(57)【要約】ヒトミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子が、超変異性の細胞及び生物を作製するために使用されうる。これらの遺伝子を細胞及びトランスジェニック動物へ導入することにより、新規かつ有用な特性を有する新たな細胞系及び動物変種が、自然な変異の速度に頼るよりも効率的に調製されうる。増強された変異の速度は、変異原を使用してさらに強化されうる。さらに、ミスマッチ修復欠損細胞の超変異性は、有用な変異を有する細胞又は哺乳動物を安定化するために軽減されうる。
2004527207.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
関心対象の遺伝子において変異を作製するための方法であって、
関心対象の遺伝子と、誘導可能転写制御因子の調節下にあるミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子とを含む超変異性哺乳動物細胞を増殖させる工程；
関心対象の遺伝子が変異を保持しているか否かを決定するため、細胞を試験する工程；及び
ドミナントネガティブ対立遺伝子の発現を減少させることにより、ミスマッチ修復活性を細胞に回復させる工程を含む、方法。
【請求項２】
試験工程が、関心対象の遺伝子のヌクレオチド配列を分析することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
試験工程が、関心対象の遺伝子から転写されたｍＲＮＡを分析することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
試験工程が、関心対象の遺伝子によりコードされたタンパク質を分析することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
試験工程が、細胞の表現型を分析することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
哺乳動物細胞が、細胞が超変異性となるよう、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を含むポリヌクレオチドを哺乳動物細胞へ導入する過程により作成される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
リーティングフレームシフトを引き起こすポリモノヌクレオチド鎖（ｔｒａｃｔ）が介在しているレポーター遺伝子が、哺乳動物細胞へ導入され、超変異性をモニタリングさせる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物において変異を作製するための方法であって、
誘導可能転写制御因子の調節下にあるミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を含む哺乳動物１個体以上を誘導条件下で成長させる工程；
成長工程中に獲得された新たな形質を有する哺乳動物１個体以上を選択する工程；
哺乳動物を非誘導条件に供することにより、遺伝子の安定性を哺乳動物に回復させる工程を含む、方法。
【請求項９】
新たな形質が、ヌクレオチド配列を分析することにより同定される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
新たな形質が、ｍＲＮＡを分析することにより同定される、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
新たな形質が、タンパク質を分析することにより同定される、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
新たな形質が、表現型を分析することにより同定される、請求項８記載の方法。
【請求項１３】
請求項８記載の方法により作成されたトランスジェニック哺乳動物。
【請求項１４】
ミスマッチ修復遺伝子がＰＭＳ２である、請求項１３記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項１５】
ミスマッチ修復遺伝子がヒトＰＭＳ２である、請求項１３記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項１６】
対立遺伝子が切断変異を含む、請求項１３記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項１７】
対立遺伝子がコドン１３４に切断変異を含む、請求項１５記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項１８】
切断変異が野生型ＰＭＳ２のヌクレオチド４２４のチミジンである、請求項１７記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項１９】
関心対象の遺伝子において変異を作製するための方法であって、
（ａ）関心対象の遺伝子と、（ｂ）誘導可能転写制御因子の調節下にあるミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子とを含む哺乳動物細胞を誘導条件下で増殖させる工程；
細胞を変異原と接触させる工程；
改変された遺伝子、改変されたＲＮＡ、改変されたポリペプチド、又は改変された表  現型的形質を含む細胞１個以上を選択する工程を含む、方法。
【請求項２０】
非誘導条件下で培養することにより、選択された１個以上の細胞におけるドミナントネガティブ対立遺伝子の発現を減少させる工程をさらに含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
ドミナントネガティブ対立遺伝子の発現を、ドミナントネガティブ対立遺伝子の部位特異的変異誘発により減少させる、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
関心対象の遺伝子において変異を作製するための方法であって、
（ａ）関心対象の遺伝子と、（ｂ）ミスマッチ修復遺伝子の遺伝学的欠陥とを含む細胞を、変異原で処理する工程；
改変された遺伝子、ＲＮＡ、ポリペプチド、又は表現型的形質を含む細胞１個以上を選択する工程を含む、方法。
【請求項２３】
ミスマッチ修復遺伝子の遺伝学的欠陥が、ＰＭＳ２に存在する、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ミスマッチ修復遺伝子の遺伝学的欠陥が、ＰＭＳ１に存在する、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
ミスマッチ修復遺伝子の遺伝学的欠陥が、ＭＬＨ１に存在する、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
ミスマッチ修復遺伝子の遺伝学的欠陥が、ＭＳＨ２に存在する、請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
ミスマッチ修復遺伝子の遺伝学的欠陥が、ＧＴＢＰ／ＭＳＨ６に存在する、請求項２２記載の方法。
【請求項２８】
ミスマッチ修復遺伝子の遺伝学的欠陥が、ＭＳＨ３に存在する、請求項２２記載の方法。
【請求項２９】
遺伝学的欠陥がドミナントネガティブ変異である、請求項２２記載の方法。
【請求項３０】
遺伝学的欠陥がドミナントネガティブ変異である、請求項２３記載の方法。
【請求項３１】
遺伝学的安定性が回復するよう、補足ミスマッチ修復遺伝子を１個以上の選択された細胞に導入する工程をさらに含む、請求項２２記載の方法。
【請求項３２】
補足ミスマッチ修復遺伝子が、１個以上の選択された細胞において構成性の活性を有する、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
補足ミスマッチ修復遺伝子が誘導可能に制御される、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
補足ミスマッチ修復遺伝子がＰＭＳ２である、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
補足ミスマッチ修復遺伝子がＰＭＳ１である、請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
補足ミスマッチ修復遺伝子がＭＬＨ１である、請求項３１記載の方法。
【請求項３７】
補足ミスマッチ修復遺伝子がＭＳＨ２である、請求項３１記載の方法。
【請求項３８】
補足ミスマッチ修復遺伝子がＧＴＢＰ／ＭＳＨ６である、請求項３１記載の方法。
【請求項３９】
補足ミスマッチ修復遺伝子がＭＳＨ３である、請求項３１記載の方法。
【請求項４０】
補足ミスマッチ修復遺伝子が、ミスマッチ修復正常細胞との細胞−細胞融合により、１個以上の選択された細胞に導入される、請求項３１記載の方法。
【請求項４１】
細胞のミスマッチ修復活性を測定するための方法であって、
ポリモノヌクレオチド鎖の下流の遺伝子のリーティングフレームを崩壊させるポリモノヌクレオチド鎖をコーディング領域に含んでいる遺伝子の細胞における機能（遺伝子の機能は細胞の減少したミスマッチ修復活性と相関している）をアッセイする工程を含む、方法。
【請求項４２】
遺伝子のリーティングフレームを崩壊させないポリモノヌクレオチド鎖を遺伝子内に有する細胞が、対照として使用される、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
細胞がミスマッチ修復の欠陥を有する、請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
ミスマッチ修復正常性（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）細胞が対照として使用される、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
誘導可能転写制御因子の調節下にあるミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を含む哺乳動物。
【請求項４６】
ミスマッチ修復遺伝子がＰＭＳ２である、請求項４５記載の哺乳動物。
【請求項４７】
ミスマッチ修復遺伝子がヒトＰＭＳ２である、請求項４５記載の哺乳動物。
【請求項４８】
対立遺伝子が切断変異を含む、請求項４５記載の哺乳動物。
【請求項４９】
対立遺伝子がコドン１３４に切断変異を含む、請求項４８記載の哺乳動物。
【請求項５０】
切断変異が野生型ＰＭＳ２のヌクレオチド４２４のチミジンである、請求項４９記載の哺乳動物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０００年５月１７日出願の６０／２０４，７６９に基づく優先権を主張するものであり、その開示は本明細書に明示的に組み込まれる。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、ミスマッチ修復遺伝子の領域に関する。特に、本発明は、変異誘発の分野に関する。
【０００３】
発明の背景
過去４年間に、リンチ（Ｌｙｎｃｈ）症候群ＩＩとしても既知の遺伝性非ポリポーシス性大腸癌症候群（Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ Ｎｏｎｐｏｌｙｐｏｓｉｓ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ／ＨＮＰＣＣ）の遺伝学的原因が、その疾患に罹患した血族の大部分について確認された（１３）。ＨＮＰＣＣの分子的基礎は、欠陥ミスマッチ修復（ＭＭＲ）に起因する遺伝学的不安定性を含む。ｍｕｔＳホモログＧＴＢＰ、ｈＭＳＨ２、及びｈＭＳＨ３、並びにｍｕｔＬホモログｈＭＬＨ１、ｈＰＭＳ１、及びｈＰＭＳ２を含む、ＭＭＲ過程に参与していると考えられるタンパク質をコードする多くの遺伝子が、齧歯類及びヒトにおいて同定されている（２，７，１１，１７，２０，２１，２２，２４）。これらの遺伝子のうちの４つ（ｈＭＳＨ２、ｈＭＬＨ１、ｈＰＭＳ１、及びｈＰＭＳ２）の生殖系列変異が、ＨＮＰＣＣ家系において同定された（２，１１，１３，１７，２４）。ＭＭＲ欠損により生じる変異誘発欠陥（ｍｕｔａｔｏｒ ｄｅｆｅｃｔ）は、任意のＤＮＡ配列に影響を与えうるが、ＭＭＲ異常に対する特に高い感受性を有するのはミクロサテライト配列である（１４）。従って、ミクロサテライトの不安定性は、欠陥ＭＭＲの有用な指標である。ミクロサテライトの不安定性は、ＨＮＰＣＣ患者に生じる事実上全ての腫瘍において発生するのに加え、別個の分子的特性及び表現型的特性を有する散発性腫瘍の極一部にも見出される（２７）。
【０００４】
ＨＮＰＣＣは、常染色体優性遺伝するため、罹患家族メンバーの正常細胞は、（罹患している親から遺伝した）関連ＭＭＲ遺伝子の変異対立遺伝子１個と、（罹患していない親から遺伝した）野生型対立遺伝子１個とを含有している。しかしながら、腫瘍発生の初期の段階において、野生型対立遺伝子が体細胞性変異によって不活化されて、機能性ＭＭＲ遺伝子を有しない細胞が残され、ＭＭＲ活性の著しい欠陥がもたらされる。腫瘍細胞における欠陥ＭＭＲを作製するためには、生殖系列変異に加え体細胞性変異が必要とされるため、他の遺伝性癌を惹起する腫瘍抑制遺伝子の二対立遺伝子不活化と類似した、このメカニズムは、一般的に、２ヒットを含むものと呼ばれる（１１，１３，２５）。この２ヒットメカニズムと一致して、ＨＮＰＣＣ患者の非新生物細胞は、一般に、野生型対立遺伝子の存在のため、ほぼ正常なレベルのＭＭＲ活性を保持している。
【０００５】
欠陥ＭＭＲを有する広範囲の生物が、ゲノム全体に拡がった遺伝子変異を有することが見出されている。全ての場合に、これらの生物は、特定のＭＭＲ遺伝子の両コピーに生殖系列変異を有している。最近、ニコライデス（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ）らの研究により、ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を導入することにより、高等生物由来の細胞においてＭＭＲの減少が達成されうることが示された。これらのデータは、そのような手法の使用によって、新たな出力形質を生成させるため遺伝学的に改変された生物が作製されうることを示唆している。当分野においては、遺伝学的な多様性を作製するためのさらなる方法が必要とされている。
【０００６】
発明の概要
本発明の目的は、細胞を超変異性にするための方法を提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、遺伝学的に改変された細胞系を提供することである。
【０００８】
本発明の別の目的は、表現型的に改変された細胞系を提供することである。
【０００９】
本発明のさらに別の目的は、細胞において遺伝学的超変異の速度を増強するための方法を提供することである。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、細胞において関心対象の（１個以上の）遺伝子を変異させる方法を提供することである。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、遺伝学的に改変された細菌プリンホスホリラーゼのための材料の組成物を、特許請求の範囲に記載することである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、真核細胞のミスマッチ修復欠損をモニタリングするための診断道具としての、遺伝学的に改変された細菌プリンホスホリラーゼのための材料の組成物を、特許請求の範囲に記載することである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、真核細胞における改変されたミスマッチ修復を測定するための、ポリモノヌクレオチド鎖（ｔｒａｃｔ）を組み込むことにより遺伝学的に改変された遺伝子を作製するための材料の組成物を、特許請求の範囲に記載することである。
【００１４】
本発明のさらに別の目的は、新たな表現型を有する細胞を作出する方法を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに別の目的は、新たな表現型及び安定なゲノムを有する細胞を作出する方法を提供することである。
【００１６】
本発明のさらに別の目的は、細胞又は生物のゲノムの遺伝学的安定性を制御する方法を提供することである。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、ドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子変異体を含有する誘導可能ベクターを使用して超変異性細胞系を作製することである。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、誘導された遺伝子発現条件下で、ドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子変異体を有する誘導可能ベクターを含有している超変異性細胞系をスクリーニングすることである。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、誘導された遺伝子発現条件下で、ドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子変異体を有する誘導可能ベクターを含有している超変異性細胞系を、改変された遺伝子構造及び／又は新たな表現型に関してスクリーニングすることである。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、ゲノムの安定性を回復させるため、構造的に改変された標的遺伝子及び／又は新たな表現型を含有している細胞におけるドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の発現をオフ状態にすることである。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、化学変異原又は電離放射線の存在下で、誘導条件下で、ドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子変異体を含む誘導可能ベクターを含有している超変異性細胞系を、構造的に改変された標的遺伝子及び／又は新たな表現型に関してスクリーニングすることである。次いで、改変された遺伝子構造及び／又は新たな表現型を含有している細胞を誘導分子から離し、遺伝学的安定性を回復させる。
【００２２】
本発明のこれら及びその他の目的は、下記の態様のうちの一つ以上によって提供される。本発明の一つの態様において、超変異性細胞を作成するための方法が提供される。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子をコードするポリヌクレオチドが細胞へ導入される。細胞は、遺伝子の導入の結果として超変異性となる。
【００２３】
本発明の別の態様において、単離された超変異性細胞が提供されるであろう。細胞は、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を含む。細胞をＤＮＡアルキル化剤に曝す。細胞は増強された超変異速度を示す。
【００２４】
本発明の別の態様において、関心対象の遺伝子に変異を導入するための方法が提供される。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子をコードするポリヌクレオチドが、細胞へ導入される。細胞は、遺伝子の導入の結果として超変異性となる。細胞は、関心対象の遺伝子をさらに含む。細胞を増殖させる。関心対象の遺伝子が変異を保持しているか否かを決定するため、細胞が試験される。
【００２５】
本発明の別の態様において、真核細胞のミスマッチ修復活性を測定するため、ポリモノヌクレオチド鎖を遺伝子に挿入するための方法が提供される。ポリモノヌクレオチド鎖が、遺伝子又はｃＤＮＡのコーディング領域にアウトオブフレーム（ｏｕｔ−ｏｆ−ｆｒａｍｅ）で挿入される。その遺伝子が、細胞へ導入される。ポリモノヌクレオチド鎖が、ミスマッチ修復欠損により改変される。インフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）の改変された遺伝子が作製される。
【００２６】
本発明の別の態様において、細胞の新たな表現型を生成させるための方法が提供される。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子をコードするポリヌクレオチドが、細胞へ導入される。細胞は、遺伝子の導入の結果として超変異性となる。細胞を増殖させる。新たな表現型の発現に関して細胞が試験される。本発明の別の態様は、改変された標的遺伝子及び／又は新たな表現型のための、化学変異原又は電離放射線の存在下での、誘導条件下での、ドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子変異体からなる誘導可能ベクターを含有している細胞の使用である。次いで、改変された遺伝子構造及び／又は新たな表現型を含有している細胞を誘導分子から離し、遺伝学的安定性を回復させる。ここで、細胞は、組換え製造及び／又は遺伝子発見（これらに限定はされない）のような商業的な特性のために使用される。
【００２７】
本発明の別の態様は、改変された標的遺伝子及び／又は新たな表現型のための、化学変異原又は電離放射線の存在下での、誘導条件下での、関心対象の遺伝子を含有しているＭＭＲ欠陥細胞の使用である。次いで、改変された遺伝子構造及び／又は新たな表現型を含有している細胞は、野生型ＭＭＲ補足遺伝子で安定的に形質導入し、遺伝学的安定性を回復させる。ここで、細胞は、組換え製造又は遺伝子発見のために使用される。
【００２８】
本発明の別の態様において、欠陥ミスマッチ修復遺伝子を有する細胞において、遺伝学的安定性を回復させるための方法が提供される。ミスマッチ修復過程の活性を回復させ、そのゲノムは安定となる。
【００２９】
本発明の別の態様において、欠陥ミスマッチ修復活性及び新たに選択された表現型を有する細胞において、遺伝学的安定性を回復させるための方法が提供される。ＭＭＲ欠損は、ゲノム変異を介した内因性ＭＭＲ遺伝子の不活化により、又はドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子対立遺伝子を生成させる真核発現ベクターの導入により、起こりうる。内因性ＭＭＲ遺伝子の欠陥により内因性ＭＭＲ遺伝子を欠いている細胞の場合には、細胞が、新たな表現型、又は改変された遺伝子、ＲＮＡ、もしくはポリペプチドに関して選択される。細胞は、宿主細胞のゲノム欠陥を補足する正常な機能性ＭＭＲ遺伝子の導入によって、遺伝学的に安定なものとなる。この補足群は、ミスマッチ修復欠損に参与していることが知られている任意の遺伝子の使用を含みうる。ドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子の発現が、ＤＮＡ超変異性を誘導するために使用される場合には、ドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子発現は、誘導分子の除去により、又は当業者によって使用されている標準的な遺伝子ノックアウト技術を使用して、ドミナントネガティブ遺伝子対立遺伝子の発現をノックアウトすることにより抑制されるであろう（Ｗａｌｄｍａｎ，Ｔ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：５１８７−５１９０，１９９５）。いずれの場合にも、細胞の遺伝学的安定性が回復し、新たな表現型は安定なものとなる。
【００３０】
本発明のこれら及びその他の態様は、生物、細胞、及び動物において増強された変異性を作製しうる方法を当分野に提供し、潜在的に有用なゲノム改変を保持している安定な生物、細胞、及び動物を提供する。
【００３１】
ドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子対立遺伝子の使用は、制御された様式で、宿主生物のゲノム全体に全体的な変異を作製する上で重要である。ドミナントネガティブ対立遺伝子の使用は、広範囲の宿主（細菌、酵母、哺乳動物、植物）において全体的な変異誘発を誘導しうることが以前に証明されているが、ゲノムワイドな変異を作製するため、ドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子変異体をオン状態にした後、新たな生物学的出力形質（例えば、化学変異原に対する耐性）を選択し、遺伝学的安定性を回復させるためドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子対立遺伝子をオフ状態にするための、誘導可能ベクターの使用は、本発明の新たな局面である。ここで、この方法は、新たな表現型に関与している遺伝子の遺伝学的変異に関してスクリーニングされうる、遺伝学的に多様な原核細胞、真核細胞、及び哺乳動物細胞の作製に適している。さらに、本出願は、誘導可能発現因子の調節下にあるドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子対立遺伝子の、ＭＭＲ正常細胞への導入の使用を開示する。次いで、安定的、又は一過性的形質導入された細胞が、ドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の発現をもたらす誘導分子へと曝される。ドミナントネガティブ産物の発現は、内因性ＭＭＲ機構を妨害し、それにより遺伝学的に多様な亜系をもたらす遺伝学的不安定性を引き起こす。次いで、これらの細胞は、特別な選択アッセイ下に置かれ、新たな表現型及び／又は改変された遺伝子構造に関してスクリーニングされる。改変された標的遺伝子及び／又は新たな表現型を含有している亜系の樹立の後、次いで、誘導分子の除去により、細胞が遺伝学的に安定なものとなり、ここで、改変された遺伝子を含有している、かつ／又は新たな表現型を示す安定な細胞系が生成する。この細胞系は、遺伝子発見、薬物標的発見、組換え遺伝子変異誘発、及び／又は組換えタンパク質産生のために使用されうる。
【００３２】
ＭＭＲ欠損生物が、ゲノムワイドな又は遺伝子座特異的な変異誘発の増強されたレベルをもたらすアルキル化剤又は電離放射線のようなＤＮＡ損傷剤に対する比較的高い耐性を有することはよく確立されている。本明細書において、本発明者らは、誘導可能発現因子の調節下にあるドミナントネガティブＭＭＲを発現している細胞系の、増強されたゲノムワイドな変異誘発をもたらしうるＤＮＡ損傷剤への曝露の使用を開示する。次いで、細胞系は、標的遺伝子内の変異に関してスクリーニングされるか、又は新規表現型に関してスクリーニングされる。次いで、遺伝学的安定性を回復させるため、ドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子対立遺伝子を「オフ状態」にするため、改変された遺伝子又は表現型を有する亜系は、誘導剤から除去される。この細胞系は、遺伝子発見、薬物標的発見、組換え遺伝子変異誘発、及び／又は組換えタンパク質産生のために使用されうる。
【００３３】
最後に、天然にＭＭＲの欠陥を有する哺乳動物細胞系の使用が、関心対象の遺伝子を含有しているプラスミドを導入するために使用されうる。遺伝子を導入し、一過的又は安定的に発現させる。ここで、細胞を増殖させ、構造及び／又は機能の改変を有するものを同定するため、導入された遺伝子の構造及び／又は機能をスクリーニングする。変異速度を増強するため、宿主におけるゲノムワイドな変異の速度を増強するための、アルキル化化学変異原又は電離放射線（これらに限定はされない）のようなＤＮＡ損傷剤へとさらに細胞を曝すこともできる。関心対象の遺伝子に変異を含有している（１個以上の）細胞が作製された後、細胞は内因性ＭＭＲ欠陥を補足する遺伝子で安定的に形質導入される。ここで、細胞系は遺伝学的に安定なものとなり、細胞系は、遺伝子発見、組換え遺伝子変異誘発、及び／又は組換えタンパク質産生のための改変された遺伝子産物の作製に適したものとなる。
［発明の詳細な説明］
【００３４】
本発明者らは、ミスマッチ修復を欠損している細胞を利用することにより、超変異性の細胞を開発し、改変された遺伝子、ＲＮＡ、ポリペプチドおよび細胞、または新しい表現型を有する生物体全体を創造するための方法を発見した。そのような遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子は、細胞またはトランスジェニック動物へ導入される場合、ＤＮＡ修復の効率性が低下することにより自然突然変異の割合が増加し、それにより、細胞または動物を超変異性にする。超変異性細胞または動物は、その後、遺伝子に新しい突然変異を発生させて、宿主細胞または生物体の新しい出力形質を生み出すために利用されうる。本発明者らは、ＤＮＡに損傷を引き起こす化学薬品の使用により、ドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子の対立遺伝子を発現している細胞において、超変異性の割合を増幅させうることを示す。本発明者らはまた、改変された遺伝子の選択およびＭＭＲ（ミスマッチ修復）を回復することによる宿主細胞または生物体の遺伝子的安定性の回復が、改変された遺伝子、ＲＮＡ、またはポリペプチドからなる安定的生物学的生産物へと導くことができることも示す。
【００３５】
細菌から哺乳動物細胞の範囲に及ぶ細胞におけるタンパク質複合体は、ミスマッチ修復、またはミスマッチプルーフリーディングと呼ばれる過程を実行する。ミスマッチ修復遺伝子とは、そのようなミスマッチ修復複合体のタンパク質の一つをコードする遺伝子である。何か特定の作用機構の理論に結びつける必要はないが、ミスマッチ修復複合体はヌクレオチド塩基の非相補的対合から生じるＤＮＡヘリックスの歪みを検出するものと考えられている。新しい方のＤＮＡ鎖における非相補的塩基が切除され、その切除された塩基が古い方のＤＮＡ鎖に相補的である適切な塩基に置換される。このようにして、細胞は、ＤＮＡ複製における誤りの結果として生じる多くの突然変異を排除する。
【００３６】
ドミナントネガティブ対立遺伝子は、同じ細胞に野生型対立遺伝子が存在している場合でさえも、ミスマッチ修復の欠損した表現型を引き起こす。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子の例には、コドン１３４において切断突然変異を起こすヒト遺伝子ｈＰＭＳ２−１３４がある。その突然変異は、この遺伝子の産生物を１３４番目のアミノ酸の位置で異常に終結させ、その結果として、Ｎ末端の１３３個のアミノ酸を含む短縮されたポリペプチドを生じる。そのような突然変異は、ＤＮＡ複製後細胞に蓄積される突然変異の割合の増加を引き起こす。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子の発現は、野生型対立遺伝子の存在下でさえも、ミスマッチ修復活性の障害を生じる。そのような効果を生じる任意の対立遺伝子を本発明において使用することができる。
【００３７】
ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を、ヒト、動物、酵母、細菌、または他の生物体の細胞から得ることができる。欠損したミスマッチ修復活性について細胞をスクリーニングすることにより、そのような対立遺伝子を同定することができる。癌を有する動物またはヒト由来の細胞を、欠損したミスマッチ修復についてスクリーニングすることができる。大腸癌患者由来の細胞は特に有用でありうる。ミスマッチ修復タンパク質をコードする任意の細胞由来のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡを野生型配列からの変異として分析することができる。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子をまた、例えば、ｈＰＭＳ２−１３４対立遺伝子または他のミスマッチ修復遺伝子の変異体を生成することにより、人工的に作成することができる。部位特異的突然変異誘発の様々な技術を使用することができる。超変異性細胞または動物を発生させることにおける使用について、自然的であろうと人工的であろうと、そのような対立遺伝子の適合性は、それがドミナントネガティブ対立遺伝子であるかどうかを決定するために、１つまたは複数の野生型対立遺伝子の存在下においてその対立遺伝子により引き起こされるミスマッチ修復活性を試験することにより、評価することができる。
【００３８】
ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を導入された細胞、生物体、または動物は、超変異性になるものと思われる。これは、そのような細胞または動物の自然突然変異の割合がそのような対立遺伝子を含有しない細胞または動物と比較して上昇していることを意味する。自然突然変異の割合の上昇程度は、正常の細胞または動物の自然突然変異の割合の少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、または１０００倍となりうる。
【００３９】
本発明の１つの局面に従って、ミスマッチ修復タンパク質のドミナントネガティブ型をコードするポリヌクレオチドを任意の真核細胞またはトランスジェニック動物へ導入する。遺伝子は、ミスマッチ修復複合体、例えば、ＰＭＳ２、ＰＭＳ１、ＭＬＨ１、ＧＴＢＰ、ＭＳＨ３またはＭＳＨ２の部分であるタンパク質をコードする任意のドミナントネガティブ対立遺伝子であってもよい。ドミナントネガティブ対立遺伝子は、天然に存在しているか、または実験室で作成されうる。ポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、または化学的合成ポリヌクレオチドの形であってもよい。ポリヌクレオチドは、常時活性型プロモーターセグメント（限定されるものではないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１□またはＬＴＲ配列のような）を含む発現ベクターへ、またはドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子の発現を制御することができる、テトラサイクリン、またはエクジソン／グルココルチコイド誘導性ベクターのような誘導性プロモーター配列へクローニングすることができる。ポリヌクレオチドをトランスフェクションにより細胞へ導入することができる。
【００４０】
トランスフェクションとは、ポリヌクレオチドを細胞へ導入する任意の過程である。トランスフェクションの過程を、生きている動物に、例えば、遺伝子治療用のベクターを使って行うことができる、またはインビトロで、例えば、培養における１つまたは複数の単離された細胞の懸濁液を使って行うことができる。細胞は、例えば、ヒトまたは他の霊長類、哺乳動物または他の脊椎動物、無脊椎動物、および原生動物または酵母のような単細胞型生物体から単離された細胞を含む、真核細胞の任意の型であってもよい。
【００４１】
一般的に、トランスフェクションは、細胞の懸濁液、または単細胞を使って実行されるものと思われるが、処理された細胞または組織の画分が、トランスフェクトされた細胞を増殖させてかつ使用できるように、そのポリヌクレオチドを組み入れるのに十分である限りは、他の方法もまた適用されうる。そのポリヌクレオチドのタンパク質産物は、細胞において一過性にまたは安定的に発現されてもよい。トランスフェクションについての技術はよく知られている。ポリヌクレオチドを導入するために利用可能な技術は、限定されるものではないが、エレクトロポレーション、形質導入、細胞融合、塩化カルシウムの使用、および対象の細胞との融合のための脂質とともにポリヌクレオチドをパッキングする方法を含む。いったん、細胞をミスマッチ修復遺伝子をトランスフェクトしたならば、細胞を培養において増殖かつ複製することができる。トランスフェクションが安定的な場合には、多くの細胞産生について遺伝子が一貫したレベルで発現されるような、その後に細胞系が生じる。
【００４２】
単離された細胞は、ヒトおよび動物の組織から、酵素、例えば、コラゲナーゼまたはトリプシンなどでその組織を前処理するまたはしないのいずれかで、個々の細胞を機械的に分離して取り出し、かつそれらを適当な細胞培養培地へ移行することにより得られる細胞である。そのような単離された細胞は、典型的には、他の細胞型の非存在下で培養される。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子の導入について選択される細胞は、初代細胞培養もしくは不死化した細胞系の形態における真核細胞由来であってもよいし、または単細胞型生物体の懸濁液由来であってもよい。
【００４３】
ミスマッチ修復タンパク質のドミナントネガティブ型をコードするポリヌクレオチドは、トランスジェニック動物を作成することにより動物のゲノムへ導入されうる。動物は、トランスジェニック動物を作成するために適当な技術が利用可能である任意の種であってもよい。例として、トランスジェニック動物は、例えばウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマなどの家畜から；例えば、ミルクに組換えタンパク質を発現するウシ、ブタ、またはヤギのような組み換えタンパク質の生産に使用される動物から；または、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギなどの研究または生産物試験用の実験動物から調製されうる。
【００４４】
当技術分野において公知のトランスジェニック動物を作成するための任意の方法を使用することができる。トランスジェニック動物を作成する一つの過程に従って、ポリヌクレオチドは動物の受精卵へ注入され、その注入された卵は、偽妊娠のメスへ置かれる。卵は、ポリヌクレオチドが組み入れられかつ発現している成熟動物へと発育する。受精卵は、卵および偽妊娠のメスと同じ種の供与体動物の精子からインビトロで作成され、偽妊娠のメスは、受精卵を受けて妊娠するようにホルモン処理によって調製される。トランスジェニック動物を作成する代替方法は、ポリヌクレオチドを注入またはトランスフェクションにより胚性細胞へ導入することおよびその胚性細胞を発育胚へ再導入することを含む。この方法では、しかしながら、ポリヌクレオチドが生殖系列細胞へ組み入れられない場合には、その遺伝子は子孫へ伝えられないと思われる。それゆえ、この方法により作成されたトランスジェニック動物は、その遺伝子が動物の生殖細胞へ組み入れられているかどうかを決定するために評価しなければならない。いったん、トランスジェニック動物が作成されると、それらは生殖年齢まで成長することができ、そして交尾して出産し、トランスジェニック動物の群体が維持されうる。
【００４５】
いったん、トランスフェクションされた細胞系またはトランスジェニック動物の群体が作成されれば、それを１つまたは複数の対象の遺伝子において新しい突然変異を発生させるために使用することができる。対象の遺伝子は、細胞系もしくはトランスジェニック動物に本来所有されている、または細胞系もしくはトランスジェニック動物へ導入されている任意の遺伝子でありうる。突然変異を導入するためにそのような細胞または動物を使用することの利点は、その細胞または動物が商業的に有益な生物学的生産物を生産しうる遺伝的改変の広いスペクトルをもちうることである。超変異性動物をその後、育て、新しい所望の出力形質（ミルク生産、ペスト抵抗性などのような）について選択することができる。いったん、新しい形質が同定されれば、ドミナントネガティブ対立遺伝子は、当業者に使用される技術によりその対立遺伝子を直接的にノックアウトすること、または所望の形質および安定的ゲノムを有する子孫を選択するためにそのドミナントネガティブ対立遺伝子を欠損している仲間へ交配することにより除去されうる。もう一つの代替法は、ＣＲＥ−ＬＯＸ発現系を使用することであり、それにより、いったん新しい出力形質が確立されれば、ドミナントネガティブ対立遺伝子が動物のゲノムからスプライスされる。
【００４６】
本発明のもう一つの局面は、宿主のゲノムにおいて突然変異の割合の増幅を引き起こすためのＭＭＲを欠損している細胞（変異された内因性ＭＭＲ遺伝子による、またはドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の導入を通して）および化学的変異誘発物質の使用である。ＭＭＲ活性の欠損は、ＤＮＡ損傷試薬の毒性効果に対して、より抵抗性の細胞を作成することで知られていた。本発明は、正常性（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）ＭＭＲ細胞を作成すること；ドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子の発現およびその後ＤＮＡ変異誘発物質の使用でゲノムの超変異性を増幅することによるミスマッチ修復欠損の利用について開示する。本出願はまた、新しい遺伝的構造および／または新しい表現型を有する細胞を発生させるゲノムの変化の割合を増加させるために本来ＭＭＲを欠損している細胞を用いることおよび化学的変異誘発物質の曝露の有用性についても開示する。化学的変異誘発物質は、化学的性質、例えば、アルキル化剤、架橋結合剤などにより分類できる。他のものは本明細書に列挙されていないのだが、以下の化学的変異誘発物質は、本発明に従って有用である。Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＥＮＵ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＭＮＵ）、プロカルバジン塩酸塩、クロラムブシル、シクロホスファミド、メチルメタンスルホン酸（ＭＭＳ）、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、硫酸ジエチル、アクリルアミドモノマー、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、メルファラン、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジメチルニトロソアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、７，１２−ジメチルベンズアントラセン（ｄｉｍｅｔｈｉｌｂｅｎｚ（ａ）ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ、ＤＭＢＡ）、酸化エチレン、ヘキサメチルホスホルアミド、ブスルファン。本発明の好ましい局面において、１００個の遺伝子ごとに１つの突然変異；１突然変異／１，０００遺伝子の範囲の突然変異の割合を与える、突然変異誘発技術が利用される。そのような組み合わせ（ＭＭＲ欠損および化学的変異誘発物質）の使用により、各特定の試薬によって優先的に誘発されるゲノムの変化（限定されるものではないが、遺伝子のコード領域、遺伝子のイントロンの領域、または５’もしくは３’の基部および／もしくは末端領域の関連内のＤＮＡセグメントの伸展または欠失、点突然変異、改変反復配列のような）の広いアレイでの発生を可能にするものと思われる。
【００４７】
突然変異は、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、または対象の遺伝子に関連するアミノ酸の配列を調べることによって、細胞または動物の遺伝子型における変化について分析することにより、検出されうる。突然変異はまた、遺伝子の表現型をスクリーニングすることにより検出されうる。改変された表現型は、突然変異遺伝子によりコードされるタンパク質の電気泳動易動度、分光学的性質、または他の物理学的もしくは構造的特性における変化を同定することにより検出されうる。タンパク質の改変された機能について、インサイチューにおいて、単離された形において、またはモデル系においてスクリーニングすることもできる。限定されるものではないが、タンパク質分泌、薬品耐性、病原体耐性などのような、対象の遺伝子の機能に関連する細胞または動物の任意の性質の変化についてスクリーニングすることができる。
【００４８】
本出願のもう一つの発明は、ドミナントネガティブの発現および正常に機能するＭＭＲ遺伝子の発現を制御する誘導性ベクターの使用である。本出願は、いったん、新しい出力形質、改変された遺伝子、ＲＮＡまたはポリペプチドを示す宿主細胞または生物体が、化学的変異誘発物質の組み合わせの有りまたは無しで、形質選択を通して発生したならば、この細胞または生物体の遺伝的安定なバージョンを確立するために、ＤＮＡ安定性を回復する、そのようなストラテジーを使用することの有用性について開示する。ドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子を異所性に発現した結果としてのＭＭＲ欠損細胞の場合において、ＭＭＲ活性は、細胞培養または生物体の環境から誘導物質分子を除去することにより、減少または完全に無くなる。さらに、ドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の発現は、生殖細胞または体細胞におけるＤＮＡノックアウト技術分野での当業者に標準的な方法を使って、ＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子をノックアウトすることにより、抑制させることができる（Ｗａｌｄｍａｎ， Ｔ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５：５１８７−５１９０， １９９５）。
【００４９】
さらにもう一つの発明は、ＨＣＴ１１６、ＤＬＤ−１などのようなＭＭＲ欠損細胞系において、それらによる細胞が化学的変異誘発物質で処理され、病原体耐性、薬品耐性などのような新しい出力形質について選択されており、ＭＭＲ活性を回復することの利用について開示する。細胞は、その後、内因性ＭＭＲ欠損を補足し、かつ新しい出力形質、改変された遺伝子配列、改変されたＲＮＡ発現および／または改変されたタンパク質発現を示す細胞または生物体のＤＮＡ安定性を回復する野生型ＭＭＲ遺伝子のコピーでトランスフェクトされる。
【００５０】
上記の開示は、一般的に本発明を説明している。より完全な理解は、以下の明細な実施例を参照することにより得ることができ、実施例は、例示の目的としてのみ本明細書に提供され、本発明の範囲を限定するものではない。
【００５１】
実施例１：ミスマッチ修復正常性細胞において超変異性を引き起こすドミナントネガティブミスマッチ修復タンパク質の使用
著明なＭＭＲの欠陥は、２人のＨＮＰＣＣ患者の正常細胞で見出された。この欠陥がインビボで操作的であることは、そのような患者の非腫瘍性細胞においてマイクロサテライトの不安定性の広範な存在により証明された。２人の患者の１人は、ｈＰＭＳ２遺伝子のコドン１３４での生殖系列切断突然変異（ｈＰＭＳ２１３４突然変異）を有し、一方、もう一人の患者はｈＭＬＨ１遺伝子内の小さな生殖系列欠失を有していた（２６）。これらのデータは、このように、ＨＮＰＣＣ患者の生化学的および生物学的特徴を説明するものとして一般的に信じられている２つ対象のモデルに矛盾した。これらの患者の正常細胞におけるこのＭＭＲ欠損についての根拠は不明瞭であり、いくつかの可能性のある解釈が提示された。例えば、関連しているＭＭＲ遺伝子の第二の対立遺伝子が未発見の機構を通してこれらの患者の生殖系列において不活性化されているという可能性、または、ＭＭＲ過程に関与する他の遺伝子の未知の突然変異が既知の生殖系列の突然変異と協力して存在しているという可能性があった。ＭＭＲ欠損が正常な増殖および発生と矛盾しないことは、マウスでのノックアウト実験から明らかであり、これらの可能性（１、３、６）を支持している。または、変異誘発遺伝子がドミナントネガティブ効果を発揮し、その結果として、対応するＭＭＲ遺伝子およびＭＭＲ過程に関与するすべての他の遺伝子の野生型対立遺伝子の存在下でさえもＭＭＲ欠損を生じるという可能性があった。これらの可能性の間を区別するために、本発明者らは、ＭＭＲ正常性細胞系においてｈＰＭＳ２１３４突然変異によりコードされる切断型ポリペプチドを発現し、かつ細胞のＭＭＲ活性に対するその影響を分析した。その結果より、この突然変異体が真にドミナントネガティブの効果を発揮することができ、その結果としてＭＭＲ欠損の生化学的および遺伝学的顕在化を生じたことが示された。
【００５２】
ＭＭＲ正常性シリアンハムスターＴＫｔｓ１３細胞系（以後、ＳＨ細胞と呼ぶ）に、様々なｈＰＭＳ２発現プラスミドと、ＭＭＲ活性を評価するためのレポーター構築物とを同時トランスフェクトした。ｈＰＭＳ２発現プラスミドは、正常なｈＰＭＳ２遺伝子産物または上記の患者において同定された切断型ｈＰＭＳ２遺伝子を含んでいた（それぞれ、ＰＭＳ２ＷＴおよびＰＭＳ２１３４、図１Ａ）。ｈＰＭＳ２配列を欠いている「空の」ベクター（ＰＭＳ２ＮＯＴ、図１Ａ）が追加の対照として果たした。レポーター構築物ｐＣＡＲＯＦ（ｏｕｔ ｏｆ ｆｒａｍｅ）は、ハイグロマイシン耐性遺伝子と、コード領域の５’末端に２９個の塩基対のアウトオブフレームポリＣＡ鎖を含むβ−ガラクトシダーゼ遺伝子とを含んでいた。レポーター構築物ｐＣＡＲＩＦ（ｉｎ ｆｒａｍｅ）は、ポリＣＡ鎖が２７個の塩基対である点を除いて一致しており、それゆえ、β−ガラクトシダーゼのリーディングフレームを妨害しなかった（図１Ｂ）。ｐＣＡＲＯＦレポーターは、トランスフェクションに引き続いてフレーム回復突然変異（すなわち、挿入または欠失）が起こらないかぎりは、β−ガラクトシダーゼ活性を生じないであろう。
【００５３】
異なるトランスフェクションスキームはＳＨ細胞に対するＰＭＳ２１３４突然変異の効果を評価するために使用された。第一のスキームにおいて、発現ベクターと、レポーターとを共に同時トランスフェクションした。１７日間のハイグロマイシンでの選択の結果として１００クローン以上含有するプールおよび個々のクローンが生成され、ウェスタンブロット法およびβ−ガラクトシダーゼアッセイ法のために収集された。ＰＭＳ２ＷＴおよびＰＭＳ２１３４で形質導入されたＳＨ細胞は、ウェスタンブロット上に抗ＰＭＳ２抗体で評価されたことだが、予想されたサイズのポリペプチドを合成した（図２Ａおよび図２Ｂ）。予想されたように、事実上、β−ガラクトシダーゼ活性は、ｐＣＡＲＯＦレポーターと、ＰＭＳ２ＮＯＴとをトランスフェクトしたＳＨ細胞において、観察されなかった（図２Ｃ）。しかしながら、ＰＭＳ２１３４をトランスフェクトしたＳＨ細胞は、ＰＭＳ２ＷＴをトランスフェクトした細胞以上にβ−ガラクトシダーゼ活性を有意に発現した（図２Ｃ）。これらの結果より、ＰＭＳ２１３４構築物によりコードされる切断型ポリペプチドが内因性ＭＭＲ機構を撹乱させ、その結果として、リーディングフレームを回復する欠失または挿入を生じたことが示唆された。レポーター構築物の多コピーが本発明者らの条件下で形質導入されたため、これらの推定される欠失または挿入の正確な性質を評価することができず、かつ野生型β−ガラクトシダーゼ配列は予想された突然変異体を遙かに越える量があり、直接的シーケンシングによるそれらの証明は除外された。
【００５４】
第二のスキームにおいて、ＳＨ細胞を各ＰＭＳ２発現ベクターと、ハイグロマイシン耐性プラスミドｐＬＨＬ４とを同時トランスフェクトした。１００個以上のクローンを含むハイグロマイシン耐性培養物はプールされかつ増量された。これらの培養物は、その後、ｐＣＡＲＩＦまたはｐＣＡＲＯＦレポーターと、ジェネテシン選択が可能な別々のプラスミドとを同時トランスフェクトした。２週間後、ハイグロマイシンおよびジェネテシンの両方に耐性である１００個以上のコロニーをそれぞれ含む、プールされた細胞をβ−ガラクトシダーゼ活性を評価するためにＸｇａｌで染色した。図３に示されるように、ＰＭＳ２１３４をトランスフェクトした培養物（パネルＢ）は多くの青色の細胞を含んでいたが、一方、ＰＭＳ２ＷＴをトランスフェクトした培養物（パネルＡ）においては、事実上、どの細胞も青色ではなかった。各場合において、トランスフェクション効率は、ｐＣＡＲＩＦを用いる平行トランスフェクションにより調整され、その平行トランスフェクションはまた、様々なＰＭＳ２効果遺伝子を発現する細胞のβ−ガラクトシダーゼ活性についての対照としての役割を果たし、すべての場合において類似したβ−ガラクトシダーゼ発現レベルであるという結果であった（示されず）。同様の実験プロトコールをＭＭＲ正常性ヒト胚性腎臓細胞系２９３に適用した場合、ＰＭＳ２ＷＴトランスフェクションと比較してＰＭＳ２１３４トランスフェクション後のβ−ガラクトシダーゼ活性において増加もまた観察された。これらの細胞は、ｐＣＡＲＯＦと、様々なＰＭＳ２効果プラスミドとを同時トランスフェクトし、ハイグロマイシンで１７日間選択した。１７日目に、コロニーをβ−ガラクトシダーゼ活性を評価するためにＸｇａｌで染色し、β−ガラクトシダーゼ発現細胞について評点をつけた。表１に示されるように、ＰＭＳ２１３４ポリペプチドを発現するそれらの細胞のみが検出可能なβ−ガラクトシダーゼ活性を発現した。これらのデータは、げっ歯類系およびヒト系の両方において、類似したｈＰＭＳ２１３４タンパク質のドミナントネガティブ効果を証明し、かつこれらの研究においてげっ歯類系の有用性を確証している。
【００５５】
【表１】ｐＣＡＲＯＦレポーター構築物と、ＰＭＳ２効果プラスミドとをトランスフェクトした２９３クローンのβ−ガラクトシダーゼ発現。２９３細胞は、ｐＣＡＲＯＦβ−ガラクトシダーゼレポータープラスミドと、ＰＭＳ２ＮＯＴ、ＰＭＳ２ＷＴ、またはＰＭＳ２１３４効果プラスミドとを同時トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞は、ハイグロマイシンで１７日間選択し、β−ガラクトシダーゼ活性のためにＸｇａｌで染色した（青色の細胞）。下記の結果は、３連の実験の平均値  ＋／  標準偏差を示す。
2004527207.tif 000003
【００５６】
プラスミド
完全長野生型ｈＰＭＳ２ ｃＤＮＡは、記載されているように、ヒトＨｅＬａ ｃＤＮＡライブラリーから得られた（１８）。アミノ酸１３４位に終止コドンを含むｈＰＭＳ２  ｃＤＮＡは、突然変異が発見された患者からＲＴＰＣＲ法により得られた（９）。ｃＤＮＡ断片は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが続いているＳＶ４０プロモーターを含むｐＳＧ５ベクターへＢａｍＨＩ部位にクローニングされた（８）。図１に記載されているｐＣＡＲレポーターベクターは、参照文献２１および２５に記載されているように、構築された。
【００５７】
細胞系およびトランスフェクション
シリアンハムスター線維芽細胞Ｔｋｔｓ１３およびヒトＨＥＫ２９３細胞は、ＡＴＣＣから得られ、記載されているように培養された（１５）。ｈＰＭＳ２を発現する安定的にトランスフェクションされた細胞系は、ＰＭＳ２発現ベクターおよび３：１（ｐＣＡＲ：ｐＬＨＬ４）の割合でハイグロマイシン耐性遺伝子をコードするｐＬＨＬ４プラスミドの同時トランスフェクションにより作製され、かつハイグロマイシンで選択された。ｐＣＡＲレポーターを含む安定的にトランスフェクトされた細胞系は、ｐＣＡＲベクターをネオマイシン耐性プラスミドをコードするｐＮＴＫプラスミドまたはｐＬＨＬ４のいずれかとともに同時トランスフェクションにより作製された。すべてのトランスフェクションは、以前に記載されているように、リン酸カルシウムを用いて行われた（１５）。
【００５８】
β−ガラクトシダーゼアッセイ法
ｐＣＡＲでのトランスフェクションに続いて１７日間目に、β−ガラクトシダーゼアッセイ法を４５ ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ Ｍ ＮａＰＯ４および０．６ ｍｇ／ｍｌ クロロフェノールレッドβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中の２０ ｇのタンパク質を用いて行った。反応は、１時間インキュベートされ、０．５ Ｍ Ｎａ２ＣＯ３の添加により停止させ、かつ５７６ ｎｍでの分光測光法により分析された（１６）。インサイチューβ−ガラクトシダーゼ染色のために、細胞をＰＢＳ中の１ ％ グルタルアルデヒドで固定化し、０．１５ Ｍ ＮａＣｌ、１ ｍＭ ＭｇＣｌ２、３．３ ｍＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６、０．２ ％ Ｘｇａｌ中で２時間、３７℃でインキュベートした。
【００５９】
ウェスタンブロット法
ＰＭＳ２についてのウェスタンブロットは、実施例５に記載されているように、ヒト完全長ポリペプチドのコドン１〜２０に対して産生したポリクローナルな抗ヒトＰＭＳ２を用いて行われた。
【００６０】
実施例２：ドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子の対立遺伝子はＭＭＲ活性に欠陥を引き起こす
ＰＭＳ２ＷＴおよびＰＭＳ２１３４をトランスフェクトされた細胞の間でのβ−ガラクトシダーゼ活性における違いについてもっとも可能性が高い解釈は、ＰＭＳ２１３４タンパク質がＭＭＲ活性を妨害し、その結果として、ｐＣＡＲＯＦレポーター内の高頻度の突然変異およびＯＲＦの再確立を起こすということである。ＭＭＲは変化するという仮説を直接的に試験するために、本発明者らは、実施例１に記載されているように、ＰＭＳ２−ＷＴ、ＰＭＳ２−１３４またはＰＭＳ２−ＮＯＴの空のベクターを含む細胞からの個々のクローンでのＭＭＲについて生化学的アッセイ法を使用した。核抽出物は、クローンから調製され、以前に記載されている条件下で、／ＣＡ＼挿入欠失またはＧ／Ｔミスマッチのいずれかを含むヘテロ二重鎖基質とともにインキュベートされた。／ＣＡ＼およびＧ／Ｔのヘテロ二重鎖は、それぞれ、３’方向および５’方向からの修復を試験するために使用された。これらのアッセイにおいて、ＰＭＳ２−１３４発現クローンとその他のクローンとの間には劇的な違いがあった（表２Ａ）。すべてのクローンは基質を３’方向から修復したが（／ＣＡ＼ヘテロ二重鎖）、ＰＭＳ２１３４ポリペプチドを発現する細胞は、ほとんど５’修復活性をもたなかった。ＰＭＳ２１３４トランスフェクションから生じるプールされたクローンについて、またはヘテロ二重鎖が２４塩基対ループを含む場合、ミスマッチ修復における同様の方向上の欠陥は明らかであり、それらの例は表２Ｂに示されている。３’／ＣＡ＼ＰＭＳ２−ＷＴ修復アッセイにおいて、ＭＭＲ活性に少量の減少が観察されたが、おそらく、ＰＭＳ２タンパク質の過剰発現による生化学的アッセイ法における干渉の結果であろう。インサイチューβ−ガラクトシダーゼアッセイ法において、ＰＭＳ２−ＷＴにより有意な活性を生じなかったが（図３；表１）、インビボの条件を反映している可能性がより高い結果といえる。
【００６１】
【表２】ＳＨクローン（Ａ）またはプールされた培養物（Ｂ）由来の核抽出物のミスマッチ修復活性。抽出物を２４ ｆｍｏｌのヘテロ二重鎖でのＭＭＲ活性について試験した。
＊これらのデータは、５つ以上の独立した実験から導かれた類似の結果を表している。
2004527207.tif 000004
【００６２】
ミスマッチ修復についての生化学的アッセイ法
核抽出物におけるＭＭＲ活性は、記載されているように、２４ ｆｍｏｌの基質を用いて行われた（１２、２５）。相補性アッセイ法は、最終ＫＣｌ濃度を１００ ｍＭへ調整しながら、〜１００ ｎｇの精製されたＭｕｔＬαまたはＭｕｔＳα成分を１００ μｇの核抽出物へ添加することにより行われた（４、１０、３０）。これらの実験に用いられる基質は、ミスマッチまで５’側１８１ヌクレオチドまたは３’側１２５ヌクレオチドの鎖切断を含む。値は少なくとも二連で行われた実験を代表している。
【００６３】
実施例３：遺伝子座における突然変異を増幅するためのＭＭＲ欠損細胞および化学的変異誘発物質の使用
遺伝的突然変異の割合を増幅しかつ改変された遺伝子、ＲＮＡ発現またはポリペプチドを有する細胞を産生するために、ＭＭＲ欠損および化学的変異誘発物質の使用は、そのような多様性を生じるための強力な道具である。ＭＭＲ欠損細胞を使用することの利点は、細胞をそのような化合物の毒性効果に対してなお、より抵抗性にさせているこの活性が減少することにより、宿主生物体または細胞の遺伝子および表現型の変化における増加が見込まれることである。以下の実験は、本発明の有用性を証明するために行われる。限定されるものではないが、ＨＣＴ１１６、ＤＬＤ−１などのようなＭＭＲについて遺伝的に欠損している細胞、またはドミナントネガティブ対立遺伝子の異所性発現によりＭＭＲ欠損にさせられている実施例１および実施例２に記載されているもののような細胞は、本発明の下で網羅される。簡単に言えば、ＭＭＲ正常性および欠損性細胞を増殖培地において、化学的変異誘発物質の範囲濃度（１ ｎｍ〜１ ｍＭ）で、１時間〜２４時間、３７℃、５％ ＣＯ２でインキュベートする。インキュベーションが完了した後、化学的変異誘発物質を培地から洗浄し、以前に記載され（Ｗａｌｋｅｒ， ＶＥら、Ｍｕｔａｎｔ Ｒｅｓ． １７：３７１−３８８， １９９９）かつ当業者に知られているように、細胞をヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミンの存在下で増殖させてＨＰＲＴ突然変異細胞について評点をつける。細胞を１０ ｃｍの組織培養皿に１ Ｘ １０５細胞／ｍｌで播き、増殖培地において１４日間、３７℃、５ ％ ＣＯ２で増殖させる。１４日後、ＨＡＴ耐性コロニー数は、顕微鏡下においてカウントすることにより測定された。典型的実験により、化学的に処理されたＭＭＲ欠損細胞において、対照細胞よりも、有意により多くの数のＨＡＴ耐性コロニーが形成されることが明らかにされ、宿主細胞／生物体の内因性遺伝子内に突然変異を増加させる能力を証明するものと思われる。ＭＭＲ欠損細胞、化学的または電離放射線への曝露を加えた使用はまた、トランスフェクションおよび一過的または安定的細胞系の選択を経て導入された標的遺伝子内にインビボで遺伝的突然変異を増幅させるために用いることができる。形質導入された標的遺伝子内に遺伝的突然変異を増幅させるためのＭＭＲ欠損に加えて化学的変異誘発物質の能力を証明するために、本発明者らは、上記の細胞の使用により、ｐＣＡＲＯＦベクター（実施例１参照）をＨＣＴ１１６細胞へトランスフェクションした。細胞をハイグロマイシン耐性によりｐＣＡＲ−ＯＦ陽性クローンについて選択した。ハイグロマイシン耐性細胞を集密まで増殖させ、１００，０００個の細胞を１０ μＭのエチル−メタン−スルホン酸（ＥＭＳ）アルキル化化合物に８時間曝し、増殖培地へ戻した。その後、細胞を一晩増殖させ、それから、３連の１０ ｃｍのディッシュに、１，０００細胞／プレートの密度で播いた。細胞を１０日間増殖させ、実施例１に記載されている方法を用いて、β−ガラクトシダーゼ活性について評点をつけた。その結果より、その化合物の非存在下で増殖した細胞において、β−ガラクトシダーゼ陽性増殖巣数は９２＋／−１０ ／ディッシュであることが示された。対照的に、ＥＭＳに曝した細胞は、β−ガ���クトシダーゼ陽性細胞数において、有意な増加を生じた（２０５＋／−１８）。これらのデータは、インビボで標的遺伝子に遺伝的突然変異を発生させるためのＭＭＲ欠損細胞に化学的変異誘発物質を加えた有用性を証明している。この方法は、商業的目的として標的遺伝子に遺伝的多様性を生じるために有用である。
【００６４】
実施例４：誘導性ベクターによるドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子を発現するミスマッチ修復欠損細胞の回復されたＤＮＡ安定性
ドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子の異所性発現を用いてＤＮＡ超変異性を誘発する能力は、遺伝的な多様性サブタイプを有する真核細胞を産生することへの多くの重要な商業的適用がある。以下の実験は、実施例１および実施例２に記載されているようなＭＭＲ欠損細胞のゲノムにおける遺伝子的変化をそのＭＭＲ正常性を回復することにより永久的に刷り込みする能力を証明している。まず、ＰＭＳ２−１３４ドミナントネガティブ対立遺伝子をｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ＰＭＳ１３４Ｓと呼ばれる真核の誘導性ベクター系ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（テトラサイクリン誘導性ベクター）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＩＮＤ／ＰＭＳ１３４Ｓと呼ばれるｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓグルココルチコイド誘導性ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へクローニングした。下記のように、Ｔｋ−ｔｓ１３またはＨＥＫ２９３細胞を各ベクターと、ｐＣＡＲ−ＯＦ（選択マーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子を含む）とを同時トランスフェクトした。空のベクターは、各組み合わせについての対照として使用された。トランスフェクションされた細胞は、ゼオシン／ハイグロマイシン（Ｚ／Ｈ）耐性細胞またはネオマイシン／ハイグロマイシン（Ｎ／Ｈ）耐性細胞について１０日間〜１４日間選択された。クローンは選び取られ、個々のクローンまたはプールとして増量された。細胞は増量され、誘導化学物質（ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ＰＭＳ１３４Ｓ用に１ μｇ／ｍｌのテトラサイクリンおよびｐＩＮＤ／ＰＭＳ１３４Ｓ用に１ μＭのエクジソン）の含有または非含有の増殖培地（１０ ％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ）で、６ウェルの組織培養プレートに１ Ｘ １０５細胞／ｍｌで播かれた。細胞培養物は収集し、３７℃、５ ％ ＣＯ２での培養の２４時間後、タンパク質発現を誘導されたＰＭＳ２−１３４についてウェスタン分析により分析した（実施例５に記載されているように）。ｐＩＮＤ／ＰＭＳ１３４Ｓ細胞の抽出物のウェスタン分析により、エクジソンの存在下で増殖された場合、〜１７ ｋｄのタンパク質の生成が明らかになったが、一方、エクジソン非含有で増殖されたそれらは検出可能なレベルをもたなかった。誘導性ＰＭＳ２−１３４発現を有するクローンは増量され、エクジソンまたはテトラサイクリンの存在下で２４時間増殖された。誘導物質の非存在下でウェスタンブロットによりＰＭＳ２−１３４発現の損失の動力学を同定するために、細胞は７２時間収集された。これらのデータより、７２時間後タンパク質は検出不可能なレベルであることが証明された。
【００６５】
誘導性ベクター系を用いて遺伝子的不安定性を誘発する能力を証明するために、ｐＩＮＤ／ＰＭＳ１３４ＳまたはｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓを含む細胞をエクジソンの含有または非含有で１４日間増殖させ、記載されているように（ＭＣＢ論文）、インサイチューでβ−ガラクトシダーゼ活性を測定するために染色した。図５に示されるように、観察可能な青色増殖巣をもたなかった空のベクター対照とは対照的に、エクジソンの存在下で増殖されたｐＩＮＤ／ＰＭＳ１３４Ｓ細胞において、有意の数の小細胞増殖巣が陽性の青色に着色した（倒立顕微鏡の評価下での観察では２５個の細胞／視野）。対照的に、誘発物質の非存在下で増殖されたｐＩＮＤ／ＰＭＳ１３４Ｓ細胞もｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ細胞のどちらも陽性に着色しなかった。これらのデータは、遺伝子においてゲノムの不安定性および遺伝的多様性を発生させるために誘導性ベクターの制御下でドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子を用いて、改変された生化学的機能および／または新しい表現型を生じる能力を証明している。
【００６６】
これらの細胞において、ＰＭＳ２−１３４発現を抑圧することでＭＭＲ正常性を回復することができることを証明するために、以下の実験を行った。細胞をＺ／ＨまたはＮ／Ｈを加えた誘導性培地中で１４日間維持した。各クローンまたはプールのサブセットを２４ウェルのファルコンのディッシュへ、５Ｘ１０４細胞／ｍｌで播いた。細胞を３７℃、５ ％ ＣＯ２で一晩増殖させた。次の日、細胞を以前に記載されているように、β−ガラクトシダーゼ発現についてインビボで染色した（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １８：１６３５−１６４１， １９９８）。青色に変化する細胞は、ＭＭＲ機構においてＰＭＳ２−１３４のドミナントネガティブの効果による内因性ＭＭＲ活性における減少のために、そのようになった。これらの細胞は、誘導物質分子の存在下または非存在下において、９６ウェルのプレートに限界希釈によりサブクローニングされた。誘導物質剤が除去されているクローンにおいて復帰細胞（青色ではない細胞）の数がより少ないことが見出された（クローンが誘導物質での常時曝露下であるプレート（４５ウェルのうち１８ウェル）とは対照的に、４５ウェルのうち４２ウェル）場合、ＰＭＳ２−１３４発現クローンにおいて回復された遺伝子的安定性が証明された。これらのデータより、ゲノムの安定性および遺伝的進化を制御する能力が、制御されたＭＭＲ遺伝子発現を用いて証明される。
【００６７】
上記の誘導性ＭＭＲ遺伝子ストラテジーと組み合わせての実施例３に記載されている化学的変異誘発物質の使用はまた、新しい表現型を有する遺伝的多様性宿主生物体を発生させるための、および／または改変された遺伝子発現の安定的生産のための方法としての適用において仕込まれる。この効果を証明するために、誘導性ドミナントネガティブ発現を含む細胞を誘導物質分子に曝し、かつ引き続いて化学的変異誘発物質または電離放射線に曝す。その後、細胞を誘導物質分子の存在下で増量し、配列分析または生化学的活性により決定されるような新しい表現型および／または改変された遺伝子構造を有する細胞について培養物を選択する。改変された遺伝子または表現型を有する細胞をその後、誘導物質分子からはずし、遺伝子的安定性および表現型を回復させる。
【００６８】
トランスフェクション
ｐＩＮＤ／ＰＭＳ１３４ＳまたはｐｃＤＮＡ／ＴＯ／ＰＭＳ１３４Ｓ誘導性ベクターを有するエクジソン受容体含有安定的ＨＥＫ２９３細胞の産生。ＨＥＫ２９３−エクジソンＲ細胞をリポフェクタミン２０００（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いて、ｐＩＮＤもしくはｐｃＤＮＡ／ＴＯの空のベクターまたはｐＩＮＤ／ＰＭＳ１３４ＳもしくはｐｃＤＮＡ／ＴＯ／ＰＭＳ１３４Ｓベクターでトランスフェクションした。細胞は、選択的マーカー耐性について選択され、クローンおよびプールは増量された。その後、安定的系を１ μＭのエクジソンに４８時間曝し、抽出物を単離し、下記のＰＭＳ１３４ポリペプチドのＮ末端に特異的な抗血清を用いて、誘導性ＰＭＳ１３４発現を有するクローンを同定するためにウェスタンブロット法により分析した。
【００６９】
プラスミド
ＰＭＳ２−１３４は、ｐＳＧ５ＰＭＳ１３４（実施例１に記載）ベクター由来のＢａｍＨＩ断片として、以下の誘導性発現ベクターへクローニングされた。テトラサイクリン誘導性ベクター（ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ＰＭＳ１３４Ｓ）は、ＥＭ−７プロモーターおよびＳＶ４０ポリＡの配列の制御下のゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）選択的マーカーを含む。プラスミドの構造はエンドヌクレアーゼ制限分析およびシーケンシングにより確認された。グルココルチコイド誘導性ベクター（ｐＩＮＤ／ＰＭＳ１３４Ｓ）は、ＳＶ４０初期プロモーターおよびポリＡの配列の制御下のネオマイシン選択的マーカーを含む。ベクターの模式図は図４に示されている。
【００７０】
トランスフェクション
誘導性発現ベクターは、単独、または実施例１に記載されているようなｐＣＡＲ−ＯＦベクターとの組み合わせのどちらかで上記の方法に従い、Ｔｋ−ｔｓ１３細胞およびＨＥＫ２９３細胞へ同時トランスフェクションされた。記載されているように（参照文献１５、Ｇｒａｓｓｏら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：２４０１６−２４０２４， １９９８）、細胞をゼオシン／ハイグロマイシン（ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ＰＭＳ１３４Ｓ）またはネオマイシン／ハイグロマイシン（ｐＩＮＤ／ＰＭＳ１３４Ｓ）耐性クローンについて選択された。耐性クローンを選び取る、および／またはプールする、かつタンパク質分析のために増量させた。
【００７１】
実施例５：ＭＭＲ遺伝子の補足遺伝子を発現することによるＭＭＲの回復および遺伝子的安定性の回復および固定されたゲノム構造の確立
限定されるものではないが、ＨＣＴ１１６、ＤＬＤ−１、およびＨＥＣ−１−Ａ細胞系（参照文献１２、２５およびＫｏｎｄｏら、Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １２５：８１８−８２５， １９９９）のような内因性遺伝子の欠陥による欠損ＭＭＲ活性を有する細胞の使用が、遺伝子の遺伝的構造を改変して、新規な抗菌剤、生理活性成長因子またはホルモン、改変された抗体構造などのような商業的に実行可能な様々な分子を生産することに役に立つことができる。そのような細胞の有用性および価値は、いったん改変された遺伝子構造が生成されれば、この遺伝子変化の完全性は、機能的補足ＭＭＲ遺伝子の導入により細胞を遺伝子的に安定させることにより細胞のゲノムに保存されうることである。この例は、遺伝子的に改変された細菌のプリンヌクレオチドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）遺伝子で、その遺伝子のＮ末端にアウトオブフレームのポリＡ鎖が挿入されている（ポリＰＮＰと呼ばれる）遺伝子の導入により、ＭＭＲ欠損細胞において遺伝子的に改変することができ、また、補足ＭＭＲ遺伝子の直接的発現によりＭＭＲ欠損細胞をＭＭＲ正常性にする場合、遺伝子的安定性となりうる。ポリＰＮＰ遺伝子は非機能的ＰＮＰ遺伝子としてコードしている。ポリＡ鎖が欠損ＭＭＲのための遺伝子的改変によりランダムに変化する場合、その鎖はランダムに変化して、機能的ＰＮＰ遺伝子およびポリペプチドの産生が可能になる。ＰＮＰは、無毒性の９−（β−Ｄ−２−デオキシ−エリスロ−ペント−フラノシル）−６−メチル−プリンのプロドラッグ（ＭＰＤと呼ばれる）基質を毒性の６−メチルプリン類似体（ＭＰと呼ばれる）に変換する（Ｓｏｒｓｃｈｅｒ， ＥＪら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：２３３−２３８， １９９４）。ポリＰＮＰ遺伝子は、抗ＨＡ抗体を用いてのウェスタンブロット分析によるコードポリペプチドの検出を容易にするために、Ｃ末端に血球凝集素エピトープタグを含むように操作された。ポリＰＮＰ遺伝子は、選択のためのハイグロマイシン耐性（Ｈｙｇ）遺伝子を有するｐＣＥＰ４発現ベクターへクローニングされた。この遺伝子を示す模式図は図７に示されている。ＰＮＰと呼ばれる相同遺伝子群はまた、インフレームポリＡ鎖がＰＮＰ活性についての陽性対照としてその遺伝子のＮ末端へクローニングされているように作成された。簡単には、ＭＭＲ欠損ＨＣＴ１１６細胞系およびＭＭＲ正常性ＨＥＫ２９３細胞系をポリＰＮＰ、ＰＮＰ発現ベクター、または空のｐＣＥＰ４ベクターでトランスフェクションした。その後、細胞はＨｙｇ耐性について選択され、クローンは単離された。増量された細胞を漸増的量のＭＰＤ（０ μＭ、１ μＭ、１０ μＭ、５０ μＭ、１００ μＭ、３００ μＭ）の存在下で１０日間増殖させた。処理期間後、細胞を血球計算器およびトリパンブルー排除によりカウントした。図８Ａに示されているように、ＨＣＴ１１６／ポリＰＮＰ細胞を１００ μＭまたは３００ μＭのＭＰＤ、それぞれの存在下において培養した場合、細胞数に２０ ％および３０ ％の減少が観察された。対照的に、ＭＭＲ正常性ＨＥＫ２９３／ポリＰＮＰ細胞については、使用されるＭＰＤの最高濃度（３００ μＭ）においてさえ、細胞増殖に減少は観察されなかった。両方の細胞系について���細胞が５０ μＭ〜３００ μＭのＭＰＤの存在下において増殖する場合、ＰＮＰの発現は、その結果として１００ ％の増殖抑制を生じ、両方の細胞系への変換されたＭＰの毒性効果を証明した。ウェスタンブロットにより、ＨＡエピトープを含むポリペプチドが実際に、ＨＣＴ１１６／ポリＰＮＰ細胞において生成されていることが確認され、このように、ポリＰＮＰ遺伝子構造が変化して機能的かつ完全長のＰＮＰ酵素を産生したことが証明された（図８Ｂ）。
【００７２】
遺伝子的安定性の回復および改変された遺伝子座の引き続く刷り込みは、実行可能な生物学的生産物を生産するための本出願の重要な発明であり、それらにより、所望の改変された出力形質を有する改変された生体分子、細胞または生物体全体を長期間の使用のために遺伝子的に安定に作成される。化学的変異誘発物質に曝されたまたは曝されていない、かつ所望の遺伝子的変化について選択された、安定的ＭＭＲ欠損細胞系を産生するために、突然変異内因性ＭＭＲ遺伝子座の代わりになることができる補足ＭＭＲ遺伝子の導入が本出願において開示されている。これは、ヒトＭｕｔＬ相同体ＭＬＨ１（１２、２４、２５）について遺伝子的に欠損しているＨＣＴ１１６細胞を用いる例により証明される。この例において、哺乳動物発現ベクターで、機能的ＭＬＨ１ポリペプチドについてコードする（ｐＣ９ＭＬＨ１）または未熟な停止コドンを有するＭＬＨ１ ｃＤＮＡについてコードする発現ベクター（ｐＣ９ＭＬＨｓｔｏｐ）が使用される。これらの発現ベクターはこのベクターを含む細胞の選択を可能にするネオマイシン（ｎｅｏ）耐性遺伝子を含む。ＭＭＲ活性を補足する能力をそうではないＭＭＲ欠損細胞において証明するため、および遺伝子座の改変された構造を永久的に刷り込みするために、ポリＰＮＰおよびｐＣ９ＭＬＨ構築物をＨＣＴ１１６細胞へ同時トランスフェクションした。細胞を１０日間、ｎｅｏおよびＨｙｇにおいて選択し、耐性クローンを単離しかつ増量させた。その後、細胞をＭＰＤの存在下で培養し、１０日後増殖についてカウントした。図９において証明されているように、ＭＬＨ１野生型ｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞は、ＭＬＨｓｔｏｐをトランスフェクトした細胞とは対照的に、ウェスタン法による測定では、ＭＬＨ１を発現していた。さらに、細胞を３００ μＭのＭＰＤの存在下で増殖した場合、ＭＬＨ１を発現しているそれらの細胞は、培地のみで増殖した細胞と比較して、全細胞増殖において２ ％の減少を示し、一方、ＭＬＨｓｔｏｐまたは空のベクターおよびポリＰＮＰをトランスフェクトした細胞は、培地のみで増殖した細胞と比較して、細胞増殖において３５ ％の低下があった。これらのデータは、異所的に発現されている野生型ＭＭＲ遺伝子またはｃＤＮＡでＭＭＲ欠陥を補足することにより、ＭＭＲ欠損細胞系のゲノム安定性を確立し、かつ生物学的活性または不活性のＰＮＰのような、新しい出力形質および／または改変されたゲノムまたはポリペプチド構造を生産するために、選択された長期間安定的系を確立することができることを証明している。
【００７３】
プラスミド
完全長野生型ｈＭＬＨ１ ｃＤＮＡは、記載されているように、ヒトＨｅｌａ ｃＤＮＡライブラリーから得られた（１８）。終止コドンを含むＭＬＨ１ ｃＤＮＡは、突然変異が発見された患者からＲＴＰＣＲにより得られた（２４）。ｃＤＮＡ断片は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（８）およびネオマイシン耐性についてコードする遺伝子が続くＣＭＶプロモーターを含む、ｐＣＥＰ９ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＸｈｏＩ部位へクローニングされた。ｐＣ９ＭＬＨ１ベクターは完全長機能ＭＬＨ１タンパク質を産生するが、一方ｐＣ９ＭＬＨ１ｓｔｏｐは非機能性の切断型ＭＬＨ１ポリペプチドを産生する。ポリＰＮＰおよびＰＮＰのベクターは図４に記載されている。ポリＰＮＰは、結果として切断型ポリペプチドを生じる、細菌のＰＮＰ遺伝子のコドン２の後に挿入される２１塩基のアウトオブフレームポリＡ鎖を含む（Ｓｏｒｓｃｈｅｒ， ＥＪら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：２３３−２３８， １９９４）。ＰＮＰは、結果として完全長の機能的に活性なＰＮＰタンパク質を生じる、細菌のＰＮＰ遺伝子のコドン２の後に挿入される２０塩基のインフレームポリＡ鎖を含む。ポリＰＮＰおよびＰＮＰ遺伝子の両方とも、終止コドンが続くＣ末端にインフレームで融合された血球凝集素（ＨＡ）エピトープを有する。ポリＰＮＰおよびＰＮＰ遺伝子は、センスプライマー：
2004527207.tif 000005
を用いてポリメラーゼ連鎖反応により構築され、ポリＡ鎖は下線を施されているが、ＰＮＰ用のプライマーはポリＡ鎖において１つ少ないＡを含む。両方の構築物についてのアンチセンスプライマーは、
2004527207.tif 000006
である。ＤＨ５α細菌のＤＮＡを増幅のための鋳型として使用した。改変されたＰＮＰ遺伝子は、以前に記載されているように、緩衝液中、９５℃を３０秒間、５４℃を１分間、７２℃を１分間の２５サイクルで増幅して産生した（１９）。増幅されたゲノムの挿入部はＴテイル化ベクター（ＴＡクローニング、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へクローニングされ、組換えクローンは正しいヌクレオチド配列を有するベクターを同定するためにシーケンシングされた。その後、ＰＮＰ断片はＴＡクローニングベクターポリリンカーからの部位を用いてｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ部位へサブクローニングされた。組換えＰＮＰ発現ベクターは、内部プライマー配列を用いる配列の確実性を保証するためにシーケンシングされた。
【００７４】
細胞系およびトランスフェクション
ヒトＨＣＴ１１６およびＨＥＫ２９３細胞はＡＴＣＣから得られ、ベンダーにより提案されているように、１０ ％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ中で培養された。細胞は、メーカーのプロトコール（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）に従いリポソームを用いてＰＮＰおよび／またはＭＬＨ１発現ベクターでトランスフェクションされた。トランスフェクション、続いてハイグロマイシンでの選択により、空のベクター、ＰＮＰまたはポリＰＮＰを発現する安定的にトランスフェクションされた細胞系が産生された。補足的実験として、ＨＣＴ１１６細胞をＰＮＰ／ＭＬＨ１、ＰＮＰ／ＭＬＨ１ｓｔｏｐ、ポリＰＮＰ／ＭＬＨ１またはポリＰＮＰ／ＭＬＨ１ｓｔｏｐで、各プラスミドの５ μｇを用いて１：１の割合で、トランスフェクションし、ハイグロマイシンおよびネオマイシン耐性について選択した。１０日後、薬剤耐性コロニーが観察され、分析のために採取した。
【００７５】
ＭＰＤ殺害性アッセイ法
ＭＰＤ殺害性アッセイ法のために、細胞を２Ｘ１０４ 細胞／ｍｌで播き、かつ１ ｍｌの等分量を２４ウェルコースター組織培養皿に播いた。殺害性アッセイ法のために、細胞を０ μＭ、１ μＭ、１０ μＭ、５０ μＭ、１００ μＭ、および３００ μＭのＭＰＤに３連で播いた。細胞をトリプシン処理して１０日間増殖させ、トリパンブルー排除を用いて血球計算器でカウントした。データは、各研究について平均値＋／−ＳＤとして示されている。
【００７６】
ウェスタンブロット
カウント後、各０ μＭ ＭＰＤで処理された細胞から同じ細胞数を試料緩衝液（６０ ｍＭ トリス、ｐＨ ６．８、２ ％ ＳＤＳ、１０ ％ グリセロール、０．１ Ｍ ２−メルカプトエタノール、０．００１ ％ ブロモフェノールブルー）に直接溶解し、５分間煮沸した。タンパク質可溶化液を１８ ％ トリス−グリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ）上での電気泳動により分離した。ゲルを４８ ｍＭ トリス、４０ ｍＭ グリシン、０．０３７５ ％ ＳＤＳ、２０ ％ メタノールにおいてイモビロン−Ｐ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上へ電気的ブロットし、０．０５ ％ Ｔｗｅｅｎ２０および５ ％ 練乳を加えたトリス緩衝生理食塩水において、室温で１時間ブロックした。フィルターをヒトＭＬＨ１または血球凝集素（ＨＡ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）に対して産生されたモノクローナル抗体（αＭＬＨ１４）および西洋わさびペルオキシダーゼ結合型ウサギ抗−マウス第二次抗体で探索し、検出のために化学ルミネッセンス（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用した。マウスＩｇＧは、第一次抗体の非特異的抗体との相互作用について評価し、かつ使用された抗血清が期待されたタンパク質を検出していることを保証するために、すべての実験について対照として使用された。
【００７７】
参照文献
2004527207.tif 000007
2004527207.tif 000008
2004527207.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ及び１Ｂ】ＰＭＳ２発現ベクター（図１Ａ）及びｐＣＡＲレポーター（図１Ｂ）の図。
【図２Ａから２Ｃ】薬物選択の１７日後の、ｐＣＡＲレポーター及びＰＭＳ２発現ベクターで同時トランスフェクトされたＳＨ細胞。
（図２Ａ）トランスフェクトされていないＳＨ細胞（レーン１）、又はＰＭＳ２ＮＯＴ（レーン２）もしくはＰＭＳ２ＷＴ（レーン３）でトランスフェクトされたＳＨ細胞に由来する溶解物のウェスタンブロット。矢印は、ｈＰＭＳ２と予想される１１０ｋＤタンパク質を示す。
（図２Ｂ）トランスフェクトされていないＳＨ細胞（レーン１）、又はＰＭＳ２ＮＯＴ（レーン２）もしくはＰＭＳ２１３４（レーン３）でトランスフェクトされたＳＨ細胞に由来する溶解物のウェスタンブロット。矢印は、ｈＰＭＳ−１３４と予想される１４ｋＤタンパク質を示す。Ａ及びＢは、いずれも、ｈＰＭＳ２のＮ末端に対して作製された抗体を用いて探索された。Ａにおける上方のポリペプチド及びＢにおける下方のポリペプチドは、交差反応性ハムスタータンパク質を表す。
（図２Ｃ）ＰＭＳ２ＮＯＴ（レーン１）、ＰＭＳ２ＷＴ（レーン２）、又はＰＭＳ２１３４（レーン３）とレポータープラスミドとで共トランスフェクトされたＳＨ細胞に由来する溶解物におけるβ−ガラクトシダーゼ活性。相対β−ガラクトシダーゼ活性とは、ｐＣＡＲＩＦでトランスフェクトされた細胞における活性と比較された、ｐＣＡＲＯＦでトランスフェクトされた細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の比として定義される。この規準化により、トランスフェクション効率がコントロールされ、様々なＰＭＳ２エフェクター遺伝子を発現している細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性がコントロールされた。
【図３Ａ及び３Ｂ】ＰＭＳ２ＷＴ発現ベクター（図３Ａ）又はＰＭＳ２１３４発現ベクター（図３Ｂ）で安定的に形質導入され、次いでｐＣＡＲＯＦで再トランスフェクトされたＳＨ細胞のプールされたクローンのインサイチューβ−ガラクトシダーゼ活性。薬物選択の１７日後に、コロニーをプールし、培養し、β−ガラクトシダーゼ活性に関して染色した。ｐＣＡＲＯＦに由来するβ−ガラクトシダーゼを発現しているＰＭＳ２１３４形質導入ＳＨ細胞のプールされた培養物が、図３Ｂに可視である。図示された各視野は、３連の実験において見出されたものの代表である。
【図４】ドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子対立遺伝子を含有している誘導可能哺乳動物発現ベクターの作製。Ｃ末端にＶ５エピトープを含む、又は含まないＰＭＳ１３４ ｃＤＮＡを、エクジソンステロイドにより制御されたｐＩＮＤ哺乳動物発現ベクターへとクローニングした。ＰＭＳ１３４ ｃＤＮＡは、熱ショック最小プロモーターに対しセンス方向でベクターの唯一のＢａｍＨＩ部位へクローニングされた。得られたベクターは、それぞれ、ｐＩＮＤＰＭＳ１３４Ｖ５又はｐＩＮＤＰＭＳ１３４と呼ばれる。ｐＩＮＤベクターは、選択可能マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を含有している。
【図５】ＰＭＳ１３４の誘導による改変された遺伝子配列の作製。オープンリーディングフレームを崩壊させ、フレームシフトを生じさせるポリＣＡリピートをβ−ｇａｌ遺伝子のＮ末端に含むβ−ガラクトシダーゼレポータープラスミドを含有しているｐＣＡＲ−ＯＦプラスミドで、空のｐＩＮＤベクター又はｐＩＮＤＰＭＳ１３４を含有している細胞をトランスフェクトした。プラスミドは、安定な系を選択するためのハイグロマイシン耐性遺伝子も含有している。Ｇ４１８／ハイグロマイシン耐性であった細胞を、１μＭエクジソンの存在下又は非存在下で１０日間増幅・増殖させた。１４日後、機能性β−ｇａｌを産生した増殖巣に関して、細胞をインサイチューで染色した。示されているように、ステロイド誘導剤の存在下で増殖させた細胞においては相当数（１視野当たり２５個）のβ−ｇａｌ陽性増殖巣が観察されたが、誘導剤分子の非存在下で増殖させた培養物においてはほとんど観察されなかった。
【図６】選択後の遺伝学的に安定な細胞の再樹立。化学誘導剤の除去（及びその後のドミナントネガティブＭＭＲ対立遺伝子の抑止）の後、クローンが遺伝学的に安定であるか否かを決定するため、ｐＩＮＤＰＭＳ１３４／ｐＣＡＲ−ＯＦクローンを単離し、機能性β−ｇａｌ活性に関して試験した。β−ｇａｌ発現を有するクローンを、クローンを含むウェルが１ディッシュ当たり４５個となるよう限界希釈して９６穴プレートに播いた。クローンを、再度、エクジソンの存在下又は非存在下で１４代（１代／日）にわたり増殖させ、β−ｇａｌ活性に関してインサイチューで染色した。示されているように、ステロイド誘導剤の非存在下で増殖させた細胞においては相当数のβ−ｇａｌ陽性クローンが観察されたが（４５ウェル中４２ウェルがβ−ｇａｌ陽性であった）、定常的な誘導剤曝露下ではより多数のクローンがβ−ｇａｌ活性を失った（４５ウェル中１８ウェルがβ−ｇａｌ陽性であった）。これらのデータは、ＭＭＲの遮断によって、インビボで遺伝学的に改変されたクローンにおいて、遺伝学的安定性を回復させることが可能であることを例証している。
【図７】Ｎ末端に挿入されたアウトオブフレームのポリＡ鎖を有する遺伝学的に改変されたプリンホスホリラーゼ（ＰＮＰ）遺伝子（ポリＰＮＰと呼ばれる）の図。この遺伝子は、非機能性ＰＮＰ遺伝子をコードする。ポリＡ鎖が、欠陥ＭＭＲによってランダムに改変された場合、鎖はシフトし、機能性ＰＮＰ遺伝子の生成を可能にする。ＰＮＰは非毒性プロドラッグ９−（β−Ｄ−２−デオキシエリスロペントフラノシル）−６−メチル−プリン（ＭＰＤと呼ばれる）を毒性６−メチルプリンアナログ（ＭＰと呼ばれる）へと変換しうる。構築物は、ウェスタンブロット分析のため、Ｃ末端にヘマグルチニン（ＨＡ）タグを有している。
【図８Ａ及び８Ｂ】ＭＰＤへ曝された場合、又は曝されない場合の、ポリＰＮＰを発現しているＭＭＲ欠陥細胞又はＭＭＲ正常細胞の毒性アッセイ。
（図８Ａ）グラフは、ＭＭＲ正常細胞と対照的に、ポリＰＮＰを発現しているＭＭＲ欠陥細胞においては、ＭＰＤプロドラッグの存在下で細胞が死滅することを示している。
（図８Ｂ）ＭＭＲ正常細胞と対照的な、ＭＭＲ欠陥細胞におけるポリＰＮＰ−ＨＡタグ化ポリペプチドの産生を示すウェスタンブロット。
【図９】ＭＰＤへ曝された場合、又は曝されない場合の、ポリＰＮＰを発現しているＭＭＲ欠陥細胞又はＭＭＲ正常細胞の毒性アッセイ法。グラフは、ＭＭＲ欠陥ＨＣＴ１１６細胞（ＭＬＨ１が遺伝学的に欠損している）において、切断型（非機能性）ＭＬＨ１ ｃＤＮＡ（ｐＣ９ＭＬＨｓｔｏｐ）でトランスフェクトされたＨＣＴ１１６細胞において見られるような活性型へとポリＰＮＰ遺伝子が変換されないという事実により示されるように、機能性ＭＬＨ１遺伝子の導入によって、細胞の遺伝学的安定性が回復することを示している。これらのデータは、ＭＭＲ欠損が機能性ＭＭＲ遺伝子（ＨＣＴ１１６／ｐＣ９ＭＬＨ１）によって補足され、従って、改変された遺伝子又は遺伝子座のゲノム完全性が維持されうることを例証している。
【図１０Ａ及び１０Ｂ】ＭＬＨ１発現構築物及びポリＰＮＰ遺伝子でトランスフェクトされた細胞のウェスタンブロット。
（図１０Ａ）ＭＬＨｓｔｏｐ発現ベクター（レーン１）又はＭＬＨ１ベクター（レーン２）でトランスフェクトされた細胞に由来する細胞溶解物を溶解させ、ＨＣＴ１１６細胞におけるＭＬＨ１タンパク質発現に関して探索した。図１０Ａに示されるように、ＭＬＨ１全長発現構築物でトランスフェクトされた細胞は、予想分子量のポリペプチド（矢印）を産生した。
（図１０Ｂ）ＭＬＨｓｔｏｐ発現ベクター（レーン１）又はＭＬＨ１ベクター（レーン２）とポリＰＮＰ遺伝子とでトランスフェクトされたＨＣＴ１１６細胞に由来する細胞溶解物を溶解させ、ＰＮＰタンパク質のＣ末端のＨＡタグを検出することができる抗ＨＡモノクローナル抗体を使用してポリＰＮＰに関して探索した。図１０Ｂに示されるように、細胞のゲノム安定性を回復させ、従ってポリＰＮＰ遺伝子のゲノム構造を維持した、機能性ＭＬＨ１ ｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞とは対照的に、ＭＬＨｓｔｏｐ発現構築物でトランスフェクトされた細胞は、予想分子量のポリペプチド（矢印）を産生した。
【図１】
2004527207.tif 000010
【図２Ａ】
2004527207.tif 000011
【図２Ｂ】
2004527207.tif 000012
【図２Ｃ】
2004527207.tif 000013
【図３】
2004527207.tif 000014
【図４】
2004527207.tif 000015
【図５】
2004527207.tif 000016
【図６】
2004527207.tif 000017
【図７】
2004527207.tif 000018
【図８Ａ】
2004527207.tif 000019
【図８Ｂ】
2004527207.tif 000020
【図９】
2004527207.tif 000021
【図１０】
2004527207.tif 000022
【国際公開パンフレット】
2004527207.tif 000023
2004527207.tif 000024
2004527207.tif 000025
2004527207.tif 000026
2004527207.tif 000027
2004527207.tif 000028
2004527207.tif 000029
2004527207.tif 000030
2004527207.tif 000031
2004527207.tif 000032
2004527207.tif 000033
2004527207.tif 000034
2004527207.tif 000035
2004527207.tif 000036
2004527207.tif 000037
2004527207.tif 000038
2004527207.tif 000039
2004527207.tif 000040
2004527207.tif 000041
2004527207.tif 000042
2004527207.tif 000043
2004527207.tif 000044
2004527207.tif 000045
2004527207.tif 000046
2004527207.tif 000047
2004527207.tif 000048
2004527207.tif 000049
2004527207.tif 000050
2004527207.tif 000051
2004527207.tif 000052
2004527207.tif 000053
2004527207.tif 000054
2004527207.tif 000055
2004527207.tif 000056
2004527207.tif 000057
2004527207.tif 000058
2004527207.tif 000059
2004527207.tif 000060
2004527207.tif 000061
2004527207.tif 000062
2004527207.tif 000063
2004527207.tif 000064
2004527207.tif 000065
2004527207.tif 000066
2004527207.tif 000067
2004527207.tif 000068
2004527207.tif 000069
2004527207.tif 000070
2004527207.tif 000071
2004527207.tif 000072
2004527207.tif 000073
2004527207.tif 000074
2004527207.tif 000075
2004527207.tif 000076
2004527207.tif 000077
2004527207.tif 000078
2004527207.tif 000079
2004527207.tif 000080
2004527207.tif 000081
【国際調査報告】
2004527207.tif 000082
2004527207.tif 000083
2004527207.tif 000084
2004527207.tif 000085
2004527207.tif 000086