(57)【要約】本発明は、網膜および視神経障害を含む神経疾患の治療に有効な被験体、それらを必要とする被験体において神経を健康的にする作用を生じるための方法および組成物を提供する。その方法は、被験体にマンノースのようなヘキソースの治療上有効な量を投与する工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療上有効な量のヘキソースを被験体に投与する工程を含む、必要とする被験体における神経疾患の治療方法。
【請求項２】
ヘキソースがD-マンノース、グルコース、およびグルコース-6-リン酸からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
被験体にcAMP調節物質を投与する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
cAMP調節物質が非加水分解性cAMP類似体、アデニル酸シクラーゼ活性化物質、cAMPを刺激するマクロファージ由来因子、マクロファージ活性化物質、カルシウムイオノフォア、膜脱分極、ホスホジエステラーゼ阻害物質、特異的ホスホジエステラーゼIV阻害物質、β2-アドレナリン受容体阻害物質、または血管作用性腸ペプチドである、請求項3記載の方法。
【請求項５】
被験体にマクロファージ由来因子を投与する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
マクロファージ由来因子がオンコモジュリン（oncomodulin）である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
マクロファージ由来因子がTGF-βである、請求項5記載の方法。
【請求項８】
治療がニューロン障害をくつがえす、請求項1記載の方法。
【請求項９】
治療が神経疾患を緩和する、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
疾患が外傷性脳損傷、卒中、脳動脈瘤、脊髄損傷、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、びまん性脳皮質（diffuse cerebral cortical）萎縮、レヴィ小体型痴呆、ピック病、メソリンボコーティカル（mesolimbocortical）痴呆、視床変性、ハンチントン舞踏病、皮質-線状体-脊髄変性、皮質-基底核（basal-ganglionic）変性、大脳小脳変性、痙性対性不全麻痺を伴う家族性痴呆、ポリグルコサン体（polyglucosan body）病、シャイ-ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳（olivopontocerebellar）萎縮、進行性核上性麻痺、変形性筋失調、ハレルフォルデン−スパッツ病、メージュ症候群、家族性振戦、ジルドラトゥレット症候群、舞踏病-有棘赤血球症（acanthocytic chorea）、フリードライヒ運動失調症、ホームズ家族性皮質小脳萎縮、ゲルストマン-シュトロイスラー-シャインカー（Scheinker）病、進行性脊髄性筋萎縮症、進行性バルバー（balbar）麻痺、原発性側索硬化症、遺伝性筋萎縮症、痙性対麻痺、腓骨部筋萎縮症、肥厚性間質性多発ニューロパシー、遺伝性多発神経炎性失調、視覚性ニューロパシー、眼筋麻痺、網膜または視神経障害からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
ヘキソースがニューロン損傷領域への導入によって投与される、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
ヘキソースが被験体の脳脊髄液に導入される、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
ヘキソースが被験体の髄腔内に導入される、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
ヘキソースが被験体の脳室、腰部、および大槽からなる群より選択される領域に導入される、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
ヘキソースが被験体の眼に局所的に投与される、または眼内注射によって投与される、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
被験体が哺乳動物である、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
哺乳動物がヒトである、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
神経疾患が脊髄損傷である、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
脊髄損傷が単麻痺、両麻痺、対麻痺、片麻痺、および四肢麻痺を特徴とする、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
視神経に対する障害が緑内障の結果である、請求項10記載の方法。
【請求項２１】
網膜に対する障害が黄斑変性の結果である、請求項10記載の方法。
【請求項２２】
包装材料、および該包装材料内に含まれる薬学的物質を含み、該包装材料が該薬学的物質が薬学的に許容されるキャリアと共に神経疾患の治療に有効な用量で十分な期間、投与されることが可能であり、その薬学的物質がD-マンノースを含むことを示すラベルを含む、製造品。
【請求項２３】
cAMP調節物質をさらに含む、請求項22記載の製造品。
【請求項２４】
オンコモジュリンをさらに含む、請求項22記載の製造品。
【請求項２５】
D-マンノースおよびcAMP調節物質、ならびに薬学的に許容されるキャリアを含む、薬学的調製物。
【請求項２６】
オンコモジュリンをさらに含む、請求項25記載の薬学的調製物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
視神経のような成熟した哺乳動物の神経は、通常、損傷を受けると再生しない。網膜神経節細胞（RGC）はそれらの損傷を受けた神経終末において発芽反応を開始するが、その成長は成功には至らずに細胞はすぐに死滅し始める（Ramon y Cajal, 1991）。それにも関わらず、RGCは末梢神経移植を介して（Aguayo et al., 1991）、また水晶体が損傷を受けた場合（Fischer et al., 2000; Leon et al., 2000）または末梢神経の断片が硝子体に移植された場合（Berry et al., 1996）は視神経自体を介して非常に長い軸索を再生することができる。これらの後者の処置は眼における活性化マクロファージの出現を促し、最近では硝子体内でのマクロファージ活性化はRGCに視神経を介して軸索を再生させる力があることが示されている（Leon et al., 2000; Yin et al., 2003）。培養において、硝子体に構造的に含まれる小分子と関連して作用するマクロファージ由来タンパク質は成熟ラットのRGCを刺激してcAMP依存的に軸索を再生させる（Yin et al., 2003）。
【０００２】
哺乳動物とは対照的に、魚類および両生類は生涯を通じて視神経を再生することができる（Jacobson, 1991）。培養の場合、キンギョRGCにおける最も強力な軸索促進因子は視神経の非神経細胞によって分泌される親水性小分子（＜500ダルトン）である。この分子はAF-1と呼ばれる（Schwalb et al., 1995; Schwalb et al., 1996）。
【０００３】
哺乳動物および非哺乳動物のニューロン再生に関与する因子について理解することは、神経疾患の治療のための治療候補薬の開発に役立つ。末梢および中枢神経系の疾患は多岐に渡り、これらの状態の多くについては有効な治療的介入策がない。神経疾患は、機械的損傷もしくは有毒物質に起因する損傷のようなニューロンに対する損傷、ニューロンの異常な成長もしくは発達、またはニューロンの活性の制御異常（ダウンレギュレーションまたはアップレギュレーションなど）によって惹起される可能性がある。当技術分野では、ニューロンまたは神経系の一部の障害に抵抗する能力、再生する能力、および所望の機能を維持する能力を改善することができ、神経疾患の治療に使用することのできる方法および組成物が必要とされている。
【発明の開示】
【０００４】
発明の概要
本発明は神経学的状態を持つ被験体に神経を健康的にする作用を生じる方法および組成物を提供する；このような作用には、被験体におけるニューロン生存性、軸索増殖、ニューロン再生または神経学的機能の正常化などが含まれる。
【０００５】
一つの局面において、本発明は治療上有効な量のヘキソース（例えば、マンノース）またはヘキソース誘導体を被験体に投与する工程、それによって被験体の神経を健康的にする作用（neurosalutary effect）を生じる工程を含む方法を提供する。
【０００６】
もう一つの態様において、本発明は、治療を必要とする被験体に有効な量のヘキソースまたはヘキソース誘導体を投与することによって、被験体に網膜および視神経障害を含む神経疾患の治療を提供する。
【０００７】
その他の態様において、本発明の方法は被験体にcAMP調節物質および／またはマクロファージ由来因子を投与する工程をさらに含む。
【０００８】
一つの局面において、ヘキソースまたはヘキソース誘導体は、そのヘキソースが被験体の中枢神経系のニューロンに接触するように、本発明に従って被験体に投与される。例えば、ヘキソースは脳室、腰部、または大槽に導入することによって髄腔内の被験体の脳脊髄液内に投与することができる。このような状況において、ヘキソースは神経を健康的にする作用を生じるために皮質ニューロンまたは網膜神経節細胞に局所的に投与することができる。
【０００９】
一部の態様において、薬学的に許容される調製物は、少なくとも1週間にわたって、またはその他の態様においては薬学的に許容される調製物が被験体に最初に投与された後に少なくとも1カ月にわたって、被験体に有効量のヘキソースを提供する持続的送達を提供する。本発明の調製物の持続的送達を達成するアプローチには、徐放性高分子カプセル、生物浸食性マトリックス、もしくは本発明のヘキソース、またはその他の治療用化合物を分散させる注入ポンプの使用が含まれる。この注入ポンプは、皮下、頭蓋内、または医学的に所望されるその他の局所に埋め込むことができる。一部の態様において、本発明の治療因子または組成物は、カテーテルを介して注入ポンプによって脳脊髄液内に、またはニューロン損傷部位もしくはニューロン変性変化部位のような局所送達が所望される部位に投与される。
【００１０】
ヘキソース誘導体および薬学的に許容されるキャリアを含む薬学的組成物を、神経疾患の治療のための薬学的組成物の使用に関する説明書と共に包装することができる。一つの態様において、薬学的組成物はcAMP調節物質および／またはマクロファージ由来因子をさらに含む。
【００１１】
本発明のその他の特徴および利点は、下記の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなる。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、神経障害を含む神経疾患の治療において有効な被験体に神経を健康的にする作用を生じるための方法および組成物を提供する。その方法は、ヘキソース（例えば、マンノース）またはヘキソース誘導体の治療上有効な量を被験体に投与する工程を含む。
【００１３】
本明細書で用いられるように、「ヘキソース」という用語には、神経を健康的にする作用を生じることのできる任意のヘキソースまたはその誘導体が含まれる。好ましいヘキソースは、D-マンノースおよびグロースである。「ヘキソース誘導体」という用語は、一つまたは複数の分子のヒドロキシル基に共有結合的またはイオン的に接続した一つまたは複数の残基（例えば、エステル、エーテル、アミノ基、アミド基、リン酸基、硫酸基、カルボキシル基、カルボキシ-アルキル基、およびそれらの組み合わせ）を持って、神経を健康的にする作用を生じることのできるヘキソース分子を指す。好ましい誘導体はグルコース-6-リン酸を含む。ヘキソース誘導体という用語は、被験体において神経を健康的にする作用を生じることのできるヘキソースまたはヘキソース誘導体のD-異性体およびL-異性体を含む。ヘキソース誘導体は当技術分野において周知であり、市販されている。
【００１４】
本明細書で用いられるように、「神経を健康的にする作用」とは、ニューロン、神経系の一部、または神経系全体の健康または機能に有利な反応または結果を意味する。このような作用の例には、ニューロンまたは神経系の一部の、損傷に抵抗する能力、再生する能力、所望の機能を維持する能力、成長する能力、または生存する能力の向上が含まれる。「神経を健康的にする作用を生じる」という表現は、神経系の構成要素における機能または回復力において、このような反応または向上が生じることまたは作用することを含む。例えば、神経を健康的にする作用生じる例としては、ニューロンに対する損傷後の軸索増殖の刺激；ニューロンをアポトーシス抵抗性とすること；ニューロンをβ-アミロイド、アンモニアまたはその他の神経毒素のような有毒化合物に対して抵抗性とすること；加齢に関連するニューロンの萎縮もしくは機能喪失の回復；または加齢に関連するコリン作用性神経支配の消失の回復が含まれる。
【００１５】
「cAMP調節物質」という用語は、細胞内におけるcAMPの量、産生、濃度、活性、もしくは安定性を調節する、または細胞性cAMPの薬学的活性を調節する能力を持つ任意の化合物を含む。cAMP調節物質は、アデニル酸シクラーゼの位置、アデニル酸シクラーゼの上流、またはアデニル酸シクラーゼの下流にて、例えばcAMP自身の位置ではcAMPの産生に至るシグナリング経路において作用することが可能である。サイクリックAMP調節物質は、細胞内部、例えばGi、Go、Gq、GsおよびGtのようなGタンパク質の位置レベルにおいて、または細胞外、例えばGタンパク質結合レセプターのような細胞外レセプターの位置において作用することができる。サイクリックAMP調節物質は、フォルスコリンのようなアデニル酸シクラーゼの活性化物質；8-ブロモ-cAMP、8-クロロ-cAMP、またはジブチリルcAMP（db-cAMP）を含むcAMPの非加水分解性類似体；イソプロテノール；血管作用性腸ペプチド；カルシウムイオノフォア；膜脱分極；マクロファージに由来するcAMP刺激因子；ザイモサンまたはIFN-γのようなマクロファージ活性化刺激物質；ペントキシフィリンおよびテオフィリンのようなホスホジエステラーゼ阻害剤；特異的ホスホジエステラーゼIV（PDE IV）阻害物質；ならびにサルブタモールのようなβ2-アドレノレセプターアゴニストを含む。cAMP調節物質という用語は、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ3BのようなホスホジエステラーゼなどのcAMPの産生、機能、活性、または安定性を阻害する化合物も含む。cAMPの産生、機能、活性、または安定性を阻害するcAMP調節物質は当技術分野において公知であり、例えば、その内容が参照として本明細書に組み入れられるNano et al., 2000に述べられている。
【００１６】
「ホスホジエステラーゼIV阻害物質」は、酵素ホスホジエステラーゼIVの活性を阻害する物質を指す。ホスホジエステラーゼIV阻害物質の例は当技術分野において既知であり、ロリプラム（A.G. Scientific, Inc.）、ニトラクアゾン（nitraquazone）、デンブフィリン（denbufylline）、チベネラスト（tibenelast）、CP-80633、などの4-アリルピロリジノン、およびCP-77059のようなキナゾリンジオンが含まれる。
【００１７】
「β2-アドレノレセプターアゴニスト」は、β2-アドレナリン作用性レセプターを刺激する物質を指す。β2-アドレノレセプターアゴニストの例は当技術分野において公知であり、サルメテロール、フェノテロール、およびイソプロテレノールが含まれる。
【００１８】
本明細書で用いられるように、「マクロファージ由来因子」という用語は、被験体において神経を健康的にする作用を生じる能力を持つマクロファージに由来する任意の因子を含む。マクロファージ由来因子には、オンコモジュリン（oncomodulin）およびTGF-βのようなペプチドが含まれるが、これらに限定されるものではない。開示が参照として本明細書に組み入れられるWO 01/091783を参照されたい。
【００１９】
被験体に「投与する」という用語は、被験体体内の所望の位置に活性化合物を送達するための任意の適切な経路によって被験体に薬学的調製物中の活性化合物を投与、送達、または適用することを含み、非経口または経口投与による送達、筋肉内注射、皮下／皮内注射、静脈内注射、口内投与、経皮送達、および直腸、結腸、膣、鼻内、または呼吸器経路による投与が含まれる。ヘキソースは、例えば、静脈内注射によって昏睡状態、麻酔状態、もしくは麻痺状態の被験体に投与することが可能であり、または胎児において神経を健康的にする作用を生じるために妊娠被験体に静脈内投与することが可能である。具体的な投与経路は、局所適用（点眼、クリーム、または眼瞼に適用されるべき浸食性調製物など）、眼房水もしくは硝子体液への眼内注射、結膜下注射もしくはテノン下（subtenon）注射を介するような眼球外層への注射、非経口投与または経口投与を含むことができる。
【００２０】
本明細書で用いられるように、「接触」という語は、本発明の化合物がニューロンに対して神経を健康的にする作用を発現できるようにその化合物をニューロンの近傍に運搬するインビボまたはインビトロにおける方法の両方を含むことを意図する。
【００２１】
本明細書で用いられるように、「有効量」には、被験体において神経を健康的にする作用を生じ得るような、所望の結果を達成するために必要な用量および期間において有効な量が含まれる。本明細書で定義される活性化合物の有効量は、被験体の疾患状態、年齢および体重、ならびに被験体において所望の反応を惹起するための活性化合物の能力になどの要因に応じて変更することができる。投与計画は至適治療反応を提供するように調整することができる。有効量は、治療上の有益な作用がその活性化合物の何らかの有毒または有害作用に勝る量でもある。
【００２２】
マンノースなどの活性化合物の治療上有効な濃度の非限定的範囲は5μM〜1mMである。好ましい態様において、その活性化合物の治療上有効な濃度は25〜500μMである。
【００２３】
活性化合物の治療上有効な量または用量は約0.001〜30mg/kg体重の範囲であってもよく、本発明のその他の範囲は約0.01〜25mg/kg体重、約0.1〜20mg/kg体重、約1〜10mg/kg、2〜9mg/kg、3〜8mg/kg、4〜7mg/kg、および5〜6mg/kg体重を含む。当業者は、被験体の疾患または傷害の程度、治療歴、全般的な健康および／または年齢、ならびにその他の併発疾患などを含む一部の要因が被験体を効果的に治療するために必要な用量に影響を及ぼす可能性があることを認識する。さらに、治療上有効な量の活性化合物を用いた被験体の治療は、一回の治療または一連の治療を含むことができる。一つの例において、被験体は約0.1〜20mg/kg体重の範囲の活性化合物を約1〜10週、あるいは2〜8週、約3〜7週の期間、または約4、5もしくは6週の期間に週1回、投与される。治療に用いられる活性化合物の有効用量は特定の治療のコースを通して増量または減量することができることも認識される。
【００２４】
「被験体」という用語は動物を含むことを意図する。特定の態様において、被験体はヒトまたはヒト以外の霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、またはげっ歯類の哺乳動物である。
【００２５】
「神経疾患」とは、被験体の神経系の疾患、障害、または正常な機能もしくは解剖学的構造に直接的もしくは間接的な影響を及ぼす状態を含むことを意図する。本発明の化合物および方法を用いて効果的に治療することのできる障害を受けやすい神経系の要素には、神経系の中枢、末梢、体性、自立性、交感および副交感構成要素、眼、耳、鼻、口またはその他の臓器における神経感覚組織、ならびにニューロン細胞および構造に関連するグリア組織が含まれる。神経疾患は、機械的損傷もしくは有毒化合物に起因する損傷のようなニューロンに対する損傷、ニューロンの異常な成長もしくは発達、またはニューロンの活性の調整異常（ダウンレギュレーションもしくはアップレギュレーションなど）によって惹起される可能性がある。神経疾患は、感覚機能（体内および外部環境における変化を感じ取る能力）；統合機能（変化を解釈する能力）；および運動機能（筋収縮または腺分泌のような作用を開始することによってその解釈に対応する能力）のような神経系機能に悪影響を及ぼすことができる。神経疾患の例には、末梢または頭蓋神経、脊髄または脳、脳神経に対する外傷または中毒性の損傷、外傷性脳損傷、卒中、脳動脈瘤、および脊髄損傷が含まれる。その他の神経疾患には、アルツハイマー病、アルツハイマー病に関連する痴呆（ピック病など）、パーキンソン病およびその他のびまん性レヴィ小体病、老年痴呆、ハンチントン病、ジルドラトゥレット症候群、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、遺伝性の運動および感覚ニューロパシー（シャルコー・マリー・トゥース病）、糖尿病性ニューロパシー、進行性核上麻痺、てんかん、およびヤーコブ-クロイツフェルト病のような認知障害および神経変性障害が含まれる。自律神経機能異常は高血圧および睡眠障害を含む。うつ病、統合失調症、統合失調感情障害、コルサコフ精神病、躁病、不安障害、または恐怖症性障害、学習もしくは記憶障害（健忘および加齢に伴う記憶喪失など）、注意欠陥障害、気分変調性障害、主要な抑うつ障害、躁病、強迫性障害、精神活性物質使用障害、不安、恐怖症、パニック障害、双極性感情障害、心因性疼痛症候群、および摂食障害のような神経精神障害も本発明の化合物および方法による治療対象である。神経疾患のその他の例には、伝染病に起因する神経系への損傷（髄膜炎、様々な病因の高熱、HIV、梅毒、またはポリオ後症候群など）、および電気に起因する神経系への損傷（電気または雷との接触、電気ショックによる精神医学療法の合併症を含む）が含まれる。発育中の脳は、新生児期および幼児期初期に加えて妊娠の多くのステージを通して発達中の中枢神経系における神経毒性の標的であり、本発明の方法は子宮内の胚もしくは胎児、未熟児、または神経学的な出生時欠損を持つ小児を含めてこのような治療を必要とする小児における神経学的欠損の予防または治療に利用することができる。さらなる神経疾患には、例えば、どちらも参照として全体が本明細書に組み入れられるHarrison's Principles of Internal Medicine（Braunwald et al., McGraw-Hill, 2001）およびAmerican Psychiatric Association's Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders DSM-IV（American Psychiatric Press, 2000）に挙げられる疾患が含まれる。眼の状態に関連する神経疾患には��網膜および視神経障害、緑内障および加齢黄斑変性が含まれる。
【００２６】
「卒中」という用語は当技術分野において認識されていて、脳の動脈の破裂または閉塞（例えば、血餅による）を原因とする突然の意識、感覚、および自発運動の減少または消失を含むことを意図する。
【００２７】
「外傷性脳損傷」は当技術分野において認識されていて、たいてい頭蓋の貫入を伴わない頭部に対する外傷性殴打が脳または連結する脊髄に障害を惹起した状態を含むことを意図する。通常、最初の外傷によって血腫、くも膜下出血、脳浮腫、頭蓋内圧上昇、および脳低酸素症が拡大し、続いて脳血流量の低下に起因する重度の二次的事象を引き起こす可能性がある。
【００２８】
「増殖」という用語は、軸索または樹状突起がニューロンから伸びるプロセスを含む。増殖の結果、新たな軸索突起の突出または既存の細胞突起の伸長を生じることができる。軸索の増殖は、5細胞直径またはこれを越える軸索突起の直線的な伸長を含むことができる。軸索突起新生を含むニューロン成長プロセスは、免疫染色法のような方法によって検出されるGAP-43発現によって立証することができる。「軸索増殖の調節」は、標的化された神経疾患に対するサルタトリー作用を生じるための軸索増殖の刺激または阻害を意味する。
【００２９】
「CNSニューロン」という用語は、脳、脳神経、および脊髄のニューロンを含むことを意図する。
【００３０】
本発明の様々な局面は、次の小区分においてさらに詳細に説明される。
【００３１】
薬学的に許容される調製物
ヘキソース誘導体および薬学的に許容されるキャリアを含む薬学的組成物、および包装された調製物も本発明によって提供される。これらの薬学的組成物は、マクロファージ由来因子および／またはcAMP調節物質も含むことができる。
【００３２】
本発明の方法において、任意でマクロファージ由来因子および／またはcAMP調節物質と併用されるヘキソース誘導体（例えば、マンノース）は薬学的に許容される調製物として投与することができる。このような薬学的に許容される調製物は、ヘキソース誘導体、ならびに薬学的に許容されるキャリアおよび／または賦形剤を含むことができる。本明細書で用いられるように、「薬学的に許容されるキャリア」には任意のすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌および抗真菌物質、等張性吸収遅延物質、および生理学的に適合可能な同等品が含まれる。例えば、キャリアは脳脊髄液内への注射に適切であることができる。賦形剤には、薬学的に許容される安定剤および崩壊剤が含まれる。本発明は、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、またはビーズの形の合成または天然ポリマー、ならびに水中油形エマルジョン、ミセル、混合ミセル、合成膜小胞、および再シール形成された赤血球を含む脂質を基剤とする調製物を含む薬学的に許容される任意の調製物に関する。
【００３３】
一つの態様において、薬学的に許容される調製物はポリマーマトリックスを含む。「ポリマー」または「ポリマー性」という用語は当技術分野において認識されていて、神経疾患のような標的とする状態の治療を実施するようにヘキソース誘導体を送達することのできるモノマー単位の繰り返しを持つ構造的枠組みを含む。これらの用語は、合成または天然に生じるコポリマーおよびホモポリマーも含む。線状ポリマー、分枝状ポリマー、および架橋ポリマーも含まれることを意味する。
【００３４】
例えば、本発明で用いられる薬学的に許容される調製物の作製に適したポリマー材料には、アルブミン、アルギン酸塩、セルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、およびポリサッカライドのような天然ポリマー、ならびにポリエステル（PLA、PLGA）、ポリエチレングリコール、ポロキソマー、ポリ無水物、および界面活性剤のような合成ポリマーが含まれる。これらのポリマーは、中枢神経系を含む神経組織と生体適合性であり、有毒な崩壊副産物を生じることなく中枢神経系において生物分解性であり、しかもそれらはポリマーの動的な特性を操作することによって活性化合物放出の方法および期間を調節する能力を持つ。本明細書で用いられるように、「生物分解性」という用語は、酵素の作用によって、加水分解作用によって、および／または被験体内のその他の同様のメカニズムによってポリマーが時間を通じて分解されることを意味する。本明細書で用いられるように「生体適合性」という用語は、ポリマーが有毒または有害でないことによって、また免疫学的拒絶を惹起しないことによって生存組織または生存有機体と適合可能であることを意味する。
【００３５】
ポリマー調製物は、内容が参照として本明細書に組み入れられる米国特許第4,883,666号に述べられるように活性化合物を液化ポリマーに分散させることによって、または内容が参照として本明細書に組み入れられるOdian G., Principles of Polymerization and ring opening polymerization, 2nd ed., John Wiley & Sons, New York, 1981に述べられるようにバルク重合、界面重合、溶液重合およびリング重合によって作製することができる。調製物の特性および特徴は、反応温度、ポリマーおよび活性化合物の濃度、使用する溶媒のタイプ、ならびに反応時間のようなパラメータを変化させることによって制御される。
【００３６】
活性治療用化合物は、本明細書において互換的に用いられる用語であるマイクロカプセル、ミクロスフェアまたはマイクロパーティクルを作製するために一つまたは複数の薬学的に許容されるポリマー内にカプセル化することができる。マイクロカプセル、ミクロスフェアまたはマイクロパーティクルは、慣習的に直径2ミリメートル以下、通常は直径500ミクロン以下の球形粒子から構成されるさらさらした粉末である。1ミクロンよりも小さい粒子は慣習的にナノカプセル、ナノパーティクルまたはナノスフェアと呼ばれる。マイクロカプセルとナノカプセル、ミクロスフェアとナノスフェア、またはマイクロパーティクルとナノパーティクルの違いの大半は大きさである；一般的に二者の内部構造の差は、もしあったとしてもわずかである。本発明の一つの局面において、平均直径の平均値は約45μmよりも小さく、好ましくは20μmよりも小さく、より好ましくは約0.1〜10μmの間である。
【００３７】
もう一つの態様において、薬学的に許容される調製物は脂質を基剤とする調製物を含む。脂質を基剤とする既知の任意の薬剤送達系を本発明の実践において用いることが可能である。例えば、多小胞性リポソーム、多層性リポソームおよびユニラメラ（unilamellar）リポソームは、内包された活性化合物の持続的放出速度が確立できるのであれば、すべて使用することができる。制御された放出多小胞性リポソーム薬剤送達系の作製方法については、PCT出願公報番号WO 9703652、WO 9513796、およびWO 9423697に述べられていて、これらの内容は参照として本明細書に組み入れられる。
【００３８】
合成膜粒子の組成物は、通常、リン脂質の組み合わせであり、通常はステロイド、特にコレステロールとの組み合わせである。その他のリン脂質またはその他の脂質も使用することが可能である。
【００３９】
合成膜粒子の産生に有効な脂質の例には、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシドが含まれて、好ましい態様には卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、およびジオレオイルホスファチジルグリセロールが含まれる。
【００４０】
活性化合物を含む脂質を基剤とする粒子の調製において、活性化合物カプセル化の有効性、活性化合物の不安定性、得られる粒子集団の均一性およびサイズ、活性化合物対脂質の割合、透過性、調製剤の不安定性、ならびに調製物の薬学的許容性のような変数が検討されるべきである。
【００４１】
導入前に、調製物は、ガンマ放射または電子ビーム滅菌のような、当技術分野の多くの有効な任意の手法によって滅菌することができる。
【００４２】
局所的使用のための眼科用製剤は複数用量（multidose）の形で包装することができる。従って、使用中の微生物汚染を防ぐために防腐剤が必要とされる。適切な保存剤には、塩化ベンザルコニウム、チメロサール、クロロブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、エデト酸2ナトリウム塩、ソルビン酸、ポリクオータニウム（polyquaternium）-1、または当業者に公知のその他の物質が含まれる。このような防腐剤は一般に0.001〜1.0％重量／容積（「％ w/v」）の量で用いられる。このような調製剤は、使用説明書と共に、眼への安全投与に適した点眼ボトルまたはチューブに入れることができる。
【００４３】
薬学的に許容される調製物の投与
本発明の薬学的に許容される調製物は、活性化合物が被験体の神経系に接触して、それによって神経を健康的にする作用を生じるように投与される。調製物の局所投与および全身投与の双方が本発明によって企図される。局所投与の望ましい特徴は、活性化合物の有効局所濃度の達成、および活性化合物の全身投与による有害な副作用の回避を含む。一つの態様において、活性化合物は被験体の脳脊髄液への導入によって投与される。本発明の一部の局面において、活性化合物は脳室、腰部、または大槽に導入される。もう一つの局面において、活性化合物は、神経もしくは索の損傷部位、疼痛もしくは神経変性部位、または神経網膜細胞に接触させるために眼内のように局所的に導入される。
【００４４】
薬学的に許容される調製物は水性賦形剤に懸濁して、通常の皮下注射針を介して、または注入ポンプを用いて導入することができる。
【００４５】
一つの態様において、本明細書に述べられる活性化合物調製物は例えばCNSに対する損傷時からその損傷発生後約100時間までの期間、例えば損傷時から24時間以内、12時間以内、または6時間以内に被験体に投与される。
【００４６】
本発明のもう一つの態様において、活性化合物調製物は被験体に髄腔内投与される。本明細書で用いられるように、「髄腔内投与」という用語は、バーホールを介しての側脳室注射、または大槽穿刺もしくは腰椎穿刺など（Lazorthes et al., 1991, and Ommaya A.K., 1984に述べられる、これらの内容は参照として本明細書に組み入れられる）を含む手法による、活性化合物調製物の被験体の脳脊髄液への直接送達を含むことを意図する。「腰部領域」という用語は、第三腰椎と第四腰椎（腰部）の間の部分を含むことを意図する。「大槽」という用語は、頭部背面の頭蓋が終了して脊髄が始まる部分を含むことを意図する。「脳室」という用語は、脊髄中心管とつながる脳の空洞を含むことを意図する。上記のいずれかの部位への活性化合物の投与は、活性化合物調製物の直接注入または注入ポンプの使用によって達成することができる。埋め込み可能または体外式のポンプおよびカテーテルを使用することができる。
【００４７】
注射に関して、本発明の活性化合物調製物は液体、好ましくはハンクス液またはリンガー液のような生理学的に適合可能な緩衝液を用いて調製することができる。さらに、活性化合物調製物は固体の形で調製して、使用直前に再溶解または懸濁することができる。凍結乾燥剤も含まれる。注射は、例えば、活性化合物調製物のボーラス注射または点滴注入（注入ポンプを用いるような）の形であることができる。
【００４８】
本発明の一つの態様において、活性化合物調製物は好ましくは損傷（中枢神経系ニューロンの異常な軸索増殖を特徴とする状態に至る）発生後100時間以内（損傷時の6時間、12時間、または24時間以内など）に被験体の脳に側脳室注射によって投与される。注射は、例えば被験体の頭蓋に開けたバーホールを介して行うことができる。もう一つの態様において、調製物は被験体の脳室内に外科的に挿入したシャントを介して、好ましくは損傷発生後100時間以内（損傷時の6時間、12時間、または24時間以内など）に投与される。例えば、比較的小さい第三および第四脳室への注射も実施可能ではあるが、注射は側脳室の大きい方に行われる可能性がある。さらにもう一つの態様において、活性化合物調製物は、好ましくは損傷発生の100時間以内（損傷時の6時間、12時間、または24時間以内など）に被験体の大槽または腰部への注射によって投与される。
【００４９】
脳内組織へのその他の投与方法は、本発明の化合物の嗅上皮への適用、これに続く嗅球への伝達、および脳のより近位部分への輸送を含む。このような投与は、噴霧調製剤またはエーロゾル化調製剤によって行うことができる。
【００５０】
本発明のもう一つの態様において、活性化合物調製物は、好ましくは損傷発生の100時間以内（損傷時の6時間、12時間、または24時間以内など）に損傷部位において被験体に投与される。
【００５１】
さらなる態様において、本発明の眼科用組成物は網膜および視神経頭部（optic nerve head）組織に対する障害を予防または抑制するために、また眼組織への障害後の機能回復を促進するために使用される。治療することのできる眼科的状態には、網膜症（糖尿病性網膜症および水晶体後線維増殖症を含む）、黄斑変性、眼の虚血、緑内障が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の方法で治療されるべきその他の状態には、虚血再灌流性（ischemia reperfusion）損傷、光化学性損傷、および眼科手術に伴う損傷、特に光または手術器具への曝露による網膜または視神経頭部に対する損傷のような眼組織に対する損傷に関連する障害が含まれる。眼科用組成物は、眼科手術後の硝子体または結膜下注射などによって、眼科手術の補助として用いることもできる。この化合物は一時的状態の急性治療のために使用することが可能であり、または特に変性疾患の症例において慢性的に投与することができる。眼科用組成物は、特に眼科手術または非侵襲性の眼科的処置もしくはその他の種類の手術の前に予防的に使用することもできる。
【００５２】
投与の期間および量
本発明の方法の好ましい態様において、活性化合物は軸索増殖の効果調節のような神経を健康的にする作用を生じるために長期間、被験体に投与される。活性化合物との持続的接触は、例えば、1週間、数週間、1カ月、またはより長期間などの期間にわたる活性化合物の反復投与によって達成することができる。より好ましくは、活性化合物を投与するために用いられる薬学的に許容される調製物は、活性化合物の被験体への「ゆっくりとした放出」のように、持続的な送達を提供する。例えば、その調製物は薬学的に許容される調製物の被験体への投与後少なくとも1週間、2週間、3週間、または4週間にわたってその活性化合物を送達することができる。好ましくは、本発明に従って治療されるべき被験体は、（反復投与もしくは持続的送達系の使用、または両者によって）少なくとも30日間にわたってその活性化合物で治療される。
【００５３】
本明細書で用いられるように、「持続的送達」という用語は投与後の期間、好ましくは少なくとも数日、1週間、数週間、1カ月、またはそれよりも長い期間を通してインビボにおける活性化合物の連続的送達を含むことを意図する。活性化合物の持続的送達は、例えば時間を通じての活性化合物の継続的治療効果によって実証することができる（例えばマクロファージ由来因子の持続的送達は、被験体における神経を健康的にする作用の継続的発現によって実証することができる）。または、活性化合物の持続的送達は、時間を通じてのインビボにおける活性化合物の存在を検出することによって実証することが可能である。
【００５４】
持続的送達のための好ましいアプローチは、ポリマーカプセル、調製物を送達するためのミニポンプ、生物浸食性インプラント、または（米国特許第6,214,622号に述べられるような）トランスジェニック自家細胞移植の使用を含む。埋め込み可能注入ポンプシステム（インフサイド（Infusaid）など；Zierski, J. et al, 1988; Kanoff, R. B., 1994などを参照されたい）および浸透ポンプ（Alza Corporationより販売）は当技術分野において使用可能である。もう一つの投与モードは、埋め込み可能で体外的にプログラム可能な注入ポンプを介するものである。適切な注入ポンプシステムおよび貯蔵システムはBlomquistによる米国特許第5,368,562号およびPharmacia Deltec Inc.によって開発されたDoanによる米国特許第4,731,058号にも述べられている。
【００５５】
投与量は改善されるべき状態の程度に伴って変化できる点に留意すべきである。任意の特定の被験体における具体的な投与計画は、個々の必要性および活性化合物の投与者または投与監督者の専門的判断に応じて期間を通じて調節されるべきであり、本明細書に引用される用量範囲は専ら例示的であって、特許請求される本発明の範囲または実践を限定することを意図しないことがさらに理解されるべきである。
【００５６】
本発明は、もう一つの態様において、本質的にヘキソース誘導体および薬学的に許容されるキャリアからなる薬学的組成物、ならびにその組成物とCNSニューロンの接触によって軸索増殖を調節するためのそれらの使用方法を提供する。「本質的に〜からなる」という用語は、その薬学的組成物が例えば神経成長因子（NGF）のようなその他のニューロン成長調節物質を含まないことを意味する。一つの態様において、本発明の薬学的組成物は包装された調製物として提供することができる。包装された調製物は、容器内の本発明の薬学的組成物、および神経疾患を有する被験体において神経を健康的にする作用を生じるためのその組成物の投与に関する、印刷された説明書を含むことができる。ニューロンの軸索増殖を調節するための医薬品の製造におけるヘキソース誘導体の使用も本発明に内包される。
【００５７】
インビトロにおけるCNSニューロンの処理
インビトロにおいて軸索増殖を調節するために、中枢または末梢神経系に由来するニューロンをインビトロにおいてヘキソース誘導体と接触させることができる。従って、当技術分野において周知の手法を用いてニューロンを被験体から単離してインビトロにおいて培養し、次に軸索増殖を調節するために本発明に従って処理することができる。つまり、（シャーレのような）適切な基質に付着している神経組織の断片からニューロンを移動させることによって、または機械的もしくは酵素的に組織を分解してニューロン懸濁液を作製することによって、ニューロン培養物を得ることができる。例えば、酵素であるトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、DNエース、プロナーゼ、ディスパーゼ（dispase）、またはそれらの様々な組み合わせを用いることができる。神経組織の単離および単離細胞を得るための組織の分解のための方法は、内容が参照として本明細書に組み入れられるFreshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, Third Ed., 1994に述べられている。
【００５８】
続いて、このような細胞を上記のような量および期間でヘキソース（単独、またはマクロファージ由来因子および／もしくはcAMP調節物質と併用）に接触させることができる。ニューロンにおいて軸索増殖の調節が達成されたら直ちに、これらの細胞を移植などによって被験体に再投与することができる。
【００５９】
スクリーニングアッセイ法
ヘキソースが被験体に神経を健康的にする作用を生じる能力は、様々な公知の任意の方法およびアッセイ法を用いて評価することができる。例えば、ヘキソース誘導体がCNS損傷のような損傷後に神経の接続および／または機能を再構築する能力は（神経組織を薄切してニューロンの分枝形成を観察することによって、または色素の細胞質輸送を示すことによって）組織学的に調べることができる。本発明の化合物がCNS損傷のような損傷後に神経の接続および／または機能を再構築する能力も、ヘキソース誘導体の網膜神経または視神経に対する障害後の網膜電図を完全または部分的に回復させる能力；または障害を受けた眼における光に対する瞳孔反応を完全もしくは部分的に回復させる能力をモニターすることによって評価することができる。
【００６０】
ヘキソースの被験体における神経を健康的にする作用を生じる能力を調べるために用いることのできるその他の試験には、被験体であるヒトまたは脊椎損傷動物モデルにおける神経学的機能の標準的試験（標準的な反射試験、泌尿器科試験、排尿水力学試験、深部および表在性疼痛認識、後肢のプロプノセプティブ（propnoceptive）プレーシング、歩行に関する試験、および誘発電位試験）が含まれる。さらに、被験体の神経インパルス伝導は、神経を健康的にする作用の発現指標である伝導活動電位の測定などによって測定することができる。
【００６１】
本発明のアッセイ法での使用に適した動物モデルはラットの部分的トランスアクションモデル（Weidner et al., 2001に記載）を含む。この動物モデルでは、ほぼ完全に横切断された脊髄の無傷の残存断片の生存性および新芽形成が化合物によってどの程度亢進され得るかということを試験する。従って、ヘキソースの投与後、これらの動物は、例えばラットが（関連する脊髄が97％切断された）前肢でいかに上手く固形飼料を扱うことができるかといったような特定の機能の回復について評価することができる。
【００６２】
本発明のアッセイでの使用に適したもう一つの動物モデルはラットの卒中モデル（Kawamata et al., 1997に記載）を含む。この論文は、損傷後の肢における感覚運動機能および前庭運動（vestibulomotor）機能の評価に用いることのできる様々な試験について詳細に記載している。これらの動物への本発明の化合物の投与は、所与の化合物、投与経路、または用量が試験動物における機能レベルの向上、または機能回復率もしくは機能維持度の向上などの神経を健康的にする作用を提供するかどうかを評価するために用いることができる。
【００６３】
卒中後のヒトの患者における経過を評価するために用いられる標準的な神経学的評価は、被験体におけるヘキソースの神経を健康的にする作用の発現能力の評価にも使用することができる。このような標準的な神経学的評価は医療分野では定法であり、例えば、MohrおよびGautierによって編集された「Guide to Clinical Neurobiology」（Churchill Livingstone Inc. 1995）に記載されている。
【００６４】
末梢神経系の機能評価に関して、標準的試験には筋電図検査、神経伝導速度測定、誘発電位評価、および前肢／後肢体性感覚誘発電位が含まれる。筋電図試験は筋における電気的活動を記録するものであり、神経および筋の機能評価に用いられる。電極は、電気的活動を記録するために筋に挿入される。電極は、挿入中の筋の安静時および収縮時の活動を記録する。神経伝導速度試験は、電気的インパルスがいかに早く末梢神経を移動するかを記録することによって、末梢神経の健康状態を評価する。末梢神経は脊髄から筋に情報を伝達する。多くの神経系疾患はこのインパルスの速度を低下させる可能性がある。皮膚にセットした電極はインパルスが神経に沿って移動した後の電気的シグナルを検出して記録する。二番目の刺激電極は神経に沿って弱い電荷を送り、刺激から反応までの時間を記録してインパルスがいかに迅速かつ完全に送られるかを調べる。
【００６５】
神経医学分野の当業者に公知である脳神経の機能に関する標準的試験には、顔面神経伝導試験；眼輪筋反射試験（まばたき反射試験）；局所性顔面神経病変、ベル麻痺、三叉神経痛および非定型性顔面痛において用いられる三叉-顔面神経反射の評価；誘発電位評価；視覚、脳幹および聴覚誘発電位測定；熱診断性の（thermo-diagnostic）小繊維試験；ならびにコンピュータ支援定性的感覚試験が含まれる。
【００６６】
本発明は以下の実施例によってさらに例証されるが、これらはさらなる制限として解釈されるべきではない。本出願を通して引用されるすべての参照、特許および出版された特許出願の内容は、参照として本明細書に組み入れられる。
【００６７】
実施例
実施例1
網膜神経節細胞によるヘキソースを用いた治療に反応した軸索の伸長
キンギョ網膜神経節細胞は内容が参照として本明細書に組み入れられるPCT出願シリアル番号第PCT/US98/03001号に述べられるように調製して、マンノースのようなヘキソース誘導体と接触させる。ヘキソース誘導体のキンギョ網膜神経節細胞から軸索増殖を刺激する能力は、PCT出願シリアル番号第PCT/US98/03001号に述べられるようにモニターされる。
【００６８】
実施例2
方法
ラット硝子体からの低分子量因子の抽出。
ラット硝子体に存在する分子は通常生理食塩液中に抽出された（硝子体8つを生理食塩液1.5mlに入れて4℃にて一晩攪拌）。硝子体は、200〜250gの正常な雄の成体Fisherラット（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）、またはレンズ損傷後7日の、この時点で本発明者らによってレンズ損傷後のRGCにおいてGAP-43アップレギュレートの明瞭な証拠が確認されるラット（Leon et al., 2000）に由来した。レンズ損傷は、既報（Leon et al., 2000）の通り30Gの針を用いて行った。硝子体抽出物は、細胞破壊片を除去するために22μM低タンパク質結合フィルター（Pall Life Sciences, Ann Arbor, MI）に通した；低分子量成分は3kDaの分子量カットオフ（MWCO）膜を介する限外ろ過によって分離した。
【００６９】
ウシ硝子体液は、ウシ新生児の眼から硝子体液1容積に対して通常生理食塩液4容積の割合で抽出した。抽出は4℃にて行った。上記のように、抽出液を22μM低タンパク質結合フィルター（Pall）に通した後、高分子量成分を除去するために3kDaカットオフ限外ろ過装置に通した。ウシ硝子体由来の小分子が成長促進においてキンギョAF-1またはイノシンのように行動するかどうかを調べるために、本発明者らは軸索成長にとって重要なプリン感受性キナーゼのアンタゴニストである6-チオグアニン（6-TG、20μM、Sigma）または細胞膜を介してのプリン輸送の阻害物質である4-（ニトロベンジル-6-チオイノシン）（NBTI, 20μM, Aldrich Chemicals）の存在下または非存在下においてその活性を調べた。
【００７０】
調整培地の分画化
活性因子を濃縮して無機塩を除去するために、ウシ硝子体の低分子量抽出物を凍結乾燥して、95％エタノールで抽出した（元々の試料容積の16％、4℃、頻繁にボルテックスに掛けながら1時間）。エタノール可溶性画分を凍結乾燥して、水400μlに再溶解して、C18逆相HPLCカラム（Delta Pak 5μ C18 100Å, Waters, Milford, MA：0.5ml/min）に適用した。緩衝液Aはトリフルオロ酢酸（TFA）の0.1％水溶液であり、緩衝液Bはイソプロパノール、アセトニトリル、および水の3 ： 2 ： 2の割合の混合液中0.08％TFAであった。溶出のための勾配は、0％Bを2分間、続いて42分かけて0〜100％Bであった。バイオアッセイは2分の画分のプールに対して実施した。
【００７１】
さらなる分離は、Sephadex G-10（Sigma）カラム1.6cm×48cmを用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより実施した。このカラムは700ダルトンよりも小さい分子を分離する。試料を20倍に濃縮して、不溶性成分を遠心分離によって除去し、生物活性のすべてを含むことが明らかとなった（示さない）可溶性部分を0.5mlの液量で適用した。カラムは蠕動性のポンプを用いて0.3ml/分にて加圧下で稼働させた。4.5ml画分を回収して、バイオアッセイはその試料における元々の濃度に対して約5％の濃度で試験した。
【００７２】
精製の最終段階は、順相HPLCカラム（Shodex aminopropyl, Thomson Instruments, Oceanside, CA）を用いて実施した。軸索促進活性を含むG-10カラム由来の画分を凍結乾燥して、80％アセトニトリル200μlに再溶解した。75％アセトニトリルを用いてカラムを予め平衡させた後、試料を1ml/分の流量で適用した。1ml画分を回収してバイオアッセイした。
【００７３】
キンギョ網膜神経節細胞培養物
哺乳動物AF-1を、先ず、解剖したキンギョ網膜神経節細胞（RGC）を用いたバイオアッセイにおいて特徴付けした。つまり、コメット品種のキンギョ（Mt.Parnell Fisheries, PA）を暗順応させて、4℃に冷却して、頚部切断により屠殺した。網膜を摘出して、パパイン中でのインキュベートおよび一連の粉砕工程で順次分離した結果、RGC濃縮細胞懸濁液を得た（Schwartz & Agronoff,; Schwalb et al., 1995）。ウェル当たり約500個のRGCを、試験すべき実験試料と共に、N1およびN2サプリメント（Bottenstein, Saito）、抗酸化剤、および別途詳細に述べられるウシ血清アルブミン（Schwalb et al., 1995）を加えたリーボビッツ（Leibovitz）L15培地（Gibco BRL）を含む所定の無血清培地に播種した。各実験において、軸索増殖の評価担当者に各ウェルに含まれる試料のタイプが分からないように、各試料のウェル4つは盲検的に24穴プレートに分布させた。実験には、陽性対照（事前に検証されたキンギョAF-1またはイノシン）および陰性対照（定められた培地単独）を加えて、同様に盲検的にプレートに4つずつ分布させた。21℃にて6日間培養後、軸索を≧5細胞直径の長さに伸長したRGCの割合として機能的に定義される軸索の増殖は、ウェル当たり約150個の連続的に生じたRGCにおいて評価した。データは、各試料のウェル4個における軸索成長の平均を求めて、陰性対照に見られた成長のレベルを引いて（一般に3〜5％）、陽性対照の純成長（通常、20〜40％）によって正規化して分析した。データは、正規化した平均値±SEMとして示す。すべての実験は少なくとも3回反復した。
【００７４】
ラット網膜神経節細胞培養物
網膜神経節細胞は、フルオロゴールド（FG：Fluorochrome, Inc.）を用いた逆行性ラベリングにより同定した。これに関して、雄の成体Sprague-Dawleyラットを麻酔して、定位装置に収容して、覆っている後大脳皮質を除去して上丘を露出させた。FGは上丘のいくつかの部位に両側的に注射した。さらに、FGを含浸させたゲルフォーム（Gelfoam）（Upjohn, Kalamazoo, MI）の小片を上丘に載せて、頭皮切開創を閉鎖して、皮膚を縫合閉鎖した。FGを視神経まで7日間、逆行的に輸送させた後、ラットを屠殺して眼球を摘出し、網膜を分離した。網膜は、パパイン処理および粉砕により順次分離した。ウェル当たり100〜150個のFG標識RGCを含む混合培養物を、24穴プレートにおいて37℃、5％CO2にて所定の無血清培地（NaHCO3を含む最小必須培地）で3日間、維持した。キンギョ培養物と同様に、すべての実験試料は四連で試験して、ランダムな方法で培養プレートに分布させた。データの統計学的処理は上記の通りであった。
【００７５】
質量分析法
Michigan State University Mass Spectrometry Facility において陽イオンまたは陰イオンモードで稼働するJEOL HX-110二重収束形質量分析計（JEOL USA, Peabody, MA）を用いてFAB質量スペクトルを得た。イオンは、Xe原子のビームを用いた衝撃（6keV）により発生させた。加速電圧は10kVであり、解像度は3000に設定した。FAB-CAD-MS/MSに関して、ヘリウムを第一の無フィールド領域に置いたセルにおける衝突ガスとして使用した。ヘリウム圧は、親イオンの存在度が50％まで減少するように調節した。データシステムにより、一定割合の電場に対する磁場（B/E）にてリンクスキャンを得た。この装置はM/Z 50から2000までスキャンした。提示するスペクトルは一回のスキャンから得られたものであった。
【００７６】
結果
小軸索促進因子（small axon-promoting factor）の哺乳動物硝子体における構成的存在
レンズ損傷は網膜神経節細胞を刺激してインビボにおいて損傷した軸索を視神経まで再生させる（Leon et al., 2000）。この成長を刺激する可能性のある因子について調べるために、本発明者らは正常な硝子体、神経圧挫およびレンズ損傷1週間後の硝子体に含まれる分子を生理食塩液中に抽出した。3kDaよりも小さい分子を限外ろ過によって分離して、バイオアッセイとしてキンギョ網膜神経節細胞を用いて軸索促進活性について調べた（Schwalb et al., 1995; Benowitz et al., 1998）。低分子量抽出物は、レンズ損傷の有無に関わらず、80倍希釈時に完全な活性を示した（図1）。この濃度の十分の一では、効果を示さなかった（データは示さない）。
【００７７】
ウシ硝子体における小軸索促進因子の存在と、キンギョAF-1のような行動
この小さな成長因子の十分な量を単離してその構造を解析するために、本発明者らはそれがウシ硝子体に存在するかどうかを調べた。ウシ硝子体抽出物の低分子量成分（VE＜3）を80倍希釈で調べたところ、キンギョ由来AF-1と同程度にキンギョRGCからの増殖を誘発した（図2）。硝子体由来因子がAF-1のように行動するかどうかを調べるために、本発明者らは次の2つの物質のいずれかによってその活性が遮断され得るかどうかを調べた：AF-1の増殖に対する作用を非競合的に遮断するがイノシンとは競合的である6-チオグアニン（Petrausch et al., 2000）；または細胞膜を介してのプリン輸送の阻害物質でありイノシンの作用は遮断するがAF-1の活性は低下させないNBTI（Benowitz et al., 1998）。NBTIはVE＜3またはAF-1に誘発される成長に対してはほとんど作用を示さなかったが、イノシンに誘発される成長は効果的に遮断した。これに対して、6-TGはVE＜3またはAF-1に誘発される成長を基準値よりも低く抑えたが、イノシンの作用については部分的に遮断したのみであった（図2）。このように、硝子体由来の低分子量因子はキンギョAF-1のように行動する。
【００７８】
小硝子体由来因子による成体ラットRGCにおける軸索再生のcAMP依存的な刺激
成体ラットの網膜は材料および方法に述べる通りに分離して培養した；RGCは、培養物の調製前にフルオロゴールドを用いた逆行性ラベリングにより同定した。その他の因子の非存在下において、RGCの約5％〜8％は3日後に軸索を＞2細胞直径の長さに伸長した。フォルスコリンを用いた、または膜透過性、非加水分解性cAMP類似体であるSp-cAMPを用いた細胞内cAMPの増加は増殖に対してほとんど作用を示さなかった。硝子体由来低分子量抽出物はわずかではあるが有意なレベルの自身の成長を刺激して（p＜0.01）、この小因子とフォルスコリンまたはSp-cAMPのいずれかとの組み合わせはこの作用を著しく増強した（図3a：低分子量因子プラスフォルスコリンまたはSp-cAMPによる成長と、いずれか一つにより得られた成長とを比較してp＜0.001）。キンギョRGCに関して上記に示した通り、6-TGは低分子量因子プラスフォルスコリン（p＜0.01）または低分子量因子プラスSp-cAMP（p＜0.05）に誘発される成長を抑制した。このように、硝子体由来低分子量因子はラットRGCをcAMP依存的に刺激して軸索を伸長する；キンギョRGCにおける軸索成長と同じく、増殖はプリン感受性メカニズムを介して調節される。低分子量断片の影響は細胞生存性における変化に無関係であった（図3b）。最大効果は、VE＜3を硝子体内でのその元々の濃度の4％に希釈した際にも達成された（図3c）。
【００７９】
ラットRGCとは異なり、キンギョRGCは、細胞内[cAMP]iが増加しなくても、VE＜3に対する確固たる反応を示した（図4）。フォルスコリン（10μM）もSp-cAMP（150μM）も自身の成長を誘発せず、これはcAMPまたはcGMPの膜透過性類似体がキンギョRGCの軸索伸長を刺激しないことを示した過去の結果（Benowitz, 1998）と一致する。AF-1に加えると、フォルスコリンおよびSp-cAMPは統計学的に有意でない増殖の低下を惹起した。逆に言えば、AF-1に誘発される成長は膜透過性非加水分解性PKAアンタゴニストであるRp-cAMP（100μM）またはPKA阻害物質であるH89（5μM）によって抑制されなかった。H89は20μMにおいてAF-1の作用を抑制したが（p＜0.001）、この濃度においてH-89はPKAに加えてその他のキナーゼにも影響を及ぼす。従って、この低分子量因子に対するキンギョRGCの反応のcAMP依存性は、ラットRGCに対する反応よりもかなり低い。
【００８０】
活性成分の単離
硝子体抽出物の低分子量画分は凍結乾燥によって濃縮して、少量の95％エタノールに抽出した。これにより軸索促進活性がほぼ完全に回収されて、無機塩の約98％が除去された（データは示さない）。逆相C18カラムで分離した後、軸索促進活性はカラムに保持されずに、最初の数分間で大きな吸光度ピークの一部として溶出された（図5a、5b）。
【００８１】
Sephadex G-10カラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより、さらなる精製を行った。軸索促進活性は、主として、主要吸光度ピークとオーバーラップする単一の画分（165〜180分）に含まれた（図5c、5d）。高濃度においても、この画分は出発物質として軸索促進活性レベルの60〜80％のみを誘発した。G-10カラムにおいて後に溶出して、単独では活性を示さない物質は、改めて活性画分に加えるとその活性を出発物質のレベルに回復させる（データは示さない）。G-10カラムから得られる活性画分を順相カラム（LC-NH2）に適用すると、活性はきわめて少ない吸光度を示す領域に遅れて溶出した（図5e、5f）。このように、順相クロマトグラフィーは高い精製度を示した。この活性画分も、陽性対照（出発物質）の約80％の増殖を刺激した。この画分を濃縮して、再度同一カラムにかけて、UV感度を最高レベルにセットした検出装置で可視化した吸光度ピークに一致する画分を回収した。バイオアッセイにより、軸索促進活性が9.8分に溶出される単一のピークに濃縮されることが明らかとなった（データは示さない）。
【００８２】
質量分析法による活性因子の同定
軸索促進活性および隣接する不活性ピークを含む精製画分は、高速原子衝撃（FAB）質量分析法により陽イオンおよび陰イオンモードにて分析した。主な結果はグリセロールの存在下において得られて、テトラエチルアンモニウムおよびニトロ安息香酸の存在下において確認された。陰イオンモードにおいて、活性画分（#17）は隣接する不活性画分（#16）には含まれないm/z＝179.2（矢印）のイオンを含んだ（図6a、b）。陰イオンモードにおけるm/z値は真の質量マイナス1プロトンに相当するので、活性画分に含まれるこの分子は180の質量を持つことが予測される。陽イオンモードにおいて、生物学的に活性な画分には隣接する不活性画分には含まれない2つのピークが出現した（m/z＝273.2および255.2：図6c、d、矢印）。陽イオンモードにおけるm/z値は1つの付加プロトンを含むので、2つの固有のイオンは272.2および254.2の質量を持つことが予測される；但し、これらのイオンが親種のグリセロール付加物（質量＝92）であるならば、大きい方の質量は180であり、これは陰イオンモードで認められた質量とほぼ等しく、他方は162である。m/z＝273のイオンの陽イオンモードでのMS/MSによるさらなる分析（図6e）により、グリセロール（m/z＝93、アステリスク）および質量180（m/z＝181、二重矢印）の存在が確認された。MS/MSも親種から18の倍数を引いた値、即ち、163、145、および127（矢印）に対応するピークを示した。後者のピークは181のイオンからのヒドロキシル基の連続的な消失を示す可能性が高く、これに対してm/z＝255および237のピークは、それぞれ、163および145のイオンのグリセロール付加物を示す可能性がある。これらの結果から、この活性分子はC6H12O6（質量＝180）の式を持つ炭水化物であることが予測される。
【００８３】
特異的炭水化物によるキンギョRGCからの軸索再生の誘発
質量分析法の結果に基づいて、本発明者らは培養中のRGCに対するヘキソース糖および関連化合物の軸索促進作用について調べた。キンギョRGCにおいて、ミオイノシトール、ケトン体であるフルクトースおよびソルボース、ならびにアルドースであるD-アロース、D-アルトロース、D-グロース、D-タロース、およびD-ガラクトースはすべて、増殖を刺激できなかった（すべて50または100μMにて調べた：図7a）。しかし、構造的に関連する2つのアルドース糖であるマンノースおよびグルコースは、ゲルろ過および順相クロマトグラフィーによりウシ硝子体抽出物から単離された低分子量因子と同程度に増殖を刺激した（図5d、fを参照）。グルコースおよびマンノースのL-エナンチオマーは不活性であった（データは示さない）。マンノースに応答しての増殖は25〜50μMで飽和して、ED50は約10μMであった（図7c）。グルコースについてほぼ等しい用量-反応曲線が得られた（データは示さない）。上記のように、ウシ硝子体に由来する成長促進因子はサイズ排除および順相クロマトグラフィーによる単離後に元々の活性の60〜80％しか保持せず（図5d、f）、自らはなんら成長を惹起しないサイズ排除カラム由来の遅い画分を改めて加えると、活性を完全に回復することができた。同様に、サイズ排除カラムから得られる同一の遅れて溶出する画分を50μMマンノースまたはグルコースに加えると、活性が増大して分画化前の硝子体抽出物のレベルに回復した（図7d）。キンギョRGCに対するグルコース（図7e）またはマンノース（示さない）の作用は、膜透過性、非加水分解性cAMP類似体であるdBcAMPで増強されなかった。反対に、プロテインキナーゼAの阻害物質であるKT5720は通常の有効量である1μMにおいてマンノースの作用を抑制せず、10μMにおいて軽微な作用を示したのみであった（図7f）。同様に、PKA阻害物質であるRp-cAMPは通常の有効用量である100μMにおいてグルコース誘発性の増殖に対して影響を及ぼさなかったが、1mMで試験した場合は成長を48％遮断した（示さない）。
【００８４】
これらの実験で用いられた培養培地は、エネルギー代謝のために、また炭素源として高濃度のガラクトース（5mM）およびピルビン酸塩（5mM）を既に提供する。従って、低マイクロモル濃度のマンノースまたはグルコースによって誘発される増殖はエネルギー代謝には関連しない可能性が高い。このことは、本発明者らの培地にATP合成において容易に用いられる5mMメチルピルビン酸を加えても影響がなかったという事実（データは示さない）によってさらに示唆される。軸索成長に対するグルコースおよびマンノースの影響がエネルギー代謝に無関係であることを示すさらなる証拠は、これらの炭水化物の低マイクロモル濃度が細胞生存性に対して影響を及ぼさないという事実から得られる（図7b）。
【００８５】
認められた作用の特異性を調べて、想定される構造-機能関連性についての洞察を得るために、本発明者らはいくつかの関連化合物の生物活性を調べた。グルコースおよびマンノースのL-エナンチオマーは完全に不活性であった（図8a）。D-グルコサミンは強い活性を示した（p＜0.001）；D-マンノサミンは、2-デオキシ-D-グルコース、3-O-メチル-D-グルコース、メチル-α-D-グルコピラノシド、メチル-β-D-グルコピラノシド、アセチルグルコサミンおよびフコースと同じく、作用を示さなかった。D-グルコース-およびD-マンノース-6-リン酸は、増殖を比較的適度ではあるが統計学的に有意に刺激した（p＜0.01）。これらの後者の2つのリン酸誘導体は負に帯電していることから、これらは細胞膜を通過しない。このことは、グルコースおよびマンノースが細胞外メカニズムを介して軸索増殖を刺激する可能性があることを示唆する。この可能性のさらなる裏付けは、グルコース輸送の阻害物質である3-O-メチルグルコース（3-O-MG）を用いた試験から得られる。100：1のモル比において、3-O-MGはグルコースの作用を遮断できなかった（図8b）。本発明者らはさらにもう一つのグルコース輸送阻害物質である2-デオキシグルコース（2-DG）の作用についても検討した。しかし、1mMの低濃度において、2-DGは軸索成長に対して非特異的な作用を及ぼして、グルコースおよびイノシン双方の作用を遮断した；イノシンは細胞内メカニズムを介して軸索の成長を刺激することが示されている（Benowitz et al., 1998。上記に示す通り、AF-1のキンギョRGCに対する作用はフォルスコリンまたはSp-cAMPのいずれかを用いた細胞内cAMP値の上昇によって亢進せず、実際には減少を示す（図4）。同様に、キンギョRGCに対するグルコースの作用はフォルスコリンの添加によって低下する（図8c）。
【００８６】
いくつかの細胞タイプにおいて、グルコースは解糖経路の最初の酵素であるヘキソキナーゼの活性によって、または下流代謝物の濃度によって検出される（Rolland et al., 2001）。キンギョRGCにおいて、グルコース-6-キナーゼおよびヘキソース-6-キナーゼ双方の阻害物質であるマンノヘプツロース（MH、10mM）は、細胞生存性にとって有害であるにも関わらず、グルコースまたはマンノースに誘発される増殖に対して影響を及ぼさなかった（図8dおよび8e）。従って、軸索成長におけるグルコース／マンノースセンサーは解糖の第一段階に関与するキナーゼではなく、6-リン酸誘導体またはいずれかの下流代謝物の細胞内濃度にも依存しない。細胞生存性の低下にも関わらずMHが増殖を遮断できないことはD-グルコースまたはD-マンノースの軸索促進作用が細胞生存性に無関係であることを示すさらなる証拠を提供する。
【００８７】
細胞外に導入された場合、D-グルコース-6-リン酸およびD-マンノース-6-リン酸は100μMにおいて適度な量の増殖を刺激して（p＜0.01）、かつ1mMにおいて測定可能な成長を刺激した（p＜0.001）（図8f）。6-リン酸誘導体は負に帯電していて、細胞膜を通過しない（Abeles et al., 1992）。このことは、6-リン酸誘導体が、ひいてはグルコースおよびマンノース自身が細胞外センサーを介して軸索増殖を刺激する可能性があることを示唆する。
【００８８】
ラットRGCのマンノースに対ｓるcAMP依存的で選択的な反応
キンギョRGCと同じく、成熟ラットに由来するRGCもマイクロモル濃度の単糖類に反応して軸索を成長させるが、いくつかの興味深い相違点がある。ラットRGCはマンノース（p＝0.05、片側）またはVE＜3単独（p＝0.05、両側）に対して辛うじて有意な反応を示して、フォルスコリン単独に対しては小規模ではあるが有意な反応を示す（図9a）。フォルスコリンの存在下において、マイクロモル濃度のマンノースはフォルスコリン単独によって誘発される軸索成長レベルを2倍以上とした（p＜0.001）。マンノースに誘発される成長は、未分画化ウシ硝子体抽出物の低分子量成分に誘発される成長と少なくとも同等であり、高濃度のグルコースを添加してもさらなる増強はなかった。その他の試験において、マンノースは50μMにおいてほぼ最大効果を達成することが認められた（データは示さない）。これに対して、グルコースはインビボにおいて生じるミリモル濃度においても、またフォルスコリンの存在下においても、フォルスコリン単独のレベルを上回る成長を誘発することはできなかった。図9bは、この作用が細胞生存性に関連しないことを示す。このように、キンギョRGCは細胞内cAMPの増加を伴うことなくグルコースまたはマンノースに反応して極めて長い軸索を伸長するが、ラットRGCはマンノースに対してcAMP依存的に選択的に反応する。
【００８９】
成熟ラット由来のRGCはキンギョRGCよりもはるかに高い反応選択性を示した。D-マンノース自体はラットRGCに対する作用をほとんど持たなかったが（図9aおよび図9c）、フォルスコリンの存在下では軸索増殖を基準値の3倍に増大させた（p＜0.001：図9aおよび9c）。この作用はVE＜3の作用とほぼ等しく（参照、図3）、同じく細胞生存性の変化には無関係であった（図9bおよび図9d）。フォルスコリンの存在下において、マンノースは50μMにて最大作用を示して、ED50は約10μMであった（データは示さない）。立体特異性はL-マンノースの不活性により実証される（図9c）。同様の条件下において、グルコースは、ミリモル濃度で存在する場合（図9a）であってもいかなる作用も持たなかった（図9c）。試験したその他の糖類の内、グルコースは若干の活性を示した（p＜0.05）（図9c）。キンギョRGCとは異なり、ラットRGCはグルコサミン（図9c）または高濃度のマンノース-6-リン酸（10mMまで：データは示さない）に対して反応しなかった。
【００９０】
ラットRGCにおけるマクロファージ由来因子およびマンノースの相加効果
培養において、10〜20kDaのマクロファージ由来タンパク質は[cAMP]iの上昇時に硝子体由来成長小因子に対するラットRGCの反応性を増強する（Yin et al., 2003）。フォルスコリンの存在下において、マクロファージで調整した培地はマンノースに対するラットRGCの反応をほぼ倍増させて、成長は基準値のほぼ6倍に増加した（図9e）。この成長は、培養RGCが3日間で伸長する軸索の50％強に相当する。
【００９１】
考察
本発明者らは、本明細書において、特定の単糖類が網膜神経節細胞の軸索再生を刺激すること、またこの作用がエネルギー代謝に依存しないことを示す。他のエネルギー源が豊富である場合であっても、キンギョRGCは低マイクロモル濃度のグルコースまたはマンノースに反応して軸索を再生する。これらの炭水化物に対する反応性は細胞内cAMPの増加を必要としない。一方、ラットRGCはより選択的である。ラットRGCはcAMP依存的にマイクロモル濃度のマンノースに反応して軸索を伸長するが、インビボにおいて認められる量とほぼ等しい量のグルコースに対しては反応しない。ラットRGCの反応は、マクロファージから分泌される高分子によってさらに増強することができる。これらの所見は、インビボにおける下等脊椎動物および高等脊椎動物の再生能が異なることを一部説明するのに役立つ可能性がある。キンギョの場合、多量のグルコースは損傷後にRGCにそれらの軸索を再生させるのに十分である可能性がある。しかし、ラットの場合は硝子体液にはマンノースが豊富であるが、その軸索再生刺激における役割は調節的というよりは許容的である可能性が高い。単独では、マンノースはインビボまたはインビトロにおいて軸索再生を誘発する能力を持たない。しかし、増加した細胞内cAMPの存在下では、マンノースはマクロファージ由来因子の作用を増強し、従って、インビボにおいてマクロファージ活性化後に見られる劇的な軸索再生において役割を担う可能性が高い（Yin et al.、提出済み）。
【００９２】
細胞培養において、キンギョ視神経の非ニューロン細胞によって調整された培地はRGCに由来する大規模な軸索再生を刺激することが明らかとなった。部分的精製の結果、この活性の大半がAF-1と呼ばれる親水性小分子に起因し得ることが明らかとなった（Schwalb et al., 1995, 1996）。さらに、培養においてAF-1は、インビボの軸索再生に関連することが知られている多くの遺伝子産物の発現を誘発することが示された（Petrausch et al., 2000）。本明細書に示す通り、哺乳動物の硝子体液は、キンギョAF-1とほぼ等しい生物物理学的特性および生物活性を持つ小分子を含む。AF-1および硝子体由来因子はいずれも親水性であり、ゲルろ過カラムにおいてコヒーレントピークとして溶出して、6-チオグアニン感受性およびNBTI-不感性にキンギョRGCからのほぼ等しいレベルの軸索成長を誘発する（本試験；Schwab et al., 1996；および未発表の所見）。さらなる精製において、ウシ硝子体に由来する低分子量因子は生物活性の大半を持つ一つの成分、および単独では軸索成長を誘発する力はないが活性因子の作用を増強する第二の成分を含むことが明らかとなった。限外ろ過、吸収率較差溶解度（differential solubility）、ゲルろ過クロマトグラフィーおよび順相HPLCの組み合わせを通じて、本発明者らは硝子体から活性成分を単離して、質量分析法によりそれがC6H12O6の式を持つ炭水化物であることを見出した。この式を持つ多くの単糖類を調べた結果、増殖刺激における高い特異性が明らかとなった。キンギョRGCの場合、立体特異性のように、炭素原子3〜5におけるヒドロキシル基の位置が強く制約され、一方、炭素2では、アミド基の置換のようにマンノースまたはグルコースの立体配置が成長を刺激する。高濃度のピルビン酸塩およびガラクトースの存在下においても成長を刺激するためには低いマイクロモル濃度が必要であったという事実は、単糖類の軸索促進作用がエネルギー代謝とは無関係であることを示す一つの指標を提供する。このことは、試験を通して認められた細胞生存性と軸索成長の解離によってさらに示される。面白いことに、マンノース-6-リン酸およびグルコース-6-リン酸も、単糖類自身よりは軽度であったが、成長を刺激した。リン酸誘導体は細胞内に侵入できないので、それらは細胞外センサー上で作用する可能性が高い。グルコースおよびマンノースが細胞外で作用する可能性は、それらのキンギョRGCに対する作用がグルコース輸送の阻害物質である3-O-メチルグルコースによって低下しないという所見によってさらに示される。ヘキソースキナーゼの阻害物質は、細胞生存性の低下にも関わらず、グルコースまたはマンノースの軸索原性（axogenic）作用を遮断しなかった。同時に、これらの所見はグルコースおよびマンノースの増殖に対する作用は細胞外センサーを介するものであり、エネルギー代謝または細胞内でのもう一つの産物への転換には無関係である可能性が高いという見解に対してさらなる支持を与えるものである。哺乳動物RGCの場合、マンノース単独は増殖を刺激して、グルコースは5mMまでの量において軸索促進作用を示さなかったことから、炭水化物の軸索原性とエネルギーに関するの役割の解離は実に明らかである。
【００９３】
サイクリックAMPは軸索成長の促進においていくつかの役割を担う可能性がある。新生ラットRGCにおいて、栄養因子が細胞生存性を刺激する能力はcAMPを必要とし、このとき少なくともいくつかの場合において、同源レセプターの細胞質から細胞膜への移行を可能とする（Meyer-Franke et al., 1995; Shen et al., 1999; Goldberg et al., 2002）。RGCの生存性がbcl-2遺伝子の過剰発現によって栄養因子非依存性となる場合であっても、RGCは依然、栄養因子刺激に反応して軸索を伸長するためにcAMPの増加を必要とする（Goldberg et al., 2002）。成長円錐において、細胞内cAMP値は様々な細胞外シグナルが引力または斥力になるかどうかの決定において速やかな効果があり、ミエリンまたは特異的ミエリンタンパク質による成長阻害を克服するための栄養因子の「プライミング」効果の介在においては遅発性作用を示す（Cai et al, Neuron, ca. 1999）。cAMPのこの後者の作用はタンパク合成依存的であり、ミエリン阻害を克服するために十分なアルギナーゼIおよびその産物であるポリアミンの発現亢進に関連する（Cai et al., 2002）。本発明者らの試験において、cAMPの役割は、本発明者らの培養培地が既に高濃度（100μM）のプトレッシンを含むことから、ポリアミン合成には関連しない可能性が高い。しかし、マンノースがGAP-43の発現をアップレギュレートできるようにするためにはcAMPが必要である。キンギョRGCの場合、細胞内cAMP値の上昇によっては増殖は促進されなかった。
【００９４】
要約すると、本発明者らの結果はキンギョ網膜神経節細胞において軸索増殖を刺激する低分子量因子、およびその他の成長因子に対する成熟ラットRGCの反応性を亢進する低分子量因子は単糖類であることを示す。キンギョRGCは低マイクロモル濃度のグルコース、マンノースまたはグルコサミンに対して相対的に非選択的な成長反応を示して、これは細胞内のcAMPの上昇を必要としない。このように、これらの糖が非常に豊富であることはインビボにおいて自然発生的に生じるキンギョ視神経の効率的な再生を説明するのに役立つ可能性がある。哺乳動物の場合、再生不全は阻害性ミエリンタンパク質および損傷部位におけるグリア瘢痕が原因とされているが、これらの障害は眼球へのマクロファージ流入を惹起する細胞内操作によって大幅に改善することができる（Berry et al., 1996; Leon et al., 2000; Fischer et al., 2000, 2001 ; Yin et al., 2003）。成体ラットRGCがマンノースおよび増加したcAMPの存在下においてマクロファージ由来因子に反応してそれらの軸索を再生するという本発明者らの所見は、高等脊椎動物の軸索再生においても単糖類が重要な役割を担う可能性があることを示す。
【００９５】
次の実施例3および4は眼内、眼周囲、または球後（retrobulbar）注射または潅流に有効な調製物である。
【００９６】
実施例3
2006503847.tif 000002
【００９７】
実施例4
2006503847.tif 000003
【００９８】
同等品
当業者は、ごく定型的な実験を用いて、本明細書に述べられる発明の具体的態様に対する多くの同等品を認識し、または確認することができる。このような同等品は特許請求の範囲によって内包されることが意図される。
【００９９】
参照
本明細書を通じて引用されるすべての参照は、参照として全体が本明細書に組み入れられる。
2006503847.tif 000004
2006503847.tif 000005
2006503847.tif 000006
2006503847.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】図1A〜Bは、ラット硝子体由来の低分子量因子の軸索促進作用を示す。図1Aは、正常なラット硝子体またはレンズ損傷1週間後の硝子体に含まれる分子が生理食塩液中に抽出されたことを示す；大きさ＜3kDaの分子を限外ろ過によって分離して、キンギョ網膜神経節細胞を用いて軸索促進活性を調べた。それらの元々の濃度の1.25％または5％のいずれかで存在する場合、その低分子量抽出物はレンズが損傷しているかいないかからは独立して、イノシンと同程度に増殖を誘発した。増殖データは、培養培地単独中での成長のレベルを引いた後に陽性対照における純成長で割って、正規化する。図1Bは細胞生存性を示す。200倍の顕微鏡視野当たりの網膜神経節細胞数はいずれの処理によっても変化しなかった。
【図２】図2は硝子体由来低分子量因子の特性を示す。硝子体抽出物から得られた低分子量因子（VE＜3）に誘発される軸索成長はプリン類似体である6-チオグアニン（6-TG）によって完全に阻害されるが、プリン輸送の阻害物質であるNBTIによっては阻害されない。これらの物質は、キンギョ視神経で調整した培地から得られる小因子であるAF-1に誘発される増殖に対してほぼ等しい作用を発揮する。これに対して、イノシンに刺激される成長は6-TGではごく一部が阻害されて、NBTIでは完全に遮断される。
【図３】図3A〜Cは、硝子体に由来する因子がラット網膜神経節細胞における軸索成長をcAMP依存的に刺激することを示す。図3Aは軸索増殖を示す。硝子体由来の低分子量因子は単独で培養中のラット網膜神経節細胞に対してわずかではあるが有意な軸索促進作用を示す。フォルスコリン（forsk）またはPKAアゴニストであるSp-cAMP-sを添加するとこの作用が著しく増強される。この成長は6-TGによって強く阻害される。結果は、培地のみで生育させた対照培養物に見られた成長レベルに対して正規化する（軸索を、長さ＞2細胞直径に伸長する細胞の8〜12％の範囲内）。図3Bは細胞生存性を示す。試験したいずれの物質もRGCの生存性を変化させなかった。** 陰性対照と比較してp＜0.01；[***] PKAアゴニストのみを加えた培養物における成長と比較してp＜0.001；[††] VE＜3およびPKAアゴニストを加えた培養物における成長と比較してp＜0.01。図3CはVE＜3が5％の濃度においてほぼ最大の反応を示すことを表す。** 陰性対照と比較してp＜0.01；[***] 陰性対照またはPKAアゴニストのみを加えた培養物と比較してp＜0.001。
【図４】図4は、キンギョRGCにおける軸索成長が細胞内cAMP値の上昇によって亢進しないことを示す。フォルスコリンまたはSp-cAMP-sは単独ではキンギョRGCにおける軸索成長を刺激せず、AF-1に誘発される増殖のレベルを抑制した。PKAアンタゴニストであるRp-cAMP-sまたはH-89（5μMにおいて）はAF-1に誘発される成長を抑制しないが、より高濃度のH89（20μM）は抑制作用を示した。** p＜0.01（AF-1のみを加えた場合の成長に比較した抑制の有意性）。
【図５】図5A〜Fは硝子体由来の小さな成長因子の単離を示す。図5AおよびBは逆相HPLCを示す。ウシ硝子体から得られた低分子量因子を濃縮して、95％エタノールに抽出し、C-18逆相カラムを用いてHPLCに供した。軸索促進活性は最も早いピークに溶出した。図5CおよびDはゲルろ過クロマトグラフィーを示す。G-10Sephadexカラムにおいて、軸索促進活性は214nmで吸光度を示す物質を多量に含むコヒーレントピークとして溶出した。図5EおよびFは順相クロマトグラフィーを示す。ゲルろ過カラムから得られた軸索促進活性を含むピークはHPLCを用いてLC-NH2順相カラムで分離された。その軸索促進活性は、214nmに吸光度を示す大半の成分よりも遅れて溶出した（矢印）。すべての場合において、バイオアッセイはキンギョ網膜神経節細胞にて実施した。
【図６】図6A〜Eは質量分析法による軸索促進因子の同定を示す。図6AおよびBは、軸索成長を誘発しないLC-NH2カラム由来の分画（6A）および軸索成長を刺激する隣接分画（6B）のm/z＝140〜220の範囲の陰イオンモードにおける高速原子衝撃質量スペクトルを示す。スペクトルはグリセロールの存在下にて実施した。活性分画のみがm/z＝179.2のピークを含む（bの矢印）。陰イオンモードのイオン質量は質量マイナス1プロトンであることから、活性分画に含まれる化学種の実際の質量は180であると予測される。図6CおよびDは、軸索成長を誘発しないLC-NH2カラム由来の分画（6C）および軸索成長を刺激する隣接分画（6D）のm/z＝230〜300の範囲の陽イオンモードにおける高速原子衝撃質量スペクトルを示す。スペクトルはグリセロールの存在下において実施した。活性分画のみがm/z＝273.12および255.13のピークを含む（矢印）。陽イオンモードのイオン質量は質量プラス1プロトンであること、およびこれらのイオンがグリセロールを持つ付加物（質量＝92）を含む可能性があることから、活性分画に含まれる化学種の実際の質量は180.13および162.12とすることができる。図6Eは、グリセロールの存在下において陽イオンモードでMS/MS分析に供した（6D）から得られたm/z＝273の化学種の質量スペクトルを示す。より高い電圧にかけた場合、m/z 273の化学種はグリセロールピーク（m/z＝93、赤いアステリスク）およびm/z＝181のイオン（二重矢印）、即ち、親種マイナスグリセロールを生じた；その他のイオンの大半は181のイオンからの18amuの連続的消失（m/z＝163、145および127、矢印）、または181の化学種のグリセロール付加物からの18amuの連続的消失（m/z＝255、237、矢印）を示す。これらの結果は、軸索促進因子が式C6H12O6を持つヘキソース糖であることを示す。
【図７】図7A〜Fは、キンギョRGCがD-グルコースおよびD-マンノースに反応してそれらの軸索を再生することを示す。図7Aは、単糖類に対しての増殖を示す。試験した多くのヘキソース糖の内、グルコース（glc）およびマンノース（man）のみが軸索成長を誘発した。試験したその他の単糖類にはミオイノシトール（myo-inos）、フルクトース（fruc）、ソルボース（sorb）、アルトロース（alt）、アロース（all）、グロース（gul）、ガラクトース（gal）およびタロース（tal）が含まれて、いずれも50または100μMであり、すべてD体である。図7Bは細胞生存性を示す。軸索再生に対するマンノースおよびグルコースの影響は、細胞生存性の変化には無関係である。図7Cは、マンノースにおける用量-反応曲線を示す。マンノースの軸索増殖に対する影響は25〜50μMにおいて飽和して、ED50は約10μMである。図7Dは、マンノースの作用がそれ自体は軸索促進作用を持たない因子によって亢進されることを示す。D-glcは単独では硝子体抽出物に見られる軸索成長レベルの約70％しか刺激しない。ゲルろ過カラムから遅れて溶出する分画（14〜17）は単独では活性を示さないが、グルコースの作用を亢進して未分画化硝子体抽出物のレベルまで回復させる。図7Eは、膜透過性cAMP類似体であるdBcAMP（1mM）がキンギョ網膜神経節細胞に対するグルコースの作用を増強しないことを示す。図7Fは、プロテインキナーゼA阻害物質であるKT5720がキンギョ網膜神経節細胞におけるマンノース誘発性の成長に対してほとんど影響を及ぼさないことを示す。
【図８】図8A〜Eは、軸索成長に対する様々なグルコース類似体および阻害物質の影響を示す。図8Aは、L-エナンチオマー（100μM）の不活性により示される通り、D-マンノースおよびD-グルコースに見られる作用の立体特異性を示す。C-2のヒドロキシル基がアミノ基で置換したグルコース類似体であるD-グルコサミン（25μM）は強い活性を示すが、マンノサミンは活性を示さない。2-デオキシ-D-グルコース（1mM）、3-O-メチル-D-グルコース、メチル-α-またはメチル-β-グルコースピラノース、N-アセチル-グルコサミン（N-Ac-グルコサミン）またはL-フコースに、活性は見られない。しかし、グルコースおよびマンノースの膜非透過性6-リン酸塩（D-glc-6-P、D-man-6-P）はわずかではあるが統計学的に有意なレベルの増殖を誘発する。** 培地のみで培養した対照細胞に比してp＜0.01；*** 陰性対照に比してp＜0.001。図8Bは、フォルスコリンがD-グルコースの作用を低下させることを示す。10μMグルコースに誘発される増殖はフォルスコリン（10μM）によって阻害される。*** グルコース単独で誘発される成長と比較してp＜0.001。図8Cは、非代謝型グルコースでありグルコース輸送の阻害物質である3-O-MGがグルコース（10μM）のこの作用を遮断できないことを示す。グルコース輸送のもう一つの阻害物質である2-DGはグルコースの作用を遮断するが、これはイノシンの作用も遮断することから、この作用は非特異的である可能性がある。図8Dは、グルコース-6キナーゼおよびヘキソース-6キナーゼ双方の阻害物質であるマンノヘプツロース（MH、10mM）が、MHが細胞生存性を低下させる図8Eに示されるように細胞生存性に対して有害であるにも関わらず、グルコースまたはマンノースに誘発される増殖に対して影響を及ぼさないことを示す（視野当たりの生存RGCを参照）。図8Fは細胞外D-グルコース-6-リン酸およびD-マンノース-6-リン酸が100μMにおいて適度な増殖を刺激して（p＜0.01）、1mMでは測定可能な成長を刺激することを示す。y軸は（b）と同一である。培地単独で培養した細胞に比して、** p＜0.01、*** p＜0.001：†† p＜0.01（グルコース単独に比して生存性が低下）。
【図９】図9A〜Eは、ラット網膜神経節細胞がcAMP依存性にマンノースに対して選択的に反応することを示す。図9Aは軸索増殖を示す。マンノースはわずかな、辛うじて有意なレベルの増殖を誘発したが、フォルスコリン（5μM）は単独でやや強い作用を示した。フォルスコリンの存在下において、マンノースは増殖の顕著な増大を誘発した；グルコースは生理学的濃度（5mM）においてこの作用を示さなかった。マンノースの作用は硝子体に由来する低分子抽出物と少なくとも同程度であり、グルコースを添加しても変化はなかった。これらの試験は、培養培地中に5％ウシ胎児血清を加えて実施された。[*] 陰性対照と比較してp＝0.05、片側t検定；** 陰性対照と比較してp＜0.01、両側t検定。*** p＜0.001；n.s.＝フォルスコリン単独に誘発される成長に比して有意でない。図9Bは細胞生存性を示す。軸索増殖に対するマンノースおよびフォルスコリンの作用は、いかなる細胞生存性の変化からも独立している。図9Cは、成熟ラットRGCがフォルスコリンの存在下においてマンノースに強く反応することを示す。グルコースは不活性である。特記する場合を除いて、糖はすべてD体である。(*) 陰性対照と比較してp＜0.05；フォルスコリン単独（点線）と比較して、* p＜0.05、*** p＜0.001。図9Dは、細胞生存性がいずれの炭水化物によっても影響されないことを示す。視野当たりの生存RGC数を、陰性対照の値に対して正規化する。図9Eは、活性化されたマクロファージより分泌されるタンパク質（＞3kDa）がマンノースの作用を亢進することを示す。*** 他のあらゆる条件と比較してp＜0.001。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【国際調査報告】
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