(57)【要約】本発明は、デキストラン硫酸エステル、またはその薬学的に許容される誘導体の使用で、超急性血液媒介炎症反応（ＩＢＭＩＲ）の治療薬の製造に使用される。さらに、本発明は、ＩＢＭＩＲにより起こる細胞移植の形態崩壊や細胞移植の組織不適合の治療薬の製造に使用されるデキストラン硫酸エステル又はその薬学的に許容される誘導体の使用に関する。本発明は、Ｉ型糖尿病を罹患している患者に適用できるものであり、患者には豚のランゲルハンス島が門脈に移植される。本発明によりデキストラン硫酸エステルの投与は移植膵島の拒絶と崩壊を抑制し、そして患者の血糖を正常にするものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
超急性血液媒介炎症反応（ＩＢＭＩＲ）の治療薬の製造のためのデキストラン硫酸エステルまたはその薬学的に許容される誘導体の使用。
【請求項２】
前記ＩＢＭＩＲが、移植細胞が外来レシピエント内に移植され、それに続いて移植細胞が血液に接触することにより生じるものである請求項１記載のデキストラン硫酸エステルの使用。
【請求項３】
移植細胞の形態崩壊の治療薬の製造のためのデキストラン硫酸エステルまたはその薬学的に許容される誘導体の使用。
【請求項４】
前記移植細胞の形態崩壊が、超急性血液媒介炎症反応（ＩＢＭＩＲ）によるものである請求項３記載のデキストラン硫酸エステルの使用。
【請求項５】
移植細胞の組織不適合の治療薬の製造のためのデキストラン硫酸エステルまたはその薬学的に許容される誘導体の使用。
【請求項６】
前記組織不適合が超急性血液媒介炎症反応（ＩＢＭＩＲ）によるものである請求項５記載のデキストラン硫酸エステルの使用。
【請求項７】
前記細胞移植がレシピエントとしての人体に対して移植される請求項２から６のいずれか記載のデキストラン硫酸エステルの使用。
【請求項８】
前記細胞移植が次のいずれかである請求項２から７のいずれかに記載のデキストラン硫酸エステルの使用。
―  同種移植  または
―  異種移植
【請求項９】
前記細胞移植が次のいずれかである請求項２から８のいずれかに記載のデキストラン硫酸エステルの使用。
―  個体細胞
―  細胞集合体  または
―  非血管新生組織
【請求項１０】
前記移植細胞が、エンゲルハンス膵島である請求項２から９のいずれかに記載のデキストラン硫酸エステルの使用。
【請求項１１】
前記デキストラン硫酸エステルが２００００Ｄａ未満、好ましくは１００００未満の分子量を有する先行する請求項のいずれかに記載のデキストラン硫酸エステルの使用。
【請求項１２】
前記デキストラン硫酸エステルの硫黄含量が１０−２５％、好ましくは１５−２０％である先行する請求項のいずれかに記載のデキストラン硫酸エステルの使用。
【請求項１３】
デキストラン硫酸エステルまたはその薬学的に許容される誘導体の治療有効量を超急性血液媒介炎症反応（ＩＢＭＩＲ）の治療が必要な患者に投与するＩＢＭＩＲの治療方法。
【請求項１４】
前記患者が人であり、前記ＩＢＭＩＲが、細胞移植が患者のレシピエント体内に移植され、それに続いて移植細胞が血液に接触することにより生じるものである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
デキストラン硫酸エステルまたはその薬学的に許容される誘導体の治療有効量を細胞移植の組織不適合の治療が必要な患者に投与する細胞移植の組織不適合症の治療方法。
【請求項１６】
前記患者が人であり、細胞移植の組織不適合が超急性血液媒介炎症反応（ＩＢＭＩＲ）によるものである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
デキストラン硫酸エステルまたはその薬学的に許容される誘導体の治療有効量を移植細胞の形態崩壊の治療が必要な患者に投与する移植細胞の形態崩壊の治療方法。
【請求項１８】
前記患者が人であり、細胞移植の組織不適合が超急性血液媒介炎症反応（ＩＢＭＩＲ）によるものである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記デキストラン硫酸エステルの治療有効量が、前記患者の血液中のデキストラン硫酸濃度として５ｍｇ／ｍｌ未満、好ましくは０．０１−１ｍｇ／ｍｌであり、更に好ましくは０．０５−０．２ｍｇ／ｍｌである請求項１３から１８に記載のいずれかの方法。
【請求項２０】
前記デキストラン硫酸エステルが前記デキストラン硫酸エステルを溶解した前記移植細胞の注入により投与される請求項１４、１５または１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記デキストラン硫酸エステルの分子量が２００００Ｄａ未満、好ましくは１００００Ｄａ未満である請求項１３から２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記デキストラン硫酸エステルの硫黄含量が１０-２５％、好ましくは１５−２０％である請求項１３から２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はデキストラン硫酸エステルの新規用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、世界で約１千万の人がＩ型糖尿病を罹患しているが、この病気はまたインスリン依存型糖尿症ともいわれる。しかし、患者の数は劇的に増加しており、２０１０年までに２５００万人に上るであろう。現在、インシュリン生産のβ細胞を導入することによりＩ型糖尿病患者の血糖値を正常に保つように研究が進められている。そのための二つの主な方法は、血管付きの膵臓移植片または分離ランゲルハンス島のいずれかの移植である。血管付きの移植片（膵臓全体）によりある程度の成功は得られたが、手術のリスクと術後の合併症の問題は依然として存在する。さらに、適当な膵臓提供者が不足しているという問題もある。反対に、分離膵臓小島の移植は通常、門脈に膵島を肝臓移植のように注入することにより行なわれ、かくして膵島は肝臓の門脈樹で血塊を作って閉塞する。
【０００３】
Shapiroと共同研究者により導入された膵島の新規な他家移植の方法[１]は、疑いもなく多くのＩ型糖尿病患者に有益である。しかし、この新規な方法でも、一人の提供者の膵臓の膵島の移植では患者の血糖値を正常にするには不足することが判明した［２］。その結果、人の膵島の供給がこの治療を制限するに至った。インシュリン産生の代替源を見つける必要がある。一つの方法は、動物組織からの膵島を使用することであり、主な候補として豚からの膵島が挙げられる。
【０００４】
膵島の他家移植が可能になる前に解決すべき主たる障害の一つは、新鮮な人血が生体内および生体外で接触すると豚の膵島が顕現する障害性炎症反応の存在である［３］。また人の膵島は門脈内移植のときに患者のＡＢＯ型血液に接触すると障害性炎症反応を誘起する［４］。炎症反応は血小板の急速な消費と活性化という特徴を有し、それは膵島の表面に接着し、凝集と捕体のカスケードの両方を促進する。さらに、膵島は血塊に埋没し白血球  ＣＤ１１ｂ＋に湿潤され、これらは全て一緒になって細胞形態の崩壊と正常血糖値の低下という結果に至る［３−４］。さらに、炎症は後のフェーズで続く細胞媒介の特定の免疫応答を加速する［５−８］。それ故、障害性炎症反応と称される、超急性血液媒介炎症反応（ＩＢＭＩＲ）の抑制は膵島同種および異種移植の成功に必須である。
【０００５】
Buhelerら［５］とCantarovichら［６］による最近の二つの研究は、従来の免疫抑制を徹底する状況下ですら、ヒトでない霊長類の肝臓門脈へ移植すると成体豚の膵島は直ちに破壊されることを示している。これらの研究から、著者らは免疫抑制薬に影響されない、強力な先天的応答、ＩＢＭＩＲが異種膵島の崩壊に関連していると結論する。
【０００６】
Fioranteらは、血管新生化不均一移植片の超急性拒絶（ＨＡＲ）の防止にデキストラン  硫酸エステルの使用を研究した［９］。クエン酸塩で凝集防止処理された人血で灌流（perfusion）された豚の肺は、異種移植モデルで３０分後にはＨＡＲが見られた。しかし、デキストラン  硫酸エステル  ２ｍｇ／ｍｌの投与は約２００分の時間、肺を延命させた。血管新生化された全器官のＨＡＲは、人血中の抗体の作用により媒介され、それは移植器官の血管の内皮細胞上の抗原に接触してこれを認識し結合する。抗体媒介のＨＡＲ反応は、捕体系の成分により亢進する［８，１０，１１］。デキストラン硫酸エステルは、また捕体活性を禁止することでも知られているので、異種移植モデルにデキストラン硫酸エステルを使用して肺の延命化がなされたことは、デキストラン硫酸エステルの抗捕体効果であると信じられている。
【０００７】
Nakanoとその協力者は、高血糖症の改善における肝細胞成長因子（ＨＦＧ）の役割を調べるために、ＳＴＺ誘起の糖尿病マウスの肝臓に単離した同系の膵島を移植した［１３］。デキストラン硫酸エステルはＨＧＦの効果を亢進することが知られており、その結果ＨＧＦはデキストラン硫酸エステルと併せてレシピエントのマウスの腹腔内に投与された。検査した全てのマウスでこの投与は正常血糖をもたらした。また、わずかのマウスでは、デキストラン硫酸エステル単独の投与はある程度の有利な効果を示したが、しかし、腎臓の皮膜下に膵島移植をする場合は、効果はなかった。マウスに投与されたデキストラン硫酸エステルに抗ＨＧＦ抗体治療を追加すると全体としてデキストラン硫酸エステルの効果を消失させ、これはこのモデルではマウスにおける同種膵島移植のデキストラン硫酸エステルの効果は内生ＨＧＦを経由することを示すものである。
【０００８】
Thomasらは、溶解性デキストラン誘導体が補体活性と生体外障害を媒介する補体を抑制することを示した［１４］。人血清中で培養された豚の大動脈内皮細胞は補体消費と活性断片Ｃ３、Ｃ５の沈殿を示し、内皮細胞に複合体Ｃ５ｂ−９の膜攻撃を示す。ＣＭＤＢ２５デキストラン硫酸エステルの２５ｍｇ／ｍｌを追加すると補体活性と細胞上への崩壊性複合体沈殿が抑制された。デキストランそれ自身にはこのような効果はない。
【０００９】
要約
本発明は従来の治療のこれらおよび他の欠点を改良する。
本発明は、超急性血液媒介炎症反応（ＩＢＭＩＲ）の治療法となることを目的とする。
本発明は、ＩＢＭＩＲに起因する細胞移植の形態崩壊の治療法となることを他の目的とする。
さらに、本発明は、ＩＢＭＩＲに起因する細胞移植の組織不適合の治療法となることを目的とする。
これらおよび他の目的は、付属の特許請求の範囲により定義される本発明により明らかとなる。
簡単に言うと、本発明は、超急性血液媒介炎症反応（ＩＢＭＩＲ）の治療のためのデキストラン硫酸エステルおよびその誘導体の使用に関する。この炎症の新規な形は、細胞または細胞集合体が生体内または生体外で外来血に接触することが契機となる。ＩＢＭＩＲの非常に重要な例は、同種または異種の細胞がレシピエント哺乳類、特に人が患者として、その体内に移植される場合である。ＩＢＭＩＲはそれに続いて、形態崩壊と移植した細胞または細胞集合体の破壊に至り、構造または組織の喪失となる。さらに、ＩＢＭＩＲはまた一般には細胞移植の組織不適合となる。
【００１０】
デキストラン硫酸エステルまたはその誘導体の投与は、ＩＢＭＩＲの有害な効果を排除しそして組織不適合と細胞移植形態崩壊を効果的に防止する。本発明に従うデキストラン硫酸エステルは、低分子量デキストラン硫酸エステル（ＬＭＷ−ＤＳ）から、たとえば数百または千ダルトン（Ｄａ）から、高分子量デキストラン硫酸エステル（ＨＭＷ−ＤＳ）まで、一般的には５０００００Ｄａを超えて、例えば１００００００Ｄａを超える分子量のものまで分子量を有することができる。デキストラン硫酸エステルの有利な効果は特にＬＭＷ−ＤＳで顕著であるが、高分子量のデキストラン硫酸エステルの投与でも肯定的な効果は観察される。本発明によるＩＢＭＩＲに対するデキストラン硫酸エステルのより大きな分子の有利な効果は、硫黄含量、すなわち、デキストラン鎖におけるグルコシル基当たりの硫酸エステル基の数が増大すると、より亢進する。ＬＭＷ−ＤＳは一般的には２０００Ｄａ以下、たとえば１００００Ｄａ以下、たとえば約５０００Ｄａの平均分子量を有する。ＬＭＷ−ＤＳの平均硫黄含量は約１０〜２５％、たとえば１５〜２０％であり、これはグルコシル基当たり約２個の硫酸エステル基に相当する。２００００Ｄａよりも高い平均分子量のデキストラン硫酸エステルにはより高濃度の硫黄濃度が利用され得る。
【００１１】
デキストラン硫酸エステルおよびその誘導体は、ＩＢＭＩＲまたは細胞移植の部位へ全身を経由して、または当該部位へ直接に（局所的に）投与され得る。このように、本発明に従い、デキストラン硫酸エステルおよびその誘導体は、経口、静脈内、腹腔内、皮下、口内、直腸内、経皮、鼻腔、気管、気管支または局所で、他の方法または吸入により、薬学的に許容され得る服用形態にある活性成分を含む薬学製剤の形で、投与され得る。
【００１２】
哺乳類、特に人の治療的処置では、デキストラン硫酸エステルおよびその誘導体は、単独で投与され得るが、しかし一般的には、薬学的に許容され得るアジュバンド、希釈材、基材と混合した薬学配合で投与され、それは投与の意図する経路および薬学実務に正当に注意して選択されえる。
【００１３】
処方におけるデキストラン硫酸エステルまたはその誘導体の量は、状態の重篤さに依存しそして治療される患者にも依存し、そして当業者に非発明的に決定され得る。本発明による投与デキストラン硫酸エステルまたはその誘導体の濃度は、デキストラン硫酸エステルに連動する副作用の影響を最小限にするために高すぎないようにする。デキストラン硫酸エステルまたはその誘導体の服用に適した多くの臨床例では哺乳類、特に人が患者の場合の治療および／または予防処置には、５ｍｇ／ｍｌより低い平均血中濃度、多分、２ｍｇ／ｍｌより低く、そして特に１ｍｇ／ｍｌより低い濃度となるものである。好ましい濃度範囲は、０．０１ｍｇ／ｍｌと１ｍｇ／ｍｌデキストラン硫酸エステルの間にあり、たとえば０．０５ｍｇ／ｍｌより高く、０．０８ｍｇ／ｍｌより高く、または０．１ｍｇ／ｍｌより高く、および／または０．８ｍｇ／ｍｌより低く、０．６ｍｇ／ｍｌより低く、０．４ｍｇ．ｍｌより低く、または０．２ｍｇ／ｍｌより低く、たとえば、０．０１ｍｇ／ｍｌと０．２ｍｇ／ｍｌの間および／または０．０５ｍｇ／ｍｌと０．２ｍｇ／ｍｌとの間の濃度範囲である。
【００１４】
本発明によるデキストラン硫酸エステルはＩ型糖尿病罹患患者に移植されたインシュリン産生β−細胞の組織不適合の抑制に特に適している。このような患者では、他の人または哺乳類からのランゲルハンス膵島、特に豚膵島が患者の門脈に膵島を注入することにより移植される。しかし、一旦膵島が患者の血液に接触すると、ＩＢＭＩＲが誘発し、そして膵島のインスリン制御機能が破壊されて膵島は拒絶される。それ故、一旦細胞または細胞集合体の移植がされると、移植部位においては少なくとも局所的にデキストラン硫酸エステルまたはその誘導体の治療濃度にまで到達していることが好ましい。このことは、実際の移植の前に予めデキストラン硫酸エステルを投与していることで達成できる。代わりに、ＩＢＭＩＲを防止し、膵島の拒絶によるいかなる破壊を防止し、患者の正常血糖値を可能とするために本発明によるデキストラン硫酸エステルを含む溶液に膵島を溶解させて注入し得る。このような細胞およびデキストラン硫酸エステル溶液におけるデキストラン硫酸エステルの濃度は十分高いことが好ましく、それにより、移植に続く初めの数時間の間、移植部位において、少なくとも局所的に、デキストラン硫酸エステルの治療濃度、好ましくは、５ｍｇ／ｍｌより低く、より好ましくは０．０１ｍｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌ、そして特に０．０１ｍｇ／ｍｌ〜０．２ｍｇ／ｍｌの濃度が達成され得る。デキストラン硫酸エステルはその後、移植部位から拡散し、局所でのデキストラン硫酸エステル濃度は低下する。いくつかの適用では、デキストラン硫酸エステルの治療的濃度は多分移植後の最初の２４−４８時間のみに必要であるので、特別なデキストラン硫酸エステルはＩＢＭＩＲの抑制に必要ではない。しかし、必要なときはいつでも、追加のデキストラン硫酸エステルが添加され、例えば、静脈内に、腹腔内にまたは他の投与経路による。当業者は理解するように、細胞または細胞集合体を含むデキストラン硫酸エステル溶液の投与は、実際の移植前のデキストラン硫酸エステルまたはその誘導体の投与と併用され得る。
【００１５】
デキストラン硫酸エステルまたはその誘導体は、移植組織の組織不適合の処置に有用な他の治療剤と併用することができる。適当であるが、これに限定されない、組織不適合の治療のためにデキストラン硫酸エステルと併用して使用され得る免疫抑制剤の例は、サイクロスポリン（cyclosporin）、タクロリマス（tacrolimus）、コルチコステロイド（corticosteroids）、ラパマイシン（rapamaycin）（シロリマス（sirolimus））およびマイコフェノラート  モフェチル（mycophenolate  mofetil）である。本発明によるデキストラン硫酸エステルの投与は、抗ＴＦ抗体および／または部位−不活性化因子ＶＩＩａの投与と併用が可能であり、これらはＩＢＭＩＲの抑制に一定の機能を有するものである。
【００１６】
図面の短い説明
更なる目的と利点を有する本発明は、添付の図面と共に、次の説明を参照して最もよく理解され得る。
図１は、豚膵島を人血で灌流する間に発生するＣ３ａに対するＬＭＷ−ＤＳの効果を図解するものである。
図２は、豚膵島を人血で灌流する間に発生するｓＣ５ｂ−９に対するＬＭＷ−ＤＳの効果を図解するものである。
図３は、ＬＭＷ−ＤＳの存在下に人血清で培養する際の補体系に対するＬＭＷ−ＤＳの直接の効果を図解するものである。
図４は、ＬＭＷ−ＤＳを含まない人血で灌流した後の豚膵島における白血球分布を示す図である。
図５は、１ｍｇ／ｍｌのＬＭＷ−ＤＳを含む人血で灌流した後の豚膵島における白血球分布を示す図である。
図６は、ＬＭＷ−ＤＳを含まない人血で灌流した後の豚膵島における血小板分布を示す図である。
図７は、１ｍｇ／ｍｌのＬＭＷ−ＤＳを含む人血で灌流した後の豚膵島における血小板分布を示す図である。
図８は、ＬＭＷ−ＤＳ処理をしていない糖尿病性の胸腺欠損マウスに門脈内移植をした後、豚膵島におけるインシュリン産生を図示するものである。
図９は、ＬＭＷ−ＤＳ処理をしていない糖尿病性の胸腺欠損マウスに門脈内移植をした後、豚膵島におけるインシュリン産生を図示するものである。
図１０は、ＬＭＷ−ＤＳ処理をしていない糖尿病性の胸腺欠損マウスに門脈内移植をした後、豚膵島における白血球分布を図示するものである。
図１１は、ＬＭＷ−ＤＳ処理をした糖尿病性の胸腺欠損マウスに門脈内移植をした後、豚膵島における白血球分布を図示するものである。
【００１７】
詳細な説明
本発明は、一般的には、超急性血液媒介炎症反応（ＩＢＭＩＲ）およびＩＢＭＩＲに起因する形態崩壊と細胞移植の組織不適合に対するデキストラン硫酸エステルの新規な驚くべき効果に関する。
ＩＢＭＩＲは比較的最近認知された炎症反応で外来血に接触した細胞または細胞集合体が契機となる。ＩＢＭＩＲは細胞上の組織因子の発現が特徴で、それはトロンビンの局所生成の契機となる。その後、活性血小板が細胞表面に接着し凝集と補体系の両方の活性化を促進する。さらに、白血球は補充されて細胞に湿潤する。これらの効果は共に外来血との接触後初めの数時間以内で細胞形態の崩壊と破壊を引き起こす。ＩＢＭＩＲはまた後のフェーズにおける、続く細胞媒介特異免疫応答を加速する。
【００１８】
ＩＢＭＩＲの非常に重要な例は、細胞または細胞集合体が、好ましくは哺乳類、特に人の患者の体内に移植された場合である。レシピエント患者の血液と接触すると、細胞はＩＢＭＩＲを引き起こし、細胞形態の崩壊、一般には細胞移植の組織不適合に至る。ＩＢＭＩＲは、ＡＢＯ−型血液の提供者からの細胞が患者へ移植される同種細胞移植の場合と、豚からサルへ及び豚から人への細胞または細胞集合体の異種移植などの異種細胞移植の場合の両方に検出される。
【００１９】
用語”移植物”は、一般的には、本発明では、好ましくは哺乳類、特に人患者のレシピエント体内へ移植される単一細胞、単一細胞のいくつかまたは多くの細胞の集合体を意味する。また、非血管新生化組織のより大なる細胞集合体が発現細胞移植物に含まれて、ここで使用される。本発明による細胞移植物の例は、Ｉ型糖尿病に罹患した患者の肝臓の門脈に移植される同種または異種のランゲルハンス島である。他の例は、パーキンソン症患者の線条体における胎生異種神経組織／細胞の移植であり得る。
【００２０】
背景技術の説明の箇所で簡単に説明したように、Ｉ型糖尿病患者の血糖値を正常にする有望な方法はインスリン産生のβ−細胞を、たとえば門脈へ移植することである。適当なインシュリン産生細胞、例えば、ランゲルハンス島の形態にあるものは、同種と異種の両方の提供者から得ることができる。正常な血糖値を得るためには数人の提供者の膵島が必要であるし、適当な人の提供者が不足していることもあり、異種の、好ましくは豚の膵島が使用され得る。しかし、同種と異種の膵島は両者ともレシピエント患者の血液に接触するとＩＢＭＩＲを顕現する。その結果、移植後数時間以内に、細胞の形態は崩壊し、そして破壊され、一般的には、細胞の一体性、構造および形態の喪失が明らかになる。これは、ランゲルハンス島から初めは顕著なインシュリン産生の増加となり、それに続いてインシュリン産生機能の喪失となる。還元すれば、移植後直ぐに正常な血糖値が行われることになる。さらに、ＩＢＭＩＲは細胞移植の組織不適合を引き起こす。
【００２１】
抗体の生産と器官拒絶を抑制する通常の免疫抑制剤の投与は、ＩＢＭＩＲまたはＩＢＭＩＲに起因する細胞移植の組織不適合にはなんら効果がない。これは、ＩＢＭＩＲとＩＢＭＩＲに起因する組織不適合の主な機構が、全器官と血管新生化組織の移植において見出された機構とは相違することを意味する。
【００２２】
次には、ＩＢＭＩＲの症状、特に、血小板消費、凝集と補体活性化および白血球湿潤を詳細に示す。さらに、各症状に対するデキストラン硫酸エステルの効果を示す。デキストラン硫酸エステルのこれらの効果のより詳細は、実施例の部で示される。
【００２３】
血小板消費からはじめるが、ＩＢＭＩＲは同種または異種の細胞または細胞集合体に接触した血液の血小板の数に影響する。血液細胞の接触に続いて自由循環系の血小板の数の顕著な現象が観察される。血小板は活性化し、細胞に接着し、血小板凝集を起こす。細胞接着に続いて、血小板は血小板リン脂質を含む数種の物質を放出し、該脂質は血塊形成と凝集系の活性化に重要である。
【００２４】
本発明によるデキストラン硫酸エステルの効果的な量の投与は、血液の血小板数の増加に見られるように、血小板の消費を抑制し、それは外来細胞または細胞集合体と接触する以前の血液で測定される値に戻す。さらに加えて、細胞に接着する血小板はデキストラン硫酸エステルによりかなり減少するが、しかし膵島を囲む血小板の痕跡量は依然として残る。これらの残った血小板の効果は、しかし、必ずしも不利ではない。動物による研究では、移植後、血管形成が確認される前に少なくとも１週間が経過することが示される［１５、１６］。血小板は例えば、血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）および繊維芽細胞成長因子［１７，１８］のような多くの重要な成長因子を含み、患者体内で血管再生や膵島合体を持続し得る。膵島移植の臨床では、膵島が門脈に塞栓すると、接着血小板の輪が、同様に、肝臓組織で合体と生存を持続する可能性がある。
【００２５】
血液と接触すると、細胞上で組織因子の発現によりまた接着し凝集する血小板により放出される物質により外来血は凝集系を活性化する。簡単には、細胞で産生した組織因子（ＴＦ）は血液凝集因子ＶＩＩａと複合化し、そして因子Ｘと酵素的に作用して活性化因子Ｘ（ＦＸａ）を形成する。その後、種々の因子の活性化カスケードが続き、それは結局、プロトロンビンからのトロンビンの生成に至る。次いでトロンビンはフィブリノゲン分子の重合を引き起こして細胞の周りに繊維血塊を形成するフィブリン繊維となるが、これらは全て当業者には周知である。トロンビンはまた血塊開始の内因性経路を活性化し、そこでは因子ＸＩＩ（ハーゲマン因子）は活性化され（ＦＸＩＩａ）、そして次に酵素的に因子ＸＩ（トロンボプラスチン前駆物質）を活性化し、その結果ＦＸＩａ、因子ＸＩの活性化形となる。またこの経路は、結局、外因性のＴＦ−活性化経路についてプロトロンビンからトロンビンを産生することになる。
【００２６】
血塊はアンチトロンビン、循環性セリン分解酵素禁止剤で抑制されることができ、それは因子ＸＩＩａ−アンチトロンビン（ＦＸＩＩａ−ＡＴ）、因子ＸＩａ−アンチトロンビン（ＦＸＩａ−ＡＴ）およびトロンビン−アンチトロンビン（ＴＡＴ）の各複合体を形成してＦＸＩＩａ、ＦＸＩａおよびトロンビンを抑制する。
【００２７】
細胞や細胞集合体の周辺に一旦形成されたフィブリン血塊は、フィブリン溶解系のプラスミンの作用で除去されえる。プラスミンはフィブリン血塊をフィブリン劣化物へ劣化させ、それにより更に血塊が生成するのを抑制する。しかし、プラスミンの作用はアルファ  ２  アンチプラスミンにより抑制され、それは遊離のプラスミンに結合してそれを不活性化し、プラスミン−アルファ  ２  アンチプラスミン（ＰＡＰ）複合体が形成される。
【００２８】
ＩＢＭＩＲは、生体内や生体外で外来血に接触した細胞の周りにフィブリン血塊が形成される特徴がある。更に加えて、ＦＸＩａ−ＡＴ、ＦＸＩＩａ−ＡＴ、ＴＡＴおよびＰＡＰの増加が認められる。ＩＢＭＩＲはＦＸＩａ−Ｃ１  ＩＮＨまたはＦＸＩＩａ−Ｃ１  ＩＮＨのいずれの量にも効果はない。本発明によるデキストラン硫酸エステルの有効量の投与は、凝集におけるＩＢＭＩＲの効果を喪失させ、それは血液中のＦＸＩａ−ＡＴ、ＦＸＩＩａ−ＡＴ、ＴＡＴおよびＰＡＰの量が減少することにより示される。デキストラン硫酸エステルの効果は、凝集系それ自体により、血小板活性化に対するデキストラン硫酸エステルの抑制効果により、またはその両方により媒介され得る。
【００２９】
血小板と凝集の活性化に続いて、ＩＢＭＩＲでは補体カスケードが発生する。補体系の成分の一つはＣ３であり、それは活性化されると、小Ｃ３断片の炎症のペプチド伝達物質とより大きな断片のＣ３ｂに分裂する。次にＣ３ｂは補体系の他の成分に結合して、Ｃ５転換酵素を形成し、それはＣ５を拡散消滅するＣ５ａと細胞表面に付着するＣ５ｂとに分裂させる。結合したＣ５ｂは、次いで更に４つの補体成分に結合して膜攻撃複合体Ｃ５ｂ−９を形成する。この複合体は、大きな膜貫通型チャンネルを形成する膜リン脂質を置換し、膜を崩壊させて、イオンや小分子の自由拡散を可能とする。このようにして、細胞は浸透性安定性を維持できず、水の浸入や電解質の損失で溶解する。
【００３０】
血小板消費の多くは、ＩＢＭＩＲの補体媒介効果が検知される前から既に発生しており、血塊反応が補体活性化を誘発することを示唆している。ＩＢＭＩＲは血液中のＣ３ａと溶解性膜攻撃型複合体Ｃ５ｂ−９の増加が検知されるように相当の補体活性化を起こす。本発明のデキストラン硫酸エステルの有効量の投与は、血液への投与の態様に依存してこれら補体成分の量を減少させる。
【００３１】
ＩＢＭＩＲはまた細胞または細胞集合体への白血球の湿潤という特徴を有する。ＣＤ１１ｂ＋  多形核細胞と単核細胞の細胞への湿潤が免疫組織化学的染色法により明瞭に認められる。免疫化学的分析は白血球湿潤がデキストラン硫酸エステルの投与により消滅することを示している。
【００３２】
本発明の第１の態様ではデキストラン硫酸エステル、または薬学的に許容されるその誘導体が、超急性血液媒介炎症反応（ＩＢＭＩＲ）の治療薬の製造に使用されることが提供される。
【００３３】
本発明の他の態様では、デキストラン硫酸エステルまたはその薬学的に許容される誘導体が、移植された移植細胞の形態崩壊の治療薬の製造に使用されることが提供される。また、デキストラン硫酸エステルまたはその薬学的に許容される誘導体が、移植された移植細胞の組織不適合の治療薬の製造に使用されることが提供される。これらの二つの効果、すなわち、哺乳類、特に人の患者における移植細胞、細胞集合体または非血管新生化組織に対する細胞形態崩壊と組織不適合はＩＢＭＩＲの有害な効果によるものである。細胞移植に対するＩＢＭＩＲ媒介の効果はＡＢＯ−型提供者の人対人の移植と他の哺乳類、好ましくは豚の提供体を使用したものとの両方で起こり得る。このようにして、デキストラン硫酸エステルは同種および異種の細胞移植の両方に治療効果を有する。
【００３４】
疑義がないようにするために、本明細書では、用語”治療”には、ＩＢＭＩＲの治療および／または予防処置を含む。用語”薬学的に許容される誘導体”は塩と溶媒和物を含む。
【００３５】
本発明で使用されるデキストラン硫酸エステルまたはその誘導体は、低分子量デキストラン硫酸エステル（ＬＭＷ−ＤＳ）、たとえば数百または千ダルトン（Ｄａ）から高分子量デキストラン硫酸エステル（ＨＭＷ−ＤＳ）、一般には５０００００Ｄａを超える分子量、たとえば１００００００Ｄａを超える分子量までの分子量を有し得る。デキストラン硫酸エステルの有利な効果は特にＬＭＷ−ＤＳで顕著であるが、しかし、高分子量のデキストラン硫酸エステル投与により肯定的な効果が見られる。しかし、より大なるデキストラン硫酸エステル分子はＦＸＩＩを活性化してある種の副作用をもたらし、それは以下でより詳細に説明する。本発明による大なるデキストラン硫酸エステル分子の有利な効果は、硫黄含量の上昇、すなわち、デキストラン鎖中のグルコシル残基当たりの硫酸エステル基の数の増大により亢進される。ＬＭＷ−ＤＳは一般に２００００Ｄａより小さい、例えば１００００Ｄａより小さい、すなわち例えば約５０００Ｄａであるような、平均分子量を有する。ＬＭＷ−ＤＳの平均硫黄含量は約１０〜２５％、たとえば１５〜２０％であり、これはグルコシル残基当たり約２個の硫酸エステル基に相当する。２００００Ｄａより高い平均分子量のデキストラン硫酸エステルでは、より大なる硫黄含量のものが使用される。
【００３６】
本発明の他の態様では、ＩＢＭＩＲの治療方法が提供され、それはデキストラン硫酸エステルまたは薬学的に許容されるその誘導体の治療に有効量を当該治療が必要な患者に投与することからなる。
【００３７】
本発明の他の態様は、細胞移植の組織不適合の治療方法であり、それは、デキストラン硫酸エステルまたは薬学的に許容されるその誘導体の治療に有効量を当該治療が必要な患者に投与することからなり、移植細胞の形態崩壊の治療方法であり、それは、デキストラン硫酸エステルまたは薬学的に許容されるその誘導体の治療に有効量を当該治療が必要な患者に投与することからなる。
【００３８】
デキストラン硫酸エステルおよびその誘導体は、ＩＢＭＩＲまたは細胞移植部位へ全身投与で適用されるか、または当業者に公知の適当な投与手段を使用して、当該部位へ直接に（局所的に）投与され得る。
【００３９】
このようにして、本発明によれば、デキストラン硫酸エステルおよびその誘導体は、経口で、静脈、腹腔、皮下、口腔、直腸、真皮、鼻、気管、気管支、局所等を経由して、消化器官を経由してまたは吸入により、薬学的に許容される服用形態にある活性成分からなる薬学調剤の形態で投与され得る。細胞移植、移植部位、および治療される患者と同じく投与ルートに従い、種々の服用態様で投与され得る。
【００４０】
哺乳類と特に人の治療的処置では、デキストラン硫酸エステルおよびその誘導体は単独で投与され得るが、しかし一般には薬学的に許容されるアジュバンド、希釈剤または担体と混合された薬学処方で投与され、それは意図する投与経路につて当然に、また標準の薬学実務から選択され得る。
【００４１】
処方中のデキストラン硫酸エステルおよびその誘導体の量は、状態の苛酷さと治療される患者に、また同様に実際の処方と利用する投与ルートに依存し、そして、当業者により非発明的に決定され得る。投与された本発明によるデキストラン硫酸エステルまたはその誘導体の濃度は、デキストラン硫酸エステルに併発する副作用を最小とするために高すぎないようにするべきである。哺乳類、特に人の患者の治療および／または予防処置におけるデキストラン硫酸エステルまたはその誘導体の服用に適した多くの臨床例では、平均血中濃度で５ｍｇ／ｍｌ未満、多分２ｍｇ／ｍｌ未満そして特に１ｍｇ／ｍｌ未満である量である。好ましい濃度範囲は、０．０１ｍｇ／ｍｌと１ｍｇ／ｍｌ  デキストラン硫酸エステルの間の範囲であり、たとえば、０．０５ｍｇ／ｍｌより大で、０．０８ｍｇ／ｍｌより大で、０．１ｍｇ／ｍｌより大で、および／または０．８ｍｇ／ｍｌ未満で、０．６ｍｇ／ｍｌ未満で、０．４ｍｇ／ｍｌ未満で、０．２ｍｇ／ｍｌ未満であり、たとえば、０．０１ｍｇ／ｍｌと０．２ｍｇ／ｍｌの濃度範囲内および／または０．０５ｍｇ／ｍｌと０．２ｍｇ／ｍｌの濃度範囲内である。これらの濃度ではＩＢＭＩＲと形態崩壊と細胞移植の組織不適合を禁止または抑止するに十分な高濃度であることが判明しているが、しかし、デキストラン硫酸エステルの通常の投与に併発する副作用を最小限にするには依然として十分低い濃度である。更に加えて、ＬＭＷ−ＤＳ中で膵島を培養しても０．０１〜１ｍｇ／ｍｌの濃度範囲では膵島機能に反する効果は見られなかった。とにかく、外科医または当業者ならば実際の投与量を決定することが可能であり、個々の患者には最も適しており、年齢、体重および特定の患者の症例に依存して変わり得る。上記の投与量は平均投与量の好ましい例である。しかし、個々にはより高いまたはより低い投与量範囲の場合があり、このような場合でも本発明の範囲内である。
【００４２】
今日、デキストラン硫酸エステルは、既にＨＩＶに対する抗−ウィルス治療の臨床実験、ウロキナーゼと組み合わせて急性脳梗塞の処置、および抗−高脂血症治療に使用され、これらではデキストラン硫酸エステルは固相と結合される。前者の二つの研究では、注入速度は約４５ｍｇ／時間であり、これは２−３週間の間、デキストラン硫酸エステル（分子量  ８０００Ｄａ）を連続注入され、血中濃度は約０．０１ｍｇ／ｍｌであった。これらの全ての患者では血小板減少（時々、出血を伴う）が、３日間処置の後に見られ、脱毛が約半分の患者に見られることが報告される。しかし、これらの効果は可逆的である。ＩＢＭＩＲ、形態崩壊および／または細胞移植の組織不適合の抑制のためにデキストラン硫酸エステルを投与することは、通常１−２日間または数日間行われる。それ故、上で認識される副作用はこのような短い投与期間（２−３週間と比較して数日間）では非常に穏やかである。
【００４３】
血漿カリクレインの活性化によるブラジキニン放出を経由してデキストラン硫酸エステルは低血圧症を誘発することが以前から知られている。しかし、この所見はＨＭＷ−ＤＳが高脂血症治療のために血漿瀉血カラムに固定化されて初めてなされ、デキストラン硫酸エステルの注射では見られない。この効果はＦＸＩＩからＦＸＩＩａへの直接の活性化の結果である。しかし、本発明では因子ＸＩＩはＬＭＷ−ＤＳによっては直接には活性化されないと支持される。前に述べたように、ＦＸＩＩａ−ＡＴとＰＡＰのレベルは細胞がＬＭＷ−ＤＳの不存在下に外来血に接触すると高揚する。しかし、このような高水準もＬＭＷ−ＤＳが添加されると常態に戻る。
【００４４】
ＩＢＭＩＲとそれに続く細胞移植および／または形態崩壊、および細胞移植の組織不適合を抑制するには、細胞移植が遂行されるならば、デキストラン硫酸エステルまたはその誘導体の治癒的濃度を、好ましくは局所的に移植の部位で達成する。これは、実際の移植の前に予めデキストラン硫酸エステルを投与することにより行われる。代わりに、患者に移植されるべき細胞または細胞集合体を、本発明に従うデキストラン硫酸エステルを溶解させて溶液となし、これを注射することによっても可能である。このような細胞とデキストラン硫酸エステル溶液におけるデキストラン硫酸エステルの濃度は十分高いことが好ましく、それによりデキストラン硫酸エステルの治療濃度、すなわち、好ましくは５ｍｇ／ｍｌ未満、より好ましくは０．０１ｍｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌの範囲内が、移植に続く初めの時間の間移植部位において（局所的に）達成され得る。当業者は理解されるように、デキストラン硫酸エステルまたはその誘導体の実際の濃度は、細胞または細胞集合体がデキストラン硫酸エステルの溶液に溶解されて移植される際には患者の血中における至適濃度よりも一時的に高いことがあり得る。それに続いて、デキストラン硫酸エステルは移植部位から拡散し、デキストラン硫酸エステルの局所的濃度が低下する。ある場合には、ＩＢＭＩＲ、形態崩壊、および／または細胞移植の組織不適合の抑制には余分のデキストラン硫酸エステルは不要であり、これはデキストラン硫酸エステルの治療濃度は、多分、移植後初めの２４−４８時間までの間でのみ必要とされるからであろう。しかし必要なときはいつでも、追加のデキストラン硫酸エステルを、たとえば静脈内へ、腹腔内へまたは上記で示した他の投与経路により添加され得る。当業者は理解されるように、実際の移植に先立ち、移植すべき細胞または細胞集合体を含むデキストラン硫酸エステルの投与は、デキストラン硫酸エステルまたはその誘導体の投与と組み合わせることができる。
【００４５】
本発明の他の態様としては、ＩＢＭＩＲの治療のために使用される製薬調剤が提供され、それはデキストラン硫酸エステルまたはその薬学的に許容され得る誘導体の有効量を含むものである。
【００４６】
本発明は又、細胞移植の組織不適合の治療に使用される製薬調剤を目的とし、それはデキストラン硫酸エステルまたはその薬学的に許容され得る誘導体の有効量を含むものであり、そして移植細胞の組織崩壊の治療に使用される製薬調剤を目的とし、それはデキストラン硫酸エステルまたはその薬学的に許容され得る誘導体の有効量を含むものである。
【００４７】
デキストラン硫酸エステルおよびその誘導体は、また移植組織の組織不適合の治療に有用な他の治療薬と組み合わせることができる。適当であるが、これに限定されない、組織不適合に治療にデキストラン硫酸エステルと共に使用され得る免疫抑制剤の例としては、サイクロスポリン（cyclosporin）、タクロリマス（tacrolimus）、コルチコステロイド（corticosteroids）、ラパマイシン（rapamaycin）（シロリマス（sirolimus））およびマイコフェノラート  モフェチル（mycophenolate  mofetil）である。本発明に従うデキストラン硫酸エステルまたはその誘導体の投与は、また、抗−ＴＦ抗体および／または部位不活性化因子ＶＩＩａの投与と併用可能であり、これらは一定のＩＢＭＩＲ抑制機能を有することが知られている。
【実施例】
【００４８】
試薬
平均分子量５０００Ｄａで硫黄含量約１７％の低分子量デキストラン硫酸エステル（ＬＭＷ−ＤＳ）をSigma  Chemicals社（セントルイス、ミズーリ州、米国）から入手した。平均分子量が１００００００Ｄａを超え、硫黄含量が１６−１９％の高分子量デキストラン硫酸エステル（ＨＭＷ−ＤＳ）は、Amersham  Bioscience社（ウプサラ、スウェーデン）から購入した。低分子量デキストラン（ＬＭＷ−Ｄ；分子量５０００Ｄａ）と高分子量デキストラン（ＨＭＷ−Ｄ；分子量＞１００００００Ｄａ）はFluka  Chemical（ブーフス、スイス）とSigma  Chemicals社（セントルイス、ミズーリ州、米国）からそれぞれ購入した。
【００４９】
ヘパリン処理
全血と接触する全ての材料には、製造者の推奨によりコーリン  ヘパリン  表面（コーリンシステム  ＡＢ社、ウプサラ、スウェーデン）を付した。ヘパリンの表面の濃度は０．５μｇ／ｃｍ２であり、これは０．１Ｕ／ｃｍ２に相当し、抗−トロンビン結合能は２−４ｐｍｏｌ／ｃｍ２である。
【００５０】
血液調製
少なくとも１４日間薬服用をしていない健康なボランティアからの、新鮮な人の血を表面ヘパリン処理をした６０−ｍｌの注射器（１８目盛り、ミクロランス；ベクトン  ディッキンス社、フラックリン  レーク、ＮＪ）に収集した。注射器のカニューレはヘパリンで表面処理をしたシリコーン  チューブに接続されている。サンプリングの間、注射器は連続して回転させた。
【００５１】
動物
ボムホルト  ガード  ブリーディング  アンド  リサーチ  センターから入手の同系交配された胸腺欠損のオスのマウス（nu/nu  ブラック−６、ボムマイス）、２０−２５ｇをレシピエントとして使用した。全ての動物は標準食餌と水を自由に摂取可能である。
【００５２】
膵島単離
酵素的と機械的膵臓消化の手法と、それに続いてRidordiら［１９，２０］で示唆されたようにFicoll勾配でろ過と分離をして２歳から３歳のスウェーデン  ランドレース種の雌豚（２００〜３００ｋｇ）の膵臓から成体の豚の膵島（ＡＰＩ）を得た。この膵島は、１０％豚血漿（GIBCO、BRL）、１  ｍＭ  硝酸カルシウム、０．０２μＭ  ニコチンアミド、２５ｍＭ  HEPES、ファンギゾン（５００μｇ／ｌ）およびゲンタマイシン（５０ｍｇ／ｌ）で栄養補給されたＭ１９９培養培地（GIBCO、BRL、ライフ  テクノロジーＬＴＤ社、パースリー、スコットランド）に懸濁され、２５０ｍｌフラスコ中、３７℃で５％炭酸ガス濃度の調湿した空気中で１４日間培養された。培地は１日目には代えたが、その後は１日毎に代えた。ジチゾン（シグマ  ケミカル、セントルイス、MO）で染色後倒立顕微鏡で測定して膵島の量と純度を測定した。
【００５３】
胸腺欠損マウスにおける糖尿病の誘発
Wennbergら［２０］の方法に従い、シグマ  ケミカル（パロ  アルト、CA,USA）からのステプトゾトシンの静脈注射により糖尿病を胸腺欠損マウスに誘発させた。ステプトゾトシンの投与は、胸腺欠損マウスの体重あたり２５０ｍｇ／ｋｇであった。血中のグルコース（β−グルコース）濃度が２日またはそれ以上の日で連続して２０mmol／ｌ（＞３６０ｍｇ／ｄｌ）を超えると、対象の動物は糖尿病に罹患したとした。
【００５４】
ＬＭＷ−ＤＳで処理したかまたは処理していない糖尿病の胸腺欠損マウスへのＡＰＩの移植
４日間培養後、５種の単離からの５μｌのＡＰＩ（〜５０００ＩＥＱ）が、１１匹の雄の同系交配された糖尿病誘発の胸腺欠損マウスの門脈を経由して肝臓へ移植され、これはイソフルレン麻酔をして外科手術をした。５匹のマウスがＬＭＷ−ＤＳで静脈処理をされた。０．１５ｍｇのＬＭＷ−ＤＳを移植の１０分間前に注入し、追加の０．３ｍｇを移植の６時間後に注入した。その後、ＬＭＷ−ＤＳは、移植後１日に２回の割合で投与され、１−２日、３−４日そして５−６日で、１、０．５および０．２５ｍｇという傾斜投与をそれぞれした。６匹（未処理）のマウスは、同様に等価の量の塩水を同様にして注入された。
【００５５】
統計分析
全てのデータは、平均値±標準誤差（mean±SEM）で示し、フリードマン分散分析（表１）、ステュデントのペア−化ｔ−試験（表３）、ウイルコクソン符号付順位検定（Wilcoxon  signed  rank  test）（表４）およびシェッフの事後比較（post  hoc  test）に続く一要因分散分析（表５）を用いて比較した。移植膵島の形態比較では、血塊形成の頻度とリンパ球湿潤強度を、ウイルコクソン  ランク  サム  試験で評価した。Ｐ−値＜０．０５は統計的に有意と見られる。
【００５６】
膵島純度
静的グルコース刺激（ＳＧＳ）試験をＡＰＩの機能試験として行った。１５個の膵島を適宜に取得し、１．６ｍＭのグルコースを含むKrebs-Ringer重炭酸塩中、６０分間、３７℃で穏や振とうした。その後、グルコース濃度を１６．７ｍＭに切り替えて、さらに６０分間継続した。上澄み液を集めて、分析まで−２０℃で保存した。上澄み液のインシュリン濃度はＥＬＩＳＡ（ＤＡＫＯ  ダイオゴノスチック  社、エリ、ＵＫ）で分析した。刺激指数（stimulator  index）は高濃度グルコースと低濃度グルコースのそれぞれにおけるインシュリン濃度比として計算した。この試験に使用したＡＰＩの純度は８１〜９５％（平均、８８．５±２．２％）の範囲にあった。静的グルコース刺激試験の刺激指数は０．８と７．８（３．４±１．２）の間にあり、平均インシュリン含量は、８５．５±６．２ｐｍｏｌ／μｇＤＮＡであった。
【００５７】
さらに、ApoGlow（商品名）キット（LumiTeck社、ノッチンガム、ＵＫ）を使用して培養したＡＰＩの生育力評価のためにＡＤＰ／ＡＴＰ比を測定した。簡単には、ＡＰＩの７５膵島当量（ＩＥＱ）をＰＢＳで洗浄し、その後ヌクレオチド放出試薬の１００μｌと室温で１０分間混合した。その後、ヌクレオチド放出試薬の２０μｌを溶液に添加し、照度計（ＦＢ  １２照度計、Berthold  Detection社、ホルチェイム、ドイツ）でＡＴＰのレベルを測定し、相対光量（ＲＬＵ）の数値で示した。１０分後、溶液中のＡＤＰはＡＤＰ−転換試薬の２０μｌの添加によりＡＴＰに転換され、その後ＲＬＵの数値を測定した。続いて、ＡＰＩ中のＡＤＰ／ＡＴＰ比をBradburyら［２１］に示唆される方法で、計算した。ＡＰＩ中のインスリン／ＤＮＡ比はWennbergらの方法［２２］に従い測定し、ｐｍｏｌ／μｇで示した。培養ＡＰＩの生存率０日と比較した３日に得られたＩＥＱのパーセントとして計算された。
【００５８】
ＬＭＷ−ＤＳのあり得る毒性は、３日間、ＬＭＷ−ＤＳ０．０１、０．０１または１ｍｇ／ｍｌの存在下、またはその不存在下で異なる３種の膵臓からのＡＰＩを培養することで評価した。３種の異なるＬＭＷ−ＤＳ濃度の試料と対照試料にたいする生存率、刺激指数、ＡＤＰ／ＡＴＰ比およびインシュリン／ＤＮＡ比の結果は、以下の表１に示す。ＬＭＷ−ＤＳは試験濃度のどれでもＡＰＩの機能、生育率、生存率に対し不利な効果は示していない。さらに、ＬＭＷ−ＤＳ処理のＡＰＩの形態と、ＬＭＷ−ＤＳなしで培養のＡＰＩのそれとの形態の違いはない。
【００５９】
表１
2006509057.tif 000002
【００６０】
血塊形成時間
クエン酸塩を含むVacutainer（商品名）管内へ４人の健康なボランティアの血を採取した。全血（９８０μｌ）をReoRox（商品名）レオメーター（グローバル  ヘモスタシス  インターナショナル社、グーテンベルグ、スウェーデン）中のポリプロピレン試料カップで３７℃で２μｌのＡＰＩと共に培養した。異なる種類のデキストランの存在または不存在下に１ＭのＣａＣｌ２の２０μｌを添加して凝固が開始した。６秒ごとに、カップをその垂直軸でねじれ振動をさせ、そして制動をして振動の振動数を求める。血塊形成時間は、制動の最大値の時間に等しい。
【００６１】
血塊時間実験からの結果は以下の表２に示した。クエン酸塩添加の人血で培養したＡＰＩは石灰化後直ちに血塊を形成し、それは平均で６．１±０．３分であった。血塊形成は、全ての投与レベルでＬＭＷ−ＤＳの存在により全く排斥され、その一方で、ＨＭＷ−ＤＳは０．１ｍｇ／ｍｌのレベルでのみ血塊形成を抑制する。ＬＭＷ−ＤとＨＭＷ−Ｄの両者は対照試料（添加剤なし）と比較して、わずかなレベルにしか血塊が形成される時間を延長させない。このようにして、ＤＳの硫酸エステル化は試験した抑制能には重要であるように思える。
【００６２】
表２
2006509057.tif 000003
【００６３】
ＩＢＭＩＲと豚からヒトへの異種移植に対するＬＭＤ−ＤＳの効果を評価するためのモデルとして、ヘパリン処理のＰＶＣ管のループで豚成体の膵島灌流が使用された。この方法は、以前に述べた方法［４，２３］を基本として少し変形したものである。一般的には、ＰＶＣ（直径  ６．３ｍｍ、長さ３９０ｍｍ）製のループで、内面はヘパリンを固定化しているものが使用された。管は特殊設計のヘパリン化処理の接続具で接続される。円形のループは接続具の端部がチューブ端部のルーメンに緊密に押し込まれて形成された。揺動装置は３７度の培養器内におかれ、ループ内に血流を生じさせるように使用される。血流が接続具とは接触しないようなセッティングでループは揺動された。
【００６４】
６個の６０分間膵島実験を行い、４種の異なる豚から分離されたＡＰＩが使用された。塩水に溶解させたＬＭＷ−ＤＳを０、０．０１，０．１，１ｍｇ／ｍｌ（最終濃度）で試験した。各実験で、ＡＰＩなしで新鮮な人血と塩水を含むループを対照として入れた。二つの実験では、ＡＰＩなしで新鮮な人血と１ｍｇ／ｍｌのＬＭＤ−デキストランを含むループがある。同時に、硫酸エステル化していないＬＭＷ−デキストランの１ｍｇ／ｍｌを含む人血による予備培養を５個の実験を行った。各実験には同じ提供者からの新鮮な人血の７ｍｌを各ループに加えた。ループは、その後ＬＭＷ−ＤＳまたは塩水のいずれかと共に揺動装置に５分間かけられた。その後、ループを開放して、５μｌのＡＰＩ（約５０００ＩＥＱ）を含むまたは含まない１００μｌの塩水をループに加え、３７℃で揺動装置で６０分更に培養をした。血中のグルコースレベルは、灌流前に、グルコメーター（グルコメーター  エリート；バイエル  ダイアグノスチックス、レフェルクセン、ドイツ）で測定した。
【００６５】
各灌流後、ループ内容は７０μｍ−径のフィルター（フィルコンス、Cuptype；DAKO、デンマーク）でろ過した。ろ過で回収された巨視的な血塊と組織は免疫組織染色のためにイソペンタン中で急速冷凍された。残りのろ過血液は、４．１ｍＭのＥＤＴＡで集めて、血液分析（血小板、リンパ球、単核白血球、および顆粒球）と凝集活性化（トロンビンー抗トロンビン［ＴＡＴ］、因子Ｘ１ａ−抗トロンビン複合体［ＦＸ１ａ−ＡＴ］、および因子ＸＩＩａ−抗トロンビン複合体［ＦＸ１１ａ−ＡＴ］）、フィブリン溶解活性化（プラスミン−アルファ  ２抗プラスミン複合体[ＰＡＰ]）、補体活性化（Ｃ３ａおよびｓＣ５ｂ−９）、およびＣ１エステラーゼ禁止剤活性化（因子ＸＩａ−Ｃ１エステラーゼ禁止剤[ＦＸＩａ−Ｃｌ  ＩＮＨ]、因子ＸＩＩａ−Ｃｌエステラーゼ禁止剤[ＦＸＩＩａ-Ｃ１  ＩＮＨ]）の分析に使用された。０、１５および３０分の試料も分析した。０−分試料では血液は管ループに加えないが、その代わりに、ＥＤＴＡ含有管へ直ちに移動した。血液試料は４℃で２０分間、３２９０ｘＧで遠心分離され、そして血漿が集められて分析まで−７０℃で保存された。ＡＰＩ灌流前の血中のグルコースレベルは、４．８〜６．２ｍｍｏｌ／ｌの範囲であった。
【００６６】
血小板数と異なる白血球の数はＥＤＴＡ処理の血液を使用して、クールター  ＡＣＴ−diffanalyzer（ベックマン  クールター、ＦＬ、ＵＳＡ）で分析された。ＴＡＴとＰＡＰは市販の酵素免疫試験（ＥＩＡ）キット（Enzygnost  TAT、ベリングスベルグ、マルブルグ、ドイツ；Imuclone（商品名）  ＰＡＰ、アメリカン  ダイアグノスティカ、グリーンウィチ、米国）を使用して定量化した。ＦＸＩａ−ＡＴ、ＦＸＩＩａ−ＡＴ、ＦＸＩａ−Ｃ１  ＩＮＨとＦＸＩＩａ−Ｃ１  ＩＮＨはSanchezらの方法［２４］に従い分析した。Ｃ３ａは前にNilsson  Ekdahlらにより記載された方法［２５］で、そしてｓＣ５ｂ−９の分析はMollnesらの方法［２５，２６］に記載されたＥＩＡを変形して分析した。
【００６７】
ＡＰＩなしで新鮮な人血を含む管ループで、血液カウントと凝集、補体パラメーターが、以下の表３に見られるように、少しく変わった。全てのこれらの変化は血液と管内面および流体−空気界面との相互作用の結果であり、通常のバックグラウンドの変化であると考えられる。
【００６８】
ＬＭＷ−ＤＳは、投与量に依存するが、巨視的な血塊を抑制し、血球消費を防止し、そして
凝集と補体活性化の両者を減少させる(表３を参照）。ＬＭＷ−ＤＳ処理の血液中の血小板の有意な増加がＬＭＷ−ＤＳ  ０．０１ｍｇ／ｍｌ濃度で観察され、これはこの低いＬＭＷ−ＤＳ濃度の通常のレベル血球数が回復することを示す。凝集活性化生成物ＴＡＴ、ＦＸＩａ−ＡＴ、ＦＸＩＩａ−ＡＴはＬＭＷ−ＤＳの０．０１ｍｇ／ｍｌで抑制されるが、しかしＦＸＩａ−ＡＴはＬＭＷ−ＤＳの０．１〜１ｍｇ／ｍｌの範囲の投与で再度わずかに増加する。
【００６９】
ＬＭＷ−ＤＳは表３に示されるように、Ｃ３ａと可溶性膜攻撃複合体ｓＣ５ｂ−９の生成により評価されて補体活性を減少させる。図１は、より詳細に、管ループ・モデルで新鮮な人血のＡＰＩ灌流を６０分間行う間Ｃ３ａが生成することに対するＬＭＷ−ＤＳの効果を示す。ＬＭＷ−ＤＳが添加された試料では血液によるＡＰＩ灌流に先立ち、５分間、デキストラン硫酸エステルは新鮮な人血で前保温される。図で白丸はＬＭＷ−ＤＳの０ｍｇ／ｍｌに、黒丸はＬＭＷ−ＤＳの０．０１ｍｇ／ｍｌに、そして白四角と黒四角はＬＭＷ−ＤＳの０．１ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌにそれぞれ対応する。ｓＣ５ｂ-９の生成に対するＬＭＷ−ＤＳの効果は対応するグラフとして図２に示される。グラフの図１と図２から明らかなように、主たる補体活性はＡＰＩ灌流後約３０分後に生じる。ＬＭＷ−ＤＳの０．１ｍｇ／ｍｌと１ｍｇ／ｍｌの投与はＣ３ａと膜攻撃複合体ｓＣ５ｂ-９の両方の生成を完全に抑制し、その一方で、ＬＭＷ−ＤＳの低濃度（０．０１ｍｇ／ｍｌ）では有意差をもってＣ３ａの生成を減少させる。
【００７０】
ＦＸＩａ−Ｃ１  ＩＮＨは灌流６０分間の管ループ試験でどれも発生しなかった。また  ＦＸＩＩａ−Ｃ１  ＩＮＨはＬＭＷ−ＤＳの存在または不存在のどちらでも変わらなかった。
ＰＡＰはＬＭＷ−ＤＳの不存在で増加し、その一方でＬＭＷ−ＤＳの０．０１ｍｇ／ｍｌでは有意に抑制された。
【００７１】
表３
2006509057.tif 000004
＊スチューデントのｔ検定を使用するとＬＭＷ−ＤＳなしのＡＰＩループに比較して優位な差である。
【００７２】
上で述べたようにＬＭＷ−ＤＳの場合に類似の管ループモデルの使用によりＬ新鮮な人血で６０分間灌流後に、血球数、凝集と補体パラメーターに対するＬＭＷ−デキストランの効果が調べられた。ＬＭＤ−ＤとＬＭＷ−ＤＳ間の比較は表４に示され、そしてＩＢＭＩＲの症例に対するＬＭＷ−ＤとＬＭＷ−Ｄと比較は無理である。硫酸エステル化されていないＬＭＷ−デキストランはＩＢＭＩＲに対するわずかな効果を示すだけである。これらのデータは硫酸エステルが、ＡＰＩが契機になるＩＢＭＩＲに対してデキストランが顕著な効果を有することを示すもののようである。
【００７３】
表４
2006509057.tif 000005
＊ウイルコクソン符号付順位検定（Wilcoxon  signed  rank  test）を使用するとＬＭＷ−Ｄを有するＡＰＩループに比較して優位な差である。
【００７４】
人の血漿中の補体系に対するＬＭＷ−ＤＳの直接の効果
人の血漿をポリプロピレン管で保温することにより、補体カスケードに対するＬＭＷ−ＤＳの直接の効果を調べた。最終濃度０、０．０１、０．１、または１ｍｇ／ｍｌのＬＭＷ−ＤＳが血漿（１ｍｌ）に加えられた。５、１０、１５、３０、４５および６０分間、３７℃で血漿を保温後に、１００μｌの血漿を１０ｍＭのＥＤＴＡを含む管に移した。これらの試料は、補体成分Ｃ３ａとｓＣ５ｂ−９の分析まで−７０℃で保管された。
【００７５】
図３は、人の血漿における補体系のＣ３ａとｓＣ５ｂ−９の存在下におけるＬＭＷ−ＤＳの効果を示す。数値は、対照試料（ＬＭＷ−ＤＳなし）におけるＣ３ａとｓＣ５ｂ−９の量に対するパーセントとして表した。充填したバーは、Ｃ３ａの生成を表し、未充填のバーはｓＣ５ｂ−９に相当する。ＬＭＷ−ＤＳの０．０１ｍｇ／ｍｌでは、補体活性の増加がＣ３ａとｓＣ５ｂ−９の両者の増加に反映されているが、しかし、１ｍｇ／ｍｌでは抑制効果が見られる。全血と血漿に対する効果は直接には比較できないが、ＬＭＷ−ＤＳ自体多分、適用されたＬＭＷ−ＤＳの最も低い投与量で補体活性を誘発する。より高い濃度では、抑制効果が優勢となる。
【００７６】
糖尿病性胸腺欠損マウスの移植生存
グルコメーター  エリート（商品名）測定器（バイエル社、ゲティンゲン、スウェーデン）を使用して、レシピエントの尾から得た血液で、血液中のグルコースを測定した。測定は、毎日午前１２時前に行い、数値はｍｍｏｌ／ｌ（１ｍｍｏｌ／ｌ■１８ｍｇ／ｄｌ）で示した。
移植片の機能喪失は、Ｂ−グルコースのレベルが二日またはそれ以上の日数連続して１１．１ｍｍｏｌ／ｌを越えるならば（＞２００ｍｇ／ｄｌ）、それが生じたと見なした。移植後の正常血糖値（＜２００ｍｇ／ｄｌ）の継続を、移植片が生存した期間とした。
【００７７】
全てのストレプトゾトシン誘発の糖尿病性胸腺欠損マウスは、移植前には重篤な高血糖症であり、レシピエントの各群間にはＢ−グルコースのレベルに差はなかった。非絶食のＢ−グルコースのレベルはＡＰＩを門脈内移植した全ての糖尿病性レシピエントで移植後直ちに低下した。しかし、しかし、表５に示すように、未治療のマウスは限られた時間のみ正常血糖値を維持するだけであった。Ｂ−グルコース・レベルは、未処理マウス６匹中４匹で移植後初めの３日間で増加した。対照的に、正常血糖値は未処理マウスよりもＬＭＷ−ＤＳ処理のマウスで有意差のあるより長い期間維持された（８．８±１．９  対  ３．５±１．２日、ｐ＝０．０４５、表５）。本実験に使用された全てのＡＰＩは、等量が腎臓皮膜下の空間に移植されるならば糖尿病性胸腺欠損のマウス
を治癒させることが示された（移植片を有する腎臓を切除すると、直ちに血糖値が上昇した）。
【００７８】
表５
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＊全ての群で有意差である。
【００７９】
免疫組織学試験
膵島と巨視的な血塊が、ＬＭＷ−ＤＳあり（０．１ｍｇ／ｍｌと１ｍｇ／ｍｌ）とＬＭＷ−ＤＳなし（対照）で６０分間血液灌流した後ろ過して回収され、埋設材中に収集され（Tissue-Tek；マイルス、エックハート、ＩＮ、アメリカ）、そしてイソペンタン中で急速冷凍された。
膵島は、その後、薄切りされて、マウス  抗−人ＣＤ４１ａ（Ｒ＆Ｄ  システム、アビドン、イギリス）と抗−ＣＤ１１ｂ＋（Clone  2LPM  １９ｃ、ダコ、カーピンテリア、ＣＡ、アメリカ）とコンジュゲートされたホースラディッシュ・パーオキシダーゼで染色した。生体内試験では、ＡＰＩを含むマウスの肝臓を、移植後１０日間で回収し、イソペンタン中で急速冷凍をした。試料は、薄切りして、ギニー豚  抗−インスリン（ダカ、カーピンテリア、ＣＡ、アメリカ）とネズミ  抗−マウス  ＣＤ１１ｂ＋（セロテック社、スカンジナビア、オスロ、スウェーデン）で染色した。
【００８０】
６０分後、未治療の対照ループから回収した膵島は、常に血塊に埋没しているのが見出された。免疫組織学的な染色により、膵島を囲むフィブリンと血小板のカプセルが示された。図４は、ＣＤ１１＋多形核球細胞と単核白血球の対照膵島への湿潤を示す。対照的に、１ｍｇ／ｍｌのＬＭＷ−ＤＳを保温の間に加えた場合は血塊形成が完全に抑制されるのが観察され、そして湿潤するＣＤ１１ｂ＋細胞の数がかなり減少し、これらは図５に示される。類似の効果がまた０．１ｍｇ／ｍｌで観察された。図６に見られるように、対照試料は細胞に厚く粘着した血小板の層を示す。膵島に粘着したずっと薄い血小板層がＬＭＷ−ＤＳ治療の試料では観察され、それは図７に示される。血液に接触しない対照膵島は、使用した全ての染色試験で陰性である。
【００８１】
未処理のマウスから回収された多くの膵島は血塊中に捕捉され、それは図８に示される。図８では、矢印は細くされた豚膵島に形成された血栓を示す。しかし、ＬＭＷ−ＤＳ治療のマウスではわずかな膵島のみが捕捉され、それは図９に示される。免疫組織学的な染色で、ＣＤ１１ｂ＋（ＭＡＣ−１）白血球の未処理マウスから回収した膵島への湿潤が観察され、それは図１０に示される。対照的に、ＬＭＷ−ＤＳ処理のマウスでは顕著に少ない湿潤ＣＤ１１ｂ＋（ＭＡＣ−１）細胞が観察され、それは図１１に示される。血栓形成頻度と白血球湿潤の度合いは、ＬＭＷ−ＤＳ処理のレシピエントで、未処理のレシピエントよりも顕著に低かった（ｐ＝０．０３４）。ここで、図４から９は倍率２００倍で、図１０と１１は倍率１００倍である。
【００８２】
添付の請求の範囲で確定される本発明の範囲から逸脱することなしに種々の変形、変化が本発明に加えられ得ることは当業者に理解される。
【００８３】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】豚膵島を人血で灌流する間に発生するＣ３ａに対するＬＭＷ−ＤＳの効果を図解する図。
【図２】豚膵島を人血で灌流する間に発生するｓＣ５ｂ−９に対するＬＭＷ−ＤＳの効果を図解する図。
【図３】ＬＭＷ−ＤＳの存在下に人血清で培養する際の補体系に対するＬＭＷ−ＤＳの直接の効果を図解する図。
【図４】ＬＭＷ−ＤＳを含まない人血で灌流した後の豚膵島における白血球分布を示す図。
【図５】１ｍｇ／ｍｌのＬＭＷ−ＤＳを含む人血で灌流した後の豚膵島における白血球分布を示す図。
【図６】ＬＭＷ−ＤＳを含まない人血で灌流した後の豚膵島における血小板分布を示す図。
【図７】１ｍｇ／ｍｌのＬＭＷ−ＤＳを含む人血で灌流した後の豚膵島における血小板分布を示す図。
【図８】ＬＭＷ−ＤＳ処理をしていない糖尿病性の胸腺欠損マウスに門脈内移植をした後、豚膵島におけるインシュリン産生を図示する図。
【図９】ＬＭＷ−ＤＳ処理をしていない糖尿病性の胸腺欠損マウスに門脈内移植をした後、豚膵島におけるインシュリン産生を図示する図。
【図１０】ＬＭＷ−ＤＳ処理をしていない糖尿病性の胸腺欠損マウスに門脈内移植をした後、豚膵島における白血球分布を図示する図。
【図１１】ＬＭＷ−ＤＳ処理をした糖尿病性の胸腺欠損マウスに門脈内移植をした後、豚膵島における白血球分布を図示する図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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