(57)【要約】【課題】ｍＲＮＡ転写体をマッピングしかつアンチセンス媒介遺伝子ノックダウンに対する有効な標的である領域を判定する装置および方法。【解決手段】多数のオリゴヌクレオチドが錯体要素の形状でアレイの同じ位置に固定される。各錯体要素を含むオリゴヌクレオチドの混合物は、標識ＲＮＡがアレイに適用される場合にデータが得られかつ解釈されるものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アレイ上の少なくともひとつの要素が、アレイ上の全ての位置の要素の配列が知られている状態で支持体に固定される特定配列の多数のオリゴヌクレオチドを含む錯体要素であることを特徴とする、アレイの特定の単一の長さまたは複数の長さのすべての考えられるオリゴヌクレオチドを含む装置。
【請求項２】
オリゴヌクレオチドはいずれかの天然、合成または改質ヌクレオチド、またはデオキシヌクレオチドから作成されることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドは各錯体要素内で物理的に分離されないことを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載の装置。
【請求項４】
すべての考えられる６〜９または１０〜１５のベースオリゴヌクレオチドがアレイ上に提示されることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の装置。
【請求項５】
アレイがマイクロアレイであることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の装置。
【請求項６】
錯体要素を構成するオリゴヌクレオチドの数が２〜１０，０００間であることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の装置。
【請求項７】
アレイ１は９６〜１００万の間の物理的に別個の錯体要素を含むことを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の装置。
【請求項８】
錯体要素はアミノリンカー技術を使用して支持体に固定されることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の装置。
【請求項９】
錯体要素がビオチン／ストレプタビジン相互作用を使用して錯体要素が支持体に固定されることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の装置。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドは固体支持体から離れて間隔をおいて配置されることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の装置。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドが６〜４０炭素原子当量間の化学スペーサを使用して固体支持体から離れて間隔をおいて配置されることを特徴とする請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
化学スペーサがアレイのアンカ群とオリゴヌクレオチド配列の先頭間に結合されることを特徴とする請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドが複数のスペーシングヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を使用してオリゴヌクレオチドの５’または３’末端を伸張することによりアレイから間隔をおいて配置されることを特徴とする請求項１０に記載の装置。
【請求項１４】
スペーシングヌクレオチドはいずれかの天然または合成ヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体であり得、かつホモ重合体またはヘテロ重合体のいずれかであることを特徴とする請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
スペーシングのひとつの方法がスペーシングの別の方法とともに使用されてもよいことを特徴とする請求項１０〜１４のいずれかに記載の装置。
【請求項１６】
特定数の所定の長さおよび所定配列オリゴヌクレオチドを特定濃度にともに混合するステップを含むことを特徴とする先行請求項に記載の装置に取付けるための錯体要素を生成する方法。
【請求項１７】
等量の個別オリゴヌクレオチドがともに混合されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
不等量の個別オリゴヌクレオチドがともに混合されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ひとつの錯体要素を構成する個別オリゴヌクレオチドが選択され、その結果、それらが互いに容易に雑種形成することを特徴とする請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
各錯体要素内の各オリゴヌクレオチドが、それが錯体要素におけるいずれかのオリゴヌクレオチドに対して６０％未満の相補性を有するように選択されることを特徴とする請求項１６〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
各錯体要素内の各オリゴヌクレオチドは、それが錯体要素におけるいずれかの他のオリゴヌクレオチドをもつ５未満の塩基の隣接相補性を有するように選択されることを特徴とする請求項１６〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
コンピュータを基本とするアルゴリズムを使用して配列を錯体要素群に割当てることを特徴とする請求項１６〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
先行請求項のいずれかに記載の錯体要素アレイを解釈し、かつ付けられた標識ＲＮＡの結合をアレイに存在する錯体要素におけるオリゴヌクレオチドのものと特定することにより付けられた天然ＤＮＡのアクセス可能範囲をマッピングする方法であって、アレイが、
ａ）アレイに付けられた標識ＲＮＡと錯体要素を構成するオリゴヌクレオチドのいずれかとの間のオリゴヌクレオチドにより生ずる信号用に走査され、
ｂ）前記信号が原錯体要素における既知配列に対して比較され、かつ
ｃ）要素間の重複が特定されることを特徴とする方法。
【請求項２４】
ＲＮＡが蛍光により標識化されることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＲＮＡが放射性物質を使って標識化されることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
ＲＮＡが標識化されず、かつ錯体要素との相互作用がＲＮＡ依存性酵素活性を使用してオリゴヌクレオチドと相互作用する延長により付けられたＲＮＡとの塩基対が可能であるそれらのオリゴヌクレオチドの自由３’末端に標識を組込むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
ＲＮＡ依存性酵素活性が逆転写酵素活性であることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
信号が蛍光発光、蛍光体画像化またはオートラジオグラフィにより検出されることを特徴とする請求項２３〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
信号が得られる各錯体要素内配列の比較により連続するアクセス可能配列を推測する重複パターンが与えられることを特徴とする請求項２３〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
標的配列がただひとつのまたは多数の不整合により発生する錯体要素を精査するための対策が取られることを特徴とする請求項２３〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
１次錯体要素からの信号を不整合錯体要素からの信号と比較することにより結合の反応速度の表示が与えられることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
信号の振幅を試験して同一錯体要素内の多数の非重複配列への結合が行われたかどうかを判定することを特徴とする請求項２３〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
標識転写体からの信号が増幅されることを特徴とする請求項２３〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
増幅が転写の間接標識付けによる２段階抗体結合により行われることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
転写されてアレイ１に付けられるＲＮＡが未変性条件下で全長または部分的ｃＤＮＡクローンから試験管内に転写されることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の方法または装置。
【請求項３６】
新生ＲＮＡが常に非変性条件下で維持されることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の方法または装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明はｍＲＮＡ転写およびアンチセンス媒介遺伝子ノックダウンに用いる有効ターゲットである範囲を判定する装置および方法に関する。さらに詳細には、この方法は、アレイの錯体要素の総数が４，０００〜２５０，０００間となるように錯体要素形状でアレイの同じ位置に固定される多数のオリゴヌクレオチドに基づく。各錯体要素を含むオリゴヌクレオチドの混合物は標識ＲＮＡがアレイに加えられる場合データが得られ、かつ１ｘ１０６および２ｘ１０９の個別の６〜１５のベースオリゴヌクレオチド間の等価物から解釈されるようなものである。
【背景技術】
【０００２】
研究または治療を目的とした遺伝子発現制御手段としてのアンチセンスが最初に報告されたのは１９７０年代であった。以後、アンチセンスの機能の仕方の解明と、効果的なアンチセンス標的をマッピングする方法の開発に多大の努力が払われてきた。
【０００３】
アンチセンスは、標的ｍＲＮＡに対し相補的である短い合成核酸、アンチセンス作用物質を細胞内に導入することで機能する。このアンチセンス作用物質はその標的ｍＲＮＡに結合して、内因性ヌクレアーゼによる分解のためのタギング（ｔａｇｇｉｎｇ）と、転座または翻訳を物理的に阻害する働きの両方を有すると考えられるメカニズムによって翻訳を抑制する。
【０００４】
アンチセンス作用物質のデザインは、ｍＲＮＡが極めて複雑な２次および３次構造を有するため複雑である。いかなるｍＲＮＡもそのヌクレオチド配列の少なくとも９０％はその分子の２次および３次構造内の分子内相互作用に関係しており、そのためアンチセンス作用物質との分子間相互作用に利用することはできない。上手く機能するアンチセンス作用物質のデザインにとって最も重要なことは、分子間ハイブリダイゼーションに使用できる潜在的標的ｍＲＮＡの存在する限られた領域を特定することである。これら利用可能な領域を特異的に標的とするアンチセンス作用物質はインビボで標的ｍＲＮＡに高い確率で結合し、そこにコードされた産物の発現レベルを効果的にノックダウンする。
【０００５】
先行技術にはアンチセンス作用物質を効率的に見つけ出すのに用いることができる様々なインビトロ実験法がある。一般にこれら実験法はオリゴヌクレオチドのライブラリを用いて、ＲＮａｓｅＨによるインビトロＲＮＡ転写体の切断を媒介するか、またはＲＮＡに結合してゲル電気泳動時の標識種の移動を遅延させるか、または別の要素のアレイ上にあるＲＮＡに結合させる方法であり、この時、各要素からの信号が検出され、その位置へ結合できるように関連付けされる。
【０００６】
方法が上手く機能するかは、標的ｍＲＮＡの配列がわかっていること、そして一般に最長２５ヌクレオチドまでの長さが重複するオリゴヌクレオチドのライブラリをデザインすることによっている。オリゴヌクレオチドライブラリにおける標的ｍＲＮＡの配列は、第１オリゴヌクレオチドが標的ｍＲＮＡ上の位置１〜１５に対し相補的であり、第２オリゴヌクレオチドが位置２〜１６に対し相補的となり、第３オリゴヌクレオチドが位置３〜１７に対し相補的になるといった様に表される。
【０００７】
先行技術では、アンチセンス作用物質が標的の配列について事前の情報を必要としない装置を用いデザインできる方法が提案されている。このような装置は、可能性のある配列のあらゆる組合せが４〜８ヌクレオチド単位のオリゴヌクレオチドで提示されているように、ガラスまたはプラスチック製の支持体の上に固定化されたオリゴヌクレオチドのアレイを設けることが提案されている。このタイプの装置は国際特許出願第ＷＯ９８／１５６５１号および米国特許第ＵＳ００６０５４２７０号に開示されている。この特許および特許出願では各オリゴヌクレオチドはアレイ上で物理的に離れていること、および標的ｍＲＮＡのハイブリダイゼーションと未結合物質の洗い流しの後に結合したオリゴヌクレオチドから信号を検出することが提案されている。その配列の存在とアレイ上の物理的に離れた位置を知ることにより、分子間ハイブリダイゼーションに利用可能である標的ｍＲＮＡの配列を推測することができる。推測された配列はアンチセンスの媒介遺伝子のノックダウンにとって有効な標的である可能性が高い。
【０００８】
第ＷＯ９８／１５６５１号および第ＵＳ００６０５４２７０号は共に考え得るあらゆる４〜８塩基の配列の組合せを含むアレイを記載する。この場合、４塩基配列の組合せでは全ての配列組合せを提示するにはアレイ上に２５６の要素が必要である、そして８塩基配列の組合せでは全ての配列組合せを提示するには６５，５３６の要素が必要となり、技術的には可能であるが、このように短い４〜８塩基ヌクレオチドをアレイの基本として使用するには困難が伴う。短い４〜８塩基オリゴヌクレオチドをアレイの基本として使用してＲＮＡ構造をマップし、効果的なアンチセンス標的である領域を特定する場合、アレイ上のオリゴヌクレオチドとそれに対しハイブリダイゼーション条件下で加えられた標識転写体との間の相互作用が極めて弱いという困難が伴う。通常の洗浄条件下では転写体は洗い流され、信号は検出されない。この状態は化学的スペーサを用いて短いオリゴヌクレオチドのアレイ要素とアレイ基材との間に間隔をとることで改善される。塩濃度を上げるか、温度を下げると非特異的バックグランドが増す傾向にあるが、信号は改善されない。特許出願第ＷＯ９８／１５６５１号では、信号がＲＮＡを４塩基オリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションして検出できることが示されている。しかし記載された方法の条件ではオリゴヌクレオチドではなくＲＮＡを固体支持体に固定化すること、およびオリゴヌクレオチドを液体の状態で変性ＲＮＡに適用する必要がある。このような条件では、ＲＮＡが本来それが持つインビボ構造に折りたたまれることは考えにくく、この実施方法は標的アンチセンスに対し好適なＲＮＡ構造様式をマップしない。
【０００９】
従って、アレイは１０ヌクレオチド長より大きなオリゴヌクレオチドのすべての考え得る組合せを含むことが求められることがわかる。各オリゴヌクレオチドがアレイに別々に取付けるとすると、アレイの数は実行不可能なほど大きくなる。ＲＮＡがその天然構造を保持可能な方法でアレイに加えられれば好都合である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
この発明の第１の目的は天然ＤＮＡ  転写をマッピングし、アンチセンス媒介遺伝子ノックダウンに対する有効な標的となる領域を判定する装置を提供することである。
この発明の第２の目的はアレイまたはマイクロアレイのオリゴヌクレオチドの特定の単一の長さまたは複数の長さのすべての考えられる組合せを提示する方法を提供することである。
この発明の第３の目的はアレイの特定要素にオリゴヌクレオチド配列を割当てる方法を提供することである。
この発明のさらに別の目的は錯体要素のアレイの解釈を行ってＲＮＡ構造のマッピングおよびアンチセンス剤のデザインを可能にする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この発明の第１の態様によれば、アレイの少なくとも１つの要素がアレイの全ての位置の要素の配列が知られている状態で支持体に固定される特定配列の多数のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、アレイの特定の単一の長さまたは複数の長さのすべての考えられるオリゴヌクレオチドを含む装置が提供される。
【００１２】
オリゴヌクレオチドはいずれかの天然、合成または修飾ヌクレオチド、またはデオキシヌクレオチドから作成される。
【００１３】
支持体には任意にガラスを選択してもよい。
あるいは、支持体はプラスチック製でもよい。
あるいは、支持体はいずれか適切な材料から作成されてもよい。
オリゴヌクレオチドは各錯体要素内で物理的に間隔をあけないことが好ましい。
すべての考えられる６〜９または１０〜１５の塩基オリゴヌクレオチドがアレイ上に提示されることが好ましい。
【００１４】
アレイはマイクロアレイであることが好ましい。
錯体要素を構成するオリゴヌクレオチドの数が２と１０，０００間であることが好ましい。
アレイ１は９６と１００万の間の物理的に別個の錯体要素を含むことが好ましい。
錯体要素は標準結合法を使用して支持体に固定されることが好ましい。
錯体要素はアミノリンカーを使用して支持体に固定されることが好ましい。
別の任意選択では、錯体要素はビオチン／ストレプタビジン相互作用を使用して支持体に固定される。
オリゴヌクレオチドはそれらの５’末端で固定されることが好ましい。
あるいは、オリゴヌクレオチドはそれらの３’末端で固定されてもよい。
任意選択で、アレイへのオリゴヌクレオチドの固定化のいずれかの適切な方法が使用されてもよい。
オリゴヌクレオチドは固体支持体から間隔をおいて配置されることが好ましい。
オリゴヌクレオチドが６〜４０の間の炭素原子当量の化学スペーサを使用して固体支持体から間隔をおいて配置されることが最も好ましい。
【００１５】
化学スペーサはアレイ上のアンカ群とオリゴヌクレオチド配列の先頭の間に結合されることが最も好ましい。
任意に、オリゴヌクレオチドの特定配列が複数のスペーシングヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を使用してオリゴヌクレオチドの５’または３’末端を延長することによりアレイとの間隔を取ってもよい。
【００１６】
例えば、６つの塩基シーケンス５’ＣＧＧＡＡＣ３’を５’ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＧＧＡＡＣ３’または５’ＣＧＧＡＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ３’とすることによりアレイと間隔をおいて配置してもよい。
任意に、スペーシングヌクレオチドには、いかなる天然または合成ヌクレオチドを使用してもよいし、ヌクレオチド類似体やホモ重合体またはヘテロ重合体も使用可能である。
この文書におけるヌクレオチドとは、デオキシヌクレオチドまたはいかなる修飾ヌクレオチド、あるいはデオキシヌクレオチドをも意味する。
任意に、ひとつのスペーシング方法と別のスペーシング方法を組合せて使用してもよい。
【００１７】
この発明の第２の態様に従って、所定の長さおよび所定配列の特定数のオリゴヌクレオチドを特定濃度で混合するステップを含む第１の態様の装置に取付けるのための錯体要素を生成する方法が提供される。
好適には、個別のオリゴヌクレオチドを等量混合する。
任意に、混合する個別のオリゴヌクレオチドは不等量でもよい。
ひとつの錯体要素を構成する個別のオリゴヌクレオチドは互いに容易にハイブリダイズしないものを選択することが好ましい。
【００１８】
各錯体要素内のオリゴヌクレオチドはそれぞれ、錯体要素における他のどのオリゴヌクレオチドに対しても６０％未満の相補性を有するように選択されることが好ましい。
各錯体要素内のオリゴヌクレオチドはそれぞれ、錯体要素における他のどのオリゴヌクレオチドとも５塩基未満の隣接相補性を有するように選択されることが好ましい。
コンピュータを基本とするアルゴリズムを使用して配列を錯体要素群に割当てることが好ましい。
【００１９】
この発明の第３の態様に従って、前記態様で記載したように、錯体要素アレイを解釈し、適用される天然ＤＮＡの利用可能領域をアレイ上の錯体要素におけるオリゴヌクレオチドに加えた標識ＲＮＡの結合を特定することによりマッピングする方法が提供されるが、このアレイは；
ａ）アレイに付けられた標識ＲＮＡと錯体要素を構成するオリゴヌクレオチドのいずれかとの間に生ずるハイブリダイゼーションによる信号が走査され、
ｂ）前記信号が原錯体要素における既知配列と比較され、かつ
ｃ）要素間の重複が特定されることを特徴とする。
ＲＮＡの標識化は、いずれかの標準手段により実施されることが好ましい。
【００２０】
任意に、ＲＮＡは蛍光により標識化される。
あるいは、ＲＮＡは放射性物質で標識化される。
あるいは、ＲＮＡが標識化されず、錯体要素との相互作用でＲＮＡ依存性酵素活性を使用して相互作用するオリゴヌクレオチドの延長により使用されるＲＮＡとの塩基対合が可能であるそれらのオリゴヌクレオチドの遊離３’末端に標識を組込むこともできる。
【００２１】
ＲＮＡ依存性酵素活性は逆転写酵素活性であることが好ましく、適切な酵素は、例えばＡＭＶ逆転写酵素またはＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素である。ＲＮａｓｅＨ  活性が欠如している人工逆転写酵素も使用可能であり、例えばＲｏｃｈｅ社からＥｘｐａｎｄ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（エキスパンド逆転写酵素）が市販されている。
【００２２】
信号は、蛍光発光、蛍光体イメージングまたはオートラジオグラフィにより検出されることが好ましい。
この発明は検出の手段により制限されるものではない。
信号を発する各錯体要素内の配列を比較することにより、連続する利用可能な配列を推測する重複パターンが得られる。
標的配列がただひとつ、または多数の不整合により発生する錯体要素を精査するための対策が取られることが好ましい。
１次錯体要素からの信号を不整合錯体要素からの信号と比較することにより結合の反応速度が示されることが好ましい。
【００２３】
同一錯体要素内の多数の非重複配列への結合が発生する場合には、信号の振幅がより高くなるので、検査することが好ましい。
任意選択で、１個または少量のオリゴヌクレオチド４に結合される標識転写体（２０％未満の錯体要素混合物を含む）からの信号６は増幅される。
最適には、増幅は転写体に２段階抗体結合による間接標識化により行なうことが好ましい。
【００２４】
上記態様のすべてにおいて、転写されてアレイ上に付けられるＲＮＡは、未変性のままで全長または部分的ｃＤＮＡクローンから試験管内に転写されることが好ましい。
新生ＲＮＡは、常に未変性条件下で維持されることが最も好ましい。
【００２５】
次に、この発明のより明確な理解のため、添付図面を参照して、例示のみの意味において本発明の実施例説明を行う。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明はアンチセンス研究ツールとそれに付随するｍＲＮＡまたはその他の生体内転写体に対する治療を対象に使用される試験管内転写体における天然ＤＮＡ内の利用可能位置を特定する問題を対象とする。方法はいかなる天然ＤＮＡの利用可能な領域をもマッピングするツールの要件に対応する。解決の鍵は、それがガラス、プラスチックまたはその他の適切な材料５の支持体上に固定された長さ６〜１６塩基、最適には１０〜１６塩基の間のオリゴヌクレオチド４の組合せライブラリを使用する非分子特定アンチセンス−デザインツールであることである。支持体５は一般的アレイまたはマイクロアレイでよい。各錯体要素２は物理的に間隔を置かないＮ個の個別オリゴヌクレオチド４を含む。この場合、Ｎは２〜１０、０００の間である。アレイ１自体は９６と１００万の間の個別の錯体要素２を含む。
【００２７】
本発明の第１の態様によれば、図１に示すように、考え得るすべての６〜９塩基および１０〜１５塩基のオリゴヌクレオチド４を含む多重化アレイ１が設けられる。アレイ１の各錯体要素２は支持体５に対して固定されるが、各要素４内で物理的に間隔をあけない特定配列の多数のオリゴヌクレオチド４を含む。アレイ１全体は多数の錯体要素２を含み、それらが特定の長さのオリゴヌクレオチド配列４の考え得るすべての組合せを提示する。
【００２８】
この発明の第２の態様によれば、図２に示すように、錯体要素２は第１の態様とともに使用するため作成される。各錯体要素２を作成するため、所定の長さおよび配列のＮ個の個別オリゴヌクレオチド４が等量で混合される（混合物で使用される不均等量のオリゴヌクレオチド４に対して異なる予測ハイブリダイゼーション反応速度を補うことは可能であるが）。次に、錯体要素２は支持体５に付けられるが、それらはアミノリンカーまたはビオチン／ストレプタビジン相互作用などの標準的な方法、あるいは他の適切な方法により固定される。オリゴヌクレオチド４の固定位置はそれらの５’または３’末端のいずれでもよい。
【００２９】
提案されるような短いオリゴヌクレオチド４の場合、オリゴヌクレオチド４を固体支持体５から間隔をおいて配置すると、標識ＲＮＡが検出される場合に発する信号６の強度が増大する。これによって、個別オリゴヌクレオチド４は、支持体５のアンカ群とオリゴヌクレオチド４配列の先頭間に結合された６〜４０炭素原子当量間の化学スペーサにより支持体５から間隔をおいて配置される。
【００３０】
この発明の第３の態様によれば、それらが互いに容易にハイブリダイズされず、紛らわしい結果を生じるほど類似しない個別オリゴヌクレオチドが各錯体要素２内から選択される。
各錯体要素２内で、オリゴヌクレオチド４は、５塩基未満の隣接相補性を持ち互いに６０％未満の相補性を有するように配置される。
【００３１】
この発明の第４の態様によれば、錯体要素アレイ１を解明し適用した天然ＤＮＡの利用可能領域をマッピングすることが可能である。錯体要素２からの信号６は、アレイ１に適用された標識ＲＮＡと、その錯体要素２を構成するＮ個のオリゴヌクレオチド４のいずれか、間のハイブリダイゼーションにより生ずることがある。従って、ｍＲＮＡ−Ｎ個の利用可能領域を特定する解決の鍵は、錯体要素２のいずれのオリゴヌクレオチドが適用した標識ＲＮＡに結合しているかを判定することである。
【００３２】
標的ＲＮＡのコピーは、新生ＲＮＡがその生体内構造の認証例に折りたためる状態で、全長または部分的ｃＤＮＡクローンから試験管内に転写される。標的ＲＮＡには、転写の間に標識ヌクレオチドに組込まれ標識化される。一旦合成されると、標的ＲＮＡはその第２次および第３次構造が保たれる条件下で維持される。
【００３３】
次に、標的ＲＮＡがアレイ１に適用されアニールしていずれかの相補オリゴヌクレオチド４にすることが可能になる。次に、未結合ＤＮＡが全て洗い流される。従って、錯体要素アレイ１を解釈するため、図３に示すように、アレイ１が信号に対して精査され、その後信号が原錯体要素２における公知の配列と比較され要素間の重複が特定される。例えば、シーケンスＣＧＧＡＡＴＧＣＴＧＣＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＣＧＡＧＴＡＴＧに対して相補ｍＲＮＡ内の利用可能領域は次の１０塩基オリゴヌクレオチド配列
１．ＣＧＧＡＡＴＧＣＴＧ
２．ＧＧＡＡＴＧＣＴＧＣ
３．ＧＡＡＴＧＣＴＧＣＣ
４．ＡＡＴＧＣＴＧＣＣＡ
５．ＡＴＧＣＴＧＣＣＡＡ
のすべてをハイブリダイズする。
【００３４】
信号を発する各錯体要素２内の配列を比較することにより、重複パターンが浮かび上がり、かつ連続する利用可能配列が推測される。標的配列がただひとつ、または多数の不整合により発生する錯体要素を精査するための対策も取られる。１次錯体要素からの信号を不整合錯体要素からの信号と比較することにより結合の反応速度が示され、かつｍＲＮＡの特定の利用可能領域がアンチセンス媒介遺伝子ノックダウンに用いる良好な標的となる可能性を判定するのに役立つ。
【００３５】
同一錯体要素内の広い利用可能領域内に、２つの非重複シーケンスが発生することもありうる。例えば、ＣＧＧＡＡＴＧＣＴＧおよびＧＣＴＴＣＴＣＧＡＧがいずれもシーケンスＣＧＧＡＡＴＧＣＴＧＣＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＣＧＡＧＴＡＴＧに発生する。このような場合では、信号６の振幅は単一ヒット錯体要素からの信号振幅より大きい。上記に挙げた実施例の他に、同一ｍＲＮＡ内の複数の重複利用可能領域が同一錯体要素２内のオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズすることができる。
【００３６】
錯体要素２から得られる信号６の強度は固体支持体５に固定される個別ハイブリダイズオリゴヌクレオチド４の総量にかなり依存する。高強度信号６を得るためには、固体支持体５はオリゴヌクレオチド４に対する高い結合親和力を有する必要があり、これは現行結合技術の限界でもある。この場合、信号６は錯体要素２混合物の２０％を含むハイブリダイズオリゴヌクレオチド４から容易に検出される。ただし、２０％未満の錯体要素混合物２を含む単一または少量のオリゴヌクレオチド４に結合される標識転写体からの信号６を増幅することは可能である。このような増幅は２段階抗体結合またはその類似結合により転写体の間接標識化により行われる。
【００３７】
ｍＲＮＡに関するアンチセンス標的をマッピングするため、標的ＲＮＡがその生体内構造の認証例に折りたためることがきわめて重要である。従って、この発明は転写されてアレイ１に適用されるＲＮＡが未変性条件下で全長または部分的ｃＤＮＡクローンから試験管内に転写されること、および新生ＲＮＡが常に未変性条件下で維持されることを含む。
【００３８】
上記に開示した実施形態は本発明の単なる模範であり、本発明は他にさまざまな形態での実施も可能である。例えば、検出は要素のＲＴ標化により行なわれるか、あるいは、検出はＦＲＥＴを使用することもできる。従って、本明細書において開示される詳細は制限を受けるものとして解釈されるべきものでなく、特許請求の範囲に用いる根拠として、そして他の適切な方法による本発明の様々な用途に関して当業者に教示するためと解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明によるアレイの斜視図である。
【図２】本発明による錯体要素の線図である。
【図３】本発明によるアレイを使用した場合に得られる結果の概略図である。
【国際公開パンフレット】
2004531708.tif 000002
2004531708.tif 000003
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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