(57)【要約】本発明は、生物学的に活性な化合物（特に、ヒト、動物、および植物の健康に有用な化合物）の試験および商品開発の有効性、処理量、および効率を改善するためのマルチテストパネルの使用に関する。特に、本発明は、臨床上の、獣医学上の、および植物の健康における見込みのある適用について生物学的に活性な化合物を試験するのに適した表現型マイクロアレイを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの生物学的に活性な化学物質に対する少なくとも２つの細胞の応答を試験する方法であって、以下の段階を含む方法：
ａ）ｉ）試験装置の各ウェルが、炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、増殖刺激栄養分、薬物、および色素生成試験基質からなる群より選択される少なくとも１つの基質を含む、限定培地を含む少なくとも２つのウェルを有する試験装置；
ｉｉ）第１の細胞および少なくとも１つの生物学的に活性な化学物質を含む第１の懸濁液；および
ｉｉｉ）第２の細胞および少なくとも１つの生物学的に活性な化学物質を含む第２の懸濁液を提供する段階、
（ｂ） 前記第１の懸濁液および前記第２の懸濁液を試験装置のウェルに接種する段階；および
（ｃ） 少なくとも１つの生物学的に活性な化学物質に対する前記第１の細胞および前記第２の細胞の応答を観察する段階。
【請求項２】
試験装置がマイクロタイタープレートおよびマイクロカードからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
懸濁液がゲル化剤をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
試験装置がウェル内にゲル化開始剤をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
懸濁液が比色指示薬をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
試験装置がウェル内に比色指示薬をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
観察が視覚による、請求項１記載の方法。
【請求項８】
観察が計器で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項９】
第１の細胞および第２の細胞の応答が非放射性である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
第１の細胞および第２の細胞が真核細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
真核細胞が動物細胞である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
動物細胞が哺乳動物細胞である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物細胞が変異体細胞である、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
第１の細胞および第２の細胞が菌類細胞である、請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
第１の細胞および第２の細胞が原核細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
原核細胞が真正細菌および古細菌からなる群より選択される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
薬物が少なくとも１つの抗菌剤を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも２つの生物学的に活性な化学物質の影響を比較する方法であって、以下の段階を含む方法：
ａ）ｉ）少なくとも１つの細胞タイプおよび少なくとも１つの生物学的に活性な化学物質を含む第１の細胞懸濁液、
ｉｉ）段階ｉ）と同じ前記少なくとも１つの細胞タイプおよび前記第１の細胞懸濁液中の前記生物学的に活性な化学物質と異なる少なくとも１つの生物学的に活性な化学物質を含む第２の細胞懸濁液、
ｉｉｉ）炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、増殖刺激栄養分、薬物、および色素生成試験基質からなる群より選択される少なくとも１つの基質を含む限定培地を含むウェルを有する第１の試験装置、
ｉｖ）炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、増殖刺激栄養分、薬物、および色素生成試験基質からなる群より選択される少なくとも１つの基質を含むウェルを有する第２の試験装置を提供する段階；
ｂ）該第１の細胞懸濁液を前記第１の試験装置の該ウェルに添加して、第１の表現型アレイを提供する段階；
ｃ）該第２の細胞懸濁液を前記第２の試験装置の該ウェルに添加して、第２の表現型アレイを提供する段階；
ｄ）第１の表現型アレイおよび第２の表現型アレイをインキュベートする段階；
ｅ）該第１の表現型アレイおよび該第２の表現型アレイにおける該細胞懸濁液の応答を観察する段階；および
ｆ）該第１の表現型アレイにおける該第１の細胞懸濁液の応答と該第２の表現型アレイにおける該第２の細胞懸濁液の応答を比較する段階。
【請求項２０】
第１の試験装置および第２の試験装置がマイクロタイタープレートおよびマイクロカードからなる群より選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
第１の細胞懸濁液および第２の細胞懸濁液がゲル化剤をさらに含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
第１の試験装置および第２の試験装置がウェル内にゲル化開始剤をさらに含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
第１の細胞懸濁液および第２の細胞懸濁液が比色指示薬をさらに含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
第１の試験装置および第２の試験装置がウェル内に比色指示薬をさらに含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２５】
第１の試験装置が第２の試験装置と同じ基質を含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２６】
観察が視覚による、請求項１９記載の方法。
【請求項２７】
観察が計器で行われる、請求項１９記載の方法。
【請求項２８】
第１の細胞および第２の細胞の応答が非放射性である、請求項１９記載の方法。
【請求項２９】
応答の比較が多次元パターン分析を用いて行われる、請求項１９記載の方法。
【請求項３０】
第１の細胞および第２の細胞が真核細胞である、請求項１９記載の方法。
【請求項３１】
真核細胞が動物細胞である、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
動物細胞が哺乳動物細胞である、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
哺乳動物細胞が変異体細胞である、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
第１の細胞および第２の細胞が菌類細胞である、請求項３０記載の方法。
【請求項３６】
第１の細胞および第２の細胞が原核細胞である、請求項１９記載の方法。
【請求項３７】
原核細胞が真正細菌および古細菌からなる群より選択される、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
薬物が少なくとも１つの抗菌剤を含む、請求項１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生物学的に活性な化合物（特に、ヒト、動物、および植物の健康に有用な化合物）の試験および商品開発の有効性、処理量、および効率を改善するためのマルチテストパネルの使用に関する。
【０００２】
発明の背景
生物学的に活性な化学物質（ＢＡＣ）は主要かつ重要な製品群を構成する。これらの化合物は、一般的に、ヒト、他の動物および植物の健康の向上に焦点を絞られている。最も大きな市場は、薬物、特に、ヒトに使用する抗菌剤および医薬品の市場である。この大きな市場のために、より良くより有効なＢＡＣを求めて、毎年、莫大な労力および費用が費やされている。
【０００３】
抗菌剤はＢＡＣの主要なカテゴリーを構成する。多くの抗菌剤が開発および販売されているが、依然として、新規の標的に作用する新規の抗菌剤が極めて必要とされる。ある程度まで、この必要性は、抗菌剤耐性病原体の急速な出現によって駆り立てられている。入手できる全ての薬物に耐性の株（例えば、腸球菌）の出現および新たな抗菌剤の発見の遅れのために、これらの耐性生物に有効な化合物が新たに探索された。この重大な必要性およびかなりの研究努力にもかかわらず、細菌性疾患治療のための新たな化学的実体は、２０年以上、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可されていない（トリアス（Ｔｒｉａｓ）およびゴードン（Ｇｏｒｄｏｎ）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８：７５７−７６２［１９９７］；ビアンチ（Ｂｉａｎｃｈｉ）およびバネイクス（Ｂａｎｅｙｘ）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６５：５０２３−５０２７［１９９９］も参照のこと）。
【０００４】
この状況は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）およびバンコマイシン耐性腸球菌（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）（ＶＲＥ）による感染の頻度が増加してきているように院内感染の分野で特に甚だしい。高度のバンコマイシン耐性がブドウ球菌に広がることが本当に心配されている。実際に、１９９６年から、バンコマイシン低感受性黄色ブドウ球菌分離株（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ｉｓｏｌａｔｅ）（ＶＩＳＡ；バンコマイシン最小発育阻止濃度［ＭＩＣ］８〜１６μｇ／ｍｌ）が、欧州、アジア、および米国において同定されている。この黄色ブドウ球菌におけるバンコマイシン低感受性の出現は、一部の株が完全に耐性になり、現在用いられている抗菌剤がこのような株に対して無効になるという可能性を高める。市中ＭＲＳＡ感染の出現がこれらの生物に対するバンコマイシン使用の増加につながったので、このことは特に心配されている。ＭＲＳＡ治療に用いることができる療法はほとんどないので、ＭＲＳＡ治療の最後の手段である薬物バンコマイシンに対して低感受性を示すＶＩＳＡ株の確認された報告は非常に気がかりなことである（例えば、クルシド（Ｋｈｕｒｓｈｉｄ）ら、ＭＭＷＲ、４８：１１６５−１１６７［２０００］を参照のこと；バーグマン（Ｂａｕｇｈｍａｎ）ら、ＭＭＷＲ ４８：１１６７−１１７１［２０００］も参照のこと）。
【０００５】
現在、最も一般的に用いられている抗菌剤は、標的として、驚くほど少数の細胞機能（例えば、細胞壁、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質の生合成）に向けられている。表１は、これらの標的、遺伝子産物、および現在用いられている標的と相互作用する一部の抗菌剤クラスをまとめている。これらの抗菌剤に対する生物耐性の例は詳細に記録が残されており、広範囲に及ぶ。従って、増えつつある抗菌剤耐性の問題に対処するのに新たな抗菌剤が必要とされることは明らかである。
【０００６】
新しい有効な抗菌剤を発見する作業は２つの段階を伴う。第１の段階では、１つまたはそれ以上の薬物標的が特定される。表１に示した経路以外の新たな経路の標的化が、この開発段階において重要な役割を果たす可能性が高い。第２の段階では、望ましくない副作用を生じることなく望ましい活性を有する化学物質を発見するために、潜在的に活性な化学物質がスクリーニングおよび評価される。
【０００７】
【表１】広く用いられる一部の抗菌剤の標的★
2004511207.tif 000002
★モイア（Ｍｏｉｒ）ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４３：４３９−４４６［１９９９］による
【０００８】
別の主要なＢＡＣカテゴリーは、ヒト疾患を妨げるように設計された医薬品（すなわち、薬物）である。疾患は、細胞の生理学的経路における異常と考えることができる。これらの経路の主な成分は、遺伝子によりコードされ、疾患に冒された細胞内で発現されるタンパク質（酵素、受容体など）である。薬物は、通常、鍵タンパク質の正常機能を回復するように、または鍵タンパク質を不活化させ、生理学的経路の異常を打ち消すように鍵タンパク質（すなわち、薬物標的）と相互作用することによって薬学的効果を発揮する。
【０００９】
抗菌剤と同様に、この医薬品を開発するプロセスは２つの段階を伴う：（１）薬物標的を特定する段階、次いで、（２）標的と特異的に相互作用して、望ましくない副作用のない望ましい効果を生じる化学物質を発見するために、候補となる活性な化学物質をスクリーニングする段階。この分野において多くの研究がなされているが、依然として、これらの化学物質のスクリーニングおよび評価の効率および有効性の改善が必要とされる。
【００１０】
より期待が持てそうな薬物を作成するプレッシャーに対応して、製薬会社およびバイオテクノロジー会社は、リード化合物を発見および評価するために高速ハイスループット法に頼ろうとするようになってきた。これらのリード化合物は、一般的に、抽出物コレクションを用いて様々な供給源から集められた化合物、コンビナトリアルケミストリー法または合理的薬物設計によって合成された化学物質の大きなライブラリーをスクリーニングすることによって選択される。
【００１１】
しかしながら、これらの方法は良いこともあるが悪いこともあった。コンビナトリアルケミストリーなどの技術を用いると、候補となる薬物標的に対する化合物ライブラリーを迅速に作成およびスクリーニングすることができる。残念なことに、これらの技術は、提案された標的に及ぼす薬物の影響を調べるだけであり、他の細胞プロセスに及ぼす影響を測定しない。ある化学物質は、標的タンパク質との相互作用に基づいて優れた候補であるかもしれないが、この化学物質はまた細胞内の他のタンパク質と相互作用し、副作用を引き起こすかもしれない。従って、薬物開発業者は、期待が持てそうな薬物候補が細胞機能の他の局面をどのように生じさせるか、ならびに同時に使用する可能性のある他の薬物とどのように相互作用するかを理解するために薬物候補を調べなければならないという点で大きな問題が残っている。これらの分野での進歩にもかかわらず、依然として、疾患治療に有効なＢＡＣを同定および開発するための、非常に感度が高く特異的でありながら、費用効率が高く使いやすい方法が必要とされる。
【００１２】
発明の概要
本発明は、生物学的に活性な化合物（特に、ヒト、動物、および植物の健康に有用な化合物）の試験および商品開発の有効性、処理量、および効率を改善するためのマルチテストパネルの使用に関する。
【００１３】
本発明は、少なくとも１つの生物学的に活性な化学物質に対する少なくとも２つの細胞の応答を試験する方法であって、以下の段階を含む方法を提供する：ａ）試験装置の各ウェルが、炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、増殖刺激栄養分、薬物、および色素生成試験基質からなる群より選択される少なくとも１つの基質を含む限定培地を含む、少なくとも２つのウェルを有する試験装置；第１の細胞および少なくとも１つの生物学的に活性な化学物質を含む第１の懸濁液；および第２の細胞および少なくとも１つの生物学的に活性な化学物質を含む第２の懸濁液を提供する段階；（ｂ）懸濁液を試験装置のウェルに接種する段階；および（ｃ）少なくとも１つの生物学的に活性な化学物質に対する第１の細胞および第２の細胞の応答を観察する段階。
【００１４】
前記方法のある態様において、試験装置は、マイクロタイタープレートおよびマイクロカードからなる群より選択される。他の態様において、懸濁液はゲル化剤をさらに含む。なおさらなる態様において、試験装置はウェル内にゲル化開始剤をさらに含む。ある態様において、懸濁液は比色指示薬をさらに含むのに対して、他の態様において、試験装置はウェル内に比色指示薬をさらに含み、他の態様において、懸濁液および試験装置のウェルは両方とも比色指示薬を含む。ある好ましい態様において、観察は視覚によるのに対して、他の好ましい態様では計器で行われる。ある特に好ましい態様において、第１の細胞および第２の細胞の応答は非放射性である。別の態様において、第１の細胞および第２の細胞は真核細胞である。ある好ましい態様において、真核細胞は動物細胞であるのに対して、他の好ましい態様において、動物細胞は哺乳動物細胞であり、ある特に好ましい態様において、哺乳動物細胞はヒト細胞である。ある態様において、哺乳動物細胞は変異体細胞である。なおさらなる態様において、第１の細胞および第２の細胞は菌類細胞であるのに対して、他の態様において、第１の細胞および第２の細胞は原核細胞である。ある好ましい態様において、薬物は少なくとも１つの抗菌剤を含む。
【００１５】
本発明は、少なくとも２つの生物学的に活性な化学物質の影響を比較する方法であって、以下の段階を含む方法をさらに提供する：ａ）少なくとも１つの細胞タイプおよび少なくとも１つの生物学的に活性な化学物質を含む第１の細胞懸濁液；第１の細胞懸濁液と同じ細胞タイプおよび第１の細胞懸濁液中の生物学的に活性な化学物質と異なる少なくとも１つの生物学的に活性な化学物質を含む第２の細胞懸濁液；炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、増殖刺激栄養分、薬物、および色素生成試験基質からなる群より選択される少なくとも１つの基質を含む限定培地を含むウェルを有する第１の試験装置；炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、増殖刺激栄養分、薬物、および色素生成試験基質からなる群より選択される少なくとも１つの基質を含むウェルを有する第２の試験装置を提供する段階；ｂ）第１の細胞懸濁液を第１の試験装置のウェルに添加して、第１の表現型アレイを提供する段階；ｃ）第２の細胞懸濁液を第２の試験装置のウェルに添加して、第２の表現型アレイを提供する段階；ｄ）第１の表現型アレイおよび第２の表現型アレイをインキュベートする段階；ｅ）第１の表現型アレイおよび第２の表現型アレイにおける細胞懸濁液の応答を観察する段階；およびｆ）第１の表現型アレイにおける細胞懸濁液の応答と第２の表現型アレイにおける細胞懸濁液の応答を比較する段階。
【００１６】
前記方法のある態様において、試験装置は、マイクロタイタープレートおよびマイクロカードからなる群より選択される。他の態様において、懸濁液はゲル化剤をさらに含む。なおさらなる態様において、試験装置はウェル内にゲル化開始剤をさらに含む。ある態様において、懸濁液は比色指示薬をさらに含むのに対して、他の態様において、試験装置はウェル内に比色指示薬をさらに含み、他の態様において、懸濁液および試験装置のウェルは両方とも比色指示薬を含む。ある好ましい態様において、観察は視覚によるのに対して、他の好ましい態様では計器で行われる。ある特に好ましい態様において、第１の細胞および第２の細胞の応答は非放射性である。別の態様において、第１の細胞および第２の細胞は真核細胞である。ある好ましい態様において、真核細胞は動物細胞であるのに対して、他の好ましい態様において、動物細胞は哺乳動物細胞であり、ある特に好ましい態様において、哺乳動物細胞はヒト細胞である。ある態様において、哺乳動物細胞は変異体細胞である。なおさらなる態様において、第１の細胞および第２の細胞は菌類細胞であるのに対して、他の態様において、第１の細胞および第２の細胞は原核細胞である。ある好ましい態様において、薬物は少なくとも１つの抗菌剤を含む。ある態様において、試験装置は第２の試験装置と同じ基質を含む。なおさらなる態様において、応答の比較は多次元パターン分析を用いて行われる。
【００１７】
本発明は、少なくとも１つの生物学的に活性な化学物質に対する生物の応答を試験する方法であって、以下の段階を含む方法をさらに提供する：ａ）試験装置の各ウェルが、炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、増殖刺激栄養分、抗菌剤、および色素生成試験基質からなる群より選択される少なくとも１つの基質を含む、少なくとも２つのウェルを有する試験装置；ならびに生物および少なくとも１つの生物学的に活性な化学物質を含む懸濁液を提供する段階；（ｂ）懸濁液を試験装置のウェルに接種する段階；および（ｃ）１つまたはそれ以上の生物学的に活性な化学物質に対する生物の応答を観察する段階。ある態様において、試験装置は、マイクロタイタープレートおよびマイクロカードからなる群より選択される。他の態様において、懸濁液はゲル化剤をさらに含む。なおさらなる態様において、試験装置はウェル内にゲル化開始剤をさらに含む。ある好ましい態様において、懸濁液は比色指示薬をさらに含むのに対して、他の好ましい態様において、試験装置はウェル内に比色指示薬をさらに含む。さらなる態様において、観察は視覚によるのに対して、他の特に好ましい態様では計器で行われる。
【００１８】
本発明はまた、少なくとも２つの生物学的に活性な化学物質の影響を比較する方法であって、以下の段階を含む方法を提供する：ａ）生物および少なくとも１つの生物学的に活性な化学物質を含む第１の細胞懸濁液；第１の細胞懸濁液と同じ生物および第１の細胞懸濁液中の生物学的に活性な化学物質と異なる少なくとも１つの生物学的に活性な化学物質を含む第２の細胞懸濁液；炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、増殖刺激栄養分、抗菌剤、および色素生成試験基質からなる群より選択される少なくとも１つの基質を含むウェルを有する第１の試験装置；炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、増殖刺激栄養分、抗菌剤、および色素生成試験基質からなる群より選択される少なくとも１つの基質を含むウェルを有する第２の試験装置を提供する段階；ｂ）細胞懸濁液を第１の試験装置のウェルに添加して、第１の表現型アレイを提供する段階；ｃ）細胞懸濁液を第２の試験装置のウェルに添加して、第２の表現型アレイを提供する段階；ｄ）第１の表現型アレイおよび第２の表現型アレイをインキュベートする段階；ｅ）第１の表現型アレイおよび第２の表現型アレイにおける細胞懸濁液の応答を観察する段階；およびｆ）第１の表現型アレイにおける細胞懸濁液の応答と第２の表現型アレイにおける細胞懸濁液の応答を比較する段階。ある態様において、第１の試験装置および第２の試験装置は、マイクロタイタープレートおよびマイクロカードからなる群より選択される。他の態様において、第１の細胞懸濁液および第２の細胞懸濁液はゲル化剤をさらに含む。さらに他の態様において、第１の試験装置および第２の試験装置はウェル内にゲル化開始剤をさらに含む。ある好ましい態様において、第１の細胞懸濁液および第２の細胞懸濁液は比色指示薬をさらに含むのに対して、他の態様において、第１の試験装置および第２の試験装置はウェル内に比色指示薬をさらに含む。ある特に好ましい態様において、第１の試験装置は第２の試験装置と同じ基質を含む。ある好ましい態様において、観察は視覚によるのに対して、他の好ましい態様では計器で行われる。特に好ましい態様において、応答の比較は多次元パターン分析を用いて行われる。
【００１９】
本発明はまた、以下を含む、少なくとも１つの生物学的に活性な化学物質の影響を試験するためのマルチウェルキットを提供する：炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、増殖刺激栄養分、抗菌剤、および色素生成試験基質からなる群より選択される少なくとも１つの基質を含む少なくとも２つのウェルを有する少なくとも１つの試験装置；ならびに少なくとも１つの生物学的に活性な化学物質を含む細胞懸濁培地。ある態様において、試験装置は、マイクロタイタープレートおよびマイクロカードからなる群より選択される。ある好ましい態様において、細胞懸濁培地はゲル化剤を含むのに対して、他の態様において、試験装置はウェル内にゲル化開始剤を含む。ある態様において、細胞懸濁液は比色指示薬をさらに含むのに対して、さらに他の態様において、試験装置はウェル内に比色指示薬をさらに含む。
【００２０】
発明の説明
本発明は、生物学的に活性な化合物（ＢＡＣ）（特に、ヒト、動物、および植物の健康に有用なＢＡＣ）の試験および商品開発の有効性、処理量、および効率を改善するための、本明細書で「表現型マイクロアレイ」または「ＰＭ」と呼ばれるマルチテストパネルの使用に関する。
【００２１】
本発明の特に好ましい態様は、疾患または疾患症状を治療するのに一般的に用いられるＢＡＣ（例えば、抗菌剤および他の化合物）を必要とするが、本発明はまた広範囲のＢＡＣを含み、ＢＡＣとして栄養分、ホルモン、増殖刺激化合物、栄養剤、ビタミン、代謝改変化合物、殺虫剤、殺鼠剤、抗真菌剤、除草剤、殺藻剤などが挙げられるが、これに限定されない。本発明は任意の供給源からのＢＡＣを含むことがさらに意図される。従って、本発明は、任意の供給源に由来するＢＡＣを評価する手段ならびに任意の適切な用途についてＢＡＣを評価する手段を提供する。
【００２２】
前記のように、大きな問題が、薬物発見および開発において用いられる従来の方法と関連している。例えば、薬物開発業者は、まず最初に、期待が持てそうな薬物候補を発見するために期待が持てそうな薬物候補を調べなければならず、次いで、期待が持てそうな薬物候補が細胞機能の他の局面をどのように生じさせるか、ならびに同時に使用する可能性のある他の薬物とどのように相互作用するかを理解するために期待が持てそうな薬物候補を調べなければならないという点で大きな問題が残っている。本発明は、ＰＭが費用効率が高くかつ迅速な生理学に基づくインビボ薬物活性分析を提供するので、これを効率的かつ効果的に試験する方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、効率的にかつ高処理量で化学物質ライブラリースクリーニングを支援するのに加えて、詳細な毒物学的分析において用いられる。例えば、哺乳動物細胞を用いたアッセイにおいて、使いやすく、高処理量、高速で、かつ費用効率が高く複数の薬物候補をアッセイするのに様々な器官を代表する一組の細胞系が用いられることが意図される。これらの結果に基づいて、最初に期待が持てそうに見えたが、実際には容認できない副作用を引き起こす化合物を、費用のかかる臨床試験を開始する前に選考から外すことができる。
【００２４】
重要なことに、本発明はまた併用される薬物を分析する方法を提供する。この態様の利点は、複数の薬物のインビボでの可能性のある相互作用を評価できることを含む。例えば、ある場合では、薬物の併用は有害なまたは拮抗する相互作用を発揮するのに対して、他の場合では、相乗作用して患者にさらなる利益をもたらす。後者の例として、サルファ薬とトリメトプリムおよびペニシリンとβ−ラクタマーゼ阻害剤などの併用が挙げられる。
【００２５】
薬物開発および治療レジメにおいて費用が常に考慮すべき事項であるので、本発明は、現在用いられている方法より優れた独特の利点を提供する。本発明は薬物開発の時間および費用をかなり節約する。例えば、最新の見積もりでは、最初の合成から最終的な食品医薬品局（ＦＤＡ）認可まで薬物を開発するのに現在、平均１４．９年かかることが分かっている（Ｒ．ハンセン（Ｈａｎｓｅｎ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ；Ｓ．Ｎ．ウィギング（Ｗｉｇｇｉｎｇ）、Ｔｅｘａｓ Ａ ＆ Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；Ｊ．Ａ．ディマシ（Ｄｉｍａｓｉ）、Ｔｕｆｔｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ、「医療市場ガイドリサーチレポート２０００（Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｍａｒｋｅｔｐｌａｃｅ Ｇｕｉｄｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０００）」、第１５版、第１巻、Ｄｏｒｌａｎｄ’ｓ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ １９１０２、［１９９９−２０００］、１−１７２頁を参照のこと）。１つの新薬の開発費は、１９７６年の５４００万ドルから現在では平均３億５９００万ドルに増加していることが報告されている（ハンセン、前記）。さらに、臨床試験中、１０個の薬物うち約９個が失敗するために、何十億ドルも費やされている（ハンセン、前記）。新薬候補を効率的に特定し、特徴付けることができ、薬物発見プロセスにおいて初期に不満足な候補を排除できれば、製薬会社は年に何十億ドルも節約することができる。
【００２６】
本発明はまた、目的のＢＡＣの作用形態を決定するのに適した方法および組成物を提供する。この態様において、本発明は、様々な細胞機能の広範なアッセイにおいてＰＭを用いる。ＰＭを用いると、ＢＡＣによって最も感度よく変えられる機能を決定することができる。例えば、ＢＡＣが細胞壁合成を阻害することが示された場合（例えば、バンコマイシン）、この試験ＢＡＣと、同様に細胞壁合成を阻害する他のＢＡＣ（例えば、セファロスポリン、ペニシリンなど）との相乗作用レベルを容易にかつ効率的に評価することができる。本発明は、ＢＡＣ間の相乗作用のタイプおよびレベルに関して定量的および定性的な測定を行うのに使用することができる。別の例において、イソロイシンなどのアミノ酸の生合成に関与する酵素活性を阻害するＢＡＣ（例えば、スルホメツロンメチル）の活性は最小表現型培地上で観察することができ（すなわち、毒性と予想される）、この影響は側鎖アミノ酸を含む表現型培地において特異的に逆転される。
【００２７】
本発明はまた、細胞に存在するＢＡＣ標的のタイプおよび数の決定に用いられる。このような決定は、好ましいＢＡＣが特異的な作用形態を有し、副作用がないという点で重要である。それぞれの候補となる新規のＢＡＣは、使用のために認可される前に多くの基準を満たさなければならない。
【００２８】
標的の選択は、新たなＢＡＣの開発において重要な初期の段階である。一般的に、標的は、十分な選択性および範囲を生じるべきである（すなわち、抗菌剤は、ヒト宿主に関連する微生物に対して特異性および／または選択性が高く、また、望ましい病原体範囲に対して活性がある）。標的は、病原体の増殖または生存能力に必須のものであるべきである（すなわち、少なくとも感染条件下で必須のものであるべきである）。アッセイおよびハイスループットスクリーニング（例えば、本発明のアッセイおよびハイスループットスクリーニング）が利用できるように、標的の機能は既知であるべきである。本発明はまた、ＢＡＣの選択性および範囲ならびに様々な標的の機能および重要度を決定および評価する手段を提供する。
【００２９】
本発明のある態様において、ＢＡＣの活性は、複数の標的との相互作用などの副作用が観察されるような方法で決定される。例えば、ある試験では、ＢＡＣ１は、１つの標的であるタンパク質１を阻害する特異的薬物である。これは、タンパク質１ならびにタンパク質５を阻害する非特異的薬物であることが分かっているＢＡＣ２と区別される。タンパク質５の阻害が有害である場合、このＢＡＣは使用に適さないことが決定される。
【００３０】
図１は、ＰＭを用いて細胞に及ぼすＢＡＣの影響を測定するように設計された本発明の１つの態様の単純化した模式図である。この図および図２において、「ｐｈｅ」の名称は細胞の表現型（例えば、表現型マイクロアレイの特定のウェルにおける細胞の増殖および／または呼吸）を示す。図１および２は、上部左に、正常細胞、および通常コードされるタンパク質の機能的活性（この例では候補となる薬物標的）を欠く変異体細胞（例えば、遺伝子ノックアウト）を示す。図１および２において、「ｇ１」は、候補となる薬物標的であるタンパク質「ｐ１」をコードする遺伝子を示す。ほとんどの薬物はタンパク質の活性をブロックすることで作用するので、薬物が添加されると、細胞には標的タンパク質の機能が無い。従って、いずれの場合でも（すなわち、薬物に変異体細胞を曝露しても正常細胞を曝露しても）、細胞には標的タンパク質（例えば、ｐ１）の機能が無い。これらの細胞の主な違いは、変異体細胞の場合、タンパク質機能は遺伝学的手段によって無くなったが、薬物に曝露された正常細胞の場合、タンパク質機能は化学的手段によって無くなったことである。図１において、薬物１は活性があり特異的であるので（すなわち、薬物１だけが表現型１を生じるので）、標的タンパク質（ｐ１）を不活化するのに良い候補である。対照的に、薬物２は、タンパク質５（ｐ５）と呼ばれる別のタンパク質ならびにｐ１を不活化するので（すなわち、薬物２は表現型１および５の両方に影響を及ぼすので）、悪い候補である。薬物２は細胞に非特異的な影響を及ぼすので、副作用を引き起こす可能性が高く、治療レジメにおいて使用するのに望ましくない化合物である可能性が高い。
【００３１】
従って、本発明のある態様において、ＢＡＣの活性は、複数の標的との相互作用などの副作用が観察されるような方法で決定される。例えば、ある試験では、ＢＡＣ１は、１つの標的であるタンパク質１を阻害する特異的薬物である。これは、タンパク質１ならびにタンパク質５を阻害する非特異的薬物であることが分かっているＢＡＣ２と区別される。タンパク質５の阻害が有害である場合、このＢＡＣは使用に適さないことが決定される。
【００３２】
図２は、ＰＭが薬物相互作用をどのように検出できるかを示す単純化した模式図である。細胞を「薬物１」および「薬物２」に同時に曝露すると、その結果として起きる影響は、薬物１の影響（すなわち、ｐｈｅ１の変化）および薬物２の影響（すなわち、ｐｈｅ５の変化）だけでなく、ｐｈｅ６およびｐｈｅ７も変化したようにそれ以上である。これは、単独で用いられた薬物の既知の影響に基づいて予測できない薬物の余分な影響を示している。この余分な影響（すなわち、ｐｈｅ６およびｐｈｅ７の変化）は有益な場合も（すなわち、相乗作用）、有害な場合もある（すなわち、拮抗作用）。
【００３３】
図３に図示したように、試験プロセス間に、様々なウェル内の細胞は異なる環境ストレス下に置かれる。これらのストレスは、適応して生き残るように細胞に圧力を加える。例えば、あるウェルでは、細胞はリンなどの元素が部分的に不足していてもよく、その一方で、他のウェルでは、細胞は高塩条件に適応していてもよく、ＤＮＡ修復を受けていてもよく、低ｐＨで増殖していてもよく、部分的に欠陥のある細胞壁を生成していてもよく、リボソーム機能が低下していてもよい。従って、本発明は、単一の培養（または細胞集団）から始めて、その培養物を様々な環境条件に曝露し、それによって異なる生理学的状態の細胞アレイを作成する手段を提供する。培養物に抗菌剤薬物または他のＢＡＣも添加する場合、本発明は、多くの環境条件下および生理学的条件下で培養物に及ぼすＢＡＣの影響を同時に観察する手段を提供する。これは、生物の抗菌剤感受性パターンを決定するような作業のための（一般的に、生物の急速な増殖をもたらす条件下でしか、すなわち最適増殖条件下でしか培養物を増殖させない）現在の実施とは非常に異なり、それより非常に強力である。
【００３４】
抗菌剤感受性試験のための従来の方法および現在の方法では、手順およびその解釈を統一するためにあらゆる努力がなされている。これらの方法は比較的簡単であるが（例えば、キルビーバウアー（Ｋｉｒｂｙ−Ｂａｕｅｒ）ディスク拡散法およびチューブ希釈法）、国立臨床検査標準協議会（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ：ＮＣＣＬＳ）によって臨床の場において厳しく管理されている（ヒンドラー（Ｈｉｎｄｌｅｒ）「抗菌剤感受性試験（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ）」イセンベルグ（Ｉｓｅｎｂｅｒｇ）（編）「臨床微生物学手順ハンドブック（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）」第１巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、［１９９４］、５．０．１〜５．２５．１頁を参照のこと）。実際に、医師は標準的方法から逸脱せず、誤解を招く結果を得ないように命じられている。
【００３５】
しかしながら、抗菌剤感受性試験は臨床微生物学研究室の最も重要な作業の１つであるが、これらの試験は、患者の疾患を治療するのに特定の抗菌剤がどのくらい良く作用するかをインビトロで予測するだけであると認識されている（ジョーゲンセン（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ）およびシャーム（Ｓａｈｍ）、「抗菌剤感受性試験：概論（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ ：Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ）、マレイ（Ｍｕｒｒａｙ）ら（編）「臨床微生物学マニュアル（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」第６版、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．［１９９５］、１２７７−１２８０頁を参照のこと）。認可されている試験手順はかなり統一されているので、異なる環境ストレス下で生物の感受性を試験する機構はない。これは、生物がインビボで遭遇する可能性がある条件などの複数の大いに異なる条件下での抗菌剤感受性の決定（ならびに特定の培養物の他の特徴の決定）を可能にする本発明とは全く対照的である。
【００３６】
従って、前記のように、本発明は相乗作用および拮抗作用の決定においてさらに用いられる。当技術分野において周知なように、使用した時に、どのＢＡＣの併用が相乗作用するか、どのＢＡＣの併用が拮抗作用するかまたは有害であるかを知ることは重要である。本発明は、これらの関係を決定するための方法および組成物を提供する。
【００３７】
本発明を用いて得られた結果は単純または複雑なパターンを生じることがあり、このパターンは、定量的に記録され、当技術分野において周知の標準的な方法を用いて分析することができる。特に、多次元パターン分析法として、ノンメトリック多次元尺度構成法（ＮＭＤＳ）、主成分分析法および正準変数分析法、ヒューリスティッククラスタリング分析法、距離行列および類似性行列の作成、データ抽出およびマイニング活動、ならびにバイオインフォマティクスのツールおよび実施が挙げられるが、これに限定されない。ＡＮＯＶＡなどの方法において、試料セットは、どのくらい厳密に同程度のばらつきを有するかに基づいて比較される。ＡＮＣＯＶＡは、データセットの結合のばらつき（ｊｏｉｎｔ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）についての情報を提供する。主成分分析法（ＰＣＡ）および正準変数分析法（ＣＶＡ）が本発明に用いられることも意図される。ＰＣＡはデータ行列の代数解析を行うのに対して、ＣＶＡは、データの同じ代数解析に関連する距離行列または類似性行列に適用される。対応分析および判別分析は、基本的なＰＣＡアルゴリズムを使用するための方法を提供する。ＣＶＡと同様に、違いはこのアルゴリズムを適用する前のデータ処理法である。モンテカルロ置換検定もまた本発明と組み合わせた使用を検討される。これらの検定は、クラスター分析結果の安定性および信頼性を示す。
【００３８】
さらに、本発明を用いて得られたデータの分析においてジニ係数の使用が用いられることが意図される（例えば、ハーチ（Ｈａｒｃｈ）ら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈ．、３０：９１−１０１［１９９７］を参照のこと）。例えば、この分析において、ある基質またはＢＡＣの不平等な使用を定量するための尺度としてジニ係数を用いることができる。しかしながら、統計方法の選択は本発明の用途によって決まる。従って、本発明はデータ分析の特定の任意の方法に限定されることが意図されない。実際に、本発明を用いて得られたデータを分析するために、シャノン指数などの方法ならびに他の適切な方法が用いられることが意図される（ガーランド（Ｇａｒｌａｎｄ）、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｅｃｏｌ．、２４：２８９−３００［１９９７］も参照のこと）。
【００３９】
さらに、本発明は、ＢＡＣ感受性プロフィールにおけるデータを決定し、データベースにおける容易な保存を可能にする方法を提供する。好ましい態様において、本発明は、微生物ならびに他の細胞の比較表現型試験に適している。
【００４０】
１つの好ましい方法において、本発明は、多くの生物系の重要な原核「モデル」生物および真核「モデル」生物である大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の表現型試験のための方法および組成物を含む。しかしながら、本発明はこれらの生物に限定されることが意図されない。実際に、本発明は、医学、獣医学、産業、および環境に重要なおよび／または関心のある生物の分析に用いられることが意図される。
【００４１】
本発明は、特定の属、種にも生物群または細胞群にも限定されることが意図されない。一般的に単離される生物に加えて、本発明の方法および組成物を用いて試験することができる細胞タイプの範囲には、複雑な形の分化、フィラメント化、胞子形成などを受ける細胞が含まれる。実際に、本発明は任意のタイプの細胞と共に用いられることも意図され、細胞として、哺乳動物細胞、昆虫細胞、および植物細胞を含む、細胞培養において維持される細胞、細胞系などが挙げられるが、これに限定されない。本発明の組成物および方法は、最も経済的に重要な生物の一部ならびに臨床的に重要な種を特に対象としている。本発明のＰＭを用いて様々な細胞を特徴付けることができるので、初代単離培地および初代培養培地の選択は特定の配合に限定されることが意図されない。
【００４２】
前記のように、本発明は、原核生物（例えば、細菌）細胞ならびに真核細胞と共に用いられる。例えば、本発明は、様々な動物および他の真核生物種から得られた細胞と共に用いられる。例えば、本発明は、哺乳動物、昆虫、鳥類、魚類、爬虫類、および両生類の細胞と共に用いられる。従って、哺乳動物細胞が本発明と共に用いられ、哺乳動物細胞として、ヒト細胞および非ヒト動物細胞（実験動物、ペット、および家畜 （例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウなど）、ウサギ（例えば、アナウサギおよび野ウサギ）、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスター、テンジクネズミなど）、および非ヒト霊長類）に由来する細胞を含む）、ならびに動物園の動物、野生化した動物、および野生動物から得られた細胞が挙げられるが、これに限定されない。従って、本発明は、任意の数の脊椎動物ならびに無脊椎動物動物と共に用いられる。本発明と共に用いられる無脊椎動物細胞の例として、昆虫（例えば、ショウジョウバエ、ゴキブリ、カ、甲虫、ガ、チョウ）および線虫（例えば、Ｃ． エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ））が挙げられるが、これに限定されない。実際に、本発明は任意の特定の種に由来する細胞に限定されることが意図されない。様々なクラスの動物（例えば、哺乳動物、爬虫類、両生類、および昆虫）に由来する細胞を細胞培養する方法および技術が当業者に周知であるので、当業者は、本発明が任意の動物供給源に由来する細胞との使用に適していることを理解する。
【００４３】
動物細胞に加えて、本発明は他の真核細胞と共に用いられ、他の真核細胞として菌類細胞が挙げられるが、これに限定されない。例えば、本発明は、酵母（例えば、カンジタ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、およびロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ））ならびにカビ（例えば、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、コクシジオイデス属（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、ヒストプラスマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、ブラストミセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、パラコクシジオデス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）など）と共に用いられる。従って、本発明は、二形性菌類ならびに形が一つしかない菌類種（すなわち、カビまたは酵母）との使用を含む。
【００４４】
動物細胞に加えて、本発明は植物から得られた細胞と共に用いられ、植物としてイネ、タバコ、トウモロコシ、シロイヌナズナが挙げられるが、これに限定されない。実際に、本発明は、農業に有用な植物（例えば、食料および飼料用の穀物）ならびに園芸に有用な植物（例えば、装飾用の植物および花）、および野生植物と共に用いられる。本発明は、任意の特定の植物または植物タイプに限定されることが意図されない。さらに、様々な植物細胞（例えば、根、茎、葉、花など）が本発明と共に用いられる。
【００４５】
さらに、本発明は、様々な器官および組織（例えば、皮膚、呼吸器系、消化器系、尿路、生殖路、循環系、骨格系、感覚系（例えば、視覚、嗅覚、味覚など）、筋肉、および結合組織に由来する細胞と共に用いられる。さらに、本発明は、様々な発生学的な細胞タイプおよび発生の様々な段階にある細胞（例えば、幹細胞、卵母細胞、接合子、胞胚腔、線維芽細胞など）と共に用いられる。従って、本発明は任意の特定のタイプの細胞に限定されることが意図されない。実際に、様々な器官、組織、および身体の系（例えば、哺乳動物、爬虫類、両生類、および昆虫）に由来する細胞を細胞培養する方法および技術が当業者に周知であるので、当業者は、本発明が任意の供給源に由来する細胞との使用に適していることを理解する。
【００４６】
本発明は、正常な真核細胞および原核細胞ならびに異常細胞（例えば、癌細胞、アポトーシスを受けている細胞、変異体細胞、前癌細胞、罹患細胞など）と共に用いられる。病原性生物または他の生物（例えば、ウイルス、細菌、マイコプラズマ、寄生生物、菌類など）に感染している細胞もまた本発明と共に用いられる。従って、本発明は、任意の特定の発生段階（例えば、胎児、成人、老人の細胞）または任意の特定の健康状態の細胞に限定されることが意図されない。変異体細胞（例えば、天然に生じる変異体細胞）ならびに遺伝子操作された細胞（例えば、ノックアウト、ノックイン）、プラスミド含有細胞、トランスフェクトされた細胞、形質転換細胞、化学的に誘導された変異体細胞、放射線で誘導された変異体細胞などもまた本発明と共に用いられる。以下の表は、本発明と共に用いられる、いくつかのインビトロ腫瘍細胞系を示す。しかしながら、本発明は、本明細書に列挙したいくつかの細胞系に限定されることが意図されない。
【００４７】
【表２】インビトロヒト腫瘍細胞系の例
2004511207.tif 000003
【００４８】
本発明は培養細胞と共にさらに用いられ、培養細胞として初代培養細胞、細胞系、細胞株、および細胞培養において維持される他の細胞が挙げられるが、これに限定されない。非常に多くの細胞系および細胞株が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）などの寄託機関から入手することができる。例えば、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、ＭＤＣＫ、Ａ−９、ＨＦＦ、ＣＨＯ、ＭＲＣ−５、ＨｅＰ−２、ＣＶ−１、ＢＧＭＫ、ＢＨＫ、ＢＨＫ−２１、Ａ５４９、ＭｖｌＬｕ、ＨＥＫ−２９３、ＨＴ−２９、ＭＣＦ−７、ＡＣ−１３３、ＣＤ−４、Ｃ３Ａ、ｈＴＥＲＴ−ＲＰＥ１、ＫＢ、３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、ＩＭＲ−９０、Ｆ９、ＰＣ１３、ＬＮＣａＰ、ＰＣ−３、ＵＳ７、ＨＵＨ−７、ＮＣＩ−４６０、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＭＢ−ＭＤＡ−２３７、ＨＭＥ、ＭＫＮ４５、ＣＤ８０−ＡＴ、Ａ２７８０、ＯＶＣＡＲ−３、ＳＫ−ＯＶ−３、ＮＢＳ−１ＬＢ、ＭＣＦ−１０、Ｒａｔ−１、ＲＴＳ３４Ｓｔなどの細胞系、ならびに本物の細胞および培養系において維持される他の細胞。
【００４９】
さらに、本発明は、選択マーカーを含む細胞と共に用いられる（すなわち、抗生物質または薬物に対する耐性を、選択マーカーが発現される細胞に付与する酵素活性をコードする遺伝子が用いられる）。選択マーカーは「優性」でもよい。優性選択マーカーは、任意の哺乳動物細胞系において検出することができる酵素活性をコードする。優性選択マーカーの例として、哺乳動物細胞に薬物Ｇ４１８耐性を付与するアミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ遺伝子とも呼ばれる）、抗生物質ハイグロマイシン耐性を付与するハイグロマイシンＧホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）遺伝子、ミコフェノール酸の存在下で増殖する能力を付与する細菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ遺伝子とも呼ばれる）、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ耐性を付与するクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｃａｔ遺伝子とも呼ばれる）が挙げられる。他の選択マーカーは、関連する酵素活性を欠く細胞系と共に使用しなければならない点で優性でない。非優性選択マーカーの例として、ｔｋ−細胞系と共に用いられるチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子、ＣＡＤ欠損細胞（すなわちＵｒｄＡ変異体）と共に用いられるｃａｄ遺伝子（すなわち、新規ウリジン生合成の最初の３つの酵素活性を有するＣＡＤタンパク質をコードする）、およびｈｐｒｔ−細胞系と共に用いられる哺乳動物ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｐｒｔ）遺伝子が挙げられる。哺乳動物細胞系における選択マーカーの使用の概要は、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋら）（サンブルックら、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ［１９８９］、１６．９−１６．１５頁）に示されている。
【００５０】
本発明は、当技術分野において一般的に用いられ、多くの科学用品供給元（例えば、バイオログ（Ｂｉｏｌｏｇ）、フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）など）から市販されているマイクロタイタープレート（「マイクロプレート」または「マイクロプレート（ＭｉｃｒｏＰｌａｔｅ）（商標）」マイクロタイタープレート）と構造が本質的に似たマルチウェル試験装置の使用を意図する。本発明は、様々な試験形式を含むことも意図される。従って、標準的なマイクロタイタープレート試験法に加えて、本発明は、様々なゲル化剤（米国特許第５，６２７，０４５号、同第５，８８２，８８２号、および同第５，９８９，８５３号に記載のようなアルギナート、カラゲーナン、およびゲランガム（例えば、ゲルライト（Ｇｅｌｒｉｔｅ）（商標）および／またはフィタゲル（Ｐｈｙｔａｇｅｌ）（商標））が挙げられるが、これに限定されない）、ならびに米国特許第５，５８９，３５０号および同第５，８００，７８５号に記載のマイクロカード（ＭｉｃｒｏＣａｒｄ）（商標）小型試験プレートと共に用いられることが意図される（これらの全てが参照として本明細書に組み入れられる）。
【００５１】
従って、１つの態様において、マイクロプレート（例えば、マイクロプレート（商標）マイクロタイタープレート）形式が用いられる。この態様において、マイクロプレート（商標）、マイクロカード（商標）、または別の容器のウェルを接種するために、懸濁細胞を含むゲル形成マトリックスが用いられる。接種の際に、ゲル形成マトリックスは液状であり、そのため、懸濁液を区画に容易に分配することができる。これらの区画は乾燥した生化学物質およびカチオンを含んでいる。ゲル形成マトリックスとカチオンが接触すると、懸濁液は固化して軟らかいゲルを形成し、細胞は均一に分配される。このゲルは、懸濁された細胞を保持するのに十分に粘度があるか、または硬く、その結果、細胞はウェルまたは試験アレイの底に沈まない。
【００５２】
別の態様において、マイクロカード（商標）小型試験形式が用いられる。本発明の装置の１つの態様は、試料が導入される液体入口を有するハウジングを含む。ハウジングはさらに、液体が複数のウェルまたは区画に流れるように試験領域と連絡する流路を含む。流路は、ウェルの一面を形成するように合わせられ、ハウジングの一方の側に取り付けられた、ガスを逃がす疎水性膜の面で囲まれている。ハウジングは、その反対側で、固形基剤によって封止されてもよい。他の態様において、可撓性のあるテープを固形基剤の代わりに用いてもよく、固形基剤をハウジングと一体になるように成形してもよい。
【００５３】
装置を、細胞を含む溶液またはゲル形成マトリックスで満たした後、装置内のゲルマトリックスがガスを逃がす膜を通って蒸発しないように装置を封止するために、テープ（例えば、ポリエステルフィルム）などのガスを逃がさない任意の材料を、ガスを逃がす膜の外面に貼り付けてもよい。供給の際に、懸濁細胞を含むゲル形成マトリックスは液状である。一度試験領域に存在するゲル開始化合物と液体が接触すると、ゲルマトリックスが生成され、懸濁細胞をトラップする。
【００５４】
本発明はキットとして使用するのに特に適している。特に、キットの形をとる本発明は、哺乳動物、昆虫、および植物の細胞に加えて一般的に単離される細菌ならびに放線菌および菌類（すなわち、酵母およびカビ）を含む様々な細胞の容易かつ迅速な表現型試験に適している。特に、本発明は、細胞を表現型分析するための（特に、候補となるＢＡＣ活性を有する様々な化合物に対する細胞の感受性および耐性を分析するための）組成物および方法を提供する。
【００５５】
本発明のＰＭは視覚的に読み取られることが意図されるが、その一方で、アッセイの結果を読み出し、読み取るのに計器が用いられることも意図される。例えば、試験パネルを読み出すための実用的で、効率的な、かつ費用効率が高いシステムが、参照として本明細書に組み入れられる米国特許出願第０９／２７７，３５３号で述べられている。この計器を用いると、細胞および細胞系を数千もの表現型について直接的かつ同時に分析するのが容易になる。本発明は、原核細胞ならびに真核細胞を表現型分析するための方法および組成物を提供する。実際に、本発明は、任意の特定の生物、細胞、または試験形式に限定されない。
【００５６】
多くの態様において、本発明は１つまたはそれ以上の試験パネルを提供し、各試験パネルは９５の表現型試験のための基質を含んでいる。特に、本発明は非常に多くのＢＡＣ化合物の試験を可能にする。しかしながら、本発明は特定の試験数に限定されることが意図されない。例えば、現在入手できるパネルの中には、１つのアレイにおいて３８４個または１５３６個の基質を試験できるものもある。従って、本発明は非常に多くのＢＡＣ化合物の試験を可能にする。しかしながら、本発明は１つのＢＡＣ化合物の試験だけに限定されることが意図されない。従って、本発明は、様々な細胞の表現型試験に適した任意のタイプの試験基質を有する試験パネルを含むことが意図される。実際に、本発明の方法において、個々のＢＡＣ、候補となるＢＡＣ、ＢＡＣの組み合わせ、および他の基質（例えば、炭素源または窒素源）と共に試験されるＢＡＣを含む、基質の組み合わせが用いられることが意図される。
【００５７】
定義
本明細書および特許請求の範囲における「試料」および「標本」という用語は、それらの最も広い意味で用いられる。他方で、これらの用語は、標本または培養物を含むことが意図される。他方で、これらの用語は生物学的試料および環境試料を含むことが意図される。これらの用語はヒトおよび他の動物から得られる全てのタイプの試料を含み、試料として体液（例えば、尿、血液、糞便、脳脊髄液（ＣＳＦ）、精液、および唾液）ならびに固形組織が挙げられるが、これに限定されない。これらの用語はまた、微生物培養用の試料を得るために一般的に用いられるスワブおよび他のサンプリング装置を意味する。
【００５８】
生物学的試料は、ヒトを含む動物、液体または組織、食品および食品成分（例えば、乳製品、野菜、肉および肉以外の有用な部分）、ならびに廃棄物でもよい。環境試料として、環境物質（例えば、表層物質、土壌、水、および産業試料）、ならびに食品および乳製品を加工する計器、装置、設備、使い捨て製品、および使い捨てでない製品から得られた試料が挙げられる。これらの例は、本発明に適用できる試料のタイプを限定すると解釈されるべきでない。
【００５９】
生物学的試料でも環境試料でも、微生物を「純粋培養」するために、まず最初に、微生物を含むと考えられる試料を濃縮手段にかけてもよく、かけなくてもよい。「濃縮手段」または「濃縮処理」によって、本発明は、（ｉ）液体、固形、半固形、または他の任意の培地および／または技術によって他の微生物から目的の特定の微生物を単離する従来の技術、ならびに（ｉｉ）他の微生物から特定の微生物を単離する新規の技術を意図する。本発明は、１つの濃縮段階または濃縮手段のタイプだけに限定されることが意図されない。例えば、試料を従来の濃縮手段にかけた後に、目的の種の株の純粋培養物が得られるように、結果として得られた調製物をさらなる精製にかけることは本発明の範囲内である。次いで、この純粋培養物を本発明の培地および方法によって分析してもよい。
【００６０】
本明細書で使用する「初代単離」という用語は、試料から直接、生物を培養するプロセスを意味する。従って、初代単離は、培養スワブ、尿試料、環境試料などから寒天プレートを接種するようなプロセスを伴う。初代単離は、固形または半固形寒天培地を用いて、または液体中で行われてもよい。本明細書で使用する「単離」という用語は、初代培養でもその後のいずれの培養（維持および／または使用のための生物の保存培養物の「継代」または「移動」を含む）でも生物の任意の培養を意味する。
【００６１】
本明細書で使用する「培養物」という用語は、１つまたはそれ以上の種類の微生物または細胞を含むと考えられる任意の試料または標本を意味する。特に好ましい態様において、この用語は細菌および菌類に関して用いられる。「純粋培養物」は、存在する生物が特定の属および種の１種類の株しかない培養物である。これは、１種類を超える微生物の属および／または種が存在する培養物である「混合培養物」と対照をなしている。
【００６２】
本明細書で使用する「真核生物」という用語は、単位膜に結合した（すなわち、真の）核を有し、通常、他の細胞小器官を有する細胞または生物を意味する。ほとんどの真核生物には、ヒストンと複合体化し、数本の染色体に存在するＤＮＡがある。真核生物として、藻類、菌類、原生動物、植物、および動物が挙げられる。本発明は、任意の特定の真核細胞または真核生物に限定されることが意図されない。実際に、この用語は、一般的に真核細胞に関連した特徴を有する任意の生物または細胞を含むことが意図される（例えば、ブロック（Ｂｒｏｃｋ）ら（編）「微生物生物学（Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）」第７版、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ［１９９４］、８６−８７頁を参照のこと）。
【００６３】
本明細書で使用する「原核生物」という用語は、単位膜に結合した（すなわち、真の）核および他の細胞小器官を欠く（すなわち核小体がない）、一般的に、単一の環状ＤＮＡからなるゲノムを有する生物または細胞を意味する。ほとんどの場合、細胞壁が存在する。原核生物として、細菌（すなわち、真正細菌）および原始の細菌（すなわち、古細菌）が挙げられる。本発明は、任意の特定の原核細胞または原核生物に限定されることが意図されない。実際に、この用語は、一般的に原核細胞に関連した特徴を有する任意の生物または細胞を含むことが意図される（例えば、ブロックら（編）「微生物生物学」、第７版、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ［１９９４］、８６−８７頁を参照のこと）。
【００６４】
本明細書で使用する「生物」という用語は微生物の任意の種またはタイプをいうために用いられ、微生物として細菌、酵母、および他の菌類が挙げられるが、これに限定されない。本明細書で使用する「菌類」という用語は、二形性菌類を含むカビおよび酵母などの真核生物に関して用いられる。
【００６５】
本明細書で使用する「胞子」という用語は、細菌、菌類、藻類、原生動物などの生物によって無性生殖で生じた（例えば、分生胞子）または有性生殖で生じた任意の形態の生殖要素を意味する。これはまた、過酷な環境条件下での生存に関して個々の細胞に有利な点をもたらす、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の一員などの微生物内の構造に関して用いられる。この用語は、「内生胞子」または「外生胞子」などの胞子の任意の特定のタイプまたは位置に限定されることが意図されない。もっと正確に言うと、この用語は最も広い意味で用いられる。
【００６６】
本明細書で使用する「微生物培地」および「微生物培養培地」および「培地」という用語は、微生物の増殖および再生のための任意の培養基を意味する。「培地」は、微生物増殖を支援する、プレートに入れられた固形培地に関して用いられてもよい。また、この定義には、半固形および液体の微生物増殖システム（生きている宿主生物を取り込んだシステムを含む）ならびに任意のタイプの培地も含まれる。
【００６７】
本明細書で使用する「培養培地」および「細胞培養培地」という用語は、インビトロでの細胞増殖（すなわち、細胞培養）を支援するのに適した培地を意味する。この用語は任意の特定の細胞培養培地に限定されることが意図されない。例えば、この定義は成長培地ならびに維持培地を含むことが意図される。実際に、この用語は目的の細胞培養物の増殖に適した任意の培養培地を含むことが意図される。
【００６８】
本明細書で使用する「限定培地」という用語は、成分が既知の培地を意味する。例えば、この用語は、組成が既知の特定の成分を用いて調製された合成培地を含む。しかしながら、本発明は、任意の特定の培地または培地のタイプに限定されることが意図されない。さらに、本発明は、追加の特徴付けられていない成分を含む限定培地を含む（すなわち、限定培地は基本培地であり、これに様々な化合物が添加される）。限定培地とは対照的に、「非限定培地」は、特徴付けられていない、または未知の構成成分（例えば、トリプカーゼソイブロス（ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）、酵母エキス、血清、血漿など）を含む培地である。
【００６９】
本明細書で使用する「単層」、「単層培養」、および「単層細胞培養」という用語は、培養基に付着しており、細胞一つ分の厚さの層として増殖する細胞を意味する。単層は、フラスコ、チューブ、カバーガラス（例えば、シェルバイアル）、ローラーボトルなどが挙げられるが、これに限定されない任意の様式中で増殖されてもよい。細胞はまた、ビーズが挙げられるが、これに限定されないマイクロキャリアに付着して増殖されてもよい。
【００７０】
本明細書で使用する「コンフルエント」という用語は、細胞で覆われていない培養基がないように互いに接触している付着細胞を意味する。
【００７１】
本明細書で使用する「付着」という用語は、「足場依存性」であり（すなわち、生存および／または増殖のために固形培養基または表面への接着を必要し）、固形培養基に接着している細胞を意味する。対照的に、「足場非依存性」細胞は、生存および／または増殖のために固形培養基または表面への接着を必要としない。
【００７２】
本明細書で使用する「接触阻止」という用語は、細胞が他の隣接する細胞と完全に接触している（例えば、コンフルエントな培養状態にある）時の、細胞膜の波打ち運動および細胞運動の阻止を意味する。この段階の後に細胞増殖が停止することが多いが、この２つは必ずしも因果関係があるとは限らない。
【００７３】
本明細書で使用する「懸濁液」および「懸濁培養」という用語は、培養基に接着せずに生存および増殖する細胞を意味する。懸濁培養は、一般的に、造血細胞、形質転換細胞系、悪性腫瘍に由来する細胞を用いて生成される。
【００７４】
本明細書で使用する「マイクロキャリアビーズ」という用語は、細胞の接着および増殖に適したビーズを意味する。これらのビーズは市販されており、培養における細胞の増殖および維持に一般的に用いられている。特に好ましい態様において、細胞をビーズに接着させ、液体増殖培地に入れて増殖させる。従って、ある態様において、細胞を懸濁液中で増殖させるが、マイクロキャリアビーズに接着させる。
【００７５】
本明細書で使用する「細胞タイプ」という用語は、細胞の供給源または特徴にかかわらず任意の細胞を意味する。
【００７６】
本明細書で使用する「細胞系」という用語は、初代細胞系、有限継代性細胞系、連続継代性細胞系、および形質転換細胞系を含むインビトロで培養された細胞を意味する。
【００７７】
本明細書で使用する「初代細胞培養」および「初代培養」という用語は、動物、植物、または昆虫の組織から直接得られた細胞培養物を意味する。これらの培養物は成人ならびに胎児の組織から得られてもよい。
【００７８】
本明細書で使用する「有限継代性細胞系」という用語は、老化の前に有限数の集団倍加が可能な細胞培養物を意味する。
【００７９】
本明細書で使用する「連続継代性細胞系」という用語は、無限の寿命を有する細胞培養物を意味する。自然形質転換から生じた細胞系もあれば、操作によって（例えば、テロメリゼーション（ｔｅｌｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）によって）得られた細胞系もある。多くの場合、この細胞は、初代細胞系または有限継代性細胞系の細胞集団が外見上増殖を止める「危機」期を経ているが、それにもかかわらず細胞サイズが小さく、増殖速度が速く、クローニング効率が高く、腫瘍形成性が増大し、様々な染色体組があるという一般的な特徴を有する細胞集団が現れる。これらの細胞はインビトロでの自然形質転換から生じる場合が多い。これらの細胞は無限の寿命を有する。
【００８０】
本明細書で使用する「形質転換細胞系」という用語は、前記のような特徴を有する連続継代性細胞系に形質転換されている細胞培養物を意味する。形質転換細胞系は腫瘍組織から直接得られてもよく、また、ウイルス全体（例えば、ＳＶ４０もしくはＥＢＶ）またはベクター系を用いて形質転換ウイルスから得られたＤＮＡ断片を用いた細胞のインビトロ形質転換によって得られてもよい。
【００８１】
本明細書で使用する「混合細胞培養」という用語は２種類の細胞の混合物を意味する。ある態様において、細胞は遺伝子操作されていない細胞系であるのに対して、他の好ましい態様において、細胞は遺伝子操作されている細胞系である。
【００８２】
本明細書で使用する「栄養要求株」という用語は、栄養剤（例えば、増殖因子）の存在下でのみ増殖することができる生物または細胞系に関して用いられる。従って、栄養要求性試験において、栄養要求株は、その増殖に必要な１つまたはそれ以上の栄養剤の存在下でしか増殖せず、必要な１つまたはそれ以上の栄養剤を欠く培地では増殖しない。
【００８３】
本明細書で使用する「炭素源」という用語は、細胞の増殖および／または代謝のための炭素の供給源として利用することができる任意の化合物に関して用いられる。炭素源は様々な形をとってもよく、ポリマー、炭水化物、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、およびペプチドが挙げられるが、これに限定されない。
【００８４】
本明細書で使用する「窒素源」という用語は、細胞の増殖および／または代謝のための窒素の供給源として利用することができる任意の化合物に関して用いられる。炭素源と同様に、窒素源は、遊離窒素ならびに窒素含有化合物などの様々な形をとってもよく、アミノ酸、ペプトン、ビタミン、および窒素塩が挙げられるが、これに限定されない。
【００８５】
本明細書で使用する「リン源」という用語は、細胞の増殖および／または代謝のためのリンの供給源として利用することができる任意の化合物に関して用いられる。他の元素（例えば、炭素および窒素）の供給源と同様に、リン源は、遊離リンならびにリン含有化合物などの様々な形をとってもよい。
【００８６】
本明細書で使用する「硫黄源」という用語は、細胞の増殖および／または代謝のための硫黄の供給源として利用することができる任意の化合物に関して用いられる。炭素源、窒素源、およびリン源と同様に、硫黄源は、遊離硫黄ならびに硫黄含有化合物などの様々な形をとってもよい。
【００８７】
本明細書で使用する「増殖刺激栄養分」という用語は、生物の増殖を促進する任意の化合物に関して用いられる。本発明は任意の特定の増殖刺激栄養分に限定されることが意図されないが、特に好ましい態様において、本発明は、増殖因子、アミノ酸、核酸前駆体、脂質、細胞膜および細胞壁前駆体、ビタミン、ホルモン、無機質、ならびに細胞増殖を刺激する他の要素および化合物の使用を意図する。
【００８８】
本明細書で使用する「薬物」という用語は、生物学的活性を有する任意の化合物を意味する。ある態様において、この用語は抗菌剤に関して用いられるが、抗菌剤に限定されることが意図されない。実際に、この用語は、細胞の成長、代謝、および／または増殖を変える化合物、ならびに微生物および／または他の細胞（例えば、動物細胞）に影響を及ぼす化合物を含む。従って、この用語は、抗炎症剤、抗ヒスタミン剤、吐剤、制吐剤、ならびに生物系および／または細胞に影響を及ぼす他の化合物などの化合物を含む。
【００８９】
本明細書で使用する「抗菌剤」という用語は、微生物の増殖を阻害するか、または微生物を死滅させる任意の化合物に関して用いられる。この用語はその最も広い意味で用いられ、天然に産生されるか、または合成によって製造される抗生物質などの化合物を含むが、これに限定されないことが意図される。この用語は、微生物の増殖を阻害するか、または微生物を死滅させるのに有用な他の任意の有機化合物および無機化合物を含むことも意図される。
【００９０】
本明細書で使用する「試験基質」という用語は、生化学的特徴に基づいて細菌を区別するのに利用することができる任意の栄養源（例えば、炭素源、窒素源、リン源、および硫黄源、ならびに増殖刺激栄養分、抗菌剤、および色素生成基質）に関して用いられる。例えば、ある細胞種は、別の種に利用されない試験基質を利用することができる。次いで、これらの２つの種を区別するために、この利用を用いることができる。非常に多くの試験基質を組み合わせて用いられることが意図される。試験基質は個々に試験されてもよく（例えば、試験ウェルもしくは試験区画または試験領域１つにつき１つの基質）、組み合わせて試験されてもよい（例えば、複数の試験基質が一緒に混合され、「カクテル」として供給される）。
【００９１】
本明細書で使用する「ＢＡＣ」という用語は、細胞に影響を及ぼす任意の化合物に関して用いられる。この影響は、細胞の増殖または呼吸の刺激または阻害でもよく、任意の細胞成分への結合でもよく、細胞の任意の機能またはタンパク質触媒活性の活性への影響でもよい。従って、本発明は任意の化合物または化合物クラスに限定されることが意図されない。実際に、本発明のＢＡＣは特定の細胞に影響を及ぼす任意の化合物を含む。
【００９２】
試験基質（例えば、１つまたはそれ以上のＢＡＣ、炭素源または窒素源など）に曝露した後、生物または細胞系の応答を検出することができる。この検出は視覚（すなわち、目）によるものでもよく、１つまたはそれ以上の機械（例えば、バイオログマイクロステーションリーダー（Ｂｉｏｌｏｇ ＭｉｃｒｏＳｔａｔｉｏｎ Ｒｅａｄｅｒ）（商標））を用いて行われてもよい。例えば、炭素源に対する生物の応答を、生物が試験基質を利用したことによる懸濁液中の濁りとして検出することができる。同様に、あるＢＡＣによって生物が阻害されない指標として増殖を用いることができる。１つの態様において、生物の増殖／代謝の有無を示すために、色が用いられる。
【００９３】
本明細書で使用する「比色指示薬」という用語、反応が起こったことを、または細胞もしくは生物が特定の化合物を代謝できることを色の変化によって示すのに用いられる任意の化合物を意味する。これは、藍色、青色、赤色、黄色、緑色、オレンジ色、茶色などの「色」の従来の意味で用いられるような任意の色、ならびに蛍光によって検出可能な色（例えば、フルオレセインの黄緑色、ローダミンの赤色など）を生じる蛍光化合物または蛍光原化合物を含むが、これに限定されない。色素（例えば、ｐＨおよびレドックス）ならびに発光原化合物などの他の指示薬が、この定義に含まれることが意図される。好ましい態様において、本発明の比色指示薬として、色素生成基質、酸化還元指示薬、およびｐＨ指示薬が挙げられるが、これに限定されない。ある特に好ましい態様において、酸化還元指示薬はテトラゾリウムバイオレットであるのに対して、他の態様では、レドックスパープルである。比色指示薬は視覚的に、または装置もしくは機械（例えば、色彩計、光度計、もしくはカメラ）によってモニターすることができる。
【００９４】
本明細書で使用する「色素生成化合物」および「色素生成基質」という用語は、その光吸収または発光の特徴によって検出システムにおいて有用な任意の化合物を意味する。この用語は、視覚的にまたは光学機械を用いて検出することができる、任意の酵素切断産物（可溶性および不溶性）を含むことが意図される。名称「色素生成」には、色の変化として検出することができる最終生成物を生成する全ての酵素基質が含まれる。これは、藍色、青色、赤色、黄色、緑色、オレンジ色、茶色などの「色」の従来の意味で用いられるような任意の色、ならびに蛍光によって検出可能な色（例えば、フルオレセインの黄緑色、ローダミンの赤色など）を生じる蛍光化合物または蛍光原化合物を含むが、これに限定されない。色素（例えば、ｐＨおよびレドックス）ならびに発光原化合物などの他の指示薬が、この定義に含まれることが意図される。
【００９５】
本明細書で使用する「ｐＨ指示薬」、「レドックス指示薬」、および「酸化還元指示薬」という用語の一般的に用いられる意味が意図される。従って、「ｐＨ指示薬」は、ｐＨ変化の検出に一般的に用いられる全ての化合物を含む。ｐＨ指示薬として、フェノールレッド、ニュートラルレッド、ブロモチモールブルー、ブロモクレゾールパープル、ブロモクレゾールグリーン、ブロモクロロフェノールブルー、ｍ−クレゾールパープル、チモールブルー、ブロモクレゾールパープル、キシレノールブルー、メチルレッド、メチルオレンジ、およびクレゾールレッドが挙げられるが、これに限定されない。「レドックス指示薬」および「酸化還元指示薬」という用語は、酸化還元電位（すなわち「ｅＨ」）の検出に一般的に用いられる全ての化合物を含む。この指示薬として、様々なタイプまたは形態のテトラゾリウム、レサズリン、メチレンブルー、およびキノンイミドレドックス色素（「メチルパープル」およびメチルパープル誘導体として知られる化合物を含む）が挙げられるが、これに限定されない。メチルパープルとして知られるキノンイミドレドックス色素は、本明細書で「レドックスパープル」（例えば、参照として本明細書に組み入れられる米国特許第５，８８２，８８２号を参照のこと）と呼ばれる。特に好ましい態様において、「レドックスパープル」は、米国特許第５，８８２，８８２号の図５、ＩＶに示される化学構造を有する化合物を含む。特性（例えば、溶解度、細胞浸透性、毒性）が改変された、および／または色／吸収波長が改変された、試薬の類似する誘導体（例えば、アルカリ塩、アルキルＯ−エステル）が、添付の実施例に記載の方法にわずかに変更を加えた方法を用いて生成されることが意図される。本発明において、レドックス指示薬として様々な形態の「レドックスパープル」（例えば、塩など）を効果的に併用できることも意図される。
【００９６】
本明細書で使用する「試験手段」および「試験装置」という用語は、少なくとも１つの生物が少なくとも１つの特徴（例えば、特定の炭素源、窒素源、もしくは色素生成基質の利用、および／またはＢＡＣ薬剤に対する感受性）について試験される試験システムに関して用いられる。この定義は、反応混合物、懸濁液、または試験を含む任意の適切な手段を含むことが意図される。この用語は、マイクロプレート、ペトリ皿、マイクロカード装置、または使用に適した他の任意の支援構造を含むことが意図される。例えば、少なくとも１つのゲル化開始剤が複数のウェルまたは区画のそれぞれに含まれるマイクロプレートが試験手段を構成する。試験手段の他の例として、ゲル開始手段がウェルに含まれないマイクロプレートが挙げられる。炭素源またはＢＡＣなどの他の化合物が区画内に含まれることも意図される。この定義は、微生物を特徴付けるためのマイクロプレート（商標）マイクロタイタープレート（バイオログから入手可能）を含む。この定義はまた、機能が似ているが、標準的なマイクロタイタープレートよりかなり小さい「マイクロカード」または小型プレートもしくはカード（例えば、多くの試験装置は都合よく使用者の手で保持することができる）を含むことが意図される。特に好ましい態様において、マイクロカードは、米国特許第５，５８９，３５０号および同第５，８００，７８５号（両方とも参照として本明細書に組み入れられる）に記載のマイクロカード（商標）装置（バイオログから入手可能）である。本発明は、特定のサイズまたは配置の試験装置または試験手段に限定されることが意図されない。例えば、様々な形式が本発明と共に用いられることが意図される。形式として、マイクロタイタープレート（マイクロプレート（商標）が挙げられるが、これに限定されない）、小型試験プレート（例えば、マイクロカード（商標）小型試験カード）、ペトリプレート、プレート内に入れられる別個の異なる培地を分けるために用いられる内部分配器を備えたペトリプレート、試験管、ならびに他の多くの形式が挙げられるが、これに限定されない。
【００９７】
本明細書で使用する「ゲル化剤」という用語は広い一般的な意味で用いられ、天然供給源から得られた化合物ならびに合成によって調製された化合物を含む。本明細書で使用する、この用語は、ある特定の条件が満たされた時に少なくとも部分的に固化する任意の物質を意味する。例えば、この定義に含まれるゲル化剤の１つは、二価カチオン（例えば、Ｍｇ２＋またはＣａ２＋）に曝露されるとゲルを形成するゲランであるゲルライト（商標）である。ゲルライト（商標）は、シュードモナス・エロデア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｌｏｄｅａ）によって産生された天然多糖を脱アセチル化することによって生成されるゲランガムであリ、カン（Ｋａｎｇ）ら（参照として本明細書に組み入れられる米国特許第４，３２６，０５２号および同第４，３２６，０５３号）によって述べられている。
【００９８】
この定義には、タンパク質ベースのゲル化剤ならびに炭水化物ベースのゲル化剤を含む、天然供給源から得られた様々なゲル化剤が含まれる。一例は、ケルプから抽出される多糖複合体である細菌学用寒天である。この定義には、ゼラチン（例えば、コラーゲンから得られる高分子量タンパク質の水溶性混合物）、ペクチン（例えば、植物から得られる多糖類）、カラゲーナンおよびアルギン酸（例えば、海草から得られる多糖類）、ならびにゴム（例えば、ある植物および細菌からの粘着性分泌物）などの化合物も含まれる。様々なカラゲーナン調製物が本発明において用いられることが意図され、ιカラゲーナンが好ましい態様を構成する。本発明において用いられるゲル化剤は、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）、ＢＢＬ、オキソイド（Ｏｘｏｉｄ）、マーコール（Ｍａｒｃｏｒ）、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、または他の供給元などの供給会社から市販され入手できることも意図される。
【００９９】
「ゲル化剤」という用語は、硬いゲル物質を形成する化合物に限定されることが意図されない。単に、とろみがあるか、または粘性のあるコロイド懸濁液から、硬いゲルまでの範囲が意図される。また、本発明は懸濁液がゲル化するのにかかる時間に限定されることが意図されない。
【０１００】
重要なことに、本発明は、生物が増殖することができるマトリックス（すなわち、「ゲルマトリックス」）の生成に適したゲル化剤を提供することが意図される。本発明のゲルマトリックスは、生物をゲル化剤を含有する水溶液と混合し、この懸濁液をゲル化開始剤に曝露した時に生成される、生物のコロイド型懸濁液である。このコロイド型ゲル懸濁液は、重力の影響によってマトリックスから沈殿することなく、生物が均一に分散されている連続マトリックス培地であることが意図される。ゲルマトリックスは、ゲル懸濁液の内部で、ゲル懸濁液の下部で、およびゲル懸濁液の上部で生物の増殖を支援する。
【０１０１】
本明細書で使用する「ゲル化開始剤」という用語は、ゲル化剤をある特定の条件または試薬に曝露した後にゲルマトリックス形成をもたらす任意の化合物または要素を意味する。「ゲル化開始剤」は、カチオン（例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、およびＫ＋）などの試薬を含むことが意図される。ゲル化剤が少なくとも１つのゲル化開始剤と接触するまで、ゲル化剤を含む懸濁液は「ゲル化しない」ままである（すなわち、懸濁液はとろみがつかず、粘度が増えず、固化しない）。接触後、懸濁液は粘性を帯び、硬いゲルを形成してもよく、形成しなくてもよい（すなわち、接触により「ゲル化」が起こる）。
【０１０２】
本明細書で使用する「接種懸濁液」または「接種物」という用語は、試験しようとする生物を接種することができる懸濁液に関して用いられる。「接種懸濁液」という用語は、特定の液体または液体物質に限定されることが意図されない。例えば、接種懸濁液は、少なくとも１つのゲル化剤を含む、水、食塩水、または水溶液からなってもよい。接種懸濁液は、水、食塩水、または任意の水性材料が添加される成分を含んでもよいことも意図される。１つの態様において、この成分は、目的の微生物に有用な少なくとも１つの成分を含むことが意図される。本発明は特定の成分に限定されることが意図されない。
【０１０３】
本明細書で使用する「キット」という用語は、試薬および他の材料の組み合わせに関して用いられる。キットは、ＢＡＣ、炭素源、窒素源、色素生成基質、希釈剤、および他の水溶液などの試薬、ならびに専用のマイクロプレート（例えば、バイオログから得られるＧＮ、ＧＰ、ＥＳ、ＹＴ、ＳＦ−Ｎ、ＳＦ−Ｐ、および他のマイクロプレート（商標））、接種物、小型試験カード（例えば、マイクロカード（商標））、およびプレートに入れられた寒天培地を含んでもよいことが意図される。本発明は、微生物の増殖、同定、および／またはＢＡＣ感受性決定に有用な他の試薬を意図する。例えば、キットは、キット成分の接種後に、微生物の増殖を検出するための試薬を含んでもよい（例えば、テトラゾリウムまたはレサズリンが本発明のある態様に含まれる）。「キット」という用語は、試薬および／または他の材料の特定の組み合わせに限定されることが意図されない。さらに、生物を、寒天表面またはブロスなどの予め成形したマトリックス上にまたはマトリックス中に接種することを伴う方法およびキットとは対照的に、本発明は、生物がゲル形成マトリックス内に懸濁されている試験プレートの接種を伴う。
【０１０４】
本明細書で使用する「卵母細胞」という用語は雌性配偶子細胞を意味し、一次卵母細胞、二次卵母細胞、および成熟した未受精卵を含む。卵母細胞は、卵質で囲まれた大きな核（すなわち、胚胞）を有する大きな細胞である。卵質は、ｍＲＮＡ、リボソーム、ミトコンドリア、卵黄タンパク質などを含む、核でない細胞質成分を含んでいる。卵母細胞の膜は本明細書では「原形質膜」と呼ばれる。
【０１０５】
本明細書で使用する「成熟前卵母細胞」という用語は、（例えば、吸引によって）卵巣から単離されたが、インビトロで成熟培地に曝露されていない、卵原細胞段階後の（すなわち、有糸分裂増殖が生じた後の）雌性配偶子細胞を意味する。吸引プロセスによって卵母細胞は成熟プロセスを始めるが、インビトロでの成熟プロセスの完了（すなわち、一次極体を押し出した二次卵母細胞の形成）には吸引された卵母細胞を成熟培地に曝露することが必要なことが当業者に知られている。成熟前卵母細胞は、一般的に、減数分裂の第一後期で止まっている。
【０１０６】
本明細書で使用する「受精前卵母細胞」という用語は、インビトロで成熟培地に曝露された後であるが、精子に曝露される前の成熟前卵母細胞などの、すなわわち、成熟しているが受精していない雌性配偶子細胞を意味する。受精前卵母細胞は第一減数分裂を完了し、一次極体を放出しており、核膜がない（受精が行われるまで核膜は改造されない。受精後、二次極体の押し出しおよび雄性前核および雌性前核の形成と共に第二減数分裂が行われる）。受精前卵母細胞はまた、第二減数分裂の中期ＩＩにある成熟卵母細胞と呼ばれることもある。
【０１０７】
本明細書で使用する「未受精卵」または「未受精卵母細胞」という用語は受精していない任意の雌性配偶子細胞を意味し、これらの用語は成熟前卵母細胞および受精前卵母細胞の両方を含む。
【０１０８】
態様をいくらか詳細に説明したが、好ましい態様の多くの変更および変化が本発明から逸脱することなく可能である。
【０１０９】
実験
以下の実施例は、本発明のある特定の好ましい態様および局面を証明し、さらに例示するために示され、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでない。
【０１１０】
以下の実験例開示では、以下の略語が適用される：ｅｑ（当量）；Ｍ（モル濃度）；μＭ（マイクロモル濃度）；Ｎ（規定）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；ｎｇ（ナノグラム）；ｌまたはＬ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；℃（摂氏度）；ＴＳＡ（トリプカーゼソイ寒天）；ＹＭＥまたはＹＥＭＥ（酵母エキス−麦芽エキス寒天；レジゲル（Ｒｅｄｉｇｅｌ）（ピーシーアールサイエンティフィック（ＲＣＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｇｏｓｈｅｎ、ＩＮ）；ゲルライト（商標）（メルクアンドカンパニー（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．）、Ｒａｈｗａｙ、ＮＪ）；レメル（Ｒｅｍｅｌ）（レメル、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）；オキソイド（オキソイド、Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）；ＢＢＬ（ベクトンディキンソンマイクロバイオロジーシステムズ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）；ディフコ（ディフコラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ、現在、ベクトンディキンソンの一部）；アクメディア（Ａｃｕｍｅｄｉａ）（アクメディア、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）；ユーエスバイオケミカル（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）（ユーエスバイオケミカルコーポレーション（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）；フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）（フィッシャーサイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）；シグマ（シグマケミカルカンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ．）；バイオログ（バイオログインク（Ｂｉｏｌｏｇ，Ｉｎｃ．）、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）；ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）；ＮＣＹＣ（ナショナルコレクションオブイーストカルチャーズ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｙｅａｓｔ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、Ｎｏｒｗｉｃｈ、Ｅｎｇｌａｎｄ）；ＮＣＣＬＳ（国立臨床検査標準協議会）；およびモレュラーデバイシーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）（モレュラーデバイシーズ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）。アミノ酸に従来用いられる３文字略語（例えば、「ａｌａ」はアラニンまたはアラニン残基を示す）もまた以下の実施例の一部において用いられる。
【０１１１】
実施例１
細菌のＢＡＣ試験
本実施例において、大腸菌（ＭＧ１６５５）の感受性を、バンコマイシン（１０μｇ／ｍｌ）またはスルファメトキサゾール（２３５μｇ／ｍｌ）の存在下で様々な追加化合物を含有するマイクロアレイにおいて試験した。マイクロアレイは、ＥＳ１、ＥＳ２、およびＥＳ３マイクロプレート（商標）と呼ばれる３種類のバイオログ（商標）感受性試験パネルにあった。０．４０％ＮａＣｌ、０．０３％プルロニックＦ６８、０．０１％フィタゲル、および０．０１％テトラゾリウムバイオレットを含有する滅菌懸濁水溶液に、８５％透過率（バイオログ（商標）濁度計を用いて測定した）の細胞密度まで生物を添加した。生物（１００μｌ／ウェル）をマイクロアレイウェルに接種する直前に、試験しようとするＢＡＣを懸濁液に添加した。これらのＥＳマイクロプレート（商標）のウェルは、トリプトン（２ｇ／Ｌ）、酵母エキス（１ｇ／Ｌ）、およびＮａＣｌ（１ｇ／Ｌ）からなる基本ブロス培地を含んでいた。
【０１１２】
１個の陽性対照ウェルに加えて、ＥＳ１プレートのウェルは以下の抗菌剤を含んでいた（ウェル１個につき特定の濃度の１つの化合物）：アクリフラビン（４．０μｇ／ｍｌ、８．０μｇ／ｍｌ、および１６μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（２．０μｇ／ｍｌ、４．０μｇ／ｍｌ、８．０μｇ／ｍｌ、および１６μｇ／ｍｌ）、ナフシリン（７５μｇ／ｍｌ、１５０μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、および６００μｇ／ｍｌ）、リンコマイシン（５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、および４００μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（０．１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、および０．８μｇ／ｍｌ）、クロロテトラサイクリン（０．１２５μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ、０．５０μｇ／ｍｌ、および１．０μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（０．０３３μｇ／ｍｌ、０．０６６μｇ／ｍｌ、０．１３３μｇ／ｍｌ、および０．２６６μｇ／ｍｌ）、ジェンタマイシン（０．２５μｇ／ｍｌ、０．５０μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、および２．０ｇ／ｍｌ）、カナマイシン（０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、および２．０μｇ／ｍｌ）、ネオマイシン（０．７５μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、３．０μｇ／ｍｌ、および６．０μｇ／ｍｌ）、バンコマイシン（１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、および８０μｇ／ｍｌ）、バシトラシン（２０８μｇ／ｍｌ、４１６μｇ／ｍｌ、８３３μｇ／ｍｌ、および１６６６μｇ／ｍｌ）、クリンダマイシン（３．３μｇ／ｍｌ、６．６μｇ／ｍｌ、１３．２μｇ／ｍｌ、および２６．４μｇ／ｍｌ）、クロキサシリン（１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、および８００μｇ／ｍｌ）、エリスロマイシン（２．５μｇ／ｍｌ、５．０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、および２０μｇ／ｍｌ）、ペニシリンＧ（５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、および４０μｇ／ｍｌ）、ノボビオシン（３３μｇ／ｍｌ、６６μｇ／ｍｌ、１３３μｇ／ｍｌ、および２６６μｇ／ｍｌ）、スピラマイシン（５．０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、および４０μｇ／ｍｌ）、トリメトプリム（０．１７μｇ／ｍｌ、０．３３μｇ／ｍｌ、０．６７μｇ／ｍｌ、および１．３μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（０．３８μｇ／ｍｌ、０．７５μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、および３．０μｇ／ｍｌ）、セファロリジン（０．７５μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、３．０μｇ／ｍｌ、および６．０μｇ／ｍｌ）、セフロキシム（０．５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、２．０μｇ／ｍｌ、および４．０μｇ／ｍｌ）、ロキシスロマイシン（１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、および８０μｇ／ｍｌ）、およびピペラシリン（０．５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、２．０μｇ／ｍｌ、および４．０μｇ／ｍｌ）。
【０１１３】
ＥＳ２プレートのウェルは以下の抗菌剤を含んでいた（ウェル１個につき特定の濃度の１つの化合物）。アゾマイシン（０．２μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌ、および１．６μｇ／ｍｌ）、リファンピン（０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、および２．０μｇ／ｍｌ）、タイロシン酒石酸塩（２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、および２００μｇ／ｍｌ）、セファゾリン（０．５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、２．０μｇ／ｍｌ、および４．０μｇ／ｍｌ）、セファロチン（２．５μｇ／ｍｌ、５．０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、および２０μｇ／ｍｌ）、セファクロール（０．６６μｇ／ｍｌ、１．３３μｇ／ｍｌ、２．６６μｇ／ｍｌ、および５．３３μｇ／ｍｌ）、リファマイシンＳＶ（１．５μｇ／ｍｌ、３．０μｇ／ｍｌ、６．０μｇ／ｍｌ、および１２μｇ／ｍｌ）、セフスロジン（４．０μｇ／ｍｌ、８．０μｇ／ｍｌ、１６μｇ／ｍｌ、および３２μｇ／ｍｌ）、セフォタキシム（０．０５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、および０．４μｇ／ｍｌ）、セホキシチン（０．７５μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、３．０μｇ／ｍｌ、および６．０μｇ／ｍｌ）、ピューロマイシン（１２μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、および１００μｇ／ｍｌ）、スペクチノマイシン（３．５μｇ／ｍｌ、７．０μｇ／ｍｌ、１４μｇ／ｍｌ、および２８μｇ／ｍｌ）、フシジン酸（５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、および４００μｇ／ｍｌ）、ホスホマイシン（０．２μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌ、および１．６μｇ／ｍｌ）、フレオマイシン（０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、および２．０μｇ／ｍｌ）、アミカシン（０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、および２．０μｇ／ｍｌ）、イソニアジド（３００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、１２００μｇ／ｍｌ、２４００μｇ／ｍｌ）、エチオナミド（２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、および２００μｇ／ｍｌ）、ＳＤＳ（５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ）、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム（１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、および８０μｇ／ｍｌ）、ＢＩＧＣＨＡＰ（２０００μｇ／ｍｌ、４０００μｇ／ｍｌ、８０００μｇ／ｍｌ、および１６，０００μｇ／ｍｌ）、ニアプルーフ（ｎｉａｐｒｏｏｆ）（０．０８％、０．１６％、０．３２％、および０．６４％）、ＣＨＡＰＳ（１５００μｇ／ｍｌ、３０００μｇ／ｍｌ、６０００μｇ／ｍｌ、１２，０００μｇ／ｍｌ）、およびＮ−ラウリルサルコシン（１０００μｇ／ｍｌ、２０００μｇ／ｍｌ、４０００μｇ／ｍｌ、および８０００μｇ／ｍｌ）。
【０１１４】
ＥＳ３プレートのウェルは以下の抗菌剤を含んでいた（ウェル１個につき特定の濃度の１つの化合物）：ナリジキン酸（０．５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、２．０μｇ／ｍｌ、４．０μｇ／ｍｌ）、タウロコール酸（６００μｇ／ｍｌ、１２００μｇ／ｍｌ、２４００μｇ／ｍｌ、および４８００μｇ／ｍｌ）、コリスチン（０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、および２．０μｇ／ｍｌ）、プロカイン（２５００μｇ／ｍｌ、５０００μｇ／ｍｌ、１０，０００μｇ／ｍｌ、および２０，０００μｇ／ｍｌ）、ジアミド（１６．６μｇ／ｍｌ、３３．３μｇ／ｍｌ、６６．６μｇ／ｍｌ、および１３３μｇ／ｍｌ）、ヒドロキシアミン（１２μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、および１００μｇ／ｍｌ）、グアニジン（５００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌ、２０００μｇ／ｍｌ、および４０００μｇ／ｍｌ）、塩化銅（ＩＩ）（２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、および１６０μｇ／ｍｌ）、塩化亜鉛（１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、および８０μｇ／ｍｌ）、塩化カドミウム（５．０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、および４０μｇ／ｍｌ）、塩化ニッケル（２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、および１６０μｇ／ｍｌ）、塩化クロム（１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、および８００μｇ／ｍｌ）、亜セレン酸ナトリウム（１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、および４００μｇ／ｍｌ）、テルル酸カリ（０．２μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌ、および１．６μｇ／ｍｌ）、硫酸マンガン（１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、および８００μｇ／ｍｌ）、塩化コバルト（１２μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、および１００μｇ／ｍｌ）、塩化銀（２．０μｇ／ｍｌ、４．０μｇ／ｍｌ、８．０μｇ／ｍｌ、および１６μｇ／ｍｌ）、クロム酸カリウム（１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、および８０μｇ／ｍｌ）、臭化カリウム（２２５μｇ／ｍｌ、４５０μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、および１８００μｇ／ｍｌ）、シアン酸ナトリウム（１５５μｇ／ｍｌ、３１０μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、および１２００μｇ／ｍｌ）、アジ化ナトリウム（５００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌ、２０００μｇ／ｍｌ、および４０００μｇ／ｍｌ）、ピコリン酸（５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、および４００μｇ／ｍｌ）、超酸化カリウム（１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、および８００μｇ／ｍｌ）、ならびにメナジオン（３．３μｇ／ｍｌ、６．６μｇ／ｍｌ、１３．３μｇ／ｍｌ、および２６．６μｇ／ｍｌ）。
【０１１５】
第１の実験の結果から、１０μｇ／ｍｌバンコマイシンの存在下で、試験された大腸菌株は１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、および８０μｇ／ｍｌのバンコマイシンにのみ一過的な感受性増大を示したことが分かった。さらに、この株は、３３μｇ／ｍｌおよび６６μｇ／ｍｌのノボビオシン、０．１７ｎｇ／ｍｌ、０．３３ｎｇ／ｍｌ、０．６７ｎｇ／ｍｌ、および１．３ｎｇ／ｍｌのトリメトプリム、２．０μｇ／ｍｌおよび４．０μｇ／ｍｌのセファゾリン、１０μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌのセファロチン、０．７５μｇ／ｍｌおよび１．５μｇ／ｍｌのセホキシチン、２００μｇ／ｍｌおよび４００μｇ／ｍｌのフシジン酸、ならびに１．０μｇ／ｍｌ、２．０μｇ／ｍｌ、および４．０μｇ／ｍｌのナリジキン酸に対する感受性の増大しか示さなかった。正常な感受性レベルが、ＥＳ１、ＥＳ２およびＥＳ３マイクロアレイパネルにおける他の試験について観察された。
【０１１６】
結果からまた、２３５μｇ／ｍｌスフファメトキサゾールの存在下で、大腸菌株は、０．２５μｇ／ｍｌ、０．５０μｇ／ｍｌ、および１．０μｇ／ｍｌのクロロテトラサイクリン、０．０３３μｇ／ｍｌ、０．０６６μｇ／ｍｌ、０．１３３μｇ／ｍｌ、および０．２６６μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、６６μｇ／ｍｌおよび１３３μｇ／ｍｌのノボビオシンに対する耐性の増大を示したが、０．１７ｎｇ／ｍｌ、０．３３ｎｇ／ｍｌ、０．６７ｎｇ／ｍｌ、および１．３ｎｇ／ｍｌのトリメトプリム、０．７５μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、３．０μｇ／ｍｌ、および６．０ｇ／ｍｌのセファロリジン、０．２μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌ、および１．６μｇ／ｍｌのアゾマイシン、０．５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ 、２．０μｇ／ｍｌ 、および４．０μｇ／ｍｌのセファゾリン、５．０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、および２０μｇ／ｍｌのセファロチン、１．３３μｇ／ｍｌ、２．６６μｇ／ｍｌ、および５．３３μｇ／ｍｌのセファクロール、８μｇ／ｍｌおよび１６μｇ／ｍｌのセフスロジン、２０μｇ／ｍｌおよび４０μｇ／ｍｌの塩化ニッケル、２００μｇ／ｍｌおよび４００μｇ／ｍｌの塩化クロム、ならびに１２μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌの塩化コバルトに対する感受性の増大を示したことが分かった。正常な感受性レベルが、ＥＳ１、ＥＳ２およびＥＳ３マイクロアレイパネルにおける他の試験について観察された。従って、本実施例は、ＢＡＣの組み合わせを用いて相乗作用および／または拮抗作用を試験するために本発明が用いられることを明確に例示する。
【０１１７】
実施例２
抗菌剤試験
本実施例において、抗菌剤化合物の代謝影響および作用機構を分析するためにＰＭを使用することが実行可能かどうかを調べた実験について述べる。詳細に述べると、この実験は、特定の細菌タンパク質との（「標的特異的」）相互作用を介して作用する化合物を、非特異的機構を介して作用する化合物と単にシグネチャー代謝プロフィール（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐｒｏｆｉｌｅ）の差に基づいて区別できるかどうかを確かめるように設計された。さらに、この実験は、同じ経路の異なる相互作用物質が似たシグネチャープロフィールを生じるかどうか、ならびに異なる経路の相互作用物質がはっきりと異なるプロフィールを生じるかどうかを確かめるように設計された。
【０１１８】
これらの実験に組み入れるために２０種類の化学物質を選択した。これらの化学物質のうち１５個は比較的特異的な作用形態を有すると考えられるが（以下の表３に「単一標的抗菌剤」として列挙した）、５つの抗菌剤は非特異的作用形態を有すると考えられる（「複数標的抗菌剤」として列挙した）。単一標的化合物の中には、細胞壁（アンピシリン、セファロチン、ホスホマイシン、およびバシトラシン）、リボソーム（クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、およびテトラサイクリン）、またはＤＮＡジャイレース（ナリジキン酸、オキソリン酸、およびクーママイシン）に対する類似した作用形態を有する３組の抗菌剤ある。
【０１１９】
部分的に発育を阻止する濃度を使用することが望ましいので、各化学物質の濃度を選択するために最初の実験セットを行った。完全に発育を阻止する濃度または発育を阻止する濃度より下の濃度を用いても情報は全く得られない。テトラゾリウムバイオレット還元（すなわち、呼吸）の阻害による紫色減少の判断基準を用いて、部分的に発育を阻止する濃度を決定した。各化合物を、部分的な呼吸阻害を生じる２種類の濃度で試験した。「１×」と呼ばれる低い方の濃度は、検出可能な呼吸阻害を生じる最低濃度であった。「２×」と呼ばれる高い方の濃度は１×濃度の２倍であった。大部分の化学物質について、４×まで倍加すると、有用でない完全に発育を阻止する濃度になった。従って、１×濃度および２×濃度のみが用いられた。化学物質濃度の選択は管理に重要なパラメータであることが確かめられた。しかしながら、本明細書で用いられた選択基準は全く妥当なものであることが分かった。唯一、カナバニンは、同等の結果を生じるのにわずかに高い濃度を必要とするように見えた。濃度が適切に選択された場合、アッセイには１種類の濃度しか必要とされない。
【０１２０】
【表３】使用化合物およびその作用形態
2004511207.tif 000004
【０１２１】
これらの実験では、大腸菌ＭＧ１６５５を２種類の濃度の２０種類の抗菌剤に対して試験した（それぞれ７個のＰＭ、合計２８０個のＰＭを使用した）。対照として抗菌剤を全く含まないＰＭ（７個一組）を毎日測定した（この合計は対照株からのデータを含まない）。これらの実験では各ＰＭは９５の表現型を含むので、ここで分析された表現型の総数は２６，６００であった。米国特許出願第０９／２７７，３５３号（参照として本明細書に組み入れられる）に記載の専門の計器を用いて、４８時間のインキュベーション期間１５分毎に、各ＰＭを速度論的にモニターした。従って、この実験のデータ点の総数は５，１０７，２００であった。これらのデータを分析するためにバイオインフォマティクスソフトウェア（バイオログ（商標））を用いた。
【０１２２】
１回の測定に集められるデータの結果は、重層された抗菌剤に曝露された細胞の速度論的表現型であり、抗菌剤に曝露されていない細胞の表現型と比較される。テトラゾリウム還元（すなわち、細胞呼吸）の２つの速度論的追跡記録が重なる時、この表現型に対する応答の差はない（「０」と示される）。対照追跡記録が抗菌剤追跡記録を超えている時、生物は「感受性」すなわち「Ｓ」とスコア付けされる。抗菌剤追跡記録が対照追跡記録を超えている時、生物は「耐性」すなわち「Ｒ」とスコア付けされる。インキュベーション後のＰＭの目視検査に基づいて、Ｓ結果とＲ結果を判断するための閾値が決定された。次いで、ソフトウェアは差異的追跡記録による面積を自動的に計算し、閾値を適用して、２６，６００全ての表現型をＳ、０、またはＲとスコア付けした。
【０１２３】
Ｓ−０−Ｒデータから距離行列を作成した。ある抗菌剤のＳ−０−Ｒ応答（一連の６６５の値）を別の抗菌剤についての応答と比較し、差を合計した。０とＳの差または０とＲの差は値１とし、ＳとＲの差は値２とした。次いで、一連の６６５の差を合計した。応答が似ている抗菌剤対は差の値が少なく、応答が非常に異なる抗菌剤対は差の値が大きい。全ての対を比較すると距離行列が得られ、この距離行列は、データを単純化および要約するのを助ける様々なクラスター図を作成するアルゴリズムの入力として使用することができる。
【０１２４】
結果から、異なるクラスの抗菌剤に対する生物の応答のばらつきが大きいことが分かった。例えば、図４は、１×濃度レベルの各抗菌剤で得られたデータの系統樹を示す。４つの細胞壁阻害剤（アンピシリン、セファロチン、ホスホマイシン、およびバシトラシン）クラスターがクラスター化し、同様に、３つのリボソーム阻害剤（クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、およびテトラサイクリン）もクラスター化している。また、ＤＮＡジャイレース阻害剤の３つのうち２つ（オキソリン酸およびクーママイシン）がクラスター化した。スルファチアゾールおよびポリミキシンＢを除く全ての単一標的抗菌剤が系統樹の密にクラスター化した中心にあるのに対して、カナバニンを除く全ての複数標的抗菌剤が系統樹の周辺部にある。
【０１２５】
第１に、これらの結果から、本発明は、単一標的抗菌剤と複数標的抗菌剤を区別するのに使用できることが分かる。複数標的抗菌剤は細胞を広くかつ非特異的に高感受性にするが、単一標的抗菌剤は特異的な「フィンガープリント」を有する。第２に、このフィンガープリントパターンを用いると、抗菌剤をその作用形態に基づいて首尾よく分類し、異なる作用形態を有する他の抗菌剤と区別できるように思われる。
【０１２６】
１つの場合において、結果は予想するほど単純ではなかった。この場合、ナリジキン酸は、他の２つのＤＮＡジャイレース阻害化学物質とクラスター化しなかった。これは、この薬物の作用機構の何かを示しているのかもしれない。さらに、ポリミキシンＢ、セルレニン、およびスルファチアゾールは、複数標的抗菌剤に非常によく似ているという結果を生じた。ポリミキシンＢおよびセルレニンは両方とも膜合成に影響を及ぼし、これは多くの細胞特性を破壊し、ならびに他の抗菌剤の非特異的透過を促進することができる。
【０１２７】
実施例３
酵母のＢＡＣ試験
本実施例では、様々な化合物に対する酵母の応答を試験した。これらの実験で用いられた酵母は、サッカロミセス・セレビシエ（ＢＹ４７４１、マーク・ジョンストン（Ｍａｒｋ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ）博士、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手した）であった。この株の遺伝子型は、Ｍａｔ ａ（すなわち、交配型「ａ」）、ｕｒａ−、ｈｉｓ−、ｌｅｕ−、およびｍｅｔ−であると示された。
【０１２８】
これらの実験では、この株がメチオニンを含まない培養培地において増殖できるかどうかを調べた。メチオニンは、この生物が他の候補となる硫黄源を利用できるかを試験するのを妨げる（すなわち、メチオニンが培養培地に添加されている場合、生物は硫黄源としてメチオニンを優先的に用いる）。
【０１２９】
酵母を、Ｒ２Ａ寒天培地（アクメディア（Ａｃｕｍｅｄｉａ））上で３０℃で４８時間増殖させた。滅菌した綿棒を用いて寒天表面から細胞を取り出し、６５％透過率（バイオログ（商標）濁度計を用いて測定した）の細胞密度まで接種液（５０ｍＭグルコース、０．１５ｍＭウラシル、０．１５ｍＭ Ｌ−ヒスチジン、０．１５ｍＭ Ｌ−ロイシン、０．１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ ＣａＣｌ２、２．０ｍＭ ＮａＣｌ、１．０ｍＭ ＫＣｌ、３．０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１．０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．１ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４、０．０１％ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット、０．０１％フィタゲル（ゲランガム）、０．０３％プルロニックＦ−６８を含む）に懸濁した。ｐＨを６．０に調節した。
【０１３０】
次いで、細胞が一組９５種類の異なる栄養分によって刺激される能力を試験するバイオログ（商標）ＥＡマイクロプレート（商標）に接種するために、細胞懸濁液（１００μｌ／ウェル）を用いた。マイクロアレイに含まれる栄養分は以下の通りであった：ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、および５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）、Ｌ−アラニン（２５μＭ）、Ｌ−アルギニン（２５μＭ）、Ｌ−アスパラギン（２５μＭ）、Ｌ−アスパラギン酸（２５μＭ）、Ｌ−システイン（２５μＭ）、Ｌ−グルタミン酸（２５μＭ）、アデノシン３’，５’−環状モノリン酸（１００μＭ）、アデニン（１００μＭ）、アデノシン（１００μＭ）、２’−デオキシアデノシン（１００μＭ）、Ｌ−グルタミン（２５μＭ）、グリシン（２５μＭ）、Ｌ−ヒスチジン（２５μＭ）、Ｌ−イソロイシン（２５μＭ）、Ｌ−ロイシン（２５μＭ）、Ｌ−リジン（２５μＭ）、Ｌ−メチオニン（２５μＭ）、Ｌ−フェニルアラニン（２５μＭ）、グアノシン３’，５’−環状モノリン酸（１００μＭ）、グアニン（１００μＭ）、グアノシン（１００μＭ）、２’−デオキシグアノシン（１００μＭ）、Ｌ−プロリン（２５μＭ）、Ｌ−セリン（２５μＭ）、Ｌ−スレオニン（２５μＭ）、Ｌ−トリプトファン（２５μＭ）、Ｌ−チロシン（２５μＭ）、Ｌ−バリン（２５μＭ）、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリン（各２５μＭ）、トランス−４−ヒドロキシＬ−プロリン（２５μＭ）、（５）４−アミノイミダゾール−４（５）−カルボキサミド（１ｍＭ）、ヒポキサンチン（１００μＭ）、イノシン（１００μＭ）、２’−デオキシイノシン（１００μＭ）、Ｌ−オルニチン（１００μＭ）、Ｌ−シトルリン（１００μＭ）、コリスミン酸（１００μＭ）、（−）シキミ酸（１００μＭ）、Ｌ−ホモセリンラクトン（１００μＭ）、Ｄ−アラニン（２５μＭ）、Ｄ−アスパラギン酸（２５μＭ）、Ｄ−グルタミン酸（２５μＭ）、ＤＬ−α，ε−ジアミノピメリン酸（２５μＭ）、シトシン（１００μＭ）、シチジン（１００μＭ）、２−デオキシシチジン（１００μＭ）、プトレッシン（２５μＭ）、スペルミジン（２５μＭ）、スペルミン（２５μＭ）、ピリドキシン（０．２５μＭ）、ピリドキサール（０．２５μＭ）、ピリドキサミン（０．２５μＭ）、β−アラニン（０．２５μＭ）、Ｄ−パントテン酸（０．２５μＭ）、オロチン酸（１ｍＭ）、ウラシル（１００μＭ）、ウリジン（１００μＭ）、２’−デオキシウリジン（１００μＭ）、キノリン酸（０．２５μＭ）、ニコチン酸（０．２５μＭ）、ニコチンアミド（０．２５μＭ）、β−ニコチンアミドアデノシンジヌクレオチド（０．２５Ｍ）、δ−アミノ−レブリン酸（０．２５μＭ）、ヘマチン（０．２５μＭ）、メシル酸デフェロキサミン（０．２５μＭ）、グルコース（１ｍＭ）、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（１００μＭ）、チミン（１００μＭ）、グルタチオン（還元型；１００μＭ）、チミジン（１００μＭ）、オキサロ酢酸（１ｍＭ）、ｄ−ビオチン（０．２５μＭ）、シアノバラミン（ｃｙａｎｏｂａｌａｍｉｎｅ）（０．２５μＭ）、ｐ−アミノ安息香酸（０．２５μＭ）、葉酸（０．２５μＭ）、イノシン（１００μＭ）、チアミン（２５μＭ）、チアミン（０．２５μＭ）、チアミンピロリン酸（０．２５μＭ）、リボフラビン（０．２５μＭ）、ピロロキノリンキノン（０．２５μＭ）、メナジオン（０．２５μＭ）、ミオイノシトール（０．２５μＭ）、酪酸（１００μＭ）、ＤＬ−α−ヒドロキシ酪酸（１００μＭ）、α−ケト酪酸（１００μＭ）、カプリル酸（１００μＭ）、ＤＬ−α−リポ酸（酸化型；０．２５μＭ）、ＤＬ−メバロン酸（０．２５μＭ）、ＤＬ−カルニチン（０．２５μＭ）、コリン（０．２５μＭ）、Ｔｗｅｅｎ（ツィーン）−２０（０．０１％）、ツィーン−４０（０．０１％）、ツィーン−６０（０．０１％）、およびツィーン−８０（０．０１％）。１つのウェル（Ａ−１）は栄養分を含まず、基準（すなわち、対照）ウェルとして用いる。
【０１３１】
接種後、マイクロアレイを３０℃で２日間インキュベートし、視覚的に観察した。細胞増殖を刺激した栄養分を含むウェルはどれも、細胞呼吸の増加およびヨードニトロテトラゾリウムバイオレット色素の減少のために濃いピンク色をしていた。
【０１３２】
３つのウェルが濃いピンク色を示した。これらのウェルは、Ｌ−メチオニン、グルタチオン、およびピリドキシンを含むウェルであった。メチオニンは増殖を刺激することが予想されたが、グルタチオンおよびピリドキシンは増殖を刺激し、メチオニンの代わりに使用できると予想しなかった。この場合、生物が様々な硫黄源を利用する能力が調べられていたので、グルタチオンは、これも硫黄を含むので使用することができなかった。しかしながら、ピリドキシンは硫黄を含まず、サッカロミセス・セレビシエＢＹ４７４１株の栄養分としてメチオニンの完全に満足のいく代用品として使用することができた。従って、ウラシル、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、およびＬ−メチオニンを含む最小培地上でＢＹ４７４１を増殖および試験する代わりに、この株を、ウラシル、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、およびピリドキシンを含む最小培地上で増殖および試験することが可能である。
【０１３３】
前記実施例から、本発明は、多くの用途および形式（または配置）におけるＢＡＣを用いた微生物および／または他の細胞タイプの広範囲で迅速な表現型アレイ試験のための、ならびに抗菌剤の開発および研究のための、予期しないかつ非常に改善したシステムであることが明らかである。さらに、一定の時点または速度論を読み取る自動システムおよび手動システムを本発明と共に用いることができる。例えば、結果は、機械の助けなしで、試験を行う人間によって視覚的に（すなわち、目で）観察されてもよい。または、結果は、マイクロタイター試験プレート（例えば、マイクロプレート（商標））または小型試験カード（例えば、マイクロカード（商標））などのマルチテスト装置の各ウェルを通る、各ウェル内の、または各ウェルからの透過率、吸光度、または反射率を測定する装置（例えば、マイクロタイタープレートリーダー）を用いて得ることができる。頻繁に間隔をあけて読み取りを行うことで速度論を読み取ってもよく、または経時的に連続して試験結果を読み取ることで速度論を読み取ってもよい。インキュベート、および本発明の方法の実施に特に適した装置の一例として、同時係属中の米国特許出願第０９／２７７，３５３号および同第０９／２６７，０３９号（両方とも参照として本明細書に組み入れられる）に記載の装置が挙げられる。
【０１３４】
マルチテストゲルマトリックスを利用する態様において、本発明は、以下を含む、先行技術より優れた非常に多くの進歩および利点をもたらす：（１）実施し、試験ウェルに接種しながら、細胞、菌糸、胞子がこぼれることもなく、またはエアロゾルにもならないので、安全性が非常に高い；（２）生化学反応が迅速に起こるので、一般的に用いられる方法より時間または日数が早く最終結果が得られる；（３）明確な生化学反応または表現型反応が得られるので、微生物の代謝特徴の正しい画像が得られる；（４）濃い、はっきりした生化学反応および色の変化が得られる；（５）細胞、菌糸、および／または胞子がウェルの底に沈殿も凝集もせず、ウェルの側面に付着しないので、均一な色および／または濁度が得られる；（６）反応が、視覚的に、または光学計器（例えば、バイオログマイクロステーションリーダー（商標））を用いて非常に観察しやすい；ならびに（７）複数の試験を行う全プロセスが極めて簡単かつ効率的であるので、生物学者側での仕事はほとんど必要とされない。これらの利点の全てが、微生物株を含む任意の細胞タイプを用いたＢＡＣの評価のための比較表現型分析を行う研究において試験結果をスコア付けする速度および精度を高める。
【図面の簡単な説明】
【図１】薬物を細胞に添加することによって細胞内の薬物標的が不活化される本発明の１つの態様の簡単な模式図である。この試験はＰＭを用いて行われる。
【図２】相乗作用薬および拮抗薬の相互作用が検出され、特徴付けられる本発明の１つの態様の簡単な模式図である。この試験もまたＰＭを用いて行われる。
【図３】マイクロタイタープレート内の様々なウェル内の環境条件およびウェル内の細胞に及ぼすこれらの条件の影響の単純化した模式図である。
【図４】様々な抗菌剤に対する大腸菌の応答を示す系統樹である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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