(57)【要約】固相刺激剤（例えば、血小板、白血球又はその両方に直接相互作用する一以上のリガンドをその表面に結合した磁性粒子、非磁性粒子又はその混合物）を用いた血小板／白血球相互作用アッセイ及びその試薬を提供する。これによって、迅速で信頼性の高い血小板／白血球相互作用のポイント・オブ・ケア評価が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板／白血球相互作用を評価する方法であって、
全血又は血液由来のサンプルを固相刺激剤に接触させる段階と、
一以上の血小板／白血球／固相刺激剤複合体の形成を検出する段階とを含み、
前記固相刺激剤は、血小板又は白血球に選択的に結合するリガンドをその表面に結合している方法。
【請求項２】
血小板／白血球相互作用を評価する方法であって、
全血又は血液由来のサンプルを固相刺激剤に接触させる段階と、
一以上の血小板／白血球／固相刺激剤複合体の形成を検出する段階とを含み、
前記固相刺激剤は、血小板又は白血球に選択的に結合するリガンドをその表面に結合している微粒子を含む方法。
【請求項３】
血小板又は白血球に選択的に結合する前記リガンドは、血漿タンパク質、血漿タンパク質フラグメント、細胞外マトリックスタンパク質、細胞外マトリックスタンパク質フラグメント及びこれらを組み合わせたものからなる群から選択されるものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
微粒子は不規則若しくは規則的な形状又は球状である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記全血又は血液由来のサンプルは哺乳類から得られるものである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳類はヒトである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
微粒子が、ポリスチレン、ラテックス、ポリカーボネート、アクリロニトリル、カルボキシレート、テフロン（登録商標）、ガラス、ナイロン、デキストラン、アガロース、アクリルアミド、シリカ、花粉、微生物、酸化鉄、非磁性金属、常磁性酸化鉄、金、白金及びパラジウムからなる群から選択される一以上の材料から作られる粒子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記接触させる段階は、攪拌、振とう、吸引、電磁場の印加、超音波、せん断力及びこれらを組み合わせたものからなる群から選択される方法によって実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記血小板又は白血球に選択的に結合するリガンドは、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ＩＩ因子、ＩＩａ因子、Ｖ因子、Ｖａ因子、ＶＩＩＩ因子、ＶＩＩＩａ因子、ＩＸ因子、ＩＸａ因子、Ｘ因子、Ｘａ因子、ＸＩ因子、ＸＩａ因子、ＸＩＩ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩＩＩ因子、ＸＩＩＩａ因子、コラーゲン、ビトロネクチン、ラミニン、オステオポンチン、フィブリリン、コンドロイチン硫酸、へパリン硫酸、前記タンパク質類のフラグメント、白血球選択性抗体及びこれらを組み合わせたものからなる群から選択されるものである、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
血小板又は白血球に選択的に結合するリガンドは、受動的吸着により又は架橋分子に結合することにより、微粒子に共有的に接着される、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記血漿タンパク質フラグメント又は細胞外タンパク質フラグメントは、組換え技術、酵素的切断又は非酵素化学的手段を用いたアミノ酸の連結によって、ペプチドの形成、ペプチド擬似体（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）の形成又はペプチドミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ）の形成により調製される、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記全血又は血液由来のサンプルが抗凝固処理されていない全血である、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記全血又は血液由来のサンプルが抗凝固処理された全血である、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記全血又は血液由来のサンプルが、軟膜に含まれる細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記全血又は血液由来のサンプルが、輸血の目的で採取された血液製剤である、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
輸血の目的で採取された前記血液製剤は、不特定ドナーの血小板（ｒａｎｄｏｍ ｄｏｎｏｒ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）、アファレーシス血小板（ａｐｈｅｒｅｓｉｓ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）、軟膜及びパックされた（ｐａｃｋｅｄ）赤血球からなる群から選択される特定の血液成分を分離するように設計された一以上の処理に更に付されたものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
全血又は血液由来のサンプルは抗凝固処理されていない全血、抗凝固処理された全血及び軟膜からなる群から選択されるものであり、全血又は血液由来のサンプルは本方法における使用前に、インビボで人工的表面に接触して置かれていたものである、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
全血又は血液由来のサンプルは抗凝固処理されていない全血、抗凝固処理された全血及び軟膜からなる群から選択されるものであり、全血又は血液由来のサンプルは本方法における使用前に、エクスビボで人工的表面に接触して置かれていたものである、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
全血又は血液由来のサンプルは抗凝固処理されていない全血、抗凝固処理された全血及び軟膜からなる群から選択されるものであり、全血又は血液由来のサンプルは本方法における使用前に、インビトロで人工的表面に接触して置かれていたものである、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
前記検出する段階は、フローサイトメトリー、細胞計数法、顕微鏡法、フォトマイクロスコピー、透過型電子顕微鏡法、走査型電子顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、ビデオ顕微鏡法、エンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、イムノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）、ゲル排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、組織化学的解析、免疫化学的解析、ポリメラーゼ連鎖反応、蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリッド形成法、サザンブロット法、ウェスタンブロット法、レーザ走査サイトメトリー、濁度測定、凝集能測定、細胞内イオン流動測定、細胞外イオン流動測定、細胞遊離物の測定、固相刺激剤／血小板／白血球凝集体サイズの測定、固相刺激剤／血小板／白血球複合体形成速度の測定及びラテックスビーズ凝集からなる群から選択される方法により実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
全血又は血液由来のサンプルは、血小板／白血球相互作用に影響を与える治療剤を用いる治療コースを受けている又は受けようとしている哺乳類から得るものであり、更に該方法は、複数の合一された懸濁液（各懸濁液は、治療中の血小板／白血球相互作用を評価するために治療コース前又は治療コース中に一定の時間間隔で哺乳類から得たサンプルを含む）の血小板／白血球相互作用の程度を測定して治療の有効性をモニターする段階を含む、請求項２記載の方法。
【請求項２２】
前記接触させる段階の中に、更に、前記全血又は血液由来のサンプル及び固相刺激剤と一定の選択された時間の間血小板／白血球相互作用に影響を与える一以上の剤を合一する段階と、前記一以上の剤を添加する前及び後の血小板／白血球相互作用の程度を測定するする段階を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
血小板／白血球相互作用アッセイ試薬であって
磁性粒子と非磁性粒子の混合物と、
白血球マーカー化合物とを含み、
前記磁性粒子はその外表面に血小板との直接相互作用に親和性を有する一定量の第一のリガンドを結合させており、前記非磁性粒子はその外表面に血小板との直接相互作用に親和性を有する一定量の第二のリガンドを結合させており、前記第一のリガンド及び前記第二のリガンドは互いに同一である又は互いに異なることができる血小板／白血球相互作用アッセイ試薬。
【請求項２４】
前記第一のリガンドが、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ＩＩ因子、ＩＩａ因子、Ｖ因子、Ｖａ因子、ＶＩＩＩ因子、ＶＩＩＩａ因子、ＩＸ因子、ＩＸａ因子、Ｘ因子、Ｘａ因子、ＸＩ因子、ＸＩａ因子、ＸＩＩ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩＩＩ因子、ＸＩＩＩａ因子、コラーゲン、ビトロネクチン、ラミニン、オステオポンチン、フィブリリン、コンドロイチン硫酸、へパリン硫酸及びこれらの活性フラグメントからなる群から選択されるものである、請求項２３に記載の血小板／白血球相互作用アッセイ試薬。
【請求項２５】
前記第一のリガンドがｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子又はその活性フラグメントである、請求項２４に記載の血小板／白血球相互作用アッセイ試薬。
【請求項２６】
前記第二のリガンドが、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ＩＩ因子、ＩＩａ因子、Ｖ因子、Ｖａ因子、ＶＩＩＩ因子、ＶＩＩＩａ因子、ＩＸ因子、ＩＸａ因子、Ｘ因子、Ｘａ因子、ＸＩ因子、ＸＩａ因子、ＸＩＩ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩＩＩ因子、ＸＩＩＩａ因子、コラーゲン、ビトロネクチン、ラミニン、オステオポンチン、フィブリリン、コンドロイチン硫酸、へパリン硫酸及びこれらの活性フラグメントからなる群から選択されるものである、請求項２３に記載の血小板／白血球相互作用アッセイ試薬。
【請求項２７】
前記第二のリガンドがｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子又はその活性フラグメントである、請求項２６に記載の血小板／白血球相互作用アッセイ試薬。
【請求項２８】
前記第一のリガンド及び前記第二のリガンドが互いに同一である、請求項２３に記載の血小板／白血球相互作用アッセイ試薬。
【請求項２９】
前記第一のリガンド及び前記第二のリガンドがそれぞれｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子又はその活性フラグメントである、請求項２８に記載の血小板／白血球相互作用アッセイ試薬。
【請求項３０】
前記第一のリガンド及び前記第二のリガンドが互いに異なる、請求項２３に記載の血小板／白血球相互作用アッセイ試薬。
【請求項３１】
前記第一のリガンド及び前記第二のリガンドの一方が、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子又はその活性フラグメントである、請求項３０に記載の血小板／白血球相互作用アッセイ試薬。
【請求項３２】
血小板／白血球相互作用アッセイ試薬であって、
磁性粒子と非磁性粒子の混合物
を含み、
前記磁性粒子か前記非磁性粒子のどちらかはその外表面に血小板との直接相互作用に親和性を有する一定量の第一のリガンドを結合させており、前記磁性粒子か非磁性粒子の他方はその外表面に白血球との直接相互作用に親和性を有する一定量の第二のリガンドを結合させている試薬。
【請求項３３】
前記第一のリガンドが、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ＩＩ因子、ＩＩａ因子、Ｖ因子、Ｖａ因子、ＶＩＩＩ因子、ＶＩＩＩａ因子、ＩＸ因子、ＩＸａ因子、Ｘ因子、Ｘａ因子、ＸＩ因子、ＸＩａ因子、ＸＩＩ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩＩＩ因子、ＸＩＩＩａ因子、コラーゲン、ビトロネクチン、ラミニン、オステオポンチン、フィブリリン、コンドロイチン硫酸、へパリン硫酸及びこれらの活性フラグメントからなる群から選択されるものである、請求項３２に記載の血小板／白血球相互作用アッセイ試薬。
【請求項３４】
前記第一のリガンドは前記非磁性粒子に結合しており、前記第二のリガンドは前記磁性粒子に結合している、請求項３２に記載の血小板／白血球相互作用アッセイ試薬。
【請求項３５】
前記第一のリガンドは前記磁性粒子に結合しており、前記第二のリガンドは前記非磁性粒子に結合している、請求項３２に記載の血小板／白血球相互作用アッセイ試薬。
【請求項３６】
前記試薬は白血球マーカー化合物を更に含む、請求項３５に記載の血小板／白血球相互作用アッセイ試薬。
【請求項３７】
前記白血球マーカー化合物が蛍光化合物である、請求項３６に記載の血小板／白血球相互作用アッセイ試薬。
【請求項３８】
血小板／白血球相互作用アッセイ方法であって、
全血又は血液由来のサンプルと血小板／白血球相互作用アッセイ試薬を振動磁界又は回転磁界の存在下接触させる段階と、
振動磁界又は回転磁界に応答した磁性粒子の運動をモニターして、全血又は血液由来のサンプル内の血小板／白血球相互作用機能の存在又は非存在、血小板／白血球相互作用のレベル又はその両方を測定する段階とを含み、
前記血小板機能アッセイ試薬は、磁性粒子と非磁性粒子の混合物と、白血球マーカー化合物とを含み、前記磁性粒子はその外表面に血小板との直接相互作用に親和性を有する一定量の第一のリガンドを結合させており、前記非磁性粒子はその外表面に血小板との直接相互作用に親和性を有する一定量の第二のリガンドを結合させており、前記第一のリガンド及び前記第二のリガンドは互いに同一である又は互いに異なることができる、血小板／白血球相互作用アッセイ方法。
【請求項３９】
前記サンプルが全血である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第一のリガンドが、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ＩＩ因子、ＩＩａ因子、Ｖ因子、Ｖａ因子、ＶＩＩＩ因子、ＶＩＩＩａ因子、ＩＸ因子、ＩＸａ因子、Ｘ因子、Ｘａ因子、ＸＩ因子、ＸＩａ因子、ＸＩＩ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩＩＩ因子、ＸＩＩＩａ因子、コラーゲン、ビトロネクチン、ラミニン、オステオポンチン、フィブリリン、コンドロイチン硫酸、へパリン硫酸及びこれらの活性フラグメントからなる群から選択されるものである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記第一のリガンドがｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子又はその活性フラグメントである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記第二のリガンドが、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ＩＩ因子、ＩＩａ因子、Ｖ因子、Ｖａ因子、ＶＩＩＩ因子、ＶＩＩＩａ因子、ＩＸ因子、ＩＸａ因子、Ｘ因子、Ｘａ因子、ＸＩ因子、ＸＩａ因子、ＸＩＩ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩＩＩ因子、ＸＩＩＩａ因子、コラーゲン、ビトロネクチン、ラミニン、オステオポンチン、フィブリリン、コンドロイチン硫酸、へパリン硫酸及びこれらの活性フラグメントからなる群から選択されるものである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記第二のリガンドがｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子又はその活性フラグメントである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記第一のリガンド及び前記第二のリガンドが互いに同一である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記第一のリガンド及び前記第二のリガンドがそれぞれｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子又はその活性フラグメントである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記第一のリガンド及び前記第二のリガンドが互いに異なる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
前記第一のリガンド及び前記第二のリガンドの一方が、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子又はその活性フラグメントである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記接触は回転磁界の存在下で起こる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
前記回転磁界は２０００〜２５００ｒｐｍで回転する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
血小板／白血球相互作用アッセイ方法であって、
全血又は血液由来のサンプルと血小板／白血球相互作用アッセイ試薬を振動磁界又は回転磁界の存在下接触させる段階と、
全血又は血液由来のサンプル内の血小板／白血球相互作用機能の存在又は非存在、血小板／白血球相互作用のレベル又はその両方を検出する段階とを含み、
前記血小板機能アッセイ試薬は磁性粒子と非磁性粒子の混合物を含み、前記磁性粒子か前記非磁性粒子のどちらかはその外表面に血小板との直接相互作用に親和性を有する一定量の第一のリガンドを結合させており、前記磁性粒子か非磁性粒子の他方はその外表面に白血球との直接相互作用に親和性を有する一定量の第二のリガンドを結合させている、血小板／白血球相互作用アッセイ方法。
【請求項５１】
前記サンプルが全血である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記第一のリガンドが、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ＩＩ因子、ＩＩａ因子、Ｖ因子、Ｖａ因子、ＶＩＩＩ因子、ＶＩＩＩａ因子、ＩＸ因子、ＩＸａ因子、Ｘ因子、Ｘａ因子、ＸＩ因子、ＸＩａ因子、ＸＩＩ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩＩＩ因子、ＸＩＩＩａ因子、コラーゲン、ビトロネクチン、ラミニン、オステオポンチン、フィブリリン、コンドロイチン硫酸、へパリン硫酸及びこれらの活性フラグメントからなる群から選択されるものである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記第一のリガンドがｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子又はその活性フラグメントである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記第二のリガンドは、白血球選択性抗体、ＶＣＡＭ−１、フィブロネクチン、ラミニン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、コラーゲン、オステオポンチン、ｖＷｆ、ビトロネクチン、トロンボスポンジン、粘膜アドレシン細胞接着分子１（ＭａｄＣＡＭ−１）、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン及びＥ−セレクチンからなる群から選択されるものである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記第一のリガンドは前記非磁性粒子に結合しており、前記第二のリガンドは前記磁性粒子に結合している、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
前記第一のリガンドは前記磁性粒子に結合しており、前記第二のリガンドは前記非磁性粒子に結合している、請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
前記血小板／白血球相互作用試薬は白血球マーカー化合物を更に含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記白血球マーカー化合物が蛍光マーカー化合物である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記検出は、前記振動磁界又は回転磁界に応答した前記磁性粒子の運動をモニターすることにより実施される、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
前記検出は、前記振動磁界又は回転磁界に応答した前記磁性粒子の運動をモニターすることにより実施される、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
前記検出は前記サンプルの凝集後の前記サンプルにおける前記白血球マーカー化合物の濃度差の検出、定量又はその両方により実施される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
前記接触は回転磁界の存在下で起こる、請求項５０に記載の方法。
【請求項６３】
前記回転磁界は２０００〜２５００ｒｐｍで回転する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
血小板／白血球相互作用を惹き起こす病態の存在を検出する方法であって、
血小板／白血球相互作用を惹き起こす病態を有する疑いのある患者から得た全血又は血液由来のサンプルと血小板／白血球相互作用アッセイ試薬を振動磁界又は回転磁界の存在下接触させる段階と、
振動磁界又は回転磁界に応答した磁性粒子の運動をモニターして、全血又は血液由来のサンプル内の血小板／白血球相互作用機能の存在又は非存在、血小板／白血球相互作用のレベル又はその両方を測定する段階とを含み、
前記血小板機能アッセイ試薬は、磁性粒子と非磁性粒子の混合物と、白血球マーカー化合物とを含み、前記磁性粒子はその外表面に血小板との直接相互作用に親和性を有する一定量の第一のリガンドを結合させており、前記非磁性粒子はその外表面に血小板との直接相互作用に親和性を有する一定量の第二のリガンドを結合させており、前記第一のリガンド及び前記第二のリガンドは互いに同一である又は互いに異なることができる方法。
【請求項６５】
前記サンプルが全血である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記第一のリガンドが、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ＩＩ因子、ＩＩａ因子、Ｖ因子、Ｖａ因子、ＶＩＩＩ因子、ＶＩＩＩａ因子、ＩＸ因子、ＩＸａ因子、Ｘ因子、Ｘａ因子、ＸＩ因子、ＸＩａ因子、ＸＩＩ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩＩＩ因子、ＸＩＩＩａ因子、コラーゲン、ビトロネクチン、ラミニン、オステオポンチン、フィブリリン、コンドロイチン硫酸、へパリン硫酸及びこれらの活性フラグメントからなる群から選択されるものである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記第一のリガンドがｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子又はその活性フラグメントである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記第二のリガンドが、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ＩＩ因子、ＩＩａ因子、Ｖ因子、Ｖａ因子、ＶＩＩＩ因子、ＶＩＩＩａ因子、ＩＸ因子、ＩＸａ因子、Ｘ因子、Ｘａ因子、ＸＩ因子、ＸＩａ因子、ＸＩＩ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩＩＩ因子、ＸＩＩＩａ因子、コラーゲン、ビトロネクチン、ラミニン、オステオポンチン、フィブリリン、コンドロイチン硫酸、へパリン硫酸及びこれらの活性フラグメントからなる群から選択されるものである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
前記第二のリガンドがｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子又はその活性フラグメントである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記第一のリガンド及び前記第二のリガンドが互いに同一である、請求項６４に記載の方法。
【請求項７１】
前記第一のリガンド及び前記第二のリガンドがそれぞれｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子又はその活性フラグメントである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記第一のリガンド及び前記第二のリガンドが互いに異なる、請求項６４に記載の方法。
【請求項７３】
前記第一のリガンドと前記第二のリガンドの内の一方が、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子又はその活性フラグメントである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記接触は回転磁界の存在下で起こる、請求項６４に記載の方法。
【請求項７５】
前記回転磁界は２０００〜２５００ｒｐｍで回転する、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
血小板／白血球相互作用を惹き起こす前記病態は、脳血管発作（ＣＶＡ）、一過性虚血性発作（ＴＩＡ）、不安定狭心症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）及び炎症からなる群から選択されるものである、請求項６４に記載の方法。
【請求項７７】
血小板／白血球相互作用を惹き起こす病態の存在を検出する方法であって、
血小板／白血球相互作用を惹き起こす病態を有する疑いのある患者から得た全血又は血液由来のサンプルと血小板／白血球相互作用アッセイ試薬を振動磁界又は回転磁界の存在下で接触させる段階と、
全血又は血液由来のサンプル内の血小板／白血球相互作用機能の存在又は非存在、血小板／白血球相互作用のレベル又はその両方を検出する段階とを含み、
前記血小板機能アッセイ試薬は磁性粒子と非磁性粒子の混合物を含み、前記磁性粒子か前記非磁性粒子のどちらかはその外表面に血小板との直接相互作用に親和性を有する一定量の第一のリガンドを結合させており、前記磁性粒子か非磁性粒子の他方はその外表面に白血球との直接相互作用に親和性を有する一定量の第二のリガンドを結合させている方法。
【請求項７８】
前記サンプルが全血である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記第一のリガンドが、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ＩＩ因子、ＩＩａ因子、Ｖ因子、Ｖａ因子、ＶＩＩＩ因子、ＶＩＩＩａ因子、ＩＸ因子、ＩＸａ因子、Ｘ因子、Ｘａ因子、ＸＩ因子、ＸＩａ因子、ＸＩＩ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩＩＩ因子、ＸＩＩＩａ因子、コラーゲン、ビトロネクチン、ラミニン、オステオポンチン、フィブリリン、コンドロイチン硫酸、へパリン硫酸及びこれらの活性フラグメントからなる群から選択されるものである、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記第一のリガンドがｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子又はその活性フラグメントである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記第二のリガンドは、白血球選択性抗体、ＶＣＡＭ−１、フィブロネクチン、ラミニン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、コラーゲン、オステオポンチン、ｖＷｆ、ビトロネクチン、トロンボスポンジン、粘膜アドレシン細胞接着分子１（ＭａｄＣＡＭ−１）、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン及びＥ−セレクチンからなる群から選択されるものである、請求項７７に記載の方法。
【請求項８２】
前記第一のリガンドは前記非磁性粒子に結合しており、前記第二のリガンドは前記磁性粒子に結合している、請求項７７に記載の方法。
【請求項８３】
前記第一のリガンドは前記磁性粒子に結合しており、前記第二のリガンドは前記非磁性粒子に結合している、請求項７７に記載の方法。
【請求項８４】
前記血小板／白血球相互作用試薬は白血球マーカー化合物を更に含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記白血球マーカー化合物が蛍光マーカー化合物である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記検出は、前記振動磁界又は回転磁界に応答した前記磁性粒子の運動をモニターすることにより実施される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８７】
前記検出は、前記振動磁界又は回転磁界に応答した前記磁性粒子の運動をモニターすることにより実施される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８８】
前記検出は前記サンプルの凝集後の前記サンプルにおける前記白血球マーカー化合物の濃度差の検出、定量又はその両方により実施される、請求項８４に記載の方法。
【請求項８９】
前記接触は回転磁界の存在下で起こる、請求項７７に記載の方法。
【請求項９０】
前記回転磁界は２０００〜２５００ｒｐｍで回転する、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
血小板／白血球相互作用を惹き起こす前記病態は、脳血管発作（ＣＶＡ）、一過性虚血性発作（ＴＩＡ）、不安定狭心症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）及び炎症からなる群から選択されるものである、請求項７７に記載の方法。
【請求項９２】
患者が血小板／白血球相互作用を惹き起こす病態に関する素因を有するか否かを決定する方法であって、
患者から得た全血又は血液由来のサンプルと血小板／白血球相互作用アッセイ試薬を振動磁界又は回転磁界の存在下で接触させる段階と、
振動磁界又は回転磁界に応答した磁性粒子の運動をモニターして、全血又は血液由来のサンプル内の血小板／白血球相互作用機能の存在又は非存在、血小板／白血球相互作用のレベル又はその両方を測定する段階とを含み、
前記血小板機能アッセイ試薬は、磁性粒子と非磁性粒子の混合物と、白血球マーカー化合物とを含み、前記磁性粒子はその外表面に血小板との直接相互作用に親和性を有する一定量の第一のリガンドを結合させており、前記非磁性粒子はその外表面に血小板との直接相互作用に親和性を有する一定量の第二のリガンドを結合させており、前記第一のリガンド及び前記第二のリガンドは互いに同一である又は互いに異なることができる方法。
【請求項９３】
前記サンプルが全血である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記第一のリガンドが、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ＩＩ因子、ＩＩａ因子、Ｖ因子、Ｖａ因子、ＶＩＩＩ因子、ＶＩＩＩａ因子、ＩＸ因子、ＩＸａ因子、Ｘ因子、Ｘａ因子、ＸＩ因子、ＸＩａ因子、ＸＩＩ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩＩＩ因子、ＸＩＩＩａ因子、コラーゲン、ビトロネクチン、ラミニン、オステオポンチン、フィブリリン、コンドロイチン硫酸、へパリン硫酸及びこれらの活性フラグメントからなる群から選択されるものである、請求項９２に記載の方法。
【請求項９５】
前記第一のリガンドがｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子又はその活性フラグメントである、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記第二のリガンドが、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ＩＩ因子、ＩＩａ因子、Ｖ因子、Ｖａ因子、ＶＩＩＩ因子、ＶＩＩＩａ因子、ＩＸ因子、ＩＸａ因子、Ｘ因子、Ｘａ因子、ＸＩ因子、ＸＩａ因子、ＸＩＩ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩＩＩ因子、ＸＩＩＩａ因子、コラーゲン、ビトロネクチン、ラミニン、オステオポンチン、フィブリリン、コンドロイチン硫酸、へパリン硫酸及びこれらの活性フラグメントからなる群から選択されるものである、請求項９２に記載の方法。
【請求項９７】
前記第二のリガンドがｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子又はその活性フラグメントである、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記第一のリガンド及び前記第二のリガンドが互いに同一である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９９】
前記第一のリガンド及び前記第二のリガンドがそれぞれｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子又はその活性フラグメントである、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記第一のリガンド及び前記第二のリガンドが互いに異なる、請求項９２に記載の方法。
【請求項１０１】
前記第一のリガンドと前記第二のリガンドの内の一方が、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子又はその活性フラグメントである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記接触は回転磁界の存在下で起こる、請求項９２に記載の方法。
【請求項１０３】
前記回転磁界は２０００〜２５００ｒｐｍで回転する、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
血小板／白血球相互作用を惹き起こす前記病態は、脳血管発作（ＣＶＡ）、一過性虚血性発作（ＴＩＡ）、不安定狭心症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）及び炎症からなる群から選択されるものである、請求項９２に記載の方法。
【請求項１０５】
血小板／白血球相互作用を惹き起こす病態の存在を検出する方法であって、
血小板／白血球相互作用を惹き起こす病態を有する疑いのある患者から得た全血又は血液由来のサンプルと血小板／白血球相互作用アッセイ試薬を振動磁界又は回転磁界の存在下で接触させる段階と、
全血又は血液由来のサンプル内の血小板／白血球相互作用機能の存在又は非存在、血小板／白血球相互作用のレベル又はその両方を検出する段階とを含み、
前記血小板機能アッセイ試薬は磁性粒子と非磁性粒子の混合物を含み、前記磁性粒子か前記非磁性粒子のどちらかはその外表面に血小板との直接相互作用に親和性を有する一定量の第一のリガンドを結合させており、前記磁性粒子か非磁性粒子の他方はその外表面に白血球との直接相互作用に親和性を有する一定量の第二のリガンドを結合させている方法。
【請求項１０６】
前記サンプルが全血である、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記第一のリガンドが、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ＩＩ因子、ＩＩａ因子、Ｖ因子、Ｖａ因子、ＶＩＩＩ因子、ＶＩＩＩａ因子、ＩＸ因子、ＩＸａ因子、Ｘ因子、Ｘａ因子、ＸＩ因子、ＸＩａ因子、ＸＩＩ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩＩＩ因子、ＸＩＩＩａ因子、コラーゲン、ビトロネクチン、ラミニン、オステオポンチン、フィブリリン、コンドロイチン硫酸、へパリン硫酸及びこれらの活性フラグメントからなる群から選択されるものである、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０８】
前記第一のリガンドがｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子又はその活性フラグメントである、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記第二のリガンドは、白血球選択性抗体、ＶＣＡＭ−１、フィブロネクチン、ラミニン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、コラーゲン、オステオポンチン、ｖＷｆ、ビトロネクチン、トロンボスポンジン、粘膜アドレシン細胞接着分子１（ＭａｄＣＡＭ−１）、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン及びＥ−セレクチンからなる群から選択されるものである、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１０】
前記第一のリガンドは前記非磁性粒子に結合しており、前記第二のリガンドは前記磁性粒子に結合している、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１１】
前記第一のリガンドは前記磁性粒子に結合しており、前記第二のリガンドは前記非磁性粒子に結合している、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１２】
前記血小板／白血球相互作用試薬は白血球マーカー化合物を更に含む、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記白血球マーカー化合物が蛍光マーカー化合物である、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記検出は、前記振動磁界又は回転磁界に応答した前記磁性粒子の運動をモニターすることにより実施される、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１５】
前記検出は、前記振動磁界又は回転磁界に応答した前記磁性粒子の運動をモニターすることにより実施される、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１６】
前記検出は前記サンプルの凝集後の前記サンプルにおける前記白血球マーカー化合物の濃度差の検出、定量又はその両方により実施される、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１７】
前記接触は回転磁界の存在下で起こる、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１８】
前記回転磁界は２０００〜２５００ｒｐｍで回転する、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
血小板／白血球相互作用を惹き起こす前記病態は、脳血管発作（ＣＶＡ）、一過性虚血性発作（ＴＩＡ）、不安定狭心症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）及び炎症からなる群から選択されるものである、請求項１０５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血小板と白血球との相互作用のポイント・オブ・ケア評価を可能とするための血小板／白血球相互作用アッセイ及びその試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血小板は白血球と相互作用することが知られているが、この相互作用は次の両方の結果として起こるものである。すなわち、正常血流下での血小板と白血球との接触（ＳｔｏｎｅとＮａｓｈ、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，１０５：５１４−２２，１９９９；Ｌｏｒｅｎｚら、Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，９：Ｓ４９−５９，１９９８）及び様々な病的プロセス（Ｒｉｎｄｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，１１８：４６０−６，１９９９；Ｐｅｙｔｏｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，２７：１１０９−１５，１９９８；Ｓｔｕａｒｄら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｏｒｇａｎｓ，２１：７５−８２，１９９８；Ｇａｗａｚら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２５：８４３−５１，１９９５）。
【０００３】
不安定狭心症や冠動脈疾患（ＣＡＤ）、脳卒中等の病態は、血小板及び白血球の高レベルの活性化を特徴とする。血小板／白血球相互作用を測定することによって、とりわけ、他の診断的因子と併用することによって、これら病態を予測することができる。また、血小板／白血球相互作用の測定は、血小板及び／又は白血球の機能を変化させるための治療をモニタリングする手段として用いることができる。
【０００４】
流血が人工的表面に曝露されると血小板／白血球相互作用が高まることが示されている。関与する細胞型及びこの相互作用の程度は、血液に接触する人工的表面の組成により異なる（Ｇａｗａｚら、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｏｒｇａｎｓ，２３：２９−３６，１９９９）。
【０００５】
血小板／白血球相互作用は各種技法を用いて定量化されてきた（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓら、米国特許第５５０３９８２号；Ｒｉｎｄｅｒら、Ｂｌｏｏｄ，７８：１７６０，１９９１；）が、この相互作用の評価は循環する血小板／白血球複合体を測定することによって行なわれてきた。現在まで、この測定は血液サンプル中に既に存在する血小板／白血球間の相互作用を評価する形をとってきた。
【０００６】
一部の病態（例えば、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、経皮的冠動脈拡張術（ＰＴＣＡ）等）においては、血小板／白血球複合体形成は、損傷した内皮下層との直接的な（プラーク形成）あるいは間接的な（ＩＣＡＭ−１等の生化学的マーカーの放出、Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓら、米国特許第５５０３９８２号参照）相互作用を伴う。
【０００７】
血小板／白血球相互作用の評価に用いる現在のアッセイシステムは、例えば、Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓらによるシステム（米国特許第５５０３９８２号）によって示されるように、既に存在する（循環する）血小板／白血球複合体が評価されるが、これらシステムは血管内皮下層（即ち、細胞外マトリックス）を代表する成分や他の固相刺激剤を用いていない。更に、個々の血小板と白血球が相互作用する閾値は、試験時のこれら細胞の活性化状態に依存して異なり得る。当該技術分野において、血小板及び／又は白血球の活性化が血小板／白血球結合の必要条件であることは知られている。また、当該技術分野においては、ある病態が血小板及び／又は白血球の活性のアップレギュレーションに関連づけられることも知られている。しかし、病的プロセスに関連する細胞活性におけるアップレギュレーションは、付加的刺激なしには血小板／白血球複合体形成をサポートするには不十分な場合があり、更に、このアップレギュレーションは、従来のシステムを用いて検出することができない場合がある。従来のシステムは、血小板／白血球複合体が維持され得る安定化固相支持体を有していない。固相刺激剤は、既に存在する血小板／白血球複合体を局在化する手段及び／又は複合体の形成及び局在化を誘発する傾向のある細胞内でその形成及び局在化しやすくする手段として用いられる。
【０００８】
固定化した内皮下／細胞外マトリックス等の固相成分の使用を組み込むように設計されたアッセイシステムが、簡便で、迅速、且つ手ごろな価格で入手可能で、臨床現場での血小板／白血球相互作用の検出に有用であることは望ましい。
【０００９】
本発明は、血漿タンパク質及び／又は細胞外マトリックスタンパク質で被覆された様々な組成の微粒子を単独で又は組み合わせて用い、血小板／白血球結合の迅速な評価を容易にすることによって従来の方法や技術における欠点に対処するものである。
【００１０】
血小板は様々なメカニズムによって白血球と相互作用し得るが、例えば、正常血流下で血小板と白血球との接触によってその相互作用が起こり得る（Ｌｏｒｅｎｚら、Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，９：Ｓ４９−Ｓ５９，１９９８）。あるいは、血小板の機能亢進に関連した病的プロセスの結果としてその相互作用が起こり得る（Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７４：Ｓ３５−Ｓ４４，１９９４；Ｒｉｎｄｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，１１８：４６０−６，１９９９）。あるいは、炎症プロセスに起因してその相互作用が起こり得る（Ｇａｗａｚら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２５：８４３−５１，１９９５）。血小板表面に見出されるレセプターは、様々な白血球上に見出されるレセプターと直接的な架橋（ｂｒｉｄｇｉｎｇ）又は媒介分子を介した間接的な連結によって相互作用する（ＷｅｂｅｒとＳｐｒｉｎｇｅｒ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１００：２０８５−９３，１９９７）。血小板及び／又は白血球の活性のアップレギュレーションによって、血小板／白血球相互作用が高められる（Ｒｉｎｄｅｒら、１９９９；ＳｔｏｎｅとＮａｓｈ、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，１０５：５１４−２２，１９９９； Ｋｏｎｓｔａｎｔｏｐｏｕｌｏｓら、１９９８；Ｇａｗａｚら、１９９５； Ｓｐａｎｅｎｂｅｒｇ、１９９４）。
【００１１】
冠動脈疾患（ＣＡＤ）、糖尿病あるいは脳血管虚血の患者は、血小板機能亢進及び進行中の炎症プロセスの両方を示す（ＭｉｃｈｅｌｓｏｎとＦｕｒｍａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，６：３４２−８，１９９９）。ＣＡＤ患者の治療には抗血小板剤及び抗炎症薬が用いられてきた（Ｖｏｒｃｈｈｅｉｍｅｒら、ＪＡＭＡ  ２８１：１４０７−１４，１９９９；Ｍａｎｎａｉｏｎｉら、Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４６：４−１８，１９９７）。
【００１２】
血小板／単球相互作用（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓら、米国特許第５５０３９８２号）及び血小板／好中球相互作用（Ｇａｗａｚら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２５：８４３−５１，１９９５）はそれぞれ、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）及び炎症を予測するものとして示唆されてきた。様々な病態における血小板／白血球相互作用には、例えばプラーク形成や局所的炎症反応における血管壁が関与していると推定される。
【００１３】
固定化した細胞外マトリックスタンパク質を用いる血小板機能評価は、ＳｈａｗとＳｔｅｗａｒｔによって記載されている（米国特許第５４２７９１３号）。この著者は、ポリスチレンビーズに固定化したｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ＶＷＦ）が、血小板を活性化し、血小板機能欠損症の患者から得た血小板の機能状態を判断するのに用い得ることを実証した。更に、この著者は、血小板の機能を変化させるようにデザインされた剤の効果を、ビーズに固定化したＶＷＦを刺激剤として用いることによりモニターし得ることも実証した。これら研究の結果は、正常な血液学的相互作用を評価すること、あるいは血管壁の成分に類似した剤の存在下での病態の血液学的結果を評価することの重要性を強調している。
【００１４】
ＳｈａｗとＳｔｅｗａｒｔは血小板の機能を判断する方法及び組成物について記載しているが、血小板／白血球相互作用を評価するために彼らの方法を用いることについての記載や示唆はない。
【００１５】
ＣＶＤＩのＴＡＳＴＭアナライザは、患者の血液サンプルにおける凝固経路の活性化に続くフィブリン重合速度を測定するものである。ＴＡＳＴＭアナライザ（使い捨て可能）は、ポイント・オブ・ケアの場において、全血を対象として分析するように設計された。ＴＡＳＴＭアナライザ用に開発された各試験のための検出システムでは、常磁性酸化鉄粒子（ＰＩＯＰ）が必須成分である。ＰＩＯＰと特定の試験用の他の凍結乾燥した各種成分とを、ＴＡＳテストカード（使い捨て可能）の浅い反応チャンバに置く。ＰＩＯＰの他に、テスト試薬は、バッファー、安定剤、フィラー及び特定の凝固経路活性剤や各種剤を含み得る。ドライ・ケミストリーテストカードをＴＡＳＴＭアナライザのスロットに挿入するとテストが開始されるテストカードは、電磁石の上の反応チャンバに自動的に置かれる。このチャンバに、発光ダイオードからの赤外光が照射される。この機器は、テストカード表面から反射された赤外光を固体フォトダイオード検出器によって測定する。血液あるいは血漿がテストカードのサンプルウェルに添加され、それが毛管現象によって反応チャンバに引き寄せられると、アナライザの光検出器が反射光の強度の変化を測定し、これによりテストは自動的に開始される。反応チャンバ内に存在するアクチベータは、患者のサンプル中の凝集カスケードを刺激してトロンビンを生成し、トロンビンはフィブリンクロットの形成を触媒する。
【００１６】
凝固試験の間、ＴＡＳＴＭアナライザの電磁石は、毎秒オンとオフを交互に繰り返す。電磁石がオンの時には磁性粒子は立ち上がり、検出器に入る反射光を増加させ、オフの時には横たわり、検出される光を減少させる。このようなＰＩＯＰの運動により、光検出器から交流電流（ＡＣ）信号が生成する。テストが進むにつれ、フィブリン重合が更に進行し、ＰＩＯＰの運動は減少する。アナライザは、所定のアルゴリズムに従ってＰＩＯＰの相対的な運動により生成される信号を解析し、各テストにおける適切なエンドポイント（凝固時間）を出力する。
【００１７】
ＰＩＯＰはＴＡＳＴＭ検出システムにとって不可欠な要素であるが、凝固カスケードやフィブリン重合の活性化には直接関与しない。テストカードの反応チャンバ内におけるＰＩＯＰとアクチベータとの間の好ましくない相互作用を防ぐために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でＰＩＯＰを被覆あるいはブロックする。ＢＳＡは、テスト用の表面成分と活性成分との間の不要な相互作用を避けるための、アッセイ開発の当業者に一般に用いられるタンパク質である。ＴＡＳＴＭシステムは、血小板と白血球との相互作用ではなく、フィブリン重合をモニターするように設計されたものである。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の一目的は、全血等の様々な血液製剤をサンプルとして用いることができ、検出が容易な血小板／白血球相互作用のためのアッセイを提供することである。
【００１９】
本発明の他の目的は、血小板／白血球相互作用を迅速に測定するために、ＴＡＳＴＭシステムにおいて用いることができる血小板／白血球相互作用のためのアッセイを提供することである。
【００２０】
本発明の更に他の目的は、好ましくは本発明のアッセイにおいて用いることができる乾式テストカード形式における血小板／白血球相互作用アッセイ試薬を提供することである。
【００２１】
本発明の更に他の目的は、本発明のアッセイを用いて、血小板／白血球相互作用を引き起こす病態を診断するための方法を提供することである。
【００２２】
本発明の更に他の目的は、本発明のアッセイを用いて、血小板及び／又は白血球の機能亢進を測定するための方法を提供することである。
【００２３】
【課題を解決するための手段】
本発明のこれら及び他の目的は、血小板／白血球相互作用を評価する方法であって、
全血又は血液由来のサンプルを固相刺激剤に接触させる段階と、
一以上の血小板／白血球／固相刺激剤複合体の形成を検出する段階とを含み、
前記固相刺激剤は、血小板又は白血球に選択的に結合するリガンドをその表面に結合している方法；該方法を行うための試薬；並びに、被験者の様々な病態及び被験者のこれら病態に対する素因によって引き起こされる血小板／白血球相互作用の発生を検出のための該方法の使用とを見出すことによって達成された。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明のより完全な理解及び本発明に付随する利益の多くは、添付図面と共に以下の詳細な説明を参照し本発明の理解が進むに従って容易に分るであろう。
本発明は、血小板／白血球相互作用アッセイ及び該アッセイに用いる試薬に関する。本発明のアッセイは、血液あるいは血液由来サンプルにおける血小板と白血球との相互作用をモニターする。本アッセイは、湿式（ｗｅｔ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）及び乾式（ｄｒｙ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）のいずれのアッセイ形式においても行うことができる。
【００２５】
本発明において、用語「白血球」及びそのフォームは通常の医学的意味を有するものである。白血球には、顆粒球やリンパ球、単球が挙げられるが、これらに限定されない。顆粒球サブグループには、好中球、好塩基球及び好酸球がある。本発明は、最も好ましくは、血小板と顆粒球及び単球との相互作用を検出するために用いる。しかし、全てのタイプの血小板／白血球相互作用も本発明アッセイの範囲に入る。
【００２６】
本発明は、懸濁液中、固相刺激剤の存在下で血小板／白血球相互作用を評価し定量化するための方法及び組成物に関する。本発明における固相刺激剤は、微粒子に単独であるいは組み合わせて固定化した、血漿タンパク質及び／又は細胞外マトリックスタンパク質あるいはこれらのフラグメントから成る。これらのタンパク質は、受動的にあるいは共有結合及び／又は架橋分子によって微粒子に接着させることができる。微粒子は単一のタイプでもよく、また、ある実施形態においては、二以上の異なるタイプの微粒子を含むことができる。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態においては、固相支持体を被覆するために用いるタンパク質は、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子、フィブリノーゲン、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、トロンボスポンジン、ラミニン、オステオポンチン、凝固因子（活性又は不活性型）、フィブリリン、コンドロイチン硫酸及びヘパリン硫酸からなる群より選択される。これらのタンパク質又はそのフラグメントは、単独で又は組み合わせて、受動的に又は共有結合によって固相支持体に固定される。固相粒子状支持体へのタンパク質の接着は、スペーサー分子を用いて行うこともできるが、これは当業者にとっては容易に明らかであろう。
【００２８】
固相刺激剤を、懸濁液中、所定の時間、所定の強制力付与条件（ｆｏｒｃｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下で血小板及び白血球のソースと混合する。強制力付与条件は幅広い反応（ａ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）が可能なように設定される。これらの反応は、例えば、単に血小板／白血球複合体を固相刺激剤に接触させこの複合体の結合をもたらす反応から、高い強制力付与条件（例えば高せん断力又は乱流）下で血小板及び／又は白血球を活性化し、懸濁固相刺激剤への血小板／白血球複合体の形成を導く反応に及ぶ。混合条件は、攪拌、振とう、吸引、電磁場及び／又はビームの適用、超音波、コーンプレート粘度計等の装置を用いたせん断力の適用又は所定寸法の導管を通る懸濁液のフローの形をとり得る。導管は、ガラスあるいはプラスチックのチューブや、マイクロチップに形成されたチャンネルや哺乳類由来の血管、反応テストカードに設けられた導管、Ｏｂｅｒｈａｒｄｔの米国特許第５１１０７２７号に記載の導管の形をとり得る。この米国特許明細書を、本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。アッセイサンプルは、通常、血小板及び白血球を含む懸濁液であり、血液あるいは血液由来のサンプルである。アッセイサンプルは、好ましくは、指（ｆｉｎｇｅｒ ｓｔｉｃｋ）から採取した全血、希釈全血、抗凝固処理された全血、洗浄細胞、軟膜又は血小板リッチの血漿である。血小板／白血球懸濁液は、被験者から直接採取するか、あるいは元々この被験者から採取し研究や輸血の目的で保存していた血液製剤から採取する。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態においては、被験対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）は哺乳類であり、最も好ましくはヒトである。
【００３０】
血小板と白血球との相互作用の評価には、この相互作用を定性的及び／又は定量的に解析できるように、所定の強制力付与条件の適用によってこれら細胞を固相支持体に接着させることを含む。
【００３１】
定性的解析は、本アッセイ時に形成される血小板／白血球／固相支持体複合体を検出することが可能ないずれの方法を用いることによっても行うことができる。このような方法の適切な例としては、巨視的検査（肉眼による）や顕微鏡法、フォトマイクロスコピー、電子顕微鏡法（透過型又は走査型）、共焦点顕微鏡法、ビデオ顕微鏡法が挙げられるが、これらに限定されない。定性的解析は、二者択一的に（又は共存的に）組織化学的解析や免疫組織化学的解析、遺伝学的解析（ＰＣＲ、ＦＩＳＨ、サザンブロット法）、ウェスタンブロット法の形をとり得る。
【００３２】
本アッセイは、血小板−白血球相互作用の定量的あるいは半定量的測定にも用いることができる。このような解析は、アッセイされるサンプル中に存在する血小板／白血球／固相支持体複合体を検出し、その複合体の数をカウントすることが可能ないずれの方法を用いることによっても行うことができる。適切な定量的あるいは半定量的解析方法としては、細胞計数法やフローサイトメトリー、スタティックサイトメトリー、レーザ走査サイトメトリー、濁度測定、吸光度測定、比色測定、エンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、細胞内あるいは細胞外イオン流動測定、細胞遊離物（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｌｅａｓａｔｅｓ）の測定、固相／血小板／白血球凝集体サイズの測定、ラテックス凝集アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。このような定量的測定のための好ましい方法は、細胞計数法及びサイトメトリー（フローサイトメトリーとスタティックサイトメトリーの両方）である。適切なサイトメーターとしては、ＣｏｍｐｕＣｙｔｅから入手可能なＯＮＣＹＴＥ（登録商標）及びＬＳＣ（登録商標）スタティックサイトメーターや、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから入手可能なＦＡＣＳＣａｎ（登録商標）及びＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）フローサイトメーター、Ｃｏｕｌｔｅｒから入手可能なＥＸＣＥＬ（登録商標）フローサイトメーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
血小板／白血球相互作用の定性的あるいは定量的評価を他のアッセイと組み合わせて行い、病態をより明確に同定し得る情報及び／又は適切な治療計画を可能とする情報をユーザーに提供することができる。一例として、（Ｍａｈａｎらの米国特許仮出願第６０／２０２６３８号に記載のように（この仮出願の明細書を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する）、あるいは従来の血小板機能テストによって）個人が血小板機能を測定したい場合や、血小板／白血球相互作用の評価に関連づけて心臓マーカー酵素を測定しＡＭＩの発症をより明確にする場合が挙げられる。このようなアッセイの組合せは、単一デバイスにおいて並行してあるいは同時に行えるよう構成され得る。所定の病態のための望ましいアッセイの他の組合せは、当業者には明白であり、本明細書に記載したものに限定されない。
【００３４】
本発明における固相刺激剤は、血小板／白血球コンジュゲートを局在化し、血小板／白血球相互作用の程度を迅速に評価することを可能にする手段を提供する。また、この固相刺激剤は、血小板及び／又は白血球の活性化を誘発し、固相刺激剤上での血小板／白血球複合体の形成を容易にすることもできる。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態においては、粒子を血漿タンパク質ソースあるいはそのフラグメントで被覆する。血漿タンパク質の例としては、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子やフィブリノーゲン、フィブロネクチン、ＩＩ因子、ＩＩａ因子、Ｖ因子、Ｖａ因子、ＶＩＩＩ因子、ＶＩＩＩａ因子、ＩＸ因子、ＩＸａ因子、Ｘ因子、Ｘａ因子、ＸＩ因子、ＸＩａ因子、ＸＩＩ因子、ＸＩＩａ因子、ＸＩＩＩ因子、ＸＩＩＩａ因子等の血液凝固因子（活性型又は不活性型、即ちチモーゲン型）、コラーゲン、ビトロネクチン、ラミニン、オステオポンチン、フィブリリン、コンドロイチン硫酸、へパリン硫酸、これらを組合わせたものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態においては、細胞外マトリックスタンパク質あるいはそのフラグメントを単独で又は組み合わせて用いて粒子を被覆する。細胞外マトリックスタンパク質の例としては、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子やフィブロネクチン、コラーゲン、オステオポンチン、ラミニン、トロンボスポンジン、フィブリリン、コンドロイチン硫酸、ヘパリン硫酸、これらを組み合わせたものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
また、白血球選択性抗体や、白血球膜成分に結合するタンパク質あるいはそのフラグメント等の白血球結合リガンドで粒子の一部を被覆することもできる。このようなタンパク質の例としては、ＶＣＡＭ−１やフィブロネクチン、ラミニン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、コラーゲン、オステオポンチン、ｖＷｆ、ビトロネクチン、トロンボスポンジン、粘膜アドレシン細胞接着分子１（ＭａｄＣＡＭ−１）、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、Ｅ−セレクチンが挙げられる。
【００３８】
タンパク質によって被覆され固相刺激剤を形成する微粒子は、いかなる形状をも取り得る。特に、微小球体あるいは不定形微粒子の形状を取り得る。この微小球体あるいは不定形微粒子は、一以上の上記タンパク質又はそのフラグメントが直接的にあるいは間接的に結合することのできるいかなる材料からも形成することができる。これらの微小球体あるいは不定形微粒子は、いかなる所望の粒径を有することができ、好ましくは、後述のＰＩＯＰと同じオーダーの粒径を有し、より好ましくは、１〜２０ミクロンの粒径を有する。微小球体あるいは不定形微粒子を構成する材料の好ましい例としては、ポリスチレン及び／又はラテックスやポリカーボネート、アクリロニトリル、カルボキシレート、テフロン（登録商標）、ガラス、ナイロン、デキストラン、アガロース、アクリルアミド、シリカ、花粉、微生物（生存可能又は生存不能）、酸化鉄、常磁性酸化鉄、常磁性粒子、非磁性金属ビーズ、金、白金、パラジウムが挙げられるが、これらに限定されない。最も好ましい材料は、Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，９７，３２１−３２９（１９９７）やＳｈａｗら、米国特許第５９５２１８４号に記載されているように、ポリスチレンビーズである。これら文献の各々を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。微小球体あるいは不定形微粒子は、元来常磁性であり、及び／又は蛍光標識され、及び／又は適切な基質及び／又は化学薬品の存在下で光反応あるいは呈色反応を引き出すのに適した酵素で標識される。
【００３９】
本発明の好ましい一実施形態においては、微粒子はポリスチレンを含み、球状を呈し、ヒト由来のｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子で被覆される。
【００４０】
本発明の最も好ましい実施形態においては、血小板／白血球複合体を捕捉するかｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子で被覆した微小球体上の血小板／白血球複合体の形成を誘発するのに充分な所定の強制力付与条件下で、所定の時間、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子で被覆した微小球体を全血（非抗凝固又は抗凝固）と混合し、引き続き、この複合体形成の存在及び／又はその量を測定する。
【００４１】
更なる好ましい実施形態においては、二種の中心的試薬要素を含む試薬を用いて本発明のアッセイを行う。第一の要素は磁性粒子、好ましくは常磁性酸化鉄（ＰＩＯＰ）であり、例えば現在ＴＡＳＴＭアナライザに用いられているもの等である（米国特許第４８４９３４０号、５１１０７２７号、５３５０６７６号、５６０１９９１号、５６７０３２９号及び５６７７２３３号に記載、これら特許の各々の明細書を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する）。これら磁性粒子は、（１）白血球と直接相互作用可能かあるいは（２）血小板と相互作用可能なリガンドを粒子表面に結合させることによって修飾されたものである。様々な磁性粒子を用いることができるが、米国特許第５１１０７２７号に記載されているように、好ましい磁性粒子はＰＩＯＰである。従って、以下の記載においては便宜上ＰＩＯＰについて言及するが、特記しない限り、ＰＩＯＰという用語はいかなる種類の磁性粒子をも表すと了解されるであろう。従来のＴＡＳでの用途におけるのと同様、ＰＩＯＰはまた、アッセイモニタリング及び検出システムにおいて中心的な役割を果たし、それによって、運動磁界に応答する修飾ＰＩＯＰの運動をモニターし、アッセイのエンドポイントを決定する。
【００４２】
この好ましい実施形態における第二の中心的試薬要素は、血小板と直接相互作用可能なリガンドで被覆した非磁性ビーズあるいは微小球体である。これらの非磁性ビーズあるいは微小球体はいかなる所望の粒径であってもよいが、好ましくは、ＰＩＯＰと同じオーダーの粒径であり、より好ましくは１〜２０ミクロンの粒径を有する。非磁性ビーズは、その表面にリガンドを結合させることができるものであればどのような非磁性材料からも作ることができる。非磁性ビーズを調製するための好ましい材料としては、上掲した微小球体あるいは不定形粒子用材料、例えばポリスチレンビーズ、ポリオレフィンビーズ、ガラスビーズ、更には非磁性金属ビーズ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。最も好ましい材料は、Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，９７，３２１−３２９（１９９７）やＳｈａｗら、米国特許第５９５２１８４号に記載されているようにポリスチレンビーズであり、これら文献の各々を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。Ｏｂｅｒｈａｒｄｔ及びＳｈａｗの特許に記載されているように、機能上の安定性、試薬の乾燥、サンプル添加の際の材料の再水和を向上させるものとして、当業者に知られている他の試薬（抗凝固剤、バッファー等）もまたテスト組成物に添加することもできる。
【００４３】
リガンドは、リガンド活性が損なわれない限り、粒子に直接的に又はスペーサーを介して間接的に結合することができる。直接的な結合は共有的に又は非共有的に起こり得る。間接的な結合はスペーサーを介して起こり得るが、そのスペーサーの例としてはペプチドスペーサー、抗体スペーサー又は炭水化物スペーサーが挙げられるがこれらに限定されるものではない。これらのスペーサーは通常は粒子とリガンドを架橋する働きをを有するだけであるが、リガンド／レセプター相互作用の効果を変えるために用いることもできる。例えば、７個のアミノ酸からなるペプチドによる架橋によって、ｖＷｆを粒子に結合させると、ｖＷｆと血小板レセプターとの相互作用は減少する場合がある。しかし、ｖＷｆの活性フラグメントを同じ７個のアミノ酸からなるペプチドによる架橋で粒子と結合させて用いると、ｖＷｆフラグメント／レセプター相互作用のアップレギュレーションとなるであろう。他のタイプにおける同様の改善はＢｅｅｒらによっても報告されている（Ｂｌｏｏｄ，７９，１１７−１２８，１９９２）。
【００４４】
本発明のアッセイの一実施形態において、振動磁界を用いる場合には、試薬は磁性粒子のみを含む。しかし、後述するように、回転磁界を用いる場合には、好ましい試薬は、磁性粒子及び非磁性粒子の両方（これら粒子は双方に結合したリガンドを有する）を含む。
【００４５】
本実施形態における非磁性粒子上の血小板と相互作用するリガンドは、その機能を果たすことが可能であり、その結果、血小板が活性化されるものであればいかなる化合物であってもよい。適切なリガンドとしては、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ｖＷｆ）、コラーゲン、トロンビン及びこれらのフラグメント（ミメトープとしても知られる。Ｍｉｌｌｅｒにより米国特許第５８７７１５５号に記載されている。この米国特許明細書を本明細書の一部を構成するものとして援用する）等が挙げられるが、これらに限定されない。用いるリガンドとして最も好ましいものはｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子あるいはそのフラグメントである。
【００４６】
非磁性粒子及び磁性粒子上で用いるリガンドは、同じリガンドであっても異なるリガンドであってもよい。両方のタイプの粒子上で同じリガンドを用いる場合、試薬内に白血球マーカーを供給することが更に必要となる。白血球マーカーは、白血球の存在を確認するための従来知られているいずれのマーカー（蛍光マーカー等）であってもよい。適切な白血球マーカーの例としては、ＣＤ４５、ＣＤ１８、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８（ＬＦＡ−１）、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８（Ｍａｃ−１）、ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８、Ｐ−セレクチンリガンド（ＰＳＧＬ−１）及びＣＤ３４が挙げられる。両方のタイプの粒子上で同じリガンドを用いる場合、最も好ましくは、このリガンドはｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子あるいはそのフラグメントである。血小板との結合を提供するのに、そして血小板を活性化するのに十分な量のリガンドが、磁性及び非磁性粒子の表面上に存在するべきであって、そのような十分量のリガンドによって十分な数の血小板が活性化され、１〜２０分、好ましくは２〜４分でアッセイのエンドポイントに達する。例えば下に述べる回転磁界の場合、初めに形成された回転ＰＩＯＰリングが固体状の円盤やドットに潰縮（ｃｏｌｌａｐｓｅ）する時にエンドポイントとなる。
【００４７】
あるいは、二種類の粒子に結合するリガンドは異なっていてもよい。これらリガンドは両方とも血小板に直接相互作用するリガンドであり得るが、互いに異なっている。このような場合、上述のように同じタイプの白血球マーカーが必要となる。しかし、別の実施形態においては、一方のリガンドは血小板に直接（及び選択的に）相互作用するリガンドとすることができ、他方のリガンドが白血球に直接（及び選択的に）相互作用する。このような白血球選択性リガンドの例としては、白血球選択性抗体やＶＣＡＭ−１、フィブロネクチン、ラミニン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、コラーゲン、オステオポンチン、ｖＷｆ、ビトロネクチン、トロンボスポンジン、粘膜アドレシン細胞接着分子１（ＭａｄＣＡＭ−１）、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、Ｅ−セレクチンが挙げられる（これら全ては、ＦＩＴＣやフィコエリトリン等の蛍光タグによって標識されているかあるいは標識されていない）。このような場合、血小板／白血球／粒子複合体の形成によって、回転ＰＩＯＰリングの潰縮のみが起こり、血小板と白血球との相互作用を示す。これにより、血小板／白血球相互作用の定性的測定が提供されるが、本実施形態では、上記のような白血球マーカーを用いることによって、あるいはＰＩＯＰリングの潰縮時間を既知の血小板／白血球相互作用活性を有する一以上のスタンダードと比較し相関させることによって、この相互作用の定量的測定も提供される。
【００４８】
本発明のアッセイにおいては、血小板機能亢進又は白血球機能亢進のいずれかが存在する場合に、血小板／白血球相互作用が観察される。しかし、両方の活性が正常以下である場合、通常、この相互作用は観察されない。しかし、上述のように、血小板及び／又は白血球を活性化させるための高い強制力付与条件を適用することによって、この相互作用を強制的に起こさせることができる。高い強制力付与条件は、被験者の血小板／白血球相互作用に対する感受性を判断することに用いることができ、従って、上述のように、特にこの強制力付与条件を特定の病態用の他の診断ツールと組み合わせることによって、この相互作用を伴う様々な病態への傾向や素因を判断するための診断ツールを提供することができる。
【００４９】
本発明のアッセイは、湿式（ｗｅｔ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）又は乾式（ｄｒｙ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）のいずれの形式をとることもできる。いずれの形式においても、比較的平坦な反応表面上で、好ましくは、上のＯｂｅｒｈａｒｄｔの米国特許に記載されているスライド等の反応でテストを行う。最も好ましくは、米国特許第５１１０７２７号に記載の反応スライド又はカードを用いて乾式で行う（この米国特許の内容を、本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する）。本アッセイは、所望のサイズの試薬チャンバを備えた、使い捨て形式のものとすることもできる。
【００５０】
本発明の血小板／白血球相互作用アッセイの好ましい実施形態を行うためには、米国特許第５１１０７２７号（先に本明細書の一部を構成するものとして援用した）に記載されている磁界等の振動磁界、あるいは米国特許第５６７０３２９号（本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する）に記載されている磁界等の回転磁界の中に反応チャンバを置く必要がある。最も好ましくは、アッセイを回転磁界の存在下で行う。磁石（振動磁界型、回転磁界型いずれか）は、反応チャンバ中に存在するＰＩＯＰすべてに実質的な影響を与えることができるように設計されなければならない。回転磁界の好ましい例においては、反応チャンバがＴＡＳテストカードに存在するチャンバである時、磁極同士はは０．５〜２．５ｃｍ離間していることができる。磁石は、磁界が回転している時、ＰＩＯＰの運動をもたらすよう、反応チャンバに十分に接近して置かれる。システム中の磁性粒子の円運動を維持することのできる頻度で、回転磁界を回転させることができ、回転数は好ましくは２０００〜２５００ｒｐｍである。回転磁界は、中心軸の周りに永久磁石が回転することによって提供（米国特許第５６７０３２９号に記載あり）されるか、あるいは円形に配置された一連の電磁石を次々に活性化することによって生成される（米国特許第５６７０３２９号）。
【００５１】
本アッセイにおける回転磁界を提供する磁石のデザインとして、直径約３．４ｃｍの金属ディスク上に取り付けられた２セットのボタン磁石を用いることができる。金属ディスクの基板は、その中心でＤＣ電気モータのシャフトに取付けられている。各ボタン磁石アッセンブリは、直径約１ｃｍの容易に入手可能なボタン磁石を３個含む。ボタン磁石は、金属基板上に互いにきっちりと対向するように置かれる。各ボタン磁石アッセンブリの上には、半径９ｍｍで厚さ約３ｍｍの第２の金属ディスク（準円、半円）の半分を置く。２つのディスクの直線状の淵は互いに向かい合い、約１．５ｃｍ離れている。全アッセンブリは、テストカードの反応チャンバの約２〜４ｍｍ下に置く。
【００５２】
全血サンプル又は血小板リッチ血漿サンプルを、上述の試薬を含み、且つ上述の磁石上に置かれる反応チャンバに添加することによって、アッセイが開始される。その磁石は、好ましくは回転磁界を生成する磁石、最も好ましくは２５００ｒｐｍで回転する磁石である。乾式形式の場合の最も好ましい形態においては、試薬をサンプルにより再水和し、磁性粒子を解放し、回転磁界によって運動し始めるようにする。回転磁界の存在下で、磁性粒子は反応領域の外縁に沿って動く濃色物質のリングあるいはバンドを形成する。リングの中心は、初めは透明かやや灰色である（即ち、実質的にＰＩＯＰをほとんど含まない）。好ましくは、非磁性粒子は検出システムの検出限界以下であるように選択する。
【００５３】
通常の非阻害サンプルでは、ＰＩＯＰのバンドは数分かかって次第に縮小し、リングの中心がＰＩＯＰで充填され、反応領域の中心に中実状のドットを形成する。非磁性ビーズ自体は、好ましくはシステム中において容易に視認できるものではなく、アッセイのエンドポイントを決定するのに関与しない。テストのエンドポイントは試薬組成物中に存在するＰＩＯＰの位置及び運動によって定まる。回転磁界により与えられる、反応領域でのＰＩＯＰの運動は、ＰＩＯＰと非磁性ビーズの双方の上に存在する固相作動剤（即ちリガンド）と接触することによって血小板を活性化することを必要とする。２つの固相の凝集は、固相へ血小板が接着すること及びその後に血小板同士が結合すること（血小板凝集）を導く血小板の活性化により、特に両タイプの粒子上の血小板リガンドを用いる場合に起こり得る。このような場合、血小板／白血球相互作用の検出は、白血球マーカー（蛍光マーカー等）を試薬混合物に含めることにより実施され得る。アッセイにより血小板／白血球相互作用が生じると、マーカーは周囲のメディアよりも凝集した粒子の中に一層行き渡るようになる。血小板／白血球相互作用が起こらなければ、マーカーは、周囲のメディアに比べ顕著に凝集粒子内に存在することはないであろう。血小板と白血球の相互作用のレベルは、凝集した粒子内のマーカーの存在の定量的測定により判断できる。凝集は血小板非存在下や阻害剤の存在下では起こらない。
【００５４】
あるいは、一方の粒子が血小板リガンドを有し、他方の粒子が白血球リガンドを有する場合、血小板／白血球相互作用の存在は直接的にあるいは間接的に観察することができる。白血球リガンドが磁性粒子又はＰＩＯＰ粒子に結合している場合、血小板と白血球との相互作用の存在は直接的に観察することができるが、これはＰＩＯＰリングの潰縮がこの相互作用なしでは起こらないからである。一方、白血球リガンドが非磁性粒子に結合している場合、血小板リガンドで被覆したＰＩＯＰの血小板／血小板相互作用によって、非常にゆっくりではあるがＰＩＯＰリングのドットへの潰縮はなお起こり得る。本実施形態における血小板／白血球相互作用の確実な判断は、上述の蛍光マーカー等のマーカーを用いることによって最良になし得るであろう。
【００５５】
本発明の本実施形態のアッセイにおいて、結合したリガンドが血小板及び／又は白血球と相互作用すると、サンプル中に自然に存在するフリーなフィブリノーゲンが活性化した血小板と相互作用し、血小板同士の凝集が起こる。例えば心筋梗塞や脳卒中患者の場合等のように、血小板及び／又は白血球の機能が亢進すると、血小板／白血球相互作用も起こる。血小板の凝集（白血球有りあるいは無しで）が進むと、ＰＩＯＰの周囲の凝集体の有効質量が増大し、粒子によって形成される外側のリングからより重い凝集体が回転磁界の中心へと移動する。アッセイの進行とともに、このリングは最終的に一個の円状ドットへと潰縮し、この円状ドットは回転磁界中心の回りを回転し続ける。
【００５６】
本アッセイのエンドポイントは、ＴＡＳアナライザで用いているのと同様な反射赤外光を利用してモニターできる。これが可能であるのは、反応チャンバの濃色リングで覆われたエリアは、一体に収束したドットのエリアよりも大きいからである。上述のように、この信号は、定性的なＹＥＳ／ＮＯを応答することも定量的な応答も可能である。
【００５７】
反応エリアの中心部分を反射材料で形成した小さなスポットで覆うと、リングから得られる信号とドットから得られる信号の差を大きくすることができる。この場合、ＰＩＯＰの濃色リングはこの反射材料の陰にかくれ、信号が増加する。また、アッセイのエンドポイントはビデオカメラや赤外線カメラでモニターできる。カメラからの出力をデジタル化した後、画像を分析し、リング及びドット構造の形成を判定する。
【００５８】
図１は、米国特許第５１１０７２７号と同様のアッセイテストカードと回転磁界を用いた本発明アッセイの実施に係る図を示す。本図においては、ＰＩＯＰは血液サンプルを加えることにより運動可能となり、反応チャンバ（２０）内にＰＩＯＰの回転リング（１０）を形成する。
【００５９】
図２は、ＰＩＯＰの回転リング（１０）が、回転磁界の軸である中心点（３０）へ向かって潰縮し始めたことを示す。また、図３は、アッセイのエンドポイントを示し、ＰＩＯＰはドット構造（４０）へと完全に潰縮している。このエンドポイントはドラマチックであり、装置を用いても視覚的にも容易に検出可能である。視覚的な検出は、上述の定量的な情報を得る迅速簡便な方法であり、ＴＡＳアナライザ等のシステムを用いた装置による検出では（好ましくは既知の血小板／白血球相互作用レベルを有する複数のサンプルを用いて作成した標準カーブと比較することにより）得られた信号を分析でき、レセプターブロックの定量的な測定が可能である。
【００６０】
振動磁界を用いた場合は、得られる信号はＯｂｅｒｈａｒｄｔの米国特許第５１１０７２７号及び第４８４９３４０号と同様の方法で、粒子の振動をモニターすることで得られた減衰カーブを分析することにより分析される。
【００６１】
本発明の概略を説明したが、更なる理解のために具体例を挙げて本発明を説明する。特段の記載のない限り、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６２】
【実施例】
ｖＷｆ被覆ＰＩＯＰの調製  ＩＳＫ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ（インディアナ州、バルパライソ）より得たマグネタイト（１０ｇ）を密閉フラスコ内の５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４、９０ｍＬ）に添加し、窒素で５分間パージした。その後ＰＩＯＰ懸濁液をモデル７００  ＰｏｗｅｒＧｅｎホモジナイザ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、直径７ｍｍのロータ・ステータを用い、セッティングを６として５分間ホモジナイズした。ホモジナイズしたＰＩＯＰのアリコート（０．７ｍＬ）を約１０μｇ／ｍＬのｖＷｆ（０．３ｍＬ）に添加し、室温で３０分間インキュベートした。
【００６３】
ｖＷｆ被覆ポリスチレンビーズの調製  Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ペンシルバニア州、ワーリントン）より得たポリスチレンビーズ（４μｍ）は、使用前に０．２ｍｏｌ／Ｌの炭酸塩バッファー（ｐＨ９．３５）で３回洗浄した。ｖＷｆを０．２ｍｏｌ／Ｌの炭酸塩バッファー（ｐＨ９．３５）で２Ｕ／ｍＬに希釈し（ｖＷｆ１ユニットはプールされた正常血漿１ｍＬ中の量で定義される）、炭酸塩バッファー中で予め平衡化したポリスチレンビーズと混合した後、４℃で一晩インキュベートした。
【００６４】
実施例１
健常ボランティアから抗凝固剤としてのクエン酸塩に採取した全血を、ヒトｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子で被覆したポリスチレン微小球体と混合した。全血（１００μＬ）をマイクロウェル中の微小球体（約５×１０５、直径４．５μｍ）（５μＬ）に添加し、ロータリーシェーカーを用いて５００ｒｐｍで１〜１０分間振とうした。マイクロウェルからアリコートを取り、顕微鏡法によって検査した。反応は、ビデオ顕微鏡法、位相差顕微鏡法及び固定塗抹標本上での分染法によって評価した。血小板が機能亢進を示した場合、又は血小板及び／又は白血球を反復遠沈（８００×ｇ、１０分間）等の機械的ストレスに付した場合、若しくは試験前に２１ゲージニードルを用いて全血を数回強制的にせん断に付した場合にのみ、白血球と血小板との複合体がｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子で被覆した微小球体と結合することが観察された。図４は、血小板／白血球／ｖＷｆ被覆ポリスチレンビーズ複合体の一例であり、ｖＷｆ被覆ビーズに結合した血小板に多形核白血球が結合している様子を示すものである。
【００６５】
実施例２
健常ボランティアから採取しヘパリン添加あるいはクエン酸添加を行った全血に対し、自動セルカウンタを用いてディファレンシャル・セルカウントを行った。全血（１００μＬ）をマイクロウェル中のｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子で被覆した微小球体（約５×１０５、直径４．５μｍ）（５μＬ）に添加し、ロータリーシェーカーを用いて５００ｒｐｍで１〜１０分間振とうした。その後、第二のカウントを反応懸濁液に対して行った。ビーズ試薬の希釈効果を考慮に入れ、白血球数の減少は、反応後のカウントと反応前のカウントとの比を計算することによって決定し、得られた結果を１００倍して白血球数の減少率を得た。付随して、被覆していない初期の微小球体を、抗凝固した全血と同様の方法で混合し、上述のように評価した。カウントデータを図５の表に示す。
【００６６】
血小板が機能亢進を示した場合、又は血小板及び／又は白血球を反復遠沈（８００×ｇ、１０分間）等の機械的ストレスに付した場合、若しくは試験前に２１ゲージニードルを用いて全血を数回強制的にせん断に付した場合にのみ、抗凝固した全血をｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子で被覆した微小球体と混合した後、白血球数の減少が見られた。これに対し、被覆していない微小球体を用いた試験では、白血球数の減少は見られなかった。位相差顕微鏡法によって、白血球／血小板複合体はｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子で被覆した微小球体と結合して凝集体を形成し、被覆していない微小球体とは結合しないことが確認された。白血球、血小板及びｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子で被覆した微小球体によって形成された凝集体はサイズが大きいため、ディファレンシャル・セルカウンタでは白血球としてカウントできないことがわかった。
【００６７】
実施例３
冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）手術を受ける予定の被験者（ｎ＝３）に対し、本発明の方法を用いて外科手術前及び外科手術時に試験を行った。外科手術時の各時間ポイント（手術前、バイパス移植時（ｏｎ ｂｙｐａｓｓ）、プロタミン投与後、集中治療室、術後２４時間後）において、クエン酸添加全血に対しディファレンシャル・セルカウントを行った。更に、各時間ポイントで得たクエン酸添加全血（１００μＬ）を、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子で被覆した微小球体（約５×１０５、直径４．５μｍ）（５μＬ）を含むマイクロウェルに添加した。このマイクロウェルをロータリーシェーカーを用いて５００ｒｐｍで１〜１０分間振とうした。第二のディファレンシャル・セルカウントをマイクロウェルから得た血液に対して行った。ビーズ試薬の希釈効果を考慮に入れ、白血球数の減少は、反応後のカウントと反応前のカウントとの比を計算することによって決定し、得られた結果を１００倍して白血球数の減少率を得た。全ての被験者の手術前のサンプルにおいて、ディファレンシャル・セルカウント法で測定した白血球数に減少が見られた。顕微鏡法によって、ＶＷＦ被覆微小球体表面上での血小板／白血球複合体形成が確認された。バイパス移植時に患者から採取した血液サンプル中では、ＶＷＦ被覆微小球体の存在下で血小板／白血球複合体の形成が確認された。しかし、いずれの被験者についても、術後２４時間後に採取した血液サンプル中では、ＶＷＦ被覆微小球体存在下での血小板／白血球複合体の形成は見られなかった。
【００６８】
実施例４
健常ボランティアから採取した全血を、クエン酸バキュテイナー採血管、ＥＤＴＡバキュテイナー採血管及びヘパリンバキュテイナー採血管へ注入した。各採血管からの血液滴を、ＶＷＦ被覆ポリスチレンビーズとＶＷＦ被覆常磁性酸化鉄粒子（ＶＷＦ−ＰＩＯＰ）との混合物を含む３個の独立した反応カードを有する反応ウェルに添加し、得られた懸濁液を５分間しっかりと混合した。全血のアリコート（５μＬ）を各カードから除去し、微視的ウェットマウント観察（位相差）及び染色塗抹（ヘマ−３染色、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）評価に付した。ＥＤＴＡ添加血液においては、ＶＷＦビーズへの血小板の弱い接着と共に大部分の血小板が結合せずに残っていることが確認された。また、ＥＤＴＡ添加血液においては、血小板はＶＷＦ− ＰＩＯＰに結合しなかった。クエン酸添加血液サンプル及びヘパリン添加血液サンプルの両方においては、多数の血小板がＶＷＦビーズに結合し、引き続きＶＷＦ−ＰＩＯＰに結合し大型の複合体を形成することが示された。結合せずに残った血小板は殆ど無かった。これらの大型のＶＷＦビーズ／血小板／ＶＷＦ−ＰＩＯＰ複合体に対する（又は複合体内での）白血球の結合は、ウェットマウント及び染色塗抹のいすれにおいても観察されなかった。血小板が機能亢進を示した場合、又は血小板及び／又は白血球を反復遠沈（８００×ｇ、１０分間）等の機械的ストレスに付した場合にのみ、クエン酸添加サンプル及びヘパリン添加サンプルにおいて、白血球と血小板との複合体がｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子で被覆した微小球体及びＶＷＦ−ＰＩＯＰと結合することが観察された。機械的ストレスよって、血小板とＶＷＦビーズ又はＶＷＦ−ＰＩＯＰとの結合が増大することはなく、また、ＥＤＴＡ血液サンプル中で白血球／血小板複合体の形成が促進されることもなかった。
【００６９】
テストカードの調製  Ｏｂｅｒｈａｒｄｔの米国特許第５１１０７２７号に記載されているような、約３０μＬの反応チャンバを有するテストカードに、上記の磁性粒子及びｖＷｆで被覆した非磁性粒子を含む試薬組成物を入れる（試薬組成物は、１ｍＬ当り被覆ＰＩＯＰ粒子を１〜２ｍｇと２×１０６〜８×１０６個のポリスチレン粒子を含む）。また、反応チャンバには、検出可能なシグナルを提供するのに充分な量の白血球マーカー（ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４５等）を入れる。一旦反応チャンバがサンプルで満たされると、次いで、上記のＯｂｅｒｈａｒｄｔの特許でテストカードの調製について記載されているように、サンプルを凍結し凍結乾燥する。
【００７０】
しかし、被覆非磁性粒子に対する被覆磁性粒子の比は限定されず、回転リングを形成しディスクあるいはドットに潰縮するのに充分な磁性粒子が存在する限りいかなる比も取り得る。
【００７１】
血小板／白血球相互作用テスト  上記の試薬を含むテストカード（使い捨て可能）を回転磁石上方のプラットフォームに置く。全血（又は他の血液由来の）サンプルをウェルに添加すると、サンプルは毛管現象によって反応チャンバに引き寄せられる。磁性粒子と非磁性粒子が遊離される時に、磁性粒子は反応チャンバの中心部の周りに回転リングを形成する。反応が進むにつれて、回転リングの内縁部は中心に向かって移動し、最終エンドポイントにおいては、内縁部は中心点に完全に潰縮しディスクあるいはドットを形成する。総経過時間は約１〜２０分であり、通常２〜４分の範囲である。
【００７２】
上記のｖＷｆ被覆ＰＩＯＰ及びｖＷｆ被覆ポリスチレン粒子を用いる場合、血小板／白血球相互作用の存在は、元の試薬組成物に存在する白血球マーカーを検出することによって判断される。あるいは、ＰＩＯＰが（ｖＷｆの代わりに）白血球リガンドで被覆されている場合、血小板／白血球相互作用の発生は、ＰＩＯＰリング自身の潰縮によって検出される。
【００７３】
前述の基本的発明思想に基づき、本発明は他の各種改良物及び変形物とすることができることは明らかである。従って、添付の請求の範囲内で、上で述べた実施形態以外の態様でも本発明を実施できるものと理解されるべきである。
【００７４】
本出願は、１９９９年１１月１５日に出願した米国仮出願第６０／１６５４６２号に基づくものであり、その全内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
回転磁界を用いた本発明のアッセイにおいて形成されたＰＩＯＰリングを示す。
【図２】
本発明のアッセイにおいて形成されたＰＩＯＰリングの中心点に向かって潰縮し始めた段階を示す。
【図３】
回転磁界の存在下におけるＰＩＯＰリングの完全な潰縮により形成されたディスクあるいはドットを示す。
【図４】
血小板／白血球／微粒子複合体の形成を示す顕微鏡写真を示す図である。
【図５】
上述した実施例において得られたカウントデータを表にまとめたものである。
【符号の説明】
１０    回転リング
２０    反応チャンバ
３０    中心点
４０    ドット構造
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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