(57)【要約】本発明はＤ−マンニトールを製造するための方法並びに生物に関する。マンニトール−２−デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）及びギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ、補因子−再生のため）を発現する生物を用い、その際にＭＤＨの糖−基質及び／又は糖−基質前駆物質が非リン酸化糖−輸送系を経て生物中へ輸送される、Ｄ−マンニトールを製造するための方法及び微生物を提供することにより、改善されたＤ−マンニトール製造が達成されることができる。有利には糖−輸送系はジモモナス＝モビリスからのグルコース促進体（ＧＬＦ）である。
2006503559.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンニトール−２−デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）を発現する生物を使用しながらＤ−マンニトールを製造する方法において、ＭＤＨの糖−基質及び／又は糖−基質前駆物質を、非リン酸化糖−輸送系を経て生物中へ輸送することを特徴とする、ＭＤＨを発現する生物の使用下でのＤ−マンニトールの製造方法。
【請求項２】
糖−輸送系として真核生物からのグルコース促進体（ＧＬＦ）を含有する生物を使用する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
糖−輸送系としてジモモナス＝モビリスからのグルコース促進体（ＧＬＦ）を含有する生物を使用する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
ＧＬＦをコードする配列番号１を有する生物を使用する、請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
糖としてグルコース及び／又はフルクトースを使用する、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ＭＤＨをコードする配列を有する生物を使用する、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
乳酸菌科の微生物から、特にリューコノストック＝プソイドメゼンテロイデスからの、ＭＤＨをコードする配列を有する生物を使用する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ＭＤＨをコードする配列番号２を有する生物を使用する、請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）をコードする配列を有する生物を使用する、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
マイコバクテリウム＝バッカエからのＦＤＨをコードする配列を有する生物を使用する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ＦＤＨをコードする配列番号３を有する生物を使用する、請求項９又は１０記載の方法。
【請求項１２】
生物として微生物を使用する、請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
バシラス属、シュードモナス属、ラクトバシラス属、リューコノストック属、腸内細菌科又はメチロトローフ酵母及び菌類の微生物を使用する、請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
Ｄ−マンニトールを微生物により製造するための、配列番号２による酵素であるＭＤＨ及び配列番号３による酵素であるＦＤＨを発現し、かつＭＤＨの糖−基質及び／又は糖−基質前駆物質を微生物中へ輸送する非リン酸化糖−輸送系を有する、微生物。
【請求項１５】
糖−輸送系が真核生物からのグルコース促進体（ＧＬＦ）である、請求項１４記載の微生物。
【請求項１６】
糖−輸送系がジモモナス＝モビリスからのグルコース促進体（ＧＬＦ）である、請求項１４又は１５記載の微生物。
【請求項１７】
生物がＧＬＦをコードする配列番号１を有する、請求項１６記載の微生物。
【請求項１８】
グルコース、フルクトース又はこれらの混合物をＤ−マンニトールに変換する、請求項１４から１７までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項１９】
乳酸菌科の微生物から、特にリューコノストック＝プソイドメゼンテロイデスからの、ＭＤＨをコードする配列を有する、請求項１４から１８までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項２０】
マイコバクテリウム＝バッカエからのＦＤＨをコードする配列を有する、請求項１４から１９までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項２１】
バシラス属、ラクトバシラス属、リューコノストック属、腸内細菌科又はメチロトローフ酵母及び菌類、並びに食品工業においても使用される全ての微生物に由来する、請求項１４から２０までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項２２】
Ｄ−マンニトールを製造するための、請求項１４から２１までのいずれか１項記載の微生物の使用。
【請求項２３】
請求項１４から２１までのいずれか１項記載の微生物において使用するためのＧＬＦをコードする配列番号１によるヌクレオチド配列。
【請求項２４】
請求項１４から２１までのいずれか１項記載の微生物において使用するためのＭＤＨをコードする配列番号２によるヌクレオチド配列。
【請求項２５】
請求項１４から２１までのいずれか１項記載の微生物において使用するためのＦＤＨをコードする配列番号３によるヌクレオチド配列。
【請求項２６】
請求項２３から２５までのいずれか１項記載の少なくとも１つ又はそれ以上のヌクレオチド配列を有する遺伝子構造。
【請求項２７】
請求項２３から２５までのいずれか１項記載の少なくとも１つ又はそれ以上のヌクレオチド配列又は請求項２６記載の１つ又はそれ以上の遺伝子構造を有するベクター。
【請求項２８】
請求項１４から２１までのいずれか１項記載の微生物を形質転換するための、請求項２３から２５までのいずれか１項記載のヌクレオチド配列の使用。
【請求項２９】
請求項２６記載の少なくとも１つの遺伝子構造を有する、請求項１４から２１までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項３０】
請求項２７記載の少なくとも１つのベクターを有する、請求項１４から２１までのいずれか１項記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｄ−マンニトールを製造するための方法並びに微生物に関する。
【０００２】
糖アルコールであるＤ−マンニトール（Ｄ−マンニット）の世界的な年間需要は、年間３０，０００ｔに達する。Ｄ−マンニトールは、食品分野において歯を痛めない甘味剤として、医学において血漿増量剤及び血管拡張薬（ヘキサニトロ誘導体）として、並びに製薬工業において錠剤の製造のために使用される。
【０００３】
Ｄ−マンニトールの大規模生産は、これまで金属触媒上で出発物質としてのグルコース／フルクトース−混合物の接触水素化を経て行われる。接触水素化の欠けている立体特異性に基づいて、Ｄ−マンニトール収率は３倍の過剰量のＤ−ソルビトールと共に２５〜３０％に過ぎない(Makkee M, Kieboom APG, Van Bekkum H (1985), Production methods of D-mannitol. Starch/Staerke 37:136-140)。
【０００４】
Ｄ−マンニトール及びＤ−ソルビトールは、炭素原子Ｃ−２上のそれらの配置によってのみ異なるので（立体異性体）、望ましくないソルビトールの分離は困難と結びついており、かつ費用がかかる。
【０００５】
代案は、微生物によるバイオトランスフォーメーション法におけるＤ−フルクトースの酵素的水素化によるＤ−マンニトールの製造を提供し、その際に蛍光菌からの組換え型マンニトール−デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）が単離され、かつカンジダ＝ボイジニからのギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）及びＮＡＤＨと共に膜反応器中でインキュベートされる(Slatner, M.他 (1998) Biotransf. 16: 351-363)。ギ酸デヒドロゲナーゼの使用により、反応容器中の膜により引き留められるＮＡＤＨの還元−酸化サイクルが作られる。それにより単にフルクトースの７０〜９０％のみがＤ−マンニトールに変換されることができた。さらに、使用されるマンニトール−デヒドロゲナーゼは乏しい安定性（半減期５０ｈ；ジチオトレイトールでの安定化後：１００ｈ）、＞３０℃の高い温度に対する並びにせん断力に対する感受性を有する。別の大きな欠点は、膜反応器が、単離される酵素、必要とされる補因子及び膜の高い費用に基づいて大工業的生産に適していないことにある。
【０００６】
Ｄ−マンニトール生産の別の可能性は発酵による方法を提供し、その際に約８５％の収率は基質としてＤ−フルクトース／Ｄ−グルコース−混合物及び触媒する生物としてヘテロ発酵性乳酸菌であるリューコノストック＝メゼンテロイデスATCC 12291の使用下に、成長する細胞を用いる発酵において得られた(Soetaert (1991) Synthesis of D-mannitol and L-sorbose by microbial hydrogenation and dehydrogenation of monosaccharides. PhD Thesis, University of Gent))。リューコノストック＝プソイドメゼンテロイデスからのＭＤＨの遺伝子及びそのキャラクタリゼーションは同様に公知である(J. Aarnikunnas他, Applied Microbiology and Biotechnology, 13. Juli 2002)。この際にＤ−マンニトールへのフルクトースの還元に必要な還元当量は、有機酸へのグルコースの酸化に由来する。Ｄ−マンニトールへの基質であるフルクトースの８５％に過ぎない変換の問題に加えてＤ−グルコースの使用は不利である、それというのも、有機酸での目的生成物の汚染は発酵の間に生じ、かつこれらの有機酸は費用のかかるプロセス工程により除去されなければならないからである。成長する細胞を用いる発酵の場合に、生成物への基質の１００％の変換が達成されることができない、それというのも基質の一部が細胞構築のためもしくは生物体量の新規形成のために消費されるからである。そのうえ、リューコノストック＝メゼンテロイデスの発酵は難しく（スライム形成）、かつ複雑な培地に基づいて高価であり、かつ上澄みの後処理は故に同様に費用がかかる。
【０００７】
文献からは、３つの別のマンニトール−２−デヒドロゲナーゼが公知であり、かつそれらの生化学的性質及びヌクレオチド−／アミノ酸配列に関しても記載されている。これには蛍光菌DSM 50106から(Bruenker P, Altenbuchner J, Mattes R (1998) Structure and function of the genes involved in mannitol, arabitol and glucitol utilization from Pseudomonas fluorescens DSM 50106. Gene 206: 117-126.)、ロドバクター＝スフェロイデスSi4から(Schneider KH, Giffhorn F, Kaplan S (1993) Cloning, nucleotide sequence and characterization of the manntiol dehydrogenase gene from Rhodobacter sphaeroides. J. Gen. Microbiology 139: 2475-2484)並びにツクリタケから(Stoop JM, Mooibroeck H (1998) Cloning and characterization of NADP-mannitol dehydrogenase cDNA from the button mushroom Agaricus bisporus、and its expression in response to NaCl stress. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4689 -4696.)のマンニトール−２−デヒドロゲナーゼが属する。最初に挙げた２つは、長鎖デヒドロゲナーゼ／レダクターゼタンパク質ファミリー（ＬＤＲ）のグループに属し、最後に挙げたものは短鎖デヒドロゲナーゼ／レダクターゼタンパク質ファミリー（ＳＤＲ）のグループに属する。
【０００８】
故に本発明の課題は、技術水準の記載された欠点を回避する、Ｄ−マンニトールの改善された製造方法を提供することである。
【０００９】
該課題は、マンニトール−２−デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）を発現する生物を用いるＤ−マンニトールの製造方法により解決され、その際にＭＤＨの糖−基質及び／又は糖−基質前駆物質は非リン酸化糖−輸送系を経て生物中へ輸送されることにより特徴付けられる。
【００１０】
本発明による方法により、ＭＤＨと反応すべき糖が予めのリン酸化なしで直接にＭＤＨによりＤ−マンニトールに変換されることができることが達成される。この直接変換により意外なことに、これまでの技術水準に比較して改善された反応上澄み中でのＤ−マンニトールの収率及び濃度が可能になる。部分的には、本発明による方法を用いて既に基質（グルコース）に対して１００％までの収率が得られる。さらに４０ｇ／Ｌまでの濃度が本発明による方法を用いて達成される。
【００１１】
生物は単細胞並びに多細胞の生物、特に微生物であると理解される。
【００１２】
さらに、該課題はＤ−マンニトールの微生物により製造するための酵素である配列番号２によるＭＤＨ及び配列番号３によるＦＤＨを発現し、かつＭＤＨの糖−基質及び／又は糖基質前駆物質を微生物中へ輸送する非リン酸化糖−輸送系を有する微生物により解決される。
【００１３】
Ｄ−マンニトールという呼称は以下にＤ−マンニットでもあることが理解されるべきである。
【００１４】
本発明の範囲内で、マンニトール−２−デヒドロゲナーゼをコードする全てのヌクレオチド配列は“mdh−遺伝子配列”という呼称にまとめられる。酵素であるマンニトール−２−デヒドロゲナーゼは、以下に“ＭＤＨ”という呼称にまとめられる。
【００１５】
相応して、ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする全てのヌクレオチド配列は、“fdh−遺伝子配列”という呼称にまとめられる。酵素であるギ酸デヒドロゲナーゼは、以下に“ＦＤＨ”という呼称にまとめられる。
【００１６】
また、グルコース促進体(Glukosefacilitator)をコードする全てのヌクレオチド配列は“glf−遺伝子配列”という呼称にまとめられる。タンパク質であるグルコース促進体は、以下に“ＧＬＦ”という呼称にまとめられる。
【００１７】
さらにヌクレオチド配列は、（ｉ）表される配列に正確に相応するか；又は（ｉｉ）表される配列に遺伝暗号の縮重の範囲内で相応する少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むか；又は（ｉｉｉ）ヌクレオチド配列（ｉ）又は（ｉｉ）に対して相補性のヌクレオチド配列でハイブリダイズする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、かつ場合により（ｉｉｉｉ） （ｉ）の機能中性なセンス突然変異を含む全てのヌクレオチド配列であると理解される。その際に、機能中性なセンス突然変異という概念は、化学的に類似のアミノ酸、例えばアラニンによるグリシン又はトレオニンによるセリンの交換を意味する。
【００１８】
本発明によれば、コードする領域（構造遺伝子）に先行する（５′−又は上流の）及び／又はその後の（３′−又は下流の）配列領域も含まれている。特にその中には調節機能を有する配列領域が含まれている。これらは転写、ＲＮＡ−安定性又はＲＮＡプロセシング並びに翻訳に影響を及ぼしうる。調節配列の例はとりわけプロモーター、エンハンサー、オペレーター、ターミネーター又は翻訳エンハンサーである。
【００１９】
それぞれの酵素には、同じか又は匹敵しうる基質−及び作用特異性を有する酵素として理解されるが、これらはしかしながら異なる一次構造を有するイソ形も含まれる。
【００２０】
修飾された形は本発明によれば、配列中、例えばポリペプチドのＮ−及び／又はＣ−末端上にか又は保存されたアミノ酸の領域中での変異が、しかし酵素の機能を妨害することなく存在する酵素であると理解されるべきである。これらの修飾は、公知方法によりアミノ酸交換の形で行われることができる。
【００２１】
有利には糖−輸送系は、好ましくは真核生物、例えば酵母に由来するヌクレオチド配列番号１によるグルコース促進体（ＧＬＦ）である。好ましくはT.Conway他(Journal of Bacteriology, Dec. 1990, p.7227-7240)によりクローニングされたジモモナス＝モビリスからのＧＬＦも使用されることができる。
【００２２】
ドイツ連邦共和国特許出願第198 18 541.3号からは、グルコース−酸化する酵素の高められた活性を有し、かつグルコース又はグルコース−含有基質を酸化によりグルコノラクトン又はグルコネートへ並びにグルコネートのリン酸化により６−ホスホグルコネートへ変換する微生物が使用されることによる、芳香環代謝からの物質の製造方法が確かに公知であり、その際にオキシダーゼ及び／又はホスファターゼの酵素活性の増大に加えてＰＥＰの存在する量の増大のために、ジモモナス＝モビリスからのグルコース促進体（ＧＬＦ）であってよいＰＥＰ−独立性グルコース−輸送タンパク質の活性が高められる。しかしながらマンニトールの製造方法は、これから引き出され得ない。
【００２３】
ＧＬＦはフルクトースに加えてグルコース又はキシロースも輸送することができ、その中で特にグルコースは安価なフルクトース−前駆物質として興味深い。グルコースは、さらに記載されるように、フルクトースに変換されることができる。
【００２４】
乳酸菌科の微生物、特にリューコノストック＝プソイドメゼンテロイデスからのＭＤＨをコードする配列は、これから合成されたＭＤＨの高い活性及び安定性に基づいてＤ−マンニトールへの変換に特に適している。
【００２５】
好ましくは該生物はＭＤＨをコードする配列番号２を発現する。
【００２６】
生物として、特に、バシラス属、シュードモナス属、ラクトバシラス属、リューコノストック属、腸内細菌科又はメチロトローフ酵母及び菌類からの微生物が適している。さらに食品工業において使用される全ての微生物が使用されることもできる。
【００２７】
特に好ましくは、使用される生物はアクロモバクター＝パルボルス(parvolus)、メチロバクテリウム＝オルガノフィルム(Methylobacterium organophilum)、マイコバクテリウム＝フォルミクム(formicum)、シュードモナス スペック101、シュードモナス＝オキサラティカス(oxalaticus)、モラキセラ種、アグロバクテリウム種、パラコッカス種、アンキロバクター＝アクアティカス(Ancylobacter aquaticus)、マイコバクテリウム＝バッカエ、蛍光菌、ロドバクター＝スフェロイデス、ロドバクター＝カプスラータス、ラクトバシラス種、乳酸短杆菌、リューコノストック＝プソイドメゼンテロイデス、グルコノバクター＝オキシダンス、カンジダ＝ボイジニ、カンジダ＝メチリカ(methylica)又はまたハンゼヌラ＝ポリモルファ(polymorpha)、アスペルギルス＝ニドゥランス又はアカパンカビ又は特に大腸菌又は枯草菌の群に由来する。
【００２８】
Ｄ−マンニトール−濃度の分析は、酵素により／測光法によりK. Horikoshiの方法(Horikoshi K. (1963) Meth. Enzym. Analysis, 第3版 6巻 H. U. Bergmeyer, 編集者, Verlag Chemie, Weinheim)に従ってか、又はLindroth他(Lindroth他 (1979) Analytical Chemistry 51: 1167-1174)により記載されたような高圧−液体−クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行われることができる。
【００２９】
酸化−還元サイクルの確立のためにギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）をコードする配列が使用されることができる。好ましくはこれはマイコバクテリウム＝バッカエに由来し、かつ配列番号３によるヌクレオチド配列を有する。これはK. Soda他, Appl. Microbiol. Biotechnol (1995) 44, 479-483からわかるように公知である。
【００３０】
これにより、収率もしくはマンニトールへの基質であるフルクトースの転化率速度のかなりの増大が補因子−再生系の生成により可能になる。その際に、基質がマンニトールへのフルクトースの還元に必要な還元当量を準備するためにもはや消費されるのではなくて、第二の酵素系により準備される。それゆえに、補酵素であるＮＡＤＨはマンニトールへの変換のために高められた範囲で利用可能である。最も頻繁に使用される系の１つは、例えばマイコバクテリウム＝バッカエからの、ギ酸デヒドロゲナーゼでの再生である。好ましくはリューコノストック＝プソイドメゼンテロイデスからの、任意のＭＤＨと一緒のこの酵素の使用により、ギ酸が電子供与体として及びＤ−フルクトースが電子受容体として機能する酸化−還元サイクルが作られる。その際に酵素であるギ酸デヒドロゲナーゼはＣＯ２へのギ酸の酸化を触媒し、かつ酵素であるＭＤＨはＤ−マンニトールへのＤ−フルクトースの還元を触媒する（図１参照）。細胞内ニコチン酸アミド−アデニン−ジヌクレオチド（ＮＡＤ）−プールは、双方の酵素間の電子−シャトルとして利用される。ＣＯ２へのギ酸の酸化は熱力学的に好都合である、それというのもＣＯ２の自由標準生成エネルギーΔＧ０’は明らかに負であり、かつＣＯ２はガスの逃げ出しにより反応平衡から取り除かれるからである。とりわけギ酸酸化から生じる、高められた細胞内ＮＡＤＨ−濃度は、ＭＤＨにより触媒されるＤ−マンニトールへのＤ−フルクトースの還元についての還元力を上昇させる。
【００３１】
本方法の別の有利な態様において、既に挙げられた炭素源に加えて、製造のための基質としてＤ−グルコースが使用される。Ｄ−グルコースは、酵素であるＤ−グルコース／キシロース−イソメラーゼ(EC 5.3.1.5)でのＤ−フルクトースへの変換により変換されることができる（２）。変換は生物の内部並びに外部で可能である。Ｄ−マンニトールの生産方法における基質としてのＤ−グルコースの使用は、本方法の経済性の明らかな改善をもたらす。
【００３２】
記載された方法のためは、ギ酸デヒドロゲナーゼ及びＭＤＨが導入される及び／又は強化される微生物だけでなく、既にギ酸デヒドロゲナーゼ又は場合によりＭＤＨを有する微生物、例えばアクロモバクター＝パルボルス、メチロバクテリウム＝オルガノフィルム、マイコバクテリウム＝フォルミクム、シュードモナス スペック101、シュードモナス＝オキサラティカス、モラキセラ種、アグロバクテリウム種、パラコッカス種、アンキロバクター＝アクアティカスも適している。これらには、微生物、例えば蛍光菌、ロドバクター＝スフェロイデス、ロドバクター＝カプスラータス、ラクトバシラス種、乳酸短杆菌、グルコノバクター＝オキシダンス並びに好ましくはまたリューコノストック＝プソイドメゼンテロイデス又は既に双方の酵素を有し、かつその都度それらの活性について強化される微生物が属している。さらに適しているのは、例えばメチロトローフ酵母、例えばカンジダ＝ボイジニ、カンジダ＝メチリカ又はまたハンゼヌラ＝ポリモルファ、菌類、例えばアスペルギルス＝ニドゥランス及びアカパンカビ並びに食品工業においても使用される全ての微生物でもある。
【００３３】
本発明による方法及び微生物を用いて、目下、生成物であるＤ−マンニトールへの基質の改善された変換を達成することが可能である。これまで公知の方法に比較して高められた生産性、並びに高められたＤ−マンニトール収率（１００％まで）が達成される。既に４０ｇ／Ｌまでの濃度が達成された。本方法は故にＤ−マンニトールの大工業的に収益を生む製造に特に適している。ギ酸デヒドロゲナーゼを用いる再生系の生成を経て、ＮＡＤＨを消費するＭＤＨについて高められた範囲で休止細胞での代謝に制限された副生物の不利な形成なしに生成物であるＤ−マンニトールへの基質の高められた変換が可能になりうる。
【００３４】
本発明には、前記の微生物の１つにおいて使用するためのＧＬＦ、ＭＤＨ及びＦＤＨをコードする配列番号１、２及び３によるヌクレオチド配列の使用も含まれる。
【００３５】
同じように本発明は少なくとも１つ又は複数の前記のヌクレオチド配列を有する遺伝子構造を含む。
【００３６】
少なくとも１つ又は複数の前記のヌクレオチド配列又は１つ又はそれ以上の前記の遺伝子構造を有するベクターは同様に本発明に含まれている。
【００３７】
本発明は、記載された微生物における前記のヌクレオチド配列、遺伝子構造及びベクターもしくはこれらのヌクレオチド配列、遺伝子構造及びベクターを有する微生物の使用も含む。
【００３８】
図面は、本発明による方法の結果並びに本方法について役割を果たす最も重要な代謝経路の略示的な図解を例示的に示す。
【００３９】
配列番号１はジモモナス＝モビリスからのＧＬＦをコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号２はリューコノストック＝プソイドメゼンテロイデスからのＭＤＨをコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号３はマイコバクテリウム＝バッカエN10からのＦＤＨをコードするヌクレオチド配列を示す。
【００４０】
以下に本発明は例示的に記載される。
【実施例】
【００４１】
Ｉ）リューコノストック＝プソイドメゼンテロイデスATCC 12291からのマンニトール−２−デヒドロゲナーゼ：酵素の精製及びキャラクタリゼーション；大腸菌中のmdh−遺伝子のクローニング及び機能発現
ａ）細菌株及びプラスミド
ＭＤＨを単離するためのソースとしてリューコノストック＝プソイドメゼンテロイデス ATCC 12291を使用した。大腸菌ＪＭ １０９（ＤＥ ３）(Promega)を、リューコノストック＝プソイドメゼンテロイデスATCC 12291からのゲノムＤＮＡを単離するための部分プラスミドバンクの生産のための宿主生物として利用した。プラスミドバンクの一部を、リューコノストック＝プソイドメゼンテロイデスATCC 12291からのゲノムＤＮＡの4.0−4.5kb Eco RIフラグメントのライゲーションによりpUC18中で生産した。
【００４２】
ｂ）培養条件
リューコノストック＝プソイドメゼンテロイデス ATCC 12291を培養するために、次の培地を使用した：
Trypton １０ｇ／ｌ、酵母抽出物１０ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ １０ｇ／ｌ、Ｄ−フルクトース２０ｇ／ｌ、Ｄ−グルコース１０ｇ／ｌ、ビタミン／ミネラル−溶液１０ｍｌ／ｌ、蒸留水中；オルト−リン酸を使用してｐＨ−値を７．５に調節。
【００４３】
ゲノムリューコノストックＤＮＡのプラスミドバンクのサブクローニング及び調製のために、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ ３）を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）又はカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）を添加してLuria-Bertani培地中で１７０rpmで３７℃で培養した。
【００４４】
ｃ）リューコノストック＝プソイドメゼンテロイデスATCC 12291からのＭＤＨの活性の決定
本発明において酵素活性を、還元反応
Ｄ−フルクトース  ＋  ＮＡＤＨ  ＋  Ｈ＋  →  Ｄ−マンニトール  ＋  ＮＡＤ＋
についてのＮＡＤＨ−濃度の減少を介して測光法により決定する。ＭＤＨの活性を測定するためのバッチはｐＨ ６．５で１００ｍＭリン酸カリウム−緩衝液中のＮＡＤＨ ２００μＭ及びＤ−フルクトース２００ｍＭを含有していた。粗抽出物及び部分的に精製された酵素単離物の比活性はタンパク質１ｍｇ当たりの単位（Ｕ／ｍｇ）として与えられ、その際に１Ｕは１分当たりの１μmol基質減少として定義される。
【００４５】
ｄ）タンパク質濃度の決定
全てのタンパク質濃度決定をBradfordの方法に従って実施した。
【００４６】
ｅ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いるタンパク質の分離
粗抽出物及び部分的に精製された酵素単離物の純度分析を、並びにウェスタンブロット上で準備的に調製を、不連続な１２％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中でLaemmliの方法に従って電気泳動により実施した。
【００４７】
ｆ）リューコノストック＝プソイドメゼンテロイデスATCC 12291からのマンニトール−２−デヒドロゲナーゼの単離
マンニトール−２−デヒドロゲナーゼを単離するために、細胞崩壊後に次の処理工程を実施した：硫酸アンモニウム−沈殿、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アニオン交換体クロマトグラフィーＩ、アニオン交換体クロマトグラフィーＩＩ、サイズ排除クロマトグラフィー、並びに等電点クロマトグラフィー ｐＨ ５〜４。
【００４８】
ＭＤＨの比活性はｐＨ＝５．３５でＤ−マンニトールへのＤ−フルクトースの還元について４５０Ｕ／ｍｇであった。
【００４９】
ｇ）分子遺伝学的方法
リューコノストック＝プソイドメゼンテロイデスATCC 12291からのゲノムＤＮＡの単離、アガロースゲルからのＤＮＡ−フラグメントの単離、ジゴキシゲニン修飾ｄＵＴＰでのＤＮＡ−プローブの標識付け及び免疫学的検出及びＤＮＡ−ＤＮＡ−ハイブリダイゼーション（サザンブロット）を実施した。
【００５０】
エドマン分解及び引き続いてＨＰＬＣ−分析を用いる４３ｋＤａ−酵素サブユニットのアミノ末端配列分析法により、八量体の(oktamere)アミノ酸配列ＭＥＡＬＶＬＴＧがもたらされた。リューコノストック＝プソイドメゼンテロイデスについてのコドン使用頻度−統計学を使用して２０４８倍に縮重されたオリゴヌクレオチド−プローブを、リューコノストック＝プソイドメゼンテロイデスATCC 12291のゲノムＤＮＡのマンニトール−２−デヒドロゲナーゼ−遺伝子検出のために誘導した（図２参照）。２４ｂｐ−ＤＮＡ−プローブに、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ−尾部を３'−末端上に設け、L.プソイドメゼンテロイデスATCC 12291のゲノムＤＮＡの部分プラスミドバンクのイムノスクリーニングに利用した。この経路で4.2kb−ＤＮＡ−フラグメントを単離した（図３）。適しているプライマーを用いてmdh−遺伝子をこのフラグメントから増幅し、ベクターｐＥＴ２４ａ（＋）中へライゲーションし、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中で形質転換及び発現させた。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２４ａ（＋）Ｌmdhの細胞抽出物は誘導後にＳＤＳ−ポリアクリル電気泳動において４３ｋＤａでの強力な過剰発現バンド及びタンパク質７０Ｕ／ｍｇのマンニトール−２−デヒドロゲナーゼの比活性を示したの対して、対照（プラスミドなしの細胞、空のプラスミドを有する細胞）は活性を示さなかった。
【００５１】
L.プソイドメゼンテロイデスATCC 12291からのmdh−遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号２に示されている。
【００５２】
ＩＩ）組換え大腸菌−株を用いるＤ−マンニトールへのＤ−フルクトースのバイオトランスフォーメーション
組換え大腸菌−株中で、酵素であるギ酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.2.1.2)及びマンニトール−２−デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.67)を、細胞中で酸化−還元サイクルを確立するために過剰発現させた。この酸化−還元サイクルにおいて、水素を、ギ酸から細胞内ＮＡＤ＋を経てＤ−フルクトースに伝達し、その際にＤ−フルクトースはＤ−マンニトールへ還元される（図１参照）。付加的に基質であるフルクトースの使用可能性を改善するために、細胞中でグルコース促進体を発現させた。
【００５３】
（ａ）株及びベクター
株：大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Star(Invitrogen)を使用した。ベクターとして、マイコバクテリウム＝バッカエからのギ酸デヒドロゲナーゼ、リューコノストック＝プソイドメゼンテロイデスからのマンニトール−２−デヒドロゲナーゼのＯＲＦをコードするｐＥＴ−２４ａ（＋）fdh/mdh及びジモモナス＝モビリスからのグルコース促進体をコードするｐＺＹ５０７glfを使用した。
【００５４】
バイオトランスフォーメーションのためには、化学的にコンピテントな大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）StarをｐＥＴ−２４ａ（＋）fdh/mdh及びｐＺＹ５０７glfで同時形質転換し、クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌ及びカナマイシン３０μｇ／ｍｌを有するＬＢ−寒天平板上で淘汰した。対照として大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ ３）StarをｐＥＴ−２４ａ（＋）fdh/mdh又はｐＺＹ５０７glfのいずれかで単独で形質転換した。形質転換体の淘汰は、クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌ（ｐＺＹ５０７glf）又はカナマイシン５０μｇ／ｍｌ（ｐＥＴ−２４ａ（＋）fdh/mdh）のいずれかを有するＬＢ−寒天平板上で行った。ｐ ｐＥＴ−２４ａ（＋）fdh/mdhで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ ３）StarについてのＬＢ−寒天平板は付加的に、マンニトール−２−デヒドロゲナーゼ及びギ酸デヒドロゲナーゼの基本発現(Basalexpression)を減少させるための１％（ｖ／ｖ）Ｄ−グルコースを含有していた。
【００５５】
（ｂ）バイオトランスフォーメーション
大腸菌中のＦＤＨ、ＭＤＨ及びＧＬＦの過剰発現後に、成長しない細胞をバイオトランスフォーメーションにおいて使用する。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ ３）Star ｐＥＴ−２４ａ（＋）fdh/mdh／ｐＺＹ５０７glfの誘導された細胞各１．０ｇを、ｐＨ ７．０の１００ｍＭリン酸カリウム−緩衝液で洗浄し、ｐＨ ６．７の１００ｍＭリン酸カリウム−緩衝液中のＤ−フルクトース５００ｍＭ及びギ酸ナトリウム５００ｍＭを有する反応溶液５０ｍｌ中に再懸濁させた。バッチを、じゃま板のない１００ｍｌ−フラスコ中で１００〜１２０rpm及び３０℃で２４ｈ振とうした。反応開始後０、１、２、３、４、５、６、８、１７及び２３ｈの時点に、ギ酸、Ｄ−フルクトース及びＤ−マンニトールの濃度の測定のために上澄みの１〜２ｍｌ−試料を採取した。試料を５０００ｇで１min遠心分離し、上澄みを０．２μｍ−ろ過し、ＨＰＬＣによる測定まで−２０℃で貯蔵した。対照として、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ ３）Star ｐＥＴ−２４ａ（＋）fdh/mdh／ｐＺＹ５０７glfの誘導されなかった細胞１．０ｇを、同じようにしてバイオトランスフォーメーションにおいて使用した。
【００５６】
反応上澄み中及び細胞不含の粗抽出物中のギ酸、Ｄ−フルクトース及びＤ−マンニトールの濃度決定を、ＨＰＬＣ−装置(Merck/Hitachi)を用いて実施した。
【００５７】
第１表は、形質転換された微生物を用いて達成されることができた結果を例示的に示す。
【００５８】
大腸菌中のギ酸デヒドロゲナーゼ及びマンニトール−２−デヒドロゲナーゼ及びグルコース促進体の並行した過剰発現が、Ｄ−フルクトース及びギ酸を有する反応媒体中でのこれらの細胞によるＤ−マンニトールの極めて高い産生をもたらすことを示すことができた。２３ｈ後に２４４ｍＭまでのマンニトールは、１７ｈ後に１５ｍＭを有するに過ぎないＧＬＦなしの方法及び１７ｈ後に２０ｍＭを有するＦＤＨなしの方法と相対している。すなわち約１２〜１５倍の改善が達成されることができた。
【００５９】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】細胞中のギ酸デヒドロゲナーゼ及びＭＤＨでの酸化還元サイクルの略示図。
【図２】リューコノストック＝プソイドメゼンテロイデス ATCC 12291のＭＤＨサブユニットのＮ末端のアミノ酸配列からの、縮重された２４塩基−オリゴヌクレオチド−プローブの誘導を示す図。
【図３】mdh−遺伝子のイムノスクリーニング後のリューコノストック＝プソイドメゼンテロイデスATCC 12291のゲノムＤＮＡ−プラスミドバンクから単離された4,191 bp Eco Rlフラグメントを示す遺伝子地図。矢印は、mdh ＯＲＦ並びに４個のＯＲＦの翻訳の方向を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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