(57)【要約】本発明は、その発現が金属イオンの存在下、又は不存在下における生育により制御され得る遺伝子を含む新規な酵母細胞、及びこのような酵母細胞の作成方法、及びこのような酵母細胞を使用して、該酵母細胞の生育又は生存に関連する特定遺伝子の発現のための要求性を測定する方法を提供する。また、本発明は、候補抗菌性化合物の単離、スクリーニング及び分析においてこのような酵母細胞を使用する方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
制御された標的遺伝子を含む酵母菌株を作成する方法であって：
（ａ）下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む酵母細胞を作成すること、
（ｉ）その発現が、金属イオン応答性エレメントのコントロール下にある、転写リプレッサタンパク質をコードする第１遺伝子、ここにおいて該リプレッサタンパク質をコードする前記第１遺伝子の発現は、前記酵母細胞の生育培地に金属イオンを加えることにより刺激される；
（ｉｉ）対象タンパク質をコードする第２遺伝子、ここにおいて該対象タンパク質をコードする該第２遺伝子の発現がその活性が前記リプレッサタンパク質によって阻害される転写コントロール配列によってコントロールされる；及び
（ｉｉｉ）バイオミネラリゼーションタンパク質をコードする第３遺伝子、ここにおいて該第３遺伝子は不活性化され、かつ該第３遺伝子の不活性化が前記酵母細胞の生育培地における金属イオンに対する該金属イオン応答性エレメントの転写応答を増強する；
（ｂ）該金属イオンを含む生育培地において該酵母細胞を培養すること、ここにおいて該金属イオンは前記対象遺伝子の発現の所定レベルの抑制をもたらすレベルに、前記金属イオン応答性エレメントを活性化するのに十分な濃度で存在する；
（ｃ）該酵母細胞から第２遺伝子の急速な涸渇が細胞生育の阻害、又は細胞死をもたらすか否か評価すること、を含む前記方法。
【請求項２】
前記抑制が必須標的遺伝子としての該標的遺伝子を特定するものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記転写リプレッサタンパク質がＲＯＸ１遺伝子によってコードされるタンパク質である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記転写コントロール配列がＡＮＢ１プロモータである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記バイオミネラリゼーション遺伝子がＳＬＦ１である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
該酵母細胞がさらに減のためにユビキチン含有ポリペプチドを標的とするタンパク質をコードする第４遺伝子を含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記第４遺伝子が金属イオン応答性エレメントのコントロール下にある、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記第４遺伝子がＵＢＲ１である、請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記転写リプレッサタンパク質がＣＹＣ８−ＬｅｘＡである、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記転写リプレッサタンパク質をコードする前記遺伝子がＲＯＸ１−ＬｅｘＡである、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
必須標的遺伝子との相互作用に関連し、候補抗菌性化合物をスクリーニングする方法であって：
（ａ）請求項１に規定される制御された必須標的遺伝子を含む制御された酵母菌株を作成し；
（ｂ）該制御された酵母菌株の生育、又は生存を停止させる金属イオンの濃度を確定し；
（ｃ）酵母生育培地中に金属イオンの連続的な希釈を作成し；
（ｄ）該連続的希釈生育培地において抑制された酵母菌株を培養し、ここにおいて該連続的希釈は制御された必須標的酵母遺伝子産物の発現の投与量依存的調製をもたらす；
（ｅ）該候補抗菌性化合物に対する該菌株の変化した感受性に関し該連続的に希釈された培養体をスクリーニングし；
（ｆ）該候補抗菌性化合物に対する変化した感受性を示す培養体に存在する金属イオン濃度を測定し；
（ｇ）工程（ｂ）の金属イオン濃度と、工程（ｆ）で測定された培地の金属イオン濃度とを比較し、かつ金属イオンのより低い濃度を工程（ｂ）と比較して工程（ｆ）における生育、又は生存を停止させるために要求される候補抗菌性化合物を同定すること、を含む前記方法。
【請求項１２】
複数の候補抗菌性化合物をスクリーニングする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
複数の候補化合物のスクリーニングが、単一アッセイと共に行うスクリーニング、及び多重同時個別検出工程を使用する個別のスクリーニングからなる群から選ばれたものである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記転写リプレッサタンパク質がＲＯＸ１遺伝子によってコードされるタンパク質である、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
前記転写コントロール配列がＡＮＢ１プロモータである、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
前記バイオミネラリゼーション遺伝子がＳＬＦ１である、請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
該酵母細胞がさらに減成に関しユビキチン含有ポリペプチドを標的とするタンパク質をコードする第４遺伝子を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１８】
前記第４遺伝子が金属イオン応答性エレメントのコントロール下にある、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
前記第４遺伝子がＵＢＲ１である、請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
前記転写リプレッサタンパク質がＣＹＣ８−ＬｅｘＡである、請求項１１記載の方法。
【請求項２１】
前記転写リプレッサタンパク質をコードする遺伝子がＲＯＸ１−ＬｅｘＡである、請求項１１記載の方法。
【請求項２２】
必須標的遺伝子に対し相補的なＤＮＡを急速にクローニングする方法であって：
（ａ）請求項１で規定する制御された必須標的遺伝子を含む制御された酵母菌株を作成すること；
（ｂ）該制御された酵母菌株の生育、又は生存を停止させる金属イオンの濃度を確立すること；
（ｃ）相補性をテストするＤＮＡを用いて該制御された酵母菌株を形質転換すること；
（ｄ）工程（ｂ）で確定された濃度の金属イオンを含む生育培地中において該形質転換制御された酵母菌株を培養すること；
（ｅ）該制御された必須標的遺伝子に相補する該ＤＮＡの能力を測定すること、ここにおいて該制御された酵母菌株の生育、又は生存は相補性を確立する；及び
（ｆ）該相補的ＤＮＡをクローニングすることを含む、前記方法。
【請求項２３】
該ＤＮＡが他の生物からの由来の遺伝子、変異ＤＮＡ、及びＤＮＡフラグメントからなる群から選ばれる、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
該生物が、ヒト、マウス、哺乳動物、ショウジョウバエ、及び菌類からなる群から選ばれる、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
該ＤＮＡがゲノム、及びｃＤＮＡライブラリーからなる群から作成される、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
前記転写リプレッサタンパク質がＲＯＸ１遺伝子によってコードされるタンパク質である、請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
前記転写コントロール配列がＡＮＢ１プロモータである、請求項２２記載の方法。
【請求項２８】
前記バイオミネラリゼーション遺伝子がＳＬＦ１である、請求項２２記載の方法。
【請求項２９】
該酵母細胞がさらに減成するためのユビキチン含有ポリペプチドを標的とするタンパク質をコードする第４遺伝子を含む、請求項２２記載の方法。
【請求項３０】
前記第４遺伝子が金属イオン応答性エレメントのコントロール下にある、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記第４遺伝子がＵＢＲ１である、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
前記転写リプレッサタンパク質がＣＹＣ８−ＬｅｘＡである、請求項２２記載の方法。
【請求項３３】
前記転写リプレッサタンパク質をコードする遺伝子がＲＯＸ１−ＬｅｘＡである、請求項２２記載の方法。
【請求項３４】
抗菌性化合物の抗菌性効果を測定する方法であって：
（ａ）請求項１に規定される制御された必須標的遺伝子を含む制御された酵母菌株を作成すること；
（ｂ）該制御された酵母菌株の生育、又は生存を停止させる金属イオンの濃度を確立すること；
（ｃ）工程（ｂ）において確定した濃度の金属イオンを含む生育培地において該制御された酵母菌株を培養すること；
（ｄ）該必須標的遺伝子が涸渇する、工程（ｃ）の培養に関連する表現型を特定すること；
（ｅ）候補抗菌性化合物を伴う生育培地において酵母菌株を培養すること；
（ｆ）該候補抗菌性化合物で処理され、工程（ｅ）の培養に関連する表現型を特定すること；、及び
（ｇ）工程（ｄ）、及び（ｆ）において測定された該表現型を比較し、該抗菌性化合物の抗菌効果を決定することを含む前記方法。
【請求項３５】
該表現型を決定することが、
（ｉ）放射能標識マクロ分子構築ブロックを伴う培養体を培養し；
（ｉｉ）各培養体において該放射能標識マクロ分子構築ブロックの取り込みレベルを測定し；及び
（ｉｉｉ）各培養体において生成した該マクロ分子生物を分析することを含む請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記転写リプレッサタンパク質がＲＯＸ１遺伝子によってコードされる該タンパク質である、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
前記転写コントロール配列がＡＮＢ１プロモータである、請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
前記バイオミネラリゼーション遺伝子がＳＬＦ１である、請求項３４記載の方法。
【請求項３９】
該酵母細胞がさらに減成に関するユビキチン含有ポリペプチドを標的とするタンパク質をコードする第４遺伝子を含む、請求項３４記載の方法。
【請求項４０】
前記第４遺伝子が金属イオン応答性エレメントのコントロール下ある、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記第４遺伝子がＵＢＲ１である、請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
前記転写リプレッサタンパク質がＣＹＣ８−ＬｅｘＡである、請求項３４記載の方法。
【請求項４３】
前記転写リプレッサタンパク質をコードする遺伝子がＲＯＸ１−ＬｅｘＡである、請求項３４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
（発明の分野）
本発明は、サッカロミセス  セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における特定遺伝子の制御された発現を行う方法、及び組物に関するものである。本発明は、関心の対象である遺伝子の同定、及びクローン、及び高処理量スクリーニング技術を用いる抗菌剤を特定することに使用することができる。また、本発明は、抗菌剤の分離、及び分析において、本発明のサッカロミセス  セレビシア菌株の使用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
（発明の背景）
関心の対象である特定遺伝子の発現を制御する能力は、多くの目的において重要である。例えば、（ｉ）特定遺伝子産物の生物学的機能の研究；（ｉｉ）異なる目的のために調製された遺伝子産物の変異体の設計；及び例えば、インヒビター、又はアクチベータのような遺伝子産物の活性に影響を与える薬剤の特定である。Ｓ．セレビシアにおける遺伝的、かつ分子的マニピュレーションの実施が容易であることは、その酵母を、組み換え遺伝子の制御された発現に関し、極めて有用な実験的生物とする。しかしながら、Ｓ．セレビシアを基礎とする多くの遺伝子発現系は、その応用性が、（ｉ）該遺伝子をスイッチオン、及びスイッチオフできる範囲、並びにそれらが起きるタイミングの範囲のような、達成し得る制御の程度；（ｉｉ）特定遺伝子産物の相対的安定性（該安定性は細胞における遺伝子産物の速やかな涸渇を難しくする）；及び（ｉｉｉ）遺伝子発現において引き金を引き、又は変化を開始させるのに用いる手順の潜在的な代謝副作用によって制限されている。
従って、遺伝子の転写、及びタンパク質産物の蓄積に関し、遺伝子発現を厳しく、かつ有効に制御することができる、Ｓ．セレビシア発現系に関する技術分野における必要性が存在する。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
【課題を解決するための手段】
（発明の要約）
本発明は、特定タンパク質（対象タンパク質）の発現を厳格に制御することができる酵母菌株を含む。本発明は該対象タンパク質の発現を外来金属によって制御することができるサッカロミセス  セレビシア細胞を提供する。これらの細胞が含むのは、例えば：
（ｉ）  転写リプレッサタンパク質をコードする第１遺伝子、その発現は金属イオン応答性エレメントのコントロール下に置かれており、該リプレッサタンパク質の発現は該細胞の生育培地に対する金属イオンの添加によって刺激される；
（ｉｉ）  対象タンパク質をコードする第２遺伝子、そこにおいて該対象タンパク質の発現はその活性がリプレッサタンパク質によって制御されているプロモータによって制御されている；及び
（ｉｉｉ）  バイオミネラリゼーションタンパク質をコードする第３遺伝子、ここにおいて該第３遺伝子は不活性化され、かつ該第３遺伝子の不活性化は添加された金属イオンに対する金属応答性エレメントの転写応答を増強する。
【０００５】
好ましい実施態様において、第１遺伝子はＲＯＸ１；第２遺伝子はＡＮＢ１プロモータによってコントロールされ；かつ第３遺伝子はＳＬＦ１である。
他の実施態様において、該第４遺伝子は金属イオン応答性エレメントのコントロール下にある場合、該酵母細胞は減成するためにユビキチン含有ポリペプチドを標的とするタンパク質をコードする第４遺伝子を含む。好ましい実施態様において該第４遺伝子はＵＢＲ１遺伝子である。
さらに本発明は対象タンパク質の発現が外来金属イオンにより刺激される酵母細胞を含む。これらの細胞が含むのは：（ｉ）対象タンパク質をコードする第１遺伝子、ここにおいて対象タンパク質をコードする遺伝子の発現は金属イオン応答性エレメントのコントロール下にあり、かつ該細胞の生育培地に対する金属イオンの添加によって刺激され；かつ（ｉｉ） バイオミネラリゼーションタンパク質をコードする第２遺伝子、該第２遺伝子は不活性化され、かつ該第２遺伝子の不活性化は添加された金属イオンのイオンに対する金属応答性エレメントの転写応答を増強する。
【０００６】
好ましい実施態様において、該金属応答性エレメントはＳｃ３４５１プロモータ、及び第２遺伝子はＳＬＦ１である。
他の側面において、本発明は、酵母細胞ゲノムに所定のプロモータＤＮＡ配列のコントロール下にある対象遺伝子の導入方法であって、シャッフルされた遺伝子フラグメントを提供する工程、該フラグメントは制限酵素切断配列を含み、シャッフルされたフラグメントをベクターに結索し、かつ該結索は該シャッフルされた遺伝子フラグメントを所定の転写コントロールＤＮＡ配列と機能的にリンクさせ、該制限酵素切断配列に関する制限酵素の特異性によって該ベクターを切断して線形化ベクターを得ること、かつ該線形化ベクターによって酵母細胞を形質転換することを含む。
【０００７】
また、本発明は、Ｓ．セレビシアにおける対象タンパク質を所定のレベルに発現する遺伝子の発現を抑制、又は活性化する方法であって、該方法は金属の存在下において前記菌株を培養する、ここにおいて該金属は該遺伝子の抑制、又は活性化の所定の水準を達するように該金属応答性セレメントを活性化するのに十分な濃度で存在することを含む。
さらに他の実施例において、また本発明は、本発明の該酵母菌株を作する方法を含み：
（ａ）下記特性を含む酵母細胞を作すること、
（ｉ）その発現が金属イオン応答性エレメントのコントロール下にある転写リプレッサタンパク質をコードする第１遺伝子、ここにおいて前記リプレッサタンパク質をコードする第１遺伝子の発現が前記酵母細胞の生育培地に対する金属イオンの添加により刺激される；
（ｉｉ）対象タンパク質をコードする第２遺伝子、前記対象タンパク質をコードする該第２遺伝子の発現はその活性が前記リプレッサタンパク質によって抑制される転写コントロール配列によってコントロールされる；及び
（ｉｉｉ）バイオミネラリゼーションタンパク質をコードする第３遺伝子、該第３遺伝子は不活性化され、かつ該第３遺伝子の不活性化は前記酵母細胞の生育培地における金属イオンに対する前記金属イオン応答性エレメントの転写応答を増強する；
（ｂ）金属イオンを含む生育培地おける該酵母細胞の培養、ここにおいて前記金属イオンは前記対象遺伝子の発現の抑制の該所定レベルをもたらすレベルに前記金属イオン応答性エレメントを活性化するのに十分な濃度で存在する；
（ｃ）該酵母細胞から第２遺伝子の急速な涸渇が細胞の生育の抑制、又は細胞死を導くか、否か評価することを含む該方法である。
【０００８】
好ましい実施態様において、該方法は必須の標的遺伝子として該標的遺伝子を特定する。
本発明の実施態様は、必須の標的遺伝子との相互作用に関する候補抗菌性化合物をスクリーニングする方法に関し、該方法は下記の工程を含む；
（ａ）本発明の制御された必須の標的遺伝子を含む制御された酵母菌株を作すること；
（ｂ）該制御された酵母菌株を生育、又は生存が止まる金属イオン濃度を確定する；
（ｃ）酵母生育培地における金属イオンの連続希釈を行うこと；
（ｄ）該連続希釈培地において該制御された酵母菌株を培養すること、ここにおいて該連続的希釈は該制御された必須の標的酵母遺伝子産物の発現の投与量依存的調整をもたらす；
（ｅ）該候補抗菌化合物に対する該菌株の他の感受性に対し連続的に希釈された培養をスクリーニングすること；
（ｆ）該候補抗菌性化合物に対する他の感受性を示す培養において存在する該金属イオン濃度を決定すること；
（ｇ）工程（ｂ）の該金属イオン濃度と、工程（ｆ）において測定された培地の金属イオン濃度とを比較して、かつより低い金属イオン濃度を要求し、工程（ｂ）と比較して工程（ｆ）における生育、又は生存を止める候補抗菌性化合物を特定することを含む。
【０００９】
該スクリーニング方法は単一候補、又は複数の候補抗菌性化合物をスクリーニングすることができる。複数の候補をスクリーニングする場合、該スクリーニングは単一アッセイにおいて共にスクリーニングすること、及び複数の多重同時個別検出工程を用いて個々にスクリーニングすることを選択する。
また、本発明は必須の標的遺伝子と相補的なＤＮＡを速やかにクローニングする方法を含み：該方法は次の工程を含む：
（ａ）本発明の制御された必須標的遺伝子を含む制御された酵母菌株を作すること；
（ｂ）該制御された酵母菌株の生育、又は生存を止める金属イオン濃度を確立すること；
（ｃ）相補性をテストするＤＮＡによって該制御された酵母菌株を形質転換すること；
（ｄ）該形質転換され、制御された酵母菌株を工程（ｂ）において確立された濃度の金属イオンを含む生育培地中で培養すること；
（ｅ）該制御された必須標的遺伝子と相補する該ＤＮＡの能力を測定すること、ここにおいて制御された酵母菌株の生育、又は生存で相補性を確定する；及び
（ｆ）該相補的ＤＮＡをクローニングすることである。
【００１０】
さらに他の実施例において、ＤＮＡは、他の生物から得られた遺伝子、変異ＤＮＡ、及びゲノム、又はｃＤＮＡライブラリーのいずれかから作成することができるＤＮＡフラグメントからなるものから選ばれたものである。さらに他の実施例において、該ＤＮＡはヒト、マウス、哺乳動物、ショウジョウバエ、及び真菌から群から選ばれた生物から選択されたものである。
さらに本発明は抗菌性化合物の抗菌効果を測定する方法を含むものであり、該方法は下記の工程を含む；
（ａ）本発明の制御された必須標的遺伝子を含む制御された酵母菌株を作成すること；
（ｂ）前記制御された酵母菌株の生育、又は生存を停止させる金属イオンの濃度を確立すること；
（ｃ）工程（ｂ）で確立された濃度の金属イオンを含む生育培地中において制御された酵母菌株を培養すること；
（ｄ）該必須標的遺伝子が涸渇する、工程（ｃ）の培養に伴う表現型を測定すること；
（ｅ）候補抗菌性化合物を含む生育培地において酵母菌株を培養すること；
（ｆ）候補抗菌性化合物で処理された工程（ｅ）の培養に伴う表現系を測定すること；
（ｇ）工程（ｄ）、及び（ｆ）において測定された表現型を比較し該抗菌性化合物の抗菌効果を測定することである。
【００１１】
さらに他の実施態様において該表現型は次の工程で測定する；
（ｉ）放射性物質でラベルしたマクロ分子構築ブロックで共に該培養物を培養すること；
（ｉｉ）それぞれの培養に関し放射性化合物で標識マクロ分子構築ブロックの取り込みレベルを確定すること；及び
（ｉｉｉ）各培地において生成されたマクロ分子生成物を分析することである。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に引用されている全ての特許、特許出願、刊行物、及び他の文献はその全体を引用により本明細書の内容とする。矛盾がある場合においては、定義を含め本明細書中の記載に従うものとする。
本明細書において、用語「転写リプレッサタンパク質」は、転写コントロール配列に直接結合するか、又は他のタンパク質、又はコファクターと関連して転写コントロール配列に結合するタンパク質をいい、該転写コントロール配列に機能的にリンクするヌクレオチド配列をコードするタンパク質の転写を抑制する。
本明細書中に用いる用語「転写コントロール配列」は、イニシエータ配列、エンハンサ配列、及びプロモータ配列のようなＤＮＡ配列であって、それらに機能的にリンクするタンパク質コード核酸配列の転写を抑制、又はコントロールするものをいう。
本明細書中で用いる用語「金属イオン応答性エレメント」とは、適当な濃度の金属イオンが存在する場合に、活性化される転写コントロール配列をいう。
本明細書中に用いる用語「不活性化」とは、遺伝子に関連して言及される場合には、ゲノムから得られた遺伝子の欠失に起因して、又はそのコード、又は調節配列の破壊によって、該遺伝子が転写できなくなることをいう。
本明細書中において用語「バイオミネラリゼーションタンパク質」とは、イオン化銅を、ＣｕＳのような水に不溶性の形態に転換するプロモータ、又は触媒として働くタンパク質をいう。
本明細書中の用語「シャッフルされた遺伝子フラグメント」とは、該遺伝子のＡＴＧ開始コドン（すなわち５’側に向かい）の上流約４００ヌクレオチドから該遺伝子のＡＴＧ開始コドン（すなわち３）からの約４００タンパク質コードヌクレオチド下流である、遺伝子のＡＴＧ開始コドンの周囲のヌクレオチド配列をいい。ここにおいて該上流、及び下流配列の方向性は、該ＡＴＧ開始コドン、及び野生型遺伝子におけるＡＴＧコドンに続く約４００下流タンパク質コードヌクレオチドが、該ＡＴＧ開始コロンの近傍、かつ上流に通常見いだされる約４００非コードヌクレオチドに対し、上流である。該シャッフルされた遺伝子フラグメントは該再配列コード、及び非コードヌクレオチド配列の間に、制限酵素切断配列を含む。
【００１３】
本明細書の用語「制限酵素切断配列」とは、１以上の制限エンドヌクレアーゼ酵素によって特異的に認識され、かつ切断される特定のヌクレオチド配列をいう。
本明細書において用語「機能的にリンクする」とは典型的には転写コントロール配列のタンパク質コードヌクレオチド配列に対する共有結合をいい、そこではタンパク質コードヌクレオチド配列の転写が該転写コントロール配列によって制御、またはコントロールされている。
本明細書に用語「直線化ベクター」とは単一部位で既に切断されている環状二本鎖ＤＮＡ分子、すなわちベクターの切断産物であって、直線二本鎖ＤＮＡ分子として得られているものである。
本明細書において「阻害」とはそれが菌類の生育、ＤＮＡ転写、タンパク質合成などとして該パラメータの減少として測定されるものをいう。このような減少量は標準（コントロール）に対する相対的な量として測定される。細胞分裂、生育、及び細胞サイクル制御における多くのサッカロミセスタンパク質の多重相互作用から、検出すべき特定の標的遺伝子は、採用される具体的スクリーニングアッセイとの関連で変化し得る。
【００１４】
本明細書中の「減少」とは、コントロールと相対的に少なくとも２５％の、好ましくは少なくとも５０％の、かつ最も好ましくは少なくとも７５％の減少として定義される。
本明細書の「生育」とは、Ｓ．セレビアシアの通常の生育パターンをいい、すなわち対数生育期の細胞倍増時間が６０分〜９０分であることをいう。富栄養培地において、野生型Ｓ．セレビシア菌株は倍増時間は９０分である。該細胞の生育は、液体培地中における細胞の光学密度に従って測定することができる。光学密度の増加は生育を示している。また、この生育は固形培地プレート上における単一細胞からのコロニー形成によって測定することができる。
【００１５】
本明細書中の「生存率」とは、生育の中断をもたらす細胞の処理に続く細胞の回復に対するＳ．セレビシアの能力をいう。生育の中断をもたらすこのような処理の例には、制限されるものではないが、生育で要求される遺伝子産物の一時的な不活性化、又は抗菌剤を用いた処理がある。生存率を測定する１つの典型的な手段に、生育を中断させる処理を除去した後に固形培地プレートにおけるコロニー形成を行う細胞の能力を試験することがある。コロニー形成を果たせなかった細胞は生存不能であったと判断される。
【００１６】
本明細書における「殺」とは生存能力の急速な喪失と定義される。急速とは少なくとも約２時間以下に特定された半数生存を伴う一群の細胞の生存能力喪失と定義される。
本明細書の「候補インヒビター」とはサッカロミセス  セレビシアの生育、又は生存を阻害する潜在的能力を有する全ての化合物をいい、用語「候補抗菌剤」と互換的に使用することができる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明はサッカロミセス  セレビシアにおける対象となる遺伝子の発現を調整する方法、及び組成物を含む。本発明は下記構成を有する組み換え酵母菌株を提供する：
（ｉ）  転写リプレッサタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子の発現は金属イオン応答性エレメントのコントロール下に置かれており、それにより該リプレッサタンパク質をコードする遺伝子の発現は細胞の生育培地に対する金属イオンの添加によって刺激される；
（ｉｉ）  対象となるタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子の発現は（ｉ）に記載されているリプレッサタンパク質によって阻害される；かつ
（ｉｉｉ） 不活性化、又は過剰発現されている金属イオン代謝に用いられる１以上の遺伝子、該遺伝子に依存して添加された金属イオンに対し転写応答が強化される。
【００１８】
前記酵母細胞において（多数のこのようなクローン細胞は集合的に「発現抑制菌株」と表記される）、対象となる遺伝子は、添加された金属イオンがない場合に発現される。対象となる遺伝子の発現を減少、又は除去するのが好ましい場合、金属イオンを該培地に添加し、該リプレッサの発現を、添加された金属イオンの濃度に依存する程度に刺激し、かつ対象となる遺伝子の転写を抑制する。
また本発明は酵母細胞（多数のこのようなクローン細胞は集合的に「誘導菌株」と表示される）を含んでおり：ここにおいて（ｉ）対象となる遺伝子は金属イオン誘導転写コントロール配列と機能的にリンクしており、その結果対象となる遺伝子の発現は培地に対する金属イオンの添加により直接刺激され、かつ（ｉｉ）すでに不活性化、又は過剰発現されている金属イオン代謝における１以上の遺伝子、該遺伝子に依存して、添加された金属イオンに対する転写応答が強化される。
【００１９】
前記操作の実施における酵母菌株の選択は本発明の実施において重要である。適当な菌株は十分な濃度、及び十分な期間、この培養培地中における金属イオンの添加を許容し、細胞の生存性、及び代謝を維持する一方、金属誘導遺伝子の最大限の発現をもたらすものである。好ましくは、該菌株の生育速度は少なくとも７５０ｍＭの硫酸銅、最も好ましくは少なくとも１ｍＭの硫酸銅の添加後少なくとも約１６時間、実質的に影響されるべきでない。加えて、該菌株は十分に生育し、かつヒスチジン、ロイシン及びウラシルのような通常の栄養に関する栄養要求性であって、例えばＨＩＳ３、ＬＥＵ２かつＵＲＡ３を遺伝子挿入のマーカーとして使用することが可能なものであるべきである。適当な酵母菌株はＣＴＹ１４５に限定されるものではないが、ＣＴＹ１４５（ＡＴＣＣ第７４４６６）及びＳ２８８Ｃ（ＡＴＣＣ第２６１０８）である。
【００２０】
いくつかの実施態様において、本発明の発明抑制菌株は、さらに前記リプレッサ遺伝子と同様に、金属イオン応答性調整エレメントのコントロール下で発現する、ユビキチン減成経路を介して減成するためのユビキチン含有ポリペプチドを標的とするタンパク質をコードする遺伝子を含む。これらの実施態様において、対象となる遺伝子は融合タンパク質として発現され、そのアミノ末端においてユビキチン減成経路で標的となる該ポリペプチド配列を含む付加的なアミノ酸を含んでいる。このような様式において、また該培地に対する金属イオンの添加は、該ユビキチン経路によって対象のタンパク質の減成が刺激され、これにより細胞から該タンパク質が涸渇する。しかし理解されるであるように、対象のいくつかのタンパク質はユビキチン標的可能融合タンパク質として機能的形態で出現されない。さらにユビキチン経路遺伝子の過剰発現は多面発現性、及び潜在的に有害な効果を発揮する。従って、また本発明はユビキチン経路タンパク質を過剰発現することなく、かつ対象の遺伝子が融合タンパク質として発現されない抑制菌株を含む。
【００２１】
本発明の実施において、ＣＵＰ１（メタロチオネイン）プロモータの配列スパンニングヌクレオチド−１０５から−１４８として同定されている、ＡＣＥ１タンパク質に関連する結合部位を含むＤＮＡ配列、これに限定されるものではないが、を含む全ての金属イオン応答性転写コントロールエレメントを使用することができる（Ｈｕｉｔｂｒｅｇｔｓｅ らの論文、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ＡｃａｄＳｃｉ． ＵＳＡ ８６：６５， １９８９）。転写開始部位に関連し直接的な、又は逆向き方向で金属イオン応答性エレメントを単独で、又タンデムリピートで使用することができ、かつ例えばＨＩＳ３プロモータのような全ての互換性プロモータと組み合わせて用いることができる。これらのエレメントと関連して、全ての適切な金属イオンを使用し発現を刺激することができ、この中には限定されるものではないがＡｇ，  Ｃｕ，  Ｃｄ，  Ｎｉ，  Ｚｎ及びＦｅイオンが含まれる。
【００２２】
本発明で用いる適当なリプレッサタンパク質には、制限されるものではないが、ＲＯＸ１、低酸素遺伝子のヘム誘導体リプレッサがある（ジンバンク  アクセス番号第Ｘ６０４５８）（Ｄｅｃｋｅｒｔ らの論文、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３９：１１４９，１９９５）。ＬｅｘＡ−ＣＹＣ８融合タンパク質、及びＬｅｘＡ−ＴＵＰ１融合タンパク質（Ｒｅｄｄ らの論文、Ｃｅｌｌ７８：７０９， １９９２）。理解されることであるが、対象となる遺伝子の上流に配置されるプロモータ配列の選択は、使用される具体的なリプレッサによって定まる。例えば、ＲＯＸ１がリプレッサである場合、対象となる遺伝子のプロモータ関連発現は、例えばＡＮＢ１，ＨＥＭ１３，ＥＲＧ１１，ＯＬＥ１遺伝子から誘導されるものである。
【００２３】
これらの遺伝子の配列は、下記ジンバンク  アクセス番号のもとで開示されている：第Ｍ２３４４０（ＡＮＢ１）；＃Ｓ８１５９２ （ＨＥＭ１３）； ＃Ｕ１０５５５， Ｕ０００９３ （ＥＲＧ１１）； 及び ４Ｕ４２６９８，＃Ｊ０５６７６ （ＯＬＥ１）。該リプレッサが細菌のＬｅｘＡドメインを含む場合、対象となる遺伝子の発現関連プロモータは、ＬｅｘＡオペレータから誘導された配列を含み得る。該ＬｅｘＡオペレータの配列は、
５’−ＴＡＣＴＧＡＴＧＴＡＣＡＴＡＣＡＧＴＡ−３’（Ｔｚａｍａｒｉａｓらの論文、Ｎａｔｕｒｅ ３６９：７５８，１９９４） （配列番号：１）；であり、また下記配列を含む合成ＬｅｘＡオペレータを採用することができる：
５’−ＴＣＧＡＧＴＡＣＴＧＴＡＴＧＴＡＣＡＴＡＣＡＧＴＡＣＣＡＴＧＡＣＡＴＡＣＡＴＧＴＡＴＧＴＣＡＴＧＡＧＣＴ−３’ （米国特許出願第４，８３ ３，０８０号） （配列番号：２）。
【００２４】
不活性化され本発明の酵母菌株を形成することができる金属イオン代謝における遺伝子には、制限されるものではないがＳＬＦ１があり、これは銅のバイオミネラリゼーションに含まれるものである。
（ジンバンク  アクセス番号Ｕ３０３７５） （Ｙｕらの論文、 Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １６：２４６４， １９９６）。ＳＬＦ１の場合、該遺伝子の不活性化は生育培地からの銅の涸渇を遅くし、かつそれにより添加された銅イオンに対するリプレッサコード遺伝子の転写応答を強化する。該結果は、遺伝子発現の恒常的銅調節を維持することができる期間を増加させる。これに代わり、例えばＣＴＲ１（金属イオントランスポータ）のようなタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現させ、添加された金属イオンに対する転写機構の感受性を増加することができる（Ｄａｎｃｉｓらの論文、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２６９ ：２５６６０， １９９４）。
【００２５】
ユビキチン経路タンパク質が金属イオンコントロールの基で発現される実施態様において、全てのユビキチン経路タンパク質は対象となる適切なアミノ酸末端タグ付与タンパク質の減成を刺激するように発現し得る。一の実施態様において、金属イオン応答性エレメントにリンクするユビキチン経路タンパク質はＵＢＲ１であり、かつ該アミノ末端タグは、アミノ末端からカルボキシル末端方向に、ユビキチン、及びｌａｃリプレッサタンパク質（ＬａｃＩ）の３１アミノ酸セグメントを含むハイブリット配列であり、一以上のエピプトープタグを付加的に含み得る。（Ｐａｒｋ らの論文 Ｐｒｏｃ． ＮａｔＩ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ ８９：１２４９， １９９２）。この実施態様において、該ハイブリットタンパク質（そのカルボキシル末端位置に対象となるタンパク質を含む）は、酵母酵素によって急速に脱ユビキニネート化され、かつ得られるハイブリットタンパク質（その末端においてアルギニン残基を含む）は、該ＵＢＲ１（金属イオンの存在下）により再度ユビキニネート化されかつ減成の標的となる。
【００２６】
Ｍｏｑｔａｄｅｒｉ らの論文（Ｎａｔｕｒｅ ３８３：１８８， １９９６）は、ＡＣＥ１プロモータの管理下におかれているＲＯＸ１及びＵＢＲ１遺伝子の統合されたコピーを担持するハプロイド酵母菌株（ＺＭＹ６０）を開示する。この遺伝子的バックグランドにおいて、対象となるユビキチン、アルギニン、ｌａｃＩ、ヘマグルチニンエピトープ、及び対象となる全長遺伝子のインフレーム融合の発現を誘導するＡＮＢ１プロモータを含むプラスミドを導入する。該培地に対する５００ｍＭ硫酸銅（ＣｕＳＯ４）の添加は、ＲＯＸ１による対象となる遺伝子の転写の抑制、及びユビキチンタグタンパク質の急速減成をもたらした。しかしながら、この菌株は、相対的に遺伝的に不安定であって、銅不感性表現型に対し、頻繁に復帰変異をもたらし、２５０ｍＭを超える濃度において銅イオンの毒性効果に高度に感受性であり、かつ相対的に短い時間で銅イオンに対し応答する（部分的に、バイオミネラリゼーションによる培地からの銅イオンの涸渇に起因する）。対象的に、本発明の酵母菌株は、１ｍＭを超える銅イオン濃度に対し長期間許容的である。さらに本発明の酵母菌株はさらに安定的な表現型を示す。その理由は該酵母ゲノムに工学的処置を施した遺伝子の統合を行うダブルクロスオーバ事象を用いる方法を採用することによる（例えば、下記実施例３及び４を参照）。
【００２７】
一群の実施態様において、本発明はＣＴＹ１４５をベースとする酵母菌株：この菌株において（ｉ）本来のＲＯＸ１遺伝子プロモータはハイブリットＨＩＳ３プロモータ−ＡＣＥ１結合部位を含むプロモータで置き換えられており；（ｉｉ）本来のＳＬＦ１遺伝子は除去されており；かつ（ｉｉｉ）対象となる遺伝子はＡＮＢ１プロモータによってコントロールされている。特長（ｉ）−（ｉｉ）は好ましくはダブルクロスオーバ戦略を用いて達成する。他の実施態様において、該ＣＴＹ１４５菌株は前記（ｉ）及び（ｉｉ）において改良されており、かつそれに加えて（ｉｉ）本来のＵＢＲ１遺伝子プロモータはハイブリットＨＩＳ３プロモータ−ＡＣＥ１結合部位を含むプロモータによって置換されており；かつ（ｉＶ）ユビキチン、ＬａｃＩフラグメント、及びエピトープタグを含むハイブリットポリペプチドをコードする配列が続く、ＡＮＢ１プロモータを含む配列が対象の遺伝子のタンパク質コード配列の５’末端に融合されている。
【００２８】
他の一群の実施態様において、本発明はＣＴＹ１４５をベースとする酵母菌株を提供し：該菌株において（ｉ）ハイブリットＨＩＳ３プロモータ−ＡＣＥ１結合部位がＣＹＣ８−ＬｘｅＡ融合タンパク質をコードする配列の上流に含む遺伝子が導入され；（ｉｉ）本来のＳＬＥ１遺伝子が削除され；かつ（ｉｉｉ）対象となる遺伝子がＬｘｅＡオペレータを含むプロモータによってコントロールされている。特長（ｉ）−（ｉｉｉ）は好ましくはダブルクロスオーバ戦略によって達成される。他の実施態様において該ＣＰＹ１４５菌株は前記の（ｉ）、及び（ｉｉ）において改良されており、かつこれに加えて（ｉｉｉ）本来のＵＢＲ１遺伝子プロモータはハイブリットＨＩＳ３プロモータ−ＡＣＥ１結合部位を含むプロモータと置換されており；かつ（ｉＶ）ユビキチン、ＬａｃＩフラグメント及びエピトープタグを含むハイブリットポリペプチドをコードする配列が後に続き、ＬｅｘＡオペレータ含有プロモータを含む配列が対象の遺伝子のタンパク質コード配列の５’末端に結合している。
【００２９】
他の一群の実施態様において、本発明は、ＣＴＹ１４５をベースとする酵母菌株を提供し、該菌株において（ｉ）対象となる遺伝子がＳｃ３４５１プロモータによってコントロールされ、かつ（ｉｉ）本来のＳＬＦ１遺伝子が削除されている。該Ｓｃ３４５１プロモータはＡＣＥ１結合部位：
（ ５’ − ＴＡＡＧＴＣＴＴＴＴＴＴＧＣＴＧＧＡＡＣＧＧＴＴＧＡＧＣＧＧＡＡＡＡＧＡＣＧＣＡＴＣ−３’） （配列番号：３） をクローニングすることにより構成されており、プラスミドＹＩｐ５５−Ｓｃ３３７０におけるＥｃｏＲＩ部位でＴＡＴＡＡ配列の上流にある（Ｓｔｒｕｈｌ らの論文、 Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ７：１０４， １９８７）。
【００３０】
方法
本発明の実施において、分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡ技術における多くの従来技術を用いることができる。このような技術は周知であり、かつ例えば下記文献に十分に説明されている：
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅｓ １， １１， ａｎｄ １１１， １９９７ （Ｆ．Ｍ．． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｄ．）；
Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ． ａｌ．， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；
ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ １１， １９８５ （Ｄ．Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．）； Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， １９８４， （Ｍ．Ｌ． Ｇａｉｔ ｅｄ．）；
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， １９８５， （Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ）；
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ， １９８４ （Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．）；
Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ， １９８６ （Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ ｅｄ．）；
Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄＥｎｚｙｍｅｓ， １９８６ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）；
Ｐｅｒｂａｌ， １９８４， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；
ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）； 及び
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ． １５４ ａｎｄ Ｖｏｌ． １５５ （Ｗｕ ａｎｄ Ｇｒｏｓｓｍａｎ， ａｎｄ Ｗｕ， ｅｄｓ．， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）．
本発明の配列を含む核酸（通常ＤＮＡ）のベクターへの挿入は、該ＤＮＡ及びベクターの双方の末端が互換性制限部位を有する場合、容易に行うことができる。これができない場合、制限エンドヌクレアーゼ切断によって生じる一本鎖ＤＮＡオーバーハングを消化することにより該ＤＮＡ、及び／又はベクターの末端を改良して、平滑末端を作成し、又は適当なＤＮＡポリメラーゼを使用して該一本鎖末端を満たすことにより同じ結果を得る必要がある。
【００３１】
それに代わり、所望の全ての部位を、例えばヌクレオチド配列（リンカー）を該末端に結索することにより作成することができる。このようなリンカーには所望の制限部位を規定する特定のオリゴヌクレオチド配列が含まれる。また、制限部位はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用により作成することができる（参照；ＳＡＩＫＩらの論文  １９８８年，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８９）。また、該切断ベクター、及びＤＮＡフラグメントを、所望の場合はホモポリマーテーリングにより改良することができる。
【００３２】
該核酸は細胞から直接分離することができる。またそれに代わりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）を使用し、化学的に合成した鎖、又はゲノム材料をテンプレートとして使用し、本発明の核酸を調製することができる。ＰＣＲに用いるプライマーは本明細書で提供される配列情報を用いて合成することができ、さらに所望であれば、適当な新しい制限部位を導入するよう設計し、組換え発現を行うために所定のベクターへの組み込みを促進することができる。
【００３３】
酵母の形質転換、酵母に遺伝子を組み込む方法、及び酵母の菌株を選択する方法が下記文献に十分に開示されている；例えば、
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｓ． １ 及び ２
Ａｕｓｕｂｅｌらの論文、ｅｄｓ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９７）．
多重破壊酵母菌株の調製を行うＵＲＡ３の使用は、Ａｌａｎｉらの論文（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１６：５４１， （１９８７））に開示されている。
【００３４】
Ｓ．セレビシアの形質転換を行う好ましい方法は次の通りである。酵母菌株を約３０℃でＹＰＤ（酵母抽出物、ペクトン、エキストラム）培地において一晩培養する。得られた培養物を約２００ｍｌのＹＰＤ培地中においてＡ６００ が約０．２となるように希釈し、かつ該Ａ６００が約０．８になるまで約３０℃で培養する。該細胞を遠心分離でペレット化し、かつ約２０ｍｌの滅菌水で洗浄する。次いで該ペレット化された酵母細胞を約１０ｍｌのＴＥＬ緩衝液（１０ｍＭ  トリスｐＨ７．５、
１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１Ｍ  酢酸リチウム）（ｐＨ７．５））に再懸濁をする。
該細胞を遠心分離によりペレット化し、かつ再び約２ｍｌのＴＥＬで再懸濁する。十分にせん断された単一鎖ＤＮＡ、及びプラスミドＤＮＡ約１００ｍｇをエッペンルドルフチューブに加える。このチューブに対し形質転換受容性酵母細胞約１００ｍｌを加え、次いで混合する。この細胞／ＤＮＡ混合物に、ＴＥＬ中４０％ＰＥＧ−３３５０を約０．８ｍｌを加え、次いで全体を混合する。この混合物を３０℃で約３０分間培養し、次いで４２℃で２０分間熱ショックを与える。該混合物を遠心分離し、上清を除去し、かつ該細胞をペレット化する。該酵母細胞ペレットを約１ｍｌのＴＥで洗浄し、遠心分離により再度ペレット化し、かつ次いで選択培地上で培養する。
【００３５】
ＰＣＲを行うためにＳ．セレビシアからゲノムＤＮＡを抽出する好ましい方法は次の通りである。３０℃で、ＹＰＤ中で一晩培養した酵母菌株培養生育物５ｍｌを遠心分離し、かつ１ｍｌのトリスｐＨ７．５／１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液中で一度洗浄する。該細胞を遠心分離により再度ペレット化し、抽出緩衝液０．２ｍｌ中に再懸濁する。該緩衝液は２％トリトンＸ１００、１％ＳＤＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリスｐＨ７．５、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡに加えフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール０．２ｍｌを含む。酸洗浄ガラスビース約０．３ｇを加える。この混合物を約３０分間渦巻き撹拌する（すなわち勢いよくかき回す）。ついでＴＥ緩衝液０．２ｍｌを加える。該混合物を遠心分離し、かつ水相を除去する。該ＤＮＡを２倍容のエタノールで水相から沈殿させる。該沈殿物をマイクロ遠心分離でペレット化し、ＴＥ５０ｍｌにＲＮアーゼＡ酵素を５ｍｇ／ｍｌを加えたものに再懸濁する。該得られた配合物を所望の濃度に希釈し、又はＰＣＲ反応に直接使用する。
【００３６】
組み換え酵母菌株に対する銅イオンの効果をアッセイするために、野生型、及び組み換え菌株をＣＳＭ培地５ｍｌ中で、３０℃で１８〜２０時間ローラドラム培養装置上で生育させる。培養物を１８〜２０時間、ＣｕＳＯ４（１０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２５０ｍＭ、１ｍＭ、及び２ｍＭ）の様々な濃度で、又はそれを加えず、ＣＳＭ培地５ｍｌ中においてＡ６００（６００ｎｍにおける光吸収が約０．０２になるように希釈する。様々なサンプルのＡ６００を読みとり、かつ記録する
酵母菌株を銅の存在、及び不存在下において時間経過により試験し、標的遺伝子産物の減少が滅菌作用（すなわち生育の阻害）又は殺菌作用（すなわち酵母を殺すこと）であるか否かを特定する。培養をＣＳＭ培地（５ｍｌ）において単一酵母コロニーから開始し、３０℃で１８〜２０時間ローラドラムにおいて生育させる。培養体を新鮮な培地中で希釈し、Ａ６００が約０．２５になるよう最終容量１０ｍｌに希釈し、かつ３０℃で約１時間生育させる。該培養体を二つに分割しその一方に１ｍＭ  ＣｕＳＯ４を加える。サンプル３００ｍｌを各培養分割から時間開始点として次へ取る。他の同様のサンプルをＣｕＳＯ４添加後１、３、５、７及び２４時間の時点で採取する。それに代え該培養体をＡ６００が約０．１になるように希釈し、かつ約３時間培養し１ｍＭ  ＣｕＳＯ４を加えた後、再びＡ６００が約０．０２になる、３時間生育させる。酵母培養体の吸光度を測定するために、通常各サンプル２００ｕｌ（マイクロリットル）を取り９６ウェル平底ポリエチレンプレートに加え、次いでプレート読み取り機に差し込み、そこで５９５ｎｍで吸光度を測定する。これらの読みとり結果から生育曲線を作成することができる。
【００３７】
ＣＦＳ数の分析を行うためＹＰＤ培地上で細胞を培養する場合、通常各サンプル１００ｍｌを滅菌水９００ｍｌで連続的に希釈する。銅イオンなしで培養した酵母、及び銅イオンの存在下で培養した野生型酵母のプレーティング希釈は、１０−３から１０−６である。銅イオンの存在下で培養した組み換え酵母に関しては、０、１，３及び７時間の時点でプレーティング希釈の範囲は１０−２から１０−５である。銅イオンの存在下で培養した酵母に関し、全ての２４時間経過時点におけるプレーティング希釈は希釈なしから１０−２の範囲である。
【００３８】
通常、各希釈液の希釈液を約１００マイクロリッターをＹＰＤ寒天プレート上に播き、３０℃で４８時間培養する。コロニー数を数え、かつ記録する。計算を行い、コロニー数をもとの培養培地のＣＦＵ／ｍｌに換算する。
応用
本発明の酵母菌株に次の用途を見る。
（ｉ）対象となる具体的遺伝子が抗菌性薬剤の発見を行うための潜在的標的として役立つことができるか否かを迅速、かつ効果的に測定すること
本発明は抗菌性薬剤の発見に役立つ標的遺伝子を特定する方法を含む。潜在的標的の同定は特定の遺伝子産物の酵母細胞からの迅速な減少（先に記載した抑制菌株として使用する）は、細胞の生育を阻害、又は細胞死をもたらす。最も有効、かつ好ましい抗菌性薬剤はその効果が迅速な殺菌であることから、その減少が細胞死をもたらす遺伝子産物が菌の生育の候補インヒビター、すなわち抗菌剤に関し好ましい潜在的な標的である。該遺伝子産物の量を減少させる程度を添加された金属の濃度によってコントロールできることから、さらに細胞死を引き起こすのに必要な遺伝子産物の減少の程度をさらに決定することが可能である。
【００３９】
様々な方法を用いて遺伝子の産物がＳ．セレビシアの生存に必須であるか否か、従って感染の確立、又は維持に必須であるか否かを決定することができる。遺伝子の必須の特性の同定はその機能に関連する付加的な情報を提供し、かつ該産物は抗菌性薬剤、又は物質に関し対象となる標的を構成する遺伝子の選択を可能にする。これらの方法の例が下記に簡潔に要約されている。これらの方法は下記の論文に記載されており、そのそれぞれは引用により明細書の内容として取り込まれている。
【００４０】
Ｇｕｔｈｒｉｅ Ｃ． ａｎｄ Ｆｉｎｋ Ｇ．Ｒ． ｅｄｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １９４，１９９ｌ，
Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ． ；
Ｒｏｓｅ Ａ．Ｈ．， Ａ．Ｅ． Ｗｈｅａｌｓ ａｎｄ Ｊ．Ｓ． Ｈａｒｒｉｓｏｎ ｅｄｓ． Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔｓ， Ｖｏｌ． ６， １９９５，Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．
Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ． ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ． Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ； １９９５， Ｗｉｌｅｙ．Ｂｒｏｗｎ Ａ．Ｊ．Ｐ． ａｎｄ Ｔｕｉｔｅ Ｍ．Ｆ． （ｅｄｓ） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２６，
１９９８， Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ・Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．
状況に依存して、所望の結果に依存し、記載されている方法の一つを用いることができる。特に遺伝子の直接的不活性化、又は該遺伝子の一時的不活性化の何れかの方法によって進めることが可能である。酵母Ｓ．セレビシアにおいて使用される方法は該酵母の染色体におけるその部位において、対象となる遺伝子の不活性化を含んでいる。野生型アレルを遺伝子マーカ（例えば栄養要求性、又は抵抗性マーカに関連する遺伝子）の遺伝子マーカの挿入により不活性化する。一般にこの挿入は公知の方法によって調製される直線削除カセットの補助を伴う遺伝子転換の方法によって達成することができる。該方法は下記文献に記載されている。
【００４１】
Ｇｕｔｈｒｉｅ Ｃ． ａｎｄ Ｆｉｎｋ Ｇ．Ｒ． ｅｄｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ｏｒ ｉｎ Ｇｕｌｔｎｅｒ ｅｔａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９６， ２４： ２５１９−２５２４
本発明の方法は殺標的遺伝子が先に記載したように銅の調節下にある場合、Ｓ．セレビシア菌株の単離に関連するものである。本発明の好ましい銅調節菌株は生育、及び／又は生存に要求される銅調節必須タンパク質を伴うものである。本発明の方法を実施する場合に、特定遺伝子の発現を銅によって厳格に調節することができるＳ．セレビシア菌株を先に記載したように調製し以下に記載する方法において使用する。
【００４２】
（ｉｉ）急速な減少が公知の抗菌製薬剤、及び候補抗菌性化合物に対する感受性を増加させる標的遺伝子産物の同定
本発明はそれが減少する場合に、公知の抗菌性薬剤、又はさらに重要な様々なスクリーニング方法を介して分離された候補抗菌性化合物に対する感受性の増加をもたらす標的遺伝子産物を同定する方法を含む。公知の抗菌性薬剤の例を上げると、アンフォテレシンＢ、及びミスタチンのようなポリエンマクロライド化合物；フルシトシン；カトコナゾール、フルコナーゾール、イトラマナゾール、及び他のトリアゾールなどがある。しかしながら、多くの必須の標的を一つで菌を攻撃する新規な抗菌性化合物を単離することは大いに有益であろう。
【００４３】
薬剤標的の遺伝子量を減少させることにより該薬剤に対する細胞の感受性が増加することが示されている（Ｇｉａｅｖｅｒらの論文、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２１：（３） ２７８−２８３， １９９９）。 Ｃｉａｅｖｅｒらの論文は、Ｓ．セレビシア（削除された２種の遺伝子コピーの一つ）の異型接合ディプロイド菌株を使用するこの感受性変化を示している。類似のアプローチが本発明の処理された銅菌株を用いて行うことができる。生育培地における濃度増加により問題となる遺伝子産物の活性を阻害する化合物に対する感受性の増加をもたらす遺伝子発現の低下が誘導される。結果として、銅、及び特定の化合物間の共同作用がある。このような共同作用を示さない化合物は対象の遺伝子にヒットする事はありそうにない。
【００４４】
本発明に従い銅制御遺伝子が必須のターゲットである事が示される場合に、本発明の処理された遺伝子菌株を使用してこのような抗菌性薬剤、及び候補抗菌性化合物の作用機序を評価し、及び特性を見いだすことができる。Ｃｕ調節菌株の生育培地中における銅イオン濃度の変更により対象となる酵母遺伝子産物の発現の濃度依存性の調節がもたらされる。特定化合物に対するこれら菌株の感受性の変化は該遺伝子が公知の抗菌性薬剤、又は対象の化合物の作用に関連していることを示唆している。これと比較して、感受性の変化を示さない化合物は該調節要素、すなわち銅制御遺伝子産物との相互作用を介する抗菌性効果を発揮しそうもない。従って、本発明の処理された酵母菌株は、化合物と相互に作用する該活性、及び遺伝子産物の特性を示すために、抗菌性化合物をスクリーニングする手段を提供する。また、この現象は公知の薬剤、及び新たに発見された抗菌性化合物の間の潜在的共同作用の確立、及び同定を提供する。
【００４５】
一の実施態様において、このような薬剤感受性を以下の非制限的方法に従い、本発明の銅制御菌株を利用して分析する。単一９６ウェルアッセイプレートにおいて、硫酸銅の連続的な希釈を右から左方向に行う。同じプレートにおいて、化合物の連続的な希釈を対向軸に沿って形成し、図１２に示すような最終的な化合物、及び銅の濃度を提供する。各ウェルにおいて１０３細胞／ｍｌの植え付けを行う。３７℃で４８時間培養した後、目視で生育を評価する。各プレートで予測される生育のパターンを図１３ａ−ｃに示す。該銅濃度が増加するに伴い、発現された標的のレベルが低下する。その結果、生育の阻害が低化合物濃度で生じる（図１３、パネルａ）。該化合物が該標的を阻害しない場合銅の存在下における生育の無効果が示される（図１３、パネルｂ）。野生型菌株をコントロールとして使用し該銅濃度が該細胞を該化合物に対してより感受性にしないことが示される（図１３、パネルｃ）。
【００４６】
（ｉｉｉ）Ｃ．アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）およびＡ．フミガスツ（ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）のような病原性菌類を含む他の生物から機能的相補性ＤＮＡフラグメント、又は機能的相補性遺伝子を迅速にクローニングすること。
本発明は、他の生物、特に病原性菌類、変異ＤＮＡ及びＤＮＡフラグメントから、相補的ＤＮＡを迅速にクローニングする方法を含む。本発明に従い、本発明の処理された酵母細胞を使用して、金属イオン制御タンパク質に相補する所定の遺伝子、変異ＤＮＡ、又はＤＮＡフラグメントの能力を評価し、かつ特徴づける。先に記載したように、本発明の該処理された酵母細胞は、このような金属イオン制御菌株の生育培地中における金属イオン濃度の変化が、該細胞の生育、及び／又は細胞の生存に必須の特定酵母遺伝子産物の消耗による細胞生育の低下、及び／又は細胞死をもたらす場合に、条件的な変異菌株の作成を提供する。他の種からのｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡライブラリーによるこれらの条件的変異株の形質転換は、涸渇したサッカロミセス遺伝子産物に対する機能的ホモログの選択、及び同定を可能にする。
【００４７】
また、この種の分析を用い、所定のタンパク質のいずれかの領域が機能に関し、必須であるかを試験することができる。これは、補完性に関し機能的に必要とされる領域を決定するために、対象となる遺伝子において公知の破壊を伴う変異体から分離された破壊された遺伝子、又はＤＮＡのフラグメントを有する条件的Ｃｕ制御菌株の形質転換により行うことができる。
条件的変異体を用いる相補性分析は酵母遺伝学の分野において周知である。事実、相補性は多くの遺伝子に関連して示されている。次のＳ．セレビシアにおける遺伝子の欠陥は、示されている種からのホモログによって補完されるものであることが公知である。
ＲＨＯ１   Ｃ．アルビカンス  ヒト、ショウジョウバエ
ＵＲＡ３   Ｃ．アルビカンス、Ｓ．ポムベ、Ｃ．ウチリス、マウス
ＣＤＣ６８  Ｋ．ラクチス
ＲＰＬ３５  Ｓ．ホムベ
ＲＰＢ６   Ｓ．ポムベ、ヒト、ショウジョウバエ
ＳＰＴ１５  Ｃ．アルビカンス、Ｓ．ポムベ、Ａ．ニヌランス
ＣＭＤ１  Ｓ．ポムベ、Ｋ．ラクチス、セノプス  ラエシス、ニワトリ
従って、一実施態様において、本発明は他の生物から機能的相補性遺伝子を迅速にクローニングする方法に関するものである。相補性分析はヒト、マウス、他の哺乳類、ショウジョウバエ；他の菌類を含む他の生物から分離された遺伝子、又はＤＮＡフラグメントを使用して行うことができる。機能的相補性遺伝子に関して分析されるべき他の菌類の例を挙げると、カンジダ  アルビカンス、カンジダ  ステラトイデア、カンジダ  トロピカリス、カンジダ  パラプシロシス、カンジダ  クルセイ、カンジダ  シュードトロピカリス、カンジダ  クイラモンディイ、カンジダ  グラブラタ、カンジダ  ルシアニアエ、又はカンジダ  ルゴサ、又はアスペルギルス、又はクリプトコッカス  タイプの菌類、及び特に、例えばアスペルギルス  フミガツス、コシデイオイデス  イミチス、クリクプトコッカス  ネオホルマンス、ヒストプラスマ  カプスラツム、ブラストミセス  デルマチチディス、パラコシディオイデス  ブラシリエンス、及びスポロスリクス  シェンクキル、又はフィコミセテス、又はユミセテスのクラスの菌類、特にバシディオミセテス、アスコミセテス、メヒアスコミセタレス（酵母）のサブクラス、及びプレクタスカレス、ギムナスカレス（皮膚、及び髪の菌類）又はヒポミセテスのクラス、特にトニデイオスポラレス、及びタロスポラレスのサブクラス、及び次の種の生物：ムコル、リゾプス、コクシディオイデス、パラコクシディオイデス（ブラストミセス、ブラシリエンシス）、エンドミセス（ブラストミセス）、アスペルギルス、メニシリウム（スコプラリオプシス）、トリコフィトン（クテノミセス）、エピデモフトム、ミクロスポロン、ピエドロイア、ホルモデンドロン、フィアロフォラ、スポロトリコン、クリプトコッカス、カンデダ、ジェオトリクム、トリコスポロン、又はトロプスロシスである。
【００４８】
相補性の方法は当該技術分野で周知である。種における必須の遺伝子とすると、相同性であり、又は他の種の同じ機能を有する遺伝子を同定することができることが知られている。当該技術分野における当業者に公知の方法を用いて、菌類の他の種において研究された遺伝子（いわゆる、「オルソロゴウス」遺伝子）、又は研究された遺伝子と同じ機能を有する他の生物の遺伝子に対する相同性を確認することができる。これらの方法の例が下記論文に記載されており、これらの内容は引用により本明細書の内容とする。
【００４９】
− Ｓａｍｂｒｏｏｋらの論文 １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．
− Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ． らの編集 Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ， １９９５， Ｗｉｌｅｙ．
−Ｇｕｔｈｒｉｅ Ｃ． ａｎｄ Ｆｉｎｋ Ｇ．Ｒ．編集． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ Ｖｏｌ． １９４，１９９１，
’Ｇｕｉｄｅｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ’， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．
このような方法には、病原性菌類のゲノム又はｃＤＮＡライブラリーに対する、相同性又は遺伝子相補性に関するスクリーニング、対象のヌクレオチド配列に対する相同性の特性により選択された特定のプライマーを用いる、このようなライブラリーＤＮＡのＰＣＲ増幅が含まれる。
【００５０】
本発明において、サッカロミセス  セレビシアの金属イオン制御条件的変異体を使用し、特定遺伝子、遺伝子フラグメント、又はＤＮＡが相補的であるか、かつ従って容易に選択し、かつクローン化できるか否か迅速に決定する。本発明の菌株を使用する場合、先に記載したように、相同性分析を実施する必要はない。本発明の菌株を使用することにより、遺伝子、及びＤＮＡフラグメントを、それらが必須の遺伝子の相補性を提供するか否か測定することにより、迅速にスクリーニングすることができる。
【００５１】
ゲノムＤＮＡ、又はｃＤＮＡライブラリーを公知の方法により調製することができ、該得られたポリヌクレオチドフラグメントを細菌Ｅ．コリ、及びＳ．セレビシアの双方において使用することができる、例えば、ｐＲＳ４２３、又はその誘導体のようなベクターである、発現ベクターに統合することができる。
一の実施態様において、同定された必須遺伝子が金属イオン制御下におかれている本発明の処理されたＳ．セレビシア菌株を、研究されている生物に対応するＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーの代表的なサンプルにより形質転換する。またこのような方法は所定のＤＮＡフラグメント、又は変異体ＤＮＡによる相補性の分析に使用することができる。前記のように、本発明の酵母菌株を金属イオンの存在下で培養する場合、該プロモータを抑制し、生存することができる唯一の酵母、該制御されたＳ．セレビシア必須遺伝子と機能的に同等、又は相補的な配列を含む組換えベクターを担持するものである。
【００５２】
相補性の決定に続き、該相補性遺伝子、又はＤＮＡ配列を、公知の方法により該組換えベクターを分離し、かつ公知の方法によりその配列を決定することにより、更に特徴を明らかにし、かつ配列を決定することができる。
この種の研究は多くの種について実施することができ、必須の遺伝子に対し配列において機能的に同一、又は相同性である遺伝子を、他の菌類、に特にヒトに対して病原性である様々な菌類から分離することができる。このような菌類はジコニセテス、バシジオミセテス、アスコミセテス、及びデウテロミセテスのクラスに属する。さらに具体的にいうと、該菌類はカンジダ  ｓｓｐのサブクラス、特にカンジダ  アルビカンス、カンジダ  グラブラタ、カンジダ  トロピカリス、カンジダ  パラプシロシス、及びカンジダ  カルセイに属する。また、該菌類はサブクラス、アスペルギルス  フミガツス、コクシジオイデス  イムニチス、クリプトコッカス  ネオホルマンス、ヒストプラスマ  カプスラツム、ブラストミセス  デルマチジス、パラコクシジオイデス  ブラシリエンシス、及びスプロロスリクス  シェンキイに属する。
【００５３】
（ｉｖ）金属イオンによる制御が陽性、又は陰性であるそれぞれ異なる遺伝子を含む菌株のライブラリーの開発
本発明は本発明の金属イオン制御菌株のライブラリーの開発を含む。このようなライブラリーは、その活性機序が未知の抗菌性薬剤に関する標的を同定するのに有用である。例えば、特定遺伝子の発現の刺激、又は抑制が、特定薬剤へのそれぞれ感受性を低下、及び増加させる場合、次いで該遺伝子が該薬剤のインビボ活性の媒介に関連するようである。細胞生理学において金属イオンの存在、又は不存在により遺伝子産物の調節の効果を評価することにより、該遺伝子産物の生理学的機序を理解することができる。さらにある種の遺伝子産物の涸渇した細胞に伴う表現型の比較を行うことにより化合物がそのような遺伝子産物を阻害する事における同様の表現型を得ることができるであろう。全Ｓ．セレビシアゲノムはすでに配列が決定されており、同定されたオープンリードフレームの全てが公開されているので、大きな菌株ライブラリーを容易に作り出すことができる（Ｇｏｆｆｅａｕ らの論文．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：５６３， １９９６； Ｇｏｆｆｅａｕ らの論文．， Ｎａｔｕｒｅ ３８７：５， １９９７）。これらのオープンリードフレームにコードされたタンパク質に対応する大部分は特徴が明らかにされている。（Ｃｏｓｔａｎｚｏ らの論文．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：７３， ２０００； Ｂａｌｌ らの論文．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：７７， ２０００； Ｍｅｗｅｓ らの論文．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：３７， ２０００）
（ｖ）抗菌性化合物を検出する、高処理量スクリーニング方法の開発
また本発明の処理された酵母細胞を使用し潜在的抗菌性化合物としての化合物を評価し、かつ特徴づける方法を含む。金属イオンの濃度の変更は、制御された酵母遺伝子産物の発現の投与量依存性調製をもたらす。特定の化合物に対するこれらの細胞の変化する感受性は、コントロールされた遺伝子産物が該化合物の活性を介在することに関連するようであり、方法阻害剤としての化合物の決定を導くことを示唆する。
【００５４】
例えば、このような化合物は天然産物発酵ライブラリー、（植物、及び微生物を含む）、組み合わせライブラリー、化合物ファイル、及び合成化合物ライブラリーにおいて見いだされ得る。例えば、合成化合物ライブラリーは、次の供給源から商業的に入手することができる：マイブリッジケミカルコーポレーション（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ，  Ｃｏｒｎｗａｌｌ， ＵＫ）、コムゲネックス（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ， ＮＪ）、バランドン  アソシエイツ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ， ＮＨ）、及びマイクロソース（Ｎｅｗ Ｍｉｌｆｏｒｄ， ＣＴ）である。稀化学ライブラリーはアルドリッチ  ケミカル  カンパニー  インコーポレーション（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， ＷＩ）から入手することができる。またそれらに代わり、細菌性、菌性、植物、及び動物抽出物の形態で天然化合物のライブラリーが例えば、パンラボラトリーズ（Ｂｏｔｈｅｌｌ， ＷＡ）、又はミコサーチ（ＮＣ）から入手可能であり、又は容易に生産可能である。これら加えて天然、及び合成されたライブラリー、及び化合物は従来の化学的、物理的、及び生化学的方法を介して容易に改質することができる。（Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅ らの論文，  Ｔｉｖｔｅｃｈ １４：６０，１９９６）。
【００５５】
その結果、本発明の更なる実施態様において、本発明の所定のサッカロミケス  セレビシアが、金属イオン調節殺標的を含むことを決定した後、該菌株を用いて菌類生育、及び／又は感染の候補阻害剤を分離することができる。複数の候補阻害剤化合物、すなわち候補抗菌性化合物をスクリーニングすることを含む本発明のスクリーニング方法を実施する場合、複数の候補抗菌性化合物を多重同時個別検出工程を用いて単一アッセイ、又は個別的にスクリーニングすることができる。先に記載したように候補抗菌性化合物に対する変化した感受性を測定するのに用いる方法は、複数の候補のスクリーニングを実施する際に使用することができる。
【００５６】
先に示したように、本明細書中で用いる「候補阻害剤」は、サッカロミセス  セレビシア、又は他の菌類の生育、及び生存を阻害する潜在性を有する全ての化合物である。本発明の方法は、本発明のサッカロミセス  セレビシア金属イオン制御菌株に対する一次スクリーニングにおける候補阻害剤化合物の同定に関するものである。
必須遺伝子が金属イオンのコントロール下にある場合に、候補阻害剤は本発明のサッカロミセス  セレビシア菌株の感受性を測定することによりスクリーニングする。本発明の方法に従い、複数の候補阻害剤を、本発明の所定の菌株を用いてスクリーニングし、該細胞が低濃度の金属イオン中で殺されるか、又は生育速度が低下するか否かを測定する。低濃度の金属イオンにより殺され、又は生育が低下する場合、次いで該スクリーニングされた化合物を潜在的抗菌剤と特徴づける。
【００５７】
候補阻害剤の調製：
試験される貯蔵溶液、及び濃縮物は、化合物によって変化するであろう。本発明の非限定的実施態様において、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ Ｄ−８７７９）中に１２．８ｍｇ／ｍｌの貯蔵溶液を調製すべきである。これにより１２８ｕｇ／ｍｌ開始テスト濃度を含む１％ＤＭＳＯの調製が可能となる。貯蔵溶液は−２０℃で貯蔵すべきであり、かつ抗菌性試験のための希釈はそれぞれのアッセイ前に新鮮な状態で行うべきである。
【００５８】
＞４μｇ ／ｍｌのＭＩＣ値を有する活性が未知である化合物に関し、１２８ｕｇ ／ｍｌから０．１２５ｕｇ／ｍｌの濃度範囲で用いるべきである。アンホテリシンＢ（Ｓｉｇｍａ Ａ２４１１）及びイトラコナゾール（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ． ｃａｔ＃３０．２１１．４４）のようなさらに活性の高い化合物ではより低い範囲の濃度が要求される（１６ｕｇ／ｍｌ〜０．０１６ｕｇ／ｍｌ）。アンホテリシンＢ、及びイトラコナゾールの貯蔵溶液は、ＤＭＳＯ 中に１．６ｍｇ／ｍｌで調製すべきである。アンホテリシンＢは約８０％のアンホテリシンＢを含む粉末として販売されている。従って、貯蔵溶液はアンホテリシンＢ  １．６ｍｇ／ｍｌ  の１ｍｌ溶液を粉末２．０ｍｇとして調製すべきである。
【００５９】
コントロール化合物の貯蔵溶液（アンホテリシンＢ又はイトラコナゾール１．６ｍｇ／ｍｌ）を最初培地中において希釈し３２ｕｇ／ｍｌの濃度とし、一方試験化合物の溶液（通常１２．８ｍｇ／ｍｌ）を２５６ｕｇ／ｍｌに希釈する。これらコントロール、及び試験化合物の双方を１：５０の希釈で提供する。テスト化合物の貯蔵溶液が１２．８ｍｇ／ｍｌでない場合、適切な希釈となるよう計算しなくてはならない。下記に記載したようにこれらの初期希釈を用いて連続的な希釈を調製しなくてはならない。化合物に対して細胞を加える場合さらに２倍に希釈する。
【００６０】
天然産物抽出物は、初期培養容量を基準として、該抽出物の２００〜２０４，８００倍希釈の範囲で試験する。該抽出物は最初１００倍で希釈し、次いで下記に示すように連続的な希釈をする。
＊＊＊＊＊
対象の標的遺伝子と相互作用する化合物は対象となる菌株の生育を低下させるか、又は菌株を殺すのに必要な金属イオン濃度において効果を有する。このような化合物はさらに開発を考慮する。
（ｖｉ）薬剤処理細胞に関する表現型模写コントロール
また、本発明は特定の抗菌性薬剤によって産み出される表現型を決定する方法を含む。特定の遺伝子産物が涸渇した細胞と関連する表現型は、その標的としてのタンパク質を特異的に阻害する化合物によって処理された細胞の表現型に対し類似の表現型を産み出す。金属イオン制御細胞が特定の抗菌性薬剤で処理された細胞と同じ表現型を生ずる場合、該化合物が評価されるべき遺伝子産物と相互作用を介しその効果を生じさせていることを示唆する。事実、化合物処理菌株の表現型は該標的遺伝子の表現型と類似、又は同じである場合、このような化合物は標的遺伝子、又はタンパク質の不活性化と関連づけることができる。
【００６１】
減少した細胞の生存性、及び／又は生育と関連した表現型は、多くのカテゴリーに分けることができる。このようなカテゴリーの非制限的な例にはＤＮＡ合成が無いこと、ＲＮＡ合成が無いこと、ＲＮＡの転移が無いこと、ｔＲＮＡが無いこと、細胞分裂が無いこと、細胞サイクルが無いこと、生育が無いこと、及び細胞膜形成が出来ないことがある。必須の細胞機能、及び遺伝子の非制限的例には、生育（ＢＯＳ１）；生存性（ＲＰＬ３１）；細胞サイクルコントロール（ＣＤＣ２３）；細胞壁維持（ＧＰＬ３）；ＤＮＡ合成（ＰＯＬ３０）；核細胞質移動（ＮＰＬ６）；ｔＲＮＡ合成（ＲＰＣ３４）；ｒＲＮＡ合成（ＲＲＮ３）；ｍＲＮＡ合成（ＳＲＢ４）；タンパク質合成（ＮＩＰ１）；及びＲＮＡスプライシング（ＰＲＰ２１）がある。Ｓ．セレビシアにおける細胞機能、及び公知の変異の例、並びに若干のこれらの例に関する文献には次のものがある：
＊内部原形質網状組織（ＥＲ）からゴルジ複合体へのタンパク質の移動
ＢＯＳ１変異体  内部原型網状組織からゴルジ複合体へのタンパク質の移動において影響を受けたサッカロミセス  セレビシアの新変異体（Ｗｕｅｓｔｅｈｕｂｅ ＬＪ， Ｄｕｄｅｎ Ｒ， Ｅｕｎ Ａ， Ｈａｍａｍｏｔｏ Ｓ， Ｋｏｒｎ Ｐ， Ｒａｍ Ｒ，Ｓｃｈｅｋｍａｎ Ｒ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９６ Ｆｅｂ；１４２（２）：３９３−４０６）
＊ＤＮＡ複製、及び修復
ＰＯＬ３０変異体  ＲＡＤ５２組み換え修復経路は、ＤＮＡ合成の間に小単鎖ＤＮＡフラグメントを蓄積するｐｏｌ３０（ＰＣＮＡ）変異体において必須である（Ｍｅｒｒｉｌｌ ＢＪ， Ｈｏｌｍ Ｃ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９８ Ｆｅｂ；１４８（２）：６１１−２４）
＊タンパク質翻訳
ＤＥＤ１変異体メッセンジャーＲＮＡ翻訳を行うためのＤＥＡＤ−ＢＯＸタンパク質ｄｅｄｉｐの要求性（Ｃｈｕａｎｇ Ｒｙ， Ｗｅａｖｅｒ ＰＬ， Ｌｉｕ Ｚ， Ｃｈａｎｇ ＴＨ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９７ Ｍａｒ． ７；２７５（５３０５）：１４６８−７１．）
＊ｍＲＮＡスプライシング
ＰＲＰ２１変異体
サカッロミケス  セレビシアＰＲＰ２１遺伝子産物はプレスプセオソームの統合部材である（Ａｒｅｎａｓ ＪＥ， Ａｂｅｌｓｏｎ ＪＮ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， １９９３ Ｊｕｌ １５：９０（１４）：６７７１−６７７５．）
＊ｔＲＮＡスプライシング
ＴＲＬ１変異体
酵母ｔＲＮＡ結紮変異体は非生存性であり、かつｔＲＮＡスプライシング中間生成物を蓄積する（Ｐｈｉｚｉｃｋｙ ＥＭ， Ｃｏｎｓａｕｌ ＳＡ， Ｎｅｈｒｋｅ ＫＷ， Ａｂｅｌｓｏｎ Ｊ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９２ Ｍａｒ ５；２６７（７）：４５７７−８２）
＊ｒＲＮＡ合成
ＲＲＮ３変異体
サッカロミセス  セレビシアにおける３５ＳリボソームＲＮＡ合成において検出される変異体分離へのアプローチ（Ｎｏｇｉ Ｙ， Ｖｕ Ｌ， Ｎｏｍｕｒａ Ｍ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９１ Ａｕｇ １５；８８（１６）：７０２６−３０）
＊長鎖脂肪酸合成
ＡＣＣ１変異体  酵母アセチル補酵素Ａアルボキシラーゼ変異体は、大長鎖脂肪酸合成を、核膜−孔複合体の構造、及び機能にリンクする（Ｓｃｈｎｅｉｔｅｒ Ｒ， Ｈｉｔｏｍｉ Ｍ， Ｉｖｅｓｓａ ＡＳ， Ｆａｓｃｈ ＥＶ，  Ｋｏｈｌｗｅｉｎ ＳＤ， Ｔａｒｔａｋｏｆｆ ＡＭ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９６ Ｄｅｃ；１６（１２）：７１６１−７２）
＊タンパク質Ｎ−グリコシレーション
ＡＬＧ１変異体
Ｓ．セレビシア  Ｇ１サイクルの過剰発現はａｌｇ１  Ｎ−グリコシレーション変異体を回復する（Ｂｅｎｔｏｎ ＢＫ， Ｐｌｕｍｐ  ＳＤ， Ｒｏｏｓ Ｊ， Ｌｅｎｎａｒｚ ＷＪ， Ｃｒｏｓｓ ＦＲ．，   Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ  １９９６ Ｊａｎ；２９（２）：１０６−１３）
＊スフィンゴ脂質合成
抗菌性薬剤に関する標的としてのスフィンゴ脂質合成。ＡＵＲ１遺伝子によるサッカロミセス  セレビシアの変異体菌株におけるイノシトール  ホスホイルセラミドシンターゼの欠陥の相補性（Ｎａｇｉｅｃ ＭＭ，Ｎａｇｉｅｃ ＥＥ， Ｂａｌｔｉｓｂｅｒｇｅｒ ＪＡ， Ｗｅｌｌｓ ＧＢ， Ｌｅｓｔｅｒ ＲＬ， Ｄｉｃｋｓｏｎ ＲＣ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ  １９９７ Ａｐｒ １１；２７２（１５）：９８０９−１７）
＊ｔＲＮＡヌクレオチジルトランスフェラーゼ
ＣＣＡ１  変異体
細胞質、及びミトコンドリアｔＲＮＡ  ヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性は酵母サッカロミセス  セレビシアにおける同じ遺伝子から誘導される（Ｃｈｅｎ ＪＹ， Ｊｏｙｃｅ ＰＢ， Ｗｏｌｆｅ ＣＬ， Ｓｔｅｆｆｅｎ ＭＣ， Ｍａｒｔｉｎ ＮＣ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９２ Ｊｕｌ ２５；２６７（２１）：１４８７９−８３）
＊エルゴステロール生合成
ＥＲＧ１１ 変異体
Ｃ−１４でラノステロール除去においてブロックされた酵母変異体。高圧液体クロマトグラフによるステロールの分離（Ｔｒｏｃｈａ ＰＪ， Ｊａｓｎｅ ＳＪ． Ｓｐｒｉｎｓｏｎ ＤＢ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９７７ Ｏｃｔ １８；１６（２１）：４７２１−６）
＊ポリアディレーション
ＦＩＰ１変異体
ＦＩＰ１遺伝子はポリ（Ａ）ポリメラーゼと直接相互作用する酵母プレ−ｍＲＮＡ  ポリアディレーション因子の構成部材をコードする（Ｐｒｅｋｅｒ ＰＪ， Ｌｉｎｇｎｅｒ Ｊ， Ｍｉｎｖｉｅｌｌｅ−Ｓｅｂａｓｔｉａ Ｌ， Ｋｅｌｌｅｒ Ｗ．  Ｃｅｌｌ １９９５ Ｍａｙ ５；８１（３）：３７９−８９）
＊ＲＮＡの核エクスポート
ＧＬＥ１変異体
必須核エクスポートを伴うＲＮＡ−エクスポートメディエータ（Ｍｕｒｐｈｙ Ｒ， Ｗｅｎｔｅ ＳＲ．  Ｎａｔｕｒｅ １９９６ Ｓｅｐ ２６；３８３（６５９８）３５７−６０）
＊ｒＲＮＡプロセッシング
ＬＣＰ５変異体
条件ポリ（Ａ）ポリメラーゼアレイによる合成致死性相互作用は１８Ｓ  ｒＲＮＡ変異に関連する遺伝子、ＬＣＰ５を同定する（Ｗｉｅｄｅｒｋｅｈｒ Ｔ， Ｐｒｅｔｏｔ ＲＦ， Ｍｉｎｖｉｅｌｌｅ−Ｓｅｂａｓｔｉａ Ｌ．  ＲＮＡ １９９８ Ｎｏｖ；４（１１）：１３５７−７２）
候補抗菌性化合物を同定するための高処理量スクリーニング（ＨＴＳ）の出現により、より多くの新しい化学物質（ＮＣＩ）が同定されてきている。その結果、系統的な方法を確立させて、高処理量で、これらのＮＣＩの作用の機序を研究する緊急な必要性が生じている。
【００６２】
本発明の一実施態様において、細胞内におけるマクロ分子標識を利用し、生合成経路の相違に関連してこれらの候補化合物の作用の標的を分析する。非制限的な一方法の例を下記に簡単に要約する。異なるマクロ分子の放射能標識構築ブロックを、酵母と共に培養し、対象となる化合物の存在、又は不存在下においてこれらの放射能標識構築ブロックの取り込みを測定する。特定のマクロ分子合成経路を阻害する化合物を、迅速に同定し、かつさらに特徴を調べることができる。
【００６３】
金属イオンの存在下において標的遺伝子の発現を一時的に現象させることができる、本発明のＳ．セレビシア金属イオン制御菌株に応用した場合に、この方法は特に効果的である。該標的遺伝子が、一時的にノックアウトされている場合、この遺伝子が関連する合成経路は直ちに影響を受け、構築ブロックの取り込みが減少する。この効果を使用して、対象となる標的遺伝子に関連する特定の表現型を特徴づけることができる。先に記載されたマクロ分子アッセイを使用して、かつ本発明の制御可能な菌株で得られたこれらの結果を比較する分析により、候補抗菌性化合物に関する表現型を迅速に決定することが可能になる。抗菌性化合物に関する予期された表現型に関連する情報は、従って、所定の標的遺伝子の機能を特異的に阻害する化合物を分析した場合にさらに増加する。
【００６４】
抗菌性化合物のこれらの分析に用いる方法の一例を以下に記載する。本発明の制御された酵母菌株を分析する場合、類似の方法を使用することができる。
準備
培養：
グルコース０．０５％、ディフコ  カザミノ酸０．０５％、アデニン０．１ｍｇ／Ｌ、及びＮ−アゼチルグルコースアミン０．１４ｍｇ／Ｌを含むＹＮＢ培地中において回転式浴を用いて３７℃で一晩酵母を生育させる。一晩生育させた培養体５ｍｌを、Ｏ．Ｄ．が０．５になるまで、同じ培地２５ｍｌに加える。
【００６５】
放射能標識：
Ｎ−アセチル−Ｄ（Ｉ−３Ｈ）グルコースアミン   アメルシャム： ＴＲＫ３７６， ９．９ Ｃｉ／ｍｍｏｌ， １ ｍＣｉ／ｍｌ
Ｄ−（５−３Ｈ）グルコース アメルシャム： ＴＲＹ，２９０， １７．４ Ｃｉ／ｍｍｏｌ， １ ｍＣｉ／ｍｌ
Ｌ（４，５−３Ｈ）ロイシン アメルシャム：ＴＲＫ５１０， １４８Ｃｉ／ｍｍｏｌ， ｌｍＣｉ／ｍｌ
（２−３Ｈ）アデニン アメルシャム：ＴＲＫ３１１， ２１ Ｃｉ／ｍｍｏｌ，ＩｍＣｉ／ｍｌ
次の内容を含む５本の異なるチューブを準備した：
１．  ＤＮＡ：放射能標識アデニン４０ｕｌ＋非標識アデニン８ｕｌ（マイクロリットル）
２．  グルカン：放射能標識グルコース４０ｕｌ
３．  キチン：放射能標識Ｎ−アセチルグルコースアミン４０ｕｌ＋非標識Ｎ−アセチルグルコースアミン４ｕｌ
４．  タンパク質：放射能標識ロイシン１６ｕｌ
５．  ＲＮＡ：放射能標識アデニン１０ｕｌ＋非標識アデニン１０ｕｌ
反応工程：
９６−ウェルプレートを異なる工程−反応のために準備する：
１．  タンパク質合成をそれぞれのウェルにおいて１０％ＴＣＡ７５ｕｌを用いてプレートにおいて停止させることができる。
【００６６】
２．  ＤＮＡ合成を該プレートにおいて核ウェルに１０％ＴＣＡ７５ｕｌを用いて停止させることができるが、タンパク質を有する異なるプレートにおいてなされなければならない。
３．  ＤＮＡ、グルカン、及びキチン合成を１２％ＫＯＨ７５ｕｌを用いて同じプレートに置いて停止させることができる。
この後水浴上でよりよく流すために、該プレートのそれぞれのコーナーで孔を穿ければならない。
該プレートを氷上に置き、反応を停止させることが好ましい。
化合物：
各マクロ分子合成を行うために、試験する化合物を三種の異なる濃度で（０ｕｇ／ｍｌを含む）と三本の異なるチューブ内に調製する。
反応：
各時点で複製する。
前記酵母培養体４ｍｌをそれぞれの異なるチューブに加え、かつタイマーをクリックしてスタートさせる。バックグランドとしてそれぞれ個別の放射能標識７５ｕｌを準備する。
５分間培養した後、各反応体１．２ｍｌを、試験する化合物の入ったチューブに加え、かつ反応物７５ｕｌを直ちに取り出して反応を停止させる。
１５，２０，２５，３５，４５，５５分の時点で反応停止を繰り返す。
反応後の操作：
沈殿：
ＤＮＡ、グルカン、及びキチン合成を測定するプレートを９０分間８０℃で加熱する。次いで３７％ＨＣｌ２４ｕｌ、及び冷５０％ＴＣＡ  １９．３ｕｌを加え、４℃で３０分間培養する。
ＲＮＡ合成を測定するプレートを４℃で３０分間培養する。
タンパク質合成を測定するプレートは１５分間８０℃で加熱し、かつ次いで４℃で３０分間培養する：
濾過：
通常機械を用いてＧＦ−Ａプレートを使用してプレートを濾過することにより、よい結果が得られる。１０％ＴＣＡ  ２００ｕｌで二回洗浄し、６５℃で培養してこれらを乾燥させる。
【００６７】
計数：
シンシレーション溶液２０ｕｌを加え、かつ計数する。
参考文献；
ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質の合成に関し：
プルプロマイシンの活性機序（Ｌａｎｄｉｎｉ Ｐ， Ｃｏｒｔｉ Ｅ， Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ＢＰ， Ｄｅｎａｒｏ Ｍ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． １９９２ Ｊｕｎ １５；２８４（Ｐｔ３） ：９３５ ）
グルカン合成に関し：
酵母スファロプラストスにおけるグルカン合成の阻害（Ｂａｇｕｌｅｙ ＢＣ， Ｒｏｍｍｅｌｅ Ｇ， Ｇｒｕｎｅｒ Ｊ， Ｗｅｈｒｌｉ Ｗ． Ｐａｐｕｌａｃａｎｄｉｎ Ｂ：  Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９７９ Ｊｕｌ； ９７ （２）：３４５−５１．）
ＲＮＡ、及びタンパク質に関し：
ビリジオフンギンスの抗微生物活性（Ｏｎｉｓｈｉ ＪＣ， Ｍｉｌｌｉｇａｎ ＪＰ， Ｂａｓｉｌｉｏ Ａ， Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ Ｊ， Ｃｕｒｏｔｔｏ Ｊ， Ｈｕａｎｇ Ｌ， Ｍｅｉｎｚ Ｍ， Ｎａｌｌｉｎ−Ｏｍｓｔｅａｄ Ｍ， Ｐｅｌａｅｚ Ｆ， Ｒｅｗ Ｄ， Ｓａｌｖａｔｏｒｅ， Ｍ， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｊ， Ｖｉｃｅｎｔｅ Ｆ， Ｋｕｒｔｚ ＭＢ  Ｊ Ａｎｔｉｂｉｏｔ （Ｔｏｋｙｏ）． １９９７ Ａｐｒ；５０（４）３３４−８．）
下記実施例は本発明の非制限的な説明を意図するものである。
【００６８】
（実施例１）  銅制御ＲＯＸ１遺伝子を含む銅寛容酵母菌株の構築
下記実験を実施して（ｉ）異なる酵母菌株の銅感受性を試験し；かつ（ｉｉ）銅制御可能ＲＯＸ１遺伝子を含む銅依存性酵母菌株を作成した。
酵母菌株ＣＴＹ１４５の銅感受性とＺＭＹ６０の銅感受性との比較を、添加される銅の量を増しながら存在させて各菌株を生育させ、かつ増殖時間毎に細胞数を測定することにより行った。生育１６時間経過後、ＺＭＹ６０の長期相生育速度が維持され影響されない銅の最高濃度は２５０ｕｌあった（図１）。対比してみると、ＣＴＹ１４５の生育速度が維持される銅の最高濃度は１ｍＭであった。従って、ＣＴＹ１４５は、ＺＭＹ６０と比べ銅に対する寛容度が少なくも４倍以上である。
【００６９】
銅誘導性ＲＯＸ１を含むＣＴＹ１４５をベースとする菌株を下記の方法で構築した。従来の酢酸リチウム／ポリエチレングリコール技術を使用して、ＣＴＹ１４５をプラスミドｐＺＭ１９５  約０．１ｕｌで形質転換した（図４Ａ−Ｄ）。ここにおいて制限酵素Ａｆ１ＩＩを用いて該プラスミドを直線化した。該プラスミドはＡＣＥ１に融合されたＨＩＳ３プロモータ配列を含む金属応答性エレメントを含む。
該プラスミドのゲノムへの統合をＵＲＡプレート上での生育する細胞の能力によりモニターした（この培地における該酵母菌株の生育には該プラスミドに含まれる機能性ＵＲＡ３遺伝子が要求される。３０℃で４８時間経過した後、該形質転換体を新鮮なＵＲＡプレート上に貼り付け、かつ３０℃でさらに４８時間再生育させた。十分に間隔があいた個別のコロニーを取り上げ、かつＹＰＤ培地５ｍｌに植え付け、３０℃で一晩生育させ、かつ該培養体５ｕｌを５−ＦＯＡプレートに植え付けた。機能性ＵＲＡ３遺伝子の存在下において、５−ＦＯＡは細胞を殺す毒素に転換される。従って、生き延びた細胞のみが組み換えによってＵＲＡ３遺伝子を失っているものである。
【００７０】
ＺＭ１９５の該ゲノムへの統合は下記のいずれの方法においても行うことができる。（１）該オリジナル統合を非特異的に生じさせる。この場合においてＵＲＡ３の５−ＦＯＡ誘導性欠失は効果を有しないであろう。（２）該本来の取り込みが特異的に生じ、かつそれに続く５−ＦＯＡ誘導が本来のプロモータ配列の戻りとして生じるであろう。（３）本来の統合を特異的に行い、かつＵＲＡ３のに続く５−ＦＯＡ誘導欠失により、ＲＯＸ１オープンリードフレーム（ＯＲＦ）の直上流に銅誘導性プロモータの正しい挿入を導く。
【００７１】
正しいプロモータ挿入を検出するため、３種のプライマーを設計した：ＲＯＸ−Ａ （５−ＴＣＡＣＡＣＡＡＡＡＧＡＡＣＧＣＡＧ−３’） （配列番号：４）、  該プロモータは、該ＯＲＦの最初のＡＴＧに対し直の５にある本来のプロモータの領域からの配列に対応する；ＲＯＸ−Ｂ（５’−ＧＡＴＧＡＣＡＧＣＴＧＴＧＧＴＡＧＧ−３’） （配列番号：５）、該プロモータはＺＭ１９５に存在しないＲＯＸ１のＯＲＦにおける配列の逆相補性である；及びＲＯＸ−Ｃ（５’−ＴＣＴＴＧＣＣＡＴＡＴＧＧＡＴＣＴＧ−３’） （配列番号： ６）、該プロモータは銅誘導性プロモータに対し内側の配列である。前記１，及び２の可能性に関し、ＲＯＸ−Ａ及びＲＯＸ−Ｂを用いるゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅により、６０１塩基対産物がもたらされ、かつＲＯＸ−Ｂ及びＲＯＸ−Ｃを用いるＰＣＲ増幅ではどのような産物も得られないであろう。３の可能性についてはＲＯＸ−Ａ、及びＲＯＸ−Ｂを用いるＰＣＲによる正しい挿入により、２６２８ｂｐ産物が得られ、かつＲＯＸ−Ｂ、及びＲＯＸ−Ｃを用いるＰＣＲにより７８５ｂｐ産物が得られるであろう。ＰＣＲ分析により、正しい再配列を受けた菌株が同定された。該この菌株はＣＵＹ１０１と命名された。
【００７２】
ＵＢＲ１遺伝子を銅誘導性プロモータＨＩＳ３−ＡＣＥ１のコントロール下に置くため、前記手順を開始菌株としてＣＵＹ１０１を用いて繰り返した。制限酵素ＡａｔＩＩを用いて消化することより直線化されたＺＭ１９７プラスミド（図５Ａ−Ｄ）を細胞に導入する。正しくプロモータ挿入がなされた細胞を同定するために、三種のＰＣＲテストプライマーを設計した：ＵＢＲ−Ａ（５’−ＡＴＣＴＴＣＧＧＡＣＡＡＡＧＧＣＡＧ−３’） （配列番号： ７）；ＵＢＲ−Ｂ（５’−ＧＴＧＴＡＡＴＴＴＴＣＧＧＧＡＴＣＧ−３’） （配列番号：８）、及びＲＯＸ−Ｃ（５’− ＴＣＴＴＧＣＣＡＴＡＴＧＧＡＴＣＴＧ−３’） （配列番号：９）。ＰＣＲ分析を使用して正しい再配列を受けた一の培養体を同定する。この菌株をＣＵＹ１０３と命名する。
【００７３】
（実施例２）：ＳＬＦ１が欠失した酵母菌株の構築
本発明を実施するため、発現の銅抑制を相対的な長期間、例えば、７日間維持するのが好ましい。野生型酵母における銅の一時的な効果は、酵母細胞が銅を生物学的に処理することができるという事実に少なくとも一部起因する。従って、時間的に過剰な野生型酵母細胞は銅の培地を涸渇させ、かつ発現に関する効果を失う。バイオミネラリゼーション活性が排除された場合、次いで細胞外銅の水準は時間経過後の定数近くに維持される。
【００７４】
酵母銅イオンバイオミネラリゼーション経路における唯一公知の遺伝子は、ＳＬＦ１遺伝子である。ＳＬＦ１遺伝子の不活性化は銅に対するわずかに高い感受性を細胞にもたらすが、培地から銅を涸渇させることができないようである（Ｙｕらの論文，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６：２４６４；１９９６）。従って、実施例１に記載されている酵母菌株におけるＳＬＦ１遺伝子は不活性化されている。
構築体をＳＬＦオープンリーディングフレームの２工程ノックアウトを行うために作成した。
プライマーＳＬＦ−Ｅ（５’−ＧＣＧＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＧＣＡＧＧＣＡＧＴＴＴＧＡＡＣ−３’）（配列番号：１０）、及びＳＬＦ−Ｆ（５’−ＧＣＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡＣＴＣＣＴＴＴＣＣＡＡＴＴＧＴＧＣ− ３’） （配列番号： １１）を使用し、テンプレートとしてゲノムＤＮＡを使用して、ＳＬＦ−１の３’−非翻訳領域を増幅した。該ＰＣＲ産物のＳａｌｌ／ＳｐｈｌフラグメントをＳａｌｌ／Ｓｐｈｌ−消化ｐＵＣ１９プラスミド（ジーンバンク  アクセス番号第Ｍ７７７８９）内にサブクローンした。この組み換えプラスミドをｐＳＬＦ３と命名した。同様に、プライマー
ＳＬＦ−Ｇ （５’ＧＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＡＣＣＣＣＴＡＡＣＴＣＴＡＧ−３’）（配列番号： １２） 、
及びＳＬＦ−Ｈ（５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＧＧＧＧＣＴＣＴＣＴＣＧＴＴＴＡＴＴＴＡＡＣＧ−３’） （配列番号： １３）を使用し、ＳＬＦ１の５−非翻訳領域を増幅し、かつＳａｃＩ／ＢａｍＨＩ、又はＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを、ＳａｃＩ／ＢａｍＨＩ、又はＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ消化ｐＳＬＦ３にクローンし、ｐＳＬＦ３５を作成した。サルモネラＨｉｓＧ配列の直接リピートにより酵母ＵＲＡ３遺伝子、及び側面に位置する細菌カナマイシン抵抗遺伝子を含む、ｐＤＪ２０の５．５ｋｂ  ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ挿入により、ＸｂａＩ  ／ＢａｍＨＩ消化ｐＳＬＦ３５内にサブクローンし、ｐＳＬＦＫＯを作成した。プラスミドｐＤＪ２０はプラスミドｐＳＰ７２（ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）から誘導され、下記エレメントからなる約５．５ｋｂ挿入にクローンされているＢａｍＨＩ部位中に挿入されているものである：
｜ｈｉｓＧ  ｜  ＵＲＡ３  ｜カナマイシン抵抗性  ｜  ｈｉｓＧ  ｜
該ｈｉｓＧエレメントはタンデムリピートとして存在する。このエレメントを含むプラスミドは増幅を行うために細菌中に形質転換することができる；カナマイシンの部位はＳ．セレビシアＵＲＡ３遺伝子を失っている細菌における２個のｈｉｓＧ領域の間の望ましくない組み換えを避けるのに役立つ。該ｈｉｓＧ、ＵＲＡ３、及びカナマイシン遺伝子は当該技術分野において周知である。分子生物学における通常の技術によりこの順序で組み立てることができ、かつプラスミドｐＤＪ２０から得る必要はない。
【００７５】
このプラスミド（ｐＳＬＦＫＯ）をＳｐｈＩ、及びＥｃｏＲＩによって消化し、かつ前記方法説明の項において記載したように従来の酢酸リチウム／ポリエチレングリコール技術を用いて、菌株ＺＭＹ６０，ＣＴＹ１４５，ＣＵＹ１０１、及びＣＵＹ１０３に導入して形質転換する。各菌株のゲノムに対するプラスミドの統合を、（−）ＵＲＡプレート上に生育する菌株の能力によりモニターした。３０℃で４８時間経過した後、形質転換体を新鮮な（−）ＵＲＡプレート上に植え付け、かつ３０℃でさらに４８時間再育成した。十分な間隔がある個々のクローンをＹＰＤ培地５ｍｌに植え付け、３０℃以上で一晩生育させ、かつ該培養体５ｕｌを５−ＦＯＡプレート上に植え付けた。
【００７６】
機能性ＵＲＡ３遺伝子の存在下において、５−ＦＯＡが転換されて細胞を殺す毒素となる。従って、生存する細胞のみが組み換えによりＵＲＡ３遺伝子を失ったものである。次のいずれかの事象が生じうる：（１）５−ＨｉｓＧ−ＵＲＡ３−ｋａｎＲ−ＨｉｓＧ−３ＮＴＳ  フラグメントを含む直線ＤＮＡの非特異的な統合が生じ、次いでＨｉｓＧリピートの間の領域の欠失が生じる；これは若干のランダムスポットにおいて５ＮＴＳ−ＨｉｓＧ−３ＮＴＳ統合を生じさせる。（２）それに代わり５ＮＴＳ−ＨｉｓＧ−ＵＲＡ３−ｋａｎＲ−ＨｉｓＧ−３ＮＴＳ配列を含む直線ＤＮＡの特異的統合が生じ、続いて、欠失が生じ、それはＳＬＦ１の全ＯＲＦが削除され、かつＨｉｓＧエレメントの単一コピーがそのスペースに残るという欠失／挿入が生じるであろう。
【００７７】
正しい遺伝子置き換えが生じたことを確認するため、ＰＣＲを下記プライマーのセットを用いて行った： （ｉ） ＨＩＳＧＣＨ （５’−ＧＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＴＡＣＣＧＧＣ−３’）（配列番号： １４） 及びＳＬＦ−Ｄ （５’−ＧＡＣＡＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＴＡＣＧ−３’） （配列番号： １５）； 及び、（ｉｉ）前記プライマーＨＩＳＧＣＨ、及び ＳＬＦ−Ｄ の逆相補性を有するプライマーである。それに代わり、ＳＬＦ−Ａ （５’−ＣＴＡＡＣＴＣＴＡＧＣＴＧＣＡＴＴＧ−３’） （配列番号：２４） （又はＳＬＦ−Ｇ） 及び ＳＬＦ−Ｄ （又は ＳＬＦ−Ｆ）を用いるＰＣＲを使用し、ＰＣＲ後に産物の長さに診断シフトを作成することができた。ＣＴＹ１４５のＳＬＦ１欠失バージョンをＣＵＹ１０４と命名し；ＣＵＹ１０１のＳＬＦ１欠失バージョンをＣＵＹ１０５と命名し；ＣＵＹ１０３のＳＬＦ１欠失バージョンをＣＵＹ１０６と命名し；かつＺＭＹ６０のＳＬＦ１欠失バージョンをＣＵＹ１０７と命名した。
【００７８】
酵母菌株ＣＴＹ１４５、ＣＵＹ１０１，ＣＵＹ１０３，ＣＵＹ１０４，ＣＵＹ１０５、及びＣＵＹ１０６の培養体をＣｕＳＯ４  ５００ｍＭを加えて完全合成培地（ＣＳＭ）５ｍｌ中に、３０℃で一分間に約６０回転の速度のローラドラム装置において培養した。２４、及び４８時間の時点で、該培養体をペレット化し、かつ ５００ｍＭ ＣｕＳＯ４を含む新鮮なＣＳＭ培地中に再懸渇した。９６時間培養した後、細胞をフィルターペーパろ紙上に集め、かつフィルターろ紙を介して吸引することにより上清を除去した。バイオミネラリゼーションは、暗色細胞ペレットの存在によって推定され、細胞表面上に配置されているように見える硫化銅（ＣｕＳ）に対する溶解性銅のバイオミネラリゼーションを示す。菌株ＣＴＹ１４５，ＣＵＹ１０１、及びＣＵＹ１０３（図９においてそれぞれＡ，Ｂ及びＣ）は、それらの暗色によって示されるように野生型ＳＬＦ１遺伝子を含む該ＳＬＦ１遺伝子を含む。ＳＬＦ１遺伝子が、除かれている菌株ＣＵＹ１０４、ＣＵＹ１０５及びＣＵＹ１０６はろ紙上に集められた後かなり明るい着色を示し、銅バイオミネラリゼーション活性が排除されていることを示す。
【００７９】
前記各酵母菌株の単一コロニーをＹＰＤプレートから拾い、振盪しながらＹＰＤ培地において３０℃で一晩生育させた。培養体を様々な濃度のＣｕＳＯ４を含むＣＳＭ培地において６００ｎｍの吸光度が０．０２になるように希釈した。該培養体を一分間に約６０回転するローラドラム装置内において３０℃で２４時間生育させた。６００ｎｍにおいて各培養体の吸光度を測定した。これは細胞密度（すなわち培養中の細胞数）の測定である。細胞密度アッセイの結果を図１０に示し、かつ硫酸銅を添加しなかった細胞において達成された細胞密度のパーセンテージとして示した。
【００８０】
（実施例３）銅誘導性プロモータを伴う、対象となる全ての遺伝子のプロモータエレメントの安定な置換を行う方法
下記方法を対象となる全ての酵母遺伝子のプロモータエレメントを安定して置換するために行った。下記戦略は下記１〜４を避けるために設計した：（１）選択可能なマーカとしてＵＲＡ３の使用、ここにおいて将来的な選択手順におけるその使用は排除した；（２）対象遺伝子のコード配列における天然の独自制限部位の要求；（３）多重サブクローニングの必要性；及び（４）本来のプロモータエレメントの復原をもたらすであろう、挿入された配列の損失を防ぐために、ＵＲＡ３選択の恒常的維持の必要性である。
【００８１】
単一、又はダブル−ＰＣＲ戦略を考察した。単一クロスオーバー事象に代えて、該方法は、酵母ゲノムに統合を行うために、ダブルクロスオーバーが生ずることを要求する。ダブルクロスオーバー事象は、起こりそうにないが、一旦起これば、得られる形質転換ハプロイド酵母菌株は選択下において維持される必要はない。ＨＩＳ３をマーカとして使用し、不必要なＵＲＡ３の使用を避ける。加えて、該ＨＩＳ３遺伝子は比較的短く、かつ従ってその増幅が比較的易しい。
【００８２】
ｐＣＲ３と命名されているプラスミドを、ＡＮＢ１プロモータと逆方向であり、かつ上流から機能的ＨＩＳ３遺伝子（上流配列を含む）を含むように構築した。該ＡＮＢ１プロモータはユビキチンタグエレメントをコードする配列の上方（すなわち５’に対し）融合させた。この目的を達成するため、ｐＵＣ８−Ｓｃ２６７６のＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩフラグメントをｐＵＣ１９中にサブクローンした。次いでＡＮＢ１プロモータ、及びユビキチンタグ領域を含む、ＺＭ１６８のＥｃｏｒＩ−ＫｐｎＩフラグメントを該プラスミド中にサブクローンした。
【００８３】
プライマーを一工程、又は二工程ＰＣＲ戦略において使用するために設計した（図２Ａ−Ｃ）。
一工程ＰＣＲ戦略：１００要素オリゴヌクレオチドを合成した。プライマー１は該遺伝子のタンパク質コード配列に対し、直５’に対する該ＤＮＡ配列の知識から得られたものであって、対象の遺伝子からの８０ｂｐの標的配列を、２０ｂｐのプラスミド配列と共に含む。非コード鎖からの配列を含む第２セットのプライマーを合成した。これらのオリゴヌクレオチドは、
プライマー２ｂ（５’−ＣＣＡＧＡＣＴＡＣＧＣＴＴＣＧＡＴＡＴＣＧ−３’） （配列番号： １６） （”＋タグ”） 、又はプライマー ２ａ （５’−ＣＡＣＡＣＴＡＡＡＡＣＡＴＣＧＡＴＡＴＴ−３’） （配列番号： １７） （”タグ無し”）と次いでイニシエータＡＴＧコドンから始まる、対象の遺伝子の１８−２０ｂｐのタンパク質コード配列と融合させた。この場合、「タグ」とはユビキチンタグの存在、又は不存在を意味する。
【００８４】
プライマー対１、及び２ａ、又は１、及び２ｂを使用し、ｐＣＲ３からＤＮＡフラグメントを増幅し、ゲノム５ＮＴＳ（非翻訳配列）からなるフラグメントを産生し、それには逆配向のＨＩＳ３が続き、ＡＮＢ１プロモータ、及び該ＯＲＦのフラグメント、又は該ＯＲＦのフラグメントに対するフレームに融合したタグ配列が続く。これらの配列を有するハプロイド酵母菌株の形質転換にダブルクロスオーバーが続き、これにより該ゲノム中への統合が行われる。これによりＨＩＳ３、ＡＮＢ１プロモータ、及び（若干の場合において）対象の遺伝子に対し５’に該タグ配列が挿入される。
【００８５】
このアプローチを使用しても、失われるＤＮＡ配列は無く、かつどの配列も複製されず、これにより挿入された配列が同時に失われるという蓋然性は相当程度減少する。ＨＩＳ３を用いた選択の後、該挿入の存在、及び配向をＰＣＲを用いて確認する。該統合がダブルクロスオーバーを要求するという理由で、ＨＩＳ３選択による選択は遺伝子型を維持するために要求されることはない。
２工程ＰＣＲ戦略：第２工程戦略を行うために、プライマーに２ａ、又は２ｂを該ＯＲＦの開始ＡＴＧで始まる対象の遺伝子の１８−２０ｂｐのＯＲＦと融合させる。プライマー、及び配列４００−１０００ｂｐ下流の逆相補性である１８−２０ヌクレオチドを含む第２プライマーを使用し、該ＯＲＦの逆相補性であり、かつ該配列がタグの正統な位置におけるフレームと融合し、又は該タグに対しフレームにおいて融合している配列となるように、ｐＣＲ３における配列に対する３タグ相補性を有する、４００−１０００ｂｐフラグメントを増幅する。
【００８６】
対抗末端に対応するフラグメントを、“ユニバーサル  ＨＩＳ３−２ＳＴＥＰ狽ニ命名されているプライマー（５’−ＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＧＴ−３’） （配列番号： １８）を、該ＯＲＦの開始ＡＴＧの直５’で逆相補的である１８−２０要素の配列に融合することにより、作成する。このフラグメントは、開始ＡＴＧに対し５’末端である４００−１０００ｂｐの配列を含む１８−２０ヌクレオチドと同一のプライマーに関連して使用され、その３’末端がｐＣＲ３におけるＨＩＳ３遺伝子の該３’末端に相補的なフラグメントを増幅する。
【００８７】
次いで二種のフラグメントを使用して、ｐＣＲ３を増幅し、逆配向のＨＩＳ３、ＡＮＢ１プロモータ、及び該ＯＲＦの長さに対するフレームと融合しているタグ配列、又は該ＯＲＦの長さが続く、ゲノム５ＮＴＳの長さを有するフラグメントを作成する。その配列を用いる形質転換、及びダブルクロスオーバーはゲノムへの統合を誘導し、その結果ＨＩＳ３、ＡＮＢ１プロモータ、及び（若干の場合）タグ配列の挿入を生じさせる。このアプローチを用いることにより、どのＤＮＡ配列も失われず、どの配列も複製されず、これにより同時に生じる欠失の蓋然性が大いに減少する。ＨＩＳ３を用いる選択の後、挿入の存在、及び配向をＰＣＲを用いて確認する。該統合はダブルクロスオーバーを要求するので、ＨＩＳ選択は該遺伝子型の維持には要求されない。
【００８８】
（実施例４）：銅誘導性プロモータを伴う、対象となる全ての遺伝子のプロモータエレメントの安定な置換をする代替方法
ＰＣＲプライマーを標的遺伝子の配列を増幅し、ベクターｐＣＲ１９Ｓｒｆ（図８）における塔Ｖャッフルされた遺伝子粕ｚ列（図６）が得られるように設計する。使用することが出来る該ＰＣＲプライマーはその長さが１８〜３６ヌクレオチドの範囲で変化し、かつ少なくとも５０％のＧＣの構成を有する。長さ１８〜３６ヌクレオチドのプライマーでＧＣの含有量が低い場合、該プライマーは少なくとも５０％ＧＣ含有量のヌクレオチドよりも３〜６ヌクレオチド長くするように作成することができる。
【００８９】
ＰＣＲプライマーを濃度１ｍｇ／ｍｌで滅菌水に溶解する。Ｓ．セレビシアから得たゲノムＤＮＡを滅菌水中に様々な濃度となるように希釈する。該一次ＰＣＲ反応を行うために通常使用するタグＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）は通常一次ＰＣＲ反応に通常使用するものであるが、他の熱安定性ポリメラーゼを使用することもできる。例えばベントポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）又はＰｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）などを使用することもできる。
【００９０】
対象となるシャッフルされた遺伝子を２種の一次ＰＣＲ反応を実施することで作成する。１において、ＡＴＧ開始コドンの上流の約４００塩基対で始まり、かつＡＴＧ開始コドンのすぐ上流で終わる標的遺伝子の一部を増幅する。第２の一次ＰＣＲ反応において、ＡＴＧ開始コドンから、又は、その直上流から始まり、ＡＴＧ開始コドンの約４００塩基対下流で終わる標的遺伝子の一部を増幅する。通常の一次ＰＣＲ反応液は、１０Ｘタグ緩衝液１０ｕｌ、２５ｍＭデオキシヌクレオチド  三リン酸１０ｕｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  １０ｕｌ、Ｓ．セレビシア  ゲノムＤＮＡ  １ｕｌ、及びプライマー対１００ｕｇ／ｍｌ（プライマー１及び２、又はプライマー３及び４）１ｕｌ、及び滅菌水６６ｕｌを含むものである。
【００９１】
通常、プライマー１は（５’末端から３’まで）７ヌクレオチド配列、次いでＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位（又は他の稀切断酵素による切断に対し感受性のある制限部位）、それに続き標的遺伝子のＡＴＧ開始コドンの上流約４００塩基対にある対象遺伝子の頂上鎖と同一である１０又は１１ヌクレオチドからなるものである。プライマー１の５’末端にある７ヌクレオチドはプライマー４におけるＮｏｔＩ部位の直３’の７ヌクレオチドと相補的である。
【００９２】
プライマー２はＡＴＧ開始コドンの直上流にある対象の遺伝子の底部鎖の配列を有し、かつ約１８〜約２１ヌクレオチドを含むであろう。
プライマー３はＡＴＧ開始コドンにある、又はそれに非常に近い標的遺伝子の頂上鎖の配列を有する。
プライマー４は、５’末端にある７ヌクレオチド配列、それに続くＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位（又は他の稀切断酵素による切断に感受性のある制限部位）、それに続くＡＴＧ開始コドンの下流約４００塩基対にある対象遺伝子の底部鎖と同一である１０、又は１１ヌクレオチドからなるものである。
通常、該反応は反応混合物を９４℃で３〜５分間加熱し、それに続き、Ｔａｇ ＤＮＡポリメラーゼ５ユニットを添加することにより開始する。次いで、該反応混合物を熱サイクルの反応、すなわち９４℃で１分間、５０℃で１分間、及び７２℃で２分間という反応３０サイクルにかけ、その後温度を４℃に下げる。該ＰＣＲ産物をアガロースゲル上を移動させ、通常約４００塩基対である適当なサイズのフラグメントを産生する条件を定める。アニーリング温度、塩濃度などの反応条件を最適化するために該方法の様々なパラメータの改善は当業者の能力の範囲内である。
【００９３】
二次ＰＣＲ反応でＤＮＡテンプレートとして一次ＰＣＲ反応産物を用いる。２種の一次ＰＣＲ産物のそれぞれの１末端は相同性であり、かつ融解した場合約２１塩基対の伸びを超えて相互にアニールする。二次ＰＣＲ反応で使用したプライマーは、一次ＰＣＲ反応で用いたプライマー２、及びプライマー３である。これらのプライマー使用は、アニールされたテンプレートＤＮＡの末端に対しアニールし、かつ該ＰＣＲ反応がシャッフルされた遺伝子反応産物を生成するのを可能にする。
【００９４】
典型的な二次ＰＣＲ反応では、１０Ｘ  Ｐｆｕ緩衝液１０ｕｌ、２０ｍＭデオキシヌクレオシドテン三リン酸１０ｕｌ、濃度１００ｕｇ／ｍｌのプライマー対１ｕｌ（すなわち一次ＰＣＲ反応から得られたプライマー２、及び３である、）滅菌水７７ｕｌ、一次ＰＣＲ産物の様々な希釈液、及び２．５活性ユニットを含むＰｆｕポリメラーゼ１ｕｌを含む。該ＰＣＲ条件は９４℃で３〜５分間チューブを初期加熱することを除く他は、一次反応で用いたものと同一である。
【００９５】
当該技術分野で周知の方法に従い、二次ＰＣＲ産物をアガロゲースゲルで電気泳動し、適当なバンド（約８００〜９００塩基対）を切り出した。次いで、該ＤＮＡを遺伝子クリーンキット（Ｂｉｏ１０１ Ｖｉｓｔａ， ＣＡ）を用いてゲルから抽出した。抽出精製されたＤＮＡを次いでベクターｐＣｕ１９Ｓｒｆ（図８）内に結紮するために使用した。
該結紮を実施するために、ＰＣＲ−スクリプトキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＬａＪｏｌｌａ， ＣＡ）を使用する。ｐＣｕ１９Ｓｒｆを、ＳｒｆＩ制限エンドヌクレアーゼで切断する。該結紮混合物はＳｒｆＩ切断ベクターＤＮＡ１００ｎｇ、１０ＸＰＣＲ スクリプト緩衝液１ｕｌ、ＡＴＰ ０．５ｕｌ、１００〜５００ｎｇを含む挿入ＤＮＡ ４〜６ｕｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｌ、及びＳｒｆＩｕｌ １ｕｌを含む。全ての試薬はＤＮＡを除き、ＰＣＲスクリプトキットにより提供される。しかしながら、このような試薬は周知であり他の供給源から商業的に入手できる。該結紮反応の反応体３ｕｌで、ギブコ／ＢＲＬ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）から得ることができる、コンピテントＤＨ５ Ａｌｐｈａ細胞に形質転換し、該細胞をアンピシリン１００ｕｇ／ｍｌ（ｕｇ／マイクログラム）を含むＬＢ培地に植える。該プレートを３７℃で１６〜１８時間培養する。単一コロニーを、制限酵素消化、及び得られたフラグメントの分析のために選択し、適切な配向を有する挿入体を含むクローンを同定する。正しい配向で挿入体を有するプラスミドを含むと確認されたコロニーを選択し、培養により増殖させる。該挿入体含有プラスミドをキアゲンＤＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）のＤＮＡ分離方法を用いて細菌宿主から精製する。また、他の周知のプラスミド生成方法を用いることができる。該生成されたＤＮＡをＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化する（又は制限部位を該シャッフルされた遺伝子に処理導入した他の稀エンドヌクレアーゼ）によって消化する。該エンドヌクレアーゼを６５℃で２０分間加熱することにより不活性化する。該精製された切断ＤＮＡを次いで用い、Ｓ．セレビシアを形質転換する。
【００９６】
菌株ＣＵＹ１０６（Ａｃｅ−ＲＯＸ１， ＡｃｅＵＢＲ１， ｄｅｌｔａＳＬＦ１， ｈｉｓ３ｄｅｔａ２００， ｌｅｕ２−３， １１２， ｕｒａ３−５２）を、ＮｏｔＩ 消化プラスミドをＤＮＡ（図７）を用いる標準的な方法で形質転換する。細胞をヒスチジンを含まないＣＳＭアガー上に植え付け、かつ３０℃で４０〜４８時間培養する。単一コロニーを選択し、かつ同じ培地上に単一コロニーを形成するために線上の植え付けを行う。単一コロニーから得られた培養体をＹＰＤにおいて生育させ、かつＰＣＲ反応により評価を行うためゲノムＤＮＡを分離し、菌株の構築を確認する。
【００９７】
ゲノム確認を行うためのＰＣＲプライマーを、該遺伝子の一末端における１プライマー（プライマー５）が、該プラスミド上、及びプライマー１としての同じ鎖上にシャッフルされた遺伝子を生成するのに用いた５プライマーからプライマー１（前述）となるよう設計する。他のプライマー（プライマー３）を３プライマーからプライマー４（前述）、及びプライマー４として同じ鎖になるように設計する。ＰＣＲ条件を一次ＰＣＲ（前述）に用いたのと同じように定める。該プラスミド配列に特異的である他のプライマー（５’−ＡＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＡＡＴＡＣＧ−３’）（配列番号：２３）を該得変異体菌株から得られたＤＮＡ、すなわちシャッフルされた遺伝子を含むものを増幅するために、プライマー３と共に使用する。このＰＣＲ反応の産物は、通常、長さが６００〜７００塩基対である。
【００９８】
野生型ゲノムＤＮＡ、及びプライマー５、及びプライマー３を用いて１〜１．５  ｋｂ  ＰＣＲ産物を増幅する。このプライマー対はこのＰＣＲ条件では変異体ゲノムＤＮＡからＰＣＲ産物を産み出さない。その理由は該産物は増幅するには大きすぎるからである（＞７ｋｂ）。
（実施例５）：銅抑制遺伝子で処理された酵母菌株における復帰変異頻度に関するアッセイ
下記アッセイを実施し、非選択条件下に維持された培養体が外来的に添加された金属イオンに対する非感受性の表現型に復帰変異するであろう頻度を評価した。異なる菌株を背景とする２種の異なる方法により産生された菌株の培養体を選択なしに生育させ、ついでアッセイを行い銅イオンの添加に対しもはや感受性でない培養中における細胞のパーセンテージを測定した。
【００９９】
ＺＭＹ７１（ＺＭ７１＃１、及びＺＭ７１＃２）の２種の独立分離体を用い、このアッセイを行った。ＺＭ７１はＺＭＹ６０から誘導されたものであり、その構築はＭｏｑｔａｄｅｒｉ Ｚ．らの論文（Ｎａｔｕｒｅ ３８３：１８８−１９１（１９９６））に記載されている。該ＳＵＡ７遺伝子は、培養培地に対し銅を添加することにより活性化されたＲＯＸ１、及びＵＢＲ１を含む菌株におけるシングルクロスオーバー戦略により、ＡＮＢ１プロモータと機能的にリンクさせた。該組み換え菌株は、ウラシル（−ＵＲＡ）を含まない培地上で選択することにより維持される。知られているように、選択を行わない場合、同時組み換えは、ＵＲＡ３遺伝子が失われ（ｕｒａ３表現型に復帰変異）、かつＡＮＢ１プロモータによるＳＵＡ７遺伝子の制御が失われている菌株をもたらし、一方ＳＵＡ７の野生型調節が回復する。
【０１００】
また、２種の独立酵母菌株分離体（１９ＳＧ１ 及び１９ＳＧ２）を使用した。これらの酵母菌株において、菌株ＣＵＹ１０６におけるＳＵＡ７遺伝子は、実施例４に詳細に記載したように、ダブルクロスオーバー戦略によってＡＮＢ１プロモータに機能的にリンクさせた。該組み換えは、ヒスチジン（−ＨＩＳ）を含有しない培地上で選択することができる菌株をもたらす。この菌株に、配列のタンデムリピートを含まない挿入を生じさせるよう処理するのに使用する方法により、−ＨＩＳ培地上での選択を行うことなく、該菌株はｈｉｓ３表現型に復帰変異し、又はＳＵＡ７遺伝子の野生型調節を獲得することはないようである。
【０１０１】
すべての菌株を、グリセロールストックから、適当な選択倍地（ＺＭ７１用ウラシル不含倍地、及び１９ＳＧ用ヒスチジン不含倍地）に画線植え付けし、かつ３０℃で７２時間培養した。単一コロニーを拾い、選択倍地２ｍｌに植え、かつ３０℃で、ローラドラム上で一晩培養した。該酵母培養体を約５秒間マイクロ遠心分離し、かつ該ペレットをＹＰＤ倍地（非選択性）２ｍｌに再懸濁した。次いで、該培養体をローラドラム上で、３０℃で２４時間生育させた。
【０１０２】
各培養体の希釈物をＹＰＤ、及びＣＳＭプラス硫酸銅１ｍＭを含むプレート上に植えた。該プレートを３０℃で７２時間培養し、かつコロニー数を数えた。ＹＰＤプレートコロニー数は培養における総細胞数を反映し、一方、ＣＳＭプラス硫酸銅１ｍＭのプレート上のコロニーは復帰変異体、すなわち銅イオンの刺激に対して非感受性になった細胞を示している。復帰変異体は、観察した総細胞数のパーセンテージとして下記表に記載されている。
【０１０３】
2004516008.tif 000003
全ての復帰変異体がＳＵＡ７部位における遺伝学的変化に起因するものではない。又、ＵＢＲ１、又はＲＯＸ１遺伝子発現の銅刺激を除去することが可能である。しかしながら、これらの遺伝子のコントロールは全ての菌株において同一であるので、これらの遺伝子の銅刺激の全ての除去は、全ての菌株に共通する背景として現れている。実施例４の方法に従って処理された１９ＳＧ菌株における２４時間当たりの復帰変異頻度における変化は、本明細書中において開示されている方法に従い、酵母における遺伝子発現の変化により達成することができる改善を示している。
【０１０４】
（実施例６）：銅のイオンのコントロール下におけるＣＹＣ８−ＬｅｘＡリプレッサを含む酵母菌株の構築
下記手順を実施し、銅コントロール下において異種リプレッサを発現する酵母菌株を作成する。この菌株は、ＲＯＸ１ベースリプレッサ菌株の潜在的な問題を回避するものであり、該菌株は多面的な効果を有し、かつＲＯＸ１、及び金属イオンの毒性を含むものである。ＬｅｘＡベースリプレッサ系において、金属イオンの添加は、ＬｅｘＡ（ＬｅｘＡオペレータ）に関する細菌誘導認識配列を含む処理されたプロモータを含む組み換え遺伝子のみを抑制する。ＣＹＣ８−Ｌｅｘａ融合が示され、該ＬｅｘＡオペレータ配列が、該酵母菌株のプロモータに隣接配置されている場合に、酵母遺伝子の転写抑制を示す（Ｋｅｌｅｈｅｒ らの論文、 Ｃｅｌｌ ６８ ：７０９，１９９２）。
【０１０５】
この系は２種の構成部材を含む：（ｉ）銅の存在下で、ＬｅｘＡ、及びＤＮＡ結合活性が無いＲＯＸ１のフラグメントの間に、ＣＹＣ８−ＬｅｘＡ融合タンパク質を発現する酵母菌株、及び（ｉｉ）オープンリードフレームの開始位置の上流に導入された場合に、ＬｅｘＡにより全ての所望の標的遺伝子を抑制するＤＮＡフラグメントである。明白に、この事は、制限された量の配列情報が入手出来る場合であっても達成される。
リプレッサ融合タンパク質は、ＬｅｘＡの該ＤＮＡ結合性ドメイン（アミノ酸１〜８７）が、ＣＹＣ８の５’非翻訳領域から誘導されたアミノ酸２３個、並びに全ＣＹＣ８タンパク質（アミノ酸１〜９６６個の）Ｎ末端に融合する。そのハイブリットタンパク質はＴＲＰ１のような条件的に「不活発な」部位から発現される。それに代わり、融合タンパク質はＬｅｘＡのＤＮＡ結合性ドメインが、酵母ＡＮＢ１プロモータに存在するものように、もはやＲＯＸ１認識配列に結合しないように変異してしまっている、ＲＯＸ１タンパク質に融合する。
【０１０６】
前記ハイブリッドリプレッサタンパク質により、特定の遺伝子を制御可能にするために、全ての遺伝子の上流に挿入できる、遺伝的制御可能プロモータカセットを設計する。該プロモータカセットは正の選択に使用することができるＨＩＳ３のような遺伝子と隣接し、例えばＣＹＣ１のようなＵＡＳ含有酵母プロモータの上流に配置されたＬｅｘＡオペレータのコピーを１から数個含む。該挿入カセットは、図２Ａ−Ｃに示された方法と類似する方法で、シングル、又はダブルラウンドＰＣＲ戦略により作成することができる。この場合において、挿入を行う位置はプロモータ領域の上流であり、かつ翻訳開始部位ではない（図３）。
【０１０７】
制御可能なプロモータを下記のように、所定の酵母標的遺伝子の上流に統合するように改良する。４種のＰＣＲプライマーを、図２Ａ−Ｃに示されているように、対象となる遺伝子の５’末端に隣接するよう限られた配列データに基づき設計する。
（ｉ）プライマーＡは、対象の遺伝子のオープンリードフレームの開始点の１００〜２００塩基対の上流に、該遺伝子に向かう方向に配置する。
（ｉｉ）プライマーＢは該オープンリードフレームの５’末端内１００〜２００塩基対に、該遺伝子の５’開始部位の方向に向けて配置する。
（ｉｖ）プライマーＣ、及びＤは該遺伝的制御可能なプロモータカセットに対し相同的な配列、並びに各遺伝子に対し特異的な配列を含む。プライマーＣは、該プロモータカセットの３’末端、この場合ＣＹＣ１プロモータの３’末端、に対応するその５’最末端配列に含む。プライマーＣの３’の半分は、対象となるオープンリードフレームの５’末端に対応する配列を含む。プライマーＤの３’末端は、対象となる遺伝子の直上流の配列に相補的な配列からなる。プライマーＤの５’末端の半分は該プロモータカセットの左側最末端、この場合ＨＩＳ３遺伝子の３’に相補的な配列からなる。
【０１０８】
プライマーＣ、及びＤの典型的な配列は下記の通りである：
プライマーＣ： ５’−ＡＣＡＡＡＴＡＣＡＣＡＣＡＣＴＡＡＡＴＴＡＡＴＡＡＴＧＮＮＮＮＮＮＮ−３’（配列番号：１９）
プライマーＤ： ５’末端 ＨＩＳ３− ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ−３’
２セットのＰＣＲ反応を実施する。最初のセットにおいて、対象の遺伝子、及び５’隣接領域を含むＤＮＡのフラグメントをテンプレートとして使用し、かつ増幅をプライマーＡ、及びＤ、又はプライマーＢ、及びＣを使用して実施する。次いで得られたフラグメントを、プロモータカセット、開始ＰＣＲ産物、及びプライマーＡ、及びＤの双方を含む、ＰＣＲの第２ラウンドに使用する。これにより対象の遺伝子の直上流のＤＮＡを標的とするＤＮＡの一部により、測方に配置されているプロモータカセットを含む大きなフラグメントが得られる（図３）。
【０１０９】
酵母への形質転換、及び統合の選択に続き、対象となる部位に対する配列特異的組み換えで作成された安定な統合体は、ＰＣＲ、又はサザンブロット分析により、正の確認を行うことができる。この戦略は前記のＬｅｘＡ融合タンパク質による抑制可能な条件的部位を作り出す。
（実施例７）：遺伝子発現の銅イオン誘導抑制の殺菌、及び静菌効果のデモンステレーション
３種の異なる酵母細胞株を、ＣＵＹ１０６菌株をベースに作成した。該酵母のＣＤＣ１５，ＳＵＡ７、及びＥＲＧ１１遺伝子を銅のイオンの変化先に記載したように生育培地に対しにより抑制可能とした。
各菌株の生存性を、硫酸銅を含まないＹＰＤ培地上で細胞を希釈し、かつ植え付けることにより該生育培地に１ｍＭ硫酸銅の添加した後８時間に渡り、いくつかの時点で評価した。酵母菌株を集め、かつ希釈した時点で本来の硫酸銅含有培養培地１ｍｌあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）を測定するために、３０℃で４８時間培養した後、計数した。該ＣＦＵ／ｍｌ値を、ＣＦＵ／Ａ６００の生存率を得るため、ＹＰＤ培地上で各分割体を希釈し、かつＹＰＤ培地上に植え付けた時点で６００ｎｍ  （Ａ６００）で本来の硫酸銅含有生育培地を測定した吸光度で割った。ＣＦＵ／ Ａ６００の検出限界は約１×１０５である。図１１は該アッセイの結果を示し、ＳＵＡ７、及びＥＲＧ１１のようないくつかの遺伝子の発現の抑制が殺菌、すなわち酵母細胞を殺すことを示し、一方ＣＤＣ１５遺伝子のような他の遺伝子の発現の抑制は該酵母細胞に関する静菌効果のみを有し、その生育を抑えるが、しかし菌を殺すことは疑われる。
【０１１０】
（実施例８）：銅制御菌株を補完する
ＢＯＳ１の野生型、及び変異体をＰＣＲを用いて作成した。該野生型Ｂｏｓ１遺伝子を下記オリゴを使用する一工程反応における反応で、サッカロミセスゲノムＤＮＡから増幅した：
ＳｃＢｏｓｌ−１ （５’− ＧＣＧＧＣＴＣＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＣＴＣＴＣＡＡＣＡＴＴＧ−３’）（配列番号：２５） 及び
ＳｃＢｏｓｌ−２ （５’− ＧＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＡＡＧＧＣＴＴＡＴＴＧＣＴＧＣＧ−３’）（配列番号：２６）。
【０１１１】
クローンされた領域は、野生型ＢＯＳ１プロモータを含み、かつそれぞれクローン化を促進する５’、及び３’末端におけるＸｈｏｌ、及びＮｏｔ１制限部位を含む。変異アレイ ｂｏｓｌ−２００は、コドン９−１３０が欠けており、かつ４種のオリゴを用いる二工程のＰＣＲにより作成した。増幅の第１ラウンドにおいて、遺伝子の５’領域を下記オリゴを用いて増幅し：
ＳｃＢｏｓｌ−ｌ 及びＳｅＢｏｓ１ ｄｅＩｒ （５’−ＣＣＡＣＣＡＡＣＧＴＴＣＣＴＣＡＣＡＧＣＡＴＧＧＴＴＧＴＡＡＡＧＡＧＣ−３’）
（配列番号：２７）
かつ、該遺伝子の３’領域を下記ゴリゴを用いて増幅した：
ＳｃＢｏｓｌｄｅｌｆ （５’−ＡＧＧＡＡＣＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＣＧ−３’）（配列番号：２８）及びＳｃＢｏｓｌ−２。
【０１１２】
増幅の第２ラウンドにおいて、第１ラウンドの増幅の２種の生成物をテンプレートとして使用し、かつプライマーＳｃＢｏｓｌｌ、及び ＳｃＢｏｓ１−２を使用して増幅した。該遺伝子を酵母発現プラスミドｐＲＳ３１５中にクローンした（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ， Ｒ．Ｓ． 及びＨｉｅｔｅｒ， Ｐ．， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２２ １９−２７，１９８９）。該プラスミドはＬＥＵ２選択性マーカ、及び該プラスミドの数を細胞当たり１、又は２コピーに制限する機能を有するＣＥＮ配列を含んでいる。該ＢＯＳ１銅制御菌株Ｙ３６０を、野生型ＢＯＳ１ｐ及びｂｏｓ１−２００変異タンパク質を発現するｐＲＳ３１５を用いて形質転換した。
【０１１３】
３種の菌株Ｙ３６０、Ｙ３６０は野生型ＢＯＳ１を発現し、かつｂｏｓｌ−２００変異タンパク質を発現するを、１ｍＭ  ＣｕＳｏ４  を含むＣＳＭプレート上に単一コロニーを形成するために線上に植え付けた。該プレートを３０℃で３日間培養し、コロニーを形成させた。生育実験の補完の結果を図１４ａ−ｃに示す。
銅の存在しない条件下で、ＢＯＳ１ｐの水準は正常に生育させたＹ３６０銅制御菌株、及び細胞において十分であった。銅の存在下において、ＢＯＳ１タンパク質のレベルは低下し、かつ該細胞は生存不能であった。従って、ｐＲＳ３１５ベクターのみを含むＹ３６０菌株は銅の存在下で死滅した。野生型ＢＯＳ１を発現するＹ３６０菌株は銅があっても生育可能であった。また、変異ｂｏｓ１−２００タンパク質を発現するＹ３６０も銅の存在下で生育可能だった。この結果、ｂｏｓ１−２００変異はこれらの条件下で涸渇しないことを示唆している。一般にこれらの適用可能な分析では補完するその能力に関し所定の標的タンパク質の領域をテストすることができる。この同じ方法を利用して、非相同遺伝子をプラスミドに挿入し、かつ本明細書中に記載した方法に従って本発明の所定の菌株の形質転換を実施することにより、Ｃｕ制御変異標的遺伝子を補完する能力に関し、非相同的なｃＤＮＡをテストすることができる。
【０１１４】
（実施例９）：化合物処理細胞に関する表現型コピーコントロール
２種の異なる酵母細胞菌株を、ＣＵＹ１０６菌株をベースに構築した。酵母ＴＡＦ１４５（Ｙ００２）、及びＲＰＣ３４（Ｙ０３８）遺伝子を、先に記載したように、生育培地に銅イオンを添加することにより制御可能にした。親ＣＵＹ１０６菌株、及びＴＡＦ１４５菌株をコントロールとして使用した。ＲＰＣ３４は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのＣ３４サブユニットをコードする必須遺伝子である。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩは、ｔＲＮＡ，５ｓＲＮＡ、及び若干の他の小ＲＮＡの合成に応答する多重サブユニット酵素である。Ｒｐｃ３４温度感受性、及び冷感受性変異体は、ｔＲＮＡ合成において欠陥を有することが示されている（Ｓｔｅｔｌｅｒ， Ｓらの論文、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７， ２１３９０−２１３９５，１９９２；及びｂｒｕｎ， Ｌ．，らの論文 ＥＭＢＯ Ｊ．１６， ５７３０−５７４１ １９９７）。ＴＡＦ１４５は、一般的な転写ファクターＩＩＤ（ＴＦＩＩＤ）構成要素であり、かついくつかのｍＲＮＡの合成に要求されるが、ｔＲＮＡ合成には必要とされない、この実験に使用された全ての菌株は、ｔＲＮＡ前駆体の生成をモニターすることにより該培地に対し銅を添加した時点のｔＲＮＡの産生に関し、アッセイを行った。
【０１１５】
菌株及び手順：
酵母菌株
ＣＵＹ１０６ （野生型）： Ａｃｅ−ＲＯＸＩ， Ａｃｅ−ＵＢＲＩ， Ｄｓｌｆｌ， ｈｉｓ３Ｄ２００，ｌｅｕ２−３，１１２， ｕｒａ３− ５２
Ｙ０３８（ＲＰＣ３４）：Ａｃｅ−ＲＯＸＩ，Ａｃｅ−ＵＢＲＩ，Ｄｓｌｆｌ，ｈｉｓ３Ｄ２００，ｌｅｕ２−３，１１２，ｕｒａ３−５２，
ＡＮＢｌｐＵｂ−Ｒｐｃ３４：：ＨＩＳ３
Ｙ００２ （ＴＡＦ１１４５）： Ａｃｅ−ＲＯＸＩ， Ａｃｅ−ＵＢＲ１， Ｄｓｌｆｌ， ｈｉｓ３Ｄ２００， ｌｅｕ２−３，１１２， ｕｒａ３−５２，
ＡＮＢ１ｐ−Ｕｂ−Ｔａｆｌ １４５：：ＨＩＳ３
酵母菌株の育成
１．酵母抽出ペプトン及びブドウ糖培地「ＹＰＤ」中で３０℃で一晩、酵母菌株を生育させる。
【０１１６】
２．朝にこの培養体をＯＤ６００＝０．１となるように希釈し、かつ３０℃で１時間生育させる。
３．ＯＤ６００（約０．２と等しい）を測定し、かつ・時間唐ノおける各培養の分割を維持する。各分割体を４℃で５，０００ｒｐｍで５分間回転させ、その上清を破棄した。該ペレットを氷冷水１ｍｌに再懸濁する。これを透明１．５ｍｌマイクロ遠心分離チューブに移した。４℃で１０秒間マイクロ遠心分離し、かつ上清を除去した。チューブをドライアイス上に置き該ペレットを凍らせ、かつ次いで貯蔵するために−８０℃で移す。
【０１１７】
４．養体を二分割し、一半を０．７５ｍＭ  ＣｕＳＯ４に移し、双方の半量を、３０℃で生育継続させる。
５．ＣｕＳＯ４（又は化合物）を導入した後、３０分、１時間、２時間、及び４時間（又は３．５時間）の時点で、それぞれの培養体を回収する。細胞を氷冷水１ｍｌ中で洗浄し、ドライアイスの上にチューブを置くことにより、該ペレットを氷結する。−７０℃で貯蔵する。
熱酸性フェノールを用いる酵母ＲＮＡの調製
１．氷上でペレットを解凍する。ペレットをＴＥＳ溶液（１０ｍＭ トリス− Ｃｌ， ｐＨ ７．５； ｌＯｎＭ ＥＤＴＡ；０．５％ ＳＤＳ）４００ｕｌ中に再懸濁する。酸性フェノール（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）４００ｕｌを加え、１０分間強くうずまき撹拌する。時折、短くうずまき撹拌しながら６５℃で３０〜６０分間培養する。
【０１１８】
２．５分間氷上に置く。４℃で最高スピードで５分間マイクロ遠心分離する。
３．水性（上部）相を透明１．５ｍｌマイクロ遠心分離チューブに移し、酸性フェノール４００ｕｌを加えて、かつ激しくうずまき撹拌する。前記工程２を繰り返す。
４．水相を新しいチューブに移し、かつクロロフォルム４００ｕｌを加える。激しくうずまき撹拌し、かつ４℃で最高スピードで５分間マイクロ遠心分離する。
５．水相を新しいチューブに移し；３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．３）４００ｕｌ、及びかつ氷冷１００％エタノール１ｍｌを加えて沈殿させる。４℃で最高スピードで５分間マイクロ遠心分離する。氷冷７０％エタノール１ｍｌ中において短くうずまき撹拌することによりＲＮＡペレットを洗浄する。先に記載したのと同様にマイクロ遠心分離を行いＲＮＡをペレット化する。
６．Ｈ２Ｏ  ５０ｕｌ中でペレットを再懸濁する（再懸濁を行うために必要ならば６５℃に加熱する）。ＯＤ２６０、及びＯＤ２８０を測定することにより、分光光学的に濃度を測定する。−２０℃で貯蔵する。（ＲＮＡ濃度＝ＯＤ２６０／０．００２５ｕｇ／ｍｌ）
７．全てのサンプル中におけるＲＮＡ濃度を２ｕｇ／ｕｌに均等化する。
８．各ＲＮＡサンプル２ｕｌを、０．７％アガロースゲル上を移動させて、等しいＲＮＡ濃度を視覚化する。
Ｓ１ヌクレアーゼ  アッセイ
１．ｔＲＮＡオリゴヌクレオチド  プローブとラベリング
Ｈ２Ｏ ２ｕｌを非標識５ｕＭ（マイクロモル）のオリゴｔＲＮＡ溶液と混合する。
（５’−ＧＧＡＡＴＴＴＣＣＡＡＧＡＴＴＴＡＡＴＴＧＧＡＧＴＣＧＡＡＡＧＣＴＣＧＣＣＴＴＡ−３’）（配列番号：２９）。この配列は、短命前駆体ｔＲＮＡの５’イントロン−エキソン結合体と相補的である。（Ｃｏｒｍａｃｋ 及び Ｓｔｒｕｈｌ， Ｃｅｌｌ， ６９， ６８５−６９６，１９９２）、かつＳ１ヌクレアーゼ  アッセイを実施するために、ＲＮＡに非相補的な３’末端に６ヌクレオチドを含む。
７０℃で５分間培養し、氷上で冷却し、かつ遠心分離し底部にサンプルを集める。該チューブに下記を加える：
２．５ｕｌ ｇａｍｍａ−３２Ｐ−ＡＴＰ （＞５０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ， １０ ｕＣｉ／ｕｌ）
１０ｕｌ  １０ｘ タンパク質キナーゼ ＰＮＫ緩衝液 （ＮＥＢ）
１ ｕｌ ＰＮＫ （ＮＥＢ）。
３７℃で４５分間培養。
７０℃で１５分間培養し、氷上、又は−２０℃で長く貯蔵する。
２．ハイブリダイゼーション
反応当たりＲＮＡ４０ｕｇを使用する。
ＲＮＡ
５×ハイブリダイゼーション緩衝液（１．５ Ｍ ＮａＣｌａ； ５ｍＭ ＥＤＴＡ； １９０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ， ｐＨ ７．０） １ｕｌ
５％トリトンＸ−１００  １ｕｌ
標識化プローブ１ｕｌ
Ｈ２Ｏ全体量が５０ｕｌになるように加える
７５℃で１５分間培養し、かつ次いで５５℃で４時間、又は一晩培養する。
【０１１９】
３．Ｓ１ヌクレアーゼ  消化
ハイブリダイゼーション終了後、５０ｕｌのハイブリダイゼーション混合物に下記の試薬を加える：
１０ｘ  Ｓ１緩衝液５０ｕｌ（３Ｍ ＮａＣｌ； ２０ｍＭ ＺｎＯＡｃ； ６００ｍＭ ＮａＯＡｃ， ｐＨ ４．５）
５％トリトンＸ−１００  ２ｕｌ
Ｈ２Ｏ  ４００ｕｌ
Ｓ１ヌクレアーゼ １５０ユニット（０．３７５ｕｌ ｏｆ ４０ＯＵ／ｕｌ  Ｓ１、ベーリンガーマンハイム社製）
３７℃で３０分間培養する。
【０１２０】
Ｈ２Ｏ  キャリアベーカ酵母ｔＲＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）５ｕｌ、及び０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  （ｐＨ８．０）５ｕｌを加え、かつ１００％エタノール１ｍｌを用い、−７０℃で３０分間かけ沈殿させる。マイクロ遠心分離機に２０分間かけ、上清を除き、かつ１０〜１５分間かけベンチトップ上でペレットを乾燥させる。シークエンシングローディング緩衝液１２ｕｌを加え、１００℃で５分間加熱し、かつ氷上に５分間置く。１０％ＴＢＥ−ウレア  ゲル（ＢＩＯＲＡＤ）上に４ｕｌ載せる。２００Ｖで２０分間泳動する。
【０１２１】
８０℃で２時間真空乾燥機においてゲルを乾燥する。オートラジオグラフィにより結果を調べる。
図１５はＣｕＳＯ４を添加した場合に、ＲＮＡ合成が、Ｃｕ制御可能ＲＰＣ３４菌株を（ＹＯ３８）において低下することを示す。ｔＲＮＡ合成はコントロールＣＵＹ１０６菌株、又はＴＡＦ１４５制御可能菌株（Ｙ００２）においてＣｕを添加した場合には減少しなかった。この結果は、ｔＲＮＡ合成におけるＲＰＣ３４の機序の公開された報告と一致し（Ｂｒｕｎ らの論文 ＥＭＢＯ Ｊ， １６：５７３０，１９９７）、かつ本発明の制御可能な菌株を用いて、抗菌性化合物を単離する場合に、予期された表現型に関する情報を提供することができる。
【０１２２】
（実施例１０）：薬剤感受性プロファイリング
Ｓ．セレビシアにおいて、必須遺伝子ＡＬＧ７は酵素、ドリコール−Ｐ−依存  Ｎ−アセチルグルコースアミン−１−Ｐトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）をコードする。該ＧＰＴ酵素はドリコール  リンク  オリゴサッカライド  Ｎ−グリコシレーションの組み立てにおける最初の工程を開始する。Ｋｕｋｕｒｕｚｉｎｓｋａらの論文（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２４７（１）５１−５９（１９９５））は、ＡＬＧ７発現の制御低下が、低下したＮ−グリコシレーション、及びツニカマイシンに対する過剰反応性をもたらすことを示した。さらに最近 Ｇｉａｅｖｅｒ らの論文は、ツニカマイシンに対するＡＬＧ７／ａｌｇ７ヘテロ接合性ディプロイドＳ．セレビシア菌株の感受性を増加させることを示した。以下に記載する分析は、ドリコール−Ｐ−依存Ｎ−アセチルグルコースアミン−１−Ｐトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）をコードする遺伝子は、銅の存在により制御が低下する場合、ツニカマイシンに対する感受性が増加したことを示した。該研究は必須遺伝子の投与量低下が遺伝子産物に対し、作用する化合物に対し感受性を獲得する一群を生じさせる。
【０１２３】
単一９６ウェルアッセイプレートにおいて、硫酸銅の連続的希釈を右から左に作成する。同一プレート上において、化合物の連続希釈を対向軸に沿って作成し、最終的な化合物、及び銅濃度を与える。各ウェルに１０３細胞／ｍｌを植える。酵母細胞の生育を、３７℃で４８時間培養した後、目視で評価した。
先に記載したようにプレートを設定し、野生型銅制御ＡＬＧ７、及び銅制御ＣＨＳ３菌株を植えた。ＣＨＳ３はキチンシンターゼをコードし二次コントロールを提供する。３７℃で４８時間の培養に続き、プレートを試験して生育を評価した（図１６）。該研究は銅濃度の増加につれてＡＬＧ７銅制御細胞のみがツニカマイシンに関する感受性を増加することを示した（図１６パネルａ）。非標的特異的遺伝子が、制御が低弱化、すなわちＣＨＳ３（図１６パネルｂ）、又は野生型（図１６パネルｃ）コントロールの制御が弱まっている場合、ツニカマイシンに対する感受性の増加は見られなかった。これらのデータは、銅が抗菌性薬剤、ツニカマイシンに共同的に作用し、かつツニカマイシン感受性の増加がＡＬＧ７コード標的の減少に起因することを示している。
【０１２４】
また、薬剤標識として先に確認された制御を行うために処理された他の菌株も試験した。銅制御遺伝子、該標的タンパク質の機能、及び試験を行った薬剤を下記の表に示す。ＡＬＧ７、及びツニカマイシンの実験を正のコントロールとしてくり返した。
【０１２５】
【表１】
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【０１２６】
この分析の結果を図１７パネルａ−ｄに示す。それぞれの場合において、該菌株は銅濃度の増加に伴い、該化合物に対する感受性の増加を示した。これらの実験は、本発明の菌株を使用して、抗菌性化合物に関する標的遺伝子を同定することができ、かつ抗菌性薬剤、及びその活性の機序を分析する手段を提供する。抗菌性標的産物の急速な減少は、薬剤に対する感受性の増加をもたらし、かつ抗菌性薬剤が働く可能な機序の分析に役立つ表現型を提供する。
【０１２７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、流酸銅の濃度増加における酵母菌株ＣＴＹ１４５、及びＺＭＹ６０の生育のグラフによる表示である。ＣＴＹ１４５はＺＭＹ６０よりも銅に対し４倍以上寛容である。
【図２】
図２Ａ−Ｃは関心の対象の全ての遺伝子に関する銅誘導性エレメントの構築に使用する本発明のシングル−又はダブル−ラウンドＰＣＲ戦略の図解表示である。シングルラウンドＰＣＲに関し、プライマー対１、及び２ａ、又は２ｂを用いて形質転換ＤＮＡを作成する。ダブルラウンドＰＣＲに関し、プライマー対２ａ、又は２ｂを、該ＡＴＧ開始部位の４００−１０００ｂｐ上流、又は下流に配置されている配列に対応する追加のプライマーを使用して、ついでＰＣＲの第２ラウンドにおいて使用して形質転換ＤＮＡを生成する長いプライマーを調製する。
【図３】
図３はその使用において関心の対象のタンパク質をコードする遺伝子をＬｅｘＡによって制御され得るようにできるＰＣＲプライマー設計戦略の図解的表示である。その上段パネルは対象の遺伝子の上流に挿入され得るプロモータコンプレックスの構造を示す。該中断パネルは使用し得るＰＣＲプライマーに対応する配列の場所を示す。該下段パネルは酵母に導入し得る対象の遺伝子と融合されたプロモータカセットを示す。
【図４】
図４Ａ−Ｂは、ＺＭ１９５プラスミドのヌクレオチド配列（配列番号：２０）を示す。
【図５】
図５Ａ−Ｄは、ＺＭ１９７プラスミドのヌクレオチド配列（配列番号：２１）を示す。
【図６】
図６は、Ｓ．セレビシアを形質転換するシャッフルされた遺伝子の生成に使用する該ＰＣＲ戦略の図解的説明である。
【図７】
図７は、Ｓ．セレビシアにシャッフルされた遺伝子を導入する形質転換機序の図解的説明である。
【図８】
図８は、ｐＣＵ１９Ｓｒｆベクター（配列番号：２２）の制限酵素地図であり、独自の制限酵素切断部位を示す。
【図９】
図９は、酵母によるバイオミネラリゼーションに関するＳＬＦ１遺伝子の欠失の効果を示す細胞フィルター写真である。
【図１０】
図１０は、ＳＬＦ１遺伝子を発現し、及び発現しない酵母菌株の生育に対する硫酸銅の効果を示すグラフである。
【図１１】
図１１は、硫酸銅の存在下において生育したコントロール、及び組み換え酵母菌株に関する生育カーブを示すグラフである。
【図１２】
図１２は、薬剤感受性希釈アッセイの図解的例である。
【図１３】
図１３は、薬剤感受性プレートアッセイに関する設定の例である。
【図１４】
図１４は、ＢＯＳ１遺伝子の野生系、変異、及びＣＵ制御形態を発現する酵母の生育に対する硫酸銅の効果を示す写真である。
【図１５】
図１５は、ＲＰＣ３４、及びＴＡＦ１４５、Ｃｕ−制御された酵母菌株におけるｔＲＮＡ合成に対する硫酸銅の効果を示すノーザンプロット分析を提供する。
【図１６】
図１６は、Ｃｕ−制御ＡＬＧ−７（パネルａ）、及びＣＨＳ３（パネルｂ）、及び野生系（パネルｃ）を発現する菌株におけるツミカマイシンに対する酵母菌株の感受性に対する硫酸銅の濃度上昇の効果を示すマイクロプレートの一連の写真である。
【図１７】
図１７は、様々な抗菌性化合物に対する酵母菌株の感受性に対する硫酸銅の濃度上昇の効果を示す一連の写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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