(57)【要約】本発明は、ドナー染色体またはドナー細胞を再プログラムさせた後に除核卵母細胞中に挿入することを特徴とする、哺乳類をクローニングする方法を提供する。本発明はまた、染色体また核をレシピエント細胞中に挿入する方法を特色とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト哺乳類をクローニングする方法であって、
（ａ）透過化細胞を再プログラミング培地中で、前記透過化細胞の核、クロマチン塊、もしくは染色体から或る因子の除去、または前記再プログラミング培地から前記核、クロマチン塊、もしくは染色体に或る因子の付加を可能にする条件下でインキュベートして、それにより再プログラムした細胞を形成するステップ；
（ｂ）前記再プログラムした細胞を有核もしくは除核卵母細胞中に挿入し、それにより核導入卵母細胞を形成するステップ；および
（ｃ）前記核導入卵母細胞または前記核導入卵母細胞から形成された胚を、前記核導入卵母細胞または前記胚が胎児に発生することを可能にする条件下で宿主哺乳類の子宮中に導入するステップを含んでなる前記方法。
【請求項２】
前記再プログラミング培地が細胞抽出物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記透過化細胞の核が膜で囲まれたまま保持され、前記核中のクロマチンが前記再プログラミング培地でのインキュベーション中に凝縮しない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
クロマチン塊を前記透過化細胞の前記再プログラミング培地中のインキュベーションから形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記再プログラムした細胞を前記再プログラムした細胞の膜が再シールすることを可能にする条件下でインキュベートする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記再プログラムした細胞を前記核導入卵母細胞中に挿入する前に前記再プログラミング培地から精製する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記胎児が生存可能な子孫に発生する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｂ）からの前記核導入卵母細胞を細胞分裂を可能にする条件下で培養し、得られる細胞の１つを１回以上再クローニングする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記透過化細胞と核導入卵母細胞が同じ種由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記非ヒト哺乳類がウシ、ヒツジ、ウサギ、ブタ、マウス、ラット、ヤギ、またはバッファローである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記非ヒト哺乳類がウシである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記透過化細胞が繊維芽細胞、上皮（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ）細胞、神経細胞、表皮（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ）細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラニン形成細胞、軟骨細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、赤血球、マクロファージ、単球、筋細胞、胚性幹細胞、胚生殖細胞、胎児細胞、胎盤細胞、または胚細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記透過化細胞が雌性生殖系の細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記透過化細胞が乳腺、卵丘、顆粒膜、または卵管細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｂ）由来の前記核導入卵母細胞が、同種由来の対照卵母細胞により発現される対応するレベルに対して５倍より低いレベルでラミンＡ、ラミンＣ、またはＮｕ−ＭＡタンパク質を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
非ヒト哺乳類をクローニングする方法であって、
（ａ）４未満の相同染色体セットを有するドナー核を、ＤＮＡ複製を起こすことなくクロマチン塊の形成を可能にする条件下で、再プログラミング培地と接触させるステップ、
（ｂ）前記クロマチン塊を卵母細胞中に挿入し、それにより核導入卵母細胞を形成するステップ、及び
（ｃ）前記核導入卵母細胞または前記核導入卵母細胞から形成された胚を、前記核導入卵母細胞または前記胚が胎児に発生することを可能にする条件下で宿主哺乳類の子宮中に導入するステップを含んでなる前記方法。
【請求項１７】
再プログラミング培地が分裂抽出物、界面活性剤及び塩溶液、界面活性剤溶液、塩溶液、またはプロテインキナーゼ溶液である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｂ）からの前記クロマチン塊を前記核導入卵母細胞中に挿入する前に前記抽出物から精製する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記胎児が生存可能な子孫に発生する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｂ）からの前記核導入卵母細胞を細胞分裂を可能にする条件下で培養し、得られる細胞の１つを１回以上再クローニングする、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記ドナー核と核導入卵母細胞が同じ種由来である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記非ヒト哺乳類がウシ、ヒツジ、ウサギ、ブタ、マウス、ラット、ヤギ、またはバッファローである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記非ヒト哺乳類がウシである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ドナー核が二倍体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記ドナー核が繊維芽細胞、上皮（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ）細胞、神経細胞、表皮（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ）細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラニン形成細胞、軟骨細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、赤血球、マクロファージ、単球、繊維芽細胞、及び筋細胞、胚性幹細胞及び胚生殖細胞、胎児細胞、胎盤細胞、または胚細胞由来である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
前記ドナー核が雌性生殖系の細胞由来である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
前記雌性生殖系の細胞が乳腺、卵丘、顆粒膜、または卵管細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ（ｂ）由来の前記卵母細胞が、同種由来の対照卵母細胞により発現される対応するレベルに対して５倍より低いレベルでラミンＡ、ラミンＣ、またはＮｕ−ＭＡタンパク質を発現する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２９】
非ヒト哺乳類をクローニングする方法であって、
（ａ）細胞、核、またはクロマチン塊を卵母細胞中に挿入し、それによって第１胚を形成するステップ；
（ｂ）第１胚由来の１以上の細胞を第２胚由来の１以上の細胞と接触させそれによって第３胚を形成するステップであって、ここで前記第２胚はｉｎ ｖｉｔｒｏ受精した胚、天然胚、または単為生殖で活性化した胚であり、かつ前記第１胚及び前記第２胚の少なくとも１つが緊密化胚である前記ステップ；及び
（ｃ）前記第３胚を、前記第３胚が胎児に発生することを可能にする条件下で宿主哺乳類の子宮中に導入するステップを含んでなる前記方法。
【請求項３０】
非ヒト哺乳類をクローニングする方法であって、
（ａ）細胞、核、またはクロマチン塊を卵母細胞中に挿入し、それによって第１胚を形成するステップ；
（ｂ）第１胚由来の１以上の細胞を第２胚由来の１以上の細胞と接触させそれによって第３胚を形成するステップであって、ここで前記第２胚はｉｎ ｖｉｔｒｏ受精した胚、天然胚、または単為生殖で活性化した胚であり、かつ前記第１胚と前記第２胚が異なる細胞期にある前記ステップ；及び
（ｃ）前記第３胚を、前記第３胚が胎児に発生することを可能にする条件下で宿主哺乳類の子宮中に導入するステップを含んでなる前記方法。
【請求項３１】
非ヒト哺乳類をクローニングする方法であって、
（ａ）クロマチン塊の形成を可能にする条件下で、ドナー核を再プログラミング培地と接触させるステップ；
（ｂ）前記クロマチン塊を卵母細胞中に挿入し、それによって第１胚を形成するステップ；
（ｃ）第１胚由来の１以上の細胞を第２胚由来の１以上の細胞と接触させそれによって第３胚を形成するステップであって、ここで前記第２胚はｉｎ ｖｉｔｒｏ受精した胚、天然胚、または単為生殖で活性化した胚である前記ステップ；及び
（ｄ）前記第３胚を、前記第３胚が胎児に発生することを可能にする条件下で宿主哺乳類の子宮中に導入するステップを含んでなる前記方法。
【請求項３２】
ステップ（ａ）が、４未満の相同染色体セットを有するドナー核を再プログラミング培地とＤＮＡ複製を起こすことなくクロマチン塊を形成することを可能にする条件下で接触させることを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
非ヒト哺乳類をクローニングする方法であって、
（ａ）透過化細胞を再プログラミング培地中で、前記透過化細胞の核、クロマチン塊、もしくは染色体から或る因子の除去、または前記再プログラミング培地から前記核、クロマチン塊、もしくは染色体に或る因子への付加を可能にする条件下でインキュベートして、それにより再プログラムした細胞を形成するステップ；
（ｂ）前記再プログラムした細胞を卵母細胞中に挿入し、それによって第１胚を形成するステップ；
（ｃ）第１胚由来の１以上の細胞を第２胚由来の１以上の細胞と接触させ、それによって第３胚を形成するステップであって、ここで前記第２胚はｉｎ ｖｉｔｒｏ受精した胚、天然胚、または単為生殖で活性化した胚である前記ステップ；及び
（ｄ）前記第３胚を、前記第３胚が胎児に発生することを可能にする条件下で宿主哺乳類の子宮中に導入するステップを含んでなる前記方法。
【請求項３４】
前記再プログラムした細胞を前記再プログラムした細胞の膜が再シールすることを可能にする条件下でインキュベートする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記再プログラミング培地が細胞抽出物である、請求項３１または３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記胎児が生存可能な子孫に成育する、請求項２９〜３１及び３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記胎児の胎盤の少なくとも１０％細胞が前記第２胚から誘導される、細胞請求項２９〜３１及び３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記胎児の胎児組織の少なくとも５０％細胞が前記第１胚から誘導される、請求項２９〜３１及び３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記非ヒト哺乳類がウシ、ヒツジ、ウサギ、ブタ、マウス、ラット、ヤギ、またはバッファローである、請求項２９〜３１及び３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記非人哺乳類がウシである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記第３胚が、同種由来の対照卵母細胞により発現される対応するレベルに対して５倍より低いレベルでラミンＡ、ラミンＣ、またはＮｕ−ＭＡタンパク質を発現する、請求項２９〜３１及び３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記第２胚由来の前記細胞を前記第１胚中の透明帯と胚細胞の間に注入する、請求項２９〜３１及び３３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
一般的に、本発明は哺乳類をクローニングする方法の改良及び染色体、核、またはクロマチン塊をレシピエント細胞中に挿入する方法を特色とする。
【０００２】
哺乳類のクローニングは、同一ＤＮＡ内容物をもつ複数哺乳類の生産を可能にする。これらの哺乳類を作製するために用いるドナー遺伝子材料は、クローン哺乳類が病気に対する抵抗力増加など所望の特性をもつように、選択するかまたは遺伝子操作することができる。残念ながら、ドナーの体細胞を用いて哺乳類をクローニングする効率は一般的に低く、核移植胚の約１〜２％しか出産に至るまで発生しない（Ｐｏｌｅｊａｅｖａら， Ｎａｔｕｒｅ ４０７：８６−９０， ２０００）。クローニングの重要な問題は、中〜後期妊娠の喪失及び低い子孫生存率である。従って、哺乳類をクローニングするためのもっと効率的な方法が必要とされている。これらの方法を改良することにより、多数の生存可能な子孫を作製するのに必要な費用と時間を削減することができる。
【０００３】
発明の概要
本発明の目的は、哺乳類をクローニングするための改良された方法を提供することにある。特に、これらの方法は、核移植胚の生存可能な子孫への発生にとって望ましくない遺伝子の転写を促進しうる転写因子などの核成分の遊離を可能にする、ドナー核のクロマチン塊への凝縮に関わる。関係する方法においては、透過化細胞（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ ｃｅｌｌ）を再プログラミング培地（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｍｅｄｉａ）（例えば、細胞抽出物）を用いてインキュベートして細胞由来の因子の付加または除去を可能にし、次いで透過化細胞の原形質膜を再シールして所望の因子を封入しかつ細胞の膜完全性（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を回復する。所望であれば、これらの方法のいずれかのステップを１回以上繰り返すかまたは異なる再プログラミング方法を続いて実施し、再プログラミングの程度を増加してクローン胎児のさらに高い生存率を得ることができる。本発明はまた、若干のまたは全ての胎盤組織が１つの遺伝源に由来しかつ大多数の胎児組織が他の遺伝源に由来するキメラ胚を作製する方法も提供する。これらのキメラ胚はより少ない胎盤異常を有しうるので、従ってより高い生存率を有しうる。さらに、融合誘発化合物の使用に関わる、クロマチン塊または核をレシピエント卵母細胞中へ挿入する新規の方法を開発した。
【０００４】
従って、第１の態様においては、本発明は哺乳類をクローニングする方法を提供する。この方法は、（ａ）４未満のセットの相同染色体（すなわち、２対未満の完全なクロマチド）を有するドナー核を、ＤＮＡ複製を起こすことなくクロマチン塊の形成を可能にする条件下で、インキュベートするステップ、（ｂ）前記クロマチン塊を除核卵母細胞中に挿入し、それにより核導入（ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ）卵母細胞を形成するステップ、及び（ｃ）前記核導入卵母細胞または核導入卵母細胞から形成された胚を、核導入卵母細胞または胚が胎児に発生することを可能にする条件下で、宿主哺乳類の子宮中に導入（ｔｒａｎｓｆｅｒ）するステップからなる。好ましい実施形態においては、転写因子、リプレッサータンパク質もしくはクロマチンリモデリングタンパク質などの核または細胞質成分を、核または得られるクロマチン塊に加えるかまたはそれらから取除くことを可能にする条件下で、ドナー核を再プログラミング培地（例えば、細胞抽出物）を用いてインキュベートする。好ましくは、クロマチン塊の形成を可能にする条件下で、ドナー核を次の１以上と接触させる：抗ＮｕＭＡ抗体の存在もしくは不在のもとでの分裂抽出物、界面活性剤及び／または塩溶液、ならびにプロテインキナーゼ溶液。他の好ましい実施形態においては、再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ）した卵母細胞または得られる胚は、ラミンＡ、ラミンＣ、またはＮｕＭＡタンパク質を、同数の細胞をもつ同種由来の対照卵母細胞または対照胚により発現される対応レベルに対して５倍より低いレベルで発現する。
【０００５】
関係する態様においては、本発明は哺乳類をクローニングする他の方法を提供する。この方法は、透過化細胞を再プログラミング培地（例えば、細胞抽出物）を用いて、透過化細胞の核、クロマチン塊、もしくは染色体から或る因子（例えば、核もしくは転写因子などの細胞質成分）の除去、または前記核、クロマチン塊、もしくは染色体に或る因子の付加を可能にする条件下で、インキュベートし、それによって再プログラムした細胞を形成するステップを含む。再プログラムした細胞を除核卵母細胞中に挿入し、得られる卵母細胞または卵母細胞から形成された胚を、卵母細胞または胚が胎児に発生しうる条件下で、宿主哺乳類の子宮中に導入する。好ましい実施形態においては、透過化細胞を、クロマチン塊の形成を可能にする条件下で、次の１以上と接触させる：抗ＮｕＭＡ抗体の存在もしくは不在のもとでの分裂抽出物、界面活性剤及び／もしくは塩溶液、またはプロテインキナーゼ溶液。さらに他の実施形態においては、透過化細胞を、間期（ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ）再プログラミング培地（例えば、間期細胞抽出物）を用いてインキュベートする。なおさらに他の実施形態においては、透過化細胞の核は、膜で囲まれたままであり、核内の染色体はこの間期再プログラミング培地を用いるインキュベーション中に凝縮しない。ある特定の実施形態においては、透過化細胞を再プログラミング培地中でインキュベートすると、ＤＮＡ複製が起こらないかまたはその細胞の５０、４０、３０、２０、１０、もしくは５％未満のＤＮＡ複製しか起こらない。他の実施形態においては、透過化細胞を再プログラミング培地中でインキュベートすると、その細胞の少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、または１００％にＤＮＡ複製が起こる。様々な実施形態においては、透過化細胞を、無傷の細胞をジギトニンなどの界面活性剤、またはストレプトリシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎ）Ｏなどの細菌性毒素を用いてインキュベートすることにより形成する。他の実施形態においては、再プログラムした細胞を再プログラムした細胞の膜が再シールしうる条件下でインキュベートをした後に卵母細胞中へ挿入する。他の好ましい実施形態においては、再構成した卵母細胞または得られる胚は、ラミンＡ、ラミンＣ、またはＮｕＭＡタンパク質を、対照卵母細胞または同数の細胞をもつ同種由来の対照胚が発現する対応レベルに対して５倍より低いレベルで発現する。
【０００６】
本発明はまた、２つの異なる胚由来の細胞の利用を含む、哺乳類をクローニングする方法も提供する。例えば、核導入胚（例えば、細胞、核、またはクロマチン塊を除核卵母細胞中に挿入することにより形成した胚）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精、天然、または単為生殖で活性化した胚由来の細胞と組み合わせることができる。核導入胚由来の細胞とそれらの子孫の大多数は得られるキメラ胚の胎児組織中に組み込まれることが好ましい。第２胚由来の細胞の少なくとも若干とそれらの子孫は胎盤組織中に組み込まれて、得られるキメラ胚の生存率を増進することが好ましい。
【０００７】
従って、かかる一態様においては、本発明は哺乳類をクローニングする方法であって、細胞、核、またはクロマチン塊を除核卵母細胞中に挿入してそれによって第１胚を形成することを特色とする。第１胚由来の１以上の細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ受精して、天然で、または単為生殖的に活性化した第２胚由来の１以上の細胞と接触させ、第３胚を形成する。この第３胚を、第３胚が胎児に発生することを可能にする条件下で宿主哺乳類の子宮中に導入する。一実施形態においては、第１胚と第２胚の少なくとも１つは緊密化胚（ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ ｅｍｂｒｙｏ）である。他の実施形態においては、第１胚と第２胚は異なる細胞期（ｃｅｌｌ−ｓｔａｇｅ）にある。第１胚と第２胚を生産するために利用されるドナー細胞と同じ種由来であってもまたは異なる属もしくは種由来であってもよい。好ましくは、胎児の栄養外胚葉または胎盤組織中の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、もしくは１００％の細胞が第２胚から誘導されるか、または胎児の内部細胞塊もしくは胎児組織の少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、もしくは１００％の細胞が第１胚から誘導される。他の好ましい実施形態においては、第１胚または第３胚は、ラミンＡ、ラミンＣ、またはＮｕＭＡタンパク質を、同数の細胞をもつ同種由来の対照胚が発現する対応レベルに対して５倍より低いレベルで発現する。
【０００８】
関係する態様においては、本発明は哺乳類をクローニングする方法であって他のを特色とする。この方法は、クロマチン塊の形成を可能にする条件下で、ドナー核を再プログラミング培地（例えば、細胞抽出物）と接触させ、クロマチン塊を除核卵母細胞中に挿入し、それにより第１胚を形成することに関わる。第１胚由来の１以上の細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精、天然、または単為生殖で活性化した第２胚由来の１以上の細胞と接触させて、第３胚を形成する。第３胚を、第３胚が胎児に発生することを可能にする条件下で宿主哺乳類の子宮中に導入する。好ましい実施形態においては、ＤＮＡ複製を起こすことなくクロマチン塊の形成を可能にする条件下で、４未満のセットの相同染色体を有するドナー核を再プログラミング培地と接触させることにより、クロマチン塊を形成する。好ましくは、ドナー核を、クロマチン塊の形成を可能にする条件下で、次の１以上と接触させる：抗ＮｕＭＡ抗体の存在もしくは不在のもとでの分裂抽出物、界面活性剤及び／または塩溶液、ならびにプロテインキナーゼ溶液。様々な実施形態においては、第１胚と第２胚の両方は緊密化（ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ）胚であるか；第１胚と第２胚の両方は前緊密化（ｐｒｅｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ）胚であるか、または胚の１つは緊密化胚であって他の胚は前緊密化胚である。第１胚と第２胚は異なる細胞期であるかまたは同じ細胞期であってもよい。第１胚と、第２胚を生産するのに用いるドナー核とは、同じ種由来であってもまたは異なる属もしくは種由来であってもよい。好ましくは、胎児の栄養外胚葉または胎盤組織中の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、もしくは１００％の細胞が第２胚から誘導されるか、または胎児の内部細胞塊または胎児組織の少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、もしくは１００％の細胞が第１胚から誘導される。他の好ましい実施形態においては、第１胚または第３胚は、ラミンＡ、ラミンＣ、またはＮｕＭＡタンパク質を、同数の細胞をもつ同種由来の対照胚が発現する対応レベルに対して５倍より低いレベルで発現する。
【０００９】
他の関係する態様においては、本発明は哺乳類をクローニングするさらに他の方法を特色とする。この方法は、透過化細胞を再プログラミング培地（例えば、細胞抽出物）を用いて、透過化細胞の核、クロマチン塊、もしくは染色体から或る因子（例えば、核もしくは転写因子などの細胞質成分）の除去、または前記核、クロマチン塊、もしくは染色体に或る因子の付加を可能にする条件下で、インキュベートして、それにより再プログラムした細胞を形成することに関わる。再プログラムした細胞を除核卵母細胞中に挿入し、それにより第１胚を形成する。第１胚由来の１以上の細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ受精、天然、または単為生殖で活性化した第２胚由来の１以上の細胞と接触させて第３胚を形成する。この第３胚を、第３胚が胎児に発生することを可能にする条件下で宿主哺乳類の子宮中に導入する。好ましい実施形態においては、透過化細胞を再プログラミング培地（例えば、細胞抽出物）を用いて、転写因子などの核または細胞質成分を核または得られるクロマチン塊へ加えるか、またはそれらから取除くことを可能にする条件下でインキュベートする。他の好ましい実施形態においては、透過化細胞を、クロマチン塊の形成を可能にする条件下で、次の１以上と接触させる：抗ＮｕＭＡ抗体の存在もしくは不在のもとでの分裂抽出物、界面活性剤及び／または塩溶液、ならびにプロテインキナーゼ溶液。さらに他の好ましい実施形態においては、透過化細胞を、間期再プログラミング培地（例えば、間期細胞抽出物）を用いてインキュベートする。なおさらに他の実施形態においては、透過化細胞の核は膜で囲まれたままであり、核内の染色体はこの間期再プログラミング培地とのインキュベーション中に凝縮しない。複数の実施形態においては、透過化細胞を再プログラミング培地中でインキュベートすると、ＤＮＡ複製は起こらないかまたはその細胞の５０、４０、３０、２０、１０、もしくは５％未満にしかＤＮＡ複製は起こらない。他の実施形態においては、透過化細胞を再プログラミング培地中でインキュベートすると、その細胞の少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、または１００％にＤＮＡ複製が起こる。様々な実施形態においては、透過化細胞は、無傷の細胞をジギトニンなどの界面活性剤、またはストレプトリシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎ）Ｏなどの細菌性毒素を用いてインキュベートすることにより形成する。さらに他の実施形態においては、再プログラムした細胞を、再プログラムした細胞の膜が再シールしうる条件下でインキュベートをした後に卵母細胞中へ挿入する。様々な実施形態においては、第１胚と第２胚の両方は緊密化胚であるか；第１胚と第２胚の両方は前緊密化胚であるか、または胚の１つは緊密化胚であって他の胚は前緊密化胚である。第１胚と第２胚は異なる細胞期であるかまたは同じ細胞期であってもよい。第１胚と第２胚を生産するために用られるドナー核とは、同じ種由来であってもまたは異なる属もしくは種由来であってもよい。好ましくは、胎児の栄養外胚葉または胎盤組織中の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、もしくは１００％の細胞が第２胚から誘導されるか、または胎児の内部細胞塊または胎児組織の��なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、もしくは１００％の細胞が第１胚から誘導される。他の好ましい実施形態においては、第１胚または第３胚は、ラミンＡ、ラミンＣ、またはＮｕＭＡタンパク質を、同数の細胞をもつ同種由来の対照胚が発現する対応レベルに対して５倍より低いレベルで発現する。
【００１０】
２つの胚由来の細胞を用いて哺乳類をクローニングする上記の方法の好ましい実施形態のいずれにおいては、第１胚または第２胚の透明帯の一部分または全てを細胞から除去した後、それぞれの胚を接触させる。一実施形態においては、第１及び第２胚由来の細胞を溶液中または固形支持体上でお互いに隣接して置いて接触させる。他の実施形態においては、標準技術を用いて第１胚由来の細胞を第２胚中に注入する。細胞は、第２胚の透明帯と胚自身の間の胚周辺部などのいずれの領域に注入してもよい。天然胚の例としては、標準の方法を用いて妊娠中の哺乳類（例えば、ウシ）から外科的もしくは非外科的に除去した胚が挙げられる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精胚の例としては、標準技術を用いて作製した細胞質内精子注入胚が挙げられる。２より多い胚（例えば、３、４、５、６以上の胚）由来の細胞を組み合わせてキメラ胚を作り、クローン哺乳類を作製しうることも意図する。
【００１１】
上記の態様の好ましい実施形態のいずれにおいても、再プログラミング培地（例えば、細胞抽出物）は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストン、プロタミン、核ラミン、転写因子、アクチベーター、またはリプレッサーなどの因子の強化または枯渇により改変する。他の実施形態においては、卵母細胞またはキメラ胚におけるＮｕＭＡまたはＡＫＡＰ９５の核内の発現レベルは、細胞質内より少なくとも２、５、１０、または２０倍大きい。さらに他の実施形態においては、卵母細胞またはキメラ細胞中のＡＫＡＰ９５タンパク質の少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００％を、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍｇ／ｍｌ ＤＮアーゼ Ｉ、及び１００ｍＭもしくは３００ｍＭ ＮａＣｌの溶液を用いて抽出する。好ましくは、クロマチン塊を再プログラミング培地（例えば、抽出物）から精製した後、除核卵母細胞中に挿入する。他の好ましい実施形態においては、クロマチン塊を除核卵母細胞中へ挿入するのは、クロマチン塊が卵母細胞に進入することを可能にする条件下で、クロマチン塊と卵母細胞を融合誘発化合物と接触させることを含む。さらに他の好ましい実施形態においては、胎児は生存可能な子孫に発生する。核導入卵母細胞または胚の少なくとも１、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０もしくは９０％が生存可能な子孫に発生することが好ましい。この方法においては、クロマチン塊を含有する卵母細胞または再プログラムした細胞を、細胞分裂を可能にする条件下で培養し、得られる細胞の１つを１回以上再クローニングしてもよい。本方法に使用されるドナー核、ドナークロマチン塊、またはドナー細胞及び卵母細胞は同じ種由来であってもよく、またはそれらは異なる種もしくは属由来であってもよい。哺乳類はヒトまたは非ヒト哺乳類であってもよく、卵母細胞は受精していても未受精であってもよい。好ましくは、ドナー細胞、クロマチン塊、または透過化細胞はＧ１またはＧ０期細胞由来である。さらに、クローン胚、胎児、もしくは哺乳類のゲノムＤＮＡは好ましくは、ドナー細胞のゲノムＤＮＡと実質的に同一である。クロマチン塊または再プログラムした細胞を胚中に挿入して、クロマチン塊または再プログラムした細胞と実質的に同一のＤＮＡをもつ細胞及び胚の天然細胞と実質的に同一のＤＮＡをもつ細胞の混合物を含有するキメラ胚、胎児もしくは哺乳類を生産することも意図する。除核卵母細胞を本発明の方法に使用しうることも意図する。
【００１２】
本発明のいずれの態様に使用される再プログラミング培地も、外因性ヌクレオチドを含有してもよいしまたは含有しなくてもよい。他の実施形態においては、再プログラミング培地に含まれるかまたは透過化細胞中で形成されるクロマチン塊と目的の遺伝子をコードする核酸を有するベクターとを、ベクター中の核酸とクロマチン塊のゲノム中の対応する核酸との間の無作為な組込みまたは相同的組換えを可能にする条件下で接触させて、クロマチン塊のゲノムを改変させる。無傷の原形質膜を欠くこと及び核膜を欠くことにより、透過化細胞中のまたは溶液中のクロマチン塊は、天然の細胞よりも遺伝的に改変するのが容易である。再プログラミング抽出物を作製するために利用しうる細胞の例は、胚性幹細胞、及び脳、血液、骨髄、膵臓、肝臓、皮膚またはその他のいずれの器官もしくは組織由来の成体幹細胞であってもよい。他の再プログラミング細胞抽出物の例は、卵母細胞抽出物（例えば、ウシまたはウニ卵母細胞抽出物）及び雄性生殖細胞抽出物（例えば、脊椎動物、無脊椎動物もしくはウシなどの哺乳類由来の精原細胞、精母細胞、精子細胞、または精子抽出物）が挙げられる。ドナーまたは透過化細胞は、不死化していなくてもまたは自然に、自発性で、もしくは遺伝的に不死化していてもよい。ドナー細胞、透過化細胞、レシピエント細胞、または細胞原形質は、胚、胎児、若年、または成体哺乳類などのいずれの年齢の供給源由来であってもよい。より若年の供給源は自発性突然変異の獲得が少なく、卵母細胞中への挿入後により長い寿命を有するであろう。
【００１３】
本発明はまた、染色体、クロマチン塊、または核をレシピエント細胞中に挿入する方法も提供する。これらの方法は、ドナー遺伝子材料をレシピエント卵母細胞に導入して哺乳類をクローニングするのに有用である。これらの方法はまた、ある細胞の遺伝材料を他の細胞のそれと置き換えるために利用することもできる。
【００１４】
本発明のこの態様によって、染色体またはクロマチン塊をレシピエント細胞中に挿入する技術であって、染色体またはクロマチン塊のレシピエント細胞への進入を可能にする条件下で、染色体またはクロマチン塊及び前記細胞を融合誘発化合物と接触させることを含む前記技術が提供される。ある好ましい実施形態においては、染色体またはクロマチン塊を変異誘発化合物とともにインキュベートした後に、レシピエント細胞と接触させる。染色体またはクロマチン塊は凝縮していても凝縮していなくてもよく、かつ染色体またはクロマチン塊及びレシピエント細胞は同じ種または異なる種もしくは属であってもよい。他の好ましい実施形態においては、レシピエント細胞は受精したまたは未受精の卵母細胞である。好ましくは、レシピエント細胞または染色体はヒトまたは非ヒト哺乳類である。様々な実施形態においては、レシピエント細胞は成体、胎児、または胚の細胞である。特に好ましい一実施形態においては、ドナー細胞の染色体の全てをレシピエント細胞中に挿入する。好ましくは、ドナー細胞は単相体（ｎのＤＮＡ含量）、二倍体（２ｎ）または四倍体であり、かつレシピエント細胞は低二倍体（２ｎ未満のＤＮＡ含量）、単相体、または除核体である。他の実施形態においては、染色体は、２つの単相体細胞のような、１より多いドナー細胞由来である。さらに他の好ましい実施形態においては、染色体は、ＤＮＡ複製なしにクロマチン塊の形成を可能にする条件下で、４未満のセットの相同染色体を有するドナー核を分裂抽出物、界面活性剤もしく／または塩、またはプロテインキナーゼと接触させることにより取得する。好ましい融合誘発化合物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びリポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（登録商標）、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ）（登録商標）、ＤＯＴＡＰＯ（登録商標）｛Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチル硫酸エステル；Ｃ４３Ｈ８３ＮＯ８Ｓ｝、ＤＯＳＰＡ（登録商標）｛２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロ酢酸エステル｝、及びＤＯＰＥ（登録商標）（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）などの脂質が挙げられる。他の好ましい脂質としては、中性及び第四級アンモニウム基を含有する一価または多価カチオン脂質が挙げられる。さらなる好ましい脂質は、コレステロール中のヒドロキシル基と脂質中の或る基との反応から形成されるコレステロール部分を有する。さらに他の好ましい脂質は、好ましくは５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、または２０〜３０個の炭素原子を含有する飽和または不飽和脂肪酸を有する。これらの脂質は、標準の化学合成技術を用いて合成するか、天然供給源から得るか、または販売元から購入することができる（Ｓｕｍｍｅｒｓら， Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ． ７１ （６）：３１９９−２０６， １９９６；Ｎａｂｅｋｕｒａら， Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ． １３ （７）：１０６９−７２， １９９６；Ｗａｌｔｅｒら， Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ． ６６ （２ Ｐｔ １）：３６６−３７６，１９９４；Ｙａｎｇら， Ｂｉｏｓｃｉ Ｒｅｐ． １３ （３）：１４３−１５７，１９９３；Ｗａｌｔｅｒ及びＳｉｅｇｅｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ６：３２（１３）：３２７１−３２８１， １９９３）。他の好ましい融合誘発化合物は、ウニ卵またはいずれの他の供給源由来であってもよい膜小胞画分などのリン脂質である（Ｃｏｌｌａｓ及びＰｏｃｃｉａ， Ｊ． ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １０９，１２７５：１２８３， １９９６）。染色体の膜小胞画分との接触は、無傷の膜で封入されてない染色体で行うのが好ましい。
【００１５】
関係する態様においては、本発明は、核をレシピエント細胞中に挿入する方法であって、核のレシピエント細胞への進入を可能にする条件下で、核及び該細胞を融合誘発化合物と接触させることを含む前記方法を提供する。融合誘発化合物は脂質であるかまたは同一のモノマーからなるものでないポリマーである。好ましくは、核を融合誘発化合物を用いてインキュベートした後に、レシピエント細胞と接触させる。様々な実施形態においては、核とレシピエント細胞は同じ種由来であるかまたは異なる種または異なる属由来である。好ましくは、核は単相体、二倍体または四倍体であり、かつレシピエント細胞は低二倍体、単相体、または除核体である。好ましい実施形態においては、レシピエント細胞は受精したまたは未受精の卵母細胞である。好ましくは、レシピエント細胞または核はヒトまたは非ヒト哺乳類由来である。他の実施形態においては、レシピエント細胞は成体、胎児、または胚の細胞である。好ましい融合誘発化合物は、リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（登録商標）、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ）（登録商標）、ＤＯＴＡＰ（登録商標）、ＤＯＳＰＡ（登録商標）、及びＤＯＰＥ（登録商標）などの脂質である。他の脂質としては、中性脂質及び第四級アンモニウム基を含有する一価または多価カチオン脂質が挙げられる。さらなる好ましい脂質は、コレステロール部分または、好ましくは５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、または２０〜３０個の炭素原子を含有する、飽和または不飽和脂肪酸を有する。他の好ましい融合誘発化合物は、ウニ卵またはいずれかの他の供給源由来の膜小胞画分などのリン脂質である（Ｃｏｌｌａｓ及びＰｏｃｃｉａ、前掲）。好ましくは、核と膜小胞画分との接触は、無傷の膜で封入されてない核によって行う。
【００１６】
本発明の様々な態様の好ましい実施形態においては、核または染色体は成体、胎児、または胚の細胞由来である。核または染色体はまた、次の好ましいドナー細胞のいずれから得てもよいし、または次の好ましいレシピエント細胞のいずれに挿入してもよい。好ましい細胞の例としては、上皮（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ）細胞、神経細胞、表皮（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ）細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラニン形成細胞、軟骨細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、赤血球、マクロファージ、単球、繊維芽細胞、及び筋細胞などの分化細胞；ならびに胚細胞（例えば、幹細胞及び胚生殖細胞）などの未分化細胞が挙げられる。他の好ましい実施形態においては、細胞は、乳腺、卵丘、顆粒膜、または卵管細胞などの雌性生殖系由来である。他の好ましい細胞は、胎児細胞及び胎盤細胞が挙げられる。好ましい細胞はまた、膀胱、脳、食道、ファローピウス管、心臓、小腸、胆嚢、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、脊椎、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿管、尿道、及び子宮などのいずれであってもよい器官が挙げられる。好ましい非ヒト哺乳類は、ウシ属（ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｂｏｓ）のメンバーが挙げられる。他の好ましい哺乳類の例は、ウシ、ヒツジ、大角ヒツジ（ｂｉｇ−ｈｏｒｎ ｓｈｅｅｐ）、ヤギ、バッファロー、アンテロープ、雄ウシ、ウマ、ロバ、ラバ、シカ、エルク、カリブー、スイギュウ（ｗａｔｅｒ ｂｕｆｆａｌｏ）、ラクダ、ラマ、アルパカ、ウサギ、ブタ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター及びサルなどの霊長類が挙げられる。さらに他の好ましい実施形態においては、核、透過化細胞または染色体は、トランスジェニック細胞もしくは哺乳類由来であるかまたはドナー細胞に見出されないもしくは天然細胞に見出されない突然変異を含有する。
【００１７】
好ましいトランスジェニックドナー核及びドナー細胞は、クローン哺乳類の疾患または寄生生物に対する耐性を改良するタンパク質をコードする。あるいは、クローン哺乳類がウシの尿、血液、または乳中に、ヒトタンパク質の産生などの組換え産物を産生するように、ドナー核またはドナー細胞を遺伝子操作することができる。例えば、ウロプラキン（ｕｒｏｐｌａｋｉｎ）プロモーターの制御下でヒトタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を挿入することにより、ウシの乳中にタンパク質を発現させることができる。クローンウシの乳中に産生されるようにした治療タンパク質の例は、ヒトモノクローナル抗体及びＩ〜ＸＩＩＩのいずれのヒト凝固因子であってもよい（Ｖｏｅｔ及びＶｏｅｔ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９０）。これらの異種タンパク質は、プロラクチンプロモーターまたはウシの乳中の発現に適したいずれの他のプロモーターの制御下でも発現させることができる。クローン哺乳類の乳、血液、または他の体液中のヒト抗体を産生するには、標準技術を利用して、抗体重鎖もしくは軽鎖に対する内因性遺伝子を不活化もしくは「ノックアウト」して機能性抗体がドナー核によりコードされないようにし、そしてヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、もしくはＩｇＭの重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子をドナー核のゲノム中に挿入する。これらのまたは他の組織もしくは体液由来の組換えタンパク質は、標準の精製法（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、前掲）を用いて精製することができる。
【００１８】
本発明の方法を用いて作製した胚、胎児、または成体哺乳類由来の細胞、組織、または器官は、ヒトの疾患の治療または予防などの医療に応用する材料供給源として利用しうることも意図する。例えば、細胞、組織、もしくは器官をｉｎ ｖｉｔｒｏでクローン胚から発生させて次いで哺乳類（例えば、ヒト）へ導入しても、クローン哺乳類から除去して異種の他の哺乳類へ導入しても、またはクローン哺乳類から除去して同種の他の哺乳類へ導入してもよい。例えば、クローン哺乳類由来の神経組織をヒト神経系内の適当な領域中に移植して、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、もしくはＡＬＳなどの神経学的疾患；または脊髄損傷を治療、予防、もしくは安定化することができる。特に、変性もしくは損傷した神経細胞をクローン哺乳類由来の対応する細胞により置換えることができる。この移植法はまた、自己免疫応答疾患を治療、予防、もしくは安定化するために利用することもできるのであり、かかる疾患は、限定されるものでないが、インスリン依存性糖尿病、慢性関節リウマチ、尋常天疱瘡、多発性硬化症、及び重症筋無力症が挙げられる。これらの方法において、レシピエント自身の免疫系により攻撃される細胞を移植細胞により置換えることができる。クローン哺乳類はまた軟骨、骨髄、もしくは他の組織もしくは器官のいずれの供給源としてでも利用することができる。
【００１９】
ドナー移植材料供給源としてのクローン哺乳類を生産するには、クローン哺乳類を作製するのに使用するドナー核もしくはドナー細胞を、ドナー材料を投与しようとするレシピエント哺乳類に見出されるＭＨＣクラスＩタンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列をもつ異種ＭＨＣクラスＩタンパク質をコードするように改変することが好ましい。あるいは、ドナー核がコードする異種ＭＨＣクラスＩタンパク質は、レシピエント哺乳類と同じ属もしくは種の他の哺乳類に見出されるＭＨＣクラスＩタンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列である。異種ＭＨＣタンパク質を発現するクローン哺乳類由来のこれらのドナー細胞、組織、もしくは器官は、レシピエント哺乳類に投与したときに、有害な免疫応答を誘発する恐れが低い。他の好ましいドナー移植材料は、ヒト補体インヒビターＣＤ５９またはヒト補体レギュレーター崩壊促進因子（ｈ−ＤＡＦ）などの、レシピエント哺乳類の補体経路を阻害する異種タンパク質を発現するように改変されたドナー核またはドナー細胞を用いて作製したクローン哺乳類から得られる（例えば、Ｒａｍｉｒｅｚら， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １５：９８９−９９８， ２０００；Ｃｏｓｔａら， Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６：６−１６， １９９９を参照）。さらに他の好ましい実施形態においては、ドナー核またはドナー細胞は、α（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼなどのガラクトシルトランスフェラーゼの発現または活性を低下または消滅する突然変異を有する（Ｔｅａｒｌｅら， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６１：１３−１９， １９９６；Ｓａｎｄｒｉｎ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． １４１：１６９−１９０， １９９４；Ｃｏｓｔａら， Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６：６−１６， １９９９）。この酵素は、このガラクトースα（１，３）−ガラクトースエピトープを発現する細胞がヒトに投与されると、細胞表面分子を炭水化物によって改変して有害な免疫応答を誘発する。従って、このエピトープの発現レベルの低いドナー移植材料はレシピエント哺乳類による拒絶発生率が低いであろう。
【００２０】
本明細書に使用される「クロマチン塊（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｍａｓｓ）」は、膜で囲まれてない１以上の染色体を意味する。クロマチン塊は、１つの細胞の染色体の全てを含有することが好ましい。凝縮した（ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ）染色体を含有する人工的に誘導したクロマチン塊は、本明細書に記載のように、核を分裂再プログラミング培地（例えば、分裂抽出物）へ曝して作ることができる。あるいは、脱凝縮した（ｄｅｃｏｎｄｅｎｓｅｄ）もしくは部分的に凝縮した染色体を含有する人工的に誘導したクロマチン塊は、本明細書に記載のように、次の１つ：抗ＮｕＭＡ抗体を含有する分裂抽出物、界面活性剤及び／または塩溶液、またはプロテインキナーゼ溶液への曝露により作製することができる。クロマチン塊は、物理的にお互いに接触していない区切られた染色体を含有してもよく、または物理的に接触した２以上の染色体を含有してもよい。
【００２１】
所望であれば、染色体凝縮のレベルは、標準の方法を利用して、ＤＮＡ染料、ＤＡＰＩによる染色強度を測定することにより決定することができる。染色体が凝縮すると、この染色強度は増加する。従って、染色体の染色強度を、間期の脱凝縮染色体（０％凝縮と定める）及び有糸分裂における最大凝縮染色体（１００％凝縮と定める）に対する染色強度と比較することができる。この比較に基づいて、最大凝縮のパーセントを決定することができる。好ましい凝縮クロマチン塊は、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００％凝縮している。好ましい脱凝縮または部分的凝縮クロマチン塊は、５０、４０、３０、２０、もしくは１０より低く凝縮している。
【００２２】
「核」は、細胞のＤＮＡのほとんどまたは全てを含有する膜で囲まれた小器官を意味する。ＤＮＡは脱凝縮した形態で染色体中にパッケージされる。好ましくは、ＤＮＡを封入する膜は１以上の脂質二重層を含むかまたはヌクレオポリン（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｉｎ）を有する。
【００２３】
「４未満の相同染色体セットを有する核」は、４ｎより少ないＤＮＡ含量を有する核（ここで「ｎ」は特定の属もしくは種の哺乳類の正常な単相体染色体セット中に見出される染色体数である）を意味する。かかる核はそれぞれの遺伝子もしくは遺伝子座の４コピーを有しない。好ましくは、核は二倍体であり、従って２つの相同染色体セットを有するが、２未満の完全なクロマチド対を有する。
【００２４】
「前核」は、減数分裂から生じる単相体核、または核導入前核を意味する。雌性前核は、雄性前核と融合する前の卵母細胞または卵子の核である。雄性前核は、受精時に卵母細胞または卵子に進入した後の、しかし雌性前核と融合する前の精子核である。核導入前核は、ドナー細胞、核、またはクロマチン塊の卵母細胞中への導入後に生成する前核（例えば、二倍体前核）である。核導入前核は、４未満の相同染色体セットを有する。
【００２５】
「ドナー細胞」は、それから核もしくはクロマチン塊が誘導される細胞または透過化細胞を意味する。
【００２６】
「透過化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」は、原形質膜における細孔の形成、または原形質膜の部分的もしくは完全な除去を意味する。
【００２７】
「再プログラミング培地」は、細胞、核、クロマチン塊、もしくは染色体から或る因子の除去、または溶液から細胞、核、クロマチン塊、もしくは染色体への或る因子の付加を可能にする溶液を意味する。好ましくは、或る因子の付加また除去は、ドナー細胞、クロマチン塊、もしくは核内の、または再プログラムしたクロマチン塊もしくは核を含有する細胞内の、ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを増加もしくは減少する。他の実施形態においては、透過化細胞、クロマチン塊、または核を再プログラミング培地内でインキュベートして、再プログラムしたクロマチン塊、または核を含有する透過化細胞または細胞の表現型をドナー細胞の表現型に対して改変する。さらに他の実施形態においては、透過化細胞、クロマチン塊、または核を再プログラミング培地内でインキュベートして、再プログラムしたクロマチン塊、または核を含有する透過化細胞または細胞の活性をドナー細胞に対して増加または消滅させる。
【００２８】
再プログラミング培地の例は、タンパク質または核酸などの生物学的分子を含有しないバッファーなどの溶液が挙げられる。かかる溶液は、核、クロマチン塊、または染色体由来の１以上の因子の除去に有用である。他の好ましい再プログラミング培地は、細胞核、細胞質、またはそれらの組合せ由来の抽出物などの抽出物である。細胞抽出物の例は、卵母細胞（例えば、哺乳類、脊椎動物、または無脊椎動物卵母細胞）、雄性生殖細胞（精原細胞、精母細胞、精子細胞、精子などの哺乳類、脊椎動物、または無脊椎動物生殖細胞）、及び幹細胞（例えば、成体または胚性幹細胞）由来の抽出物が挙げられる。さらに他の再プログラミング培地は、１以上の天然または組換え因子（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストン、プロタミン、核ラミン、転写因子、アクチベーター、リプレッサー、クロマチンリモデリングタンパク質、増殖因子、インターロイキン、サイトカイン、または他のホルモンなどの核酸またはタンパク質）が加えられた溶液もしくは抽出物、または１以上の因子が除去された抽出物である。なお他の再プログラミング培地は、界面活性剤（例えば、１以上の次の界面活性剤：ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４、ＣＨＡＰＳ、デオキシコール酸Ｎａ、ｎ−オクチルグルコシド、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、ＩＧＥＰＡＬ、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ４０、またはＴｗｅｅｎ ８０のイオン性または非イオン性界面活性剤の０．０１％〜０．１％、０．１％〜０．５％または０．５％〜２％溶液）、塩（例えば、〜０．１、０．１５、０．２５、０．５、０．７５、１、１．５または２ＭのＮａＣｌまたはＫＣｌ）、ポリアミン（例えば、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、１ｍＭまたは１０ｍＭスペルミン、スペルミジン、プロタミン、またはポリ−Ｌ−リシン）、プロテインキナーゼ（例えば、サイクリン依存性キナーゼ１、プロテインキナーゼＣ、プロテインキナーゼＡ、ＭＡＰキナーゼ、カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼ、ＣＫ１カゼインキナーゼ、またはＣＫ２カゼインキナーゼ）、及び／またはホスファターゼインヒビター（例えば、１以上の次のインヒビター：オルトバナジン酸Ｎａ、ピロリン酸Ｎａ、フッ化Ｎａ、ＮＩＰＰ１、インヒビター２、ＰＮＵＴＳ、ＳＤＳ２２、ＡＫＡＰ１４９、またはオカダイン酸（ｏｃａｄａｉｃ ａｃｉｄ）の〜１０μＭ、１００μＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ）の溶液が挙げられる。複数の実施形態においては、再プログラミング培地は、抗ＮｕＭＡ抗体を含有する。所望であれば、複数の再プログラミング培地を同時にまたは逐次的に使用してドナー細胞、核、またはクロマチン塊を再プログラミングしてもよい。
【００２９】
「間期再プログラミング培地」は、クロマチン脱凝縮及び核エンベロープ形成を誘導する培地（例えば、間期細胞抽出物）を意味する。
【００３０】
「分裂再プログラミング培地」は、クロマチン凝縮及び核エンベロープ崩壊を誘導する培地（例えば、分裂細胞抽出物）を意味する。
【００３１】
「再プログラムした細胞」は、再プログラミング培地に曝した細胞を意味する。好ましくは、ドナーまたは透過化細胞内に発現されない少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００またはそれより多いｍＲＮＡまたはタンパク質分子が、再プログラムした細胞内に発現される。他の好ましい実施形態においては、ドナーもしくは透過化細胞内に発現されないが、再プログラムした細胞内に発現されるｍＲＮＡまたはタンパク質分子の数は、１〜５、５〜１０、１０〜２５、２５〜５０、５０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、または２００〜３００である。好ましくは、再プログラムした細胞内に発現されない少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００またはそれより多いｍＲＮＡまたはタンパク質分子が、ドナー細胞または透過化細胞内に発現される。さらに他の好ましい実施形態においては、再プログラムした細胞内に発現されないが、ドナーもしくは透過化細胞内に発現されるｍＲＮＡもしくはタンパク質分子の数は、１〜５、５〜１０、１０〜２５、２５〜５０、５０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、または２００〜３００である。なおさらに他の好ましい実施形態においては、これらのＲＮＡまたはタンパク質分子はドナー細胞（すなわち、ドナーもしくは透過化出発細胞）と再プログラムした細胞の両方に発現されるが、これらの細胞内の発現レベルは、標準アッセイ（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２０００）を用いて測定して、少なくとも２、５、１０、もしくは２０倍だけ異なる。
【００３２】
「或る因子の付加」は、或る因子の、クロマチン、染色体、または核膜もしく核マトリックスなどの核エンベロープ成分との結合を意味する。あるいは、該因子は核内に取込まれて（ｉｍｐｏｒｔ）核エンベロープにより拘束または封入される。好ましくは、染色体と結合したまたは核内に位置する因子の量は少なくとも２５、５０、７５、１００、２００、もしくは５００％だけ増加する。
【００３３】
「或る因子の除去」は、或る因子の、クロマチン、染色体、または核膜もしくは核マトリックスなどの核エンベロープ成分からの解離を意味する。あるいは、該因子は核から放出されて（ｅｘｐｏｒｔ）もはや核エンベロープにより拘束または封入されない。好ましくは、染色体と結合したまたは核内に位置する因子の量は少なくとも２５、５０、７５、１００、２００、もしくは５００％だけ減少する。
【００３４】
「或る因子の強化または枯渇」は、再プログラミング培地（例えば、細胞抽出物）に元来存在する因子の量の少なくとも２０、４０、６０、８０、もしくは１００％だけの、天然または組換え因子の添加または除去を意味する。あるいは、再プログラミング培地に自然状態では存在しない天然または組換え因子を添加してもよい。好ましい因子は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストン、プロタミン、核ラミン、転写因子、アクチベーター、リプレッサーなどのタンパク質；膜小胞、及び小器官が挙げられる。ある好ましい実施形態においては、以下に記載のように、該因子を再プログラミング培地に加える前に精製する。あるいは、以下に記載の精製法の１つを用いて望ましくない因子を再プログラミング培地から除去してもよい。
【００３５】
「精製された」は、自然に随伴する他の成分から分離されたことを意味する。典型的には、或る因子は、それが自然状態で随伴するタンパク質、抗体、及び天然の有機分子の少なくとも５０重量％を含まないとき、実質的に純粋である。好ましくは、該因子は少なくとも７５重量％、さらに好ましくは、少なくとも９０重量％、そして最も好ましくは少なくとも９９重量％純粋である。実質的に純粋な因子は、化学合成、自然供給源からの因子の分離、または自然状態で該因子を産生しない組換え宿主細胞における該因子の産生により取得することができる。タンパク質、小胞、及び小器官は、当業者であれば、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２０００）などに記載の標準技術を利用して精製することができる。該因子は好ましくは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィ、光学密度、ＨＰＬＣ分析、またはウェスタン分析（Ａｕｓｕｂｅｌら、前掲）を用いて測定し、出発物質より少なくとも２、５、または１０倍純粋である。好ましい精製方法は免疫沈降、免疫アフィニティクロマトグラフィなどのカラムクロマトグラフィ、磁気ビーズ免疫アフィニティ精製、及びプレート結合抗体を用いるパンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）が挙げられる。
【００３６】
「再クローニング（ｒｅｃｌｏｎｅｄ）」は、第２ラウンドのクローニングを意味する。特に、本発明の方法により作製した胚、胎児、または成体由来の細胞を、分裂再プログラミング培地（例えば、分裂細胞抽出物）中でインキュベートしてクロマチン塊を形成し、上記のように、除核卵母細胞中に挿入してもよい。あるいは、該細胞を、上記のように、透過化し、再プログラミング培地でインキュベートし、そして除核卵母細胞中に挿入してもよい。２ラウンド以上のクローニングを実施すると、ドナークロマチン塊またはドナー細胞のさらなる再プログラミングが起こり、それによりクローニングの最終ラウンド後に生存可能な子孫を作製する機会が増加する。
【００３７】
「生存可能な子孫」は、子宮外（ｅｘ ｕｔｅｒｏ）で生存する哺乳類を意味する。好ましくは、哺乳類は、母性宿主を出た時から、少なくとも１秒間、１分間、１時間、１日間、１週間、１ヶ月、６ヶ月、または１年間生存する。該哺乳類は、生存するために、子宮内（ｉｎ ｕｔｅｒｏ）環境の循環系を必要としない。
【００３８】
「核導入卵母細胞」または「核移植卵母細胞」は、それにドナー細胞、核、またはクロマチン塊を挿入するかまたは融合した卵母細胞を意味する。該卵母細胞から形成された胚は、「核導入」または「核移植」胚と呼ばれる。
【００３９】
「胚（ｅｍｂｒｙｏ）」または「胚性（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）」は、母性宿主の子宮膜中に着床（ｉｍｐｌａｎｔ）してない発生細胞塊を意味する。従って、用語「胚」は受精卵母細胞；ドナークロマチン塊、核、もしくは再プログラムした細胞を含有する卵母細胞；前胚盤胞期発生中の細胞塊；または母性宿主の子宮膜中への着床前及び生殖隆起形成前の発生段階にあるいずれの他の発生細胞塊を意味してもよい。胚は細胞発生の複数段階を表わしうる。例えば、或る細胞胚は、受精卵（ｚｙｇｏｔｅ）と呼ばれることも；卵割した胚（ｃｌｅａｖｅｄ ｅｍｂｒｙｏ）から生じる細胞の固形球状物質は桑実胚（ｍｏｒｕｌａ）と呼ばれることも、そして胞胚腔（ｂｌａｓｔｏｃｏｅｌ）を有する胚は胚盤胞（ｂｌａｓｔｃｙｓｔ）と呼ばれることもある。「胚性細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｃｅｌｌ）」は胚から単離されるかまたは胚に含有される細胞である。
【００４０】
「胚から誘導される細胞」は、胚内の細胞の細胞分裂から得られる細胞を意味する。
【００４１】
「キメラ胚」は、２以上の胚由来の細胞から形成された胚を意味する。得られる胎児または子孫はただ１つの最初の胚から誘導された細胞を有してもまたは複数の最初の胚から誘導された細胞を有してもよい。所望であれば、標準ＦＩＳＨ分析または１つの胚に加えた膜染料の分析を利用して、胎盤組織と胎児組織に組み込まれたそれぞれの胚由来の細胞のパーセントを決定することができる。
【００４２】
「前緊密化胚（ｐｒｅｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ ｅｍｂｒｙｏ）」は、緊密化前の胚を意味する。前緊密化胚は本質的にその割球（ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅｒｅ）表面上にＥ−カドヘリンを発現しない。好ましい前緊密化胚は、同じ種の全緊密化胚より少なくとも３、５、１０、２０、３０、もしくは４０倍低いＥ−カドヘリンを発現するかまたはＥ−カドヘリンを発現しない。
【００４３】
「緊密化胚（ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ ｅｍｂｒｙｏ）」は、緊密化しつつあるかまたは緊密化後の胚を意味する。緊密化胚の割球は、その表面上にＥ−カドヘリンを発現する。このＥ−カドヘリン発現は、抗Ｅ−カドヘリン抗体を用いる標準技術を利用して測定することができる。Ｅ−カドヘリンは割球間の接着を増加させる。好ましい緊密化胚としては、緊密化過程が完了している胚が挙げられる。他の好ましい緊密化胚は、同じ種の前緊密化胚より少なくとも３、５、１０、２０、３０、または４０倍以上のＥ−カドヘリンを発現する。
【００４４】
「胎児（ｆｅｔｕｓ）」は、母性宿主の子宮膜中に移植した発生途上の細胞塊を意味する。胎児は、当業者により容易に確認される生殖隆起などの明確な特徴を有する。「胎児性細胞（ｆｅｔａｌ ｃｅｌｌ）」は胎児から単離されるかまたは胎児に含有されるいずれの細胞でもよい。
【００４５】
「単為生殖（ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）」または「単為生殖活性化」は、その核と雄性前核との融合なしに卵母細胞または卵子の受精卵を形成する発生を意味する。例えば、ある卵母細胞は受精なしに分裂するように誘導することができる。
【００４６】
「透明帯（ｚｏｎａ ｐｅｌｌｕｃｉｄａ）」は、多くの哺乳類の卵母細胞または卵子を囲む半透明な、弾性のある、非細胞層を意味する。
【００４７】
「栄養外胚葉（ｔｒｏｐｈｅｃｔｏｄｅｒｍ）」は、哺乳類胚発生の胚盤胞期における胚盤腔を囲む細胞の最外層を意味する。栄養外胚葉はさらなる発生時に胎児組織のほとんどまたは全てに生じる。
【００４８】
「内部細胞塊」は、栄養外細胞により囲まれた細胞を意味する。内部細胞塊はさらなる発生時に胎児組織のほとんどに生じる。
【００４９】
「１つの細胞型に特異的なｍＲＮＡもしくはタンパク質」は、１つの細胞型において、他の全ての細胞型における発現レベルより少なくとも１０、２０、５０、７５、または１００倍高いレベルで発現されるｍＲＮＡまたはタンパク質を意味する。好ましくはそのｍＲＮＡまたはタンパク質は１つの細胞型にだけ発現される。
【００５０】
「突然変異」は、挿入、欠失、フレームシフト突然変異、サイレント突然変異、ノンセンス突然変異、またはミスセンス突然変異などの天然または参照核酸配列の改変を意味する。好ましくは、核酸配列によりコードされるアミノ酸配列は、天然の配列から少なくとも１つのアミノ酸改変を有する。細胞、胚、胎児、または哺乳類のゲノム配列を改変するための組換えＤＮＡ技術の例は、他生物（例えば、ヒト）由来のＤＮＡ配列をゲノム中に挿入する技術、１以上のＤＮＡ配列を欠失する技術、及び１以上の塩基突然変異（例えば、位置指定または無作為突然変異）を標的ＤＮＡ配列中に導入する技術が挙げられる。これらの改変を実施する方法の例は、レトロウイルス挿入、人工染色体技術、遺伝子挿入、組織特異的プロモーターを用いる無作為挿入、相同組換え、遺伝子ターゲティング、転移因子、及び外来ＤＮＡを導入するためのいずれであってもよい他の方法が挙げられる。全てのこれらの技術は分子生物学の技術分野の業者に周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、前掲、を参照）。改変されたＤＮＡを含有するトランスジェニック細胞またはドナートランスジェニック細胞由来のクロマチン塊、染色体及び核を、本発明の方法に利用することができる。
【００５１】
「不死化」は、不死化細胞と同じ細胞型、属、及び種の天然対照細胞より、またはそれから不死化細胞が誘導されたドナー細胞より、少なくとも２５、５０、７５、９０、または９５％多くの細胞分裂を行う能力のあることを意味する。好ましくは、不死化細胞は対照細胞より、少なくとも２、５、１０、または２０倍多くの細胞分裂を行うことができる。さらに好ましくは、不死化細胞は無制限回数の細胞分裂を行うことができる。不死化細胞の例は、その正常増殖制御プロセスを改変する突然変異を、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで自然に獲得した細胞が挙げられる。さらに他の好ましい不死化細胞は、遺伝的に改変されてｒａｓ、ｍｙｃ、ａｂｌ、ｂｃｌ２、またはｎｅｕなどの発癌遺伝子を発現するか、またはエプスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ）ウイルスもしくはＳＶ４０ウイルスなどのトランスフォーミングＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスに感染している細胞が挙げられる（Ｋｕｍａｒら， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． ６５：１５３−１５９， １９９９；Ｋｎｉｇｈｔら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：３１３０−３１３４， １９８８；Ｓｈａｍｍａｈら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １６０−１９−２５， １９９３；Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ及びＨｉｎｋｕｌａ， Ｈｕｍ． Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５：９８−１０４， １９９４；Ｋａｔａｏｋａら， Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ６２：２０１−２１１， １９９７；Ｃｈａｔｅｌｕｔ ら， Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４８：６５９−６６６， １９９８）。細胞はまた、遺伝的に改変されてテロメラーゼ遺伝子を発現してもよい（Ｒｏｑｕｅｓら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６１：８４０５−８５０７， ２００１）。
【００５２】
「非不死化」は、上記のように不死化されてないことを意味する。
【００５３】
「融合誘発化合物」は、細胞に隣接して配置されると、クロマチン塊または核がレシピエント細胞中に挿入される確率を増加する化合物を意味する。例えば、融合誘発化合物は、細胞の形質膜に対するクロマチン塊、または核のアフィニティを増加しうる。融合誘発化合物はまた、核の核膜と細胞の形質膜との接合を促進してもよい。
【００５４】
「実質的に同一である」は、他の配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、または１００％同一である配列を有することを意味する。配列同一性は、典型的には、配列解析ソフトウエアを利用しそれに記載されたデフォールトパラメーターを用いて測定する（例えば、ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ， １７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ５３７０５の配列解析ソフトウエアパッケージを参照）。このソフトウエアプログラムは、様々な置換、欠失、及びその他の改変に対して相同性の程度を割当てることにより、類似の配列を対合させる。
【００５５】
本発明は、哺乳類のクローニング及びゲノム材料のレシピエント細胞への導入に関係する複数の利点を提供する。例えば、本方法は、より高いパーセントの生存可能な子孫、農業または医療用途に利用しうる哺乳類の数の増加をもたらしうる。マイクロインジェクションと比較して、本明細書に記載のリポ融合（ｌｉｐｏｆｕｓｉｏｎ）と呼ぶ、染色体、クロマチン塊、または核を細胞中に導入する方法は、細胞構造の物理的破壊をまたはマイクロピペットを用いて核もしくはクロマチン塊を拾いかつそれを細胞中に注入するのに必要な技術的スキルを要しないので、遺伝子材料の細胞中への導入方法としてより優しくかつより簡単である。本発明はまた、ウイルスまたはウイルス成分に関わる融合方法より安全でありうる。さらにリポ融合は、レシピエント細胞に対する生理学的障害を誘発することが、いくらかあるとしても、最小限であると考えられ、従って、融合細胞の内部にシグナリング事象を誘発して細胞周期進行もしくはクローン胚の発生を害しうる電気融合（ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ）より優れて有利である。
【００５６】
本発明のその他の特徴と利点は、以下の詳細な説明および請求項から明白であろう。
【００５７】
詳細な説明
本発明者らは、ドナー遺伝子材料を、レシピエント卵母細胞中に挿入する前にリモデリング（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）することを特徴とする、哺乳類をクローニングする新規の方法を開発した。リモデリングは、発生を改良して全細胞または無傷の核をレシピエント卵母細胞中に導入して誘導されるものより勝る核移植卵母細胞を得るいずれの形態学的変化を意味する。再プログラミング（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）はドナー細胞を再プログラミング培地（例えば、分裂抽出物、界面活性剤及び／または塩溶液、ならびにプロテインキナーゼ溶液）中でインキュベートして達成され、核エンベロープ解離及び恐らくはクロマチン凝縮を生じる。この核エンベロープ崩壊とクロマチン凝縮は、染色体と結合してさもなくば卵母細胞、胚、もしくは胎児発生に望ましくない遺伝子の転写を促進しうる転写調節タンパク質の放出を可能にする。レシピエント卵母細胞中に導入する前にクロマチン塊を精製することにより、さらなる調節タンパク質を除去することができる。あるいは、染色体から放出される特定の調節タンパク質を免疫的に消耗する（ｉｍｍｕｎｏｄｅｐｌｅｔｅ）か、さもなくば再プログラミング培地（例えば、細胞抽出物）から除去して、それらが染色体と再結合するのを防止してもよい。核導入の後に、卵母細胞の細胞質由来の新しいタンパク質は、卵母細胞におけるクロマチンの脱凝縮及び核エンベロープ形成期間に染色体と結合しうる。これらのタンパク質は、卵母細胞が生存可能な子孫に発生するのを可能にする遺伝子の転写を促進する。
【００５８】
このクロマチン導入クローニング法は、従来のクローニング法を用いて生産したクローン胚よりも、もっとｉｎ ｖｉｔｒｏ受精胚に似るタンパク質発現パターンをもつ胚を生産した。実施例１及び４に説明したように、クロマチン導入胚は、従来の核導入胚よりはるかに少ないラミンＡ／Ｃタンパク質を発現した。ラミンＡ／Ｃは核ラミナの体細胞特異的成分であって、分化細胞で自然に発現されるが、胚では発現されない。報じられるラミンと転写因子、クロマチンタンパク質、及びＤＮＡとの相互作用の結果、従来の核導入胚におけるラミンＡ／Ｃの発現は恐らく胚発生にとって望ましくない体細胞特異的タンパク質の発現を促進するのであろう。従って、本発明のクロマチン導入胚は、望ましくない体細胞特異的タンパク質を従来の核導入胚より少なく発現しうる。さらに、クロマチン導入胚の有するＮｕＭＡ（転写調節に関係する核マトリックスの主要成分）発現パターンは、従来の核導入胚よりもっとｉｎ ｖｉｔｒｏ受精胚に似ていた。この結果はまた、クロマチン導入胚が従来の核導入胚よりもっと効率的に再プログラミングされることも示す。
【００５９】
他のクローニング法として、透過化細胞を再プログラミング培地（例えば、細胞抽出物）中で再プログラムし、細胞に因子を付加するかまたは細胞から因子を取除くことを可能にする方法を開発した。透過化細胞の原形質膜は、好ましくは再シールして所望の因子を封入して細胞の膜完全性を回復する。次いで、再プログラムした細胞をレシピエント卵母細胞中に導入してクローン哺乳類を生産する。このクローニング方法を利用して、６０日を過ぎても生存した胎児を生産した。予備的結果は、この方法を用いて生産した胎児の４０〜６０日の胎児生存率（７／１０；７０％）は、通常の核導入胎児（８／１６；５０％）より高いことを示す。
【００６０】
本発明はまた、胎盤組織の大部分が１つの遺伝子供給源由来でありかつ胎児組織の大部分が他の遺伝子供給源由来であるキメラ胚を作製する方法も提供する。これらのキメラ胚は、胎盤異常がより少なく、従って生存率が増加しうる。かかる１つの方法においては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精または天然胚由来の細胞と、従来の核導入方法または本明細書に記載の新規クローニング方法のいずれかを用いて生産した胚由来の細胞とを接触させる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精胚由来の細胞を核導入胚の周辺部（例えば、透明帯と胚自身との間）に注入してもよい。この方法を用いて、対照核導入胚の４０日間２５％生存率に対して、６７％生存率を有するキメラ胚を生産した。代わりの方法においては、前緊密化、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精または天然胚由来の細胞を前緊密化核導入胚由来の細胞とともに、それぞれの胚由来の細胞が再組織して単一キメラ胚を作ることを可能にする条件（Ｗｅｌｌｓ 及びＰｏｗｅｌｌ， Ｃｌｏｎｉｎｇ ２：９−２２， ２０００）下でインキュベートした。両方の方法において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精または天然胚由来の細胞は、優先的に胎盤中に組込まれ、核導入法由来の細胞は優先的に胎児組織中に組込まれる。
【００６１】
本発明はまた、リポ融合（ｌｉｐｏｆｕｓｉｏｎ）と呼ぶ、核または染色体を細胞中に挿入する新規の方法も特色とする。本法は核または染色体及びレシピエント細胞を、核または染色体が細胞の細胞質中に導入されることを可能にする融合誘発化合物とともにインキュベートすることを含む。本法は、一般的に、全ての細胞型由来の核及び染色体に、ならびに全ての細胞型のレシピエント細胞に応用することができる。
【００６２】
これらの方法をさらに以下に記載する。以下に記載の方法はいずれも、細胞抽出物以外の再プログラミング培地を用いて実施できることを指摘しておく。例えば、再プログラミング培地は、１以上の天然または組換え因子（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストン、プロタミン、核ラミン、転写因子、アクチベーター、リプレッサー、クロマチンリモデリングタンパク質、増殖因子、インターロイキン、サイトカイン、またはその他のホルモンなどの核酸またはタンパク質）を、バッファーなどの溶液に加えて作ってもよい。好ましくは、該因子の１以上は卵母細胞または胚性幹細胞などの幹細胞に特異的である。
【００６３】
実施例１：従来のウシ核移植胚における核再プログラミング不完全性の証拠
ウシ前着床発生期間の核エンベロープ、核マトリックス、及びクロマチン−マトリックス界面成分の分布
前着床胚中の核エンベロープ（Ｂ型及びＡ／Ｃ型ラミン）、核マトリックス（ＮｕＭＡ）、及びクロマチン−マトリックス界面（ＡＫＡＰ９５）成分の分布を決定するために、ウシ胚をｉｎ ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）により生産して免疫蛍光分析により試験した。ウシのｉｎ ｖｉｔｒｏ受精は、先に記載（Ｃｏｌｌａｓら， Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖｅｌ． ３４：２１２−２２３， １９９３）のように実施した。簡単に説明すると、単一雄ウシ由来の凍結−融解ウシ精子を４５−９０％パーコル（Ｐｅｒｃｏｌｌ）勾配の最上層に重ねて３０分間、７００ ｘ ｇで遠心分離した。ペレット中の精子濃度を測定し、受精時の最終濃度が１０６精子／ｍｌとなるように精子を希釈した。成熟後２２時間の卵母細胞をＴＬ ＨＥＰＥＳ中で３回洗浄して４８０μｌ受精培地中に置いた。２０μｌ精子懸濁液を５０卵母細胞に対して１０６精子／ｍｌで加えた。胚検定済ミネラルオイル（ｅｍｂｒｙｏ ｔｅｓｔｅｄ ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ）（Ｓｉｇｍａ）０．３ｍｌで覆った胚培養培地０．５ｍｌ中にマウス胎児繊維芽細胞の単層を含有する、４−ウエル組織培養プレートの培養中に胚を置いた。２５〜５０胚を各ウエル中に置き、３８．５℃にて５％ＣＯ２大気雰囲気中でインキュベートした。受精率は前核発生により確認したところ９０％を超えた。
【００６４】
これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ受精ウシ胚を免疫蛍光分析するために、抗ヒト・ラミンＢ抗体をＤｒ． Ｊｅａｎ−Ｃｌａｕｄｅ Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ， ＣＮＲＳ， Ｐａｒｉｓ， Ｆｒａｎｃｅから得た。抗ヒト・ラミンＡ／Ｃモノクローナル抗体は、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入し、抗ＮｕＭＡ抗体はＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。抗ラットＡＫＡＰ９５アフィニティ−精製したウサギポリクローナル抗体はＵｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得た。ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精ウシ胚をポリＬリシンをコートしたグラスカバースリップ上に置き、３％パラホルムアルデヒドを用いて１５分間固定し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いて１５分間、透過化した（Ｃｏｌｌａｓら， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １３５：１７１５−１７２５， １９９６）。タンパク質を、２％ ＢＳＡを含むＰＢＳ／０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）を用いて１５分間ブロックした。一次抗体（抗ＡＫＡＰ９５、抗ラミンＢ、抗ＬＢＲ、抗ＮｕＭＡ、及び抗ラミンＡ／Ｃ）及び二次抗体を用いてそれぞれ３０分間インキュベートし、１： １００でＰＢＳＴ−ＢＳＡ中に希釈して使用した。ＤＮＡは０．１μｇ／ｍｌ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２を用いて対抗染色し、アンチフェード・マウント培地（ａｎｔｉｆａｄｅ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）に組込んだ。サンプルをスライド上に載せ、カバースリップをマニキュアを用いてシールした。免疫蛍光観察は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６０ 落射蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）顕微鏡上で行い、ＪＶＣ ＣＣＤカメラとＡｎａｌｙＳＩＳソフトウエアによって撮影した。画像はＡｌｄｕｓ Ｐｈｏｔｏｓｔｙｌｅｒソフトウエアを用いて処理した。蛍光シグナルの相対数値化は、ＡｎａｌｙＳＩＳ数値化プログラムを用いて実施した。データは平均相対蛍光強度として表現した。
【００６５】
ウシ胚の免疫蛍光分析は、Ｂ型ラミンが核周辺部（図１Ａ）に検出されることを示した。しかし、ラミンＡ／Ｃは前核期または８細胞期に検出されなかった。これらの初期の細胞段階でラミンＡ／Ｃを検出できないことは、分化細胞のマーカーになると予想される（Ｇｕｉｌｌｉら， ＥＭＢＯ Ｊ． ６：３７９５−３７９９， １９８７）。核マトリックス構造タンパク質、ＮｕＭＡは、試験した全ての段階で検出された（図１Ａ）。しかし、ウシ前核期胚において、ＮｕＭＡ標識は両方の前核の最小である雌性前核（ＦＰＮ）（図１Ａ矢印）に限られた。最近、初期マウス胚において特性が決定され（Ｂｏｍａｒら、２００２、提出済み原稿）かつアフィニティ精製抗ラットＡＫＡＰ９５抗体を用いて検出されたＡＫＡＰ９５も、雌性前核（ＦＰＮ）に限られた（図１Ａ）。それにも関わらず、その後の発生段階で、全ての胚盤胞の核にＡＫＡＰ９５の核内分布が観察された（図１Ａ）。
【００６６】
免疫蛍光標識の特異性を、ウシ一次胎児繊維芽細胞及びｉｎ ｖｉｔｒｏ受精胚の前核期のウェスタンブロット分析により実証した（図１Ｂ）。この分析のために、タンパク質をゲル当たり１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより４０ｍＡにて分離した。タンパク質を電気泳動により転写バッファー（２５ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ ８．３、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール、及び０．１％ ＳＤＳ）中で１００Ｖにて１時間、ニトロセルロースメンブラン上に転写した。メンブランを、Ｔｒｉｓバッファー生理食塩水（ＴＢＳ；すなわち、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、及びｐＨ ８．０の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）を用いて１０分間洗浄し、５％ミルクを含有するＴＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ）を用いて１時間ブロックし、そして次の一次抗体を用いて１．５時間インキュベートした：抗ＡＫＡＰ９５（１：２５０希釈）、抗ラミンＢ（１：１０００）、抗ＬＢＲ（１：５００）、抗ＮｕＭＡ（１：５００）、及び抗ラミンＡ／Ｃ（１：５００）。ブロットをＴＢＳＴ中で１０分間、２回洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体を用いて１時間、インキュベートした。ブロットをＴＢＳ中で１０分間、２回洗浄し、増幅された化学発光（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて現像した。
【００６７】
全てのタンパク質をその予想見かけＭｒ：６８ｋＤａ（Ｂ型ラミン）、７０及び６０ｋＤａ（それぞれ、ラミンＡ及びＣ）、〜１８０ｋＤａ（ＮｕＭＡ）、及び９５ｋＤａ（ＡＫＡＰ９５）において検出した。全体的に見て、これらの結果は、前着床ウシ胚が、交差反応性抗体を用いて検出しうる核構造タンパク質を発現することを示した。注目すべきは、ラミンＡ／Ｃはウシ前着床胚中に免疫学的に検出されない。ラミンＡ／Ｃは体細胞中に発現される（図１Ｂ）ので、これらは核移植胚における核再プログラミングに対するマーカーとなりうる。
【００６８】
核移植ウシ胚における核エンベロープ、ＭｕＭＡ、及びＡＫＡＰ９５の動態
従来のウシの核移植方法における、核エンベロープ及び核マトリックス構造の動態を試験した。これらの構造を、ラミンＡ／Ｃ及びＢ、ＮｕＭＡ、ならびにＡＫＡＰ９５それぞれに対する抗体を用いて研究した。核リモデリング中のこれらのマーカーの動態を確認するために、ウシ核移植胚は、一次胎児繊維芽細胞を用いて生産し、先に記載（Ｋａｓｉｎａｔｈａｎら， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ６４：１４８７−１４９３， ２００１）のとおり、ドナー細胞として単離した。簡単に説明すると、細胞をウシ胎児から、０．０８％トリプシン及び０．０２％ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（トリプシン−ＥＤＴＡ）を用いてトリプシン処理により収穫した。細胞を、Ｔ７５培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）、０．１５ｇ／ｍｌグルタミン（Ｓｉｇｍａ）、０．００３％（β−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、及び抗生−抗真菌物質（Ｇｉｂｃｏ）を補充したα−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中に接種した。接種後第３日に、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡを用いて収穫し、α−ＭＥＭ／ＤＭＳＯ中で凍結した。Ｇ１細胞を、先に記載（Ｋａｓｉｎａｔｈａｎら， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ６４：１４８７−１４９３， ２００１）のとおり単離した。簡単に説明すると、単離後２４時間に、５．０ ｘ １０５細胞を、ＭＥＭ／ＦＢＳの１０ｍｌを含有するＴ７５フラスコ中のプレート上にまいた。翌日、プレートをＰＢＳを用いて洗浄し、培地を１〜２時間置き換え、そしてプレートをＶｏｒｔｅｘ上で中速度にて３０〜６０秒間、振とうした。５００ ｘ ｇで５分間遠心分離して培地を除去し、ペレットを２５０μｌのＭＥＭ／ＦＢＳ中に再懸濁した。細胞質ブリッジにより結合した細胞ダブレット（ｄｏｕｂｌｅｔ）をマイクロピペットを用いて選択し、核導入に使用した。
【００６９】
ウシ核導入を、先に記載（Ｋａｓｉｎａｔｈａｎら，  Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ６４：１４８７−１４９３， ２００１）のとおり実施した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟卵母細胞を、成熟後１８−２０時間に除核した。Ｇ１ドナー細胞を卵周囲空間中に導入した後、それらを、２０マイクロ秒の間、２．４ ｋＶ／ｃｍの１回の電気パルス（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ ２００， Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ）を用いて融合した。成熟後２８〜３０時間（すなわち、卵巣から採取した後に卵母細胞を成熟培地に置いた後２８〜３０時間、かつドナー細胞との融合後少なくとも２時間）に、再構成した卵母細胞と単為生殖対照とをカルシウムイオノフォア（５μＭ）を用いて４時間（Ｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、次いで１０μｇシクロヘキシミド及び２．５μｇサイトカラシンＤ（Ｓｉｇｍａ）を含むＡＣＭ培地（１００ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、０．２７ｍＭ ＣａＣｌ２、２５ｍＭ ＮａＨＣ０３、１ｍＭ乳酸ナトリウム、０．４ｍＭピルビン酸塩、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、３ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１％ ＢＭＥアミノ酸、及び１％ ＭＥＭ非必須アミノ酸）により、５時間活性化した（Ｌｉｕら， Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ４９：２９８−３０７， １９９８）。活性化後、核移植胚もしくは卵母細胞卵を５回洗浄し、マウス胎児繊維芽細胞とともに３８．５℃にて５％ＣＯ２大気中で同時培養した。
【００７０】
再構成した胚を標準技術を利用して活性化して、融合後３時間に未成熟クロマチン凝縮（ＰＣＣ）期の胚をパラホルムアルデヒドを用いて固定し、免疫蛍光をラミンＡ／Ｃ、ラミンＢ、ＮｕＭＡ、及びＡＫＡＰ９５に対する抗体を用いて分析した（図２、ＰＣＣ）。さらに、前核（ＰＮ）期へ進行させた核移植胚のグループ（すなわち、融合後１５時間ウシ胚）を同様に分析した（図２、核移植ＰＮ）。対照として、本明細書に記載のように活性化した単為生殖卵母細胞も前核期に試験した（図２、Ｐａｒｔｈ． ＰＮ）。
【００７１】
予想のように、ドナー体細胞（ウシ胎児繊維芽細胞、図２）は文献から予期される分布をもつ全てのマーカーを発現した。未成熟クロマチン凝縮期に、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２を用いるＤＮＡ染色により、明確な凝縮染色体塊を確認した。凝縮染色体上もしくは近傍にラミンＡ／Ｃ及びＢは検出されず（図２、ＰＣＣ）、恐らく卵細胞質中でそれらが分散している結果であろう。若干の標識したＮｕＭＡを検出した；このＮｕＭＡは恐らく凝縮染色体を維持する紡錘極と関連しているのであろう。ＡＫＡＰ９５は、対照的に、凝縮染色体と関連した（ＰＣＣ）。この結果は、有糸分裂ヒト細胞におけるＡＫＡＰ９５標識を想起させる（Ｃｏｌｌａｓら， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４７：１１６７−１１８０， １９９９；Ｓｔｅｅｎら， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １５０：１２５１−１２６２， ２０００）。前核期には、全てのマーカーが検出された。ラミンＡ／Ｃは前核エンベロープに存在した（図２、核移植−ＰＮ）。これは、対照単為生殖前核のエンベロープ（図２）及び受精前核のエンベロープ（図１Ａ）にそれらが存在しないことと対照的であった。ラミンＢは、対照前核と同じ様に、核移植前核に検出された。同様に、ＮｕＭＡ及びＡＫＡＰ９５は核小体を除いて核内部を飾った。核移植前核のＮｕＭＡ標識は一貫して、対照単為生殖前核より鮮明であった（図２、核移植ＰＮとＰａｒｔｈ． ＰＮとを比較すること）。まとめると、これらの観察は、核移植胚の前核が体細胞核マーカーラミンＡ及びＣを再構築（ｒｅａｓｓｅｍｂｌｅ）し、かつ強いＮｕＭＡ染色を提示することを示す。
【００７２】
単為生殖胚と核移植胚におけるＡＫＡＰ９５の示差的固着（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）
Ａ−キナーゼ固着タンパク質ＡＫＡＰ９５は、有糸分裂の染色体凝縮と関係がある核タンパク質である。核移植後の体細胞核の再プログラミングに影響を与える他の分子マーカーとして利用するために、胎児繊維芽細胞から形成した前核期ウシ核移植胚について、ＡＫＡＰ９５の核内固着の特性を決定した。単為生殖胚由来の前核及びドナー体細胞の核におけるＡＫＡＰ９５の固着も試験した。
【００７３】
前核胚中のＡＫＡＰ９５の核内固着は、ｉｎ ｓｉｔｕで０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍｇ／ｍｌ ＤＮアーゼＩ及び１００または３００ｍＭ ＮａＣｌによる室温にて３０分間の胚の抽出により試験した。先に記したように、雄性前核はいずれのＡＫＡＰ９５も担持しなかった。対照的に、核移植胚の前核及びウシのドナー核において、有意な量のＡＫＡＰ９５とＤＮＡがＤＮアーゼＩ及び３００ ｍＭ ＮａＣｌに対して耐性があった（図３）。Ｂ型ラミンは、単為生殖体（ｐａｒｔｈｅｎｏｔｅ）または核移植前核において、ＤＮアーゼＩ及び３００ ｍＭ ＮａＣｌによって抽出されず（図３）、ＡＫＡＰ９５とＤＮＡ分布の変化は核構造の全体変化から起こったのではないことを示唆した。これらのデータは、ウシにおいては、ＡＫＡＰ９５が体細胞核と同じように、核移植前核において単為生殖前核におけるより強く核内構造に固着していることを示す。この結合がＤＮＡ組織に制約を課すのかまたは核移植胚中のゲノム組織変化から生じるのかは、今後確認すべき課題である。ＤＮアーゼＩ耐性ＤＮＡは転写上サイレントであるので、核移植後のＡＫＡＰ９５固着の不完全なリモデリングは恐らく発生上重要な遺伝子の発現を害するであろう。
【００７４】
核移植ウシ胚における、ラミンＡ／Ｃの転写ミス制御
得られた注目すべき観察所見として、ラミンＡ／Ｃはウシ核移植胚の前核周辺部で再構築されるが、この体細胞特異的マーカーはｉｎ ｖｉｔｒｏ受精及び単為生殖の前核に存在しない。従って、本発明者らは、ラミンＡ／Ｃの再構築が、（ｉ）未成熟クロマチン凝縮期（図２）に分解（ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｅ）した体細胞ラミンの再ターゲティング、（ｉｉ）母性ラミンＡ／Ｃ ｍＲＮＡプールからのラミンの翻訳と構築、または（ｉｉｉ）核移植前核における体細胞ラミンＡ（ＬＭＮＡ）遺伝子の新規転写から生じたのかどうかを研究した。
【００７５】
これらの可能性のどれであるかを識別するために、本明細書に記載の「従来の」核移植、核移植に続いての再構成胚のタンパク質合成インヒビターシクロヘキシミド（ＣＨＸ）による再構成胚の活性化、または核移植に続いてのＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）インヒビターアクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ）の存在で新規転写を抑制する活性化のいずれかにより、ウシ核移植胚を生産した。ウシ核移植胚のシクロヘキシミド中の培養については、卵母細胞をシクロヘキシミド（ＣＨＸ）中で１４時間インキュベートしたことを除くと、卵母細胞を上記のとおり核導入後に活性化した。活性化後１４時間に、卵母細胞を５回洗浄し、１５μｇ／ｍｌ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｓｉｇｍａ）を含有するＡＣＭ培地中に１時間置いた。インキュベーション後、前核発生を落射蛍光顕微鏡により観察した。次いで前核胚を３％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中で固定し、洗浄し、そしてスライド上に載せた。ウシ核移植卵母細胞のアクチノマイシンＤ中の培養については、５μｇ／ｍｌアクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ）をシクロヘキシイミドインキュベーションステップで加えたことを除くと、卵母細胞を上記のとおり核導入後に活性化した。５時間後、卵を５回洗浄して５μｇ／ｍｌアクチノマイシンＤを含有するＡＣＭ培地中に置いた。活性化後１４時間に、卵を５回洗浄し、１５μｇ／ｍｌ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ （Ｓｉｇｍａ）を含有するＡＣＭ培地中に１時間置いた。インキュベーション後、前核発生を落射蛍光顕微鏡により観察した。前核期胚を３％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中で固定し、洗浄し、そしてスライド上に載せた。
【００７６】
核移植前核周囲のラミンＢ構築は、タンパク質またはＲＮＡ合成抑制による影響を受けなかった。この結果は、ラミンＢが、先に分解した体細胞プールから及び／または卵母細胞の細胞質中のラミンＢの大きなプールから再構築されたことを示す。核移植前核に検出されたラミンＡ／Ｃ（図２）は、シクロヘキシミドを用いる活性化後に再形成した核には存在しなかった。この結果は、ラミンＡ／Ｃ構築が新規タンパク質合成を必要とし、これらのラミンがドナー核注入または細胞融合により卵母細胞中に運ばれた分解した（ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｅｄ）体細胞プールから再ターゲティングされるのでないことを示す。さらに、ラミンＡ／Ｃは、胚をアクチノマイシンＤの存在で活性化すると再構築されない。この結果は、核移植前核中のラミンＡ／Ｃ再構築が、再構成した前核中のＬＭＮＡ遺伝子の新規転写から生じることを示す。核移植前核に検出されたＮｕＭＡは、シクロヘキシミドを用いて活性化した核移植胚の前核で再構築されないが、アクチノマイシンＤ処理した核移植胚の前核にわずかに検出される。この知見は、核移植前核中のＮｕＭＡ再構築は、少なくとも部分的に、母性ＮｕＭＡ ｍＲＮＡのプールから生じる新規翻訳を必要とすることを強く示唆する。抗ＮｕＭＡ標識は、対照無処理核移植胚と比較して、アクチノマイシンＤ処理した核移植胚の前核において弱い、という一致した観察（図４のｂ’とｂ”’を比較すること）は、核移植前核中のＮｕＭＡ構築物（ａｓｓｅｍｂｌｙ）の部分が前核期のＮｕＭＡ遺伝子の新規転写から生じることを示唆する。
【００７７】
まとめると、これらの結果は、ＬＭＮＡ遺伝子は、核移植後の核リモデリング時に打切られる（ｔｕｒｎ ｏｆｆ）のではないことを示す。同様に、ＮｕＭＡ遺伝子は明らかに、前核期の核移植胚中で活性を保持する。これらの遺伝子の不活性化は、クロマチンの高度に凝縮した特性から予期されるように、恐らく未成熟クロマチン凝縮期間に一過的に起こるのであろう（図２）。これらの結果は、本明細書に記載の条件下で生産された核移植胚中の不完全な核再プログラミングを明白に説明する。先にＡＫＡＰ９５について考察したように、本発明者らは、核移植前核中のラミンＡ／Ｃの難分解性が、発生上重要な遺伝子の発現などの遺伝子発現に影響を与えることを提示する。従来報じられたラミンＡ及びＣとクロマチンタンパク質及びＤＮＡとの相互作用、ならびにこれらのラミンと転写因子との関連も、本発明者らの仮説を支持する。
【００７８】
実施例２：哺乳類をクローニングするために再プログラムしたドナークロマチン塊の使用
本発明者らは、図１に示した従来の核導入胚における再プログラミングの不完全性に関する問題を克服するため、核導入前にドナークロマチンをより効率的に再プログラムする新しい方法を開発した。これらの方法は、ドナー細胞由来の核を再プログラミング培地（例えば、細胞抽出物）中でインキュベートして核エンベロープ解離と恐らくクロマチン凝縮を起こすことに関わる。この核エンベロープ崩壊とクロマチン凝縮は、染色体と結合して、さもなくば卵母細胞、胚、もしくは胎児発生にとって望ましくない遺伝子の転写を促進しうる転写調節タンパク質の遊離を可能にする。さらに、再プログラミング培地由来の調節タンパク質がクロマチン塊と結合して発生に所望される遺伝子の転写を促進しうる。
【００７９】
クローニングに利用するドナー核のバルク調製
培養中の同調または非同調細胞集団から、数百万個の核を単離することができる。細胞集団を自然にまたは化学的に同調させることができる。好ましくは、集団中の細胞の少なくとも４０、６０、８０、９０、または１００％をＧ０またはＧ１期に停止させる。これを実施するために、細胞を、例えば５％、２％、または０％血清などの低血清中で１、２、３、またはそれより長い日数の間、インキュベートして、Ｇ０期の細胞のパーセントを増加することができる。細胞をＧ１期に同調するには、細胞を、付着細胞としてコンフルエンスまで増殖させ、次いで０．５〜１μｇ／ｍｌノコダゾール（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中で１７〜２０時間、先に記載（例えば、Ｃｏｌｌａｓら， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４７：１１６７−１１８０， １９９９及びその参考文献を参照）のようにインキュベートしてもよい。フラスコを片手で繰返し軽く叩くことにより、付着細胞を含有するフラスコを激しく振とうし、分裂細胞とＧ１期ダブレットとを剥離させる。Ｇ１期ダブレットは分裂過程末期のまだ細いブリッジで結ばれている長い細胞の対である。剥離したＧ１期ダブレットはこのダブレット構造の特徴に基づいて培地から単離することができる。Ｇ１期ダブレットは付着したままであってもよいし、単離後に２つの別々の細胞に分割してもよい。
【００８０】
同調したまたは非同調の細胞を標準方法を用いてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に回収し、そして数回の洗浄ステップを実施し、細胞をそれらの元の培地から低張バッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．５、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０μＭアプロチニン、１０μＭロイペプチン、１０μＭペプスタチンＡ、１０μＭ大豆トリプシンインヒビター、及び１００μＭ ＰＭＳＦ）に移す。例えば、細胞を５０ｍｌのＰＢＳを用いて洗浄し、５００ ｘ ｇで１０分間、４℃にて遠心分離してペレット化する。ＰＢＳ上清をデカントし、ペレット化した細胞を５０ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁し、そして上記のように遠心分離する。この遠心分離後に、ペレット化細胞を２０−５０容の氷冷低張バッファー中に再懸濁し、５００ ｘ ｇで１０分間、４℃にて遠心分離する。上清を再び捨てて、ほぼ２０容の低張バッファーを細胞ペレットに加える。細胞を注意深くこのバッファーに再懸濁し、氷上で少なくとも１時間インキュベートし、細胞を徐々に膨潤させる。
【００８１】
核を細胞から単離させるため、細胞を標準の方法を用いて溶解する。例えば、２〜５ｍｌの細胞懸濁液をガラス製ホモジナイザーに移し、最初に密着すりこぎ（ｔｉｇｈｔ−ｆｉｔｔｉｎｇ ｐｅｓｔｌｅ）１０−２０ストロークでダウンス（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイズしてもよい。あるいは、細胞懸濁液をモーター駆動ミキサー（例えば、Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ）を用いてホモジナイズしてもよい。所望であれば、細胞溶解を位相差顕微鏡を用いて拡大率４０倍でモニターしてもよい。このホモジナイズ実施中に、核は無傷のまま残し、かつほとんどのまたは好ましくは全ての小胞、小器官、及びタンパク質などの元来結合していた細胞質成分を、核から遊離しなければならない。必要であれば、１〜２０μｇ／ｍｌの細胞骨格インヒビター、サイトカラシンＢまたはサイトカラシンＤを上記の低張バッファーに加えて、この過程を容易に行うことができる。ホモジナイズは、細胞を溶解しかつ細胞質成分を核から遊離するために必要なだけ続ける。複数の細胞型では、１００、１５０、またはそれより多いストロークが必要でありうる。次いで、溶解物を氷上の１５ｍｌ円錐型チューブ中に移し、残りの膨潤細胞の懸濁液について細胞溶解操作を繰り返す。低張バッファーで作った２Ｍストック溶液からとったスクロースを細胞溶解物に加え（例えば、２Ｍストック溶液の１／８容を溶解物に加え）、２５０ｍＭスクロースの最終濃度を得る。この溶液を反転混合し、スイングアウト回転子に入れて４００ ｘ ｇで１０〜４０分間、４℃にて遠心分離して、核をペレット化する。次いで上清を捨て、ペレット化した核を１０〜２０容の核バッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５０ｍＭスクロース、２５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０μＭアプロチニン、１０μＭロイペプチン、１０μＭペプスタチンＡ、１０μＭ大豆トリプシンインヒビター、及び１００μＭ ＰＭＳＦ）中に再懸濁する。核を沈降させ、１〜２容の核バッファーに上記のように再懸濁する。新しく単離した核は、直接ｉｎ ｖｉｔｒｏ再プログラミング及び核導入に以下に記載のように使用してもよいしまたは後の使用に備えて保存してもよい。保存するには、核を核バッファー中にほぼ１０６／ｍｌまで希釈する。グリセロール（１００％グリセロールの２．４容）を加え、穏やかなピペット操作によりよく混合する。懸濁液を氷上の１．５ｍｌチューブ中に１００〜５００μｌ容のアリコートとしてとり、直接メタノール−ドライアイス浴内で凍結し、−８０℃にて保存する。使用前に、核のアリコートを氷上でまたは室温にて解凍する。氷冷核バッファーの１容を加え、その溶液を１，０００ ｘ ｇで１５分間、スイングアウトローターに入れて遠心分離する。ペレット化した核を１００〜５００μｌ核バッファー中に再懸濁し、上記のように遠心分離する。次いでペレット化した核を最小限の容積の核バッファー中に再懸濁して使用するまで氷上で保存する。
【００８２】
ドナー遺伝子材料を再プログラムするために使用する分裂抽出物または培地の調製
分裂抽出物を調製するために、体細胞株（例えば、繊維芽細胞）を、０．５〜１μｇ／ｍｌノコダゾール（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）中で１７〜２０時間、インキュベーションして分裂を同調し（例えば、Ｃｏｌｌａｓら， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４７：１１６７−１１８０， １９９９及びその参考文献）、分裂細胞を、先に記載のように、激しく振とうして剥離させる。剥離したＧ１期ダブレットは捨ててもよいしまたは剥離細胞の大部分（典型的には、少なくとも８０％）を構成する分裂細胞とともに残してもよい。回収した剥離細胞を５００ ｘ ｇで１０分間、１０ｍｌ円錐型チューブ中で４℃にて遠心分離する。複数の細胞ペレットをプールして全容積５０ｍｌの冷ＰＢＳ中に再懸濁し、そして５００ ｘ ｇで１０分間、４℃にて遠心分離する。このＰＢＳ洗浄ステップを繰り返す。細胞ペレットをほぼ２０容の氷冷細胞溶解バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．２、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０μＭ アプロチニン、１０μＭ ロイペプチン、１０μＭ ペプスタチンＡ、１０μＭ 大豆トリプシンインヒビター、１００μＭ ＰＭＳＦ、及び任意に２０μｇ／ｍｌサイトカラシンＢ）中に再懸濁し、そして細胞を８００ ｘ ｇで１０分間、４℃にて遠心分離して沈降させる。上清を捨て、細胞ペレットを、１容以下の細胞溶解バッファー中に注意深く再懸濁する。細胞を氷上で１時間インキュベートして、細胞を膨潤させる。その細胞をチップソニケーターを用いる音波処理、またはガラスすり鉢とすりこぎを用いるダウンス（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイゼーションのいずれかにより溶解する。細胞溶解は、細胞と核の少なくとも９０％が溶解するまで実施し、それを位相差顕微鏡を用いて確認する。細胞と核の少なくとも９０％を溶解するために必要な音波処理時間は、抽出物を調製するために用いる細胞型によって変わりうる。
【００８３】
細胞溶解物を１．５ｍｌ遠心チューブ中に置いて、１０，０００〜１５，０００ ｘ ｇで１５分間、４℃にてテーブルトップ型遠心分離機を用いて遠心分離した。チューブを遠心分離機から取除いて、直接氷上に置いた。上清を２００μｌピペットチップを用いて注意深く採集し、数個のチューブからの上清をプールして氷上においた。この上清は「分裂細胞質」または「ＭＳ１５」抽出物である。クロマチン塊を作製するために通常法または顕微法のいずれを利用するかに依って、この細胞抽出物を氷上で１チューブ当たり５０μｌまたは１０μｌ容のアリコートとする。抽出物を液体窒素上で直ぐ瞬間凍結し、使用まで−８０℃にて保存する。あるいは、細胞抽出物を超遠心チューブに入れて氷上に置く（例えば、ＳＷ５５ Ｔｉローター；Ｂｅｃｋｍａｎに適合した）。必要あれば、チューブは上部にミネラルオイル層を重ねる。その抽出物を２００，０００ ｘ ｇで３時間、４℃にて遠心分離してＭＳ１５抽出物が含有する膜小胞を沈降させる。遠心分離の終りに、オイルを捨てる。上清を注意深く採集し、必要あればプールし、そして氷上の冷１．５ｍｌチューブ内に置く。この上清は、「ＭＳ２００」または「分裂細胞質ゾル」抽出物と呼ぶ。この抽出物のアリコートを採取し、ＭＳ １５抽出物について記載したように、凍結させる。
【００８４】
所望であれば、抽出物を追加の核因子によって強化することができる。例えば、核を、再プログラミング抽出物を誘導した細胞型の細胞から、または任意の他の細胞型の細胞から精製して、上記のように音波処理により溶解する。核因子を、０．１５〜８００ｍＭの濃度のＮａＣｌまたはＫＣｌを含有する核バッファー中で、攪拌下、１０〜６０分間のインキュベーションによって抽出する。溶解物を遠心分離して非抽出成分を沈降させる。目的の抽出因子を含有する上清を透析して、ＮａＣｌまたはＫＣｌを除去する。透析した核抽出物のアリコートを作って、凍結保存する。この核抽出物を様々な濃度で上記の全細胞抽出物に加えた後、核に再プログラミングのために加える。
【００８５】
分裂抽出物はまた、卵母細胞または雄性生殖細胞などの生殖細胞から調製することもできる。例えば、卵母細胞抽出物を作製するには、この段階で自然に停止している中期（ｍｅｔａｐｈａｓｅ）ＩＩ卵母細胞を収穫し、洗浄して、上に記載のように溶解することができる。雄性生殖細胞抽出物を調製するには、畜殺場から得た精巣から、該器官を細かく切り刻んで収穫した細胞をスクロースまたはパーコール（ｐｅｒｃｏｌｌ）勾配上で分画遠心して、生殖細胞を単離する。生殖細胞を体細胞（Ｌｅｙｄｉｇ及びＳｅｒｔｏｌｉ細胞）から分離し、懸濁させて洗浄し、かつＰＢＳ中で沈降させる。次いで細胞を、上記の氷冷細胞溶解バッファー中で１回洗浄し、そして音波処理により溶解する。溶解物を、１５，０００ ｘ ｇで１５分間、４℃にて遠心分離し、上清（すなわち、生殖細胞抽出物）のアリコートを作り、液体窒素で瞬間凍結する。
【００８６】
細胞抽出物の代わりに、再プログラミング培地はまた、１以上の天然もしくは組換え因子（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストン、プロタミン、核ラミン、転写因子、アクチベーター、リプレッサー、クロマチンリモデリングタンパク質、増殖因子、インターロイキン、サイトカイン、または他のホルモンなどの核酸またはタンパク質）を、バッファーなどの溶液に加えて作ることもできる。１以上の因子が卵母細胞または幹細胞に特異的であることが好ましい。
【００８７】
分裂抽出物または培地に対する核の曝露による、凝縮クロマチン塊の形成
ＭＳ１５もしくはＭＳ２００抽出物または分裂培地のアリコートを氷上で解凍する。ＡＴＰ産生系（０．６μｌ）を２０μｌの抽出物または培地に加えてボルテックスにより混合する。ＡＴＰ産生系の調製については、Ｈ２Ｏ中に調製した等比率の１００ｍＭ ＡＴＰストック、１Ｍクレアチンリン酸、及び２．５ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼストック溶液（１００ｘ）を混合し、使用まで氷上に保存する。ＡＴＰ産生系を抽出物に加えた後の最終濃度は、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭクレアチンリン酸、及び２５μｇ／ｍｌクレアチンキナーゼである。
【００８８】
核懸濁液を、抽出物または培地１０μｌ当たり１μｌ核の濃度にて抽出物または培地に加え、ピペット操作によりよく混合し、３０、３３、３５、３７、または３９℃水浴中でインキュベートする。混合物を含有するチューブを静かに定期的間隔で軽く叩いて染色体がチューブ底に固まるのを防止する。核エンベロープ崩壊及び染色体凝縮を、毎１５分などの定期的間隔にて顕微鏡下でモニターする。核エンベロープが崩壊しかつ染色体が凝縮を開始すると、抽出物または培地からクロマチン塊の回収を始める。
【００８９】
分裂抽出物または培地及び抗ＮｕＭＡ抗体に対する核の曝露による、脱凝縮クロマチン塊の形成
あるいは、単離した核を核マトリックスタンパク質ＮｕＭＡに対する抗体を用いて前処理した後に上記方法を実施することにより、凝縮していないまたは部分的にしか凝縮していないクロマチン塊を形成することができる（Ｓｔｅｅｎら， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４９， ５３１−５３６， ２０００）。この方法は、ドナー核を囲む核膜の分解によりクロマチンからの核成分除去は可能にするが、凝縮ステップは抗ＮｕＭＡ抗体の添加により阻害される。染色体凝縮を阻止することにより、染色体を分裂抽出物中でインキュベートしても、染色体破損または消失のリスクを減ずることができる。
【００９０】
この方法については、精製した細胞核（２，０００核／μｌ）を、０．７５μ／ｍｌリソレシチンを含有する核バッファー５００μｌ中で１５分間、室温にて透過化する。過剰のリソレシチンは、核バッファーで作った３％ ＢＳＡの１ｍｌを加えて５分間氷上でインキュベートすることにより、クエンチする。次いで核を沈降させ、核バッファーで１回洗浄する。核を、抗ＮｕＭＡ抗体（１：４０希釈；Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有する１００μｌの核バッファーに２，０００核／μｌにて再懸濁する。氷上で静かに攪拌しながら１時間インキュベーションした後、核を５００ ｘ ｇで１Ｍスクロースを通して２０分間沈降させる。次いで、前節で記載したように、核を核バッファーに再懸濁し、ＡＴＰ産生系を含有する分裂抽出物または培地に加える。場合によっては、抗ＮｕＭＡ抗体を抽出物または培地に加えて、さらに染色体凝縮を防止してもよい。
【００９１】
界面活性剤及び／もしくは塩溶液またはプロテインキナーゼに対する核の曝露による、脱凝縮クロマチン塊の形成
凝縮してないかまたは部分的にしか凝縮していないクロマチン塊はまた、界面活性剤またはプロテインキナーゼに対する曝露により形成することもできる。界面活性剤を用いて核内の染色体と結合していないかまた弱く結合している核成分を可溶化し、核エンベロープの除去をもたらすことができる。この方法については、精製した細胞核（２，０００〜１０，０００核／μｌ）を、０．１％〜０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００またはＮＰ−４０などの界面活性剤を補充した核バッファー中でインキュベートする。核エンベロープの除去を容易にするため、ＮａＣｌなどの追加の塩、をほぼ０．１、０．１５、０．２５、０．５、０．７５、または１Ｍの濃度にてバッファーに加えてもよい。静かに振とうしながら氷上での３０〜６０分間インキュベーションの後に、１０００ ｘ ｇにてスイングアウト回転子中で、全容積に依存して１０〜３０分間、遠心分離して核を沈降させる。ペレット化した核を、０．５〜１ｍｌ核バッファーに再懸濁し、上記のように沈降させる。この洗浄方法を２回繰返して界面活性剤と余分の塩を完全に除去する。
【００９２】
あるいは、組換えまたは天然プロテインキナーゼを単独でまたは組み合わせて使用し、核エンベロープを除去することができる。好ましくは、プロテインキナーゼは、標準方法を用いて精製するかまたは市販の精製品を入手する。これらのキナーゼは核膜、核マトリックス、またはクロマチンの成分をリン酸エステル化することにより核エンベロープの除去をもたらすことができる（例えば、Ｃｏｌｌａｓ及びＣｏｕｒｖａｌｉｎ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０：５−８， ２０００を参照）。好ましいキナーゼは、サイクリン依存キナーゼ１（ＣＤＫ１）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、ＭＡＰキナーゼ、カルシウム／カルモジュリン依存キナーゼ（ＣａｍＫＩＩ）、及びＣＫ１カゼインキナーゼもしくはＣＫ２カゼインキナーゼが挙げられる。この方法については、ほぼ２０，０００精製核を、リン酸化バッファー２０μｌ中で室温にて１．５ｍｌ遠心チューブ内でインキュベートする。ＣＤＫ１（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に対する好ましいリン酸化バッファーは、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．２−７．６）、１０ｍＭ ＭｇＳ０４、８０ ｍＭ β−グリセロリン酸、５ｍＭ ＥＧＴＡ、１００μＭ ＡＴＰ、及び１ｍＭ ＤＴＴを含有する。ＰＫＣに対する、好ましいリン酸化バッファーは、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．２−７．６）、１０ｍＭ ＭｇＳ０４、１００μＭ ＣａＣｌ２、４０μｇ／ｍｌホスファチジルセリン、２０μＭジアシルグリセロール、１００μＭ ＡＴＰ、及び１ｍＭ ＤＴＴを含有する。ＰＫＣとＣＤＫ１の両方を同時に用いるのであれば、４０μｇ／ｍｌホスファチジルセリン及び２０μＭジアシルグリセロールを補充したＣＤＫ１リン酸化バッファーを使用する。ＰＫＡに対する好ましいリン酸化バッファーは、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳ０４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び１００μＭ ＡＴＰを含有する。ＭＡＰキナーゼに対しては、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、及び１ｍＭ ＤＴＴ を補充したＰＫＡリン酸化バッファーを使用することができる。ＣａｍＫＩＩに対しては、１ｍＭ ＤＴＴを補充したＰＫＡバッファーまたはアップステート・バイオロジー（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ｖｅｎｅｍａら Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２７２：２８１８７−９０， １９９７）のＣａｍキナーゼアッセイキットを使用する。
【００９３】
リン酸化反応は、プロテインキナーゼを加えることにより開始し、最終量２５〜１００ｎｇまで加える。反応物は室温にて１時間までインキュベートする。このインキュベーションの間、核エンベロープ崩壊を顕微鏡により１５分程度の間隔でモニターする。核エンベロープ崩壊後に、核を上記のように３回洗浄して界面活性剤溶液を除去する。
【００９４】
培地、抽出物、界面活性剤及び／もしくは塩溶液、またはプロテインキナーゼ溶液からのクロマチン塊回収
凝縮した、部分的に凝縮した、または凝縮していないクロマチン塊を含有する抽出物または溶液を、核バッファーで作った等容積の１Ｍスクロース溶液の下に置く。１，０００ ｘ ｇで、サンプル容積に依存して１０〜３０分間、スイングアウト回転子中で４℃にて遠心分離することにより、クロマチン塊を沈降させる。上清を捨て、ペレット化クロマチン塊を注意深いピペット操作により０．１〜１．０ｍｌの核バッファーまたはリポ融合バッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０μＭアプロチニン、１０μＭロイペプチン、１０μＭペプスタチンＡ、１０μＭ大豆トリプシンインヒビター、及び１００μＭ ＰＭＳＦを含有する２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ約ｐＨ７．０もしくはｐＨ７．５、または２０ｍＭ ＭＥＳ約ｐＨ ６．２）に再懸濁し、そして１，０００ ｘ ｇで１０〜３０分間、遠心分離する。上清を捨て、ペレット化クロマチン塊を核バッファーまたはリポ融合バッファーに再懸濁し、使用まで氷上に保存する。それぞれのクロマチン塊を、顕微操作皿（ｍｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｉｓｈ）に入ったオイル下のＨＥＰＥＳ緩衝化培地２０μｌドロップ（ｄｒｏｐ）へ移す。１つのクロマチン塊を、以下に記載のようにそれぞれの除核卵母細胞中に挿入する。
【００９５】
クロマチン塊を調製する顕微法（ｍｉｃｒｏｍｅｔｈｏｄ）
上記のＡＴＰ産生系、界面活性剤及び／もしくは塩溶液、またはプロテインキナーゼ溶液を含有するＭＳ１５またはＭＳ２００抽出物または分裂培地１０−２０μｌドロップ（ｄｒｏｐ）をペトリ皿内に置く。次いで、単離したＧｌ期細胞ダブレットまたはＧ０期細胞を含有する培地の５０μｌドロップ、細胞溶解を容易にするため用いる０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００またはＮＰ−４０を含有するＨＥＰＥＳ−または重炭酸塩−緩衝培地の別の５０μｌ「溶解」ドロップ、及び卵母細胞注入培地の５０μｌドロップを加える。これらの液ドロップはそれぞれ、ＣＯ２平衡化ミネラルオイルを用いて覆う。溶解した細胞または核を洗浄するために使用する５０μｌ「洗浄ドロップ」の培地もペトリ皿に加える。
【００９６】
細胞をマイクロピペットを用いて溶解ドロップへ移す。静かにアスピレーションを繰返して細胞膜をピペット中で溶解する。細胞が溶解すると、溶解物を静かに洗浄ドロップ中に押出し、核を直接再アスピレーションして界面活性剤を除く。任意に、核を透過化し、抗ＮｕＭＡ抗体とともにインキュベートした後、分裂抽出物または培地に加えてもよい。次いで核を、ＭＳ１５、ＭＳ２００、もしくは培地、界面活性剤及び／もしくは塩溶液、またはプロテインキナーゼ溶液のドロップ中に押出す。核溶解及び染色体凝縮を、上記のように、モニターする。核エンベロープが崩壊すると、もし抗ＮｕＭＡ抗体なしの分裂抽出物を用いた場合は、染色体は凝縮を開始するので、単一の無傷クロマチン塊をマイクロピペットを用いて単離し、次に記載する除核レシピエント卵母細胞に導入する。
【００９７】
卵母細胞の除核
好ましくは、レシピエント卵母細胞は中期ＩＩ期の卵母細胞である。この段階では、卵母細胞は活性化されうるかまたは既に十分活性化していて受精精子に対すると同じように導入したクロマチン塊を処理する。卵母細胞の除核については、卵母細胞中のＤＮＡの一部分または全てを除去するかまたは不活性化することが好ましい。このレシピエント卵母細胞中のＤＮＡの破壊または除去は、卵母細胞の遺伝子材料がクローン哺乳類の成長及び発生に寄与することを防止する。卵母細胞の前核を破壊する１つの方法は、紫外光への曝露である（Ｇｕｒｄｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｘｅｎｏｐｕｓ Ｌａｅｖｉｓ ：−Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｕｓｅｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｋａｙ及びＰｅｎｇ編， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ｖｏｌｕｍｅ ３６： ｐａｇｅｓ ２９９−３０９， １９９１に収載）。あるいは、卵母細胞前核を、標準技術により、外科的に除去してもよい（例えば、ＭｃＧｒａｔｈ及びＳｏｌｔｅｒ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２０：１３００−１３１９， １９８３を参照）。１つの可能な方法においては、１本のニードルを卵母細胞中に挿入し、核をニードルの内部空間中にアスピレートする。次いでそのニードルを卵母細胞から、形質膜を破壊しないように取外す（米国特許第４，９９４，３８４号及び第５，０５７，４２０号）。
【００９８】
クロマチン塊を卵母細胞へ挿入するためのリポ融合
クロマチンは、以下に記載のリポ融合によるかまたは標準マイクロインジェクションまたは電気融合技術によってレシピエント卵母細胞中に導入することができる（例えば、米国特許第４，９９４，３８４号及び第５，９４５，５７７号を参照）。次のリポ融合法はまた、染色体を他のレシピエント細胞中に挿入する他の応用にも利用することができる。
【００９９】
クロマチン塊を、上記のように、有糸分裂抽出物、界面活性剤及び／または塩溶液、あるいはプロテインキナーゼ溶液から遠心分離により単離し、次いでリポ融合バッファーを用いて洗浄する。クロマチン塊は使用まで氷冷リポ融合バッファー中に保存することができる。あるいは、クロマチン塊のアリコートを作り、液体窒素またはメタノール−ドライアイス浴中で凍結して、−８０℃にて凍結保存する。リポ融合溶液は、１以上の融合誘発試薬とリポ融合バッファーとを、それぞれほぼ５：１〜１：１０の比率で混合して調製する。融合誘発試薬は、限定されるものでないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びリポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（登録商標）、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ）（登録商標）、ＤＯＴＡＰ（登録商標）、ＤＯＳＰＡ（登録商標）、ＤＯＰＥ（登録商標）などの親油性化合物、ならびに膜小胞画分から成る。例えば、ＤＯＴＡＰ（登録商標）などのカチオン性脂質を、リポ融合バッファー中でほぼ０．１〜３０μｇ／ｍｌの濃度にて使用してもよい。あるいは、カチオン性脂質とＤＯＰＥ（登録商標）などの中性脂質との混合物からなるリポソーム組成物を利用してもよい。
【０１００】
新しく調製したまたは凍結解凍したクロマチン塊をリポ融合溶液と混合して、クロマチン塊を該化合物によりコーティングすることが可能となる。インキュベーションを２０〜３０℃の温度にてほぼ１０〜３０分間行う。クロマチン塊を含有するリポ融合溶液のミクロドロップをＣＯ２平衡化ミネラルオイルの下に置く。除核レシピエント卵母細胞を含有するドロップも調製する。リポ融合試薬によりコーティングしたクロマチン塊をマイクロピペットで拾い上げ、卵母細胞の細胞質と透明帯との間の囲卵腔に挿入する。クロマチン塊を卵母細胞膜の隣に置いて卵母細胞との接触を確実にする。クロマチン塊−卵母細胞複合体を２０〜３０℃の温度に維持し、融合を顕微鏡下でモニターする。融合が起こると、再構成した卵母細胞を以下に記載のように活性化する。
【０１０１】
再構成卵母細胞の活性化、培養、及び移植
極体放出（ｐｏｌａｒ ｂｏｄｙ ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）及び染色体損失を防止するため、卵母細胞をサイトカラシンＢの存在下で活性化するかまたは活性化後にサイトカラシンＢを直接加えることができる（Ｗａｋａｙａｍａら， ＰＮＡＳ ９６：１４９８４−１４９８９， １９９９；Ｗａｋａｙａｍａら， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４：１０８−１０９， ２０００）。再構成卵母細胞の活性化には、電気的または非電気的手段のいずれかを用いてもよい。細胞を活性化する電気的技術は当技術分野で周知である（例えば、米国特許第４，９９４，３８４号及び第５，０５７，４２０号を参照）。細胞を活性化する非電気的手段には、当技術分野で知られる、細胞分裂の確率を増加するいずれの方法も含まれうる。卵母細胞を活性化する非電気的手段の例としては、エタノール；イノシトール三リン酸；Ｃａ＋＋イオノフォア及びプロテインキナーゼインヒビター；タンパク質合成インヒビター；ホルボールエステル；タプシガルギン、または任意の精子成分の存在下で卵母細胞をインキュベートする方法が挙げられる。活性化のための他の非電気的方法としては、卵母細胞を冷ショックまたは機械的ストレスに供する方法が挙げられる。あるいは、核導入後１〜３時間、卵母細胞を活性化するＳｒ２＋及び細胞質分裂と極体放出を防止するサイトカラシンＢを含有する培地中で、卵母細胞をほぼ６時間インキュベートしてもよい（Ｗａｋａｙａｍａら， ＰＮＡＳ ９６：１４９８４−１４９８９， １９９９；Ｗａｋａｙａｍａら， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４：１０８−１０９， ２０００）。クローニングする哺乳類の型に依存して、好ましい活性化の長さは変わりうる。例えば、ウシなどの家畜では、卵母細胞活性化期間は一般的に約１６〜５２時間または好ましくは約２８〜４２時間の範囲である。
【０１０２】
活性化の後、卵母細胞を適切な時間、培地中に置いて、得られる胚を発生させる。２細胞期以後の段階に、胚をレシピエント代理母（ｆｏｓｔｅｒ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ｆｅｍａｌｅ）中に移して出産まで発生させる。ウシ種の場合、胚は典型的には胚盤胞期（例えば、ほぼ６〜８日間）まで培養した後、母体宿主に移す。他のクローン動物については、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養に適切な長さは当業者であれば公知であるかまたは日常的な実験により決定することができる。
【０１０３】
胚を哺乳類の子宮中に移植する方法も当技術分野では周知である。胚の発生段階を宿主哺乳類の発情期と関連づけることが好ましい。胚を哺乳類の子宮内に置けば、胚は出産まで発生しうる。あるいは、胚を選んだ時まで子宮内で発生させ、次いで胚（または胎児）を標準の外科的方法を用いて取り、その健康及び生存可能性を確認する。１つの種由来の胚を他の種由来の動物の子宮環境中に置くことができる。例えば、ウシ胚はヒツジの卵管内で発生しうる（Ｓｔｉｃｅ及びＫｅｅｆｅｒ， Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ４８：７１５−７１９， １９９３）。いずれの胚と子宮との異種間関係でも本発明の方法に利用しうる。
【０１０４】
核と卵母細胞または他のレシピエント細胞とのリポ融合
リポ融合溶液は、上記のように、１以上の融合誘発試薬とリポ融合バッファーとをそれぞれほぼ５：１〜１：１０の比率で混合して調製する。上記のように、新しく調製したまたは凍結解凍した核をリポ融合溶液と混合して、化合物により該核をコーティングさせる。インキュベーションを２０〜３０℃の温度にてほぼ１０〜３０分間行う。核を含有するリポ融合溶液のミクロドロップをＣＯ２平衡化ミネラルオイルの下に置く。レシピエント細胞、好ましくは除核細胞を含有するドロップも調製する。上記のように、顕微操作によるかまたは遺伝物質を紫外光に曝露して損傷させることにより、染色体もしくは核を物理的に除去することによって除核レシピエント細胞を調製する。卵母細胞中への挿入については、リポ融合試薬を用いてコーティングした核をマイクロピペット中に拾い上げ、卵母細胞の細胞質と透明帯との間の囲卵腔に挿入する。他のレシピエント細胞中への挿入については、コーティングした核を細胞膜の隣に置いて細胞との接触を確実にすることが好ましい。核−細胞複合体を、２０〜３０℃の温度に維持し、融合を顕微鏡を用いてモニターする。融合が起こると、再構成した卵母細胞を上記のように活性化する。
【０１０５】
実施例３：再プログラムした透過化細胞の哺乳類クローニングへの利用
細胞はまた、細胞から核またはクロマチン塊を単離する必要なしに再プログラムすることもできる。この方法では、細胞を透過化し次いで培地（例えば、細胞抽出物）と細胞との間の因子交換を可能にする条件下で、間期または有糸分裂再プログラミング培地にインキュベートする。間期培地を用いれば、細胞中の核は膜結合したまま残り；有糸分裂培地を用いれば、核エンベロープ崩壊及びクロマチン凝縮が起こりうる。この培地におけるインキュベーションにより核を再プログラムした後に形質膜を再シールして、所望の培地由来の因子を含有する無傷の再プログラムした細胞を形成することが好ましい。所望であれば、培地を、実施例２に記載の追加の核因子を用いて富化してもよい。次いで再プログラムした細胞をレシピエント卵母細胞と融合させ、再構成した卵母細胞から形成された胚をレシピエントの母体哺乳類中に挿入してクローン哺乳類を作製する。
【０１０６】
細胞の透過化
この方法を用いて再プログラムしうる細胞としては、非同調細胞及びＧ０、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２、もしくはＭ期またはこれらの期の組合せに同調した細胞が挙げられる。細胞は、ジギトニンまたはストレプトリシンＯを用いた透過化などのいずれの標準方法を用いて透過化してもよい。簡単に説明すると、細胞を標準方法を用いて回収し、ＰＢＳで洗浄する。ジギトニン透過化については、細胞をほぼ０．００１〜０．１％の濃度のジギトニンを含有する培地中に再懸濁し、そして氷上で１０分間インキュベートする。ストレプトリシンＯによる透過化については、細胞をストレプトリシンＯ溶液（例えば、Ｍａｇｈａｚａｃｈｉら， ＦＡＳＥＢ Ｊ． １１：７６５−７４， １９９７、及びその参考文献を参照）中で約１５、３０、または６０分間、室温にてインキュベートする。いずれのインキュベーションの後でも、細胞を４００ ｘ ｇで１０分間の遠心分離により洗浄する。この洗浄ステップを、ＰＢＳ中の再懸濁及び沈降により２回繰返す。細胞は使用まで室温にてＰＢＳ中に維持する。透過化した細胞は、以下に記載の再プログラミング用の間期または有糸分裂培地に直接加えることが好ましい。
【０１０７】
再プログラミング培地の調製
間期再プログラミング抽出物を調製するには、間期培養細胞を、標準方法を用いて回収し、５００ ｘ ｇで１０分間、１０ｍｌ円錐型チューブ中で４℃にて遠心分離することによって洗浄する。上清を捨て、細胞ペレットを全容量５０ｍｌの冷ＰＢＳ中に再懸濁する。細胞を５００ ｘ ｇで１０分間、４℃にて遠心分離する。この洗浄ステップを繰返し、そして細胞ペレットをほぼ２０容量の氷冷した間期細胞溶解バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．２、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、１０μＭアプロチニン、１０μＭロイペプチン、１０μＭペプスタチンＡ、１０μＭ大豆トリプシンインヒビター、１００μＭ ＰＭＳＦ、及び任意に２０μｇ／ｍｌサイトカラシンＢ）中に再懸濁する。細胞を８００ ｘ ｇで１０分間、４℃にて遠心分離して沈降させる。上清を捨て、細胞ペレットを、１容量以下の間期細胞溶解バッファー中に注意深く再懸濁する。細胞を氷上で１時間インキュベートして、細胞を膨潤させる。その細胞をチップソニケーターを用いる音波処理、またはガラス乳鉢と乳棒を用いるダウンス（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイゼーションのいずれかにより溶解する。細胞溶解は、細胞と核の少なくとも９０％が溶解するまで実施し、それを位相差顕微鏡を用いて評価することができる。細胞と核の少なくとも９０％が溶解するのに必要な音波処理時間は、抽出物を調製するために用いる細胞型に依って変わりうる。
【０１０８】
細胞溶解物を１．５ｍｌ遠心分離チューブ中に置いて、１０，０００〜１５，０００ ｘ ｇで１５分間、４℃にて卓上遠心分離機を用いて遠心分離する。チューブを遠心分離機から取り、直ちに氷上に置く。上清を２００μｌピペットチップを用いて注意深く回収し、数個のチューブからの上清をプールして氷上におく。この上清は「間期細胞質」または「ＩＳ１５」抽出物である。この細胞抽出物を、氷上で１チューブ当たり２０μｌ容量のアリコートとし、そして直ちに液体窒素上で瞬間凍結して使用まで−８０℃にて保存する。あるいは、細胞抽出物を氷上の超遠心分離チューブ（例えば、ＳＷ５５ Ｔｉ回転子；Ｂｅｃｋｍａｎに適合した）中に置く。必要であれば、チューブは上部にミネラルオイル層を重ねる。抽出物を２００，０００ ｘ ｇで３時間、４℃にて遠心分離して、ＩＳ １５抽出物中に含有される膜小胞を沈降させる。遠心分離が終わると、オイルを捨てる。上清を注意深く回収し、必要であればプールし、そして氷上の冷１．５ｍｌチューブ中に置く。この上清を「ＩＳ２００」または「間期細胞質ゾル」抽出物と呼ぶ。抽出物のアリコートをとり、ＩＳ １５抽出物について記載したように凍結する。
【０１０９】
所望であれば、抽出物をさらなる核因子を用いて富化することができる。例えば、核を、再プログラミング抽出物が由来する細胞型の細胞からまたは任意の他の細胞型の細胞から精製し、上記の音波処理により溶解させてもよい。核因子を、０．１５〜８００ ｍＭの濃度でＮａＣｌまたはＫＣｌを含有する核バッファー中に攪拌下、１０〜６０分間のインキュベーションにより抽出する。溶解物を遠心分離して非抽出可能成分を沈降させる。目的の抽出された因子を含有する上清を透析してＮａＣｌまたはＫＣｌを排除する。透析した核抽出物のアリコートをとり、凍結保存する。この核抽出物を様々な濃度で上記の全細胞抽出物に加えた後、再プログラミングのための細胞に加える。
【０１１０】
間期抽出物はまた、卵母細胞または雄性生殖細胞などの生殖細胞から調製することもできる。例えば、卵母細胞を上記のように活性化し、５時間培養して間期に進入させる。次いで卵母細胞を、ＥＤＴＡを溶解バッファーから省くことを除いて中期ＩＩ卵母細胞抽出物に対する実施例２に記載のように処理する。雄性生殖細胞抽出物は実施例２に記載のように調製することができる。
【０１１１】
再プログラミング培地はまた、細胞抽出物の代わりに、１以上の天然または組換え因子（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストン、プロタミン、核ラミン、転写因子、アクチベーター、リプレッサー、クロマチンリモデリングタンパク質、増殖因子、インターロイキン、サイトカイン、または他のホルモンなどの核酸またはタンパク質）をバッファーなどの溶液に加えて形成することもできる。好ましくは、１以上の因子は卵母細胞または幹細胞に特異的である。
【０１１２】
培地中の細胞の再プログラミング
透過化細胞を、上記の間期再プログラミング培地または実施例２に記載の有糸分裂再プログラミング培地の１つに、ほぼ１００〜１，０００細胞／μｌの濃度にて懸濁する。ＡＴＰ産生系及びＧＴＰを上記のように抽出物に加え、該反応物を３０〜３７℃にて２時間までインキュベートして抽出物から細胞への因子の移行を促進しかつ因子の核取り込みまたは染色体結合を活性化する。再プログラムした細胞を８００ ｘ ｇで遠心分離し、再懸濁により洗浄し、そしてＰＢＳ中で４００ ｘ ｇで遠心分離する。細胞を２０〜３０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有する培地、２ｍＭ ＣａＣｌ２（１Ｍ水溶液のストックから加えた）を含有するＲＰＭＩ １６４０、または２ｍＭ ＣａＣｌ２を含有するα−ＭＥＭ培地中に再懸濁し、そして１〜３時間、３７℃にて通常の細胞培養インキュベーター内でインキュベートして、細胞膜の再シーリングを可能にする。次いで、細胞を通常の温培地（１０％のＦＣＳ）中で洗浄し、そしてさらに標準培養条件を用いて培養する。
【０１１３】
透過化細胞を溶液中の代わりにカバースリップ上で再プログラミングする代替法
あるいは、細胞をカバースリップ上に置く間に透過化して、細胞の取扱いを最小化しかつ細胞の遠心分離を排除し、それにより細胞の生存率を最大化することができる。細胞（例えば、繊維芽細胞）を、１２ウエルプレートにおいて、ＲＰＭＩ １６４０中の１６ｍｍポリ−Ｌ−リシンコーティングしたカバースリップ上で増殖させて、カバースリップ１枚当たり５０，０００〜１００，０００細胞にする。細胞を２００ｎｇ／ｍｌストレプトリシンＯを含むＣａ２＋非含有のＨａｎｋｓ平衡食塩水（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）中で５０分間、３７℃にて通常大気中で透過化する。所望であれば、これらの条件で透過化される細胞のパーセントを、ヨウ化プロピジウム取込みに基づいて測定することができる。ストレプトリシンＯを吸引し；カバースリップを再プログラミング培地８０〜１００μｌによってオーバーレイし；そして細胞を３０分間〜１時間、３７℃にてＣＯ２雰囲気でインキュベートする。再プログラミング培地は好ましくはＡＴＰ産生系ならびにＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰをそれぞれ１ｍＭ含有する。形質膜を再シールするために、２ｍＭ ＣａＣｌ２を含有するα−ＭＥＭ培地、２０〜３０％ウシ胎児血清を含有する培地、または２ｍＭ ＣａＣｌ２を含有するＲＰＭＩ１６４０をウエルに加え、細胞を２時間、３７℃にてインキュベートする。
【０１１４】
透過化および再シール細胞の割合に対する、様々なストレプトリシンＯ処理の影響
透過化及び再シール細胞のパーセントを評価するために、ストレプトリシンＯインキュベーションの用量と時間滴定を実施した（表１）。細胞の透過化は、ストレプトリシンＯ処理終了時におけるＤＮＡ染色ヨウ化プロピジウムの０．１μｇ／ｍｌの取込みにより評価した。別の細胞群について、再シールを、再シール処理終了時に、同様に評価した。
【０１１５】
【表１】
2004516835.tif 000002
【０１１６】
ストレプトリシンＯ処理を用いて透過化しかつ有糸分裂抽出物に曝した、ウシ繊維芽細胞の生存率の評価
０もしくは５００ｎｇ／ｍｌストレプトリシンＯにより透過化しかつ再シールした細胞、またはストレプトリシンＯにより透過化し、有糸分裂抽出物に３０もしくは６０分間曝し、かつ再シールした細胞について、ＴＵＮＥＬ分析を実施してアポトーシスを評価した。ＴＵＮＥＬ陽性細胞は、アポトーシス（すなわち、細胞死）を受けた細胞である。このデータは、ストレプトリシンＯそれ自身はアポトーシスを誘導しないことを示す（表２）。ＴＵＮＥＬ分析に基づくと（表２）、ストレプトリシンＯで処理した細胞の有糸分裂抽出物への６０分間曝露はアポトーシス率の１０％増加を誘導するが、３０分間曝露は誘導しない。これらのデータに基づくと、抽出物中におけるドナー細胞の３０分間インキュベーションが、６０分間インキュベーションよりも好ましい。細胞の免疫蛍光分析によれば、３０分間インキュベーションは試験した核の大部分（約９０％、ｎ＞１００）に核エンベロープ崩壊を誘導することを示した。
【０１１７】
さらに、クロマチン導入法について実施例４に記載した、抽出物中でインキュベートしかつバッファーＮまたはＴＬ−ＨＥＰＥＳのいずれか及びスクロース中で洗浄した精製核は、アポトーシスを受けない（それぞれ２／３４及び３／４７がＴＵＮＥＬ陽性）。
【０１１８】
【表２】
2004516835.tif 000003
【０１１９】
これらのクローニング法に対して選択された透過化方法は、５００ｎｇ／ｍｌ ＳＬＯ、３０分間、３８℃であった。再プログラムした細胞を囲む無傷の膜を形成するために選択した再シール方法は、２ｍＭ ＣａＣｌ２を含有するα−ＭＥＭ培地中での２時間インキュベーションであった。
【０１２０】
再構成卵母細胞の形成、活性化、培養、及び移植
再プログラムした細胞を、標準のマイクロインジェクションまたは電気融合技術（例えば、米国特許第４，９９４，３８４号及び第５，９４５，５７７号を参照）を用いて、レシピエント卵母細胞中に挿入または融合する。例えば、スクロース（例えば、２．５％のスクロース）の存在もしくは不在の標準細胞培地中で、前記細胞を卵母細胞の隣に置いて、細胞を注入ピペット中に引いてもよい。次いでピペットを数回アスピレートして細胞を溶解し、核から細胞質成分を除去し、次いで核を卵母細胞中に注入する。次に、実施例２に記載のような標準法を用いて、再構成した卵母細胞を活性化し、培養し、そしてレシピエント母体哺乳類中に移植してクローニング哺乳類を生産する。
【０１２１】
実施例４：２つの新規クローニング方法：クロマチン導入（ＣＴ）及びストレプトリシンＯ導入（ＳＬＯＴ）を用いるより完全な核再プログラミングの証明
実施例１に説明したように、従来の核移植前核期の胚では不完全な核リモデリング及び再プログラミングが起こる。この知見を、前核の核移植胚の核エンベロープにおけるラミンＡ／Ｃの構築と過剰ＮｕＭＡ免疫蛍光標識により実証した。より完全な核再プログラミングを、実施例２に記載のクロマチン塊導入法ならびに実施例３に記載の細胞透過化及び再プログラミング法（ＳＬＯＴとも呼ぶ）を用いて達成した。
【０１２２】
有糸分裂抽出物中でインキュベートしたウシ繊維芽細胞核のｉｎ ｖｉｔｒｏ核崩壊の評価及び得られるクロマチン塊の特性決定
有糸分裂ウシ繊維芽細胞から調製した抽出物は、一貫して投入精製繊維芽細胞核の約８０％の崩壊を支持した（図５）。中期ＩＩ卵母細胞からの抽出物（すなわち、受精前に中期ＩＩで自然停止した卵母細胞からの抽出物）も核崩壊の成功を支持した（３０分以内に核の７５％）。
【０１２３】
投入した間期核（図６Ａ）、ＭＳ１５有糸分裂抽出物中でインキュベートした核から得たクロマチン塊（図６Ｂ）、及び卵母細胞抽出物中でインキュベートした核から得たクロマチン塊（図６Ｃ）を、次のマーカー：ラミンＢ受容体（ＬＢＲ）、核内膜の内在性タンパク質（膜マーカー）；ラミンＢ、核ラミナの遍在成分；ラミンＡ／Ｃ、分化細胞にのみ存在して胚に存在しない核ラミナの体細胞特異的成分；ＮｕＭＡ、核マトリックスの主要成分；ＡＫＡＰ９５、核のＰＫＡアンカータンパク質；及びＤＮＡの発現について試験した。試験したクロマチンユニットの約１００％において、体細胞細胞質ゾルＭＳ１５及び卵母細胞ＭＳ１５抽出物の両方が、ラミンＢ、ラミンＡ／Ｃ、ＬＢＲ、及びＮｕＭＡの可溶化を誘導した（図６Ｂ及び６Ｃ）。予想したように、ＡＫＡＰ９５は、先に有糸分裂ヒト細胞で観察されたように（Ｃｏｌｌａｓら， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４７：１１６７−１１８０， １９９９）、染色体と結合したままであった。この結果は、実施例１で成熟前のクロマチン凝縮期におけるウシ核移植胚についても記載した。使用した方法、すなわち従来の核移植、核注入（ＮＩ）、またはクロマチン導入に関係なく、有糸分裂抽出物及び卵母細胞抽出物の両方が、無傷の卵母細胞と同様に、核エンベロープ可溶化を促進するのに効率的であると思われた（図７）。
【０１２４】
クロマチン導入により生産した前核胚と、核移植及び核注入胚由来の前核との比較
クロマチン導入胚を作製するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟した卵母細胞を、成熟後ほぼ１８〜２０時間に除核した。間期ウシ胎児繊維芽細胞由来の核を、本明細書に記載のウシ胎児細胞から調製したＭＳ１５有糸分裂抽出物中でインキュベートした。核エンベロープ崩壊が起こった後でかつクロマチン凝縮が完了する前に、クロマチン塊を抽出物から単離した。特に、間期の染色体凝縮レベル（０％凝縮と呼ぶ）及び有糸分裂中の染色体凝縮の最高レベル（１００％凝縮と呼ぶ）と比較して、クロマチンがほぼ５０〜６０％凝縮した時に、クロマチン塊を単離した。この段階では、クロマチン塊中の個々の染色体は識別できず、かつクロマチン塊の端部は不規則な形状を有した。有糸分裂抽出物から単離したクロマチン塊を、２．５％のスクロースならびに除核卵母細胞を有するＴＬ ＨＥＰＥＳのミクロドロップ中に置いた。スクロースは、以後の注入過程で受ける卵母細胞の損傷を最小限にするためバッファーに加えた。クロマチン塊を、斜角（ｂｅｖｅｌｅｄ）マイクロインジェクションピペットによりＢｕｒｌｅｉｇｈピエゾドリル（Ｐｉｅｚｏ Ｄｒｉｌｌ）（Ｆｉｓｈｅｒｓ， ＮＹ）（周波数２Ｈｚ、７５マイクロ秒間、振幅７０Ｖ）を用いて、卵母細胞中に注入した。典型的には、２、３、４、または５パルスなどの多重パルスを実施して、ニードルが十分に卵母細胞に貫通して注入するようにした。注入後、卵母細胞を、連続希釈したＴＬ ＨＥＰＥＳを含むスクロース中で洗浄し、浸透圧ショックを最小限にした。成熟後２８〜３０時間（すなわち、卵母細胞を卵巣から回収後、成熟培地に置いて後２８〜３０時間、かつまた、クロマチン塊注入後、少なくとも２時間）、再構築された卵母細胞及び単為生殖発生のための対照をカルシウムイオノフォア（５μＭ）を用いて４分間（Ｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ならびに１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミド及び２．５μｇ／ｍｌサイトカラシンＤ（Ｓｉｇｍａ）を含むＡＣＭ培地［１００ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、０．２７ｍＭ ＣａＣｌ２、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１ｍＭ乳酸ナトリウム、０．４ｍＭピルベート、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、３ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（脂肪酸非含有）、１％のＢＭＥアミノ酸、及び１％のＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ）］を用いて５時間、先に記載（Ｌｉｕら， Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ４９：２９８−３０７， １９９８）のように活性化した。活性化後、卵を５回洗浄し、胚検定済ミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ）０．３ｍｌによって覆ったマウス胎児繊維芽細胞及び０．５ｍｌの胚培地を含有する４ウエル組織培養プレートの培養中に置いた。２５〜５０胚をそれぞれのウエル中に置いて、３８．５℃にて５％のＣＯ２大気中でインキュベートした。所望であれば、カルシウム（例えば、約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３、３．５、５ｍＭ、またはそれを超えるＣａＣｌ２）を約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、またはそれより長い時間、培地に加えて、注入後の卵母細胞の再シールを促進してもよい。再シールした卵母細胞は、本明細書に記載の標準方法を用いてレシピエント哺乳類中に移植すると、恐らく卵母細胞を取り囲む無傷の層によって、生存率が増加すると思われる。
【０１２５】
核注入胚は、抽出物中でインキュベートしていない間期ウシ胎児繊維芽細胞核をクロマチン塊の代わりに卵母細胞に注入したことを除き、クロマチン導入胚について上記で記載したように形成した。核移植胚は、実施例１に記載の通常の方法を用いて作製した。
【０１２６】
核移植、核注入、ならびにクロマチン導入前核は、予想したようにラミンＢ（図８Ａ、赤標識）及びＡＫＡＰ９５（図８Ｂ、赤標識）を再構築する。核移植及び核注入前核はまた、ラミンＡ／Ｃ、体細胞特異的成分（図８Ａ、緑標識）も再構築し、核移植胚に対して上に報じた結果と一致する。しかし、クロマチン導入前核及び対照単為生殖前核（ｃｏｎｔｒｏｌ ｐａｒｔｈｅｎｏｔｅ ｐｒｏｎｕｃｌｅｉ）はラミンＡ／Ｃ（図８Ａ）を再構築しない。核移植前核はまた、ほとんどのクロマチン導入または単為生殖前核と異なり、ＮｕＭＡ（緑標識）も含有する（図８Ｂ、緑標識）。或る比率の単為生殖核及びクロマチン導入核は、上に報じたように、低レベルのＮｕＭＡを構築する。
【０１２７】
核のｉｎ ｖｉｔｒｏ分解（ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ）と続いてのクロマチン導入は、形態学的に対照単為生殖前核と類似した前核を生じる。対照的に、核移植及び核注入前核は、体細胞特異的成分（ラミンＡ／Ｃ及び広範なＮｕＭＡ標識）を有する。この結果は、従来の核移植または核注入方法後の核リモデリングが不完全であることを示す。上記のように、核移植及び核注入前核中に検出されるラミンＡ／Ｃは、前核期に新規に転写されたラミンに由来する。核ラミン及び恐らくＮｕＭＡは転写調節及びヒトの疾患に関係があるので、通常の核移植前核におけるラミンＡ／Ｃの持続は不適当な機能的再プログラミングを示しうる。本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ核分解及びクロマチン導入は、従来の核移植または核注入よりもっと正常な前核を生産すると結論する。
【０１２８】
再プログラムしたクロマチン塊または透過化細胞をドナー供給源として利用するクローニングの効率
実施例３に記載のように、「ＳＬＯＴ」と呼ぶ新規のクローニング方法を開発したが、この方法は、一次ウシ胎児繊維芽細胞のストレプトリシンＯ（ＳＬＯ）−誘導透過化、透過化細胞の再プログラミング培地（例えば、有糸分裂抽出物）への３０分間曝露、該繊維芽細胞の２ｍＭカルシウムを含む培養による再シール、及びクロマチンの標準細胞融合方法を用いる卵母細胞への導入を含む。
【０１２９】
このクローニング方法のために、ストレプトリシンＯ（Ｓｉｇｍａ Ｓ−５２６５；保存粉末形状で４℃にて保存した２５，０００ユニット）のバイアルを４００μｌ Ｈ２Ｏに溶解してよく混合した。全ての内容物を１５−ｍｌ円錐型チューブに移し、次いで３．６ｍｌ Ｈ２Ｏを加え、ボルテックス攪拌により混合した。１０μｌのアリコートを−２０℃にて０．０６２Ｕ／μｌのストック濃度で凍結した。細胞（約１００，０００）を１００μｌ ＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、ｃａｔ． Ｎｏ． １４１７０−１２０）中に室温にて懸濁した。これらの細胞はコンフルエントであって、従って、細胞の約８０〜８５％はＧ１期にあり、その他の大多数の細胞はＳ期にあった。ストレプトリシンＯストック溶液（５μｌ）（すなわち、最終濃度５００ｎｇ／ｍｌまたは０．３Ｕ／μｌ）を加え、その混合物を３８℃にて２５分間、水浴でインキュベートした。インキュベーション中、チューブを静かに２〜３回軽く叩いて細胞を懸濁状態に保持した。室温ＰＢＳ（２００μｌ）を加え、穏やかなピペッティングによりよく混合した。細胞を、５０００ｒｐｍで５分間、室温にて卓上遠心分離機により遠心分離した。全ての上清を捨てた。この段階で、ペレットは小さく、透明には見えないであろう。ＡＴＰ産生系を含有する有糸分裂抽出物（４０μｌ、「ＭＳ １５」）を加えてよく混合した。該抽出物は、細胞の遠心分離中に、１バイアル４０μｌの抽出物を解凍しかつ１．２μｌのＡＴＰ産生系を加え、よく混合し、そして室温にてインキュベートすることにより調製した。この有糸分裂抽出物は、上記の節でクロマチン塊の作製に使用したのと同じ抽出物であった。混合物を３８℃にて水浴中で３０分間、インキュベートし、チューブを時折穏やかに軽く叩いた。室温再シール培地（ＲＭ、５００μＬ）（１Ｍストックから２ｍＭへＣａＣｌ２を補足した完全α−ＭＥＭ［Ｂｉｏ−Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ］培地）を加えた。チューブを開放したまま、ＣＯ２インキュベーター中で２時間、時折チューブを軽く叩いて細胞の懸濁状態を保持してインキュベートした。細胞を、５，０００ｒｐｍで５分間、室温にて卓上遠心分離機中で遠心分離した。細胞ペレットを室温ＴＬ ＨＥＰＥＳ（Ｂｉｏ−Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ、ｃａｔ． Ｎｏ． ０４−６１６Ｆ）の１００μｌ中に再懸濁し、さらに９００μｌのＴＬ ＨＥＰＥＳを加えた。核導入は標準方法を用いて実施した。先にクロマチン導入に関する節で説明したように、卵母細胞を活性化してレシピエント哺乳類へ導入した。
【０１３０】
本発明のこのＳＬＯＴ法及びクロマチン導入法を用いて形成した胚の発生を表３に要約する。ＳＬＯＴ胚に対する胚盤胞期への発生は、通常の核導入胚と比較すると、若干低かった。胚盤胞期におけるＳＬＯＴと核導入発生との間の相違は、ＳＬＯＴに対してより核導入に対して大きい割合の細胞周期Ｇ１期の細胞を使用していることの影響によるのであろう。クロマチン導入胚の生存率はより低く、これは侵入方法のためと予想される。
【０１３１】
核導入とＳＬＯＴ胚については、妊娠４０日における妊娠率は匹敵した（表３）。ＳＬＯＴ胚の妊娠４０日〜６０日の生存率は、通常の方法を用いて生産した核導入胚のものより高い傾向にあった。
【０１３２】
【表３】
2004516835.tif 000004
【０１３３】
上記のように、クロマチン導入胚の生存率は、再構成卵母細胞をカルシウム中で数時間インキュベートして卵母細胞の再シールさせた後、レシピエント哺乳類中に挿入することにより、増加しうる。ＳＬＯＴ胚の生存率はまた、細胞を培養から取出して卵母細胞と融合するまでの時間を短縮することによっても増加することができる。例えば、ストレプトリシンＯ中のインキュベーション、再プログラミング培地中のインキュベーション、及び／または再シール培地中のインキュベーションの時間の長さを短縮してもよい。特に、再シール培地中のインキュベーションは、ほぼ１時間以下に短縮しうる。この短縮した再シール処理を、上記の２ｍＭカルシウムの存在下ででまたはより高い濃度のカルシウム（例えば、約２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、または６．０ｍＭカルシウム）の存在下で実施して再シール率を増加してもよい。卵母細胞との融合前に細胞を処理する時間を短縮することにより、Ｓ期に入りＤＮＡ複製を開始して再構成卵母細胞の生存率を低下する細胞は恐らくより少なくなるであろう。
【０１３４】
実施例５：キメラ哺乳類を作製する方法
哺乳類をクローニングする従来の方法を用いて起こる自然な流産の多くは、胎児の問題よりも胎盤異常に起因すると考えられる。従って、主に或る起源に由来する胎盤組織（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精した、天然の、または単為生殖で活性化した胚）と主に他の起源に由来する胎児組織（例えば、核導入胚）とを用いるキメラ胚を生産する方法が開発されている。主にｉｎ ｖｉｔｒｏ受精した、天然の、または単為生殖で活性化した胚由来の細胞から誘導された胎盤組織を有するキメラ胚は、天然の胎盤組織によりよく類似し、生存可能な子孫の生産の増加をもたらし得る。子孫の細胞の大部分が核導入胚由来の細胞から誘導され、従って、核導入細胞を作製するために利用するドナー細胞と実質的に同一なゲノムを有することが好ましい。
【０１３５】
かかる１つの方法においては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精胚由来の細胞を、従来の核導入法または本明細書に記載の新規のクローニング法のいずれかを用いて生産した緊密化胚の周辺（例えば、透明帯と胚自身との間）に注入する。代替方法においては、前緊密化、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精胚由来の細胞を、本発明のクローニング方法の１つを用いて（例えば、再プログラムしたクロマチン塊または透過化細胞をドナー供給源として用いて）生産した前緊密化胚由来の細胞とともに、それぞれの胚由来の細胞が再組織して単一のキメラ胚を生産することが可能である条件下で、インキュベートする（Ｗｅｌｌｓ及びＰｏｗｅｌｌ， Ｃｌｏｎｉｎｇ ２：９−２２， ２０００）。両方の方法において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精胚由来の細胞を優先的に胎盤中に組み込み、かつ核導入法由来の細胞を優先的に胎児組織中に組み込む。これらの方法を以下にさらに記載する。
【０１３６】
Ｇ１繊維芽細胞の単離
核導入胚を生産するためのドナー細胞としてＧ１繊維芽細胞を単離するために、先に記載された「振り切り（ｓｈａｋｅ ｏｆｆ）」法を利用した（Ｋａｓｉｎａｔｈａｎら， Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈ． １９：１１７６−１１７８， ２００１）。簡単に説明すると、単離２４時間前に、５．０ ｘ １０５細胞を、α−ＭＥＭ＋ＦＣＳの１０ｍｌを含有する１００ｍｍ組織培養プレート上にプレーティングした。翌日、プレートをＰＢＳを用いて洗浄し、単離１〜２時間前に、培地を置き換えた。次いでプレートをＶｏｒｔｅｘ−Ｇｅｎｉｅ ２（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、中速）上で３０〜６０秒間振とうした。培地を取出し、５００ ｘ ｇで５分間、遠心し、そしてペレットをＭＥＭ＋ＦＣＳの２５０μｌ中に再懸濁した。この細胞懸濁液は、細胞間橋により結合した新しく分裂した細胞ダブレット、複数の単一細胞、及び中期または後期細胞から成った。細胞間橋により結合した細胞ダブレットを、核導入用ドナー細胞として使用した。
【０１３７】
核移植、活性化、及び胚培養
単離したＧ１繊維芽細胞を用いる核導入方法を、本質的に先に記載（Ｃｉｂｅｌｌｉら， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １６（７）：６４２−６４６， １９９８；Ｋａｓｉｎａｔｈａｎら， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ６４（５）：１４８７−１４９３， ２０００）のように実施した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟した卵母細胞を成熟後ほぼ１８〜２０時間に除核し、染色体除去をビスベンズイミド（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、Ｓｉｇｍａ）標識により紫外光下で確認した。これらの細胞質体−ドナー細胞カプレット（ｃｏｕｐｌｅｔ）を、２０マイクロ秒間、２．４ｋＶ／ｃｍ（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｅｌｌマニピュレーター２００、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の単一電気パルスを使って融合した。成熟後３０時間に、再構築した卵母細胞と対照を、カルシウムイオノフォア（５μＭ）（Ｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて４分間、及び１０μｇシクロヘキシミド及び２．５μｇサイトカラシンＤ（Ｓｉｇｍａ）を含有するＡＣＭ培地（１００ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、０．２７Ｍｍ ＣａＣｌ２、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１ｍＭ乳酸ナトリウム、０．４ｍＭ ピルベート、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、３ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（脂肪酸非含有）、１％のＢＭＥアミノ酸、及び１％のＭＥＭ非必須アミノ酸；全てＳｉｇｍａ製）を用いて６時間、先に記載（Ｌｉｕら， Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ４９：２９８−３０７， １９９８；Ｐｒｅｓｉｃｃｅら， Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ３８：３８０−３８５， １９９４）のように活性化した。活性化の後、卵をＨＥＰＥＳ緩衝ハムスター胚培地（ＨＥＣＭ−ＨＥＰＥＳ、１１４ｍＭ ＮａＣｌ、３．２ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ乳酸ナトリウム、０．１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、及び１％のＢＭＥアミノ酸；Ｓｉｇｍａ）中で５回洗浄し、胚検定済ミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ）０．２ｍｌによって覆ったマウス胎児繊維芽細胞及び胚培地０．５ｍｌを含有する４ウエル組織培養プレートの培養中に置いた。２５〜５０の胚をそれぞれのウエル中に置いて、３８．５℃にて５％のＣＯ２を含む大気中でインキュベートした。第４日目に１０％のＦＣＳを培地に加えた。第７及び８日目に胚盤胞期への発生を記録した。
【０１３８】
ウシｉｎ ｖｉｔｒｏ受精
ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精を、ウシｉｎ ｖｉｔｒｏ受精胚を生産するために先に記載された（Ｃｏｌｌａｓら， Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ３４：２２４−２３１， １９９３）ように実施した。４５％及び９０％の等張性パーコール勾配を、精子ＴＬストックを用いて調製した（Ｐａｒｒｉｓｈら， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ２４：５３７−５４９， １９８５）。単一雄ウシから得た凍結解凍したウシ精子を勾配の上層に重ね、３０分間、７００ ｘ ｇで遠心分離した（６．３７インチ・チップ半径を用いて２０００ｒｐｍ）。ペレット中の精子濃度を確認し、精子を、精子ＴＬ（精子ＴＬストック、１ｍＭピルベート、６ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、及び１％のＰＳ）に受精時の最終濃度が１０６精子／ｍｌとなるように希釈した。成熟後２２時間に、卵母細胞をＴＬ ＨＥＰＥＳ中で３回洗浄し、６ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．２ｍＭピルベート、２０ｕＭペニシラミン、１０ｕＭヒポタウリン、１ｍＭエピネフェリン（Ｌｅｉｂｆｒｉｅｄら， Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｆｅｒｔｉｌ． ６６：８７−９３， １９８２）、及び０．００４ｕｇ／ｍｌヘパリンを含有するＮｕｎｃウエル中の受精ＴＬ（Ｂａｖｉｓｔｅｒら， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ２８：２３５−２４７， １９８３）の４８０μｌ中に置いた。２０マイクロリットルの精子を加えて５０卵母細胞に対して１０６精子／ｍｌの最終濃度とした。培養条件は、核導入について上記に記載したものと同じであった。受精率は前核発生に基づくと９０％を超えた。
【０１３９】
キメラ核導入胚
８細胞期（６〜１２割球）のｉｎ ｖｉｔｒｏ受精胚を、受精後ほぼ９６時間、緊密化前に回収した。透明帯をプロテアーゼ（ＴＬ−ＨＥＰＥＳ中、３ｍｇ／ｍｌ）を用いて除去した。透明帯解離を、解剖顕微鏡を用いて注意深くモニターした。透明帯が最初に解離するのが見られると（約２分間）、胚を取出してＴＬ−ＨＥＰＥＳ中で洗浄し、そしてＨａｎｋ’ｓ平衡食塩水を含有する３０ｍｍペトリ皿に移し、３７．５℃にて３０分間インキュベートした。これらの前緊密化胚の割球を、１００ｍｍペトリ皿中のミネラルオイル下のＴＬ−ＨＥＰＥＳのミクロドロップ（５０μｌ）中に移した。第４日目の８〜１６細胞期の核導入胚を選択し、割球を含有する同じミクロドロップ中に移した。これらの核導入胚は、前緊密化胚（例えば、８細胞期胚）と緊密化胚（例えば、１６細胞期胚）の両方を含んだ。次いで、４〜６の割球を、斜角マイクロピペット（３５μｍ直径）により標準のミクロ操作技術を用いて核導入胚中に移した。割球を導入した後、核導入胚に対して記載したように、胚を培養した。
【０１４０】
第７及び８日目に、キメラ胚の胚盤胞への発生を評価した。胚盤胞はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精胚由来の細胞に加えられた膜色素ＤｉＩの存在についても分析し、その後に核導入胚中へ注入した。細胞を第４日目に標識し、第７日目に観察した。この色素は、元来染色した細胞の子孫における数回の細胞分裂に対して維持され、数回の細胞分裂後のキメラ胚を分析することを可能にする。この分析に基づいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精胚由来の細胞をキメラ胚中に組み込んだ。所望であれば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精胚または核導入胚のいずれかの核酸に対して特異的なプローブとの蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を、標準方法を利用して実施してもよい（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． １４．７．１−１４．７．１２， １９９５を参照）。このＦＩＳＨ分析を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養中の及びその胚から発生した胎児または子孫におけるキメラ胚のそれぞれの胚から誘導された細胞の分布（例えば、何パーセントの細胞が内部細胞塊中に組み込まれ、何パーセントが栄養外胚葉中に組み込まれたか）を決定することができる。あるいは、緑色蛍光タンパク質などのレポーター遺伝子を１つの胚由来の細胞に加え、キメラ胚の胎盤及び様々な胎児組織への細胞の組み込みをモニターするために使用できる。
【０１４１】
胚導入
第７及び８日目に、核導入胚及びキメラ核導入胚から誘導されたグレード１及び２の核導入胚盤胞を、第６及び７日目の同調したレシピエント未経産雌ウシ中に導入した。レシピエントを、Ｌｕｔａｌｙｓｅ（Ｐａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ、Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ＭＩ）の１回注入により同調した後、発情を検出した。レシピエントを、胚導入後第３０日目及び第６０日目に、受胎産物の存在について超音波検査により、その後３０日毎に直腸触診により、２４０日まで検査した。キメラ胚に対して及びトランスジェニックウシ繊維芽細胞と卵母細胞との融合により生産した対照胚に対しての第４０日目の妊娠結果を表４に比較する。これらの結果は、第４０日目まで生存したキメラ胚の数がより大きかったことを示す。
【０１４２】
【表４】
2004516835.tif 000005
【０１４３】
キメラ胚を生産するための代替方法
標準方法を用いて、キメラ胚を生産するための上記方法を改変することができる。例えば、天然胚を外科的に哺乳類（例えば、ウシ）から単離するかまたは卵母細胞を標準技術を用いて単為生殖的に活性化して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精胚の代わりに利用することができる。所望であれば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精した、天然の、または単為生殖で活性化した胚由来の、より少ない数の細胞（例えば、１、２、３、４、または５個の細胞）を核導入胚中に注入して、胎児組織中に組み込まれることとなる注入細胞とそれらの子孫のパーセントを減少してもよい。あるいは、より多い数の細胞（例えば、６、７、８、９、１０、１１個またはそれより多い細胞）を注入して、胎盤組織中に組み込まれる注入細胞とそれらの子孫のパーセントを増加してもよい。さらに、他の細胞期の胚由来の細胞を利用してもよい。例えば、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６、５１２、またはより後期の細胞期のｉｎ ｖｉｔｒｏ受精した、天然の、または単為生殖で活性化した胚を、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６、５１２、またはより後期の細胞期の核導入胚中に注入してもよい。注入細胞と核導入胚は同じ細胞期であってもまたは異なる細胞期であってもよい。一実施形態においては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精した、天然の、または単為生殖で活性化した胚は、核導入胚と比較して、増加した倍数性（例えば４ｎのＤＮＡ含量）を有し、注入細胞を栄養外胚葉（すなわち、主に胎盤組織を形成する胚の細胞の最外層）にさらに偏らせる。所望であれば、透明帯の全てまたは部分は、注入前に除去するよりも、むしろ注入細胞を囲んだまま維持することができる。
【０１４４】
他の代替方法においては、前緊密化または緊密化した、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精した、天然の、または単為生殖胚由来の細胞を、前緊密化核導入胚由来の細胞とともに、それぞれの胚由来の細胞が再組織して単一キメラ胚の生産を可能にする条件（Ｗｅｌｌｓ及びＰｏｗｅｌｌ， Ｃｌｏｎｉｎｇ ２：９−２２， ２０００）下でインキュベートする。ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精した、天然の、または単為生殖胚由来の細胞は、主に栄養外胚葉に、そして最終的に胎盤組織に寄与すると予想され、かつ核導入胚由来の細胞は主に内部細胞塊に、そして最終的に胎児組織に寄与すると予想される。両方の胚由来の細胞は、同じ細胞期または異なる細胞期にあってもよく、そしてそれぞれの胚由来の同じかまたは異なる数の細胞を組み合わせて凝集胚（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｅｍｂｒｙｏ）を形成してもよい。
【０１４５】
他の実施形態
以上の説明から、様々な用途と条件に本発明を適応するために本明細書に記載した本発明に対して改変と修飾を行いうることは明らかであろう。そのような実施形態も、以下の特許請求の範囲内にある。
【０１４６】
本明細書に記述した全ての刊行物は、それぞれの独立した刊行物または特許出願が特定してかつ個々に参照により組み入れられると示されたのと同程度に、本明細書に参照により組み入れられる。
【０１４７】
本出願ファイルはカラーの図面（図３、６Ａ〜６Ｃ、８Ａ、及び８Ｂ）を含む。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａ及び１Ｂは、ウシ前着床（ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）胚における核エンベロープ及び核マトリックスタンパク質の免疫検出を説明する。図１Ａは、同じ抗体を用いて試験したｉｎ ｖｉｔｒｏ受精ウシ胚の前核期及び８細胞期における写真である。図１Ａの矢印は、前核期胚の雌性前核の抗ＮｕＭＡ及び抗ＡＫＡＰ９５標識に対するものである。図１Ａにおいて、挿入写真は０．１μｇ／ｍｌ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２を用いて標識したＤＮＡの写真である（バー、２０μｍ）。図１Ｂは、ウシ繊維芽細胞（上段）及び前核期胚（下段）の免疫ブロット分析である。図１Ｂの右側に分子量マーカーをｋＤａで示す。
【図２】
図２は、核移植胚における未成熟クロマチン凝縮及び前核構築期間の核エンベロープ、ＭｕＭＡ、及びＡＫＡＰ９５の動態を説明する。図２は、ウシのドナー繊維芽細胞（ドナー細胞）、未成熟クロマチン凝縮期の核移植胚（融合後３時間）、前核期の核移植胚（融合後１９時間）、及び本明細書に記載のとおり活性化した単為生殖前核期胚の写真である。抗ラミンＢ、ラミンＡ／Ｃ、ＮｕＭＡ、及びＡＫＡＰ９５抗体を用いて、ドナー核の分解（ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ）及び新しい前核の構築（ａｓｓｅｍｂｌｙ）を、注入後「ｈｐｉ（ｈｏｕｒｓ ｐｏｓｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）」３時間（未成熟クロマチン凝縮期「ＰＣＣ」）及び注入後７時間（「ＮＴ ＰＮ」）に認めた。１０ｍＭ ＳｒＣｌ２を用いてＭＩＩ卵母細胞の単為生殖活性化後に形成された雌性前核（「Ｐａｒｔｈ． ＰＮ」）も、活性化処置開始後５時間に分析した。ラミンＡ／Ｃは、ウシ前核期の核移植胚の前核に構築された。ＤＮＡは０．１μｇ／ｍｌ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２を用いて対抗染色した。ＴＲＩＴＣは、ＴＲＩＴＣ複合二次抗体による標識を意味する（バー２０μｍ）。
【図３】
図３は、ＡＫＡＰ９５が、単為生殖胚と比較して、核移植胚の前核にさらに強く固着していることを示すグラフである。このグラフは、３％パラホルムアルデヒドで固定する前に、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び１ｍｇ／ｍｌ ＤＮアーゼＩを１００または３００ ｍＭ ＮａＣｌと一緒に用いて室温にて３０分間ｉｎ ｓｉｔｕ抽出した後の、単為生殖体（ｐａｒｔｈｅｎｏｔｅｓ）前核、核移植胚、及び体細胞ドナー核中の、非抽出ラミンＢ、ＡＫＡＰ９５、及びＤＮＡラベリングの相対的パーセントを示す。Ｂ型ラミン（赤）及びＡＫＡＰ９５（緑）の局在化を、二重免疫蛍光により試験した。各チャネル−赤（ｌａｉｍｎＢ）、青（ＤＮＡ）、及び緑（ＡＫＡＰ９５）−の蛍光標識強度を数値化した。対照値（１００％非抽出）は、固定前に０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００だけを用いて透過化した胚または細胞中のＢ型ラミン、ＤＮＡ、及びＡＫＡＰ９５染色の相対量を表す。各グループについてほぼ３０個の胚を試験した。
【図４】
図４は、ラミンＡ／Ｃが各移植胚中の前核再構成時にｄｅ ｎｏｖｏ転写されることを示す。図４は、繊維芽細胞融合及び卵母細胞活性化により生産したウシ前核移植胚の写真であって；５μＭイオノマイシンによる４分間に続いて１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミド／２．５μｇ／ｍｌサイトカラシンＤによる４時間の処理（ｂ’、−）、（ｂ’）と同様のイオノマイシン／シクロヘキシミド／サイトカラシンＤによる処理に続いて１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミドによる追加の９時間の培養（ｂ”、ＣＨＸ）、または全活性化処理の間、１μｇ／ｍｌアクチノマイシンＤを一緒に用いた（ｂ’）と同様のインキュベーション（ｂ”’）のいずれかによって得たものである。抗ラミンＢ（ウサギポリクローナル）及び抗ラミンＡ／Ｃ（ｍＡｂ）抗体を同じ調製物に用いた。挿入写真は０．１μｇ／ｍｌ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２を用いて標識したＤＮＡの写真である（バー、２０μｍ）。
【図５】
図５は、分裂細胞形質抽出物（Ｍ−Ｓ１５）、分裂細胞ゾル抽出物（Ｍ−Ｓ２００）、及び卵母細胞抽出物（ＭＩＩ−Ｓ１５）中の染色体凝縮及び核エンベロープ分解のグラフである（３〜５複製物についてｎ＝３００−４００核を試験した）。
【図６】
図６Ａ〜６Ｃは、精製した投入ウシ繊維芽細胞核（図６Ａ）、分裂細胞ゾル抽出物中に産生した凝縮クロマチン（図６Ｂ）、及び卵母細胞抽出物（図６Ｃ）の免疫蛍光分析の写真のセットである。表示の核マーカーを試験した。ＤＮＡはプロピジウムヨージド（赤）を用いて対抗染色した（バー、１０μｍ）。
【図７】
図７は、通常の核移植後（ＮＴ）または核注入（ＮＩ）法に従って及び本発明の方法によるクロマチン塊の卵母細胞注入（ＣＴ）に従って、卵母細胞で得た凝縮クロマチンの免疫分析写真のセットである。両方の検出可能なラミンＢ及びＡ／Ｃは可溶化されているようである（バー、１０μｍ）。
【図８】
図８Ａ及び８Ｂは、クロマチン導入、核移植、または核注入から得られる、前核の免疫蛍光分析の写真のセットである。核移植、核注入、またはクロマチン導入の１９時間後に、胚を固定した。対照単為生殖前核（Ｐａｒｔ．）も試験した。図８ＡはラミンＡ／Ｃ及びＢの分析を示す。図８ＢはＡＫＡＰ９５及びＮｕＭＡの分析を示す。ラミンＡ／Ｃ（緑ラベル）は、核移植及び核注入前核においてだけ現れる（バー、３０μｍ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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