(57)【要約】生物におけるグルコース濃度を低下させる組成物および方法を提供する。特に意図される組成物には、タウマチン様蛋白質に結合し、植物から単離される化合物が含まれる。意図される組成物はさらに、グルコース濃度を低下させるために有効な濃度で血中の脂質濃度を低下させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む組成物：
タウマチン様蛋白質に結合する化合物であって、化合物がグルコース濃度を低下させるために有効な濃度で生物に投与されると、生物におけるグルコース濃度を低下させる化合物。
【請求項２】
化合物が植物から単離される、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
植物がイネ科（ｐｏａｃｅａｅ）植物である、請求項２記載の組成物。
【請求項４】
植物がオオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）である、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
化合物が、麦芽処理、ひきつぶし、塩抽出、緩衝液抽出、エタノール抽出、陰イオン交換クロマトグラフィー、および分子ふるいからなる群より選択される少なくとも一つの方法を用いて単離される、請求項２記載の組成物。
【請求項６】
化合物の分子量がわずか１０００ Ｄａである、請求項１記載の組成物。
【請求項７】
化合物のＵＶ吸収極大が約２６０ ｎｍである、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
化合物が少なくとも１０ ｍｇ／ｍｌの濃度で親油性溶媒において可溶性である、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
化合物が新たに合成される、請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
タウマチン様蛋白質がオオムギから単離される、請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
トコールをさらに含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
化合物が、グルコース濃度を低下させるために有効な用量で血中の脂質濃度をさらに低下させる、請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
脂質がトリグリセリド、脂肪酸、ＨＤＬ−コレステロール、およびＬＤＬ−コレステロールからなる群より選択される、請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
生物が哺乳類である、請求項１記載の組成物。
【請求項１５】
哺乳類が非インスリン依存型真性糖尿病であると診断される、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
グルコース濃度が血中のグルコース濃度を含み、血中グルコース濃度が１２０ ｍｇ／ｄｌを超える、請求項１４記載の組成物。
【請求項１７】
血中グルコース濃度が２００ ｍｇ／ｄｌを超える、請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
以下を含む組成物：
植物種子が麦芽処理され、抽出物が水性抽出段階を含むプロトコールを用いて麦芽処理された植物種子から調製され、
抽出物がグルコース濃度を低下させるために有効な濃度で生物に投与された場合に、抽出物が生物におけるグルコース濃度を低下させる、植物種子抽出物。
【請求項１９】
植物種子が、オオムギの種子である、請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
麦芽処理が３０℃〜６５℃の間の温度で行われる、請求項１８記載の組成物。
【請求項２１】
抽出段階に、水性緩衝液による抽出が含まれる、請求項１８記載の組成物。
【請求項２２】
グルコース濃度が血中グルコース濃度を含み、生物がヒトである、請求項１８記載の組成物。
【請求項２３】
以下を含む、生物におけるグルコース濃度を低下させる方法：
タウマチン様蛋白質に結合する化合物を含む組成物を提供する段階；および
グルコース濃度を低下させるために有効な用量で生物に組成物を投与する段階。
【請求項２４】
生物がヒトである、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ヒトが非インスリン依存型真性糖尿病と診断される、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
グルコース濃度が血中のグルコース濃度を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
血中のグルコース濃度が１２０ ｍｇ／ｍｌを超える、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
血中のグルコース濃度が２００ ｍｇ／ｍｌを超える、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
化合物が植物から単離される、請求項２３記載の方法。
【請求項３０】
植物がオオムギである、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
化合物の分子量が１０００ Ｄａに過ぎず、少なくとも１０ ｍｇ／ｍｌの濃度で親油性溶媒に可溶性であり、ＵＶ吸収極大が約２６０ ｎｍである、請求項２３記載の方法。
【請求項３２】
化合物が麦芽処理、ひきつぶし、塩抽出、緩衝液抽出、エタノール抽出、陰イオン交換クロマトグラフィー、および分子ふるいからなる群より選択される少なくとも一つの方法を用いて単離される、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
化合物が新たに合成される、請求項２３記載の方法。
【請求項３４】
投与する段階が経口投与を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項３５】
組成物がグルコース濃度を低下させるために有効な用量で血中脂質濃度をさらに低下させる、請求項２３記載の方法。
【請求項３６】
脂質がトリグリセリド、脂肪酸、ＨＤＬ−コレステロール、およびＬＤＬ−コレステロールからなる群より選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項３７】
組成物がさらにトコールを含む、請求項２３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明の分野は食品補助剤および関連する方法である。
【０００２】
発明の背景
血中グルコースおよび血中脂質の上昇は、多数の疾患における比較的一般的な基礎状態であり、様々な方法で起こりうる。他の原因の中でも、血中グルコースレベルの上昇はしばしば、糖尿病状態に関連した代謝の変化によって促進され、糖尿病状態の治療にはしばしば、メトホルミン、スルホニル尿素等のような合成経口抗糖尿病薬と共に、インスリン治療が含まれる。血中脂質および血中グルコースが上昇した人において何らかの臨床パラメータが改善するにもかかわらず（すなわち、少なくともある程度の血中グルコースの低下）、インスリン抵抗性、アレルギー反応等を含む様々な副作用が、インスリンを用いる長期治療によって生じる可能性がある。
【０００３】
糖尿病、特に非インスリン依存型真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）のもう一つの治療はしばしば、酵母、または酵母の誘導体に基づく。酵母は、クロム塩の存在下で増殖することができ、そのようにして増殖した酵母細胞または酵母抽出物は、インスリンの生物作用を増強することが知られている化合物である「耐糖能因子（ＧＴＦ）」が特に豊富である。いくつかの酵母調製物は、上昇した血中グルコース濃度を低下させるために役立つが、多くの場合、高血糖状態を改善するためにはかなりの量の酵母調製物をかなりの期間摂取しなければならない。その上、長期間に及ぶ酵母調製物の長期使用は、いくらかの患者、特に、酵母感染症の既往を有する患者にとっては問題となる傾向がある。なおさらに、多くの粗酵母調製物は味が苦く、患者によっては、不快である可能性がある。
【０００４】
酵母調製物に関連した問題の少なくともいくつかを軽減するために、濃縮して、苦みのない、凍結乾燥した酵母調製物が開発されている。そのような調製物は、典型的に錠剤型であり、食事の際に都合よく摂取することができる。しかし、そのような細胞／抽出物の比較的高度の処理は、酵母調製物の生物活性を低下させる可能性がある。その上、少なくともいくつかの抗高血糖活性を維持するためには、保存剤および添加剤（例えば、錠剤を圧縮またはそうでなければ成形するため）が典型的に必要である。
【０００５】
非インスリンに基づく血中グルコースを低下させるなお他の方法において、ピコリン酸クロムを投与してもよい。ピコリン酸クロムは、ヒトにおいて上昇した血中グルコースを低下させるために中等度に有効であると報告されている。しかし、ピコリン酸クロムは、かなりの毒性を示し、したがって、一般的に安全でないと見なされる可能性がある。
【０００６】
高い血中グルコース濃度を低下させる様々な方法が当技術分野で既知であるが、それらの全てまたはほとんど全てが一つまたはそれ以上の短所を有する。したがって、依然としてグルコース濃度を低下させる改善された組成物および方法を提供する必要がある。
【０００７】
発明の概要
本発明は、生物においてグルコース濃度を低下させる組成物および方法に向けられる。より詳しく述べると、意図される組成物は、タウマチン様蛋白質に結合して、グルコース濃度を低下させるために有効な濃度で化合物を生物に投与した場合に生物におけるグルコース濃度を低下させる化合物を含む。
【０００８】
本発明の主題の一つの局面において、化合物は、植物、好ましくはイネ科（Ｐｏａｃｅａｓｅ）に属する植物、および最も好ましくはオオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）から単離される。意図される単離方法には、麦芽処理、ひきつぶし、塩抽出、緩衝液抽出、エタノール抽出、陰イオン交換クロマトグラフィー、および分子ふるいが含まれる。または、意図される化合物は、少なくとも部分的に新たに合成してもよい。
【０００９】
本発明の主題のもう一つの局面において、意図される化合物は疎水性であり、分子量は１０００ Ｄａに過ぎず、少なくとも１０ ｍｇ／ｍｌの濃度で親油性溶媒に可溶性であり、ＵＶ／ＶＩＳ吸収最大は約２６０ ｎｍである。特に好ましい局面において、組成物はさらに、血中脂質（例えば、トリグリセリド、脂肪酸、ＨＤＬ−コレステロール、およびＬＤＬコレステロール）濃度を低下させ、本発明の主題のなおさらなる局面において、組成物はさらに、トコール、ビタミン、または血中グルコースおよび／または血中脂質の調節において活性であっても活性でなくてもよい他の食品補助剤を含んでもよい。
【００１０】
本発明の主題のさらなる局面において、生物におけるグルコース濃度を低下させる方法は、タウマチン様蛋白質に結合する化合物を含む組成物が提供される段階を含む。もう一つの段階において、意図される組成物は、グルコース濃度を低下させるために有効な用量で生物に投与される。
【００１１】
本発明の様々な目的、特徴、局面および長所は、以下の本発明の好ましい態様の詳細な説明からより明らかとなると思われる。
【００１２】
詳細な説明
本発明において用いられるように、「タウマチン様蛋白質に結合する化合物」という用語は、他のオオムギ蛋白質に対する結合と比較して、オオムギからのタウマチン様蛋白質に対して少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも１００倍の結合選択性を示す任意の化合物または化合物の混合物を意味し、意図される化合物のタウマチン様蛋白質に対する結合は、好ましくはＫＤが１０−３Ｍ未満、より好ましくは１０−４Ｍ未満であると考えられる。結合様式は、一つの相互作用（例えば、疎水性相互作用）に限定される必要はなく、多数の相互作用（例えば、静電気的相互作用および水素結合等）を含んでもよい。結合は可逆的であるが、非可逆的結合も除外されないと特に考えられる。オオムギからのタウマチン様蛋白質は、本発明の主題に従う化合物の一般的に好ましい結合パートナーであるが、微生物、植物、および動物を含む別の起源からのタウマチン様蛋白質も同様に考慮される。タウマチン様蛋白質は、十分に特徴が調べられたクラスのポリペプチドであり、例えば、その全てが参照として本明細書に組み入れられる、チェトコビッチ（Ｃｖｅｔｋｏｖｉｃ）ら（Ｊ． Ｓｅｒｂ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ６２（９）：７７７〜７８６（１９９７））、チェトコビッチ（Ｃｖｅｔｋｏｖｉｃ）ら（Ｊ． Ｓｅｒｂ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ６２（１）：５１〜５６（１９９７））、およびチェトコビッチ（Ｃｖｅｔｋｏｖｉｃ）ら（Ｊ． Ｉｎｓｔ． Ｂｒｅｗ． １０３：１８３〜１８６（１９９７））に記載されている。
【００１３】
同様に、本明細書において用いられるように、「グルコース濃度の上昇」という用語は、正常と見なされる臨床範囲より上である濃度（すなわち、１１０ ｍｇ／ｄｌ以上）を意味する。同様に、「脂質濃度の上昇」という用語は、正常と見なされる臨床範囲より上である血中脂質濃度を意味する。
【００１４】
図１において、生物におけるグルコース濃度を低下させる方法１００は、タウマチン様蛋白質に結合する化合物を含む組成物が提供される段階１１０を有する。続く段階１２０において、組成物を、グルコースの血中濃度を低下させるために有効な用量で哺乳類に投与する。
【００１５】
本発明の主題の特に好ましい局面において、組成物はオオムギから調製し（下記の実施例に概要するように）、非インスリン依存型真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）と診断された人に１日３回各々５００ ｍｇを経口投与する。このように、特に好ましい組成物には、タウマチン様蛋白質に結合して、グルコース濃度を低下させるために有効な濃度で化合物を生物に投与した場合に生物におけるグルコース濃度を低下させる化合物が含まれる。
【００１６】
本発明の主題のもう一つの局面において、適当な組成物および化合物は、オオムギからの調製物に限定される必要はなく、オオムギ以外の様々な植物からの調製物を含んでもよく、特に意図されるもう一つの植物には、オオムギ種、およびイネ科植物が含まれる。意図される組成物および／または化合物の調製物は好ましくは植物抽出物由来であるが、意図される組成物および／または化合物はまた、意図される化合物がタウマチン様蛋白質に結合して、生物におけるグルコース濃度を低下させる限り、微生物（すなわち、細菌、真菌、酵母、単細胞真核生物）、または動物から単離してもよい。
【００１７】
なおさらなるもう一つの局面において、意図される化合物は、均一になるまで単離、精製してもよく、構造を解明してもよいと認識すべきである。その結果、意図される化合物および／または組成物は、インビトロで完全に（新たに）または部分的に合成／改変してもよいと認識すべきである。例えば、意図される化合物が部分合成される場合、意図される化合物の前駆物質を植物または微生物から単離してもよく、次に意図される化合物に達するように一つまたはそれ以上の段階を行ってもよい。または、意図される化合物を一つまたはそれ以上の段階において改変して、特に望ましい物理化学的特性を付与してもよい。例えば、意図される化合物は、極性化合物（例えば、ポリエチレングリコール）によってエステル化して、水溶性を増加させてもよい。もう一つの例において、意図される化合物は、生物に対する放出速度を制御するために、樹脂またはその他の材料にカップリングさせてもよい。
【００１８】
好ましい意図される化合物は比較的低い分子量を有し、典型的に１０００ Ｄａに過ぎないが、分子量はかなり変動し、化合物が単離される起源、合成による改変、二量体形成、および多量体形成に大きく左右されると認識すべきである。同様に、適した化合物は、約２６０ ｎｍでＵＶ吸収極大を有する化合物に限定される必要はなく（下記に概要する方法を用いて単離された意図される化合物について特徴的である）、ＵＶ２６０のピーク以外の様々な光学的特徴も同様に適している。同様に、オオムギから単離された意図される化合物は、少なくとも１０ ｍｇ／ｍｌの濃度で親油性溶媒に溶解性であるが、より高いまたはより低い溶解性も同様に意図され、典型的に、意図される化合物が単離された起源、および／または意図される化合物のさらなる化学修飾に依存すると考えられる。本明細書において用いられるように「親油性溶媒」という用語には、水との混和性が１０容量％未満である全ての溶媒が含まれる。
【００１９】
意図される化合物は化学的に実質的に純粋であることが一般的に好ましいが（すなわち、意図される化合物の濃度は９０重量％を超える、好ましくは９５重量％以上、最も好ましくは９９重量％を超える）、意図される化合物は一つまたはそれ以上のある分子にカップリングしてもよく、特に意図される分子には、タウマチン様蛋白質が含まれるとも認識すべきである。このように、意図される組成物には、意図される化合物とタウマチン様蛋白質との複合体が含まれ、特に、意図される化合物と適当な起源から単離されるタウマチン様蛋白質との複合体が含まれる（下記）。
【００２０】
グルコース濃度に関して、グルコース濃度は血中グルコース濃度であると一般的に意図される。しかし、さらに意図されるグルコース濃度には、生体内に認められる分子に共有結合または非共有結合したグルコース濃度も含まれ、特に意図されるもう一つのグルコース濃度には、グリコシル化蛋白質濃度が含まれる（例えば、グリコシル化ヘモグロビンまたはコラーゲン）。
【００２１】
適したタウマチン様蛋白質は、オオムギから単離されると一般的に考えられるが、代わりのタウマチン様蛋白質も同様に考慮され、組換え系において発現されてもよく、またはされなくてもよい微生物、植物、および動物から単離されたタウマチン様蛋白質が含まれる。当技術分野で既知のタウマチン様蛋白質の単離に関して様々なプロトコールが存在し（例えば、バール（Ｂａｒｒｒｅ）ら、「熟したバナナの果実からの大量のタウマチン様蛋白質の精製と構造分析（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎ ａｂｕｎｄａｎｔ ｔｈａｕｍａｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｒｉｐｅ ｂａｎａｎａ ｆｒｕｉｔ）」、Ｐｌａｎｔａ ２０００、１１月号；２１１（６）：７９１〜９）；オウ（Ｏｈ）ら（「リンゴの果実に大量に発現される３１ ｋＤａの病原性関連−５／タウマチン様（ＰＲ５／ＴＬ）蛋白質をコードするｃＤＮＡの単離（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ３１−ｋＤａ， ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄ ５／ｔｈａｕｍａｔｉｎ−ｌｉｋｅ （ＰＲ５／ＴＬ）ｐｒｏｔｅｉｎ ａｂｕｎｄａｎｔｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ａｐｐｌｅ ｆｒｕｉｔ．）」、Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０００、２月号；６４（２）：３５５〜６２）；タターサルら（Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌ、「ブドウにおける糖蓄積開始と漿果の軟化に関連して非常に高レベルで蓄積する果実特異的タウマチン様蛋白質の同定と特徴付け（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｒｕｉｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ， ｔｈａｕｍａｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｓ ａｔ ｖｅｒｙ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｎｓｅｔ ｏｆ ｓｕｇａｒ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｅｒｒｙ ｓｏｆｔｅｎｉｎｇ ｉｎ ｇｒａｐｅｓ）」、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １９９７、７月号；１１４（３）：７５９〜６９）、既知の全てのプロトコールは、本明細書に示した開示と共に用いるために適していると見なされる。
【００２２】
意図される組成物は、ＮＩＤＤＭを患っている人における血中グルコース濃度の上昇を低下させるのみならず、肥満、食事の影響等を含むＮＩＤＤＭ以外の理由のために血中グルコース濃度が上昇した人における血中グルコース濃度も低下させる可能性があると特に認識すべきである。ＮＩＤＤＭを有する、または有さない人は、血中グルコース濃度が少なくとも９０ ｍｇ／ｄｌ、より好ましくは少なくとも１２０ ｍｇ／ｄｌ、および最も好ましくは少なくとも２００ ｍｇ／ｄｌであると特に考えられる。
【００２３】
さらに、意図される組成物はまた、上昇した血中脂質濃度（下記）を都合よく低下させることが示されており、この場合血中脂質には特に、トリグリセリド、脂肪酸、ＨＤＬ−コレステロール、およびＬＤＬ−コレステロールが含まれ、血中脂質の低下は血中グルコースレベルの低下と同時に起こってもよく、または血中グルコースレベルの低下と無関係であってもよいとさらに考えられる。
【００２４】
本発明の主題のさらなる局面において、意図される組成物はさらに、血中脂質濃度を低下させることが知られている組成物、および／または血糖濃度を低下させることが知られている組成物を含む活性または不活性成分をさらに含んでもよいと認識されるべきである。例えば、代わりの組成物は、トコール、ビタミン類、および／または無機質調製物、ＧＴＦ、メトホルミン、スルホニル尿素等の少なくとも一つを含んでもよい。不活性成分には、増量剤、着色剤、安定化剤等が含まれる。
【００２５】
このように、上昇した血中のグルコース濃度が約１５０ ｍｇ／ｍｌであって、上昇した血中の総コレステロール濃度が約２８０ ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上である人（例えば、ＮＩＤＤＭと診断された人）を治療する例示的な方法は、意図される組成物が提供される一つの段階を有する。さらなる段階において、組成物は、グルコース濃度を低下させるために有効な用量で人に投与される。
【００２６】
血中グルコースレベルに関して、本発明の主題に従う治療が、約１５０ ｍｇ／ｄｌの血中グルコースレベルに限定される必要はないが、これはまた、７０〜１１０ ｍｇ／ｄｌ以上の多くのグルコース濃度において必要とされる可能性があると考えられる。特定の理論またはメカニズムに拘束されたくはないが、血中グルコースレベルの低下は、細胞へのグルコース取り込みの増強による可能性があると考えられる。しかし、本発明の主題に従う組成物は、非ＧＴＦ組成物であることに注意しなければならない。意図される治療の期間は有意に変化してもよく、適した期間は１回投与の範囲内であってもよく、同様に、１週間、数週間、数ヶ月、およびさらに数年を含む既定の期間であってもよい。その結果、本発明の主題に従う組成物はまた、高血糖症、または何らかの形の異常脂血症を予防するために人に予防的に投与してもよいと認識される。
【００２７】
本発明の主題のさらにもう一つの局面において、組成物は、人以外の生物に投与してもよく、特に好ましい代わりの生物には、家畜（例えば、ウシ、ブタ、ウマ等）およびペット（例えば、イヌ、ネコ、齧歯類、トリ等）が含まれる。意図される組成物に関して上記と同じ検討が適用される。
【００２８】
本発明の主題に従う治療によって、特に肥満、ＮＩＤＤＭ、または体重増加に関連したその他の病態を有する人において有意な体重低下が起こる可能性があると特に考えられる。本発明の主題に従う治療は、血中グルコースの低下のみに限定されず、特定の脂質または脂質群の低下が同時に（または単独で）含まれる可能性があると一般的に考えられる。例えば、総コレステロールのわずかな上昇（例えば、２２０ ｍｇ／ｄｌ）は、意図される化合物による治療の適応となる可能性がある。または、ＨＤＬとＬＤＬとの不均衡（すなわち、ＬＤＬ＞＞ＨＤＬ）は、本発明の主題に従う治療を用いて正常となる可能性があると考えられる。同様に、患者における総コレステロールが上昇する必要はないが、トリグリセリドレベルの上昇により意図される方法による治療がなおも必要とされる可能性がある。
【００２９】
用量、投与剤形、および投与経路に関して、５００ ｍｇを１日３回毎日経口投与の他にも多くの代わりの経口調製物が存在すると考えられる。例えば、比較的高用量を必要とする場合、用量は５００ ｍｇ〜５ｇ／日またはそれ以上まで増加してもよい。抽出物の効力が比較的弱い場合、より高い用量をまた必要としてもよい。同様に、低用量（例えば、維持療法）を必要とする場合、または抽出物の効力が比較的高い場合、５００ ｍｇ〜２５ ｍｇまたはそれ未満の１日量が適当である。したがって、他のパラメータの中でも患者の特定の病態および調製物の効力は、適用回数を少なくとも部分的に左右すると一般的には考えられる。例えば、高用量を患者に投与する場合、４〜６回およびそれ以上を含む１日３回を超えるの用量が考えられる。低用量、特に、５００ ｍｇ／日より低い用量を考慮する場合、１回、２日に１回、またはより少ない投与が適当である。
【００３０】
当然、投与剤形はかなり変化してもよいと認識すべきでもある。例えば、経口投与は錠剤に限定される必要はなく、代わりの経口投与剤は、粉末、ゲルカプセル剤、シロップ剤、ゲル等を含んでもよい。経口投与が望ましくない場合、注射剤、経皮、肺内、または鼻腔内輸送を含む代わりの経路も同様に適当であるとさらに考えられる。
【００３１】
実施例
以下の実施例は、本発明の主題に従う意図される化合物を作製および使用するための様々な実験方法を提供する。実施例１および２はそれぞれ、本発明の主題に従う組成物を作製するための基礎的および改善された方法を記述する。実施例１および２の方法に従って単離された化合物の生物活性を実施例３および４に記載し、実施例５は、タウマチン様蛋白質に対する意図される化合物の特異的結合に関する実験的根拠を提供する。
【００３２】
実施例１
オオムギの穀粒をビールの醸造の技術分野で周知の方法に従って、麦芽処理した（例えば、「醸造科学の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｒｅｗｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、第二版、ジョージＪ． フィックス（Ｇｅｏｒｇｅ Ｊ． Ｆｉｘ）；醸造出版；ＩＳＢＮ：０９３７３８１７４８、または「テッド・ゴールドハンマーの醸造ハンドブック（Ｔｈｅ Ｂｒｅｗｅｒｓ’ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｂｙ Ｔｅｄ Ｇｏｌｄｈａｍｍｅｒ）」；ＫＶＰ出版；ＩＳＢＮ：０９６７５２１２０３を参照のこと）。麦芽から可溶性物質を抽出して、制御された酵素的変換によってさらなる不溶性の固体を可溶性の物質に変換するために、典型的な醸造のスケジュールに従って、すりつぶした麦芽（水に懸濁）に洗浄段階を続いて適用した。温度サイクルは以下の通りであった：４０℃で６０分間のインキュベーション、５０℃で６０分間のインキュベーション、６０℃で６０分間のインキュベーション、７２℃で６０分間のインキュベーション、および７５〜８０℃で６０分間のインキュベーション。試料の可溶性部分を殻およびその他の不溶性物質から分離して、凍結乾燥した。
【００３３】
４０℃でひきつぶした後に得られた凍結乾燥したオオムギ抽出物を、その成分に分画するための基礎とした。第一の画分は、ｐＨ ７．８の５０ ｍＭリン酸緩衝液によって平衡にしたＤＥＡＥセファセルカラム（２．６×２０ ｃｍ）を用いる調製用液体クロマトグラフィーによって行った。凍結乾燥試料１５０ ｍｇを緩衝液１０ ｍｌに溶解して、カラムに載せた。直線的ＮａＣｌ勾配（０〜０．５ Ｍ）を流速１０ ｍｌ／ｈで流した。画分（各２ｍｌ）を回収して、溶出を２８０ ｎｍでモニターした。ＤＥＡＥクロマトグラフィーによって、明確な４つの蛋白質ピーク画分が得られた：Ｉ−塩基性、ＩＩ−中性、ＩＩＩ−およびＩＶ−酸性。それぞれのピーク画分を回収して、脱塩し、カットオフの孔サイズが１０００ダルトンであるメンブレンを用いるメンブレン限外濾過によって濃縮し、濃縮した対応する画分が、酵母の発酵速度に影響を及ぼすか否かを調べた。塩基性画分Ｉは有意な阻害作用を示したが（すなわち、酵母発酵速度の減少）、残りの３つの濃縮画分はほとんど不活性であった。後に同定できるが（データは示していない）、画分Ｉにおける主な蛋白質様成分はタウマチン様蛋白質を表す。プールした蛋白質画分Ｉ〜ＩＶ（すなわち、イオン交換クロマトグラフィーによって得られた画分）のメンブレン限界濾過の際に、いくつかの画分の濾液が、約２６０ ｎｍでのＵＶ吸収極大を示すＬＭＷ（低分子量）物質を含むことが認められた。これらの知見が元となり、本発明者らは、分子ふるいクロマトグラフィーを用いてこれらの画分の蛋白質からこれらのＬＭＷ物質を分離した。
【００３４】
その目的のため、ＤＥＡＥ−セファセルカラムＩ〜ＩＶによる４つの分離された画分をプールして凍結乾燥した。セファデックスＧ−７５〜５０カラム（２．８×８０ ｃｍ）上で、０．５ Ｍ ＮａＣｌを含むｐＨ ７．８の５０ ｍＭリン酸緩衝液によって分子ふるいクロマトグラフィーを行った（流速−１２ ｍｌ／ｈ、画分２ｍｌ、溶出は２６０ ｎｍで記録）。吸光度が２６０ ｎｍ付近のＬＭＷ化合物は比較的高い溶出容量で溶出された。分離された画分に、個々にセファデックスＧ−７５〜５０カラム上での分子ふるいを行うと、ＬＭＷ化合物は、分離終点付近で溶出され、これらは典型的に６０〜８０番目の画分の間にあった。これらの画分はＧＭＭ−１、ＧＭＭ−２、およびＧＭＭ−４と命名された。またこの画分はＬＭＷ成分で構成される。
【００３５】
ＧＭＭ−１、ＧＭＭ−２、およびＧＭＭ−４は全て、酵母の発酵を増強し、タウマチン様蛋白質に強くかつ可逆的に結合し（低塩濃度でタウマチン様蛋白質に結合し、高塩濃度でタウマチン様蛋白質から遊離される）、ＮＩＤＤＭと診断された人における高い血中グルコース濃度および高い血中脂質濃度を低下させた。
【００３６】
実施例２
麦芽処理したオオムギ粉２０ ｇを水８０ ｍｌに懸濁して、室温で一晩攪拌した。懸濁液に０．８ Ｍ ＮａＣｌ溶液１２０ ｍｌを加えて、攪拌しながら塩抽出を２４時間継続した。水性抽出物をセルロースフィルターパッド上で減圧濾過によって懸濁液から分離した。または、クエン酸もしくはその他の緩衝液も同様に、水性抽出物の調製にとって適していると考えられる。
【００３７】
濾過した抽出物を凍結乾燥するか、または減圧蒸発させた。そのようにして得られた乾燥麦芽抽出物（収率約１２〜１４ ｇ）は、抽出溶媒を起源とするＮａＣｌ ５．６ ｇと水溶性オオムギ成分の複雑な混合物とを含んだ。濾過した凍結乾燥抽出物を、温エタノール５０ ｍｌずつ２回にわけて激しく攪拌しながら２時間抽出することによって精製した。エタノール抽出物を濾過して、合わせ、減圧下で蒸発させて油性残査を得た。油性残査を水１５ ｍｌに再度溶解して凍結乾燥すると、硬いガラス状の黄色がかった産物が全量で約３ｇ得られた。
【００３８】
ガラス状の黄色がかった産物は酵母の発酵を増強し、タウマチン様蛋白質に強くかつ可逆的に結合し（低塩濃度でタウマチン様蛋白質に結合し、高塩濃度でタウマチン様蛋白質から遊離される）、ＮＩＤＤＭと診断された人における高い血中グルコース濃度および高い血中脂質濃度を低下させた。
【００３９】
このように、意図される組成物は、植物種子が麦芽処理されて（好ましくは約３０℃〜６５℃の温度で）、抽出物が水性抽出段階（例えば、クエン酸緩衝液のような水性緩衝液を用いて）を含むプロトコールを用いて麦芽処理された植物種子から調製され、抽出物がグルコース濃度を低下させるために有効な濃度で生物に投与される場合に生物におけるグルコース濃度を低下させる、植物の種子抽出物（好ましくはオオムギ由来）を含むことが認識されるべきである。
【００４０】
実施例３
実施例１からのＬＭＷ画分（ＧＭＭ−１、ＧＭＭ−２、およびＧＭＭ−４）および実施例２からのガラス状の黄色がかった産物の生物活性を、改変ワールブルク法を用いて嫌気条件で醸造酵母発酵速度の定量によってモニターした（ミルスキー（Ｍｉｒｓｋｙ， Ｎ．）ら、Ｊ． Ｉｎｏｒｇ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３（１）：１１〜２１（１９８０）、参照として本明細書に組み入れられる）。
【００４１】
湿った醸造酵母細胞２ｇ（約２０％乾燥重量）を発酵培地（ｐＨ ５．７の６０ ｍＭリン酸緩衝液２５ ｍｌおよび５％（ｗ／ｖ）グルコース溶液１０ ｍｌ）に懸濁させて、実施例１または２からの産物のアリコートを試験のために発酵培地に加えた。インキュベーションは、５０ ｍｌ発酵フラスコにおいて２５℃で６０分間行った。発酵速度は生成されたＣＯ２の容積から測定した。調べたＬＭＷ画分または実施例２からの産物は全て、約２０〜４０％の範囲で酵母の発酵速度を増加させたという点において有意な生物活性または生理活性を示した。本明細書において用いられるように、生理活性化合物は、発酵を増加させるまたは減少させる化合物である。さらなる実験において、ＧＭＭ−２の活性を好気条件で調べた。緩衝液からのＮａＣｌと空気中の酸素の複合作用によって酵母発酵が一般的に制限されるにもかかわらず（パスツール効果）、生成されたＣＯ２の相対量は実験に含めた対照と比較して倍加した。嫌気および好気条件でＧＭＭ−２画分に関する同等の結果を下記の図５に示す。結果は、酵母の代謝に及ぼす単離されたＬＭＷ物質の調節活性を明らかに証明している。
【００４２】
実施例４
実施例２において得られた産物をＮＩＤＤＭと診断された人において用いるために調べた。男性２５人を外来診療（内分泌科）から募集した。群の平均年齢は５１歳で、範囲は３６〜７４歳であった。カルテをスクリーニングして、インスリンまたは経口血糖降下剤を服用している糖尿病患者を除外した。被験者全員が、試験期間中、その通常の食事習慣と健康関連行動を維持することに同意した。実験的治療は６ヶ月間行った。参加者は、調製物を錠剤として各１，０００ ｍｇを１日３回経口投与するように指示された。
【００４３】
被験者全員を、補充前と、試験の種類に応じて試験期間中２週間に１回、または毎月の間隔で、血漿中グルコース、グルコシル化ヘモグロビンＨｂＡｃ１、トリグリセリドおよびコレステロールに関して調べた。被験者を下記のパターンに従って群にさらに分類した。
【００４４】
血漿グルコース：血漿グルコースレベルに従って、被験者を効果の差によって３つの群に分類した：Ｉ−血漿グルコース濃度８ｍＭｏｌ／Ｌまで；ＩＩ−８〜１０．５ ｍＭｏｌ／ＬおよびＩＩＩ−１０．５ ｍＭｏｌ／Ｌを超える。グリコシル化ヘモグロビン（ＨｂＡｃ１）；ＨｂＡｃ１レベルに従って、被験者を２つの群に分類した：Ｉ−修飾ヘモグロビン１０％未満およびＩＩ−１０％以上。治療前後の血糖症に関連する試験結果を図３Ａに示す。
【００４５】
さらなる組の臨床試験を上記に概要したものと類似のプロトコールに従って１０人のボランティアの人々について実施した。この第二の実験において、血中グルコースを絶食時と食後に９０日間にわたって測定し、結果を図３Ｂに示す。明らかにわかるように、意図される化合物の投与によって、絶食時および／または食後の血中グルコースは少なくとも５％低下し、より典型的に少なくとも１０％、および最も典型的に少なくとも２０％低下した。同様に、グリコシル化ヘモグロビンのレベルは、意図される化合物の投与後に、少なくとも５％、より典型的に少なくとも２０％、および最も典型的に少なくとも５０％低下した。
【００４６】
ＮＩＤＤＭと診断された被験者の脂質状態は、血漿中のトリグリセリド、およびコレステロール（総、ＬＤＬおよびＨＤＬ型として）レベルを調べることによって治療前後に決定した。図４Ａおよび４Ｂに示す試験結果には、糖尿病疾患による脂質代謝の乱れを有する被験者が含まれる。
【００４７】
図４Ａに示す被験者の脂質状態には、トリグリセリドの血漿レベル、総コレステロールに対するトリグリセリドの比、およびＬＤＬ／ＨＤＬ比が含まれる。後者の２つの比は、アテローム性動脈硬化症の危険因子として知られている。図４Ａからわかるように、意図される化合物の投与によって、トリグリセリドは５０％まで低下し、ＨＤＬコレステロールに対するトリグリセリドの比は約１〜２０％有意に低下し、ＬＤＬ対ＨＤＬコレステロールの比はさらにより劇的に低下した（約４０％）。図４Ｂに示す脂質状態には、意図される化合物および／または組成物の９０日間に及ぶ投与後の試験患者１０人のさらなる結果が含まれる。
【００４８】
実施例５
タウマチン様蛋白質は、実施例１および図２に一般的に概要した方法に従って調製した。そのように単離されたタウマチン様蛋白質に、分子量カットオフ約１０００ダルトンのメンブレンを用いてメンブレン濃縮器において反復分子ふるいを行った。蛋白質調製物の最初の濾過の第一ラウンド後、緩衝液９９ ｍｌ（ｐＨ ７．８の５０ ｍＭリン酸緩衝液、０．５ Ｍ ＮａＣｌ）を残留物（すなわち、タウマチン様蛋白質画分）約１ｍｌに加え、その後同じ緩衝液によって濾過ラウンド３回を行って、残りのＧＭＭ化合物（すなわち、本明細書において示した上昇したグルコースを低下させる化合物）をタウマチン様蛋白質調製物から除去した。濾液のＵＶ吸収を２６０ ｎｍでモニターして、濾液からの試料容積の生物活性を実施例３に概要したプロトコールに従って調べた。そのように調製したタウマチン様蛋白質をＮａＣｌ不含緩衝液（ｐＨ ７．８の５０ ｍＭリン酸緩衝液）を用いるメンブレン濾過によって脱塩し、以下の方法においてさらに用いた。
【００４９】
脱塩したタウマチン様蛋白質溶液（１０ ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌに、ＧＭＭ−１溶液（１ｍｇ／ｍｌ）１．０ ｍｌを加え、混合物を室温で２時間インキュベートした。２時間後、ｐＨ ７．８の５０ ｍＭリン酸緩衝液９８ ｍｌを混合物に加えて、未結合のＧＭＭ−１を、緩衝液によるその後の限外濾過３ラウンド（各ラウンドは容積で１：１００希釈）によって除去した。
【００５０】
ＧＭＭ−１が結合したタウマチン様蛋白質を試料１とした。次に、試料１に溶媒としてｐＨ ７．８の５０ ｍＭリン酸緩衝液、０．５ Ｍ ＮａＣｌを用いセファデックスＧ−７５カラムを用いて、分子ふるいクロマトグラフィーを行ったところ、低分子量画分が、吸光度２８０ ｎｍのタウマチン様蛋白質の高分子量画分から分離されて吸光度２６０ ｎｍで溶出された。低分子量画分を濃縮して、脱塩し、全量を１．０ ｍｌにして、これを試料２とした。次に、試料１および２を実施例３に概要する方法を用いて生物活性に関して調べた。試料１は、発酵速度を増加させなかったが、試料２は、好気的および嫌気的実験条件の双方において発酵速度を有意に増加させ、それによって、タウマチン様蛋白質に対するＧＭＭ−１の可逆的結合が明らかに示された。同じ方法をＧＭＭ−２およびＧＭＭ−４について繰り返した。得られた結果は、示したＧＭＭ−１実験と類似であった。
【００５１】
このように、生物におけるグルコース濃度を低下させるための組成物および方法の特定の態様および適用を開示している。しかし、既に記載したそれら以外にもより多くの改変は、本明細書に記載した本発明の概念を逸脱することなく実施可能であることは、当業者に明らかであるはずである。したがって、本発明の主題は、添付の意図される特許請求の範囲の真意以外に制限されない。その上、明細書および意図される特許請求の範囲の双方を解釈する場合、全ての用語は、本文と一致するように可能な限り最も広い意味で解釈されるべきである。特に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、要素、成分または段階を非排他的に言及すると解釈されるべきであり、言及された要素、成分、または段階は、表現として言及されていないその他の要素、成分または段階と共に存在、使用または組み合わせてもよいことを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の主題に従う血中グルコース濃度を低下させる例示的な方法を示す流れ図である。
【図２】意図される化合物とタウマチン様蛋白質の例示的な調製を示す図である。
【図３】図３Ａは、本発明の主題に従って意図される組成物を用いた場合のボランティアの人々における血中グルコース濃度の低下を示す表である。図３Ｂは、本発明の主題に従って意図される組成物を用いた場合のボランティアの人々における血中グルコース濃度の低下を示すもう一つの表である。
【図４】図４Ａは、本発明の主題に従って意図される組成物を用いた場合のボランティアの人々における血中脂質濃度の低下を示す表である。図４Ｂは、本発明の主題に従って意図される組成物を用いた場合のボランティアの人々における血中脂質濃度の低下を示すもう一つの表である。
【図５】嫌気性および好気性条件で意図される化合物と共にインキュベートした酵母の発酵速度を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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