(57)【要約】中枢神経系（ＣＮＳ）若しくは末梢神経系（ＰＮＳ）の損傷、障害又は疾患の治療において、ＣＮＳ若しくはＰＮＳでのニューロンの変性を防止若しくは阻害するための、又は神経の再生を促進するための医薬組成物及び方法は、（ａ）神経系（ＮＳ）特異的抗原又はその類似体、（ｂ）ＮＳ特異的抗原若しくはその類似体由来のペプチド、（ｃ）コポリマー１、コポリマー１関連ペプチド若しくはポリペプチド、及びポリＧｌｕ５０Ｔｙｒ５０から成る群から選択されるコポリマー、並びに（ｄ）非自己抗原、から成る群から選択される作用物質をパルスされた抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原提示細胞及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物であって、前記抗原提示細胞が、
（ａ）神経系（ＮＳ）特異的抗原又はその類似体、
（ｂ）ＮＳ特異的抗原若しくはその類似体に由来するペプチド、又は前記ペプチドの類似体若しくは誘導体、
（ｃ）コポリマー１、コポリマー１関連ペプチド若しくはポリペプチド、及びポリＧｌｕ５０Ｔｙｒ５０から成る群から選択されるコポリマー、並びに
（ｄ）非自己抗原、
から成る群から選択される作用物質をパルスされたものである医薬組成物。
【請求項２】
前記抗原提示細胞がヒト抗原提示細胞である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記抗原提示細胞が単球、マクロファージ、樹状細胞及びＢ細胞から成る群から選択される、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記抗原提示細胞がヒト樹状細胞である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ヒト樹状細胞が個体の皮膚、脾臓、胸腺、骨髄、リンパ節又は末梢血から得られた、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記抗原提示細胞が、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、βインターフェロン（ＩＦＮ−β）、ＩＦＮ−γ、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、単球遊走活性化因子（ＭＣＡＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、コロニー刺激因子１（ＣＳＦ−１）、神経栄養因子３（ＮＴ−３）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、リピドＡ、トリペプチドｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（Ｆｍｌｐ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、イオノホアＡ２３１８７、ビタミンＤ３結合タンパク質、ＣＤ４０リガンド及びリポ多糖（ＬＰＳ）から成る群から選択される少なくとも１つの生物学的に活性な刺激性作用物質を含有する培地で培養された、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記抗原提示細胞がＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、又はＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦの両方を含有する培地で培養された、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記抗原提示細胞がＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦの両方を含有する培地で培養されたヒト樹状細胞である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記抗原提示細胞がＮＳ特異的抗原又はその類似体をパルスされたものである、請求項１から７までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ＮＳ特異的抗原がミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、Ｓ−１００、βアミロイド、Ｔｈｙ−１、Ｐ０、ミエリン抗原Ｐ２、神経伝達物質受容体、Ｎｏｇｏ−Ａ、Ｎｏｇｏ−Ｂ、Ｎｏｇｏ−Ｃ、及びＮｏｇｏ受容体（ＮｇＲ）から成る群から選択される、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記抗原提示細胞がＮＳ特異的抗原に、又はその類似体に由来するペプチドをパルスされたものである、請求項１から７までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ペプチドがＭＢＰ由来ペプチドである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記ＭＢＰペプチドがＭＢＰ８７−９９ペプチド（配列番号２）である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記抗原提示細胞がＮＳ特異的抗原由来のペプチドの類似体をパルスされたものである、請求項１から７までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記ペプチドがＭＢＰペプチドの類似体である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記類似体がＭＢＰ−Ｇ９１（配列番号３）、ＭＢＰ−Ａ９１（配列番号４）、及びＭＢＰ−Ａ９６（配列番号５）から成るペプチドの群から選択される、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記抗原提示細胞がコポリマー１をパルスされたものである、請求項１から７までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記抗原提示細胞がポリＧｌｕ５０Ｔｙｒ５０をパルスされたものである、請求項１から７までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
中枢神経系（ＣＮＳ）又は末梢神経系（ＰＮＳ）におけるニューロンの変性を防止若しくは阻害するための、又は神経の再生を促進するための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
ＣＮＳ又はＰＮＳの損傷、障害又は疾患を治療するための、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
ＣＮＳにおける前記損傷が脊髄損傷、鈍性外傷、穿通外傷、脳の直撃若しくは対側衝撃、出血性卒中、又は虚血性卒中である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記障害又は疾患が、糖尿病性神経障害、老人性認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、顔面神経（ベル）麻痺、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ビタミン欠乏症、てんかん、健忘症、不安、痛覚過敏、精神病、発作、酸化ストレス、オピエート耐性及び依存症、緑内障、視神経障害、年齢関連黄斑変性、又は網膜変性である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
中枢神経系（ＣＮＳ）又は末梢神経系（ＰＮＳ）におけるニューロンの変性を防止若しくは阻害するための、又は神経の再生を促進するための方法であって、それを必要とする個体に、
（ａ）神経系（ＮＳ）特異的抗原又はその類似体、
（ｂ）ＮＳ特異的抗原若しくはその類似体に由来するペプチド、又は前記ペプチドの類似体若しくは誘導体、
（ｃ）コポリマー１、コポリマー１関連ペプチド又はポリペプチド、及びポリＧｌｕ５０Ｔｙｒ５０から成る群から選択されるコポリマー、並びに
（ｄ）非自己抗原、
から成る群から選択される作用物質をパルスされた有効量の抗原提示細胞を投与することを含む方法。
【請求項２４】
前記抗原提示細胞がヒト抗原提示細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗原提示細胞が単球、マクロファージ、樹状細胞及びＢ細胞から成る群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗原提示細胞が、必要とする前記個体から得られた自己樹状細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記樹状細胞が前記個体の皮膚、脾臓、胸腺、骨髄、リンパ節又は末梢血から得られた、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗原提示細胞が、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、βインターフェロン（ＩＦＮ−β）、ＩＦＮ−γ、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、単球遊走活性化因子（ＭＣＡＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、コロニー刺激因子１（ＣＳＦ−１）、神経栄養因子３（ＮＴ−３）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、リピドＡ、トリペプチドｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（Ｆｍｌｐ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、イオノホアＡ２３１８７、ビタミンＤ３結合タンパク質、ＣＤ４０リガンド及びリポ多糖（ＬＰＳ）から成る群から選択される少なくとも１つの生物学的に活性な刺激性作用物質を含有する培地で培養された、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗原提示細胞がＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、又はＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦの両方を含有する培地で培養された、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗原提示細胞がＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦの両方を含有する培地で培養されたヒト樹状細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＣＮＳ又はＰＮＳの損傷、障害又は疾患の治療方法であって、それを必要とする個体に、
（ａ）神経系（ＮＳ）特異的抗原又はその類似体、
（ｂ）ＮＳ特異的抗原若しくはその類似体に由来するペプチド、又は前記ペプチドの類似体若しくは誘導体、
（ｃ）コポリマー１、コポリマー１関連ペプチド又はポリペプチド、及びポリＧｌｕ５０Ｔｙｒ５０から成る群から選択されるコポリマー、並びに
（ｄ）非自己抗原、
から成る群から選択される作用物質をパルスされた有効量の抗原提示細胞を投与することを含む方法。
【請求項３２】
ＣＮＳにおける前記損傷が脊髄損傷、鈍性外傷、穿通外傷、脳の直撃若しくは対側衝撃、出血性卒中、又は虚血性卒中である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記障害又は疾患が糖尿病性神経障害、老人性認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、顔面神経（ベル）麻痺、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ビタミン欠乏症、てんかん、健忘症、不安、痛覚過敏、精神病、発作、酸化ストレス、オピエート耐性及び依存症、緑内障、視神経障害、年齢関連黄斑変性、又は網膜変性である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗原提示細胞が損傷部位に、又はその近辺に局所投与される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗原提示細胞が全身投与される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
脊髄損傷の治療方法であって、それを必要とする個体に、
（ａ）神経系（ＮＳ）特異的抗原又はその類似体、
（ｂ）ＮＳ特異的抗原若しくはその類似体に由来するペプチド、又は前記ペプチドの類似体若しくは誘導体、
（ｃ）コポリマー１、コポリマー１関連ペプチド又はポリペプチド、及びポリＧｌｕ５０Ｔｙｒ５０から成る群から選択されるコポリマー、並びに
（ｄ）非自己抗原、
から成る群から選択される作用物質をパルスされた有効量の自己樹状細胞を投与することを含む方法。
【請求項３７】
前記自己樹状細胞がＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地で培養後に配列番号４のペプチドをパルスされたものである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ＣＮＳ又はＰＮＳの損傷の治療方法であって、それを必要とする個体に非自己抗原を免疫すること、及び前記非自己抗原をパルスされた有効量の抗原提示細胞を、前記個体の損傷部位にその後に投与することを含む治療方法。
【請求項３９】
ＣＮＳ又はＰＮＳの損傷の治療方法であって、非自己抗原をパルスされた有効量の抗原提示細胞を、必要とする個体の損傷部位に投与することを含み、前記個体が前記非自己抗原に予め曝露された個体である治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組成物及び方法に関し、さらに具体的には適当な抗原をパルスされた抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞を含む組成物、及び中枢神経系（ＣＮＳ）又は末梢神経系（ＰＮＳ）におけるニューロンの変性を防止若しくは阻害するための、又は神経再生を促進するための方法に前記抗原をパルスされた細胞を使用することに関する。
【０００２】
略号：ＡＰＣ：抗原提示細胞、ＡＰＬ：改変ペプチドリガンド、ＣＮＳ：中枢神経系、ＢＢＢ：Ｂａｓｓｏ、Ｂｅａｔｔｉｅ及びＢｒｅｓｎａｈａｎのオープンフィールド移動尺度、ＤＣ：樹状細胞、ＥＡＥ：実験的自己免疫性脳脊髄炎、ＧＭ−ＣＳＦ：顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ＭＢＰ：ミエリン塩基性タンパク質、ＭＨＣ：主要組織適合複合体、ＮＳ：神経系、ＰＮＳ：末梢神経系、ＲＴ−ＰＣＲ：逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ＳＣＩ：脊髄損傷
【背景技術】
【０００３】
神経系には、脳と脊髄から成る中枢神経系（ＣＮＳ）と、脳と脊髄以外の神経と神経節から成る末梢神経系（ＰＮＳ）が含まれる。神経系の傷害は、穿通外傷や鈍性外傷のような外傷性損傷、又はアルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、糖尿病性神経障害、老人性認知症、及び虚血などの疾患又は障害に起因する可能性がある。
【０００４】
免疫系はたいていの組織で防御、修復及び治癒に必須の役割を演じるが、ＣＮＳではその独特な免疫特権が原因となって、免疫反応は比較的限定されている。損傷後に哺乳類のＣＮＳが機能的回復を達成できないことは、損傷した組織と免疫系の間の対話が無効なことを反映している。よって、ＣＮＳと血中マクロファージとの限られたコミュニケーションは、切断された軸索が再成長する能力に影響するが、活性化マクロファージを移植するとＣＮＳの軸索の再成長が促進されることが示された（Ｒａｐａｌｉｎｏら、１９９８）。
【０００５】
哺乳類のＣＮＳのニューロンは損傷後に自然に再生しないことから、ＣＮＳ損傷はしばしば運動機能や知覚機能の永続的な欠陥を招くおそれがある。
【０００６】
脊髄損傷（ＳＣＩ）は、しばしば著しく転帰不良であり、それは直接損傷したニューロンに対する傷害と再生に乏しいことだけが原因ではなく、初期損傷を免れた隣接するニューロンに対する二次的な傷害も原因となる。これらの二次的な事象は、正常レベルに比べ毒性過剰の生理学的物質や自己化合物の分解産物のような、損傷が誘発する破壊性自己化合物の活性によって主に引き起こされる（Ｆａｄｅｎ、１９９３）。よって、ＳＣＩからの回復は傷害の広がりを防止すること（すなわち神経保護）によって、及び細胞体がまだ生存している傷害を受けた繊維の再増殖を促進すること（すなわち再生）によって改善できる可能性がある（Ｂａｓｓｏら、１９９６；Ｂａｖｅｔｔａら、１９９９；Ｂａｚａｎら、１９９５；Ｂｅａｔｔｉｅら、１９９７；Ｂｅｈｒｍａｎｎら、１９９４；Ｂｅｔｈｅａら、１９９９；ＢｌｅｓｃｈとＴｕｓｚｙｎｓｋｉ、１９９７；Ｂｒｅｇｍａｎ、１９９８；Ｂｒｅｗｅｒら、１９９９；ＣｏｎｓｔａｎｔｉｎｉとＹｏｕｎｇ、１９９４；Ｃｒｏｗｅら、１９９７；Ｆｒａｎｚｅｎら、１９９８；Ｈａｕｂｅｎら、２０００；Ｌｉｕら、１９９４；Ｍｏａｌｅｍら、１９９９）。
【０００７】
ＣＮＳの損傷への免疫の関与は、回復に有害な作用を有し、二次的な傷害を媒介することに活発な役割を演じると長い間考えられてきた。一次病変は局所炎症を含めた変化を引き起こす。ごく最近まで、炎症細胞は傷害の拡散を部分的に担うため、脊髄損傷後の免疫活性を全て回避し最小化すべきであるという意見の一致がみられた。したがって、メチルプレドニゾロンのような大用量の抗炎症剤を用いた治療によって、脊髄損傷後の炎症を減らすことに試行が集中した。
【０００８】
最近２、３年の研究は、もしも適正に調節されるなら、細胞性免疫は損傷した脊髄の再増殖に中心的な役割を演じることを示す証拠をもたらした（Ｂｕｔｏｖｓｋｙら、２００１；Ｈａｕｂｅｎら、２００１；Ｈａｕｂｅｎら、２０００；Ｈａｕｂｅｎら、２００１；Ｈａｕｂｅｎら、２０００）。脊髄損傷又は視神経損傷後に適正に調節された免疫応答は、損傷を免れた繊維を二次変性から保護し、傷害を受けた繊維の細胞体を救い、切断された軸索の再増殖を促進することを助ける。中枢神経系（ＣＮＳ）関連ミエリン抗原に特異的なＴ細胞を受動免疫又は能動免疫すると、視神経挫滅又は脊髄挫傷のラット及びマウスモデルにおいて二次変性が減少する（Ｆｉｓｈｅｒら、２００１；Ｈａｕｂｅｎら、２０００；Ｍｏａｌｅｍら、１９９９；Ｙｏｌｅｓら、２００１）。さらに、完全に離断した脊髄又は視神経に、自己坐骨神経で活性化したマクロファージを局所移植すると、機能の回復を幾分伴う再生性増殖が生じる（Ｆｒａｎｚｅｎら、１９９８；Ｌａｚａｒｏｖ−Ｓｐｉｅｇｌｅｒら、１９９６；Ｒａｐａｌｉｎｏら、１９９８）。
【０００９】
米国特許第５８００８１２号、第６１１７４２４号及び第６２６７９５５号は全て本出願人に譲渡されているが、哺乳動物のＣＮＳにおける軸索の再生の促進に自己単核食細胞を使用するための方法と組成物を開示している。例えば損傷した脊髄における、損傷部又はその近辺で哺乳動物のＣＮＳに投与する前に、神経セグメント、真皮、皮膚のような刺激性組織と共に、又は１つ若しくは複数の前記刺激性組織で馴化した培地と共に、或いは刺激性細胞若しくは刺激性細胞で馴化した培地と共に、或いは少なくとも１つの生物活性作用物質、例えばＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１０のようなサイトカインと共に、単核食細胞を培養することによってそれらの細胞を好ましくは活性化する。
【００１０】
本出願人のＰＣＴ公報ＷＯ９９／６００２１は、損傷又は疾患の影響を改善するためにＣＮＳ又はＰＮＳにおける変性を防止又は阻害するための組成物を記載している。その組成物は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、それ由来のペプチド又はそれで活性化されたＴ細胞のような神経系（ＮＳ）特異的抗原を含む。本出願人のＰＣＴ公報ＷＯ０２／０５５０１０は、損傷又は疾患の影響を改善するための、ＣＮＳ若しくはＰＮＳにおける神経再生を促進するための、又は変性を弱めるか阻害するための医薬組成物を開示している。その医薬組成物は、ＣＮＳ特異的抗原由来の自己ペプチドの変更によって得られるペプチドか、又はそのような変更ＣＮＳペプチドによって活性化されたＴ細胞を含む。その変更は、自己ペプチドの１つ又は複数のアミノ酸残基を種々のアミノ酸残基と置換することにあり、前記変更ＣＮＳペプチドは自己ペプチドによって認識されるＴ細胞受容体を依然として認識できるが、親和性は低い。
【００１１】
コポリマーＣｏｐ１及びそれを用いて活性化されたＴ細胞は、神経保護性を付与しグルタミン酸塩の毒性からＣＮＳ細胞を保護することが示された。ＰＣＴ公報ＷＯ０１／５２８７８及びＷＯ０１／９３８９３は共に本出願人のものであるが、Ｃｏｐ１、Ｃｏｐ１関連ペプチド及びポリペプチド、並びにそれを用いて活性化されたＴ細胞が、グルタミン酸塩の毒性からＣＮＳ細胞を保護し、さらにＣＮＳ又はＰＮＳにおいてニューロンの変性を防止若しくは阻害するか、又は神経の再生を促進することを開示している。ＷＯ０３／００２２１４０も本出願人のものであるが、（以前はポリＧＴと呼ばれポリＹＥとも名付けられた）コポリマーであるポリＧｌｕ５０Ｔｙｒ５０、及びそれを用いて活性化されたＴ細胞がグルタミン酸塩の毒性からＣＮＳ細胞を保護し、さらにＣＮＳ又はＰＮＳにおいてニューロンの変性を防止若しくは阻害するか、又は神経の再生を促進することも開示している。具体的には、前記出願では、視神経繊維において生存している網膜神経節細胞数が、アジュバント及びＰＢＳを免疫されたマウスよりもＣｏｐ１又はポリＧｌｕ，Ｔｙｒを免疫されたマウスで有意に大きかったことを示した。上に引用した個々の及び全ての特許及び特許出願は、ここに完全に開示されるかのごとく、これによってその全体が参照として組み入れられる。
【００１２】
効果的な免疫応答は、２つの主要な細胞群、すなわちリンパ球（Ｂ細胞及びＴ細胞）と抗原提示細胞を必要とする。抗原を単独で認識できるＢ細胞上の膜結合抗体とは異なり、膜上のＴ細胞受容体は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と呼ばれる細胞膜糖タンパク質と結合した抗原のみを認識できる。ＭＨＣ分子には主に２種がある。ＭＨＣクラスＩ分子はほぼ全ての有核細胞に発現し、ＭＨＣクラスＩＩ分子は抗原提示細胞（ＡＰＣ）にのみ発現する。表面にＣＤ４膜糖タンパク質が存在することが特徴的なヘルパーＴ（ＴＨ）細胞は、ＡＰＣの表面のＭＨＣクラスＩＩ分子と共に表出される抗原を認識すると活性化する。
【００１３】
ＡＰＣはまず抗原をインターナリゼーションし、次にＭＨＣクラスＩＩ分子と結合した抗原の一部を膜上に表出する。ＴＨ細胞はＡＰＣの膜上で抗原−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体を認識しその複合体と相互作用する。さらにＡＰＣは付加的な補助刺激シグナルを生成し、ＴＨ細胞を活性化させる。
【００１４】
多様な細胞がＡＰＣとして機能できる。これらの細胞の顕著な特性は、ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現できることと、補助刺激シグナルを送達できることである。３種の細胞、樹状細胞、マクロファージ及びＢリンパ球がプロＡＰＣとして分類されている。
【００１５】
樹状細胞（ＤＣ）は造血幹細胞から骨髄系系列を介して派生するが、発生の正確な経路は完全には解明されていない。ＤＣは単球／マクロファージ系列の一部として発生するか、又は全く別個の系列から発生するかは明らかでない。血液ＤＣは骨髄のミエロイド系前駆細胞から発生し、組織において多様な種類のＤＣに分化する。それらのＤＣは組織の特異的部位に応じて、ランゲルハンス細胞（表皮と粘膜）、間質ＤＣ（心臓、肺、肝臓、腎臓、消化管）、指状かん入ＤＣ（二次リンパ組織のＴ細胞領域及び胸腺髄質に存在）及び循環ＤＣ（血液及びリンパ、血中白血球の０．１％を構成する）に分類される。
【００１６】
種々の部位に存在するＤＣは種々の形態と機能を有するが、それらの全てがＭＨＣクラスＩＩ分子及びＢ７補助刺激ファミリーの構成成分、すなわち糖タンパク質Ｂ７−１及びＢ７−２、の両者を高レベル構成性発現するプロＡＰＣである。このことから、ナイーブＴＨ細胞に対してＭＨＣクラスＩＩ分子と共に抗原を効果的に提示すること、及び完全なＴ細胞活性化に必要な補助刺激シグナルを送達することも可能となる。その補助刺激シグナルはナイーブＴ細胞を増殖させ、特異的な機能を成し遂げるエフェクターＴ細胞に分化させる。これらの特徴のために、ＤＣはＡＰＣとして機能できるようになる前に活性化される必要があるマクロファージ及びＢ細胞よりも強力なＡＰＣであるとみなされている。ノンプロＡＰＣとして分類される他の数種の細胞を、ＭＨＣクラスＩＩ分子及び補助刺激シグナルを発現するように誘導できる。
【００１７】
相当数の文献が、樹状細胞（ＤＣ）の主要な役割を一般に免疫応答の、特に自己免疫応答の促進とモジュレーションであるとしている（Ｋｎｉｇｈｔら、２００２；Ｌｉｎｋら、２００１）。ＤＣは主要な機能が抗原提示である免疫細胞である。ＤＣはナイーブＴ細胞を刺激し、Ｔ細胞応答の質を調節し、一次免疫応答を開始する並はずれた能力を有する（ＭｅｌｌｍａｎとＳｔｅｉｎｍａｎ、２００１）。ＤＣの作用は活発な自己免疫の付与から免疫寛容の付与まで多様であり、ＤＣはＴ細胞の分化に変化を引き起こすことができる（Ｄｉｔｔｅｌら、１９９９；Ｔｕｒｌｅｙ、２００２；Ｘｉａｏら、２００１）。
【００１８】
免疫制御に果たすＤＣの多様な活性は、ＤＣのサブセット及び系列の多様性並びにまだ未熟であるもののＤＣの機能的柔軟性と相関する（Ｌｉｕ、２００１）。これらの細胞の成熟状態、並びにそれらの細胞が活性化するときの量と状況は、生じる休止免疫応答の性質を決定する。ＤＣの分化の別個の３段階について最近記載され、ＤＣが部分的に成熟しているか半成熟しているときに寛容が付与される一方で、完全に成熟したＤＣのみが免疫原性であることが示唆された。Ｔ細胞介在性免疫応答を誘導する決定的シグナルは、ＤＣからの前炎症性サイトカイン、具体的にはインターロイキン（ＩＬ）−１２、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αの放出を伴うＣＤ８６（Ｂ７．２）及びＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣ−ＩＩ）分子の発現であると考えられる（ＬｕｔｚとＳｃｈｕｌｅｒ、２００２）。
【００１９】
ＤＣはナイーブヘルパーＴ細胞と細胞傷害性Ｔ細胞の両方を感作する独特の能力を保持することから、感染症、癌及び自己免疫疾患の免疫応答のモジュレーションにＤＣを使用できる可能性があることに多くの関心が集まった。癌の免疫療法、並びに細菌、ウイルス及び他の病原体感染の免疫療法に樹状細胞性ワクチンが提案された。
【００２０】
本出願のいかなる節におけるいかなる参照の引用又は確認も、そのような参照が本発明の従来技術として利用できるという承認として解釈するものではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明によると、ミエリン塩基性タンパク質配列由来ペプチド（ＭＢＰ８７−９９）又は前記ペプチドのアミノ酸９１をアラニンに置換した類似体（ＭＢＰ−Ａ９１）をパルスされた樹状細胞を局所注射すると、脊髄挫傷後のラットが劇的に回復することが発見された。
【００２２】
よって、一側面では本発明は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）及び薬学的に許容性の担体を含む医薬組成物を提供し、ここで前記ＡＰＣは、
（ａ）神経系（ＮＳ）特異的抗原又はその類似体、
（ｂ）ＮＳ特異的抗原若しくはその類似体に由来するペプチド、又は前記ペプチドの類似体若しくは誘導体、
（ｃ）コポリマー１、コポリマー１関連ペプチド、コポリマー１関連ポリペプチド及びポリＧｌｕ５０Ｔｙｒ５０から成る群から選択されるコポリマー、並びに
（ｄ）非自己抗原、
から成る群から選択される作用物質をパルスされたものである。
【００２３】
本発明のＡＰＣにはヒト単球、マクロファージ、Ｂ細胞及びさらに好ましくは樹状細胞が含まれるが、それらに限定されない。
【００２４】
本発明の医薬組成物は神経保護、すなわちＣＮＳ若しくはＰＮＳにおけるニューロンの変性の防止若しくは阻害に、又は神経再生の促進に、具体的には軸索の傷害を生じているか軸索の傷害を伴うものを含めたＣＮＳの損傷、障害又は疾患の治療に有用である。
【００２５】
別の側面では、本発明は神経保護の方法、すなわちＣＮＳ又はＰＮＳにおけるニューロンの変性を防止又は阻害する方法を提供する。その方法は、それを必要とする個体に、上記作用物質（ａ）〜（ｄ）から成る群から選択される作用物質をパルスされた有効量のＡＰＣを投与することを含む。
【００２６】
具体的な一実施形態ではこの神経保護方法は、軸索の傷害を生じたか、又は軸索の傷害を伴うものを含めたＣＮＳの損傷、障害又は疾患におけるニューロンの変性を防止又は阻害することを目的とする。
【００２７】
さらなる側面では、本発明はＣＮＳ又はＰＮＳにおける神経再生を促進する方法を提供し、その方法はそれを必要とする個体に、上記作用物質（ａ）〜（ｄ）から成る群から選択される作用物質をパルスされた有効量のＡＰＣを投与することを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明によると、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）ペプチドを特異的にパルスされたＤＣをラットの脊髄挫傷部位に注射した。この注射の目的は、損傷部位に豊富に存在する抗原に対する十分に制御された適応免疫応答を刺激することであった。我々は、ＭＢＰペプチドをパルスされたＤＣを使用すると、免疫系を活用する方法が得られるであろうと仮定し、損傷した脊髄組織の保護と再生の両面に対するＭＢＰペプチドの機能を探索した（Ｈａｕｂｅｎら、２０００；Ｒａｐａｌｉｎｏら、１９９８）。併発する自己免疫疾患のリスクを低下させる一方で良好な転帰を得ようと、我々は改変ペプチドリガンドである、位置９１のアミノ酸リシンをアラニンと置換したＭＢＰセグメント（アミノ酸８７〜９９）でもＤＣをパルスした。この変更ペプチド（ＭＢＰ−Ａ９１）は、弱自己反応性Ｔ細胞を活性化することによって実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を誘導するリスクなしに自己免疫を誘導して、本来の脳炎誘発ペプチドと交差反応することが示された（Ｇａｕｒら、１９９７）。損傷した脊髄を有するラットにワクチンとして使用すると、そのペプチドは防御性自己免疫を誘発できる（Ｈａｕｂｅｎら、２００１ｂ）。結果は、ＭＢＰ由来ペプチドをパルスされたＤＣは、ＳＣＩ後に局所又は全身のどちらかに注射されるならば、移動活動の回復を促進することを示した。ＭＲＩによって形態学的及び解剖学的に測定した組織の保存性にも回復が現れた。
【００２９】
一側面では、本発明はヒトＡＰＣ及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物を提供し、ここで前記ＡＰＣは、
（ａ）神経系（ＮＳ）特異的抗原又はその類似体、
（ｂ）ＮＳ特異的抗原若しくはその類似体に由来するペプチド、又は前記ペプチドの類似体若しくは誘導体、
（ｃ）コポリマー１、コポリマー１関連ペプチド、コポリマー１関連ポリペプチド及びポリＧｌｕ５０Ｔｙｒ５０から成る群から選択されるコポリマー、並びに
（ｄ）非自己抗原、
から成る群から選択される作用物質をパルスされたものである。
【００３０】
本明細書において使用されるように、「ＡＰＣ」という用語は、限定することなしに末梢血から得られた単球、組織又は腔を含めた部位から得られるマクロファージ、骨髄又は血液から得られたマクロファージ前駆細胞を培養することによって誘導されたマクロファージ、脾臓、リンパ節皮膚及びリンパ液を含めた部位から得られた樹状細胞（ＤＣ）、骨髄又は血液から得られるＤＣ前駆細胞を培養することによって誘導されたＤＣ、並びに骨髄又は血液から得られたＢ細胞を含むことを意図する。
【００３１】
ヒトＡＰＣは循環から、又はＡＰＣが属する組織から得ることができる。末梢血は、単球、マクロファージ、ＤＣ及びＢ細胞の、容易に利用できる態勢の整った供給源であり、本発明の好ましい実施形態に係り供給源として使用される。他の供給源からのＡＰＣは当技術分野で十分に公知であり、そのようなＡＰＣには、限定することなしに、腹腔又は胸腔のような漿膜腔から得られたマクロファージ、肺胞マクロファージ、及び（肝臓における）クッパー細胞及び（ＣＮＳにおける）小膠細胞のような種々の用語で知られている可能性のある他の組織（例えば肝臓、脾臓、胸腺）に関連するマクロファージがある。さらにＡＰＣには、Ｂリンパ球と、いっそう好ましくはＤＣがある。
【００３２】
一実施形態ではＡＰＣは、これによって完全に開示されたとして本明細書に参照として組み込まれる本出願人のＰＣＴ／ＩＬ０２／００９３０に記載されているような、血液から調製できるヒトマクロファージ又は単球である。前に指摘した米国特許第５８００８１２号、第６１１７４２４号及び第６２６７９５５号に記載したように、単球及びマクロファージを真皮、皮膚又は神経分節のような組織と共に培養することによって、それらの細胞を任意選択でまず刺激してもよい。
【００３３】
好ましい一実施形態では、ＡＰＣは、皮膚の表皮（ランゲルハンス細胞）のような非リンパ組織及び脾臓、骨髄、リンパ節及び胸腺のようなリンパ組織、並びに血液（血液ＤＣ）及びリンパ（ベール細胞）を含めた循環系を含めた、ヒトＤＣが存在する組織から得ることができるヒトＤＣである。ヒト末梢血は、容易に利用できる態勢の整ったヒトＤＣの供給源であり、本発明の好ましい実施形態に係る供給源として使用される。さい帯血はヒトＤＣの別の供給源であり、望まれるならばさい帯血はＤＣの供給源として使用でき、そのＤＣは必要ならば後で使用するために凍結保存できる。
【００３４】
本発明に特に好ましいのは、治療用製剤を投与される被験者の末梢血から精製された自己ＤＣの使用である。
【００３５】
ＡＰＣ、具体的にはＤＣは、ヒト末梢血を含めてそれらの細胞が属する組織に少数しか存在しないため、それらのＡＰＣを使用するには濃縮するか単離しなければならない。濃縮法は当業者に十分公知であり、濃縮法には限定することなしに水ひ、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配のような適当な密度の材料を通過する遠心分離のような反復密度勾配分離法、及び正の選択、負の選択及びそれらの組合せ、並びに適当な表面に選択的に接着させた後、低温で又は低濃度の二価陽イオンでの取り出し、機械的取り出し又はリドカイン存在下での取り出しがある。
【００３６】
好ましい一実施形態では、ＡＰＣはＦｉｃｏｌ又はＰｅｒｃｏｌｌ勾配で分画し、Ｐｅｒｃｏｌｌの界面から富単球画分を回収し、適当な培地で再懸濁し、テフロン（登録商標）バッグに入れて３７℃で培養することによって、末梢血から得られる。
【００３７】
いったんＤＣが得られたら、それらのＤＣを適当な培地で培養して、細胞数を増やし、かつ／又は抗原の取込み、プロセシング及び提示に最適な状態にＤＣを維持する。
【００３８】
ヒトではＤＣは３つのサブセット、すなわち共にミエロイド系である、表皮の基底層及び基底層上層に局在するランゲルハンス細胞（ＬＣ）、及び真皮及び大部分の臓器に存在する間質ＤＣ又は皮膚ＤＣ、並びに血液及びリンパ系器官に存在するＣＤ４＋、ＣＤ１１ｃ−、ＣＤ１３−、ＣＤ３３−及びＣＤ１２３＋であるリンパ系ＤＣを含む。
【００３９】
本発明のＤＣは、好ましくはリンパ系サブセット由来の自己ＤＣである。血液、骨髄及びリンパ系組織からＤＣを単離するための標準法でそれらのＤＣを単離することができる。好ましくは細胞の少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、いっそうさらに好ましくは少なくとも８０％、及びなおさらに好ましくは少なくとも９０％がＤＣである。実質的に精製されたＤＣの調製物、例えば細胞の少なくとも９５％がＤＣであるような調製物が特に好ましい。
【００４０】
インビトロＤＣ培養系によって高度に純粋なＤＣを多数作り出すことが可能である。ＤＣは骨髄又は末梢血に存在するＣＤ３４＋造血前駆細胞から培養でき（Ｃａｕｘら、１９９７、１９９６）、ＣＤ３４＋前駆細胞から分化した３種の血液前駆細胞であるＣＤ１４＋単球（Ｓａｌｌｕｓｔｏら、１９９４）、ＣＤ１１ｃ＋前駆細胞及びＣＤ１１ｃ−前駆細胞（Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら、２０００）からも培養できる。
【００４１】
本発明に係り、血液から単離されたＤＣはＨｏら、２００２が記載したように外因性サイトカインなしに培養できるし、又はＤＣは少なくとも１つの生物学的に活性な刺激性作用物質を含有する培地で培養される。その作用物質にはトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、βインターフェロン（ＩＦＮ−β）、ＩＦＮ−γ、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、単球遊走活性化因子（ＭＣＡＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、コロニー刺激因子１（ＣＳＦ−１）、神経栄養因子３（ＮＴ−３）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、リピドＡ、トリペプチドｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（Ｆｍｌｐ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、カルシウムイオノホアＡ２３１８７、ビタミンＤ３結合タンパク質、Ｔ細胞類似体であるＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、及びリポ多糖（ＬＰＳ）のような細菌産物があるが、それらに限定されない。
【００４２】
一実施形態では、血液又は骨髄のＣＤ３４＋細胞由来の機能的ＤＣをカルシウムイオノホア処理と組み合わせた二段階培養によって作り出すことができる。その培養では、第一段階でＣＤ３４＋造血前駆細胞をＳＣＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６及びＧ−ＣＳＦが存在する培地で約１０日間培養し、次にＤＣを誘導するためにＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４及びＴＮＦ−α存在下で７〜１１日間培養しカルシウムイオノホア剤Ａ２３１８７で処理する（Ｌｉｕら、２００２）。補助刺激分子（ＣＤ８６、ＣＤ８０）の発現はイオノホア剤でさらに処理することによって上向き調節される。
【００４３】
別の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−１３を含む培地で、さらに好ましくはＧＭ−ＣＳＦ及び／又はＩＬ−４の存在下でＤＣを培養する。本発明によると、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下で７日間培養すると大量のＤＣが得られた。好ましい一実施形態では、インビトロ培養でＤＣの「成熟性」を適当な状態に維持するために、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４又はそれらの両方の存在下で、好ましくはそれぞれ約５００ｕｎｉｔ／ｍｌの組合せで細胞を培養する。
【００４４】
プラスチック組織培養フラスコのような適当な細胞培養装置で、又はさらに有利には疎水性培養バッグで、ＤＣを培養できる。閉鎖系でＤＣを発生させ、抗原を負荷し、成熟させることができることから、その培養バッグの方が、臨床用ＤＣワクチンの調製に適することが示された（Ｇｕｙｒｅら、２００２）。
【００４５】
成熟時にＤＣは表現型と機能に大きな変化を遂げる。エンドサイトーシス受容体と食作用受容体が消失する一方で、高レベルのＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現、Ｔ細胞刺激に必要な補助刺激分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＣＤ４０）の上向き調節、及び成熟ＤＣの独特のマーカーであるＣＤ８３の発現が起こる（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕとＳｔｅｉｎｍａｎ、１９９８）。接着分子（ＩＣＡＭ−１及びＶＬＡ４）を含めた他の数種の分子も上向き調節される。後期エンドソームでの抗原（Ａｇ）プロセシングは外来細胞及び感染性微生物の短鎖ペプチドへの分解を必要とし、その短鎖ペプチドは膜タンパク質のＭＨＣＩＩと結合する。ＭＨＣＩＩのＡｇ提示能を最大化するために、成熟ＤＣはＭＨＣＩＩ分子の生合成を一過性に増加させ、最も顕著にはＭＨＣ分子は細胞膜に大規模に輸送され、そこではエンドサイトーシスの速度が低下しているためにＭＨＣ分子の半減期が延長する（Ｐｉｅｒｒｅら、１９９７）。多数のＭＨＣＩＩ分子が細胞膜に蓄積し、さらに補助刺激分子の発現が増加することで、Ｔリンパ球に対する高度に効率的なＡｇ提示が可能になる。細胞表面ではこれらの分子は数日間安定で、ＣＤ４＋Ｔ細胞による認識に利用され得る。
【００４６】
本発明の一実施形態では、ＡＰＣ、好ましくはＤＣは、上記のように好ましくは活性化後に、ＮＳ特異的抗原、好ましくはＣＮＳ特異的抗原又はその類似体をパルスされる。「ＮＳ特異的抗原」という用語は、ここではＴ細胞を特異的に活性化し、活性化後に活性化Ｔ細胞が患者のＮＳの損傷、障害又は疾患部位に蓄積するＮＳ抗原のことを呼ぶ。本発明のＮＳ特異的抗原の例には、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、Ｓ−１００、βアミロイド、Ｔｈｙ−１、Ｐ０、ミエリン抗原Ｐ２、神経伝達物質受容体、Ｎｏｇｏタンパク質（Ｎｏｇｏ−Ａ、Ｎｏｇｏ−Ｂ及びＮｏｇｏ−Ｃ）、及びＮｏｇｏ受容体（ＮｇＲ）があるが、それらに限定されない。この定義には前記ＮＳ特異的抗原の類似体も含まれる。
【００４７】
別の実施形態では、ＡＰＣ、好ましくはＤＣは上に定義されるＮＳ特異的抗原に由来するペプチドをパルスされる。本明細書において使用されるように、「ＮＳ特異的抗原由来ペプチド」という用語は、ＮＳ特異的抗原の配列内に含まれるアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。
【００４８】
さらに好ましい実施形態では、そのペプチドはヒトＭＢＰ配列（配列番号１、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号３０７１６０）に由来する、すなわちそのペプチドはＭＢＰ配列内に含まれる配列を有する。これらのＭＢＰペプチドには、ＭＢＰの残基７５〜９５、８６〜９５、８２〜９８及び好ましくは残基８７〜９９を含むペプチドがあるが、それらに限定されない。好ましい一実施形態では、ＭＢＰペプチドは、ヒトＭＢＰのアミノ酸残基８７〜９９（ここではＭＢＰ８７−９９と呼ぶ）から成る配列番号２のペプチドであり、
ＶａｌＨｉｓＰｈｅＰｈｅＬｙｓＡｓｎＩｌｅＶａｌＴｈｒＰｒｏＡｒｇＴｈｒＰｒｏ
の配列である。
【００４９】
本発明の別の好ましい実施形態では、ＡＰＣ、好ましくはＤＣは、ここで「改変ペプチドリガンド」又は「ＡＰＬ」と呼ぶ改変ペプチドをパルスされる。その改変ペプチドはＮＳ抗原由来ペプチドの類似体であり、ＭＨＣ結合部位ではなくＴＣＲ結合部位の重要なアミノ酸が改変されることによって、その改変ペプチドは脳炎誘発しないが依然としてＴ細胞受容体を認識する。
【００５０】
さらに好ましい実施形態では、本発明の変更ＣＮＳペプチドは配列番号２のＭＢＰペプチドの類似体であり、そのペプチドには、ＭＢＰ８７−９９のＬｙｓ残基９１をＧｌｙ（ＭＢＰ−Ｇ９１、配列番号３）若しくはＡｌａ（ＭＢＰ−Ａ９１、配列番号４）に置換したペプチドか、又はＰｒｏ残基９６をＡｌａ（ＭＢＰ−Ａ９６、配列番号５）に置換したペプチドがあるが、それらに限定されない。これらのペプチドの配列を以下に示す。
【化１】
2006503808.tif 000002
【００５１】
多発性硬化症の治療のためにＵＳ５９４８７６４に開示されたような、ヒトＭＢＰの残基８６〜９９由来で、位置９１、９５又は９７を改変したような他の類似体も本発明に包含される。
【００５２】
さらなる実施形態では、ＡＰＣ、好ましくはＤＣはＣｏｐ１、又はＣｏｐ１関連ペプチド若しくはポリペプチドをパルスされる。コポリマー１又はＣｏｐ１は、４つのアミノ酸であるチロシン−グルタミン酸−アラニン−リシンから成るランダム共重合体であり、ＭＢＰと機能的に交差反応し抗原提示をＭＨＣクラスＩＩ上でＭＢＰと競合できる。酢酸グラチラマーの一般名で知られている酢酸塩の形のＣｏｐ１は、ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）（Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．、ペターティクヴァ、イスラエル）の商品名で多発性硬化症の治療用に数か国で承認されている。共に２００１年１月２２日出願の米国特許出願第０９／７５６３０１号及び第０９／７６５６４４号に記載されているように、Ｃｏｐ−１関連ポリペプチドを調製できる。両出願は、これによってここに完全に開示されたかのごとく参照によりその全体が組み込まれる。Ｃｏｐ−１関連ペプチドはＷＯ／００５２４９に開示され、その全体の内容はこれによって参照によりここに組み込まれる。
【００５３】
さらに別の実施形態では、ＡＰＣ、好ましくはＤＣは、上に指摘した本出願人のＷＯ０３／０２２１４０に指摘された、以前はポリＧＴと呼ばれｐＥＹとも名付けられたポリＧｌｕ５０Ｔｙｒ５０をパルスされる。
【００５４】
いっそうさらなる実施形態では、ＡＰＣ、好ましくはＤＣは、卵アルブミン及び破傷風毒素を例とするが、それらに限定されない非自己抗原をパルスされる。次に、前記非自己抗原を以前に免疫されたことのある、必要とする個体に、その非自己抗原をパルスされたＤＣを局所移植する。通常は、その非自己抗原の免疫は損傷の発生後すぐに実施され、パルスされたＤＣがその６〜１４日後にその損傷部位に移植される。このように、非自己抗原に特異的なＴ細胞が、他の特異性を有するＴ細胞に混じって損傷部位に達するが、前記特異的Ｔ細胞のみがＡＰＣ上に露出する抗原によって活性化され、神経保護作用を表出する。この点で、非自己抗原である卵アルブミンに特異的なＴ細胞が、損傷部位に蓄積するが神経保護作用を有さないことが本発明者らによって示されたことに気付くと興味深い（Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇら、１９９８）。しかし、本発明によると卵アルブミンが損傷部位に移植されたＡＰＣによって提示されると、卵アルブミンを予め免疫することによって発生した卵アルブミン特異的Ｔ細胞は損傷部位に蓄積し、活性化して神経保護作用を発揮する。非自己抗原が破傷風毒素の場合、損傷直後の免疫は通常必要ではない。それは、人口の大部分となる個体が過去に破傷風毒素を免疫されているからである。
【００５５】
本発明によると、培養後にＤＣをすぐに使用することもできるし、凍結保存することもできる。さらなる使用には、ＤＣを収集し、例えば１０％ジメチルスルホキシド及び２％ヒトアルブミンを含有する溶液のような凍結保護剤で処理し、バッグに入れ、そのバッグを−８０℃の冷凍庫に直接入れるか、−１℃／ｍｉｎの古典的な液体窒素速度調節冷凍庫を使って凍結保存する。凍結した調製物を用時に解凍し患者に投与する。抗原をパルスする前にＤＣを凍結して貯蔵し、それから抗原をパルスして患者に投与することもできる。ＤＣの免疫表現型及びＴ細胞刺激能はＤＣの凍結と解凍によって変化しなかったことを複数の研究が示した（Ｇａｒｄｅｒｅｔら、２００１）。
【００５６】
本発明の医薬組成物の調製には、滅菌した薬学的に許容できる担体に、抗原をパルスされた細胞を懸濁する。好ましい実施形態では、その薬学的に許容できる担体はＰＢＳ、培地又はその細胞が懸濁される薬学的に許容できる流体である。しかし、代替的な薬学的に許容できる担体は、当業者にたやすく明らかとなるであろう。
【００５７】
本発明の医薬組成物は、中枢神経系（ＣＮＳ）又は末梢神経系（ＰＮＳ）におけるニューロンの変性の防止若しくは阻害に、又は神経再生の促進に有用であり、具体的には、軸索の傷害を生じるか、軸索の傷害を伴うものを含めて、ＣＮＳ若しくはＰＮＳの損傷、障害若しくは疾患により引き起こされるニューロンの変性の防止又は阻害に有用である。
【００５８】
その損傷、障害又は疾患は、脳、脊髄又は視神経を含めたＰＮＳ又はＣＮＳのいかなる部位にも位置し得る。そのような損傷、障害又は疾患の一例は、脊髄損傷、鈍性外傷、脳の直撃又は対側衝撃、穿通外傷、神経外科手術又は他の手技を施行する際に被る外傷を含めた外傷である。そのような損傷、障害又は疾患の別の例は、出血性卒中又は虚血性卒中を含めた卒中である。そのような損傷、障害又は疾患のさらに別の例は、眼関連疾患、例えば緑内障、年齢関連黄斑変性、視神経障害又は網膜変性である。ＰＮＳ又はＣＮＳの損傷、障害又は疾患のいっそうさらなる例には、糖尿病性神経障害、老人性認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、顔面神経（ベル）麻痺、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ビタミン欠乏症、てんかん、健忘症、不安、痛覚過敏、精神病、発作、酸化ストレス、オピエート耐性及び依存症がある。
【００５９】
被験者が、遺伝、代謝、毒性、栄養、感染又は自己免疫起源の神経障害のような、中枢神経系又は末梢神経系の他の疾患も有しているか否かにかかわりなく、本発明の組成物及び方法は、軸索の傷害を生じるおそれのあるＣＮＳ損傷、障害又は疾患を治療するために有用である。
【００６０】
本発明は、ＣＮＳ若しくはＰＮＳにおけるニューロンの変性を防止若しくは阻害するための、又は神経の再生を促進するための方法もさらに提供し、その方法は、それを必要とする個体に抗原をパルスされた細胞、好ましくは本明細書において記述するような抗原をパルスされた有効量の樹状細胞を投与することを含む。
【００６１】
ＮＳ抗原をパルスされたＡＰＣ、好ましくはＤＣは患者の局所又は全身に、例えば静脈内、皮下、皮内、気管内又は鼻腔内に投与され得る。
【００６２】
好ましい実施形態では、ＡＰＣ、好ましくはＤＣはＣＮＳ損傷直後に投与され、神経外科的に適した手法で、例えばガラス製マイクロピペット又は注射筒を用いてＣＮＳ損傷部位に、又はその部位の近くに導入される。しかし、本発明は、ＣＮＳが損傷、障害又は疾患を負った後のいかなる時点で、例えば１週間以内、２週間以内又はそれを超えてＤＣを投与することも包含している。
【００６３】
ヒトに使用するときの、抗原をパルスされた細胞の至適用量は、本明細書において記述されたラットの実験から導き出すことができる。そのラットの実験によると、局所投与で脊髄損傷を治療するときの至適用量は、ラットの脊髄１つあたり５×１０５個のＤＣ、ｉ．ｖ．投与では１０６個のＤＣ、ｓ．ｃ．投与では２×１０６個のＤＣであることが分かった。当業者に明白であるように、治療される病変又は損傷部位で影響を受けている神経繊維の数に比例して用量を増減できる。ヒトでは、細胞の量と注射の回数は細胞の遊走特性と傷害を受けた繊維の領域に応じて計算しなければならないであろう。神経変性障害の治療には、注射するＤＣの数は傷害を受けた組織の面積あたりで計算すべきである。
【００６４】
本発明の一実施形態では、付随する自己免疫疾患のリスクなしに良好な転帰を得ようと、ミエリン抗原、すなわちペプチドＭＢＰ８７−９９を特異的にパルスしたＤＣが使用された。代替的に、ＭＢＰ−Ａ９１と名付けた改変ペプチドリガンドをパルスされたＤＣが使用された。そのペプチドリガンドは本来の脳炎誘発ペプチドと交差反応するが実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を誘導せず、損傷した脊髄を有するラットに適用すると防御自己免疫を誘導できたことが示された（Ｈａｕｂｅｎら、２００１ｂ）。
【００６５】
本明細書において述べた結果は、インビトロでミエリン由来脳炎誘発ペプチドＭＢＰ８７−９９又は非脳炎誘発性ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされた骨髄由来ＤＣを局所投与することによって処理されたラットが、脊髄挫傷から劇的に回復したことを示した。機能的回復の増進は、オープンフィールドにおける移動に、並びに形態学的及び免疫細胞化学的に測定された神経組織の生存の向上に現れた。形態解析から、空洞形成の減少及び新芽形成の増加を実証した。
【００６６】
脊髄損傷からの回復が、十分に制御された局所免疫応答を増強することによって助長できることを認識して、本発明は、抗原又はワクチンの全身投与によって活性化されたＴ細胞を注射することよりもむしろ、ミエリン抗原に感作された効果的なＡＰＣ、すなわちＤＣを局所投与する有効性を実験した。本明細書における結果は、ビヒクルを注射された対照に比べ、選択されたペプチドをパルスされたＤＣの注射を受けた脊髄損傷ラットで、有意に回復が向上したことを示した。
【００６７】
損傷が誘導する自己破壊過程は不完全な脊髄損傷（ＳＣＩ）後に重大な機能的喪失を引き起こす。自然免疫応答の細胞要素（マクロファージ）及び適応免疫応答の細胞要素（Ｔ細胞）の両方は、適正に活性化され調節されるなら、ＳＣＩ後に外傷後再増殖と保護を促進する。樹状細胞（ＤＣ）はエフェクターＴ細胞及び制御性Ｔ細胞の活性化を誘発し、自然免疫系と適応免疫系の機能を連結する。これらの細胞は病原性作用物質に対する身体応答も開始及び調節し、外来抗原及び自己抗原の両方に対する免疫応答を制御する。本出願の本明細書において、ＭＢＰ由来の脳炎誘発性又は非脳炎誘発性ペプチドをパルスされた骨髄由来ＤＣを損傷後１２日以内に（全身的に又は病変部位への局所注射により）投与するとき、損傷後の注射によって重症の不完全ＳＣＩからの有意かつ顕著な回復が生じることが示される。成熟Ｔ細胞を欠如したＤＣレシピエンドでは有意な保護はみられなかった。フローサイトメトリー、ＲＴ−ＰＣＲ及び増殖アッセイはここで調製され使用されたＤＣが成熟していて免疫原性であったことを示した。まとめると、本結果はＤＣ介在性神経保護がＴ細胞依存性全身免疫応答の誘導を介して達成されたことを示している。神経組織のより良好な保存並びに嚢胞及び瘢痕組織の形成の減少は、ＤＣで処理されたラットにおける機能的回復の改善を伴った。抗原特異的ＤＣの使用は、自己免疫応答の一過性誘導を介して、免疫介在性修復及び維持、並びに自己破壊性化合物からの保護という最大の利益を得るための効果的な方法となり得る。
【００６８】
本発明の範囲を制限しようと望むことなしに、本発明の好ましい側面を例示するために以下の実施例を提供する。
【実施例】
【００６９】
材料と方法
（ａ）動物
近交系のＬｅｗｉｓ又はＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＰＤ）成ラット（１０〜１２週齢、２００〜２５０ｇ）をＷｅｉｚｍａｎｎ科学研究所動物繁殖センター（レホヴォト、イスラエル）から調達した。照明と温度を調節した室内でラットを飼育し、各実験で齢を合わせた。実験動物の管理のための国立衛生研究所及びＷｅｉｚｍａｎｎ科学研究所のガイドラインに従って全ての動物を取り扱った。
【００７０】
（ｂ）抗原
変更（非脳炎誘発）ＭＢＰペプチドを、脳炎誘発ペプチドであるＭＢＰアミノ酸８７〜９９の、リシン残基９１をアラニンに置換することによって誘導した（Ａ９１、Ｗｅｉｚｍａｎｎ科学研究所、レホヴォト、イスラエルで合成）。実験に使用した全てのペプチドは逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）による確認では＞９５％の純度を有した。卵アルブミンをＳｉｇｍａ、イスラエルから購入した。
【００７１】
（ｃ）ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）
ＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）を用いて総ＲＮＡを抽出した。第一鎖ｃＤＮＡ合成反応では、ＲＮＡを６５℃で５分間温置し、氷冷し、次にオリゴｄＴプライマー、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのｄＮＴＰ混合物、及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＮアーゼ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ロックヴィル、メリーランド州）２００Ｕの存在下で４２℃で１時間逆転写した。プライマー５０〜７０ｐｍｏｌ、０．１ｍＭのｄＮＴＰ混合物、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在下でＤｙＮＡｚｙｍｅ  ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ  Ｏｙ、リヒトントゥンティー、フィンランド）０．６Ｕを用いて、生成したｃＤＮＡを増幅した。サイクリング条件は、９４℃で３０秒間の変性、６０℃で１分間のアニーリング、７２℃で２分間の伸長、及び最終サイクル後の７２℃で７分間であった。Ｌ−１９では２４サイクル、ＩＬ−６では３４サイクル、ＴＮＦ−αでは３３サイクル及びＩＬ−１２ｐ−４０では３４サイクルでｃＤＮＡ試料を増幅した。ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで電気泳動してから臭化エチジウムで染色して可視化した。以下のプライマーを使用した。
【化２】
2006503808.tif 000003
【００７２】
（ｄ）ラット樹状細胞の調製
ＤＣを以前に記載された方法（Ｌｕｔｚら、１９９９；Ｔａｌｍｏｒら、１９９８）を幾分修正して骨髄から発生させた。安楽死させた雄性成ＳＰＤラット（７〜１１週齢）から大腿骨と脛骨を取り出し、筋肉と結合組織を除き、７０％エタノールに３分間浸して消毒してから、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。骨の両端をハサミで切断し、２３Ｇの注射針をつけた注射筒を用いカルシウム及びマグネシウムを含有しないＰＢＳで髄を流し出した。強くピペッティングして細胞塊を壊した。赤血球をＡＣＫ緩衝液で溶解させた。骨髄細胞を計数し、２５０ｍｌ容のフラスコに２〜５×１０６細胞／ｍｌの濃度で広げた（総量１５ｍｌ）。ペニシリン及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、β−メルカプトエタノール（５０μＭ）、ピルビン酸塩（１ｍＭ）、非必須アミノ酸（１：１００）、及び１０％熱不活性化ウシ胎仔ろ過血清を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（以後ＤＣ培地と呼ぶ）に細胞を増殖させた。サイトカインである組換えマウス顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｒｍＧＭ−ＣＳＦ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、ロッキーヒル、ニュージャージー州）及び組換えマウスインターロイキン４（ｒｍＩＬ−４、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を共に２０ｎｇ／ｍｌの濃度で第０日に添加した。第２日及び第４日に培地をサイトカイン類を補充したＤＣ培地と交換し、浮遊細胞を捨てた。第７日に細胞を集め、遠心分離し、特異的抗原（２０μｇ／ｍｌ）を含有する新鮮ＤＣ培地（サイトカインを添加せず、２×１０６細胞／ｍｌ）に再懸濁した。細胞にパルスし（すなわち抗原と共に２時間培養し）、新鮮ＤＣ培地で洗浄し、注射まで氷冷して保存した。注射の直前に細胞を遠心分離し、ＰＢＳに再懸濁した（局所注射にはＰＢＳ５μｌに５×１０５個の細胞、静脈内（ｉ．ｖ．）注射にはＰＢＳ１ｍｌに１×１０６個の細胞、皮下（ｓ．ｃ．）注射にはＰＢＳ１ｍｌに２×１０６個の細胞）。局所注射では細胞をハミルトンシリンジに入れ、損傷部位の脊髄に注射した。ｓ．ｃ．注射では、細胞を頚部の２か所の注射部位に注射した（各０．５ｍｌ）。ｉ．ｖ．注射では細胞を尾静脈に注射した。
【００７３】
（ｅ）脊髄損傷
Ｒｏｍｐｕｎ（キシラジン、１０ｍｇ／ｋｇ、Ｖｉｔａｍｅｄ、イスラエル）及びＶｅｔａｌａｒ（ケタミン、５０ｍｇ／ｋｇ、Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、フォートドッジ、アイオワ州）を筋肉内注射することでラットを麻酔した。Ｔ８レベルの椎弓切除によってラットの脊髄を露出させた。麻酔導入の１時間後に椎弓切除した脊髄に、ＮＹＵインパクターを用いて５０ｍｍの高さから１０ｇの棒を落とした（「重症の」損傷と定義）（Ｂａｓｓｏら、１９９６；Ｈａｕｂｅｎら、２０００；Ｈａｕｂｅｎら、２０００；Ｙｏｕｎｇ、１９９６）。ＮＹＵインパクターは、十分に校正した挫傷を脊髄に負わせることが示された装置である。
【００７４】
（ｆ）ＤＣ投与のための実験プロトコル
骨髄由来の培養ＤＣに、ＭＢＰペプチド８７−９９、ＭＢＰ由来改変ペプチドＡ９１又は卵アルブミン（２０μｇ／ｍｌ）を２時間パルスし、得られたＤＣをＰＢＳで洗浄し、注射直前に適当な数と体積に調整した。（ｅ）に上述したようにＮＹＵインパクターを用いてＳＰＤラット又はＬｅｗｉｓラットの脊髄にＴ９レベルで挫傷を負わせた。対照群のラットにはＰＢＳ５μｌを注射するかパルスされていないＤＣを注射した。ＳＣＩの直後に、処理群には損傷部位の局所に、又は頚部の隣接する２部位の皮下に、又は尾静脈内に、ＰＢＳに懸濁した（ｄ）に記録した濃度のＤＣを注射した。対照ラットには処理ラットと同体積のＰＢＳをそれぞれ局所又は皮下又は静脈内に注射した。
【００７５】
遅延処理の効果を調べるために、ラットをＳＣＩの１２又は２８日後に麻酔し、椎弓切除領域を露出させ、損傷した脊髄を覆う治癒組織を注意深く分離することによって脊髄をさらに露出させた。上記のようにＤＣ又はＰＢＳを次に脊髄に注射した。
【００７６】
（ｇ）脊髄挫傷からの回復の評価
後肢の移動行動から機能的回復を測定した。尺度０（完全麻痺）から２１（正常な運動性）までの尺度のＢａｓｓｏ、Ｂｅａｔｔｉｅ及びＢｒｅｓｎａｈａｎのオープンフィールド移動評価尺度（ＢＢＢ）を用いてこれを評点した（Ｂａｓｓｏら、１９９６；Ｈａｕｂｅｎら、２００１；Ｈａｕｂｅｎら、２０００；Ｊａｋｅｍａｎら、２０００；Ｍａら、２００１；Ｙｏｕｎｇ、１９９６）。評点を盲検化して、観察者が各ラットの受けた処理を認知できないことを確実にした。ほぼ１週間に１回、平坦な滑らない床面をもつ成形プラスチックでできた円形の囲い（直径９０ｃｍ、壁の高さ７ｃｍ）の中心に動物を４分間置くことによってオープンフィールドにおける体幹、尾及び後肢の移動活動性を評価した。それぞれの評価の前に、ラットに会陰感染、後肢の創傷、並びに尾及び足の自食症がないか注意深く観察した。
【００７７】
（ｈ）動物の飼育
脊髄損傷ラットでは、自動性排泄が回復する第２週の終わりまで１日に２回（損傷後の初めの４８時間では１日３回）、膀胱の圧搾を手で援助した。尿路感染の証拠又は全身疾患の何か他の兆候がないかラットを注意深く監視した。挫傷後第１週に、さらにその期間の後に血尿が生じた場合、ツベルクリン用シリンジ（１日に溶液０．３ｍｌ）で経口投与することで、１クールのスルファメトキサゾール（４００ｍｇ／ｍｌ）及びトリメトプリム（８ｍｇ／ｍｌ）（Ｒｅｓｐｒｉｍ、Ｔｅｖａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イスラエル）をラットに服用させた。日常視診には、椎弓切除部位に感染の証拠がないか観察すること、及び後肢に自食症又は圧迫の兆候がないか評価することを含めた。
【００７８】
（ｉ）組織学
表示した時点でラットに０．１Ｍの冷ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１００ｍｌを４℃で心臓内に潅流してから、４％パラホルムアルデヒド２００ｍｌ（グルコースを５％含む０．１ＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４に調製）を潅流した。脊髄を取り出し、１０％リン酸緩衝ホルムアルデヒドで一晩、後固定し、エタノールで一晩脱水し、パラフィンブロックに包埋した。各ブロックから調製した連続切片（４μｍ）をヘマトキシリン及びエオジン、又はルクソールファストブルーで染色した。
【００７９】
（ｊ）増殖アッセイ
各群ラット３匹を損傷後１２日に安楽死させ、脾臓を切除し、圧迫して微小ワイヤメッシュに通した。ＡＣＫ溶解緩衝液（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ、米国）で赤血球を溶解後、脾臓細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、β−メルカプトエタノール（５×１０−５Ｍ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、非必須アミノ酸及びラット自己血清１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を補充したＤＭＥＭを含む増殖用培地に再懸濁した。コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ、１．２５μｇ／ｍｌ）若しくはＭＢＰ８１−９９（１０μｇ／ｍｌ）若しくはＭＢＰ６８−８２（１０μｇ／ｍｌ）若しくはＭＢＰ−Ａ９１（１０μｇ／ｍｌ）若しくはＭＯＧ３５−５５（１０μｇ／ｍｌ）を加えてあるか、又は抗原を加えない培地１００μｌで平底マイクロタイターウェルで１試料あたり４穴を使って、脾臓細胞を３７℃で７２時間、相対湿度９０％及び７％ＣＯ２で培養した（細胞３×１０６個／ｍｌ）。７２時間の培養の最終１６時間に各穴に添加された３［Ｈ］チミジン（１μＣｉ／穴）の取込みを測定することによって増殖応答を決定した。
【００８０】
（ｋ）拡散異方性磁気共鳴画像法
ラットを安楽死させ、脊髄を摘出し、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）で観察した。Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＭＸ４００大口径スペクトロメーターで５ｍｍのヘルムホルツコイルとアクティブ型シールド傾斜磁場を備えた顕微鏡プローブを用いて、拡散異方性を測定した。ラットの同一性は観察者には分からないようにした。軸位断で９個のマルチスライスエコー撮像を行い、中央のスライスが脊髄損傷の中心に位置するようにした。ＴＥ３１ｍｓ、ＴＲ２０００ｍｓ、拡散時間１５ｍｓ、拡散傾斜持続時間３ｍｓ、視野０．６ｃｍ、マトリックスサイズ１２８×１２８ピクセル、スライス厚０．５ｍｍ及びスライス間１．１８ｍｍで画像を得た。左から右への画像は頭から足への軸位断を表す。４つの拡散傾斜値（０、２８、４９及び７１ｇ／ｃｍ）をリード方向（横拡散）又はスライス方向（縦拡散）に沿って適用した。各ピクセルについての重み付き最小二乗法による直線回帰を用いて、横（Ｔ)及び縦（Ｌ)方向のみかけの拡散係数のマップを得て、そのマップから異方性比率のマトリックスを導出した。各スライスにおいて蓄積した異方性を積分した。各ラットについてスライスの異方性の積分値が最小となったところを損傷部位と定義した。
【００８１】
（ｌ）嚢胞面積の測定
脊髄の縦方向の切片を作製する前に、（ｉ）に記述したように各ラットを心臓内潅流した。脊髄を取り出し、（グルコース５％を含む０．１ＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４で調製した）４％パラホルムアルデヒドで一晩、後固定し、ＰＢＳで短時間洗浄し、３０％ショ糖溶液に移し、少なくとも３日間凍結保存した。全ての操作を４℃で行った。中央に損傷部位を有する脊髄の２０ｍｍのブロックを摘出し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（Ｍｉｌｅｓ、インディアナ州）に包埋し、液体窒素に入れた。クリオスタットを使って凍結した脊髄のブロックから縦方向の切片（厚さ２０μｍ）を作製し、ゼラチンをコートしたスライドガラスに載せ、室温で乾燥させた。切片を７０％エタノールを溶媒とする０．３％スダンブラックＢ溶液（メルク、ダルムシュタット、ドイツ）で１分間処理した。染色しすぎた場合は、満足な染色となるまで、その切片を新鮮７０％エタノールに浸した。さらに分析するまで、そのスライドガラスを防湿庫に入れ４℃で保存した。各脊髄（各群についてｎ＝４）からの５０枚の切片を検査した。そのうち目的の両側と正中矢状領域に相当する５番目、２５番目、４５番目の切片を選択し、さらなる定量分析に供した。嚢胞の大きさを半自動画像解析で決定した。脊髄切片の境界を手動で規定することによって、ブランクのピクセル（すなわち組織が存在しないピクセル）の数を自動的に測定し（Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓプログラム）、嚢胞の累積サイズを得た（各ピクセルは１．８×１．８μｍ２）。
【００８２】
（ｍ）ＦＡＣＳ分析
骨髄由来培養ＤＣ（５×１０５個）をＣＤ８６−ＦＩＴＣ（抗Ｂ７．２、マウスＩｇＧ１ｋ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）、ＯＸ６（抗ＭＨＣ−ＩＩマウスＩｇＧ１ｋ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＥＤ−１（Ｓｅｒｏｔｅｃ、オックスフォード、イギリス）、ＣＤ４５ＲＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、及びそれらの対照抗体で染色した。正常マウス血清（２％）及び希釈した特異的抗体を含有するＰＢＳ１００μｌ中に細胞を４℃で３０分間放置した。細胞をＰＢＳ４ｍｌで洗浄し、０．１％ＰＦＡ溶液４００μｌに再懸濁した。試料をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ハイデルベルグ、ドイツ）で分析した。Ｌｅｕｃｏｐｅｒｍ試薬（Ｓｅｒｏｔｅｃ、オックスフォード、イギリス）を用いて製造業者の指示に従ってＥＤ−１を染色した。
【００８３】
（ｎ）統計解析
行動及び形態データをＳｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定で解析した。オープンフィールド運動スコアを損傷後の種々の時点で測定したことから、反復のある２因子ＡＮＯＶＡでもデータを解析した。
【００８４】
実施例１：骨髄由来ＤＣのキャラクタリゼーション
まずＤＣ調製物の純度並びに細胞の成熟度を調べた。骨髄由来ＤＣの表面の補助刺激Ｂ７．２（ＣＤ８６）及びＭＨＣ−ＩＩ分子の発現をフローサイトメトリーで分析した。図１Ａに示すように、注射用に回収する時点（第７日）で、大部分の細胞（９４％）はＢ７．２及びＭＨＣ−ＩＩを発現したが、培養を開始した日（第０日）では、細胞の１．６％だけがこれらのＤＣマーカーを発現していた。
【００８５】
高レベルのＢ７．２及びＭＨＣ−ＩＩを発現する可能性のある他の種類の細胞にはマクロファージとＢ細胞がある。したがって、我々はフローサイトメトリーで第７日の培養物を分析し、マクロファージのマーカーであるＥＤ−１及びＢ細胞のマーカーであるＣＤ４５ＲＡの発現を調べた。図１Ｂのヒストグラムは、細胞はこれらのマーカーの両方に関して陰性であったことを示している。
【００８６】
我々はＤＣの成熟度について、及び抗原の曝露によってその成熟度が影響を受けるかについても検討した。ＤＣにＭＢＰ−Ａ９１をパルスする前後に、細胞からＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行ってサイトカインであるＴＮＦα、ＩＬ−１２及びＩＬ−６の発現を検出した。成熟ＤＣはこれら全てのサイトカインを発現するが、半成熟ＤＣ又は未熟ＤＣはそれらを発現しないことが知られている（ＬｕｔｚとＳｃｈｕｌｅｒ、２００２）。図１Ｃに示すように、ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされたＤＣはこれらのサイトカインの３つ全てを発現したため、成熟していると特徴付けられた。パルスされていないＤＣも同様のサイトカインを発現した。よって、本実施例で使用したＤＣは成熟していて、その成熟度は抗原をパルスしたことには依存しなかったとみられる。
【００８７】
実施例２：ＳＣＩを負ったラットに及ぼす、ＭＢＰ８７−９９又はその類似体ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされた樹状細胞の作用：ミエリンペプチドに曝露された骨髄由来ＤＣの局所移植はＳＣＩからの機能的回復を促進する
（ｅ）の方法の項に述べたように、雄性ＳＰＤラットに重症の挫傷を負わせた。ＭＢＰペプチド８７−９９又は変更した（よって、もはや脳炎を誘発しない）ペプチドＭＢＰ−Ａ９１を、（２時間培養することによって）パルスされた骨髄由来ＤＣを損傷直後のラットに、方法の項で述べたように局所注射した。対照群にはビヒクル（ＰＢＳ）を局所注射した。ＢＢＢ移動評価尺度の０〜２１の尺度（Ｂａｓｓｏら、１９９６）で機能的回復を評価した。ここで０は運動性なし、２１は完全な運動性を示す。盲検化して評点することで、ラットの同一性を確実に隠した。
【００８８】
重症の挫傷とＰＢＳの局所注射後に、ラットは初発ショックからの極めて限られた回復を示した（図２）。しかし、ＭＢＰ８７−９９（図２Ａ）又はＭＢＰ−Ａ９１（図２Ｂ）をパルスされたＤＣを使って処理された損傷ラットは、有意な回復の改善を示し、その改善は挫傷性ＳＣＩの１１日後に検出できた（図２Ａ、２Ｂ）。処理を受けたラットの７０％から８０％で回復が明らかで、一部のラットでは移動スコア９に達し（図２Ｃ）、後肢の関節３か所全てで広範囲の運動が現れ（ＢＢＢスコア７）、足底を着け（ＢＢＢ＝８）、静止して体重を支えた（ＢＢＢ＝９）。処理ラットにおける平均ＢＢＢスコア±ＳＥＭは６．４±０．９であった（図２Ｂ、２Ｃ）。対照ラットでは、本実験セットで得られた最高のＢＢＢスコアは、後肢の関節のわずかな運動に現れた４で、平均スコアは２．３±０．６であった。
【００８９】
局所注射されたＤＣが脊髄の回復を促進する能力に、抗原特異性が役割を果たすかどうかを検討するために、我々はパルスされていないＤＣ及び卵アルブミンのような関連性のない抗原をパルスされたＤＣの効果を２組の別々の実験で試験した。結果は、パルスされていないＤＣで処理された動物の回復は、ＰＢＳで処理された対照と有意差がないことを示した（図３Ａ）。独立した付加的な４実験で同様の結果を得た。卵アルブミンをパルスされたＤＣも回復にいかなる影響も及ぼさなかった（図３Ｂ）。
【００９０】
重症の脊髄挫傷及び、ＭＢＰペプチド８７−９９をパルスされたＤＣの局所注射又はＰＢＳ注射を行った３．５か月後に摘出したラット脊髄の組織分析は、空洞形成が少なく損傷部位が小さいことから明らかなように、対照（ｎ＝４）よりもＤＣ処理ラット（ｎ＝４）で組織の保存が有意に良好であることを示した（図４Ａ対４Ｂ）。処理ラットの病変部位は対照よりも有意に（１／２〜１／３に）縮小していた。各脊髄についておよそ５０枚のスライスを検査し、その全てが同様のパターンを示した。ＤＣ処理された脊髄の嚢胞面積は未処理脊髄における面積よりも縮小していた。各脊髄からの３切断面を表す異なる３つのスライスで嚢胞の定量を行い、その３切断面と同じ平面が全ての脊髄を代表するようにした。異なる４匹の動物での３枚のスライスの平均値を図４Ｃに示す。嚢胞面積の比較から有意差が示され、ＭＢＰペプチドをパルスされたＤＣを用いた処理で脊髄空洞（脊髄中心の空洞形成）の量が減少することを示唆した。
【００９１】
自己免疫性疾患の誘導に感受性を有するラットの系統と抵抗性を有するラットの系統の間で（Ｈａｕｂｅｎら、２００１；Ｋｉｐｎｉｓら、２００１）、さらに雄性と雌性のマウス又はラットの間で（Ｈａｕｂｅｎら、２００２）、ＳＣＩからの自然回復に差があることが報告されている。したがって、ＥＡＥ感受性系統である雌性Ｌｅｗｉｓラットを、ＭＢＰ由来ペプチドをパルスされたＤＣで処理することの効果を検討することは興味深かった。図５は、ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされたＤＣを外傷後に局所注射することが脊髄損傷した雌性Ｌｅｗｉｓラット６匹の機能的回復に及ぼす有意な効果をＰＢＳを注射された雌性同腹仔と比較して表したものである（反復のある２因子ＡＮＯＶＡ、Ｐ≦０．０１、ｄｆ＝１、Ｆ検定＝８．７０１）。ＰＢＳを注射された対照のＢＢＢスコアの最高値は５．２±０．２（平均±ＳＥＭ）であったが、ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされたＤＣを注射されたラットでは最大平均スコア７．２±０．４（Ｐ≦０．００５、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定）に達した（図５Ａ）。ＳＣＩの６か月後に各群のラット２匹の脊髄を摘出し、組織分析用に加工した。各脊髄からおよそ２０枚の切片（４μｍ）を検査した。各群からの代表的な切片を図５Ｂ及び５Ｃに示す。ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされたＤＣで処理されたラットの脊髄はニューロン組織の保存性が高く、空洞形成が少ないことを示した。
【００９２】
実施例３：脊髄損傷からのＤＣ誘導性の回復の根拠となる免疫学的メカニズムへの洞察
観察された、ＤＣ処理による神経保護作用がＴ細胞依存性であるかどうかを決定するために、出生時に胸腺切除を行って成熟Ｔ細胞を欠く成雄性ＳＰＤラットを脊髄損傷させ、ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされたＤＣを局所注射した。正常なＴ細胞の機能が存在しないとき、ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされたＤＣは機能的回復に有意な効果を及ぼさなかった（図６）。示した結果は、胸腺摘出されたＳＰＤラットを用いて施行された３つの実験のうち代表的な１つの実験のものである。雄と雌で同様の結果を得た。１つの実験と別の実験で動物の体重が変動したため、常に同じ実験の群間でＢＢＢスコアを比較したことに注意すべきである。よって、胸腺摘出された動物の対照群でＢＢＢスコアが比較的高いことを、これらの動物でＤＣが回復を促進しなかったという論拠としてとらえるべきではない。胸腺摘出されたラットでＴ細胞介在性応答が欠如していることを、アジュバントに入れたウシ血清アルブミンをラットに注射し、ワクチン接種に応答した脾臓細胞のエクスビボ増殖応答を評価することで確認した（データは表示せず）。
【００９３】
我々は、グラム陰性菌の細胞壁糖脂質成分であり、感染に関連した炎症に役割を果たす（ＧａｌａｎｏｓとＦｒｅｕｄｅｎｂｅｒｇ、１９９３；ＵｌｅｖｉｔｃｈとＴｏｂｉａｓ、１９９４）リポ多糖（ＬＰＳ）によって活性化されたＤＣが、さらに強い免疫応答を誘導することによって機能的回復を促進するかどうかについても検討した。結果は、ＬＰＳと共にＤＣを培養しても有意な有益効果を誘導しないことを示した。さらに、ＬＰＳとＭＢＰ−Ａ９１の両方をパルスされたＤＣはＭＢＰ−Ａ９１のみをパルスされたＤＣと同じ効果を示した（データは表示せず）。これらの結果は、脊髄の回復に必要な局所免疫応答が抗原特異性であることを示唆している。
【００９４】
実施例４：ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされた樹状細胞の全身投与は機能的回復を促進する
ＤＣが成熟していてそれらの作用機序がＴ細胞依存性であることが分かったことから、回復に及ぼす有益効果が全身投与によって再現できるかを確認することが興味深かった。我々は、パルスされたＤＣの全身注射がパルスする抗原に特異的な全身Ｔ細胞応答を誘発できるかどうかをまず検討した。脊髄損傷した雄性ＳＰＤにＭＢＰ−Ａ９１をパルスされた１×１０６個のＤＣ又はＰＢＳをｉ．ｖ．注射した（図７）。その１０日後に各群のラット３匹を安楽死させ、脾臓を取り出し、脾臓細胞の増殖を種々のミエリンペプチドの存在下で試験した。図７Ａは、対照であるミエリン由来ペプチドＭＯＧ３５−５５の存在下での脾臓細胞の増殖に対する試験したペプチドそれぞれ（ＭＢＰ−Ａ９１、ＭＢＰ８１−９９及びＭＢＰ６８−８２）の存在下での脾臓細胞の増殖を示す。ＰＢＳを注射されたラットではなく、ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされたＤＣをｉ．ｖ．注射されたラットの脾臓細胞は、ＭＯＧペプチドよりもＭＢＰペプチドに対して有意に強力なＴ細胞応答を表出した。これらの結果は、ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされた１×１０６個のＤＣを全身投与すると、直接関連するＭＢＰペプチドであるＡ９１に対する、及びＭＢＰ８１−９９のような他のＭＢＰ由来ペプチドに対する、並びに恐らくエピトープ拡散のメカニズムを介してＭＢＰ６８−８２にも対するＴ細胞応答を誘発することを示唆している（Ｗｉｌｄｂａｕｍら、２００２）。
【００９５】
これらの発見に励まされ、我々は脊髄損傷ラットの機能的回復にこの全身投与経路が及ぼす効果を検討した。雄性ＳＰＤラットにＳＣＩを負わせ、その直後に、ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされたＤＣをｉ．ｖ．注射によって投与した。損傷の１５日後から、試験した全ての時点で回復に及ぼす有意な効果を観察した（図７Ｂ、７Ｃ）。ラットで達成された最高スコアは９．５で、他の経路で注射されたラットのスコアよりも有意に高いとはいえなかったが、ｉ．ｖ．注射後に回復したラットの数は他の経路で処理後に観察された数よりも大きかった。興味深いことに、脊髄損傷したＳＰＤラットでは、ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされたＤＣ（２×１０６個の細胞／ラット）をｓ．ｃ．注射によって投与しても、ＰＢＳを注射された対応のある対照で得られたよりも有意に良好な回復が生じた（反復のある２因子ＡＮＯＶＡ、Ｐ≦０．０１、ｄｆ＝１、Ｆ検定＝１２．３５３）（図８）。本実験に使用したＳＰＤラットは雌で、よって自然回復は雄よりも良好であったことに注意（図８）。
【００９６】
実施例５：脊髄挫傷後に樹状細胞ワクチン接種を行える時間の猶予（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｗｉｎｄｏｗ）
ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされたＤＣを遅延局所注射する効果を検討するために、雄性ＳＰＤラット２０匹に重症の脊髄挫傷を負わせ、損傷後１０日間のそれらのラットのＢＢＢ移動スコアを監視した。第１１日に、ＢＢＢスコアが最も低いラット１２匹をランダムに２群に分けた。両群の平均ＢＢＢスコア±ＳＥＭは同様であった（第１群で１．０±０．４、第２群で０．９±０．２５、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定でＰ≦０．８７）。翌日（ＳＣＩの１２日後）、一方の群のラットの病変部位に、ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされた５×１０５個のＤＣを注射し、もう一方の群にパルスされていないＤＣを注射した。損傷後第２９日から、その２群のラットにおける移動（ＢＢＢ）スコアに有意差を認めた（Ｐ≦０．０５、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定；図９Ａ、９Ｂ）。ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされたＤＣを用いた遅延処理が機能的回復に及ぼす全般的な効果は、統計的に有意であった（反復のある２因子ＡＮＯＶＡ、Ｐ≦０．０５、ｄｆ＝１、Ｆ検定＝６．２０６）。ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされたＤＣの局所投与を損傷後２８日目に実施することでこの典型的な実験を繰り返したときには、ＤＣは移動の回復に有意な効果を示さなかった（図９Ｃ、９Ｄ）。
【００９７】
実施例６：ＭＢＰペプチドをパルスされた樹状細胞をワクチン接種後に神経組織の保存性が改善することの形態学的証拠
挫傷性ＳＣＩの直後に、ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされたＤＣ又はＰＢＳを損傷部位に局所注射した９か月後に、各群の安楽死させた雄性ＳＰＤラット２匹から脊髄部（中央に損傷部位を有する約３ｃｍ）を摘出し、拡散強調ＭＲＩ（ＤＷ−ＭＲＩ）でスキャンした。１．１８ｍｍ間隔で０．５ｍｍの仮想スライスを分析した。得られた軸位の画像を解析してみかけの拡散係数、及び白質の完全性のマーカーである組織の異方性の値を得た（Ｎｅｖｏら、２００１）。ＤＷ−ＭＲＩ画像から得られた軸位の異方性のマップは、摘出された脊髄に沿った拡散異方性の連続面積を表す。ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされたＤＣで処理された群のマップでは、異方性の面積はＰＢＳ処理された対照群よりも大きい（図１０Ａ）。処理ラットにみられる連続的な縦方向の構造と対照的に、ＰＢＳを注射された対照から得たスライスは、構築された構造が病変部位の中心で消失し、病変部位から離れたスライスでも拡散異方性の面積が比較的小さい（図１０Ａ）。さらに、異方性値の積分を表す異方性和（ＳＡＩ）は、走査した部分の全長にわたって対照よりもＭＢＰ−Ａ９１をパルスされたＤＣで処理されたラットで高かった（図１０Ｂ）。行動の転帰はＭＲＩの結果とよく相関した。すなわち行動スコアが高いほど病変部位でみられた拡散異方性の面積が大きかった（Ｈａｕｂｅｎら、２０００）。
【００９８】
考察
上に表した結果は、インビトロでＭＢＰ由来ペプチド又は関連ペプチドをパルスされた骨髄由来ＤＣの局所又は全身注射によって処理されたラットでは、挫傷性ＳＣＩ後の移動機能が有意に改善したことを示している。その処理の有益効果は形態学的にも明らかで、組織観察でみられる神経組織のより良好な保護とＭＲＩで観察された処理ラットの脊髄における空洞のサイズの減少を伴った。
【００９９】
一般の仮説とは逆に、ＤＣは髄膜及び脈絡叢を含めたＣＮＳの特異的領域に分布することが分かった（ＭｃＭｅｎａｍｉｎ、１９９９）。このことから、ＤＣがＣＮＳ環境を「採取」し、リンパ節でＣＮＳ抗原を提示することが恐らく可能となるであろう。他の器官と組織では、ＤＣは生理条件でＭＨＣに関連して自己抗原を提示するがそれらにたいして応答を開始する補助刺激能を欠いている。これはＣＮＳ抗原にも十分正しくあてはまる可能性があり、ＣＮＳ関連自己抗原に対する末梢性免疫寛容の維持におそらく寄与するであろう。例えば細胞に対する損傷後のような病理状態では、ＤＣは成熟過程を経て、高度に効果的で刺激的な方法でＴリンパ球に組織由来抗原を提示できるようになる。成ラットのＣＮＳの虚血性損傷後にＤＣは病変部位に蓄積し（Ｋｏｓｔｕｌａｓら、２００２）、ラットでの挫傷性ＳＣＩにはＤＣの化学誘引物質の発現の上向き調節が続く（ＭｃＴｉｇｕｅら、１９９８）。本発明人らは、損傷後のＣＮＳ自己抗原に対する適応免疫応答の刺激は、身体そのものの治癒メカニズムの正常な一部であること（Ｙｏｌｅｓら、２００１）、及び「防御自己免疫」という新しく提唱された概念の主要な特徴を示した（Ｍｏａｌｅｍら、１９９９；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９９９）。
【０１００】
内因性自己免疫応答は、見たところ日々の維持には十分である（Ｎｅｖｏら、２００３；ＳｃｈｗａｒｔｚとＫｉｐｎｉｓ、２００２）が、ＣＮＳの外傷に伴う二次変性を阻止するには不十分なようである。しかし、自然免疫及び適応免疫の操作によって内因性自己免疫応答を増強することができる（Ｆｉｓｈｅｒら、２００１；Ｈａｕｂｅｎら、２０００；Ｍｏａｌｅｍら、１９９９）。ＤＣは特異的免疫応答を開始することが示された。そのような操作は、腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘発するために利用され、現在、癌療法のための臨床試験の途中である（Ｌａｕら、２００１）。
【０１０１】
多数の研究が、ＤＣは免疫寛容を誘導できＥＡＥの発生を阻止できると示した。それらの研究の全てで使用されたＤＣは、恐らく未熟又は半成熟であった（ＬｕｔｚとＳｃｈｕｌｅｒ、２００２）。表面マーカーと特異的サイトカインを使用することによって、我々は本出願で使用されたＤＣが成熟していることを示した。さらに、ＭＢＰ関連ペプチドをパルスされたＤＣで処理されたラットから得た脾臓細胞のエックスビボでの増殖がＭＢＰペプチドに応答して増強したという観察から、我々のＤＣが寛容を誘導することは除外された。この結論は、もしラットが新生仔のときにミエリン関連抗原に対して寛容となっていたなら、又はそれらの動物が免疫応答の発現能を抑制する制御性ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の投与を受けていたならば、それらのラットにおけるＤＮＳ損傷の転帰は悪化することを実証した我々の研究室の最近の実験結果と合致している（Ｋｉｐｎｉｓら、２００２；ＳｃｈｗａｒｔｚとＫｉｐｎｉｓ、２００２）。
【０１０２】
ＤＣが効果的な免疫応答を刺激する能力を有するにもかかわらず、特異的脳炎誘発自己抗原をパルスされたＤＣによる、正常ラット又はマウスにおける免疫活性化が、我々の知るところでは、ＥＡＥを誘導すると示されたことは全くない。ある研究では、放射線照射されたマウスにおいてＥＡＥがＤＣの投与により誘導されたが、それは同時にＭＢＰという脳炎誘発ペプチドに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞が投与された場合だけであった（Ｄｉｔｔｅｌら、１９９９）。抗原をパルスされたＤＣは本研究でＳＣＩからの回復を改善したが、我々の研究所ではそれらのＤＣをナイーブラットの局所（脊髄内）、皮下、又は静脈内に注射した後に、ＥＡＥの兆候は観察されなかった（データは表示しない）。よって、このような方法でＤＣで処理することは、破壊的な自己免疫を避ける一方で、望ましい免疫応答を誘発する限りにおいて安全であると思われる。
【０１０３】
本出願における実験は、ＥＡＥに対する抵抗性とＣＮＳ外傷に耐える能力が異なるＳＰＤとＬｅｗｉｓという２系統のラットで実施された（Ｋｉｐｎｉｓら、２００１）。両系統において抗原をパルスされたＤＣを用いた処理は有効であった。Ｌｅｗｉｓ系統で我々は、（ＢＢＢスコアで測定した）自然回復が明らかに雄性ラットよりも優れている雌性ラットを使用した（Ｈａｕｂｅｎら、２００２；Ｓｔｅｉｎ、２００１）。それでもなお、ＤＣ処理は雌において依然有効であった。このことは雌の内因性応答は、損傷が誘導する変性の全てではなく一部を妨げることを示唆している。
【０１０４】
たとえＤＣ注射を損傷後１２日間まで遅らせても、ＳＣＩからの回復が改善することを我々はここで示した。その実験で使用したラットの移動活性を処理前に評価し、ＢＢＢスコアが２以下のラットのみを使用した。ラットの均一な群をランダムに２群に分け、その一方をＤＣで処理し、もう一方を対照とした。この手法で、同一群内で、並びに処理群と非処理群との間で挫傷を受けたラット同士の傷害の重症度の変動を最小にした。興味深いことに、対照群ではわずかな改善だけを認めたが、処理ラットでの転帰は、損傷直後に処理された場合とほぼ同様に良好であった。この知見はＤＣ処理ラットにおける機能的回復の根拠となるメカニズムが神経保護と新芽形成の両方を必要とすることを示唆している可能性もあろう。神経保護は軸索がまだ変性していない時期にだけ作動するという制限があるが、新芽形成はその後に大きく貢献する可能性がある。治療を行える時間の猶予が比較的広いことは、ＳＣＩの患者を治療する上で臨床的に重要であろう。ラットの横断した脊髄にマクロファージを移植することにより誘導された再生と機能的回復に関する以前の発見（Ｒａｐａｌｉｎｏら、１９９８）、並びにミエリンペプチドの受動又は能動免疫がマクロファージと小膠細胞の局所活性化を引き起こすという事実（Ｂｕｔｏｖｓｋｙら、２００１）を心に留めると同時に、ＤＣの注射は未損傷の軸索に神経保護作用を示すこと加えて、新芽形成と損傷した軸索の再生を引き起こすという可能性が残る。
【０１０５】
パルスされていないＤＣ又は関連性のないタンパク質である卵アルブミンをパルスされたＤＣを用いた処理は、損傷した脊髄に効果を有さなかった。ＭＢＰペプチド又は改変ＭＢＰペプチドＡ９１をパルスされたＤＣは有益で、成熟ＤＣは抗原提示細胞として挙動し、よって脊髄損傷したラットに投与されるときは関連性のあるＣＮＳ抗原を伴う場合にのみ活性であり得ることを示した。
【０１０６】
本発明の好ましい実施形態では、改変ＭＢＰペプチドＡ９１をＭＢＰの天然ペプチドの代わりに使用した。それは、改変ペプチドはＳＣＩ用のワクチンとしてＭＢＰと同様に有効であるが脳炎誘発性ではないからである（Ｈａｕｂｅｎら、２００１ｂ）。パルスされたＤＣとパルスされていないＤＣの間に表現型の差はなかった。それは両ＤＣでサイトカインの発現が同等であることで示された。パルスされたＤＣと対照のパルスされていないＤＣの両方が富血清培地（１０％ウシ胎仔血清）で培養中に、並びに特異的ペプチドが添加されたパルスの最終の２、３時間に、他の多くの無関係なタンパク質に曝露されていることを心に留めておくべきである。これらの事実は、その処理が抗原特異的であるという主張にさらにいっそう支持を添えるものである。さらに、強力な前炎症性化合物であるＬＰＳによるＤＣの刺激は、抗原特異的なパルスの必要性を代替しなかった。
【０１０７】
本出願でのいくつかの発見は、損傷した脊髄に及ぼすＤＣの効果に全身免疫メカニズムが介在することを示唆している。第一に、局所、皮下又は静脈内に投与されたＤＣの脊髄に対する効果に有意差はなかった。第二に、処理されたラットの脾臓細胞を種々の抗原でエックスビボで刺激すると、未処理ラットの脾臓細胞よりもミエリンペプチドに対して強い増殖応答を示した。これは、挫傷ラットに投与されたＤＣがミエリンペプチドに対して全身免疫応答を誘発したことを明らかに示している。その実験で投与されたＤＣは改変ミエリンペプチドＡ９１（行動実験でＤＣにパルスするために使用されたペプチド）をパルスされたもので、そのＤＣは抗原の類似性とエピトープの拡散が原因でエックスビボで試験された優占的ミエリンペプチドに対する応答をおそらく誘発した。第三に、出生時に胸腺摘出されたラットに注射するとき、ＤＣは挫傷性ＳＣＩからの回復に効果を及ぼさなかった。出生時に胸腺摘出されたラットが（新生仔の胸腺で通常発生する）成熟Ｔリンパ球を欠いていたことは、脊髄回復に及ぼすＤＣの有益効果は少なくとも部分的にＴ細胞に依存することを示している。このように注射されたＤＣは全身性の抗原特異的なＴ細胞依存性免疫応答を誘発する。
【０１０８】
上に指摘したように、種々のＤＣ投与経路は達成された最大の回復に有意には影響しなかったが静脈内投与で処理を行ったときにより多くのラットで高いＢＢＢスコアを達成した。これはＤＣの皮下又は局所投与に比べて静脈内処理の均一性を反映しているのかもしれない。静脈内投与されたＤＣは脾臓及び他のリンパ器官に達すると想定することが妥当である。静脈内注射された成熟ＤＣは注射後１日以内に脾臓に到達して脾臓のＴ細胞領域に選択的に局在することが示された（Ｓａｉら、２００２）。ＤＣの静脈内投与経路は免疫寛容の誘導（Ｍｅｎｇｅｓら、２００２）と免疫活性化の誘導（Ｆｏｎｇら、２００１；Ｌａｕら、２００１；Ｓａｉら、２００２）の両方に有効であることが公知である。
【０１０９】
本明細書における結果は特異的抗原をパルスされたＤＣが、ＳＣＩからのラットの回復に有益効果を及ぼすことを明らかに示している。我々は、ＤＣの効果は全身性でＴ細胞依存性であること、及びミエリンペプチドのワクチン接種と同様にＤＣがＭＢＰペプチドに対する適応免疫応答を誘発すると結論する。よって、我々の処理は、ＤＣワクチン接種としてみなすことができ、アジュバントに入れたペプチドを用いたワクチン接種のように、局所自然応答を助長し、身体そのものの自己修復メカニズム、すなわち病変部位に存在する抗原に対する適応全身免疫応答を促進することによって、ストレスの大きな損傷誘導状態と対抗する手段である。
【０１１０】
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【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１Ａ】本明細書における実験で使用した樹状細胞が成熟していることを示す図である。培養第１日（ｄ０）の、並びに組換えマウス（ｒｍ）ＧＭ−ＣＳＦ及びｒｍＩＬ−４の存在下で７日間培養後の、ラット骨髄由来ＤＣのＦＡＣＳ分析。第０日では少数の細胞（１．６％）のみがＢ７．２（ＣＤ８６）分子とＭＨＣクラスＩＩ（ＯＸ６）分子の両方を発現している。７日後には、大部分の細胞（９４％）がＣＤ８６分子とＭＨＣクラスＩＩ分子の両方を表面に大量に発現している。
【図１Ｂ】本明細書における実験で使用した樹状細胞が成熟していることを示す図である。ｒｍＧＭ−ＣＳＦ及びｒｍＩＬ−４の存在下で７日間培養後のラット骨髄由来ＤＣのＦＡＣＳ分析。点線は対照ＩｇＧ抗体を用いた染色、薄い線と濃い線はそれぞれマクロファージマーカー（ＥＤ−１）及びＢ細胞マーカー（ＣＤ４５ＲＡ）を用いた染色を示す。ヒストグラムに示されるように、細胞はこれらのマーカーを発現していない。
【図１Ｃ】本明細書における実験で使用した樹状細胞が成熟していることを示す図である。ＭＢＰ−Ａ９１をパルスする前（左）及びパルスの２時間後（右）の、７日間培養したＤＣのＲＴ−ＰＣＲ。培養ＤＣは、ＭＢＰ−Ａ９１をパルスする前後の両方で成熟ＤＣのマーカーであるＩＬ−６、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１２を発現している。表示した値は、同様の結果となった２つの実験の一方からのものである。
【図２Ａ】脊髄挫傷を有するラットにミエリン塩基性ペプチドＭＢＰ８７−９９又はＭＢＰ−Ａ９１をパルスされた骨髄由来樹状細胞を局所注射した効果を示す図である。重症の脊髄挫傷（重量１０ｇのＮＹＵインパクターを高さ５０ｍｍから落下）の直後に、ＭＢＰ８７−９９（丸印）をパルスされたＤＣを損傷部位に注射すると、ＰＢＳを注射した対照に比べて、雄性ＳＰＤラットに有意な神経保護を付与する（各群ｎ＝６）。
【図２Ｂ】脊髄挫傷を有するラットにミエリン塩基性ペプチドＭＢＰ８７−９９又はＭＢＰ−Ａ９１をパルスされた骨髄由来樹状細胞を局所注射した効果を示す図である。ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされたＤＣを損傷部位に注射すると（ｎ＝７）、移動動作の有意な改善を生じる。この処理の神経保護効果は統計的に有意であった（＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定；反復のある２因子ＡＮＯＶＡ、Ｐ≦０．０１、ｄｆ＝１、Ｆ検定＝９．６５８）。
【図２Ｃ】脊髄挫傷を有するラットにミエリン塩基性ペプチドＭＢＰ８７−９９又はＭＢＰ−Ａ９１をパルスされた骨髄由来樹状細胞を局所注射した効果を示す図である。記録されたスコアは試験の最終時点での個々のラットのスコアであることに注意されたい。
【図３Ａ】パルスされていないか、又は関連性のないペプチドをパルスされた骨髄由来ＤＣの局所注射が脊髄挫傷ラットに有益効果を及ぼさないことを示す図である。雄性ＳＰＤラットの脊髄挫傷直後に、骨髄由来の未パルスＤＣを損傷部位に局所注射した（ｎ＝１２）。対照ラットにはＰＢＳを同様に注射した（ｎ＝１０）。棒はスコアがプラトー（最大値）に達した時点での各群の平均ＢＢＢスコアを表す。未パルスＤＣはビヒクルであるＰＢＳで処理したときに比べ回復に効果を及ぼさなかった。結果は、対照の平均スコアが同等となった２つの実験をプールしたものである。その他の４つの実験も同様のパターンを示した。
【図３Ｂ】パルスされていないか、又は関連性のないペプチドをパルスされた骨髄由来ＤＣの局所注射が脊髄挫傷ラットに有益効果を及ぼさないことを示す図である。脊髄挫傷の直後に、動物はＰＢＳ、又は卵アルブミンをパルスされた骨髄由来ＤＣのどちらかの局所注射を受けた（各群は雄性ＳＰＤラット６匹）。棒はスコアがプラトー（最大値）に達した時点の各群の平均ＢＢＢスコアを表す。２群の間で回復に有意差はない。
【図４Ａ】ＭＢＰペプチドをパルスされた樹状細胞の局所移植後に空洞形成が限定していることを示す図である。ビヒクルで処理したラットの脊髄凍結切片に存在する嚢胞領域（１群あたりｎ＝４）。
【図４Ｂ】ＭＢＰペプチドをパルスされた樹状細胞の局所移植後に空洞形成が限定していることを示す図である。ＭＢＰペプチドをパルスされたＤＣで処理されたラットの脊髄の凍結切片に存在する嚢胞領域（１群あたりｎ＝４）。
【図４Ｃ】ＭＢＰペプチドをパルスされた樹状細胞の局所移植後に空洞形成が限定していることを示す図である。各群４つの脊髄について３平面から撮像した３つのスライスにおける空洞面積を（Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓで）測定した。異なる群間で嚢胞面積は有意差を示した（Ｐ＜０．０１、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定）。このことはＭＢＰペプチドをパルスされたＤＣで処理することが脊髄空洞（脊髄中心の空洞形成）の量を有意に減少させることを示唆している。
【図５Ａ】雌性Ｌｅｗｉｓラットにおいて脊髄損傷後に、改変ミエリンペプチドをパルスされた骨髄由来樹状細胞を用いた局所処理の結果としての回復が改善することを示す図である。重症の脊髄挫傷直後に雌性Ｌｅｗｉｓラット６匹にＭＢＰ−Ａ９１をパルスされた５×１０５個のＤＣを局所注射し、対応する対照５匹にＰＢＳを注射した。ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされたＤＣの注射によってＢＢＢ評価尺度で測定した移動動作に有意な改善が生じた（＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定；反復のある２因子ＡＮＯＶＡ、Ｐ≦０．０１、ｄｆ＝１、Ｆ検定＝８．７０１）。
【図５Ｂ】雌性Ｌｅｗｉｓラットにおいて脊髄損傷後に改変ミエリンペプチドをパルスされた骨髄由来樹状細胞を用いた局所処理の結果としての回復が改善することを示す図である。ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされたＤＣ細胞で処理され、損傷と処理の６か月後にＢＢＢスコア８を示す雌性Ｌｅｗｉｓラットから得た脊髄切片をルクソールファストブルーで染色したものの顕微鏡写真。
【図５Ｃ】雌性Ｌｅｗｉｓラットにおいて脊髄損傷後に改変ミエリンペプチドをパルスされた骨髄由来樹状細胞を用いた局所処理の結果としての回復が改善することを示す図である。ＰＢＳで処理され、損傷と処理の６か月後にＢＢＢスコア５を示す雌性Ｌｅｗｉｓラットから得た脊髄切片をルクソールファストブルーで染色したものの顕微鏡写真。これらの切片は、ルクソールファストブルー染色で組織学的に分析されたＤＣ処理ラット２匹及び対照ラット２匹から得た脊髄切片を代表するものである。処理ラットでは神経組織の保存性が有意に良好で、嚢胞が有意に縮小していることに注意されたい。
【図６】Ｔ細胞を欠いたラットにおいて改変ミエリンペプチドＭＢＰ−Ａ９１をパルスされた樹状細胞による神経保護活性が欠如していることを示す図である。新生仔に対する胸腺摘出の３か月後に雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＰＤ）ラット（各群ｎ＝５）に脊髄挫傷を負わせてから、ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされた５×１０５個のＤＣ又はＰＢＳを局所注射した。正常なＴ細胞の機能が存在しないと、ＤＣは回復に有意な効果を及ぼさなかった。示した結果は胸腺摘出された雄性及び雌性ＳＰＤでの３つの実験を代表するものである。
【図７Ａ】ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされた樹状細胞の静脈内（ｉ．ｖ．）投与が、脊髄損傷後の機能的回復を促進することを示す図である。ＳＰＤ雄性ラット１６匹に重症の挫傷性ＳＣＩを負わせ、ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされた１×１０６個のＤＣ又はＰＢＳをｉ．ｖ．注射した。１０日後に、各群からラット３匹を安楽死させ、脾臓を取り出し、Ｔ細胞の増殖を試験した。ＰＢＳを注射されたラットではなく、ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされたＤＣの注射を受けたラットの脾臓細胞は、ＭＢＰペプチド（ＭＢＰ８１−９９、ＭＢＰ６８−８２及びＡ９１）に対してＭＯＧ３５−５５に対するよりも有意に強いＴ細胞応答を示した。これはＭＢＰ−Ａ９１をパルスされたＤＣが関連するミエリン抗原に対するＴ細胞応答を誘導することを示唆している。
【図７Ｂ】ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされた樹状細胞の静脈内（ｉ．ｖ．）投与が、脊髄損傷後の機能的回復を促進することを示す図である。ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされたＤＣの静脈内注射によって、ＰＢＳのｉ．ｖ．注射後に得られたよりも有意に良好な機能的回復が生じた（各群ｎ＝５、反復のある２因子ＡＮＯＶＡ、Ｐ≦０．００３、ｄｆ＝１、Ｆ検定＝１８．４３）。
【図７Ｃ】ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされた樹状細胞の静脈内（ｉ．ｖ．）投与が、脊髄損傷後の機能的回復を促進することを示す図である。試験した最終時点での各ラットのスコア。
【図８】ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされた樹状細胞の皮下（ｓ．ｃ．）投与が脊髄損傷からの機能的回復を促進することを示す図である。重症の挫傷性ＳＣＩ直後に、ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされた２×１０６個のＤＣ又はＰＢＳを雌性ＳＰＤラット（ｎ＝３及び４）にｓ．ｃ．注射した。ＤＣ−ＭＢＰ−Ａ９１で処理されたラットは対照よりも有意に良好な移動動作を示した（＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定；反復のある２因子ＡＮＯＶＡ、Ｐ≦０．０１、ｄｆ＝１、Ｆ検定＝１２．３５３）。
【図９Ａ】ミエリンペプチドをパルスされた樹状細胞の注射には治療を行える時間の猶予が１２日間あることを示す図である。重症の挫傷性ＳＣＩによって麻痺したラットに１２日遅れて注射しても機能的回復が有意に改善する。雄性ＳＰＤ２０匹に重症の挫傷を負わせ、その１２日後に移動スコアの低い１１匹をランダムに２群に分けた。ラット６匹にはＭＢＰ−Ａ９１をパルスされた５×１０５個のＤＣを損傷部位に注射し、残りの５匹にはＭＢＰ−Ａ９１を加えない培地で培養した５×１０５個のＤＣを移植した。
【図９Ｂ】ミエリンペプチドをパルスされた樹状細胞の注射には治療を行える時間の猶予が１２日間あることを示す図である。損傷後２９日（処理の１７日後）から１６０日までに測定した全ての時点で、ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされたＤＣで処理したラットの移動動作は、対照ラットよりも有意に良好であった（＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定）。ミエリンペプチドをパルスされたＤＣを注射する全般効果は、対照に比べて有意であった（反復のある２因子ＡＮＯＶＡ、Ｐ≦０．０５、ｄｆ＝１、Ｆ検定＝６．２０６）。試験した最終時点における個々のラットのスコア。
【図９Ｃ】ミエリンペプチドをパルスされた樹状細胞の注射には治療を行える時間の猶予が１２日間あることを示す図である。同様の実験方法を用いてＭＢＰ−Ａ９１をパルスされた５×１０５個のＤＣ（ｎ＝６）又は５×１０５個のＤＣ（ｎ＝５）を、脊髄損傷した雄性ＳＰＤラットの損傷部位にＳＣＩの２８日後に局所投与した。
【図９Ｄ】ミエリンペプチドをパルスされた樹状細胞の注射には治療を行える時間の猶予が１２日間あることを示す図である。２群で回復に有意差はみられなかった。
【図１０Ａ】挫傷した脊髄の拡散異方性を示すマップを描いた図である。ＳＣＩの９か月後に、脊髄を摘出し、固定し、５ｍｍのＮＭＲ管に入れた。図は、ＭＢＰ−Ａ９１をパルスされたＤＣを局所注射したラット及び対照ラットの挫傷した脊髄の代表的なマップを示す。左から右へのスライスは吻側から尾側への軸位スライスに対応する。色は異方性の値に対応する。マップは処理されたラットの病巣部位で縦方向に配列した組織が保存されていることを示している。対照ラットにおける損傷部位が処理群のラットにおけるよりも極めて大きいことに注意されたい。最小の異方性の値を有するスライスで損傷部位の中心（星印）を決定した。
【図１０Ｂ】挫傷した脊髄の拡散異方性を示すマップを描いた図である。複数のスライスにわたるＳＡＩ（異方性の合計）の値の空間分布。図は、各群ラット２匹のうち代表的な１匹の結果を示す。処理ラットでは移動スコアは８．５で、対照では１．０であった。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ｂ】
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【国際調査報告】
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