(57)【要約】本発明は、有糸分裂及び減数分裂を含む細胞周期進行に関与するヒト遺伝子について記載するものである。本発明はまた、細胞での細胞周期進行の調節におけるこの「細胞周期進行」遺伝子及びタンパクの使用、並びにこの遺伝子又はタンパクの調節因子、したがって有糸分裂及び減数分裂の調節因子を同定する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における疾患の予防、治療又は診断の方法に使用する、図１から１８０における奇数の配列番号からなる群から選択されるポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
【請求項２】
個体における疾患の予防、治療又は診断の方法に使用する、図１から１８０における偶数の配列番号からなる群から選択されるポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチド又はポリヌクレオチドを使用して前記ポリペプチドと結合することができる物質を同定し、その方法が、前記ポリペプチド、又は前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを、適切な条件下で候補物質とともにインキュベートするステップと、前記物質が前記ポリペプチドと結合したかどうかを確認するステップとを含む、前記請求項に特定した使用のための、請求項１に記載のポリヌクレオチド又は請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチド又はポリヌクレオチドを使用して前記ポリペプチドの機能を調節することができる物質を同定し、その方法が、前記ポリペプチド、又は前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを、候補物質とともにインキュベートするステップと、前記ポリペプチドの活性がそれによって調節されたかどうかを確認するステップとを含む、前記請求項に特定した使用のための、請求項１又は３に記載のポリヌクレオチド或いは請求項２又は３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチド又はポリペプチドを、好ましくは有効量で、そのような治療を必要とする個体に投与する、前記請求項に特定した使用のための、請求項１から４のいずれか記載のポリヌクレオチド又はポリペプチド。
【請求項６】
前記方法によって同定された前記物質を、そのような治療を必要とする個体に投与する、前記請求項に特定した使用のための、請求項３又は４に記載のポリヌクレオチド又はポリペプチド。
【請求項７】
（ａ）ハイブリダイズする条件下で、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を含む生物試料を、ポリヌクレオチドの少なくとも１５ヌクレオチドのフラグメントを含むプローブと接触させるステップと、（ｂ）前記プローブと試料中の核酸との間に形成される二重鎖を検出するステップとを含む方法で、生物試料中で前記ポリヌクレオチドの有無を検出する、前記請求項に特定した診断に使用するための、請求項１から６のいずれか記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
（ａ）ポリペプチドと結合することができる抗体を提供するステップと、（ｂ）抗体−抗原複合体の形成が可能な条件下で生物試料を前記抗体とともにインキュベートするステップと、（ｃ）前記抗体を含む抗体−抗原複合体が形成されたかどうかを確認するステップとを含む方法で、生物試料中で前記ポリペプチドの有無を検出する、前記請求項に特定した診断に使用するための、請求項１から７のいずれか記載のポリペプチド。
【請求項９】
個体における疾患の予防、治療又は診断の方法に使用する、図１から１８０における偶数の配列番号からなる群から選択されるポリペプチドと、結合することができる抗体。
【請求項１０】
前記方法が、細胞又は組織試料を前記抗体と接触させるステップと、抗体／抗原複合体を検出するステップとを含み、前記検出によって前記疾患又は疾病が示唆される、前記請求項に特定した診断に使用するための、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
前記疾患が、増殖性疾患、哺乳動物の組織での細胞増殖を特徴とする疾患又は疾病、或いは腫瘍、好ましくは癌を含む、前記請求項に特定した使用のための、請求項１から１０のいずれか記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド又は抗体。
【請求項１２】
生物試料中のポリヌクレオチドの有無を検出する方法であって、
（ａ）ハイブリダイズする条件下で、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む生物試料を、図１から１８０における奇数の配列番号からなる群から選択される核酸の、少なくとも１５ヌクレオチドのフラグメントを含むプローブと接触させるステップと、
（ｂ）前記プローブと前記試料中の核酸との間に形成された二重鎖を検出するステップと
を含む方法。
【請求項１３】
細胞において、好ましくは単離細胞において図１から１８０における奇数の配列番号からなる群から選択されるポリヌクレオチドの発現を調節する、好ましくはダウンレギュレートする方法であって、前記ポリヌクレオチドに対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、又は前記ポリヌクレオチドに対応するアンチセンスＲＮＡ、又はそのフラグメントを細胞内に導入するステップを含む方法。
【請求項１４】
その対応遺伝子の機能に影響を及ぼすことができる物質を同定する方法におけるポリペプチドの使用であって、前記ポリペプチドが、図１から１８０における偶数の配列番号からなる群から選択されるポリペプチドの使用。
【請求項１５】
細胞分裂周期を阻害できる物質を同定するアッセイにおけるポリペプチドの使用であって、前記ポリペプチドが、図１から１８０における偶数の配列番号からなる群から選択されるポリペプチドの使用。
【請求項１６】
前記物質が、細胞周期進行を、好ましくは有糸分裂及び／又は減数分裂を阻害できる、請求項１４又は１５に記載の使用。
【請求項１７】
請求項３、４、１４又は１５に記載の方法又はアッセイによって同定される物質。
【請求項１８】
ポリペプチドの機能を阻害する方法、又は細胞分裂周期の機能を制御する方法における、請求項１７に記載の物質の使用。
【請求項１９】
細胞において細胞周期進行を調節する方法であって、
（ａ）前記細胞中に、
（ｉ）図１から１８０における偶数の配列番号のうちいずれかのポリペプチドをコードする核酸配列、
（ii）図１から１８０における偶数の配列番号のうちいずれかのポリペプチドに対して、配列同一性が少なくとも８０％であるポリペプチドをコードする核酸配列、
（iii）図１から１８０における奇数の配列番号のうちいずれかを含む配列を有する核酸、
（iv）図１から１８０における奇数の配列番号のうちいずれかを含む配列を有する核酸に対して、配列同一性が少なくとも８０％である核酸、
（ｖ）（ｉ）から（iv）のうちいずれかの相補体
からなる群から選択され、制御配列と作動的に連結している核酸配列を導入して形質転換するステップと、
（ｂ）前記核酸配列が発現する条件下で前記細胞を培養するステップとを含み、それによって、前記細胞において細胞周期進行を調節する方法。
【請求項２０】
細胞において細胞周期進行を調節する方法であって、
（ａ）前記細胞中に、
（ｉ）図１から１８０における奇数の配列番号のうちいずれかの、長さ１５〜４０ヌクレオチドの配列を含む第１基部と、
（ii）図１から１８０における奇数の配列番号のうちいずれかの配列の連続した１５〜４０ヌクレオチドと相補的な、長さ１５〜４０ヌクレオチドの配列を含む第２基部であって、前記第１基部と第２基部が互いにハイブリダイズして二重鎖基部を形成することができる基部と、
（iii）前記２つの基部を連結するループ部と
を含むリボ核酸（ＲＮＡ）前駆体をコードする単離核酸配列を導入して形質転換するステップと、
（ｂ）前記核酸配列が発現する条件下で前記細胞を培養するステップとを含み、それによって、前記細胞において細胞周期進行を調節する方法。
【請求項２１】
前記核酸配列が、図１から１８０における偶数の配列番号からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸配列が、図１から１８０における奇数の配列番号からなる群から選択される配列、又はその相補体を含む、請求項１９、２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
好ましくは細胞の増殖を低下させることにより、細胞周期進行を遅延させる、請求項１９から２２のいずれか記載の方法。
【請求項２４】
好ましくは細胞の増殖を促進することにより、細胞周期進行を促進する、請求項１９から２２のいずれか記載の方法。
【請求項２５】
請求項１９から２４のいずれか記載の方法によって形質転換される宿主細胞。
【請求項２６】
抗増殖性タンパク質を哺乳動物に提供する方法であって、請求項１９から２４のいずれか記載の方法によって形質転換された哺乳動物細胞を前記哺乳動物中に導入するステップを含む方法。
【請求項２７】
図１から１８０における奇数の配列番号からなる群から選択される核酸配列によってコードされるＲＮＡ前駆体。
【請求項２８】
生物活性成分として、請求項２７に記載のＲＮＡ前駆体を含む組成物。
【請求項２９】
細胞増殖を特徴とする疾患又は疾病、好ましくは癌を治療する方法に使用する、請求項２７に記載のＲＮＡ前駆体又は請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
有効成分として、
（ａ）図１から１８０における奇数の配列番号の細胞周期進行核酸配列、
（ｂ）図１から１８０における偶数の配列番号からなる群から選択される細胞周期進行ポリペプチド、又は
（ｃ）図１から１８０における偶数の配列番号からなる群から選択される細胞周期進行ポリペプチドに対する抗体、
及び薬学的に許容される担体
を含む医薬組成物。
【請求項３１】
哺乳動物の組織における細胞増殖を特徴とする疾患又は疾病を治療する方法に使用するための、図１から１８０における偶数の配列番号からなる群から選択される細胞周期進行ポリペプチドのアンタゴニストであって、前記方法が、前記組織を前記アンタゴニストと接触させるステップを含むアンタゴニスト。
【請求項３２】
哺乳動物の組織における細胞増殖を特徴とする疾患又は疾病を治療する方法に使用するための、図１から１８０における偶数の配列番号からなる群から選択される細胞周期進行ポリペプチドのアゴニストであって、前記方法が、前記組織を前記アゴニストと接触させるステップを含むアゴニスト。
【請求項３３】
哺乳動物の組織における細胞増殖を特徴とする疾患又は疾病を治療するためのキットであって、
（ａ）図１から１８０における奇数の配列番号のうちいずれかの核酸配列によってコードされるポリペプチド、
（ｂ）図１から１８０における奇数の配列番号のうちいずれかのヌクレオチド配列を有する核酸、又は
（ｃ）（ａ）のポリペプチドのエピトープを認識する抗体
を含むキット。
【請求項３４】
図１から１８０における奇数の配列番号のうちいずれかの核酸配列を有する細胞周期進行遺伝子を少なくとも２つ含むアレイ。
【請求項３５】
前記核酸配列がＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列である、請求項３４に記載のアレイ。
【請求項３６】
図１から１８０における偶数の配列番号のうちいずれかのポリペプチド配列を有する細胞周期進行タンパク質を少なくとも２つ含むアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有糸分裂や減数分裂を含めた細胞周期進行のプロセスに関係する多数のヒト遺伝子、及びそれがコードするタンパク質に関する。本発明はまた、細胞での細胞周期進行の調節におけるこの「細胞周期進行」遺伝子及びタンパク質の使用、並びにこの遺伝子又はタンパク質の調節因子、したがって有糸分裂及び減数分裂の調節因子を同定する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
正常細胞の増殖性成長は、一連の異なるステップである、細胞周期として知られているプロセスを介する規則正しい進行を必要とする。細胞周期を介する進行は、栄養利用能、細胞サイズ及び成長因子により、リン酸化カスケード、並びに細胞周期の各期で必要な特定のタンパク質の厳密に制限された発現及び安定性に関係する複雑なシグナル伝達経路を介して調節されている。
【０００３】
細胞周期は、Ｍ期から開始され、このとき細胞質の分裂（細胞質分裂（cytokinesis））が行われる。Ｍ期に続いてＧ１期に入り、このとき細胞は高率の生合成及び増殖を再開する。Ｓ期ではＤＮＡ合成が開始され、ＤＮＡ量が２倍になったときに終了する。次いで細胞はＧ２期に入り、これは有糸分裂が開始されるときに終了し、染色体の濃縮が見られることがその合図となる。最終段階まで分化した細胞は、Ｇ１期で停止し、もはや細胞分裂を起こさない。
【０００４】
一連の細胞周期事象は、個々の各段階が完了していることを次の段階が開始される前に確認する特定のチェックポイントで厳密に制御されている。癌を含めて、異常な細胞増殖と関係するヒト疾患は、細胞周期進行のこの厳密な制御が乱れたときに生じる。
【０００５】
細胞周期及びその制御に関与する遺伝子及び遺伝子産物が解明されると、癌及び他の増殖関連疾患（例えばアテローム性動脈硬化症）の予防上、診断上及び治療上の対応に新たな機会がもたらされる。
【０００６】
その一方で、制御された形で、細胞の増殖を亢進させることが所望されることもある。例えば、細胞増殖は、創傷治療に、また組織の増殖が所望される場所で有用である。したがって、増殖阻止を促進し、亢進し又は防止する遺伝子、その遺伝子産物及びその調節因子の同定が所望される。
【０００７】
細胞周期の構成成分及び調節因子の同定が所望されているにも関わらず、この分野におけるこのような化合物は不足している。したがって、その活性が細胞周期進行と関係する遺伝子及びその対応するタンパク質産物を同定すると有利であるはずである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、細胞周期進行に、例えば有糸分裂及び／又は減数分裂のプロセスに関与する多数のヒト遺伝子をこれまでに同定した。ＲＮＡｉを用いて遺伝子発現をノックダウンし、細胞周期進行における異常について得られた表現型を評価することによる、細胞周期進行に関与する遺伝子を同定するために設計したアッセイを通じて、これらの遺伝子の役割を発見した。
【０００９】
本発明の第１の態様によれば、個体における疾患の予防、治療又は診断の方法に使用する、図１〜１８０における奇数の配列番号からなる群から選択されるポリヌクレオチド、又はそのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが提供される。
【００１０】
本発明の第２の態様によれば、個体における疾患の予防、治療又は診断の方法に使用する、図１〜１８０における偶数の配列番号からなる群から選択されるポリペプチドが提供される。
【００１１】
好ましくは、このポリペプチド又はポリヌクレオチドを使用して、このポリペプチドと結合することができる物質を同定し、この方法は、このポリペプチド又はこのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを、候補物質とともに適切な条件下でインキュベートするステップと、この物質がこのポリペプチドと結合するかどうかを確認するステップとを含む。
【００１２】
好ましくは、このポリペプチド又はポリヌクレオチドを使用して、このポリペプチドの機能を調節することができる物質を同定し、この方法は、このポリペプチド又はこのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを、候補物質とともにインキュベートするステップと、このポリペプチドの活性がそれによって調節されたかどうかを確認するステップとを含む。
【００１３】
好ましい実施形態では、このポリヌクレオチド又はポリペプチドを、そのような治療を必要とする個体に、好ましくは有効量投与する。その代替として、又はそれに加えて、この方法によって同定された物質を、そのような治療を必要とする個体に投与する。
【００１４】
好ましくは、このポリヌクレオチドは、（ａ）ハイブリダイズする条件下で、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を含む生物試料を、このポリヌクレオチドの少なくとも１５ヌクレオチドのフラグメントを含むプローブと接触させるステップと、（ｂ）プローブと試料中の核酸との間に形成される二重鎖を検出するステップとを含む方法で、生物試料中のポリヌクレオチドの有無を検出する、前記に特定した診断に使用するために提供される。
【００１５】
好ましくは、（ａ）ポリペプチドと結合することができる抗体を提供するステップと、（ｂ）抗体−抗原複合体の形成が可能な条件下で生物試料を前記抗体とともにインキュベートするステップと、（ｃ）前記抗体を含む抗体−抗原複合体が形成されたかどうかを確認するステップとを含む方法で、生物試料中のポリペプチドの有無を検出する。
【００１６】
本発明の第３の態様によれば、個体における疾患の予防、治療又は診断の方法に使用する、図１〜１８０における偶数の配列番号からなる群から選択されるポリペプチドと結合することができる抗体が提供される。
【００１７】
好ましくは、この抗体は、その方法が、細胞又は組織試料を抗体と接触させるステップと、抗体／抗原複合体を検出するステップとを含み、前記検出によって前記疾患又は疾病が示唆される前記に特定した診断に使用するために提供される。
【００１８】
好ましくは、この疾患は、増殖性疾患又は哺乳動物の組織おける細胞増殖による疾患又は疾病、或いは腫瘍を含み、好ましくは癌を含む。
【００１９】
本発明の第４の態様によれば、生物試料中のポリペプチドの有無を検出する方法が提供され、この方法は、（ａ）ハイブリダイズする条件下で、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む生物試料を、図１〜１８０における奇数の配列番号からなる群から選択される核酸の少なくとも１５ヌクレオチドのフラグメントを含むプローブと接触させるステップと、（ｂ）プローブと試料中の核酸との間に形成される二重鎖を検出するステップとを含む。
【００２０】
本発明の第５の態様によれば、細胞において、好ましくは単離細胞において図１〜１８０における奇数の配列番号からなる群から選択されるポリヌクレオチドの発現を調節する、好ましくはダウンレギュレートする方法が提供され、この方法は、そのポリヌクレオチドに対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、又はそのポリヌクレオチドに対応するアンチセンスＲＮＡ、又はそのフラグメントを細胞内に導入するステップを含む。
【００２１】
本発明は、第６の態様で、その対応遺伝子の機能に影響を及ぼすことができる物質を同定する方法におけるそのポリペプチドの使用を提供し、そのポリペプチドは、図１〜１８０における偶数の配列番号からなる群から選択される。
【００２２】
本発明の第７の態様によれば、細胞分裂周期を阻害できる物質を同定するアッセイにおけるポリペプチドの使用が提供され、そのポリペプチドは、図１〜１８０における偶数の配列番号からなる群から選択される。
【００２３】
好ましくは、この物質は細胞周期進行を、好ましくは有糸分裂及び／又は減数分裂を阻害することができる。
【００２４】
本発明の第８の態様によれば、上記に示した方法又はアッセイによって同定された物質が提供される。
【００２５】
本発明の第９の態様によれば、ポリペプチドの機能を阻害する方法、又は細胞分裂周期の機能を制御する方法におけるこのような物質の使用が提供される。
【００２６】
本発明の第１０の態様によれば、細胞において細胞周期進行を調節する方法であって、（ａ）その細胞中に、（ｉ）図１〜１８０における偶数の配列番号のうちいずれかのポリペプチドをコードする核酸配列、（ii）図１〜１８０における偶数の配列番号のうちいずれかのポリペプチドに対して、配列同一性が少なくとも８０％であるポリペプチドをコードする核酸配列、（iii）図１〜１８０における奇数の配列番号のうちいずれかを含む配列を有する核酸、（iv）図１〜１８０における奇数の配列番号のうちいずれかを含む配列を有する核酸に対して、配列同一性が少なくとも８０％である核酸、及び（ｖ）（ｉ）〜（iv）のうちいずれかの相補体からなる群から選択され、制御配列と作動的に連結している核酸配列を導入して形質転換するステップと、（ｂ）核酸配列が発現する条件下でその細胞を培養するステップとを含み、それによって、その細胞において細胞周期進行を調節する方法が提供される。
【００２７】
本発明の第１１の態様として、細胞において細胞周期進行を調節する方法であって、（ａ）その細胞中に、（ｉ）図１〜１８０における奇数の配列番号のうちいずれかにの、長さ１５〜４０ヌクレオチドの配列を含む第１基部と、（ii）図１〜１８０における奇数の配列番号のうちいずれかの配列の連続した１５〜４０ヌクレオチドと相補的な、長さ１５〜４０ヌクレオチドの配列を含む第２基部と、（iii）その２つの基部を連結するループ部とを含み、第１基部と第２基部が互いにハイブリダイズして二本鎖基部を形成することができるリボ核酸（ＲＮＡ）前駆体をコードする単離核酸配列を導入して形質転換するステップと、（ｂ）核酸配列が発現する条件下でその細胞を培養するステップとを含み、それによって、その細胞において細胞周期進行を調節する方法が提供される。
【００２８】
好ましくは、この核酸配列は、図１〜１８０における偶数の配列番号からなる群から選択されるポリペプチドをコードする。好ましくは、この核酸配列は、図１〜１８０における奇数の配列番号からなる群から選択される配列、又はその相補体を含む。
【００２９】
ある実施形態では、好ましくは細胞の増殖を低下させることにより、細胞周期進行を遅延させる。他の実施形態では、好ましくは細胞の増殖を促進することにより、細胞周期進行を促進する。
【００３０】
本発明の第１２の態様によれば、記載した方法によって形質転換された宿主細胞が提供される。
【００３１】
本発明の第１３の態様によれば、抗増殖性タンパク質を哺乳動物に提供する方法が提供され、この方法は、上記に示した方法によって形質転換された哺乳動物細胞を哺乳動物中に導入するステップを含む。
【００３２】
本発明の第１４の態様によれば、図１〜１８０における奇数の配列番号からなる群から選択される核酸配列によってコードされるＲＮＡ前駆体が提供される。本発明の第１５の態様によれば、生物活性成分としてこのようなＲＮＡ前駆体を含む組成物が提供される。
【００３３】
好ましくは、このＲＮＡ前駆体又は組成物は、細胞増殖を特徴とする疾患又は疾病、好ましくは癌を治療する方法に使用するためのものである。
【００３４】
本発明の第１５の態様によれば、有効成分として、（ａ）図１〜１８０における奇数の配列番号の細胞周期進行核酸配列、（ｂ）図１〜１８０における偶数の配列番号からなる群から選択される細胞周期進行ポリペプチド、又は（ｃ）図１〜１８０における偶数の配列番号からなる群から選択される細胞周期進行ポリペプチドに対する抗体、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。
【００３５】
本発明の第１６の態様によれば、哺乳動物の組織における細胞増殖を特徴とする疾患又は疾病を治療する方法に使用するための、図１〜１８０における偶数の配列番号からなる群から選択される細胞周期進行ポリペプチドのアンタゴニストが提供され、この方法は、組織をアンタゴニストと接触させるステップを含む。
【００３６】
本発明の第１７の態様によれば、哺乳動物の組織における細胞増殖を特徴とする疾患又は疾病を治療する方法に使用するための、図１〜１８０における偶数の配列番号からなる群から選択される細胞周期進行ポリペプチドのアゴニストが提供され、この方法は、組織をアゴニストと接触させるステップを含む。
【００３７】
本発明の第１８の態様によれば、哺乳動物の組織における細胞増殖を特徴とする疾患又は疾病を治療するためのキットが提供され、このキットは、（ａ）図１〜１８０における奇数の配列番号のうちいずれかの核酸配列によってコードされるポリペプチド、（ｂ）図１〜１８０における奇数の配列番号のうちいずれかのヌクレオチド配列を有する核酸、又は（ｃ）（ａ）のポリペプチドのエピトープを認識する抗体を含む。
【００３８】
本発明の第１９の態様によれば、図１〜１８０における奇数の配列番号のうちいずれかの核酸配列を有する細胞周期進行遺伝子を少なくとも２つ含むアレイが提供される。
【００３９】
好ましくは、核酸配列はＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列である。
【００４０】
本発明の第２０の態様によれば、図１〜１８０における偶数の配列番号のうちいずれかのポリペプチド配列を有する細胞周期進行タンパク質を少なくとも２つ含むアレイが提供される。
【００４１】
「細胞周期進行」とは、細胞周期におけるステップ又は段階のうちいずれか、例えば、核膜の形成、細胞周期の静止期（Ｇ０）からの脱出、Ｇ１進行、染色体の脱濃縮、核膜の分解、ＳＴＡＲＴ、ＤＮＡ複製の開始、ＤＮＡ複製の進行、ＤＮＡ複製の終了、中心体の複製、Ｇ２進行、有糸分裂又は減数分裂の機能の活性化、染色体の濃縮、中心体分離、微小管の核形成、紡錘体の形成及び機能、微小管モータータンパク質との相互作用、染色分体の分離及び解離、有糸分裂の機能の不活性化、収縮環の形成、並びに細胞質分裂の機能を意味する。本明細書において開示されるポリヌクレオチド及びポリペプチドの機能には、染色質との結合、複製複合体の形成、複製許可、リン酸化又は他の二次的修飾活性、タンパク質溶解性分解、微小管との結合、アクチンとの結合、セプチンとの結合、微小管重合中心核形成活性、及び細胞周期シグナル伝達経路の構成成分との結合などの機能もある。本明細書において開示されるポリヌクレオチド及びポリペプチドの「機能活性」が増大し又は低下することは、これらの機能のうち１つが変化する結果、細胞周期進行が促進される又は遅延することを意味する。細胞周期進行の変化は、多数の標準的なアッセイのうちいずれか、例えば有糸分裂指数によって測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
本文書は、細胞周期進行に関与するヒト遺伝子について記載するものである。このような遺伝子は、候補物質が細胞周期進行の抑制因子であるかどうかを確認する、本明細書に記載のアッセイに使用することができる。同じアッセイを使用して、物質が細胞周期進行の促進因子であるかどうかを確認することができる。
【００４３】
このようなアッセイには、本明細書に記載のポリペプチドと物質の結合の程度を決定する結合アッセイがある。このようなアッセイには、物質が、本明細書に記載のポリペプチドと、そのポリペプチドと結合することが知られている他の物質との結合を阻害するかどうかを確認するものもある。
【００４４】
そのアッセイには、本明細書に記載のポリペプチドと結合することが知られている物質を試料に添加し、結合が生じたかどうかを確認することにより、試料中でのそのポリペプチドの有無を決定するアッセイもある。或いは、配列がそのポリペプチドをコードする核酸に基づく核酸プローブを使用して、試料中でのそのポリペプチドをコードする核酸の有無を決定することもできる。その核酸が試料中に存在する場合、そのプローブを試料に添加し、ハイブリダイズする条件下でインキュベートして、その核酸との結合を生じさせることができる。このようなプローブを標識して、結合が生じたかどうかをより容易に決定することができる。或いは、核酸プローブの代わりに、核酸又はポリペプチドに特異的な抗体を使用することもできる。
【００４５】
本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸に変異が生じているかどうかを知りたい状況では、その核酸を含む試料を得、変異が生じていると考えられる領域に特異的な核酸プローブを使用することができる。変異のない同じ核酸を含む試料と比べて結合が認められないことは、核酸がその位置に変異を含むことを示唆する。核酸のどこに変異が生じているか分からない場合、その核酸の全長を包含する一連の連続したプローブを使用することができる。
【００４６】
これらのアッセイを使用して、組織、例えば腫瘍、又は過剰増殖している細胞を有すると疑われる組織で、本明細書に記載のポリペプチドが過剰発現しているかどうかを確認することもできる。既知のリガンドがそのポリペプチドと結合する組織に由来する試料に、かなりの量のそのリガンドを添加することができる。試料中で結合リガンドポリペプチド複合体の量が通常認められるものより多い場合、そのポリペプチドは過剰発現している。「通常」とは、同じ生物の他の組織又は他の生物の同じ組織の試料で認められる、或いは予め決定した基底発現量と比較したポリペプチドの量を意味し得る。
【００４７】
上記に記載のアッセイのうちいずれかを、本明細書に記載の核酸又はポリペプチドの有無を、或いは本明細書に記載のポリペプチドの発現レベルを決定するためのキットに組み込むことができる。
【００４８】
本発明の実施は、特に示さない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の従来技術を使用し、これらは当業者の能力の範囲内である。このような技術は、文献中に説明されている。例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)；B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons；J. M. Polak and James O’D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press；M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press；及びD. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Pressを参照されたい。これらの一般的な各書籍を、参照により本明細書に組み込む。
【００４９】
「細胞周期進行を調節する」とは、所与の細胞を処理するときの細胞周期が進行する通常の傾向が、それ以外環境的条件が同じである無処理細胞と比べて、促進又は遅延のどちらかに変化することを意味する。
【００５０】
ＦＡＣＳ分析、顕微鏡又は細胞周期タンパク質の状態に基づくアッセイによって、有糸分裂を測定することができる。標準的なアッセイには、それだけに限らないが、細胞周期停止、細胞周期分析、様々な細胞型の細胞増殖、例えばアポトーシス細胞の形態観察又はアネキシンＶ−ＦＩＴＣアッセイによるアポトーシスの検出、及び様々な動物モデルでの癌細胞増殖又は腫瘍増殖の抑制を評価する、分子生物学分野で使用されるそのプロトコルが含まれる。このようなアッセイは、当業者に周知である。アッセイの例について本明細書に記載する。
【００５１】
本明細書に記載の方法及び組成物において、タンパク質の「機能活性」とは、そのタンパク質がその本来の環境において果たす機能について述べている。タンパク質の機能活性を変化させることには、その範囲内で、そのタンパク質自体の本来の活性を増大させる、低下させる又はその他の形で変化させることが含まれる。さらに、それには、その範囲内で、そのタンパク質をコードする核酸の発現レベルを増大させる若しくは低下させること、及び／又は細胞内分布を変化させること、並びに／或いはそのタンパク質自体の細胞内分布を変化させることも含まれる。
【００５２】
「発現」という用語は、遺伝子のＤＮＡ鋳型を転写して対応するｍＲＮＡを産生し、このｍＲＮＡを翻訳して対応する遺伝子産物（すなわちペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質）を産生することを指す。
【００５３】
「ポリヌクレオチド」又は「ポリペプチド」とは、本明細書で開示されるＤＮＡ又はタンパク質の配列を意味する。この用語には、その配列に類似した変異体も含まれ、その変異体は、その基準配列と同様の生物活性を有する。このような変異配列には、「対立遺伝子」（同じ種又は密接に関係する種において同じ遺伝子座に見られる変異配列）、「相同遺伝子」（共通の祖先ＤＮＡ配列に由来する系統による第２の遺伝子に関係し、種分化によって（「オルソロガス遺伝子」）又は遺伝子重複（「パラロガス遺伝子」）によって分離した遺伝子）が、このような変異体が本明細書で開示される（複数の）基準配列と同様の生物活性を保持している限り含まれる。
【００５４】
それには、本明細書で開示されるポリヌクレオチド及びポリペプチドにおける無顕性多型及び保存的置換も、このような変異体が本明細書で開示される（複数の）基準配列と同様の生物活性を保持している限り含まれるものとする。
【００５５】
ポリペプチド
本明細書において同定されたポリペプチドが、表１に示すポリペプチド、又は表１に示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を有するそのポリペプチド、又はそのフラグメントに限らず、任意の供給源から、例えば関連ウイルス／細菌タンパク質、細胞相同ペプチド及び合成ペプチドから得られた相同な配列、並びにその変異体又は誘導体をも含むことが理解されるであろう。
【００５６】
したがって、本明細書において「ポリペプチド」が指すものには、哺乳動物（例えば、マウス、ラット又はウサギ）、特に霊長類などの動物を含めた他の種由来の相同体をコードする配列も含まれる。特に好ましいポリペプチドには、相同なヒト配列がある。
【００５７】
この用語はまた、表１に示す核酸によってコードされるアミノ酸配列の変異体、相同体又は誘導体、並びにそのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の変異体、相同体又は誘導体をも包含する。
【００５８】
本文書において、相同な配列は、本明細書で開示されるポリペプチド配列のうちいずれか１つと、少なくとも５０又は１００、好ましくは２００、３００、４００又は５００アミノ酸にわたるアミノ酸レベルで少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％同一である、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むとみなされる。特に、相同性は通常、タンパク質機能に必須でない隣接配列ではなく必須であると知られている配列のその領域に関して考慮するべきである。このことは、関連性が低い生物由来の相同な配列を考慮するときに特に重要である。
【００５９】
機能上の類似性（すなわちアミノ酸残基の化学的特性／機能が類似していること）の点から相同性を考慮することもできるが、本文書においては、配列同一性の点から相同性を表すことが好ましい。
【００６０】
肉眼で、又はより一般には、容易に入手可能な配列比較プログラムの援助によって相同性比較を行うことができる。これらの公的に及び商業的に利用可能なコンピュータプログラムにより、２つ以上の配列間の％相同性を算出することができる。
【００６１】
連続した配列について％相同性を算出することができ、すなわち、ある配列を他の配列と位置合わせし、ある配列内の各アミノ酸を他の配列内の対応するアミノ酸と、１回に１残基ずつ直接比較する。これは、「ギャップなし」アラインメントと呼ばれる。通常、そのようなギャップなしアラインメントは、比較的少数の残基の配列（例えば５０より少ない連続したアミノ酸）にしか実施できない。
【００６２】
これは、非常に単純なかつ矛盾のない方法であるが、例えば、その他の部分では同一な一対の配列において、１つの挿入又は欠失からその後のアミノ酸残基のアラインメントが乱れ、それによって、全体的なアラインメントを行ったときに％相同性が潜在的に大きく低下することを考慮に入れることができない。したがって、ほとんどの配列比較法は、全体的な相同性スコアに過度にペナルティーを課すことなく、考えられる挿入及び欠失を考慮した適切なアラインメントを作成するように設計されている。これは、配列アラインメント中に「ギャップ」を挿入して、局所相同性の最大化を試みることによって実現される。
【００６３】
しかし、これらのより複雑な方法では、同数の同一アミノ酸についての、比較する２配列間でのより高い関連性を反映する、可能な限り少数のギャップを有する配列アラインメントのスコアが多数のギャップを有するものより高くなるように、アラインメント中に生じる各ギャップに「ギャップペナルティー」を課す。ギャップの存在に対する比較的高いコスト、及びギャップ内の次の各残基に対するより低いペナルティーに課す「アフィンギャップコスト」が通常使用される。これは、最も一般に使用されるギャップスコア化システムである。もちろん、ギャップペナルティーが高いと、より少数のギャップを有する最適化されたアラインメントが作成される。ほとんどのアラインメントプログラムでは、ギャップペナルティーを変更することが可能である。しかし、配列比較にそのようなソフトウェアを使用する時には、初期設定値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧウィスコンシンベストフィットパッケージ（GCG Wisconsin Bestfit package）（下記を参照）を使用するとき、アミノ酸配列の初期設定ギャップペナルティーは、１つのギャップに対して−１２、各伸長に対して−４である。
【００６４】
したがって、最大％相同性の算出には、第１に、ギャップペナルティーを考慮した最適なアラインメントの作成が必要となる。そのようなアラインメントを実行するのに適したコンピュータプログラムは、ＧＣＧウィスコンシンベストフィットパッケージ（米国ウィスコンシン大学；Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387）。配列比較を行うことができる別のソフトウェアの例には、それだけに限らないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ausubel et al., 1999 ibid - Chapter 18を参照）、ＦＡＳＴＡ（Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410）及びＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツールセットがある。ＢＬＡＳＴもＦＡＳＴＡも、オフライン及びオンラインでの検索に使用可能である（Ausubel et al., 1999 ibid, pages 7-58 to 7-60を参照）。しかし、ＧＣＧベストフィットプログラムを使用することが好ましい。
【００６５】
同一性の点から最終的な％相同性を測定することができるが、アラインメントプロセス自体は通常全か無かの対比較に基づくものではない。その代わりに、化学的類似性又は進化上の距離に基づいて各対比較にスコアを割り当てる、一定比率の類似性スコア行列が一般に使用される。通常使用されるそのような行列の例は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列というＢＬＡＳＴプログラムセットの初期設定行列である。ＧＣＧウィスコンシンプログラムは一般に、公的な初期設定値、又は供給される場合はカスタム型記号比較表を使用する（さらなる詳細については使用者用説明書を参照）。ＧＣＧパッケージでは公的な初期設定値を、又は他のソフトウェアの場合はＢＬＯＳＵＭ６２などの初期設定行列を使用することが好ましい。
【００６６】
ソフトウェアで最適なアラインメントを作成した後、％相同性、好ましくは％配列同一性を算出することができる。ソフトウェアは通常、配列比較の一部としてこれを行い、数値による結果を出す。
【００６７】
アミノ酸配列に関して「変異体」又は「誘導体」という用語には、得られたアミノ酸配列が非改変配列と同じ活性を実質的に保持する、好ましくは表１に示すポリペプチド、又は表１に示す核酸配列によってコードされるポリペプチドと少なくとも同じ活性を有するという条件で、配列に１つ（又は複数）のアミノ酸の任意の置換、変更、改変、代替、欠失又は付加を起こしたものも含まれる。
【００６８】
表１に示す核酸によってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド或いはそのフラグメント又は相同体を、本明細書における使用のために改変することができる。通常、配列の生物活性を維持する改変を行う。改変配列が非改変配列の生物活性を保持する条件で、アミノ酸の置換を、例えば１、２又は３〜１０、２０又は３０の置換を行うことができる。或いは、改変を行って、本明細書に記載のポリペプチドの１つ又は複数の機能ドメインを故意に不活性化することもできる。アミノ酸の置換には、例えば治療上投与されるポリペプチドの血漿半減期を長くするために、天然に存在しないアナログの使用が含まれ得る。
【００６９】
例えば以下の表に従って、保存的置換を行うことができる。第２列の同じ区画の、好ましくは第３列の同じ行のアミノ酸は、互いに置換ることができる。
【００７０】
(表)
2006515754.tif 000002
【００７１】
本明細書に記載の方法及び組成物に使用するポリペプチドには、上記で述べた全長配列のフラグメントも含まれる。好ましくは、前記フラグメントは、エピトープを少なくとも１つ含む。エピトープを同定する方法は、当業者に周知である。フラグメントは通常、少なくとも６アミノ酸、より好ましくは１０、２０、３０、５０又は１００アミノ酸を含む。
【００７２】
タンパク質は通常、組換えによる手段によって、例えば下記に記載のように作成される。しかしこれは、固相合成など当業者に周知の技術を使用する、合成による手段によって作成することもできる。タンパク質は、例えば抽出及び精製を促進するために、融合タンパク質として作成することもできる。融合タンパク質の相手の例には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×Ｈｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合及び／又は転写活性化ドメイン）及びβ−ガラクトシダーゼがある。融合したタンパク質の配列の除去が可能となるように、融合タンパク質の相手と対象とするタンパク質の配列の間にタンパク質分解性切断部位を含むことも都合がよい可能性がある。融合タンパク質は、対象とするタンパク質の配列の機能を阻害しないことが好ましい。タンパク質は、動物細胞由来の細胞抽出物の精製によって得ることもできる。
【００７３】
細胞周期進行タンパク質を含む多量体タンパク質をも包含するものとする。「多量体」とは、サブユニットタンパク質の複数コピーを含むタンパク質を意味する。サブユニットタンパク質は、本明細書に記載のタンパク質の１つ、例えば、本明細書において複数回反復して開示された細胞周期進行タンパク質でよい。このような多量体は融合タンパク質又はキメラタンパク質でもよく、例えば反復した細胞周期進行タンパク質をポリリンカー配列及び／又は１つ又は複数の細胞周期進行ペプチドと結合することができ、これは単一コピー中に存在してもよく、一列に反復してもよく、例えばタンパク質は全体のタンパク質内に複数の多量体を含んでもよい。
【００７４】
タンパク質は、実質的に単離された形のものでよい。タンパク質の意図された目的を妨げない担体又は希釈剤とタンパク質を混合し、それを依然として実質的に単離されたものとみなしてもよいことが理解されるであろう。そのようなタンパク質はまた、実質的に精製された形のものでもよく、その場合それは一般にそのタンパク質を製剤中に含み、その製剤中の９０％を超えるタンパク質、例えば９５％、９８％又は９９％が本明細書において同定されたタンパク質である。
【００７５】
ポリペプチドは、判定用標識で標識することができる。判定用標識は、そのポリペプチドを検出することを可能にするどんな適切な標識でもよい。適切な標識には、放射性同位体、例えば１２５Ｉ、酵素、抗体、ポリヌクレオチド、及びビオチンなどのリンカーがある。イムノアッセイなどの診断の手順に標識ポリヌクレオチドを使用して、試料中の関連ポリペプチドの量を決定することができる。血清学的な又は細胞が媒介する免疫アッセイにポリペプチド又は標識ポリペプチドを使用して、標準的なプロトコルを用いて動物又はヒトにおいて前記ポリペプチドに対する免疫応答性を検出することもできる。
【００７６】
ポリペプチド又は標識ポリペプチド或いはそのフラグメントを、固相に、例えばマイクロアレイ、イムノアッセイのプレート穴又は計量棒の表面に固定することもできる。そのような標識及び／又は固定化ポリペプチドを、適切な試薬、対照、説明書などと一緒に、適切な容器中のキットに包装することができる。イムノアッセイによりポリペプチド或いはその対立遺伝子又は種の変異体に対する抗体を検出する方法に、そのようなポリペプチド及びキットを使用することができる。
【００７７】
イムノアッセイの方法は、当技術分野で周知であり、一般に、（ａ）前記タンパク質に対する抗体が結合可能なエピトープを含むポリペプチドを提供するステップと、（ｂ）抗体−抗原複合体の形成が可能な条件下で生物試料を前記ポリペプチドとともにインキュベートするステップと、（ｃ）前記ポリペプチドを含む抗体−抗原複合体が形成されたかどうかを確認するステップとを含む。
【００７８】
例えばタンパク質発現又は機能が調節されているかどうかを検出する際に、ポリペプチドを検出するために、イムノアッセイを使用することができる。
【００７９】
本明細書において同定されたポリペプチドをin vitro又はin vivoの細胞培養系に使用して、疾患における機能を含めて、細胞機能におけるその対応する遺伝子及びその相同体の役割を研究することができる。例えば、切断型又は改変型ポリペプチドを細胞内に導入して、細胞内で働く正常機能を阻害することができる。組換え発現ベクター（下記を参照）からこのポリペプチドをin situで発現させることにより、このポリペプチドを細胞内に導入することができる。場合によっては、この発現ベクターはこのポリペプチドの発現を制御する誘導性プロモーターを運搬する。
【００８０】
昆虫細胞や哺乳動物細胞などの適当な宿主細胞を使用すると、組換え発現産物に対して最適な生物活性を与えるのに必要となる可能性がある翻訳後修飾（例えば、ミリストイル化、糖鎖付加、切断、脂質付加、及びチロシン、セリン又はスレオニンのリン酸化）が行われることが予想される。本明細書に記載のポリペプチドが発現するこのような細胞培養系を、細胞内でそのポリペプチドの機能を阻害又は促進する候補物質を同定するアッセイ系に使用することができる。
【００８１】
きわめて好ましい実施形態では、細胞周期進行ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８、３９０、３９２、３９４、３９６、３９８、４００、４０２、４０４、４０６及び４０８（「図１〜１８０における偶数の配列番号」）からなる群から選択される。
【００８２】
ポリヌクレオチド
実施例において開示される遺伝子をノックダウンすると、細胞周期欠損が生じ、したがってその遺伝子及びそれによってコードされるタンパク質が細胞周期機能に重要な役割を果たしていることを、本明細書において実証する。
【００８３】
本明細書に記載のポリヌクレオチド又は核酸には、表１に示すポリヌクレオチド、或いは表１に示す核酸によってコードされるポリペプチドをコードする任意の１つ又は複数の核酸配列、及びそのフラグメントがある。フラグメントは通常、完全長ポリヌクレオチドの少なくとも連続した１５ヌクレオチド、より好ましくは完全長ポリヌクレオチドの少なくとも連続した２０、３０、５０又は１００ヌクレオチドを含む。遺伝コードを参照することにより、このようなポリペプチドをコードする核酸配列を同定することは容易である。さらに、核酸配列をポリペプチド配列に翻訳し、かつ／又はその逆を行うコンピュータプログラムが使用可能である。核酸及びその対応するポリペプチド配列の開示には、そのポリペプチド配列をコードする核酸（及びその配列）すべての開示が含まれる。
【００８４】
遺伝コードの縮重の結果、多数の様々なポリヌクレオチドが同じポリペプチドをコードする可能性があることが、当業者に理解されるだろう。さらに、当業者が、通常の技術を用いて、ポリペプチドを発現させるどんな特定の宿主生物のコドンの使用をも反映させるために、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド代替を行うことができることが理解されるはずである。
【００８５】
好ましい実施形態では、核酸はｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡなどのポリヌクレオチドを含む。そのようなポリヌクレオチドは通常、ショウジョウバエｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びゲノムＤＮＡ、ヒトｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びゲノムＤＮＡなどを含み得る。実施例中で核酸配列のアクセッション番号を提供し、それらがコードするポリペプチドは、ヒトゲノム配列データベース（Human Genome Sequence database）、ＧａｄＦｌｙ、ＦｌｙＢａｓｅなどを含めた、ショウジョウバエ配列データベース、ヒト配列データベースなどの関連するデータベースにおけるそのようなアクセッション番号の使用に由来し得る。特に、バークレーショウジョウバエゲノム計画（Berkeley Drosophila Genome Project）の注釈付きショウジョウバエ配列データベース（ＧａｄＦｌｙ：ワールドワイドウェブサイト「fruitfly.org」、ディレクトリ「/annot/」内にあるショウジョウバエのゲノム注釈データベース（Genome Annotation Database of Drosophila ））を使用して、ショウジョウバエ及びヒトのそのようなポリヌクレオチド又はポリペプチド配列を同定することができる。ポリペプチド配列を用いてＢＬＡＳＴなどの配列データベースを検索することにより、関連する配列を得ることもできる。特に、ＴＢＬＡＳＴＮを用いた検索を使用することができる。
【００８６】
本明細書に記載の方法及び組成物に使用する核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含み得る。それは、一本鎖でもよく、二本鎖でもよい。それはまた、その中に合成又は改変ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドでもよい。オリゴヌクレオチドに対する多数の様々な種類の改変は、当技術分野で周知である。これには、メチルスルホン酸及びホスホロチオエート骨格、分子の３’及び／又は５’末端へのアクリジン又はポリリシン鎖付加がある。本文書の目的で、当技術分野で使用可能であるどんな方法によっても、本明細書に記載のポリヌクレオチドを改変することができることが理解されるはずである。ポリヌクレオチドのin vivoでの活性を高め又は生存期間を延長するために、このような改変を実施することができる。
【００８７】
本明細書に記載の方法及び組成物に使用するヌクレオチド配列に関して、「変異体」、「相同体」又は「誘導体」という用語には、配列に１つ（又は複数）の核酸の任意の置換、変更、改変、代替、欠失又は付加を起こしたものも含まれる。好ましくは、前記変異体、相同体又は誘導体は生物活性を有するポリペプチドをコードする。
【００８８】
上記に示したように、配列相同性に関して、本明細書における配列リストに示す配列と、好ましくは少なくとも５０又は７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性が存在する。より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の相同性が存在する。上記に記載のように、ヌクレオチド相同性比較を行うことができる。好ましい配列比較プログラムは、上記に記載のＧＣＧウィスコンシンベストフィットプログラムである。初期設定スコア化行列では、同一の各ヌクレオチドに対して整合値１０であり、各不整合に対して−９である。初期設定ギャップ作成ペナルティーは−５０であり、初期設定ギャップ伸長ペナルティーは各ヌクレオチドに対して−３である。
【００８９】
本明細書に提示する配列、或いはその任意の変異体、フラグメント又は誘導体と、或いは上記のいずれかの相補体と選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列の使用についても記載する。ヌクレオチド配列は、好ましくは少なくとも長さ１５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも長さ２０、３０、４０又は５０ヌクレオチドを含む。
【００９０】
本明細書において、「ハイブリダイゼーション」という用語には、「核酸の鎖が塩基対形成によって相補的な鎖と結合するプロセス」、並びにポリメラーゼ連鎖反応技術において実施される増幅のプロセスが含まれる。
【００９１】
本明細書に提示するヌクレオチド配列と、又はその相補体と選択的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは一般に、少なくとも２０、好ましくは少なくとも２５又は３０、例えば少なくとも４０、６０又は１００以上の連続したヌクレオチドの領域にわたり、本明細書に提示する対応するヌクレオチド配列との相同性が少なくとも７０％、好ましくは８０又は９０％、より好ましくは少なくとも９５％又は９８％である。
【００９２】
「選択的にハイブリダイズ可能である」という用語は、核酸が、表１に示す配列を有する核酸とバックグラウンドよりかなり上のレベルでハイブリダイズすることが認められることを意味する。バックグラウンドとは、試料中での試験核酸と非特異的なＤＮＡ構成要素との相互作用によって生じたシグナルのレベルを意味し、これは標的ＤＮＡで観察される特異的な相互作用の強さの１／１０、好ましくは１／１００である。例えば、プローブを例えば３２Ｐで放射標識することにより、相互作用の強さを測定することができる。
【００９３】
ハイブリダイゼーション条件は、Berger及び Kimmel（1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA）に教示される、核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づいており、下記で説明する、定義された「ストリンジェンシー」を与える。ストリンジェンシーの条件はまた、米国特許第５９７６８３８号にも記載され、その教示について、その全体を参照により本明細書に組み込む。特に、きわめてストリンジェントな条件、ストリンジェントな条件、ストリンジェンシーを低下させた条件、及びストリンジェンシーが最低の条件の例が、米国特許第５９７６８３８号の１５ページの表に示されている。ハイブリダイゼーション中及びその後の溶液のストリンジェンシーの条件の例が示され、きわめてストリンジェントな条件は、少なくとも例えばその表の条件Ａ〜Ｆのストリンジェンシーであり、ストリンジェントな条件は、少なくとも例えばその表の条件Ｇ〜Ｌのストリンジェンシーであり、ストリンジェンシーを低下させた条件は、少なくとも例えばその表の条件Ｍ〜Ｒのストリンジェンシーである。
【００９４】
最大のストリンジェンシーは通常、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い）で生じ、高いストリンジェンシーはＴｍより約５℃〜１０℃低い温度で生じ、中程度のストリンジェンシーはＴｍより約１０℃〜２０℃低い温度で生じ、低いストリンジェンシーはＴｍより約２０℃〜２５℃低い温度で生じる。当業者なら理解されるであろうが、最大のストリンジェンシーによるハイブリダイゼーションを用いて同一のポリヌクレオチド配列を同定又は検出することができるが、中程度の（又は低い）ストリンジェンシーによるハイブリダイゼーションを用いて、類似した又は関連するポリヌクレオチド配列を同定又は検出することができる。
【００９５】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの条件とは、第１の核酸配列の第２の核酸配列とのハイブリダイゼーションを可能にする温度及び緩衝液の組成の条件を指し、この条件は互いにハイブリダイズする配列間の同一性の程度を決定する。したがって、「高ストリンジェンシー条件」とは、互いに非常に類似した核酸配列だけがハイブリダイズする条件である。中ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする場合、その配列は互いに類似性が低い可能性がある。低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズさせるには、２つの配列にさらに低い類似性が必要となる。ハイブリダイゼーションの条件を、ハイブリダイゼーションが起こらないストリンジェンシーのレベルから、ハイブリダイゼーションが最初に観察されるレベルまで変化させることにより、所与の配列がそれと最も類似する配列とハイブリダイズする条件を決定することができる。特定のハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する正確な条件には、イオン強度、温度、ホルムアミドなどの不安定化剤の濃度だけではなく、核酸配列の長さ、その塩基の組成、２配列間の不整合塩基対の百分率、及び他の同一でない配列内での配列のサブセット（例えば短い反復配列）の発生の頻度などの要因もある。洗浄とは、その際に、互いにハイブリダイズしている配列間の最小レベルの類似性を決定するために条件を設定するステップである。一般に、相同なハイブリダイゼーションしか生じない最も低い温度から、２配列間の１％の不整合により、選択したＳＳＣのどんな濃度でも融解温度（Ｔｍ）が１℃低下する。一般に、ＳＳＣの濃度を倍にすると、Ｔｍが約１７℃上昇する。この指針を用いて、見出された不整合のレベルに応じて洗浄の温度を経験的に決定することができる。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、Current Protocols in Molecular Biology （Ausubel, F.M. et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., 1995、最新の補巻付き）のページ２．１０．１〜２．１０．１６、及び６．３．１〜６．３．６に説明されている。
【００９６】
高ストリンジェンシー条件は、（１）１×ＳＳＣ（１０×ＳＳＣ＝３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  クエン酸Ｎａ３−２Ｈ２Ｏ（８８ｇ／ｌ）、１Ｍ  ＨＣｌでｐＨを７．０に調整）、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、６５℃、（２）１×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、４２℃、（３）１％ウシ血清アルブミン（区画Ｖ）、１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）（１Ｍ  ＮａＨＰＯ４＝１ｌ当たりＮａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ  １３４ｇ、８５％Ｈ３ＰＯ４  ４ｍｌ）、７％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、６５℃、（４）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．０２Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１×デンハルト溶液（Denhardt’s solution）（１００×＝フィコール４００（Ficoll 400）１０ｇ、ポリビニルピロリドン１０ｇ、ウシ血清アルブミン（区画Ｖ）１０ｇ、水で５００ｍｌに調整）、１０％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、４２℃、（５）５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、６５℃、又は（６）５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、４２℃でのハイブリダイゼーションを、（１）０．３〜０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、又は（２）１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、４０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、１％ＳＤＳ、６５℃の高いストリンジェンシーの洗浄とともに使用することができる。上記の条件は、５０塩基対以上のＤＮＡとＤＮＡのハイブリッドに使用するものとする。ハイブリッドが長さ１８塩基対未満と考えられる場合、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を、ハイブリッドの計算されたＴｍより５〜１０℃低い温度にすべきであり、ここでＴｍ（℃）＝（２×塩基Ａ及びＴの数）＋（４×塩基Ｇ及びＣの数）である。長さが約１８〜約４９塩基対と考えられるハイブリッドでは、Ｔｍ（℃）＝（８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６1(％ホルムアミド)−５００／Ｌ）であり、ここで「Ｍ」は一価の陽イオン（例えば、Ｎａ＋）のモル濃度であり、「Ｌ」はハイブリッドの塩基対の長さである。
【００９７】
中ストリンジェンシー条件は、（１）４×ＳＳＣ（１０×ＳＳＣ＝３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  クエン酸Ｎａ３−２Ｈ２Ｏ（８８ｇ／ｌ）、１Ｍ  ＨＣｌでｐＨを７．０に調整）、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、６５℃、（２）４×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、４２℃、（３）１％ウシ血清アルブミン（区画Ｖ）、１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）（１Ｍ  ＮａＨＰＯ４＝１ｌ当たりＮａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ  １３４ｇ、８５％Ｈ３ＰＯ４  ４ｍｌ）、７％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、６５℃、（４）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．０２Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１×デンハルト溶液（１００×＝フィコール４００  １０ｇ、ポリビニルピロリドン１０ｇ、ウシ血清アルブミン（区画Ｖ）１０ｇ、水で５００ｍｌに調整）、１０％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、４２℃、（５）５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、６５℃、又は（６）５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、４２℃でのハイブリダイゼーションを、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃の中程度のストリンジェンシーの洗浄とともに使用することができる。上記の条件は、５０塩基対以上のＤＮＡとＤＮＡのハイブリッドに使用するものとする。ハイブリッドが長さ１８塩基対未満と考えられる場合、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を、ハイブリッドの計算されたＴｍより５〜１０℃低い温度にすべきであり、ここでＴｍ（℃）＝（２×塩基Ａ及びＴの数）＋（４×塩基Ｇ及びＣの数）である。長さが約１８〜約４９塩基対と考えられるハイブリッドでは、Ｔｍ（℃）＝（８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（％ホルムアミド）−５００／Ｌ）であり、ここで「Ｍ」は一価の陽イオン（例えば、Ｎａ＋）のモル濃度であり、「Ｌ」はハイブリッドの塩基対の長さである。
【００９８】
低ストリンジェンシー条件は、（１）４×ＳＳＣ（１０×ＳＳＣ＝３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  クエン酸Ｎａ３−２Ｈ２Ｏ（８８ｇ／ｌ）、１Ｍ  ＨＣｌでｐＨを７．０に調整）、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、５０℃、（２）６×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、４０℃、（３）１％ウシ血清アルブミン（区画Ｖ）、１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）（１Ｍ  ＮａＨＰＯ４＝１ｌ当たりＮａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ  １３４ｇ、８５％Ｈ３ＰＯ４  ４ｍｌ）、７％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、５０℃、（４）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．０２Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１×デンハルト溶液（１００×＝フィコール４００  １０ｇ、ポリビニルピロリドン１０ｇ、ウシ血清アルブミン（区画Ｖ）１０ｇ、水で５００ｍｌに調整）、１０％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、４０℃、（５）５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、５０℃、又は（６）５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、４０℃でのハイブリダイゼーションを、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃、又は（２）０．５％ウシ血清アルブミン（区画Ｖ）、１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、４０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％ＳＤＳの低いストリンジェンシーの洗浄とともに使用することができる。上記の条件は、５０塩基対以上のＤＮＡとＤＮＡのハイブリッドに使用するものとする。ハイブリッドが長さ１８塩基対未満と考えられる場合、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を、ハイブリッドの計算されたＴｍより５〜１０℃低い温度にすべきであり、ここでＴｍ（℃）＝（２×塩基Ａ及びＴの数）＋（４×塩基Ｇ及びＣの数）である。長さが約１８〜約４９塩基対と考えられるハイブリッドでは、Ｔｍ（℃）＝（８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６1(％ホルムアミド)−５００／Ｌ）であり、ここで「Ｍ」は一価の陽イオン（例えば、Ｎａ＋）のモル濃度であり、「Ｌ」はハイブリッドの塩基対の長さである。
【００９９】
好ましい態様では、ストリンジェントな条件（例えば、６５℃、０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０））下で、本明細書に記載のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列の使用を開示する。
【０１００】
ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、二本鎖のどちらの鎖についても、個々での又は組み合わせての使用が本文書に包含される。ポリヌクレオチドが一本鎖である場合、そのポリヌクレオチドと相補配列の使用も本文書の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【０１０１】
表１の配列との相同性が１００％でないが、本明細書に記載の方法及び組成物に使用することができるポリヌクレオチドを、多数の方法で得ることができる。本明細書に記載の配列の他の変異体を、例えば、個体の、例えば様々な集団由来の個体の範囲から作られたＤＮＡライブラリーにプロービングを行うことによって得ることができる。さらに、他のウイルス性／細菌性、又は細胞性相同体、特に哺乳動物細胞（例えば、ラット、マウス、ウシ及び霊長類細胞）で認められる細胞性相同体を得ることができ、そのような相同体及びそのフラグメントは一般に、表１に示す配列と選択的にハイブリダイズすることができる。他の動物種から作られたｃＤＮＡライブラリー又はゲノムＤＮＡライブラリーにプロービングを行い、ストリンジェンシーが中程度〜高度の条件下で、その配列のうちいずれか１つの全部又は一部を含むプローブでそのようなライブラリーにプロービングを行うことによって、そのような配列を得ることができる。表１の列３に示すヒト相同体をコードするヌクレオチド配列を使用して、他の霊長類／哺乳動物相同体又は対立遺伝子変異体を同定できることが好ましい。
【０１０２】
表１の配列の変異体及び相同体内の配列を標的とするように設計されたプライマーを使用する縮重ＰＣＲを用いて、変異体及び系統／種の相同体を得ることもできる。例えば、いくつかの変異体／相同体のアミノ酸配列を位置合わせすることにより、保存された配列を予測することができる。当技術分野で知られているコンピュータソフトウェアを用いて、配列アラインメントを行うことができる。例えば、ＧＣＧウィスコンシンパイルアッププログラム（GCG Wisconsin PileUp program）が広く使用されている。
【０１０３】
縮重ＰＣＲに使用するプライマーは、１つ又は複数の縮重のある位置を含み、既知の配列に対する一本鎖配列プライマーを用いて配列をクローニングするのに使用するものより低ストリンジェンシー条件で使用される。関連性が低い生物由来の配列間の全体のヌクレオチド相同性が非常に低い可能性が高く、したがってこの状況では標識フラグメントでライブラリーをスクリーニングするのではなく縮重ＰＣＲが選択される方法となる可能性があることが当業者に理解されるであろう。
【０１０４】
さらに、ＢＬＡＳＴプログラムセットなどの検索アルゴリズムを用いてヌクレオチド及び／又はタンパク質データベースを検索することにより、相同な配列を同定することができる。この手法を、下記及び実施例に記載する。
【０１０５】
或いは、特徴的な配列の部位特異的変異生成によって、このようなポリペプチドを得ることができる。これは、例えばポリヌクレオチド配列が発現している特定の宿主細胞についてのコドン選択を最適化するために、配列に無顕性コドン変化が必要となる場合に有用である可能性がある。制限酵素認識部位を導入するために、或いはポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの性質又は機能を変化させるために、他の配列変化が所望される可能性がある。例えば、その調節機能を欠失させる変異遺伝子が生じている核酸配列中で認められる特定のコード変化を表すのに、さらなる変化が望ましい可能性がある。このような変化に基づくプローブを診断用プローブとして使用して、このような変異体を検出することができる。
【０１０６】
ポリヌクレオチドを使用して、プライマー、例えばＰＣＲプライマー、代替の増幅反応用のプライマー、プローブ、例えば放射活性標識又は非放射活性標識を用いた従来の手段により、判定用標識で標識したプローブを作成することもでき、或いはポリヌクレオチドをベクター中にクローン化することもできる。このようなプライマー、プローブ及び他のフラグメントは、長さが少なくとも８、９、１０又は１５ヌクレオチドであり、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドであり、例えば少なくとも２５、３０又は４０ヌクレオチドであり、また本明細書におけるポリヌクレオチドという用語に包含される。
【０１０７】
本明細書に記載の方法及び組成物に使用するＤＮＡポリヌクレオチドやプローブなどのポリヌクレオチドは、組換えにより、合成により、又は当業者が使用可能な任意の手段によって作成することができる。これは、標準的な技術によってクローン化することもできる。細胞周期進行タンパク質をコードする１つ又は複数の単離ポリヌクレオチドを含む組成物、例えば細胞周期進行タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、またこのようなベクターを含む宿主細胞についても記載する。「宿主細胞」とは、ベクターによって移入された核酸の受容体として使用されている又は使用することができる細胞を意味する。宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、或いは昆虫細胞である可能性があり、単一細胞として、或いは集合体として、例えば培養物として、或いは組織培養物中に、組織又は生物中に存在し得る。宿主細胞は、多細胞生物、例えば哺乳動物の正常又は罹患組織に由来する可能性もある。本明細書において、宿主細胞には、核酸で形質転換した元の細胞だけでなく、その核酸を依然として含んでいるそのような細胞の子孫も含まれるものとする。組み込まれないベクター、例えばプラスミドとして外因性ポリヌクレオチドを維持することができ、或いはそれを宿主ゲノム中に組み込むこともできる。ベクターは、制御配列、例えばポリヌクレオチドの発現を可能とする配列を含むこともできる。
【０１０８】
一般に、プライマーは、所望の核酸配列を１回に１ヌクレオチド段階的に製造する合成手段によって作成される。自動化技術を用いてこれを実現するための技術は、当技術分野で容易に使用可能である。
【０１０９】
より長いポリヌクレオチドは一般に、組換えによる手段、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローン化技術を用いて作成される。この手段では、クローン化することが所望される脂質標的配列の領域に隣接する１対のプライマー（例えば約１５〜３０ヌクレオチド）を作成し、動物又はヒト細胞から得られたｍＲＮＡ又はｃＤＮＡにプライマーを接触させ、所望の領域が増幅される条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行い、（例えば、アガロースゲル上の反応混合物を精製することによって）増幅したフラグメントを単離し、増幅したＤＮＡを回収する。プライマーは、増幅したＤＮＡが適切なクローニングベクター中にクローン化できるように、適切な制限酵素認識部位を含むように設計することができる。
【０１１０】
本明細書に記載の方法及び組成物に使用するポリヌクレオチド又はプライマーは、判定用標識を有してもよい。適切な標識には、３２Ｐや３５Ｓなどの放射性同位体、酵素標識、又はビオチンなどのタンパク質標識がある。ポリヌクレオチド又はプライマーにこのような標識を付加することができ、当業者に周知の技術を用いることによって検出することができる。
【０１１１】
当業者なら、本明細書に記載の方法及び組成物に使用するポリヌクレオチド又はプライマー、或いはその標識又は非標識フラグメントを、ヒト又は動物の体内のポリヌクレオチドを検出又は配列決定する、核酸に基づく試験に使用することができる。
【０１１２】
このような検出試験は一般に、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む生物試料を、本明細書に記載のポリヌクレオチド又はプライマーを含むプローブと、ハイブリダイズする条件下で接触させるステップと、プローブと試料中の核酸の間に形成された二本鎖を検出するステップとを含む。ＰＣＲなどの技術を使用して、又はプローブを固体支持体上に固定化し、プローブとハイブリダイズしない試料中の核酸を除去し、次いでプローブとハイブリダイズした核酸を検出することにより、このような検出を実現することができる。或いは、固体支持体上に試料の核酸を固定化することもでき、そのような支持体と結合したプローブの量を検出することができる。この適切なアッセイ法及び他の形態は、例えばＷＯ  ８９／０３８９１号及びＷＯ  ９０／１３６６７号に見つけることができる。
【０１１３】
本明細書に記載の方法及び組成物に使用するヌクレオチドの配列決定試験には、標的ＤＮＡ又はＲＮＡを含む生物試料を、ポリヌクレオチド又はプライマーを含むプローブと、ハイブリダイズする条件下で接触させるステップと、例えばSangerのジデオキシ鎖伸長終結法（dideoxy chain termination method）（Sambrook et al.を参照）によってその配列を決定するステップが含まれる。
【０１１４】
このような方法は一般に、標的ＤＮＡ又はＲＮＡに対する相補鎖の合成により、適切な試薬の存在下でプライマーを伸長させるステップと、１つ又は複数のＡ、Ｃ、Ｇ又はＴ／Ｕ残基で伸長反応を選択的に終結させて、鎖伸長反応及び終結反応が生じることを可能にし、サイズに従って伸長産物を分離して、選択的終結が生じた場所でヌクレオチドの配列を決定するステップとを含む。適切な試薬には、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、デオキシヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、緩衝液並びにＡＴＰがある。ジデオキシヌクレオチドは、選択的終結に使用する。
【０１１５】
表１に示す生物試料中のヌクレオチドを検出し配列決定する試験を使用して、例えば、白血病細胞、並びに胸部、卵巣、肺、大腸、膵、精巣、肝、脳、筋及び骨の腫瘍などの固形腫瘍を含めた癌細胞内に、変化した遺伝子配列を有することが疑われる個体の細胞内に特定の配列があるかどうかを確認することができる。増殖性疾患に罹患している患者の細胞を同様に試験することもできる。
【０１１６】
さらに、実施例に記載する遺伝子の同定により、遺伝性疾患におけるこれらの遺伝子の役割を調べることが可能となる。一般に、これには、例えば腫瘍を有する動物又はヒトにに由来する細胞内での（例えばＰＣＲ配列分析を用いて）遺伝子の状態を明らかにすることが含まれる。
【０１１７】
本明細書に記載の方法及び組成物に使用するプローブを、適切な容器中の試験キットの形に都合よく包装することができる。このようなキットでは、キットが設計されたアッセイ形態がそのような結合を必要とする場合、固体支持体にプローブを結合させてよい。キットはまた、プロービングを行う試料を処理し、試料中の核酸とプローブをハイブリダイズさせるのに適した試薬、対照試薬、説明書などを含んでもよい。
【０１１８】
きわめて好ましい実施形態では、細胞周期進行ポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１３、３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９、３３１、３３３、３３５、３３７、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７５、３７７、３７９、３８１、３８３、３８５、３８７、３８９、３９１、３９３、３９５、３９７、３９９、４０１、４０３、４０５及び４０７（図１〜１８０における奇数の配列番号）からなる群から選択される。
【０１１９】
相同性検索
任意の適切な相同性アルゴリズムを用いて、例えば初期設定パラメータを用いて、配列相同性（又は同一性）を決定することができる。
【０１２０】
パラメータが初期設定値に設定されたＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用すると有利である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、米国政府（「．ｇｏｖ」）の国立衛生研究所（National Institutes of Health）（「ｎｉｈ」）の国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）（「．ｎｃｂｉ」）のワールドワイドウェブサイト（「ｗｗｗ」）にある、「／Ｂｌａｓｔ／」ディレクトリ内の「ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ」ファイル内に詳細に記載されている。検索パラメータは、下記の通りに定義されており、定義された初期設定パラメータに設定すると有利である。
【０１２１】
有利には、ＢＬＡＳＴで評価するときに「十分な相同性」は、ＥＸＰＥＣＴ値が少なくとも約７、好ましくは少なくとも約９、最も好ましくは１０以上で整合する配列と同等とみなす。ＢＬＡＳＴ検索におけるＥＸＰＥＣＴの初期設定閾値は通常１０である。
【０１２２】
ＢＬＡＳＴ（基本局所アラインメント検索ツール）（Basic Local Alignment Search Tool）は、プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、及びｔｂｌａｓｔｘによって使用される発見的検索アルゴリズムであり、これらのプログラムの重要性は、Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6):2264-8の統計的方法（上記に記載の「ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ」ファイルを参照）を用いた知見とその小さな機能強化によるものとされる。ＢＬＡＳＴプログラムは、例えば質問配列に対する相同体を同定する、配列類似性検索に合わせて作成された。このプログラムは一般に、モチーフ型検索に有用でない。配列データベースの類似性検索における基本的な問題についての議論に関しては、Altschul et al. (1994)を参照されたい。
【０１２３】
米国国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトで使用可能な５つのＢＬＡＳＴプログラムは、以下のタスクを行う。
【０１２４】
「ｂｌａｓｔｐ」は、タンパク質の配列データベースに対してアミノ酸質問配列を比較する。
【０１２５】
「ｂｌａｓｔｎ」は、ヌクレオチド配列データベースに対してヌクレオチド質問配列を比較する。
【０１２６】
「ｂｌａｓｔｘ」は、タンパク質の配列データベースに対して、ヌクレオチド質問配列（両方の鎖）の６フレームの概念上の翻訳産物を比較する。
【０１２７】
「ｔｂｌａｓｔｎ」は、６つのリーディングフレーム全部で動的に翻訳されたヌクレオチド配列データベース（両方の鎖）に対して、タンパク質の質問配列を比較する。
【０１２８】
「ｔｂｌａｓｔｘ」は、ヌクレオチド配列データベースの６つのフレームの翻訳物に対して、ヌクレオチド質問配列の６フレームの翻訳物を比較する。
【０１２９】
ＢＬＡＳＴは、以下の検索パラメータを使用する。
【０１３０】
ＨＩＳＴＯＧＲＡＭは、各検索のスコアのヒストグラムを提示し、初期設定は「はい」となっている。（ＢＬＡＳＴマニュアル（BLAST Manual）のパラメータＨを参照）。
【０１３１】
ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮＳは、報告される整合した配列の短い記述の数を特定の数に制限する；初期設定の制限は記述数１００である。（マニュアルページのパラメータＶを参照）。ＥＸＰＥＣＴ及びＣＵＴＯＦＦも参照されたい。
【０１３２】
ＡＬＩＧＮＭＥＮＴＳは、データベース配列を特定の数に制限し、それについて高スコアセグメント対（high-scoring segment pair）（ＨＳＰ）を報告する；初期設定の制限は５０である。これより多いデータベース配列が報告についての統計的有意性の閾値（下記のＥＸＰＥＣＴ及びＣＵＴＯＦＦを参照）を満足する場合、整合した最も統計的に有意なものだけを報告する。（ＢＬＡＳＴマニュアルのパラメータＢを参照）。
【０１３３】
ＥＸＰＥＣＴは、データベース配列に対する整合を報告することについての統計的有意性の閾値である；初期設定値は１０であり、これはKarlin and Altschul (1990)の確率モデルによれば、１０の整合が単に偶然に認められることが予想されるためである。整合の統計的有意性がＥＸＰＥＣＴの閾値より大きい場合、その整合は報告されない。ＥＸＰＥＣＴの閾値を低くするとより厳格となるが、整合が報告される機会は少なくなる。分数の値は許容される。（ＢＬＡＳＴマニュアルのパラメータＥを参照）。
【０１３４】
ＣＵＴＯＦＦは、高スコアセグメント対の報告についてのカットオフスコアである。初期設定値はＥＸＰＥＣＴ値から算出される（上記を参照）。ＨＳＰの統計的有意性が、ＣＵＴＯＦＦ値と同じスコアである単独のＨＳＰが有するとみなされるはずの有意性と少なくとも同程度高い場合にのみ、データベース配列についてのＨＳＰを報告する。ＣＵＴＯＦＦの値を高くするとより厳格となるが、整合が報告される機会は少なくなる。（ＢＬＡＳＴマニュアルのパラメータＳを参照）。通常、有意性の閾値は、ＥＸＰＥＣＴを用いてより直観的に扱われ得る。
【０１３５】
ＭＡＴＲＩＸは、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＮ及びＴＢＬＡＳＴＸの代替のスコア化行列を指定する。初期設定行列は、ＢＬＯＳＵＭ６２（Henikoff & Henikoff, 1992, Proc. Natl. Aacad. Sci. USA 89(22):10915-9）である。妥当な代替の選択には、ＰＡＭ４０、ＰＡＭ１２０、ＰＡＭ２５０及びＩＤＥＮＴＩＴＹがある。ＢＬＡＳＴＮに使用可能な代替のスコア化行列はなく、ＢＬＡＳＴＮの要求でＭＡＴＲＩＸの命令を指定すると、エラー反応が返される。
【０１３６】
ＳＴＲＡＮＤは、ＴＢＬＡＳＴＮ検索を、データベース配列の上部の鎖だけ又は下部の鎖だけに制限し、或いはＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＸ検索を、質問配列の上部の鎖又は下部の鎖のリーディングフレームだけに制限する。
【０１３７】
ＦＩＬＴＥＲは、組成上の複雑性が低い質問配列のセグメントを隠し、これはWootton & Federhen (1993) Computers and Chemistry 17:149-163のＳＥＧプログラムによって決定され、或いは短い周期の内部反復からなるセグメントを隠し、これはClaverie & States, 1993, Computers and Chemistry 17:191-201のＸＮＵプログラムによって、又はＢＬＡＳＴＮではTatusov及びLipmanのＤＵＳＴプログラムによって決定される（ＮＣＢＩのワールドワイドウェブサイトを参照）。フィルタリングによって、ｂｌａｓｔ出力から統計的に有意であるが、生物学的に興味深くない報告（例えば、一般的な、酸性、塩基性又はプロリンに富む領域）を削除し、データベース配列に対する特異的なマッチングに使用可能な、質問配列の生物学的により興味深い領域を残すことができる。
【０１３８】
フィルタプログラムによって発見された複雑性の低い配列は、ヌクレオチド配列では文字「Ｎ」（例えば１３回反復した「Ｎ」）を、タンパク質の配列では文字「Ｘ」（例えば９回反復した「Ｘ」）を用いて置換られる。
【０１３９】
フィルタリングは、質問配列（又はその翻訳産物）にのみ適用され、データベース配列には適用されない。初期設定のフィルタリングは、ＢＬＡＳＴＮではＤＵＳＴ、他のプログラムではＳＥＧである。
【０１４０】
ＳＷＩＳＳ−ＰＬＯＴの配列に適用したときにＳＥＧ、ＸＮＵ、又はその両方で隠されるものが全くないことは異常ではなく、そのためフィルタリングによっていつも効果が得られると予想するべきでない。さらに、配列全体が隠される場合もあり、このことから、フィルタリングされない質問配列に対して報告されるどんな整合の統計的有意性も疑うべきであることが示唆される。
【０１４１】
ＮＣＢＩ−ｇｉは、アクセッション名及び／又は位置名に加えて、出力中に識別子ＮＣＢＩ  ｇｉが示されるようにする。
【０１４２】
最も好ましくは、上記に記載のＮＣＢＩワールドワイドウェブサイトの「／Ｂｌａｓｔ／」ディレクトリ内で提供されている、簡単なＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを用いて配列比較を行う。
【０１４３】
抗体
表１に示す核酸によってコードされるポリペプチド又はそのフラグメントに対するモノクローナル又はポリクローナル抗体の使用についても記載する。
【０１４４】
抗体を産生する方法は、当業者に周知である。ポリクローナル抗体が所望される場合、選択した哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）を、ポリペプチドの（複数の）エピトープを有する免疫原性ポリペプチドで免疫感作させる。免疫感作動物の血清を収集し、既知の手順に従って処理する。ポリペプチドのエピトープに対するポリクローナル抗体を含む血清が、他の抗原に対する抗体を含む場合、免疫親和性クロマトグラフィーによって、そのポリクローナル抗体を精製することができる。ポリクローナル抗血清を産生し処理する技術は、当業者に周知である。より広範に免疫応答を生じさせるために、ポリペプチド又はそのフラグメントを他のポリペプチドにハプテン化して、動物又はヒトにおける免疫原として使用することができる。
【０１４５】
当業者なら、ポリペプチドのエピトープに対するモノクローナル抗体を容易に作成することもできる。ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作成する一般的な方法は周知である。細胞融合により、また癌遺伝子ＤＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換や、Epstein-Barrウイルスによるトランスフェクションなどの他の技術によっても、不死化した抗体産生細胞系を作成することができる。本明細書に記載のポリペプチドのエピトープに対して産生されたモノクローナル抗体のパネルを、様々な特性、すなわちアイソタイプ及びエピトープ親和性があるかどうかスクリーニングすることができる。
【０１４６】
代替技術では、例えばファージが様々な相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するその被覆表面上にｓｃＦｖフラグメントを発現する、ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングする。この技術は、当業者に周知である。
【０１４７】
表１に示す核酸によってコードされるポリペプチドのエピトープに対するモノクローナル抗体もポリクローナル抗体も診断に特に有用であり、中和するものは受動的免疫療法に有用である。特に、モノクローナル抗体を使用して、抗イディオタイプ抗体を産生させることができる。抗イディオタイプ抗体とは、それに対する保護が所望される作用因子の抗原の「内部イメージ」を有するイムノグロブリンである。
【０１４８】
抗イディオタイプ抗体を産生させる技術は、当技術分野で知られている。この抗イディオタイプ抗体も、治療に有用である可能性がある。
【０１４９】
本文書の目的において、「抗体」という用語には、別に特定しない限り、標的抗原に対する結合活性を保持する、抗体全体のフラグメントが含まれる。そのようなフラグメントには、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）２、並びに単鎖抗体（ｓｃＦｖ）がある。さらに、抗体及びそのフラグメントは、例えばＥＰ−Ａ−２３９４００号に記載のように、ヒト化抗体でもよい。
【０１５０】
（ａ）記載のように抗体を提供するステップと、（ｂ）抗体−抗原複合体の形成が可能な条件下で生物試料を前記抗体とともにインキュベートするステップと、（ｃ）前記抗体を含む抗体−抗原複合体が形成されたかどうかを確認するステップとを含む方法により、生物試料において、本明細書において同定された細胞周期進行ポリペプチドを検出する際に、抗体を使用することができる。
【０１５１】
適切な試料には、脳、胸部、卵巣、肺、大腸、膵、精巣、肝、筋及び骨組織などの組織の抽出物又はそのような組織に由来する腫瘍性増殖物の抽出物がある。
【０１５２】
細胞周期進行タンパク質と特異的に結合する抗体を、当業者に周知の診断方法及び診断キットに使用して、体液又は組織中の細胞周期進行タンパク質を検出又は定量することができる。この試験の結果を使用して、癌、及び細胞周期進行が媒介する他の疾患の発生又は再発を診断又は予測することができる。
【０１５３】
増殖活性を特徴とする疾患の診断又は予測における細胞周期進行タンパク質、そのタンパク質に対する抗体、そのタンパク質及び／又はその抗体を含む組成物の使用についても開示する。本明細書において、「予測方法」とは、疾患、特に細胞周期進行に依存的な疾患と診断されたヒト又は動物の疾患の進行に関する予測を可能にする方法を意味する。本明細書において、「診断方法」とは、ヒト又は動物における細胞周期進行に依存的な疾患の存在又は型の決定を可能にする方法を意味する。
【０１５４】
細胞周期進行タンパク質を診断方法及び診断キットに使用して、そのタンパク質と結合できる抗体を検出又は定量することができる。このキットは、細胞周期進行タンパク質に対する循環中の抗体の検出を可能にするはずであり、これにより、例えば癌細胞が増殖していることが示唆される。このような循環中の抗タンパク質抗体を有する患者は、複数の腫瘍及び癌を発生する可能性がより高いことがあり、治療後又は寛解期に癌を再発する可能性がより高いことがある。
【０１５５】
本明細書に記載の方法及び組成物に使用する抗体を、固体支持体に結合させることができ、かつ／又は適切な試薬、対照、説明書などと一緒に、適切な容器中のキットに包装することができる。
【０１５６】
診断用組成物中で使用するとき、好ましくは抗体を検出するための手段と一緒に抗体を提供し、その手段は酵素による手段、蛍光による手段、放射性同位体による手段又は他の手段であり得る。抗体及びその検出手段は、診断を意図した診断キットにおいて、同時、別々、又は順次に使用するために提供することができる。
【０１５７】
細胞周期進行遺伝子発現の測定
多数の様々な方法を用いて、遺伝子発現のレベルを決定することができる。
【０１５８】
（ａ）ＲＮＡレベル
遺伝子発現は、ＲＮＡレベルで検出することができる。例えば、酸フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出（ＲＮＡｚｏｌ  Ｂ、Biogenesis）、又はＲＮｅａｓｙ  ＲＮＡ調製キット（Qiagen）の使用を含めたＲＮＡ抽出技術を用いて、細胞からＲＮＡを抽出することができる。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する典型的なアッセイの形には、核ランオンアッセイ（nuclear run-on assay）、ＲＴ−ＰＣＲ及びＲＮａｓｅ保護アッセイ（RNase protection assay）がある（Melton et al., Nuc. Acids Res. 12:7035）。使用することができる検出のための方法には、放射活性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識及び他の適当な標識がある。
【０１５９】
通常、ＲＴ−ＰＣＲを使用してＲＮＡ標的を増幅する。この方法では、逆転写酵素を使用して、ＲＮＡを相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転換し、次いでそれを増幅して検出を促進することができる。
【０１６０】
多数のＤＮＡ増幅法が知られており、そのほとんどが酵素的連鎖反応（ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、自己維持型配列複製など）、又はそれがクローン化されているベクターの全部又は一部の複製を利用する。
【０１６１】
多くの標的及びシグナル増幅法が文献中に記載されており、例えば、これらの方法の一般的な総説は、Landegren, U. et al., Science 242:229-237 (1988)、及びLewis, R., Genetic Engineering News 10:1, 54-55 (1990)である。
【０１６２】
ＰＣＲとは、特に米国特許第４６８３１９５号及び４６８３２０２号に記載されている核酸増幅法である。ＰＣＲを使用して、診断においてどんな既知の核酸をも増幅することができる（Mok et al., 1994, Gynaecologic Oncology 52:247-252）。自己維持型配列複製（３ＳＲ）は、ＴＡＳの改変法であり、酵素カクテル及び適当なオリゴヌクレオチドプライマーによって媒介される、逆転写酵素（ＲＴ）、ポリメラーゼ及びヌクレアーゼが働く連続した循環を介して核酸鋳型の等温増幅を行う（Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874）。ライゲーション増幅反応又はライゲーション増幅システムは、標的鎖につきＤＮＡリガーゼ及び４つのオリゴヌクレオチド、２つを使用する。この技術は、Wu, D. Y. and Wallace, R. B., 1989, Genomics 4:560に記載されている。Ｑβレプリカーゼ技術では、一本鎖ＲＮＡを複製するバクテリオファージＱβのＲＮＡレプリカーゼを使用して標的ＤＮＡを増幅し、これはLizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197に記載されている。
【０１６３】
代替の増幅技術を利用することもできる。例えば、ローリングサークル増幅（Lizardi et al., 1998, Nat Genet 19:225）は、商業的に使用可能な増幅技術（ＲＣＡＴ（商標））であり、ＤＮＡポリメラーゼによって駆動し、等温条件下で、直線的又は幾何的動態で環状オリゴヌクレオチドプローブを複製することができる。さらなる技術である、鎖代替増幅（ＳＤＡ、Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:392）は、特定の標的に独特な、明確に限定された配列から開始する。
【０１６４】
（ｂ）ポリペプチドレベル
遺伝子発現はまた、細胞周期進行ポリペプチドを測定することによって検出することもできる。これは、細胞周期進行ポリペプチドと結合する分子を用いて実現することができる。細胞周期進行ポリペプチドの存在を検出するためにそのタンパク質と直接的に又は間接的に結合する適切な分子／作用因子には、ペプチドやタンパク質など天然に存在する分子、例えば抗体があり、又はそれは合成分子でもよい。
【０１６５】
イムノブロットなど上記に記載の標準的な実験技術を使用して、同じ細胞集団中の無処理細胞と比較して細胞周期進行タンパク質の変化レベルを検出することができる。
【０１６６】
遺伝子発現はまた、ポリペプチドの翻訳後のプロセシング又は核酸の転写後の修飾における変化を検出することによって決定することもできる。例えば、ポリペプチドの示差的リン酸化、ポリペプチドの切断やＲＮＡの選択的スプライシングなどを測定することができる。ポリペプチドなどの遺伝子産物の発現レベル、並びにその翻訳後修飾は、２Ｄポリアクリルアミドゲル電気泳動など独自のタンパク質アッセイ又は技術を用いて検出することができる。
【０１６７】
当技術分野で知られているどんな方法によっても、免疫特異的結合について抗体のアッセイを行うことができる。使用することができるイムノアッセイには、それだけに限らないが、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチイムノアッセイ、免疫沈降法、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散法、凝集法、補体結合法、免疫放射線測定法、蛍光免疫法、プロテインＡイムノアッセイなどの技術を用いた、競合的及び非競合的アッセイ系がある。このようなアッセイは、当技術分野で通常行われている（例えば、Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照、この文献全体を参照により本明細書に組み込む）。
【０１６８】
アレイ
アレイ技術及びそれと関係する様々な技術及び適用は、一般に多数の教科書及び文書に記載されている。これには、Lemieux et al., 1998, Molecular Breeding 4:277-289；Schena and Davis. Parallel Analysis with Biological Chips. in PCR Methods Manual (eds. M. Innis, D. Gelfand, J. Sninsky)；Schena and Davis, 1999, Genes, Genomes and Chips. In DNA Microarrays: A Practical Approach (ed. M. Schena), Oxford University Press, Oxford, UK, 1999)；The Chipping Forecast (Nature Genetics special issue; January 1999 Supplement)；Mark Schena (Ed.), Microarray Biochip Technology, (Eaton Publishing Company)；Cortes, 2000, The Scientist 14(17):25；Gwynne and Page, Microarray analysis: the next revolution in molecular biology, Science, 1999, August 6；Eakins and Chu, 1999, Trends in Biotechnology, 17:217-218があり、また様々なワールドワイドウェブサイトもある。
【０１６９】
アレイ技術は、一般に、「１つの実験に１つの遺伝子」の原則通りに働き、その結果、処理能力が低く、遺伝子機能の「全体像」を理解することができないという分子生物学の従来の方法に伴う不都合を克服する。現在、アレイ技術の主な適用には、配列の同定（遺伝子／遺伝子変異）、及び遺伝子の発現レベル（量）の決定がある。遺伝子発現プロファイル作成にアレイ技術を、場合によってはプロテオミクス技術と組み合わせて使用することができる（Celis et al., 2000, FEBS Lett, 480(1):2-16；Lockhart and Winzeler, 2000, Nature 405(6788):827-836；Khan et al., 1999, 20(2):223-9）。アレイ技術の他の適用も、当技術分野で知られており、それには、例えば、遺伝子の発見、癌研究（Marx, 2000, Science 289: 1670-1672；Scherf et al., 2000, Nat Genet 24(3):236-44；Ross et al., 2000, Nat Genet 2000, 24(3):227-35）、ＳＮＰ分析（Wang et al., 1998, Science 280(5366):1077-82）、薬物の発見、ファーマコゲノミクス、疾患の診断（例えば、微小流体素子の利用：Chemical & Engineering News, February 22, 1999, 77(8):27-36）、毒物学（Rockett and Dix (2000), Xenobiotica 30(2):155-77；Afshari et al., 1999, Cancer Res 59(19):4759-60）、及びトキシコゲノミクス（機能ゲノミクスと分子毒物学の複合分野）がある。トキシコゲノミクスの目標は、毒物に対する中毒反応と、そのような毒物にさらされた対象の遺伝子プロファイルの変化との相関を発見することである（Nuwaysir et al., 1999, Molecular Carcinogenesis 24:153-159）。
【０１７０】
本文書において、アレイ技術を、例えば、本明細書において同定された１つ又は複数の細胞周期進行タンパク質の発現分析に使用することができる。一実施形態では、アレイ技術を使用して、本明細書において同定された多数の細胞周期進行タンパク質に対する候補化合物の効果について同時にアッセイを行うことができる。したがって、少なくとも１つの、少なくとも２つの又は少なくともいくつかの表１に示す核酸又はそのフラグメントが含まれるマイクロアレイ、或いはタンパク質又は抗体アレイをさらに提供する。
【０１７１】
一般に、試料のどんなライブラリー又は群も、そのライブラリー又は群の構成要素を空間的に分離することによって、整然とアレイ中に配列することができる。アレイに配列するのに適したライブラリーの例には、その中でも、核酸ライブラリー（ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチドなどのライブラリーを含む）、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質ライブラリー、並びにリガンドライブラリーなど任意の分子を含むライブラリーがある。したがって、本文書において「ライブラリー」に言及する場合、別段指示される状況でない限り、そのような言及は、アレイの形のライブラリーへの言及を含むとみなされるべきである。本文書において、「ライブラリー」は、本明細書において同定された細胞周期進行タンパク質の試料を含み得る。
【０１７２】
一般的に、試料（例えば、ライブラリー構成要素）を固相上に、好ましくは固体基板上に固定し又は固定化し、試料の拡散及び混合を制限する。好ましい実施形態では、ＤＮＡ結合リガンドのライブラリーを調製することができる。具体的には、膜、及び樹脂やガラスなどの非極性基板を含めて、十分に平坦な固相にライブラリーを固定化することができる。さらに、索引作業（すなわち、特定の試料を参照する又はそれに到達すること）が容易となるように、試料を配列することが好ましい。通常、試料はグリッド情報中のスポットとして適用する。一般のアッセイ系は、この目的に適合し得る。例えば、１つの穴に複数の試料を入れて、又は各穴に単一の試料を入れて、アレイをマイクロプレートの表面上に固定化することができる。さらに、固体基板は、ニトロセルロースやナイロン膜（例えば、ブロット実験で使用する膜）などの膜でよい。代替の基板には、ガラス、又は珪酸を基礎とする基板がある。したがって、当技術分野で知られているどんな適当な方法によっても、例えば、電荷の相互作用によって、或いは穴の壁部若しくは底部、又は膜の表面への化学結合によって試料を固定化することができる。配列し、固定する他の手段には、例えば、ピペット混合、液滴接触、圧電による手段、インクジェット及びバブルジェット技術、静電気の適用などを使用することができる。珪素を基礎とするチップの場合、フォトリソグラフィーを利用してチップ上に試料を配列し固定することができる。
【０１７３】
固体基板上に「スポット形成」することによって試料を配列することができるが、これは手動で行うこともでき、試料を正確に配置するためにロボットの使用により行うこともできる。一般に、アレイはマクロアレイ又はマイクロアレイと呼ばれることがあり、その違いは試料スポットのサイズである。マクロアレイは通常、スポットサイズが約３００ミクロン以上の試料を含み、現存するゲル及びブロットスキャナーによって容易に画像化することができる。マイクロアレイにおける試料のスポットサイズは通常直径２００ミクロン未満であり、このアレイは通常数千スポットを含む。したがって、マイクロアレイは、特殊化したロボット及び画像化装置が必要となることがあり、これらは特注する必要があるかもしれない。装置については、一般に総説 Cortese, 2000, The Scientist 14(11):26に記載されている。
【０１７４】
ＤＮＡ分子の固定化したライブラリーを作成する技術は、当技術分野において記載がある。一般に、ほとんどの従来技術の方法では、例えば固体基板上の様々な別々の位置に様々な順列の配列を組み立てるための遮へい技術を用いて、一本鎖核酸分子ライブラリーを合成する方法について記載されている。米国特許第５８３７８３２号は、その内容を参照により本明細書に組み込むが、非常に大規模な組み込み技術に基づく、珪素基板に固定化したＤＮＡアレイ作成の改良法について記載している。特に、米国特許第５８３７８３２号は、基板上の空間的に確定した位置に特定の組のプローブを合成する、「タイリング」と呼ばれる戦略について記載し、これを使用して、固定化したＤＮＡライブラリーを作成することができる。米国特許第５８３７８３２号はまた、使用することもできる初期の技術についての参照文献も提供している。
【０１７５】
ペプチド（又はペプチド擬似物）のアレイを、それぞれ別個のライブラリー構成要素（例えば、独特のペプチド配列）をアレイ中の別々の予め確定した位置に配置するように、表面上に合成することもできる。各ライブラリー構成要素の素姓を、アレイ中のその空間的な位置によって決定する。所定の分子（例えば標的又はプローブ）と、ライブラリーの反応性構成要素との結合による相互作用が行われるアレイ中の位置を決定し、それによって、空間的な位置に基づいてライブラリーの反応性構成要素の配列が同定される。この方法は、米国特許第５１４３８５４号；ＷＯ  ９０／１５０７０号及びＷＯ  ９２／１００９２号；Fodor et al., 1991, Science 251:767；Dower and Fodor, 1991, Ann. Rep. Med. Chem. 26:271に記載されている。
【０１７６】
検出の助けとするために、容易に検出可能などんなレポーターでも、例えば、蛍光、生物発光、リン光、放射活性などのレポーターで標的及びプローブを標識することができる。そのようなレポーター、その検出、標的／プローブとの結合などは、本文書の他の箇所で論じている。プローブ及び標的を標識することは、Shalon et al., 1996, Genome Res 6(7):639-45にも開示されている。
【０１７７】
ＤＮＡアレイの特定の例には、以下のものがある。
【０１７８】
形式Ｉ：ガラスなどの固体表面にロボットスポッティングを用いてプローブｃＤＮＡ（長さ約５００〜約５０００塩基）を固定化し、それを１組の標的に別々に又は混合してさらす。この方法は、スタンフォード大学で開発されたと広く考えられている（Ekins and Chu, 1999, Trends in Biotechnology, 17:217-218）。
【０１７９】
形式II：オリゴヌクレオチド（約２０〜約２５ｍｅｒのオリゴ）又はペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブのアレイを、in situ（チップ上）で、又は従来通りに合成した後チップ上で固定化することによって合成する。標識した試料ＤＮＡにアレイをさらし、ハイブリダイズさせ、相補配列の素姓／量を決定する。このようなＤＮＡチップは、GeneChip（登録商標）という商標でAffymetrix, Inc.から販売されている。
【０１８０】
販売されているマイクロアレイ型の一部の例が、例えばMarshall and Hodgson, 1998, Nature Biotechnology 16(1):27-31に示されている。
【０１８１】
データ分析も、アレイに関する実験の重要な部分である。マイクロアレイ実験からの生データは通常画像であり、これを遺伝子発現の行列、すなわち行が例えば遺伝子を表し、列が例えば組織などの様々な試料又は実験条件、及び例えば特定の試料における特定の遺伝子の発現レベルを特徴付ける各細胞の数を表す表に変換する必要がある。その根底にある生物学的プロセスについての情報を引き出す場合、この行列をさらに分析しなければならない。（管理データ及び非管理データの分析、並びにバイオインフォマティックスの手法を含めた）データ分析の方法は、Brazma and Vilo J, 2000, FEBS Lett 480(1):17-24に開示されている。
【０１８２】
上記に開示したように、タンパク質、ポリペプチドなどをアレイ中に固定化することもできる。例えば、プロテインチップを用いるプロテオームのマイクロアレイ分析に抗体が使用されている（Borrebaeck CA, 2000, Immunol Today 21(8):379-82）。ポリペプチドアレイについては、例えば、MacBeath and Schreiber, 2000, Science, 289(5485):1760-1763の総説がある。
【０１８３】
細胞周期進行タンパク質の機能活性の改変
細胞周期進行タンパク質に、又はそれをコードする核酸に直接的に又は間接的に結合することができる適当な分子／作用因子により、細胞周期進行タンパク質の機能活性を改変することができる。その作用因子は、ペプチドやタンパク質など天然に存在する分子、例えば抗体でもよく、合成分子でもよい。細胞周期進行タンパク質の発現レベルを調節する方法には、例えば、アンチセンス技術の使用がある。
【０１８４】
アンチセンス構築物、すなわち、センス核酸又はｍＲＮＡに相補的な核酸、好ましくはＲＮＡの構築物については、米国特許第６１０００９０号（Monia et al）、及びNeckers et al., 1992, Crit Rev Oncog 3(1-2):175-231に詳細に記載されており、その文書の教示を参照により特に組み込む。遺伝子発現を調節する他の方法は、当業者に知られており、それには優性ネガティブ手法並びに遺伝子の発現又は機能活性を阻害するペプチド又は小分子の導入が含まれる。
【０１８５】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の直接導入によって誘導される転写後遺伝子発現抑制（ＰＴＧＳ）の方法であり、様々な生物で特定の遺伝子の発現をノックアウトする有用な手段として現れた。ＲＮＡｉは、Fire et al., Nature 391:806-811 (1998)に記載されている。ＰＴＧＳの他の方法は既知であり、それには、例えば導入遺伝子又はウイルスの導入が含まれる。一般に、ＰＴＧＳでは、発現抑制を受けた遺伝子の転写物は合成されるが、それが速やかに分解されるので蓄積しない。ＲＮＡｉを含めたＰＴＧＳの方法は、例えば、Ambion.comワールドワイドウェブサイトの「/hottopics/」ディレクトリ内の「rnai」ファイルに記載されている。
【０１８６】
in vitroでのＲＮＡｉに適した方法を本明細書に記載する。このような方法の１つでは、ｓｉＲＮＡ（短干渉ＲＮＡ）を導入する。現在のモデルでは、この２１〜２３ヌクレオチドのｄｓＲＮＡがＰＴＧＳを誘導できることが示唆されている。有効なｓｉＲＮＡを設計する方法は、例えば、上記に記載のＡｍｂｉｏｎウェブサイトに記載されている。ＲＮＡ前駆体はまた、本明細書に記載の細胞周期進行核酸配列の１つの全部又は一部がコードするものでもよい。
【０１８７】
アッセイ
本明細書に記載のポリペプチドと結合し、例えば、核膜の形成、細胞周期の静止期（Ｇ０）からの脱出、Ｇ１進行、染色体の脱濃縮、核膜の分解、ＳＴＡＲＴ、ＤＮＡ複製の開始、ＤＮＡ複製の進行、ＤＮＡ複製の終了、中心体の複製、Ｇ２進行、有糸分裂又は減数分裂の機能の活性化、染色体の濃縮、中心体分離、微小管の核形成、紡錘体の形成及び機能、微小管モータータンパク質との相互作用、染色分体の分離及び解離、有糸分裂の機能の不活性化、収縮環の形成、細胞質分裂の機能、染色質との結合、複製複合体の形成、複製許可、リン酸化又は他の二次的修飾活性、タンパク質溶解性分解、微小管との結合、アクチンとの結合、セプチンとの結合、微小管重合中心核形成活性、並びに細胞周期シグナル伝達経路の構成成分との結合に影響を及ぼす物質を同定するのに適したアッセイについても記載する。
【０１８８】
一般に、１つ又は複数の細胞周期進行のこれらの局面を阻害する物質は、それを完全に阻害し、又は対照と比べて、濃度５００ｍＭ未満でタンパク質活性の有意（すなわち５０％を超える）な低下を誘導する。好ましくは、その阻害は対照と比べて７５％であり、より好ましくは９０％、最も好ましくは対照と比べて９５％又は１００％である。１つ又は複数の細胞周期進行のこれらの局面を促進又は増強する物質は、対照と比べて、濃度５００ｍＭ未満でタンパク質活性の有意（すなわち５０％を超える）な増大を誘導する。好ましくは、その増大は対照と比べて７５％であり、より好ましくは９０％、最も好ましくは対照と比べて９５％又は１００％である。
【０１８９】
さらに、アッセイを使用して、適当な場合に、本明細書に記載のポリペプチドの、細胞分裂周期機構の構成成分との結合に干渉する物質を同定することができる。このようなアッセイは、通常in vitroで行う。全細胞アッセイにおいて、予備的なin vitroアッセイで同定された候補物質の、細胞そのものに対する効果を試験するアッセイも提供する。下記に記載するアッセイ、又は当技術分野で知られているどんな適当なアッセイを使用しても、これらの物質を同定することができる。
【０１９０】
したがって、下記に記載のアッセイ、すなわち有糸分裂アッセイ、減数分裂アッセイ、ポリペプチド結合アッセイ、微小管結合／重合アッセイ、微小管精製及び結合アッセイ、微小管重合中心核（ＭＴＯＣ）核形成アッセイ、モータータンパク質アッセイ、紡錘体の集合及び機能についてのアッセイ、ＤＮＡ複製についてのアッセイ、染色体濃縮アッセイ、キナーゼアッセイ、キナーゼ抑制因子アッセイ、及び全細胞アッセイのいずれかで同定された１つ又は複数の物質について説明し、それぞれのアッセイについても下記にさらに詳細に説明する。
【０１９１】
調節因子スクリーニングアッセイ
細胞周期進行タンパク質の活性及び／又は発現についてin vitro及びin vivoアッセイを使用して、阻害、活性化、又は調節の活性を有する化合物を同定することができ、それには、例えばリガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、並びにその相同体及び擬似物がある。調節因子と推定される試験化合物を組織又は細胞試料に添加し、その試験化合物の細胞周期進行タンパク質の機能及び／又は発現に対する効果をモニターすることによって、調節因子スクリーニングを行うことができる。試験化合物を投与しない同じ試料をも、対照としてモニターする。次いで、それだけに限らないが、顕微鏡による分析、生存率の検定、複製能、組織学的検討、細胞に関係する特定のＲＮＡ又はポリペプチドのレベル、細胞又は細胞溶解液によって発現される酵素活性のレベル、及び他の細胞又は化合物と相互作用する細胞の能力を含めた任意の適切な表現型の判断基準によって、処理細胞及び無処理細胞を比較する。
【０１９２】
細胞周期進行を誘導する方法は、当技術分野で周知であり、この方法には、それだけに限らないが、成長因子にさらす方法がある。処理細胞と無処理細胞の違いは、試験化合物に起因する効果を示す。
【０１９３】
本明細書に記載のポリペプチドとの相互作用の結果、細胞周期進行を阻害する物質は、いくつかの方法でそれを行うことができる。例えば、その物質が細胞分裂、有糸分裂及び／又は減数分裂を阻害する場合、それは、例えばポリペプチドと結合し、他の構成成分と相互作用する部位を遮へいし又は変化させることにより、紡錘体装置の構成成分とのポリペプチドの結合を直接阻害することができる。ＤＮＡ複製を阻害する物質は、複製に関与するタンパク質のリン酸化又は脱リン酸化を阻害することによってそれを行うことができる。例えば、キナーゼ抑制因子６−ＤＭＡＰ（６−ジメチルアミノプリン）は、複製の開始を妨害する（Blow, J.J., 1993, J Cell Biol 122:993-1002）。好都合なことに、この型の候補物質は、例えば下記に記載するin vitro結合アッセイによって予備的スクリーニングを行い、次いで下記に記載する全細胞アッセイで試験することができる。候補物質の例には、本明細書に記載のポリペプチドを認識する抗体がある。
【０１９４】
記載のポリペプチドと直接結合することができる物質はまた、その細胞内局在を、したがってその正常の基質と相互作用する能力を変化させることにより、細胞周期進行におけるその機能を阻害する可能性もある。その物質は、そのポリペプチドと直接結合することにより、又は他の構成成分とのそのポリペプチドの相互作用を間接的に阻害することにより、その細胞内局在を変化させることができる。例えば、ＤＮＡポリメラーゼα−プライマーゼ酵素のｐ６８とｐ１８０サブユニットの相互作用は、ｐ１８０が核内に移動するために必要であることが知られ（Mizuno et al., 1998, Mol Cell Biol 18:3552-62）、したがって、ｐ６８とｐ１８０との相互作用を阻害する物質は、核への移動に、したがってプライマーゼの活性に影響を及ぼす。有糸分裂に影響を及ぼす物質は、ポリペプチド及び有糸分裂装置の構成成分が細胞内で接触することを妨害することによってそれを行うことができる。
【０１９５】
これらの物質は、例えば下記に記載する全細胞アッセイを使用して試験することができる。細胞周期進行を阻害するかどうか、関連ポリペプチドの非機能的相同体を試験することもできる。この相同体が、そのタンパク質の正常の機能を有さず、又は細胞分裂周期機構と結合したタンパク質の機能を遮断することができないが、細胞分裂周期機構の構成成分との結合に関して、野生型タンパク質と競合する可能性があるからである。そのような非機能的相同体には、天然に存在する変異体及び改変配列又はそのフラグメントが含まれ得る。
【０１９６】
或いは、この構成成分の結合を直接妨害する代わりに、この物質は、生物学的に使用できる量のポリペプチドを抑制することもできる。これは、例えば転写、転写物の安定性、翻訳又は翻訳後の安定性のレベルでこの構成成分の発現を阻害することによって行うことができる。このような物質の例は、ｍＲＮＡ生合成量を抑えるアンチセンスＲＮＡ又は二本鎖干渉ＲＮＡ配列である。
【０１９７】
適切な候補物質には、実施例に記載のポリペプチドの配列に基づくペプチド、特にサイズが約５〜３０又は１０〜２５アミノ酸のもの、或いは１つ又は複数の残基が代替されているそのようなペプチドの変異体がある。無作為な配列、又は多様性が最大のペプチドパネルをもたらすように常に変化している配列を含むペプチドパネル由来のペプチドを使用することができる。
【０１９８】
適切な候補物質には、本明細書に記載のポリペプチドに特異的な抗体産物（例えば、モノクローナル及びポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体並びにＣＤＲ移植抗体）も含まれる。さらに、組み合わせたライブラリー、ペプチド及びペプチド擬似物、合成化学物質、オリゴヌクレオチド、並びに天然の産物のライブラリーを、細胞分裂周期機構、例えば有糸分裂／減数分裂装置（微小管など）とのポリペプチドの結合の抑制因子としての活性があるかどうかでスクリーニングすることができる。候補物質を最初のスクリーニングで、例えば１反応につき１０つの物質のバッチで使用することができ、阻害を示すその組の物質は個々に試験される。次いで、下記に記載のものなどのin vitroのスクリーニングで活性を示す候補物質を、抑制因子にさらし、細胞周期の任意の段階で抑制されるかどうかを試験する哺乳動物細胞などの全細胞系で試験することができる。
【０１９９】
物質が細胞周期進行活性を抑制し、低下させ、増大させ、促進し、又は活性化することが認められたとき、その物質は、そのような活性の調節因子として同定される。一般に、１つ又は複数の細胞周期進行のこれらの局面を阻害する物質は、それを完全に阻害し、又は対照（すなわち、細胞周期進行の１つ又は複数の局面を調節しないことが知られている物質）と比べて、濃度５００ｍＭ未満でタンパク質活性の有意（すなわち５０％を超える）な低下を誘導する。好ましくは、その阻害は対照と比べて７５％であり、より好ましくは９０％、最も好ましくは対照と比べて９５％又は１００％である。その阻害は、細胞周期進行を妨害する可能性もあり、単に細胞周期進行を遅延させる又は延長するだけの可能性もある。１つ又は複数の細胞周期進行のこれらの局面を促進又は増強する物質は、対照と比べて、濃度５００ｍＭ未満でタンパク質活性の有意（すなわち５０％を超える）な増大を誘導する。好ましくは、その増大は対照と比べて７５％であり、より好ましくは９０％、最も好ましくは対照と比べて９５％又は１００％である。
【０２００】
ポリペプチド結合アッセイ
本明細書に記載のポリペプチドと結合する物質を同定するアッセイの１つの型では、固体支持体上に固定化したポリペプチドを、固定化していない候補物質と接触させ、対象とするポリペプチドと候補物質が互いに結合するかどうか、及び／又はその結合がどの程度かを決定する。或いは、候補物質を固定化し、本文書に示すポリペプチドを固定化しなくてもよい。
【０２０１】
細胞周期進行ポリペプチドと物質の結合は、一過性、可逆性又は永続性である可能性がある。好ましくは、この物質は、対照ポリペプチド（すなわち、細胞周期進行ポリペプチドでないことが知られているポリペプチド）との結合のＫｄ値より低いＫｄ値でこのポリペプチドと結合する。好ましくは、この物質のＫｄ値は、対照ポリペプチドとの結合のＫｄ値の１／２であり、より好ましくはＫｄ値が１／１００であり、最も好ましくはＫｄ値が対照ポリペプチドとの結合の値の１／１０００である。
【０２０２】
好ましいアッセイ法では、このポリペプチドをアガロースビーズなどのビーズ上に固定化する。通常これは、細菌、酵母、又は高等真核細胞系中でＧＳＴ融合タンパク質として構成成分を発現させ、グルタチオン−アガロースビーズを用いて細胞粗抽出物からＧＳＴ融合タンパク質を精製することによって実現する（Smith and Johnson, 1988; Gene 67(10):31-40）。対照として、固定化したポリペプチドと、ＧＳＴ融合タンパク質でない候補物質の結合を、このポリペプチドの不在下で確認する。次いで、固定化したポリペプチドと候補物質の結合を確認する。この型のアッセイは、ＧＳＴプルダウンアッセイとして当技術分野で知られている。さらに、候補物質を固定化し、ポリペプチドを固定化しなくてもよい。
【０２０３】
構成成分、例えばＮｉ−ＮＴＡアガロース及びヒスチジンタグの付いた構成成分の１つを固定化するための、親和性が異なる精製システムを用いて、この型のアッセイを行うことも可能である。
【０２０４】
候補物質とこのポリペプチドの結合を、当技術分野で周知の種々の方法で確認することができる。例えば、非固定化構成成分を（例えば、放射活性標識、エピトープタグ、又は酵素−抗体結合物で）標識することができる。或いは、免疫学的な検出技術によって結合を確認することもできる。例えば、反応混合物にウェスタンブロットを行い、そのブロットに、非固定化構成成分を検出する抗体でプロービングを行うことができる。ＥＬＩＳＡ技術を使用することもできる。
【０２０５】
候補物質を、通常終濃度１〜１０００ｎｍｏｌ／ｍｌまで、より好ましくは１〜１００ｎｍｏｌ／ｍｌまで添加する。抗体の場合、使用する終濃度は、通常１００〜５００μｇ／ｍｌ、より好ましくは２００〜３００μｇ／ｍｌである。
【０２０６】
微小管結合／重合アッセイ
微小管と結合する細胞周期進行ポリペプチドの場合、他の型のin vitroアッセイでは、候補物質が微小管とポリペプチドの結合を調節するかどうかを確認する。このようなアッセイは通常、候補物質の存在下又は不在下でポリペプチドを微小管と接触させるステップと、候補物質が微小管とポリペプチドの結合に影響を及ぼすかどうかを確認するステップとを含む。候補物質の不在下でこのアッセイを使用して、ポリペプチドが実際に微小管と結合することを確認することもできる。
【０２０７】
細胞周期進行ポリペプチドと物質の結合は、一過性、可逆性又は永続性である可能性がある。好ましくは、この物質は、対照ポリペプチド（すなわち、細胞周期進行ポリペプチドでないことが知られているポリペプチド）との結合のＫｄ値より低いＫｄ値でこのポリペプチドと結合する。好ましくは、この物質のＫｄ値は、対照ポリペプチドとの結合のＫｄ値の１／２であり、より好ましくはＫｄ値が１／１００であり、最も好ましくはＫｄ値が対照ポリペプチドとの結合の値の１／１０００である。
【０２０８】
以下の通りに微小管を調製し、アッセイを行う。
【０２０９】
微小管の調製及び結合アッセイ
基本的に以前の記載の通りに（Saunders et al., 1997, J. Cell Biol. 137(4):881-90）、０〜３時間齢のショウジョウバエ（Drosophila）胚から微小管を精製する。２倍量の氷冷溶解緩衝液（０．１Ｍ  Ｐｉｐｅｓ／ＮａＯＨ、ｐＨ６．６、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．９Ｍグリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍｌロイペプチン及び１μｇ／ｍｌペプスタチン）中で胚約３ｍｌをDounceホモジナイザーでホモジナイズする。氷上で１５分インキュベートすることによって微小管を脱重合し、次いでその抽出物を１６０００ｇで３０分間、４℃で遠心する。その上清を、１３５０００ｇで９０分間、４℃で遠心する。ＧＴＰを１ｍＭ、タキソールを２０μＭまで添加し、室温で３０分間インキュベートすることにより、この後者の上清中の微小管を重合する。この抽出物のアリコート３ｍｌを、溶解緩衝液中に調製した１５％のショ糖のクッション３ｍｌの上に重層する。スイングアウト型ローターを使用して、５４０００ｇで３０分間、２０℃で遠心した後、微小管のペレットを溶解緩衝液中に再懸濁させる。
【０２１０】
以前の記載の通りに微小管重層アッセイを行う（Saunders et al., 1997）。１レーン当たり５００ｎｇの組換えＡｓｐ、組換えポリペプチド、及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Sigma）を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画化し、ＰＶＤＦ膜（Millipore）上にブロットする。その膜は、低脂肪粉乳（ＬＦＰＭ）を５％含むＴＢＳＴ（５０ｍＭトリス  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）中で１時間予めインキュベートし、次いで溶解緩衝液で１５分間、３回洗浄する。次いで、１ｍＭ  ＧＤＰ、１ｍＭ  ＧＴＰ、又は１ｍＭ  ＧＴＰ−(−Ｓを含む溶解緩衝液中で３０分間そのフィルタをインキュベートする。ＧＴＰを終濃度１ｍＭまで添加し、それを３７℃で３０分間インキュベートすることにより、溶解緩衝液中の濃度２μｇ／ｍｌで、ＭＡＰを含まないウシ脳チューブリン（Molecular Probes）を重合する。ヌクレオチド溶液を除去し、重合した微小管を含む緩衝液を膜に添加して３７℃で１時間インキュベートし、タキソールを終濃度１０μＭまで加えて最後に３０分間インキュベートした。次いで、このブロットをＴＢＳＴで３回洗浄し、抗βチューブリン抗体（Boehringer Mannheim）を２．５μｇ／ｍｌで使用し、Super Signal検出システム（Pierce）を使用し、標準的なウェスタンブロットの手順を用いて、結合したチューブリンを検出する。
【０２１１】
この型のアッセイの一実施形態では、重合した微小管を作成するのに使用する細胞抽出物から、対象とするポリペプチドを使い果たすことが望ましい可能性がある。このことは、例えば適切な抗体を使用することによって実現する可能性がある。
【０２１２】
この型のアッセイの単純な拡張法は、（通常上記に記載の濃度で添加する）候補物質の有無で、in vitroで重合するチューブリンの能力（例えば、Andersen and Karsenti, 1997, J. Cell. Biol. 139(4):975-83で使用されている）に対する精製ポリペプチドの効果を試験することである。好都合なことに、アフリカツメガエル（Xenopus）の無細胞抽出物を、例えばチューブリンの供給源として使用することができる。
【０２１３】
微小管重合中心（ＭＴＯＣ）核形成活性アッセイ
候補物質、例えば上記に記載の結合アッセイを使用して同定されるものを、微小管重合中心核形成活性アッセイを使用してスクリーニングして、それがＭＴＯＣを阻害することができるかどうかを確認することができ、このことは、例えば星状体形成によって測定される。最も単純な形でのこのアッセイは、候補物質の不在下で微小管重合中心核形成活性を有することにより星状体が形成される細胞抽出物に候補物質を添加するステップを含む。
【０２１４】
物質が細胞周期進行活性を阻害し又は低下させることが認められたとき、その物質はそのような活性を阻害するものとして同定される。一般に、１つ又は複数の細胞周期進行のこれらの局面を阻害する物質は、それを完全に阻害し、又は対照（すなわち、細胞周期進行の１つ又は複数の局面を調節しないことが知られている物質）と比べて、濃度５００ｍＭ未満でタンパク質活性の有意（すなわち５０％を超える）な低下を誘導する。好ましくは、その阻害は対照と比べて７５％であり、より好ましくは９０％、最も好ましくは対照と比べて９５％又は１００％である。その阻害は、細胞周期進行を妨害する可能性もあり、単に細胞周期進行を遅延させる又は延長するだけの可能性もある。
【０２１５】
好ましい実施形態では、このアッセイ系は、（ｉ）対象とするポリペプチド、及び（ii）通常、免疫除去（immunodepletion）によって（又は変異細胞由来の抽出物の使用によって）除去される、対象とする機能的ポリペプチド以外の微小管重合中心核形成活性に必要な構成成分を含む。その構成成分自体は、混合するまで微小管の核形成が起こらないように、通常２つの部分に分けられる。対象とするポリペプチドは、最初に２つの部分のうちの１つに存在してもよく、その後２つの部分の混合前に添加してもよい。
【０２１６】
その後、対象とするポリペプチド及び候補物質を構成成分の混合物に添加し、例えば、対象とするポリペプチドを免疫染色し、免疫蛍光顕微鏡法で星状体形成を視覚化することにより、中心体からの微小管核形成を測定する。構成成分混合物に添加する前に、対象とするポリペプチドを候補物質とともに予めインキュベートしてもよい。或いは、同時に又はどちらかの順に、対象とするポリペプチドと候補物質をどちらも構成成分混合物に直接添加してもよい。
【０２１７】
微小管重合中心核形成に必要な構成成分には通常、Moritz et al., 1998, J. Cell Biol. 142(3):775-86に記載の通りに調製する、塩によって露出させた中心体が含まれる。２ＭのＫＩで中心体調製物を露出させることで、中心体タンパク質ＣＰ６０、ＣＰ１９０、ＣＮＮ及び(チューブリンが取り出される。そのうち、ＣＰ６０とＣＰ１９０は、微小管核形成に不要と思われる。通常、その他の最小限の構成成分を、除去細胞抽出物として提供し、又は、対象とするポリペプチドの非機能的変異体を有する細胞由来の細胞抽出物として提供すると好都合である。通常、標識チューブリン（通常β−チューブリン）も、星状体形成を視覚化する際の助けとなるように添加する。
【０２１８】
或いは、塩によって露出させていない部分的に精製された中心体を、構成成分の一部として使用することもできる。この場合、チューブリン、好ましくは標識チューブリンだけが、構成成分混合物が完成するのに必要である。
【０２１９】
候補物質を、通常終濃度１〜１０００ｎｍｏｌ／ｍｌまで、より好ましくは１〜１００ｎｍｏｌ／ｍｌまで添加する。抗体の場合、使用する終濃度は、通常１００〜５００μｇ／ｍｌ、より好ましくは２００〜３００μｇ／ｍｌである。
【０２２０】
候補物質による星状体形成阻害の程度は、対照の無処理細胞調製物について単位面積当たりの正常な星状体の数を測定し、候補物質で処理した細胞について単位面積当たりの正常な星状体の数を測定し、その結果を比較することによって決定することができる。通常、候補物質は、処理した細胞調製物が、無処理細胞調製物で見られる星状体の数の５０％未満、好ましくは４０、３０、２０又は１０％未満である場合、ＭＴＯＣの全体性を阻害することができるとみなされる。試料間の標準化を可能にするために、(−チューブリンについて細胞を染色して、存在し得るＭＴＯＣの最大数を決定することも望ましい。
【０２２１】
モータータンパク質アッセイ
対象とするポリペプチドは、Ｅｇ５様モータータンパク質などのモータータンパク質とin vitroで相互作用することができる。モータータンパク質をカバーガラス上に固定化したアッセイを用いて、そのようなプロセスに対する候補物質の効果を決定することができる。次いで、ローダミン標識微小管を加え、蛍光顕微鏡法によってその移動を追跡することができる。したがって、候補物質の有無で移動の程度及び／又は速度を比較することにより、候補物質の効果を決定することができる。一般に、対象とするポリペプチドと結合することが知られている候補物質を、このアッセイで試験する。或いは、処理能力の高いアッセイを使用してモータータンパク質の調節因子を同定し、得られた同定物質を、上記に記載のように、対象とするポリペプチドに影響を及ぼすかどうか試験する。
【０２２２】
通常このアッセイは、タキソールによって安定化させた微小管を使用する（例えば、Howard and Hyman 1993, Chandra and Endow, 1993、共に“Motility Assays for Motor Proteins” Ed. Jon Scholey, pub. Academic Press中の章）。しかし対象とするポリペプチドが微小管の安定な重合（上記を参照）を促進する場合、この微小管を運動性アッセイに直接使用することができる。
【０２２３】
通常、相互作用に対する候補物質の効果を試験する前に、モータータンパク質及び対象とするポリペプチドを用いる、上記に記載の単純なタンパク質とタンパク質の結合アッセイを使用して、そのポリペプチドがモータータンパク質と結合することを確認することもできる。
【０２２４】
細胞周期進行ポリペプチドと物質の結合は、一過性、可逆性又は永続性である可能性がある。好ましくは、この物質は、対照ポリペプチド（すなわち、細胞周期進行ポリペプチドでないことが知られているポリペプチド）との結合のＫｄ値より低いＫｄ値でこのポリペプチドと結合する。好ましくは、この物質のＫｄ値は、対照ポリペプチドとの結合のＫｄ値の１／２であり、より好ましくはＫｄ値が１／１００であり、最も好ましくはＫｄ値が対照ポリペプチドとの結合の値の１／１０００である。
【０２２５】
紡錘体の集合及び機能のアッセイ
対象とするポリペプチドの機能及びその機能に対する候補物質の効果を調べるさらなるアッセイは、紡錘体の集合及び機能を測定するアッセイである。通常、そのようなアッセイは、２つの型の紡錘体の集合が可能なアフリカツメガエルの無細胞系を用いて行う。「半紡錘体」の集合経路では、ＣＳＦ停止卵母細胞の細胞質抽出物を、精子染色質と混合する。その後形成する半紡錘体は、互いに融合する。より生理的な方法は、カルシウムの添加によってＣＳＦ停止抽出物を誘導して、間期に入るようにすることであり、このときＤＮＡが複製され、動原体が形成される。次いで、新鮮なＣＳＦ停止抽出物を添加して、中心体複製及び紡錘体形成を伴う有糸分裂を誘導する（このシステムの議論については、Tournebize and Heald, 1996, Nature 382(6590):420-5を参照）。
【０２２６】
さらに、一般に、本明細書に記載のポリペプチド、又は非機能的なポリペプチドの変異体と結合することが知られている候補物質を、このアッセイで試験する。或いは、処理能力の高いアッセイを使用して紡錘体の形成及び機能の調節因子を同定し、得られた同定物質を、上記に記載のように、対象とするポリペプチドの結合に影響を及ぼすかどうか試験する。
【０２２７】
細胞周期進行ポリペプチドと物質の結合は、一過性、可逆性又は永続性である可能性がある。好ましくは、この物質は、対照ポリペプチド（すなわち、細胞周期進行ポリペプチドでないことが知られているポリペプチド）との結合のＫｄ値より低いＫｄ値でこのポリペプチドと結合する。好ましくは、この物質のＫｄ値は、対照ポリペプチドとの結合のＫｄ値の１／２であり、より好ましくはＫｄ値が１／１００であり、最も好ましくはＫｄ値が対照ポリペプチドとの結合の値の１／１０００である。
【０２２８】
ＤＮＡ複製のアッセイ
対象とするポリペプチドの機能及びその機能に対する候補物質の効果を調べる他のアッセイは、ＤＮＡ複製についてのアッセイである。ＤＮＡ複製のアッセイを行うための多数の無細胞系が開発されている。これらを使用して、ある物質の存在下でアッセイを行うことにより、その物質がＤＮＡ複製を妨害又は阻害できるかどうかのアッセイを行うことができる。適切な無細胞アッセイ系には、例えばＳＶ−４０アッセイがある（Li and Kelly, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci USA 81:6973-6977；Waga and Stillman, 1994, Nature 369:207-212）。例えばCrevel and Cotteril, 1991, EMBO J. 10:4361-4369に記載のようなショウジョウバエの無細胞複製系を使用することもできる。好ましいアッセイは、Blow and Laskey (1986, Cell 47:577-587)及びSheehan et al. (1988, J. Cell Biol. 106:1-12)に記載のアフリカツメガエル卵の低速遠心上清抽出物に由来する無細胞アッセイであり、これは、アフリカツメガエル精子ＤＮＡからなる基質、又はＨｅＬａ核へのヌクレオチドの取り込みを測定する。ヌクレオチドを放射標識し、シンチレーション計測によってその取り込みのアッセイを行ってもよい。或いは、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を核酸代替物として用い、複製活性を密度代替によって測定することも好ましい。後者のアッセイは、真の複製開始事象をＤＮＡ修復の結果である取り込みから区別することができる。Krude et al., 1997, Cell 88:109-19により報告されたヒト無細胞複製アッセイを使用して、対象とするポリペプチドに対する物質の効果についてアッセイを行うこともできる。
【０２２９】
物質が細胞周期進行活性を阻害し又は低下させることが認められたとき、その物質はそのような活性を阻害するものとして同定される。一般に、１つ又は複数の細胞周期進行のこれらの局面を阻害する物質は、それを完全に阻害し、又は対照（すなわち、細胞周期進行の１つ又は複数の局面を調節しないことが知られている物質）と比べて、濃度５０ｍＭ未満でタンパク質活性の有意（すなわち５０％を超える）な低下を誘導する。好ましくは、その阻害は対照と比べて７５％であり、より好ましくは９０％、最も好ましくは対照と比べて９５％又は１００％である。その阻害は、細胞周期進行を妨害する可能性もあり、単に細胞周期進行を遅延させる又は延長するだけの可能性もある。
【０２３０】
他のin vitroアッセイ
対象とするポリペプチドと結合する物質を同定する他のアッセイも提供する。例えば、当技術分野で知られているように、アフリカツメガエル卵に由来するin vitro無細胞系を用いて、染色体濃縮に影響を及ぼす物質のアッセイを行うことができる。
【０２３１】
細胞周期進行ポリペプチドと物質の結合は、一過性、可逆性又は永続性である可能性がある。好ましくは、この物質は、対照ポリペプチド（すなわち、細胞周期進行ポリペプチドでないことが知られているポリペプチド）との結合のＫｄ値より低いＫｄ値でこのポリペプチドと結合する。好ましくは、この物質のＫｄ値は、対照ポリペプチドとの結合のＫｄ値の１／２であり、より好ましくはＫｄ値が１／１００であり、最も好ましくはＫｄ値が対照ポリペプチドとの結合の値の１／１０００である。
【０２３２】
キナーゼ活性又はタンパク質分解活性に影響を及ぼす物質は重要である。例えば、ユビキチン−プロテアソームが媒介するタンパク質分解の時間的な制御が、正常なＧ１期及びＳ期の進行に重要であることが知られている（Krek, 1998, Curr Opin Genet Dev 8:36-42に概説されている）。ＳＣＦ（Ｓｋｐ１−キュリン（cullin）−Ｆボックスタンパク質リガーゼ複合体）と称される多数のＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼは、ユビキチン化反応物に基質特異性を与えるが、タンパク質キナーゼは、分解する予定の基質をリン酸化し、それを、ＳＣＦによって触媒されるユビキチン修飾に好ましい標的に転換する。さらに、後期促進複合体／サイクロソーム（ＡＰＣ／Ｃ）による、ユビキチンが媒介するタンパク質分解は、有糸分裂中の姉妹染色分体の分離、及び有糸分裂からの脱出に不可欠である（Listovsky et al., 2000, Exp Cell Res 255:184-191）。
【０２３３】
キナーゼ活性を阻害する又はそれに影響を及ぼす物質は、当技術分野で知られているキナーゼアッセイを用いて、例えば候補物質の存在下で適当なペプチド又は他の基質への３２Ｐの取り込みを測定することによって同定することができる。同様に、適当なポリペプチド基質の切断の増大又は低下を検出することにより、タンパク質分解活性を阻害する又はそれに影響を及ぼす物質のアッセイを行うことができる。
【０２３４】
この及び他のタンパク質又はポリペプチドの活性についてのアッセイは、当業者に知られており、適切に使用して、対象とするポリペプチドと結合しその活性に影響を及ぼす物質を同定することができる。
【０２３５】
全細胞アッセイ
細胞全体に対して、有糸分裂及び／又は減数分裂を含む細胞周期進行に対するその影響について候補物質を試験することもできる。好ましくは、その候補物質は、上記に記載のin vitroの方法によって同定されている。或いは、細胞分裂、通常は有糸分裂を阻害できる物質の処理能力の速いスクリーニングを、予備的なスクリーニングとして使用し、次いで上記に記載のin vitroアッセイに使用して、その影響が対象とする特定のポリペプチドに対するものであることを確認することができる。
【０２３６】
複数の方法で、候補物質、すなわち試験化合物を細胞に投与することができる。例えば、それを細胞培養培地に直接添加することもでき、細胞内に注入することもできる。或いは、ポリペプチドの候補物質の場合、細胞を核酸構築物で形質転換し、細胞内でそのポリペプチドの発現を誘導することができる。好ましくは、そのポリペプチドの発現は、調節可能なプロモーターの制御下にある。
【０２３７】
通常、上記に記載の方法によって同定された候補物質の、細胞分裂周期の特定の段階に対する効果を決定するアッセイは、候補物質を細胞に投与するステップと、その物質が細胞分裂周期のその段階を阻害するかどうかを確認するステップとを含む。細胞集団における細胞周期進行を測定する技術は、当技術分野で周知である。処理した細胞における細胞周期進行の程度を、無処理の対照細胞集団における細胞周期進行の程度と比較して、阻害がもしあればその阻害の程度を決定する。例えば、有糸分裂／減数分裂に向かうことができない、集団内の細胞の割合を測定し、無処理集団における細胞の割合とこれを比較するすることにより、有糸分裂又は減数分裂の抑制因子のアッセイを行うことができる。
【０２３８】
使用する候補物質の濃度は通常、その細胞内の終濃度が in vitroアッセイについて上記に記載したものと類似するようなものである。
【０２３９】
候補物質は通常、細胞分裂周期の特定の段階（すなわち、有糸分裂）に向かう細胞の割合が無処理対照細胞集団で観察される割合の５０％未満、好ましくは４０、３０、２０又は１０％未満である場合、細胞分裂周期における特定の段階（例えば、有糸分裂）の抑制因子であるとみなされる。
【０２４０】
上記のアッセイにおいて、対象とするポリペプチドが表１に示すいずれかの核酸配列によってコードされるポリペプチドであると適切である。
【０２４１】
治療上の使用
多数の腫瘍が、細胞周期進行における欠陥、例えば正常な細胞周期制御の欠失に関係している。したがって、腫瘍細胞は急速な、またしばしば異常な有糸分裂を示すことがある。したがって、癌を治療するための１つの治療上の手法は、急速に分裂する細胞の有糸分裂を阻害することである。一般に、このような手法を、どんな増殖性疾患の治療に使用することもできる。一般に、増殖性疾患は、その疾患又は疾病と関係する細胞増殖が、対照と比べて有意に（すなわち、５０％以上）阻害されている場合、「治療」されていると定義される。好ましくは、その阻害は対照と比べて７５％であり、より好ましくは９０％、最も好ましくは対照と比べて９５％又は１００％である。その阻害は、細胞増殖を妨害する可能性もあり、単に細胞増殖を遅延させる又は延長するだけの可能性もある。
【０２４２】
したがって、記載のポリペプチドが正常な細胞周期進行に必要であると思われるので、これは、特に腫瘍細胞及び他の増殖性細胞においてその機能の阻害の標的となる。癌を治療するための他の治療上の手法は、抗血管新生手法でもよく、この手法では血管新生を標的とし、したがって腫瘍の血管の成長が阻害され、それによって腫瘍の血液供給が奪われる。
【０２４３】
本明細書において、増殖異常という用語は広い意味で、細胞周期の制御を必要とするどんな異常をも、例えば、再狭窄や心筋症などの心血管異常、糸球体腎炎や慢性関節リウマチなどの自己免疫異常、乾癬などの皮膚異常、マラリア、気腫、脱毛などの抗炎症性、抗真菌性、抗寄生虫性異常を含むように使用される。
【０２４４】
増殖異常には、悪性及び前腫瘍性異常も含まれる。本明細書に記載の方法及び組成物は、肺小細胞癌、腎癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、大腸癌、乳癌などの腺癌の治療又は診断に関して特に有用である。例えば、治療の可能性がある悪性腫瘍には、急性及び慢性白血病、リンパ腫、骨髄腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、リンパ管内皮肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、リンパ管肉腫、滑膜腫、中皮腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫などの肉腫、大腸癌、卵巣癌、前立腺癌、膵癌、乳癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、絨毛癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、精上皮腫、胎生期癌、子宮頚癌、精巣腫瘍、肺癌、肺小細胞癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽腫、聴覚神経腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、希突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、並びに網膜芽細胞腫がある。
【０２４５】
考えられる１つの手法は、遺伝子機能を阻害し、腫瘍細胞の細胞周期進行を妨害するために、好ましくは腫瘍細胞に選択的に、本明細書に記載のポリヌクレオチドに対するアンチセンス構築物を発現させることである。アンチセンス構築物を使用して、遺伝子機能を阻害し、増殖性細胞の細胞周期進行を妨害することもできる。他の手法は、細胞周期機構の細胞性構成成分について内因性遺伝子産物と競合することにより機能阻害を引き起こす、本文書に記載のポリペプチドの非機能的変異体を使用することである。或いは、本明細書に記載のポリペプチドと結合する、上記に記載のアッセイによって同定された化合物を腫瘍又は増殖性細胞に投与して、そのポリペプチドの機能を妨害することもできる。このことは、例えば、遺伝子治療を用いて、又は化合物の直接投与によって実現することができる。本明細書に記載の適切な抗体を、治療薬として使用することもできる。
【０２４６】
或いは、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡは、一連の生物における遺伝子発現に干渉する強力な方法であり、哺乳動物で成功することが最近示されている（Wianny and Zernicka-Goetz, 2000, Nat Cell Biol 2:70-75）。本明細書に記載のポリヌクレオチドの配列に対応する二本鎖ＲＮＡを候補生物の卵母細胞及び細胞に導入して又はその中で発現させて、細胞分裂周期進行に干渉することができる。
【０２４７】
さらに、本明細書に記載の多数の変異は、異常な減数分裂の表現型を示す。有糸分裂ではなく減数分裂だけに影響を及ぼす変異は、生存できるが、生存できる配偶子を産生することができず、したがって生殖能力がない生物を生じさせることになるため、異常な減数分裂は、不妊における重要な要因である。したがって、減数分裂に関与する遺伝子の解明は、生殖の問題の診断及び予防／処置における重要なステップである。したがって、減数分裂に影響を及ぼす物質を同定する方法に、減数分裂に欠陥がある変異ショウジョウバエで同定されたポリペプチド（実施例で明確に示す）を使用することができる。さらに、このポリペプチド、及びそれに対応するポリヌクレオチドを使用して、減数分裂について研究し、不妊を示す、考えられる変異を同定することができる。このことは、不妊の問題の診断に役立つであろう。
【０２４８】
投与
本明細書に記載のアッセイ法によって同定された又は同定できる物質は、好ましくは、様々な成分と組み合わせて、有用な組成物を作成することができる。好ましくは、その組成物を薬学的に許容される担体又は希釈剤と組み合わせて、医薬組成物を作成する（これはヒト使用のためのものでもよく動物使用のためのものでもよい）。適切な担体及び希釈剤には、等張食塩水液、例えばリン酸緩衝食塩水液がある。この組成物を直接注射によって投与することができる。非経口、筋内、静脈内、皮下、眼内又は経皮投与用に、この組成物を処方することができる。通常、体重１ｋｇ当たり０．０１〜３０ｍｇの投与量で、好ましくは１ｋｇ当たり０．１〜１０ｍｇで、より好ましくは体重１ｋｇ当たり０．１〜１ｍｇの投与量で各タンパク質を投与することができる。
【０２４９】
細胞周期進行を阻害する、例えば有糸分裂又は減数分裂を阻害する際に使用するポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド／ベクター（又はアンチセンス構築物）は、むき出しの核酸構築物として直接投与することができる。これはさらに、宿主細胞ゲノムと相同な隣接配列を含んでよい。むき出しの核酸としてポリヌクレオチド／ベクターを投与するとき、投与する核酸の量は、通常１μｇ〜１０ｍｇ、好ましくは１００μｇ〜１ｍｇでよい。例えば、適切な調節構築物により、又は標的ウイルスベクターの使用により、腫瘍又は増殖性細胞を特異的に標的とするポリヌクレオチド／ベクターを使用することが特に好ましい。
【０２５０】
哺乳動物細胞によるむき出しの核酸構築物の取り込みは、複数の既知のトランスフェクション技術、例えばトランスフェクション用薬剤の使用を含むものによって促進される。この薬剤の例には、陽イオン剤（例えば、リン酸カルシウム及びＤＥＡＥデキストラン）及びリポフェクション用薬剤（lipofectant）（例えばlipofectam（商標）及びtransfectam（商標））がある。通常、核酸構築物をトランスフェクション用薬剤と混合して、組成物を作成する。
【０２５１】
好ましくは、本明細書に記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド、化合物又はベクターを、膜転移配列と共役させ、接合し、連結し、融合させ、又はその他の形で結合させることができる。
【０２５２】
好ましくは、細胞質膜及び／又は核膜を通り抜けることができるタンパク質（すなわち、膜転移配列）と共役させ、接合し、連結し、融合させ、又はその他の形で結合させることにより、本明細書に記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド、化合物又はベクターなどを細胞内に送達することができる。好ましくは、対象とする物質を、転移活性の原因であるそのようなタンパク質由来のドメイン又は配列と融合又は共役させる。転移ドメイン及び配列には、例えばＨＩＶ−１トランス活性化タンパク質（Ｔａｔ）由来のドメイン及び配列、ショウジョウバエアンテナペディアホメオドメインタンパク質、並びに単純ヘルペス１ウイルスＶＰ２２タンパク質がある。極めて好ましい実施形態では、対象とする物質をペネトラチン（penetratin）タンパク質又はそのフラグメントと共役させる。ペネトラチンは、配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫを含み、Derossi et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:10444-50に記載され、細胞内送達のためのペネトラチンと薬剤の共役物の使用は、ＷＯ  ００／０１４１７号に記載されている。ＷＯ  ００／２９２７号に記載のように、切断型及び改変型のペネトラチンを使用することもできる。
【０２５３】
好ましくは、そのポリヌクレオチド、ポリペプチド、化合物又はベクターを、薬学的に許容される担体又は希釈剤と組み合わせて、医薬組成物を作成する。適切な担体及び希釈剤には、等張食塩水液、例えばリン酸緩衝食塩水液がある。非経口、筋内、静脈内、皮下、眼内又は経皮投与用に、この組成物を処方することができる。
【０２５４】
経時放出型又は持続放出型送達系の使用をも、本開示に含まれる。このような系は、手術が困難又は不可能である状況、例えば患者が加齢又は疾患の経過自体で衰弱している状況、又は損益分析で管理が治療を上回ると決定する状況に極めて望ましい。
【０２５５】
本明細書において、持続放出マトリックスとは、酵素又は酸／塩基による加水分解、又は溶解によって分解可能な物質、通常はポリマーから作成されるマトリックスである。体内に挿入された後、このマトリックスは酵素及び体液によって作用する。持続放出マトリックスは、望ましくは生体適合性物質から選択される。
【０２５６】
熟練開業医であれば、任意の特定の患者及び状態でも最適な投与経路及び投与量を容易に決定できると思われるので、記載した投与経路及び投与量は、単に指針であるものとする。
【０２５７】
さらなる態様
次に、本発明のさらなる態様及び実施形態を下記の段落に示す；本発明がこれらの態様を包含することが理解されるはずである。これらの段落では、細胞周期進行ポリペプチドという用語には、好ましくは配列リストに示す偶数の配列番号が含まれるべきであり、細胞周期進行核酸という用語には、好ましくは配列リストに示す偶数の配列番号が含まれるべきである。
【０２５８】
細胞周期進行ポリペプチドの機能を調節する作用因子を同定する方法について記載し、その方法は、（ａ）細胞周期進行ポリペプチド及び候補作用因子を含む試料を提供するステップと、（ｂ）試料内での候補作用因子と細胞周期進行ポリペプチドの結合を測定するステップと、（ｃ）試料内での候補作用因子と細胞周期進行ポリペプチドの結合を、細胞周期進行ポリペプチドと結合しないことが知られている対照作用因子と細胞周期進行ポリペプチドの結合を比較するステップを含み、対照作用因子と細胞周期進行ポリペプチドの結合と比べて試料内での候補作用因子と細胞周期進行ポリペプチドの結合が増加していると、候補作用因子が細胞周期進行ポリペプチドの機能を調節することが示唆される。
【０２５９】
試料中に細胞周期進行ポリペプチドが存在するかどうかを検出する方法についても記載し、その方法は、（ａ）ハイブリダイズする条件下で、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む生物試料を、細胞周期進行核酸の少なくとも１５ヌクレオチドのフラグメントを含むプローブと接触させるステップと、（ｂ）プローブと試料中の核酸との間に形成される二重鎖を検出するステップとを含み、二重鎖が検出されると、試料中に細胞周期進行ポリペプチドが存在することが示唆される。
【０２６０】
試料中に細胞周期進行ポリペプチドが存在するかどうかを検出する方法について記載し、その方法は、（ａ）細胞周期進行ポリペプチドと結合することができる抗体を提供するステップと、（ｂ）抗体−抗原複合体の形成が可能な条件下で生物試料を前記抗体とともにインキュベートするステップと、（ｃ）前記抗体を含む抗体−抗原複合体を検出するステップとを含み、抗体−抗原複合体が検出されると、試料中に細胞周期進行ポリペプチドが存在することが示唆される。
【０２６１】
細胞内で細胞周期進行を調節する方法について記載し、その方法は、（ａ）制御配列と作動的に連結している二本鎖の細胞周期進行核酸配列又はその相補体を細胞内に導入して形質転換するステップと、（ｂ）その核酸配列が発現する条件下で細胞を培養するステップとを含み、それによって細胞内で細胞周期進行が調節される。
【０２６２】
細胞内で細胞周期進行を調節する方法について記載し、その方法は、（ａ）制御配列と作動的に連結している、細胞周期進行ポリペプチドをコードする二本鎖核酸配列を細胞内に導入して形質転換するステップと、（ｂ）その核酸配列が発現する条件下で細胞を培養するステップとを含み、それによって細胞内で細胞周期進行が調節される。
【０２６３】
細胞内で細胞周期進行を調節する方法について記載し、その方法は、（ａ）制御配列と作動的に連結している、細胞周期進行ポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする二本鎖核酸配列を細胞内に導入して形質転換するステップと、（ｂ）その核酸配列が発現する条件下で細胞を培養するステップとを含み、それによって細胞内で細胞周期進行が調節される。
【０２６４】
細胞内で細胞周期進行を調節する方法について記載し、その方法は、（ａ）細胞に、（ｉ）細胞周期進行核酸配列の連続した１５〜４０ヌクレオチドと同一な、長さ１５〜４０ヌクレオチドの配列を含む第１基部と、（ii）細胞周期進行核酸配列の連続した１５〜４０ヌクレオチドと相補的な、長さ１５〜４０ヌクレオチドの配列を含む第２基部と、（iii）その２つの基部を連結するループ部とを含み、第１基部と第２基部が互いにハイブリダイズして二本鎖基部を形成することができるリボ核酸（ＲＮＡ）前駆体をコードする核酸配列と作動的に連結した制御配列を含む単離核酸配列を導入して形質転換するステップと、（ｂ）核酸配列が発現する条件下でその細胞を培養するステップとを含み、それによって細胞内で細胞周期進行が調節される。
【０２６５】
本明細書に記載の方法のいずれかでは、核酸配列は、細胞周期進行核酸配列又はその相補体である。その核酸配列は、細胞周期進行ポリペプチドをコードし得る。その核酸配列は、細胞周期進行ポリペプチドと８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードし得る。
【０２６６】
本明細書に記載の方法を使用して、細胞周期進行を遅延させることができる。その遅延によって、細胞の増殖を低下させることができる。
【０２６７】
本明細書に記載の方法を使用して、細胞周期進行を促進することができる。その促進によって、細胞の増殖を促進することができる。
【０２６８】
細胞周期進行核酸配列によってコードされるＲＮＡ前駆体について記載する。そのようなＲＮＡ前駆体は、生物活性成分である組成物中に含まれ得る。そのようなＲＮＡ前駆体又は組成物は、哺乳動物の組織をそのＲＮＡ前駆体又は組成物に接触させることにより、その組織での細胞増殖を特徴とする疾患又は疾病の治療に使用することができる。その疾患は、癌である可能性がある。
【０２６９】
本明細書に記載の方法によって形質転換された宿主細胞について記載する。そのような宿主細胞は、細胞周期進行核酸配列の全部又は一部を含む可能性がある。そのような宿主細胞は、細胞周期進行ポリペプチド配列の全部又は一部を発現することができる。
【０２７０】
本明細書に記載の方法を使用して、抗増殖性タンパク質を哺乳動物に提供することができ、この方法は、本明細書に記載の方法によって形質転換された哺乳動物細胞を哺乳動物中に導入するステップを含む。
【０２７１】
有効成分として、細胞周期進行核酸配列と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物について記載する。
【０２７２】
有効成分として、細胞周期進行ポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物について記載する。
【０２７３】
有効成分として、細胞周期進行核酸配列に対する抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物について記載する。哺乳動物の組織での細胞増殖を特徴とする疾患又は疾病を診断する方法にそのような抗体を使用することができ、その方法は、その組織を抗体と接触させるステップと、抗体／抗原複合体を検出するステップとを含み、前記検出によって前記疾患又は疾病が示唆される。
【０２７４】
有効成分として、細胞周期進行ポリペプチドに対する抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物について記載する。哺乳動物の組織での細胞増殖を特徴とする疾患又は疾病を診断する方法にそのような抗体を使用することができ、その方法は、その組織を抗体と接触させるステップと、抗体／抗原複合体を検出するステップとを含み、前記検出によって前記疾患又は疾病が示唆される。
【０２７５】
哺乳動物の組織での細胞増殖を特徴とする疾患又は疾病を治療する方法について記載し、その方法は、細胞周期進行ポリペプチドのアンタゴニストとその組織を接触させるステップを含む。
【０２７６】
哺乳動物の組織での細胞増殖を特徴とする疾患又は疾病を治療する方法について記載し、その方法は、細胞周期進行ポリペプチドのアゴニストとその組織を接触させるステップを含む。
【０２７７】
哺乳動物の組織での細胞増殖を特徴とする疾患又は疾病を治療するためのキットについて記載し、そのキットは、（ａ）細胞周期進行核酸配列によってコードされるポリペプチド、（ｂ）細胞周期進行ヌクレオチド配列を有する核酸、又は（ｃ）（ａ）のポリペプチドのエピトープを認識する抗体を含む。
【０２７８】
細胞周期進行核酸配列を有する細胞周期進行遺伝子を少なくとも２つ含むアレイについて記載する。その核酸配列は、ＤＮＡ配列である可能性がある。その核酸配列は、ＲＮＡ配列である可能性がある。
【０２７９】
示すポリペプチドの配列を有する細胞周期進行タンパク質を少なくとも２つ含むアレイについて記載する。したがって、最初の態様では、（ｉ）表１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ii）表１に示す核酸によってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、（iii）ｉ）又はii）と少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチド、（iv）表１に示す配列を有する、又はｉ）〜iii）のいずれかに示す配列を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｖ）iv）に示す配列と選択的にハイブリダイズすることができる核酸、或いは（vi）iv）又はｖ）の相補体の機能活性を増大させ、低下させ、又はその他の形で変化させるステップを含む、細胞内で細胞周期進行を調節する方法が提供される。
【０２８０】
適切には、その方法は、遺伝子発現を低下させるステップを含む。好ましい実施形態では、その方法は、その核酸に対応する二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ、又はその核酸に対応するアンチセンスＲＮＡ、或いはそのフラグメントを細胞内に導入することにより、核酸の機能活性を低下させるステップを含む。
【０２８１】
他の実施形態では、その方法は、遺伝子発現を増大させるステップを含む。
【０２８２】
特に好ましい実施形態では、核酸又はポリペプチドは、表１に示すヒト核酸又はポリペプチドを含む。
【０２８３】
一実施形態では、その方法は、（ａ）（ｉ）表１に示す配列を有する核酸、（ii）ストリンジェントな条件下でｉ）に示す配列とハイブリダイズする核酸、又は（iii）ii）の相補体からなる群から選択される核酸配列を含む発現ベクターを提供するステップと、（ｂ）その発現ベクターを細胞内に導入し、細胞内でのコードされたポリペプチドの発現を可能にする条件下で細胞を維持するステップとを含む。
【０２８４】
細胞周期進行に関与する遺伝子を知ることにより、異常な細胞周期進行と関係する病状の治療に関する治療薬の開発が可能となる。
【０２８５】
したがって、個体の疾患の予防、治療又は診断の方法における、表１に示す核酸又は表１に示すポリペプチド或いはそのフラグメントの使用について記載する。
【０２８６】
適切には、核酸又はポリペプチドは、表１に示すヒト核酸又はポリペプチドを含む。
【０２８７】
一実施形態では、この核酸又はポリペプチドを使用して、このポリペプチドと結合することができる物質を同定し、この方法は、このポリペプチドを、候補物質とともに適切な条件下でインキュベートするステップと、この物質がこのポリペプチドと結合するかどうかを確認するステップとを含む。
【０２８８】
他の実施形態では、この核酸又はポリペプチドを使用して、このポリペプチドの機能を調節することができる物質を同定し、この方法は、このポリペプチドを、候補物質とともにインキュベートするステップと、このポリペプチドの活性がそれによって調節されたかどうかを確認するステップとを含む。
【０２８９】
したがって、細胞周期進行を阻害できる物質を同定するアッセイにおける、表１に示す核酸によってコードされる細胞同期進行ポリペプチドの使用について記載する。
【０２９０】
そのような治療を必要とする個体に、核酸又はポリペプチドを投与することができる。その代替として、又はそれに加えて、この方法によって同定された物質を、そのような治療を必要とする個体に投与する。
【０２９１】
上記の使用によって同定された物質も提供される。細胞周期進行に、例えば有糸分裂及び／又は減数分裂に影響を及ぼす方法などの治療法に、このような物質を使用することができる。
【０２９２】
（ａ）上記の方法の１つを行うステップと、（ｂ）そのようなポリペプチドと結合することができるものとして同定された、１又は複数の物質を多量に調製するステップとを含むプロセスについて記載する。
【０２９３】
（ａ）上記の方法の１つを行うステップと、（ｂ）ポリペプチドと結合することができるものとして同定された、１又は複数の物質を含む医薬組成物を調製するステップとを含むプロセスも提供される。
【０２９４】
その使用は、診断の方法のためのものでよく、その場合、（ａ）ハイブリダイズする条件下で、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む生物試料を、表１に示す核酸の少なくとも１５ヌクレオチドのフラグメントを含むプローブと接触させるステップと、（ｂ）プローブと試料中の核酸との間に形成される二重鎖が検出するステップとを含む方法で、生物試料中の核酸の有無を検出する。
【０２９５】
その代替として、又はそれに加えて、（ａ）ポリペプチドと結合することができる抗体を提供するステップと、（ｂ）抗体−抗原複合体の形成が可能な条件下で生物試料を前記抗体とともにインキュベートするステップと、（ｃ）前記抗体を含む抗体−抗原複合体が形成されたかどうかを確認するステップとを含む方法で、生物試料中のポリペプチドの有無を検出する。
【０２９６】
特に好ましい実施形態では、この疾患は、細胞周期の欠陥に関係する疾患、特に癌などの増殖性疾患を含む。
【０２９７】
薬学的に許容される担体又は希釈剤と一緒に、以下のもののうち１又は複数のいずれかを含む医薬組成物について記載する：表１に示す核酸によってコードされるポリペプチド又はその一部；表１に示す核酸を含むベクター；表１に示す核酸配列によってコードされるポリペプチドのエピトープを認識する抗体。
【０２９８】
一実施形態では、この医薬組成物はワクチン組成物である。
【０２９９】
さらなる態様では、治療に使用する、表１に示す核酸が提供される。
【０３００】
さらなる態様では、治療に使用する、表１に示す核酸によってコードされるポリペプチドが提供される。
【０３０１】
さらなる態様では、治療に使用する、表１に示す核酸によってコードされるポリペプチドと結合することができる抗体が提供される。
【０３０２】
或いは、表１に示す核酸によってコードされる細胞周期進行タンパク質の活性増強に関係する疾患に罹患している患者を治療する方法についても記載し、この方法は、前記細胞周期進行タンパク質のアンタゴニストを患者に投与するステップを含む。
【０３０３】
他の態様では、表１に示す核酸によってコードされる細胞周期進行タンパク質の活性低下に関係する疾患に罹患している患者を治療する方法が提供され、この方法は、前記細胞周期進行タンパク質のアゴニストを患者に投与するステップを含む。
【０３０４】
さらなる態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド又は抗体を含むキット、並びに有害な変異体を含めたポリヌクレオチド及びポリペプチドの有無の診断にそのようなキットを使用する方法について記載する。
【０３０５】
したがって、以下のもののうち１又は複数のいずれかを含む、疾患又は疾患に対する感受性の診断キットが提供される：表１に示す核酸配列によってコードされるポリペプチド又はその一部；表１に示すヌクレオチド配列を有する核酸；表１に示すヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされるポリペプチドのエピトープを認識する抗体。
【０３０６】
一実施形態では、前記診断キットは、表１に示す核酸配列又はそのフラグメントを有する細胞周期進行遺伝子を少なくとも２つ含む核酸又は他のマイクロアレイなどのアレイを含む。そのフラグメントは、長さ１５ヌクレオチド以上、最大でその遺伝子の全長でもよい。
【０３０７】
適切には、この疾患又は症候群は、癌などの、異常な細胞周期又は増殖と関係するものである。
【実施例】
【０３０８】
次に、実施例により、本発明についてさらに記載するが、この実施例は本発明を実施する際に当業者の助けとなるように働くことを意味するものであり、本発明の範囲をどんな形にも限定するものではない。
【０３０９】
緒言
新しいヒト細胞周期調節遺伝子を同定するために、培養ショウジョウバエ細胞でＲＮＡｉを基礎にしたノックダウン手法を行い、その後有糸分裂指数を評価する（Cellomics Arrayscan）ことにより、細胞周期進行におけるそのショウジョウバエの同等物の役割を明らかにし、ヒト細胞でＲＮＡｉを行い、その後ＦＡＣＳ分析及び顕微鏡観察を行うことにより、ヒト遺伝子の役割を確認することによって候補遺伝子を同定した。
【０３１０】
データが記載されている、ヒト細胞周期進行遺伝子及びそのショウジョウバエの同等物を表１に提示する。複数のタンパク質の配列ｇｉ番号が列挙され、ショウジョウバエ遺伝子の選択的転写物又はスプライシング変異体がそのデータベースに列挙されている。これらのヒト及びショウジョウバエの遺伝子及びタンパク質は、例えば、抗増殖性分子をスクリーニングするのに有用である。
【０３１１】
その相同性（ショウジョウバエ及びヒト）は、その遺伝子の領域内での集団の相同性であり、ヒト遺伝子全体とショウジョウバエ全体の比較とは無関係である。引用した類似性は、その遺伝子の相同性が最も高い領域と関係する。そのスコアは、相同性の確実性も示し、スコアが高いと確実性も高いことを示す。そのスコアは、百分率の類似性だけでなく、その類似性が拡張する配列の長さとも関係する。
【０３１２】
この相同体は、ＢＬＡＳＴ検索を行い、相同性が最も高い、すなわち、偶然によらない整合度に従って、遺伝子が降順に順位付けられている検索結果リストの最上位に最も近いヒトタンパク質を同定することによって同定されている。ある場合には、ショウジョウバエとヒトの遺伝子に相同性がある他の部分が存在する。
【０３１３】
【表１】
2006515754.tif 000003
【０３１４】
2006515754.tif 000004
【０３１５】
2006515754.tif 000005
【０３１６】
2006515754.tif 000006
【０３１７】
2006515754.tif 000007
【０３１８】
2006515754.tif 000008
【０３１９】
１）Ｄ．ＭＥＬ−２ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの合成
ｉ）ゲノムＤＮＡ
樹立培養物由来のＤ．Ｍｅｌ−２細胞を、ショウジョウバエＳＦＭ／グルタミン／Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ入りの５００ｍｌエレンマイヤーフラスコ中で、培養物が１ｍｌ当たり細胞２×１０７個に達するまで、２８℃で増殖させた。
【０３２０】
細胞をペレットにし、ＰＢＳ５０ｍｌで２回洗浄し、次いでこのペレットを１倍量（１０ｍｌ）の消化緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  トリス  ｐＨ８、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌ  プロテイナーゼＫ）中に再懸濁させ、５０℃で１５分間（Hybaid 回転器で）インキュベートした ＤＮＡを等量のフェノール／クロロホルムで３回、等量のクロロホルムで２回抽出した。
【０３２１】
次いで、１／２量の７．５Ｍ酢酸アンモニウム及び２倍量の９７％エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させ、−２０℃で１５分間インキュベートし、次いで１００００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心した。そのペレットを７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、次いで１０ｍＭトリス（ｐＨ８．５）１２ｍｌに溶解させた。
【０３２２】
ＰＣＲ反応でゲノムＤＮＡ鋳型を必要とするすべてのショウジョウバエ遺伝子を増幅するのに十分なゲノムＤＮＡを得るために、この手順をさらに７回反復し、ゲノムＤＮＡを貯留し、その濃度をＡ２６０／Ａ２８０値を測定することによって評価した。
【０３２３】
ii）ｃＤＮＡ
Ｄ．Ｍｅｌ−２全ＲＮＡを以下の通りに調製した：
【０３２４】
１ｍｌ当たり細胞５×１０６個のＤＭＥＬ−２培養物５０ｍｌから細胞をペレットにし、それをＰＢＳ５０ｍｌで２回洗浄し、次いで、コレックス（corex）管内で、４ｍｌの変性溶液（４Ｍグアニジンチオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５％Ｎ−ラウリルサルコシン（サルコシル）、０．１Ｍ  ２−メルカプトエタノール）中に再懸濁させた。
【０３２５】
ｐＨ４．０の２Ｍ  酢酸ナトリウムを４００μｌ加え、転倒混和した後、水飽和フェノールを４ｍｌ、その後４９：１のクロロホルム／イソアミルアルコールを８００μｌ加え、次いでその懸濁物を氷上で１５分間インキュベートした。次いでその混合物を１００００ｒｐｍで３０分間遠心し、水相を新しい管に移した。イソプロパノールを４ｍｌ加えてＲＮＡを沈殿させ、２０℃で２０分間インキュベートした。ＲＮＡを４℃、１００００ｒｐｍで３０分間遠心してＲＮＡをペレットにし、そのペレットを変性溶液１２００μｌ中に溶解させた。２回目にイソプロパノールを１２００μｌ加えてＲＮＡを沈殿させ、−２０℃で２０分間インキュベートした。次いでその混合物を４℃、１００００ｒｐｍで３０分間遠心してＲＮＡをペレットにし、ついでそれを７５％エタノール１ｍｌで洗浄し、室温で１０分間インキュベートし、次いで４℃で５分間遠心した。その上清を除去し、ペレットを乾燥させた後、ＲＮａｓｅ及びＤＮａｓｅを含まない水８００μｌ中にそれを再懸濁させた。全ＲＮＡ調製物の濃度を、Ａ２６０／Ａ２８０値から評価した。
【０３２６】
ＲＴ−ＰＣＲ用SuperScript（商標）第１鎖合成システム（Invitrogen Ltd, 3 Fountain Drive, Inchinnan Business Park, Paisley PA4 9RF, UK）を用いて、Ｄ．Ｍｅｌ−２ｃＤＮＡを調製した。
【０３２７】
ＰＣＲ反応でｃＤＮＡ鋳型を必要とするすべてのショウジョウバエ遺伝子を増幅するのに十分なｃＤＮＡを調製するために、９６穴プレート中で９６  ５０μｌのｃＤＮＡ調製物の反応を以下の通りに実施した：
【０３２８】
反応混合物（１）（Ｄ．Ｍｅｌ−２ＲＮＡ  ８００μｇ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物２５０μｌ、５００μｇ／ｍｌオリゴｄＴプライマー２５０μｌ、ＲＮａｓｅ及びＤＮａｓｅを含まない水を終量２．６ｍｌまで加える）を調製し、９６穴プレートの各穴に２６μｌずつ分注し、次いで６５℃で５分間インキュベートした。
【０３２９】
反応混合物（２）（１０×ＲＴ緩衝液５００μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  １０００μｌ、０．１Ｍ  ＤＴＴ  ５００μｌ、ＲＮａｓｅ  ＯＵＴ  ２５０μｌ及びSuperScript（商標）II  ＲＴ  ２５０μｌ）を調製し、それを４２℃で２分間予め温めておき、次いで反応混合物（１）を２６μｌ含む９６穴プレートの各穴に２５μｌずつ加えた。
【０３３０】
そのプレートを熱密封し、ＰＴＣ−２２５サーモサイクラー（MJ Research, 590 Lincoln Street, Waltham, MA 02451-1003, USA）上で４２℃で１時間、次いで７０℃で１５分間インキュベートした。この反応物を氷上に５分間置き、次いでＲＮａｓｅ  Ｈを各穴に２．５μｌ加え、これを３７℃で２０分間インキュベートした。この反応物を貯留し、混合し、２００μｌのアリコートとして−２０℃で保存した。
【０３３１】
２）ショウジョウバエ遺伝子特異的ｄｓＲＮＡの生成
ｉ）ＲＮＡｉプライマーの設計及び注文
ｄｓＲＮＡの調製のための鋳型として使用するショウジョウバエ遺伝子群の特定の配列を増幅するためのプライマーを、PhilaSysプライマー設計プログラム（PhilaSysArnis Software Pvt. Ltd 120-1A Elephant Rock Road, 3 Brock Jaayenagar, Bangalore 560011, India）を用いて設計した。このプログラムは、ＮＣＢＩデータベース内のそれぞれのショウジョウバエ遺伝子に適したプライマーを同定するように設計され、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ結合部位配列（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ）を各プライマーの５’末端に付ける。
【０３３２】
以下のパラメータをプライマー設計プロセスに使用した：
最終ＰＣＲ産物長＝５００〜５５０塩基対
プライマー長＝２５〜３５塩基対
プライマーの融解温度＝５０．０〜８０．０℃
最小％ＧＣ＝３５．０
回文配列の最大許容長＝８塩基対
ヘアピンループの自由エネルギーの最大許容値＝−１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ
プライマーとプライマーの二本鎖の自由エネルギーの最小許容値＝−１５．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ
プライマーとプライマーの３’末端の二本鎖の自由エネルギーの最小許容値＝−３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ
プライマー対の間の融解温度の差の最大値＝５℃
プライマー間の％ＧＣの差の最大値＝１０．０
プライマー濃度＝２５０ｐＭｏｌ
塩濃度＝５０ｍＭ
【０３３３】
エキソン内の配列を増幅するプライマーの組には、ゲノム配列のタグを付けた（このことはＰＣＲ反応にゲノムＤＮＡを使用できることを意味する）が、複数のエキソンにまたがる配列には、ｃＤＮＡ配列のタグを付けた（このことは、その遺伝子特異的配列のＰＣＲ増幅にｃＤＮＡの鋳型が必要となることを意味する）。
【０３３４】
遺伝子に適したプライマーの組がプライマー設計プログラムによって同定されなかった場合、パラメータを変更し検索プロセスを反復した。最低限のパラメータ設定は以下の通りであった：
最終ＰＣＲ産物長＝１５０〜２００塩基対
プライマー長＝２５〜３５塩基対
プライマーの融解温度＝５０．０〜６５．０℃
プライマーの最小％ＧＣ＝３０．０
回文配列の最大許容長＝１０塩基対
ヘアピンループの自由エネルギーの最大許容値＝−２．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ
プライマーとプライマーの二本鎖の自由エネルギーの最小許容値＝−１０．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ
プライマーとプライマーの３’末端の二本鎖の自由エネルギーの最小許容値＝−５．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ
プライマー対の間の融解温度の差の最大値＝８℃
プライマー間の％ＧＣの差の最大値＝１５．０
プライマー濃度＝２５０ｐＭｏｌ
塩濃度＝５０ｍＭ
【０３３５】
９６穴サーモスプリントプレート中の、濃度５０μＭである混合前の状態のプライマー（表２）を、ＭＷＧ（MWG Biotech (UK) Ltd, Mill Court, Featherstone Road, Wolverton Mill South, Milton Keynes, MK12 5RD, UK）に注文した。
【０３３６】
ii）次いでこのプライマーを使用して、ｄｓＲＮＡ作成のためのショウジョウバエ遺伝子特異的ＰＣＲ産物を合成した。
【０３３７】
各プレートのプライマーの詳細を、MWG AG BiotechのＲｏｂｏＳｅｑ  ４２０４ＳＥ試料データベースに入れた。
【０３３８】
製造業者の説明書に従って、RoboSeq 4204SEを用いて９６穴プレートの形式でＰＣＲ反応物を分注した。各反応物は、製造業者の説明書に従って、１７μＭ遺伝子特異的プライマー組３μｌ、場合に応じてＤ．Ｍｅｌ−２ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ（２μｇ／ｍｌ）２μｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２付き１．１×サーモスタートＰＣＲマスター混合物（ABgene House, Blenheim Road, Epsom, Surrey KT19 9AP, UK）４５μｌからなった。RoboSeq 4204SEが割り当てた各プレートのバーコードを記録し、そのプレートを−８０℃で保存した。
【０３３９】
RoboSeq 4204SEがＰＣＲ反応の準備を完了した後、そのプレートを密封し、ＰＴＣ−２２５サーモサイクラーに移し、ステップ２及び３を３５回反復するプログラムＴＨＥＲＭＯＰＣを実行した：
１：９５℃  ００：１５
２：９５℃  ００：３０
３：５５℃  ００：４５
４：７２℃  ０１：００
５：７２℃  ０５：００
６：４℃  ∞
【０３４０】
MilliporeのMontage（商標）PCR96Cleanup Kit （Millipore (U.K.) Ltd, Units 3&5, The Courtyards, Hatters Lane, Watford, WD18 8YH, UK）と一緒にRoboSeq 4204SEを用いて、このＰＣＲ産物を精製した。
【０３４１】
RoboSeq 4204SEが割り当てた各プレートのバーコードを再度記録し、その精製ＰＣＲ産物プレートを−２０℃で保存した。
【０３４２】
各ＰＣＲ産物プレートを解凍し、元の増幅反応に使用した順向プライマーに対応するが、５’側のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ結合部位配列は含まない、順に並んだ配列決定用プライマーを用いて配列決定反応を実行することによって、配列を確認した。配列決定反応は、Lark Technologies, Inc.（Radwinter Road, Saffron Walden, Essex, CB11 3HY, UK）によって行われた。
【０３４３】
得られた配列を試験した穴のそれぞれに関する遺伝子の配列と確実に対応させるために、ＮＣＢＩデータベースのＢＬＡＳＴ検索によってその配列を確認した。
【０３４４】
iii）遺伝子特異的ＰＣＲ産物を、in vitro転写反応の鋳型として使用して、遺伝子特異的ｄｓＲＮＡを作成した。
【０３４５】
反応は、RoboSeq 4204SEを用いた９６穴プレートの形式で準備し、各反応物は、遺伝子特異的ＰＣＲ産物８μｌ、３．３×Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ緩衝液（１３０．７ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．１）、１６．３ｍＭ  ＤＴＴ、１３．１％ＰＥＧ  ８０００、０．０３％  Triton X-100、６５．３ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ））６μｌ、２５ｍＭ  ｒＮＴＰ混合物４μｌ、５０Ｕ／μｌ  酵母無機ピロホスファターゼ  ０．５μｌ、２０Ｕ／μｌ  Ｒｎａｓｉｎ  １μｌ、８０Ｕ／μｌ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ０．５μｌからなった。この反応物を、ＰＴＣ−２２５サーモサイクラーで３７℃で４時間インキュベートした。
【０３４６】
転写されたＲＮＡを、ＤＮａｓｅ  Ｉ（２Ｕ／μｌ）で３７℃で１５分間処理し、再度RoboSeq 4204SEを用いてＲＮａｓｅを含まないMilli-Q水を８０μｌ加えることによって希釈した。ＲＮＡをアニールするために、この試料を９５℃に加熱して１０分間置き、次いで１晩ゆっくりと室温に冷却した。
【０３４７】
RoboSeq 4204SEが割り当てた各プレートのバーコードを記録し、そのｄｓＲＮＡプレートを−２０℃で保存した。
【０３４８】
iv）赤色蛍光タンパク質（Red Fluorescent Protein）（ＲＦＰ）（Matz et al., 1999, Nat Biotechnol. 17:969-973）由来の対照配列、ショウジョウバエｏｒｂｉｔ及びショウジョウバエｐｏｌｏ  ｄｓＲＮＡの合成。ＲＦＰ遺伝子がＤ．Ｍｅｌ−２細胞にないため、全体にわたってＲＦＰ  ｄｓＲＮＡを陰性対照として使用した。２つの十分に明らかとなっているショウジョウバエ細胞周期遺伝子ｏｒｂｉｔ（Inoue et al., 2000, J Cell Biol. 149:153-166、Maiato et al., 2002, J Cell Biol. 157:749-760）及びｐｏｌｏ（Sunkel and Glover, 1988, J Cell Sci. 89:25-38、Fenton and Glover, 1993, Nature 363:637-640、Carmena et al., 1998, J Cell Biol. 143:659-671）を標的とするｄｓＲＮＡを、全体にわたって陽性対照として使用した。これは、実験によりｏｒｂｉｔ又はｐｏｌｏ遺伝子発現のＲＮＡｉが細胞周期進行にかなり影響を及ぼす（図１８１のＤ．Ｍｅｌ−２細胞のＦＡＣＳ像を参照）ことが明らかとなっているからである。
【０３４９】
わずかに異なる点があるが、基本的には前記の通りに、９６穴プレートでの９６反応の形式でこれらの対照ｄｓＲＮＡを調製した。
【０３５０】
以下のプライマーＲＦＰ−１及びＲＦＰ−２と一緒に、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Invitrogen）にクローン化されている０．５ｍｇ／ｍｌの７１６ｂｐのＲＦＰ配列０．１μｌから、ＲＦＰ遺伝子特異的配列のＰＣＲ増幅を行った。
ＲＦＰ−１
TAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGCCCGACGT
ＲＦＰ−２
TAATACGACTCACTATAGGGCGATGCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGT
【０３５１】
Ｄ．Ｍｅｌ−２  ｃＤＮＡから、プライマーＲＮＡｉ７及びＲＮＡｉ８を用いてｐｏｌｏ特異的配列を増幅した。
ＲＮＡｉ７
GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGCCGCGAAGCCCGAGGATAAGAGCA
ＲＮＡｉ８
GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGATGACCATATCCGCCGCCGGTTTCCTT
【０３５２】
Ｄ．Ｍｅｌ−２ゲノムＤＮＡから、プライマーＲＮＡｉ１９２及びＲＮＡｉ１９３を用いてｏｒｂｉｔ特異的配列を増幅した。
ＲＮＡｉ１９２
TAATACGACTCACTATAGGGAGACCCGCATTGGCCGAACACCTGGAACC)
ＲＮＡｉ１９３
TAATACGACTCACTATAGGGAGAACGTCGAGACCCCGCACCTGTAGAGT
【０３５３】
ｐｏｌｏ、ｏｒｂｉｔ又はＲＦＰの９６個のｄｓＲＮＡ調製物を貯留し、その濃度をＡ２６０／Ａ２８０値から評価した。この試料を分注し、−２０℃で保存した。
【０３５４】
ｖ）アガロースゲル電気泳動、並びにPicoGreen試薬（Molecular Probes, PoortGebouw, Rijnsburgerweg 10, 2333 AA Leiden, The Netherlands）、及びRoboSeq 4204SEと連結したＫＣ４蛍光測定器（Bio-Tek（登録商標）Instruments, Inc., Winooski, Vermont）を使用する蛍光測定により、製造業者の推奨に従って、試料中のｄｓＲＮＡの質及び濃度を評価した。ｄｓＲＮＡの濃度を評価するのに使用する標準曲線を、ｓｓＲＮＡを除去するために、ｄｓＲＮＡ（２００μｇ）を０．３Ｍ  ＮａＣｌの存在下で２０μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＡで３０℃で３０分間処理する以外は基本的に上記の通りに調製したｏｒｂｉｔ  ｄｓＲＮＡを用いて作成した。０．１ｍｇ／ｍｌ  プロテイナーゼＫで反応を停止させ、フェノール／クロロホルムで１回、クロロホルムで１回抽出し、０．１倍量のＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）及び２．５倍量の純エタノール（−２０℃）で沈殿させることによってｄｓＲＮＡを精製した。１３０００ｒｐｍで３０分間、４℃で遠心した後、このｄｓＲＮＡペレットを７０％ＥｔＯＨ（−２０℃）で洗浄し、ＲＮａｓｅ及びＤＮａｓｅを含まないMilli-Q Ｈ２Ｏ  ２００μｌで再懸濁させた。この標準ｄｓＲＮＡの濃度を、Ａ２６０／Ａ２８０の読み取り値を用いて評価した。
【０３５５】
vi）各ショウジョウバエ遺伝子特異的ｄｓＲＮＡを希釈し、１穴につきｄｓＲＮＡ１μｇを用いて、９６穴Packard Viewplateの３穴に並べて入れ、トランスフェクションの準備を行った。
【０３５６】
３）ショウジョウバエＤ．ＭＥＬ−２細胞におけるＲＮＡ干渉
ｉ）Ｄ．Ｍｅｌ−２細胞を以下の通りに培養し、ｄｓＲＮＡのトランスフェクションに備えた。
【０３５７】
１０％ＤＭＳＯ、ショウジョウバエＳＦＭ（Gibco #15240）、１％  ２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Gibco #25030）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Gibco #15140）中に凍結保存されたＤ．Ｍｅｌ−２細胞（継代＃８）を１ｍｌ含む凍結用瓶を急速に解凍し、ショウジョウバエＳＦＭ／グルタミン／Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐを５ｍｌ含む２５ｃｍ２組織培養フラスコに中身をそのまま移した。細胞が集密状態に近づくまで細胞を２８℃で４〜５日間増殖させ、そのときショウジョウバエＳＦＭ／グルタミン／Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐを１０ｍｌ含む７５ｃｍ２組織培養フラスコに細胞を移した。細胞が集密状態に近づくまで、さらに細胞を２８℃で３〜４日間増殖させた。細胞を１：１０に分割し、３〜４日毎に新鮮な培地を入れ、その日付と継代番号をフラスコに記録した。解凍後３回の継代で、Ｄ．Ｍｅｌ−２細胞のトランスフェクションの準備を行った。
【０３５８】
ii）新しい各Ｄ．Ｍｅｌ−２細胞群について、以下の通りに、蛍光標識したｄｓＲＮＡを用いて、細胞のｄｓＲＮＡトランスフェクションの効率を評価した。
【０３５９】
各鎖に５’側のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ結合部位を含むＲＦＰ、ショウジョウバエｐｏｌｏ又はショウジョウバエｏｒｂｉｔ特異的ＰＣＲ産物８μｌを使用して、アミノアリル代替ＵＴＰを用いてｄｓＲＮＡを合成し、各鋳型につき３反応物を準備した。各反応物は、３．２７×Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ緩衝液（１３０．７ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．１）、１６．３ｍＭ  ＤＴＴ、１３．１％ＰＥＧ  ８０００、０．０３％  Triton X-100、６５．３ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ））６．１２μｌ、１００ｍＭ  ＡＴＰ１μｌ、１００ｍＭ  ＣＴＰ１μｌ、１００ｍＭ  ＧＴＰ１μｌ、１００ｍＭ  アミノアリル−ＵＴＰ１μｌ（Sigma A5660）、５０Ｕ／μｌ  酵母無機ピロホスファターゼ  ０．５μｌ、２０Ｕ／μｌ  Ｒｎａｓｉｎ  １μｌ、及び８０Ｕ／μｌ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ０．５μｌからなった。
【０３６０】
非標識ＲＦＰ、ショウジョウバエｐｏｌｏ又はショウジョウバエｏｒｂｉｔ  ｄｓＲＮＡも、アミノアリル代替ＵＴＰの代わりに各反応物に１００ｍＭ  ＵＴＰを１μｌ使用するだけで、同様にして合成した。
【０３６１】
ＰＴＣ−２２５サーモサイクラーでこの反応物を３７℃で４時間インキュベートし、次いで３７℃で１５分間ＤＮａｓｅＩ（２Ｕ／μｌ）で処理し、１０分間９５℃に加熱し、次いで１５分にわたって４℃に冷却することによってアニールした。標識又は非標識のＲＦＰ、ショウジョウバエｐｏｌｏ又はショウジョウバエｏｒｂｉｔ  ｄｓＲＮＡを含む３つの同じ反応物を貯留し、それぞれにＲＮａｓｅ及びＤＮａｓｅを含まない水を１４０μｌ加えた。
【０３６２】
BioRad P30 MicroBiospin カラム１８個を、１回の洗浄につき緩衝液０．５ｍｌで３回カラムを洗浄することにより、１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ７．５）に緩衝液交換した。各貯留ｄｓＲＮＡ調製物を３つに分け、製造業者の推奨に従って、それをカラムに通過させ（１カラムにつき約６５μｌ）、次いで再貯留した。各精製ｄｓＲＮＡ調製物に、ＤＭＳＯ中に１０ｍｇ／ｍｌに再懸濁させたAlexaFluor 594−スクシンイミジルエステル（Molecular Probes A-20004）３３μｌ、及び５００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ７．５）８μｌを加えた。このｄｓＲＮＡ及び標識を暗所内で室温で１晩インキュベートした。
【０３６３】
再度、各ｄｓＲＮＡ調製物を３つに分け、それぞれをBioRad P30 MicroBiospinカラム（１０ｍＭ  トリス  ｐＨ７．４）に通過させることにより、それを精製した。その３つの精製ｄｓＲＮＡ調製物を再貯留し、０．１倍量のＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）及び２．５倍量の純エタノール（−２０℃）を加えることによって沈殿させた。そのｄｓＲＮＡを４℃、１３０００ｒｐｍで３０分間遠心し、上清を除去した。そのペレットを７０％ＥｔＯＨ（−２０℃）で２回洗浄し、次いで空気乾燥させ、次いで１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）２００μｌ中に再懸濁させた。
【０３６４】
試料中のｄｓＲＮＡの濃度及び質を、Ａ２６０／Ａ２８０の読み取り値から、またアガロースゲル電気泳動によって評価した。ｄｓＲＮＡ調製物の濃度を６７ｎｇ／μｌに調整し、それぞれをPackard viewplateの１６穴に１５μｌずつ分注した：
カラム１及び２に標識ｐｏｌｏ  ｄｓＲＮＡ
カラム３及び４に標識ｏｒｂｉｔ  ｄｓＲＮＡ
カラム５及び６に標識ＲＦＰ  ｄｓＲＮＡ
カラム７及び８に非標識ｐｏｌｏ  ｄｓＲＮＡ
カラム９及び１０に非標識ｏｒｂｉｔ  ｄｓＲＮＡ
カラム１１及び１２に非標識ＲＦＰ  ｄｓＲＮＡ
【０３６５】
各穴に、予め２８℃に温めておいた新鮮なショウジョウバエＳＦＭ／グルタミン／Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐで１ｍｌ当たり細胞２．３×１０５個に希釈した、対数増殖中のＤ．Ｍｅｌ−２細胞を３５μｌ加えた。その細胞を、湿潤箱内で２８℃で１時間、ｄｓＲＮＡ（６０ｎＭ）とともにインキュベートし、次いで予め２８℃に温めておいたショウジョウバエＳＦＭ／グルタミン／Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐをそれに１００μｌ加え、ｄｓＲＮＡを含む細胞を湿潤箱に戻し、２８℃で７２時間置いた。その培地を除去し、予め２８℃に温めておいた固定液（３．７％ホルムアルデヒド、１．３３ｍＭ  ＣａＣｌ２、２．６９ｍＭ  ＫＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．５２ｍＭ  ＭｇＣｌ２−６Ｈ２Ｏ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、８．５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）１００μｌとともに細胞を１５分間インキュベートした。固定液を除去し、洗浄緩衝液（１．３３ｍＭ  ＣａＣｌ２、２．６９ｍＭ  ＫＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．５２ｍＭ  ＭｇＣｌ２−６Ｈ２Ｏ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、８．５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）１００μｌで細胞を洗浄した。浸透化緩衝液（Permeabilisation Buffer）（３０．８ｍＭ  ＮａＣｌ、０．３１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．５７ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ、０．０２％  Triton X-100）１００μｌで１５分間細胞を処理し、再度洗浄緩衝液１００μｌで洗浄した後、染色液（１μｇ／ｍｌ  Hoechst 33258、１．３３ｍＭ  ＣａＣｌ２、２．６９ｍＭ  ＫＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．５２ｍＭ  ＭｇＣｌ２−６Ｈ２Ｏ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、８．５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）を1穴に５０μｌ加えた。光から保護した状態で、細胞を染色液とともに１時間インキュベートした。染色液を除去し、細胞を洗浄緩衝液１００μｌで２回洗浄した。最後にアジ化ナトリウム０．０２％を含む洗浄緩衝液を細胞に２００μＬ加え、このプレートを密封し、製造業者の推奨に従って、１０×対物レンズ及びQuadBGRFRフィルタセット付きのCellomics ArrayScan HCS System（Cellomics Europe, St. Mary's Court, The Broadway, Old Amersham, Bucks, HP7 0UT, UK）を用いて、そのトランスフェクション効率を分析した。
【０３６６】
iii）遺伝子特異的ｄｓＲＮＡを用いたＤ．Ｍｅｌ−２細胞のトランスフェクションを、上記に詳細に述べた蛍光標識対照ｄｓＲＮＡの場合と同様に実施した。
【０３６７】
Ｄ．Ｍｅｌ−２細胞をｄｓＲＮＡとともに２８℃で７２時間インキュベートした後、固定液を２８℃に予め温めておき、一次及び二次抗体の指定量の半分だけを一次抗体液及び染色液にそれぞれ加えた以外は基本的に製造業者の推奨に従って、Cellomics Mitotic Index Hitkitを用いて細胞を固定し染色した。このキットは、有糸分裂指数の決定を可能にするための、免疫蛍光検出、及び分裂中の細胞の核に豊富なリン酸化核ヒストンタンパク質の局在に基づいた、終点が固定されたアッセイを提供する。有糸分裂指数（ＭＩ）は、集団内で細胞分裂を行っている細胞の分画を表し、細胞増殖を特徴付けるのに役立つ手段である。有糸分裂指数の算出値は、無制御な細胞増殖のために癌細胞で高いことが多い。
【０３６８】
１０×対物レンズ及びDualBGlpフィルタセット付きのCellomics ArrayScan HCS Systemを用いて、製造業者の推奨に従って有糸分裂指数を分析した。
【０３６９】
Data Viewer内の各プレートの穴についての細胞数を調べることにより、確認された各穴について細胞２５００個を評価した。
【０３７０】
その遺伝子を含むプレート上のＲＦＰ対照と比較した、各遺伝子の平均ＭＩ値、標準偏差及びＴ検定スコア（等分散の２試料の両側分布を推定）を、Arrayscanによって得られた有糸分裂指数データから算出した。その遺伝子を含むプレート上の水対照と比較した、各遺伝子のＴ検定スコアも、やはり等分散の２試料の両側分布を推定して算出し、各遺伝子のその２つのＴ検定スコアを組み合わせて、集計Ｔ検定スコアを得た。また、各遺伝子特異的ｄｓＲＮＡをトランスフェクトしたＤ．Ｍｅｌ−２細胞の有糸分裂指数を、そのプレートのＲＦＰ対照ｄｓＲＮＡをトランスフェクトした細胞の有糸分裂指数の百分率として表した。また、ＲＦＰ対照と比較した、各遺伝子のＭＩの百分率の変化を下記のように算出した：
【０３７１】
【数１】
2006515754.tif 000009
【０３７２】
この値から、ＭＩの絶対的変化を同定した。
【０３７３】
集計Ｔ検定スコアが０．１未満の遺伝子は有意とみなし、ＲＦＰ対照と比較したＭＩのその絶対的変化に従ってそれを順位付けして、さらに分析した（下記の表２を参照）。    
【０３７４】
【表２】
2006515754.tif 000010
【０３７５】
2006515754.tif 000011
【０３７６】
2006515754.tif 000012
【０３７７】
2006515754.tif 000013
【０３７８】
４）ショウジョウバエＤ．Ｍｅｌ−２細胞の有糸分裂指数に対する、トランスフェクトしたｄｓＲＮＡの濃度依存的効果の分析
トランスフェクトしたＤ．Ｍｅｌ−２細胞の有糸分裂指数に対する遺伝子特異的ｄｓＲＮＡの初期効果を確認するため、また、ＭＩに対する投与量依存的効果をも実証するため、ｄｓＲＮＡの濃度依存的効果を試験する。
【０３７９】
濃度が１穴当たり１０ｎｇ〜１穴当たり４μｇの範囲にあるショウジョウバエ遺伝子特異的ｄｓＲＮＡをＤ．Ｍｅｌ−２細胞にトランスフェクトし、前記に記載のように、Cellomics Mitotic Index HitKitを用いてトランスフェクトした細胞の有糸分裂指数のアッセイを行う。各Cellomicsアッセイプレートには、その範囲の遺伝子特異的ｄｓＲＮＡ試料が含まれ、同じ範囲の比較用のＲＦＰ対照ｄｓＲＮＡ試料も含まれる。
【０３８０】
各遺伝子について、各濃度で遺伝子特異的ｄｓＲＮＡをトランスフェクトしたＤ．Ｍｅｌ−２細胞の、及び各濃度で対照ｄｓＲＮＡをトランスフェクトした細胞の有糸分裂指数値を示す棒グラフを作成する以外は、基本的に前記の通りに得られたデータを分析する。＋／−１標準偏差に対応する誤差棒も含まれる。
【０３８１】
５）ヒト相同体
自動化されているウェブ上の質問システムを使用して、ＲＮＡｉによってＤ．Ｍｅｌ−２細胞の有糸分裂指数に有意な変化が生じたショウジョウバエ遺伝子のＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴから、整合するＢＬＡＳＴヒットを同定した。
【０３８２】
Expert Protein Analysis Systemワールドウェブサイト（「expasy.org」）の登録配列取得サービス（「/cgi-bin/get-entries」）を使用して、ショウジョウバエ遺伝子名を用いてＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ内の整合する登録配列を見つけた。この検索は、遺伝子名の項目で正確な文字列の整合を、生物の項目で「ショウジョウバエ」を使用した。ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ及びｔｒＥＭＢＬデータセットの１つ又は複数のアクセッション番号がこの検索によって返された。
【０３８３】
各アクセッション番号を使用して、対応する完全なＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ登録配列を同定し、これは、expasy.orgの「/cgi-bin/hub」から、アクセッション番号を請求することによって返された。Expasy.orgのＢＬＡＳＴサービス（「/cgi-bin/blast.pl」）を介するＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベースに対するｂｌａｓｔｐの質問配列として、各登録配列を使用した。すべてのｂｌａｓｔヒットを保存したが、ラット、マウス又はヒトで整合したもののみを出力ファイルに含めた。上記の生物由来のヒットのＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴファイルを、expasy.org（「/cgi-bin/hub」）から請求した。
【０３８４】
ショウジョウバエタンパク質の大部分にわたって相同性が最も高い（類似性＞２５％、及びＢＬＡＳＴスコア＞１０）ヒト相同体を、さらなる検証のために取っておいた。ある場合では、複数のヒトタンパク質が、ショウジョウバエ遺伝子の相同体として同定された。
【０３８５】
ヒト相同体の配列の参照を表１に示す。
【０３８６】
６）ＲＮＡｉによるヒト有糸分裂遺伝子機能の検証
同定されたヒト遺伝子相同体を、最初に、Ｕ２ＯＳ細胞における遺伝子発現のＲＮＡ干渉によって検証し、ＦＡＣＳ分析を用いて正常な細胞周期進行に必要なヒト遺伝子を同定する。
【０３８７】
ｉ）ヒト遺伝子特異的ｓｉＲＮＡの設計及び注文
遺伝子特異的ＲＮＡｉ用のｓｉＲＮＡ配列を、Ambion.comサイトの「/techlib/misc/」ディレクトリ内の「siRNA_finder.html」ファイルにあるｓｉＲＮＡ  ＦＩＮＤＥＲを用いて同定する。オープンリーディングフレームの中間及び３’末端で、ＧＣ量が４２．９％〜５２．４％のｓｉＲＮＡを同定した。見込みのあるｓｉＲＮＡでＢＬＡＳＴ検索を行って、それが選択したヒト標的遺伝子に独特であることを確認する。ｓｉＲＮＡが他のヒト遺伝子と８１％を超える同一性がある場合、次の隣接したｓｉＲＮＡを選択する。選択した各配列について、０．２μＭの精製しアニールした二本鎖ｓｉＲＮＡをDharmacon（Dharmacon Research, Inc., 1376 Miners Drive, #101, Lafayette, CO 80026, USA）に注文する。ＲＮａｓｅ及びＤＮａｓｅを含まない水にｓｉＲＮＡを再懸濁させ、これを用いて２０ｍＭの貯蔵溶液を調製する。
【０３８８】
ii）ＲＮＡｉ分析用ヒト細胞系の培養
ヒトＨｅｌａ及びＵ２ＯＳ細胞系を、ｓｉＲＮＡのトランスフェクション用に下記の培地中で培養する：Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム及びピリドキシン入りＤＭＥＭ（Gibco: #41966-029（InVitrogen Corporation, Carlsbad, California, USA））５００ｍｌ、ＦＢＳ（Ｅ．Ｕ．承認済み、Gibco; #10106-169）５０ｍｌ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ  ５０００ＩＵ（Gibco: #15070-063）５ｍｌ。
【０３８９】
ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞系を、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム及びピリドキシン入りＤＭＥＭ（Gibco: #41966-029）４００ｍｌ、イーグル塩（Earle’s salts）、Ｌ−グルタミン、ＮａＨＣＯ３入りＭ１９９（Sigma; #M4530）１００ｍｌ、ＦＢＳ（Ｅ．Ｕ．承認済み、Gibco; #10106-169）５０ｍｌ中で培養する。
【０３９０】
細胞を継代するために、７５ｃｍ２フラスコの細胞から培地を除去し、予め温めておいた（３７℃）ＰＢＳ（Dulbecco、Ｗ／Ｏカルシウム及びマグネシウム、Ｗ／Ｏ重炭酸ナトリウム; Gibco #14190-094）で細胞を洗浄する。予め温めておいた（３７℃）トリプシン／ＥＤＴＡ（Gibco #25300-054）をこれに０．５ｍｌ加え、それを細胞の表面に均一に広げ、３７℃で５分間インキュベートする。予め温めておいた（３７℃）適当な培地４．５ｍｌでトリプシンを中和し、細胞をフラスコの表面からピペット混合で洗浄する。
【０３９１】
血球計算板を用いて、細胞密度を測定する。
【０３９２】
iii）遺伝子特異的ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＵ２ＯＳ細胞のＦＡＣＳ分析を以下の通りに実施する：
【０３９３】
Ｕ２ＯＳ細胞に２４０ｎＭの各遺伝子特異的ｓｉＲＮＡをトランスフェクトするが、各トランスフェクションについて、６穴プレートの１穴当たりに、１ｍｌ当たり細胞１×１０５個の細胞懸濁液を２ｍｌ使用し、細胞を３７℃／５％ＣＯ２で１晩増殖させる。ｓｉＲＮＡを解凍し、オリゴフェクタミン試薬（Oligofectamine Reagent）を室温に予め温めておき、培地をすべて３７℃に予め温めておく。ＲＮａｓｅを含まない滅菌エッペンドルフチューブ中で、２０ｍＭの各ｓｉＲＮＡ溶液１２μｌをＯｐｔｉＭＥＭ無血清培地（Gibco #31985-039）２００μｌを加える。各トランスフェクション反応物に対して、オリゴフェクタミン（商標）試薬（Invitrogen #12252-011）８μｌを、OptiMEM５２μｌと混合し、室温で１０分間インキュベートする。すべてのトランスフェクションについて、これをまとめて調製する。
【０３９４】
オリゴフェクタミン／OptiMEM  ６０μｌを各ｓｉＲＮＡと混合し、室温で１５〜２０分間インキュベートする。次いで、各ｓｉＲＮＡ／オリゴフェクタミン混合物にOptiMEMを１２８μｌ加える。細胞から培地を除去し、細胞をＰＢＳで簡単に洗浄し、抗生物質及びＦＢＳを含まない適当な細胞培地６００μｌで再度栄養を与えた後、ｓｉＲＮＡ／オリゴフェクタミン混合物４００μｌを６穴皿中の細胞に加え、３７℃／５％ＣＯ２で４時間これをインキュベートする。続いてこの培養物に、２０％ＦＢＳ及び抗生物質を含む適当な細胞培地を１ｍｌ補充し、細胞を３７℃／５％ＣＯ２で４８時間インキュベートする。
【０３９５】
各実験について、Photinus pyralis（ＧＬ３）ルシフェラーゼ遺伝子（アクセッション番号  Ｕ４７２９６）（Harborth et al., 2001, J Cell Sci. 114:4557-4565）を標的とするｓｉＲＮＡ（ａａＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡ）をトランスフェクトした細胞、及びｓｉＲＮＡをトランスフェクトしない細胞が、陰性対照として含まれる。有糸分裂を遮断することが以前本発明者らによって明らかになっているＥｃｔ２  ｓｉＲＮＡ  ＣＯＤ１５１３（ａａＧＵＧＧＧＣＵＵＵＧＵＡＡＡＧＡＵＧＧ）が、陽性対照として含まれる（図１８２のＦＡＣＳ像を参照）。
【０３９６】
インキュベーション後、各穴の上清を１５ｍｌ遠心管に移す。予め温めておいた（３７℃）トリプシン／ＥＤＴＡ  ０．５ｍｌで穴をすすぎ、これを同じ穴の上清２ｍｌと合わせる。残っている細胞に予め温めておいた（３７℃）トリプシン／ＥＤＴＡをさらに０．５ｍｌ加え、それを細胞の表面に均一に広げ、３７℃で５分間インキュベートする。トリプシン処理した細胞を同じ穴の上清２．５ｍｌに加え、２０００ｒｐｍで５分間遠心することによって細胞をペレットにする。その上清を除去し、細胞をＰＢＳ１ｍｌ中に再懸濁させ、再懸濁した細胞をエッペンドルフチューブに移す。２０００ｒｐｍ、１分間の微量遠心によって細胞をペレットにし、ほとんどのＰＢＳを除去し、管をたたくことにより、残っているＰＢＳ中に細胞を再懸濁させる。管にボルテックスをかけながら、細胞に７０％エタノールを１ｍｌ滴下し、固定した細胞をー２０℃で１晩保存する。
【０３９７】
１０００ｒｐｍで１分間遠心することによって細胞をペレットにし、ほとんどのエタノールを除去し、前記のように管をたたくことにより、残っているエタノール中に細胞を再懸濁させる。管にボルテックスをかけながら、細胞にＰＢＳを０．５ｍｌ滴下する。細胞を６ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡ  ３μｌとともにインキュベートし、５ｍｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム１２．５μｌでそのＤＮＡを３７℃で３０分間染色し、次いで分析の準備が整うまで氷上でこれを保存する。
【０３９８】
BD FACSCalibur（商標）System（BD Biosciences, European Office, Denderstraat 24, 9320 Erembodegem, Belgium）で、ＦＬ３チャネル及びCellQuestソフトウェアを用いて細胞のＤＮＡ量を分析する。
【０３９９】
図１８３に示す像が現れるまで、ＦＳＣ及びＳＳＣチャネルの電圧を変化させる。
【０４００】
ＦＬ３チャネルの電圧も、Ｇ１期、Ｓ期及びＧ２／Ｍ期の細胞の分析が可能となるように変化させ、図１８４に示すように、ゲート（Ｇ２）を設定して、細胞凝集によって生じる事象の重なりを除外する。
【０４０１】
ゲートをかけて得られた事象１００００個を分析用に採集し、上記に示したように、ＦＳＣ−Ｈ対ＳＳＣ−Ｈの、及びＦＬ３−Ａ対ＦＬ３−Ｗのドットブロットを作成する。
【０４０２】
ゲートをかけた領域（Ｇ２）内のＦＬ３−Ｈに対するカウント数を示すヒストグラム、及び関連ヒストグラム統計データも作成する。ヒストグラム統計データを用いて、Ｇ１期の事象、Ｓ期の事象及びＧ２／Ｍ期の事象を算出する。この場合、Ｇ１期の事象数はＭ２×２であり、Ｇ２／Ｍ期の事象数はＭ３×２であり、Ｓ期の事象数は、Ｍ１−［（Ｍ２×２）＋（Ｍ３×２）］である。例えば、図１８５を参照されたい。
【０４０３】
統計データを比較し、またヒストグラム像を重ねることにより、遺伝子特異的ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞の細胞周期像を、ＧＬ３  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした対照細胞と比較して、正常な細胞周期進行に必要なヒト遺伝子を同定する。
【０４０４】
肉眼で陰性対照の像と比較したときにＦＡＣＳ像が顕著に異なっている場合、その細胞周期像の変化は重大とみなされる。
【０４０５】
７）ｓｉＲＮＡトランスフェクションによって生じる異常なヒト細胞表現型を、ｓｉＲＮＡ処理細胞の免疫染色及び顕微鏡分析によって評価する。
【０４０６】
前記のように培養したＵ２ＯＳ及びＨｅＬａヒト細胞系に２４０ｎＭの遺伝子特異的ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞で異常なＦＡＣＳ像を誘導することが以前に示されているｓｉＲＮＡを選択する。清潔な２２×２２ｍｍ滅菌カバーガラスを、トランスフェクションに用いる６穴プレートの各穴の中に最初に置く以外は基本的に上記に詳細に述べたように、細胞にトランスフェクトする。
【０４０７】
ｉ）顕微鏡分析のための、ｓｉＲＮＡ処理ヒト細胞の免疫染色を以下の通りに実施する：
【０４０８】
培地を穏やかに除去し、予め３７℃に温めておいた固定液（６０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、４ｍＭ  ＭｇＳＯ４、ＫＯＨでｐＨ６．８に調整、３．７％ホルムアルデヒド）１ｍｌとともに、細胞を室温で１０分間インキュベートする。その固定液を除去し、ＰＢＴ（ＰＢＳ＋０．１％Triton X-100）１ｍｌで、室温で２分間細胞を浸透化させる。その浸透化溶液を除去し、ブロッキング溶液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．１％Triton X-100）１ｍｌとともに、室温で１時間細胞をインキュベートする。そのブロッキング溶液を、一次抗体液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．１％Triton X-100／１：３００希釈のラットＹＬ１／２抗−(−チューブリン抗体（SeroTec #MCA77G）／１：７５０希釈のウサギ抗−γ−チューブリン抗体（Sigma #DQ-19））０．５ｍｌに入れ換え、一次抗体液とともに、室温で２時間又は４℃で１晩細胞をインキュベートする。細胞にＰＢＴ１ｍｌ、５分間の洗浄を３回行い、次いで二次抗体液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．１％Triton X-100／１：３００希釈のＴＲＩＴＣ−ロバ抗ラットＩｇＧ（Jackson Immunoresearch # 712-026-150）／１：３００希釈のAlexaFluor 488−ヤギ抗ウサギ（Molecular Probes #A-11008））０．５ｍｌとともに、室温で４５〜６０分間細胞をインキュベートする。細胞にＰＢＴ１ｍｌ、５分間の洗浄を再度３回行い、ＰＢＳ１ｍｌ、５分間の洗浄を１回行う。最後に、ＤＡＰＩを含む封入剤（７５％グリセロール中１．２５％（ｗ／ｖ）ｎ−プロピルガレート／０．５μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩ、４℃で保存）を用いて、そのカバーガラスを清潔な顕微鏡用スライドガラス上に細胞の付いた側を下にして封入し、それを爪用エナメル剤で密封し、光から保護して４℃で保存する。
【０４０９】
ii）免疫染色したｓｉＲＮＡ処理細胞の有糸分裂表現型の分析
ＤＮＡ（Zeissフィルタセット０１）、α−チューブリン（Zeissフィルタセット１５）及びγ−チューブリン（Zeissフィルタセット１０）の染色を、Zeiss Axioskop２プラス（Carl Zeiss Ltd., Woodfield Road, Welwyn Garden City, Herts. AL7 1LU, UK）上のPlan-neofluar  ４０×／１．３０油浸Ｐｈ３及びPlan-Apochromat  ６３×／１．４０油浸Ｐｈ３対物レンズを用いて観察し、Axiocam HR CCDカメラ及びAxioVision  ３．０ソフトウェアを用いて画像を取得する。
【０４１０】
各実験について、前期／前中期、中期、後期及び終期の正常に見える有糸分裂細胞の数、並びに細胞周期の各段階の異常な細胞を定量化する。各実験について、有糸分裂細胞を２００〜２５０個評価する。異常な細胞のうち、誤整列染色体及び遅延染色体を有する割合、異常な紡錘体の形態を示す数を定量化する。各核と結合する中心体の数についても記録する。表現型のより完全な特徴付けでは、倍数性及び細胞生存率（細胞の集密状態及びアポトーシス細胞数）、多核の間期細胞の数、並びに核及び全体的な細胞の形態を評価する。特定の遺伝子特異的ｓｉＲＮＡが細胞周期の異常な表現型を引き起こすかどうかを確認するために、ＧＬ３  ｓｉＲＮＡ対照をトランスフェクトした細胞の表現型との比較を行う。
【０４１１】
有糸分裂の全体的な欠陥が陰性対照より約１０％以上増大した場合に、陽性の結果と判断する。しかし、有糸分裂の全体的な欠陥の数は有意に増大しないが、ある特定の欠陥を有する細胞の割合が有意に増大する例も存在し、これも重大なものとみなされる。
【０４１２】
８）疾患との関係
腫瘍細胞及び正常細胞における（複数の）遺伝子の発現レベルを、癌プロファイルアレイと遺伝子特異的放射活性プローブのハイブリダイゼーションのレベルを評価することによって決定する。このアレイは、腫瘍細胞由来、及び１３の組織型に由来するそれと同等な正常細胞由来の合計２４０のｃＤＮＡからなる（Cat no. 7841-1 - Clontech Laboratories, Inc., 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, CA 94303-4230, USA）。遺伝子又は遺伝子の一部を含むプラスミドから約５００ｂｐの遺伝子特異的ＤＮＡ配列を増幅し、そのＰＣＲ産物を標準的なＰＣＲ精製プロトコル（QIAquick PCR purification - QIAGEN GmbH, Max-Volmer-Strasse 4, 40724 Hilden, Germany）に従って、そのＰＣＲ産物を精製する。次いで、６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌのα３２Ｐ［ｄＣＴＰ］（Amersham Biosciences UK Ltd., Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire HP7 9NA）を用いて、標準的なランダムヘキサマー標識プロトコル（High prime - Roche Diagnostics Ltd., Bell Lane, Lewes, East Sussex BN7 1LG, UK）に従って、精製したＰＣＲフラグメントを放射活性標識する。
【０４１３】
標準的な製造業者のプロトコル（Clontech）に従って、放射活性プローブ１００ｎｇで癌プロファイルアレイにプロービングを行うことにより、正常細胞と癌細胞の間の遺伝子発現レベルの変化を検出する。簡潔に述べると、変性した剪断サケ精巣ＤＮＡを１．５ｍｇ含むExpressHyb（Clonetech）１０ｍｌ中で、癌プロファイルアレイを６５℃で９０分間プレハイブリダイズする。そのプレハイブリダイゼーション液を捨て、標識ＤＮＡプローブ、Ｃｏｔ−１  ＤＮＡ  ３０μｇ、剪断サケ精巣ＤＮＡ  １５０μｇ及び１％  ２０×ＳＳＣを含むExpressHyb  ５ｍｌ中で、癌プロファイルアレイを６５(で１晩ハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後、癌プロファイルアレイに２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ４０ｍｌ中で６５℃、３０分間の洗浄を４回行った後、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中で６５℃、３０分間の洗浄を１回行う。５×ＳＳＣ中で、室温で５分間最後の洗浄を行う。
【０４１４】
増感スクリーンを用いて−７０℃で６〜１４日間アレイをＸ線フィルム（Kodak Biomax MR）にさらすことにより、癌プロファイルアレイと結合した遺伝子特異的放射標識ＤＮＡを検出する。
【０４１５】
遺伝子発現が増大している場合の数及び低下している場合の数を記録することにより、癌プロファイルアレイにおける遺伝子の発現パターンを評価する。組織試料中の試料のうち５０％を超えるものから、４つ以上の組織型における遺伝子発現の低下又は増大が生じる場合、腫瘍細胞の遺伝子発現の変化は重大とみなされる。
【０４１６】
本文書中で挙げた各出願及び特許を、各出願及び特許の手続き中を含めて上記の各出願及び特許中で引用又は参照された各文書（「出願引用文書」）を、各出願及び特許でまたいずれの出願引用文書で引用された又は挙げられたいずれの製品についてのいずれの製造業者の説明書やカタログも、参照により本明細書に組み込む。さらに、本文で引用したすべての文書を、本文で引用した文書で引用又は参照されたすべての文書を、本文で引用した又は挙げたいずれの製品についてのいずれの製造業者の説明書又はカタログも、参照により本明細書に組み込む。
【０４１７】
本発明の記載された方法及びシステムの様々な改変及び変更は、本発明の範囲及び趣旨を逸脱することなく当業者に理解されるであろう。本発明を特定の好ましい実施形態に関して記載してきたが、特許請求の範囲の発明がそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことを理解されたい。実際、分子生物学又はその関連分野の技術者なら明らかである、本発明を実施するための記載された形態の様々な改変は、特許請求の範囲に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０４１８】
【図１】ショウジョウバエ（Drosophila）遺伝子ＣＧ３６３２（ＧＩ  １０７２８２８１）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、４つの転写物ＣＴ１２１６３（配列番号１）、ＣＴ１３６８０（配列番号３）、ＣＴ１３７００（配列番号５）及びＣＴ１３７１８（配列番号７）を有し、これらはそれぞれＧＩアクセッション番号ＡＡＦ４８５８３（配列番号２）、ＡＡＦ４８５８４（配列番号４）、ＡＡＦ４８５８２（配列番号６）及びＡＡＦ４８５８１（配列番号８）をコードする。
【図２】ショウジョウバエ遺伝子Ｐｐ１−８７Ｂ（ＧＩ  ７２９９５７２）（配列番号９）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５４８１０（配列番号１０）をコードする。
【図３】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ３５２４（ＧＩ  １０７２７３６５）（配列番号１１）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５１１４９（配列番号１２）をコードする。
【図４】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ９３１１（ＧＩ  １０７２７９２３）（配列番号１３）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ４９７０５（配列番号１４）をコードする。
【図５】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ９０９２（ＧＩ  ７２９７０３７）（配列番号１５）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５２３２１（配列番号１６）をコードする。
【図６】ショウジョウバエ遺伝子Ａｒｒ１（ＧＩ  １０７２８８５０）（配列番号１７）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５３６４４（配列番号１８）をコードする。
【図７】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ９１５０（ＧＩ  ７２９７０３７）（配列番号１９）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５２３３８（配列番号２０）をコードする。
【図８】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１１１０２（ＧＩ  １０７２８２３２）（配列番号２１）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ４８３２０（配列番号２２）をコードする。
【図９】ショウジョウバエ遺伝子Ｓｍｒ（ＧＩ  ７２９２７８８）（配列番号２３）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ４８１９６（配列番号２４）をコードする。
【図１０】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ８０４５（ＧＩ  ７３００３３５）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、３つの転写物ＣＴ２４０７２（配列番号２５）、ＣＴ２４１０２（配列番号２７）及びＣＴ２４０９２（配列番号２９）を有し、これらはそれぞれＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５５５１７（配列番号２６）、ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５５５１９（配列番号２８）及びＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５５５２３（配列番号３０）をコードする。
【図１１】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１０４２０（ＧＩ  ７３０１２８０）（配列番号３１）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５６４２２（配列番号３２）をコードする。
【図１２】ショウジョウバエ遺伝子Ｈｓｃ７０−２（ＧＩ  １０７２６４９７）（配列番号３３）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５４８９９（配列番号３４）をコードする。
【図１３】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１０８０５（ＧＩ  ７２９７１６７）（配列番号３５）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５２４４７（配列番号３６）をコードする。
【図１４】ショウジョウバエ遺伝子ｅＩＦ−４ａ（ＧＩ  ７２９７０３７）（配列番号３７）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５２３１７（配列番号３８）をコードする。
【図１５】ショウジョウバエ遺伝子ＡＣＸＡ（ＧＩ  ７２９７９８３）（配列番号３９）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５３２２８（配列番号４０）をコードする。
【図１６】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１５１１７（ＧＩ  １０７２７４５６）（配列番号４１）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５７６０２（配列番号４２）をコードする。
【図１７】ショウジョウバエ遺伝子ＢＧ：ＤＳ０１７５９．２（ＧＩ  ７２９８１２１）（配列番号４３）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５３３７６（配列番号４４）をコードする。
【図１８】ショウジョウバエ遺伝子ＴｅｐIII（ＧＩ  ７２９７２６４）（配列番号４５）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５２５４２（配列番号４６）をコードする。
【図１９】ショウジョウバエ遺伝子Ｈｓｃ７０−４（ＧＩ  １０７２６５４１）（配列番号４７）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５５１５０（配列番号４８）をコードする。
【図２０】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ７０６９（ＧＩ  １０７２６６９２）（配列番号４９）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５５９８０（配列番号５０）をコードする。
【図２１】ショウジョウバエ遺伝子ＡＣＸＥ（ＧＩ  ７２９７９８３）（配列番号５１）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５３２２９（配列番号５２）をコードする。
【図２２】ショウジョウバエ遺伝子ＥＧ：５２Ｃ１０．５（ＧＩ  １０７２７４８０）（配列番号５３）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５７７８９（配列番号５４）をコードする。
【図２３】ショウジョウバエ遺伝子ｇａｔＡ（ＧＩ  １０７２６６１０）（配列番号５５）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５５６２４（配列番号５６）をコードする。
【図２４】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１７１４９（ＧＩ  １０７２７８０３）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、２つの転写物ＣＴ３３３１０（配列番号５７）及びＣＴ３８０８６（配列番号５９）を有し、これらはそれぞれＧＩアクセッション番号ＡＡＦ４９０５２（配列番号５８）及びＧＩアクセッション番号ＡＡＦ４９０５１（配列番号６０）をコードする。
【図２５】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ２９０５（ＧＩ  １０７２８１６３）（配列番号６１）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５７３４２（配列番号６２）をコードする。
【図２６】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ２３３６（ＧＩ  １０７２７１２１）（配列番号６３）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５４１１１（配列番号６４）をコードする。
【図２７】ショウジョウバエ遺伝子ＴＥＲ９４（ＧＩ  １０７２７６７２）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、２つの転写物ＣＴ７７６８（配列番号６５）及びＣＴ７７７６（配列番号６７）を有し、これらはそれぞれＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５８８６３（配列番号６６）及びＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５８８６４（配列番号６８）をコードする。
【図２８】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ６３１３（ＧＩ  １０７２６７３９）（配列番号６９）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５６２６７（配列番号７０）をコードする。
【図２９】ショウジョウバエ遺伝子ａｕｒ（ＧＩ  １０７２６４７３）（配列番号７１）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５４７２３（配列番号７２）をコードする。
【図３０】ショウジョウバエ遺伝子Ｐｋ９１Ｃ（ＧＩ  １０７９９４９８）（配列番号７３）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５５５９４（配列番号７４）をコードする。
【図３１】ショウジョウバエ遺伝子Ｔｏｐ２（ＧＩ  １０７２８８７４）（配列番号７５）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５３８０２（配列番号７６）をコードする。
【図３２】ショウジョウバエ遺伝子α−Ｅｓｔ１（ＧＩ  １０７２７１０１）（配列番号７７）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＧ２２２０２（配列番号７８）をコードする。
【図３３】ショウジョウバエ遺伝子Ｎｒｋ（ＧＩ  １０７２７５８２）（配列番号７９）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５８４２０（配列番号８０）をコードする。
【図３４】ショウジョウバエ遺伝子ｏｔｋ（ＧＩ  １０７２７６１７）（配列番号８１）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５８５９６（配列番号８２）をコードする。
【図３５】ショウジョウバエ遺伝子ｃａｄ（ＧＩ  １０７９９４９７）（配列番号８３）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５３９２３（配列番号８４）をコードする。
【図３６】ショウジョウバエ遺伝子Ｒｕｔ（ＧＩ  １０７２８２５２）（配列番号８５）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ４８３８８（配列番号８６）をコードする。
【図３７】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ８００２（ＧＩ  １０７２８３３４）（配列番号８７）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ４８９４２（配列番号８８）をコードする。
【図３８】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１０３３５（ＧＩ  １０７２７９６８）（配列番号８９）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ４９９３６（配列番号９０）をコードする。
【図３９】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ８０７０（ＧＩ  １０７２７６９３）（配列番号９１）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５８９８６（配列番号９２）をコードする。
【図４０】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ７４６０（ＧＩ  １０７２７８５３）（配列番号９３）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ４９３１０（配列番号９４）をコードする。
【図４１】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１７７３５（ＧＩ  １０７２７１７２）（配列番号９５）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５２０９２（配列番号９６）をコードする。
【図４２】ショウジョウバエ遺伝子Ｇｙｃα９９Ｂ（ＧＩ  ７３０１７９０）（配列番号９７）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５６９１７（配列番号９８）をコードする。
【図４３】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１３８９３（ＧＩ  ７２９１９５９）（配列番号９９）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ４７３９６（配列番号１００）をコードする。
【図４４】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１８１７６（ＧＩ  １０７２８０１９）（配列番号１０１）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５０２１４（配列番号１０２）をコードする。
【図４５】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ８８５８（ＧＩ  １０７２７６１７）（配列番号１０３）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５８５５４（配列番号１０４）をコードする。
【図４６】ショウジョウバエ遺伝子Ａｃ７６Ｅ（ＧＩ  １０７３３３４６）（配列番号１０５）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ４９０８９（配列番号１０６）をコードする。
【図４７】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１７０１０（ＧＩ  ７２９７９１５）（配列番号１０７）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５３１８２（配列番号１０８）をコードする。
【図４８】ショウジョウバエ遺伝子Ｔｋｖ（ＧＩ  ７２９６９５２）（配列番号１０９）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５２２３０（配列番号１１０）をコードする。
【図４９】ショウジョウバエ遺伝子Ｄｎｔ（ＧＩ  １０７２８８６８）（配列番号１１１）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５３７８３（配列番号１１２）をコードする。
【図５０】ショウジョウバエ遺伝子ＡＣＸＤ（ＧＩ  １０７２７２４２）（配列番号１１３）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ４７６２１（配列番号１１４）をコードする。
【図５１】ショウジョウバエ遺伝子Ａａｔｓ−ａｌａ−ｍ（ＧＩ  １０７２８１３７）（配列番号１１５）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５０８０４（配列番号１１６）をコードする。
【図５２】ショウジョウバエ遺伝子Ｇｅｋ（ＧＩ  ７２９１７３７）（配列番号１１７）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ４７１６３（配列番号１１８）をコードする。
【図５３】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ３２１６（ＧＩ  １０７２６９９２）（配列番号１１９）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ４６６４９（配列番号１２０）をコードする。
【図５４】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ５６５３（ＧＩ  １０７２８０３７）（配列番号１２１）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５０３４５（配列番号１２２）をコードする。
【図５５】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１７７４０（ＧＩ  １０７２７６０６）（配列番号１２３）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５８５３５（配列番号１２４）をコードする。
【図５６】ショウジョウバエ遺伝子ＴｅｐＩ（ＧＩ  ７２９８２５５）（配列番号１２５）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５３４９０（配列番号１２６）をコードする。
【図５７】ショウジョウバエ（Drosophila）遺伝子（ＧＩ  １０７２７３４９）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、５つの転写物ＣＴ４３１５４（配列番号１２７）、ＣＴ４２４５２（配列番号１２９）、ＣＴ４３１５２（配列番号１３１）、ＣＴ４３１５８（配列番号１３３）及びＣＴ４３１６０（配列番号１３５）を有し、これらはそれぞれＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５１０８２（配列番号１２８）、ＧＩアクセッション番号ＡＡＧ２２２５１（配列番号１３０）、ＧＩアクセッション番号ＡＡＧ２２２５２（配列番号１３２）、ＧＩアクセッション番号ＡＡＧ２２２５３（配列番号１３４）及びＧＩアクセッション番号ＡＡＧ２２２５４（配列番号１３６）をコードする。
【図５８】ショウジョウバエ遺伝子Ａｃ１３Ｅ（ＧＩ  １０７２８２６５）（配列番号１３７）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ４８４６８（配列番号１３８）をコードする。
【図５９】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ２６６７（ＧＩ  ７２９８９３５）（配列番号１３９）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５４１５４（配列番号１４０）をコードする。
【図６０】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ７８４２（ＧＩ  １０７２７８７２）（配列番号１４１）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ４９３７７（配列番号１４２）をコードする。
【図６１】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１７４８６（ＧＩ  ７２８９８５３）（配列番号１４３）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ４５４６２（配列番号１４４）をコードする。
【図６２】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ６９６９（ＧＩ  １０７２６７０５）（配列番号１４５）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５６０４３（配列番号１４６）をコードする。
【図６３】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１２２６２（ＧＩ  １０７２８０７１）（配列番号１４７）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５０５２４（配列番号１４８）をコードする。
【図６４】ショウジョウバエ遺伝子Ｆｒａｙ（ＧＩ  １０７２６６０１）（配列番号１４９）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５５５６７（配列番号１５０）をコードする。
【図６５】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ６８７９（ＧＩ  １０７２６７５６）（配列番号１５１）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５６３３４（配列番号１５２）をコードする。
【図６６】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１１５９４（ＧＩ  １０７２７２９０）（配列番号１５３）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ４７８２３（配列番号１５４）をコードする。
【図６７】ショウジョウバエ遺伝子Ｓ６ｋII（ＧＩ  １０８０３７２６）（配列番号１５５）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５０９４５（配列番号１５６）をコードする。
【図６８】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１１７１４（ＧＩ  １０７２７９８２）（配列番号１５７）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５００５３（配列番号１５８）をコードする。
【図６９】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ３５３４（ＧＩ  ７３００１９３）（配列番号１５９）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５５３７１（配列番号１６０）をコードする。
【図７０】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ７３３５（ＧＩ  １０７２７８０３）（配列番号１６１）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ４９０６７（配列番号１６２）をコードする。
【図７１】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１１２７５（ＧＩ  ７２９１３５５）（配列番号１６３）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ４６８１４（配列番号１６４）をコードする。
【図７２】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１６７２６（ＧＩ  １０７２８０１９）（配列番号１６５）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５０２２９（配列番号１６６）をコードする。
【図７３】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ７５１４（ＧＩ  １０７２７３１３）（配列番号１６７）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ４７９３１（配列番号１６８）をコードする。
【図７４】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１７２８３（ＧＩ  ７３００２４１）（配列番号１６９）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５５４１６（配列番号１７０）をコードする。
【図７５】ショウジョウバエ遺伝子ＢｃＤＮＡ：ＧＨ０７６２６（ＧＩ  １０７２７３６５）（配列番号１７１）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５１１４８（配列番号１７２）をコードする。
【図７６】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１６７５２（ＧＩ  １０７２８４７８）（配列番号１７３）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ４６０３７（配列番号１７４）をコードする。
【図７７】ショウジョウバエ遺伝子Ｒｐｔ１（ＧＩ  １０７２７７５７）（配列番号１７５）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５９２１９（配列番号１７６）をコードする。
【図７８】ショウジョウバエ遺伝子Ｗｔｓ（ＧＩ  ７３０１９６９）（配列番号１７７）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５７０８５（配列番号１７８）をコードする。
【図７９】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１５８２（ＧＩ  ７２９２５５４）（配列番号１７９）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ４７９７３（配列番号１８０）をコードする。
【図８０】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１２２８９（ＧＩ  １０７２７９８２）（配列番号１８１）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５００６５（配列番号１８２）をコードする。
【図８１】ショウジョウバエ遺伝子Ｐｅｐｃｋ（ＧＩ  １０７２７４６９）（配列番号１８３）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５７６７６（配列番号１８４）をコードする。
【図８２】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ５６６５（ＧＩ  １０７２６９０６）（配列番号１８５）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５１５７９（配列番号１８６）をコードする。
【図８３】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ７２８５（ＧＩ  １０７２７８３９）（配列番号１８７）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ４９２５９（配列番号１８８）をコードする。
【図８４】ショウジョウバエ遺伝子Ｂｔ（ＧＩ  １０７２６３１３）（配列番号１８９）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５９３１６（配列番号１９０）をコードする。
【図８５】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ８７９５（ＧＩ  １０７２６５０５）（配列番号１９１）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５４９２９（配列番号１９２）をコードする。
【図８６】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１０９６７（ＧＩ  １０７２７９５５）（配列番号１９３）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ４９８７８（配列番号１９４）をコードする。
【図８７】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ３８０９（ＧＩ  １０７２６４８０）（配列番号１９５）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５４７５７（配列番号１９６）をコードする。
【図８８】ショウジョウバエ遺伝子Ａｃｋ（ＧＩ  １０７２７２９０）（配列番号１９７）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ４７８３９（配列番号１９８）をコードする。
【図８９】ショウジョウバエ遺伝子Ａｂｌ（ＧＩ  １０７２７８７８）（配列番号１９９）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ４９４３１（配列番号２００）をコードする。
【図９０】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ７３６２（ＧＩ  １０７２６５３４）（配列番号２０１）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５５０９６（配列番号２０２）をコードする。
【図９１】ショウジョウバエ遺伝子Ｃｙｐ９ｆ２（ＧＩ  ７２９９５７２）（配列番号２０３）のヌクレオチド配列を示す図である。この遺伝子は、タンパク質ＧＩアクセッション番号ＡＡＦ５４８０３（配列番号２０４）をコードする。
【図９２】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ３６３２のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ９ＵＥＧ３）の核酸配列（配列番号２０５）及びアミノ酸配列（配列番号２０６）を示す図である。
【図９３】ショウジョウバエ遺伝子Ｐｐ１−８７Ｂのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ３６８７３）の核酸配列（配列番号２０７）及びアミノ酸配列（配列番号２０８）を示す図である。
【図９４】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ３５２４のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ１６７０２）の核酸配列（配列番号２０９）及びアミノ酸配列（配列番号２１０）を示す図である。
【図９５】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ９３１１のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ９Ｈ３Ｓ７）の核酸配列（配列番号２１１）及びアミノ酸配列（配列番号２１２）を示す図である。
【図９６】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ９０９２のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ１６２７８）の核酸配列（配列番号２１３）及びアミノ酸配列（配列番号２１４）を示す図である。
【図９７】ショウジョウバエ遺伝子Ａｒｒ１のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ４９４０７）の核酸配列（配列番号２１５）及びアミノ酸配列（配列番号２１６）を示す図である。
【図９８】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ９１５０のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ９ＢＵＣ７）の核酸配列（配列番号２１７）及びアミノ酸配列（配列番号２１８）を示す図である。
【図９９】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１１１０２のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号ＢＡＡ３１６３４）の核酸配列（配列番号２１９）及びアミノ酸配列（配列番号２２０）を示す図である。
【図１００】ショウジョウバエ遺伝子Ｓｍｒのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｏ７５３７６）の核酸配列（配列番号２２１）及びアミノ酸配列（配列番号２２２）を示す図である。
【図１０１】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ８０４５のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ４２６５５）の核酸配列（配列番号２２３）及びアミノ酸配列（配列番号２２４）を示す図である。
【図１０２】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１０４２０のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ９Ｈ１７３）の核酸配列（配列番号２２５）及びアミノ酸配列（配列番号２２６）を示す図である。
【図１０３】ショウジョウバエ遺伝子Ｈｓｃ７０−２のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ１１１４２）の核酸配列（配列番号２２７）及びアミノ酸配列（配列番号２２８）を示す図である。
【図１０４】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１０８０５のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ９Ｈ５８３）の核酸配列（配列番号２２９）及びアミノ酸配列（配列番号２３０）を示す図である。
【図１０５】ショウジョウバエ遺伝子ｅＩＦ−４ａのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ９６ＥＡ８）の核酸配列（配列番号２３１）及びアミノ酸配列（配列番号２３２）を示す図である。
【図１０６】ショウジョウバエ遺伝子ＡＣＸＡの２つのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ０８４６２及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ４０１４５）の核酸配列（それぞれ配列番号２３３及び２３５）及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号２３４及び２３６）を示す図である。
【図１０７】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１５１１７のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ０８２３６）の核酸配列（配列番号２３７）及びアミノ酸配列（配列番号２３８）を示す図である。
【図１０８】ショウジョウバエ遺伝子ＴｅｐIIIのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ８ＴＤＪ３）の核酸配列（配列番号２３９）及びアミノ酸配列（配列番号２４０）を示す図である。
【図１０９】ショウジョウバエ遺伝子Ｈｓｃ７０−４のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ１１１４２）の核酸配列（配列番号２４１）及びアミノ酸配列（配列番号２４２）を示す図である。
【図１１０】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ７０６９のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ１４７８６）の核酸配列（配列番号２４３）及びアミノ酸配列（配列番号２４４）を示す図である。
【図１１１】ショウジョウバエ遺伝子ＡＣＸＥの２つのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ４０１４５及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ５１８２８）の核酸配列（それぞれ配列番号２４５及び２４７）及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号２４６及び２４８）を示す図である。
【図１１２】ショウジョウバエ遺伝子ＥＧ：５２Ｃ１０．５のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ９Ｙ２１７）の核酸配列（配列番号２４９）及びアミノ酸配列（配列番号２５０）を示す図である。
【図１１３】ショウジョウバエ遺伝子ｇａｔＡのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ９Ｈ０Ｒ６）の核酸配列（配列番号２５１）及びアミノ酸配列（配列番号２５２）を示す図である。
【図１１４】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１７１４９のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ９ＮＵＨ３）の核酸配列（配列番号２５３）及びアミノ酸配列（配列番号２５４）を示す図である。
【図１１５】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ２９０５のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ９Ｙ６Ｈ４）の核酸配列（配列番号２５５）及びアミノ酸配列（配列番号２５６）を示す図である。
【図１１６】ショウジョウバエ遺伝子ＴＥＲ９４のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ５５０７２）の核酸配列（配列番号２５７）及びアミノ酸配列（配列番号２５８）を示す図である。
【図１１７】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ６３１３のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号ＢＡＡ３１６７２）の核酸配列（配列番号２５９）及びアミノ酸配列（配列番号２６０）を示す図である。
【図１１８】ショウジョウバエ遺伝子ａｕｒの２つのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｏ６０４４５及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｏ６０４４６）の核酸配列（それぞれ配列番号２６１及び２６３）及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号２６２及び２６４）を示す図である。
【図１１９】ショウジョウバエ遺伝子Ｐｋ９１Ｃのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ９６ＳＪ５）の核酸配列（配列番号２６５）及びアミノ酸配列（配列番号２６６）を示す図である。
【図１２０】ショウジョウバエ遺伝子Ｔｏｐ２の２つのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ１１３８８及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ０２８８０）の核酸配列（それぞれ配列番号２６７及び２６９）及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号２６８及び２７０）を示す図である。
【図１２１】ショウジョウバエ遺伝子α−Ｅｓｔ１のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ２２３０３）の核酸配列（配列番号２７１）及びアミノ酸配列（配列番号２７２）を示す図である。
【図１２２】ショウジョウバエ遺伝子Ｎｒｋのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｏ１５１４６）の核酸配列（配列番号２７３）及びアミノ酸配列（配列番号２７４）を示す図である。
【図１２３】ショウジョウバエ遺伝子ｏｔｋのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ１３３０８）の核酸配列（配列番号２７５）及びアミノ酸配列（配列番号２７６）を示す図である。
【図１２４】ショウジョウバエ遺伝子ｃａｄのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ９９６２６）の核酸配列（配列番号２７７）及びアミノ酸配列（配列番号２７８）を示す図である。
【図１２５】ショウジョウバエ遺伝子Ｒｕｔのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｏ４３３０６）の核酸配列（配列番号２７９）及びアミノ酸配列（配列番号２８０）を示す図である。
【図１２６】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ８００２のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号ＢＡＣ０２７０８）の核酸配列（配列番号２８１）及びアミノ酸配列（配列番号２８２）を示す図である。
【図１２７】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１０３３５のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ１３７１６）の核酸配列（配列番号２８３）及びアミノ酸配列（配列番号２８４）を示す図である。
【図１２８】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ８０７０のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ９ＮＶＵ７）の核酸配列（配列番号２８５）及びアミノ酸配列（配列番号２８６）を示す図である。
【図１２９】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ７４６０のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ９６ＱＴ３）の核酸配列（配列番号２８７）及びアミノ酸配列（配列番号２８８）を示す図である。
【図１３０】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１７７３５のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ１４６６９）の核酸配列（配列番号２８９）及びアミノ酸配列（配列番号２９０）を示す図である。
【図１３１】ショウジョウバエ遺伝子Ｇｙｃα９９Ｂのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ３３４０２）の核酸配列（配列番号２９１）及びアミノ酸配列（配列番号２９２）を示す図である。
【図１３２】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１３８９３のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｏ７６０５４）の核酸配列（配列番号２９３）及びアミノ酸配列（配列番号２９４）を示す図である。
【図１３３】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１８１７６のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号ＡＡＨ３３９１８）の核酸配列（配列番号２９５）及びアミノ酸配列（配列番号２９６）を示す図である。
【図１３４】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ８８５８のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｏ１５０７４）の核酸配列（配列番号２９７）及びアミノ酸配列（配列番号２９８）を示す図である。
【図１３５】ショウジョウバエ遺伝子Ａｃ７６Ｅの２つのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ０８４６２及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ５１８２８）の核酸配列（それぞれ配列番号２９９及び３０１）及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号３００及び３０２）を示す図である。
【図１３６】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１７０１０のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ９Ｈ４７７）の核酸配列（配列番号３０３）及びアミノ酸配列（配列番号３０４）を示す図である。
【図１３７】ショウジョウバエ遺伝子Ｔｋｖの３つのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｏ００２３８、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ３６８９４及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ０４７７１）の核酸配列（それぞれ配列番号３０５、３０７及び３０９）及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号３０６、３０８及び３１０）を示す図である。
【図１３８】ショウジョウバエ遺伝子Ｄｎｔのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ３４９２５）の核酸配列（配列番号３１１）及びアミノ酸配列（配列番号３１２）を示す図である。
【図１３９】ショウジョウバエ遺伝子ＡＣＸＤの２つのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ０８４６２及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ４０１４５）の核酸配列（それぞれ配列番号３１３及び３１５）及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号３１４及び３１６）を示す図である。
【図１４０】ショウジョウバエ遺伝子Ａａｔｓ−ａｌａ−ｍのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ４９５８８）の核酸配列（配列番号３１７）及びアミノ酸配列（配列番号３１８）を示す図である。
【図１４１】ショウジョウバエ遺伝子Ｇｅｋのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ９Ｙ５Ｓ２）の核酸配列（配列番号３１９）及びアミノ酸配列（配列番号３２０）を示す図である。
【図１４２】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ３２１６の２つのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ１６０６６及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ２０５９４）の核酸配列（それぞれ配列番号３２１及び３２３）及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号３２２及び３２４）を示す図である。
【図１４３】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ５６５３のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ９６ＱＴ３）の核酸配列（配列番号３２５）及びアミノ酸配列（配列番号３２６）を示す図である。
【図１４４】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１７７４０のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ９ＨＣＢ６）の核酸配列（配列番号３２７）及びアミノ酸配列（配列番号３２８）を示す図である。
【図１４５】ショウジョウバエ遺伝子ＴｅｐIのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ８ＴＤＪ３）の核酸配列（配列番号３２９）及びアミノ酸配列（配列番号３３０）を示す図である。
【図１４６】ショウジョウバエ遺伝子のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ１３９７６）の核酸配列（配列番号３３１）及びアミノ酸配列（配列番号３３２）を示す図である。
【図１４７】ショウジョウバエ遺伝子Ａｃ１３Ｅの２つのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｏ６０５０３及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｏ６０２６６）の核酸配列（それぞれ配列番号３３３及び３３５）及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号３３４及び３３６）を示す図である。
【図１４８】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ２６６７のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ１６７６０）の核酸配列（配列番号３３７）及びアミノ酸配列（配列番号３３８）を示す図である。
【図１４９】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ７８４２のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｏ９５５１０）の核酸配列（配列番号３３９）及びアミノ酸配列（配列番号３４０）を示す図である。
【図１５０】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１７４８６のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ９ＮＷＬ６）の核酸配列（配列番号３４１）及びアミノ酸配列（配列番号３４２）を示す図である。
【図１５１】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ６９６９のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ９２６２６）の核酸配列（配列番号３４３）及びアミノ酸配列（配列番号３４４）を示す図である。
【図１５２】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１２２６２のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ１１３１０）の核酸配列（配列番号３４５）及びアミノ酸配列（配列番号３４６）を示す図である。
【図１５３】ショウジョウバエ遺伝子Ｆｒａｙのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｏ９５７４７）の核酸配列（配列番号３４７）及びアミノ酸配列（配列番号３４８）を示す図である。
【図１５４】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ６８７９のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ９２６２６）の核酸配列（配列番号３４９）及びアミノ酸配列（配列番号３５０）を示す図である。
【図１５５】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１１５９４のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ９６Ｃ１１）の核酸配列（配列番号３５１）及びアミノ酸配列（配列番号３５２）を示す図である。
【図１５６】ショウジョウバエ遺伝子Ｓ６ｋIIのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ５１８１２）の核酸配列（配列番号３５３）及びアミノ酸配列（配列番号３５４）を示す図である。
【図１５７】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１１７１４の２つのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ９ＨＡＢ２及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｏ４３７９１）の核酸配列（それぞれ配列番号３５５及び３５７）及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号３５６及び３５８）を示す図である。
【図１５８】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ３５３４のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｏ７５１９１）の核酸配列（配列番号３５９）及びアミノ酸配列（配列番号３６０）を示す図である。
【図１５９】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ７３３５のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ５００５３）の核酸配列（配列番号３６１）及びアミノ酸配列（配列番号３６２）を示す図である。
【図１６０】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１１２７５の２つのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ９ＨＡＢ２及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｏ４３７９１）の核酸配列（それぞれ配列番号３６３及び２６５）及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号３６４及び３６６）を示す図である。
【図１６１】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１６７２６のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ３４９８１）の核酸配列（配列番号３６７）及びアミノ酸配列（配列番号３６８）を示す図である。
【図１６２】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ７５１４のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ０２９７８）の核酸配列（配列番号３６９）及びアミノ酸配列（配列番号３７０）を示す図である。
【図１６３】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１７２８３のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ１４０９１）の核酸配列（配列番号３７１）及びアミノ酸配列（配列番号３７２）を示す図である。
【図１６４】ショウジョウバエ遺伝子ＢｃＤＮＡ：ＧＨ０７６２６のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ１６７０２）の核酸配列（配列番号３７３）及びアミノ酸配列（配列番号３７４）を示す図である。
【図１６５】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１６７５２のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ８ＴＤＵ８）の核酸配列（配列番号３７５）及びアミノ酸配列（配列番号３７６）を示す図である。
【図１６６】ショウジョウバエ遺伝子Ｒｐｔ１のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ３５９９８）の核酸配列（配列番号３７７）及びアミノ酸配列（配列番号３７８）を示す図である。
【図１６７】ショウジョウバエ遺伝子Ｗｔｓの２つのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｏ９５８３５及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ９Ｐ２Ｘ１）の核酸配列（それぞれ配列番号３７９及び３８１）及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号３８０及び３８２）を示す図である。
【図１６８】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１５８２のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号ＡＡＭ７３５４７）の核酸配列（配列番号３８３）及びアミノ酸配列（配列番号３８４）を示す図である。
【図１６９】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１２２８９のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ５００５３）の核酸配列（配列番号３８５）及びアミノ酸配列（配列番号３８６）を示す図である。
【図１７０】ショウジョウバエ遺伝子Ｐｅｐｃｋのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ１６８２２）の核酸配列（配列番号３８７）及びアミノ酸配列（配列番号３８８）を示す図である。
【図１７１】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ５６６５のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ０６８５８）の核酸配列（配列番号３８９）及びアミノ酸配列（配列番号３９０）を示す図である。
【図１７２】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ７２８５のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ９６ＴＦ２）の核酸配列（配列番号３９１）及びアミノ酸配列（配列番号３９２）を示す図である。
【図１７３】ショウジョウバエ遺伝子Ｂｔのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ８ＷＺ４２）の核酸配列（配列番号３９３）及びアミノ酸配列（配列番号３９４）を示す図である。
【図１７４】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ８７９５のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ９ＧＺＱ４）の核酸配列（配列番号３９５）及びアミノ酸配列（配列番号３９６）を示す図である。
【図１７５】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ１０９６７のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｏ７５３８５）の核酸配列（配列番号３９７）及びアミノ酸配列（配列番号３９８）を示す図である。
【図１７６】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ３８０９のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ５５２６３）の核酸配列（配列番号３９９）及びアミノ酸配列（配列番号４００）を示す図である。
【図１７７】ショウジョウバエ遺伝子Ａｃｋのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｑ０７９１２）の核酸配列（配列番号４０１）及びアミノ酸配列（配列番号４０２）を示す図である。
【図１７８】ショウジョウバエ遺伝子Ａｂｌのヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ００５１９）の核酸配列（配列番号４０３）及びアミノ酸配列（配列番号４０４）を示す図である。
【図１７９】ショウジョウバエ遺伝子ＣＧ７３６２のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ１４７８６）の核酸配列（配列番号４０５）及びアミノ酸配列（配列番号４０６）を示す図である。
【図１８０】ショウジョウバエ遺伝子Ｃｙｐ９ｆ２のヒト相同体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ参照番号Ｐ０８６８４）の核酸配列（配列番号４０７）及びアミノ酸配列（配列番号４０８）を示す図である。
【図１８１】Ｄ．Ｍｅｌ−２細胞のＦＡＣＳ像を示す１対のグラフである。
【図１８２】有糸分裂の遮断を起こすＥｃｔ２  ｓｉＲＮＡ  ＣＯＤ１５１３（ａａＧＵＧＧＧＣＵＵＵＧＵＡＡＡＧＡＵＧＧ）をトランスフェクトした細胞を示す図である。
【図１８３】ＦＳＣ及びＳＳＣチャネルの電圧を調整した後の好ましい像である。
【図１８４】ＦＬ３チャネルの電圧も、Ｇ１期、Ｓ期及びＧ２／Ｍ期の細胞の分析が可能となるように変化させ、細胞凝集によって生じる事象の重なりを除外するためにゲート（Ｇ２）を設定した後の像である。
【図１８５】ゲートをかけた領域（Ｇ２）内のＦＬ３−Ｈに対するカウント数を示すヒストグラム、及び作成した関連ヒストグラム統計データを示す図である。ヒストグラム統計データを用いて、Ｇ１期の事象、Ｓ期の事象及びＧ２／Ｍ期の事象を算出する。この場合、Ｇ１期の事象数はＭ２×２であり、Ｇ２／Ｍ期の事象数はＭ３×２であり、Ｓ期の事象数は、Ｍ１−［（Ｍ２×２）＋（Ｍ３×２）］である。
【図１８５】ゲートをかけた領域（Ｇ２）内のＦＬ３−Ｈに対するカウント数を示すヒストグラム、及び作成した関連ヒストグラム統計データを示す図である。ヒストグラム統計データを用いて、Ｇ１期の事象、Ｓ期の事象及びＧ２／Ｍ期の事象を算出する。この場合、Ｇ１期の事象数はＭ２×２であり、Ｇ２／Ｍ期の事象数はＭ３×２であり、Ｓ期の事象数は、Ｍ１−［（Ｍ２×２）＋（Ｍ３×２）］である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【図２５−４】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３５】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３６−３】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１−１】
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【図４１−２】
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【図４１−３】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４−１】
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【図４４−２】
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【図４５−１】
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【図４５−２】
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【図４６−１】
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【図４６−２】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０−１】
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【図５０−２】
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【図５１−１】
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【図５１−２】
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【図５２−１】
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【図５２−２】
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【図５３−１】
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【図５３−２】
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【図５４】
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【図５５−１】
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【図５５−２】
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【図５６−１】
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【図５６−２】
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【図５７−１】
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【図５７−２】
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【図５７−３】
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【図５７−４】
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【図５７−５】
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【図５７−６】
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【図５８−１】
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【図５８−２】
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【図５９−１】
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【図５９−２】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５−１】
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【図６５−２】
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【図６６】
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【図６７−１】
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【図６７−２】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１−１】
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【図７１−２】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５−１】
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【図７５−２】
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【図７５−３】
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【図７６】
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【図７７−１】
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【図７７−２】
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【図７８−１】
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【図７８−２】
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【図７９−１】
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【図７９−２】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３−１】
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【図８３−２】
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【図８４−１】
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【図８４−２】
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【図８４−３】
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【図８４−４】
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【図８４−５】
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【図８４−６】
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【図８４−７】
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【図８４−８】
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【図８５】
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【図８６−１】
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【図８６−２】
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【図８７】
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【図８８−１】
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【図８８−２】
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【図８９−１】
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【図８９−２】
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【図９０−１】
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【図９０−２】
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【図９１】
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【図９２−１】
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【図９２−２】
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【図９３】
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【図９４−１】
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【図９４−２】
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【図９４−３】
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【図９５−１】
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【図９５−２】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９−１】
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【図９９−２】
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【図１００−１】
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【図１００−２】
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【図１００−３】
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【図１０１】
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【図１０２−１】
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【図１０２−２】
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【図１０３】
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【図１０４−１】
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【図１０４−２】
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【図１０５】
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【図１０６−１】
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【図１０６−２】
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【図１０６−３】
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【図１０６−４】
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【図１０７】
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【図１０８−１】
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【図１０８−２】
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【図１０９】
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【図１１０】
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【図１１１−１】
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【図１１１−２】
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【図１１１−３】
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【図１１１−４】
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【図１１２−１】
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【図１１２−２】
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【図１１２−３】
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【図１１３】
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【図１１４】
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【図１１５−１】
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【図１１５−２】
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【図１１５−３】
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【図１１５−４】
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【図１１６】
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【図１１７−１】
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【図１１７−２】
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【図１１７−３】
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【図１１８】
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【図１１９】
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【図１２０−１】
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【図１２０−２】
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【図１２０−３】
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【図１２１】
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【図１２２】
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【図１２３−１】
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【図１２３−２】
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【図１２４】
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【図１２５−１】
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【図１２５−２】
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【図１２６−１】
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【図１２６−２】
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【図１２７】
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【図１２８】
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【図１２９】
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【図１３０−１】
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【図１３０−２】
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【図１３１】
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【図１３２】
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【図１３３】
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【図１３４−１】
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【図１３４−２】
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【図１３５−１】
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【図１３５−２】
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【図１３５−３】
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【図１３６】
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【図１３７−１】
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【図１３７−２】
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【図１３８】
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【図１３９−１】
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【図１３９−２】
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【図１３９−３】
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【図１４０】
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【図１４１−１】
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【図１４１−２】
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【図１４１−３】
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【図１４２−１】
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【図１４２−２】
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【図１４２−３】
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【図１４３】
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【図１４４】
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【図１４５−１】
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【図１４５−２】
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【図１４６】
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【図１４７−１】
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【図１４７−２】
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【図１４７−３】
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【図１４８−１】
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【図１４８−２】
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【図１４９】
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【図１５０】
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【図１５１−１】
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【図１５１−２】
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【図１５２】
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【図１５３−１】
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【図１５３−２】
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【図１５４−１】
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【図１５４−２】
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【図１５５】
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【図１５６】
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【図１５７】
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【図１５８】
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【図１５９−１】
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【図１５９−２】
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【図１６０】
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【図１６１】
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【図１６２】
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【図１６３】
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【図１６４−１】
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【図１６４−２】
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【図１６４−３】
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【図１６５】
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【図１６６】
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【図１６７−１】
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【図１６７−２】
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【図１６７−３】
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【図１６８】
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【図１６９】
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【図１７０−１】
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【図１７０−２】
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【図１７１】
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【図１７２】
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【図１７３−１】
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【図１７３−２】
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【図１７３−３】
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【図１７３−４】
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【図１７３−５】
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【図１７３−６】
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【図１７３−７】
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【図１７３−８】
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【図１７３−９】
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【図１７３−１０】
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【図１７３−１１】
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【図１７３−１２】
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【図１７３−１３】
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【図１７３−１４】
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【図１７３−１５】
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【図１７３−１６】
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【図１７３−１７】
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【図１７３−１８】
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【図１７３−１９】
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【図１７３−２０】
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【図１７３−２１】
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【図１７３−２２】
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【図１７３−２３】
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【図１７３−２４】
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【図１７３−２５】
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【図１７３−２６】
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【図１７３−２７】
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【図１７３−２８】
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【図１７３−２９】
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【図１７３−３０】
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【図１７４】
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【図１７５−１】
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【図１７５−２】
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【図１７６】
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【図１７７−１】
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【図１７７−２】
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【図１７８−１】
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【図１７８−２】
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【図１７９】
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【図１８０】
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【図１８１】
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【図１８２】
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【図１８３】
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【図１８４】
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【図１８５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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