することを含んで成る上記方法。
【請求項５】
上記組織が、目の組織、皮膚の組織、腫瘍、関節内の組織、骨髄、鼻の上皮、前立腺、卵巣および子宮内膜組織から成る群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該組織が目の組織である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記哺乳動物が、虚血性網膜症を有する哺乳動物、虚血性網膜症を発症する危険性がある哺乳動物、黄斑変性を有する哺乳動物、および黄斑変性を発症する危険性がある哺乳動物から成る群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
さらに別の抗新脈管形成因子をＰＥＤＦと一緒に上記細胞に供給することを含んで成る、請求項１、２、３または４に記載の方法。
【請求項９】
組織の細胞中のＰＥＤＦ発現をアップレギュレートする方法であって、該組織に高酸素を誘導し、これにより該細胞中のＰＥＤＦの発現をアップレギュレートすることを含んで成る上記方法。
【請求項１０】
哺乳動物の黄斑変性の処置法であって、外因性のＰＥＤＦを該哺乳動物の目に付随する内皮細胞に、該ＰＥＤＦが該目の新脈管形成を阻害するために十分な条件下で提供し、これにより該黄斑変性を処置することを含んで成る上記方法。
【請求項１１】
哺乳動物の良性の新形成物を処置する方法であって、ＰＥＤＦを該哺乳動物に投与し、これにより該良性の新形成物を処置することを含んで成る上記方法。
【請求項１２】
上記の良性の新形成物が鼻のポリープである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記の哺乳動物が嚢胞性線維症を有するヒトである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
上記の良性の新形成物が前立腺内にある、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
組織中の新脈管形成を阻害する方法であって、外因性のＰＥＤＦを該組織に付随する内皮細胞に、照射、化学療法、少なくとも１つの生物学的応答モディファイヤーの使用、およびレーザー処置から成る群から選択される少なくとも１つの他の処置と一緒に、該ＰＥＤＦが該組織中で新脈管形成を阻害するために十分な条件下で提供することを含んで成る上記方法。
【請求項１６】
ＰＥＤＦポリペプチドを含んで成る組成物を上記細胞に暴露することにより、上記ＰＥＤＦが該細胞に提供または投与される、請求項１、２、３、４、１０、１１または１５に記載の方法。
【請求項１７】
上記細胞にＰＥＤＦをコードする単離された核酸を含んで成るベクターを移し、これにより上記ＰＥＤＦが該細胞中で発現し、そして分泌されることにより該ＰＥＤＦが提供または投与される、請求項１、２、３、４、１０、１１または１５に記載の方法。
【請求項１８】
ＰＥＤＦをコードする上記の単離された核酸が、配列番号２を含んで成る、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＰＥＤＦをコードする上記の単離された核酸が、ＰＥＤＦの生物学的に活性なフラグメントをコードする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
上記のＰＥＤＦの生物学的に活性なフラグメントが、配列番号１のアミノ酸配列中に含まれる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
上記のＰＥＤＦの生物学的に活性なフラグメントが、配列番号１のアミノ酸４４からアミノ酸１２１を含んで成る、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
上記のＰＥＤＦの生物学的に活性なフラグメントが、配列番号１のアミノ酸４４−７７を含んで成る、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
上記のＰＥＤＦが配列番号１を含んで成る、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
上記のＰＥＤＦが配列番号１の生物学的に活性なフラグメントを含んで成る、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
上記のＰＥＤＦの生物学的に活性なフラグメントが、配列番号１のアミノ酸４４からアミノ酸１２１を含んで成る、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
上記のＰＥＤＦの生物学的に活性なフラグメントが、配列番号１のアミノ酸４４−７７である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
他の細胞群にＰＥＤＦをコードする単離された核酸を含んで成るベクターをトランスフェクトし、これにより該ＰＥＤＦが該他の細胞中で発現し、そして分泌され、そしてそのようにトランスフェクトされた該他の細胞群をそのように分泌されるＰＥＤＦが上記内皮細胞と接触できる部位へ移すことにより、上記ＰＥＤＦが該内皮細胞に提供または投与される請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
上記の単離された核酸が配列番号２である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
上記の単離された核酸がＰＥＤＦの生物学的に活性なフラグメントをコードする、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
上記のＰＥＤＦの生物学的に活性なフラグメントが、配列番号２のフラグメントによりコードされる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
上記の単離された核酸の該他の細胞群へのトランスフェクションが、該他の細胞中に組み込まれていないか、または安定に組み込まれたＤＮＡからＰＥＤＦの発現をもたらす、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
上記ＰＥＤＦが全身の循環を介して上記細胞に供給される、請求項１７に記載の方法。
【請求項３３】
上記ＰＥＤＦが局所投与を介して上記細胞に供給される、請求項１７に記載の方法。
【請求項３４】
上記ＰＥＤＦポリペプチドがＰＥＤＦポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントである、請求項１６に記載の方法。
【請求項３５】
上記のＰＥＤＦポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントが、配列番号１のアミノ酸配列内に含まれる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
上記のＰＥＤＦの生物学的に活性なフラグメントが、配列番号１のアミノ酸４４からアミノ酸１２１を含んで成る、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
上記のＰＥＤＦの生物学的に活性なフラグメントが、配列番号１のアミノ酸４４−７７を含んで成る、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
腫瘍内のＰＥＤＦの存在をアッセイすることよる腫瘍の重篤度を測定する方法であって、腫瘍内のＰＥＤＦの不存在は進行した状態を示し、そして腫瘍内のＰＥＤＦの存在は腫瘍の初期状態を示す上記方法。
【請求項３９】
さらに別の抗新脈管形成因子をＰＥＤＦと一緒に上記細胞に供給することを含んで成る、請求項１０、１１または１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
発明の背景
新脈管形成は、新しい血管が形成される基本的なプロセスである。このプロセスには血管内皮細胞の組織への移動、続いてそのような内皮細胞の血管への圧縮（ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）が関与する。新脈管形成は外因性血管新生物質により誘導することができるか、あるいは自然な条件の結果であり得る。このプロセスは再生、発育および創傷修復のような様々な正常な身体活動に必須である。このプロセスは完全に解明されていないが、毛細血管の一次細胞である内皮細胞の成長および移動を刺激する分子、そして阻害する分子の複雑な相互作用が関与する。正常条件下で、これらの分子は数年から数十年も持続し得る長期間、微小血管を静止期（すなわち毛細管の成長が無い）に維持するようである。内因細胞の代謝時間は約１０００日である。しかし適切な条件下で（例えば創傷の修復中）、これらの同じ細胞は急激な増殖を受け、そしてより一層短期間内に代謝され、そして５日間の代謝速度がこれらの条件下では典型的である（Ｆｏｌｋｍａｎ ａｎｄ Ｓｈｉｎｇ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（１６）：１０９３１−１０９３４；Ｆｏｌｋｍａｎ ａｎｄ Ｋｌａｇｓｂｒｕｍ，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：４４２−４４７）。
【０００２】
新脈管形成は正常条件下で高度に調節されているが、多くの疾患（「新脈管形成性疾患」として特徴つけられる）は、持続的な非調節の新脈管形成により活発化となる。そのような疾患状態において、非調節の新脈管形成は特定の疾患を直接引き起こすか、あるいは現存する病状を悪化させるかのいずれかである。例えば目の新生血管形成は失明の最も多い原因と考えられ、そして目のおよそ２０の疾患の病因の基礎になる。関節炎のような特定のこれまでに存在している状態では、新たに形成された毛細血管が関節に侵入し、そして軟骨を破壊する。糖尿病では網膜中に形成された新しい毛細管はガラス体液に侵入し、そして出血させ、失明を引き起こす。
【０００３】
充実性腫瘍の成長および転移も、新脈管形成に依存的である（Ｆｏｌｋｍａｎ，１９８６，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４６：４６７−４７３；Ｆｏｌｋｍａｎ，１９８９，Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８２：４−６；Ｆｏｌｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．、１９９５、「腫瘍の新脈管形成（Ｔｕｍｏｒ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）」、第１０章、第２０６〜３２頁、ガンの分子的基礎（Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ）で、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ ｅｔ ａｌ．、編集（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ）。例えば約２ｍｍより大きな直径に拡大する腫瘍は、それら自体の血液供給を得なければならず、そして新しい毛細血管の成長を誘導することにより供給しなければならないことが示された。このような新しい血管が腫瘍に埋め込まれた後、新血管は腫瘍の成長に必須な栄養および成長因子、ならびに腫瘍細胞が循環に入り、そして肝臓、肺または骨のような別の部位へ転移する手段を提供する（Ｗｅｉｎｄｎｅｒ１９９１，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２４（１）：１０８）。腫瘍を有する動物に薬剤として使用する時、新脈管形成の自然なインヒビターは小さい腫瘍の成長を妨げることができる（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｃｅｌｌ ７９：３１５−３２８）。実際に幾つかのプロトコールで、そのようなインヒビターの適用はたとえ処置を停止した後でも腫瘍の退縮および休眠状態を導く（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃｅｌｌ ８８：２７７−２８５）。さらに新脈管形成のインヒビターを特定の腫瘍に供給することにより、他の治療計画（例えば化学療法）に対するそれらの応答を有効とする（ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅ）ことができる（例えばＴｅｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５７：９２０−９２５を参照にされたい）。
【０００４】
数種の新脈管形成インヒビターが新脈管形成性疾患の処置に使用するために現在開発中であるが（Ｇａｓｐａｒｉｎｉ，１９９６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３２Ａ（１４）：３２７９−２３８５）、これらの提案されている阻害化合物には付随する欠点がある。例えばスラミンは有力なインヒビターであるが、抗腫瘍活性に達するために必要な用量ではヒトに重篤な全身的毒性を引き起こす。レチノイド、インターフェロンおよび抗エストロゲン類のような他の化合物は、ヒトの使用には安全であるようだが、わずか１週間の抗−新脈管形成効果しかない。さらに別の化合物は作成することが難しいか、または経費がかかる。加えて新脈管形成の数種の異なるインヒビターを同時に投与することが、真に効果的な処置に必要かもしれない。
【０００５】
したがって新脈管形成を阻害するための新規方法および組成物の開発が長い間必要とされている。本発明はこれらの必要性を満たす。
【０００６】
発明の簡単な要約
本発明は神経芽腫細胞の分化を誘導する方法に関する。この方法は、ＰＥＤＦを細胞に投与し、これにより細胞の分化を誘導することを含んで成る。
【０００７】
また本発明は神経芽腫細胞の成長を遅らせる方法に関する。この方法もＰＥＤＦを細胞に投与し、これにより該細胞の成長を遅らせることを含んで成る。
【０００８】
さらに本発明には哺乳動物の虚血性網膜症の処置法を含む。この方法は外因性のＰＥＤＦを該哺乳動物の目に付随する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）内皮細胞に、ＰＥＤＦが目の新脈管形成を阻害するために十分な条件下で提供し、これにより該虚血性網膜症を処置することを含んで成る。
【０００９】
さらに本発明は哺乳動物の組織中の新脈管形成を阻害する方法を含み、この方法は外因性ＰＥＤＦを、該ＰＥＤＦが該組織中の新脈管形成を阻害するために十分な条件下で該哺乳動物に全身的に提供することを含んで成る。１つの観点では、組織は目の組織、皮膚の組織、腫瘍、関節内の組織、骨髄、鼻の上皮、前立腺、卵巣および子宮内膜組織から成る群から選択される。好適な態様では、組織は目の組織である。さらなる態様では、哺乳動物は虚血性網膜症を有する哺乳動物、虚血性網膜症を発症する危険性がある哺乳動物、黄斑変性を有する哺乳動物、および黄斑変性を発症する危険性がある哺乳動物から成る群から選択される。
【００１０】
また本発明には、組織の細胞中のＰＥＤＦ発現をアップレギュレートする（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ）方法を含み、この方法は組織に高酸素を誘導し、これにより細胞中のＰＥＤＦの発現をアップレギュレートすることを含んで成る。
【００１１】
加えて、本発明は哺乳動物の黄斑変性の処置法を含み、この方法は外因性のＰＥＤＦを哺乳動物の目に付随する内皮細胞に、ＰＥＤＦが目の新脈管形成を阻害するために十分な条件下で提供し、これにより黄斑変性を処置することを含んで成る。
【００１２】
本発明は、哺乳動物の良性の新形成物を処置する方法を含み、この方法はＰＥＤＦを哺乳動物に投与し、これにより該良性の新形成物を処置することを含んで成る。１つの観点では、良性の新形成物は鼻のポリープである。別の観点では、哺乳動物は嚢胞性線維症を有するヒトである。さらなる観点では、良性の新形成物は前立腺内にある。
【００１３】
加えて、組織中の新脈管形成を阻害する方法が提供される。この方法は外因性のＰＥＤＦを組織に関係する内皮細胞に、照射、化学療法、少なくとも１つの生物学的応答モディファイヤー（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒ）の使用、およびレーザー処置から成る群から選択される少なくとも１つの他の処置と一緒に、ＰＥＤＦが組織中で新脈管形成を阻害するために十分な条件下で提供することを含んで成る。
【００１４】
細胞にＰＥＤＦが提供されるか、または投与される本明細書に列挙する方法の各々において、ＰＥＤＦはＰＥＤＦポリペプチドを含んで成る組成物を細胞に暴露することにより提供または投与される。
【００１５】
あるいは細胞にＰＥＤＦが提供されるか、または投与される本明細書に列挙する方法の各々において、ＰＥＤＦは細胞にベクターを移すことにより細胞に提供または投与され、ベクターはＰＥＤＦをコードする単離された核酸を含んで成り、これによりＰＥＤＦが該細胞中で発現し、そして分泌される。
【００１６】
１つの観点では、ＰＥＤＦをコードする単離された核酸は配列番号２を含んで成る。別の観点では、ＰＥＤＦをコードする単離された核酸はＰＥＤＦの生物学的に活性なフラグメントをコードする。特定の態様では、ＰＥＤＦの生物学的に活性なフラグメントは、配列番号１のアミノ酸配列中に含まれる。他の態様ではＰＥＤＦの生物学的に活性なフラグメントは、配列番号１のアミノ酸４４からアミノ酸１２１、または配列番号１のアミノ酸４４−４７を含んで成る。さらに他の態様では、ＰＥＤＦは配列番号１を含んで成る。
【００１７】
別の態様では、他の細胞群にＰＥＤＦをコードする単離された核酸を含んで成るベクターをトランスフェクトし、これによりＰＥＤＦが該他の細胞中で発現し、そして分泌され、そしてそのようにトランスフェクトされた該他の細胞群をそのように分泌されるＰＥＤＦが該内皮細胞と接触できる部位へ移すことによりＰＥＤＦが該内皮細胞に提供または投与される。
【００１８】
１つの態様では、単離された核酸は配列番号２である。別の態様では、単離された核酸はＰＥＤＦの生物学的に活性なフラグメントをコードし、好適な態様では配列番号２のフラグメントによりコードされる。
【００１９】
別の観点では、単離された核酸の該他の細胞群へのトランスフェクションが、他の細胞中に組み込まれていないか、または安定に組み込まれたＤＮＡからＰＥＤＦの発現をもたらす。
【００２０】
さらに別の観点では、ＰＥＤＦが全身の循環を介して、局所投与を介して細胞に供給される。
【００２１】
本明細書で記載するように、外因的に提供されるＰＥＤＦにはＰＥＤＦポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントを含み、これは１つの態様では配列番号１のアミノ酸配列内に含まれる。好ましくは、ＰＥＤＦの生物学的に活性なフラグメントは、配列番号１のアミノ酸４４からアミノ酸１２１を含んで成る。また好ましくはＰＥＤＦの生物学的に活性なフラグメントは、配列番号１のアミノ酸４４−７７を含んで成る。
【００２２】
本発明はまた腫瘍内のＰＥＤＦの存在をアッセイすることよる腫瘍の重篤度（ｓｅｖｅｒｉｔｙ）の測定法も含み、ここで腫瘍内のＰＥＤＦの不存在は進行した状態を示し、そして腫瘍内のＰＥＤＦの存在は腫瘍の初期状態を示す。
【００２３】
ＰＥＤＦが細胞に投与または提供される本発明の各々の方法において、方法はさらに別の抗新脈管形成因子をＰＥＤＦと一緒に該細胞に供給することを含んで成る。
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明は、新脈管形成を阻害するための完全長の色素上皮由来成長因子（ＰＥＤＦ；Ｓｔｅｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（４）：１５２６−１５３０）およびＰＥＤＦの任意の抗新脈管形成誘導体の使用を包含する。また本発明は新脈管形成を阻害するための完全長のＰＥＤＦおよびＰＥＤＦの任意の抗新脈管形成誘導体ををコードする核酸の使用を包含する。
【００２５】
本発明の方法の内容の中で、ＰＥＤＦは有効な抗新脈管形成特性を有するタンパク質であり、そしてそれには本明細書に記載するようなＰＥＤＦの任意の抗新脈管形成誘導体を含む。ＰＥＤＦポリペプチドの１つの形（完全長のＰＥＤＦ）は、図６Ａ（配列番号１）に説明するが、本発明はこの例示する配列の使用に限らない。実際に、他のＰＥＤＦ配列が当該技術分野（例えば公開された国際公開第９５／３３４８０号および同第９５／２４５２９号明細書を参照にされたい）で知られている。さらに遺伝子配列は異なる種および個体の間で変動し得ることは周知である。この対立遺伝子の変動の自然な範囲は、本発明の範囲内に含まれる。さらにそしてあるいは、ＰＥＤＦポリペプチドは例示する配列または他の自然に生じるＰＥＤＦポリペプチドに由来する１以上の点突然変異を含むことができる。すなわちＰＥＤＦポリペプチドは典型的には配列番号１のすべてまたは一部に少なくとも約７５％相同的であり、そして好ましくは配列番号１のすべてまたは一部に少なくとも少なくとも約８０％相同的であり（例えば、配列番号１に少なくとも約８５％相同的である）；より好ましくはＰＥＤＦポリペプチドは配列番号１のすべてまたは一部に少なくとも約９０％相同的であり（配列番号１のすべてまたは一部に少なくとも約９５％相同的であるような）；そして最も好ましくはＰＥＤＦポリペプチドは配列番号１のすべてまたは一部に少なくとも約９７％相同的である。実際に、ＰＥＤＦポリペプチドはエピトープタグおよびＨｉｓタグのような他のドメインを含むこともできる（例えばタンパク質は融合タンパク質であることができる）。
【００２６】
本発明の内容の中で、ＰＥＤＦポリペプチドは既知のＰＥＤＦ配列またはそれらの誘導体の挿入、欠失、または置換突然変異体であることができるか、または含んで成ることができる。好ましくは任意の置換はＰＥＤＦポリペプチドの生化学的特性を最小に破壊する保存的置換である。すなわちアミノ酸残基を置換するために突然変異が導入される場合、正に荷電した残基（Ｈ、ＫおよびＲ）は好ましくは正に荷電した残基に置換される；負に荷電した残基（ＤおよびＥ）は好ましくは負に荷電した残基に置換される；中性の極性残基（Ｃ、Ｇ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、ＴおよびＹ）は、好ましくは中性の極性残基に中性される；そして中性の非極性残基（Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、ＶおよびＷ）は、好ましくは中性の非極性残基に置換される。さらにＰＥＤＦポリペプチドは既知のＰＥＤＦタンパク質またはそれらのフラグメントの活性フラグメントであることができる。実際に、配列番号１に由来する切断されたフラグメントは、活性なＰＥＤＦポリペプチドである。例えば配列番号１の１から２０の残基は分泌中に開裂され、そしてＰＥＤＦ活性には無くても済む。さらに他の活性なＰＥＤＦ天然および合成ポリペプチドは、配列番号１の残基４４から１５７のような（例えば配列番号１の残基４４−１２１および４４−７７）、配列番号１の残基２１から３８２に由来する配列を含んで成る。もちろん、挿入、欠失、または置換突然変異はタンパク質のグリコシル化に影響を及ぼすことができるが、ＰＥＤＦポリペプチドは本発明の方法に使用するために必要な抗新脈形成特性を保有するためにグリコシル化される必要はない。例えばＰＥＤＦの活性な３４アミノ酸フラグメントがグリコシル化されていない図７に提示するデータを参照されたい。
【００２７】
本発明はさらに、ＰＥＤＦのアミノ酸の１以上のＤ−アイソマー形を含むことができるＰＥＤＦポリペプチドの使用を含むと解釈される。ペプチドは開示した同じアミノ酸で作られているが、少なくとも１つのアミノ酸、そして恐らくすべてのアミノ酸がＤ−アミノ酸であるレトロ−インベルソＤ−アミノ酸ＰＥＤＦペプチドの製造は、いったん本発明から着手すれば簡単な問題である。ペプチド中のすべてのアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、そして分子のＮ−およびＣ−末端が逆である場合、結果はＬ−アミノ酸形の分子と同じ位置で同じ構造の基を有する分子である。しかし分子はタンパク質溶解的分解に対してより安定であり、したがって本明細書で列挙する多くの応用に有用である。
【００２８】
また本発明の方法は、図６Ｂ（配列番号２）に例示するような生物学的に活性なＰＥＤＦをコードする核酸、または本明細書で定義するＰＥＤＦ活性を有するそれらの任意のフラグメントの状態のＰＥＤＦの使用も含むと解釈すべきである。すなわち本発明はＰＥＤＦの前述のフラグメントをコードする核酸およびそれらの任意の誘導体および配列番号２に実質的に相同的である核酸とは生物学的に活性なＰＥＤＦをコードするそれらのフラグメントの使用を含むと解釈すべきである。
【００２９】
本明細書で使用する「生物学的に活性なＰＥＤＦ」という用語は、本明細書に含む実験の詳細／実験の章で提示される任意のアッセイで、新脈管形成を阻害することができる任意のＰＥＤＦポリペプチド、フラグメントまたは誘導体を意味する。
【００３０】
ＰＥＤＦの生物学的に活性なフラグメントは、ＰＥＤＦの３４アミノ酸フラグメント（３４ｍｅｒ）として本明細書の実施例の章で例示されている。このフラグメントの単離および特性決定に関する手順は、当業者の観点で本明細書に詳細に提供する。すなわち本明細書に提供される指示に従い本発明で有用なＰＥＤＦの生物学的に活性なフラグメントを同定することは容易な問題であり、したがって本発明は本明細書に開示する任意の、およびすべてのそのようなフラグメントおよびそれらの修飾および誘導体を含むと解釈すべきである。さらに本発明は本明細書で定義する用語であるＰＥＤＦの生物学的に活性なフラグメントをコードする任意の、およびすべての核酸を含むと解釈すべきである。前述の特許請求の範囲で使用した用語「ＰＥＤＦ」は、本明細書で定義するＰＥＤＦの生物学的に活性なＰＥＤＦのすべての形を含むと解釈すべきである。
【００３１】
本明細書でＰＥＤＦを指すために使用する用語「外因性」により、この用語は細胞中で自然には発現されない任意の、およびすべてのＰＥＤＦを含むと解釈すべきである。例えば「外因性ＰＥＤＦ」は組換え法を使用して細胞中に導入された核酸から発現したＰＥＤＦ、細胞に加えられたＰＥＤＦ、および任意の、およびすべてのそれらの組み合わせを含むと解釈すべきである。したがって、この用語は細胞自体へのＰＥＤＦの添加のみに限定されず、ＰＥＤＦが細胞に導入された核酸から発現された時、細胞中のＰＥＤＦの発現も含むと拡大して解釈すべきである。
【００３２】
ＰＥＤＦポリペプチドは、一部は活性化された内皮細胞の移動および生存を弱めることにより新脈管形成を阻害するが、これは内皮が組織中に広がる能力を下げる。すなわち本発明は、そのような細胞に外因性のＰＥＤＦを提供することにより内皮細胞の移動を阻害する方法を提供する。新脈管形成を弱めることとは別に、本方法は腸管癒着、クローン病、アテローム硬化症、強皮症および過形成性瘢痕（例えばケロイド）のような内皮細胞移動の刺激が関係する疾患を処置するために有用である。
【００３３】
本発明の方法に従い、ＰＥＤＦは目的の組織に付随する内皮細胞に提供される。そのような細胞は、目的組織を含んで成る細胞、組織に導入された外因性の細胞または組織中ではない隣の細胞であることができる。すなわち例えば細胞は組織の細胞であることができ、そしてＰＥＤＦはＰＥＤＦが細胞に接触するようにその場所に提供される。あるいは細胞は組織に導入された細胞であることができ、この場合ＰＥＤＦは細胞が組織に導入される前に細胞に移されることができ（例えばインビトロ）、ならびに組織に導入された後にその場に移されることができる。
【００３４】
ＰＥＤＦが細胞に導入され、次いで哺乳動物に移される時、本発明はＰＥＤＦを細胞に導入する様式により限定されると解釈すべきではない。また細胞が哺乳動物に導入される様式により本発明が限定されるとも解釈すべきではない。以下にさらに詳細に記載するように、ＤＮＡを細胞に導入する方法はそのような細胞を哺乳動物の組織中に送達する方法のように周知である。
【００３５】
内皮細胞が付随する組織は、内皮の移動または拡大を阻害することが望まれる任意の組織である（例えば、新脈管形成を阻害するために）。１つの応用では組織は目の組織であり、この場合、外因性ＰＥＤＦの存在は目の種々の疾患に関係する新規な新脈管形成を阻害するだろう。例えば本発明の方法は目の創傷、低酸素症、感染、外科的医術、レーザ手術、糖尿病、網膜芽腫、黄斑変性、虚血性網膜症、または目の他の疾患または障害を処置するために有用である。これに関連して、本方法は種々の目の疾患に関連する失明の防止または視野の喪失を遅らせるために有用である。ほとんどの糖尿病患者は最終的に疾患により引き起こされる虚血に応答して網膜の血管の過剰成長による視野の損失を患う。同様に、高レベルの酸素に暴露された未熟な新生児は、網膜の静脈閉塞または他の血管または虚血性異常の結果として網膜症を発症する。本明細書に記載するように、虚血により誘導される網膜症はＰＥＤＦの全身または局所投与により防止およびまたは処置することができる。レーザー手術の場合、目に関してはＰＥＤＦを使用して処置後の血管の再成長を防止することができる。レーザーは過剰な血管を破壊するために使用されるが、それらはまた幾つかの新脈管形成を誘導する網膜中の創傷も作る。ＰＥＤＦを用いた全身性または局所的処置は、そのような再成長を防止するために役立つ。
【００３６】
本明細書で使用する「網膜症」という用語は、硝子体に入っても入らなくてもよい網膜内または回りの血管の異常な発育を意味する。傷害、疾患、虚血の発生、レーザーまたは他の医原性処置が、網膜症を誘導し得る。
【００３７】
別の応用では組織は皮膚の疾患であり、この場合は外因性ＰＥＤＦの存在が幾つかの皮膚疾患に関連する新生血管形成を防止する。例えば本方法は乾癬、強皮症、皮膚の腫瘍、感染の結果としての新生血管形成（例えば、ネコに引っ掻かれたことによる疾患、細菌性の潰瘍化等）、または他の皮膚疾患のような疾患および障害を処置するために有用である。ＰＥＤＦが皮膚に提供される場合、ＰＥＤＦは皮膚の表面または皮膚表面下の皮膚組織に、あるいは全身的にも提供することができる。さらにＰＥＤＦを哺乳動物の皮膚に移すことは皮膚の毛髪の成長をも刺激することができる。特定の理論に拘束されることなく、ＰＥＤＦは毛包内の新脈管形成を媒介することにより、かつ／またはニューロン組織近くの分化に影響を及ぼすことにより毛髪の成長に影響を与えると考えられる。
【００３８】
別の態様では、組織は腫瘍（例えば、良性または癌腫性の成長）であり、この場合、本発明の方法は腫瘍内または腫瘍への血管の成長を阻害し、そして場合により腫瘍細胞の分化、そしてゆっくりとした分割を誘導する。腫瘍内の血管の成長を阻害することは、所定のサイズを越えた成長を支持するために腫瘍に供給される十分な栄養および酸素を妨げる。すなわち本発明の方法は、遺伝的素因（例えばＢＲＣＡ−１突然変異キャリアー、ｐ５３突然変異を持つＬｉ Ｆｒａｕｍｅｎｉ患者等）または外の発癌物質（例えばタバコ、アルコール、工業用溶媒）の存在により既に存在する癌腫細胞から腫瘍の核形成を防止することができる。腫瘍形成の防止の外に、本発明の方法は既存の腫瘍の成長を遅らせ、すなわち腫瘍をより容易に阻止および摘出し、そして腫瘍の退行を引き起こすことができる。この応用は手術を施すことが難しい腫瘍を処置するために高度に有利である（例えば悩または前立腺腫瘍）。加えてこの方法は限定するわけではないが神経芽腫を含む小児腫瘍の処置に有用である。さらに、現存する腫瘍内の血管数を最小にすることは、腫瘍が転移する可能性を下げる。腫瘍の処置において、この方法は単独または他の処置と組み合わせて使用して腫瘍の成長を制御することができる。実際に本発明の方法を採用することにより、幾つかの腫瘍の他の治療に対する応答を強化することができる。例えば本発明の方法は化学療法または放射線処方の前処置（例えば約１週間前に）に、そしてそれらの処置中に続行して採用することができる。本発明の方法は例えばインターフェロンまたは他の抗新脈管形成物質のような生物学的応答モディファイヤーの使用と組み合わせて使用してもよく、そしてまたインビボで抗新脈管形成物質の生産を誘導する作用物質の使用との組み合わせも有用である。さらに本発明の方法は細胞の分化を促進する作用物質、特に限定するわけではないが悩腫瘍細胞の分化を促進する作用物質と組み合わせて使用してもよい。
【００３９】
本発明の方法が他の組織に適用される場合、新生血管形成の防止は宿主の障害を効果的に処理する。すなわち例えば本発明の方法を血管の障害（例えば血管腫およびアテローム硬化症プラーク内の毛細管増殖）、筋肉の疾患（例えば心筋の新脈管形成または平滑筋内の新脈管形成）、関節（例えば関節炎、血友病関節等）、および新脈管形成が関係する他の疾患（例えばＯｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ症候群、プラーク新生血管形成、毛細管拡張症、血管線維腫、創傷の肉芽化等）の処置の一部として使用することができる。さらに本発明は特に嚢胞性線維症患者の鼻のポリープ、骨髄細胞の異常な成長から起こる白血病、および前立腺ガンの処置に有用である。本発明は一般に、前立腺に含まれる良性の新生組織形成の処置に有用となる。
【００４０】
新生血管形成と関連する障害および症状の処置とは別に、新脈管形成の阻害は新生血管形成に関係する正常な生理学的症状の発生をモジュレートまたは防止するために使用することができる。本発明の方法を用いて、卵巣または内皮内のＰＥＤＦの存在。このように例えば本発明は出産制御に使用することができる。したがって、排卵、胚の着床、胎盤形成等に関係する新生血管形成を弱めることができる。
【００４１】
本発明の方法は新脈管形成に関係する疾患または障害の発生を防止する手段としても有用であり、すなわちこの方法は、疾患の危険性がある患者の疾患を防止するための予防法として有用である。例えば、そして限定するわけではないが、ＰＥＤＦは糖尿病患者の糖尿病網膜症の発生を防止するために、特定のガンの危険性があると知られている人にその特定のガンの発生を防止するため等に使用することができる。すなわち本発明の方法は、明白な疾患の処置に限定されると解釈するべきではなく、むしろ疾患の危険がある患者の疾患の防止に有用であると解釈すべきである。
【００４２】
本発明は、前ガン創傷、例えば限定するわけではないが特に嚢胞性線維症を有する患者における鼻のポリープの処置を含むと解釈すべきである。これらの患者の鼻のポリープは新脈管形成性であり、そしてさらに嚢胞性線維症患者の悩脊髄液は過剰な新脈管形成因子ＶＥＧＥを含む。特に嚢胞性線維症患者におけるこれらの症状の緩和は（ここで緩和はＰＥＤＦの投与を含んで成る）、したがって本発明の方法に含まれる。
【００４３】
本発明の方法の内容の中で、ＰＥＤＦは単独または他の既知の抗新脈管形成因子と一緒に供給することができる。例えばＰＥＤＦはインテグリン結合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）を遮断する抗体およびペプチド、メタロプロティナーゼを阻害するタンパク質および低分子（例えばマルミスタット：ｍａｒｍｉｓｔａｔ）、内皮細胞中でリン酸化カスケードを遮断する作用物質（例えばハーバマイシン：ｈｅｒｂａｍｙｃｉｎｅ）、新脈管形成の既知のインデューサーに関するドミナントネガティブ受容体、新脈管形成のインデューサーに対する抗体、あるいはそれらの活性を遮断する他の化合物（例えばスラミン：ｓｕｒａｍｉｎ）または他の手段により作用する他の化合物（例えばレチノイド、ＩＬ−５、インターフェロン等）と一緒に使用することができる。実際にそのような因子が新脈管形成を異なるメカニズムでモジュレートすると、他の抗新脈管形成物質と組み合わせてＰＥＤＦを使用することは所望の組織中で新脈管形成をより効力的に（しかも効力的に相乗的に）阻害することができる。ＰＥＤＦは１以上の他の抗新脈管形成因子と使用することができる。好ましくは少なくとも２種の抗新脈管形成因子をＰＥＤＦと一緒に使用してよい。
【００４４】
本明細書で検討するように、ＰＥＤＦは有力な因子である。すなわち１つのプロトコールでは、この方法は細胞にＰＥＤＦポリペプチドを供給することによりＰＥＤＦを提供することが含まれる（例えば適切な組成物中で）。本発明に使用するためのＰＥＤＦポリペプチドを得るために任意の適当な方法を使用することができる。多くの適切なＰＥＤＦポリペプチドは、ＰＥＤＦを自然に生産している組織から、または種々のＰＥＤＦ−生産細胞（例えば網膜芽腫細胞系 ＷＥＲ１２７）によりコンディショニングされた培地から精製することができる。例えばＰＥＤＦはすべての種類の筋肉、脾臓の巨核球、繊維芽細胞、腎臓管、大脳Ｐｕｒｋｉｎｊｅ細胞、毛包の毛脂（ｐｌｐｉｏｓｅｂａｃｅｏｕｓ）腺および網膜細胞により生産されることが知られている。自然に存在するＰＥＤＦの特に良好な供給源は、目から抽出される硝子体および水性体液である。これらのタンパク質抽出物（または他の供給源）からＰＥＤＦを精製するための１つのプロトコールは、３０ＫＤａの限外濾過膜を使用した濃縮／透析、続いて約６５％〜約９５％硫酸アンモニウムの範囲の沈殿、続いて０．５Ｍ メチル−α−マンノピラノシドでのレンチルレクチン セファロース カラム、続いてファルマシア（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ） ＨｉＴｒａｐヘパリンカラムから０．５Ｍ ＮａＣｌでの勾配／イソクラティック溶出による。ＰＥＤＦポリペプチドを精製するための他のプロトコールは、当該技術分野では既知である（例えば、公開された国際特許出願９５／３３４８０号および同第９３／２４５２９号明細書を参照にされたい）。配列番号１により表される自然なＰＥＤＦポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して約４５〜５０ｋＤａのタンパク質であると同定される。他のＰＡＧＥポリペプチドは標準的な直接ペプチド合成法を使用して合成することができる（例えば、固相合成（例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４；Ｂａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３０：７０５−７３９；および米国特許第５，４２４，３９８号明細書を参照にされたい）を介するような、Ｂｏｎｄａｎｓｚｋｙ，１９８４、ペプチド合成の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（スプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）出版、ハイデルベルグ）に要約されているような）。もちろんＰＡＧＥポリペプチドの遺伝子も既知であり（例えば公開された国際特許出願９５／３３４８０号および同第９３／２４５２９号明細書を参照にされたい）；そしてまたＧｅｎｅＢａｎｋ 寄託番号Ｕ２９９５３も参照にされたい）、あるいは本明細書で検討するポリペプチド配列から推定することができるので、ＰＥＤＦポリペプチドは標準的な組換えＤＮＡ法により生成することができる。
【００４５】
別のプロトコールでは、ＰＥＤＦポリペプチドはＰＥＤＦをコードする核酸を含む発現ベクターを問題の組織に付随する細胞に移すことにより、問題の組織に提供することができる。細胞はＰＡＧＥポリペプチドを、これが組織中の内皮細胞に適当に提供されてそれらの移動を阻害するように、すなわち目的の組織中の、または全身的に新脈管形成を弱めるように生産し、そして分泌する。ＰＥＤＦポリペプチドをコードする核酸配列は既知であり（例えば公開された国際特許出願第９５／３３４８０および同第９３／２４５２９号明細書を参照にされたい）；およびまたＧｅｎｅＢａｎｋ 寄託番号Ｕ２９９５３を参照にされたい）、そして他は本明細書で検討するポリペプチド配列から推定することができる。すなわちＰＥＤＦ発現ベクターは典型的には既知のＰＥＤＦ配列に相同的である単離された核酸配列を含み、例えばそれらは少なくとも軽度の緊縮条件下で、より好ましくは中度の緊縮条件下で、最も好ましくは高度な緊縮条件下で（軽度、中度および高度な緊縮に関する定義については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、１９８９、モレキュラークローニング：ア ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールドスプリングハーバー出版に説明されている通りである）、既知の配列の少なくとも１つのフラグメントにハイブリダイズする。
【００４６】
ＰＥＤＦをコードする核酸に加えて発現ベクターはプロモーターを含み、そして本発明の内容においては、プロモーターは細胞中でＰＥＤＦ遺伝子の発現を駆動することができなければならない。多くのウイルスプロモーターがそのような発現カセットでの使用に適当である（例えば、レトロウイルスＩＴＲｓ、ＬＴＲｓ、前初期ウイルスプロモーター（ＩＥｐ）（ヘルペスウイルスＩＥｐのような（例えばＩＣＰ４−ＩＥｐおよびＩＣＰ０−ＩＥｐ）、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥｐ）、および他のウイルスプロモーター（例えば後期ウイルスプロモーター、潜在−活性（ｌａｔｅｎｃｙ−ａｃｔｉｖｅ）プロモーター（ＬＡＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、およびネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）プロモーター））。他の適当なプロモーターは、エンハンサー配列を含む真核生物プロモーター（例えばウサギβ−グロビン調節配列）、構成的に活性なプロモーター（例えばβ−アクチンプロモーター等）、シグナルおよび／または組織特異的プロモーター（例えば、ＴＮＦまたはＲＵ４８６に反応性のプロモーターのような誘導性および／または抑制性プロモーター、メタロチオニンプロモーター等）、および腫瘍−特異的プロモーターである。
【００４７】
発現ベクターの中で、ＰＥＤＦ遺伝子およびプロモーターはプロモーターがＰＥＤＦ遺伝子の発現を駆動することができるように操作可能に連結される。この操作可能な連結が維持される限り、発現ベクターはインターナルリボソームエントリーサイト（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅｓ：ＩＲＥＳ）により分けられた同義遺伝子のような１以上の遺伝子を含むことができる。さらに発現ベクターは場合によりスプライス部位、ポリアデニレーション配列、転写調節要素（例えばエンハンサー、サイレンサー等）、または他の配列のような他の要素を含むことができる。
【００４８】
発現ベクターは、それらが中に含むＰＥＤＦをコードする単離された核酸を発現することができる様式で細胞中に導入されなければならない。任意の適当なベクターを採用することができ、それらの多くは当該技術分野では既知である。そのようなベクターの例には、裸のＤＮＡベクター（オリゴヌクレオチドまたはプラスミドのような）、アデノ−随伴ウイルスベクターのようなウイルスベクター（Ｂｅｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：９５−１０４）、アデノウイルスベクター（Ｂｅｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：Ｓ６８）、ヘルペスウイルスベクター（Ｆｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：２６５−２８７）、パッケージされたアンプリコン（Ｆｅｄｅｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１６３６−１６４０）、パピローマウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター、ポリオーマウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター、ワクシニアウイルスベクターおよびその他のベクターを含む。目的の発現ベクターに加えて、ベクターには例えば選択性マーカー（例えばβ−ｇａｌまたはトキシンに対する耐性を付与するマーカー）、薬理学的に活性なタンパク質、転写因子のような他の遺伝的要素、あるいは他の生物学的に活性な物質も含むことができる。
【００４９】
選択した任意のベクターは、真核細胞で大量に生産できなければならない。さらにベクターはＰＥＤＦ配列を含むか、または含まないいずれかの目的細胞に移されることができるように、ＰＥＤＦ配列を含まないベクターは対照ベクターとして役立つように構築できることが必要であり、ＰＥＤＦ配列を含むベクターは実験用または治療用ベクターである。ベクター核酸を操作するための方法は、当該技術分野では周知であり（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，同上を参照にされたい）、そして直接クローニング、レコンビナーゼを使用した部位特異的組換え、相同的組換え、および組換えベクターを構築するための他の適当な方法を含む。この様式で発現ベクターは任意の所望の細胞中で複製し、任意の所望の細胞中で発現することができ、そしてさらに任意の所望する細胞のゲノム中に組み込むことができるようになるように構築することができる。
【００５０】
ＰＥＤＦ発現ベクターはＤＮＡを細胞に移すために適当な任意の手段により細胞に導入される。多くのそのような方法が当該技術分野では周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，同上；またＷａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， 組換えＤＮＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ）、第１２章、第２版、サイエンティフィック アメリカン ブックス（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ）。このようにプラスミドは、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、リポソーム−媒介トランスフェクション、遺伝子銃、マイクロインジェクション、ウイルスキャプシド−媒介転移、ポリブレン−媒介転移、プロトプラスト融合等のような方法により移される。ウイルスベクターは細胞の直接的感染により細胞に最も良くに移される。しかし感染の様式はウイルスおよび細胞の厳密な性質に大変依存するかもしれない。
【００５１】
誘導性プロモーターの制御下でＰＥＤＦ遺伝子が移された細胞は、必要ならば一過性の形質転換体として本発明の方法で使用することができる。そのような細胞自体は次いで、哺乳動物にそこでの治療的利益のために移すことができる。典型的には細胞はその中で発現され、そしてそこから分泌するＰＥＤＦが新脈管形成を阻害するために所望の内皮細胞と接触するように、哺乳動物の部位に移される。あるいは特にベクターがインビトロで加えられた細胞の場合は、細胞を最初に数回のクローン選択にかけて（通常は、ベクター中の選択性マーカー配列の使用によりなされる）、安定な形質転換体を選択することができる。そのような安定な形質転換体は、次いで哺乳動物にそこでの治療的利益のために移される。
【００５２】
ＰＥＤＦはまた、ＰＥＤＦをコードする単離された核酸を含んで成るベクターを他の細胞群にトランスフェクトすることにより内皮細胞に提供することができ、これによりＰＥＤＦが他の細胞中で発現し、そしてそこから分泌する。そのようにトランスフェクトした他の細胞群は、次いでそのように分泌したＰＥＤＦが内皮細胞と接触し、そして新脈管形成を阻害する哺乳動物の部位に移される。他の細胞からのＰＥＤＦの発現および分泌は、次いで内皮細胞に利益をもたらす。ＰＥＤＦをコードするＤＮＡが細胞に安定に組み込まれる必要はない。ＰＥＤＦは細胞中の組み込まれていない、または組み込まれたＤＮＡから発現し、そして分泌され得る。
【００５３】
細胞内で、ＰＥＤＦ遺伝子は細胞がＰＥＤＦポリペプチドを発現し、そして分泌するよおに発現する。遺伝子の成功裏の発現は、標準的な分子生物学的技法を使用して評価することができる（例えばノーザンハイブリダイゼーション、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、酵素イムノアッセイ等）。トランスフェクトした細胞からのＰＥＤＦ遺伝子の発現およびＰＥＤＦの分泌を検出するための試薬は、当該技術分野では既知である（例えば、公開された国際特許出願第９５／３３４８０および同第９３／２４５２９号明細書を参照にされたい）；Ｓｔｅｅｌ ｅｔ ａｌ．，同上）。
【００５４】
目的の組織の場所に依存して、ＰＥＤＦは目的とする組織内の内皮細胞にＰＥＤＦを提供するための任意の適当な様式で供給することができる。すなわち例えばＰＥＤＦの供給源（すなわち本明細書に記載するようなＰＥＤＦポリペプチドまたはＰＥＤＦ発現ベクター、またはＰＥＤＦを発現する細胞）を有する組成物を全身性の循環に導入することができ、これは目的の組織にＰＥＤＦの供給源を分布するだろう。あるいはＰＥＤＦの供給源を含有する組成物は、目的の組織に局所的に適用することができる（例えば注射、または連続注入としてのポンプ送液、あるいは腫瘍内またはガン内部または皮下部位へのボーラスとして、皮膚表面のすべてまたは一部への適用、目の表面上への滴下等）。
【００５５】
ＰＥＤＦの供給源がＰＥＤＦポリペプチド（例えば適当な組成物中の）である場合、組織中の新脈管形成を阻害するために十分な濃度および時間で提供される。
【００５６】
新脈管形成の阻害は一般に、新しい血管が新芽を発生するか、または循環している幹細胞が到着し、そして続いて内皮細胞に分化するかにかかわらず新しい血管の発生を停止することと考えられる。しかしＰＥＤＦは活性化された内皮細胞のアポトーシスを誘導することができるので、本発明との関連で新脈管形成の阻害はＰＥＤＦによる細胞の、特に腫瘍の新脈管形成因子により活性化された時、腫瘍近く、またはその中の既存の血管中の細胞の死亡を誘導することと解釈するべきである。すなわち本発明の内容の中で、新脈管形成の阻害は新規血管の発生の阻害を含むと解釈するべきであり、この阻害は同時に近くの既存の血管を破壊してもしなくてもよい。
【００５７】
ＰＥＤＦが自然に生産される場合、ＰＥＤＦは約２５０ｎＭもの高さの濃度で存在することができる。ＰＥＤＦは非毒性であるので、より高濃度の状態で組織に供給することができる。しかしＰＥＤＦの効力を仮定すると、本発明の方法では約１０ｎＭ未満のようなさらに低濃度（例えばわずか０．０１ｎＭ）で使用することができる。実際に幾つかのプロコールでは、約２ｎＭ ＰＥＤＦ未満で新脈管形成および内皮細胞の移動を効果的に阻害する。タンパク質を含んで成る組成物の配合に依存して、ＰＥＤＦは所望する組織中で新脈管形成を遅らせるために十分なタイムコースにわたり供給される。プロトコールによっては（例えばＰＥＤＦが皮膚または目の表面に供給される場合）、繰り返し適用することが抗新脈管形成効果を強化し、そして幾つかの適用では必要となるかもしれない。ＰＥＤＦの供給源がＰＥＤＦ発現ベクターである場合、ＰＥＤＦを発現する細胞は効果的な（すなわち組織中の新脈管形成を阻害するために十分な）量のタンパク質を生産する。
【００５８】
本発明の方法を行うために、本発明はＰＥＤＦの供給源および適当な希釈剤を含んで成る薬理学的組成物を提供する。ＰＥＤＦの供給源に加えて、組成物には１以上の薬理学的に許容されるキャリアーを含む希釈剤を含む。本発明に従い使用するための医薬組成物は、賦形剤を含んで成る１以上の薬理学的または生理学的に許容されるキャリアー、ならびに製薬的に使用することができる調製物への活性化合物の加工を容易にする任意の補助剤を使用して、通常の様式で配合することができる。適切な配合は選択する投与の経路に依存する。すなわち例えば全身注射には、ＰＥＤＦの供給源は水溶液、好ましくは必要に応じてポリエチレングリコールのような安定化剤を含んでもよい生理学的に適合性のあるバッファーに配合することができる。粘膜を介する（ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ）投与には、浸透するべきバリアーに対して適当な浸透剤を製剤中に使用する。そのような浸透剤は一般に当該技術分野では知られている。経口投与には、ＰＥＤＦの供給源は錠剤、ピル、ドラジェ、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、リポソーム、懸濁液等に包含するための適当なキャリアーと組み合わせることができる。吸入による投与には通常、ＰＥＤＦ供給源は適当な推薬を使用した加圧パックまたはネブライザーからエアゾール噴霧による提供の状態で送達される。ＰＥＤＦの供給源は注射、例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与用に配合することができる。そのような組成物は油性または水性賦形剤中の懸濁液、溶液または乳液のような状態をとることができ、そして沈殿防止剤、安定化剤および／または分散剤のような配合剤を含むことができる。皮膚への適用には、ＰＥＤＦの供給源は適当なゲル、マグマ、クリーム、軟膏または他のキャリアーに配合することができる。目への適用には、ＰＥＤＦの供給源は水溶液、好ましくは生理学的に適合性のあるバッファーに配合することができる。ＰＥＤＦの供給源は、当該技術分野で既知であるような他の医薬組成物中に配合することもできる。医薬組成物および製剤の詳細な考察は、本明細書のいたるところに提供する。
【００５９】
腫瘍の中にはＰＥＤＦが低下しているか、または存在しないものもあることが知られているので、本発明は腫瘍内のＰＥＤＦの存在をアッセイすることにより腫瘍の予後を評価する方法も提供する。この方法には腫瘍から組織または流体を得、そして組織または流体中のＰＥＤＦの存在または不存在を検出することを含む。組織または流体は、例えば尿、血漿、血清または硝子体液もしくは水性体液であることができる。腫瘍中のＰＥＤＦ濃度が高いほど、腫瘍が新脈管形成を受ける可能性は低い相関にある。すなわち腫瘍中のより高いＰＥＤＦ濃度は腫瘍形成の比較的初期の段階の指標であり、したがって楽観的指標である。逆に所定の腫瘍中のＰＥＤＦの不存在は、あるいは低レベルのＰＥＤＦの存在は、腫瘍形成がより進んだ段階の指標である。本明細書で言うＰＥＤＦレベルの高い、または低いとは、正常な問題としている疾患を持たない良い個体から得た同一組織中のＰＥＤＦレベルと比較している。
【００６０】
ＰＥＤＦレベルの評価は、ＰＥＤＦ遺伝子発現をレベルを評価するアッセイを使用して行うことができる（例えば、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンハイブリダイゼーション、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション等）。あるいは分泌したＰＥＤＦの存在は免疫学的アッセイ、ＰＥＤＦ精製アッセイまたはＰＡＧＥ分析等により測定することができる）。そのような腫瘍中のＰＥＤＦの存在を検出するための試薬は、当該技術分野では既知である（例えば、公開された国際特許出願第９５／３３４８０および同第９３／２４５２９号明細書を参照にされたい）。
【００６１】
本発明はまた、本発明のペプチド組成物および哺乳動物の細胞または組織に組成物を外膜的に投与することを記載する使用説明書を含んで成るキットも含む。別の態様では、このキットは化合物を哺乳動物に投与する前に、本発明の組成物を溶解または懸濁するために適する（好ましくは滅菌）溶媒を含んで成る。上記のすべてに加え、本発明は細胞中の内因性ＰＥＤＦの発現を調節する方法も含むと解釈すべきである。例えば、細胞に一過性の高酸素を誘導することにより細胞中でのＰＥＤＦ生産をアップレギュレートすることが可能である。そのような処置は新脈管形成のインデューサーをダウンレギュレートする付加的利点を有する。本発明は本明細書に記載する処置の各モダリティーに対してこの方法を応用することを含むと解釈すべきである。
定義
本明細書で使用する以下の各用語は、この章にあるその用語に関連する意味を有する。
【００６２】
冠詞“ａ”および“ａｎ”は、本明細書では１または１より多い（すなわち少なくとも１つの）冠詞の文法的目的語を指す。例として“ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ”は、１つの要素または１以上の要素を意味する。
【００６３】
本明細書で使用する用語「隣接する」とは、介在するヌクレオチドを持たない、互いに直接付いているヌクレオチド配列を称する。例として２つが５’−ＡＡＡＡＡＴＴＴ−３’または５’−ＴＴＴＡＡＡＡＡ−３’のように連結している時、ペンタヌクレオチド５’−ＡＡＡＡＡ−３’はトリヌクレオチド５’−ＴＴＴ−３’に隣接するが、２つが５’−ＡＡＡＡＡＣＴＴＴ−３’のように連結している時は隣接していない。
【００６４】
本明細書で使用する「症状を緩和する」とは、症状の重篤度を減少することを意味する。
【００６５】
本明細書で使用するアミノ酸は、以下の表に示すようにそれらの完全な名前により、それらに対応する三文字暗号により、またはそれらに対応する一文字暗号により表す：
【００６６】
【表１】
2004516001.tif 000002
【００６７】
遺伝子の「コード領域」は、遺伝子の転写により生成されるｍＲＮＡ分子のコード領域にそれぞれ相同的または相補的である遺伝子のコード鎖のヌクレオチド残基および遺伝子の非コード鎖のヌクレオチドから成る。
【００６８】
遺伝子の「ｍＲＮＡ−コード領域」は、遺伝子の転写により生成されるｍＲＮＡ分子のコード領域にそれぞれ相同的または相補的である遺伝子のコード鎖のヌクレオチド残基および遺伝子の非コード鎖のヌクレオチド残基から成る。真核細胞中の特定の場合に起こるｍＲＮＡプロセッシングにより、遺伝子のｍＲＮＡコード領域はゲノム中に生じる遺伝子中に互いに分かれた１つの領域または複数の領域を含んで成る。遺伝子のｍＲＮＡコード領域がゲノム中で分かれた領域を含んで成る場合、「ｍＲＮＡコード領域」は、これらの領域の両方を個別に、または集合的に称する。
【００６９】
本明細書で使用する「相補的」とは、２つの核酸、例えば２つのＤＮＡ分子の間のサブユニット配列の相補性といった広い概念を称する。両分子中のヌクレオチド位が互いに正常に対合することができるヌクレオチドにより占められている場合、核酸はこの位置で互いに相補的であると考えられる。すなわち２つの核酸は、各分子中で実質的な数（少なくとも５０％）の対応する位置が、互いに正常に塩基対合するヌクレオチド（例えばＡ：ＴおよびＧ：Ｃヌクレオチド対）により占められている時、互いに相補的である。
【００７０】
「疾患」とは動物が恒常性を維持することができない動物の健康状態であり、そして疾患が改善しない場合、動物の健康状態は悪化し続ける。疾患は、疾患の症状の重篤度、患者が経験するそのような症状の頻度、またはその両方が減少する場合、「緩和」する。
【００７１】
「コードする」とは、定めたヌクレオチド配列（すなわちｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）または定めたアミノ酸配列およびそれらから生じる生物学的特性を有する、生物学的プロセスにおいて他のポリマーおよび高分子の合成のために鋳型として役立つ遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡのようなポリヌクレオチド中の特異的なヌクレオチド配列の固有の特性を称する。すなわち遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生物学的系中でタンパク質を生産する場合、タンパク質をコードする。遺伝子またはｃＤＮＡの転写の鋳型として使用するコード鎖（ｍＲＮＡ配列と同一であり、そして通常は配列表に提供されるヌクレオチド配列）、および非コード鎖は、タンパク質または遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の生成物をコードすると言うことができる。
【００７２】
特に言及しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重変更体であり、そして同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はイントロンを含んでもよい。
【００７３】
本明細書で使用する「相同的な」とは、２つのポリマー分子間、例えば２つの核酸分子間、例えば２つのＤＮＡ分子または２つのＲＮＡ分子、あるいは２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列の類似性を称する。２つの分子の両方のサブユニット位が同じ単量体サブユニットで占められている時、例えば２つの各ＤＮＡ分子の位置がアデニンで占められているならば、それらはその位置で相同的である。２つの配列間の相同性は、対合または相同的な位置の数の直接的関数であり、例えば２つの化合物の配列中の位置の半分（例えば１０個のサブユニット長のポリマーの５つの位置）が相同的であるならば、２つの配列は５０％相同的であり、位置の９０％（例えば１０のうちの９）が対合するかまたは相同的ならば、２つの配列は９０％の相同性を共有する。例として、ＤＮＡ配列３’ＡＴＴＧＣＣ５’および３’ＴＡＴＧＧＣは、５０％の相同性を共有する。
【００７４】
本明細書で使用する「相同性」は、「同一性」と同義語的に使用される。
【００７５】
２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性の測定は、数学的アルゴリズムを使用して行うことができる。例えば２つの配列を比較するために有用な数学的アルゴリズムは、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７）により修飾されたＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−５８７７）のアルゴリズムである。このアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ（１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに包含されており、そして例えばバイオテクノロジー情報に関する国立センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ＮＣＢＩ）のユニバーサル リソース ロケーター“ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／”を有する世界的ウェッブサイトでアクセスすることができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド調査は、以下のパラメーターを使用してＮＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩウェッブサイトでは“ｂｌａｓｔｎ”と命名されている）で行うことができる：本明細書に記載する核酸に相同的なヌクレオチド配列を得るために、ギャップペナルティ＝５；ギャップエクステンションペナルティ＝２；ミスマッチペナルティ＝３；マッチリワード＝１；期待値１０．０；およびワードサイズ＝１１。ＢＬＡＳＴタンパク質調査は、以下のパラメーターを使用してＸＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩウェッブサイトでは“ｂｌａｓｔｎ”と命名されている）またはＮＣＢＩ“ｂｌａｓｔｐ”プログラムで行うことができる：本明細書に記載するタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列を得るために、期待値１０．０、ＢＬＯＳＵＭ６２ スコアリングマトリックス。比較を目的としてギャップのある整列を得るためには、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴをＡｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ（１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）に記載されているように利用することができる。あるいはＰＳＩ−ＢｌａｓｔまたはＰＨＩ−Ｂｌａｓｔを使用して、分子（Ｉｄ．）間の明確な関係および共通のパターンを共有する分子間の関係を検出する反復調査を行うことができる。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢｌａｓｔおよびＰＨＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する時、各プログラムのデホルトパラメーター（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）を使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照にされたい。
【００７６】
２つの配列間のパーセント同一性は、ギャプを用いて、または用いずに上記の技法に類似する技法を使用して測定することができる。パーセント同一性の算出には、典型的に厳密な対合がカウントされる。
【００７７】
本明細書で使用する「使用説明書」は、本発明の組成物のその指定する用途についてその有用性を分かつために使用することができる公報、記録、図表または任意の他の表現媒体を含む。例えば本発明のキットの使用説明書は、組成物を含む容器に付けられているか、または組成物を含む容器と一緒に輸送されてもよい。あるいは使用説明書は、使用説明書および組成物が受容者により連携して使用されることを意図して容器とは別に輸送されてもよい。
【００７８】
「単離された核酸」とは、自然に存在する状態ではそれを挟む配列から分離された核酸セグメントまたはフラグメントを称し、例えば自然に存在するゲノム中のフラグメントに隣接する配列である、例えばフラグメントに通常は隣接する配列から取り出されたＤＮＡフラグメントを称する。この用語はまた、核酸に自然に付随する他の成分、例えば細胞中で自然に付随するＲＮＡまたはＤＮＡまたはタンパク質から実質的に精製された核酸にも適用する。したがってこの用語は、ベクター中に、自律複製プラスミドまたはウイルス中に、あるいは原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡ中に取り込まれた組換えＤＮＡ、あるいは他の配列から独立して分かれた分子として存在するもの（例えばｃＤＮＡもしくはゲノムまたはＰＣＲもしくは制限酵素消化により生産されたｃＤＮＡフラグメント）も含む。これはまたさらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含む。
【００７９】
２つのポリヌクレオチドを「操作可能に連結する」という記載は、２つのポリヌクレオチドの少なくとも１つが生理学的効果を発揮することができ、これにより他方が特性付けられるような様式で核酸分子中に配列された２つのポリヌクレオチドを含んで成る１本鎖または２本鎖核酸部分を意味する。例として、遺伝子のコード領域に操作可能に連結されたプロモーターはコード領域の転写を促進することができる。
【００８０】
「ポリヌクレオチド」とは、核酸の１本鎖、または平行もしくは反平行鎖を意味する。すなわちポリヌクレオチドは、１本鎖または２本鎖核酸のいずれかでよい。
【００８１】
用語「核酸」は、典型的には大きなポリヌクレオチドを称する。
【００８２】
用語「オリゴヌクレオチド」は、典型的には短いポリヌクレオチドを称し、一般に約５０ヌクレオチド以下である。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列により表される時（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）、これはまた“Ｔ”を“Ｕ”に置き換えたＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）を含む。
【００８３】
ポリヌクレオチド配列を記載するために、本明細書では通常の表記を使用する：１本鎖ポリヌクレオチド配列の左手末端は５’−末端である；２本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は５’−方向と称する。
【００８４】
新生ＲＮＡ転写物へのヌクレオチドの５’から３’方向への付加は、転写方向と称する。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖は「コード鎖」と称する；ＤＮＡ上の示す点より５’に位置するＤＮＡ鎖上の配列は「上流配列」と称する；ＤＮＡ上の示す点より３’のＤＮＡ鎖上の配列は「下流配列」と称する。
【００８５】
本明細書で使用するように、用語「プロモーター／調節配列」とは、プロモーター／調節配列に操作可能に連結された遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を意味する。場合によりこの配列はコアプロモーター配列でよく、そして他の場合ではこの配列は、遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列および他の調節要素を含んでもよい。プロモーター／調節配列は、例えば組織特異的様式で遺伝子産物を発現するものでよい。
【００８６】
「構成的プロモーターは、細胞中で一定の様式で、操作可能に連結した遺伝子の発現を駆動するプロモーターである。例として細胞のハウスキーピング遺伝子の発現を駆動するプロモーターは、構成的プロモーターであると考えられる。
【００８７】
「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドに操作可能に連結した時、細胞中にプロモーターに対応するインデューサーが存在する時にのみ遺伝子産物が生きている細胞中で実質的に生産されるようにするヌクレオチド配列である。
【００８８】
「組織特異的」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドに操作可能に連結した時、細胞がプロモーターに対応する組織型の細胞である時にのみ遺伝子産物が生きている細胞中で実質的に生産されるようにするヌクレオチド配列である。
【００８９】
少なくとも約７５％、そして好ましくは少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％相補的なオリゴヌクレオチドのみが互いにアニールする条件下で２つのオリゴヌクレオチドがアニールする場合、第１のオリゴヌクレオチドは第２のオリゴヌクレオチドに、「高い緊縮度で」アニールする。２つのオリゴヌクレオチドをアニールするために使用する条件の緊縮度は、因子の中でもアニーリング媒質の温度、イオン強度、インキューベーション時間、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドのＧ−Ｃ含量、および分かっている場合は２つのオリゴヌクレオチド間の予想される非−相同性の程度の関数である。アニーリング条件の緊縮度を調整する方法は既知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、１９８９、モレキュラークローニング：ア ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨークを参照にされたい）。
【００９０】
用語「実質的に純粋」とは、自然に付随する成分から分離された化合物、例えばタンパク質またはポリペプチドを言う。典型的には、化合物はサンプル中の全材料の少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９９％（容量によりか、湿潤重量または乾燥重量によるか、またはモルパーセントまたはモル画分による）が目的とする化合物である時に実質的に純粋である。純度は任意の適当な方法、例えばポリペプチドの場合はカラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析により測定することができる。化合物、例えばタンパク質も、それが自然に付随する成分を本質的に含まない時、あるいはそれが自然な状態で付随する天然の混入物から分離されている時に実質的に精製されている。
【００９１】
本明細書で使用する「実質的に純粋な核酸」は、それを自然に存在する状態で挟んでいる配列から精製された核酸配列、セグメントまたはフラグメント、例えば通常、フラグメントに隣接する配列、例えばＤＮＡが自然に存在するゲノム中のフラグメントに隣接する配列から取り出されたＤＮＡフラグメントを称する。この用語はまた、自然に核酸に付随する他の成分、例えば細胞中で核酸に自然に付随するＲＮＡまたはＤＮＡまたはタンパク質から実質的に精製された核酸にも適用する
「予防的」処置とは、疾患に関係する病状を発症する危険性を下げる目的で、疾患の兆候を表さないか、または疾患の初期の兆候のみを現す個体に投与する処置である。
【００９２】
「治療的」処置とは、病状の兆候を下げるか、または排除する目的で、病状の兆候を現す個体に投与する処置である。
【００９３】
「治療に効果的な量」の化合物は、化合物を投与する個体に有益な効果を提供するために十分な化合物の量である。「ベクター」は単離された核酸を含んで成り、そして単離された核酸を細胞内部に送達するために使用することができる物質の組成物である。多数のベクターが当該技術分野では知られており、それらには限定するわけではないが、直線状ポリヌクレオチド、イオン性または両イオン性化合物を付随するポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスが含まれる。すなわち用語「ベクター」には、自律複製プラスミドまたはウイルスを含む。この用語は、例えばポリリシン化合物、リポソーム等のような核酸を細胞に移し易くする非プラスミドおよび非ウイルス化合物も含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例には、限定するわけではないがアデノウイルスベクター、アデノ−随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター等を含む。
【００９４】
「発現ベクター」には、発現するヌクレオチド配列に操作可能に連結された発現制御配列を含んで成る組換え体ポリヌクレオチドを含んで成るベクターを称する。発現ベクターは発現に関して十分にシスに作用する要素を含んで成り；発現に関する他の要素は宿主細胞またはインビトロ発現系により供給することができる。発現ベクターには、コスミド、プラスミド（例えば裸の、またはリポソームに含まれた）、および組換え体ポリヌクレオチドに組み込まれたウイルスのような当該技術分野で既知のこれらすべてを含む。
ペプチドの修飾および合成
以下の章はペプチドの修飾およびそれらの合成に関する。もちろん本発明の方法に有用なペプチドは活性に影響することなく修飾されたアミノ酸残基を包含してよい。例えば末端はブロッキング基、すなわちＮ−およびＣ−末端を「望ましくない分解」（この用語は、化合物の機能に影響を及ぼす可能性がある化合物のその末端での任意の種類の酵素的、化学的または生化学的分解、すなわち化合物のそれらの末端での連続分解を包含することを意味する）から保護し、かつ／または安定化するために適当な化学的置換基を含むように誘導化することができる。
【００９５】
ブロッキング基には、ペプチドのインビボ活性に悪い影響を及ぼさないペプチド化学の分野で通常に使用されている保護基を含む。例えば適当なＮ−末端ブロッキング基は、Ｎ−末端のアルキル化またはアシル化により導入することができる。適当なＮ−末端ブロッキング基の例には、Ｃ１−Ｃ５分枝または非分枝アルキル基、ホルミルおよびアセチル基のようなアシル基、ならびにアセトアミドメチル（Ａｃｍ）基のようなそれらの置換形を含む。アミノ酸のデスアミノ同族体も有用なＮ−末端ブロッキング基であり、そしてペプチドのＮ−末端にカップリングするか、またはＮ−末端残基の代わりに使用することができる。Ｃ−末端のカルボキシル基が含まれているか、またはいないいずれかの適当なＣ−末端ブロッキング基には、エステル、ケトンまたはアミドを含む。エステルまたはケトンを形成するアルキル基、特にメチル、エチルおよびプロピルのような低級アルキル基、および１級アミン（−ＮＨ２）のようなアミドを形成するアミノ基、およびメチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルエチルアミノ等のようなモノ−およびジ−アルキルアミノ基は、Ｃ−末端ブロッキング基の例である。アグマチン（ａｇｍａｔｉｎｅ）のようなデスカルボキシル化アミノ酸同族体も有用なＣ−末端ブロッキング基であり、そしてペプチドのＣ−末端残基にカップリングするか、またはそれに代えて使用することができる。さらに末端の遊離アミノおよびカルボキシル基をペプチドから一緒に除去して、ペプチドの活性に影響を及ぼさずにそれらのデスアミノおよびデスカルボキシル化形態を得ることができると考えられる。
【００９６】
他の修飾もペプチドの生物活性に悪い影響を及ぼさずに包含することができ、これらには限定するわけではないが、１以上の自然なＬ−異性体のアミノ酸をＤ−異性体のアミノ酸に置換することを含む。すなわちペプチドは１以上のＤ−アミノ酸残基を含んでもよく、あるいはすべてがＤ−形であるアミノ酸を含んで成ってもよい。本発明によるペプチドのレトロ−インベルソ形、例えばすべてのアミノ酸がＤ−アミノ酸形に置換された逆転ペプチドも意図する。
【００９７】
本発明の酸付加塩は、機能的均等物と意図する。すなわち本発明のペプチドは、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸、または酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、蓚酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、シンナミン、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸等のような有機酸で処理して、本発明の方法での使用に適するペプチドの水溶性塩を提供する。
【００９８】
本発明はまた、本明細書に開示する核酸によりコードされるタンパク質またはペプチドの同族体を提供する。同族体は、保存的アミノ酸配列の差異により、または配列に影響しない修飾により、または両方により自然に存在するタンパク質またはペプチドとは異なることができる。
【００９９】
例えば保存的アミノ酸の変化を行うことができ、これはタンパク質またはペプチドの１次配列を改変するが、通常その機能は改変しない。保存的アミノ酸置換は、典型的には以下の群内の置換を含む：
グリシン、アラニン；
バリン、イソロイシン、ロイシン；
アスパラギン酸、グルタミン酸；
アスパラギン、グルタミン；
セリン、トレオニン；
リシン、アルギニン；
フェニルアラニン、チロシン。
【０１００】
上記のように、修飾（通常は１次配列を改変しない）は、ポリペプチドのインビボまたはインビトロの化学的誘導化、例えばアセチル化またはカルボキシル化を含む。またグリコシレーションの修飾、例えばポリペプチドの合成およびプロセッシングまたはさらなるプロセッシング工程中にグリコシル化パターンを修飾することにより作られるもの；例えばポリペプチドをグリコシル化に影響を及ぼす酵素（例えば哺乳動物のグリコシル化または脱グリコシル化酵素）に暴露することによるものを含む。またリン酸化アミノ酸残基、例えばホスホチロシン、ホスホセリンまたはホスホトレオニンを有する配列も含む。
【０１０１】
また、タンパク質溶解的分解に対するそれらの耐性を改善するために、または溶解性を至適化するために、または治療薬としてより適するようにするために、通例の分子生物学的技法を使用して修飾したポリペプチドを含む。そのようなポリペプチドの同族体には、自然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基、例えばＤ−アミノ酸または自然には存在しない合成アミノ酸を含有するものを含む。本発明のペプチドは本明細書に記載する具体的な例示法の生成物に限定されない。
【０１０２】
本発明のペプチドは、Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌにより固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、第２版、１９８４、ピアス化学社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ロックフォード、イリノイ州に記載されているように；およびＢｏｎｄａｎｓｚｋｙ ａｎｄ Ｂｏｎｄａｎｓｚｋｙによりペプチド合成の実際（Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、１９８４、スプリンガー出版、ニューヨークに記載されているように、標準的な十分に確立された固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により容易に調製することができる。最初に、適当に保護されたアミノ酸残基を、そのカルボキシル基を通して架橋結合したポリスチレンまたはポリアミド樹脂のような誘導化された不溶性のポリマー性支持体に付ける。「適当に保護された」とは、アミノ酸のα−アミノ基上の、および任意の側鎖官能基上の両方の保護基の存在を言う。側鎖保護基は一般に合成を通じて使用する溶媒、試薬および反応条件に対して安定であり、そして最終的なペプチド生成物に影響を与えない条件下で除去することが可能である。オリゴペプチドの段階的合成は、最初のアミノ酸からＮ−保護基の除去により行い、そしてそれに所望するペプチドの配列中の次のアミノ酸のカルボキシル末端をカップリングさせる。このアミノ酸も適当に保護される。入って来るアミノ酸のカルボキシルを活性化し、支持体に結合しているアミノ酸のＮ−末端と、カルボジイミド、対称酸無水物またはヒドロキシベンゾトリアゾールまたはペンタフルオロフェニルエステルのような「活性エステル」基の形成のような反応性基の形成により反応させることができる。
【０１０３】
固相ペプチド合成法の例には、α−アミノ保護基としてｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルを利用するＢＯＣ法、およびアミノ酸残基のα−アミノを保護するために９−フルオレニルメチルオキシカルボニルを利用するＦＭＯＣ法を含み、その両方法が当業者には周知である。
【０１０４】
Ｎ−および／またはＣ−ブロッキング基の取り込みは、固相ペプチド合成法に通例なプロトコールを使用して行うこともできる。Ｃ−末端ブロッキング基を取り込むためには、例えば所望のペプチド合成を典型的には固相として、樹脂からの開裂が所望のＣ−末端ブロッキング基を有するペプチドを生じるように、化学的に修飾された支持体樹脂を使用して行う。Ｃ−末端が１級アミノブロッキング基を持つペプチドを提供するために、例えば合成はｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂を使用して、ペプチド合成が終了した時、塩酸を用いた処理により所望するＣ−末端がアミド化されたペプチドを放出するように行う。同様にＣ−末端でのＮ−メチルアミンブロッキング基の取り込みは、Ｎ−メチルアミノエチル−誘導化ＤＶＢ、ＨＦ処理でＮ−メチルアミド化Ｃ−末端を持つペプチドを放出する樹脂を使用して行う。エステル化によるＣ−末端のブロッキングも、通例の手順を使用して達成することができる。これにより樹脂から側鎖ペプチドの放出を可能とする樹脂／ブロッキング基の組み合わせの使用を伴い、引き続き所望するアルコールを用いた処理でエステル官能基の形成を可能とする。メトキシアルコキシベンジルアルコールまたは均等なリンカーで誘導化されたＤＶＢ樹脂と組み合わせたＦＭＯＣ保護基をこの目的に使用することができ、支持体からの開裂はジクロロメタン中のＴＦＡにより行う。適当に活性化されたカルボキシル官能基の例えばＤＣＣを用いたエステル化は、所望のアルコールの添加、続いて脱保護、そしてエステル化ペプチド生成物の単離により進めることができる。
【０１０５】
Ｎ−末端ブロッキング基の取り込みは、例えば適当な無水物およびニトリルを用いた処理により合成するペプチドが樹脂に付いている間に行うことができる。例えばＮ−末端にアセチルブロッキング基を取り込むために、樹脂にカップリングしたペプチドをアセトニトリル中の２０％無水酢酸で処置することができる。Ｎ−ブロッキングしたペプチド生成物は次に樹脂から開裂し、脱保護し、そして引き続いて単離することができる。
【０１０６】
化学的または生物学的合成法のいずれかから得たペプチドが所望するペプチドであることを確認するために、ペプチド組成の分析を行うべきである。そのようなアミノ酸組成分析は高解像マススペクトロメトリーを使用して行い、ペプチドの分子量を決定することができる。あるいは、または加えて、ペプチドのアミノ酸含量を水性の酸中でペプチドを加水分解し、そして分離し、同定し、そしてＨＰＬＣを使用して、あるいはアミノ酸分析機使用して混合物の成分を定量することにより確認することができる。ペプチドを連続的に分解し、そして順序正しくアミノ酸を同定するタンパク質シークエネーターも、ペプチド中の配列を明らかに定めるために使用することができる。
【０１０７】
本発明の方法で使用する前に、ペプチドは精製して混入物を除去する。これに関して、ペプチドは適切な管理会社により設定された標準に合うように精製されると思われる。多数の通例の精製手順の１つを使用して、必要な純度のレベルに達することができ、それらの方法には例えばＣ４−、Ｃ８−またはＣ１８−シリカのようなアルキル化シリカカラムを使用する逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む。有機含量を上げる勾配移動相、例えば通常は少量のトリフルオロ酢酸を含有する水性バッファー中のアセトニトリルを一般に精製に使用する。イオン−交換クロマトグラフィーもそれらの電荷に基づきペプチドを分離するために使用することができる。
医薬組成物
本明細書に記載する任意の方法を使用して同定される化合物は配合され、そして本明細書に開示する疾患の処置に哺乳動物に投与することができることを今、記載する。
【０１０８】
本発明は、有効成分として本発明の方法に有用な化合物を含んで成る医薬組成物の調製および使用を包含する。そのような医薬組成物は個体に投与するための適当な形態中に有効成分単独で成るか、または医薬組成物は有効成分および１以上の医薬的に許容されるキャリアー、１以上のさらなる成分、またはこれらの組み合わせを含んで成ることができる。有効成分は当該技術分野で周知であるように、生理学的に許容されるカチオンまたはアニオンと組み合わせるような、生理学的に許容されるエステルまたは塩の状態で医薬組成物中に存在することができる。
【０１０９】
本明細書で使用するように用語「医薬的に許容されるキャリアー」とは、有効成分と組み合わせられ、そして組み合わせた後に個体に有効成分を投与するために使用することができる化学組成物を意味する。
【０１１０】
本明細書で使用するように用語「生理学的に許容される」エステルまたは塩とは、医薬組成物中の他の成分と適合性がある有効成分のエステルまたは塩の状態を意味し、これは組成物が投与される個体に対して有害ではない。
【０１１１】
本明細書に記載する医薬組成物の製剤は薬理学の分野で既知の、またはこれから開発される任意の方法により調製することができる。一般にそのような調製法には、有効成分をキャリアーまたは１以上の他の補助成分と合わせ、そして次いで必要または望む場合は、生成物を所望の単−または多−投薬用量単位に成形または包装する工程を含む。
【０１１２】
本明細書で提供される医薬組成物の記載は、原理的にはヒトに医師の処方に基づき投与するために適する医薬組成物を対象とするが、当業者はそのような組成物がすべての種類の動物への投与に一般に適当であると理解するだろう。組成物を種々の動物への投与に適するようにするために、ヒトへの投与に適する医薬組成物の修飾は十分に理解されており、そして標準的な技術を持つ獣医薬理学者は、必要ならば実験を行い、単に日常的なそのような修飾を計画し、そして行うことができる。本発明の医薬組成物の投与が意図される個体は、限定するわけではないが、ヒトおよび他の霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコおよびイヌのような商業的に意味のある哺乳動物、ニワトリ、アヒル、ガチョウおよび七面鳥を含む商業的に意味のある鳥である。
【０１１３】
本発明の方法に有用な医薬組成物は、経口、直腸、膣、非経口、肺、鼻内、頬面、目内、気管内または投与の他の経路に適する形態に調製、包装、そして販売することができる。他の意図する製剤には、放出される（ｐｒｏｊｅｃｔｅｄ）ナノ粒子、リポソーム調製物、有効成分を含有する再封（ｒｅｓｅａｌｅｄ）赤血球、および免疫学に基づく製剤を含む。
【０１１４】
本発明の医薬組成物は、単位投薬用量として、または複数の単位投薬用量として調製、包装、またはバルクで販売されることができる。本明細書で使用する「単位投薬用量」とは、予め定めた量の有効成分を含んで成る医薬組成物の別個の量である。有効成分の量は一般に、個体に投与される有効成分の投薬用量に等しいか、あるいは例えばそのような投薬用量の半分または３分の１のような投薬用量の便利な画分である。
【０１１５】
本発明の医薬組成物中の有効成分、医薬的に許容されるキャリアーおよびさらなる成分の相対的量は、処置する個体の同一性、サイズ、および状態に依存して、およびさらに組成物が投与される経路に依存して変動するだろう。例として組成物は０．１％から１００（重量／重量）％の間の有効成分を含んで成ることができる。
【０１１６】
有効成分に加えて、本発明の医薬組成物はさらに１以上の付加的な医薬的に活性な作用物質を含んで成ることができる。特に意図する付加的な作用物質にはシアニドおよびシアネートスカベンジャーのような制吐薬およびスカベンジャーを含む。
【０１１７】
本発明の医薬組成物の制御された、または徐放性の製剤は、通例の技法を使用して作ることができる。
【０１１８】
経口投与に適する本発明の医薬組成物の製剤は、限定するわけではないが各々が予め定めた量の有効成分を含有する錠剤、硬質または軟質カプセル、カシェ剤、トローチまたはロゼンジを含む別々の固体の用量単位の状態で調製、包装または販売されることができる。経口投与に適する他の製剤は、限定するわけではないが粉末化または粒状製剤、水性または油性懸濁液、水性または油性溶液または乳液を含む。
【０１１９】
本明細書で使用するように、「油性」液体は炭素を含有する液体分子を含んで成り、そして水よりも低い極性を現すものである。
【０１２０】
有効成分を含んで成る錠剤は、例えば場合により１以上のさらなる成分と共に有効成分を圧縮または成型することにより作ることができる。圧縮錠剤は、適当なデバイス中で、場合により１以上の結合剤、潤滑剤、賦形剤、表面活性剤および分散剤と混合した粉末または粒状調製物のような自由に流動する状態で有効成分を圧縮することにより調製できる。成型された錠剤は、適当なデバイス中で有効成分、医薬的に許容されるキャリアーおよび混合物を湿らせるために少なくとも十分な液体の混合物を成型することにより作ることができる。錠剤の製造に使用する医薬的に許容される賦形剤には、限定するわけではないが、不活性希釈剤、造粒および崩壊剤、結合剤、および潤滑剤を含む。既知の分散剤には限定するわけでないが、ジャガイモ澱粉およびグリコール酸ナトリウム澱粉を含む。既知の表面活性剤には限定するわけではないが、ラウリル硫酸ナトリウムを含む。既知の希釈剤には限定するわけではないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、微晶質セルロース、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウムおよびリン酸ナトリウムを含む。既知の造粒および崩壊剤は限定するわけではないが、トウモロコシ澱粉およびアルギン酸を含む。既知の結合剤には限定するわけではないが、ゼラチン、アカシア、前−ゼラチン化トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドンおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む。既知の潤滑剤には限定するわけではないが、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリカおよびタルクを含む。
【０１２１】
錠剤は非コートでもよく、あるいは既知の方法を使用してコートして個体の胃腸管での崩壊を遅らせ、これにより徐放性および有効成分の吸収を提供することができる。例としてモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルのような材料を錠剤にコートするために使用することができる。さらなる例として、錠剤は米国特許第４，２５６，１０８号；同第４，１６０，４５２号；および同第４，２６５，８７４号明細書に記載されている方法を使用してコートして、浸透的に制御された放出錠剤を形成してもよい。錠剤は医薬的に洗練され、そして口に合う調製物を提供するために、さらに甘味料、香料、着色剤、保存剤、またはこれらの幾つかの組み合わせを含んで成ることができる。
【０１２２】
有効成分を含んで成る硬質カプセルは、ゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物を使用して作ることができる。そのような硬質カプセルは有効成分を含んで成り、そしてさらに例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンのような不活性な固体希釈剤を含む付加的な成分を含んで成ることができる。
【０１２３】
有効成分を含んで成る軟質ゼラチンカプセルは、ゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物を使用して作ることができる。そのような軟質カプセルは有効成分を含んで成り、これは水またはピーナッツ油、液体パラフィンまたはオリーブ油のような油媒質と混合してもよい。
【０１２４】
経口投与に適する本発明の医薬組成物の液体製剤は、液体状態で、または使用前に水もしくは別の適当な賦形剤を用いて再構成することを意図した乾燥生成物の状態で調製、包装、そして販売され得る。
【０１２５】
液体懸濁液は、水性または油性賦形剤中に有効成分の懸濁液を作成するための通例の方法を使用して調製することができる。水性賦形剤には、例えば水および等張性塩溶液を含む。油性賦形剤には、例えばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、落花生、オリーブ、ゴマのような植物油、またはヤシ油、分画した植物油、および液体パラフィンのような鉱物油を含む。液体懸濁液はさらに、限定するわけではないが沈殿防止剤、分散剤または湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、保存剤、バッファー、塩、香料、着色剤、および甘味料を含む１以上の付加的成分を含んで成ることができる。油性懸濁液はさらに、増粘剤を含んでもよい。既知の沈殿防止剤には限定するわけではないが、スルビトールシロップ、水素化可食性脂肪、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、アカシアゴム、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース誘導体を含む。既知の分散剤または湿潤剤は限定するわけではないが、レシチンのような自然に存在するホスファチド、アルキレンオキシドと脂肪酸と、長鎖脂肪族アルコールと、脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分的エステルと、または脂肪酸および無水ヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物（例えば、それぞれポリオキシエチレンステアレート、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレート、およびポリオキシエチレンソルビタンモノオレート）を含む。既知の乳化剤には限定するわけではないが、レシチンおよびアカシアを含む。既知の保存剤には限定するわけではないが、メチル、エチルまたはｎ−プロピル−パラ−ヒドロキシベンゾエート、アスコルビン酸およびソルビン酸を含む。既知の甘味料には、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、シュクロースおよびサッカリンを含む。油性懸濁液用の既知の増粘剤には、例えば蜜蝋、硬質パラフィンおよびセチルアルコールを含む。
【０１２６】
水性または油性溶媒中の有効成分の液体溶液は、実質的には液体懸濁液と同じ様式で調製できるが、主な差異は有効成分が溶媒中に懸濁しているというより溶解している点である。本発明の医薬組成物の液体溶液は、液体懸濁液に関して記載した各成分を含んで成ることができ、沈殿防止剤は溶媒に有効成分を溶解する目的には必要ないと考えられる。水性溶媒は、例えば水および等張性塩溶液を含む。油性溶媒には、例えばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、落花生、オリーブ、ゴマのような植物性油、またはヤシ油、分画した植物油、および液体パラフィンのような鉱物油を含む。
【０１２７】
本発明の医薬調製物の粉末化および粒状製剤は、既知の方法を使用して調製することができる。そのような製剤は、例えば錠剤を形成するために、カプセルを充填するために、または水性もしくは油性賦形剤を加えることにより水性もしくは油性懸濁液または溶液を調製するために使用して個体に直接投与することができる。これらの製剤の各々はさらに、１以上の分散または湿潤剤、沈殿防止剤および保存剤を含んで成ってもよい。増量剤および甘味剤、香料または着色剤のようなさらなる賦形剤もこれらの製剤に含むことができる。
【０１２８】
本発明の医薬組成物は、水中油型の乳液または油中水型の乳液の状態で調製、包装または販売することもできる。油相はオリーブ油または落花生油のような植物性油、液体パラフィンのような鉱物油、あるいはこれらの組み合わせでよい。そのような組成物はさらに、アカシアゴムまたはトラガカントガムのような自然に存在するゴム、ダイズまたはレシチンホスファチドのような自然に存在するホスファチド、ソルビタンモノオレートのような脂肪酸と無水ヘキシトールの組み合わせに由来するエステルまたは部分エステル、およびポリオキシエチレンソルビタンモノオレートのようなそのような部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物のような、１以上の乳化剤をさらに含んで成ることができる。これらの乳液はまた、例えば甘味剤または香料のような付加的成分を含んでもよい。
【０１２９】
本発明の医薬組成物は、直腸投与に適する製剤に調製し、包装し、そして販売することができる。そのような組成物は、例えば座薬、停留浣腸調製物および直腸または結腸潅注用の溶液の状態でよい。
【０１３０】
座薬製剤は、有効成分を通常の室温（すなわち約２０℃）で固体であり、そして個体の直腸内温度（すなわち健康なヒトでは約３７℃）で液体である非炎症性の医薬的に許容される賦形剤と合わせることにより作成できる。適当な医薬的に許容される賦形剤には、限定するわけではないが、カカオ脂、ポリエチレングリコール、および種々のグリセリドを含む。座薬製剤は限定するわけではないが、酸化防止および保存剤を含む種々の付加的成分をさらに含んで成ることができる。
【０１３１】
直腸または結腸潅注用の停留浣腸調製物または溶液は、有効成分を医薬的に許容される液体キャリアーと合わせることにより作成できる。当該技術分野で周知なように、浣腸調製物は個体の直腸構造に合わせた送達デバイスを使用して投与され、そしてその中に包装されることができる。浣腸調製物は限定するわけではないが酸化防止剤および保存剤を含む種々の付加的成分をさらに含んで成ることができる。
【０１３２】
本発明の医薬組成物は、膣投与用に適する製剤の状態で調製、包装または発売することができる。そのような組成物は例えば座薬、含浸またはコートしたタンポンのような膣に挿入可能な材料、膣洗浄用調製物、またはゲルもしくはクリームもしくは膣潅注用の溶液のような状態であることができる。
【０１３３】
化学組成物で材料を含浸またはコートする方法は当該技術分野では既知であり、そして限定するわけではないが化学組成物を表面に沈積または結合させる方法、化学組成物を材料の合成中に材料の構造に取り込む方法（すなわち、生理学的に分解可能な材料を用いるような）、および水性もしくは油性溶液または懸濁液を吸収材料に吸収させ、その後に乾燥させるか、またはさせない方法を含む。
【０１３４】
膣内潅注のための膣洗浄用調製物または溶液は、有効成分を医薬的に許容される液体キャリアーと合わせることにより作成できる。当該技術分野で周知なように、膣洗浄用調製物は個体の膣の構造に合わせた送達デバイスを使用して投与され、そしてその中に包装されることができる。膣洗浄用調製物は限定するわけではないが酸化防止剤、抗生物質、抗真菌剤および保存剤を含む種々の付加的成分をさらに含んで成ることができる。
【０１３５】
本明細書で使用する医薬組成物の「非経口投与」には、個体の組織の物理的裂け目を特徴とする投与、および組織中の裂け目を通す医薬組成物の投与の任意の経路を含む。このような非経口投与には、限定するわけではないが組成物の注射による、外科的創傷を通す組成物の適用による、組織を浸透する非外科的創傷を通す組成物の適用による医薬組成物の投与等を含む。特に非経口投与には、限定するわけではないが皮下、腹腔、筋肉内、胸骨内注射、および腎臓透析注入法を含む。
【０１３６】
非経口投与に適する医薬組成物の製剤は、滅菌水または滅菌等張塩溶液のような医薬的に許容されるキャリアーと合わせた有効成分を含んで成る。そのような製剤は、ボーラス投与または連続投与に適する状態で調製、包装または販売することができる。注射可能な製剤は、保存剤を含有するアンプルまたは多回用量容器のような単位剤形で調製、包装または販売することができる。非経口投与用製剤は、限定するわけでないが懸濁液、溶液、油性または水性賦形剤中の乳液、ペースト、および移植可能な徐放性または生分解性製剤を含む。そのような製剤は、限定するわけでないが沈殿防止剤、安定化剤または分散剤を含む１以上の付加的成分をさらに含んでよい。非経口投与用の製剤の１つの態様では、有効成分は再構成された組成物の非経口投与前に、適当な賦形剤（例えば滅菌された発熱物質を含まない水）で再構成するための乾燥状（すなわち粉末または粒状）で提供される。
【０１３７】
医薬組成物は、滅菌された注射可能な水性または油性懸濁液または溶液の状態で調製され、包装され、そして販売されることができる。この懸濁液または溶液は既知の技術に従い配合され、そして有効成分に加えて本明細書に記載する分散剤、湿潤剤、または沈殿防止剤を含んで成ることができる。そのような滅菌された注射可能な製剤は、例えば水または１，３−ブタンジオールのような非毒性の非経口的に許容されうる希釈剤または溶媒を使用して調製することができる。他の許容できる希釈剤および溶媒には、限定するわけではないがリンゲル溶液、等張塩化ナトリウム溶液および合成モノ−またはジ−グリセリドのような固定油を含む。有用である他の投与可能な製剤には、微晶質状中に、リポソーム調製物中に、あるいは生分解性ポリマー系の成分として有効成分を含んで成るものを含む。徐放性または移植用の組成物には、乳液、イオン交換樹脂、溶解性が乏しいポリマー、または溶解性が乏しい塩のような医薬的に許容されるポリマー性または疎水性材料を含んで良い。
【０１３８】
局所投与に適する製剤には、限定するわけでないがクリーム、軟膏またはペーストのようなリニメント、ローション、水中油型または油中水乳液のような液体または半−液体調製物、および溶液または懸濁液を含む。局所的に投与可能な製剤は、例えば約１％〜約１０（重量／重量）％の有効成分を含んで成ることができるが、有効成分の濃度は溶媒中の有効成分の溶解度の限界の高さでよい。局所投与用の製剤は、本明細書に記載するさらに１以上の付加的成分を含んで成ることができる。
【０１３９】
本発明の医薬組成物は、頬面窩洞を介する肺への投与に適する製剤に調製、包装または販売することができる。そのような製剤は有効成分を含んで成り、そして約０．５〜約７ナノメートル、そして好ましくは約１〜約６ナノメートルの範囲の直径を有する乾燥粒子を含んで成ることができる。そのような組成物は、推薬流を粉末を分散させるために向ける乾燥粉末リザーバーを含んで成るデバイスを使用するか、あるいは密閉容器中の低沸点推薬に溶解または懸濁した有効成分を含んで成るデバイスのような自己−推進溶媒／粉末−分散容器を使用した、投与に都合良い乾燥粉末状であることができる。好ましくはそのような粉末は、少なくとも粒子の９５重量％が０．５ナノメートルの直径よりも大きく、そして少なくとも粒子数の９５％が７ナノメートル未満の直径を有する。より好ましくは少なくとも粒子の９５重量％が１ナノメートルの直径よりも大きく、そして少なくとも粒子数の９０％が６ナノメートル未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、好ましくは糖のような微細な固体の粉末希釈剤を含み、そして単位剤形で都合よく提供される。
【０１４０】
低沸点の推薬には一般に、大気圧下で６５゜Ｆ未満の沸点を有する液体推薬を含む。一般に推薬は組成物の５０〜９９．９（重量／重量）％を構成することができ、そして有効成分は組成物の０．１〜２０（重量／重量）％を構成することができる。推薬はさらに液体の非イオン性または固体のアニオン性表面活性剤または固体希釈剤（好ましくは有効成分を含んで成る粒子と同じ次元の粒子サイズを有する）のような付加的成分を含んで成ることができる。
【０１４１】
肺へ送達するために配合される本発明の医薬組成物も、溶液または懸濁液の液滴の状の有効成分を提供することができる。そのような製剤は有効成分を含んで成る場合によっては滅菌された水性または希釈アルコール溶液または懸濁液として調製、包装または販売されることができ、そして噴霧化または微塵化デバイスを使用して都合よく投与することができる。そのような製剤はさらに、限定するわけでないがサッカリンナトリウムのような香料、揮発性油、緩衝剤、表面活性剤またはメチルヒドロキシベンゾエートのような保存剤を含む１以上の付加的成分を含んで成ることができる。この投与経路により提供される液滴は、好ましくは約０．１〜約２００ナノメートルの範囲の平均直径を有する。
【０１４２】
本明細書で肺への送達に有用であると記載する製剤は、本発明の医薬組成物の鼻内送達にも有用である。
【０１４３】
鼻内投与に適する別の製剤は、有効成分を含んで成り、そして約０．２〜５００マイクロメートルの平均粒子を有する粗い粉末である。そのような製剤は鼻からかぐ様式で、すなわち鼻孔付近に保持された粉末の容器から鼻の通路を通す迅速な吸入により投与される。
【０１４４】
鼻からの投与に適する製剤は、例えば有効成分をわずか約０．１（重量／重量）％から、１００（重量／重量）％までも含んで成ることができ、そしてさらに本明細書に記載する１以上の付加的な成分を含んでもよい。
【０１４５】
本発明の医薬組成物は、バッカル投与に適する製剤で調製、包装または販売することができる。そのような製剤は、常法を使用して作成することができる錠剤またはトローチ状であることができ、そして例えば０．１〜２０（重量／重量）％の有効成分、経口で溶解または分解可能な組成物を含んで成るバランス、および場合により本明細書に記載した１以上の付加的成分を含んで成る。あるいはバッカル投与に適する製剤は、有効成分を含んで成る粉末またはエアゾール化もしくは微塵化した溶液もしくは懸濁液を含んで成ることもできる。そのような粉末化、エアゾール化またはエアゾール化した製剤は分配した時に、好ましくは約０．１から約２００ナノメートルの範囲の平均粒子または液滴サイズを有し、そしてさらに本明細書に記載する１以上の付加的な成分を含んでもよい。
【０１４６】
本発明の医薬組成物は、眼内投与に適する製剤で調製、包装または販売することができる。そのような製剤は例えば水性または油性液体キャリアー中に有効成分の０．１〜１．０（重量／重量）％溶液または懸濁液を含む点眼薬の状態でよい。そのような液滴はさらに、緩衝剤、塩または本明細書に記載する１以上の他の付加的な成分を含んでもよい。有用である他の眼内に投与可能な製剤には、微晶質形またはリポソーム調製物中に有効成分を含んで成るものを含む。
【０１４７】
本明細書で使用するように、「付加的な成分」には限定するわけでないが、１以上の以下の成分を含む：賦形剤；表面活性剤；分散剤；不活性希釈剤；造粒剤および崩壊剤；結合剤；潤滑剤；甘味剤；香料；着色剤；保存剤；ゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物；水性賦形剤および溶媒；油性賦形剤および溶媒；沈殿防止剤；分散および湿潤剤；乳化剤；粘滑剤；バッファー；塩；増粘剤；増量剤；乳化剤；酸化防止剤；抗生物質；抗真菌剤；安定化剤；および医薬的に許容されるポリマー性または疎水性材料。本発明の医薬組成物に含むことができる他の「付加的な成分」は、当該技術分野では既知であり、そして例えばＧｅｎａｒｏ編集、１９８５、シミングトンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、マック（Ｍａｃｋ）出版社、イーストン、ペンシルベニア州に記載され、これは引用により本明細書に編入する。
【０１４８】
ＰＥＤＦを含んで成る徐放性組成物も特に有用となり得る。例えば徐放性組成物は目の硝子体に使用することができ、そしてまた目の後ろに使用することもできる。本明細書のいたることろで記載するように、徐放性組成物はＰＥＤＦを投与するために全身性または他の送達経路にも有用であり得る。当業者は、望ましい結果を達成するために所望の疾患を処置するために使用することができる適切な徐放性組成物を知っている。
【０１４９】
典型的には動物、好ましくはヒトに投与することができる本発明の組成物の投薬用量は、動物の体重１ｋｇあたり１μｇ〜約１００ｇの量の範囲である。投与する正確な投薬用量は、限定するわけでないが動物の種類および処置する疾患状態の種類、動物の年齢および投与経路を含む多数の種々の因子に依存して変動するだろう。好ましくは化合物の投薬用量は、動物の体重１ｋｇあたり約１ｍｇ〜約１０ｇで変動するだろう。より好ましくは投薬用量は動物の体重１ｋｇあたり約１０ｍｇ〜約１ｇで変動するだろう。
【０１５０】
化合物は動物に毎日、数回の頻度で投与することができ、あるいは化合物は１日１回、１週間に１回、２週間毎に１回、１月に１回、または数ケ月に１回または１年に１回未満のようなさらに少ない頻度で投与することもできる。投薬の頻度は当業者には容易に明らかであり、そして限定するわけでないが処置する疾患の種類および重篤度、動物の種類および年齢等のような任意の数の因子に依存するだろう。
【０１５１】
【実施例】
実施例
ここで本発明を以下の実施例を参照にして記載する。これらの実施例は具体的説明の目的のみに提供され、そして本発明がこれらの実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ本明細書に提供される技法の結果として明らかとなる任意の、そしてすべての変更を包含すると解釈するべきである。
【０１５２】
細胞培養、タンパク質およびＤＮＡの操作等のようなこれらの実施例で使用する手法は、当該技術分野では周知である（一般にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，同上を参照にされたい）。したがって簡潔にするために、実験プロトコールは詳細に記載しない。
実施例１
ここに記載するデータは、ＰＥＤＦが内皮細胞の移動を防止することを示す。
【０１５３】
様々な血管内皮細胞型の移動は、ＰＥＤＦを培養した内皮細胞、特にウシの腎近傍毛細管、ヒトの臍帯およびヒトの皮膚の微小血管組織から単離した内皮細胞に加えることにより測定した。
【０１５４】
細胞は、逆転させて改良したＢｏｙｄｅｎチャンバー中のゼラチンで固めたＮｕｃｌｅｏｐｏｒｅ膜（ウシの毛細管細胞には５μｍ孔、そして他の細胞には８μｍ孔）上にまいた。２時間後、チャンバーを再度逆転させ、そして試験物質を各ウェルの上に加えた。具体的には群を培養基のみ（対照）、１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、２ｎＭ ＰＥＤＦ（完全長ＰＥＤＦ）、または１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（塩基性繊維芽細胞増殖因子）および１０ｎＭＰＥＤＦの両方のいずれかに暴露した。次いで細胞は３〜４時間移動できるようにした。この後に膜を固定し、そして染色し、そして移動した細胞数を計数した。
【０１５５】
アッセイの結果は、最大移動のパーセントとして図１に与える（誤差棒は、標準誤差測定を表す、ｎ＝４）。示すように、血管内皮細胞の３種類の型のすべてがｂＦＧＦの存在下でほぼ１００％の移動を表した。しかしＰＥＤＦの存在下では、かなり少ない移動が観察された。これらの結果はＰＥＤＦが内皮細胞の移動を阻害することを示す。これらの結果は、ＰＥＤＦタンパク質が培養した網膜芽腫細胞のニューロン分化を誘導し、小脳顆粒細胞の神経栄養因子およびグリア細胞の細胞分裂抑制因子になることを仮定すると、驚くことである（Ｔａｎｉｗａｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６８：２６−３２；Ｓｕｇｉｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｎｅｉｕｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．４９：７１０−７１８；Ｔｏｍｂｒａｎ−Ｔｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｅｘｐ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．５３：４１１−４１４；Ｂｅｃｅｒｒａ，１９９７，ＰＥＤＦに関する構造−機能研究（Ｓｔｒｕｃｔｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ＰＥＤＦ）、第２１章、セルピンの化学および生物学で（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｅｒｐｉｎｓ）、Ｃｈｕｒｃｈ ｅｔ ａｌ．、編集、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）出版）。
実施例２
ここに与えるデータは、ＰＥＤＦによる細胞移動の防止が内皮細胞に特異的であることを示す。
【０１５６】
ＰＥＤＦが繊維芽細胞または平滑筋の移動を防止する能力を、ヒトの二倍体繊維芽細胞系ＷＩ−３８、ヒトの包皮繊維芽細胞、血管平滑筋、および正常なヒトの好中球から得た細胞を使用して試験した。
【０１５７】
アッセイは実施例１に示したように行ったが、ＰＥＤＦの用量を０．０１ｎＭ〜約５０ｎＭに変動させ、そして移動アッセイは逆転チャンバー無しで行った。さらに移動のインデューサーは細胞の型により変動させた（ＩＬ−８は１μｇ／ｍｌで使用し、そしてＰＥＤＦは２５０ｐｇ／ｍｌで使用した）。
【０１５８】
この実験の結果は図２Ａ−２Ｄに与える。これらの図で示すように、ＰＥＤＦはいかなる細胞系の移動も阻害しなかった。この結果はＰＥＤＦの抗移動活性が血管内皮細胞に特異的であることを示す。
実施例３
ここに与えるデータは、ＰＥＤＦが他の抗新脈管形成因子と比べた時に、内皮細胞移動の最も有力な阻害物質であることを示す。
【０１５９】
実施例１に概説したプロトコールに準じて、ウシの腎近傍毛細管内皮細胞をｂＦＧＦ、ＰＥＤＦおよび幾つかの既知の抗新脈管形成因子に暴露した。５０％の移動を達成するために必要な上記因子の量を測定し、そしてＥＤ５０として報告する。より小さいＥＤ５０測定値はより有力な抗新脈管形成因子を示す。表１に示すこの実験の結果は、ＰＥＤＦが高度に有力な抗新脈管形成因子であることを示す。
【０１６０】
2004516001.tif 000003
実施例４
これらのデータは、ＰＥＤＦが既知の新脈形成物質の新脈形成活性を阻害することを示す。
【０１６１】
実施例１に概説したプロトコールに準じて、ウシの腎近傍毛細管内皮細胞を５種の既知の新脈管形成物質単独に、または０．１μｇ／ｍｌ ＰＥＤＦと組み合わせたものに暴露した。特にａＦＧＦは５０ｎｇ／ｍｌの濃度で使用し、ｂＦＧＦは１０ｎｇ／ｍｌの濃度で使用し、ＩＬ−８は４０ｎｇ／ｍｌの濃度で使用し、ＰＥＤＦは２５０ｐｇ／ｍｌの濃度で使用し、そしてＶＥＧＦは１００ｐｇ／ｍｌの濃度で使用した。
【０１６２】
このアッセイの結果を図３に与える。示すように、細胞の移動は脈管形成物質の種類にかかわらずＰＥＤＦによりかなり阻害された。これらの結果はＰＥＤＦが媒介する血管内皮細胞の移動の阻害がｂＦＧＦ誘導に特異的ではなく、ＰＥＤＦがこれらの細胞の移動を阻害するために全般的に作用することを示している。
実施例５
これらのデータは、ＰＥＤＦがインビボの新生血管形成を阻害することを示す。種々のタンパク質を含んで成るペレットを、ラットの無血管角膜に移植した。ペレットはｂＦＧＦを含むか、または含まず、そしてまたはＰＥＤＦまたは対照として機能するウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のいずれかを含んだ。７日後、ラットの角膜を調査して新脈管形成が生じたかどうかを決定した。
【０１６３】
このアッセイの結果を表２に与える。示すように、ｂＦＧＦを欠くペレットを注入したものからは脈管形成は観察されなかった。しかしｂＦＧＦおよびＢＳＡを用いて移植したすべての目では、脈管形成が観察された。さらにｂＦＧＦおよびＰＥＤＦを同時に注入すると、角膜には新生血管形成が生じなかった。これらの結果は、ＰＥＤＦがインビボでの新脈管形成の有力なインヒビターであることを示している。
【０１６４】
2004516001.tif 000004
実施例６
ここに与えるデータは、完全なＰＥＤＦタンパク質以外のＰＥＤＦポリペプチドが活性な抗新脈管形成剤であることを示す。
【０１６５】
完全なＰＥＤＦタンパク質のトリプシン処理は、タンパク質を配列番号１のアミノ酸３５２で開裂し、タンパク質の約３〜５ｋＤａのカルボキシ末端を除去する（Ｂｅｃｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２５９２２−２５９９９）。この手順を使用してフラグメントを作成し、そして短縮化Ｎ−ＰＥＤＦフラグメント（配列番号１のアミノ酸２１−３８２を表す）を、ヘパリンアフィニティクロマトグラフィーによりトリプシンから精製した。
【０１６６】
上記に概説したプロトコールに準じて使用して、種々の濃度の完全長ＰＥＤＦまたは短縮化ペプチドのいずれかを、それら各々が内皮細胞移動に影響する能力について評価した。短縮化したペプチドに関して作成されたデータを図５に示す。これらのデータを完全長ＰＥＤＦの活性（図４を参照にされたい）と比較すると、両タンパク質が内皮細胞移動の阻害に同様に有力となることが明らかである。これらの結果は完全長ＰＥＤＦ以外のペプチドが活性なＰＥＤＦポリペプチドであることを示している。
【０１６７】
ＰＥＤＦに由来するさらなる短縮化ペプチドは、上記に記載したように改良Ｂｏｙｄｅｎチャンバー内の９代目のヒトの皮膚の微小血管内皮細胞（クローンテックス（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）、セル システムズ（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して内皮細胞移動アッセイにおいて試験し、そして結果を図７に示す。図７Ａでは、精製した組換えＰＥＤＦ（ｒＰＥＤＦ）、細菌が生産したＰＥＤＦ（ＢＨ）または配列番号１に関するアミノ酸残基７８−１２１（４４−ｍｅｒ）および４４−７７（３４−ｍｅｒ）を含むＰＥＤＦペプチドの存在下で、細胞をＶＥＧＦの勾配に暴露した。抗新脈管形成効果がＰＥＤＦペプチドに特異的であり、そして混入によるものではないかどうかを確認することを示す場合は中和抗体を加えた。完全長ＰＥＤＦ調製物は２５ｎＭで使用し、ＰＥＤＦに対する中和ポリクローナル抗血清は、１：２００希釈で、組換えヒトＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｓシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ））は２００ｐｇ／ｍｌで使用した。図７Ｂでは、細胞を３４−ｍｅｒおよび４４−ｍｅｒペプチドの濃度が増しながら存在する中でＶＥＧＦの勾配に暴露した。この実験に使用した抗血清はアフィニティ精製せず、一方、ここに与える他のすべての実験で使用した抗血清はアフィニティ精製した。
【０１６８】
データは、４１８アミノ酸ＰＥＤＦタンパク質の３４アミノ酸ペプチドフラグメントが抗新脈管形成活性を有することを確証した。このペプチドは毛細管内皮細胞のインデューサー、ＶＥＧＦへの移動を遮断した。さらにこのデータは３４アミノ酸ペプチドの活性が、２つのペプチド（その１つは３４−ｍｅｒ内に含まれた）に特異的なポリクローナル抗体の添加により排除できたことを示す。このペプチドは約１０ｎＭのＥＤ５０を有する。ほとんどのペプチドがｎＭ範囲よりはμＭ範囲でＥＤ５０を有するので、小ペプチドは並外れて活性である。完全なＰＥＤＦに関するＥＤ５０は約０．３ｎＭである。この並外れた効力により、このペプチドは本発明の方法、そして特に新脈管形成に影響することができる治療用化合物の開発に有用となり得る。
【０１６９】
またこれらのデータは、抗新脈管形成性のＰＥＤＦの領域を、網膜芽腫細胞での分化を誘導する領域および神経栄養性の領域から分ける。このような後者の２つの性質は本明細書で見いだされた３４アミノ酸ペプチドによっては誘導されないが、３４アミノ酸ペプチドとは重複しないＰＥＤＦの隣接するペプチドフラグメントにより誘導されることが示された（Ａｌｂｅｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３１６０５−３１６１２）。すなわち本発明の方法において、ＰＥＤＦの神経活性が新脈管形成療法中に合併症を引き起こす場合、そのような合併症はＰＥＤＦの３４アミノ酸ペプチドフラグメントを使用することにより回避することができるはずである。この知見は図７に例示され、ここではＰＥＤＦタンパク質のアミノ酸４４〜７７を表すＰＥＤＦの３４アミノ酸ペプチドが抗新脈管形成剤として活性であるが、アミノ酸７８〜１２１を含んで成る隣接する４４アミノ酸ペプチドは抗新脈管形成剤として活性ではないことを示す。
実施例７
これらのデータは、皮膚に適用した外因性ＰＥＤＦがそこでの毛髪の成長を促進することを示す。
【０１７０】
さらなる実験では、精製したヒスチジン−標識ＰＥＤＦの注射が毛包密度の上昇、および自然には無毛である無胸腺症（ヌード／ヌード）マウスの皮膚にふさ状分岐の成長をもたらした。この結果はＰＥＤＦが新たな毛髪の成長を刺激する可能性を有することを示唆している。
【０１７１】
ＰＥＤＦは、毛包中（毛脂腺）に存在する細胞を含む多くの細胞型により発現されるタンパク質である。毛包密度の上昇は、精製したＰＥＤＦを４日間連続して毎日注射した実験的に生成した神経芽腫の上にある皮膚で観察された。これは塩水賦形剤を同様に注射した腫瘍をもつ対照動物では観察されなかった。
【０１７２】
処置は、１００μｌ容量のリン酸緩衝化生理食塩水中に全部で２μｇの精製したヒスチジン−標識ＰＥＤＦを４日間連続して毎日、２〜３部位／腫瘍に注射することから成った。５日目に、注射部位上に小さな増加した毛髪成長の領域が記録された。マウスは過剰用量のメタファンを使用して安楽死させ、そして腫瘍を外科的に摘出した。腫瘍組織をスライスし、そして緩衝化ホルマリンに少なくとも２４時間漬けた。組織はパラフィンに包埋し、そして組織検査用に調製した。ＰＥＤＦで処理した神経芽腫の上にある皮膚は、塩水賦形剤を注射した腫瘍の上にある皮膚と比べた時に、毛包密度が上昇していた（図８）。毛包密度における同様の上昇は、精製したＰＥＤＦの注射後の腫瘍の不存在下で見られた。
実施例８
ここで与えるデータは、ＰＥＤＦが神経芽腫の分化を誘発するという事実を表し、これによりこれらの腫瘍を処置に関する基礎を提供する。神経芽腫細胞のインビトロ処置および実験的に作成した神経芽腫の精製したヒスチジン−標識ＰＥＤＦタンパク質を用いたインビボ処置は、細胞の分化を誘発した。したがってこれらのデータは、ＰＥＤＦをこれらの細胞に投与することがこれらの腫瘍の分化を誘導し、したがってよりゆっくりと成長させる効果的な手段であることを示唆している。
【０１７３】
ＰＥＤＦはシュワン細胞を含む多くの細胞型により発現そして分泌されるタンパク質である。神経芽腫は悪性腫瘍であり、そしてこれらの細胞中のシュワン細胞の存在がより良い結果と関係している。ここに与えるデータは、シュワン細胞の存在が神経芽腫の好ましい予後を導くという理由の１つは、これらの細胞がＰＥＤＦを生産するという事実であることを示す。そこで生産されるＰＥＤＦは腫瘍細胞に傍分泌様式で作用して、それらの分化を誘導する。かりにも分化した神経芽腫細胞は、よりゆっくりと成長するので、神経芽腫へのＰＥＤＦの投与はこの細胞の成長をゆっくりさせることによりこの腫瘍の新規療法を提供する。細胞成長は、（１）ＰＥＤＦを腫瘍に栄養を供給する血管を形成する内皮細胞に結合させ、そしてそれらの成長を防止し、それにより間接的に腫瘍を抑制する、および（２）ＰＥＤＦを腫瘍細胞に直接結合させ、これによりそれらの分化を誘導する２つの方法で遅らせる。
【０１７４】
インビトロ実験は、ＰＥＤＦが神経芽腫に由来する細胞系に及ぼす効果を確かめるために行った。２種の神経芽腫に由来する細胞系は、アメリカン ティシュ タイプ アンド カルチャーから得たＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）およびＳＫ−Ｎ−ＳＨであった。両細胞系は、１０％ウシ胎児血清（フローラボラトリーズ（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、マックレーン、バージニア州）を含有するＤＭＥＭ中のカルチャー中で、３７℃で５％ＣＯ２にて維持した。細胞（１．２５×１０４／ｍｌ）を再懸濁し、そして１ｍｌ／ウェルを使用して２４ウェルプレートにまいた。２４時間後、ＰＥＤＦを３連でウェルに０、１，０、７．５、１または１０ｎＭで加え、そして細胞をさらに２４時間インキューベーションした。分化した細胞のパーセントは、ウェルあたり３つの重複しない１ｍｍ２面積中の総細胞数を計数することにより決定した。細胞は５０ミクロン長より大きな神経突起の突出を保有する場合、分化したと考えた。
【０１７５】
図９Ａおよび９Ｂに与える結果、および対照およびＰＥＤＦ処置群の写真を図１０に示す。さらに、新脈管形成アッセイにおいてＰＥＤＦ活性を中和することができるＰＥＤＦ誘導化ペプチドに対して生じた抗体を細胞に加えた時、抗体はＰＥＤＦが誘発する分化を効果的に遮断した（図１０）。
【０１７６】
インビボ実験を行ってＰＥＤＦの神経芽腫に及ぼす効果を測定した。ヒトの神経芽腫は各マウスの後部脇腹上の２カ所に１×１０６ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）細胞を皮下注射することにより、無胸腺症（ｎｕ／ｎｕ）マウスに実験的に誘導した。腫瘍が触診できるサイズ（約８ｍｍ直径）に成長した時、ＰＥＤＦ処置を始めた。全部で２μｇの精製したヒスチジン−標識ＰＥＤＦ（１００μｌのリン酸緩衝化生理食塩水中）を２〜３カ所／各腫瘍に４日間連続して毎日注射した。５日目に、マウスは過剰用量のメタファンを使用して安楽死させ、そして腫瘍を外科的に摘出した。腫瘍組織をスライスし、そして緩衝化ホルマリンに少なくとも２４時間置いた。組織はパラフィンに包埋し、そして組織検査用に調製した。切片は、ニューロフィラメントタンパク質を認識する抗体（ダコ（Ｄａｋｏ）、カルピンテリア、カリフォルニア州）で染色した。ＰＥＤＦで処置した神経芽腫は、ニューロフィラメントタンパク質に関する陽性染色の獲得により測定された増大した分化を表した（図１１）。全部で６種のＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）腫瘍をＰＥＤＦで処置し、そして６／６がニューロフィラメント染色について適度から強力な陽性だった。全部で４種の腫瘍をＰＢＳで処置し、そしてすべてが陰性か、またはより豊富な細胞質を含む単一細胞で集中染色を表した（図１１）。
実施例９
この実施例に与えるデータは、ＰＥＤＦがヒトおよびマウスの目を硝子液および角膜で新脈管形成の主要なインヒビターであり、そしてインビトロおよびインビボでの酸素圧（ｔｅｎｓｉｏｎ）により制御される証拠を提供する。
【０１７７】
疾患の不存在では、哺乳動物の目の脈管は自然な新脈管形成のインヒビターの存在により静止している。本発明では、ＰＥＤＦは脈管が角膜に侵入することを防止し、そして硝子液の正常な抗新脈管形成活性の要因であることを示す。ここに与える実験では、角膜細胞によるＰＥＤＦの分泌が低酸素により増し、そして高酸素で低下し、この損失は角膜の新生血管形成において許される役割を果たすことを示唆している。すなわちＰＥＤＦは目の、特に病理的な新生血管形成が視野を狭め、そして失明を導く虚血による網膜症の処置に治療として有用である。
【０１７８】
新脈管形成、先在する血管から新しい血管の成長は、自然に存在するインヒビターの影響により新規の血管の成長が妨げる場合、ほとんどの健康な組織では強力な調節下にある（Ｂｏｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ ６９：１３５；Ｈａｎａｈａｎ ａｎｄ Ｆｏｌｋｍａｎ，１９９６，Ｃｅｌｌ ８６：３５３）。そのような制御の破壊は関節炎からガンに至る様々な疾患の発症に本質的な役割を果たす（Ｆｏｌｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ２０６−２３２）。健康な哺乳動物の目では、脈管は通常、両区分とも抗−新脈管形成活性を有することが示された角膜からおよび硝子体から排除される（Ｂｒｅｍ ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ａｍ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．８４：３２３；Ｈｅｎｋｉｎｄ，１９７８，Ａｍ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．８５：２８７；Ｋａｍｉｎｓｋａ ａｎｄ Ｎｉｅｄｅｒｋｏｍ，１９９３，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３４：２２２）。角膜からの血管を塞げないことは、視力の損失、混濁および異常な回復と関係する（Ｋａｍｉｎｓｋａ ａｎｄ Ｎｉｅｄｅｒｋｏｍ，１９９３，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３４：２２２）。網膜では、過剰な新生血管形成は増殖性糖尿病網膜症ならびに加齢に関係する黄斑変性のような虚血性の網膜症の基礎となり、現在、西欧圏で視野の損失を引き起こしている。以下に与えるデータは、例外的に有力な新脈管形成の新規インヒビターとして、および健康な硝子体および角膜の長期に認識される抗新脈管形成活性の原因となる分子として、網膜タンパク質色素上皮に由来する因子（ＰＥＤＦ）を同定する。
【０１７９】
網膜芽腫抑制遺伝子（Ｒｂ）により調節されるかもしれない目の抗新脈管形成因子を同定することを目的とする研究では、野生型Ｒｂ遺伝子、ＷＥＲＩ−Ｒｂ−２７Ｒを発現するレトロウイルスで感染させた網膜芽腫細胞系により前以てコンディショニングした培地を分画した。（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：４４８１）。タンパク質精製スキームでは、１０００から１２５０倍に濃縮された抗新脈管形成活性および銀染色したタンパク質ゲル上に１本の５０−ｋＤバンドをもたらした。ＰＥＤＦはＷＥＲＩ−Ｒｂ−２７Ｒ無血清コンディショニング培地から、蒸留水に対する透析（分子量カットオフ、３０ｋＤ）、６０〜９５％硫酸アンモニウム沈殿、レンチルレクチンＳｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））から０．５Ｍ α−メチル−Ｄ−マンノピラノシドを用いた段階的溶出、そしてＨｉＴｒａｐヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ファルマシア）からＮＡＣｌの上昇勾配での溶出から成る連続工程により精製した。（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：４４８１）。精製は内皮細胞移動アッセイによりモニターし、そして収率は１７．５％であった。移動アッセイは、記載のようにウシの腎近傍毛細管内皮細胞またはヒトの皮膚の微小血管内皮細胞（クローンテックス（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用して各サンプルに関して４連で行った（Ｐｏｌｖｅｒｎｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８：４４０）。多数の実験を合わせるために、バックグラウンドの移動（Ｂｋｇｄ）は賦形剤（０．１％ウシ血清アルブミン）について最初に引き算され、そして次いでインデューサー単独に対する最大移動を１００％に設定することにより標準化した。すべての実験を２回から５回繰り返した。統計はステューデントのｔ試験を用いて標準化する前に生のデータについて行った。標準誤差はパーセントに転換した。タンパク質のタンパク質溶解に由来する内部ペプチドのエドマン分解は、２つの不明量な配列（ＴＳＬＥＤＦＹＬＤＥＥＲＴＶＲＶＰＭＭＸＤ）（配列番号３）および（ＩＡＱＬ−ＰＬＴＧＸＭ（配列番号４）を生じた。アミノ酸残基に関する１文字の略号は以下の通りである：Ａ，Ａｌａ；Ｄ，Ａｓｐ；Ｅ，Ｇｌｕ；Ｆ，Ｐｈｅ；Ｇ，Ｇｌｙ；Ｉ，Ｉｌｅ；Ｌ，Ｌｅｕ；Ｍ，Ｍｅｔ；Ｐ，Ｐｒｏ；Ｑ，Ｇｌｎ；Ｒ，Ａｒｇ；Ｓ，Ｓｅｒ；Ｔ，Ｔｈｒ；Ｖ，Ｖａｌ；Ｘ、任意のアミノ酸；そしてＹ，Ｔｙｒ。ＢＬＡＳＴタンパク質相同性調査では、ＰＥＤＦが同一配列を有することが明らかとなった。タンパク質のミクロ配列分析では、このタンパク質が以前に記載した色素上皮−由来因子（ＰＥＤＦ）と同一であることが示された。
【０１８０】
ＰＥＤＦは、培養したＹ７９網膜芽細胞のニューロン分化を誘導する因子としてヒトの網膜色素上皮細胞のコンディショニング培地から最初に精製された。（Ｂｅｃｃｅｒｒａ、セルピンの化学および生物学（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｅｒｐｉｎｓ）、Ｃｈｕｒｃｈ，ｅｔ ａｌ．編集、（プレナム、ニューヨーク、１９９７）、第２２３−２３７頁）。（Ｔｏｍｂｒａｎ−Ｔｉｎｋ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｅｘｐ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．５３：４１１ １９９１；Ｓｔｅｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：１５２６）。ＰＥＤＦは小脳の顆粒細胞に神経向性であり、ミクログリアの成長を阻害し、そしてまたアーリーポピュレーションダブリングレベルｃＤＮＡ（ｅａｒｌｙ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｌｅｖｅｌ ｃＤＮＡ：ＥＰＣ−１）とも呼ばれ、若い細胞サイクルＧｏ期中にそのアップレギュレーションに影響を及ぼすが、老化した培養繊維芽細胞には影響しない。（Ｔａｎａｗａｋｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６４：２５０９；Ｙ．Ｓｕｇｉｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．４９：７１０）。Ｐｉｇｎｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８９４９ １９９３）；（Ｔｏｍｂｒａｎ−Ｔｉｎｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１５：４９９２ １９９５）。タンパク質はセリンプロテアーゼインヒビター（セルピン）ファミリーと配列および構造相同性を共有するが、プロテアーゼは阻害しない。（Ｂｅｃｃｅｒｒａ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２３１４８ １９９３）；Ｂｅｃｃｅｒｒａ，ｅｔ ａｌ．，１９９５ ｉｂｉｄ．２７０：２５９９２）。ＷＥＲＩ−Ｒｂ−２７Ｒコンディショニング培地から精製した抗新脈管形成活性は、活性がタンパク質がＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルからの単一バンドとして回収される時に保持され（Ｄａｗ ｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，非公開データ）、そして組換えＰＥＤＦまたはＰＥＤＦペプチドのいずれかに対して生じた抗体で中和されるので、ＰＥＤＦによるものであり、微量の混入物によるものではないと思われた。（図１２Ａ）。
【０１８１】
ＰＥＤＦの生物学的に精製したもの、ならびに組換え体は、ラットの角膜の新生血管形成を効果的に阻害した（図１３Ａおよび１３Ｂ）。ヒトのＰＥＤＦ ｃＤＮＡはＣＯＯＨ−末端ヘキサヒスチジン標識をコードするようにポリメラーゼ連鎖反応により工作し、ｐＣＥＰ４（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバッド、カリフォルニア州）にクローン化し、そしてヒトの胚性腎細胞にトランスフェクトした。組換えＰＥＤＦはＸｐｒｅｓｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバッド、カリフォルニア州）を用いてコンディショニングした培地から精製した。インビトロで、ＰＥＤＦは内皮細胞の移動を０．４ｎＭの中央効果用量（ＥＤ５０）で用量依存的様式で阻害し（図１２Ｂ）、このアッセイにおける中で最も有力な新脈管形成の天然インヒビターとし（ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｆｅａｔｕｒｅ／ｄａｔａ／１０４００７から入手できる補足する図面を参照にされたい）、純粋なアンギオスタチン（図１２Ｂ）、トロンボスポンジン−１（０．５ｎＭのＥＤ５０）およびエンドスタチン（３ｎＭのＥＤ５０）よりもわずかに活性であった。１．０ｎＭ以上の用量では、ＰＥＤＦは毛細管内皮細胞の塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）−誘導化増殖も４０％まで阻害した。
【０１８２】
ＰＥＤＦは、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン−８、酸性繊維芽細胞増殖因子およびリゾホスファチジン酸を含む我々が試験した各々の新脈管形成インデューサーに対して内皮細胞の移動を阻害した。（ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｆｅａｔｕｒｅ／ｄａｔａ／１０４００７０から入手できる補足する図面を参照にされたい）。これは内皮細胞に対して幾らかの特異性を示し、ウシの腎近傍腺またはヒトの皮膚から培養した、および臍帯管に由来する微小血管の移動を阻害した。対照的に、ＰＥＤＦが内皮細胞を阻害するために必要な濃度の１０倍で存在した時でも、ヒトの包皮または肺繊維芽細胞、大動脈平滑筋細胞、口腔角質細胞、または好中球の刺激性サイトカインに向かう移動を阻害しなかった。（ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｆｅａｔｕｒｅ／ｄａｔａ／１０４００７０から入手できる補足する図面を参照にされたい）。
【０１８３】
中和ＰＥＤＦ抗体は、ヒト（図１２Ｃ）、マウスおよびウシの角膜から調製した基質抽出物による内皮細胞化学走性の阻害を低下させた（Ｋｌｉｎｔｗｏｒｔｈ，１９９１，角膜の新脈管形成：総合的な論説（Ｃｏｒｎｅａｌ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ）（スプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）−出版、ニューヨーク）：Ｋａｍｉｎｓｋａ ａｎｄ Ｎｉｅｄｅｒｋｏｒｎ，１９９３，Ｉｎｖｅｓｔｉｇ，Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３４：２２２）。基質抽出物の調製には、角膜は付随する上皮、およびできるかぎり内皮を含まず、氷冷リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で徹底的に洗浄し、そして小さいフラグメントに切り刻み、これを０．５ＭＭフェニルメタンスルホニルフルオリドを含有するＰＢＳ中で２４時間インキューベーションした。抽出物を濾過滅菌し、−８０℃で保存し、そしてミリリットルあたり１０μｇの最終タンパク質濃度で移動アッセイで試験した。同様に、ＰＥＤＦおよびプロテインＡビーズへ結合した抗体の除去は、ウシおよびヒトの基質抽出物から抗新脈管形成活性を完全に排除した（図１３Ａおよび１３Ｂ）。さらにＰＥＤＦに対する中和抗体の添加により、外因性の新脈管形成インデューサーの不存在下で、新たな脈管のラット角膜への侵入が刺激された（図１２Ａおよび１２Ｂ）。これは局所的なＰＥＤＦの封鎖によるものと思われ、これは角膜中の内因性の脈管形成刺激活性を暴露した（図１２Ｃ、１３Ａおよび１３Ｂ）。ＰＥＤＦに対する抗体単独ではインビトロで内皮細胞の移動を刺激せず（図１２Ａ）、そしてＰＥＤＦペプチド３２７〜３４３とそれに対して生じた抗体をプレインキューベーションした時、ラットの角膜には新生血管形成は観察されなかった（図１３Ａおよび１３Ｂ）。ＰＥＤＦペプチド単独では新脈管形成アッセイにおいて中性であった（図１３Ａ）。
【０１８４】
角膜のように、硝子体液も抗新脈管形成性であり（Ｂｒｅｍ，ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．８４：３２３；Ｈｅｎｋｉｎｄ １９７８ ｉｂｉｄ．８５：２８７）、そして一般的には血管を欠き、そしてまた高濃度のＰＥＤＦを含む（Ｂｅｃｃｅｒｒａ，１９９７、セルピンの化学および生物学（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｅｒｐｉｎｓ）；Ｃｈｕｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７，編集（プレナム出版）、第２２３−２３７頁）；Ｗｕ ａｎｄ Ｂｅｃｃｅｒｒａ，１９９６，Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３７：１９８４）。硝子体液からのＰＥＤＦの除去はその抗新脈管形成活性を排除し、そして基になる新脈管形成刺激活性を現すことが見いだされた（図１２Ｃ、１３Ａおよび１３Ｂ）。硝子体中のＰＥＤＦのレベルは、１ミリリットルの硝子体あたり４ｎｇのＶＥＧＦの存在でも（増殖性の糖尿病網膜症の患者から得た硝子体液中に見いだされる濃度に等しい）、内皮細胞の移動を阻害するために十分であった（Ａｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎ．Ｅｎｇｌｅ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３１：１４８０；Ａｄａｍｉｓ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．１１８：４４５）。トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）は、目の新生血管形成のインヒビターになると仮定された（Ｏｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．１６：９；Ｈａｙａｓａｋａ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６３：１０８９；Ｖｉｎｏｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．８９：４３）。しかし我々の実験では、 ＴＧＦβアイソフォーム１、２および３の中和により、硝子体液または角膜抽出物の抗新脈管形成活性はインビトロで変わらなかったか（ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｆｅａｔｕｒｅ／ｄａｔａ／１０４００７から入手できる補足する図面を参照にされたい）、またはインビボでの角膜の新生血管形成の誘導は変わらなかった（図１３Ａ）。
【０１８５】
新生児では、周囲の酸素濃度の変化が網膜の脈管密度を調節することができる。この効果は通常、新脈管形成インデューサーであるＶＥＧＦのレベルの変化に起因し、ＶＥＧＦは酸素が限られている時にはアップレギュレートされ、そして酸素が過剰な時はダウンレギュレートされる（Ａｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：１０４５７；Ａｄａｍｉｓ，ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ａｒｃｈ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．１１４：６６；Ｐｒｏｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｅｘｐ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．６５：５５５）。ＰＥＤＦも酸素により調節されるのかどうかを決定するために、新生マウスを出生後７から１２日に７５％酸素（高酸素）に暴露し、この条件は脈管形成低下（ｕｎｄｅｒｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ）網膜の発生（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３５：１０１）およびＶＥＧＦ ｍＲＮＡの減少（Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ａｒｃｈ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．１１４：１２１９）を導く。超酸素に暴露した９匹のうちの８匹のマウスの網膜が、１２日目にＰＥＤＦについて強く染色され（図１４Ｂ）、一方、正常酸素（２１％酸素）に維持された１０匹の未処置動物はＰＥＤＦ染色を示した（図１４Ａ）。未処置動物では、網膜発生中のＰＥＤＦレベルは、新脈管形成インヒビターに関して予想されたパターンに従った。ＰＥＤＦ免疫染色は、網膜の脈管が発生している時、３匹の動物のうち３匹が１８日以前は染色されなかったか、または弱かったが（図１４Ａおよび１４Ｃ）（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｍｉｃｒｏｖａｓ．Ｒｅｓ．３６：２７５）、２１日では４匹のマウスのうちの４匹（図１４Ｄ）、および網膜の新生血管形成が本質的に完了した時は６匹の成体のうちの６匹が強かった（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｍｉｃｒｏｖａｓ．Ｒｅｓ．３６：２７５）。最高のＰＥＤＦレベルは光受容体細胞層、網膜のほとんどの無血管層で見られた。
【０１８６】
ＰＥＤＦに及ぼす酸素調節の効果をさらに調査するために、網膜芽腫細胞を低酸素（０．５％）、あるいは低酸素症を刺激する化学薬剤に維持した（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１２１４）。予想どおり、低酸素は酵素−結合免疫吸着アッセイにより測定されるようにコンディョニング培地中のＶＥＧＦのレベルにおいて９．５±４．８倍の上昇を誘導し、そしてＰＥＤＦのレベルを１１．８±４．７倍まで減少させた（図１５Ａ）。Ｒｂ−陰性網膜芽腫細胞およびＲｂを再度発現する復帰変異体の応答は同じであった（図１５Ａ）。ＰＥＤＦ ｍＲＮＡの差異は、低酸素−処理および未処理細胞間で検出されず（図１５Ｂ）、ＰＥＤＦの低酸素調節は翻訳または翻訳後レベルで起こることを示唆した。
【０１８７】
低酸素腫瘍細胞でコンディョニングした培地は、正常酸素腫瘍酸素でコンディョニングした培地よりも脈管形成性であった（図１５Ｃ）。低酸素は、最大の内皮細胞化学走性の５０％を誘導するのに必要な培地の濃度を、１ミリリットルあたり４．０から０．３μｇに下げた。これら細胞の新脈管形成活性に対してわずかに貢献するだけのＶＥＧＦの中和は、低酸素コンディョニング培地の脈管形成活性を下げなかったが、ＰＥＤＦの中和は通常酸素の腫瘍培地を低酸素細胞に由来する培地の脈管形成性の程度にした（図１５Ｃ）。これらのインビトロ実験に一致して、１２のヒト網膜芽腫病理検体のうちの１２に存在する腫瘍細胞がＰＥＤＦについて染色されず、恐らくこれは部分的には腫瘍環境における限定された酸素により（Ｇｕｌｌｅｄｇｅａｎｄ Ｄｅｗｈｉｒｓｔ，１９９６，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１６：７４１）、一方、隣接する正常な網膜は陽性であった。
【０１８８】
まとめると、ＰＥＤＦは酸素が限られている時には新脈管形成の許容的環境を（腫瘍および網膜症におけるように）、そして酸素濃度が正常または高い時は阻害的環境を作ることにより、目の血管成長の調節に寄与しているらしい。
【０１８９】
ＰＥＤＦの高い効力およびＰＥＤＦが作用することができる広い範囲の新脈管形成インデューターを考慮すると、ＰＥＤＦは病理的な目の新生血管形成ならびに網膜芽腫に有用な治療薬となることが示され、ここでＰＥＤＦの細胞分化を誘導し（Ｔｏｍｂｒａｎ−Ｔｉｎｋ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｅｘｐ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．５３：４１１；Ｓｔｅｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：１５２６）、そして新脈管形成を阻害する二重活性が特に効果的である。
実施例１０
ここで与えるデータは、ＰＥＤＦを用いた全身処置による虚血性網膜症の改善を示す。
【０１９０】
網膜症は、７日齢のマウスをその母親と酸素テントに置き、そして動物を７５％酸素／２５％窒素の環境に１２日まで維持することにより、Ｃ５７／ＢＬ６マウスに誘導した。１２日に動物をテントから取り出し、そして周囲環境（２１％酸素）に置いた。１２日から１６日まで、子には１日１回、１００μｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）賦形剤、または１１．２μｇもしくは２２．４μｇのＰＥＤＦ（ＰＢＳ中）のいずれかを腹腔注射することにより処置した。子はメタファンで安楽死させ、そして１ｍｌの固定剤（４％パラホルムアルデヒド／１００ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２）／４％シュクロース）を心臓の左心室を通して潅流した。目を摘出し、そして固定剤中に置き、パラフィンに包埋し、そして組織検査にかけた。目の断面を作成し、ヘマトキシリン−フロキシン−サファリン（ＨＰＳ）で染色し、そして角膜、レンズ、網膜および視神経を含む１つの断面中の網膜の内部制限膜（ｉｎｎｅｒ ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ）をわたる内皮細胞核の数を計数した。図１６ＡはＰＢＳ処置動物の目の網膜症を具体的に説明し、箱は低出力画像における網膜の内部制限膜を貫通した脈管の束を囲んでいる。この脈管の束の高出力における画像を図１６Ｂに示す。図１６Ｃおよび１６Ｄは、ＰＥＤＦ処置マウスの目を具体的に説明するが、脈管の束は存在しない。内皮細胞核の＃を定量した（表３）。ＰＥＤＦ処置動物は、網膜の内部制限膜をわたった内皮細胞に有意な減少があり、そして用量／応答関係を示すことができた（図１７）。
【０１９１】
【表２】
2004516001.tif 000005
【０１９２】
本明細書で述べる各特許、特許出願および公報は、引用により本明細書に編入する。
【０１９３】
本発明を具体的態様について開示したが、本発明の他の態様および変更も、本発明の精神および範囲から逸脱することなく当業者により考案され得る。前述の特許請求の範囲は、そのようなすべての態様および均等な変更態様を含む。
【図面の簡単な説明】
【図１】
大きなおよび小さい血管およびヒトおよびウシ種に由来する内皮細胞の移動を阻害するＰＥＤＦの能力を具体的に説明する。
【図２】
図２Ａ−２Ｄから成り、血管内皮細胞以外の細胞の移動を阻害する種々のＰＥＤＦ用量の無能力をグラフで表すことにより、ＰＥＤＦの血管内皮に対する特異性を具体的に説明する。図２Ａは、ヒトの上皮に由来するＷＩ−３８細胞に関するデータを表す。図２Ｂはヒトの包皮繊維芽細胞に関するデータを表す。図２Ｃはヒトの血管平滑筋細胞に関するデータを表す。図２Ｄはヒトの好中球に関するデータを表す。
【図３】
塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＥＤＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）および酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）を含む新脈管形成の様々なインデューサーに向かう毛細管内皮細胞の移動を防止するＰＥＤＦの能力を示すグラフである。
【図４】
完全長ＰＥＤＦ（［書き込んだ丸］四角）の抗新脈管形成活性を表す用量応答曲線のグラフであり、ＰＥＤＦがナノモル下の濃度で毛細管内皮細胞のｂＦＧＦへ向かう移動の阻害において活性であり、そして新脈管形成の別のインヒビターであるアンギオスタチン（［空の］丸）よりも活性であることを示す。
【図５】
Ｃ−末端から５ｋＤａが無い短縮化ＰＥＤＦポリペプチドの抗新脈管形成活性を表す用量応答曲線であり、このＰＥＤＦのフラグメントが完全な活性を保持していることを示す。
【図６】
図６Ａおよび６Ｂから成り、完全長ＰＥＤＦのアミノ酸配列（配列番号１）、および完全長ＰＥＤＦをコードする核酸配列（配列番号２）である。自然に存在する多形により、アミノ酸レベルでアミノ酸残基９７および９８はＥＱまたはＤＥであることができ、そしてＤＮＡレベルで、これらのアミノ酸をコードする対応するヌクレオチドはしだかってＧＡＧ ＣＡＧまたはＧＡＣ ＧＡＧである。
【図７】
図７Ａおよび７Ｂから成り、ＰＥＤＦに由来する種々の短縮化ペプチドが新脈管形成に及ぼす効果を表す２つのグラフである。
【図８】
図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃから成り、ＰＥＤＦで処置した動物から得た皮膚切片の一連の顕微鏡写真の像であり、ここでは毛包を表す。ヌードマウスの皮下で成長しているヒトＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）神経芽腫に、２ｇの精製ＰＥＤＦを４日間連続して２〜３カ所／腫瘍に注射した。５日目に、毛が処置した腫瘍上に成長していることが認められた。組織切片（ＰＥＤＦ処置した図８Ｂおよび８Ｃを参照にされたい）は、賦形剤のみ（ＰＢＳ−処置した図８Ａ）で処置した腫瘍の上にある皮膚に比べて、３倍上昇した毛包密度を表した。毛包密度における同様の上昇が、精製ＰＥＤＦの注射後に腫瘍の不存在下で見られた。
【図９】
図９Ａおよび９Ｂから成り、細胞を精製したＰＥＤＦの示した濃度で２４時間処置した時、培養したヒトの神経芽腫細胞（図９ＡのＳＫ−Ｎ−ＢＥ、および図９ＢのＳＫ−Ｎ−ＳＨ）の増加した分化を表す一連のグラフである。下向きの矢印は処理した細胞の５０％に分化を誘導した用量を示す。
【図１０】
図１０Ａ−１９Ｃから成り、バッファーで（対照、図１０Ａ）、ＰＥＤＦで（図１０Ｂ）、または中和抗−ＰＥＤＦ抗体の存在下でのＰＥＤＦで（図１０Ｃ）、インビトロで処理した培養したヒトＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）神経芽腫細胞の一連の顕微鏡写真である。分化を示す高い頻度の突起の突出が、図１０Ｂにのみ見られる。
【図１１】
図１１Ａ−１１Ｅから成り、賦形剤のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ；図１１Ａおよび１１Ｂ）を注射したヌードマウス、またはヒトＰＥＤＦを注射したヌードマウス（図１１Ｃ、１１Ｄおよび１１Ｅ）で成長するヒトＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）神経芽腫の一連の顕微鏡写真である。神経芽腫は固定し、そして分化の指標であるニューロフィラメントタンパク質について染色した。劇的に上昇した染色、したがって分化が処置した腫瘍で見られた。図１１Ｃでは分化がＰＥＤＦを注射した針の跡に沿って明らかに存在する（中央上部の明らかな方形）。
【図１２】
図１２Ａ−１２Ｃから成り、培養した内皮細胞の移動に及ぼす精製したＰＥＤＦの阻害活性、およびヒトの硝子体液および角膜抽出物の抗新脈管形成活性に関するＰＥＤＦの要件を表す一連のグラフである。図１２Ａ：ＷＥＲＩ−Ｒｂ−１７Ｒ（Ｘｕ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：２８８１）培地から精製したＰＥＤＦ（０．１ｇ／ｍｌ）は単独で、または組換えＰＥＤＦに対する抗体（抗−ＥＰＣ−１；２０ｇ／ｍｌ）またはＰＥＤＦペプチドに対する抗体（抗−ＰＥＤＦ；１ｇ／ｍｌ）と組み合わせて、ウシの毛細管内皮細胞の抗新脈管形成ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）に向かう移動を阻害する能力について試験した。ＰＥＤＦ抗ペプチド抗体（抗−ＰＥＤＦ）はＰＥＤＦアミノ酸３２７−３４３を含有するペプチドに対してウサギで生成し、カサガイヘモシアニンに結合し、そしてペプチドカラムでアフィニティ精製した。細菌組換えＰＥＤＦ／ＥＰＣ−１に対するポリクローナル抗血清（抗−ＥＰＣ−１）をＤｉＰａｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，により記載され（１９９５，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２２０：１７８）、そして抗新脈管形成タンパク質であるアンギオテンシンはＯ’Ｒｅｉｌｌｙ，ｅｔ ａｌ．，（１９９４，Ｃｅｌｌ ７９：３１５）に記載されている。購入した試薬は、中和抗ＶＥＧＦ（ジェンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）、ＴＧＦに対するｐａｎ抗体、およびリソホスファチジン酸（シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、セントルイス、モンタナ州）を除くすべての新脈管形成インデューサー（Ｒ＆Ｄ システムズ、ミネアポリス、ミネソタ州）を含んだ。すべてのタンパク質および抗体は生物学アッセイで使用する前にＰＢＳに対して徹底的に透析した。移動アッセイは、ウシ腎近傍毛細管内皮細胞またはヒト皮膚の微小血管内皮細胞（クローンテックス社、サンディエゴ、 カリフォルニア州）を用いて記載されているように（Ｐｏｌｅｒｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４：４４０）、各サンプルについて４連で行った。多数の実験を合わせるために、バックグラウンド移動（Ｂｋｇｄ）は最初に賦形剤（０．１％ウシ血清アルブミン）に向かう移動を引き算し、そしてデータはインデューサー単独に対する最大移動を１００％設定することにより標準化した。すべての実験は２〜５回繰り返した。統計はステューデントｔ試験で標準化する前に生のデータで行った。標準誤差は百分率に変換した。図１２Ｂ：増加する濃度でアンギオテンシン（［〇］丸印）または組換えＰＥＤＦ（［  ］四角）を図１２Ａのように試験した。ヒトＰＥＤＦ ｃＤＮＡはポリメラーゼ連鎖反応でＣＯＯＨ−末端ヒスチジン標識をコードするように工作し、ｐＣＥＰ４（インビトロゲン、カールスバッド、カリフォルニア州）にクローン化し、そしてヒトの胚性腎細胞にトランスフェクトした。組換えＰＥＤＦはＸｐｒｅｓｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロゲン、カールスバッド、カリフォルニア州）を用いてコンディショニングした培地から精製した。図１２Ｃ：示したように希釈したヒトの硝子体液およびヒトの角膜基質抽出物（ミリリットルあたり１０ｇのタンパク質で使用した）を、インデューサーであるＶＥＧＦ（０．１ｎｇ／ｍｌ）または抗−ＰＥＤＦ（１ｇ／ｍｌ）の存在下（あるいはＶＥＧＦおよび抗−ＰＥＤＦの両方の存在下）でアッセイした。ヒトの硝子体液は、目の疾患がない個体から得た３体の死体の目からぬいた。液体は使用するまで凍結した。新鮮な硝子体液はウシおよびマウスの目から得た。基質抽出物の調製には、角膜は付随する上皮、およびできるかぎり内皮を含まず、氷冷リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で徹底的に洗浄し、そして小さいフラグメントに切り刻み、これを０．５ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリドを含有するＰＢＳ中で２４時間インキューベーションした。抽出物を濾過滅菌し、−８０℃で保存し、そしてミリリットルあたり１０ｇの最終タンパク質濃度の移動アッセイで試験した。棒は、５回の別個の実験の平均の標準偏差（ＳＥＭ）を示す（図１２Ａ）。図１２Ｂおよび１２Ｃの場合は、１つの代表的実験からのデータを標準誤差を用いて示す。
【図１３】
図１３Ａおよび１３Ｂ−１から１３Ｂ−８から成り、精製したＰＥＤＦによる、および正常なヒトの硝子体および角膜に自然に存在するＰＥＤＦによる新生血管形成の阻害を表す表および一連の顕微鏡写真の像である。図１３Ａ：組換え（ｒＰＥＤＦ）または精製した（ｐＰＥＤＦ）ＰＥＤＦ（８ｎＭ）、ＰＥＤＦペプチド３２７−３４３（２００ｇ／ｍｌ）、非希釈硝子体液または角膜抽出物（ミリリットルあたり２００ｇのタンパク質で使用）を、賦形剤（ＰＢＳ）と含み、そして無血管のラット角膜へ移植する示したＨｙｄｒｏｎ ペレットへの添加を行った。陽性の応答として７日までに縁からペレットへ向かう血管の激しい内向きの成長が記録された（Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８：４４０）。記録された場合は、プロテインＡビーズに結合した抗−ＰＥＤＦを使用して、硝子体液および角膜抽出物からＰＥＤＦを除去した。図１３Ｂ：×１３倍率で示す図１３Ａからの角膜応答の代表的写真。ＰＥＤＦ抗ペプチド抗体（抗−ＰＥＤＦ）は、ＰＥＤＦアミノ酸３２７−３４３を含有するペプチドに対してウサギで生成し、カサガイヘモシアニンに結合し、そしてペプチドカラムでアフィニティ精製した。細菌組換えＰＥＤＦ／ＥＰＣ−１に対するポリクローナル抗血清（抗−ＥＰＣ−１）はＤｉＰａｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，により記載され（１９９５，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２２０：１７８）、そして抗新脈管形成タンパク質であるアンギオテンシンはＯ’Ｒｅｉｌｌｙ，ｅｔ ａｌ．，（１９９４，Ｃｅｌｌ ７９：３１５）に記載されている。購入した試薬は、中和抗ＶＥＧＦ（ジェンザイム、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）、ＴＧＦに対するｐａｎ抗体、およびリソホスファチジン酸（シグマ）を除くすべての新脈管形成インデューサー（Ｒ＆Ｄ システムズ、ミネアポリス、ミネソタ州）を含んだ。すべてのタンパク質および抗体は生物学アッセイで使用する前にＰＢＳに対して徹底的に透析した。
【図１４】
図１４Ａ−１４Ｆから成り、新生時マウスにおいて高酸素によるＰＥＤＦタンパク質発現の誘導を表す一連の顕微鏡写真の像である。網膜は、周囲温度に維持した（図１４Ａ、１４Ｃおよび１４Ｄ）、またはＰ７からＰ１２に７５％酸素に暴露した（図１４Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスから、出生後１２日（Ｐ１２）（図１４Ａおよび１４Ｂ）、ｐ１８（ｃ）、またはＰ２１（図１４Ｄ）に摘出し、そしてＰＥＤＦについて染色した。赤−茶色により示されるＰＥＤＦの蓄積（矢じり）に注目されたい。図１４Ｄに直接隣接する対照切片は、第１抗体無し（図１４Ｅ）またはＰＥＤＦペプチド３２７−３４３を含む第１抗体（図１４Ｆ）のプレインキューベーション後に染色された。図１４Ａに示す網膜層は網膜色素上皮（ＲＰＥ）、外核層（ＯＮＬ）、内核層（ＩＮＬ）、およびガングリオン細胞層（ＧＣＬ）を含む。マウスの目は摘出してから１〜５分内にホルマリンで固定した。免疫染色のために、パラフィン−包埋切片を抗−ＰＥＤＦとインキューベーションし、そしてＡＢＣ法（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ；ベクターラボズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）、ベーリンガム、カリフォルニア州）で視覚化した。尺度棒、２５ｍ。ＰＥＤＦ抗ペプチド抗体（抗−ＰＥＤＦ）は、ＰＥＤＦアミノ酸３２７−３４３およびアミノ酸５５−７１を含有する２つのペプチドに対してウサギで生成し、カサガイヘモシアニンに結合した。これをアミノ酸３２７−３４３を含むペプチドを含有するカラムでアフィニティ精製した。すべてのタンパク質および抗体は生物学アッセイで使用する前にＰＢＳに対して徹底的に透析した。
【図１５】
図１５Ａ−１５Ｃから成り、培養した網膜芽腫細胞中の低酸素が誘導するＰＥＤＦタンパク質のダウン−レギュレーションを表すイムノブロットの像およびグラフである。図１５Ａ：３種のＲｂ−陰性細胞系（ＷＥＲＩ−Ｒｂ−２７，Ｙ７９およびＷＥＲＩ−Ｒｂ−１；すべてはメリーランド州、ロックビルのアメリカンタイプカルチャーコレクションから）および１つのＲｂ−陽性系（ＷＥＲＩ−Ｒｂ−２７Ｒ）（Ｘｕ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：４４８１）の培養からの培地中に存在するＰＥＤＦのイムノブロット分析。細胞は正常酸素（Ｎ；２１％Ｏ２）、低酸素（Ｈ；０５％Ｏ２）、またはＣｏＣｌ２（Ｃｏ；１００Ｍ）中で維持し、そして無血清培地を等しい数の細胞から４８時間にわたり集めた。レーンあたり５ｇのタンパク質を含有するブロットを抗−ＰＥＤＦで釣り上げ、そしてＥＣＬで発色させた（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、アーリントンハイツ、イリノイ州）。図１５Ｂ：低酸素に２４〜４８時間暴露した後のＷＥＲＩ−Ｒｂ−２７細胞から単離した全細胞性ＲＮＡ（レーンあたり１０ｇ）のノーザンブロット。ブロットは１．５ｋｂの完全長ＰＥＤＦ ｃＤＮＡまたは添加を制御するための８１９−塩基対のアクチンプローブを用いて釣り上げた。数はデンシトメトリーにより測定したＰＥＤＦ対−アクチンｍＲＮＡレベルの比率を示す。図１５Ｃ：正常または低酸素ＷＥＲＩ−Ｒｂ−１細胞に由来する培地（ミリリットルあたり２ｇの総タンパク質量で使用）を、ヒトの皮膚の微小血管内皮細胞の移動を誘導させる能力について試験した。移動アッセイはウシ腎近傍毛細管内皮細胞またはヒトの皮膚の微小血管内皮細胞（クローンテックス、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いて、記載されているように（Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８：４４０）、各サンプルに関して４連で行った。多数の実験を合わせるために、バックグラウンド移動（Ｂｋｇｄ）は最初に賦形剤（０．１％ウシ血清アルブミン）に向かう移動を引き算し、そしてデータはインデューサー単独に対する最大移動を１００％設定することにより標準化した。すべての実験は２〜５回繰り返した。統計はステューデントｔ試験で標準化する前に生のデータで行った。標準誤差は百分率に変換した。アッセイには培地単独、または培地に中和抗−ＰＥＤＦ（１ｇ／ｍｌ）または抗−ＶＥＧＦ（２０ｇ／ｍｌ）を加えたものを含んだ。ＶＥＧＦが誘導する移動は、抗−ＶＥＧＦにより完全に排除され、そして抗−ＰＥＤＦにより影響を受けなかった。ＰＥＤＦ抗ペプチド抗体（抗−ＰＥＤＦ）は、ＰＥＤＦアミノ酸３２７−３４３を含有するペプチドに対してウサギで生成し、カサガイヘモシアニンに結合し、そしてペプチドカラムでアフィニティ精製した。ＶＥＧＦが誘導する移動は、抗−ＶＥＧＦにより完全に排除され、そして抗−ＰＥＤＦにより影響を受けなかった。単独で試験した時、いずれの抗体も移動に影響しなかった。６７細胞に等しい１００％が１０高い出力の場で移動した。
【図１６】
ば１６Ａ−１６Ｄから成り、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおいて、高酸素が誘導する網膜症での血管の成長に及ぼすＰＥＤＦの効果を表す一連の顕微鏡写真の像である。図１６Ａおよび１６ＢはＰＢＳ、賦形剤で処理した。図１６Ｃおよび１６ＤはＰＥＤＦで処理した。
【図１７】
マウスを対象とした網膜症とＰＥＤＦ処置の間の用量応答関係を表すグラフである。
【図１】
2004516001.tif 000006
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004516001.tif 000127
【国際調査報告】
2004516001.tif 000128
2004516001.tif 000129