(57)【要約】骨、軟骨、または軟質の接合組織のような、組織の増殖を支援するための一定の基質および当該基質を調製するための方法を提供する。一定の多糖類が一定の酸化剤と反応してその多糖類における糖の環状構造が開環してアルデヒド基が形成される。これらのアルデヒド基は鉱物質化したコラーゲンに対する共役結合を形成するために反応する。上記基質は移植または注入が可能であり、あるいは、上記ポリアルデヒド型多糖類および鉱物質化したコラーゲンの各開始材料を原位置において上記基質を形成するために別々に注入することもできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織の修復を支援するための一定の基質を調製する方法において、一定の外因性の多糖類を酸化してアルデヒド基を有する一定の修飾した外因性の多糖類を形成する工程、および前記修飾した外因性の多糖類を諸条件下において鉱物質化したコラーゲンと反応させて、前記アルデヒド基が鉱物質化したコラーゲンと架橋するように反応して前記基質を形成する工程を含む方法。
【請求項２】
さらに、前記基質に一定の増殖因子を添加する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増殖因子がＴＧＦ−βの超系統群における各要素、ＢＭＰ系統群における各要素、各種の増殖分化因子（ＧＤＦ’ｓ）、ＡＤＭＰ−１、線維芽増殖因子系統群の各要素、各種タンパク質のヘッジホッグ系統群の各要素、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）系統群の各要素、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）系統群の各要素、インターロイキン（ＩＬ）系統群の各要素、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）系統群の各要素から成る群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記増殖因子が一定の骨形態発生タンパク質（ＢＭＰ）である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記多糖類がヒアルロン酸、硫酸コンドロイチン、硫酸デルマタン、硫酸ケラタン、ヘパラン、硫酸ヘパラン、デキストラン、硫酸デキストラン、またはアルギネートを含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記多糖類がヒアルロン酸を含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記コラーゲンがＩ型およびＩＩ型のコラーゲンから成る群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記多糖類を酸化する工程が前記多糖類の過ヨウ素酸塩による処理を含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記基質を形成するために使用する前記鉱物質化したコラーゲンおよび前記多糖類がそれぞれ９９：１乃至１：９９の重量比率の範囲内で存在している請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記範囲がそれぞれ９：１乃至１：９の重量比率である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
アルデヒド基を含むために前記多糖類における約１％乃至５０％の反復単位が酸化される請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
アルデヒド基を含むために前記多糖類における約１％乃至５％の反復単位が酸化される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記基質が凍結および凍結乾燥により形成される請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記基質が湿式堆積処理および空気乾燥処理により形成される請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
さらに、前記基質内においてフィブリンを形成するためにフィブリノゲンおよびトロンビンを添加する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記組織が骨、軟骨および軟質組織から成る群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
組織の修復を支援するための基質において、一定の外因性の多糖類に共役的に架橋している鉱物質化したコラーゲンを含有しており、前記多糖類が前記鉱物質化したコラーゲンに対する共役結合を形成する当該多糖類における酸化された糖の環状構造を介して前記コラーゲンに対して架橋している基質。
【請求項１８】
さらに、一定の増殖因子を含有する請求項１７に記載の基質。
【請求項１９】
前記増殖因子がＴＧＦ−βの超系統群における各要素、骨形態発生タンパク質系統群における各要素、各種の増殖分化因子（ＧＤＦ’ｓ）、ＡＤＭＰ−１、線維芽増殖因子系統群の各要素、各種タンパク質のヘッジホッグ系統群の各要素、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）系統群の各要素、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）系統群の各要素、インターロイキン（ＩＬ）系統群の各要素、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）系統群の各要素から成る群から選択される請求項１８に記載の基質。
【請求項２０】
前記増殖因子が一定の骨形態発生タンパク質である請求項１８に記載の基質。
【請求項２１】
前記多糖類がヒアルロン酸、硫酸コンドロイチン、硫酸デルマタン、硫酸ケラタン、ヘパラン、硫酸ヘパラン、デキストラン、硫酸デキストラン、またはアルギネートを含む請求項１７に記載の基質。
【請求項２２】
前記多糖類がヒアルロン酸である請求項２１に記載の基質。
【請求項２３】
前記基質が前記鉱物質化したコラーゲンおよび前記多糖類を９９：１乃至１：９９の範囲内の一定の重量比率で含有している請求項１７に記載の基質。
【請求項２４】
前記コラーゲンがＩ型およびＩＩ型のコラーゲンから成る群から選択される請求項１７に記載の基質。
【請求項２５】
さらにフィブリンを含有している請求項１７に記載の基質。
【請求項２６】
生体内における骨または軟骨組織の増殖を行なう方法において、所望の骨または軟骨の増殖部位に請求項１７に記載の一定の基質を投与する工程を含む方法。
【請求項２７】
生体内における骨または軟骨組織の増殖を誘発する方法において、所望の骨または軟骨の増殖部位に請求項１８に記載の一定の基質を投与する工程を含む方法。
【請求項２８】
生体内における骨または軟骨組織の増殖を行なう方法において、所望の骨または軟骨の増殖部位に、当該骨または軟骨の増殖を支援するために前記部位に一定の基質を形成するために十分な各量において、
（ａ）アルデヒド基を有するように修飾されている一定の外因性の多糖類、
（ｂ）鉱物質化したコラーゲン、および
（ｃ）随意的に、一定の増殖因子を投与する工程を含む方法。
【請求項２９】
生体内における骨または軟骨組織の増殖を誘発する方法において、所望の骨または軟骨の増殖部位に、当該骨または軟骨の増殖を支援するために前記部位に一定の基質を形成するために十分な各量において、
（ａ）アルデヒド基を有するように修飾されている一定の外因性の多糖類、
（ｂ）鉱物質化したコラーゲン、および
（ｃ）一定の増殖因子を投与する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は骨、軟骨および軟質組織等の組織の治療的修復用の架橋および鉱物化したコラーゲン−多糖類基質、当該基質の製造方法、および組織を修復するための当該組織の使用方法に関する。本発明は単独または組織修復用の各種の増殖因子等の別の治療剤との組み合わせにおける移植または注入により投与される架橋および鉱物質化したコラーゲン−多糖類基質を提供する。
【０００２】
発明の背景
無制限の供給様式で製造できる自原性の骨に等しい骨の伝導性を提供する一定の骨移植用基質に対する臨床的な要望が存在している。一部の骨置換体が利用可能であるが、多くの物はそれぞれの使用およびＸ線による評価を複雑にしている物理的な取扱性および吸収性に欠けている材料により構成されている。
【０００３】
同様に、多年にわたる多大の研究にもかかわらず、軟骨組織における軟骨細胞の表現型の分化または維持を支援する一貫して有効な市販製品が存在していない。損傷した軟骨の修復を容易にするための従来の手法は既存の宿主軟骨の移植および／または各種のプロテーゼの移植を含む。これらの方法の制限はドナー組織の利用可能性およびプロテーゼ移植片の制限された寿命である。さらに最近において、各種の高分子の支持骨格上における成熟した軟骨細胞の生体外培養が軟骨移植材料を発生する目的において採用されているが、この方法はまた広く容認されておらず、その一部の理由は、この方法が２種類の外科処置を含むためであり、その一つは軟骨細胞を収集することであり、他の一つは生体外での増殖後にこれらの細胞を移植することである。
【０００４】
コラーゲンおよびグリコスアミノグリカンは骨および軟骨の再生における使用に適している２種類の生体材料である。コラーゲンを基材とする各種の基質は骨移植処理において使用されている。さらに、Ｉ型コラーゲンは、骨形成性の骨芽細胞に対して、良好な細胞接着性を有している。また、コラーゲンは増殖における一定の活性なまたは不活性な両方の支持骨格材料として作用する能力を有している。
【０００５】
骨はリン酸カルシウムの各種の結晶に対して一定の規則的な様式で密接に結合しているＩ型コラーゲン原線維により構成されていることを特徴としている。微量成分は一定の高分子の配列構造ならびに鉱物質相に主に付随している一連の小分子を含む。
【０００６】
骨の特徴の一つは極めて小さい寸法の結晶であることである。骨の結晶は最小の生物学的に形成されている既知の結晶の内の一つであり、実際に、結晶学者は結晶が数個の単位細胞の厚さのみにより完全に安定になることが予測できない。それゆえ、コラーゲン質の骨の構造はその形成、成分、および特性に関して特異的な特徴を有している。
【０００７】
コラーゲン原線維に付随して一定の規則的な様式で安定に分散しているリン酸カルシウムを含む鉱物質化または鉱化したコラーゲンが米国特許第５，２３１，１６９号において開示されており、この特許文献は本明細書に参考文献として含まれる。
【０００８】
ヒアルロン酸は軟骨細胞外基質における天然成分であり、容易に滅菌処理されて、生体崩壊性であり、広範囲な濃度および方式で製造できる。このヒアルロン酸は一般に生体相容性であり、その吸収特性はそれぞれのモノマーの各種のポリマー形態への操作により、最も一般的には、そのグルクロン酸残基におけるカルボン酸基のエステル化により調整できる。
【０００９】
フィブリンを含む生体接着物質は一定の組織接着医療装置として長い経歴を有しており、欧州において（１９９３年１１月９日に発行されている米国特許第５，２６０，４２０号）市場で入手可能であると考えられる。この適用範囲を制限している一つの障害はその短い転換期間および存在時間であり、この時間は移植部位に応じて数日間から数週間の範囲である。このフィブリン接着物質内へのコラーゲン線維の取り込みが報告されている（シエラ（Ｓｉｅｒｒａ）他，１９９３年，トランス・ソサイエテイ・バイオマテリアル（Ｔｒａｎｓ． Ｓｏｃ． Ｂｉｏｍａｔｅｒ．），１６巻，２５７頁および米国特許第５，２９０，５５２号）。しかしながら、フィブリン単独の場合に比べてコラーゲン／フィブリンの組成物の場合には比較的に長い凝固時間が必要とされる。
【００１０】
従って、望ましくない生体外における培養方法に依存することなく構造の完全性を維持して組織修復のために使用できる生体崩壊性で生体相容性の基質が依然として要望されている。
【００１１】
発明の概要
本発明は架橋および鉱物質化したコラーゲン−多糖類基質、当該基質を調製するための方法、および骨、軟骨およびその他の軟質接合組織等の組織の修復において移植または注入により上記基質を使用する方法を提供する。この鉱物質化したコラーゲンは任意の種類の精製した、天然の、修飾した、または組換えのコラーゲンにより形成できる。使用可能な多糖類の種類はヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、アルギネート、およびその他の長鎖多糖類を含む。好ましい実施形態において、この多糖類はヒアルロン酸である。
【００１２】
本発明の架橋および鉱物質化したコラーゲン−多糖類基質は組織の増殖を行なうために単独、または増殖因子との組み合わせにおいて使用できる。
【００１３】
本発明の基質と共に使用可能な増殖因子はＴＧＦ−β１，２および３、骨形態発生タンパク質（ＢＭＰ’ｓ）、増殖分化因子（ＤＧＦ’ｓ）、およびＡＤＭＰ−１を含むＴＧＦ−βの超系統群（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）における各要素、酸性および塩基性の線維芽増殖因子（ＦＧＦ−１および−２）を含む線維芽増殖因子系統群の各要素、インデイアン、ソニックおよびデザート・ヘッジホッグを含む各種タンパク質のヘッジホッグ（ハリネズミ属）系統群の各要素、ＩＧＦ−Ｉおよび−ＩＩを含むインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）系統群の各要素、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＡＡを含む血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）系統群の各要素、ＩＬ−１乃至−６を含むインターロイキン（ＩＬ）系統群の各要素、およびＣＳＦ−１、Ｇ−ＣＳＦ、およびＧＭ−ＣＳＦを含むコロニー刺激因子（ＣＳＦ）系統群の各要素を含むがこれらに限らない。
【００１４】
本発明の鉱物質化したコラーゲン−多糖類基質を作成する方法は一定の外因性の多糖類を酸化してアルデヒド基を有する一定の修飾した外因性の多糖類を形成する工程、およびこの修飾した外因性の多糖類を諸条件下において鉱物質化したコラーゲンと反応させて、その各アルデヒド基が鉱物化したコラーゲンと架橋するように反応して一定の架橋した基質を形成する工程を含む。この方法はさらに一定の増殖因子を上記基質に添加する工程を含むことができる。一定の増殖因子は上記修飾した多糖類を鉱物質化したコラーゲンと反応させる工程の前または後のいずれにおいても添加できる。この鉱物質化したコラーゲンは米国特許第５，２３１，１６９号により分散または可溶化したコラーゲンにより調製される。
【００１５】
本発明は上記基質を所望の組織修復の部位に投与することにより組織の増殖を行なうために一定の架橋および鉱物質化したコラーゲン−多糖類基質を使用する方法も提供する。この一定の増殖因子との組み合わせにおける基質は所望の修復の部位における組織の増殖を誘発するために移植または注入により投与できる。さらに、フィブリンを含む一定の基質を投与して上記基質を組織欠損部位等のような所望の部位に固定できる。
【００１６】
上記の調製された基質は所望の組織増殖の部位に移植できる。また、この多糖類および鉱物質化したコラーゲンの各開始材料は、何らかの増殖因子等と共に、所望の組織増殖の部位に別々に注入することも可能である。その部位において混合することにより、上記基質が原位置において形成され、その部位の形状に一致する。
【００１７】
本明細書において用いられているように、「修復（ｒｅｐａｉｒ）」は新しい組織の増殖として定められている。この新しい組織は元の損失した組織に対してその表現型または遺伝子型において同一であっても同一でなくてもよい。また、本明細書において用いられているように、「組織の再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ）」は上記の増殖した新しい組織が元の組織と一致していることを意味する。また、組織修復は、例えば、一定の関節部の欠損におけるヒアリン関節軟骨の線維軟骨による置換等のような、損失した組織を非同一組織により置換した結果とすることもできる。なお、修復に関連する基本的な細胞特性は接着、増殖、移動および分化を含む。
【００１８】
「伝導（ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ）」とは、例えば、骨、軟骨または軟質組織等の宿主組織が上記架橋したコラーゲン−多糖類基質の上または中への既存組織の伸展により増殖することを意味する。この伝導において、各種の修復細胞は上記基質の上または中に移動して周囲の宿主組織と同一の新しい組織を合成および再造形する。また、この誘発（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）とは、各種の先祖細胞の増殖および分化が刺激されることを意味する。これらの先祖細胞は周囲の宿主組織と連続的になるように新しい組織を合成および再造形し続ける。
【００１９】
本明細書において用いられているように、一定の組織の欠損は一定の先天性の状況、外傷、手術、ガンまたはその他の病気の結果とすることができる。
【００２０】
また、本明細書において用いられているように、一定の外因性の多糖類とは一定の遊離の多糖類を言う。
【００２１】
上記鉱物化したコラーゲンの多糖類に対する比率は上記基質の物理的および生物学的な諸特性の両方を変えるために変更可能である。この鉱物質化したコラーゲンの割合が高くなるほど、さらに多孔質のスポンジ状の基質が得られる。また、多糖類の割合が高くなるほど、高いゲル状の基質が得られる。
【００２２】
好ましい実施形態の説明
本発明の基質を調整する方法は一定の外因性の多糖類における糖の環状部分を開環する工程、および、例えば、一定の選択性的な酸化剤として過ヨウ素酸ナトリウムまたはカリウムを用いて末端のヒドロキシル基をアルデヒドに酸化する工程を含む。この様式で製造されるアルデヒド基の量は化学量論的に調整可能である。一般的に、上記環状構造の約１％乃至５０％がこの様式で開環できる。さらに好ましくは、約１％乃至５％の環が開環してアルデヒド基を形成する。これらのアルデヒド基はコラーゲンのペプチド鎖におけるアミン部位においてそのコラーゲンと共役的な架橋を形成できる。これらのアルデヒド基は別の架橋性の化合物の添加を伴わずに原位置において形成され、この場合の多糖類の主鎖とその主鎖に対して架橋するコラーゲン原線維との間の分子間距離は一定の架橋性の化合物を使用している場合の対応する距離よりも小さいと考えられる。従って、これらの多糖類およびコラーゲンの主鎖は比較的に密接に結合しており、この結合により、骨、軟骨または軟質の接合組織の増殖を支援、実行または誘発する一定の基質を提供するという目的において一定の有利な構造が形成される。
【００２３】
上記コラーゲンを製造するための開始材料は任意の種類の精製した、天然の、修飾した、または組換えのコラーゲンとすることができる。骨の増殖において好ましいコラーゲンはＩ型コラーゲンであるが、軟骨の増殖において好ましいコラーゲンはＩＩ型コラーゲンである。このコラーゲンは架橋されていてもよく、架橋されていなくてもよいが、上記多糖類のアルデヒド基に対して架橋するために側鎖の各基に対する接近性を高めるためには、このコラーゲンは架橋されていないことが好ましい。軟骨修復のような、固有の細胞接着部位をマスキングすることが望まれるＩ型コラーゲンを組織修復のために用いる場合には、これらの接着部位は非細胞接着性の多糖類の使用によりマスキングして細胞同士の相互作用および接着の増加を支援することができる。
【００２４】
上記鉱物質化されるコラーゲンは通常的に分散状態または可溶化したコラーゲンになり、この場合の可溶化は一定の高められたｐＨ値、通常において、少なくとも約ｐＨ８、さらに通常的に約ｐＨ１１乃至ｐＨ１２であり、一般的に１規定（１Ｎ）よりも低い一定の媒体中においてそのコラーゲン供給源を分散することにより達成される。一般的に、水酸化ナトリウムが用いられるが、別のアルカリ金属の水酸化物または水酸化アンモニウム等のような、別の水酸化物も有用であると考えられる。
【００２５】
上記コラーゲンの濃度は一般に約１重量％乃至１０重量％、さらに通常的に約１重量％乃至５重量％の範囲内にできる。このコラーゲンの媒体は一般に約０．０００１乃至０．１規定の範囲内の塩基性の濃度になる。さらに、このｐＨ値は反応の過程中において一般に約１０乃至１３、好ましくは約１２の範囲内に維持される。
【００２６】
さらに、リン酸塩およびカルシウムが一般に約０．０１０．２Ｍ、好ましくは約０．０２５Ｍ乃至０．０７５Ｍの範囲内の一定濃度における溶液として添加される。また、上記コラーゲン媒体に添加されるこれらの溶液の量は一般に少なくとも１０％、通常的に少なくとも２５％で約４００％以下、一般に約５０％乃至１５０％の範囲内でそのコラーゲン媒体の量を増加する。これにより、このコラーゲンの溶液は一般に４倍以上には希釈されない。
【００２７】
上記の添加速度は比較的に遅く、一般に少なくとも約１時間で約７２時間以下、一般に約２時間乃至１８時間の範囲内、通常的に約４時間乃至１６時間の範囲内である。例えば、１リットルのコラーゲン分散液の場合に、合計で約１リットルの各試薬が添加され、この添加速度は１時間当たりに５０ｍｌ乃至１５０ｍｌの範囲内になる。
【００２８】
各試薬の添加は一定の化学量論的な比率において行なうことができるが、化学量論的であることは必要ではなく、約５０％までの、好ましくは約２５％以下の化学量論からの変化が好ましい。従って、化学量論的な添加が維持されない場合に、一部の成分が枯渇しても、別の成分の添加が続けられる可能性がある。
【００２９】
上記の反応の過程中に、穏やかな攪拌が維持されて、上記のコラーゲン原線維およびリン酸カルシウムの鉱物質の実質的に均一な混合が確実におこなわれる。また、通常的に約４℃で約４０℃以下、好ましくは約１５℃乃至３０℃の範囲内の穏やかな温度条件が採用される。さらに、上記コラーゲンのリン酸カルシウム鉱物質に対する重量比率は一般に約８：２乃至１：１、さらに通常的に約７：３になる。
【００３０】
上記の添加の完了後に、攪拌、例えば、かきまぜ処理が通常的に少なくとも約１時間、さらに通常的に約２時間継続され、この攪拌はさらに続けることも可能である。この攪拌の継続量は上記製品の調製に対して重要ではない。
【００３１】
上記反応の完了後に、その鉱物質化したコラーゲンが種々の様式で処理可能になる。この製品はあらゆる未結合の鉱物質または上記媒体中の別の成分を除去すると共にさらに中性のｐＨ値にするために繰り返して洗浄することが可能である。なお、この洗浄は水、塩類溶液等により容易に行なうことができる。
【００３２】
上記の鉱物質化したコラーゲンはさらに種々の様式で処理できる。これらの対象の組成物はホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、各種のクロム塩、ジイソシアネート等のような種々の架橋剤により架橋することができる。
【００３３】
上記のポリアルデヒド型多糖類および鉱物質化したコラーゲンが別々に注入可能な材料であり、これらが接触した時に反応して所望の組織増殖または増殖の部位において原位置で上記基質を形成できることが本発明の一つの特徴である。この利点は手術的な移植処置が必要でないこと、および流動性の開始材料がその反応の完了前に上記部位の形状に一致することである。この結果、予め形成されている固体基質の切断および整形の必要を伴わずに上記部位に対して形状が一致する一定の基質が得られる。
【００３４】
利用可能な上記多糖類の種類はヒアルロン酸、硫酸コンドロイチン、デルマタン、硫酸デキストラン、アルギネート、およびその他の長鎖多糖類を含む。一般的に、この多糖類は約１，０００ダルトン（ＤＡ）乃至１０，０００，０００ダルトンの一定の平均分子量を有する。
【００３５】
上記外因性の多糖類における糖の環状構造の開環のための試薬は過ヨウ素酸カリウムまたはナトリウム等の末端の水酸基をアルデヒドに酸化する任意の選択的酸化性の試薬とすることができる。さらに、別の試薬は特定の糖酸化酵素を含む。
【００３６】
上記の好ましい多糖類はヒアルロン酸である。この多糖類の鉱物質化したコラーゲンに対する相対比率により種々の物理的および生物学的な特徴がその基質に与えられる。さらに、この多糖類の鉱物質化したコラーゲンに対する比率は一定のモル比率の基準または一定の重量比率の基準において特徴付けることができる。一般的に、鉱物質化したコラーゲンの多糖類に対する重量比率は９９：１乃至１：９９である。このことは、ヒアルロン酸において１，０００，０００ダルトンの一定の平均分子量およびコラーゲン（非鉱物質化状態の重量に基づく）において１００，０００ダルトンと仮定する場合に、それぞれ、９９．９：０．１乃至１：９の一定のモル比率を示している。このモル比率は使用する多糖類およびコラーゲンの実際の分子量により変化し得る。本明細書において開示されている好ましい実施形態において、上記コラーゲンの多糖類に対する重量比率は９：１乃至約１：９である。
【００３７】
さらに、上記鉱物質化したコラーゲンの多糖類に対する比率は上記基質の物理的および生物学的な両方の諸特性を変化するために変更可能である。生物学的には、Ｉ型コラーゲンの比率を高めることにより骨の組成および構造にさらに密接に近づき、ＩＩ型コラーゲンの比率を高めることにより軟骨の組成にさらに密接に近づく。骨形成性の細胞はコラーゲンにおける特定の細胞接着部位に対して相互作用して、分割、移動、および分化して新しい骨を形成する。
【００３８】
あるいは、上記の多糖類、好ましくはヒアルロン酸の比率を高めることにより、一定の自然な軟骨基質にさらに密接して近づく。加えて、多糖類の比率を高めると、コラーゲンにおける特定の細胞接着部位の一部がマスキングされ、軟骨組織の発育において重要な別の細胞同士の相互作用および凝集が助長される。
【００３９】
本発明の基質と共に使用可能な増殖因子はＴＧＦ−β１，２および３、骨形態発生タンパク質（ＢＭＰ’ｓ）、増殖分化因子（ＤＧＦ’ｓ）、およびＡＤＭＰ−１を含むＴＧＦ−βの超系統群（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）における各要素、酸性および塩基性の線維芽増殖因子（ＦＧＦ−１および−２）を含む線維芽増殖因子系統群の各要素、インデイアン、ソニックおよびデザート・ヘッジホッグを含む各種タンパク質のヘッジホッグ（ハリネズミ属）系統群の各要素、ＩＧＦ−Ｉおよび−ＩＩを含むインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）系統群の各要素、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＡＡを含む血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）系統群の各要素、ＩＬ−１乃至−６を含むインターロイキン（ＩＬ）系統群の各要素、およびＣＳＦ−１、Ｇ−ＣＳＦ、およびＧＭ−ＣＳＦを含むコロニー刺激因子（ＣＳＦ）系統群の各要素を含むがこれらに限らない。これら増殖因子の各調製物は市場において、あるいは、組織からまたは組換えの各種供給源からの単離および精製のいずれかにより得られる。これらの増殖因子は一定の広い投薬範囲（フェントグラム（ｆｅｎｔｏｇｒａｍ）乃至ミリグラムの範囲）にわたり上記コラーゲン／ＨＡ／フィブリンの各種基質に投入できる。費用、安全性および所望の増殖因子の放出プロファイル等の各種の要因により、上記基質に投入される増殖因子の量が決まる。
【００４０】
トロンビンはフィブリノゲンに対応する一定の触媒として作用してフィブリンを生成する。本発明において、これらのフィブリノゲンおよびトロンビンは酸化した外因性の多糖類および鉱物質化したコラーゲンを入れた一定の反応容器に個別に添加される。この実施形態において、最終的な反応が望まれるまで、これらのフィブリノゲンおよびトロンビンを分離し、上記の酸化した外因性の多糖類および鉱物質化したコラーゲンを分離した状態に維持することが望ましい。
【００４１】
上記基質を形成する場合に使用するフィブリノゲンの濃度は好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ以上である。一方、上記トロンビンは約０．０１ＮＩＨ単位乃至約１００ＮＩＨ単位／ｍｌ、好ましくは約０．１ＮＩＨ単位乃至２．０ＮＩＨ単位／ｍｌの一定濃度で上記フィブリノゲンに添加される。このトロンビンは種々の供給源から市場において入手可能である。また、フィブリノゲンは患者の自己血漿または市場の各種の供給源から入手できる。本発明による上記基質は所望の形状の各種の金型内における凍結乾燥、湿式堆積処理、および空気乾燥処理により任意の形状に形成できる。また、一定の高い比率の多糖類を含む湿式堆積処理した材料は一定の骨折部分または関節部分の中に注入または直接的に供給するための粘性のゲルとして形成することも可能である。上述したように、各種の開始材料は注入可能でもあり、別々に注入して所望の組織増殖の部位において混合することにより、不所望な副生成物を形成することなく反応できる。
【００４２】
本発明による基質の有用性は各種の生体外および生体内の両方の試験において示すことができる。生体外の試験においては、ワング（Ｗｏｎｇ）およびコーン（Ｃｏｈｎ），（ＰＮＡＳ　ＵＳＡ（ＰＮＡＳ ＵＳＡ），７２巻，３１６７頁乃至３１７１頁，１９７５年）の方法による一連のコラーゲナーゼ消化により得られる一次胎児ラット頭蓋冠細胞、またはタイベルグ（Ｔｈｙｂｅｒｇ）およびモスカレウスキー（Ｍｏｓｋａｌｅｗｓｋｉ），（セル・テイシュー・リサーチ（Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．，２０４巻，７７頁乃至９４頁，１９７９年）による一次ラット骨端軟骨、またはブレイン−セラ，Ｏ（Ｂｌｅｉｎ−Ｓｅｌｌａ Ｏ）他，（メソッズ・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．），４３巻，１６９頁乃至１７５頁，１９９５年）の方法により得られるラビット関節軟骨細胞を上記の各基質内に接種して１週間乃至４週間にわたり従来的な諸条件下において培養する。その後、これらの培養物を処理して組織学的に評価する。
【００４３】
本発明による多糖類−鉱物質化コラーゲンの各基質の特別な利点はこれらの成分が架橋および鉱物質化したコラーゲンに匹敵する増殖因子の結合能力を有しているだけでなく、はるかに高い骨伝導性を有していることである。さらに、この多糖類−鉱物質化コラーゲンは多糖類−鉱物質化コラーゲンに匹敵する骨伝導性を有すると共に、これらは比較的に低い増殖因子放出速度を有しており、このことは上記基質内における増殖因子の保持において有利である。
【００４４】
また、本発明の各基質における軟骨伝導能力は一次ラットの骨髄細胞および間質細胞ならびにレチン酸処理した一次ラットまたはラビットの軟骨細胞またはヒトの間葉幹細胞における接着、移動、増殖および分化の有効な支援により決定できる。骨髄細胞および骨髄間質細胞は全層欠損の肋軟骨下骨髄において見られる早期軟骨先祖細胞に極めて似ている。生後２週間乃至３週間の近親交配ルイス（Ｌｅｗｉｓ）ラットの長骨から骨髄を採取し、一定の基質に直接的に加えて、標準的な諸条件下において２週間にわたり培養した。これらの培養物により増殖した接着性の間質細胞を継代処理して使用のために凍結した。６代までの継代の各細胞を用いて上記基質上に培養または接種した。
【００４５】
レチン酸処理した軟骨細胞は軟骨形成における後期の段階を示す。一次産物のレチン酸処理は各細胞の一定候補の基質上における培養処理または接種処理の前に行なう（デイエツ，Ｕ（Ｄｉｅｔｚ， Ｕ．）他，１９９３年，ジャーナル・セル・バイオロジー（Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．），５２（１）巻，５７頁乃至６８頁）。
【００４６】
また、別の方法において、初期および後期の段階の各軟骨細胞の生体外調査が、各種の間質細胞による各基質の条件付けを可能にすると共に、これらをさらに成熟した軟骨細胞に置き換えるために、併合されている。この様式において、軟骨形成の初期段階における各基質の進展がこの処理の後期の段階における各作用について調査できる。
【００４７】
上記基質における細胞の接着および増殖は細胞数およびミトコンドリアの活性に基づく生活能力を測定できる一定のＭＴＳアッセイによりモニターする。各種の間質細胞または軟骨細胞を接着の分析のために血清の存在下または非存在下において各基質上で６時間乃至８時間にわたり培養し、さらに増殖の評価のために１週間乃至２週間にわたり培養する。
【００４８】
また、細胞移動の試験において、各基質は多孔質のトランス−ウェル（Ｔｒａｎｓ−ｗｅｌｌ）膜培養インサート物（コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ））の上に塗布または嵌合される。各種の間質細胞がこのトランス−ウェル膜の上部チャンバー内における各基質の上部に接種され、一定の化学誘引物質（増殖因子、ＰＤＧＦ）がその下部チャンバー内に配置される。培養の１２時間乃至１８時間後に、上記基質を通してトランス−ウェル膜の下面部に移動した細胞がＭＴＳアッセイにより定量される。さらに、各基質が上部チャンバーから除去され、組織学的に処理されて浸潤の程度が評価される。
【００４９】
軟骨形成および骨形成に関連する各種の分化標識の分析がタンパク質および転写の量の両方について評価される。分析可能な特定の標識は（１）ＩＩ型コラーゲンおよびＩＩＡ、ＩＩＢの各イソ型、（２）アグリカン・プロテオグリカン、（３）ＩＸ、ＸおよびＸＩ型の各コラーゲン、（４）Ｉ型コラーゲン、（５）軟骨基質タンパク質（ＣＭＰ）、（６）カート−１（Ｃａｒｔ−１）転写因子、（７）フィブロネクチン（ＥＤＡ、ＥＤＢの各イソ型）、（８）デコリン・プロテオグリカン、（９）リンク・タンパク質、（１０）ＮＧ−２プロテオグリカン、（１１）ビグリカン・プロテオグリカン、（１２）アルカリ・ホスファターゼを含む。また、分化はノーザン／ＰＣＰ分析、ウエスタン・ブロット処理により、あるいは、代謝細胞標識化により測定できる。
【００５０】
上記ノーザン／ＰＣＰ分析の場合に、ＲＮＡが各複合基質上において培養した各種の間質細胞または軟骨細胞から標準的な処置により単離される。細胞型に応じて１週間乃至６週間の範囲の最適な培養期間を決定するために時間経過試験が採用できる。このようにして単離したＲＮＡはノーザン・ゲルおよび特定のｃＤＮＡまたはＰＣＲ用の増殖処理した各種プローブによるハイブリッド形成技法により分析される。このノーザン分析はオートラジオグラフのデンシトメトリー走査およびハウスキーピング遺伝子信号（Ｇ３ＰＤＨ）への正規化により定量化される。さらに、このノーザン分析は分析する各種遺伝子の公表されているｃＤＮＡシーケンスにより生成される各プライマーによる定量的なＰＣＲ分析により補足される。
【００５１】
また、ウエスタン・ブロット処理の場合には、可溶化したタンパク質溶解産物が標準的な技法（スピロ，Ｒ．Ｃ．（Ｓｐｉｒｏ Ｒ． Ｃ．）他，１９９１年，ジャーナル・セル・バイオロジー（Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．），１１５巻，１４６３頁乃至１４７３頁）により各種の複合基質上において培養した細胞から単離される。各細胞の溶解後に、比較的に強力な変性剤（８Ｍ尿素、Ｇｎ塩酸（ＧｎＨＣＬ））中において各基質を抽出して、基質結合したまたは取り込まれた各種のタンパク質を取り出して調べる。各種のタンパク質サンプルが特定のポリクローナルまたはモノクローナルの抗体により標準的なウエスタン・ブロット技法により分析される。
【００５２】
また、代謝細胞標識化においては、一定の複合基質において培養した細胞が標準的な技法（スピロ（Ｓｐｉｒｏ）他，同上）により３５ＳＯ４ 、３５Ｓ−メチオニンまたは３ Ｈ／１４Ｃ標識化アミノ酸により代謝的に放射性標識化される。さらに、可溶化した細胞および基質に結合したタンパク質が関連のタンパク質に対して特異的な各種の抗体により定量的に免疫沈降処理されて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（スピロ（Ｓｐｉｒｏ）他，同上）により分析される。これらの結果の定量はオートラジオグラフのデンシトメトリー走査処理により行なわれ、これらの信号が各種の細胞等価物またはアクチンのようなハウスキーピング・タンパク質に対して正規化される。
【００５３】
加えて、生体内における軟骨形成性の分化を支援する本発明の基質の能力が近親交配したラットの軟質組織移植モデルにおいて試験できる。ラットの骨髄細胞または間質細胞が高密度で各基質上に接種され、１０％のＦＢＳ血清および各種の抗生物質を含有しているＭＥＭ培地中において一晩にわたり培養された後に、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）拡散チャンバー内に移されて、生後８週間の各レシピエントの腹腔内または皮下に移植される。３週間後に各小室を採取して、軟骨形成について組織学的に評価する。
【００５４】
さらに、上記各複合基質の生体内における軟骨表現型を維持する能力を評価するために異系交配のラット内の移植モデルが用いられる。肋軟骨の軟骨細胞が高密度で各基質上に接種されて、１％のラット血清および各種の抗生物質を含有しているハムＦ−１２（Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２）中において一晩にわたり培養される。その後、これらの接種された各基質は生後８週間のオスのスプラグ−ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）種のラットにおいて閉塞性切開（ｂｌｕｎｔ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）により形成した後脛骨筋嚢の中に移植される。その後、体外移植組織を１４日目および２８日目に採取して、基質の相容性、軟骨の増殖、アグリカンおよびＩＩ型コラーゲンに対する染色に基づく分化した表現型の維持について組織学的に評価する。
【００５５】
加えて、本発明の一定の基質の、周囲の血清、組織流体の中、または各種軟骨先祖細胞の分泌生成物中において見られる細胞外基質タンパク質（各種のプロテオグリカン、タンパク質および増殖因子）に対して相互作用する能力は一定の基質の軟骨伝導性の能力に相関している。本発明の各基質の各種細胞外基質タンパク質に対する相互作用はウエスタン・ブロット処理、アフィニティ同時電気泳動技法および各種の結合特性等の当該技術分野における熟練者において知られている各種の手段により測定できる。
【００５６】
本発明の基質に対して結合している血清タンパク質を定量するために、この基質を増加した量の血清（種々の種および供給源）を含有している培養培地内において培養する。洗浄後に、結合していた各種のタンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中における煮沸により溶離し、不溶化した基質が遠心分離により除去される。その後、ウエスタン・ブロット処理を行ない、フィブロネクチンおよびビトロネクチン等の特定的に結合している各種の成分を確認する。
【００５７】
アフィニティ同時電気泳動法を用いて本発明の基質に結合しているプロテオグリカンを分析する。ウシおよびラット（あるいはその他の供給源）から単離した３５ＳＯ４ 標識化またはヨウ素化したプロテオグリカン（アグリカン）が各種の複合基質またはコラーゲン支持骨格のみを含有しているＡＣＥゲル（リー，Ｍ．Ｋ．（Ｌｅｅ Ｍ． Ｋ．）他，１９９１年，８８巻，２７６８頁乃至２７７２頁）中に投入される。このコラーゲン支持骨格に対するヒアルロン酸または硫酸デキストランを加えた場合または除いた場合の上記アグリカンの結合親和力はその複合基質における一定の軟骨基質を組織化する能力として考えられる。
【００５８】
鉱物質化したコラーゲンを基材とする複合基質に対する一定のタンパク質の相互作用の評価は大過剰のコラーゲン・タンパク質により潜在的に妨げられる可能性がある。このような鉱物質化したコラーゲンの支持骨格は十分な固有の構造的完全性を有しており、その完全な可溶化を妨げる程度に架橋されているが、一部のコラーゲン・タンパク質は上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中に可溶化する可能性がある。従って、このことは、別の結合しているタンパク質、特に細胞合成された各種のコラーゲンの可視化を不明瞭にする可能性があり、ウエスタン・ブロット分析において多量のバックグラウンドを生じると考えられる。それゆえ、別の手法はこの結合性の分析において放射性標識化またはビオチニル化したタンパク質を使用する方法である。各種の血清タンパク質は上記の各複合基質を伴う培養の前にビオチニル化した後にアビジン基材の各種試薬により現像できる。これら両方の手法は上記支持骨格におけるコラーゲン・タンパク質の影響を伴わずに各種の基質に結合した成分の可視化を可能にする。
【００５９】
あるいは、Ｉ型からＩＩ型へのコラーゲンの発現における変化およびＩＩ型コラーゲンにおけるＩＩＡからＩＩＢのイソ型の転写のスプライシング（サンデル，Ｌ．Ｊ．（Ｓａｎｄｅｌｌ， Ｌ． Ｊ．）他，１９９１年，ジャーナル・セル・バイオロジー（Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．），１１４巻，１３０７頁乃至１３１９頁）が一定の軟骨形成性の経路に到る分化を決定するために当該技術分野における熟練者において知られている各種の手段により測定される。さらに、軟骨に結合したプロテオグリカン、アグリカン（シュミット，Ｔ．Ｍ．（Ｓｃｈｍｉｄ， Ｔ． Ｍ．）他，１９８５年，ジャーナル・セル・バイオロジー（Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．），１００巻，５９８頁乃至６０５頁およびクエットナー，Ｋ．Ｅ．（Ｋｕｅｔｔｎｅｒ Ｋ． Ｅ．），１９９２年，クリニカル・バイオケミストリー（Ｃｌｉｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．），２５巻，１５５頁乃至１６３頁）および一定の軟骨ホメオタンパク質（ｈｏｍｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）転写因子（カート−１（Ｃａｒｔ−１））の発現は軟骨細胞の直系に与えられる各種の細胞に対応する標識と考えられる。
【００６０】
生体内の試験において、上記基質は生後６週間のオスのスプラグ−ドーリー種のラットにおける頭頂骨内に形成した５ｍｍ×３ｍｍの欠損部分の中への移植による一定のラット頭蓋欠損モデルにおける骨の治癒を支援する能力について評価される。これらの欠損部分はラジオグラフおよび組織学的な分析により２８日目において評価されている。
【００６１】
軟骨修復における生体内モデルはラビットにおける一定の全層関節軟骨欠損部分である（アミエル（Ａｍｉｅｌ）他，１９８５年，ジャーナル・ボーン・ジョイント・サージェリー（Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．），６７Ａ巻，９１１頁）。約３．７ｍｍの直径および５ｍｍの深さの寸法の各欠損部分が成育したオスのニュージーランド（Ｎｅｗ Ｚｅｅｌａｎｄ）種のホワイト・ラビットにおける内側大腿顆の中心部分に形成される。その後、これらの欠損部分は基質により充填されるか、対照として未充填状態のまま放置される。さらに、これらの欠損部分は６週間目および１２週間目において形態学的におよび組織学的に評価される。
【００６２】
本発明の基質は、脊椎固定等の外科的切除、外傷、感染、ガンまたは遺伝的な欠損に伴う骨および／または軟骨の欠損部分の治療において使用できる。本発明による基質はその基質の目的とされる用途、その基質の物理的特性およびその基質における鉱物質化したコラーゲンの多糖類に対する重量比率に応じて移植、直接的な供給または注入により供給することができる。
【００６３】
本発明の一例の態様において、上記基質はその多糖類に対して比較的に高い一定の割合の鉱物質化したコラーゲンを含有して供給され、一定のスポンジ様の形態であり、脊椎固定における場合のような、新しい骨組織の増殖が望まれる部位において外科的に移植される。一例の態様において、上記基質はさらにＢＭＰ−２等の一定の増殖因子を含有している。また、一例の態様において、上記基質はこの基質を所望の部位に固定することを容易にするためのフィブリンを含有している。また、本発明の一例の態様において、上記開始用のポリアルデヒド型の多糖類および鉱物質化したコラーゲンは任意の所望の各種の増殖因子と共に所望の組織増殖部位に別々に注入される。これらの材料はその所望の部位において上記基質を形成するためにその原位置でそれぞれ反応する。
【００６４】
本発明の別の態様において、上記基質はその鉱物質化したコラーゲンに対して比較的に高い割合の多糖類を含有しており、一定の粘性のゲルとして形成され、骨の欠損部の充填、骨折修復および歯周欠損部への移植等のような、新しい骨組織の増殖が望まれる一定の部位内に直接的に供給または注入される。本発明のさらに別の態様において、上記基質は一定の比較的に高い割合の多糖類を含有して供給され、一定の粘性ゲルとして形成されて、変性性関節症または慢性関節リウマチ等における、外傷を誘発した軟骨損傷部分または病気を誘発した軟骨損傷部分等のような、軟骨組織の増殖が望まれる一定の部位内に直接的に注入されるか一定の関節鏡処置を介して配給される。
【００６５】
当該技術分野における熟練者により理解されるように、骨または軟骨の組織の増殖または増殖を行なうために供給される上記基質の量は処理される骨または軟骨の欠損部分の程度に応じて決まる。さらに、当該技術分野における熟練者により理解されるように、費用、安全性、および所望の増殖因子の放出プロファイルがその基質に投入される増殖因子の種類および量を決める。
【００６６】
以下の各種の実施例は例示を目的として示されており、本発明を何ら限定することを目的としていない。
【００６７】
実施例１
移植可能なアミン結合した鉱物質化コラーゲンおよび多糖類
原料である鉱物質化したＩ型コラーゲンおよび多糖類型ポリアルデヒドを米国特許第５，２３１，１６９号および同第５，８６６，１６５号において開示されている方法によりそれぞれ調製した。鉱物質化したセムドＦ型コラーゲン（ｓｅｍｅｄ Ｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ）（６３ｍｇ／ｍｌ）を一定の強力混合器の容器内に同一の容量比率で一定のヒアルロネート−ポリアルデヒド溶液（７ｍｇ／ｍｌ、５％の反復単位が酸化されている、ｐＨ７．５乃至ｐＨ９．０）と共に混合した。この混合物にシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３ ，５．０Ｍ、１．０ＭＮａＯＨ中）を加えて最終的な濃度を１０ｍＭにした。その後、この混合物を１０秒間にわたり低速で３回混合した。この反応は一定の締り嵌め式のポリプロピレン・スクリュー・キャップと共に組み込まれている一定の厚肉型のボトルの中にこのスラリーを注ぎ入れることにより継続し続けた。このボトルを２４時間にわたり暗所中において周囲温度で１００回転／分の速度で回転した。その後、このスラリーを一定の金型の中に注ぎ入れて凍結乾燥した。このようにして一定の基質が形成され、この基質を脱イオン水により洗浄してＮａＣＮＢＨ３ を除去して、再び凍結乾燥した。この手順を繰り返して別の各種の酸化した多糖類と共にｍＣＯＬにより一連の基質を作成した。さらに、これら基質の表面特性、構造および生物学的活性をｍＣＯＬの各種多糖類に対する比率、多糖類の種類、多糖類において生じたアルデヒド基の密度、基質の密度、ならびに、凍結乾燥の処理を変更することにより調整した。
【００６８】
実施例２
移植可能なイミン結合した鉱物質化コラーゲンおよび多糖類
上記ＮａＣＮＢＨ３ を使用しないことを除いて、各基質を上記実施例１において説明されている手順により調製した。
【００６９】
実施例３
フィブリンを伴う注入可能なゲル基質
これらのゲル基質をフィブリンジェット（ＦｉｂｒｉｎＪｅｔ）（商標）外科用密封材配給システムにより調製した。一般的な手順の詳細が以下において説明されている。
【００７０】
約１００μｍの直径のｍＣＯＬ線維およびフィブリノゲン（ｍＣＯＬ，４２ｍｇ／ｍｌ、フィブリノゲン，２１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．５）を単一の注射器の中に投入し、トロンビン（１単位乃至５単位／ｍｌ（Ｕ／ｍｌ））を含有している同一容量の活性化ヒアルロネート溶液（７ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．５）を別の注射器の中に入れた。これらの両方の注射器を一定の１８Ｇニードルを連結したフィブリンジェット（ＦｉｂｒｉｎＪｅｔ）（商標）外科用密封材配給システムに取り付けた。これら２種類の組成部分をそれぞれの注射器を通して同時に流し出すことにより、上記針（ニードル）の流出部分において３分以内にゲル基質が形成した。
【００７１】
上記の手順を繰り返して、ｍＣＯＬ、フィブリノゲン、および別の各種の酸化した多糖類により一連の注入可能なゲル基質を作成した。さらに、これらゲル基質の表面特性、多孔質構造および生物学的活性をｍＣＯＬおよび各種多糖類のフィブリノゲンに対する比率、多糖類の種類、アルデヒド基の密度、最終的な基質の密度およびトロンビンの濃度を変更することにより調整した。また、ゲル化時間およびゲル硬度を加えるトロンビンの量により調整した。
【００７２】
実施例４
血漿を伴う注入可能なゲル基質
上記フィブリノゲンの代わりに血漿を用いたことを除いて、各ゲル基質を実施例３において説明されている方法により調製した。血漿を１５分間にわたり３，０００ｒｐｍで遠心処理した全血にシトレート（クエン酸塩、１０重量％）を加えて調製した。
【００７３】
実施例５
血漿を伴う注入可能なゲル基質
上記トロンビンの代わりに５０ｍＭの塩化カルシウム溶液を用いたことを除いて、各ゲル基質を実施例４において説明されている方法により調製した。
【００７４】
実施例６
全血を伴う注入可能なゲル基質
上記血漿の代わりに全血を用いたことを除いて、各基質ゲルを実施例３において説明されている方法により調製した。
【００７５】
実施例７
各種増殖因子を伴う移植可能な基質
各種の増殖因子を各種の基質に投入する一般的な手順が以下のように説明されている。
【００７６】
上記の実施例１および実施例２において調製した各基質と同様にｍＣＯＬおよび活性な各種多糖類により調製した各基質を用いた。乾燥処理前の各基質を５ｍｍ×４ｍｍ×２ｍｍの寸法を有する立方体に切断した。各立方体における水分の取り込みを測定し、各切断片当たりに８５±５μｌであることが分かった。さらに、増殖分化因子−５（ＧＤＦ−５，０．５８８ｍｇ／ｍｌ、２０ｍＭ酢酸中）を各基質試料に各切断片当たりに８５μｌで滴下により加えた。このＧＤＦ−５を投入した各基質試料を５分間にわたりフード中において周囲温度で自然放置した後に、−７８℃において凍結し、凍結乾燥した。
【００７７】
上記の手順を繰り返して、別の各種の酸化した多糖類を伴うｍＣＯＬにより作成した各基質に、各種の骨形態発生タンパク質、トランスフェリン増殖因子−β、およびインスリン様増殖因子等のような、種々の濃度の一連の増殖因子を投入した。
【００７８】
さらに、上記の手順を繰り返して、別の各種の酸化した多糖類を伴うｍＣＯＬにより作成した各基質に、ＤＮＡ、各種のホルモン、およびサイトカインを投入した。
【００７９】
実施例８
各種増殖因子を伴う移植可能なゲル基質
各種の増殖因子を注入可能な各種のゲル基質に投入する一般的な手順が以下のように説明されている。
【００８０】
ｍＣＯＬ線維（Ｄ．Ｉ．＜１００μｍ，４２ｍｇ／ｍｌ）、フィブリノゲン（２１ｍｇ／ｍｌ）、およびＧＤＦ−５（１００μｇ／ｍｌ）を単一の注射器の中に投入し、トロンビン（１単位乃至５単位／ｍｌ（Ｕ／ｍｌ））を含有している同一容量の活性化ヒアルロネート溶液（７ｍｇ／ｍｌ）を別の注射器の中に入れた。これらの両方の注射器を一定の１８Ｇニードルを連結したフィブリンジェット（ＦｉｂｒｉｎＪｅｔ）（商標）外科用密封材配給システムに取り付けた。これら２種類の組成部分をそれぞれの注射器を通して同時に流し出すことにより、上記針の流出部分において３分以内にＧＤＦ−５を含有しているゲル基質が形成した。
【００８１】
上記の手順を繰り返して、さらに別の増殖因子、ホルモン、およびサイトカインを含有している一連の注入可能なゲル基質を作成した。
【００８２】
実施例９
各基質からのＧＤＦ−５の比較持続放出性
トレーサーとして放射性標識化したＧＤＦ−５を用いて、５０μｇ／試験片の比率で予め投入したＧＤＦ−５を含む移植可能なｍＣＯＬ／ＨＡの各基質（５×４×２ｍｍ）を上記実施例７において説明されているように調製した。さらに、グルタルアルデヒドにより交差架橋したｍＣＯＬおよびヒアルロネート型ポリアルデヒドにより交差架橋したＣＯＬ（ＣＯＬ／ＨＡ）にも上記ＧＤＦ−５を同一比率で投入して、これらを対照として用いた。これらの基質からのＧＤＦ−５の放出速度を調べた。各種類の基質の合計５個の試験片の内の１個の試験片を３０ｍＭの酢酸により調整したｐＨ４．０の５．０ｍｌのＰＢＳを入れた２．０ｍｌのポリプロピレン・チューブの中に入れた。これらのチューブを３７℃において穏やかに振盪した。この媒質を一定の指定された時間に新しく取り替えて、それぞれの取り替えた培地における放射能をシンチレーション・カウンターにより検出した。図において示されているように、ｍＣＯＬ／ＨＡおよびグルタルアルデヒド結合した各基質の両方からのＧＤＦ−５の放出はＣＯＬ／ＨＡの基質からの放出よりも長い持続時間を示した。これらのｍＣＯＬ／ＨＡおよびグルタルアルデヒド結合した各基質は９０％のｍＣＯＬを含有しているが、ＣＯＬ／ＨＡの基質は同量の非鉱物質化ＣＯＬを含有しているので、これらの結果はＧＤＦ−５がＣＯＬに対する結合よりもさらに効果的にｍＣＯＬ線維に対して結合していたことを示している。従って、ｍＣＯＬ／ＨＡの基質はＧＤＦ−５の持続的配給においてＣＯＬ／ＨＡの基質よりも優れていると考えられる。
【００８３】
さらに、上記の手順を繰り返して、ｍＣＯＬ／ＨＡの各基質から放出される一連の増殖因子、ホルモン、およびサイトカインの速度を決定した。
【００８４】
実施例１０
移植可能な各基質の骨伝導性
９部のｍＣＯＬおよび１部のＨＡポリアルデヒド（５％の反復単位が酸化されている）を含む各基質を実施例２において説明されているように調製した。５ｍｍ×３ｍｍ×２ｍｍの寸法を有する各基質の試料をエタノールにより滅菌処理して生後６週間のスプラグ−ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）種のオスのラットにおける頭頂骨内に形成した各欠損部分に移植した。これらの欠損部分をラジオグラフおよび組織学的分析により２８日目において評価し、これらの結果を表１にまとめた。基質の移植を伴わない欠損部分はラジオグラフにおけるわずかな減少（２０±２％）のみを示し、グルタルアルデヒド交差架橋したｍＣＯＬにより充填した欠損部分は比較的に高い減少（５５±３％）を示し、ｍＣＯＬ／ＨＡにより充填した欠損部分はラジオグラフにおけるさらなる増加（８８±３％）を示し、この値はＣＯＬ／ＨＡの基質により充填した値（９３±４％）と類似していた。また、組織学的評価はこれらのラジオグラフによる結果に相関していた。すなわち、ｍＣＯＬ／ＨＡまたはＣＯＬ／ＨＡのいずれかにより充填した欠損部分はｍＣＯＬにより充填した値よりも高い骨の形成の評価点を示した（表１）。これらｍＣＯＬ／ＨＡおよびＣＯＬ／ＨＡの両方の基質は１０％のＨＡを含有しているので、１００％のｍＣＯＬにより調製したｍＣＯＬとは異なっており、これらの結果はコラーゲン基材の各基質に対する１０％のＨＡの導入がそれぞれの骨伝導性を高めたことを示している。
【表１】
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【００８５】
実施例１１
細胞の生体外増殖および骨表現型の発現
この実施例はｍＣＯＬ／ＨＡ基質が胎児ラットの頭蓋冠細胞（ＦＲＣｓ）の増殖を支援して生体外における骨表現型の発現を示すことを示している。上記ＦＲＣｓを生後１９日の胎児により調製して増殖し、９０％ｍＣＯＬおよび１０％ＨＡ（５％の反復単位が酸化されている）を含有する実施例２において説明されている方法により作成した基質の中に接種して、４週間にわたり標準的な諸条件下において培養した。その後、各培養物を細胞増殖およびアルカリ・ホスファターゼ活性（ＡＬＰ）について評価した。これらの結果は上記基質に接種したＲＦＣｓが継続的に増殖して、その細胞数が１日目に比べて２８日目において９倍に増加したことを示した。さらに、骨の形成についての一定の標識である、ＡＬＰの発現もまた経時的に増加して２１日目において最高値に到達し、接種したＦＰＣの分化を誘導するためのｍＣＯＬ／ＨＡの骨形成における有用性を示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】
実施例９において記載されている３種類の基質からのＧＤＦ−５の比較的な放出速度のグラフである。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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