(57)【要約】本発明は修飾されたナトリウム排泄増加性化合物およびその結合体を開示する。特に、結合形態のｈＢＮＰは、そこに結合している少なくとも１個の修飾部分を含有して提供される。この修飾ナトリウム排泄増加性化合物結合体は、未修飾の対向ナトリウム排泄増加性化合物に比較し、ｃＧＭＰ産生を刺激する活性を保有し、ＮＰＲ−Ａレセプターに対する結合活性を保有し、および或る態様では、循環系中での改善された半減期を保有する。経口、非経口、皮下および血管内投与形態の当該化合物および結合体は、心臓疾患、特に充血性心不全の処置および／または治療用に製造することができる。種々の長さおよび形状を有するオリゴマー構造体を含有する修飾部分がまた、開示されている。天然配列以外であるアミノ酸配列を有する、当該ナトリウム排泄増加性化合物の類縁体がまた、開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）ナトリウム排泄増加性分子ＮＰＲ−Ａ結合部位、および
（ｉｉ）少なくとも１個の修飾部分結合部位
を含有する生物学的に活性なナトリウム排泄増加性化合物；および
（ｂ）上記修飾部分結合部位に結合されている少なくとも１個の修飾部分；
を含有するナトリウム排泄増加性化合物結合体であって、このナトリウム排泄増加性化合物結合体は、対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物に対する酵素による分解に比較して増大した耐性、増大した循環半減期、増加した生体利用性、および延長された効果持続性からなる群から選択される１種または２種以上の利点を示す、上記ナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項２】
対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物に比較し、治療的に格別の割合でｃＧＭＰ刺激活性を保有することをさらに特徴とする、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項３】
対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物のｃＧＭＰ刺激活性の少なくとも３０％を保有することをさらに特徴とする、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項４】
対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物のｃＧＭＰ刺激活性の少なくとも５０％を保有することをさらに特徴とする、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項５】
対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物のｃＧＭＰ刺激活性の少なくとも７０％を保有することをさらに特徴とする、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項６】
対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物のｃＧＭＰ刺激活性の少なくとも９０％を保有することをさらに特徴とする、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項７】
対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物よりもさらに親水性であることをさらに特徴とする、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項８】
対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物よりもさらに両親媒性であることをさらに特徴とする、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項９】
対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物よりもさらに親油性であることをさらに特徴とする、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項１０】
修飾部分がアルキル基からなるものではない、請求項９に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項１１】
対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物よりも大きいプロテアーゼ分解耐性であることをさらに特徴とする、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項１２】
ナトリウム排泄増加性化合物が下記配列を含有する、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体：
Ａ1ＰＸ1ＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＸ2ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＸ3ＶＬＲ（配列番号：    ）
（ここで、
Ａ1は、ナトリウム排泄増加性ペプチドに天然で存在するアミノ酸または一連のアミノ酸であり、
Ｘ1、Ｘ2およびＸ3は、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＧｌｙからなる群から独立して選択され、およびＸ1、Ｘ2およびＸ3の少なくとも１個はＬｙｓである）。
【請求項１３】
ナトリウム排泄増加性化合物が、脳ナトリウム排泄増加性ペプチド、動脈ナトリウム排泄増加性ペプチド、Ｃ−型ナトリウム排泄増加性ペプチドまたはデンドロアスピス（dendroaspis）ナトリウム排泄増加性ペプチドのペプチドまたは生物学的に活性なペプチドセグメントを含有する、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項１４】
ナトリウム排泄増加性化合物が、
（ａ）アミノ酸配列：
Ｘ1−Ｃ1ＦＧＲＸ2ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ2−Ｘ3（配列番号：    ）
（ここで、
Ｘ1は、存在していてもよく、また存在する場合、１〜１０個のアミノ酸を有するアミノ酸配列であり、
Ｘ2は、Ｇｌｙ、ＡｒｇまたはＬｙｓであり、および
Ｘ3は、存在していてもよく、また存在する場合、１〜１０個のアミノ酸を有するアミノ酸配列である）、
（ｂ）ループを形成するためのＣ1−Ｃ2間のジスルフィド結合、
を含有する、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項１５】
Ｘ1がＡｒｇまたはＧｌｙである、請求項１４に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項１６】
Ｘ1が下記群から選択される、請求項１４に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体：
（ａ）Ｌｙｓ；
（ｂ）Ｇｌｙ；
（ｃ）Ａｒｇ；
（ｄ）ＳＧ−（配列番号：    ）、ＧＳＧ−（配列番号：    ）、ＱＧＳＧ−（配列番号：    ）、ＶＱＧＳＧ−（配列番号：    ）、ＭＶＱＧＳＧ−（配列番号：    ）、ＰＫＭＶＱＧＳＧ−（配列番号：    ）、およびＳＰＫＭＶＱＧＳＧ−（配列番号：    ）；
（ｅ）ＬｙｓのＧｌｙへの置換およびＬｙｓのＡｒｇへの置換からなる群から選択される置換を含有する（ｄ）のｈＢＮＰセグメント；
（ｆ）ＧｌｙのＬｙｓへの置換およびＡｒｇのＬｙｓへの置換からなる群から選択される置換を含有する（ｄ）のｈＢＮＰセグメント；
（ｇ）挿入Ｌｙｓを含有する（ｄ）のｈＢＮＰセグメント；
（ｈ）ナトリウム排泄増加性ペプチドのＮ−末端テイルのＣ−末端セグメントおよびＮ−末端テイル；
（ｉ）ＬｙｓのＧｌｙへの置換およびＬｙｓのＡｒｇへの置換からなる群から選択される置換を含有する（ｈ）のＣ−末端セグメントおよびＮ−末端テイル；
（ｊ）ＬｙｓのＧｌｙへの置換およびＬｙｓのＡｒｇへの置換からなる群から選択される置換を含有する（ｈ）のＣ−末端セグメントおよびＮ−末端テイル；
（ｋ）挿入Ｌｙｓを含有する（ｈ）のＣ−末端セグメントおよびＮ−末端テイル。
【請求項１７】
Ｘ3が下記群から選択される、請求項１４に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体：
（ａ）Ｌｙｓ；
（ｂ）Ｇｌｙ；
（ｃ）Ａｒｇ；
（ｄ）ｈＢＮＰセグメント  ＫＶ（配列番号：    ）、ＫＶＬ（配列番号：    ）、ＫＶＬＲ（配列番号：    ）、ＫＶＬＲＲ（配列番号：    ）、およびＫＶＬＲＲＨ（配列番号：    ）；および
（ｅ）ＬｙｓのＧｌｙへの置換およびＬｙｓのＡｒｇへの置換からなる群から選択される置換を含有する（ｄ）のｈＢＮＰセグメント；
（ｆ）ＧｌｙのＬｙｓへの置換およびＡｒｇのＬｙｓへの置換からなる群から選択される置換を含有する（ｄ）のｈＢＮＰセグメント；
（ｇ）挿入Ｌｙｓを含有する（ｄ）のｈＢＮＰセグメント；
（ｈ）ナトリウム排泄増加性ペプチドのＮ−末端セグメントおよびＣ−末端テイル；
（ｉ）ＬｙｓのＧｌｙへの置換およびＬｙｓのＡｒｇへの置換からなる群から選択される置換を含有する（ｈ）のＣ−末端テイルのＮ−末端セグメントおよびＣ−末端テイル；
（ｊ）ＬｙｓのＧｌｙへの置換およびＬｙｓのＡｒｇへの置換からなる群から選択される置換を包含する（ｈ）のＣ−末端テイルのＮ−末端セグメントおよびＣ−末端テイル；
（ｋ）挿入Ｌｙｓを含有する（ｈ）のＣ−末端テイルのＮ−末端セグメントおよびＣ−末端テイル。
【請求項１８】
ナトリウム排泄増加性化合物が、
（ａ）ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＫＶＬ（配列番号：    ）；
（ｂ）ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ（配列番号：    ）；および
（ｃ）ＬｙｓのＧｌｙへの置換およびＬｙｓのＡｒｇへの置換からなる群から選択される置換を含有するセグメント（ａ）または（ｂ）；
からなる群から選択される配列を含有する、請求項１４に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項１９】
Ｘ1がｈＢＮＰのＮ−末端から１〜９個のアミノ酸残基配列を含有する、請求項１４に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項２０】
Ｘ1が、ＳＰＸ3ＭＶＱＧＳＧ（配列番号：    ）を含有し、およびＸ2が修飾部分結合部位を有する、請求項１４に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項２１】
Ｘ3が、ｈＢＮＰのＣ−末端から１〜６個のアミノ酸残基配列を含有する、請求項１４に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項２２】
Ｘ3が、ＫＶＬＲＲＨ（配列番号：    ）、ＫＶＬＲＲ（配列番号：    ）、ＫＶＬＲ（配列番号：    ）、ＫＶＬ、ＫＶまたはＫを含有する、請求項１４に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項２３】
ナトリウム排泄増加性化合物が、Ｌｙｓ３Ａｒｇ、Ｌｙｓ１４Ａｒｇ、Ａｒｇ３０Ｌｙｓ、Ｌｙｓ２７ＡｒｇおよびＡｒｇ３１Ｌｙｓからなる群から選択される１種または２種以上の変異を有する天然ｈＢＮＰ配列（配列番号：    ）を含有する、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項２４】
ナトリウム排泄増加性化合物が１個または２個以上の挿入または欠失を有する天然ｈＢＮＰ配列（配列番号：    ）を含有する、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項２５】
ナトリウム排泄増加性化合物が天然ｈＢＮＰアミノ酸配列（配列番号：    ）およびＮ−末端またはＣ−末端Ｌｙｓを含有する、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項２６】
（ａ）ナトリウム排泄増加性化合物をコードする２種または３種以上のアミノ酸配列を含有するマルチペプチドを含有し；
（ｂ）任意に、各セットまたは隣接ナトリウム排泄増加性化合物をコードする配列間にスペーサー配列を含有し；
（ｃ）任意に、マルチペプチドのどちらかの末端または両末端にエクステンションを有し、このエクステンションは１個または２個以上のアミノ酸を含有する；
ことをさらに特徴とする、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項２７】
ナトリウム排泄増加性ペプチド単位がそれぞれ、ｈＢＮＰ（配列番号：    ）またはその生物学的に活性な類縁体、セグメントまたはセグメント類縁体を包含する、請求項２６に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項２８】
ナトリウム排泄増加性化合物が天然ＢＮＰからなる、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項２９】
ナトリウム排泄増加性化合物が天然ｈＢＮＰからなる、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項３０】
ナトリウム排泄増加性化合物が天然ＡＮＰからなる、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項３１】
ナトリウム排泄増加性化合物がイヌＢＮＰからなる、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項３２】
ナトリウム排泄増加性化合物がウロジラチン（urodilatin）からなる、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項３３】
ナトリウム排泄増加性化合物がＤＮＰからなる、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項３４】
ナトリウム排泄増加性化合物が下記アミノ酸配列を含有する、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体：
Ｘ1ＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＸ2ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＸ3（配列番号：    ）
（ここで、Ｘ1、Ｘ2およびＸ3はそれぞれ、Ｌｙｓ、ＧｌｙおよびＡｒｇからなる群から独立して選択され、ただしＸ1、Ｘ2およびＸ3の少なくとも１個はＡｒｇまたはＧｌｙである）。
【請求項３５】
配列が、
（ａ）ＳＰＫ、ＰＫおよびＫからなる群から選択されるエクステンション、Ｘ1へのＮ−末端、；および／または
（ｂ）−ＶＬＲＲＨ（配列番号：    ）、−ＶＬＲＲ（配列番号：    ）、−ＶＬＲ、−ＶＬおよび−Ｖからなる群から選択されるエクステンション、Ｘ3へのＣ−末端；
を含有する、請求項３４に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体
【請求項３６】
Ｘ1がＬｙｓであり、Ｘ2がＡｒｇであり、およびＸ3がＡｒｇである、請求項３４に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体
【請求項３７】
ナトリウム排泄増加性化合物が下記アミノ酸配列を含有する、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体：
ＣＦＧＲＸ1ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＸ2（配列番号：    ）
（ここで、Ｘ1およびＸ2は、修飾部分にカプリングされている修飾部分結合部位を含有する）。
【請求項３８】
Ｘ1が修飾部分にカプリングされているＬｙｓを含有する、請求項３７に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項３９】
Ｘ2が修飾部分にカプリングされているＬｙｓを含有する、請求項３７に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項４０】
修飾部分結合部位が、天然または非天然アミノ酸側鎖、ナトリウム排泄増加性化合物のＮ−末端およびナトリウム排泄増加性化合物のＣ−末端からなる群から選択される部分を包含する、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項４１】
修飾部分結合部位が、Ｌｙｓ側鎖である、請求項４０に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項４２】
請求項３７に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体が１個のみの修飾部分を含有する、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項４３】
（ａ）ナトリウム排泄増加性化合物がｈＢＮＰのＬｙｓ3〜Ｃｙｓ26セグメントおよびこのセグメントのＣｙｓ10をＣｙｓ26にカプリングするジスルフィド結合を含有し（配列番号：    ）；
（ｂ）一個の修飾部分がＬｙｓ3の部位でナトリウム排泄増加性化合物にカプリングされている（配列番号：    ）；
請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項４４】
ナトリウム排泄増加性化合物が、ｈＢＮＰのＣｙｓ10〜Ｃｙｓ26セグメントおよびＣｙｓ10〜Ｃｙｓ26をカプリングするジスルフィド結合を含有し、当該ナトリウム排泄増加性化合物結合体は当該セグメントのＬｙｓ14に、そこにカプリングされている一個の修飾部分を有する、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項４５】
ナトリウム排泄増加性化合物がｈＢＮＰのＣｙｓ10〜Ｌｙｓ27セグメント（配列番号：    ）を含有し、当該ナトリウム排泄増加性化合物は当該セグメントのＬｙｓ27において、そこにカプリングされている１個の修飾部分を有するモノ−結合体である、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項４６】
ナトリウム排泄増加性化合物がｈＢＮＰのＣｙｓ10〜Ｈｉｓ32セグメントおよび当該セグメントのＣｙｓ10〜Ｃｙｓ26をカプリングするジスルフィド結合を含有し、当該ナトリウム排泄増加性化合物は当該セグメントのＬｙｓ27において、そこにカプリングされている１個の修飾部分を有するモノ−結合体である、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項４７】
ナトリウム排泄増加性化合物がｈＢＮＰのＣｙｓ10〜Ｃｙｓ26セグメントおよび当該セグメントのＣｙｓ10〜Ｃｙｓ26をカプリングするジスルフィド結合を含有し、当該ナトリウム排泄増加性化合物は当該化合物のＮ−末端において、そこにカプリングされている１個の修飾部分を有するモノ−結合体である、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項４８】
（ａ）ナトリウム排泄増加性化合物がｈＢＮＰアミノ酸配列からなり；および
（ｂ）ナトリウム排泄増加性化合物結合体が、
（ｉ）ｈＢＮＰアミノ酸配列のＬｙｓ3においてナトリウム排泄増加性ペプチドにカプリングされている修飾部分；および
（ｉｉ）ｈＢＮＰアミノ酸配列のＬｙｓ14においてナトリウム排泄増加性ペプチドにカプリングされている修飾部分；
を含有するジ−結合体である；
請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項４９】
（ａ）ナトリウム排泄増加性化合物がｈＢＮＰであり；および
（ｂ）ナトリウム排泄増加性化合物結合体が、
（ｉ）ｈＢＮＰアミノ酸配列のＬｙｓ3においてナトリウム排泄増加性ペプチドにカプリングされている修飾部分；および
（ｉｉ）ｈＢＮＰアミノ酸配列のＬｙｓ27においてナトリウム排泄増加性ペプチドにカプリングされている修飾部分；
を含有するジ−結合体である；
請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項５０】
ナトリウム排泄増加性化合物配列がＮ−末端テイルを含有し、および修飾部分が当該Ｎ−末端テイルに位置しているアミノ酸にカプリングされている、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項５１】
Ｎ−末端テイルがナトリウム排泄増加性ペプチドのＮ−末端テイルの天然配列またはナトリウム排泄増加性ペプチドのＮ−末端テイルのＣ−末端セグメントからなる、請求項５０に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項５２】
修飾部分が下記式を有する、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体：
2006515579.tif 000072
（式中、
各Ｃは、独立して選択され、ｍ個の炭素を有するアルキル基であり、ｍは１〜２０であり；および
各ＰＡＧは、独立して選択され、ｎ個の付属単位を有するポリアルキレングリコール基であり、ｎは２〜２５であり；
各Ｘは、独立して選択され、結合性基である）。
【請求項５３】
ｍが１〜１８である、請求項５２に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項５４】
ｍが１〜１６である、請求項５２に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項５５】
ｎが２〜２０である、請求項５２に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項５６】
ｎが２〜１５である、請求項５２に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項５７】
ｎが２〜１０である、請求項５２に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項５８】
各Ｘが−Ｃ−、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、および−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−からなる群から独立して選択される、請求項５２に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項５９】
修飾部分がナトリウム排泄増加性化合物を対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物よりもさらに親油性にする、請求項５２に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項６０】
修飾部分がナトリウム排泄増加性化合物を対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物よりもさらに親水性にする、請求項５２に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項６１】
修飾部分がナトリウム排泄増加性化合物を対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物よりもさらに両親媒性にする、請求項５２に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項６２】
修飾部分が下記式を有する、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体：
2006515579.tif 000073
（式中、
ＰＡＧは、ｎ個の付属単位を有するポリアルキレングリコール基であり、ｎは２〜２５であり；
Ｘは、ＯまたはＮであり；および
各ｏは、独立して選択され、１〜１５である）。
【請求項６３】
ｎが２〜２０である、請求項６２に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項６４】
ｎが２〜１５である、請求項６２に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項６５】
ｎが２〜１０である、請求項６２に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項６６】
各ｏが独立して選択され、１〜１３である、請求項６２に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項６７】
各ｏが独立して選択され、１〜９である、請求項６２に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項６８】
各ｏが独立して選択され、１〜６である、請求項６２に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項６９】
各Ｘが−Ｏ−である、請求項６２に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項７０】
修飾部分がナトリウム排泄増加性化合物を対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物よりもさらに親油性にする、請求項６２に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項７１】
修飾部分がナトリウム排泄増加性化合物を対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物よりもさらに親水性にする、請求項６２に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項７２】
修飾部分がナトリウム排泄増加性化合物を対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物よりもさらに両親媒性にする、請求項６２に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項７３】
修飾部分が下記式を有する、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体：
2006515579.tif 000074
（式中、
各Ｃは、独立して選択され、ｍ個の炭素を有するアルキル基であり、ｍは１〜２０であり；および
各ＰＡＧは、独立して選択され、ｎ個の付属単位を有するポリアルキレングリコール基であり、ｎは２〜２５であり；
各Ｘは、独立して選択され、結合性基であり；
ｏは、１〜１５である）。
【請求項７４】
ｍが１〜１８である、請求項７３に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項７５】
ｍが１〜１６である、請求項７３に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項７６】
ｎが２〜２０である、請求項７３に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項７７】
ｎが２〜１５である、請求項７３に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項７８】
ｎが２〜１０である、請求項７３に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項７９】
ｏが１〜１３である、請求項７３に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項８０】
ｏが１〜９である、請求項７３に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項８１】
ｏが１〜６である、請求項７３に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項８２】
各Ｘが−Ｃ−、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、および−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−からなる群から独立して選択される、請求項７３に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項８３】
修飾部分がナトリウム排泄増加性化合物を対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物よりもさらに親油性にする、請求項７３に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項８４】
修飾部分がナトリウム排泄増加性化合物を対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物よりもさらに親水性にする、請求項７３に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項８５】
修飾部分がナトリウム排泄増加性化合物を対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物よりもさらに両親媒性にする、請求項７３に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項８６】
修飾部分が直鎖状または分枝鎖状ポリアルキレングリコール基を含有する、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項８７】
修飾部分がアルキル基にカプリングした糖基を含有する、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項８８】
修飾部分が糖基をさらに含有する、請求項８７に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項８９】
ポリアルキレングリコール基がポリエチレングリコール基を包含する、請求項８６に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項９０】
ポリアルキレングリコール基が２〜２５個のポリアルキレングリコール付属単位を有する、請求項８６に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項９１】
ポリアルキレングリコール基が２〜２０個のポリアルキレングリコール付属単位を有する、請求項８６に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項９２】
ポリアルキレングリコール基が２〜１５個のポリアルキレングリコール付属単位を有する、請求項８６に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項９３】
ポリアルキレングリコール基が２〜１０個のポリアルキレングリコール付属単位を有する、請求項８６に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項９４】
修飾部分が直鎖状または分枝鎖状アルキル基をさらに含有する、請求項８６に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項９５】
修飾部分が糖基をさらに含有する、請求項９４に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項９６】
アルキル基が炭素１〜２０個を有する、請求項９４に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項９７】
アルキル基が炭素１〜１８個を有する、請求項９４に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項９８】
アルキル基が炭素１〜１６個を有する、請求項９４に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項９９】
アルキル基が、−Ｃ−、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、および−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−からなる群から選択されるリンカーによってポリアルキレングリコール基から分離されている、請求項９４に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項１００】
修飾部分がナトリウム排泄増加性化合物を対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物よりもさらに親油性にする、請求項９４に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項１０１】
修飾部分がポリアルキレングリコール基をアルキル基にカプリングする結合を含有し、この結合はインビボで加水分解性である、請求項９４に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項１０２】
修飾部分がナトリウム排泄増加性化合物にカプリングされている直鎖状または分枝鎖状ポリアルキレングリコール部分およびナトリウム排泄増加性化合物に対して遠位にある部位でポリアルキレングリコール部分にカプリングされている直鎖状または分枝鎖状アルキル基を含有する、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項１０３】
修飾部分がナトリウム排泄増加性化合物にカプリングされている直鎖状または分枝鎖状アルキル部分およびナトリウム排泄増加性化合物に対して遠位にある部位でアルキル部分にカプリングされている直鎖状または分枝鎖状ポリアルキレングリコール基を含有する、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項１０４】
修飾部分が表１のオリゴマー部分からなる群から選択される、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項１０５】
修飾部分がインビボで加水分解可能である結合によってナトリウム排泄増加性化合物にカプリングされている、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項１０６】
修飾部分が血液流中で加水分解可能である結合によってナトリウム排泄増加性化合物にカプリングされている、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項１０７】
修飾部分がインビボで非加水分解性である結合によってナトリウム排泄増加性化合物にカプリングされている、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項１０８】
修飾部分が血液流中で非加水分解性である結合によってナトリウム排泄増加性化合物にカプリングされている、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項１０９】
修飾部分がエステル、カーボネート、カルバメート、アミド、エーテルおよびアミンからなる群から選択される結合によってナトリウム排泄増加性化合物にカプリングされている、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項１１０】
修飾部分がインビボで加水分解可能であり、ペジル化（pegylated）ナトリウム排泄増加性化合物を生成する、請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項１１１】
修飾部分がインビボで加水分解可能であり、１〜６個のＰＥＧ単位を有する１種または２種以上のＰＥＧ部分を含有するペジル化ナトリウム排泄増加性化合物を生成する、請求項１１０に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項１１２】
請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体を含有する医薬製剤。
【請求項１１３】
腸内、非経口、経口、皮下、舌下、口腔、鼻、静脈内および筋肉内からなる群から選択される供給経路用に処方されている、請求項１１２に記載の医薬製剤。
【請求項１１４】
過剰レベルの細胞外液体を特徴とする状態の処置方法であって、その必要性を有する対象に医薬上で許容される量の請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体を投与することを包含する、上記方法。
【請求項１１５】
状態が充血性心不全を包含する、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
状態が慢性充血性心不全を包含する、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１７】
状態が急性充血性心不全を包含する、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１８】
ナトリウム排泄増加性化合物結合体が自己投与される、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１９】
ナトリウム排泄増加性化合物結合体が経口投与される、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２０】
ナトリウム排泄増加性化合物結合体が、腸内、非経口、経口、皮下、舌下、口腔、鼻、静脈内および筋肉内からなる群から選択される投与経路を経て投与される、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２１】
状態が高血圧である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２２】
請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体の製造方法であって、
（ａ）２個または３個以上のナトリウム排泄増加性化合物単位を含有するナトリウム排泄増加性ペプチドマルチペプチドを結合させ；
（ｂ）このナトリウム排泄増加性ペプチドマルチペプチドを分解させ、ナトリウム排泄増加性化合物結合体を生成し；
（ｃ）この分解されたナトリウム排泄増加性化合物結合体を酸化し、ナトリウム排泄増加性化合物結合体中に１個または２個以上のジスルフィド結合を形成させる；
ことを包含する、上記製造方法。
【請求項１２３】
ナトリウム排泄増加性化合物が、ｈＢＮＰのＣｙｓ10〜Ｃｙｓ26（配列番号：    ）を含有し、および工程１２２（ｃ）がＣｙｓ10とＣｙｓ26との間にジスルフィド結合を生成する、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体の製造方法であって、
（ａ）２個または３個以上のナトリウム排泄増加性化合物単位を含有するマルチペプチドナトリウム排泄増加性化合物を製造し；
（ｂ）このナトリウム排泄増加性ペプチドマルチペプチドを分解させ、ナトリウム排泄増加性ペプチド化合物を生成し；
（ｃ）このナトリウム排泄増加性化合物を結合させ、ナトリウム排泄増加性化合物結合体を生成し；
（ｄ）このナトリウム排泄増加性化合物結合体を酸化し、ナトリウム排泄増加性化合物結合体中に１個または２個以上のジスルフィド結合を形成させる；
ことを包含する、上記製造方法。
【請求項１２５】
ナトリウム排泄増加性化合物が、ｈＢＮＰのＣｙｓ10〜Ｃｙｓ26（配列番号：    ）を含有し、および工程１２２（ｃ）がＣｙｓ10とＣｙｓ26との間にジスルフィド結合を生成する、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
請求項１に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体の製造方法であって、
（ａ）２個または３個以上のナトリウム排泄増加性化合物単位を含有するマルチペプチドナトリウム排泄増加性化合物を製造し；
（ｂ）このナトリウム排泄増加性ペプチドマルチペプチドを分解させ、ナトリウム排泄増加性化合物を生成し；
（ｃ）この分解されたナトリウム排泄増加性化合物を酸化し、ナトリウム排泄増加性化合物中に１個または２個以上のジスルフィド結合を形成し；次いで
（ｄ）このナトリウム排泄増加性化合物を結合させる；
ことを包含する、上記製造方法。
【請求項１２７】
修飾されたプロ−ポリナトリウム排泄増加性ペプチド結合体であって、
（ａ）修飾部分結合部位およびＮＰＲ−Ａ結合部位を有する少なくとも１個のナトリウム排泄増加性ペプチド単位；
（ｂ）少なくとも１個のナトリウム排泄増加性ペプチド単位の修飾部分結合部位に結合されている少なくとも１個の修飾部分；
（ｃ）リーダー配列；および
（ｄ）リーダー配列を第一のナトリウム排泄増加性ペプチド結合体にカプリングする酵素により分解可能なスペーサー；
を含有する、上記修飾されたプロ−ポリナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項１２８】
少なくとも１個の修飾部分結合部位、ＮＰＲ−Ａ結合領域および天然ナトリウム排泄増加性ペプチドアミノ酸配列に比較し、そこに置換されている少なくとも１個のＬｙｓ残基を含有するナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体であって、上記置換Ｌｙｓ残基がアミノ酸修飾部分結合部位ではない、ナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
【請求項１２９】
１個または２個以上の置換Ｌｙｓ残基がＬｙｓ３Ｇｌｙ、Ｌｙｓ３Ａｒｇ、Ｌｙｓ１４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ１４Ａｒｇ、Ｌｙｓ２７Ｇｌｙ、またはＬｙｓ２７Ａｒｇからなる群から選択される置換を包含する、請求項１２８に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
【請求項１３０】
構造：
ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＸ1ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＸ2ＶＬＲＲＨ（配列番号：    ）
（ここで、Ｘ1はＬｙｓであり、およびＸ2はＬｙｓ以外であるか、またはＸ1はＬｙｓであり、およびＸ2はＬｙｓ以外であるであるか、またはＸ1およびＸ2はＬｙｓ以外である）
を含有する、請求項１２８に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
【請求項１３１】
Ｘ1がＬｙｓであり、およびＸ2がＡｒｇまたはＧｌｙであるか、またはＸ1がＬｙｓであり、およびＸ2がＡｒｇまたはＧｌｙであるか、またはＸ1およびＸ2が独立して選択され、ＡｒｇまたはＧｌｙである、請求項１３０に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
【請求項１３２】
構造：
ＣＦＧＲＸ1ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＸ2ＧＣ（配列番号：    ）
（ここで、Ｘ1は結合部位を含有していないアミノ酸であり、およびＸ2は修飾部分結合部位を含有するアミノ酸である）
を含有する、ナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
【請求項１３３】
Ｘ1がＡｒｇであり、およびＸ2がＬｙｓである、請求項１３２に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
【請求項１３４】
構造：
Ｘ1−ＣＦＧＲＸ3ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ−Ｘ2（配列番号：    ）
（ここで、Ｘ1は１〜１０個のアミノ酸を有するアミノ酸配列であり、Ｘ2は１〜１０個のアミノ酸を有するアミノ酸配列であり、およびＸ3はＬｙｓ以外である）
を有するナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
【請求項１３５】
Ｘ３がＡｒｇまたはＧｌｙである、請求項１３４に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
【請求項１３６】
Ｘ1がＳＰＹ1ＭＶＱＧＳＧ（配列番号：    ）であり、ここでＹ1は修飾部分結合部位を含有する、請求項１３４に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
【請求項１３７】
Ｘ1が、
（ａ）ナトリウム排泄増加性ペプチドのＮ−末端テイルおよびＮ−末端テイルのＣ−末端セグメント；
（ｂ）ＬｙｓのＧｌｙへの置換およびＬｙｓのＡｒｇへの置換からなる群から選択される置換を包含する（ａ）のＣ−末端セグメントおよびＮ−末端テイル；
（ｃ）ＧｌｙのＬｙｓへの置換およびＡｒｇのＬｙｓへの置換からなる群から選択される置換を包含する（ａ）のＣ−末端セグメントおよびＮ−末端テイル；
（ｄ）挿入Ｌｙｓを含有する（ａ）のＣ−末端セグメントおよびＮ−末端テイル；
からなる群から選択される、請求項１３４に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
【請求項１３８】
Ｘ2がＹ2ＶＬＲＲＨ（配列番号：    ）であり、ここでＹ2はＬｙｓ以外である、請求項１３４に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
【請求項１３９】
Ｙ2がＡｒｇである、請求項１３８に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
【請求項１４０】
Ｘ2が、
（ａ）ナトリウム排泄増加性ペプチドのＣ−末端テイルのＮ−末端セグメントおよびＣ−末端テイル；
（ｂ）ＬｙｓのＧｌｙへの置換およびＬｙｓのＡｒｇへの置換からなる群から選択される置換を包含する１３７（ａ）のＣ−末端テイルのＮ−末端セグメントおよびＣ−末端テイル；
（ｃ）ＧｌｙのＬｙｓへの置換およびＡｒｇのＬｙｓへの置換からなる群から選択される置換を包含する１３７（ａ）のＣ−末端テイルのＮ−末端セグメントおよびＣ−末端テイル；
（ｄ）挿入Ｌｙｓを含有する１３７（ａ）のＣ−末端テイルのＮ−末端セグメントおよびＣ−末端テイル；
からなる群から選択される、請求項１３４に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
【請求項１４１】
構造：
Ｘ1−ＣＦＧＲＸ3ＭＤＲＩＧＬＧＣ−Ｘ2（配列番号：    ）
（ここで、Ｘ1は１〜９個のアミノ酸を有するペプチドであり、Ｘ2は１〜６個のアミノ酸を有するペプチドであり、およびＸ3はＬｙｓ以外である）
を有するナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
【請求項１４２】
Ｘ3がＡｒｇまたはＧｌｙである、請求項１４０に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
【請求項１４３】
Ｘ1がＳＰＹ1ＭＶＱＧＳＧ（配列番号：    ）であり、ここでＹ1は修飾部分結合部位を含有する、請求項１４２に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
【請求項１４４】
Ｘ2がＹ2ＶＬＲＲＨ（配列番号：    ）であり、ここでＹ2はＬｙｓ以外である、請求項１４２に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
【請求項１４５】
Ｙ2がＡｒｇである、請求項１４４に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
【請求項１４６】
Ｘ3がＡｒｇであり、Ｘ1が配列ＳＰＫＭＶＱＧＳＧ（配列番号：    ）であり、およびＸ2が配列ＲＶＬである、請求項１４４に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
【請求項１４７】
構造：
Ｘ1−ＣＦＧＲＸ3ＭＤＲＩＸ4ＧＬＧＣ−Ｘ2
（ここで、
（ａ）Ｘ1は１〜１０個のアミノ酸を有するアミノ酸配列であり、
（ｂ）Ｘ2は１〜１０個のアミノ酸を有するアミノ酸配列であり、
（ｃ）Ｘ4は１〜４個のアミノ酸を有するアミノ酸配列であり、および
（ｄ）Ｘ3はＬｙｓ以外である）
を有するナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
【請求項１４８】
Ｘ1も、またＸ2もどちらもナトリウム排泄増加性ペプチドに天然に存在する配列ではない、請求項１４７に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
【請求項１４９】
Ｘ3がＡｒｇまたはＧｌｙである、請求項１４７に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド。
【請求項１５０】
Ｘ1がＳＰＹ1ＭＶＱＧＳＧ（配列番号：    ）であり、ここでＹ1は修飾部分結合部位を含有する、請求項１４７に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド。
【請求項１５１】
Ｘ2がＹ2ＶＬＲＲＨ（配列番号：    ）であり、ここでＹ2はＬｙｓ以外である、請求項１４７に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
【請求項１５２】
Ｙ2がＡｒｇである、請求項１５１に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
【請求項１５３】
Ｌｙｓ１４ＡｒｇまたはＬｙｓ１４Ｇｌｙの置換を含有するｈＢＮＰ類縁体。
【請求項１５４】
Ｌｙｓ２７ＡｒｇまたはＬｙｓ２７Ｇｌｙの置換を含有するｈＢＮＰ類縁体
【請求項１５５】
Ｌｙｓ３ＡｒｇまたはＬｙｓ３Ｇｌｙの置換を含有するｈＢＮＰ類縁体。
【請求項１５６】
（ａ）（ｉ）ナトリウム排泄増加性分子ＮＰＲ−Ａ結合部位；および
（ｉｉ）少なくとも１個の修飾部分結合部位；
を含有するナトリウム排泄増加性化合物；および
（ｂ）上記修飾部分結合部位に結合した少なくとも１個の修飾部分；
を含有するナトリウム排泄増加性化合物結合体であって、
このナトリウム排泄増加性化合物は、対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物に比較して、治療的に有意の割合のｃＧＭＰ刺激活性を保有する、上記ナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項１５７】
（ａ）（ｉ）ナトリウム排泄増加性分子ＮＰＲ−Ａ結合部位；および
（ｉｉ）少なくとも１個の修飾部分結合部位；
を含有するナトリウム排泄増加性化合物；および
（ｂ）上記修飾部分結合部位に結合した少なくとも１個の修飾部分；
を含有するナトリウム排泄増加性化合物結合体であって、
このナトリウム排泄増加性化合物結合体は、対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物のｃＧＭＰ刺激活性の少なくとも５０％を保有する、上記ナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項１５８】
（ａ）（ｉ）ナトリウム排泄増加性分子ＮＰＲ−Ａ結合部位；および
（ｉｉ）少なくとも１個の修飾部分結合部位；
を含有するナトリウム排泄増加性化合物；および
（ｂ）上記修飾部分結合部位に結合した少なくとも１個の修飾部分；
を含有するナトリウム排泄増加性化合物結合体であって、
このナトリウム排泄増加性化合物結合体は、対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物に比較して、さらに親水性である、上記ナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項１５９】
（ａ）（ｉ）ナトリウム排泄増加性分子ＮＰＲ−Ａ結合部位；および
（ｉｉ）少なくとも１個の修飾部分結合部位；
を含有するナトリウム排泄増加性化合物；および
（ｂ）上記修飾部分結合部位に結合した少なくとも１個の修飾部分；
を含有するナトリウム排泄増加性化合物結合体であって、
このナトリウム排泄増加性化合物結合体は、対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物に比較して、さらに両親媒性である、上記ナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項１６０】
（ａ）（ｉ）ナトリウム排泄増加性分子ＮＰＲ−Ａ結合部位；および
（ｉｉ）少なくとも１個の修飾部分結合部位；
を含有するナトリウム排泄増加性化合物；および
（ｂ）上記修飾部分結合部位に結合した少なくとも１個の修飾部分；
を含有するナトリウム排泄増加性化合物結合体であって、
このナトリウム排泄増加性化合物結合体は、対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物に比較して、さらに親油性であり、ここで少なくとも１個の修飾部分はアルキル部分からなるものではない、上記ナトリウム排泄増加性化合物結合体。
【請求項１６１】
下記式を有する化合物：
2006515579.tif 000075
式中、
各Ｃは独立して選択され、ｍ個の炭素を有するアルキル基であり、ｍは１〜２０であり；および
各ＰＡＧは独立して選択され、ｎ個の付属単位を有するポリアルキレングリコール基であり、ｎは２〜２５であり；
各Ｘは独立して選択され、結合性部分である。
【請求項１６２】
下記式を有する化合物：
2006515579.tif 000076
式中、
各Ｃは独立して選択され、ｍ個の炭素を有するアルキル基であり、ｍは１〜２０であり；および
各ＰＡＧは独立して選択され、ｎ個の付属単位を有するポリアルキレングリコール基であり、ｎは２〜２５であり；
各Ｘは独立して選択され、結合性部分である。
【請求項１６３】
下記式を有する化合物：
2006515579.tif 000077
式中、
ＰＡＧはｎ個の付属単位を有するポリアルキレングリコール基であり、ｎは２〜２５であり；および
各ＸはＯまたはＮであり；および
各ｏは独立して選択され、１〜１５である。
【請求項１６４】
下記式を有する化合物：
2006515579.tif 000078
式中、
ＰＡＧはｎ個の付属単位を有するポリアルキレングリコール基であり、ｎは２〜２５であり；
各ＸはＯまたはＮであり；および
各ｏは独立して選択され、１〜１５である。
【請求項１６５】
下記式を有する化合物：
2006515579.tif 000079
式中、
各Ｃは独立して選択され、ｍ個の炭素を有するアルキル基であり、ｍは１〜２０であり；および
各ＰＡＧは独立して選択され、ｎ個の付属単位を有するポリアルキレングリコール基であり、ｎは２〜２５であり；
各Ｘは独立して選択され、結合性部分であり；
ｏは１〜１５である。
【請求項１６６】
下記式を有する化合物：
2006515579.tif 000080
式中、
各Ｃは独立して選択され、ｍ個の炭素を有するアルキル基であり、ｍは１〜２０であり；および
各ＰＡＧは独立して選択され、ｎ個の付属単位を有するポリアルキレングリコール基であり、ｎは２〜２５であり；
各Ｘは独立して選択され、結合性部分であり；
ｏは１〜１５である。
【請求項１６７】
式：
2006515579.tif 000081
（式中、
各Ｃは独立して選択され、ｍ個の炭素を有するアルキル基であり、ｍは１〜２０であり；
各ＰＡＧは独立して選択され、ｎ個の付属単位を有するポリアルキレングリコール基であり、ｎは２〜２５であり；
各Ｘは独立して選択され、結合性部分である）
で表わされる化合物の製造方法であって、
（ａ）式：
Ｃm−Ｘ−ＰＡＧn−ＯＨ
で表わされる化合物を、式：
2006515579.tif 000082
（式中、Ｘ2はハライドである）
で表わされる化合物と反応させ、ここで反応は塩基および溶媒の存在下に行い、
2006515579.tif 000083
を生成し、次いで
（ｂ）（ａ）の生成物を、ルイス酸および溶媒の存在下に、式：
Ｃm−Ｘ−ＰＡＧn−ＯＨ
で表わされる化合物と反応させ、
2006515579.tif 000084
を生成させることを包含する、上記製造方法。
【請求項１６８】
塩基がＮａＨであり、および溶媒がテトラヒドロフランである、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１６９】
ルイス酸がＢＦ3ＯＥｔ2である、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１７０】
式：
2006515579.tif 000085
（式中、
各Ｃは独立して選択され、ｍ個の炭素を有するアルキル基であり、ｍは１〜２０であり；および
各ＰＡＧは独立して選択され、ｎ個の付属単位を有するポリアルキレングリコール基であり、ｎは２〜２５であり；
各Ｘは独立して選択され、結合性部分である）
で表わされる化合物の製造方法であって、
請求項０の生成物をパラニトロクロロホーメートまたはジスクイミジル（disuccimidyl）カーボネートと反応させることを包含する、上記製造方法。
【請求項１７１】
式：
2006515579.tif 000086
（式中、
ＰＡＧはｎ個の付属単位を有するポリアルキレングリコール基であり、ｎは２〜２５であり；
ＸはＯまたはＮであり；および
各ｏは独立して選択され、１〜１５である）
で表わされる化合物の製造方法であって、
式：
2006515579.tif 000087
（式中、ｏは上記定義のとおりである）
で表わされる化合物を、溶媒中で、式：
ＯＨ−ＰＡＧn−Ｘ
（式中、Ｘは−ＮＨまたは−ＯＨである）
で表わされる化合物と反応させ、式：
2006515579.tif 000088
で表わされる化合物を生成させることを包含する、上記製造方法。
【請求項１７２】
式：
2006515579.tif 000089
（式中、
ＰＡＧはｎ個の付属単位を有するポリアルキレングリコール基であり、ｎは２〜２５であり；
ＸはＯまたはＮであり；および
各ｏは独立して選択され、１〜１５である）
で表わされる化合物の製造方法であって、
請求項１７０の生成物を、ジスクシンイミジルカーボネート、パラニトロクロロホーメート、ホスゲンおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドからなる群から選択される活性化剤を用いて活性化することを包含する、上記製造方法。
【請求項１７３】
式：
2006515579.tif 000090
（式中、
各Ｃは独立して選択され、ｍ個の炭素を有するアルキル基であり、ｍは１〜２０であり；および
各ＰＡＧは独立して選択され、ｎ個の付属単位を有するポリアルキレングリコール基であり、ｎは２〜２５であり；
各Ｘは独立して選択され、結合性部分であり；
ｏは１〜１５である）
で表わされる化合物の製造方法であって、
請求項０の生成物を、溶媒中で塩基の存在下に、式：
2006515579.tif 000091
で表わされる化合物と反応させることを包含する、上記製造方法。
【請求項１７４】
塩基がＫ2ＣＯ3であり、および溶媒が水性および／または有機溶媒である、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７５】
式：
2006515579.tif 000092
（式中、
各Ｃは独立して選択され、ｍ個の炭素を有するアルキル基であり、ｍは１〜２０であり；および
各ＰＡＧは独立して選択され、ｎ個の付属単位を有するポリアルキレングリコール基であり、ｎは２〜２５であり；
各Ｘは独立して選択され、結合性部分であり；
ｏは１〜１５である）
で表わされる化合物の製造方法であって、
請求項１の方法に従い生成された化合物を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させることを包含する、上記製造方法。
【請求項１７６】
構造：
ＳＰＸ1ＭＭＨＸ2ＳＧＣＦＧＲＲＬＤＲＩＧＳＬＳＧＬＧＣＮＶＬＲＸ3Ｙ
（ここで、Ｘ1はＬｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓであり、Ｘ2はＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓであり、およびＸ3はＡｒｇまたはＨｉｓである）
を含有するナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
【請求項１７７】
Ｓ残基で結合している修飾部分を含有する、請求項１７６に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
【請求項１７８】
構造：
ＳＰＺ1ＭＶＱＧＡＧ−ＣＦＧＲＺ2ＭＤＲＩＳＳＳＳＸ1Ｘ2Ｘ3Ｃ
（ここで、Ｚ1はＡｒｇであるか、またはＬｙｓ以外のアミノ酸であり、およびＺ2はＡｒｇであるか、またはＬｙｓ以外のアミノ酸であり、Ｘ1はＧｌｙ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅまたはその同類置換であり、Ｘ2はＬｅｕ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅまたはその同類置換であり、およびＸ3はＧｌｙおよびＡｒｇであるか、またはその同類置換である）
を含有するナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
【請求項１７９】
Ｚ1がＬｙｓであり、およびＺ2がＬｙｓ以外である、請求項１７８に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
【請求項１８０】
構造：
ＫＣＦＫＧＫＮＤＲＸ1ＫＸ2ＱＳＧＬＸ3Ｃ−ＮＳＦＫＹ
（ここで、Ｘ1はＴ、ａ、Ｒ、Ｈ、Ｐ、Ｔ、Ｅであり；Ｘ2はＫ、Ｎ−メチル、Ａｒｇ、Ｓ、Ｄ、Ｐであり；Ｘ3はＡｒｇ、Ｋ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｐ、Ｏｒｎ、Ｈａｒ、ｐ−アミジノフェニルＡｌａ、Ｉ、であるか、ＧｌｙまたはＴｒｙ以外の陽電荷を有するいずれか別のアミノ酸である）
を含有するナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
【請求項１８１】
１個または２個以上のＬｙｓ残基がそこに結合している修飾部分を含有するナトリウム排泄増加性ペプチド結合体を包含することをさらに特徴とする、請求項１７８または１８０に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．  関連出願との相互関係
本出願は、２００２年１１月２６日付けで出願された米国仮出願出願番号６０／４２９，１５１に基づいており、また優先権を主張するものであり、その内容全体を引用してここに組入れる。
【０００２】
２．  政府支持声明
本発明は、ＮＩＨ  Ｇｒａｎｔ  ＃Ｒ４３ＨＬ０７４５２９−０１により支持されている研究プロジェクトの下に政府の支持をもってなされた。米国政府は、この特許に一定の権利を有する。
【０００３】
３．  発明の分野
本発明は、ナトリウム排泄増加性化合物結合体（natriuretic compoud conjugate）および種々のナトリウム排泄増加性化合物、ならびに充血性心臓病およびこの疾患に関連する状態の処置におけるこれらの使用に関する。一例として、本発明による組成物は医薬として活性なナトリウム排泄増加薬およびプロドラッグを提供し、これらは経口、鼻、静脈内または皮下投与に適する製剤として使用することができる。本発明はまた、ナトリウム排泄増加性化合物結合体の製造方法、およびこれらを含有する組成物、ならびにこれらの結合体および化合物の使用方法を提供する。一例として、ナトリウム排泄増加性化合物結合体は、ＮＰＲ−Ａ結合部分、少なくとも１個の修飾部分結合部位を含有するナトリウム排泄増加性ペプチドを包含し、また修飾部分結合部位に結合される少なくとも１個の修飾部分を含有する。或る態様において、この化合物結合体は、天然ナトリウム排泄増加性ペプチドの薬理学的活性を保有し、また増強された特性、例えば改良された生体利用性、タンパク質分解活性に対する増強された耐性、および／または血流中で延長された活性を有する。別の態様において、この化合物結合体は加水分解性プロドラッグとして提供され、このプロドラッグは天然ナトリウム排泄増加性ペプチドに比較し、プロドラッグ形態で減少された薬理学的活性を有するが、このプロドラッグはインビボで加水分解されると、活性ナトリウム排泄増加性化合物を放出することができる。
【０００４】
本発明はまた、組換えペプチドおよびタンパク質の分野、ならびにこれらの組換えペプチドおよびタンパク質の製造方法に関する。特に、本発明はナトリウム排泄増加性ペプチドおよびタンパク質の類縁体を開示する。この本発明による類縁ナトリウム排泄増加性化合物は、対応するナトリウム排泄増加性ペプチドの天然配列に対し少なくとも１個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するものとして説明することができる。或る態様において、本発明による類縁ナトリウム排泄増加性化合物は、脳タイプナトリウム排泄増加性ペプチド（ＢＮＰ）、特にヒトＢＮＰ（ｈＢＮＰ）、ウロジラチン（urodilatin）、イヌ脳ナトリウム排泄増加性ペプチド（ｃＢＮＰ）、心房ナトリウム排泄増加性ペプチド（ＡＮＰ）、特にヒトＡＮＰ（ｈＡＮＰ）、デンドロアスピス（dendroaspis）ナトリウム排泄増加性ペプチド（ＤＮＰ）、またはＣ−タイプナトリウム排泄増加性ペプチド（ＣＮＰ）、特にヒトＣＮＰ（ｈＣＮＰ）の天然形態の薬理学的活性を有するものとして説明することができる。
【背景技術】
【０００５】
４．  発明の背景
心臓血管系疾病は、性別または民族に関係なく米国における主導的死亡原因を構成する。これらの病気の中で、充血性心不全症（ＣＨＦ）は広く増加し続けている唯一の疾病である（ＭａｓｓｉｅおよびＳｈａｈ、１９９７；ＰａｃｋｅｒおよびＣｏｈｎ、１９９９）。アメリカン心臓協会（American Heart Association）によれば、１９７９年から１９９９年までに、多くの病院が病院からの退院数およびＣＨＦによる死亡数の両方がほぼ２．５倍に増加している。現時点で、約５百万人のアメリカ人がＣＨＦを有するものと診断されており、また年間約５５０，０００人に新しい介護が生じている（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，２００１）。この生命を脅かす状態は、多大の経済的衝撃を随伴する。実際に、単独で最大の医療出費が存在する（Ｋａｙｓｅｒ，２００２）。ＣＨＦを処置するための直接的および間接的経費は＄５６百万ほど高いものと推定されている（Ｈｕｓｓａｒ，２００２）。ＨＦ処置のための病院の経費は、全部の形態の複合癌にかかわる経費の２倍よりも多い（Ｏ′ＣｏｎｎｅｌｌおよびＢｒｉｓｔｏｗ，１９９４）。
【０００６】
ＣＨＦは通常的死亡原因であり、処置に高い間接的経費を伴い、また高い死亡率を有する。患者がＣＨＦであると診断された場合、１年死亡率は約２０％である（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，２００１）。同じ状態への再発の可能性は非常に高く、最近に再発にかかわる数種の研究が行われた（ＣｈｉｎおよびＧｏｌｄｍａｎ，１９９７；Ｋｒｕｎｈｏｌｚ，Ｐａｒｅｎｔ等、１９９７；Ｋｒｕｍｈｏｌｚ，Ｃｈｅｎ等、２０００）。診断の１年以内に３５％を越える再発率が代表的である（Ｔｓｕｃｈｉｈａｓｈｉ，Ｔｓｕｔｓｕｉ等、２００１）。このような頻発する再発は多回の救急室訪問および入院患者入院加療をもたらす（Ｋｒｕｍｈｏｌｚ，Ｐａｒｅｎｔ等、１９９７）。多回の入院加療および不適当な治療は、ＣＨＦを患う患者が直面する現在の状況を明確にしている。
【０００７】
最近の無作為の研究は、家庭ベースの管理が再発率を強力に減少させることができ、生存期間を延長させることができ、またＣＨＦを患う患者の生活の質を改善することができることを示した（Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｍａｒｌｅｙ等、１９９９）。社会経済的因子を考察する独立した研究において、Ｔｓｕｃｈｉｈａｓｈｉ等は、死亡率を減少させ、またＣＨＦが随伴する総合的費用を低下させるためには、外来患者および家庭ベース管理の両方が必要であるという結論に達した（Ｔｓｕｃｈｉｈａｓｈｉ，Ｔｓｕｔｓｕｉ等、２００１）。明確なこととして、外来患者ベースで使用することができる新しい治療法が、この成長する市場で猛烈に必要とされている。
【０００８】
脳タイプナトリウム排泄増加性ペプチド（ＢＮＰ）は、心臓血管系、腎臓および内分泌系ホメオスタシスに包含されるペプチド一族の一員である。ＢＮＰは、動脈ナトリウム排泄増加性ペプチド（ＡＮＰ）の発見後、ほぼ数十年の１９８８年に発見された（Ｓｕｄｏｈ，Ｋａｎｇａｗａ等、１９８８）。これはブタ脳から最初に単離されたが、血管平滑筋および内皮細胞のレセプターにおけるその活性が知られている。ＢＮＰは心臓によって産生される内因性ペプチドである。これは最初に、プレプロ（prepro）−ＢＮＰとして産生され、次いで１個のジスルフィド結合を有する３２−アミノ酸である活性形態まで２回、短縮される。
【０００９】
図１に例示されているように、ＢＮＰは細胞表面の膜結合タンパク質であるナトリウム排泄増加性ペプチドレセプターＡ（ＮＰＲ−Ａ）に結合する。この結合事象は、細胞質ゾルにおけるグアニレートシクラーゼによるｃＧＭＰの合成の引き金となる。この二次メッセンジャーを経て、ＢＮＰは、これが関連する心臓血管系、腎臓および内分泌系効果を成就する。ＢＮＰの調節は、数種の相違する手段によって達成される。ＮＰＲ−Ａに結合し、次いでｃＧＭＰ産生を刺激するＢＮＰ分子は、循環系から分離されるが、ＢＮＰが応答を惹起することなく排除されることによる別の手段が存在する。最も普遍的な分離手段はクリアランスレセプター、ナトリウム排泄増加性ペプチドレセプターＣ（ＮＰＲ−Ｃ）への結合を経る。ＮＰＲ−Ｃに結合すると、このペプチドは細胞中に取り込まれ、次いで酵素により分解される。クリアランスの次の主要手段は、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）による分解である。この中性エンドペプチダーゼは細胞表面上の膜結合酵素である。最終的に、ＢＮＰは腎臓濾過によって小規模で分離される。
【００１０】
正常な状態において、ＢＮＰは動脈および心室で少量が産生される。しかしながら、心室は心臓代償不全期間中に伸張され、産生されるＢＮＰの量は格別に増加される。動脈も依然として包含されるが、心室が産生の主要部位になる。心臓は、ＣＨＦの発現時点における代償不全期間中に生じる心室伸張に応答してＢＮＰを産生する。ＢＮＰの作用は、ナトリウム排泄増加、利尿、血管拡張、および拡張期血圧降下を包含する。これらの作用は二次メッセンジャー、環状グアノシンモノホスフェート（ｃＧＭＰ）の作用を経て生じる。ｃＧＭＰの産生は、ＢＮＰが血管、腎臓および肺の内皮細胞の表面に位置する膜結合レセプターであるナトリウム排泄増加ペプチドレセプターＡ（ＮＰＲ−Ａ）と相互作用する場合に惹起される。ＢＮＰの血漿濃度は、ＣＨＦの重篤度の増加とともにますます増加する。この増加にもかかわらず、ＢＮＰの有益な効果は重篤なＣＨＦでは鈍化され、明白なＣＨＦにおける相対的障害状態の可能性を高める。別様に、ＢＮＰの血漿濃度測定に現時点で採用されている分析法はプレプロ−ＢＮＰとその成熟形態との間を特別に差別していないことから、このプロ（pro）−ホルモンは明白なＣＨＦにおけるその成熟形態に適度に進行しないことがある。従って、心臓が産生することができるＢＮＰの量が圧倒的であるか、またはプレプロ−ＢＮＰがその活性形態に適度に変換されないかのどちらかであり、従ってその有益な作用は減少される。心臓病の発症時点におけるその初期産生によって、ＢＮＰはＣＨＦ発症の危険性が高い患者検出用の診断マーカーとして重要になった（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｂｕｒｎｅｔｔ等、１９９６；ＭｃＤｏｎａｇｈ，Ｒｏｂｂ等、１９９８；Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｎｉｃｈｏｌｌｓ等、１９９８；Ｎａｇａｙａ，Ｎｉｓｈｉｋｉｍｉ等、２０００；Ｋａｗａｉ，Ｈａｔａ等、２００１；Ｍａｉｓｅｌ，Ｋｒｉｓｈｎａｓｗａｍｙ等、２００２；ＭｃＮａｉｒｙ，Ｇａｒｄｅｔｔｏ等、２００２）。
【００１１】
ＢＮＰは数種の経路で心臓代償不全を減少する機能を果たす。名称が意味するように、ＢＮＰはナトリウム排泄および尿排出量の増加を導く。ＢＮＰはまた、血管拡張作用物質として作用し、その効果は数種の別の作用によって強化される。これらの機能の中で最も顕著な機能は、レニン−アンギオテンシン−アルドステロン系（ＲＡＡＳ）の干渉におけるＢＮＰが演じる役割にある。ＢＮＰは血管収縮ペプチドアンギオテンシンの発現における鍵の酵素であるレニンの阻害を導く。ＢＮＰは血管組織の裏打ち材である内皮細胞の過剰増殖を抑制する。この過剰増殖は放置すると、血流を格別に減少させることができる。ＢＮＰが心臓代償不全を減少する機能を果たす最後の方法は、そのルシトロピック（lusitropic）効果である。これは心室の心筋弛緩を改善し、これにより拡張期血圧の低下をもたらす。
【００１２】
医薬としてのペプチドの使用には実用上の制限が存在する。腸および血流の両方におけるタンパク質分解は、治療剤としてペプチドを使用することに付随する障害である。非内因性ペプチドが遭遇するもう一つの難点は、免疫原性である。これらの問題の結果として、医薬工業界のアプローチは、医薬化学を用いる小型の非ペプチド分子を発見することにあった。このアプローチは成功しているが、費用がかかり、時間を消費し、また薬物動態学および毒性の観点から不確実性に満ちている。さらにまた、ペプチドレセプターに対しアゴニスト活性を有する小型有機分子の同定は格別の挑戦をもたらした。
【００１３】
「ＰＥＧ化」（PEGylated）タンパク質の使用は、今日まで充分に確立されているが、これらは注射用途に制限されている。本発明は経口利用可能なポリペプチド結合体、例えば脳タイプナトリウム排泄増加性ペプチド（ｈＢＮＰ）を提供する。詳細に言えば、本発明は充血性心不全の処置における製剤として、治療性ペプチドおよびタンパク質に結合したＰＥＧを含有する結合体を提供する。これらの製剤はタンパク質分解酵素に対してｈＢＮＰを保護する機能を果たし、これにより、この製剤をヒトナトリウム排泄増加性ペプチドレセプターＡのアゴニストとして効果的に使用することが可能にされる。このアゴニスト性活性の結果として、ｃＧＭＰの増大した産生が得られる。
【００１４】
２００１年８月に、ｈＢＮＰ（天然ペプチド）が急性充血性心不全処置用にナトレコル(Natrecor)（登録商品名）の商品名でＦＤＡによって承認された。ナトレコル（登録商品名）は過去二十年間の間にＣＨＦ処置用に承認された最初の医薬であった。これは４８時間の時間をかけて静脈内に連続注入することによって投与される。この医薬は高価であり、また入院を必要とすることから、ナトレコル（登録商品名）は最も急性の場合にのみ使用されている。ナトレコル（登録商品名）は、集中治療室で過ごす患者の時間を短縮することによって、数種の別の治療法よりも安価であるものと考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
現時点で、ほぼ５００万人のアメリカ人がＣＨＦを患っており、５５０，０００人以上の新しいケースが毎年、報告されている（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，２００１）。現時点で、ＣＨＦ処置用の直接的費用は、＄２０億万を充分に超えている（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，２００１）。心臓損傷が生じる前の心不全発症の検知に現在利用することができる診断方法の場合、退院患者におよび家庭ベースの介護で使用することができる拡大された用途を有する医薬に対する多大の要求が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
５．  発明の要旨
本発明は広義には、変異形態および修飾形態の数種の天然産生ナトリウム排泄増加性ペプチド、タンパク質、類縁体およびこれらのナトリウム排泄増加性ペプチドの化学的結合体を包含し、これらは、それらの天然産生対応物質に優る利点を有する。一例として、これらの利点の一つは、タンパク質分解性分解に対する増大した耐性、血流中における改善された存続時間、および／または細胞膜障壁を横切る改善された横断能力を包含する。
【００１７】
本発明の数種の態様に従うナトリウム排泄増加性化合物結合体は、ナトリウム排泄増加性タンパク質レセプターＡ結合性部分（motif）（ＮＰＲ−Ａ）、少なくとも１個の修飾部分結合部位および少なくとも１個の上記修飾部分結合部位に結合した少なくとも１個の修飾部分を含有する。上記ナトリウム排泄増加性化合物に結合体の一部として結合している修飾部分の観点から、このナトリウム排泄増加性化合物結合体は、本明細書に記載されているとおりの修飾部分を含有していない天然ナトリウム排泄増加性化合物に比較し、修正された親水性物性を有する。一例として、また制限するものではないものとして、また本明細書にさらに充分に開示されているものとして、この修飾部分はいずれか種々のサイズ、形状、置換および配置を有するオリゴマーの形態であることができる。
【発明の効果】
【００１８】
或る場合、このナトリウム排泄増加性化合物結合体の特徴は、少なくとも部分的に、対応する未修飾形態の天然ナトリウム排泄増加性化合物に比較し、酵素分解、例えばタンパク質分解に対するその増大された耐性にある。これらの化合物結合体は、対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物に比較し、ｃＧＭＰ刺激活性などの生物学的活性を治療的に有意のパーセンテージで保有することをさらに特徴とする。この保有されたｃＧＭＰ刺激活性は、インビトロで測定し、対応する未結合形態のナトリウム排泄増加性ペプチドの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、９０％、９５％または９９％まででさえあることができる。対応する未修飾ナトリウム排泄増加性化合物（未結合）に比較して、修飾部分を有する本発明によるナトリウム排泄増加性化合物結合体の改善された特徴の別の例は、当該ナトリウム排泄増加性化合物のＧＩ器官を通過する能力および血流中に入る能力の改善、当該ナトリウム排泄増加性化合物の改善された親水性、親油性または両親媒性、当該ナトリウム排泄増加性化合物の水性環境または有機溶媒中における改善された溶解性、当該ナトリウム排泄増加性化合物の細胞膜を横切る能力の改善、当該ナトリウム排泄増加性化合物の脳−血管障壁を横切る能力の改善、当該ナトリウム排泄増加性化合物の或るレセプター、細胞、組織または臓器に標的を定める能力、および当該ナトリウム排泄増加性化合物の改善された薬物動態学的挙動を包含する。好適態様において、当該ナトリウム排泄増加性化合物の生物学的活性成分の分解は、約２のｐＨにおいて約２時間よりも短い時間であって、未修飾（未結合）生物学的活性ナトリウム排泄増加性化合物の分解よりも短い。当該ナトリウム排泄増加性化合物のナトリウム排泄増加性化合物成分は、例えば血漿、プロテアーゼ、肝臓ホモジネート、酸性状態および／または塩基性状態において、未結合ナトリウム排泄増加性化合物に比較し、当該ナトリウム排泄増加性化合物結合体の成分としてさらに安定であることができる。
【００１９】
本発明によるナトリウム排泄増加性ペプチド結合体は、抗高血圧効果、天然ペプチドが随伴する心臓血管系、腎臓、および／または内分泌に対する効果を誘発させることができる。或る態様において、このナトリウム排泄増加性ペプチドの修飾はｈＢＮＰなどのペプチドをタンパク質分解から防護し、また腸壁を通過する全身循環中への放出を促進し、これによりナトリウム排泄増加、利尿、および／または血管拡張をもたらす。従って、本発明によるナトリウム排泄増加性ペプチド結合体は、経口製剤として効果的に付与することができる（病院施設における数日間の連続的静脈注入の代わりに）。この利点は、従来不可能であった自己投与することができることによって、別種のＣＨＦ治療が随伴する病院費用を減少させるものと予想され、また初期段階（例えば、クラスＩ）および慢性ＣＨＦ、ならびに急性ＣＨＦを包含するように、ナトリウム排泄増加性ペプチド、特にｈＢＮＰの治療用途を拡大するものと期待される。本発明の好適態様は、分解性酵素に対し増大された耐性を有し、また腸内皮を横切る経口放出および輸送に適する非免疫原性ペプチド結合体にある。
【００２０】
本発明はまた、ナトリウム排泄増加性化合物結合体の数種の製造方法を提供する。これらの修飾部分は、例えば直鎖状または分枝鎖状ＰＥＧの形態をとることができ、または別のポリマー構造をとることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
６．  定義
別段の定義がなされていないかぎり、本明細書で使用されている全部の技術的および科学的用語は、本発明が属する技術の当業者によって共通して理解される意味と同一の意味を有する。本明細書の本発明の説明で使用されている用語は、特定の態様を説明するためのものであって、本発明を制限しようとするものではない。読者に都合がよいように、ヘッダーを使用するが、これもまた、本発明を制限しようとするものではない。本明細書に記載の全部の刊行物、特許出願、特許およびその他の引用文献は、それらのブランド名によってここに引用されているいずれの商品名の医薬を包括的挿入するものとして、それら全体を引用してここに組入れる。
【００２２】
単数形態の“ａ”“ａｎ”および“ｔｈｅ”は、別段の明確な指示がなされていないかぎり複数形態を包含するものとする。
【００２３】
本明細書および特許請求の範囲で使用されているものとして、下記用語は示されている意味を有する。
【００２４】
「アミノ酸」は、別段の記載がないかぎり、そのＬまたはＤ立体異性体のいずれかであるいずれかの天然産生、人工、または合成アミノ酸であると定義される。「残基」の用語は、用語「アミノ酸」と相互変換可能な用語として使用されており、また多くの場合、アミノ酸の指定配列における特定の位置を有するものとして示されている。
【００２５】
この記述に使用されている全部のアミノ酸の頭文字は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２（ｂ）に記載されているとおりに、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｒａｄｅｍａｒｋ  Ｏｆｆｉｃｅにより許容されているものである。下記一文字によるアミノ酸指定を本発明の説明に使用する。未知または特定されていないアミノ酸の指定には、Ｘａａを使用する。本明細書に提供されている構造の特定の残基上に付けられている数字は、この残基の位置の番号を表わす。この残基番号は、例えばｈＢＮＰおよびＡＮＰの天然ペプチド類縁体に付加されている置換がなされている残基を表わすために、以下の記載において、一文字によるアミノ酸命名と組合わせて使用されている。
【００２６】
従って、一例として、変異ｈＢＮＰが、野生型ｈＢＮＰの残基位置番号３において、アルギニン（Ｒ）がリジン（Ｋ）により置き換えられている合成されたものである場合、“ＢＮＰＫ３Ｒ”または“ｈＢＮＰ（１−３２）Ｋ３Ｒの命名法が用いられる。複数の置換は、以下で例示されるように、各置換基を分離するカンマを用いて同一様相で表わされる。
【００２７】
“ｈＢＮＰ（１−３２）Ｋ３Ｒ、Ｋ１４Ｒ、Ｋ２７Ｒ”は、残基位置３のアルギニンがリジンによって置き換えられており（すなわち、Ｋ３Ｒ）、残基位置１４のアルギニンがリジンによって置き換えられており（すなわち、Ｋ１４Ｒ）、また位置２７のアルギニンがリジンにより置き換えられている（すなわち、Ｋ２７Ｒ）、上記で定められているｈＢＮＰ配列を有する三重（triple）変異ｈＢＮＰを表わす。別種の変異は類似の方法で定義される。
【００２８】
“ｈＢＮＰ（１−３２）Ｋ３Ｒ、Ｋ１４Ｒ”の用語は、ｈＢＮＰの残基３および１４でリジンがアルギニンによって置き換えられている二重（double）変異を表わす。
Ａ＝ａｌａ＝アラニン          ｎｌｅ＝ノルロイシン
Ｒ＝ａｒｇ＝アルギニン        ｃｈａ＝シクロヘキシルアラニン
Ｎ＝ａｓｎ＝アスパラギン      Ａ*＝ｈａｒ＝ヘモアルギニン
Ｄ＝ａｓｐ＝アスパラギン酸    ｏｒｎ＝オルニチン
Ｃ＝ｃｙｃ＝システイン        ｐｅｎ＝ペニシラミン
Ｑ＝ｇｌｎ＝グルタミン        ｐｈｇ＝フェニルグリシン
Ｅ＝ｇｌｕ＝グルタミン酸      ｍｐａ＝メルカプトプロピオン酸
Ｇ＝ｇｌｙ＝グリシン          ａ＝ａｌａ*＝Ｄアラニン
Ｈ＝ｈｒｓ＝ヒスチジン        Ｃ*＝ヘモシステイン
Ｉ＝ｉｌｅ＝イソロイシン
Ｌ＝ｌｅｕ＝ロイシン
Ｋ＝ｌｙｓ＝リジン
Ｍ＝ｍｅｔ＝メチオニン
Ｆ＝ｐｈｅ＝フェニルアラニン
Ｐ＝ｐｒｏ＝プロリン
Ｓ＝ｓｅｒ＝セリン
Ｔ＝ｔｈｒ＝スレオニン
Ｗ＝ｔｒｐ＝トリブトファン
Ｙ＝ｔｙｒ＝チロシン
Ｖ＝ｖａｌ＝バリン
【００２９】
「両親媒性」は、水および脂質の両方に溶解する能力を意味し、また「両親媒性部分」および「両親媒性基」の用語は、両親媒性であり、および／またはポリペプチドまたは非ポリペプチド医薬に結合した場合、生成する結合体、例えばＰＥＧ−脂肪酸オリゴマー、糖脂肪酸オリゴマーの両親媒性を増大させる部分を意味する。
【００３０】
「生物学的活性」は、治療的活性または薬理学的活性を有する作用剤を表わし、例えばアゴニスト、部分的アゴニストまたはアンタゴニストを表わす。
【００３１】
本明細書で用いられているものとして、「有効量」は無毒性であるが、所望の治療効果をもたらすのに充分な量を表わす。下記で指摘されるように、必要とされる正確な量は、対象ごとに変化し、年齢、対象の一般的健康状態、処置される状態の重篤度、投与される特定の生物学的活性薬剤などに応じて変化する。いずれかの対象に適当な「有効」量は、関連する参考書および刊行物を参照することによって、および／または常習的試験を用いることによって、当業者により決定することができる。
【００３２】
「加水分解性」は、生理学的条件下に加水分解される分子結合を表わす。
【００３３】
「親水性」は、水に溶解する能力を意味し、および「親水性部分」または「親水性基」の用語は、親水性であるか、および／またはもう一つの化学物質に結合した場合、このような化学物質の親水性を増加する部分を表わす。例は、これらに制限されないものとして、糖およびポリアルキレン分子、例えばポリエチレングリコールを包含する。
【００３４】
「親油性」は、脂肪、例えば脂肪および脂肪組織に蓄積する化学物質に対し親和性を有し、脂質に溶解する能力を有し、および／または生物学的膜を浸透するか、生物学的膜と相互作用するか、および／または生物学的膜を横切る能力を有することを意味し、および「親油性部分」または「親油性基」の用語は、親油性であるか、および／またはもう一つの化学物質に結合した場合、このような化学物質の親油性を増加する部分を表わす。
【００３５】
「低級アルキル」は、炭素原子１〜６個を有する置換または未置換アルキル基を表わす。
【００３６】
「モノ分散」（monodispersed）は、混合物中の化合物の約１００パーセントが同一分子量を有する化合物の混合物を表わす。
【００３７】
成分、例えば本発明による組成物の塩、担体、賦形剤または稀釈剤について使用されている「医薬として許容される」の用語は、組成物中の別の成分と適合することができる成分を表わす。すなわち、このような成分は、生物学的活性物質の生物学的活性を消去することなく本発明によるナトリウム排泄増加性化合物結合体と組合わせることができ、また有害な副作用（例えば、毒性、刺激性、およびアレルギー性応答）を伴うことなく本発明により提供されるとおりに対象に使用するのに適する成分を表わす。副作用は、それらの危険性が当該医薬組成物によってもたらされる利益に優る場合、「不適当」である。医薬として許容される成分の例は、これらに制限されないものとして、全部の標準的調剤用担体、例えば緩衝された塩類溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジヨン、ミクロエマルジョンおよび種々のタイプの湿潤剤を包含する。
【００３８】
「ポリアルキレングリコール」は、直鎖状または分枝鎖状ポリアルキレングリコールポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびポリブチレングリコールを表わし、またポリアルキレングリコールのモノアルキルエーテルを包含する。特定の態様において、ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールまたは“ＰＥＧ”である。「ＰＥＧ付属単位」（PEGsubunit）の用語は、１個のポリエチレングリコール単位、すなわち−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）−を表わす。
【００３９】
「プロドラッグ」（prodrug）は、化学的に誘導体化されている生物学的活性物質を表わし、対象に投与されると、このプロドラッグは代謝され、生物学的活性物質を生成する。
【００４０】
本明細書において使用されているものとして、「処置」または「処置する」の用語は、病気または疾病に冒されている対象に対し利益を付与するいずれかの種類の処置を表わし、対象の状態（例えば、１種または２種以上の症状）における改善、状態の進行の遅滞、病気または疾病の発現の防止または遅延、正常な生理学的機能の強化などを包含する。
【００４１】
８．  発明の詳細な説明
本発明の或る態様に従うナトリウム排泄増加性化合物結合体は、ナトリウム排泄増加性ペプチドレセプターＡ結合性部分（ＮＰＲ−Ａ）、少なくとも１個の修飾部分結合部位および少なくとも１個の上記修飾部分結合部位に結合している修飾部分を含有するナトリウム排泄増加性化合物を包含する。上記ナトリウム排泄増加性化合物に結合体の一部として結合されている修飾部分によって、このナトリウム排泄増加性化合物結合体は本明細書に記載の修飾部分を含有していない天然ナトリウム排泄増加性化合物に比較し、変更された親水性物性を有することができる。例として、また制限するものではないものとして、また本明細書にさらに充分に記載されているように、この修飾部分はいずれか種々の大きさ、形状、置換および配置の形態をとることができる。
【００４２】
８．１  ナトリウム排泄増加性化合物
本発明によるナトリウム排泄増加性化合物結合体は、ナトリウム排泄増加性ペプチドレセプター、例えばＮＰＲ−Ａのための結合部位、およびそこに修飾部分をカプリングさせるための結合部位を有するナトリウム排泄増加性化合物を含有する。
【００４３】
８．１．１  天然ナトリウム排泄増加性ペプチド
ナトリウム排泄増加性化合物は天然ナトリウム排泄増加性ペプチド、例えばいずれかの種、例えばヒト、イヌおよびラットからの、例えばＡＮＰ、ＢＮＰ、ＣＮＰまたはＤＮＰのアミノ酸配列を有することができる。好適天然ナトリウム排泄増加性ペプチドはヒトＢＮＰ、ラットＢＮＰ、イヌＢＮＰまたはｈＡＮＰである。天然配列はまた、プロ−ナトリウム排泄増加性ペプチドおよびプレ−プロペプチドを包含することができる。
【００４４】
８．１．２．  ナトリウム排泄増加性化合物類縁体
ナトリウム排泄増加性化合物はまた、天然ナトリウム排泄増加性ペプチドの生物学的活性類縁体（ナトリウム排泄増加性類縁体）であることができる。一例として、生物学的活性類縁体は、元の化合物の生物学的活性を消失しない切断（truncation）、欠失、挿入、置換、置き換え、側鎖エクステンション、および融合タンパク質またはこれらの組合せを有する天然ナトリウム排泄増加性化合物であることができる。好ましくは、この類縁体は天然または人工ＮＰＲ−Ａ結合部分を含有し、またＮＰＲ−Ａ結合にかかわる活性を部分的にまたは全体的に保有する。
【００４５】
ナトリウム排泄増加性ポリペプチド類縁体（analogs）は、種々の方法により得ることができる。例えば、相互反応性結合能力を損傷することなく、天然ナトリウム排泄増加性ペプチド構造中の或るアミノ酸を別のアミノ酸により置換することができる。或る場合、当技術で開示されているように、このような修飾は、ＮＰＲ−Ｃ、クリアランスレセプターに比較し増大したＮＰＲ−Ａに対する親和性をもたらし、従って延長された半減期をもたらす。
【００４６】
好ましくは、この類縁体はナトリウム排泄増加性分子結合性部分、例えばＮＰＲ−Ａ結合性部分を含有する。
【００４７】
ナトリウム排泄増加性ペプチドは、例えば下記配列によって定義することができる：
ＣＦＧＲＸＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ（配列番号：２）
【００４８】
（ここで、Ｘは、修飾部分結合部位を有する化合物、例えばアミノ酸残基である）。或る態様において、Ｘは修飾部分が結合することができるアミノ酸を含有する。例えば、Ｘは修飾部分が結合できるアミノ酸ＬｙｓまたはＣｙｃを含有することができる。別の態様において、Ｘはリジン以外であることができる。これらの態様において、未結合ペプチドはまた、本発明の態様であり、この場合、Ｘはアルギニンであるか、またはそこに結合部位を創生することができるリジン以外のアミノ酸である。これらの別様の構造は下記のとおりである：
【００４９】
ＣＦＧＲＸ1ＭＤＲＩＸ2ＧＬＧＣ
（ここで、Ｘ1はリジンであり、Ｘ2は１〜４個のアミノ酸である）。Ｘ2は、Ｓ、ＳＳ、ＳＳＳ、ＳＳＳＳ、Ｋ、ＫＳ、ＫＳＳまたはＫＳＳＳであることができる。ＫがＸ2として、またはＸ2の配列の一部として含有されている場合、修飾部分結合部位である。
【００５０】
ナトリウム排泄増加性化合物は、例えば下記構造を有する：
Ｘ1−ＣＦＧＲＸ3ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ−Ｘ2（配列番号：    ）
【００５１】
（ここで、Ｘ1およびＸ2の少なくとも一方が存在する場合、Ｘ1は１〜１０個のアミノ酸を有するペプチドであり、Ｘ2は１〜６個のアミノ酸を有するペプチドであり、およびＸ3はリジン以外、例えばアルギニンである）。一例として、Ｘ1はｈＢＮＰのＮ−末端から１〜１０個のアミノ酸残基配列の全部またはＣ−末端断片を含有することができる。一態様において、Ｘ1はＳＰＺ1ＭＶＱＧＳＧ−（配列番号：    ）、ＳＰＺ1ＭＶＱＧ、ＳＰＺ1ＭＶＱ、ＳＰＺ1ＭＶ、ＳＰＺ1Ｍ、ＳＰＺ1、ＰＺ1ＭＶＱＧＳＧ、Ｚ1ＭＶＱＧＳＧを包含し、ここでＺ1はリジンまたはアルギニンである。Ｚ1がリジンである場合、修飾部分結合部位が提供される。別の態様において、Ｘ2はｈＢＮＰのＣ−末端から１〜６個のアミノ酸残基配列の全部またはＮ−末端断片を含有することができる。一態様において、Ｘ2は配列Ｚ2ＶＬＲＲＨ（配列番号：    ）、Ｚ2ＶＬＲＲ（    ）、Ｚ2ＶＬＲ（    ）、Ｚ2ＶＬ、Ｋ、Ｒ、ＲＶＬＲＲ（    ）、ＲＶＬＲ（    ）、ＲＶＬ、ＲＶ、またはＲであり、ここでＺ2はリジンまたはアルギニンであることができる。Ｚ2がリジンである場合、修飾部分結合部位が提供される。Ｚ1がリジンである場合、Ｚ2はリジン以外であることができ、またＺ2がリジンである場合、Ｚ1はリジン以外であることができる。別様に、Ｘ1およびＸ2はいずれかのナトリウム排泄増加性ペプチドから得られるいずれかのＮ−末端およびＣ−末端テイルアミノ酸配列であることができる。或る態様において、Ｎ−末端および／またはＣ−末端テイル配列が存在し、また詳細には、ｈＢＮＰのＮ−末端およびＣ−末端テイル配列またはそのいずれかの断片ではない。未結合ナトリウム排泄増加性化合物がまた、本発明の態様であることは明白である。
【００５２】
一態様において、ナトリウム排泄増加性化合物類縁体は下記アミノ酸配列を含有する：
Ｘ1ＭＶＱＧＳＧＣ1ＦＧＲＸ2ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ2Ｘ3（配列番号：    ）
（ここで、Ｘ1、Ｘ2およびＸ3はそれぞれ、ＬｙｓおよびＬｙｓ以外のアミノ酸からなる群から独立して選択され、およびＸ1、Ｘ2およびＸ3の少なくとも１個はＬｙｓであり、およびＸ1、Ｘ2およびＸ3の少なくとも１個はＬｙｓ以外のアミノ酸である；および
Ｃ1およびＣ2はシステインであり、ジスルフィド結合によってカプリングさせることができる）。未結合ペプチド類縁体はまた、本発明の態様であることは明白である。
【００５３】
一態様において、Ｘ1、Ｘ2およびＸ3の少なくとも１個はＡｒｇである。もう一つの態様において、Ｘ1はＬｙｓであり、Ｘ2はＡｒｇであり、およびＸ3はＡｒｇである。この態様はまた、ここに記載のアミノ酸配列、Ｘ1に対するＮ−末端、および／またはＸ3に対するＣ−末端を包含することができる。一例として、存在する場合、Ｎ−末端テイル配列は、Ｓ−またはＳＰ−であることができ、および存在する場合、Ｃ−末端テイルは、−ＶＬＲＲＨ、−ＶＬＲＲ、−ＶＬＲ、−ＶＬ、または−Ｖであることができる。或る態様において、Ｎ−末端および／またはＣ−末端テイル配列が存在し、詳細には、これはｈＢＮＰまたはその断片のＮ−末端およびＣ−末端テイルではない。
【００５４】
もう一つの態様において、ナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体は下記アミノ酸配列を含有する：
ＣＦＧＲＸ1ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＸ2（配列番号：    ）
（ここで、Ｘ1およびＸ2の少なくとも一方は、修飾部分にカプリングされている修飾部分結合部位を含有するアミノ酸であり、他方はいずれか別のアミノ酸または未結合Ｌｙｓである）。一態様において、Ｘ1はその側鎖で修飾部分にカプリングされているＬｙｓであり、およびＸ2は別種のアミノ酸、例えばＧｌｙまたはＡｒｇである。別様に、Ｘ2はその側鎖で修飾部分にカプリングされているＬｙｓであり、およびＸ1は別種のアミノ酸、例えばＧｌｙ、Ａｒｇまたはリジン以外のアミノ酸である。別の態様において、Ｘ1はその側鎖で修飾部分にカプリングされているＬｙｓであり、およびＸ2は未結合Ｌｙｓである。別様に、Ｘ2はその側鎖で修飾部分にカプリングされているＬｙｓであり、およびＸ1は未結合Ｌｙｓである。未結合ペプチドがまた、本発明の態様であることは明白である。
【００５５】
実際上、全部のナトリウム排泄増加性ペプチドを本発明に従い修飾することができる。例として、修飾に適する候補者であるペプチド／タンパク質は、ＰＣＴＵＳ０２１７５６７に開示されており、これを引用することによってここに詳細を組入れる。一例として、ＢＮＰは天然配列中にＬｙｓ残基を含有し、これは好ましくは、オリゴマー用結合部位として活動する。ＢＮＰが天然ペプチドである本発明の或る態様において、このペプチドの結合性領域からいずれの結合部位も除去することが望ましいことがあり、または結合部位を消失させることが望ましいこともある。オリゴマーがペプチド配列の特定のＬｙｓ残基の部位で結合しないことが望まれる場合、このＬｙｓはもう一種のアミノ酸、例えばアルギニンにより置換することができる。一例として、Ｌｙｓ14の部位における結合が有意の量の保有活性をもたらすという本出願人の驚くべき発見により、この領域における非加水分解性オリゴマーとの結合は活性を決定することができる。従って、このような結合部位を、類似の化学的性質を有するが、容易に結合しないアミノ酸により置換することが望ましいこともある。一例として、ｈＢＮＰ配列において、Ｌｙｓ14はＡｒｇにより置換することができ、これにより天然ＢＮＰにかかわるペプチド配列のＬｙｓ部位でペプチドと結合させると好ましい。アミノ酸置換は、Ｌｙｓの代わりに容易に結合しないアミノ酸による置換を選択することができる。
【００５６】
或る場合、結合用の追加の部位を付与することが望ましいこともある。例えば、或る態様において、陽電荷帯電アミノ酸残基をＬｙｓ残基により置き換える。例えば、ＡＮＰペプチド（天然配列）の場合、Ａｒｇ27をＬｙｓにより置き換えることができる。
【００５７】
結合部位を付加する変異は、変異および結合が生成するペプチド結合体の活性、特にそのＮＰＲ−Ａに対する親和性を消失させないように選択することができる。一態様において、ナトリウム排泄増加性化合物は、１個または２個以上のＬｙｓ残基がｈＢＮＰ配列中に挿入されているか、および／またはｈＢＮＰの末端に付加されているか、および／または１個または２個以上の天然Ｌｙｓ残基が欠失しているか、または同類置換により置き換えられている天然ｈＢＮＰアミノ酸配列あると定義される。好ましくは、このような置換または挿入は、１種または２種以上のナトリウム排泄増加性ペプチドのテイルアミノ酸配列に存在させる。
【００５８】
或る態様において、この結合部位は、Ｎ−末端テイル部位またはその付近における挿入、置換または付加、例えばＮ−末端テイルアミノ酸配列内における挿入または置換、好ましくはＮ−末端またはＮ−末端から位置１、２、３、４または５のアミノ酸における、または別様に、位置Ｉ、ループを創生するＣｙｓ架橋の一部を形成するＮ−末端ＣｙｓからＮ−末端方向の２、３、４、５、６、７、８または９のアミノ酸における挿入または置換であることができる。好適態様において、ナトリウム排泄増加性化合物は、Ｌｙｓ3→Ａｒｇ、Ｌｙｓ14→Ａｒｇ、Ａｒｇ30→ＬｙｓおよびＬｙｓ27→Ａｒｇからなる群から選択される１種または２種以上の変異を有する天然ｈＢＮＰ配列として定義され、この場合、上記１種または２種以上の変異は、当該ナトリウム排泄増加性ペプチド化合物の生物学的活性を消失させないものである。１個よりも多くの修飾部分、例えばオリゴマーの付加は、酵素安定性を改善し、および／または吸着性を強化する。
【００５９】
かなりのナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体は、天然ナトリウム排泄増加性ペプチドのループ部分、例えばｈＢＮＰのＣｙｓ10−Ｃｙｓ26を含有し、この場合、Ｃｙｓ10とＣｙｓ２６とはジスルフィド結合によりカプリングされ、ループを形成している。或る場合、このループは、当該置換、欠失および／または挿入が天然配列の活性を消失させないかぎり、天然配列とは相違しているアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を包含することができる。このような変更されたループ配列は、Ｓｃｈｏｅｎｆｅｉｌｄａ等による“Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂ−ｔｙｐｅ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ，”ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４１４（１９９７）２６３−２６７に見出すことができ（この記載全体を引用してここに組入れる）、またレセプター−Ｃ（ＮＰＲ−Ｃ）に比較して好ましいナトリウム排泄増加性ペプチドレセプター−Ａ（ＮＰＲ−Ａ）を結合するＢＮＰの変異体も開示されている（米国特許６，５２５，０２２および米国特許６，０２８，０５５）。例として、このナトリウム排泄増加性ループは、当該ループのナトリウム排泄増加性活性を消失させない１種または２種以上の同類置換（conservative substitution）を有する天然ループを含有することができる。例えば、或る場合、ループは天然ループ（例えば、ｈＢＮＰの天然ループ）の配列を有し、また１、２、３、４、５、６、７または８個の同類置換を有する。もう一つの態様において、このループは、生物学的活性を消失させない一組のアミノ酸の除去によって短縮されている。一態様において、このペプチド類縁体は、ｈＢＮＰのＣｙｓ10−Ｃｙｓ26ループを含有し、この場合、Ｌｙｓ14はＧｌｙまたはＡｒｇにより置換されている。もう一つの態様において、このループのＳＳＳＳ部分は変更または欠失されている。
【００６０】
さらに、このナトリウム排泄増加性ペプチドループまたは天然ループの類縁体は、Ｎ−末端テイルおよび／またはＣ−末端テイル、例えば天然ナトリウム排泄増加性ペプチドのテイル、例えばｈＢＮＰ1-9およびｈＢＮ（Ｐ2）7-32-を含有することができる。これらのテイルは生物学的活性を消失させない１個のアミノ酸またはペプチドである。或る場合、当該置換、欠失および／または挿入が天然配列の活性を消失させないかぎり、これらのテイルは天然配列と相違するアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を包含することができる。一態様において、このテイルまたはこれらのテイルは、天然配列に基づくが、１個または２個以上のアミノ酸により切断されている。一例として、存在する場合、Ｎ−末端テイルは次のｈＢＮＰ配列８−９、７−９、６−９、５−９、４−９、３−９、２−９、および１−９から選択することができ；また１個または２個以上のＬｙｓ残基がＧｌｙまたはＡｒｇ残基により置換されている上記セグメントのいずれかから選択することができる。同様に、存在する場合、Ｃ−末端テイルは、ｈＢＮＰセグメント２７−２８、２７−２９、２７−３０、２７−３１および２７−３２から選択することができ；また１個または２個以上のＬｙｓ残基がＧｌｙまたはＡｒｇ残基により置換されている上記セグメントのいずれかから選択することができる。好適ループ＋テイルナトリウム排泄増加性ペプチドは、ｈＢＮＰセグメント１−２９；ｈＢＮＰセグメント１−２６；およびその１個または２個以上のＬｙｓ残基がＧｌｙまたはＡｒｇにより置換されている上記ｈＢＮＰセグメントのどちらかを包含する。
【００６１】
上記類縁体に加えて、本発明で使用するのに適する広く種々の類縁体が当技術で開示されている。例えば、１９９２年５月１９日付けで発行された米国特許５，１１４，９２３（この特許の全記載を引用してここに組入れる）は、式Ｒ1−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｒ2で表わされるナトリウム排泄増加性活性を有するペプチドを開示している。この式において、Ｒ1は、（Ｈ）；Ｇｌｙ−；Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−；Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−；Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−；Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−；Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−；Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−；Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−；Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−；およびＲ3−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−から選択され、この式において、Ｒ3はヒトタンパク質にかかわる位置１−９９の１０２アミノ酸配列またはそのＣ−末端タンパク質であり、およびＲ2は、（Ｈ）；ＮＨ2、ＮＨＲ′であるか、または修飾部分′および修飾部分″は独立し、低級アルキル（１−４Ｃ）であり、またはＲ2はＬｙｓ；Ｌｙｓ−Ｖａｌ；Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ；Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ；Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ；Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ；Ｌｙｓ−ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ；またはそのアミド（ＮＨ2、ＮＨＲ′またはＮＲ′修飾部分）である。
【００６２】
１９９０年２月２日付けで発行された米国特許４，９０４，７６３（この特許の全記載を引用してここに組入れる）はまた、本発明で使用するのに適するナトリウム排泄増加性活性ペプチド類縁体、例えばＸ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−ＯＨ（ここで、ＸはＨ、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−またはＨ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙである）を開示している。
【００６３】
１９９０年２月２７日付けで発行された米国特許４，９０４，７６３（この特許の全記載を引用してここに組入れる）はまた、本発明で使用するのに適する別のナトリウム排泄増加性活性ペプチド類縁体を開示しており、この化合物はＸ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｙ（ここで、２システインはジスルフィド結合により架橋されている）を包含する。この式において、ＸはＨまたはＨ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−を意味し、およびＹは−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＯＨ、−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＯＨ、−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＯＨ、−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＯＨ、−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ、−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＯＨ、またはその塩を表わす。もう一種の使用するのに適する類縁体は、１９８９年１２月１４日付けで発行されたＰＣＴ出願公開Ｎｏ．ＷＯ８９１２０６９に開示されている。
【００６４】
本発明で使用するのに適するもう一種のナトリウム排泄増加性活性ペプチド類縁体の追加の一組は、２００３年６月１２日付けで発行された米国特許公開Ｎｏ．２００３０１０９４３０（この特許の全記載を引用してここに組入れる）に開示されている。この刊行物は、式：Ｒ1−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ／Ｌｙｓ−Ｌｅｕ／Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ／Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ／Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｒ2で表わされるナトリウム排泄増加性活性を有するペプチドを開示している。この式において、Ｒ1は（Ｈ）、Ｇｌｙ−、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ａｓｐ／Ｌｙｓ／Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ｇｌｎ−Ａｓｐ／Ｌｙｓ／Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｍｅｔ／Ｖａｌ−Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ｇｌｎ−Ａｓｐ／Ｌｙｓ／Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｔｈｒ／Ｍｅｔ−Ｍｅｔ／Ｖａｌ−Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ｇｌｎ−Ａｓｐ／Ｌｙｓ／Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｌｙｓ−Ｔｈｒ／Ｍｅｔ−Ｍｅｔ／Ｖａｌ−Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ｇｌｎ−Ａｓｐ／Ｌｙｓ／Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ／Ｍｅｔ−Ｍｅｔ／Ｖａｌ−Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ｇｌｎ−Ａｓｐ／Ｌｙｓ／Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ／Ｍｅｔ−Ｍｅｔ／Ｖａｌ−Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ｇｌｎ−Ａｓｐ／Ｌｙｓ／Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、またはブタ、イヌまたはヒトＢＮＰの天然上流配列の１０−１０９アミノ酸配列、もしくはその組み合わせからなる群から選択され；Ｒ2は（ＯＨ）、ＮＨ2またはＮＲ′Ｒ″（ここで、Ｒ′およびＲ″は独立して低級アルキル（この場合、１−４Ｃ）であるか、またはＡｓｎ／Ｌｙｓ、Ａｓｎ／Ｌｙｓ−Ｖａｌ、Ａｓｎ／Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ａｓｎ／Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ、Ａｓｎ／Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ／Ｌｙｓ、Ａｓｎ／Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ／Ｌｙｓ−Ｔｙｒ／Ｈｉｓまたはそのアミド（ＮＨ2またはＮＲ′Ｒ″）であり、ただし式がＲ1−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｒ2であり、およびＲ1がＡｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙである場合、Ｒ2はＡｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒではない。
【００６５】
さらにもう一種の類縁体は、Ｓｃｉｏｓにより１９９７年１１月２６日付けで発行されたヨーロッパ特許ＥＰ０５４２８６３Ｂ１に記載されている。この特許は、Ｎ−末端からＣ−末端まで；Ｇｌｕ残基またはＡｓｐ−Ｇｌｙ配列をＳｔａｐｈＶ８分解部位に含有していない約１０−約５０ＫＤａのキャリアタンパク質；上記キャリアのＣ−末端に位置するＧｌｕ残基またはＡｓｐ−Ｇｌｙ配列を含有するＳｔｅｐｈＶ８分解部位；および；および上記分解部位に融合しているＳｔｅｐｈＶ８分解部位を含有していないペプチド；を包含する融合タンパク質を開示しており、上記融合タンパク質は約８．０またはそれ以上のｐＩを示す。この特許はまた、６−２０アミノ酸のＮ−末端リーダーの使用を開示している。
【００６６】
本発明で使用するのに適する別種のナトリウム排泄増加性活性ペプチド類縁体は、２００２年７月４日付けで発行された米国特許公開Ｎｏ．２００２００８６８４３（この特許の全記載を引用してここに組入れる）に開示されている。この刊行物は、生理学的活性ポリペプチド、Ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−ＯＨ［ここで、２システインは架橋されている］を開示している。この式において、ＸはＨ、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−またはＨ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−である。
【００６７】
このような置換の実施に際し、アミノ酸のヒドロパティック指数（hydropathic index）を考慮することができる。ポリペプチドに相互作用性生物学的機能を付与するアミノ酸ヒドロパティック指数の重要性は一般に、当技術で理解されている。アミノ酸の相対的ヒドロパティック特性が生成したポリペプチドの二次構造に寄与すること、次いでこれが別の分子とタンパク質との相互反応を定めることは受け入れられている。各アミノ酸は、その疎水性および帯電性に基づくヒドロパティック指数で下記のとおりに表わされる：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；Ｌｙｓ（−３．９）；およびＡｒｇ（−４．５）。当業者に理解されるように、或るアミノ酸は、類似のヒドロパティック指数またはスコアを有する別のアミノ酸の代わりに置換することができ、類似の生物学的活性を有するポリペプチドを依然として得ることができる。すなわち、生物学的機能性の点で同等なポリペプチドを依然として得ることができる。このような変更を行う際に、そのヒドロパティック指数が相互に±２以内であるアミノ酸の置換は好適であり、相互に±１以内であるアミノ酸の置換は特に好適であり、相互に±０．５以内であるアミノ酸の置換はさらに特に好適である。
【００６８】
同様のアミノ酸の置換を親水性に基づき効果的になすことができることはまた、理解される。米国特許４，５５４，１０１（この特許の全記載を引用してここに組入れる）は、その隣接アミノ酸の親水性によって支配されるタンパク質の最大局所的平均親水性はタンパク質の生物学的性質に関連するという情報を提供している。米国特許４，５５４，１０１に詳細に記載されているように、下記親水性値がアミノ酸残基に対し示されている：Ａｒｇ（＋３．０）；Ｌｙｓ（±３．０）；アスパルテート（±３．０±１）；グルタメート（±３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。当業者に理解されているように、アミノ酸は類似の親水性値を有する別種のアミノ酸の代わりに置換することができ、また生物学的に同等のもの、特に免疫学的に同等なポリペプチドを得ることができる。このような変更において、その親水性値が相互に±２以内であるアミノ酸の置換は好適であり、その親水性値が相互に±１以内であるアミノ酸の置換は特に好適であり、その親水性値が相互に±０．５以内であるアミノ酸の置換はさらに特に好適である。
【００６９】
上記で概述したように、アミノ酸置換／挿入はアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づくことができる。上記種々の特性を考慮する具体的置換（すなわち、そのポリペプチドの生物学的活性を重大に変更することなく相互変換することができるアミノ酸）は当業者にとって周知であり、例えばＡｒｇとＬｙｓ；グルタメートとアスパルテート；セリンとスレオニン；グルタミン酸とアスパラギン酸；およびバリン、ロイシンとイソロイシンを包含する。
【００７０】
当業者に理解されているように、ナトリウム排泄増加性ペプチド（例えば、ＢＮＰ）類縁体は、これらに制限されないものとして、古典的（溶液）方法、固体相方法、半固体相方法、および組換えＤＮＡ方法を包含する種々の認識されているペプチド合成技術により製造することができる。
【００７１】
８．１．３  マルチ−ＢＮＰペプチド
ナトリウム排泄増加性化合物はまた、２個または３個以上のナトリウム排泄増加性化合物単位を順に有する、および場合により、各ナトリウム排泄増加性化合物単位間にスペーサー配列を含有するマルチペプチドであることもできる。これらの化合物はまた、場合により、ナトリウム排泄増加性化合物の末端のどちらか、または両方にリーダーおよび／またはエクステンション配列を含有することができる。例えば、例として、また制限するものではないとして、また制限を伴わないものとして、各マルチペプチドの構造および／または式は、下記構造を有することができる：ＮＰ−［ＮＰ］n；ＮＰ−［スペーサー−ＮＰ］n；リーダー−［スペーサー−ＮＰ］n；リーダー−［スペーサー−ＮＰ］n−エクステンション、
【００７２】
ここで、
ＮＰ−［ＮＰ］n；
ＮＰ−［スペーサー−ＮＰ］n；
リーダー−ＮＰ−［ＮＰ］n；
リーダー−ＮＰ−［スペーサー−ＮＰ］n；
リーダー−［スペーサー−ＮＰ］n；
リーダー−［スペーサー−ＮＰ］n−エクステンション；
リーダー−ＮＰ−［スペーサー−ＮＰ］n−エクステンション；
【００７３】
ここで、
ｎは、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であることができる；
ＮＰは、ナトリウム排泄増加性ペプチドまたはナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体である；
【００７４】
スペーサーは、例えばＮＰに存在していない酵素切断部位、好ましくは酵素分解部位またはＮＰに存在していない化学的分解部位であることができ、また化学的結合期間中、当該マルチペプチドのＮＰのＮ−末端をブロックし、および細胞質または細胞培地における当該マルチペプチドの溶解性を改良することができる；
【００７５】
リーダーは、例えば１個のアミノ酸、アミノ酸配列、ペプチド（例えば、リーダーペプチドまたはシグナルペプチド）、またはタンパク質であることができ、またリーダーはＮ−末端を結合からブロックし、当該マルチペプチド（例えば、酵素カクテル；Ｖ８プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼ（Ｇｌｕ−Ｃ）およびエンドプロテイナーゼ（Ａｓｐ−Ｎ））により分解可能な（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−の精製を補助し；溶解性を改良し、および／または細胞からの排出を補助する（例えば、Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ）；またリーダーは好ましくは、酵素分解または化学的分解によってマルチペプチドから分離することができる。
【００７６】
エクステンションは、例えば１個のアミノ酸、アミノ酸配列、ペプチド（例えば、リーダーペプチドまたはシグナルペプチド）、またはタンパク質であることができ；またエクステンションはＣ−末端を結合からブロックし、当該マルチペプチド（例えば、（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ）の精製を補助し；溶解性を改良し、および／または細胞からの排出を補助する（例えば、酵素カクテル；Ｖ８プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼ（Ｇｌｕ−Ｃ）およびエンドプロテイナーゼ（Ａｓｐ−Ｎ））により切断されるＡｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ）；またエクステンシヨンは好ましくは、酵素分解または化学的分解によってマルチペプチドから分離することができる。
【００７７】
リーダーは、例えば細胞にＢＮＰを分泌させる１個のペプチドもしくはプレリーダー配列または融合相手タンパク質の前または後のプレリーダー配列であることができ、また化学的結合期間中、当該マルチペプチドのＮＰのＮ−末端をブロックし、および／または細胞質または細胞培地における当該マルチペプチドの溶解を補助することができる；および
【００７８】
エクステンションは、例えば当該マルチペプチドの精製を補助し、また細胞質または細胞培地における当該マルチペプチドの溶解を補助することができる。
【００７９】
一態様において、スペーサーは、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇであり、リーダーは、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇであり、およびエクステンションは、（Ｈｉｓ）6−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇである。この態様において、ＮＰはトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢ酵素カクテルを用い放出させることができる。
【００８０】
一態様において、スペーサーは、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇであり、リーダーは、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇであり、およびエクステンションは、（Ｈｉｓ）6−ＡＡＡ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇである（ここで、ＡＡＡはアミノ酸残基３−４０個、好ましくは３−１５個の長さを有するアミノ酸配列である）。この態様において、ＮＰはトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢ酵素カクテルを用い放出させることができる。
【００８１】
もう一つの態様において、スペーサーは、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇであり、リーダーは、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇであり、およびエクステンションは、（Ｈｉｓ）6−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇである。この態様において、ＮＰはトロンビンおよびカルボキシペプチダーゼＢ酵素カクテルを用い放出させることができる。
【００８２】
もう一つの態様において、スペーサーは、Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇであり、リーダーは、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇであり、およびエクステンションは、（Ｈｉｓ）6−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇである。この態様において、ＮＰはトロンビンおよびカルボキシペプチダーゼＡ酵素カクテルを用い放出させることができる。
【００８３】
もう一つの態様において、スペーサーは、Ｍｅｔ−Ｍｅｔであり、およびエクステンションは、（Ｈｉｓ）6−ＡＡＡ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔである（ここで、ＡＡＡはアミノ酸残基３−４０個の長さを有するアミノ酸配列である）。この態様において、ＮＰはＣＮＢｒを用い放出させることができる。
【００８４】
もう一つの態様において、スペーサーは、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕであり、リーダーは、Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕであり、およびエクステンションは、（Ｈｉｓ）6−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕである。この態様において、ＮＰはＶ８プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ）およびエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎカクテルを用い放出させることができる。
【００８５】
もう一つの態様において、スペーサーは、Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕであり、リーダーは、Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕであり、およびエクステンションは、（Ｈｉｓ）6−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕである。この態様において、ＮＰはＶ８プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ）を用い放出させることができ、これにより新規ＮＰ類縁体であるＮＰ−Ｇｌｕが得られる。
【００８６】
もう一つの態様において、スペーサーは、Ｇｌｕ−Ｇｌｕであり、リーダーは、Ｃ−末端に存在するＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａであり、およびエクステンションは、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ（Ｈｉｓ）6−Ｇｌｕである。この場合、そのＣ−末端は、エンテロキナーゼにより分解させることができる融合相手、適当な融合タンパク質に結合されている。この態様において、ＮＰはＶ８プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ）を用い放出させることができ、これにより新規ＮＰ類縁体であるＮＰ−Ｇｌｕが得られる。
【００８７】
もう一つの態様において、スペーサーは、Ｇｌｕ−Ｇｌｕであり、リーダーは、Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕであり、およびエクステンションは、（Ｈｉｓ）6−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕである。この場合、そのＮ−末端は、エンテロキナーゼにより分解させることができる融合相手、適当な融合タンパク質に結合されている。この態様において、ＮＰはＶ８プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ）を用い放出させることができ、これにより新規ＮＰ類縁体であるＮＰ−Ｇｌｕが得られる。
【００８８】
もう一つの態様において、スペーサーは、Ｇｌｕ−Ｇｌｕであり、リーダーは、Ｃ−末端に存在するＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａであり、およびエクステンションは、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−（Ｈｉｓ）6−Ｇｌｕである。この場合、そのＣ−末端は、融合相手、適当な融合タンパク質に結合されている。この態様において、ＮＰはＶ８プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ）を用い放出させることができ、これにより新規ＮＰ類縁体であるＮＰ−Ｇｌｕが得られる。
【００８９】
もう一つの態様において、スペーサーは、Ｇｌｕ−Ｇｌｕであり、リーダーは、Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕであり、およびエクステンションは、Ｇｌｕ−（Ｈｉｓ）6−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕである。この場合、そのＮ−末端は、融合相手、適当な融合タンパク質に結合されている。この態様において、ＮＰはＶ８プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ）を用い放出させることができ、これにより新規ＮＰ類縁体であるＮＰ−Ｇｌｕが得られる。
【００９０】
８．２  修飾部分
修飾部分は、ナトリウム排泄増加性化合物、例えばＢＮＰペプチド化合物を修飾する部分であり、本明細書に記載の望ましい性質を化合物に付与する。一例として、修飾部分は種々の環境（例えば、ＧＩ器官、および／または血流）におけるナトリウム排泄増加性化合物の分解速度を減少させることができ、これによりこのような環境において、修飾部分が存在しない場合における分解に比較し、修飾形態のナトリウム排泄増加性化合物は分解量が少ない。好適修飾部分は、ナトリウム排泄増加性化合物が親のナトリウム排泄増加性化合物の生物学的活性を治療的に重大なパーセンテージで保有することを可能にするものである。
【００９１】
８．２．１  安定性、溶解性および／または生物学的活性に作用する部分
ナトリウム排泄増加性化合物に結合し、親のナトリウム排泄増加性化合物の安定性、溶解性および／または生物学的活性が変更されている本明細書に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体を形成する多くの部分が存在する。例は、親水性ポリマーまたはオリゴマー、両親媒性ポリマーまたはオリゴマー、および親油性ポリマーまたはオリゴマーを包含する。
【００９２】
このポリマー（または短鎖オリゴマー）は、それらの幹鎖中に弱いまたは分解性の結合を含有することができる。一例として、ポリアルキレングリコールは、加水分解的に不安定な結合、例えばラクチド、グリコライド、カーボネート、エステル、カルバメートなどを含有することができ、これらは加水分解に対し感受性を有する。これは当該ポリマーを低分子量断片に分解することを可能にする。このようなポリマーの例は、例えばＨｕｂｂｅｌｌ等に対する米国特許Ｎｏ．６，１５３，２１１に記載されている。
【００９３】
代表的親水性、両親媒性および親油性ポリマーおよびオリゴマーは、以下で詳細に説明する。
【００９４】
８．２．２  親水性部分
親水性部分は、当業者に理解されているように種々の親水性部分であることができ、これらに制限されないものとして、ポリアルキレングリコール部分、別種の親水性ポリマー、糖部分、ポリソルベート部分、およびその組合せを包含する。
【００９５】
８．２．２．１  ポリアルキレングリコール部分
ポリアルキレングリコールは、反復するアルキレングリコール単位を有する化合物である。或る態様において、この単位は全部が同一である（例えば、ポリエチレングコールまたはポリプロピレングリコール）。別の態様において、このアルキレン単位は、相違している（例えば、ポリエチレン−プロピレングリコール、またはプルロニクス（PLURONICS）（登録商品名））。これらのポリマーは、ランダムコポリマー（例えば、エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドとが共重合している場合）、または分枝鎖状またはグラフトコポリマーであることができる。
【００９６】
ポリエチレングリコールまたはＰＥＧは好適ポリアルキレングリコールであり、高度の望ましい性質を有し、また一般に、食品医薬局（Food and Drug Administration）によって安全であると見なされている（ＧＲＡＳ）ことから生物学的用途で有用である。ＰＥＧは、式−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−を有し、式中ｎは約２〜約４０００またはそれ以上である。ＰＥＧは代表的に、無色であり、無臭であり、水溶性または水混和性であり（分子量に応じる）、熱安定性であり、化学的に不活性であり、加水分解的に安定であり、また一般に無毒性である。ＰＥＧはまた、生体適合性であり、また代表的に、身体で免疫応答を生じない。本発明の好適ＰＥＧ部分は、好適順に示されている下記範囲から選択されるＰＥＧ付属単位数を包含する：２〜５０、２〜４０、２〜３０、２〜２５、２〜２０、２〜１５、２〜１０。或る態様において、修飾部分は、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の付属単位を含有する。
【００９７】
ＰＥＧは、単分散であることができ（例えば、両方ともに２００１年６月４日付けで出願された米国特許出願Ｎｏ．０９／８７３，７３１および同Ｎｏ．０９／８７３，７９７に本出願人によって以前に開示されており、これらの全記載を引用してここに組入れる）、または多分散物資は市場に一般的に供給されている。単分散の場合、これは、ポリアルキレングリコールが単一の分子量を有するか、または比較的狭い範囲の分子量を有することを意味する。比較的低分子量の単分散ポリマーの利点の一つは、これらが容易に確定できる結合体分子を形成することにあり、これにより再現性合成およびＦＤＡ認定の両方を促進できる。
【００９８】
ＰＥＧは、各末端にヒドロキシル基を有する線状ポリマーであることができる（ナトリウム排泄増加性化合物に結合される前）。ＰＥＧはまた、アルコキシ−ＰＥＧ、例えばメトキシ−ＰＥＧ（またはｍＰＥＧ）であることができ、この場合、末端の一方は比較的不活性のアルコキシ基であり、他方の末端はヒドロキシル基である（これがナトリウム排泄増加性化合物にカプリングする）。ＰＥＧはまた、分枝鎖状であることもでき、この場合、一具体例において、Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）mで表わすことができる（式中、Ｒは中心（代表的に多価）芯形成部分、例えばペンタエリスリトールまたはグリセロールを表わし、およびｍは腕部の数を表わす）。各分枝は相違することができ、また末端に、例えばエーテルおよび／またはエステルを有することができる。腕部ｍの数は３〜１００、またはそれ以上の範囲であることができ、また末端ヒドロキシル基の１個または２個以上はナトリウム排泄増加性化合物の残りの部分にカプリングさせることができ、または別様に、化学修飾に付すことができる。別種の分枝鎖状ＰＥＧは、式（ＣＨ3Ｏ−ＰＥＧ−）pＲ−Ｚ（式中、ｐは２または３に等しく、Ｒは中心芯部分、例えばＬｙｓまたはグリセロールを表わし、およびＺは容易に化学的に活性化されるカルボキシルなどの基を表わす）で表わされる化合物を包含する。さらにもう１種の分枝鎖状形態の側鎖ＰＥＧは、ＲＥＧ幹鎖に沿って、またはさらに、ＰＥＧ鎖の末端に存在する反応性基、例えばカルボキシル基を有する。フォーク状ＰＥＧは、分枝鎖状ＰＥＧのもう１種の形態であり、式ＰＥＧ（−ＬＣＨＸ2）n（式中、Ｌは結合基であり、およびＸは活性化末端基である）で表わされる。ポリエチレングリコールまたはＰＥＧの用語は、直鎖状または分枝鎖状ＰＥＧの全部の形態を表わし、また包含する。ポリアルキレングリコールまたはＰＥＧは、直鎖状または分枝鎖状ＰＥＧの全部の形態を包含する
【００９９】
８．２．２．２  糖部分
本明細書に記載のナトリウム排泄増加性化合物は、当業者にとって公知のように、糖部分を含有することができる。一般に、糖部分は、少なくとも１個のサッカロース基の炭水化物生成物である。代表的糖部分は、これらに制限されないものとして、グリセロール基、モノ−、ジ−、トリ−およびオリゴサッカライド、およびポリサッカライド、例えばデンプン、グリコーゲン、セルロース、およびポリサッカライドガムを包含する。特定のモノサッカライドは、Ｃ6およびそれ以上（好ましくは、Ｃ6〜Ｃ8）の糖、例えばグルコース、フラクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、およびセドヘプタロースを包含する；ジ−およびトリ−サッカライドは、２個または３個のモノサッカライド単位を有する分子（好ましくは、Ｃ5〜Ｃ8）、例えばスクロース、セロビオース、マルトース、ラクトース、およびラフィノースを包含する。糖部分を用いる結合は、米国特許５，６８１，８１１、同５，４３８，０４０および同５，３５９，０３０に記載されている（これらの全記載を引用してここに組入れる）。
【０１００】
８．２．２．３  ポリソルベート部分
ポリソルベート部分は、当業者に理解されているように、種々のポリソルベートであることができ、制限するものではないものとして、ソルビタンエステルおよびポリオキシエチレンにより誘導体化されたポリソルベートを包含する。ポリソルベート部分を使用する結合体は米国特許５，６８１，８１１、同５，４３８，０４０および同５，３５９，０３０に記載されており、これらの全記載を引用してここに組入れる。
【０１０１】
８．２．２．４  生体適合性水溶性ポリカチオン性部分
或る態様において、生体適合性水溶性ポリカチオン性部分を使用することができる。生体適合性水溶性ポリカチオン性部分は、例えば側鎖基として結合しているプロトン化ヘテロ環を有するいずれかのポリマーを包含する。「水溶性」は、ポリマー全体が水性溶液、例えば緩衝された塩類溶液または共溶媒として添加された少量の有機溶媒を含有する緩衝された塩類溶液に２０〜３７℃の温度で溶解することを意味する。或る態様において、このポリマーそれ自体は、水性溶液それ自体に充分に溶解しないが、水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ鎖をグラフトすることによって溶液にされる。この例は、ポリマー幹鎖またはポリマー側鎖のどちらかにアミン基を有するポリアミン、例えばポリ−Ｌ−Ｌｙｓ、およびポリ（Ｄ−Ｌｙｓ）、ポリ（オルニチン）、ポリ（Ａｒｇ）およびポリ（ヒスチジン）を包含する天然または合成アミノ酸の陽電荷に帯電させた別種のポリアミノ酸またはアミノ酸混合物、ならびに非ペプチドポリアミン、例えばポリ（アミノスチレン）ポリ（アミノアクリレート）、ポリ（Ｎ−メチルアミノアクリレート）、ポリ（Ｎ−エチルアミノアクリレート）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノアクリレート）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノアクリレート）、ポリ（アミノメタアクリレート）、ポリ（Ｎ−メチルアミノメタアクリレート）、ポリ（Ｎ−エチルアミノメタアクリレート）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメタアクリレート）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメタアクリレート）、ポリ（エチレンイミン）、四級アミンのポリマー、例えばポリ（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミノアクリレート）、ポリ（メチルアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロライド）、および天然または合成ポリサッカライド、例えばキトサン（chitosan）を包含する。
【０１０２】
８．２．２．５  その他の親水性部分
別種の親水性ポリマーもまた、使用することができる。この例は、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、例えばポリ（オキシエチル化グリセロール）、ポリ（オキシエチル化ソルビトール）、およびポリ（オキシエチル化グルコース）；ポリ（ビニルアルコール）（“ＰＶＡ”）；デキストラン；炭水化物ベースポリマーなどを包含する。これらのポリマーは、直鎖状または分枝鎖状の上記ポリマーのモノマーを基材とするホモポリマー、もしくはランダムまたはブロックコポリマーおよびターポリマーであることができる。
【０１０３】
適当な追加のポリマーの特定の例は、これらに制限されないものとして、ポリ（オキサゾリン）、二官能性ポリ（アクリロイルモルホリン）（“ＰＡｃＭ”）、およびポリ（ビニルピロリドン）（“ＰＶＰ”）を包含する。ＰＶＰおよびポリ（オキサゾリン）は当技術で周知のポリマーであり、それらの製造は当業者にとって自明である。ＰＡｃＭおよびその合成、ならびに使用は、米国特許５，６２９，３８４および同５，６３１，３２２に記載されており、これらの全記載を引用してここに組入れる。
【０１０４】
８．２．３  生体接着性ポリアニオン性部分
或る種の親水性ポリマーは、強力に有用な生体接着性物性を有するように見える。このようなポリマーの例は、例えばＭａｔｈｉｏｗｉｔｚ等に対する米国特許Ｎｏ．６，１９７，３４６に記載されている。これらのカルボキシル基含有ポリマー（例えば、ポリ（アクリル酸））は、生体接着性物性を示し、また本明細書に記載のナトリウム排泄増加性化合物と容易に結合する。分解するとカルボン酸基を露呈する生体腐食性ポリマー、例えばポリ（ラクチド−コ−グリコライド）、ポリアンハイドライド、およびポリオルトエステルはまた、生体接着性ポリマーである。これらのポリマーは胃腸器官へのナトリウム排泄増加性化合物の放出に使用することができる。ポリマーが分解すると、これらはカルボン酸基を露呈することができ、これにより胃腸器官に強力に接着できるようになる。これらはまた、ナトリウム排泄増加性化合物結合体の放出にも役目を果たすことができる。
【０１０５】
８．２．４  親油性部分
或る態様において、修飾部分は親油性部分を包含する。この親油性部分は、当業者に理解されているように、種々の親油性部分であることができ、これらに制限されないものとして、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アリールアルキル基、アルキルアリール基、脂肪酸基、アダマンタンチルおよびコレステリル、ならびに親油性ポリマーおよび／またはオリゴマーを包含する。
【０１０６】
アルキル基は、飽和または不飽和の直鎖状、分枝鎖状または環状炭化水素鎖であることができる。或る態様において、アルキル基は少なくとも１個、２個、３個または４個以上の炭素原子を有する。別の態様において、アルキル基は炭素原子１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個を有する直鎖状飽和または不飽和アルキル基である。例は、飽和直鎖状アルキル基、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシルおよびエイコシル；飽和分枝鎖状アルキル基、例えばイソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル；およびこれらに制限されないものとして、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを包含する上記飽和アルキル基から誘導される不飽和アルキル基；を包含する。別の態様において、アルキル基は低級アルキル基である。さらにもう一つの態様において、アルキル基はＣ1〜Ｃ3低級アルキル基である。或る態様において、修飾部分は、特定的にアルキル基からなるものではなく、または特定的に低級アルキル基からなるものではなく、または特定的にアルカン基からなるものではなく、または特定的に低級アルカン基からなるものではない。
【０１０７】
アルキル基は、未置換であるか、または１個または２個以上の置換基を有することができ、このような置換基は好ましくは、当該結合体の合成方法を干渉しないか、または当該結合体の生物学的活性を消失させないものである。潜在的干渉機能は、この機能を非干渉性にするような保護基により適当に防護することができる。このような置換基は別の非干渉性置換基により置換されていてもよい。「非干渉性」の用語は、本発明の方法に従い行われるいずれかの反応に有害な影響を及ぼさないことを特徴とする置換基を表わす。脂肪酸基は、天然または合成の飽和または不飽和で直鎖状または分枝鎖状脂肪酸基を包含する種々の脂肪酸基であることができる。或る場合、脂肪酸基は少なくとも２個、３個、４個または５個以上の炭素原子を有する。別の態様において、この脂肪酸基は炭素原子２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個または２４個を有する。
【０１０８】
修飾性基がアリール環である場合、この環は、これがカルバメート基と分子内様相で反応でき、その加水分解を補助するように位置している親核官能性基（例えば、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨＲ′）により官能性化することができる。或る態様において、この親核性基は加水分解または別様でインビボ分解される可能性を有する保護基により保護されており、この場合、保護基が脱保護されると、結合体の加水分解および親ナトリウム排泄増加性化合物の放出が促進される結果が得られる。
【０１０９】
８．２．５  両親媒性基
或る態様において、修飾部分は両親媒性基を包含する。かなりのポリマーおよびオリゴマーは両親媒性である。これらはしばしば、親水性基および親油性基を含有するブロックコポリマー、分枝鎖状ポリマーまたはグラフトポリマーであり、直鎖状、分枝鎖状またはグラフトポリマーまたはコポリマーなどのオリゴマーおよび／またはポリマーの形態であることができる。
【０１１０】
開示されている親水性ポリマーまたはオリゴマーは、本明細書に記載の親油性基および親水性基のいずれかの組合せを包含することができる。このようなポリマーまたはオリゴマーは代表的に、少なくとも１個の反応官能性基、例えばハロ、ヒドロキシル、アミノ、チオール、スルホン酸、カルボン酸、イソシアネート、エポキシ、エステルなどを含有し、これらはしばしば、ポリマーの末端に存在する。これらの反応官能性基は親油性直鎖状または分枝鎖状のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、またはアルキルアリール基、もしくはポリマーまたはオリゴマーの結合に使用することができ、これにより親水性ポリマーまたはオリゴマーの親油性を増大させることができる（およびこれにより親水性ポリマーまたはオリゴマーの一般的両親媒性を増大させることができる）。
【０１１１】
この親油性基は、例えばモノ−またはジ−カルボン酸から誘導することができ、もしくは相当する場合、ハイドライドまたは酸クロライドなどのカルボン酸の反応同等基であることができる。親油性基の適当な先駆体の例は、酢酸、プロピオン酸、酪酸、バレリアン酸、イソ酪酸、トリメチル乳酸、カプリル酸、ヘプタン酸、カプリン酸、ペラルゴン酸、乳酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、セラチン酸、モンタノン酸、イソステアリン酸、イソノナン酸、２−エチルヘキサノン酸、オレイン酸、リチノール酸、リノレイン酸、リノール酸、エルカ酸、大豆脂肪酸、亜麻仁脂肪酸、脱水ひまし油脂肪酸、トール油脂肪酸、桐油脂肪酸、ヒマワリ脂肪酸、サフラワー脂肪酸、アクリル酸、メタアクリル酸、無水マレイン酸、無水オルトフタル酸、無水テレフタル酸、イソフタル酸、アジピン酸、アゼライン酸、セバシン酸、無水テトラヒドロフタル酸、無水ヘキサヒドロフタル酸、コハク酸およびポリオレフィンカルボン酸である。
【０１１２】
末端親油性基は同等基である必要はない、すなわち生成するコポリマーは、同一または相違する末端親油性基を含有することができる。この親油性基は、上記したように、１種以上のモノ−またはジ−官能性アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールアルキルまたはアルキルアリール基から誘導することができる。
【０１１３】
８．２．５．１  ＰＥＧ／アルキル修飾部分
修飾部分は、１個または２個以上の直鎖状または分枝鎖状ポリアルキレングリコール基および／または１個または２個以上の直鎖状または分枝鎖状の置換または未置換アルキル基を含有する直鎖状または分枝鎖状ポリマー分子であることができる。しかしながら、或る態様において、この修飾部分は特に、アルキル基からなるものではなく、また別の態様において、この修飾部分は特に、アルカン基からなるものではない。ポリアルキレングリコール基は、或る態様において、ポリアルキレングリコール付属単位２〜２５個、さらに好ましくは２〜２０個、理想的には２〜１５個を含有する。このポリアルキレングリコール基は、或る態様において、ＰＥＧを包含する。アルキル基は、或る態様において、好ましくは炭素原子２〜２０個、さらに好ましくは２〜１５個、さらに好ましくは２〜１０個を有する。アルキル基は好ましくしは、アルカン分子である。
【０１１４】
修飾部分は、例えば下記式を有することができる：
2006515579.tif 000002
式中、各Ｃは、独立して選択され、ｍ個の炭素を有するアルキル基であり、およびｍは１〜２０、好ましくは２〜１５、さらに好ましくは２〜１０であり；および各ＰＡＧは独立して選択され、ｎ個の付属単位を有するポリアルキレングリコール分子であり、およびｎは２〜２５、好ましくは２〜１８、さらに好ましくは２〜１６であり；各Ｘは独立して選択され、ＰＡＧをＣにカプリングさせる結合基、好ましくは−Ｃ−、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、または−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である。式Ｉおよび式ＩＩＩの場合、および或る態様において、Ｃｍ−Ｘ基は存在しておらず、またＰＡＧｎ基は末端に−ＯＨ基または−ＯＣＨ3基を有する。一例として、ＰＡＧは、付属単位１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個を有するメトキシ末端またはヒドロキシ末端ＰＥＧであることができる。
【０１１５】
式ＩＩで表わされるオリゴマーはそれ自体が本発明の態様であることは明白である。このオリゴマーは、例えば二価アルコールとして、または活性化オリゴマーとして提供することができる。式Ｉで表わされるオリゴマーはそれ自体が本発明の態様であることは明白である。このオリゴマーは、例えば一価アルコールとして、または活性化オリゴマーとして提供することができ、ＢＮＰ以外の生体活性化合物、例えばインスリン、カルシトニン、インターフェロン、成長ホルモンなどの結合に使用することができる。修飾部分は、例えば下記式を有することができる：
2006515579.tif 000003
【０１１６】
式中、各Ｃは、独立して選択され、ｍ個の炭素を有するアルキル基であり、およびｍは１〜２０、好ましくは２〜１５、さらに好ましくは２〜１０であり；および各ＰＡＧは独立して選択され、ｎ個の付属単位を有するポリアルキレングリコール分子であり、およびｎは２〜２５、好ましくは２〜１８、さらに好ましくは２〜１６であり；各Ｘは−Ｏ−または−ＮＨ−であり；各ｏは独立して選択され、１〜１５、好ましくは１〜１３、さらに好ましくは１〜９、さらに好ましくは１〜６である。式ＩＩで表わされるオリゴマーはそれ自体が本発明の態様であることは明白である。このオリゴマーは、例えば一価アルコールとして、または活性化オリゴマーとして提供することができ、ＢＮＰ以外の生体活性化合物、例えばインスリン、カルシトニン、インターフェロン、成長ホルモンなどの結合に使用することができる。
【０１１７】
修飾部分は、例えば下記式を有することができる：
2006515579.tif 000004
【０１１８】
式中、各Ｃは、独立して選択され、ｍ個の炭素を有するアルキル基であり、およびｍは１〜２０、好ましくは２〜１５、さらに好ましくは２〜１０であり；および各ＰＡＧは独立して選択され、ｎ個の付属単位を有するポリアルキレングリコール分子であり、およびｎは２〜２５、好ましくは２〜１８、さらに好ましくは２〜１６であり；各Ｘは独立して選択され、ＰＡＧをＣにカプリングさせる結合基、好ましくは−Ｃ−、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、または−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−からなり；各ｏは独立して選択され、１〜１５、好ましくは１〜１３、さらに好ましくは１〜９、さらに好ましくは１〜６である。式Ｉで表わされるオリゴマーはそれ自体が本発明の態様であることは明白である。このオリゴマーは、例えば一価アルコールとして、または活性化オリゴマーとして提供することができ、式Ｉおよび式ＩＩＩの場合および或る態様において、Ｃｍ−Ｘ基は存在しておらず、またＰＡＧｎ基は末端に−ＯＨ基または−ＯＣＨ3基を有する。一例として、ＰＡＧは、付属単位１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個を有するメトキシ末端またはヒドロキシ末端ＰＥＧであることができる。
【０１１９】
式ＩＩＩで表わされるオリゴマーはそれ自体が本発明の態様であることは明白である。このオリゴマーは、例えば一価アルコールとして、または活性化オリゴマーとして提供することができ、ＢＮＰ以外の生体活性化合物、例えばインスリン、カルシトニン、インターフェロン、成長ホルモンなどの結合に使用することができる。
【０１２０】
本発明による結合体の医薬としての特性、例えば親水性／親油性は、ＰＥＧモノマーの数、アルキル鎖の種類および長さ、ＰＥＧ−ペプチド結合の性質、および結合部位の数を調節することによって変えることができる。ＰＥＧ−ペプチド結合の正確な性質は、生理学的ｐＨまたは血漿中において加水分解に対し安定であり、および／または感受性であるように変えることができる。
【０１２１】
８．２．６  塩形成性部分
或る態様において、修飾部分は塩形成性部分を含有する。この塩形成性部分は、当業者に理解されているように、種々の適当な塩形成性部分であることができ、これらに制限されないものとして、カルボキシレートまたはアンモニウムを包含する。或る態様において、修飾部分が塩形成性部分を含有する場合、ナトリウム排泄増加性化合物結合体は、塩形態で提供される。これらの態様において、ナトリウム排泄増加性化合物結合体は、当業者に理解されているように、適当な医薬として許容される対向イオンを随伴する。このようなイオンは、これらに制限されないものとして、塩素、臭素、ヨウ素、ホスフェート、アセテート、カーボネート、スルフェート、トシレートおよびメシレートなどの陰イオン、またはナトリウム、カリウム、カルシウム、リチウムおよびアンモニウムなどの陽イオンを包含する。
【０１２２】
修飾部分は、いずれかの親水性部分、親油性部分、両親媒性部分、塩形成性部分、およびその組合せを包含することができる。好適態様において、修飾部分は、（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）pＣＨ3（式中、ｐは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である）；（ＣＨ2）qＣＨ3（式中、ｑは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である）；ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）rＯＨ（式中、ｒは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である）；Ｃ（ＣＨ2ＯＨ）3；ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）2；Ｃ（ＣＨ3）3；ＣＨ（ＣＨ3）2；ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）sＣ（Ｏ）（ＣＨ2）tＣＨ3（式中、ｓは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０であり、およびｔは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である）；および（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）yＣ（Ｏ）（ＣＨ2）zＣＨ3（式中、ｙは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０であり、およびｚは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である）；からなる群から選択される。
【０１２３】
特定の目的で上記した修飾部分の例は、本発明を例示しようとするものであり、いずれの観点からも制限するものと解釈されるべきではない。当業者は、特定の機能性を得るために結合体用に適する修飾部分は本明細書および特許請求の範囲に記載の化学的結合メカニズムの範囲内にあることができることを認識するであろう。従って、追加の基を選択することができ、また本明細書に記載の本発明の原則に従い使用することができる。
【０１２４】
８．３  結合戦略
本発明によるナトリウム排泄増加性化合物結合体は、対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物結合体に比較し、相違するレベルの生物学的活性を有することができる。或る態様において、ナトリウム排泄増加性化合物は、或る程度の、または全部の未修飾状態の活性を保有するが、修飾部分との結合の程度、分子中の結合部位の選択および修飾部分の選択のような因子の観点から、インビボ分解に対して低い感受性を有し、従って、増大した血漿半減期を有する。一例として、本発明によるナトリウム排泄増加性化合物は、当該ナトリウム排泄増加性化合物構造の１、２、３、４、５または６以上の部位を、この部位における修飾部分の会合を促進するのに適する相当する結合部位で修飾部分を含有するように修飾することができる（すなわち、修飾部分結合）。一例として、このような適当な結合部位はアミノ酸残基、例えばＬｙｓアミノ酸を含有することができる。
【０１２５】
多くの態様において、例えば生物学的活性作用物質は、部分的に、レセプター中の活性部位に結合することによって機能する。多くの場合、官能性基、例えばアミノ酸残基が修飾されると、この作用物質はもはや、その活性部位に結合しない。例えば、ＢＮＰの場合、当該ペプチドはＮＰＲ−Ａ結合に対し特別の親和性を有する。ナトリウム排泄増加性分子が修飾され、修飾部分を有する場合、ＢＮＰがレセプターに対して有する親和性は同一であることもあり、または減少されていることもある。或る態様において、本発明によるナトリウム排泄増加性化合物結合体は、天然の未結合ナトリウム排泄増加性化合物に比較し、低い活性を有するが、未結合ナトリウム排泄増加性化合物結合体に比較し、改善された特徴、例えばタンパク質分解に対する増大された耐性および血漿中半減期、または細胞膜を横切る能力を保有する。例えば、ナトリウム排泄増加性化合物の長期間放出が望まれる場合、減少された活性が好ましいことがあることが予想される。
【０１２６】
或る態様において、ナトリウム排泄増加性化合物結合体は、モノ結合体である。別の態様において、ナトリウム排泄増加性化合物結合体は、マルチ結合体、例えばジ−結合体、トリ−結合体、テトラ−結合体、ペンタ−結合体などである。ナトリウム排泄増加性化合物上の修飾部分の数は、ナトリウム排泄増加性化合物上の結合部位の数によってのみ制限される。もう一つの別の態様において、本発明によるナトリウム排泄増加性化合物結合体は、モノ−結合体、ジ−結合体、トリ−結合体、テトラ−結合体および／またはペンタ−結合体の混合物である。一例として、或る態様において、生物学的活性ナトリウム排泄増加性化合物は、ｈＢＮＰであり、これはその３２天然アミノ酸配列内に包含されており、Ｎ−末端Ｌｙｓ3、Ｌｙｓ14およびＬｙｓ27を包含する４個の好適結合部位を有する。本発明の研究は、Ｎ−末端Ｌｙｓ3、Ｌｙｓ14またはＬｙｓ27で結合したモノ−結合体、およびｈＢＮＰに対する高度に好適な戦略としてＬｙｓ3／Ｌｙｓ14およびＬｙｓ3／Ｌｙｓ27におけるジ−結合体、ならびに関連ナトリウム排泄増加性ペプチドおよび類縁体を指摘する。
【０１２７】
修飾部分は好ましくは、ナトリウム排泄増加性化合物に共有カプリングさせる。修飾部分上の１個よりも多くの基をナトリウム排泄増加性化合物に共有カプリングさせることができる。このカプリングは加水分解性結合または非加水分解性結合、またはこれら２種の混合物（すなわち、相違する結合部位における相違する結合）を採用することができる。
【０１２８】
或る態様において、ナトリウム排泄増加性化合物は、加水分解性結合を用いて修飾部分にカプリングさせる（例えば、エステル、カーボネートまたはカルバメート結合）。加水分解性カプリングの使用は、プロドラッグとして作用するナトリウム排泄増加性化合物結合体を提供する。プロドラッグ手段は、ナトリウム排泄増加性化合物−修飾部分結合体が不活性である場合（すなわち、当該結合体はナトリウム排泄増加性化合物の一次活性メカニズムにより身体に影響を及ぼす能力に欠けている場合）、例えば修飾部分結合部位がナトリウム排泄増加性化合物の結合領域に存在する場合に望ましいことがある。加水分解性カプリングの使用はまた、１個または２個以上の修飾部分が各ナトリウム排泄増加性化合物−修飾部分結合体から分離され、活性医薬が提供されることから、一定の期間にわたりナトリウム排泄増加性化合物が投与されることによって、経過時間放出効果または制御放出効果を得ることができる。
【０１２９】
別の態様において、ナトリウム排泄増加性化合物は、非加水分解性結合（例えば、カルバメート、アミドまたはエーテル結合）を用い修飾部分にカプリングさせる。非加水分解性結合の使用は、延長された経過時間、好ましくは少なくとも２時間にわたりナトリウム排泄増加性化合物−修飾部分結合体を血流中に循環させることができることが望まれる場合、好適であることがある。ナトリウム排泄増加性化合物を修飾部分に非加水分解性様相で共有カプリングさせるために用いられる結合は代表的に、共有結合（１個または２個以上）、エステル基、カーボネート基、カルバメート基、アミド基および二級アミン基からなる群から選択される。
【０１３０】
さらに別の態様において、部分的プロドラッグを使用することができ、この場合、修飾部分の一部分が加水分解される。一例として、米国特許６，３０９，６３３（この特許の全記載を引用してここに組入れる）は、親水性成分および親油性成分を含有し、この親油性成分がインビボで加水分解され、ミクロペジル化（micropegylated）結合体が生成される。
【０１３１】
１個よりも多くの修飾部分（好ましくは、複数個）をナトリウム排泄増加性化合物にカプリングさせることができる。複数個の修飾部分は同一であると好ましい。しかしながら、複数個の修飾部分は相互に相違していてもよく、または別様に、複数個の修飾部分の中の数個が同一であることもでき、また数個が相違することができることは理解される。複数個の修飾部分をナトリウム排泄増加性化合物にカプリングさせる場合、１個または２個以上の修飾部分を加水分解性結合によりナトリウム排泄増加性化合物にカプリングさせ、および１個または２個以上の修飾部分を非加水分解性結合によりナトリウム排泄増加性化合物にカプリングさせると好ましいことがある。別法として、複数個の修飾部分のナトリウム排泄増加性化合物へのカプリング結合の全部が加水分解性であるが、例えば１個または２個以上の修飾部分を身体内でナトリウム排泄増加性化合物からより迅速に分離でき、また１個または２個以上の修飾部分を身体内でナトリウム排泄増加性化合物からゆっくりと分離できるように、これらは種々の程度の加水分解性を有することもできる。
【０１３２】
修飾部分は医薬の種々の親核性残基においてナトリウム排泄増加性化合物にカプリングさせることができ、このような残基は、これらに制限されないが、親核性ヒドロキシル官能性基および／またはアミノ官能性基を包含する。親核性ヒドロキシル官能性基は、例えばセリンおよび／またはチロシン残基に見出すことができ、また親核性アミノ官能性基は、例えばヒスチジンおよび／またはＬｙｓ残基に、および／またはポリペプチドの１個または２個以上のＮ−末端に見出すことができる。修飾部分をナトリウム排泄増加性ペプチドのＮ−末端にカプリングさせる場合、このカプリングは好ましくは、二級アミンを形成する。
【０１３３】
８．４  結合体の合成
合成の具体例は以下に示す例で説明する。反応条件（例えば、モル比、溶媒混合物および／またはｐＨ）は、公知原則に従い制御することができる。一例として、Ｌｙｓのアミノ官能性基における結合は、反応溶液のｐＨをＬｙｓのｐＫa以下に維持することによって抑制することができる。
【０１３４】
ナトリウム排泄増加性化合物結合体の混合物は、例えばＨＰＬＣを用いて、分離し、また単離することができ、これによりナトリウム排泄増加性化合物結合体、例えばモノ−、ジ−またはトリ−結合体を得ることができる。特定の単離結合体の結合程度（例えば、単離分子がモノ−結合体であるか、ジ−結合体であるか、またはトリ−結合体でるか）は、これに制限されないものとして、質量分析法を包含する当業者に理解されているような種々の技術を用いて測定することができ、および／または確認することができる。特定の結合体の構造（例えば、ｈＢＮＰモノ結合体のＮ−末端、Ｌｙｓ3、Ｌｙｓ14またはＬｙｓ27）は、これに制限されないものとして、配列分析、ペプチドマッピング、選択的酵素分解、および／またはエンドペプチダーゼ分解を包含する当業者に理解されているような種々の技術を用いて測定することができ、および／または確認することができる。
【０１３５】
ナトリウム排泄増加性化合物上の１個または２個以上の反応部位は保護することができ、例えばナトリウム排泄増加性化合物を適当な保護基、例えばＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）またはＮ−（９−フルオレニルヒドロキシカルボニル）（Ｎ−ＦＭＯＣ）と反応させることができる。この方法は、例えばポリペプチドの１個または２個以上のＮ−末端に修飾部分を有する不飽和ナトリウム排泄増加性化合物結合体（すなわち、全部が親核性残基ではない結合体）の形成が望まれる場合、好適であることがある。このような保護に引続き、保護されたナトリウム排泄増加性化合物の実質的に単分散混合物を活性化修飾部分の実質的単分散混合物と反応させ、１個または２個以上の親核性残基にカプリングされた修飾部分（１個または２個以上）を有し、および別の親核性残基にカプリングされた保護基を有するナトリウム排泄増加性化合物結合体の混合物を得る。この結合反応後、ナトリウム排泄増加性化合物−修飾部分結合体は、当業者に理解されているように、脱保護化することができる。必要に応じて、ナトリウム排泄増加性化合物結合体の混合物は次いで、上記のように分離し、ナトリウム排泄増加性化合物結合体の混合物を得ることができる。別法として、ナトリウム排泄増加性化合物−修飾部分結合体の混合物は、脱保護化に先立ち、分離することもできる。
【０１３６】
本発明の驚くべき態様において、本発明者等は、ナトリウム排泄増加性化合物に隣接する（すなわち、ナトリウム排泄増加性化合物とＰＥＧ基との間に位置する）アルキル基を有するＰＥＧ−アルキル基を用いるｈＢＮＰ結合体の合成が格別に望ましいＬｙｓ3結合部位における優先的結合をもたらすことを見出した。従って、一面において、本発明はＰＥＧ−アルキルオリゴマーのアルキル部分を活性化し、この活性化されたＰＥＧ−アルキルオリゴマーをｈＢＮＰにカプリングさせることを包含するＬｙｓ3におけるｈＢＮＰの優先的結合方法を提供する。
【０１３７】
８．５  医薬組成物
本明細書に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体を含有する医薬組成物を調製することができる。このような組成物は代表的に、医薬上で許容される担体と組合わされているか、または担体中に混合されている修飾ナトリウム排泄増加性化合物を含有する。この担体は当該医薬組成物中のいずれか別の成分に適合でき、また患者に対し有害であってはならないという観点から許容されるものでなければならない。担体は固体または液体、もしくはその両方であることができ、また単位剤型製剤として、例えば錠剤として、プロドラッグを用いて調剤すると好ましく、このような単位剤型製剤は、ナトリウム排泄増加性化合物結合体を約０．０１または０．５重量％から約９５重量％または９９重量％までの量で含有する。医薬組成物は、これらに制限されないものとして、１種または２種以上の補助成分を包含する諸成分を混合することを包含する調剤学で周知の技術のいずれかによって調製することができる。
【０１３８】
本発明の態様に従う医薬組成物は、経口、直腸、鼻、局所、吸入（例えば、エアゾルによる）、口腔（例えば、舌下）、膣、非経口（例えば、皮下、筋肉内、皮内、関節内、胸膜内、腹膜内、脳内、動脈内または静脈内）、局所（例えば、気道表面を包含する皮膚および粘膜の両方の表面）、および経皮投与に適するものを包含するが、いずれか与えられた場合に最も適する経路は、処置される状態の種類および重篤度、ならびに使用される特定のプロドラッグの性質に依存する。
【０１３９】
経口投与に適する医薬組成物は、分離した単位、例えばカプセル剤、カシェ剤、トローチ剤、または錠剤として提供することができ、これらはそれぞれ、粉末または顆粒として；水性または非水性液体中の溶液または懸濁液として；または水中油型または油中水型エマルジョンとして；既定量のプロドラッグを含有する。このような製剤は、プロドラッグおよび適当な担体（上記したように、１種または２種以上の補助成分を包含することができる）を一緒に合わせる工程を包含する調剤用のいずれか適当な技術によって調製することができる。一般に、本発明の態様に従う医薬組成物は、プロドラッグを液状または微粉砕した固体担体、もしくはその両方と均一に、また緊密に混合し、次いで必要に応じ、生成する混合物を成形することによって調製される。一例として、錠剤は、任意に１種または２種以上の補助成分とともにプロドラッグを含有する粉末または顆粒を圧縮または成形することによって調製することができる。圧縮錠剤は、適当な機械において、任意に結合剤、滑剤、不活性稀釈剤、および／または界面活性剤および／または分散剤と混合されている自由流動形態、例えば粉末または顆粒形態の混合物を圧縮することによって調製することができる。成形錠剤は、適当な機械において、不活性液状結合剤で湿らせた粉末状化合物を成形することによって調製することができる。
【０１４０】
口腔（舌下）投与に適する医薬組成物は、風味付け基剤、通常、ショ糖およびアカシアまたはトラガカント中にプロドラッグを含有するトローチ、および不活性基剤、例えばゼラチンおよびグリセリンまたはショ糖およびアカシア中にプロドラッグを含有するペストリイを包含する。
【０１４１】
非経口投与に適する本発明の態様に従う医薬組成物は、プロドラッグの無菌水性および非水性注射溶液を包含し、これらの製剤は好ましくは、意図する受容者の血液と等張である。これらの製剤は酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤および当該組成物を意図する受容者の血液と等張にする溶質を含有することができる。水性および非水性無菌懸濁液は懸濁剤および増粘剤をまた含有することができる。これらの組成物は単位用量または多回用量容器、例えば密封アンプルおよびバイアル中に存在させることができ、また無菌液状担体、例えば塩類溶液または注射用水の使用直前における添加のみを必要とする凍結乾燥（真空凍結乾燥）状態で保存することもできる。即席型注射溶液および懸濁液は、上記の種類の無菌粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。一例として、密封容器内に単位用量形態でプロドラッグを含有する注射用の安定な無菌組成物を提供することができる。プロドラッグは適当な医薬上で許容される担体により再構成することができ、これにより対象に注射するのに適する液状組成物を生成する凍結乾燥物の形態が得られる。単位用量形態は代表的に、プロドラッグ約１０ｍｇ〜約１０ｇを含有する。プロドラッグが実質的に水不溶性である場合、充分な量の生理学的に許容される乳化剤を、プロドラッグを水性担体中で乳化させるのに充分な量で使用することができる。このような適当な乳化剤の一つは、ホスファチジルコリンである。
【０１４２】
皮膚に局所施用するのに適する医薬組成物は、好ましくは軟膏、クリーム、ペースト、ゲル、スプレイ、エアゾルまたはオイルの形態をとる。使用できる担体は、石油ゼリイ、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、経皮強化剤およびその２種または３種以上の組合せを包含する。
【０１４３】
経皮投与に適する医薬組成物は、延長された期間にわたり受容者の皮膚と緊密に接触して留まるのに適する分離したパッチとして提供することができる。経皮投与に適する組成物はまた、イオントホレシス（iontophoresis）によって放出させることができ（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３（６）：３１８（１９８６）参照）、また代表的に、プロドラッグの必要に応じて緩衝されている水性溶液の形態をとることができる。適当な製剤はクエン酸塩またはビス／トリス（bis/tris）緩衝液（ｐＨ６）またはエタノール／水を含有し、また活性剤０．１〜０．２Ｍを含有する。
【０１４４】
８．６  投与および処置方法
本発明によるナトリウム排泄増加性化合物結合体および医薬製剤は、未修飾（未結合）生物学的活性ナトリウム排泄増加性化合物に比較し、１種または２種以上の改善された特性を示す。修飾部分の付与は当該ナトリウム排泄増加性化合物を種々の環境（例えば、胃腸器官（ＧＴ器官））における分解から防御することができ、従って、このような環境において、修飾部分の不存在下に分解される未修飾形態の分解に比較し、分解は少ない。特に、本発明による或る修飾形態は全身的循環系中に医薬として許容される量の生物学的活性ナトリウム排泄増加性化合物が最終的に付与されるような用量で経口投与することができる。すなわち、充分な量のナトリウム排泄増加性化合物がＧＩ器官で生き残ることができ、ナトリウム排泄増加性化合物がｃＧＭＰの産生の引き金となるのに充分な医薬活性量で全身に存在するように血流中に入ることが可能にされる。好ましくは、この修飾部分の付加は、経口投与された場合、経口投与された未結合ナトリウム排泄増加性化合物の血流中への放出に比較し、経口投与された未結合ナトリウム排泄増加性化合物の血流中への放出を改善する。さらに好ましいこととして、経口投与されたナトリウム排泄増加性化合物結合体の活性化合物の血流中への放出の改善は、経口投与された未結合の親のナトリウム排泄増加性化合物である活性化合物の血流中への放出の少なくとも２倍である。さらにまた好ましいこととして、経口投与されたナトリウム排泄増加性化合物結合体である活性化合物の血流中への放出の改善は、経口投与された未修飾（未結合）生物学的活性ナトリウム排泄増加性化合物である活性化合物の血流中への放出の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、または５００倍である。従って、本発明によるナトリウム排泄増加性化合物結合体の投与は、未修飾生物学的活性ナトリウム排泄増加性化合物に比較し、生物学的活性ナトリウム排泄増加性化合物のより大きい生体利用性をもたらすことができる。経口経路の投与は、別種のＣＨＦ治療が随伴する病院経費を減少させることができ、および／またはｈＢＮＰの初期段階および慢性ＣＨＦ、ならびに急性ＣＨＦを包含するＣＨＦに対する治療的使用を拡大することができる。
【０１４５】
従って、一面において、本発明は、ナトリウム排泄増加性ペプチド化合物を用いる処置に感受性を有する病的状態の処置方法を提供し、この方法は治療有効量の本発明によるナトリウム排泄増加性化合物結合体を、その必要性を有する対象に投与することによるものである。ナトリウム排泄増加性化合物結合体は、例えば経腸および非経腸を包含する種々の経路により適当に投与することができる。好適経路の例は、経口、皮下、舌下、口腔、鼻、静脈内および筋肉内を包含する。
【０１４６】
心不全症に対する本発明によるナトリウム排泄増加性化合物結合体の使用には数種の手段を用いることができる。例えば、ナトリウム排泄増加性化合物結合体は単治療（monotherapy）として、好ましくは経口剤型単独で供与することができることが考えられる。現時点で使用される医薬の主戦略は下記戦略を包含する：
【０１４７】
利尿薬−ＣＨＦが随伴する心臓の液体蓄積および生じる拡張を軽減する。
血管拡張薬−動脈および静脈を膨張させ、血流を増加させる。
イノトロッピック薬−心臓筋肉の収縮力を増加させる。
強心性医薬−心臓の収縮力を増加させ、また心拍数を減少させる。
アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬−血管収縮性アンギオテンシンＩＩの、その合成の最終段階における産生を抑制する。
【０１４８】
アンギオテンシンレセプター遮断薬（ＡＲＢ′ｓ）−アンギオテンシンの産生は可能であるが、その動脈活性は抑制する。
カルシウムチャンネル遮断薬−カルシウム流入を抑制し、血管および平滑筋弛緩をもたらす。
ニトレート−平滑筋を弛緩させ、静脈および動脈を拡張させる。
ベータ−遮断薬−カテコールアミンの作用をブロックし、心臓に対するストレスを少なくし、収縮力および収縮速度を低下させる。
【０１４９】
ナトリウム排泄増加性化合物結合体の利点の数種は、先ずＣＨＦ処置に対する別の手段に関連し、また連続的に注入される、その未修飾形態でのナトリウム排泄増加性ペプチドの現在の使用に比較して考慮することができる。本発明による経口ナトリウム排泄増加性化合物結合体は、ナトリウムおよび過剰の水を排除することによる充血の軽減を予測できるナトリウム排泄増加性および利尿性を示す。このような機能は現時点では、利尿剤およびカリウム補助剤によるものが提案されている。本発明によるナトリウム排泄増加性化合物結合体は、現時点では血管拡張薬、カルシウムチャンネル遮断薬、およびニトレート製剤を用いて行われている血管および心筋弛緩性を有するものと予想される。本発明によるナトリウム排泄増加性化合物結合体は、現時点ではＡＣＥ阻害剤およびＡＲＢ′ｓを用いて行われているレニン−アンギオテンシン−アルドステロン系（ＲＡＡＳ）を抑制するものと予想される。さらにまた、このナトリウム排泄増加性化合物結合体は、イオノトロピックおよび強心薬が随伴する突然死の危険性および負の作用に欠けているものと予想される。このナトリウム排泄増加性化合物結合体は、全部ではないが、数群の心臓血管系医薬が有する利点のかなりを有することができるとともに、慣用の治療が有する負の作用を減少された程度で有するか、全く有していない。
【０１５０】
本発明によるナトリウム排泄増加性化合物結合体はまた、ナトレコル（NATRECOR）（登録商品名）（Ｓｃｉｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡにより製造されているネシリチド（nesiritide））に優る利点を有する。或る種の利点は、本発明の態様に従う両親媒性オリゴマーが提供する増強された薬物動態学的プロフィールに関与することができる。一例として、プロテアーゼ（ＮＥＰなど）による分解に対する耐性は、未結合ペプチドに比較し、より長い循環系半減期を導くことができる。このようなオリゴマーが結合されているＢＮＰまたはＡＮＰの経口投与することができる能力から格別の利点を得ることができる。一例として、ナトレコル（登録商品名）は４８時間かけて連続注入によって投与され、一回あたりの高価格および病院費用を有する。本発明の態様に従う経口ｈＢＮＰ化合物結合体は、総合的に低価格で投与することができ、また病院外で利用することができ、さらに自己投与することができる。最も急性のＣＨＦの場合に病院内での使用に制限されるのに対し、本発明の態様に従う経口結合体は、慢性ＣＨＦの緩慢な発症を被っている対象に使用することができる。投与の容易性、病院備蓄に対する要求の減少、および／または心不全の高い危険性を有する患者において自己投与される（例えば、家庭で）予防的治療剤としての本発明によるナトリウム排泄増加性化合物結合体の有用性を支持する。従って、本発明の態様に従うｈＢＮＰ化合物結合体の経口製剤は、ナトレコル（登録商品名）の有する利点の全部ではないがかなりを有しているとともに、改善された薬物動態学的プロフィールの利点、より大きい投与容易性、減少された病院経費、慢性ＣＨＦを包含するという指示範囲の拡大、および／または初期段階心臓血管系疾病における有用性を有する。
【０１５１】
親のナトリウム排泄増加性化合物を摂取するか、または摂取しようとしている対象は、別に（または追加として）、本明細書に記載のナトリウム排泄増加性化合物製剤を摂取することができる。一例として、非経口投与されたナトリウム排泄増加性化合物、例えば通常、ナトレコル（登録商品名）を用いて処置される障害を被っている患者を、本明細書に記載の修飾形態の製剤を有効量で用いて処置することができる。別法として、従来、このような薬剤が注射または静脈投与によってのみ投与されていた場合でも、このナトリウム排泄増加性化合物は吸入により、またはさらに好ましくは経口投与により投与することができる。
【０１５２】
一態様において、本発明は対象に対し生物学的活性薬剤を放出させる方法を提供し、この方法は生物学的活性薬剤を本発明による修飾ナトリウム排泄増加性化合物として経口投与することを包含する。この場合、経口投与されたナトリウム排泄増加性化合物の一部はＧＩ器官にそのままの状態で留まり、腸壁を横切って、血流中に入り、またＧＩ器官を離れた後、このナトリウム排泄増加性化合物の一部分または全部はインビボで加水分解され、医薬として許容される量の生物学的活性薬剤を生成する。この加水分解は、例えば血流中で、または肝臓で生じる。この方法において、修飾形態のナトリウム排泄増加性化合物は、対応する経口投与された未修飾生物学的活性薬剤の経口生体利用性に比較し、経口投与された生物学的活性薬剤の経口生体利用性を増強させることができる。
【０１５３】
その使用が本発明の範囲にあるいずれかのナトリウム排泄増加性化合物の有効量は、薬剤毎に、および患者毎に幾分変化し、例えば患者の年齢および状態、ならびに放出経路に応じる。このような用量は、当業者にとって既知の常習的薬理学的方法に従い測定することができる。一般的提案として、患者の体重に基づき計算し、約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量が治療効力を有する。高レベルに関連する毒性は活性体の重量に基づき計算し、全重量として、静脈投与用量を約１０ｍｇ／ｋｇまでのような低レベルに制限することができる。約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量を経口投与に使用することができる。代表的に、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの用量を筋肉内注射に使用することができる。投与頻度は通常、一日一回、二回または三回であるか、または状態を制御するために必要に応じることができる。処置持続期間は処置される状態のタイプに応じ、また患者の寿命ができるだけ長くなるようにすることができる。
【０１５４】
本発明に従い処置される適当な対象は、これらに制限されないものとして、トリ類および哺乳動物対象、好ましくは哺乳動物を包含する。本発明に従う哺乳動物は、これらに制限されないものとして、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、クマ、齧歯類（例えば、ラットおよびマウス）、ウナギ類、霊長目、ヒトなどを包含し、また胎内哺乳動物を包含する。ヒト対象は好適である。両性およびいずれかの発症段階のヒト対象（すなわち、新生児、小児、若年、思春期、成人）を本発明に従い処置することができる。
【０１５５】
本発明に従うトリ類の具体例は、ニワトリ、カモ、七面鳥、アヒル、ウズラ、キジ、ダチョウ類（例えば、オーストリッチ）および家庭飼育トリ類（例えば、ハトおよびカナリア）を包含し、また卵内トリを包含する。
【０１５６】
８．７  分析
本発明によるナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体は、天然ペプチドが随伴する心臓血管系、腎臓および／または内分泌系に対する効果を誘発させることができる。細胞に基づく分析法を使用し、結合体がヒトナトリウム排泄増加性ペプチドレセプターＡの熟達したアゴニストであり、ｃＧＭＰの適度の産生を導くことを証明することができる。生化学的分析法を使用し、結合体が望ましい生体利用性を提供することを証明することができる。確立されたイヌモデルにおいて、先導的結合体を試験することができる。所望の候補薬物をラットおよびイヌにおいて詳細な薬物動態学的、薬理学的、および毒性学的試験に付すことができる。本発明の態様に従うＢＮＰ結合体は初期段階、慢性および急性心不全症の処置に有用である。
【０１５７】
本発明による新規ペプチドおよび新規結合体は、ヒトナトリウム排泄増加性ペプチドレセプターＡ（ＮＰＲ−Ａ）に対するアゴニスト活性にかかわりインビボで試験することができる。ＢＮＰの血管弛緩性、ナトリウム排泄増加性、および利尿性物性は二次メッセンジャー、環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）に帰するものと見なされる。ｃＧＭＰの産生はグアニレートシクラーゼに付随し、この酵素はＢＮＰがＮＰＲ−Ａに結合すると、活性化される。ｃＧＭＰ産生は、ＮＰＲ−Ａを内因発現するヒト大動脈内皮細胞の培養物で測定することができる。従って、本発明によるナトリウム排泄増加性化合物結合体およびナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体の相対的活性は、これらの細胞におけるｃＧＭＰ産生のレベルにより測定することができる。
【０１５８】
本発明による結合体は、プロテアーゼに対する増大された耐性にかかわり試験することができる。一般に、経口放出される医薬を消化性酵素、例えばペプシン、トリプシン、および／またはキモトリプシンに曝す。ペプチド医薬の場合、これらの酵素は特に問題であることができる。しかしながら、ペプチド結合体は、これらの酵素に対し増大した耐性を示した。消化性酵素カクテルを使用し、本発明によるｈＢＮＰ結合体およびその他の結合体の消化器官酵素に対する増大した耐性を試験することができる。ナトリウム排泄増加性化合物結合体は好ましくは、対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物に比較し、タンパク質分解性分解に対し低い感受性を有する、すなわち、当該結合体は対応する未結合化合物に比較し、さらにゆっくりと消化される。
【０１５９】
結合体は経口生体利用性にかかわり試験することができる。結合体の経口生体利用性は、例えばラットで試験することができる。当該結合体は経口栄養管により胃腸器官に投与することができ、血流中のｈＢＮＰ結合体の存在を利用可能な放射線免疫分析法を用いて評価することができる。本発明の態様に従う結合体は好ましくは、経口および／または口を経由して利用することができる、すなわち治療的に有効な量の結合体を経口により、および／または口を経由して放出させることができる。
【０１６０】
当該結合体は経口投与による追加の利点とともに、天然ナトリウム排泄増加性ペプチド（例えば、ｈＢＮＰ）の活性のいくらか、または全部を保有することができる。このような化合物は、急性ＶＨＦの処置に付随する価格を低下させ、および／またはこの治療の適用範囲を初期段階および慢性のＣＨＦを包含するように拡大することができる。
【０１６１】
一面において、本発明はデータ一般化方法を提供し、この方法は本発明によるナトリウム排泄増加性化合物結合体または一連のこのようなナトリウム排泄増加性化合物結合体を分析し、次いでこのような分析から得られたデータを蓄積する分析法を包含する。従って、これらのデータそれ自体およびこれらのデータの使用は、本発明のさらにもう一つの態様を構成するものと理解される。
【０１６２】
８．８  オリゴマー状修飾部分
本発明はまた、数種のＰＥＧ直鎖状および分枝鎖状アミン、ミクロペジル化およびアルキル−ＰＥＧ修飾部分を提供する。一例として、本発明は下記式を有する化合物を提供する：
2006515579.tif 000005
【０１６３】
式中、各Ｃは、独立して選択され、ｍ個の炭素を有するアルキル基であり、およびｍは１〜２０であり；および各ＰＡＧは独立して選択され、ｎ個の付属単位を有するポリアルキレングリコール分子であり、およびｎは２〜２５であり；各Ｘは独立して選択され、結合基である。別様に、Ｃ、ｍ、Ｘ、ＰＥＧおよびｎは、式Ｉについて上記されているとおりである。式Ｉおよび式ＩＩＩの場合、および或る態様において、Ｃｍ−Ｘは存在しておらず、またＰＥＧｎ基は−ＯＨ基またはＯＣＨ3基を末端に有する。一例として、ＰＡＧは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個の付属単位を有するメトキシ末端またはヒドロキシル末端ＰＥＧであることができる。
【０１６４】
別の態様において、本発明は下記式を有する化合物を提供する：
2006515579.tif 000006
【０１６５】
式中、各Ｃは、独立して選択され、ｍ個の炭素を有するアルキル基であり、およびｍは１〜２０であり；および各ＰＡＧは独立して選択され、ｎ個の付属単位を有するポリアルキレングリコール分子であり、およびｎは２〜２５であり；各Ｘは独立して選択され、結合基である。別様に、Ｃ、ｍ、Ｘ、ＰＥＧおよびｎは、式Ｉについて上記されているとおりである。式Ｉおよび式ＩＩＩの場合、および或る態様において、Ｃｍ−Ｘ部分は存在しておらず、またＰＥＧｎ基は−ＯＨ基またはＯＣＨ3基を末端に有する。一例として、ＰＡＧは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個の付属単位を有するメトキシ末端またはヒドロキシル末端ＰＥＧであることができる。
【０１６６】
もう一つの態様において、本発明は下記式を有する化合物を提供する：
2006515579.tif 000007
この化合物において、ＰＡＧはｎ個の付属単位を有するポリアルキレングリコール分子であり、およびｎは２〜２５であり；ＸはＯまたはＮであり；および各ｏは独立して選択され、１〜１５である。別様に、ＰＥＧ、ｍおよびＸは、式ＩＩについて上記されているとおりである。
【０１６７】
本発明はまた、下記式を有する化合物を提供する：
2006515579.tif 000008
式中、ＰＡＧはｎ個の付属単位を有するポリアルキレングリコール分子であり、およびｎは２〜２５であり；ＸはＯまたはＮであり；および各ｏは独立して選択され、１〜１５である。別様に、ＰＥＧ、ｍおよびＸは、式ＩＩについて上記されているとおりである。
【０１６８】
もう一つの態様において、下記式を有する化合物が提供される：
2006515579.tif 000009
式中、各Ｃは、独立して選択され、ｍ個の炭素を有するアルキル基であり、およびｍは１〜２０であり；および各ＰＡＧは独立して選択され、ｎ個の付属単位を有するポリアルキレングリコール基であり、およびｎは２〜２５であり；各Ｘは独立して選択され、結合基であり；およびｏは１〜１５である。別様に、Ｃ、ｍ、ＰＥＧ、Ｘおよびｎは、式ＩＩＩについて上記されているとおりである。
【０１６９】
本発明はまた、各式を有する化合物を提供する：
2006515579.tif 000010
式中、各Ｃは、独立して選択され、ｍ個の炭素を有するアルキル基であり、およびｍは１〜２０であり；および各ＰＡＧは独立して選択され、ｎ個の付属単位を有するポリアルキレングリコール基であり、およびｎは２〜２５であり；各Ｘは独立して選択され、結合部分であり；およびｏは１〜１５である。別様に、Ｃ、ｍ、ＰＥＧ、Ｘおよびｎは、式ＩＩＩについて上記されているとおりである。
【０１７０】
本発明はまた、本明細書に記載されている修飾部分の数種の製造方法を提供する。式：
2006515579.tif 000011
（式中、Ｃ、ｍ、Ｘ、ＰＥＧおよびｎは式Ｉについて上記されているとおりである）
で表わされる化合物の製造方法が提供される。
【０１７１】
この方法は、式：
Ｃm−Ｘ−ＰＡＧn−ＯＨ
で表わされる化合物を、塩基および溶媒の存在下に、式：
2006515579.tif 000012
で表わされる化合物と反応させ、生成物「ａ」：
2006515579.tif 000013
を生成し、この生成物を、ルイス酸および溶媒の存在下に、式：
Ｃm−Ｘ−ＰＡＧn−ＯＨ
で表わされる化合物と反応させ、式：
2006515579.tif 000014
で表わされる化合物を生成する工程を包含するものとして説明することができる（上記各式において、Ｃ、ｍ、Ｘ、ＰＡＧおよびｎは式Ｉについて上記されているとおりである）。Ｃｌは別のハロゲン、例えばＢｒにより置き換えることができる。一例として、塩基はまた、ＮａＨに特定することができ、また溶媒はテトラヒドロフランに特定することができる。この方法に用いられるルイス酸はまた、ＢＦ3ＯＥｔ2に特定することができる。
【０１７２】
本発明のもう一つの方法は、式：
2006515579.tif 000015
（式中、Ｃ、ｍ、Ｘ、ＰＡＧおよびｎは式Ｉについて上記されているとおりである）
で表わされる化合物の製造について説明される。
【０１７３】
この方法は、生成物：
2006515579.tif 000016
（式中、Ｃ、ｍ、Ｘ、ＰＡＧおよびｎは上記定義のとおりである）
をパラニトロクロロホーメートまたはジスクシイミジルカーボネートと反応させる工程を包含する。
【０１７４】
本発明のさらにもう一つの態様は、式：
2006515579.tif 000017
（式中、ＰＡＧ、ｎ，Ｘおよびｏは式ＩＩについて上記に定義されているとおりである）
で表わされる化合物の製造方法を提供する。
【０１７５】
この方法は、式：
2006515579.tif 000018
（式中、ｏは式Ｉについて上記に定義されているとおりである）
で表わされる化合物を、溶媒中で、式：
ＨＯ−ＰＡＧn−Ｘ
（式中、Ｘは−ＮＨまたは−ＯＨである）
で表わされる化合物と反応させ、式：
2006515579.tif 000019
（式中、ＰＡＧ、ｎ、Ｘおよびｏは式ＩＩについて上記に定義されているとおりである）
で表わされる化合物を生成する工程を包含する。
【０１７６】
本発明はまた、式：
2006515579.tif 000020
（式中、ＰＡＧ、ｎ、Ｘおよびｏは式ＩＩについて上記に定義されているとおりである）
で表わされる化合物の製造方法を提供する。
【０１７７】
この方法は、生成物：
2006515579.tif 000021
（式中、ＰＡＧ、ｎ、Ｘおよびｏは式ＩＩについて上記に定義されているとおりである）
を、活性化剤、例えばジスクシンイミジルカーボネート、パラニトロクロロホーメート、ホスゲンおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて活性化する工程を包含するものとして説明することができる。
【０１７８】
本発明のもう一つの態様は、式：
2006515579.tif 000022
（式中、Ｃ、ｍ、ＰＡＧ、ｎおよびｏは式ＩＩＩについて上記に定義されているとおりである）
で表わされる化合物の製造方法を提供する。
【０１７９】
この方法は、上記式ＩＶで同定されている生成物を、溶媒中で塩基の存在下に、式：
2006515579.tif 000023
（式中、ｏは式ＩＩＩについて上記に定義されているとおりである）
で表わされる化合物と反応させる工程を包含するものとして説明することができる。この方法の好適態様において、塩基はＫ2ＣＯ3であり、および溶媒は水性および／または有機溶媒である。
【０１８０】
さらに、本発明はまた、式：
2006515579.tif 000024
（式中、Ｃ、ｍ、ＰＡＧ、ｎおよびｏは式ＩＩＩについて上記に定義されているとおりである）
で表わされる化合物の製造方法を提供する。この方法は一般に、上記式ＶＩＩＩの製造方法に従い製造された化合物を活性化剤、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させることを包含する。
【実施例】
【０１８１】
９．  例
下記例は、本発明の代表的典型を示すものである。下記例の或る態様は、本発明の実施に最良典型の証明に見出される技術および方法を用いて説明される。本記載および本発明が関連する技術における公知一般レベルの観点から、当業者にとって、下記例が例示しようとするのみのものであり、また本発明の範囲から逸脱することなく、多くの変化、修正および変更を採用することができることは明白である。
【０１８２】
９．１  ＰＥＧ−アルキル修飾部分の活性化（炭酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル２−［２−（２−｛２−［２−（２−ヘキサデシルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エチルエステル（ＩＩ））
ヘキサエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、Ｉ（０．２０２ｇ、０．４ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５ｍｌ）に溶解し、次いでジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ、０．１５７ｇ、０．６ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、トリエチルアミン（０．１２ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を滴下添加し、１０分後、反応混合物は清明になった。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。〜１６時間の撹拌後、粗製反応混合物を蒸発乾燥させ、次いで飽和ＮａＨＣＯ3（１０ｍｌ）に溶解し、酢酸エチル（２ｘ２０ｍｌ）により洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、次いで蒸発乾燥させた。この粗製生成混合物を、カラムクロマトグラフイにより精製し（シリカ、ＥｔＯＡｃ／メタノール、１０：１）、標題の化合物ＩＩ  ０．２５８ｇ（８１％）を油状物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ６４８．８４（Ｍ＋Ｈ）+。
【０１８３】
2006515579.tif 000025
【０１８４】
９．２  分枝鎖状ＰＥＧアミン修飾部分の合成（炭酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル２−［２−（２−ヘキシル−デカノイルアミン）−エトキシ］−エチルエステル（ＩＶ））
四塩化炭素１００ｍｌ中の２−ヘキシル−デカン酸Ｉ（１０ｇｍ、３８．９ｍｍｏｌ）の溶液に、チオニルクロライド（５．５ｇｍ、４６．６ｍｍｏｌ）を３０分かけて滴下添加した。添加完了後、この反応混合物を３時間にわたり還流させた。反応が完了した後、四塩化炭素を蒸留により分離し、この反応混合物を濃縮し、粗製酸クロライドを得た。この粗製酸クロライドを分別蒸留により精製し、ＩＩを清明な液体として得た（１０．１ｇｍ、９１％）。ＥＳＩ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ２７５．８７（Ｍ＋Ｈ）+。
【０１８５】
ジクロロメタン１０ｍｌ中の２−（２−アミノ−エトキシ）−エタノール（５７５ｇ、５．４７ｍｍｏｌ）の冷却溶液に、２−ヘキシル−デカノイルクロライドＩＩ（７５０ｍｇ、２．７４ｍｍｏｌ）を３０分かけて滴下添加した。添加完了後、この反応混合物温度の温度を２５℃に高めた。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。〜２０時間の撹拌後、この粗製反応混合物を１Ｎ  ＨＣｌにより酸性にし、次いでＨ2Ｏ  １０ｍｌにより稀釈した。この反応混合物を次いで、ジクロロメタンにより抽出した。この有機層を次いで、１Ｎ  ＨＣｌ、水により洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、次いで濃縮した。この粗製生成物をフラッシュクロマトグラフイにより精製し（シリカ、勾配溶出：ＣＨＣｌ3中２〜５％メタノール）、単分散化合物ＩＩＩ  ９０２ｍｇ（９６％）をオフホワイト色固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ３４４．５４（Ｍ＋Ｈ）+。
【０１８６】
この単分散分枝鎖状Ｃ１６−ＰＥＧ２  ＩＩＩ（２００ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５ｍｌ）およびジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ、０．２２４ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）に溶解した。次いで、トリエチルアミン（０．１１８ｇ、１．１７ｍｍｏｌ）を滴下添加し、１０分後、この反応混合物は清明になった。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。〜１６時間の撹拌後、この粗製反応混合物を蒸発乾燥させ、次いで飽和ＮａＨＣＯ3（１０ｍｌ）に溶解し、酢酸エチル（２ｘ２０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、次いで蒸発乾燥させた。この残留物をカラムクロマトグラフイにより精製し（シリカ、ＥｔＯＡｃ／メタノール、１０：１）、油状物ＩＶ（０．２０６ｇ、７４％）０．２０６ｇ（７４％）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ４８５．６３（Ｍ＋Ｈ）+。
【０１８７】
2006515579.tif 000026
【０１８８】
９．３  ＰＥＧ−アルキル修飾部分の合成および活性化（１６−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メトキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ヘキサデカン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル  エステル）
エタノール（３００ｍｌ）中の単分散１６−ブロモ−ヘキサデカン酸（１５．３ｇ、４５ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｈ2ＳＯ4（１．５ｍｌ、３１．２５ｍｍｏｌ）を添加し、次いで反応混合物を４８時間にわたり撹拌した。この粗製反応混合物を水で稀釈し、次いでジクロロメタン（２ｘ３００ｍｌ）により抽出した。この有機層を次いで、Ｈ2Ｏ（３００ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ3（２ｘ３００ｍｌ）、Ｈ2Ｏ（３００ｍｌ）により洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、次いで蒸発乾燥させ、オフホワイト色固形物ＩＩ（１６．０３ｇ、収率９８％）を得た。
【０１８９】
ＴＨＦ（２５０ｍｌ）中の単分散ヘプタエチレングリコールモノメチルエーテル（８．５１ｇ、２５ｍｍｏｌ）の溶液に、カリウムｔ−ブトキシド（３．１ｇ、２７．５ｍｍｏｌ、〜３０分かけて少しづつ）を添加した。この反応混合物を次いで、１時間にわたり撹拌し、次いでＴＨＦ（９０ｍｌ）に溶解したＩＩ（１０ｇ、２７．５ｍｏｌ）を滴下添加し、次いでこの反応混合物を一夜にわたり撹拌した。この粗製反応混合物をセライトに通して濾過し（ＣＨ2ＣＨ2〜２００ｍｌにより洗浄）、次いで蒸発乾燥させ、油状物を得た。この粗製油状物をフラッシュクロマトグラフイにより精製し（シリカ、勾配溶出：ＣＨＣｌ3中２〜５％メタノール）、清明な黄色油状物ＩＶ、２．４８ｇ（１６％）を得た。
【０１９０】
単分散化合物ＩＶ（２．２２ｇ、３．５６ｍｍｏｌ）の油状物に、１Ｎ  ＮａＯＨ（５０．０ｍｌ）、メタノール２５ｍｌ、エタノール２５ｍｌを添加し、この反応混合物を２４時間にわたり撹拌した。この粗製反応混合物を濃縮し、酸性にし（ｐＨ〜２）、ＮａＣｌにより飽和し、次いでＣＨ2Ｃｌ2（３ｘ７５ｍｌ）により洗浄した。この有機層を集め、飽和ＮａＣｌにより洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、次いで蒸発乾燥させ、単分散化合物Ｖを白色固形物として得た。この粗製固形物をフラッシュクロマトグラフイにより精製し（シリカ、酢酸エチル）、Ｖ、８５８ｍｇ（４０％）を得た。
【０１９１】
単分散ｍＰＥＧ７−Ｃ１６−酸Ｖ（３２４ｍｇ、５４４ｍｍｏｌ）を無水メチレンクロライド１５ｍｌに溶解し、次いで無水メチレンクロライド中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（９４ｍｇ、８１６ｍｍｏｌ）および１−エチル−３（３′−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・ＨＣｌ（ＥＤＣｌ・ＨＣｌ、１５６ｍｇ、８１６ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。この反応混合物を２４時間にわたり撹拌し、次いで１Ｎ  ＨＣｌ、水により洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、次いで濃縮した。この粗製生成物をフラッシュクロマトグラフイにより精製し（シリカ、勾配溶出：ＣＨＣｌ3中２〜５％メタノール）、単分散活性化ＭＰＥＧ７−Ｃ１６  ＶＩを清明な油状物として得た（２９０ｍｇ、７７％）。
【０１９２】
2006515579.tif 000027
【０１９３】
９．４  ＰＥＧ−アルキル修飾部分の活性化（１２−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メトキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ドデカン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル）
単分散ｍＰＥＧ−Ｃ１２−酸Ｉ（５００ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）を無水メチレンクロライド２０ｍｌ中に溶解し、次いで無水メチレンクロライド中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１６０ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ）および１−エチル−３−（３′−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・ＨＣｌ（ＥＤＣＨ・ＨＣｌ、２３３ｍｇ、１．３９０ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。この反応混合物を２４時間にわたり撹拌し、次いで１Ｎ  ＨＣｌ、水により洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、次いで濃縮した。この粗製生成物をフラッシュクロマトグラフイにより精製し（シリカ、勾配溶出：ＣＨＣｌ3中２〜５％メタノール）、単分散活性化ＭＰＥＧ７−Ｃ１６  ＶＩを清明な油状物として得た（３７０ｍｇ、６２％）。
【０１９４】
2006515579.tif 000028
【０１９５】
９．５  ＰＥＧ修飾部分の合成（炭酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル  エステル２−メトキシ−エチルエステル）
単分散分枝鎖状ＭＰＥＧ１  Ｉ（２００ｍｇ、２．６３ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２０ｍｌ）に溶解し、次いでジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ、ＩＩ、１．００ｇ、３．９４ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、トリエチリアミン（０．３９９ｇ、３．９４ｍｍｏｌ）を滴下添加し、１０分後、この反応混合物は清明になった。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。〜１６時間にわたり撹拌した後、この粗製反応混合物を蒸発乾燥させ、次いでＮａＨＣＯ3（２０ｍｌ）に溶解し、酢酸エチル（２ｘ５０ｍｌ）により洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイ（シリカ、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ、１０：１）に付し、固形物ＩＩＩを得た（０．３４６ｇ、収率６０％）。ＥＳＩ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ２１８．０９（Ｍ＋Ｈ）+。
【０１９６】
2006515579.tif 000029
【０１９７】
９．６  加水分解性ミクロペジル化修飾部分の合成（ヘキサン酸２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニルオキシ）−エチルエステル）
単分散分枝鎖状Ｃ６−ＰＥＧ１  Ｉ（１００ｍｇ、０．６２５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１０ｍｌ）に溶解し、次いでジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ、ＩＩ、０．２４０ｇ、０．９３６ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、トリエチルアミン（０．０９５ｇ、０．９３６ｍｍｏｌ）を滴下添加し、１０分後、この反応混合物は清明になった。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。〜１６時間の撹拌後、この粗製反応混合物を蒸発乾燥させ、次いで飽和ＮａＨＣＯ3（１０ｍｌ）に溶解し、酢酸エチル（２ｘ２０ｍｌ）により洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し（シリカ、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ、１０：１）、オフホワイト色固形物ＩＩＩを得た（０．１４６ｇ、収率７８％）。ＥＳＩ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ３０２．２９（Ｍ＋Ｈ）+。
【０１９８】
2006515579.tif 000030
【０１９９】
９．７  直鎖状ｍＰＥＧ修飾部分の合成（炭酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル  エステル２−（２−メトキシ−エトキシ）エチルエステル）
単分散分枝鎖状ＭＰＥＧ２  Ｉ（４７０ｍｇ、３．９１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２０ｍｌ）に溶解し、次いでジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ、ＩＩ、１．５０ｇ、５．８７ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、トリエチルアミン（０．５９４ｇ、５．８７ｍｍｏｌ）を滴下添加し、１０分後、この反応混合物は清明になった。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。〜１６時間の撹拌後、この粗製反応混合物を蒸発乾燥させ、次いで飽和ＮａＨＣＯ3（２０ｍｌ）に溶解し、酢酸エチル（２ｘ５０ｍｌ）により洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し（シリカ、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ、１０：１）、固形物ＩＩＩを得た（０．６３２ｇ、収率６２％）。ＥＳＩ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ２６２．２３（Ｍ＋Ｈ）+。
【０２００】
2006515579.tif 000031
【０２０１】
９．８  加水分解性ミクロペジル化修飾部分の合成（ドデカン酸２−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキソカルボニルオキシ）−エトキシ］−エチルエステル）
単分散分枝鎖状Ｃ１２−ＰＥＧ２  Ｉ（２００ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１０ｍｌ）に溶解し、次いでジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ、ＩＩ、０．２６５ｇ、１．０３５ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、トリエチルアミン（０．１０４ｇ、１．０３５ｍｍｏｌ）を滴下添加し、１０分後、この反応混合物は清明になった。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。〜１６時間の撹拌後、この粗製反応混合物を蒸発乾燥させ、次いで飽和ＮａＨＣＯ3（１０ｍｌ）に溶解し、酢酸エチル（２ｘ２０ｍｌ）により洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し（シリカ、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ、１０：１）、油状物ＩＩＩを得た（０．２４７ｇ、収率８３％）。ＥＳＩ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ４３０．５０（Ｍ＋Ｈ）+。
【０２０２】
2006515579.tif 000032
【０２０３】
９．９  直鎖状ＰＥＧ修飾部分の合成（炭酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル  エステル２−［２−（２−メトキシ−エトキシ）−エトキシ］−エチルエステル）
単分散分枝鎖状ＭＰＥＧ３  Ｉ（２００ｍｇ、１．２１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２０ｍｌ）に溶解し、次いでジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ、ＩＩ、０．４６８ｇ、１．８２ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、トリエチルアミン（０．１８４ｇ、１．８２ｍｍｏｌ）を滴下添加し、１０分後、この反応混合物は清明になった。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。〜１６時間の撹拌後、この粗製反応混合物を蒸発乾燥させ、次いで飽和ＮａＨＣＯ3（２０ｍｌ）に溶解し、酢酸エチル（２ｘ５０ｍｌ）により洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し（シリカ、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ、１０：１）、固形物ＩＩＩを得た（０．２０６ｇ、収率５５％）。ＥＳＩ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ３０６．１１（Ｍ＋Ｈ）+。
【０２０４】
2006515579.tif 000033
【０２０５】
９．１０  加水分解性ミクロペジル化修飾部分の合成（ヘキサン酸２−｛２−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニルオキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エチルエステル）
単分散分枝鎖状Ｃ６−ＰＥＧ３  Ｉ（２００ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２０ｍｌ）に溶解し、次いでジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ、ＩＩ、０．３０９ｇ、１．２０９ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、トリエチルアミン（０．１２２ｇ、１．２０９ｍｍｏｌ）を滴下添加し、１０分後、この反応混合物は清明になった。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。〜１６時間の撹拌後、この粗製反応混合物を蒸発乾燥させ、次いで飽和ＮａＨＣＯ3（１０ｍｌ）に溶解し、酢酸エチル（２ｘ２０ｍｌ）により洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し（シリカ、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ、１０：１）、油状物ＩＩＩを得た（０．２０３ｇ、収率６４％）。ＥＳＩ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ３９０．４０（Ｍ＋Ｈ）+。
【０２０６】
2006515579.tif 000034
【０２０７】
９．１１  ベンジル消去加水分解性オリゴマーの合成（６−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メトキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−ヘキサン酸４−（４−ニトロ−フェノキシカルボニルオキシメチル）−フェニルエステル）
カリウム  ｔｅｒｔ−ブトキシド（３．６４ｇ、３２．４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ２５０ｍｌ中に溶解した。ＴＨＦ１０ｍｌ中のＭＰＥＧ6アルコール（９．５８ｇ、３２．３ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液を２時間にわたり撹拌した。市販エチル６−ヒドロキシ−ヘキサノエートから製造されたメシレート（７．０ｇ、２９．４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ１５ｍｌに溶解し、次いでＰＥＧ溶液に添加した。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。反応をＭｅＯＨ２５ｍｌにより停止させ、次いでセライトの短いパッドに通して濾過した。この濾過液を減圧濃縮し、この残留物をフラッシュクロマトグラフイにより精製し（ＥｔＯＡｃ／２％ＭｅＯＨ）、Ｉを３．１９ｇ（２５％）の量で得た。ＥＳＩ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ４６１．０７（Ｍ＋Ｎａ）+。
【０２０８】
エチルエステルを加水分解するために、Ｉ  １．１ｇ（２．５１ｍｍｏｌ）を１Ｎ  ＮａＯＨ  ３５ｍｌにより処理した。６時間後、初期に濁っていた混合物は清明な黄色溶液になった。この混合物をＮａＣｌで飽和し、次いで濃ＨＣｌによりｐＨ２まで酸性化した。この溶液をＣＨ2Ｃｌ2  １００ｍｌにより抽出した。この有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、次いで減圧濃縮し、カルボン酸ＩＩ  ０．８０ｇ（７８％）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ４３３．１０（Ｍ＋Ｈ）+。
【０２０９】
カルボン酸ＩＩＩ（０．８０ｇ、１．９５ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2  １６ｍｌに溶解し、次いでＮ2雰囲気に置いた。この溶液に、ＥＤＣ  ０．４８６ｇ（２．５ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）０．２８８ｇ（２．５ｍｍｏｌ）を添加した。５時間後、ＥＤＣ  ０．２ｇおよびＮＨＳ  ０．１２ｇをさらに添加し、反応を完了させた。ＴＬＣが未反応カルボン酸の無残留を示した時点で、この混合物をＣＨ2Ｃｌ2  ６０ｍｌにより稀釈し、次いで冷１Ｎ  ＨＣｌ（１ｘ１００ｍｌ）、冷水（２ｘ１００ｍｌ）およびブライン（３ｘ１００ｍｌ）で洗浄した。この有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、次いで減圧濃縮し、ＩＩＩ  ０．７１ｇ（７１％）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ５０８．１７（Ｍ＋Ｈ）+、５３０．０７（Ｍ＋Ｎａ）+。
【０２１０】
４−ヒドロキシペンジルアルコール（２．９３ｇ、３．６ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ２．９８ｇ（２４．４ｍｍｏｌ）を乾燥ＣＨ2Ｃｌ2  １２０ｍｌ中に溶解した。化合物ＩＩＩ（１．２ｇ、２．３７ｍｍｏｌ）を別の４０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2４０ｍｌ中に溶解し、次いで添加した。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。この混合物を１Ｎ  ＨＣｌ（２ｘ２００ｍｌ）およびブライン（２ｘ２００ｍｌ）で洗浄した。この有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、次いで蒸発乾燥させた。この残留物をフラッシュクロマトグラフイにより精製し（シリカ、ＥｔＯＡｃ／１０％ＭｅＯＨ）、オリゴマーＩＶ  ０．７０１ｇ（５８％）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ：５３９．１０ｍ／ｅ（Ｍ＋Ｎａ）+。
【０２１１】
オリゴマーＩＶ（０．５６２ｇ、１．０９ｍｍｏｌ）を乾燥ＣＨ2Ｃｌ2  １５ｍｌに溶解した。この溶液に、ＴＥＡ  ０．２３ｍｌ（１．６４ｍｍｏｌ）およびｐ−ニトロ−フェニルクロロホーメート０．３２９ｇ（１．６４ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。この混合物を次いで、追加のＣＨ2Ｃｌ2  １５ｍｌにより稀釈し、次いで１Ｎ  ＨＣｌにより、次いで水１５ｍｌにより洗浄した。この有機層をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、次いで濃縮乾燥させた。この粗製生成物をフラッシュクロマトグラフイにより精製し（シリカ、勾配溶出：３／１ＥｔＯＡｃ／ヘキサン−ＥｔＯＡｃ）、活性化オリゴマー５０４ｍｇ（７４％）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ６８２．７２（Ｍ＋Ｈ）+、、７０４．７２（Ｍ＋Ｎａ）+。
【０２１２】
2006515579.tif 000035
【０２１３】
９．１２  アリールカルバメート加水分解性修飾部分の合成（炭酸４−（６−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メトキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−ヒドロキシ）−フェニルエステル４−ニトロ−フェニルエステル）
ＭＰＥＧ6アルコール（１０．０ｇ、３３．７ｍｍｏｌ）を乾燥ＣＨ2Ｃｌ2  ４０ｍｌに溶解し、生成する溶液を氷浴中で０℃に冷却させた。ＴＥＡ（５．６４ｍｌ、４０．５ｍｍｏｌ）を添加し、次いでメタンスルホニルクロライド３．１３ｍｌ（４０．５ｍｍｏｌ）を滴下添加した。この反応混合物を０℃において３０分間にわたり撹拌し、次いで氷浴から分離し、室温に戻し、次いで一夜にわたり撹拌した。この反応混合物を追加のＣＨ2Ｃｌ2により稀釈し、次いで飽和ＮａＨＣＯ3および水により洗浄した。この有機層をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、次いで減圧濃縮し、ＭＰＥＧ6メシレート、Ｉ  １２．４ｇ（９８％）を得た。
【０２１４】
１，６−ヘキサンジオールの溶液をジオール６．３１１ｇ（５３．４１ｍｍｏｌ）および乾燥ＴＨＦ  １８０ｍｌから製造した。この溶液を０℃に冷却させ、Ｎ2雰囲気に置いた。この溶液に、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（５．９９６ｇ、５３．４１ｍｍｏｌ）を添加し、生成する混合物を１時間にわたり撹拌した。この混合物に、ＴＨＦ  ３０ｍｌ中のＩ（１０．０ｇ、２６．７ｍｍｏｌ）を添加した。全体を０℃においてさらに３０分間にわたり撹拌し、次いで室温まで温まるままにし、次いで一夜にわたり撹拌した。この反応混合物をセライトに通して濾過した。セライトをＣＨ2Ｃｌ2によりすすぎ、集めた濾液を減圧濃縮した。この残留物をＣＨ2Ｃｌ2に再溶解し、次いで水により洗浄した。この有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、次いで蒸発乾燥させた。フラッシュクロマトグラフイにより精製した（シリカ、ＣＨＣｌ3／１０％ＭｅＯＨ）。若干の生成物を調整用ＴＬＣによりさらに精製した（ＥｔＯＡｃ／１０％ＭｅＯＨ）。総合収量はＩＩの３．９３２ｇ（３７％）であった。
【０２１５】
ＩＩ（３．９２３ｇ、９．８９ｍｍｏｌ）を乾燥ＣＨ2Ｃｌ2  １６ｍｌに溶解し、生成する溶液を０℃に冷却させ、Ｎ2雰囲気に置いた。トリエチルアミン（１．６５ｍｌ、１１．９ｍｍｏｌ）を添加し、次いでメタンスルホニルクロライド０．９２ｍｌ（１１．９ｍｍｏｌ）を滴下添加した。この反応混合物を０℃においてさらに３０分間にわたり撹拌し、次いで室温に戻るままにし、次いで一夜にわたり撹拌した。この反応混合物を追加のＣＨ2Ｃｌ2により稀釈し、次いで飽和ＮａＨＣＯ3および水により洗浄した。この有機層をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、次いで減圧濃縮し、メシレートＩＩＩ  ４．２５ｇ（９１％）を得た。
【０２１６】
乾燥ＴＨＦ  ５０ｍｌを含有するフラスコにおいて、４−ベンジルオキシフェノール５．００１ｇ（２４．９７ｍｍｏｌ）を溶解した。カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１．２０２ｇ、９．９８９ｍｍｏｌ）を添加し、生成する混合物を不活性雰囲気下に室温で１時間にわたり撹拌した。ＴＨＦ  ２０ｍｌ中のＩＩＩ  ３．９５０ｇ（８．３２４ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。さらに１８時間後、混合物全体をＭｅＯＨ  １０ｍｌにより静止させ、次いでセライトの短いパッドに通し濾過した。この濾液を減圧濃縮し、残留物をフラッシュクロマトグラフイにより精製し（シリカ、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ  ２０：１）、化合物ＩＶ  １．５８４ｇ（３３％）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ５７９．１６（Ｍ＋Ｈ）+、６０１．１４（Ｍ＋Ｎａ）+。
【０２１７】
化合物ＩＶ（０．６８３ｇ、１．１８ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ  ２０ｍｌに溶解した。この溶液に、ＭｅＯＨ中の５％Ｐｄ／Ｃ  １３６ｍｇのスラリイを添加した。この混合物全体をＨ2雰囲気下に置き、次いでＴＬＣが出発材料の全部が消費されたことを示すまで撹拌した。この混合物を次いで、セライトに通して濾過し、この濾液を蒸発乾燥させ、Ｖ  ４１２ｍｇ（７１％）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ５１１．０９（Ｍ＋Ｎａ）+。
【０２１８】
オリゴマーＶ（０．６０５ｇ、１．０９ｍｍｏｌ）を乾燥ＣＨ2Ｃｌ2  １５ｍｌに溶解した。この溶液に、ＴＥＡ  ０．２３ｍｌ（１．６４ｍｍｏｌ）およびｐ−ニトロ−フェニルクロロホーメート０．３２９ｇ（１．６４ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。この混合物を次いで、追加のＣＨ2Ｃｌ2  １５ｍｌにより稀釈し、次いで１Ｎ  ＨＣｌ１５ｍｌで、次いで水１５ｍｌで洗浄した。この有機層をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、次いで蒸発乾燥させた。この粗製生成物をフラッシュクロマトグラフイにより精製し（シリカ、勾配溶出：３／１ＥｔＯＡｃ／ヘキサン−ＥｔＯＡｃ）、活性化オリゴマー４９１ｍｇ（７５％）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ６５４．７１（Ｍ＋Ｈ）+６７５．７１（Ｍ＋Ｎａ）+。
【０２１９】
2006515579.tif 000036
【０２２０】
９．１３  オリゴマー分子の活性化方法
本例は、本発明によるオリゴマー状分子を活性化できる方法を説明するものである。
【０２２１】
９．１３．１  方法Ｉ：ＤＳＣを用いる活性化
アルキル−ＰＥＧ−ＯＨ、Ｉ（０．４ｍｍｏｌ、１当量）をアセトニトリル（５ｍｌ）に溶解し、次いでジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ、０．６ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加した。次いで、トリエチルアミン（１．２ｍｍｏｌ、１．５当量）を滴下添加し、１０分後、この反応混合物は清明になった。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。〜１６時間の撹拌後、粗製反応混合物を蒸発乾燥させ、次いで飽和ＮａＨＣＯ3（１０ｍｌ）に溶解し、酢酸エチル（２ｘ２０ｍｌ）により洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し（シリカ、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ、１０：１）、活性化オリゴマーＩＩを得た。
【０２２２】
2006515579.tif 000037
【０２２３】
９．１３．２  方法ＩＩ：ＮＨＳを用いる活性化
ＭＰＥＧ−アルキル−酸Ｉ（０．５４４ｍｍｏｌ、１．０当量）を無水メチレンクロライド１５ｍｌに溶解し、次いで無水メチレンクロライド中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．８１６ｍｍｏｌ、１．５当量）および１−エチル−３−（３′−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・ＨＣｌ（ＥＤＣｌ・ＨＣｌ、０．８１６ｍｍｏｌ、１．５当量）の溶液を添加した。この反応混合物を数時間にわたり撹拌し、次いで１Ｎ  ＨＣｌ、水により洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、濾過し、次いで濃縮した。この粗製生成物をフラッシュクロマトグラフイにより精製し（シリカ、勾配溶出：ＣＨＣｌ3中２〜５％メタノール）、活性化ＭＰＥＧ−アルキル−酸、ＩＩを得た。
【０２２４】
2006515579.tif 000038
【０２２５】
９．１４  分枝鎖状ＰＥＧを用いる修飾部分の合成（６−［２−（２−｛２−［２−（２−メトキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−１−（２−｛２−［２−（２−メトキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシメチル）−エトキシカルボニルアミノ］−ヘキサン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル  エステル）
2006515579.tif 000039
１．  テトラエチレングリコールモノメチルエーテル（１４．０ｇ、６７ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（９０ｍｌ）に溶解し、次いでＮａＨ（１．７７ｇ、７４ｍｍｏｌ）を少しづつ添加し、この反応混合物を２時間にわたり撹拌した。次いで、エピクロロヒドリン（２６．３ｍｌ、０．３４ｍｏｌ）を滴下添加し、この反応混合物を室温で４８時間にわたり撹拌した。この粗製反応混合物をセライトに通して濾過し、次いでＣＨ2Ｃｌ2（２５０ｍｌ）により洗浄した。この濾液をＨ2Ｏ（２ｘ２５０ｍｌ）により洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し（シリカ、酢酸エチル）、１を清明な油状物として得た（１０．１５ｇ、収率５７％）。
【０２２６】
2006515579.tif 000040
２．  テトラエチレングリコールモノメチルエーテル（７．９６ｇ、０．０３８ｍｏｌ）および１（１０．ｌ、０．０３８ｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）に溶解し、次いでＢＦ3・ＯＥｔ2（０．４８ｍｌ、０．００３８ｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。粗製反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2（２００ｍｌ）で稀釈し、飽和ＮａＨＣＯ3（３００ｍｌ）、Ｈ2Ｏ（３００ｍｌ）により洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し（シリカ、酢酸エチル／ＭｅＯＨ、１０：１）、２を清明な油状物として得た（４．５ｇ、収率２５％）。
【０２２７】
2006515579.tif 000041
３．  ４−ニトロクロロホーメート（２．８７ｇ、１４．３ｍｍｏｌ）および２（４．５ｇ、９．５ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（４５ｍｌ）に溶解した。１０分間の撹拌後、ＴＥＡ（２．１ｍｌ、１５ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。粗製反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2（１３０ｍｌ）により稀釈し、１Ｍ  ＨＣｌ（１７５ｍｌ）、Ｈ2Ｏ（１７５ｍｌ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し（シリカ、酢酸エチル／ＭｅＯＨ、１５：１）、３を帯黄色油状物として得た（２．３８ｇ、収率４０％）。
【０２２８】
2006515579.tif 000042
４．  ６−アミノカプロン酸（０．１２６ｇ、０．９６ｍｍｏｌ）およびＫ2ＣＯ3（０．２２１ｇ、１．６ｍｍｏｌ）をＨ2Ｏ（ＤＬ、５ｍｌ）に溶解した。次いで、３（０．５ｇ、０．８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（０．７ｍｌ）に溶解し、次いで滴下添加した。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。粗製反応混合物をＨ2Ｏ（２０ｍｌ）により稀釈し、ＨＣｌによりｐＨ〜１に酸性化し、ＣＨ2Ｃｌ2（２ｘ２５ｍｌ）で洗浄し、この有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し（シリカ、ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ、１５：１）、４を清明な油状物として得た（０．４２８ｇ、収率８５％）。
【０２２９】
2006515579.tif 000043
５．  方法ＩＩを用いる活性化：４（０．４０ｇ、０．６４ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．０８８ｇ、０．７７ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．１６０ｇ、０．８３ｍｍｏｌ）およびＣＨ2Ｃｌ2（５ｍｌ）。カラムクロマトグラフイ（シリカ、酢酸エチル／ＭｅＯＨ、１０：１）に付し、５を清明な油状物として得た（０．３２０ｇ、収率６９％）。
【０２３０】
９．１５  直鎖状ＰＥＧ−アルキル修飾部分の合成（炭酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−ヘキシルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エチルエステル）
2006515579.tif 000044
１．  トリエチレングリコール（３０ｇ、０．２ｍｏｌ）をＮａＯＨの溶液（Ｈ2Ｏ  ８ｍｌ中８ｇ）に溶解し、次いで１０分間にわたり撹拌した。次いで、ベンジルクロライド（７ｍｌ、０．０６２ｍｏｌ）を添加し、この反応混合物を１００℃に加熱し、次いで一夜にわたり撹拌した。粗製反応混合物を飽和ＮａＣｌ（５００ｍｌ）により稀釈し、ＣＨ2Ｃｌ2（２ｘ４００ｍｌ）で洗浄し、この有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し（シリカ、酢酸エチル−酢酸エチル／ＭｅＯＨ、１０：１）、１を帯黄色油状物として得た（９．８７ｇ、収率６７％）。
【０２３１】
2006515579.tif 000045
２．  ＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍｌ）中の１（９．８７ｇ、０．０４１ｍｏｌ）の溶液に、ＴＥＡ（７．１ｍｌ、０．０５４ｍｏｌ）を添加した。この溶液を次いで、氷浴中で０℃に冷却させ、次いでＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍｌ）に溶解したメタンスルホニルクロライド（３．９ｍｌ、０．０４９ｍｏｌ）を滴下添加した。この反応混合物を０℃において０．５時間、次いで室温で４時間、撹拌した。粗製反応混合物をセライトに通して濾過し、ＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）により洗浄し、この濾液を飽和ＮａＨＣＯ3（１５０ｍｌ）、Ｈ2Ｏ（１５０ｍｌ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、次いで蒸発乾燥させ、２を黄色油状物として得た（１１．０６ｇ、収率８５％）。
【０２３２】
2006515579.tif 000046
３．  テトラエチレングリコール（７．３２ｇ、０．０３８ｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１４０ｍｌ）に溶解し、次いでＮａＨを０．５時間かけて少しづつ添加し、次いでこの反応混合物をさらに１時間にわたり撹拌した。次いで、２（６．０ｇ、０．０１９ｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍｌ）に溶解し、滴下添加し、次いでこの反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。粗製反応混合物をセライトに通して濾過し、ＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）により洗浄し、次いで蒸発乾燥させた。生成する油状物をＣＨ2Ｃｌ2（１５０ｍｌ）に溶解し、Ｈ2Ｏ（１５０ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ3（１５０ｍｌ）、Ｈ2Ｏ（１５０ｍｌ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し（シリカ、酢酸エチル／ＭｅＯＨ、１０：１）、３を黄色油状物として得た（３．８３ｇ、収率４９％）。
【０２３３】
2006515579.tif 000047
４．  ２と同様の方法で製造した：ヘキサノール（６．２ｍｌ、０．０５ｍｏｌ）、メタンスルホニルクロライド（４．６ｍｌ、０．０５８ｍｏｌ）、ＴＥＡ（８．６ｍｌ、０．０６５ｍｏｌ）、およびＣＨ2Ｃｌ2（６０ｍｌ）、４を黄色油状物として得た（７．８ｇ、収率８６％）。
【０２３４】
2006515579.tif 000048
５．  テトラヒドロフラン（１６０ｍｌ）中の３（５．４５ｇ、０．１３ｍｏｌ）の溶液に、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１．６０ｇ、０．０１４４ｍｏｌ）を添加し、この反応混合物を１．５時間にわたり撹拌した。次いでテトラヒドロフラン（２０ｍｌ）に溶解した４（２．５９ｇ、０．０１４４ｍｏｌ）を滴下添加し、この反応混合物を一夜にわたり撹拌した。粗製反応混合物をセライトに通して濾過し、ＣＨ2Ｃｌ2で洗浄し、次いで蒸発乾燥させた。生成する油状物を酢酸エチル（１５０ｍｌ）に溶解し、Ｈ2Ｏ（２ｘ１５０ｍｌ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し（シリカ、酢酸エチル）、５を帯黄色油状物として得た（２．４０ｇ、収率３６％）。
【０２３５】
2006515579.tif 000049
６．  酢酸エチル（１６ｍｌ）中の５（２．４ｇ、４．８ｍｍｏｌ）の溶液に、活性炭上パラジウム１０重量％（１．０ｇ）を添加し、この反応容器を隔壁で密封した。Ｈ2を含有するバルーンを、針により隔壁内に導入し、この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。粗製反応混合物をセライトに通して濾過し、酢酸エチルにより洗浄し、次いで蒸発乾燥させ、６（１．６１ｇ、収率８２％）を清明な油状物として得た。
【０２３６】
2006515579.tif 000050
７．  ホスゲン溶液（トルエン中２０％ホスゲン１５ｍｌ）を−１０℃に冷却し、次いでトルエン（５ｍｌ）に溶解した６（１．６０ｇ、３．９ｍｍｏｌ）を滴下添加した。この反応混合物を−１０℃で０．５時間、次いで室温で４時間、撹拌した。ホスゲンおよびトルエンを次いで、留去し、生成した油状物を減圧乾燥させ、７を帯黄色油状物として得た。
【０２３７】
2006515579.tif 000051
８．  方法ＩＩを用いる活性化：７（１．６５ｇ、０．７９ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．４３７ｇ、３．８ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（２．７ｍｌ、３．８ｍｍｏｌ）、およびＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍｌ）。カラムクロマトグラフイに付し（シリカ、酢酸エチル／ＭｅＯＨ、１５：１）、８（１．０６ｇ、収率５７％）を清明な油状物として得た。
【０２３８】
９．１６  分枝鎖状アルキル−ＰＥＧ−アルキルの合成（６−［２−（２−｛２−［２−（２−ヘプチルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−１−（２−｛２−［２−（２−ヘプチルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシメチル）−エトキシカルボニルアミノ］−ヘキサン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル）
2006515579.tif 000052
１．  例９．１５に示されている方法と同一の方法で製造した：ヘキサノール（１８ｍｌ、０．１５ｍｏｌ）、メタンスルホニルクロライド（１２．３ｍｌ、０．１６ｍｏｌ）、ＴＥＡ（２５ｍｌ、０．１８ｍｏｌ）、およびＣＨ2Ｃｌ2（１８０ｍｌ）。１（２３．１ｇ、収率８５％）を黄色油状物として得た。
【０２３９】
2006515579.tif 000053
２．  テトラエチレングリコール（５０．５ｇ、０．２６ｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（３５０ｍｌ）に溶解し、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（２９．２ｇ、０．２６ｍｏｌ）を０．５時間かけて少しづつ添加した。この反応混合物をさらに１時間にわたり撹拌し、次いでＴＨＦ（５０ｍｌ）に溶解した１（２３．０ｇ、０．１３ｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。粗製反応混合物をセライトに通して濾過し、ＣＨ2Ｃｌ2で洗浄し、次いで蒸発乾燥させた。生成した油状物をＣＨ2Ｃｌ2（３００ｍｌ）に溶解し、Ｈ2Ｏ（２ｘ３００ｍｌ）により洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し（シリカ、酢酸エチル）、２（１８．５１ｇ、収率５１％）を清明な油状物として得た。
【０２４０】
2006515579.tif 000054
３．  テトラヒドロフラン（６０ｍｌ）中の２（１０．０ｇ、３６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＮａＨ（０．９５ｇ、４０ｍｍｏｌ）を少しづつ添加し、この反応混合物を０．５時間にわたり撹拌した。次いでエピクロロヒドリン（１４．１ｍｌ、０．３４ｍｏｌ）を滴下添加し、この反応混合物を室温で４８時間にわたり撹拌した。粗製反応混合物をセライトに通して濾過し、ＣＨ2Ｃｌ2で洗浄し、次いで蒸発乾燥させた。生成した油状物をＣＨ2Ｃｌ2（２００ｍｌ）に溶解し、飽和ＮａＣｌ（２００ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ3（２００ｍｌ）、Ｈ2Ｏ（２００ｍｌ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し（シリカ、酢酸エチル／ヘキサン、１０：１）、３（５．４６ｇ、収率４５％）を清明な油状物として得た。
【０２４１】
2006515579.tif 000055
４．  ＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍｌ）中の２（４．５４ｇ、１６ｍｍｏｌ）および３（５．４６ｇ、１６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＢＦ3・ＯＥｔ2（０．４８ｍｌ、０．００３８ｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。粗製反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍｌ）により稀釈し、飽和ＮａＨＣＯ3（１００ｍｌ）、Ｈ2Ｏ（１００ｍｌ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し（シリカ、酢酸エチル−酢酸エチル／ＭｅＯＨ、１０：１）、４（２．４０ｇ、収率２４％）を清明な油状物として得た。
【０２４２】
2006515579.tif 000056
５．  ４−ニトロクロロホーメート（１．１８ｇ、５．８ｍｍｏｌ）および４（２．４ｇ、３．９ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（２５ｍｌ）に溶解した。１０分の撹拌後、ＴＥＡ（０．８９ｍｌ、６．４ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。粗製反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2（７５ｍｌ）により稀釈し、１Ｍ  ＨＣｌ（１００ｍｌ）、Ｈ2Ｏ（１００ｍｌ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し（シリカ、酢酸エチル）、５（１．０４ｇ、収率３４％）を帯黄色油状物として得た。
【０２４３】
2006515579.tif 000057
６．  ６−アミノカプロン酸（０．１５７ｇ、１．２ｍｍｏｌ）およびＫ2ＣＯ3（０．２７６ｇ、２．０ｍｍｏｌ）をＨ2Ｏ（ＤＩ、８ｍｌ）に溶解した。次いで、５（０．８０ｇ、１．０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１．０ｍｌ）に溶解し、次いで滴下添加した。３を添加し、次いでエタノール（２ｍｌ）を添加すると油状小滴物が生成された。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。粗製反応混合物をＨ2Ｏ（３０ｍｌ）により稀釈し、ＨＣｌによりｐＨ〜１に酸性化し、ＣＨ2Ｃｌ2（２ｘ３５ｍｌ）で洗浄し、その有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し（シリカ、酢酸エチル／ＭｅＯＨ、２０：１）、６（０．７２０ｇ、収率４６％）を清明な油状物として得た。
【０２４４】
2006515579.tif 000058
７．  方法ＩＩを用いる活性化：６（０．３５６ｇ、０．４６ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．０６３ｇ、０．５５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．１１５ｇ、０．６ｍｍｏｌ）、およびＣＨ2Ｃｌ2（３ｍｌ）。カラムクロマトグラフイに付し（シリカ、酢酸エチル）、７（０．１８０ｇ、収率４５％）を清明な油状物として得た。
【０２４５】
９．１７  糖−ＰＥＧ−アルキル修飾部分の合成（２，２−ジメチル−プロピオン酸４，５−ビス（２，２−ジメチル−プロピオニルオキシ）−６−（２，２−ジメチル−プロピオニルオキシメチル）−３−｛６−［２−（２−｛２−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニルオキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−ヘキサノイルアミノ｝−テトラヒドロ−ピラン−２−イルエステル）
2006515579.tif 000059
１．  例９．１５に示されている方法と同一の方法で製造した：エチル６−ヒドロキシヘキサノエート（８．０ｇ、０．０５ｍｏｌ）、メタンスルホニルクロライド（４．６ｍｌ、０．０６ｍｏｌ）、ＴＥＡ（１０ｍｌ、０．０７２ｍｏｌ）およびＣＨ2Ｃｌ2（３２ｍｌ）。１（１１．１５ｇ、収率９３％）を黄色油状物として得た。
【０２４６】
2006515579.tif 000060
２．  テトラエチレングリコール（１９．１ｇ、０．０９８ｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１９０ｍｌ）に溶解し、次いでＮａＨ（１．６９ｇ、０．０７１ｍｏｌ）を０．５時間かけて少しづつ添加した。この反応混合物をさらに１時間にわたり撹拌し、次いでテトラヒドロフラン（１０ｍｌ）に溶解した１（２３．０ｇ、０．１３ｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。粗製反応混合物をセライトに通して濾過し、ＣＨ2Ｃｌ2で洗浄し、次いで蒸発乾燥させた。生成した油状物をＣＨ2Ｃｌ2（２００ｍｌ）に溶解し、飽和ＮａＣｌ（２００ｍｌ）、Ｈ2Ｏ（２００ｍｌ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し（シリカ、酢酸エチル／ＭｅＯＨ、２５：１）、２（１．６０ｇ、収率１０％）を清明な油状物として得た。
【０２４７】
2006515579.tif 000061
３．  １Ｍ  ＮａＯＨ（６ｍｌ）中の２（１．６０ｇ、４．７ｍｍｏｌ）の溶液を室温で２時間にわたり撹拌した。この粗製反応混合物を飽和ＮａＣｌ（２４ｍｌ）により稀釈し、ｐＨ〜２に酸性化し、ＣＨ2Ｃｌ2（２ｘ３０ｍｌ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、次いで蒸発乾燥させ、３（１．０８ｇ、収率７３％）を清明な油状物として得た。
【０２４８】
2006515579.tif 000062
４．  ２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ピバロイル−β−Ｄ−ガラクトスピラノシルアミン（０．８３６ｇ、１．６ｍｍｏｌ）および３（０．５０ｇ、１．６ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（８ｍｌ）に溶解した。次いで、ＥＤＣＩ（０．３６８ｇ、１．９２ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。一夜の撹拌後、反応は不完全であり、従ってＥＤＣＩ（０．３６８ｇ、１．９２ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。粗製反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2（２２ｍｌ）により稀釈し、１Ｍ  ＨＣｌ（３０ｍｌ）、Ｈ2Ｏ（３０ｍｌ）、飽和ＮａＣｌ（３０ｍｌ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し（シリカ、酢酸エチル／ＭｅＯＨ）、４（０．３９７ｇ、収率３１％）を粘性油状物として得た。
【０２４９】
2006515579.tif 000063
５．  方法Ｉを用いる活性化：４（０．３９７ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．０６３ｇ、０．６０ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（０．１０ｍｌ、０．７５ｍｍｏｌ）、およびアセトニトリル（４ｍｌ）。カラムクロマトグラフイに付し（シリカ、酢酸エチル）、５（０．２５６ｇ、収率５６％）を粘性油状物として得た。
【０２５０】
９．１８  加水分解性、非加水分解性およびペジル化（pegylated）ナトリウム排泄増加性結合体
本例はほとんど全部のクラスのオリゴマー部分、特に非加水分解性オリゴマー、ミクロペジル化オリゴマーおよび加水分解性オリゴマーを含有する修飾ナトリウム排泄増殖性化合物結合体を提供する本発明の有用性を証明するものである。
【０２５１】
本発明によるｈＢＮＰ結合体を、ペプチド上の相違する位置で結合されている種々のオリゴマーを用いて合成した。特性の最良の組合せ（レセプターにおけるアゴニスト活性、タンパク質分解に対する耐性および経口生体利用性）を有する結合体はさらに大規模のインビボ試験の先導的候補になった。
【０２５２】
天然ｈＢＮＰは契約したペプチド合成業者から入手した。結合体に使用された両親媒性オリゴマーはオリゴマー供給業者から入手し、およびｈＢＮＰへの結合にかかわり特別にデザインされ、また合成されたオリゴマーを得た。結合は図２に例示されている３段階結合戦略に従った。クラス１オリゴマーを先ず、試験した。クラス１オリゴマーとの広範囲の結合は活性を減少させることから、クラス２オリゴマーを用いるトリ結合体およびテトラ結合体を評価した。クラス２オリゴマーは有効ではないことから、２種のプロドラッグ結合体（クラス３オリゴマー）を評価した。
【０２５３】
第一クラスの結合体は非加水分解性である。この群の結合体の場合、投与される医薬物質（すなわち、結合体）はレセプター部位で作用する物質である。換言すれば、このオリゴマーおよびペプチドへのその結合は、投与時点からクリアランス時点まで一体で残留する。これらのオリゴマーは一般に、アルキル部分およびＰＥＧ部分から構成することができる。結合体を経口利用性にし、またタンパク質分解に対し耐性にする当該オリゴマーの効果を最大にするには、アルキル部分およびＰＥＧ部分の長さを変更することができ、また順序を切り換えることができる。結合の程度（例えば、モノ結合、ジ結合）はまた、操作することができる。この第一クラス内に入る結合体を提供することができる或る種のオリゴマーおよびこのような結合体を得る方法は、Ｅｋｗｕｒｉｂｅに対する米国特許Ｎｏ．５，３５９，０３０；Ｅｋｗｕｒｉｂｅに対する米国特許Ｎｏ．５，４３８，０４０；Ｅｋｗｕｒｉｂｅに対する米国特許Ｎｏ．５，６８１，８１１；Ｅｋｗｕｒｉｂｅに対する米国特許Ｎｏ．６，１９１，１０５；１９９９年１２月３１日付けで出願された米国特許出願Ｎｏ．０９／４７４，９１５；１９９９年１２月１３日付けで出願された米国特許出願Ｎｏ．０９／４５９，４４３；２００１年６月４日付けで出願された米国特許出願Ｎｏ．０９／８７３，７９７；に記載されており、これらの記載を引用してその全体をここに組入れる。
【０２５４】
第二クラスの結合体はミクロペジル化されている。このクラスの結合体の場合、オリゴマーのアルキル部分は、当該結合体が血流に入ると分離される。これらの結合体は、結合がナトリウム排泄増加性ペプチドのレセプター、ＮＰＲ−Ａに対する結合に必要である領域内で生じる場合に特に有用であることができる。このような場合、第一クラスのオリゴマーは安定性および放出性にかかわり有益であることができるが、活性に対しては有害であることもある。第二クラスの結合体はこの問題を減少または消滅させる。両親媒性オリゴマーは消化器官の通過に際し一体に保持され、また十二指腸上部における吸収を強化させる。循環系に入ると、アルキル部分が分離される。従って、これはレセプターに到達すると、より小さいオリゴマーが循環ペプチドに結合する。或る態様において、減少された立体干渉がレセプターにおける活性の増大を導く。この第二クラス内に入る結合体を提供することができる或る種のオリゴマー、およびこのような結合体を得る方法は、Ｅｋｗｕｒｉｂｅ等に対する米国特許Ｎｏ．６，３０９，６３３；および２００１年１２月１９日付けで出願された米国特許出願Ｎｏ．１０／０１８，８７９；に記載されており、これらの記載を引用してその全体をここに組入れる。
【０２５５】
第三クラスの結合体は充分に加水分解性である。このクラスの結合体の場合、当該結合体が吸収されると、オリゴマー全体が分解される。第二クラスと同様に、これらの結合体は、結合が結合に必要である領域内で生じる場合、特に有用であることができる。しかしながら、ミクロペジル化結合体が充分の活性を依然として保有していない場合、第三クラスの結合体はオリゴマーのレセプター結合を干渉する能力を完全に取り除くことができる。この場合、結合体は消化器官の通過に際し、一体に保持される。結合体が吸収されると、オリゴマーが分解され、天然ペプチドが循環系に放出される。
【０２５６】
ｈＢＮＰの結合：両親媒性オリゴマー（Ｃ6ＰＥＧ7）のカルボキシル基は、ペプチド化学における一般的活性化剤であるＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化される。活性化されると、オリゴマーは水性またはＤＭＳＯ溶液中でペプチドに結合する。ｈＢＮＰは４個の結合部位を有する：３個のＬｙｓ残基およびＮ−末端基。反応の化学量論を変更することによって、結合の程度（モノ−、ジ−など）を制御することができる。生成物分布は反応条件を変更することによって変えることができる。結合に好適な部位が活性分析により発見されたならば、化学量論および反応条件を変えることによって所望の結合体の優勢合成を達成することができる。
【０２５７】
ＰＥＧ−アルキルオリゴマーの選択：アルカン成分（疎水性）およびＰＥＧ成分（親水性）の相対的長さを変更することによって、結合体の両親媒性および溶液構造を改良することができる。ＰＥＧ部分は溶液として非常に柔軟であり、酵素に対する耐性において重要な役割を演じる。アルキル部分は腸における吸収を増大させることができ、および／または細胞膜と相互作用することができる。後者の特性は、目標が細胞表面の膜結合タンパク質、例えばＮＰＲ−Ａである場合、特に重要である。従って、オリゴマーの選択は、酵素安定性および経口生体利用性の観点から結合体の効力を決定することができる。
【０２５８】
ｈＢＮＰ結合体の精製：反応混合物は、調整用ＨＰＬＣカラム（Ｃ−１８）でイソプロパノール／水（０．１％トリフルオロ酢酸）からなる溶剤勾配系を用いて精製される。溶剤を蒸発させ、次いで凍結乾燥させ、乾燥生成物を得る。結合体の純度は、逆相ＨＰＬＣおよび質量分析によって測定する。
【０２５９】
９．１８．１  クラス１オリゴマー：非加水分解性
非加水分解性オリゴマー（クラス１）を用いる３０種以上の結合体を合成した。このクラスの結合体の場合、投与される医薬物質はレセプターとして作用する物質である。換言すれば、オリゴマーおよびそのペプチドへの結合は投与時点からクリアランス時点まで一体性を保有した。ペプチドマッピング実験はｈＢＮＰのオリゴマーが結合する部位を明らかにした。反応に添加されるオリゴマーの量を変えることによって、生成物分布を示すことができる。見出された優勢モノ結合体は、Ｌｙｓ３で結合していた；この優勢結合体はＬｙｓ３およびＬｙｓ４で結合しているオリゴマーを含有していた。反応条件を変更することによって、トリ結合体および／またはテトラ結合体を独占的生成物として形成することができた。トリ結合体は、オリゴマーがＬｙｓ３、Ｌｙｓ１４およびＬｙｓ２７で結合していることを特徴としていた。テトラ結合体はＮ−末端に四つ目の結合を付加していた。最初に、利用できる全部のモノ−、ジ−、トリ−およびテトラ−結合体をインビトロ活性試験用に単離した。この活性データに基づき、クラス１オリゴマーを用いた場合、Ｌｙｓ３モノ結合体を目標にした。
【０２６０】
９．１８．２  クラス２オリゴマー：ミクロペジル化
Ｌｙｓ１４およびＬｙｓ２７がＢＮＰの結合タンパク質に存在しており（またはＢＮＰの結合タンパク質に隣接しており）、これらの部位のミクロペグ（micropeg）結合体は当該ペプチドをさらに充分に結合させることができ、また活性を依然として保有することから、ミクロペジル化オリゴマー（クラス２）を用いる８種の結合体を理論に基づき合成した。両親媒性オリゴマーは消化器官を一体のまま通過し、十二指腸上部における吸収を強化する。循環系に入ると、アルキル部分が分離される。従って、レセプターに到達する時点で、より小さいオリゴマーが循環するペプチドに結合される。このクラスのトリ−およびテトラ−結合体を、アルキル基の分離前および分離後の両方で合成した。アルキル基が分離された後でさえも、これらの結合体は治療的に有意な程度の活性を保有していたが、３個または４個の部位でＢＮＰに結合している小さいＰＥＧ単位を活性について測定した（データは次項に示されている）。
【０２６１】
９．１８．３  クラス３オリゴマー：加水分解性オリゴマー
充分に加水分解性であるオリゴマー（クラス３）を用いる８種の結合体を合成した。このクラスの結合体の場合、これらの結合体は消化器官を一体のまま通過した。結合体が吸収されると、オリゴマーが分離され、天然ペプチドが循環系に放出される。第二クラスと同様に、これらの結合体は、結合に必要である領域内で結合が生じる場合、有用である。しかしながら、ミクロペジル化結合体が依然として、活性ではない状況では、この第三クラスの結合体は、オリゴマーがレセプター結合を干渉する可能性を有することは完全に明白である。モノ−、ジ−、トリ−およびテトラ−結合体をこのクラスのオリゴマーから製造した。トリおよびテトラ結合体の活性は低かった。２種の結合体を試験した。
【０２６２】
反応混合物は、イソプロパノール／水（０．１％テトラフルオロ酢酸）からなる溶剤勾配系を用いる調整用ＨＰＬＣ（Ｃ１８）で精製した。溶剤を蒸発させ、次いで凍結乾燥させ、乾燥粉末状の結合体を得た。これらの結合体の純度は逆相ＨＰＬＣおよび質量分析により測定した。
【０２６３】
天然ＢＮＰを、天然の野生型ｈＢＮＰペプチドの活性測定値を得るために分析試験した。使用された天然ｈＢＮＰペプチドは、１−３２アミノ酸配列を有していた：ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＫＶＬＲＲＨ（配列番号：    ）。この配列において、Ｃ10とＣ26とはジスルフィド結合により結合し、結合を形成している。２９種の構築物の構造および結果を表１に示す。ＢＮＰ結合体はＥＣ５０およびＥｍａｘについて評価し、これらの数値を天然ペプチドについて同一実験条件下に得た数値と比較した。オリゴマー部分を有していない天然ＢＮＰ（１−３２ａａ）に対する比較として、これらのデータを表１に示す。これらの結果は、クラス１修飾部分Ｌｙｓ３を含有するモノ結合体ＢＮＰ（ＢＮＰ−００２）およびＬｙｓ１４またはＬｙｓ２７にクラス２修飾部分を有するモノ結合体ＢＮＰが好適であることを指摘している。
【０２６４】
モノ−１、モノ−２、モノ−３およびモノ−４は、ＢＮＰのモノ結合体であり、これらがＨＰＬＣで溶出される順序で標識されている。下記表において、モノ−１  ＢＮＰは、Ｌｙｓ−３ＢＮＰ残基に指定の修飾部分（オリゴマー構造）を含有するＢＮＰペプチド結合体である。モノ−２およびモノ−３はＨＰＬＣで一緒に溶出され、Ｌｙｓ−１４とＬｙｓ−２７との混合物である。ジ結合体は一般に、ＨＰＬＣで密接に一緒になって溶出される混合物として得られる。主要ジ結合体は、Ｌｙｓ３／Ｌｙｓ１４およびＬｙｓ３／Ｌｙｓ２７である。優勢トリ結合体はＬｙｓ３、Ｌｙｓ１４およびＬｙｓ２７で結合されている。「モノ−４」として特定されている生成物はＢＮＰペプチドのＮ−末端に修飾部分（オリゴマー）を含有する。「モノ−１」は、ＢＮＰペプチドのＬｙｓ３に結合されている修飾部分を含有する。「モノ−２」生成物は、ＢＮＰペプチドのＬｙｓ１４またはＢＮＰペプチドのＬｙｓ２７に結合されている修飾部分（オリゴマー）を含有する。
【０２６５】
2006515579.tif 000064
【０２６６】
2006515579.tif 000065
【０２６７】
2006515579.tif 000066
【０２６８】
９．１９  ナトリウム排泄増加性ペプチド候補−ウロジラチン(Urodilatin)、デンドロアスピス（Dendroaspis）ナトリウム排泄増加性ペプチド（ＤＮＰ）、およびイヌナトリウム排泄増加性ペプチド
保有されている薬理学的活性、強化された細胞膜透過性、および／またはタンパク質分解耐性を備えたいずれか多くの種々の生体活性ナトリウム排泄増加性ペプチド結合体を構築するために、本発明による結合技術は、かなり多くの相違するナトリウム排泄増加性ペプチドおよびこれらのペプチドの類縁体とともに使用することができるものと予測される。本明細書の数種の例に記載のｈＢＮＰに加えて、これらの候補ペプチドは、リストの一部として、ペプチド、ペプチド断片および完全ペプチドを包含し、また複数−構築物を生物的に均等なペプチド／タンパク質の下記組合せから製造し、および／または単離した。態様で製造された構築物およびその同類置換構築物は本発明の範囲内に包含され、また充血性心不全の処置について本明細書に定義されているとおりに少なくとも１個の修飾部分を用いて結合されている、これらの構築物を含有する医薬組成物は本発明の範囲内に包含される。これらのペプチドは修飾性結合部分に従う構造を有する。
【０２６９】
１．  ウロジラチン（Ｎ−末端に４つ目の追加の残基を有するｈＢＮＰ）
ＴＡＰＲＳＬＲＲＳＳＣＦＧＧＲＭＤＲＩＧＡＱＳＧＬＧＣＮＳＦＸ1Ｙ（配列番号：    ）
アミノ酸Ｔは修飾部分結合部位を表わす。上記配列において、Ｘ1はリジンであるか、またはアルギニン以外のアミノ酸である。Ｘ1がリジンである場合、第二の修飾部分結合部位が付与される。
【０２７０】
２．  イヌナトリウム排泄増加性ペプチド（イヌＮＰ）
イヌＢＮＰはしばしば、結合体の製造において天然の利点を提供する。そのループ領域には、結合部位は存在しない。結合部位はＮ−およびＣ−末端テイルに存在する。これらの特徴は活性を実質的に失うことなく結合を可能にする。これはまた、生成物のより少ない分布を導き、より高い収率およびより容易な精製をもたらす。
ＳＰＸ1ＭＭＨＸ2ＧＧＣＦＧＲＲＬＤＲＩＧＳＬＳＧＬＧＣＮＶＬＲＸ3Ｙ（配列番号：    ）
Ｘ1、Ｘ2およびＸ3のアミノ酸部位は修飾部分結合部位を提供する。この中性ペプチドにおいて、ペプチドの３個の部位全部を修飾部分との結合に利用することができる。そのループ領域はアミノ酸１０（Ｃ）〜アミノ酸２６（Ｃ）に特定される。位置３、１４または２７に存在するアミノ酸のいずれか２個または３個はＬｙｓ以外、例えばＡｒｇにより置換することができる。
【０２７１】
３．  デンドロアスピスナトリウム排泄増加性ペプチド（ＤＮＰ）
ＥＶＸ1ＹＤＰＣＦＧＨＸ2ＩＤＲＩＮＨＶＳＮＬＧＣＰＳＬＲＤＰＲＰＮＡＰＳＴＳＡ（配列番号：    ）
Ｘ1およびＸ2のアミノ酸部位は修飾部分結合部位である。この例において、Ｘ1およびＸ2は両方ともに、アミノ酸Ｌｙｓである。或る態様において、Ｘ1はＡｒｇであり、およびＸ2はＡｒｇである。そのＮ−末端はまた、結合部位である。好ましくは、Ｘ1がリジンである場合、Ｘ2はアルギニン（またはリジン以外）である。場合により、このペプチドはＮ−末端に追加の結合部位を有する。
【０２７２】
４．  Ｃ−タイプナトリウム排泄増加性ペプチド（ＣＮＰ）
ＧＬＳＫ1ＧＣＦＧＬＫ2ＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号：    ）
Ｋ1およびＫ2のアミノ酸部位は修飾部分結合部位である。この例において、Ｋ1およびＫ2は両方ともに、アミノ酸Ｌｙｓである。しかしながら、このペプチドの類縁体は、ペプチドのこれらの位置のどちらか、または両方に追加の結合部位を含有することができる。場合により、このペプチドはＮ−末端に追加の結合部位を有することができる。
【０２７３】
５．  ＡＮＰ（ヒト）（ラット）（ブタ）
ＳＬＲＲＳＳＣＦＧＧＲＸＤＲＩＧＡＱＳＧＬＧＣＮＳＦＲＹ（配列番号：    ）
この例において、ＸはＭｅｔ（Ｍ）またはＩｌｅ（Ｌ）であり、この場合、修飾部分結合部位はＮ−末端に存在し、またはＲをＫにより置き換え、修飾部分部位を付与することができる。
【０２７４】
９．２０  ヒトナトリウム排泄増加性ペプチドレセプターＡ（ＮＰＲ−Ａ）におけるアゴニスト活性
ＢＮＰの血管弛緩性、ナトリウム排泄増加性および利尿性物性は、二次メッセンジャー、環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）に帰因する。ｃＧＭＰの製造は、ＢＮＰが内皮細胞の表面上でナトリウム排泄増加性ペプチドレセプターＡ（ＮＰＲ−Ａ）に結合する場合に活性化される酵素であるグアニレートシクラーゼによって達成される。非加水分解性（クラス１）オリゴマーまたはミクロペジル化（クラス２）オリゴマーのどちらかと結合している結合体のナトリウム排泄増加性ペプチドレセプターＡ（ＮＰＲ−Ａ）を発現するヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）の産生を刺激する能力を評価した。ミクロペジル化クラスの場合、結合体はアルキル部分を結合させて、または結合させずに試験した。充分に加水分解性のオリゴマー（クラス３）との結合体はこの分析では試験しなかった。この理由は、最終的に循環系に放出される化合物が天然ペプチドであることにある。
【０２７５】
非加水分解性（クラス１）オリゴマーを用いるトリ−およびテトラ−結合体は、ほとんど活性を有していなかった。従って、ミクロペジル化（クラス１）オリゴマーを用いるトリ−およびテトラ−結合体を製造し、また試験した。これらのクラス２オリゴマーから得られたインビトロデータを表２に示す。
【０２７６】
2006515579.tif 000067
【０２７７】
図３は、クラス１オリゴマーを用いる種々のＬｙｓ−３結合体にかかわる活性曲線を示している。表２中の４種の結合体は、天然形態のＢＮＰペプチドを用いて得られた活性（表３）に近似する平均Ｅmaxおよび平均ＥＣ50を示しており、従って別の分析法によりさらに評価した。
【０２７８】
2006515579.tif 000068
【０２７９】
一次ＨＡＥＣは、ｃＧＭＰスクリーニング用にＣｌｏｎｅｔｉｃｓから購入した。試験の前日に、細胞を１２ウエルプレート中に入れた。試験当日、細胞を０．５ｍＭ  ＩＢＭＸとともに３７℃で１０分間かけて予備インキュベートし、ホスホジエステラーゼ類を阻害した。３７℃においてさらに６０分間かけて、被験化合物を細胞に添加し、次いでインキュベーションを細胞溶解によって停止させ、ｃＧＭＰを測定した。ＥＬＩＳＡに基づくｃＧＭＰキットを使用し、ｃＧＭＰ産生を測定した（Ｃａｔｃｈ−Ｐｏｉｎｔ−ｃｙｃｌｉｃ  ＧＭＰ  Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｔ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、カタログ番号＃Ｒ８０７４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）。このキットは９６−ウエルホーマットにおける競合免疫検定法によりｃＧＭＰを測定するものである。細胞溶解物を被覆ミクロプレートに添加し、次いで抗−ｃＧＭＰ抗体およびホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＰＲ）−ｃＧＭＰ結合体を添加した。これらのプレートを室温で２時間にわたりインキュベートし、次いで４回、洗浄した。基質溶液を添加し、次いで各ウエルの蛍光強度を定量した。この蛍光シグナル強度は、ｃＧＭＰのレベルの増加に従い減少した。天然ｈＢＮＰを陽性対照として各試験で試験した。
【０２８０】
９．２１  ＢＮＰ結合体およびプロテアーゼに対する増大された活性
インビトロで活性であったナトリウム排泄増加性化合物を、種々のプロテアーゼ、例えばトリプシンおよびキモトリプシンの存在下におけるそれらの安定性について試験する。これらの化合物結合体のプロテアーゼに対する安定性は、トリプシンおよびキモトリプシンの存在下における化合物結合体の半減期によって評価することができる。すなわち、これらの分析で評価された数種の結合体は天然ｈＢＮＰよりも長い半減期を有していた。例えば、図４を参照することができる。
【０２８１】
結合体を、３７℃において２〜１２０分間、酵素とともにインキュベートした。１：１  １％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：イソプロパノール静止溶液の添加によって、消化を停止させた。ｈＢＮＰ結合体の消化を、各試験において、天然ｈＢＮＰの消化と比較した。各試料中に残留する本発明による化合物結合体の量をＨＰＬＣ分析法により定量した。
【０２８２】
９．２２  ＢＮＰ結合体および経口生体利用性
インビトロで活性であった結合体を、ラットにおいて、それらの経口生体利用性について試験した。結合体を経口栄養胃管により胃腸器官に投与し、次いで血流中のｈＢＮＰ結合体の存在を利用できる放射線免疫検定法を用いて評価した。ｈＢＮＰ検出用抗体は特異性であり、ラットとの交差反応性は１％よりも低い。従って、交差反応および内因性ｈＢＮＰによる干渉は見出されなかった。
【０２８３】
体重約２５０ｇの成熟した雄ラットをｈＢＮＰおよびｈＢＮＰ結合体の経口生体利用性の測定に使用した。ラットを一夜かけて絶食させ、次いで水道水を適時に与えた（ただし、投与前の２時間から投与後の１時間までは水を与えない）。
【０２８４】
投与前、ラットの体重を測定し、各投与群の体重がほぼ同一であるように、体重によって投与群全体を分配した。一経過時間に対し５匹のラットを使用した。結合体は液状脂肪酸組成物として２．５ｍｇ／ｋｇの投与量で投与した。投与後、５分、１５分、３０分および６０分の時点で、血液試料を採取した。全投与試験において、中心静脈血液を採取し、遠心処理した。血漿試料を分析用に−８０℃で凍結させた。
【０２８５】
ｈＢＮＰ結合体の血漿濃度を、血漿中ヒトＢＮＰの定量測定に特異的な市販免疫放射能分析（immunoradiometric assay）（ＩＲＭＡ）によって測定した（シオノリア（SHIONORIA）（登録商品名）ＢＮＰ、カタログ番号１２７０２４、Ｓｈｉｏｎｏｇｉ  ＆  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）。投与ラットから血液をＥＤＴＡ被覆プラスティックポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）採血管に採取し、次いで冷却（２〜８℃）遠心管において１６００〜２０００ｘｇで５分間かけて遠心処理した。試料は分析まで、無霜冷凍庫内で−８０℃においてプラスティック管に入れて保存した。試料５００μＬをＩＲＭＡ用に使用した。試料１００μＬを、125Ｉ−ＢＮＰ試薬２００μＬおよび１種の抗−ＢＮＰ抗体被覆ビーズとともに管に添加した。各管を渦巻き状に振盪し、次いで振盪することなく、２〜８℃において１８〜２２時間にわたりインキュベートした。これらの管を次いで、吸引し、洗浄溶液（緩衝溶液＋０．０５％ＮａＮ3）２．０ｍｌで洗浄し、次いで再吸引した。洗浄処理を反復し、次いで管の内容物を吸引した。各管の残留放射能をガンマ計数機により計測した。この放射能は試料中のｈＢＮＰまたはｈＢＮＰ結合体の濃度に直比例する。ｈＢＮＰ結合体の試料を正確に定量し、またｈＢＮＰ結合体と天然ＢＮＰとの間の抗体認識の差違を可能にするために、対応するｈＢＮＰ結合体について得られた標準曲線から濃度を測定した。
【０２８６】
ラットに投与された４種の結合体は、全部が投与後の５分の時点で循環系で測定可能であった（図５）。これら４種の結合体は、ＢＮＰ−００２、ＢＮ−０２１、ＢＮ−０２２およびＢＮ−０２４であった。
【０２８７】
９．２３  ペプチド構造体に対するジ結合体、モノ結合体およびトリ結合体ポリマー修飾の製造
本例は、選択されたマルチ−結合形態の生体活性ペプチドの生成における本発明の有用性を証明するために示されている。一例として、この説明はヒトナトリウム排泄増加性ペプチド、ｈＢＮＰのモノ−結合体、ジ−結合体およびトリ−結合体について記述する。
【０２８８】
ｈＢＮＰへの結合方法
ｈＢＮＰへの結合にかかわり使用された方法と同一の方法により、オリゴマーを結合させる。相違点の一つは、付加できる活性化オリゴマーがさらに多い点にある（１〜１０当量；好ましくは３〜５当量）。
【０２８９】
リジンを配列のテイルに存在させた。複数の結合部位は、プロテアーゼの存在下において、より大きい安定性を提供するものと推定される。ループ内に結合部位が欠けていると、ＮＰＲ−Ａ結合部分における結合に有利である。
【０２９０】
９．２４  ｈＢＮＰ両親媒性ポリマー結合体の合成
相違するサイズおよび化学組成を有する両親媒性オリゴマーを使用することによって、ペプチド結合体、例えばｈＢＮＰ結合体の吸収および分配物性を変更することができる。結合体スクリーニングを使用し、どの結合体が天然ペプチドの活性を保有するか、また酵素に対して増大した耐性を示すかについて測定した。特徴（例えば、レセプターにおけるアゴニスト活性、タンパク質分解に対する耐性、および経口生体利用性）の望ましい組合せを有する結合体は、さらに大規模のインビボ試験用の先導的候補になる。
【０２９１】
９．２４．１  ＢＮＰへの一般的結合方法
モノ結合ｈＢＮＰは、このペプチドのＬｙｓ３またはＬｙｓ１４、もしくはＬｙｓ２７またはＮ−末端部位を使用する。
方法Ｉ：モノ結合体の製造
ｈ−ＢＮＰ（１当量）をＤＭＳＯに溶解する（１ｍｌ／ｈ−ＢＮＰ３５ｍｇ）。活性化オリゴマー（１．１当量）を少量のＴＨＦに溶解し、次いでＤＭＳＯ中のｈ−ＢＮＰの溶液に添加した。反応はＨＰＬＣにより監視した。ＨＰＬＣ監視用試料は、反応混合物５０μＬを採取し、次いでこれを０．１％ＴＦＡ含有Ｈ2Ｏ  ５００μＬで稀釈することによって調製した。反応は４５分間かけて行った。反応混合物を直ちに精製しない場合、精製を行うことができるまで凍結させた。
【０２９２】
方法ＩＩ：複数結合体の製造
ｈ−ＢＮＰ（１当量）をＤＭＳＯに溶解する（１ｍｌ／ｈ−ＢＮＰ３５ｍｇ）。ｈ−ＢＮＰが溶解された時点で、ＴＥＡ（１２０当量）を添加し、この溶液を５分間、撹拌した。次いで、活性化オリゴマー（ジ結合体の場合は２．２当量、トリ結合体の場合は４当量、テトラ結合体の場合は５当量）を少量のＴＨＦに溶解し、次いでＤＭＳＯ中のｈ−ＢＮＰの溶液に添加した。反応はＨＰＬＣにより監視した。ＨＰＬＣ監視用試料は、反応混合物５０μＬを採取し、次いでこれを０．１％ＴＦＡ含有Ｈ2Ｏ  ５００μＬで稀釈することによって調製した。反応は４５分間かけて行った。反応混合物を直ちに精製しない場合、精製を行うことができるまで凍結させた。
ジ結合体ｈＢＮＰは、ｈＢＮＰの部位Ｌｙｓ３およびＬｙｓ１４、またはＬｙｓ３およびＬｙｓ２７を使用する。
トリ結合体ｈＢＮＰは、部位Ｌｙｓ３、Ｌｙｓ１４およびＬｙｓ２７を使用する。
【０２９３】
９．２５  ナトリウム排泄増加性化合物類縁体
本例は、本発明の実施に使用するための種々の形態を有する生体活性ＢＮＰ様ペプチドおよびそのペプチド断片を提供する本発明の有用性を証明するものである。これら種々の形態または類縁体は、対応する天然ペプチド／タンパク質からの天然産生アミノ酸の場所に１種または２種以上の変異アミノ酸が存在することを特徴とするものである。
【０２９４】
１．  ｈＢＮＰ−ループ領域単独の類縁体
ＣＦＧＲＸＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ−（配列番号：１）
ここで、ＸはＬｙｓ以外のアミノ酸であるか、またはＸはＡｒｇまたはＧｌｙである。
【０２９５】
２．  ｈＢＮＰ−３ＡｒｇまたはＬｙｓ以外のアミノ酸の類縁体
−ＳＰＲＭＶＱＧＳＧ−ＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ−Ｘ2−（配列番号：    ）
ここで、Ｘ2は１〜１０長さのアミノ酸、好ましくは１〜６長さのアミノ酸である。或る態様において、Ｘ2は、ＫＶＬＲＲＨ、ＫＶＬＲＲ、ＫＶＬＲ、ＫＶＬ、ＫＶ、Ｋ、ＲＶＬＲＲＨ、ＲＶＬＲＲ、ＲＶＬＲ、ＲＶＬ、ＲＶまたはＲである。
【０２９６】
３．  ｈＢＮＰ−３変異部位類縁体：３Ａｒｇ、１４Ａｒｇ、２７Ａｒｇ
ＳＰＸ1ＭＶＱＧＳＧ−ＣＦＧＲＸ2ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ−Ｘ3ＶＬＲＲＨ（配列番号：    ）
ここで、Ｘ1はＬｙｓであるか、またはＬｙｓ以外のアミノ酸であり、Ｘ2はＬｙｓ以外のアミノ酸であり、およびＸ3はＬｙｓであるか、またはＬｙｓ以外のアミノ酸である。或る態様において、Ｘ1、Ｘ2およびＸ3は独立して、ＡｒｇまたはＧｌｙである。別の態様において、Ｘ1はＬｙｓであり、Ｘ2およびＸ3は独立して、ＡｒｇまたはＧｌｙである。好適態様において、Ｘ1、Ｘ2およびＸ3の少なくとも一つはＬｙｓである。
【０２９７】
４．  ｈＢＮＰ−１４および２７Ａｒｇおよび末端修飾部位、Ｘ1の類縁体
Ｘ1ＳＰＫＭＶＱＧＳＧ−ＣＦＧＲＸ2ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ−Ｘ3ＶＬＲＲＨ−（配列番号：    ）
ここで、Ｘ1はＣ−末端修飾部位（Ｓｅｒ）であり、およびＸ2およびＸ3はＬｙｓ以外のアミノ酸である。或る態様において、Ｘ2およびＸ3は独立して、ＡｒｇまたはＧｌｙである。別の態様において、Ｘ2はＡｒｇであり、およびＸ3はＬｙｓである。
【０２９８】
５．  ｈＢＮＰ−１４Ａｒｇの類縁体
（全部が、そのテイルの一方または両方がループまで短縮されている）
Ｘ1−ＣＦＧＲＲＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ−Ｘ2（配列番号：    ）
ここで、Ｘ1は１〜１０長さのアミノ酸、好ましくは１〜９長さのアミノ酸であり、およびＸ2は１〜１０長さのアミノ酸、好ましくは１〜６長さのアミノ酸でる。Ｘ1は、ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣ、ＰＫＭＶＱＧＳＧＣ、ＫＭＶＱＧＳＧＣ、ＭＶＱＧＳＧＣ、ＶＱＧＳＧＣ、ＱＧＳＧＣ、ＧＳＧＣ、ＳＧＣ、ＧＣ、Ｃ、ＳＰＫ、ＳＰＫＭ、ＳＰＫＭＶ、ＳＰＫＭＶＱ、ＳＰＫＭＶＱ、ＫＭＶＱ、ＫＭＶ、ＫＭＶＱＧ、ＫＭＶＱＧＳ、ＫＭＶＱＧＳＧまたはＫＭＶＱＧＳＧＣを包含することができる。Ｘ2はＫＶＬＲＲＨ、ＫＶＬＲＲ、ＫＶＬＲ、ＫＶＬ、ＫＶ、Ｋ、ＲＶＬＲＲＨ、ＲＶＬＲＲ、ＲＶＬＲ、ＲＶＬ、ＲＶまたはＲを包含することができる。
【０２９９】
６．  ｈＢＮＰ１−２９−３ＡｒｇまたはＬｙｓ以外のアミノ酸の類縁体
ＳＰＸ1ＭＶＱＧＳＧ−ＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ−ＫＶＬ（配列番号：    ）
ここで、Ｘ1はＡｒｇであるか、またはＬｙｓ以外のもう一種のアミノ酸である。
【０３００】
７．  ｈＢＮＰ１−２６−３ＡｒｇまたはＬｙｓ以外のアミノ酸の類縁体
ＳＰＸ1ＭＶＱＧＳＧ−ＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ（配列番号：    ）
ここで、Ｘ1はＡｒｇまたはＧｌｙであるか、またはＬｙｓ以外のもう一種のアミノ酸である。
【０３０１】
８．  ｈＢＮＰ短縮Ｃ−末端テイルＬｙｓ１４Ａｒｇ、２７Ａｒｇ、またはＬｙｓ以外のアミノ酸の類縁体
Ｘ1−ＣＦＧＲＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ−ＲＶＬＲＲＨ（配列番号：    ）
ここで、Ｘ1は１〜１０長さのアミノ酸、好ましくは１〜９長さのアミノ酸である。Ｘ1は、ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣ、ＰＫＭＶＱＧＳＧＣ、ＫＭＶＱＧＳＧＣ、ＭＶＱＧＳＧＣ、ＶＱＧＳＧＣ、ＱＧＳＧＣ、ＧＳＧＣ、ＳＧＣ、ＧＣまたはＣを包含することができる。
【０３０２】
９．  ｈＢＮＰ−Ｌｙｓ１４ＡｒｇまたはＬｙｓ以外のアミノ酸の類縁体
−ＣＦＧＲＸ1ＭＤＲＩＸ2ＧＬＧＣ−（配列番号：    ）
ここで、Ｘ1はＡｒｇであるか、またはＬｙｓ以外のアミノ酸であり、およびＸ2は１〜４アミノ酸である。或る態様において、Ｘ2は、ＳＳＳＳ、ＳＳＳ、ＳＳ、Ｓ、ＫＳＳＳ、ＫＳＳまたはＫＳである。
【０３０３】
１０．  ｈＢＮＰ−Ｌｙｓ３０Ａｒｇまたは同様の電荷を有する別の同等のアミノ酸の類縁体
ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＸ1ＲＨ（配列番号：    ）
ここで、Ｘ1はＡｒｇであるか、またはＬｙｓ以外のアミノ酸である。
【０３０４】
１１．  ｈＢＮＰ−２７ＡｒｇまたはＬｙｓ以外のアミノ酸の類縁体
ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＸ1ＶＬＲＲＨ（配列番号：    ）
ここで、Ｘ1はＬｙｓであるか、またはＡｒｇ以外のアミノ酸である。
【０３０５】
１２．  ｈＢＮＰの延長形態
−ＳＰＫＭＶＱＧＳＧ−ＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ−ＫＶＬＲＲＨ−Ｘ2（配列番号：    ）
ここで、Ｘ2は、Ｌｙｓ、ＣｙｓまたはＬｙｓ＋Ｘａａnであり、ここでｎは１〜１００、１〜５０または１〜１０であり、およびＸａａは、独立して選択されるいずれかのアミノ酸または一群のアミノ酸であるか、または未知のアミノ酸である。
【０３０６】
１３．  欠失変異ｈＢＮＰ類縁体
−ＣＦＧＲＸ1ＭＤＲＩＸ2ＧＬＧＣ−（配列番号：    ）
ここで、Ｘ1はＡｒｇであるか、またはＬｙｓ以外のアミノ酸であり、およびＸ2は１〜４アミノ酸、例えばＳＳＳＳ、ＳＳＳ、ＳＳ、Ｓ、ＫＳＳＳ、ＫＳＳまたはＫＳである。
【０３０７】
１４．  ｈＢＮＰ類縁体−レセプター特異性
ＳＰＺ1ＭＶＱＧＳＧ−ＣＦＧＲＺ2ＭＤＲＩＳＳＳＳＸ1Ｘ2Ｘ3Ｃ
ここで、Ｚ1はアルギニンであるか、またはリジン以外のアミノ酸であり、およびＺ2はアルギニンであるか、またはリジン以外のアミノ酸であり、Ｘ1はＧｌｙ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅまたはその同類置換基であり、Ｘ2はＧｌｙ、Ａｒｇまたはその同類置換基であり、およびＸ3はＧｌｙ、Ａｒｇまたはその同類置換基である。この類縁体の別の態様において、Ｚ1はリジンであり、およびＺ2はアルキルニンであるか、またはＬｙｓ以外のアミノ酸である。
【０３０８】
１５．  ＡＮＰ類縁体
ＫＣＦＫＧＫＮＤＲＸ1ＫＸ2ＱＳＧＬＸ3Ｃ−ＮＳＦＫＹ
ここで、Ｘ1はＴ、ａ、Ｒ、Ｈ、Ｐ、Ｅであり；Ｘ2はＫ、Ｎ−メチル、Ａｒｇ、Ｓ、ＤまたはＰであり；Ｘ3はＡｒｇ、Ｋ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｐ、Ｏｒｍ、Ｈａｒ、Ｈａｒ、ｐ−アミジノフェニルＡｌａ、Ｉ、Ｇｌｙ以外の陽電荷を有するいずれか別のアミノ酸、またはＴｒｙである。
【０３０９】
９．２６  天然ＢＮＰおよびＢＮＰプロ−ペプチドの組換え製造およびＢＮＰ結合体製造に対するプロペプチド手段
経口投与経路には大量のＢＮＰペプチドの供給が必要である。ＢＮＰを供給するための合成手段に随伴する高価格および供給量の限界によって、結合されたＢＮＰペプチドの製造には、組換え技術が好適であると思われる。結合体製造用のペプチドを供給するための組換え技術をここで説明する。
【０３１０】
９．２６．１  組換え技術の選択
グリコシル化していない小型タンパク質（＞１０，０００Ｋ）を発現することが知られており、また容易に単離できる可溶性形態を有する高発現組換え技術を目標として選択する。
【０３１１】
承認されている医薬ナトレコル（登録商品名）用のバルク（bulk）ＢＮＰの製造に、Ｅ−コリ（E-coli）を基礎材料とする発現系（Ｓｅｉｌｈａｍｅｒ等による米国特許５，１１４，９２３を引用してここに組入れる）を使用する。Ｅ−コリ細菌系の使用は周知であり、過去数十年の単鎖タンパク質の組換え製造に工業界でよく利用されている。このＥ−コリ系は一般に、実験室使用用の単純な系である。かなりの新しいＥ−コリ系が高い細胞密度をもって開発されており、高収率のタンパク質発現が得られている。しかしながら、一般に、その不溶性形態でタンパク質を封入体（inclusion body）中に分泌する傾向を有し、また不適当に折り重なる傾向（システインアミノ酸残基間の不適当なジスルフィド結合）を有することから、Ｅ−コリ系の使用には制限があった。これらの制限はしばしば、高価な商品を導き、封入体からのタンパク質の単離に、高価な下流プロセッシング（down stream processing）工程を行わなければならず、また不適当に折り重ねられたタンパク質をその天然状態に再生しなければならない。
【０３１２】
９．２７  プロ−タンパク質（ｐｒｏ−ＢＮＰ）配列の構築
ナトリウム排泄増加性化合物はまた、２個または３個以上のナトリウム排泄増加性化合物単位を順に有し、また任意に、ナトリウム排泄増加性化合物単位間にスペーサー配列を有するマルチ−ペプチドであることができ、その構築はまた、ナトリウム排泄増加性化合物のどちらかの末端または両末端にリーダー配列および／またはエクステンション配列を有することができる。一例として、このマルチペプチドをいずれか特定の構築に制限するものではないが、マルチペプチドは下記構造を有することができる：
【０３１３】
ＮＰ−［ＮＰ］n；
ＮＰ−［スペーサー−ＮＰ］n；
リーダー−ＮＰ−［ＮＰ］n；
リーダー−ＮＰ−［スペーサー−ＮＰ］n；
リーダー−［スペーサー−ＮＰ］n；
リーダー−［スペーサー−ＮＰ］n−エクステンション；
リーダー−ＮＰ−［スペーサー−ＮＰ］n−エクステンション；
【０３１４】
ｎは、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０であることができ；ＮＰはナトリウム排泄増加性ペプチドまたはナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体であり；
スペーサーは、例えばＮＰ中に存在しない酵素分解部位であることができる（例えば、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ）；
【０３１５】
リーダーは、例えば１個のアミノ酸、アミノ酸配列、ペプチド（例えば、リーダーペプチドまたはシグナルペプチド）、またはタンパク質であることができ、またリーダーは結合からＮ−末端をブロックし、マルチペプチドの精製を補助し（例えば、酵素カクテル：Ｖ８プロテアーゼ（エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃ）により分解可能な（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−）、溶解を改善し、および／または細胞からの排出を補助する（例えば、Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ）ように選択される；リーダーは好ましくは、酵素分解または化学分解によってマルチペプチドから分離することができるものである。
【０３１６】
エクステンションは、例えば１個のアミノ酸、アミノ酸配列、ペプチド（例えば、リーダーペプチドまたはシグナルペプチド）、またはタンパク質であることができ、またエクステンションは結合からＣ−末端をブロックし、マルチペプチドの精製を補助し（例えば、（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−）、溶解を改善し、および／または細胞からの排出を補助する（例えば、酵素カクテル：Ｖ８プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ）およびエンドプロテイナーゼ（Ａｓｐ−Ｎ）により分解可能なＡｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ）ように選択される；エクステンションは好ましくは、酵素分解または化学分解によってマルチペプチドから分離することができるものである。
【０３１７】
もう一つの例において、酵素分解部位、好ましくはＮＰに存在しない酵素分解部位（例えば、Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ）である。この構築物中のリーダーはまた、細胞にＢＮＰを排出させるシグナルペプチド、例えばＡｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕであることができる。マルチペプチドの精製を補助するものと考えられる構築に使用することができる「エクステンション」（例えば、（Ｈｉｓ）６−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ）をまた、含有することができる。ペプチド結合体の分解に使用することができる酵素は、Ｖ８プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ）である。生成する生成物はＮＰ−Ｇｌｕである。
【０３１８】
本発明はまた、プロ−Ｘ−ポリペプチドを提供し、ここでＸはナトリウム排泄増加性ペプチドである。ＢＮＰ用のプロ−Ｘ−ペプチドは、プロ部分として、また酵素分解部位によりＢＮＰ配列に結合させることができるリーダーペプチドを担持するようにデザインすることができる。遺伝子配列は、選択された組換え技術においてペプチドの発現をプロ−ＢＮＰペプチドとしてコードするようにデザインすることができる。このプロ−部分はまた、発酵スキームからのさらに効果的な精製の目的で選択することもできる。プロ−ＢＮＰペプチドは、発現後にオリゴマーと結合させることができ、次いでこのプロ−部分を選択された酵素により分解することができ、移動性にすることができ、または不動化することができ、これにより慣用のクロマトグラフイ法により高収率でさらに容易に精製することができるＢＮＰ結合体を得ることができる。特定の酵素分解部位は、プロ部分とＢＮＰ配列との間に包含させる。このようにすると、プロ部分を酵素により分解することができ、ＢＮＰ配列を得ることができる。
【０３１９】
プロ−ＢＮＰモデル合成
プロ−ＢＮＰ構築をＢＮＰ配列および追加の特別のアミノ酸を有する合成プロ−ＢＮＰモデルで評価する。この合成モデルはオリゴマーを結合させ、次いで特異的酵素による分解に付し、ＢＮＰ−オリゴマー結合体の製造を追跡するものである。
【０３２０】
プロ−ＢＮＰのデザイン
リーダー配列［プロ部分（promoiety）］は、合成モデルに基づく特異的酵素分解配列を有する小型ペプチドを包含することができる。別の官能性アミノ酸配列をまた、リーダー／スペーサー配列に挿入することができ、これによりプロ−ＢＮＰタンパク質の精製を容易にすることができる。リーダー配列はまた、結合期間中の望ましくない修飾からＮ−末端を保護するプロ部分として作用することができ、また特異的酵素処理で分解させることができる。別の特徴をまた、リーダーペプチド配列に組入れることができ、これによりプロ−ＢＮＰとしての、またはプロ−ＢＮＰオリゴマー結合体としての単離を容易にすることができる。リーダーペプチドはまた、ＢＮＰ配列のＣ−末端に付加することもできる。リーダーペプチドはまた、公知融合タンパク質の付加を可能にするようにデザインすることができる。
【０３２１】
プロ−ＢＮＰ用の発現系の構築および組換え体発現
プロ−ＢＮＰ発現
機能的に特異的なリーダー配列は、選択された組換え技術の発現遺伝子配列または発現カセット中に挿入するためのＢＮＰのＮ−末端または／およびＣ−末端に付与される。構築物の一つにおいて、既知融合タンパク質の発現配列（Ｇａｋｅｎ等）をまた、発現遺伝子中に挿入することができる。確立された方法に従い、細胞で発現された遺伝子の充分の形質転換を監視することができる。正の形質転換（positive transgenic）された単離体を単離し、次いでデザインされたタンパク質の発現を評価するために増殖させることができる。発現されたタンパク質は精製することができ、次いで配列決定することができる。精製されたプロ−ＢＮＰ構築物を次いで、評価することができる。選択された細胞系の特徴を確定し、将来の選択用途に選択することができる。
【０３２２】
９．２８  プロ−マルチペプチドの製造
トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼ−Ｂ分解スペーサーおよびＨｉｓタッグ付きリーダーペプチドを備えたプロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１の構築
完全長さのプロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１のコード配列は、次式に従い得ることができる：
リーダー−ＮＰ−［スペーサー−ＮＰ］n
ここで、スペーサーは、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇであり；
リーダーは、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇであり；
エクステンションは、（Ｈｉｓ）6−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇであり；
ＮＰは、ｈＢＮＰである。
この態様において、ＮＰはトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢ酵素カクテルを用いて放出させることができる。
【０３２３】
（ａ）プラスミド構築
標準的分子生物学的技術を使用し、プロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１のアミノ酸配列［（Ｈｉｓ）6−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ．］−ＢＮＰ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−ＢＮＰ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−ＢＮＰ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−ＢＮＰ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−ＢＮＰ］発現用プラスミドを構築する。このプラスミドは使用されるホスト細胞（例えば、Ｅ−コリ）用に最適化されたコドン(Codon)である。このマルチペプチド配列をコードするＤＮＡ断片を、ホストリーダー配列から出発して合成的に組立て、次いでその分解部位をＢＮＰ配列のＨｉｓタグの３′／５′の順序で付加する。この配列のｃＤＮＡをポリアクリルアミドゲルから標準的技術により精製する。このプラスミド構造は制限酵素分析により確認する。
【０３２４】
（ｂ）発現および細胞採集
プロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１を発現するＥ−コリ細胞をプロ−ペンタペプチド生成に充分な栄養物質とともに培養する。（Ｈｉｓ）6タグ  プロ−ペンタＢＮＰを細胞破裂、引続く遠心分離、接面濾過（tangential filtration）／限外濾過、均質化および封入体の可溶化により細胞から収集する。
【０３２５】
（ｃ）可溶化封入体からアフィニティクロマトグラフイによるプロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１の単離
ＨｉＴｒｐキレート形成性（Ｎｉ2+）ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用意し、このカラムを１０カラム容量の蒸留水で洗浄し、保存溶液を除去し、金属イオン溶液（ＮｉＳＯ4、０．１Ｍ）を充填し、次いで蒸留水で洗浄し、未結合物を除去する。封入体可溶化後の濾過溶液を、このカラムに添加し、次いでこのカラムを１０カラム容量のビディング緩衝液（biding buffer）（２０ｍＭホスフェート緩衝液、ｐＨ７．４、０．５Ｍ塩化ナトリウムおよび２０ｍＭイミダゾール含有）で洗浄する。溶出緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、０．５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．５Ｍイミダゾール含有）を使用し、カラムを溶出し、次いで追加の２カラム容量の１００％溶出緩衝液により溶出する。この方法は、カラムのＮｉ2+親和性に対するキレート化により、（Ｈｉｓ）6タグペンタペプチドを細胞回収試料からの別の成分から精製する。このペンタペプチドの純度は、ＲＰ−ＨＰＬＣ法により＞３０％であることが分析される。
【０３２６】
（ｄ）精製および分析
このペンタペプチドを次いで、Ｃ−１８調整用ＨＰＬＣにより＞７５％まで精製する。精製されたペンタペプチドをＥＳ／ＭＳ分析法により分析し、プロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１の予想分子量（ＭＷ）にかかわるＭ＋１イオンピークを得る。この物質のミクロ配列決定を使用し、当該マルチペプチドのアミノ酸配列を確認する。
【０３２７】
９．２９  プロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１からのＬｙｓ−３ＢＮＰ結合体の複数単位の製造
（ａ）ペンタペプチドの結合
プロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１（３．２０ｘ１０−４ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ  ５ｍｌに溶解する。この溶液に、トリエチルアミン４５μＬを添加する。この溶液を５分間にわたり撹拌し、次いでエタノール中の活性化ＰＥＧ７−ヘキシルオリゴマー（１９．６ｘ１０−４ｍｍｏｌ）を添加する。ＨＰＬＣ分析がプロ−ペンタペプチドの消費を示すまで反応を進行させ、次いでこの反応を５０％水性酢酸溶液０．５ｍｌの添加により停止させる。この反応混合物を次いで、処理し、次いで１００ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）中に交換する。この混合物の主要成分は、各ＢＮＰ単位のＬｙｓ３で結合されたマルチペプチドであると予想される。
【０３２８】
（ｂ）オリゴマー結合プロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１の結合されたＢＮＰ単位への酵素カクテル分解
一定量の例２（ａ）からの生成混合物のトリス−ＨＣｌ溶液をＨＰＬＣにより分析し、その中のポリペプチド濃度を測定する。トリプシン（ＴＰＣＫ処理されている；ウシ膵臓から）の溶液を１００ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）中で調製する。カルボキシペプチダーゼＢ（ウシ膵臓から）の溶液を１００ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）中で調製する。
【０３２９】
粗製混合物（１ｍｏｌ当量）を次いで、トリプシン（１．３９ｘ１０-3ｍｏｌ当量）およびカルボキシペプチダーゼＢ（４．５６ｘ１０-4ｍｏｌ当量）と反応させる。３０分後、反応をアセトニトリル中の１％トリフルオロ酢酸により停止させる。この反応の生成混合物を処理し、次いでＨＰＬＣにより分析する。保持時間（対照標準の保持時間と比較する）および質量スペクトル分析を使用し、同定し、確認する。この反応の予想生成物は、Ｌｙｓ３ヘキシル−ＰＥＧ７−結合ＢＮＰ、Ｌｙｓ１４ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマー−結合ＢＮＰ、Ｌｙｓ２７ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマー−結合ＢＮＰ、ジ−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマー結合ＢＮＰ、デスＡｒｇ−Ｈｉｓ  ＢＮＰおよびデスＡｒｇ−Ｈｉｓヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマー結合（Ｌｙｓ３またはＬｙｓ１４またはＬｙｓ２７）ＢＮＰである。この混合物の主要成分は、Ｌｙｓ３−ヘキシル−ＰＥＧ７−結合ＢＮＰである。
【０３３０】
９．３０  粗製結合混合物からのプロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１結合体の精製
例２（ｂ）に記載の結合反応から得られる各主要成分を、逆相ＨＰＬＣを用いて単離する。カラム（直径１．０ｃｍ．ｘ長さ２５ｃｍ．）に、ポリペプチドおよびタンパク質の分割に有用であることが知られている市販Ｃ１８固定相を充填し、次いでＨＰＬＣ系と組合せる。この系を、７５％移動相Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸含有Ｈ2Ｏ）および２５％移動相Ｂ（０．１％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル）の混合物からなる溶出緩衝液により平衡化する。例２１（ａ）からの生成混合物のトリス−ＨＣｌ溶液をカラムに適用し、主要成分を分離し、次いでアセトニトリル成分のパーセンテージを２５％から５５％に増量する勾配溶出を用い溶出する。フラクションを集め、次いでＨＰＬＣにより分析し、その中の生成物を同定し、および純度を測定する。各生成物の共通フラクシヨンを集め、溶媒を回転蒸発により分離する。各生成物ピークを同定し、および純度をＨＰＬＣおよび質量スペクトル分析により決定する。予想生成物は、３マルチペプチドモノ結合体（各ＢＮＰ単位のＬｙｓ３またはＬｙｓ１４またはＬｙｓ２７のいずれかで結合）、３マルチペプチドジ結合体（Ｌｙｓ３およびＬｙｓ１４、またはＬｙｓ１４およびＬｙｓ２７、またはＬｙｓ２７およびＬｙｓ３で結合）、１マルチペプチドトリ結合体（Ｌｙｓ３、Ｌｙｓ１４およびＬｙｓ２７で結合）および１マルチペプチドテトラ結合体（リーダーペプチドのＮ−末端、Ｌｙｓ３、Ｌｙｓ１４およびＬｙｓ２７で結合）からなる。
【０３３１】
９．３１  単離されたプロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１の結合体の酵素カクテル分解からのＬｙｓ３−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマー結合ＢＮＰの製造
例３に記載の方法を用いて得られる結合体、モノ結合Ｌｙｓ３−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマープロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１を１００ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）に溶解させ、生成する溶液をＨＰＬＣにより分析し、その中のポリペプチド濃度を測定する。トリプシン（ＴＰＣＫ処理されている；ウシ膵臓から）の溶液を１００ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）中で調製する。カルボキシペプチダーゼＢ（ウシ膵臓から）の溶液を１００ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）中で調製する。粗製混合物（１ｍｏｌ当量）を次いで、トリプシン（１．３９ｘ１０−３ｍｏｌ当量）およびカルボキシペプチダーゼＢ（４．５６ｘ１０−４ｍｏｌ当量）と反応させる。３０分後、反応をアセトニトリル中の１％トリフルオロ酢酸により停止させる。生成物を処理し、次いでＨＰＬＣにより分析する。保持時間（対照標準の保持時間に対する）および質量スペクトル分析を使用し、同定し、確認する。この反応の予想生成物は、使用される各結合体にそれぞれ対応する。一例として、モノ結合Ｌｙｓ３−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマー−結合プロ−ペンタペプチドＢＮＰ−１は、Ｌｙｓ３−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマー−結合ＢＮＰおよびデスＡｒｇ−Ｈｉｓ  Ｌｙｓ３−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマー結合ＢＮＰである。
【０３３２】
引用文献
下記引用文献をそれらの全体をもってここに組入れる。
2006515579.tif 000069
【０３３３】
2006515579.tif 000070
【０３３４】
2006515579.tif 000071
【図面の簡単な説明】
【０３３５】
【図１】図１は、ＢＮＰの作用様相および調節様相を示す図解図である。
【図２】図２は、オリゴマー活性化および結合、引続く３列結合戦略を示す代表的スキームを示す図解図である。クラス１修飾部分は非加水分解性であり、クラス２修飾部分はミクロペジル化されており、およびクラス３修飾部分は充分に加水分解性である。
【図３】図３は、ｈＢＮＰまたはｈＢＮＰ結合体の濃度の関数としてＨＡＥＣ細胞の環状ＧＭＰ産生を示すグラフである（■＝天然；▲＝ＢＮ−００２；▼＝ＢＮ−０２１；◆＝ＢＮ−０２２；●＝ＢＮ−０２４）。
【図４】図４は、ＢＮＰおよびＢＮＰ結合体のトリプシン消化を示すグラフである（−●−＝経過時間（分）対％ＢＮＤＩ；・●・＝経過時間（分）対％ＢＮＤ２；▼＝経過時間（分）対％ＢＮＤ２；▼＝経過時間（分）対％ＢＮＤ３４ＤＩ；■＝経過時間（分）対％ＢＮＤ０３４Ｄ２）。
【図５】図５は、ラットに経口投与後の種々の経過時点におけるｈＢＮＰ結合体の血漿レベルを示すグラフである（■＝ＢＮ−００２、▲＝ＢＮ−０２１、◆＝ＢＮ−０２２、●＝ＢＮ−０２４）。
【図１】
2006515579.tif 000093
【図２】
2006515579.tif 000094
【図３】
2006515579.tif 000095
【図４】
2006515579.tif 000096
【図５】
2006515579.tif 000097
【国際調査報告】
2006515579.tif 000098
2006515579.tif 000099
2006515579.tif 000100
2006515579.tif 000101
2006515579.tif 000102
2006515579.tif 000103
2006515579.tif 000104
2006515579.tif 000105
2006515579.tif 000106