(57)【要約】患者の病変組織または損傷組織を治療するための方法であって、生体吸収性ビーズまたは粒子と一体化した、病変組織または損傷組織に対応する正常組織中に通常見られるタイプの細胞および/またはそれらの適切な前駆細胞、ならびに場合によってはゲルおよび/またはゲル形成物質を、前記患者の病変組織または損傷組織が発生している部位に投与することを含む方法を開示する。細胞および/またはそれらの適切な前駆細胞が軟骨細胞、胚性幹細胞および/または骨髄間質細胞である場合、本発明の方法は、例えば原発性骨関節症に伴う関節軟骨変性を治療するのに適している。患者の病変組織または損傷組織を治療するための組織様特性を有する装具であって、生体吸収性ビーズまたは粒子と一体化した、病変組織または損傷組織に対応する正常組織中に通常見られるタイプの細胞および/またはそれらの適切な前駆細胞、ならびに場合によってはゲルおよび/またはゲル形成物質を含む装具も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の病変組織または損傷組織を治療するための方法であって、生体吸収性ビーズまたは粒子と一体化した、前記病変組織または損傷組織に対応する正常組織中に通常見られるタイプの細胞および/またはそれらの適切な前駆細胞、ならびに場合によってはゲルおよび/またはゲル形成物質を、前記患者の前記病変組織または損傷組織が発生している部位に投与することを含む方法。
【請求項２】
細胞および/または前駆細胞がビーズまたは粒子と結合して一体化した、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
生体吸収性ビーズまたは粒子が薬剤として許容されるポリマーを含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリマーがゼラチンおよびコラーゲンからなる群から選択される生体系ポリマーである、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
ポリマーがポリ(グリコリド)、ポリ(ラクチド)およびポリ(ラクチド-コ-グリコリド)からなる群から選択される合成ポリマーである、請求項3に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリマーが生体系ポリマーと合成ポリマーの混合物であり、ゼラチンおよびコラーゲンからなる群から前記生体系ポリマーを選択し、ポリ(グリコリド)、ポリ(ラクチド)およびポリ(ラクチド-コ-グリコリド)からなる群から前記合成ポリマーを選択する、請求項3に記載の方法。
【請求項７】
生体吸収性ビーズまたは粒子が薬剤として許容される非ポリマー物質を含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項８】
粉砕した骨および脱塩した骨からなる群から非ポリマー物質を選択する、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記生体吸収性ビーズまたは粒子が官能性をもち、または細胞接着を促進するのに適切な物質で被覆された、請求項3から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記生体吸収性ビーズまたは粒子が、増殖因子、グリコサミノグリカンおよび親水性化合物からなる群から選択される有益な作用剤をさらに含む、請求項3から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記生体吸収性ビーズまたは粒子が約20〜2500μmの直径または寸法を有する、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体吸収性ビーズまたは粒子の平均サイズが約50〜200μmである、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記ゲルおよび/またはゲル形成物質が生体吸収性である、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ゲルおよび/またはゲル形成物質が、コラーゲン、フィブリン、ヒアルロナン、キトサンおよびこれらの混合物からなる群から選択される生体系ポリマーを含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記ゲルおよび/またはゲル形成物質が、ポリ(エチレンオキシド)とα-ヒドロキシ酸のエンドキャップされた光重合性ブロックコポリマーからなる群から選択される合成ポリマーを含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１６】
前記ゲルおよび/またはゲル形成物質が生体系ポリマーと合成ポリマーの混合物を含み、コラーゲン、フィブリン、ヒアルロナン、キトサンおよびこれらの混合物からなる群から前記生体系ポリマーを選択し、ポリ(エチレンオキシド)とα-ヒドロキシ酸のエンドキャップされた光重合性ブロックコポリマーからなる群から前記合成ポリマーを選択する、請求項13に記載の方法。
【請求項１７】
前記ゲルおよび/またはゲル形成物質が、増殖因子、グリコサミノグリカンおよび親水性化合物からなる群から選択される有益な作用剤をさらに含む、請求項13から16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ゲルおよび/またはゲル形成物質が接着物質を含む、請求項13から17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
平均約3〜500個の細胞および/または前駆細胞が前記ビーズまたは粒子のそれぞれと一体化している、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞および/または前駆細胞が軟骨細胞、胚性幹細胞および/または骨髄間質細胞である、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞および/または前駆細胞が線維芽細胞および/またはその前駆細胞である、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞および/または前駆細胞が脂肪細胞および/またはその前駆細胞である、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞および/または前駆細胞が骨芽細胞および/またはその前駆細胞である、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞および/または前駆細胞が細胞型および/または前駆細胞型の混合物である、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
病変組織または損傷組織が発生している部位の組織の中または下にゲルおよび/またはゲル形成物質を閉じ込めることによって、前記生体吸収性ビーズまたは粒子と一体化した前記細胞および/またはそれらの適切な前駆細胞ならびにゲルおよび/またはゲル形成物質を投与する、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
病変組織または損傷組織が発生している部位の組織フラップまたは他の膜フラップの下にゲルおよび/またはゲル形成物質を閉じ込めることによって、前記生体吸収性ビーズまたは粒子と一体化した前記細胞および/またはそれらの適切な前駆細胞ならびにゲルおよび/またはゲル形成物質を投与する、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞および/または適切な前駆細胞が軟骨細胞であり、治療すべき病変組織または損傷組織が関節軟骨である、請求項25または26に記載の方法。
【請求項２８】
患者の病変組織または損傷組織を治療するための方法であって、
(i)前記病変組織または損傷組織に対応する正常組織中に通常見られるタイプの細胞および/またはそれらの適切な前駆細胞を得るステップ、
(ii)生体吸収性ビーズまたは粒子の存在下で前記細胞および/または前駆細胞を増殖させ、それによって前記増殖した細胞および/または前駆細胞を前記ビーズまたは粒子に結合させるステップ、および
(iii)場合によってはゲルおよび/またはゲル形成物質中にある、前記細胞および/または前駆細胞が結合したビーズまたは粒子を、前記患者の前記病変組織または損傷組織が発生している部位に投与するステップ
を含む方法。
【請求項２９】
適切な培地を含むバイオリアクター中でステップ(ii)を実施し、前記培地を撹拌し通気する、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
前記バイオリアクターが、細胞および/または前駆細胞、培地および生体吸収性ビーズまたは粒子を動かすのに役立つ内部撹拌翼を装着したタンブラータイプのバイオリアクターである、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記バイオリアクターがスピナーフラスコである、請求項29に記載の方法。
【請求項３２】
患者の病変組織または損傷組織を治療するための方法であって、
(i)前記病変組織または損傷組織に対応する正常組織中に通常見られるタイプの細胞および/またはそれらの適切な前駆細胞を得るステップ、
(ii)前記細胞および/または前駆細胞を増殖させるステップ、
(iii)前記増殖した細胞および/または前駆細胞を生体吸収性ビーズまたは粒子に結合させるステップ、および
(iv)場合によってはゲルおよび/またはゲル形成物質中にある、前記細胞および/または前駆細胞が結合したビーズまたは粒子を、前記患者の前記病変組織または損傷組織が発生している部位に投与するステップ
を含む方法。
【請求項３３】
生体吸収性ビーズまたは粒子が薬剤として許容されるポリマーを含む、請求項28から32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリマーがゼラチンおよびコラーゲンからなる群から選択される生体系ポリマーである、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
ポリマーが、ポリ(グリコリド)、ポリ(ラクチド)およびポリ(ラクチド-コ-グリコリド)からなる群から選択される合成ポリマーである、請求項33に記載の方法。
【請求項３６】
前記ポリマーが生体系ポリマーと合成ポリマーの混合物であり、ゼラチンおよびコラーゲンからなる群から前記生体系ポリマーを選択し、ポリ(グリコリド)、ポリ(ラクチド)およびポリ(ラクチド-コ-グリコリド)からなる群から前記合成ポリマーを選択する、請求項33に記載の方法。
【請求項３７】
生体吸収性ビーズまたは粒子が、薬剤として許容される非ポリマー物質を含む、請求項28から32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
粉砕した骨および脱塩した骨からなる群から非ポリマー物質を選択する、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
前記生体吸収性ビーズまたは粒子が官能性をもち、または細胞接着を促進するのに適切な物質で被覆された、請求項28から38のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記生体吸収性ビーズまたは粒子が、増殖因子、グリコサミノグリカンおよび親水性化合物からなる群から選択される有益な作用剤をさらに含む、請求項28から39のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記生体吸収性ビーズまたは粒子が約20〜2500μmの直径または寸法を有する、請求項28から40のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記生体吸収性ビーズまたは粒子の平均サイズが約50〜200μmである、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
前記ゲルおよび/またはゲル形成物質が生体吸収性である、請求項28から42のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ゲルおよび/またはゲル形成物質が、コラーゲン、フィブリン、ヒアルロナン、キトサンおよびこれらの混合物からなる群から選択される生体系ポリマーを含む、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
前記ゲルおよび/またはゲル形成物質が、ポリ(エチレンオキシド)とα-ヒドロキシ酸のエンドキャップされた光重合性ブロックコポリマーからなる群から選択される合成ポリマーを含む、請求項43に記載の方法。
【請求項４６】
前記ゲルおよび/またはゲル形成物質が生体系ポリマーと合成ポリマーの混合物を含み、コラーゲン、フィブリン、ヒアルロナン、キトサンおよびこれらの混合物からなる群から前記生体系ポリマーを選択し、ポリ(エチレンオキシド)とα-ヒドロキシ酸のエンドキャップされた光重合性ブロックコポリマーからなる群から前記合成ポリマーを選択する、請求項43に記載の方法。
【請求項４７】
前記ゲルおよび/またはゲル形成物質が、増殖因子、グリコサミノグリカンおよび親水性化合物からなる群から選択される有益な作用剤をさらに含む、請求項43から46のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
ゲルおよび/またはゲル形成物質が接着物質を含む、請求項43から47のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
平均約3〜500個の細胞および/または前駆細胞が前記ビーズまたは粒子のそれぞれに結合している、請求項28から48のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞および/または前駆細胞が軟骨細胞、胚性幹細胞および/または骨髄間質細胞である、請求項28から49のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞および/または前駆細胞が線維芽細胞および/またはその前駆細胞である、請求項28から49のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞および/または前駆細胞が脂肪細胞および/またはその前駆細胞である、請求項28から49のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞および/または前駆細胞が骨芽細胞および/またはその前駆細胞である、請求項28から49のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞および/または前駆細胞が細胞型および/または前駆細胞型の混合物である、請求項28から49のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
細胞および/または前駆細胞がステップ(ii)で5〜2000倍に増殖する、請求項28から54のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
細胞および/または前駆細胞がステップ(ii)で10〜100倍に増殖する、請求項55に記載の方法。
【請求項５７】
病変組織または損傷組織が発生している部位の組織の中または下にゲルおよび/またはゲル形成物質を閉じ込めることによって、前記生体吸収性ビーズまたは粒子ならびにゲルおよび/またはゲル形成物質に結合した前記細胞および/またはそれらの適切な前駆細胞を投与する、請求項28から49のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
病変組織または損傷組織が発生している部位の組織フラップまたは他の膜フラップの下にゲルおよび/またはゲル形成物質を閉じ込めることによって、前記生体吸収性ビーズまたは粒子と一体化した前記細胞および/またはそれらの適切な前駆細胞ならびにゲルおよび/またはゲル形成物質を投与する、請求項28から49のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記細胞および/または適切な前駆細胞が軟骨細胞であり、治療すべき病変組織または損傷組織が関節軟骨である、請求項57または58に記載の方法。
【請求項６０】
患者がヒトである、請求項1から59のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
患者の病変組織または損傷組織を治療するための組織様特性を有する装具であって、生体吸収性ビーズまたは粒子と一体化した、前記病変組織または損傷組織に対応する正常組織中に通常見られるタイプの細胞および/またはそれらの適切な前駆細胞、ならびに場合によってはゲルおよび/またはゲル形成物質を含む装具。
【請求項６２】
患者の組織を増大させるための組織様特性を有する装具であって、生体吸収性ビーズまたは粒子と一体化した、増大させようとする組織に通常見られるタイプの細胞および/またはそれらの適切な前駆細胞、ならびに場合によってはゲルおよび/またはゲル形成物質を含む装具。
【請求項６３】
細胞および/または前駆細胞がビーズまたは粒子に結合して一体化した、請求項61または62に記載の装具。
【請求項６４】
生体吸収性ビーズまたは粒子が、薬剤として許容されるポリマーを含む、請求項61から63のいずれか一項に記載の装具。
【請求項６５】
前記ポリマーがゼラチンおよびコラーゲンからなる群から選択される生体系ポリマーである、請求項64に記載の装具。
【請求項６６】
ポリマーがポリ(グリコリド)、ポリ(ラクチド)およびポリ(ラクチド-コ-グリコリド)からなる群から選択される合成ポリマーである、請求項64に記載の装具。
【請求項６７】
前記ポリマーが生体系ポリマーと合成ポリマーの混合物であり、ゼラチンおよびコラーゲンからなる群から前記生体系ポリマーを選択し、ポリ(グリコリド)、ポリ(ラクチド)およびポリ(ラクチド-コ-グリコリド)からなる群から前記合成ポリマーを選択する、請求項64に記載の装具。
【請求項６８】
生体吸収性ビーズまたは粒子が、薬剤として許容される非ポリマー物質を含む、請求項61から63のいずれか一項に記載の装具。
【請求項６９】
粉砕した骨および脱塩した骨からなる群から非ポリマー物質を選択する、請求項68に記載の装具。
【請求項７０】
前記生体吸収性ビーズまたは粒子が官能性をもち、または細胞接着を促進するのに適切な物質で被覆された、請求項64から69のいずれか一項に記載の装具。
【請求項７１】
前記生体吸収性ビーズまたは粒子が、増殖因子、グリコサミノグリカンおよび親水性化合物からなる群から選択される有益な作用剤をさらに含む、請求項61から70のいずれか一項に記載の装具。
【請求項７２】
前記生体吸収性ビーズまたは粒子が約20〜2500μmの直径または寸法を有する、請求項61から70のいずれか一項に記載の装具。
【請求項７３】
前記生体吸収性ビーズまたは粒子の平均サイズが約50〜200μmである、請求項72に記載の装具。
【請求項７４】
前記ゲルおよび/またはゲル形成物質が生体吸収性である、請求項61から73のいずれか一項に記載の装具。
【請求項７５】
前記ゲルおよび/またはゲル形成物質が、コラーゲン、フィブリン、ヒアルロナン、キトサンおよびこれらの混合物からなる群から選択される生体系ポリマーを含む、請求項74に記載の装具。
【請求項７６】
前記ゲルおよび/またはゲル形成物質が、ポリ(エチレンオキシド)とα-ヒドロキシ酸のエンドキャップされた光重合性ブロックコポリマーからなる群から選択される合成ポリマーを含む、請求項75に記載の装具。
【請求項７７】
前記ゲルおよび/またはゲル形成物質が生体系ポリマーと合成ポリマーの混合物を含み、コラーゲン、フィブリン、ヒアルロナン、キトサンおよびこれらの混合物からなる群から前記生体系ポリマーを選択し、ポリ(エチレンオキシド)とα-ヒドロキシ酸のエンドキャップされた光重合性ブロックコポリマーからなる群から前記合成ポリマーを選択する、請求項74に記載の装具。
【請求項７８】
前記ゲルおよび/またはゲル形成物質が、増殖因子、グリコサミノグリカンおよび親水性化合物からなる群から選択される有益な作用剤をさらに含む、請求項61から77のいずれか一項に記載の装具。
【請求項７９】
前記ゲルおよび/またはゲル形成物質が接着物質を含む、請求項61から78のいずれか一項に記載の装具。
【請求項８０】
平均約3〜500個の細胞および/または前駆細胞が前記ビーズまたは粒子のそれぞれと一体化した、請求項61から79のいずれか一項に記載の装具。
【請求項８１】
前記細胞および/または前駆細胞が軟骨細胞、胚性幹細胞および/または骨髄間質細胞である、請求項61から80のいずれか一項に記載の装具。
【請求項８２】
前記細胞および/または前駆細胞が線維芽細胞および/またはその前駆細胞である、請求項61から80のいずれか一項に記載の装具。
【請求項８３】
前記細胞および/または前駆細胞が脂肪細胞および/またはその前駆細胞である、請求項61から80のいずれか一項に記載の装具。
【請求項８４】
前記細胞および/または前駆細胞が骨芽細胞および/またはその前駆細胞である、請求項61から80のいずれか一項に記載の装具。
【請求項８５】
前記細胞および/または前駆細胞が細胞型および/または前駆細胞型の混合物である、請求項61から80のいずれか一項に記載の装具。
【請求項８６】
患者の病変組織または損傷組織を治療するための方法であって、生体吸収性ビーズまたは粒子と一体化した、前記病変組織または損傷組織に対応する正常組織中に通常見られるタイプの細胞および/またはそれらの適切な前駆細胞、ならびに場合によってはゲルおよび/またはゲル形成物質を含み組織様特性を有する装具を、前記患者の前記病変組織または損傷組織が発生している部位に移植することを含む方法。
【請求項８７】
患者の組織を増大させるための方法であって、生体吸収性ビーズまたは粒子と一体化した、増大させようとする組織中に通常見られるタイプの細胞および/またはそれらの適切な前駆細胞、ならびに場合によってはゲルおよび/またはゲル形成物質を含み組織様特性を有する装具を、組織を増大させようとする前記患者の部位に移植することを含む方法。
【請求項８８】
細胞および/または前駆細胞がビーズまたは粒子に結合して一体化した、請求項86または87に記載の方法。
【請求項８９】
生体吸収性ビーズまたは粒子が、薬剤として許容されるポリマーを含む、請求項86から88のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記ポリマーがゼラチンおよびコラーゲンからなる群から選択される生体系ポリマーである、請求項89に記載の方法。
【請求項９１】
ポリマーがポリ(グリコリド)、ポリ(ラクチド)およびポリ(ラクチド-コ-グリコリド)からなる群から選択される合成ポリマーである、請求項89に記載の方法。
【請求項９２】
前記ポリマーが生体系ポリマーと合成ポリマーの混合物であり、ゼラチンおよびコラーゲンからなる群から前記生体系ポリマーを選択し、ポリ(グリコリド)、ポリ(ラクチド)およびポリ(ラクチド-コ-グリコリド)からなる群から前記合成ポリマーを選択する、請求項89に記載の方法。
【請求項９３】
生体吸収性ビーズまたは粒子が、薬剤として許容される非ポリマー物質を含む、請求項86から88のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
粉砕した骨および脱塩した骨からなる群から非ポリマー物質を選択する、請求項93に記載の方法。
【請求項９５】
前記生体吸収性ビーズまたは粒子が官能性をもち、または細胞接着を促進するのに適切な物質で被覆された、請求項89から94のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記生体吸収性ビーズまたは粒子が、増殖因子、グリコサミノグリカンおよび親水性化合物からなる群から選択される有益な作用剤をさらに含む、請求項86から95のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記生体吸収性ビーズまたは粒子が約20〜2500μmの直径または寸法を有する、請求項86から95のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記生体吸収性ビーズまたは粒子の平均サイズが約50〜200μmである、請求項97に記載の方法。
【請求項９９】
前記ゲルおよび/またはゲル形成物質が生体吸収性である、請求項86から98のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記ゲルおよび/またはゲル形成物質が、コラーゲン、フィブリン、ヒアルロナン、キトサンおよびこれらの混合物からなる群から選択される生体系ポリマーを含む、請求項99に記載の方法。
【請求項１０１】
前記ゲルおよび/またはゲル形成物質が、ポリ(エチレンオキシド)とα-ヒドロキシ酸のエンドキャップされた光重合性ブロックコポリマーからなる群から選択される合成ポリマーを含む、請求項100に記載の方法。
【請求項１０２】
前記ゲルおよび/またはゲル形成物質が生体系ポリマーと合成ポリマーの混合物を含み、コラーゲン、フィブリン、ヒアルロナン、キトサンおよびこれらの混合物からなる群から前記生体系ポリマーを選択し、ポリ(エチレンオキシド)とα-ヒドロキシ酸のエンドキャップされた光重合性ブロックコポリマーからなる群から前記合成ポリマーを選択する、請求項99に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ゲルおよび/またはゲル形成物質が、増殖因子、グリコサミノグリカンおよび親水性化合物からなる群から選択される有益な作用剤をさらに含む、請求項86から102のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ゲルおよび/またはゲル形成物質が接着物質を含む、請求項86から103のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
平均約3〜500個の細胞および/または前駆細胞が前記ビーズまたは粒子のそれぞれと一体化した、請求項86から104のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記細胞および/または前駆細胞が軟骨細胞、胚性幹細胞および/または骨髄間質細胞である、請求項86から105のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記細胞および/または前駆細胞が線維芽細胞および/またはその前駆細胞である、請求項86から105のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記細胞および/または前駆細胞が脂肪細胞および/またはその前駆細胞である、請求項86から105のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記細胞および/または前駆細胞が骨芽細胞および/またはその前駆細胞である、請求項86から105のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記細胞および/または前駆細胞が細胞型および/または前駆細胞型の混合物である、請求項86から105のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記患者がヒトである、請求項86から110のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
患者の組織を増大させるための方法であって、生体吸収性ビーズまたは粒子と一体化した、増大させようとする組織中に通常見られるタイプの細胞および/またはそれらの適切な前駆細胞、ならびに場合によってはゲルおよび/またはゲル形成物質を、組織を増大させようとする前記患者の部位に投与することを含む方法。
【請求項１１３】
細胞および/または前駆細胞がビーズまたは粒子に結合して一体化した、請求項112に記載の方法。
【請求項１１４】
生体吸収性ビーズまたは粒子が、薬剤として許容されるポリマーを含む、請求項112または113に記載の方法。
【請求項１１５】
前記ポリマーがゼラチンおよびコラーゲンからなる群から選択される生体系ポリマーである、請求項114に記載の方法。
【請求項１１６】
ポリマーがポリ(グリコリド)、ポリ(ラクチド)およびポリ(ラクチド-コ-グリコリド)からなる群から選択される合成ポリマーである、請求項114に記載の方法。
【請求項１１７】
前記ポリマーが生体系ポリマーと合成ポリマーの混合物であり、ゼラチンおよびコラーゲンからなる群から前記生体系ポリマーを選択し、ポリ(グリコリド)、ポリ(ラクチド)およびポリ(ラクチド-コ-グリコリド)からなる群から前記合成ポリマーを選択する、請求項114に記載の方法。
【請求項１１８】
生体吸収性ビーズまたは粒子が、薬剤として許容される非ポリマー物質を含む、請求項112または113に記載の方法。
【請求項１１９】
粉砕した骨および脱塩した骨からなる群から非ポリマー物質を選択する、請求項118に記載の方法。
【請求項１２０】
前記生体吸収性ビーズまたは粒子が官能性をもち、または細胞接着を促進するのに適切な物質で被覆された、請求項114から119のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記生体吸収性ビーズまたは粒子が、増殖因子、グリコサミノグリカンおよび親水性化合物からなる群から選択される有益な作用剤をさらに含む、請求項114から120のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記生体吸収性ビーズまたは粒子が約20〜2500μmの直径または寸法を有する、請求項112から121のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記生体吸収性ビーズまたは粒子の平均サイズが約50〜200μmである、請求項122に記載の方法。
【請求項１２４】
前記ゲルおよび/またはゲル形成物質が生体吸収性である、請求項112から123のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記ゲルおよび/またはゲル形成物質が、コラーゲン、フィブリン、ヒアルロナン、キトサンおよびこれらの混合物からなる群から選択される生体系ポリマーを含む、請求項124に記載の方法。
【請求項１２６】
前記ゲルおよび/またはゲル形成物質が、ポリ(エチレンオキシド)とα-ヒドロキシ酸のエンドキャップされた光重合性ブロックコポリマーからなる群から選択される合成ポリマーを含む、請求項124に記載の方法。
【請求項１２７】
前記ゲルおよび/またはゲル形成物質が生体系ポリマーと合成ポリマーの混合物を含み、コラーゲン、フィブリン、ヒアルロナン、キトサンおよびこれらの混合物からなる群から前記生体系ポリマーを選択し、ポリ(エチレンオキシド)とα-ヒドロキシ酸のエンドキャップされた光重合性ブロックコポリマーからなる群から前記合成ポリマーを選択する、請求項124に記載の方法。
【請求項１２８】
前記ゲルおよび/またはゲル形成物質が、増殖因子、グリコサミノグリカンおよび親水性化合物からなる群から選択される有益な作用剤をさらに含む、請求項124から127のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記ゲルおよび/またはゲル形成物質が接着物質を含む、請求項124から128のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３０】
平均約3〜500個の細胞および/または前駆細胞が前記ビーズまたは粒子のそれぞれと一体化した、請求項112から129のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記細胞および/または前駆細胞が軟骨細胞、胚性幹細胞および/または骨髄間質細胞である、請求項112から130のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記細胞および/または前駆細胞が線維芽細胞および/またはその前駆細胞である、請求項112から130のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記細胞および/または前駆細胞が脂肪細胞および/またはその前駆細胞である、請求項112から130のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３４】
前記細胞および/または前駆細胞が骨芽細胞および/またはその前駆細胞である、請求項112から130のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記細胞および/または前駆細胞が細胞型および/または前駆細胞型の混合物である、請求項112から130のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病変組織または損傷組織、特に、例えばスポーツ傷害または外傷によって起こる原発性の変形性関節症および他の関節軟骨損傷に伴う関節軟骨変性を治療するための方法および装具に関する。本発明を、(例えば、美容のための)組織の増大に応用することもできる。
【背景技術】
【０００２】
関節軟骨は、骨関節(例えば膝)内の骨を覆い、摩擦の少ない安定な動きをもたらし、圧迫に耐え、負荷を分散させる。関節軟骨は、簡単な無血管の硝子軟骨基質のように見えるが、実際には、軟骨細胞および細胞外基質(ECM)の比較的複雑な構造からなり、基質の形態および生化学に基づいて4つのゾーン(すなわち、表面、移行、中間および石灰化の各ゾーン)に組織化されている。これらのゾーンのそれぞれは、3つの異なる部分(すなわち、細胞周囲、細胞領域、および細胞間領域)からなる。ヒト関節軟骨の体積の5%未満を占める軟骨細胞は、変性したECM分子を交換し、そのため組織の統合性(すなわち、サイズおよび機械的諸特性)を維持するのに必須である。ECMは、コラーゲン(主に、II型コラーゲン)、糖タンパク質、プロテオグリカン、および関節軟骨の組織重量の最大約80%を占める組織液を含めたいくつかの成分を含む。コラーゲン成分はECMに線維メッシュ構造(fibre mesh structure)を与え、糖タンパク質はこの構造の安定性に資すると考えられる。プロテオグリカンは、線維間の空間を埋める大きな凝集モノマー(すなわち、アグリガン(aggregans))を含み、その親水性のために、弾性および負荷分散特性の多くを関節軟骨にもたらしていると考えられている。最後に、栄養素源および酸素源を含む組織液は、圧迫に耐え、変形後にその正常な形状に復帰する能力を関節軟骨に付与する(総説として、TemenoffおよびMikos、2000を参照されたい)。
【０００３】
関節軟骨の変性または傷害に起因する関節痛は、すべての年代の人々を悩ます一般的な疾患である。その主な原因は、原発性骨関節症および軟骨を損失させる外傷である(BuckwalterおよびMankin、1998)。最近、米国だけで4300万人にものぼる人々が何らかの形の関節炎に罹っていると推定された(http://orthoinfo.aaos.org/の「Arthritis Brochure」を参照されたい)。スポーツ傷害によって起こる軟骨損傷も多い。
【０００４】
残念なことに、その複雑な構造が一因となって(TemenoffおよびMikos、同上)、関節軟骨は自己修復能力が極めて乏しく、その結果、関節軟骨の変性および傷害は何年も続き、さらに変性が進むことも多い(すなわち、二次性骨関節症)。
【０００５】
関節軟骨変性の治療選択肢を、4つの指針、すなわち置換、軽減、切除および再建に従って分類することができる。関節軟骨の置換は、人工関節または同種移植片を使用するものである。症状の軽減は、欠陥関節中のひとつの骨の一部を除去して負荷およびストレスを減少させる骨切り術により行うことができる。切除は、変性した関節軟骨を外科的に除去し、その後に周囲の正常な関節軟骨組織を結合するものである。このような切除術は、中間物挿入関節形成術を使用しても使用しなくてもよい。最後に、再建は、関節軟骨および軟骨下骨を含めた関節面の治癒または再生を意味する。再建は、(例えば、増殖因子などの医薬品または骨髄から多能性幹細胞を「補充する」ための軟骨下の穿孔、研磨または微小破壊を使用した)自己修復を促進する試み、あるいは軟骨細胞または関節軟骨を再生する能力を有する他の細胞の移植による新しい関節面の再生であってもよい。
【０００６】
近年、適切な「再建」治療、より具体的には、新しい関節面の再生(「生体表面再形成(biological resurfacing)」と呼ぶこともある)を含めた治療法を開発する研究が多数なされてきた。このような治療法は、骨切り術または人工関節での置換よりも患者への外傷を少なくすることができ、免疫学的に許容されず外来の病原体を含む恐れがある同種移植片や患者の別の部位に損傷を与えることを避けられない複数の自家移植片を使用するよりも利点が多い。提案されているひとつの「生体表面再形成」治療は、患者から採取した関節軟骨の生検組織から軟骨細胞を回収するものである(Freed等、1999)。これらの細胞を培養により増殖させ、骨膜フラップの下に注射することによって患者に戻し、縫合して増殖した軟骨細胞が修復の必要な部位に確実に残るようにする。この治療法は、過去10年間にわたり人体試験でかなり有望であったが(TemenoffおよびMikos、同上)、骨膜フラップが必要なことがこの技術に別の制限を加え、また、注射した軟骨細胞上で骨膜フラップを縫合する行為が近隣の組織に損傷をもたらす可能性がある。さらに、増殖した細胞が表現型的、機能的に軟骨細胞として残っていることを示す証拠がない。実際、これらの細胞が機械的に劣る組織を生成する線維芽細胞様細胞に脱分化した恐れがある。
【０００７】
自己細胞および骨膜フラップからなる上記系の使用に代わり得るものは、病変組織または損傷組織の所望の形状および形態に近い予備成形した多孔性骨格を使用することであり、それに軟骨細胞を播いて少なくとも2〜3週間培養する。次いで、生成する等価な組織を所望の部位に移植する(Thomson等、1995)。コラーゲンベースの骨格を用いた最近の研究は有望なものではあるが、現在この分野で行なわれている研究の大部分は、骨格に適した合成ポリマー材料を探し出すことに関心が向いている。というのは、合成ポリマー材料は多量に製造することができるうえに、ドナーのコラーゲンから病原体が不完全にしか除去されない恐れがあることに関連する諸問題を克服できる可能性が高いからである(TemenoffおよびMikos、同上)。検討されている合成ポリマー材料の具体例は、FDAによって認可されたポリマー、ポリ(グリコリド)(PGA)、ポリ(ラクチド)(PLA)およびポリ(ラクチド-コ-グリコリド)(PLGA)コポリマーの繊維である。これらのポリマー繊維は、織ってメッシュにすることもでき、生分解性であり、したがって、徐々に分解して組織が増殖する空間を着実に形成し、また、関節軟骨が再建された後で骨格を手術によって除去する必要がないという点で、非分解性ポリマーに優る数々の利点を有する。
【０００８】
しかし、骨格を使用することは、移植手術を要するという重大な欠点がある。したがって、軟骨細胞を注射でき、続いてin situで架橋して骨格マトリックスを形成できるポリマーの開発に注力している研究グループもある。例えば、フィブリノーゲンとトロンビンを組み合わせて注射して、分解性のフィブリンメッシュを形成することができる(Sims等、1998)。また、アルギン酸塩も、カルシウムで架橋できることから検討された(RodriguezおよびVacanti、1998)。しかし、アルギン酸塩は、免疫原性であることが判明し(Kulseng等、1999)、合成ポリマー材料よりも重度の炎症反応を起こす(Cao等、1998)。したがって、エチレンオキシドとプロピレンオキシドのコポリマーであるPEO-co-PPO(Cao等、同上)およびポリ(エチレンオキシド)とα-ヒドロキシ酸のエンドキャップされた光重合性ブロックコポリマー(Hubbell、1998)を含めて注射可能な合成ポリマーゲル材料でも研究が行なわれてきた。
【非特許文献１】
TemenoffおよびMikos、2000
【非特許文献２】
BuckwalterおよびMankin、1998
【非特許文献３】
http://orthoinfo.aaos.org/「Arthritis Brochure」
【非特許文献４】
Freed等、1999
【非特許文献５】
Thomson等、1995
【非特許文献６】
Sims等、1998
【非特許文献７】
RodriguezおよびVacanti、1998
【非特許文献８】
Kulseng等、1999
【非特許文献９】
Cao等、1998
【非特許文献１０】
Hubbell、1998
【非特許文献１１】
Bisucci T、Hewitson TD、Darby IA、(2000)「cRNA probes:comparison of isotopic and non-isotopic detection methods」、Methods in Molecular Biology、123:291〜303
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、組織再生、特に関節軟骨再生のための代替方法に関し、軟骨細胞および/または他の適切な前駆細胞を、患者の組織再生を要する部位に投与するための生体吸収性ビーズまたは粒子に結合させまたは混合するものである。この方法は、上述の生分解性ポリマー骨格の、望むならば注射により投与できることを含めて多数の利点に資すると考えられる。また、理論に拘泥するつもりはないが、ビーズまたは粒子を使用すると機械的利点および空間を充填する利点が提供され、物理的な支持、および圧迫に対する耐性が付与されて組織再生が進むと考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、一態様では、本発明は、患者の病変組織または損傷組織を治療するための方法を提供するものであって、前記方法は、生体吸収性ビーズまたは粒子と一体化した、前記病変組織または損傷組織に対応する正常組織中に通常見られるタイプの細胞および/またはそれらの適切な前駆細胞、ならびに場合によってはゲルおよび/またはゲル形成物質を、前記患者の前記病変組織または損傷組織が発生している部位に投与することを含む。
【００１１】
前記細胞および/または前駆細胞は、単にビーズまたは粒子と混合して一体化することができ、したがってビーズまたは粒子に結合している必要はない。適切な容器中で細胞および/または前駆細胞をビーズまたは粒子と低せん断で撹拌して混合することができる。ゲルおよび/またはゲル形成物質は、細胞および/または前駆細胞およびビーズまたは粒子と同時に混合することができ、または後で混合することができる。しかし、細胞および/または前駆細胞を、ビーズまたは粒子に結合して一体化することが好ましい。これは、細胞および/または前駆細胞をビーズまたは粒子の存在下で増殖させることによって達成することができる。
【００１２】
したがって、第2の態様では、本発明は、患者の病変組織または損傷組織を治療するための方法を提供するものであって、前記方法は、以下のステップ、すなわち、
(i)前記病変組織または損傷組織に対応する正常組織中に通常見られるタイプの細胞および/またはそれらの適切な前駆細胞を得ること、
(ii)生体吸収性ビーズまたは粒子の存在下で前記細胞および/または前駆細胞を増殖させ、それによって前記増殖した細胞および/または前駆細胞を前記ビーズまたは粒子に結合させること、および
(iii)場合によってはゲルおよび/またはゲル形成物質中にある、前記細胞および/または前駆細胞が結合したビーズまたは粒子を、前記患者の前記病変組織または損傷組織が発生している部位に投与することを含む。
【００１３】
上記ステップ(i)と(ii)の間に、追加の増殖ステップを実施できることは当業者には容易に理解できよう。このような追加の増殖ステップは、例えば単層中での細胞増殖であってもよい。
【００１４】
ビーズまたは粒子の存在下で細胞および/または前駆細胞を増殖させる必要は全くなく、別法では、細胞および/または前駆細胞を増殖させ、続いて、ビーズまたは粒子に結合させることができることも当業者には容易に理解できよう。
【００１５】
したがって、第3の態様では、本発明は、患者の病変組織または損傷組織を治療する方法を提供するものであって、前記方法は、以下のステップ、すなわち、
(i)前記病変組織または損傷組織に対応する正常組織中に通常見られるタイプの細胞および/またはそれらの適切な前駆細胞を得ること、
(ii)前記細胞および/または前駆細胞を増殖させること、
(iii)前記増殖した細胞および/または前駆細胞を生体吸収性ビーズまたは粒子に結合させること、および
(iv)場合によってはゲルおよび/またはゲル形成物質中にある、前記細胞および/または前駆細胞が結合したビーズまたは粒子を、前記患者の前記病変組織または損傷組織が発生している部位に投与することを含む。
【００１６】
前記細胞および/または前駆細胞を、個々の病変組織または損傷組織タイプの再生に適したタイプの細胞であるように選択する(例えば、治療すべき組織タイプの成熟分化細胞)。したがって、例として示すと、病変または損傷皮膚を治療するためには、本発明の方法で使用する細胞は、線維芽細胞および/またはその前駆細胞とすべきである。再生すべき組織が骨である場合、この細胞を骨芽細胞および/またはその前駆細胞とすべきであり、脂肪組織を治療するためには、この細胞を脂肪細胞および/またはその前駆細胞とすべきである。
【００１７】
本発明の方法は、関節軟骨変性またはけがを治療(例えば修復)するために使用することが好ましい。この点で、関節軟骨組織再生を、関節軟骨変性またはけがの部位で行うことができ、生体吸収性ビーズまたは粒子は徐々に分解するので再生後にビーズまたは粒子を除去する必要がない。本発明の方法の本願では、使用する細胞は軟骨細胞および/またはその前駆細胞である。また、上述したように、組織再生が進行している間、ビーズまたは粒子が機械的利点および空間充填の利点を提供すると考えられる。すなわち、ビーズまたは粒子は、骨関節を物理的に支持し、関節が動く際の摩擦を軽減し、圧迫に対する耐性を付与することで、関節軟骨変性またはけがに対して負荷に耐えるクッションの役割を果たすことができる。また、ビーズまたは粒子をゲルまたはゲル形成物質に入れて投与する場合、ビーズまたは粒子は、欠陥組織の空間充填に悪影響を及ぼし得るゲルの収縮を防止すると考えられる。
【００１８】
軟骨細胞および/または前駆細胞は、当分野で一般的な任意の方法によって、最も好都合には、組織生検によって収集することができる。適切な軟骨細胞前駆細胞は、胚性幹細胞および骨髄間質細胞などの未分化細胞である。軟骨細胞および/または前駆細胞は、治療すべき患者から得ることが好ましい。
【００１９】
第2および第3の各態様の方法における増殖ステップは、細胞および/または前駆細胞を、当分野で一般的な任意の方法によって好ましくは5〜2000倍、より好ましくは10〜100倍に増殖させる。例えば、(例えば寒天ゲルを含むペトリ皿や含まないペトリ皿など)適切な皿の中で細胞を培養することによって増殖を実施することができるが、より好ましくは、培地が撹拌され通気されているバイオリアクター中で増殖を実施する。また、増殖は、複数のステージを含んでいてもよい。例えば、フィブロネクチン(Fn)およびビトロネクチン(Vn)などの血清接着タンパク質(serum adhesion proteins)によって細胞の拡散を媒介することができる適切な皿の中の単層として軟骨細胞および/またはその前駆細胞をまず増殖させ、その後バイオリアクターで増殖させることができる。上述したように、増殖または増殖の一部を、生体吸収性ビーズまたは粒子の存在下で実施してもよいし、実施しなくてもよい。また、増殖または増殖の一部の間にビーズまたは粒子が存在する場合、細胞および/または前駆細胞を取り出し、生体吸収性ビーズまたは粒子上に「再播種」することができる。この場合、最初に述べたビーズまたは粒子は必ずしも生体吸収性ビーズまたは粒子でなくてもよい。増殖がバイオリアクターで培養するものである場合、生体吸収性ビーズまたは粒子を培地に添加するのが好都合である。しかし、ビーズまたは粒子なしで増殖を行う場合、上述のことから明らかなように、増殖した細胞および/または前駆細胞を引き続き生体吸収性ビーズまたは粒子に結合させる必要がある。
【００２０】
第2および第3の各態様の方法に使用する細胞(例えば軟骨細胞)および/または前駆細胞の増殖に適した簡単なバイオリアクターは、スピナーフラスコである。あるいは、細胞、培地および(存在するならば)生体吸収性ビーズまたは粒子を動かすのに役立つ内部撹拌翼を装着していても、いなくてもよいタンブラータイプのバイオリアクター(例えば、Synthecon(商標)Inc.STLV(商標)Rotary Cell Culture System)により、細胞および/または前駆細胞の増殖を実施することができる。
【００２１】
軟骨細胞を使用する場合、スピナーフラスコまたはタンブラータイプのバイオリアクターで培養すると、細胞の表現型が確実に維持されるはずである。しかし、増殖が、基本的に静止した培地中での培養を必要とする場合、軟骨細胞の脱分化を防止するステップを取り入れることが必要なこともある。どちらの場合でも、培地は、細胞増殖および細胞の諸特性を制御するアスコルビン酸塩または増殖因子などのサプリメントを含むことができる。
【００２２】
本発明の方法で利用する生体吸収性ビーズまたは粒子は、好ましくは、容易に注射できるようなサイズである。したがって、生体吸収性ビーズまたは粒子は、好ましくは約20〜2500μmの直径または寸法、より好ましくは約50〜200μmの平均サイズを有する。適切な生体吸収性ビーズは、規則的な形状(例えば、ミクロスフェアなどの球状、卵形、円板状または棒状)でも規則的な形状の混合物でもよい。一方、適切な生体吸収性粒子は、通常、固体物質を粉砕しまたは粉末にして一般に製造される多種多様な不規則形状粒子からなる。
【００２３】
生体吸収性ビーズまたは粒子は、ゼラチンおよびコラーゲン(特にI型および/またはII型)などの生体系ポリマー(biologically-based polymers)、および細胞用骨格に使用されるポリマーなどの合成ポリマー(すなわち、PGA、PLAおよびPLGA)、および生体系ポリマーと合成ポリマーの混合物を含めて、薬剤として許容される任意のポリマーを含むことができる。あるいは、生体吸収性ビーズまたは粒子は、骨粒子(例えば、粉砕した骨および脱塩した骨の粒子)を含めた他の薬剤として許容される非ポリマー性物質を含むことができる。また、生体吸収性ビーズまたは粒子は、このようなポリマー物質と非ポリマー物質の混合物を含むことができる。
【００２４】
生体吸収性ビーズまたは粒子は、スピナーフラスコまたはタンブラータイプのバイオリアクター中でビーズまたは粒子が十分流動可能なサイズおよび密度であることが好ましい。このことは、細胞増殖および軟骨細胞を使用する場合には軟骨細胞の表現型の維持に役立つ。
【００２５】
生体吸収性ビーズまたは粒子は、官能性を持たせたり、細胞接着を促進するのに適切な物質(例えば、細胞表面の抗原に結合する抗体またはその断片、またはI、II、VI、IX、XI型コラーゲンなどのECMタンパク質など)で被覆したりすることができ、かつ/または軟骨細胞を使用する場合には、表現型を維持するのに役立つ薬剤(例えばII型コラーゲン)で被覆することもできる。また、ビーズまたは粒子は、増殖因子(例えばTGFβ、EGF、FGF、IGF-1およびOP-1など)、グリコサミノグリカン(GAGs)(例えば、アグリカン、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン)および親水性化合物(例えば、ポリリジン、キトサン、ヒアルロナン)など他の有益な作用剤を含むことができる。
【００２６】
ビーズまたは粒子を、適切な細胞および/または前駆細胞と一体化し、ゲルおよび/またはゲル形成物質に入れて患者に投与することが好ましい。しかし、これに加えまたはこれとは別に、適切な細胞および/または前駆細胞と一体化したビーズまたは粒子を、適切な薬剤として許容される担体(例えば、生理食塩水、無菌組織培地など)と組み合わせて投与してもよい。
【００２７】
適切なゲルおよび/またはゲル形成物質は、好ましくは、生体吸収性であり、ビーズまたは粒子が実質的に投与部位に確実に保持されるタイプのものである。したがって、ゲルおよび/またはゲル形成物質は、投与部位の周囲組織にゲルまたは形成されたゲルを接着する接着物質(例えばフィブリンおよび/またはコラーゲン、またはトランスグルタミナーゼ系)を含む。これとは別に、またはこれに加え、ビーズまたは粒子を含有するゲルおよび/またはゲル形成物質を組織(例えば、皮膚組織および/または脂肪組織)内または組織(例えば、骨膜フラップ)もしくは他の膜フラップ(例えばコラーゲン膜)の下に閉じ込めることによって、投与部位にビーズまたは粒子を実質的に保持することができる。
【００２８】
適切なゲルおよびゲル形成物質は、コラーゲン溶液または繊維の懸濁液、ヒアルロナンまたはキトサン(加水分解されたキチン)などの生体系ポリマー(すなわち、天然または処理された天然ポリマー)、またはポリ(エチレンオキシド)とα-ヒドロキシ酸のエンドキャップされた光重合性ブロックコポリマーなどの合成ポリマーを含むことができる。ゲルおよび/またはゲル形成物質は、(上述したものを含めた)増殖因子、グリコサミノグリカン(GAGs)および(上述したものなどの)親水性化合物など他の有益な作用剤を含むこともできる。
【００２９】
第2および第3の各態様の方法では、ビーズまたは粒子に結合した細胞および/または前駆細胞は、投与できる状態になった場合、集密的または集密化前の状態であってもよい。平均約3〜500個の細胞および/または前駆細胞が、好ましくは、各生体吸収性ビーズまたは粒子と一体になっている。しかし、この数値はビーズまたは粒子の諸特性(例えば、組成およびサイズ)に応じて変わる。投与する場合、ビーズまたは粒子1cm３当たり1×10５〜1×10９個の結合した細胞および/または前駆細胞を使用することが好ましい。
【００３０】
軟骨細胞を使用する場合、軟骨細胞が細胞外基質を分泌し始める前またはその後に、ビーズまたは粒子に結合した軟骨細胞を患者に投与することができる。しかし、細胞外基質は注射が困難になり得る凝集体を形成する恐れがあるので、細胞外マトリックスを分泌し始めた後の方が好ましくない。
【００３１】
本発明の第3の態様の方法では、細胞および/または前駆細胞をまず増殖させ、次いで(すなわちその後に)生体吸収性ビーズまたは粒子に結合させる。これは、適切な皿(例えばペトリ皿)または組織培養フラスコ内で実施することができる。また、生体吸収性ビーズまたは粒子は、官能性を持たせたり、細胞接着を促進するのに適切な物質で被覆したりすることができ、かつ/または軟骨細胞の表現型を維持するのに役立つ薬剤で被覆することもできる。ビーズまたは粒子は、増殖因子、グリコサミノグリカン(GAGs)および親水性化合物など他の有益な作用剤を含むこともできる。
【００３２】
本発明の第3の態様の方法では、細胞および/または前駆細胞が結合したビーズまたは粒子を、ステップ(iii)の直後あるいは細胞および/または前駆細胞をビーズまたは粒子上でさらに培養した後に患者に投与することができる。
【００３３】
ビーズまたは粒子と一体化した細胞および/または前駆細胞ならびにゲルおよび/またはゲル形成物質を、好ましくは注射または関節鏡を使った送達によって投与する。
【００３４】
本発明の方法は、主にヒトへの使用、特に(例えば、膝、指、股関節または他の関節の)関節軟骨組織変性またはけがの治療に関連して使用されることを意図している。しかし、この方法が、獣医への応用(例えば、競走馬の関節軟骨変性またはけがの治療、およびペットの関節軟骨変性またはけがの治療)に適しているであろうことも容易に予想できる。
【００３５】
本発明は、病変組織または損傷組織の治療のために患者に外科的に移植できる組織様装具(tissue-like device)の製造も包含する。
【００３６】
したがって、第4の態様においては、本発明は、患者の病変組織または損傷組織を治療するための組織様特性を有する装具を提供するものであって、前記装具は、生体吸収性ビーズまたは粒子と一体化した、前記病変組織または損傷組織に対応する正常組織中に通常見られるタイプの細胞および/またはそれらの適切な前駆細胞、ならびに場合によってはゲルおよび/またはゲル形成物質を含む。
【００３７】
生体吸収性ビーズまたは粒子と一体化した前記細胞および/または前駆細胞、ならびに場合によってはゲルおよび/またはゲル形成物質を、組織様の塊を形成するのに十分な時間培養することによってこの装具を調製することができる。細胞および/または前駆細胞は、生体吸収性ビーズまたは粒子に結合していても結合していなくてもよい。生体吸収性ビーズは、この装具を移植する前に完全に分解していてもよいが、ビーズまたは粒子は移植時にこの装具内で実質的に変わっていないことが好ましい。
【００３８】
第5の態様では、本発明は、患者の病変組織または損傷組織を治療するための方法を提供するものであって、前記方法は前記患者の前記病変組織または損傷組織が発生している部位に第4の態様による装具を移植することを含む。
【００３９】
様々なタイプの細胞を同じタイプでも異なるタイプでもよいビーズ上で併用して病変組織または損傷組織を修復できることは、当業者には容易に理解できよう。
【００４０】
本発明を組織の増大(例えば、はん痕または顔のしわの治療)に使用できることも当業者には容易に理解できよう。
【００４１】
「結合」という用語によって、本発明者らは、細胞および/または前駆細胞が生体吸収性ビーズまたは粒子に接着し、個々の生体吸収性ビーズまたは粒子に結合している前記細胞および/または前駆細胞が実質的にすべてこのビーズまたは粒子に結合したままである任意の機序を意味する。このような機序は、(ビーズに共有結合できる)抗体、またはECMタンパク質(例えば、I、II、VI、IX、XI型コラーゲンなど)、またはこのビーズにやはり共有結合できるそれらの断片によって、軟骨細胞および/または前駆細胞を前記ビーズに結合させることを含む。
【００４２】
「ゲル」という用語によって、本発明者らは、上述したように、生体吸収性ビーズまたは粒子の沈降(参考:生体吸収性ビーズまたは粒子は、生理食塩水から容易に沈降する)を遅らせることができる任意の粘性または半固形溶液または懸濁液を意味する。このような溶液および懸濁液は、#2ツァーンカップ(Gardco,Inc.)(#2ツァーンカップ中44ml)で37℃大気圧で30秒以内に流出しないことが好ましい。このような溶液または懸濁液は、#4ツァーンカップ(Gardco,Inc.)で流出しない、すなわち、37℃大気圧下2分で流出する量が初期体積(#4ツァーンカップ中44ml)の5%未満であることがより好ましい。
【００４３】
本明細書を通して使用する「含む」(「comprise」、「comprises」および「comprising」)は、記述するステップ、成分もしくは特徴、またはさらなるステップ、成分、特徴を包含しもしくは包含しない一群の諸ステップ、諸成分もしくは諸特徴、または一群の諸ステップ、諸成分もしくは諸特徴を包含することを意味するものである。
【００４４】
本明細書に含まれる文書、行為、材料、装具、論文などに関する考察は、単に本発明のコンテクストを提供するためのものである。任意のまたはすべてのこれらの事項が従来技術の基礎の一部を形成し、本願の各請求項の優先権日前にオーストラリアまたはその他の国に存在する、本発明に関連する分野の通常の一般的な知識であったことを認めるものと解釈すべきではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
以下の非限定的な実施例および添付の図面により本発明を以下にさらに詳細に記述する。
【実施例１】
【００４６】
軟骨細胞の単離
ペニシリンおよびストレプトマイシン100μg/mlを含有するDMEM/10%FBSまたは自家血清中に新しい軟骨組織を収集する。計量後、この組織をDMEM3〜4mlを入れた無菌ペトリ皿中に置き、滅菌した鋭利なメスで1mm３の小片に解体する。次いで、PBS中の10%w/vトリプシンにより37℃で1時間この組織小片を消化する。組織1グラム当たり約2mlの10%w/vトリプシンを使用する。残りの組織小片を、遠心分離(1000rpm、5分間)して収集し、PBS、次いで(組織1グラム当たり約5〜10mlの)水で洗浄する。次いで、組織1グラム当たり2mlの細菌コラゲナーゼとヒアルロニダーゼの混合物を用いて第2の消化ステップを37℃で終夜実施する。ヒアルロニダーゼ2mg(1520単位)および(トリス50mM、CaCl２10mM、pH7.0の緩衝液中-70℃で貯蔵した3000単位/mlの貯蔵物から取った)コラゲナーゼ貯蔵物200μlをDMEM2mlに添加し、フィルターで滅菌して消化混合物を調製する。消化した組織を70μmのNylon細胞ストレーナーに通し、細胞を洗浄し、遠心分離して収集する。少量既知の一定分量について細胞数および生存能力をトリパンブルー染色でカウントして評価する。
【実施例２】
【００４７】
線維芽細胞の単離
新鮮な皮膚を、毛を除去して70%エタノールで洗浄後、ペニシリンおよびストレプトマイシン100μg/mlを含有するDMEM/10%FBSまたは自家血清中に収集する。この組織をDMEM3〜4mlを入れた無菌ペトリ皿中に置き、滅菌した鋭利なメスで1mm３の小片に解体する。ペニシリンおよびストレプトマイシン100μg/mlを含有するDMEM/10%FBSまたは自家血清中にこれらの組織小片を放置し培養して、線維芽細胞が組織培養プラスチック上に移動できるようにする。細胞が組織培養プラスチック上で見えるようになった後、組織を除去し、細胞を継代培養する。少量既知の一定分量について細胞数および生存能力をトリパンブルー染色でカウントして評価する。
【実施例３】
【００４８】
骨芽細胞の単離
ペニシリンおよびストレプトマイシン100μg/mlを含有するDMEM/10%FBSまたは自家血清中に新鮮な皮質骨を収集する。この骨をDMEM3〜4mlを入れた無菌ペトリ皿中に置く。ペニシリンおよびストレプトマイシン100μg/mlを含有するDMEM/10%FBSまたは自家血清中でこれらの骨片を放置し培養して、骨芽細胞が組織培養プラスチック上に移動できるようにする。細胞が組織培養プラスチック上で見えるようになった後、骨を除去し、細胞を継代培養する。少量既知の一定分量について細胞数および生存能力をトリパンブルー染色でカウントして評価する。
【実施例４】
【００４９】
幹細胞の単離
成体の間充織幹細胞(MSC)を骨髄吸引液から収集する。骨髄を無菌PBSで2回洗浄し、次いでペニシリンおよびストレプトマイシン100μg/mlを含有するDMEM/10%FBSまたは自家血清中に再分散する。次いで、骨髄細胞をPercollクッション(密度1.073g/ml)上に層状に重ね、250gで30分間遠心分離して細胞を収集し、組織培養フラスコに移す。デキサメタゾン、増殖因子およびサイトカインを含めて種々の添加剤を使用して特異的な細胞系統を選択し増殖させる。
【実施例５】
【００５０】
単層中での細胞培養
上記実施例1〜4の手順に従って単離した線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞および他のタイプの細胞などの細胞を、ペニシリンおよびストレプトマイシン100μg/mlを含有するDMEM/10%FBSまたは自家血清中、37℃5%二酸化炭素雰囲気下で組織培養プラスチック上で培養する。1日おきに培地を添加または交換する。細胞が集密的に増殖したら、次いでトリプシン処理し、フラスコ中に単層として再び蒔き、またはビーズ/粒子に移す。
【実施例６】
【００５１】
非吸収性ビーズ上での細胞培養
表面積250〜500cm２のビーズまたは粒子、例えば、Cytodexビーズ(Pharmacia Biotech)を、37℃に加温した培地(ペニシリンおよびストレプトマイシン100μg/mlを含有するDMEM/10%FBSまたは自家血清)50mlで予洗し、次いで125mlスピナーボトル中に置く。新鮮な単離細胞、前もって継代培養した細胞または前もって単離し凍結させた細胞のいずれかの1×10５個の細胞を、ビーズまたは粒子に添加する。次いで、ボトルを37℃の(5%CO２を含む)インキュベーター中、3時間にわたり30分ごとに25rpmで2分間断続的に、次いでさらに3時間にわたり30分ごとに2分間断続的に、次いで最初に45rpmで15分間、次いで50rpmで15分間、55rpmで15分間、次いで最終速度の60rpmまで連続的に撹拌する。次いで、最初の接種物に応じて通常5〜8日間、この速度で90%集密的になるまで細胞を増殖させる。ビーズまたは粒子上に細胞を収集するため、遊離させさらに接種する場合でも患者へ送達するために調製したりさらに処理したりする場合でも、細胞およびビーズを37℃に加温したPBSで洗浄し、遠心分離して回収する。
【実施例７】
【００５２】
ゼラチンビーズの調製
ゼラチン微粒子を乳化法により合成する。簡潔に述べると、ゼラチンを酢酸50mMに溶解して20%(w/v)とする。オリーブオイル200mlを37℃に加温する。暖めたオリーブオイルを300rpmで撹拌する。次いで、37℃に維持したゼラチン溶液40mlを、20ゲージの針を通してオリーブオイルに添加する。この溶液は、10%w/wの未変性コラーゲンも含むように調製する。このエマルジョンを90分間撹拌し続ける。次いで、ゼラチン粒子を固めるためにエマルジョンを30分間4℃で撹拌して冷却する。PBS中の0.2%Triton X-100  500mlをエマルジョンに添加し、室温で10分間撹拌する。次いで、この混合物を分液漏斗に入れ、1時間静置する。下部の液体を収集し、ゼラチン微粒子が沈殿した後、上部の液体を慎重にデカントして除き、粒子を2回水洗する。PBS中の0.1%グルタルアルデヒド  500mlをゼラチン微粒子に添加し、1時間撹拌して架橋させる。次いで架橋したゼラチンビーズを数回水洗し、エタノールに浸漬する。エタノールをデカントし、ゼラチン微粒子を減圧下で乾燥する。細胞を接種する前にゼラチンビーズを終夜PBSで、次いで軟骨細胞培地で再水和する。ゼラチン微粒子の平均粒径は約110μmである。
【実施例８】
【００５３】
ゼラチンビーズ上での細胞培養
表面積250〜500cm２のゼラチンビーズを、37℃に加温した培地(ペニシリンおよびストレプトマイシン100μg/mlを含有するDMEM/10%FBSまたは自家血清)50mlで予洗し、次いで125mlスピナーボトル中に置く。新鮮な単離細胞、前もって継代培養した細胞または前もって単離し凍結させた細胞のいずれかの1×10５個の細胞をビーズまたは粒子に添加する。次いで、ボトルを37℃の(5%CO２を含む)インキュベーター中、3時間にわたり30分ごとに25rpmで2分間断続的に、次いでさらに3時間にわたり30分ごとに45rpmで2分間断続的に、次いで最初に45rpmで15分間、次いで50rpmで15分間、55rpmで15分間、次いで最終速度の60rpmまで連続的に撹拌する。次いで、最初の接種物に応じて通常5〜8日間、この速度で90%集密的になるまで細胞を増殖させる。ビーズまたは粒子上に細胞を収集するため、遊離させさらに接種する場合でも患者へ送達するために調製したりさらに処理したりする場合でも、37℃に加温したPBSで細胞およびビーズを洗浄し、遠心分離して回収する。軟骨細胞をゼラチンビーズに添加してから7日後のゼラチンビーズ上の細胞増殖を図1Aに示す。
【実施例９】
【００５４】
PLGAビーズおよび粒子の調製
ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)85:15w/w(PLGA)を、テトラヒドロフランに溶解し、次いで1%ポリビニルアルコール含有水溶液中に撹拌乳化した。PLGAビーズを沈殿させて収集し、デカンテーションにより5回水洗した。次いで、ビーズを終夜減圧乾燥した。通常、平均粒径が105μmである30μm〜300μmのビーズを得た。ビーズをし分により80μm〜120μmの狭い粒径範囲に分画した。別法では、より大きな粒子をホモジナイザーで粉砕し、PLGA1gを水500mlに懸濁した液を用いて、所望の粒径範囲のPLGA粒子を得た。し分によって所望の粒径範囲、例えば50μm〜250μmの不規則な形状の粒子を得た。PLGAビーズおよび粒子の表面改質を、コラーゲン50μg/mlを含有するリン酸緩衝生理食塩水溶液からコラーゲンIまたはコラーゲンIIを室温で1時間吸着させて実施した。続いて、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄して結合の弱いコラーゲンを除去した。
【実施例１０】
【００５５】
PLGAビーズ上での細胞培養
表面積250〜500cm２のPLGAビーズを、37℃に加温した培地(ペニシリンおよびストレプトマイシン100μg/mlを含有するDMEM/10%FBSまたは自家血清)50mlで予洗し、次いで125mlスピナーボトル中に置く。新鮮な単離細胞、前もって継代培養した細胞または前もって単離し凍結させた細胞のいずれかの1×10５個の細胞を、ビーズまたは粒子に添加する。次いで、ボトルを37℃の(5%CO２を含む)インキュベーター中、3時間にわたり30分ごとに25rpmで2分間断続的に、次いでさらに3時間にわたり30分ごとに45rpmで2分間断続的に、次いで最初に45rpmで15分間、次いで50rpmで15分間、55rpmで15分間、次いで最終速度の60rpmまで連続的に撹拌する。次いで、最初の接種物に応じて通常5〜8日間、この速度で90%集密的になるまで細胞を増殖させる。ビーズまたは粒子上に細胞を収集するため、遊離させさらに接種する場合でも患者へ送達するために調製したりさらに処理したりする場合でも、細胞およびビーズを37℃に加温したPBSで洗浄し、遠心分離して回収する。軟骨細胞をPLGAビーズに添加してから14日後のPLGAビーズ上の軟骨細胞培養物を図1Bに示す。ヤギ抗II型コラーゲン抗体で軟骨細胞を染色してII型コラーゲンの合成を表示させた。
【実施例１１】
【００５６】
骨粒子の調製
接着組織のない、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄した新鮮な骨を乾燥し、次いで粉砕し粉にして粒子を準備し、それをし分により分別して、例えば120μmのふるいを通過し80μmのふるいに溜まる画分を得る。これらの粒子をメタノール、ジクロロメタンおよびアセトンで洗浄して脱脂する。次いで、PBSで2回、その後水で粒子を洗浄し、乾燥させる。0.5M  EDTA中、pH7.4で20時間にわたり骨粒子を撹拌して脱塩骨粒子を調製する。静かに遠心して分離した後、このプロセスを少なくともさらに2回繰り返した。
【実施例１２】
【００５７】
骨粒子上での細胞培養
骨粒子上での細胞培養は、PLGAビーズの代わりに未処理および脱塩骨粒子を用いた以外は実施例10と同様であった。
【実施例１３】
【００５８】
バイオリアクター中での細胞培養
細胞が付着したビーズまたは粒子を、実施例6または8または10または12に記載したように、Synthecon(商標)Rotary Cell Culture SystemのHigh Aspect Ratio Vesselなどのバイオリアクターに入れ、ペニシリンおよびストレプトマイシン100μg/mlを含むDMEM/10%FBSまたは自家血清でこの容器を満たし、気泡を除去する。5%二酸化炭素を含み加湿されたインキュベーター中、初期回転速度15rpmで培養を続ける。次いで、ビーズまたは粒子の性質およびサイズに応じて、ビーズまたは粒子が沈殿したり容器の縁と衝突したりせず、培養容器内に流れの軌道を形成するように速度をさらに調節する。1日または2日ごとに培地を交換または追加する。
【実施例１４】
【００５９】
単層培養物からの細胞の除去および移動
37℃に加温したPBS中の0.3%w/vトリプシンを、25cm２当たり5mlの量で組織培養フラスコに直接添加する。最大5分間静置した後、ピペットを静かに操作してまたは機械を静かに操作してプラスチックから細胞を取り出す。1000rpmで5分間遠心分離してトリプシン溶液中の細胞を収集する。次いで上清を除去し、細胞を培地5mlに静かに再懸濁させる。トリパンブルー法で細胞をカウントする。
【実施例１５】
【００６０】
ポリマービーズからの細胞の除去
収集し洗浄したビーズ上の細胞に加温した0.3%w/vトリプシン6mlを直接加え、37℃で10〜15分間撹拌せずにインキュベートする。この混合物に加温したPBS20mlを加え、ピペットで静かに上下させて70μmよりも大きいサイズのビーズまたは粒子から細胞を取り出す。細胞およびビーズまたは粒子を70μmのフィルターを通して50ml管に移す。1000rpmで5分間遠心分離して、フィルターを通過する細胞を収集する。上清を除去し、培地5mlに細胞を静かに再懸濁させる。トリパンブルー法で細胞をカウントする。
【実施例１６】
【００６１】
ゼラチンビーズからの細胞の除去
収集し洗浄したビーズ上の細胞に加温した0.3%w/vトリプシン6mlを直接加え、37℃で20分間インキュベートする。ゼラチンビーズを酵素で消化して、機械的に激しく撹拌せずに溶液中に細胞を遊離させる。1000rpmで5分間遠心分離して細胞を収集する。上清を除去し、培地5mlに細胞を静かに再懸濁させる。トリパンブルー法で細胞をカウントする。
【実施例１７】
【００６２】
移植用吸収性ビーズ上への細胞の移動
実施例7または9または11のように、新鮮な単離細胞、単層培養中でまたは非吸収性ビーズもしくは粒子上でまたは吸収性ビーズもしくは粒子上で前もって継代培養した細胞、あるいは前もって単離し培養し凍結させた細胞のいずれかの、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞または他のタイプの細胞などの細胞を、37℃に加温した培地(ペニシリンおよびストレプトマイシン100μg/mlを含有するDMEM/10%FBSまたは自家血清)中に懸濁し、予洗したビーズまたは粒子に添加し、実施例6または8または10または12のように撹拌速度を徐々に上げて付着させる。
【実施例１８】
【００６３】
アルシアンブルー染色による細胞の評価
ビーズまたは粒子上で細胞を培養すること(実施例6、8、10、12)の利点は、表現型が制御できることである。関節軟骨の場合、脱分化した線維軟骨細胞から軟骨細胞を識別できる種々の組織化学的および免疫組織化学的マーカーを用いて表現型をモニターする。アルシアンブルーは、関節軟骨のグリコサミノグリカン用の一般的な染色剤であり、2%のろ過溶液としてpH2.5の3%酢酸中で調製される。中性緩衝ホルムアルデヒドで2〜3分間固定した後、スライドを3%酢酸中で3分間インキュベートする。37℃で少なくとも20時間アルシアンブルー溶液を使用し、スライドを水洗し、ニュートラルレッド染色を2分間行う。Histoclear中でマウンティングする前にエタノールで洗浄する。
【実施例１９】
【００６４】
免疫組織化学的染色による細胞の評価
培養細胞の表現型を特異的免疫マーカーを用いてモニターする。関節の軟骨細胞の場合、II型コラーゲンに対する抗体を使用して正確な表現型をモニターし、抗I型コラーゲン抗体を使用して変化または脱分化の程度をモニターする。例えば抗コラーゲン抗体を用いて、基質の産生について細胞を染色しようとする場合、少なくとも6日間新しいアスコルビン酸を最終濃度50μg/mlまで培養物に毎日添加しなければならない。加温したPBSで洗浄した後、PBS中の50%(v/v)メタノールで10分間1回、PBS中の70%(v/v)冷メタノールで10分間2回、最後に70%(v/v)エタノール水溶液でビーズ上の細胞を予備固定する(prefix)。アルシアンブルーなどのプロテオグリカン染色剤とともに使用する別の固定液として、ホルマリンまたはグルタルアルデヒドを使用してもよい。一次抗体をPBSで希釈し(例えば、PBSで1/5に希釈したヤギ抗II型コラーゲン)、室温で1時間使用し、次いでPBSで洗浄後、PBSで希釈したFITC複合抗体(例えば、PBSで1/200に希釈したウサギ抗ヤギFITC)を室温で1時間使用した。ビーズをPBSで2回洗浄後、封入剤(mounting medium)(例えば、グリセロール90%、PBS10%、DABCO0.025%)中に再懸濁する。Optiscan共焦点顕微鏡で蛍光画像を収集する。
【実施例２０】
【００６５】
in situハイブリダイゼーションおよびRT-PCRによる細胞の評価
in situハイブリダイゼーションによる特徴決定のための細胞を、実施例19のようにして固定した。例えばI型コラーゲンまたはII型コラーゲンをコードするmRNAのin situハイブリダイゼーションを、Bisucci T、Hewitson TD、Darby IA、(2000)「cRNAプローブ:同位体検出方法と非同位体検出方法の比較(cRNA probes:comparison of isotopic and non-isotopic detection methods)」、Methods in Molecular Biology、123:291〜303の方法に従いUTP-３３P検出法により実施する。ヒトコラーゲンproα1(I)遺伝子の372bp領域からなるI型コラーゲンリボプローブまたはウシコラーゲンα1(II)遺伝子の200bp領域からなるII型コラーゲンリボプローブを使用する。
【００６６】
RT-PCRの場合、実施例5および実施例14のようにして、細胞(ブタ軟骨細胞)を単層で培養し回収する。REzol(商標)C&T(USA)1ml中で細胞を撹拌して完全に溶解させる。細胞溶解物をミクロチューブに移し、室温で5分間インキュベートする。次いで、細胞溶解物をクロロホルム0.2mlと激しく混合し、室温で2分間インキュベートする。4℃12,000×gで15分間遠心分離した後、上部の水層を新しいミクロチューブに移し、等体積のイソプロパノールを添加して穏やかに混合する。試料を室温で10分間インキュベートし、4℃12,000×gで10分間遠心分離した。上清を慎重に除去し、RNAの塊を75%エタノール1ml中で撹拌混合して洗浄し、次いで4℃12,000×gで5分間遠心分離する。次いでエタノールを慎重に除去し、RNAの塊を風乾する。DEPC20μlで処理した水にRNAの塊を溶解する。次いで、オリゴdTプライマーおよびSUPERSCRIPT(商標)IIを用いて製造者(Life Technologies)の推奨に従いmRNAをcDNAに逆転写する。
【００６７】
RT反応からの一定分量2μlを使用し、解析した遺伝子に特異的なプライマーを用いて転写物を増幅する。95℃で3分間変性し、その後95℃1分間の変性、50℃1分間のアニーリングおよび72℃1分間の伸長を35サイクル行ってPCR反応を実施する。解析した遺伝子に特異的なプライマーを以下のように設計する。
【００６８】
【化１】
2004531297.tif 000002
【００６９】
これを図2に示す。
【実施例２１】
【００７０】
合成ゲルの調製
グリコール酸または乳酸などのα-ヒドロキシ酸のオリゴマーと末端で重合させ、オリゴ(α-ヒドロキシ酸)末端のすべてを重合性アクリレート基でエンドキャップしたPEOからなる前駆体を使用し、長波長の紫外線にこの前駆体を短時間曝して重合してゲルを形成させることによって、適切なゲル、すなわち生体吸収性ゲルを形成する。
【実施例２２】
【００７１】
細胞、ビーズおよび合成ゲルの混合物の調製
細胞を、実施例8に示したようにゼラチンビーズ基質または他の基質から除去した後、自家血清もしくはウシ胎児血清を含有するDMEM中で、実施例7のようにして作製した新しいゼラチンビーズまたは実施例9もしくは実施例11に示したような他の生体吸収性ビーズもしくは粒子と混合し、実施例21で示したような合成ゲル前駆体と混合して均一な混合物を形成させ、紫外線に短時間曝してゲルを形成させる。
【実施例２３】
【００７２】
生体(コラーゲン)ゲルの調製
I型コラーゲン、II型コラーゲンまたはこれらのコラーゲンの混合物4gを50mM酢酸溶液1リットルに溶解した。このコラーゲン溶液を4℃9500rpmで45分間回転させた。この上清を回収した。コラーゲン溶液を透析バッグに入れ、1M酢酸25リットルで2日間、次いで水を複数回交換しながら水25リットルで4日間透析した。次いで、コラーゲン溶液を密封した透析バッグを層流フード中に1日吊るして濃縮した。コラーゲン溶液の最終濃度は約20mg/ml(2%w/v)であった。
【実施例２４】
【００７３】
細胞、ビーズおよび生体ゲルの混合物の調製
細胞を、実施例8に示したようにゼラチンビーズ基質または他の基質から除去した後、自家血清もしくはウシ胎児血清を含有するDMEM中で実施例7のようにして作製した新しいゼラチンビーズまたは他の生体吸収性ビーズもしくは粒子と混合し、実施例23のようにして調製した2%コラーゲン溶液などの生体ゲルまたは前駆体と混合して、細胞およびビーズまたは粒子が均一に混合した均一な混合物を形成し、この混合物を37℃でインキュベーションしてゲルを形成させる。
【実施例２５】
【００７４】
細胞付着ビーズ(cells-on-beads)と合成ゲルの混合物の調製
実施例8に示したようなゼラチンビーズ基質または他の生体吸収性ビーズもしくは粒子に付着した細胞を、培養混合物を沈殿させ次いで余分な培地を除去することによって収集する。次いで、細胞付着ビーズを実施例21に示したような合成ゲル前駆体と混合して均一な混合物を形成させ、紫外線に短時間曝してゲルを形成させる。
【実施例２６】
【００７５】
細胞付着ビーズと生体ゲルの混合物の調製
実施例8に示したようなゼラチンビーズ基質または他の生体吸収性ビーズもしくは粒子に付着した細胞を、培養混合物を沈殿させ次いで余分な培地を除去することによって収集する。次いで、細胞付着ビーズを実施例23に示したように調製した2%コラーゲン溶液などの生体ゲルまたは前駆体と混合して均一な混合物を形成させる。コラーゲン溶液9部を10×DMEM1部および1NNaOH0.1部と混合した。この混合物4部を軟骨細胞-ゼラチンビーズ複合体1部と混合した。37℃のインキュベーターで1時間インキュベーションしてゲルを生成させた。あるいは、埋植した混合物に対して体温によってゲルを生成することもできよう。
【実施例２７】
【００７６】
細胞/ビーズ/生体ゲル混合物のin vitroでの培養
実施例24で調製したような細胞とビーズを含有する生体ゲルを、例えば24ウェルのプレートに移し、軟骨細胞培地1.5mlを各試料に添加する。軟骨細胞培地を1日おきに交換し、アスコルビン酸100μg/mlを毎日補給する。in vitroでの評価のために、3日、7日、14日、21日および28日後に試料を収集する。
【実施例２８】
【００７７】
細胞付着ビーズ/生体ゲル混合物のin vitroでの培養
実施例26で調製したような細胞付着ビーズを含有する生体ゲルを、細胞培養プレートに移し、実施例27に記載したようにアスコルビン酸の存在下で培養する。ビーズと一体化した軟骨細胞は、3日目までゲル中で増殖し、軟骨細胞の表現型と一致する新しいII型コラーゲンとグリコサミノグリカンの基質を分泌した。図3に示すように、ビーズが存在すると、ゲル収縮の速度と程度がかなり減少する。
【実施例２９】
【００７８】
細胞/ビーズ/合成ゲル混合物のin vitroでの培養
実施例22で調製したような細胞とビーズを含有する合成ゲルを、細胞培養プレートに移し、実施例27に記載したようにアスコルビン酸の存在下で培養する。
【実施例３０】
【００７９】
細胞付着ビーズ/合成ゲル混合物のin vitroでの培養
実施例25で調製したような細胞付着ビーズを含有する合成ゲルを、細胞培養プレートに移し、実施例27に記載したようにアスコルビン酸の存在下で培養する。
【実施例３１】
【００８０】
細胞/ビーズ/生体ゲル混合物の動物への移植
実施例24または26に示したようなI型コラーゲンゲル中の細胞とビーズまたは細胞付着ビーズのどちらかをヌードマウスに皮下注射する。1カ月および2カ月後にこのヌードマウスを屠殺し、形成された新しい組織の組織学的および免疫組織学的評価を行う。ヌードマウスの外植片から、ゼラチン、I型コラーゲンで改変したゼラチンおよび脱塩した骨を含めた様々なビーズを用いて関節軟骨を産生できることがわかる。送達ゲルとしてI型コラーゲンを用いると、1カ月以内に良好な組織の形成が認められ、これが2カ月続く。実施例18、19および20に記載したような組織化学的および免疫組織化学的評価から、基質および軟骨の表現型が正しいことがわかる。I型コラーゲンゲルを含む脱塩骨粒子上の培養軟骨細胞を用いた新しい組織形成の一例を図4に示す。
【実施例３２】
【００８１】
in vitroで培養した材料の動物への移植
実施例27または28に示したような生体ゲル混合物中の細胞とビーズまたは細胞付着ビーズのどちらか、例えばI型コラーゲンゲル中の線維芽細胞、軟骨細胞または骨芽細胞とゼラチンビーズを用いて、ヌードマウスの皮下に外科的に移植する。1カ月および2カ月後にこのヌードマウスを屠殺し、形成された新しい組織の組織学的評価を行う。
【実施例３３】
【００８２】
細胞付着ビーズ/合成ゲル混合物の動物への移植
実施例22または25に示すような合成ゲル混合物、例えばポリエチレングリコール/乳酸-グリコール酸/α-ヒドロキシ酸型の中の細胞とビーズまたは細胞付着ビーズのどちらかを、ヌードマウスに皮下注射する。1カ月および2カ月後にこのヌードマウスを屠殺し、形成された新しい組織の組織学的評価を行う。
【実施例３４】
【００８３】
細胞含有混合物を用いた軟骨欠損部の修復
細胞(軟骨細胞)、ビーズまたは粒子およびゲルの調製物を使用する。この混合物、例えば実施例26に示すような2%I型コラーゲン混合物中のゼラチンビーズ基質に付着した軟骨細胞を、ビーズまたは粒子が容易に通過できる22ゲージなどの十分な直径の針を有するシリンジに充填する。次いで、ヒツジの膝に設けた軟骨の欠損部にこの材料を注射する。移植した軟骨細胞含有材料上に一枚の自家骨膜を貼って移植した材料を所定の位置に保持することもできる。傷を閉じた後、膝を一時的に固定してコラーゲンが半固形のゲルを形成できるようにする。
【実施例３５】
【００８４】
細胞含有混合物を用いた軟骨欠損部の修復
実施例21に示すような合成ゲルを使用し、材料を軟骨欠損部に入れた後紫外線に短時間曝してゲルを形成させる以外は実施例34に示すように、細胞(軟骨細胞)、ビーズまたは粒子およびゲルの調製物を用いて膝欠損部の修復を行う。移植した軟骨細胞含有材料上に一枚の自家骨膜を貼って移植した材料を所定の位置に保持することもできる。
【実施例３６】
【００８５】
in vitroでの培養移植片を用いた軟骨欠損部の修復
細胞(軟骨細胞)、ビーズまたは粒子およびゲルの調製物を使用する。この混合物、例えば実施例27に示すような2%I型コラーゲン混合物中のゼラチンビーズ基質に付着した軟骨細胞を、アスコルビン酸を補給した細胞培養物に10日間保持して、軟骨細胞およびゼラチンビーズを含有する組織様材料が形成されるようにする。次いで、ヒツジの膝に設けた軟骨の欠損部にこの組織様材料を外科的に移植する。移植した軟骨細胞含有材料上に一枚の自家骨膜を貼って移植した材料を所定の位置に保持することもできる。
【実施例３７】
【００８６】
細胞含有混合物を用いた骨欠損部の修復
細胞成分としての骨芽細胞および粉砕した骨粒子を含む以外は実施例34のようにして材料を調製し、ヒツジの大腿骨中の円形欠損部に注射した。2ヵ月後に組織学的検査をして骨が修復されていることを確認した。
【実施例３８】
【００８７】
細胞含有混合物を用いた骨欠損部の修復
BMP 2または他の増殖因子を添加する以外は実施例37のようにして骨芽細胞、粉砕骨粒子およびI型コラーゲンを含有する材料を調製する。ヒツジの大腿骨中の円形欠損部にこの材料を注射し、2ヵ月後に組織学的検査をして骨が修復されていることを確認した。
【実施例３９】
【００８８】
細胞含有混合物を用いた組織欠損部の修復
細胞成分としての線維芽細胞およびゼラチンビーズを含む以外は実施例34のようにして材料を調製し、ヒツジに皮下注射した。2ヵ月後に組織学的検査をして組織が修復されていることを確認した。
【実施例４０】
【００８９】
細胞含有混合物を用いた組織欠損部の修復
細胞成分としての脂肪細胞およびゼラチンビーズを含む以外は実施例34のようにして材料を調製し、ヒツジに皮下注射した。2ヵ月後に組織学的検査をして組織が修復されていることを確認した。
【実施例４１】
【００９０】
細胞含有混合物を用いた組織欠損部の修復
実施例39および40のように線維芽細胞および脂肪細胞の2種類のタイプの細胞を細胞成分として材料を調製し、ゼラチンビーズ上で個別に培養し、これらをコラーゲンゲル中で混合し、ヒツジに皮下注射した。2ヵ月後に組織学的検査をして組織が修復されていることを確認した。
【００９１】
「参考文献」
2004531297.tif 000003
【００９２】
概述した本発明の精神または範囲から逸脱することなく具体的な実施形態に示したように本発明を様々に変形しかつ/または改変できることは、当業者には容易に理解されよう。したがって、本実施形態はすべての点で例示的なものであり、限定的なものではないと考えるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】ゼラチンビーズ(A)およびPLGAビーズ(B)上における軟骨細胞の細胞増殖の顕微鏡像である(実施例8および10)。
【図２】細胞の表現型をRT-PCRにより評価した結果を示す図である。2%アガロースゲル上の電気泳動によってPCR産物を分析する(実施例20)。
【図３】I型コラーゲンゲル中のビーズ(ゼラチン)がある場合とない場合で、軟骨細胞を2週間培養した後のゲル収縮に対するビーズの効果を示す図である(実施例28)。
【図４】I型コラーゲンゲルを含む脱塩骨粒子上の培養軟骨細胞を用いた新しい組織形成の例を示す図である(実施例31)。
【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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