(57)【要約】ｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーおよび標準的な化学療法剤を含む併用処置レジメンによる、腫瘍の処置のための改善された治療方法が提供される。この併用処置レジメンは、化学療法による処置に感受性の癌を処置するための、ｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーアンチセンスを含む第１組成物および化学療法剤を含む第２組成物を含むキットを用いて、第１組成物および第２組成物が、該第１組成物の投与後少なくとも１日の時間間隔、および該第２組成物の投与後少なくとも数時間の時間間隔を開けて連続的に投与されるレジメンである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学療法による処置に感受性の癌を処置するためのキットであって、該キットは、ｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーアンチセンスを含む第１組成物および化学療法剤を含む第２組成物を含み、ここで、該第１組成物および該第２組成物は、該第１組成物の投与後少なくとも１日の時間間隔、および該第２組成物の投与後少なくとも数時間の時間間隔を空けて、連続的に投与される、キット。
【請求項２】
請求項１に記載のキットであって、ここで、前記ｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーアンチセンスが１２残基長〜２５残基長の間であり、そして配列番号１、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群より選択される配列を含む、キット。
【請求項３】
請求項１に記載のキットであって、ここで、前記アンチセンスオリゴマーが以下：
（ａ）実質的に無電荷の骨格；
（ｂ）５０℃より大きいＴｍにて高い親和性で標的ＲＮＡの相補的配列とハイブリダイズする能力；
（ｃ）ヌクレアーゼ耐性；および
（ｄ）細胞内への能動的または促進性の輸送のための能力
によって特徴付けられる、キット。
【請求項４】
請求項３に記載のキットであって、前記アンチセンスオリゴマーの骨格が、以下：
【化１】
2004537517.tif 000012
からなる群より選択される構造を有する、キット。
【請求項５】
前記化学療法剤が、シスプラチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、タキソール、ならびにこれらのアナログおよび誘導体からなる群より選択される、請求項１に記載のキット。
【請求項６】
前記ｃ−ｍｙｃに対するアンチセンスオリゴマーの投与が、前記化学療法剤の投与の少なくとも１日後に開始される、請求項１に記載のキット。
【請求項７】
前記化学療法剤の投与の少なくとも１日後に続く前記オリゴマーの組成物の投与が、治療サイクルを示し、該治療サイクルが複数回繰り返され、各サイクルが少なくとも１日間隔である、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
現在のところ化学療法によって処置されている患者における癌の処置のためのオリゴマーの組成物であって、該組成物が、ｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーアンチセンスを含み、ここで、該組成物が化学療法剤の投与の前後に投与される、組成物。
【請求項９】
請求項９に記載のオリゴマー組成物であって、該オリゴマー組成物が１２塩基長〜２５塩基長の間であり、そして配列番号１、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群より選択される配列を含む、オリゴマー組成物。
【請求項１０】
請求項８に記載のオリゴマーであって、該オリゴマーが、
（ａ）実質的に無電荷の骨格；
（ｂ）５０℃より大きいＴｍにて高い親和性で標的ＲＮＡの相補的配列とハイブリダイズする能力；
（ｃ）ヌクレアーゼ耐性；および
（ｄ）細胞内への能動的または促進性の輸送のための能力
によって特徴付けられる、オリゴマー。
【請求項１１】
請求項１０に記載のオリゴマー組成物であって、該オリゴマー組成物が、以下：
【化２】
2004537517.tif 000013
からなる群より選択される構造を有する、オリゴマー組成物。
【請求項１２】
化学療法による処置に感受性の癌の処置のための薬学的組成物の調製のための、ｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーアンチセンスおよびの化学療法剤の使用であって、ここで、該ｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーアンチセンスおよび該化学療法剤が、該化学療法剤の投与後数時間の時間間隔、および該オリゴマーアンチセンスの投与後少なくとも１日の時間間隔を空けて、連続的に投与される、使用。
【請求項１３】
請求項１２に記載の使用であって、ここで、前記ｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーアンチセンスが１２残基長〜２５残基長の間であり、そして配列番号１、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群より選択される配列を含む、使用。
【請求項１４】
請求項１２に記載の使用であって、ここで、前記アンチセンスオリゴマーが、
（ａ）実質的に無電荷の骨格；
（ｂ）５０℃より大きいＴｍにて高い親和性で標的ＲＮＡの相補的配列とハイブリダイズする能力；
（ｃ）ヌクレアーゼ耐性；および
（ｄ）細胞内への能動的または促進性の輸送のための能力
によって特徴付けられる、使用。
【請求項１５】
請求項１４に記載の使用であって、ここで、前記アンチセンスオリゴマーの骨格が、以下：
【化３】
2004537517.tif 000014
からなる群より選択される構造を有する、使用。
【請求項１６】
前記化学療法剤が、シスプラチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、タキソール、ならびにこれらのアナログおよび誘導体からなる群より選択される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１７】
前記ｃ−ｍｙｃに対するアンチセンスオリゴマーの投与が、前記化学療法剤の投与の少なくとも１日後に開始される、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記化学療法剤の投与の少なくとも１日後に続く、前記オリゴマーの組成物の投与が、治療サイクルを示し、該治療サイクルが複数回繰り返され、各サイクルが少なくとも１日間隔である、請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、伝統的な癌化学療法剤の投与と一緒に、ｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーアンチセンスを投与することによる、インビボでの癌の免疫療法のための方法に関する。
【０００２】
（参考文献）
【０００３】
【表１】
2004537517.tif 000002
2004537517.tif 000003
2004537517.tif 000004
。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
癌の発生は、複雑な複数段階プロセスであり、このプロセスは、細胞性プロトオンコジーン（プロトオンコジーンｃ−ｍｙｃを含む（Ｄｅｎｈａｒｄｔ，ＤＴ，１９９９；Ｐｅｎｄｅｒｇａｓｔ  ＧＣ，１９９９））の発現レベルの変化に関連している。ｃ−ｍｙｃは、細胞増殖、細胞分化、および細胞アポトーシスを調節し、このｃ−ｍｙｃの異常な発現は、多数のヒトの癌（肺癌、結腸直腸癌、乳癌、膀胱癌、白血病、肺癌などが挙げられる（Ｄａｎｇら、１９９９））に関連している。多数の癌における塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックスの核内ｃ−ｍｙｃのアップレギュレートされた発現または異常な発現に関連した報告書によって、多数のアプローチを使用したｃ−ｍｙｃ阻害効果を評価する前臨床的研究および臨床的研究が行われる。
【０００５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび抗体が、目的の標的タンパク質の合成を特に妨害し得ることが、実証されている。それらの疎水性に起因して、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リン脂質膜とよく相互作用し（Ａｋｈｔａｒら、１９９１）、そしてこのことは、細胞膜と相互作用した後、オリゴヌクレオチドが生存細胞中に活発的に輸送されることを示唆している（Ｌｏｋｅら、１９８９；Ｙａｋｕｂｏｖら、１９８９：Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９９）。
【０００６】
ホスホロチオエート骨格を有し、７つの癌関連遺伝子（ｐ５３、ｂｃｌ−２、ｃ−ｒａｆ、Ｈ−ｒａｓ、プロテインキナーゼＣα、およびプロテインキナーゼＡ）に対して指向されるアンチセンス化合物を試験するために、研究が行われている。副作用（一過性血小板減少症、疲労および発熱が挙げられる）が観察されており、これは、ホスホロチオエート骨格に起因する。さらに、標的遺伝子発現の阻害は、「せいぜい適度」であると決定され、決定的な臨床学的活性は、観察されていない（Ｙｕｅｎら、２０００）。
【０００７】
ｃ−ｍｙｃ翻訳開始部位に標的化されたホスホロチオエート（ＰＳＯ）およびＮ３’−Ｐ−５’ホスホラミデートアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたさらなる研究は、種々の腫瘍細胞型の増殖の阻害を報告している（Ｌｅｏｎｅｔｔｉら、１９９６；Ｓｍｉｔｈら、１９９８；およびＳｋｏｒｓｋｉら、１９９７）。これらの研究は、ｃ−ｍｙｃインヒビターが癌および再狭窄のような増殖性疾患を処置する際に臨床学的に有用であり得ることを示唆する。
【０００８】
ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）は、新規のアンチセンス構造型を示し、ここで、ホスホジエステル結合は、無電荷のホスホラミデート結合によって置き換えられ、そしてデオキシリボース糖は、モルホリン環によって置き換えられる（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎら、１９９７）。ＰＭＯは、種々のヌクレアーゼおよびプロテアーゼに対して耐性であり（Ｈｕｄｚｉａｋら、１９９６）、類遺伝子性ホスホジエステルＤＮＡよりも、ＲＮＡに対して高い親和性で結合し（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎら、１９９７）、かつ翻訳開始の立体化学的インヒビターとして作用する（Ｇｈｏｓｈら、１９９９）ことが、実証されている。
【０００９】
ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーは、正常なプレｍＲＮＡのスプライシングを阻害し、異常にスプライシングされたｍＲＮＡを産生することが示されている（Ｈｕｄｚｉａｋら、２０００）。ｃ−ｍｙｃに対するＰＭＯアンチセンスは、癌細胞におけるｃ−ｍｙｃ翻訳の配列特異的インヒビター（これは、ｃ−ｍｙｃタンパク質発現を減少させ、Ｇ０／Ｇ１の細胞周期を停止させる）であることが実証されており、癌治療における使用を提案されている（Ｈｕｄｚｉａｋら、２０００）。
【００１０】
癌処置のストラテジーにおける利点にもかかわらず、有効性の欠乏および／または現在使用されている化学療法剤の毒性に起因した有意な副作用が、依然として問題として残っている。薬物毒性は、生命に関わる状態を起こすほど激しくあり得、これは、副作用を中和するための薬物の投与を必要とし、かつ薬物毒性は、化学療法剤の減少および／または中断を引き起こし得、これは、患者の処置および／または生活の質に悪影響を及ぼし得る。
【００１１】
遺伝子療法ストラテジーが試みられており、そしてこれは、継続中の臨床試験の目的である。しかし、伝統的な化学療法と一致して、送達系の特異性の欠如およびこれらの送達系に起因する有毒な副作用が克服されて、そのようなストラテジーが臨床学的信頼性を有しなければならない。
【００１２】
従って、現在の治療的アプローチの欠陥に対応する、改善された癌処置レジメンの必要性が依然として残っている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
従って、本発明の１つの局面は、化学療法による処置に対して感受性の癌を処置するための改善方法を提供することであり、ここで、この改善は、処置レジメンに関し、この処置レジメンは、ｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーアンチセンスおよび化学療法剤を癌患者に投与する工程を包含し、ここで、ｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーアンチセンスおよび化学療法剤は、連続的かつ少なくとも１日間隔を空けて、投与され得る。
【００１４】
本発明の別の局面は、化学療法に対して感受性の癌を処置するための薬学的組成物の調製における、ｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーアンチセンスおよび化学療法剤の使用を提供することであり、ここでｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーアンチセンスおよび化学療法剤は、連続的かつ少なくとも１日間隔を空けて、投与され得る。
【００１５】
本発明の関連した局面は、現在化学療法によって処置されている患者における癌を処置するためのオリゴマー組成物を提供することであり、この組成物は、ｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーアンチセンスを含有し、ここで、この組成物は、化学療法剤を投与する前後に、投与される。
【００１６】
本発明のなお別の局面は、化学療法による処置に対して感受性の癌を処置するためのキットを提供することである。このようなキットは、第一の組成物および第二の組成物を備え、第一の組成物は、ｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーアンチセンスを含有し、第二の組成物は、化学療法剤を含有し、ここで、この第一の組成物および第二の組成物は、連続的かつ少なくとも１日間隔を空けて、投与され得る。
【００１７】
好ましくは、アンチセンスオリゴマーは、約１２塩基長〜２５塩基長を有し、そして、以下によって特徴付けられる：
（ａ）実質的に無電荷の骨格；
（ｂ）５０℃よりも高いＴｍにおいて高い親和性で標的ＲＮＡの相補的な配列とハイブリダイズする能力；
（ｃ）ヌクレアーゼ耐性；および、
（ｄ）能動的または促進的な細胞内への輸送能力。
【００１８】
好ましくは、アンチセンスオリゴマーは、ｃ−ｍｙｃについてのｍＲＮＡ翻訳開始コドンにまたがる配列、またはｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡのスプライスアクセプター領域に標的される。本発明を実施する際に使用するための好ましいｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマー配列の例としては、配列番号１、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１として表わされる配列を含むオリゴマーが挙げられる。
【００１９】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の詳細な説明が添付の図面および実施例とともに読まれた場合に、より完全に明らかになる。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
以下の用語は、本明細書中において使用される場合、他に示されない限り、以下の意味を有する：
本明細書中において使用される場合、用語「化合物」、「薬剤」、「オリゴマー」および「オリゴヌクレオチド」は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに対して、交換可能に使用され得る。同様に、用語「化合物」および「薬剤」は、本発明を実施する際に使用するための化学療法化合物に関して、交換可能に使用され得る。
【００２１】
本明細書中において使用される場合、用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」および「アンチセンスオリゴマー」は、交換可能に使用され、そしてアンチセンスオリゴマーが、ワトソン−クリック塩基対合によって、ＲＮＡにおける標的配列とハイブリダイズし、この標的配列内で、ＲＮＡ：オリゴマーヘテロ二重鎖を形成することを可能にする、ヌクレオチド塩基およびサブユニットからサブユニットへの骨格の配列をいう。オリゴマーは、標的配列に対する正確な配列相補性または近い相補性を有し得る。このようなアンチセンスオリゴマーは、標的配列を含むｍＲＮＡの翻訳をブロックまたは阻害し得、あるいは遺伝子転写を阻害し、二本鎖配列または一本鎖配列に結合し得、そしてそれはハイブリダイズする配列に「指向される」といわれ得る。
【００２２】
本発明において使用するための、アンチセンスオリゴヌクレオチドについての例示的な構造としては、図１Ａ〜Ｅに示される、β−モルホリノサブユニット型が挙げられる。ポリマーは、１より多い連結型を含み得ることが、理解される。
【００２３】
図１におけるサブユニットＡは、１原子のリンを含む連結を含み、この連結は、図２のＡに示される５原子の繰り返し単位の骨格（ここで、モルホリノ環は、１原子のホスホンアミド連結によって、連結されている）を形成する。
【００２４】
図１のサブユニットＢは、図２においてＢで示されるような、６原子の繰り返し単位の骨格に設計される。図１の構造Ｂにおいて、５’モルホリノ炭素をリンの基に連結している原子Ｙは、硫黄、窒素、炭素、または好ましくは、酸素であり得る。リンからぶら下がるＸ部分は、以下のうちの任意のものであり得る：フッ素；アルキルまたは置換アルキル；アルコキシまたは置換アルコキシ；チオアルコキシまたは置換チオアルコキシ；あるいは非置換、一置換、または二置換の窒素（環式構造を含む）。
【００２５】
図１のサブユニットＣ〜Ｅは、図２においてＣ〜Ｅに対して示されるような、７原子ユニット長の骨格を示す。図１の構造Ｃにおいて、Ｘ部分は、図１の構造Ｂにおいてと同様であり、そして部分Ｙは、メチレン、硫黄、または好ましくは、酸素であり得る。図１の構造Ｄにおいて、Ｘ部分およびＹ部分は、図１の構造Ｂにおいてと同様である。図１の構造Ｅにおいて、Ｘは、図１の構造Ｂにおいてと同様であり、そしてＹは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲである。図１Ａ〜Ｅに示される全てのサブユニットにおいて、ＺはＯまたはＳであり、そしてＰｉまたはＰｊは、アデニン、シトシン、グアニンまたはウラシルである。
【００２６】
本明細書中において使用される場合、「モルホリノオリゴマー」とは、代表的なポリヌクレオチドに水素結合し得る塩基を支持する骨格を有する、ポリマー分子をいい、ここで、このポリマーは、ペントース糖骨格部分（より具体的には、ヌクレオチドおよびヌクレオシドに代表的なホスホジエステル結合によって連結したリボース骨格）を欠くが、環窒素を通しての結合を有する環窒素を含む。好ましい「モルホリノ」オリゴヌクレオチドは、図２Ｂに示される形態のモルホリノ骨格構造からなり、ここで、（ｉ）これらの構造は、リン含有連結（１〜３原子長であり、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を、隣接するサブユニットの５’環外炭素に結合させる）によって一緒に連結されており、そして（ｉｉ）ＰｉおよびＰｊは、塩基特異的水素結合による、ポリヌクレオチドにおける塩基への結合に効果的な、プリン塩基対合部分またはピリミジン塩基対合部分である。
【００２７】
本発明のこの好ましい局面は、図２Ｂに示されており、この図は、ホスホロジアミデート連結によって結合されたような２つのサブユニットを示す。モルホリノオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴマーを含む）は、例えば、共有に係る米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，５２１，０６３号、および同第５，５０６，３３７号（これらの全てが、明白に本明細書中に参考として援用される）に詳述されている。
【００２８】
本明細書中において使用される場合、「ヌクレアーゼ耐性」オリゴマー分子（オリゴマー）とは、骨格がホスホジエステル結合のヌクレアーゼ切断に感受性ではないオリゴマーである。例示的なヌクレアーゼ耐性アンチセンスオリゴマーは、オリゴヌクレオチドアナログ（例えば、ホスホロチオエートおよびホスフェート−アミンＤＮＡ（ｐｎＤＮＡ）（これらの両方が、荷電骨格を有する）、ならびにメチル−ホスホネート、モルホリノ、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴヌクレオチド（これらの全ては、無電荷の骨格を有し得る））である。
【００２９】
本明細書中において使用される場合、標的ポリヌクレオチドに「特異的にハイブリダイズする」オリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴマーとは、生理学的条件下で、３７℃よりかなり高いＴｍ（好ましくは、少なくとも５０℃、そして代表的には、６０℃〜８０℃以上）で、標的にハイブリダイズするオリゴマーである。このようなハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（規定されたイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列についての熱融点（Ｔ［ｍ］）より約１０℃、そして好ましくは約５℃低いように選択される）に対応する。所定のイオン強度およびｐＨにおいて、Ｔ［ｍ］は、標的配列の５０％が、相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズする温度である。
【００３０】
２つの一本鎖ポリヌクレオチドの間で逆平行構造でハイブリダイゼーションが起こる場合、ポリヌクレオチドは、互いに対して「相補的」であると記載される。第一のポリヌクレオチドの鎖の１つと第二のポリヌクレオチドの鎖の１つとの間でハイブリダイゼーションが起こり得る場合、二本鎖ポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドに対して「相補的」であり得る。相補性（１つのポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドと相補的である程度）は、一般的に認容されている塩基対合規則に従って、互いに水素結合を形成すると予測される向かい合う鎖における塩基の位置の観点で定量可能である。
【００３１】
本明細書中において使用される場合、オリゴマーに関する用語「アナログ」とは、参照オリゴマーのものと類似の構造的特性と化学的特性との両方を有する物質を意味する。
【００３２】
本明細書中において使用される場合、配列が第一の配列であるポリヌクレオチドが、生理学的条件下で第二のポリヌクレオチド配列に特異的に結合するか、または特異的にハイブリダイズする場合に、第一の配列は、第二の配列に対して「アンチセンス配列」である。
【００３３】
本明細書中において使用される場合、「標的ＲＮＡが関与する塩基特異的細胞内結合事象」とは、細胞の内側の標的ＲＮＡ配列に対する、オリゴマーの配列特異的結合をいう。例えば、一本鎖ポリヌクレオチドは、配列が相補的な一本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合し得る。
【００３４】
本明細書中において使用される場合、「ヌクレアーゼ耐性ヘテロ二重鎖」とは、アンチセンスオリゴマーの、その相補的標的（遍在的な細胞内ヌクレアーゼおよび細胞外ヌクレアーゼによるインビボでの分解に対して抵抗性である）への結合によって形成される、ヘテロ二重鎖をいう。
【００３５】
本明細書中において使用される場合、「ｃ−ｍｙｃ」とは、癌または腫瘍の発達および成長に向けて、細胞に方向を与える癌遺伝子または遺伝子をいう。「ｃ−ｍｙｃ」は、以下にさらに詳述されるように、種々の型の癌における遺伝子増幅に関連する。
【００３６】
本明細書中において使用される場合、用語「ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマー」とは、相補的またはほぼ相補的なｃ−ｍｙｃ核酸配列に対して高い親和性を有する（すなわち、「特異的にハイブリダイズする」）、ヌクレアーゼ耐性アンチセンスオリゴマーをいう。
【００３７】
本明細書中において使用される場合、オリゴヌクレオチドに対して用語「発現を調節する」とは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴマー）が、発現またはＲＮＡの翻訳を妨害することによって、所定のタンパク質の発現を増強するかまたは減少させるかのいずれかの能力をいう。増強されたタンパク質発現の場合、アンチセンスオリゴマーは、抑制遺伝子（例えば、腫瘍抑制遺伝子）の発現をブロックし得る。減少したタンパク質発現の場合、アンチセンスオリゴマーは、所定の遺伝子の発現を直接ブロックし得るか、またはその遺伝子から翻訳されるＲＮＡの加速された破壊に寄与し得る。
【００３８】
本明細書中において使用される場合、用語「腫瘍」および「癌」は、増殖制御の損失を示し、そして細胞の異常に大きなクローンを形成する、細胞をいう。腫瘍細胞または癌細胞は、一般に、接触阻止を失っており、そして侵襲性であり得、そして／または転移する能力を有し得る。
【００３９】
本明細書中において使用される場合、アンチセンスオリゴマーに対する「有効量」とは、単回用量としてかまたは一連の用量の一部としてかのいずれかで哺乳動物被験体に投与される、選択された標的核酸配列の発現を阻害するために有効な、アンチセンスオリゴマーの量をいう。
【００４０】
本明細書中において使用される場合、個体または細胞の「処置」とは、その個体または細胞の天然の推移を変化させることを試みる際に使用される、任意の型の介在である。処置としては、例えば、薬学的組成物の投与が挙げられるが、これらに限定されず、そして予防的にか、または病理学的事象の開始もしくは病因学的因子との接触に続いてかのいずれかで、実施され得る。
【００４１】
（ＩＩ．本発明を実施する際に使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド）
（Ａ．アンチセンスオリゴヌクレオチドの型）
１５〜２０塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常、哺乳動物ゲノム中に１つの相補的配列を有するために十分に長い。さらに、少なくとも１７個のヌクレオチドの長さを有するアンチセンス化合物は、相補的な標的ｍＲＮＡ配列と十分にハイブリダイズすることが示されている（Ｃｏｈｅｎら、１９９１）。
【００４２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドによる発現の阻害を考慮するための、２つの一般的な機構が提唱されている（例えば、Ａｇｒａｗａｌら、１９９０；Ｂｏｎｈａｍら、１９９５；およびＢｏｕｄｖｉｌｌａｉｎら、１９９７を参照のこと）。
【００４３】
第一に、オリゴヌクレオチドとｍＲＮＡとの間で形成されるヘテロ二重鎖は、ＲＮａｓｅ  Ｈに対する基質であり、ｍＲＮＡの切断をもたらす。このクラスに属するか、またはこのクラスに属すると提唱されるオリゴヌクレオチドとしては、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、およびホスホジエステル（すなわち、非修飾の「天然」オリゴヌクレオチド）が挙げられる。このような化合物は、一般に、高い活性を示し、そしてホスホロチオエートは、現在、アンチセンス適用において最も広範に使用されるオリゴヌクレオチドである。しかし、これらの化合物は、細胞タンパク質への非特異的結合に起因する、所望でない副作用（Ｇｅｅら、１９９８）、および非標的ＲＮＡヘテロ二重鎖の不適切なＲＮａｓｅ切断（Ｇｉｌｅｓら、１９９３）を生じる傾向がある。
【００４４】
第二のクラスのオリゴヌクレオチドアナログ（「立体ブロッカー」あるいは「ＲＮａｓｅ  Ｈ不活性」または「ＲＮａｓｅ  Ｈ耐性」と称される）は、ＲＮａｓｅ  Ｈの基質として働くことが観察されておらず、そして標的ＲＮＡ形成、核−細胞質の輸送または翻訳を立体的にブロックすることによって働くと考えられる。このクラスとしては、メチルホスホネート（Ｔｏｕｌｍｅら、１９９６）、モルホリノオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、２’−Ｏ−アリル修飾オリゴヌクレオチドまたは２’−Ｏ−アルキル修飾オリゴヌクレオチド（Ｂｏｎｈａｍ，１９９５）、およびＮ３’→Ｐ５’ホスホロアミデート（Ｇｅｅ，１９９８）が挙げられる。
【００４５】
天然に存在するオリゴヌクレオチドは、ホスホロジエステル骨格を有し、この骨格は、ヌクレアーゼによる消化に対して感受性である；しかし、この骨格の特定の修飾は、ネイティブなオリゴヌクレオチドのこのような消化に対する耐性を増加させる（例えば、Ｓｐｉｔｚｅｒら、１９８８を参照のこと）。
【００４６】
（Ｂ．好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチド）
選択された核酸標的配列の領域に相補的な塩基配列に加えて、好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的な標的配列に対する高度に特異的な結合、ならびに細胞系および無細胞系における標的核酸の発現のブロックの効力を示す。
【００４７】
本発明の方法において使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、以下の１つ以上の特性を有する：（１）実質的に無電荷の骨格（例えば、Ｕｈｌｍａｎｎら、１９９０）、（２）標的ＲＮＡの相補的配列と、高い親和性（すなわち、実質的に３７℃より高温、好ましくは少なくとも５０℃、そして代表的には６０℃〜８０℃以上のＴｍ）でハイブリダイズする能力、（３）少なくとも８塩基、一般的には約８〜４０塩基、好ましくは１２〜２５塩基のサブユニット長さ、（４）ヌクレアーゼ耐性（Ｈｕｄｚｉａｋら、１９９６）ならびに（５）（ｉ）ホスホロチオエートアンチセンスオリゴマーとの競合的結合、および／もしくは（ｉｉ）検出可能なレポーターを細胞内に輸送する能力によって証拠付けられる、能動的または容易にされた移送の能力。
【００４８】
モルホリノオリゴヌクレオチド、特に、ホスホロアミデートまたはホスホロジアミデートに連結したモルホリノオリゴヌクレオチドは、相補的またはほぼ相補的な核酸に対する高い結合親和性を有することが示されている。モルホリノオリゴマーはまた、非特異的アンチセンス活性をほとんどまたは全く示さず、良好な水溶性を与え、ヌクレアーゼに対して免疫性であり、そして低い製造費用を有することが示されている（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎら、１９９７）。
【００４９】
モルホリノオリゴマーの合成、構造、および結合特性は、米国特許第５，６９８，６８５号；同第５，２１７，８６６号；同第５，１４２，０４７号；同第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，５２１，０６３号；および同第５，５０６，３３７号（これらの各々は、明白に本明細書中に参考として援用される）に詳述されている。
【００５０】
本発明の好ましいアンチセンスオリゴマーは、上記引用された特許において示される形態のモルホリノサブユニットから構成され、ここで、（ｉ）このモルホリノ基は、無電荷の連結によって一緒に連結されており、この連結は、１〜３原子の長さであり、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を、隣接するサブユニットの５’環外炭素に結合させ、そして（ｉｉ）このモルホリノ基に付着した塩基は、プリンまたはピリミジンの塩基対合部分であり、塩基特異的水素結合によって、ポリヌクレオチドにおける塩基に結合するために効果的である。このプリンまたはピリミジンの塩基対合部分は、代表的に、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシルまたはチミンである。このようなオリゴマーの調製は、米国特許第５，１８５，４４４号（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎら、１９９３）（これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されている。この参考文献に示されるように、いくつかの型の非イオン性連結が、モルホリノ骨格を構築するために使用され得る。
【００５１】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの例示的な骨格構造としては、図１Ａ〜Ｅに示されるβ−モルホリノサブユニット型が挙げられる。ポリヌクレオチドは、１より多い連結型を含み得ることが、理解される。
【００５２】
図１におけるサブユニットＡは、１原子のリンを含む連結を含み、この連結は、図２のＡに示される５原子の繰り返し単位の骨格（ここで、モルホリノ環は、１原子のホスホンアミド連結によって、連結されている）を形成する。
【００５３】
図１のサブユニットＢは、図２においてＢで示されるような、６原子の繰り返し単位の骨格を示す。構造Ｂにおいて、５’モルホリノ炭素をリンの基に連結している原子Ｙは、硫黄、窒素、炭素、または好ましくは、酸素であり得る。リンからぶら下がるＸ部分は、以下のうちの任意のものであり得る：フッ素；アルキルまたは置換アルキル；アルコキシまたは置換アルコキシ；チオアルコキシまたは置換チオアルコキシ；あるいは非置換、一置換、または二置換の窒素（環式構造を含む）。好ましい実施形態において、リンからぶら下がるＸ部分は、ジメチルアミノ基［Ｎ（ＣＨ３）２］である。
【００５４】
図１のサブユニットＣ〜Ｅは、図２においてＣ〜Ｅに対して示されるような、７原子ユニット長の骨格に設計される。図１の構造Ｃにおいて、Ｘ部分は、図１の構造Ｂにおいてと同様であり、そして部分Ｙは、メチレン、硫黄、または好ましくは、酸素であり得る。図１の構造Ｄにおいて、Ｘ部分およびＹ部分は、図１の構造Ｂにおいてと同様である。図１の構造Ｅにおいて、Ｘは、構造Ｂにおいてと同様であり、そしてＹは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲである。図１Ａ〜Ｅに示される全てのサブユニットにおいて、ＺはＯまたはＳであり、そしてＰｉまたはＰｊは、アデニン、シトシン、グアニンまたはウラシルである。
【００５５】
好ましい「モルホリノ」オリゴヌクレオチドは、図２Ｂに示される形態のモルホリノサブユニット構造からなり、ここで、（ｉ）これらの構造は、リン含有連結（１〜３原子長であり、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を、隣接するサブユニットの５’環外炭素に結合させる）によって一緒に連結されており、そして（ｉｉ）ＰｉおよびＰｊは、塩基特異的水素結合による、ポリヌクレオチドにおける塩基への結合に効果的な、プリン塩基対合部分またはピリミジン塩基対合部分である。
【００５６】
（Ｃ．好ましいアンチセンス標的）
本発明を実施する際に、目的の遺伝子の関連する領域から転写されるｍＲＮＡは、一般に、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的化される；しかし、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡが、標的化され得る。例えば、二本鎖ＤＮＡは、二重鎖ＤＮＡの深いほうの溝の部位に配列特異的に結合するように設計された、非イオン性プローブを使用して、標的化され得る。例示的なプローブは、米国特許第５，１６６，３１５号（ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ，１９９２）（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載されている。このようなプローブは、本明細書中において、一般に、アンチセンスオリゴマーと称され、これらのオリゴマーが標的核酸の発現をブロックする能力をいう。
【００５７】
本発明の方法において、アンチセンスオリゴマーは、ｃ−ｍｙｃ核酸配列の領域に、生理学的条件下で、３７℃より実質的により高温（例えば、少なくとも５０℃、そして好ましくは６０℃〜８０℃）のＴｍで、ハイブリダイズするように設計される。このオリゴマーは、核酸に対して高い結合親和性を有するように設計され、そしてｃ−ｍｙｃ標的配列に対して１００％相補的であり得るか、またはオリゴマーとｃ−ｍｙｃ標的配列との間で形成されるヘテロ二重鎖が十分に安定であり、細胞から体液への遷移の間の細胞ヌクレアーゼの作用および他の様式の分解に耐える限り、ミスマッチを含み得る（例えば、対立遺伝子改変体を収容するため）。ミスマッチは、存在する場合、ハイブリッド二重鎖の中央よりも、端部の領域に向かって、不安定化が少ない。認容されるミスマッチの数は、二重鎖の安定性の十分に理解された原理に従って、オリゴマーの長さ、二重鎖におけるＧ：Ｃの塩基対の割合、二重鎖におけるミスマッチの位置に依存する。
【００５８】
このようなアンチセンスオリゴマーは、ｃ−ｍｙｃ標的配列と必ずしも１００％相補的ではないが、ｃ−ｍｙｃの発現が調節されるように標的配列に安定にかつ特異的に結合することが、効果的である。良好な特異性と組み合わせて、安定な、効果的な結合を可能にするために適切な長さのオリゴマーは、約８〜４０ヌクレオチド塩基単位であり、そして好ましくは、約１２〜２５ヌクレオチドである。標的塩基との縮重した塩基対合を生じさせるオリゴマー塩基もまた、標的との塩基対合特異性が維持されることを仮定して、考慮される。
【００５９】
１つの好ましいアプローチにおいて、本発明のアンチセンス方法を使用する遺伝子発現の調節のための標的は、ｃ−ｍｙｃに対するｍＲＮＡ翻訳開始コドンにまたがる配列を含む。代替の好ましいアプローチにおいて、ｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡのスプライスアクセプター領域が標的化される。ｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡの他の領域（開始剤部位またはプロモーター部位、イントロン結合部位またはエキソン結合部位、３’未翻訳領域、および５’未翻訳領域のうちの１つ以上が挙げられる）が標的化され得ることが、理解される。スプライスされたＲＮＡとスプライスされていないＲＮＡとの両方が、本発明の方法において使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計のためのテンプレートとして働き得ることが、さらに理解される（例えば、Ｈｕｄｚｉａｋら、２０００（明白に本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
【００６０】
Ｈｕｄｚｉａｋら、２０００は、形質転換されたヒトおよびラットの線維芽細胞（それぞれ、ＮＲＫおよびＷＩ−３８）に対する抗増殖効果を有することが示された、ｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡに対してアンチセンスである、多数のオリゴマーを記載する。例示的なアンチセンスオリゴマーを、以下の表１に提供する。
【００６１】
（表１．例示的なアンチセンスオリゴマー）
【００６２】
【表２】
2004537517.tif 000005
１全ての配列は、５’→３’方向で示される；Ｍは、５−メチルシトシンを表す；Ｔは、チミンを表す；Ｒは、その配列が、ラットｃ−ｍｙｃ配列に相補的であることを意味する；そしてＨは、その配列が、ヒト配列に相補的であることを意味する。
【００６３】
本発明の例示的な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、配列番号１，配列番号８、配列番号９、配列番号１０または配列番号１１として表される配列を含むＰＭＯである。
【００６４】
（ＩＩＩ．ｃ−ｍｙｃ）
ｃ−ｍｙｃは、細胞増殖、分化およびアポトーシスを調節する原癌遺伝子であり、そしてその異常な発現は、しばしばヒト癌において観察される。ｃ−ｍｙｃの異常な構成的発現または過剰発現は、多数のヒト癌（例えば、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、膀胱癌、白血病、肺癌などを含む）に関連している（例えば、Ｂｉｅｃｈｅら、１９９９を参照のこと）。
【００６５】
原癌遺伝子は、種々の機構によって癌遺伝子に対して活性化され、この機構としては、（１）プロモーターの挿入、（２）エンハンサーの挿入、（３）染色体転移、（４）遺伝子増幅、および（５）点変異が挙げられる。本明細書中で使用される場合、原癌遺伝子に対する「活性化」とは、遺伝子の転写が、例えば、発現無しから低レベルの発現まで増加されることを意味する。機構（１）〜（４）は、癌遺伝子の発現レベルの増加を生じ、一方、（５）は、変更された遺伝子産物の発現を生じる。証拠は、ある形態の癌遺伝子発現と腫瘍抑制遺伝子の不活性化は、癌の発生に必要であることを示唆する。
【００６６】
ｍｙｃ原癌遺伝子は、他の遺伝子の発現を直接調節する転写因子として記載されており、他の遺伝子の例としては、ＥＣＡ３９、ｐ５３、オルニチンデカルボキシレート（ＯＤＣ）、αプロキモシンおよびＣＤＣ２５Ａが挙げられる（Ｂｅｎ−Ｙｏｓｅｆら、１９９８）。
【００６７】
ニワトリにおいて、特定の鳥類白血病ウイルスでのニワトリＢ細胞の感染の後、プロウイルスは、ｍｙｃ遺伝子の付近に組み込まれ、このプロウイルスは、プロモーターまたはエンハンサーのいずれかとして作用するウイルス長末端反復（ＬＴＲ）によって活性化されて、ｍｙｃの発現およびＢ細胞の形成を生じる。同様に、バーキットリンパ腫において、エンハンサー配列が転移して、ｍｙｃの発現を生じる（例えば、Ｇａｕｗｅｒｋｙら１９９３を参照のこと）。
【００６８】
ｃ−ｍｙｃは、正常な造血幹細胞において発現され、そしてヒト上皮幹細胞の分化を促進することが示されている（Ｇａｎｄａｒｉｌｌａｓら、１９９７）。休止細胞が細胞循環に再び入る場合、ｃ−ｍｙｃの発現が上方制御されること、およびｃ−ｍｙｃの異所的発現が、増殖阻害シグナル、分化刺激因子またはマイトジェンの撤退に応答する細胞周期の停止を防ぐことが観察されている（例えば、Ａｍａｔｉら、１９９８を参照のこと）。さらに、アポトーシスインヒビターのｂｃｌ−２の発現は、結腸直腸癌細胞において、ｃ−ｍｙｃの発現と逆相関する（例えば、Ｐｏｐｅｓｃｕ  ＲＡら、１９９８を参照のこと）。
【００６９】
ｃ−ｍｙｃを過剰発現する白血病細胞株および結腸癌細胞株のｃ−ｍｙｃアンチセンスホスホロチオエートオリゴマー処理の後、競合的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、細胞増殖の阻害が、結腸癌細胞株および白血病細胞株において、それぞれ、２０倍〜１００倍のｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡの減少の検出と共に観察された（Ｌｉら、１９９５、ＭｃＧｕｆｆｉｅら、２０００；Ｓｋｏｒｓｋｉら、１９９７およびＨｕａｎｇら、１９９５もまた参照のこと）。さらに、ｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡタンパク質結合部位標的に対するオリゴデオキシヌクレオチドアンチセンスは、配列特異的な様式でＲＮＡ結合を７５％阻害することが示された。このようなｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理されたＫ５６２細胞は、ｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡレベルおよびｃ−ｍｙｃタンパク質レベルの両方において濃度依存的減少を示した。対照的に、翻訳開始コドンを標的化するｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｃ−ｍｙｃタンパク質レベルを減少するが、ｍＲＮＡレベルを増大することが示された（Ｃｏｕｌｉｓら、２０００）。
【００７０】
さらに、サルにおけるホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの腎臓効果に関する研究は、毒性の非特異性および証拠を示した。これらの化合物は、腎臓に蓄積され、高用量で近位細管変性を引き起こすことが示された（Ｍｏｎｔｅｉｔｈら、１９９９）。これは、化学治療剤との共沈殿および腎臓における沈殿物の蓄積を生じるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの荷電した性質に起因し得る。対照的に、荷電したホスホロチオエートオリゴヌクレオチドとは異なり、本発明のＰＭＯは、実質的に無電荷であり、従って、シスプラチン（ｃｉｓｐａｌｔｉｎ）のような化学治療剤との相互作用またはこのような化学治療剤との共沈殿のための部位を欠く。
【００７１】
驚くべきことに、同一人に譲渡された米国特許出願０９／６７９，４７５（ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／２５４０５）に記載されるように、ｃ−ｍｙｃに対するアンチセンスオリゴマーが造血幹細胞の富化集団を処理するために使用された場合、この造血幹細胞集団の発生は、調節された。
【００７２】
本発明は、ｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーアンチセンスが、いくつかの幅広く使用される化学治療剤と併用される場合、抗癌効力結果を増大するという驚くべき発見を示す。実施例１に示される結果から分かり得るように、Ｃ５７ＢＬマウスにおいてＬｅｗｉｓ肺細胞由来腫瘍を用いるモデルを使用して、ｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーアンチセンス（ＡＶＩ−４１２６、配列番号１）で処理した腫瘍におけるｃ−ｍｙｃの発現の阻害が、シスプラチン処理に関して、アンチセンスオリゴマーの投与のタイミングに依存性であることが見出された。さらに、このｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーは、シスプラチン、エトポシドおよびタキソールの抗腫瘍活性を有意に増大するが、５−ＦＵの抗腫瘍活性は増大しないことが示された（図８Ａ〜８Ｄを参照のこと）。
【００７３】
（ＩＶ．従来の癌処置レジメン）
現在の癌治療レジメンは、多数の欠陥に直面しており、その最も重要なものは、効力の欠損および頻繁な毒性副作用である。癌治療剤の臨床的使用に対する主な制限の１つは、処置に対する耐性の発生である。薬物耐性の問題は、固形腫瘍および白血病を処置するために使用される多数の化学治療剤（シスプラチン型化合物を含む）を用いた場合に観察されている。このような耐性は、代表的に、化学治療の後の腫瘍の再発によって証明される。結果として、ほとんどの治療レジメンは、耐性を回避するための方法として、２つ以上の異なる薬物を含む。さらに、高用量の化学治療が、代表的に、効果的な処置のために必要とされる。このような高用量は、毒性副作用に関連する。
【００７４】
本発明の実施に使用するための化学治療剤は、癌治療において確立された用途を有する多数の薬剤を含む。本発明で使用するための例示的な化学治療剤は、代謝拮抗剤（酸化ストレスを引き起こす化合物）、およびトポイソメラーゼインヒビターである。いずれの特定の理論にも縛られないが、化学治療剤は、それ自体、あまり分化していない細胞に対してより毒性であり、化学治療剤に抵抗性のより高度に分化した癌細胞の集団が、化学治療処置の後に残ると考えられている。このような細胞は、より分化され得、従って、ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーによる阻害または細胞死に対してより感受性である。
【００７５】
例示的な抗癌薬としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（１）代謝拮抗剤（例えば、葉酸アナログおよびメトトレキサート（ＭＴＸ）；ピリミジンアナログ（例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルオロデオキシウリジン、シトシンアラビノシドおよびシタラビン）；プリンアナログ（例えば、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）および６−チオグアニン（６−ＴＧ））；（２）アルキル化剤（例えば、窒素マスタード、メクロレタミン、シクロホスファミド（ＣｙｔｏｘａｎＲ）、メルファランおよびクロラムブシル）；（３）天然産物（ビンカアルカノイド、ビンクリスチン（ＯｎｃｏｖｉｎＲ）、ビンブラスチン（ＶｅｌｂａｎＲ）、ビノレルビン（ＮａｖｅｌｂｉｎｅＲ）、エピポドフィロトキシン、エトポシド（ＶｅＰｅｓｉｄＲ、ＶＰ−１６）およびタキソール（ＰａｃｌｉｔａｘｅｌＲ）が挙げられるが、これらに限定されない）；（４）抗腫瘍抗生物質として特徴付けられる化合物（アントラサイクリン、ドキソルビシンヒドロクロリド、（アドリアマイシンＲ）、ダウノルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、（ブレノキサンＲ）、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、マイトマイシンＣ、プリカマイシンおよび（ミトラマイシン）が挙げられるが、これらに限定されない）；ならびに（５）種々の薬剤（シスプラチン、カルボプラチン、アスパラギナーゼ、ヒドロキシウレア、ミトタン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ；Ｌｙｓｏｄｒｅｎ）、タモキシフェンおよびプレドニゾンが挙げられるが、これらに限定されない）。
【００７６】
シスプラチン（ｃｉｓ−白金、プラチノール（ｐｌａｔｉｎｏｌ）；ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金；およびｃＤＤＰとも呼ばれる）は、精巣癌、卵巣腫瘍および種々の他の癌の治療においてしばしば用いられる広範なクラスの水溶性白金配位化合物の代表である（例えば、Ｂｌｕｍｅｎｒｅｉｃｈら、１９８５；Ｆｏｒａｓｔｉｅｒｅら、２００１を参照のこと）。
【００７７】
臨床的にｃＤＤＰを用いる方法は、当該分野で周知である。例えば、ｃＤＤＰは、一ヶ月に１回、一日で６時間にわたって、遅い静脈内注入によって投与されてきた。局所的病巣について、ｃＤＤＰは、局所注射によって投与され得る。腹腔内注入もまた、用いられ得る。ｃＤＤＰは、多薬剤レジメンの一部である場合、または患者がより高い投薬に対する有害反応を有する場合、１回の処置あたり１０ｍｇ／ｍ２ほどの低用量で投与され得る。一般に、臨床的用量は、１回の処置あたり約３０〜約１２０１５０ｍｇ／ｍ２または１５０ｍｇ／ｍ２である。
【００７８】
代表的に、白金含有化学治療剤は、例えば、上記のような遅い静脈内注入によってか、または局所注射によって、非経口投与される。シスプラチンの病巣内（腫瘍内）投与およびＩＰ投与の効果は、Ｎａｇａｓｅら、１９９７およびＴｈｅｏｎら、１９９３に記載される。
【００７９】
シスプラチンは広く使用されているが、シスプラチン（ｃＤＤＰまたはプラチノール）の投与後に報告される副作用が、一般的であり、そしてこれには脱毛もしくは脆い毛髪、食欲および／もしくは体重の減少、下痢、吐気および嘔吐、ならびに指先およびつま先のしびれもしくは刺痛が挙げられる。一般に、シスプラチンの効果は、非特異的であり、シスプラチンの投与は、全ての迅速に増殖している組織に対する損傷を生じる。例えば、Ｇａｎｄａｒａら、１９９１；Ｐｅｔｅｒｓら、２０００；Ｊｏｎｅｓら、１９９５；およびＢｙｈａｒｄｆ  ＲＷ、１９９５を参照のこと。
【００８０】
さらに、シスプラチンは、狭い範囲の腫瘍に対して効果的であり、そして耐性の発生が、報告されている（Ｏｎｏｄａら、１９８８）。
【００８１】
タキソール（パクリタキセル）は、もともと、種々のイチイ属（Ｔａｘａｃｅａｅ）の種の樹皮からわずかな収量で単離された複雑なジテルペノイドである。タキソールはまた、現在、化学合成により調製され得る（例えば、Ｎｉｃｏｌａｏｕら、１９９４を参照のこと）。タキソールは癌化学治療において最も強力な薬剤の１つを構成し、卵巣癌および乳癌の処置についてＦＤＡにより認可されており、そして肺、皮膚および心臓／頸部の癌の処置において潜在的な有用性を示した。
【００８２】
タキソールおよび関連の薬剤の臨床的有用性は、コスト、制限されたバイオアベイラビリティ（低い水溶性に起因する）、および多耐性細胞の発生により制限されてきた。可溶化剤（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（ポリエトキシル化ヒマシ油）およびアルコール）は、溶解度を改善することが示されており、そしてマイクロカプセル化形態が記載されている（例えば、ＷＯ９３／１８７５１を参照のこと）。
【００８３】
一般に、タキソール（パクリタキセル）について報告される副作用としては、白血球数および赤血球数の減少、感染、吐気および嘔吐、食欲の減少、味覚の変化、脱毛、関節痛および筋肉痛、端部のしびれ、ならびに下痢が挙げられる。
【００８４】
エトポシド（エトポシド（ＶＰ−１６、ＶｅＰｅｓｉｄ  Ｏｒａｌ））は、種々の癌（精巣癌、肺癌、リンパ腫、神経芽種、非ホジキンリンパ腫、カポージ肉腫、ウィルムス腫、種々のタイプの白血病などを含む）の治療において現在使用されている。
【００８５】
エトポシドは、一般に、経口投与または静脈内投与される。Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ  Ｏｒａｌ（ＶＰ−１６、ＶｅＰｅｓｉｄ  Ｏｒａｌ）の投与と関連する副作用としては、吐気および嘔吐、食欲不振、胃痛、疲労、ならびに脱毛が挙げられる。エトポシドおよび関連の化合物の主な用量を制限する副作用は、好中球減少症であり、これはしばしば、特にさらなる化学治療剤または放射線で処置されている患者において重篤である。
【００８６】
５−ＦＵ（フルオロウラシル、商品名：５−ＦＵ、Ａｄｒｕｃｉｌ）は、種々の癌（結腸癌、直腸癌、乳癌、胃癌、膵臓癌、卵巣癌、頸部癌、膀胱癌、膣疣を含む）、および光線性角化症（ある型の前癌性皮膚病変）についての化学治療のために使用されている。５−ＦＵは、代表的に、静脈内（ＩＶ）注射によって、ＩＶ注入（点滴）によって、経口的に、または皮膚に直接塗布されるクリームとして投与される。５−ＦＵは、広範に実証される副作用（脱毛、頭痛、衰弱、疼痛（ａｃｈｉｎｅｓｓ）、太陽光に対する皮膚の敏感性、水疱皮膚または挫瘡、食欲および／または体重の減少、ならびに手または足の刺痛を含む）と関連している。
【００８７】
現在の化学治療処置レジメンの広範な副作用および長期の効力の欠損を考えると、このような副作用を軽減もしくは排除し、そして／または増大した治療効果を示す新たなまたは改良された癌処置レジメンが、医学界に対して有意な価値がある。
【００８８】
（Ｖ．本発明の方法を使用する癌の処置）
本発明は、ｃ−ｍｙｃをコードする核酸配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、従来の癌処置（すなわち、化学治療および／または放射線治療）と共に用いて、癌を処置するための方法を提供する。
【００８９】
本発明は、高いＴｍ、細胞に活動的に輸送または容易に輸送され得ること、および相補的またはほぼ相補的なｃ−ｍｙｃ核酸配列に高親和性で結合し得ることにより特徴付けられる、安定な、実質的に無電荷のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、癌患者に投与され得、細胞によるｃ−ｍｙｃの発現を阻害し得、そして従来の化学治療剤と共に投与された場合、腫瘍増殖の調節を生じ得るという発見に基づく。
【００９０】
（Ａ．癌の処置）
本明細書中に記載される方法を使用して、従来の癌処置と共にｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーを被験体にインビボで投与することは、多数の因子に依存して、患者の改善された治療的結果をもたらし得、この因子としては、（１）ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーの投与の持続時間、用量および頻度、（２）化学治療に使用される化合物の持続時間、用量および頻度、（３）化学治療剤の投与に関するｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマー投与の持続時間およびタイミング、ならびに（４）被験体の一般的な状態が挙げられる。
【００９１】
一般に、癌患者に関して改善された治療的結果とは、癌細胞または固形腫瘍の増殖の減速または減少、あるいは癌細胞の総数または全腫瘍量の減少をいう。
【００９２】
この方法の好ましい適用において、被験体は、ヒト被験体である。この被験体はまた、癌患者、特に、ある形態の白血病、リンパ腫、神経芽種、乳癌、結腸癌、肺癌または任意のタイプの癌を有すると診断された患者であり得、ここでこの患者は、化学治療または放射線治療で処置されているか、または処置されたことがある。この方法はまた、急性骨髄性白血病または慢性骨髄性白血病、胆管癌、黒色腫、多発性骨髄腫、骨肉腫、胃肉腫、神経膠腫、膀胱癌、頸部癌、結腸直腸癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌および胃癌の処置に適用可能である。
【００９３】
単独または幹細胞移植と併用した化学治療および／または放射線治療は、多数の悪性疾患（急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、神経芽種、リンパ腫、乳癌、結腸癌、肺癌、卵巣癌、胸腺腫、生殖細胞腫瘍、多発性骨髄腫、黒色腫、精巣癌、肺癌および脳癌を含む）の標準的な処置レジメンである。
【００９４】
多くの癌処置レジメンは、患者の免疫抑制を生じ、その患者は、貧血、血小板減少症（低い血小板数）および／または好中球減少症（低い好中球数）を有したままである。このような癌処置の後、患者は、しばしば、感染に対する防御が出来なくなる。免疫抑制のための支持的なケアとしては、患者が感染因子に曝露されないように、患者を保護的に隔離すること；抗生物質（例えば、抗ウイルス剤および抗真菌剤）の投与；ならびに／または貧血、血小板減少症および／もしくは好中球減少症を処置するための周期的な輸血が挙げられ得る。
【００９５】
ヒト癌患者の処置において使用するための造血幹細胞の数を増加するのに有効な様式で、ＨＳＣを含む細胞集団をｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーに曝露することによって造血幹細胞（ＨＳＣ）数を増加させる方法は、同一人に譲渡された米国特許出願０９／６７９，４７５（ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／２５４０５）（本明細書中で明確に参考として援用される）に記載されている。この参考文献は、ｃ−ｍｙｃ処理を使用して、培養条件に依存して、ＨＳＣ数を増加させ、ＨＳＣ由来の特定の系列の方向付けられた先祖の細胞の数を増加させることを記載している（ＷＯ０１／２５４０５）。
【００９６】
この機構は本発明の一部ではないが、癌遺伝子経路間の相乗作用が、以前に記載されており、そしてｃ−ｍｙｃ発現の調節解除は好ましい第２の癌遺伝子経路について選択されることが示唆されている（Ｄ’Ｃｒｕｚら、２００１）。本明細書中で示される結果は、ｃ−ｍｙｃレベルの減少は、アンチセンスで処理された腫瘍において達成されるが、ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーの処理は、増殖速度を変更しないことを示す。これは、ｃ−ｍｙｃ発現が形質転換プロセスに影響を与えるが、形質転換された表現型の維持に関与する唯一の因子ではないモデルと一致する。従来の化学治療剤との併用レジメンにおいて、ｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーアンチセンスの投与の後に観察される驚くべき予想外の結果は、ｃ−ｍｙｃが、形質転換された表現型の維持においても重要であり得ることを示唆する。本明細書中で示される結果（実施例１）は、ＬＬＣ１腫瘍（シスプラチンに対して固有に耐性である）が、ｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーアンチセンス（ＡＶＩ−４１２６、配列番号１）を含む処置レジメンにおいて、シスプラチンに対する増加した感受性を示すことを示す。腫瘍は、ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマー処置が化学治療の後に行われる場合、シスプラチンとタキソールの処置、およびより少ない程度のエトポシドに対して有意により感受性であった。
【００９７】
本明細書中に記載される方法、従来の化学治療とｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーアンチセンスの投与とを併用する関連の治療レジメンはまた、多発性嚢胞腎疾患の処置および心臓血管疾患の処置における有用性を見出す。シスプラチンまたはタキソールの投与とｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーアンチセンスの投与とを併用する処置レジメンが、特に注目される。このような処置レジメンにおいて、化学治療剤は、アンチセンスオリゴマーの投与の前、それと同時またはその後に投与され得る。
【００９８】
（Ｂ．処置レジメン）
本発明は、癌治療のための方法を提供し、ここで、ｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーアンチセンスおよび１種以上の化学療法剤が患者に投与される。本明細書中に記載される方法の好ましい局面において、このｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーは、１種以上の化学療法剤の投与前または投与後（同時ではない）に患者に投与される。
【００９９】
一つの好ましい実施形態において、シスプラチンが、ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーの投与前または投与後（同時ではない）に患者に投与される。
【０１００】
一つの例示的な実施形態において、シスプラチン（ｃＤＤＰ、プラチノール）、タキソール（パクリタキセル）またはエトポシド（ＶＰ−１６、ＶｅＰｅｓｉｄ  Ｏｒａｌ）を、１〜５日間毎日、好ましくは、３日間連続して投与し、続いて、１日以上抗癌処置をせずに、次いでｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーアンチセンスを、２〜７日間毎日、好ましくは、５日間連続して投与し、この化学療法およびアンチセンスオリゴマー投与のサイクルを、少なくとも２回繰り返した。
【０１０１】
別の例示的な実施形態において、シスプラチン（ｃＤＤＰ、プラチノール）、タキソール（パクリタキセル）またはエトポシド（ＶＰ−１６、ＶｅＰｅｓｉｄ  Ｏｒａｌ）を、１〜５日間毎日、好ましくは、３日間連続して投与し、続いて、ｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーアンチセンスを２〜７日間毎日、好ましくは、５日間連続して投与し、この化学療法およびアンチセンスオリゴマー投与のサイクルを、少なくとも２回繰り返した。
【０１０２】
別の好ましい実施形態において、連続しておよび少なくとも１日の時間間隔を置いてｃ−ｍｙｃおよび化学療法剤に対するオリゴマーアンチセンスを投与する。好ましくは、ｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーアンチセンスを、少なくとも２日間毎日投与し、続いて１日以上化学療法剤を投与し、ｃ−ｍｙｃに対するアンチセンスオリゴマーおよび化学療法剤の代替の投与サイクルを少なくとも２回繰り返した。２種の化合物の投与間の時間間隔は、好ましくは、最後に投与した化合物の半減期の少なくとも３倍であり、最後に投与した化合物が、他の化合物の投与前に患者からほとんど取り除かれることを確実にする。
【０１０３】
代表的に、化学療法化合物は、２〜６時間の半減期で取り除かれるので、約６〜２４時間で、クリアランスが可能となる。代表的に、ｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーアンチセンスは、１８〜２４時間の半減期で取り除かれるので、２〜３日の期間で、クリアランスが可能となる。
【０１０４】
当業者に理解されるように、最適な処置レジメンは変化し、化学療法およびアンチセンスオリゴマーの投与のさらなるサイクルが意図されるか否かを決定するために、１回以上のサイクルの化学療法およびアンチセンスオリゴマーの投与前および投与後に、患者の処置および一般的な健康状態において疾患の状態を評価することは、本発明の処置方法の範囲内である。このような評価は、代表的に、従来の癌化学療法を評価するために代表的に使用される試験の使用によって実施され、「モニタリング処置」と題された以下のセクションにおいてさらに記載されている。
【０１０５】
本発明を実施するのに使用するための好ましい処置レジメンとしては、一般に、ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーの投与前に、１種以上の化学療法剤の投与を含む。このメカニズムは、本発明の一部ではないが、化学療法後に、化学療法に対して不応性である癌細胞群が残り、そしてこのような細胞は、より分化され得、従って、化学療法後に投与されるｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーによる改変に対してより感受性である。
【０１０６】
上記のように、これらの方法における使用ための好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、実質的に無電荷のホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）であり、安定性、高いＴｍによって特徴付けられ、そして以下によって証明されるような、能動的または促進性の輸送を可能とする：（ｉ）ホスホロチオエートアンチセンスオリゴマーとの競合結合、および／または（ｉｉ）検出可能なレポーターを細胞に輸送するための能力。
【０１０７】
この実施形態の一つの好ましい局面において、このオリゴマーは、配列番号１、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１として示される配列からなる群から選択されるＰＭＯである。
【０１０８】
（Ｃ．化学療法剤の送達）
本発明の重要な局面は、薬学的に受容可能なキャリア中の１種以上の化学療法剤の効果的な送達である。
【０１０９】
本発明の一つの局面に従って、化学療法剤および対応する経路の選択、ならびに送達のタイミングは、以下の１以上の利点がある：（ｉ）処置下で、特定の型の癌の処置における確立された使用；（ｉｉ）ｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーアンチセンスと併用して投与される場合に、改善された治療を生じるように選択された化学療法剤の能力；ならびに（ｉｉｉ）試薬の癌細胞への十分に局在化された曝露を達成するのに有効な投薬形態による、化学療法剤の局所送達。
【０１１０】
本発明の実施において、化学療法剤が、癌化学療法において確立された使用を有する、経路および処置レジメンを使用することによって投与される。上記のように、最適な経路は、化学療法剤により変化する。しかし、代表的に好ましい経路としては、ゆっくりな静脈内注入（ＩＶ液滴）、経口投与および局所注射が挙げられる。この処方物は、種々の投薬形態（例えば、注入可能な溶液、薬物放出カプセル、移植片）であるか、またはリポソームもしくはマイクロカプセルのようなキャリアと併用して容易に投与される。
【０１１１】
多数の化学療法剤のための推奨される投薬形態が確立されており、通常の供給源（例えば、ｔｈｅ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｏｒａｄｅｌｌ、Ｎ．Ｊ．により刊行されている））から入手し得る。必要である場合、これらのパラメーターは、十分に確立された手順および分析（例えば、臨床実験）によって各系について決定され得る。
【０１１２】
例えば、経口投与された場合、この活性化合物は、不活性な希釈物と、もしくは食用キャリア中で合わせられ得るか、または硬シェルゼラチンカプセルもしくは軟シェルゼラチンカプセル中に包理され得るか、錠剤に圧縮され得るか、食物に直接取り込まれ得るか、賦形剤とともにとりこまれ得るか、あるいは摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、カシェ剤、などの形態で使用され得る。適切な量の活性化合物は、特定の化学療法剤に対して特異的であり、そして一般に当該分野で公知である。このような治療的に有効な組成物中の活性化合物の量は、適切な投薬量が得られるような量である。
【０１１３】
非経口投与は、適切な緩衝化水溶液、および生理食塩水またはグルコースを使用して等張性形態で調製された液体希釈物を使用して達成され得る。このような水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、および腹腔内投与のために適切である。（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照のこと）。注射可能な滅菌溶液を、必要とされる量の適切な溶媒中に化学療法剤を、含まれる種々の他の成分とともに取り込み、続いて濾過滅菌することによって調製する。注射可能な滅菌溶液中に使用するための滅菌粉末を、真空乾燥もしくは凍結乾燥技術または他の手段により、活性な化学療法剤と、予め滅菌された溶液から調製されるさらなる所望の成分との粉を生じるように調製し得る。
【０１１４】
本発明は、１種以上の化学療法剤の投与、および癌の化学療法のためのｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーアンチセンスの投与を含む、処置レジメンを意図することが、理解される。このような処置レジメンは、さらなる癌処置（例えば、放射線治療）、さらなる化学療法および／または免疫療法の前、同時、または後に投与され得る。
【０１１５】
本発明は、−ｍｙｃアンチセンスオリゴマー投与を含まない処置レジメンに比べて、ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマー投与も含む処置レジメンにおいて投与された場合、１種以上の化学療法剤の投与が減少され得るという利点を提供する。このような併用処置は、若年もしくは老年の患者において利点があり、この癌は、−ｍｙｃアンチセンスオリゴマー投与を含まない処置レジメンに対して困難である。
【０１１６】
（Ｄ．患者へのアンチセンスオリゴマーの送達）
アンチセンスの標的ｃ−ｍｙｃ核酸配列への効率的な送達は、本発明の方法の重要な局面である。本発明の一つの局面に従って、以下で議論される投与様式は、１つ以上の重要な特徴を利用する：（ｉ）高い細胞の取り込み速度を有するアンチセンス化合物の使用、（ｉｉ）ｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡ処置およびｍＲＮＡ翻訳に干渉するためのアンチセンス化合物の能力、および（ｉｉｉ）癌細胞に対する局在化された高濃度の化合物を達成するのに効率的な投与様式による、アンチセンスオリゴマーの送達。
【０１１７】
本発明に従って、オリゴマーアンチセンスのｃ−ｍｙｃへの効果的な送達としては、種々の全身経路（経口経路および非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、および筋肉内）を含む）；ならびに吸入送達および経皮送達が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１１８】
ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーを被験体の血流に送達させるために有効な任意の方法がまた、意図されることが理解される。
【０１１９】
アンチセンスオリゴマーの経皮送達は、例えば、局所投与のために適用される、薬学的に重要可能なキャリアの使用によって達成され得る。モルホリノオリゴマーの送達の一つの例は、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９７／４０８５４（本明細書中で参考として援用される）において記載されている。
【０１２０】
ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび投与される化学療法剤の量は、２種の型の薬剤の併用が、治療的に有効であるような量である。投薬量は、患者の年齢、健康、性別、大きさ、および体重、投与経路、薬物の毒性、ならびにオリゴヌクレオチドおよび化学療法剤に対する癌の相対的な感受性のような因子に従って変化する。代表的に、１種以上の用量のアンチセンスオリゴマーが、一般に、約１〜２週間の期間の定期的な間隔で投与される。経口投与のための好ましい用量は、約１ｍｇのオリゴマー／患者〜約２５ｍｇのオリゴマー／患者（成人の体重（７０ｋｇ）に基づく）である。いくつかの場合において、２５ｍｇのオリゴマー／患者よりも多い用量が、必要であり得る。ＩＶ投与のために、好ましい用量は、約０．５ｍｇのオリゴマー／患者〜約１０ｍｇのオリゴマー／患者（成人の体重（７０ｋｇ）に基づく）である。このアンチセンス化合物は、一般に、少なくとも２００〜４００ｎＭのアンチセンスオリゴマーの血液濃度のピークを生じるのに十分な量で投与される。より多い量またはより少ない量のオリゴヌクレオチドが、必要とされる場合に投与され得、そして維持用量は、より低くてよい。
【０１２１】
一般に、この方法は、適切な薬学的キャリアで、ｃ−ｍｙｃ核酸標的配列の発現を阻害するのに有効な量のアンチセンス剤を被験体に投与する工程を包含する。
【０１２２】
結果として、アンチセンスオリゴヌクレオチド組成物が、任意の従来のビヒクル（これは、生理学的に受容可能である）で投与され得る。このようなオリゴヌクレオチド組成物は、当業者によって使用される、任意の種々の標準的な生理学的に受容可能なキャリアを含み得る。このような薬学的キャリアの例としては、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、水、水性エタノール、エマルジョン（例えば、油／水エマルジョン、トリグリセリルエマルジョン）、湿潤剤、錠剤、およびカプセルが挙げられるが、これらに限定されない。適切な生理学的に受容可能なキャリアの選択は、選択された投与形態に依存して変化することが理解される。
【０１２３】
いくつかの場合において、リポソームは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞への取り込みを促進するために使用され得る（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＡＳ、１９９６；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎら、１９９４；Ｎａｋａｍｕｒａら、２００１；およびＬｏｕら，２００１を参照のこと）。
【０１２４】
ヒドロゲルがまた、例えば、ＷＯ９３／０１２８６に記載されているように、アンチセンスオリゴマー投与のためのビヒクルとして使用され得る。あるいは、オリゴヌクレオチドは、ミクロスフェア（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）または微粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）で投与され得る（例えば、Ｗｕら、１９９９を参照のこと）。
【０１２５】
徐放組成物はまた、本出願の範囲内であることが意図される。これらは、フィルムまたはマイクロカプセルのような形状物品の形態で、半透性のポリマー材料を含み得る。
【０１２６】
本発明の方法において使用するための、インビボで有効な用量のｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチドが、投与の頻度および投与の経路、ならびに処置を受けている被験対の状態に従って変化することが理解される。従って、このようなインビボ治療は、一般に、処置される状態に適切な試験よるモニタリング、および最適の治療結果を達成するための、用量または処置レジメンにおける対応する調整を必要とする。
【０１２７】
一つの好ましい実施形態において、このオリゴマーは、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）（薬学的に受容可能なキャリアを含む）であり、そして経口投与される。本実施形態のさらなる局面において、モルホリノｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチドは、短期間の間の規則的な間隔（例えば、２週間以内の間、毎日）で投与される。しかし、いくつかの場合において、アンチセンスオリゴマーは、より長期間にわたって継続的に投与される。
【０１２８】
いくつかの場合において、この処置レジメン（例えば、放射線治療、免疫治療および／またはさらなる化学療法）は、さらなる介在を含む。このような処置は、化学療法剤およびｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーの投与前、投与間、または投与後に行われ得る。
【０１２９】
（ＶＩ．アンチセンスオリゴマーの効果の評価）
（Ａ．アンチセンスオリゴマー処置の効果の分析）
候補アンチセンスオリゴマーを、急性細胞毒性および慢性細胞毒性（例えば、それぞれ３Ｈ−ロイシンおよび３Ｈ−チミジンの取り込みを介して測定されるような、タンパク質合成およびＤＮＡ合成での効果）について、周知の方法に従って、評価する。さらに、種々のコントロールオリゴマー（例えば、センス配列、ナンセンス配列もしくはスクランブルアンチセンス配列、またはミスマッチ塩基を含む配列のようなコントロールオリゴヌクレオチド）により、候補アンチセンスオリゴマーの結合の特異性を確認する。このような試験結果は、無差別の抑止からの遺伝子発現のアンチセンス阻害の特異的な効果を認めるために重要である。（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔら、１９９５を参照のこと）。従って、配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの非標的配列に対する非特異的な結合を制限するのに必要とされる場合、改変され得る。
【０１３０】
標的ＲＮＡとのヘテロ二重鎖を形成する際の、所定のアンチセンスオリゴマー分子の有効性は、当該分野で公知のスクリーニング方法によって決定され得る。例えば、このオリゴマーは、ｃ−ｍｙｃを発現する細胞培養物でインキュベートし、そして標的ＲＮＡ上の効果を、以下の存在または非存在をモニタリングすることによって評価する（１）当業者に公知の手順を使用する、標的配列および非標的配列によるヘテロ二重鎖の形成；（２）ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロットのような標準的な技術によって決定されるようなｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡの量；あるいは（３）ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットのような標準的な技術によって決定されるようなｃ−ｍｙｃタンパク質の量。
【０１３１】
（Ｂ．動物モデル）
抗癌治療を評価するために当業者に慣用的に使用される動物モデルを使用して、本発明の方法の有効性を示した。例は、Ｓｍｉｔｈら、２０００に記載されている。このモデルは、ルイス肺細胞（ＬＬＣ１）、高度腫瘍形成性の肺癌細胞株を、同系Ｃ５７−ｂｌｋマウスに移植することに基づく。ＬＬＣ１は、２００，０００個の細胞がＣ５７−ＢＬマウスの右横腹上に皮下移植される４日まで、かなりの腫瘍を産生する。治療効果を、２５日目の研究の終わりに、腫瘍の長さおよび幅ならびに腫瘍の重量の毎日のキャリパ測定に基づいて評価した。ｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡ（ＡＶＩ−４１２６，配列番号１）に対するＡ２０ベースＰＭＯアンチセンスを、モデルの有効性について評価した。インタクトなＡＶＩ−４１２６を、３００μｇ／マウス／１日でのｉｐ投与後に、腫瘍組織中に見出し、これは、ｃ−ｍｙｃ発現を減少させたが、腫瘍の増殖を有意に減少させなかった。ＡＶＩ−４１２６をまた、ｉ．ｐ．（３００μｇ／マウス／１日）で、化学療法と併用して投与した。シスプラチン（８３μｇ／マウス／１日）（２〜４日目および１３〜１５日目）とＡＶＩ−４１２６（２〜８日目および１３〜１９日目）との同時投与は、シスプラチン単独に対する腫瘍増殖阻害にさらなる効果を有さない（実施例１）。２〜４日目および１３〜１５日目にシスプラチンを投与し、続いて６〜１２日目および１７〜２３日目にＡＶＩ−４１２６を投与した併用レジメンは、シスプラチン単独よりも有意に多く腫瘍増殖を阻害し、抗腫瘍効果が、シスプラチンおよびＡＶＩ−４１２６処置を別々とする用量スケジュールを必要とすることを示した（図８Ａ）。この抗腫瘍活性の増加は、タキソールとの併用により、より少ない範囲のエトポシドで実証された。
【０１３２】
実施例１に記載されるさらなる結果は、ＡＶＩ−４１２６での処置が、ＬＬＣ１腫瘍中のｃ−ｍｙｃの発現を阻害し、そして併用化学療法において、強力な抗癌剤としての可能性を有することを例示する。
【０１３３】
（ＶＩＩ．モニタリング処置）
本明細書中に記載される方法に関する所定の治療レジメンの効果を、例えば、処置下で癌の型に対して適切な診断技術を使用して、モニタリングし得る。
【０１３４】
評価の正確な性質は、処置される状態に依存して変化し、そして処置レジメンは、このような診断試験の結果に基づいて、示されるように、調整（用量、頻度、経路など）され得る。
【０１３５】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する有効なインビボ処置レジメンが、投与の頻度および経路、ならびに処置下の被験体の状態に従って変化する（すなわち、予防的投与  対  局所的感染または全身的感染に応答した投与）ことが理解される。従って、このようなインビボ治療は、一般的に、最適な治療的結果を達成するために、用量または処置レジメンにおいて、処置および対応する調整下で、状態（例えば、癌）の特定の型に適切な試験によってモニターすることを必要とする。
【０１３６】
癌の診断およびモニタリングは、一般的に、（１）生検、（２）超音波、（３）Ｘ線、（４）磁気共鳴画像化、（５）核酸検出方法、（６）血清学的検出方法（すなわち、従来のイムノアッセイ）および（７）他の生化学的方法のうちの１つ以上を含む。このような方法は、定性的または定量的であり得る。
【０１３７】
本明細書中に記載される方法を含む所与の治療レジメンの効力は、例えば、さらに上記されるように、処置下の疾患条件の一般的な指標によってモニターされ得る。
【０１３８】
核酸プローブは、処置下において、ｃ−ｍｙｃ配列または特定の癌に関連する他の核酸配列に基づいて設計され得る。核酸増幅試験（例えば、ＰＣＲ）はまた、このような検出方法において使用され得る。
【０１３９】
疾患状態を示す診断試験および他の生理学的因子の正確な性質が、処置される特定の状態およびこの処置が予防的または治療的のいずれであるかに依存して変化することが理解される。
【０１４０】
被験体が特定の型の癌を有するとして診断された場合、癌の状態はまた、処置下で特定の型の癌をモニターするために当業者によって代表的に使用される診断技術を使用してモニターされる。
【０１４１】
アンチセンスオリゴマー処置レジメンは、処置下でのイムノアッセイ、他の生化学的試験および生理学的試験の結果に基づいて、示されるように、調整（用量、頻度、経路など）され得る。
【０１４２】
（ＶＩＩＩ．本発明の適用／有用性）
本明細書中に記載されるように、従来の癌処置（例えば、化学療法および／または放射線療法）とともに、ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる癌の処置は、癌の増殖および／または拡散を遅延または排除する際の有用性を見出す。例えば、本発明の方法は、（１）癌細胞の増殖を阻害または停止し得；（２）毒性副作用の減少をもたらす、化学療法剤の低用量および／または短期間の投与を可能にし得；（３）化学療法剤に対する耐性の発達の可能性を減少させる、化学療法剤の低用量または短期間の投与を可能にし得；（４）実質的にに変化せず、そして化学療法剤と共沈しない型のアンチセンスオリゴマー（例えば、ＰＭＯ）を提供し得；そして（５）ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマー投与がない処置レジメンにおいて投与される場合の効力に必要とされる化学療法剤の用量に耐えることができない患者集団に対する代替的な効率的な処置レジメンを提供し得る。
【０１４３】
本明細書中に引用される全ての特許および文献の参考文献は、その全体が、本明細書によって参考として援用される。
【０１４４】
以下の実施例は、例示であるが、いかなるようにも本発明を制限するようには意図されない。
【実施例】
【０１４５】
（材料および方法）
（モルホリノオリゴマー合成）ｃ−ｍｙｃ翻訳開始部位（ＡＶＩ−４１２６；配列番号１）、マウスｐ２１配列（配列番号３）、マウスＲＡＤ５１配列（配列番号４）およびスクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）コントロール（配列番号２）に相補的な配列を有するモルホリノホスホロジアミデートオリゴマー（ＰＭＯ）は、ＡＶＩ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ、ＯＲ）によって合成されそして精製される。精製は、逆相ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分析法によって決定されるように、９０％より高かった。凍結乾燥されたＰＭＯを、注射のための滅菌生理食塩水中に溶解させた。
【０１４６】
（腫瘍細胞）本明細書中で記載される研究において使用されるＬｅｗｉｓ肺細胞株（ＬＬＣ１）は、１９５１年に、Ｍ．Ｒ．Ｌｅｗｉｓ博士によって樹立されたＬｅｗｉｓ肺癌に由来し、そして、癌化学療法剤の評価のために使用されている（Ｍａｙｏ，１９７２；Ｂｅｒｔｒａｍら、１９８０）。Ｌｅｗｉｓ肺癌細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）は、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、およびアンホテリシン（０．２５μｇ／ｍｌ）を補充したＤＭＥＦ−１２培地中、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気湿潤インキュベーター中で、維持した。細胞を、移植のとき、対数増殖期の約７０％コンフルエントな培養物として採取し、そして培地中の細胞懸濁物として、１００μｌ注射当たり２００，０００個の細胞の濃度で注射した。
【０１４７】
（同系のマウス）２２ｇ〜２４ｇの体重のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ、Ｇｉｌｒｏｙ、ＣＡ）を、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  ａｔ  Ｏｒｅｇｏｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＯＳＵ），Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，ＯＲにおいて、滅菌プラスチックケージ内に収容した。マウスに齧歯動物の食料（Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を利用可能にし、水道水を自由に与え、そして１２時間明／暗サイクルに曝した。１９７５年のヘルシンキ宣言の倫理指針に確認される全ての動物プロトコルは、ＯＳＵの「Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ」によって認証された。
【０１４８】
（ｃ−ｍｙｃタンパク質のイムノブロット分析）全ての抗体を、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から得た。３００μｇのＬＬＣ１タンパク質溶解物を、１２％ｖ／ｖドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）／アクリルアミド分離ゲルを用いて５％ＳＤＳ／アクリルアミドスタッキングゲルにおいて分析した。ゲルを、標準的なウェスタンブロットプロトコルに従って、ブロットし、プローブし、そして可視化した。膜を、ブロック緩衝液（Ｇｅｎｏｔｅｃｈ）中で１：２０００に希釈したウサギ抗マウスｃ−ｍｙｃポリクローナル抗体Ｎ−２６２（ｓｃ−７６４）またはＣ−１９（ｓｃ−７８８）、続いて、ヤギ抗ウサギＨＲＰ結合抗体（ｓｃ−２０５４）を用いてプローブした。ｃ−ｍｙｃおよびアクチンタンパク質の相対量を、ＥＣＬｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によって可視化し、そして１Ｄ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ  ＮＹ）を使用して、Ｋｏｄａｋ  ４４０  Ｉｍａｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎにおいて分析した。次いで、膜を、ストリッピング緩衝液（Ｇｅｎｏｔｅｃｈ）において、２０分間２５℃で浸し、そしてヤギ抗マウスβ−アクチンポリクローナル抗体（ｓｃ−１６１６）の１：２０００希釈を用いて再プローブし、これを、タンパク質ローディングコントロールとして供給し、続いて、ロバ抗ヤギＨＲＰ結合抗体（ｓｃ−２０５６）を用いて再プローブした。
【０１４９】
（ＬＬＣ１腫瘍組織におけるＡＶＩ−４１２６のＨＰＬＣ検出）腫瘍組織溶解物（腫瘍保有マウスへの１００μｇのＡＶＩ−４１２６の単回注射の４時間後に調製される）におけるＡＶＩ−４１２６の存在を、ＡＶＩ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ（Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，ＯＲ）において開発された５’−フルオレセイニルＤＮＡ：ＡＶＩ−４１２６（ＦＤＮＡ：ＡＶＩ−４１２６）二重検出方法によって決定した。簡単に述べると、ＦＤＮＡプローブに相補的な１５マーの内部ＰＭＯ標準（５’−ＧＡＧＧＧＧＣＡＴＣＧＴＣＧＣ−３’（配列番号１４））の５００ｎｇの内部標準（２．２９ｍｇ  ＰＭＯ／０．０２５Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液１ｍＬの１０μｌ、ｐＨ＝８）を、各腫瘍組織溶解物に添加した。溶解物を、２５０μｌメタノールと合わせ、そして徹底的に混合した。サンプルを、１５，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を除去し、そしてｇ  １０分間、７０℃まで加熱した。サンプルを１０分間遠心分離し、そして上清を、１時間低熱で、Ｓａｖａｎｔ  ＳＣ１１０スピードバキュームにおいて乾燥した。次いで、乾燥したサンプルを、透明シェルバイアル中で、１００μｌ  Ｔｒｉｓ緩衝液と合わせ、そして凍結乾燥した。各凍結乾燥したサンプルを、ＡＶＩ−４１２６に相補的な配列を有する１．０  ＯＤ／ｍｌの５’フルオレセイニルＤＮＡプローブ（ＦＤＮＡ、５’−フルオレセイニル−ＧＣＧＡＣＧＡＴＧＣＣＣＣＴＣＡＡＣＧＴ−３’（配列番号１５））の１００μｌアリコートを用いて再水和した。
【０１５０】
次いで、全体で１００μｌのサンプルを、蛍光検出を用いて、逆相ＨＰＬＣを使用して、ＦＤＮＡ：ＡＶＩ−４１２６二重鎖の存在について分析した。サンプルを、蛍光検出器およびＡＩ−２００オートサンプラー（１００μｌ注入ループ容積）を備えるＶａｒｉａｎ  ＨＰＬＣポンプ（モデル９０１０  ｉｎｅｒｔ）を使用して、Ｄｉｏｎｅｘ  ＤＮＡＰａｃ  ＰＡ−１００カラム（４×２５０）に注入した。移動相（Ａ：０．０２５Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝８およびＢ：０．０２５Ｍ  Ｔｒｉｓ／１Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ＝８）を、使用前に０．２ミクロンフィルターを通したＨＰＬＣグレード溶媒を使用して調製した。ポンプ勾配プログラムは、４９４ｎｍ（励起）および５１８ｎｍ放出波長での経口検出を用いて、１．５ｍｌ／分の流速で、９０％Ａ＋１０％Ｂ（０分）および５５％Ａ＋４５％Ｂ（２０分）であった。
【０１５１】
（白金／シスプラチンのＩＣＰ−ＭＳ検出および定量）組織溶解物（ＬＬＣ１腫瘍組織の４０ｍｇ）の２００μＬアリコートを、１．３３ｍＬの王水に溶解させ、続いて、１０倍に希釈した。次いで、サンプルを、Ａｎａｔｅｋ  Ｌａｂｓ（Ｍｏｓｃｏｗ，ＩＤ）によるＬｏｎｇら（１６）の方法に従って、Ｐｔの存在についてＩＣＰ−ＭＳ技術によって分析した。
【０１５２】
（統計的分析）平均±ＳＥＭとして報告される全てのデータを、コンピュータープログラムＩｎＳｔａｔ２（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）によって決定した。ｐ値を、ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙ複数比較試験を使用して、ＩｎＳｔａｔ２によって計算した。グラフ、線形回帰、および勾配を、Ｐｒｉｓｍ  ｖ２．０（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して生成した。
【０１５３】
（実施例１）
（ＡＶＩ−４１２６および化学療法を用いた腫瘍研究）
５日の馴化に続いて、上記のように世話をされたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ，Ｇｉｌｒｏｙ，ＣＡ）を、イソフランを用いて麻酔し、剃毛し、そして約２００，０００の生存可能なＬＬＣ１細胞を、皮下的に、右背脇腹に注射した（研究０日目）。固形の均一な腫瘍増殖が、ＬＬＣ１細胞注射の４日後に一定に得られることを確実にするために、注射部位を、毎日モニターした。化学療法注射を、ｉ．ｐ．注射の前に、毎日新たに調製した（表１を参照のこと）。全てのＰＭＯおよびシスプラチン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、０．１ｍｌの注射容量に調整して、滅菌の非発熱性生理食塩水（Ｓｉｇｍａ）中に溶解した。タキソールストック溶液（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｅ  ＥＬおよびエタノール中の６ｍｇ／ｍｌ、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ，Ｓｙｒａｃｕｓｅ，ＮＹ）を、注射の前に、１×ＰＢＳ中、１ｍｇ／ｍｌに希釈した。エトポシド（Ｓｉｇｍａ）ストック溶液を、１１ｍｇ／ｍｌで７０％エタノールに溶解し、続いて、５ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで生理食塩水で希釈することによって調整した。５−ＦＵ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を、１２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で、生理食塩水中に溶解した。
【０１５４】
ｃ−ｍｙｃ翻訳開始部位（ＡＶＩ−４１２６；配列番号１）、マウスｐ２１配列（配列番号３）、マウスＲＡＤ５１配列（配列番号４）およびスクランブルコントロール（配列番号２）に相補的な配列を有するモルホリノホスホロジアミデートオリゴマー（ＰＭＯ）を、上記のように合成し、そして精製した。
【０１５５】
最初の研究を、腫瘍におけるＡＶＩ−４１２６レベルを決定するため、およびｃ−ｍｙｃタンパク質レベルの配列特異的阻害を評価するために実施した。ＬＬＣ１移植の２４日後に、腫瘍を有するマウスに、生理食塩水、ＡＶＩ−４１２６またはスクランブルコントロール（１００μｇ／マウスＩＰ）のいずれかの注射を与えた。腫瘍を、４時間後に切り出し、そしてＡＶＩ−４１２６について評価し、そして以下に記載されるように、ｃ−ｍｙｃタンパク質について、イムノブロットによって分析した。
【０１５６】
３つの研究（Ａ、Ｂ、およびＣ）に使用される処置群を、表１に要約する。動物を以下に記載されるように処置した。治療効力を、デジタルカリパーを用いた腫瘍面積（長さ×幅、ｃｍ２）の毎日の測定および安楽死のときに決定された腫瘍質量に基づいて、評価した。全ての研究において、マウスは、ＰＭＯ処置の最終日に、ＣＯ２での窒息によって安楽死させた。腫瘍を迅速に除去し、秤量し、そして約０．２５ｇの腫瘍組織を、組織のホモジネーションの３０分前に溶解緩衝液中に溶解されたプロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット（ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ  Ｍｉｎｉ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含む１．０ｍｌ  Ｔｉｓｓｕｅ−ＰＥ溶解緩衝液（Ｇｅｎｏｔｅｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中でホモジネートさせた。溶解物を、１５，０００×ｇで、１５分間４℃で遠心分離し、上清の１５０μｌのアリコートを、電気泳動サンプルと１：１で合わせ、そして１００℃で５分間煮沸した。
【０１５７】
（表２．併用化学療法レジメン）
【０１５８】
【表３】
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（Ａ．ＡＶＩ−４１２６は、ＬＬＣ１腫瘍組織において検出可能である）ＡＶＩ−４１２６のＨＰＬＣ蛍光検出を、ＡＶＩ−４１２６または生理食塩水で処置されたマウスからの腫瘍組織溶解物において実施した。ＦＤＮＡ：ＡＶＩ−４１２６二重鎖を表す蛍光ピークを示す代表的なＨＰＬＣ分析は、ＡＶＩ−４１２６で処置されたマウスにおいてのみ容易に検出可能である（図４Ｃ）。ＡＶＩ−４１２６の分解の証拠は、観測されなかった。ＡＶＩ−４１２６の投与は、腫瘍組織における白金レベルに影響しなかった（データは示さず）。
【０１５９】
（Ｂ．ＡＶＩ−４１２６は、ＬＬＣ１腫瘍組織におけるｃ−ｍｙｃレベルを減少する）イムノブロット分析を、腫瘍組織におけるｃ−ｍｙｃレベルを検出するために実施した。ＡＶＩ−４１２６の単回注射は、生理食塩水およびスクランブルＰＭＯコントロールにおいて検出されたレベルに対して、７７％および６３％だけ、ｃ−ｍｙｃのレベルを減少した（図５Ａ）。ｃ−ｍｙｃは、生理食塩水、ＡＶＩ−４１２６単独、シスプラチン、または表２Ａ、群（５）に記載されるＡＶＩ−４１２６およびシスプラチンの組合せを用いて処置されたマウスから採取された腫瘍からの溶解物において、同様に、コントロールと比較した減少をした。（図７および８Ａを参照のこと）。
【０１６０】
別々の用量のＡＶＩ−４１２６およびシスプラチンで処置された動物は、イムノブロット分析を実施するのに十分な腫瘍組織を生じなかった。生理食塩水処置群またはＡＶＩ−４１２６処置群における代表的な動物からの４つの腫瘍は、図６Ａおよび図６Ｂに提示され、これらは、ｎ−末端特異的ｃ−ｍｙｃ抗体およびｃ末端特異的ｃ−ｍｙｃ抗体を用いてプローブされたイムノブロットの画像を示す。β−アクチンタンパク質レベルに正規化されたバンド強度の分析（図６Ｃ）は、生理食塩水またはＡＶＩ−４１２６のみを用いて処置された動物からの代表的な腫瘍における生理食塩水コントロールと比較して、７４％（ｎ−末端抗体、図６Ａ）および６１％（ｃ末端抗体、図６Ｂ）の阻害ｃ−ｍｙｃレベルを明らかにする。バンドは、約６６ｋＤを示し、ＡＶＩ−４１２６によって引き起こされたヒト細胞におけるｃ−ｍｙｃスプライス改変体について報告された３８ｋＤバンドの証拠がなかった（１３）。図７Ａに提示されるイムノブロット分析は、シスプラチン＋ＡＶＩ−４１２６を投与されたマウスが、ｃ−ｍｙｃの減少（生理食塩水と比較して７２％）を明らかにした。生理食塩水と比較して、シスプラチン処置群におけるｃ−ｍｙｃレベル間に統計的な差異はなかった。
【０１６１】
（Ｃ．ＡＶＩ−４１２６およびシスプラチンを用いた併用化学療法の抗腫瘍効果は、スケジュール依存性である）全ての処置群についての毎日の腫瘍面積を、図８Ａ〜Ｃに提示する。腫瘍増殖を、シスプラチンが、単独で投与されたか、ＡＶＩ−４１２６と同時投与されたか、またはＡＶＩ−４１２６処置との交互レジメンで投与された、併用研究で、分析した。腫瘍を有するマウスに、ＡＶＩ−４１２６がシスプラチンと同時投与される２回の処置を与えた場合（表２Ａ、群５を参照のこと）、腫瘍増殖速度および研究の終了における質量は、シスプラチン単独と異ならなかった（データは、示さず）。しかし、シスプラチンを受容した群の腫瘍増殖速度は、ＡＶＩ−４１２６単独または生理食塩水で処置された群よりも、有意に低かった（ｐ＜００１）。
【０１６２】
腫瘍を有するマウスに、シスプラチンおよびＡＶＩ−４１２６の投与を揺らがせた（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）２回のレジメンを投与された（表２Ａ、群４）場合、２回のシスプラチン単独（ｐ＜００１）または生理食塩水（ｐ＜００１）を投与されたマウスと比較して、腫瘍増殖速度の減少があった（図８パネルＡおよび表３）。シスプラチンおよびＡＶＩ−４１２６処置を交互にしたレジメンからの腫瘍の部検は、非常に小さい非侵襲性の腫瘍節を明らかにしたが、シスプラチン単独ならびにシスプラチンおよび同時投与されるＡＶＩ−４１２６で処置されたマウスは、非常に侵襲性で、脈管新生した。
【０１６３】
ＡＶＩ−４１２６とエトポシド、タキソールまたは５−ＦＵの投与を交互にしたさらなる研究は、増強した効力が、化学療法に依存することを明らかにした。シスプラチンは、最も効果的であり、エトポシドおよびタキソールが続く。全ての３つの薬剤の効力が、ＴＧＲによって示されるようなそれぞれの単一薬剤処置レジメンまたは生理食塩水と比較して、全ての３つの処置について、処置レジメンに対するＡＶＩ−４１２６の添加によって有意に向上された（ｐ＜００１）。５−ＦＵは、単一薬剤としてまたはＡＶＩ−４１２６との組合せて、比較的非効率的であった（表３および図８Ｄを参照のこと）。
【０１６４】
ＡＶＩ−４１２６についてのコントロールＰＭＯオリゴマーは、広範に研究されており、以前に報告されている（Ｈｕｄｚｉａｋら、２０００）。
【０１６５】
スクランブルコントロールＰＭＯ（配列番号２）は、ｃ−ｍｙｃレベルに対して効果を有さなかった。ＡＶＩ−４１２６と同じプロトコルでＰＭＯ骨格を試験するために、２つのＰＭＯを使用し、上記のように、ｐ２１ＡＳ（配列番号３）およびＲＡＤ５１ＡＳ（配列番号４）を合成し、ＡＶＩ−４１２６で効果的であった同じレジメンを使用するこのモデルで試験した。これらの配列は、シスプラチンと併用された場合、向上した効果を生じなかった。これらの分子について腫瘍増殖速度および研究の最後での質量を、表３に示す。
【０１６６】
要約すると、表３に示された結果は、ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーが、シスプラチン、エトポシド、またはタキソールのいずれかを用いる交互レジメンで投与される処置プロトコルが、腫瘍増殖速度（ＴＧＲ）および腫瘍サイズにおいて有意な減少を生じた（それぞれ、１８．６％、３６．８％、５０．９％）。
【０１６７】
（表３．種々の併用処置についての腫瘍質量および増殖速度の要約）
【０１６８】
【表４】
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＊腫瘍増殖速度は、腫瘍面積における変化が線型である場合の、１４日目〜２５日の腫瘍面積の変化を分析するための線形回帰を使用して、計算した。提示されるデータは、勾配±標準偏差である。
【０１６９】
（表４．本発明の支持に提供される配列）
【０１７０】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】図１は、ポリマーを形成するために適切な、５原子連結基（Ａ）、６原子連結基（Ｂ）、および７原子連結基（Ｃ〜Ｄ）を有する、いくつかの好ましいモルホリノ系サブユニットを示す。
【図２】図２Ａ〜Ｄは、それぞれ図１のサブユニットＡ〜Ｄを使用して構築された、例示的なモルホリノオリゴヌクレオチド（Ａ〜Ｄと印される）の繰返しサブユニットセグメントを示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｇは、オリゴヌクレオチドアナログにおける無電荷の連結型の例を示す。
【図４】図４Ａ〜Ｃは、生理食塩水またはＡＶＩ−４１２６での１回の腹腔内注射で処理されたＬＬ腫瘍保有マウス由来の腫瘍組織を代表する、逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。この図は、参照コントロールクロマトグラム（図４Ａ）、生理食塩水（図４Ｂ）または３００μｇのＡＶＩ−４１２６（図４Ｃ）で処理されたマウス由来の腫瘍溶解物を代表するクロマトグラムを提供する。
【図５】図５ＡおよびＢは、生理食塩水（レーン１および２）；１００μｇのｃ−ｍｙｃのスクランブル（混合）コントロールオリゴマーアンチセンスオリゴマー（配列番号２；レーン３および４）；または１００μｇのＡＶＩ−４１２６アンチセンスオリゴマー（配列番号１；レーン５および６）を１回注射された、大きな樹立されたＬＬ腫瘍を保有するマウス由来の溶解物における、ｃ−ｍｙｃおよびβ−アクチンタンパク質の代表的な免疫ブロット分析の結果を示す；ここで、レーン７は、ｃ−ｍｙｃに対する陽性コントロールである。
【図６】図６Ａ〜Ｃは、生理食塩水（レーン２〜５）およびＡＶＩ−４１２６（レーン６〜９）で処理されたマウス由来の、代表的な腫瘍溶解物のウェスタンブロットの画像を提供する。レーン１は、ｃ−ｍｙｃ陽性コントロールであり、ここで、パネルＡは、Ｎ末端ｃ−ｍｙｃ抗体でプローブされ、パネルＢは、Ｃ末端ｃ−ｍｙｃ抗体でプローブされ、そしてパネルＣは、β−アクチン抗体でプローブされ、そして負荷コントロールとして働く。
【図７】図７ＡおよびＢは、生理食塩水（レーン１〜２）、シスプラチン（レーン３〜４）およびシスプラチンとＡＶＩ−４１２６（レーン５〜６）で処理された群由来の、代表的な腫瘍溶解物のウェスタンブロットの画像を提供する。図４Ａは、ブロットをＮ末端ｃ−ｍｙｃ抗体でプローブした場合の結果を示し、そして図４Ｂは、ブロットをβ−アクチン抗体でプローブした場合の結果を負荷コントロールとして示す。
【図８】図８Ａ〜Ｄは、表１に記載されるような併用化学療法処置における、ＡＶＩ−４１２６の効果を示し、ここで、ＡＶＩ−４１２６は、シスプラチン（図８Ａ）、タキソール（図８Ｂ）、エトポシド（図８Ｃ）、および５−ＦＵ（図８Ｄ）との交互処置レジメンで投与される。
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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