(57)【要約】対象由来のサンプル、好ましくは血清サンプルまたは腫瘍組織抽出物中のｈＫ６を検出することによる、対象における卵巣癌の診断、予後、およびモニタリングの方法。ｈＫ６は、ｈＫ６を検出または結合する試薬、好ましくはｈＫ６またはその一部に特異的に反応性である抗体、を使用して測定し得る。腫瘍イメージング用の標識を有するｈＫ６に結合する試薬を使用する、ｈＫ６を伴う腫瘍のイメージング方法も記載される。
2004511810.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象中の卵巣癌に伴うｈＫ６を検出する方法であって、
（ａ）対象由来のサンプルを採取すること；
（ｂ）サンプル中のｈＫ６を検出または同定すること；および
（ｃ）検出される量を基準で検出される量と比較すること、
を含む方法。
【請求項２】
段階（ｂ）に、ヒト角質層キモトリプシン酵素（ＨＳＣＣＥ）、カリクレイン４、カリクレイン５、カリクレイン８、カリクレイン９、カリクレイン１０、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＯＶＸ１、リソホスファチジン酸（ＬＰＡ）または癌胚抗原（ＣＥＡ）の１種またはそれ以上を検出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階（ｂ）に、ＣＡ１２５、カリクレイン９およびカリクレイン１０の１種またはそれ以上を検出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
対象由来のサンプル中のｈＫ６を定量することにより対象中の卵巣癌を診断またはモニタリングする方法であって、
（ａ）対象由来の生体サンプルを、検出可能な物質で直接または間接的に標識されたｈＫ６特異的抗体と接触させること；
（ｂ）検出可能な物質を検出してサンプル中のｈＫ６を定量すること；
（ｃ）定量されたｈＫ６を基準のレベルと比較すること、
を含む方法。
【請求項５】
卵巣癌を診断またはモニタリングする方法であって、
（ａ）生体サンプルを、検出可能な物質で直接または間接的に標識された第一のｈＫ６特異的抗体、および固定された第二のｈＫ６特異的抗体とインキュベートすること；
（ｂ）第一抗体を第二抗体から分離させ、第一抗体相と第二抗体相を生じさせること；
（ｃ）第一または第二抗体相中の検出可能な物質を検出することにより、生体サンプル中のｈＫ６を定量すること；および
（ｄ）定量されたｈＫ６を基準のレベルと比較すること、
を含む方法。
【請求項６】
生体サンプルが血清または腫瘍組織抽出物である、請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
生体サンプルが血清である、請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
基準が非卵巣癌の対象または良性疾病の対象で検出されるｈＫ６レベルである、請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
基準のものより大きいｈＫ６量の検出が、後期の疾病または疾病進行および死亡のリスクの増大を示すものである、請求項１ないし請求項８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
段階（ａ）で、第一および第二抗体を同時または連続的に生体サンプルと接触させる、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、免疫学的に活性な抗体断片、ヒト化抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、遺伝子的に加工した一本鎖Ｆｖ分子、またはキメラ抗体である、請求項４ないし請求項１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
検出可能な物質がアルカリフォスファターゼである、請求項４ないし請求項１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
アルカリフォスファターゼが蛍光基質を使用して検出される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ｈＫ６が時間分解蛍光を使用して測定される、請求項１ないし請求項１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ｈＫ６に伴う腫瘍をイメージングする方法であって、
（ａ）腫瘍を、ｈＫ６に結合する試薬と、腫瘍に伴うｈＫ６に試薬を結合させるのに十分な時間インキュベートすること、但し、試薬は腫瘍イメージング用の標識を帯びている；
（ｂ）腫瘍に局在化した標識の存在を検出すること、
を含む方法。
【請求項１６】
段階（ａ）に、ヒト角質層キモトリプシン酵素（ＨＳＣＣＥ）、カリクレイン４、カリクレイン５、カリクレイン８、カリクレイン９、カリクレイン１０、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＯＶＸ１、リソホスファチジン酸（ＬＰＡ）または癌胚抗原（ＣＥＡ）、好ましくはＣＡ１２５に結合する試薬の１種またはそれ以上とインキュベートすることをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
各試薬が段階（ｂ）で区別できるように標識されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
卵巣癌をイメージングするためのインビボの方法であって、
（ａ）ｈＫ６に結合する試薬を患者に注射すること、但し、試薬は卵巣癌イメージング用の標識を帯びている；
（ｂ）試薬をインビボでインキュベートし、卵巣癌に伴うｈＫ６に結合させること；および
（ｃ）卵巣癌に局在化した標識の存在を検出すること、
を含む方法。
【請求項１９】
試薬がｈＫ６を認識する抗体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
標識が放射性標識、蛍光標識、核磁気共鳴活性標識、陽電子放出断層撮影（「ＰＥＴ」）スキャナーで検出可能な陽電子放出同位元素、化学発光物質または酵素マーカーである、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１ないし請求項２０のいずれかに記載の方法を実行するためのキット。
【請求項２２】
酵素で標識されたｈＫ６特異的抗体；および酵素の基質を含む、請求項１ないし請求項２０のいずれかに記載の方法を実行するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、卵巣癌腫の診断および予後方法に関するものである。
【０００２】
発明の背景
最近まで、ヒトカリクレイン遺伝子ファミリーは３遺伝子のみからなると考えられていた：膵臓／腎臓カリクレイン（ＫＬＫ１、ｈＫ１タンパク質をコードする）、ヒト腺カリクレイン２（ＫＬＬ２、ｈＫ２タンパク質をコードする）およびヒトカリクレイン３（ＫＬＫ３、ｈＫ３タンパク質、あるいは前立腺特異的抗原、ＰＳＡをコードする）。後の２種のカリクレイン、即ちＰＳＡおよびｈＫ２は、比較的前立腺特異的であり、これらには既に前立腺癌の診断およびモニタリング用バイオマーカーとしての重要な適用法が見出されている（１−６）。
【０００３】
ヒトカリクレイン遺伝子ファミリーの新構成員が最近発見された（１）。今やこの遺伝子ファミリーは少なくとも１４種の遺伝子を含み、これらは全てセリンプロテアーゼをコードし、ＤＮＡとアミノ酸のレベルの両方で有意な相同性を示す。そしてこれらは、他の非カリクレイン遺伝子に挿入されることなく全て染色体座１９ｑ１３．３−ｑ１３．４に縦列に位置する。この分野の研究は、最近概説された（１）。
【０００４】
ＫＬＫ６遺伝子（ヒトカリクレイン６、ｈＫ６をコードする）は、３研究グループにより独立にクローニングされ、以前にザイム（ｚｙｍｅ）（７）、プロテアーゼＭ（８）、およびニューロシン（ｎｅｕｒｏｓｉｎ）（９）の名称を付けられていた。最近、全ての新規発見および伝統的カリクレイン遺伝子についての均一な命名法が確立された（１０）。ＫＬＫ６遺伝子は、２４４アミノ酸長のトリプシン様セリンプロテアーゼをコードし、その１６アミノ酸はシグナルペプチドを構成し、５アミノ酸は活性化ペプチドを構成する。成熟型酵素は２２３アミノ酸からなる。ｈＫ６は分泌タンパク質であることが以前に予想された（７−９、１１）。このことは、ｈＫ６タンパク質が脳脊髄液、乳頭吸引液、乳房嚢胞液、男性および女性の血清、精漿、羊水および乳癌細胞質を含む様々な体液中で見つかったことにより、最近立証された（１２）。Ｌｉｔｔｌｅ ら（７）は、この酵素が脳内でアミロイド生成（ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃ）能力を有し、アルツハイマー病の発生と進行に関与し得ると論証した。他は、ディファレンシャル・ディスプレイ法により同じ遺伝子をクローニングし、それが乳癌の攻撃的な形態では下方調節されていることを見出した（８）。同じ遺伝子は Ｙａｍａｓｈｉｒｏ らによって、ヒト結腸腺癌細胞系のＣＯＬＯ２０１からクローニングされた（９）。
【０００５】
古典的ヒトカリクレインの中で、ＰＳＡは最も価値ある前立腺癌のバイオマーカーであると証明され、現在この疾病の診断およびモニタリングに使用されている（２−４）。別の見込みある前立腺バイオマーカーのｈＫ２もまた、最近導入された（５、６）。新たに発見されたカリクレイン（１）の中では、いずれもいかなる悪性腫瘍の血清マーカーとしても調べられていない。なぜなら、現在のところ、高い敏感度と特異度を有する分泌タンパク質を測定する方法が存在しないからである。
【０００６】
卵巣癌は、女性の生殖器系の他のいかなる癌よりも死を引き起こしやすい、深刻な疾病である（１３）。この疾病は、早期に診断されれば生存率が劇的に改善されるので、早期検出を助け、悪性度（ｇｒａｄｅ）および／または病期（ｓｔａｇｅ）分けを容易にするバイオマーカーの同定に大きな関心がある（１５）。不幸なことに、ＣＡ１２５（１６−１９）、インヒビン（２０−２３）、ＯＶＸ１（２４）並びに他のマーカー（２５に概説）を含む現在の卵巣癌腫血清マーカーは、幾許かの見込みを示したが、広範な臨床的好評を博してはいない。もう１つの見込みある卵巣癌マーカーである、リソホスファチジン酸（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）も、この目的のためには同じ価値を有するようである（２６）。
【０００７】
卵巣癌腫の新しいバイオマーカーの発見と確認に、至急の要望がある。特に、血清分析による卵巣癌の早期診断は、効果的な処置の適用を介して臨床成果を改善し得る。
【０００８】
発明の概要
種々の体液中のｈＫ６を測定するための高感度ｈＫ６免疫アッセイが開発された（実施例１）。この鋭敏なアッセイを使用して、卵巣癌患者の大部分で血清中のｈＫ６濃度が有意に増大していることが見出された。特に、正常非癌患者および良性疾病の患者と比較すると、ｈＫ６は卵巣癌患者で有意に増大していると見出された。従って、ｈＫ６は、卵巣癌の診断およびモニタリング用の新しいバイオマーカーを構成する。ｈＫ６は、後期卵巣癌の診断およびモニタリングに使用し得、そして手術前または再発後のバイオマーカーとしても使用し得る。
【０００９】
本発明はまた、卵巣腫瘍抽出物中のｈＫ６量を定量し、ｈＫ６の量と、手術による切除の時に記録した臨床病理的変量とを、そして無進行生存率および全生存率とを関連付けた。ｈＫ６レベルの増大は、長期にわたりより攻撃的な腫瘍行動を予測するものであると分かった。ｈＫ６陽性は、疾病の進行と死の両方のリスクにおいて、約２倍の増大に伴うことが分かった。
【００１０】
ｈＫ６およびｈＫ６に結合する試薬は、卵巣癌を検出するのに使用し得る。特に、それらは卵巣癌の診断的評価および卵巣癌の素因のある患者の同定に使用できる。
【００１１】
本発明は、対象由来のサンプル中のｈＫ６を測定することを含む、対象の卵巣癌を診断およびモニタリングする方法に関連する。ｈＫ６は、ｈＫ６を検出または結合する試薬、好ましくはｈＫ６またはその一部に特異的に反応性である抗体を使用して測定し得る。
【００１２】
本発明のある態様では、
（ａ）患者由来のサンプルを採取すること；
（ｂ）サンプル中のｈＫ６を検出または同定すること；および
（ｃ）検出される量を基準で検出される量と比較すること、
を含む、患者の卵巣癌に伴うｈＫ６を検出するための方法が提供される。
【００１３】
本発明はまた、（ａ）対象から生体サンプルを入手すること；（ｂ）該サンプル中のｈＫ６量を検出すること；および（ｃ）検出された該ｈＫ６量を、予め決定された基準と比較すること、但し、基準のものよりも高いレベルのｈＫ６の検出は、卵巣癌、特に後期の卵巣癌の存在を示すものである、を含む、卵巣癌について対象を調べる方法にも関連する。
【００１４】
「検出」または「検出する」の用語は、標的であるｈＫ６、そのサブユニット、または試薬に結合した標的の組合せなどの有無を、アッセイすること、定量すること、イメージングすることまたはその他の方法で確立すること、並びに卵巣癌、転移、病期、または類似する状態の１つまたはそれ以上の事実に基づく特徴について、アッセイすること、イメージングすること、確認すること、確立すること、またはその他の方法で判定することを含む。この用語は、ｈＫ６についての診断、予後、モニタリングの適用を包含する。
【００１５】
ある実施態様では、本発明は、（ａ）生体サンプルを、検出可能な物質で直接または間接的に標識されたｈＫ６特異的抗体と反応させること；および（ｂ）検出可能な物質を検出すること、を含む、対象由来の生体サンプル中のｈＫ６を定量することにより対象中の卵巣癌を検出する方法に関連する。
【００１６】
本発明はさらに、（ａ）対象由来の生体サンプルを、検出可能な物質で直接または間接的に標識されたｈＫ６特異的抗体と反応させること；および（ｂ）検出可能な物質を検出すること、を含む、対象由来のサンプル中のｈＫ６を定量することにより対象中の卵巣癌腫を診断およびモニタリングする方法に関連する。
【００１７】
本発明の方法の実施態様は、（ａ）対象由来の生体サンプルを、酵素で直接または間接的に標識されたｈＫ６特異的抗体と反応させること；（ｂ）酵素の基質を添加すること、但し、基質は、基質または酵素と基質の反応生成物が蛍光錯体を形成するように選択する；（ｃ）蛍光錯体の蛍光を測定することにより、サンプル中のｈＫ６を定量すること；および（ｄ）定量したレベルを基準のものと比較すること、を含む。基準は、対象患者由来の他のサンプルまたは対照対象について得られるレベルに相応し得る。ある実施態様では、定量したレベルを卵巣癌腫のない対象について定量されたレベルと比較する。その際、対照対象と比較して増大したｈＫ６レベルは、卵巣癌腫、特に後期の卵巣癌腫を示すものである。
【００１８】
本発明の好ましい実施態様は、以下の段階を含む。
（ａ）生体サンプルを、検出可能な物質で直接または間接的に標識された第一のｈＫ６特異的抗体、および固定された第二のｈＫ６特異的抗体と反応させること；
（ｂ）第一抗体を第二抗体から分離させ、第一抗体相と第二抗体相を生じさせること；
（ｃ）第一または第二抗体相中の検出可能な物質を検出することにより、生体サンプル中のｈＫ６を定量すること；および
（ｄ）定量されたｈＫ６を基準のレベルと比較すること。
【００１９】
基準は、健康な対照対象由来、良性疾病の対象由来、早期疾病の対象由来、または対象のその他のサンプル由来のサンプルについて定量されるレベルに相応し得る。基準と比較して増大したｈＫ６レベルは、卵巣癌、特に後期の卵巣癌を示すものである。
【００２０】
本発明は、複数の卵巣癌マーカーを使用する本明細書に記載の方法も企図している。従って、本発明は、ｈＫ６および卵巣癌特異的インジケーターである他のマーカーの存在について、生体サンプルを分析する方法を企図している。他のマーカーには、ヒト角質層キモトリプシン酵素（ＨＳＣＣＥ）、カリクレイン４、カリクレイン５、カリクレイン８、カリクレイン９、カリクレイン１０、カリクレイン１１などのカリクレイン；ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＯＶＸ１、リソホスファチジン酸（ＬＰＡ）および癌胚抗原（ＣＥＡ）に対するマーカーが含まれる。好ましくは、他のマーカーはカリクレインマーカーである。好ましい実施態様では、マーカーは、ｈＫ６、ｈＫ１０、およびＣＡ１２５の２種またはそれ以上である。本明細書に記載の方法は、さらなるマーカーまたはマーカーの核酸を検出するための試薬を含めることにより改変してもよい。
【００２１】
本発明はまた、
（ａ）腫瘍を、ｈＫ６に結合する試薬と、腫瘍に伴うｈＫ６に試薬を結合させるのに十分な時間インキュベートすること、但し、試薬は腫瘍イメージング用の標識を帯びている；
（ｂ）腫瘍に局在化した標識の存在を検出すること、
を含む、ｈＫ６を伴う腫瘍のイメージング方法にも関連する。
【００２２】
発明のある態様に従って、１種またはそれ以上のカリクレインを標的とするように構築された試薬を対象に投与することを含む、インビボの方法が提供される。
【００２３】
従って、本発明は、イメージング用の標識を帯び、かつカリクレイン、好ましくはｈＫ６、に結合する１種またはそれ以上の試薬を哺乳動物に投与し、次いで哺乳動物をイメージングすることを含む、インビボの方法を企図している。
【００２４】
発明の好ましい態様によると、
（ａ）カリクレイン６に結合する試薬を患者に注射すること、但し、試薬は卵巣癌イメージング用の標識を帯びている；
（ｂ）試薬をインビボでインキュベートさせ、卵巣癌に伴うカリクレイン６に結合させること；および
（ｃ）卵巣癌に局在化した標識の存在を検出すること、
を含む、卵巣癌をイメージングするためのインビボ方法が提供される。
【００２５】
発明のある実施態様では、試薬はカリクレインを認識する抗体である。発明の別の実施態様では、試薬はカリクレインを認識する化学物質である。
【００２６】
試薬は、カリクレインをイメージングするための標識を帯びている。イメージングに有用な標識の例は、放射性標識、蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、核磁気共鳴活性標識、陽電子放出断層撮影（「ＰＥＴ」）スキャナーで検出可能な陽電子放出同位元素、ルシフェリンなどの化学発光物質、およびペルオキシダーゼやフォスファターゼのような酵素マーカーである。短距離検出器プローブで検出可能な短距離放射線放射物質も採用できる。
【００２７】
本発明はまた、複数の卵巣癌マーカーを使用する、本明細書に記載の局在化またはイメージングの方法も企図している。例えば、卵巣癌イメージング用の方法は、ヒト角質層キモトリプシン酵素（ＨＳＣＣＥ）、カリクレイン４、カリクレイン５、カリクレイン８、カリクレイン９、カリクレイン１０、カリクレイン１１、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＯＶＸ１、リソホスファチジン酸（ＬＰＡ）または癌胚抗原（ＣＥＡ）、好ましくはＣＡ１２５、に結合する１種またはそれ以上の試薬を患者に注射することをさらに含み得る。
【００２８】
本発明はまた、発明の方法を実行するためのキットにも関連する。
【００２９】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明白になる。しかしながら、本発明の精神と範囲の内での様々な変更や改変は、この詳細な説明から当業者に明らかになるので、詳細な説明と特定の実施例は、発明の好ましい実施態様を示す一方で、例示説明のみに供されると理解すべきである。
【００３０】
図面の説明
ここで、図面に関して発明を説明する。
図１は、ｈＫ６タンパク質アッセイの較正曲線である。ゼロ基準の蛍光（〜１８，０００任意蛍光単位）を、他の全測定値から差引いた。
図２は、３種の体液の高速液体クロマトグラフィーによる分離と、開発されたｈＫ６免疫アッセイによる全画分の分析の結果を示す。３種全部の液中で、〜３０ｋＤａの分子量に相当する画分３８−４２の辺りで単一の免疫反応性ピークが検出された。カラムを分子量基準で較正した（上部に矢印で示す；量はｋＤａ表記である）。乳汁のサンプルは、ＨＰＬＣカラムに注入する前に１０倍に希釈した。
【００３１】
図３は、様々なヒト組織細胞質抽出物の、ｈＫ６タンパク質についての分析結果を示すグラフである。
図４は、８０人の卵巣癌腫患者の血清におけるｈＫ６濃度の度数分布を示すグラフである。表１でカットオフとして使用した１５μｇ／Ｌのレベルを矢印で示す。約６６％の卵巣癌患者は、このカットオフ値よりも高い血清ｈＫ６濃度を有する。他の２９８個の非卵巣癌の血清サンプルからは、ほんの２個の血清が１５μｇ／Ｌよりわずかに高い値を有した（表１参照）。
【００３２】
図５は、卵巣癌患者由来の９６個の血清サンプルにおけるｈＫ６濃度とＣＡ１２５濃度との間の相関を示すグラフである。
図６は、卵巣癌患者からの連続的血清サンプルにおけるｈＫ６とＣＡ１２５の分析を示すグラフである。これらのデータは、ｈＫ６が患者のモニタリングに価値があることを示唆する。
【００３３】
図７Ａは、正常、良性、癌患者でのｈＫ６分布を示すグラフである。
図７Ｂは、正常、良性、癌患者でのＣＡ１２５分布を示すグラフである。
図８は、手術前と手術後の卵巣癌患者の血清サンプルにおけるｈＫ６濃度を示すグラフである。
図９は、血清ｈＫ６濃度とＣＡ１２５濃度との間の相関を示すグラフである。
図１０は、血清ｈＫ６濃度の敏感度と特異度を示すグラフである。
図１１Ａは、ｈＫ６濃度対卵巣癌の病期を示すグラフである。
図１１Ｂは、ｈＫ６濃度対卵巣癌の悪性度を示すグラフである。
図１２Ａは、生存可能性対無進行生存（ＰＦＳ）を示すグラフである。
図１２Ｂは、生存可能性対全生存（ＯＳ）を示すグラフである。
【００３４】
図１３（Ａ）は、卵巣腫瘍抽出物におけるｈＫ６比活性の度数分布を示すグラフである。３５ｎｇ／ｍｇ総タンパク質の値は、カイ二乗解析によると、研究集団の全生存率を最も良好に予測する境界に相当する（カイ二乗プロットは、図１３（Ｂ）参照）。３５ｎｇ／ｍｇ総タンパク質を超えるｈＫ６の腫瘍はｈＫ６陽性と分類し、そして３５ｎｇ／ｍｇ総タンパク質より少ないか、または等しい値のものはｈＫ６陰性と分類した。この基準により、腫瘍の３０％が陽性と分類された。（Ｂ）最も良好に全生存率を予測するｈＫ６陽性腫瘍とｈＫ６陰性腫瘍との間の境界を判定するための、ｈＫ６腫瘍比活性対カイ二乗統計値のプロット。最大の潜在的予測能力は、２８ないし４０ｎｇｈＫ６総抽出タンパク質で生じ、ピークは３５ｎｇｈＫ６／ｍｇ総抽出タンパク質であった。
【００３５】
図１４は、正常卵巣組織（「正常」）および卵巣癌（「癌」）からの抽出物中のｈＫ６濃度の比較を示すグラフである。Ｎは、各グループの試料数を示す。水平の棒は、各グループにおけるｈＫ６比活性の中央値（ｎｇ ｈＫ６／ｍｇ総抽出タンパク質）を表す。クラスカル・ワリス検定により、抽出されたｈＫ６の比活性は、卵巣腫瘍標本で有意に上昇したことが示された（Ｐ＜０．００１）。
【００３６】
図１５は、Ｉ／ＩＩ期およびＩＩＩ／ＩＶ期の卵巣癌患者由来のの腫瘍抽出物中の、ｈＫ６比活性（ｎｇ ｈＫ６／ｍｇ総抽出タンパク質）の分布を示すグラフである。Ｎは、各グループに含まれる腫瘍数を示す。水平の棒は、ｈＫ６腫瘍比活性の中央値を表す。マン・ホイットニー検定により、ｈＫ６比活性は、ＩＩＩ／ＩＶ期の卵巣癌患者からの腫瘍において有意に上昇したことが論証された（Ｐ＝０．００２）。
【００３７】
図１６は、研究下にある全患者集団のカプラン・マイヤーの生存率曲線：ｈＫ６状態の影響を示す。上：無進行生存率（ＰＦＳ）。下：全生存率（ＯＳ）。各グループの患者数（ｎ）は、ｈＫ６陽性とｈＫ６陰性との間の生存率の差異について統計的に有意である（Ｐ値）と示されている。進行と全生存の両方の時間に対するｈＫ６陽性の悪影響は、有意である。
【００３８】
図１７は、程度ＩおよびＩＩの卵巣腫瘍患者における、無進行生存率（ＰＦＳ）と全生存率（ＯＳ）に対するｈＫ６状態（陽性または陰性）の影響を示すグラフである。各グループの患者数（ｎ）は、ｈＫ６陽性の個体とｈＫ６陰性の個体との間の生存率の差異について統計的に有意である（Ｐ値）と示されている。進行と全生存の両方の時間に対するｈＫ６陽性の悪影響は、有意である（Ｐ＜０．００２）。
【００３９】
図１８は、様々な悪性状態、細胞タイプおよび起源（上皮性対間葉性）の卵巣新生物における、ｈＫ６の免疫組織学的局在を示すブロットである。（Ａ）卵巣の一般的な悪性上皮性腫瘍である、侵襲性乳頭漿液腺癌（ｉｎｖａｓｉｖｅ ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｓｅｒｏｕｓ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）。多数の腫瘍細胞の強い細胞質染色と、ストロマや脈管に全く染色がないことに注目されたい。（Ｂ）上皮性と繊維性の良性混合新生物である、漿液性嚢胞線維腫。繊維状成分に免疫染色は見られないが、嚢胞を囲む上皮の細胞質では強い陽性である。（Ｃ）良性平滑筋腫瘍である、卵巣平滑筋腫。染色がないことに注目されたい。（Ｄ）悪性状態が低い、中間的悪性度の上皮腫瘍である、ムチン上皮腫瘍。新生物上皮の弱い、拡散した細胞質染色と、支持ストロマに染色がないことに注目されたい（左端）。
【００４０】
発明の詳細な説明
前述のように、本発明は対象由来の生体サンプル中のｈＫ６を検出することにより、対象の卵巣癌腫をモニタリング、診断または予後する方法を提供する。ある実施態様では、本方法は、ｈＫ６に結合する試薬、好ましくは検出可能な物質で直接または間接的に標識されたｈＫ６特異的抗体、とサンプルを反応させること、および検出可能な物質を検出することを含む。
【００４１】
本発明の方法は、非疾患状態と比べて過剰量または不足量のｈＫ６、または疾患状態（例えば、卵巣癌）もしくは疾患状態への進行に相応する、修飾されたｈＫ６（例えば、全長に満たない）の存在の検出に使用してもよい。本明細書に記載した方法は、例えば宿主から新たに取出した細胞グループ中の、悪性または前悪性細胞の存在可能性を評価するのに使用してもよい。かかる方法は、腫瘍の検出、その成育の定量、および疾病の診断および予後の補助に使用できる。本方法は、癌転移の存在の検出、並びに手術、癌化学療法、および／または放射線療法後の、全腫瘍の非存在または除去の確認に使用できる。それらはさらに、癌化学療法および腫瘍の再出現のモニタリングに使用できる。
【００４２】
本発明の方法は、後期卵巣癌腫の診断、および卵巣癌腫の疾病進行と致死性の予後に特に有用である。本明細書に例示説明するように、基準と比較して増大したレベルのｈＫ６が血清中に検出されることは、後期疾病を示すものであり、そして基準と比較して増大したレベルのｈＫ６が腫瘍組織またはその抽出物中に検出されることは、疾病進行および致死性のリスクの増大を示すものである。
【００４３】
「サンプル」「生体サンプル」などの用語は、ｈＫ６を発現または含有すると分かっているか、または疑われる材料を意味する。試験サンプルは、供給源から得たまま直接か、あるいはサンプルの特性を改変する予処理に続いて、使用できる。サンプルは、細胞（例えば腫瘍細胞）を含む組織または抽出物、および例えば血液全体、血漿、血清、唾液、眼のレンズ液、脳脊髄液、汗、尿、乳汁、腹水、滑液、腹水などの、生理的液体などのいかなる生体供給源にも由来することができる。サンプルは、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトから入手できる。サンプルは、血液から血漿を調製する、粘性の液を希釈するなど、使用前に処理できる。処理方法は、濾過、蒸留、抽出、濃縮、妨害物質の不活性化、試薬の添加などを含むことができる。タンパク質をサンプルから単離し、本発明の方法に利用してもよい。好ましい実施態様では、生体サンプルは、血清または腫瘍組織抽出物であり、最も好ましくは血清である。
【００４４】
本発明の実施態様では、本明細書に記載の方法を、対象由来の生体サンプル中のｈＫ６を検出することによる、卵巣癌腫の診断およびモニタリングに、そして予想に適合させる。これらの適用は、試験される対象に由来するサンプル中に検出されるｈＫ６の量を、他のサンプルまたは対象由来の以前のサンプルに検出されるレベル、または対照サンプルに検出されるレベルと比較することを要する。健康な対象または良性疾病の対象に由来する対照サンプルのレベルは、予期的および／または遡及的な統計的研究により確立し得る。臨床的に明らかな疾病または異常を持たない健康な対象を、統計的研究のために選択し得る。診断は、対照サンプルまたは同一対象で検出された過去のレベルと比較して、統計的に異なるｈＫ６レベルを見出すことによってなされ得る。
【００４５】
「ｈＫ６」の用語は、ヒトカリクレイン６（ザイム、プロテアーゼＭおよびニューロシンとしても知られる）を表し、それは２４４アミノ酸長のトリプシン様セリンプロテアーゼであり、その１６アミノ酸はシグナルペプチドを構成し、５アミノ酸は活性化ペプチドを構成する（７、８および９）。この用語は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０１３９８８、ＡＦ１４９２８９、ＨＳＵ６２８０１、Ｄ７８２０３およびＮＭ００２７７４のヒトカリクレイン６の全ての相同体、天然産生対立遺伝子変異体、アイソフォームおよび前駆体を包含する。一般的に、例えば、ヒトカリクレイン６の天然産生対立遺伝子変異体は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０１３９８８、ＡＦ１４９２８９、ＨＳＵ６２８０１、Ｄ７８２０３およびＮＭ００２７７４に示される配列と有意な相同性（７０−９０％）を共有する。対立遺伝子変異体は、ＫＬＫ６配列からの保存的アミノ酸置換を含有し得、あるいは、例えばマウスカリクレイン６相同体などのｈＫ６相同体中の相応する位置からのアミノ酸置換を含有するであろう。
【００４６】
「対象」の用語は、卵巣癌に冒されているか、または冒されている疑いのある、哺乳動物などの温血動物を表す。好ましくは、「対象」はヒトを表す。
【００４７】
本発明の方法で使用するｈＫ６特異的抗体は、科学的または商業的供給源から入手し得る。あるいは、単離した天然のｈＫ６または組換えｈＫ６を、抗体、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、および免疫学的に活性な断片（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２断片）、抗体重鎖、抗体軽鎖、ヒト化抗体、遺伝子的に加工した一本鎖Ｆｖ分子（Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ， 米国特許第４，９４６，７７８号）、または、例えばマウス抗体の結合特異性を有するが、残りの部分はヒト由来である、キメラ抗体の調製に使用してもよい。モノクローナルおよびポリクローナル抗体、断片およびキメラを含む抗体は、当業者に既知の方法を使用して調製し得る。好ましくは、本発明の方法で使用する抗体は、１０−７Ｍより大きいか、または等しいＫａで結合する場合、ｈＫ６に対して反応性である。本発明のサンドイッチ免疫アッセイでは、マウスポリクローナル抗体とウサギポリクローナル抗体を利用する。
【００４８】
ｈＫ６と特異的に反応する抗体、または酵素結合もしくは標識誘導体などの誘導体は、様々な生体サンプル中のｈＫ６の検出に使用し得る。それらは例えば、タンパク質の抗原決定因子と抗体との結合相互作用に依存するいかなる既知の免疫アッセイにも使用し得る。かかるアッセイの例は、放射性免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光、免疫沈降、ラテックス凝集反応、血球凝集反応および組織学的試験である。
【００４９】
ｈＫ６特異的抗体は、検出可能な物質で標識され、検出可能な物質の存在に基づいて生体サンプル中で局在化または同定されてもよい。検出可能な物質の例には、以下のもの：放射性同位元素（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、ルミノールなどの発光標識；酵素標識（例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ）、ビオチン基（これは、例えば蛍光マーカーまたは光学的方法や熱量測定方法で検出できる酵素活性を含むストレプトアビジンなどの、マークしたアビジンで検出できる）、二次レポーターに認識される、予め決定したポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。ｈＫ６に反応する抗体に対する特異性を有する二次抗体の導入により一次抗原抗体反応が増幅される、間接的方法も採用し得る。例えば、ｈＫ６に特異性を有する抗体がウサギＩｇＧ抗体ならば、二次抗体は、本明細書に記載の検出可能な物質で標識されたヤギ抗ウサギガンマグロブリンであり得る。
【００５０】
上記の抗体を結合または標識する方法は、当業者に容易に達成される（例えば、Ｉｎｍａｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ３４， Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐａｒｔ Ｂ， Ｊａｋｏｂｙ ａｎｄ Ｗｉｃｈｅｋ （ｅｄｓ．）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐ． ３０， １９７４； および Ｗｉｌｃｈｅｋ ａｎｄ Ｂａｙｅｒ， ”Ｔｈｅ Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，” Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １７１：１−３２， １９８８ ｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ｏｒ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｅｎｚｙｍｅ ｏｒ ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐａｒｔｎｅｒ 参照）。
【００５１】
時間分解蛍光分析を、シグナルの検出に使用し得る。例えば、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ ＴＫ ａｎｄ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ １９９２：６４：３４２−３４６ に記載の方法を、従来の時間分解蛍光光度計を用いて使用してもよい。
【００５２】
従って、本発明の実施態様に従うと、ｈＫ６抗体を酵素で標識し、酵素の基質を添加する方法が提供される。但し、基質は基質または酵素と基質の反応生成物がランタニド金属と蛍光錯体を形成するように選択する。ランタニド金属を添加し、蛍光錯体の蛍光を測定することにより、サンプル中のｈＫ６を定量する。ｈＫ６特異的抗体は、直接または間接的に酵素で標識し得る。酵素は、酵素の基質または酵素と基質の反応生成物がユーロピウムやテルビウムなどのランタニド金属と錯体形成する能力に基づいて選択される。適する酵素の例には、アルカリフォスファターゼおよびβ−ガラクトシダーゼが含まれる。好ましくは、酵素はアルカリフォスファターゼである。ｈＫ６抗体は、間接的に酵素で標識してもよい。例えば、抗体をリガンド結合対の１パートナーと結合させ、酵素をリガンド結合対のもう一方のパートナーと共役させてもよい。代表例には、アビジン−ビオチンおよびリボフラビン−リボフラビン結合タンパク質が含まれる。好ましくは、抗体をビオチン化し、酵素をストレプトアビジンと共役させる。
【００５３】
本方法では、サンプル中のｈＫ６に結合した抗体を、酵素の基質を添加することにより検出する。基質は、ランタニド金属（例えば、ユーロピウム、テルビウム、サマリウムおよびジスプロシウム、好ましくはユーロピウムおよびテルビウム）の存在下で、基質または酵素と基質の反応生成物がランタニド金属と蛍光錯体を形成するように選択する。かかる蛍光錯体をもたらす酵素と酵素の基質の例は、Ｄｉａｍａｎｄｉｓ の米国特許第５，３１１２，９２２号に記載されている。一例として、抗体が直接または間接的にアルカリフォスファターゼで標識されているとき、本方法で採用する基質は、リン酸４−メチルウンベリフェリルまたはリン酸５−フルオロサリチルである。錯体の蛍光強度は、典型的には、例えば ＣｙｂｅｒＦｌｕｏｒ ６１５ Ｉｍｕｎｏａｎａｌｙｚｅｒ （Ｎｏｒｄｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｋａｎａｔａ， Ｏｎｔａｒｉｏ）などの時間分解蛍光強度計を使用して測定する。
【００５４】
サンプル、ｈＫ６特異的抗体またはｈＫ６は、固定化してもよい。適する担体の例は、アガロース、セルロース、デキストラン、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、リポソーム、カルボキシメチルセルロースポリスチレン、濾紙、イオン交換樹脂、プラスチックフィルム、プラスチックチューブ、ガラスビーズ、ポリアミン−メチルビニルエーテル−マレイン酸コポリマー、アミノ酸コポリマー、エチレン−マレイン酸コポリマー、ナイロン、絹などである。担体は、例えば、チューブ、試験プレート、ウェル、ビーズ、ディスク、球体などの形状であってもよい。固定化抗体は、例えば臭化シアン共役などの既知の化学または物理学的方法を使用して、材料を適する不溶担体と反応させることにより調製し得る。
【００５５】
ある実施態様によると、免疫アッセイでｈＫ６を測定することにより、本発明は血液サンプルまたは腫瘍組織抽出物、好ましくは血清サンプル中のｈＫ６を測定する手段を提供する。ｈＫ６の測定に様々な免疫アッセイ法を使用できることは、当業者に明らかである。一般に、ｈＫ６免疫アッセイ法は、競合または非競合的であり得る。典型的に、競合的方法には、固定化または固定可能なｈＫ６の抗体（抗ｈＫ６）と、標識化形態のｈＫ６を採用する。サンプルのｈＫ６と標識化ｈＫ６が抗ｈＫ６への結合を競合する。生じる抗ｈＫ６に結合した標識化ｈＫ６（結合画分）を、非結合のままのもの（非結合画分）から分離した後、結合または非結合画分のいずれかの標識の量を測定し、例えば標準曲線との比較によるなど、任意の従来の方法で試験サンプル中のｈＫ６量と相関させ得る。
【００５６】
好ましくは、ｈＫ６の測定に非競合的方法を使用する。最も一般的な方法は、「サンドイッチ」方法である。このアッセイでは、２種の抗ｈＫ６抗体を採用する。抗ｈＫ６抗体の一方は、直接または間接的に標識化し（「検出抗体」と呼ばれることもある）、他方を固定化または固定可能にする（「捕獲抗体」と呼ばれることもある）。捕獲および検出抗体を同時または連続的に試験サンプルと接触させることができる。連続的方法は、捕獲抗体をサンプルとインキュベートし、予め決定した時間の後、検出抗体を添加すること（「順行」方法と呼ばれることもある）により達成される；または、最初に検出抗体をサンプルとインキュベートし、次いで捕獲抗体を添加することもできる（「逆行」方法と呼ばれることもある）。必要なインキュベーションが起こった後、アッセイを完了するために、捕獲抗体を液状試験混合物から分離し、分離した捕獲抗体相または液状試験混合物の残りの少なくとも一部で標識を測定する。一般に、捕獲と検出抗体とに結合された（間に「サンドイッチ」された）ｈＫ６を含むので、それは捕獲抗体相で測定する。
【００５７】
典型的な２部位のｈＫ６免疫測定アッセイでは、捕獲および検出抗体の一方または両方は、ポリクローナル抗体である。検出抗体で使用する標識は、当分野で従来既知のいずれのものからも選択できる。標識は、酵素または化学発光部分であり得るが、放射性同位元素、発蛍光団、検出可能なリガンド（例えば、標識化されたリガンドの結合パートナーによる二次的結合により検出可能）などであってもよい。好ましくは、抗体は酵素で標識し、酵素と基質の反応生成物が蛍光錯体を形成するように選択された基質を添加することによって検出される。捕獲抗体は、試験混合物の残部から分離される手段を提供するように選択される。従って、捕獲抗体は、既に固定された形態または不溶形態でアッセイに導入でき、あるいは固定可能形態、つまりアッセイに捕獲抗体を導入した後で固定化を達成させられる形態であり得る。固定化捕獲抗体は、磁気粒子、ラテックス粒子、マイクロタイタープレートのウェル、ビーズ、キュベットまたは他の反応容器などの固相に、共有結合または非共有結合的に結合した抗体を含み得る。固定可能捕獲抗体の例は、例えばハプテン、ビオチンなどのリガンド部分で化学的に修飾され、固定化形態のリガンドの結合パートナー、例えば抗体、アビジンなど、との接触により後で固定化できる抗体である。ある実施態様では、固相に結合した捕獲抗体の種特異的抗体を使用して、捕獲抗体を固定化し得る。
【００５８】
本発明の特定のサンドイッチ免疫アッセイ方法は、ｈＫ６に対して反応性である２種の抗体、ｈＫ６に対して反応性である抗体に対する特異性を有する、酵素標識で標識化された二次抗体、および酵素の蛍光基質を採用する。ある実施態様では、酵素はアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）であり、基質はリン酸５−フルオロサリチルである。ＡＬＰは蛍光基質のリン酸５−フルオロサリチルからリン酸を切取り、５−フルオロサリチル酸（ＦＳＡ）を産生する。次いで、５−フルオロサリチル酸は、強い蛍光を発する三重複合体ＦＳＡ−Ｔｂ（３＋）−ＥＤＴＡを形成でき、これはＴｂ３＋蛍光を時間分解様式で測定することにより定量できる。蛍光強度は、本明細書に記載のように時間分解蛍光光度計を使用して測定する。
【００５９】
上記の免疫アッセイ方法と構成は、例示を意図しており、限定的意味ではなく、一般的に、本発明ではいかなる免疫アッセイ方法または構成も使用できることが理解される。
【００６０】
本発明の方法は、サンプル中のｈＫ６を定量するための診断キットを使用して実行できる。一例として、キットは、ｈＫ６特異的抗体、酵素で標識されたその抗体に対する抗体；および酵素の基質を含み得る。キットはまた、マイクロタイタープレートのウェル、基準、アッセイ希釈剤、洗浄緩衝液、粘着性プレートカバー、および／またはキットを使用して本発明の方法を実行するための指示書も含み得る。
【００６１】
ｈＫ６特異的抗体はまた、卵巣癌の管理におけるイメージング方法論で使用し得る。本発明は、ｈＫ６、および場合により１種またはそれ以上の他のカリクレイン、好ましくはｈＫ４、ｈＫ５、ｈＫ８、ｈＫ９、ｈＫ１０およびｈＫ１１を含むがこれらに限定されるわけではない、卵巣癌に伴うカリクレイン、を伴う腫瘍をイメージングするための方法を提供する。
【００６２】
本発明はまた、複数の卵巣癌マーカーを使用する、本明細書に記載のイメージング方法も企図している。例えば、卵巣癌をイメージングする方法は、ｈＫ６に結合する試薬と、ヒト角質層キモトリプシン酵素（ＨＳＣＣＥ）、カリクレイン４、カリクレイン５、カリクレイン８、カリクレイン９、カリクレイン１０、カリクレイン１１、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＯＶＸ１、リソホスファチジン酸（ＬＰＡ）または癌胚抗原（ＣＥＡ）、好ましくはＣＡ１２５に結合する、１種またはそれ以上の試薬を利用し得る。好ましくは、イメージング中に区別できるように、各試薬を標識化する。
【００６３】
ある実施態様では、本方法はインビボの方法であり、対象または患者は、イメージング標識を帯び、かつカリクレイン、好ましくはｈＫ６を標的化または結合する能力のある１種またはそれ以上の試薬を投与される。試薬をインビボでインキュベートし、腫瘍、好ましくは卵巣腫瘍に伴うカリクレイン（類）に結合させる。標識の存在は卵巣癌に局在化し、そして当業者に既知のイメージング装置を使用して局在化した標識を検出する。
【００６４】
試薬は、カリクレイン（類）を認識する抗体または化学物質であり得る。発明のある態様では、試薬は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、またはそれらの断片、または一本鎖抗体、二価抗体、分子認識ユニット、およびペプチドまたはペプチドを模倣する成分を含むがこれらに限定されるわけではない、それらの構成要素である。本発明の方法で使用するカリクレイン特異的抗体は、科学的または商業的供給源から入手し得、あるいは単離した天然カリクレインまたは組換えカリクレインを、本明細書に記載のように抗体などを調製するのに利用してもよい。
【００６５】
試薬は、カリクレイン特異的抗体のエピトープを模倣し、かつカリクレインに結合するペプチドであってもよい。ペプチドは、従来の固相化学を使用して、合成業者で産生され得る。一例として、Ｎ２Ｓ２キレートが錯体形成するチロシン、リジンまたはフェニルアラニンのいずれかを含むペプチドを調製し得る（米国特許第４，８９７，２５５参照）。抗カリクレインペプチド結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を、次いで放射性標識（例えば、９９ｍＴｃ過テクネチウム酸ナトリウムまたは１８８Ｒｅ過レニウム酸ナトリウム）と組合せ、それをカリクレイン産生腫瘍の位置を知るのに使用し得る。
【００６６】
試薬は、カリクレインをイメージングするための標識を帯びる。試薬は、放射性核種イメージングで使用するために標識化し得る。特に、試薬は直接または間接的に放射性同位元素で標識化し得る。本発明で使用し得る放射性同位元素の例は、以下のものである：２７７Ａｃ、２１１Ａｔ、１２８Ｂａ、１３１Ｂａ、７Ｂｅ、２０４Ｂｉ、２０５Ｂｉ、２０６Ｂｉ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、８２Ｂｒ、１０９Ｃｄ、４７Ｃａ、１１Ｃ、１４Ｃ、３６Ｃｌ、４８Ｃｒ、５１Ｃｒ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、１６５Ｄｙ、１５５Ｅｕ、１８Ｆ、１５３Ｇｄ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ｇａ、１９８Ａｕ、３Ｈ、１６６Ｈｏ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１１５ｍＩｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８９Ｉｒ、１９１ｍＩｒ、１９２Ｉｒ、１９４Ｉｒ、５２Ｆｅ、５５Ｆｅ、５９Ｆｅ、１７７Ｌｕ、１５Ｏ、１９１ｍ−１９１Ｏｓ、１０９Ｐｄ、３２Ｐ、３３Ｐ、４２Ｋ、２２６Ｒａ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、８２ｍＲｂ、１５３Ｓｍ、４６Ｓｃ、４７Ｓｃ、７２Ｓｅ、７５Ｓｅ、１０５Ａｇ、２２Ｎａ、２４Ｎａ、８９Ｓｒ、３５Ｓ、３８Ｓ、１７７Ｔａ、９６Ｔｃ、９９ｍＴｃ、２０１Ｔｌ、２０２Ｔｌ、１１３Ｓｎ、１１７ｍＳｎ、１２１Ｓｎ、１６６Ｙｂ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、８８Ｙ、９０Ｙ、６２Ｚｎおよび６５Ｚｎ。好ましくは、放射性同位元素は１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉ、９９ｍＴｃ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、３２Ｐ、１５３Ｓｍ、６７Ｇａ、２０１Ｔｌ、７７Ｂｒ、または１８Ｆであり、光学スキャン装置でイメージングされる。
【００６７】
生体試薬を放射性同位元素で標識化する手法は、当分野で一般的に知られている。米国特許第４，３０２，４３８号は、トリチウム標識化の手法を記載している。特にマウスのモノクローナル抗体に適合させた、ヨウ化物化、トリチウム標識化、および３５Ｓ標識化の手法は、Ｇｏｄｉｎｇ， Ｊ． Ｗ． （前出、ｐｐ １２４−１２６）およびそこで引用されている文献に記載されている。抗体、その結合部分、プローブ、またはリガンドなどの生体試薬をヨウ化物化する他の手法は、科学文献に記載されている（Ｈｕｎｔｅｒ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ， Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５ （１９６２）， Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：１０１４−１０２１ （１９７４） および 米国特許第３，８６７，５１７号および第４，３７６，１１０号参照）。試薬のヨウ化物化手法は、Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ８９：１１４−１２３ （１９６３）； Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ， Ｊ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １１３：２９９−３０５ （１９６９）； および Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２８９−２９７ （１９７１） に記載されている。９９ｍＴｃ−標識化手法は、Ｒｈｏｄｅｓ， Ｂ． ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｂｕｒｃｈｉｅｌ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ： Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｍａｓｓｏｎ １１１−１２３ （１９８２） およびこれらで引用されている文献に記載されている。抗体または断片のテクネチウム−９９ｍによる標識化はまた、例えば米国特許第５，３１７，０９１号、米国特許第４，４７８，８１５号、米国特許第４，４７８，８１８号、米国特許第４，４７２，３７１号、米国特許第Ｒｅ３２，４１７号および米国特許第４，３１１，６８８号に記載されている。１１１Ｉｎ−標識化生体試薬に適する手法は、Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ， Ｄ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ６５：１４７−１５７ （１９８３）， Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ， ３５：５５４−５５７ （１９８４）， および Ｂｕｃｋｌｅｙ， Ｒ． Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｆ．Ｅ．Ｂ．Ｓ． １６６：２０２−２０４ （１９８４）に記載されている。
【００６８】
本発明のインビボ方法のために、試薬はまた、常磁性同位元素で標識化してもよい。磁気共鳴イメージングで有用な要素の例には、ガドリニウム、テルビウム、スズ、鉄、またはこれらの同位元素が含まれる（インビボ核磁気共鳴イメージングについての考察には、例えば Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） ＪＡＣＣ １４， ４７２−４８０； Ｓｈｒｅｖｅ ｅｔ ａｌ．， （１９８６） Ｍａｇｎ． Ｒｅｓｏｎ． Ｍｅｄ． ３， ３３６−３４０； Ｗｏｌｆ， Ｇ Ｌ．， （１９８４） Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓ． Ｍｅｄ． ＮＭＲ １６， ９３−９５； Ｗｅｓｂｅｙ ｅｔ ａｌ．， （１９８４） Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓ． Ｍｅｄ． ＮＭＲ １６， １４５−１５５； Ｒｕｎｇｅ ｅｔ ａｌ．， （１９８４） Ｉｎｖｅｓｔ． Ｒａｄｉｏｌ． １９， ４０８−４１５ を参照）。
【００６９】
放射性標識化試薬の場合、試薬を患者に投与してもよく、それはその試薬が結合するカリクレインを有する腫瘍に局在化し、例えばガンマカメラやエミッション・トモグラフィを使用する放射性核種スキャニングなどのインビボの既知技法を使用して、検出または「イメージング」される（例えば　Ａ． Ｒ． Ｂｒａｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｍａｇｉｎｇ”， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｒ． Ｗ． Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．， （ｅｄｓ．）， ｐｐ． ６５−８５ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）参照）。Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ にある Ｐｅｔ ＶＩ と呼ばれるスキャナーのような、陽電子放出軸横断トモグラフィスキャナー（ｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｒａｎｓａｘｉａｌ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ｓｃａｎｎｅｒ）も、放射性標識が陽電子を放出する場合（例えば、１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏ、および１３Ｎ）に使用できる。
【００７０】
放射性同位元素標識化試薬を使用する全身イメージング技法を、一次腫瘍と転移した腫瘍の両方の位置を知るために使用できる。カリクレイン特異的抗体、または同じエピトープ特異性を有するその断片を、適する放射性核種またはその組合せに結合させ、非経口的に投与する。卵巣癌には、投与は、好ましくは静脈注射である。標識の生体分布をシンチグラフィーでモニタリングし、標識の蓄積を卵巣癌細胞の存在と関連付ける。全身イメージング技法は、米国特許第４，０３６，９４５号および第４，３１１，６８８号に記載されている。診断および治療的使用に有用な、抗体および抗体断片と対になれる試薬の他の例には、金属結合性タンパク質および断片（例えば、米国特許第４，７３２，８６４号）が含まれる。これらの試薬は、癌、特に卵巣癌の病期診断（ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｓｔａｇｉｎｇ）および可視化に有用であり、手術および／または放射線処置計画をより効果的に使用できるようにする。
【００７１】
本発明は、本発明の方法を実行するためのキットも企図している。キットは、抗体またはカリクレインのエピトープに特異的に結合する抗体断片、および腫瘍細胞に伴うエピトープへの抗体の結合を検出する手段を、使用前にさらに希釈され得る濃縮物（凍結乾燥組成物を含む）として、あるいは使用時の濃度で含み、バイアルは１またはそれ以上の用量を含み得る。キットがインビボでの使用を企図されている場合、所望の量と濃度の試薬を有する単用量を滅菌容器内に提供してもよい。直接的使用のための製剤を提供する容器は、通常他の試薬を必要としない。例えば、キットがインビボイメージング用の放射性標識抗体の調製物を含有する場合である。
【００７２】
以下の非限定的実施例は、本発明の例示説明である。
実施例１
ヒトカリクレイン６（ザイム／プロテアーゼＭ／ニューロシン）の免疫蛍光測定アッセイ
材料と方法
ジフルーニサルリン酸塩（ＤＦＰ）は、実験室で合成した（ジフルーニサルは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ から入手した）。ＤＦＰ原液は、０．１モル／Ｌ ＮａＯＨ中、０．０１モル／Ｌであった。ＤＦＰ原液は、４℃で少なくとも６ヶ月間安定である。アルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＧＡＲＩｇ−ＡＬＰ）とヒツジ抗マウス免疫グロブリンＧ（Ｆｃフラグメント特異的）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ から入手した。ＧＡＲＩｇ−ＡＬＰの作業溶液は、アッセイ緩衝液（後述）中で原液を３，０００倍に希釈して調製した。白色、不透明の１２−ウェルポリスチレンマイクロタイター小片は、Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｓ．， Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ， ＶＡ から入手した。基質緩衝液は、１リットル当り０．１モルのＮａＣｌと１ｍモルのＭｇＣｌ２を含有するトリス緩衝液（０．１モル／Ｌ、ｐＨ９．１）であった。基質作業溶液（ＤＦＰ、基質緩衝液中１ｍモル／Ｌ）は、ＤＦＰ原液を基質緩衝液中で１０倍に希釈して使用直前に調製した。洗浄溶液は、１Ｌの１０ｍモル／Ｌトリス緩衝液、ｐＨ７．４０中に、９ｇのＮａＣｌと０．５ｇのポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸塩（Ｔｗｅｅｎ ２０）を溶解させて調製した。現像溶液は、１リットル当り、１モルのトリスベース、０．４モルのＮａＯＨ、２ｍモルのＴｂＣｌ３および３ｍモルのＥＤＴＡを含有した（ｐＨ調整なし）。アッセイ緩衝液Ａは、１リットル当り６０ｇのＢＳＡ、０．５ｇのアジ化ナトリウム、１００ｍＬの正常ヤギ血清、２５ｍＬの正常マウス血清、５ｇのウシＩｇＧおよび０．５ｇの Ｔｗｅｅｎ ２０ を含有する、５０ｍモル／Ｌトリス緩衝液、ｐＨ７．４０であった。アッセイ緩衝液Ｂは、マウス血清を省く以外は、アッセイ緩衝液Ａと同じであった。
【００７３】
臨床サンプル
いくつかの臨床サンプルを使用して、ｈＫ６の存在を調べた。これらには、男性および女性の個体（健康血液ドナー）からの血清および尿のサンプル、針吸引で得られた乳房嚢胞液、以前に記載のように調製した乳癌細胞質抽出物（１１）、羊水、授乳女性の乳汁、精漿、乳頭吸引液（ＮＡＦ）および脳脊髄液（ＣＳＦ）が含まれた。さらに、以前に記載のように調製したヒト組織細胞質抽出物のパネルを試験した （Ｈａｓｓａｐｏｇｌｉｄｏｕ， Ｓ． ｅｔ ａｌ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９９３， ８：１５０１−１５０９）。最適測定条件を確立するために、全サンプルを様々な希釈率で試験した。手法は、１９８３年に改訂された、１９７５年のヘルシンキ宣言の倫理基準に従った。
全組織および液のサンプルは、使用するまで−８０℃で貯蔵した。
【００７４】
器具
時間分解蛍光光度計、ＣｙｂｅｒＦｌｕｏｒ ６１５ Ｉｍｍｕｎｏａｎａｌｙｚｅｒ （ＭＤＳ Ｎｏｒｄｉｏｎ， Ｋａｎａｔａ， ＯＮ， Ｃａｎａｄａ） を使用して、白色マイクロタイターウェル中のＴｂ３＋蛍光を測定した。この手法は、別に詳細に記載されている （Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ， ＴＫ， ｅｔ ａｌ Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ １９９２， ６４：３４２−３４６； Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ＲＡ ｅｔ ａｌ， Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９６ ４２： ６７５−６８４）。
【００７５】
手法
組換えｈＫ６タンパク質の産生と精製　１．４−ｋｂのｈＫ６ｃＤＮＡを含有するプラスミドをトランスフェクションしたヒト２９３細胞を、３週間Ｇ４１８（４００ｍｇ／Ｌ）中で生育させて選択し、その後時間安定形質転換体を単離した。１つのクローンが、培養培地中に同定可能な量のｈＫ６タンパク質を生成した。この細胞系を培養し、組織培養上清を回収し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ 限外濾過装置 （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ ０２４５４）を使用して濃縮した。濃縮細胞培養上清からのｈＫ６の精製は、０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリルの線状勾配を使用する逆相高圧液体クロマトグラフィー（Ｃ−８， Ａｑｕａｐｏｒｅ ＲＰ−３００， ０．４５ ｘ ２５ ｃｍ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）により達成した。一般に、勾配は１分につきアセトニトリル１％の割合で増大した。ｈＫ６を含有する画分の位置をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確かめ、回収し、凍結乾燥し、−２０℃で貯蔵した（Ｌｉｔｔｌｅ ＳＰ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｌ Ｃｈｅｍ １９９７：２７２：２５１１３５−２５１４２）。
【００７６】
ｈＫ６に対するポリクローナル抗体の生成　精製した組換えｈＫ６タンパク質を使用して、標準的な手法を用いてウサギとマウスを免疫した（Ｃａｍｐｂｅｌｌ Ａｍ， Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｉｎ： Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ． Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ ＴＫ （ｅｄｓ）００． ９５−１１５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９６）。さらに精製せず、ウサギとマウスの抗血清を免疫蛍光測定アッセイの開発に使用した。
【００７７】
ヒツジ抗マウス免疫グロブリンによるマイクロタイタープレートの被覆　５０ｍモル／Ｌトリス緩衝液、ｐＨ７．８０に希釈した被覆抗体を１ウェルにつき５００ｎｇ／１００μＬで一晩インキュベートすることにより、白色ポリスチレンマイクロタイターウェルを被覆した。次いでウェルを洗浄溶液で６回洗浄し、２００μＬ／ウェルのブロック溶液（５０ｍモル／Ｌのトリス、ｐＨ７．８０中の１０ｇ／Ｌ ＢＳＡ）で１時間ブロックした。さらに６回洗浄した後、ウェルの使用準備が整った。
【００７８】
ｈＫ６較正　１リットルにつき６０ｇのＢＳＡと０．５ｇのアジ化ナトリウムを含有する５０ｍモル／Ｌトリス緩衝液、ｐＨ７．８０中で組換え精製ｈＫ６タンパク質を希釈することにより、０、１、５、２０、５０および２００μｇ／ＬのｈＫ６較正剤（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）を調製した。
【００７９】
ｈＫ６アッセイ　較正剤またはサンプル（１００μＬ）を、マイクロタイターウェルにピペットで移し、そしてアッセイ緩衝液Ｂで５，０００倍に希釈したポリクローナルマウス抗ｈＫ６抗血清５０μＬを添加した。次いでウェルを室温で２時間、震盪しながらインキュベートし、６回洗浄した。各ウェルにアッセイ緩衝液Ａで１，０００倍に希釈したウサギ抗ｈＫ６抗体１００μＬを添加し、上記のように３０分間インキュベートし、次いで６回洗浄した。アッセイ緩衝液Ａで３，０００倍に希釈した、アルカリフォスファターゼに結合したヤギ抗ウサギ免疫グロブリン１００μＬを各ウェルに添加し、上記のように３０分間インキュベートした。次いでウェルを６回洗浄した；１ｍモル／ＬのＤＦＰ作業基質溶液１００μＬを添加し、上記のようにウェルを１０分間インキュベートした。１００μＬの現像溶液を各ウェルに添加し、ウェルを機械震盪により１分間混合し、時間分解蛍光光度計で蛍光を測定した。較正とデータの換算は、ＣｙｂｅｒＦｌｕｏｒ ６１５ Ｉｍｍｕｎｏａｎａｌｙｚｅｒ で自動的に実施した。
【００８０】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）：別に記載された手法（Ｙｕ Ｈ， Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ， Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９３： ３９：２１０８−２１１４； Ｄｉａｍａｎｄｉｓ， ＥＰ ａｔ ａｌ Ｃｌｉｌｎ Ｃｈｅｍ １９９７：４３：１３６５−１３７１）を使用して、様々な体液をゲル濾過カラムで分別した。ＨＰＬＣ画分を回収し、開発した免疫蛍光測定アッセイでｈＫ６について分析した。
【００８１】
結果
アッセイの最適化
組換えｈＫ６タンパク質に対する２種のポリクローナル抗体を使用した。一方はマウスで生成させ、他方はウサギで生成させた。選択したアッセイの構成（ヒツジ抗マウス抗体によるウェルの間接的被覆およびアルカリフォスファターゼに結合したヤギ抗ウサギ免疫グロブリンによる免疫複合体の検出）は、一次抗体の精製や結合を必要とせずに、良好な感度を示した（後述）。使用する抗体の量、様々なアッセイ段階の希釈剤およびインキュベーション時間を最適化した。最低の達成可能検出限界および最良のアッセイ線形性およびダイナミック・レンジに基づいて、最適条件を選択した。最終的な条件は前記した。
【００８２】
較正曲線、検出限界、精度
提唱するｈＫ６アッセイの典型的な較正曲線を図１に示す。ゼロ較正プラス２つの標準偏差の蛍光に相応するｈＫ６濃度として定義される検出限界は、＜０．５μ／Ｌである。作動（ｒｕｎ）中および作動間の精度を、様々な臨床サンプルを用いて２−５０μｇ／Ｌの間の様々なｈＫ６濃度で評価した。全件で、変動係数（ＣＶ）は２ないし９％であり、典型的なマイクロタイタープレートベースの免疫アッセイの精度と一致した。
【００８３】
特異性
ｈＫ６タンパク質は、様々な体液で検出された。免疫蛍光測定アッセイがｈＫ６を高い感度と特異性で測定することを確認するために、３種の体液（即ち、１つは授乳女性由来のヒト乳汁、１つは脳脊髄液、そして１つは血清中に高レベルのこのバイオマーカーを有することが分かっている卵巣癌患者由来の血清サンプル）をゲル濾過カラムで分離し、ゲル濾過カラム上で測定した。結果を図２に示す。試験した３種全部の体液中に、分子量〜３０ｋＤａの単一の免疫反応種が検出され、これはｈＫ６タンパク質の分子量と一致した。これより高い分子量の複合体は検出されず、これらの体液中でｈＫ６が遊離形態で存在することを示唆した。他の血清プロテアーゼ（例えば、ＰＳＡ）は、大部分がプロテアーゼ阻害剤と結合して血清および他の液の中に存在している（Ｓｔｅｎｍａｎ Ｕ−Ｈ， ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９１： ５１：２２２−２２６）； Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ Ａ ｅｔ ａｌ Ｃｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９０； １９４； ７５５−７６３）。
【００８４】
体液および組織抽出物中のｈＫ６
体液中のｈＫ６の存在について予備的情報を得るために、表１に示すように様々な臨床サンプルを分析した。最高濃度のｈＫ６は授乳女性の乳汁に見出され、続いて脳脊髄液、乳頭吸引液および乳房嚢胞液であった。ｈＫ６はまた、男性と女性の血清サンプル、精漿の大部分、そして比較的低い割合で羊水および乳房腫瘍細胞質抽出物にも検出された。ｈＫ６タンパク質は、尿中に検出されなかった。
【００８５】
数々のヒト組織細胞質抽出物を試験した。最高濃度のｈＫ６は唾液腺で検出され、続いて肺、結腸、輸卵管、胎盤、乳房、下垂体および腎臓であった。試験した次の組織は陰性であった：皮膚、脾臓、骨、甲状腺、心臓、輸尿管、肝臓、筋肉、子宮内膜、精巣、膵臓、精嚢、卵巣、副腎および前立腺（図３）。
【００８６】
考察
本発明者らは、体液および組織抽出物中のｈＫ６タンパク質を定量するのに適するポリクローナル抗体と免疫蛍光測定手法を開発した。ｈＫ６タンパク質の豊富な天然供給源は未知であったので、ポリクローナルウサギおよびマウス抗体を生成させるのに組換えｈＫ６タンパク質を使用した。この組換えタンパク質は、いかなる混入タンパク質もない高純度を保証する。選択されたアッセイ構成は、使用する一次抗体のさらなる精製や結合を必要とせず、従って鋭敏な免疫蛍光測定手法の開発に便利な方法である。同じ原理は、以前に、体液中のｐ５３腫瘍抑制因子の測定に採用された（Ｈａｓｓａｐｏｇｌｉｄｏｕ Ｓ ｅｔ ａｌ， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９９３： ８： １５０１−１５０９）。
【００８７】
開発されたｈＫ６タンパク質の免疫アッセイは、良好な感度、ダイナミック・レンジおよび線形性を示した（図１）。このアッセイは、調べる体液中に単一の免疫反応性バンドを検出することが、さらに立証された。血清では、このプロテアーゼは、ｈＫ２測定での観察と同様に、遊離形態で存在する （Ｂｌａｃｋ， ＭＨ ｅｔ ａｌ Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９９； ４５：７９０−７９９）。しかしながら、これは、大部分がα１−アンチキモトリプシンに結合して血清中に存在することが知られている、ＰＳＡの状況と対照的である（Ｓｔｅｎｍａｎ Ｕ−Ｈ， ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９１： ５１：２２２−２２６）； Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ Ａ ｅｔ ａｌ Ｃｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９０； １９４； ７５５−７６３）。
【００８８】
比較的多数の体液の探索により、ｈＫ６タンパク質は授乳女性の乳汁および乳頭吸引液や乳房嚢胞液を含む他の乳房分泌物中に比較的高濃度で存在することが示された（表１）。以前に、ＰＳＡとｈＫ２を含む他のカリクレインの存在が、これらの体液で論証されてきた（Ｙｕ， Ｈ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ； Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９５： ４１：５４−５８； Ｓａｕｔｅｒ ＥＲ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖｅｎｔ １９９６ ９６７−９７０； Ｄｉａｍａｎｄｉｓ Ｅｐ ｅｔ ａｌ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ １９９６３８：２５９−２６４； Ｂａｌｃｋ ＭＨ ｅｔ ａｌ Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２０００； ８２：３６１−３６７； Ｂｌｃａｋ ＭＨ ｅｔ ａｌ Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９９；４５： ７９０−７９９； ｙｕ Ｈ． ａｎｄ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９５：４１：２０４−２１０； Ｂｌａｃｋ ＭＨ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ， Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ ２０００ ５９：１−１４）。大量のｈＫ６タンパク質が脳脊髄液に検出され、このことはｈＫ６が脳組織において高レベルで発現しているという観察と一致する（Ｌｉｔｔｌｅ， 前出）。ｈＫ６は、男性と女性の血清および精漿、そして低い割合で羊水および乳房腫瘍細胞質にも見出された。以前に、ＰＳＡとｈＫ２は、同様にこれらの体液中で立証されている （Ｙｕ， Ｈ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ； Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９５： ４１：５４−５８； Ｓａｕｔｅｒ ＥＲ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖｅｎｔ １９９６ ９６７−９７０； Ｄｉａｍａｎｄｉｓ Ｅｐ ｅｔ ａｌ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ １９９６３８：２５９−２６４； Ｂａｌｃｋ ＭＨ ｅｔ ａｌ Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２０００； ８２：３６１−３６７； Ｂｌｃａｋ ＭＨ ｅｔ ａｌ Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９９；４５： ７９０−７９９； ｙｕ Ｈ． ａｎｄ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９５：４１：２０４−２１０； Ｂｌａｃｋ ＭＨ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ， Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ ２０００ ５９：１−１４）。精漿は極めて高いレベルのＰＳＡとｈＫ２を含有するが（Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ １９９９： ２５：１４−２６’ ＲｉｔｔｅｎｈｏｕｓｅＨｅ ｅｔ ａｌ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｓｃｉ １９９８： ３５：２７５−３６８）、本明細書に記載のアッセイでは、非常に少量のｈＫ６がこの体液で検出された（表１）ことに注目するのは興味深い。このことはさらに、相同タンパク質であるＰＳＡとｈＫ２が、開発されたｈＫ６アッセイといかなる重大な交差反応性も有さないことを立証する。
【００８９】
本発明で開発されたアッセイは、体液中のｈＫ６タンパク質を検出するための最初の方法を示している。結果はさらに、その推定アミノ酸配列から予想されたように、ｈＫ６が分泌タンパク質であることを立証する （Ｙｏｕｓｅｋ ＧＭ ｅｔ ａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９９９；６２：２５１−２５９）。
【００９０】
実施例２
材料と方法
ｈＫ６の免疫蛍光測定アッセイ
この免疫蛍光測定アッセイの詳細は、既に説明した（実施例１および参考文献１２を参照）。アッセイは、一方はマウスで生成させ、他方はウサギで生成させた２種のｈＫ６特異的ポリクローナル抗体を利用した。これは、時間分解蛍光測定の原理を検出に組込んだ、非競合的免疫蛍光測定手法である。アッセイは、＜１０％の精度で０．５−２００μｇ／Ｌの範囲のｈＫ６を測定した。血清サンプルは、サンプルの予処理なしで分析した。
【００９１】
この調査では、様々な悪性腫瘍を有する患者から得た血清サンプルの残りを使用した（表２）。血清中で起こり得るｈＫ６上昇を検出する機会を増やすために、比較的高い腫瘍負荷を有する患者（正常の上限より少なくとも１０倍高い腫瘍マーカーレベルで示される）を含めた。全血清サンプルは、−２０℃で分析まで最長１年間貯蔵した。手法は、１９８３年に改訂された、１９７５年のヘルシンキ宣言の倫理基準に従った。
【００９２】
腫瘍マーカーの分析
腫瘍マーカーＣＡ１２５、ＰＳＡ、ＣＥＡおよびＡＦＰを、Ｅｌｅｃｓｙｓ 免疫アッセイ分析機 （Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）で分析した。ＣＡ１５．３、ＣＡ１９．９およびｈＣＧは、Ｉｍｍｕｎｏ １ 免疫アッセイ分析機（Ｂａｙｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ， ＮＹ）で分析し、カルシトニンは、Ｄｉａｓｏｒｉｎ， Ｉｔａｌｙ の放射性免疫アッセイキットで測定した。腫瘍マーカーの正常値の上限は、３５ＫＵ／Ｌ（ＣＡ１２５）、４μｇ／Ｌ（ＰＳＡ）、１０μｇ／Ｌ（ＡＦＰ）、５μｇ／Ｌ（ＣＥＡ）、３５ＫＵ／Ｌ（ＣＡ１５．３）、３７ＫＵ／Ｌ（ＣＡ１９．９）、１０ＩＵ／Ｌ（ｈＣＧ）および１００ｎｇ／Ｌ（カルシトニン）であった。
【００９３】
結果
全部で３７８個の血清サンプルを、以前に記載されたｈＫ６の免疫蛍光測定アッセイで分析した（１２）。これらのサンプルは、正常個体（男性および女性）由来、または様々な悪性腫瘍の患者由来のいずれかであった。得られたデータを表２に示す。ｈＫ６濃度は１５μｇ／Ｌ （任意のカットオフで）を、正常対照の全てが超えず、そして卵巣以外の悪性腫瘍の患者に由来するサンプルでは２個のみが超えたが、卵巣癌腫患者の大部分（〜６６％）では、血清のｈＫ６濃度がかなり上昇していた（＞１５μｇ／Ｌ）。卵巣癌患者の血清のｈＫ６値分布を、図４に示す。図５に示すように、ｈＫ６濃度とＣＡ１２５レベルとの相関は乏しく、統計的に有意ではない。
【００９４】
図６では、４人の卵巣癌患者における連続的な血清ｈＫ６とＣＡ１２５濃度の経時変化についてのデータを提示する。モニタリング期間中にｈＫ６濃度は変化し、ＣＡ１２５と同様に、この新バイオマーカーは、患者の管理に有用性を有し得ることを示唆している。
【００９５】
考察
表２のデータは、調査結果をまとめたものであり、試験したあらゆる癌のタイプ（正常男性および女性対、乳癌、甲状腺癌、精巣癌、胃腸の癌、前立腺癌、肺癌および卵巣癌）の中で、卵巣癌患者のみが、循環器系におけるこのバイオマーカーレベルの有意な上昇を示すことを立証する。約６６％の患者が、試験した他のあらゆる癌の特異度を９８−１００％まかなえるカットオフである、１５μｇ／Ｌより高いレベルを有した。これらのデータは非常に有望であるが、卵巣癌腫の循環器系バイオマーカーとしてのｈＫ６の価値に関して、全卵巣癌患者が比較的高レベルのＣＡ１２５（＞３７２ＫＵ／Ｌ、これは参照範囲上限より約１０倍高い）を有することを考慮するべきである。図６のデータは、ｈＫ６の血清レベルが卵巣癌モニタリング中に経時変化することを示し、このバイオマーカーが初期処置後の患者のモニタリングに有用であり得ることを示唆している。
【００９６】
図５から明らかなように、ｈＫ６濃度とＣＡ１２５との間には有意な相関はなく、これら２つのバイオマーカーが卵巣癌腫の診断と管理のために相補的であり得ることを示唆している。
【００９７】
結論として、約６６％の卵巣癌患者において、血清ｈＫ６濃度が有意に増大している最初の証拠が提供される。他の様々な悪性腫瘍で増大が見られなかったので、本試験は卵巣癌特異的と考えられる。従って、ｈＫ６は、卵巣癌の新しい血清バイオマーカーになり、それは疾病の診断およびモニタリングに有用であり得る。
【００９８】
実施例３
材料と方法
患者集団
本研究には、９７人の明らかに健康な女性（２６から７２歳；平均値＝５２歳、中央値＝４９歳）、１４１人の良性疾病の女性（２１から７６歳；平均値＝４６歳、中央値＝４５歳）および１４６人の組織学的に証明された一次卵巣腫瘍の患者（２８から７８歳；平均値＝５６歳、中央値＝５７歳）が含まれた。良性病変のうち、５０人は子宮内膜性に、２２人はムチン性（ｍｕｃｉｎｏｓｕｍ）に、１０人は卵巣奇形腫性に、２６人は類皮性（ｄｅｒｍｏｉｄｅａ）に、１５人は黄体性に、そして１８人は漿膜性に分類された。腫瘍は、国際産科婦人科連合（ＦＩＧＯ）の基準に従って病期に分類した。組織学的分類は、世界保健機関およびＦＩＧＯの勧告に基づいた。病期、悪性度、組織タイプ、手術後の残存腫瘍、減容積（ｄｅｂｕｌｋｉｎｇ）の成功および化学療法への反応に関する卵巣癌患者の特徴を、表７に示す。全患者の血清サンプルを手術前、治療開始前に回収し、分析まで−８０℃で貯蔵した。１０５人の卵巣癌患者について、血清は手術後にも入手可能であった。このサンプルは手術の約２−３週間後に得られた。
【００９９】
血清は、次の４施設から得た：トリノ大学婦人科腫瘍学部門、イタリア（正常の９７人、良性の１４人、癌の２１人）；オランダ（癌の４０人）；ベルギー（良性の１３人、癌の８５人）；フィンランド、ヘルシンキ大学中央病院、臨床化学部（良性の１１４人）。
【０１００】
中央値２５ヶ月（１−１０６ヶ月の範囲）の期間、生存率と疾病の進行について患者をモニタリングした。１３１人の卵巣癌患者について、追跡情報が入手可能であった。これらのうち、追跡期間中に６４人（４９％）が再発し、２８人（２１％）が死亡した。
【０１０１】
ｈＫ６とＣＡ１２５の分析
ＣＡ１２５は、市販の自動免疫アッセイ法（Ｉｍｍｕｌｉｔｅ ２０００， Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ， ＣＡ）で測定した。この方法では、正常の上限は２３ＫＵ／Ｌである。ｈＫ６の濃度は、ここで記載した手法（１２）を幾分か改変したものを用いて測定した。このアッセイでは、マイクロタイターウェルに直接被覆したモノクローナル抗ｈＫ６マウス抗体（捕獲抗体）、ポリクローナルウサギ検出抗体およびアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体を採用した。シグナルを時間分解蛍光測定法により定量した。アッセイは、０．１μｇ／Ｌの検出限界と、５０μｇ／Ｌまでのダイナミック・レンジを有した。精度は測定範囲内で＜１０％であった。各作動につき３つの品質管理用サンプルを含め、血清サンプルを２部で分析した。
【０１０２】
統計解析
データを解析するために、臨床および病理学的パラメーターに従って、患者を異なるグループに分けた。手術前後のｈＫ６血清濃度間の差異の解析を、ノンパラメトリックのマクニマーの検定で実施した。二項分布を使用して、マクニマー検定の有意レベルを計算した。
【０１０３】
敏感度対（１−特異度）をプロットしてｈＫ６およびＣＡ１２５血清濃度について受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を構築し、ＲＯＣ曲線より下の面積（ＡＵＣ）を算出した。非癌グループには、正常個体および良性疾病の患者が含まれた。異なる変量間の相関を、スピアマン相関係数により評価した。ノンパラメトリックのマンホイットニーＵ検定を使用して２グループ間の差異を判定し、２以上のグループ間の差異の解析にノンパラメトリックのクラスカル・ワリス検定を使用した。これらの試験では、血清中のｈＫ６濃度を連続変量として扱った。ｈＫ６血清濃度は、ｈＫ６陽性（＞４．４μｇ／Ｌ）またはｈＫ６陰性（＜４．４μｇ／Ｌ）としても分類された。この二分法的変量と他の臨床病理的変量の関係は、適するようにカイ二乗（χ２）検定またはフィッシャーの直接法で確立した。
【０１０４】
ｈＫ６陽性とｈＫ６陰性の患者との間の生存率の差異を立証するために、カプラン・マイヤーの無進行生存率および全生存率の曲線を構築した。ログランク検定を使用して生存曲線間の差異の有意さを調べた。患者の全生存率（ＯＳ）と疾病の進行（無進行生存率；ＰＦＳ）に対する血清ｈＫ６濃度の影響を、一変量と多変量の両方のコックス比例ハザード回帰モデルにより計算したハザード比で評価した。多変量解析では、疾病の病期、腫瘍の悪性度、残存腫瘍および組織学的タイプを含む、生存に影響し得る臨床および病理学的変量を補正した。
【０１０５】
結果
癌および非癌患者の血清ｈＫ６濃度：非癌（正常；ｎ＝９７）、良性疾病（ｎ＝１４１）、手術前（ｎ＝１４６）および手術後（ｎ＝１０５）の卵巣癌患者の血清ｈＫ６濃度の平均値、中央値、範囲および選択した百分位の値を、表３に示す。非癌（正常）と良性疾病の患者との間の平均値と中央値は、統計的に有意ではなかった。手術前の卵巣癌患者の平均および中央ｈＫ６値は、非癌と良性のグループより有意に高かった（ｐ＜０．００１）。患者の３グループ（正常、良性、手術前の卵巣癌）のｈＫ６濃度の分布を、対応するＣＡ１２５値と共に図７にさらに表示する。明らかに、手術前の血清ｈＫ６濃度は、正常と良性疾病の患者との間で異ならないが、卵巣癌患者の割合では有意に上昇している（図７Ａ）。逆に、ＣＡ１２５値は正常から良性へ、癌患者へ、漸進的に増大している（図７Ｂ）。
【０１０６】
ｈＫ６陽性とｈＫ６陰性としてこの患者集団を二分法的に分類するには、４．２μｇ／Ｌ（診断特異度９０％）と４．４μｇ／Ｌ（診断特異度９５％）のｈＫ６カットオフを選択した。
【０１０７】
手術後の血清ｈＫ６濃度の変化：１０５人の卵巣癌患者について、手術前と手術後の血清サンプルを選択した。図８に示すように、７１人の患者（６８％）が、手術後にｈＫ６濃度の低下を示し、２１人（２０％）は値が変化せず、そして１３人は術後により高いｈＫ６血清レベルを有した。マクニマー検定により、手術後の濃度低下は統計的に極めて有意であった（ｐ＜０．００１）。
【０１０８】
血清ｈＫ６とＣＡ１２５濃度との間の相関：図９の対数プロットは、血清ｈＫ６濃度とＣＡ１２５濃度との間に弱い相関があることを示す（スピアマン相関ｒｓ＝０．４４）。相関は有意であるが、なお多くの完全に可変の値を有するサンプルがある。例えば、約５００ＫＵ／ＬのＣＡ１２５レベルでは、ｈＫ６濃度は２−４０μｇ／Ｌの範囲であるが、一方約６μｇ／ＬのｈＫ６レベルのサンプルは、５から＞５，０００ＫＵ／Ｌの範囲のＣＡ１２５値を有し得る。
【０１０９】
血清ｈＫ６濃度の診断敏感度と特異度：この計算には、表４に示すように、患者の様々なサブグループを考慮した。非癌グループには、正常か、または良性疾病を有するかの全患者が含まれた。全患者グループを解析すると、診断敏感度は９０％の特異度で約５４％、そして９５％の特異度で５０％であった。図１０の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は、ｈＫ６と比較して、ＣＡ１２５がわずかに診断的に有利であることを示す。しかしながら、ｈＫ６濃度は比較的低いＣＡ１２５の患者のサブセットで上昇し得るので、２つのマーカーは組合せて作用できる。ＣＡ１２５＞６０ＫＵ／Ｌの患者のサブグループでは、ｈＫ６の診断敏感度は、９０および９５％の特異度で各々７１および６５％であった。低ＣＡ１２５（＜２３ＫＵ／Ｌ）の患者のサブグループでは、約１３−１７％の患者は、ｈＫ６カットオフ４．４（特異度９５％）または４．３μｇ／Ｌ（特異度９０％）で、各々なお上昇したｈＫ６を有した。ＣＡ１２５がわずかに上昇した（２３−６０ＫＵ／Ｌ）患者のサブグループでは、ｈＫ６の診断敏感度は、９５−９０％の特異度で各々１５−２６％であった（表４）。
【０１１０】
表５では、ＣＡ１２５単独またはＣＡ１２５プラスｈＫ６のいずれかを使用して、卵巣癌患者の同定におけるｈＫ６のさらなる貢献を計算した。病期の分かる全患者（Ｎ＝１２４）の中で、ｈＫ６分析は、ＣＡ１２５の敏感度を、両マーカーの特異度カットオフ９０％または９５％で、１２％または１３％まで増大させる。卵巣癌病期Ｉ／ＩＩ（４３人の患者）で、貢献はなお有意であった。ｈＫ６の追加は、ＣＡ１２５単独の敏感度を、両マーカーの特異度カットオフ９０％または９５％で、３０％から４２％まで、または２６％から３７％まで各々上昇させた。
【０１１１】
表６は、血清ｈＫ６濃度に基づいて、卵巣癌を有する相対的リスク（ＲＲ）をまとめる。相対的リスクは、ｈＫ６濃度の増大に伴い指数関数的に上昇し、ｈＫ６が＞４．３μｇ／Ｌのとき２０の値に達した。ＲＲは、多変量解析でＣＡ１２５レベルを補正した後、なお実質的であった（ＲＲ＝５．３）。
【０１１２】
血清ｈＫ６の予後的価値：高い卵巣癌病期と悪性度は、高い血清ｈＫ６濃度と強く関連する（図１１および表７）。さらに、漿液性腺癌腫は、より頻繁に高い血清ｈＫ６濃度と関連し（確率６８％）、子宮内膜性腫瘍（確率３３％）が続き；ムチン性腫瘍はまれにしか高い血清ｈＫ６に関連しない（９％）。さらに、高い血清ｈＫ６濃度は、残存腫瘍の存在、最適下限の減容積および乏しい化学療法への反応に関連する。これらの全関連は、極めて有意であった（ｐ＜０．００１）。
【０１１３】
一変量コックス解析では、血清ｈＫ６濃度は、短い無進行生存と全生存に関連した（表８）。これらの関連は、多変量解析で統計的に有意のままであった。ＣＡ１２５の予後的価値は、多変量解析ではもはや統計的に有意ではなかった。手術前の血清ｈＫ６を除いて、疾病の病期は、多変量解析において無進行生存率と全生存率の両方に関連する参考パラメーターにすぎなかった（表６）。
【０１１４】
同様のデータが、カプラン・マイヤーの生存分析（図１２）で得られた。手術前の血清ｈＫ６が高い患者は、術前のｈＫ６レベルが低い患者より、もっと短い無進行生存と全生存を有した。高い血清ｈＫ６の実質的に全ての患者が６年までに再発した一方で、低い術前血清ｈＫ６の患者の５０％以上は、鎮静したままであった。
【０１１５】
考察
早期診断、予後、治療反応のモニタリングおよび予測のための新たな卵巣癌バイオマーカーの発見は、臨床成果の改善に貢献するであろう。十分に受入れられている唯一の卵巣癌バイオマーカーであるＣＡ１２５は、２０年前に発見された。数々の可能性のある他の卵巣癌バイオマーカーが同定されたが、それらの臨床的価値は確立されていない（２７）。新規卵巣癌バイオマーカーである、拡張されたヒトカリクレイン遺伝子ファミリーの構成員のヒトカリクレイン６（ｈＫ６）が、本明細書に記載されている。
【０１１６】
伝統的な卵巣癌バイオマーカーであるＣＡ１２５は、早期の卵巣癌を診断できるには及ばない。早期疾病に対する低敏感度に加えて、ＣＡ１２５はまた、低い特異度、即ちレベルの上昇が多くの腹部の良性疾病にも見られるという欠点も持つ。現在、単一の癌バイオマーカーが最適な癌診断および管理に必要な全情報をもたらすわけではないことが、広く受入れられている。現在の趨勢は、組合せて使用できる複数のバイオマーカーの同定に焦点を当てることである。かかるアプローチは、卵巣癌で臨床的な将来性を有すると既に示されている（２８、２９）。
【０１１７】
血清ｈＫ６は、卵巣癌腫の新規バイオマーカーに当る。このバイオマーカーは、ＣＡ１２５よりも卵巣癌に特異的である。なぜなら、ＣＡ１２５と対照的に、良性疾病で上昇が見られないからである（図７）。ｈＫ６の診断敏感度は、同じ特異度カットオフでＣＡ１２５の診断敏感度よりわずかに低い（表５および図１０）。しかしながら、ｈＫ６は、病期Ｉ／ＩＩの疾病を含む疾病の全病期で、ＣＡ１２５の診断敏感度を増大させる（表５）。ｈＫ６とＣＡ１２５との間の弱い相関にも関わらず（図９）、上昇したｈＫ６レベルを有する正常なＣＡ１２５の患者が依然として存在する（表４）。従って、ＣＡ１２５とｈＫ６は、バイオマーカー各々単独の診断敏感度を増大させるために組合せて使用できる。
【０１１８】
ＣＡ１２５の状況と同様に、ｈＫ６濃度は、子宮内膜性およびムチン性癌腫においてよりも、漿液性卵巣癌腫においてより頻繁に上昇する（表７）。血清ｈＫ６濃度はまた、後期および高悪性度の疾病においても、より頻繁に上昇する。血清ｈＫ６濃度は、患者の行く末の強力な予測因子である。術前ｈＫ６濃度が４．４μｇ／Ｌ以上の患者は、術前にｈＫ６が低い患者よりも有意に悪い予後である（表８および図１２）。血清ｈＫ６濃度は、血清ＣＡ１２５よりも強力な予後インジケーターである。ＣＡ１２５の予後的価値は、多変量解析で消滅するが、表８の多変量解析に示すように、血清ｈＫ６は独立した予後インジケーターである。血清ｈＫ６は、術後にレベルが有意に低下するので、腫瘍細胞に由来するようである（図８）。卵巣腫瘍抽出物におけるｈＫ６分析の予後的価値を調べる実施例４の研究では、腫瘍細胞におけるｈＫ６の過剰発現が免疫組織化学的に確認され、腫瘍内ｈＫ６濃度も強い予後予測因子である証拠がさらに与えられた。興味深いことに、ｈＫ４、ｈＫ５、ｈＫ７、ｈＫ８、ｈＫ９およびｈＫ１０の酵素を含む、ヒトカリクレイン遺伝子ファミリーの他の構成員の多くは、卵巣癌で予後的重要性を有することが既に示されている（３４−４１）。トリプシン、ヘプシンおよびテスチシン（ｔｅｓｔｉｓｉｎ）を含む、カリクレインファミリーに属さないセリンプロテアーゼも、卵巣癌で予後的重要性を有することが示されている（４２−４４）。しかし、長年に渡り、多くの他のタンパク質分解酵素が、多くの癌で予後的価値を有することが知られてきた（概説には、４５および４６を参照）。癌の予後におけるタンパク質分解酵素の関与についての生物学的メカニズムは、細胞外マトリックスを分解し、従って侵襲と転移を助長する能力を含む（４７−４９）。カリクレインファミリー遺伝子の複数の構成員が、卵巣癌で無制御であるように思われる。従って、このプロテアーゼファミリーの他の構成員が、潜在的卵巣癌バイオマーカーとして出現する可能性がある。これらのプロテアーゼが癌の進行に関わるならば、それらは治療標的として適する候補であり得る。
【０１１９】
表７は、手術前の血清ｈＫ６濃度が、卵巣癌患者の化学療法に対する反応の予測因子であり得ることを予備的に示す。非反応者の中で、８１％が上昇した手術前ｈＫ６濃度を有し、一方これらの患者の１９％が低いｈＫ６濃度を有した。化学療法に対して完全または部分的反応のいずれかを有した患者の中で、５７％は低い術前ｈＫ６濃度を有した（ｐ＜０．００１）。
【０１２０】
結論として、血清ｈＫ６濃度は、診断、予後および予測ツールとしての潜在的有用性を有する、卵巣癌腫の新規バイオマーカーに当る。ｈＫ６とＣＡ１２５の組合せは、早期の疾病を含む、全病期の卵巣癌の診断敏感度を改善する。
【０１２１】
実施例４
ＫＬＫ６卵巣組織
患者と方法
卵巣癌患者　１８０人の一次卵巣癌患者がこの研究に含まれた。これらの患者は、イタリアのトリノ大学婦人科で卵巣癌の手術を受けた。患者の年齢は２５ないし８２歳の範囲であり、中央値は５９歳であった。癌の臨床的病期、腫瘍の悪性度と組織構造、および残存腫瘍の量を含む、臨床および病理学的情報を手術時に記録した。閉経状態を記録し、化学療法への反応をモニターした。腫瘍を国際産科婦人科連合（ＦＩＧＯ）の基準に従って病期に分類した。組織学的分類は、世界保健機関およびＦＩＧＯの勧告に基づいた。この研究に含まれた腫瘍のうち、８０は漿液乳頭性、３２は未分化性、２７は子宮内膜性、１３はムチン性、１４は透明細胞、１０はミュラー管性、４はその他と分類された。残存腫瘍の大きさは０ないし９ｃｍの範囲であり、中央値は１．１ｃｍであった。
【０１２２】
生存と疾病の進行（明確な進行なし、または進行）について、期間の中央値６２ヶ月（１ないし９９ヶ月の範囲）にわたり患者をモニターした。１６５人の患者について、追跡情報が入手可能であった。これらのうち、追跡期間中に９７人（５４％）が再発し、６１人（３４％）が死亡した。
【０１２３】
調査は、１９８３年に改訂された、１９７５年のヘルシンキ宣言の倫理基準に従って実行し、イタリア、トリノの Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ に承認された。
【０１２４】
腫瘍細胞抽出物の調製　手術直後に液体窒素中で腫瘍組織を凍結し、抽出するまで−８０℃で貯蔵した。２０ないし１００ｍｇの凍結組織をドライアイス上で微細粉末に粉砕し、１０倍量の抽出緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｇ／ＬのＮＰ−４０界面活性剤、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフッ化物、１ｇ／Ｌのアプロチニン、１ｇ／Ｌのロイペプチン）に添加した。生じた懸濁液を、氷上で３０分間インキュベートし、その間１０分ごとにボルテックスをかけた。混合物を１４，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、上清（細胞抽出物）を回収し、分析するまで−８０℃で貯蔵した。抽出物のタンパク質濃度を、アルブミン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）を基準としてビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ）法で測定した。
【０１２５】
卵巣細胞抽出物中のｈＫ６の測定　腫瘍細胞抽出物中のｈＫ６濃度を、以前に記載され、詳細に評価された（１２）、高い敏感度と特異度の非競合ｈＫ６免疫アッセイで定量した。アッセイは、時間分解蛍光検出による連続的２部位免疫測定フォーマットに、一方はマウスで生成させ、他方はウサギで生成させた２種のｈＫ６特異的ポリクローナル抗体を組込んだ。基準、腫瘍細胞抽出物および対照プールの分析を、９６ウェルポリスチレンマイクロタイタープレート中で２部で実行し、免疫アッセイには２００μＬの試料を加えた。組換えｈＫ６を使用する標準曲線は、０．５μｇ／Ｌないし２００μｇ／Ｌの範囲であった。アッセイの精度は１０％より良好であった。シグナル検出およびデータの換算は、ＣｙｂｅｒＦｌｕｏｒ ６１５ Ｉｍｍｕｎｏａｎａｌｙｚｅｒ により自動的に実施した。
【０１２６】
免疫組織化学による卵巣腫瘍試料中のｈＫ６の局在　酵母細胞中で産生したｈＫ６全長組換えタンパク質に対して、ウサギポリクローナル抗体を生成させた。標準的な免疫ぺルオキシダーゼ法に従って、ｈＫ６の免疫組織化学染色を実施した。概略を述べると、パラフィン包埋組織切片（４μｍ）を固定し、パラフィンを取り除いた。内在性ペルオキシダーゼ活性を３％水性過酸化水素で１５分間ブロックした。切片を０．４％ペプシンで、ｐＨ２．０で５分間、４２℃で処理し、２０％タンパク質ブロッカー（Ｓｉｇｎｅｔ Ｌａｂｓ） で１０分間ブロックした。次いで、一次抗体を１：４００の希釈で、１時間室温で添加した。洗浄後、抗体希釈緩衝液（ＤＡＫＯ）で４倍に希釈したビオチン化抗ウサギ抗体（Ｓｉｇｎｅｔ）を添加した。インキュベーションと洗浄に続いて、ストレプトアビジンタグ付のホースラディッシュペルオキシダーゼを３０分間室温で添加した。洗浄後、５−１０分間のアミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）で検出を達成した。スライドをヘマトキシリンで対比染色し、次いでカバースリップでマウントした。
【０１２７】
統計解析　統計解析は、ＳＰＳＳソフトウェアで実施した（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ． Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， ＣＡ）。データを解析するために、臨床および病理学的パラメーターに従って、患者を異なるグループに分けた。卵巣腫瘍抽出物中の総タンパク質１ｍｇ当りのｈＫ６量（即ち、比活性）の分布がガウス分布ではなかったので、ノンパラメトリックのマン・ホイットニーＵ検定を使用して２グループ間の差異を判定し、２グループ以上の間の差異の解析にクラスカル・ワリス検定を使用した。これらの検定では、腫瘍抽出物中のｈＫ６比活性（ｎｇ ｈＫ６／ｍｇ総タンパク質）を連続変量として扱った。ｈＫ６腫瘍抽出物比活性は、ｈＫ６陽性（＞３５ｎｇ／ｍｇ総タンパク質；説明には図７Ｂを参照）またはｈＫ６陰性（＜３５ｎｇ／ｍｇ総タンパク質）のいずれかとしても分類した。他の臨床病理的相関に対するこの二分法的変量の関係は、適するようにカイ二乗（χ２）検定またはフィッシャーの直接法で確立した。患者の生存と疾病の進行（無進行生存）に対する腫瘍抽出物のｈＫ６比活性の影響を、一変量と多変量の両方のコックス比例ハザード回帰モデル（３０）により計算したハザード比で評価した。多変量解析では、疾病の病期、腫瘍の悪性度、残存腫瘍、組織学的タイプおよび年齢を含む、生存に影響し得る臨床および病理学的変量を補正した。ｈＫ６陽性とｈＫ６陰性の患者との間の生存率の差異を立証するために、カプラン・マイヤーの無進行生存率および全生存率の曲線（３１）を構築した。ログランク検定（３２）を使用して生存曲線間の差異の有意さを調べた。全患者のデータセットを全体として解析した後、疾病の病期により、腫瘍の悪性度により、そして手術後の残存腫瘍の量（減容積の成功）により個別に層化したサブグループに対してプロセスを繰返した。生存および疾病の進行に対する腫瘍ｈＫ６レベル（陽性または陰性）の影響を、各サブグループについて一変量および多変量モデルにより判定した。
【０１２８】
結果
卵巣腫瘍抽出物におけるｈＫ６比活性の分布　１８０人の患者からの卵巣腫瘍抽出物中のｈＫ６比活性の分布（図１３Ａ）は、０．０４ｎｇ／ｍｇ総タンパク質ないし４９７ｎｇ／ｍｇ総タンパク質の範囲にあり、平均値は３３ｎｇ／ｍｇ総タンパク質、中央値は１３．２ｎｇ／ｍｇ総タンパク質であった。３５ｎｇ／ｍｇ総タンパク質の値は、カイ二乗解析（χ２＝７．３；Ｐ＝０．００７）により、全生存率を予測する観点で陰性腫瘍から陽性腫瘍を区別するのに最適なカットポイントとして同定された（図１３Ｂ）。３０パーセントの腫瘍がこの基準でｈＫ６陽性であった。腫瘍抽出物のｈＫ６比活性は、続く解析において連続変量および二分法的変量（＜３５ｎｇ／ｍｇ総タンパク質、＞３５ｎｇ／ｍｇ総タンパク質）の両方として扱った。
【０１２９】
ｈＫ６比活性（ｎｇ ｈＫ６／ｍｇ総タンパク質）は、正常卵巣組織（平均３．５、標準誤差２．５、範囲０．０５ないし２０．８）または良性疾患の卵巣組織（平均３．２、標準誤差２．６、範囲０．０３ないし２１．５）から調製された抽出物と比較して、卵巣腫瘍抽出物（平均３２．７、標準誤差３．８、範囲０．０４ないし４９７）で有意に上昇した（クラスカル・ワリス検定でＰ＜０．００１）（図１４）。さらなる解析により、組織タイプにより層化すると（即ち、漿液性対、未分化性対、子宮内膜性、など）、卵巣腫瘍間にｈＫ６比活性の有意な差異はないことが示された（データ非掲載）。
【０１３０】
ｈＫ６状態と他の臨床病理学的変量との関係　ｈＫ６陽性とｈＫ６陰性の患者の間で、様々な臨床病理学的変量の分散を表９にまとめた。ｈＫ６状態とこれらの変量との関係を、適するようにカイ二乗（χ２）検定またはフィッシャーの直接法のいずれかで調べた。ｈＫ６状態と、腫瘍の悪性度、閉経状態および化学療法に対する反応との間に関係は観察されなかった。しかしながら、ｈＫ６陽性患者は、進行した疾病（病期ＩＩ−ＩＶ）、漿液性腫瘍組織構造およびより大きい残存腫瘍（＞１ｃｍ）を有する可能性が高かった（全てＰ＜０．０５）。連続変量として扱ったときの腫瘍抽出物のｈＫ６比活性は、疾病の病期に比例した。図１５は、病期によって層化したｈＫ６比活性の分布を示す。ｈＫ６比活性は、病期ＩＩＩ／ＩＶの卵巣癌抽出物において、病期Ｉ／ＩＩのそれにおいてよりも有意に高かった（マン・ホイットニーＵ検定でＰ＝０．００２）。
【０１３１】
一変量および多変量生存解析　疾病の進行および全生存に対するｈＫ６比活性、他の臨床病理学的変量および年齢の影響を表１０に提示する。一変量解析では、ｈＫ６陽性患者は、有意に上昇した疾病進行（ハザード比＝１．７１）および死亡（ハザード比＝１．８８）のリスクを有した（Ｐ＜０．０５）。ｈＫ６の比活性を連続変量として扱うと、ハザード比はｈＫ６陰性腫瘍のもの（任意に１．００と設定する）と非常に近かったが、疾病進行のリスク（ハザード比＝１．００５）における僅かな上昇は、Ｐ＝０．００１でかなり有意であった。カプラン・マイヤーの生存曲線は、ｈＫ６陽性とｈＫ６陰性の患者の間の生存率の差異を論証した。図１６に示すように、無進行および全生存の可能性は、それぞれｈＫ６陰性患者よりもｈＫ６陽性患者で低かった。
【０１３２】
無進行生存および全生存に対するｈＫ６陽性の悪影響は、多変量解析では失われた。表１０に示すように、生存結果を他の臨床病理学的変量について補正すると、ｈＫ６陽性とｈＫ６陰性の患者は、統計的に近い疾病進行率および全生存率を有した。腫瘍悪性度も、多変量解析では、一変量解析におけるその予後的有意さを失った。疾病の病期および手術後の残存腫瘍のみが、多変量解析で生存結果に対する独立的効果を維持した。
【０１３３】
患者のサブグループにおける一変量および多変量解析　病期、腫瘍悪性度、および減容積の成功（残存腫瘍）に基づいて、患者を異なるサブグループに分けた。各サブグループにおいて、疾病の進行と全生存に対するｈＫ６陽性と陰性の影響を、一変量と多変量のコックス比例ハザード回帰モデルにより判定した。結果を表１１に示す。ｈＫ６比活性（陽性、陰性）は、腫瘍悪性度ＩまたはＩＩの患者サブグループで有意に影響を与えた。一変量解析により、ｈＫ６陽性患者は、ｈＫ６陰性患者の約９倍疾病の進行をこうむりやすく、５倍死亡しやすいことが解明された。これらの生存率の差異は、データを多変量解析に処した後でさえ有意なままであった。ｈＫ６陽性から生じる両結果の相対的リスクは、目下約４倍であった（Ｐ＜０．０３）。ｈＫ６状態は、悪性度ＩＩＩの腫瘍の患者ではかかる効果を有さず、初期の疾病の患者および手術後に１ｃｍ以上の残存腫瘍を有する患者でも、いかなる識別可能な効果も論証されなかった。一変量解析により、ｈＫ６陽性である進行した疾病（病期ＩＩＩおよびＩＶ）の患者のサブグループにおける、疾病進行および死亡のリスクにおける２倍の増大が解明されたが、その効果は多変量解析では失われた。逆のことが手術時に最適の腫瘍減容積（残存腫瘍が直径１ｃｍ以下）で特徴付けられる患者のサブセットで起こった。ｈＫ６陽性は、一変量解析で疾病進行または生存に対して論証可能な悪影響を有さなかったが、データを多変量解析に処すと統計的に有意になり、有害リスクにおいて各々３．５および５．５倍の増大をもたらした。補正した変量が結果に全く影響しないとき、一変量モデルで何も生じないのに多変量モデルにおいて効果が現れる。本研究の場合、このことは、この特定の患者サブセットにおいて、疾病の病期、腫瘍悪性度、腫瘍組織構造および患者の年齢は、疾病の進行と全生存に対して予後的潜在能力を有さないことを意味する。悪性度ＩまたはＩＩの卵巣腫瘍患者サブセットのカプラン・マイヤーの生存曲線を図１７に示す。先に述べた一変量解析から期待されたように、ｈＫ６陽性とｈＫ６陰性の患者の間に、疾病の進行および生存に有意な差異があった。
【０１３４】
卵巣腫瘍のｈＫ６免疫組織化学染色　パラフィン包埋腫瘍切片のｈＫ６免疫組織化学染色は、腫瘍抽出物のｈＫ６比活性におおよそ比例した（データ非掲載）。良性、境界または悪性腫瘍を含む４つの卵巣組織におけるｈＫ６タンパク質の免疫組織化学的局在を、図１８に描写する。ｈＫ６染色は、上皮細胞に限定され、繊維状支持ストロマを含む間葉性要素には存在しなかった。ｈＫ６は上皮細胞の細胞質内で染色されたが、染色強度は腫瘍調製物の間、そして内で変動した。
【０１３５】
考察
増大したｈＫ６合成が、長期にわたってより攻撃的な腫瘍行動を予測するものであることが判明した。他の臨床病理学的変量および年齢を別にして考えると、研究下にある全患者集団にわたって、ｈＫ６陽性は、疾病の進行と死亡の両リスクにおける約２倍の増大と関連した。この効果は、全患者集団の多変量解析で結果を他の臨床病理学的変量および年齢に補正すると失われたが、多変量解析を腫瘍悪性度の低い患者および手術後の残存腫瘍が少ない（直径で＜１ｃｍ）患者に限定すると失われなかった。前者の患者サブグループでは、ｈＫ６陽性は疾病の進行と死亡のリスクにおける約４倍の増大を予測し（Ｐ＜０．０３）、一方後者のサブグループにおける相応するハザード比は、各々３．７５および５．５であった（Ｐ＜０．０２）。データは、これらの２サブグループにおいてｈＫ６陽性が独立した予測的潜在能力を有し、従来測定されてきた臨床パラメーターと病理学的相関からは探り出せなかった腫瘍行動に、長期にわたって洞察を与えることを示す。それ故に、ｈＫ６試験は、かかる患者の個別化された効果的な処置に貢献し得る。
【０１３６】
ｈＫ６は、非悪性卵巣組織と比較して、卵巣腫瘍で頻繁に過剰発現されることが見出された。この過剰発現は、早期の疾病由来よりも後期の疾病由来の腫瘍において高い傾向がある。組織化学的研究により、ｈＫ６は卵巣の上皮細胞により合成され、細胞質区画内に拡散して分布することが示唆された。
【０１３７】
上皮性卵巣癌は、婦人科系悪性腫瘍の中でも最も予後が悪いものの１つである。主な理由は、診断の４分の３以上が、疾病が既に局所的または遠位の転移を確立したときになされるからである（３３）。問題を複雑にすることに、腫瘍の進行と攻撃性は、従来の臨床および病理学的マーカーと変わりやすく相関する。従って、この疾病に関し、さらなる診断および予後マーカーに対する重要な要望があり、数々の潜在能力のあるマーカーが同定された。
【０１３８】
好ましい実施例であると現在考えられるものを参照して本発明を説明したが、本発明は開示した実施例に限定されないことを理解すべきである。反対に、本発明は、添付の請求の範囲の精神と範囲内にある様々な修正および均等物の取合せを包含することを意図している。
【０１３９】
全刊行物、特許および特許出願は、各個別の刊行物、特許または特許出願を特別かつ個別に出典明示により全体を本明細書の一部とすると指示するのと同程度に、出典明示により全体を本明細書の一部とする。
以下の詳細な引用は、明細書中で参照した参照文献を示す。
【０１４０】
表１−様々な液中のｈＫ６タンパク質の分析
【表１】
2004511810.tif 000003
１．授乳女性より
２．試験したサンプルの数
３．乳頭吸引液
４．乳癌患者から得られたＮＡＦ
【０１４１】
表２−正常個体および様々な悪性腫瘍患者の血清のヒトカリクレイン６（ｈＫ６）濃度
【表２】
2004511810.tif 000004
１．血清ＣＡ１５．３レベル＞４１４ＫＵ／Ｌ（上限レファレンス・レンジ３５ＫＵ／Ｌ）
２．カルシトニンレベル＞１．１３５ｎｇ／Ｌ（上限レファレンス・レンジ１００ｎｇ／Ｌ）
３．ｈＣＧレベル＞６９ＩＵ／Ｌ（上限レファレンス・レンジ１０ＩＵ／Ｌ）またはＡＦＰレベル＞１１０μｇ／Ｌ（上限レファレンス・レンジ１０μｇ／Ｌ）
４．ＣＡ１９．９レベル＞６２９ＫＵ／Ｌ（上限レファレンス・レンジ３７ＫＵ／Ｌ）およびＣＥＡレベル＞１．０００μｇ／Ｌ（上限レファレンス・レンジ５μｇ／Ｌ）
５．ＰＳＡ＞３２４μｇ／Ｌ（上限レファレンス・レンジ４μｇ／Ｌ）
６．ＣＡ１２５＞３７２ＫＵ／Ｌ（上限レファレンス・レンジ３５ＫＵ／Ｌ）
【０１４２】
表３：非癌（健康）、良性疾病および卵巣癌患者における血清ｈＫ６の記述的統計
【表３】
2004511810.tif 000005
【０１４３】
表４：選択されたカットオフポイントでの血清ｈＫ６濃度の敏感度と特異度の比較
【表４】
2004511810.tif 000006
【０１４４】
表５：ＣＡ１２５単独、ｈＫ６単独およびＣＡ１２５＋ｈＫ６分析の卵巣癌診断敏感度（両マーカーの特異度カットオフ９０および９５％）
【表５】
2004511810.tif 000007
【０１４５】
表６：血清ｈＫ６の四分位による卵巣癌の相対的リスクａ（ＲＲ）
【表６】
2004511810.tif 000008
ａ 無条件ロジスティック回帰モデルから評価
ｂ 多変量モデルはＣＡ１２５四分位で補正した
【０１４６】
表７：卵巣癌患者におけるｈＫ６状態と他の変量との関係＊
【表７】
2004511810.tif 000009
＊ ｈＫ６カットオフ＝４．４μｇ／Ｌ（中央値）
ａ χ２検定
ｂ フィッシャーの直接法
ｃ ＯＤ、最適の減容積（０−１ｃｍ）；最適下限の減容積（＞１ｃｍ）
ｄ ＣＴＸ、化学療法；ＮＣ変化なし；ＰＤ、進行性疾病；ＣＲ、完全な反応；ＰＲ、部分的な反応；ＮＥ、評価せず
Ｘ 状態は未詳
【０１４７】
表８：無進行および全生存率に関する血清ｈＫ６の一変量および多変量解析
【表８】
2004511810.tif 000010
ａ ハザード比（ＨＲ）はコックス比例ハザード回帰モデルにより評価した
ｂ 評価したＨＲの信頼区間
ｃ 漿液性対その他
ｄ カットオフ＝９８ＫＵ／Ｌ（９５％の特異度；５３％の敏感度；４８番目の百分位）
【０１４８】
表９．１８０人の卵巣癌患者におけるｈＫ６状態と他の変量との関係
【表９】
2004511810.tif 000011
ａ χ２検定
ｂ フィッシャーの直接法
ｃ ＣＴＸ；化学療法、ＮＣ；変化なし、ＰＤ；進行性疾病、ＣＲ；完全な反応、ＰＲ；部分的な反応、ＮＥ；評価せず
Ｘ．状態は未詳
【０１４９】
表１０．ｈＫ６の予後的価値の一変量および多変量解析
【表１０】
2004511810.tif 000012
ａ ハザード比（ＨＲ）はコックス比例ハザード回帰モデルにより評価した
ｂ 評価したＨＲの信頼区間
ｃ 漿液性対その他
【０１５０】
表１１．患者サブグループのコックス比例ハザード回帰分析
【表１１】
2004511810.tif 000013
ａ ハザード比（ＨＲ）はコックス比例ハザード回帰モデルにより評価した
ｂ 評価したＨＲの信頼区間
ｃ 多変量モデルは疾病の病期、残存腫瘍、組織学的タイプおよび年齢に補正した
ｄ 多変量モデルは腫瘍の悪性度、残存腫瘍、組織学的タイプおよび年齢に補正した
ｅ 最適の減容積（０−１ｃｍの残存腫瘍）；最適下限の減容積（＞１ｃｍ残存腫瘍）
ｆ 多変量モデルは疾病の病期、腫瘍の悪性度、組織学的タイプおよび年齢に補正した
【０１５１】
明細書中で参照した参照文献の詳細な引用
１． Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ， Ｙｏｕｓｅｆ ＧＭ， Ｌｕｏ ＬＹ， Ｍａｇｋｌａｒａ Ａ， Ｏｂｉｅｚｕ ＣＶ．　Ｔｈｅ ｎｅｗ ｈｕｍａｎ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．　Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２０００；１１：５４−６０．
２． Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ．　Ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ　ｉｔｓ ｕｓｅｆｕｌｎｅｓｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．　Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ １９９９；２５：１４−１６．
３． ＭｃＣｏｒｍａｃｋ ＲＴ， Ｒｉｔｔｅｎｈｏｕｓｅ ＨＧ， Ｆｉｎｌａｙ ＪＡ， Ｓｏｋｏｌｏｆｆ ＲＬ， Ｗａｎｇ ＴＪ， Ｗｏｌｆｅｒｔ ＲＬ， Ｌｉｌｊａ Ｈ， Ｏｅｓｔｅｒｌｉｎｇ ＪＥ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ： ａ ｎｅｗ ｅｒａ．　Ｕｒｏｌｏｇｙ １９９５；４５：７２９−７４４．
４． Ｃｈｕ ＴＭ．　Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．　Ｔｕｍｏｒ Ｂｉｏｌ １９９７；１８：１２３−１３４．
５． Ｓｔｅｎｍａｎ Ｕ−Ｈ．　Ｎｅｗ ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｓｓａｙｓ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｌａｎｄｕｌａｒ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ （ｈＫ２） ａｓ ａ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ．　Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９９；４５：７５３−７５４．
【０１５２】
６． Ｒｉｔｔｅｎｈｏｕｓｅ ＨＧ， Ｆｉｎｌａｙ ＪＡ， Ｍｉｋｏｌａｊｃｚｙｋ ＳＤ， Ｐａｒｔｉｎ ＡＷ．　Ｈｕｍａｎ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ２ （ｈＫ２） ａｎｄ ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ （ＰＳＡ）： Ｔｗｏ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ， ｂｕｔ ｄｉｓｔｉｎｃｔ， ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ．　Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｓｃｉ １９９８；３５：２７５−３６８．
７． Ｌｉｔｔｌｅ ＳＰ， Ｄｉｘｏｎ ＥＰ， Ｎｏｒｒｉｓ Ｆ， Ｂｕｃｋｌｅｙ Ｗ， Ｂｅｃｋｅｒ ＧＷ， Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｍ， Ｄｏｂｂｉｎｓ ＪＲ， ｅｔ ａｌ．　Ｚｙｍｅ， ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ｃＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ；ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｒａｉｎ．　Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９７；２７２：２５１３５−２５１４２．
８． Ａｎｉｓｏｗｉｃｚ Ａ， Ｓｏｔｉｒｏｐｏｕｌｏｕ Ｇ， Ｓｔｅｎｍａｎ Ｇ． Ｍｏｋ ＳＣ， Ｓａｇｅｒ Ｒ．　Ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｈｏｍｏｌｏｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ａｎｄ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．　Ｍｏｌ Ｍｅｄ １９９６；２：６２４−６３６．
９． Ｙａｍａｓｈｉｒｏ Ｋ， Ｔｓｕｒｕｏｉｋｏ Ｎ， Ｋｏｄａｍａ Ｓ， Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ Ｍ， Ｙａｍａｍｕｒａ Ｔ， Ｔａｎａｋａ Ｔ， Ｎａｋａｚａｔｏ Ｈ， Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｎ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｒｙｐｓｉｎ−ｌｉｋｅ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ （ｎｅｕｒｏｓｉｎ） ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｂｒａｉｎ．　Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９９７；１３５０：１１−１４．
１０． Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ， Ｙｏｕｓｅｆ ＧＭ， Ｃｌｅｍｅｎｔｓ Ｊ， Ａｓｈｗｏｒｔｈ ＬＫ， Ｙｏｓｈｉｄａ Ｓ， Ｅｇｅｌｒｕｄ Ｔ， Ｎｅｌｓｏｎ ＰＳ， Ｓｈｉｏｓａｋａ Ｓ， Ｌｉｔｔｌｅ Ｓ， Ｌｉｌｊａ Ｈ， Ｓｔｅｎｍａｎ Ｕ−Ｈ， Ｒｉｔｔｅｎｈｏｕｓｅ ＨＧ， Ｗａｉｎ Ｈ．　Ｎｅｗ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ．　Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ （ｉｎ ｐｒｅｓｓ）．
【０１５３】
１１． Ｙｏｕｓｅｆ ＧＭ， Ｌｕｏ Ｌ−Ｙ， Ｓｃｈｅｒｅｒ ＳＷ， Ｓｏｔｉｒｏｐｏｕｌｏｕ Ｇ， Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｚｙｍｅ／ｐｒｏｔｅａｓｅＭ／ｎｅｕｒｏｓｉｎ （ＰＲＳＳ９）， ａ ｈｏｒｍｏｎａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ−ｌｉｋｅ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ．　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９９９； ６２： ２５１−２５９．
１２． Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ， Ｙｏｕｓｅｆ ＧＭ， Ｓｏｏｓａｉｐｉｌｌａｉ ＡＲ， Ｇｒａｓｓ Ｌ， Ｐｏｒｔｅｒ Ａ， Ｌｉｔｔｌｅ Ｓ， Ｓｏｔｉｒｏｐｏｕｌｏｕ Ｇ． Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ６ （ｚｙｍｅ／ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｍ／ｎｅｕｒｏｓｉｎ） ａｎｄ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．　Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００， ３３： ３６９−３７５．
１３． Ｒｉｍａｎ Ｔ， Ｐｅｒｓｓｏｎ Ｉ， Ｓｔａｆｆａｎ Ｎ．　Ｈｏｒｍｏｎａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ： ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖｉｄｅｎｃｅ． Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １９９８；４９：６９５−７０７．
１４． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎａｄａ： Ｃａｎａｄｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ １９９９， Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｃａｎａｄａ， １９９９．
１５． Ｍｅｎｏｎ Ｕ， Ｊａｃｏｂｓ ＩＪ．　Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．　Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ ２０００；１２：３９−４２．
【０１５４】
１６． Ｄａｖｅｌｌａｒ ＥＭ， ｖａｎ Ｋａｍｐ ＧＪ， Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅｎ ＲＡ， Ｋｅｎｅｍａｎｓ Ｐ．　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＡ １２５ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｓｅｒｕｍ．　Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９８；４４：１４１７−１４２２．
１７． Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ ＡＮ， Ｊａｃｏｂｓ ＩＪ．　Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＣＡ １２５ ｉｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．　Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍａｒｋｅｒｓ １９９８；１３：２１６−２２０．
１８． Ｍａｇｇｉｎｏ Ｔ， Ｇａｄｄｕｃｃｉ Ａ．　Ｓｅｒｕｍ ｍａｒｋｅｒｓ ａｓ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ： ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．　Ｅｕｒ Ｊ Ｇｙｎａｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ ２０００；２１：６４−６９．
１９． Ｂａｓｔ ＲＣ Ｊｒ， Ｘｕ ＦＪ， Ｙｕ ＹＨ， Ｂａｒｎｈｉｌｌ Ｓ， Ｚｈａｎｇ Ｚ， Ｍｉｌｌｓ ＧＢ．　ＣＡ １２５： ｔｈｅ ｐａｓｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ．　Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍａｒｋｅｒｓ １９９８；１３：１７９−１８７．
２０． Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ＤＭ， Ｋａｈｉｒ Ｎ， Ｂｕｒｇｅｒ ＨＧ， Ｍａｍｅｒｓ Ｐ， ＭｃＣｌｏｕｄ ＰＩ， Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ Ｋ， ＭＣＧｕｃｋｉｎ Ｍ．　Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｎｈｉｂｉｎ ａｎｄ ＣＡ １２５ ａｓｓａｙｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．　Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９９；４５：６５１−６５８．
【０１５５】
２１． Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｍｅｓｓｅｒｌｉａｎ ＧＭ．　Ｉｓ ｉｎｈｉｂｉｎ ａ ｓｅｒｕｍ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ？　Ｅｕｒ Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ２０００；４２：３３１−３３３．
２２． Ａｌａ−Ｆｏｓｓｉ ＳＬ， Ｍａｅｎｐａａ Ｊ， Ｂｌａｕｅｒ Ｍ， Ｔｕｏｈｉｍａａ Ｐ， Ｐｕｎｎｏｎｅｎ Ｒ．　Ｉｎｈｉｂｉｎ Ａ， Ｂ ａｎｄ ｐｒｏ−ａｌｐｈａＣ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｆｌｕｉｄ ｉｎ ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｏｖａｒｉａｎ ｔｕｍｏｒｓ．　Ｅｕｒ Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ２０００；１４２：３３４−３３９．
２３． Ｂｕｒｇｅｒ ＨＧ， Ｂａｉｌｌｉｅ Ａ， Ｄｒｕｍｍｏｎｄ ＡＥ， Ｈｅａｌｙ ＤＬ， Ｊｏｂｌｉｎｇ Ｔ， Ｍａｍｅｒｓ Ｐ， Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ＤＭ， ｅｔ ａｌ．　Ｉｎｈｉｂｉｎ ａｎｄ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．　Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８；３９：７７−８７．
２４． Ｘｕ ＦＪ， Ｙｕ ＹＨ， Ｄａｌｙ Ｌ， ＤｅＳｏｍｂｒｅ Ｋ， Ａｎｓｅｌｍｉｎｏ Ｌ， Ｈａｓｓ ＧＭ， Ｂｅｒｃｈｕｃｋ Ａ， ｅｔ ａｌ．　ＯＶＸ１ ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｓ ＣＡ−１２５ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｔ ｓｅｃｏｎｄ−ｌｏｏｋ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ．　Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １９９３；１１：１５０６−１５１０．
【０１５６】
２５． Ｂｅｒｅｋ ＪＳ， Ｂａｓｔ ＲＣ Ｊｒ．　Ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．　Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｓｅｒｉａｌ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．　Ｃａｎｃｅｒ １９９５；７６：２０９２−２０９６．
２６． Ｘｕ Ｙ， Ｓｈｅｎ Ｚ， Ｗｉｐｅｒ ＤＷ， Ｗｕ Ｍ， Ｍｏｒｔｏｎ ＲＥ， Ｅｌｓｏｎ Ｐ， Ｋｅｎｎｅｄｙ ＡＷ， ｅｔ ａｌ．　Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｏｖａｒｉａｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ．　Ｊ Ａｍ Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃ １９９８；２８０：７１９０７２３．
２７． Ｍｙｅｒ， ｔ， Ｒｕｓｔｉｎ ＧＪＳ． Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２０００；８２：１５３５−１５３８．
２８． Ｗｏｏｌａｓ ＲＰ， Ｘｕ ＦＪ， Ｊａｃｏｂｓ ＩＪ， Ｙｕ Ｙ， Ｄａｌｙ Ｌ， Ｂｅｒｃｈｕｃｋ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｅｌｅｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｒｕｍ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｔａｇｅ Ｉ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｊ． Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ １９９３；８５：１７４８−１７５１．
２９． Ｗｏｏｌａｓ ＲＰ， Ｃｏｎａｗａｙ ＭＲ， Ｘｕ Ｆ， Ｊａｃｏｂｓ ＩＪ Ｙｕ Ｙ， Ｄａｌｙ， Ｌ ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｒｕｍ ｍａｒｋｅｒｓ ａｒｅ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｏ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｆｒｏｍ ｂｅｎｉｇｎ ｐｅｌｖｉｃ ｍａｓｓｅｓ． Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ １９９５；５９：１１１−１１６．
３０． Ｃｏｘ， ＤＲ． Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｔａｂｌｅｓ ａｎｄ ｌｉｆｅ ｔａｂｌｅｓ． Ｊ． Ｒ． Ｓｔａｔ．Ｃｏｓ．Ｂ， ３４：１８７−２０２，１９７２．
【０１５７】
３１． Ｋａｐｌａｎ， Ｅ．Ｌ， ａｎｄ Ｍｅｉｅｒ， Ｐ． Ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ． Ｊ． Ａｍ． Ｓｔａｔ． Ａｓｓｏｃ． ５３：４５７−４８１， １９５８．
３２． Ｍａｎｔｅｌ， Ｎ． Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｄａｔａ ａｎｄ ｔｗｏ ｎｅｗ ｒａｎｋ ｏｒｄｅｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ａｒｉｓｉｎｇ ｉｎ ｉｔｓ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐ． ５０：１６３−１７０， １９６６．
３３． Ｇａｔｔａ， Ｇ． Ｌａｓｏｔａ， Ｍ．Ｂ． ａｎｄ Ｖｅｒｄｅｃｃｈｉａ， Ａ． Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｗｏｍｅｎ ｗｉｔｈ ｇｙｎｅａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｕｍｏｕｒｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｅｒｉｏｄ １９７８−１９８９． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ３４： ２２１８−２２２５， １９９８．
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【０１５８】
３６． Ｍａｇｋｌａｒａ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００１；７：８０６−８１１．
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３８． Ｌｕｏ， ＬＹ ｅｔ ａｌ， Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ ２００１；３０６：１１１−１１８．
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４０． Ｔａｎｉｍｏｔｏ Ｈ． ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ １９９９；８６：２０７４−２０８２．
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４３． Ｔａｎｉｍｏｔｏ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９７；５７：２８８４−２８８７．
４４． Ｈｉｒａｈａｒａ Ｆ．， ｅｔ ａｌ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ １９９８；６８：１６２−１６５．
４５． Ｄｕｆｆｙ， ＭＪ， Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｍｅｔａｓｉｓ １９９２；１０：１４５−１５５．
【０１６０】
４６． Ｍａｔｒｉｓｉａｎ， ＬＭ， Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １９９９；９：Ｒ７７６−Ｒ７７８．
４７． Ｋｌｅｉｎｅｒ ＤＥ， Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ＷＧ， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９９９；４３：Ｓ４２−Ｓ５１．
４８． Ｗｏｏｄｈｏｕｓｅ ＥＣ ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ １９９７；８０：１５２９−２５３７．
４９． Ａｚｎａｖｏｏｒｉａｎ， Ｓ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ １９９３；７１：１３６８−１３８３．
【図面の簡単な説明】
【図１】ｈＫ６タンパク質アッセイの較正曲線である。
【図２】３種の体液の高速液体クロマトグラフィーによる分離と、開発されたｈＫ６免疫アッセイによる全画分の分析の結果を示す。
【図３】様々なヒト組織細胞質抽出物の、ｈＫ６タンパク質についての分析結果を示すグラフである。
【図４】８０人の卵巣癌腫患者の血清におけるｈＫ６濃度の度数分布を示すグラフである。
【図５】卵巣癌患者由来の９６個の血清サンプルにおけるｈＫ６濃度とＣＡ１２５濃度との間の相関を示すグラフである。
【図６】卵巣癌患者からの連続的血清サンプルにおけるｈＫ６とＣＡ１２５の分析を示すグラフである。
【図７Ａ】正常、良性、癌患者でのｈＫ６分布を示すグラフである。
【図７Ｂ】正常、良性、癌患者でのＣＡ１２５分布を示すグラフである。
【図８】手術前と手術後の卵巣癌患者の血清サンプルにおけるｈＫ６濃度を示すグラフである。
【図９】血清ｈＫ６濃度とＣＡ１２５濃度との間の相関を示すグラフである。
【図１０】血清ｈＫ６濃度の敏感度と特異度を示すグラフである。
【図１１Ａ】ｈＫ６濃度対卵巣癌の病期を示すグラフである。
【図１１Ｂ】ｈＫ６濃度対卵巣癌の悪性度を示すグラフである。
【図１２Ａ】生存可能性対無進行生存（ＰＦＳ）を示すグラフである。
【図１２Ｂ】生存可能性対全生存（ＯＳ）を示すグラフである。
【図１３Ａ】卵巣腫瘍抽出物におけるｈＫ６比活性の度数分布を示すグラフである。
【図１３Ｂ】ｈＫ６腫瘍比活性対カイ二乗統計値のプロットである。
【図１４】正常卵巣組織および卵巣癌からの抽出物中のｈＫ６濃度の比較を示すグラフである。
【図１５】Ｉ／ＩＩ期およびＩＩＩ／ＩＶ期の卵巣癌患者由来のの腫瘍抽出物中の、ｈＫ６比活性の分布を示すグラフである。
【図１６】研究下にある全患者集団のカプラン・マイヤーの生存率曲線：ｈＫ６状態の影響を示す。
【図１７】程度ＩおよびＩＩの卵巣腫瘍患者における、無進行生存率と全生存率に対するｈＫ６状態の影響を示すグラフである。
【図１８】様々な悪性状態、細胞タイプおよび起源の卵巣新生物における、ｈＫ６の免疫組織学的局在を示すブロットである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004511810.tif 000104
【国際調査報告】
2004511810.tif 000105
2004511810.tif 000106
2004511810.tif 000107
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