(57)【要約】本発明は、免疫応答を刺激するために、ヒトおよび非ヒト動物に投与するための細菌免疫原性因子を提供する。また本発明は哺乳類種、特にヒト患者への大腸菌ＦｉｍＨタンパク質の変異体のワクチン接種のための方法を提供し、前記変異体は大腸菌の種々の株から得られる。また本発明は病原体細菌種による感染からワクチン受容者を保護する抗体の産生を提供する。他の見地において、本発明は病原体細菌種の診断およびまたは保護／処置因子として用いられ得る前記タンパク質およびタンパク質複合体に対する抗体を提供する。ポリペプチド、特に細菌シャペロンおよび細菌アドへシンの複合体などの結合ポリペプチドを産生するプラスミドに基づく方法もまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一つの免疫原性ポリペプチドであって、ここで前記ポリペプチドが配列番号：２３から４５および５５の残基２６から１８６より成るグループから選択された配列より成ることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
請求項１記載の免疫原性ポリペプチドであって、ここで前記ポリペプチドがさらに配列番号：２３から４５および５５から選択された配列の約Ｎ末端の３分の２から成ることを特徴とするポリペプチド。
【請求項３】
請求項１記載の免疫原性ポリペプチドであって、ここで前記ポリペプチドが配列番号：２３から４５および５５より成るグループから選択されたアミノ酸配列を持つことを特徴とするポリペプチド。
【請求項４】
請求項１記載の免疫原性ポリペプチドであって、ここで前記配列が配列番号：５５であることを特徴とするポリペプチド。
【請求項５】
請求項２記載の免疫原性ポリペプチドであって、ここで前記配列が配列番号：５５であることを特徴とするポリペプチド。
【請求項６】
請求項３記載の免疫原性ポリペプチドであって、ここで前記配列が配列番号：５５であることを特徴とするポリペプチド。
【請求項７】
一つの単離されたポリヌクレオチドであって、ここで前記ポリヌクレオチドが請求項１記載のポリペプチドをコード化していることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項８】
一つの単離されたポリヌクレオチドであって、ここで前記ポリヌクレオチドが請求項３記載のポリペプチドをコード化していることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項９】
一つの単離されたポリヌクレオチドであって、ここで前記ポリヌクレオチドが請求項６記載のポリペプチドをコード化していることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項１、２あるいは３記載の免疫原性的に有効な量の免疫原性ポリペプチドより成る一つのワクチン組成物であって、ここで前記免疫原性ポリペプチドが薬理学的許容担体中にあることを特徴とするワクチン組成物。
【請求項１１】
請求項４、５あるいは６記載の免疫原性的に有効な量の免疫原性ポリペプチドより成る一つのワクチン組成物であって、ここで前記免疫原性ポリペプチドが薬理学的許容担体中にあることを特徴とするワクチン組成物。
【請求項１２】
請求項６記載の免疫原性的に有効な量の免疫原性ポリペプチドより成る一つのワクチン組成物であって、ここで前記免疫原性ポリペプチドが薬理学的許容担体中にあることを特徴とするワクチン組成物。
【請求項１３】
一つの抗体であって、ここで前記抗体が配列番号：２３から４５および５５から選択されたアミノ酸配列を持つポリペプチドに結合することを特徴とする抗体。
【請求項１４】
請求項１３記載の抗体であって、ここで前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする抗体。
【請求項１５】
腸内バシラス菌関連疾患に感染する危険のある患者を前記疾患から保護するための一つの方法であって、ここで前記方法が、前記患者に有効な量の請求項１０、１１および１２記載のワクチン組成物を投与することより成ることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５記載の方法であって、ここで前記疾患が尿路感染症であることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１５記載の方法であって、ここで前記疾患が膀胱感染症であることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１５記載の方法であって、ここで前記疾患が腸内細菌科の細菌により引き起こされることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８記載の方法であって、ここで前記細菌が大腸菌であることを特徴とする方法。
【請求項２０】
腸内バシラス菌関連疾患に苦しむ患者の前記疾患を処置するための一つの方法であって、ここで前記方法が、前記患者に有効な量の請求項１０、１１あるいは１２記載のワクチン組成物を投与することより成ることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項２０記載の方法であって、ここで前記疾患が尿路感染症であることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２０記載の方法であって、ここで前記疾患が膀胱感染症であることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２０記載の方法であって、ここで前記疾患が腸内細菌科の細菌により引き起こされることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２３記載の方法であって、ここで前記細菌が大腸菌であることを特徴とする方法。
【請求項２５】
腸内バシラス菌関連疾患に苦しむ患者の前記疾患を処置するための一つの方法であって、ここで前記方法が、前記患者に有効な量の請求項１３あるいは１４記載の抗体を投与することより成ることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項２５記載の方法であって、ここで前記疾患が尿路感染症であることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２５記載の方法であって、ここで前記疾患が膀胱感染症であることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２５記載の方法であって、ここで前記疾患が腸内細菌科の細菌により引き起こされることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２８記載の方法であって、ここで前記細菌が大腸菌であることを特徴とする方法。
【請求項３０】
ポリペプチドを発現する一つの組み換え細胞であって、ここで前記ポリペプチドが配列番号：２３から４５および５５より成るグループから選択されたアミノ酸配列より成ることを特徴とする細胞。
【請求項３１】
請求項３０記載の組み換え細胞であって、ここで前記アミノ酸配列が配列番号：５５の配列であることを特徴とする細胞。
【請求項３２】
一つのベクターであって、ここで前記ベクターが、配列番号：２３から４５および５５より成るグループから選択されたアミノ酸配列より成るポリペプチドをコード化したポリヌクレオチドより成ることを特徴とするベクター。
【請求項３３】
請求項３２記載のベクターであって、ここで前記アミノ酸配列が配列番号：５５の配列であることを特徴とするベクター。
【請求項３４】
請求項３２記載のベクターであって、ここで前記ベクターがプラスミドｐＣＧＡ１３９−１−１より成ることを特徴とするベクター。
【請求項３５】
請求項３３記載のベクターであって、ここで前記ベクターがプラスミドｐＣＧＡ１３９−１−１より成ることを特徴とするベクター。
【請求項３６】
ポリペプチドを産生するための一つのプロセスであって、ここで前記プロセスが、請求項３４記載のベクターを含有する組み換え細胞から前記ポリペプチドを発現することより成ることを特徴とするプロセス。
【請求項３７】
請求項３６記載のプロセスであって、ここで前記ポリペプチドが配列番号：２３から４５および５５より成るグループから選択されたアミノ酸配列より成ることを特徴とするプロセス。
【請求項３８】
請求項３７記載のプロセスであって、ここで前記ポリペプチドがさらに細菌アドへシンに結合する細菌シャペロンより成ることを特徴とするプロセス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本出願は２０００年７月７日に出願された合衆国暫定特許出願番号６０／２１６７５０号の優先権を主張し、その開示は全体で引用例としてここに組み込まれている。
【０００２】
本発明は、尿路疾患等の細菌により引き起こされる疾患の予防、診断および処置のためのワクチン組成物における使用のための細菌アドへシンタンパク質およびその活性断片、特にヒトおよび動物における免疫応答を刺激するための免疫因子としての前記アドへシンの使用に関する。
【０００３】
【発明の背景】
尿路感染症（ここでは“ＵＴＩ”）は、細菌の細胞への付着により媒介される疾患プロセスを示す。大腸菌は尿路の最も一般的な病原体であり、無症候性細菌尿、急性膀胱炎および急性腎盂腎炎の症例の８５％以上、同様に再発性膀胱炎の６０％以上そして再発性腎盂腎炎感染症の最低３５％の原因である。その上さらに、女性のおおよそ２５％−３０％が初期感染後の最初の１２ヶ月の間に再発性大腸菌尿路感染症を経験するが、２次あるいは３次感染後、再発の割合は６０％−７５％に増加する。大腸菌尿路感染症についての高い発症率、持続性および大幅な支出を考慮すると、この疾患に対する感受性を減少させるための予防ワクチンが必要である。
【０００４】
多くの因子が大腸菌尿路感染症の獲得および進行の原因となるが、一般的に泌尿器上皮への定着が感染プロセスに必要な段階であると認められる。大腸菌尿路感染症の典型的な進行において、腸管由来の細菌は膀胱に上行し、膀胱粘膜に付着する。ここで前記細菌は増殖し、尿管および腎臓に上行する前に感染（膀胱炎）を起こす。大腸菌の泌尿器上皮へのピリ線毛媒介付着の中断あるいは予防は、尿路感染症の進行を抑制あるいは遅らせ得る。この点に関して多くの研究は、宿主尿路上皮細胞への付着の媒介にピリ線毛が果たす役割を指摘してきた。
【０００５】
感染の開始のためには、細菌病原体は第一に宿主の適当な標的組織に定着できなければならない。多くの病原体にとって、この組織は粘膜表面に位置する。定着は、粘膜の上皮を形成する細胞により発現される受容体への細菌の付着から始まる。付着は、細胞受容体に特異的に結合する細菌上のタンパク質により媒介される。これらのタンパク質、すなわちアドへシンは細菌の表面上に直接発現するか、あるいはより典型的にはピリ繊毛、繊毛あるいは原線維と呼ばれる細長い棒状のたんぱく質構造体の構成要素として発現する。
【０００６】
１型ピリ線毛は、膀胱への定着の開始および膀胱炎の誘発に重要であると考えられるのに対して、Ｐピリ線毛は、感染を上行させ腎盂腎炎を確実にすることに役割を果たすと考えられる。
【０００７】
前記ピリ線毛は、ピリ線毛組立てに必要とされる複数の異なる構造タンパク質から成るヘテロ重合体構造である。２つの型のピリ線毛は特に関心のあるものであり、それはＰピリ線毛および１型ピリ線毛である。Ｐピリ線毛保有細菌は、哺乳類の腎臓細胞上の糖脂質のグルボシド中に存在するｇａｌ−（α１−４）ｇａｌ部分を認識し結合する。１型ピリ線毛保有細菌は、膀胱上皮細胞の糖脂質および糖タンパク質中のＤ−マンノースを認識して結合する。
【０００８】
ＦｉｍＨは、真核生物細胞表面上のマンノース含有糖タンパク質を介した１型ピリ線毛保有細菌の宿主細胞への付着を促進するＤ−マンノース結合アドへシンである。ＦｉｍＣはそのペリプラズムシャペロンタンパク質である。
【０００９】
この詳説において、“ピリ線毛”、“線毛”および“原線維”という用語は、細菌、最も一般的にはグラム陰性細菌の細胞外表面上に位置するヘテロ重合体タンパク質構造体を示すために用いられる。通常これらの構造体は外膜に固定される。この詳説全体にわたって、ピリ線毛、線毛および原線維という用語は交代可能に用いられ得る。
【００１０】
ここで用いたように、“ペリプラズムシャペロン”という用語は、共通結合エピトープの認識により種々のシャペロン結合タンパク質と複合体を形成することが可能な細菌のペリプラズムに局在するタンパク質と定義される。シャペロンは、細菌細胞からペリプラズム中に輸送されるタンパク質が本来の構造に納まるための鋳型として働く。シャペロン結合タンパク質とシャペロンとの組合せはまた、ペリプラズム中に局在するプロテアーゼによる分解から結合タンパク質を保護するために働き、水溶液中での前記結合タンパク質の溶解度を増加させ、組立てピリ線毛への連続した正確な結合をもたらす。シャペロンタンパク質は、ピリ線毛の組立てを媒介することにより前記組立てに関連するが、構造には組み込まれないグラム陰性細菌中のタンパク質の種類である。ＦｉｍＣは、細菌の１型ピリ線毛の組立てを媒介するペリプラズムシャペロンタンパク質である。
【００１１】
前記シャペロンは、特定倍のシャペロンタンパク質をシャペロンあるいはピリ線毛のドメインあるいはらせん鎖の欠失の代わりに挿入することにより、対応するアドへシンあるいはピリ線毛の適切な自然構造の形成を導くことができることが最近報告された。したがって、ＦｉｍＨタンパク質は、前記シャペロンの不在下ではなく存在下において自然の構造を持つ傾向がある［参照：Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ　ｅｔ　ａｌ，　Ｘ−ｒａｙ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＦｉｍＣ−ＦｉｍＨ　Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ−Ａｄｈｅｓｉｎ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　ｆｒｏｍ　Ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　Ｅ．　ｃｏｌｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８５，１０６１（１９９９）；Ｓａｕｅｒ　ｅｔ　ａｌ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　Ｂａｓｉｓ　ｏｆ　Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｉｌｕｓ　Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８５，１０５８（１９９９）］。加えて最近の発表は、必要なシャペロン鎖が、欠失構造を提供し正確な自然の構造を産生するために、ＦｉｍＨ等のアドへシンあるいはピリ線毛タンパク質中に挿入することが可能であることを示唆した；Ｂａｒｎｈａｒｔ，Ｍ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，ＰａｐＤ−ｌｉｋｅ　Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ　Ｐｒｏｖｉｄｅ　ｔｈｅ　Ｍｉｓｓｉｎｇ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｆｏｌｄｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｉｌｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），１０．１０７３／ｐｎａｓ．１３０１８３８９７（２０００年６月２０日にオンラインで発表された）。
【００１２】
精製完全１型あるいはＰピリ線毛に対する抗体は、膀胱炎および腎盂腎炎等の疾患のマウスおよび霊長類モデルの両方において、それぞれ膀胱炎および腎盂腎炎に対して効果がある。参照：Ａｂｒａｈａｍ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ　Ｉｍｍｕｎ．４８：６２５（１９８５），Ｒｏｂｅｒｔｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９１：１１８８９（１９９４），Ｏ′Ｈａｎｔｅｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７５：３４７（１９８５）。しかし、前記効果は、免疫原として用いられたピリ線毛が得られた相同性大腸菌株あるいは小群の血清学上相互に反応する異種株のどちらかに限定される。したがって、大部分がピリ線毛の主要な構造タンパク質（すなわちＰａｐＡあるいはＦｉｍＡ）より成るワクチンは、これらのより高度な可変タンパク質に対して作成された抗体が免疫付与のために用いられた株に特異的であるため、その価値は限定的であると思われる。
【００１３】
それ以上に、ＦｉｍＨに対する抗体は防御するものであると思われる。Ｂａｒｎｈａｒｔ，Ｍ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，ＰａｐＤ−ｌｉｋｅ　Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ　Ｐｒｏｖｉｄｅ　ｔｈｅ　Ｍｉｓｓｉｎｇ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｆｏｌｄｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｉｌｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），１０．１０７３／ｐｎａｓ．１３０１８３８９７（２０００年６月２０日にオンラインで発表された）。
【００１４】
最近、Ｓｏｋｕｒｅｎｋｏ　ｅｔ　ａｌ［参照：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７，３６８０−８６（１９９５）］は、大腸菌のマンノース感受性アドへシンの量的変異が主としてＦｉｍＨアドへシンの構造の差異によることを発見した。さらなる調査は、ＦｉｍＨレクチンのモノマンノシル残基と相互作用する能力が大腸菌アドへシンを尿路上皮に媒介させる能力と強く関連するために、１型線毛の特定の表現型変異体がその他のもの以上に尿路における大腸菌の病原性に寄与することを示した［Ｓｏｋｕｒｅｎｋｏ　ｅｔ　ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１７８８０−１７８８６（１９９７）］。従来は、モノマンノース残基（尿路上皮糖タンパク質のオリゴ糖部分に豊富な構造）へのアドへシンの結合を増加させるＦｉｍＨ遺伝子のランダム点突然変異が、マウス尿路における病原性の増加を与えると考えられていた［参照：Ｓｏｋｕｒｅｎｋｏ　ｅｔ　ａｌ，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９５，８９２２−８９２６（１９９８）］。
【００１５】
【発明の簡単な要約】
一見地において本発明は、一つあるいはそれ以上のアミノ酸残基においてそれぞれ異なり、また免疫原性ポリペプチドを含むワクチン接種に続く、動物、特にヒト患者の防御につながる免疫応答を引き起こす細菌大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の種々の株から得られた免疫原性ポリペプチドに関する。
【００１６】
本発明の一つの目的は、大腸菌により引き起こされる感染、特に尿路感染症の予防および処置のためのワクチンの構成要素として有益な、免疫原性ＦｉｍＨポリペプチドを提供することである。特異的な実施例において、本発明のポリペプチドは図２に示されたアミノ酸配列を持つ。ここに開示された新規のポリペプチドより成る前記ワクチン組成物は、ワクチン接種および尿路感染症、特に大腸菌により引き起こされるものの処置において有益である。一つの実施例において、本発明にしたがったワクチン組成物は、ＦｉｍＣなどシャペロンとの複合体あるいはＦｉｍＨアドへシンの構造を安定化するために働くＦｉｍＣの配列の一部との複合体の形態の安定した構造として、図２のポリペプチド（あるいはマンノース結合能力を持ちワクチンとして働くことができる図２の配列の不完全な分節）より成る。特定の実施例は、図２の共通配列（配列番号：５５）を用いる。
【００１７】
本発明の他の目的は、ここに開示された新規のポリペプチドに対する特異性を持ち、そのアミノ酸配列が図２に示される、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を含む抗体を提供することである。
【００１８】
本発明のまたさらなる目的は、ここに開示されたワクチン組成物を用いて尿路感染症を予防するための予防法を提供することである。
【００１９】
本発明のまたさらなる目的は、尿路の疾患を処置するための方法を提供することであり、前記方法はここに開示されたワクチン組成物の使用および前記ワクチン組成物およびそこに含まれるポリペプチドに対して生成された抗体の使用より成る。
【００２０】
本発明の他の目的は、図３から６のプラスミドより成るベクターを用いて、組み換え細胞からポリペプチドを調製するための新規方法を提供することである。特異的な実施例において、ポリペプチドは図２のアミノ酸配列より成る。一つの実施例において、このプロセスおよびプラスミドは、ＦｉｍＨあるいは共通配列を含む図２に示された任意のポリペプチド等の細菌アドへシンと融合する、ＦｉｍＣ等の細菌シャペロンより成るポリペプチドを調製するために用いることができる。
【００２１】
【発明の説明】
本発明の一つの目的は、ワクチンのための免疫原性組成物を利用すること（あるいは診断用または受動ワクチンとして用いるための抗体を産生すること）であり、前記免疫原性組成物は、新規ポリペプチド、特にＦｉｍＨポリペプチドあるいはその変異体より成り、また単独あるいは、シャペロンまたはシャペロンの安定化部位との複合体、またはポリペプチドあるいはポリペプチド様構造を形成するために共に結合する一連の単離された非連続ドメイン、特にマンノース結合ドメインより成る。
【００２２】
本発明の一つの実施例において、１型ピリ線毛を産生する細菌由来のＦｉｍＨタンパク質（自然にあるいは組み換えにより産生されたものおよび機能的類似体）は意図される。さらにより特には、大腸菌ＦｉｍＨタンパク質は意図される。
【００２３】
本発明は、配列番号：２３から４５および５５の最低残基２６から１８６より成るグループから選択された配列より成る単離されたポリペプチドを提供する。
【００２４】
本発明はさらに、配列番号：２３から４５および５５から選択された、約Ｎ末端の３分の２の（約残基１から１８６を含む）配列より成る、単離されたポリペプチドに関する。
【００２５】
本発明はまたさらに、配列番号：２３から４５および５５より成るグループから選択されたアミノ酸配列より成る、単離されたポリペプチドに関する。
【００２６】
本発明のポリペプチドは、任意の望ましい組合せあるいは相対濃度での一つあるいはそれ以上のポリペプチドより成る組成物の形態で、都合よく提示され得る。さらに、本発明はここに開示された新規ポリペプチドの活性先端、部位、断片あるいは分節を含む。
【００２７】
本発明はまた、本発明の一つあるいはそれ以上のポリペプチドあるいはその活性先端、断片、部位あるいは分節をコード化する単離されたポリヌクレオチドに関する。一つの実施例において、単離されたポリヌクレオチドは図１（ａ）−１（ｊ）に示される。
【００２８】
本発明にしたがったワクチン組成物は、免疫原性の活性先端、部位、断片および分節、また任意のおよび全ての活性組合せを含む、免疫原性的に有効な量の本発明のポリペプチドより成るものである。ここで前記ポリペプチドあるいは活性断片は、全ての適切な希釈剤あるいは賦形剤を含む薬理学的許容担体中に懸濁される。
【００２９】
本発明はまた、ここに開示された任意のポリペプチド（配列番号：２３から４５および５５）、前記ポリペプチドの免疫原性活性先端、部位、断片および分節に対して特異的な、ポリクローナルあるいはモノクローナル、組み換えあるいは合成の抗体に関する。ここで前記抗体は単独で、あるいは任意のまたは全てのその活性組合せで用いられ得る。
【００３０】
配列全体がワクチン形成のために用いられる前記ポリペプチドは、通常シャペロン、特にＦＩＭＣと（ＦｉｍＣＨ複合体を形成するために−参照：Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ　ｅｔ　ａｌ（１９９９）およびＳａｕｅｒ　ｅｔ　ａｌ（１９９９）、その開示は全体で引用例としてここに組み込まれる）混合されることにより構造的に安定する。あるいはここで前記構造安定化は、ワクチンとして用いるためのアドヘシンの安定化を引き起こす、ＦｉｍＣ等のシャペロンの部位でアドへシンの構造を補完することにより引き起こされる［参照：Ｂａｒｎｈａｒｔ　ｅｔ　ａｌ．ｓｕｐｒａ，その開示は全体で引用例としてここに組み込まれる］。あるいはここで、図２のアドへシンの配列のマンノース結合部位は、自然の分子から単離されるかあるいは合成され、その後１、２、３あるいはそれ以上の（自然のタンパク質以外の）単一ポリペプチドの一部等のドメインより成る構造を形成するために結合する。あるいはここで前記ドメインは、その他の化学連鎖により結合する。
【００３１】
ここに開示されたポリペプチドおよび断片の免疫原性および防護特性のために、本発明はさらに動物、特に疾患に苦しむヒト患者の前記疾患の予防およびまたは処置のための方法に関し、ここで前記方法は、前記動物に一定量の前記予防およびまたは処置に有効な本発明のワクチン組成物を投与することより成る。本発明の特異的な実施例において、前記疾患は尿路感染症あるいは膀胱感染症である。好ましい実施例において、前記疾患は前記予防およびまたは処置に対して有効な腸内細菌科の細菌、特に大腸菌により引き起こされる。
【００３２】
本発明はさらに動物、特に疾患に苦しむヒト患者の前記疾患を処置する方法に関し、前記方法は、前記動物に治療上有効な量のここに開示された本発明の抗体を投与することより成る。本発明の特異的な実施例において、前記疾患は尿路感染症あるいは膀胱感染症である。好ましい実施例において、前記疾患は腸内細菌科の細菌、特に大腸菌により引き起こされる。
【００３３】
本発明はまた、配列番号：２３から４５および５５より成るグループから選択されたポリペプチドおよびその断片を発現する組み換え細胞に関する。ここで“発現”という用語は、本発明の開示されたポリヌクレオチドからポリペプチドを合成することを意味する。
【００３４】
本発明はまた、本発明のポリペプチドおよびその活性断片をコード化するポリヌクレオチドから選択されたポリヌクレオチドより成るベクターに関する。
【００３５】
ここでの開示にしたがって、本発明はまた、配列番号：２３から４５および５５のポリペプチドより成るグループから選択された、ペリプラズムシャペロンおよびポリペプチドあるいはその活性断片より成る免疫原性複合体を含む。
【００３６】
前記免疫原性組成物の好ましい実施例は、前記免疫原性組成物の活性構成要素がＦｉｍＨアドヘシンタンパク質変異体のマンノース結合断片から選択された一つであるか、あるいは前記タンパク質が提供者相補性単ポリペプチド構造であるかまたは前記変異体から得られた非連続マンノース結合ドメインより成る免疫原性複合体の形態で存在する組成物である（１９９９年７月１５日に出願された、Ｌａｎｇｅｒｍａｎｎ，合衆国特許出願番号６０／１４４０１６参照、その開示は全体で引用例としてここに組み込まれている）。
【００３７】
本発明の他の見地において本発明の免疫原性組成物は、疾患、特に尿路感染症を診断あるいは処置するための抗体を産生し、あるいは前記感染症の予防およびまたは処置のためのワクチンおよび免疫原性組成物の免疫原に対する抗体の高力価を維持するための追加免疫ワクチンを産生するために利用され得る。
【００３８】
出願人は、ＦｉｍＨポリペプチドが大腸菌の種々の株間で高く保存されていることを発見した。それ以上に、株間で起こるアミノ酸変換は通常同様のアミノ酸部位で起こる。
【００３９】
大腸菌株間のＦｉｍＨの高い保存の結果、一つの株由来のＦｉｍＨポリペプチドは、その他の大腸菌株がＦｉｍＨレクチンにより細胞に結合することを抑制あるいは予防し、およびまたはその他の大腸菌株により引き起こされる感染の予防およびまたは処置を提供する抗体反応を引き起こすことができる。本発明の（共通配列を含む）ＦｉｍＨタンパク質およびポリヌクレオチドに対する配列番号は、表１に示され、図１および２そして表２のデータに示された菌株の指示と相関する。
【００４０】
本発明にしたがって開示されたポリペプチドを、尿路および膀胱感染症、特に大腸菌により引き起こされるものの予防およびまたは処置に使用するための治療上有効なワクチン組成物を形成するために利用することができる種々の方法がある。
【００４１】
ここでの教示にしたがって、本発明はペリプラズムシャペロンタンパク質、特に本発明にしたがったＦｉｍＣおよびＦｉｍＨ変異体の精製複合体より成る免疫原性組成物に向けられる。ＦｉｍＣはＦｉｍＨと同一の大腸菌株あるいは異なる株から獲得することができる。ＦｉｍＨポリペプチドあるいはその部位は、それを必要とするヒト患者に適切に導入された場合に免疫応答を引き起こすことができる免疫原性形態における複合体中に維持される。ここで用いられるように、“それを必要とする患者”という用語は、ピリ線毛を産生する病原菌、特に大腸菌および関連細菌に感染しあるいは感染する恐れのあるヒトを示す。調査目的のために、マウスモデルは特定状況における前記患者をシミュレートするために利用することができる。Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ　ｅｔ　ａｌ．，ｓｕｐｒａおよびＳａｕｅｒ，ｅｔ　ａｌ．，ｓｕｐｒａ参照。
【００４２】
本発明にしたがったポリペプチドはまた、ＦｉｍＣとの複合体を必要としない前記ＦｉｍＨ変異体の自然構造を形成することにより、治療上有効なワクチン組成物の構成要素として用いることができる。したがって、ここに開示されたＦｉｍＨ変異体は、安定化のために必要なＦｉｍＣの配列をそこに組込む方法等の組み換え法により容易に産生される（参照Ｂａｒｎｈａｒｔ　ｅｔ　ａｌ（２０００））。
【００４３】
本発明の新規ポリペプチドあるいはＦｉｍＨ変異体を利用する追加の方法は、前記変異体の非連続ドメインより成る合成構造体を形成することである。ＦｉｍＨの細胞結合部位は通常マンノース結合分節より成り、分子のＮ末端の約３分の２より成ることは知られている。残りのピリ線毛結合部位は、細菌細胞の原線維において複合体を形成するためにＦｉｍＨと相互作用する分節である。したがって本発明のＦｉｍＨ変異体は、図２に表された配列のＮ末端の３分の２の特異的で、比較的短いマンノース結合ドメインのみを産生するように容易に処理される。これらのドメインの全てあるいは一部は、非連続マンノース結合ドメインより成るポリペプチドを提供するために適当なリンカー配列あるいはその他の結合構造物を用いてつなぎ合わされ得る。その全体構造は、ここに開示されたワクチン組成物への使用に対して、高い免疫原性構造を提供する（Ｌａｎｇｅｒｍａｎｎ　ｓｕｐｒａ参照）。
【００４４】
もちろん、ＦｉｍＨ変異体を利用する３つの方法のみが本発明にしたがって開示されたが、その他の有益な実施例はここでの技術に関連する分野における通常の知識を有する者に示される。
【００４５】
本発明のタンパク質およびその免疫学的活性断片は、細菌の病原種に対する免疫性を与える抗体の産生を刺激するワクチン組成物を調製するための有益な免疫原である。さらに、抗原性成分としての精製タンパク質を含むワクチンの調製は、この分野における通常の知識水準で十分に行うことができる。
【００４６】
ここにおいて有益な薬学組成物はまた、組成物を受容した個体に有害な抗体の産生を引き起こさない任意の薬学因子を含み、不都合な毒性を伴わずに投与することができる、任意の適切な希釈剤あるいは賦形剤を含む薬学的許容担体を含む。薬学的許容担体は、鼻およびその他の呼吸器輸送あるいは眼系統への輸送のための噴霧形式において有益な担体を含む、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノール、その他同種のもの等の液体を含むが、これらに限定されない。
【００４７】
ワクチン組成物は通常ワクチンの効果を高めるために働くことができる、ｐＨを安定化するための追加の物質、あるいは抗原性補強剤、湿潤剤または乳化剤として機能する追加の物質を組み込み得る。
【００４８】
ワクチンは通常非経口投与用に作られ、皮下あるいは筋肉内に注入される。前記ワクチンはまたこの分野において知られた方法を用いて、座薬としてあるいは経口投与用に作ることができる。
【００４９】
病原細菌に対する免疫性を与えるのに十分なワクチン量は、この分野における通常の知識を有する者に十分知られた方法により測定される。この量は年齢、性別および全体的な生理的状態の検討材料、必要とされる免疫性の水準を含むワクチン需要者の性質に基づいて測定される。ここでワクチンは皮下あるいは筋肉内注射により投与され、１から５００μｇの範囲の精製タンパク質が投与され得る。
【００５０】
ワクチンとしての使用に加えてここに開示されたＦｉｍＨ変異体は、受動免疫治療での使用、診断用試薬としての使用およびアフィニティークロマトグラフィー等のその他のプロセスにおける試薬として使用するための抗体の産生を刺激する免疫原としての使用のために利用可能である。
【００５１】
本発明の一見地において、本発明の大腸菌シャペロンＦｉｍＣおよびＦｉｍＨ変異体より成る複合体は、組み換え細胞からの、そのアミノ酸およびヌクレオチド配列がこの分野において知られているＦｉｍＣと（図２にしたがった配列の）適切なＦｉｍＨ変異体ポリペプチドとの共同発現により形成され得る。
【００５２】
加えて、ワクチンに有益なＦｉｍＣ−ＦｉｍＨ複合体はここに開示された示された株の細胞のペリプラズム空間から回収することができる。これらの複合体は、野生型株において産生されるよりも多い水準でＦｉｍＣタンパク質を発現する組み換え大腸菌株中に比較的多量に見られる。適切な組み換え株は、ＦｉｍＣの発現がアラビノースプロモーターの管理下にある株である、Ｃ６００／ｐＨＪ９２０５である。この分野における通常の知識を有する者は、容易に調節することができるその他のポロモーター配列もまた用いられ得ることを認識するであろう。もちろん前記細胞は、一つあるいはそれ以上の本発明のＦｉｍＨ変異体ポリペプチドを発現するように容易に処理される。ペリプラズムの抽出物は、高張ショ糖溶液の存在下での細菌のリゾチームへの接触により得られる。ＦｉｍＣ−Ｈ複合体はまた、この分野においてよく知られた従来のタンパク質精製法を用いて精製することができる。
【００５３】
同様の方法として、大腸菌に本発明の全長ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドを産生させ、その後タンパク質を断片化するかあるいはその断片自体が組み換えにより産生されることにより組み換えにより産生されるＦｉｍＨ断片は、マンノース結合アフィニティー精製により単離され得る。したがって、マンノース結合を保持するＦｉｍＨタンパク質の断片のみが単離される。好ましくは、前記マンノース結合断片はＨｉｓ−タグ等の標識を持ち、ニッケルクロマトグラフィー等の方法により精製され得る。
【００５４】
ここで用いられたように“部位”、“分節”および“断片”という用語は、ポリペプチドに関して用いられる場合には、アミノ酸残基等の残基の連続した配列を示し、前記配列はより大きな配列の一部を形成する。例えば、ポリペプチドがトリプシンあるいはキモトリプシン等の一般的な任意のエンドペプチダーゼでの処置を受けた場合には、前記処置の結果生じたオリゴペプチドは当初のポリペプチドの部位、分節あるいは断片に相当する。ポリヌクレオチドに関して用いられた場合には、前記用語は任意の一般的なエンドヌクレアーゼでの前記ポリヌクレオチドの処置により産生される産物を示す。
【００５５】
本発明のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド、例えば図１のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの精製を可能にする標識配列に対する枠組みに融合するコード配列を持ち得る。標識配列は例えば、細菌宿主の場合には、標識に融合した成熟ポリペプチドの精製を提供するためのｐＱＥ−９ベクターにより提供される６−ヒスチジンタグであり得る。あるいは例えば標識配列は、哺乳類宿主の場合には、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグであり、例えばＣＯＳ−７細胞が用いられる。ＨＡタグはインフルエンザヘマグルチニンタンパク質から得られたエピトープに一致する（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３７：７６７（１９８４））。
【００５６】
本発明はまた、一つあるいはそれ以上の本発明のアドへシンタンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝的に処理された宿主細胞および、単離され、実質的に免疫原性として精製された形態における組み換え技術による前記アドへシンタンパク質およびまたはシャペロンタンパク質の産生に関する。
【００５７】
宿主細胞は、本発明のシャペロン、アドへシンタンパク質、アドへシンタンパク質のマンノース結合断片、あるいはその他同種のものをコード化するポリヌクレオチドより成るベクターを用いて遺伝的に処理（形質導入あるいは形質転換またはトランスフェクト）され、前記ベクターは例えばクローニングベクターあるいは発現ベクターであり得る。ベクターは例えばプラスミド、ウイルス粒子、ファージその他の形態であり得る。処理された宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換細胞の選択あるいは前記ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの増幅に適するように調節された従来の栄養培地中で培養することができる。温度、ｐＨその他同種のもの等の培養条件は、発現について選択された宿主細胞に以前に用いた条件であり、通常の知識を有する者にとって明らかである。
【００５８】
ベクターは染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母菌プラスミド、プラスミドおよびファージＤＮＡの組合せから得られたベクター、ワクシニア、アデノウイルス、家禽ジフテリアウイルスおよび仮性狂犬病などのウイルスＤＮＡを含む。しかし、その他のベクターも宿主中で複製可能であり生存可能である限りは使用することができる。前記方法およびその他のものはこの分野における通常の知識を有する者の適用範囲内であると思われる。
【００５９】
発現ベクター中のＤＮＡ配列は、直接ｍＲＮＡ合成のために適切な発現コントロール配列（プロモーター）に動作可能に結合する。前記プロモーターの代表的な例としては、ＬＴＲあるいはＳＶ４０プロモーター、大腸菌ｌａｃあるいはｔｒｐ、ファージラムダＰＬプロモーター、および原核あるいは真核細胞あるいはそのウイルス中の遺伝子の発現をコントロールすることが知られているその他のプロモーターであり得る。発現ベクターはまた翻訳開始および転写ターミネーターに関するリボソーム結合部位を含む。ベクターはまた増幅発現に関する適切な配列を含み得る。
【００６０】
加えて発現ベクターは、真核細胞培養についてのジヒドロ葉酸還元酵素あるいはネオマイシン耐性あるいは大腸菌におけるテトラサイクリンあるいはアンピシリンまたはカナマイシン耐性などの、形質転換宿主細胞の選択のための表現型形質を提供するために、好ましくは一つあるいはそれ以上の選択マーカー遺伝子を含む。
【００６１】
例えばＦｉｍＣ−Ｈ複合体の最適な発現は、ＦｉｍＨおよびＦｉｍＣ遺伝子を含むが各遺伝子がそれぞれのｌａｃプロモーターに基づくという利点を持つ新規に構成された単一ベクターを用いて得られる。したがって、一つのｌａｃプロモーターはＦｉｍＣに関連して５′に位置する。一方第２のｌａｃプロモーターはＦｉｍＨ遺伝子に関連して５′に位置する。このプラスミドは、基礎ベクターとして共通プラスミドｐＵＣ１９を用いてうまく構成された（Ｙａｎｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．，Ｖｉｅｒｉｒａ，Ｊ．ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ，　Ｊ．，Ｇｅｎｅ，３３：１０３−１１９（１９８５））。この新しいプラスミドは、［Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｔ．Ａ．，Ｖａｎ　Ｂｏｇｅｌｅｎ，Ｒ．Ａ．，ａｎｄ　Ｎｅｉｄｈａｒｔ，Ｆ．Ｃ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９：２８３−２８７（１９８４）に示されたように］宿主大腸菌株ＢＬ２１を形質転換するために使用され、その後増殖の中央対数段階でＩＰＴＧを用いて誘発された場合に、細菌のペリプラズム空間中でのＦｉｍＣＨ複合体の最大の発現をもたらす。この原料はその後、ここに開示されたものを含む、この分野においてよく知られた方法により抽出され精製される。
【００６２】
上記の適切なＤＮＡ配列および適切なプロモーターあるいはコントロール配列を含むベクターは、宿主のタンパク質の発現を可能にするように、適切な宿主を形質転換するために用いることができる。
【００６３】
適切な宿主の代表的な例としては、大腸菌、ストレプトミセス、ネズミチフス菌等の細菌細胞、酵母菌等の真菌細胞、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ　Ｓｆ９等の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳあるいはＢｏｗｅｓメラノーマ等の動物細胞、アデノウイルス、植物細胞その他であり得る。適切な宿主の選択は、ここでの教示からこの分野における通常の知識を有する者の適用範囲内であると思われる。
【００６４】
より特には、本発明はまた上に広く示された配列の一つあるいはそれ以上より成る組み換え構成物を含む。前記構成物は、本発明の配列が順方向あるいは逆方向で挿入されるプラスミドあるいはウイルスベクター等のベクターより成る。この実施例の好ましい見地において前記構成物はさらに、例えば配列に動作可能に結合したプロモーターを含む調節配列より成る。多数の適切なベクターおよびプロモーターはこの分野における通常の知識を有する者に知られており、市販されている。以下のベクターは例として提供される。細菌：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。真核細胞：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかし、その他の任意のプラスミドあるいはベクターは宿主中で複製可能および生存可能である限りは用いることができる。
【００６５】
ポロモーター領域は、選択マーカーを伴うＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターあるいはその他のベクターを用いて任意の望ましい遺伝子から選択することができる。二つの適切なベクターはｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。特定の指定された細菌プロモーターはｌａｃ１、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰＲ、ＰＬおよびＴＲＰを含む。真核細胞プロモーターは前初期ＣＭＶ、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲｓおよびマウスメタロチオネイン−Ｉを含む。適切なベクターおよびプロモーターの選択はこの分野における通常の技術の水準で十分である。
【００６６】
さらなる実施例において、本発明は上記構成物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、哺乳類細胞等の高等真核細胞あるいは酵母菌細胞等の下等真核細胞であり得る。また宿主細胞は細菌細胞等の原核細胞であり得る。宿主細胞中への構成物の導入は、リン酸カルシウム遺伝子導入法、ＤＥＡＥ−デキストラン処理法あるいはエレクトロポレーション法により達成することができる（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．，Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．，Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１９８６））。
【００６７】
宿主細胞中の構成物は、組み換え配列によりコード化された遺伝子産物を産生する従来の方法において用いることができる。代わって、本発明のポリペプチドは従来のペプチド合成機により、合成的に産生することができる。
【００６８】
成熟したタンパク質は、適切なプロモーターのコントロールの下で哺乳類細胞、酵母菌、細菌あるいはその他の細胞中に発現することができる。細胞の自由な翻訳システムもまた、本発明のＤＮＡ構成物から得られたＲＮＡｓを用いて前記タンパク質を産生するために用いることができる。原核および真核宿主、同様に分子生物学におけるその他の方法に用いるための適切なクローニングおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９），Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９７）およびＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６２，（Ｔｕａｎ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９７）に記載されており、その開示は全体で引用例としてここに組み込まれている。
【００６９】
高等真核細胞による本発明のポリペプチドをコード化するＤＮＡの転写は、ベクター内へのエンハンサー配列の挿入により増加する。エンハンサーはＤＮＡのシス作用領域であり、プロモーターに対してその転写を増加するように働く通常約１０から３００ｂｐである。例は、複製開始点の後期側ｂｐ１００から２７０上のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側上のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーを含む。
【００７０】
通常組み換え発現ベクターは複製起点および宿主細胞の形質転換を可能にする選択マーカー、例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子およびＳ．セレヴィシエＴＲＰ１遺伝子、また下流の構造配列の転写を導く高度に発現する遺伝子から得られたプロモーターを含む。前記プロモーターは、特に３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、α−因子、酸ホスファターゼあるいは熱ショックタンパク質などの解糖酵素をコード化するオペロンから得ることができる。異種構造配列は、適切な段階で翻訳開始および終結配列と共に組み立てられる。付随的に異種配列は、例えば発現した組み換え生成物の安定あるいは簡易化した精製等の望ましい性質を与えるＮ末端同定ペプチドを含む、融合タンパク質をコード化することができる。
【００７１】
細菌を使用するための有益な発現ベクターは、適切な翻訳開始および終結シグナルと共に望ましいタンパク質をコード化する構造ＤＮＡ配列を、機能的プロモーターを伴う実施可能なリーディング相中に挿入することにより構成される。ベクターは一つあるいはそれ以上の表現型選択マーカーおよびベクターの維持を確実にし、また望ましくは宿主中での増幅を提供する複製起点より成る。形質転換のための適切な原核生物宿主は、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌およびシュードモナス、ストレプトマイシンおよびスタフィロコッカス属中の種々の種を含むが、その他のものもまた選択の対象として用いることができる
代表的であるが限定しない例として、細菌の使用のための有益な発現ベクターは、選択マーカーおよびよく知られたクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝子要素より成る市販のプラスミドから得られた細菌複製起点より成り得る。前記市販ベクターは、例えばｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を含む。これらのｐＢＲ３２２“中心”部分は、適切なプロモーターおよび発現するための構造配列と結合する。
【００７２】
適切な宿主株の形質転換および宿主株の適切な細胞濃度への増殖に続き、選択されたプロモーターは適切な方法（例えば温度変化あるいは化学導入）により導入され、細胞は追加の期間培養される。
【００７３】
細胞は通常遠心分離により回収され、物理的あるいは化学的方法により分離され、その結果生じた粗抽出物にはさらなる精製が続けられる。
【００７４】
タンパク質の発現に用いられる細菌細胞は、凍結融解サイクリング、音波処理、フレンチプレス、機械的破壊あるいは細胞溶解因子の使用を含む任意の適当な方法により分離することが可能であり、前記方法はこの分野における通常の知識を有する者に十分に知られている。
【００７５】
種々の哺乳類細胞培養システムもまた組み換えタンパク質を発現するために用いることができる。哺乳類発現システムの例は、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ，２３：１７５（１９８１）に示されたサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系および例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅｌａおよびＢＨＫ細胞系等の相性ベクターを発現することが可能なその他の細胞系を含む。哺乳類発現ベクターは複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、また任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライシング供与および受容部位、転写終結配列および５′フランキング非転写配列より成る。ＳＶ４０スプライシングから得られたＤＮＡ配列およびポリアデニル化部位は望ましい非転写遺伝子要素を提供するために用いられ得る。
【００７６】
ポリペプチドは、よく知られたタンパク質回収および精製法により、組み換え細胞培養から回収およびまたは精製することができる。前記方法論は硫酸アンモニウムあるいはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンあるいは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含み得る。タンパク質再生方法は、成熟タンパク質の構造の完成のために必要な場合に用いることができる。この見地において、シャペロンは前記再生方法において用いられ得る。最終的に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は最終精製方法に用いることができる。
【００７７】
本発明において免疫原として有益なポリペプチドは、自然精製産物あるいは化学合成方法の産物または組み換え技術により原核生物あるいは真核生物宿主（例えば細菌、酵母菌、高等植物、昆虫および哺乳類の培養細胞）から産生されたものであり得る。組み換え産生方法に用いられた宿主に依存して、本発明のポリペプチドはグリコシル化されているかあるいはグリコシル化されていない。
【００７８】
アドへシンタンパク質と複合したペリプラズムシャペロンタンパク質の単離のための方法はこの分野において既知であり、例としてＪｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９０：８３９７−８４０１（１９９３）参照。さらに単独に発現したアドへシンタンパク質は、この分野においてよく知られた組み換え発現／単離法により単離され得る。前記単離の典型的な例は、タンパク質あるいはＨｉｓタグまたはタンパク質構造の一部として発現する分割可能なリーダーあるいは末端に対する抗体を利用し得る。
【００７９】
本発明のポリペプチドが単離あるいは精製された形状であり得ることは考慮される。
【００８０】
ポリペプチド（あるいはポリヌクレオチド）に関して、本発明の背景における“単離された”という用語は、物質が本来の環境（例えばここに開示されたポリペプチドを組み換えにより産生するために用いられる細胞）から移されることを意味する。前記ペプチドは組成物の一部であり、さらに単離された結果、前記ベクターあるいは組成物は自然環境の一部でなくなる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは好ましくは単離された状態で提供され、好ましくは均一な状態まで精製される。
【００８１】
本発明にしたがって開示された組み換えおよびまたは免疫原性ポリペプチドはまた“精製された”状態であり得る。“精製された”という用語は、完全な精製度を必要とせずむしろ相対的な意味として意図され、高度に精製された調製あるいは部分的にのみ精製された調製を含むことができ、これらの用語は関連分野における通常の知識を有する者により理解される。例えば、ｃＤＮＡライブラリーから単離された個々のクローン由来のポリペプチドは慣習的に電気泳動的に同質になるまで精製される。最初の材料あるいは自然の材料の、最低精製度の次数１、好ましくは次数２あるいは３、より好ましくは次数４あるいは５の精製は明確に考慮される。その上、重量あたり、好ましくは０．００１％あるいは最低０．０１％または０．１％そしてさらに望ましくは１％あるいはそれ以上の精製度を持つ主張したポリペプチドは明確に考慮される。
【００８２】
本発明のポリペプチドの組み換え精製の目的のために、“発現産物”という用語は、遺伝子の自然の翻訳産物であるポリペプチドあるいはタンパク質および遺伝暗号縮重の結果として同等のものをコード化し、その結果同一アミノ酸をコード化する任意の核酸配列を意味する。
【００８３】
本発明のワクチン組成物の形成において有益なＦｉｍＣＨポリペプチドは、種々のクローニングシステムを用いて適切にクローン化され得る。ここに開示された任意のＦｉｍＨ配列（参照図２）を組み込み得るＦｉｍＣＨ分子の合成のための有益なクローニングシステムの一つの例は、実施例２に示され、クローニングシステムに基づくプラスミドを利用する。ここに示されたＦｉｍＣＨ複合体は、１：１の等モル割合の二つのタンパク質：ＦｉｍＣ（２２．８ｋＤａ）およびＦｉｍＨ（２９．１ｋＤａ）より成る５２ｋＤａの複合体より成る。ＦｉｍＣＨ複合体は、ＦｉｍＣおよびＦｉｍＨ遺伝子の発現をそれぞれ促進する二つの別個のＬａｃ誘導可能プロモーターを伴うｐＵＣを基礎とするベクター（ｐＧＣＡ１３９−１−１）から発現する。ｐＧＣＡ１３９−１−１ベクター中のＦｉｍＣおよびＦｉｍＨ遺伝子は尿病原体大腸菌単離Ｊ９６から得られた。
【００８４】
ＦｉｍＣＨ複合体は大腸菌株ＢＬ２１のペリプラズム中で産生され、標準クロマトグラフィー法によりペリプラズム抽出物から精製される。ＦｉｍＣＨタンパク質は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）およびクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）加えて０．２ＭのＮａＣｌを含む、その溶解度に適合する多数の異なる緩衝液において形成される。このクエン酸ナトリウム／ナトリウム処方はＦｉｍＣＨ複合体の安定性を増強し、また通常用いられる希釈剤と適合する。
【００８５】
プラスミドｐＣＧＡ１３９−１−１は、ここに開示されたワクチン組成物に用いるための比較的多量の大腸菌シャペロン−アドヘシン複合体、ＦｉｍＣＨを産生する手段として構成された。前記ワクチンは、尿路の粘膜への大腸菌の付着を阻止し、それにより感染の原因となる定着を予防することにより作用する。
【００８６】
プラスミドベクターｐＣＧＡ１３９−１−１は以下の遺伝要素を含有する：（１）大腸菌ＦｉｍＣシャペロン遺伝子、続いて（２）ＦｉｍＨアドヘシン遺伝子、双方ともに大腸菌株Ｊ９６（尿路感染症（ＵＴＩ）単離）由来のものであり、それぞれの自然シグナル配列（ｎｓｓ）がそれぞれの前に置かれる；（３）カナマイシン耐性（ｋａｎｒあるいはｋｒ）マーカー；（４）導入されない場合にｌａｃプロモーターに結合するリプレッサータンパク質をコード化するｌａｃ１ｑ；（５）不活化ベータラクタマーゼ（ｂｌａ）遺伝子；（６）ｐＵＣ複製起点（ｏｒｉ）；および（７）２つのｌａｃプロモーター、一つはｆｉｍＣシグナルの前に置かれ、他方はｆｉｍＨの前に置かれる。
【００８７】
ポリペプチド、その断片あるいはその他の誘導体またはその類似体、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を産生するための免疫原として用いることができる。これらの抗体は、例えばポリクローナルあるいはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまたキメラ、単鎖およびヒト化抗体、同様にＦａｂ断片あるいはＦａｂ発現ライブラリーの産物を含む。この分野において既知である種々の方法は、前記抗体および断片の産生のために用いられ得る。
【００８８】
本発明の配列に対応する種々のＦｉｍＨポリペプチドに対して生成された抗体は、動物中へのポリペプチドの直接注入あるいは動物、好ましくは非ヒトへのポリペプチドの投与により得ることができる。得られた抗体はその後ポリペプチドに結合する。この様式において、ポリペプチドの断片のみをコード化する配列であっても、自然のポリペプチド全体に結合する抗体を生成するために用いることができる。
【００８９】
モノクローナル抗体の調製のために、連続継代細胞系培養により産生される抗体を提供する任意の技術を用いることができる。例は、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５））、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　４：７２（１９８３））およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ，ｅｔ　ａｌ．（１９８５）ｉｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）を含む。
【００９０】
単鎖抗体の産生について開示された技術（合衆国特許番号４９４６７７８）は、この発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体の産生に適応させることができる。また形質転換マウスは、この発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化抗体を発現させるために用いられ得る。
【００９１】
前記開示および以下に続く例の理解を容易にするために、特定の高頻度に登場する方法およびまたは用語が開示される。
【００９２】
“プラスミド”は、大文字およびまたは数字が前に置かれおよびまたは後に続く小文字ｐにより表される。ここでの最初のプラスミドは市販され制限なく公然と利用可能であり、あるいは公表された方法にしたがって利用可能なプラスミドから構成することができる。加えて、開示されたものに相当するプラスミドはこの分野において知られており、通常の知識を有する者に明らかである。
【００９３】
本発明の方法の実施において、特定の緩衝液、培地、試薬、細胞、培養条件その他同種のものについての指示は限定することを意図するものではなく、この分野における通常の知識を有する者が、議論が提示される特定の背景において関連しあるいは有益であると認める全ての関連材料を含むように読み取るように意図するものであることはもちろん理解されるべきである。例えば、一つの緩衝液システムあるいは培養培地を別のものに置換し、同一でなくとも同様の結果を得ることができる。この分野における通常の知識を有する者は、過度の実施例がなくとも、前記置換がここに開示された方法の使用におけるその目的に最適に働くようにすることを可能にするための前記システムおよび方法論の十分な知識を持つ。
【００９４】
本発明はここでさらに以下の限定されない例として開示される。これらの例の開示の適用において、本発明にしたがって開示された方法のその他の異なる実施例はもちろん関連分野における通常の知識を有する者に示されることは明確に留意すべきである。
【００９５】
【発明の実施の形態】
（実施例１）
本発明のＦｉｍＨ変異体を用いた受動免疫は以下のように示された。ＦｉｍＣおよびＦｉｍＣＨ複合体に対する抗血清（ＦｉｍＨの起源としての株Ｊ９６（配列番号：４４）およびＦｉｍＣの起源としての株ＮＵ１４）は、２つの異なるプールとして生成され、これらの実験に用いられた。マウスは、抗Ｃあるいは抗ＦｉｍＣＨウサギ血清の各１００μｌで、摂取前に２４時間および４時間腹腔内に受動免疫された。ウサギ血清に対する終点力価は、それぞれの抗原に対してＥＬＩＳＡにより最低１：５０００００となるように測定された。
【００９６】
それぞれの株の細菌はその後回収され、洗浄されリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁され、細胞濃度はＯＤ＝１．８（ａｔ６００ｎｍ）に調整された。この懸濁液はその後ＰＢＳで１：１０に希釈され、モルモット赤血球を用いて血球凝集反応（ＨＡ）について試験された。この最終懸濁液は摂取材料として用いられ、生存率はＴＳＡプレート上で測定された。マウスは麻酔され、その後約３×１０７ｃｆｕ（コロニー形成単位）を含む大腸菌懸濁液の５０μｌを尿道内に摂取した。摂取後２日目マウスは犠牲にされ、膀胱は摘出され１％マンノースを添加した５００μｌＰＢＳ中に回収された。膀胱あたりのＣＦＵの数値は、組織テスターで膀胱をすりつぶし、その後ＴＳＡプレート上で懸濁液を希釈し、平板培養することにより測定された。膀胱あたりのコロニー形成単位の平均値は測定され、データは（表２に示されたように）ｌｏｇＣＦＵ／膀胱に変換された。
【００９７】
【表１】
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【００９８】
【表２】
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【００９９】
（実施例２）
ＦｉｍＣＨ産生のためのプラスミドベクターの構成
ＦｉｍＣＨの産生のためのプラスミドベクター、ｐＣＧＡ１３９−１−１は、複数の段階で構成される。この例はＪ９６由来のＦｉｍＨおよびＦｉｍＣの使用に向けられるが、この例はまた本発明のＦｉｍＨ変異体にも適用される。
【０１００】
ｐＣＧＡ１０１−８の構成
ゲノムＤＮＡは大腸菌株Ｊ９６から調製される。１．０ｍｌの一晩の培養から得られたペレットはＰＢＳで洗浄され、５００μｌ滅菌スクロースＴｒｉｓＥＤＴＡ（０．３モーラースクロース：１００ミリモーラーＴｒｉｓ、ｐＨ８．０：５０ミリモーラーＥＤＴＡ）中に再懸濁され、０．０１μｇリゾチームが添加された。懸濁液は３７℃で１０分間インキュベートされ、ＳＤＳが最終濃度の０．５％まで添加された。混合液はその後３７℃で１０分間、ＲＮａｓｅで処置された。その後ＤＮＡは、水飽和フェノール、続く２４：１割合ｖ／ｖのクロロフォルム：イソアミルアルコールの混合およびエタノール沈殿により抽出された。その結果生じたペレットは７０％エチルアルコールで洗浄、乾燥され、１０．０ｍＭ　Ｔｒｉｓおよび０．１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む溶液中に再懸濁された。このＤＮＡはｆｉｍＣ遺伝子のＰＣＲ増幅のための鋳型として用いられた。
【０１０１】
ＰＣＲは、それぞれＮｃｏｌおよびＢｇｌＩＩ制限酵素認識部位を含む、プライマーｇａ１Ｆおよびｇａ２Ｒ（それぞれ配列番号：５６および５７）を用いて行われた。用いられた条件は：９５℃で１．０分間の１サイクル；９５℃で３０秒間の鎖の分離、５０℃で３０秒間のアニーリングおよび７２℃で２．０分間の鎖伸長から成る増幅の２５サイクルであった。この後、全末端の完全な伸長を確実にするための７２℃で１０分間の１サイクルが続いた。ＰＣＲ産物はＱｉａｇｅｎカラムを通して精製され、遺伝子はベクターｐＰＷ１９Ｒ（構造は以下に示された）中、プラスミド上のＰｅｌＢリーダー配列に対して３′にクローン化された。その結果がプラスミドｐＣＧＡ１０１−８であった（図３に示される）。
【０１０２】
ｐＣＧＡ１２２−３０の構成
カナマイシン耐性遺伝子は、ｐＥＴ２６ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）からＡｌｗＮｌ／Ｓｔｙｌ断片として摘出され、ｐＴＴＱ１８Ｋを産生するｌａｃ１ｑのｐＴＴＱ１８の５′中の固有のＤｒａｌｌ部位中にクローン化された。このプラスミドはｌａｃ１ｑおよびｋａｎｒ遺伝子を縦列に含有するため、単一カセットとしてクローン化することができる（図４参照）。
【０１０３】
ＦｉｍＨの最適の収率を得るための試みにおいて、その自然のシグナルはＰｅｌＢリーダー配列を置換するために用いられた。重複ＰＣＲを利用した方法が用いられた。プライマリーＰＣＲ分節は、（１）ｆｉｍＨ遺伝子およびプライマーｇａ１３Ｆおよびｇａ６Ｒ（それぞれ配列番号：５８および５９）を伴うゲノムＪ９６ＤＮＡ由来のその自然のシグナルおよび（２）プライマーｇａ１１Ｆおよびｇａ９Ｒ（それぞれ配列番号：６０および６１）を伴うｐＰＷ１９Ｒ由来のｌａｃプロモーター／オペレーター（ｌａｃ　ｐ／ｏ）であった。重複ＰＣＲの結果、それぞれＢｇｌＩＩおよびＳａｌｌ部位を含有するｇａ１１Ｆおよびｇａ６Ｒの提供された単鎖断片となった。
【０１０４】
ベクターｐＣＧＡ１２２−３０は、（１）ｌａｃ　ｐ／ｏ、ｆｉｍＨ自然シグナル配列、加えてｆｉｍＨより成るＢｇｌＩＩ／Ｓａｌｌ　ＰＣＲ断片；（２）ベータラクタマ−ゼ遺伝子、ｐＵＣｏｒｉ、ｌａｃ　ｐ／ｏ、ｐｅｌＢリーダーおよびｆｉｍＣを含有するｐＣＧＡ１０１−８由来のＢｇｌＩＩ／Ｓｃａｌ断片および（３）Ｓａｌｌ／Ｓｃａｌ断片としてのｐＴＴＱ１８Ｋ由来のｌａｃｑおよびｋａｎｒを含有するカセットの連結反応により作成された。
【０１０５】
ｐＧＡ１３９−１の構成および最終クローンの選択
ｆｉｍＣに対するＰｅｌＢシグナル５′はｆｉｍＣ自然シグナルに置換された。ｆｉｍＣ自然シグナル置換のためのプライマリー断片は（１）プライマーｇａ２４Ｆおよびｇａ２３Ｒを伴うゲノムＪ９６ＤＮＡおよび（２）前述のプライマーを伴うｐＰＷ１９Ｒ由来のｌａｃ　ｐ／ｏから得られた。ＦｉｍＣおよびその自然シグナルは、それぞれＡｆｌＩＩＩおよびＢｇｌＩＩ部位を含有するプライマーｇａ２４Ｆおよびｇａ２Ｒを伴う一つのカセットとして得られた重複ＰＣＲの結果であった。産物は、ｐＣＧＡ１２６−１を産生するｐＣＧＡ１２２−３０へＡｆｌＩＩＩ／ＥｃｏＲＩを置換してクローン化された（図５および配列番号：４６参照）。
【０１０６】
ベータラクタマーゼ（ｂｌａ）遺伝子は、Ｓｃａｌ部位への中断により不活化された。これに続いてエクソヌクレアーゼ（Ｂａｌ３１）および続くデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）の充填処理がなされた。プラスミドは最終的に約６０塩基の欠失の結果再結合され、その結果プラスミドｐＣＧＡ１３９−１が形成された（図５および６参照）。
【０１０７】
ｐＣＧＡ１２６−１はその全体の配列が読み取られ、Ｓｃａｌ部位での欠失（それによりｐＣＧＡ１３９−１プラスミドが生じる）は配列読み取りにより確認された。
【０１０８】
プラスミドｐＣＧＡ１３９−１は、タンパク質発現を最適にするためにＢＬ２１大腸菌宿主株中に転換された。２０マイクロリットルのＢＬ２１コンピテント細胞はピペットで採られ、前冷却１．５ｍｌポリプロピレンチューブ中に入れられた。１マイクロリットルのベクターは添加され、混合液は氷上で５分間インキュベートされた。細胞は４２℃の水槽中で正確に３０秒間熱ショックを受け、続いて氷上で２分間インキュベートされた。ＳＯＣ培地（８０μｌ）が添加され、続いて３７℃で１時間、２５０ｒｐｍで振動されインキュベートされた。培養液は５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する２ＸＹＴ寒天上に播種され、プレートは３７℃で一晩インキュベートされた。最適な培地およびＳＯＣ液の製法は、細胞培養に関する標準参考書に見ることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ（１９８９），ｓｕｐｒａ，ａｔ　ｂｏｏｋ３，ａｐｐｅｎｄｉｘ　ｐａｇｅ　Ａ．２．）。
【０１０９】
プラスミド調製および凍結１５−２０％グリセロールストックは最適な培養液中で一晩増殖した個々のコロニーから作成された。Ｓｃａｌ部位の欠如および５０μｇ／ｍｌアンピシリンに対する感受性の両方により、候補が選択された。プラスミドはさらに標的タンパク質の産生について分析された。ｐＣＧＡ１３９−１は、５０μｇ／ｍｌカナマイシン含有２ＸＹＴ寒天上への播種によりクローン化された。６つのクローンはその制限傾向、ウェスタンブロット分析およびＦｉｍＣＨタンパク質の産生にしたがって分析された。単一コロニーは、溶液中で一晩増殖させ、Ｎｕｎｃバイアル中の１５％−２０％無菌グリセロール中に−７０℃の温度で保存された。
【０１１０】
一晩経った培養液は５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する最適な溶液中で１：３０に希釈され、中間対数段階（ＯＤ６００で約０．３）まで３７℃で増殖させた。各培養液の１５ｍｌは２．０ｍＭ　ＩＰＴＧで誘導され３時間後回収された。各サンプルの複数の１ｍｌの部分サンプルはエッペンドルフ遠心分離機で、２分間、１４０００ｒｐｍで沈殿された。全タンパク質はＢＣＡ分析により測定され、非誘導および誘導培養の全タンパク質の１μｇは、既知の濃度のＦｉｍＣＨスタンダードに対する電気泳動のために２つのポリアクリルアミドゲルに装填された。ＦｉｍＣおよびＦｉｍＨは別個のゲル／膜上で分析された。サンプルはまた、ＦｉｍＣＨタンパク質の水準についてイオン交換クロマトグラフィーを通して分析された。
【０１１１】
タンパク質はウェスタンブロットによりニトロセルロース膜に移され、２％粉ミルクでブロックされ、ＦｉｍＣあるいはＦｉｍＨ−Ｔ３に対するプライマリーポリクローナル抗体で処理された。膜は、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を加えたＰＢＳで３回（各洗浄１５分間）洗浄され、その後ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合するロバ抗ウサギ二次抗体が１時間適用された。膜は前述のように洗浄され、続いて抗ＨＲＰ検出試薬、ＥＣＬあるいはＥＣＬ−ｐｌｕｓで処理された。ニトロセルロースは最終的にｘ線フィルムに感光され、Ｍ３５−Ａ　ｘ−ｏｍａｔｉｃプロセッサーで現像された。
【０１１２】
ＦｉｍＣＨ産物のイオン交換クロマトグラフィーのために、すべてのサンプルは２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁され、１２分間超音波分解され、ＰＢＳで４倍に希釈された。各サンプルは１００００ｒｐｍで３分間、０．４５ミクロンスピンフィルターユニット中に遠心分離され、分析のためにＨＰＬＣマイクロバイアル中に移された。Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｍｏｎｏ−Ｓ　ＨＲ５／５カラム（５ｍｍ×５０ｍｍ）は、分析サンプル中のピリ繊毛タンパク質の定量化のために用いられた。移動相Ａは２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）；移動相Ｂは０．５Ｍ塩化カリウムを含有する移動相Ａであった。Ｂの０％−３０％の勾配のＡは、２０分間１．２５ｍｌ／ｍｉｎの流速で流された。抽出されたタンパク質は内因性トリプトファン蛍光検出（励起２８０ｎｍ、発光３３５ｎｍ）を用いて検出された。標準曲線は、５．２μｇ／ｍｌから１５．６μｇ／ｍｌの濃度に希釈された参照標準材料を用いて作成された。校正曲線の相関係数は≧Ｏ．９９５であった。ＦｉｍＣＨの濃度は、回帰分析を用いて産生の頂点下の領域の標準曲線から測定された。
【０１１３】
ベクターｐＰＷ１９Ｒの構成
このベクターは、Ｎｏｔ１−Ｎｃｏ１断片としてｐＰＷ１４Ｒから得られた遺伝子間領域を、追加のｌａｃＰ／Ｏ、ＲＢＳおよびＰｅｌＢリーダーを与えるｐＰＷ１９中に挿入することにより構成された。ｐＰＷ１９はベクターｐＰＷ１６の修飾であり、ｃ−ｍｙｃエピトープのコード化配列をＮｏｔ１−Ｓａｌ１リンカーとしてのｐＰＷ８中にクローニングすることにより作成された。
【０１１４】
ｐＰＷ８はｐＰＷ６の修飾であり、ｐＰＷ４の誘導体であり、後者はＮｏｔ１部位、４Ｄ４エピトープ配列および終結コドンを含有する６０ｂｐの合成リンカーのＢａｍＨ１−Ｓａｌ１断片としてのｐＰＷ２中への挿入により作成される。
【０１１５】
ｐＰＷ２は、全長遺伝子３（ｐＳＰＬＩＩＩ（ＪＡＳ）由来）をｐＰＷ１中にクローニングすることにより作成された。後者はＰｅｌＢリーダー配列（大腸菌中へのペクチン溶解物のペリプラズム挿入に向けられるアミノ末端配列）をベクターｐＵＣ１１８中にクローニングすることにより調製された。
【０１１６】
【表３】
2004502447.tif 000004
【０１１７】
ＦｉｍＣＨのクローニングに用いられた構造に対応するヌクレオチド配列は以下の通りであった：配列番号：４７はＪ９６ＦｉｍＣ加えてシグナル配列を示し、配列番号：４８はＪ９６ＦｉｍＨを示し、配列番号：４９はカナマイシン耐性遺伝子に対する配列を示し、配列番号：５０はｌａｃ１Ｑに対する配列を示し、配列番号：５１は（残基２８５−３３５に及ぶ例２に示された欠失を伴う）ベータラクタマーゼの配列を示し、配列番号：５２は複製起点の配列を示し、配列番号：５３はＬａｃ　ｐ／ｏの配列を示す（ここで２つのプロモーター配列は、プラスミドの（１）残基１００から２１５および（２）残基９９０から１１０５（配列番号：４６）に見られる）。
【０１１８】
したがって本発明はまた、図３から６のプラスミドより成るベクターを用いた組み換え細胞からポリペプチドを調製する新しい方法に関する。特異的な実施例において、ポリペプチドは図２のアミノ酸配列より成る。一つの実施例においてこのプロセスおよびプラスミドは、ＦｉｍＨ等の細菌アドへシンに結合したＦｉｍＣ等の細菌シャペロン、あるいは任意の共通配列を含む図２に示された任意のポリペプチドより成るポリペプチドを調製するために用いることができる。本発明の方法に基づくプラスミドは、任意のポリペプチドを調製するために用いることができるが、特にここに示されたアドへシンタンパク質のシャペロン複合体の調製に用いられる。したがって、例えば大量のＦｉｍＣＨ、ペリプラズム細菌シャペロンの複合体、ＦｉｍＣおよび細菌アドヘシン、ＦｉｍＨはここに開示されたプロセスを用いて容易に調製される。
【０１１９】
上記技術を踏まえて本発明の多様な修飾および改良が可能である。したがって付記された主張の範囲内において、本発明は特異的に示された以外のやり方で実施され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１（ａ）】大腸菌から得られ、本発明にしたがって開示された一群のＦｉｍＨポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を示す図。配列は図１（ａ）から図１（ｊ）まで続く。
【図１（ｂ）】図１（ａ）と同じ。
【図１（ｃ）】図１（ａ）と同じ。
【図１（ｄ）】図１（ａ）と同じ。
【図１（ｅ）】図１（ａ）と同じ。
【図１（ｆ）】図１（ａ）と同じ。
【図１（ｇ）】図１（ａ）と同じ。
【図１（ｈ）】図１（ａ）と同じ。
【図１（ｉ）】図１（ａ）と同じ。
【図１（ｊ）】図１（ａ）と同じ。
【図２（ａ）】左に記載された特定の株の、種々の大腸菌株の一群のＦｉｍＨタンパク質に対するアミノ酸配列および配列変異体を示す図。配列は図２（ａ）から図２（ｃ）まで続く。共通配列は下端に示される。Ｊ９６のＦｉｍＨに対する配列は本分野において既知である。
【図２（ｂ）】図２（ａ）と同じ。
【図２（ｃ）】図２（ａ）と同じ。
【図３】ｐＣＧＡ１０１−８として示されたベクターの構成を示す図。
【図４】ｐＣＧＡ１２２−３０として示されたベクターの構成を示す図。
【図５】最終クローンｐＣＧＡ１３９−１−１の選択の段階を示す図。
【図６】ｐＣＧＡ１３９−１−１として示されたベクターの遺伝子の配列を示す図。
【図１（ａ）】
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【図１（ｂ）】
2004502447.tif 000006
【図１（ｃ）】
2004502447.tif 000007
【図１（ｄ）】
2004502447.tif 000008
【図１（ｅ）】
2004502447.tif 000009
【図１（ｆ）】
2004502447.tif 000010
【図１（ｇ）】
2004502447.tif 000011
【図１（ｈ）】
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【図１（ｉ）】
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【図１（ｊ）】
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【図２（ａ）】
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【図２（ｂ）】
2004502447.tif 000016
【図２（ｃ）】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2004502447.tif 000020
【図６】
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【国際公開パンフレット】
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2004502447.tif 000122
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004502447.tif 000123
【国際調査報告】
2004502447.tif 000124
2004502447.tif 000125
2004502447.tif 000126