(57)【要約】本発明は、ヒト染色体１２に位置付けられる、ＰＴＸ１をコードする新規な核酸分子を提供する。ＰＴＸ１をコードする核酸分子、それによってコードされるタンパク質およびそれに対する抗体は、癌の診断、予知および治療を容易にするために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の配列を含む、ＰＴＸ１をコードする核酸分子。
【請求項２】
ｃＤＮＡである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
ＲＮＡである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
ゲノムＤＮＡに存在するエキソンをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
二本鎖ＤＮＡである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項６】
以下の群から選択される配列を含む、ＰＴＸ１をコードする単離核酸分子：
ａ）配列番号１；
ｂ）配列番号１に特異的にハイブリダイズする配列；
ｃ）配列番号２のポリペプチドをコードする配列；
ｄ）配列番号１の相補鎖；および、
ｄ）ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）からなる群から選択される配列の自然対立遺伝子変異体。
【請求項７】
１０から５０の間のヌクレオチドを有し、請求項６に記載の核酸分子に特異的に結合する、アンチセンス分子をコードする核酸分子。
【請求項８】
請求項６に記載の核酸分子を含む、組換え発現ベクター。
【請求項９】
前記ベクターが、プラスミド、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびレトロウイルスからなる群から選択される、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】
前記宿主細胞が、細菌、菌類細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞からなる群から選択される、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１に記載の核酸分子の発現産物である、単離ポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１４】
ポリペプチドの生産および精製方法であって、以下の工程、
ａ）前記ポリペプチドが生産される条件下で請求項１０に記載の宿主細胞を培養する工程；
ｂ）前記ポリペプチドを前記宿主細胞培養物から回収する工程、
を含む方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載のポリペプチドに対して免疫学的に特異的な抗体。
【請求項１６】
請求項１２に記載のポリペプチドに結合する試験化合物を同定する方法であって、以下の工程：
ａ）配列番号１の核酸分子の発現により生産された精製ポリペプチドを提供する工程；
ｂ）前記ペプチドを、前記ペプチドに対して結合アフィニティーを有すると推測される試験化合物と、反応混合物中で接触させる工程；および、
ｃ）前記試験化合物と前記ペプチドとの間の複合体形成について前記混合物をアッセイする工程、
を含む方法。
【請求項１７】
前記ペプチドが生物活性を有し、前記試験化合物がそのアゴニスト活性について評価される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペプチドが生物活性を有し、前記試験化合物がそのアンタゴニスト活性について評価される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
患者試料中の核酸配列における突然変異を同定する方法であって、以下の工程：
ａ）前記患者から核酸試料を単離する工程；
ｂ）前記核酸試料と配列番号１の核酸配列とを、十分な相補性を有する配列間でＤＮＡ二本鎖を形成するような低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程；
ｃ）存在すれば前記ＤＮＡ二本鎖を単離する工程、および、
ｄ）ミスマッチ塩基対（ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ）について前記二本鎖を評価する工程、
を含む方法。
【請求項２０】
前記ミスマッチ塩基対が、前記患者試料からの前記核酸における欠失の存在によるものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ミスマッチ塩基対が、前記患者試料からの前記核酸における挿入の存在によるものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ミスマッチ塩基対が、ポイントミューテーションの存在によるものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
配列番号１の相補配列に特異的にハイブリダイズすることができる、配列番号１の核酸配列由来の核酸プローブを用いて、試験試料中の標的核酸分子を同定する方法であって、プローブと試験試料とをハイブリダイズする条件下で接触させる工程、およびハイブリダイゼーションが起こったか否かを観察する工程、を含む方法。
【請求項２４】
前記プローブが、ＰＴＸ１をコードする核酸またはその突然変異遺伝子を同定するために用いられる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＰＴＸ１活性を調節する薬剤を同定する方法であって、以下の工程：
ａ）ＰＴＸ１を発現する細胞と、ＰＴＸ１活性を調節することができると推測される薬剤とを、細胞成長を支持することができる培地で接触させる工程；
ｂ）前記ＰＴＸ１を発現する細胞の増殖を、前記薬剤の存在下と非存在下の両方で測定する工程；および、
ｃ）前記薬剤の存在下におけるＰＴＸ１を発現する細胞の増殖と、前記薬剤の非存在下におけるＰＴＸ１を発現する細胞の成長とを比較して、細胞増殖における上昇または減少が、前記薬剤がＰＴＸ１活性を調節することができることを示すものであるという工程を含む方法。
【請求項２６】
癌の感受性に関連するＰＴＸ１遺伝子の発現を検出するためのキットであって、少なくとも１つの、発現したＰＴＸ１核酸に特異的に結合することができる核酸プローブを含むキット。
【請求項２７】
癌の感受性に関連するＰＴＸ１遺伝子の発現を検出するためのキットであって、少なくとも１つの、発現したＰＴＸ１核酸によってコードされるポリペプチドに特異的に結合することができる抗体を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、引用により本出願にその全体の開示内容が含有される、２０００年８月２２日出願の米国仮出願６０／２２６，９９３号に対し、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、前立腺癌の診断および治療に関し、より具体的には、前立腺癌の診断および治療のために有用な、新規な核酸分子、タンパク質そして免疫学的にそれに特異的な抗体に関する。
【０００３】
発明の背景
本出願において、本発明の属する技術分野の状況をより完全に記載するために、著者名および刊行年をかっこで示していくつかの刊行物を引用する。これらの刊行物の開示内容は、引用により本出願に含有される。
【０００４】
癌の分子的基礎は、過去数年間にわたり大きな研究努力が向けられてきたテーマである。この努力により、異常な細胞増殖は癌遺伝子の活性化のみならず、正常な細胞分裂の維持において重要であると思われる機能を有する特定の遺伝子の破壊によっても起こるということが見出された。周知の例として、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子における突然変異がヒトの癌において共通にみられ、種々の組織起源の腫瘍タイプにおいて検出されている。
【０００５】
本年、米国においておよそ２０万人の男性が前立腺癌であると診断され、その結果３万８千人の命が失われると予測される。そのように多数であるため、前立腺癌は米国の男性においてもっとも頻繁に悪性腫瘍であると診断され（皮膚のものを除く）、そのグループにおける癌関連死の第２の主要な原因であるといえる。医者は通常前立腺における塊を発見することにより癌を検出するが、それは精子の生存力を維持させるためにクルミ型の構造を有する。そのような塊は、ありきたりの検査、あるいは突然の排尿不快感または時折の性的不能を訴える患者によって促される検査において発見され得る。
【０００６】
前立腺癌が、良性の前立腺過形成とよばれる疾患の治療の過程で検出される例もある。この病気、すなわち加齢による前立腺の肥大は、４５歳以上の全ての男性の半分以上を冒すものであり、（たとえより漸進的であるとしても）前立腺腫瘍によって起こるものと同じ泌尿器障害を引き起こすものである。症状が非常に苦痛なものとなると、前立腺の一部を削り取る方法である、尿道を横切る前立腺の切除が行われることもある。切除が行われる場合は常に摘出した組織を悪性腫瘍の証拠確認のために顕微鏡での分析にかけるが、時折悪性腫瘍が発見されることがある。
【０００７】
前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）についての簡単な血液検査が、前立腺癌を検出するための第３の手段である。ＰＳＡレベルの上昇は、前立腺異常の症状を示さない人における癌の存在の前兆となり得る。
【０００８】
前立腺癌は非常に不均一性を示す疾患である。前立腺の発癌に関連するとして多くの遺伝子が同定されているにもかかわらず（Ｌａｒａ ｅｔ ａｌ．， １９９９； Ｓｃｉａｖｏｌｉｎｏ ａｎｄ Ａｂａｔｅ−Ｓｈｅｎ， １９９８）、前立腺癌の発達の基礎となるメカニズムはいまだによく理解されていない。しかしそれは、細胞の増殖、分化およびプログラムされた細胞死を調節する遺伝子の遺伝的変化を含む複数工程のプロセスであると考えられている。これらの腫瘍抑制遺伝子の欠失または減少が、しばしば癌の発達を導くのである。
【０００９】
発明の概要
前立腺癌の発達を基礎づける生物学的プロセスをさらに理解するため、本発明者らは正常な前立腺組織に発現しているが悪性前立腺組織には発現していない腫瘍抑制遺伝子を同定した。したがって、本発明により、細胞分化および腫瘍形成の調節に関わる構成成分の同定、検出および／または分子キャラクタリゼーションに有用な新規な生物学的分子が提供される。
【００１０】
本発明の好適な態様において、ヒトＰＴＸ１タンパク質をコードする単離核酸分子が提供される。特に好適な態様において、ヒトＰＴＸ１タンパク質は配列番号２の配列を含むアミノ酸配列を有する。本発明のＰＴＸ１核酸分子の例は、配列番号１の配列を含む。
【００１１】
本発明の別の態様によると、（１）配列番号１、（２）配列番号１の相補鎖のあらかじめ選択された一部または全部と特異的にハイブリダイズする配列、（３）配列番号１のあらかじめ選択された部分を含む配列、（４）配列番号１の相補鎖、および（５）配列番号２の配列を含むポリペプチドの一部または全部をコードする配列、からなる群から選択される配列を有する単離核酸分子が提供される。そのような部分配列は本発明のＰＴＸ１遺伝子の相同体を同定および単離するためのプローブとして有用である。したがって、配列番号１の核酸の自然対立遺伝子変異体をコードする単離核酸配列も本発明の枠内であると考えられる。自然対立遺伝子変異体という語は後で定義する。
【００１２】
本発明のＰＴＸ１をコードする核酸を含む宿主細胞もまた本発明の枠内に含まれる。そのような宿主細胞は、細菌細胞、菌類細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞およびその他の動物細胞を含むが、それらに限定されるものではない。ＰＴＸ１をコードする核酸は、宿主細胞への導入のために簡単にプラスミドまたはレトロウイルスベクターにクローニングすることができる。そのような細胞はＰＴＸ１発現を調節する化合物を同定するためのスクリーニング方法において有用である。そのように同定された化合物は、前立腺癌の治療において治療的価値を有する可能性がある。
【００１３】
本発明の別の態様によると、単離ヒトＰＴＸ１タンパク質が提供される。このＰＴＸ１タンパク質の発現の減少は、前立腺癌の成長の調節解除に関係している。
【００１４】
本発明の好適な態様において、タンパク質はヒト起源のものであり、配列番号２のアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、タンパク質は配列番号１の自然対立遺伝子変異体によってコードされてもよい。あるアミノ酸変異が自然対立遺伝子変異体によってコードされるヒトＰＴＸ１タンパク質に存在している限りは、そのようなタンパク質は本発明の枠内である。上記のヒトＰＴＸ１タンパク質に免疫学的に特異的な抗体も提供される。
【００１５】
本発明のさらに別の態様において、前立腺癌の危険がある、あるいは現在前立腺癌を患っている患者の遺伝子スクリーニングおよび診断評価の方法が提供される。本発明の核酸のハイブリダイゼーション特異性は、前立腺癌に共通の表現型の特徴を示す患者の差異評価のために有用である可能性がある。本発明の好適な態様において、患者試料中の核酸配列における突然変異を同定するための方法が提供される。この方法は、患者から核酸試料を単離する工程、該核酸試料を配列番号１の核酸配列と十分な相補性のある配列間でＤＮＡ二本鎖を形成させるような低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程、ＤＮＡ二本鎖を単離する工程、および該二本鎖をミスマッチ塩基対（ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ）について評価する工程を含む。
【００１６】
別の態様において、本発明の核酸分子は、ＰＴＸ１またはその突然変異のための、診断ハイブリダイゼーションプローブまたは診断ＰＣＲ分析のプライマーとして使用することができる。アンチセンス分子も本発明により提供され、ＰＴＸ１発現の調節において有用でありうる。本発明に含まれるその他の方法には、ＰＴＸ１タンパク質の存在について生物試料を評価するための免疫検出方法がある。
【００１７】
本発明のその他の態様によると、ＰＴＸ１活性を調節する薬剤を同定するための方法が提供される。この方法は、ＰＴＸ１を発現する細胞を、ＰＴＸ１活性を調節することができると推測される薬剤と接触させる工程、該薬剤の存在下および非存在下の両方で、ＰＴＸ１を発現する細胞の増殖を測定する工程、および該薬剤の存在下と該薬剤の非存在下での、ＰＴＸ１を発現する細胞の増殖を比較する工程を含む。該薬剤の存在下での細胞増殖における変化は、その薬剤がＰＴＸ１活性を調節する能力を指し示すものである。
【００１８】
本発明のさらに別の態様において、癌の感受性に関連するＰＴＸ１発現を検出するためのキットが提供される。そのようなキットはヒト前立腺癌の診断に有用であり得る。
【００１９】
図面の簡単な説明
図１は、４つの選択されたクローンについてのＲＴ−ＰＣＲによるディファレンシャル発現を示すゲルである。ファーストストランドｃＤＮＡを正常前立腺（Ｎ）および前立腺腫瘍（Ｔ）から単離したトータルＲＮＡ１０μｇから合成した。ｃＤＮＡの２μｌのアリコットを各クローンに特異的なプライマーを用いて増幅した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで分析した。分子サイズマーカー（Ｍ）はＢｓｔＮＩで消化したｐＢＲ３２２ＤＮＡである。クローン１４９と３４８は、正常前立腺（Ｎ）においてバンドが存在するが前立腺腫瘍（Ｔ）においては存在しないことによって示されるように、正常前立腺においてのみ発現していた。クローン３４１と３９４は正常前立腺と前立腺腫瘍の両方で発現していた。クローン３４８をさらなるキャラクタリゼーションのために選び、本明細書においてＰＴＸ１と称する。
【００２０】
図２は、全長ＰＴＸ１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。オーバーラップするｃＤＮＡを組み合わせたヌクレオチド配列とそのＰＴＸ１タンパク質への翻訳を５’から３’方向において示す。ヌクレオチド配列とアミノ酸配列（配列番号２）の番号付けは、右側に示す。ＡＡＴＡＡＡ配列に下線を引いてある。
【００２１】
図３は、ＰＴＸ１遺伝子がヒト染色体１２に位置づけられるということを示すゲルである。２４の体細胞雑種のパネルのＤＮＡサンプルと３つのゲノムＤＮＡコントロールを、「方法」において記載したＰＴＸ１−特異的プライマーを用いて増幅させた。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで分析した。レーン１，２，３，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２１，２２のＤＮＡサンプルは、その番号に対応する単一のヒト染色体を含む。レーン４のサンプルは２つのヒト染色体、４および７を含む。レーン２０のサンプルは３つの染色体、２０、８および４を含む。レーン２３，２４，２５，２６および２７のサンプルは、染色体Ｘ、染色体Ｙ、ヒトＤＮＡ、ハムスターＤＮＡおよびマウスＤＮＡをそれぞれ含む。分子サイズマーカー（Ｍ）はＨｉｎｄＩＩＩで消化したラムダＤＮＡである。ヒト染色体１２およびヒトＤＮＡを含むサンプルのみにおいて２ｋｂのバンドが生じ（レーン１２および２５）、これによりＰＴＸ１遺伝子はヒト染色体１２に位置付けられることが示される。全てのレーン（レーン２５を除く）に存在する小さいサイズのバンドは、げっ歯類ＰＴＸ１遺伝子に関連するものであろう。
【００２２】
図４は、組換えＰＴＸ１タンパク質の、Ｔａｌｏｎ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎカラムでの精製を示すゲルである。組換えタンパク質を細菌宿主から抽出し、実施例１に記載のようにＴａｌｏｎ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎカラムで精製した。レーン１は全タンパク質を含むものであり；レーン２は組換えＰＴＸ１タンパク質の第一の溶出を含むものであり；レーン３はＰＴＸ１タンパク質の第二の溶出を含むものであり；そしてレーン４は分子量マーカーを含むものである。
【００２３】
図５は、正常前立腺および前立腺腫瘍におけるＰＴＸ１タンパク質の免疫局在性を示す顕微鏡写真である。切片を組換えヒトＰＴＸ１に対するウサギ抗血清を用いてＰＴＸ１の存在について染色した。赤色部分は陽性の免疫反応性産物を示す。正常腺上皮の細胞質と核の両方が強い染色を示したが、腫瘍領域は染色を示さなかった。
【００２４】
図６は、ＰＴＸ１およびＣＤＡ１４のｃＤＮＡ（それぞれ配列番号１および４）のヌクレオチド配列比較を示す。アラインメントはＰＴＸ１のヌクレオチド配列（上段、本研究）とＣＤＡ１４の公表配列（下段、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０００）とに基づくものである。アラインメントを至適化するために必要な箇所にはギャップを導入した。垂直の線は同一のヌクレオチドを示す。コード配列において単一塩基差が５つあることに注目されたい。
【００２５】
図７は、ＰＴＸ１とＣＤＡ１４タンパク質との推定アミノ酸配列のアラインメントを示す。ＰＴＸ１のアミノ酸配列（上段；配列番号２）とＣＤＡ１４（下段；配列番号５）がアラインされ、相同性を最大化するために必要な箇所にはギャップが導入された。垂直の線は同一の残基を示す。３つの単一塩基挿入により読み枠の変化が起こっていることに注目されたい。
【００２６】
図８は、様々な発現コンストラクトで形質移入されたＰＣ−３前立腺腫瘍細胞の、インヴィトロの成長曲線のグラフを示す。ＰＴＸ１アンチセンスＲＮＡを発現する細胞の増殖を四角で示す；ルシフェラーゼＲＮＡを発現する細胞の成長を丸で示す；そしてＰＴＸ１ＲＮＡを発現する細胞の成長を三角で示す。結果は３つの別々の実験の平均である。
【００２７】
図９は、受託番号ＡＣ００９３１８（Ｍｕｚｎｙ ｅｔ ａｌ．， ２０００）で寄託されたゲノム配列から決定したヒトＰＴＸ１遺伝子のエキソン−イントロンジャンクションを示す。ここに示すエキソン−イントロンジャンクションの配列は、公表されたゲノム配列（配列番号６−３１）に対して相補的である。エキソン配列は大文字で示し、イントロン配列は小文字で示す。エキソン配列の上に示す数字は、ゲノム配列上のエキソンの境界を示す。
【００２８】
発明の詳細な記載
本発明によると、ヒト染色体１２から、ＰＴＸ１と命名される新規な遺伝子が、サブトラクティブハイブリダイゼーションによって単離された。正常組織において発現しているが前立腺腫瘍組織においては発現していないＰＴＸ１は、前立腺腫瘍発達の抑制における役割を果たしている。
【００２９】
ＰＴＸ１をコードする全長ｃＤＮＡが５’−および３’−ＲＡＣＥによって単離された。この１３２７−ｂｐ  ｃＤＮＡ（配列番号１）のヌクレオチド配列分析により、３７７アミノ酸残基のタンパク質（配列番号２）が予測され、該タンパク質は推定核内移行シグナル（ＲＲＬＮＲＫＫ；配列番号３）をそのアミノ−末端に有する。
【００３０】
ＰＴＸ１遺伝子はヒト染色体１２に位置しており、いたることろに発現している。ｃＤＮＡのセグメントを大腸菌で発現させ、特異的抗体の作成のためにＰＴＸ１タンパク質の断片を作った。免疫組織化学分析を用いたところ、ＰＴＸ１タンパク質は正常前立腺の腺上皮（特に基底細胞）の核に位置しており、前立腺癌にはなかった。ＰＴＸ１の遺伝子構成は、該ｃＤＮＡ配列を、機能が未知の公表されたヒトゲノム配列と比較することによって確立された。
【００３１】
本発明の組成物は、前立腺癌の診断および治療において有用であろう。本発明の核酸は、染色体および遺伝子マッピングアッセイにおいてＰＣＲのために；遺伝子発現レベルを変化させるためのセンスおよびアンチセンス核酸の生成のために；および／またはペプチド断片の作成のために；そして免疫特異的抗体の作成のために利用できる。ＰＴＸ１活性における遺伝子的および生化学的変化をアッセイするための方法、そしてＰＴＸ１活性を変化させることができる薬剤の同定のための方法も提供される。そのような薬剤は前立腺癌の治療のための治療薬として有用であろう。最後に、ＰＴＸ１遺伝子置換療法も本発明の枠内に含まれる。
【００３２】
Ｉ．定義
本発明の理解を容易にするために以下の定義が与えられる。
【００３３】
本明細書に用いられる「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖であれ二本鎖であれ、そして一本鎖の場合は直鎖状または環状形態のその相補配列の分子を含む、あらゆるＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。核酸分子について議論する場合、特定の核酸分子の配列または構造は、５’から３’方向に配列を表す通常の慣行に従って本明細書中に記載され得る。本発明の核酸について言及する際、「単離核酸」という語を用いる場合がある。この語は、ＤＮＡについて適用する場合、それが由来する生物の天然のゲノムにおいてすぐ近くに隣接する配列から分離されたＤＮＡ分子を指す。例えば、「単離核酸」は、プラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターに挿入されたＤＮＡ分子、または原核または真核細胞あるいは宿主生物のゲノムＤＮＡに組み入れられたＤＮＡ分子を含む。
【００３４】
ＲＮＡについて適用する場合、「単離核酸」という語は第一に上記の単離ＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子を指す。その他にその語は、その天然状態（即ち細胞または組織内）において結合している他の核酸から十分に分離されたＲＮＡ分子のことを指す場合もある。単離核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）はさらに生物学的または合成手法によって直接生成され、そしてその生成過程において存在するその他の構成成分から分離された分子のことを指すこともある。
【００３５】
核酸の特定配列の「自然対立遺伝子変異体」、「突然変異体」および「誘導体」は、特定の配列に密接に関連するが、自然にまたは計画的に配列または構造において変化を有している核酸配列を指す。密接に関連とは、配列のヌクレオチドの少なくとも約７５％、しかししばしば９０％以上が、特定の配列認識番号（配列番号）を用いて称される核酸配列の規定された長さにわたって一致することを意味する。密接に関連する核酸配列の間のヌクレオチド配列における変化または差異は、特定の核酸配列の性質において通常の複製または重複の過程において起こる配列におけるヌクレオチド変化を表し得る。その他の変化を特定の目的のために配列中に特別にデザインおよび導入することができ、例えば、核酸の調節領域においてアミノ酸コドンまたは配列を変化させることができる。そのような特定の変化は様々な突然変異誘発技術を用いてインヴィトロで作ることができ、あるいは、変化を誘発あるいは選抜する特定の選抜状況に置いた宿主生物体において作ることができる。そのような特別に作成された配列変異体は、元の配列の「突然変異体」または「誘導体」と称される。
【００３６】
特定の配列について言及する場合の、「パーセント類似性」、「パーセント同一性」および「パーセント相同性」という語は、ウィスコンシン大学のＧＣＧソフトウェアプログラムに示されているのと同様に用いられる。
【００３７】
本発明は、ＰＴＸ１ポリペプチド、即ち本発明のタンパク質の、活性部分、断片、誘導体および機能的あるいは非機能的擬似体（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）も含む。そのようなポリペプチドの「活性部分」とは、全長ポリペプチドより短いペプチドであるが、測定可能な生物活性を保持するペプチドを意味する。
【００３８】
ＰＴＸ１ポリペプチドの「断片」または「部分」とは、少なくとも約５から７の連続するアミノ酸、しばしば少なくとも約７から９の連続するアミノ酸、典型的には少なくとも約９から１３の連続するアミノ酸、そして最も好ましくは少なくとも約２０から３０またはそれ以上の連続するアミノ酸の、一続きのアミノ酸残基を意味する。ＰＴＸ１ポリペプチド配列の断片、抗原決定基、あるいはエピトープはＰＴＸ１タンパク質アミノ酸配列の部分に対して免疫応答を引き起こすために有用である。
【００３９】
ＰＴＸ１ポリペプチドの様々な「変異体」が本質的に存在する。これらの変異体は、タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列における差異によって特徴付けられる対立遺伝子であってもよいし、異なるＲＮＡプロセッシングまたは翻訳後修飾を含むものであってもよい。当業者であれば、１または複数のアミノ酸置換、欠失、付加または交換を有する変異体を作成することができる。これらの変異体はとりわけ、：（ａ）１または複数のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸によって置換されている変異体、（ｂ）１または複数のアミノ酸がポリペプチドに付加している変異体、（ｃ）１または複数のアミノ酸が置換基を含んでいる変異体、および（ｄ）例えば抗体に対するエピトープ、ポリヒスチジン配列、ビオチン部分などの、ＰＴＸ１ポリペプチドに有用な特性を与えることのできる、融合パートナー、タンパク質タグ、またはその他の化学的部分などの、別のペプチドまたはポリペプチドと該ポリペプチドとが融合した変異体を含む。本発明のその他のＰＴＸ１ポリペプチドは、ある種からのアミノ酸残基が他の種の対応する残基と、保存または非保存部分において置換している変異体を含む。その他の態様において非保存部分のアミノ酸残基が、保存または非保存残基と置換される。遺伝的（抑制、削除、突然変異など）、化学的および酵素的技術を含む、これらの変異体を得るための技術は当業者に知られている。そのような対立遺伝子変異体、類似体、断片、誘導体、突然変異体および、選択的核酸プロセッシング形態および選択的翻訳後修飾形態を含む修飾が、ＰＴＸ１ポリペプチドの生物学的性質のいくらかを保持するＰＴＸ１ポリペプチドの誘導体に帰結する程度まで、それらは本発明の枠内に含まれる。
【００４０】
本明細書で用いられる「機能的」という語は、列挙されたアッセイまたは目的のために核酸またはアミノ酸配列が機能し得ることを意味する。
【００４１】
「本質的に〜からなる」という語は、特定のヌクレオチドまたはアミノ酸について言及する場合は、所与の配列番号の性質を有する配列を意味する。例えば、アミノ酸配列に言及して用いられる場合、この語は、配列それ自体およびその配列の基礎的および新規な特性に影響を与えないような分子修飾を含む。
【００４２】
「レプリコン」とは例えば、プラスミド、コスミド、バクミド（ｂａｃｍｉｄ）、ファージまたはウイルスなどの、主にそれ自身の制御下で複製することができるあらゆる遺伝的要素である。レプリコンはＲＮＡでもＤＮＡでもよく、一本鎖でも二本鎖でもよい。
【００４３】
「ベクター」とは例えば、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージまたはウイルスのような、他の遺伝子配列または要素（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が付加してその付加した配列または要素の複製を引き起こすような、レプリコンである。
【００４４】
「発現オペロン」とは、例えばプロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（例えばＡＴＧまたはＡＵＧコドン）、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどの、転写および翻訳制御配列を有し、そして宿主細胞または生物体においてポリペプチドをコードする配列の発現を促進する、核酸セグメントのことを指す。
【００４５】
本明細書で用いる「オリゴヌクレオチド」という語は、本発明の配列、プライマーおよびプローブを指し、２またはそれ以上、好ましくは３以上の、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドからなる核酸分子と定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは様々な因子およびそのオリゴヌクレオチドの特定の適用および使用などに依存する。
【００４６】
本明細書で用いる「プローブ」という語は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸であって、ＲＮＡでもＤＮＡでもよく、精製制限酵素消化産物として天然に生じたものでも合成によって作成されたものでもよく、該プローブに相補的な配列を有する核酸にアニーリングあるいは特異的にハイブリダイズすることのできるものを指す。プローブは一本鎖でも二本鎖でもよい。プローブの正確な長さは、温度、プローブの出所および使用方法を含む様々な因子に依存する。例えば、診断用としては、標的配列の複雑さに依存して、オリゴヌクレオチドプローブは典型的には１５−２５またはそれ以上のヌクレオチドを含むが、より少ないヌクレオチドを含むものでもよい。本明細書におけるプローブは特定の標的核酸配列の異なる鎖に「実質的に」相補的なものとなるよう選択される。これは、プローブはあらかじめ定められた一連の条件の下でそれらのそれぞれの標的鎖に「特異的にハイブリダイズする」あるいはアニーリングすることができるように十分相補的でなければならないことを意味する。したがって、プローブ配列は標的の正確な相補配列を反映するものである必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片をプローブの５’または３’末端に連結させることができ、残りのプローブ配列が標的鎖に対して相補的で有ればよい。その他に、プローブ配列が標的核酸配列に特異的にアニーリングするように十分に相補性を有していれば、非相補的塩基またはより長い配列をプローブ中に散在させることができる。
【００４７】
「特異的にハイブリダイズする」という語は、当該技術分野において通常に用いられるあらかじめ定められた条件下でハイブリダイゼーションが可能なほどに十分に相補的な配列を有する２つの一本鎖核酸分子の間の結合を指す（「実質的に相補的」ということもある）。特に、この語はオリゴヌクレオチドと本発明の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子に含まれる実質的に相補的な配列とのハイブリダイゼーションを指し、オリゴヌクレオチドと、非相補配列を有する一本鎖核酸とのハイブリダイゼーションを実質的に除外するものである。
【００４８】
本明細書において使用する「プライマー」という語は、ＲＮＡまたはＤＮＡである一本鎖または二本鎖の、生物系由来、制限酵素消化または合成によって生じたオリゴヌクレオチドであって、適切な環境におかれるとテンプレート依存核酸合成のイニシエーターとして機能的に作用することができるものを指す。適切な核酸テンプレート、好適な核酸のヌクレオシド三リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、好適な補因子および適切な温度およびｐＨなどの条件とともに存在すれば、プライマーはポリメラーゼの作用またはプライマー伸長産物を生成する類似の活性による、ヌクレオチドの付加によってその３’末端において伸長し得る。プライマーは特定の条件および適用するものの要求に依存して、その長さが変動し得る。例えば、診断適用においては、オリゴヌクレオチドプライマーは通常１５−２５またはそれ以上の長さのヌクレオチドである。プライマーは所望の伸長産物の合成を開始するために、すなわち、ポリメラーゼまたは類似の酵素による合成の開始における使用のために適切な並置に、プライマーの３’ヒドロキシル部分を提供するのに十分な態様で所望のテンプレート鎖とアニーリングすることができるように、所望のテンプレートに対して十分に相補的であらねばならない。プライマー配列が所望のテンプレートの正確な相補鎖を表すものである必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド配列をその他においては相補的なプライマーの５’末端に連結させてもよい。その他に、プライマー配列が伸長産物の合成のためのテンプレート−プライマー複合体を機能的に提供するのに十分に、所望のテンプレート鎖との配列と相補性を有していれば、非相補的塩基をオリゴヌクレオチドプライマー配列中に散在させてもよい。
【００４９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、引用により本出願にその全体の開示を包含させる、米国特許第４，６８３，１９５号、４，８００，１９５号および４，９６５，１８８号において記載されている。
【００５０】
本明細書において用いられる、「レポーター」、「レポーターシステム」、「レポーター遺伝子」または「レポーター遺伝子産物」という語は、核酸が、発現した場合に、例えば生物学的アッセイ、イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイにより、あるいは比色、蛍光発生、化学発光、その他の方法により簡単に測定可能なレポーターシグナルを生じる産物をコードする遺伝子を含む、操作的遺伝子システムを意味する。核酸はＲＮＡでもＤＮＡでもよく、直鎖状でも環状でもよく、一本鎖でも二本鎖でもよく、アンチセンス方向でもセンス方向でもよいが、レポーター遺伝子産物の発現のための必要な調節要素に操作的にリンクしているものである。必要な調節要素はレポーターシステムの性質およびレポーター遺伝子がＤＮＡかＲＮＡの形態であるかにより変化するが、プロモーター、エンハンサー、翻訳調節配列、ポリＡ付加シグナル、転写終止シグナルなどの要素を含むものであってそれらに限定されるものではない。
【００５１】
「形質転換」、「形質移入」、「形質導入」の語は、核酸が細胞または宿主生物に導入されるあらゆる方法または手段を指し、同じ意味を表すために互換的に用いられる。そのような方法には、トランスフェクション、エレクトロポーレーション、マイクロインジェクション、ＰＥＧ−融合などが含まれるがそれらに限定されるものではない。
【００５２】
導入された核酸はレシピエント細胞または生物の核酸に統合（共有結合）していてもしていなくてもよい。例えば細菌、酵母、植物および哺乳類細胞においては、導入された核酸はエピソーム要素としてすなわち、プラスミドのような独立のレプリコンとして維持されうる。そうではなく、導入された核酸がレシピエント細胞または生物の核酸に統合されて、その細胞または生物に安定に維持され、さらにレシピエント細胞または生物の子孫細胞または生物に伝えられ、あるいは、受け継がれることもある。最後に、導入された核酸がレシピエント細胞または宿主生物に一過性にのみ存在することもある。
【００５３】
本出願においてアミノ酸残基は以下の表の３文字または１文字省略によって特定される。
【００５４】
【表１】
2004518409.tif 000002
【００５５】
本明細書において記載されるアミノ酸残基は好ましくは”Ｌ”異性体型である。しかし、所望のポリペプチドの特性が保持される限りは、”Ｄ”異性体型の残基がＬ−アミノ酸残基と置換してもよい。本明細書に表示するすべてのアミノ酸残基配列は、通常のように左から右にアミノ末端からカルボキシ末端方向であることを確認しておく。
【００５６】
「単離タンパク質」または「単離および精製タンパク質」という語が本明細書中に用いられることがある。この語は、第一に、本発明の単離核酸分子の発現によって生じたタンパク質のことを言う。そうではなくて、この語を「実質的に純粋な」形態で存在するために十分に、それが自然に結合している他のタンパク質から分離されているタンパク質のことを指すこともある。「単離」とは、他の化合物または物質との人工または合成混合物を排除するものではなく、例えば不完全な精製、安定剤の付加、または例えば免疫原性調製物や医薬上許容される調製物へと混合することによって存在し得る、基本的活性を阻害しないような不純物の存在を排除するものではない。
【００５７】
「実質的に純粋な」という語は、所与の物質（例えば核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質など）を重量で少なくとも５０−６０％含む調製物を指す。より好ましくは、該調製物は所与の化合物を少なくとも重量で７５％含み、最も好ましくは重量で９０−９５％含む。純度は所与の化合物について適切な方法（例えばクロマトグラフィー法、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析、その他）によって測定される。
【００５８】
「成熟タンパク質」または「成熟ポリペプチド」とは、ポリタンパク質前駆体からのタンパク分解性プロセッシングのような、その起源の過程においてポリペプチドに対して通常起こるあらゆるプロセッシング現象の後のポリペプチド配列を有するポリペプチドを意味する。成熟タンパク質の配列または境界の命名において、成熟タンパク質配列の第一アミノ酸はアミノ酸残基１と命名される。本明細書において用いられる場合、成熟タンパク質に結合しており、通常はそのタンパク質への結合がみられないような、アミノ酸１に先行するアミノ酸残基は、アミノ酸−１、−２、−３などと命名される。組換え発現系について、メチオニン開始コドンはしばしば効率的な翻訳の目的で利用される。その結果得られるポリペプチドにおけるこのメチオニン残基は、本明細書において用いられる場合、成熟ＰＴＸ１タンパク質配列に対して−１と位置付けられる。
【００５９】
「タグ」、「タグ配列」または「タンパク質タグ」という語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸、ペプチド、タンパク質あるいはその他の化学物質のいずれかの化学的部分であって、他の配列に付加された場合に、特にその配列の検出または単離において、さらなる有用性を提供したり有用な特性を与えたりするものを指す。したがって、例えば、ホモポリマー核酸配列または捕獲オリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列は、プライマーまたはプローブ配列に付加されて、次なる伸長産物やハイブリダイズした産物の単離を容易にすることができる。タンパク質タグの場合、ヒスチジン残基（例えば４から８の連続するヒスチジン残基）をタンパク質のアミノ末端かカルボキシ末端に付加して、キレート金属クロマトグラフィーによるタンパク質単離を容易にすることができる。その他に、特異的抗体分子やその他の分子（例えば、フラッグエピトープ、ｃ−ｍｙｃエピトープ、インフルエンザＡウイルスの膜貫通エピトープ、ヘマグルチニンタンパク質、タンパク質Ａ、セルロース結合ドメイン、カルモジュリン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、キチン結合ドメイン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、その他）に反応性のエピトープや結合決定基を表すアミノ酸配列、ペプチド、タンパク質または融合パートナーをタンパク質に付加して、アフィニティーまたはイムノアフィニティークロマトグラフィーなどの方法によるタンパク質単離を容易にすることができる。化学的タグ部分は、核酸またはタンパク質に付加されてアビジン試薬との相互作用によって単離または検出を容易にするビオチンなどの分子やその他のものを含む。多くのその他のタグ部分が当業者に知られており、想像され得るものであり、本定義の枠内に含まれる。
【００６０】
「クローン」または「クローン細胞集団」とは、単一の細胞または共通の祖先から有糸分裂によって生じた細胞の集団のことである。
【００６１】
「細胞系」とは、一次細胞または細胞集団のクローンであって、多世代に渡ってインヴィトロで安定に成長することができるもののことである。
【００６２】
「免疫応答」は、機能している免疫系を有する宿主において、ウイルス性抗原などの抗原によって生じるあらゆる反応を意味する。免疫応答は、体液性の性質、すなわち免疫グロブリンまたは抗体の産生を伴うものであってもよいし、細胞性の性質、すなわち様々なタイプのＢおよびＴリンパ球、樹状細胞、マクロファージ、抗原提示細胞その他を伴うものであってもよいし、それらの両方であってもよい。免疫応答はサイトカイン、リンホカイン、その他の様々なエフェクター分子の産生または生成も伴う。免疫応答は、インヴィトロおよび様々な細胞または動物システムの両方において測定することができる。そのような免疫応答は、障害からの宿主の保護において重要であり、予防的および治療的に利用することができる。
【００６３】
「抗体」または「抗体分子」とは、抗体およびその断片を含む、特異的抗原に結合するあらゆる免疫グロブリンのことをいう。この語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、二重特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体を含むものである。本明細書において用いる場合、抗体または抗体分子は、無処置の免疫グロブリン分子および当該技術分野においてＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）として知られている部分のような免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の両方を含む。
【００６４】
本明細書において用いる、「生体宿主」の語は、あらゆる非−ヒト自律生物のことを意味する。
【００６５】
ＩＩ．ＰＴＸ１をコードする核酸分子、ＰＴＸ１タンパク質およびそれに対する抗体の調製
Ａ．核酸分子
本発明のＰＴＸ１タンパク質をコードする核酸分子は２つの一般的な方法によって調製することができる：（１）適切なヌクレオチド三リン酸から合成することができるし、（２）生物ソースから得ることもできる。両方法は、当該技術分野に周知のプロトコールを利用するものである。
【００６６】
配列番号１を有する全長ｃＤＮＡのような、ヌクレオチド配列情報が入手可能であれば、オリゴヌクレオチド合成により本発明の単離核酸分子を調製することができる。合成オリゴヌクレオチドは、アプライドバイオシステム３８Ａ  ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３８Ａ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｓｉｚｅｒ）または類似の装置を用いてホスホラマダイト法によって調製することができる。その結果得られたコンストラクトを、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のような当該技術分野で公知の方法によって精製すればよい。本発明のＤＮＡ分子のように長い二本鎖ポリヌクレオチドは、現在のオリゴヌクレオチド合成方法に固有のサイズ制限のため、段階的に合成しなければならない。したがって、例えば２．６ｋｂの二本鎖分子は適切な相補性を有するいくつかのより小さいセグメントとして合成すればよい。作成した相補的セグメントを次に、隣接するセグメントとの付着のために、各セグメントが適当な付着末端を有するようにアニーリングさせればよい。隣接するセグメントをＤＮＡリガーゼの存在下で付着末端をアニーリングさせることによって連結させて、全体の２．６ｋｂ二本鎖分子を構築することができる。そのように構築された合成ＤＮＡ分子は次いでクローニングして適切なベクター中で増幅させるとよい。
【００６７】
ＰＴＸ１をコードする核酸配列は、当該技術分野に公知の方法を用いて適当な生物ソースから単離することができる。好適な態様において、ｃＤＮＡクローンをヒト起源の発現ライブラリーから単離する。別の態様においてＰＴＸ１をコードするゲノムクローンを単離してもよい。また、その他の動物種からのＰＴＸ１をコードするｃＤＮＡまたはゲノムクローンを得ることもできる。
【００６８】
本発明によると、配列番号１のタンパク質コード領域と適当なレベルの配列相同性を有する核酸は、適当なストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件によって同定することができる。例えば、ハイブリダイゼーションはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． １９８９の方法によって行うことができ、これは、５ｘＳＳＣ、５ｘデンハルト試薬、０．５−１．０％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性断片化サケ精子ＤＮＡ、０．０５％ピロリン酸ナトリウムおよび５０％のホルムアミド：を含むハイブリダイゼーション溶液を用いるものである。ハイブリダイゼーションは３７−４２℃で少なくとも６時間行う。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを以下のように洗浄する：（１）室温で５分間、２ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳ；（２）室温で１５分間、２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ；（３）３７℃で３０分−１時間、１ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳ；（４）３０分ごとに溶液を変えながら４２−６５℃で２時間、１ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳ。
【００６９】
特定の配列相同性を有する核酸分子間のハイブリダイゼーションを得るために要求されるストリンジェンシー条件の計算のための１つの一般式は（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９）下記式である：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／二本鎖におけるｂｐ数
【００７０】
上記式を実例により説明すると、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］および５０％ホルムアミドを用い、ＧＣ含量が４２％で平均プローブサイズが２００塩基の場合、Ｔｍは５７℃である。ＤＮＡ二本鎖のＴｍは相同性が１％低下すると１−１．５℃低下する。したがって、配列同一性が約７５％以上の標的であれば、４２℃のハイブリダイゼーション温度を用いれば観察される。そのような配列は、本発明の核酸配列と実質的に相同的なものと考えられる。
【００７１】
本発明の核酸はあらゆる適切なクローニングベクターにおいてＤＮＡとして維持され得る。好適な態様において、クローンはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）のようなプラスミドクローニング／発現ベクターに維持され、適当な大腸菌宿主細胞において増殖する。
【００７２】
本発明のＰＴＸ１をコードする核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡおよび一本鎖または二本鎖のそれらの断片を含む。したがって、本発明は、配列番号１の配列を含むｃＤＮＡの選択されたセグメントのような、本発明の核酸分子の少なくとも１つの配列にハイブリダイズすることができる配列を有するオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのセンスまたはアンチセンス鎖）を提供する。そのようなオリゴヌクレオチドは、その他の種におけるＰＴＸ１遺伝子または相同体を検出または単離するためのプローブとして有用である。
【００７３】
上述の核酸配列を、１または複数のヌクレオチドの付加、置換、挿入または欠失によって修飾してもよいが、好ましくは、配列番号１に示す配列を有する核酸分子またはその相補配列と選択的にハイブリダイズする能力を失わず、即ちオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと所与の配列の１つとの相同性の程度が十分に高いように修飾してもよい。
【００７４】
好適な態様のいくつかにおいて、配列番号１に示す配列またはその相補配列あるいは癌感受性に関連する対立遺伝子の断片である、本発明によるオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチドの長さであり、より好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドの長さであり、最も好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの長さである。オリゴヌクレオチドのデザインは当業者の能力の範囲内のものである。好適なオリゴヌクレオチドは１０から１００の間のヌクレオチド塩基の長さのものである。そのような断片はそれぞれ本発明の態様を表す。
【００７５】
断片およびその他のオリゴヌクレオチドは、上述のようにプライマーまたはプローブとして使用可能であるが、試験試料における癌感受性の指標となる配列の存在を判定することに関する方法においても（例えばＰＣＲによって）作成することもできる。
【００７６】
そのようなオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーは全長配列（および突然変異体、対立遺伝子、変異体および誘導体）と同様に、ＰＴＸ１、対立遺伝子、突然変異体またはその変異体の存在について、核酸を含む試験試料をスクリーニングする方法においても有用であり、特に、癌に対する感受性や素因を示す方法において有用であって、プローブは試験される個体から得た試料からの標的配列とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件は、非特異的結合が最小になるように調節され、好ましくはストリンジェントから中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が用いられる。当業者であれば、簡単にそのようなプローブをデザインし、それらを標識し、そしてＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ （１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ （１９９２）などのテキストを参考にハイブリダイゼーション反応についての好適な条件を考案することができる。
【００７７】
アミノ酸配列情報（配列番号２）に基づいて、遺伝暗号の縮重を考慮してオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーをデザインすることができる。核酸増幅における使用のためのオリゴヌクレオチドは、約１０またはそれ以下の（例えば６、７または８）コドン、即ち約３０またはそれ以下の長さのヌクレオチド（例えば１８、２１または２４）を有していればよい。一般に特異的プライマーは１４ヌクレオチド以上の長さであるが１８から２０を超えないものである。当業者であればＰＣＲなどの方法における使用のためのプライマーのデザインについて精通している。
【００７８】
全長コード配列またはオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーなどの本発明による核酸分子は、例えば、その中身が外界の環境から保護されているようなバイアルなどの好適な容器中において、キットの一部として提供することができる。キットは例えば、ＰＣＲおよび／または試験試料における目的の核酸の存在を判定するための方法における、核酸分子の利用のための説明書を含んでいてもよい。核酸分子がＰＣＲにおける使用を目的としているキットは、ポリメラーゼ、ヌクレオシド、緩衝溶液などの、反応に必要である１または複数のその他の試薬を含んでいてもよい。核酸分子は、当該技術分野において標準的に用いられる、放射性、蛍光、生物的または酵素のタグあるいは標識などの、検出可能な標識またはマーカーで標識しておいてもよい。そのような標識の使用に関する米国特許には、米国特許第３，８１７，８３７；３，８５０，７５２；３，９３９，３５０；３，９９６，３４５；４，２７７，４３７；４，２７５，１４９および４，３６６，２４１号が含まれ、そのそれぞれが引用により本出願に含まれる。
【００７９】
本発明によるポリペプチドを作る簡便な方法は、発現系における核酸分子の使用により、それをコードする核酸分子を発現させることである。これについては後述する。本発明の核酸分子を含むベクターおよびそのようなベクターおよび／または本発明による核酸を含む宿主細胞は、本発明のさらなる態様を構成するものである。
【００８０】
例えば細胞または細胞の祖先への核酸分子の導入および／または細胞または祖先に内因する配列の遺伝的変化の結果として（そのような導入はインヴィトロでもインヴィヴォでも起こり得る）、本発明による核酸分子を含む宿主細胞は、（例えば細胞体において）動物、特にヒトであっても非ヒトであってもよい、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタなどの哺乳動物またはニワトリなどの鳥類である生物体に含まれていてもよい。そのような細胞を含む、遺伝的に改変された、あるいはトランスジェニックの動物または鳥類もまた、本発明のさらなる態様として提供される。
【００８１】
本発明のトランスジェニック動物は、癌の治療に有効である可能性のある治療薬の評価のための動物疾患モデルとして有用で有り得る。しかし、そのような改変された動物またはトランスジェニック動物はおそらく、研究の点から、特にその改変が、ＰＴＸ１またはその対立遺伝子に対応する核酸分子の欠失（「ノックアウト」）または突然変異である、遺伝的に改変された動物の場合さらに有用である。
【００８２】
Ｂ．タンパク質
本発明の全長ＰＴＸ１タンパク質は公知の方法により、いろいろな手段で調製することができる。該タンパク質は、例えばヒトまたは動物培養細胞あるいは組織などの適当なソースからイムノアフィニティー精製によって精製することができる。
【００８３】
ＰＴＸ１をコードする核酸分子またはそのスプライス変異体が入手可能であれば、当該技術分野で公知のインヴィトロ発現方法を用いてコードされるタンパク質を作ることができる。例えば、ｃＤＮＡまたは遺伝子をインヴィトロ転写のために、ｐＳＰ６４またはｐＳＰ６５などの適当なインヴィトロ転写ベクターにクローニングし、次いでコムギ胚芽またはウサギ網状赤血球などの好適な無細胞翻訳系において無細胞翻訳させることができる。インヴィトロ転写および翻訳系は、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ またはＢＲＬ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄから市販されている。
【００８４】
また、好適な態様によると、好適な原核生物または真核生物系における発現により大量のＰＴＸ１を作ることができる。例えば、配列番号１を有するｃＤＮＡなどのＤＮＡ分子の一部または全部を、大腸菌などの細菌細胞およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母細胞における発現に適したプラスミドベクターに挿入してもよいし、昆虫細胞における発現のためにバキュロウイルスベクターに挿入してもよい。そのようなベクターは宿主細胞（例えば大腸菌または昆虫細胞）におけるＤＮＡの発現のために必要な調節要素を含んでおり、調節要素は宿主細胞においてＤＮＡを発現させるように位置付けられる。そのような発現のために必要とされる調節要素は、プロモーター配列、転写開始および終結配列を含み、そして任意にエンハンサー配列を含む。
【００８５】
組換え原核生物または真核生物系における核酸発現によって生産されたＰＴＸ１タンパク質は、当該技術分野において公知の方法によって精製することができる。好適な態様において、市販の発現／分泌系が使用でき、組換えタンパク質が発現した後、宿主細胞から分泌され、周囲の培地から簡単に精製することができる。発現／分泌ベクターを用いない場合、それに替わるアプローチとして、組換えタンパク質に特異的に結合する抗体との免疫相互作用、あるいはＮ−末端またはＣ−末端に６−８のヒスチジン残基をタグ付加した組換えタンパク質の単離のためのニッケルカラムなどによる、アフィニティー分離によって組換えタンパク質を精製するものが含まれる。さらに別の態様において、ＧＳＴ融合タンパク質を用いて精製を容易にすることができる。そのような方法は組換えタンパク質精製の分野における専門家によって一般的に用いられるものである。
【００８６】
上述の方法によって調製された、本発明のＰＴＸ１タンパク質は標準的方法によって分析することができる。例えば、そのようなタンパク質はアミノ酸配列分析および／またはゲル電気泳動にかけることができる。
【００８７】
上述のように、本発明は、製薬、薬剤の開発、診断キットにおける使用およびインヴィヴォでのその特性と役割のさらなる研究のための、ＰＴＸ１ポリペプチドまたはその断片またはその活性部分も提供する。
【００８８】
アミノ酸配列変異体、対立遺伝子、誘導体または突然変異体であるポリペプチドも本発明によって提供される。変異体、対立遺伝子、誘導体または突然変異体であるポリペプチドは１または複数のアミノ酸の付加、置換、欠失および挿入により配列番号２において与えられる配列とは異なるアミノ酸配列を有しているであろう。そのようなポリペプチドのうち好適なものはＰＴＸ１機能、すなわち、以下の特性の１または複数を有している：配列番号２にその配列が示されているポリペプチドに反応する抗体との免疫交差反応性、および配列番号２にそのアミノ酸配列が示されているポリペプチドとのエピトープの共有（例えば、２つのポリペプチド間の免疫交差反応性によって判定される）。
【００８９】
配列番号２に示すアミノ酸配列の、アミノ酸配列変異体、対立遺伝子、誘導体または突然変異体であるポリペプチドは、示された配列と約３５％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上または約９５％以上の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むものであってよい。特定のアミノ酸配列変異体は、１，２，３，４，５−１０，１０−２０，２０−３０，３０−４０，４０−５０，５０−１００，１００−１５０アミノ酸または１５０アミノ酸以上の挿入、付加、置換または欠失により配列番号２に示す配列と異なっているであろう。アミノ酸「相同性／同一性」について、これは（例えばアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用いて決定される、アミノ酸類似性の確立した法則による）類似性または同一性であると理解すればよい。ＧＡＰは２つの完全な配列をマッチの数を最大化させてギャップの数を最小化させるようにアラインさせる、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ ａｌｇｏｒｉｔｈｍを用いるものである。一般的に、ギャップ作成ペナルティ＝１２でギャップ伸長ペナルティ＝４の、デフォールトパラメーターが用いられる。ＧＡＰの使用が好ましいが、一般的にデフォールトパラメーターを用いる、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９０ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０５−４１０）；ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ （１９９８） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５： ２４４４−２４４８）またはｔｈｅ Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ （１９８１） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １４７： １９５−１９７）を含むがそれらに限定されるものではない、その他のアルゴリズムを用いてもよい。本明細書における「相同性」および「相同的」という語のいずれかの使用は、比較する配列間に必要な進化的関連があることを意味するものではない。これらの語は、「相同的組換え」という句におけるのと同じように用いられ、すなわち単にこの語は適当な条件下で組換わる程度に十分に類似している２つのヌクレオチド配列を要求するものにすぎない。
【００９０】
本発明によるポリペプチドはその活性または機能を調節する分子のスクリーニングにおいて使用することができる。そのような分子は、治療（おそらく予防も含む）上有用であろう。
【００９１】
本発明はまた、本発明のタンパク質に免疫特異的に結合することができる抗体も提供する。ＰＴＸ１に対するポリクローナル抗体が標準的方法によって調製できる。好適な態様において、ＰＴＸ１の様々なエピトープと免疫特異的に反応するモノクローナル抗体が調製される。モノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの一般的方法によって、標準的プロトコールに従って調製できる。ＰＴＸ１に免疫特異的に相互作用するポリクローナルまたはモノクローナル抗体はそのようなタンパク質の同定および精製に利用することができる。例えば、抗体はそれらと免疫特異的に相互作用するタンパク質のアフィニティー分離のために利用できる。抗体はまた、タンパク質およびその他の生物学的分子との混合物を含むサンプルから、タンパク質を免疫沈降させるために使用することができる。抗−ＰＴＸ１抗体のその他の使用は後述する。
【００９２】
本発明による抗体は様々な方法で改変させたものでもよい。実際、「抗体」という語は要求される特異性を備えた結合ドメインを有するあらゆる結合物質を含むものと解釈されるべきである。したがって、本発明では、合成分子および形態が抗体の模倣であって抗原またはエピトープに結合できるようにした分子を含む、抗体断片、抗体の誘導体、機能的同等体および相同体が包含される。
【００９３】
抗原またはその他の結合パートナーと結合することができる抗体断片の例には、ＶＬ、ＶＨ、ＣｌおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の一腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片；単離ＣＤＲ領域およびＦ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でのジスルフィド結合により連結した２つのＦａｂ断片を含む二価断片がある。一本鎖Ｆｖ断片も含まれる。
【００９４】
その親である非−ヒト抗体よりも免疫原性が少ない抗体を提供するために、通常、骨格アミノ酸残基の一部の変更を伴う、ヒト骨格領域に非−ヒトソースからのＣＤＲｓを接合した、ヒト化抗体も本発明の枠内に含まれる。
【００９５】
ＩＩＩ．ＰＴＸ１をコードする核酸、ＰＴＸ１タンパク質およびそれに対する抗体の利用
腫瘍抑制遺伝子、ＰＴＸ１の同定により、前立腺癌の診断、予知、遺伝子治療のための利用が提供される。ＰＴＸ１をコードする核酸、タンパク質およびそれに対する抗体の単離により、新形成疾患の予知指標として、および多くの種類の癌の治療のための治療剤としての広範な利用が提供される。
【００９６】
さらに、本発明によるＰＴＸ１−関連核酸、タンパク質およびそれに対する抗体は、その他の腫瘍抑制遺伝子の同定のためのリサーチツールとして利用できる。
【００９７】
Ａ．ＰＴＸ１をコードする核酸
ＰＴＸ１をコードする核酸は本発明による様々な目的のために利用することができる。ＰＴＸ１をコードするＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの断片は、ＰＴＸ１タンパク質をコードする遺伝子の存在および／または発現を検出するためのプローブとして利用できる。そのようなアッセイのためにＰＴＸ１をコードする核酸がプローブとして利用される方法は、以下のものを含むがそれらに限定されるものではない：（１）インサイチュハイブリダイゼーション；（２）サザンハイブリダイゼーション；（３）ノザンハイブリダイゼーション；そして（４）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの多種の増幅反応。
【００９８】
本発明のＰＴＸ１をコードする核酸は、本明細書において示すように他の種からの関連遺伝子を同定するためのプローブとして利用することもできる。当該技術分野において周知であるように、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、核酸プローブと様々な程度の相同性を有する相補配列とのハイブリダイゼーションを許容するように調整することができる。したがって、ＰＴＸ１をコードする核酸はＰＴＸ１と様々な程度の関連を有するその他の遺伝子の同定および特徴づけに有用であり、それによって前立腺癌のさかんな進行に関与する、観察される遺伝子発現の変化をさらに特徴付けることが可能になる。さらに、それらを用いてＰＴＸ１と相互作用するタンパク質をコードする遺伝子を同定することができ（例えば、「相互作用トラップ」技術による；米国特許第５，５８０，７３６号を参照されたい。）、それによってさらに癌の進行に関与する細胞シグナル伝達機構の解明が促進される（Ｇｏｌｅｍｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。
【００９９】
ＰＴＸ１をコードする核酸分子、またはその断片は、ＰＴＸ１の生産を制御するためにも利用可能であり、したがって、疾患シグナル伝達経路に関与し得るタンパク質の量を調節することができる。ＰＴＸ１タンパク質の生理的量の変化は、腫瘍進行を停止させるのに用いられるその他の薬剤と共同的に作用することができる。前立腺癌の疾患モデルにおいて本発明の核酸分子はＰＴＸ１の発現を減少させるために用いることができる。この態様において、ＰＴＸ１をコードする遺伝子の発現制御配列を標的とするアンチセンス分子を用いる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは核酸、プレ−ｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡの相補配列にハイブリダイズするようにデザインされ、所与のＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド（例えば自然ＰＴＸ１ポリペプチドまたはその突然変異体または変異体形態のいずれか）の産生を阻害し、それによってその発現が減少するか全く阻害される。ＰＴＸ１をコードする配列に加えて、アンチセンス技術をＰＴＸ１遺伝子の制御配列、例えば翻訳開始部位などのＰＴＸ１コード配列の５’側方配列を標的化するのに利用することができる。アンチセンスオリゴマーは、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、例えばｍＲＮＡ分子の翻訳を阻害するなどの所望の効果を発揮するのに十分な長さである必要がある。しかし、小さいオリゴマーの方がインヴィヴォではより効率的に細胞に取り込まれる傾向があり、より多数のアンチセンスオリゴマーが標的ｍＲＮＡの位置に送達され得るということに注意しなければならない。好ましくは、アンチセンスオリゴマーは十分な特異性を達成するために少なくとも１５ヌクレオチド長でなければならない。アンチセンス技術に用いられるオリゴヌクレオチドは好ましくは１５から３０ヌクレオチドの間の長さである。あらかじめ決定された遺伝子の発現レベルを減少させるためのアンチセンス分子の使用は当該技術分野において公知である。アンチセンス配列の構築およびそれらの使用は、Ｐｅｙｍａｎ ａｎｄ Ｕｌｍａｎ， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ９０： ５４３−５８４ （１９９０）， Ｃｒｏｏｋｅ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃａｌ．， ３２： ３２９−３７６ （１９９２）およびＺａｍｅｃｎｉｋ ａｎｄ Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ， Ｐ． Ｎ． Ａ． Ｓ．， ７５： ２８０−２８４ （１９７４）において記載されている。完全なＰＴＸ１ｃＤＮＡを逆方向に含むアンチセンスコンストラクトを作成することができる。
【０１００】
別の態様において、ＰＴＸ遺伝子の過剰発現を、過剰発現が、コードされるタンパク質であるＰＴＸ１の過剰生産を導くことができる細胞において、ＰＴＸ１活性の回復を評価するための実験において、前立腺癌細胞に導入する。ＰＴＸ１の細胞における過剰生産は免疫蛍光またはその他の当該技術分野で公知の標準的技術によって評価することができる。また、この方法によるＰＴＸ１の過剰発現は、細胞が徐々により悪性になる際に起こる、タンパク質−タンパク質複合体形成に関与するその他の成分の単離および特徴づけを容易にすることができる。
【０１０１】
上述のように、ＰＴＸ１をコードする核酸は、実質的に純粋なＰＴＸ１タンパク質またはその選択された部分を大量に生産するためにも有用である。
【０１０２】
Ｂ．ＰＴＸ１タンパク質および抗体
精製ＰＴＸ１タンパク質またはその断片を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体を作成することができ、これら抗体は、ＰＴＸ１（またはＰＴＸ１を含む複合体）の、生検試料または培養細胞における存在および蓄積についての感度のよい検出試薬としても役立つものである。組換え技術によりＰＴＸ１タンパク質の一部または全部を含む融合タンパク質の発現が可能である。全長タンパク質またはタンパク質の断片を利用して、このタンパク質の様々なエピトープに対して特異的な一連のモノクローナル抗体を作成することができ、それによって前立腺細胞におけるこのタンパク質の検出の感度をより高くすることができる。
【０１０３】
ＰＴＸ１に免疫学的に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を、このタンパク質の検出および定量のために計画された様々なアッセイに用いることができる。そのようなアッセイには以下のものが含まれるがそれらに限定されるものではない：（１）フローサイトメトリー分析；（２）前立腺細胞におけるＰＴＸ１の免疫化学的位置決定；および（３）前立腺細胞からの抽出物のイムノブロット分析（例えば、ドットブロット、ウェスタンブロット）。さらに、上述のように、抗−ＰＴＸ１はＰＴＸ１の精製のために使用することができる（例えば、アフィニティーカラム精製、免疫沈降）。
【０１０４】
上述の議論より、本発明の、ＰＴＸ１をコードする核酸、ＰＴＸ１発現ベクター、ＰＴＸ１タンパク質および抗−ＰＴＸ１抗体を利用して、前立腺進行の危険にある患者の評価の目的で、ＰＴＸ１遺伝子発現を検出し、そしてＰＴＸ１タンパク質蓄積を変化させることが可能であることが理解できる。本発明はまた、正常前立腺細胞が悪性腫瘍を引き起こす際の、疾患進行の調節に関与する、遺伝子およびタンパク質の相互作用の解明を容易にする材料を提供するものである。
【０１０５】
ＰＴＸ１をコードする核酸分子またはポリペプチド／タンパク質を検出するための例示的な方法には以下のものが含まれる：
ａ）患者からの試料における、本発明の核酸分子の存在を判定すること；または、
ｂ）患者からの試料における、ＰＴＸ１遺伝子によってコードされるポリペプチドの存在を判定し、そして存在する場合はそのポリペプチドが全長であるか、および／または突然変異しているか、および／または正常レベルで発現しているか、を判定すること；または、
ｃ）ＤＮＡ制限マッピングを用いて、患者からの核酸分子の試料を制限酵素が切断した場合に生じる制限酵素切断パターンと、ＰＴＸ１をコードする核酸配列から得られる制限酵素切断パターンとを比較すること；または、
ｄ）ＰＴＸ１核酸配列に結合することができる特異的結合メンバーを使用するか（この特異的結合メンバーは、ＰＴＸ１配列にハイブリダイズすることができる核酸あるいはＰＴＸ１核酸配列に対する特異性を有する抗体ドメインを含む物質を含むものである）、あるいはそれによってコードされるポリペプチドに結合することができる特異的結合メンバーを使用すること（この特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーのその結合パートナーに対する結合が検出できるように標識されたものである）；または、
ｅ）患者からの試料におけるＰＴＸ１配列をスクリーニングするためにＰＴＸ１核酸配列に基づく１または複数のプライマーを用いるＰＣＲを使用すること。
【０１０６】
「特異的結合ペア」は、特異的結合メンバー（ｓｂｍ）と結合パートナー（ｂｐ）からなり、それらは互いに特別の特異性を有し、正常な条件においてその他の分子に優先して互いに結合するものである。特異的結合ペアの例には、抗原と抗体、リガンドと受容体および相補的ヌクレオチド配列がある。当業者であれば、多くのほかの例を知っており、本明細書において列挙する必要はない。さらに、「特異的結合ペア」という語は、特異的結合メンバーと結合パートナーのいずれかまたは両方が、大きな分子の一部をなすときも適用される。特異的結合ペアが核酸配列である態様において、それらはアッセイの条件下で互いにハイブリダイズするのに十分な長さである必要があり、好ましくは１０ヌクレオチド長以上であり、より好ましくは１５または２０ヌクレオチド長以上のものである。
【０１０７】
癌感受性対立遺伝子のスクリーニングのための大抵の態様において、試料中のＰＴＸ１をコードする核酸分子は、最初に、その他の試料中に存在する配列と比べて分析物の量を増加させるために、例えばＰＣＲを用いて増幅される。これによって標的配列が試料中に存在する場合、標的配列はより高い感度で検出できることになる。この最初の工程は、当該技術分野において重要になりつつある高感度のアレイ技術を用いることによって回避することができる。
【０１０８】
ＰＴＸ１をコードする核酸配列の同定とその前立腺癌との関連により、本発明の態様による、試験試料におけるＰＴＸ１をコードする核酸分子の変異体形態、具体的には癌、特に前立腺癌に特異的に関連する対立遺伝子または変異体の存在または不存在を確かめるための上述の材料と方法の使用の提供が可能となる。これは個人の癌の素因を診断するためのものとすることができる。それはＰＴＸ１に関連する疾患を患う患者の癌の診断のためのものとすることができる。
【０１０９】
これによって適切な治療および／または予防方法の計画が可能となり、治療の能率化が図られる。このアプローチはさらに、もっとも利益を受けるであろう患者に標的をしぼることによって、治療を能率的にすることができる。
【０１１０】
本発明の別の態様によると、ＰＴＸ１産物の機能を回復させるための好適な薬剤を同定するための、癌治療用薬剤のスクリーニング方法が提供される。遺伝子移入または薬理学的手段（例えば、ＰＴＸ１の構造および／または機能を真似た小分子）によるＰＴＸ１機能の回復によって、前立腺癌細胞の異常成長特性が改良されると期待できる。
【０１１１】
薬剤スクリーニングアッセイにおいて用いられるＰＴＸ１ポリペプチドまたは断片は、溶液中の遊離のものでもよく、個体支持体に付着したものでもよく、あるいは細胞内におけるものでもよい。薬剤スクリーニングの１つの方法は、好ましくは競合結合アッセイにおいて、当該ポリペプチドまたは断片を発現する組換えポリヌクレオチドによって安定に形質転換された真核または原核宿主細胞を利用するものである。そのような細胞は生細胞でも固定形態であっても、標準的結合アッセイに用いることができる。例えば、ＰＴＸ１ポリペプチドまたは断片と試験されている薬剤との間の複合体形成を判定してもよいし、ＰＴＸ１ポリペプチドまたは断片と既知のリガンドとの間の複合体の形成が、試験されている薬剤によって阻害される程度を調べてもよい。
【０１１２】
薬剤スクリーニングの別の技術は、ＰＴＸ１ポリペプチドと適当な結合アフィニティーを有する化合物の高処理量スクリーニングを提供するものであり、１９８４年９月１３日に公開された、ＧｅｙｓｅｎのＰＣＴ公開出願ＷＯ８４／０３５６４号に詳細に説明されている。簡単に述べると、プラスチックピンまたはその他の表面などの固体基体上で多くの異なる小さいペプチド試験化合物が合成される。このペプチド試験化合物をＰＴＸ１ポリペプチドと反応させて洗浄する。結合したＰＴＸ１ポリペプチドは次に当該技術分野で周知の方法によって検出される。
【０１１３】
精製ＰＴＸ１を上述の薬剤スクリーニング技術における使用のためにプレートに直接コーティングすることができる。しかし、ポリペプチドに対する非中和抗体を用いて抗体を捕獲してＰＴＸ１ポリペプチドを固相に固定化することができる。
【０１１４】
本発明は、ＰＴＸ１ポリペプチドに特異的に結合することができる中和抗体が、試験化合物と、ＰＴＸ１ポリペプチドまたはその断片に対する結合について競合する、競合薬剤スクリーニングアッセイの使用をも考慮するものである。この方法では、ＰＴＸ１ポリペプチドの１または複数の抗原決定基を共有する、あらゆるペプチドの存在を検出するために抗体を利用できる。
【０１１５】
薬剤スクリーニングのさらなる技術は、非機能的ＰＴＸ１遺伝子を有する宿主真核細胞系または細胞（上述のようなもの）の使用を含む。これらの宿主細胞系または細胞はＰＴＸ１ポリペプチドレベルが欠損している。この宿主細胞系または細胞を、薬剤化合物の存在下で培養する。宿主細胞の成長速度を測定して、該化合物がＰＴＸ１欠損細胞の成長を調節することができるかを判定する。
【０１１６】
合理的な薬剤デザインの目的は、問題の生物学的に活性なポリペプチドの、または、それらと相互作用する小分子（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤）の構造的アナログを作って、例えば薬剤をより活性または安定な形態のポリペプチドにしたり、例えば薬剤をインヴィヴォでのポリペプチドの機能を促進または阻害するようにしたりすることである。例えば、Ｈｏｄｇｓｏｎ， （１９９１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９： １９−２１を参照されたい。１つのアプローチにおいて、まず、Ｘ線結晶解析、核磁気共鳴、コンピュータモデリングまたはより一般的にはいくつかのアプローチの組み合わせにより、目的のタンパク質（例えばＰＴＸ１ポリペプチド）または例えばＰＴＸ１−ＤＮＡ複合体の三次元構造を決定する。相同的タンパク質の構造に基づくモデリングによってポリペプチドの構造に関する有用な情報が得られる場合もある。合理的薬剤デザインの例は、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の開発がある（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９： ５２７−５３３）。さらにペプチド（例えばＰＴＸ１ポリペプチド）をアラニンスキャン（Ｗｅｌｌｓ， １９９１ Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍ． ２０２：３９０−４１１）によって分析することもできる。この技術では、アミノ酸残基がアラニンに置換され、そのペプチド活性に対する効果が判定される。ペプチドの各アミノ酸残基をこのように分析して、ペプチドの重要な領域を決定する。
【０１１７】
機能アッセイによって選択された標的特異的抗体を単離してその結晶構造を解明することも可能である。原則として、このアプローチは、次なる薬剤デザインの基礎となり得るファーマコア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）を生成するものである。機能的で薬理学的に活性の抗体に対する抗−遺伝子型抗体（抗−ｉｄ）を作成することによってタンパク質結晶解析を全くしないことも可能である。鏡像の鏡像であるため、抗−ｉｄの結合部位は元の分子のアナログであると予測される。抗−ｉｄを用いて、化学的または生物学的に作られたペプチドのバンクからペプチドを同定および単離することができる。選択されたペプチドはファーマコアとして作用するであろう。
【０１１８】
したがって、例えば改良されたＰＴＸ１ポリペプチド活性または安定性を有する薬剤や、ＰＴＸ１ポリペプチド活性の、阻害剤、アゴニスト、アンタゴニストなどとして作用する薬剤をデザインすることができる。クローニングされたＰＴＸ１配列を利用可能なために、Ｘ線結晶解析などの分析研究などを行うのに十分な量のＰＴＸ１ポリペプチドを作ることが可能である。さらに、本明細書において提供するＰＴＸ１タンパク質配列の知識は、Ｘ線結晶解析の替わりに、またはそれに加えて、コンピュータモデリング技術の使用を導くものであろう。
【０１１９】
本発明はさらに、生物学的に融和性の溶液、医薬上許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、または当業者に周知のその他の物質中の、「組成物」であって、本発明の核酸、ポリペプチド、ベクターまたは抗体を含むものを提供する。生物学的に融和性の溶液は、本発明のポリペプチド、核酸、ベクターまたは抗体が、例えば生物活性を発揮できる形態などの活性形態で維持される溶液のことをいう。一般的にそのような生物学的に融和性の溶液は、塩イオンを含む、例えば、Ｔｒｉｓ、リン酸、ＨＥＰＥＳバッファーなどの水性バッファーであろう。通常塩イオンの濃度は生理的レベルと類似のものであろう。生物学的に融和性の溶液は、安定剤および保存料を含んでいてもよい。
【０１２０】
そのような組成物は、局所、経口、非経口、鼻腔内、皮下、および眼内経路による投与のために調剤することができる。非経口投与とは、静脈注射、筋内注射、動脈注射または注入技術を含む意味である。組成物は、所望であれば標準的な周知の非毒性の生理的に許容される担体、アジュバントおよび媒体を含む投薬単位調剤において非経口的に投与できる。
【０１２１】
好適な滅菌注射調製物は非毒性の非経口的に許容される溶媒または希釈液中の溶液または懸濁液であろう。医薬上許容される担体の例は、塩水、緩衝塩水、等張塩水（例えばリン酸１ナトリウムまたはリン酸２ナトリウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムまたはマグネシウム塩化物またはそのような塩の混合物）、リンゲル液、ブドウ糖、水、滅菌水、グリコール、エタノールおよびそれらの混合物である。１，３−ブタンジオールおよび滅菌固定油が溶媒または懸濁媒体として簡便に用いられる。合成モノ−またはジ−グリセリドを含むあらゆる低刺激の固定油が用いられる。オレイン酸などの脂肪酸も注射調製物において有用である。
【０１２２】
組成物の媒体は、薬剤吸収物として作用可能な親水性ポリアクリル酸ポリマーなどの、あらゆる生物学的適合性または非細胞毒性の（ホモまたはへテロの）ポリマーから調製されるヒドロゲルであってもよい。そのようなポリマーは例えば引用により本出願にその内容全体が含まれる、出願ＷＯ９３／０８８４５号において記載されている。それらのいくつか、具体的には、エチレンおよび／またはプロピレンオキシドから得られるものなどが、市販されている。ヒドロゲルは例えば外科切除の間に処置されている組織の表面に直接おいてもよい。
【０１２３】
本発明は、ヒトまたはその他の動物に有効量の本発明の組成物を投与することを含む「治療方法」を提供するものである。
【０１２４】
有効量は、年齢、治療されるべき症状のタイプおよび重症度、体重、所望の治療時間、投与方法およびその他のパラメーターによって変動する。有効量は内科医またはその他の適当な医学専門家によって決定される。
【０１２５】
本発明のＰＴＸ１ポリペプチドは、生物学的に融和性の緩衝液において、一日当たり体重との比較で、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、そして最も好ましくは約１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの用量で腫瘍内注入によって投与してもよい。また、本発明のペプチドを発現する核酸を、前立腺腫瘍癌細胞への取り込みを促進するようなベクターまたはリポソーム中で、腫瘍に直接送達してもよい。
【０１２６】
以下の実施例は本発明の実施の例示的な方法を提供するものであって、本発明の範囲を制限する意図のものではない。
【０１２７】
実施例１
染色体１２上の腫瘍抑制遺伝子の候補、ＰＴＸ１の同定
本実施例はサブトラクティブハイブリダイゼーションを用いて、正常な前立腺には存在するが前立腺癌においては存在しない、染色体１２に位置する新規な遺伝子ＰＴＸ１を同定したことを記載するものである。
【０１２８】
Ｉ．材料と方法
以下のプロトコールを本発明の実施を容易にするために提供する。
【０１２９】
サブトラクティブハイブリダイゼーション：トータルＲＮＡをヒト正常前立腺（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅによる善意の提供）および前立腺癌（我々の部門からの病理標本の残り）からＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ （１９８７）に従って抽出した。ポリＡ＋ｍＲＮＡを、オリゴテックスｍＲＮＡミニキット（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ ｍＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてトータルＲＮＡから精製した。サブトラクティブハイブリダイゼーションをＰＣＲ−選択ｃＤＮＡサブトラクションキット（ｔｈｅ ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ ｃＤＮＡ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて行い、製造業者により提供される手法に厳密にしたがった。正常前立腺ｃＤＮＡを「テスター」として用い、前立腺腫瘍ｃＤＮＡを「ドライバー」として用いた。共通の配列を除くためのハイブリダイゼーションの後、テスターｃＤＮＡには存在しており、ドライバーｃＤＮＡには存在していない、差異的に発現しているｃＤＮＡをＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅した。ＰＣＲ産物はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸化し、平滑末端を、ＳｍａＩで切断され脱リン酸化されたｐＵＣ１８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に連結し、ＸＬ１−Ｂｌｕｅコンピテントセル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。ランダムに取り上げたコロニーからのプラスミドＤＮＡのミニ調製物を、ＰＣＲ−選択ディファレンシャルスクリーニングキット（ｔｈｅ ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｋｉｔ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に付属のマニュアルに記載されているようにサブトラクトされたプローブを用いてドットブロット形式でスクリーニングした。陽性クローンをさらにヌクレオチド配列分析によってスクリーニングした。
【０１３０】
５’−および３’−ＲＡＣＥ：全長ｃＤＮＡを単離するために、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅キット（ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた。ポリＡ＋ｍＲＮＡを、２３０μｇの正常前立腺トータルＲＮＡからオリゴテックスｍＲＮＡミニキット（ｔｈｅ Ｏｌｉｇｏｔｅｘ ｍＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。ポリＡ＋ＲＮＡの半分を５’−ＲＡＣＥレディｃＤＮＡの合成のために用い、残りの半分を３’−ＲＡＣＥレディｃＤＮＡの合成のために用いた。５’−および３’−ＲＡＣＥをＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅キットのマニュアルにしたがって行った。ＰＣＲ断片を上述のようにｐＵＣ１８にサブクローニングした。
【０１３１】
ＰＴＸ１の組織発現：ヒト組織におけるＰＴＸ１の発現をＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．から購入したファーストストランドｃＤＮＡ（ヒト多組織ｃＤＮＡパネルＩおよびＩＩ）を用いてＲＴ−ＰＣＲによって調べた。５μｌのｃＤＮＡのアリコットを、ＰＴＸ１−特異的またはβ−アクチン−特異的プライマーを用いて総容量７５μｌで増幅した。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９６℃１分を１サイクル；９４℃１分、５９℃１分、７２℃２分を３５サイクル；その後７２℃７分を１サイクル。ＰＣＲ産物の２０μｌのアリコットを２％アガロースゲルで分析した。試験した組織は以下の通りであった：脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、胎盤、骨格筋、大腸、卵巣、末梢血白血球、前立腺、小腸、脾臓、精巣および胸腺。
【０１３２】
ＰＴＸ１遺伝子のヒト染色体での位置決定：単染色体体細胞雑種ＰＣＲ可能ＤＮＡ（Ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄ ＰＣＲａｂｌｅ ＤＮＡｓ）（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、ＰＴＸ１遺伝子のヒト染色体上での位置決定に用いた。２４雑種と３コントロールのパネルの２５０ｎｇのＤＮＡのアリコットをＰＴＸ１−特異的プライマーを用いて総容量７５μｌで増幅した。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９６℃１分を１サイクル：９４℃１分、５５℃１分、７２℃２分を３０サイクル；その後７２℃７分で１サイクル。ＰＣＲ産物の１０μｌのアリコットを１％アガロースゲルで分析した。
【０１３３】
組換えＰＴＸ１の発現と抗血清の産生：ＰＴＸ１タンパク質の残基１２１−２０８に対応するコード配列を、５’末端にＮｃｏＩ部位および３’末端にＢａｍＨＩ部位を備えた合成プライマーを用いて増幅した。増幅された断片をアガロースゲルから精製して、細菌発現プラスミドベクターｐＣＡＬ−ｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。組換えタンパク質の精製を容易にするためにＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ部位の間のｐＣＡＬ−ｃベクターの配列を、連続する６つのＨｉｓコドンとその後に終止コドンを含む配列に置換した。発現プラスミドをＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬコンピテントセル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。
【０１３４】
組換えＰＴＸ１タンパク質を生産するために、発現プラスミドを有する細菌を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２００ｍｌのＬＢ培地でＯＤ６００が０．６−１．０になるまで生育させ、２ｍＭ  ＩＰＴＧで２時間誘導をかけた。細胞を収集し、２０ｍｌのＢ−Ｐｅｒ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）で溶解し、インクルージョンボディを遠心分離によって集め、Ｂ−Ｐｅｒ試薬の１／１０希釈液で３回洗浄した。組換えタンパク質をインクルージョンボディから、１０ｍｌの抽出バッファー（６ＭグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭメルカプトエタノール、ｐＨ８．０）を用いて４℃で一晩かけて抽出した。タンパク質抽出物を１ｍｌの予め平衡化しておいたＴａｌｏｎ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ）と室温で２０分間混合した。この樹脂を１０ｍｌの洗浄バッファー（６ＭグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、５ｍＭメルカプトエタノール、ｐＨ７．０）で２回洗浄し、小カラムに充填した。カラムを５ｍｌの洗浄バッファーで３回洗浄し、５ｍｌの溶出バッファー（６ＭグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．０）で溶出した。精製したタンパク質を４℃で３回、４リットルの１０ｍＭ重炭酸アンモニウム中で透析し、そして凍結乾燥した。乾燥したタンパク質をウサギ中でポリクローナル抗体を注文生産するために Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌに送った。
【０１３５】
ＰＴＸ１の免疫組織化学位置決定：指示した場合を除き全工程を室温で行った。ヒト前立腺癌切片をキシレン中で３回それぞれ５分間脱パラフィン処理し、特級エタノール中で再水和させ、抗原回収溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム／クエン酸、ｐＨ６．０）中で１５ｐｓｉの圧力で１０分間煮沸した。切片をバッファー１（１００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）でそれぞれ５分間、２回洗浄した。切片を２００μｌのブロッキング溶液（１％ブロッキング試薬［Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ］、１００ｍＭマレイン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で１時間インキュベートし、次いで２００μｌのブロッキング溶液中の２％ヤギ血清で３０分間インキュベートした。これを次に１００μｌの１次抗血清（ブロッキング溶液中１：１００に希釈）で１時間インキュベートした。バッファー１で５分間の洗浄を３回した後、切片を１００μｌのヤギ抗−ウサギＩｇＧ／アルカリフォスファターゼ接合体（ブロッキング溶液中１：１００に希釈）で１時間インキュベートした。切片をバッファー１で５分間、３回洗浄し、ＡＰバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．５）で１回洗浄し、そして２００μｌの新たに調製したＶｅｇａ Ｒｅｄ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ （Ｂｉｏｍｅｄａ Ｃｏｒｐ）で３０−６０分インキュベートした。最後に切片をヘマトキシリンで対比染色し、特級エタノール中で脱水し、キシレンで浄化してＰｅｒｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にマウントした。
【０１３６】
ＩＩ．結果：
ＰＴＸ１ｃＤＮＡの分子クローニングおよびキャラクタリゼーション：多数のクローンがサブトラクティブハイブリダイゼーションから得られた。３９６のランダムに取り上げたコロニーのうち、５７がサブトラクトされたｃＤＮＡプローブを用いたドットブロットハイブリダイゼーションにより陽性であることが判明した。これらをさらにヌクレオチド配列分析によりスクリーニングした。これら５７クローンのうち、５６％がセメノジェリン（ｓｅｍｅｎｏｇｅｌｉｎ）ｃＤＮＡであった。その他のクローンは、ミトコンドリアＤＮＡ（１１％）、２８ＳリボゾームＲＮＡ（７％）、プロラクチン−誘導タンパク質（７％）およびムチン（５％）であった。残りのクローン（１４％）は独特の配列であった。これらのクローンのうち４つ（＃１４９、３４１、３４８および３９４）が新規な配列であった。正常前立腺と前立腺腫瘍のｃＤＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲにより、クローン１４９と３４８が正常前立腺において差異的に発現しているｃＤＮＡであることが示された（図１）。クローン３４８をさらなる特徴づけのために選択し、そしてＰＴＸ１と再命名した。
【０１３７】
クローン３４８は１６７ｂｐ長しかなかったので、全長ｃＤＮＡを５’−および３’−ＲＡＣＥを用いて単離した。５’−ＲＡＣＥにより１８０ｂｐ断片が得られ、３’−ＲＡＣＥにより１．３ｋｂ断片が得られた。これら２つのクローンを組み合わせたヌクレオチド配列は、３’末端に２６ｂｐのポリ（Ａ）テイルを含む、１３２７ｂｐのｃＤＮＡ配列（配列番号１）からなるものである（図２）。連続するオープンリーディングフレームが存在し、塩基８７のＡＴＧコドンから開始して塩基１２１８のＴＡＡコドンで終結する。他に可能性のあるＡＴＧコドンが塩基２１、５１および５９と、上流に３つあるが、これらのコドンを用いた場合、タンパク質が途中で終結してしまう。したがって、このヌクレオチド配列は、３７７アミノ酸残基からなるタンパク質（配列番号２）をコードしているようである。５’−非翻訳領域は８６塩基対（ｂｐ）長である。一方、３’−非翻訳領域は１０７ｂｐ長であって塩基１２７８と１２８３の間に１つのＡＡＴＡＡＡ配列を含む。この配列はポリ（Ａ）テイルの１８ｂｐ上流に過ぎず、おそらくＲＮＡプロセッシングおよびポリアデニル化に用いられている（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎｌｅｅ， １９７６）。
【０１３８】
ＰＴＸ１遺伝子の組織発現および染色体位置決定：ＰＴＸ１−特異的プライマーおよびヒト多組織ｃＤＮＡパネルを用いたＲＴ−ＰＣＲによる発現研究によって、ＰＴＸ１はテストした１６の全てのヒト組織において発現していることが示された（データは示さず）。単染色体体細胞雑種パネルを用いたＰＣＲによる染色体位置決定研究では、ヒト染色体１２またはヒトゲノムＤＮＡコントロールを含むサンプルにおいてのみ予測されたサイズのバンドが生じた（図３）。これらの結果は、ＰＴＸ１遺伝子がヒト染色体１２に位置していることを示すものである。
【０１３９】
ＰＴＸ１タンパク質の細菌での発現および免疫学的位置決定：ＰＴＸ１に対する特異的抗体を作成するために、まず、ＰＴＸ１配列のセグメントを、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）タグとの１２．４ｋＤａの融合タンパク質としてｐＣＡＬ−ｃ発現ベクター中で発現させた。しかし、この融合タンパク質は、Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ． （１９９２）に記載されているようにリフォールディングさせてグアニジンＨＣｌを除去するために透析したところ、不溶性となった。これによってカルモジュリン樹脂を用いて融合タンパク質を精製するのが不可能となった。この問題を解決するために、ｐＣＡＬ−ｃベクターのトロンビン切断配列を、６つの連続するＨｉｓコドンとその後に終止コドンを含む配列と置換した。これによって組換えタンパク質を変性条件下でＴａｌｏｎ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎによって精製することが可能となった（図４）。この方法を用いると、およそ３ｍｇの組換えタンパク質を２００ｍｌの培養液から常套手段によって得ることができる。
【０１４０】
ＰＴＸ１に対する抗血清を用いた、ヒト前立腺および前立腺腫瘍組織の切片の免疫組織化学的分析により、正常前立腺の腺上皮の細胞質および核が染色されるが、前立腺腫瘍については陰性であることが示された（図５）。正常前立腺の切片についての免疫前血清を用いた免疫染色も、陰性の結果を示した（データは示さず）。これは、ＰＴＸ１抗血清による正常前立腺の免疫染色が特異的であったことを示すものである。
【０１４１】
ＰＴＸ１遺伝子のＰＣ−３腫瘍細胞系発現：ＰＴＸ１の機能を解明するために、ＰＴＸ１をコードする核酸分子のコード配列を、テトラサイクリン−抑制性発現プラスミド、ｐＴＲＥ２（Ｔｅｔ−Ｏｆｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ； Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に「センス」および「アンチセンス」の両方の方向性で挿入した。その結果得られた発現コンストラクトを、ｐＴＫ−Ｈｙｇプラスミドとともに、Ｇ４１８耐性、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ−形質移入ＰＣ−３前立腺腫瘍細胞系に共形質移入した。次いで安定な形質移入体をＧ４１８とハイグロマイシンで選抜した。培地からテトラサイクリンを除去することによって、アンチセンスまたはセンスＰＴＸ１ＲＮＡの誘導を行った。誘導により、センスＰＴＸ１コンストラクトを形質移入された細胞の増殖速度と生存細胞数はともに減少したが、アンチセンスＰＴＸ１コンストラクトを形質移入された細胞は、コントロール細胞（ルシフェラーゼ発現コンストラクトを形質移入されたＰＣ−３細胞）よりも速く増殖した。センス、アンチセンスおよびルシフェラーゼコンストラクトを形質移入されたＰＣ−３細胞の成長曲線を図８に示す。センスおよびアンチセンスＰＴＸ１ＲＮＡの誘導は、ＰＴＸ１および発現ベクターに特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによって確かめられた。誘導されたＲＮＡのＰＴＸ１翻訳への効果も、免疫組織化学によって確かめられた（データは示さず）。
【０１４２】
軟寒天アッセイにおいてアンチセンスＰＴＸ１コンストラクトを形質移入された細胞はすぐにコロニーを形成したが、ルシフェラーゼまたはセンスＰＴＸ１コンストラクトで形質移入された細胞はほとんどまたは全くコロニーを形成しなかった。これらの結果はＰＴＸ１が足場依存細胞増殖に対する抑制タンパク質である可能性を示している。
【０１４３】
ＩＩＩ．議論
本発明は、新規なヒト核タンパク質をコードするＰＴＸ１の全長ｃＤＮＡの単離および配列キャラクタリゼーションに関する。このｃＤＮＡは、正常前立腺において発現しているが前立腺癌においては発現していないということに基づいて選択された。それは正常ヒト組織においてはいたるところに発現している。前立腺癌におけるその発現は下方制御されており、そのことはＲＴ−ＰＣＲと免疫組織化学的分析の両方によって確かめられた。推定タンパク質配列はＲＲＬＮＲＫＫ配列（配列番号３）を含み、これは推定二分核定位シグナルである（Ｍｅｌｃｈｉｏｒ ａｎｄ Ｇｅｒａｃｅ， １９９５）。ＰＴＸ１が核に所在することは免疫組織化学的分析によって確かめられた。さらにそれは高度に保存されているため、ヒトＰＴＸ１−特異的プライマーはげっ歯類の対応物も検出することができる（図３）。ＰＴＸ１が核に所在することおよび前立腺癌において下方制御されていることは、ＰＴＸ１が腫瘍抑制遺伝子の候補であることを示唆する。
【０１４４】
ＧｅｎＢａｎｋデータベースに対してＰＴＸ１配列をサーチしたところ、機能が未知のタンパク質をコードする、ＣＤＡ１４として知られる他のｃＤＮＡが見つかった（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。ＰＴＸ１とＣＤＡ１４のヌクレオチド配列相同性分析により、これらは高度に類似していることが判明した。しかし、これら２つのｃＤＮＡにはいくつかの重要な違いがある（図６）。ＣＤＡ１４は５’末端においてＰＴＸ１よりも２塩基対（ｂｐ）長い。しかし、これら２つの余分な塩基対はゲノム配列には存在しない（以下により詳細に説明する）。その３’−非翻訳領域もＰＴＸ１よりも４２ｂｐ長い。これは異なるポリアデニル化部位の利用による可能性がある。ｍＲＮＡに多数のポリアデニル化部位が存在することは珍しくなく、ブタプロホルモン転換酵素ＰＣ１／３（Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．， １９９５）などの他のｍＲＮＡにおいて存在していることが報告されている。ＣＤＡ１４のコード領域において塩基６９６，７１５および７３１に３つの１塩基挿入があり、これは推定タンパク質配列の位置２０３−２１１における１１残基を変化させるものである（図７）。このアミノ酸配列の変化はタンパク質の構造と機能を有意に変化させるものである。塩基２３９および８８７においても２つの１塩基相違があり、それぞれ１コドンに影響を及ぼしている。これらの配列の不一致の１つの可能性のある説明は、ＣＤＡ１４が、クロム親和細胞腫から単離されたことより、自然突然変異体である可能性があるということである。
【０１４５】
ＧｅｎＢａｎｋデータベースでのサーチによりヒト染色体１２ｐの２０３ｋｂ断片においてＰＴＸ１遺伝子が同定された（Ｍｕｚｎｙ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。これもまた、ＰＴＸ１遺伝子の染色体位置決定を確認するものである。このゲノム配列とｃＤＮＡ配列とを比較することにより、エキソンの位置と大きさを決定することができる。ＰＴＸ１遺伝子は４０ｋｂを少し超えて広がっており、４１−１４３ｂｐの１４のエキソンと、０．５−９．４ｋｂの１３のイントロンを含んでいる（図９；配列番号６−３１）。ＴＡＴＡまたはＣＡＡＴプロモーター要素は５’−側方配列において存在しない。ゲノム配列はまた、ＣＤＡ１４のコード領域の塩基６９６、７１５および７３１における３つの１塩基挿入を否定するが、塩基２３９および８８７におけるＣＤＡ１４の２つの１塩基変化は肯定する（図６）。
【０１４６】
染色体１７の喪失が前立腺の腫瘍形成の初期段階で起こることがあるが、染色体１２（特に１２ｐ）の喪失はより進行した段階で起こることがある（Ｂｒｏｔｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｋｉｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。微量キュベット−媒介染色体移行を用いて、１２ｐｔｅｒ−ｑ１３に対応するヒト染色体１２の部分が前立腺腫瘍抑制活性を有することが示された（Ｂｅｒｕｂｅ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。一方、同じ技術を用いて、ヒト染色体１２の７０−ｃＭ部分が転移を抑制するが腫瘍形成は抑制しないことが示された（Ｌｕｕ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。
【０１４７】
別の実験によりＰＴＸ１はヒト前立腺組織における足場依存細胞増殖も抑制することが示唆される。ＰＴＸ１をコードする核酸分子のＰＣ−３前立腺腫瘍細胞系における発現の結果、細胞増殖が低下したが、ＰＴＸ１をコードする核酸のアンチセンスの発現は、細胞増殖の上昇を引き起こした（図８）。したがって、ＰＴＸ１の翻訳がアンチセンスＲＮＡによって阻害されると細胞は制御を失って成長することになる。しかし、ＰＴＸ１を過剰発現させると、細胞増殖は抑止される。これらの結果から、ＰＴＸ１がヒト前立腺癌における細胞成長および腫瘍進行の抑制において重要な役割を有することが強く示唆される。
【０１４８】
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【０１６１】
Ｓｏｎｇ， Ｈ．， Ｇａｏ， Ｇ．， Ｐｅｎｇ， Ｙ．， Ｒｅｎ， Ｓ．， Ｃｈｅｎ， Ｚ．， ａｎｄ Ｈａｎ， Ｚ． （２０００）． Ａ ｎｏｖｅｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ． ＧｅｎＢａｎｋ ｄａｔａｂａｓｅ， ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ： ＮＭ＿０１６５７０ ａｎｄ ＡＦ２１６７５１．
【０１６２】
本発明のいくつかの好適な態様について上記に詳細に例証したが、本発明がそれらの態様に限定されることを意図したものではない。特許請求の範囲に記載する、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、それらに対する様々な改変が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、４つの選択されたクローンについてのＲＴ−ＰＣＲによるディファレンシャル発現を示すゲルである。ファーストストランドｃＤＮＡを正常前立腺（Ｎ）および前立腺腫瘍（Ｔ）から単離したトータルＲＮＡ１０μｇから合成した。ｃＤＮＡの２μｌのアリコットを各クローンに特異的なプライマーを用いて増幅した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで分析した。分子サイズマーカー（Ｍ）はＢｓｔＮＩで消化したｐＢＲ３２２ＤＮＡであった。クローン１４９と３４８は、正常前立腺（Ｎ）においてバンドが存在するが前立腺腫瘍（Ｔ）においては存在しないことによって示されるように、正常前立腺においてのみ発現していた。クローン３４１と３９４は正常前立腺と前立腺腫瘍の両方で発現していた。クローン３４８をさらなるキャラクタリゼーションのために選び、本明細書においてＰＴＸ１と称する。
【図２】図２は、全長ＰＴＸ１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。オーバーラップするｃＤＮＡを組み合わせたヌクレオチド配列とそのＰＴＸ１タンパク質への翻訳を５’から３’方向において示す。ヌクレオチド配列とアミノ酸配列（配列番号２）の番号付けは、右側に示す。ＡＡＴＡＡＡ配列に下線を引いてある。
【図３】図３は、ＰＴＸ１遺伝子がヒト染色体１２に位置づけられるということを示すゲルである。２４の体細胞雑種のパネルのＤＮＡサンプルと３つのゲノムＤＮＡコントロールを、方法において記載したＰＴＸ１−特異的プライマーを用いて増幅させた。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで分析した。レーン１，２，３，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２１，２２のＤＮＡサンプルは、その番号に対応する単一のヒト染色体を含む。レーン４のサンプルは２つのヒト染色体、４および７を含む。レーン２０のサンプルは３つの染色体、２０、８および４を含む。レーン２３，２４，２５，２６および２７のサンプルは、染色体Ｘ、染色体Ｙ、ヒトＤＮＡ、ハムスターＤＮＡおよびマウスＤＮＡをそれぞれ含む。分子サイズマーカー（Ｍ）はＨｉｎｄＩＩＩで消化したラムダＤＮＡであった。ヒト染色体１２およびヒトＤＮＡを含むサンプルのみにおいて２ｋｂのバンドが生じ（レーン１２および２５）、これによりＰＴＸ１遺伝子はヒト染色体１２に位置付けられることが示される。全てのレーン（レーン２５を除く）に存在する小さいサイズのバンドは、げっ歯類ＰＴＸ１遺伝子に関連するものであろう。
【図４】図４は、組換えＰＴＸ１タンパク質の、Ｔａｌｏｎ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎカラムでの精製を示すゲルである。組換えタンパク質を細菌宿主から抽出し、実施例１に記載のようにＴａｌｏｎ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎカラムで精製した。レーン１は全タンパク質を含むものであり；レーン２は組換えＰＴＸ１タンパク質の第一の溶出を含むものであり；レーン３はＰＴＸ１タンパク質の第二の溶出を含むものであり；そしてレーン４は分子量マーカーを含むものであった。
【図５】図５は、正常前立腺および前立腺腫瘍におけるＰＴＸ１タンパク質の免疫局在性を示す顕微鏡写真である。切片を組換えヒトＰＴＸ１に対するウサギ抗血清を用いてＰＴＸ１の存在について染色した。赤色部分は陽性の免疫反応性産物を示す。正常腺上皮の細胞質と核の両方が強い染色を示したが、腫瘍領域は染色を示さなかった。
【図６】図６は、ＰＴＸ１およびＣＤＡ１４のｃＤＮＡ（それぞれ配列番号１および４）のヌクレオチド配列比較を示す。アラインメントはＰＴＸ１のヌクレオチド配列（上段、本研究）とＣＤＡ１４の公表配列（下段、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０００）とに基づくものであった。アラインメントを至適化するために必要な箇所にはギャップを導入した。垂直の線は同一のヌクレオチドを示す。コード配列において単一塩基差が５つあることに注目されたい。
【図７】図７は、ＰＴＸ１とＣＤＡ１４タンパク質との推定アミノ酸配列のアラインメントを示す。ＰＴＸ１のアミノ酸配列（上段；配列番号２）とＣＤＡ１４（下段；配列番号５）がアラインされ、相同性を最大化するために必要な箇所にはギャップが導入された。垂直の線は同一の残基を示す。３つの単一塩基挿入により読み枠の変化が起こっていることに注目されたい。
【図８】図８は、様々な発現コンストラクトで形質移入されたＰＣ−３前立腺腫瘍細胞の、インヴィトロの成長曲線のグラフを示す。ＰＴＸ１アンチセンスＲＮＡを発現する細胞の増殖を四角で示す；ルシフェラーゼＲＮＡを発現する細胞の成長を丸で示す；そしてＰＴＸ１ＲＮＡを発現する細胞の成長を三角で示す。結果は３つの別々の実験の平均である。
【図９】図９は、受託番号ＡＣ００９３１８（Ｍｕｚｎｙ ｅｔ ａｌ．， ２０００）で寄託されたゲノム配列から決定したヒトＰＴＸ１遺伝子のエキソン−イントロンジャンクションを示す。ここに示すエキソン−イントロンジャンクションの配列は、公表されたゲノム配列（配列番号６−３１）に対して相補的である。エキソン配列は大文字で示し、イントロン配列は小文字で示す。エキソン配列の上に示す数字は、ゲノム配列上のエキソンの境界を示す。
【図１】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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