(57)【要約】本発明は、一般に、Ｇタンパク質共役レセプター（「ＧＰＣＲ」）に関し、そしてより詳細には、Ｇタンパク質共役レセプターに結合する化合物に関する。本発明の方法は、Ｇタンパク質共役レセプターに結合する治療化合物を同定および調製することによって、疾患の処置に有用である。本発明は、Ｇタンパク質共役レセプターについての結合化合物の組成物を提供し、そしてＧタンパク質共役レセプターについての結合化合物を同定するための方法を提供する。本発明はまた、このような化合物を含む治療剤も提供する。
2004502134.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇタンパク質共役レセプターに対する結合化合物を同定する方法であって、該方法は、以下：
ａ）２つ以上の分子のライブラリーを提供する工程；
ｂ）Ｇタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する分子を提供する工程であって、該分子が支持体に結合される、工程；
ｃ）該２つ以上の分子のライブラリー由来の分子を、該支持体に結合されたＧタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する該分子に結合する工程；
ｄ）該支持体に結合された該分子から該結合した分子を分離する工程；および
ｅ）Ｇタンパク質共役レセプターに対する結合化合物として該結合した分子を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記２つ以上の分子のライブラリーが、直鎖ペプチド、環状ペプチド、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、ペプチド模倣化合物、および低分子化合物からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｇタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する前記分子が、部分的に精製されたＧタンパク質共役レセプターである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記２つ以上の分子の少なくとも１つが、レセプター、酵素、または他のタンパク質に結合し得るタンパク質を置換し得るペプチド、ペプチド模倣物、または低分子からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
実質的に塩化ナトリウムの非存在下で、Ｇタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する前記分子を溶解する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
低塩濃度を有する緩衝液を用いてＧタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する前記分子を溶解する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記２つ以上の分子の少なくとも１つが、Ｇタンパク質共役レセプター結合活性に対する拮抗効果を有する分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ライブラリーがファージライブラリーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記工程ａ、ｂ、ｃ、およびｄが前記工程ｅの前に少なくとも１回繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
Ｇタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する前記分子が、Ｇタンパク質共役レセプター分子および以下からなる群より選択されるタグを含む、請求項１に記載の方法：ＧＳＴ、ＦＬＡＧ、６×Ｈｉｓ、Ｃ−ＭＹＣ、ＭＢＰ、Ｖ５、Ｘｐｒｅｓｓ、ＣＢＰ、およびＨＡ。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法に従って同定されるＧタンパク質共役レセプターに対する結合化合物。
【請求項１２】
患者において疾患または障害を予防する方法であって、該方法は、生理学的キャリア中に請求項１１に記載の化合物を含む治療組成物を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１３】
前記疾患または障害が、ＨＩＶ感染である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記疾患または障害が、ＡＩＤＳである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
患者において疾患または障害を処置または予防する方法であって、該方法は、徐放性の注入可能な処方物中に請求項１１に記載の化合物を含む治療組成物を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１６】
前記疾患または障害が、ＨＩＶ感染である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記疾患または障害が、ＡＩＤＳである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
Ｇタンパク質共役レセプターに対する試験分子の相対的な結合親和性を同定するためのコンピュータに補助される方法であって、該方法は、以下：
ａ）Ｇタンパク質共役レセプターを特徴付ける入力データをコンピュータプログラムに入力する工程；
ｂ）その各々の配列は既知であるが、その結合親和性は未知である、少なくとも１つの試験ペプチド様分子を特徴付ける入力データを入力する工程；
ｃ）各試験ペプチド様分子に対する相対的な結合親和性の予測を生成するために、該コンピュータプログラムを用いて適用された各試験ペプチド様分子を分析し、そしてこのような予測を出力する工程；
を包含する、方法。
【請求項１９】
Ｇタンパク質共役レセプターに対する結合化合物の相互作用部位のアミノ酸配列モチーフを決定するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）Ｇタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する分子とペプチドライブラリーを、該Ｇタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する分子と該ペプチドライブラリーとの間の相互作用を可能にする条件下で、接触させる工程；
ｂ）該Ｇタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する分子が、該ペプチドライブラリーと相互作用し、その結果、該Ｇタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する分子と該Ｇタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する分子と相互作用し得るライブラリーのメンバーの亜集団との間で、複合体が形成される工程；
ｃ）該Ｇタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する分子と相互作用し得ないライブラリーのメンバーから、該Ｇタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する分子と相互作用し得るライブラリーのメンバーの該亜集団を分離する工程；
ｄ）該Ｇタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する分子と相互作用し得るライブラリーのメンバーの該亜集団を直鎖状にする工程；
ｅ）直鎖状にされたライブラリーのメンバーの混合物中での、各変性位置において異なるアミノ酸残基の相対的な豊富さを決定する工程；および
ｆ）該直鎖状にされたライブラリーのメンバーの混合物中での、各変性位置において異なるアミノ酸残基の該相対的な豊富さに基づき、該Ｇタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する分子の相互作用部位のアミノ酸配列モチーフを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法に従って同定された、Ｇタンパク質共役レセプターに対する結合化合物のアミノ酸配列モチーフ。
【請求項２１】
請求項１９に記載の方法により決定された、Ｇタンパク質共役レセプターに対するアミノ酸配列モチーフを有する結合化合物。
【請求項２２】
前記ペプチドライブラリーの少なくとも１つのメンバーが少なくとも１つの非天然のアミノ酸を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｇタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する分子が、直鎖ペプチド、環状ペプチド、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、ペプチド模倣化合物、および低分子化合物からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記ペプチドライブラリーが、直鎖ペプチド、環状ペプチド、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、ペプチド模倣化合物、および低分子化合物からなる群より選択される少なくとも１つの分子を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
Ｇタンパク質共役レセプターに対する結合化合物の相互作用部位のアミノ酸配列モチーフに基づくメンバーを含むライブラリーであって、該モチーフは、ペプチドライブラリー由来の少なくとも１つのペプチドのメンバーが該Ｇタンパク質共役レセプターに対する結合化合物と相互作用することを可能にし、そして該Ｇタンパク質共役レセプターに対する結合化合物と相互作用する少なくとも１つのペプチドのアミノ酸配列を決定することにより決定される、ライブラリー。
【請求項２６】
Ｇタンパク質共役レセプターの結合特性に対応する化合物を可溶化および固定化する方法であって、Ｇタンパク質共役レセプターの結合に対応する化合物を決定する場合に、該可溶化および固定化が、実質的に塩化ナトリウムの非存在下で実施される、方法。
【請求項２７】
Ｇタンパク質共役レセプターの結合特性に対応する化合物を可溶化および固定化する方法であって、Ｇタンパク質共役レセプターの結合に対応する化合物を決定する場合に、該可溶化および固定化が、低塩濃度を用いることにより実施される、方法。
【請求項２８】
前記低塩濃度が、予め決定された量のマグネシウムおよびカルシウムを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
構築されたＧタンパク質共役レセプター転移ベクターであって、該転移ベクターがＧタンパク質共役レセプター分子および以下からなる群より選択されるタグを含む、ベクター：ＧＳＴ、ＦＬＡＧ、６×Ｈｉｓ、Ｃ−ＭＹＣ、ＭＢＰ、Ｖ５、Ｘｐｒｅｓｓ、ＣＢＰ、およびＨＡ。
【請求項３０】
薬物スクリーニングアッセイにおいてＧタンパク質共役レセプターの三次元構造を使用する方法であって、該方法は、以下：
ａ）該三次元構造を用いて合理的な薬物設計を実施することにより潜在的な薬物を選択する工程であって、ここで、該選択工程がコンピュータモデリングと組合されて実施される、工程；
ｂ）第１のＧタンパク質共役レセプターを含む第１の分子と該潜在的な薬物とを接触させる工程；および
ｃ）該潜在的な薬物と該第１の分子との結合を検出する工程；
を包含し、ここで、潜在的な薬物は、該潜在的な薬物が該第１の分子に結合する場合に薬物として選択される、方法。
【請求項３１】
前記第１の分子が標識される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１の分子が固体支持体に結合される、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国特許出願第６０／１９０，９４６号、同第６０／１９０，９９６号および同第６０／１９１，２９９号の利益を主張し、これらの各々の開示は、参考として本明細書に援用される。代理人書類番号ＣＮＳ−００５およびＣＮＳ−００７により識別される２００１年３月２０日に出願された出願への参照もまた行われ、これらの各々の開示は、本明細書に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、Ｇタンパク質共役レセプター（「ＧＰＣＲ」）に関し、そしてより詳細には、Ｇタンパク質共役レセプターに結合する化合物に関する。本発明の方法は、Ｇタンパク質共役レセプターに結合する治療化合物を同定および調製することによって、疾患の処置に有用である
（発明の背景）
レセプターは、一般に、抗原、ホルモンまたは神経伝達物質のような細胞外因子と弱い可逆的結合を形成する、細胞膜中または細胞内に位置する分子構造である。各レセプターは、特異的因子と結合するために設計されている。レセプターの特定のファミリーに、７回膜貫通（「７ＴＭ」）、Ｇタンパク質共役レセプター（「ＧＰＣＲ」）がある。これらのレセプターは、これらレセプターが結合した細胞外因子からシグナルを伝えるために、グアニンヌクレオチド結合性タンパク質（「Ｇタンパク質」）と連結する。このＧタンパク質は、グアニンジホスフェート（「ＧＤＰ」）と結合するとき、Ｇタンパク質は不活性であるか、または「オフ・ポジション」にある。同様に、このＧタンパク質がグアニントリホスフェート（「ＧＴＰ」）と結合するとき、Ｇタンパク質は活性であるか、または「オン・ポジション」にあり、それによって細胞内の生物学的応答の活性化が媒介される。
【０００３】
一般に、身体中のほとんどすべての細胞の活性は、細胞外シグナルにより調節されている。ヒト中および広範な範囲の生物との多くの生理学的事象は、ＧＰＣＲを経由する、タンパク質媒介膜貫通シグナル伝達を用いる。特定のＧＰＣＲからのシグナルは、細胞中のＧタンパク質の活性化を引き起こす。シグナルの大部分は、ＧＰＣＲにより細胞内部に伝達される。シグナルの伝達は、リガンド結合および連結Ｇタンパク質の活性化により達成される。このシグナル伝達プロセスには多くの局面が存在し、これには、ＧＰＣＲの複数のレセプターサブタイプおよびそれらのＧタンパク質連結相当物、ならびに種々の連結細胞内メッセンジャーが含まれる。このシグナル伝達は、関与するタンパク質に依存して、細胞内プロセス（単数または複数）の全体的活性化もしくは部分的活性化または不活性化を生じ得る。ＧＰＣＲに結合する重要なシグナル伝達分子または神経伝達物質は、例えば、モルヒネ、ドパミン、ヒスタミン、５−ヒドロキシトリプタミン、およびアデノシンを含む。
【０００４】
ＧＰＣＲは、タンパク質のスーパーファミリーを構成する。現在、２０００を超えるＧＰＣＲが文献で報告され、これらは、３つのファミリーに分類される：ロドプシン様ファミリー、代謝調節型グルタミン酸ファミリー、およびカルシトニンレセプターである。例えば、Ｊｉ　ＴＨら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（２８）：１７２９９−３０２（１９９８）を参照のこと。報告されたＧＰＣＲは、特徴付けられたレセプター、およびリガンドが同定されていないオーファンレセプターの両方を含む。例えば、Ｗｉｌｓｏｎ　Ｓら、Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｈａｇａ　Ｔ、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ　Ｇ編　ＣＲＣ　ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、９７−１１６頁（１９９９）：Ｗｉｌｓｏｎ　Ｓら、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２５（７）：１３８７−９２（１９９８）；およびＭａｒｃｈｅｓｅ　Ａら、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２０（９）：３７０−３７５（１９９９）を参照のこと。ＧＰＣＲの数の多さにもかかわらず、一般に、各ＧＰＣＲは、類似の分子構造を共有している。各ＧＰＣＲは、種々の長さのアミノ酸残基のストリングを含む。ＧＰＣＲは、トランスメンブレンと呼ばれる７つの別のコイルにある細胞膜内にある。ＧＰＣＲのアミノ末端は、細胞外ループを有して細胞の外側にあり、その一方、カルボキシル末端は、細胞内ループを有して細胞の内側にある。
【０００５】
一般に、三次構造の類似性もまた同様にＧタンパク質によって共有されている。代表的には、Ｇタンパク質はまた、ヘテロトリマーＧタンパク質とも呼ばれ、３つのサブユニット、α、βおよびγからなる。代表的なＧタンパク質では、このαサブユニットは、ＧＴＰａｓｅドメインおよびαヘリックスドメインの２つのドメインを含む。このＧＴＰａｓｅドメインは、βシートを取り囲むヘリックスを含む。αヘリックスドメインは、Ｇタンパク質に特有であり、そして５つのより短いヘリックスにより取り囲まれた長い中央ヘリックスを含む。βおよびγサブユニットは、しばしば、β−γダイマーと呼ばれる。このβサブユニットは、プロペラ上にブレードのように配置されたシート、αヘリックスおよびこのヘリックスを「プロペラブレード」と連結するループを含む、「βプロペラ」タンパク質である。その一方、γサブユニットは、一般に、内因性の三次構造をもたず；それに代わって、構造的支持は、βサブユニットに依存すると考えられている。βサブユニットとの相互作用は、一部、個々のサブユニットのＮ末端ヘリックス間のコイルドコイル相互作用によって媒介されると考えられている。
【０００６】
ＧＰＣＲに対するリガンドは、低分子ならびにペプチドおよび小タンパク質を含む。これらのリガンドとそれらのレセプターとの間の相互作用は、システムによって変動するが、それらはすべて、４つの細胞外ドメインおよびＮ末端のいくつかにある残基との相互作用を必要とし得る。既知のリガンドをもつＧＰＣＲは、多発性硬化症、糖尿病、慢性関節リウマチ、喘息、アレルギー、炎症性大腸炎、いくつかの癌、甲状腺疾患，心臓病、網膜色素変性症、肥満、神経学的障害、骨粗鬆症、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染および後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）に関連している。例えば、Ｍｕｒｐｈｙ　ＰＨら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｖ．５２（１）：１４５−１７６（２０００）；Ｍａｎｎｓｔａｄｔ　Ｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７７（５）：Ｆ６６５−７５（１９９９）；Ｂｅｒｇｅｒ　ＥＡら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：６５７−７００（１９９９）；Ｓａｕｎｄｅｒｓ　Ｊら、Ｄｒｕｇ　Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ４（２）：８０−９２（１９９９）；Ｈｅｂｅｒｔ　ＴＥら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７６（１）：１−１１（１９９８）；Ｊａｃｏｂｓｏｎ　ＥＤら、Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．１５（４−５）：２０７−４２（１９９７）；Ｍｅｊｉ　ＪＴ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５７（１−２）：３１−８（１９９６）；およびＣｈａｎｍｅｒｓ　Ｊら、Ｎａｔｕｒｅ　４００：２６１−４（１９９９）を参照のこと。一般に、Ｇタンパク質共役レセプターは、結合するリガンドのタイプに基づき、異なるクラス：ペプチド、生体アミン、ヌクレオチド関連、脂質ベース、アミノ酸ベース、および網膜（すなわち光ベース）、にさらに分類され得る。特に重要なのは、例えば、ＣＣケモカインレセプター５およびＣＸＣケモカインレセプター４のようなペプチド基質を結合するレセプターのクラスであって、これは、最大の規定されたクラスである。
【０００７】
ＧＰＣＲは、シグナル伝達のためのレセプターとして供されることが示されているが、研究者が、ＧＰＣＲの高解像度Ｘ線結晶学的構造を得ることは困難であった。なぜなら、ネイティブな立体配座のために脂質との複雑な相互作用を必要とする７ＴＭタンパク質を結晶化することの困難性のためである。脂質との相互作用の必要性はまた、ＧＰＣＲの生物学的に活性な形態の調製を困難にする。なぜなら、これらの脂質の不在下では、これらは、可溶化の間に生物学的活性な立体配座を保持するために多大な注意を払わなければ、特異的にリガンドを結合する能力が最小であるかもしくはその能力のない、変性された凝集物を容易に形成するからである。Ｘ線構造の非存在下で、リガンド結合に関与するＧＰＣＲの領域を規定するために、種々のアプローチが用いられている。これらのアプローチは、一般に、ＧＰＣＲの活性のための構造的要求を研究するために、非ヒトホモログ、キメラレセプター、および点変異体との結果を比較することを含む。
【０００８】
例えば、ＣＣケモカインレセプター５（「ＣＣＲ５」）およびＣＸＣケモカインレセプター４（「ＣＸＣＲ４」）のような、ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳに関連する特異的ＧＰＣＲは、ＨＩＶのコレセプターとして供され、その結果、それらは、ＨＩＶと相互作用し、細胞中へのウイルスの侵入を容易にする。従って、研究は、細胞中へのウイルスの侵入を阻害する治療的薬剤として作用する、天然リガンドを同定することを求めている。その他のＧＰＣＲに関し、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４は、可溶化および精製することが非常に困難である。なぜなら、それらは、通常、折り畳まれ、かつ細胞膜のネイティブな脂質の存在下で維持される必要があるからである。
【０００９】
従って、当該分野では、ＧＰＣＲ結合性化合物を同定する方法、および、例えば、ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳのような疾患および障害を防止または処置するためのＧＰＣＲ結合性治療剤の同定に対する必要性がある。このような治療剤は、ＧＰＣＲへの天然リガンドの結合を阻害し得る、ペプチド、ペプチド模倣物、または低分子を含み得る。このような方法および組成物は本明細書中に提供される。
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、ＧＰＣＲに結合する化合物、およびこれらの結合性化合物を同定する方法を提供する。１つの実施形態では、ＧＰＣＲに結合するモチーフおよびＧＰＣＲに結合し得るリガンドを提供するためのスクリーニング方法が提供される。別の実施形態では、本発明は、例えば、ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳのような疾患または障害の予防または処置における使用に適切な、治療ペプチド、ペプチド模倣物、または低分子の設計および同定を含む。
【００１１】
１つの実施形態では、本発明の方法は、ＧＰＣＲに結合するモチーフのスクリーニングおよび同定、ならびにその潜在的なリガンドのスクリーニングに有用な、線状および環状ペプチドライブラリーの合成および精製を提供する。本発明の方法は、このようなライブラリーにおける使用のための線状または環状ペプチド中への非天然アミノ酸およびＤ立体配座のアミノ酸の取り込みを提供する。このようなアミノ酸を有するペプチドを含むライブラリーは、増大した結合親和性およびタンパク質分解に対する抵抗性から生じるインビボの作用の持続時間を示す。
【００１２】
好ましい実施形態では、本発明は、リードリガンド同定工程のために、ペプチド（線状および環状、天然および非天然アミノ酸）、ペプチド模倣物、および低分子化合物の高度に多様なライブラリーの使用を提供する。このようなリガンドは、ＧＰＣＲ結合活性に対し、直接的または間接的にアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。
【００１３】
好ましい実施形態では、本発明は、予備的なモチーフ情報の同定のためのファージディスプレイ方法の使用、次いで、本発明の精製されたレセプター調製物および高度に多様なライブラリーを用いるアフィニティー精製の付加的なラウンドを提供する。特に好ましい実施形態では、ファージディスプレイ技術は、環状ペプチドおよび／またはペプチド模倣物ライブラリーの使用と組み合わせられる。
【００１４】
本発明の別の実施形態では、コンピューター支援設計技術を用い、ＧＰＣＲ活性に対するアゴニストまたはアンタゴニスト能力について、リード化合物を、実質的にスクリーニングし、同定し、設計し、または評価する。このような技術は、ＧＰＣＲおよび潜在的な結合パートナーの両方の分子情報および構造情報に基づき、このタンパク質を結合パートナーと実際に整列することによって、コンピューターで生成した三次元イメージを用いる。コンピュータ支援スクリーニングのために設計されたライブラリーの場合では、リードの最適化のために必要な大量の情報は、ライブラリー設計から直接得られる。１つの実施形態では、潜在的なリードは、実際のライブラリーの予備スクリーニングまたは特定のその他の手段により同定される。本発明の１つの実施形態は、構造を基礎にした合理的薬物設計による生物学的に適切や薬物のスクリーニングを含む。このような場合では、タンパク質（または類似のファミリーメンバー）、ペプチドまたは分子の三次元構造が決定され、そして潜在的なアゴニストおよび／またはアンタゴニストが、コンピューターモデリングで支援されて設計される。本発明の好ましい実施形態では、適切な薬物が同定された後、この薬物をＧＰＣＲと接触させ、それによって、結合複合体が、可能な薬物とＧＰＣＲとの間で形成される。薬物をＧＰＣＲに接触させる方法は、一般に、薬物開発の技術分野の当業者により理解される。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、部分的に精製されたＧＰＣＲの、治療的に有用な化合物の同定において密に結合するリガンドの選択、同定、および改良を実施するための因子としての使用を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、修飾されたＧＰＣＲを生成するための標識方法の使用を含み、このタンパク質は、スクリーニング方法に関与する精製工程および同定工程を容易にするように機能する。別の実施形態において、本発明は、ベクター中に操作された適切な特異的プロテアーゼ部位を有する標識配列（すなわち、ＧＳＴ、ＦＬＡＧ、６×Ｈｉｓ、２重標識されたＦＬＡＧ−ＧＳＴ、Ｃ−ＭＹＣ、ＭＢＰ、Ｖ５、Ｘｐｒｅｓｓ、ＣＢＰ、ＨＡ）に融合されたＧＰＣＲに対応する核酸配列を含む。
【００１６】
特に好ましい実施形態において、本発明の方法は、ＧＰＣＲの可溶化および固定化を提供し、本明細書において提供されるリガンド選択方法を容易にする。ＧＰＣＲは、任意の供給源（不活性な沈殿したタンパク質調製物；細胞膜調製物；および細胞全体の調製物が挙げられるが限定されない）に由来し得る。１つの実施形態において、本発明は、バキュロウイルス発現系または任意の他の適切な発現系由来の膜を用いて、一般的な親和性判定について、コンビナトリアルライブラリーを直接スクリーニングする方法を提供する。本発明の１つの実施形態において、部分的に精製されたＧＰＣＲは、密な結合リガンドの選択、同定、および改良の実施に用いられる。好ましい実施形態において、部分的に精製された標識化ＧＰＣＲは、隔離された形態で使用され、多様化したライブラリー（集中または高度な多様化）を密に結合するリガンドのアフィニティー精製のためにスクリーニングされる。本発明の好ましい実施形態において、適切なリガンドの可溶化および固定化についての条件は、低塩（例えば、低マグネシウム濃度または低カルシウム濃度）；および塩化ナトリウムなし（「ＮａＣｌ」）（０．０ｎＭ　ＮａＣｌ）での使用を提供する。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、Ｎ末端が特異的にブロックされたペプチドまたは配列決定し得ない他のアナログを有する固定されたタンパク質から、ライブラリーの結合成分を溶出する工程を包含する。なお別の実施形態において、本発明は、コンビナトリアルライブラリーを樹脂固定化タンパク質に結合する工程を包含する。別の実施形態において、本発明は、標識化配列を有する精製ポリペプチドを含み、このポリペプチドは、アッセイのために適切な親和性樹脂上に固定化され得る。さらなる実施形態は、Ｎ末端が特異的にブロックされたペプチドまたは配列決定し得ない他のアナログを用いてその結合ライブラリーを有する標識化されたタンパク質を放出または溶出する工程を包含する。なお別の実施形態において、本発明の方法は、親和性樹脂上に固定化された後およびコンビナトリアルライブラリーが複合体を放出するために結合された後、目的のタンパク質から標識を、（タンパク質／ベクター内で設計されるような）特異的なプロテアーゼを用いて、切断する工程を包含する。
【００１８】
なお別の実施形態において、標的リガンドは、直鎖状ペプチドのライブラリー、ペプチド模倣物のライブラリー、環状ペプチドのライブラリー、またはファージディスプレイ技術によって同定された最初のモチーフを用いて開発された重点ライブラリー（ｆｏｃｕｓｅｄ　ｌｉｂｒａｒｙ）あるいは上記のいずれかを組合わせたライブラリーから選択される。別の実施形態において、標的リガンドは、ペプチドもしくは他のリガンドを用いてか、またはｐＨ変化もしくはカオトロピックな因子（例えば、尿素または塩酸グアニジン）（これらは、水の水素結合構造および疎水性の影響を減少することによって濃縮された溶液中のタンパク質を変性し得る）を用いることによって、レセプター調製物から溶出される。本明細書中に開示される方法を用いて同定されたＧＰＣＲに対するリガンドがまた、本発明によって意図される。本発明のなお別の実施形態において、タンパク質配列決定技術が、アフィニティー精製工程によって同定されるリガンドの構造決定のために使用される。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、例えば、疾患または障害（例えば、ＨＩＶ感染またはＡＩＤＳのような）の処置に適切な、本発明の方法を用いて同定されたＧＰＣＲ結合の低分子アンタゴニストのような治療剤を含む。別の実施形態において、疾患または障害に罹患する患者は、本発明の方法（例えば、ＧＰＣＲの低分子アンタゴニスト結合のような）を使用して同定された化合物を含む治療剤で処置される。別の実施形態において、疾患または障害に罹患する患者（例えば、ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳのような）は、治療剤（例えば、ＧＰＣＲインヒビターおよび逆転写酵素ならびにプロテアーゼインヒビターを含む）の併用した使用を通して処置される。
【００２０】
本発明の特定の好ましい実施形態の詳細な説明が、以下に提供される。本発明の他の実施形態が、続く詳細な説明を再考に基づいて明らかである。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
一般的に、本発明の方法は、ＧＰＣＲの結合モチーフの決定を提供する。さらに、本発明の方法は、ＧＰＣＲとその天然のリガンドとの相互作用の、アゴニストまたはアンタゴニストの同定を提供し、それによって、治療リード化合物の同定を提供する。本発明において特に有用である、ライブラリー設計のための方法およびライブラリー合成のための方法、ならびにライブラリーのスクリーニングのための方法が、以下の特許および特許出願に記載され、これらの各々の開示は、本明細書中に参考として援用される：Ｃａｎｔｌｅｙら、米国特許第５，５３２，１６７号；Ｃａｎｔｌｅｙら、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／３６９，６４３（１９９８年１２月１７日出願）；Ｃａｎｔｌｅｙら、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／４３８，６７３（１９９９年１１月１２日出願）；Ｈｕｎｇ−Ｓｅｎら、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／０８６，３７１（１９９８年５月２８日出願）；Ｈｕｎｇ−Ｓｅｎら、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／８６４，３９２（１９９９年６月２４日出願）；ならびにＬａｉら、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／３８７，５９０（１９９９年８月３１日出願）。
【００２２】
本発明の方法に従って、ＧＰＣＲは、クローン化され、そして発現され、そして活性について試験される。ＧＰＣＲは、ＧＰＣＲのリガンド結合特性の特徴の決定を容易にするために、Ｃ末端上またはＮ末端上に標識され得る。例示的な標識としては、６×Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ＧＳＴ、Ｖ５、Ｘｐｒｅｓｓ、ｃ−ｍｙｃ、ＨＡ、ＣＢＤ、およびＭＢＰが挙げられるが、これらに限定されない。標識されたＧＰＣＲは、例えば、天然および／もしくは非天然の、アミノ酸、ペプチド模倣物および／もしくは低分子を有する、直鎖状ペプチドならびに／または環状ペプチドを含むライブラリーのスクリーニングにおいて使用される。このようなペプチド模倣物および低分子は、任意の天然または合成の、化合物、組成物、化学物質、タンパク質、またはＧＰＣＲの結合化合物に関するスクリーニングに使用される上記のいずれかの任意の組み合わせもしくはＧＰＣＲの結合化合物に関するスクリーニングに使用される上記のいずれかの任意の改変を含み得る。
【００２３】
１つの局面において、本発明の方法において有用な配向された変性ペプチドライブラリー方法は、リガンド結合について重要であることが知られているかもしくは疑われる非変性位置中の１つ以上のアミノ酸、ならびに、例えば変性位置におけるおおよそ等しい割合の１８アミノ酸からなる可溶性ペプチドライブラリーを使用する。システインおよびトリプトファンは、配列決定に対する特定の分析的な困難性を回避するために削除され得る。このようなライブラリーは、図１に示され、ここで、Ｘは、任意の１８アミノ酸からなる変性位置を表し、そしてリジンもしくはアルギニンは、非変性位置に固定されている。さらなる残基が、図１に示される配列のＮ末端に付加され得る。なぜなら、最初および第２の配列決定サイクルにおいて妨害物質がしばしば存在するからである。さらなる残基が、Ｃ末端に付加され得、シーケンサーカートリッジ中のフィルターへこのポリペプチドを良好に固着するためのアミノ酸を提供する。
【００２４】
本発明の別の局面は、続く同定工程のために、ペプチド（直鎖状アミノ酸および環状アミノ酸、天然アミノ酸および非天然アミノ酸）、ペプチド模倣物、ならびに低分子化合物の非常に多様なライブラリーの使用を提供する。例えば、これらのリガンドは、レセプターに対するこの機能において、反発的であるかまたは拮抗的であり得る。一般に、本発明は、治療的に有用な化合物の経路として密接に結合したリガンドの選択、同定、および改良を実行するための因子として、部分的に精製されたＧＰＣＲを使用する。さらに、本発明は、本明細書中で提供される効率的なリガンド選択方法を容易にする、可溶化手順および固定化手順の開発ならびに使用を提供する。詳細には、特定のＧＰＣＲの効率的なリガンド選択についての最適な条件は、低塩（例えば、マグネシウムもしくはカルシウム濃度が低いかまたは存在せず、そしてＮａＣｌ濃度が存在しない使用を包含する。例えば、不活性な沈殿タンパク質、細胞膜調製物および全細胞調製物を使用するリガンド選択方法が、さらに本明細書中に提供される。
【００２５】
本発明の１つの局面において、スクリーニング工程は、ファージディスプレイ技術を包含し得る。このようなファージディスプレイシステムは、選択された標的分子に結合するペプチドライブラリーをスクリーニングするため、および所望の特性についてこれらのタンパク質をスクリーニングするための可能性を有する機能的タンパク質を提示するために、使用されてきた。このディスプレイアプローチのより最近の改良は、バクテリオファージ表面上に酵素ならびに抗体フラグメントを発現することを可能にし、従って、特定のリガンドで選択することによって特定の特性の選択を可能にする。例えば、Ｓｍｉｔｈ　ＳＦら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍ．２１７：２２８〜２５７（１９９３）を参照のこと。ファージディスプレイ方法は、予備モチーフの情報の同定のために使用され、そして続いて、本発明の精製されたレセプター調製物および非常に多様なライブラリー（特に、環状ペプチドおよびペプチド模倣物ライブラリー）を用いるさらなる回数の親和性精製のために使用され得る。このファージディスプレイ方法は、天然のアミノ酸のモチーフを同定することを可能にする。ファージディスプレイに由来する情報は、例えば、増強された薬学的特性を有するリガンドを選択するために、新規なアミノ酸アナログまたは環状ペプチドを含む合成ライブラリーを使用する親和性精製方法中に取り入れられ得る。初期ライブラリー、二次ライブラリーおよび三次ライブラリーの使用は、結合部位の特異性の定義をより完全にする。初期ライブラリーからの情報を組み込む二次ライブラリーが、配列決定され得る。初期ライブラリーにおいて、いくつかの変性位置が、特定のアミノ酸について高い性能をもたらし得、そしてこれらは、第２のライブラリーにおいて好ましいアミノ酸からなる非変性位置になり得る。例えば、Ｗｕ　Ｒ、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２７１（２７）：１５９３４〜４１（１９９６）を参照のこと。
【００２６】
あるいは、またはさらに、コンピューター補助設計技術が、ペプチド、ペプチド模倣物および低分子のスクリーニングならびに／または設計において使用され得る。例えば、ＧＰＣＲ配列、膜貫通予測、および変異誘発研究から得られた任意の構造情報に加えて、ロドプシンの結晶構造（例えば、Ｐａｌｃｚｅｗｓｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８９（５４８０）：７３９〜７４５（２０００）を参照のこと）のような情報と共に、コンピューター補助設計技術は、実質的に、そのＧＰＣＲ活性に関して潜在的な化合物をスクリーニング、同定、設計および検査し得る。適切なペプチド、ペプチド模倣物および低分子の設計において補助するために使用され得るコンピュータープログラムとしては、例えば、Ｄｏｃｋ、ＦｒｏｄｏおよびＩｎｓｉｇｈｔが挙げられる。生物学的に適切な薬物のスクリーニングについての方法の例は、合理的な薬物設計に基づく構造に依存する。このような場合、このタンパク質、ペプチドまたは分子の三次元構造は、決定されるかまたはモデリングされ、そして可能性のあるアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、コンピューターモデリングを用いて設計される。例えば、Ｂｕｔｔら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ，１２月号　９２〜９８（１９９３）；Ｗｅｓｔら、ＴＩＰＳ，１６：６７〜７４（１９９５）；Ｄｕｎｂｒａｃｋら、Ｆｏｌｄｉｎｇ＆Ｄｅｓｉｇｎ，２：２７〜４２（１９９７）を参照のこと。適切な薬物が同定された後、この薬物はＧＰＣＲと接触し、ここで、結合複合体は、可能性のある薬物とＧＰＣＲとの間で形成される。ＧＰＣＲへの薬物の接触方法は、薬物開発分野の当業者によって一般に理解される。
【００２７】
スクリーニング工程は、液相において実行されても良いし、またはアフィニティカラム上で固定されているＧＰＣＲを用いて実行されても良い。親和性樹脂を使用する標識化ＧＰＣＲの固定化に加えて、配列決定の他の形態は、ライブラリーからの選択リガンドの親和性精製を実行するために使用され得る。これらの形態としては、以下の例が挙げられるがこれらに限定されない。このレセプターおよび結合ライブラリー成分は、平衡透析を使用して、非結合ライブラリー成分から分離され得る。この標識化レセプターは、特定の親和性膜に結合され得、これはプレートの形態であるか、または別々である。次いで、このライブラリーは、この膜と共にインキュベートされ得、そして容易に洗浄して、非特異的結合成分を除去し得る。サイズ排除方法論が、ライブラリーとのレセプターのプレインキューベーションの後に、非結合成分から精製レセプター結合ライブラリー複合体を分離するために使用され得る。さらに、レセプターを含むミセル複合体（これは、脂質ならびに界面活性剤を取り込んでも良いし、取り込まなくても良い）は、選択親和性成分の結合後に、差次的遠心分離によってライブラリーから分離され得る。一般に、高親和性リガンドは、低ｐＨまたは高塩濃度を使用して放出され得、そして本明細書中に記載される配列決定によって構造が同定される。
【００２８】
標的レセプターに対する最も高い親和性を有するこれらのリガンドを決定する目的で、一般に、２００よりも多くのペプチドライブラリーが、それぞれのライブラリーのそれぞれの阻害結合を決定するためにスクリーニングされ得る。一般に、１００μＭで、１０％より高い阻害は、親和性精製を介する配列の連続する評価のために有意であった。本発明のさらなる局面において、一旦、好ましいアミノ酸残基が、高い優先値（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｖａｌｕｅ）に起因してライブラリーの変性位置でＧＰＣＲによって同定されると、特定のペプチドは、ライブラリー合成のために使用されるのと同じ方法によって合成される。本発明の１つの実施例において、高優先値は、１よりも大きい。この値は、サンプルの値からコントロールの値を引き、そして参照値で割ることによって決定される。本発明の好ましい実施形態において、この優先値は、１．２よりも大きい。本発明のより好ましい実施形態において、この優先値は、２よりも大きい。同定されたペプチド配列の合成の後、このペプチドは、例えば高速液体クロマトグラフィ（「ＨＰＬＣ」）によって精製され、そして組成は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ」）およびＥｄｍａｎ配列決定によって確認される。一般に、相対的親和性は、レセプター精製において使用される放射標識結合アッセイを改変することによって測定され得る。
【００２９】
親和性精製ペプチドから得られたモチーフの特異性を増強するために、他の方法が使用され得る。このライブラリーの結合成分は、特定のＮ末端ブロックペプチドまたは他の配列決定不可能なアナログを用いて固定化されたタンパク質から溶出され得る。ライブラリーの結合の後に親和性樹脂からの微量の汚染物の放出を避けるために、その結合ライブラリーで標識したＧＰＣＲの放出／溶出は、特定のＮ末端ブロックペプチドまたは他の配列決定不可能なアナログを使用して、達成され得る。これは、アセチル化ＦＬＡＧペプチドを使用して行なわれ、樹脂からＧＰＣＲ−ＦＬＡＧレセプターを溶出し得る。あるいは、このＧＰＣＲ由来の標識は、親和性樹脂上に固定化した後に、そしてコンビナトリアルライブラリーが複合体から放出される後に、特異的プロテアーゼ（タンパク質／ベクター中に設計されるような；エンテロキナーゼまたはトロンビンのいずれか）を使用して切断され得る。最後に、ライブラリーは、単一アッセイかまたはアレイアッセイにおいて、（有意に少ないタンパク質を使用して）レセプターに結合するライブラリーの能力について、例えば、Ｓｆ９細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）もしくはＨｉｇｈ　Ｆｉｖｅ細胞（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ）（両方共Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手し得る）由来のＧＰＣＲ−含有膜を使用する結合アッセイによってプレスクリーニングされ得る。このスクリーニングは、ＧＰＣＲならびに多くの直鎖状および環状ライブラリーを使用して、結合についての天然のリガンドを阻害する際の、これらのライブラリーの有効性を決定するために実行され得る。
【００３０】
さらに、ＧＰＣＲに加え、他のレセプターおよび可溶性タンパク質は、本方法を用いて、スクリーニングされて、治療的用途のアゴニストまたはアンタゴニストを生成し得る。本スクリーニング方法論に従うタンパク質の型の例は、１回膜貫通型タンパク質、ＰＩＧテールレセプター、プロゲステロンレセプター、アレスチン、核レセプター、サイトカインレセプター、および本質的には、任意のタンパク質結合タンパク質、または任意のペプチド結合タンパク質を含むが、これに限定されない。ＩＬ−１２は、サイトカインレセプターの１つの型であり、これは、本発明の方法において、Ｉ型糖尿病のような疾患の処置のための治療的化合物を同定するのに有用である。例えば、Ｆａｌｃｏｎｅ　Ｍら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：６７０〜６７６（１９９９）を参照のこと。ＰＩＧテールレセプターは、カテプシンＤ（２５）およびナチュラルキラー細胞レセプター（例えば、ＣＤ４８およびＣＤ５５）（２６）を含む。例えば、Ｏｇｉｅｒ−Ｄｅｎｉｓ　Ｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２１１（３）：９３５〜４２（１９９５）；およびＳｃｕｂｅｒｔ　Ｊら、Ｂｌｏｏｄ　７６（６）：１１８１〜７（１９９０）を参照のこと。プロゲステロンレセプターは、生物学な関連を有する周知の核レセプターである。例えば、Ｃｈａｕｃｈｅｒｅａｕ　Ａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（１２）：８５４０〜８５４８（２０００）；Ｆｅｗｉｎｇｓ　ＰＥら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．９２（３）：４０１〜４０５（２０００）を参照のこと。アレスチンは、可溶性タンパク質結合タンパク質のファミリーであって、これは、シグナル終末における役割によって、広範な疾患に関与する。例えば、Ｗｉｌｓｏｎ　ＣＪら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．３（１０）：６８３〜６（１９９３）を参照のこと。これらは、本様式に容易に適用され得るタンパク質のわずかな例である。
【００３１】
本発明の方法はさらに、ＨＩＶ感染あるいはＡＩＤＳのような疾患または障害を有する患者の処置のために適切なＧＰＣＲ活性に対して拮抗的である、ペプチド、ペプチド模倣物、および／または低分子を含む治療剤の設計を包含する。ＧＰＣＲについての結合化合物ならびに最適な合成の同定およびそれらの精製は、多くの疾患または障害（例えば、ＡＩＤＳおよびＨＩＶ感染など）の有効な処置を提供する。一般に、本発明の小さいペプチドリガンド結合化合物（環状ペプチドリガンドおよび直鎖状ペプチドリガンドの両方）は、増大した結合親和性および作用を有し、そしてタンパク質溶解に耐性であることを示す。例えば、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、性腺刺激ホルモン放出ホルモンレセプター（「ＧｎＲＨＲ」）、および特定の環状ペプチドについてのライブラリー由来のペプチドは、標的タンパク質に対する増大した結合活性を示すことが、確認されている。
【００３２】
本発明の特定の実施形態は、以下の実施例において記載され、これらは限定を意味するものではない。
【００３３】
（実施例）
（実施例１：標識化ＧＰＣＲの調製および配向された直鎖状ペプチドライブラリーを使用するスクリーニング）
種々のＧＰＣＲベクターを、レセプターの精製をより容易にする当業者に公知な標準的技術を使用して、エピトープ標識を含むバキュロウイルス発現系のために調製し得る。標識は、タンパク質のＮ末端またはＣ末端で組み込まれ得る。ＧＰＣＲについて、このレセプターのＣ末端の標識は、組み込まれて、レセプターのリガンド結合特性（これはこの分子のＮ末端または細胞外領域にある）の特徴を決定する。Ｃ末端　６×Ｈｉｓタグ構築物およびＣ末端ＦＬＡＧ構築物の構築は、実施例として以下で提供される。代替の標識としては、例えば、ＧＳＴ、Ｖ５、Ｘｐｒｅｓｓ、ｃ−ｍｙｃ、ＨＡ、ＣＢＤおよびＭＢＰが挙げられ得る。これらの構築物を、当業者に公知の標準的な技術を使用して、類似の手順によって作製した。
【００３４】
この６×Ｈｉｓタグは、ニッケルキレート化を使用して、一段階精製を可能にする。ＧＰＣＲのためのｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）ならびに所望の遺伝子の３’末端および５’末端についてのプライマー、ならびにこの遺伝子の中央を使用して、適切なｃＤＮＡライブラリーから単離し得る。Ｃ末端標識を作製するために、目的の遺伝子をＥ．ｃｏｌｉベクター（ｐＥＴ３０ａ）に、Ｃ末端６×Ｈｉｓタグを用いてサブクローニングした。次いで、この新規に作製されたレセプターを切除し、そしてｐＢｌｕｅＢａｃ（バキュロウイルス転移ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））に連結した。この構築物を、制限消化および配列決定の両方を使用して分析し、次いで、タンパク質発現分野の当業者によって代表的に行なわれるように、発現のためにＳｆ９昆虫細胞（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にトランスフェクトした。
【００３５】
Ｃ末端細菌ＦＬＡＧ構築物を、Ｓｉｇｍａから入手し得る（ｐＦＬＡＧ−ＣＴＣ）。標準的な技術を使用する同様のストラテジーを、このベクターの構築に使用した。このＧＰＣＲをｐＦＬＡＧ−ＣＴＣプラスミドを用いて連結し、次いでＣ末端ＦＬＡＧ標識中にサブクローニングし、そして消化したｐＢｌｕｅＢａｃベクター中に連結した。この構築物を、制限消化および配列決定の両方を使用して分析し、そして発現のためにＳｆ９昆虫細胞またはＨｉｇｈ　Ｆｉｖｅ昆虫細胞中にトランスフェクトした。
【００３６】
Ｓｆ９細胞またはＨｉｇｈ　Ｆｉｖｅ細胞においてＧＰＣＲ遺伝子を発現するために、ＧＰＣＲ挿入物を含むｐＢｌｕｅＢａｃベクターを、Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ　ＤＮＡと共に、カチオン性リポソーム媒介トランスフェクションを用いて標準的な技術を使用して同時トランスフェクトした。ＧＰＣＲを、相同組替えによってバキュロウイルスゲノム中に挿入した。細胞を、トランスフェクション後２４時間から４〜５日までモニターした。約７２時間後、このトランスフェクション上清を、標準的なプラークアッセイを使用して、組替えプラークについてアッセイした。組替えウイルスを有する細胞は、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトシド）の存在下で増殖させた場合、青いプラークを生成した。これらのプラークを精製し、そしてこの単離物を、標準的技術を使用する組替えの正確さについて、ＰＣＲによって確認した。これにより、高力価ストックを生成し、そして発現研究のために、感染をこのストックから標準的技術を使用して実行した。トランスフェクトについてのコントロールとしては、細胞のみおよび転移ベクターが挙げられる。
【００３７】
ＧＰＣＲの発現のための構築物は、開始ベクターｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から作製され、上記ベクターにおけるトロンビンおよびエンテロキナーゼ切断部位を除去し得る。ＧＳＴタグは、ＰＣＲを用いてマルチクローニングサイトに添加されて、ＧＳＴタグを生じ、次いで、当業者に公知の標準的な手順を用いて、切断されたベクター（ＳｍａＩ／ＥｃｏＲＩ）に連結される。その後、ベクターは、操作の簡便化のためにＬｉｆｅｔｅｃｈから提供されるＧａｔｅｗａｙ技術を用いて、適合性にされる。これは、この技術（Ｌｉｆｅｔｅｃｈから得られる）に所望される組換え部位を含む、ＳｍａＩ部位カセットに連結されることによって達成される。目的のＧＰＣＲは、組換えのための接着部位を含むように遺伝子を伸長するためのプライマーを用いたＰＣＲを使用して増幅される。次いで、このＰＣＲ産物を、バキュロウイルスベクターに、ＢＰクロナーゼ（ｃｌｏｎａｓｅ）（相同組換えに必要とされる酵素）を用いて取り込み、バキュロウイルス発現のための、エンテロトキシンまたはトロンビン切断部位を伴わず、Ｃ末端ＧＳＴタグを有するＧＰＣＲを含む、ベクターを作製する。このベクターは、Ｓｆ９細胞に、発現に必要なウイルスストックの調製のために同時トランスフェクトされる。このウイルスは、精製されたプラークであり、ＰＣＲおよび配列決定されたクローンは、ＧＰＣＲの発現のために使用され得る。３つのＧＰＣＲを有するこの構築物の時間経過は、レセプターの最大の発現に必要な時間がより少なく、タンパク質分解がより少ないことを実証した。例えば、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、およびＧｎＲＨＲについては、発現に２４〜４８時間必要とした。ＧｎＲＨＲおよびＣＣＲ５に、より少ないタンパク質分解が生じた。
【００３８】
Ｓｆ９細胞またはＨｉｇｈ　Ｆｉｖｅ細胞においてＧＰＣＲ標識化レセプターを発現するために、標識挿入物を含むｐＢｌｕｅＢａｃベクターを、Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ　ＤＮＡと共に、カチオン性リポソーム媒介トランスフェクションを用いて標準的な技術を使用して同時トランスフェクトした。この標識化レセプターを、相同組替えによってバキュロウイルスゲノム中に挿入した。細胞を、トランスフェクション後２４時間から４〜５日までモニターした。約２４〜７２時間後、このトランスフェクション上清を、標準的なプラークアッセイを使用して、組替えプラークについてアッセイした。組替えウイルスを有する細胞は、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトシド）の存在下で増殖させた場合、青いプラークを生成した。これらのプラークを精製し、そしてこの単離物を、標準的技術を使用する組替えの正確さについて、ＰＣＲによって確認した。これにより、高力価ストックを生成し、そして発現研究のために、感染をこのストックから標準的技術を使用して実行した。トランスフェクトについてのコントロールとしては、細胞および転移ベクターが挙げられる。
【００３９】
Ｓｆ９細胞またはＨｉｇｈ　Ｆｉｖｅ細胞を、当業者に公知である標準的技術を使用して、接着培養物および懸濁培養物の両方として維持した。この接着細胞を、コンフルエントになるまで増殖させ、そして１：５の比で、脱落技術（ｓｌｏｕｇｈｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を使用して継代した。懸濁細胞を、（剪断を最小にするために）０．１％のプルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ−６８を有するスピナーフラスコ中で１×１０６細胞／ｍｌの密度まで継代培養することによって２〜３ヶ月、維持した。
【００４０】
組替えウイルスでの感染後の時間経過を使用して、標準的な技術を使用して発現についての最適な増殖条件を決定した。スピナーフラスコからの細胞のアリコートを、この時間経過ににわたって採取し、８００×ｇで１０分間４℃で遠心分離し、そして上清とペレットの両方を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロット分析によってアッセイした。このＧＰＣＲを、膜分画（ペレット）中にあると予測した。全ての実行可能な系を、発現のレベルについてこの様式でアッセイした。標準的放射性結合アッセイを、膜調製物において、天然リガンドを用いて行って、活性について系を評価する。しばしばあるオーファンレセプターの場合のように、天然リガンドが公知でない場合（ここで、レセプターの活性は、規定されていない）、この活性は、当業者に公知の標準的な細胞に基づくアッセイを用いて、Ｇタンパク質共役シグナル活性について、アッセイされる。
【００４１】
この膜分画を、最初に全Ｓｆ９細胞をペレット化し（８００×ｇ、１０分間４℃）、次いでこのペレットを溶解緩衝液に均質化によって再懸濁することによって単離する。代表的な溶解緩衝液は、中性ｐＨの付近であり、そしてプロテアーゼインヒビターのカクテルを含み、この両方は、当業者にとって標準的な技術である。例えば、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼは、阻害剤（例えば、ＰＭＳＦ、アプロチニン、ロイペプチン、フェナトロリン、ベンズアミジンＨＣｌ）と共に使用され得る。膜をペレット化する。可溶化をまた、異なる界面活性剤（例えば、β−ドデシルマルトシド、ｎ−オクチル−グルコシド、ＣＨＡＰＳ、デオキシコール酸、ＮＰ−４０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０、ジギトニン、両性洗浄剤、ＣＹＭＡＬ、ラウロイルサルコシンなどであるが、これらに限定されない）によるこのレセプターの可溶化を、量および活性について比較した。可溶化をまた、変化するＮａＣｌ濃度を使用して行った。従来の考えにも関わらず、低塩（例えば、低カルシウムおよび低マグネシウム濃度）を使用する、実質的にＮａＣｌが存在しないこの可溶化の工程により、量および活性について比較した場合、予期しなかった最適な可溶化条件が得られた。０．０ｎＭのＮａＣｌを有することで、カウンター直感（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｉｎｔｕｉｔｉｖｅ）であるが、結合特性を有する可溶化および固定化候補（例えば、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４）の場合、最もよい条件を提供した。単離のための候補を、以下に記載するように精製を達成した。
【００４２】
可溶化および活性のための適切な界面活性剤（例えば、ＮＰ−４０）を決定した後、ＧＰＣＲを、膜分画から精製した。正確な精製スキームは、選択した構築物に依存し、これは活性および可溶化の簡便さの問題である。６×Ｈｉｓ標識化レセプターの精製のために、膜分画をＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）上に界面活性剤（例えば、ＮＰ−４０）の存在下でロードし、十分に洗浄し、そしてイミダゾールで溶出した。ＦＬＡＧ標識化レセプターの精製を、抗ＦＬＡＧ　Ｍ２親和性マトリクス（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して、界面活性剤の存在下で実行し、そしてグリシンで溶出した。この精製を、本明細書において記載される実験中の系について見出される適切な界面活性剤（例えば、ＮＰ−４０）の存在下で実行した。精製したレセプターの活性は、本明細書に記載されるように評価した。
【００４３】
ペプチドを、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル／ｔｅｒ．−ブチル（「Ｆｍｏｃ」／「ｔＢｕ」）に基づく方法を介し、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４３３Ａ合成機を用いて、Ｒｉｎｋアミド樹脂（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ、置換レベル０／．５４ｍｍｏｌ／ｇ）上に取り付けた。ｔＢｕをＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＴｙｒの側鎖の保護のために使用し、ｔｅｒｔ．−ブチルオキシカルボニル（「Ｂｏｃ」）をＬｙｓおよびＴｒｐの側鎖の保護のために使用し、２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（「Ｐｂｆ」）をＡｒｇの側鎖の保護のために使用し、そしてトリフェニルメチル（「トリチル」，「Ｔｒｔ」）をＣｙｓ、Ｈｉｓ、ＡｓｎおよびＧｌｎの側鎖の保護のために使用した。合成のスケールを０．２０ｍｍｏｌとした。この樹脂を、最初にＮ−メチルピロリジノン（「ＮＭＰ」）で洗浄し、その後、ピペリジン：ＮＭＰ（１：４）の１×３分および１×７．６分の処置をＮα−Ｆｍｏｃ除去のために行った。全てのＦｍｏｃ−アミノ酸を、以下の製造者のプロコトルに従ってＮ−［（１Ｈ−ベンゾトリアゾ−ル−１−イル）（ジメチルアミノ）メチレン］−Ｎ−メチルメタナミニウムヘキサフルオロホスフェートＮ−オキシド（Ｎ−［（１Ｈ−ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｌｙ）（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ］）−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎａｍｉｎｉｕｍ　ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｎ−ｏｘｉｄｅ）（「ＨＢＴＵ」）と結合した：（ａ）１．０ｍｍｏｌの誘導体化したアミノ酸を２．１ｇのＮＭＰ中に溶解した；（ｂ）０．９ｍｍｏｌの、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（「ＤＭＦ」）中で０．５ＭのＨＢＴＵをこのアミノ酸のカートリッジに添加し、そしてこの溶液を６分間混ぜ合わせた；（ｃ）１．０ｍＬの２．０ＭのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（「ＤＩＥＡ」）を含有するＮＭＰをこのカートリッジに添加した；（ｄ）ＨＢＴＵ溶液をこの樹脂に移し、混ぜ合わせる間、気温で４０分間反応させた。この樹脂を濾過し、そして総体積９０ｍｌのＮＭＰで６回リンスして、そしてこのサイクルを繰り返した。高度に縮重し指向されたペプチドライブラリーを構築するためのこの１ポット法（ｏｎｅ　ｐｏｔ　ｍｅｔｈｏｄ）において、樹脂のバッチを、この樹脂のどのような分割もなしに、コンビナトリアルアミノ酸の混合物と反応させた。
【００４４】
出発混合物中のアミノ酸濃度を調整することによって、相対的な結合速度を制御し、これによってライブラリー中のアミノ酸の等しい取りこみを確実にする。天然のＢｏｃ保護されたアミノ酸およびＦｍｏｃ保護されたアミノ酸の混合物の１ポット合成に対しての最適化は、以前に記載されている（例えば、米国特許第５，２２５，５３３号；Ｉｖａｎｅｔｉｃｈら、Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ　ＵＳＡ、２４７〜２６０頁（１９９６）；Ｂｕｅｔｔｎｅｒら、ＩｎｎｏｖａｔｉｏｎおよびＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ　ｉｎ　Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａｎｄＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，Ｍａｙｆｌｏｗｅｒ　Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ　Ｌｔｄ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＫ，１６９〜１７４頁（１９９４）；Ｏｓｔｒｅｓｈら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ　３４：１６８１〜９（１９９４）；Ｓｏｎｇｙａｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　８７：８７〜９８（１９９８）；およびＨｅｒｍａｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　２：１４７〜１５５（１９９６）を参照）。開裂反応を、トリフルオロ酢酸（「ＴＦＡ」）：Ｈ２Ｏ：アニソール：トリイソプロピルシラン（「ｉＰ３ＳｉＨ」）（８７．５：５：５：２．５，約６ｍＬ）中のペプチジル樹脂を、３時間、２５℃で攪拌することにより実施した（例えば、Ｈｅｒｍａｎら、１９９６を参照）。濾液を回収して、この樹脂をさらにＴＦＡで洗浄した。冷（−７８℃）ジエチルエーテルを、合わせた抽出物に添加し、そしてこの溶液を−７８℃まで冷却した。上清を除去した後、得られた沈澱物を、冷エーテルで数回洗浄して、氷酢酸中に溶解し、そして凍結乾燥した。
【００４５】
環状ペプチドライブラリーに対して、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＨ）−ＯＤｍａｂ（Ｄｍａｂ，４−［Ｎ−（１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソキシシクロヘキシリジン）−３−メチルブチル）アミノ］−ベンジル（４−［Ｎ−（１−（４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，６−ｄｉｏｘｏｘｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｉｄｅｎｅ）−３−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ）ａｍｉｎｏ］−ｂｅｎｚｙｌ））は、上記のように鎖が伸長された後に、Ｒｉｎｋアミド樹脂にアンカーされた側鎖である。直鎖状のアセンブリの後、Ｄｍａｂ基およびＦｍｏｃ基の除去を、ヒドラジン：ＤＭＦ（１：４９）を用いた７分間の処理およびピペリジン：ＮＭＰ（１：４）の６×３分の処理のそれぞれによって、達成した。この樹脂を、手動の環化のために、ポリプロピレンフリットを含んだシリンジに移した。樹脂上のヘッドトゥテイル（ｈｅａｄ　ｔｏ　ｔａｉｌ）環化を、ＮＭＰ：ＤＭＦ：ジクロロメタン、メチレンクロリド、ＤＣＭ）（１：１：１）中の１％Ｔｒｉｔｉｏｎ　Ｘを含む溶液中の７−アザベンゾトリアゾ−ル−１−イロキシ）−トリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（「ＰｙＡＯＰ」）：ＤＩＥＡ（１：２、４当量）を用いて、５５℃で２時間、実施した。未反応の直鎖状前駆体を、ＤＭＦ中のＦｍｏｃ−Ｎｖａ−ＯＨ／ＰｙＡＯＰ／ＤＩＥＡ（「Ｎｖａ」、「ノルバリン」）（１：１：２、４当量）で、１×１８時間および１×３時間、処理をした。続く上記のような開裂および側鎖の脱保護によって、環状ペプチドライブリーおよび対応する直鎖状（非環化）配列を含む混合物を産生した。所望の環状ペプチドライブラリーを精製して、逆相高速液体クロマトグラフィー（「ＲＰ−ＨＰＬＣ」）によって直鎖状夾雑物を除去した。
【００４６】
ペプチドおよびペプチドライブラリーを、ＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ（Ｌｏｕｉｓｉａｎａ　Ｓｔａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、およびエドマン分解によって、特徴づけた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ分析によって、不完全な脱保護、脱ブロック化、またはアルキル化に起因する、高分子量の不純物の存在の検出が可能である。エドマン分解は、ライブラリー中の各縮重位置における各アミノ酸量についての定量的な情報を提供する。
【００４７】
合成された出発ライブラリーは、単一の非縮重指向化アミノ酸（すなわち、Ｍ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ａ、ここでＸは、システイン以外の全てのアミノ酸の縮重した等モル混合物である）を有する。環状ライブラリー（ヘッドトゥテイル）はまた、単一の、非縮重指向化アミノ酸を用いて調製した。これらの出発ライブラリーの使用を通して、いくつかの縮重した位置において最適化された残基を規定し、そして２次ライブラリーを作製し、これらの位置を固定する。例えば、ヘッドトゥテイル環化ライブラリー　シクロ（Ｍ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｎ）は、（固定されたＲから）第−４位はリジンであるべきであり、その第−２位はアスパラギン酸であるべきであり、第−１位はヒスチジンであるべきであり、そして第＋３位はリジンであるべきであり、結果として第２ライブラリーは、シクロ（Ｍ−Ｋ−Ｘ−Ｄ−Ｈ−Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｋ−Ｎ）であることを示す。
【００４８】
指向された線形ペプチドライブラリーを、固定化されたＧＰＣＲおよび単離された高親和性ペプチドの小画分を含むカラムに適用した。結合ドメインを使用したペプチドライブラリースクリーニングを示した概念図を、図２に示し得る。洗浄後、結合ペプチドをこのカラムから溶離した。次に、結合したペプチドおよびこのカラムに適用したライブラリー全体の両方を、別個にエドマン分解に供し、そして位置の関数としてアミノ酸分布を決定した。最後に、縮重位置でのアミノ酸の傾向を決定する。例えば、セリンが、出発ライブラリー中のアミノ酸の第＋１位で５％であるが、高親和性ペプチド中の第＋１位で、アミノ酸の１５％である場合、第＋１位はセリンに対する選択が存在する。その位置での優先値３が得られる。表１は、結合ドメインを使用したペプチドライブラリー法の使用の選択的な概観を提供する。
【００４９】
【表１】
2004502134.tif 000003
（実施例２：ＧＳＴタグ化ＣＣＲ５の調製およびスクリーニング）
ライブラリーを、Ｒｉｎｋ　Ａｍｉｄｅ　ＭＢＨＡ樹脂（置換：０．５４ｍｍｏｌ／ｇｍ）を使用して９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基と共に、ＡＢＩ　４３３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｒｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）上に合成した。縮重位置に対するアミノ酸のほぼ等しいカップリングを得るために、アミノ酸量を、文献値を考慮して経験的に調節した。例えば、Ｈｏｏｋ　Ｗ．ら、Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．４４：１３２３（１９８５）を参照のこと。例示的なカップリング試薬は、１当量のペプチドに対して１当量の、ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴ／ＤＩＥＡであった。開裂はカクテル（８２％　ＴＦＡ、５％フェノール、５％チオアニソール、２．５％　１，２−エタンジチオール、５％水）によって達成した。ペプチドをメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルから沈澱した。ライブラリーをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ（Ｌｏｕｓｉａｎａ　Ｓｔａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）およびアミノ酸配列決定によって特徴づけた。
【００５０】
出発ライブラリーは、例えば、単一な非縮重指向化アミノ酸（すなわち、Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ）を使用した。２次ライブラリーは、いくつかの縮重位置に見出された最適な残基を固定化することにより調製し得る。例えば、Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘは、第−４位がプロリンであるべきであり、その結果２次ライブラリーは、Ｐ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘであることを示し得る。
【００５１】
レセプターのＧＳＴ形態を用いたペプチドライブラリーの使用を本明細書中で提供する。ＧＳＴタグ化ＧＰＣＲの場合、このレセプターはこのライブラリーに曝露され得、そして、遠心分離によりこれらの膜を、ペレットすることによって、遊離ペプチドと結合したペプチドとの分離を達成した。ＧＳＴタグ化精製レセプターをペプチドライブラリー、約１μｍｏｌｅのペプチドおよび約１ｎｍｏｌの結合部位と共にインキュベートした。インキュベーション後、結合したペプチドを伴ったレセプターを、遠心分離によって非結合ペプチドから分離した（ペレット中のレセプター・ペプチド複合体、上清中の非結合ペプチド）。非特異的に結合したペプチドを、徹底的な洗浄によって除去し得、そして低いｐＨ（２．５以下）のペレットの再懸濁物を使用して結合したペプチドを除去した。このペプチドを配列決定し、コンセンサス配列を決定した。
【００５２】
ＦＬＡＧ−タグ化ＧＰＣＲを、ペプチドライブラリースクリーニングのために使用する場合、このレセプターを抗ＦＬＡＧ　Ｍ２親和性マトリックス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）上に固定化した。さらなる精製アプローチはＧＳＴ構築物および固定したグルタチオン（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用し得た。
【００５３】
結合したペプチド混合物と出発ペプチドライブラリーの両方を、標準的な技術を使用して配列決定し得た。各アミノ酸量を、位置の関数として、決定した。各位置の各アミノ酸に対する優先値を、出発ライブライブラリーに存在するアミノ酸量とペプチドの結合画分とを比較することによって計算した。これらの手順を使用して、多くの結合ドメインと相互作用するペプチドの好ましい配列を生成し、そしてこれを表１に記載した。
【００５４】
また、２次ライブラリーを出発ライブラリーからの情報を組み込むことによって配列決定し得た。特徴付けのこの第１のラウンドについて、ファージディスプレイ技術をまた使用して予備的な結合モチーフを同定する。ファージディスプレイ法は、天然のアミノ酸のモチーフの同定を提供する。ファージディスプレイ技術は、ＤＮＡ配列を、ファージ被覆タンパク質の１つをコードする遺伝子中へ挿入することを包含する。この遺伝子を特定の位置に挿入して、その結果発現されたタンパク質挿入物は他の分子と相互作用し得る。結果として、コードされたペプチドまたはタンパク質配列を、ファージ表面上に提示し、そして結合のために曝露する。縮重ヌクレオチドを挿入することによって、各ファージは、異なったペプチド配列を発現し得る（「ファージライブラリー」）。このファージライブラリーと固定したレセプターとのインキュベーションを使用して、このレセプターに特異的に結合する配列を同定し得る。シグナルは、単離されたファージを増殖することよって増幅することができるので、微弱なシグナルでさえ検出し得る。ファージディスプレイから導出した情報は、薬学的特徴を増大したリガンドを選択するために、新規のアミノ酸アナログまたは環状ペプチドを含む合成ライブラリーを使用する、親和性精製法に対して適用可能である。出発ライブラリー、２次ライブラリーおよび３次ライブラリーの使用によって、結合部位の特異性の完全な定義を提供した。
【００５５】
一旦、好ましいアミノ酸残基を、このライブラリーの縮重位置における、高い優先値を使用して同定すると、特異的なペプチドをライブラリー合成に用いたような方法によって合成し得た。これらをＨＰＬＣによって精製し、そして組成をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳによって確認した。
【００５６】
相対的な親和性を、レセプター精製に使用したヨウ素化結合アッセイを改変することによって測定し得る。従って、この精製したレセプター膜から［１２５Ｉ］−リガンドを提示するこれらのペプチドの能力を測定し得た。しかし、この天然リガンドが既知でない場合、この活性を当該分野で標準的な細胞に基いたアッセイを使用して測定し得る。また、会合定数を当該分野で標準的な技術を使用して決定し得る。
【００５７】
（実施例３：タグ化したＣＣＲ５の調製と分析およびこれのライブラリースクリーニング）
（Ａ．ＣＣＲ５のクローニングおよび発現）
ＣＣＲ５　ｃＤＮＡ（図４の配列を参照）をベクターｐＣＤＮＡ３中のＲｅｃｅｐｔｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得た。タグを、レセプターのＣ末端に加え、本明細書中に記載のような、標準的な技術を使用する親和性精製アッセイのために、レセプターを固定するのに使用した。さらに、ＧｅｎＢａｎｋ　登録番号Ｕ５７８４０に相関するＣＣＲ５　ｃＤＮＡを、ベクターｐＣＤＮＡ３中で使用し得る。Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ由来のＣＣＲ５　ｃＤＮＡと、ＧｅｎＢａｎｋ　登録番号Ｕ５７８４０に相関するＣＣＲ５　ｃＤＮＡとの間の唯一の違いは、第１８０位の塩基の点変異（このアミノ酸配列において、ロイシンをグルタミンに変化させる）である。以下は、このタグ化方法を使用した実験からの具体的な例である：
（Ｃ末端ヒスチジンタグを伴ったＣＣＲ５の構築（昆虫選択発現系））
ＣＣＲ５−ＨＩＳ構築物をこの系から誘導した。ＰＣＲをＣＣＲ５／ｐｃＤＮＡ５（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ製）をテンプレートとして使用して、そしてプライマー５−Ａｇｅ　Ｈｉｓおよびプライマー５−Ｓｐｅ　Ｈｉｓを使用して実施した。この最初のプライマーによって、独特のＳｐｅＩ部位を、ＣＣＲ５の開始ＡＴＧの直前に誘導した。第２のプライマーによって、ＣＣＲ５の終止コドンを、ｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のヒスチジンタグとインフレームであるＡｇｅＩ部位の中へ変異した。ＰＣＲ産物をＳｐｅＩとＡｇｅＩで消化し、次いで、同様に消化されたｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓの中へ連結した。この構築物は、ＣＣＲ５−Ｈｉｓ−ＰＩＺＴとして同定される。
【００５８】
（Ｃ末端ヒスチジンタグを伴ったＣＣＲ５の構築（バキュロウイルス発現系））
ＣＣＲ５−Ｈｉｓ−ＰＩＺＴをＨａｅＩＩとＳｐｅＩで消化し、次いで、クレノウフラグメントで埋めた。ＣＣＲ５−Ｈｉｓを含むこのフラグメントを、予めＮｈｅＩで消化され、そしてクレノウで平滑化したｐＢｌｕｅｂａｃ　４．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中へ、連結した。この構築物を方向の正確さについてチェックした。これは、ＣＣＲ５−ＨＩＳと呼ばれる。この構築物を、制限消化および標準的な技術を用いた配列決定によって確認した。この構築物を発現のために使用し、そして十分に発現され、そして親和性精製スクリーニングでの使用のための活性形態にあることを決定した。
【００５９】
（Ｃ末端ＦＬＡＧタグを有するＣＣＲ５の構築）
標準的な技術を使用するＰＣＲを、テンプレートとしてＣＣＲ５／ｐｃＤＮＡ３（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ製）ならびにプライマー５−Ｘｈｏ　ｐＦＬＡＧおよびプライマー５−Ｓａｌ　ｐＦＬＡＧを使用して実施した。第１のプライマーは、ＣＣＲ５のイニシエーターＡＴＧの直前の固有のＸｈｏＩ部位を操作した。第２のプライマーは、ＣＣＲ５の停止コドンをＳａｌＩ制限部位に変異した（Ｓｉｇｍａ製のｐＦＬＡＧ−ＣＴＣのＦＬＡＧタグを用いてインフレームで）。ＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩおよびＳａｌＩで消化し、そして同様に消化したｐＦＬＡＧ−ＣＴＣ（細菌の発現ベクター）に連結した。この構築物を、ＣＣＲ５−ＦＬＡＧ−ＣＴＣと呼ぶ。次いで、ＣＣＲ５−ＦＬＡＧを、ＸｈｏＩおよびＳｃａＩで消化し、そしてクレノウ断片で充填した。ＣＣＲ５−ＦＬＡＧ−ＣＴＣを含むフラグメントを、最初にＮｈｅＩで消化し、次いで、クレノウで平滑化したｐＢｌｕｅｂａｃ４．５に連結した。この最終構築物を、ＣＣＲ５−ＦＬＡＧとして同定する。この構築物を、制限消化によって確認し、そして標準的な技術を使用して配列決定した。この構築物を、発現のために使用し、そしてアフィニティー精製スクリーニングにおける使用のために十分にかつ活性な形態で発現することを決定した。
【００６０】
（Ｃ末端ＧＳＴタグを有するＣＣＲ５の構築）
ＰＣＲを、テンプレートとしてＣＣＲ５／ｐｃＤＮＡ３（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ製）ならびにプライマーＧＳＴ−ＢａｍＨＩおよびプライマーＧＳＴ−ＮｄｅＩを使用して実施した。第１のプライマーを、ＣＣＲ５の停止コドンを、ＢａｍＨＩ制限部位に変異した（ｐＥＳＰ−３のＦＬＡＧ／ＧＳＴタグを用いてインフレームで）。第２のプライマーを、ＣＣＲ５の開始コドンにおける固有のＮｄｅＩ部位に導入した。ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩで消化し、そして同様に消化したｐＥＳＰ−３（酵母発現ベクター）に連結した。この構築物を、ｐＣＰ８と呼ぶ。次いで、ｐＣＰ８を、ＮｄｅＩおよびＳｍａＩで消化し、そしてクレノウ断片で充填した。ＣＣＲ５−ＧＳＴを含むフラグメントを、最初にＢｇｌＩＩで消化し、次いでクレノウで平滑化した、ｐＢｌｕｅｂａｃ４．５に連結した。この最終構築物を、ｐＣＰ１０として同定する。このタンパク質を記載する場合、この構築物を、ＣＣＲ５−ＧＳＴとして同定する。この構築物を、制限消化によって確認し、そして標準的な技術によって配列決定した。この構築物を、発現のために使用し、そしてアフィニティー精製スクリーニングにおける使用のために十分にかつ活性な形態で発現することを判定した。
【００６１】
３つの新しい構築物のためのベクター（ＣＣＲ５−ＦＬＡＧ、ＣＣＲ５−ＧＳＴおよびＣＣＲ５−ＨＩＳ）を使用して、それぞれのウイルスストックの産生のためにＳｆ９細胞を同時トランスフェクトした。これらのウイルスストックを、標準的なプラークアッセイを使用して精製し、次いで実験に使用して、種々のＣ末端タグを有するＣＣＲ５の発現の最適化のために感染させた。Ｈｉｇｈ　Ｆｉｖｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をまた、これらのＣＣＲ５タグ化構築物でトランスフェクトし、そしてＣＣＲ５の発現について試験した。全ての構築物について、適切なタグ化レセプターを発現することを判定した。７２時間後の発現レベルは、Ｓｆ９細胞について発現レベルよりもＨｉｇｈ　Ｆｉｖｅ細胞において５倍ほど高かった。全ての上記の実験を、当業者に公知の標準的な技術を使用して行なった。
【００６２】
ＣＣＲ５の発現のための第４の構築物を、スターティングベクターｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から作製し、以前記載したベクターにおけるトロンビン開裂部位およびエンテロキナーゼ開裂部位を除去した。ＧＳＴタグを、ＰＣＲを使用することによってマルチクローニング部位に付加してＧＳＴタグを精製し、次いで、当業者に公知の標準的な方法を使用して消化したベクター（ＳｍａＩ／ＥｃｏＲＩ）に連結した。次に、このベクターを、操作の容易化のためにＬｉｆｅｔｅｃｈ製のＧａｔｅｗａｙ技術と適合性にした。これを、この技術のために必要な組換え部位を含むカセット（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ製）にＳｍａＩを連結することによって行なった。ＣＣＲ５を、プライマーを使用してＰＣＲを用いて増幅して、組換えのための結合部位を含む遺伝子を伸長した。次いで、ＰＣＲ産物を、ＢＰクロナーゼ（相同組換えに必要な酵素）を使用してバキュロウイルスベクターに組み込んで、エンテロキナーゼ開裂部位またはトロンビン開裂部位を有さず、Ｃ末端ＧＳＴタグ有するＣＣＲ５を含むバキュロウイルス発現のためのベクターを作製した。このベクターを、発現のために必要なウイルスストックの調製のためにＳｆ９細胞に同時トランスフェクトした。このウイルスをプラーク精製し、そしてＰＣＲおよび配列チェックしたクローンを、ＣＣＲ５の発現のために使用した。この構築物のタイムコースは、タンパク質のより少ないのタンパク質分解が観察され、そしてより少ない時間が、レセプターの最大の発現を得るために必要であったことを示した。
【００６３】
（Ｂ．ＣＣＲ５の活性）
それぞれのタグ化ＣＣＲ５遺伝子（ＣＣＲ５−ＧＳＴ、ＣＣＲ５−ＦＬＡＧおよびＣＣＲ５−ＨＩＳ）を、本明細書中に記載されるように、Ｓｆ９細胞およびＨｉｇｈ　Ｆｉｖｅ細胞において発現させた。全てのＳｆ９細胞株由来の全細胞およびＨｉｇｈ　Ｆｉｖｅ細胞株由来の全細胞を、低張緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ　ＥＤＴＡ）を使用して溶解し、そして膜調製物を、当業者に公知の標準的な技術を使用するホモジナイズおよび遠心分離によって作製した。ＣＣＲ５−ＧＳＴ、ＣＣＲ５−ＦＬＡＧおよびＣＣＲ５−ＨＩＳに関する膜調製物を、それぞれ、標準的な放射リガンド結合アッセイを使用してアッセイした。結合アッセイを、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１％　ＢＳＡ中の５μｇの膜を用いて実施した。放射リガンドＭＩＰ１−β（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、「ＮＥＮ」から得た）を、冷ＭＩＰ１α（競合リガンド；ＣＣＲ５に対する天然のリガンドは、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１βおよびＭＩＰ１αである）と共に、および冷ＭＩＰ１αなしで室温で１時間、膜と共にインキュベートし、濾過し、洗浄し、そして結合した放射活性計数を、シンチレーションカウンターを使用して測定した。非トランスフェクト細胞を、この実験のコントロールとして使用した。膜調製物の活性は、少なくとも２０％の活性タンパク質を有するＲｅｃｅｐｔｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭＩＰ１−β結合に関してＫｄ＜１ｎＭ）によって得られた膜調製物に匹敵した。
【００６４】
（Ｃ．ＣＣＲ５の可溶化）
溶解した全細胞調製物および膜調製物の両方を、可溶化のために使用した。ＣＣＲ５（ＣＣＲ５−ＦＬＡＧ、ＣＣＲ５−ＧＳＴおよびＣＣＲ５−ＨＩＳ）のタグ化バージョンの可溶化を、約６．８〜約８．２の範囲のｐＨで、界面活性剤（例えば、ＮＰ−４０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、β−Ｄ−マルトシド、ｎ−オクチルグルコシド、ＣＹＭＡＬ、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔｓ、Ｔｗｅｅｎ−２０、ライソホスファチジルコリン、ＣＨＡＰＳなど）、塩（例えば、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＫＣｌなど）、緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ、Ｈｅｐｅｓ、Ｈｅｐｐｓ、Ｐｉｐｅｓ、Ｍｅｓ、Ｍｏｐｓ、酢酸、リン酸、イミダゾールなど）の多くの異なる組み合わせを使用して実施した。最適な可溶化のための条件を、ｐＨ８．１でＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３〜１４および低塩（例えば、低いマグネシウムおよびカルシウムであって、ＮａＣｌはない（０．０ｎＭ　ＮａＣｌ）を使用して見出した。好ましい実施形態において、少なくとも２０％の可溶化された、固定化タンパク質は、活性である。非常に好ましい実施形態において、少なくとも３０％、４０％、５０％および７５％の可溶化された固定化タンパク質は、活性である。
【００６５】
（Ｄ．ＣＣＲ５の固定化）
可溶化後、ＣＣＲ５−ＧＳＴとＣＣＲ５−ＦＬＡＧの両方を、精製のためおよびペプチドライブラリーのスクリーニングのための活性タンパク質として使用するためにアフィニティーカラムに固定化した。ライブラリーからのアフィニティー精製のためのＧＰＣＲの固定化を示す概略図を図３に示す。ＣＣＲ５−ＧＳＴを、グルタチオン−アガロース（Ｐｉｅｒｃｅ）およびグルタチオン−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒａｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）に結合し、そして固定化し、そしてＣＣＲ５−ＦＬＡＧを、ＦＬＡＧエピトープを認識する特異的な抗体カラム（Ｍ２カラム，Ｓｉｇｍａ）に固定化した。活性形態におけるタンパク質の固定化は、カラムにある間、活性を維持するための界面活性剤ならびに適切なｐＨおよび適切な塩状態を必要とした。この活性を、放射標識化ＭＩＰ−１β（上記の膜アッセイに用いた）および冷ＭＩＰ−１αを用いた競合を使用して放射活性結合によって測定した。トランスフェクトされていない細胞を、カラム単独と同様に、この活性のためのコントロールとして使用した。これらの実験は、活性形態の樹脂に（アフィニティー精製スクリーニングに十分な）精製形態のマイクログラム量のレセプターを固定する能力を実証した。
【００６６】
（Ｅ．ペプチドライブラリー合成）
ライブラリーを、Ｒｉｎｋ　Ａｍｉｄｅ　ＭＢＨＡ樹脂（置換：０．５４ｍｍｏｌ／ｇｍ）を使用して９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基を有するＡＢＩ　４３３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｒｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）において合成した。アミノ酸の混合物を、位置を縮重するために使用する場合、およそ等量のアミノ酸の結合を、文献値を考慮にいれた後、経験的にアミノ酸の量を調節することによって得た（例えば、Ｉｖａｎｅｔｉｃｈら，Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２６７巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ　ＵＳＡ，２４７〜２６０頁（１９９６）を参照のこと）。結合剤は、ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴ／ＤＩＥＡ（等価のペプチドあたり１当量）であった。切断を、カクテル（８２％　ＴＦＡ、５％　フェノール、５％　チオアニソール、２．５％　１，２−エタンジチオール、５％　水）によって行なった。ペプチドは、メチル三級ブチルエーテルから沈殿させた。ライブラリーを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ（Ｌｏｕｉｓｉａｎａ　Ｓｔａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）およびアミノ酸配列決定によって特徴付けた。
【００６７】
第１のライブラリーは、単一、縮重塩基性ベースアミノ酸（すなわち、Ｍ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｗ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ａ−Ｋ−Ｋ−Ｋ）を使用した。これらの第１のライブラリーの使用を介して、幾つかのまたは全ての縮重位置における最適な残基を、規定した。第２のライブラリーを、全ての位置を規定していなかった場合、作製し、それによって規定の位置を固定した。
【００６８】
（Ｆ．固定化ＣＣＲ５を使用するペプチドライブラリーのスクリーニング）
特定の樹脂に固定化されたタンパク質を用いて（例えば、ＣＣＲ５−ＧＳＴをグルタチオン−セファロースにかまたはＣＣＲ５−ＦＬＡＧをＭ２抗体−アガロースに固定化する）、無数の化合物のスクリーニングを、一緒にインキュベートすること、およびＣＣＲ５によって好まれるリガンドを精製する自然の選択および結合親和性を可能にすることによって行い得る。これらの実験を、直鎖状ライブラリー４Ｐ４（＋）および他のライブラリーを使用して実施した。
【００６９】
（Ｇ．ファージディスプレイ）
スクリーニングにおいて有用な代替の方法またはさらなる方法として、固定された機能的ＣＣＲ５を使用して、当業者に公知の標準的な技術を使用してＣＣＲ５に結合するファージを単離した。アッセイにおいて使用されたグルタチオン−セファロースビーズ、ＢＳＡおよびＭＩＰ１βからのバックグラウンドのサブトラクションを、これらの化合物の混合物と共にファージライブラリーをインキュベートすることによって実施した。レセプターとの、サブトラクションしたファージライブラリー（すなわち、ＮＥＢ、ＰｈＤ　Ｃ７Ｃ）のインキュンベーション後、結合したファージを、天然のＣＣＲ５リガンド（ＭＩＰ−１β）およびグリシン、ｐＨ２．２の両方とによって溶出した。ＰｈＤ　Ｃ７Ｃは、ジスルフィド間に７個の無作為なアミノ酸を有する特殊なファージライブラリーであり、そしてＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ（「ＮＥＢ」）から得られ得る。複数回のスクリーニングを実施した。両方の条件は、ＣＣＲ５に結合し、そしてリガンド結合を阻害し得る特定の配列を提供した。
【００７０】
（実施例４：タグ化ＣＸＣＲ４の調製および分析ならびにそのライブラリースクリーニング）
（Ａ．ＣＸＣＲ４のクローニングおよび発現）
ＣＸＣＲ４を、二等分した脾臓ｃＤＮＡライブラリーから単離し、そして一緒にスプライスした。これらの２つのフラグメントを、ＰＣＲ技術ならびに３’末端および５’末端に対するプライマーならびにＣＸＣＲ４遺伝子の中央部を使用して単離した。全長クローンを、３’プライマーおよび５’プライマーを使用して単離しなかったが；しかし、２等分を、単離し、そして遺伝子内の固有のＢａｍＨＩ部位を使用して一緒に連結した。構築物の同定を、配列決定によって確認した。選択的スプライス短縮形態もまた、単離した。これを、ＣＸＣＲ４短縮型と呼ぶ。タグを、レセプターのＣ末端に付加し、標準的な技術を使用するアフィニティー精製アッセイのためにそれらを固定するために使用した。以下は、このタグ化方法を使用した実験からの具体的な実施例である。
【００７１】
（Ｃ−末端ヒスチジンタグを有するＣＸＣＲ４の構築（昆虫選択発現系））
ＧｎＲＨＲ（性腺刺激ホルモン放出ホルモンレセプター）に関する遺伝子を含む以前の構築物を、使用して、第１のＣＸＣＲ４構築物を作製した。ＧｎＲＨＲに関する遺伝子を、スプライスし、そしてＣＸＣＲ４に関する単離したｃＤＮＡによって置換した。このベクターは、本来、Ｃ末端に６×Ｈｉｓタグを有するｐｅｔ３０ａベクターであった。
【００７２】
（Ｃ末端ＦＬＡＧタグを有するＣＸＣＲ４構築物の構築）
ＰＣＲを、プライマー５’ＢｓｐＥ１　ＣＸＣＲ４およびプライマー３’Ｂｇｌ　ＣＸＣＲ４を使用して実施し、そしてＳｉｇｍａ製のｐＦＬＡＧ−ＣＴＣ（細菌発現ベクター）のＦＬＡＧタグを有するインフレームＣＸＣＲ４の連結のための固有の部位を操作した。この構築物を、ＣＸＣＲ４−ＦＬＡＧ−ＣＴＣと呼ぶ。次いで、ＣＸＣＲ４−ＦＬＡＧを、消化によって除去し、そしてクレノウ断片で充填した。ＣＸＣＲ４−ＦＬＡＧを含むフラグメントを、最初に、消化し、次いで、クレノウで平滑化したｐＢｌｕｅｂａｃ４．５に連結した。この最終構築物を、ＣＸＣＲ４−ＦＬＡＧと呼ぶ。この構築物を、制限消化によって確認し、そして標準的な技術を使用して配列決定した。この構築物を、発現のために使用し、そしてアフィニティー精製スクリーニングにおける使用のために十分にかつ活性な形態で発現することを判定した。
【００７３】
（Ｃ末端ＧＳＴタグを有するＣＸＣＲ４構築物の構築）
新しく構築されたＣＸＣＲ４−ＦＬＡＧ　ｃＤＮＡを、ＣＴＣベクターから除去し、そしてＣＣＲ５の代わりに（ＢｇｌおよびＢｓｐＥ１を使用して）別の構築物（ＣＣＲ５−ＧＳＴ）にサブクローニングした。これは、１工程を使用してＣＸＣＲ４−ＧＳＴのためのベクターを作製した。の構築物を、制限消化によって確認し、そして標準的な技術を使用して配列決定した。この構築物を、発現のために使用し、そしてアフィニティー精製スクリーニングにおける使用のために十分にかつ活性な形態で発現することを判定した。
【００７４】
（Ｎ末端６×Ｈｉｓタグを有するＣＸＣＲ４の構築）
この構築物を市販のベクター、ｐＢｌｕｅｂａｃＨｉｓ２ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＣＸＣＲ４をサブクローニングすることにより調製した。この構築物を、標準的技術を用いた制限消化および配列決定により確認した。
【００７５】
３つの新規の構築物、ＣＸＣＲ４−ＦＬＡＧ、ＣＸＣＲ４−ＧＳＴ、およびＣＸＣＲ４−ＨＩＳのベクターを用いて、それぞれのウイルスストックの作成のためにＳｆ９細胞を同時トランスフェクトした。これらのウイルスストックを、標準的なプラークアッセイを用いて精製し、次いでその種々のＣ末端タグを有するＣＸＣＲ４の発現の最適化に関する感染実験において用いた。Ｈｉｇｈ　Ｆｉｖｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）もまた、これらのＣＸＣＲ４タグ化構築物を用いてトランスフェクトし、そしてＣＸＣＲ４の発現について試験した。全ての構築物を適切にタグ化したレセプターを発現するために決定した。Ｈｉｇｈ　Ｆｉｖｅ細胞における７２時間後の発現レベルは、Ｓｆ９細胞におけるレベルよりも５倍高かった。
【００７６】
（Ｂ．ＣＸＣＲ４の活性）
それぞれのタグ化ＣＸＣＲ４遺伝子（ＣＸＣＲ４−ＦＬＡＧ、ＣＸＣＲ４−ＧＳＴ、およびＣＸＣＲ４−ＨＩＳ）を、本明細書中に記載される、Ｓｆ９およびＨｉｇｈ　Ｆｉｖｅ細胞に同時トランスフェクションするために用いた。Ｓｆ９およびＨｉｇｈ　Ｆｉｖｅ細胞株由来の全細胞を、低張緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ　ＥＤＴＡ）を使用して溶解し、そして膜調製物を、当業者に公知の標準的な技術を使用するホモジナイズおよび遠心分離によって作製した。ＣＸＣＲ４−ＧＳＴ、ＣＸＣＲ４−ＦＬＡＧおよびＣＸＣＲ４−ＨＩＳについての膜調製物を、標準的な放射性リガンド結合アッセイを使用してアッセイした。放射リガンド［１２５Ｉ］−ＳＤＲ−１（ＮＥＮ）を、冷ＳＤＦ−１（競合する天然のリガンド）と共に、およびそれを伴わずに、室温にて１時間、膜と共にインキュベートし、濾過し、洗浄し、そして結合した放射性計数をシンチレーション計数を用いて検出した。非トランスフェクト細胞を、この実験のコントロールとして使用した。膜調製物の活性は、少なくとも２０％の活性タンパク質を生じた。
【００７７】
（Ｃ．ＣＸＣＲ４の可溶化）
溶解した全細胞および膜調製の両方を、可溶化のために使用した。ＣＸＣＲ４にタグ化バージョン（ＣＸＣＲ４−ＦＬＡＧ、ＣＸＣＲ４−ＧＳＴおよびＣＸＣＲ４−ＨＩＳ）の可溶化を、界面活性剤（例えば、ＮＰ−４０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、β−Ｄ−マルトシド、ｎ−オクチルグルコシド、ＣＹＭＡＬ、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔｓ、Ｔｗｅｅｎ−２０、ライソホスファチジルコリン、ＣＨＡＰＳなど）、塩（例えば、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＫＣｌなど）、緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ、Ｈｅｐｅｓ、Ｈｅｐｐｓ、Ｐｉｐｅｓ、Ｍｅｓ、Ｍｏｐｓ、酢酸、リン酸、イミダゾールなど）の多くの異なる組み合わせを約６．８〜約８．２の範囲のｐＨにて使用して実施した。最適な可溶化のための条件を、ｐＨ８．１でＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３〜１４および低塩（例えば、低いマグネシウムおよびカルシウムであって、ＮａＣｌはない（０．０ｎＭ　ＮａＣｌ）を使用して見出した。好ましい実施形態において、少なくとも２０％の可溶化された、固定化タンパク質は、活性である。非常に好ましい実施形態において、少なくとも３０％、４０％、５０％および７５％の可溶化された、固定化タンパク質は、活性である。
【００７８】
（Ｄ．ＣＸＣＲ４の固定化）
可溶化後、ＣＸＣＲ４−ＧＳＴを、精製のためおよびペプチドライブラリーのスクリーニングにおける使用のための活性タンパク質として使用するためにアフィニティーカラムに固定化した。ライブラリーからのアフィニティー精製のためのＧＰＣＲの固定化の示す概略図を、図３に示す。ＣＸＣＲ４−ＧＳＴを、グルタチオン−アガロース（Ｐｉｅｒｃｅ）およびグルタチオン−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒａｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）に結合し、そして固定化した。活性形態のタンパク質の固定化は、カラム上に置かれる間、活性形態を維持するために界面活性剤の使用ならびに適切なｐＨおよび塩濃度を必要とした。この活性を、放射標識したＳＤＦ−１（上記の膜アッセイを伴う場合）放射性結合および冷ＳＤＦ−１との競合により決定した。トランスフェクトされていない細胞を、カラム単独と同様に、この活性のためのコントロールとして使用した。これらの実験は、活性形態の樹脂に、アフィニティー精製スクリーニングに十分な精製形態のマイクログラム量のレセプターを固定する能力を実証した。
【００７９】
（Ｅ．ペプチドライブラリー合成）
ライブラリーを、Ｒｉｎｋ　Ａｍｉｄｅ　ＭＢＨＡ樹脂（置換：０．５４ｍｍｏｌ／ｇｍ）を使用して９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基を有するＡＢＩ　４３３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｒｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）において合成した。アミノ酸の混合物を、位置を縮重位置について使用する場合、およそ等量のアミノ酸の結合を、文献の値を考慮にいれた後、経験的にアミノ酸の量を調節することによって得た（例えば、Ｉｖａｎｅｔｉｃｈら，Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２６７巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ　ＵＳＡ，２４７〜２６０頁（１９９６）を参照のこと）。結合剤は、ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴ／ＤＩＥＡ（等価のペプチドあたり１当量）であった。切断を、カクテル（８２％　ＴＦＡ、５％　フェノール、５％　チオアニソール、２．５％　１，２−エタンジチオール、５％　水）によって行なった。ペプチドは、メチル三級ブチルエーテルから沈殿した。ライブラリーを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ（Ｌｏｕｉｓｉａｎａ　Ｓｔａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）およびアミノ酸配列決定によって特徴付けた。
【００８０】
第１のライブラリーは、単一、非縮重塩基性ベースアミノ酸（すなわち、Ｍ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｗ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ａ−Ｋ−Ｋ−Ｋ）を使用した。これらの第１のライブラリーの使用を介して、幾つかのまたは全ての縮重位置における最適な残基を、規定した。第２のライブラリーを、全ての位置を規定していなかった場合、作製し、それによって規定の位置を固定した。
【００８１】
（Ｆ．固定化ＣＸＣＲ４を使用するペプチドライブラリーのスクリーニング）　タンパク質を、特定の樹脂に固定化し（例えば、ＣＸＣＲ４−ＧＳＴをグルタチオン−セファロースに固定化する）、無数の化合物のスクリーニングを、一緒にインキュベートすること、およびＣＸＣＲ４に好まれるリガンドを精製する自然の選択および結合親和性を可能にすることによって行い得る。これらの実験を、１０のライブラリーを使用して実施した。そしてこれらの実験は、他のライブラリーを用いて実施し得る。
【００８２】
（Ｇ．ファージディスプレイ）
スクリーニングにおいて有用な代替の方法またはさらなる方法として、固定された機能的ＣＸＣＲ４を使用して、当業者に公知の標準的な技術を使用してＣＸＣＲ４に結合するファージを単離した。アッセイにおいて使用されたグルタチオン−セファロースビーズ、ＢＳＡおよびＳＤＦ１αからのバックグラウンドのサブトラクションを、これらの化合物の混合物と共にファージライブラリーをインキュベートすることによって実施した。レセプターとの、サブトラクションしたファージライブラリー（すなわち、ＮＥＢ　ＰｈＤ　Ｃ７Ｃ）のインキュンベーション後、結合したファージを、天然のＣＸＣＲ４リガンド（ＳＤＦ１α）およびグリシン、ｐＨ２．２の両方とによって溶出した。ＰｈＤ　Ｃ７Ｃは、ジスルフィド間に７個の無作為なアミノ酸を有する特殊なファージライブラリーであり、そしてＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ（「ＮＥＢ」）から得られ得る。複数回のスクリーニングを実施した。両方の条件は、ＣＸＣＲ４に結合し、そしてリガンド結合を阻害し得る特定の配列を提供した。
【００８３】
（実施例５：疾患および障害の予防または処置）
しかし、現在、治療用ペプチド、ペプチド模倣物、または疾患および障害（例えば、ＡＩＤＳおよびＨＩＶ感染）の予防および処置のために使用されるＧＰＣＲ結合の低分子アゴニストもしくはアンタゴニストの生産、処方および使用の間に、いくつかの複雑な問題が生じる。ＧＰＣＲの治療的結合化合物の商業的生産のコストおよび技術的難易度を最小化する生物学的に適切なアンタゴニストまたはアゴニストはさらに、本発明によって意図される。さらに、アンタゴニストまたはアゴニストに対する免疫学的応答を与えず、その結果その有効性を妨害する、ＧＰＣＲ結合の生物学的に適切なアンタゴニストまたはアゴニストは、本発明によって意図される。さらに、生成されたＧＰＣＲ結合のアンタゴニストまたはアゴニストの、生物学的効力の有意な喪失を伴わない、商業的に妥当な有効期限を与える適切な処方は、本発明において意図される。さらに、ＡＩＤＳおよびＨＩＶ感染のような疾患および状態の予防および処置のために適切な、個体に対する投与のための有用な用量は、本発明において意図される。
【００８４】
単独でまたは他の適切な分子と混合した、ＧＰＣＲ結合の阻害に関してコンピテントな適切な候補物の同定は、本発明によって意図される。このような候補物はさらに、ＡＩＤＳおよびＨＩＶ感染のような疾患および状態の予防および処置のために生物学的に適切な、上記で同定された候補物の商業的に重要な量の生産を意図する。さらに、本発明は、最初に同定されたアナログの所望されない任意の特性（例えば、インビボでの毒性または貯蔵の際の分解傾向）が緩和される、ＧＰＣＲ結合アンタゴニスト、アゴニストまたは誘導体の治療的品質の商業的に重要な量の生産を提供する。
【００８５】
ペプチド、ペプチド模倣物、またはＧＰＣＲ結合活性の低分子アンタゴニストの同定および設計後の、ＡＩＤＳおよびＨＩＶ感染のような疾患を予防および処置する方法は、本明細書中に記載のようなＧＰＣＲ結合を阻害し得る化合物を含む組成物を投与する工程を包含する。投与は、任意の適合性の経路によるものであり得る。従って、適切な場合、投与は、経口または非経口（投与の静脈内および腹腔内の投与経路を含む）を含み得る。特に好ましい方法は、適切な処方物の徐放性注射によるものである。さらに、投与は、組成物のボーラスの定期的な注射によるものであり得るかまたは体外（例えば、静脈内バッグ）または体内（例えば、生物分解性の（ｂｉｏｅｒｏｄａｂｌｅ）移植）であるリザーバからの静脈内または腹腔内投与によってより連続的になされ得る。
【００８６】
本発明によって意図される治療的組成物を、任意の適切な手段によって、直接（例えば、注射、移植または組織部位に対する局所的投与によるように局所的に）、または全身的に（例えば、非経口的にまたは経口的に）個体に提供し得る。組成物が非経口的に（例えば、静脈内、皮下、分子内、眼、腹腔内、筋内、頬、直腸、膣、眼窩内、頸部内、頭蓋内、脊髄内、室内、鞘内、大槽内、嚢内、鼻腔内によって）またはエアロゾル投与によって提供される場合、この組成物は、水性または生理学的に適合な液体懸濁物または溶液の部分を含み得る。従って、キャリアまたはビヒクルは、生理学的に受容可能であり、その結果、所望の組成物の被験体への送達に加えて、患者の電解質および／または容量バランスに他の悪影響を及ぼさない。
【００８７】
非経口投与に有用な溶液は、薬学の分野で周知の方法（例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ　ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ（Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．、編）、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂ．、１９９０に記載される方法）のいずれかによって調製され得る。本発明の治療用薬剤の処方物としては、例えば、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール、植物起源の油、水素化ナフタレンなど）が挙げられ得る。特に、直接投与のための処方物は、所望の部位での薬剤の維持を補助するグリセロールおよび他の高粘度の組成物を含み得る。生体適合性、好ましくは生体吸収性（ｂｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ）のポリマー（例えば、ヒアルロン酸、コラーゲン、リン酸三カルシウム、ポリブチレート、ラクチドならびにグリコリドポリマーおよびラクチド／グリコリドコポリマーを含む）は、インビボで薬剤の放出を制御する有用な賦形剤であり得る。ペプチド薬物についての徐放性注射可能処方物の概念は、十分受け入れられており、そしていくつかの利点を提供する。第一に、例えば、バイオアベイラビリティーが高い。第二に、処置レジメンは、１ヶ月または３ヶ月当たり１回（ＡｂｏｔｔのＬｅｕｐｒｏｎ（登録商標）のように）または１年に１回（例えば、ＡｌｚａのＶｉａｄｕｒ（登録商標））からなり得る。第三に、徐放性注射可能処方物は、実質的に、使用され得る用量を減少させる（Ｌｅｕｐｒｏｎ注射用量は、１ｍｇ／日であるが、９０日の処方物使用量（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｕｓｅ）は、総量１１．２５ｍｇである）。また、増大した効力は、治療が感染性を予防するために連続して存在する場合に達成され得る。この考えは、感染のｓｌｏｗ−ｔｏ−ｃｌｅａｒ沈着の再形成（例えば、記憶Ｔ細胞コンパートメント）を予防することにより疾患の治癒を達成する必要性の観点から特に重要である。例えば、Ｌｅｅ，Ｖ．編、Ｐｅｐｔｉｄｅ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ＮＹ（１９９１）を参照のこと。
【００８８】
これらの薬剤のための他の潜在的に有用な非経口送達システムとしては、エチレン−ビニルアセテートコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入システム、およびリポソームが挙げられる。吸引投与のための処方物は、賦形剤として、例えば、ラクトースを含むか、または水溶液（例えば、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココレートおよびデオキシコレートを含む）かもしくは鼻ドロップまたは鼻腔内へ適用されるためのゲルの形態での投与のための油性溶液であり得る。非経口投与のための処方物はまた、頬投与のためのグリココレート、結腸投与のためのメトキシサリチラート、または膣投与のためのクエン酸（ｃｕｔｒｉｃ　ａｃｉｄ）を含み得る。
【００８９】
本発明のさらなる局面および実施形態は、当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、固定された非変性リジンもしくはアルギニン、ならびにおおよそ等しい割合の１８アミノ酸からなる８個の変性位置を有する、ペプチドライブラリーを示す。
【図２】図２は、結合ドメインを用いたペプチドライブラリーのスクリーニングを示す。
【図３】図３は、ライブラリーからのアフィニティー精製のためのＧＰＣＲの固定化を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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