(57)【要約】その状態をチェックするために、ヒトまたは動物の体から採取された液体試料のタンパク質および／またはペプチドのパターンを定性的および／または定量的に決定する方法および装置を提供する。液体試料のペプチドおよびタンパク質は処理され、次いで分析にかけられ、ヒトまたは動物の体の状態を示す基準値および試料値ならびにそれから誘導される偏差および対応が確立され、データベースに自動的に保存され、かつタンパク質および／またはペプチドのパターンが再び決定される際には、最適な対応の検索が自動的に行われる。この方法では、タンパク質および／またはペプチドの質量成分または構造成分が確立かつ保存される。続いて、保存された質量成分または構造成分の通常の評価から、実際の質量または実際の構造が計算され、かつ液体試料中に含有されるタンパク質および／またはペプチドへの割当てが、計算された実際の質量または実際の構造の組み合わせから行われる。
2006515430.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは動物の体から、その状態をチェックするために採取された液体試料（１０）のタンパク質および／またはペプチドのパターンを定性的および／または定量的に決定する方法であって、液体試料（１０）のペプチドおよびタンパク質が処理され、次いで分析にかけられ、ヒトまたは動物の体の状態を示す基準値および試料値ならびにそれらから誘導される偏差および対応（correspondence）が確立され、データベースに自動的に保存され、かつタンパク質および／またはペプチドのパターンが再び決定される際には、最適な対応の検索が自動的に行われる方法であり、タンパク質および／またはペプチドの質量成分または構造成分が確立されかつ保存され、続いて、保存された質量成分または構造成分の通常の評価から、実際の質量または実際の構造が計算され、かつ液体試料（１０）中に含有されるタンパク質および／またはペプチドへの割当てが、計算された実際の質量または実際の構造の組み合わせから行われることを特徴とする、方法。
【請求項２】
液体試料（１０）の前記ペプチドおよびタンパク質が、キャピラリー電気泳動によって分離され、次いで直接イオン化され、検出のために、インターフェース（１８）を介してオンライン結合質量分析計（２０）に移される方法であって、質量分析計（２０）からの個々のスペクトルが継続的に保存され、続いて保存された個々のスペクトルの通常の評価から、実際の質量および関連する全振幅が計算され、かつ液体試料（１０）中に含有されるタンパク質および／またはペプチドへの割当てが、計算された実際の質量および関連する全振幅の組み合わせから行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
スペクトルに含まれる干渉、特にノイズの除去が、個々のスペクトルを保存した後、および実際の質量および関連する全振幅を計算する前に行われることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
事前に設定された閾値を超える質量および全振幅のみが評価されることを特徴とする、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
タンパク質および／またはペプチドのパターンの新たな決定において、すべての液体試料にそれらが存在することから、基準値としてデータベースに保存されている個々のタンパク質および／またはペプチドの質量および全振幅から、質量および全振幅の較正が行われることを特徴とする、請求項２から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ヒトまたは動物の体から、その状態をチェックするために採取された液体試料（１０）のタンパク質またはペプチドのパターンを定性的および／または定量的に決定する装置であって、処理手段と、解析手段と、装置を制御するための、および測定値の自動評価および保存のための、および既に保存されている測定値と新たな測定値とを比較するためのプログラムを有するコンピューターユニット（２２）とを備え、ヒトまたは動物の体の状態を示す基準値および試料値ならびにそれらから誘導される偏差および対応（correspondence）を確立し、データベースに自動的に保存することができ、かつタンパク質および／またはペプチドのパターンが再び決定される際には、最適な対応の検索が自動的に行うことができる装置であり、タンパク質および／またはペプチドの質量成分または構造成分を前記解析手段によって確立することができ、かつ前記質量成分または構造成分をメモリーに値として保存することができ、かつ実際の質量または実際の構造を前記コンピューターユニット（２２）によって計算することができ、かつ液体試料（１０）中に含有されるタンパク質および／またはペプチドへの割当てが、計算された実際の質量または実際の構造の組み合わせから、およびデータベースに保存された値とのその比較から行うことができることを特徴とする、装置。
【請求項７】
前記装置が、キャピラリー電気泳動（１４）と、イオン化ユニット（１６）と、インターフェース（１８）を介してオンラインでそれに結合された質量分析計（２０）と、装置を制御するための、および測定値の自動評価および保存のための、および既に保存されている測定値と新たな測定値とを比較するためのプログラムを有するコンピューターユニット（２２）と、を備える装置であって、質量分析計（２０）からの個々のスペクトルをメモリーに継続的に保存することができ、かつ実際の質量および関連する全振幅を前記コンピューターユニット（２２）によって計算することができ、かつ液体試料（１０）中に含有されるタンパク質および／またはペプチドへの割当てが、計算された実際の質量および関連する全振幅の組み合わせから、およびデータベースに保存された値とのその比較から行うことができることを特徴とする、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
スペクトルに含まれる干渉、特にノイズの除去が、個々のスペクトルを保存した後、および実際の質量および関連する全振幅を計算する前に、コンピューターユニット（２２）によって行うことができることを特徴とする、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
それを超える質量および全振幅を評価することができる閾値を、コンピューターユニット（２２）によって事前に設定することができることを特徴とする、請求項７または８に記載の装置。
【請求項１０】
タンパク質および／またはペプチドのパターンの新たな決定において、すべての液体試料にそれらが存在することから、基準値としてデータベースに保存されている個々のタンパク質および／またはペプチドの質量および全振幅から、コンピューターユニット（２２）によって、質量および全振幅の較正を行うことができることを特徴とする、請求項７から９のいずれかに記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、請求項１に記載の一般的部分（generic part）による方法および請求項６の一般的部分による装置に関する。
【０００２】
ＷＯ０１／８４１４０  Ａ２から、液体試料のタンパク質および／またはペプチドのパターンを定性的および／または定量的に決定する一般的方法および一般的装置が知られている。液体試料のタンパク質および／またはペプチドは、キャピラリー電気泳動によって分離され、次いで直接イオン化され、検出のために、インターフェースを介してオンライン結合質量分析計に移される。
【０００３】
長期間にわたるヒトまたは動物の体の状態のモニタリングでは、この状態を示す基準値および試料値ならびにそれらから誘導される偏差および対応（correspondence）が、データベースに自動的に保存され、タンパク質および／またはペプチドのパターンが再び決定される際には、最適な対応の検索が自動的に行われる。
【０００４】
本発明の目的は、液体試料のタンパク質および／またはペプチドのパターンを定性的および／または定量的に決定する方法および装置での通常の収集および評価方法において、液体試料に含有されるタンパク質およびペプチドを迅速かつ再現可能に確立することである。
【０００５】
請求項１に記載の一般的部分による方法において、および請求項６に記載の一般的部分による装置において、この目的は、それぞれの特許請求の範囲に記載の特徴によって達成される。
【０００６】
更なる開発および有利な実施形態は、従属する請求項から分かる。
【０００７】
タンパク質および／またはペプチドの質量成分または構造成分を継続的に保存することによって、生データの多次元データフィールドが得られ、そのデータフィールドから実際の質量または実際の構造を計算アルゴリズムによって独立的に計算することができる。
【０００８】
質量分析法による決定を用いた一実施形態に従って、質量分析計からの得られた個々のスペクトルを継続的に保存することによって、スペクトル全体の三次元データフィールドが得られる。第１の次元はスペクトル線の振幅を表し、第２の次元は時間を表し、第３の次元は質量を表す。このように、計算アルゴリズムによる評価から、実際の質量および関連する全振幅に関して正確なステートメントを得ることができる。この方法において、すべての質量および全振幅が、通常の評価方法において確立され、液体試料中に含有されるタンパク質および／またはペプチドへの同時割り当て（simultaneous assignment）が、保存値との比較に利用可能である。
【０００９】
更なる開発に従って、スペクトルに含まれる干渉、特にノイズの除去が、個々のスペクトルを保存した後、および実際の質量および関連する全振幅を計算する前に行われる。
【００１０】
干渉、特にノイズは、必要なシグナルとは異なり、分光写真において規則正しく繰り返すラインを生成しないことから、干渉は必要なシグナルと区別することができ、それによって干渉を除去することができる。必要なシグナルの収集および分解能が、このようにして高められ、その結果、そのスペクトル線がより低い振幅を有する、より大きな数の異なるタンパク質および／またはペプチドを確立することができる。
【００１１】
事前に設定された閾値を超える質量および全振幅のみを評価することが好ましい。これによって、評価された個々のスペクトルからのデータの量が減り、コンピューターによる処理時間が短縮される。
【００１２】
さらに、タンパク質および／またはペプチドのパターンの新たな決定では、すべての液体試料中にそれらが存在することから、基準値としてデータベースに保存された、個々のタンパク質および／またはペプチドの質量および全振幅から、質量および全振幅の較正を行うことができる。
【００１３】
この測定では、決定することができるタンパク質および／またはペプチドのいくつかは、調べられるすべての液体試料に絶えず存在し、さらには、ほぼ同じ濃度で存在するという、予備調査から得られた知識が利用される。これは、正常な結果および逸脱している結果を有するドナーからの試料に等しく当てはまる。基準としてこれらのタンパク質および／またはペプチドを使用することによって、スペクトル、したがって質量および全振幅の生値を、タンパク質および／またはペプチドのパターンの新たな決定において較正することができ、保存されているパターンとの比較が容易になる。
【００１４】
以下に、行われた実施例および一連の実験によって、本発明を説明する。
【００１５】
図１は、本発明による装置を示す。液体試料１０、好ましくは血清または尿を超遠心分離および限外濾過することによって得られた画分をキャピラリー電気泳動装置１４に移す。直接結合されたイオン化ユニット１６およびインターフェイス１８を介して、画分の分子がオンライン結合質量分析計２０に到達する。質量分析計２０の分光写真は、メモリーおよびデータベースを備えるコンピューターユニット２２に移行される。一方、プログラム制御コンピューターユニット２２は、装置を制御する役割を果たす。さらに、検出により得られた測定値は自動的に評価され、データベースに保存される。さらに、プログラムは、既に保存されている測定値と新たな測定値とを自動的に比較する。
【００１６】
この比較から、ヒトまたは動物の体の状態を説明するために使用することができる、合同（congruent）および逸脱（deviating）パラメーターが確立される。
【００１７】
データベースを使用して、ヒトまたは動物の体の同一の、同様な、または異なる状態を同定することが可能である。
【００１８】
ヒトまたは動物の体から採取される液体試料のタンパク質および／またはペプチドのパターンを定性的および／または定量的に決定するための本発明による方法は、当業者によって行うことができる。この適用に医師は必要なく、医学検査室で行う必要はない。
【００１９】
図２は、測定値を処理して結果を得る経路の概略図である。それに加えて、測定期間全体にわたって、強度の大雑把な経過が表されている。強度の経過からの約３秒のタイムスロットについては、関連する分光写真が示されている。左下の画像は、測定期間中のすべての分光写真の三次元像を示す。第１の次元である時間軸は右から左に走る。強度軸は、輝度によって表される。質量軸は、下から上へと走る。干渉を除去し、計算アルゴリズムを使用した後、コンピューターユニットは、個々のすべてのスペクトルから実際の質量および全振幅を確立する。第１のデータ解析において、すべてのピークが同定される。次の段階では、同位体分布および複合質量（conjugated mass）のどちらも使用して、各ピークの電荷が測定される。最後に、調べられた液体試料すべてにおいて９０％を超える確率で生じる実際の質量の表が右下に示される。
【００２０】
図３ａ〜ｄは、正常な結果および逸脱する結果を有する液体試料、すなわちＭＮＧＮ（膜性糸球体腎炎）、ＭＣＧ（微少変化型糸球体腎炎）およびＦＳＧＳ（巣状糸球体硬化症）の三次元質量スペクトルの一般的な例の図、および関連する表を示す。それぞれの病理学的結果から、一般的なタンパク質パターンが示される。異なる疾患に応じて細分して、試験のデータを統計学的評価し、健康な被験者からのデータと比較した。健康な被験者に存在する多くのポリペプチドは、病理学的結果を有する被験者において検出することができず、その他のポリペプチドは、健康な被験者では見出すことができず、病理学的結果を有する被験者においてのみ見出すことができた。このように、特定の疾患に特有のタンパク質パターンが確立される。
【００２１】
以下の手順を用いて、結果を求めた。すべての被験者を腎生検によって事前に調べた。尿素中の正常なペプチドパターンを確立するために、正常な腎機能を有する比較可能な性別および年齢の正常な被験者１８名のグループを調べた。すべての被験者からの尿試料を午前中に収集した。試料を−７０℃で保存した。試料の処理のために、試料を解凍し、その２ｍｌをＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｃ２カラムで分画して、ポリペプチドを濃縮し、塩、尿素および他の干渉成分を除去した。０．５％ギ酸を含有する水中の５０％アセトニトリルでポリペプチドを溶出した。溶出液を凍結乾燥し、水２０μｌに溶解した。
【００２２】
移動相は、水中の３０％エタノールおよび０．５％ギ酸を含有した。同じ液体を担体液として用い、試料を３００ｎｌ／分で圧力下にて（１ｐｓｉで１０秒）注入した。それは、試料約１００ｎｌに相当する。測定の実施は、３０ｋＶおよび０．２ｐｓｉで４５分間行った。
【００２３】
表１に示すように、正常な尿試料のうちの９０％を超える試料に５１種のポリペプチドを見出すことができた。さらに、その試料の＞７０％において７０種のポリペプチドを見出すことができ、すべての試料の＞５０％において更なる１８３種のポリペプチドを見出すことができた。この方法を使用することによって、１つの試料において約１０００種のポリペプチドを検出することができた。健康な被験者のうちの５０％を超える被験者において、これらのペプチドのうちの約３００種を見出すことができた。このデータから、正常なパターンを確立することが可能となる。微少変化型糸球体腎炎（ＭＣＧＮ）の被験者からの１３個の尿試料、膜性ＧＮ（ＭＮＧＮ）の被験者からの１３個の尿試料および巣状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）の被験者からの７個の尿試料を正常なパターンと比較した。
【００２４】
すべての試料のうち９０％を超える試料で見出された３種のポリペプチドを内部標準として使用した。ＭＣＧＮ被験者のうち９０％を超える被験者において独占的に、１７種のポリペプチドが見出された。ＭＮＧＮ被験者において独占的に、他の１７種のポリペプチドが見出された。１３１２、１６７９および１７３７Ｄａの３種のポリペプチドがすべての試料中に存在した。比較可能性を確保するために、これらを内部標準として用いた。これらのデータの再現性によって、ポリペプチドスペクトルに基づいて、糸球体腎炎を鑑別診断することが可能となる。したがって、尿試料から得られたポリペプチドスペクトルを比較することによって、異なる３つの形態の糸球体腎炎を区別することが可能となる。
【００２５】
次の段階において、腎炎の被験者３３名を調べた。そのデータを表２にまとめる。被験者すべてが、治療のために免疫抑制剤の異なる投与計画を予め受け、およびその１９名が、検査時に低用量のコルチコステロイドおよび／またはシクロスポリンＡを服用した。タンパク質排出３．５ｇ／日のネフローゼタンパク尿を被験者２名で検出した。被験者１２名は尿中に１日当たりタンパク質３．５〜０．５ｇを示し、被験者３名は０．５〜０．１５ｇ／日を示し、被験者１６名は臨床的寛解状態にあり、タンパク尿＜０．１５／日および正常な血清クレアチニン値であった。
【００２６】
個々の試験からのデータをデータベースにおいてグループ分けした（３つの疾患それぞれに対して１つ）。続いて、一般的なタンパク質パターンを表すこれらのデータベースからの値を比較した。各疾患グループにおいて有意な相同性が見出された。遡及的な鑑別診断にポリペプチドパターンの比較を利用することができた。ＭＮＧＮ、ＭＣＧおよびＦＳＧＳの被験者から得られたスペクトルの一般的な例を図３に示す。それぞれの疾患は、一般的なタンパク質パターンを示す。異なる疾患に応じて細分して、試験のデータを統計学的に評価し、健康な被験者からのデータと比較した。健康な被験者に存在する多くのポリペプチドは、罹患している被験者において検出することができず、その他のポリペプチドは、健康な被験者においては見出すことができず、罹患している被験者においてのみ見出すことができた。このように、特定の疾患に特有のタンパク質パターンを確立することができる。
【００２７】
表３は、３つの疾患グループと比較して、正常な対照のうち７０％を超える対照において見出された１２２種のポリペプチドの一覧を示す。罹患している被験者では多くのタンパク質が欠けていた。ＭＣＧ被験者の大部分が臨床的寛解状態であったが、正常な対照に存在する５６種のポリペプチドは、罹患している被験者からの試料の＜２５％のみに見出すことができた。正常な対照のうち＞９０％に見出された９種のポリペプチドは、ＭＮＧＮの被験者では欠けていた。他の４７種のポリペプチドは、この被験者グループのうち＜２５％で検出することができた。このグループにおいても、正常な対照または他の疾患において欠けていた、多くのポリペプチドを見出すことができた。ＭＮＧＮ被験者において特異的に存在するが、ＭＣＧまたはＦＳＧＳ被験者のうちの＜２５％に存在する１７種のポリペプチドを同定することができた。あるポリペプチドは健康な被験者においては決して検出することができなかった。他の１７種のポリペプチドをＭＣＧの被験者から採取した尿中にのみ検出することができた。これらの被験者の大部分が臨床的寛解状態であったことから、これはすべて、さらに注目すべきことである。
【００２８】
使用した略語は以下の意味を有する：
ＭＮＧＮ  膜性糸球体腎炎
ＦＳＧＳ  巣状糸球体硬化症
ＭＣＧＮまたはＭＣＧ  微少変化型糸球体腎炎
【００２９】
【表１】
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【００３０】
【表２】
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【００３１】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明による装置の概略図である。
【図２】測定値を処理して結果を得る経路の概略図である。
【図３−１】正常な結果および逸脱している結果を有する液体試料の三次元質量スペクトルの図、ならびに関連する表を示す。
【図３−２】正常な結果および逸脱している結果を有する液体試料の三次元質量スペクトルの図、ならびに関連する表を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【国際調査報告】
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