(57)【要約】【課題】口蹄疫ウイルスの中空カプシドの有効量を抗原として用いた口蹄疫に対するワクチン。【解決手段】中空カプシドはカプシドをコードする口蹄疫ウイルスのゲノムのＰ１領域のｃＤＮＡと、３Ｃプロテアーゼをコードする口蹄疫ウイルスのゲノム領域のｃＤＮＡとを真核細胞内で発現させることによって得られる。ワクチンは獣医学的用途に適したキャリアまたは賦形剤をさらに含む。さらに、ＶＰ２配列への突然変異の挿入（システイン導入）によって中空カプシドとその結果生じるウイルスを安定化させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
口蹄疫ウイルスの中空カプシドの有効量を抗原として用いた口蹄疫に対するワクチンであって、上記中空カプシドはカプシドをコードする口蹄疫ウイルスのゲノムのＰ１領域のｃＤＮＡと、３Ｃプロテアーゼをコードする口蹄疫ウイルスのゲノム領域のｃＤＮＡとを真核細胞内で発現させることによって得られ、さらに、獣医学的用途に適したキャリアまたは賦形剤を含むワクチン。
【請求項２】
Ｐ１をコードするｃＤＮＡが２Ａの全部または一部をさらにコードする請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
３ＣをコードするｃＤＮＡがさらにタンパク３Ｂの全部または一部もコードする請求項１または２に記載のワクチン。
【請求項４】
中空カプシドがワクチン中にサブユニットとして十分な量で存在する請求項１〜３のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項５】
サブユニット形の中空カプシドが、ウイルス起源の誘発性プロモータまたは後期プロモータの制御下でインビトロ発現ベクターによって真核細胞内でｃＤＮＡを発現させて得られる請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
プロモータがＴ７バクテリオファージプロモータ、熱ショックプロモータ、メタロチオネインプロモータおよびエクジソンまたはステロイドによって誘発できるプロモータの中から選択される請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
プロモータがＴ７バクテリオファージプロモータであり、サブユニット形の中空カプシドがＴ７ポリメラーゼの発現の存在下でｃＤＮＡを発現させて得られる請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
発現ベクターがウイルス性ベクター、好ましくはポックスウイルス、特にワクシニアウイルスおよびプラスミドベクターの中から選択されるか、発現カセットが真核細胞内に組み込まれる請求項５〜７のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項９】
ベクターがポックスウイルスであり、ウイルス起源の後期プロモータがワクシニアウイルスのＰ１１Ｋ、ワクシニアウイルスのＰ２８Ｋおよび牛痘ウイルスのＰ１６０ＫＡＴＩの中から選択される請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
真核細胞がＢＨＫ−２１、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＲＫ１３、Ｖｅｒｏ、ＭＤＢＫまたはＰＫ１５細胞株である請求項４〜９のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１１】
中空カプシドを保存する培地、特にＤＭＥＭタイプの培地で作られた請求項４〜１０のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１２】
アジュバントをさらに含む請求項４〜１１のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１３】
アジュバントとして水酸化アルミニウム、サポニン、アブリジン、ＤＤＡ、アクリルまたはメタクリル酸のポリマー、無水マレイン酸とアルケニル誘導体のポリマーＧＭ−ＣＳＦを含むか、油中水、水中油または水中油中水エマルションの形をした請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１４】
インビボでカプシドを製造するためにｃＤＮＡを含む発現ベクターを含む請求項１〜３のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１５】
ベクターがウイルス性ベクターまたはプラスミドベクターである請求項１４に記載のワクチン。
【請求項１６】
ウイルス性ベクターがポックスウイルス、特にワクシニアウイルス、鶏痘およびカナリア痘等のアビポックス、アライグマ痘、豚痘、カプリポックス、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスの中から選択される請求項１５に記載のワクチン。
【請求項１７】
ｃＤＮＡがウイルス起源の後期プロモータの制御下でウイルス性ベクターによって発現する請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１８】
ベクターがポックスウイルスで、ウイルス起源の後期プロモータがワクシニアウイルスのＰ１１Ｋ、ワクシニアウイルスのＰ２８Ｋおよび牛痘ウイルスのＰ１６０ＫＡＴＩの中から選択される請求項１７に記載のワクチン。
【請求項１９】
ｃＤＮＡが、ウイルス起源または細胞起源の強い早期プロモータ、好ましくはサイトメガロウィルス早期プロモータＣＭＶ−ＩＥの制御下でプラスミドベクターによって発現する請求項１７に記載のワクチン。
【請求項２０】
ｃＤＮＡが、ＳＶ４０ウイルスの早期または後期プロモータ、ロウスサルコマ（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ）ウイルスのＬＴＲプロモータ、デスミンプロモータまたはアクチンプロモータのようなサイトスケルトン遺伝子のプロモータの中から選択されたプロモータの制御下でプラスミドベクターによって発現する請求項１９に記載のワクチン。
【請求項２１】
燐酸緩衝液１０００重量部当たりＮａＣｌ生理食塩水９重量部を用いて作られる請求項１４〜２０のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２２】
ワクチンがアジュバントを含む請求項１４〜２０のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２３】
ワクチンがウイルス性ベクターを含み、アジュバントが下記式の第四アンモニウム塩を含む請求項２２に記載のワクチン：
【式１】2004501874.tif 000050
（ここで、
Ｒ１は１２〜１８の炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖脂肪族基を表し、
Ｒ２は２〜３の炭素原子を有する他の脂肪族基を表し、
Ｘはヒドロキシルまたはアミン基である）
【請求項２４】
アジュバントがＤＭＲＩＥ、好ましくは中性脂質、特にＤＯＰＥと組み合わされてＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥの形にしたものを含む請求項２３に記載のワクチン。
【請求項２５】
ワクチンがプラスミドベクターを含み、アジュバントがアクリルまたはメタクリル酸のポリマーまたは無水マレイン酸とアルケニル誘導体のポリマーを含む請求項２２に記載のワクチン。
【請求項２６】
アジュバントがカルボマーを含む請求項１３または２３に記載のワクチン。
【請求項２７】
アジュバントがＧＭ−ＣＳＦを含む請求項２２に記載のワクチン。
【請求項２８】
インビボでＧＭ−ＣＳＦを発現するベクターを含む請求項２２に記載のワクチン。
【請求項２９】
中空カプシドが熱的に安定化された請求項１〜２８のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項３０】
中空カプシドが自然でないジスルフィド架橋を含む請求項２９に記載のワクチン。
【請求項３１】
ｃＤＮＡが、システインをコードするコドンを組み込んで修飾した、ＶＰ２、ＶＰ０またはＰ１をコードする配列を含む請求項２９または３０に記載のワクチン。
【請求項３２】
アミノ酸１７９をコードするコドンをシステインをコードするコドンに代える請求項３１に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の技術分野】
本発明は口蹄疫（ｆｉｅｖｒｅ ａｐｈｔｅｕｓｅ）に対するワクチン、特に熱的な安定性が改良されたワクチンに関するものである。
本発明はさらに、このワクチンの製造方法と、このワクチン製造での抗原の利用と、このワクチンを用いた予防接種法とに関するものである。
本発明は特に、ウイルスの自然な配列と比べて修飾された、ヌクレオチド配列、特にｃＤＮＡおよびアミノ酸配列に関するものである。
本発明はさらに、修飾されたヌクレオチド配列の発現産物と、これらの修飾を組み込んだ口蹄疫抗原およびウイルスとに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
口蹄疫は飼育動物が発症する最も毒性および伝染性の高い病気の１つである。この病気は世界中の多くの国、特にアフリカ、アジアおよび南アメリカの風土病であり、時々、大流行する病気である。この病気が発生した国は、感染群の生産性、重量および乳生産の低下および外国との通商停止によって経済的に極めて深刻な結果に陥ることになる。この病気に対する対策は厳しい輸入規制、衛生管理および検疫の実施、罹患動物の屠殺であり、大流行時には国または地域レベルまたは病気の周辺区域での予防手段としての不活化ワクチンを用いた予防接種プログラムの実施である。
【０００３】
この病気は潜伏期間が短く、感染力が強く、口および足に潰瘍ができ、幼若動物は死ぬこともあるのが特徴である。口蹄疫は多くの動物種、特にウシ、ブタ、ヒツジおよびヤギで発症する。この病気の原因となる物質はアフタウイルス属ピコルナウイルス科（Ｃｏｏｐｅｒ達、Ｉｎｔｅｒｖｉｏｌｏｇｙ、１９７８、１０、１６５−１８０）に属するリボ核酸（ＲＮＡ）ウイルスである。口蹄疫ウイルスは英語の略語でＦＭＤＶ（ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）ともよばれる。現在、７種の口蹄疫ウイルスすなわちヨーロッパ型（Ａ、ＯおよびＣ）、アフリカ型（ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、ＳＡＴ３）およびアジア型（Ａｓｉａ １）が知られている。さらに、多くの亜型が識別されている（Ｋｌｅｉｄ達、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８１、２１４、１１２５−１１２９）。
このウイルスは約８５００のヌクレオチドからなる正の極性を有する一本鎖ＲＮＡ分子を含む直径が２５ｎｍの裸の正二十面体である。このＲＮＡ分子はタンパクＰ１またはＰ８８として知られるカプシド前駆体を含む単一のポリタンパクをコードする単一の転写解読枠（ＯＲＦ）からなる。このタンパクＰ１のアミノ末端はミリスチル化されている。
【０００４】
タンパクＰ１は成熟過程でプロテアーゼ３ＣによってＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ３（または１ＡＢ、１Ｄ、１Ｃ）として知られる３つのタンパクに分れる（Ｂｅｌｓｈａｍ Ｇ．Ｊ．， 生物物理学および分子生物学の進歩、１９９３、６０、２４１−２６１）。タンパクＶＰ０はビリオンで２つのタンパクＶＰ４およびＶＰ２（または１Ａおよび１Ｂ）に分裂する。タンパクＶＰ０のＶＰ１およびＶＰ３への変換機構および成熟したビリオンの形成機構は知られていない。タンパクＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３は分子量が約２６，０００Ｄａであるが、タンパクＶＰ４の分子量は小さく、約８，０００である。
【０００５】
カプシドタンパクの単純な会合によってプロモータまたは５Ｓ分子が形成される。このプロモータが口蹄疫ウイルスカプシドの基本成分である。このプロモータが複合して五量体になって１２Ｓ分子を形成する。上記ビリオンは１２個の１２Ｓ五量体の会合による１４６Ｓ粒子によってゲノムのＲＮＡ分子をカプシド化して得られる。  ウイルス性カプシドは内部にＲＮＡ分子が存在しない状態で形成されることもある。この場合のカプシドは中空である。この中空カプシドは７０Ｓ粒子ともよばれる。中空カプシドの形成はウイルス複製中に自然に起きることもあれば、化学処理によって人工的に製造することもできる。
【０００６】
口蹄疫に対するワクチンは一般に多価ワクチンにして効果を上げる必要がある。このワクチンの組成はその地域での優占型が変わったらすぐに新しいものに代える必要がある。さらに、この病気が動物集団で急速に広がるのを防ぐためには免疫が速く誘導され、感染防御性が高いワクチンであるのが望ましい。
口蹄疫に対する有効なワクチンを開発するために多くの仮説、研究法および提案が出されてきたが、現在、市場に出ているワクチンは不活化ウイルスのみである。
化学的不活化処理はウイルスの免疫抗原性を低下させ、中和抗体を生成させることがある。所定の投与量に免疫応答を刺激するためのアジュバントを添加しなければならないことが多いが、アジュバントの組成によっては炎症反応を誘発することがある。不活化ワクチンは長期の免疫を与えるものではないので、ブースター接種は毎年行わなければならず、問題が起きたとき、特に大流行したときにはより頻繁に行わなければならない。さらに、不完全な不活化の危険および／または不活化ワクチン製造中にウイルスが逃げる危険もある（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９８１， Ｎａｔｕｒｅ， ２９３， ４７９−４８０）。
サブユニットワクチンおよび組換えベクターの製造を可能にする遺伝子工学の技術が開発されてはいるが、多くの試みにもかかわらず、これまでに市場に出たものはない。
【０００７】
本研究より前に自然の中空カプシドに関する研究がされている。Ｒｏｗｌａｎｄｓ達（Ｒｏｗｌａｎｄｓｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９７５、２６、２２７−２３８）はＡ１０口蹄疫のビリオンは主として４つのタンパクＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４を含むことを開示している。これに対して、自然の中空カプシド（組換えで得られたものではなくＡ１０口蹄疫ウイルスの培地から精製したもの）は基本的に分割されていないタンパクＶＰ０を含む。同一の結果はＡ−Ｐａｎｄｏ口蹄疫ウイルスを用いてＲｗｅｙｅｍａｍｕ（Ｒｗｅｙｅｍａｍｕ ａｌ．， Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９７９、５９、６９−７９）によって示されている。Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ存在下での透析後に遠心分離して得た人工的な中空カプシドはタンパクＶＰ４を全く含まない。Ｒｏｗｌａｎｄｓ達によればこれらの人工カプシドは免疫原性が低く、自然の中空カプシドはホルムアルデヒド処理によって安定化した後にした免疫原性を示さず、著者が述べているように、モルモットで自然中空カプシドにより誘発される抗体応答は不安定である。天然の中空カプシドの安定化の必要性に関してはＲｏｗｌａｎｄｓ達とＲｗｅｙｅｍａｍｕ達で意見が一致していない。Ｒｗｅｙｅｍａｍｕ達の場合、ホルムアルデヒド処理は天然の中空カプシドの抗原性レベルに影響を与えない。免疫原性はモルモットでの中和抗体の誘発だけでテストされただけである。
【０００８】
多くの研究者は中空カプシドに関する上記の考えに賛同しておらず、反対する者もいる。例えばＤｏｅｌ Ｔ．Ｒ．とＣｈｏｎｇ Ｗ．Ｋ．Ｔ． 達（Ｄｏｅｌ Ｔ．Ｒ． ａｌ．， Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９８２、７３、１８５−１９１）は、中空カプシドは亜型Ａ２４の口蹄疫ビリオンよりも安定していないので免疫原性が低いという結論を実験結果から出している。
【０００９】
昆虫の細胞内での組換えバキュロウイルスによるカプシドタンパクの前駆体Ｐ１をコードする遺伝子の発現と、Ｅ．ｃｏｌｉ内での３Ｃプロテアーゼと組み合わされたＰ１をコードする遺伝子の発現とが比較されている（Ｇｒｕｂｍａｎ達、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９３，１１，８２５−８２９、Ｌｅｗｉｓ達、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９１，６５，６５７２−６５８０）。Ｅ．ｃｏｌｉ内でのＰ１と３Ｃの共発現によって中空カプシド７０Ｓの集合が起こる。これら２つの構築物の発現産物によってモルモットおよびブタで中和抗体が生じる。Ｐ１／バキュロウイルス構築物で得られた抗体価は低い。これと同じ発現産物はブタで部分的な保護を誘発する。しかし、この病気から保護されたブタの中には攻撃ウイルスの複製から保護されないものもいる。
上記著者はさらに、Ｅ．ｃｏｌｉ．発現系がこれらのタンパクをミリスチル化せず、プロテアーゼ３Ｃはこの細胞に対して有毒であることを確認している。Ｌｅｗｉｓ達の結論は、ウイルスの構造および動物を最大限に保護するのに必要なカプシドの構造に関する基本的な問題には答えが出ていないというものである。さらに、Ｇｒｕｂｍａｎ達はワクチン製剤前に中空カプシドを安定化する必要があることを確認しており、さらに、ウイルス性培地から抽出して得た中空カプシドを用いた場合の問題点に関しても認めている（上記参照）。
【００１０】
口蹄疫の中空カプシドＡ１０、Ａ２４、Ｏ１Ｋを得るためにワクシニアウイルスからなる発現系も用いられている（Ａｂｒａｍｓ達、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９５、７６、３０８９−３０９８）。各亜型ごとに２つの主構築物が作られている。これらはワクシニアウイルスの早期／後期ｐ７．５ＫプロモータまたはバクテリオファージＴ７プロモータの制御下で前駆体Ｐ１およびプロテアーゼ３Ｃをコードするヌクレオチド配列の断片を含んでいる。ヒト細胞培地での組換えとインビトロ発現の実験のみが行われている。ｐ７．５Ｋプロモータを含む構築物によって形質転換された細胞培地では組換えワクシニアウイルスを単離できなかった。その理由は不明である。プロモータＴ７を含む構築物によって形質転換された細胞培地では組換えワクシニアウイルスベクターを得ることができ、ウイルス性タンパクＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ３を発現し、さらに中空カプシドを得ることができている。これらの実験は口蹄疫ウイルスの形態研究のためであって、ワクチンの作成および効果の評価を対象とするものではない。
【００１１】
Ｃｈｉｎｓａｎｇａｒａｍ達はｈＣＭＶ−ＩＥプロモータに依存するＰ１−２Ａと３Ｃとをコードするカセットを含むプラスミドを試験している（Ｃｈｉｎｓａｎｇａｒａｍ達、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９８，７２（５）、４４５４−４４５７）。これらのプラスミドをブタに接種して中和抗体を誘発しているが、ブタのグループによっては２回の接種では保護免疫ができなかったり、４回の接種後に保護免疫ができたものがある。この著者はサイトカインの共発現により誘発される免疫応答を改良するのが好ましいという結論を出している。
【００１２】
上記のアプローチはワクチン製造を目指すものではないが、口蹄疫ウイルスのタンパクＶＰ１を単独で使用するか、融合すなわち合成ペプチドとしての使用しようとした著者もいる。
Ｅ．ｃｏｌｉ．のトリプトファンオペロンのタンパクＬＥと、口蹄疫ウイルスのタンパクＶＰ１の断片（モノマー形態におけるアミノ酸１３１−１５７）とからなる融合タンパクを用いた研究をブタで行い（Ｍｏｒｇａｎ達、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．，１９９０、５１、４０−４５）、その結果とＡ１２口蹄疫から構築した同様の融合タンパク（タンデム型でアミノ酸１３７−１６８）を用いて得られた結果とが比較されている。Ｇｉａｖｅｄｏｎｉ達（Ｇｉａｖｅｄｏｎｉ達、Ｊ．，Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９１，７２，９６７−９７１）は口蹄疫ウイルスＯ１のタンパクＶＰ１のＣ末端領域の断片を有する融合タンパクＴｒｐＥについて記載している。Ｈｕａｎｇ達はβガラクトシダーゼと、口蹄疫ウイルスＯのＶＰ１配列の２つのタンデム反復とを含む組換え融合タンパクについて記載している（Ｈｕａｎｇ達、Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９，１２（１），１−８）。
【００１３】
タンパクＶＰ１の一部または全部を含む融合タンパクはウイルス性ベクターすなわちヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルスを使用することも得られる。下記文献にはウシヘルペスウイルスの糖タンパクｇｐＩＩＩと融合した口蹄疫ウイルスのペプチド配列を含む融合タンパク（ＶＰ１のアミノ酸２００〜２１３と結合したＶＰ１のアミノ酸１４１〜１５８）を作るのに用いたウシヘルペスが記載されている。
【特許文献１】カナダ国特許出願第２，０４７，５８５号
【００１４】
さらに、タンパクＶＰ１の免疫原性領域（この領域に関してはＳｔｒｏｈｍａｉｅｒ達、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９８２，５９，２９５−３０６を参照）をベースにした合成ペプチドを含むワクチンが開発され、試験されている。
Ａｇｔｅｒｂｅｒｇ達（Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９０、８、４３８−４４０）は、形質転換したＥ．ｃｏｌｉ．バクテリア中で、口蹄疫Ａ１２のタンパクＶＰ１の２つの免疫原性決定基（領域１４１−１５３および２００−２０７）と、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２の膜タンパクとを含む融合タンパクを製造し、この融合タンパク１００μｇを筋肉内経路でモルモットに投与している。その結果、相同抗原投与後に検出可能なレベルで中和抗体および保護が示されている。
下記文献には（口蹄疫ウイルスＡ１２のＶＰ１の領域１３４−１６８に対応する）Ａ、ＯまたはＡｓｉａ型の口蹄疫ウイルスのＶＰ１の抗原部位の共通配列に対応する合成ペプチドが記載されている。
【００１５】
【特許文献２】国際特許出願第９９／６６９５４号
下記文献には口蹄疫ウイルスタンパクの部分配列に対応する少なくとも８個のアミノ酸を含む合成ペプチドが記載されている。
【特許文献３】国際特許出願第９８／１２３３３号
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、口蹄疫に対する有効かつ確実なワクチンを提供することにある。
本発明の他の目的は、口蹄疫に対する安全なワクチンを提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、低用量で効果のある抗口蹄疫ワクチンを提供することにある。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明の対象は、口蹄疫ウイルスの中空カプシドの有効量を抗原として用いた口蹄疫に対するワクチンにある。この中空カプシドはカプシドをコードする口蹄疫ウイルスのゲノムのＰ１領域の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）と、３Ｃプロテアーゼをコードする口蹄疫ウイルスのゲノム領域のｃＤＮＡとを真核細胞内で発現させることによって得られる。本発明ワクチンは獣医学的用途として医薬上許容されるキャリアまたは賦形剤をさらに含む。定義上、機能Ｌタンパクは発現されないので、構築物はＬをコードするｃＤＮＡを含まず、好ましくはＬの全部または一部をコードするｃＤＮＡは全く含まない。
【００１８】
好ましくはＰ１と少なくとも２Ａの一部、好ましくは２Ａの全部とを発現する。この発現には２Ａを超える領域が含まれていてもよく、例えば実施例に示すように２Ｂの一部を含んでいてもよい。
３Ｃと３Ｂタンパクの一部、例えば２つの隣接した３Ｂタンパクと、例えば実施例のように３Ｄの無機能性部分とを発現するのが好ましい。
［図３］（配列番号３８、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ３８）は口蹄疫ウイルスのＡ１０株のＰ１（アミノ酸２−７３７）、２Ａ（アミノ酸７３８−７５３）、３Ｃ（アミノ酸９１３−１１２６）のヌクレオチド配列と対応するアミノ酸配列とを示している。他タイプおよび亜型の配列は実施例に示すようにＧｅｎｂａｎｋから入手できる。
【００１９】
本発明の第１実施例では、中空カプシドがワクチン中にサブユニットとして十分な量で存在する。このサブユニットは１つのプロモータ、好ましくは同じプロモータに依存する領域Ｐ１および３ＣのｃＤＮＡを発現させて得るのが好ましい。このプロモータはウイルス起源の誘発性プロモータまたは後期プロモータにするのが好ましい。
使用可能な発現ベクターはウイルス性ベクター、好ましくはポックスウイルス、特にワクシニアウイルスまたはアデノウイルスのウイルス、ヘルペスウイルスおよびプラスミドベクターからなる。これらの発現ベクターは一次真核細胞または細胞株内で中空カプシドを確実にインビトロ発現させるのに用いられる。変形例では、発現カセットを真核細胞内に組み込むために組込みベクターを用いる。使用可能な真核細胞は細胞株からの細胞、例えばＢＨＫ−２１、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＲＫ１３、Ｖｅｒｏ、ＭＤＢＫ、ＰＫ１５細胞であるのが好ましい。
【００２０】
誘発性プロモータとしてはＴ７バクテリオファージプロモータ、熱ショックプロモータ、メタロチオネインプロモータおよびエクジソンまたはステロイドによって誘発できるプロモータを挙げることができる。Ｔ７バクテリオファージプロモータを用いると、バクテリオファージＴ７のポリメラーゼと中空カプシドとが共発現する。
ベクターとしてポックスウイルスを用いた場合のウイルス起源の後期プロモータとしてはワクシニアウイルスのＰ１１Ｋ、ワクシニアウイルスのＰ２８Ｋおよび牛痘ウイルスのＰ１６０Ｋ ＡＴＩを挙げることができる。
サブユニットは凍結または凍結乾燥させて保存するのが好ましい。
投与量は０．３〜３０μｇ、特に０．５〜２０μｇ、好ましくは１〜１０μｇ、さらに好ましくは１〜５μｇにすることができる。一回の投与容積は０．２〜５ｍｌ、好ましくは１〜３ｍｌにすることができる。
【００２１】
サブユニットワクチンの摂取培地（賦形剤、キャリア）は中空カプシドを保存することができる培地、例えばＤＭＥＭ型培地にするのが好ましい。
サブユニットワクチンは非経口投与、好ましくは皮下投与または筋肉内投与、特に無針注射装置（加圧流）を用いて皮内投与することができる。
当業者は各予防接種プログラムごとに用いる各ワクチンの接種回数および投与量を正確に規定するのに必要な能力を有している。
本発明ワクチンは一つまたは複数のアジュバントを含むのが好ましい。
本発明のサブユニットワクチン用のアジュバントとしては（１）水酸化アルミニウム、サポニン（例えばＱｕｉｌＡ）、アブリジン、ＤＤＡ、（２）アクリルまたはメタクリル酸のポリマー、無水マレイン酸とアルケニル誘導体のポリマーを用いることができ、あるいは（３）油中水、水中油または水中油中水エマルションの形の製剤にすることができる。
【００２２】
エマルションとしては特に（欧州薬局方型の）軽流動パラフィン油、スクアランまたはスクアレン等のイソプレノイド油、アルケン、特にイソブテンまたはデセンのオリゴマー化によって得られるオイル、直鎖アルキル基を有する酸またはアルコールのエステル、特に植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ（カプリル酸／カプリン酸）グリセロール、トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセロール、ジオレイン酸プロピレングリコール、分岐鎖を有する脂肪酸またはアルコールのエステル、特にイソステアリン酸のエステルをベースにしたものを挙げることができる。エマルションを形成するのに乳化剤と一緒に油を用いることができる。乳化剤は非イオン系界面活性剤、特にポリオキシエチレン化脂肪酸（例えば、オレイン酸）、ソルビタン、マンニッド（例えば、オレイン酸無水マンニトール）、グリセロール、ポリグリセロール、プロピレングリコールのエステル、必要に応じてさらにエトキシ化オレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸、ヒドロキシステアリン酸のエステル、脂肪アルコールおよびポリオール（例えばオレインアルコール）のエーテル、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマー、特にプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、登録商標）、特にＬ１２１（Ｈｕｎｔｅｒ達、１９９５年、「アジュバントの理論および実用」参照（Ｅｄ．Ｓｔｅｗａｒｄ−Ｔｕｌｌ，Ｄ．Ｅ．Ｓ）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、ＮＹ、５１−９４；Ｔｏｄｄ達、Ｖａｃｃｉｎｅ，１９９７、１５、５６４−５７０）にするのが好ましい。
【００２３】
アクリルまたはメタクリル酸のポリマーは糖または多価アルコールのポリアルケニルエーテルによって架橋できる。これらの化合物はカルボマーという名前で知られている（Ｐｈａｒｍｅｕｒｏｐａ ｖｏｌ．８、ｎ。２、６月、１９９６年）。当業者はさらに下記文献を参照することもできる。この特許の内容は本明細書の一部を成す。
【００２４】
【特許文献４】米国特許出願２，９０９，４６２号
この文献には、少なくとも３個、好ましくは８個以下のヒドロキシル基を有するポリヒドロキシル化合物によって架橋された上記の種のアクリルポリマーであって、少なくとも３個のヒドロキシル基の水素原子が少なくとも２個の炭素原子を有する不飽和脂肪ラジカルで置換されたポリマーが記載されている。好ましいラジカルは２〜４個の炭素原子を含むラジカル、例えばビニル、アリル等の不飽和エチレン基である。不飽和ラジカルはそれ自身でメチル等の他の置換基を含むことができる。商品名カルボポル（Ｃａｒｂｏｐｏｌ、登録商標）（ＢＦ Ｇｏｏｄｒｉｃｈ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）で市販の製品が特に適している。これらはアリルサッカロースまたはアリルペンタエリトリトールによって架橋される。その中でも、カルボポル（Ｃａｒｂｏｐｏｌ、登録商標）９７４Ｐ、９３４Ｐおよび９７１Ｐを挙げることができる。
【００２５】
無水マレイン酸とアルケニル誘導体とのコポリマーの中で好ましいコポリマーは直鎖または例えばジビニルエーテルで架橋された、無水マレイン酸とエチレンとのコポリマーであるＥＭＡ（登録商標）（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）である。このコポリマーに関してはＪ．Ｆｉｅｌｄｓ達、Ｎａｔｕｒｅ、１８６：７７８−７８０、１９６０年６月４日（この文献の内容は本明細書の一部を成す）を参照されたい。
アクリルまたはメタクリル酸のポリマーとＥＭＡ（登録商標）とは構造の点で下記の式の基本単位から形成されるのが好ましい：
【００２６】
【式２】
2004501874.tif 000002
【００２７】
（ここで、
Ｒ１およびＲ２はＨまたはＣＨ３を表し、同一でも異なっていてもよく、
ｘ＝０または１、好ましくはｘ＝１、
ｙ＝１または２、ただし、ｘ＋ｙ＝２）
ＥＭＡ（登録商標）ではｘ＝０およびｙ＝２であり、カルボマーではｘ＝ｙ＝１である。
【００２８】
最終ワクチン組成におけるポリマー濃度は０．０１〜１．５％Ｐ／Ｖ、特に０．０５〜１％Ｐ／Ｖ、好ましくは０．１〜０．４％Ｐ／Ｖになる。
本発明の第２実施例では、ワクチンがインビボで中空カプシドを産成するためにｃＤＮＡを含む発現ベクターを含んでいる。この中空カプシドはプラスミド発現ベクターまたはウイルス性発現ベクターに挿入され且つ１つのプロモータ、好ましくは同じプロモータに依存するように位置されたＰ１および３Ｃ領域のｃＤＮＡのインビボ発現で得るのが好ましい。このプロモータはウイルス起源の強い早期プロモータまたは後期プロモータにするのが好ましい。
ウイルス性ベクターの場合、ウイルス起源の後期プロモータを用いるのが好ましい。ウイルス性ベクターは好ましくはポックスウイルス、特にワクシニアウイルス、アビポックス（例えば鶏痘、カナリア痘）、アライグマ痘、豚痘、カプリポックス、または複製型アデノウイルス、特にブタアデノウイルスおよびヘルペスウイルスにするのが好ましい。ウイルス起源の後期プロモータは、ポックスウイルスの場合、ワクシニアウイルスのＰ１１Ｋプロモータ、ワクシニアウイルスのＰ２８Ｋプロモータおよび牛痘ウイルスのＰ１６０ＫＡＴＩプロモータにすることができる。
【００２９】
定義上、プラスミド発現ベクター（またはプラスミド）は、発現すべきｃＤＮＡとそのインビボ発現に必要な要素とを含むポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ転写単位をカバーする。プラスミドの形態は環状、スーパーコイルまたはその他の形であるのが好ましい。直線状のプラスミドも本発明範囲に含まれる。
プラスミドの場合、ウイルス起源または細胞起源の強い早期プロモータ、特にヒトまたはマウス起源、場合によってはラットまたはモルモット等の他の起源のサイトメガロウィルスＣＭＶ−ＩＥの早期プロモータを用いるのが好ましい。ＳＶ４０ウイルスの早期または後期プロモータまたはロウスサルコマ（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ）ウイルスのＬＴＲプロモータを用いることもできる。細胞性プロモータとしてはデスミンプロモータまたはアクチンプロモータのようなサイトスケルトン遺伝子のプロモータを挙げることができる。
【００３０】
組換えワクチンは凍結または凍結乾燥させるか、液状で保存・貯蔵するのが好ましい。
本発明ワクチンに用いられるウイルス性ベクターの量は少なくとも約１０３ｐｆｕである。好ましくは一回の投与量で約１０４ｐｆｕ〜約１０１０ｐｆｕ、例えば約１０５ｐｆｕ〜１０９ｐｆｕ、特に約１０６ｐｆｕ〜約１０８ｐｆｕである。
本発明ワクチンに用いられるプラスミドベクターの量は投与量で約１μｇ〜約２ｍｇ、好ましくは約５０μｇ〜約１ｍｇである。一回の投与容量は０．２〜５ｍｌ、好ましくは１〜３ｍｌにするのが好ましい。
本発明の組換えワクチンは通常の投与経路で周知の方法を用いて投与することができる。本発明の好ましい実施例では筋肉内投与または皮下投与、あるいは無針注射装置を用いて皮内投与される。ウイルス性ベクターでは筋肉内投与または皮下投与が好ましい。ウイルス性またはプラスミドベクターは粘膜投与することもできる（例：経口、経鼻）。
【００３１】
これらのワクチンは一つまたは複数のアジュバントを含むのが好ましい。ウイルス性ベクターの場合には、アクリルまたはメタクリル酸のポリマーまたは無水マレイン酸とアルケニル誘導体とのポリマー、特にカルボマー、特にカルボポル（Ｃａｒｂｏｐｏｌ、登録商標）を用いるのが有利である（これらのアジュバントは既に述べたものである）。
プラスミドベクターは下記一般式の第四アンモニウム塩を含むカチオン脂質をアジュバントとして加えて作るのが好ましい：
【００３２】
【式３】
2004501874.tif 000003
【００３３】
（ここで、
Ｒ１は１２〜１８の炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖脂肪族基を表し、
Ｒ２は２〜３の炭素原子を有する他の脂肪族基を表し、
Ｘはヒドロキシルまたはアミン基である）
上記脂質はＤＭＲＩＥ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３− ビス（テトラデシルオキシ）−１−プロパンアンモニウム、ＷＯ−Ａ−９６３４１０９）であるのが好ましく、さらに好ましくは中性脂質、特にＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノ−ルアミン；ＢｅｈｒＪ．Ｐ１９９４，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５，３８２−３８９）と組み合わされて、ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥの形にするのが好ましい。プラスミドを上記アジュバントと使用直前に混合するのが好ましい。動物投与前、好ましくは１０〜６０分前、特に３０分前に混合して錯体にするのが好ましい。ＤＯＰＥが存在するときのＤＭＲＩＥ：ＤＯＰＥのモル比は９５：５〜５：９５、特に１：１である。
【００３４】
プラスミド：ＤＭＲＩＥまたはＤＭＲＩＥ：ＤＯＰＥアジュバントの重量比は５０：１〜１：１０、特に１０：１〜１：５、好ましくは１：１〜１：２である。
アジュバントを含むまたは含まない上記本発明のワクチンは、インビボで発現される一種または複数のサイトカインをアジュバントとして含むこともできる。好ましくはＧＭ−ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ； 顆粒球マクロファ−ジ−コロニ−形成刺激因子、Ｃｌａｒｋ Ｓ．Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８７． ２３０． １２２９； Ｇｒａｎｔ ＳＭ． ｅｔ ａｌ． Ｄｒｕｇｓ １９９２． ５３． ５１６）を用いる。これはワクチン組成物にＧＭ−ＣＳＦタンパクを直接組み込むことで実行でき、好ましくは、ＧＭ−ＣＳＦをコードする配列を発現可能な状態で発現ベクター、例えばＦＭＤＶ抗原をコードするヌクレオチド配列を含むベクターまたはその他のベクターに挿入することで実行できる。発現ベクタ−としてはプラスミドを使用するのが好ましい。ＧＭ−ＣＳＦは予防注射される動物種に従って選択する。従って、ウシではウシＧＭ−ＣＳＦ（Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ 他 Ｍｏｌｅｃ．１９８８。２５．８４３−８５０）が使われ、ブタではブタＧＭ−ＣＳＦ（Ｉｎｕｍａｒｕ Ｓ．およびＴａｋａｍａｔｕ Ｈ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．、１９９５、７３，４７４−４７６）が使われる。
【００３５】
ＧＭ−ＣＳＦを発現するベクターを製造する場合、上記のＧＭ−ＣＳＦ配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースからアクセス番号Ｄ２１０７４（ブタ）、Ｕ２２３８５（ウシ）、Ｘ５５９９１（ヒツジ）でアクセスできる。
本発明の他の対象は抗口蹄疫サブユニットワクチンの製造方法にある。この方法ではＰ１領域のｃＤＮＡの発現および３Ｃ領域のｃＤＮＡの発現によってウイルスの中空カプシドを作り、このカプシドを獣医学的用途に適した担体または賦形剤中に（好ましくは少なくとも１種のアジュバントの存在下で）配合する。
本発明の他の対象は、本発明でインビトロで製造された中空カプシドの、抗口蹄疫サブユニットワクチンの製造での使用にある。このワクチンは獣医学的用途に適した担体または賦形剤を（好ましくは少なくとも１種のアジュバントの存在下で）さらに含む。
【００３６】
本発明の他の対象は、本発明のサブユニットワクチンを動物、特に家畜、特にウシ、ヒツジ、ブタまたはヤギ種に投与することを含む口蹄疫の予防接種方法にある。投与法および投与量は上記の通りである。
本発明のサブユニットワクチンに関する上記の種々の特徴はこれらの各目的にも適用される。
本発明の他の対象は、抗口蹄疫用の組換えワクチンの製造方法にある。この製造方法では中空カプシドが作られる条件下でタンパクＰ１とタンパク３Ｃをインビボで発現するウイルス性またはプラスミドベクターを作り、これらのベクターを獣医学的用途に適した担体または賦形剤中に（好ましくは少なくとも１種のアジュバントの存在下で）配合する。
【００３７】
本発明の他の対象は、本発明のウイルス性またはプラスミドベクターの、抗口蹄疫用の組換えワクチンの製造での使用にある。このワクチンは獣医学的用途に適した担体または賦形剤を（好ましくは少なくとも１種のアジュバントの存在下で）さらに含む。
本発明の他の対象は、本発明の組換えワクチンを動物、特に家畜、特にウシ、ヒツジ、ブタまたはヤギ種に投与することからなる口蹄疫の予防接種方法にある。投与法および投与量は上記の通りである。
本発明のウイルス性またはプラスミドベクターを用いる組換えワクチンに関する上記の各種特徴はこれらの目的にも適用される。
【００３８】
本発明の他の対象は、本発明のワクチンと、口蹄疫ウイルスに対する他のタイプ（例えばＯ， Ａ， Ｃ， ＳＡＴ１， ＳＡＴ２， ＳＡＴ３， Ａｓｉａ）、他の亜型（例えばＡ１０， Ａ１２ Ａ２４， Ｏ１）またはその他の変種の少なくとも１種の他のワクチンとを組合せた多価ワクチンにある。この多価ワクチンは獣医学的用途に適した担体または賦形剤中に（好ましくはアジュバント、特に上記アジュバントと一緒に）配合されるのが好ましい。
本発明の他の対象は、本発明のワクチンと、他の病原体に対する少なくとも１種のワクチン、特に狂犬病ウイルスとを組合せた多価ワクチンにある。この多価ワクチンは獣医学的用途に適した担体または賦形剤中に（好ましくはアジュバント、特に上記のアジュバントと一緒に）配合される。
【００３９】
本発明の他の対象は、口蹄疫ウイルスの中空カプシドおよび得られたワクチンの温度安定性を向上させることにある。
中空カプシドの温度安定性はジスルフィド架橋を形成して行うのが有利である。
この温度安定性の向上は、カプシドの構造タンパクのポリペプチド配列、タンパクＶＰ２中の元の配列のアミノ酸をシステインアミノ酸で置換することによって得られる。このアミノ酸はアミノ酸配列番号３８（［図３］）の１７９位置にある。一般に、アミノ酸の位置は他の口蹄疫ウイルスと同一である（特に実施例で用いた株の場合）。他のウイルスの配列ではその位置は極めてわずかに異なっていてもよく、例えば１７８または１８０であってもよい。このアミノ酸を含む領域はαヘリックスに対応する。突然変異させるアミノ酸を同定または確認するために、この領域のアミノ酸配列が各種の口蹄疫ウイルスの間で構造内によく維持されることから考えて、この領域のアミノ酸配列を配列番号３８の（例えば約１０またはそれ以上、例えば１０〜２０のアミノ酸の）対応する領域と整列させ、特に、株Ｏ１， Ａ１０， Ａ２４， Ａ２２， Ｃ１， Ｃ３， ＳＡＴ２の配列を比較することによって、この領域は下記のように書くことができる：
【００４０】
Ｘ１Ｇｌｙ Ｘ３Ｘ４Ｇｌｙ Ｘ６Ｌｅｕ Ｘ８Ｘ９Ｓｅｒ Ｘ１１Ｘ１２Ｔｙｒ Ｍｅｔ
（ここで、
Ｘ４およびＸ１１はＴｙｒ， ＨｉｓまたはＰｈｅ（疎水性アミノ酸）であり、
Ｘ３， Ｘ８およびＸ１２はＶａｌ，Ｍｅｔ，ＩＩｅ，ＴｈｒまたはＡｌａであり、
Ｘ６はＨｉｓ， Ｇｌｎ， Ａｒｇ， Ｌｙｓ， ＳｅｒまたはＧｌｙであり、これはＣｙｓ突然変異するアミノ酸であり、
Ｘ１はＨｉｓまたはＬｙｓ（塩基性アミノ酸）であり、
Ｘ９はＡｓｐ， ＧｌｕまたはＬｙｓ（酸性および塩基性アミノ酸）である）
【００４１】
突然変異するアミノ酸は口蹄疫ウイルスＡ１０のＰ１前駆体の１７９位置に位置するヒスチジンである。
このアミノ酸は口蹄疫ウイルスＯ１のＰ１前駆体の１７９位置のセリンである。
このアミノ酸は口蹄疫ウイルスＣ１のＰ１前駆体の１７９位置のグリシンである。
このアミノ酸は口蹄疫ウイルスＡ２４のＰ１前駆体の１７９位置のヒスチジンである。
慣例に従って、開始コドンに対応するメチオニン（天然の配列では存在しないので加える）に１の番号を付ける。
すなわち、ヌクレオチドレベルでは元のコドンをシステインをコードするコドンすなわちｃＤＮＡではＴＧＴまたはＴＧＣコドン、ＲＮＡではＵＧＵまたはＵＧＣコドンで置換する。
【００４２】
本発明の他の対象は、上記の修飾を組み込んだヌクレオチド配列、特にｃＤＮＡにある。特に、本発明の対象はＶＰ２（またはＶＰ０）をコードする配列、特にこの修飾を組み込んだＰ１、例えばＰ１−２ＡまたはＰ１−２Ａ−２Ｂの一部と、これらを組み込んだ配列、例えばこれらを発現させることができる配列（プロモータ、ＡＴＧコドン等）を含む配列を含むｃＤＮＡ配列とそれを組み込んだベクターにある。
本発明の他の対象は、これらのヌクレオチド配列から得られたアミノ酸配列と、中空カプシドと、熱的に安定した（すなわち、熱安定性が向上した）口蹄疫ウイルスにある。これらは天然のカプシドおよびウイルスには存在しないジスルフィド架橋を含むのが好ましい。特に、これらは既に述べたように、天然のアミノ酸の代わりにシステインを含むＶＰ２タンパクを含む。
【００４３】
本発明の好ましい実施例では、上記ワクチンは上記の修飾の使用をベースにしたもるのであり、従って、ｃＤＮＡ配列は結果的に修飾されており、インビトロまたはインビボで得られる中空カプシドはジスルフィド架橋を有する。
同様に、上記の本発明の他の全ての目的（方法、使用、プロセス）でもこれらの特徴を有するのが好ましい。
以下、添付図面を参照して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
本発明の構築物の配列リスト（ＳＥＱ ＩＤ＝配列番号）
【００４４】
【式４】
2004501874.tif 000004
【００４５】
【式５】
2004501874.tif 000005
【００４６】
【式６】
2004501874.tif 000006
【００４７】
【実施例】
プラスミドの構築は全てＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９）に記載の標準的な分子生物学手法（クローニング、制限酵素による消化、一本鎖相補ＤＮＡの合成、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡポリメラーゼによるオリゴヌクレオチドの延長等）を用いて行った。本発明で使われる全ての制限断片は「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」キット（ＢＩＯｌＯｌ社、Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を用いて単離した。
口蹄疫ウイルスのヌクレオチドおよびポリペプチドの配列はＧｅｎＢａｎｋデ−タベ−スから番号Ｘ００４２９（Ａ１０）、Ｘ００８７１（Ｏ１Ｋ）、ＡＪ２５１４７６（Ａ２４）、ＡＪ１３３３５７（Ｃ Ｓｐａｉｎ Ｏｌｏｔ）で入手可能である。
【００４８】
実施例１
口蹄疫ウイルス株の培養
口蹄疫ウイルス株０１Ｋ（Ｆｏｒｓｓ達、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２（１６），６５８７−６６０１）、Ａ２４（Ｗｅｄｄｅｌｌ達、１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２，２６１８−２６２２）、Ａ１０（Ｃａｒｏｌｌ達、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２（５），２４６１−２４７２）、Ｃ Ｓｐａｉｎ Ｏｌｏｔ（Ｔｏｊａ達、１９９９、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，６４（２）、１６１−１７１）をＢＨＫ−２１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）寄託番号ＣＣＬ−１０で得られるベビーハムスターの腎臓）で培養して増殖する。
１％の酵母抽出物と１ｍｌ当たり約１００，０００セル含む５％の子ウシ血清とで補ったＭＥＭ イーグル培地を入れた２５ｃｍ２のファルコンフラスコでＢＨＫ−２１細胞を培養する。この細胞を＋３７℃で培養する。
３日後、細胞の層が集密状態に達する。次いで、培地を血清ではなく０．４％のラクトアルブミン加水分解物と０．３％のペプトン（ｐＨ７．４）とで補ったＭＥＭ イーグルに取り替え、口蹄疫ウイルスを１ｐｆｕ〜約２０セルの量で添加する。
細胞変性効果（ＣＰＥ）が完了したとき（一般に培養開始から２４時間後）、ウイルス性懸濁液を回収し、遠心分離し、−７０℃で凍結させて清澄化する。１バッチのウイルスを製造するにはこれを３〜４回続けて行う必要がある。このバッチウイルスを−７０℃で貯蔵する。
上記操作を各口蹄疫ウイルス株ごとに繰り返す。
【００４９】
実施例２
口蹄疫ウイルス株からのウイルス性ＲＮＡの抽出
実施例１で得られた、口蹄疫ウイルス株Ａ２４のウイルス性懸濁液１００ｍｌに含まれるウイルス性ＲＮＡを解凍後、メーカーの指示に従って「高純度ＴＭウイルス性ＲＮＡキット」（カタログ番号１，８５８，８８２号、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の溶液で抽出する。抽出終了後に得られたＲＮＡ残留物をＲＮａｓｅを含まない１０ｍｌの滅菌蒸留水に再懸濁する。
各口蹄疫ウイルス株のウイルス性ＲＮＡを同じ条件下で抽出する。
実施例３
口蹄疫ウイルスＡ１０の中空カプシド用発現プラスミドの構築
口蹄疫ウイルスＡ１０の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を「遺伝子増殖 ＲＮＡ ＰＣＲキット」（カタログ番号Ｎ ８０８ ００１７、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ ０６８５９、ＵＳＡ）を用いてメーカーの指定した条件下で合成する。第１断片の場合には、口蹄疫ウイルスＡ１０のウイルス性ＲＮＡ懸濁液（実施例２）５０μｌと下記オリゴヌクレオチドとを用いて逆転写反応および連鎖増殖反応（「ＴＩ−ＡＣＰ」または「ＲＴ−ＰＣＲ」反応法）を行う：
【００５０】
【式７】
2004501874.tif 000007
【００５１】
上記オリゴヌクレオチド対によってＥｃｏＲＶ制限酵素部位およびＡＴＧ相開始コドンをＰ１をコードするヌクレオチド配列に組み込むことができる。
オリゴヌクレオチドＪＣＡ３０６を延長してこのオリゴヌクレオチドとＲＮＡマトリクスとのハイブリダイゼーションでｃＤＮＡの第１鎖を合成する。
ｃＤＮＡの第１鎖の合成条件は４２℃の温度で１５分、次いで９９℃で５分、最後に４℃で５分である。オリゴヌクレオチド対ＪＣＡ３０５およびＪＣＡ３０６の存在下でのＰＣＲ反応の条件は９５℃の温度で２分、次いで３５サイクル（９５℃で１分、次いで６２℃で１分、次いで７２℃で２分）、最後に７２℃で７分であり、２５８３ｂｐ断片が得られる。
この断片をＥｃｏＲＶおよびＸｈｏＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で約２５５０ｂｐ ＥｃｏＲＶ−ＸｈｏＩ断片を単離した。この断片をＡ断片とよぶ。
第２断片では、口蹄疫ウイルスＡ１０のウイルス性ＲＮＡ懸濁液（実施例２）５０μｌと下記オリゴヌクレオチドとを用いてＰＣＲ反応を行う：
【００５２】
【式８】
2004501874.tif 000008
【００５３】
上記オリゴヌクレオチド対によってＢｇＩＩＩ制限酵素部位および相終止コドンを３Ｃプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列に組み込むことができる。
オリゴヌクレオチドＪＣＡ３０８を延長してこのオリゴヌクレオチドとＲＮＡマトリクスとのハイブリダイゼーションでｃＤＮＡの第１鎖を合成する。
ｃＤＮＡの第１鎖の合成条件は４２℃の温度で１５分、次いで９９℃で５分、最後に４℃で５分である。オリゴヌクレオチド対ＪＣＡ３０７およびＪＣＡ３０８の存在下でのＰＣＲ反応の条件は９５℃の温度で２分、次いで３５サイクル（９５℃で１分、次いで６２℃で１分、次いで７２℃で２分）、最後に７２℃で７分であり、９３６ｂｐ断片が得られる。
この断片をＢｇＩＩＩおよびＸｈｏＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で約９００ｂｐ のＢｇＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片を単離した。この断片をＢ断片とよぶ。
Ａ断片とＢ断片とを、予めＢｇＩＩＩとＥｃｏＲＶで消化した発現プラスミドｐＶＲ１０１２（Ｈａｒｔｉｋｋａ Ｊ達、１９９７、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、７、１２０５−１２１７）にリゲートして、プラスミドｐＪＣＡ１６１（８３２７ｂｐ）を得た。このプラスミドはヒトサイトメガロウィルスの初期プロモータまたはｈＣＭＶ−ＩＥ（即時初期ヒトサイトメガロウィルス）の制御下で、自己組織化可能なカプシドタンパクを作るのに十分なポリタンパクの一部をコードする挿入断片を含む。
【００５４】
実施例４
亜型の口蹄疫ウイルス０１Ｋ、Ｃ Ｓｐａｉｎ Ｏｌｏｔ、Ａ２４の中空カプシド用発現プラスミドの構築
亜型の口蹄疫ウイルス０１Ｋ、Ｃ Ｓｐａｉｎ Ｏｌｏｔ、Ａ２４を実施例３と同じ方法で合成する。Ｏ１Ｋでは下記オリゴヌクレオチド対を用いて最初のＰＣＲ反応で２５８３塩基対（ｂｐ）断片を作り、消化および単離後、約２５５０ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＸｈｏＩ断片を得た。この断片をＣ断片とよぶ。
【００５５】
【式９】
2004501874.tif 000009
【００５６】
第２のＰＣＲ反応では下記オリゴヌクレオチド対を用いて９３０ｂｐ断片を作り、消化および単離後、約９００ｂｐのＢｇＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片を得た。この断片をＤ断片とよぶ。
【００５７】
【式１０】
2004501874.tif 000010
【００５８】
Ｃ断片とＤ断片とを、予めＢｇＩＩＩとＥｃｏＲＶで消化した発現プラスミドｐＶＲ１０１２にリゲートして、プラスミドｐＪＣＡ１６２（８３２７ｂｐ）を得た。
Ｃ Ｓｐａｉｎ Ｏｌｏｔでは、下記オリゴヌクレオチド対を用いて最初のＰＣＲ反応で２５６８塩基対（ｂｐ）断片を作り、消化および単離後、約２５４０ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＸｈｏＩ断片を得た。この断片をＥ断片とよぶ。
【００５９】
【式１１】
2004501874.tif 000011
【００６０】
第２のＰＣＲ反応では下記オリゴヌクレオチド対を用いて９４７ｂｐ断片を作り、消化および単離後、約９００ｂｐのＢｇＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片を得た。この断片をＦ断片とよぶ。
【００６１】
【式１２】
2004501874.tif 000012
【００６２】
Ｅ断片とＦ断片とを、予めＢｇＩＩＩとＥｃｏＲＶで消化した発現プラスミドｐＶＲ１０１２にリゲートして、プラスミドｐＪＣＡ１６３（８３１２ｂｐ）を得た。
Ａ２４の場合には下記オリゴヌクレオチド対を用いて最初のＰＣＲ反応で約２６３０ （ｂｐ）断片を作り、消化および単離後、約２５８０ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＸｈｏＩ断片を得た。この断片をＧ断片とよぶ。
【００６３】
【式１３】
2004501874.tif 000013
【００６４】
第２のＰＣＲ反応では下記オリゴヌクレオチド対を用いて約９５０ｂｐ断片を作り、消化および単離後、約９４０ｂｐのＢｇＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片を得た。この断片をＨ断片とよぶ。
【００６５】
【式１４】
2004501874.tif 000014
【００６６】
Ｇ断片とＨ断片とを、予めＢｇＩＩＩとＥｃｏＲＶで消化した発現プラスミドｐＶＲ１０１２にリゲートして、プラスミドｐＪＣＡ１６４（大きさ約８４００ｂｐ）を得た。
実施例５
Ａ２４／Ａ１０用発現プラスミドの構築
口蹄疫ウイルスＡ２４のｃＤＮＡを実施例３と同じ方法で合成した。
口蹄疫ウイルスＡ２４のＲＮＡ懸濁液（実施例２） ５０μｌと下記オリゴヌクレオチドとを用いてＰＣＲ反応を行う：
【００６７】
【式１５】
2004501874.tif 000015
【００６８】
約２３００ｂｐの断片が得られる。
この断片をＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で約１７１０〔ｂｐ〕の ＥｃｏＲＶ− ＨｉｎｄＩＩＩ断片を単離した。この断片をＩ断片とよぶ。
２３００ｂｐの断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａｌで消化し、アガロースゲル電気泳動で約５５０ｂｐの ＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｐａｌ断片を単離した。この断片をＪ断片とよぶ。
プラスミドｐＪＣＡ１６１（実施例３）をＡｐａｌおよびＥｃｏＲＶで消化し、アガロースゲル電気泳動で約５９６０ｂｐの Ａｐａｌ−ＥｃｏＲＶ断片を単離した。この断片をＫ断片とよぶ。
断片Ｉ、Ｊ、Ｋを一緒にリゲートしてプラスミドｐＪＣＡ１６５（８３３３ｂｐ）を得た。このプラスミドは、自己組織化可能なカプシドタンパクを作るのに十分な、ポリタンパクＡ２４の構造的部分とＡ１０の酵素的部分とをコードする挿入断片を含む。
【００６９】
実施例６
組換えワクシニアウイルスｖＶ１００（Ａ１０）の構築
プラスミドｐＪＣＡ１６１（実施例）マトリクスと、下記のオリゴヌクレオチドとを用いてＰＣＲ反応を行い、約３４６２ｂｐの断片を増殖した：
【００７０】
【式１６】
2004501874.tif 000016
【００７１】
上記オリゴヌクレオチド対によってＥｃｏＲＩ制限酵素部位を増殖断片の各末端に組み込むことができる。
上記オリゴヌクレオチド対の存在下でのＰＣＲ反応の条件は９５℃の温度で２分、次いで３５サイクル（９５℃で１分、次いで６２℃で１分、次いで７２℃で２分）、最後に７２℃で７分である。
この断片をＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で３４４８ｂｐ のＥｃｏＲＩ− ＥｃｏＲＩ断片を単離した。
ワクシニアウイルス（ＷＲ株）のゲノムに対するＰＣＲ反応は下記オリゴヌクレオチドを用いる：
【００７２】
【式１７】
2004501874.tif 000017
【００７３】
ＰＣＲ反応条件は上記実施例と同様であり、４８８ｂｐ断片が得られる。この断片をＣｌａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で３６７ｂｐの断片を単離した。この後者の断片を予めＣｌａＩとＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＧＳ２０（Ｍａｃｋｅｔｔ達、Ｊ；Ｖｉｒｏｌ．，１９８４、４９、８５７−８６４）に挿入する。こうして得られたプラスミドをＥｃｏＲＩで直線化し、その中に３４４８ｂｐのＥｃｏＲＩ ＥｃｏＲＩ断片を挿入してベクターｐＪＣＡ１６６を得た。
当業者はワクシニアウイルスのＰ１１Ｋプロモータと、このプロモータの上流とＥｃｏＲＩ部位の下流にそれぞれワクシニアウイルスのＴＫ遺伝子の２つのブランチとを含むプラスミドｐｖＦＯＨＣ（Ｎｅｗｔｏｎ達、ワクチン８７、１９８７、Ｃｈａｎｏｃｋ達編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１２−２１）を用いることもできるのが有利である。
ＴＫ遺伝子以外、特に遺伝子ＨＡ、Ｍ２Ｌ等のワクシニアウイルスの挿入部位を用いてもよい。
【００７４】
プラスミドｐＪＣＡ１６６をワクシニアウイルス（ＷＲ株、ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１１９）に感染させたＣＯＳ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎアクセス番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５１で得られるアフリカミドリザルの腎臓細胞）にトランスフェクトする。１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのグルタミン、５００ＵＩ／μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、１２．５μｇ／ｍｌの真菌帯（ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）（全て最終濃度）で補ったＤＭＥＭ（ダルベッコの修正イーグル培地）培地を入れたペトリ皿で１ｍｌ当たり約１００，０００セル含むＣＯＳ細胞を５％のＣＯ２を含む雰囲気中に＋３７℃で１６時間培養する。セルが集密状態に達したときに、培地を取り除く。次いでＣＯＳ細胞をワクチンウイルス（ＷＲ株）に３ＤＩＣＣ５０／セルの感染効率（ｍｏｉ）で感染させ、次いで皿を１時間培養する。次いで培養物を無血清ＤＭＥＭ媒体で洗浄する。プラスミド／リポフェクチン／Ｏｐｔｉｍｅｍ混合物（８μｌのリポフェクチン、１９２μｌのＯｐｔｉｍｅｍ、８μｇのプラスミドを含む２００μｌの蒸留水）を各皿に添加し、このプラスミドはｐＪＣＡ１６６である。これらの皿を５％のＣＯ２を含む雰囲気中に＋３７℃で３０分毎に攪拌しながら４〜６時間培養する。次いで１０％のウシ胎児血清で補ったＤＭＥＭ培地を各皿に添加し、これらの皿を５％のＣＯ２を含む雰囲気中に＋３７℃で１６時間培養する。
【００７５】
次いでこの細胞を回収して−２０℃で凍結貯蔵することができる。
５ｍｌのＤＭＥＭ培地を入れた６ｃｍ皿で５％のＣＯ２を含む雰囲気中に＋３７℃で１６時間培養した１４３ＴＫ−ヒト細胞培養物（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎアクセス番号ＣＲＬ−８３０３で得られる）に対する組換えワクシニアウイルスを選択する。
前回得られたトランスフェクション懸濁液を添加する。３７℃で１時間培養した後、組換えワクシニアウイルスＴＫ−を選択するために１ｍｌ当たり２５μｇの５−ブロモデソキシウリジン（ＢＵｄＲ）を添加する。培養を４８時間延長して組換え細胞を発生させることができる。３回の連続した組換えワクシニアウイルスの選択／精製サイクルを実施する。
【００７６】
２４個のウェルプレートに１ｍｌ当たり２５μｇのＢＵｄＲを含むＤＭＥＭ培地を有する１４３ＴＫ−細胞を播種する。＋３７℃で２時間培養した後、２μｌのＰＢＳ緩衝液にそれぞれ取った約１０のスポットを１０個のウェルにトランスファーさせる。次いでこれらのスポットを４８〜７２時間培養する。
培養後、各ウェルの培養物の上澄みに対し、オリゴヌクレオチドＪＣＡ３０５およびＪＣＡ３０８に関して「Ｇｅｎｅ Ｒｅｌｅａｓｅｒ」法（Ｃａｍｂｉｏ）を用いてＰＣＲ反応を行う。
ポジティブと判明したウェルで組換えウイルスに新たに精製サイクルを行う。ｖＶ１００ｒとして知られる組換えウイルスを増殖させ、−７０℃またはマイナス２０℃で貯蔵する。
【００７７】
実施例７
Ｏ、ＣおよびＡタイプの場合のワクチンの組換えウイルスの構築
口蹄疫ウイルスのＯ、ＣおよびＡタイプ用の組換えワクシニアウイルスの構築は実施例６と同じ方法で達成される。
タイプＯの場合：
プラスミドｐＪＣＡ１６２（実施例４）マトリクスと、下記のオリゴヌクレオチドとを用いてＰＣＲ反応を行い、約３４７０ｂｐの断片を増殖した：
【００７８】
【式１８】
2004501874.tif 000018
【００７９】
消化および単離後、３４４８ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片を予めＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐｖＦＯＨＣに挿入して、プラスミドｐＪＣＡ１６７を得た。
実施例６に記載の方法に従って組換えを行う。オリゴヌクレオチドＪＣＡ３０９およびＪＣＡ３１２におけるＰＣＲ反応によって陽性領域が選択される。１つの領域を増殖させ、得られた組換えウイルス株をｖＶ１０１とよぶ。
タイプＣの場合：
プラスミドｐＪＣＡ１６３（実施例４）マトリクスと、下記のオリゴヌクレオチドとを用いてＰＣＲ反応を行い、約３４６０ｂｐの断片を増殖した：
【００８０】
【式１９】
2004501874.tif 000019
【００８１】
消化および単離後、３４３９ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片を予めＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐｖＦＯＨＣに挿入して、プラスミドｐＪＣＡ１６８を得た。
実施例６に記載の方法に従って組換えを行う。オリゴヌクレオチドＪＣＡ３１３およびＪＣＡ３１６におけるＰＣＲ反応によって陽性プラークが選択される。１つのプラークを増殖させ、得られた組換えウイルス株をｖＶ１０２とよぶ。
タイプＡの場合：
プラスミドｐＪＣＡ１６４（実施例４）マトリクスと、下記のオリゴヌクレオチドとを用いてＰＣＲ反応を行い、約３５５０ｂｐの断片を増殖した：
【００８２】
【式２０】
2004501874.tif 000020
【００８３】
消化および単離後、約３５３０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片を予めＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐｖＦＯＨＣに挿入して、プラスミドｐＪＣＡ１６９を得た。
実施例６に記載の方法に従って組換えを行う。オリゴヌクレオチドＪＣＡ３１７およびＪＣＡ３２０におけるＰＣＲ反応によって陽性プラークが選択される。１つのプラークを増殖させ、得られた組換えウイルス株をｖＶ１０３とよぶ。
タイプＡの変異体の場合：
プラスミドｐＪＣＡ１６５（実施例５）マトリクスと、下記のオリゴヌクレオチドとを用いてＰＣＲ反応を行い、約３４８０ｂｐの断片を増殖した：
【００８４】
【式２１】
2004501874.tif 000021
【００８５】
消化および単離後、約３４６３ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片を予めＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐｖＦＯＨＣに挿入して、プラスミドｐＪＣＡ１７０を得た。
実施例６に記載の方法に従って組換えを行う。オリゴヌクレオチドＪＣＡ３１７およびＪＣＡ３１２におけるＰＣＲ反応によって陽性プラークが選択される。１つのプラークを増殖させ、得られた組換えウイルス株をｖＶ１０４とよぶ。
【００８６】
実施例８
インビトロ発現用のワクチン（Ａ１０）の組換えウイルスの構築
ｐＪＣＡ１６１プラスミド（実施例３）を制限酵素ＥｃｏＲＶとＢＧＩＩＩで消化する。アガロースゲル電気泳動で寸法が約３４５０ｂｐの ＥｃｏＲＶ−ＢＧＩＩＩ断片を単離した。この断片をクレノウポリメラーゼで処理し、ブラントエンドを作り、予めＢａｍＨＩで消化してクレノウポリメラーゼで処理したｐＢＧ２００プラスミド（Ａｂｒａｍｓ達、１９９５、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ，７６，３０８９−３０９８）にリゲートしてドナープラスミドｐＪＣＡ１７１を得た。
プラスミドｐＢＧ２００はＴ７バクテリオファージプロモータと、Ｔ７転写終結因子と、このプロモータの上流とターミネータの下流にそれぞれワクシニアウイルスのＴＫ遺伝子の２つのブランチとを含む（ｐＢＧ２００の構築に関してＦｕｅｒｓｔ達の分子および細胞の生物学、１９８７、７、２５３８−２５４４を参照）。プラスミドｐＢＧ２００上のＢａｍＨＩ挿入部位はプロモータとＴ７のターミネータとの間である。
実施例６に記載の方法を用いて組換えを行う。オリゴヌクレオチドＪＣＡ３０５およびＪＣＡ３０８におけるＰＣＲ反応によって陽性プラークが選択される。１つのプラークを増殖させ、得られた組換えウイルス株をｖＶ１０５とよぶ。
組換えウイルス株を−２０℃または−７０℃で保存する。
【００８７】
実施例９
Ｏ、ＣおよびＡタイプのインビトロ発現用組換えワクシニアウイルスの構築
口蹄疫ウイルスのＯ、ＣおよびＡタイプ用の組換えワクシニアウイルスの構築は実施例８と同じ方法で達成される。
タイプＯの場合：
ｐＪＣＡ１６２プラスミド（実施例４）を制限酵素ＥｃｏＲＶとＢＧＩＩＩで消化する。寸法が約３４５０ｂｐの ＥｃｏＲＶ−ＢＧＩＩＩ断片を単離した後、この断片をクレノウポリメラーゼで処理し、ブラントエンドを作り、予めＢａｍＨＩで消化してクレノウポリメラーゼで処理したｐＢＧ２００プラスミドにリゲートしてドナープラスミドｐＪＣＡ１７２を得た。
オリゴヌクレオチドＪＣＡ３０９およびＪＣＡ３１２におけるＰＣＲ反応によって選択された１つのプラークは増殖され、得られた組換えウイルス株をｖＶ１０６とよぶ。
【００８８】
タイプＣの場合：
ｐＪＣＡ１６３プラスミド（実施例４）を制限酵素ＥｃｏＲＶとＢＧＩＩＩで消化する。大きさが約３４４０ｂｐの ＥｃｏＲＶ−ＢＧＩＩＩ断片を単離した後、この断片をクレノウポリメラーゼで処理し、ブラントエンドを作り、予めＢａｍＨＩで消化してクレノウポリメラーゼで処理したｐＢＧ２００プラスミドにリゲートしてドナープラスミドｐＪＣＡ１７３を得た。
オリゴヌクレオチドＪＣＡ３０９およびＪＣＡ３１２におけるＰＣＲ反応によって選択された１つのプラークは増殖され、得られた組換えウイルス株をｖＶ１０６とよぶ。
【００８９】
タイプＡの場合：
ｐＪＣＡ１６４プラスミド（実施例４）を制限酵素ＥｃｏＲＶとＢＧＩＩＩで消化する。寸法が約３５２０ｂｐの ＥｃｏＲＶ−ＢＧＩＩＩ断片を単離した後、この断片をクレノウポリメラーゼで処理し、ブラントエンドを作り、予めＢａｍＨＩで消化してクレノウポリメラーゼで処理したｐＢＧ２００プラスミドにリゲートしてドナープラスミドｐＪＣＡ１７４を得た。
オリゴヌクレオチドＪＣＡ３１７およびＪＣＡ３２０におけるＰＣＲ反応によって選択された１つのプラークは増殖され、得られた組換えウイルス株をｖＶ１０８とよぶ。
タイプＡの変異体の場合：
ｐＪＣＡ１６５プラスミド（実施例５）を制限酵素ＥｃｏＲＶとＢＧＩＩＩで消化する。寸法が約３４５０ｂｐの ＥｃｏＲＶ−ＢＧＩＩＩ断片を単離した後、この断片をクレノウポリメラーゼで処理し、ブラントエンドを作り、予めＢａｍＨＩで消化してクレノウポリメラーゼで処理したｐＢＧ２００プラスミドにリゲートしてドナープラスミドｐＪＣＡ１７５を得た。
オリゴヌクレオチドＪＣＡ３１７およびＪＣＡ３１２におけるＰＣＲ反応によって選択された１つのプラークは増殖され、得られた組換えウイルス株をｖＶ１０９とよぶ。
【００９０】
実施例１０
中空ウイルス性カプシドの製造および精製
ウサギ腎臓細胞ＲＫ１３（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎからアクセス番号ＣＣＬ−３７で得られる）を、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのグルタミン、５００ＵＩ／μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、１２．５μｇ／ｍｌの真菌帯で補った２０ｍｌのＤＭＥＭ培地を入れた１７５ｃｍ２の２０個のファルコンフラスコ（各ファルコンフラスコは集密状態で約２×１０７セル含む）で＋３７℃で培養する。
次いで、各ファルコンフラスコに組換えワクシニアウイルスｖＴＦ７−３およびｖＶ１０８（実施例９）をそれぞれ１０ ＤＩＣＣ５０／セルの感染効率（ｍｏｉ）で添加する。このウイルス性培養物を１００％の細胞変成効果が得られるように３７℃で約２４時間保持する。
組換えワクシニアウイルスｖＴＦ７−３（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２１５３で得られる）は、ワクシニアウイルスのｐ７．５Ｋプロモータの制御下でＴ７バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼを含む（Ｆｕｅｒｓｔ達、１９８６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３、８１２２−８１２６）。
【００９１】
ＲＮＡポリメラーゼＴ７の生成はＴ７プロモータの制御下で挿入断片の発現を誘発させる。このようにして口蹄疫ウイルスのＰ１前駆体と３Ｃプロテアーゼは製造され、中空カプシドは自己組織化する。
ウイルス性懸濁液を回収して遠心分離によって清澄化する（４，０００回転／分で３０分間、４℃）。
残留物を０．５％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０（Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１ ７５４ ５９９）を含む０℃の３０ｍｌの燐酸緩衝液（４０ｍＭの燐酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．６）で再懸濁する。細胞を０℃の氷上で２０分間溶解させる。
細胞片を１０，０００回転／分で２０分間４℃で遠心分離して回収する。上澄みを０℃の氷上で保持する。細胞片は６ｍｌの燐酸緩衝液で再懸濁する。抽出は（等量の）クロロホルムを用いて行う。この抽出で得られた水相は前回得られた上澄みと合わさって１５％のショ糖クッション（２ｍｌ）に堆積し、これをベックマンＳＷ２８ロータで遠心分離する（２８，０００回転／分、５時間、４℃）。残留物を１ｍｌの燐酸緩衝液にそ取り、４℃で貯蔵する。
【００９２】
得られた残留物を再懸濁し、次いで２０μｌのＲＮａｓｅ（１０ｍｇ／ｍｌ）で氷上で１０分間処理する。次いで１０μｌの１０％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０を添加し、全体を氷上に１０分置く。次いで懸濁液を等量のクロロホルムで抽出する。水相（１ｍｌ）を回収し、１５−４５％ショ糖勾配（約１２ｍｌ）上でベックマンＳＷ４０ロータで遠心分離する（４０，０００回転／分、５時間、１２℃または１８，０００回転／分、１６時間、１２℃）。
【００９３】
次いで上記勾配を０．８ｍｌの１４個の画分に分割する。吸光度を２２０ｎｍで測定する。吸光度にピークに対応する画分を回収する。これらの画分はウイルス性中空カプシドＡ２４を含む。回収されたタンパクの特殊性をウエスタンブロット法で検証する。
亜型０１Ｋ、Ｃ Ｓｐａｉｎ Ｏｌｏｔ、Ａ２４／Ａ１０のウイルス性中空カプシドはこの実施例に記載の方法と全く同じ方法で得られるが、組換えワクシニアウイルスｖＶ１０８の代わりにｖＶ１０６（実施例９）ｖＶ１０５（実施例８）、ｖＶ１０７（実施例９）およびｖＶ１０９（実施例９）を用いる。
こうして得られたタンパク画分はワクチンに用いられるまで４℃で保存する。
【００９４】
実施例１１
サブユニットワクチンの製造
実施例１０で得られた合計１６５μｇの中空口蹄疫ウイルスカプシドを含むショ糖勾配の１３．２ｍｌの画分を、２７．５ｍｌの１．５％水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）と０．２９ｍｌのサポニンとを含む１４．０１ｍｌのＤＭＥＭで製剤にする。
こうして得られた５５ｍｌを次いで２つのフラスコに、第１のフラスコには３０ｍｌ、第２のフラスコには２５ｍｌになるように分ける。５ｍｌの投与量にはサポニンの３６０個の溶血性単位を有する１５μｇのウイルス性中空カプシドが含まれる。
中空粒子の量は２２０ｎｍでの吸光度を測定してウシ血清アルブミン溶液（ＢＳＡ）を標準として用いて分光光度法によって求める。
【００９５】
実施例１２
組換えワクチンの製造
ワクチンを製造するために組換えワクシニアウイルスｖＶ１００〜ｖＶ１０５（実施例６および７）をカルボマー溶液と組み合わせる。好ましいカルボマーはＢＦ Ｇｏｏｄｒｉｃｈ社、オハイオ州、ＵＳＡで作られたＣａｒｂｏｐｏｌＴＭ９７４Ｐ（分子量約３，０００，０００）である。
最初に、カルボポル（Ｃａｒｂｏｐｏｌ、登録商標）９７４Ｐ の１．５％株溶液を１ｇ／ｌの塩化ナトリウムを含む蒸留水を用いて調製する。次いでこの株溶液を用いて、生理食塩水によって調製した４ｍｇ／ｍｌのカルボポル（Ｃａｒｂｏｐｏｌ、登録商標）９７４Ｐ の溶液を製造する。この株溶液を適量の生理食塩水と、一回または連続した複数回で混合し、１Ｎ（またはより濃度の高い）水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを各段階で調節して最終ｐＨを７．３〜７．４にする。
こうして得られた直ちに使用できる状態のカルボポル（Ｃａｒｂｏｐｏｌ、登録商標）９７４Ｐ溶液は、凍結乾燥した組換えウイルスに加えたり、組換えウイルスの濃縮株溶液を希釈したりするのに用いることができる。例えば、投与量１ｍｌ当たり１０８ｐｆｕを含むウイルス性懸濁液を得るためには、ウイルス性株溶液を１０８．３ｐｆｕ／ｍｌの抗体価を得るように希釈し、次いで同部の上記使用可能状態の４ｍｇ／ｍｌのカルボポル（Ｃａｒｂｏｐｏｌ、登録商標）９７４Ｐ溶液で希釈する。
【００９６】
実施例１３
ＤＮＡワクチンの製造
一つまたは複数のプラスミドｐＪＣＡ１６１〜ｐＪＣＡ１６５を含んだＤＮＡ溶液をＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９）に記載の方法でエタノ−ル沈殿で濃縮する。ＤＮＡ残留物は、１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように０．９％ ＮａＣｌ溶液に取る。適量の無菌のＨ２０を用いたＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥの生理食塩水で取り、０．７５ｍＭ  ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ溶液を調製する（ＤＭＲＩは（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３− ビス（テトラデシルオキシ）−１−プロパンアンモニウム（ＷＯ−Ａ−９６３４１０９）であり、ＤＯＰＥはジオレイルホスファチジルエタノ−ルアミン（ＢｅｈｒＪ．Ｐ１９９４，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５，３８２−３８９）である）。
プラスミドＤＮＡ−脂質錯体製剤は、０．７５ｍＭ ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ溶液を０．９％ ＮａＣｌの１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液とを同部に希釈して作る。気泡を避けるために、カチオン脂質溶液を含む小びんの内壁に沿って２６Ｇ針を用いてＤＮＡ溶液を少しずつ導入する。二つの溶液が混合したら穏やかに振盪をする。０．３７５ｍＭのＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥおよび５００μｇ／ｍｌのプラスミドから成る最終組成物を得る。
上記の全ての操作で使う全ての溶液は室温であるのが望ましい。ＤＮＡ／ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ錯体生成は動物を免疫する３０分前に室温で行う。
【００９７】
実施例１４
ウシでの実験
ウイルス性中空カプシドから実施例１１で得られた口蹄疫ウイルスＡ２４に対するワクチンｖＶ１０９を６頭のウシに投与する。
注射は肩部側の頚部の各側に皮下経路で行う。最初の５頭のウシには５ｍｌ（２×２．５ｍｌ）を投与し、６頭目のウシには４ｍｌ（２×２．０ｍｌ）を投与する。この６頭目のウシには「ＵＣ１０」を耳に針で投与する。
１回目の予防接種の３１日後に、各ウシの頚部両側に皮下経路で２回目の注射を行う（最初の５頭のウシには４ｍｌ（２×２．０ｍｌ）を投与し、６頭目のウシには０．５ｍｌ（２×０．２５ｍｌ）を投与する）。
（最初の予防接種から）０日後に予防接種したウシから血液サンプルｄ６、ｄ１３、ｄ２０、ｄ３１、ｄ３８、ｄ４２、ｄ５２を取り出し、屠殺する。
予防接種したウシと２頭の予防接種していない対照ウシの全てのウシに、１０４．４感染性用量／ｍｌの抗体価（ウシ甲状腺細胞での抗体価）のＡ２４口蹄疫ウイルスを舌皮内経路（１頭につき１０×０．１０ｍｌ）で投与する。この投与は一回目の予防接種の４２日後に行う。
各ウシの体温（表２）と舌、口および足における口蹄疫の徴候（［表１］）を毎日検査する。抗口蹄疫ウイルスＡ２４中和抗体のレベルをモニターする（［図１］）。
【００９８】
病原投与後のウシの口蹄疫臨床徴候
【表１】
2004501874.tif 000022
【００９９】
略記号の説明：
Ｔ０：健康な舌、ウイルス複製の徴候なし、注射部位に痕跡なし
Ｔ１：健康な舌、ウイルス複製の徴候なし、注射部位に外傷のみ
Ｔ２：舌に一次病巣あり
Ｔ３：舌または口の他の部分に一次および二次病巣あり
４Ｆ０：４足全てに口蹄疫の徴候なし
４Ｆ＋：４足全てに小胞あり
ＮＤ：  臨床試験なし
【０１００】
以上の結果から、予防接種したウシは全て、接種部位が局部的であっても、口蹄疫ウイルスＡ２４の感染から守られることがわかる。他のウシよりも弱い追加免疫を注射したウシＵＣ１０も保護される。逆に、ウイルスが感染しやすい対照ウシは抗原投与の２日後に口に、５日後に足に目立って発症する。
【０１０１】
病原投与後のウシの体温（℃）のモニタリング
【表２】
2004501874.tif 000023
【０１０２】
以上の結果から、他のウシよりも弱いブースターを注射したウシＵＣ１０でも、予防接種したウシは高熱を出さない。逆に、対照ウシは高熱を出し、熱は抗原投与の２日後にピークに達し、その後、通常の体温に戻る。
［図１］から、予防接種したウシは抗抗蹄疫ウイルスＡ２４中和抗体が強い反応を示し、１回目の予防接種から約１３日後に第１のピークがくることがわかる。ブースター接種後、中和抗体の強い反応が認められる。この反応は他のウシよりも弱いブースターを接種したウシＵＣ１０にも認められる。抗原投与後、抗体レベルは上昇しないが、これはＦＤＭＶ Ａ２４ウイルスが抗体反応を刺激する程には十分に複製していないことを示す。
結論として、組換えワクシニアウイルス発現ベクターから得られたウイルス性中空カプシドから製造した口蹄疫Ａ２４ウイルス用ワクチンはウシにおいて一次および二次免疫反応を誘発する。抗原投与後、ウシは全て口蹄疫およびウイルスの複製から守られる。
【０１０３】
実施例１５
Ａ１０構築における突然変異誘発
ヒスチジン１７９（実施例３のプラスミドｐＪＣＡ１６１によってコードされるポリタンパクの位置、メチオニンイニシエータを１とする）をコードするコドンを、システインをコードするコドンに代える目的で、Ａ１０構築に向けた突然変異誘発をオリゴヌクレオチドとＰＣＲ反応とを用いて行う。
プラスミドｐＪＣＡ１６１マトリクスとし、下記オリゴヌクレオチドとを用いてＰＣＲ反応を行って５５９ｂｐの断片を増殖した。この断片をＬ断片とよぶ。
【０１０４】
【式２２】
2004501874.tif 000024
【０１０５】
ＰＣＲ反応の第１サイクルの条件は９５℃で２分、次いで６２℃で２分、７２℃で３分である。
続くＰＣＲ反応の３５サイクルは実施例６に記載の条件と同じである。
プラスミドｐＪＣＡ１６１マトリクスと、下記のオリゴヌクレオチドとを用いてＰＣＲ反応を行い、約１０１２ｂｐの断片を増殖した。この断片をＭ断片とよぶ。
【０１０６】
【式２３】
2004501874.tif 000025
【０１０７】
ＰＣＲ反応の条件は実施例６に記載の条件と同じである。
Ｌ断片およびＭ断片のマトリクスと、オリゴヌクレオチドＪＣＡ３０９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５）およびＪＣＡ３３２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２８）とを用いてＰＣＲ反応を行い、１５５２ｂｐの断片を増殖した。ＰＣＲ反応の条件は実施例６に記載の条件と同じである。
この断片をＥｃｏＲＶおよびＮｈｅＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で１５２７ｂｐ ＥｃｏＲＶ− ＮｈｅＩ断片を単離した。この断片をＮ断片とよぶ。
プラスミドｐＪＣＡ１６１をＮｈｅＩ、次いでＥｃｏＲＶで消化し、アガロースゲル電気泳動で１５２７ｂｐ ＮｈｅＩ − ＥｃｏＲＶ断片を単離した。この断片とＮ断片とをリゲートしてプラスミドｐＪＣＡ１７６（８３２７ｂｐ）を得た。このプラスミドは自己組織化可能な突然変異した熱安定性のカプシドタンパクを作るのに十分なポリタンパクＡ１０の一部をコードする挿入断片を含む。
プラスミドｐＪＣＡ１７６を用いて実施例８に従って組換えワクシニアウイルスを構築するが、この場合は断片ＥｃｏＲＶ−ＢｇＩＩＩをプラスミドｐＪＣＡ１６１ではなく、プラスミドｐＪＣＡ１７６から得る。こうして得られた組換えウイルスをｖＶ１１０とよぶ。
【０１０８】
実施例１６
０１Ｋ構築における突然変異誘発
セリン１７９（実施例４のプラスミドｐＪＣＡ１６２によってコードされるポリタンパク内の位置であり、メチオニンイニシエータを１とする）をコードするコドンを、システインをコードするコドンに代える目的で、０１Ｋ構築に向けた突然変異誘発をオリゴヌクレオチドとＰＣＲ反応とを用いて行う。
プラスミドｐＪＣＡ１６２マトリクスと、下記のオリゴヌクレオチドとを用いてＰＣＲ反応を行い、５５９ｂｐの断片を増殖した。この断片をＯ断片とよぶ。
【０１０９】
【式２４】
2004501874.tif 000026
【０１１０】
第２のＰＣＲ反応をプラスミドｐＪＣＡ１６２マトリクスと、下記のオリゴヌクレオチドとを用いて行い、１１４７ｂｐの断片を増殖した。この断片をＰ断片とよぶ。
【０１１１】
【式２５】
2004501874.tif 000027
【０１１２】
第３のＰＣＲ反応をＯ断片およびＰ断片のマトリクスと、オリゴヌクレオチドＪＣＡ３０５（配列番号１）およびＪＣＡ３３５（配列番号３１）とを用いて行い、１６７９ｂｐの断片を増殖した。
この断片をＥｃｏＲＶおよびＮａｒｌで消化し、アガロースゲル電気泳動で１６５４ｂｐ ＥｃｏＲＶ− Ｎａｒｌ断片を単離した。この断片をＱ断片とよぶ。
プラスミドｐＪＣＡ１６２をＮａｒｌ、次いでＥｃｏＲＶで消化し、アガロースゲル電気泳動で約６６７０ｂｐ Ｎａｒｌ−ＥｃｏＲＶ断片を単離した。この断片とＱ断片とをリゲートしてプラスミドｐＪＣＡ１７７（８３２７ｂｐ）を得た。このプラスミドは自己組織化可能な突然変異した熱安定性のカプシドタンパクを作るのに十分なポリタンパクＯ１Ｋの一部をコードする挿入断片を含む。
プラスミドｐＪＣＡ１７７を用いて実施例９に従って組換えワクシニアウイルスを構築するが、この場合は断片ＥｃｏＲＶ−ＢｇＩＩＩをプラスミドｐＪＣＡ１６２ではなく、プラスミドｐＪＣＡ１７７から得る。こうして得られた組換えウイルスをｖＶ１１１とよぶ。
【０１１３】
実施例１７
Ｃ Ｓｐａｉｎ Ｏｌｏｔ構築における突然変異誘発
グリシン１７９（実施例４のプラスミドｐＪＣＡ１６３によってコードされるポリタンパク内の位置、メチオニンイニシエータを１とする）をコードするコドンをシステインをコードするコドンに代える目的で、Ｃ Ｓｐａｉｎ Ｏｌｏｔ構築に向けた突然変異誘発をオリゴヌクレオチドとＰＣＲ反応とを用いて行う。
プラスミドｐＪＣＡ１６３マトリクスと、下記のオリゴヌクレオチドとを用いてＰＣＲ反応を行い、５５９ｂｐの断片を増殖した。この断片をＲ断片とよぶ。
【０１１４】
【式２６】
2004501874.tif 000028
【０１１５】
第２のＰＣＲ反応をプラスミドｐＪＣＡ１６３マトリクスと、下記のオリゴヌクレオチドとを用いて行い、６８１ｂｐの断片を増殖した。この断片をＳ断片とよぶ。
【０１１６】
【式２７】
2004501874.tif 000029
【０１１７】
第３のＰＣＲ反応をＲ断片およびＳ断片のマトリクスと、オリゴヌクレオチドＪＣＡ３１３（配列番号９）およびＪＣＡ３３８（配列番号３４）とを用いて行い、１２１３ｂｐの断片を増殖した。
この断片をＥｃｏＲＶおよびＮａｅｌで消化し、アガロースゲル電気泳動で１６５４ｂｐ ＥｃｏＲＶ− Ｎａｅｌ断片を単離した。この断片をＴ断片とよぶ。
プラスミドｐＪＣＡ１６３をＮａｅｌ、次いでＥｃｏＲＶで消化し、アガロースゲル電気泳動で約７１２０ｂｐ Ｎａｅｌ− ＥｃｏＲＶ断片を単離した。この断片とＴ断片とをリゲートしてプラスミドｐＪＣＡ１７８（８３１２ｂｐ）を得た。このプラスミドは自己組織化可能な突然変異した熱安定性のカプシドタンパクを作るのに十分なポリタンパクＣ Ｓｐａｉｎ Ｏｌｏｔの一部をコードする挿入断片を含む。
プラスミドｐＪＣＡ１７８を用いて実施例９に従って組換えワクシニアウイルスを構築するが、この場合は断片ＥｃｏＲＶ−ＢｇＩＩＩをプラスミドｐＪＣＡ１６３ではなく、プラスミドｐＪＣＡ１７８から得る。こうして得られた組換えウイルスをｖＶ１１２とよぶ。
【０１１８】
実施例１８
Ａ２４構築における突然変異誘発
ヒスチジン１７９（実施例４のプラスミドｐＪＣＡ１６４によってコードされるポリタンパク内の位置であり、メチオニンイニシエータを１とする）をコードするコドンを、システインをコードするコドンに代える目的で、Ａ２４構築に向けた突然変異誘発をオリゴヌクレオチドとＰＣＲ反応とを用いて行う。
プラスミドｐＪＣＡ１６４マトリクスと、下記のオリゴヌクレオチドとを用いてＰＣＲ反応を行い、５５９ｂｐの断片を増殖した。この断片をＵ断片とよぶ。
【０１１９】
【式２８】
2004501874.tif 000030
【０１２０】
第２のＰＣＲ反応をプラスミドｐＪＣＡ１６４マトリクスと、下記のオリゴヌクレオチドとを用いて行い、５０７ｂｐの断片を増殖した。この断片をＶ断片とよぶ。
【０１２１】
【式２９】
2004501874.tif 000031
【０１２２】
第３ＰＣＲ反応をＵ断片およびＶ断片のマトリクスと、オリゴヌクレオチドＪＣＡ３１７（配列番号１３）およびＪＣＡ３３４（配列番号３７）とを用いて行い、１０３９ｂｐの断片を増殖した。
この断片をＥｃｏＲＶおよびＢＩｎＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で１６５４ｂｐ ＥｃｏＲＶ− ＢＩｎＩ断片を単離した。この断片をＷ断片とよぶ。
プラスミドｐＪＣＡ１６４をＢＩｎＩ、次いでＥｃｏＲＶで消化し、アガロースゲル電気泳動で約７３６０ｂｐ ＢＩｎＩ− ＥｃｏＲＶ断片を単離した。この断片とＷ断片とをリゲートしてプラスミドｐＪＣＡ１７９（約８４００ｂｐ）を得た。このプラスミドは自己組織化可能な突然変異した熱安定性のカプシドタンパクを作るのに十分なポリタンパクＡ２４の一部をコードする挿入断片を含む。
プラスミドｐＪＣＡ１７９を用いて実施例９に従って組換えワクシニアウイルスを構築するが、この場合は断片ＥｃｏＲＶ−ＢｇＩＩＩをプラスミドｐＪＣＡ１６４ではなく、プラスミドｐＪＣＡ１７９から得る。こうして得られた組換えウイルスをｖＶ１１３とよぶ。
【０１２３】
実施例１９
熱的に安定化したウイルス性中空カプシドの製造および精製
実施例１０と全く同じ方法で、組換えワクシニアウイルスｖＶ１０８をそれぞれｖＶ１１０（実施例１５）、ｖＶ１１１（実施例１６）、ｖＶ１１２（実施例１７）およびｖＶ１１３（実施例１８）に代えて、修飾されたウイルス性中空カプシドの亜型Ａ１０、Ｏ１Ｋ、Ｃ Ｓｐａｉｎ ＯｌｏｔおよびＡ２４を得た。
【０１２４】
実施例２０
熱安定性のモニタリング
口蹄疫ウイルスＡ１０の修飾されたウイルス性中空カプシド（実施例１９）を入れた１０本の管を用意して数量化する。各管には０．８μｇのカプシドを０．５ｍｌの燐酸緩衝液で調製したもの（ｐＨ７．６）を入れた。
これらの１０本の管を５０℃の水浴に１時間放置し、次いで冷却した。カプシドの各サンプルをショ糖勾配（１５〜３５％）上で１２℃で２．５時間遠心分離する（ベックマンＳＷ４０ロータで４０，０００回転／分）。得られた各勾配を１ｍｌの１２個の画分に分割する。各画分の０．５ｍｌを１ｍｌの無水エタノールの存在下で−２０℃で１６時間沈殿させる。
残留物を回収し、乾燥し、充填緩衝液中で再懸濁し（Ｍａｎｉａｔｉｓ達、１９８２年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ，ＵＳＡ）、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ１０％アクリルアミド電気泳動ゲルに載せる。基本的にタンパクＶＰ１と反応する抗１４０Ｓ Ａ１０ポリクローナルモルモット抗体によって、移動後のタンパク帯が現れる。
中空カプシドは画分７および８の勾配に移行するが、分解された中空カプシドは画分１１の勾配上部近くに留まる。
ウエスタンブロット法（［図２］）から、変異体に対応する中空カプシドは常に５０℃で１時間後に結合する（ゲルＡ）が、変異していない中空カプシドは予想通り熱処理に耐えることができないことがわかる。
【０１２５】
実施例２１
口蹄疫ウイルスの熱安定性中空カプシドを含むサブユニットワクチンの製造
実施例１１と同様な方法を、修飾されていないウイルス性中空カプシドを修飾されたウイルス性中空カプシド（実施例１９）に代えて行い、亜型Ａ１０、Ｏ１Ｋ、Ｃ Ｓｐａｉｎ ＯｌｏｔおよびＡ２４の修飾されたウイルス性中空カプシド得た。
本発明は上記実施例に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載の本発明の精神を逸脱しない限り、種々の変形例を含むものである。
【０１２６】
【配列表】
【表３】
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【０１２７】
【表４】
2004501874.tif 000033
【０１２８】
【表５】
2004501874.tif 000034
【０１２９】
【表６】
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【０１３０】
【表７】
2004501874.tif 000036
【０１３１】
【表８】
2004501874.tif 000037
【０１３２】
【表９】
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【０１３３】
【表１０】
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【０１３４】
【表１１】
2004501874.tif 000040
【０１３５】
【表１２】
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【０１３６】
【表１３】
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【０１３７】
【表１４】
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【０１３８】
【表１５】
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【０１３９】
【表１６】
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【０１４０】
【表１７】
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【０１４１】
【表１８】
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【０１４２】
【表１９】
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【０１４３】
【表２０】
2004501874.tif 000049
【図面の簡単な説明】
【図１】ウシで測定した抗口蹄疫Ａ２４の中和抗体の抗体価グラフ（ｌｏｇ表記）
【図２】得られたゲルの写真。
【図３】口蹄疫ウイルスＡ１０株のＰ１（アミノ酸２〜７３７）、２Ａ（アミノ酸７３８〜７５３）、３Ｃ（アミノ酸９１３〜１１２６）に対応するヌクレオチド配列およびアミノ酸配列。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2004501874.tif 000195
2004501874.tif 000196
2004501874.tif 000197
2004501874.tif 000198
2004501874.tif 000199
2004501874.tif 000200
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