(57)【要約】本発明は、子癇前症の治療および診断に関する物質および方法、特に、グリコシルホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＤ（ＧＰＩ−ＰＬＤ）タンパク質の使用に関する。特に、内因性のグリコシルホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＤ（ＧＰＩ−ＰＬＤ）のアンタゴニストを使用できる。また、子癇前症を有するまたは子癇前症を引き起こすおそれのある患者を診断する方法では、特に、患者から得られたサンプルにおけるＧＰＩ−ＰＬＤの量および／またはＧＰＩ−ＰＬＤ活性を調べる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
子癇前症の予防または治療のための医薬の調製のための内因性のグリコシルホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＤ（ＧＰＩ−ＰＬＤ）のアンタゴニストの使用。
【請求項２】
ＧＰＩ−ＰＬＤアンタゴニストが、子癇前症を引き起こす内因性のＧＰＩ−ＰＬＤと競合または置換する、請求項１記載の使用。
【請求項３】
ＧＰＩ−ＰＬＤアンタゴニストが、アポリポタンパクＡ１から内因性のＧＰＩ−ＰＬＤを置換する、請求項２記載の使用。
【請求項４】
ＧＰＩ−ＰＬＤまたはアンタゴニストが、胎盤における内因性のＧＰＩ−ＰＬＤと競合する、請求項２記載の使用。
【請求項５】
アンタゴニストが外的に投与されたＧＰＩ−ＰＬＤである、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
ＧＰＩ−ＰＬＤが不活性であるかまたは低下した活性を有する、請求項５記載の使用。
【請求項７】
活性が、グリコシルホスファチジルイノシトールのホスホジエステル結合の切断である、請求項６記載の使用。
【請求項８】
ホスホジエステル結合の切断が、Ｐ型イノシトールホスホグリカン（ＩＰＧ）を放出する、請求項７記載の使用。
【請求項９】
ＧＰＩ−ＰＬＤが、図６記載のアミノ酸配列を有する全長ＧＰＩ−ＰＬＤのフラグメントである、請求項１ないし８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
ＧＰＩ−ＰＬＤが、ＧＰＩ−ＰＬＤを発現および分泌可能な宿主細胞により産生される、請求項１ないし９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
患者の免疫系による宿主細胞の拒絶を妨げながら、宿主細胞により産生されるＧＰＩ−ＰＬＤが患者に分泌されるように、宿主細胞が生物適合性ポリマーにカプセル内包されている、請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
子癇前症の予防または治療のためのＧＰＩ−ＰＬＤまたはそのフラグメントを含む組成物を含むキット。
【請求項１３】
子癇前症を有するまたは子癇前症を引き起こすおそれのある患者を診断する方法であって、患者から得られたサンプルにおけるＧＰＩ−ＰＬＤの量および／またはＧＰＩ−ＰＬＤ活性を調べることを含む方法。
【請求項１４】
以下の工程：
（ａ）ＧＰＩ−ＰＬＤに特異的な結合部位を有する結合剤を固定した固形支持体と、患者から得られたサンプルとを接触させる工程；
（ｂ）結合剤に結合するＧＰＩ−ＰＬＤの量またはＧＰＩ−ＰＬＤの活性を調べる工程
を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
さらに以下の工程：
（ｃ）工程（ｂ）で得られた値をコントロールの患者から得られた測定値と比較して、その患者が子癇前症を有するかまたはその症状を引き起こす危険性があるかを調べる工程
を含む、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、子癇前症の治療および診断に関する物質および方法、特に、グリコシルホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＤ（ＧＰＩ−ＰＬＤ）タンパク質の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
子癇前症は、子宮胎盤循環の不全により特徴付けされる（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら，１９６７）胎盤の疾患である（Ｒｅｄｍａｎ，１９９１）。これは、全妊婦の約１０％が患い、致命的な状態となる可能性があり、かつ、周産期死亡率における主要要因である。一以上の胎盤由来ファクターが母方の循環系に放出され、直接的または間接的に、母方の内皮機能不全を引き起こし、次いで、凝固系の活性化、増大した血管透過性、および血管収縮に次ぐ母方の器官における虚血を伴う母方の問題を引き起こすことが示されている（Ｒｏｂｅｒｔｓら，１９８９）。この病気のさらに注目すべき特徴は、胎盤におけるグリコーゲン蓄積の大量かつ異常な増加であり、制御不能の炭水化物代謝を示唆している（Ａｒｋｗｒｉｇｈｔら，１９９３）。
【０００３】
イノシトールホスホグリカン（ＩＰＧ）は、そのレセプターに対するインスリン結合により活性化されるシグナル伝達経路におけるメディエーターとして関連付けられてきた。二つの異なるクラスのＩＰＧ活性が同定されており、ＡおよびＰ型と称されている。両方のクラスが、膜グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）に対するホスホリパーゼ作用により生じると考えられる。先の調査では、胎盤に極めて高レベルのＰ型ＩＰＧを示し、正常な胎盤より子癇前症の胎盤で２倍以上のＰ型ＩＰＧを示した。ＩＰＧは子癇前症患者の尿においても増加し、ＩＰＧレベルは、蛋白尿および血漿アラニン−アスパルタート・トランスアミナーゼ活性のような子癇前症の他のマーカーと相関される（ＷＯ９８／１０７９１参照）。それゆえ、子癇前症における異常な胎盤の炭水化物代謝は、ＩＰＧの上昇したレベルの結果である可能性がある。しかしながら、高ＩＰＧレベルの原因は、解明されていない。
【０００４】
ＧＰＩ−ＰＬＤタンパク質は、ウシおよびヒト血清中に豊富に存在する。これらは、膵臓のランゲルハンス細胞で最初に合成され、アポリポタンパクＡ１（ＡｐｏＡ１）と結合して循環系に放出されると考えられている（Ｈｏｅｎｅｒら，１９９３）。ＧＰＩ−ＰＬＤ酵素は、それによって多数の細胞表面タンパクが細胞膜に付着するグリコシルホスファチジルイノシトールを加水分解ことができる。ＧＰＩ−ＰＬＤは、ジアシルグリセロールを生成するホスホリパーゼＣ活性とは対称的に、ホスホジエステル結合を切断し、ホスファチジン酸を遊離させる。
【０００５】
ＧＰＩ−ＰＬＤのさらに提案される機能は、そのレセプターに対する成長因子またはホルモン結合に反応して、形質膜中の“フリー”のＧＰＩを切断することによりイノシトールホスホグリカンを生成することである（Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒら，１９９４）。ＧＰＩ−ＰＬＤのこの役割は、マスト細胞において証明された。そこでは、これらの細胞のＩｇＥ依存性活性化が、ヒスタミン、すなわち炎症反応のメディエーターのような物質を含む、その顆粒内容物の放出をもたらす。抗原の存在下でヒスタミンが放出される；この放出はＩＰＧの添加によって模倣することができ、抗ＧＰＩ−ＰＬＤ抗体の添加によりブロックされる（Ｌｉｎら，１９９１）。
【０００６】
米国特許第５４１８１４７号（Ｈａｕｎｇら）は、ウシ肝臓からのＧＰＩ−ＰＬＤの精製、並びに、その後の、ウシ肝臓、ヒト肝臓、およびヒト膵臓ｃＤＮＡライブラリーからの３つのＧＰＩ−ＰＬＤ酵素のクローニングについて記載している。この特許は、ヒトおよびウシ肝臓からのＧＰＩ−ＰＬＤの全長ｃＤＮＡおよびアミノ酸配列、およびこの酵素のヒト膵臓形態の部分的ｃＤＮＡおよびアミノ酸配列について報告している。次いで、ＧＰＩ−ＰＬＤの膵臓形態の全長配列がＴｓａｎｇら（１９９２）において報告され、この酵素は、胸、目、脾臓および扁桃からのｃＤＮＡライブラリーにおいて見出された。この酵素の３つの形態は、ヒト肝臓酵素と８２％の配列同一性およびヒト膵臓酵素と８１％の配列同一性を有する、ウシ肝臓ＧＰＩ−ＰＬＤの推定される成熟タンパク配列と高度に相同である。ＧＰＩ−ＰＬＤのヒト肝臓および膵臓形態のアミノ酸配列は受託番号Ｌ１１７０１およびＬ１１７０２の下にＧｅｎＢａｎｋに寄託され、それぞれ８４１および８４０アミノ酸を構成する。ＧＰＩ−ＰＬＤのヒト肝臓および膵臓形態は、９４．６％の配列同一性を有する。ＧＰＩ−ＰＬＤの構造は、Ｓｃａｌｌｏｎら，１９９１においてさらに議論されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】
概して、本発明は、子癇前症の予防、治療および診断のためのＧＰＩ−ＰＬＤの使用に関する。ある特定の理論に拘束されることなく、本発明は、実質的なＧＰＩ−ＰＬＤ活性が胎盤に存在するが、この酵素活性に重要なタンパクはそれ自身では胎盤において発現されないという事実に基づいている。むしろ、それは母方の循環系から胎盤に取り込まれるのであろう。結果として、子癇前症における胎盤に存在する異常なまたは制御不全のＧＰＩ−ＰＬＤ活性は、循環するＧＰＩ−ＰＬＤの特徴が変更されるように、母親にＧＰＩ−ＰＬＤを投与することにより修正可能であろう。これは、異常なまたは制御不全のＧＰＩ−ＰＬＤにより引き起こされた問題を修正するための、例えば、子癇前症の病因論に関与する胎盤ＩＰＧの異常な放出およびｉｎ ｓｉｔｕ産生を低減するための、ＧＰＩ−ＰＬＤの投与により治療可能である。任意選択的な実施態様では、本発明は、ＧＰＩ−ＰＬＤアンタゴニスト、例えばＡｐｏ−Ａ１から異常または制御不全のＧＰＩ−ＰＬＤと競合または置換することができる、例えば不活性ＧＰＩ−ＰＬＤの投与を提供する。
【０００８】
従って、第一の態様では、本発明は、子癇前症の予防または治療のための医薬の調製のための、内因性グリコシルホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＤ（ＧＰＩ−ＰＬＤ）のアンタゴニストの使用を提供する。
【０００９】
ある実施態様では、ＧＰＩ−ＰＬＤアンタゴニストは、子癇前症を引き起こす内因性ＧＰＩ−ＰＬＤと競合または置換する。この競合は循環系で起こり、それによって胎盤に到達し取り込まれる内因性のＧＰＩ−ＰＬＤの量を低減する。競合は、アポリポタンパクＡ１のようなキャリアーに結合した内因性ＧＰＩ−ＰＬＤを置換および／または置き換え得る。あるいは、または付加的に、外因性ＧＰＩ−ＰＬＤが胎盤に取り込まれて、そこで内因性の酵素と競合し、それによって、子癇前症を引き起こすことにおける有害な効果を緩和することもできる。
【００１０】
ＧＰＩ−ＰＬＤアンタゴニストは、ＧＰＩ−ＰＬＤタンパクまたはそのフラグメントであってもよい。ある実施態様では、ＧＰＩ−ＰＬＤは、不活性であるか、または、例えばグリコシルホスファチジルイノシトールのホスホジエステル結合切断活性の低下した活性を有する。子癇前症の治療において、かかるＧＰＩ−ＰＬＤ変異体は、Ｐ型イノシトールホスホグリカンの産生を低減することができる。その上昇したレベルが子癇前症の胎盤に存在することが知られており、かかる症状と関係する。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は、子癇前症の予防または治療のための医薬の調製のためのＧＰＩ−ＰＬＤをコードする核酸分子の使用を提供する。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は、子癇前症の予防または治療のための医薬の調製における、ＧＰＩ−ＰＬＤを発現および分泌することが可能な宿主細胞の使用を提供する。ある実施態様では、宿主細胞は、その宿主細胞により産生されるＧＰＩ−ＰＬＤは患者に分泌されるものの、患者の免疫系による宿主細胞の拒絶を妨げることができるように、例えば、生体適合ポリマーにカプセル内包される。生体適合ポリマーに細胞をカプセル内包する方法は、ＷＯ９３／１６６８７およびＷＯ９６／３１１９９に記載されている。
【００１３】
さらなる態様では、本発明は、子癇前症の予防または治療のためのＧＰＩ−ＰＬＤを含む組成物を含むキットを提供する。ＧＰＩ−ＰＬＤを含む組成物は、単独で、または子癇前症の治療のための他の医薬と組み合わせて、同時または連続的投与により投与されうる。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は、子癇前症を有するまたはそれを発症する危険性のある患者を診断する方法を提供する。この方法は、患者から得られたサンプルにおけるＧＰＩ−ＰＬＤの量および／またはＧＰＩ−ＰＬＤ活性を調べることを含む。
【００１５】
ある実施態様では、本発明は、子癇前症を有するまたはそれを発症する危険性のある患者を診断する方法を提供し、この方法は、以下の工程：
（ａ）ＧＰＩ−ＰＬＤに特異的な結合部位を有する結合剤を固定した固形支持体と、患者から得られたサンプルとを接触させる工程；
（ｂ）結合剤に結合するＧＰＩ−ＰＬＤの量またはＧＰＩ−ＰＬＤの活性を調べる工程
を含む。
【００１６】
この方法は、さらに以下の工程：
（ｃ）工程（ｂ）で得られた値をコントロールの患者から得られた測定値と比較して、その患者が子癇前症を有するかまたはその危険性があるかを調べる工程を含んでもよい。
【００１７】
本発明のこれらのおよびその他の態様を、以下により詳細に記載する。例示的であって限定的でなく、本発明の実施態様を添付の図面を参照しながら記載する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
ＧＰＩ−ＰＬＤタンパク質
用語“ＧＰＩ−ＰＬＤ生物学的活性”とは、ここでは、ホスホジエステル結合の切断によりグリコシルホスファチジルイノシトールからホスファチジン酸を遊離させること、例えば、ＧＰＩ−アンカータンパクを放出すること、または膜結合グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）からイノシトールホスホグリカン（ＩＰＧ）を生成することにおける、ＧＰＩ−ＰＬＤの酵素活性と定義される。Ｈｅｌｌｅｒら（１９９４）に記載されているように、この活性は、全長ＧＰＩ−ＰＬＤのＮ末端３９ｋＤ部分に局在している。
【００１９】
本発明は、胎盤における内因性のＧＰＩ−ＰＬＤの影響、例えば、胎盤により取り込まれた内因性の母方のＧＰＩ−ＰＬＤからもたらされる制御不全を緩和するいくつかのクラスの物質を用いて行うことができる。
【００２０】
最初に、外因性のＧＰＩ−ＰＬＤを患者に投与して、内因性の酵素と競合させ、例えばＧＰＩ−ＰＬＤキャリアーであるアポリポタンパクＡ１からそれを取り除き、それによって胎盤に到達して制御不全を引き起こす内因性の酵素の量を低減させる。外因性ＧＰＩ−ＰＬＤは、胎盤における内因性酵素とさらに競合し、内因性酵素の有害な作用を緩和することができる。この態様では、ＧＰＩ−ＰＬＤはキャリアー、特にＡｐｏＡ１と共に投与されて、酵素の任意選択的循環源を提供しても良い。
【００２１】
さらなるクラスのＧＰＩ−ＰＬＤ物質は、酵素的に不活性であるか、低減された生物学的活性を有するＧＰＩ−ＰＬＤ物質またはフラグメントである。これらの物質は競合的アンタゴニストとして作用し、例えばＡｐｏＡ１から内因性ＧＰＩ−ＰＬＤを置換することにより、胎盤による取り込みに関して内因性酵素と競合するか、あるいは、胎盤における内因性酵素と競合して、一以上の内因性酵素の有害な作用を低減する。
【００２２】
上記考察に基づいて、ここに記載されるＧＰＩ−ＰＬＤの医学的使用は、Ｈｕａｎｇら、およびＰＣＴ／ＧＢ９９／０４３９９に開示されているＧＰＩ−ＰＬＤバリアントを用いることができる。当業者であればここに記載されている技術および当該技術分野で周知の技術を用いて、大量のこれらのタンパク、またはそのフラグメント、活性部分、バリアントおよびアレルを、医薬としての使用のために製造することができる。
【００２３】
本発明における使用のためのＧＰＩ−ＰＬＤバリアントは、ホスホジエステル結合の切断によりグリコシルホスファチジルイノシトールからホスファチジン酸を遊離させるＧＰＩ−ＰＬＤの酵素活性を維持することが好ましい。
【００２４】
他の実施態様では、ＧＰＩ−ＰＬＤは、非酵素学的活性バリアント、または低減されたＧＰＩ−ＰＬＤ活性を有するバリアントとすることができる。これは、異常または制御不全のＧＰＩ−ＰＬＤの過剰活性がこの症状の原因因子であるような子癇前症を治療するために用いることができる。このケースでは、非酵素学的活性バリアントは、例えばそのＡｐｏ−Ａ１キャリアーからの、異常または制御不全ＧＰＩ−ＰＬＤとの競合または置換が可能であり、それによって胎盤に存在するＧＰＩ−ＰＬＤ活性をダウンレギュレートする効果を有する。このような競合アンタゴニストの設計および合成は、本願に記載されたＧＰＩ−ＰＬＤに関する情報を用いて容易に実施することが可能である。
【００２５】
これら従来技術の配列のアミノ酸配列バリアントまたはアレルであるＧＰＩ−ＰＬＤタンパク質も、本発明において用いることができる。バリアントまたはアレルであるポリペプチドは、既知のアミノ酸配列から、一以上のアミノ酸の一以上の付加、置換、欠失および挿入により相違するアミノ酸配列を有する。ある実施態様では、ポリペプチドは、上記のＧＰＩ−ＰＬＤ酵素機能を有する。他の実施態様では、ＧＰＩ−ＰＬＤは、酵素学的に不活性であり、例えば、ＩＰＧを放出する活性を有さず、かつ、異常または制御不全ＧＰＩ−ＰＬＤと競合して、胎盤における異常なＧＰＩ−ＰＬＤをダウンレギュレートすることができる。
【００２６】
図６に記載されているアミノ酸配列のバリアントまたはアレルであるＧＰＩ−ＰＬＤタンパク質は、図６記載のアミノ酸配列と約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、または約９９％より高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。配列比較および同一性の計算は、Ｃｌｕｓｔｅｒプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，１９９４）を用いて、以下のパラメーター（ペアワイズ・アライメントパラメーター：ウェイトマトリックス：パムシリーズ；ギャップオープンペナルティー：１０．００；ギャップエクステンションペナルティー：０．１０）を用いて実施することができる。あるいは、ＧＣＧプログラムを用いることができる。これは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＵＳＡ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．１から入手可能である。特定のアミノ酸配列バリアントは、図６記載のものから、１アミノ酸、２、３、４、５−１０、１０−２０、２０−３０、３０−５０、５０−１００、１００−１５０、または１５０より多くのアミノ酸の挿入、付加、置換または欠失により相違してもよい。
【００２７】
ある実施態様では、本発明のバリアントＧＰＩ−ＰＬＤポリペプチドは、ヒトＧＰＩ−ＰＬＤと比較して、成熟配列のアミノ酸６８９から６９２のリン酸化部位において、すなわちアミノ酸モチーフＲＲＦＳ内に、アミノ酸配列の相違を有する。用語“バリアントＧＰＩ−ＰＬＤポリペプチド”は、とりわけ、この領域内に、一以上のアミノ酸の欠失、置換および／または挿入により修飾されたポリペプチドを含むことが意図される。これらの配列相違は、親のＧＰＩ−ＰＬＤポリペプチドのＧＰＩ−ＰＬＤアミノ酸配列を変更した結果であってもよく、野生型ＧＰＩ−ＰＬＤポリペプチド、または例えばそのポリペプチドをコードする核酸の操作による、ポリペプチド自身を変更することによる、またはバリアントタンパクのｄｅ ｎｏｖｏ合成による、一以上の他の変更を含むＧＰＩ−ＰＬＤポリペプチドである。好ましい実施態様では、ＧＰＩ−ＰＬＤは、例えば、機能的Ｎ末端ドメインを含むことにより、その生物学的活性の一つを、少なくとも部分的に保持する。
【００２８】
欠失は、この領域内の１つ、２つ、３つ、または４つ全てのアミノ酸の欠失の形態を取ってもよい。一部の実施態様では、ＧＰＩ−ＰＬＤ分子のより大きな部分を包含するより大きな欠失の部分であってもよい。好ましい実施態様では、バリアントＧＰＩ−ＰＬＤポリペプチドは、ヒト野生型ＧＰＩ−ＰＬＤのアミノ酸配列とは、６８９から６９２残基を含む欠失により相違するアミノ酸配列を有する。
【００２９】
挿入は、ＲＲＦＳモチーフ内のアミノ酸の間に、それを中断するように挿入された１、２、３、４または５またはそれ以上のさらなるアミノ酸の形態を取りうる。
【００３０】
置換は、野生型ヒトＧＰＩ−ＰＬＤのアミノ酸６８９から６９２に対応する領域内の１つ、２つ、３つ、または４つ全てのアミノ酸の置換の形態を取りうる。この領域内の置換は、ＧＰＩ−ＰＬＤポリペプチドの他の部分を内包するより広範な一連の置換の部分であってもよい。特に、実践的な使用を有するＧＰＩ−ＰＬＤのミュータント形態は、野生型配列とは異なる。これらのミュータントの一部は、以下に記載の実験で用いられる。
【００３１】
これらの配列相違は、親のＧＰＩ−ＰＬＤポリペプチドのＧＰＩ−ＰＬＤアミノ酸配列を変更した結果であってもよく、野生型ＧＰＩ−ＰＬＤポリペプチド、または例えばそのポリペプチドをコードする核酸の操作による、ポリペプチド自身を変更することによる、またはバリアントタンパクのｄｅ ｎｏｖｏ合成による、一以上の他の変更を含むＧＰＩ−ＰＬＤポリペプチドである。好ましい実施態様では、ＧＰＩ−ＰＬＤは、例えば、機能的Ｎ末端ドメインが存在することにより、その生物学的活性の一つを、少なくとも部分的に保持する。
【００３２】
また、本発明は、子癇前症の予防または治療のための医薬の製造のためのＧＰＩ−ＰＬＤタンパク質の活性部分およびフラグメントの使用を含む。
【００３３】
ＧＰＩ−ＰＬＤタンパク質の“活性部分”は、前記全長ＧＰＩ−ＰＬＤタンパク質よりも短いが、少なくともその本質的な酵素活性を維持しているポリペプチドである。例えば、上記酵素活性は、酵素のＮ末端３９ｋＤ部分に存在することが知られている。例えば、ＧＰＩ−ＰＬＤタンパク質の部分は、他のタンパクとの相互作用により隔離剤または競合的アンタゴニストとして作用することができる。典型的に、活性部分は、ＧＰＩ−ＰＬＤの少なくとも約３００アミノ酸、より好ましくは少なくとも５００アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも７００アミノ酸を含み、例えば、アミノ酸は、図６に記載された配列から、１以上のモチーフから選択される。
【００３４】
ＧＰＩ−ＰＬＤタンパク質の“フラグメント”は、少なくとも約５から７の連続するアミノ酸、少なくとも約７から９の連続するアミノ酸、典型的には少なくとも約９から１３の連続するアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも約２０から３０以上の連続するアミノ酸、さらに好ましくは４０より多くのアミノ酸、さらに好ましくは１００より多くのアミノ酸のアミノ酸残基を意味する。
【００３５】
本発明にかかる子癇前症の予防または治療のための医薬の調製における使用のためのポリペプチドは、例えばコードする核酸（これについては以下参照）からの発現による産生の後に単離および／または精製（例えば、抗体を用いて）することができる。本発明にかかるポリペプチドは、化学合成により全体的または部分的に生成することもできる。
【００３６】
ＧＰＩ−ＰＬＤポリペプチドは、例えば、エフェクター分子、ラベル、薬剤、毒素および／またはキャリアーまたは輸送分子のような結合パートナーに結合させることもできる。本発明のペプチドを、ペプチジルおよび非ペプチジルカップリングパートナーに結合させる技術は、当該技術分野で周知である。ある実施態様では、キャリアー分子は、Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａのホメオドメインから誘導された１６ａａペプチド配列（例えば、“Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ”の名称で市販されている）であり、これは末端のＣｙｓ残基を介してペプチドに結合できる。“Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ”分子とその特性は、ＷＯ９１／１８９８１に記載されている。
【００３７】
ＧＰＩ−ＰＬＤ核酸
“ＧＰＩ−ＰＬＤ核酸”は、ＧＰＩ−ＰＬＤ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子を含む。ヒトおよびウシのＧＰＩ−ＰＬＤ酵素の適切な全長配列は、例えば、Ｈｕａｎｇら、Ｔｓａｎｇら（１９９２）により、およびＰＣＴ／ＧＢ９９／０４３９９において、提供されている。これらの形態のＧＰＩ−ＰＬＤは、ヒト染色体６にマップされ、Ｄ６Ｓ１６６０−Ｄ６Ｓ１５５８の４センチモルガン領域において、位置９５．９５および９９．７１に含まれる（ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＭａｐ’９８）。この遺伝子は、６ｐ２２．３に対応する細胞発生領域から開始し、６ｐ２１．３に伸びる。またこの領域は、ＩＤＤＭ１およびＨＬＡ遺伝子座を含む（ＨＬＡ遺伝子は、隣接するＤ６Ｓ１５５８−Ｄ６Ｓ１６１６間にマップされる）。マウスのＧＰＩ−ＰＬＤ遺伝子は、染色体１３の、ｆｉｍ １遺伝子座の近くにマップされており、これはヒトの染色体６に見出されている。
【００３８】
ＧＰＩ−ＰＬＤコード配列は、上記の公表された配列の一つであっても、相補的核酸配列であってもよく、また、これらの配列の一つの配列バリアント、誘導体、またはアレルであってもよい。この配列は、示された配列の一以上のヌクレオチドの一以上の付加、挿入、欠失および置換といった変化により、示された配列とは異なってもよい。ヌクレオチド配列に対する変化は、遺伝コードにより決定されるような、タンパクレベルにおけるアミノ酸変化をもたらしても、そうでなくてもよい。
【００３９】
コードされたポリペプチドは、公表されたＧＰＩ−ＰＬＤアミノ酸配列の一つとは一以上のアミノ酸残基が相違するアミノ酸配列を含むことができる。公知のＧＰＩ−ＰＬＤのアミノ酸配列ミュータント、バリアントまたはアレルであるポリペプチドをコードする核酸の使用は、本発明によりさらに企図される。かかるポリペプチドについては、以下に議論する。かかるポリペプチドをコードする核酸は、上記のＧＰＩ−ＰＬＤタンパク質に関する公表されたコード配列と、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、または約９９％より高い配列同一性を示しうる。
【００４０】
また本発明は、ＧＰＩ−ＰＬＤ核酸配列のフラグメントの使用も含み、フラグメントは、好ましくは、少なくとも１２、１５、３０、４５、６０、１２０、または２４０ヌクレオチドの長さである。
【００４１】
一般に、本発明にかかる使用のための核酸は、単離物として、単離および／または精製された形態で、または本来的に結合しているような物質からフリーまたは実質的にフリーな形態、例えば、一以上の発現制御配列を除いて、ヒトゲノム中でその遺伝子に隣接している核酸からフリーまたは実質的にフリーな形態で提供される。核酸は、全体的または部分的に合成されてもよく、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよい。本発明にかかる核酸がＲＮＡを含む場合、示された配列に対する言及は、ＵがＴの変わりに置換された、ＲＮＡ等価物の参照として解釈されるべきである。
【００４２】
ＧＰＩ−ＰＬＤ遺伝子の全部または一部をコードする核酸配列および／またはその制御エレメントは、ここに含まれる情報および参考文献および当該技術分野において公知の技術を用いて、当業者により容易に調製される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，およびＡｕｓｕｂｅｌら，１９９２参照。これらの技術は、（ｉ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、例えばゲノムソースからかかる核酸のサンプルを増幅すること、（ｉｉ）化学合成、または（ｉｉｉ）Ｅ．ｃｏｌｉにおける増幅を含む。ＧＰＩ−ＰＬＤ配列に対する変更は、例えば部位特異的な変異誘発を用いて、変更されたＧＰＩ−ＰＬＤタンパク質の発現を提供し、または、核酸を発現するために用いられた宿主細胞におけるコドン選択を考慮するように行うことができる。
【００４３】
ＧＰＩ−ＰＬＤ核酸配列の発現を得るために、この配列を、ＧＰＩ−ＰＬＤ核酸に機能的に結合したコントロール配列を有するベクターに組み込んでその発現を調節することができる。発現系の使用は洗練された域に達している。ベクターは、挿入された核酸の発現を誘導するプロモーターまたはエンハンサー、ＧＰＩ−ＰＬＤタンパクが融合物として産生されるような核酸配列、および／または宿主細胞において産生されたポリペプチドが細胞から分泌されるような分泌シグナルをコードする核酸のような他の配列を含んでもよい。ＧＰＩ−ＰＬＤタンパク質は、ベクターが機能する宿主細胞にベクターをトランスフォームし、ＧＰＩ−ＰＬＤタンパク質が産生されるように宿主細胞を培養し、かつ、宿主細胞またはその周りの培地からＧＰＩ−ＰＬＤタンパク質を回収することにより得られる。原核および真核細胞が、当該技術分野においてかかる目的に使用され、Ｅ．ｃｏｌｉの株、酵母、並びにＣＯＳまたはＣＨＯ細胞のような真核細胞を含む。宿主細胞の選択はこれらの細胞において発現されたＧＰＩ−ＰＬＤタンパク質の特性を調節するために用いることができ、例えば、ポリペプチドが宿主細胞において貯蔵される場所を調節し、またはその糖鎖形成およびリン酸化のような特性に影響を与える。
【００４４】
核酸の増幅のためのＰＣＲ技術は、米国特許第４６８３１９５号に記載されている。一般的に、かかる技術は、増幅のターゲットであるポリヌクレオチド配列に同一または類似するように適切なフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができるようにターゲット配列の端からの配列情報が公知である必要がある。ＰＣＲは、鋳型核酸の変性（二本鎖であれば）、ターゲットに対するプライマーのアニーリング、およびポリメライゼーションという工程を含む。増幅反応の鋳型として使用またはプローブされる核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。ＰＣＲは、ゲノムＤＮＡ、特異的なＲＮＡ配列およびｍＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミド配列からの特異的な配列を増幅するために用いることができる。公表されたＧＰＩ−ＰＬＤタンパク核酸配列は、当業者がＰＣＲプライマーを設計することを容易にする。ＰＣＲ技術の一般的使用に関する参考文献は、Ｍｕｌｌｉｓら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１：２６３，１９８７； Ｅｈｒｌｉｃｈ （ｅｄ），ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９； Ｅｈｒｌｉｃｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：１６４３−１６５０，１９９１； ”ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ； Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”， Ｅｄｓ．Ｉｎｎｉｓら，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０を含む。
【００４５】
本発明にかかる使用のための核酸は、図に示された核酸配列の一以上のフラグメント、特にコドンの使用または統計分析に基づいて比較的希な配列のフラグメントとハイブリダイズするように設計された一以上のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを用いて得ることができる。上記の図示された核酸配列のフラグメントとハイブリダイズするように設計されたプライマーは、ターゲット核酸がクローン化されたクローニングベクター中の配列にハイブリダイズするように設計された一以上のオリゴヌクレオチドと共に用いられてもよく、またいわゆる“ＲＡＣＥ”（ｃＤＮＡ末端の急速増幅）でも用いることができ、これではライブラリーのｃＤＮＡが、オリゴヌクレオチドリンカーにライゲートされ、ＰＣＲは図示されたＧＰＩ−ＰＬＤ核酸配列とハイブリダイズするプライマーおよびオリゴヌクレオチドリンカーにハイブリダイズするプライマーを用いて行われる。
【００４６】
かかるオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー、並びに全長配列（およびミュータント、アレル、バリアントおよび誘導体）は、ＧＰＩ−ＰＬＤタンパク質のアレル、ミュータントおよびバリアントの存在について核酸を含むテストサンプルをスクリーニングすることにも有用であり、プローブは試験される個人から得られたサンプルからのターゲット配列とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションの条件は、非特異的結合を最小化するように調節され、好ましくは、ストリンジェントないし適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が好ましい。当業者であれば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９２）のようなテキストを参考にして、容易に、かかるプローブを設計し、ラベルし、ハイブリダイゼーション反応の適切な条件を工夫することができる。
【００４７】
“ストリンジェントな条件”の例は、（１）洗浄に低いイオン強度と高い温度、例えば０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム／０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムで５０℃を用いる；（２）ハイブリダイゼーションの際にホルムアミドのような変性剤、例えば５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ＢＳＡ／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．５（７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む）、４２℃を用いる；または（３）５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍ クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、超音波処理したサケ精液ＤＮＡ（５０ｍｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストラン、４２℃を用い、０．２ｘＳＳＣで４２℃、および５０％ホルムアミドで５５℃で洗浄し、次いで、５５℃でＥＤＴＡを含有する０．１ｘＳＳＣからなる高いストリンジェンシーの洗浄を行う。これらのハイブリダイゼーション条件は、ＧＰＩ−ＰＬＤ核酸配列とハイブリダイズする核酸配列を定義することにおいて用いることができ、それゆえ、本発明の一部を形成する。
【００４８】
ＧＰＩ−ＰＬＤ核酸の使用
ＧＰＩ−ＰＬＤ核酸配列はＧＰＩ−ＰＬＤを発現することができる細胞系統の調製に使用することができる。かくして、本発明は、子癇前症の予防または治療のための、例えば患者への移植のための医薬の調製のための宿主細胞の使用を提供し、この宿主細胞は、ＧＰＩ−ＰＬＤをコードする核酸で形質転換され、ＧＰＩ−ＰＬＤを発現および分泌することができる。一部の実施態様では、患者の免疫系による宿主細胞の拒絶を避けながら、宿主細胞により産生されたＧＰＩ−ＰＬＤが患者に分泌されるように、宿主細胞は、例えば生物適合性ポリマー中にカプセル内包される。生物適合性ポリマーに細胞をカプセル内包する方法は、ＷＯ９３／１６６８７およびＷＯ９６／３１１９９に記載されている。
【００４９】
ウイルスベクターのようなベクターは、広範囲の種々のターゲット細胞に遺伝子を導入するために従来技術で使用されてきた。典型的に、所望のポリペプチドの発現から有益な治療または予防効果を与えるのに十分な比率の細胞にトランスフェクションが起こるように、ベクターがターゲット細胞に曝される。トランスフェクションされた核酸は、各ターゲット細胞のゲノムに永久的に取り込まれて、永続的な効果を与えるか、あるいは、治療が定期的に繰り返される必要がある。
【００５０】
種々のベクター、ウイルスベクターとプラスミドベクターの両方が、当該技術分野において公知である。米国特許第５２５２４７９号およびＷＯ９３／０７２８２を参照。特に、いくつかのウイルスが、遺伝子トランスファーベクターとして用いられており、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＳＶおよびＥＢＶを含むヘルペスウイルス、およびレトロウイルスを含む。従来技術における多くの遺伝子治療プロトコールが、無能力化されたマウスレトロウイルスを用いている。
【００５１】
ウイルスベクターの使用に代わる、核酸を細胞に導入するための他の公知の方法は、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈、マイクロインジェクションのような機械的技術、リポソームを媒介した輸送および直接的ＤＮＡ取り込みおよびレセプター介在ＤＮＡトランスファーを含む。
【００５２】
薬剤調合
本発明のＧＰＩ−ＰＬＤは、種々の方法で誘導されてもよい。ここで用いる酵素の“誘導体”は、塩、Ｍｎ２＋およびＺｎ２＋のような金属イオンとの配位複合体、ｉｎ ｖｉｖｏ加水分解可能エステルのようなエステル、遊離酸または塩基、水和物、プロドラッグまたは脂質、カップリングパートナーを含む。
【００５３】
本発明の酵素の塩は、好ましくは生理学的によく寛容され無毒のものである。塩の多くの例は、当業者に公知である。リン酸または硫酸のような酸性基を有する化合物は、Ｎａ、Ｋ、ＭｇおよびＣａのようなアルカリまたはアルカリ土類金属、およびトリエチルアミンおよびトリス（２−ヒドロキシエチル）アミンのような有機アミンと塩を形成することができる。塩は、アミンのような塩基性基を有する化合物と、塩酸、リン酸または硫酸のような無機酸または酢酸、クエン酸、安息香酸、フマル酸または酒石酸のような有機酸を有する化合物との間に形成されうる。酸性および塩基性の両方の基を有する化合物は、内部塩を形成することができる。
【００５４】
エステルは、当該技術分野で周知の技術を用いて、化合物に存在するヒドロキシル基またはカルボン酸基と、適切なカルボン酸またはアルコール反応パートナーとの間に形成することができる。
【００５５】
酵素のプロドラッグとしての誘導体は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで、活性酵素およびアクチベーターの一つへと変換可能である。典型的に、化合物の少なくとも一つの生物学的活性は、化合物のプロドラッグ形態においては低減され、化合物またはその代謝物質を放出するためのプロドラッグの変換により活性化されうる。
【００５６】
他の誘導体は、その化合物のカップリングパートナーを含み、そこでは化合物が、例えば化合物に化学的に結合または物理的に結合していることにより、カップリングパートナーに結合している。カップリングパートナーの例は、ラベルまたはレポーター分子、支持基質、キャリアーまたは輸送分子、エフェクター、薬剤、抗体、または阻害剤を含む。カップリングパートナーは、ヒドロキシル基、カルボキシル基、またはアミノ基のような化合物上の適切な官能基を介して、本発明の化合物と共有結合することができる。他の誘導体は、リポソームで化合物を処方することを含む。
【００５７】
薬学的組成物
ＧＰＩ−ＰＬＤタンパク質は、単独で、または子癇前症に関する他の治療と組み合わせて投与することができる。ＧＰＩ−ＰＬＤタンパク質および付随するあらゆる組成物を薬学的組成物に調合できる。これは、一以上の上記物質に加えて、薬学的に許容できる賦形剤、キャリアー、バッファー、安定化剤または当業者に周知の他の物質を含んでもよい。かかる物質は、無毒性であるべきであり、活性成分の効力を妨げるべきではない。キャリアーまたは他の物質の正確な性質は、投与経路、例えば経口、静脈、皮膚または皮下、鼻腔、筋内、腹腔内経路、に依存し得る。
【００５８】
経口投与用の薬学的組成物は、タブレット、カプセル、粉末、または液体状であってもよい。タブレットは、ゼラチンのような固形キャリアーまたはアジュバントを含んでもよい。液状の薬学的組成物は、一般に、水、ペトロレアム、動物または植物油、鉱油または合成油のような液状キャリアーを含む。生理食塩水、デキストロースまたは他のサッカリド溶液、エチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコール類を含むことができる。
【００５９】
静脈内、皮膚または皮下注射では、活性成分は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容できる水溶液の形態である。当業者であれば、例えば、塩化ナトリウム液、リンガー液、乳酸加リンガー液のような等張ビヒクルを用いて適切な溶液を調製することができる。防腐剤、安定化剤、バッファー、酸化防止剤および／または他の添加剤を必要に応じて含むことができる。
【００６０】
本発明で用いられる化合物は、好ましくは“予防有効量”または“治療有効量”で個人に投与され（場合によっては、予防は治療とも考えられる）、それは、例えば子癇前症の一以上の症状の緩和、例えば血小板凝縮の低減、血栓形成の低減、または糸球体腎炎の低減など、個人に利益を示すに十分なものである。実際の投与量、投与の速度およびタイムコースは、治療対象の性質および深刻さに依存する。治療の処方、例えば投与量等の決定は、一般医師および他の医学博士の責任範囲内であり、典型的には、処理されるべき疾患、患者の状態、輸送部位、投与方法、および医師に公知の他のファクターを考慮する。上記技術およびプロトコールの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｏｌ，Ａ．（ｅｄ），１９８０に見られる。
【００６１】
組成物は、単独で、またはその他の治療剤と組み合わせて、治療すべき症状により、同時または連続的に投与することができる。例えば、本願に開示されている治療は、ＷＯ９８／１０７９１における子癇前症の治療について開示されたＰ型ＩＰＧアンタゴニストの使用と組み合わされてもよい。ＩＰＧ−Ｐアンタゴニストのあるクラスの例は、抗体、例えばＷＯ９８／１１１１７およびＷＯ９９／４７５６５に記載されているポリクローナルおよびモノクローナル抗体である。
【００６２】
さらなる態様では、本発明は、子癇前症の診断および／または治療に使用できる物質を含む製造品を提供する。製造品は、容器とラベルを含む。適切な容器は、例えばガラスまたはプラスチックのような物質から形成されるボトル、バイアル、シリンジおよび試験管を含む。容器は、子癇前症の診断または治療に有効な組成物を保有し、無菌の通路口、例えば組成物にアクセス可能なように針で穴開けされるストッパーを備える。この製造品が子癇前症の予防または治療に用いられる場合には、組成物はＧＰＩ−ＰＬＤ、またはそのバリアント、活性部分またはフラグメントを含むことができる。この製造品は、任意に、ＧＰＩ−ＰＬＤとの混合物で、または一以上のさらなる容器におけるキットの一部として、子癇前症の治療のためのまたはＧＰＩ−ＰＬＤの薬理学的特徴を改善するための一以上のさらなる活性成分を含むことができる。製造品が子癇前症の診断に用いられる場合、容器は、ここに記載したアッセイを実施するのに有益な一以上の試薬を保有するように用いられる。容器上のまたは容器と結合したラベルは、子癇前症の診断または治療のための組成物の使用を示し、使用者向けの詳細な説明書を提供する。製造品は、さらに、薬理学的に許容可能なバッファー、リンガー液および／またはデキストロース溶液を含む第二の容器を含んでもよい。
【００６３】
診断アッセイ
ＧＰＩ−ＰＬＤ活性、または患者の生物学的サンプル中におけるこの酵素の量または濃度を調べる方法は、当該技術分野で周知であり、かつ、子癇前症またはここで議論される他の症状の一つを有するかまたはそれを生じる危険性があるか否かを決定するために本発明で用いられる。かかる分析の目的は、子癇前症の深刻さまたは予想される経過を調べることにおいて医師を助けるために、および／またはその治療を最適化するために、診断または予後に使用される。
【００６４】
好ましい診断方法は、胎盤に存在する異常または制御不全のＧＰＩ−ＰＬＤ活性が子癇前症の原因の一つであると考えられるので、ＧＰＩ−ＰＬＤ活性の測定に基づく。ある実施態様では、この方法は、例えばラベルされた基質に対するＧＰＩ−ＰＬＤの作用を測定することにより、患者から得られた生物学的サンプルにおけるＧＰＩ−ＰＬＤ活性を測定することを含む。あるいはまたはさらには、サンプル中のＧＰＩ−ＰＬＤの濃度または量を調べてもよい。典型的に、血液、血清、組織サンプル（特に胎盤）、または尿のような生物学的サンプルを用いる。サンプルに依存して、例えば、細胞片または望ましくない混入物をサンプルから除くため、予備処理工程を実施することが有利である。
【００６５】
一部の実施態様では、ＧＰＩ−ＰＬＤ活性を調べるためのアッセイ方法は、他の分子に優先してＧＰＩ−ＰＬＤに特異的に結合し得る結合部位を有する結合剤を用いる。ここで特に、他の分子とはサンプル中に存在しそうな分子である。結合剤の例は、ＧＰＩ−ＰＬＤを特異的に結合できる抗体、レセプターおよび他の分子を含む。結合剤は、固形支持体に、例えば所定の位置に固定されて、アッセイ中の操作を容易にすることが好都合である。これは、例えば、ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジンを用いて結合剤を固形支持体に化学的に結合させることにより、物理吸着または化学吸着のような当該技術で周知の技術を用いて達成することができる。
【００６６】
このサンプルは、一般に、サンプルに存在するＧＰＩ−ＰＬＤが結合剤に結合できるような適切な条件下で結合剤と接触させる。ＧＰＩ−ＰＬＤ活性は、ＧＰＩ−ＰＬＤにより切断されるホスホジエステル結合を有し、ホスファチジン酸とＧＰＩアンカーを放出するグリコシルホスファチジルイノシトールのような適切な基質を用い、かつ、アッセイ系における酵素反応を、例えば基質または反応産物の量を追跡することによってモニタリングして調べることができる。このプロセスは、基質をラベル化し、基質のラベルの減少または反応産物のラベルの増加を調べることにより容易とされ得る。
【００６７】
サンプル中のＧＰＩ−ＰＬＤの量（その活性よりむしろ）の測定の場合、結合剤の結合部位の分配占有（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｏｃｃｕｐａｎｃｙ）は、現像剤を用いて調べることができる。現像剤は、現像剤が結合剤の占有された結合部位についてアナライトと競合する（例えばアナライトのラベル化したアナログを用いて）競合法で用いることができ、また、ラベル化された現像剤が結合剤により結合されたアナライトまたは占有された結合部位に結合する（例えば、適切な結合特異性を有する抗体を用いて）非競合的方法で用いることができる。両方の方法が、例えば、既知の濃度のアナライトを含むサンプルを用いて得られたスタンダードとの比較により、アナライトに占有された結合部位の総数、かくして、サンプル中のアナライトの濃度の示度を与える。
【００６８】
典型的に、基質または現像剤は、検出可能な、好ましくは測定可能なシグナルを直接的または間接的に生成するラベルまたはレポーター分子でタグが付される。レポーター分子の結合は、直接的または間接的に、共有的、例えばペプチド結合を介して、または非共有的であってもよい。ペプチド結合を介した結合は、抗体およびレポーター分子をコードする遺伝子融合体の組み換え発現の結果であってもよい。Ｈｕｎｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５，１９６２； Ｄａｖｉｄら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：１０１４，１９７４； Ｐａｉｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９，１９８１； およびＮｙｇｒｅｎ，Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７，１９８２に記載されている方法を含む、検出可能な部分に抗体を別個に結合させる当該技術分野で公知のあらゆる方法を用いることができる。
【００６９】
一つの好ましいモードは、基質または現像剤の各種の、スペクトルで単離された吸収または放射特性を備えた個々の蛍光色素、蛍光体またはレーザー染料との共有結合である。適切な蛍光色素は、フルオレセイン、ローダミン、ルシフェリン、フィコエリトリン、およびテキサスレッドを含む。適切な発色染料は、ジアミノベンジジンを含む。他の検出可能なラベルは、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２６Ｉまたは９９Ｔｃのような放射活性アイソトープラベル、およびアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはセイヨウワサビペルオキシダーゼのような酵素ラベルであって、検出可能な反応産物をもたらす反応を触媒し、かつシグナルの増幅を提供することができるものを含む。
【００７０】
他のレポーターは、着色、磁性、または常磁性のラテックスビーズのような高分子コロイド粒子または粒状物質、および視覚的に観察される、電気的に検出される、またはそれ以外で記録される直接または間接的に検出可能なシグナルを引き起こすことができる生物学的または化学的活性剤を含む。これらの分子は、例えば、色を発色または変化させる、あるいは電気特性に変化を生じる反応を触媒する酵素であってもよい。エネルギー状態間の電子項遷移が特徴的なスペクトル吸収または放出をもたらすように、それらは分子的に励起可能であってもよい。これらは、バイオセンサーと共に用いられる化学成分を含んでもよい。
【００７１】
上述したように、当該技術分野で周知の技術を用いて検出可能であるように、基質または現像剤がラベルされる（例えば放射活性、蛍光または酵素ラベル）。かくして、放射活性ラベルは、シンチレーションカウンターまたは他の放射線計測装置を用いて、蛍光ラベルはレーザーおよび共焦点顕微鏡を用いて、そして酵素ラベルは典型的には色の変化を生じる基質に対する酵素ラベルの作用により検出することができる。
【００７２】
実験記載
本発明は、ＧＰＩ−ＰＬＤ酵素活性が胎盤に存在するが、この活性に重要なタンパクがそれ自身では胎盤に発現されないという事実に基づいている。ＧＰＩ−ＰＬＤは、アポリポタンパクＡ１（ＡｐｏＡ１）と結合して、血液中を循環することが知られており、それゆえ胎盤のＧＰＩ−ＰＬＤは母方の循環系に由来し得る。
【００７３】
胎児の遺伝子の半分は父親から遺伝するため、胎児は、母親とは遺伝的に異なる。胎盤は、母方というよりはむしろ、胎児に由来する。これは、胎盤における父方にコードされたファクターが、母方から誘導されたＧＰＩ−ＰＬＤの取り込みまたはプロセッシングに関与し得る、またはｉｎ ｓｉｔｕでその活性に影響を与えるかもしれないという可能性をもたらす。かくして、父方のファクターは、胎盤におけるＧＰＩ−ＰＬＤ活性に関与しうる。結果的に、特定の理論に拘束されることを望まないが、胎盤における母方のＧＰＩ−ＰＬＤと父方にコードされたファクターとの間の不適合性が、胎盤における異常なＧＰＩ−ＰＬＤ活性をもたらし、胎盤および尿に見られる異常に高レベルのＰ型ＩＰＧを引き起こし、子癇前症に見られる制御不全の炭水化物代謝を引き起こすのかもしれない。かくして、外因性のＧＰＩ−ＰＬＤの投与は、子癇前症の予防または治療において治療的に有効であろう。かかる投与は、ＧＰＩ−ＰＬＤの任意選択的循環源を提供するために、ＡｐｏＡ１と結合していてもよい。しかしながら、特に好ましい実施態様では、ＧＰＩ−ＰＬＤはＡｐｏＡ１を伴わずに投与される。この場合、外因性のＧＰＩ−ＰＬＤは、母方のＡｐｏＡ１の結合部位に関して内因性の母方のＧＰＩ−ＰＬＤと競合しうることが考えられる。結果的に、外因性のＧＰＩ−ＰＬＤは、内因性酵素を置換し、胎盤に到達する内因性ＧＰＩ−ＰＬＤの量を低減し、かつ、それを外因性酵素で置換し得る。さらなる実施態様では、本発明は、ＧＰＩ−ＰＬＤアンタゴニスト、例えば、子癇前症を引き起こす異常なまたは制御不全のＧＰＩ−ＰＬＤと競合し、かつ／または例えばＡｐｏＡ１からかかるＧＰＩ−ＰＬＤを置換することができる、この酵素の酵素学的に不活性な形態の使用を提供する。
【００７４】
【実施例】
実施例１：ＧＰＩ−ＰＬＤは胎盤に存在する
胎盤の抽出物を調製し、ＧＰＩ−ＰＬＤの血清形態に対するポリクローナル好血清を用いてイムノブロッティングすることによりＧＰＩ−ＰＬＤの存在について試験した。胎盤全体（レーン１）または胎盤絨毛組織（レーン２−６）をバッファー（０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．６、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ、１μｇ／ｍｌ アプロチニン、１００μｇ／ｍｌ フェミルメチルスルホニルフルオリド）中でホモジナイズした。０．３ｍｇのタンパク質を、ゲルローディングバッファー（０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％メルカプトエタノール、０．００４％ブロモフェノールブルーを含有）において煮沸させることにより変性させ、８％アクリルアミド溶解ゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。次いでタンパク質を、ニトロセルロース膜にエレクトロブロッティングにより移した。ＧＰＩ−ＰＬＤタンパク質を、ＥＣＬ＋ウェスタンブロット検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いかつ製造元のプロトコールに従って、抗体染色により視覚化した。ポリクローナル抗ＧＰＩ−ＰＬＤ抗血清は、Ｌａ Ｒｏｃｈｅから入手した。
【００７５】
図１は、胎盤のホモジナート（レーン１）、健常者の微絨毛調製物（レーン２、３、４、６）、および子癇前症患者の胎盤の微絨毛調製物（レーン５）におけるＧＰＩ−ＰＬＤの存在を示す。ポリクローナル抗ＧＰＩ−ＰＬＤ抗体は、約５０ｋＤａの分子量のタンパクを認識し、これは母方の血清から取り込まれたＧＰＩ−ＰＬＤタンパクの細胞内切断の産物を表すと考えられる。この酵素の１００ｋＤａの血清形態は一部のサンプルにおいて検出されるが、酵素の優勢な形態ではない。
【００７６】
実施例２：胎盤におけるホスホリパーゼＤ酵素活性の存在
微絨毛におけるホスホリパーゼ酵素活性の存在を、ＧＰＩアンカー加水分解アッセイを用いて調べた。
【００７７】
抽出した微絨毛膜をバッファーＡ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、０．１％ＮａＮ３、０．５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０）に可溶化し、かつ予め調製しておいた等量の基質反応物（４０ｍＭ ＴｒｉｓＭａｌｅａｔｅ ｐＨ７．０、０．１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０および６μｇの［３Ｈ］ミリスタート−ラベル化バリアント表面糖タンパク（［３Ｈ］ｍｆＶＳＧ）を含む）と３７℃でインキュベートした。この反応を、５００μｌの１Ｍ ＮＨ４ＯＨ−飽和ブタノールの添加により停止させ、相分離を遠心により行った（１３０００ｒｐｍ、５分）。３００μｌの上の有機相をシンチレーションカウントした。
【００７８】
図２および３は、ｍｆＶＳＧの加水分解を用いて胎盤の微絨毛におけるＧＰＩ特異的ホスホリパーゼ活性の存在を確認するものである。インキュベーションの時間（図２）またはタンパク濃度（図３）を変化させ、両方とも％ｍｆＶＳＧ加水分解と陽性の関係を示した。
【００７９】
図２に示されているように、これは、ｍｆＶＳＧの時間に依存した加水分解をもたらし、ラジオラベルは有機相に移動し、タンパクの可溶形態（ｓＶＳＧ）は水相に解放される。図３では、ｍｆＶＳＧの加水分解速度が、このアッセイに存在する微絨毛組織の量に依存することが示されており、これは、図２に示された加水分解が、ＧＰＩアンカーの自発的加水分解というよりむしろ、胎盤に存在するファクターによるものであることを示している。
【００８０】
実施例３：ホスホリパーゼ活性のクラス
ｍｆＶＳＧ加水分解に重要なホスホリパーゼ活性のクラスを調べるために、このアッセイを繰り返して、加水分解産物を薄層クロマトグラフィーで調べた。ホスホリパーゼＣによるＧＰＩアンカーの加水分解は、ジアシルグリセロールを生じることが公知である。対称的に、ホスホリパーゼＤ活性は、ホスファチジン酸を生じることが予想される。
【００８１】
健常者の胎盤（レーン４、５）、または子癇前症患者の胎盤（レーン６、７）から抽出した０．２５ｍｇの胎盤微絨毛膜タンパク質を、ホスファターゼインヒビター、５０ｍＭフッ化ナトリウム、および２．６ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムの不在下（レーン４、５）または存在下（レーン５、７）で、３７℃で３時間、［３Ｈ］ｍｆＶＳＧとインキュベートした。コントロールとして、同じ量の基質を、精製したウシＧＰＩ−ＰＬＤ（レーン２）またはトリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）のＧＰＩ−ＰＬＣ（レーン３）のいずれかと共にインキュベートした。
【００８２】
反応をＮＨ４ＯＨ飽和ブタノールで停止させた後に、３００μｌの有機相を、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ濃縮装置を用いて乾燥させ、２０μｌのクロロホルム／メタノール（２：１ ｖ／ｖ）に再懸濁させた。再懸濁させた脂質産物をＴＬＣプレートにスポットし、クロロホルム／メタノール／０．２５％ＫＣｌ（５５：４５：１０）で展開した。空気乾燥後、プレートをＥｎ３Ｈａｎｃｅを用いてスプレーして、２週間オートラジオグラフィーフィルムに曝露させた。
【００８３】
ＧＰＩ−ＰＬＤ切断のホスファチジン酸産物（レーン２）が、ホスファターゼインヒビターをこの反応中に含んだ場合の健常者（レーン５）と子癇前症患者（レーン７）の両方の胎盤微絨毛に見られた。
【００８４】
図４は、胎盤の微絨毛に存在するＧＰＩ特異的ホスホリパーゼ活性がホスホリパーゼＤ型のものであることを示すＴＬＣプレートのオートラジオグラフを示す。反応産物は、図４に示されている。
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【００８５】
ｍｆＶＳＧと、健常者および子癇前症患者の微絨毛の両方の抽出物とのインキュベーションは、ジアシルグリセロールとホスファチジン酸の両方の移動度を有する産物を生じる。ホスファターゼインヒビターであるフッ化ナトリウムとオルトバナジン酸ナトリウムの、反応混合物への添加は、ジアシルグリセロールのバンドの消失をもたらし、ホスファチジン酸バンドの強度の増加を伴う。
【００８６】
加水分解反応の直接産物は、ホスファチジン酸であり、次いで、混入ホスファターゼによりジアシルグリセロールへと脱リン酸化される。それゆえ、このデータは、胎盤の微絨毛におけるホスホリパーゼＤ活性の存在をはっきりと証明する。
【００８７】
実施例４：ホスホリパーゼＤは胎盤において発現されない
ｍＲＮＡを健常者および子癇前症患者の両方の胎盤サンプルから調製し、ｃＤＮＡを各サンプルから逆転写により調製した。分娩後速やかに液体窒素中で凍結した１００ｍｇの胎盤由来の組織を、ＲＮＡｚｏｌＢ試薬（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｌｔｄ．， Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）において、製造元の指示書に従ってホモジナイズした。この方法で抽出した５μｇの全ＲＮＡを、ランダムヘキサマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をプライマーとして、３５μｌの反応ボリュームで、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いてｃＤＮＡへと逆転写した。この反応物の２．５μｌを、ヒトＧＰＩ−ＰＬＤ遺伝子に特異的な２５マーのオリゴヌクレオチド（フォワードオリゴ：ＴＴＣＴＴＧＧＡＧＧＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＡＴＧＧＣ、リバースオリゴ：ＴＧＡＧＡＧＣＣＡＣＣＴＡＴＧＡＡＣＡＴＴＧＴＣＣ）、または細胞質βアクチン遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド（フォワードオリゴ：ＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＡＴＣＧＣＣＧＣ、リバースオリゴ：ＡＴＣＴＴＣＴＣＧＣＧＧＴＴＧＧＣＣＴＴ）の５０ｐモルの存在下で、５０μｌの反応ボリュームで、ＰＣＲにより増幅させた。３０の変性（９４℃、２５秒）、アニーリング（ＧＰＩ−ＰＬＤ：６３℃、：βアクチン：５２．３℃、３０秒）、および伸長（７２℃、３０秒）サイクルのＰＣＲを、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った。
【００８８】
図５は、ＧＰＩ−ＰＬＤが、健常者または子癇前症患者の胎盤のいずれにも発現されないことを示すＲＴ−ＰＣＲ反応を示す。
【００８９】
レーン１および３は、それぞれ、健常者および子癇前症患者サンプルから調製されたｃＤＮＡを含む。レーン２および４は、逆転写酵素を省略したコントロール（それぞれ、健常者および子癇前症患者について）である。それゆえ、これらのサンプル中に見られるあらゆる産物は、混入しているゲノムＤＮＡの増幅によってもたらされるに違いない。レーン５はポジティブコントロールを含む；βアクチンについては、普遍的なヒトｃＤＮＡライブラリーであり、ＧＰＩ−ＰＬＤについては、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーから単離されたｃＤＮＡクローンである。レーン６は、ｃＤＮＡを全く含まないため、ＰＣＲのネガティブコントロールである。健常者および子癇前症患者の胎盤から調製されたｃＤＮＡを用いたβアクチンＰＣＲにおける期待されるサイズ（３５３ｂｐ）の産物の存在は、ＲＮＡ合成が成功したことを示している。４８８ｂｐのより大きな産物は、ゲノムＤＮＡからのみ得られた。しかしながら、３１３ｂｐの期待されるＧＰＩ−ＰＬＤ反応産物は、いずれのサンプルにも見られなかった。ＧＰＩ−ＰＬＤ ＰＣＲが成功したことから（レーン５）、ＧＰＩ−ＰＬＤをコードする遺伝子（ＧＰＬＤ１）は胎盤において発現されないと結論づけることができる。
【００９０】
かくして、ＧＰＩ−ＰＬＤ ｍＲＮＡは、ヒトの胎盤においてＧＰＩ−ＰＬＤ酵素活性の存在を実証可能であるにもかかわらず、この組織で検出することができない。これは、微絨毛における酵素が、胎盤で発現されるのではなく、母方の貯蔵する循環酵素に由来するという結論を導く。微絨毛は、母親と胎児との間にバリア層を形成し、これが母親から胎児への栄養の取り込みを媒介する。かくして母方の循環系から取り込まれた分子は微絨毛において検出可能であると期待できよう。それゆえ、これらの知見は、ＧＰＩ−ＰＬＤが母方の循環系から胎盤により取り込まれることと完全に一致する。
【００９１】
「参考文献」
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【図面の簡単な説明】
【図１】胎盤（レーン１）と、健常者（レーン２、３、４、６）および子癇前症患者（レーン５）の胎盤の微絨毛調製物の、ホモジナートにおけるＧＰＩ−ＰＬＤの存在を示すウェスタンブロットを示す。
【図２】ｍｆＶＳＧの加水分解を用いた胎盤微絨毛におけるＧＰＩ特異的ホスホリパーゼ活性の存在の確認を示す。
【図３】ｍｆＶＳＧの加水分解を用いた胎盤微絨毛におけるＧＰＩ特異的ホスホリパーゼ活性の存在の確認を示す。
【図４】胎盤微絨毛に存在するＧＰＩ特異的ホスホリパーゼ活性がホスホリパーゼＤ型であることを示すＴＬＣプレートのオートラジオグラフを示す。
【図５】ＧＰＩ−ＰＬＤをコードする遺伝子が健常者および子癇前症患者の胎盤のいずれにも発現されないことを示すＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）反応の結果を示す。
【図６Ａ】ＰＣＴ／ＧＢ９９／０４３９９に開示されているヒト肝臓ＧＰＩ−ＰＬＤの推測されるアミノ酸配列のアライメントを示す。ウシおよびヒト肝臓ＧＰＩ−ＰＬＤ配列は米国特許第５４１８１４７号に開示されている（Ｈｕａｎｇら）。
【図６Ｂ】ＰＣＴ／ＧＢ９９／０４３９９に開示されているヒト肝臓ＧＰＩ−ＰＬＤの推測されるアミノ酸配列のアライメントを示す。ウシおよびヒト肝臓ＧＰＩ−ＰＬＤ配列は米国特許第５４１８１４７号に開示されている（Ｈｕａｎｇら）。
【図２】
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【図３】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年11月21日(2002.11.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
子癇前症の予防または治療のための医薬の調製のための内因性のグリコシルホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＤ（ＧＰＩ−ＰＬＤ）のアンタゴニストの使用。
【請求項２】
ＧＰＩ−ＰＬＤアンタゴニストが、子癇前症を引き起こす内因性のＧＰＩ−ＰＬＤと競合または置換する、請求項１記載の使用。
【請求項３】
ＧＰＩ−ＰＬＤアンタゴニストが、アポリポタンパクＡ１から内因性のＧＰＩ−ＰＬＤを置換する、請求項２記載の使用。
【請求項４】
ＧＰＩ−ＰＬＤまたはアンタゴニストが、胎盤における内因性のＧＰＩ−ＰＬＤと競合する、請求項２記載の使用。
【請求項５】
アンタゴニストが外的に投与されたＧＰＩ−ＰＬＤである、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
ＧＰＩ−ＰＬＤが不活性であるかまたは低下した活性を有する、請求項５記載の使用。
【請求項７】
活性が、グリコシルホスファチジルイノシトールのホスホジエステル結合の切断である、請求項６記載の使用。
【請求項８】
ホスホジエステル結合の切断が、Ｐ型イノシトールホスホグリカン（ＩＰＧ）を放出する、請求項７記載の使用。
【請求項９】
ＧＰＩ−ＰＬＤが、図６記載のアミノ酸配列を有する全長ＧＰＩ−ＰＬＤのフラグメントである、請求項１ないし８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
ＧＰＩ−ＰＬＤが、ＧＰＩ−ＰＬＤを発現および分泌可能な宿主細胞により産生される、請求項１ないし９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
患者の免疫系による宿主細胞の拒絶を妨げながら、宿主細胞により産生されるＧＰＩ−ＰＬＤが患者に分泌されるように、宿主細胞が生物適合性ポリマーにカプセル内包されている、請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
子癇前症を有するまたは子癇前症を引き起こすおそれのある患者を診断する方法であって、患者から得られたサンプルにおけるＧＰＩ−ＰＬＤの量および／またはＧＰＩ−ＰＬＤ活性を調べることを含む方法。
【請求項１３】
以下の工程：
（ａ）ＧＰＩ−ＰＬＤに特異的な結合部位を有する結合剤を固定した固形支持体と、患者から得られたサンプルとを接触させる工程；
（ｂ）結合剤に結合するＧＰＩ−ＰＬＤの量またはＧＰＩ−ＰＬＤの活性を調べる工程
を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
さらに以下の工程：
（ｃ）工程（ｂ）で得られた値をコントロールの患者から得られた測定値と比較して、その患者が子癇前症を有するかまたはその症状を引き起こす危険性があるかを調べる工程
を含む、請求項１３記載の方法。
【国際調査報告】
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