(57)【要約】本発明は、ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインと特異的に結合するタンパク質に、前記タンパク質の使用のほかにＥＤｂ−フィブロネクチンドメインの受容体またはＥＤｂ−フィブロネクチンドメインそれ自体と結合する化合物のスクリーニング方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の性質：
ａ）ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインと特異的に結合する能力を有し、
ｂ）内皮細胞中で特異的に発現または活性化され、
ｃ）腫瘍のストローマ細胞中で特異的に発現または活性化され、
ｄ）腫瘍細胞中で特異的に発現または活性化され、
ｅ）ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインとのその結合がポリペプチドにより阻害され、そして
ｆ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定した場合、軽鎖に関しては１２０〜１３０ ｋＤａの、そして重鎖に関しては１５０〜１６０ ｋＤａの見かけの分子量を有する、
を有するタンパク質。
【請求項２】
以下の性質：
ａ）ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインと特異的に結合する能力を有し、そしてその結合領域が、配列番号１〜３からなる群から選択される少なくとも１つの配列により特徴づけられ、
ｂ）内皮細胞中で特異的に発現または活性化され、
ｃ）腫瘍のストローマ細胞中で特異的に発現または活性化され、
ｄ）腫瘍細胞中で特異的に発現または活性化され、
ｅ）ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインとのその結合が配列番号１〜３からなる群から選択される配列を含むポリペプチドにより阻害され、そして
ｆ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定した場合、軽鎖に関しては１２０〜１３０ ｋＤａの、そして重鎖に関しては１５０〜１６０ ｋＤａの見かけの分子量を有する、
請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
以下の性質：
ａ）ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインと特異的に結合する能力を有し、そしてインテグリンのα２β１鎖を含み、
ｂ）内皮細胞中で特異的に発現または活性化され、
ｃ）腫瘍のストローマ細胞中で特異的に発現または活性化され、
ｄ）腫瘍細胞中で特異的に発現または活性化され、
ｅ）ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインとのその結合がポリペプチドにより阻害され、そしてインテグリンのα鎖を含み、そして
ｆ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定した場合、軽鎖に関しては１２０〜１３０ ｋＤａの、そして重鎖に関しては１５０〜１６０ ｋＤａの見かけの分子量を有する、
請求項１又は２記載のタンパク質。
【請求項４】
前記内皮細胞が増殖性内皮細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項５】
ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインとのその結合が内皮細胞、腫瘍−ストローマ細胞および腫瘍細胞の接着を媒介する、タンパク質。
【請求項６】
ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインとのその結合が内皮細胞、腫瘍−ストローマ細胞および腫瘍細胞の接着を媒介するタンパク質であって、結合領域が配列番号１〜３からなる群から選択される少なくとも１つの配列により特徴づけられるタンパク質。
【請求項７】
結合領域がインテグリンのα２β１鎖を含む請求項６記載のタンパク質。
【請求項８】
ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインとのその特異的結合が内皮細胞の増殖を誘導する、タンパク質。
【請求項９】
ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインとのその特異的結合が内皮細胞の増殖を誘導するタンパク質であって、結合領域が配列番号１〜３からなる群から選択される少なくとも１つの配列により特徴づけられるタンパク質。
【請求項１０】
結合領域がインテグリンのα２β１鎖を含む請求項９記載のタンパク質。
【請求項１１】
ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインとのその特異的結合がコラーゲンマトリックス中の内皮細胞の増殖、移動および分化を誘導するタンパク質。
【請求項１２】
ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインとのその特異的結合がコラーゲンマトリックス中の内皮細胞の増殖、移動および分化を誘導するタンパク質であって、結合領域が配列番号１〜３からなる群から選択される少なくとも１つの配列により特徴づけられるタンパク質。
【請求項１３】
結合領域がインテグリンのα２β１鎖を含む請求項１２記載のタンパク質。
【請求項１４】
ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインと結合し、特定のシグナル伝達経路を誘導するタンパク質であって：
フォーカルアドヒージョンキナーゼ、
ＣＤ６リガンド（ＡＬＣＡＭ）、
ビトロネクチン受容体のα鎖、
組込まれたα８サブユニット、および
フォリスタチン関連タンパク質のための前駆体（１または複数）
からなる群から選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を誘導するタンパク質。
【請求項１５】
ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインと結合し、特定のシグナル伝達経路を誘導するタンパク質であって：
フォーカルアドヒージョンキナーゼ、
ＣＤ６リガンド（ＡＬＣＡＭ）、
ビトロネクチン受容体のα鎖、
組込まれたα８サブユニット、および
フォリスタチン関連タンパク質のための前駆体（１または複数）
からなる群から選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を誘導するタンパク質であって、結合領域が配列番号１〜３からなる群から選択される少なくとも１つの配列により特徴づけられるタンパク質。
【請求項１６】
結合領域がインテグリンのα２β１鎖を含む請求項１５記載のタンパク質。
【請求項１７】
請求項１〜１０のいずれかに記載のタンパク質と結合し得る抗体。
【請求項１８】
配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質と結合し得る抗体。
【請求項１９】
ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインに特異的である作用を阻害し得る請求項１７〜１８のいずれかに記載の抗体。
【請求項２０】
結合および阻害がｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで実行される請求項１７〜１８のいずれかに記載の抗体。
【請求項２１】
モノクローナルまたは組換え体である請求項１７〜２０のいずれかに記載の抗体。
【請求項２２】
ｓｃＦｖ断片である請求項１７〜２１のいずれかに記載の抗体。
【請求項２３】
請求項１〜１０のいずれかに記載のタンパク質を発現する細胞。
【請求項２４】
請求項１７〜２２のいずれかに記載の抗体を発現する細胞。
【請求項２５】
請求項１７〜２２のいずれかに記載の抗体を発現するファージ。
【請求項２６】
ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインの受容体と結合する化合物のスクリーニング方法であって、１つまたは複数のこれらの化合物の存在下での細胞の応答と、これらの化合物の非存在下での前記細胞の対照応答との比較を含んで成る方法であり、前記細胞が
請求項１〜１０のいずれかに記載のタンパク質を発現し、あるいは
このタンパク質をコードする核酸を含み、そして
前記応答または対照応答がＥＤｂ−フィブロネクチンドメインまたはその一部分の受容体により媒介される方法。
【請求項２７】
前記応答または対照応答がＥＤｂ−フィブロネクチンドメインで被覆された表面への細胞の接着を含んで成る請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインの結合領域が配列番号１〜４の配列またはその一部分を含む請求項２６〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
応答または対照応答がＥＤｂ−フィブロネクチンドメインまたはその一部分で被覆される表面上の細胞の増殖を含んで成る請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
前記応答または対照応答がＥＤｂ−フィブロネクチンドメインまたはその一部分と混合されるコラーゲンマトリックス中での内皮細胞の増殖、移動および分化を含んで成る請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
前記化合物が抗体、人工抗体、抗体断片、ペプチド、低分子化合物、アプタマーおよびＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒからなる群から選択される請求項２６〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記抗体が組換え抗体である請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記抗体がｓｃＦｖおよびその断片からなる群から選択される請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインと結合する化合物のスクリーニング方法であって、
ａ）異なる濃度の１つまたは複数の化合物の存在下で、一定濃度の、ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインを含むタンパク質または配列番号１〜４で表わされる配列の１つを有するタンパク質と細胞を接触させ、そして
ｂ）これらの化合物の非存在下でのＥＤｂ−フィブロネクチンドメインを含むタンパク質または配列番号１〜４で表わされる配列の１つを有するタンパク質に対する細胞の対照応答との比較における、化合物の存在下でのＥＤｂ−フィブロネクチンドメインを含むタンパク質または配列番号１〜４で表わされる配列の１つを有するタンパク質に対する細胞の応答における差を測定する、
ことを含んで成る方法であって、
前記細胞が請求項１〜１０のいずれかに記載のタンパク質を発現し、あるいは  このタンパク質をコードする核酸を含む、
ことを特徴とする方法であり、そして前記の応答または対照応答がＥＤｂ−フィブロネクチンドメインの受容体により媒介される前記の方法。
【請求項３５】
応答または対照応答が、ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインまたはその一部分で被覆される表面への細胞の接着を含んで成る請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記応答または対照応答が、ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインまたはその一部分で被覆される表面上の細胞の増殖を含んで成る請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
前記応答または対照応答が、ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインまたはその一部分と混合されるコラーゲンマトリックス中の内皮細胞の増殖、移動および分化を含んで成る請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
前記化合物が抗体、人工抗体、抗体断片、ペプチド、低分子化合物、アプタマーおよびＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒからなる群から選択される請求項３４〜３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインの受容体またはＥＤｂ−フィブロネクチンドメインと結合する化合物をスクリーニングするための、配列番号１〜４からなる群から選択される配列を含むタンパク質をコードする核酸の使用。
【請求項４０】
ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインの受容体またはＥＤｂ−フィブロネクチンドメインと結合する化合物をスクリーニングするための、請求項１〜１０のいずれかに記載のタンパク質または請求項１７〜２２のいずれかに記載の抗体の使用。
【請求項４１】
ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインの受容体またはＥＤｂ−フィブロネクチンドメインと結合する化合物をスクリーニングするための、請求項２３〜２４のいずれかに記載の細胞の使用。
【請求項４２】
診断または治療目的のための抗体またはｓｃＦｖ融合タンパク質を開発するための、配列番号１〜４からなる群から選択される配列を含むタンパク質をコードする核酸の使用。
【請求項４３】
診断または治療目的のための抗体またはｓｃＦｖ融合タンパク質を開発するための請求項１〜１０のいずれかに記載のタンパク質の使用。
【請求項４４】
診断または治療目的のための抗体またはｓｃＦｖ融合タンパク質を開発するための請求項２３〜２４のいずれかに記載の細胞の使用。
【請求項４５】
診断または治療目的のための抗体またはｓｃＦｖ融合タンパク質を開発するための請求項２５記載のファージの使用。
【請求項４６】
前脈管形成療法のための配列番号１〜４からなる群から選択される配列を含むタンパク質の使用。
【請求項４７】
診断目的のための配列番号１〜４からなる群から選択される配列を含むタンパク質の使用。
【請求項４８】
遺伝子療法における配列番号１〜４からなる群から選択される配列を含むタンパク質の使用。
【請求項４９】
内皮細胞と結合する表面を被覆するための配列番号１〜４からなる群から選択される配列を含むタンパク質の使用。
【請求項５０】
被覆がｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで実行される請求項４９記載の使用。
【請求項５１】
細胞培養中の配列番号１〜４からなる群から選択される配列を含むタンパク質の使用。
【請求項５２】
少なくとも１つのトランスプラントと一緒の、配列番号１〜４からなる群から選択される配列を含むタンパク質の使用。
【請求項５３】
トランスプラントが血管（１または複数）、皮膚、角膜、腎臓、肝臓、骨髄、心臓、肺、骨、胸腺、小腸、膵臓、その他の内部器官、ならびにその一部分および細胞からなる群から選択される請求項５２記載の使用。
【請求項５４】
少なくとも１つのインプラントと一緒の、配列番号１〜４からなる群から選択される配列を含むタンパク質の使用。
【請求項５５】
インプラントが、肺インプラント、人工ペースメーカー、人工心弁、血管インプラント、内人工器官、ねじ、副子、プレート、ワイヤ、ピン、杆状体、人工関節、胸部インプラント、人工頭部プレート、義歯、充填物およびブリッジからなる群から選択される請求項５４記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインと特異的に結合するタンパク質に関する。
フィブロネクチンは、マトリックス糖タンパク質の重要な一種類である。それらの主な役割は、多数の異なる細胞外マトリックスへの細胞の接着を促すことにある。培養中の非形質転換化細胞の表面のフィブロネクチンの存在、ならびに形質転換化細胞の場合におけるそれらの非存在は、重要な接着タンパク質としてのフィブロネクチンの同定をもたらす。それらは多数の種々のその他の分子、例えばコラーゲン、硫酸ヘパリン−プロテオグリカンおよびフィブリンと相互作用し、したがって細胞形状および細胞骨格の作製を調節する。さらに、それらは創傷治癒において重要であり、この場合、血管の損傷領域への血小板の接着を可能にすることにより、それらは当該分野におけるそして血餅の形成におけるマクロファージおよびその他の免疫細胞の移動を可能にする。
【０００２】
フィブロネクチンは、各鎖が約６０〜７０ｎｍ長である２つの同様のペプチドの二量体である。少なくとも２０の異なるフィブロネクチン鎖が同定されており、そのすべてが、単一フィブロネクチン遺伝子のＲＮＡ転写体の選択的スプライシングにより生成される。フィブロネクチンのタンパク質分解的消化の分析は、ポリペプチドが６つの重度に折り畳まれたドメインから成り、その各ドメインは次に、それらのアミノ酸配列に関する類似性により３種類（Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型）に分類されるいわゆる反復配列（「反復体」）を含有する、ということを示す。二量体の両鎖の中心領域は、平均で９０アミノ酸長であるいわゆるＩＩＩ型反復の区域からなる（Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔ， Ａ．Ｒ．， Ｖｉｏｂｅ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ， Ｋ．， ａｎｄ Ｂａｒａｌｌｅ， Ｆ．Ｅ．， １９８３． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｃｌｏｎｅｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ ａｎｄ Ｂｏｖｉｎｅ Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｓ． Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８０， ３２１８−２２）。
【０００３】
構造的研究は、各ＩＩＩ型反復が７つのβ鎖からなり、これが２つの逆平行フォールドシートに折り畳まれ、短いループ領域が考え得るタンパク質−タンパク質相互作用部位として露呈される、ということを明示した（Ｌｅａｈｙ， Ｄ．Ｊ．； Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ， Ｗ．Ａ．； Ａｕｋｈｉｌ， Ｉ． ａｎｄ Ｅｒｉｃｋｓｏｎ， Ｈ．Ｐ．， １９９２． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ Ｔｙｐｅ ＩＩＩ Ｄｏｍａｉｎ ｆｒｏｍ Ｔｅｎａｓｃｉｎ Ｐｈａｓｅｄ ｂｙ ＭＡＤ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｅｌｅｎｏｍｅｔｈｉｏｎｙｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５８， ９８７−９１）。ＩＩＩ型のこれらの反復は、フィブロネクチンが、細胞表面分子、いわゆる「インテグリン」と頭語作用する接着分子として作用するのを可能にする。「インテグリン」という用語は、細胞外マトリックスおよび細胞内細胞骨格間の媒介物質として作用し、したがって細胞接着および移動を誘導する関連群のヘテロ二量体細胞表面分子を説明するために、調査文献（Ｈｙｎｅｓ， Ｒ．Ｏ．， １９８７， Ｃｅｌｌ ４８， ５４９−５５０）中で１９８７年に最初に用いられた。
【０００４】
これらのヘテロ二量体受容体は、特定の細胞機能に関する細胞外環境からのシグナルを「取り込む」かまたは媒介する。今日までに、１７のβサブユニットが２０より多いアルファサブユニットと特異的にそして非教諭的に相互作用して、特に２０もの異なるファミリーを形成し得ることが既知である（Ｐｌｏｗ， Ｅ．Ｆ． ｅｔ ａｌ． ２０００， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２７５， ２１７８５−２１７８８）。ＩＩＩ型のフィブロネクチンの１０回目の反復で見出される配列ＲＧＤＳは、特に、少なくとも８つの異なるインテグリンとのフィブロネクチンの相互作用を媒介する。さらに、少なくとも４つのインテグリンがＲＧＤＳ非依存的方法でフィブロネクチンと特異的に相互作用し得る、ということが示された（Ｐｌｏｗ， Ｅ．Ｆ． ｅｔ ａｌ． ２０００， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２７５， ２１７８５−２１７８８）。
【０００５】
ＩＩＩ７−、ＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９およびＩＩＩ１０配列のほかに、ＩＩＩ型の反復配列の群は、反復体ＥＩＩＩＢおよびＥＩＩＩＡ（ＥＤｂおよびＥＤａ）を含む。今日まで、これら２つの反復配列の機能についての定義はほとんどまたは全くない。Ｊａｒｎａｇｉｎ， Ｗ．等による研究（Ｊａｒｎａｇｉｎ， Ｗ．； Ｒｏｃｋｅｙ， Ｄ．； Ｋｏｔｅｌｉａｎｓｋｙ， Ｖ．； Ｗａｎｇ， Ｓ． ａｎｄ Ｂｉｓｓｅｌｌ， Ｄ． １９９４， Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｖａｒｉａｎｔ Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｓ ｉｎ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ： Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｏｕｒｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＥＩＩＩＡ Ｓｅｇｍｅｎｔ ｉｎ Ｒａｔ Ｈｅｐａｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ， １２７， ２０３７−４８）は、ＥＤａドメインが損傷に対する肝臓の初期応答に関与し、そしてさらにＥＤａドメインは細胞接着過程の媒介に関与すると思われる、ということを示唆する。ＥＤｂ−配列（ＥＤｂ−ＦＮまたはＥＤ−Ｂ ＥＤＢ）を含有するフィブロネクチンアイソフォームは正常成人組織中では検出され得ないが、しかし胎児組織ならびにまさに創傷治癒中の腫瘍組織中では強力な発現を示す。
【０００６】
腫瘍の発達中に、腫瘍が増殖する組織の細胞外マトリックスは、既存のマトリックス構成成分のタンパク質分解的分解により改質される。これと関連して、正常組織のものとは区別され、腫瘍増殖により適した環境を提供し、新脈管形成を促す腫瘍誘導性細胞外マトリックスが生成される。新脈管形成は腫瘍増殖におけるもっとも重要な過程の１つであり、新規の血管が既存の内皮被覆血管から生じる過程を指す。新脈管形成は、あるサイズを超えた腫瘍の増殖を支持する新しい毛管における内皮細胞の細胞外マトリックスのタンパク質分解、増殖、指向性移動および分化を必要とするより侵襲性過程である。
【０００７】
ＥＤｂフィブロネクチンは、腫瘍増殖と関連していた。さらに、ＥＤｂ−ＦＮは、新脈管形成過程中に新血管周囲に濃縮され、したがって新脈管形成に関するマーカーを提供する（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ， Ｐ．； Ｖｉａｌｅ， Ｇ．； Ｄｏｒｃａｒａｔｔｏ， Ａ．； Ｎｉｃｏｌｏ， Ｇ．； Ｋａｃｚｍａｒｅｋ， Ｊ．； Ｑｕｅｒｚｅ， Ｇ．； Ｚａｒｄｅ， Ｌ． （１９９４） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ５９：６１２−６１８）。
ＥＤｂドメインは、９１個のアミノ酸を含み、９６％〜１００％であるラットおよびニワトリフィブロネクチン間の極高配列相同性を有するＩＩＩ型の反復配列である。ＲＧＤＳ配列または、インテグリンとの相互作用を媒介することが既知であるその他のアミノ酸配列はドメイン内には生じない。ＥＤ−Ｂドメインの特定の機能は今日まで未知である。種々の細胞に関する接着／細胞増殖に関する一般的刺激機能についての推測を実施する３つの研究が発表されている。
【０００８】
Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｃｕｌｐ （１９９６）， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌｓ Ｒｅｓ． ２２３， ９−１９は、細胞フィブロネクチンが、フィブロネクチンの一次転写体の選択的スプライシングによって細胞により調節され得るおそらくは接着促進配列としてＥＤｂドメインおよびＩＩＩ型の隣接反復配列を含有する、ということを示した。
【０００９】
その後の研究（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｃｕｌｐ， １９９８， Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｍｅｔａｓｔ．， １６， １， ３０−４２）において、特に、インテグリンを検出する反復配列ＩＩＩ８−９−１０により媒介されるものとは区別されるメカニズムにより、フォーカルアドヒージョンタンパク質のチロシンリン酸化を生じる細胞−シグナル事象をＥＤｂドメインが誘導する、ということが示され得た。細胞外マトリックスとのまたはその他の細胞との細胞接着は、多数の現象、例えば細胞増殖、細胞分化および細胞形質転換の調節に関与する細胞シグナルのための重要な供給源である、ということが益々認められつつある。接着誘導性シグナリングとしては、タンパク質−チロシン−キナーゼの活性化および異なるシグナル分子のチロシンリン酸化のカスケードが挙げられる。
【００１０】
前記の研究の著者等は、このシグナル過程に関して、１２５ ｋＤａフォーカルアドヒージョンキナーゼ（ＦＡＫ）は、細胞内シグナル分子、例えばＳｒｃ（Ｘｉｎｇ， Ｚ．； Ｃｈｅｎ， Ｈ．Ｃ．； Ｎｏｗｌｅｎ， Ｊ．Ｋ．； Ｔａｙｌｏｒ， Ｓ．Ｊ．； Ｓｈａｌｌｏｗａｙ， Ｄ．， ａｎｄ Ｇｕａｎ， Ｊ．Ｌ．， １９９４， Ｄｉｒｅｃｔ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖ−Ｓｒｃ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｆｏｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｓｒｃ ＳＨ２ Ｄｏｍａｉｎ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ． ５， ４１３−２１）、Ｇｒｂ２（Ｓｃｈｌａｅｐｆｅｒ， Ｄ．Ｄ．； Ｈａｎｋｓ， Ｓ．Ｋ．， Ｈｕｎｔｅｒ， Ｔ． ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｅｒ， Ｐ．， １９９４， Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ Ｒａｓ Ｐａｔｈｗａｙ ｂｙ ＧＲＢ２ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ Ｆｏｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｋｉｎａｓｅ． Ｎａｔｕｒｅ， ３７２， ７６８−９１）、およびＰＩ−３−キナーゼ（Ｃｈｅｎ， Ｈ．Ｃ． ａｎｄ Ｇｕａｎ， Ｊ．Ｌ．， １９９４， Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｋｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ ｉｔｓ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３−Ｋｉｎａｓｅ． Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１， １０１４８−５２）の活性化に、マトリックスタンパク質との細胞相互作用を結びつけるという最重要性を有する、ということを指摘したいと思う。
【００１１】
別のフォーカルアドヒージョンタンパク質ｐ１３０ｃａｓから、それは接着媒介性シグナル事象に、ならびに特定の癌遺伝子活性に関与するということも推測されるが、しかし今日までその特定の機能は説明されていない（Ｓａｋａｉ， Ｒ．； Ｉｗａｍａｔｓｕ， Ａ．； Ｈｉｒａｎｏ， Ｎ．， ｅｔ ａｌ． １９９４， Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ， ｐ１３０， Ｆｏｒｍｓ Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｗｉｔｈ ｖ−Ｓｒｃ ｉｎ ａ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍａｎｎｅｒ． ＥＭＢＯ Ｊ． １３， ３７４８−５６； Ｐｅｔｃｈ， Ｌ．Ａ．； Ｂｏｃｋｈｏｌｔ， Ｓ．Ｍ．， Ｂｏｕｔｏｎ， Ａ．， Ｐａｒｓｏｎｓ， Ｊ．Ｔ． ａｎｄ Ｂｕｒｒｉｄｇｅ， Ｋ．， １９９５， Ａｄｅｈｅｓｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐ１３０ ＳＰＣ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ， １０８， １３７１−９； Ｐｏｌｔｅ， Ｔ．Ｒ． ａｎｄ Ｈａｎｋｓ， Ｓ．Ｋ．， １９９５， Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ｆｏｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ Ｃｒｋ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｐ１３０Ｃａｓ， Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９２， １０６７８−８２）。
【００１２】
ＣｈｅｎとＣｕｌｐ（１９９８， ａａＯ）による研究は、一反復タンパク質ＥＤｂが、ＢＡＬＢ／ｃ ３Ｔ３細胞の増殖に関して、ならびにＦＡＫ−チロシンリン酸化の誘導に関して、隣接反復体ＩＩＩ８等より大きく促された、ということを示している。生理学的濃度の細胞フィブロネクチンの場合、インテグリンとのＩＩＩ１０からのテトラペプチドＲＦＤＳの結合は、ＩＩＩ１０およびインテグリン媒介性メカニズム間の相互作用からチロシンリン酸化応答が生じないよう、おそらくは細胞接着に不適切な強度を有するシグナルを生じる、という仮説が出された。種々の媒介性細胞接着に対する応答に関する差は、種々の小ＧＴＰ結合タンパク質の種々の活性化により生成される、とさらに仮定される。
【００１３】
すべてｒａｓスーパーファミリーの成員であるこれらのタンパク質のうちの３つ、即ちｃｄｃ４２、ｒａｃおよびｒｈｏは、細胞−形態学的変化の場合に重要な役割を演じる。ｃｄｃ４２は、ｒａｃから引き続き上流で作用し、フィロポディアの出現を直接的に誘導する（Ｎｏｂｅｓ， Ｃ．Ｄ． ａｎｄ Ｈａｌｌ， Ａ．， １９９５， Ｒｈｏ， ｒａｃ ａｎｄ ｃｄｃ４２ ＧＴＰａ−ｓｅｓ Ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｈｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｆｏｃａｌ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ａｃｔｉｎ Ｓｔｒｅｓｓ Ｆｉｂｅｒｓ， Ｌａｍｅｌｌｉｐｏｄｉａ ａｎｄ Ｆｉｌｏｐｏｄｉａ， Ｃｅｌｌ． ８１， ５３−６２）。ｒａｃの活性化は次に、ラメリポディアの形成およびフィロポディア間のアクチンフィラメントの網状構造に関与する。さらに下流では、ｒａｃによりｒｈｏが活性化され、そしてフォーカルアドヒージョンおよびアクチンストレス繊維を誘導し得る。
【００１４】
これらの事象はすべてチロシンキナーゼの活性化によっており、そして、それはこれらの過程に関与するとＦＡＫから推量される。ＣｈｅｎとＣｕｌｐは、７−ＥＤｂ−８を介して接着する細胞と、８−９−１０を介して接着する細胞との間の形態学的差は、小ＧＴＰ結合タンパク質の種々の活性化に基づいている、と推測している。前記は、インテグリン媒介性シグナル経路による８−９−１０を介した接着はフォーカルアドヒージョンおよびアクチンストレス繊維を精製するためのｒｈｏの活性化を最終的にもたらすが、一方、７−ＥＤｂ−８を介したＢＡＬＢ／ｃ−３Ｔ３細胞の接着はｃｄｃ４２タンパク質およびｒａｃタンパク質の活性化のみをもたらし、ｒｈｏを活性化しない、ということを示唆する。しかしながら前記の推測に関しては、２つの研究のいずれにおいてもデータが提示されていない。
【００１５】
別の研究（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｕｏｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １１０， ２２７１−２２８０）は、培養繊維芽細胞の細胞接着はＥＤｂ−フィブロネクチンドメインを含むフィブロネクチン断片の存在により強化される、ということを示す。前記は、スプライス化ＥＤｂドメインは細胞接着および細胞増殖の強化に関して重要な生物学的機能を有し得る、ということを示唆する。しかしながらＥＤｂの非存在下での断片中のＥＤａの含入は、細胞における良好なフォーカルアドヒージョンの形成を妨げる。この研究の著者等は、これが、フィブロネクチン分子中の２つのドメインの含入が、強力な漸進的運動過程が促される程度に細胞接着が達成されるメカニズムを生じ得るという事実に基づいており、この場合、接着および接着の喪失の両方が細胞の強力な漸進的運動に必要である、と推測している。
【００１６】
ニワトリ胚および成体マウスに関する研究は、ＥＤｂ−媒介性新脈管形成が内皮細胞インテグリンα３β１の阻害により遮断され得る、ということを示した（Ｒｅｎａｔｏ ｅｔ ａｌ．， ＡＡＣＲ ２００１， ＬＢ−６０）。
前記の研究および試験はいずれもＥＤｂドメインの機能に関する明瞭な応答を生じていないが、しかしながらＥＤｂドメインに対して考え得る受容体（単数または複数）の同一性に関して記述されている。
【００１７】
したがって本発明の目的は、ＥＤｂドメインの機能をさらに明らかにすることである。本発明の別の目的は、ＥＤｂドメインに対して考え得る特異的受容体を同定することである。本発明の別の目的は、ＥＤｂ−特異的接着メカニズム、ならびに新脈管形成の過程に関与し得る受容体分子との相互作用を明らかにすることである。さらに、特異的結合に関与するＥＤｂ領域を同定することが本発明の一目的である。
【００１８】
本発明の目的は、以下の性質：
ａ）ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインと特異的に結合する能力を有し、
ｂ）内皮細胞中で特異的に発現または活性化され、
ｃ）腫瘍のストローマ細胞中で特異的に発現または活性化され、
ｄ）腫瘍細胞中で特異的に発現または活性化され、
ｅ）ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインとのその結合がポリペプチドにより阻害され、そして
ｆ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定した場合、軽鎖に関しては１２０〜１３０ ｋＤａの、そして重鎖に関しては１５０〜１６０ ｋＤａの見かけの分子量を有する、
を有するタンパク質により達成される。
【００１９】
特に好ましいのは、以下の性質：
ａ）ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインと特異的に結合する能力を有し、その結合領域が、配列番号１〜３からなる群から選択される少なくとも１つの配列により特徴づけられ、
ｂ）内皮細胞中で特異的に発現または活性化され、
ｃ）腫瘍のストローマ細胞中で特異的に発現または活性化され、
ｄ）腫瘍細胞中で特異的に発現または活性化され、
ｅ）ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインとのその結合が配列番号１〜３からなる群から選択される配列を含むポリペプチドにより阻害され、そして
ｆ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定した場合、軽鎖に関しては１２０〜１３０ ｋＤａの、そして重鎖に関しては１５０〜１６０ ｋＤａの見かけの分子量を有する、
を有するタンパク質である。
【００２０】
実際特に好ましいのは、以下の性質：
ａ）ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインと特異的に結合する能力を有し、そしてインテグリンのα２β１鎖を含み、
ｂ）内皮細胞中で特異的に発現または活性化され、
ｃ）腫瘍のストローマ細胞中で特異的に発現または活性化され、
ｄ）腫瘍細胞中で特異的に発現または活性化され、
ｅ）ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインとのその結合がポリペプチドにより阻害され、そしてインテグリンのα鎖を含み、そして
ｆ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定した場合、軽鎖に関しては１２０〜１３０ ｋＤａの、そして重鎖に関しては１５０〜１６０ ｋＤａの見かけの分子量を有する、
を有するタンパク質である。
【００２１】
好ましい実施態様では、内皮細胞は増殖性内皮細胞である。
好ましい実施態様では、ストローマ細胞は腫瘍−ストローマ細胞である。
さらに、本発明の目的は、ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインとのその結合が内皮細胞、腫瘍−ストローマ細胞および腫瘍細胞の接着を媒介するタンパク質により達成される。結合領域は本明細書中では、配列番号１〜３からなる群から選択される少なくとも１つの配列により特徴づけられ得るし、そして特にインテグリンのα２β１鎖を含む。
【００２２】
本発明の目的は、ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインとのその特異的結合が内皮細胞の増殖を誘導するタンパク質によっても達成される。結合領域は、本明細書中では、配列番号１〜３からなる群から選択される少なくとも１つの配列により特性化され、そして特に、インテグリンのα２β１鎖を含む。
【００２３】
さらに、本発明の目的は、ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインとのその特異的結合がコラーゲンマトリックス中の内皮細胞の増殖、移動および分化を誘導するタンパク質であって、結合領域が少なくとも１つの配列により特性化されるタンパク質により達成される。結合領域は本明細書中では、配列番号１〜３からなる群から選択される少なくとも１つの配列により特性化され、そして特にインテグリンのα２β１鎖を含む。
【００２４】
本発明の目的はさらに、ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインと結合し、特定のシグナル伝達経路を誘導するタンパク質であって、
フォーカルアドヒージョンキナーゼ、
ＣＤ６リガンド（ＡＬＣＡＭ）、
ビトロネクチン受容体のα鎖、
組込まれたα８サブユニット、および
フォリスタチン関連タンパク質のための前駆体（１または複数）
からなる群から選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を誘導するタンパク質により達成される。
【００２５】
結合領域は、配列番号１〜３からなる群から選択される少なくとも１つの配列により特徴づけられ、そして特にインテグリンのα２β１鎖を含む。
特定のシグナル伝達経路の誘導において、少なくとも１つの前記の遺伝子が少なくとも１つの場所で誘導されるのが好ましい。この場合、好ましくは少なくとも１つの前記の遺伝子は２つの場所で誘導される。
本発明の目的は、本発明のタンパク質と結合し得る抗体によっても達成される。
【００２６】
さらに、本発明の目的は、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質と結合し得る抗体により達成される。
好ましい実施態様では、抗体は、ＥＤｂドメインに特異的である作用を阻害し得る。
結合および阻害は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで実行されるのが好ましい。
好ましい実施態様では、抗体はモノクローナルまたは組換え体である。
好ましい実施態様では、抗体はｓｃＦｖ断片である。
【００２７】
本発明の目的は、本発明のタンパク質を発現する細胞により達成される。
さらに、本発明の目的は、本発明の抗体を発現する細胞により達成される。
さらに、本発明の目的は、本発明の抗体を発現するファージにより達成される。
【００２８】
本発明の目的は、ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインの受容体と結合する化合物のスクリーニング方法であって、１つまたはそれ以上のこれらの化合物の存在下での細胞の応答と、これらの化合物の非存在下での前記細胞の対照応答との比較を含んで成る方法であり、細胞が
本発明のタンパク質を発現し、または
このタンパク質をコードする核酸を含み、そして
前記応答または対照応答がＥＤｂ−フィブロネクチンドメインの受容体により媒介される、方法によっても達成される。
【００２９】
好ましい実施態様では、応答または対照応答はＥＤｂ−フィブロネクチンドメインまたはその一部分で被覆される表面への細胞の接着を包含する。
本方法の好ましい実施態様では、ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインの結合領域は、配列番号１〜４の配列またはその一部分を含む。
応答または対照応答は、ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインまたはその一部分で被覆される表面上の細胞の増殖を包含するのが好ましい。
【００３０】
好ましい実施態様では、応答または対照応答は、ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインまたはその一部分とともに用いられるコラーゲンマトリックス中の内皮細胞の増殖、移動および分化を包含する。
化合物は、抗体、抗体断片、人工抗体、ペプチド、低分子化合物、アプタマーおよびＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒからなる群から選択されるのが好ましい。
好ましい実施態様では、抗体は組換え抗体である。
抗体は、ｓｃＦｖおよびその断片からなる群から選択されるのが好ましい。
【００３１】
本発明の目的は、ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインと結合する化合物のスクリーニング方法であって、
ａ）異なる濃度の１つまたはそれ以上の化合物の存在下で、一定濃度の、ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインを含むタンパク質または配列番号１〜４で表わされる配列の１つを有するタンパク質と細胞を接触させ、そして
ｂ）これらの化合物の非存在下でのＥＤｂ−フィブロネクチンドメインを含むタンパク質または配列番号１〜４で表わされる配列の１つを有するタンパク質に対する細胞の対照応答との比較における、化合物の存在下でのＥＤｂ−フィブロネクチンドメインを含むタンパク質または配列番号１〜４で表わされる配列の１つを有するタンパク質に対する細胞の応答における差を測定する、
ことを含む方法であって、
前記細胞が本発明のタンパク質を発現し、あるいは
このタンパク質をコードする核酸を含む、
方法であり、そして応答または対照応答がＥＤｂ−フィブロネクチンドメインの受容体により媒介される、方法によっても達成される。
【００３２】
この場合、応答または対照応答は、ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインまたはその一部分で被覆される表面への細胞の接着を包含するのが好ましい。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技法の標準方法を用いて産生され、ヒト腫瘍低温切片に関する免疫組織学により特性化される（図１３参照）。
例として：ＡＫ ＡＭ−ＥＤＢｒ−２（ネズミＩｇＧ１／κ）
好ましい実施態様では、応答または対照応答は、ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインまたはその一部分で被覆される表面上の細胞の増殖を包含する。
別の好ましい実施態様では、応答または対照応答は、ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインまたはその一部分と混合されるコラーゲンマトリックス中の内皮細胞の増殖、移動および分化を包含する。
【００３３】
化合物は、抗体、人工抗体、抗体断片、ペプチド、低分子化合物、アプタマーおよびＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒからなる群から選択されるのが好ましい。
本発明の目的は、ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインの受容体またはＥＤｂ−フィブロネクチンドメインと結合する化合物をスクリーニングするための、配列番号１〜４からなる群から選択される配列を含むタンパク質をコードする核酸の使用によりさらに達成される。
本発明の目的は、ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインの受容体またはＥＤｂ−フィブロネクチンドメインと結合する化合物をスクリーニングするための本発明のタンパク質または本発明の抗体の使用によっても達成される。
【００３４】
本発明の目的は、ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインの受容体またはＥＤｂ−フィブロネクチンドメインと結合する化合物をスクリーニングするための本発明の細胞の使用によっても達成される。
本発明の目的は、診断または治療目的のための抗体またはｓｃＦｖ融合タンパク質を開発するための、配列番号１〜４からなる群から選択される配列を含むタンパク質をコードする核酸の使用によっても達成される。
【００３５】
本発明の目的は、診断または治療目的のための抗体またはｓｃＦｖ融合タンパク質を開発するための本発明のタンパク質の使用によっても達成される。治療目的は、即ち、ＥＤｂおよび受容体間の特異的相互作用を阻害する化合物での抗血管形成療法と定義される。これと関連して、抗体は、受容体およびＥＤｂの両方に対して向けられ、配列番号１〜３のペプチドおよびその安定化誘導体、ならびに低分子化合物が用いられる。
【００３６】
本発明の目的は、診断または治療目的のための抗体またはｓｃＦｖ融合タンパク質を開発するための本発明の細胞の使用によっても達成される。
本発明の目的は、診断または治療目的のための抗体またはｓｃＦｖ融合タンパク質を開発するための本発明のファージの使用によっても達成される。
本発明の目的は、前脈管形成療法のための配列番号１〜４からなる群から選択される配列を含むタンパク質の使用によっても達成される。
本発明の目的は、診断目的のための配列番号１〜４からなる群から選択される配列を含むタンパク質の使用によっても達成される。
【００３７】
本発明の目的は、遺伝子療法における配列番号１〜４からなる群から選択される配列を含むタンパク質の使用によっても達成される。
本発明の目的は、内皮細胞と結合する表面を被覆するための配列番号１〜４からなる群から選択される配列を含むタンパク質の使用によっても達成される。
この場合、被覆はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで実行されるのが好ましい。
本発明の目的は、細胞培養中の配列番号１〜４からなる群から選択される配列を含むタンパク質の使用によっても達成される。
本発明の目的は、少なくとも１つのトランスプラントと一緒の、配列番号１〜４からなる群から選択される配列を含むタンパク質の使用によっても達成される。
【００３８】
この場合、トランスプラントは、血管（単数または複数）、皮膚、角膜、腎臓、肝臓、骨髄、心臓、肺、骨、胸腺、小腸、膵臓、その他の内部器官、ならびにその一部分および細胞からなる群から選択されるのが好ましい。
本発明の目的は、少なくとも１つのインプラントと一緒の、配列番号１〜４からなる群から選択される配列を含むタンパク質の使用によっても達成される。
この場合、インプラントは、肺インプラント、人工ペースメーカー、人工心弁、血管インプラント、内人工器官、ねじ、副子、プレート、ワイヤ、ピン、杆状体、人工関節、胸部インプラント、人工頭部プレート、義歯、充填物およびブリッジからなる群から選択されるのが好ましい。
【００３９】
「ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインに特異的である作用」とは、ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインにより生成されるが、しかしＥＩＩＩ７、ＥＩＩＩ８等により生成されないようなすべての作用と定義される。このような作用は、例えばＣｈｅｎとＣｕｌｐ（１９９８， ａａＯ）に記載されており、即ち、ドメインＥＩＩＩ８−９−１０により媒介される接着後のより遅いと思われるリン酸化と対照的な、いくつかの細胞内タンパク質の迅速チロシン−リン酸化である。「低分子化合物」は、その相対的分子量が約１０００〜１２００であるすべての化合物と定義される。「アプタマー」は、多数の生体分子に対する高特異的リガンドと作用し得る核酸を生成するために作製される分子と定義される。
【００４０】
「前脈管形成療法」は、新脈管形成が必要とされる任意の形態の治療と定義される。「抗脈管形成治療／療法」は、新脈管形成を阻害するよう意図される任意の形態の治療／療法と定義される。「遺伝子療法」は、タンパク質の排除または調製により影響を及ぼされ得る疾患の場合の正常遺伝子機能の遺伝子関連機能不全または修復を排除するよう意図される任意の形態の療法と定義される。それは、身体細胞中への外来ＤＮＡの浸潤を包含し得るが、しかしそれに限定されるとは考えられない。「細胞培養」とは、細胞培地および細胞培養容器と定義されるものである。細胞培養容器は、好ましくは細胞培養瓶、細胞培養皿、細胞培養ボウル、細胞培養プレート、微小滴定プレート、９６−ボウルプレート、細胞培養フラスコおよびバイオリアクターからなる群から選択される。
【００４１】
「診断目的」とは、生物体／器官／細胞の状態の検定に、あるいは特異的状態部類（例えば特定疾患）への生物体／器官／細胞の共通状態の割当てに役立つすべての目的であり、例えばこれは、物理的値、例えば温度等、または化学的値、例えば濃度等を測定するためのキット／化学試薬／測定装置の使用であり得るが、それらに限定されない。
【００４２】
「治療目的」とは、生物体／器官／細胞の疾患状態の改善または治癒に役立つすべての目的である。「タンパク質の、インプラントを伴う使用」という語句は、時間または空間的に同一である使用を意味する。例えばタンパク質分子は、身体中へのその「組入れ」においてインプラントに結合され得るし、さもなくばそれらはインプラントから物理的に分離され得るが、しかしそれらはインプラントの「組入れ」と同時に投与される（注射等）。
【００４３】
以下の実施例および図面に基づいて、ここで本発明を詳細に説明する。
図１は、本試験において用いられる、そしてＩＩＩ型の種々の反復配列を伴う種々のドメイン構造を有する種々の組換えフィブロネクチン断片を図示する。この場合、Ｆｎ−７−Ｂ−８−９はフィブロネクチンドメイン７を含み、ＥＤｂＢは８および９を含み、Ｆｎ−７−８−９はドメイン７、８および９を含み、ＥＤ−ＢはドメインＥＤｂを含み、ＦＮ−１０はドメイン１０を含み、そしてＦｎ−６はドメイン６を含む。これらのタンパク質は、大腸菌中でＨｉｓタグで提示されるタンパク質として発現され、そしてニッケル−キレート−セファロースカラム上で精製された。本試験に用いられる参照番号は、文献中に用いられたものに対応する。この場合、略号ＦＮ−Ｂ、ＥＤ−Ｂ、ＥＤＢおよびＥＤｂはすべて、各々の場合のＥＤｂ−フィブロネクチンドメインを指し、そして同義であるとみなされ得る。
【００４４】
図２は、内皮細胞（ＥＣ）またはストローマ細胞（ＳＣ）の増殖に及ぼすＥＤｂ−フィブロネクチンドメイン（ＥＤ−Ｂ）の作用を調べた増殖検定の結果を示す。１０００細胞／ボウルを９６−ボウルプレート中でインキュベートした。可溶性ＥＤ−Ｂ（１０μｇ／ｌ）を、増殖検定中に培地に付加した。３日後、ＭＴＳ検定により細胞数を決定した。塩基性フィブロネクチン増殖因子（ｂＦＧＦ）により、細胞の増殖を誘導した。それは、ＥＤ−ＢがｂＦＧＦの非存在下では作用を示さず、そしてＩＩＩ型のフィブロネクチンドメインに関する作用も細胞中のｂＦＧＦの存在下で検出され得ない、ということを示した（データは示されていない）。
【００４５】
ヒト内皮細胞増殖に及ぼすＥＤ−Ｂの作用は、ゼラチン上に平坦化されていた細胞中（ＥＣ／ゼラチン）で、そしてコラーゲン上で平坦化されていた細胞（ＥＣ／コラーゲン）においても決定され得たが、しかしながらこの場合、後者作用はゼラチン上での平坦化と同様に有意であったわけではない。ゼラチン上でのヒトストローマ細胞（ＳＣ／ゼラチン）の場合には、ｂＦＧＦの非存在下でさえ、ヒト内皮細胞をかなり上回る増殖が起こった。それは、ｂＦＧＦまたはｂＦＧＦ＋ＥＤ−Ｂの付加により増大され得なかった。細胞計数のための比較基準として、４９０ ｎｍでの吸光度を測定した。
【００４６】
増殖検定のために、以下の実験法にしたがった：
材料：  ９６−ボウルプレート（平底）、Ｎｕｎｃ
培地：ＭＣＤＢ １３１、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、アムフォテリシン（０．２５μｇ／ｍｌ）、ヘパリン（２０μｇ／ｍｌ）、熱不活性化ＦＣＳ（５％）
方法：
細胞（１００μｌ中５００〜１０００／ボウル（９６−ボウルプレート））を、ｂＦＧＦ（１〜３ ｎｇ／ｍｌ）またはＶＥＧＦ（３０〜５０ ｎｇ／ｍｌ）を含有する培地中で３日間培養する。滴定により、各バッチに関して正確な量を測定すべきである：最大増殖刺激を達成する最小濃度が最適である。実験前の細胞の同調は必要でないが、しかし実行し得る。３日後、メーカーの情報にしたがって、ＭＴＳキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）により細胞数を決定する。いくつかの点での吸光度を測定して、線状範囲（０．５；１；２；４時間）における最大吸光度を得ることが推奨される。
対照：
陰性対照、マイトジェンなし（増殖なし）（−ｂＦＧＦ／ＶＥＧＦ）
陽性対照、マイトジェン使用（最大刺激）（＋ｂＦＧＦ／ＶＥＧＦ）
【００４７】
図３は、扁平球体からの内皮細胞の分割に及ぼすＥＤ−Ｂの作用を示す。このために、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞Ｈｕｍａｎ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｖｅｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ）−扁平球体をコラーゲン中に包埋し、６μｇ／ｍｌのＥＤ−Ｂの存在下または非存在下で、１０μｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（塩基性繊維芽細胞増殖因子）の付加により分割するよう誘導した。分割はｂＦＧＦ単独の付加により誘導され、次にＥＤ−Ｂ（＋ｂＦＧＦ＋ＥＤ−Ｂ）の付加によりさらに刺激され得る、ということが示された。
【００４８】
分割試験（管形成試験）のために、以下の実験方法を用いた：
材料：
メチルセルロース、最高粘度（Ｓｉｇｍａ）
細胞培養用のトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）
丸底９６−ボウルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＃６５０１８５）
組換えｂＦＧＦ（Ｇｉｂｃｏ＃１３２５６−０２９）
組換えＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）
抗ラットＣＤ３１（ＲＤＩ＃ＲＤＩ−ＣＤ３１ＴＬＤ）
ヘパリン（Ｇｉｂｃｏ＃１５０７７−０２７）
【００４９】
溶液：
ＰＢＳ／抗生物質剤：細胞培養−ＰＢＳ、１０ｘＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、２．５μｇ／ｍｌのアムフォテリシン、１％ゼラチン（Ｄｉｆｃｏ、冷却後、オートクレーブ処理し、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐおよびアムフォテリシン（０．２５μｇ／ｍｌ）と混合する）
培地：ＭＣＤＢ １３１、グルタミン、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、アムフォテリシン（０．２５μｇ／ｍｌ）、ヘパリン（２０μｇ／ｍｌ）、熱不活性化ＦＣＳ（１０％）
増殖培地：２ ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦおよび１０ ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを含有する培地
細胞：
ＨＵＶＥＣ
皮膚ＭＶＥＣ（継代＞４）
【００５０】
方法：
内皮細胞をトリプシン／ＥＤＴＡを用いて溶解し、０．２４％メチルセルロースを含有する培地中で５０００細胞／ｍｌで希釈する。各々２００ μｌ（１０００細胞）をＧｒｅｉｎｅｒプレートのボウルに付加し、一夜インキュベートする。円形細胞クラスター（扁平球体）を、斜角面先端を有する１ ｍｌピペットを用いて収穫し、遠心分離処理する。扁平球体を１．２％メチルセルロース／ＦＣＳ中に再懸濁し、中和コラーゲンゲルと混合する。ＥＤｂＢおよびｂＦＧＦを共重合した。
図から明らかなように、分割に際しての有意の増大は、ＥＤ−Ｂの付加によりｂＦＧＦ誘導性値を超えて起こる。
【００５１】
図４は、ＥＤ−Ｂで被覆された微小滴定ボウルプレートへの内皮細胞の接着の結果を示す。このために、それらの支持体のトリプシン処理（トリプシン／ＥＤＴＡ）によりそれらのオリジナル培養容器からの内皮細胞を溶解し、次に、種々の濃度（０、１、２、３、５、１０、２０、４０μｇ／ｍｌ）のＥＤ−Ｂで被覆された微小滴定ボウルプレート中でインキュベートし、１時間接着させたままにした。陰性対照として、１ ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）で被覆されたボウルを用いた。ＢＳＡ（＜１０％）との接着を差し引いた。
【００５２】
クリスタルバイオレットで染色し、その後ＳＤＳで溶解することにより、接着を定量した。５９５ ｎｍでの吸光度を測定することにより、定量を実行した。図中でＡ ｎｍ 約 １．０６で水平に引かれた線は、血漿−フィブロネクチンへの１００％接着を示す。
この試験の結果は、ＥＤ−Ｂで被覆された表面に細胞が接着することを示し、これは、ＥＤ−Ｂに対する細胞表面の受容体を示唆する。
接着／接着試験のために、以下の実験方法を用いた：
溶液：
１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、エタノール沈降）
ＰＢＳ中の２％血清（またはトリプシン中和溶液）
培地：ＭＣＤＢ １３１、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、アムフォテリシン（０．２５μｇ／ｍｌ）、ヘパリン（２０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、エタノール沈降）、０．１％クリスタルバイオレット、ＰＢＳ中２％グルタルアルデヒド、濾過により滅菌（２％ＳＤＳ）
【００５３】
方法：
９６−ボウルプレート（Ｎｕｎｃ）を、３７℃で１時間、タンパク質で被覆する。小タンパク質またはペプチド（＜２０ ｋＤａ）を用いる場合、ペプチドをプレート上で乾燥することが推奨される（滅菌バンク下で被覆なしで一夜）。次にボウルを、３７℃で１時間、１％ＢＳＡで飽和する。細胞を１ｘトリプシン中に溶解し、２％血清で洗浄して、トリプシンを不活性化し、培地中に再懸濁する。抗体またはペプチドを試験する場合、細胞をペプチドを含有する懸濁液中で３７℃で３０分間予備インキュベートする。１０４細胞／ボウル（９６−ボウルプレート）を５０〜１００μｌの容積中で３７℃で１時間インキュベートする。
【００５４】
上清を注意深く注ぎ出して、プレートを逆さにしたままにして、紙タオル上で１分間水気を切って、付着細胞をクリスタルバイオレット／グルタルアルデヒドで１５分間染色して、接着させる。ボウルをＰＢＳで３回洗浄し、次に、２％ＳＤＳを付加する（振盪器中で１５分）ことにより、細胞を溶解する。５９５ ｎｍでの吸光度を測定する。水で３回洗浄後、細胞を、所望により、再び染色する。
対照：
陰性対照：空ボウル（ＢＳＡ対照）
陽性対照：血漿−フィブロネクチン（２．５μｇ／ｍｌ）
接着％＝Ａ５９５（試料）：１００ｘ Ａ５９５（フィブロネクチン）
【００５５】
図５は、その配列がＥＤ−Ｂで被覆された微小滴定ボウルプレートへの接着前に、その配列がＥＤｂ−フィブロネクチンドメインの部分配列である２５０μＭの種々の合成ペプチドとともに細胞を予備インキュベートした以外は、図４の場合と同様の試験の結果を示す。５９５ ｎｍ（Ａ５９５）での吸光度の測定により、接着を決定した。図に適用されたペプチド名は、図６で説明されている。この場合、ペプチド配列Ｎｏ．０４３は配列番号１で表わされる配列に対応し、ペプチド配列Ｎｏ．５５３は配列番号２に対応し、ペプチド配列Ｎｏ．０３８は配列番号３に対応する。より高いＡ５９５値は非阻害化接着に対応し、一方、より低いＡ５９５値は対応するペプチドによる接着の阻害に対応する。
図４に関して記載された方法にしたがった。
【００５６】
図６は、ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインの全体配列から除去された選定配列名を有する合成ＥＤ−Ｂの部分配列を示す。アミノ酸に関する一文字暗号を用いる。
図７は、ここでは微小滴定ボウルプレートをＥＤｂ−フィブロネクチンドメインで被覆せず、むしろ図５からの試験で阻害性を立証したペプチド、または非阻害性を立証したペプチドとともに予備インキュベートし、したがってペプチドで被覆された以外は、図５の場合と同様の試験結果を示す。この場合、これらの試験における細胞は、ここでは、Ａ５９５値に対して測定した阻害ペプチドのそれぞれ１つを用いたコーティングの場合、接着を示すが、一方、非阻害性を立証した図５からのペプチドはいかなる接着ももたらさない、ということが示されている。
図４に関して記載された方法にしたがった。
【００５７】
図８は、ＥＤｂ−フィブロネクチンドメイン（ＥＤ−Ｂ）のモデル構造を示す。これから、阻害ペプチドＮｏ．１（配列番号１）、Ｎｏ．２（配列番号２）およびＮｏ．３（配列番号３）の位置が示される。それは、これらの阻害ペプチドがＥＤ−Ｂのループ１またはループ５上に位置し、したがって細胞とのまたは細胞上に見いだされる受容体との結合が起こるドメインの領域を同定することを示す。図８に示したＥＤ−Ｂドメインのモデル構造は、ＩＩＩ型のフィブロネクチンドメイン７のすでに決定された構造に基づいている。Ｎ−ＴおよびＣ−Ｔは、ＮまたはＣ末端を表わす。
【００５８】
図９は、分割試験において、毛管様構造の誘導（管形成）における、ＥＤ−Ｂおよび予め阻害性と決定されたペプチドの付加、ならびにＩＩＩ型のフィブロネクチンドメインの付加の作用を調べる試験の結果を示す。最大作用は、コラーゲンゲルへの塩基性Ｂｆｇｆ誘導性浸透による付着を阻害する配列番号２のペプチドにより生成される、ということが示されている。したがってこのペプチドは、コラーゲンゲル中での内皮細胞の浸透に及ぼす刺激作用を有する。したがってこのペプチドはＥＤｂの結合領域に対応し、ＥＤｂそれ自体と同様に、コラーゲン中での内皮細胞の浸透を刺激する。
図３に関して記載された方法にしたがった。
【００５９】
図１０は、表面標識化ヒト皮膚内皮細胞からの細胞溶解物のアフィニティークロマトグラフィーの結果を示す。この点で、細胞表面でビオチニル化される増殖性内皮細胞を洗剤で溶解し、アフィニティークロマトグラフィーに付したが、この場合、挿入ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインを用いてまたは用いずに（ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインを用いた場合＝Ｆｎ−７−Ｂ−８−９、ＥＤｂ−フィブロネクチンドメインを用いなかった場合＝Ｆｎ−７−８−９）、フィブロネクチンの短い断片をセファロースに結合した。１２０〜１３０ｋＤａの見かけの分子量を有するビオチニル化タンパク質は、ＥＤ−Ｂ含有断片と特異的に結合する（矢印参照）、ということが示され得る。ＥＤＴＡにより、溶離を実行する。下記のいくつかの分画を収集した。
【００６０】
次に分画にＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理を施して、ストレプタビジン−ペルオキシダーゼを用いたウエスタンブロットおよび化学発光（ＥＣＬ）により試験した。トレース１および５は前溶離分画を示し、一方、トレース２、３、４または６、７、８は溶離分画１、２および３を示す。トレース１〜４は、Ｆｎ−７−８−９を用いたクロマトグラフィーを示し、一方、トレース５〜８はＦｎ−７−Ｂ−８−９を用いたクロマトグラフィーを示す。本明細書に示した結果は、１２０〜１３０ ｋＤａの分子量を有する顕著な帯域がＥＤｂ含有フィブロネクチン断片と特異的に結合するタンパク質であり、したがってＥＤｂ−フィブロネクチンドメインの受容体を表わす、ということを強く示す。
【００６１】
内皮細胞のビオチニル化および溶解のために、以下の実験方法にしたがった：
材料：  ビオチンアミドヘキサン酸−３−スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシニミド−エステル；Ｓｉｇｍａ
ＰＢＳ ｗ／ｏ Ｍｇ／Ｃａ（ダルベッコ）
ＨＥＰＥＳ緩衝液：２０ ｍｍｏｌのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、１ ｍｍｏｌのＣａＣｌ２、１μｍのＭｇＣｌ２、０．１％ＮａＮ３
１％ＣＨＡＰＳ（ｖ／ｖ）、および
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ完全ミニプロテアーゼ阻害剤ＥＤＴＡ無含有カクテル錠剤
【００６２】
方法：ビオチニル化の前および後に、細胞培養瓶をＰＢＳ ｗ／Ｃａ＋Ｍｇでそれぞれ３回洗浄する。最終洗浄過程前に、ビオチン緩衝液（１ ｍｇ／１５ ｍｌのＰＢＳ）を調製する。ぐるりと回しながら、瓶の底全体に容積が分散し得るよう、各々の瓶に５ ｍｌの緩衝液（２２５ ｃｍ２に対して）または１２．５ ｍｌ（５００ ｃｍ２プレート）を底の中央にピペット分取する。次に一次培養瓶を溶解緩衝液容積の半分で処理する。緩衝液も瓶の底の中央にピペット分取し、全表面に分散させる。次に細胞掻取り器の助けを借りて、細胞を掻き取る。
【００６３】
次に一次培養瓶の全容積を二次瓶にピペット分取し、その過程を反復する。最終瓶後に、容積を５０ ｍｌ円錐遠心管中に移す。溶解緩衝液の他の半分を用いて、この過程を全培養瓶中で反復し（細胞掻取り器を用いずに）、最終容積も遠心管に付加する。それを、室温で５分間、３０００ ｒｐｍで５０ ｍｌ円錐培養管中で遠心分離する（Ｈｅｒａｅｕｓ卓上遠心機）。溶解物をピペット分取で取り出して、理想的にはアフィニティークロマトグラフィーのために直ちに用いられるべきである（しかしながら、緊急の場合、それは−８０℃で凍結もし得る）。
【００６４】
セファロースとのタンパク質の共有結合のために、以下の方法を選択した：
材料：  活性化ＣＨセファロース４ＢＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、コード番号１７−０４９０−０１、１ ｍｍｏｌのＨＣｌ、２．２％ＮａＨＣＯ３
方法：  ＨＣｌを氷浴中で冷却し、セファロースを室温に加熱させる
次に、セファロースを１ ｍｍｏｌのＨＣｌで洗浄する。１０ ｍｌのＨＣｌがセファロース１ ｍｌ当たりで必要とされる。セファロースを予備冷却管中に徐々に滴下させ、そこで次に約１５分間膨張する（１ ｇのセファロースは、３ ｍｌの膨潤セファロースに対応する）。次に管を８００ Ｕで１分間遠心分離する。上清をピペット分取で取り出して、廃棄する。
この過程を３回反復する。
【００６５】
３回目の洗浄後、ＨＣｌを再び付加し、管をぐるりと回して、８００ Ｕで３〜５分間遠心分離する。上清をピペットで取り出して、ペレットを２０ ｍｌのミリポア水で溶解し、２つの新しい遠心管に移す（７−ＥＤＢ−８−９セファロースおよび７−８−９セファロースの各々に１つの管、即ち、反復体ＩＩＩ７、ＥＤｂ、ＩＩＩ８およびＩＩＩ９またはＩＩＩ７、ＩＩＩ８およびＩＩＩ９を伴うポリペプチドをセファロースに結合する）。管を再び直ちに遠心分離して、上清をピペットで取り出し、１〜５ ｍｇのタンパク質／セファロース１ ｍｇを結合し得る（即ち２ ｍｇのタンパク質／１ ｍｌのセファロース７−８−９、２ ｍｇのタンパク質／１ ｍｌのセファロース７−ＥＤＢ−８−９）。
【００６６】
ぐるりと回して試験管を混合する。次に、２．２％ＮａＨＣ３（５０μｌ／ｍｌ）の付加を迅速に実行する。その結果、残留ＨＣｌが中和される。「ロッカーテーブル」上で最大段階で１〜５時間、試験管をぐるりと回して、十分に混合する。
次に試験管を再び遠心分離する。
セファロースとの共有結合に用いられるタンパク質濃度を決定するために、ブラッドフォード検定を実行した：
材料：  ＢＳＡストック溶液、２ ｍｇ／ｍｌブラッドフォード試薬
方法：  ＢＳＡ溶液を以下のようにＮｕｎｃ−免疫プレート（Ｍａｘｉ Ｓｏｒｐ）に適用する：５μｇ−４μｇ−３μｇ−２μｇ−１μｇ（８０μｌのＶｏｌ．＋２０μｌの検定）
ＢＳＡ用予備希釈：５μｇ／５０μｌ＝０．１ ｍｇ／ｍｌ
１：２０希釈によりストック溶液２ ｍｇ／ｍｌを０．１ ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈する。
【００６７】
アフィニティークロマトグラフィーを実行するために、または溶離のために、以下の手法を選択した：
ａ）アフィニティークロマトグラフィー
材料：  活性化ＣＨセファロース４ＢＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、コード番号１７−０４９０−０１
緩衝液Ａ（２０ ｍｍｏｌのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、１ ｍｍｏｌのＣａＣｌ２、１ ｍｍｏｌのＭｇＣｌ２、０．１％ＮａＮ３）
緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ＋１５０ ｍｍｏｌのＮａＣｌ＋０．１％チャプス）
緩衝液Ｃ（緩衝液Ａ＋０．１％チャプス）
ｐＨ４緩衝液（ミリポア水＋０．１％氷酢酸＋０．１％チャプス）
ＥＤＴＡ緩衝液（緩衝液Ａ＋２００ｍｍｏｌのＥＤＴＡｐＨ８．５＋０．１％チャプス）
方法：  溶解物を先ず、カラム上に３回載せる。
【００６８】
液体を収集するための試験管は、カラムの下に見出される。最初の２ ｍｌの溶解物をエッペンドルフピペットで注意深くゲルに付加する。さらに加える溶解物の容積を量るために、測量ピペットを用いる。カラムは真っ直ぐであるよう留意すべきである。初めてカラムを用いる場合、すべてのタンパク質を含有しない緩衝液による「ドライ運転」を実行した後に、実際の運転を行なう。カラム投入は５回以下で用いるべきである。
溶解物が凍結（マイナス８０℃）されている場合には、それを水浴中で先ず加熱し、次に遠心分離（３０００ Ｕで５分）する。
しかしながら、溶解物を凍結するには新鮮な溶解物が常に選択される。
溶解物から５００ μｌをピペットでエッペンドルフ容器に取り出す。
【００６９】
これを、クロマトグラフィーの前後の溶解物の試験に用いる。
２つのカラム（７−８−９セファロース用および７−Ｂ−８−９セファロース用各１）を用いる場合には、各々の場合、溶解物容積の半分を各々のカラムに入れる。両カラムは、同一流量を有するべきである。これが実情でない場合、「遅い方の」カラムが対応する時間長に近づけられる。理想的流量は、０．２〜０．５ ｍｌ／分である。
溶解物がカラムを３回通って実験した場合、５００μｌを実験物からエッペンドルフ容器中にピペット分取し、それを混合した後、このように試験をここで実行し得る。
次に１０カラム容積の緩衝液Ｂおよび緩衝液Ｃの各々をカラム上に投入する。次に洗浄過程を完了する。
【００７０】
ｂ）溶離
予備溶離：緩衝液Ｃをカラム上に投入し、したがって洗浄操作にもかかわらずタンパク質が依然として残留するか否かに留意し得る。５００μｌをエッペンドルフ容器中に収集する（２ｘ５００μｌに対応する２つのカラムを用いる）。
ＥＤＴＡ溶離：ＥＤＴＡはＣａおよびＭｇイオンを錯化する。その結果、ネイ非細胞タンパク質は溶離され、これが結合のためにＣａおよびＭｇを必要とする。２ｘ４ ｍｌのＥＤＴＡ緩衝液をカラム（または両カラム）に入れて、２つの分画（Ｅ１およびＥ２／ＢＥ１およびＢＥ２）をファルコン管中に収集する。次に管内容物を混合し、５０００μｌを１つの（または２つの）エッペンドルフ容器（単数または複数）中にピペット分取する。
【００７１】
ｐＨ４溶離：緩衝液の実際のｐＨは３．７である。中性ｐＨ範囲（ｐＨ６〜８）外では、受容体とそのタンパク質との結合は阻害され得る。ＥＤＴＡ溶離の場合と同様に、ここでも、２ｘ４ ｍｌのｐＨ４緩衝液をカラムに入れて、２つの分画で収集し、各々において、５００μｌをピペット分取する（４．１および４．１／Ｂ４．１およびＢ４．２）。
次に、酸を洗い落とすよう、３カラム容積の緩衝液Ａをカラムに付加する。最後の酸カラムはカラム中に残存する。カラムを閉じて、冷蔵庫中で保持する。
エッペンドルフ容器中の５００μｌ分画を少なくとも１５時間、−８０℃で凍結して、次に「スピードバックＳｐｅｅｄ Ｖａｃ」中で凍結乾燥する。
このようにして得られた分画または予備溶離分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して、還元条件下でウエスタンブロット処理を施した。
【００７２】
図１１は、図１０の場合と同一実験を示すが、但し、ここでは、溶解内皮細胞ではなく、むしろ溶解ストローマ細胞を用いる。図１１に示したウエスタンブロットでは、トレース１〜３はＦｎ−７−８−９によるアフィニティーカラムの溶離を示し、一方、トレース４〜６はＦｎ−７−Ｂ−８−９のアフィニティーカラムの溶離を示す。トレース１および４は予備溶離因子であり、一方、トレース２、３または５、６はそれぞれの溶離実験の分画１および２を示す。図１０で認められ得るように、１２０〜１３０ｋＤａの見かけの分子量を有する顕著な帯域は、ヒト皮膚−ストローマ細胞からのこの細胞溶解物では決定され得ない。
【００７３】
前記の説明、特許請求の範囲および図面に開示される本発明の特徴は、その種々の実施態様において本発明の実施のために、別々にそして任意の組合せでともに不可欠であり得る。
【００７４】
図１２は、前記のようにアフィニティークロマトグラフィーにより精製され、ＳＤＳ−勾配ゲル電気泳動（４〜１２％）により分離されたＥＤ−Ｂ結合タンパク質を示す。特異的濃縮二重帯域（矢印）を切り出して、質量分光学により分析した。
配列分析は単離タンパク質をα２−β１インテグリンとして明瞭に同定し、β１サブユニットの主要重帯域はα２サブユニットの軽帯域に対応する。
この知見は、ＥＤＢとの結合が主にインテグリンのβ１サブユニットにより媒介される、ということを示唆する。実験した細胞型に対応して、β１と組合せた他のαサブユニット（例えばα２）もＥＤＢ−ＦＮとの結合を媒介し得る。
【００７５】
図１３は、免疫組織学により特性化されるヒト腫瘍低温切片を示す。ここで、
Ａは、腎細胞癌を表し、矢印はＡＫ ＡＭ−ＥＤＢｒ−２による特異的染色を示す。
Ｂは、同一調製物のクローズアップを表わす。
Ｃは、肝細胞癌を表わす。
Ｄは、黒色腫を表わす（ここでは、特異的染色は見出されなかった）。
【００７６】
ＥＤＢ受容体の分析
帯域を１Ｄ−ゲルから切り出し、ＮＨ４ＨＣＯ３溶液およびアセトニトリルで洗浄し、乾燥して、ゲル中のタンパク質の分解のためにトリプシン溶液と混合した。消化溶液中のゲルから溶離したペプチドをμＣ１８カラム上で濃縮し、脱塩して、ＭＡＬＤＥ−質量分析法（＝消化タンパク質のペプチド質量の一覧）で測定した。
任意のゲル帯域から判明したペプチド質量を用いてデータベース探索を実行した。不確かな探索結果の場合、個々のペプチドの付加的ＭＡＬＤＩ−ＰＳＤスペクトル（断片スペクトル）を測定した。スペクトルを用いて示唆ペプチド配列を直接的に確証する（スペクトルの解釈）か、またはこれらのスペクトルを用いてデータベース探索を実施した。
【００７７】
帯域Ａ＝  調製物６からの帯域１
調製物５からの帯域４
酸性溶離からの帯域４
結果：インテグリンα２
−−  帯域４のデータベース探索結果参照
−−  帯域１および６からのスペクトルは同一のもっとも強いペプチドを示す。
帯域１からのペプチドのＰＳＤ−スペクトルはインテグリンα２の部分配列を確証する
【００７８】
帯域Ｂ＝  調製物６からの帯域２
調製物５からの帯域５
酸性溶離からの帯域７
結果：インテグリンβ１
−−  帯域５および７のデータベース探索結果参照
−−  帯域２のスペクトルは同一のもっとも強いペプチドを示す。
帯域２からのＰＳＤ−スペクトルによるデータ探索はインテグリンβ１を確証した
ＢＳＡ
−−  ３つの帯域すべてに含有される
−−  ＰＳＤ−スペクトルおよび多数のペプチド質量を用いてデータベース探索により確証される。
【００７９】
【表１】
2004529848.tif 000002
【００８０】
【表２】
2004529848.tif 000003
【００８１】
【表３】
2004529848.tif 000004
【００８２】
【表４】
2004529848.tif 000005
【００８３】
【表５】
2004529848.tif 000006
【００８４】
【表６】
2004529848.tif 000007
【００８５】
【表７】
2004529848.tif 000008
【００８６】
【表８】
2004529848.tif 000009
【００８７】
【表９】
2004529848.tif 000010
【００８８】
【表１０】
2004529848.tif 000011
【００８９】
【表１１】
2004529848.tif 000012
【００９０】
【表１２】
2004529848.tif 000013
【００９１】
【表１３】
2004529848.tif 000014
【００９２】
【表１４】
2004529848.tif 000015
【００９３】
【表１５】
2004529848.tif 000016
【００９４】
【表１６】
2004529848.tif 000017
【００９５】
【表１７】
2004529848.tif 000018
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本試験において用いられるＩＩＩ型の反復配列を図示する。
【図２】
図２は、種々の支持体上の内皮細胞またはヒトストローマ細胞に及ぼすＥＤｂ−フィブロネクチンドメイン（ＥＤ−Ｂ）の影響下での増殖検定の結果を示す。
【図３】
図３は、ＥＤ−Ｂの影響下での内皮細胞の分割試験（管形成試験）の結果を示す。
【図４】
図４は、ＥＤ−Ｂで被覆された表面への内皮細胞の接着を試験した接着試験の結果を示す。
【図５】
図５は、その配列がＥＤｂ−フィブロネクチンドメインの部分配列である種々の合成ペプチドとともに細胞を予備インキュベートした以外は、図４の場合と同様の試験の結果を示す。
【図６】
図６は、図５で用いたＥＤｂ−フィブロネクチンドメインからの合成ペプチドの部分配列を示す。
【図７】
図７は、種々の合成ＥＤ−Ｂペプチドに対する内皮細胞の接着試験の結果を示す。
【図８】
図８は、ＥＤ−Ｂの主ペプチド鎖のモデル構造中の図６〜７に見出される合成ペプチドの位置を示す。
【図９】
図９は、分割試験（管形成試験）における毛管様構造の誘導におけるＥＤｂ−フィブロネクチンドメインおよびループ５由来ペプチド（配列番号２）の作用を示す。
【図１０】
図１０は、表面標識化ヒト皮膚−内皮細胞からの細胞溶解物のＦｎ−７−８−９またはＦｎ−７−Ｂ−８−９の使用による２つのアフィニティークロマトグラフィー実行の結果を示す。
【図１１】
図１１は、表面標識化ヒト皮膚−ストローマ細胞からの細胞溶解物のＦｎ−７−８−９またはＦｎ−７−Ｂ−８−９の使用による２つのアフィニティークロマトグラフィー実行の結果を示す。
【図１２】
図１２は、ＥＤｂＢ受容体のアフィニティークロマトグラフィー精製を示す。
【図１３】
図１３は、免疫組織学により特性化されるヒト腫瘍低温切片を示す。
【図２】
2004529848.tif 000019
【図４】
2004529848.tif 000020
【図５】
2004529848.tif 000021
【図６】
2004529848.tif 000022
【図７】
2004529848.tif 000023
【図９】
2004529848.tif 000024
【国際公開パンフレット】
2004529848.tif 000025
2004529848.tif 000026
2004529848.tif 000027
2004529848.tif 000028
2004529848.tif 000029
2004529848.tif 000030
2004529848.tif 000031
2004529848.tif 000032
2004529848.tif 000033
2004529848.tif 000034
2004529848.tif 000035
2004529848.tif 000036
2004529848.tif 000037
2004529848.tif 000038
2004529848.tif 000039
2004529848.tif 000040
2004529848.tif 000041
2004529848.tif 000042
2004529848.tif 000043
2004529848.tif 000044
2004529848.tif 000045
2004529848.tif 000046
2004529848.tif 000047
2004529848.tif 000048
2004529848.tif 000049
2004529848.tif 000050
2004529848.tif 000051
2004529848.tif 000052
2004529848.tif 000053
2004529848.tif 000054
2004529848.tif 000055
2004529848.tif 000056
2004529848.tif 000057
2004529848.tif 000058
2004529848.tif 000059
2004529848.tif 000060
2004529848.tif 000061
2004529848.tif 000062
2004529848.tif 000063
2004529848.tif 000064
2004529848.tif 000065
2004529848.tif 000066
2004529848.tif 000067
2004529848.tif 000068
2004529848.tif 000069
2004529848.tif 000070
2004529848.tif 000071
2004529848.tif 000072
2004529848.tif 000073
2004529848.tif 000074
2004529848.tif 000075
2004529848.tif 000076
2004529848.tif 000077
2004529848.tif 000078
2004529848.tif 000079
2004529848.tif 000080
2004529848.tif 000081
2004529848.tif 000082
2004529848.tif 000083
2004529848.tif 000084
2004529848.tif 000085
2004529848.tif 000086
2004529848.tif 000087
2004529848.tif 000088
2004529848.tif 000089
2004529848.tif 000090
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004529848.tif 000091
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004529848.tif 000092
【国際調査報告】
2004529848.tif 000093
2004529848.tif 000094
2004529848.tif 000095
2004529848.tif 000096
2004529848.tif 000097
2004529848.tif 000098
2004529848.tif 000099
2004529848.tif 000100
2004529848.tif 000101
2004529848.tif 000102
2004529848.tif 000103
2004529848.tif 000104
2004529848.tif 000105
2004529848.tif 000106
2004529848.tif 000107
2004529848.tif 000108