(57)【要約】本発明は、生体材料に特異的結合するバイオプローブの適用に関し、そのように標識された材料の類似生体材料の環境からの電気泳動及び／又は誘電泳動による該材料の検出及び／又は分離を可能にするバイオプローブの適用に関する。前記バイオプローブは、それらが生体材料の電気及び／又は誘電特性を変化させることに特徴がある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気泳動又は誘電泳動によって生体材料を検出するか又は精製するための方法であって、以下の工程：
ａ）　異なる種を含有する生体材料を提供する工程；
ｂ）　部分Ａと部分Ｂとを有するバイオプローブであって、その部分Ａが少なくとも１つの前記種に特異的に結合し、その部分Ｂが前記バイオプローブの特異的結合により標識される１つ又はそれを超える種の電気特性及び／又は誘電特性を変化させ、そのようにして前記標識された種の電気泳動及び／又は誘電泳動による検出及び／又は精製を可能にするか又は改善するバイオプローブを加える工程；
ｃ）　１つ又はそれを超える生体種と特異的結合バイオプローブとの前記複合体又は複合体群を電気泳動又は誘電泳動によって検出するか又は精製するための電場を形成する工程；
を含んでなる方法。
【請求項２】
生体材料に特異的に結合するバイオプローブを電気泳動又は誘電泳動により検出するか又は精製する方法であって、以下の工程：
ａ）　少なくとも１つの種を含有する生体材料を提供する工程；
ｂ）　バイオプローブ又は様々なバイオプローブであって、各々の場合に、少なくとも１つの前記種に特異的に結合する部分Ａと、バイオプローブの結合により標識された１つ又はそれを超える種の電気的及び／又は誘電特性を変化させ、そのようにして１つ又はそれを超える生体種と生体材料とのこのやり方で形成する複合体の検出及び／又は精製を可能にする部分Ｂとを含んでなるバイオプローブ又は様々なバイオプローブを加える（それら様々なバイオプローブが異なる結合特異性を有し、且つ加えられたそれらバイオプローブの少なくとも１つが前記生体材料に結合することを伴う）工程；
ｃ）　１つ又はそれを超える生体種と特異的結合バイオプローブとの前記複合体又は複合体群を電気泳動又は誘電泳動により検出するか又は精製するための電場を形成する工程；
を含んでなる方法。
【請求項３】
前記バイオプローブの部分Ａは、タンパク質、好ましくは抗体若しくはペプチド、無機化合物、炭水化物、核酸、脂質、又は生体材料に特異的に結合する他の有機化合物であるか、或いは前記群の少なくとも１つを含んでなる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記バイオプローブの部分Ｂは、核酸；電気的に荷電されたペプチド；ポリ第４級アミン；有機酸；有機塩基；無機物質；脂質；脂肪酸；又は、ワックス、オイル、及びステロール類からなるファミリーからの化合物であるか、或いは前記群の少なくとも１つを含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記バイオプローブの部分Ａは、ペプチド又はタンパク質であり、前記バイオプローブの部分Ｂは、前記ペプチド又はタンパク質についてコードしており且つ前記ペプチド又はタンパク質と共有結合させた核酸であり、前記ペプチド又はタンパク質は、前記核酸に好ましくはピューロマイシン分子を介して共有結合している、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸は、１本鎖ＲＮＡ若しくは２本鎖ＲＮＡ、又は１本鎖ＤＮＡ若しくは２本鎖ＤＮＡ、或いはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ２重鎖である、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記バイオプローブの部分Ａであるか又は前記部分に含まれている特異的結合ペプチドは、サッカロミセス　セレビシエからのＳｔｅ２ｐレセプター、ＴＳＨ、ＦＳＨ、ＥＧＦ、ＴＮＦ、トランスフェリン、インシュリン、ＦＧＦ、ＴＧＦβ、ＩＧＦ、アギオテンシンＩＩ、及びソマトスタチンレセプターからなる群からのレセプターに結合するリガンドである、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記生体材料は、組織、細胞、細胞小器官、ウイルス、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、若しくは他の有機化合物であるか、又は前記群の少なくとも１つを含んでなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記電気泳動法は、フリーフロー電気泳動である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記電気泳動又は誘電泳動法は、バイオチップを使用して行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１１】
前記バイオプローブの助けで特異的に標識された前記材料が、追加的に異なる様式で特異的に標識される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記追加的標識が、色標識、蛍光標識、又は放射性標識である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
以下に表される分子バイオプローブ：レセプターに特異的に結合するタンパク質部分を有し、且つ直接的に又は介在連結部分を介して核酸に共有結合しており、該核酸が好ましくは５個を超えるヌクレオチドを含んでなり、該分子の前記タンパク質部分が、サッカロミセス　セレビシエからのＳｔｅ２ｐレセプター、ＴＳＨ、ＦＳＨ、ＥＧＦ、ＴＮＦ、トランスフェリン、インシュリン、ＦＧＦ、ＴＧＦβ、ＩＧＦ、アギオテンシンＩＩ、及びソマトスタチンレセプターからなる群からのレセプターのためのリガンドを含んでなる。
【請求項１４】
前記核酸は、前記タンパク質部分についての遺伝子情報をを含んでなる、請求項１３に記載のバイオプローブ。
【請求項１５】
前記核酸は、１本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、又はＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ２重鎖である、請求項１３又は１４に記載のバイオプローブ。
【請求項１６】
以下に表される分子バイオプローブ：生体材料に特異的に結合するタンパク質部分を含んでなり、且つ直接的に又は介在連結部分を介して脂質分子に共有結合しており、そして、組織、細胞、細胞小器官、ウイルス、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、又は他の有機化合物であるか、或いは前記群の少なくとも１つを含んでなる。
【請求項１７】
以下に表される分子バイオプローブ：生体材料に特異的に結合するタンパク質部分を含んでなり、且つ直接的に又は介在連結部分を介してポリ第４級アンモニウム化合物に共有結合しており、そして、組織、細胞、細胞小器官、ウイルス、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、又は他の有機化合物であるか、或いは前記群の少なくとも１つを含んでなる。
【請求項１８】
前記タンパク質部分は、サッカロミセス　セレビシエからのＳｔｅ２ｐレセプター、ＴＳＨ、ＦＳＨ、ＥＧＦ、ＴＮＦ、トランスフェリン、インシュリン、ＦＧＦ、ＴＧＦβ、ＩＧＦ、アギオテンシンＩＩ、及びソマトスタチンレセプターからなる群からのレセプターに関するリガンドを含んでなる分子である、請求項１６又は１７に記載のバイオプローブ。
【請求項１９】
前記介在連結部分がピューロマイシ分子を含んでなる、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載のバイオプローブ。
【請求項２０】
生体材料と、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載されるような前記材料に特異的に結合するバイオプローブとの複合体であって、該生体材料が、組織、細胞、細胞小器官、ウイルス、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、又は他の有機化合物であるか、或いは前記群の少なくとも１つを含んでなる複合体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
バイオプローブ及びそれの使用
本発明は、バイオプローブ（ｂｉｏｐｒｏｂｅ）に関し、生体材料への特異的結合によりそれらの電気的及び／又は誘電特性を変化させ、それによって、このやり方で修飾されたその材料の検出及び／又は精製を、電気泳動及び／又は誘電泳動（ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）の手段により可能にするバイオプローブに関する。
【０００２】
１又はそれを超える生体種（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｅｓ）を生体材料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ）のプールから又は非常に類似する生体種を含んでなるバックグラウンドから選択的に取り出すことは、バイオテクノロジー、生物学的分析、及び診断において頻繁な仕事である。ここで、生体材料は、例えば、組織、細胞、ウイルス、細胞小器官、タンパク質、タンパク質複合体、炭水化物、脂質、若しくは他の有機化合物、又は列記されたそれら群の混合物であり得る。よって、異なる種は、前記群の少なくとも１つから由来する。その分離又は検出原理が基礎にするそれら様々な生体種の特性の相違は非常に小さく、それがあっても分離及び／又は検出はしばしば多大な困難を伴わずしてしか達成し得ないほどである。
【０００３】
生体材料を検出して分離することについて複数の解決的戦略が存在する（Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ ａｎｄ Ｚｏｒｂａｓ （１９９８） Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ． Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄａｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）。原則的に、細分化されるそれら種の特性の相違を分離及び検出のために利用する方法は、前記種の検出及び分離が、提供される生体材料の選択的修飾によってのみ達成される方法と区別することができる。
【０００４】
様々な種を検出すること及び／又は分離することに使用される生体材料に特徴的な特性は、とりわけ、極性、疎水性、電荷、大きさ、質量、及び濃度である。前記特性を利用する方法の例は、電気泳動、ゲルろ過、アフィニティクロマトグラフィー、及び遠心分離である。
【０００５】
生体材料が特定の方法で選択的に標識され、様々な種の分離又は検出がその標識のみに起因して又は前記標識により変化する特性に起因して可能になるという方法は、抗体−抗原相互作用に基づくあらゆるすべての方法である。これらの例は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）法、及びＦＡＣＳ（蛍光性活性化細胞選別）とＭＡＣＳ（磁性活性化細胞選別）の特定の変法である。これら場合において、酵素、蛍光色素、又は磁性ビーズは、この方法で標識される種の検出又は精製を可能にするために、特異的に結合する抗体を使用することにより生体材料の特定の種に選択的に結合する。
【０００６】
生体材料を分画することが非常に難しいという方法の挙げ得る例は、フリーフロー電気泳動（ｆｒｅｅ−ｆｌｏｗ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ＦＦＥ）である（Ｂａｕｅｒ Ｊ． （１９９９） Ｊ．Ｃｈｒｏｍ． Ｂ ７２２： ５５）。この方法では、薄流蒸気が互いに接近した２つのガラスプレートの間を通過する。その流動方向に垂直に電場を適用することで、供された生体材料の様々な種をそれらの異なる荷電に起因して分画することが可能となる。例えば、ＦＦＥが細胞を分画するために使用されるなら、前記細胞は、それらの負の電荷に起因してそのカソードにより電気的に引き寄せられる。この場合における細胞の横移動速度は、それら細胞の表面電荷密度に依存する。異なる表面電荷密度を持つ細胞は、異なる横移動速度を有するので、互いに分離できる。ＦＦＥの決定的に不都合な点は、生体材料は非常に類似した電荷特性を有することが良くあるという事実である。例えば、すべての細胞は、負電荷で、しかも良くあることに殆ど同一の表面電荷密度を有するので、多大な困難を伴わずしてＦＦＥの手段によって互いを分離することはできない。ＦＦＥにおいて、適正な分析は、しばしば、細胞の表面電荷密度が病原的変化によって十分に修飾される場合にしか達成できない。この理由から、ＦＦＥの使用は今日急速に減り、そして、しばしばより高価で技術的により複雑な他の方法に取って代わられている。
【０００７】
誘電泳動の比較的新しい方法（Ｆｉｅｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７０： １９０９； Ｂｅｔｔｓ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｓｙｍｐ． Ｓｕｐｐｌ． ８５： ２０１）においてもまた、上記ＦＦＥのような電気泳動法に起きているのと同様の問題を扱わなければならない。誘電泳動（ＤＥＰ）は、生体材料の誘電特性（ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）を、前記材料を互いから分離するために利用する方法である。誘電泳動は、生体材料が不均一な変動電場に曝されたときに起こる。生体材料は、それの誘電特性（不変な又は誘導可能な電気双極子）に起因してその不均一電場内を移動し、結果として分画化が可能になる。
【０００８】
例えば、細胞は、双極子化されて、それ故に誘電泳動に利用できるあらゆる領域を含有している。これらの領域は、細胞を囲う荷電２重膜、その細胞又は細胞小器官の境界をなす細胞膜、及びその細胞内部の極性細胞質も含む。
【０００９】
誘電泳動は、例えば、細胞、細菌、他の微生物を分画するのに使用され得る。しかし、誘電泳動を、例えば、核酸、タンパク質、脂質又は他の有機化合物のような他の生体材料を分画するために使用することも考え得る。
【００１０】
誘電泳動の可能な用途の例は、飲料水、食物及び生体液の病原性微生物に関する試験、及び骨髄又は末梢血液からの肝細胞の濃縮である。
誘電泳動は、生体材料の誘電特性もまたしばしば非常に類似しているので、異なる種の分画がより困難になるという不都合を有している。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、電気泳動的及び／又は誘電泳動の分析力を増強し、そのようにして改良された検出及び／又は精製法を利用可能にすることである。
【００１２】
その目的は、特定の種へ又は少なくとも１つの種を含有する生体材料のプールからの特定種の群へのバイオプローブの特異的結合により達成され、その結果として、このやり方で標識された種の電気泳動及び／又は誘電特性は選択的且つ特異的に変化し、そのようにして、このやり方で標識された種、又はバイオプローブと生体材料との前記バイオプローブの結合により形成されている複合体を精製且つ／又は検出することを可能にする。
【００１３】
本発明によると、ここで生体材料は、特に、組織、細胞、細胞小器官、ウイルス、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、又は他の有機化合物からなる群から選択される、特に少なくとも１つの群の少なくとも１つの種を含んでなり、且つ、それら種は修飾されてもよい。
【００１４】
ここに記載される本発明の通常の手法と比較した本質的利点は、生体種とバイオプローブとの前記生体種への前記バイオプローブの結合により形成される複合体の簡易且つ迅速な分離の可能性であり、他方において、この利点は、このやり方で選択的に標識された種の検出又は精製を可能にすることであるが、逆に、異なる結合特異性を持つバイオプローブのプールから１つ又はそれを超えるバイオプローブを選択的に取り出すために使用されてもよい。後者の場合、その分離法を行う前に、特にその生体材料を異なる結合特異性を持つ創作バイオプローブのライブラリーと接触させて、選択的に結合するバイオプローブを前記ライブラリーから同定し且つ単離可能にすることができる。
【００１５】
ＦＡＣＳ及びＭＡＣＳのような手法と比較して本発明の方法の決定的に有利な点は、バイオプローブは、標識された生体材料の検出及び／又は精製を可能とするために蛍光色素又は磁性ビーズによる複雑な方法で修飾される必要がないこと、そして、同様にＦＡＣＳ及びＭＡＣＳのような手法に不可避である複雑な装置が必要とされないことである。
【００１６】
生体材料を検出するか又は精製するための本発明の方法は、以下の工程：
ａ）　異なる種を含有する生体材料を提供する工程；
ｂ）　部分Ａと部分Ｂとを有するバイオプローブであって、その部分Ａが少なくとも１つの前記種に特異的に結合するものであり、且つその部分Ｂが、前記バイオプローブの特異的結合により標識された１つ又はそれを超える種の電気的及び／又は誘電特性を変化させ、前記標識された種の電気泳動及び／又は誘電泳動による検出及び／又は精製を可能にするか又は改善するバイオプローブを加える工程；
ｃ）　電気泳動又は誘電泳動によって、１つ又はそれを超える生体種と特異的結合バイオプローブとの前記複合体又は複合体群を検出するか又は精製するための電場を形成する工程；
を特に含んでなる。
【００１７】
提供された生体材料に特異的に結合するバイオプローブを同定し且つ単離する目的のため、本発明の方法は、下記の工程：
ａ）　少なくとも１つの種を含有する生体材料を提供する工程；
ｂ）　バイオプローブ又は様々なバイオプローブであって、各々の場合に少なくとも１つの前記種に特異的に結合する部分Ａと、バイオプローブの結合により標識された１つ又はそれを超える種の電気的及び／又は誘電特性を変化させ、１つ又はそれを超える生体種と生体材料とのこのやり方で形成する複合体の検出及び／又は精製を可能にする部分Ｂとを含んでなるバイオプローブ又は様々なバイオプローブを加える（それら様々なバイオプローブは異なる結合特異性を有するものであり、且つ加えられたバイオプローブの少なくとも１つが前記生体材料に結合するものであることを伴う）工程；
ｃ）　電気泳動又は誘電泳動によって、１つ又はそれを超える生体種と特異的結合バイオプローブとの前記複合体又は複合体群を検出するか又は精製するための電場を形成すること；
を特に含んでなる。
【００１８】
この場合、（ｂ）による様々なバイオプローブは、特に、異なる基質特異性のバイオプローブのライブラリーであることができ、それは、１０９を超える、特に１０１２を超える異なるバイオプローブを含んでなる。
【００１９】
本発明のバイオプローブは、そのプローブとその生体材料との間の特異的相互作用を媒介する部分Ａと、前記生体材料の特性をその望ましいやり方で変化させる、即ち、電気泳動に関する電荷、及び誘電泳動に関する誘電率、特定の導電性又は分極化能力を変化させる部分Ｂとを含んでなる。ここでは、それら部分ＡもＢも互いに構造的に別離している必要はない。
【００２０】
バイオプローブの部分Ａは、例えば、生体材料に特異的に結合するペプチドであるか又はそれを含んでなる。この場合、そのペプチドとその生体材料上に存在するペプチドレセプターとの間の特異的相互作用が形成される。そのような相互作用の例は、サッカロミセス　セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα因子レセプターＳｔｅ２ｐのそれに対応するα因子ペプチドリガンドとの作用である。更なる例は、ＴＳＨレセプター（Ｓｃｈｕｐｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｔｈｙｒｏｉｄ ６： ５７５）、ＦＳＨレセプター（Ｔｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３１： ７９９）、ＥＧＦレセプター（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｄａｎ． Ｍｅｄ． Ｂｕｌｌ． ４５： １２１）、ＴＮＦレセプター（Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ． （１９９４） ２０ Ｔｈｙｍｕｓ ２３： １７７）、トランスフェリンレセプター（Ｐｏｎｋａ ａｎｄ Ｌｏｋ （１９９９） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３１： １１１１）、インシュリンレセプター（Ｍｉｌａｚｚｏ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２： ３９２４）、ＦＧＦレセプター（Ｋｉｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ５： １１５）、ＴＧＦβレセプター（Ｄｅｒｙｎｃｋ ｅｔ ａｌ． ２５ （１９９４） Ｐｒｉｎｃｅｓｓ Ｔａｋａｍａｔｓｕ Ｓｙｍｐ． ２４： ２６４）、ＩＧＦレセプター（Ｐｅｙｒａｔ ａｎｄ Ｂｏｎｎｅｔｅｒｒｅ （１９９２） Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｔｒｅａｔ． ２２： ５９）、アギオテンシンＩＩレセプター（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ （１９９４） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｎｅｐｈｒｏｌ． Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ． ３： １１２）、及びソマトスタチンレセプター（Ｓｃｈｏｎｂｒｕｎｎ ３０ （１９９９） Ａｎｎ． Ｏｎｃｏｌ． １０ Ｓｕｐｐｌ． ２： １７）と、それらの特定のリガンドとの相互作用である。同様に、望ましい生体材料に特異的に結合できるすべてのペプチドを使用することができる。
【００２１】
また、特異的に結合する部分Ａは、抗体でもよく、特に、例えば、細胞表面上の抗体認識マーカー構造体である。そのようなマーカー構造体の例は、トランスフェリンレセプターである。さらに部分Ａは、生体材料に特異的に結合する低分子量構造体を含んでなるものでもよい。そのような低分子量構造体の例は、アセチルコリンレセプターに特異的に結合するアセチルコリンである。しかし、バイオプローブの部分Ａは、例えば、炭水化物、脂質、無機化合物、核酸、又は生体材料に特異的に結合するあらゆる他のリガンドでもよいし、これらの群の１つを含んでなるものでもよい。
【００２２】
部分Ａに連結する生体材料の部分Ｂは、その生体材料に結合したとき、このやり方で修飾された生体材料の挙動が電場及び／又は誘電場において変化するようにそれの電気的及び／又は誘電的特性を変化させる構造体であるか、或いはそれを含んでなる。これは、例えば、電荷を導入することによるか、誘電率を変動させることにより且つ／又は前記生体材料の特定の導電性を変動させることにより引き起こされ得る。この関係おいて、電荷のキャリヤーの例は、酸性又は塩基性アミノ酸（アスパラート、グルタメート、リジン、アルギニン）、核酸（１本鎖及び２本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ２重鎖）、有機酸及び有機塩基（タルトレート、シトレート、アミン類）、ポリ第４級アミン類、及び無機質電荷キャリヤーである。また、生体材料の誘電的挙動を変化させる構造体は、上述した構造体に加えて、例えば、脂質、脂肪酸、ワックス、オイル、及びステロールのような疎水性で電気的に中性な構造である。
【００２３】
好ましい態様において、バイオプローブの部分Ｂは、そのバイオプローブの部分Ａに直接に又は介在的連結部分を介して共有結合する核酸であるか、或いはそれを含んでなる。この場合において、その核酸は、少なくとも５又は１０、特に好ましくは、少なくとも１５又は２０ヌクレオチドを含んでなる。
【００２４】
そのバイオプローブの特定の態様において、前記バイオプローブの部分Ｂは、そのバイオローブの部分Ａについての遺伝子情報を含む核酸を含んでなり、そのバイオプローブの部分Ａはタンパク質又はポリペプチドを含んでなり、そのバイオプローブ部分Ｂは、バイオプローブの部分Ａに共有結合する１本鎖若しくは２本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ或いはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ２重鎖を含んでなることを伴う。ここにおいても、特に好ましくは、バイオプローブの部分Ａは、Ｓｔｅ２ｐレセプター、ＴＳＨレセプター、ＦＳＨレセプター、ＥＧＦレセプター、ＴＮＦレセプター、トランスフェリンレセプター、インシュリンレセプター、ＦＧＦレセプター、ＴＧＦβレセプター、ＩＧＦレセプター、アギオテンシンＩＩレセプター、及びソマトスタチンレセプターに関するリガンドを含んでなり、そして、そのバイオプローブの部分Ｂは、各々の場合において前記リガンドについての配列コーディングを含んでなる核酸である。この好ましい態様において、バイオプローブの部分Ａ及び部分Ｂはユニットを介して互いに好ましく共有結合され、そのユニットは、共有結合の形成を伴いリボソームにより触媒される翻訳反応における伸長ペプチド鎖を受け継ぐことができる。これとの関連において、前記ユニットは、例えば、ピューロマイシン分子又はピューロマイシン類縁体、及び／又はアミノ酸又はアミノ酸類縁体を含んでなる。これに関連して、例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４： １２２９７， ＷＯ ９８／１６６３６ ａｎｄ Ｋｒａｙｅｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ． （１９７９） Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２３：１．も参照されたい。
【００２５】
特異的結合バイオプローブで与えられる生体材料からの特定種の選択的標識に加えて、蛍光色素、色素（例えば、ヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）、カルコフルーア（Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ）のようなもの）、適切に標識された特異的結合に結合する抗体（例えば、ＦＩＴＣ）、生体材料の簡易な検出を可能にする放射性標識化合物（例えば、３５Ｓ−メチオニン）又は他の化合物で前記種を標識することもできる。
【００２６】
バイオプローブの手段により標識された生体材料は、一定の電場を使用して電気泳動的に、例えばフリーフロー電気泳動により、又は不均一な変動電場を使用して誘電泳動により、検出され且つ／又は分画されることができる。それらバイオプローブを、特にＤＥＰ内で使用することは、その分析力を改善する。バイオプローブでの生体種を標識し、次いで電気泳動又は誘電泳動によりその生体材料を分画する本発明の方法は、バイオチップの使用において特に好ましく適用できる。好ましくは、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． （Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７０：２３２１）に記載されるようなバイオチップを適用するためにここに与えられるべきである。バイオチップは、小型形態の分離及び／又は検出を行うことを可能にする。小型化はそれに付随して、実験上の複雑さを、例えばＦＡＣＳとの比較して低減することができる。
【００２７】
チップ上の細胞の誘電分画は、既に記載されており（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７０：２３２１）、この特定の事例において、分画される種の誘電特性の相違が、分画を可能にするほど十分に大きかった。本発明のバイオプローブの使用は、前記生体種それら自体の誘電特性の相違が、誘電泳動を介した分画を可能にするほど十分に大きくない場合でさえも、生体種の分画を可能にする。
【００２８】
【実施例】
実施例１：
バイオプローブの調製
バイオプローブは、ＤＮＡ配列から出発し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写と翻訳を経て調製される。Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ （１９９７； Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４： １２２９７）によると、翻訳の際に形成するそれらペプチドは、それのｍＲＮＡとピューロマイシン分子を介して共有結合する。かくして、そのペプチド部分は特異的結合体となるが、そのｍＲＮＡ部分は、中性ｐＨ領域におけるその強い負電荷に起因して、選択及び検出が可能となるように生体材料の物理特性を変化させる。その例示的態様において、生体材料は、α因子レセプター（ＳＴＥ２）を発現する交配型ＭＡＴａのサッカロミセス　セレビシエ種の一群の酵母細胞である（Ｄａｖｉｓ ａｎｄ Ｄａｖｅｙ （１９９７） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｔｒａｎｓ． ２５： １０１５）。その詳細な手順を次に記載する。標準的手法（オリゴヌクレオチド合成）を介して調製することもでき、また市販（例えば、ＩＮＴＥＲＡＣＴＩＶＡ Ｔｈｅ Ｖｉｒｔｕａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｕｌｍ）されてもいるＤＮＡ配列（配列番号１）から出発し、２本鎖ＤＮＡ分子（配列番号２）を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を経て産生させる。そのＤＮＡ分子は下記の配列領域：Ｔ７プロモーター配列；ＴＭＶ翻訳開始配列；５’コード化Ｅ ｔａｇ、α因子配列、及び３’コード化Ｓｔｒｅｐ ｔａｇを含むコーディング領域を有する。そのＰＣＲは、次のような技術により行われる。
【００２９】
下記の成分がＰＣＲ反応容器に加えられる。
１μｌのＤＮＡ（オリゴヌクレオチド合成から、１ｎｍｏｌ， 配列番号１に相当する）
１０μｌのＴａｑポリメラーゼ緩衝液、１０×（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ）
１０μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ）
１０μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ミックス（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ）
１０μｌの１０μＭ プライマー１（配列番号３）
１０μｌの１０μＭ プライマー２（配列番号４）
２μｌの５Ｕ／μｌ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ）
ＰＣＲプログラムは、次のように特徴づけられる：１０サイクルの９５℃での１分、５５℃での２分、７２℃での２分。
【００３０】
そのＤＮＡを定量し、そして、その２本鎖ＤＮＡの約１ｎｍｏｌがｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のために鋳型として使用される。その転写は、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ， ＵＳＡ）からの商業的に入手可能なシステムを使用して行われる。その標準的な混合物は、次の通りである。
５０μｌのＤＮＡ鋳型（１ｎｍｏｌ）
２０μｌの反応緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ）
２０μｌの７５ｍＭ ＡＴＰ（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ）
２０μｌの７５ｍＭ ＣＴＰ（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ）
２０μｌの７５ｍＭ ＧＴＰ（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ）
２０μｌの７５ｍＭ ＵＴＰ（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ）
２０μｌの酵素ミックス（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ）
３０μｌのＨ２Ｏ
その混合物を３７℃で１時間インキュベートする。そのＲＮＡがフェノール−クロロホルム抽出を経て得られ（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ． １９９４）、次いで定量される。
【００３１】
バイオプローブを調製するために、そのｍＲＮＡは、その３’末端で修飾されて、短いＤＮＡ配列がそのｍＲＮＡ上に存在し、ピューロマイシン分子が前記短いＤＮＡ配列の３’末端に存在するようにされなければならない。この技法は、Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｄｎ Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９７； 上記参照）により説明されている。その例示的態様において、その修飾は次のようにして行われる。
２ｎｍｏｌのｍＲＮＡ
２ｎｍｏｌのリンカー（配列番号５；ＩＮＴＥＲＡＣＴＩＶＡ， Ｕｌｍ）
２ｎｍｏｌのスプリント（配列番号６；ＩＮＴＥＲＡＣＴＩＶＡ， Ｕｌｍ）
１２５μｌまでのＨ２Ｏ
その混合物を７０℃で３分間加熱し、室温で１５分間冷却する。次いで、１５μｌの１０×リガーゼ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ）及び１０μｌの２０Ｕ／μｌ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を加える。そのピューロマイシンキャリヤーリンカーを、室温で４時間インキュベートすることによりそのｍＲＮＡにライゲートする。
【００３２】
その混合物全部を１０ｎｍｏｌのアンチスプリント（配列７）と混合し、そして８０℃で５分間加熱する。次いで、そのライゲーション混合物を氷上で冷やし、そのライゲート化ｍＲＮＡを定量する。
【００３３】
そのバイオプローブは、１０μｌの３５Ｓメチオニン（ＡＰｂｉｏｔｅｃｈ， Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）、１５μｌのアミノ酸マスターミックス（メチオニン無し）（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ）、及び２００μｌのＲｅｔｉｃ Ｌｙｓａｔｅ ＩＶＴ（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ）を２００ｐｍｏｌのライゲート化ＲＮＡに加えて、前記ｍＲＮＡを翻訳することにより調製される。Ｈ２Ｏは３００μｌまで加えられる。その混合物を３０℃で３０分間インキュベートする。次いで、１００μｌの２．５ Ｍ ＫＣｌ及び７０μｌの１Ｍ ＭｇＣｌ２を加えて、その混合物を−２０℃で一晩置く。バイオプローブは、１０ｍｌの結合緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８．０； １０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０； １Ｍ ＮａＣｌ； ０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）をその翻訳混合物に加えて、それに１０ｍｇのオリゴｄＴセルロース（ＡＰｂｉｏｔｅｃｈ， Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）を加えることにより得られる。その混合物を４℃で１時間インキュベートする。結合したバイオプローブを持つセルロースは、８ｍｌの結合緩衝液でろ過及び洗浄することにより取り出される。それらバイオプローブは、４回の１００μｌのＨ２Ｏで溶出される。それらバイオプローブは、シンチレーションカウンター内で３５Ｓ放射性崩壊を測定することにより定量され、次いで、生体材料に結合させるために使用されることができる。
【００３４】
【化１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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