(57)【要約】物体の３次元画像化の技術は、空間領域の中の物体にマスクが適用される反復する溶剤平坦化方式を利用する。この空間領域の中では、マスクの外側の細部が捨てられる。次に、作業画像は空間周波数領域に変換され、そして空間周波数領域からの位相情報がオリジナルの振幅情報と組み合わされて合併され更新された作業画像を生じ、そして次に、適切な収束パラメータが満たされるまでこの合併され更新された作業画像が同じマスク段階および合併段階を受けることができる。この技術は、生体分子のような単一の粒子物体を電子顕微鏡を用いて画像化するのに特に適している。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ソース画像振幅情報とマスクを定めるマスク情報とから物体の３次元画像を生成する方法であって、
前記物体の予測される３次元の輪郭に対応するマスクの外側の作業画像の部分を除去するために空間領域の中の前記物体の前記作業画像に前記マスクを適用する段階と、
前記作業画像を表す生成された振幅情報および位相情報を形成するために前記作業画像を周波数領域に変換する段階と、
周波数領域の中に更新された作業画像を形成するために前記ソース画像の振幅情報を前記生成された位相情報と合併させる段階と、
前記更新された作業画像を空間領域に変換する段階と、
収束基準が満たされるまで前記更新された作業画像に前記適用段階および後の段階を行うことを繰り返す段階とを有する方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記物体が
分子と、
マクロ分子と、
マクロ分子複合体と、
の１つである方法。
【請求項３】
請求項１および請求項２のいずれかに記載の方法において、前記ソース画像の振幅情報および前記ソース画像の位相情報が電子顕微鏡法により得られる方法。
【請求項４】
請求項３記載の方法において、前記物体が電子顕微鏡法の下にある時ガラス相の流体の中に埋め込まれる方法。
【請求項５】
請求項１〜請求項４のいずれかに記載の方法において、前記ソース画像の振幅情報および前記ソース画像の位相情報が前記物体に行われた複数の画像化動作から採取された画像データを組み合わせることから得られる方法。
【請求項６】
請求項５記載の方法において、前記複数の画像化動作が前記物体の異なる段階について実行される方法。
【請求項７】
請求項５および請求項６のいずれかに記載の方法において、前記画像化動作が前記物体について焦点が合っていなくおよび破壊的である方法。
【請求項８】
請求項１〜請求項７のいずれかに記載の方法において、閾値レベルを越える空間周波数領域の中で局所的変動を有する前記画像の部分を識別することによって前記マスクが形成される方法。
【請求項９】
請求項１〜請求項８のいずれかに記載の方法において、前記更新された作業画像を形成する際に前記合併させる段階が前記生成された振幅情報を前記ソース画像の振幅情報と混合する方法。
【請求項１０】
ソース画像の振幅情報およびマスクを定めるマスク情報から物体の３次元画像を生成する装置であって、
前記物体の予測される３次元の輪郭に対応する前記マスクの外側の作業画像の部分を除去するために空間領域の中の前記物体の前記作業画像に前記マスクを適用するように動作することができ、
前記作業画像を表す生成された振幅情報および位相情報を形成するために前記作業画像を周波数領域に変換するように動作することができ、
周波数領域の中に更新された作業画像を形成するために前記ソース画像振幅情報を前記生成された位相情報と合併させるように動作することができ、
前記更新された作業画像を空間領域に変換するように動作することができ、
収束基準が満たされるまで前記更新された作業画像に前記適用動作および後の動作を繰り返すように動作することができる、データ処理論理を有する装置。
【請求項１１】
請求項１０記載の装置であって、前記物体が
分子と、
マクロ分子と、
マクロ分子複合体と、
の１つである装置。
【請求項１２】
請求項１０および請求項１１のいずれかに記載の装置であって、前記ソース画像振幅情報および前記ソース画像位相情報が電子顕微鏡法から得られる装置。
【請求項１３】
請求項１２記載の装置であって、前記物体が電子顕微鏡法の下にある時にガラス相の流体の中に埋め込まれる装置。
【請求項１４】
請求項１０〜請求項１３のいずれかに記載の装置であって、前記ソース画像の振幅情報および前記ソース画像の位相情報が前記物体に行われた複数の画像化動作から採取された画像データを組み合わせることから得られる装置。
【請求項１５】
請求項１４記載の装置において、前記複数の画像化動作が前記物体の異なる段階で実行される装置。
【請求項１６】
請求項１４および請求項１５のいずれかに記載の装置において、前記画像化動作が前記物体について焦点が合っていなくおよび破壊的である装置。
【請求項１７】
請求項１０〜請求項１６のいずれかに記載の装置において、閾値レベルを越える空間周波数領域の中で局所的変動を有する前記画像の部分を識別することによって前記マスクが形成される装置。
【請求項１８】
請求項１０〜請求項１７のいずれかに記載の装置において、前記更新された作業画像を形成する際に前記生成された振幅情報を前記ソース画像の振幅情報と混合するように前記データ処理論理が動作することができる装置。
【請求項１９】
ソース画像の振幅情報およびマスクを定めるマスク情報から物体の３次元画像を生成するためにコンピュータを制御するコンピュータ・プログラム・プロダクトであって、
前記物体の予測される３次元の輪郭に対応する前記マスクの外側の作業画像の部分を除去するために空間領域の中の前記物体の前記作業画像に前記マスクを適用する段階と、
前記作業画像を表す生成された振幅情報および位相情報を形成するために前記作業画像を周波数領域に変換する段階と、
周波数領域の中に更新された作業画像を形成するために前記ソース画像の振幅情報を前記生成された位相情報と合併させる段階と、
前記更新された作業画像を空間領域に変換する段階と、
収束基準が満たされるまで前記更新された作業画像に前記適用段階および後の段階を繰り返す段階とを有するコンピュータ・プログラム・プロダクト。
【請求項２０】
請求項１９記載のコンピュータ・プログラム・プロダクトであって、前記物体が
分子と、
マクロ分子と、
マクロ分子複合体と、
の１つであるコンピュータ・プログラム・プロダクト。
【請求項２１】
請求項１９および請求項２０のいずれかに記載のコンピュータ・プログラム・プロダクトであって、前記ソース画像の振幅情報および前記ソース画像の位相情報が電子顕微鏡法によって得られるコンピュータ・プログラム・プロダクト。
【請求項２２】
請求項２１記載のコンピュータ・プログラム・プロダクトであって、前記物体が電子顕微鏡法の下にある時にガラス相の流体の中に埋め込まれるコンピュータ・プログラム・プロダクト。
【請求項２３】
請求項１９〜請求項２２のいずれかに記載のコンピュータ・プログラム・プロダクトであって、前記ソース画像の振幅情報および前記ソース画像の位相情報が前記物体に行われた複数の画像化動作から採取された画像データを組み合わせることから得られるコンピュータ・プログラム・プロダクト。
【請求項２４】
請求項２３記載のコンピュータ・プログラム・プロダクトにおいて、前記複数の画像化動作が前記物体の異なる段階で実行されるコンピュータ・プログラム・プロダクト。
【請求項２５】
請求項２３および請求項２４のいずれかに記載のコンピュータ・プログラム・プロダクトにおいて、前記画像化動作が前記物体について焦点が合っていなくおよび破壊的であるコンピュータ・プログラム・プロダクト。
【請求項２６】
請求項１９〜請求項２５のいずれかに記載のコンピュータ・プログラム・プロダクトにおいて、閾値レベルを越える空間周波数領域の中で局所的変動を有する前記画像の部分を識別することによって前記マスクが形成されるコンピュータ・プログラム・プロダクト。
【請求項２７】
請求項１９〜請求項２６のいずれかに記載のコンピュータ・プログラム・プロダクトにおいて、前記更新された作業画像を形成する際に前記合併段階が前記生成された振幅情報と前記ソース画像の振幅情報とを混合するコンピュータ・プログラム・プロダクト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単一粒子電子顕微鏡法によって例えば生体分子のような物体の３次元画像化の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
単一粒子の低温ＥＭ（ｃｒｙｏ−ＥＭ）は開発中の分野である。現在日常的に達成することができている５〜１０オングストロームのレベルの解像度において、蛋白質の中のαヘリックスを可視化することができ、場合によってはβシートをも可視化することができる。けれども、アミノ酸側鎖または核酸塩基の画像化はまだ到達されていないままである。したがって、大きな生体分子集合体の低温ＥＭの現状は、ミオグロビンまたはヘモグロビンのαヘリックスが最初に可視化された時の初期の蛋白質結晶学を思い出させる。生体材料の高解像度電子顕微鏡法は、厳しい高真空の環境とイオン化作用を行う電子放射線とのために装置の発明が妨げられていた。イオン化作用を行う電子放射線の照射が行われるとすぐに試料は破壊されてしまう。１９８０年代の初期に、ハイデルベルクのＥＭＢＬのジャック・デュボチェ（Ｊａｃｑｅｓ  Ｄｕｂｏｃｈｅｔ）およびそのグループは「低温ＥＭ」の試料作成技術を完成させた［デュボチェ（Ｄｕｂｏｃｈｅｔ）ほか１９８８年］。例えばカーボンのフォイルの中の小さな穴に溶液の薄い層を張り、それを低温の液体エタンの中に冷凍突入させることによって液体窒素温度にまで急速に冷却し、それにより固化したこの溶液はすべての実際的な考察に対しては全く水のように振る舞うガラス相になる。この技術は、例えばそれらの自然のままの水和状態にあるウイルスの最高によく保存された画像をもたらす［アドリアン（Ａｄｒｉａｎ）ほか１９８４年］。
【０００３】
試料の分子画像に基づいて３次元（３Ｄ）構造を計算するために、良好でそして効率的なアルゴリズムと強力なコンピュータとを組み合わせることが必要である。電子顕微鏡画像を処理するために必要な計算技術の開発は、アーロン・クラッグ（Ａａｒｏｎ  Ｋｌｕｇ）［デロシーア（ＤｅＲｏｓｉｅｒ）およびクラッグ（Ｋｌｕｇ）１９６８年、クロウザ（Ｃｒｏｗｔｈｅｒ）１９７１年］を中心とする主としてケンブリジのグループによって約３０年前に開始された。この技術により、２０面体のウイルスの構造の計算が７オングストローム〜９オングストロームの解像度のレベル［コンウエイ（Ｃｏｎｗａｙ）ほか１９９７年、
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ほか１９９７年］にまで可能になり、さらに最近は５．９オングストロームの解像度のレベル［ファン・ヒール（ｖａｎ  Ｈｅｅｌ）ほか２０００年］または４．５オングストロームの解像度のレベル（進行中の研究）にさえ可能になった。完全に対称な構造に対してこれまでに達成された最高の解像度は大腸菌の５０Ｓの大きなリボゾーム・サブユニットに対する７．５オングストロームである［マタディーン（Ｍａｔａｄｅｅｎ）ほか１９９９年］。Ｘ線結晶学と比べる時、単一粒子の低温ＥＭ方式の１つの卓越した強さは、徹底した結晶化実験に訴えることなく、リボゾームのような生体複合体の異なる機能状態を画像化するその能力である［シュタルク（Ｓｔａｒｋ）ほか１９９７年ａ、１９９７年ｂ、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎｎ）ほか１９９７年］。他方、Ｘ線結晶学は、大きなリボゾーム・サブユニット［バン（Ｂａｎ）ほか２０００年］および小さなリボゾーム・サブユニット［ウインバリ（Ｗｉｍｂｅｒｌｙ）ほか２０００年、シュルエンツェン（Ｓｃｈｌｕｅｎｚｅｎ）ほか２０００年］のそれぞれの最近のはなばなしい構造のような原子的分解能の構造を得るのに優れている。電子顕微鏡法は、２Ｄ結晶の画像に基づいて原子的分解能の構造を得ている［ヘンダーソン（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ）１９９０年］。けれども、良質の結晶がないために、電子結晶学的に解決されているのはほんの少数の構造だけである。単一粒子の画像だけに基づいて、原子的な分解能の構造を得ることが強く要請されている。
【０００４】
達成できる分解能を制限しているのは顕微鏡ではない。２００〜３００ｋＶの加速電圧で動作しそして試料を液体窒素温度に保持することができるまたは液体ヘリウム温度にさえ保持することができる台を備えた最近の電界放射銃の電子顕微鏡は２オングストロームを越える情報を有する安定な無機試料の画像を生じている［ゼンリン（Ｚｅｍｌｉｎ）ほか１９９６年］。冷却は、データ収集の期間中に生体分子が損なわれることがなくそのままにしておくのを助ける。けれども、生体マクロ分子に対する許容できる露出のレベルは、画像の中の約３オングストロームの情報を直接に見るのに必要な露出よりも約３桁程度だけ低いままである。生体材料の高解像度の構造を達成することはノイズとの戦いであり、そして極めてノイズの多い多数の分子画像を平均化することが必要である（［ファン・ヒール（ｖａｎ  Ｈｅｅｌ）ほか２０００年］を参照）。
【０００５】
高解像度の結果を達成する際の主要な問題点は、分子画像を収集する前に分子を見ることができないことであり、したがってその画像に焦点を合わせることができないことである。分子画像の中の高解像度の位相は焦点のずれを変えると共に急速に振動し、そして単一粒子の低温ＥＭの主要な問題点は、極めてノイズの多いデータの組の中の激しい位相の変動にもかかわらず、高周波情報をコヒーレントに平均しなければならないことである。顕微鏡写真のそれぞれの面積領域に対する焦点のずれパラメータを精密に決定することは簡単ではない。このように精度が無いことは別にして、粒子の寸法および氷の層の厚さはデータの中の焦点のずれのパラメータを決定する際に固有の不確定さを生ずる。この不確定さの最終的な効果は高周波画像の細部を不鮮明にすることである（「焦点のずれのエンベロープ（ｄｅｆｏｃｕｓ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ）」［ファン・ヒール（ｖａｎ  Ｈｅｅｌ）ほか２０００年］）。粒子の中における焦点のずれの変動の効果は「エバルド球の曲率」の効果としてまた知られている［デロシーア（ＤｅＲｏｓｉｅｒ）２０００年］。
【０００６】
本発明の１つの特徴から見るならば、ソース画像の振幅情報とマスクを定めるマスク情報とから物体の３次元画像を生成する方法が得られる。前記方法は
前記物体の予測される３次元の輪郭に対応する前記マスクの外側の作業画像の部分を除去するために、空間領域の中の前記物体の前記作業画像に前記マスクを適用する段階と、
前記作業画像を表す生成された振幅情報および位相情報を形成するために前記作業画像を周波数領域に変換する段階と、
周波数領域の中に更新された作業画像を形成するために前記ソース画像の振幅情報と前記生成された位相情報とを合併する段階と、
前記更新された作業画像を空間領域に変換する段階と、
収束基準が満たされるまで前記更新された作業画像に前記マスクを前記適用する段階およびその後の段階を繰り返す段階と、
を有する。
【０００７】
本発明は、驚く程良好な結果を生ずる画像を形成するために反復する溶剤平坦化方式を適用する。
【０００８】
本発明の技術は、例えば、薬の発見の分野に用いるために、例えば医薬品を目標とするマクロ分子およびマクロ分子集合体にについてどのように収斂させていくかに関して、マクロ分子およびマクロ分子複合体の３次元構造を決定するのに特に適している。
【０００９】
提案された技術は、物体の２次元投影画像の振幅情報がコントラスト転送関数［ファン・ヒール（ｖａｎ  Ｈｅｅｌ）２０００年］による位相変化によって損なわれないという事実を活用することによって、非常に高い分解能を達成する。
【００１０】
本発明の技術は異なるソースから得られる広範囲の情報に適用できることが分かるであろうが、本発明は電子顕微鏡法と共に用いるのが特に適切である。電子顕微鏡法は潜在的に高い分解能の画像を生ずることができるが、しかし繊細な生体試料に応用することに対してそれは厳しい画像化技術であるという欠点を有している。したがって、試料を観察して（したがって、装置の焦点を合わせて）その画像を取得する前にこれらの試料を破壊してしまう。したがって、多くの実効的には焦点のずれた画像が得られ、このような画像を解析するのに本発明の技術が用いられ、それによりて高分解能の画像が生成される。この高分解能の画像の生成の際には、位相情報が少なくともある程度回復される。
【００１１】
電子顕微鏡法に関連して、水のようなガラス相の流体の中に埋め込まれた物体を画像化するのにこの技術は特に適している。
【００１２】
マスクの作成は本発明の中で重要な段階であり、そして自動的利用に対して適切であるマスクを構成する非常に好ましい方法は、閾値を越える空間周波数範囲の中の局所的変動を有する画像の部分を識別することによってマスクが作成される方法であることが分かるであろう。
【００１３】
この技術は分散型の計算技術に対してまた十分に適切である。
【００１４】
本発明のその他の特徴により、前記の技術に従って動作する装置と、前記の技術に従ってコンピュータを制御するためのコンピュータ・プログラムを支援するコンピュータ・プログラム・プロダクトとが得られる。
【００１５】
次に、本発明の１つの実施例を添付図面を参照して説明する。この実施例は単に１つの例として取り上げたものである。
【００１６】
結果の解像度を持続的に改良することを可能にする１つの重要な技術は多変量の統計データの圧縮および分類である（ファン・ヒール（ｖａｎ  Ｈｅｅｌ）およびフランク（Ｆｒａｎｋ）１９８１年；ファン・ヒール１９８４年、１９８９年；ファン・ヒールほか２０００年）。これらのパターン認識技術により、その極端なノイズ・レベルにもかかわらず、わずかに異なる配向状態またはわずかに異なる焦点のずれ状態にある分子画像を弁別することができる。種々の種類の構成要素を平均化することによってノイズの減少を達成した後、（「角度的再構成」［ファン・ヒール１９８７年］によって）通常はオイラ（Ｅｕｌｅｒ）配向だけを指定することができる。（約３．５オングストロームよりよい）それらの原子座標を用いて解釈可能である構造に向かって解像度が増大する時、Ｘ線結晶学に用いられるデータの改善技術を粒子の画像化に対して採用することを探求する際に利点がある。
【００１７】
Ｘ線結晶学において、直接に観測できるものは結晶の回折振幅である。それは、回折ピークの相対的位相は回折パターンの登録の際に失われる（「位相問題」）からである。この位相は、重金属誘導体の古典的な利用を含む種々の技術によって後で回復されなければならない。それとは対照的に、単一の粒子の低温ＥＭでは、観測可能であるものはマクロ分子の投影画像である。この投影画像は非常にノイズを含んでいるけれども、振幅の情報と位相の情報との両方を含んでいる。
【００１８】
Ｘ線結晶学的な溶剤の平坦化（ｓｏｌｖａｎｔ  ｆｌａｌｌｅｎｉｎｇ）は、分子の外側では結晶の中で構造のない密度の溶剤のみが存在するはずであるという事実を活用する。したがって、既知の分子のエンベロープの外側の電子密度をゼロに設定することによって、このような先験的な知識を活用することが正当化される。修正された実空間の密度をフーリエ空間にフーリエ変換した後、実験的な振幅（または計算された振幅）と課された実空間の制約によって修正された位相とを組み合わせることによって、複雑な構造因子を精錬化（ｒｅｆｉｎｅ）することができる。フーリエ空間の中の構造因子の位相を精錬化するために、この処理工程が繰り返して適用される（ワングＢ−Ｃ（Ｗａｎｇ  Ｂ−Ｃ）１９８５年、アブラハム（Ａｂｒａｈａｍ）およびレスリイ（Ｌｅｓｌｉｅ）１９９６年）。
【００１９】
単一の原子の画像化に対するこの原理の適応は付録Ｉに記載されている。
【００２０】
この考察の出発点として、多数（Ｏ［１００００］−Ｏ［１０００００００］）のノイズの多い分子画像に基づいて標準的な３Ｄ再構成が既に実行されていると仮定する。具体的にいえば、コントラスト転送関数（「ＣＴＦ（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」）の少なくとも近似的な補正は、分子情報が個々の分子の環境にわたってもはや広がっていなくて粒子の境界の内部に集中するようになる、というように達成されている［ファン・ヒール（ｖａｎ  Ｈｅｅｌ）ほか２０００年］と仮定する。したがって、（予備的な）３Ｄ再構成がいったん利用可能であれば、着目している分子複合体の３Ｄ境界がどのようであるかをかなり確実に述べることができる。したがって、構造の全体を囲う３Ｄマスクを定めることができる。（関連する空間周波数領域内において）バックグラウンドの変動よりも大幅に大きな局所的変動を有する領域を３Ｄ容積内に見い出すことによって、３Ｄマスクを生成するアルゴリズムが得られる。
【００２１】
第１の例として、大腸菌の大きなリボゾーム・サブユニットの３Ｄ再構成［マタディーン（Ｍａｔａｄｅｅｎ）ほか、１９９９］が、１つの溶剤平坦化手順の性質を解明するためのテスト物体として用いられる（付録２を見よ）。したがって、３Ｄ再構成の振幅成分の全部と分子のまわりの３Ｄマスクとマップの低周波位相成分とが、この手順に対する入力として用いられる。この非対称分子の場合には、この手順は鮮明な球面フーリエ空間マスクを備えた低域フィルタ作用によってオリジナルの位相に課された鋭いカット・オフ・レベルの〜２倍にまで位相を統計的に有意に拡張することができる（付録２）。この実験は、もし実験的位相の範囲を越えて利用可能である信頼できる振幅を有するならば、位相を高い解像度に広げることは低温ＥＭの中で可能である。
【００２２】
この種の実験は、ランブリカス・テレストリス（Ｌｕｍｂｒｉｃｕｓ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）のＤ６対称性の巨大虫ヘモクロビンの３Ｄ再構成を試みることによって、段階をさらに推し進めることができる（ファン・ヒールほか２０００年）（付録３を見よ）。低域フィルタ作用を受けたマップからの位相を用いて反復を開始するよりはむしろ、この例は乱数発生器によって全く生成された密度を含む３Ｄ容積でもって出発し、そして次にこの「マップ」にＤ６対称性を課する。その結果は、オリジナルの構造の位相が驚異的な精度で回復することを示した。反復する溶剤平坦化手順の期間中、Ｄ６対称性を課することが規則的に繰り返され、そしてこのことは溶剤平坦化工程の全体の収束を改善する。
【００２３】
最も新しい結果（付録４、図８）は、リボゾームのような完全に非対称な粒子に対し、乱数発生器によって生成された密度を有する３次元の容積領域から得られる初期位相と実験的な振幅で出発するならば、正しい位相を生成することがまた可能であることを示した。
【００２４】
溶剤平坦化手順を適用するためにこれらの例において必要である２つの技術（プログラム）（［ワングＢ−Ｃ（Ｗａｎｇ  Ｂ−Ｃ）１９８５年、アブラハム（Ａｂｒａｈａｍｓ）およびレスリイ（Ｌｅｓｌｉｅ）１９９６年］を参照）は自動マスキング・プログラムである。この自動マスキング・プログラムは再構成容積の内側で着目する物体を見出だすべき場所を定め、および付録１に説明されているように実際の単一粒子の溶剤平坦化（ＳＰＳＦ（ｓｉｎｇｌｅ−ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｆｌａｔｔｅｎｉｎｇ）手順により進むプログラムを定める。（この新らしい単一粒子プログラムはＩＭＡＧＩＣソフトウエア・システムの中で実装することができる［ファン・ヒール（ｖａｎ  Ｈｅｅｌ）ほか１９９６年］）。自動マスキング・プログラムは、再構成容積の中の点（「ボクセル（ｖｏｘｅｌ）」）のおのおのの３Ｄ環境の中の局所的変動を決定することに基づいている。それにより、関連する周波数領域の中の変動だけが考察される（出版準備中）。これはノイズの多い画像の中の物体を検出することを目指す以前のアルゴリズムに類似している［ファン・ヒール（ｖａｎ  Ｈｅｅｌ）１９８２年］。１つの興味をもって観察されることは、典型的な再構成容積の典型的には約１０−１５％だけが着目している分子を実際に含んでいることである。この傾向は、利用可能な面積領域の言葉でいえば、分子投影によって占有される面積領域の約４倍を扱うフレームの中に２次元の分子画像を配置することである。その結果、３Ｄ再構成容積の〜１／８だけが満たされるであろう。
【００２５】
フーリエ空間の中で容積の１／８だけが満たされる結果として、振幅情報および位相情報はフーリエ空間のボクセルのおのおののまわりの〜８個のボクセルの環境にわたって相関関係にあるであろう（相関容積は物体によって満たされた相対的容積の逆数である）。Ｘ線結晶学では、結晶の溶剤量が高ければ高い程、溶剤平坦化位相の精密度がますます良く働くであろう。単一粒子の低温ＥＭでは、望むような大きさの箱を着目する粒子の回りに配置することができ、したがって「溶剤の含有量」を望むように高く作成することができ、したがってフーリエ空間の相関容積を意のままに広げることができる。実際、第１の実験結果（付録４）では、３次元画像の全体は３次元画像の容積の８倍の容積の中にそれ自身が埋め込まれた。したがって、リボゾームはそのリボゾームの容積のほぼ６４倍の「溶剤」の中に埋め込まれた。期待されるべきであるように、溶剤対分子のこのように高い容積比は溶剤平坦化手順の収束を改善する。Ｘ線結晶学の慣例に従って、溶剤平坦化手順はフーリエ空間の低解像度の端部で開始し、そしてゆっくりと高解像度の情報を含む。アルゴリズムの反復当たりのフーリエ空間の半径の増大は、それらが相関容積の内部にほぼ止まるように小さく選定される。
【００２６】
低温ＥＭテスト・データに関して単一粒子の溶剤平坦化に対する新しいプログラムを適用する時（付録２および付録３を見よ）、驚異的な品質の結果が用意されることは困難であった、すなわち、生体マクロ分子の構造を分子画像の振幅だけを（ほぼ）用いてそしてそれらの位相を（ほぼ）無視して再構成できることは困難であった。５０Ｓリボゾーム・サブユニット・テスト（付録２）では、溶剤平坦化手順によって達成される解像度において約２の因子の増大をすることは情報内容において約８（２3）倍の増大に対応し、そしてこのレベルの改良は明らかに結果に反映する。虫のヘモクロビンの例（付録３）では、オリジナルの位相はなにも用いられていないから、（ＦＳＣによって定められるような）情報内容の増大は驚異的である。これらの観察は、もしデータの中の高像度位相を同期して進めるために通常与えられる注意が払われるならば、いくらか直感に反している。この第１の実験結果は、この方式（付録４）は実際には大きな影響を与えるであろうことを示す。
【００２７】
単一粒子溶剤平坦化は全く新規な技術である。種々のパラメータが収束を制御することができる。これまで行われたテストでもって明らかになった１つの特徴は、高い点群対称性を有する分子に対して特性は一層良好であることである。ここで１つの例として用いられた虫のヘモクロビンはＤ６の点群対称性を有し、そしてそれは完全に非対称な５０Ｓリボゾーム・サブユニットよりもはるかに急速に解に向かって収束する。特に、多数の溶剤平坦化反復サイクルの後にＤ６対称性を再び課することができ、そしてその対称化は高周波成分の良好な収束に導く。それとは対照的に、反復の過程における非対称なリボゾームはマスクの端部に逆らってゆっくりと移動する傾向があり、それは再構成マスクの中と反復の期間中の溶剤領域（マスクの外側の領域）にそれたパワーの中との両方でエラーを増大することに導く。けれども、良好な収束パラメータを備える場合には、このような問題点は消滅する傾向がある。収束を改良するための１つの技術が、反復のおのおのの期間中に溶剤領域（マスクの外側）をゼロに設定する代わりに、Ｘ線結晶学的な溶剤平坦化から順応された。もしマスクを課する前にその位置で見出だされた密度の一部分の負量に新しい外側の密度が設定されるならば、収束は改善される。多くの新しい収束パラメータおよび新しい収束戦略がまた有用であることが分かった。例えば、周波数の領域において、３次元物体の位相が利用可能であるだけでなく、またその振幅も利用可能である。これらの振幅を入力される実験的な振幅でちょうど置き換えるよりはむしろ、実験的な振幅と計算された振幅との間の差の一部分を含むことがこの手順の収束に対して利点がある。計算された振幅を含む程度により、種々の収束基準の関数を作成することができる。有用な基準は、（Ｘ線結晶学における標準的な基準である）「Ｒ因子」の特性を有する周波数領域（フーリエ空間）の中の原点までの距離の関数として計算される曲線、振幅スペクトルおよび情報の「フーリエ・シェル相関」［ＦＳＣ（Ｆｏｕｒｉｅｒ−Ｓｈｅｌｌ−Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）：ハラオツ（Ｈａｒａｕｚ）およびファン・ヒール、１９８６年］、であることが分かった。これらの曲線は、大抵は、基準と計算された振幅（Ｒ因子）との間で計算される、または精密化された再構成（ＦＳＣ情報）の異なる反復の間で計算される。
【００２８】
ここで、考え方の全く異なる学派について述べておかなくてはならない。物体の後方の複雑な波面が画像面の振幅と回折面の振幅とによって十分に決定される範囲を考察した多くの出版物が存在する［サクストン（Ｓａｘｔｏｎ）１９７８年を参照］。溶剤平坦化アルゴリズムはこのような手順の特別な場合として見ることができる。Ｘ線結晶学における位相の問題は、もし回折スポットの間からの情報が利用可能であるならば、原理的には解決することができるかも知れない回折パターンの「臨界サンプリング（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｓａｍｐｌｉｎｇ）」の結果であることが前から知られていた［サイレ（Ｓａｙｒｅ）１９５２年、
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２００１年］。最近の理論的な計算では、「オーバーサンプリング」［ノイツェ（Ｎｅｕｔｚｅ）ほか２０００年］によって漸次導入される単一分子の回折パターンを集めるために、将来の自由電子レーザの可能な応用が考えられた。実際、最近のコンピュータ実験では、ミアオ（Ｍｉａｏ）ほか［ミアオ（Ｍｉａｏ）ほか２０００年］は、シュミレートされた単一粒子Ｘ線回折パターンだけからリボゾーム・モノマの構造を再構成することが可能であることを示した。
【００２９】
前記で提案された単一粒子溶剤平坦化手順と理論的な単一粒子回折実験との間にはその考え方に少しの違いがあるけれども、相互に密接な関係がある。ＳＰＳＦ方式に用いられるべき画像情報は今日利用可能であるが、一方最初のＸ線レーザはなお構成されなければならない。種々の改良された方式がなお設置されなければならなく、そしてこれらの手順の実際的な細部と理論的な細部とのすべてをこなすのにはいくらかの時間がかかるであろう。例えば、どのような種類の情報が実空間のマスク／エンベロープによって表されるか？  それは明らかに位相情報であるその物体に関する形状情報を表す。予備的な３Ｄ再構成の解像度が良くなれな良くなる程、ますます良くマスクを定めることができ、それは溶剤平坦化によって位相拡張の品質に影響する。また、マスク情報の左右像は、正しい３Ｄマップと鏡映された３Ｄマップとがそれらの振幅と同じように両立可能であるという事実にもかかわらず、正しい左右像に向けて再構成を直接に収束させる。マスクは当面は「従来の」単一粒子の３Ｄ再構成の結果であるであろう。したがって、従来の方式により決定された位相の結果であるであろう。完全に「最初から」位相を調整する方式としてよりはむしろ、位相拡張手順としてＳＰＳＦ手順を考えることは多分もっと適切である。それにもかかわらず、ＳＰＳＦ低温ＥＭ方式はそれらの以前のＸ線結晶学方式よりもさらに効果的であることを証明するであろうことは、全くありうることであるように思われる。
【００３０】
前記で与えられた第１の例では、答が初めに分かっており、そして課題は、すべての高解像度位相を無視した後または位相を全く無視した後に、答を回復することであった。けれども現実の利益は、高解像度位相の完全な同期を達成すべきであるよりも、顕微鏡写真の中の分子画像から高解像度位相を決定することがはるかに簡単であるという事実からきている。単一粒子のデータの高解像度位相を決定するために、これらの分子画像の間の完全な（並進）整合を見い出さなければならなく、そして前記で考察したようにそれらの個々の焦点のずれのパラメータを精密に決定しなければならない。前記で与えられた最後の例は、すなわち７０Ｓロボゾーム機能複合体の例（および付録４、図８）は、現実の実験データと共にこの技術をうまく応用した例である。高解像度画像データの振幅を活用したこの新規な技術により、単一粒子の低温ＥＭの解像度を大幅に改善することができる。その手順は、分子の３Ｄ自動相関関数（ＡＣＦ（ａｕｔｏ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ））または３Ｄ自己相関関数（ＳＣＦ（ｓｅｌｆ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ））［ファン・ヒールほか１９９２年］の３Ｄ再構成として実空間で設置することができる、または等価なことであるが、これらの粒子の３Ｄ強度スペクトルすなわち振幅のスペクトルを集めることによってフーリエ空間の中で設置することができる。ＳＰＳＦ方式からの付加的な解像度の後押しでもって〜５−７オングストロームの解像度において低温ＥＭ構造が既に存在しているから、原子的な解像度までの単一の低温ＥＭは間もなく可能であるであろう。
【００３１】
図９は、前記で説明した技術を実施するのに用いることができる型式の汎用のコンピュータ２００の概要図である。汎用コンピュータ２００は、中央処理装置２０２と、ランダム・アクセス・メモリ２０４と、読出し専用メモリ２０６と、ネットワーク・インタフェース・カード２０８と、ハード・ディスク駆動装置２１０と、表示駆動装置２１２と、モニタ２１４と、キーボード２１８を備えたユーザの入力／出力回路２１６と、共通のバス２２２を通してすべてに接続されたマウス２２０とを有する。動作の際には、中央処理装置２０２は１つまたは多数のランダム・アクセス・メモリ２０４や読出し専用メモリ２０６およびハード・ディスク駆動装置２１０の中に記憶することができる、またはネットワーク・インタフェース・カード２０８を通して動的にダウンロードすることができる、コンピュータのプログラム命令を実行するであろう。実行された処理の結果が表示駆動装置２１２およびモニタ２１４を通してユーザに対して表示することができる。汎用のコンピュータ２００の動作を制御するためのユーザの入力は、キーボード２１８またはマウス２２０からユーザの入力出力回路２１６を通して受け取ることができる。コンピュータのプログラムは種々の異なるコンピュータ言語で書くことができることは分かるであろう。コンピュータのプログラムは記録媒体に記憶および配布することができる、または汎用のコンピュータ２００に動的にダウンロードすることができる。適切なコンピュータ・プログラムの制御の下で動作する時、汎用のコンピュータ２００は前記で説明した技術を実行することができ、そして前記で説明した技術を実行するための装置を形成すると考えることができる。汎用のコンピュータ２００のアーキテクチャは大幅に変えることができ、そして図９はほんの１つの例を示しただけである。
【００３２】
参考文献
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【００３５】
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【００４６】
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【００５０】
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【００５１】
シュタルクＨ（Ｓｔａｒｋ  Ｈ）、オルロバＥＶ（Ｏｒｌｏｖａ  ＥＶ）、リンケ・アッペルＪ（Ｒｉｎｋｅ−Ａｐｐｅｌ  Ｊ）、
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ミューラＦ（Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｆ）、ロッドニナＭ（Ｒｏｄｎｉｎａ  Ｍ）、ウインタメイヤＷ（Ｗｉｎｔｅｒｍｅｙｅｒ  Ｗ）、ブリマコンブＲ（Ｂｒｉｍａｃｏｍｂｅ  Ｒ）、ファン・ヒールＭ（ｖａｎ  Ｈｅｅｌ  Ｍ）「電子低温顕微鏡法により明らかにされた転移前および転移後のリボゾームの中のｔＲＮＡの配列（Ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔＲＮＡｓ  ｉｎ  ｐｒｅ−ａｎｄ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｃｒｙｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）」Ｃｅｌｌ  ８８（１９９７）１９−２８、
【００５２】
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【００５３】
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【００６０】
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ワングＢ−Ｃ（Ｗａｎｇ  Ｂ−Ｃ）：「マクロ分子結晶学における位相の不明確さの解明（Ｒｅｓｏｌｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈａｓｅ  ａｍｂｉｇｕｉｔｙ  ｉｎ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １１５（１９８８）１４８−１５７、
【００６３】
シュルーエンツェンＦ（Ｓｃｈｌｕｅｎｚｅｎ  Ｆ）、トォシルジＡ（Ｔｏｃｉｌｊ  Ａ）、ザリバックＲ（Ｚａｒｉｖａｃｈ  Ｒ）、ハームスＪ（Ｈａｒｍｓ  Ｊ）、グルーマンＭ（Ｇｌｕｅｈｍａｎｎ  Ｍ）、ジャネルＤ（Ｊａｎｅｌｌ  Ｄ）、バッシャンＡ（Ｂａｓｈａｎ  Ａ）、バーテルスＨ（Ｂａｒｔｅｌｓ  Ｈ）、アグモンＩ（Ａｇｍｏｎ  Ｉ）、フランセシＦ（Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉ  Ｆ）、ヨナスＡ（Ｙｏｎａｔｈ  Ａ）：「３．３オングストローム解像度における機能的に活性化された小さなリボゾーム・サブユニットの構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｓｍａｌｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｔ  ３．３Ａ  ｒｅｓｏｌｉｔｉｏｎ）」Ｃｅｌｌ  １０２（２０００）６１５−６２３、
【００６４】
ウインバリＢＴ（Ｗｉｍｂｅｒｌｙ  ＢＴ）、ブローダセンＤＥ（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎ  ＤＥ）、クレモンスＷＭ（Ｃｌｅｍｏｎｓ  ＷＭ）、モーガン・ワーレンＲ．Ｊ．（Ｍｏｒｇａｎ−Ｗａｒｒｅｎ  Ｒ．Ｊ．）、カータＡ．Ｐ．（Ｃａｒｔｅｒ  Ａ．Ｐ．）、ボンラインＣ（Ｖｏｎｒｈｅｉｎ  Ｃ）、ハーテシュＴ（Ｈａｒｔｓｃｈ  Ｔ）、ラマクリッシュナンＶ（Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ）：「３０Ｓリボゾーム・サブユニットの構造（Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ３０  Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｓｕｂｕｎｉｔ）」Ｎａｔｕｒｅ  ４０７（２０００）３２７−３３９、
【００６５】
ゼンリンＦ（Ｚｅｍｌｉｎ  Ｆ）、ベックマンＥ（Ｂｅｃｋｍａｎｎ  Ｅ）、ファン・デア・マストＫＤ（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍａｓｔ  ＫＤ）：「ショトキ電界放射体およびヘリウム冷却超電導対物レンズを備えた２００Ｋｖ電子顕微鏡（Ａ  ２００  Ｋｖ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  ｗｉｔｈ  Ｓｃｈｏｔｔｋｙ  ｆｉｅｌｄ  ｅｍｉｔｔｅｒ  ａｎｄ  ａ  ｈｅｌｉｕｍ−ｃｏｏｌｅｄ  ｓｕｐｅｒ−ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ  ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  ｌｅｎｓ）」Ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ３（１９９６）２２７−２３８、
【００６６】
溶剤平坦化手順に対する入力は、（１）高解像度に対する実験的な３Ｄ振幅、（２）「溶剤」からそれを分離する分子の外側の輪郭を定める３Ｄマスク、（３）回折振幅データの解像度よりは低い解像度にまで信頼できる位相を備えた３Ｄマップ。この手順は次のことを必然的に伴う。
【００６７】
（Ｅ）  溶剤領域の中に残留する変調を抑制するために、媒体解像入力３Ｄマップの上に３Ｄマスクを課する。
【００６８】
（Ｂ）  マスクされたマップを３Ｄフーリエ変換（３Ｄ−ＦＦＴ）した後、結果として得られる変換の中の位相は物体の制限された範囲と一致する（そして捨てられた振幅もそうである）。
【００６９】
（Ｃ）  混成フーリエ・マップを形成するためにオリジナルの（実験的の）入力３Ｄ振幅と新しい位相を合併する。
【００７０】
（Ｄ）  ３Ｄフーリエ変換混成フーリエ・マップが実空間に戻す。
【００７１】
（Ｅ）  もし収束基準が満たされないならば、精密化された実空間をプロセス（Ａ）に再び入れる。
【００７２】
付録２
５０Ｓリボソーム・サブユニットの位相拡張
図２（Ａ）を見よ。大腸菌の５０Ｓリボゾーム・サブユニットの３Ｄ再構成からの断面が［マタディーン（Ｍａｔａｄｅｅｎ）ほか１９９９年］のデータの組を用いて計算された。このマップは、非対称な粒子に対する溶剤平坦化実験に対するテスト物体として用いられる。曲線はこのテスト物体の回転平均化されたパワー・スペクトル分布を示す。
【００７３】
図３（Ｂ）を見よ。入力画像の低域フィルタ作用（ナイキスト周波数の０．１５倍までの球形ハード・マスク）を受けたものが溶剤平坦化テストに対する出発点として用いた。テスト物体（Ａ）とフィルタ作用を受けた出発モデルとの間のフーリエ・シェル補正［ハラオツ（Ｈａｒａｕｚ）およびファン・ヒール（ｖａｎ  Ｈｅｅｌ）１９８６年、オーロバ（Ｏｒｌｏｖａ）ほか１９９６年］は尖鋭なフーリエ空間マスクを反映する。
【００７４】
図４（Ｃ）を見よ。付録１に示されたアルゴリズムの数百回の反復を用いて、低解像度位相の大部分を復活することができる。統計的に有意に到達しない高周波データ成分に表れる総計の変動はオリジナル・マップの中の総計の変動の数パーセントよりも少ないことを表す。
【００７５】
付録３
ランダム・ノイズからの位相の生成
図５（Ａ）を見よ。ランブリカス・テレストリス（Ｌｕｍｂｒｉｃｕｓ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）の巨大ヘモクロビンの３Ｄ再構成［ファン・ヒール（ｖａｎ  Ｈｅｅｌ）ほか２０００年］が溶媒平坦化のテスト物体として用いられる。「ウォームヘモクロビン（ｗｏｒｍ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）」はＤ６の点群対称性を有する。１２８3マップのいくつかの断面だけが示されている。分子は利用可能な３Ｄ容積の１５％以下を占有する。その回転パワー・スペクトル分布は任意のユニットの中の曲線に示されている。
【００７６】
図６（Ｂ）を見よ。位相調整に対する出発のモデル、すなわち課されたＤ６対称性を備えたランダム・ノイズ密度。テスト物体（Ａ）とこの対称化されたランダム・ノイズ出発モデルとの間のフーリエ・シェル相関［ハロオツ（Ｈａｒａｕｚ）およびファン・ヒール（ｖａｎ  Ｈｅｅｌ）１９８６年］は３−σ有意曲線を越えた相関を明らかに示さない。原点に近い低解像シェルの中の少数の「ボクセル」により、低解像の統計的変動は大きい。
【００７７】
図７（Ｃ）を見よ。オリジナルの位相の再生が、ここに示された断面に示され、そしてオリジナルのマップと位相拡張マップとの間のＦＳＣに示されている。このマップのコントラストが反転された。それは、反復アルゴリズムはコントラストをひっくり返すからである（反転されたマップは同じ振幅スペクトルを有する）。
【００７８】
付録４
ランダム・ノイズからの位相の生成：第１の実験結果
図８を見よ。大腸菌の終端複合体の７０Ｓリボゾーム（リリーズ因子２を有する複合体の中のバクテリア・リボゾーム）の第１の３Ｄ再構成の立体図は、全く実験的な振幅情報とマスクの利用可能性とに基づいている。振幅情報は３次元の自己相関関数［ファン・ヒール（ｖａｎ  Ｈｅｅｌ）ほか１９９２年］の形式の空間領域から集められた。マスクは、局所的変動技術に基づく従来の方式［ファン・ヒール（ｖａｎ  Ｈｅｅｌ）ほか２０００年］に基づくこのリボゾームの予備的な３次元再構成のまわりに生成された。振幅情報に基づいてこの再構成を生成するために、新しい収束法が主なテキストに説明されているように適用された。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】画像化工程の概要図。
【図２】例示された画像とこれらの画像の性質を示す付随する曲線を示した図。
【図３】例示された画像とこれらの画像の性質を示す付随する曲線を示した図。
【図４】例示された画像とこれらの画像の性質を示す付随する曲線を示した図。
【図５】例示された画像とこれらの画像の性質を示す付随する曲線を示した図。
【図６】例示された画像とこれらの画像の性質を示す付随する曲線を示した図。
【図７】例示された画像とこれらの画像の性質を示す付随する曲線を示した図。
【図８】例示された画像とこれらの画像の性質を示す付随する曲線を示した図。
【図９】本発明の技術を実施するために用いることができる汎用コンピュータのアーキテクチャを示した概要図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年7月17日(2003.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電子顕微鏡法から得られるソース画像振幅情報とマスクを定めるマスク情報とから単一粒子の物体の３次元画像を生成する方法であって、
前記物体の予測される３次元の輪郭に対応するマスクの外側の作業画像の部分を除去するために空間領域の中の前記物体の前記作業画像に前記マスクを適用する段階と、
前記作業画像を表す生成された振幅情報および位相情報を形成するために前記作業画像を周波数領域に変換する段階と、
周波数領域の中に更新された作業画像を形成するために前記ソース画像の振幅情報を前記生成された位相情報と合併させる段階と、
前記更新された作業画像を空間領域に変換する段階と、
収束基準が満たされるまで前記更新された作業画像に前記適用段階および後の段階を行うことを繰り返す段階とを有する方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記物体が
分子と、
マクロ分子と、
マクロ分子複合体と、
の１つである方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、前記物体が電子顕微鏡法の下にある時にガラス相の流体の中に埋め込まれる方法。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれかに記載の方法において、前記ソース画像の振幅情報および前記ソース画像の位相情報が前記物体に行われた複数の画像化動作から採取された画像データを組み合わせることから得られる方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法において、前記複数の画像化動作が前記物体の異なる段階について実行される方法。
【請求項６】
請求項４および請求項５のいずれかに記載の方法において、前記画像化動作が前記物体について焦点が合っていなくおよび破壊的である方法。
【請求項７】
請求項１〜請求項６のいずれかに記載の方法において、閾値レベルを越える空間周波数領域の中で局所的変動を有する前記画像の部分を識別することによって前記マスクが形成される方法。
【請求項８】
請求項１〜請求項７のいずれかに記載の方法において、前記更新された作業画像を形成する際に前記合併させる段階が前記生成された振幅情報を前記ソース画像の振幅情報と混合する方法。
【請求項９】
電子顕微鏡号から得られるソース画像の振幅情報およびマスクを定めるマスク情報から単一粒子の物体の３次元画像を生成する装置であって、
前記物体の予測される３次元の輪郭に対応する前記マスクの外側の作業画像の部分を除去するために空間領域の中の前記物体の前記作業画像に前記マスクを適用するように動作することができ、
前記作業画像を表す生成された振幅情報および位相情報を形成するために前記作業画像を周波数領域に変換するように動作することができ、
周波数領域の中に更新された作業画像を形成するために前記ソース画像振幅情報を前記生成された位相情報と合併させるように動作することができ、
前記更新された作業画像を空間領域に変換するように動作することができ、
収束基準が満たされるまで前記更新された作業画像に前記適用動作および後の動作を繰り返すように動作することができる、データ処理論理を有する装置。
【請求項１０】
請求項９記載の装置であって、前記物体が
分子と、
マクロ分子と、
マクロ分子複合体と、
の１つである装置。
【請求項１１】
請求項１０記載の装置であって、前記物体が電子顕微鏡法の下にある時にガラス相の流体の中に埋め込まれる装置。
【請求項１２】
請求項９〜請求項１１のいずれかに記載の装置であって、前記ソース画像の振幅情報および前記ソース画像の位相情報が前記物体に行われた複数の画像化動作から採取された画像データを組み合わせることから得られる装置。
【請求項１３】
請求項１２記載の装置において、前記複数の画像化動作が前記物体の異なる段階で実行される装置。
【請求項１４】
請求項１２および請求項１３のいずれかに記載の装置において、前記画像化動作が前記物体について焦点が合っていなくおよび破壊的である装置。
【請求項１５】
請求項９〜請求項１４のいずれかに記載の装置において、閾値レベルを越える空間周波数領域の中で局所的変動を有する前記画像の部分を識別することによって前記マスクが形成される装置。
【請求項１６】
請求項９〜請求項１５のいずれかに記載の装置において、前記更新された作業画像を形成する際に前記生成された振幅情報を前記ソース画像の振幅情報と混合するように前記データ処理論理が動作することができる装置。
【請求項１７】
電子顕微鏡法から得られるソース画像の振幅情報およびマスクを定めるマスク情報から単一粒子の物体の３次元画像を生成するためにコンピュータを制御するコンピュータ・プログラム・プロダクトであって、
前記物体の予測される３次元の輪郭に対応する前記マスクの外側の作業画像の部分を除去するために空間領域の中の前記物体の前記作業画像に前記マスクを適用する段階と、
前記作業画像を表す生成された振幅情報および位相情報を形成するために前記作業画像を周波数領域に変換する段階と、
周波数領域の中に更新された作業画像を形成するために前記ソース画像の振幅情報を前記生成された位相情報と合併させる段階と、
前記更新された作業画像を空間領域に変換する段階と、
収束基準が満たされるまで前記更新された作業画像に前記適用段階および後の段階を繰り返す段階とを有するコンピュータ・プログラム・プロダクト。
【請求項１８】
請求項１７記載のコンピュータ・プログラム・プロダクトであって、前記物体が
分子と、
マクロ分子と、
マクロ分子複合体と、
の１つであるコンピュータ・プログラム・プロダクト。
【請求項１９】
請求項１７記載のコンピュータ・プログラム・プロダクトであって、前記物体が電子顕微鏡法の下にある時にガラス相の流体の中に埋め込まれるコンピュータ・プログラム・プロダクト。
【請求項２０】
請求項１７〜請求項１９のいずれかに記載のコンピュータ・プログラム・プロダクトであって、前記ソース画像の振幅情報および前記ソース画像の位相情報が前記物体に行われた複数の画像化動作から採取された画像データを組み合わせることから得られるコンピュータ・プログラム・プロダクト。
【請求項２１】
請求項２０記載のコンピュータ・プログラム・プロダクトにおいて、前記複数の画像化動作が前記物体の異なる段階で実行されるコンピュータ・プログラム・プロダクト。
【請求項２２】
請求項２０および請求項２１のいずれかに記載のコンピュータ・プログラム・プロダクトにおいて、前記画像化動作が前記物体について焦点が合っていなくおよび破壊的であるコンピュータ・プログラム・プロダクト。
【請求項２３】
請求項１７〜請求項２２のいずれかに記載のコンピュータ・プログラム・プロダクトにおいて、閾値レベルを越える空間周波数領域の中で局所的変動を有する前記画像の部分を識別することによって前記マスクが形成されるコンピュータ・プログラム・プロダクト。
【請求項２４】
請求項１７〜請求項２３のいずれかに記載のコンピュータ・プログラム・プロダクトにおいて、前記更新された作業画像を形成する際に前記合併段階が前記生成された振幅情報と前記ソース画像の振幅情報とを混合するコンピュータ・プログラム・プロダクト。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
本発明の１つの特徴から見るならば、電子顕微鏡法から得られるソース画像の振幅情報とマスクを定めるマスク情報とから単一粒子の物体の３次元画像を生成する方法が得られる。前記方法は
前記物体の予測される３次元の輪郭に対応する前記マスクの外側の作業画像の部分を除去するために、空間領域の中の前記物体の前記作業画像に前記マスクを適用する段階と、
前記作業画像を表す生成された振幅情報および位相情報を形成するために前記作業画像を周波数領域に変換する段階と、
周波数領域の中に更新された作業画像を形成するために前記ソース画像の振幅情報と前記生成された位相情報とを合併する段階と、
前記更新された作業画像を空間領域に変換する段階と、
収束基準が満たされるまで前記更新された作業画像に前記マスクを前記適用する段階およびその後の段階を繰り返す段階と、
を有する。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明は電子顕微鏡法と共に用いるのが特に適切である。電子顕微鏡法は潜在的に高い分解能の画像を生ずることができるが、しかし繊細な生体試料に応用することに対してはそれは厳しい画像化技術であるという欠点を有しており、したがって、試料を観察して（したがって、装置の焦点を合わせて）その画像を取得する前にこれらの試料を破壊してしまう。したがって、多くの実効的には焦点のずれた画像が得られ、このような画像を解析するのに本発明の技術が用いられ、それによって高分解能の画像が生成される。この高分解能の画像の生成の際には、位相情報が少なくともある程度回復される。クレーム１−２７を１−２４に変更する。




【国際調査報告】
2004531009.tif 000050
2004531009.tif 000051