(57)【要約】本発明は、内耳感覚有毛細胞及び内耳支持細胞を含む内耳細胞の形成を刺激する方法に関する。本発明の該方法は、内耳細胞を損傷及び／又は死滅させて、新しい内耳細胞の形成を刺激する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
内耳支持細胞からの内耳感覚有毛細胞の形成を刺激する方法であって、損傷される第一の内耳感覚有毛細胞と接触している支持細胞からの一以上の新規内耳感覚有毛細胞の形成を促進する条件下で、第一の内耳感覚有毛細胞を損傷させることを備えた方法。
【請求項２】
前記支持細胞が、ヘンゼン細胞、ダイテルス細胞、内柱細胞、境界細胞、外柱細胞からなる群から選択される請求項１の方法。
【請求項３】
前記第一の感覚有毛細胞が、有効量の化学物質と接触させることによって損傷される請求項１の方法。
【請求項４】
前記化学物質が抗生物質である請求項３の方法。
【請求項５】
前記抗生物質がアミノグリコシドである請求項４の方法。
【請求項６】
前記抗生物質が、インビトロにおいて約０．０１ｍＭ乃至約１０ｍＭの濃度で使用される請求項４の方法。
【請求項７】
前記抗生物質が、インビボにおいて約１００ｍｇ／ｋｇ／ｄ乃至約１０００ｍｇ／ｋｇ／ｄの濃度で使用される請求項４の方法。
【請求項８】
前記化学物質が、シスプラチン、カルボプラチン、およびメトトレキサートからなる群から選択され、インビトロにおいて約０．０１ｍＭ乃至約０．１ｍＭの範囲の濃度で、又はインビボにおいて約５ｍｇ／ｋｇ／ｄ乃至約１０ｍｇ／ｋｇ／ｄの範囲の濃度で使用される請求項３の方法。
【請求項９】
前記化学物質が、ポリ−Ｌ−リジン及び塩化マグネシウムからなる群から選択され、前記ポリ−Ｌ−リジンはインビトロにおいて約０．１ｍＭ乃至約１．０ｍＭの範囲の濃度で使用され、前記塩化マグネシウムはインビトロにおいて約５ｍＭ乃至約１００ｍＭの範囲の濃度で使用される請求項３の方法。
【請求項１０】
前記化学物質が注射によって内耳に送達される請求項３の方法。
【請求項１１】
前記化学物質がカニューレを通じて内耳に送達される請求項３の方法。
【請求項１２】
損傷される前記第一の内耳感覚有毛細胞と接触している支持細胞からの前記一以上の新規内耳感覚有毛細胞の形成が、内耳感覚有毛細胞の形成を刺激し得る転写因子をコードする核酸分子及び内耳支持細胞中で活性な細胞周期阻害剤の阻害剤からなる群から選択される物質を前記内耳支持細胞内で発現させることによってさらに刺激される請求項１の方法。
【請求項１３】
前記一以上の新規内耳感覚有毛細胞の形成が、内耳感覚有毛細胞の形成を刺激し得る転写因子をコードする核酸分子を前記内耳支持細胞内で発現させることによってさらに刺激される請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記転写因子が、ＰＯＵ４Ｆ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＯＵ４Ｆ３、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、及びＢｒｎ３ｃからなる群から選択される請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記一以上の新規内耳感覚有毛細胞の形成が、内耳支持細胞中で活性な細胞周期阻害剤の阻害剤を前記内耳支持細胞内で発現させることによってさらに刺激される請求項１２の方法。
【請求項１６】
前記細胞周期阻害剤の阻害剤がアンチセンス核酸分子である請求項１５の方法。
【請求項１７】
前記アンチセンス核酸分子が、ストリンジェントな条件下で、ｐ５７Ｋｉｐ２、ｐ２７Ｋｉｐ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ１９Ｉｎｋ４ｄ、ｐ１８Ｉｎｋ４ｃ、ｐ１５Ｉｎｋ４ｂ、及びｐ１６Ｉｎｋ４ａからなる群から選択される細胞周期阻害剤をコードする核酸分子にハイブリダイズする請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記アンチセンス核酸分子が、５５℃での２×ＳＳＣを超えるハイブリダイゼーションストリンジェンシー下で、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、及び１８からなる群から選択される核酸配列を含む核酸分子にハイブリダイズする請求項１７の方法。
【請求項１９】
内耳の聴覚機能を改善させる方法であって、
（ａ）損傷される第一の内耳感覚有毛細胞に接触している支持細胞からの一以上の新規内耳感覚有毛細胞の形成を促進する条件下で、第一の内耳感覚有毛細胞を損傷させることと、
（ｂ）工程（ａ）に従って処置した内耳の聴覚機能の改善を測定することとを備える方法。
【請求項２０】
有効量の化学物質と接触させることによって前記第一の内耳感覚有毛細胞が損傷され、内耳感覚有毛細胞の形成を刺激し得る転写因子をコードする核酸分子及び内耳支持細胞中で活性な細胞周期阻害剤の阻害剤からなる群から選択される物質を前記内耳支持細胞内で発現させることによって一以上の新規内耳感覚有毛細胞の形成がさらに刺激される請求項１９の方法。
【請求項２１】
内耳支持細胞の形成を刺激する方法であって、一以上の新規内耳支持細胞の形成を促進する条件下で、第一の内耳支持細胞を損傷させることを備えた方法。
【請求項２２】
前記第一の内耳支持細胞が、ヘンゼン細胞、ダイテルス細胞、内柱細胞、境界細胞、外柱細胞からなる群から選択される請求項２１の方法。
【請求項２３】
有効量の化学物質と接触させることによって前記第一の内耳支持細胞が損傷される請求項２１の方法。
【請求項２４】
前記化学物質が抗生物質である請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記抗生物質がアミノグリコシドである請求項２４の方法。
【請求項２６】
前記抗生物質が、インビトロにおいて約０．０１ｍＭ乃至約１０ｍＭの濃度で使用される請求項２４の方法。
【請求項２７】
前記抗生物質が、インビボにおいて約１００ｍｇ／ｋｇ／ｄ乃至約１０００ｍｇ／ｋｇ／ｄの濃度で使用される請求項２４の方法。
【請求項２８】
前記化学物質が、シスプラチン、カルボプラチン、およびメトトレキサートからなる群から選択され、インビトロにおいて約０．０１ｍＭ乃至約０．１ｍＭの濃度で、又はインビボにおいて約５ｍｇ／ｋｇ／ｄ乃至約１０ｍｇ／ｋｇ／ｄの濃度で使用される請求項２３の方法。
【請求項２９】
前記化学物質がポリ−Ｌ−リジン及び塩化マグネシウムからなる群から選択され、前記ポリ−Ｌ−リジンはインビトロにおいて約０．１ｍＭ乃至約１．０ｍＭの濃度で使用され、前記塩化マグネシウムはインビトロにおいて約５ｍＭ乃至約１００ｍＭの範囲の濃度で使用される請求項２３の方法。
【請求項３０】
前記化学物質が注射によって内耳に送達される請求項２３の方法。
【請求項３１】
前記化学物質がカニューレを通じて内耳に送達される請求項２３の方法。
【請求項３２】
一以上の新規内耳支持細胞の前記形成が、内耳支持細胞の形成を刺激し得る転写因子をコードする核酸分子及び内耳支持細胞中で活性な細胞周期阻害剤の阻害剤からなる群から選択される物質を前記内耳支持細胞内で発現させることによってさらに刺激される請求項２１の方法。
【請求項３３】
一以上の新規内耳支持細胞の前記形成が、内耳支持細胞の形成を刺激し得る転写因子をコードする核酸分子を内耳支持細胞内で発現させることによってさらに刺激される請求項３２の方法。
【請求項３４】
前記転写因子が、ＰＯＵ４Ｆ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＯＵ４Ｆ３、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、及びＢｒｎ３ｃからなる群から選択される請求項３３の方法。
【請求項３５】
一以上の新規内耳支持細胞の前記形成が、内耳支持細胞中で活性な細胞周期阻害剤の阻害剤を内耳支持細胞内で発現させることによってさらに刺激される請求項３２の方法。
【請求項３６】
細胞周期阻害剤の前記阻害剤がアンチセンス核酸分子である請求項３５の方法。
【請求項３７】
前記アンチセンス核酸分子が、ストリンジェントな条件下で、ｐ５７Ｋｉｐ２、ｐ２７Ｋｉｐ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ１９Ｉｎｋ４ｄ、ｐ１８Ｉｎｋ４ｃ、ｐ１５Ｉｎｋ４ｂ、及びｐ１６Ｉｎｋ４ａからなる群から選択される細胞周期阻害剤をコードする核酸分子にハイブリダイズする請求項３６の方法。
【請求項３８】
前記アンチセンス核酸分子が、５５℃での２×ＳＳＣを超えるハイブリダイゼーションストリンジェンシー下で、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、及び１８からなる群から選択される核酸配列を含む核酸分子にハイブリダイズする請求項３７の方法。
【請求項３９】
内耳の聴覚機能を改善させる方法であって、
（ａ）一以上の新規内耳支持細胞の形成を促進する条件下で、第一の支持細胞を損傷させることと、
（ｂ）工程（ａ）に従って処置した内耳の聴覚機能の改善を測定することとを備えた方法。
【請求項４０】
有効量の聴器毒性物質と接触させることによって前記第一の内耳支持細胞が損傷され、内耳支持細胞の形成を刺激し得る転写因子をコードする核酸分子及び内耳支持細胞中で活性な細胞周期阻害剤の阻害剤からなる群から選択される物質を内耳支持細胞内で発現させることによって一以上の新規内耳支持細胞の形成がさらに刺激される請求項３９の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、内耳感覚有毛細胞及び内耳支持細胞を含む内耳細胞の形成を刺激する方法及び組成物に関する。
【０００２】
発明の背景
「神経性難聴（ｎｅｒｖｅ　ｄｅａｆｎｅｓｓ）」とも称される感覚神経性聴覚喪失（ＳＮＨＬ、ｓｅｎｓｏｒｉｎｅｕｒｏｎａｌ　ｈｅａｒｉｎｇ　ｌｏｓｓ）は、米国だけでも何千万人もの人々が冒されている重大なコミュニケーション障害である。音を検出する内耳感覚有毛細胞の喪失が、本疾患の主原因であると考えられている。内耳の解剖学的構造は当業者に周知である（例えば、Ｇｒａｙ’ｓ　Ａｎａｔｏｍｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９７７）、８５９−８６７ページを参照、参考文献として本明細書に援用される）。簡潔に述べれば、内耳には、音を感知する蝸牛（ｃｏｃｈｌｅａ）、角加速度を感知する半規管、及び直線加速度を感知する耳石器官（ｏｔｏｌｉｔｈｉｃ　ｏｒｇａｎｓ）という三つの感覚性部位が存在する。これらの各感覚部位では、一層以上の内耳支持細胞の上に特殊化した感覚有毛細胞が配列されている。支持細胞は、内耳内の感覚有毛細胞の基礎を成し、少なくとも一部ではこれを取り囲み、物理的に支持している。作動時には、前記感覚有毛細胞は音又は動作に応じて物理的に屈折し、それらの屈折が神経に伝達され、処理及び解釈のために神経のインパルスが脳に送られる。
【０００３】
哺乳動物では、内耳は、通常、損傷を受けた又は死滅した内耳感覚有毛細胞を再生することができない。このため、感覚有毛細胞の死滅又は変質に起因する聴覚障害は、永久的な聴覚障害に至るのが通常である。感覚神経性聴覚喪失は、加齢に相関した喪失（老年性難聴）、騒音への曝露、薬物への曝露（例えば、抗生物質及び抗癌治療剤）、感染症、遺伝的突然変異（症候群性及び非症候群性）、及び自己免疫疾患を含む多数の現象によって引き起こされ得る。
【０００４】
現在のところ、後天性感覚神経性聴覚喪失の治療には、外用聴覚補助具及び人工内耳（ｃｏｃｈｌｅａｒ　ｉｍｐｌａｎｔ）が使用されている。両装置ともに治療的な利用可能性は限られており、より重要なことには、聴覚の感覚性上皮の構造又は機能を回復させるという課題に応えるものではない。
【０００５】
内耳細胞の再生を刺激することができる転写因子をコードする核酸分子を内耳細胞に導入する工程を含んだ内耳細胞の再生を刺激する方法を開示している国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／２４８２９号には、感覚性内耳有毛細胞を再生するという課題に対するより最近のアプローチが開示されている。
【０００６】
本明細書に開示されているように、既存の内耳感覚有毛細胞を破壊することによって、本来は静的な内耳支持細胞（一以上の細胞周期阻害剤タンパク質の発現レベルが低下しているか、又は細胞周期タンパク質活性が低下している）が再び細胞周期に入って、内耳感覚有毛細胞を形成するように誘導することができる子孫細胞（ｐｒｏｇｅｎｙ　ｃｅｌｌ）の産生が促進されることを本発明者らは発見した。基礎を成している及び／又は周囲を取り囲んでいる内耳支持細胞を刺激して感覚有毛細胞へと発育させるには、既存の内耳感覚有毛細胞の破壊で足りる事例もある。支持細胞から感覚有毛細胞を効率的に再生させるには、本明細書に記載されているように、既存の内耳感覚有毛細胞の破壊に、少なくとも一つの他の刺激を組み合わせることが必要となる事例もある。さらに、本発明者らは、（内耳感覚有毛細胞の再生を刺激して、または刺激せずに）内耳支持細胞の増殖を刺激することによって、内耳の聴覚機能が改善することを発見した。
【０００７】
発明の要約
本発明は、内耳感覚有毛細胞（ｉｎｎｅｒ　ｅａｒ　ｓｅｎｓｏｒｙ　ｈａｉｒ　ｃｅｌｌ）及び内耳支持細胞（ｉｎｎｅｒ　ｅａｒ　ｓｕｐｐｏｒｔ　ｃｅｌｌ）を含む内耳細胞の形成を刺激する方法を提供する。本発明の該方法は、内耳細胞を損傷及び／又は死滅させることによって、新しい内耳細胞の形成が刺激されるという予測できない観察に基づいている。
【０００８】
ある側面において、本発明は、内耳支持細胞からの内耳感覚有毛細胞の形成を刺激する方法を提供する。本発明の該側面に係る方法は、損傷を受けた感覚有毛細胞と接触している一以上の支持細胞からの一以上の新規感覚有毛細胞の形成を促進する条件下で、一以上の内耳感覚有毛細胞を損傷させる工程（ａ）を含む。好ましくは、複数の内耳支持細胞から、複数の内耳感覚有毛細胞が形成される。本発明の該側面に係る方法は、必要に応じて、損傷を受けた内耳感覚有毛細胞と接触している内耳支持細胞からの一以上の内耳感覚有毛細胞の形成をさらに刺激する工程（ｂ）を含む。工程（ｂ）は、工程（ａ）の前、間、後に、又は工程（ａ）と重複して（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）行うことができる。ある実施態様では、前記損傷を受けた内耳感覚有毛細胞と接触している一以上の内耳支持細胞からの一以上の内耳感覚有毛細胞の形成を刺激する前記工程は、前記内耳支持細胞が細胞周期に入るように刺激した後、前記内耳支持細胞の子孫のうち少なくとも一部が分化して内耳感覚有毛細胞を形成するように刺激する工程を含む。
【０００９】
内耳感覚有毛細胞は、例えば、内耳感覚有毛細胞を損傷させるのに有効な抗生物質、好ましくはアミノグリコシド抗生物質などの一定量の聴器毒性物質（ｏｔｏｔｏｘｉｃ　ａｇｅｎｔ）と接触させることによって損傷させることができる。前記聴器毒性物質は、当業者に周知である任意の手段、例えば（針及び注射器などを用いた）注射（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）又はカニューレによって内耳の中に導入することができる。本発明の該側面のある実施態様では、内耳感覚有毛細胞は、死滅するように十分損傷させる。
【００１０】
本発明の幾つかの実施態様では、内耳感覚有毛細胞に対して加えられる損傷によって、前記損傷を受けた内耳感覚有毛細胞に接触している内耳支持細胞からの一以上の新規内耳感覚有毛細胞の形成が刺激される。しかしながら、別の実施態様では、内耳感覚有毛細胞に対して加えられる損傷は、単独では、前記損傷を受けた内耳感覚有毛細胞に接触している内耳支持細胞から一以上の新規内耳感覚細胞が形成されるのを効率的に刺激するには不十分である。このため、本発明の該側面に係る前記方法のある実施態様においては、内耳感覚有毛細胞を損傷させ、且つ内耳支持細胞から内耳感覚有毛細胞が形成されるように刺激し得る転写因子を（感覚有毛細胞を損傷させる工程の前、間、及び／又は後に）内耳支持細胞内で発現させることによって、内耳支持細胞からの内耳感覚有毛細胞の形成を刺激する。例えば、本発明のある実施態様では、転写因子の発現が可能な条件下で、内耳支持細胞から内耳感覚有毛細胞が形成されるように刺激し得る転写因子をコードする核酸分子を内耳支持細胞中に導入する。内耳支持細胞からの内耳感覚有毛細胞の形成を刺激し得る転写因子の代表的な例には、ＰＯＵ４Ｆ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＯＵ４Ｆ３、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、及びＢｒｎ３ｃが含まれる。
【００１１】
本発明の該側面に係る方法の別の実施態様では、内耳感覚有毛細胞を損傷させ、且つ内耳支持細胞中で活性な一以上の細胞周期阻害剤の発現を（感覚有毛細胞を損傷させる工程の前、間、及び／又は後に）阻害することによって、内耳支持細胞からの内耳感覚有毛細胞の形成を刺激する。細胞周期阻害剤の阻害剤は、細胞内で細胞周期阻害剤に対して直接又は間接に作用する物質（タンパク質等）であり得る。代表的な例として、内耳支持細胞中で活性な細胞周期阻害剤には、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、及びｐ５７Ｋｉｐ２を含むいわゆるＣＩＰ／ＫＩＰファミリーのサイクリン依存性キナーゼ阻害剤等のサイクリン依存性キナーゼ阻害剤が含まれる。例えば、ストリンジェントな条件下（２×ＳＳＣ、５５℃を上回るストリンジェンシーなど）で、内耳支持細胞の中で活性な細胞周期阻害剤をコードする（ｍＲＮＡ分子等の）核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を発現する発現ベクターを内耳支持細胞中に導入することによって、内耳支持細胞中で活性な細胞周期阻害剤の発現を阻害することができる。
【００１２】
さらに、内耳支持細胞からの内耳感覚有毛細胞の形成を刺激するためには、ＴＧＦ−α、インシュリン、及びＩＧＦ−１等の様々な組換え増殖因子を使用することができる。本発明を実施する際に、インビトロで使用される組換え増殖因子の代表的な有効濃度範囲は、１〜１０００ｎｇ／ｍｌである。より具体的には、ＴＧＦ−αは、１〜１００ｎｇ／ｍｌからの有効濃度で使用することが好ましい。インシュリンは、１００〜１０００ｎｇ／ｍｌからの有効濃度で使用することが好ましい。ＩＧＦ−１は、１０〜１０００ｎｇ／ｍｌからの有効濃度で使用することが好ましい。インビボで適用する場合には、インビボで前述の濃度を与えるのに十分な量の組換え増殖因子が投与されるであろう。
【００１３】
本発明の該側面に係る好ましい実施態様では、内耳支持細胞からの内耳感覚有毛細胞の形成は、処置を受けた内耳の聴覚機能に改善をもたらす。このように、ある側面では、本発明は、内耳の聴覚機能を改善させる方法であって、（ａ）損傷を受けた第一の内耳感覚有毛細胞に接触している支持細胞からの一以上の新規内耳感覚有毛細胞の形成を促進する条件下で、第一の内耳感覚有毛細胞を損傷させる工程と、（ｂ）工程（ａ）に従って処置した内耳の聴覚機能の改善を測定する工程とを備える方法を提供する。
【００１４】
別の側面では、本発明は、内耳支持細胞の形成を刺激する方法を提供する。本発明の該側面に係る方法は、（例えば、損傷を受けた内耳支持細胞と接触している内耳支持細胞の細胞分裂によって）新しい内耳支持細胞の形成を促進する条件下で内耳支持細胞を損傷させる工程を含む。本発明の該側面では、内耳支持細胞からの内耳感覚有毛細胞の形成を刺激する本発明の前記方法に関して本明細書に記載したものと同じ技術を用いて、前記内耳支持細胞を損傷させ、新しい内耳支持細胞の形成を刺激する。このため、例えば、内耳支持細胞を損傷させるのに有効な一定量の聴器毒性物質（アミノグリコシド系抗生物質など）と接触させることによって、内耳支持細胞を損傷させることができる。この場合にも、例として、内耳支持細胞を損傷させ、且つ内耳支持細胞の分裂を刺激して新しい内耳支持細胞を形成させ得る転写因子（ＰＯＵ４Ｆ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＯＵ４Ｆ３、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、及びＢｒｎ３ｃ等）を（内耳支持細胞を損傷させる前、間、及び／又は後に）内耳支持細胞内で発現させることによって、新しい内耳支持細胞の形成をさらに刺激することができる。本発明の該側面に係る好ましい実施態様では、内耳支持細胞の増殖は、前記処置を受けた内耳の聴覚機能を改善させる。
【００１５】
本発明の前記方法は、感覚有毛細胞及び支持細胞などの内耳細胞の形成を刺激するのに有用である。さらに、本発明の方法は、内耳細胞の死滅又は損傷によって引き起こされたヒト等の哺乳動物の聴覚障害（ｈｅａｒｉｎｇ　ｄｉｓｏｒｄｅｒ）の症状を改善させるのに有用である。さらに、本発明の前記方法は、内耳支持細胞からの内耳支持細胞の形成及び／又は内耳感覚有毛細胞の形成を刺激することができる遺伝子及び／又はタンパク質を同定するために使用することができる。
【００１６】
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明で使用する「ＳＳＣ」という略号は、核酸ハイブリダイゼーション溶液で用いられる緩衝液を指す。１リットルの２０×（２０倍濃縮）原液ＳＳＣ緩衝溶液（ｐＨ７．０）は、１７５．３ｇの塩化ナトリウムと８８．２ｇのクエン酸ナトリウムとを含有する。
【００１７】
本明細書で使用する「一以上の内耳感覚有毛細胞を損傷（ｄａｍａｇｉｎｇ）させる」若しくは「第一の内耳感覚有毛細胞を損傷させる」という用語、又はこれと文法的に等価な用語は、損傷を受けた細胞と実質的に同じ条件下で培養されているが、損傷を受けていない内耳感覚有毛細胞と比べて、損傷を受けた感覚有毛細胞の構造、生化学、及び／又は生理に有害な変化を加えること（損傷を受けた細胞を死滅させることを含む）を意味する。
【００１８】
本明細書で使用する「聴覚機能を改善させる」若しくは「聴覚機能の改善」、又はこれと文法的に等価な用語は、本発明の前記方法に従って内耳を処置することによって、音に対する内耳の感度を少なくとも１０％改善させること、又は本発明の処置を受ける前には音に対して完全に不能であった内耳の音に対する感度に測定可能な何らかの改善を与えることを意味する。処置を受けた内耳の音に対する感度は、当業者に知られた任意の手段（聴性脳幹反応等）によって測定され、本発明の処置を受けておらず、被処置内耳と実質的に同一の条件下で培養されている対照内耳の音に対する感度と比較される。
【００１９】
本明細書で核酸配列の比較又はアミノ酸配列の比較に対して用いられる場合、「配列の相同性」（「配列の同一性」とも称される）という用語は、対象配列と候補配列とを並列させ、最大のパーセント相同性（同一性）を得るために必要であればギャップを導入した後に得られる（配列相同性の一部として何らの保存的置換も考慮しない）、候補アミノ酸配列又は核酸配列の一部又は全部と同一である対象アミノ酸配列又は核酸配列中のアミノ酸残基又は核酸残基のパーセントを意味する。Ｎ又はＣ末端伸長及び挿入は何れも、相同性を低下させるものと解釈してはならない。必要であれば、最大のパーセント相同性（同一性）を得るために導入されたギャップの数又は長さには、重み付けを与えない。
【００２０】
ある側面において、本発明は、内耳支持細胞からの内耳感覚有毛細胞の形成を刺激する方法を提供する。本発明の該側面に係る前記方法は、損傷を受けた感覚有毛細胞と接触している一以上の支持細胞からの一以上の新規感覚有毛細胞の形成を促進する条件下で、一以上の内耳感覚有毛細胞を損傷させる工程（ａ）を含む。好ましくは、複数の内耳支持細胞から、複数の内耳感覚有毛細胞が形成される。本発明の該側面に係る方法は、必要に応じて、損傷を受けた内耳感覚有毛細胞と接触している内耳支持細胞からの一以上の内耳感覚有毛細胞の形成をさらに刺激する工程（ｂ）を含む。工程（ｂ）は、工程（ａ）の前、間、後に、又は工程（ａ）と重複して行うことができる。本発明の該側面に係る前記方法は、インビボ及びインビトロで使用することができる。
【００２１】
内耳の解剖学的構造は当業者に周知である（例えば、Ｇｒａｙ’ｓ　Ａｎａｔｏｍｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９７７）、８５９−８６７ページを参照、参考文献として本明細書に援用される）。特に、蝸牛は、音を感知するのに一次的に必要とされるコルチ器を含む。図１に示されているように、コルチ器１０は基底膜１２を含んでおり、基底膜１２の上には、境界細胞（ｂｏｒｄｅｒ　ｃｅｌｌ）１６、内柱細胞１８、外柱細胞２０、内指節細胞２２、ダイテルス細胞（Ｄｉｅｔｅｒ’ｓ　ｃｅｌｌ）２４、ヘンゼン細胞（Ｈｅｎｓｅｎ’ｓ　ｃｅｌｌ）２６を含む様々な支持細胞１４が存在している。支持細胞１４は、内有毛細胞２８と外有毛細胞３０とを支持する。内有毛細胞２８と外有毛細胞３０の上には、被蓋膜３２が配置されている。ある側面において、本発明は、基礎を成している支持細胞１４から感覚有毛細胞２８及び３０の再生を刺激するように適合される。別の側面では、本発明は、支持細胞１４の形成を刺激するように適合される。
【００２２】
本明細書に開示されているように、既存の内耳感覚有毛細胞を破壊することによって、本来は静的な内耳支持細胞が再び細胞周期に入って、内耳感覚有毛細胞を形成するように誘導することができる子孫細胞の産生が促進されることを本発明者らは観察した。基礎を成している及び／又は周囲を取り囲んでいる内耳支持細胞を刺激して感覚有毛細胞へと発育させるには、既存の内耳感覚有毛細胞の破壊で足りる事例もある。支持細胞からの感覚有毛細胞を効率的に再生させるには、本明細書に記載されているように、既存の内耳感覚有毛細胞の破壊に他の刺激を組み合わせることが必要となる事例もある。
【００２３】
本発明の一側面を実施する場合には、例えば、内耳感覚有毛細胞を損傷させるのに有効な一定量の聴器毒性物質と接触させることによって、内耳感覚有毛細胞を損傷させる。内耳感覚有毛細胞を損傷させるのに有用な聴器毒性物質の代表的な例には、アミノグリコシド系抗生物質（ネオマイシン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、カナマイシン、アミカシン、及びトブラマイシン等）が含まれる。本発明を実施する場合、前述のアミノグリコシド系抗生物質は、典型的には、インビトロでは約０．０１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲の有効濃度で使用され、インビボでは約１００〜約１，０００ｍｇ／ｋｇ体重／日（ｍｇ／ｋｇ／ｄ）の範囲の有効濃度で使用される。内耳感覚有毛細胞を損傷させるのに有用な別の化学物質の代表例には、以下の抗癌剤：シスプラチン、カルボプラチン、及びメトトレキサートが含まれ、典型的には、インビトロでは約０．０１ｍＭ〜０．１ｍＭの範囲の有効濃度で使用され、インビボでは約５〜約１０ｍｇ／ｋｇ／ｄの範囲の有効濃度で使用される。他の有用な化学物質には、インビトロで約０．１〜１．０ｍＭの範囲の有効濃度であるポリ−Ｌ−リジン、及びインビトロで約５〜１００ｍＭの範囲の有効濃度である塩化マグネシウムが含まれる。
【００２４】
一又は複数の聴器毒性物質は、当業者に知られた任意の手段によって（例えば、針及び注射器を用いた注射によって、又は蝸牛開口術（ｃｏｃｈｌｅｏｓｔｏｍｙ）によって内耳中に導入することができる。蝸牛開口術では、蝸牛を穿刺し、化学物質を蝸牛中に導入することができるカテーテルを挿入する。蝸牛開口術法は、例えば、Ｌａｌｗａｎｉ，Ａ．Ｋ．らの「Ｈｅａｒｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１１４：１３９−１４７（１９９７）」に開示されており、本文献は、参考文献として本明細書に援用される。
【００２５】
本発明の方法のある実施態様では、内耳感覚有毛細胞を損傷させ、且つ内耳支持細胞から内耳感覚有毛細胞が形成されるように刺激し得る転写因子を（内耳感覚有毛細胞を損傷させる前、間、及び／又は後に）少なくとも幾つかの内耳支持細胞内で発現させることによって、内耳支持細胞からの内耳感覚有毛細胞の形成を刺激する。例えば、ある実施態様では、転写因子の発現が可能な条件下で内耳感覚有毛細胞の形成を刺激し得る転写因子をコードする核酸分子を内耳支持細胞中に導入する。
【００２６】
本発明の該側面において有用な転写因子は、本発明の方法を実施する際に使用したときに、内耳支持細胞からの内耳感覚有毛細胞の再生を刺激する能力を有する。本発明の該側面において有用な転写因子の中には、内耳感覚有毛細胞の正常な発育及び／又は正常な機能に必要とされるものがある。
【００２７】
本発明の該側面において有用な転写因子の代表的な例には、ＰＯＵ４Ｆ１（Ｃｏｌｌｕｍ，　Ｒ．　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２０（１８）：４９１９−４９２５（１９９２））、ＰＯＵ４Ｆ２　（Ｘｉａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｅｕｒｏｎ　１１：６８９−７０１（１９９３））、ＰＯＵ４Ｆ３（Ｖａｈａｖａ，　Ｏ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７９（５３５８）　：１９５０−１９５４（１９９８）、Ｇｅｒｒｅｒｏ　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ．．　Ｓｃｉ．　（Ｕ．Ｓ．Ａ．）　９０（２２）：１０８４１−１０８４５　（１９９３），Ｘｉａｎｇ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ．．　Ｓｃｉ．　（Ｕ．Ｓ．Ａ．）　９３（２１）：１１９５０−１１９５５（１９９６），　Ｘｉａｎｇ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　１５（７Ｐａｒｔ　１）：４７６２−４７８５　（１９９５），　Ｅｒｋｍａｎ，Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　３８１（６５８３）：６０３−６０６（１９９６），　Ｘｉａｎｇ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　（Ｕ．Ｓ．Ａ．）　９４（１７）：９４４５−９４５０（１９９７）に開示されているＢｒｎ３ａ（Ｂｒｎ３．０としても知られる）、Ｂｒｎ３ｂ　（Ｂｒｎ３．２としても知られる）、及びＢｒｎ３ｃ（Ｂｒｎ３．１としても知られる）（これらの各文献は、参考文献として本明細書に援用される）。本発明の該側面において有用な転写因子の中には、少なくとも一つのホメオドメイン及び／又は少なくとも一つのＰＯＵ特異的なドメインを有し、約３３ｋＤａ〜約３７ｋＤａの範囲の分子量を有するものがある。
【００２８】
本明細書で使用する「ホメオドメイン」という用語は、配列番号１に記載されているホメオドメインアミノ酸配列と少なくとも５０％相同（少なくとも７５％相同、又は少なくとも９０％相同など）であるアミノ酸配列を意味する。
【００２９】
本明細書で使用する「ＰＯＵ特異的なドメイン」という用語は、配列番号２に記載されているＰＯＵ特異的ドメインアミノ酸配列と少なくとも５０％相同（少なくとも７５％相同、又は少なくとも９０％相同など）であるアミノ酸配列を意味する。
【００３０】
二つのタンパク質配列間又は二つの核酸配列間のパーセント相同性を決定するために使用することができるアルゴリズムの例は、Ｋａｒｌｉｎ　ａｎｄ　Ａｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９０：５８７３−５８７７（１９９３））で改変されたＫａｒｌｉｎ　ａｎｄ　Ａｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８７：２２６４−２２６８　（１９９０））のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＮＢＬＥＳＴ及びＸＢＬＥＳＴに組み込まれている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））。
【００３１】
本発明を実施する上で有用なさらに好ましい内耳細胞転写因子は、ＰＯＵ４Ｆ３転写因子相同体（以下、ＰＯＵ４Ｆ３相同体と称する）である。本発明を実施する上で有用なＰＯＵ４Ｆ３相同体は、支持細胞から内耳感覚有毛細胞の再生を刺激することができ、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有し、配列番号３の核酸分子によってコードされるＰＯＵ４Ｆ３転写因子と少なくとも２５％相同（少なくとも５０％相同、又は少なくとも７５％相同、又は少なくとも９０％相同等）である。本明細書で使用する「ＰＯＵ４Ｆ３相同体」という用語には、配列番号４に記載されているアミノ酸配列を有するＰＯＵ４Ｆ３タンパク質が含まれ、これは本発明を実施する上で最も好ましい内耳細胞転写因子である。本発明を実施する上で有用な他のＰＯＵ４Ｆ３相同体の代表例は、Ｘｉａｎｇ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　１５　（７）：　４７６２−４７８５　（１９９５）に記載されており、本文献は参考文献として本明細書に援用される。
【００３２】
本発明を実施する上で有用な転写因子をコードするさらに別の核酸分子は、当業者に公知の様々なクローニング技術を用いることによって単離することができる。例えば、クローニングされたＰＯＵ４Ｆ３相同体のｃＤＮＡ若しくは遺伝子、又はその断片は、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ），　Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｅ．　Ｆ．　Ｆｒｉｔｓｃｈ　ａｎｄ　Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｄｓ．，」の９．５２〜９．５５頁（引用した頁は、参考文献として本明細書に援用される）に記載されているようなニトロセルロースフィルター又はナイロン膜上に固定された核酸に放射線標識した核酸プローブをハイブリダイズさせる技術を用いたハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。ＰＯＵ４Ｆ３相同体をコードする更なる核酸分子を同定するのに好ましいハイブリダイゼーションプローブは、配列番号３に記載された核酸配列を有するｃＤＮＡ分子（又はその相補配列）の少なくとも１５ヌクレオチド長の断片であるが、配列番号３に記載された核酸配列を有する完全なｃＤＮＡ分子も、ＰＯＵ４Ｆ３相同体をコードする更なる核酸分子を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして有用である。本発明において、ＰＯＵ４Ｆ３相同体をコードする更なる核酸分子を同定するための最も好ましいハイブリダイゼーションプローブは、核酸配列５’−ＴＡＧ　ＡＡＧ　ＴＧＣ　ＡＧＧ　ＧＣＡ　ＣＧＣ　ＴＧＣ　ＴＣＡ　ＴＧＧ　ＴＡＴ　Ｇ−３’（配列番号５）を有するオリゴヌクレオチドである。
【００３３】
ＰＯＵ４Ｆ３相同体をコードする更なる核酸分子を（サザンブロッティングによって）同定するのに有用な高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション及び洗浄条件の例は、１ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡ、２０％ドデシル硫酸ナトリウムを含有する０．２５Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．２）中、６８℃でのハイブリダイゼーションであり、洗浄（３回洗浄、各洗浄は６５℃で２０分）は、１ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡ、１％ドデシル硫酸ナトリウムを含有する２０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．２）中で行われる。
【００３４】
ＰＯＵ４Ｆ３相同体をコードする更なる核酸分子を（サザンブロッティングによって）同定するのに有用な中度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション及び洗浄条件の例は、１ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡ、２０％ドデシル硫酸ナトリウムを含有する０．２５Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．２）中、４５℃でのハイブリダイゼーションであり、洗浄は、０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムを含有する５×ＳＳＣ中、５５℃〜６５℃で行われる。
【００３５】
この場合にも、例えば、本発明において有用な転写因子をコードする核酸分子は、Ｔｈｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　（Ｋ．　Ｂ．　Ｍｕｌｌｉｓ，　Ｆ．　Ｆｅｒｒｅ，　Ｒ．　Ａ．　Ｇｉｂｂｓ，　ｅｄｓ），　Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ　Ｂｏｓｔｏｎ　（１９９４）（参考文献として本明細書に援用される）に記載されているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単離することができる。このように、例えば、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて１ｓｔストランドＤＮＡの合成を開始させ、標的ＤＮＡ分子と相同であるｃＤＮＡ分子の５’非翻訳領域の一部に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて２ｎｄストランドｃＤＮＡの合成を開始させることができる。続くＰＣＲのラウンドは、前記２ｎｄストランドｃＤＮＡ合成プライマーと標的ＤＮＡ分子に相同なｃＤＮＡ分子の３’非翻訳領域の一部に対応するプライマーとを用いて開始させることができる。
【００３６】
非限定的な例として、本発明において有用な転写因子をコードする核酸分子を増幅するための代表的なＰＣＲ反応条件は以下のとおりである。（氷上の）チューブの中に以下の試薬を混合して、ＰＣＲ反応混合液、すなわちＤＮＡテンプレート（例えば、最大１μｇのゲノムＤＮＡ又は最大０．１μｇのｃＤＮＡ）、０．１〜０．３ｍＭ　ｄＮＴＰ、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（１０×ＰＣＲ緩衝液は５００ｍＭ　ＫＣｌ、１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３を含有する）、５０ｐｍｏｌの各ＰＣＲプライマー（ＰＣＲプライマーは、好ましくは２０ｂｐを超える長さ、及び１０２〜１０３の縮重度を有するべきである）、２．５ユニットのＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）、及び最終容量５０μｌの脱イオン水を得る。前記反応混合液を含有するチューブをサーモサイクラー中に置き、サーモサイクラーのプログラムを以下のように実行する。９４℃で２分変性させた後、９４℃３０秒、４７℃〜５５℃３０秒、及び７２℃３０秒〜２．５分を３０サイクル。
【００３７】
ＰＣＲプライマーは、公知の標的タンパク質配列の一部又は全部に見られる保存されたアミノ酸配列のモチーフに対して設計することが好ましいであろう。更なるＰＯＵ４Ｆ３相同体をクローニングするためのＰＣＲプライマーを設計する基礎となり得る保存されたアミノ酸配列モチーフの例は、配列番号２に記載されたアミノ酸配列を有するＰＯＵ特異的ドメイン、及び配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するホメオドメインである。
【００３８】
さらに、本発明を実施する上で有用な転写因子をコードする更なる核酸分子は、例えば、転写因子タンパク質を認識する抗体を用いることによって単離することもできる。モノクローナル及びポリクローナル抗体を調製する方法は当業者に周知であり、例えば、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｅ．　Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｄ．　Ｌａｎｅ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８８）」の第５及び第６章（引用した章は、参考文献として本明細書に援用される）に記載されている。非限定的な例として、「Ｘｉａｎｇ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　１５（７）：４７６２−４７８５　（１９９５）　ａｎｄ　Ｘｉａｎｇ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）　９４：９４４５−９４５０　（１９９７）」（本文献は、参考文献として本明細書に組み込まれる）に記載されているように、Ｂｒｎ３のＣ末端から構築された融合タンパク質に対する抗体が首尾よく産生された。
【００３９】
本発明を実施する上で有用な転写因子をコードする核酸分子は、例えば、発現ライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。非限定的な例として、ＰＯＵ４Ｆ３相同体タンパク質をコードする一以上のクローンを同定するために、抗ＰＯＵ４Ｆ３相同体抗体を用いて、ｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることができる。ＤＮＡ発現ライブラリー技術は、当業者に周知である。ｃＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニングは、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．，　Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｅ．　Ｆ．　ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．　（１９８９）　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　２ｎｄ　ｅｄ．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＮＹ」の１２章（本文献の引用した章は、参考文献として本明細書に援用される。）に完全に論述されている。
【００４０】
代表的な例として、発現ライブラリーをスクリーニングするための抗体を生じさせるのに有用な抗原は、以下のように調製することができる。Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）等のプラスミドベクター中に、ＰＯＵ４Ｆ３相同体等の転写因子をコードする完全長のｃＤＮＡ（又は完全長ではないが、全てのコード領域を含んでいるｃＤＮＡ分子）をクローニングすることができる。続いて、Ｅ．Ｃｏｌｉ株（Ｅ．Ｃｏｌｉ　ＸＬ１−Ｂｌｕｅ等、同じくＳｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．から入手可能）中に前記組換えベクターを導入し、前記ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質をＥ．Ｃｏｌｉ中で発現させ、次いで精製する。例えば、目的のｃＤＮＡ分子を含むＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターを有するＥ．Ｃｏｌｉ　ＸＬ１−Ｂｌｕｅは、１００μｇのアンピシリン／ｍｌを含有するＬＢ培地中、３７℃で一晩増殖させ得る。アンピシリンを含有する５ｍｌの新鮮なＬＢ培地を接種するために、一晩培養したものから５０μｌ分取して使用することができ、１ｍＭ　ＩＰＴＧで誘導する前に、激しく攪拌しながらＡ６００＝０．５になるまで培養物を３７℃で増殖させる。さらに２時間増殖させた後、懸濁物を遠心し（１０００×ｇ、１５分、４℃）、培地を除去して、好ましくは１ｍＭのＥＤＴＡと一以上のプロテイナーゼ阻害剤とを含有する１ｍｌの冷たい緩衝液中に、沈降した細胞を再懸濁させる。該細胞は、微小プローブを用いた音波処理によって破壊させることができる。冷却した音波処理物を遠心によって清澄にし、当業者に知られたタンパク質精製技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，　Ｖｏｌ．１８２　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，　Ｍｕｒｒａｙ　Ｐ．　Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，　ｅｄ　（１９９０）（参考文献として本明細書に援用される）に開示されているもの等）によって、発現された組換えタンパク質を上清から精製する。
【００４１】
モノクローナル及びポリクローナル抗体を調製する方法は、当業者に周知であり、例えば、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｅ．　Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｄ．　Ｌａｎｅ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８８）」の第５及び第６章（引用した章は、参考文献として本明細書に援用される）に記載されている。ある代表的な例では、精製されたタンパク質に特異的なポリクローナル抗体は、ホイッフルボールを移植したニュージーランドウサギ中に生じさせることができる。ホイッフルボール肉芽腫中に、間隔を置いて、１μｇのタンパク質を直接注入する。代表的な投与計画は、１日目、１４日目、及び３５日目に注射すること（それぞれ、１μｇのタンパク質）である。第一の注射（免疫前血清）の一週間前と最後の注射から４０日後（免疫後血清）に、肉芽腫液を採取する。
【００４２】
本発明を実施する上で有用な転写因子の欠失、置換、変異、及び／又は挿入に得られる配列変種も、本発明の方法で使用することができる。本発明の実施に有用な転写因子のアミノ酸配列変種は、野生型の転写因子タンパク質をコードするＤＮＡ配列を変異させることによって、例えば、一般に位置指定突然変異導入と称される技術を用いることによって構築してもよい。本発明を実施する上で有用な転写因子をコードする核酸分子は、当業者に周知の様々なＰＣＲ技術によって変異させることができる（例えば、以下の文献を参照（本文献の引用された部分は、参考文献として本明細書に援用される）「ＰＣＲ　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」Ｍ．　Ａ．　Ｉｎｎｉｓ，　Ｄ．　Ｈ．　Ｇｅｌｆａｎｄ　ａｎｄ　Ｊ．　Ｊ．　Ｓｎｉｎｓｋｙ，　ｅｄｓ．，　１９９５，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，　ＣＡ　（Ｃｈａｐｔｅｒ　１４）；“ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，　Ｍ．　Ａ．　Ｉｎｎｉｓ，　Ｄ．　Ｈ．　Ｇｅｌｆａｎｄ，　Ｊ．　Ｊ．　Ｓｎｉｎｓｋｙ　ａｎｄ　Ｔ．　Ｊ．　Ｗｈｉｔｅ，　ｅｄｓ．，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　ＮＹ　（１９９０）））。
【００４３】
非限定的な例として、本発明を実施する上で有用な転写因子をコードする核酸分子中に位置指定変異体を導入するために、ＣｌｏｎｔｅｃｈのＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットで利用されている二プライマー系を用いてもよい。該系中の標的プラスミドを変性した後、２つのプライマーを前記プラスミドに同時にアニールさせる。これらのプライマーのうちの一方は所望の位置指定変異を含有しており、他方はプラスミド中の別の位置に変異を含有しているために制限部位が失われている。次いで、これらの２つの変異を強固に連鎖させながら、２ｎｄストランドの合成を行い、得られたプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ．のｍｕｔＳ株の中に形質転換させる。形質転換された微生物からプラスミドを単離し、（それによって、変異していないプラスミドを直鎖にする）適切な制限酵素を用いて制限消化した後、Ｅ．ｃｏｌｉ．中に再度形質転換する。この系によって、一本鎖ファージミドのサブクローニング又は作製の必要なしに、発現プラスミド中に直接突然変異を生成させることが可能となる。２つの突然変異の強い連鎖と非突然変異プラスミドのその後の直鎖化とによって、高い変異効率がもたらされ、最小限のスクリーニングが可能となる。最初に制限部位プライマーを合成した後には、この方法では、変異部位当たりただ一つの新規プライマー種を使用するだけで足りる。各位置変異体を個別に調製するのではなく、所定の部位に所望の突然変異を全て同時に導入するために、一群の「設計された縮重（ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）」オリゴヌクレオチドプライマーを合成してもよい。変異体クローンを同定し、分類するために、プラスミドＤＮＡの変異領域を配列決定することによって、形質転換体をスクリーニングすることができる。次いで、各変異ＤＮＡを完全に配列決定又は制限消化し、（変異していない対照とバンドシフトを比較することによって）配列中に他の変化が生じていないことを確認するために、Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔゲル（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）上での電気泳動によって分析することができる。
【００４４】
この場合にも、非限定的な例として、本発明を実施する上で有用な転写因子をコードする核酸分子中に位置指定変異体を導入するために、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットで用いられている２プライマー系を使用してもよい。二本鎖プラスミドＤＮＡ（標的変異部位を有するインサートを含有する）を変性し、プラスミドＤＮＡの各ストランドが標的変異部位において相補的な２つのオリゴヌクレオチドと混合する。Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼを用いてアニールしたオリゴヌクレオチドプライマーを伸長させることによって、ねじれ型（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）のニックを含有する変異したプラスミドを作製する。温度サイクルを経た後、制限酵素ＤｐｎＩ（メチル化又はヘミメチル化ＤＮＡを切断するが、メチル化されていないＤＮＡは切断しない）を用いて、変異していない親ＤＮＡテンプレートを消化する。テンプレートＤＮＡを与えるＥ．Ｃｏｌｉの多くの株は、必要とされるメチラーゼ活性を有しているので、親テンプレートＤＮＡは、殆ど常にメチル化又はヘミメチル化されている。所望の突然変異を取り込んでいるアニールした残りのベクターＤＮＡをＥ．Ｃｏｌｉ中に形質転換する。
【００４５】
ある位置指定変異導入実験を設計する際には、まず非保存的な置換（例えば、ＡｌａをＣｙｓ、Ｈｉｓ、又はＧｌｕ）を作製し、その結果、活性が著しく損なわれるかどうかを決定することが一般に望ましい。もし、活性の喪失又はノックアウトによって、その残基が重要であることが、このようにして実証されれば、側鎖の長さを変えるためにＡｓｐをＧｌｕに、ＳｅｒをＣｙｓに、又はＡｒｇをＨｉｓにするような保存的な置換を行うことができる。疎水性セグメントの場合、変化させるのに有用なのは概ねサイズであるが、アルキル側鎖を芳香族に代えることもできる。
【００４６】
本発明を実施する上で有用な転写因子をコードする核酸分子を用いた、他の位置指定突然変異導入技術を利用してもよい。例えば、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　２ｎｄ　ｅｄ．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８９）」の１５．３節の記載（参考文献として本明細書に援用される）に従って、ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化後に連結を行い、本発明を実施する上で有用な転写因子の欠失変種を作製してもよい。上記Ｓａｍｂｒｏｏｋらの１５．３節に記載されているように、挿入変種を構築するために同様の戦略を使用してもよい。
【００４７】
本発明を実施する上で有用な転写因子の置換変種を調製するために、オリゴヌクレオチドを用いた変異導入を利用してもよい。オリゴヌクレオチドを用いた変異導入は、本発明を実施する上で有用な転写因子の欠失及び挿入変種を調製するためにも便利に使用し得る。この技術は、Ａｄｅｌｍａｎら（ＤＮＡ　２：１８３［１９８３］）、上述のＳａｍｂｒｏｏｋら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」，　１９９１，　Ｗｉｌｅｙ（ＮＹ），　Ｆ．　Ｔ．　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｒ．　Ｂｒｅｎｔ，　Ｒ．　Ｅ．　Ｋｉｎｇｓｔｏｎ　Ｄ．　Ｄ．　Ｍｏｏｒｅ，　Ｊ．　Ｄ．　Ｓｅｉｄｍａｎ，　Ｊ．　Ａ．　Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｋ．　Ｓｔｒｕｈｌ，　ｅｄｓ．，（参考文献として本明細書に援用される）によって記載されているように、本分野において周知である。
【００４８】
一般的に、本発明を実施する上で有用な転写因子をコードする核酸分子中に二以上のヌクレオチドを挿入、欠失、又は置換させるためには、少なくとも２５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドが使用される。変異をコードするヌクレオチドの何れかの側に対して完全に一致する１２〜１５のヌクレオチドを有するものが最適なオリゴヌクレオチドであろう。本発明を実施する上で有用な野生型転写因子タンパク質を変異させるためには、適切なハイブリダイゼーション条件下で、一本鎖ＤＮＡテンプレート分子に前記オリゴヌクレオチドをアニールさせる。続いて、ＤＮＡ重合酵素（通常はＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片）を加える。該酵素は、変異を有するＤＮＡ鎖の合成を完結させるために、前記オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用する。このように、ＤＮＡの一方の鎖がベクター中に挿入された野生型タンパク質をコードし、ＤＮＡのもう一方の鎖が同じベクター中に挿入された変異型のタンパク質をオードするように、ヘテロ二本鎖分子が形成される。該へテロ二本鎖分子は、続いて、適切な宿主細胞中に形質転換される。
【００４９】
２以上のアミノ酸が置換された変異体は、複数の方法のうちの一つによって作製し得る。アミノ酸がポリペプチド鎖中で互いに近接して存在するのであれば、所望の全アミノ酸置換をコードする一つのオリゴヌクレオチドを用いて同時に変異させ得る。しかしながら、アミノ酸が互いにある程度離れている（例えば、１１アミノ酸以上隔たっている）のであれば、所望の変化を全てコードする単一のオリゴヌクレオチドを作製することはより困難である。代わりに、２つの別の方法のうちの１つを使用し得る。第一の方法では、置換すべき各アミノ酸につき、各別のオリゴヌクレオチドを作製する。続いて、該オリゴヌクレオチドを一本鎖テンプレートＤＮＡに同時にアニールさせると、テンプレートから合成されるＤＮＡの他方の鎖は、所望のアミノ酸置換を全てコードするであろう。別の方法では、所望の変異体を与えるために２ラウンド以上の変異導入を行う。第一のラウンドは、単一変異体に関して説明したとおりであり、野生型タンパク質のＤＮＡをテンプレートとして使用し、第一の所望のアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドを該テンプレートにアニールさせ、続いてヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子を作製する。第二ラウンドの突然変異導入では、第一ラウンドの突然変異導入で産生された変異ＤＮＡをテンプレートとして利用する。このように、該テンプレートは既に一以上の変異を含有している。続いて、所望のアミノ酸置換を更にコードするオリゴヌクレオチドを該テンプレートにアニールさせると、ここで得られるＤＮＡの鎖は、第一及び第二ラウンドの両突然変異導入に由来する変異をコードしている。得られたこのＤＮＡは、第三ラウンドの変異導入等でテンプレートとして使用することができる。
【００５０】
本発明を実施する上で有用な転写因子の最初のクローニング工程には、宿主細胞として原核細胞を使用し得る。原核細胞は、大量のＤＮＡの迅速な産生、位置指定突然変異導入に使用される一本鎖ＤＮＡテンプレートの作製、多数の変異体及び／又は内耳細胞転写因子候補の同時スクリーニング、及び作製された変異体のＤＮＡ配列決定を行う上で特に有用である。適切な原核宿主細胞には、Ｅ．　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　９４株（ＡＴＣＣ番号３１，４４６）、Ｅ．　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ番号２７，３２５）、Ｅ．　ｃｏｌｉ　Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ番号３１，５３７）、及びＥ．　ｃｏｌｉ　Ｂが含まれるが、ＨＢ１０１、ＪＭ１０１、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９のような他の多くのＥ．ｃｏｌｉの株や、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ等の棹菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ又はＳｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓａｎｓ等の他の腸内細菌科、及び様々なＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種を含む他の多くの原核細胞種及び属を全て宿主として使用し得る。原核細胞又は頑強な細胞壁を有する他の宿主細胞は、上記のＳａｍｂｒｏｏｋらの１．８２節に記載されている塩化カルシウム法を用いて形質転換することが好ましい。あるいは、これらの細胞を形質転換するために、電気穿孔を使用してもよい。原核細胞の形質転換技術は、「Ｄｏｗｅｒ，　Ｗ．　Ｊ．，　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２：２７５−２９６，　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｒｐ．，　１９９０；　Ｈａｎａｈａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｅｔｈ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２０４：６３（１９９１）」に記載されている。
【００５１】
当業者に明らかであるように、本発明を実施する上で有用な転写因子をコードする核酸分子をクローニングし、発現し、及び／又は操作するために、宿主細胞と互換性のある種に由来するレプリコン及び調節配列を含有する任意のプラスミドベクターも使用し得る。通常、前記ベクターは、複製部位と、形質転換された細胞を表現型によって選択できるようにするマーカー遺伝子と、一以上のプロモーターと、外来ＤＮＡを挿入するための幾つか制限部位を含有するポリリンカー領域とを有する。Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換に典型的に使用されるプラスミドには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣＩ１８、ｐＵＣ１１９、及びＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｍ１３が含まれ、これらは全て、上記のＳａｍｂｒｏｏｋらの１．１２〜１．２０節に記載されている。しかしながら、他の多くの適切なベクターも利用可能である。これらのベクターは、アンピシリン及び／又はテトラサイクリン耐性をコードする遺伝子を含有しており、これらのベクターを形質転換された細胞がこれらの抗生物質の存在下で増殖できるようにする。
【００５２】
原核細胞ベクター中で最も一般的に使用されるプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７５：６１５［１９７８］；Ｉｔａｋｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８：１０５６［１９７７］；Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：５４４［１９７９］）、及びトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，８：４０５７［１９８０］；ＥＰＯ　Ａｐｐｌ．　Ｐｕｂｌ．ＮＯ．３６，７７６）、及びアルカリホスファターゼ系が含まれる。一般的には、これらのプロモーターが多用されているが、他の微生物のプロモーターも使用されている。それらのヌクレオチド配列に関する詳細は文献に記載されており、当業者であれば、それらを機能的にプラスミドベクター中に連結することが可能である（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０：２６９［１９８０］参照）。
【００５３】
複製配列をコードするＤＮＡと、制御配列と、表現型選択遺伝子と、本発明を実施する上で有用な転写因子をコードするＤＮＡとを含有する適切なベクターは、標準的な組換えＤＮＡ操作を用いて構築される。本分野において周知であるように（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，上記参照）、単離されたプラスミド及びＤＮＡ断片は切断され、目的に適合するように加工（ｔａｉｌｏｒ）され、所望のベクターを与えるように特定の順序で互いに連結される。
【００５４】
本発明の方法の別の実施態様では、内耳感覚有毛細胞を損傷させ、且つ内耳支持細胞中で活性な一以上の細胞周期阻害剤の発現を（内耳感覚有毛細胞を損傷させる前、間、及び／又は後に）阻害させることによって、内耳支持細胞からの内耳感覚有毛細胞の形成を刺激する。このようにして、損傷を受けた感覚有毛細胞と接触している内耳支持細胞を刺激して分裂させ、少なくとも幾つかの子孫が内耳感覚有毛細胞が形成するようにさせることができる。代表的な例として、内耳支持細胞中で活性な細胞周期阻害剤には、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、及びｐ５７Ｋｉｐ２を含むいわゆるＣＩＰ／ＫＩＰファミリーのサイクリン依存性キナーゼ阻害剤等のサイクリン依存性キナーゼ阻害剤が含まれる。
【００５５】
内耳支持細胞内で活性な細胞周期阻害剤の具体例には、ｐ５７Ｋｉｐ２（Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　９（６）：６３９−６４９（１９９５）（配列番号６）；ｐ２７Ｋｉｐ１（Ｃｅｌｌ　７８（１）：５９−６６（１９９４）　配列番号８及び９））；ｐ２１Ｃｉｐ１（Ｅｌ−Ｄｉｅｒｙ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ　７５（４）：８１７−８２５（１９９３）（配列番号１０及び１１）；ｐ１９　Ｉｎｋ　４ｄ（Ｃｈａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５（５）：２６８２−２６８８　（１９９５）（配列番号１２及び１３））；ｐｌ８　Ｉｎｋ　４ｃ（Ｇｕａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　８（２４）：２９３９−２９５２（１９９４）（配列番号１４及び１５））；ｐ１５　Ｉｎｋ　４ｂ（Ｈａｎｎｏｎ　ａｎｄ　Ｂｅａｃｈ，　３７１（６４９４）：２５７−２６１（１９９４）（配列番号１６及び１７））；ｐ１６　Ｉｎｋ　４ａ　（Ｓｅｒｒａｎｏ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　３６６（６４５６）：７０４−７０７（１９９３）（配列番号１８及び１９））が含まれる。本発明を実施する上で有用な細胞周期阻害剤をコードする核酸分子は、５５℃２×ＳＳＣを上回る少なくとも一つのハイブリダイゼーションストリンジェンシー下で（６０℃で１×ＳＳＣ、又は６０℃で０．２×ＳＳＣなど）、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、及び１８に記載されている核酸分子のうちの何れか一つのアンチセンス鎖にハイブリダイズする。
【００５６】
細胞周期阻害剤の阻害剤は、細胞内で細胞周期阻害剤に対して直接又は間接的な態様で作用するタンパク質等の物質であり得る。さらに、細胞周期阻害剤の阻害剤は、細胞周期阻害剤タンパク質をコードする核酸分子の全部又は一部に相補的なアンチセンス核酸分子であって、ストリンジェントな条件下（５５℃で２×ＳＳＣを上回るストリンジェンシー等（例えば６０℃で１×ＳＳＣ、又は６０℃で０．２×ＳＳＣ））で細胞周期阻害剤タンパク質をコードする核酸分子にハイブリダイズする（ｍＲＮＡ分子等の）アンチセンス核酸分子であり得る。
【００５７】
内耳支持細胞中での細胞周期阻害剤遺伝子の発現を阻害するためには、本分野で知られている任意の方法を使用することができる。例えば、内耳支持細胞中で活性な細胞周期阻害剤をコードする核酸分子の一部（又は全部）を、プロモーター配列に対してアンチセンスの方向に含むベクターを内耳支持細胞中に導入することによって、内耳支持細胞中で活性な細胞周期阻害剤の発現を阻害することができる。
【００５８】
一般的に、その正常な転写方向とは逆向きであり、このため宿主細胞内で発現される標的ｍＲＮＡ分子と相補的なＲＮＡ転写物を発現するＤＮＡ配列を、アンチセンス技術は利用している（すなわち、アンチセンス遺伝子のＲＮＡ転写物は、ワトソン−クリックの塩基対合を介して、標的ｍＲＮＡ分子にハイブリダイズすることができる）。標的遺伝子の発現を妨害することが可能であれば、アンチセンス遺伝子は、数多くの様々な方法で構築し得る。前記標的遺伝子のコード領域（又はその一部）をその正常な転写方向に対して逆向きにして、その相補鎖の転写をさせることにより、アンチセンス遺伝子によってコードされるＲＮＡとセンス遺伝子によってコードされるＲＮＡを相補的とすることによって、アンチセンス遺伝子を構築することができる。
【００５９】
一般的には、前記アンチセンス遺伝子は、一又は複数の前記標的遺伝子の少なくとも一部と実質的に同一であろう。しかしながら、発現を阻害するには、前記配列が完全に同一である必要はない。一般的には、より短いアンチセンス遺伝子を使用する場合には、これを埋め合わせるために、より高い相同性を使用することができる。典型的には、最小の同一性は、約６５％超であるが、これより高い同一性によって、内在配列の発現がより効果的に抑圧されるかもしれない。約８０％より相当大きな同一性が好ましいが、約９５％乃至完全な同一性が最も好ましいであろう。
【００６０】
さらに、前記アンチセンス遺伝子は、標的遺伝子と同一のイントロン又はエキソンパターンを有する必要はなく、前記標的遺伝子の非コードセグメントは、標的遺伝子発現のアンチセンス抑制を達成する上で、コードセグメントと同等に有効であるかもしれない。通常は、少なくとも約３０又は４０ヌクレオチドのＤＮＡ配列をアンチセンス遺伝子として使用すべきであるが、これより長い配列も好ましい。次いで、前記構築物を一以上の内耳支持細胞中に導入し、ＲＮＡのアンチセンスストランドを作製する。
【００６１】
標的遺伝子の発現を阻害するために、触媒作用を有するＲＮＡ分子又はリボザイムも使用することができる。標的ＲＮＡと特異的に対合し、特定の位置のホスホジエステル骨格を切断するＲＮＡリボザイムをコードするリボザイム導入遺伝子を設計することによって、標的ＲＮＡを機能的に不活化することが可能である。この切断を行う際に、リボザイム自体は変化しないので、リボザイムはリサイクルされ、他の分子を切断することができる。アンチセンスＲＮＡ中にリボザイム配列を含めることによって、アンチセンスＲＮＡにＲＮＡ切断活性が付与され、それによりアンチセンス構築物の活性を増大させる。Ｔａｂｌｅｒら（１９９１、Ｇｅｎｅ　１０８：１７５）は、単一構築物において、アンチセンスＲＮＡ技術の利点とリボザイム技術の利点とを組み合わせることによって、触媒能を有するＲＮＡの構築を大幅に簡素化した。リボザイムの触媒には、より小さな相同性領域が必要とされるので、切断部位が保存されていれば、大きな遺伝子ファミリーの様々な要素の抑制を促進することができる。
【００６２】
標的遺伝子活性を抑圧させるのに適した別の戦略では、優性阻害（ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｎｅｇａｔｉｖｅ）突然変異を作出するための一般的な基準に従って（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ　Ｉ，　Ｎａｔｕｒｅ　３２９：２１９−２２２（１９８７））、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の変異型又は部分欠失型をセンス発現させる。
【００６３】
転写因子をコードする核酸分子（又はアンチセンスＤＮＡ分子を含むベクター）を内耳細胞中に導入し、その中で発現させるためには、直接注入、電気穿孔、ウイルスによって介される遺伝子送達、アミノ酸によって介される遺伝子送達、遺伝子銃による遺伝子送達、リポフェクション及び熱ショックを含む本分野で知られている任意の遺伝子送達法を使用することができる。非ウイルス的な内耳細胞への遺伝子送達法は、Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｈｕｎｇ，Ｍ−Ｃ，及びＷａｇｎｅｒ，Ｅ．，の「Ｎｏｎ−Ｖｉｒａｌ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ　（１９９９）」（参考文献として本明細書中に援用される）に開示されている。
【００６４】
例えば、インサイチュで又は身体から細胞を取り出した後に、ウイルスベクターによって細胞内に遺伝子を導入することができる。例えば、レトロウイルスは、感染後、宿主細胞の染色体中にその遺伝子を挿入することができるＲＮＡウイルスである。ウイルスのタンパク質をコードする遺伝子を欠くが、細胞に感染する能力を保持し、その遺伝子を標的細胞の染色体中に挿入するレトロウイルスベクターが開発されている（Ａ．Ｄ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．１：５〜１４（１９９０））。
【００６５】
アデノウイルスベクターは、患者に直接投与するように設計されている。レトロウイルスベクターとは異なり、アデノウイルスベクターは宿主細胞の染色体中には組み込まれない。その代わり、アデノウイルスベクターを用いて細胞中に導入された遺伝子は、限られた期間だけ存続する染色体外因子（エピソーム）として核の中に維持される。アデノウイルスベクターは、気道の上皮細胞、内皮細胞、肝細胞及び様々な腫瘍を含む多数の異なる組織中に存在する分裂中の細胞及び分裂していない細胞にインビボで感染する（Ｂ．Ｃ．Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ａｄｖ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌ　Ｒｅｖ．１２：１８５〜１９９（１９９３））。
【００６６】
他のウイルスベクターは、治療遺伝子をニューロンに送達する幾つかの初期投薬において使用され、幾つかの形態の脳腫瘍に治療遺伝子を送達するために使用できる可能性を秘めた単純ヘルペスウイルス（巨大な二重鎖ＤＮＡウイルス）である（Ｄ．Ｓ．Ｌａｔｃｈｍａｎ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：１７９〜９５（１９９４））。ワクシニアウイルスの組換え体は、大きな挿入断片を収容することができ、相同組換えによって産生される。現在まで、このベクターはヒトＩＬ−１β及び共刺激分子であるＢ７−１及びＢ７−２などのインターロイキン類（ＩＬｓ）を輸送するために使用されてきた（Ｇ．Ｒ．Ｐｅｐｌｉｎｓｋｉ等、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．２：１５１〜９（１９９５）；Ｊ．Ｗ．Ｈｏｄｇｅ等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５４：５５５２〜５５（１９９４））。
【００６７】
遺伝子治療への別のアプローチでは、ＤＮＡプラスミドが患者に直接導入される（Ｆ．Ｄ．Ｌｅｄｌｅｙ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．６：１１２９〜１１４４（１９９５））。プラスミドＤＮＡは、体内の細胞によって取り込まれ、組換えタンパク質の発現を誘導することができる。典型的には、プラスミドＤＮＡは、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジオレイルオキシプロピル（ｄｉｏｌｃｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）−３−トリメチルアンモニウムブロマイド）及びＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）などの１以上の脂質とプラスミドＤＮＡとが会合したリポソームの形態で細胞に送達される。ＤＯＴＭＡを用いた製剤は、動物モデルの肺上皮細胞において発現することが示された（Ｋ．Ｌ．Ｂｒｉｇｈａｍ等、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，２９８：２７８〜２８１（１９８９）；Ａ．Ｂ．Ｃａｎｏｎｉｃｏ等、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２４〜２９（１９９４））。さらに、５％ＰＶＰ（５０，０００ｋＤａ）と共に処方されたプラスミドＤＮＡを筋肉注射すると、筋肉内でのレポーター遺伝子の発現レベルを、生理食塩水中のＤＮＡのみを注射した場合に見られるレベルの２００倍も増大させることが研究により示された（Ｒ．Ｊ．Ｍｕｍｐｅｒ等、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１３：７０１〜７０９（１９９６）；Ｒ．Ｊ．Ｍｕｍｐｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔ．Ｒｏｌ．Ｂｉｏａｃ．Ｍａｔｅｒ．２２：３２５〜３２６（１９９５））。プラスミドＤＮＡの筋肉内投与は、何ヶ月にもわたり持続する遺伝子発現をもたらす（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ等、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３６３〜３６９（１９９２）；Ｍ．Ｍａｎｔｈｏｒｐｅ等、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．４：４１９〜４３１（１９９３）；Ｇ．Ａｓｃａｄｉ等、Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌ．３：７１〜８１（１９９ｌ）；Ｄ．Ｇａｌ等、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６８：１８〜２５（１９９３））。
【００６８】
さらに、ＤＮＡの取り込みと発現は、甲状腺（Ｍ．Ｓｉｋｅｓ等、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．５：８３７〜８４４（１９９４））及び滑膜（Ｊ．Ｙｏｖａｎｄｉｃｈ等、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．６：６０３〜６１０（１９９５））へのプラスミドを直接注射した後にも観察されている。肝臓（Ｍ．Ａ．Ｈｉｃｋｍａｎ等、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．５：１４７７〜１４８３（１９９４））、皮膚（Ｅ．Ｒａｚ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：９５１９〜９５２３（１９９４））への間質内注入、気道への喉頭注入（Ｋ．Ｂ．Ｍｅｙｅｒ等、Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　２：４５０〜４６０（１９９５））、内皮への適用（Ｇ．Ｄ．Ｃｈａｐｍａｎ等、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｒｅｓ．７１：２７〜３３（１９９２）；Ｒ．Ｒｉｅｓｓｅｎ等、Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ，４：７４９〜７５８（１９９３））、及び静脈内投与（Ｒ．Ｍ．Ｃｏｎｒｙ等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５４：１１６４〜１１６８（１９９４））後に低レベルの遺伝子発現が観測された。
【００６９】
標的細胞へのＤＮＡの供給を増大させるために、様々な装置が開発されている。簡単なアプローチの１つは、標的細胞をカテーテル又はＤＮＡ含有を含有する移植可能な材料と物理的に接触させることである（Ｇ．Ｄ．Ｃｈａｐｍａｎ等、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｒｅｓ．７１：２７〜３３（１９９２））。別のアプローチは、液柱を標的組織内に高圧下で直接投入する、針を使用しない噴射式注射装置を利用することである（Ｐ．Ａ．Ｆｕｒｔｈ等、Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０：３６５〜３６８（１９９２）；Ｈ．Ｌ．Ｖａｈｌｓｉｎｇ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１７５：１１〜２２（１９９４）；Ｆ．Ｄ．Ｌｅｄｌｅｙ等、Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８Ａ：２２６（１９９４））。
【００７０】
別の遺伝子送達装置は、「遺伝子銃」又はＢｉｏｌｉｓｔｉｃＴＭ、すなわちＤＮＡで被覆された微粒子を細胞の核内にインビボで直接投入する弾道装置である。核内に入った後、ＤＮＡはその金又はタングステン微粒子から溶け出し、標的細胞によって発現され得る。この方法は、遺伝子を皮膚、肝臓、及び筋に直接導入するために効率的に使用されてきた（Ｎ．Ｓ．Ｙａｎｇ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：９５６８〜９５７２（１９９０）；Ｌ．Ｃｈｅｎｇ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０：４４５５〜４４５９（１９９３）；Ｒ．Ｓ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：２７２６〜２７３０（１９９１））。
【００７１】
蝸牛開口術では、蝸牛を穿刺し、核酸分子などの化学物質を蝸牛内に導入することができるカテーテルを挿入する。蝸牛開口術は、例えば、Ｌａｌｗａｎｉ，Ａ．Ｋ．等、Ｈｅａｒｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１１４：１３９〜１４７（１９９７）に開示されている（本文献を参考文献として本明細書に援用する）。
【００７２】
標的へ遺伝子を送達するための別のアプローチ方法は、分子の抱合体を使用することであり、この抱合体は核酸を細胞に特異的にターゲティングさせるために核酸又はＤＮＡの結合剤が付着したタンパク質又は合成リガンドからなる（Ｒ．Ｊ．Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：１１５４８〜５２（１９９３）；Ｂ．Ａ．Ｂｕｎｎｅｌｌ等、Ｓｏｍａｔ．Ｃａｌｌ　Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１８：５５９〜６９（１９９２）；Ｍ．Ｃｏｔｔｅｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：６０９４〜９８（１９９２））。ＤＮＡが分子抱合体と結合すれば、タンパク質−ＤＮＡ複合体が得られる。この遺伝子送達系は、異なるリガンドを使用することによって様々なタイプの細胞を標的とした送達が可能であることが示されている（Ｒ．Ｊ．Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：１１５４８〜５２（１９９３））。例えば、ビタミンの葉酸塩は、葉酸塩受容体を過剰発現する細胞（例えば、卵巣癌細胞）内へのプラスミドＤＮＡの送達を促進するリガンドとして使用されてきた（Ｓ．Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ等、Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．１：１８５〜９１（１９９４））。マラリアのスポロゾイト周囲タンパクは、硬変症、糖尿病、及び肝細胞癌などの、肝細胞上のＡＳＯＲ受容体の発現が低下した条件下で、肝臓特異的に遺伝子を送達するために使用されてきた（Ｚ．Ｄｉｎｇ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：３６６７〜７６（１９９５））。癌細胞上の上皮成長因子（ＥＧＦ）の受容体が過剰発現すると、肺癌細胞によるＥＧＦ／ＤＮＡ複合体の特異的な取込みが可能になった（Ｒ．Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．３：４〜１０（１９９６））。現時点で好ましい遺伝子送達法は、リポフェクションである。
【００７３】
本発明の方法をインビトロで利用する場合、コルチ器を含む内耳全体を、好ましくは切除し、培養し、培養器の中で処置する。内耳をインビトロで培養するために有用な装置の現時点で好ましい実施例は、米国特許第５，４３７，９９８号、米国特許第５，７０２，９４１号、及び米国特許第５，７６３，２７９号に開示されており、これらの各文献は参考文献として本明細書に援用される。
【００７４】
一般に、内耳を培養するための装置の現時点で好ましい実施例としては、少なくとも一部をシリコンゴムなどのガス透過性材料で構成することができる壁を備える管状容器を含む、ガス透過性のバイオリアクターが挙げられる。１つの好ましい実施例における容器は、その半分がガス透過性材料で構成され、残りの部分が非透過性材料で作製されるように構成されている。一般に入手可能なガス透過性材料は不透明である。したがって、バイオリアクターの少なくとも一部に非透過性材料を使用することによって、管状容器チャンバーの目視検査を可能にする利点を付与することができる。
【００７５】
管状容器は、端部が閉じられており、実質的に水平な長手方向の中心軸を有し、容器への１以上のアクセスポートを有する。容器にアクセスポートが与えられていることによって、バイオリアクターに培地及び細胞を入れ、古い培地を管状容器から取り出すことができる。これは、バルブ又はシリンジポートとも呼ばれる、容器のアクセスポートを通して容易になされる。好ましい実施例においては、容器のアクセスポートは、シリンジポートを備えるバルブで構成される。
【００７６】
容器は、その水平な長手方向の中心軸の周りを回転できることが好ましい。好ましい回転手段は、取付け基盤の上に配置されたモーターアセンブリーであり、管状容器に取り付けるための手段を有する。回転スピードは、管状容器内の内耳が一定して動いているように調節することができるが、管状容器内の水性培地中に著しい乱れを起こすほど管状容器の回転を速くすべきではない。
【００７７】
必要に応じ、管状容器の壁の少なくとも一部を構築する際にガス透過性材料を使用すると、容器チャンバー内の細胞を培養する培地中に容器の壁を通して酸素が拡散できるようになる。同様に、二酸化炭素は壁を通して拡散し、容器の外へ拡散する。したがって、管状容器の壁の少なくとも一部を構築する際にガス透過性材料を使用することによって、通常は、バイオリアクター容器内に空気を注入する必要がなくなる。しかし、内耳を培養するためにさらに酸素が必要な場合には、バイオリアクター容器内の水性培地中への空気注入を利用することができる。水性培地中に空気を注入するために空気ポンプを利用するときには、空気ポンプのバルブを埃から保護するためにエアフィルターも使用する。
【００７８】
本発明を実施する上で有用なバイオリアクターの別の実施例は、少なくとも一部がガス透過性材料で構成され得る壁を備える環状容器である。環状とは、環状、ドーナツ状、及び他の実質的に対称形のリング状の形をした管状容器を含むものと本明細書では定義される。環状容器は端部が閉じられ、実質的に水平な長手方向の中心軸を有する。
【００７９】
別の実施例においては、本発明を実施する上で有用なバイオリアクターは、少なくとも一部がガス透過性材料で構成された管状容器を備える。この容器は端部が閉じられ、該容器がそれを中心に回転する実質的に水平な長手方向の中心軸を有する。容器はさらに、摺動可能に相互に連結された２つの部材を備え、第一の部材は第二の部材内に摺動可能に装着され、それらの間に液密な封止を形成して、容積可変の管状容器を提供する。バイオリアクターは、その実質的に水平な長手方向の中心軸の周囲に管状容器を回転させるための手段を備える。容器の１以上のアクセスポートが、容器内に又は容器から材料を移動するために設けられている。
【００８０】
汚染を最小限にする必要がある場合には（例えば、ＡＩＤＳ又はヒトの組織の研究）、本発明を実施する上で有用なバイオリアクターの廃棄性が特に利点となる。また、摺動可能に相互連結された部材を備えた前記バイオリアクターの実施例は、調節によって、必要とされる正確なサイズのバイオリアクターを提供することができる。
【００８１】
体液で満たされた感覚器官を培養するために本発明を実施する上で有用な、現時点で好ましい市販のバイオリアクターは、Ｈｉｇｈ　Ａｓｐｅｃｔ　Ｒａｔｉｏ　Ｖｅｓｓｅｌ（ＨＡＲＶＴＭ）及びＣｙｌｉｎｄｒｉｃａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｖｅｓｓｅｌ）（ＣＣＣＶＴＭ）として知られ、Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ，Ｉｎｃ．（８０５４　Ｅｌ　Ｒｉｏ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ）によって製造されている。
【００８２】
Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ培地は、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（本社　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）によって生産されている）のＮｅｕｒａｌｂａｓａｌＴＭ培地は、Ｂ２７又はＮ２の培地サプリメントを追加する必要はあるが、内耳をインビトロで培養するための現時点で好ましい培地である。しかし、本発明を実施する際に、体液で満たされた感覚器官を培養するために、他の培地を首尾よく使用することもできる。他の適切な培地としては、ウシ胎児血清又はウマ血清を含むＤＭＥ、ＢＭＥ、及びＭ−１９９が挙げられる。前記培地のすべてが、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬによって販売されている。ＮｅｕｒａｌｂａｓａｌＴＭ培地を使用する場合には、長い培養期間（＞９６時間）を試行するときに、Ｎ２又はＢ２７サプリメントがより重要な役割を果たす。
【００８３】
別の側面においては、本発明は内耳支持細胞の形成を刺激するための方法を提供する。本発明のこの側面に係る方法は、（例えば、損傷した内耳支持細胞と接触している内耳支持細胞の細胞分裂によって）内耳の新しい支持細胞の形成を促進する条件下で内耳支持細胞に損傷を与えるステップを含む。本発明のこの側面においては、内耳支持細胞からの内耳感覚有毛細胞の形成を刺激する本明細書に記載の方法と同じ手法を用いて、内耳支持細胞を損傷させ、新しい内耳支持細胞の形成を刺激する。したがって、例えば、アミノグリコシド抗生物質などの内耳支持細胞を損傷させる効果を有するある量の聴器毒性物質と接触させることによって、内耳支持細胞に損傷を与えることができる。また、例えば、内耳支持細胞に損傷を与え、内耳支持細胞を刺激して新しい内耳支持細胞を分裂、形成することができる転写因子（ＰＯＵ４Ｆ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＯＵ４Ｆ３、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、及びＢｒｎ３ｃなど）を内耳支持細胞内に（内耳支持細胞の損傷前、損傷中、及び／又は損傷後に）発現させることによって、新しい内耳支持細胞の形成をさらに刺激することができる。本発明のこの側面の好ましい実施例においては、内耳支持細胞の増殖は、処置した内耳の聴覚機能に改善をもたらす。
【００８４】
以下の例は、本発明を実施するために現在考えられる最良の形態を単に説明するものにすぎず、本発明を限定するものと解釈すべきではない。
【００８５】
例１
不死化した支持細胞系におけるインビトロでのＰＯＵ４Ｆ３の過剰発現
ＰＯＵ４Ｆ３は、内耳有毛細胞に対して顕著な特異性を示すＤＮＡ結合転写因子である。ＰＯＵ４Ｆ３の突然変異が、マウスの発育不全、及びマウスとヒトの聴覚損失を起こすことは周知である。有毛細胞前駆体の発生を誘導する際のＰＯＵ４Ｆ３の役割は、ＰＯＵ４Ｆ３を内耳支持細胞系に移入することによって検討される。
【００８６】
生培地中のＰＯＵ４Ｆ３の発現を検出するため、ＰＯＵ４Ｆ３及びＧＦＰの両コード領域を含むバイシストロン性ｍＲＮＡから翻訳された強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の発現をモニターする。具体的には、７０ｂｐの５’ＵＴＲ及び７３ｂｐの３’ＵＴＲを含むＰＯＵ４Ｆ３をコードする１２５０ｂｐのｃＤＮＡが、ヒトＣＭＶの主要な最初期プロモーター／エンハンサーからすぐ下流に、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）のユニークなＥｃｏＲＶ制限酵素切断部位に定方向にクローン化される。介在する合成イントロンは、ＰＯＵ４Ｆ３遺伝子から下流側にクローン化され、ｍＲＮＡの安定性を高める。脳心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）は、ＰＯＵ４Ｆ３遺伝子とＧＦＰ遺伝子との間にクローン化され、同じｍＲＮＡからのＧＦＰ及びＰＯＵ４Ｆ３タンパク質の翻訳を可能にする。ＧＦＰコード領域の直後には、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニル化シグナルが存在する。この発現カセットは、バイシストロン性プロモーターを利用するように設計されており、発現されたＧＦＰを蛍光顕微鏡の下で視覚化することによって、ＰＯＵ４Ｆ３及びＧＦＰのトランスフェクション及び発現の追跡を可能にする。この第二世代のＧＦＰベクターは、より明るい蛍光に対して最適化された野生型ＧＦＰの赤方偏移した変異体（最大励起＝４８８ｎｍ、最大発光＝５０７ｎｍ）を有する。高レベルのＰＯＵ４Ｆ３タンパク質を発現する細胞の同定を最適化するため、ｐＩＲＥＳ２ベクターは部分的に能力を喪失させたＩＲＥＳ配列を利用する（Ｒｅｅｓ，Ｓ．等、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　２０：１０２１１０（１９９６））。この減衰されたＩＲＥＳは、ＧＦＰ開始コドンにおける翻訳開始速度を、ＰＯＵ４Ｆ３遺伝子のそれよりも低下させることになる。
【００８７】
支持細胞系（ＵＣＬ）は、１１２ｋｂ−ｔｓＡ５８トランスジェニックマウス（Ｉｍｍｏｒｔａｍｏｕｓｅ）の内耳前庭感覚上皮から確立した。出生後１日のマウス由来の卵形嚢を切除し、３７℃にてサーモリシンで短時間処理した後、感覚上皮（有毛細胞及び支持細胞）を単離した。得られた支持細胞系を、急速な細胞増殖を刺激する許容的な条件（３３℃及びγＩＮＦ）で数回継代した後に誘導させた。３〜４日でコンフルエンスに達した。このプロセスによって全ての有毛細胞が死滅したことが、ＩＣＣ及び電子顕微鏡分析（ＥＭ）によって確認された。ＵＣＬは、ＺＯ−１と呼ばれる抗体（支持細胞内に存在するタイトジャンクションを標識する）及びＥＭ（タイトジャンクションの複合体、分泌小胞、及び管腔面の微絨毛（全て支持細胞に特徴的である）を示した）によってさらに特定された。
【００８８】
ＵＣＬ細胞系用培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）、ウシ胎児血清（１０％）及びγＩＮＦ（２０ｕ／ｍｌ）からなった。培地は、細胞の増殖速度に応じて週に２〜３回交換した。３〜４週で単細胞をコンフルエントかつ継代可能にすることができる特殊な接種法を用いて単細胞クローンを発生させた。非許容的条件（３７℃又は３９℃、γＩＮＦ無し、ＦＢＳは少量又は無し）では、細胞増殖は停止する。
【００８９】
高いトランスフェクション効率がＵＣＬにすでに観察されれば、血清のない限定された培地中でこれらの細胞を増殖させ、継代する。これが確立されると、これらの細胞は、プラスミドをコードするＩＲＥＳ−ＧＦＰ−ＰＯＵ４Ｆ３でリポフェクション処理される。１〜６ＤＩＶにわたりＧＦＰの発現に関して培地をモニターする。生培地中にＧＦＰの蛍光が高い期間が観測されたら、培地を固定し、ＰＯＵ４Ｆ３及びカルビンジンＩＣＣ用に調製する。
【００９０】
例２
破壊されたコルチ器の培養物におけるＰＯＵ４Ｆ３の過剰発現
Ｐ７〜Ｐ１４マウス由来の培養物を置床し、１ｍＭのネオマイシンを用いて２ＤＩＶにわたり組織を破壊する。培地を取り出し、培養物をｐＩＲＥＳ２−ＧＦＰ−ＰＯＵ４Ｆ３で６時間リポフェクション処理し、１〜６ＤＩＶの間新鮮な培地中で回復させる。培養物をアルデヒドで固定し、ＰＯＵ４Ｆ３及びカルビンジン免疫細胞化学法のために処理する。ｐＩＲＥＳ２−ＧＦＰのみでリポフェクション処理した培養物をコントロールとする。三重標識した細胞（ＧＦＰ、ＰＯＵ４Ｆ３、及びカルビンジン免疫反応に対し陽性）が存在することは、破壊されたコルチ器において、ある有毛細胞の表現型が採り入れられるのをＰＯＵ４Ｆ３が促進できることを示している。ミオシン６及びミオシン７ａなどのタンパク質に対して誘導されるポリクロナール抗体を使用し、ミオシン６及びミオシン７ａなどの他の有毛細胞に選択的なマーカーに対する抗体を用いることによって、この表現型の測定がさらに確実なものとなる。
【００９１】
ミオシン６及びミオシン７ａなどの、有毛細胞に特異的なマーカーの発現は、Ｂｒｎ３．１転写因子の発現がＥ１３．５に始まってから２〜３日後のＥ１６の時点で、マウス胎児のコルチ器において観察される。
【００９２】
例３
ｐ２７Ｋｉｐ１−／−マウスにおける内耳有毛細胞の再生
ｐ２７Ｋｉｐ１−／−及び＋／−のマウスにおける以前の報告では、内耳有毛細胞（ＩＨＣ）と外耳有毛細胞（ＯＨＣ）の両領域中に過剰な有毛細胞（ＨＣ）が存在という定性的な証拠が示された。（Ｃｈｅｎ，Ｐ．，Ｓｅｇｉｌ，Ｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１２６：１５８１〜１５９０（１９９９）；Ｌｏｗｅｎｈｅｉｍ，Ｈ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９６：４０８４〜４０８８（１９９９））。残念ながら、これらの観察結果の全部ではないが幾つかは、周囲の支持細胞の著しい過形成によって極めて十分に説明された。そのため、ｐ２７Ｋｉｐ１−／−、＋／−、及び＋／＋のマウスの蝸牛中のＩＨＣ及びＯＨＣの数を測定した。ＨＣの数が真に増加したかどうかをさらに正確に評価するために、同一の蝸牛由来の領域を幾つか分析した。ＨＣに特異的なマーカーであるミオシンＶＩＩａ抗体を用いて、ｐ２７Ｋｉｐ１−／−の蝸牛におけるＩＨＣの数が、ｐ２７Ｋｉｐ１＋／−及び＋／＋の蝸牛におけるそれと比較して、２０％増加したことが観測された。しかし、一つの分析領域でＯＨＣの数が１０％増加した以外には、ｐ２７Ｋｉｐ１−／−、＋／−及び＋／＋の蝸牛のＯＨＣの総数に統計的な有意差はなかった（表１）。表１に、４週齢のｐ２７Ｋｉｐ１＋／＋、＋／−、−／−のマウスにおける有毛細胞の数（ｎ）を示す。コルチ器の長軸に沿って、異なる３つの部位から得られた１００μｍの長さの感覚上皮について計数を実施した。距離は蝸牛の頂端からの角度に相当する（±標準偏差）。＋／＋、＋／−、及び−／−間の同じ有毛細胞領域を比較した。統計的な有意性を、ＡＮＯＶＡを用いて決定した。
【００９３】
【表１】
2004502785.tif 000003
【００９４】
聴覚の有毛細胞が、出生から１０日目に聴覚が発生した後で生成されたのかどうかを決定するために、Ｓ期の間に増殖細胞に取り込まれるヌクレオチド類縁体であるブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ；３０ｍｇ／ｋｇ／ｓ．ｃ）を、２週齢のｐ２７Ｋｉｐ１−／−、＋／−及び＋／＋のマウス（Ｐ１０〜１２）に１日に３回全身投与した。次いで、それ以上の注射をせずに２日間又は２週間マウスを回復させた。光学及び蛍光顕微鏡法を用いた免疫細胞化学法によって、ＢｒｄＵ陽性のＨＣを同定した。蝸牛もミオシンＶＩ及びミオシンＶＩＩａに対する抗体で標識された。最後の注射後に２日間回復させた２週齢のｐ２７Ｋｉｐ１−／−の蝸牛においては、ＢｒｄＵに陽性な細胞の中にＢｒｄＵ／ミオシンＶＩＩａに陽性な細胞は観測されなかった。しかし、最後の注射から１４日間回復させた４週齢のｐ２７Ｋｉｐ１−／−の蝸牛においては、ＢｒｄＵ／ミオシンＶＩＩａに陽性なＨＣが観測された。これらの二重標識されたものの大部分はＩＨＣであった。この定性的な知見は、本発明者らのＩＨＣ数及びＯＨＣ数の定量的な評価と類似している。ｐ２７Ｋｉｐ１＋／−、＋／＋のマウスでは、２日及び１４日の回復の時点でＢｒｄＵに陽性な細胞が全くなかった。これらのデータを表２にまとめる。表２は、ＢｒｄＵ又はＢｒｄＵ／アミカシンを注射し、２日又は１４日回復させた２週齢及び４週齢のｐ２７Ｋｉｐ１＋／＋、＋／−及び−／−のマウスのコルチ器内に存在するＢｒｄＵ被標識細胞の数（ｎ）を示している。蝸牛の頂端側の半分から採取された１０００μｍの長さの感覚上皮に対して計数を行った（±標準偏差）。＋／＋、＋／−、及び−／−間でＢｒｄＵのグループにおける増殖を比較した。ＢｒｄＵ／アミカシンのグループにおける増殖を、同じ遺伝子型のＢｒｄＵのみのグループにおける増殖と比較した。ＡＮＯＶＡを用いて統計的な有意性を決定した。
【００９５】
【表２】
2004502785.tif 000004
【００９６】
聴覚のＨＣを再生することができるかどうかを確認するために、硫酸アミカシンを全身注射し（Ｐ７〜Ｐ１２）、次いでＢｒｄＵを注射して（Ｐ１０〜Ｐ１２）ＨＣを破壊した。最後の注射から２日又は１４日のいずれかにマウスを屠殺した。アミカシンの組織破壊効果は少なくとも２倍であった。第一に、ｐ２７Ｋｉｐ１−／−及び＋／−の両マウスにおいて、ＢｒｄＵのみの処置に比べて、アミカシン／ＢｒｄＵ処置後にＢｒｄＵに陽性な細胞の数が増加した。ｐ２７Ｋｉｐ１＋／−の蝸牛では、ＢｒｄＵによって標識された細胞の数は検査した試料の多くで増加したが、すべてのｐ２７Ｋｉｐ１＋／−の蝸牛がＢｒｄＵに陽性な細胞を示したわけではない。ＨＣが再生したという証拠は、標識された蝸牛を解剖することによって確認した。第二に、ｐ２７Ｋｉｐ１−／−の蝸牛においてアミカシンによる組織破壊後に、より多数のＢｒｄＵに陽性なＨＣが観測された。ＢｒｄＵに陽性なＨＣの大多数は、硫酸アミカシンがＨＣを損傷又は死滅させた蝸牛領域（蝸牛の基底側の半分）に現れた。ＢｒｄＵに陽性な細胞は、アミカシン／ＢｒｄＵ又はＢｒｄＵのみを処置した後の野生型の蝸牛には観測されなかった。これらのデータを表２にまとめる。
【００９７】
特異的なタンパク質のレベルを測定するために、単一の蝸牛ライセートを連続的に希釈し、ポリアクリルアミドゲルの上を泳動させた。ｐ２７Ｋｉｐ１−／−の蝸牛から、より強いミオシンＶＩＩａバンドが観測されたが、ミオシンＶＩ及びＶＩＩａのレベルは、ｐ２７Ｋｉｐ１−／−、＋／−、及び＋／＋の蝸牛の間でほぼ等しく見えることがウェスタンブロット法によって示された。ｐ２７Ｋｉｐ１＋／−の蝸牛は、野生型の蝸牛において見られるｐ２７Ｋｉｐ１タンパク質レベルの約５０％を含有しており、硫酸アミカシン処理後に、ｐ２７Ｋｉｐ１が正常値の５０％に低下することによって、支持細胞の増殖が刺激され、ある程度の有毛細胞の再生を起こさせ得ることが示唆された。
【００９８】
蝸牛のタンパク質レベルを測定するために使用した手順は以下の通りである。ＨＥＰＥＳ（２５ｍＭ）、ＮＰ−４０（０．７％）、アプロチニン（１ｍＭ）、ロイペプチン（１μｇ／ｍｌ）、ペプスタチン（１０μＭ）、フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）（１ｍＭ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（１ｍＭ）、及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（２ｍＭ）を含有する１０μｌの抽出緩衝液を用いて、蝸牛をチューブに移す。蝸牛を直ちにホモジナイズし、チューブを氷上に約３０分間放置する。５μｌの４Ｘサンプル緩衝液を添加し、塩濃度を０．５Ｍまで調節する。サンプルを９０〜１００℃に５分間加熱し、次いで１３，０００ｒｐｍにて１０分間遠心し、上澄みを回収する。上澄みからの一定分量のタンパク質を取り、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの上で２００Ｖにて５０分間泳動させ、タンパク質をＰＶＤＦメンブレン上に１００Ｖにて１時間転写する。メンブレンは、１０％Ａｍｅｒｓｈａｍ製ブロッキングバッファーで１時間又は一晩ブロックしたものである。ブロッキングバッファー中の一次抗体をメンブレンに１時間適用し、次いでメンブレンをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで５回（１回当たり５分間）洗浄する。ヤギ抗マウス又はヤギ抗ウサギアルカリホスファターゼと抗ビオチンＡＰとを用いてメンブレンを１時間プローブし、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで５回（１回当たり５分間）洗浄する。
【００９９】
末梢前庭器官においてｐ２７Ｋｉｐ１が同様の役割を果たすかを判定するために、ｐ２７Ｋｉｐ１＋／−及び＋／＋のマウスの卵形嚢、球形嚢、及びクリステの増殖能力を調べた。マウス（Ｐ７〜Ｐ１２）に硫酸アミカシン（５００ｍｇ／ｋｇ／ｄ／ｓ．ｃ）を６日連続して全身注射し、Ｐ１０〜Ｐ１２の間に、複製マーカーであるブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ；３０ｍｇ／ｋｇ／ｄ／ｓ．ｃ）も注射した。マウスには、ＢｒｄＵのみも同様にして注射した。次いで、１４日後にマウスを屠殺し、前庭の感覚器官を固定し、解剖し、ＢｒｄＵの免疫細胞化学法のために処理した。ＢｒｄＵに陽性な核を光学顕微鏡法及びノマルスキーオプティクスを用いて、全検鏡板からカウントした。一部の器官を断面分析のためにさらに処理した。
【０１００】
ＢｒｄＵのみを投与したｐ２７Ｋｉｐ１−／−のマウスでは、球形嚢及び卵形嚢においてごく低レベルのＢｒｄＵ標識細胞が観測された。しかし、アミカシン／ＢｒｄＵの併用処理後には、両器官でＢｒｄＵに陽性な細胞の数が４０倍に増加した。標識された細胞のおよそ半分がダブレットとして出現し、細胞分裂の直後か、又は分裂中であることを示唆した。プラスチックの断面から、ＢｒｄＵによって標識された細胞の大多数が、感覚上皮の基底層内の、基底膜に沿って存在することが判明した。ＢｒｄＵに陽性なＨＣは、何れの耳石器官にも観察された。これらの再生されたＨＣの大部分は、杯細胞（ｃａｌｙｘ）と接触しているタイプＩのＨＣとして現れた。ＢｒｄＵのみを投与したｐ２７Ｋｉｐ１＋／−のマウスでは、球形嚢又は卵形嚢のいずれにも増殖は観察されなかった。アミカシン／ＢｒｄＵの併用処理後は、ごく低レベルの増殖が誘導された。ｐ２７Ｋｉｐ１＋／＋のマウスでは、アミカシン／ＢｒｄＵ又はＢｒｄＵのみで処理した後に、球形嚢又は卵形嚢のいずれにもＢｒｄＵに陽性な核は観察されなかった。興味深いことに、アミカシン／ＢｒｄＵ又はＢｒｄＵのみで処理した後には、いずれの遺伝子型のクリステにもＢｒｄＵに陽性な細胞は観察されなかった。これらのデータは、様々な前庭の感覚器官の中で、及び前庭の感覚器官とコルチ器との間で、ｐ２７Ｋｉｐ１を欠失する際の効果が極めて異なることを示唆している。これらのデータを表３にまとめる。表３は、ＢｒｄＵ又はＢｒｄＵ／アミカシンを注射し、その後１４日間回復させた４週齢のｐ２７Ｋｉｐ１＋／＋、＋／−、及び−／−のマウスの前庭器官内のＢｒｄＵ標識細胞の数を示す。卵形嚢、球形嚢、クリステの感覚上皮全体からカウントを行った（±標準偏差）。ＢｒｄＵ群では、＋／＋，＋／−、及び−／−の間の同じ感覚器官における増殖のレベルを比較することによって、統計的な有意性を決定した。ＢｒｄＵ／アミカシン群では、同一遺伝子型の同一感覚器官における増殖レベルを比較することによって、統計的な有意性を決定した。統計的有意性はＡＮＯＶＡを用いて決定した。
【０１０１】
【表３】
2004502785.tif 000005
【０１０２】
やや薄い切片を選択してプラスチックに再度包埋し、薄片に切り、電子顕微鏡下で検査した。ＢｒｄＵに陽性なＨＣは、不動毛の束、クチクラのプレート、シナプスの形成を証拠付ける杯細胞の（ｃａｌｙｃｅａｌ）神経支配を示した。
【０１０３】
例４
ｐ２７Ｋｉｐ１発現のアンチセンス阻害
ｐ２７Ｋｉｐ１＋／＋の蝸牛においてｐ２７Ｋｉｐ１の遺伝子産物を阻害することが非有糸分裂の支持細胞の増殖を可能にするかどうかを試験するために、野生型コルチ器の外植片（Ｐ７〜Ｐ１０、聴覚が発生した年齢）をｐ２７Ｋｉｐ１アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＮｓ）で処理した。外植片の培養物は、蝸牛からコルチ器を解剖し、蓋膜を除去し、Ｃｅｌｌ−ｔａｋで被覆されたガラススライドにコルチ器を接着させることによって置床し、３７℃にて５％ＣＯ２環境に維持した。次いで、９５％を超えるＨＣを死滅させる聴器毒性抗生物質（１ｍＭ硫酸ネオマイシン）に外植片を４８時間曝した（Ｋｉｌ，Ｊ．等、ＡＲＯ　ａｂｓ．，２１：６７２（１９９８））。次いで、ネオマイシンを含有する培地を除去し、ｐ２７Ｋｉｐ１アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｏｎｓ）（４０ｎＭ）をカチオン性脂質を用いて２４〜４８時間にわたって投与した（リポフェクション）。これらの生きている培養物の幾つかを蛍光下で検査して、ＦＩＴＣと抱合されたアンチセンスＯＮの存在を検出した。
【０１０４】
ＦＩＴＣに陽性な支持細胞は１８〜２４時間で検出され、２４〜４８時間の間にその数と蛍光強度が増加した。培養物をアルデヒドで固定し、ＢｒｄＵの免疫細胞化学法のために処理した。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＮ）処理の２４時間後に、ほとんどの蝸牛培養物においてＢｒｄＵに陽性な支持細胞が出現した。アンチセンスＯＮで処理し、アンチセンスＯＮ無しでさらに２４時間回復させた培養物中に、ＢｒｄＵに陽性なダブレットが出現した。このことから、Ｍ期がうまく完結し、続いて細胞分裂が起こり得ることが示唆された。リポフェクションのみで処理された培養物は、ＢｒｄＵによって標識されたごく少量の支持細胞を含有していた。
【０１０５】
本発明者らは、ｐ２７Ｋｉｐ１アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与すると、野生型の蝸牛において支持細胞の増殖を誘導できることを認めた。この知見はユニークで相当に重要なものである。ｐ２７Ｋｉｐ１アンチセンスＯＮが増殖を誘導することを実証した以前の研究は、一過性に又は可逆的に増殖が停止した、活発に分裂する細胞において見られた（Ｃｏａｔｓ，Ｓ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２：８７７〜８８０（１９９６）；Ｄａｏ，Ｍ．Ａ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１３００６〜１３０１１（１９９８））。本発明者らの結果は、最後まで分化した器官中に存在する有糸分裂の終了した細胞が、ｐ２７Ｋｉｐ１の遺伝子産物を阻害すると、再度細胞周期に入ることを初めて実証した。
【０１０６】
また、支持細胞の増殖は、マウスのコルチ器では、通常はＥ１２〜１４の間に停止する。この時点以降、支持細胞の分化は出生後生活期間の第２週を通して継続する。外植の時には、本明細書に記載の処理を行なった培養物は、やや成熟した形態的諸特性をすでに発達させている。これらのデータは、有毛細胞の再生を誘導することが可能な手段としてのｐ２７Ｋｉｐ１アンチセンスＯＮの役割をさらに支持するものである。ｐ２７Ｋｉｐ１＋／−のマウスにおいては、タンパク質の量が正常値の５０％に低下すると、最後まで分化した支持細胞の幾つかが、ｐ２７Ｋｉｐ１の遮断を克服して再度細胞周期に入って、増殖することが可能になる。
【０１０７】
出生後のコルチ器では、他の上皮器官で細胞の増殖を誘導する増殖因子を添加しても、細胞の増殖又は有毛細胞の再生をインビトロ又はインビボのいずれにおいても促進しない。本明細書に報告する実験では、その欠失によりコルチ器がその有毛細胞の一部を自発的に再生することを可能にする、やや遍在性の強力な細胞周期阻害剤を同定した。１コピーの遺伝子及び正常値の５０％の量のタンパク質を含むマウスのコルチ器では、聴覚の有毛細胞を再生することが可能である。
【０１０８】
さらに、１ｍＭのネオマイシンを含有する１００μｌのＮｅｕｒｏＢａｓａｌ培地（Ｇｉｂｃｏ）中のＣｅｌｌＴａｋ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で被覆したガラススライド（Ｎｕｎｃ）上に器官型の培養物を確立させることができる。この処理によって有毛細胞の９５％が死滅し、トランスフェクションのレベルも亢進される。培養物は、市場で入手可能なリポフェクション試薬（例えば、Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ；ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いて、アンチセンス分子によりリポフェクションされる。培地は、増殖細胞を同定するためにＢｒｄＵ（１０μＭ）も含有する。さらに、この増殖効果を増加又は促進させるために、ＴＧＦ−α（１〜１００ｎＭ）、インシュリン（１０〜１００μＭ）、及びＩＧＦ−１（１〜１００μＭ）などの様々な組換え増殖因子を使用することができる。
【０１０９】
例５
モルモットの繊維芽細胞系における細胞増殖をインビトロで刺激するためのｐ２７Ｋｉｐ１アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用
血清の除去及び増殖の停止期間にｐ２７Ｋｉｐ１アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＮ）に反応する細胞系培養物を確立した。これらの培養物にはモルモットの繊維芽細胞系（ＪＨ４）が含まれる。１６マーアンチセンスＯＮ（配列番号２０に示す核酸配列を有する）のリポフェクションは、ＪＨ４細胞系において停止していた増殖を、正常値の４０％以上にまで増大させた。
【０１１０】
例６
モルモットの蝸牛におけるｐ２７Ｋｉｐ１アンチセンス分子を用いた支持細胞の増殖の刺激
アンチセンスＯＮが外リンパ腔を通して首尾よく送達でき、成熟したモルモットのコルチ器に変化を誘発できることが最近の独立した２つの研究で示された（Ｄ’Ａｌｄｉｎ，Ｃ．等、Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．，５５：１５１〜１６４（１９９８）；Ｌｅｂｌａｎｃ，Ｃ．Ｒ．等、Ｈｅａｒ．Ｒｅｓ．，１３５：１０５〜１１２（１９９９））。らせん状の神経節、支持細胞、並びに内部及び外部らせん状溝細胞（ｓｕｌｃｕｓ　ｃｅｌｌ）中に、浸透圧ポンプの設置後２４時間以内に、ＧｌｕＲ２のｍＲＮＡの特異的配列に対するＦＩＴＣアンチセンスＯＮが存在することが認められた。それに続くＧｌｕＲ２／３タンパク質の選択的な減少も、インサイチュで観測された（Ｄ’Ａｌｄｉｎ等、１９９８、同上）。
【０１１１】
成熟モルモットのコルチ器におけるｐ２７Ｋｉｐ１の発現パターンは、発育中及び成熟したマウスに観察されるものと類似していることが見出された。モルモットの蝸牛における支持細胞の増殖は、以下のように刺激される。
【０１１２】
すなわち、イソフルラン（誘導用に５％、維持用に２〜３％）の吸入によって又はケタミン（５０ｍｇ／ｍｇ）及びキシラジン（９ｍｇ／ｋｇ）の筋肉注射によって、全身麻酔をかける。耳介の後部に局所的に１％リドカインを注射する。動物を暖かなパッドの上に置いて手術中の基礎体温を一定に維持する。呼吸及び循環を注意深くモニターする。カテーテルのコイル及び浸透圧ミニポンプ（ＡＬＺＥＴ、カタログ番号２００２、最長１４日間の流速０．５μｌ／ｈ）からなる注入ユニットを外科的に移植することによって、モルモットの内耳の中に薬物を送達した。コイルには薬物が充填されており、浸透圧ミニポンプは色素を輸送する。内耳に送られる薬物の総量は、コイルに送られる色素の量によりモニターすることができる。薬物は、１３７ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１１ｍＭのグルコースからなり、ｐＨが７．４で浸透圧モル濃度が３００ｍＯｓｍ／ｌの人工の外リンパ溶液に溶解させる。
【０１１３】
外科的処置はすべて、解剖顕微鏡の下、無菌状態で行なわれる。耳後部の切開によって乳様突起状の気腫性嚢胞（中耳腔）を露出させ、１ｍｍの切断バーを使用して開口させ、蝸牛基底回転が見えるようにする。０．５ｍｍのダイヤモンドバーを用いて、正円窓の約１ｍｍ下方に蝸牛開窓部を設けた。この部位から内耳の外リンパ液が洩れるのが観察されれば、蝸牛開窓部の位置が正しいことが確認される。注入ユニットの先端部を蝸牛開窓部の中に挿入し、チューブを歯科用セメントによって中耳の壁面に固定する。注入ユニットを頸部の後に設けた皮下ポケットの中に格納する。皮膚の切開部を２−０絹糸で層状に縫合する。その後のあらゆる平衡失調又は回転動作を避けるために、また実験を完結させるのに必要な動物の数を削減するために、この処置を両方の耳に施す。この処置は片側当たり約３０分を要する。
【０１１４】
注入ユニットを交換するための反復手術は、移植１週後に全身麻酔をして行なう。この処置は、最初の耳後部の皮膚切開によってのみ行なわれ、中耳腔へ再び入ることはない。この処置は、注入ユニット当たり５〜１０分かかる。活動性、食欲、飲水、糞便、及び体重を点検することによって、動物の術後の状態を毎日モニターする。術後動物の体重が２０％以上減少した場合、或いは極度の回転動作や頭部傾斜を示した場合には、動物を屠殺する。手術の不快感は生じていないはずであり、この処置は術後の不快感を僅かに生ずるにすぎない。
【０１１５】
下記表４に示すように、正常な対照動物には人工の外リンパ溶液を１又は２週間与えた。有毛細胞の損失グループには、硫酸ゲンタマイシンを１週間投与して有毛細胞を死滅させ、すぐに屠殺するか、２週間回復させた。徐々に且つ全て喪失させるはずである３通りの濃度を使用した。５％（ｗ／ｖ）デキストロース溶液中のカチオン性リポソームを１〜２週にわたり送達した。このグループの目的はリポフェクションによって何らかの損傷が起きないかを調べることである。有毛細胞を喪失した後のリポフェクションでは、ゲンタマイシン含有ポンプを脂質含有ポンプと置き換える。有毛細胞を損失した後のリポフェクション＋アンチセンスでは、さらに１週間ＦＩＴＣアンチセンスをリポフェクションする。損傷後のリポフェクション＋アンチセンス＋増殖因子では、１週間の送達後に、アンチセンスと増殖因子のリポフェクションをさらに１週間続ける。幾つかのグループでは、アンチセンスとＴＧＦ−α、インシュリン、及びＩＧＦ−１を含む増殖因子との併用を要する。すべての動物において、ＢｒｄＵを充填した個別の浸透圧ポンプを皮下に移植して、有糸分裂が活性な細胞の同定を可能にしている。
【０１１６】
【表４】
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【０１１７】
ゲンタマイシンに起因する有毛細胞の損傷は、全載染色法を用いて、ミオシンＶＩＩａ（有毛細胞に特異的なマーカー）の免疫細胞化学法及びファロイジン（Ｆ−アクチンのマーカー）の組織化学法により点検した。リポソーム及びｐ２７Ｋｉｐ１アンチセンスオリゴヌクレオチドのトランスフェクション効率は、ＦＩＴＣによって標識された核の存在を落射蛍光の下で観察することによって評価する。ＢｒｄＵの免疫組織化学法は、増殖がｐ２７Ｋｉｐ１アンチセンスＯＮ処理によって誘導されたかどうかを決定するために使用する。試料を選択し、電子顕微鏡法によって分析する。
【０１１８】
有毛細胞総数に対する新しい支持細胞の数を評価するために、ＢｒｄＵ及びミオシンＶＩＩａを用いた二重標識を使用して幾つかの実験を行なう。
【０１１９】
新しい支持細胞の数を定量するために、ＢｒｄＵ及びビメンチンを用いた二重標識を使用して別の実験を行なう。ＢｒｄＵ、ビメンチン、及びミオシンを用いた二重標識は、新しい支持細胞の数と新しい有毛細胞の数とを識別する。哺乳類におけるコルチ器の支持細胞の増殖及び聴覚の有毛細胞の再生に対するベースラインは０であり、その結果、観測される少数の事象で、片側ＡＮＯＶＡを用いて、統計的有意性をより容易に達成できるようになる。
【０１２０】
例７
モルモットにおける聴器毒性傷害及び／又はｐ２７Ｋｉｐ１アンチセンス処理後の聴覚機能の評価
聴器毒性傷害及び／又はｐ２７Ｋｉｐ１アンチセンス処理した後のモルモットにおいて、聴性脳幹反応（ＡＢＲ）を試験する。ある期間にわたり同じ動物の中で、並びに同じ又は異なるグループの動物にわたってＡＢＲの閾値を比較する（手術前及び手術後）。各刺激の回数及び強度に対する片側分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて有意性を決定する。ｐ値が０．０５未満の差異を統計的に有意と見なす。従前の研究からこの操作は、術後のＡＢＲ反応を減衰させないことが判明している。
【０１２１】
誘発されたＡＢＲを記録するために、モルモットにアベルチン（１．２％原液で０．２ｍｌ／体重１０ｇ／ｉ．ｍ．）で麻酔をかける。外耳道近くの皮下に探査電極を取り付ける（０．１ｍｍ銀線；Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ）。ブレグマの吻側にドリルで開けた穴（又は、耳道内へ挿入したイヤホン及び耳介に手術用テープで固定した音を伝達するチューブ）にジュラルミンの参照電極を配置する。接地電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ２ペレット）を背後に固定する。音刺激は、１００μｓ間の広帯域のクリック音又は１０ｍｓのトーンバースト（上昇／下降時間　１ｍｓ）のいずれかである。音が減衰されるチャンバー（ＴＤＴモデルＡＣ−１）内にモルモットを置く。聴覚誘発反応ワークステーション（Ａｕｄｉｔｏｒｙ　Ｅｖｏｋｅｄ　Ｒｅｓｐｏｎｓｅ　Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ）（ＳｍａｒｔＥＰ；Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ　Ｈｅａｒｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて反応を測定し記録する。クリック音及びトーンバーストの両刺激ともに、２０から８５ｄＢに５ｄＢ刻みで増加する一連の刺激強度の中にモルモットを置く。トーンバーストの場合、５０ｄＢの一定強度の一連の刺激周波数（１、２、４、８、１６、３２Ｈｚ）も使用する。刺激は１秒間に５回繰り返し、合計５１２回の試験を平均することになる。閾値は、反復可能で視覚的に検出可能なＡＢＲを誘発できる最低強度として定義される。
【０１２２】
例８
硫酸アミカシンで処理したｐ２７ヘテロ接合体マウスにおける聴覚機能の改善　この例ではアミカシンで処理してから４週後にさらに回復の時間を与えた以外は、本明細書の表２で報告した実験に記述したマウスと同じように実験動物を処理した。イソフルランで麻酔をかけたマウスにおいて、頭部３箇所に設置した皮下記録電極を用いた聴性脳幹反応（ＡＢＲ）を利用して聴覚機能を測定した。音の強度の閾値は、単一の周波数を異なる音の強度として出すことによって決定した（強度はデシベルを単位として測定した）。ＡＢＲを誘発するのに要するトーン強度が高いほど、聴覚の閾値がより高く、すなわち聴覚機能が劣る。図３〜６に示したデータは、ｐ２７ヘテロ接合体マウスの８匹のうち５匹で聴覚が改善したことを示している（Ｐ＜０．００１）。
【０１２３】
本明細書の表２では、ＢｒｄＵ標識及び形態学的基準によって評価したところによれば、１０匹のｐ２７ヘテロ接合体マウスのうち５匹で、内部細胞の増殖が再生することが証明された。これらのデータから、ＢｒｄＵによって標識された細胞の大部分が支持細胞であり、有毛細胞ではないことが示された。したがって、ｐ２７ヘテロ接合体マウスにおける聴覚機能の改善は、支持細胞のみが再生し、又は支持細胞が有毛細胞とともに再生したことによるものかもしれない。
【０１２４】
例９
マウスのコルチ器の培養系における遺伝子送達及び遺伝子発現のリポフェクション方法
コルチ器をリポフェクションするために、生後７〜１４日のマウスから得た、通算で最長８日間インビトロ（ＤＩＶ）で増殖させた蝸牛の外植片を利用した。培養物は、Ｂ２７サプリメントを補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｇｉｂｃｏ）で構成される規定の培地中で増殖させた。培養物を、内耳の感覚性の有毛細胞を選択的に死滅させるアミノグリコシド抗生物質に曝した（１ｍＭ硫酸ネオマイシンに４８時間）。次いで、Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）の８つの異なる脂質の組み合わせを試験した。ＣＭＶ即時型／初期遺伝子プロモーター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）によって駆動されるβ−ガラクトシダーゼのレポーター遺伝子をコードする細菌のプラスミドを６時間にわたって送達した。培養物をアルデヒドで固定し、β−ガラクトシダーゼの発現のためにｘ−ｇａｌによる組織化学法を用いて処理した。Ｘ−ｇａｌ標識が支持細胞中に出現した（未破壊組織では長さ１０００μｍ当たり５〜１０の細胞が標識されたのに対して、有毛細胞を以前に含有していた感覚上皮領域では長さ１０００μｍ当たり５４．３＋／−１５．３の細胞が標識された）。
【０１２５】
β−ガラクトシダーゼの発現を検出するのに要する労力、構築物をコードするβ−ガラクトシダーゼの大きさ（すなわち４．１ｋｂｐ）、及びこの技術と他の所望のＩＣＣ手順との互換性が低いことを考え、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）をコードするプラスミドで培養物をリポフェクションした。ＧＦＰの検出には、標準のＦＩＴＣフィルターセット（励起最大４８８ｎｍ、発光最大５０９ｎｍ）が必要であり、ＡＡＶベクターシステムを使用して、蝸牛の有毛細胞、支持細胞及び神経細胞内に首尾よく移入された。
【０１２６】
本発明者らの繁殖コロニー由来のＰ７〜Ｐ１４Ｓｗｉｓｓ　Ｗｅｂｓｔｅｒマウスから置床させたコルチ器の培養物を、多様な市販のリポフェクション試薬（すなわち、ＦｕＧＥＮＥトランスフェクション試薬；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いてリポフェクションする。これらの効率を、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ　Ｋｉｔによって達成されたトランスフェクション効率と比較する。外植片の中央から採取した長さ１０００μｍにわたってコルチ器内のＧＦＰに陽性な細胞の数をカウントして、より優れたリポフェクション試薬及びより優れた脂質とＤＮＡとの比（３：１、６：１、９：１）を決定する。細胞をカウントする画像処理ソフトウェアプログラムに画像を直接出力するＣＣＤデジタルカメラを装備したＮｉｋｏｎ落射蛍光顕微鏡を用いて細胞を可視化する。
【０１２７】
次に、有毛細胞のアミノグリコシド抗生物質による組織破壊を後続のリポフェクションと組み合わせる。有毛細胞を死滅させるために、１ｍＭの硫酸ネオマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含有する培地を、４８期間にわたって培養物内に投与する。新生児のマウス由来の培養物とは異なり、聴覚器官の発達した生後２週のマウスは、この濃度のネオマイシンにより容易に影響を受けて、カルビンジン免疫反応及びプラスチック断面分析で測定して９５％を超える有毛細胞が失われることになる。残りの支持細胞を、ＧＦＰをコードするプラスミドを用いて６時間にわたりリポフェクションする。さらに１〜４ＤＩＶの間（合計３〜６ＤＩＶ）、新鮮な培地中で培養物をリンスし増殖させる。培養物をアルデヒドで固定し、ＧＦＰを落射蛍光の下で直接可視化する。アルデヒドで固定した後にＧＦＰの蛍光が失われることを示した報告が幾つかなされている。このため市販のＧＦＰの抗生物質（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を使用して、リポフェクションした細胞の蛍光を増大させることが必要になるかもしれない。
【０１２８】
例１０
マウスの内耳の切除法とインビトロでの培養
マウスの内耳を以下のようにして切除した。生後７〜１４日のＳｗｉｓｓ　Ｗｅｂｓｔｅｒマウスを断頭し、それらの頭蓋を７０％エタノールに５分間浸漬して消毒した。無菌条件下で、頭蓋を正中矢状軸に沿って半分に切断し、３５ｍｍのプラスチック培養皿（Ｎａｌｇｅ　Ｎｕｎｃ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０００　Ｎｏｒｔｈ　Ａｕｒｏｒａ　Ｒｏａｄ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ　６０５６３）中の３ｍｌの培地（ｐＨ７．４のＮｅｕｒａｌｂａｓａｌＴＭ培地；Ｇｉｂｃｏ）中に置いた。手術用鉗子を用いて、内耳の骨迷路系が見えるようにして、側頭骨から切り離した。重なった結合組織、あぶみ骨、顔面神経、及びあぶみ骨動脈を除去した。細い鉗子を用いて、蝸牛の側方壁の頂回転を通して直径約２ｍｍの小さな穴を開けた。蝸牛の開存性卵円又は正円窓と共に、この外科的に設けられた導管により、体液で満たされた内耳内に培地が容易に拡散できるようになる。
【０１２９】
一般には、前述のようにして切除して調製した内耳を、Ｎ２又はＢ２７培地サプリメント（いずれもＧｉｂｃｏ−ＢＲＬによって販売されている。カタログ番号１７５０４−０３６）のいずれか、１０Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び０．２５μｇ／μｌのフンギゾンを補充した５０又は５５ｍｌのＮｅｕｒａｌｂａｓａｌＴＭ培地を含むＨＡＲＶＴＭ又はＣＣＣＶＴＭ容器に移す。Ｂ２７サプリメントは、５０Ｘ濃度として販売され、０．５Ｘ（例えば、５０ＸのＢ２７原液５５０μｌを５５ｍｌのＮｅｕｒａｌｂａｓａｌＴＭ培地に添加する）の使用濃度で使用する。Ｎ２サプリメント原液は１００Ｘ濃度であり、１Ｘ（例えば、１００ＸのＮ２原液５５０μｌを５５ｍｌのＮｅｕｒａｌｂａｓａｌＴＭ培地に添加する）の使用濃度で使用する。次いで、その容器を３７℃で９５％空気／５％ＣＯ２環境の組織培養用インキュベーターに入れる。次いで、その容器を２４〜１６８時間にわたり３９ｒｐｍで回転させる。４８時間ごとに培地の５０％を交換する。１個の容器で最低２個、最高１２個の内耳を首尾よく培養することができた。
【０１３０】
内耳の感覚性の有毛細胞を破壊するために、１ｍＭの硫酸ネオマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ　１４５０８，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ　６３１７８）を含むＮｅｕｒａｌｂａｓａｌＴＭ／Ｎ２又はＢ２７培地中に２４〜４８時間内耳を放置する。この培養期間の後、培地をネオマイシンのない培地で完全に置き換える。
【０１３１】
例１１
培地
表５は、Ｇｉｂｃｏによって販売されているＮｅｕｒａｌｂａｓａｌＴＭ培地（１ｘ）の組成である。濃度はすべて使用濃度、すなわち、体液で満たされた感覚器官がインキュベートされる培地中の成分の濃度である。
【０１３２】
【表５】
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【０１３３】
以下の抗生物質をＮｅｕｒａｌｂａｓａｌＴＭ培地に添加することができる。Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬによって販売されているフンギゾン試薬（アンフォテリシンＢ　０．２５μｇ／ｍｌ、及びデソキシコール酸ナトリウム　０．２５μｇ／ｍｌ）、カタログ番号１７５０４−０３６。Ｓｉｇｍａによって販売されているペニシリンＧ（１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、カタログ番号Ｐ３４１４。Ｓｉｇｍａによって販売されている硫酸ネオマイシン（１ｍＭ）、カタログ番号Ｎ６３８６。ＮｅｕｒａｌｂａｓａｌＴＭ培地には、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）を補充してもよい。
【０１３４】
例１２
長期培養中の感覚上皮の活力度のアッセイ
本発明の一側面を実施する際に、培養容器を回転させることによって与えられる微重力環境により、感覚性の有毛細胞又は非感覚性の支持細胞が著しく劣化又は喪失することなく、内耳の感覚上皮を長い培養期間（＞１６８時間）維持することが可能となる。感覚性及び非感覚性の細胞の表面を標識するＦ−アクチン（ファロイジン−ＦＩＴＣ）用プローブを用いて、並びにカルシウム結合性タンパク質であるカルビンジンに対する有毛細胞の特異抗体を用いて感覚性の上皮を標識することにより、感覚性の有毛細胞の活性度が長期培養中持続することを実証するデータが得られた。両標識は、落射蛍光顕微鏡法の下で検出され、撮影された。
【０１３５】
内耳の感覚上皮の正常な細胞構造が維持されていることが断面のデータから示された。例えば、コルチ器は、正常な聴覚機能に必要なコルチトンネル及びニュエル腔と呼ばれる体液で満たされた幾つかの腔を有する。これらの腔は、有毛細胞と支持細胞との間に生じ、長期培養後も維持される。通常の重力環境においては（すなわち、培養容器を回転させることなく内耳が浮いている時には）、感覚性の上皮は退化し始める。回転させないと、２４時間以内には、有毛細胞は完全に失われるか細胞死の様々な末期症状を起こしているように見える。４８時間後には、支持細胞は完全に消失し、或いは存在してもコルチトンネル及びニュエル腔がすべて失われる。容器を回転させることにより、この劣化が抑制され、正常な細胞構造が維持される。
【０１３６】
本発明の好ましい実施例を図示し、説明したが、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、その中で様々な変更が可能であることが理解されよう。
【０１３７】
［配列表］
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【０１３８】
【図面の簡単な説明】
前述の側面及び本発明によって得られる数多くの利点がより容易に理解されるとともに、添付の図面と合わせて、以下の詳細な説明を参照することによって、よりよく理解できるであろう。
【図１】
図１は、コルチ器の断面を示している。
【図２】
図２は、２４時間血清飢餓状態にして、該２４時間の終わり４時間にＢｒｄＵを短時間標識させた後のＢｒｄＵ標識モルモットＪＨ４細胞の数を示している。細胞は、蛍光顕微鏡下で計数した。脂質とｐ２７ｋｉｐ１ＡＳを組み合わせることによって、１０％ＦＢＳ刺激で見られたものの４０％まで、成長停止を反転させた（ｐ＜０．０００１）。（＋）ＦＢＳ、（−）ＦＢＳなし、（ＡＳ）アンチセンスオリゴヌクレオチド、（ｌｉｐｉｄ）リポフェクション。
【図３】
図３は、マウスの内耳を硫酸アミカシンで処置してから２週後におけるマウスの右耳のＡＢＲ閾値を示している。略号は、ＡＢＲ＝聴性脳幹反応（ａｕｄｉｔｏｒｙ　ｂｒａｉｎｓｔｅｍ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ）、ｄＢ＝デシベル、ＳＰＬ＝音圧レベル、Ｗｔ＝野生型、Ｈｅｔ＝ｐ２７ヘテロ接合体、Ｋｏ＝ｐ２７ノックアウト、ｋＨＺ＝キロＨｚである。
【図４】
図４は、マウスの内耳を硫酸アミカシンで処理してから２週後におけるマウスの左耳のＡＢＲ閾値を示している。略号は、図３の説明に記載されているものと同じである。
【図５】
図５は、マウスの内耳を硫酸アミカシンで処理してから４週後におけるマウスの右耳のＡＢＲ閾値を示している。略号は、図３の説明に記載されているものと同じである。
【図６】
図６は、マウスの内耳を硫酸アミカシンで処理してから４週後におけるマウスの左耳のＡＢＲ閾値を示している。略号は、図３の説明に記載されているものと同じである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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