(57)【要約】そのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列が下記（Ａ）に与えられたポルテレシアコアルクタタの塩耐性Ｌ−ミオイノシトール−１−ホスフェートシンターゼ（ＰＩＮＯ１）。
2006515519.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）に示すようなヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列の、ポルテレシアコアルクタタ（Ｐｏｒｔｅｒｅｓｉａ  ｃｏａｒｃｔａｔａ）由来の塩耐性Ｌ−ミオイノシトール−１−ホスフェートシンターゼ（ＰＩＮＯ１）。
Ａ．ＰＩＮＯ１のヌクレオチド及び推定アミノ酸配列：
2006515519.tif 000006
【請求項２】
ＰＩＮＯ１のヌクレオチド配列が、栽培されたコメ由来のＬ−ミオイノシトール−１−ホスフェートシンターゼであるＲＩＮＯ１と比べて、さらに２個のアミノ酸を含み、５１２個のアミノ酸を含む蛋白質を生じる、請求項１に記載のコードＤＮＡ配列。
【請求項３】
塩耐性Ｌ−ミオイノシトール−１−ホスフェートシンターゼ遺伝子を得る方法であって、
（ｉ）ポルテレシアコアルクタタの葉から前記Ｌ−ミオイノシトール−１−ホスフェートシンターゼ遺伝子の全長ｃＤＮＡを、逆転写とそれに続くポリメラーゼ連鎖反応によって単離すること、
（ｉｉ）前記単離されたＬ−ミオイノシトール−１−ホスフェートシンターゼ遺伝子を配列決定すること
を含む方法。
【請求項４】
適当な細菌発現ベクターｐＥＴ  ２０Ｂ（＋）にＰＩＮＯ１の前記単離された全長ｃＤＮＡをクローニングして、発現プラスミドを作製する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
発現ＰＩＮＯ１遺伝子産物を得るために、前記プラスミドを、宿主株Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ−２１（ＤＥ３）に導入した、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記発現ＰＩＮＯ１蛋白質を、８Ｍ尿素、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭＥ、及び２ｍＭ  ＰＭＳＦを含む可溶化緩衝液中に可溶化する、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、塩耐性Ｌ−ミオイノシトール−１−ホスフェートシンターゼ及びそれを得る方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
農業バイオテクノロジーにおいて、長年の目標の１つは、塩分、乾燥及び温度の媒介による脱水（これらは全て直接の浸透圧ストレスを導くものである）などの環境ストレスに対する作物植物（ｃｒｏｐ  ｐｌａｎｔ）の耐性を向上させることである。そのような非生物的なストレス条件に対して植物が反応する機構の１つは、適合溶質又は浸透保護剤と呼ばれる非毒性生体分子を合成することによる。これらの化合物は、３種のカテゴリー、即ち、アミノ酸（例えば、プロリン）、オニウム化合物（例えば、グリシンベタイン、ジメチルスルホニオプロピオネート）、及びポリオール／糖（例えば、イノシトール、オノニトール／ピニトール、マンニトール、トレハロース）に分類される。代謝工学技術によってこれら化合物の合成における重要なステップをコードする遺伝子を移入することで浸透圧保護剤を過剰生産させることは、生物工学技術者にとってストレス耐性の作物植物を作製するための選択肢である。そのようなアプローチは、原核生物系及び真核生物系において限定的な成功をおさめている。さらに重要なことは、その操作の重要なステップが、ストレス耐性の酵素蛋白質をコードすること自体であることを回避可能な点である。
【０００３】
選択されたオスモライト（ｏｓｍｏｌｙｔｏｓ）の過剰生産を伴う代謝工学は、植物や他の有機体においてストレス耐性表現型を付与するための１つの選択肢であるが、その作用のためにストレス耐性の遺伝子／酵素を使用した系は１つもなかった。それ故、トランスジェニック系における標的遺伝子／酵素の機能的な発現は、予測不能のままであった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
この発明の目的は、塩耐性Ｌ−ミオ−イノシトール−１−ホスフェートシンターゼ遺伝子を作製することである。
【０００５】
この発明の他の目的は、イノシトール生産のための塩耐性遺伝子を得る方法を提供することである。
【０００６】
この発明のさらなる目的は、モデル作物植物において塩耐性Ｌ−ミオイノシトール−１−ホスフェートシンターゼを遺伝子移入して、その機能的発現によって光合成の機能が減退することなく塩の存在下で生育する能力をもたらすことである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ポルテレシアコアルクタタ（Ｐｏｒｔｅｒｅｓｉａ  ｃｏａｒｃｔａｔａ）由来の塩耐性Ｌ−ミオイノシトール−１−ホスフェートシンターゼを提供する。
【０００８】
また本発明により、塩耐性ミオイノシトール−１−ホスフェートシンターゼ遺伝子を得る方法であって、
（ｉ）ポルテレシアコアルクタタ（ＰＩＮＯ１）の葉から前記Ｌ−ミオイノシトール−１−ホスフェートシンターゼ遺伝子の全長ｃＤＮＡを、逆転写とそれに続くポリメラーゼ連鎖反応によって単離すること、
（ｉｉ）前記単離されたＬ−ミオイノシトール−１−ホスフェートシンターゼ遺伝子を配列決定すること、
（ｉｉｉ）発現プラスミド構築物を得るために適当な細菌発現ベクターにＰＩＮＯ１の前記単離された全長ｃＤＮＡをクローニングすること
を含む方法が提供される。
形質転換による細菌宿主株Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）への発現プラスミド構築物の導入、及びＩＰＴＧによるＰＩＮＯ１遺伝子産物の発現の誘導。
【０００９】
前記発現されたＰＩＮＯ１遺伝子産物の封入体としての単離、８Ｍ尿素、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  βメルカプトエタノール（ＭＥ）及び２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含む緩衝液中での活性酵素蛋白質の可溶化と単離、並びに均一にするための完全な精製。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
ポルテレシアコアルクタタ（ＰＩＮＯ１）由来のＬ−ミオイノシトール−１−ホスフェートシンターゼ遺伝子のクローニングと配列決定、並びに該遺伝子とオリザサチバ（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ）（ＲＩＮＯ１）由来のものとの比較
【００１１】
Ｌ−ミオイノシトール−１−ホスフェートシンターゼ遺伝子の全長ｃＤＮＡが、ポルテレシアコアルクタタ（ＰＩＮＯ１）及びオリザサチバ（ＲＩＮＯ１）の葉のポリＡ（ＲＮＡ）から、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって得られている。全ＲＮＡを、オリザ及びポルテレシアの成熟した葉からＯｓｔｒｅｍらの方法（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４、１２７０〜１２７５頁、１９８７年）にしたがって単離した。該全ＲＮＡからポリＡ−ＲＮＡを、ｐｏｌｙＡｔｒａｃｔ  ｍＲＮＡ単離キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって製造元の指示にしたがって単離した。２０〜３０ｎｇのポリＡ−ＲＮＡを、製造元のプロトコルにしたがってＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＮＡ分解酵素Ｈ−逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｓｔｓ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いた第１のｃＤＮＡ合成に使用した。このように合成したｃＤＮＡを、イノシトールシンターゼ遺伝子のＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。オリザ（ＲＩＮＯ１）とポルテレシア（ＰＩＮＯ１）のイノシトールシンターゼの全長ｃＤＮＡのクローニングのために、センス（５’〜３’）及びアンチセンス（３’〜５’）オリゴヌクレオチドプライマーを、公表されたＲＩＮＯ１配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０１２１０７）に基づいて設計し、ＰＣＲ増幅を以下の通り行った：９４−１分［９４−１．５分、５５、１．５分、７２、２分］×３２回、７２、１０分。製造元の指示にしたがって、該増幅産物が予想どおりのサイズ（約１．５ｋｂ）であるか否かを調べ、ゲルからバンドを溶出させ、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、ｐＧＥＭ  Ｔ−Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に、４℃で一晩にわたり連結させた。連結混合物を、高性能ＪＭ１０９競合細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）の形質転換のために使用し、形質転換体を、一晩増殖させたアンピシリン／ＩＰＴＧ／Ｘ−ｇａｌプレート上での青／白選択に基づいて選択した。プラスミドのミニプレップ（Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ）を形質転換体から単離し、該ＤＮＡをＥｃｏＲ１で切断し、切断したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で解析して、約１．５ｋｂと予想される挿入断片の有無を調べた。挿入断片サイズを確認した後、プラスミドＤＮＡを形質転換体から単離し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。クローンは、オリザサチバからのイノシトールシンターゼの遺伝子をＲＩＮＯ１として、ポルテレシアコアルクタタからのものをＰＩＮＯ１として特定した。
【００１２】
各クローンのヌクレオチド配列を自動ＤＮＡ配列決定法で決定した。配列決定方法は、以下の指定プライマーによるクローンの配列決定サイクルを数回行うものである：
１．第１回目は、５’末端にＴ７プロモーターのプライマーを用い、３’末端にＳＰ６プロモーターのプライマーを用いた。
２．第２回目は、ＲＴ−ＰＣＲ増幅に使用されたとき遺伝子の５’末端と３’末端に設計されたプライマーを用いた。
３．第３回目の配列決定では、開始部位から約２５０塩基対下流と終止部位の２５０ヌクレオチド上流の位置に設計されたプライマーを用いた。
【００１３】
各セットの配列決定データをまとめ、比較して、ポルテレシアコアルクタタからのＬ−ミオイノシトール−１−ホスフェート（ＰＩＮＯ１）及びオリザサチバからのＬ−ミオイノシトール−１−ホスフェート（ＲＩＮＯ１、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＢ０１２１０７）の完全な配列を明らかにした。ＰＩＮＯ１の完全な配列を下記に示す。
ＰＩＮＯ１配列：
2006515519.tif 000003
【００１４】
この配列は、ＧｅｎＢａｎｋに提出されており（寄託番号ＡＦ４１２３４０）、２００３年６月２３日まで秘密に保たれる。
【００１５】
ＰＩＮＯ１のアミノ酸配列とＲＩＮＯ１のアミノ酸配列との比較
2006515519.tif 000004
【００１６】
解析によって、ＰＩＮＯ１遺伝子のヌクレオチド配列はかなり非同一性であり、ＲＩＮＯ１とＰＩＮＯ１は、アミノ酸配列において中間部（ＰＩＮＯ１のアミノ酸１７３からアミノ酸３２０のあいだ）の約１１０個の領域について異なっている遺伝子産物を生じ、遺伝子の他の部分は完全な同一性を有するということが明らかにされた。非同一性部分は、欠失／付加を含み、ＲＩＮＯ１で報告されているアミノ酸５１０個に代えアミノ酸５１２個を持つ蛋白質をもたらすＰＩＮＯ１の場合には、さらに２個のアミノ酸を伴う保存的置換を含んでいる。
【００１７】
細菌発現ベクターにおけるＲＩＮＯ１とＰＩＮＯ１の発現：
ＲＩＮＯ１とＰＩＮＯ１のｃＤＮＡを細菌発現ベクターｐＥＴ  ２０Ｂ（＋）の適切なクローニング部位にサブクローニングした。得られたプラスミドを宿主株Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ−２１（ＤＥ３）に導入した。該細菌を、ＬＢ培地で０．５吸光度単位のＡ６００まで増殖させ、３０℃で６時間のあいだ０．５ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。該細菌を、遠心分離で収集し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、各１０ｍＭのＮＨ４ＣｌとＭＥ、２ｍＭ  ＰＭＳＦを含む緩衝液中で超音波処理によって溶解した。溶解抽出物を遠心分離し、可溶性及び膜の分画の両方からの蛋白質を、Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｎａｔｕｒｅ、２２７、６８０〜６８５頁、１９７０年）にしたがった１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続く免疫検出用ウエスタンブロットによって解析した。分離した蛋白質をＰＶＤＦ膜上にブロットし、そのブロットを、エントアメーバの精製した組換えＬ−ミオイノシトール−１−ホスフェートシンターゼ（Ｌｏｈｉａら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．、９８、６７〜７９頁、１９９９年）又はオリザの葉由来の精製した細胞基質性Ｌ−ミオイノシトール−１−ホスフェートシンターゼに対して産生されたウサギの抗Ｌ−ミオイノシトール−１−ホスフェートシンターゼ抗体（１：５００）で探った。結合抗体をケミルミネッセンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓからのキット）によって検出した。このような実験の結果は、ＲＩＮＯ１とＰＩＮＯ１の両方が主に膜分画で発現された（図２、ＡとＢ、レーン１と３）ことを示している。
【００１８】
発現ＲＩＮＯ１及びＰＩＮＯ１蛋白質の可溶化：
発現ＲＩＮＯ１及びＰＩＮＯ１蛋白質を、室温で３０分間保った可溶化緩衝液（８Ｍ尿素、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭＥ、２ｍＭ  ＰＭＳＦ）中において、ペレット分画から可溶化した。可溶化サンプルを１５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清を取り、同じ緩衝液中で尿素濃度を８Ｍから２Ｍへ段階的に希釈して連続的に透析した。可溶化サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロットでＲＩＮＯ１及びＰＩＮＯ１蛋白質について調べた（図３、ＡとＢ、レーン２と４）。可溶化後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって、発現蛋白質が可溶化分画（図３Ａ）にあることが明らかにされ、これを、ウエスタンブロット解析（図３Ｂ）で再度確認した。
【００１９】
可溶化ＲＩＮＯ１及びＰＩＮＯ１蛋白質の精製：
透析されたサンプル内の蛋白質を、当研究所（ＲａｙＣｈａｕｄｈｕｒｙら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１１５、７２７〜７３６頁、１９９７年）から以前に記述された手順でＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｃｅｌ及びＢｉｏｇｅｌ  Ａ０．５によって精製した。可溶化透析サンプルを取り、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｃｅｌカラム（ベッドボリューム２０ｍｌ）に載せた。カラムへの蛋白質の吸収を２時間行った後、流出物を回収し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、各１０ｍＭのＮＨ４ＣＬとＭＥ、２ｍＭ  ＰＭＳＦ、２０％グリセロールを含む緩衝液Ａで洗浄した。洗浄は、非結合蛋白質の溶出のために上記ベッドボリュームの約３倍の体積の緩衝液を使い、分画のＡ２８０が０に近づくまで行った。結合蛋白質を、緩衝液Ａ中でＮＨ４Ｃｌ濃度の０．０１から０．２５Ｍまでの直線的勾配液６０ｍｌで溶出させた。複数の１ｍｌの分画を０．４ｍｌ／分の速度で回収した。イノシトールシンターゼ活性を有する分画を集め、濃縮し、緩衝液Ａを２Ｌ交換して４℃で６時間透析した。透析濃縮した集められたＤＥＡＥ分画をＢｉｏｇｅｌ  Ａ０．５カラムに載せ、ベッドボリュームの３倍の緩衝液Ａで予備平衡化した。蛋白質を緩衝液Ａを用いて０．１ｍｌ／分の流速で複数の０．５ｍｌの分画に溶出させた。イノシトールシンターゼ活性を含む分画を集め、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）１０ｍＭ  ＭＥの２Ｌの１回交換で透析した。
【００２０】
発現ＲＩＮＯ１及びＰＩＮＯ１蛋白質の生化学的特性決定
精製された細菌性発現ＲＩＮＯ１及びＰＩＮＯ１蛋白質の生化学的特性を決定した（表１）。基質（グルコース６ホスフェート）及びコファクター（ＮＡＤ）のＫｍ及びＶｍａｘ値の推定値を、Ｌｉｎｅ−Ｗｅａｖｅｒ  Ｂｕｒｋ解析法を使い、Ｂｉｏｇｅｌ  ０．５Ａで精製した組み換えシンターゼを用いて得た。オリザ（ＲＩＮＯ１）とポルテレシア（ＰＩＮＯ１）の組換えシンターゼのグルコース６ホスフェートに対するＫｍ値の間には違いがある。ポルテレシア（ＰＩＮＯ１）の組換えシンターゼのグルコース６ホスフェートに対するＫｍ値がより低いことは、オリザ組換えシンターゼ（ＲＩＮＯ１）に比べて、基質特異性がより高いことを示している。どちらの場合も最適酵素活性は３７℃のときであったが、ポルテレシア組換えシンターゼ（ＰＩＮＯ１）の最適ｐＨは８．０であり、オリザ組換えシンターゼ（ＲＩＮＯ１）では７．５であった。
【００２１】
塩感受性に関して、ＲＩＮＯ１及びＰＩＮＯ１蛋白質は大きく異なっている。精製された天然の酵素（図４、Ａ）の場合のように、発現組換えＲＩＮＯ１及びＰＩＮＯ１蛋白質は、塩感受性／耐性特性（図４、Ｂ）に関して同様の特徴を示す。天然及び組換えＲＩＮＯ１蛋白質はどちらもインビトロでＮａＣｌに対して感受性であるが、ＰＩＮＯ１の蛋白質は、インビトロ条件下でＮａＣｌ濃度５００ｍＭまでは塩に対して耐性であることが判明しており、これは、両者の発現遺伝子産物が、天然酵素蛋白質と同様の塩感受性及び塩耐性特性を保持していることの証拠を提示している。
【表１】
2006515519.tif 000005
【００２２】
本発明を添付図面と実施例を参照して以下に詳細に説明するが、該図面と実施例は、発明の単なる例示であり、発明の範囲をいかようにも限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００２３】
ＲＩＮＯ１とＰＩＮＯ１の構造的研究：蛍光、円偏光二色性及びゲル濾過研究
塩分ストレスに対するＲＩＮＯ１とＰＩＮＯ１の異なる挙動の構造的な基礎を理解するために、我々は、蛍光、円偏光二色性（ＣＤ）及びゲル濾過実験を行った。
【００２４】
オリザサチバ（ＲＩＮＯ１）及びポルテレシアコアルクタタ（ＰＩＮＯ１）由来のイノシトールシンターゼの組換え調製物のトリプトファン蛍光スペクトルを、図４のパネルＡ及びＢにそれぞれ示す。添加塩の非存在下で、ＲＩＮＯ１は、最大発光波長においてＰＩＮＯ１よりもかなり高い蛍光強度を示す。両方の場合において最大発光は３３６ｎｍ近くにとどまる。ＲＩＮＯ１の蛍光強度は、添加塩の存在下でかなり失われ、一方ＰＩＮＯ１ではむしろ強くなっている。６００ｍＭを超える塩濃度において、ＲＩＮＯ１及びＰＩＮＯ１両者の蛍光強度は同等になることも興味深い。
【００２５】
塩濃度が増大するとともにＲＩＮＯ１の蛍光強度が漸進的に減少することは、構造的な変化を示唆している。しかしながら、ＲＩＮＯ１の最大発光は、増大する塩濃度の関数として不変であり、これは、トリプトファン環境が変化しないことを意味する。トリプトファン残基は、通常、球状構造の内部に埋まっている。したがって、塩誘導変化はトリプトファン微小環境を乱さない。おそらく、他の蛋白質セグメントがトリプトファンのより近くへと移動され、エネルギー移動を容易にし、よって蛍光強度を減少させる。ＰＩＮＯ１の構造は、塩の添加に対して安定である。塩は静電気的な相互作用を遮るので、ＲＩＮＯ１とＰＩＮＯ１の外表面における荷電残基の曝露にはかなりの差がある。
【００２６】
二次レベルにおける溶液中のＲＩＮＯ１及びＰＩＮＯ１蛋白質の構造を、遠ＵＶ円偏光二色性（ＣＤ）分光法によって探った。ＲＩＮＯ１及びＰＩＮＯ１蛋白質のＣＤスペクトルは、形状においてほとんど同じであり、特性バンドを示す（図５）。該スペクトルを、インターネット上のＫ２Ｄサーバから入手可能なＫ２Ｄプログラムにしたがった非線形曲線適合解析によって３パラメータ二次構造解析（へリックス、シート及びランダム）にかけた。該解析によって、ＲＩＮＯ１及びＰＩＮＯ１の両者は、とても良く似た二次構造要素を有しており、約２５％がαへリックス、約２５％がβシート、５０％がランダム及び他の構造であることが明らかになった。明白に、これら２つの蛋白質の違いは、これらの二次構造要素が詰め込まれる様子が違うために生じている。
【００２７】
塩の添加によるＲＩＮＯ１の構造的な変化の性質のさらなる洞察を得るために、我々は、ＲＩＮＯ１及びＰＩＮＯ１蛋白質のゲルパーミエーションクロマトグラフィーを添加塩の存在及び非存在下の両方で行った。そのクロマトグラムを図６（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）に示す。ＲＩＮＯ１蛋白質は、塩の非存在下では単一のピークとして溶出する一方、４００ｍＭ  ＮａＣｌを添加すると、そのオリジナルピークがかなり小さくなると同時に高分子量分画が現れることがわかり、ＮａＣｌの添加によるＲＩＮＯ１蛋白質のオリゴマー形成を示唆している。対照的に、ＰＩＮＯ１蛋白質は、ＮａＣｌの存在及び非存在下の両方において、天然の三量体会合対応する同一の所で溶出する。活性データは、該蛋白質の三量体形は酵素的に活性であり、オリゴマー形（四量体のサイズ）は不活性であることを示している。オリゴマー形成は主に球の内部ではなく蛋白質表面に影響を与えるので、ＲＩＮＯ１蛋白質の塩感受性は、塩耐性のＰＩＮＯ１蛋白質と比べたときの上記表面に広く存在するイオン環境における違い及び表面近くの疎水性における違いを含むある提案された機構によって説明できるかもしれない。
【００２８】
塩生育中にＰＩＮＯ１遺伝子で形質転換されたタバコ草の表現型
ＰＩＮＯ１の植物系への移入がその植物の塩存在下での生育を助けるかどうかを決定するために、アグロバクテリウム介在手順を用いてＰＩＮＯ１遺伝子で形質転換したタバコ草を産生した。このために、標準的手順に従って、ＰＩＮＯ１遺伝子を植物発現ベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３０１にクローニングし、アグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４に動員した。再生培地で前培養したタバコ葉のディスクを、ＰＩＮＯ１−ｐＣＡＭＢＩＡ構築物を含むアグロバクテリウム培地の懸濁液に１時間漬け、セフォタキシムとハイグロマイシンを追加した再生培地に戻した。苗条及び根が成長した後、再生した小植物体を、さらなる生育のために０、１００、２００及び４００ｍＭのＮａＣｌを含む培養器に移した。ｐＣＡＭＢＩＡベクターのみで形質転換したコントロール小植物体も類似の方法で塩環境で生育した。増大するＮａＣｌ量の存在下で生育したこれらの植物（コントロール及びＰＩＮＯ１形質転換体）の比較は、コントロール植物は２００ｍＭ  ＮａＣｌの存在下で葉緑素の損失を見せるが、ＰＩＮＯ１形質転換植物は、表示された塩濃度ではそのような葉緑素の損失を見せず、４００ｍＭ塩では、どちらのタイプの植物も生育できなかった（図７）ことを示している。このことは、ＰＩＮＯ１形質転換植物は、形質転換されていない植物の生育に対して通常は阻害的である濃度のＮａＣｌの存在下で、光合成の仕組みを維持することができることを示唆している可能性がある。
【００２９】
上記の実験は、ＰＩＮＯ１遺伝子配列が、塩ストレスに耐性のトランスジェニック作物植物の作製のための有用な道具になるかもしれないことを強く示唆する。
【００３０】
発明を詳細に且つその具体的な実施形態を参照して説明してきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱又は離れることなく多様な変更や改変をなすことが可能であることは、当業者には明らかであろう。このように、ここに収容した開示事項は、明白な同等物及び置き換えもその範囲内に含む。
【００３１】
上に挙げた説明的実施例及び比較データを特に参照して発明を詳細に説明してきたが、以下に付加した特許請求の範囲によってより具体的に定義する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図２】図２（原文：Ｆｉｇ．１（Ａ））は、細菌による発現ＲＩＮＯ１及びＰＩＮＯ１の蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析であり、レーン１と２は誘導と非誘導のＲＩＮＯ１であり、レーン３と４は誘導と非誘導のＰＩＮＯ１であり、レーン５と６は誘導と非誘導のコントロールである。（Ｂ）は（Ａ）の対応ウエスタンブロット。
【図３】図３（原文：Ｆｉｇ．２（Ａ））は、尿素可溶化の後の誘導された系におけるペレット及び上清分画内の蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥであり、レーン１と２は誘導ＲＩＮＯ１のペレットと上清であり、レーン３と４は誘導ＰＩＮＯ１のペレットと上清である。（Ｂ）は（Ａ）の対応ウエスタンブロット。
【図４】図４（原文：Ｆｉｇ．３）：精製された天然（Ａ）及び組換え（Ｂ）酵素についての増大するＮａＣｌ濃度の存在下でのイノシトールシンターゼ活性。
【図５】図５（原文：Ｆｉｇ．４）：増大するＮａＣｌ濃度における精製されたＲＩＮＯ１（Ａ）及びＰＩＮＯ１（Ｂ）蛋白質のトリプトファン蛍光解析であり、トレーシング１、２、３及び４は、この系における０、１００ｍＭ、２００ｍＭ及び４００ｍＭ  ＮａＣｌに対応する。
【図６】図６（原文：Ｆｉｇ．５）：４００ｍＭ  ＮａＣｌの非存在及び存在下でのＲＩＮＯ１及びＰＩＮＯ１蛋白質のＳｕｐｅｒｏｓｅ−１２でのゲル濾過パターン。（Ａ）ＮａＣｌ無しのＲＩＮＯ１、（Ｂ）ＮａＣｌ有りのＲＩＮＯ１、（Ｃ）ＮａＣｌ無しのＰＩＮＯ１、（Ｄ）ＮａＣｌ有りのＰＩＮＯ１。差込部は、示唆された分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥと免疫ドットブロットを示す。
【図７】図７（原文：Ｆｉｇ．６）：ＲＩＮＯ１及びＰＩＮＯ１蛋白質の円偏光二色性スペクトル。
【図８】増殖培地においてＮａＣｌの多様な濃度で生育した非形質転換及びＰＩＮＯ１形質転換タバコ草の表現型。
【図１−１】
2006515519.tif 000007
【図１−２】
2006515519.tif 000008
【図２】
2006515519.tif 000009
【図３】
2006515519.tif 000010
【図４】
2006515519.tif 000011
【図５】
2006515519.tif 000012
【図６】
2006515519.tif 000013
【図７】
2006515519.tif 000014
【国際調査報告】
2006515519.tif 000015
2006515519.tif 000016