(57)【要約】【解決手段】  エストロゲンベータ受容体アゴニストである化合物を血管反応性亢進を患ったまたはその危険性がある患者に対して投与する工程を含む、血管反応性亢進を予防または治療する方法。前記投与は皮膚への局所的なものであることが好ましい。
2006509758.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管反応性亢進の発生率と重症度を軽減することを必要とする患者において血管反応性亢進の発生率と重症度を軽減する方法であって、
エストロゲンベータ受容体アゴニストを前記患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項２】
請求項１の方法において、前記患者の前記血管反応性亢進は、冠動脈血管攣縮によって発症されるものである。
【請求項３】
請求項１の方法において、前記患者の前記血管反応性亢進は、末梢動脈の反応性亢進によって発症されるものである。
【請求項４】
請求項１の方法において、前記エストロゲンベータ受容体アゴニストは、５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオールである。
【請求項５】
請求項１の方法において、前記エストロゲンベータ受容体アゴニストは、エストロゲンベータ受容体アゴニスト活性を有する５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール誘導体である。
【請求項６】
請求項５の方法において、前記５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール誘導体は、５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール−３ヘミコハク酸塩、５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール−１７−硫酸ナトリウム塩、５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール−３−酢酸塩、５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール−１７−酢酸塩、５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール−二酢酸塩、５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール−二安息香酸塩、５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール−ジヘミコハク酸塩、５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール−ジプロピオン酸塩、および５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール−１７−ヘキサヒドロ安息香酸塩から成る群から選択されるものである。
【請求項７】
請求項１の方法において、前記エストロゲンベータ受容体アゴニストは、エピエストリオールである。
【請求項８】
請求項１の方法において、前記エストロゲンベータ受容体アゴニストは、ゲニステインまたはジアリールプロピオニトリルである。
【請求項９】
請求項４の方法において、投与される５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオールの量は、３０〜３０００ｐｇ／ｍｌの血清濃度を得るのに十分な量である。
【請求項１０】
請求項９の方法において、投与される５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオールの量は、３０〜３００ｐｇ／ｍｌの血清濃度を得るのに十分な量である。
【請求項１１】
請求項１の方法において、前記エストロゲンベータ受容体アゴニストは、ホルモン補充療法と共に同時投与されるものである。
【請求項１２】
請求項１１の方法において、前記ホルモン補充療法は、エストロゲン、アンドロゲン、およびプロゲスチン療法から成る群から選択されるものである。
【請求項１３】
請求項１の方法において、前記エストロゲンベータ受容体アゴニストは、皮膚への局所適用によって患者に投与されるものである。
【請求項１４】
請求項１３の方法において、前記エストロゲンベータ受容体アゴニストは、液体、クリーム、ジェル、ローション、軟膏、および経皮貼布から成る群から選択される局所用製剤中に含まれるものである。
【請求項１５】
請求項１の方法において、前記エストロゲンベータ受容体アゴニストは、皮膚への局所性投与以外によって、患者に投与されるものである。
【請求項１６】
請求項１５の方法において、前記投与は、経口、直腸、膣、局所、舌下、鼻、皮内、吸入、または持続性移植片投与経路によって患者に投与されるものである。
【請求項１７】
血管反応性亢進を患ったまたはその危険性がある患者に対して、エストロゲンベータ受容体アゴニスト化合物を投与するためのキットであって、
容器と、前記容器内にエストロゲンベータ受容体アゴニストを含む局所用製剤と、血管反応性亢進の重症度を予防または軽減するのに効果的な前記エストロゲンベータ受容体アゴニストの量を提供する前記製剤の量を調剤するための使用説明書とを含む、キット。
【請求項１８】
請求項１７のキットにおいて、前記エストロゲンベータ受容体アゴニストは、５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオールである。
【請求項１９】
請求項１７のキットにおいて、前記エストロゲンベータ受容体アゴニストは、エストロゲンベータ受容体作用活性を有する５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール誘導体である。
【請求項２０】
請求項１９のキットにおいて、前記５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール誘導体は、５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール−３ヘミコハク酸塩、５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール−１７−硫酸ナトリウム塩、５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール−３−酢酸塩、５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール−１７−酢酸塩、５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール−二酢酸塩、５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール−二安息香酸塩、５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール−ジヘミコハク酸塩、５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール−ジプロピオン酸塩、５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール−１７−ヘキサヒドロ安息香酸塩から成る群から選択されるものである。
【請求項２１】
請求項１７のキットにおいて、前記エストロゲンベータ受容体アゴニストはエピエストリオールである。
【請求項２２】
請求項１７のキットにおいて、前記エストロゲンベータ受容体アゴニストはゲニステインまたはジアリールプロピオニトリルである。
【請求項２３】
請求項１７のキットにおいて、前記局所用製剤は、液体、クリーム、ジェル、ローション、軟膏、および経皮貼布から成る群から選択されるものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発生率あるいは重症度を軽減する、および冠動脈反応性のような冠動脈疾患、脳梗塞のような脳血管疾患、および間欠性跛行またはレイノー病のような末梢血管障害を含む疾患を治療あるいは予防する、化合物の使用に関連するものである。
【背景技術】
【０００２】
冠動脈心臓病、脳梗塞、およびその他の血管疾患を含む心血管疾患は、経済先進国の男女の主な死亡原因である。心血管疾患の最も一般的な致死形態は虚血性心疾患である。虚血性心疾患は、主に冠動脈のアテローム性動脈硬化症によって引き起こされると一般的には考えられている。これは、動脈の内膜においてプラークを形成し、通路（チャネル）の狭窄が起こり、その結果心臓への血流が損なわれる病気である。
【０００３】
虚血性心疾患の危険性増加は、閉経後または卵巣切除した女性で観察され、重要な医学的課題を提示している。虚血性心疾患は、更年期以降の女性の主な死亡原因であり、卵巣ステロイドホルモンの喪失の重要性に関係している。
【０００４】
高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ）の低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）に対する比が高いことにより、血小板の形成が低下する、あるいは場合によっては逆転するということが理解されて以来、血流におけるこの比を高めようと試みることにより、虚血性心疾患を抑制することが戦略となっている。卵巣エストロゲンステロイドホルモンであるエストラジオールは、前記ＨＤＬ／ＬＤＬの比を高めることが観察されており、さらに今までの研究によって、更年期以降の女性のためのエストロゲン補充療法が、冠状動脈疾患、心筋梗塞、関連する心血管系疾患の発生率を５０％まで抑制することが示されている。
【０００５】
血管攣縮は、貫壁性心筋虚血を導き、突然心臓死を招く可能性がある、冠状動脈の筋肉の異常に強くかつ持続性の収縮である。心血管疾患における冠攣縮性狭心症の役割は、今もなお議論の余地があり、心血管疾患治療の取り組みは、冠攣縮性狭心を軽減する方法に重点が置かれていない。それどころか、冠攣縮性狭心症は、例えばアテローム性動脈硬化症とその他の構造的損傷によって生じるような局部的な血管の損傷に起因し、長期にわたり心血管疾患を治療するには、動脈硬化性プラークを予防する必要であり、血管攣縮を防ぐために治療をする必要はないと一般的に信じられている。
【０００６】
米国特許第６，０５６，９７２号公報（この参照により本明細書に組み込まれ、以下「ハームスメイヤー（Ｈｅｒｍｓｍｅｙｅｒ）特許」と称する）において、ハームスメイヤーは、プロゲステロンの値が低いと、プロゲステロン単独あるいはエストラジオールとの併用によって、冠動脈に直接影響することにより、冠動脈反応性を阻害することができ、従って特定の有害な心血管系現象と疾患を阻害するために使用できると開示している。プロゲステロンは、エストラジオールと併用すると、対立しないエストロゲンの副作用の発生率を劇的に軽減する。ハームスメイヤーは、プロゲステロンを、少なくとも１日４時間で、プロゲステロンの血中濃度が０．１ナノグラム／１ｍｌから４ナノグラム／１ｍｌ未満の間になる量を投与することにより、冠動脈血管攣縮が予防することができ、前記の量は、プロゲステロンが１ｍｌあたり６ナノグラム未満のピーク値を生じるものであると開示している。さらに、ハームスメイヤーは、プロゲステロンが既存の血管攣縮の治療に使用してもよいことを開示している。
【０００７】
ハームスメイヤーは、エストロゲンの存在下で、プロゲステロンが欠乏している場合、血小板で見出される濃度において二つの主な血小板放出生成物、セロトニンとトロンボキサンＡ２の相乗的な組み合わせによって、長期間（５分より長い）の肥大血管収縮が確実に始まることを開示している。ハームスメイヤーはこれらの二つの化合物を更年期のサルに投与すると、ヒトの動脈血管収縮の症状に類似した極めて強い局所的な収縮が生じることを開示している。これらの重度の誘発性血管収縮は、エストラジオールおよび／またはプロゲステロンの投与により予防、あるいは終結させられる。
【発明の開示】
【発明の効果】
【０００８】
本明細書で用いる「予防する」という用語は、ある病気の発生を阻害することを意味しており、つまり病気の発生率または発生頻度を低減することを意味する。「予防する」という用語は「予防的に治療する」という用語と同じ意味で用いられてもよい。「予防する」という用語は、本明細書において方法に関して用いられる場合、前記方法を使用すると前記病気が二度と発生しないという保障をするものではなく、むしろ前記方法が病気の発生を阻害し、病気の発生率あるいは頻度を軽減することを意味、あるいは暗示する。
【０００９】
エストロゲン受容体ベータアゴニストは、例えば更年期後の女性などのように内因性エストロゲンの重要な原料（ソース）が欠乏している特定の人を含む個人において、例えば冠攣縮性狭心症などの血管反応性亢進の発展を抑制するということが驚くべきことに発見されている。本発明の方法の一実施形態によると、冠動脈血管攣縮を含む血管反応性亢進の発生率または重症度は、それらを必要とする患者に対して、エストロゲン受容体ベータアゴニストを有効量投与することによって軽減され、従って、冠動脈血管攣縮の形成を含む反応性亢進と定義する深刻な長期血管収縮は抑制され、心筋虚血の発生率および／または重症度が軽減される。好ましい実施形態において、前記エストロゲン受容体ベータアゴニストは、５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオールであり、本明細書では「３βＡジオール」としても称される。本出願において、本発明は３βＡジオールを用いて説明される。しかしながら、これは単に実例であり、本発明は３βＡジオールだけでなく、エストロゲン受容体ベータアゴニスト活性を有する３βＡジオールの誘導体、および例えばエピエステリオールなどのその他のステロイド、および非ステロイドにも関連することが理解される。３βＡジオールの誘導体型は、５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール−３ヘミコハク酸塩、５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール−１７−硫酸ナトリウム塩、５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール−３−酢酸塩、５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール−１７−酢酸塩、５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール−二酢酸塩、５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール−二安息香酸塩、５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール−ジヘミコハク酸塩、５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール−ジプロピオン酸塩、および５α−アンドロスタン−３β，１７β−ジオール−１７−ヘキサヒドロ安息香酸塩、および既知あるいは今後発見され得るあらゆるエストロゲン受容体ベータアゴニストを含むがこれに限定されず、特にエストロゲン受容体アルファを超えて選択的であるエストロゲン受容体ベータアゴニストに関連する。本発明に適したエストロゲン受容体ベータアゴニストの例としては、エピ−エストリオール（エストリオールのα異性体）、ゲニステイン、およびジアリールプロピオニトリル（ＤＰＮ）を含む。
【００１０】
前述の有効量は、例えば冠動脈血管攣縮の重症度を軽減することによって、重要臓器への血流不全を導く血管反応性を予防あるいは軽減する、あるいは冠動脈攣縮の存在を改善あるいは終結させるのに十分な量である。３βＡジオールの好ましい量は、それを必要とする対象者に対して投与する場合、血清濃度が３０〜３０００ｐｇ／１ｍｌの間となる量であり、最も好ましくは３０〜３００ｐｇ／１ｍｌの間となる量である。この血清濃度は、投与量が、例えば冠動脈血管攣縮、脳梗塞、または間欠性跛行など、虚血を示すような反応性亢進の重症度を予防または軽減するのに十分であれば、必要に応じてこの範囲より高いかまたは低くてもよい。もちろん、３βＡジオール以外のエストロゲンベータ受容体アゴニストの投与量は、投与される正確なエストロゲンベータ受容体アゴニストによる上記範囲と異なってもよい。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、例えば反応性を軽減あるいは正常化するのに効果的な３βＡジオールなど、エストロゲン受容体ベータアゴニストをある量投与することによる、血管反応性亢進を抱えた患者を治療する方法である。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、例えば３βＡジオールなどのエストロゲン受容体ベータアゴニストを、それを必要とする対象者に対して投与するためのキットである。前記キットは、容器を収容したパッケージと、容器の中にエストロゲン受容体ベータアゴニストを含む局所用製剤と、使用説明書とを含む。前記使用説明書は、例えば局所性クリームの塗布など、皮膚に局所的に塗布する場合、血管反応性亢進の重症度および虚血の傾向を予防あるいは軽減するのに効果的なエストロゲン受容体ベータアゴニストの量を提供する製剤の量を調剤するためのものである。前記キットの構成要素は、局所用製剤の測定量を調剤するための取り出し容器（ディスペンサー）である。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、経皮貼布を用いることによって患者にエストロゲン受容体ベータアゴニストを投与するためのキットである。前記パッチはハウジングと、ハウジングの容器（Ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）と、ヒト対象者の表皮に対して配置するための容器に隣接したハウジングに付着した膜と、前記膜を対象者の表皮に保持するためのハウジングに付着した粘着剤とを含む。前記キットは血管反応性亢進および虚血を治療するための前記パッチを用いるための使用説明書を含むのが好ましい。担体中のエストロゲン受容体ベータアゴニストは、容器中に含まれており、前記パッチは、長期にわたる血管収縮と虚血の発生率または重症度を軽減するのに効果的なエストロゲン受容体ベータアゴニストの血中濃度を達成するように、ある量のエストロゲン受容体ベータアゴニストを対象者の表皮に運ぶように構成され準備されている。
【００１４】
本発明の実施形態のいずれにおいても、エストロゲン受容体ベータアゴニストは、同時あるいは別々の投与で、エストラジオールなどの女性ホルモン（エストロゲン）、テストステロンなどの男性ホルモン（アンドロゲン）やそれらの誘導体、あるいはプロゲステロンなどのプロゲスチンのような、ホルモン補充療法と一緒に適用されても良い。
【００１５】
好ましい化合物である３βＡジオールおよびその誘導体を含む本発明のエストロゲン受容体ベータアゴニストは、例えば内膜過形成、血管再狭窄、血管形成後増殖、レイノー病、閉塞性血栓血管炎（バージャー病）、同種移植血管障害（心臓および腎臓の移植において発生する合併症など）、糖尿病性血管症、および高血圧血管障害など、血管増殖異常の予防と治療において効用を有する。
【００１６】
本発明のこれらと他の観点は、以下の記載と本出願の添付の一部分により詳しく記載されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
米国特許第６，０５６，９７２号公報のハームスメイヤーの開示のその全て、特に（１）本発明のキットがプロゲステロンの代わりにエストロゲンベータ受容体アゴニストを含むことを除いてはハームスメイヤーの特許のものと実質的に同一であるキット、および（２）本発明に適用できるｉｎ  ｖｉｖｏ実験はプロゲステロンおよび／またはエストロゲンの代わりにエストロゲンベータ受容体アゴニストを用いていることを除いては、ハームスメイヤー特許の開示と実質的に同一である、血管反応性亢進の重症度を予防または軽減する有効性、あるいは長期にわたる血管収縮および虚血を終結する有効性を測定した実施例１および２におけるｉｎ  ｖｉｖｏ実験の方法、の開示は、本明細書に組み込まれる。
【００１８】
本発明は、血管反応性に関連しており、さらに一観点において、例えば冠動脈攣縮などの血管反応性亢進と虚血とを予防または治療するためのエストロゲンベータ受容体アゴニストの使用を含み、従って心血管疾患を予防する。本明細書で用いられる心血管疾患とは、心筋梗塞、虚血性心疾患、心臓麻痺、脳梗塞、狭心症、および末梢血管疾患を意味する。本明細書で用いられる血管反応性とは、適用される血管収縮薬の刺激に対する動脈の反応の振幅と持続時間の程度である。本発明によると、血管を収縮させる物質に対して、例えば冠動脈あるいは末梢動脈などの動脈の反応性を軽減するための方法が提供され、従って、冠攣縮性狭心症を含む長期にわたる血管収縮に起因する虚血を予防または治療する。従って本発明の前記方法は、発生率を軽減するように虚血を予防するように、または、例えば血管収縮性物質に対する局所的血管反応性亢進に起因すると仮定される、５分以上、または１５分もしくはそれ以上もの異常に長い持続期間の病巣性あるいは広汎性の狭窄による虚血を軽減するように適応される。
【００１９】
動脈反応性は、間接的または直接的に測定できる。間接的な測定手段は、例えば血管平滑筋細胞のセロトニン（５ＨＴ）およびＵ４６６１９などのトロンボキサンＡ２模倣薬に対する応答性などの細胞の反応性を含み、本明細書とハームスメイヤー特許で記載したようにｉｎ  ｖｉｔｒｏに適用される。直接的な測定手段は、例えばｉｎ  ｖｉｖｏにおける機械的損傷、またはセロトニンとＵ４６６１９の組み合わせを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ反応性亢進動物の処置など、虚血性血管収縮を含む状態に対するｉｎ  ｖｉｖｏ動物血管の反応性を含み、本明細書とハームスメイヤー特許に記載されている。
【００２０】
血管攣縮は異常に強く持続した冠動脈の筋肉の収縮であり、貫壁性心筋虚血を導き、突然心臓死を招くことが多い。血管攣縮は、冠動脈が特徴的な「砂時計」の形になった長期にわたる収縮を呈する状態を引き起こす。「血管攣縮」という用語は、文献において、異常で生死にかかわるというよりは、血流を自己調節する手段としての正常で健康である血管収縮を表すために乱用されていることが多い。本明細書で用いられているように、冠攣縮性狭心症は、隣接した下流の膨張と砂時計パターンを伴い、５分以上持続する、病巣部における対照直径の３３％未満、好ましくは２５％未満となる心外膜の冠動脈狭窄として定義されている。
【００２１】
冠動脈反応性の概念は、文献において、本明細書で用いられているものと異なる意味で用いられていることに注意する。Ｗｉｌｌｉａｍｓら（Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，２４（７）：１７５７〜１７６１（１９９４））は、この用語を、罹患した動脈における膨張の欠如と比較して正常冠動脈の膨張を直接引き起こすアセチルコリンに対する反応性における血管拡張能力という意味で用いている。この使用法によると、反応性の減退は異常である。本明細書で用いられる反応性亢進は、血管に作用する物質に対する収縮筋の応答性の悪化した振幅および／または持続時間を指す。従って、血管収縮刺激に対する反応性亢進は、冠状動脈虚血および血管攣縮の根底をなし、Ｗｉｌｌｉａｍらによって発見されたアテローム性サルのように、刺激物に対する血管拡張神経の減退した反応性は、冠状動脈の血流を増加させるために冠動脈が開放し損ない、またはアセチルコリンに対する反応性において開放したままになる機構とは別であり異なる機構である。
【００２２】
本発明は、メスアカゲザルの研究、およびアカゲザルからの血管筋細胞の研究から生じているが、これらの研究の結果が直接人間、特に女性に適用できることが当業者によって理解されるであろう。これはメスアカゲザルが女性における女性ホルモンの生理学的効果のために優れた動物モデルとして確立されているからである。これらの実験は、男性における心筋虚血の予防的な治療としてのエストロゲンベータ受容体アゴニストの基礎も提供する。
【００２３】
従って、本発明は男女に有用である。本発明は特に、自然状態、手術、または疾病のために異常に低い値のエストロゲンおよびプロゲステロンを有する女性に有用である。一般的には、そのような女性は更年期以降または卵巣切除しており、紅潮と寝汗を患っている。そのような女性は、別に健康でもあり得る。特にそのような女性は、高コレステロール血症であるか、そうでなくてもよい。これについて、本発明は、冠状動脈反応性亢進がアテローム性動脈硬化症と無関係である可能性があり、エストロゲンベータ受容体アゴニストが脂質を経た経路だけではなく、動脈血管収縮において直接的な効果を有している可能性があるという、驚くべき発見を提供するものである。
【００２４】
ハームスメイヤー特許に記載されているメスのアカゲザルを用いた動物実験は、冠攣縮性狭心症が、損傷がない場合に、血管筋の反応性亢進が局所的であるためにプラークまたはその他の血管病状を引き起こすことを明らかにしている。特に、血管攣縮はアテローム動脈硬化症ではないアカゲザルにおいて起こり、これにより純粋な反応性はきわめて重要な冠状動脈の血流を事実上停止する原因となるのに十分であることを実証している。冠攣縮性狭心症は貫壁性心筋虚血に至り、突然心臓死をもたらす。さらにそのような血管筋反応性亢進は、特定の血管収縮試因子の冠動脈内注射を用いた誘発や惹起によって誘発され得ることがわかっていた。従って、アテローム性動脈硬化症を予防する高繊維質の食事を与えられたこれらのアカゲザルにおいて、冠動脈反応性亢進または血管攣縮に起因する生命を脅かす心筋虚血は、アテローム性動脈硬化または血管病状がない場合、薬物によって刺激され得ることがわかっていた。
【００２５】
本発明は、他の部分は外見上健康である対象者、および外見上健康ではない対象者において有用である。本明細書で用いる外見上健康であるとは、心筋梗塞のような急性有害心血管症状を以前に経験していない個人を意味する（例えば、一次的な心臓血管症状のために、二次的な有害心血管疾患のリスクが高まっていない個人など）。外見上健康な個人は、別段疾病の症状を示してもいない。すなわち、そのような個人は、医学の専門家に検査してもらった場合、健康で疾病の症状がないとみなされる。
【００２６】
本発明は同様に「非高コレステロール血症対象者」と「高コレステロール血症対象者」において有用である。非高コレステロール血症対象者は、高コレステロール血症対象者のために確立された現在の基準には適合しない。高コレステロール血症対象者は心血管疾患の発生率の上昇に関連している。高コレステロール血症対象者は、ＬＤＬ値が１９０ｍｇ／ｄｌ以上、または１６０ｍｇ／ｄｌ以上であり、かつ早期冠状動脈性心臓病の家族歴、喫煙（１日１０本以上）、高血圧症、低ＨＤＬ（３５ｍｇ／ｄｌ未満）、糖尿病、高インスリン血症、異常肥満、高リポタンパクで脳血管疾患または閉塞性末梢血管障害の既往歴がある、または虚血性心臓疾患である場合、ＬＤＬが１３０以上である、からなる群から選択される少なくとも２つのリスク要因を有する。
【００２７】
従って本発明は、今までエストロゲンによる治療をしていなかった患者集団の治療に関連して有用である。そのような患者はエストロゲン治療を要する症状がなくてもよい。
【００２８】
本発明は冠動脈と動脈細胞を用いて説明されているが、本発明は血管筋細胞が存在する身体の他の部分にも適用できることが、当業者によってさらに理解されるであろう。従って本発明は、例えばレイノー病または間欠性跛行などの末梢血管疾患の予防と治療に有用であり、さらに例えば内膜過形成、血管再狭窄、血管形成後増殖、閉塞性血栓血管炎、同種移植血管障害、糖尿病性血管症、および高血圧性血管障害などの血管増殖異常の予防と治療に有用である。
【００２９】
最適の予防効果を達成するために、エストロゲンベータ受容体アゴニストは望ましい血中濃度を提供するように継続的に投与されてもよい。例えば経口または血管内投与など、他の形態の投与は、不便であり持続した血中濃度を与えないためあまり好ましくない。
【００３０】
好ましい剤型は局所用製剤である。本明細書で用いる「局所」とは皮膚表面に外部から塗布することを意味する。「局所」の定義において具体的に除外されるものは、例えば膣腔、直腸腔、もしくは口腔などの腔である。また角質層も除外される。エストロゲンベータ受容体アゴニストは、プロピレングリコール、ソルビトール、セチルアルコール、およびステアリルアルコールを組み合わせた水性中に溶解させることが好ましい。エストロゲンベータ受容体アゴニストは非極性油にも溶解させてもよい。ビタミンＥ（トコフェロール）は、前記剤型においてこの目的に使用させる好ましい非極性油の１つである。アロエベラと例えば緩和薬などのその他の水性物質は、好ましい皮膚クリームを得るための添加剤として含むこともできる。
【００３１】
輸送システムとしての、そのようなクリームにおけるエストロゲンベータ受容体アゴニストの有効性は、少なくとも部分的に、対象者の血流への直接的な経皮吸収と遅速性経皮吸収との組み合わせに起因すると考えられている。結果として、皮膚に塗布されるクリーム剤型におけるエストロゲンベータ受容体アゴニストは、何時間にもわたり吸収され放出され、これにより１日の大半において低いが比較的持続した値の暴露を与える。
【００３２】
当業者に知られている局所用製剤は一般的に、非固体、液体、クリーム、ジェル、ローション、または軟膏製剤である。それらは皮膚浸透促進剤を含んでもよい。皮膚浸透促進剤は、薬物と一緒に皮膚に同時塗布した場合、薬物が皮膚に浸透する能力を高め、血流に輸送される因子である。皮膚浸透剤はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ（１９９０））で議論されており、これはこの参照により本明細書に組み込まれる。
【００３３】
パッチ技術もまたエストロゲンベータ受容体アゴニストの輸送システムとして使用されてもよい。経皮パッチは一般的に、ハウジングと、ハウジングの中にある容器と、ヒト対象者の表皮に対して配置するための、貯蔵所に隣接しハウジングに付着した膜とを含む。前記パッチは、膜を対象者の表皮に保持するための、ハウジングに付着した粘着剤も含む。本発明の使用に適し、さらに本発明に従った量のエストロゲンベータ受容体アゴニストを輸送することができるパッチは、以下の先行技術特許、米国特許第３，７３１，６８３号公報、米国特許第３，７９７，４９４号公報、米国特許第４，３３６，２４３号公報、米国特許第４，６２８，０５２号公報、米国特許第４，７０４，２８２号公報、米国特許第４，７８８，０６２号公報、米国特許第４，９０６，１６９号公報、米国特許第５，１６４，１９０号公報、において見出されてもよく、これらの公開は本明細書にこの参照により組み込まれる。
【００３４】
局所的な経路に加えて、もちろん様々な投与経路が受け入れられる。一般的に言って本発明の方法は、医学的に許容できるあらゆる投与様態を用いて実施してもよく、それらの投与様態は、臨床上受け入れ難い副作用を引き起こさずに、エストロゲンベータ受容体アゴニストの望ましい値を実現する様態を意味する。そのような投与様態は経口、直腸、膣、局所、舌下、鼻、皮内、または例えば吸入などのその他の非経口経路を含む。静脈内、筋肉内、およびその他の注入可能な経路は特に好ましくないか、または長期にわたる治療と予防に適していない。
【００３５】
薬剤的組成物は、便利な単一投与形態で存在してもよく、製薬学の専門家において既知の任意の方法によって調整されてもよい。全ての方法は、１もしくはそれ以上の副成分を構成する担体と活性成分を合わせる工程を含む。一般的に、前記組成物は、脂質担体、細かく分割した固体担体またはその両方と、活性成分とを均一かつ親密に合わせることにより調整され、さらに必要であれば製品を成形する。上述したように、様々な投与様態に適した製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓにおいて見出すことができる。
【００３６】
他の輸送システムとしては、徐放、遅延放出、または持続放出輸送システムを含むことができる。そのようなシステムは、活性化合物の反復投与を避けることができ、対象者と医師に対する利便性を高めることができる。多種類の放出輸送システムが利用可能であり、当業者に既知である。それらは例えばポリ（ラクチド−グリコール酸塩）、共重合シュウ酸塩、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、およびポリ無水物などの高分子ベースシステムを含む。薬物を含む前述の高分子のマイクロカプセルは、例えば米国特許第５，０７５，１０９号公報に記載されている。輸送システムは、非高分子システムも含み、それらは例えばコレステロール、コレステロールエステル、および脂肪酸、または例えばモノ−、ジ−、およびトリ−グリセリドなどの中性脂肪などのステロール、ヒドロゲル放出システム、シラスティックシステム、ペプチドベースシステム、ワックス被覆物、従来の結合剤と賦形剤を用いた圧縮錠剤、部分的融解移植物、および同種のものなどである。具体例は、（ａ）例えば米国特許第４，４５２，７７５号公報、第４，６６７，０１４号公報、第４，７４８，０３４号公報、第５，２３９，６６０号公報に記載されているように、活性化合物が充填剤の内部の形態中に含まれている侵食システム、（ｂ）例えば米国特許第３，８３２，２５３号公報、第３，８５４，４８０号公報に記載されているように、活性化合物が制御された割合で高分子から浸透する拡散システム、を含むがこれに限定されない。さらに、移植に適用できるものもあるポンプベースハードウェア輸送システムが使用され得る。
【００３７】
長期持続放出移植の使用は望ましい。本明細書で用いる長期放出は、移植が少なくとも３０日間、好ましくは６０日間、活性成分の治療的値を輸送するために、構成され準備されることを意味する。長期持続放出移植は当業者に既知であり、上記の放出システムのうちいくつかを含む。
【００３８】
本発明は様々なキットも含む。それぞれのキットは、例えば前述の血中濃度を達成する量の、血管反応性亢進を予防または治療するのに効果的なエストロゲンベータ受容体アゴニストの量を調剤するための使用説明書を含むことが好ましい。各キットはその中にエストロゲンベータ受容体アゴニストの製剤も含まれており、それはエストロゲンベータ受容体アゴニストの適切な量を輸送するように構成され準備されているか、またはエストロゲンベータ受容体アゴニストの適切な量の調剤を可能にする調剤方法と一緒になっているかどちらかを含んでいる。従って、前記キットは、好ましくは上記の使用説明書を収納したパッケージを含む。前記キットは、瓶のような容器の中に含まれたエストロゲンベータ受容体アゴニストの局所用製剤を含んでもよい。容器は、例えば広口瓶、瓶、ガラス瓶、チューブ、小さな包み、および同種のものなどのエストロゲンベータ受容体アゴニストを含むためのあらゆる道具であってもよい。このキットは、本発明に従った使用のために、エストロゲンベータ受容体アゴニストの局所用製剤の適切な量を容器から引き出すために使用される注射器を任意に含む。
【００３９】
好ましい一実施形態において、任意な測定道具は注射器である。しかしながら、前記測定道具は、製剤の測定された量を調剤するための当業者に既知のそのような道具であればどれでもよく、またはキットに測定道具がなくてもよい。例えば、前記測定道具は、本発明に従ってエストロゲンベータ受容体アゴニストの測定された量を輸送することができる容器（例えばポンプ式ディスペンサーと一緒になった瓶）に取り付けられた目盛り付きポンプであってもよい。この調剤道具は単に計量カップまたはガラス瓶、または加圧式エアゾール瓶であってもよい。エストロゲンベータ受容体アゴニストの一定量を調剤するための手段はいずれも本発明によると有用である。
【００４０】
エストロゲンベータ受容体アゴニストを含んだ局所クリーム、ジェル、ローション、または軟膏は、個別の小さな包みに含まれていてもよく、それぞれの小さな包みは局所適用のための適切な投与量を含む。キットは例えば３０、６０、１００、またはそれ以上の小さな包みなど、そのような小さな包みを複数個含んでいてもよく、それぞれの小さな包みは、例えばおよそ１．２〜３．２ｍｌ、好ましくは絞ったときにおよそ１．０〜３．０ｍｌを供給するおよそ２ｍｌのクリームというように、一定量のクリームを含んでおり、言い換えれば一定量のエストロゲンベータ受容体アゴニストを含むものである。前記キットはエストロゲンベータ受容体アゴニストを含み、調剤するための方法として、詳細に前述したような経皮パッチを含んでもよい。
【００４１】
本発明はさらに以下の限定されない実施例において開示される。
【実施例１】
【００４２】
動物
６匹の成人卵巣切除メスアカゲザル（Ｍｏｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）は以下に記載した研究に採用された。どのサルも高コレステロール餌投与はされてはおらず、すべてのサルについて心疾患の痕跡がないことが後で立証された。各サルは血液化学検査を含む標準的な身体検査を受けた。前記サルは卵巣切除後、少なくとも３ヶ月で研究に入れられた。
【実施例２】
【００４３】
カテーテル法
血管造影法は、一晩絶食後、ケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ体重、筋肉内）による前麻酔から始め、イソフルラン（１．５％〜３％で誘発し、０．７５％〜１．２５％で維持）と共に麻酔の気管内チューブと無影灯（ｌｉｇｈｔ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｐｌａｎｅ）を挿管し、３３％の亜酸化窒素と６７％の酸素、または１００％の酸素を気化させた。両側大腿骨動脈内の３Ｆカテーテルによって、冠状動脈カテーテル法と、組織的動脈圧と心拍を連続的に記録が可能であり、それらは各サルとも最初の麻酔値と近い値を維持していた。静脈内にヘパリン（１，０００Ｕ）を注射し、最低血圧を６０ｍｍＨｇ以上に維持するために、１２０ｍｌ以下のピルビン酸化リンガー溶液と、０〜５０ｍｌのデキストラン溶液とを使用した（随時）。加温パッドは、麻酔前の体温に対する体温の減少が２℃以内となるように維持するのを補助した（直腸温度計で監視した）。心電図（ＥＣＧ）は、グールド８−チャンネル記録装置に記録し、皮膚動脈酸素飽和度、呼吸数、および終期呼吸二酸化炭素も監視した。
【００４４】
全ての試験は、コンピュータ化された定量的冠状動脈造影法を可能にするためにビデオテープに記録した（一過性の蛍光透視像と継続的な音声の注釈を伴う）。ハームスメイヤー特許で説明されていた理由により、感受性サルにおいて冠動脈血管攣縮の発現を刺激するための因子は、セロトニンとＵ４６６１９の組み合わせとした。
【００４５】
３Ｆカテーテルの配置は、放射線不透明造影剤で十分充填されるように調節し、逆流と冠動脈樹の分岐部の隔離を制限した。通常、左の冠動脈前下行枝（ＬＡＤ）が選択されていたが、左の回旋枝、または右冠動脈を代わりに使用してもよい。カメラの角度を冠血管樹の最適画像に合わせた後、温かい（３５〜３８℃）ヘキサブリックス（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）放射線不透明造影剤の１〜２ｍｌ大量瞬時投与（ボーラス）は、最適に注入するために手ですばやく注入した。蛍光透視像は、蛍光透視鏡のＣアームを伴ったＯＥＣモデル９８００デジタルＸ線システムを使用したフイルムに記録し、デジタル処理で記録し、その後の分析で評価した。ヘキサブリックス０．２ｍｌの短時間の注射を含む、最適な定量的血管造影法のための全ての処置は、その後のコンピューター分析のためにビデオテープに記録した。
【００４６】
全ての薬物注射は、冠動脈内（ＩＣ）投与によって、ゆっくり、３０±１秒にわたり１ｍｌという一定流量で行われた。薬物注射の間隔は、血圧と心拍が次の注射前に基準から１５％以下の変化に戻っていることが認められる状態で、一般的に７〜１０分であり、少なくとも４分であった。手順を正確に記載するために、全ての濃度はシリンジ濃度（冠血流量による希釈のために訂正されていない）であった。
【実施例３】
【００４７】
血管攣縮予防のためのエストリオールの効果
０．３％のエストリオール局所クリームは以下の成分で処方した。
化合物 ％濃度  ｗ／ｗ
エストリオール                      ０．３
セチルアルコール、ＮＦ              ６
ステアリルアルコール、ＮＦ          ３
ラウリル硫酸ナトリウム塩、ＮＦ      ０．２
イソプロピルパルミテート、ＮＦ      １．７
プロピレングリコール、ＵＳＰ        ８
ソルビトール溶液、ＵＳＰ            １２．９
乳酸、ＵＳＰ                        １．２
ベンジルアルコール、ＮＦ            ２．１
蒸留水、ＵＳＰ                      ＱＳ  １００
【００４８】
実施例１の６匹のアカゲザルは、この０．３％エストリオール局所クリームで毎日処置した。前記クリームはサルの皮膚の毛をそった部分に擦り込んだ。皮膚クリームのこの投与量は、クリーム各１ｍｌ中にある３ｍｇのエストリオールを１０％吸収する想定に基づき、１ｍｌあたりおよそ０．３ｍｇのエストリオールを吸収することが見込まれる。前記エストリオールはＳｔｅｒａｌｏｉｄｓ（ウィルトン、ニューハンプシャー州）から購入した。
【００４９】
０．２ｍｇ／ｋｇのエストリオール局所クリームで毎日処置し、４週間後、前記サルは冠状動脈カテーテル法で実験し、セロトニン（１００μＭ）とＵ４６６１９（１μＭ）の注入によって反応性を評価した。セロトニンとＵ４６６１９は１００：１のモル比の組み合わせで３０秒にわたり１ｍｌを繰り返しゆっくり冠動脈内に注入し、冠状動脈血中濃度がセロトニンで６．７μＭ、Ｕ４６６１９で６７ｎＭになるように体重で調節した（０．２ｍｇ／ｋｇ）。これら２つの成分の前記値は、計算された冠状動脈流量希釈に基づく。静脈血サンプルは研究を始める直前と、プロゲステロンとエストリオールを測定するための処置の２週間後と４週間後とに採取した。尿サンプルは心臓カテーテル法の直前に採取した。
【００５０】
血管造影は、７０％酸素および３０％Ｎ２Ｏと共に、イソフルラン（０．７５〜１．２５％）全身麻酔の下で実行した。ケタミン鎮静作用（１０ｍｇ／ｋｇ）、および気管内チューブを配置した後、全身血圧と冠状動脈カテーテル法の同時測定ために、両方の大体動脈にカニューレを挿入した。ヘパリン１０００ユニットによる動脈内の抗凝血、および７５〜１５０ｍｌのピルビン酸化リンガー溶液による体液の補充、および最小の対照最低血圧が６０ｍｍＨｇに達するために必要に応じて１０〜５０ｍｌのデキストランを要する。
【００５１】
サルの冠動脈（左前下行枝または左回旋枝）にカテーテルを挿入し、上記実施例１で記載したように薬剤を注入した。
【００５２】
統計分析は、ｐ<０．０５を有意として認め、スチューデントｔ−検定（対応なし）またはカイ二乗で実施した。
【００５３】
表１はエストリオールが血管攣縮を予防した本研究の主な結果を示す。エストリオールを投与したサルはいずれも（６匹／６匹）、研究の期間、血管攣縮を患わなかった。ハームスメイヤー特許において開示されているように、セロトニンとＵ４６６１９の組み合わせは、予想どおりそれを投与した非保護動物のすべてにおいて血管攣縮を引き起こした。従ってこの結果は、エストリオールが冠攣縮性狭心症の予防に効果的であることの決定的な証拠になる。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
データはエストリオールの投与による冠攣縮性狭心症の予防作用は明確であったことを示しており、１２工程の冠動脈内セロトニン＋Ｕ４６６１９の注入手順において、Ｅ３処置サルのいずれも血管攣縮を示さなかった。プラセボ処置のみを受けたすべてのヒストリカルコントロールの６匹すべてのサルが、５分間以上、対照より３３％小さい直径となる診断基準に合った冠攣縮性狭心症を示した。
【実施例４】
【００５６】
冠動脈の直径に対するエストリオールの効果
前の実施例で使用し、かつエストリオールのクリームで処置した動物の冠動脈の最小直径を処置前に測定し、続いて３０秒間にわたり誘発刺激を注入（Ｓ＋Ｕ連続注入）し、誘発刺激の前後で対照動物と比較した。図１で説明されるように、このデータは、エストリオールで処置していないＯＶＸサルの冠動脈が５分間以上もの長い間、対照より３３％小さい直径に減少する血管攣縮を受けたことを示している。この収縮は対照ＯＶＸ動物研究の６匹中６匹すべてにおいて生じた。
【００５７】
一方、エストリオール処置サルの６匹すべてにおいて、最小直径は、誘発性攣縮に対して予防効果を示した。ＯＶＸサルのエストリオール処置と無処置の間の最小直径の違いは、ｐ<０．０５で有意であった。
【実施例５】
【００５８】
アカゲザル冠動脈の培養
他の目的で犠牲になったアカゲザルから心臓または主要血管を検視で取り除き、哺乳動物のための冷イオン溶液（ＩＳＭ２）に直ちに浸した。ＩＳＭ２は、１００ｍＭのＮａＣｌ、１６ｍＭのＮａＨＣＯ３、０．５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、４．７ｍＭのＫＣｌ、１．８ｍＭのＣａＣｌ２、０．４ｍＭのＭｇＣｌ２、０．４ｍＭのＨｇＳＯ４、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、および５．５ｍＭのデキストロースをｐＨ７．３〜７．４で含んでいた。単細胞は心臓のための多段階工程において酵素的に解離し、冠動脈は心室の前壁と後壁および房室溝から解体する。前記冠動脈切片はきれいにした後、小片に切り、哺乳動物−第５等級（ＣＶ５Ｍ）培養液で１０分間、続いてグルタミン酸カリウム（ＫＧ）溶液で１０分間、両方とも室温でさらした。ＣＶ５Ｍは４．０ｍＭのＬ−グルタミン、１００μｇ／ｍＬのシプロフロキサシン、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）、および９０％のＭＥＭ−アール塩（Ｅａｒｌｅｓ’ｓ  ｓａｌｔｓ）に溶解した１６ｍＭのＮａＨＣＯ３、および１０％ウマ血清を含む。ＫＧ溶液は１４０ｍＭのグルタミン酸カリウム、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）、１６ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、および１６．５ｍＭのデキストロースを含んでいた。
【００５９】
冠動脈組織はその後、酵素溶液（１ｍｌあたり４３０Ｕのコラゲナーゼ、および１ｍｌあたり２ｍｇのウシ血清アルブミンと共に１ｍｌあたり２Ｕのエラスターゼ、および３７℃のＫＧ１０ｍｌ中の１００μＭのＣａ２＋）中、ゆっくり攪拌しながら３７℃で６０分間培養した。上清は、１０％のウマ血清入り４℃のＫＧ保持溶液（ＫＧ−Ｈ）２５ｍｌに移動し、１０ｍｌの酵素溶液を分散していない組織断片に加えた。
【００６０】
酵素暴露は冷却と血清添加によって最小限に抑えた。分散細胞を含んだ保持溶液（１０％血清入り）は、４℃において２００Ｇで５分間遠心分離した。上清を取り除いた後、前記細胞は３７℃のＣＶ５Ｍ５ｍｌ中に再懸濁し、線維芽細胞の優先的な接着が認められるまで３７℃で１時間培養した。上清に残った細胞は、数を数え、遠心分離によって、１ｍｌあたり〜１００，０００個生細胞まで濃縮し、３７℃でＣＶ５Ｍに再懸濁した。ＶＭＣはその後、培養プレート内の無菌ガラスカバースリップ上に播種し、９５％空気−５％ＣＯ２、および湿度９５％中、３７℃で、接着のために１２時間そのままで維持し、その後ＣＶ５Ｍで満たした。懸濁液からの細胞は、成長最適培地フラスコ中に同様に播種し、１２時間後ＣＶ５Ｍで満たした。
【００６１】
１％培地（ＣＶ５ＭＭ、ウマ血清の濃度が１％であることを除いてはＣＶ５Ｍと同一）への培地交換は、２〜４日後、成長因子を低減するために使用された。各温度（４℃と３７℃）における、正確なｐＨ制御（ｐＨ７．３〜７．４）は、ＨＥＰＥＳ緩衝液の温度係数の認識と許容度によって維持された。細胞の二次培養は、簡潔なトリプシン処理によって行われ、続いてトリプシンを中和し、培地で洗浄し、１％血清入り培地中で細胞懸濁液を再構成し、培養プレートとカバースリップにまいた。Ｃａ２＋画像試験のために、初代培養ＶＭＣを使用した。低血清（１％）培地のこれらの培養条件の下、ＶＭＣは、収縮と弛緩、受容体、およびイオンチャンネルの機能特性を、何週間もの間、少なくとも２回の細胞分割と再度細胞をまく間、維持できる。
【実施例６】
【００６２】
Ｆｌｕｏ３による細胞内Ｃａ２＋とＶＭＣにおけるヒペリシン蛍光（２波長蛍光）によるＰＫＣ（タンパクキナーゼＣ）
細胞内Ｃａ２＋変化の画像は蛍光指標であるＦｌｕｏ３を用いて行った。ＶＭＣが付着したガラスカバースリップは、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ顕微鏡上の３００μＬのＬＦ９２２ラミネーターフローチャンバーに設置し、１分あたり１ｍＬの速度で連続的にＩＳＭ２で満たした。生細胞蛍光データ収集は、画像処理ソフトウェアに連動した光子計算ＨａｍａｍａｔｓｕＶＩＭカメラで行った。簡潔に言うと、ＶＭＣに３μＭのＦｌｕｏ３を１０分間取り込み（流れを止める）、その後ＩＳＭ２で５分間洗浄した（満たし続ける）。ＶＭＣは刺激のために、ステイビル（ｓｔａｂｉｌｅ）トロンボキサンＡ２模倣薬であるセロトニンとＵ４６６１９の組み合わせに暴露した。この組み合わせは、１０μＭ濃度のセロトニンと１００ｎＭ濃度のＵ４６６１９を含み、Ｓ＋Ｕと称する。前記ＶＭＣは、前記Ｓ＋Ｕの組み合わせに１５秒間暴露し（流れを止める）、その後連続的にＩＳＭ２で満たした。前記Ｓ＋Ｕの組み合わせは、たとえ数秒のみの存在であったとしても、卵巣切除アカゲザルにいて血管収縮を引き起こす特徴的な長く続く虚血を確実に誘導した。Ｃａ２＋の画像は、刺激後３１分間一定時刻に作動する手順（ｆｌｕｏ３としてＣａ２＋は５５０ｎｍの蛍光強度と分布で刺激後１、２、５、１０、１５、２０、３０分、ヒペリシンとしてＰＫＣは６００〜６６０ｎｍの蛍光強度で３、４、９、１６、２１、および３１分）に従って記録した。画像は収集し、強度はＩｍａｇｅ  Ｊ画像分析を用いて測定した。
【実施例７】
【００６３】
エストリオールによるインビトロＶＭＣの持続的予防
外科的閉経（ＯＶＸ）サルは対照群と無処置群の２群に分け、２番目の群は先に述べたようにエストリオールクリームで処置した。２群のサルからＶＭＣを採取し、上述の実施例５のように培養し、実施例６で記載したように、細胞内Ｃａ２＋値の変化の画像を得た。データは図２に示した。
【００６４】
ＯＶＸサルから単離したＶＭＣは、経皮的なエストリオールで毎日４週間処置した後、０誘発（０ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）（１５秒１００μＭセロトニンと１００ｎｍのＵ４６６１９（Ｓ＋Ｕ）刺激）の前に２週間培養すると、１０〜３０秒の短いＣａ２＋の急上昇の予防状態が見られ、２分後標準値近くまで減少した。一方、無処置ＯＶＸからの、ステロイドがない培地中で１〜２週間培養したＶＭＣは、０時間における同じ１５秒間のＳ＋Ｕの刺激誘発に対し、最初のＣａ２＋急上昇を伴って反応性亢進的に反応し、５〜１０分後、反応性亢進を示す第２段階のＣａ２＋シグナル上昇が続いた。この２群間の相違は、ｐ<０．０５で有意であった。
【実施例８】
【００６５】
試験化合物のエストロゲン受容体ベータ活性
エストロゲン受容体ベータ活性化補助因子蛍光偏光試験は、既知のエストロゲン受容体リガンド（エストラジオール、ＩＣＩ１８２，７８０、タモキシフェン、およびＯＨ−タモキシフェン）と試験化合物（エストリオール、３βＡジオール、およびエピエストリオール）と共に蛍光偏光を用いて、企業が販売しているＥＲβ活性化補助因子試験キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を適用したＰａｎＶｅｒａ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ発見スクリーニングによって行った。
【００６６】
図３のグラフのＸ軸上のデータは、０．０３８ｎＭから１２４０ｎＭまでの各予想リガンドのために試験した濃度の対数で表した。偏光において半極大の増加と減少を引き起こす前記リガンド濃度は、ＥＲβ／Ｄ２２相互作用のリガンドＥＣ５０と等しい。ｍＰである縦座標のＹ軸は、蛍光偏光単位を表す。偏光の増加はアゴニスト活性を示す。逆に、偏光の減少は拮抗薬活性を示す。データは、３通りで行われた試験からの偏光値の平均＋／−標準偏差で表す。
【００６７】
図３に示したように、エストリオールとエストラジオールは、顕著なエストロゲンアルファアゴニスト活性も同様に有しているが、エストロゲンベータアゴニストである。エピエストリオールと３βＡジオールもまたエストロゲンアルファ受容体以上にエストロゲンベータに対して選択的な化合物であり、エストリオールおよびエストラジオールと同様に、ベータ受容体活性を有した。他の試験リガンドはエストロゲンベータ受容体アゴニスト活性を示さず、高い濃度で、エストロゲンベータ受容体拮抗薬としての機能を示した。
【実施例９】
【００６８】
エストリオール、３βＡジオール、およびエピエストリオールの効果の比較
図４は、インビトロにおけるアカゲザル冠状動脈ＶＭＣのＣａ２＋反応において、エストリオール、３βＡジオール、およびエストリオール処理の比較効果を示した。３００ｐＭの３βＡジオール、１ｎＭのエストリオール、または１ｎＭのエピエストリオールのいずれかで７２時間処理した後、前述したようにＳ＋Ｕによる１５秒間の刺激に対する反応におけるＣａ２＋シグナルの経時変化を測定した。対照と比較して、エストリオールは保護性（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）であることがわかった。しかしながら、エストリオールの保護作用は、エストロゲンベータ受容体選択的アゴニストである３βＡジオールとエピエストリオールより弱いことがわかった。前記データはｐ<０．０５で有意であることがわかった。
【実施例１０】
【００６９】
３βＡジオールの濃度効果
実施例９の研究は３０ｐＭから３ｎＭの範囲の４つの異なる濃度において、３βＡジオールのみを用いて繰り返した。データは図５にグラフで示した。
【００７０】
示したように、３０ｐＭの３βＡジオール濃度は、Ｃａ２＋反応において、無処置対照ＶＭＣと同様の結果であった。３０ｐＭより大きい濃度において、保護状態は確立されていた。前記データはｐ<０．０５で有意であることがわかった。
【実施例１１】
【００７１】
異なるエストロゲンベータ受容体アゴニストの比較
実施例８〜１０の研究を、３βＡジオール（３００ｐＭ）、ゲニステイン（１０ｎＭ）、およびＤＰＮ（１ｎＭ）の３つの異なるエストロゲンベータ受容体アゴニストを用いて繰り返した。データは図６にグラフで示した。
【００７２】
示したように、各エストロゲンベータ受容体アゴニストは、対照と比較してＶＭＣにおいて保護状態を引き起こした（ｐ<０．０５）。３βＡジオールによる保護作用はゲニステインまたはＤＰＮで得られたものより優れていた。
【実施例１２】
【００７３】
ＲＲ−テトラヒドロクリセン（ＲＲＴＨＣ）による選択的ＥＲβ拮抗作用の効果
実施例８〜１１の研究をエストロゲンベータ受容体拮抗薬ＲＲＴＨＣで前処理したＶＭＣを用いて繰り返した。データは図７ＡとＢに図解した。
【００７４】
図７Ａに示したように、０時間におけるＳ＋Ｕによる１５秒間の刺激に反応したＣａ２＋シグナルの経時変化は、インビトロにおいて３００ｐＭの３βＡジオールで７２時間処理した保護作用が、ＲＲＴＨＣ（３０μＭ、３βＡジオール３時間前と３βＡジオールの期間）で前処理したＶＭＣで遮断されていることを示した。データはｐ<０．０５で有意であることがわかった。
【００７５】
図７Ｂに示したように、Ｓ＋Ｕによる１５秒間の刺激に反応したＣａ２＋シグナルの経時変化は、インビトロにおいて、ＲＲＴＨＣによる処理１〜６時間後は示さなかったが、ＲＲＴＨＣの７２時間後に対照を超えて増強された過敏状態を示した。データはｐ<０．０５で有意であることがわかった。
【実施例１３】
【００７６】
実施例で利用した溶液と薬物
表２は細胞培養溶液と実施例で利用した薬物を示した。エストロゲン活性を有することで知られているフェノールレッドは、すべての試薬から除いている。維持培地（ＶＭＣが十分に接着した後に用いられる）は２〜４日後に加え、その後の交換培地は、ウマ血清濃度が１％に減らしてあること以外はＣＶ５Ｍと同一のものであるＣＶ５Ｍ１である。エストロゲンとプロゲステロンはＣＶ５Ｍ培地において検出できない（<０．１ｎｇ／ｍｌ）。
【００７７】
【表２】
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【００７８】
すべての溶液は、ＨＥＰＥＳ酸とＮａ＋−ＨＥＰＥＳ塩基とでｐＨ滴定し、対象とする使用温度（氷、ベンチトップ、培養溶液のためにそれぞれ４℃、２２℃、および３７℃）で誤差がないように測定した。ＤＭＳＯ中、１０ｍＭのｆｌｕｏ３の原液は、ＩＳＭ２で１０００倍に希釈する。０．１％のＤＭＳＯ中に貯蔵した２００ｎＭのヒペリシンは、ＩＳＭ２中２０μＭのβ−ヒドロキシプロピルシクロデキストリンで１：１で混合する。セロトニン溶液は新しく作られた１０ｍＭの貯蔵ＩＳＭ２で希釈した。
【００７９】
明細書に記載した本発明さらなる改善、使用、および応用について、当業者は理解するであろう。そのような改善は、本請求項に包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図１は、卵巣切除した無処理のサル、および卵巣切除しエストリオール処理したサルにおける収縮刺激後の冠動脈の直径の％変化を示した図である。
【図２】図２は、インビトロにおける、処理していない血管筋細胞と比較したエストリオールで処理した血管筋細胞の持続性の保護作用を示した図である。
【図３】図３は、ＥＲβ活性化補助因子蛍光偏光試験における、各試験化合物のエストロゲンベータ受容体活性を示した図である。
【図４】図４は、インビトロにおける、アカゲザルの冠状動脈ＶＭＣのＣａ２＋応答性において、エストリオール、３βＡジオール、およびエピエストリオール処理の比較効果を示した図である。
【図５】図５は、インビトロにおける、アカゲザルの冠状動脈ＶＭＣにおけるＣａ２＋応答性の、３βＡジオールの濃度範囲の効果の比較を示した図である。
【図６】図６は、アカゲザルの冠状動脈ＶＭＣにおけるＣａ２＋応答性の、３βＡジオールと他のエストロゲン受容体ベータ選択的配位子との比較を示した図である。
【図７Ａ】図７は１対のグラフである。図７Ａは、ＶＭＣを収縮性刺激から保護するエストロゲン受容体ベータアゴニストの能力における、選択的エストロゲン受容体ベータ拮抗作用の効果を示す。
【図７Ｂ】図７は１対のグラフである。図７Ｂは冠状動脈ＶＭＣにおけるＣａ２＋応答性のエストロゲン受容体ベータ拮抗薬の効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【国際調査報告】
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