(57)【要約】植物の成長および／または商品収量を増大させる方法が提供される。その方法は、その植物内で、配列番号３、５、６または７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％相同なアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現させることによって達成される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の成長および／または商品収量を増大させる方法であって、その植物内で、配列番号３、５、６または７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％相同なアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現させることを含む方法。
【請求項２】
植物は、４０％未満の湿度を特徴とする環境で生育される請求項１の方法。
【請求項３】
植物は、１０μＭ未満の細胞間ＣＯ２濃度を特徴とする環境で生育される請求項１の方法。
【請求項４】
植物内における前記ポリペプチドの発現は、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド領域を含む核酸コンストラクトで、植物細胞の少なくとも一部を形質転換することによって達成される請求項１の方法。
【請求項５】
前記形質転換は、アグロバクテリウムを介した形質転換、ウイルス感染、エレクトロポレーションおよびパーティクルボンバードメントからなる群より選択される方法によって達成される請求項４の方法。
【請求項６】
前記アミノ酸配列は、配列番号３、５、６または７に記載のとおりである請求項１の方法。
【請求項７】
前記核酸コンストラクトは、トランジットペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド領域をさらに含む請求項４の方法。
【請求項８】
前記核酸コンストラクトは、前記第１ポリヌクレオチド領域の転写を指示するためのプロモーター配列をさらに含む請求項４の方法。
【請求項９】
前記核酸コンストラクトは、前記第１および前記第２ポリヌクレオチド領域の転写を指示するためのプロモーター配列をさらに含む請求項４の方法。
【請求項１０】
前記プロモーターは真核細胞中で機能的である請求項８の方法。
【請求項１１】
前記プロモーターは構成的プロモーター、誘導性プロモーター、発生段階に応じて制御されるプロモーターおよび組織特異的プロモーターからなる群より選択される請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記植物はＣ３植物である請求項１の方法。
【請求項１３】
前記Ｃ３植物は、トマト、ダイズ、ジャガイモ、キュウリ、ワタ、コムギ、イネ、オオムギ、レタス、アキノキリンソウ、バナナおよびポプラからなる群より選択される請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記植物はＣ４植物である請求項１の方法。
【請求項１５】
前記Ｃ４植物は、トウモロコシ、サトウキビおよびモロコシからなる群より選択される請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記ポリペプチドを発現させる植物は、前記ポリペプチドを発現させない同様の植物と比較して、両者を同様の成長条件下で生育した場合に、少なくとも１０％は高い成長速度を特徴とする請求項１の方法。
【請求項１７】
前記成長速度は、増加した生体重、増加した乾物重、増加した根成長、増加したシュート成長、および増加した経時的な花の発育からなる群より選択される少なくとも１つの成長パラメーターによって決定される請求項１６の方法。
【請求項１８】
配列番号３、５、６または７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％相同なアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現させる形質転換植物であって、同様の成長条件下で生育した類似する非形質転換植物と比較して増大した成長を特徴とする形質転換植物。
【請求項１９】
前記生育条件は、４０％未満の湿度条件を含む請求項１８の形質転換植物。
【請求項２０】
前記アミノ酸配列は、配列番号３、５、６または７に記載のとおりである請求項１８の形質転換植物。
【請求項２１】
前記形質転換植物はＣ３植物である請求項１８の形質転換植物。
【請求項２２】
前記Ｃ３植物は、トマト、ダイズ、ジャガイモ、キュウリ、ワタ、コムギ、イネ、オオムギ、レタス、アキノキリンソウ、バナナ、ポプラおよび柑橘類からなる群より選択される請求項２１の形質転換植物。
【請求項２３】
前記形質転換植物はＣ４植物である請求項１８の形質転換植物。
【請求項２４】
前記Ｃ４植物は、トウモロコシ、サトウキビおよびモロコシからなる群より選択される請求項２３の形質転換植物。
【請求項２５】
前記形質転換植物の成長速度は、類似する非形質転換植物と比較して、両者を同様の成長条件下で生育した場合に、少なくとも１０％は高い請求項１８の形質転換植物。
【請求項２６】
前記成長速度は、生体重、乾物重、根成長、シュート成長、および花の発育からなる群より選択される少なくとも１つの成長パラメーターによって決定される請求項２３の形質転換植物。
【請求項２７】
前記形質転換植物は、さらに、同様の条件下で生育した類似する非形質転換植物と比較して増加した商品収量を特徴とする請求項１８の形質転換植物。
【請求項２８】
前記生育条件は、水ストレス、低湿度、塩ストレス、および／または低ＣＯ２条件を含む請求項１８の形質転換植物。
【請求項２９】
核酸発現コンストラクトであって、
（ａ）配列番号３、５、６または７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％相同なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする第１ポリヌクレオチド領域と、
（ｂ）プロモーターとして機能的である、真核細胞における前記第１ポリヌクレオチド領域の転写を指示するための、第２ポリヌクレオチド領域と
を含む核酸発現コンストラクト。
【請求項３０】
前記プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、発生段階に応じて制御されるプロモーター、および組織特異的プロモーターからなる群より選択される請求項２９の核酸発現コンストラクト。
【請求項３１】
前記プロモーターは植物プロモーターである請求項２９の核酸発現コンストラクト。
【請求項３２】
前記第１ポリヌクレオチド領域は、さらに、前記ポリペプチドに翻訳的に融合されたトランジットペプチドをコードする請求項２９の核酸発現コンストラクト。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野および背景
本発明は、増大した成長を特徴とする植物、ならびにその作出に役立つ方法および核酸コンストラクトに関する。
【０００２】
作物の成長および生産性は商業栽培者にとって最も重要なパラメーターである。そのようなパラメーターは、例えばその植物の性質、植物内での資源配分、成長環境における資源の利用可能性、および病原体を含む他の生物との相互作用など、非常に多くの因子による影響を受ける。
【０００３】
ほとんどの作物の成長および生産性は、カルボキシル化酵素リブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ））にとってのＣＯ２の利用可能性によって制限される。そのような利用可能性は、ＣＯ２の周囲濃度および気孔伝導度、ならびにルビスコによるＣＯ２固定の速度（この酵素のＫｍ（ＣＯ２）およびＶｍａｘによって決まる）によって決定される［３１−３３］。
【０００４】
Ｃ３植物では、ルビスコが存在する部位におけるＣＯ２濃度が、とりわけ水ストレス条件下では、この酵素のＫｍ（ＣＯ２）よりも低くなる。したがって、例えば水ストレスが引き起こしうる気孔閉鎖などによって誘発される低ＣＯ２条件にばく露されると、これらの作物は成長および生産性の大幅な低下を示す。
【０００５】
多くの光合成微生物は、ルビスコが存在する部位にＣＯ２を濃縮する能力を持っているので、これによってＣＯ２に対するルビスコの親和性が低いことによって生じる制限を克服できる［３４］。
【０００６】
Ｃ４およびＣＡＭ生理群の高等植物も、空間的（Ｃ４の場合）または時間的（ＣＡＭの場合）に隔てられた二重のカルボキシル化によって、ルビスコが存在する部位におけるＣＯ２濃度を上昇させることができる。
【０００７】
植物の成長および生産性は、とりわけＣ３作物の場合には、ルビスコにとってのＣＯ２利用可能性および固定速度に大きく依存しているので、植物内でのＣＯ２濃度または固定を増大させるために植物の遺伝子を改変する試みが、そのような改変が成長または収量の増加につながることを期待して、数多くなされてきた。
【０００８】
したがって、数多くの研究が光合成細菌またはＣ４植物のＣＯ２濃縮機構をＣ３植物に導入しようと試みてきたが、それらは今までのところ、ほとんどまたは全く不成功に終わっている。
【０００９】
例えば、ルビスコを遺伝子改変してＣＯ２に対するその親和性を高めようとする研究［３５］や、Ｃ４代謝を担ういくつかの遺伝子によるＣ３植物（イネ）の形質転換［３６−４０］などが記載されている。
【００１０】
そのようなアプローチは理論的にはＣ３植物におけるＣＯ２固定の増大をもたらしうるが、そのような研究から得られた結果は期待はずれだった。
【００１１】
したがって、増大した成長および／または増加した商品収量を示す植物を作出する方法の必要性は広く認識されており、そのような方法を手に入れることは極めて有益であるだろう。
【００１２】
発明の概要
本発明の一側面によれば、ある植物の成長および／または商品収量を増大させる方法であって、その植物内で、配列番号３、５、６または７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％相同なアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現させることを含む方法が提供される。
【００１３】
本発明のもう一つの側面によれば、配列番号３、５、６または７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％相同なアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現させる形質転換植物であって、同様の成長条件下で生育した類似する非形質転換植物と比較して増大した成長を特徴とする形質転換植物が提供される。
【００１４】
以下に説明する本発明の好ましい態様のさらなる特徴によれば、植物は、４０％未満の湿度を特徴とする環境で生育される。
【００１５】
本明細書に記載する好ましい態様のさらなる特徴によれば、植物は、空気中のＣＯ２濃度（空気中で約０．０３５％ＣＯ２、溶液状態で１０μＭ  ＣＯ２）と同等またはそれ未満のＣＯ２濃度を特徴とする環境で生育される。
【００１６】
本明細書に記載する好ましい態様のさらなる特徴によれば、植物内におけるポリペプチドの発現は、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド領域を含む核酸コンストラクトで、植物細胞の少なくとも一部を形質転換することによって達成される。
【００１７】
本明細書に記載する好ましい態様のさらなる特徴によれば、形質転換は、アグロバクテリウムを介した形質転換、ウイルス感染、エレクトロポレーションおよびパーティクルボンバードメントからなる群より選択される方法によって達成される。
【００１８】
本明細書に記載する好ましい態様のさらなる特徴によれば、アミノ酸配列は、配列番号３、５、６、７に記載のとおりである。
【００１９】
本明細書に記載する好ましい態様のさらなる特徴によれば、核酸コンストラクトは、トランジットペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド領域をさらに含む。
【００２０】
本明細書に記載する好ましい態様のさらなる特徴によれば、核酸コンストラクトは、第１ポリヌクレオチド領域の転写を指示するためのプロモーター配列をさらに含む。
【００２１】
本明細書に記載する好ましい態様のさらなる特徴によれば、核酸コンストラクトは、第１および第２ポリヌクレオチド領域の転写を指示するためのプロモーター配列をさらに含む。
【００２２】
本明細書に記載する好ましい態様のさらなる特徴によれば、プロモーターは真核細胞中で機能的である。
【００２３】
本明細書に記載する好ましい態様のさらなる特徴によれば、プロモーターは構成的プロモーター、誘導性プロモーター、発生段階に応じて制御されるプロモーターおよび組織特異的プロモーターからなる群より選択される。
【００２４】
本明細書に記載する好ましい態様のさらなる特徴によれば、植物はＣ３植物である。
【００２５】
本明細書に記載する好ましい態様のさらなる特徴によれば、Ｃ３植物は、トマト、ダイズ、ジャガイモ、キュウリ、ワタ、コムギ、イネ、オオムギ、ヒマワリ、バナナ、タバコ、レタス、キャベツ、ペチュニア、アキノキリンソウおよびポプラからなる群より選択される。本明細書に記載する好ましい態様のさらなる特徴によれば、植物はＣ４植物である。
【００２６】
本明細書に記載する好ましい態様のさらなる特徴によれば、Ｃ４植物は、トウモロコシ、サトウキビおよびモロコシ（ｓｏｈｒｇｕｍ）からなる群より選択される。
【００２７】
本明細書に記載する好ましい態様のさらなる特徴によれば、上記ポリペプチドを発現させる植物は、上記ポリペプチドを発現させない同様の植物と比較して、両者をＣＯ２が制限因子になる同様の成長条件下で生育した場合に、少なくとも１０％は高い成長速度を特徴とする。
【００２８】
本明細書に記載する好ましい態様のさらなる特徴によれば、成長速度は、増加した生体重、増加した乾物重、増加した根成長、増加したシュート成長、および経時的な花の発育からなる群より選択される少なくとも１つの成長パラメーターによって決定される。
【００２９】
本明細書に記載する好ましい態様のさらなる特徴によれば、形質転換植物は、さらに、同様のＣＯ２制限条件下で生育した類似する非形質転換植物と比較して増加した商品収量を特徴とする。
【００３０】
本発明のもう一つの側面によれば、（ａ）配列番号３、５、６または７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％相同なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする第１ポリヌクレオチド領域と、（ｂ）プロモーターとして機能的である、真核細胞における第１ポリヌクレオチド領域の転写を指示するための、第２ポリヌクレオチド領域とを含む核酸発現コンストラクトが提供される。
【００３１】
本明細書に記載する好ましい態様のさらなる特徴によれば、プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーターおよび組織特異的プロモーターからなる群より選択される。
【００３２】
本明細書に記載する好ましい態様のさらなる特徴によれば、プロモーターは植物プロモーターである。
【００３３】
本明細書に記載する好ましい態様のさらなる特徴によれば、第１ポリヌクレオチド領域は、さらに、上記ポリペプチドに翻訳的に融合されたトランジットペプチドをコードする。
【００３４】
本発明は、増大した成長を特徴とする植物ならびにその作出に役立つ方法および核酸コンストラクトを提供することにより、現在知られている構成の短所に、うまく対処するものである。
【００３５】
図面の簡単な説明
本明細書では、一例として添付の図面を参照しながら、本発明を説明する。以下に図面に関して詳述するにあたって、本明細書に記載する詳細は単なる一例であって、本発明の好ましい態様をわかりやすく説明するために過ぎず、本発明の原理および概念的側面の最も有用で理解しやすい説明であると考えられる説明を行う目的で記載するものであることを強調しておく。この点に関して、本発明の構成上の特徴を、本発明の根本的理解に必要とされる以上に詳細に示そうとはしていないが、本発明のいくつかの形態を実際に体現する方法は、本明細書と図面とを合わせて考慮することにより、当業者には明白になる。
図１は、不活性化ライブラリー断片の挿入（星印で示す）が突然変異体ＩＬ−２の生成をもたらしたＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７９４２中のゲノム領域の概略図である。ＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ６２６１６として入手することができる。制限部位の印は次のとおりである：Ａ−ＡｐａＩ、Ｂ−ＢａｍＨＩ、Ｅｉ−ＥｃｏＲＩ、Ｅ−ＥｃｏＲＶ、Ｈ−ＨｉｎｃＩＩ、Ｈｉ−ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｋ−ＫｐｎＩ、Ｍ−ＭｆｅＩ、Ｎ−ＮｈｅＩ、Ｔ−ＴａｑＩ。下線付きの文字は、プローブとして使用したＤＮＡ断片の終止位置を表す。ＥＭＢＬ３ライブラリーから単離された関連断片をＥ１、Ｅ２およびＥ３で表す。Ｐ１およびＰ２はＰＣＲによって得られた断片である。三角印はＫａｎｒをコードするカートリッジが挿入された部位を示す。オープンリーディングフレームを矢印で示し、他のタンパク質に対するそれらの類似性を注記してある。Ｓｌｌおよびｓｌｒ（４桁の数字が続いている）はＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ６８０３中の相同遺伝子［２３］；ＹＺ０２−ｍｙｃｔｕ、アクセッション番号Ｑ１０５３６；ＩＣＣ、アクセッション番号Ｐ３６６５０；Ｙ１２８−ＳＹＮＰ６、アクセッション番号Ｐ０５６７７；ＹＧＧＨ、アクセッション番号Ｐ４４６４８；ｓｌｌ０７５４およびＰ４５１４１と相同なリボソーム結合因子Ａ；ｓｌｌ００７７およびＮｉｆＳと相同なＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼである。ＯＲＦ２８０はここに記載する概略図の上流から始まっていた。
図２は、ＯＲＦ４６７（ＩＣＴＢ、配列番号２）とｓｌｒ１５１５（ＳＬＲ、配列番号４）との核酸配列アラインメントを示す。垂直線はヌクレオチドの一致を示す。ギャップはハイフンで示されている。アラインメントは、Ｂｌａｓｔソフトウェアを使用し、ギャップペナルティーを存在に関して１０、伸長に関して１０、平均マッチを１０、平均ミスマッチを−５として行った。一致ヌクレオチドは５６％である。
図３は、ＩｃｔＢタンパク質（ＩＣＴＢ、配列番号３）とｓｌｒ１５１５がコードするタンパク質（ＳＬＲ、配列番号５）とのアミノ酸配列アラインメントを示す。一致アミノ酸は整列した配列の間にその一文字記号で表し、類似アミノ酸は＋記号によって示す。アラインメントは、Ｂｌａｓｔソフトウェアを使用し、ギャップ開始ペナルティーを１１、ギャップ伸長ペナルティーを１、行列をｂｌｏｓｕｍ６２として行った。一致アミノ酸は４７％、類似アミノ酸は１６％、総相同性は６３％である。
図４ａ〜ｂは、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２（４ａ）および変異体ＩＬ−２（４ｂ）によるＣＯ２およびＨＣＯ３−取り込みの速度を外部Ｃｉ濃度の関数として表したグラフである。ＬＣおよびＨＣはそれぞれ低ＣＯ２（空気）下または高ＣＯ２（空気中５％ＣＯ２）下で生育した細胞である。速度は、メンブレンインレット質量分析計（ＭＩＭＳ）を使った定常状態光合成中の測定から評価した［６，７，２２］。
図５は、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２および突然変異体ＩＬ−２に見いだされるｉｃｔＢの一領域のＤＮＡ配列相同性比較を表す。この領域は、突然変異体では、１点交叉事象のせいで重複していた。野生型と比較すると、ＢａｍＨＩ側には１個の追加ヌクレオチドと６ヌクレオチドの欠失とが見つかり、ＡｐａＩ側では４個のヌクレオチドが欠失していた（図１参照）。これらの変化により、ＩｃｔＢ中には、ＢａｍＨＩ側およびＡｐａＩ側のそれぞれ１６８アミノ酸後または８０アミノ酸後に停止コドンが生じた。この図に示す配列はｉｃｔＢの６９番目のアミノ酸から始まっている。
図６は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製のバイナリーベクターｐＢＩ１２１内に３５Ｓプロモーター、エンドウ・ルビスコの小サブユニットに由来するトランジットペプチド（ＴＰ）（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ｘ０４３３４のヌクレオチド座標３２９〜４９８。４９８位のＧをＴで置き換えたもの）、ｉｃｔＢコード領域、ＮＯＳ終結配列およびカナマイシン耐性（ＫｎＲ）を含む、本発明のトランスジェニック植物の作出に使用されるｉｃｔＢコンストラクトを示す。
図７は、ｉｃｔＢと１８Ｓ  ｒＤＮＡの両方をプローブとして使用したトランスジェニックおよび野生型（ｗ）シロイヌナズナおよびタバコ植物のノーザンブロット解析である。
図８は、細胞間ＣＯ２濃度による影響を受ける野生型および本発明のトランスジェニックタバコ植物における光合成の速度を表す図。植物１および１１がトランスジェニックである。
図９は、トランスジェニック（Ａ、ＢおよびＣ）ならびに野生型（ＷＴ）シロイヌナズナ植物で行った成長実験を表す図。各生育鉢には１つの野生型植物と３つのトランスジェニック植物を植えた。データを植物の平均乾物重量±Ｓ．Ｄ．として記載する。成長条件は実施例の項で説明する。
【００３６】
好ましい実施態様の説明
本発明は、増大した成長および／または果実収量および／または開花率を特徴とする植物を作出する方法、その方法によって作出される植物、およびそのような方法に利用される核酸コンストラクトの発明である。具体的に述べると、本発明は、Ｃ３植物の成長速度および／または果実収量を、特に低湿度および／または低ＣＯ２濃度を特徴とする条件下で生育した場合に、大幅に増加させるために使用することができる。
【００３７】
本発明の原理および作用は、図面とそれに付随する説明とを参照することにより、より良く理解されるだろう。
【００３８】
本発明の少なくとも一つの態様を詳しく説明する前に、本発明が、その応用にあたって、以下に説明しまたは図面に示す構成の詳細および成分の配置に限定されないことを理解しておくべきである。本発明には他の態様も可能であり、本発明はさまざまな方法で実施または実行することができる。また、本明細書で使用する表現および用語は、説明のために使用されるのであって、これらを限定であるとみなしてはならない。
【００３９】
作物の成長サイズ／速度および／または商品収量を増加させることは、とりわけ成長／栽培条件が例えば水不足などの理由で最適条件ではない地域では、最重要事である。
【００４０】
本発明をなすにあたって、本発明者らは、ラン藻無機炭素輸送体をコードすると推定される外因性ポリヌクレオチドを発現させる植物が、とりわけ低湿度または低ＣＯ２濃度を特徴とする条件下で生育した場合に、増大した成長を特徴とすることを、発見した。
【００４１】
したがって本発明によれば、配列番号３、５、６または７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％相同なアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現させる形質転換植物が提供される。
【００４２】
本発明の形質転換植物は、同様の成長条件下で生育した類似する非形質転換植物と比較して、増大した成長を特徴とする。
【００４３】
本明細書で使用する「増大した成長」という語句は、増大した成長速度、あるいは植物もしくはその商品部分の生体重、乾物重またはサイズによって決定される植物体全体の、また好ましくはその植物の商品部分の、増加した成長サイズ／重量（増加した収量）を表す。
【００４４】
下記実施例の項でさらに詳述するとおり、本発明の形質転換植物は、例えば、類似する非形質転換植物の成長速度と比較して、両植物を同様の成長条件下で生育した場合に、少なくとも１０％高い成長速度を示す。
【００４５】
本発明の好ましい態様によれば、上記ポリペプチドは、Ｂｌａｓｔソフトウェアを使用しギャップ開始ペナルティーを１１、ギャップ伸長ペナルティーを１、行列をｂｌｏｓｕｍ６２として決定した場合に、配列番号３、５、６もしくは７またはその一部に対して、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、理想的には９５〜１００％相同（一致＋類似）である。
【００４６】
本発明の好ましい態様によれば、上記成長条件は、４０％未満の湿度および／または空気中のＣＯ２濃度より低いＣＯ２濃度を特徴とする。
【００４７】
本発明の形質転換植物はどの植物であってもよく、例えばトマト、ダイズ、ジャガイモ、キュウリ、ワタ、コムギ、イネ、オオムギなどのＣ３植物、または例えばトウモロコシ、サトウキビ、モロコシ（ｓｏｈｒｇｕｍ）などのＣ４植物を含むが、これらに限るわけではない。
【００４８】
本発明の形質転換植物は、上述したポリペプチドをコードする核酸分子またはポリヌクレオチドを、植物の細胞に導入することによって作出される。
【００４９】
そのような核酸分子またはポリヌクレオチドは、配列番号２、４、８または９の少なくとも一部分であって、増加した成長という形質をもたらすポリペプチドをコードしている部分に相当する配列を持つことができる。
【００５０】
これに代えて、またはこれに加えて、核酸分子は、Ｂｌａｓｔソフトウェアを使用しギャップペナルティーを存在に関して１０、伸長に関して１０、平均マッチを１０、平均ミスマッチを−５として決定した場合に、上記の部分と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、理想的には９５〜１００％一致する配列を持つことができる。この点で、配列番号２、４、８または９を使って相同な配列を容易に単離することができ、それらを下記実施例の項で説明するようにその重炭酸イオン輸送活性について試験できることは理解されるだろう。そのような相同配列を単離する方法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら［９］などに詳しく説明されており、これにはハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ増幅が含まれうる。
【００５１】
さらに、上記に代えて、または上記に加えて、核酸分子は、配列番号２、４、８または９の上記部分とハイブリダイズする能力を有する配列を持つことができる。長い核酸（例えば長さが２００ｂｐを超える核酸）のハイブリダイゼーションは、本発明の好ましい態様では、ストリンジェントなハイブリダイゼーションまたは中等度のハイブリダイゼーションによって達成される。この場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、１０％デキストラン硫酸、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳおよび５×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含むハイブリダイゼーション溶液により、６５℃で行われ、最終洗浄は０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの最終洗浄溶液を使って６５℃で行われる。一方、中等度のハイブリダイゼーションは、１０％デキストラン硫酸、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳおよび５×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含むハイブリダイゼーション溶液により、６５℃で行われ、最終洗浄は１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの最終洗浄溶液を使って５０℃で行われる。
【００５２】
好ましくは、本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチドには、当該ポリペプチドを特定の膜に向かわせる働きをするＮ末端トランジットペプチドが融合されている。そのような膜は、例えば細胞膜であることができ、そこでは上記ポリペプチドが重炭酸イオンをアポプラストから細胞質内に輸送する働きをするだろう。また、そのような膜は、葉緑体の外膜および好ましくは内膜であることもできる。本明細書に記載するように機能するトランジットペプチドは当技術分野ではよく知られている。そのようなトランジットペプチドのさらに詳しい説明は、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎら  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（１９９０）２：５２５−５３２；Ｓａｕｅｒら  ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９０）９：３０４５−３０５０；Ｍｕｅｃｋｌｅｒら  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２２９：９４１−９４５；Ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８３）１３３：１７−２１；Ｙｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）１８９：２３９−２４２；Ｉｔｕｒｒｉａｇａら  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（１９８９）１：３８１−３９０；ＭｃＫｎｉｇｈｔら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８：４９３９−４９４３；ＭａｔｓｕｏｋａおよびＮａｋａｍｕｒａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：８３４−８３８などに記載されている。「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｐｌａｎｔｓ」と題する最近の教科書（Ｃ．ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＡ．Ｊ．Ｒ．Ｐｏｒｔｅｒ編，１９９８，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ニュージャージー州トトワ）には、植物内で組換えタンパク質を生産する方法および植物細胞内の異なるコンパートメントにタンパク質をターゲティングする方法が記載されている。ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍとＰｏｒｔｅｒによるこの書籍は参照により本明細書に組み込まれる。しかし、多くの膜結合型タンパク質は取り外しの可能なトランジットペプチドを提示しないことも、当業者には理解されるだろう。そのような場合は、当該タンパク質内の一定のアミノ酸配列が、そのタンパク質の構造部分としてだけでなく、トランジットペプチドとしても働くと、一般に考えられている。
【００５３】
好ましくは、本発明の核酸分子は、植物細胞を形質転換してその細胞内での本核酸分子の発現を可能にするためのベクターとして設計された核酸コンストラクト内に含まれる。
【００５４】
植物発現は、内在ゲノム配列または細胞小器官ポリヌクレオチド配列（例えば葉緑体もしくはミトコンドリア）中に存在する植物プロモーターの下流に本発明の核酸分子を（好ましくは核酸コンストラクトを使って）導入し、よって植物細胞内でのその発現を可能にすることによって、達成することができる。
【００５５】
そのような場合、核酸コンストラクトは、上記ゲノムまたは細胞小器官ポリヌクレオチド配列の特定のポリヌクレオチド領域またはランダムなポリヌクレオチド領域に本核酸分子を「ノックイン」できるようにする配列をさらに含む。
【００５６】
好ましくは、本発明の核酸コンストラクトは、植物細胞内で本核酸分子の発現を指示するのに役立つ植物プロモーターをさらに含む。
【００５７】
本明細書および特許請求の範囲で使用する「植物プロモーター」という語句は、植物細胞（ＤＮＡ含有小器官を含む）内で遺伝子発現を指示することができるプロモーターを包含する。そのようなプロモーターは植物、細菌、ウイルス、真菌または動物から得ることができる。そのようなプロモーターは、構成的（すなわち複数の植物組織内で高レベルの遺伝子発現を指示する能力を持つプロモーター）でも、組織特異的（すなわち１つまたは複数の特定植物組織における遺伝子発現を指示する能力を持つプロモーター）でも、誘導性（すなわち刺激を受けて遺伝子発現を指示する能力を持つプロモーター）でも、キメラでもよい。
【００５８】
したがって、使用する植物プロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーターまたはキメラプロモーターであることができる。
【００５９】
構成的植物プロモーターの例には、例えば、ＣａＭＶ３５ＳおよびＣａＭＶ１９Ｓプロモーター、ＦＭＶ３４Ｓプロモーター、サトウキビ桿状バドナウイルスプロモーター、ＣｓＶＭＶプロモーター、シロイヌナズナ  ＡＣＴ２／ＡＣＴ８アクチンプロモーター、シロイヌナズナ  ユビキチンＵＢＱ１プロモーター、オオムギ葉チオニンＢＴＨ６プロモーター、およびイネアクチンプロモーターなどがある。
【００６０】
組織特異的プロモーターの例には、例えばマメ・ファゼオリン貯蔵タンパク質プロモーター、ＤＬＥＣプロモーター、ＰＨＳβプロモーター、ゼイン貯蔵タンパク質プロモーター、ダイズ由来のコングルチンガンマプロモーター、ＡＴ２Ｓ１遺伝子プロモーター、シロイヌナズナ由来のＡＣＴ１１アクチンプロモーター、セイヨウアブラナ由来のｎａｐＡプロモーター、およびジャガイモ・パタチン遺伝子プロモーターなどがある。
【００６１】
誘導性プロモーターは、特定の刺激、例えば光、温度、化学物質、干ばつ、高塩分、浸透圧ショック、酸化的条件を含むストレス条件などによって誘導される、または発病時に誘導される、プロモーターであり、例えばエンドウｒｂｃＳ遺伝子由来の光誘導性プロモーター、アルファルファｒｂｃＳ遺伝子由来のプロモーター、干ばつ時に活性なプロモーターＤＲＥ、ＭＹＣおよびＭＹＢ、高塩分および浸透圧ストレス時に活性なプロモーターＩＮＴ、ＩＮＰＳ、ｐｒｘＥａ、Ｈａ  ｈｓｐ１７．７Ｇ４およびＲＤ２１、ならびに病原体ストレス時に活性なプロモーターｈｓｒ２０３Ｊおよびｓｔｒ２４６Ｃなどがこれに含まれる。
【００６２】
本発明の核酸コンストラクトは、好ましくは、広宿主域原核生物複製起点、原核生物選択可能マーカー、そしてアグロバクテリウム形質転換の場合は、植物染色体へのアグロバクテリウムを介した導入のためのＴ−ＤＮＡ配列を与える追加ポリヌクレオチド領域を、さらに含む。異種配列を容易に検出しがたい場合、コンストラクトは、好ましくは、植物細胞が形質転換されたかどうかを決定するのに適した選択可能マーカー遺伝子も持つだろう。イネ科の植物に適したマーカーの一般論は、ＷｉｌｍｉｎｋおよびＤｏｎｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｔｒ．（１９９３）１１：１６５−１８５に記載されている。
【００６３】
適切な原核生物選択可能マーカーとして、アンピシリン、カナマイシンまたはテトラサイクリンなどの抗生物質に対する耐性が挙げられる。当技術分野では知られているように、ベクター中には、追加の機能をコードする他のＤＮＡ配列も存在しうる。
【００６４】
植物ゲノムへの異種配列の組込みを可能にするのに適した配列も推奨される。これらは、植物ゲノムへの異種発現カセットのランダム挿入を可能にするトランスポゾン配列ならびにＴｉ配列を含むかもしれない。
【００６５】
本発明の核酸コンストラクトを利用して植物細胞を安定にまたは一過性に形質転換することができる。安定形質転換の場合、本発明の核酸分子は植物ゲノムに組み込まれるので、これは安定な遺伝形質になる。一過性形質転換の場合、核酸分子は形質転換された細胞によって発現されるが、ゲノムには組み込まれないので、これは一過性の形質になる。
【００６６】
単子葉植物および双子葉植物に外来遺伝子を導入するには、さまざまな方法がある（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９１）４２：２０５−２２５；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３３８：２７４−２７６）。
【００６７】
植物ゲノムＤＮＡへの外因性ＤＮＡの安定な組込みを引き起こす原理的方法には、主なアプローチが２つある。すなわち、
（ｉ）アグロバクテリウムを介した遺伝子導入：Ｋｌｅｅら  （１９８７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８：４６７−４８６；ＫｌｅｅおよびＲｏｇｅｒｓ「Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｖｏｌ．６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｇｅｎｅｓ」（Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．およびＶａｓｉｌ，Ｌ．Ｋ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，カリフォルニア州サンディエゴ，１９８９）の２〜２５頁；Ｇａｔｅｎｂｙ「Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（Ｋｕｎｇ，Ｓ．およびＡｒｎｔｚｅｎ，Ｃ．Ｊ．編，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，マサチューセッツ州ボストン，１９８９）の９３〜１１２頁と、
（ｉｉ）直接ＤＮＡ取り込み：Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら「Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｖｏｌ．６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｇｅｎｅｓ」（Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．およびＶａｓｉｌ，Ｌ．Ｋ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，カリフォルニア州サンディエゴ，１９８９）の５２〜６８頁；例えばプロトプラストへのＤＮＡの直接取り込み法：Ｔｏｒｉｙａｍａ，Ｋ．ら  （１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１０７２−１０７４；植物細胞の短い電気ショックによって誘発されるＤＮＡ取り込み：Ｚｈａｎｇら  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．（１９８８）７：３７９−３８４；Ｆｒｏｍｍら  Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３１９：７９１−７９３；パーティクルボンバードメントによる植物細胞または植物組織へのＤＮＡ注入：Ｋｌｅｉｎら  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：５５９−５６３；ＭｃＣａｂｅら  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：９２３−９２６；Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．（１９９０）７９：２０６−２０９；マイクロピペットシステムを使用する方法：Ｎｅｕｈａｕｓら，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８７）７５：３０−３６；ＮｅｕｈａｕｓおよびＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．（１９９０）７９：２１３−２１７；またはＤＮＡと発芽花粉との直接インキュベーションによる方法：ＤｅＷｅｔら「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｖｕｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ」（Ｃｈａｐｍａｎ，Ｇ．Ｐ．，Ｍａｎｔｅｌｌ，Ｓ．Ｈ．およびＤａｎｉｅｌｓ，Ｗ．編，Ｌｏｎｇｍａｎ，ロンドン，１９８５）の１９７〜２０９頁；Ｏｈｔａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ（１９８６）８３：７１５−７１９など
である。
【００６８】
アグロバクテリウム系には、植物ゲノムＤＮＡに組み込まれる明確なＤＮＡセグメントを含むプラスミドベクターの使用が含まれる。植物組織の接種方法は植物の種およびアグロバクテリウム送達系によって異なる。広く使用されているアプローチはリーフディスク法であり、これは植物体全体の分化の開始にとって良い出発点となる任意の組織外植片を使って行うことができる。Ｈｏｒｓｃｈら「Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ａ５」（Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  ドルドレヒト，  １９８８）の１〜９頁。補足的アプローチでは、アグロバクテリウム送達系を、真空浸透と組み合わせて使用する。アグロバクテリウム系はトランスジェニック双子葉植物の作出にはとりわけ実用的である。
【００６９】
植物細胞にＤＮＡを直接導入するには、さまざまな方法がある。エレクトロポレーションでは、プロトプラストを強い電場に短時間ばく露する。マイクロインジェクションでは、極めて小さいマイクロピペットを使ってＤＮＡを細胞中に直接機械的に注入する。微粒子ボンバードメントでは、硫酸マグネシウム結晶またはタングステン粒子などのマイクロプロジェクタイルにＤＮＡを吸着させ、そのマイクロプロジェクタイルを物理的に加速して細胞または植物組織内に打ち込む。
【００７０】
安定形質転換に続いて、植物の繁殖を行う。最も一般的な植物繁殖法は種子による方法である。しかし、種子はメンデルの法則の支配を受ける遺伝分散に従って植物により産生されるので、種子繁殖による再生には、ヘテロ接合性ゆえに収穫物が均一性に欠けるという欠点がある。基本的に、各種子は遺伝的に異なり、それぞれが独自の形質を持って成長する。したがって、再生された植物が、親トランスジェニック植物と同じ形質および特徴を持つように形質転換植物を作出することが好ましい。したがって形質転換植物は、形質転換植物の迅速で一貫した再生をもたらす微細繁殖によって再生されることが好ましい。
【００７１】
微細繁殖は、選択された親植物または栽培品種から切除された単一の組織片から新世代植物を成長させる方法である。この方法により、融合タンパク質を発現させる好ましい組織を持つ植物の大量再生が可能になる。生成する新世代植物は元の植物と遺伝的に同一であり、元の植物の特徴をすべて持っている。微細繁殖により、高品質な植物材料を短期間で大量に生産することができ、元のトランスジェニック植物または形質転換植物の特徴を保存する上で、選択した栽培品種を素早く増殖させることができる。植物をクローン化することの利点は、植物増殖のスピードと、生産される植物の品質および均一性である。
【００７２】
微細繁殖は、段階間で培養培地または成長条件の変更を必要とする多段階法である。したがって微細繁殖法には４つの基本的段階、すなわち第１段階（初期組織培養）、第２段階（組織培養増殖）、第３段階（分化および植物形成）ならびに第４段階（温室栽培およびハードニング）が含まれる。第１段階（初期組織培養）では組織培養を樹立し、夾雑物の不在を証明する。第２段階では、生産目標を満たすのに十分な組織試料が得られるまで、初期組織培養を増殖させる。第３段階では、第２段階で成長させた組織試料を分割し、個々の小植物体に成長させる。第４段階では、形質転換小植物体をハードニング用の温室に移し、自然環境でも生育できるように、光に対する植物の耐性を徐々に増加させる。
【００７３】
今のところは安定形質転換が好ましいが、本発明では、葉細胞、分裂細胞または植物体全体の一過性形質転換も考えられる。
【００７４】
一過性形質転換は、上述の直接ＤＮＡ導入法のいずれか、または改変植物ウイルスを使ったウイルス感染によって達成することができる。
【００７５】
植物宿主の形質転換に役立つことが示されているウイルスには、例えばＣａＭＶ、ＴＭＶおよびＢＶがある。植物ウイルスを使った植物の形質転換は、米国特許第４８５５２３７号（ＢＧＶ）、ＥＰ−Ａ  ６７５５３（ＴＭＶ）、特表昭６３−１４６９３（ＴＭＶ）、ＥＰＡ  １９４８０９（ＢＶ）、ＥＰＡ  ２７８６６７（ＢＶ）、およびＧｌｕｚｍａｎ，  Ｙ．ら「Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」コールドスプリングハーバー研究所、ニューヨーク、ｐ．１７２−１８９（１９８８）に記載されている。植物を含む多くの宿主で外来ＤＮＡを発現させるためのシュードウイルス粒子は、ＷＯ８７／０６２６１に記載されている。
【００７６】
非ウイルス外因性核酸配列を植物に導入し植物内で発現させるための植物ＲＮＡウイルスの構築は、上記の文献ならびにＤａｗｓｏｎ，Ｗ．Ｏ．ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７２：２８５−２９２；Ｔａｋａｍａｔｓｕら  ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８７）６：３０７−３１１；Ｆｒｅｎｃｈら  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８６）２３１：１２９４−１２９７；およびＴａｋａｍａｔｓｕらＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９０）２６９：７３−７６によって実証されている。
【００７７】
ウイルスがＤＮＡウイルスである場合は、ウイルス自体に適切な改変を施すことができる。あるいは、外来ＤＮＡを持つ望ましいウイルスベクターの構築が容易になるようにウイルスをまず細菌プラスミドにクローニングすることもできる。次に、ウイルスをそのプラスミドから切り出すことができる。ウイルスがＤＮＡウイルスである場合は、細菌の複製起点をウイルスＤＮＡに結合し、それを細菌によって複製させることができる。このＤＮＡの転写および翻訳により、ウイルスＤＮＡを包むコートタンパク質が産生されるだろう。ウイルスがＲＮＡウイルスである場合は、一般的にはｃＤＮＡとしてウイルスをクローニングし、プラスミドに挿入する。次に、そのプラスミドを使って構築のすべてを行うことができる。次に、プラスミドのウイルス配列を転写することによってＲＮＡウイルスを生成し、ウイルス遺伝子の翻訳によってウイルスＲＮＡを包むコートタンパク質を産生させる。
【００７８】
本発明のコンストラクトに含まれるような非ウイルス外因性核酸配列を植物に導入し植物内で発現させるための植物ＲＮＡウイルスの構築は、上記の文献および米国特許第５３１６９３１号によって実証されている。
【００７９】
ある態様では、天然のコートタンパク質コード配列をウイルス核酸から欠失させて、植物宿主内での発現、組換え植物ウイルス核酸のパッケージング、および組換え植物ウイルス核酸による宿主の全身感染の確保が可能な非天然植物ウイルスコートタンパク質コード配列および非天然プロモーター（好ましくは非天然コートタンパク質コード配列のサブゲノムプロモーター）を挿入した植物ウイルス核酸を用意する。あるいは、タンパク質が産生されるように非天然核酸配列をコートタンパク質遺伝子内に挿入することによって、コートタンパク質遺伝子を不活性化してもよい。組換え植物ウイルス核酸は、１つまたは複数の追加非天然サブゲノムプロモーターを含んでもよい。各非天然サブゲノムプロモーターは、植物宿主内で隣接する遺伝子または核酸配列を転写または発現させることができ、互いに組換えを起こしたり、天然サブゲノムプロモーターと組換えを起こしたりすることはできない。非天然（外来）核酸配列は、天然植物ウイルスサブゲノムプロモーターに隣接して挿入するか、または２以上の核酸配列が含まれている場合には、天然および非天然植物ウイルスサブゲノムプロモーターに隣接して挿入することができる。非天然核酸配列はサブゲノムプロモーターの制御下に宿主植物内で転写または発現されて、所望の産物を産生する。
【００８０】
第２の態様では、天然コートタンパク質コード配列が非天然コートタンパク質コード配列の代わりに非天然コートタンパク質サブゲノムプロモーターの一つに隣接している点以外は第１の態様と同様の組換え植物ウイルス核酸を用意する。
【００８１】
第３の態様では、天然コートタンパク質遺伝子がそのサブゲノムプロモーターに隣接しており、１つまたは複数の非天然サブゲノムプロモーターがウイルス核酸に挿入されている組換え植物ウイルス核酸を用意する。挿入される非天然サブゲノムプロモーターは、植物宿主内で隣接する遺伝子を転写または発現させることができ、互いに組換えを起こしたり、天然サブゲノムプロモーターと組換えを起こしたりすることはできない。非天然核酸配列は、非天然サブゲノム植物ウイルスプロモーターに隣接して、その配列が当該サブゲノムプロモーターの制御下に宿主植物中で転写または発現されて所望の産物が産生されるように挿入することができる。
【００８２】
第４の態様では、天然コートタンパク質コード配列が非天然コートタンパク質コード配列で置換されている点以外は第３の態様と同様の組換え植物ウイルス核酸を用意する。
【００８３】
ウイルスベクターは、組換え植物ウイルス核酸がコードするコートタンパク質によって包まれて、組換え植物ウイルスを生じる。組換え植物ウイルス核酸または組換え植物ウイルスを使って適当な宿主植物を感染させる。組換え植物ウイルス核酸は宿主中で複製し、宿主全体に広がり、宿主内で外来遺伝子（単離された核酸）を転写または発現させて、所望のタンパク質を産生させる能力を持つ。
【００８４】
上記の他に、本発明の核酸分子を葉緑体ゲノムに導入して、葉緑体で発現させることもできる。
【００８５】
外因性核酸配列を葉緑体のゲノムに導入する技術は知られている。この技術には以下の手順が含まれる。第１に、１細胞あたりの葉緑体数がおよそ１個まで減少するように、植物細胞を化学的に処理する。次に、少なくとも１つの外因性核酸分子を葉緑体に導入する目的で、外因性核酸をパーティクルボンバードメントによって細胞中に導入する。外因性核酸は、葉緑体に固有の酵素によって容易に達成される相同組換えによって葉緑体ゲノム中に組み込まれうるように選択される。そのために、外因性核酸は、目的とする遺伝子の他に、葉緑体のゲノムに由来する少なくとも１つの核酸ストレッチを含む。さらに、外因性核酸は選択可能マーカーを含む。この選択可能マーカーは、逐次選択操作によって、そのような選択後に葉緑体ゲノムのコピーのすべてまたは実質上すべてが外因性核酸を含むことを確かめるのに役立つ。この技術に関するさらなる詳細は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４９４５０５０号および第５６９３５０７号に記載されている。このように、ポリペプチドを葉緑体のタンパク質発現系によって産生させて、葉緑体の内膜に組み込ませることができる。
【００８６】
このように本発明は、方法、核酸コンストラクト、ならびにそのような方法およびコンストラクトを使って作出される形質転換植物であって、増大した成長速度および／または増加した商品収量を特徴とする形質転換植物を提供する。
【００８７】
本発明のさらなる目的、利点、および新規な特徴は、限定を意図しない以下の実施例を精査すれば、当業者には明らかになるだろう。また、上に説明し特許請求の範囲に記載する本発明のさまざまな態様および側面については、それぞれにその実験的裏付けを、以下の実施例に見いだすことができる。
実施例
次に、下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明とともに、本発明を非限定的な様式で例示する。
一般に、本明細書中で使用される命名法および本発明において用いられる実験室手順には、分子的技術、生化学的技術、微生物学的技術および組換えＤＮＡ技術が含まれる。そのような技術は文献に詳細に説明されている。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ他、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ他、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ他（編）、「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」、第１巻〜第４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に示されるような方法論；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）、第３編；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ他（編）、「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（編）、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）を参照のこと。様々な利用可能な免疫アッセイが特許および科学文献に広範囲に記載されている：例えば、米国特許第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）、および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、第１巻〜第３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ他、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）。これらはすべて、全体が本明細書中に示されているかのように参考として組み込まれる。他の一般的な参考文献がこの文書中に示されている。参考文献中の手順は、この分野では十分に知られていると考えられ、そして読者の便宜のために提供される。参考文献に含まれる情報はすべて、参考として本明細書中に組み込まれる。
【００８８】
実施例１
ｉｃｔＢの単離および特徴付け
材料および実験方法
成長条件：
Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７９４２株およびその突然変異体ＩＬ−２の培養物は、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ  ｐＨ７．８および２５μｇ・ｍＬ−１カナマイシン（突然変異体の場合）を添加したＢＧ１１培地中、３０℃で生育させた。空気中の５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２（高ＣＯ２）、または空気をＣＯ２非含有空気と１：１の割合で混合することによって調製した空気中の０．０１７５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２で、培地を曝気した。大腸菌（ＤＨ５α株）は、必要に応じてカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）またはアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ培地［９］で生育させた。
【００８９】
光合成およびＣｉ取り込みの測定
無機炭素（Ｃｉ）依存的Ｏ２発生の速度は、他の文献に記載されているようにＯ２電極［１０］によって、およびメンブレンインレット質量分析計（ＭＩＭＳ［６，１１］）によって測定した。ＭＩＭＳは定常状態光合成中のＣＯ２およびＨＣＯ３−取り込みの評価にも使用した［６］。ＣＯ２またはＨＣＯ３−の供給に続くＣｉフラックスは、濾過遠心分離技術［１０］によって決定した。実験を行う１２時間前に、対数増殖期の高ＣＯ２生育細胞を低または高ＣＯ２に移した。収集した後、細胞を２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ  ｐＨ８．０に再懸濁し、１００μｍｏｌ光子量・ｍ−２・ｓ−１の光束下に空気（Ｃｉ濃度は約０．４ｍＭだった）で曝気した。一部を抜き取り、直ちに遠心管に入れ、同様の光および温度条件下に保った。最終Ｃｉ濃度に影響を及ぼさない少量の１４Ｃ−ＣＯ２または１４Ｃ−ＨＣＯ３−を注入し、５秒後に遠心分離によってＣｉ取り込みを停止させた。
【００９０】
一般的ＤＮＡ操作：
ゲノムＤＮＡは、他の文献に記載されているように単離した［１２］。クローニングおよびサザン解析には、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用し［１２−１３］、Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｄ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ＫｉｔまたはＤＩＧシステム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使った。配列解析はＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒサイクルシークエンシングキット、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（３７７ＤＮＡシークエンシング  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使って行った。ここで使用したゲノムライブラリーは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州ラホーヤ）から入手できるＬａｍｂｄａ  ＥＭＢＬ３／ＢａｍＨＩベクターキットを使って構築した。
【００９１】
突然変異体ＩＬ−２の構築および単離
ＤｏｌｇａｎｏｖおよびＧｒｏｓｓｍａｎ［１４］が開発した方法の変法を使って、新しい高ＣＯ２要求突然変異体を生成させて、単離した［４，５］。簡単に述べると、ゲノムＤＮＡをＴａｑＩで消化し、改変ブルースクリプト  ＳＫプラスミドのポリリンカーのＡｃｃＩ部位に連結した。ブルースクリプト由来のアンピシリン耐性付与遺伝子は、カナマイシン耐性（Ｋａｎｒ［８］）をコードするカートリッジの（ＳｃａＩ部位への）挿入によって不活性化した。そのライブラリーをＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７９４２株細胞にトランスフェクトした［１２］。Ｋａｎｒを付与する１点交叉事象により、さまざまな遺伝子の不活性化が起こった。Ｋａｎｒ細胞を低ＣＯ２条件に８時間ばく露して適応させた後、アンピシリン処理（４００μｇ／ｍＬ）を１２時間行った。低ＣＯ２に適応する能力を持ち、したがってこれらの条件下で成長することができる細胞は、この処理によって排除された。低ＣＯ２条件下で分裂することができない高ＣＯ２要求突然変異体ＩＬ−２は、高ＣＯ２濃度存在下でのアンピシリンの除去および成長後に、生き残り、これを回収した。
【００９２】
突然変異体ＩＬ−２からの関連損傷ゲノム領域のクローニング
突然変異体から単離したＤＮＡを、ポリリンカー中のＡｃｃＩ部位の一方の側に位置するＡｐａＩ、ＡｃｃＩ部位の他方の側に位置するＢａｍＨＩもしくはＥｃｏＲＩ、またはベクターもＫａｎｒカートリッジも切断しないＭｆｅＩで消化した。これらの酵素はゲノムＤＮＡも切断した。消化されたＤＮＡを自己連結させた後、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（ＤＨ５α株）のトランスフェクションを行った。次に、複製起点、Ｋａｎｒカートリッジおよび不活性化された遺伝子の一部を含むベクター配列を持つＫａｎｒコロニーを単離した。この方法を使って、突然変異体に挿入されたベクターの両側の隣接領域をクローニングした。プラスミドから単離された１．３Ｋｂｐ  ＡｐａＩ断片および０．８Ｋｂｐ  ＢａｍＨＩ断片（１つのＡｐａＩ部位およびＢａｍＨＩ部位はベクターポリリンカーに由来）を、野生型ゲノムのＥＭＢＬ３ゲノムライブラリー中の関連クローンを同定するためのプローブおよびサザン解析用のプローブとして使用した。野生型ゲノム（配列番号１）におけるこれらの断片の位置を図１に示す。ＡｐａＩ断片は、図１にＴおよびＡで示す（配列番号１の）１６００位と２８９９位の間にあり、ＢａｍＨＩ断片は、図１にＢおよびＴで示す（配列番号１の）４１２５位と４９５７位の間にある。０．８Ｋｂｐ  ＢａｍＨＩ断片は１．６Ｋｂｐ  ＨｉｎｃＩＩ断片（図１にＥ３で示す）とハイブリダイズした。１．３Ｋｂｐ  ＡｐａＩ断片は約６ＫｂｐのＥｃｏＲＩ断片とハイブリダイズした。興味深いことに、この断片はゲノムライブラリーからＥ．ｃｏｌｉにはクローニングできなかった。そこで、ＢａｍＨＩ部位（２３４８位、配列番号１、図１）を使って、ＥＭＢＬ３クローンを、４．０Ｋｂｐと１．８Ｋｂｐの２つのクローニング可能な断片（それぞれＥ１およびＥ２、Ｅ１は図１の開始点にあるＨｉｎｄＩＩＩの上流に位置するＳａｕ３Ａから始まっている）に分割した。これら３つの断片が実際に図１に示すように位置しているという証拠は、野生型ＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲ（断片Ｐ１およびＰ２（図１）の合成をもたらす）によって得た。配列解析により、ＩＬ−２中の関連領域を野生型の対応する配列と比較することが可能になった。
【００９３】
ＩＬ−２突然変異体の生理学的解析：
ＩＬ−２突然変異体は高ＣＯ２濃度の存在下では野生型細胞とほぼ同じように成長したが、低ＣＯ２下では成長することができなかった。光合成速度を外部Ｃｉ濃度の関数として解析したところ、ＩＬ−２突然変異体の見かけの光合成親和性は２０ｍＭ  Ｃｉであることがわかった。これは低ＣＯ２条件でのＣｉの濃度より約１００倍高い。ＩＬ−２におけるＣｉ濃度の関数としての光合成速度に関する曲線は、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２の他の高ＣＯ２要求突然変異体で得られる曲線と似ていた［１６，１７］。これらのデータから、ＩＬ−２が低ＣＯ２下で成長することができないのは、この突然変異体の光合成能力が低いためであることが示唆された。
【００９４】
このような特徴を示す高ＣＯ２要求突然変異体は、異常カルボキシソームを持つ突然変異体［９，１０，１２，１８，１９］またはＣｉ取り込みの活性化に欠陥を持つ突然変異体［２０，２１］に認められている。現在までに特徴づけられたカルボキシソーム欠損突然変異体はすべて、野生型細胞と同様に細胞内にＣｉを蓄積することができた。しかし、これらの変異体は、低ＣＯ２にばく露された突然変異体細胞中のルビスコの活性化状態が低いために、そのＣｉを光合成に効率よく利用することができなかった［１０］。これは、正常なカルボキシソームを持つがＨＣＯ３−取り込みに障害を示す突然変異体ＩＬ−２には当てはまらなかった（表１、図４ａ〜ｂ）。１４Ｃｉ蓄積の測定により、高ＣＯ２で生育した野生型と突然変異体とでは、ＨＣＯ３−およびＣＯ２取り込みは類似していることがわかった（表１）。
【表１】
2004531252.tif 000002
【００９５】
成長培地中のＣＯ２濃度による影響を受けるＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７９４２および突然変異体ＩＬ−２におけるＣＯ２取り込みおよびＨＣＯ３−取り込みの速度。高ＣＯ２条件下で生育した細胞または低ＣＯ２に１２時間ばく露した細胞の一方向ＣＯ２またはＨＣＯ３−取り込みを、細胞内に蓄積したＣｉ  μｍｏｌ・ｍｇ−１  Ｃｈｌ・ｈ−１で表す。記載する結果は３回の異なる実験（各実験では４つのレプリカを使用）の平均値であり、データの範囲は平均の±１０％以内だった。ＷＴ＝野生型。
【００９６】
野生型細胞によるＨＣＯ３−の取り込みは、低ＣＯ２条件に１２時間ばく露した後、約６倍増加した。これに対し、同じ処理を行っても、ＩＬ−２突然変異体の場合は、ＨＣＯ３−取り込みが２倍までしか増加しなかった。ＣＯ２の取り込みは、高ＣＯ２条件から低ＣＯ２条件への移行後に、野生型でもＩＬ−２突然変異体でも約５０％増加した。これらのデータは、突然変異体ＩＬ−２ではＨＣＯ３−輸送が損なわれており、ＣＯ２取り込みは損なわれていなかったことを示している。
【００９７】
定常状態光合成時にＭＩＭＳ［７，２２］によって見積もったＨＣＯ３−取り込みのＶｍａｘ（図４ａ）は、高ＣＯ２および低ＣＯ２で生育した野生型の場合、それぞれ２２０および２９０μｍｏｌ  ＨＣＯ３−・ｍｇ−１  Ｃｈｌ・ｈ−１であり、対応するＫ１／２（ＨＣＯ３−）はそれぞれ０．３および０．０４ｍＭ  ＨＣＯ３−だった。これらの推定値は、先に報告された値とよく一致している［７］。これに対して、高ＣＯ２で生育した突然変異体ＩＬ−２では、ＨＣＯ３−輸送系が見かけ上不活性だった。ＨＣＯ３−濃度の関数としてのＨＣＯ３−輸送速度に関する曲線は、予想される可飽和速度論（野生型に見られるもの）とは似ておらず、拡散による過程で予想されるような線形依存性に近かった（図４ｂ）。野生型が示すＶｍａｘに似たＨＣＯ３−取り込みの速度を達成するには、培地中のＨＣＯ３−の濃度を２５ｍＭという高い値にまで上昇させることが不可欠だった。
【００９８】
高ＣＯ２で生育した野生型およびＩＬ−２によるＣＯ２取り込みの推定Ｖｍａｘはどちらも約１３０〜１５０μｍｏｌ  ＣＯ２・ｍｇ−１  Ｃｈｌ・ｈ−１で同等であり、Ｋ１／２（ＣＯ２）値は約５μＭだったことから（図４ａ〜ｂ）、ＩＬ−２における突然変異によってＣＯ２取り込みが受ける影響ははるかに少ないことがわかった。低ＣＯ２に１２時間ばく露した突然変異体細胞は、ＨＣＯ３−取り込みに関して可飽和速度論を示したことから、運搬体の関与が示唆された。しかし、Ｋ１／２（ＨＣＯ３−）は４．５ｍＭ  ＨＣＯ３−（すなわち高ＣＯ２および低ＣＯ２で生育した野生型のそれぞれ１／１５および１／１００）であり、Ｖｍａｘは約２００μｍｏｌ  ＨＣＯ３−・ｍｇ−１  Ｃｈｌ・ｈ−１だった。これらのデータは、突然変異体において高親和性ＨＣＯ３−取り込みが失活した後に活性化されまたは利用される低親和性ＨＣＯ３−輸送体が存在することを示している。低親和性輸送体の活性は、低ＣＯ２にばく露した突然変異体に見られる可飽和輸送速度論をもたらした。これらのデータにより、本突然変異体が低ＣＯ２シグナルに応答できることも証明された。
【００９９】
使用した上記２つの方法で得られるデータが、高ＣＯ２条件下で生育した野生型および突然変異細胞におけるＨＣＯ３−取り込みに関して一致しない理由は、完全にはわかっていない。ＭＩＭＳ法では、ＨＣＯ３−取り込みが正味の光合成とＣＯ２取り込みとの差として評価されるという事実に関係しているのかもしれない［６，７，２２］。したがって、突然変異体が正味の光合成を示さない３ｍＭ未満のＣｉ濃度では、ＨＣＯ３−取り込みをゼロとして計算した（図４ａ〜ｂ）。これに対して、ここで使用した濾過遠心分離技術では、同位体交換により、定常状態に近い一方向ＨＣＯ３−輸送を測定したが、結果のばらつきの一部はこれによって説明することができる。それにもかかわらず、どちらの方法によって得られたデータも、低ＣＯ２にばく露された突然変異細胞におけるＨＣＯ３−取り込みの著しい阻害を、明確に示している。突然変異体が低ＣＯ２に順化する間にＨＣＯ３−取り込みの特徴が変化したのに対して、ＣＯ２輸送は影響を受けなかったというのは興味深いことである（図４ａ〜ｂ）。したがって、ＩＬ−２の高ＣＯ２要求表現型は、低ＣＯ２への非順化ではなく、ＨＣＯ３−輸送体の突然変異によって生じると考えられる。
【０１００】
ＩＬ−２突然変異体のゲノム解析
ＩＬ−２はＨＣＯ３−輸送が損なわれているので、これを使って、高親和性ＨＣＯ３−取り込みに関与する関連ゲノム領域を同定し、クローン化した。図１は、１点交叉組換え事象（星印で示す）による不活性化ベクターの挿入がＩＬ−２突然変異体をもたらしたＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７９４２中のゲノム領域の概略図を表す。配列解析（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ６２６１６、配列番号１）によって、いくつかのオープンリーディングフレーム（図１の説明で特定する）が同定されたが、その一部はＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ＰＣＣ  ６８０３で同定されたものに似ている［２３］。野生型のＤＮＡ配列を、突然変異体ＩＬ−２中の２つの反復領域（１点交叉によるもの）のＤＮＡ配列と比較したところ、後者にいくつかの変異が確認された。これには、ＡｐａＩ側の４ヌクレオチドの欠失、およびＢａｍＨＩ側の６ヌクレオチドの欠失と１ｂｐの付加が含まれていた（図５）。これらの変異の理由はわからないが、これらはゲノムＤＮＡと不活性化ライブラリー中のインサートを持つスーパーコイルプラスミドとの１点交叉組換え中に生じたものである。Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７９４２の突然変異体ＪＲ１２の高ＣＯ２要求表現型も、ベクターの一部およびゲノム領域の一部が１点交叉事象中に欠失し、それが低ＣＯ２下でのプリン生合成の欠損につながったことによってもたらされた［２４］。
【０１０１】
図５に示す変異は、ＩＬ−２におけるＯＲＦ４６７（配列番号１のヌクレオチド２６７０−４０７３、配列番号２）の両コピーの不活性化につながるフレームシフトをもたらした。それぞれ２９１９位および３８９７位（配列番号１）にあるＯＲＦ４６７中のＥｃｏＲＶ部位またはＮｈｅＩ部位へのＫａｎｒカートリッジの挿入（図１に三角印で示す）により、野生型よりはかなり（約５０％）遅いものの低ＣＯ２条件下にカナマイシンの存在下で成長する能力を持つ突然変異体が得られた。これらの突然変異体のサザン解析により、それらが部分二倍体であること、すなわち野生型ゲノム領域と突然変異型ゲノム領域の両方を含むことが、明確に示された。
【０１０２】
図２および図３は、ｉｃｔＢと、遺伝子バンク中に同定されたｉｃｔＢに最も似ている配列ｓｌｒ１５１５との、それぞれ核酸およびアミノ酸アラインメントを示す。これらの核酸配列間の一致ヌクレオチド（図２）は５６％、これらのアミノ酸配列間の一致アミノ酸（図３）は４７％、これらのアミノ酸間の類似アミノ酸（図３）は１６％であって、両者の間の総相同性は６３％になる（図３）ことに注目されたい。膜貫通ドメインなしで解析すると、これらのアミノ酸配列間で一致するアミノ酸は４０％、これらのアミノ酸配列間で類似するアミノ酸は１２％であって、両者の間の総相同性は５２％になる。
【０１０３】
実施例２
ｉｃｔＢ−推定無機炭素輸送体
ＯＲＦ４６７がコードするタンパク質（配列番号３）は１０個の推定膜貫通領域を含み、膜結合型タンパク質である。これは、Ｅ．ｃｏｌｉのＮａ＋／パントテン酸共輸送体（アクセッション番号Ｐ１６２５６）を含むいくつかの酸化還元タンパク質に対してある程度相同である。Ｎａ＋イオンはラン藻におけるＨＣＯ３−取り込みにとって不可欠であり、Ｎａ＋／ＨＣＯ３−共輸送の関与の可能性が議論されている［３，２５，２６］。第４膜貫通ドメインの配列は、最も外側にある２つの位置がＯＲＦ４６７では保存的変化で置換されている点以外はＡＴＰシンターゼのサブユニットＣ中のＤＣＣＤ結合モチーフと類似する領域を含んでいる。多くの輸送タンパク質がＯＲＦ４６７の遺伝子産物に相同であることからも、これがおそらくはＨＣＯ３−取り込みに関与する輸送タンパク質であることが示唆される。ＯＲＦ４６７をここではｉｃｔＢ（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｃａｒｂｏｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ（無機炭素輸送）Ｂの略［２７］）と呼ぶ。
【０１０４】
低ＣＯ２にばく露したＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２の細胞質膜中に蓄積する４２ｋＤａポリペプチドをコードするｃｍｐＡ［２８］と、硝酸塩輸送に関与するｎｒｔＡ［２９］との配列類似性から、ＣｍｐＡはＨＣＯ３−輸送に従事するＡＢＣ型輸送体のペリプラスム部分である可能性が生じた［２１，４２］。しかしｃｍｐＡの不活化は、正常空気ＣＯ２レベルで成長するというＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＰＣＣ７９４２［３０］およびＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ＰＣＣ６８０３［２１］の能力には影響を及ぼさなかったが、空気中２０ｐｐｍのＣＯ２では成長が減少した［２１］ことから、この４２ｋＤａポリペプチドの役割ははっきりしていない。Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７９４２は、ｃｍｐＡによってコードされるもの、ＩｃｔＢ、および低ＣＯ２にばく露された突然変異体ＩＬ−２細胞で発現される、その正体がまだ解明されていないもの、という３種類のＨＣＯ３−運搬体を持っている可能性がある。これらの輸送体により、細胞はさまざまな環境条件下で無機炭素供給を維持することができる。
【０１０５】
実施例３
ｉｃｔＢを発現させるトランスジェニック植物
ｉｃｔＢのコード領域を、強力なプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）の下流およびエンドウ・ルビスコ小サブユニットのトランジットペプチドの下流に、トランジットペプチドとインフレームでクローニングした。この発現カセットをベクター配列に連結して、図６に示すコンストラクトを作製した。
【０１０６】
アグロバクテリウム法を使って、シロイヌナズナ  ｔｈａｌｉａｎａおよびタバコ植物を、上記の発現カセットで形質転換した。野生型およびトランスジェニックシロイヌナズナ植物の実生を発芽させ、湿潤条件下で１０日間栽培した。次に、各鉢が１つの野生型植物と３つのトランスジェニック植物とを含むように、実生を鉢に移した。鉢を２つの生育箱（Ｂｉｎｄｅｒ，ドイツ）に置き、２０〜２１℃、２００マイクロモル光子・ｍ−２・秒−１（９時間：１５時間、明：暗）で生育した。相対湿度は一方の生育箱では３０〜３５％に保ち、他方の生育箱では７０〜７５％に保った。成長実験では、１８日間の生育後に植物を両方の生育箱から収集した。植物を素早く秤量し（生体重）、乾燥重を決定するために乾燥器で一晩乾燥した。
【０１０７】
植物ＲＮＡのノーザン解析により、ｉｃｔＢ  ｍＲＮＡのレベルはトランスジェニック植物毎に変動し、野生型植物では予想どおりｉｃｔＢ  ｍＲＮＡは検出されないことが証明された（図７）。
【０１０８】
ＣＯ２濃度に関する光合成特性の測定により、タバコ（図８）でもシロイヌナズナ（図なし）でも、飽和ＣＯ２レベルでの光合成の速度は、トランスジェニック植物と野生型植物とで同等であることがわかった。これに対して、空気レベルまたはそれより低いレベル（例えば水ストレス下で気孔が閉じた場合に起こるようなレベル）のＣＯ２下では、トランスジェニック植物は野生型よりかなり高い光合成速度を示した（図８）。細胞間ＣＯ２濃度に対する光合成に関する曲線の傾きはトランスジェニック植物の方が急勾配であることに注目されたい。これはトランスジェニック植物の方がルビスコの活性が高いことを示唆している。
【０１０９】
実施例４
ｉｃｔＢトランスジェニック植物の成長速度
ｉｃｔＢ発現が光合成能力に対して正の効果を持つことから、本発明のトランスジェニック植物を、野生型植物と比較した成長速度について、さらに調べた（図９）。当然ながら、水を十分に供給し、高い（約７０％の）相対湿度下に維持した植物の方が、成長は速かった。そのような条件下では、野生型植物とトランスジェニック植物との間に有意差はなかった。
【０１１０】
これに対して、水の供給が制限され湿度が低い（４０％未満）条件下では、トランスジェニック・シロイヌナズナ植物は、野生型よりもかなり早く成長した（図９）。これらのデータにより、特に、気孔閉鎖が細胞間ＣＯ２レベルの低下につながり、よって成長遅延につながりうる乾燥した条件において、植物の生産性を向上させることを目的とするｉｃｔＢの潜在的用途が証明された。
【０１１１】
ｉｃｔＢ発現が成長に対して極めて大きな効果を持つ理由は、葉緑体へのＨＣＯ３−の移行が増大する結果として、トランスジェニック植物ではルビスコが存在する部位でのＣＯ２濃度が上昇するためであると考えられ、これはＣＯ２に関する補償点を低下させ、産生される有機物質のデルタ１３Ｃを低下させると予想される［３１］。表２は、トランスジェニック植物では補償点がわずかに低かったが、その差は統計的に有意ではなかったことを示している。細胞間ＣＯ２濃度に対する光合成に関する曲線の傾き（図８）は、トランスジェニック植物の方が急勾配であった。これは（一般に認められている光合成のモデル［３１〜３３］によれば）ルビスコの活性が野生型よりも高いことを示唆している。トランスジェニック植物および野生型植物におけるルビスコの活性を比較した本発明者らの実験では、前者の方が活性が高いことが示唆された（図なし）。
【表２】
2004531252.tif 000003
【０１１２】
したがって、本発明の教示を応用することにより、例えばトマト、ダイズ、ジャガイモ、キュウリ、ワタ、コムギ、イネ、オオムギなどを含むＣ３植物およびトウモロコシ、サトウキビ、モロコシ（ｓｏｈｒｇｕｍ）などを含むＣ４作物などの植物を形質転換し、それによって、とりわけ制限的ＣＯ２および／または水制限条件下で、より速く成長し、より高い収穫量をもたらす植物を作出することができる。
【０１１３】
実施例５
ｉｃｔＢホモログ
ｉｃｔＢとの機能的類似性を示す２つの追加アミノ酸配列を下記表３に挙げる。ｉｃｔＢと７５〜８０％相同なポリペプチド（表４）をコードしているこれらの配列も、上述した成長または収量の増大を結果として達成するために、植物の形質転換に使用することができる。
【表３】
2004531252.tif 000004
【表４】
2004531252.tif 000005
【０１１４】
産業上の利用可能性
トランスジェニック・シロイヌナズナ植物で得られた結果に基づいて（上記第２節参照）、コムギ、イネ、オオムギ、ジャガイモ、ワタ、ダイズ、レタスおよびトマトを含む最重要作物の一部でｉｃｔＢを発現させると、とりわけ、食用作物の商業栽培が成長条件（例えばアフリカのさまざまな地域を特徴づける乾燥した成長条件など）によって阻害される地域において、成長および商品収量の有意な増加が起こると予想される。
【０１１５】
以上、本発明をその特定態様に関して説明したが、多くの代替、変更および変形態様が当業者にとって明白であることは明らかである。したがって、特許請求の範囲の精神およびその広い範囲に包含されるそれらの代替、変更および変形態様は、全て本発明に包含されるものとする。本明細書で言及した刊行物、特許、特許出願およびアクセッション番号によって特定した配列は全て、個々の刊行物、特許、特許出願またはアクセッション番号によって特定した配列が参照により本明細書に組み込まれることを具体的かつ個別的に表示した場合と同じ程度に、参照により完全な形で本明細書に組み込まれるものとする。また、本願で行う参考文献の引用および特定は、当該参考文献を本発明に対する先行技術として利用できることを自認するものではないと解釈されるものとする。
【０１１６】
2004531252.tif 000006
2004531252.tif 000007
2004531252.tif 000008
2004531252.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】不活性化ライブラリー断片の挿入（星印で示す）が突然変異体ＩＬ−２の生成をもたらしたＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７９４２中のゲノム領域の概略図である。
【図２ａ】ＯＲＦ４６７（ＩＣＴＢ、配列番号２）とｓｌｒ１５１５（ＳＬＲ、配列番号４）との核酸配列アラインメントを示す。垂直線はヌクレオチドの一致を示す。
【図２ｂ】図２ａの続きである。
【図３】ＩｃｔＢタンパク質（ＩＣＴＢ、配列番号３）とｓｌｒ１５１５がコードするタンパク質（ＳＬＲ、配列番号５）とのアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図４ａ】Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２によるＣＯ２およびＨＣＯ３−取り込みの速度を外部Ｃｉ濃度の関数として表したグラフである。
【図４ｂ】変異体ＩＬ−２によるＣＯ２およびＨＣＯ３−取り込みの速度を外部Ｃｉ濃度の関数として表したグラフである。
【図５】Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２および突然変異体ＩＬ−２に見いだされるｉｃｔＢの一領域のＤＮＡ配列相同性比較を表す。
【図６】Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製のバイナリーベクターｐＢＩ１２１内に３５Ｓプロモーター、エンドウ・ルビスコの小サブユニットに由来するトランジットペプチド（ＴＰ）（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ｘ０４３３４のヌクレオチド座標３２９〜４９８。４９８位のＧをＴで置き換えたもの）、ｉｃｔＢコード領域、ＮＯＳ終結配列およびカナマイシン耐性（ＫｎＲ）を含む、本発明のトランスジェニック植物の作出に使用されるｉｃｔＢコンストラクトを示す。
【図７】ｉｃｔＢと１８Ｓ  ｒＤＮＡの両方をプローブとして使用したトランスジェニックおよび野生型（ｗ）シロイヌナズナおよびタバコ植物のノーザンブロット解析である。
【図８】細胞間ＣＯ２濃度による影響を受ける野生型および本発明のトランスジェニックタバコ植物における光合成の速度を表す。
【図９】トランスジェニック（Ａ、ＢおよびＣ）ならびに野生型（ＷＴ）シロイヌナズナ植物で行った成長実験を表す。
【図１】
2004531252.tif 000010
【図２ａ】
2004531252.tif 000011
【図２ｂ】
2004531252.tif 000012
【図３】
2004531252.tif 000013
【図４ａ】
2004531252.tif 000014
【図４ｂ】
2004531252.tif 000015
【図５】
2004531252.tif 000016
【図６】
2004531252.tif 000017
【図７】
2004531252.tif 000018
【図８】
2004531252.tif 000019
【図９】
2004531252.tif 000020
【国際公開パンフレット】
2004531252.tif 000021
2004531252.tif 000022
2004531252.tif 000023
2004531252.tif 000024
2004531252.tif 000025
2004531252.tif 000026
2004531252.tif 000027
2004531252.tif 000028
2004531252.tif 000029
2004531252.tif 000030
2004531252.tif 000031
2004531252.tif 000032
2004531252.tif 000033
2004531252.tif 000034
2004531252.tif 000035
2004531252.tif 000036
2004531252.tif 000037
2004531252.tif 000038
2004531252.tif 000039
2004531252.tif 000040
2004531252.tif 000041
2004531252.tif 000042
2004531252.tif 000043
2004531252.tif 000044
2004531252.tif 000045
2004531252.tif 000046
2004531252.tif 000047
2004531252.tif 000048
2004531252.tif 000049
2004531252.tif 000050
2004531252.tif 000051
2004531252.tif 000052
2004531252.tif 000053
2004531252.tif 000054
2004531252.tif 000055
2004531252.tif 000056
2004531252.tif 000057
2004531252.tif 000058
2004531252.tif 000059
2004531252.tif 000060
2004531252.tif 000061
2004531252.tif 000062
2004531252.tif 000063
2004531252.tif 000064
2004531252.tif 000065
2004531252.tif 000066
2004531252.tif 000067
2004531252.tif 000068
2004531252.tif 000069
2004531252.tif 000070
2004531252.tif 000071
2004531252.tif 000072
2004531252.tif 000073
2004531252.tif 000074
2004531252.tif 000075
2004531252.tif 000076
2004531252.tif 000077
2004531252.tif 000078
2004531252.tif 000079
2004531252.tif 000080
2004531252.tif 000081
2004531252.tif 000082
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004531252.tif 000083
【国際調査報告】
2004531252.tif 000084