(57)【要約】本発明は、単離ヒト部位１プロテアーゼプロモーター領域に関する。本発明はまた部位１プロテアーゼの発現を減少させる、およびそれにより肥満および／または糖尿病に関連する医学的状態の処置に有用である可能性のある薬剤のスクリーニング法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２に記載のヌクレオチド配列、または部位１プロテアーゼプロモーター活性を示すそのフラグメント；
（ｂ）（ａ）の相補鎖；および
（ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）または（ｂ）に定義のヌクレオチド配列にハイブリダイズできるヌクレオチド配列；
から選択される、単離ヒト部位１プロテアーゼプロモーター領域。
【請求項２】
請求項１に記載のヒト部位１プロテアーゼプロモーター領域を含む、組換え構築物。
【請求項３】
ヒト部位１プロテアーゼプロモーター領域が検出可能産物に操作可能に連結している、請求項２に記載の組換え構築物。
【請求項４】
検出可能産物をコードする該遺伝子がヒト部位１プロテアーゼ遺伝子である、請求項３に記載の組換え構築物。
【請求項５】
更にレポーター遺伝子を含む、請求項２に記載の組換え構築物。
【請求項６】
請求項２から５のいずれかに記載の組換え構築物を含む、ベクター。
【請求項７】
請求項２から５のいずれかに記載の組換え構築物で安定に形質転換された、宿主細胞。
【請求項８】
請求項６に記載のベクターで安定に形質転換された、宿主細胞。
【請求項９】
（ｉ）候補薬剤とヒト部位１プロテアーゼプロモーターを接触させる；そして
（ｉｉ）該候補薬剤が部位１プロテアーゼの発現を減少させるかどうかを測定する段階を含み、このような減少が部位１プロテアーゼプロモーター活性の減少または阻害ができる薬剤の指標である、部位１プロテアーゼプロモーター活性の減少または阻害ができる薬剤の同定法。
【請求項１０】
（ｉ）候補薬剤とヒト部位１プロテアーゼプロモーターを接触させる；そして
（ｉｉ）該候補薬剤が部位１プロテアーゼの発現を減少させるかどうかを測定する段階を含み、このような減少が肥満に関連する医学的状態の処置に有用な薬剤の指標である、肥満に関連する医学的状態の処置に有用な薬剤の同定法。
【請求項１１】
候補薬剤の存在下または非存在下に、請求項７または８に記載の細胞において発現されるレポーター遺伝子をアッセイし、コントロールレベルの発現と比較して減少または阻害された発現の試験レベルが部位１プロテアーゼプロモーター活性の減少または阻害ができる薬剤の指標である、部位１プロテアーゼプロモーター活性の減少または阻害ができる薬剤の同定法。
【請求項１２】
候補薬剤の存在下または非存在下に、請求項７または８に記載の細胞において発現されるレポーター遺伝子をアッセイし、コントロールレベルの発現と比較して減少または阻害された発現の試験レベルが肥満に関連する医学的状態の処置に有用な薬剤の指標である、肥満に関連する医学的状態の処置に有用な薬剤の同定法。
【請求項１３】
肥満に関連する医学的状態の処置に有用な医薬の製造における、請求項９から１２のいずれかに記載の方法により同定された化合物の使用。
【請求項１４】
必要な患者に、請求項９から１２のいずれかに記載の方法により同定された薬剤の治療的有効量を投与することを含む、肥満に関連する医学的状態の処置法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、単離ヒト部位１プロテアーゼプロモーター領域に関する。本発明はまた部位１プロテアーゼの発現を減少させる、およびそれにより肥満および／または糖尿病に関する医学的状態の処置に有用である可能性のある、薬剤のスクリーニング法に関する。
【０００２】
背景技術
ステロール制御要素結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）
細胞膜の完全さは、コレステロールの量とリン脂質における不飽和および飽和脂肪酸の量の間のバランスにより維持される。このバランスは、コレステロールおよび脂肪酸生合成の酵素をコードする遺伝子を活性化する、ステロール制御要素結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ；レビューのために、Ｂｒｏｗｎ ＆ Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ （１９９７） Ｃｅｌｌ ８９， ３３１−３４０； Ｂｒｏｗｎ ＆ Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ （１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９６， １１０４１−１１０４８参照）と呼ばれる膜結合転写因子により部分的に維持されている。転写を促進するために、ＳＲＥＢＰの活性ＮＨ２−末端ドメインは二つの連続的開裂により小胞体膜から遊離される。第１は部位１プロテアーゼ（Ｓ１Ｐ）と呼ばれる、小胞体管腔内に突出したＳＲＥＢＰの親水性ループを開裂する膜結合スブチリシン遊離セリンプロテアーゼである。第２の部位２での開裂は、亜鉛メタロプロテアーゼであると考えられる疎水性タンパク質Ｓ２Ｐの作用を必要とする。これらの制御タンパク質分解性開裂反応は、最終的に膜、細胞および血中のコレステロールのレベルの制御を担う。
【０００３】
ＳＲＥＢＰの３つのイソ型が同定されている。ＳＲＥＢＰ−１ａおよびＳＲＥＢＰ−１ｃはｈと角遺伝子によりコードされ、そのＮ末端酸転写活性化ドメインが異なる。ＳＲＥＢＰ−１ａのＮ末端は長く、付加的酸性アミノ酸を含み、より強力な転写因子であるという観察と一致する（Ｐａｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ４０， ２６１３８−１６１４８）。ＳＲＥＢＰ−２は異なる遺伝子により産生され、ＳＲＥＢＰ−１ａよりも長い活性化ドメイン類似物を含む。近年の証拠は、ＳＲＥＢＰ−２の主機能がコレステロール合成を制御するが、一方ＳＲＥＢＰ−１のものは脂肪酸合成を制御することを示す（Ｐａｉ ｅｔ ａｌ．、前掲）。
【０００４】
ＳＲＥＢＰ転写因子機能の阻害は、遊離脂肪酸およびコレステロールの細胞性合成の減少を導き、その臨床的利点は細胞シ得インシュリン感受性の増加および冠動脈疾患（ＣＡＤ）の減少を含むと予測される。更に、ＳＲＥＢＰ−１は脂肪細胞サイズおよび数の両方の増加の細胞性機構を代表する（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０１， １−９）。ほとんどの肥満が一般的に細胞サイズおよび細胞数の両方の増加が関与するため、ＳＲＥＢＰ−１の阻害は肥満に正の効果を有することが予測される。食餌の多価不飽和脂肪酸の脂質低下効果は、ＳＲＥＢＰ−１発現の阻害効果に直接由来すると考えられる（Ｘｕ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４， ２３５７７−２３５８３）。
【０００５】
ＳＲＥＢＰ−１およびＳＲＥＢＰ−２のハムスター肝臓における独立した制御を示すデータが存在し、ＳＲＥＢＰ−１または−２の特異的標的化の可能性を示唆する（Ｓｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２， ９３５−９３８）。
【０００６】
ＳＲＥＢＰ−２のドミナント陽性形を肝臓および脂肪組織で過剰発現するトランスジェニックマウスは、コレステロール合成の複数の酵素をコードするｍＲＮＡのレベルの非常に増加したレベルを示した。脂肪酸合成に関与する酵素も増加しているが、少ない程度である（Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０１， ２３３１−２３３９）。肝臓および脂肪組織において構造的に活性なＳＲＥＢＰ−１ａを過剰発現するトランスジェニックマウスは、脂肪酸およびコレステロールに関与する酵素のｍＲＮＡの非常に増加したレベルを示した（Ｓｈｉｍａｎｏ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９８， １５７５−１５８４）。その肝臓は、脂肪酸およびコレステロールの大量の蓄積のために約４倍大きかった。トランスジェニックマウスにおける含脂肪細胞ＳＲＥＢＰ−１ｃの対応するバージョンの過剰発現はインシュリン耐性および糖尿病をもたらした（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １２， ３１８２−３１９４）。細胞培養において、このような過剰発現は先に含脂肪細胞分化の促進をすることが示された。栄養過多が、肥満ｆａ／ｆａ Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病性脂肪質ラットの肝臓および島におけるＳＲＥＢＰ−１ｃ発現を促進させることが更に示されている（Ｋａｋｕｍａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９７：８５３６−８５４１）。
【０００７】
Ｓ１プロテアーゼ
上記のように、ＳＲＥＢＰは、活性転写因子を遊離するタンパク質分解により活性化される。管腔スブチリシン様プロテアーゼ部位１プロテアーゼ（Ｓ１Ｐ９が２段階タンパク質分解段階の最初を担う。Ｓ１Ｐによる開裂は、部位２プロテアーゼによる更なる開裂を可能にする。Ｓ１Ｐはコレステロールによるフィードバック阻害の標的である。
【０００８】
ハムスター由来のＳ１Ｐがクローン化されている（Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ２， ５０５−５１４）。（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＡＦ０７８１０５； 配列番号５および６）。（当時未同定であった）ヒト遺伝子の対応する配列は、Ｎａｇａｓｅ ｅｔ ａｌ． （１９９５） ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２， ３７−４３ （ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． Ｄ４２０４５３； 配列番号３および４）に開示された。
【０００９】
ＳＲＥＢＰおよびＳ１Ｐは第３のタンパク質と共局在化している：インビボ部位１開裂に必要であるＳＲＥＢＰ開裂活性化タンパク質（ＳＣＡＰ）。ＳＣＡＰがステロール制御の部位を含み、少数のタンパク質、例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼに保存されている。
【００１０】
一つのみのＳ１Ｐがヒト発現配列タグ（ＥＳＴ）の中で同定されている。したがって、Ｓ１Ｐはスブチリシン様プロテアーゼの中のサブファミリーの唯一のメンバーであり得る。
【００１１】
結果として、ＳＲＥＢＰは哺乳類の脂肪および糖代謝の重要なレギュレーターであり、ＳＲＥＢＰの直接的または間接的下方制御はＩＩ型糖尿病；肥満、高コレステロール血症および他の心臓血管系疾患または脂肪異常血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａｓ）に治療的に価値を有し得る。
【００１２】
部位１プロテアーゼは、ＳＲＥＢＰ経路を妨げると予測される治療的介入の分子標的を示す。部位１プロテアーゼ活性の阻害原理が異なるの二つの概念を：（ｉ）タンパク質分解的活性の不活性化（古典的阻害剤）によるものまたは（ｉｉ）部位１プロテアーゼ遺伝子発現レベルの調節によるものと仮定し得る。部位１プロテアーゼ遺伝子の発現の調節のために、部位１プロテアーゼプロモーターの制御を担う制御領域の同定の必要性がある。プロモーターにおけるこのような制御領域は、部位１プロテアーゼの発現を阻害する、およびそれによりＳＲＥＢＰ経路を阻害するための薬剤の同定に使用できるであろう。
【００１３】
本発明の記載
ヒト部位１プロテアーゼ（Ｓ１Ｐ）遺伝子の５’−フランキング領域（プロモーター領域）はクローン化および配列決定されている。このプロモーター領域は、部位１プロテアーゼの転写を阻害する化合物の同定のための生物学的アッセイに有用である。ＳＲＥＢＰ経路の阻害は、ＩＩ型糖尿病；肥満、高コレステロール血症および他の心臓血管系疾患または脂肪異常血症に治療的に価値を有すると予測される。
【００１４】
結果として、第一の態様において、本発明は：
（ａ）配列番号２に記載のヌクレオチド配列、または部位１プロテアーゼプロモーター活性を示すそのフラグメント；
（ｂ）（ａ）の相補鎖；および
（ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）または（ｂ）に定義のヌクレオチド配列にハイブリダイズできるヌクレオチド配列；
から選択される、単離ヒト部位１プロテアーゼプロモーター領域を提供する。
【００１５】
“プロモーター領域”なる用語は、１個以上の遺伝子の転写を制御するために機能するＤＮＡの領域を意味し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位および制御プロモーター機能と相互作用する同じ分子上の他のＤＮＡ配列の存在により構造的に同定される。
【００１６】
本発明の核酸分子は、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ、ＰＣＲにより単離したＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびこれらの組み合わせを含む。ゲノムＤＮＡは、当分野で既知の方法を使用して、ゲノムライブラリーの本明細書に記載のｃＤＮＡによるスクリーニングにより得られ得る。
【００１７】
本発明の好ましい形において、該核酸分子は配列表の配列番号２と同一のヌクレオチド配列を有する。しかし、本発明の核酸分子は、配列番号２に示す配列に厳密に限定されるものではない。むしろ、本発明は、Ｓ１Ｐプロモーター活性を有する限り、置換、小欠失、挿入または介入のような修飾を有する核酸分子を包含する。本発明に包含されるのは、ヌクレオチド配列が、配列表の配列番号２に示すヌクレオチド配列と少なくとも９０％相同性、好ましくは少なくとも９５％相同性である核酸分子である。
【００１８】
“ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件”なる用語は、標準プロトコール（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， 前掲）から既知であり、例えば０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、＋６５℃でフィルター結合ＤＮＡとハイブリダイズさせ、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで＋６８℃で洗浄すると理解されよう。
【００１９】
部位１プロテアーゼプロモーター活性を示す該“フラグメント”（部分配列）は、コンピューター補助配列分析、例えば、転写因子結合部位の予測により、当業者により同定できる。
【００２０】
本発明は、更に、上記のヒト部位１プロテアーゼプロモーター領域を含む組換え構築物を提供する。好ましくは、該構築物は、検出可能産物、特にヒト部位１プロテアーゼ遺伝子（配列番号３）をコードする遺伝子に操作可能に連結したＳ１Ｐプロモーター領域を含む。
【００２１】
“連結した”なる用語は、遺伝子産物およびＳ１Ｐプロモーター、またはその活性フラグメントをコードするヌクレオチド配列が、連続核酸配列内に位置することを示す。“操作可能に連結した”なる用語は、遺伝子産物をコードできるヌクレオチド配列が、Ｓ１Ｐプロモーターが適当な条件下で遺伝子産物の発現を制御するようにＳ１Ｐプロモーターに連結していることを意味する。操作可能に連結している二つのヌクレオチド配列は、例えばＴＡＴＡボックスを含む、転写に必須の要素を含む。
【００２２】
本発明の組換え構築物は、更に、レポーター遺伝子を含む。本明細書で使用する限り、“レポーター遺伝子”なる用語は、単純な安価な方法または試薬を使用して同定でき、Ｓ１Ｐプロモーターまたはその活性フラグメントに操作可能に連結した遺伝子産物をコードする遺伝子を意味する。例えばルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼまたは緑色蛍光タンパク質レポーター遺伝子のようなレポーター遺伝子を、本発明のスクリーニングアッセイにおける転写活性の測定に使用できる（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ （ｅｄ．）， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， Ｖｏｌ． １８５， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． （１９９０）参照；またＳａｍｂｒｏｏｋ、前掲参照）。
【００２３】
他の態様において、本発明は上記の組換え構築物を含むベクターを提供する。“ベクター”なる用語は、複製のための宿主細胞へのＤＮＡの移入におよび／または宿主細胞による外来ＤＮＡの適当な発現に有用である外来ＤＮＡの任意の運搬体を意味する。組換え構築物で安定に形質転換された宿主細胞は本発明の更なる態様である。このような宿主細胞は、原核生物細胞、単細胞性真核細胞、または多細胞性生物由来の細胞であり得る。ベクターの宿主細胞への導入を行なうために用いる方法は、組換えＤＮＡ法に精通した当業者に既知の標準法である。“形質転換”または“トランスフェクト”なる用語は、外来ＤＮＡが適当な宿主細胞に移入される工程を意味する。
【００２４】
更に重要な態様において、本発明はＳ１Ｐ遺伝子の転写を行なうことによる、Ｓ１Ｐレベルを調節する薬理学的薬剤のスクリーニングに有用である。本明細書で使用する限り、“薬剤”なる用語は、単純または複雑有機分子、ペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドのような生物学的または化学的化合物を意味する。結果として、本発明は、Ｓ１Ｐプロモーターを含む細胞を提供する；該細胞と候補薬剤を接触させる；そして該候補薬剤の非存在下に存在しない効果に関して該細胞をモニタリングすることを含む、Ｓ１Ｐプロモーターを調節することができる薬剤の同定法を含む。
【００２５】
本発明の好ましい形は、（ｉ）候補薬剤とヒト部位１プロテアーゼプロモーターを接触させる；そして（ｉｉ）該候補薬剤が部位１プロテアーゼの発現を減少させるかどうかを測定する段階を含み、このような減少が部位１プロテアーゼプロモーター活性の減少または阻害ができる薬剤の指標である、部位１プロテアーゼプロモーター活性の減少または阻害ができる薬剤の同定法を含む。
【００２６】
スクリーニング目的で、適当な宿主細胞を、本発明のＳ１Ｐプロモーターの制御下にレポーター遺伝子を有するベクターで形質転換できる。レポーター遺伝子の発現は、既知の活性（すなわち、標準薬剤）、または推定活性（すなわち、“試験薬剤”または“候補薬剤”）を有する薬剤の存在下または非存在下で測定できる。試験薬剤の存在下でのレポーター遺伝子の発現レベルの変化を標準薬剤によりもたらされるものと比較する。この方法で、活性剤が同定され、本アッセイにおけるその相対的効果が測定される。
【００２７】
ヒトＳ１Ｐプロモーターに作用する薬剤は、更なる段階として、候補薬剤とヒトＳ１Ｐプロモーターの間の直接結合相互作用の分析により同定できる。大分子との相互作用は、ゲルシフト分析、フットプリンティングまたはＮＭＲのような技術を使用して試験し得る（Ｌａｔｃｈｍａｎ， Ｄ． Ｓ． （Ｅｄ．） （１９９５） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ． Ｉｎ： Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， ｐｐ．１７−４４参照）。二本鎖ＤＮＡにＤＮＡ塩基対への挿入なしに可逆性に結合するように見える小分子化合物が同定されている。方法は、この非挿入結合が、紫外分光分析、プローブとしてのエチジウムでの蛍光分析、粘度計および他の水力学的技術、円偏光二色性および核磁気共鳴分光測定法を使用して特徴付けできると記載されるものである（Ｂａｇｕｌｅｙ， Ｂ．Ｃ． （１９８２） Ｎｏｎｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｖｅ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４３：１６７−１８１； Ｇｍｅｉｎｅｒ， Ｗ．Ｈ． （１９９８） ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ａｓ ａ ｔｏｏｌ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇｓ． Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ５（２）：１１５−１３５； Ｗｅｍｍｅｒ， Ｄ．Ｅ． ＆ Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｐ．Ｇ． （１９９４） Ｕｓｅ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ ｐｒｏｂｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ−ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２３９：７３９−７６７参照）。
【００２８】
ヒトＳ１Ｐプロモーターに作用する薬剤を同定する方法は、２００１年４月５日出願のスウェーデン特許出願第０１０１２１９−６号に記載されている。このような方法は段階
（ａ）ＲＮＡフラグメントの構造を予測する；
（ｂ）段階（ａ）の適当な予測された、少なくとも一つの独立した幹（ｓｔｅｍ）を含むＲＮＡ−フラグメントを選択する；
（ｃ）段階（ｂ）のＲＮＡ−フラグメントに対応するＤＮＡ−フラグメントを合成する；
（ｄ）段階（ｃ）のＤＮＡ−フラグメントを、翻訳によりシグナルを発生し、それによりレポーター構築物を形成するレポーターアッセイ遺伝子の上流近接に挿入する；
（ｅ）ＲＮＡ−結合に関して試験すべき分子とレポーター構築物のＲＮＡ−フラグメントの間の相互作用をモニターする、レポーター遺伝子アッセイを行なう
段階を含む。
【００２９】
上記のように、部位１プロテアーゼプロモーター活性を減少または阻害できる薬剤は、特に肥満；およびＩＩ型糖尿病；高コレステロール血症；アテローム性動脈硬化症および他の心臓血管系疾患または脂肪異常血症に治療的価値を有する可能性がある。結果として、本発明は、必要とする患者に、本発明の方法により同定された薬剤の治療的有効量を投与することを含む、肥満に関する医学的状態の処置法を含む。
【００３０】
“処置”なる用語は：（ｉ）疾患の予防、すなわち、疾患の臨床的症状を発症しないようにする；（ｉｉ）疾患を阻害する、すなわち、臨床的症状の発症を抑える；および／または（ｉｉｉ）疾患を軽減する、すなわち、臨床症状の回復をもたらすことを含む、哺乳類における疾患の任意の処置を意味する。“有効量”なる用語は、処置する疾患状態の処置を提供するのに十分な投与量を意味する。これは、患者、疾患および行なう処置に依存して変化する。
【００３１】
明細書を通して、“標準プロトコール”および“標準法”なる用語は、分ｓ胃生物学技術の関連で使用するとき：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｅｄｉｔｏｒｓ Ｆ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９９４またはＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ． ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ １９８９のような通常の研究室マニュアルに見られるプロトコールおよび方法であると理解されるべきである。
【００３２】
実施例
実施例１：Ｓ１Ｐプロモーターフラグメントのクローニング
Ｓ１プロモーター遺伝子の５’フランキング領域のクローニングのために、原則として、Ｓｉｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３， １０８７−１０８８；およびＳｉｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９５） ＣＬＯＮＴＥＣＨｎｉｑｕｅｓ Ｘ， １−３に記載のような、ゲノム歩行戦略（ｇｅｎｏｍｉｃ ｗａｌｋｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ）を使用した。ＦＯＭＡ ３４５およびＦＯＭＡ ３４６と名付けた二つのプライマーをｃＤＮＡの５’領域において選択した：
ＦＯＭＡ ３４５：５’−ＣＴＣ ＣＧＣ ＧＧＣ ＧＡＡ ＣＡＣ ＧＣＣＴ−３’（配列番号３の１２６−１０８位に対応）
ＦＯＭＡ ３４６：５’−ＣＧＧ ＧＡＧ ＣＴＣ ＡＧＧ ＧＣＣ ＧＧＣ−３’（配列番号３の１６３−１４６位に対応）。
【００３３】
使用した他の薬剤は、“Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ Ｋｉｔ”（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）で得た。この方法の原則は、アダプター−ライゲートゲノムＤＮＡを鋳型として使用する２連続ＰＣＲ反応の実行である。最初のＰＣＲ反応において、“外部”プライマー、すなわち、ＦＯＭＡ ３４５およびＡＰ１（アダプタープライマー１）を使用する。この反応のプロトコールは：
（＋９５°で２５秒；＋７２°で４分）×７サイクル（＋９５°で２５秒；＋６７°で４分）×３５サイクル（＋６７°で４分）×１サイクルであった。
【００３４】
第２のＰＣＲ反応において、“内部”プライマーを使用した（ＦＯＭＡ ３４６およびＡＰ２）。第１のＰＣＲからの反応混合物を５０倍に希釈し、１μｌのこのカクテルを第２反応の鋳型として使用した。第２反応のプロトコールは：
（＋９５°で２５秒；＋７２°で４分）×５サイクル
（＋９５°で２５秒；＋６７°で４分）×２５サイクル
（＋６７°で４分）×１サイクルであった。
【００３５】
反応混合物をキット製造者の指示書に従い調製した。第２のＰＣＲ御地、生成物を２％アガロースゲル中での電気泳動により分析した。役１ｋｂ長の生成物がアダプター−ライゲートゲノムＤＮＡ−ライブラリーの一つに観察された（ＨＤＬ２）。この生成物を、標準クローニング法によりＴＯＰＯベクターＰＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）にクローン化し、その後配列決定した。９８０ｂｐ配列を得た（配列番号１）。
【００３６】
実施例１：Ｓ１Ｐプロモーター配列の集合
Ｃｅｌｅｒａデータベース（Ｒｅｌｅａａｓｅ １．１３）を、実施例１で得た９８０ｂｐ配列をくれリー配列として使用して調査した。ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２）を配列同一性の測定に使用した。ＢＬＡＳＴ分析を行なうためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に入手可能である。ゲノム配列と重複する６個のフラグメント（ＧＡ＿１６３３０５５４； ＧＡ＿２５７９１４２６； ＧＡ＿２３１９４１９５； ＧＡ＿２８９６９３６２； ＧＡ＿１８９０２４９２； ＧＡ＿２４４５４６５０）を検索した。これらの６個のフラグメントを再びＣｅｌｅｒａデータベース（Ｒｅｌｅａｓｅ １．１３）での調査に使用し、他の７つのフラグメントにより拡張された（ＧＡ＿２４４２１４０４、ＧＡ＿２１９８４８０２、ＧＡ＿２８７３５３７０、ＧＡ＿２１０４５４３０、ＧＡ＿９４９１２３２、ＧＡ＿１３４５３６９７、ＧＡ＿２５２２４１３７）。全１３のフラグメントと実施例１で得た９８０ｂｐフラグメントを一緒に最後に凝集させ、Ｃａｐ２プログラム（Ｈｕａｎｇ （１９９６） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３３， ２１−３１）を使用して、２４６９ｂｐ ｃｏｎｔｉｇ（配列番号２）とした。
【００３７】
実施例３：調節化合物の同定のためのレポーター遺伝子アッセイ
レポーター遺伝子アッセイは、細胞におけるシグナル転写活性のツールとして既知である（化学ルミネッセントおよび生物ルミネッセントレポーター遺伝子アッセイのレビューのために、Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１９， １６９−１８１参照）。例えば、発光タンパク質であるルシフェラーゼは、Ｓ１Ｐプロモーター活性の調節剤のアッセイのための有用なツールを提供する。細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＣＯＳ７細胞）を、部位１プロテアーゼ発現構築物および転写因子結合部位の下流にルシフェラーゼタンパク質の遺伝子を含むレポーター構築物の両方で一過性に共トランスフェクトする。ルシフェラーゼ活性は、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）から商品として入手可能なルシフェラーゼアッセイ試薬を使用して定量的に測定し得る。調節化合物の候補の存在下対非存在下での発光の差が調節活性の指標である。
【００３８】
ルシフェラーゼレポータープラスミドを、ルシフェラーゼレポーター遺伝子が挿入プロモーターにより駆動されるｐＧＬ２ベクター中への、部位１プロテアーゼプロモーターの対応する部分への９８０ｂｐ配列（配列番号１）のクローニングにより調製する。構築物をその後マウス前駆脂肪細胞系３Ｔ３−Ｌ１（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ９２．１）、ヒト腎臓細胞系２９３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３）およびヒト肝腫瘍細胞系ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−８０６５）にトランスフェクトする。インシュリン、グリタゾンおよびステロールを含む多くの物質で刺激した後の変わったプロモーター活性をルシフェラーゼの読み出しにおける変化として測定する。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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