(57)【要約】本発明は、生得の免疫系の細胞の炎症前免疫応答を誘導する能力を保持するｈｓｐ６０のフラグメントを同定する。ｈｓｐ６０のこれらのフラグメント由来のより小さいペプチドが、それらが生得の免疫系の細胞におけるｈｓｐ６０による炎症前免疫応答の誘導を低下もしくは予防さえする能力を有する限りはｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用することが可能であるという予期しない知見がさらに開示される。それはさらに、それらが免疫系の細胞におけるｈｓｐ６０による炎症前免疫応答の誘導を低下もしくは予防する能力を有する限りはｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用することが可能である、こうしたペプチドの変異体、誘導体および類似物を開示する。本発明はまた、こうしたペプチドフラグメントもしくはそれらの変異体、誘導体および類似物を含んで成る製薬学的組成物、ならびに炎症性疾患もしくは障害を予防もしくは改善するためのそれらの使用も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用する能力を有し、ｈｓｐ６０による生得の免疫系の細胞の炎症前免疫応答の誘導を低下もしくは予防するその能力を特徴とするｈｓｐ６０の変異体、誘導体、類似物もしくはペプチドフラグメント。
【請求項２】
５ないし３０アミノ酸のペプチド配列を含んで成る、請求項１に記載のｈｓｐ６０のアンタゴニスト。
【請求項３】
５ないし２５アミノ酸のペプチド配列を含んで成る、請求項１に記載のｈｓｐ６０のアンタゴニスト。
【請求項４】
７ないし１８アミノ酸のペプチド配列を含んで成る、請求項１に記載のｈｓｐ６０のアンタゴニスト。
【請求項５】
（ｉ）ヒトｈｓｐ６０の残基１２６−１６０；
（ｉｉ）ヒトｈｓｐ６０の残基１４０−１９２；
（ｉｉｉ）ヒトｈｓｐ６０の残基２２０−２５０；
（ｉｖ）ヒトｈｓｐ６０の残基２６９−２９０；
（ｖ）ヒトｈｓｐ６０の残基３１０−３４４；
（ｖｉ）ヒトｈｓｐ６０の残基３９０−４２１；および
（ｖｉｉ）ヒトｈｓｐ６０の残基３５０−４００
より成る群から選択されるｈｓｐ６０のフラグメント由来のペプチド配列を有する、請求項２−４のいずれか１つに記載のｈｓｐ６０のアンタゴニスト。
【請求項６】
ｈｓｐ６０のフラグメントが：
（ｉ）ヒトｈｓｐ６０の残基１２６−１５６；
（ｉｉ）ヒトｈｓｐ６０の残基１５７−１９１；
（ｉｉｉ）ヒトｈｓｐ６０の残基１５８−１９２；
（ｉｖ）ヒトｈｓｐ６０の残基１５８−１９１；
（ｖ）ヒトｈｓｐ６０の残基１６１−１９１；
（ｖｉ）ヒトｈｓｐ６０の残基１６１−１９２；
（ｖｉｉ）ヒトｈｓｐ６０の残基２２２−２４９；
（ｖｉｉｉ）ヒトｈｓｐ６０の残基３１０−３４４；および
（ｉｘ）ヒトｈｓｐ６０の残基３１５−３４４；
より成る群から選択される、請求項５に記載のアンタゴニスト。
【請求項７】
（ｉ）Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ；
（ｉｉ）Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ；
（ｉｉｉ）Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ；
（ｉｖ）Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ；
（ｖ）Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ；
（ｖｉ）Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ；
（ｖｉｉ）Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ；
（ｖｉｉｉ）Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ；
（ｉｘ）Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ；
（ｘ）Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ；
（ｘｉ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ；
（ｘｉｉ）Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ；および
（ｘｉｉｉ）Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ
より成る群から選択される配列を有する、請求項６に記載のｈｓｐ６０のアンタゴニスト。
【請求項８】
ｈｓｐ６０のフラグメントの主鎖が環化されたペプチド類似物であって、前記類似物は最低１個の構成単位を組み込み、前記構成単位は、アミド、チオエーテル、チオエステルもしくはジスルフィドを含んで成る架橋基に連結されたペプチド主鎖の最低１個の窒素原子を含有するものであり、ここで、最低１個の構成単位が前記架橋基を介して連結されて、第二の構成単位、該配列の１アミノ酸残基の側鎖、もしくは末端アミノ酸残基より成る群から選択される部分と環状構造を形成し、ｈｓｐ６０による生得の免疫系の細胞の炎症前免疫応答の誘導を低下もしくは予防するその能力を特徴とするｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用する能力を有する、類似物。
【請求項９】
ｈｓｐ６０のフラグメントが、請求項５−７のいずれか１つに記載の配列を有する、請求項８記載の主鎖が環化されたペプチド類似物。
【請求項１０】
ｈｓｐ６０の残基４０８−４１６の主鎖が環化されたペプチド類似物。
【請求項１１】
環状構造が：
（ｉ）ｈｓｐ６０の残基４０８および４１４；
（ｉｉ）ｈｓｐ６０の残基４０９および４１６；
（ｉｉｉ）ｈｓｐ６０の残基４０８および４１６；ならびに
（ｉｖ）ｈｓｐ６０の残基４０９および４１４
より成る群から選択される位置に配置される２個の構成単位を架橋することにより形成される、請求項１０に記載の主鎖が環化されたペプチド類似物。
【請求項１２】
（ａ）細胞表面上に無傷のＴｏｌｌ様レセプター複合体を担持する生得の免疫系の細胞を、ｈｓｐ６０のフラグメントと接触させること；および
（ｂ）該細胞により産生された炎症前メディエーターもしくはエフェクターの量を測定すること
の段階を含んで成り、
ここで、前記炎症前メディエーターもしくはエフェクターの産生の増大が、生得の免疫系による炎症前応答を導き出すｈｓｐ６０のフラグメントの能力を示す、炎症前免疫応答を導き出す能力を有するｈｓｐ６０のフラグメントの同定方法。
【請求項１３】
段階（ｂ）が、該細胞により産生されたＴＮＦαおよび／もしくはＮＯの量を測定することを含んで成り；
ここで、ＴＮＦαおよび／もしくはＮＯの産生の増大が、生得の免疫系による炎症前応答を導き出すｈｓｐ６０のフラグメントの能力を示す、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）細胞表面上にＴｏｌｌ様レセプター複合体を担持する生得の免疫系の細胞を、試験されるべき化合物の存在下および非存在下で、ｈｓｐ６０、もしくは炎症前応答を誘導する能力を有するそのフラグメントと接触させること；ならびに
（ｂ）該化合物の存在が、前記細胞による炎症前メディエーターもしくはエフェクターの産生に対する影響を有するかどうかを決定すること
の段階を含んで成り、
ここで、前記炎症前メディエーターもしくはエフェクターの産生の低下もしくは予防が、ｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用する該化合物の能力を示す、
それらがｈｓｐ６０による炎症前応答の誘導を低下もしくは予防することができることを特徴とするｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用することができる化合物の同定、スクリーニングおよび／もしくは特徴づけ方法。
【請求項１５】
段階（ｂ）が、該細胞により産生されたＴＮＦαおよび／もしくはＮＯの量を測定することを含んで成り；
ここで、産生ＴＮＦαおよび／もしくはＮＯの低下もしくは予防がｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用する該化合物の能力を示す、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
有効成分として請求項１ないし１１のいずれか１つに記載のｈｓｐ６０のアンタゴニストを含んで成る、製薬学的組成物。
【請求項１７】
炎症性疾患もしくは障害の治療のための製薬学的組成物の製造のための、請求項１ないし１１のいずれか１つに記載のｈｓｐ６０のアンタゴニストの使用。
【請求項１８】
炎症性疾患が：自己免疫疾患、糖尿病、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、慢性炎症、アテローム硬化症、炎症性腸疾患、反応性関節炎、慢性感染症、移植片拒絶、歯肉炎、胃炎、潰瘍、血栓症、アレルギーおよび急性感染症から選択される、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
有効成分として、治療上有効な量の請求項１−１１のいずれか１つに記載のｈｓｐ６０のアンタゴニストを含んで成る製薬学的組成物を用いる、それの必要な患者の治療方法。
【請求項２０】
自己免疫疾患、糖尿病、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、慢性炎症、アテローム硬化症、歯肉炎、炎症性腸疾患、反応性関節炎、慢性感染症、移植片拒絶、胃炎、潰瘍、血栓症、アレルギーおよび急性感染症から選択される炎症性疾患の治療のための、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
有効成分として、請求項１−１１のいずれか１つに記載のｈｓｐ６０のアンタゴニストを含んで成る製薬学的組成物を用いる、それの必要な患者の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ｈｓｐ６０による生得の免疫系の炎症前応答の誘導を低下もしくは予防する能力を有することを特徴とするｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用することが可能なペプチドおよびペプチド類似物に関する。本発明は、さらに、炎症性障害および自己免疫疾患の予防もしくは治療に有用な、こうしたペプチドおよびペプチド類似物もしくは変異体ならびにそれらの誘導体を含んで成る製薬学的組成物に関する。
【０００２】
（発明の背景）
熱ショックタンパク質
熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）は、全ての種の全ての細胞により産生される遍在性ポリペプチドである。熱ショックタンパク質は、分子シャペロンとして作用する構成タンパク質（Ｂｅｃｋｅｒ　Ｊ．とＣｒａｉｇ　Ａ．Ｅ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９；１１、１９９４）および誘導可能なストレスタンパク質の双方として発現され、そして従ってストレスタンパク質ともまた称される。細胞内でのｈｓｐ発現のアップレギュレーションは、細胞が温度の突然の増大に直面された場合に最初に記述された。後に、他の傷害もまたｈｓｐ合成を誘導する可能性があることが見出された。
【０００３】
分子シャペロンは、複合体中のオリゴマータンパク質の翻訳後集成、タンパク質の細胞内フォールディングおよび輸送、ならびに誤ったフォールディング（ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ）（変性）もしくは不必要なタンパク質−タンパク質相互作用からの変性されたタンパク質の「保護」において不可欠の役割を演じるタンパク質である。
【０００４】
熱ショックタンパク質は、一方で配列および他方で機能の双方に関して系統発生上最良に保存されたタンパク質のひとつである。ヒトおよび細菌の熱ショックタンパク質は５０％以上相同である（Ｊｉｎｄａｌら　Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．９：２２７９、１９８９）。
自己免疫および炎症におけるｈｓｐ６０
ｈｓｐ６０は、タンパク質のフォールディングおよび変性、ならびにミトコンドリアへのタンパク質の転移における主要な役割をもつミトコンドリアのシャペロンである。ミトコンドリア中で、それはこれらのタンパク質の再フォールディング、および必要な場合にはオリゴマー複合体へのそれらのその後の集成を助長する。
【０００５】
ｈｓｐ６０は、ストレスの多いおよび炎症の条件下で細胞の細胞質中で見出され；細胞の感染もしくは上昇されたサイトカインレベルが細胞のストレス応答を誘導することができる。従って、ｈｓｐ６０が高度に免疫原性のタンパク質であることは驚くべきことでない。すなわち、それはグラム陰性細菌の「共通抗原」である。細菌および自己の双方のｈｓｐ６０に対する免疫学的反応性は一般的集団において高度に優勢である。病原体に向けられる免疫応答は、高い相同性により自己免疫応答に容易に転化する可能性があるためである。
【０００６】
複数のｈｓｐ６０エピトープに対するＴ細胞応答は、１型糖尿病（Ｅｌｉａｓら　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　８８：３０８８、１９９１）、慢性関節リウマチおよび若年性関節炎、多発性硬化症、強直性脊椎炎、骨盤炎症関連の不妊症、炎症性腸疾患、アテローム硬化症、移植片拒絶、それ以上を包含する、多様な自己免疫および炎症性疾患（ｖａｎ　Ｅｄｅｎら　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　１９；３０３、１９９８）で存在する。免疫系は、ヒトと細菌の類似物との間で交差反応性であるかもしくは特異的であるかのいずれかのｈｓｐ６０エピトープと反応する。
【０００７】
免疫学的寛容は、実験系においてこれまでｈｓｐ６０エピトープに達しておらず、免疫系がこの特定のタンパク質を認識するよう素因を作られていることを示す。それは、一般的（健康）集団ならびに炎症性障害をもつ患者において強力に免疫原性のタンパク質である。
【０００８】
良性および病原性の細菌への連続的曝露は、細菌のｈｓｐ６０に宿主を再曝露することにより、ｈｓｐ６０の応答に対する追加免疫（ｂｏｏｓｔｅｒ）として作用する。さらに、感染の間に分泌される炎症性サイトカインは、自己ｈｓｐ６０の局所組織発現を上昇させる。炎症の間に損傷された細胞は、免疫学的に活性の環境に対し大量の自己ｈｓｐ６０を放出し、免疫に至る。
【０００９】
標的組織中でのｈｓｐ６０発現を伴う炎症性疾患は：
（ｉ）自己免疫疾患：糖尿病（Ｂｉｒｋら　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　９３：１０３２、１９９６）、多発性硬化症、慢性関節リウマチ（ｖａｎ　Ｅｄｅｎら　Ｎａｔｕｒｅ、３３１：１７１、１９８８）、若年性慢性関節炎
（ｉｉ）慢性炎症：炎症性腸疾患、反応性関節炎。
（ｉｉｉ）移植片拒絶（Ｂｉｒｋら　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、９６：５１５９、１９９９）。
（ｉｖ）アテローム硬化症
を包含する。
ｈｓｐ６０およびアテローム硬化症：
ｈｓｐ６０は、ヒトｈｓｐ６０に対する自己抗体が患者および実験動物モデルの臨床状態と相関することが立証されたため、アテローム硬化症に関係している。示唆された機構は、自己反応性のｈｓｐ６０特異的なＴ細胞が大動脈内膜の内皮細胞上で過剰発現されるｈｓｐ６０に応答することであった。代替の一機構が、ｈｓｐ６０がアテローム中のマクロファージの８９％で発現されるという知見により示唆される。さらに、ｈｓｐ６０は、ＴＮＦα、ＩＬ−６およびマトリックス分解性メタロプロテイナーゼの産生のようなアテローム硬化症に関係したマクロファージ機能を刺激する可能性がある。ｈｓｐ６０は同様に内皮細胞に作用して、Ｅ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１およびＩＬ−６の産生を誘導する。接着分子はアテロームへの単球およびリンパ球の転送を高める一方、炎症前サイトカインは斑の不安定性および血栓症を高めることができる。従って、ｈｓｐ６０は、標的およびエフェクター細胞双方におけるアテローム発生を促進する夥しい分子の発現を活性化する可能性がある。
治療における熱ショックタンパク質の使用
いくつかの開示は、自己免疫疾患の診断、治療もしくは予防における免疫調節物質としての熱ショックタンパク質の使用を特許請求する。特許文書の大部分は、以前にｈｓｐ６５としてもまた知られた細菌の熱ショックタンパク質６０もしくはこれらのタンパク質のフラグメントに関する。
【００１０】
例えば、ＩＤＤＭの発生の予兆の診断マーカーとしてはたらく、ＩＤＤＭの発症の間に人体により産生される特定のタンパク質は、約６５ｋＤの大きさを有するヒト熱ショックタンパク質（ヒトｈｓｐ６５）、もしくは欧州特許第０４１７２７１号、ならびに米国特許第５，１１４，８４４号；同第５，６７１，８４８号；同第５，５７８，３０３号および同第５，７８０，０３４号明細書に開示されるところのそれと交差反応性の抗原である。
【００１１】
本ｈｓｐ６０タンパク質のフラグメントがＩＤＤＭおよび宿主対移植片病の予防もしくは緩和において治療上有用な実体として作用するかもしれないことが開示されている（国際特許出願第ＷＯ　９６／１９２３６号、同第ＷＯ　９７／０１９５９号および同第ＷＯ　９８／０８５３６号明細書）。
【００１２】
加えて、ｈｓｐ６０のフラグメントは、米国特許第５，７３６，１４６号および同第５，８６９，０５８号明細書に開示されるとおり、不十分に免疫原性の抗原の免疫原性を増大させることにより、合成ワクチンの開発のための担体として使用されるかもしれない。
【００１３】
欧州特許第０２６２７１０号明細書は、自己免疫性関節炎および類似の自己免疫疾患の緩和、治療および診断に有用なポリペプチドを開示する。該特許請求されるポリペプチドは、「抗原Ａ」と命名された細菌タンパク質（後にミコバクテリアのｈｓｐ６０と同定された）由来である。
【００１４】
ＰＣＴ出願第ＷＯ　９２／０４０４９号明細書は、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ｈｓｐ６０のフラグメントに相同な最低７アミノ酸のペプチドを開示し、これはＴリンパ球の活性化および増殖を阻害し、そして免疫反応および免疫関係疾患から保護することができる。
【００１５】
ＰＣＴ出願第ＷＯ　８９／１２４５５号および同第ＷＯ　９４／２９４５９号明細書は、免疫応答を生じさせるかもしくは高める、または免疫寛容を誘導する、自己免疫疾患の予防もしくは治療、ならびに感染症もしくは癌を治療もしくは予防するためのストレスタンパク質および類似物の使用を開示する。それに対する免疫応答が望ましいタンパク質に融合されたストレスタンパク質を含んで成る融合タンパク質が特許請求される。
【００１６】
ＰＣＴ出願第ＷＯ　９５／２５７４４号明細書は、炎症性自己免疫疾患を治療および予防するため、ならびに移植片拒絶を予防するために使用される、関係した哺乳動物エピトープに相同なエピトープを含有する微生物のストレスタンパク質フラグメントを開示する。保護的エピトープはストレスタンパク質の短い５〜１５ＡＡの領域中に配置され、それらは微生物と動物との間で高度に保存されている。
【００１７】
ＰＣＴ出願第ＷＯ　９７／１１９６６号および同第ＷＯ　９６／１００３９号明細書は、自己免疫性疾患、とりわけ関節炎の予防もしくは治療に有用である、微生物の熱ショックタンパク質由来の２１アミノ酸までのポリペプチドを開示する。
【００１８】
ＰＣＴ出願第ＷＯ　９６／１６０８３号明細書は、炎症性の病態、とりわけ慢性関節リウマチの治療のための製薬学的製品中で有用であるヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の１０ｋＤの熱ショックタンパク質（ｈｓｐ１０）由来のペプチド２５アミノ酸長を開示する。
【００１９】
ＰＣＴ出願第ＷＯ　９１／０２５４２号明細書は、ＩＬ−６および／もしくはＴＮＦαの異常に高い放出により引き起こされるもしくは付随される慢性の炎症性障害を治療するための、ミコバクテリウム　バッケ（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｖａｃｃａｅ）由来の抗原性および／もしくは免疫調節性物質、ならびにとりわけｈｓｐ６０の使用を開示する。
【００２０】
ＰＣＴ出願第ＷＯ　９６／１８６４６号明細書は、自己免疫性のＣＮＳ疾患、例えば多発性硬化症、慢性炎症性ＣＮＳ疾患および原発性脳腫瘍の治療もしくは予防に使用されるミコバクテリアｈｓｐ６０由来の９〜２０アミノ酸のペプチドを開示する。
【００２１】
他の発明者らがｈｓｐ６０以外の熱ショックタンパク質を治療に使用する。例えば、米国特許第５，３４８，９４５号明細書は、外因性ｈｓｐ７０を使用するアテローム硬化症、動脈再狭窄および酸素欠乏性神経損傷の治療のための、熱ショックタンパク質を用いるストレスをかけられた組織中での死亡の低下方法を開示する。
【００２２】
他の発明（例えば、日本国特許第１０２１２２３０号、同第０９２４１１５９号明細書）は、ｈｓｐ６０もしくはｈｓｐ２７ファミリーに属するタンパク質の発現を阻害し、そして従って自己免疫疾患および癌の治療に有用である合成および天然の化合物および抽出物を開示する。
Ｔｏｌｌタンパク質
国際特許出願第ＷＯ　９９／２０７５６号明細書は，ヒトＴｏｌｌタンパク質およびこれらのタンパク質を特異的に結合する抗体をコードするＤＮＡ配列を開示する。該ポリペプチドは、Ｔｏｌｌに媒介される形質導入に関与する他のタンパク質（例えば天然のリガンド）を同定するため、レセプターおよびリガンドの模倣物についてスクリーニングするため、ならびに抗体を生成させるために使用される。
【００２３】
国際特許出願第ＷＯ　９８／５０５４７号明細書は、Ｔｏｌｌ様レセプターのヒトＤＮＡならびにそれら由来のタンパク質およびペプチドを開示する。該化合物は、リン酸代謝の変化、炎症機能もしくは生得の免疫応答の調節における使用について特許請求される。結合する化合物、好ましくはこれらのタンパク質もしくはペプチドに特異的に結合する抗体もしくは抗体フラグメントもまた開示される。
【００２４】
しかしながら、前述の過程におけるＴｏｌｌタンパク質の正確な役割は解明されていない。
【００２５】
従って、ある種の疾患に影響することにおいて、およびとりわけ炎症前免疫応答の調節において、自己のｈｓｐ６０およびおそらくＴｏｌｌ様レセプター複合体の役割を調節すること、ならびに、こうした応答を抑制もしくは予防さえするのに有用である分子を提供することの必要性が存在する。
【００２６】
背景技術のいずれも、ｈｓｐ６０のアンタゴニストとして有用でありかつｈｓｐ６０による炎症前免疫応答の誘導を低下もしくは予防する能力を有する、本明細書に開示されるｈｓｐ６０ペプチド、変異体、誘導体および類似物を教示もしくは示唆しない。
【００２７】
（発明の要約）
ｈｓｐ６０による生得の免疫系の細胞の炎症前免疫応答の誘導を低下もしくは予防する能力を有することを特徴とするｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用することが可能であるｈｓｐ６０の新規抗炎症性ペプチドを提供することが、本発明の一目的である。ｈｓｐ６０による炎症前の生得の免疫応答の誘導を低下もしくは予防する能力を有することを特徴とするｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用することが可能であるｈｓｐ６０のペプチドの変異体、誘導体および類似物を提供することが、本発明の別の目的である。本発明のアンタゴニストは、好ましくは５ないし３０アミノ酸残基、より好ましくは５ないし２５アミノ酸残基、最も好ましくは７ないし１８アミノ酸残基を含んで成るペプチド、ならびにそれらの変異体、誘導体もしくは類似物であることができる。
【００２８】
本発明のさらなる一目的は、炎症前免疫応答を導き出すのに適切であるｈｓｐ６０の部分の同定、およびこうした応答を低下もしくは予防する分子を提供することに関する。従って、約２０ｋＤもしくはそれ未満の分子量を有しかつ炎症前の生得の免疫応答を誘導するｈｓｐ６０の能力を保持するヒトｈｓｐ６０タンパク質のフラグメントを提供することが、本発明の別の目的である。これらのフラグメントは、それらがｈｓｐ６０により誘導される炎症応答のアンタゴニストとしてはたらくことを特徴とする変異体、誘導体および類似物の設計のために、本発明によりとりわけ有用である。
【００２９】
本発明の原理によれば、ｈｓｐ６０のある種の炎症前フラグメントが、阻害性の変異体、誘導体および類似物の設計における有用な先導物としてはたらくために同定された。予期されないことに、これらのフラグメント以内からのより短いペプチドが、それらがｈｓｐ６０により誘導される炎症前応答を低下もしくは予防さえすることができることを特徴とする抗炎症活性を所有することが今や開示される。これらのより短いペプチドは、本明細書でｈｓｐ６０の抗炎症性ペプチドと称することができる。
【００３０】
一般に、本発明の抗炎症性のペプチド、誘導体および変異体は、プロセシングを受けかつ必ずしも天然のタンパク質中で露出されていないｈｓｐ６０のエピトープ由来であることができる。逆に、それらはｈｓｐ６０分子の表面上に露出されるタンパク質のエピトープもしくはループ由来であることができる。
【００３１】
本発明により、現在より好ましい類似物が、ｈｓｐ６０と呼称される分子のある種のエピトープを模倣するように設計されることが今や開示される。最も好ましいペプチドはヒトｈｓｐ６０の類似物を包含する一方、付加的な好ましい類似物は細菌のｈｓｐ６０の類似物を包含する。
【００３２】
本発明の最も好ましい態様によれば、抗炎症性ペプチド、ならびに開示および特許請求されるフラグメントの変異体、誘導体および類似物は、ｈｓｐ６０により誘導される炎症応答のアンタゴニストとして作用するそれらの能力を特徴とする。
【００３３】
それらが対応する直鎖状配列に比較して改良された特性を有する、熱ショックタンパク質もしくはそれら由来のペプチドの環状誘導体および類似物を提供することが、本発明のなお別の目的である。改良された特性は、限定されるものでないが、延長された代謝安定性、もしくは作用の高められた選択性を挙げることができる。
【００３４】
本発明のフラグメントの変異体および誘導体の好ましい一態様において、これらの分子は、架橋基に連結されたペプチド主鎖の１個の窒素原子を含有する最低１個の構成単位を組み込む主鎖が環化されたペプチド類似物であるようにさらに改変される。好ましくは、これらの環状ペプチド類似物は、直鎖状ペプチド配列の５ないし３０アミノ酸残基に対応することができる。より好ましい主鎖が環化された類似物は５〜１８残基を有し、最低１個の構成単位が末端、側鎖もしくは別の構成単位に連結されて環状ペプチド類似物を形成する。とりわけ、より大きな特異性をもつペプチド類似物に到達しそれにより高められた臨床選択性に到達することが一般に望ましい。
【００３５】
本発明の現在最も好ましい抗炎症性ペプチド、および該ペプチド配列の変異体、誘導体もしくは類似物が今や開示される。すなわち、
好ましい態様は、ヒトｈｓｐ６０の配列由来である。付加的な好ましい態様は細菌ｈｓｐ６０の配列由来である。
【００３６】
本発明の好ましい態様は：
ａ．ヒトｈｓｐ６０の残基１２６−１６０。この領域のより好ましい一部分はヒトｈｓｐ６０の残基１２６−１５６にわたる。
ｂ．ヒトｈｓｐ６０の残基１４０−１９２。この領域のより好ましい部分は、ヒトｈｓｐ６０の残基１５７−１９１、１５８−１９２、１５８−１９１、１６１−１９１および１６１−１９２にわたる類似物を含んで成る。
ｃ．ヒトｈｓｐ６０の残基２２０−２５０。この領域の最も好ましい一部分はヒトｈｓｐ６０の残基２２２−２４９にわたる。
ｄ．ヒトｈｓｐ６０の残基２６９−２９０。
ｅ．ヒトｈｓｐ６０の残基３１０−３４４。この領域の好ましい一部分はヒトｈｓｐ６０の残基３１５−３４４にわたる。
ｆ．ヒトｈｓｐ６０の残基３９０−４２１。
ｇ．本発明の現在最も好ましい一態様は、ヒトｈｓｐ６０の残基３５０−４００の部分に対応する誘導体、変異体およびペプチド類似物を含んで成る。
より成る群から選択される配列を有するフラグメントの抗炎症性のペプチド、変異体、誘導体および類似物を包含する。
【００３７】
本発明の付加的な最も好ましいペプチドおよびペプチド類似物は：
ｉ．ヒトｈｓｐ６０の残基２２７−２３６に対応するＴｙｒ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ
ｉｉ．ヒトｈｓｐ６０の残基３６４−３７３に対応するＬｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ
ｉｉｉ．ヒトｈｓｐ６０の残基３６９−３７８に対応するＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ
ｉｖ．ヒトｈｓｐ６０の残基３７１−３８０に対応するＩｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ
ｖ．ヒトｈｓｐ６０の残基３７２−３８１に対応するＧｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ
ｖｉ．ヒトｈｓｐ６０の残基４０３−４１２に対応するＶａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ
ｖｉｉ．ヒトｈｓｐ６０の残基４０５−４１４に対応するＬｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ
である。
【００３８】
本発明の付加的なより好ましい誘導体、変異体およびペプチド類似物は、ヒトｈｓｐ６０配列の残基３６４−３８１、すなわちＬｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒに基づく。この配列の好ましい抗炎症性のペプチドおよびペプチド類似物は、場合によっては最低１個の残基がアラニンで置き換えられた１０〜１８アミノ酸残基を含んで成る。現在最も好ましいペプチド類似物は：
ｉ．ヒトｈｓｐ６０の残基３６７−３８１に対応するＬｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ；
ｉｉ．ヒトｈｓｐ６０の残基３７２−３８１に対応するＬｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ
である。
【００３９】
本発明の別の好ましい態様は、ヒトｈｓｐ６０の残基４０３−４１２の誘導体、変異体およびペプチド類似物を含んで成る。この領域の最も好ましい類似物は、以下の配列：
ｉ．Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ；
ｉｉ．Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ；
ｉｉｉ．Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ；
ｉｖ．Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ
を包含する。
【００４０】
本発明のなお他のより好ましい類似物は、ヒトｈｓｐ６０の残基４０８−４１６の主鎖が環化されたペプチド誘導体、変異体および類似物である。これらの類似物は、場合によっては位置４１５にＡｓｎの代わりに１個のＧｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｅｕもしくは２Ａｂｕ残基を有する。
【００４１】
この配列の現在最も好ましい類似物は：残基４０８および４１４、残基４０９−４１６、残基４０８−４１６、ならびに残基４０９−４１４より成る群から選択される位置に２個の架橋基を含んで成る主鎖が環化されたノナペプチドを包含する。他の好ましい主鎖が環化された類似物は５〜１８残基を有し、最低１個の構成単位が末端、側鎖もしくは別の構成単位に連結されて環状ペプチド類似物を形成する。
【００４２】
上および実施例に列挙される全部の配列はそれ自体有用であり、かつ、改良された特性をもつ誘導体、変異体および類似物の設計および合成の基礎としてもまた使用してよい。
【００４３】
本発明の別の目的は、ｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用することができる本発明のフラグメントの変異体、誘導体もしくは類似物、および場合によっては製薬学的に許容できる担体を含んで成る製薬学的組成物を提供することである。
【００４４】
本発明はさらに、本発明のフラグメントの変異体もしくは誘導体を含んで成る製薬学的組成物の製造方法に関する。
【００４５】
前記化合物の製薬学的組成物への処方は、製薬学的に許容できる担体、賦形剤および／もしくは希釈剤の添加をさらに含んでよい。
【００４６】
熱ショックタンパク質の薬理学的に活性な類似物および製薬学的に許容できる担体もしくは希釈剤を含んで成る製薬学的組成物は、こうした組成物を使用する慢性の炎症性疾患、移植片拒絶および自己免疫疾患の治療方法がそうであるとおり、本発明の別の態様を表す。
【００４７】
本発明の製薬学的組成物は、有利には、最低１種の抗炎症性ペプチドもしくはペプチド類似物を含んで成り、その配列は熱ショックタンパク質分子の一部分に由来するかもしくはそれを模倣する。これらの製薬学的組成物は、経口で、局所でもしくは全身でを包含するいずれかの適する投与経路により投与してよい。好ましい投与様式は、限定されるものでないが静脈内および筋肉内注入のような非経口経路を挙げることができる。付加的な好ましい投与経路は、限定されるものでないが鼻吸入もしくは経口摂取を介する投与を挙げることができる。
【００４８】
それらがｈｓｐ６０による炎症前応答の誘導を低下もしくは予防することができる限りはｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用することができる化合物の同定、スクリーニングおよび／もしくは特徴づけ方法を提供することが、本発明の別の目的である。試験されるべき化合物は、いずれかの可能な化合物、例えば、上述されたところのｈｓｐ６０のフラグメントの変異体および誘導体、無機もしくは有機化合物、抗体、例えばモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、Ｆａｂフラグメントのような抗体フラグメント、可溶性のＴｏｌｌ様レセプター４もしくはＴｏｌｌ様レセプター２、またはこれらのレセプターのフラグメントもしくは複合体などであることができる。
【００４９】
炎症前免疫応答を導き出す能力を有するｈｓｐ６０のフラグメントの同定、スクリーニングおよび／もしくは特徴づけ方法、ならびに／または、本発明のｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用することができる化合物の同定方法はまた、高スループットおよび超高スループットの定量および／もしくは定性的スクリーニング方法を含んでよい。
【００５０】
本発明の化合物は、それらの病因論もしくは病理学に熱ショックタンパク質を伴う疾患の予防もしくは治療のための製薬学的組成物中の有効成分として有用である。
【００５１】
この点に関して、ｈｓｐ６０が生得の免疫系の細胞の炎症前免疫応答の誘導の原因である、ある種の疾患および病状の抑制もしくは予防で有用である分子を提供することが、本発明の一目的である。
【００５２】
本発明は、従って、自己免疫性疾患（限定されるものでないが糖尿病、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、重症筋無力症および全身性エリテマトーデスを挙げることができる）、慢性炎症（限定されるものでないがアテローム硬化症、炎症性腸疾患、反応性関節炎を挙げることができる）、慢性感染症、移植片拒絶、歯肉炎、胃炎、潰瘍、血栓症、アレルギーならびに急性感染症のような炎症性疾患の治療のための製薬学的組成物の製造のための、本発明のｈｓｐ６０のフラグメントの変異体、誘導体もしくは類似物の使用に関する。
【００５３】
背景技術における開示はｈｓｐ６０由来の多数の特定のペプチドに関し、それらは特異的Ｔ細胞レセプターとのそれらのペプチドの相互作用に基づく特定の疾患もしくは障害の治療で有用である。本発明は、免疫系の他の細胞により媒介される生得の免疫応答の抑制もしくは予防に有用であるｈｓｐ６０の新規ペプチドに向けられ、かつ、Ｔ細胞応答を調節するそれらの能力について以前に特許請求された既知のｈｓｐ６０ペプチドの全部を除外する。
【００５４】
（発明の詳細な記述）
本発明は、生得の免疫系の細胞による炎症前免疫応答を誘導することが可能であるｈｓｐ６０のフラグメントの同定に関する。より具体的には、本発明は、それらがｈｓｐ６０による炎症前免疫応答の誘導を低下もしくは予防する能力を有する限りはｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用することが可能であるこれらのフラグメントのより小さい抗炎症性ペプチド、変異体および誘導体にさえ関する。本発明はまた、こうしたペプチドもしくは変異体およびそれらの誘導体を含んで成る製薬学的組成物にも関する。
【００５５】
本発明は、ｈｓｐ６０がＴｏｌｌ様レセプター４複合体に結合し、そして結果として下に例示されるところの生得の免疫系の細胞における強力な炎症前応答を導き出すという知見に基づく。こうした応答は上述されるところのｈｓｐ６０のより小さいフラグメントによってもまた導き出される可能性があることがさらに見出された。本発明により提供される知識を用い、生得の免疫系の細胞において炎症前応答を導き出すのに重要なｈｓｐ６０の領域を同定することが今や可能である。
【００５６】
予期されないことに、抗炎症特性を所有するｈｓｐ６０のより小さいペプチドさえ同定することが可能であること、および、これらのペプチドは無傷のｈｓｐ６０への曝露により導き出される炎症応答を低下もしくは予防することが可能であることが今や開示される。
【００５７】
一アプローチは、ｈｓｐ６０の三次元モデルを構成すること、および（ａ）ないし（ｌ）の前述のアミノ酸伸長のどれが溶媒に露出されることが期待されるかを決定することである。ｈｓｐ６０の三次元モデルは、その細菌の相同物のＧＲＯＥＬタンパク質データベースエントリＰＤＢ　１ｇｒｌ．ｅｎｔ（Ｂｒａｉｇら、Ｎａｔｕｒｅ　３７１（１９９４）、５７８もまた参照されたい）の結晶学的に既知の構造からの相同性により構成された。従って、例えば溶媒に露出されているとして同定されたアミノ酸伸長ならびにそのより小さいフラグメントを化学的に合成すること、ならびに、上述されたところのアッセイを使用して炎症前もしくは抗炎症性のいずれかの応答を導き出すそれらの能力についてそれらを試験することが可能である。
【００５８】
さらに、ｈｓｐ６０がＴｏｌｌ様レセプター４複合体に結合するという知識に基づき、ｈｓｐ６０の配列を、Ｔｏｌｌが背腹のパターン形成（ｄｏｒｓｏ−ｖｅｎｔｒａｌ　ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ）を制御するドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）でのＴｏｌｌレセプターの天然のリガンドであるｓｐａｅｔｚｌｅタンパク質（ＭａｒｉｓａｔｏとＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ｃｅｌｌ　７６（１９９４）、６７７）のものと比較することが今や可能である。この比較（スキームＩを参照されたい）により、６領域の相同性を決定することができ、それによりＴｏｌｌ様レセプター４複合体の認識部位に潜在的に結合することができるｈｓｐ６０内のアミノ酸配列の同定を可能にする。
【００５９】
ｈｓｐ６０のこれらのエピトープもしくはフラグメント内で同定されたより小さいｈｓｐ６０ペプチドが、それらが下で広範囲に例示されるとおりｈｓｐ６０に対する応答を低下もしくは予防する限りはそれら自身が抗炎症活性を発揮することができることが、予期されないことに発見された。
【００６０】
さらに、ｓｐａｅｔｚｌｅタンパク質の二次構造を予測することが可能である。これは、ｓｐａｅｔｚｌｅタンパク質の対応する部分に対する構造的類似性を示すｈｓｐ６０のフラグメントの同定を可能にする。６領域の分析は：
領域１はｓｐａｅｔｚｌｅの２種のフラグメントとのとかなりの程度の相同性を示す（この領域および整列はスキームＩ中の箱１として印をつけられる。箱中の矢印は、該フラグメントが次の行に続くことを示す）。
【００６１】
【表１】
2004501061.tif 000002
【００６２】
領域２はｓｐａｅｔｚｌｅに対する配列の相同性を示さないが、それでもなお、２個のループ（一方は第一のヘリックスに先行しかつ他方は２個の間）と一緒にｈｓｐ６０内の２個の溶媒に露出されるヘリックスにわたる。ループおよびヘリックスの双方が溶媒に露出され、そして従ってｈｓｐ６０上の潜在的認識部位である。ｓｐａｅｔｚｌｅは４本のヘリックスの束であると予測されるため、同一のレセプターによる認識を可能にする領域２とｓｐａｅｔｚｌｅとの間の構造の相同性が、この領域内の明らかな配列の相同性の欠如にもかかわらず、可能である。
【００６３】
領域３はｓｐａｅｔｚｌｅの単一のフラグメント（スキームＩ中の箱２として印をつけられる）と有意の相同性を示す。この領域は高度に柔軟性であり、ＧＲＯＥＬ結晶構造、そしてこれゆえにｈｓｐ６０モデル中の表面に露出されたループである。領域３に相同な領域中のｓｐａｅｔｚｌｅの二次構造もまたループであると予測される。従って、分析の全部が、このフラグメントがｔｏｌｌレセプターによる認識の見込みのある候補であると示唆する。
【００６４】
領域４は、ｓｐａｅｔｚｌｅの１フラグメント（スキームＩ中の箱３として印をつけられる）と有意の相同性を示す。それはｈｓｐ６０モデル中で部分的にのみ露出される。この領域とｓｐａｅｔｚｌｅ中の対応する領域との間の構造の比較は、このフラグメントの大きな一部分がＧＲＯＥＬ結晶中で乏しい電子密度を示すため、単純でない。
【００６５】
領域５は、相同性を示す短いフラグメントにより尾をつけられるｓｐａｅｔｚｌｅと配列の相同性を示さないｈｓｐ６０の大きなフラグメントにわたる（スキームＩ中の箱４）。このフラグメントのＣ末端部分（箱４配列を包含しかつ上流の付加的な９残基が表面に露出される）。
【００６６】
領域６はｓｐａｅｔｚｌｅの２種のフラグメントとの相同性を示す（スキームＩ中の箱５；矢印は次の行へのこの領域の連続の限界を定める）。該フラグメント全体は、表面に露出されたヘリックス、次いで短いβ−鎖、短い部分的に露出されたループおよび付加的なヘリックスより成る。第一のヘリックスに相同なｓｐａｅｔｚｌｅフラグメントはループであると予測されるが、それでもなおＣ末端ヘリックスに相同なフラグメントもまたヘリックスであると予測される。Ｌｙｓ３５９ないしＡｓｐ３９９にわたるｈｓｐ６０の付加的な一領域はｓｐａｅｔｚｌｅの１フラグメントに対するかなりの程度の相同性を示し、かつ、溶媒に露出される。
を示した。
【００６７】
本発明の現在好ましい一態様において、ヒトｈｓｐ６０タンパク質のフラグメントは、ヒトｈｓｐ６０のトリプシン消化物により、とりわけ、ｈｓｐ６０タンパク質を好ましくは１：５４の酵素／タンパク質重量比でトリプシンで処理すること、反応混合物を３７℃でそれぞれ０．５、１．５、５．４および１６．５時間インキュベートすること、反応を停止した後にこれらの反応混合物を合わせること、それらを遠心分離すること、上清を濾過しそしてそれを０．５ｍｌ／分の速度でＰＢＳを用いてスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）−７５　ＦＰＬＣカラム上でのゲル濾過クロマトグラフィーにかけること、画分を収集すること、場合によってはそれらを濃縮すること、および上述されたところの炎症前応答を誘導するそれらの能力についてそれらをアッセイすることにより、得ることができる。さらなる精製のためには、炎症前応答についての試験で活性である画分を、水中０．１％ＴＦＡおよびアセトニトリル中０．１％ＴＦＡの勾配を用いるＣ−４カラム上での逆相ＨＰＬＣにかけ、画分を収集し、そして炎症前免疫応答を誘導するそれらの能力についてそれらを再度試験することができる。
【００６８】
さらにより好ましい一態様において、本発明のフラグメントは、天然のｈｓｐ６０タンパク質中に存在する以下のアミノ酸伸長：
（ｉ）Ｇｌｕ１２６ないしＬｙｓ１５６；
（ｉｉ）Ｌｙｓ１５７ないしＬｙｓ１９１；
（ｉｉｉ）Ｇｌｎ１５８ないしＬｙｓ１９２；
（ｉｖ）Ｇｌｎ１５８ないしＬｙｓ１９１；
（ｖ）Ｐｒｏ１６１ないしＬｙｓ１９１；
（ｖｉ）Ｐｒｏ１６１ないしＬｙｓ１９２；
（ｖｉｉ）Ｇｌｙ２２２ないしＬｙｓ２４９；
（ｖｉｉｉ）Ｌｙｓ２６９ないしＡｒｇ２９０；
（ｉｘ）Ｌｙｓ３１０ないしＬｙｓ３４４；
（ｘ）Ａｓｐ３１５ないしＬｙｓ３４４；
（ｘｉ）Ｌｅｕ３９０ないしＶａｌ４２１；および
（ｘｉｉ）Ｔｈｒ５２７ないしＧｌｙ５７１
の最低１種を含有し、
ここで、添え字として与えられる数字は、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベース受託番号Ｐ１０８０９に開示されるところのヒトｈｓｐ６０タンパク質の対応するアミノ酸残基の位置を表す。
【００６９】
本発明のｈｓｐ６０フラグメント、ならびにそれらの誘導体および／もしくは変異体は、他の（ポリ）ペプチド配列に連結してよいか、または、融合タンパク質（１種もしくは複数）の一部であってよい。こうした（ポリ）ペプチド／融合タンパク質は、前記フラグメント、誘導体もしくは変異体の特徴を改良するよう工作してよい。例えば、精製、取扱いもしくは貯蔵過程の間の安定性および／もしくは持続性を改良するため、または宿主生物体および／もしくは患者における安定性、半減期および／もしくは持続性を改良するために、さらなるアミノ酸を付加してよい。
【００７０】
さらに、本発明のｈｓｐ６０フラグメント、誘導体および／もしくは変異体は、炎症性免疫応答もしくはそれらの潜在的治療においてある役割を演じる他のタンパク質もしくはペプチドに融合してよい。マーカー分子および／もしくはマーカーアミノ酸配列に連結される本発明のｈｓｐ６０のフラグメント、誘導体もしくは変異体を含んで成る分子もまた本発明の範囲内にある。こうした配列は、限定されるものでないが、ペプチド標識、ヒスチジン標識、蛍光分子、ＧＦＰ、ＦＬＡＧおよびＧＳＴを挙げることができる。
【００７１】
本発明のフラグメントの変異体および誘導体の好ましい一態様において、これらの分子は「主鎖が環化されたペプチド類似物」であるようにさらに改変される。主鎖が環化されたペプチド類似物は、ペプチド主鎖の１個の窒素原子を含有する最低１個の構成単位を組み込む好ましくは５ないし３０アミノ酸のペプチド配列を含んで成る。とりわけ、より大きな特異性をもつペプチド類似物を達成してそれにより高められた臨床選択性を達成することが一般に望ましい。有機化学および分子生物学の大きな進歩の結果として、多くの生物活性ペプチドを、今や、薬理学的および臨床的利用性に十分な量で製造することができる。従って、最近数年間に、ペプチドが関係する疾病の治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）および治療（ｔｈｅｒａｐｙ）のための新たな方法が確立された。しかしながら、薬物としてのペプチドの使用は、以下の要因、すなわちａ）消化管および血清中でのタンパク質分解に対するそれらの低い代謝安定性；ｂ）とりわけそれらの比較的大きい分子量もしくは特異的輸送系の欠如または双方による、経口摂取後のそれらの不十分な吸収；ｃ）肝および腎によるそれらの迅速な排泄；ならびにｄ）非標的器官系におけるそれらの所望されない副作用（ペプチドレセプターは生物体中で広範に分布される可能性があるため）により制限される。
【００７２】
従って、天然のペプチド分子の欠点を克服するコンホメーション的に束縛されたペプチド類似物を製造してそれにより改良された治療特性を提供することが、最も有益であるとみられる。ペプチドのコンホメーションの束縛に対する１つの概念的アプローチは、ペプチドの主鎖から主鎖の環化を提案したＧｉｌｏｎら（Ｂｉｏ−ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３１（１９９１）、７４５）により導入された。この戦略の理論的利点は、所定のペプチドの特異的レセプターとの相互作用に決定的であるかもしれない側鎖を妨害することなく、ペプチド主鎖の炭素もしくは窒素を介して環化を遂げる能力を包含する。この概念は目的のいかなる直鎖状ペプチドにも応用可能であると予見されたが、現実には、提案されたスキーム中の制限要因が、架橋基を介して連結されるべきであるアミノ酸を置き換えるのに使用されなければならない適当な構成単位を利用可能性とした。主鎖環化のこの概念の実務への実際の適応は、当初、グリシン以外のアミノ酸の構成単位のいかなる実際的製造方法も考案することの不可能性により制限された（Ｇｉｌｏｎら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８７（１９９２）、５６８７）。Ｇｉｌｏｎおよび共同研究者によるさらなる開示（第ＷＯ  ９５／３３７６５号、同第ＷＯ  ９７／０９３４４号明細書、米国特許第５，７２３，５７５号、同第５，８１１，３９２号および同第５，８８３，２９３号明細書）が、主鎖が環化されたペプチド類似物の合成で必要とされる構成単位の製造方法を提供した。最近、ブラジキニン類似物の主鎖が環化されたペプチド類似物（米国特許第５，８７４，５２９号明細書）、ならびにソマトスタチン活性を有する主鎖が環化されたペプチド類似物（第ＷＯ  ９８／０４５８３号明細書および米国特許第５，７７０，６８７号明細書）を製造するためのこれらの方法の成功裏の使用もまた開示された。これらの方法の全部が引用することによりそっくりそのまま本明細書に組み込まれる。
【００７３】
本発明はまた、
ａ）細胞表面上に無傷のＴｏｌｌ様レセプター複合体を担持する細胞を、ｈｓｐ６０のフラグメントと接触させること；および
ｂ）該細胞により産生された炎症前メディエーターもしくはエフェクターの量を測定すること
の段階を含んで成る、炎症前免疫応答を導き出す能力を有するｈｓｐ６０のフラグメントの同定方法も提供し；
ここで、炎症前メディエーターもしくはエフェクターの産生の増大が炎症前応答を導き出すｈｓｐ６０のフラグメントの能力を暗示する。本方法は、炎症前メディエーターＴＮＦαおよび／もしくはＮＯについて下で例示される。
【００７４】
段階（ａ）で使用されるｈｓｐ６０のフラグメントはｈｓｐ６０のいかなる可能なフラグメントであることもできる。好ましくは、こうしたフラグメントは、最低５アミノ酸残基、より好ましくは最低１０、なおより好ましくは最低２０、および最も好ましくは最低５０アミノ酸残基の長さを有する。こうしたフラグメントは、例えばｈｓｐ６０タンパク質の切断により、例えばトリプシン消化物のようなタンパク質分解性切断により、もしくは例えばＣＮＢｒでの化学的切断により生じさせることができるか、または、それは当業者に公知の方法を使用して化学的に合成することができる。
【００７５】
該方法の段階（ａ）で使用される細胞は、好ましくは、無傷のＴｏｌｌ様レセプター４複合体を担持する細胞である。しかしながら、ヒトにおいてはＴｏｌｌ様レセプター２がｈｓｐ６０レセプターであることが可能であるため、こうしたレセプターを担持する細胞もまた使用してよい。好ましくは、該方法で使用される細胞はリンパ細胞、およびより好ましくはマクロファージ、例えばヒトもしくはマウスのマクロファージである。こうした方法で使用することができる細胞の例は、Ｊ７７４細胞、すなわちジャーマン  コレクション  オブ  ミクロオーガニズムス  アンド  セル  カルチャーズ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＤＳＭＺ、ドイツ・ブラウンシュヴァイク）から購入することができるマウスマクロファージ細胞系Ｊ７７４Ａ．１、もしくは、それぞれブリーディング  アンド  リサーチ  センター  Ａ／Ｓ（Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ＆  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ａ／Ｓ）（ボムホルトガード（Ｂｏｍｈｏｔｌｇａｒｄ）、デンマーク・ライ）およびチャールズ  リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）（ドイツ・ズルツフェルト）から購入することができるマウス系統Ｃ５７ＢＬ／６ＪＢｏｍおよびＣ３Ｈ／ＨｅＮの骨髄由来マクロファージである。こうした骨髄由来マクロファージの調製法は当業者に公知であり、かつ、実施例１にもまた記述する。
【００７６】
陰性対照として、チャールズ  リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）（ドイツ・ズルツフェルト）から購入することができるＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスの骨髄由来細胞を使用することができる。これらのマクロファージは、機能的に欠陥のあるＴｏｌｌ様レセプター４膜タンパク質を発現し、そしてＴＮＦαおよびＮＯの産生によりｈｓｐ６０に応答しない。
【００７７】
しかしながら、ここに記述される方法は、炎症前免疫応答を導き出す能力を有するｈｓｐ６０のフラグメントを同定するのに有用であるのみならず、しかしまた前記分子の特徴づけおよび／もしくはスクリーニングにも使用してよい。
【００７８】
本発明は、さらに、上述された方法の段階（ａ）および（ｂ）、ならびに
ｃ）炎症前応答を導き出す能力を有するとして段階（ａ）で同定されたｈｓｐ６０のフラグメントを製薬学的組成物に処方すること
の段階を含んで成る、製薬学的組成物の製造方法に関する。
【００７９】
前記フラグメントの製薬学的組成物への処方は、製薬学的に許容できる担体、賦形剤および／もしくは希釈剤の添加をさらに含んでよい。記述される方法の助けを借りて、炎症前免疫応答を導き出す能力をなお有するｈｓｐ６０のより小さいフラグメントを同定することが今や可能である。こうしたより小さいフラグメントの助けを借り、また、Ｔｏｌｌ様レセプター４複合体と相互作用するｈｓｐ６０タンパク質の領域を同定することにより、順に、ｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用することができるこれらのフラグメントの変異体を設計してそれによりｈｓｐ６０による炎症前免疫応答の誘導を低下もしくは予防することが可能である。
【００８０】
従って、本発明はまた、とりわけそれらがｈｓｐ６０による炎症前免疫応答の誘導を低下もしくは予防することができる限りは、ｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用する能力を有する本発明のｈｓｐ６０フラグメントの変異体および誘導体にも関する。この情況で、アンタゴニストは、好ましくはこうした応答を低下もしくは予防するペプチドもしくはペプチド模倣物である。
【００８１】
本発明はまた、それらがｈｓｐ６０による炎症前応答の誘導を低下もしくは予防することができる限りはｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用することができる化合物の同定、スクリーニングおよび／もしくは特徴づけ方法も提供し、ここで、本方法は、
ａ）細胞表面上に無傷のＴｏｌｌ様レセプター複合体を担持する細胞を、試験されるべき化合物の存在下および非存在下で、ｈｓｐ６０もしくは炎症前応答を誘導する能力を有するそのフラグメントと接触させること；ならびに
ｂ）該化合物の存在が炎症前メディエーターもしくはエフェクターの産生に対する影響を有するかどうかを決定すること
の段階を含んで成り、
ここで、炎症前メディエーターもしくはエフェクターの産生の低下もしくは予防が、ｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用する該化合物の能力を暗示する。現在、本発明の方法は、アッセイにおいて前記細胞のＴＮＦαおよび／もしくはＮＯの産生を使用して下に例示される。
【００８２】
該方法の段階（ａ）で挙げられた細胞に関して、同一物が、炎症前免疫応答を導き出す能力を有するｈｓｐ６０のフラグメントの同定方法に関して上に既に示されたとおり当てはまる。該方法の段階（ａ）で挙げられたｈｓｐ６０のフラグメントは、炎症前免疫応答を導き出す能力を有する本発明のｈｓｐ６０のいかなるフラグメントであることもできる。
【００８３】
細胞により産生されるＴＮＦαおよび／もしくはＮＯの量の測定は、上および実施例に記述されるとおり実施することができる。
【００８４】
試験されるべき化合物は、いかなる可能な化合物、例えば上述されたところのｈｓｐ６０のフラグメントの変異体および誘導体、無機もしくは有機化合物、抗体、例えばモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、Ｆａｂフラグメントのような抗体フラグメント、可溶性のＴｏｌｌ様レセプター４もしくはＴｏｌｌ様レセプター２、またはこれらのレセプターのフラグメントもしくは複合体などであることもできる。
【００８５】
本発明はさらに、上述された方法の段階（ａ）および（ｂ）、ならびに
ｃ）ｈｓｐ６０のアンタゴニストであるとして段階（ｂ）で同定された化合物を製薬学的組成物に処方すること
の段階を含んで成る、製薬学的組成物の製造方法に関する。
【００８６】
前記化合物の製薬学的組成物への処方は、製薬学的に許容できる担体、賦形剤および／もしくは希釈剤の添加をさらに含んでよい。
【００８７】
炎症前免疫応答を導き出す能力を有するｈｓｐ６０のフラグメントの同定、スクリーニングおよび／もしくは特徴づけ方法、または本発明のｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用することができる化合物の同定方法はまた、いわゆる高スループットスクリーニング法、ならびに９６穴、３８４穴、１５３６穴（および他）の商業的に入手可能なプレートを使用して実施される類似のアプローチも含んでよい（とりわけ、Ｓｐｅｎｃｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６１（１９９８）、６１−６７を参照されたい）。本発明で使用されるべきこれらの方法は、限定されるものでないが、高スループットスクリーニングにおける均質な光学密度の読出し（例えばＮＯおよびＴＮＦαについての）を挙げることができる（例えば、Ｐｏｐｅ、ＤＤＴ  ４（１９９９）、３５０−３６２を参照されたい）。上および付属として付けられる実施例に記述されるところの細胞に基づくアッセイは、とりわけ、シンチレーション計数、蛍光測定、発光測定もしくは吸光度シグナルの測定のような検出技術と組み合わせてよい。従って、上および付属として付けられる実施例に記述される方法は、高スループットおよび超高スループットスクリーニング方法を誘導する定量的および／もしくは定性的スクリーニング方法に容易に適合させることができる。
【００８８】
さらに、本発明は、ｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用することができる本発明のフラグメントの変異体、誘導体もしくは類似物、および場合によっては製薬学的に許容できる担体を含んで成る製薬学的組成物に関する。この点での「ｈｓｐ６０のアンタゴニスト」という用語は、好ましくは、これらの分子がｈｓｐ６０による炎症前免疫応答の誘導を低下もしくは予防することが可能であることを意味する。最後に、本発明はまた、自己免疫疾患（限定されるものでないが糖尿病、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、重症筋無力症および全身性エリテマトーデスを挙げることができる）、慢性炎症（限定されるものでないがアテローム硬化症、炎症性腸疾患、反応性関節炎を挙げることができる）、慢性感染症、移植片拒絶、歯肉炎、胃炎、潰瘍、血栓症、アレルギーならびに急性感染症のような炎症性疾患の治療のための製薬学的組成物の製造のためのｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用することができる本発明のフラグメントの変異体、誘導体もしくは類似物の使用にも関する。
用語および定義：
本明細書に関連して、「ｈｓｐ６０タンパク質」という用語は、熱ショックタンパク質、すなわち、細胞がとりわけ温度の突然の上昇と直面される場合、またはそれらが他の細胞間、細胞内もしくは細胞外のストレスと直面される場合にその発現が細胞中でアップレギュレートされるタンパク質を指す。さらに、「ｈｓｐ６０タンパク質」はミトコンドリアのシャペロンを指す。とりわけ、「ｈｓｐ６０タンパク質」という用語は、約６０ｋＤの分子量を有するタンパク質を意味する。好ましくは、「ｈｓｐ６０タンパク質」という用語は、ヒトｈｓｐ６０タンパク質、好ましくはＪｉｎｄａｌら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９（１９８９）、２２７９）に開示されるところのアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。
【００８９】
本明細および請求の範囲の目的上、「ヒトｈｓｐ６０」という用語は、６０ｋＤのヒト熱ショックタンパク質のみならず、しかしまたいずれかの種の６０ｋＤの熱ショックタンパク質に対し生じられたポリクローナル抗体と交差反応するヒト血清中で見出されるいずれかの他の関係した分子も包含することを意図している。この定義は、限定されるものでないとは言え、既に発見されている６５ｋＤ、３０ｋＤ、２５ｋＤおよび４７ｋＤのタンパク質を挙げることができることをとりわけ意図している。
【００９０】
ヒトｈｓｐ６０分子はかつてｈｓｐ６５と呼称されたが、しかし、より正確な分子量情報のゆえに今やｈｓｐ６０と呼称され；いずれの呼称によってもタンパク質は同一である。
【００９１】
本発明に関して「フラグメント」という用語は、それが天然のｈｓｐ６０タンパク質中に存在するところの配列中の最低５、より好ましくは最低１０、なおより好ましくは最低２０、および最も好ましくは最低３０の連続するアミノ酸を含んで成るｈｓｐ６０タンパク質の一部、または例えば酵素的にもしくは他の手段によりｈｓｐ６０タンパク質を切断することにより得てよいｈｓｐ６０タンパク質の一部を意味する。この場合、フラグメントは必ずしも連続的アミノ酸配列のみを含有する必要はないが、しかし、例えばジスルフィド結合、ペプチド結合もしくはいずれかの他の共有結合により相互に連結されることができるこうした配列の２種もしくはそれ以上を含有してよい。
【００９２】
本発明に関して「約２０ｋＤもしくはそれ未満の分子量」という用語は、とりわけ質量分析もしくは還元条件下でのＳＤＳ  ｐａｇｅにより測定される場合に２２ｋＤ未満、好ましくは２１ｋＤ未満、および最も好ましくは２０ｋＤ未満の分子量を意味する。好ましい一態様において、フラグメントは１５ｋＤ未満、より好ましくは１０ｋＤ未満、およびなおより好ましくは５ｋＤ未満の分子量を有する。
【００９３】
本発明に関して「炎症前応答を誘導するｈｓｐ６０の能力」という用語は、とりわけ、生得の免疫系の細胞において炎症前応答を導き出す能力を意味する。これは、例えばマクロファージ、例えばＣ３Ｈ／ＨｅＮもしくはＣ５７ＢＬ／６マウスのマクロファージまたはＪ７７４細胞におけるＴＮＦαおよび／もしくはＮＯ形成の誘導により測定することができ（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１９９９）、３２１２）、ここで、ＴＮＦαおよび／もしくはＮＯ形成の誘導／増大は炎症前免疫応答を誘導する能力を示す。炎症前応答の誘導の測定は、とりわけ、Ｃｈｅｎら（上記引用文中）もしくは実施例に記述されるとおり実施することができる。従って、ＴＮＦαの誘導は、例えばＣｈｅｎら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１９９９）、３２１２）に記述されるところのサンドイッチＥＬＩＳＡを使用することによりそれぞれのタンパク質への曝露前および後にマクロファージにより産生されるＴＮＦαの量を測定すること、ならびに例えばブランクとしての培地単独に対する組換えサイトカイン（ジェンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）、英国ケント州）を用いて得られた標準曲線を使用することによりＴＮＦαを定量することにより決定することができる。ＮＯ形成の誘導は、例えば、Ｃｈｅｎら（上記引用文中）に記述されるところの比色的グリース（Ｇｒｉｅｓｓ）反応を使用して培養上清中に蓄積された亜硝酸塩（ＮＯ２−）の濃度を測定することによりマクロファージにより放出されたＮＯの量を測定することにより、決定することができる。
【００９４】
本発明に関して「ｈｓｐ６０のアンタゴニスト」という用語は、好ましくは、これらの分子がｈｓｐ６０による炎症前免疫応答の誘導を低下もしくは予防することが可能であることを意味する。この能力は、誘導物質として例えば天然のｈｓｐ６０を使用すること、ならびに試験されるべき変異体もしくは誘導体を添加し、そしてＴＮＦαおよび／もしくはＮＯにより例示されるところの炎症前メディエイターエフェクターの産生に対する影響を、ｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用する試験される分子の能力を暗示する炎症前メディエーターもしくはエフェクター（例えばＴＮＦαおよび／もしくはＮＯ）産生の減少もしくは阻害を用いて測定することを除き、ｈｓｐ６０のフラグメントが炎症前免疫応答を誘導する能力を有するかどうかを決定するための上述されたと同一のアッセイを使用することにより決定することができる。
【００９５】
タンパク質、タンパク質フラグメントおよび／もしくはペプチドが炎症前応答を誘導するかどうかを決定するためには、細胞、すなわちマクロファージを、例えば９６穴平底マイクロタイタープレートに接種する（ウェルあたり２００μｌ中２×１０５個の細胞）。２４時間の前インキュベーション（３７℃、５％  ＣＯ２）後に、試験されるべきタンパク質、タンパク質フラグメントおよび／もしくはペプチドを多様な濃度で培養物に添加し、そしてＴＮＦαおよびＮＯの産生を測定する前に多様な時間間隔の間、インキュベーションを継続する。
【００９６】
本明細書で使用されるところの「ペプチド」はペプチド結合により連結されるアミノ酸の配列を示す。本発明のペプチド類似物は、５ないし３０アミノ酸残基、好ましくは５ないし２４残基、より好ましくは７ないし１８アミノ酸の配列を含んで成り、各残基はアミノおよびカルボキシ末端を有することを特徴とする。
【００９７】
「変異体」という用語は、こうした分子が１個もしくはそれ以上のアミノ酸変化を除き、本発明のフラグメントのアミノ酸配列を有することを意味する。こうした変異体は、例えば、点特異的突然変異誘発により、かように突然変異されたＤＮＡを適切な宿主細胞中で発現させることにより、および産生された（ポリ）ペプチドを細胞培養物から回収することにより、ヒトｈｓｐ６０の対応するフラグメントをコードする対応するＤＮＡ配列を突然変異させることにより生じさせることができる。こうした変異体の生成方法、およびそれらの製造方法、例えば組換えＤＮＡ技術は当業者に公知である。しかしながら、「変異体」という用語は、天然に存在する分子ならびに前記組換え技術により生じさせることができる分子もまた含んで成る。
【００９８】
「誘導体」という用語は、本発明のフラグメントが、それがもはや炎症前免疫応答を誘導することが可能でないがしかしこの点に関してｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用することができるような方法で改変されることを意味する。こうした改変は、例えば、該フラグメントの１個もしくはそれ以上のアミノ酸残基の側鎖の改変を包含する。従って、本発明の情況において、「誘導体」という用語は、好ましくは同一の三次元構造を含むかもしれないがしかし化学的および／もしくは物理化学的に改変されるｈｓｐ６０のフラグメントの「誘導体」を含んで成る。さらに、改変技術は遺伝子および／もしくは分子生物学的技術を含んで成る。従って、前記「誘導体」は、突然変異誘発技術、もしくは（側）特異的合成により生じさせることができる。さらに、当該技術分野で公知の技術を使用して、こうした誘導体を検出および／もしくは特徴づけすることができる。これらの技術は、とりわけ、ペプチド模倣物（ａｌ−Ｏｂｅｉｄｉ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９（１９９８）、２０５−２２３；Ｂｏｈｍ、Ｊ．Ｃｏｍ．Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．１０（１９９６）、２６５−２７２）もしくはコンビナトリアルライブラリー（例えば、Ｄｏｒｎｅｒ、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４（１９９６）、７０５−７１５を参照されたい）の使用を含んで成る。さらに、本発明のｈｓｐ６０フラグメントの三次元および／もしくは結晶学的構造を使用して、前記「誘導体」を推定および／もしくは生成することができる。適切な「誘導体」の設計はコンピュータに補助されてもよい。
【００９９】
「類似物」という用語は、それらがα−アミノ酸のα−窒素に結合された架橋基をもつ新規構成単位を組み込むことを特徴とするペプチド類似物に関する。とりわけ、これらの化合物は、最低１個の構成単位を組み込む好ましくは５ないし３０アミノ酸のペプチド配列を含んで成る主鎖が環化された類似物であり、前記構成単位は、アミド、チオエーテル、チオエステルもしくはジスルフィドを含んで成る架橋基に連結されたペプチド主鎖の１個の窒素原子を含有し、ここで、最低１個の構成単位が前記架橋基を介して連結されて、第二の構成単位、該配列のアミノ酸残基の側鎖、もしくは末端アミノ酸残基より成る群から選択される一部分をもつ環状構造を形成する。より好ましくは、該ペプチド配列は５〜２４アミノ酸を組み込み、なおより好ましくは、それは７〜１８アミノ酸を組み込む。
【０１００】
「構成単位」という用語は、一般式番号１：
【０１０１】
【化１】
2004501061.tif 000003
【０１０２】
のＮαが誘導体化されたα−アミノ酸を示し、
式中、Ｘは、アルキレン、置換アルキレン、アリーレン、シクロアルキレンおよび置換シクロアルキレンより成る群から選択されるスペーサー基であり；Ｒ’は場合によっては特定の保護基と結合されたアミノ酸側鎖であり；そしてＧは、アミン、チオール、アルコール、カルボン酸およびエステル、ならびにアルキルハロゲン化物より成る群から選択される官能基であり；それは該ペプチド配列に組み込まれ、そしてその後、官能基Ｇを介して、前記ペプチド配列中のアミノ酸の側鎖の１つ、もしくは別のωが官能性化されたアミノ酸誘導体と選択的に環化される。構成単位を製造するための方法論は、第ＷＯ　９５／３３７６５号および同第ＷＯ　９８／０４５８３号明細書、ならびに米国特許第５，７７０，６８７号および同第５，８８３，２９３号明細書（その全部は、そっくりそのまま本明細書に示されるかのように、それに引用することにより本明細書に明確に組み込まれる）として公開された国際特許出願に記述される。
【０１０３】
構成単位は、対応する改変されたアミノ酸の三文字記号、次いで反応基の型（アミンについてＮ、カルボキシルについてＣ）、および間のメチレン基の数の表示により略記する。例えば、Ｇｌｙ−Ｃ２は、カルボキシル反応基をもつ改変されたＧｌｙ残基および２個の炭素のメチレンスペーサーを記述し、また、Ｐｈｅ−Ｎ３はアミノ反応基をもつ改変されたフェニルアラニン基および３個の炭素のメチレンスペーサーを呼称する。
【０１０４】
ある種の略語を、本発明ならびにそれの作成および使用の様式を記述するために本明細書で使用する。
【０１０５】
例えば、２Ａｂｕは２−アミノ酪酸を指し、Ａｌｌｏｃはアリルオキシカルボニルを指し、Ｂｏｃはｔ−ブチルオキシカルボニル基を指し、ＤＩＥＡはジイソプロピルエチルアミンを指し、ＥＤＴはエタンジチオールを指し、Ｆｍｏｃはフルオレニルメトキシカルボニル基を指し、ＨＢＴＵはヘキサフルオロリン酸１−ヒドロキシベンズトリアゾリルテトラメチルウロニウムを指し、ＨＯＢＴは１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを指し、ＨＰＬＣは高速液体クロマトグラフィーを指し、ｈｓｐは熱ショックタンパク質を指し、ＩＤＤＭはインスリン依存型糖尿病を指し、ｋＤはキロダルトンを指し、ＭＰＳは多重平行合成（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｐａｒａｌｌｅｌ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を指し、ＭＳは質量分析を指し、ＮＭＭはＮ−メチルモルホリンを指し、ＮＭＰは１−メチル−２−ピロリドノンを指し、ＮＯは一酸化窒素を指し、ＰｙＢＯＰはヘキサフルオロリン酸ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリスピロリジノホスホニウムを指し、ＰｙＢｒＯＰはヘキサフルオロリン酸ブロモトリスピロリジノホスホニウムを指し、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸を指し、そしてＴＮＦは腫瘍壊死因子を指す。
【０１０６】
本発明で使用されるアミノ酸は、商業的に入手可能であるかもしくは慣例の合成方法により入手可能であるものである。ある種の残基はペプチドへの特別の組み込み方法を必要とするかもしれず、また、該ペプチド配列への連続的、発散性および収束性のいずれかの合成アプローチが本発明で有用である。天然のコードされるアミノ酸およびそれらの誘導体は、ＩＵＰＡＣの協約に従った三文字記号により表す。表示が存在しない場合、Ｌ異性体を使用した。Ｄ異性体は残基の略記の前の「Ｄ」により示す。
【０１０７】
当業者に既知のところのアミノ酸の保存的置換は本発明の範囲内にある。保存的アミノ酸置換は、同一の型の官能基もしくは側鎖（例えば脂肪族、芳香族、正の電荷をもつ、負の電荷をもつ）を有する別のものでの一アミノ酸の置き換えを包含する。これらの置換はまた、該化合物の生物学的利用性を増大させるためのＰｈｅ残基のＮ−メチル−Ｐｈｅ残基での置き換え、ならびに経口の生物学的利用性を増大させるためのアミノ末端での単糖および二糖部分の結合（Ｎｅｌｓｏｎ−Ｐｉｅｒｃｙら　Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ａｎｄ　Ｍｅｔａｂ．７８：３２９、１９９４）、もしくは経口の生物学的利用性、中枢神経系への浸透、特定の細胞集団に標的を定めること、などを高めるかもしれないところの他のこうした置換も包含する。
好ましい類似物の記述
本発明のｈｓｐ６０の現在好ましいフラグメント、変異体、誘導体および類似物を今や開示する。
【０１０８】
好ましい態様はヒトｈｓｐ６０の配列由来である。付加的な好ましい態様は細菌のｈｓｐ６０の配列由来である。
【０１０９】
本発明の好ましい態様は：
ａ．ヒトｈｓｐ６０の残基１２６−１６０。この領域のより好ましい一部分はヒトｈｓｐ６０の残基１２６−１５６にわたり；
ｂ．ヒトｈｓｐ６０の残基１４０−１９２。この領域のより好ましい部分は、ヒトｈｓｐ６０の残基１５７−１９１、１５８−１９２、１５８−１９１、１６１−１９１および１６１−１９２にわたり；
ｃ．ヒトｈｓｐ６０の残基２２０−２５０。この領域の最も好ましい一部分はヒトｈｓｐ６０の残基２２２−２４９にわたり；
ｄ．ヒトｈｓｐ６０の残基２６９−２９０；
ｅ．ヒトｈｓｐ６０の残基３１０−３４４。この領域の好ましい部分はヒトｈｓｐ６０の残基３１５−３４４にわたり；
ｆ．ヒトｈｓｐ６０の残基３９０−４２１；
ｇ．本発明の現在最も好ましい一態様は、ヒトｈｓｐ６０の残基３５０−４００の誘導体、変異体およびペプチド類似物を含んで成る
より成る群から選択される配列を有するフラグメントの変異体、誘導体および類似物を包含する。
【０１１０】
本発明のさらなる最も好ましいペプチド類似物は；
ｉ．ヒトｈｓｐ６０の残基２２７−２３６に対応するＴｙｒ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ；
ｉｉ．ヒトｈｓｐ６０の残基３６４−３７３に対応するＬｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ；
ｉｉｉ．ヒトｈｓｐ６０の残基３６９−３７８に対応するＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ；
ｉｖ．ヒトｈｓｐ６０の残基３７１−３８０に対応するＩｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ；
ｖ．ヒトｈｓｐ６０の残基３７２−３８１に対応するＧｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ；
ｖｉ．ヒトｈｓｐ６０の残基４０３−４１２に対応するＶａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ；
ｖｉｉ．ヒトｈｓｐ６０の残基４０５−４１４に対応するＬｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ
である。
【０１１１】
本発明のさらなるより好ましい誘導体、変異体およびペプチド類似物は、ヒトｈｓｐ６０配列の残基３６４−３８１、すなわちＬｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒに基づく。この配列の好ましいペプチド類似物は、場合によっては最低１個の残基がアラニンで置き換えられた１０〜１８残基のペプチドである。最も好ましいペプチド類似物は：
ｉ．ヒトｈｓｐ６０の残基３６７−３８１に対応するＬｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ；
ｉｉ．ヒトｈｓｐ６０の残基３７２−３８１に対応するＬｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ
である。
【０１１２】
本発明の別の好ましい態様は、ヒトｈｓｐ６０の残基４０３−４１２の誘導体、変異体およびペプチド類似物を含んで成る。この領域の最も好ましい類似物は、以下の配列：
ｉ．Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ；
ｉｉ．Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ；
ｉｉｉ．Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ；
ｉｖ．Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ
を包含する。
【０１１３】
本発明のなお他のより好ましい類似物は、ヒトｈｓｐ６０の残基４０８−４１６の主鎖が環化されたペプチド誘導体、変異体および類似物である。これらの類似物は、場合によっては位置４１５にＡｓｎの代わりにＧｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｅｕもしくは２Ａｂｕ残基を含んで成る。この配列の最も好ましい類似物は、連結されて環状構造を形成する位置：４０８−４１４、４０９−４１６、４０８−４１６および４０９−４１４に２個の架橋基を含んで成るノナペプチドである。他の好ましい主鎖が環化された類似物は５〜１８残基を有し、最低１個の構成単位が末端、側鎖もしくは別の構成単位に連結されて環状ペプチド類似物を形成する。
【０１１４】
上および実施例に列挙される全部の配列はそれ自体有用として、かつ、改良された特性をもつ誘導体、変異体および類似物の設計および合成の基礎としてもまた使用してよい。
一般的方法
ペプチドの合成、精製および特徴づけの一般的方法：
合成：
樹脂：０．２〜０．７ｍｍｏｌ／ｇｒの負荷をもつ１ｇのリンク（Ｒｉｎｋ）アミドもしくはテンタジェル（Ｔｅｎｔａ−ｇｅｌ）樹脂。
Ｆｍｏｃ脱保護：７ｍＬのＮＭＰ中２０％ピペリジンを用いる。振とうしながら１０ｍｌのＮＭＰで２分間の５回の洗浄の後に続く１５分間２回。
カップリング：
１．通常のカップリング（単純なアミノ酸へのカップリング）：７ｍｌのＮＭＰ中に３等量のアミノ酸、３等量のＰｙＢｒｏＰおよび６等量のＤＩＥＡを含有する溶液を用いる。振とうしながら０．５〜２時間。カップリングはニンヒドリン試験によりモニターし、そしてニンヒドリン溶液が黄色になるまで反復する。
２．１０ｍｌのジメチルホルムアミド中に５等量のＤＩＣおよび５等量のＨＯＢＴを含有する溶液を用いるＨｉｓおよびＡｓｎのカップリング。
３．Ｇｌｙ構成単位へのカップリング：７ｍｌのＮＭＰ中に３等量のアミノ酸、３等量のＰｙＢｒｏＰおよび６等量のＤＩＥＡを含有する溶液を用いる。振とうしながら１〜４時間、２回。
４．Ｇｌｙでない構成単位へのカップリング：１５ｍｌのジオキサンもしくはＴＨＦ中に５等量のアミノ酸、１．５等量のチオホスゲンおよび１３等量のコリジンを含有する溶液を用いる。振とうしながら６０℃で４０分間、３回。
【０１１５】
主鎖が環化されたペプチド類似物を合成する態様においては直交する保護が必要とされる。現在の好ましい一態様によれば、アリル／Ａｌｌｏｃ脱保護および環化を以下のとおり実施する。すなわち
構成単位のアリルおよびＡｌｌｏｃ保護基の除去：５％酢酸および２．５％　ＮＭＭを含有する３０ｍｌのジクロロメタン中のペプチドあたり１．５等量のＰｄ（ＰＰｈ３）４を用いる。振とうしながら１〜４時間。
【０１１６】
環化：７ｍｌのＮＭＰ中に３等量のＰｙＢＯＰおよび６等量のＤＩＥＡを含有する溶液を用いる。振とうしながら０．５〜２時間。環化はニンヒドリン試験によりモニターし、そして必要な場合は反復する。
【０１１７】
切断：スカベンジャー、すなわち１〜１５％　Ｈ２Ｏ、１〜５％  ＴＩＳおよび１〜５％  ＥＤＴを補充された８２〜９５  ％ＴＦＡを用いる。
精製：
各主鎖環状ペプチドの個々の精製方法を、他の粗成分からの環状ペプチドの最大の単離を与えるように分析ＨＰＬＣ上で開発する。分析方法は通常、固定相としてＣ−１８  ヴァイダック（Ｖｙｄａｃ）カラム  ２５０×４．６ｍｍおよび０．１％  ＴＦＡを含有する水／ＡＣＮ混合物勾配を使用して実施する。
【０１１８】
調製方法は、２’’のＣ−１８ヴァイダック（Ｖｙｄａｃ）調製方法での分析的分離方法を包含することにより設計する。精製過程の間、環状ペプチドを含有するピークを、半自動化フラクションコレクターを使用して収集する。収集された画分を、純度チェックのため分析的ＨＰＬＣに注入する。純粋な画分を合わせそして凍結乾燥する。
特徴づけ：
合わせられた純粋な凍結乾燥された物質は、ＨＰＬＣ、ＭＳおよびキャピラリー電気泳動により、ならびに、ペプチド含量およびアミノ酸比の決定についてのアミノ酸分析により、純度について分析する。
多重平行合成（ＭＰＳ）形式のライブラリーの合成、精製および特徴づけの一般的方法：
ＭＰＳ手順を慣例のペプチド発生手順として使用する。個々のペプチド、もしくは数種のペプチドの群を、溶媒の通過を可能にするがしかし固相マトリックスの通過を可能にしないフィルターを装備された９６穴マイクロタイタープレート中で合成する。全部の弁の同時の閉鎖および開放を可能にする単純かつ効率的弁装置（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により製造される）を使用する。該系は、ある大きさより大きい粒子を進ませない底の溶媒浸透性の膜を各ウェルに装備するアプローチを利用する。該方法は、ウェル中に樹脂を置き、溶媒中で反応を実施し、そして真空を適用することにより全部のウェルから同時に溶媒を除去することを可能にする。標準的な９６穴形式で利用可能であるこれらの特殊なプレートは、９６種のペプチドの平行した合成を同時に可能にする。該手順の合成スケールはウェルあたり１〜５μモルの範囲にある。標準的な９６穴形式でもまた実施されるＣ１８逆相カラム（セップパック（ＳｅｐＰａｋ）精製）による精製の後に、ペプチドを慣例に１ｍｌの水に溶解して、１〜５ｍＭの理論的粗濃度（合成スケールに依存する）を生じさせる。生じるペプチドの化学的質のモニタリングをＥＳＩ−ＭＳ分析により実施する。異なる操作者により異なる機会に製造された数枚のプレートの分析は、粗調製物中での所望のペプチド質量の存在により判断されるとおり、約８０％の全体的成功率を示した。ＭＰＳからのペプチドのさらなる分析はＬＣ−ＭＳにより実施する。該分析は、大スケールで個別に合成されたペプチドの粗調製物に類似の粗ペプチドの質を示した。多様な段階もしくは完全合成は、今や、自動ペプチド合成機を使用して自動的に実施される。本例示によれば、ペプチドは現在、アドヴァンスト  ケムテック（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ）のＡＣＴ  ３９６、およびアドヴァンスト  ケムテック（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ）の加熱装置Ｌａｂ  Ｔｅｃｈ  ４を使用して自動的に合成される。
ＭＰＳ形式での合成についての詳述された手順：
６μモルの容量について、０．６ｍｍｏｌ／ｇｒの置換をもつ１０ｍｇの樹脂を使用する。
【０１１９】
Ｆｍｏｃ脱保護：各ウェルに、５００μｌのＮＭＰ中５％ピペリジンを２回添加する。反応を１５分間振とうする。ＮＭＰを吸引により除去する。
【０１２０】
Ｆｍｏｃ脱保護後の洗浄：樹脂を、各ウェルに６００μｌのＮＭＰを入れること、次いで窒素流による溶液の排出により洗浄する。洗浄過程を４回反復する。
ＨＢＴＵを使用するカップリング：
ウェル容量：６μｍｏｌ
ウェルあたりのカップリングあたりのアミノ酸の量：３０μｍｏｌ
ＮＭＰ濃縮物中のアミノ酸：０．２Ｍ
使用されるアミノ酸容量：１５０μｌ
ＨＢＴＵ量：３０μｍｏｌ
ＨＢＴＵ濃度：０．２Ｍ
使用されるＨＢＴＵ容量：１５０μｌ
添加されるＤＩＥＡ：１５０μｌのＮＭＰ中０．４Ｍ
総反応容量：４５０μｌ
アミノ酸をＮＭＰ中のＨＯＢＴの溶液に溶解する。樹脂を、各ウェルに６００μｌのＮＭＰを入れること、次いで窒素流による溶媒の排出により洗浄する。洗浄過程は４回反復する。カップリング反応を１時間２回反復する。
ムカヤマ試薬を使用するカップリング（ある状況でのみ実施される）：
６５０ｍＭのアミノ酸溶液−４０μｌ
１１１ｍｇ／ｍｌのムカヤマ試薬−６０μｌ
ウェルあたり添加されるコリジン−１５μｌ
ＰｙＢｒｏＰとのカップリングについてと同一の手順。反応温度５０℃、反応時間：第一のカップリング４時間、第二のカップリング１６時間。
【０１２１】
主鎖が環化されたペプチドを合成する態様において、アリル／Ａｌｌｏｃ脱保護および環化を以下のとおり実施する：
アリル  Ａｌｌｏｃ脱保護：この段階は、５％酢酸＋２．５％  ＮＭＭを含有する２０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中の１．５ｇのＰｄ（ＰＰｈ３）４の１８０μｌの溶液の添加により、集成の完了後に実施する。
【０１２２】
環化：この段階は、ＮＭＰ＋ＤＩＥＡ中のＰｙＢｏＰの１００μｌの溶液の添加により実施する。
【０１２３】
樹脂からのペプチドの切断およびセップパック（ＳｅｐＰａｋ）精製：最後のＦｍｏｃ脱保護後に、樹脂を深いウェルのマイクロタイタープレートに移し、各ウェルに、２．５％  ＴＩＳ、２．５％  Ｈ２Ｏ、２．５％  ＥＤＴを含有する３００μｌのＴＦＡ溶液を添加する。ＴＦＡの除去は凍結乾燥により実施する。切断後、ペプチドをセップパック（ＳｅｐＰａｋ）により精製する。
ｈｓｐ６０のフラグメント、誘導体、変異体および類似物の生物学的スクリーニング
１．炎症前免疫応答を導き出す能力を有するｈｓｐ６０のフラグメントの同定：  本方法は、以下の段階、すなわち
ａ）それらの表面上に無傷のＴｏｌｌ様レセプター複合体を担持する細胞をｈｓｐ６０のフラグメントと接触させること；ならびに
ｂ）該細胞により産生されたＴＮＦαおよび／もしくはＮＯの量を測定することを含んで成る。
【０１２４】
ＴＮＦαおよび／もしくはＮＯの産生の増大は、炎症前応答を導き出すｈｓｐ６０のフラグメントの能力を暗示する。
【０１２５】
段階（ａ）で使用されるｈｓｐ６０のフラグメントは、ｈｓｐ６０のいずれかの可能なフラグメントであることができる。好ましくは、こうしたフラグメントは最低５アミノ酸残基、より好ましくは最低１０、なおより好ましくは最低２０、および最も好ましくは最低５０アミノ酸残基の長さを有する。こうしたフラグメントは、例えばｈｓｐ６０タンパク質の切断、例えばトリプシン消化物のようなタンパク質分解性切断により、もしくは例えばＣＮＢｒでの化学的切断により生じさせてよいか、またはそれは当業者に公知の方法を使用して化学的に合成することができる。
【０１２６】
該方法の段階（ａ）で使用される細胞は、好ましくは、無傷のＴｏｌｌ様レセプター４を担持する細胞である。しかしながら、ヒトにおいてはＴｏｌｌ様レセプター２がｈｓｐ６０レセプターであることが可能であるため、こうしたレセプターを担持する細胞もまた使用してよい。好ましくは、該方法で使用される細胞はリンパ細胞、およびより好ましくはマクロファージ、例えばヒトもしくはマウスのマクロファージである。こうした方法で使用することができる細胞の例は、Ｊ７７４細胞、すなわちジャーマン  コレクション  オブ  ミクロオーガニズムス  アンド  セル  カルチャーズ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＤＳＭＺ、ドイツ・ブラウンシュヴァイク）から購入することができるマウスマクロファージ細胞系Ｊ７７４Ａ．１、もしくは、それぞれブリーディング  アンド  リサーチ  センター  Ａ／Ｓ（Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ＆  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ａ／Ｓ）（ボムホルトガード（Ｂｏｍｈｏｔｌｇａｒｄ）、デンマーク・ライ）およびチャールズ  リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）（ドイツ・ズルツフェルト）から購入することができるマウス系統Ｃ５７ＢＬ／６ＪＢｏｍおよびＣ３Ｈ／ＨｅＮの骨髄由来マクロファージである。こうした骨髄由来マクロファージの調製法は当業者に公知であり、かつ、実施例１にもまた記述する。
【０１２７】
陰性対照として、チャールズ  リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）（ドイツ・ズルツフェルト）から購入することができるＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスの骨髄由来細胞を使用することができる。これらのマクロファージは、機能的に欠陥のあるＴｏｌｌ様レセプター４膜タンパク質を発現し、そしてＴＮＦαおよびＮＯの産生によりｈｓｐ６０に応答しない。
【０１２８】
タンパク質、タンパク質フラグメントおよび／もしくはペプチドが炎症前応答を誘導するかどうかを決定するためには、細胞すなわちマクロファージを例えば９６穴平底マイクロタイタープレートに接種する（ウェルあたり２００μｌ中２×１０５個の細胞）。２４時間の前インキュベーション（３７℃、５％  ＣＯ２）後に、試験されるべきタンパク質、タンパク質フラグメントおよび／もしくはペプチドを多様な濃度で培養物に添加し、そしてＴＮＦαおよびＮＯの産生を測定する前に多様な時間間隔の間、インキュベーションを継続する。
２．ｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用することができる化合物の同定、スクリーニングおよび／もしくは特徴づけ：
ｈｓｐ６０による炎症前免疫応答の誘導を低下もしくは予防するための能力は、誘導物質として例えば天然のｈｓｐ６０を使用すること、ならびに、試験されるべき変異体もしくは誘導体を添加し、そしてｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用する試験される分子の能力を暗示するＴＮＦαおよび／もしくはＮＯの産生の減少もしくは阻害を用いて、ＴＮＦαおよび／もしくはＮＯの産生に対する影響を測定することを除き、上述されたところの方法番号１を使用することにより決定することができる。
【０１２９】
該方法は、以下の段階、すなわち
ａ）それらの表面上に無傷のＴｏｌｌ様レセプター複合体を担持する細胞を、試験されるべき化合物の存在下および非存在下で、ｈｓｐ６０もしくは炎症前応答を誘導する能力を有するそのフラグメントと接触させること；ならびに
（ｂ）該化合物の存在が、前記細胞のＴＮＦαおよび／もしくはＮＯの産生に対する影響を有するかどうかを決定すること
を含んで成り、
ここで、ＴＮＦαおよび／もしくはＮＯの産生の低下もしくは予防が、ｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用する該化合物の能力を暗示する。
【０１３０】
該方法の段階（ａ）で挙げられた細胞に関して、同一物が上の方法１でのとおり当てはまる。該方法の段階（ａ）で挙げられたｈｓｐ６０のフラグメントは、炎症前免疫応答を導き出す能力を有する本発明のｈｓｐ６０のいかなるフラグメントであることもできる。
【０１３１】
細胞により産生されるＴＮＦαおよび／もしくはＮＯの量の測定は、上および実施例に記述されるとおり実施することができる。
【０１３２】
試験されるべき化合物は、いかなる可能な化合物、例えば上述されたところのｈｓｐ６０のフラグメントの変異体および誘導体、無機もしくは有機化合物、抗体、例えばモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、Ｆａｂフラグメントのような抗体フラグメント、可溶性のＴｏｌｌ様レセプター４もしくはＴｏｌｌ様レセプター２、またはこれらのレセプターのフラグメントもしくは複合体などであることもできる。
３．ＴＮＦαおよび／もしくはＮＯ形成の誘導の測定方法：
ＴＮＦαおよび／もしくはＮＯ形成の誘導は、マクロファージ、例えばＣ３Ｈ／ＨｅＮもしくはＣ５７ＢＬ／６マウスのマクロファージまたはＪ７７４細胞中で測定することができ（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１９９９）、３２１２）、ここで、ＴＮＦαおよび／もしくはＮＯ形成の誘導／増大は炎症前免疫応答を誘導する能力を示す。炎症前応答の誘導の測定は、とりわけ、Ｃｈｅｎら（上記引用文中）もしくは実施例に記述されるとおり実施することができる。従って、ＴＮＦαの誘導は、例えばＣｈｅｎら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１９９９）、３２１２）に記述されるところのサンドイッチＥＬＩＳＡを使用することによりそれぞれのタンパク質への曝露前および後にマクロファージにより産生されるＴＮＦαの量を測定すること、ならびに例えばブランクとしての培地単独に対する組換えサイトカイン（ジェンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）、英国ケント州）を用いて得られた標準曲線を使用することによりＴＮＦαを定量することにより決定することができる。ＮＯ形成の誘導は、例えば、Ｃｈｅｎら（上記引用文中）に記述されるところの比色的グリース（Ｇｒｉｅｓｓ）反応を使用して培養上清中に蓄積された亜硝酸塩（ＮＯ２−）の濃度を測定することによりマクロファージにより放出されたＮＯの量を測定することにより、決定することができる。
【０１３３】
加えて、ｈｓｐ６０のフラグメント、変異体、誘導体および類似物は、Ｔ細胞増殖応答、マウスモデルにおけるインスリン炎および糖尿病に対する影響、ならびにＰＣＴ特許出願第ＷＯ  ９６／１９２３６号および同第ＷＯ  ９７／０１９５９号明細書に記述されるところのペプチド安定性についてスクリーニングしてよい。
【０１３４】
炎症前免疫応答を導き出す能力を有するｈｓｐ６０のフラグメントの同定、スクリーニングおよび／もしくは特徴づけ方法、または本発明のｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用することができる化合物の同定方法はまた、いわゆる高スループットスクリーニング法、ならびに９６穴、３８４穴、１５３６穴（および他）の商業的に入手可能なプレートを使用して実施される類似のアプローチも含んでよい（とりわけ、Ｓｐｅｎｃｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６１（１９９８）、６１−６７を参照されたい）。本発明で使用されるべきこれらの方法は、限定されるものでないが、高スループットスクリーニングにおける均質な光学密度の読出し（例えばＮＯおよびＴＮＦαについての）を挙げることができる（例えば、Ｐｏｐｅ、ＤＤＴ  ４（１９９９）、３５０−３６２を参照されたい）。上および付属として付けられる実施例に記述されるところの細胞に基づくアッセイは、とりわけ、シンチレーション計数、蛍光測定、発光測定もしくは吸光度シグナルの測定のような検出技術と組み合わせてよい。従って、上および付属として付けられる実施例に記述される方法は、高スループットおよび超高スループットスクリーニング方法を誘導する定量的および／もしくは定性的スクリーニング方法に容易に適合させることができる。
【０１３５】
熱ショックタンパク質のフラグメント、変異体および誘導体は、多数の既知の熱ショックタンパク質の配列に部分的に基づき構築されるか、もしくは、以前に未知の新規配列に基づき、下の実施例に提示される。以下の実施例は該化合物の作成および使用方法、ならびに本発明の方法を具体的に説明することを意図しており、そして、いかなる方法でも制限として解釈されるべきでない。
【０１３６】
実施例
以下の実施例は本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１：ｈｓｐ６０の可能なリガンドとしてのＴｏｌｌ様レセプター４複合体の同定
組換えヒトｈｓｐ６０はストレスジェン  バイオテクノロジーズ（ＳｔｒｅｓｓＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（カナダ・ビクトリア）から得た。ＣｐＧモチーフを含有する、２種の免疫刺激性オリゴヌクレオチド５’−ＡＣＣ  ＧＡＴ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＧＣＣ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  Ｇ−３’（Ｐａｌ＋）（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８（１９９４）、８３１）および５’−ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＡＴＧ  ＣＴ−３’（ＯＤＮ１６６８）（Ｈａｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１７（１９９８）、６２３０；Ｓｐａｒｗａｓｓｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１９９７）、１６７１）、ならびにＣｐＧモチーフを欠く対応する非刺激性オリゴヌクレオチド５’−ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＡＴＧ  ＣＴ−３’（ＯＤＮ１７２０）（Ｈａｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１７（１９９８）、６２３０；Ｓｐａｒｗａｓｓｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１９９７）、１６７１）を、ライフ  テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（ドイツ・カールスルーエ）から購入した。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｂ  ０．２６からのリポ多糖（ＬＰＳ）はシグマ（Ｓｉｇｍａ）（ドイツ・ダイゼンホーフェン）から得た。
【０１３７】
マウス骨髄由来マクロファージの調製のため、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮおよびＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスをチャールズ  リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）（ドイツ・ズルツフェルト）から購入し、また、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＢｏｍマウスを、ブリーディング  アンド  リサーチ  センター  Ａ／Ｓ（Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ＆  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ａ／Ｓ）（ボムホルトガード（Ｂｏｍｈｏｌｔｇａｒｄ）、デンマーク・ライ）から購入した。骨髄細胞は、８〜１２週齢のマウスの大腿骨および脛骨を氷冷ＰＢＳで洗い流すことにより得た。洗浄した後、２．５×１０６個の骨髄細胞を、５％熱不活性化ウマ血清、１５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、ライフ  テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、１５％  Ｌ９２９細胞馴化培地（Ｂｕｒｇｅｓｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（１９８５）、１６００４）、ならびにアンピシリン（２５ｍｇ／ｌ）、ペニシリン（１２０ｍｇ／ｌ）、ストレプトマイシン（２７０ｍｇ／ｌ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸（１０ｍｌ／ｌ、１００×）、２４ｍＭ  ＮａＨＣＯ３および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを補充された６５％  ＲＰＭＩ  １６４０を含有する１０ｍｌのプルツニク（Ｐｌｕｚｎｉｋ）培地を用いて、組織培養皿中でインキュベート（３７℃、５％  ＣＯ２）した。７日の培養後に、付着性の骨髄由来マクロファージを、氷冷のＣａ＋＋、Ｍｇ＋＋を含まないハンクス液（ＨＢＳＳ、ライフ  テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））とともにの１０分間のインキュベーション、次いでＨＢＳＳでの２回の洗浄（５００ｇ、５分）によりはがした。非特異的エステラーゼ染色（Ｌｏｆｆｌｅｒ、Ｋｌｉｎ．Ｗｓｃｈｒ．３９（１９６１）、１２２０）により、＞９８％の細胞がマクロファージの特徴を表した。
【０１３８】
マクロファージの刺激のために、細胞を９６穴平底マイクロタイタープレート（ファルコン／ベクトン  ディッキンソン（Ｆａｌｃｏｎ／Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ニュージャージー州フランクリンレイクス）に接種した（ウェルあたり２００μｌ中２×１０５個の細胞）。２４時間の前インキュベーション（３７℃、５％  ＣＯ２）の後に、多様な濃度のｈｓｐ６０、ＬＰＳおよびオリゴヌクレオチドを培養物に添加し、そしてインキュベーションを異なる時間間隔の間継続した。
【０１３９】
マクロファージから放出されたＴＮＦαの量を、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１９９９）、３２１２）により定量した。ＴＮＦαは、ブランクとしての培地単独に対する組換えサイトカイン（ジェンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）、英国ケント州）を用いて得られた標準曲線を使用して定量した。結果は１ｍｌあたりのｐｇのＴＮＦαとして表した。
【０１４０】
亜硝酸塩産生の測定のために、マクロファージにより放出されたＮＯの量を、既に記述された（Ｃｈｅｎら、上記引用文中）ところの比色的グリース（Ｇｒｉｅｓｓ）反応を使用して、培養上清中に蓄積された亜硝酸塩（ＮＯ２−）の濃度を測定することにより評価した。結果は１ｍｌあたりのＮＯ２−のマイクロモルを示す。
【０１４１】
得られたデータは平均＋ＳＤとして表す。統計学的解析は両側のスチューデント検定を使用して実施した。差異はｐ＜０．０５で統計学的に有意とみなした。
【０１４２】
図１から明らかであるとおり、マウス系統Ｃ５７ＢＬ／６およびＣ３Ｈ／ＨｅＮの骨髄由来マクロファージは、大量のＴＮＦαの迅速な分泌を伴い、ＬＰＳもしくはヒトｈｓｐ６０に応答した。突然変異体のＴｏｌｌ様レセプター４を担持するＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスからのマクロファージの平行した研究は、ＬＰＳもしくはｈｓｐ６０のいずれかに対する応答を示さなかった。しかしながら、これらの細胞は、炎症刺激に対し完全に不応性でなかった。ミコバクテリアの配列（ＯＤＮ１６６８）由来かつ強力な免疫刺激性ＣｐＧモチーフを含有するオリゴデオキシヌクレオチドは、ＬＰＳ非応答体系統において強いＴＮＦα応答を誘導した。第二のＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチド（Ｐａｌ＋）はより少なく刺激性であった一方、ＣｐＧの不足した（ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ１７２０）は応答を誘発しなかった（図１）。
【０１４３】
図１は、Ｃ５７ＢＬ／６（細かい平行線を付けられた棒）、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ（白色の棒）およびＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス（黒色の棒）の骨髄由来マクロファージを、培地、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ｈｓｐ６０（１０μｇ／ｍｌ）、Ｐａｌ＋（３０μｇ／ｍｌ）、ＯＤＮ１６６８（３０μｇ／ｍｌ）もしくはＯＤＮ１７２０（３０μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートしたを示す。６時間後に、培養上清中のＴＮＦα濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。該データは、四重で実施された３ないし４回の実験の平均＋ＳＤを表す。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ（およびＣ５７ＢＬ／６）マクロファージに対する有意差を＊＊＊、ｐ＜０．００１として示す。ｈｓｐ６０に対する応答の用量依存性を、２種のＣ３Ｈ系統からのマクロファージを用いてさらに分析した。有意のＴＮＦα応答は、３μｇ／ｍｌのｈｓｐ６０（０．０５μｍｏｌ／ｌ）を用いてＣ３Ｈ／ＨｅＮマクロファージで得られた一方、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマクロファージではこうした応答は１０倍より高いｈｓｐ６０レベルでさえみられなかった（図２Ａ）。力学の分析は、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマクロファージにおいて６〜１２時間の間に分泌されたＴＮＦαのピークレベルを示した。ＴＩｒ４欠損マクロファージにおいて、ＴＮＦα産生は７２時間の観察期間を通じて非存在であった（図２Ｂ）。
【０１４４】
図２は、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ（白丸）およびＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス（黒丸）の骨髄由来マクロファージを、増大する濃度のｈｓｐ６０とともに６時間インキュベートした（Ａ）か、もしくはそれらを１０μｇ／ｍｌのｈｓｐ６０の用量で異なる時間間隔の間インキュベートした（Ｂ）を示す。培養上清中のＴＮＦα濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。該データは、三重で実施された３回の実験からの平均＋ＳＤを表す。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ由来マクロファージに対する有意差を＊＊＊、ｐ＜０．００１として示す。
【０１４５】
図３から明らかであるとおり、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ（しかしＣ３Ｈ／ＨｅＪでない）のマウスのマクロファージはＬＰＳ攻撃にＮＯ産生を伴い応答し、これはエンドトキシンに誘導されるＮＯ形成がＴｌｒ４依存性であることを示す。
【０１４６】
図３は、Ｃ５７ＢＬ／６（細かい平行線を付けられた棒）、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ（白色の棒）およびＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス（黒色の棒）の骨髄由来マクロファージを、培地、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ｈｓｐ６０（１０μｇ／ｍｌ）、Ｐａｌ＋（３０μｇ／ｍｌ）、ＯＤＮ１６６８（３０μｇ／ｍｌ）もしくはＯＤＮ１７２０（３０μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートしたを示す。２４時間後に、培養上清中に蓄積された亜硝酸塩の濃度をグリース（Ｇｒｉｅｓｓ）反応により測定した。該データは、四重で実施された３ないし４回の実験の平均＋ＳＤを表す。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ（およびＣ５７ＢＬ／６）のマクロファージに対する有意差は＊＊＊、ｐ＜０．００１として示す。
【０１４７】
ｈｓｐ６０を刺激として採用した場合に、同一の結果が、Ｔｌｒ４欠損マクロファージにおける一酸化窒素応答の完全な欠如を伴い得られた。対照的に、２種のマクロファージ型は、強く刺激性のＣｐＧ  ＤＮＡ、ＯＤＮ１６６８を刺激として使用した場合に非常に類似のＮＯ応答を示した一方、より小さく刺激性のＣｐＧオリゴヌクレオチドＰａｌ＋は、ＣｐＧの不足したＯＤＮ１７２０について真実であったとおり、ＮＯ形成を誘導することを失敗した（図３）。ＴＮＦα産生に比較して類似の濃度のｈｓｐ６０（３μｇ／ｍｌ）が、ＮＯを導き出すのに必要とされた。ｈｓｐ６０濃度を１０倍増大させることは、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマクロファージにおける約５倍より高い亜硝酸塩レベルを生じさせた一方、Ｔｌｒ４欠損マクロファージは完全に不応性のままであった（図４Ａ）。上清中の亜硝酸塩の蓄積は、培養の４８と７２時間との間に最大レベルに達した。この期間を通じて、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマクロファージ中でのＮＯ産生の表示は存在しなかった（図４Ｂ）。
【０１４８】
図４は、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ（白丸）およびＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス（黒丸）の骨髄由来マクロファージを、増大する濃度のｈｓｐ６０とともに２４時間インキュベートした（Ａ）か、もしくはそれらを１０μｇ／ｍｌのｈｓｐ６０の用量で異なる時間間隔の間インキュベートした（Ｂ）を示す。培養上清中に蓄積された亜硝酸塩の濃度をグリース（Ｇｒｉｅｓｓ）反応により測定した。該データは三重で実施された３回の実験の平均＋ＳＤを表す。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ由来のマクロファージに対する有意差を＊＊＊、ｐ＜０．００１として示す。
【０１４９】
上述された結果は、細胞外のｈｓｐ６０がＴｌｒ４の内在性リガンドであることを示唆する。炎症応答を伴いエンドトキシンに応答する能力が異なる２種の緊密に関係した系統、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮおよびＣ３Ｈ／ＨｅＪの骨髄由来マクロファージを比較した（Ｓｕｌｔｚｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ２１９（１９６８）、１２５３；ＷａｔｓｏｎとＲｉｂｌｅｔ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４０（１９７４）、１１４７）。この機能的差異は、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスにおける機能的に欠陥のあるＴｌｒ４膜タンパク質によるとして最近同定された。後者の系統において、Ｔｌｒ４のＣ末端部分は、ＬＰＳに誘導されるシグナル伝達を妨害するコドン７１２の突然変異（ｌｐｓｄ）を含有する（Ｐｏｌｔｏｒａｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２（１９９８）、２０８５；Ｑｕｒｅｓｈｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９（１９９９）、１６５；Ｈｏｓｈｉｎｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１９９９）、３７４９）。興味深いことに、Ｔｌｒ４欠損マクロファージは、エンドトキシンがメタロプロテイナーゼ−９の発現を刺激することがなお可能であるため、ＬＰＳに完全に非応答性であるわけでない（Ｊｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１９９９）、３５９６）。
【０１５０】
実際、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ（Ｉｐｓｄ）マウスからのマクロファージは、ＬＰＳに誘導されるＴＮＦα産生に明瞭に不応性と見出された。興味深いことに、誘導可能なＮＯ形成もまた機能的Ｔｌｒ４に厳密に依存すると見出されたが、とは言えシグナル伝達の要件はＴＮＦαのものと異なる（Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（１９９３）、９７３０；Ｋａｊｉｍｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３（１９９４）、１６１２）。免疫刺激性のＣｐＧ  ＤＮＡへのｌｐｓｄマクロファージの曝露は、双方、すなわちＴＮＦαおよびＮＯ産生を刺激し、これは、生得の免疫応答を刺激するためのＴｌｒ４依存性および非依存性の経路がマクロファージ中に共存することを示す。また、これらのデータは、ＣｐＧ  ＤＮＡシグナル伝達がＴｌｒ４を介して起こらないことを立証する。一緒にすれば、ヒトｈｓｐ６０によるＴＮＦαもしくはＮＯ応答の刺激が、ここで機能的Ｔｌｒ４膜タンパク質の存在に完全に依存するとして見出された。従って、同一の膜貫通シグナル伝達レセプターがｈｓｐ６０およびＬＰＳに対する生得の免疫応答を媒介するようである。広範囲の制御が、エンドトキシンの汚染の役割を排除するために、細胞外の哺乳動物ｈｓｐ６０の免疫刺激活性の２個の以前の報告で実施された（Ｋｏｌら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３（１９９９）、５７１；Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１９９９）、３２１２）。これらの制御は、ＬＰＳの中和のためのポリミキシンＢの使用、もしくはｈｓｐ６０を抑制するがしかしＬＰＳ活性を抑制しない熱処理によるタンパク質の変性を包含する。また、われわれは、別の供給源からのエンドトキシンを含まない調製物（ペプトール  リミテッド（Ｐｅｐｔｏｒ  Ｌｔｄ．）から、ｈｓｐ６０  １μｇあたり０．１μＥＵ未満のエンドトキシン汚染、未発表データ）を用いて本質的な知見を再現することが可能であった。最後に、エンドトキシンを含まない細菌のリポタンパク質は、Ｔｏｌｌ様レセプター−２経路を介して生得の免疫応答を媒介することが最近、報告されている（Ａｌｉｐｒａｎｔｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５（１９９９）、７３６；Ｂｒｉｇｈｉｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５（１９９８）、７３６；Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３（１９９９）、２３８２）。これらの観察結果は、Ｔｌｒ４およびＴｌｒ２がＬＰＳのレセプターとして機能するのみならず（Ｐｏｌｔｏｒａｋら、上記引用文中；Ｋｉｒｓｃｈｎｉｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８（１９９８）、２０９１；Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄら、上記引用文中）、しかしタンパク質リガンドの認識にもまた関与することを強調する。
【０１５１】
哺乳動物細胞中のＴｏｌｌ様レセプターの以前に記述されたリガンドは微生物起源のものであり、これは生得の免疫応答におけるこれらのレセプターの機能と調和する。シャペロンｈｓｐ６０が哺乳動物のＴｏｌｌ様レセプターの推定の内在性リガンドであることが今や見出された。この知見は、Ｔｏｌｌ様レセプターが微生物病原体に対する生得の免疫防禦における機能を有するかもしれないのみならず、しかしまた内在性リガンドと相互作用することにより生理学的機能も供給することを示唆する。これは、Ｔｏｌｌが内在性リガンドとしてはたらくｓｐａｅｔｚｌｅでの背腹のパターン形成を制御するドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）での状況を暗示する（ＭａｒｉｓａｔｏとＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ｃｅｌｌ  ７６（１９９４）、６７７）一方、成体の昆虫においては、Ｔｏｌｌが抗真菌および抗菌応答を制御する（Ｌｅｍａｉｔｒｅら、Ｃｅｌｌ  ８６（１９９６）、９７３）。
【０１５２】
双方、すなわちＴｏｌｌ様レセプターおよびｈｓｐ６０が系統発生の初期に見出され、また、双方が顕著に保存された構造のものであることは注目すべきである。これは、それらの相互作用が関連性がありかつまたより原始的な生物体でも起こるかもしれないことを示す。哺乳動物のｈｓｐ６０は通常、シャペロンとして機能するその能力に従って、細胞内部に隔離される。しかしながら、ｈｓｐ６０は、それが炎症の間の組織細胞の壊死の間に自由にされる場合、もしくはｈｓｐ６０が多様な型のストレスに応答して原形質膜に部分的に転移される場合に到達可能になる。従って、自己のｈｓｐ６０は生得の免疫系に対して危険な抗原としてはたらくかもしれないことが提案された（Ｃｈｅｎら、上記引用文中）。
【０１５３】
哺乳動物のｈｓｐ６０とＴｌｒ４複合体との間の相互作用の正確な機構は解明されるべきままである。ＣＤ１４およびＭＤ−２を用いて、Ｔｌｒ４複合体の２メンバーが同定され、その双方がＴｌｒ４のＬＰＳ応答性を強く強化する。ＬＰＳは、ＣＤ  １４を介して、ならびにＣＤ  １４に依存せずにＴｌｒ４に結合するようである。ヒトＴＩｒ２について、ＬＰＳへの直接結合がインビトロで立証され、また、効率的なシグナル伝達は血清のＣＤ１４を必要とするようである。同様に、細菌のリポタンパク質とＴｌｒ２との間の相互作用の機構は未だ決定されていない。
【０１５４】
要するに、ヒトｈｓｐ６０の炎症前シグナル伝達は機能的Ｔｌｒ４に依存性と見出された。この知見は、Ｔｌｒ４複合体の内在性リガンドの存在、およびストレスをかけられたもしくは損傷された組織細胞に対する正常な組織細胞の生得の免疫識別におけるＴｏｌｌ様レセプターの役割を示唆する。
実施例２：マクロファージにおける炎症前応答を誘導することが可能なヒトｈｓｐ６０のフラグメントの同定
１．トリプシンによるｈｓｐ６０の酵素的タンパク質分解：
Ｈｉｓ標識（ｔａｇ）ｈｓｐ６０（該タンパク質のＮ末端に６個のヒスチジン残基を伴い発現されたｈｓｐ６０）をニッケルカラム上で親和性精製した（ヘキサヒスチジンはニッケルのキレート剤である）。６０μｌのＰＢＳ中４．５ｍｇ／ｍｌを使用して、１：５４の酵素：タンパク質重量比で５０μｇの配列決定等級改変トリプシン（ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）カタログ番号１４１８０２５）を溶解した。混合物を３７℃でインキュベートし、そしてサンプルを０．５、１．５、５．４および１６．５時間後に採取した。サンプルを４℃で一夜保存し、そしてその後−２０℃に移した。各５μｌのサンプルを、５μｌの負荷緩衝液とともに沸騰させ、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動した（４〜２０％勾配２００Ｖで３０分間、バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ））。４画分を一緒に合わせ、そして１分間遠心分離した。上清を濾過し、そしてその後、０．５ｍｌ／分の速度でＰＢＳを用いてスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）−７５  ＦＰＬＣカラム上でのゲル濾過クロマトグラフィーにかけた。５個の澄明な画分および２個のピークショルダーを、図５に記述されるとおり得た。第一のピークが無傷のｈｓｐ６０を含有することが（ｈｓｐ６０の類似のゲル濾過クロマトグラフィー後に）見出された。タンパク質濃度をマイクロＢＳＡキット（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ））により測定した。結果を表番号１に要約する。
【０１５５】
【表２】
2004501061.tif 000004
【０１５６】
全画分を、双方とも３０００ダルトンのカットオフをもつセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）ＹＭ−３（２ｍｌ容積）、およびその後マイクロコン（ｍｉｃｒｏｃｏｎ）ＹＭ−３（０．５ｍｌ容積）により、約１ｍｇ／ｍｌの濃度に濃縮した。画分を、Ｊ７７４細胞を使用した（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１９９）、３２１２）ことを除いて、上述されたとおりにＴＮＦαおよびＮＯの産生を誘導するそれらの能力について試験した。Ｊ７７４マクロファージ培養物に添加されたトリプシンフラグメントの濃度、ならびにこれらの実験の結果を図８および９に示す。画分１および２が活性であることが見出された。
２．逆相ＨＰＬＣによるトリプシン分解されたｈｓｐ６０の画分２の分離
５０μｌの画分２を、４０℃で７５分間の水中０．１％　ＴＦＡおよびアセトニトリル中０．１％　ＴＦＡの勾配を使用して、Ｃ−４カラム（ヴァイダック（Ｖｙｄａｃ）２１４ＴＰ５４、プロテインＲＰ−Ｃ４、２５０×４．６ｍｍ、５μ）上での逆相ＨＰＬＣにより分離した。
【０１５７】
結果（２１５．０ｎｍでの吸光度）を図６に要約する。得られた８個の主ピークを収集し、そしてそれらのＮ末端配列についてエドマン分解により、また、それらの質量についてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分析した。８画分のそれぞれにおいて、１種もしくはそれ以上の質量が見出された。見出された質量をｈｓｐ６０の可能なトリプシンフラグメントに合致させた。一例を図７に示し、これはピーク番号３のＭＳ分析の結果を示す。
【０１５８】
全体として、同定されたフラグメントにより表される５領域が存在する。すなわち
１．Ｅ１２６−Ｋ１５６もしくはＬ３９０−Ｒ４２０の一方内である１つの質量。
２．４個の正確な質量および１個の可能な質量をもつ領域Ｋ１５７−Ｋ１９２。
３．１個の正確な質量をもつ領域Ｇ２２２−Ｋ２４９。
４．１個の正確な質量をもつ領域Ｋ２６９−Ｒ２９０。
５．２個の正確な質量をもつ領域Ｋ３１０−Ｋ３４４。
３．同定されたフラグメントの構造分析
トリプシン消化物の活性の画分の質量分析により同定されたフラグメントは（同一群内のフラグメントは大きな程度の重なりを示すことに注意されたい）：
１）Ｇｌｕ１２６−Ｌｙｓ１５６
２）Ｌｙｓ１５７−Ｌｙｓ１９１
Ｇｌｎ１５８−Ｌｙｓ１９２
Ｇｌｎ１５８−Ｌｙｓ１９１
Ｐｒｏ１６１−Ｌｙｓ１９１
Ｐｒｏ１６１−Ｌｙｓ１９２
３）Ｇｌｙ２２２−Ｌｙｓ２４９
４）Ｌｙｓ２６９−Ａｒｇ２９０
５）Ｌｙｓ３１０−Ｌｙｓ３４４
Ａｓｐ３１５−Ｌｙｓ３４４
６）Ｌｅｕ３９０−Ｖａｌ４２１
である。
【０１５９】
これらの結果を分析するために、いくつかのアプローチを付随して実行した。すなわち
ａ）ヒトｈｓｐ６０の三次元モデルを、その細菌の相同物の結晶学的に既知の構造ＧＲＯＥＬからの相同性により構成した。これは、トリプシン消化物の活性の画分内で見出されたフラグメントのそれぞれについて、ｈｓｐ６０タンパク質全体の枠組み内でどれが溶媒に露出されていると予測されるかを決定することを可能にした。
ｂ）ｔｏｌｌレセプターの天然のリガンド、ｓｐａｅｔｚｌｅの配列をｈｓｐ６０のものと整列させ、そして変動する程度の相同性の数種のフラグメントを同定した（スキームＩを参照されたい）。これは、消化物の活性の画分内で見出されたｈｓｐ６０フラグメントのどれがｔｏｌｌレセプターの認識部位に潜在的に結合する可能性があるかを決定することを可能にした。
ｃ）ｓｐａｅｔｚｌｅタンパク質の二次構造を予測した。これは、ｓｐａｅｔｚｌｅのフラグメントに対する相同性を示したトリプシン消化物の活性の画分中のフラグメントのそれぞれについて、構造の比較を可能にした。
【０１６０】
上に列挙された６領域の分析は：
領域１はｓｐａｅｔｚｌｅの２フラグメントとのとかなりの程度の相同性を示す（この領域および整列はスキームＩ中の箱１として印をつけられる（説明：＊同一の残基、：非常に類似の残基、．類似の残基）。箱中の矢印はフラグメントが次の行に続くことを示す）。
【０１６１】
領域２はｓｐａｅｔｚｌｅに対する配列の相同性を示さないが、それでもなお、２個のループ（一方は第一のヘリックスに先行しかつ他方は２個の間）と一緒にｈｓｐ６０内の２個の溶媒に露出されるヘリックスにわたる。ループおよびヘリックスの双方が溶媒に露出され、そして従ってｈｓｐ６０上の潜在的認識部位である。ｓｐａｅｔｚｌｅは４本のヘリックスの束であると予測されるため、同一のレセプターによる認識を可能にする領域２とｓｐａｅｔｚｌｅとの間の構造の相同性が、この領域内の明らかな配列の相同性の欠如にもかかわらず可能である。
【０１６２】
領域３はｓｐａｅｔｚｌｅの単一のフラグメント（スキームＩ中の箱２として印をつけられる）との有意の相同性を示す。この領域は高度に柔軟性であり、ＧＲＯＥＬ結晶構造、そしてこれゆえにｈｓｐ６０モデル中の表面に露出されたループである。領域３に相同な領域中のｓｐａｅｔｚｌｅの二次構造もまたループであると予測される。従って、分析の全部が、このフラグメントがｔｏｌｌレセプターによる認識の見込みのある候補であることを示唆する。
【０１６３】
領域４は、ｓｐａｅｔｚｌｅの１フラグメント（スキームＩ中の箱３として印をつけられる）との有意の相同性を示す。それはｈｓｐ６０モデル中で部分的にのみ露出される。この領域とｓｐａｅｔｚｌｅ中の対応する領域との間の構造の比較は、このフラグメントの大きな一部分がＧＲＯＥＬ結晶中で乏しい電子密度を示すため、単純でない。
【０１６４】
領域５は、相同性を示す短いフラグメントにより尾をつけられるｓｐａｅｔｚｌｅと配列の相同性を示さないｈｓｐ６０の大きなフラグメントにわたる（スキームＩ中の箱４）。このフラグメントのＣ末端部分（箱４配列を包含しかつ上流の付加的な９残基が表面に露出される）。
【０１６５】
領域６はｓｐａｅｔｚｌｅの２種のフラグメントとの相同性を示す（スキームＩ中の箱５；矢印は次の行へのこの領域の連続の限界を定める）。該フラグメント全体は、表面に露出されたヘリックス、次いで短いβ−鎖、短い部分的に露出されたループおよび付加的なヘリックスより成る。第一のヘリックスに相同なｓｐａｅｔｚｌｅフラグメントはループであると予測されるが、それでもなおＣ末端ヘリックスに相同なフラグメントもまたヘリックスであると予測される。Ｌｙｓ３５９ないしＡｓｐ３９９にわたるｈｓｐ６０の付加的な一領域はｓｐａｅｔｚｌｅの１フラグメントに対するかなりの程度の相同性を示し、かつ、溶媒に露出される。この領域に対応するフラグメントがトリプシン消化物の活性の画分中で観察されなかったという事実にもかかわらず、この領域が活性の原因であるかどうかが検討されるであろう。
を示した。
【０１６６】
これらの分析のそれぞれは若干の程度の不確実性を伴うため、それらの全部と一致するための要件は現実的でない、従って、上の７領域（質量分析からの６個および付加的な挙げられた領域）のそれぞれを、ｈｓｐ６０モデル内のフラグメントの構造を至適に模倣するよう設計された５〜１０残基の大きさ範囲のペプチドループ（１個もしくは複数）の重なり合う主鎖が環化された類似物のアレイ（ａｒｒａｙｓ）の多重平行合成により検討する。該アレイは、天然のものに同一もしくはそれに近い配列を有するがしかしなお変動する束縛されたコンホメーションにこれらの配列を捕捉する、構造化された主鎖が環化された類似物に集中された。活性のペプチド類似物を同定すれば、配列の変動を伴うにもかかわらず活性のものと同一の全体的コンホメーションを有する主鎖が環化された類似物のアレイを設計することができる。これら後者の類似物はｔｏｌｌレセプターに対する親和性を向上させるかもしれない。
実施例３：ｈｓｐ６０のトリプシン消化物およびフラグメントのスクリーニング  ｈｓｐ６０のトリプシン消化物フラグメントのより大スケールの１バッチを、実施例番号２に記述されたものに類似の手順を使用して生じさせた。
【０１６７】
３種の主画分１、２および３をサイズ排除ＦＰＬＣ分離により得た。各画分をその後、逆相ＨＰＬＣにより下位分画した。ピークを別個に収集しかつ凍結乾燥した。
【０１６８】
主画分および分離されたピークを、Ｊ７７４Ａ細胞中でのＴＮＦα分泌に対する刺激および阻害効果について試験した。
【０１６９】
結果：刺激活性が画分１および２で検出された。
実施例４：２０−ｍｅｒの重なり合うペプチドの合成およびスクリーニング
１０残基の重なり合い（および隣接するペプチド間の１０残基の移動）を伴う２０残基長さの３６種の重なり合うペプチドを、ヒトｈｓｐ６０の残基１１１−４９０の領域にわたって合成した。
【０１７０】
該ペプチドを、ｈｓｐ６０に誘導されるＴＮＦ分泌の阻害について試験した。
【０１７１】
予備結果を表番号２に要約する：
【０１７２】
【表３】
2004501061.tif 000005
【０１７３】
実施例５：ヒトｈｓｐ６０の重なり合う１０−ｍｅｒペプチドフラグメントの設計
ｈｓｐ６０の活性の短いフラグメントを見出すために、ヒトｈｓｐ６０の１８２種のペプチドフラグメントを、表番号３に示されるところの入手可能な全部のデータの統合に基づき設計した。これは：
１）ｈｓｐ６０の第一の断片化（トリプシン消化）研究の結果（活性およびＭＳ分析）。
２）ｈｓｐ６０の三次元モデル；とりわけ上のフラグメントのそれぞれの表面到達可能性の分析。
３）ｓｐａｅｔｚｌｅに対する相同性（ｓｐａｅｔｚｌｅのモデルに基づく配列上および構造的の双方）。
４）ヒトｈｓｐ６０の残基１１１−４９０にわたる２０−ｍｅｒの重なり合うペプチドの活性の結果
を包含する。
【０１７４】
【表４】
2004501061.tif 000006
【０１７５】
注：
１）領域１−６は断片化研究に一致する。領域７は断片化研究で現れなかったが、それでもなおｓｐａｅｔｚｌｅとのその相同性およびその見かけの表面露出は、それがスクリーニングに値する領域であることを示唆した。
２）ｓｐａｅｔｚｌｅに対する構造の相同性は第一の近似モデルに基づく。
３）全部の配列はヒトｈｓｐ６０の配列を指す（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベース受託番号Ｐ１０８０９およびスキームＩ）．
４）ｎ．ｔ．＝試験されない
５）全部で１８２種のペプチドが存在する
６）１０種のペプチドをプレート中で２回反復した（２枚の９６穴プレートについて１９２種を生じる）：
２０−ｍｅｒの活性ペプチドの第一の領域からの５種のペプチド。
上の領域７の中央部分からの５種のペプチド。
【０１７６】
プレート１＋２は１９２種のデカペプチドを含有する。すなわち、５８種のペプチドはヒトｈｓｐ６０の残基１２６−１９２にわたり、２２種は残基２２０−２５０にわたり、１３種は残基２６９−２９０にわたり、２６種のペプチドは残基３１０−３４４にわたり、そして６３種のペプチドは残基３５０−４２１にわたり、全部は１アミノ酸の移動を伴う。（１０種の付加的ペプチドは、領域２からの５種のペプチドおよび領域７からの５種の反復物である）。
実施例６：１０−ｍｅｒの１９２種のペプチドの合成
ペプチドを、自動ペプチド合成機（アドヴァンスト　ケムテック（Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＣｈｅｍＴｅｃｈ）のＡＣＴ　３９６）および加熱装置（アドヴァンスト　ケムテック（Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＣｈｅｍＴｅｃｈ）のＬａｂ　Ｔｅｃｈ　４）を使用する多重平行合成（ＭＰＳ）形式で合成した。各９６種のペプチドの２枚のプレートを合成した。ペプチドは、合成機の製造元により推奨される手順、簡潔には：
合成スケール：ウェルあたり６μｍｏｌのペプチド。
樹脂：リンク（Ｒｉｎｋ）アミド
化学：Ｆｍｏｃ化学、ＮＭＰ中２５％ピペリジンでの脱保護。
カップリング：カップリング試薬として５等量のＨＢＴＵ／ＨＯＢＴおよび塩基として１０等量のＤＩＥＡを用いる。
切断：９２．５％　ＴＦＡ、２．５％　Ｈ２Ｏ、２．５％　ＴＩＳ、２．５％　ＥＤＴの溶液を用いる。
部分的精製：切断されたペプチドを、セップパック（Ｓｅｐ−Ｐａｋ）（Ｃ−１８）プレートカラムを通過させることにより実施された。
を使用する固相法により合成した。
【０１７７】
ペプチドを、質量スペクトル分析により試験した。大部分のペプチドの期待された質量が見出された。
実施例７：ｈｓｐ６０の阻害についての１０−ｍｅｒペプチドのスクリーニング　粗ペプチドを５００μｌの水に再懸濁し、そして（出願の実施例番号１に記述されたとおり）Ｊ７７４細胞中でｈｓｐ６０に誘導されるＴＮＦαおよび一酸化窒素（ＮＯ）分泌の阻害について、１：１０の希釈で試験した。選択されたペプチドを、ＣｐＧに誘導されるＴＮＦα分泌の阻害についてもまた（同等なアッセイで）試験した。ＣｐＧは、配列：５’−ＴＣＣＡＴＡＡＣＧＴＴＧＣＡＡＡＣＧＴＴＣＴＧ−３’（Ｋｒｉｅｇ　ＡＭ．ＣｐＧ　ＤＮＡ：ａ　ｎｏｖｅｌ　ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　１９９９；７：６４−５）をもつ非特異的免疫刺激性オリゴヌクレオチドモチーフである。ＣｐＧは、Ｊ７７４細胞を刺激して、ｈｓｐ６０により使用されるものと異なる機構でＴＮＦαを産生させ、そして従ってＴＮＦ分泌の非選択的阻害（ｈｓｐ６０の特異的阻害により媒介されない）に対する陰性対照としてはたらく。本発明の好ましいペプチドは、ｈｓｐ６０により誘導されるＴＮＦα分泌を阻害するが、しかしＣｐＧに誘導されるＴＮＧα分泌を阻害しない。
【０１７８】
選択されたペプチドの活性の結果を図１０に要約する。ペプチド配列は表番号４に要約する。この図中のペプチドは、合成された全１９２種のペプチドのスクリーニングにおいて見出された活性に基づき再スクリーニングのため選択した。該結果は、ｈｓｐ６０もしくはＣｐＧでの誘導に応答してのＴＮＦ分泌の阻害パーセントとして提示され、そして２回の反復物の平均である。
【０１７９】
【表５】
2004501061.tif 000007
【０１８０】
【表６】
2004501061.tif 000008
【０１８１】
この組のペプチドからの最も活性かつ特異的な類似物は：
ｈｓｐ６０の残基２２７−２３６にわたるペプチド番号６６
ｈｓｐ６０の残基３６４−３７３にわたるペプチド番号１３４
ｈｓｐ６０の残基３６９−３７８にわたるペプチド番号１３９
ｈｓｐ６０の残基３７１−３８０にわたるペプチド番号１４１
ｈｓｐ６０の残基３７２−３８１にわたるペプチド番号１４２
ｈｓｐ６０の残基４０３−４１２にわたるペプチド番号１７３
ｈｓｐ６０の残基４０５−４１４にわたるペプチド番号１７５
である。
実施例８：ヒトｈｓｐ６０の残基３６４−３８１からの付加的ペプチドの設計
第二世代の重なり合うペプチドを、１０−ｍｅｒペプチドのスクリーニングに基づき設計した。この組は、ヒトｈｓｐ６０配列の残基３６４−３８１（ＫＡＱＩＥＫＲＩＱＥＩＩＥＱＬＤＶＴ）にわたる領域を研究することを目的とする。この領域内で数種のペプチドがＴＮＦ分泌の特異的阻害を立証したからである。
【０１８２】
図１１は：
Ｉ．ｈｓｐ６０モデルのこの領域中で見出されるヘリックス全体にわたる１８−ｍｅｒのペプチド；
ＩＩ．野性型ペプチドおよび１アミノ酸がアラニンで置き換えられたペプチドを包含する１０、１３および１５残基の三組の重なり合うペプチド（アラニン−スキャン（Ａｌａｎｉｎ−ｓｃａｎ）、Ａはアラニンで置き換えられた位置を表す）；
ＩＩＩ．野性型ペプチドおよび２アミノ酸がアラニンで置き換えられたペプチドを包含する１０および１３残基の二組の重なり合うペプチド（二重位置アラニン−スキャン）
を包含する９６種のペプチドを記述する；
実施例９：主鎖が環化されたペプチドの設計
領域７由来の第二世代のペプチドもまた設計した。この領域内にｈｓｐ６０を阻害するペプチドが見出されたからである（表４のペプチド１７３および１７５）。該プレートは、ｈｓｐ６０の残基４０８−４１６の配列に基づく主鎖が環化されたペプチドを含有する。該ペプチド（表５）は、位置４０８−４１４、４０９−４１６、４０８−４１６および４０９−４１４の間を架橋する４種の型の環化を伴う９残基長である。数種の型の構成単位（表５中で太字で標識される）を、異なる架橋の大きさおよび型を形成するために架橋基として利用している。位置４１５のＡｓｎ残基を、合成の考慮によりＧｌｎもしくは別の残基で置き換えている。加えて（表６）、ｈｓｐ６０の残基４０３−４１２に基づく直鎖状ペプチドを設計した。
【０１８３】
【表７】
2004501061.tif 000009
【０１８４】
【表８】
2004501061.tif 000010
【０１８５】
【表９】
2004501061.tif 000011
【０１８６】
【表１０】
2004501061.tif 000012
【０１８７】
本発明はある種の好ましい態様および実施例について記述された一方、多くの変更および改変を、本発明のペプチドおよび類似物の活性を至適化するために実施してよいことが当業者により認識されるであろう。該実施例は非制限的として解釈されるべきであり、かつ、本発明により開示される原理の具体的説明の目的上のみはたらき、その範囲は後に続く請求の範囲により規定される。
【図面の簡単な説明】
本発明は、後に続く図面および好ましい態様の詳述された記述に関して、より良好に理解されるであろう：
【図１】
発明にかかる、野性型もしくは突然変異体のＴｌｒ４をもつ骨髄由来マクロファージからのＴＮＦα産生に対するヒトｈｓｐ６０の示差的効果を示す。
【図２】
発明にかかる、ｈｓｐ６０に誘導されるＴＮＦα産生の用量依存性および時間経過を示す。
【図３】
発明にかかる、野性型もしくは突然変異体のＴｌｒ４をもつ骨髄由来マクロファージからのＮＯ産生に対するヒトｈｓｐ６０の示差的効果を示す。
【図４】
発明にかかる、ｈｓｐ６０に誘導されるＮＯ産生の用量依存性および時間経過を示す。
【図５】
発明にかかる、スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）−７５　ＦＰＬＣカラム上でのｈｓｐ６０のトリプシンフラグメントのゲル濾過クロマトグラフィーの溶出プロフィルを示す（実施例２、節１に記述される）。
【図６】
発明にかかる、ｈｓｐ６０から得られたトリプシンフラグメントの下位画分のＣ−４カラム上での逆相ＨＰＬＣの結果を示す（実施例２、節２に記述される）。
【図７】
発明にかかる、３４１１ダルトンの分子量を示す（Ｇｌｕ１２６ないしＬｙｓ１５６もしくはＬｅｕ３９０ないしＡｒｇ４２０に対応する）ＨＰＬＣ分離（図６）中のピーク番号３の質量スペクトル分析を示す。
【図８】
発明にかかる、マクロファージにおけるＴＮＦαの産生を誘導するそれらの能力についてのｈｓｐ６０およびｈｓｐ６０のトリプシンフラグメントの試験の結果を示す（実施例１、節１）。
【図９】
発明にかかる、マクロファージにおけるＮＯの産生を誘導するそれらの能力についてのｈｓｐ６０およびｈｓｐ６０のトリプシンフラグメントの試験の結果を示す（実施例１、節１）。
【図１０】
発明にかかる、ｈｓｐ６０の阻害についてのデカペプチドのスクリーニングの結果を記述する（実施例７）。
【図１１】
発明にかかる、ヒトｈｓｐ６０の残基３６４−３８１の領域に基づく９６種のペプチド類似物の設計を図解で記述する（実施例８）。
【図１】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2004501061.tif 000101
2004501061.tif 000102