(57)【要約】遺伝子，特にＨＥＲ２，ＢＡＣＥ，ＴＥＲＴ，ＰＴＰ−１Ｂ，ＭｅｔＡＰ−２，ＨＢＶ，ホスホランバン，プレセニリン−２およびＰＫＣ−アルファの発現の阻害剤として有用な核酸分子（アンチセンスまたはリボザイム）。核酸分子は，糖および／または塩基成分および／またはリン酸骨格上で種々の方法により修飾することができる。これらは，標的遺伝子の発現の増加が関与する疾病の治療用の医薬処方において用いられる。また，修飾されたピリミジンヌクレオチド三リン酸を合成する方法およびこれをオリゴヌクレオチド中に取り込ませる方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式４：
【化１】
2004512810.tif 000484
［式中，各Ｘ，Ｙ，およびＺは，独立して，同じでも異なっていてもよいヌクレオチドを表し；ｌは３以上の整数であり；ｍは１より大きい整数であり；ｎは１より大きい整数であり；ｏは３以上の整数であり；Ｚ’はＺに相補的なヌクレオチドであり；Ｙ’はＹに相補的なヌクレオチドであり；各Ｘ（ｌ）およびＸ（ｏ）は，独立して標的核酸配列と安定に相互作用するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり；Ｗは２ヌクレオチドのリンカーであり；Ａ，Ｕ，Ｇ，およびＣは，ヌクレオチドを表し；Ｃは２’−アミノであり；および＿＿は化学結合を表す］
を有する酵素的核酸分子。
【請求項２】
式５：
【化２】
2004512810.tif 000485
［式中，各Ｘ，Ｙ，およびＺは，独立して，同じでも異なっていてもよいヌクレオチドを表し；ｌは３以上の整数であり；ｎは１より大きい整数であり；ｏは３以上の整数であり；Ｚ’はＺに相補的なヌクレオチドであり；各Ｘ（ｌ）およびＸ（ｏ）は，独立して，標的核酸配列と安定に相互作用するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり；Ｗは２ヌクレオチド以上の長さのリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーであり；Ａ，Ｕ，Ｇ，およびＣは，ヌクレオチドを表し；Ｃは２’−アミノであり；および−は化学結合を表す］
を有する酵素的核酸分子。
【請求項３】
ｌが４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，および１５からなる群より選択される，請求項１または２のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項４】
ｍが２，３，４，５，６，および７からなる群より選択される，請求項１記載の酵素的核酸分子。
【請求項５】
ｎが２，３，４，５，６，および７からなる群より選択される，請求項１または２のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項６】
ｏが３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，および１５からなる群より選択される，請求項１または２のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項７】
ｌおよびｏが同じ長さである，請求項１または２のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項８】
ｌおよびｏが異なる長さである，請求項１または２のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項９】
標的核酸配列が，ＲＮＡ，ＤＮＡおよびＲＮＡ／ＤＮＡ混合ポリマーからなる群より選択される，請求項１または２のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項１０】
前記化学結合が，リン酸エステル結合，アミド結合，ホスホロチオエート，およびホスホロジチオエートからなる群より選択される，請求項１または２のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項１１】
前記ＣＱが２’−デオキシ−２’−ＮＨ２および２’−デオキシ−２’−Ｏ−ＮＨ２からなる群より選択される，請求項１または２のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項１２】
細胞において遺伝子の発現を阻害する方法であって，請求項１または２のいずれかに記載の酵素的核酸分子を前記阻害に適した条件下で前記細胞に投与する工程を含む方法。
【請求項１３】
別個のＲＮＡ分子を切断する方法であって，請求項１または２のいずれかに記載の酵素的核酸分子を前記別個のＲＮＡ分子の切断に適した条件下で前記別個のＲＮＡ分子と接触させることを含む方法。
【請求項１４】
前記切断が二価カチオンの存在下で行われる，請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記二価カチオンがＭｇ２＋である，請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記酵素的核酸分子が化学的に合成されたものである，請求項１または２のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項１７】
前記酵素的核酸分子が少なくとも１つのリボヌクレオチドを含む，請求項１または２のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項１８】
前記酵素的核酸分子がリボヌクレオチド残基を含まない，請求項１または２のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項１９】
前記酵素的核酸分子が少なくとも１つの２−アミノ修飾を含む，請求項１または２のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項２０】
前記酵素的核酸分子が少なくとも３個のホスホロチオエート修飾を含む，請求項１または２のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項２１】
前記ホスホロチオエート修飾が前記酵素的核酸分子の５’末端にある，請求項２０記載の酵素的核酸分子。
【請求項２２】
前記酵素的核酸分子が５’−キャップまたは３’−キャップまたは５’−キャップおよび３’−キャップの両方を含む，請求項１または２のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項２３】
前記５−キャップがホスホロチオエート修飾である，請求項２２記載の酵素的核酸分子。
【請求項２４】
前記３’−キャップが反転無塩基成分である，請求項２２記載の酵素的核酸分子。
【請求項２５】
式３：
【化３】
2004512810.tif 000486
［式中，Ｒは，独立して，２’−Ｏ−メチル−２，６−ジアミノプリンリボシド；２’−デオキシ−２’アミノ−２，６−ジアミノプリンリボシド；２’−（Ｎ−アラニル）アミノ−２’−デオキシ−ウリジン；２’−（Ｎ−フェニルアラニル）アミノ−２’−デオキシ−ウリジン；２’−デオキシ−２’−（Ｎ−β−アラニル）アミノ；２’−デオキシ−２’−（リシル）アミノウリジン；２’−Ｃ−アリルウリジン；２’−Ｏ−アミノ−ウリジン；２’−Ｏ−メチルチオメチルアデノシン；２’−Ｏ−メチルチオメチルシチジン；２’−Ｏ−メチルチオメチルグアノシン；２’−Ｏ−メチルチオメチル−ウリジン；２’−デオキシ−２’−（Ｎ−ヒスチジル）アミノウリジン；２’−デオキシ−２’−アミノ−５−メチルシチジン；２’−（Ｎ−β−カルボキシアミジン−β−アラニル）アミノ−２’−デオキシ−ウリジン；２’−デオキシ−２’−（Ｎ−β−アラニル）−グアノシン；２’−Ｏ−アミノ−アデノシン；２’−（Ｎ−リシル）アミノ−２’−デオキシ−シチジン；２’−デオキシ−２’−（Ｌ−ヒスチジン）アミノシチジン；５−イミダゾール酢酸２’−デオキシウリジン，５−［３−（Ｎ−４−イミダゾールアセチル）アミノプロピニル］−２’−Ｏ−メチルウリジン，５−（３−アミノプロピニル）−２’−Ｏ−メチルウリジン，５−（３−アミノプロピル）−２’−Ｏ−メチルウリジン，５−［３−（Ｎ−４−イミダゾールアセチル）アミノプロピル］−２’−Ｏ−メチルウリジン，５−（３−アミノプロピル）−２’−デオキシ−２−フルオロウリジン，２’−デオキシ−２’−（β−アラニル−Ｌ−ヒスチジル）アミノウリジン，２’−デオキシ−２’−β−アラニンアミド−ウリジン，３−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピペラジノ［２，３−Ｄ］ピリミジン−２−オン，５−［３−（Ｎ−４−イミダゾールアセチル）アミノプロピル］−２’−デオキシ−２’−フルオロウリジン，５−［３−（Ｎ−４−イミダゾールアセチル）アミノプロピニル］−２’−デオキシ−２’−フルオロウリジン，５−Ｅ−（２−カルボキシビニル−２’−デオキシ−２’−フルオロウリジン，５−［３−（Ｎ−４−アスパルチル）アミノプロピニル−２’−フルオロウリジン，５−（３−アミノプロピル）−２’−デオキシ−２−フルオロシチジン，および５−［３−（Ｎ−４−スクシニル）アミノプロピル−２’−デオキシ−２−フルオロシチジンからなる群より選択されるいずれかのヌクレオシドである］
を有する化合物。
【請求項２６】
請求項２５記載の化合物をオリゴヌクレオチド中に取り込ませる方法であって，前記化合物を，前記化合物の前記オリゴヌクレオチド中への取り込みに適した条件下で，核酸テンプレート，ＲＮＡポリメラーゼ酵素，および修飾ヌクレオチド三リン酸取り込みのエンハンサーを含む混合物と接触させる工程を含む方法。
【請求項２７】
前記ＲＮＡポリメラーゼがＴ７ＲＮＡポリメラーゼである，請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記ＲＮＡポリメラーゼが変異体Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼである，請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
前記ＲＮＡポリメラーゼがＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼである，請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
前記ＲＮＡポリメラーゼが変異体ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼである，請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
前記ＲＮＡポリメラーゼがＴ３ＲＮＡポリメラーゼである，請求項２６記載の方法。
【請求項３２】
前記ＲＮＡポリメラーゼが変異体Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼである，請求項２６記載の方法。
【請求項３３】
修飾ヌクレオチド三リン酸取り込みの前記エンハンサーが，ＬｉＣｌ，メタノール，ポリエチレングリコール，ジエチルエーテル，プロパノール，メチルアミン，およびエタノールからなる群より選択される，請求項２６記載の方法。
【請求項３４】
ピリミジンヌクレオチド三リン酸を合成する方法であって，
ａ．　ピリミジンヌクレオシドを，ピリミジンヌクレオチド一リン酸の形成に適した条件下でリン酸化試薬，トリアルキルリン酸およびジメチルアミノピリジンを含む混合物と接触させる一リン酸化；および
ｂ．　工程（ａ）からの前記ピリミジン一リン酸を，前記ピリミジンヌクレオチド三リン酸の形成に適した条件下でピロリン酸化試薬と接触させるピロリン酸化の各工程を含む方法。
【請求項３５】
前記ピリミジンヌクレオシド三リン酸がウリジン三リン酸である，請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記ウリジン三リン酸が２’−糖修飾を有する，請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
前記ウリジン三リン酸が２’−Ｏ−メチルチオメチルウリジン三リン酸である，請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記リン酸化試薬が，オキシ塩化リン，ホスホ−トリス−トリアゾリドおよびホスホ−トリス−トリイミダゾリドからなる群より選択される，請求項３４記載の方法。
【請求項３９】
前記トリアルキルリン酸がトリエチルリン酸である，請求項３４記載の方法。
【請求項４０】
前記ピロリン酸化試薬がトリブチルアンモニウムピロリン酸である，請求項３４記載の方法。
【請求項４１】
前記オリゴヌクレオチドがＲＮＡである，請求項２６記載の方法。
【請求項４２】
前記オリゴヌクレオチドが酵素的核酸分子である，請求項２６記載の方法。
【請求項４３】
前記オリゴヌクレオチドがアプタマーである，請求項２６記載の方法。
【請求項４４】
オリゴヌクレオチドを合成するためのキットであって，ＲＮＡポリメラーゼ，修飾ヌクレオチド三リン酸取り込みのエンハンサーおよび請求項２５記載の少なくとも１つの化合物を含むキット。
【請求項４５】
オリゴヌクレオチドを合成するためのキットであって，ＤＮＡポリメラーゼ，修飾ヌクレオチド三リン酸取り込みのエンハンサーおよび請求項２５記載の少なくとも１つの化合物を含むキット。
【請求項４６】
前記ＲＮＡポリメラーゼがバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼである，請求項４４記載のキット。
【請求項４７】
前記ＲＮＡポリメラーゼがバクテリオファージＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼである，請求項４４記載のキット。
【請求項４８】
前記ＲＮＡポリメラーゼがバクテリオファージＴ３ＲＮＡポリメラーゼである，請求項４４記載のキット。
【請求項４９】
前記ＲＮＡポリメラーゼが変異体Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼである，請求項４４記載のキット。
【請求項５０】
前記キットが，請求項２５記載の少なくとも２つの異なる化合物を含む，請求項４４または４５記載のキット。
【請求項５１】
ヒスチジル修飾を含む核酸触媒であって，金属イオン補因子の非存在下でエンドヌクレアーゼ反応を触媒しうる核酸触媒。
【請求項５２】
前記触媒が別個の核酸分子を切断しうる，請求項５１記載の核酸触媒。
【請求項５３】
前記別個の核酸分子がＲＮＡ分子である，請求項５２記載の核酸触媒。
【請求項５４】
前記別個の核酸分子がＤＮＡ分子である，請求項５２記載の核酸触媒。
【請求項５５】
前記核酸触媒が少なくとも１つのリボヌクレオチドを含む，請求項５１記載の核酸触媒。
【請求項５６】
前記核酸分子がＨＥＲ２遺伝子のＲＮＡを切断するエンドヌクレアーゼ活性を有する，請求項２記載の酵素的核酸分子。
【請求項５７】
前記核酸分子が，表５８，５９および６２において標的配列として規定される基質配列のいずれかに相補的な配列を含む，請求項５６記載の酵素的核酸分子。
【請求項５８】
前記核酸分子が，表５８，５９および６２においてリボザイム配列として規定されるいずれかのリボザイム配列を含む，請求項５６記載の酵素的核酸分子。
【請求項５９】
請求項５６記載の酵素的核酸分子を用いて癌を治療する方法。
【請求項６０】
前記癌が乳癌である，請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
請求項５６記載の酵素的核酸分子を用いてＨＥＲ２遺伝子のレベルに関連する状態を治療する方法。
【請求項６２】
前記酵素的核酸分子が，ＲＮＡに相補的な５−３０ヌクレオチドを有する基質結合領域を含む，請求項５６記載の酵素的核酸分子。
【請求項６３】
前記酵素的核酸分子が，ＲＮＡに相補的な７−１２ヌクレオチドを有する基質結合領域を含む，請求項５６記載の酵素的核酸分子。
【請求項６４】
請求項５６記載の酵素的核酸分子を含む哺乳動物細胞。
【請求項６５】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である，請求項６４記載の哺乳動物細胞。
【請求項６６】
請求項１または２のいずれかに記載の酵素的核酸分子を含む哺乳動物細胞。
【請求項６７】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である，請求項６６記載の哺乳動物細胞。
【請求項６８】
細胞においてＨＥＲ２遺伝子の発現を阻害する方法であって，請求項５６記載の酵素的核酸分子を前記阻害に適した条件下で前記細胞に投与する工程を含む方法。
【請求項６９】
ＨＥＲ２遺伝子に由来するＲＮＡを切断する方法であって，請求項５６記載の酵素的核酸分子を前記ＲＮＡ分子の切断に適した条件下で前記ＲＮＡ分子と接触させることを含む方法。
【請求項７０】
請求項１または２のいずれかに記載の酵素的核酸分子を含む医薬組成物。
【請求項７１】
請求項５６記載の酵素的核酸分子を含む医薬組成物。
【請求項７２】
ＨＥＲ２のレベルに関連した状態を有する患者を治療する方法であって，請求項５６記載の酵素的核酸分子を前記治療に適した条件下で前記患者に投与することを含む方法。
【請求項７３】
前記方法が，１またはそれ以上の他の治療と組み合わせて行われる，請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
前記酵素的核酸分子が，１またはそれ以上の他の治療と組み合わせて用いられる，請求項５９記載の方法。
【請求項７５】
前記酵素的核酸分子が少なくとも１つの糖修飾を含む，請求項５６記載の酵素的核酸分子。
【請求項７６】
前記酵素的核酸分子が少なくとも１つの核酸塩基修飾を含む，請求項５６記載の酵素的核酸分子。
【請求項７７】
前記酵素的核酸分子が，少なくとも１つのリン酸骨格修飾を含む，請求項５６記載の酵素的核酸分子。
【請求項７８】
前記リン酸骨格修飾が，ホスホロチオエート，ホスホロジチオエートおよびアミドからなる群より選択される，請求項５６記載の酵素的核酸分子。
【請求項７９】
ベータ部位ＡＰＰ−切断酵素（ＢＡＣＥ）およびテロメラーゼリバーストランスクリプターゼ（ＴＥＲＴ）遺伝子からなる群より選択される，遺伝子の発現をダウンレギュレートする酵素的核酸分子。
【請求項８０】
前記遺伝子がベータ部位ＡＰＰ−切断酵素（ＢＡＣＥ）である，請求項７９記載の酵素的核酸分子。
【請求項８１】
前記遺伝子がテロメラーゼリバーストランスクリプターゼ（ＴＥＲＴ）である，請求項７９記載の酵素的核酸分子。
【請求項８２】
蛋白質−チロシンホスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ），メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭｅｔＡＰ−２），Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ），ホスホランバン（ＰＬＮ），およびプレセニリン（ｐｓ−２）遺伝子からなる群より選択される，遺伝子の発現をダウンレギュレートする核酸分子。
【請求項８３】
前記核酸分子が酵素的核酸分子である，請求項８２記載の核酸分子。
【請求項８４】
前記核酸分子がアンチセンス核酸分子である，請求項８２記載の核酸分子。
【請求項８５】
前記遺伝子が蛋白質−チロシンホスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）である，請求項８２−８４のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項８６】
前記遺伝子がメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭｅｔＡＰ−２）である，請求項８２−８４のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項８７】
前記遺伝子がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）である，請求項８２−８４のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項８８】
前記遺伝子がホスホランバン（ＰＬＮ）である，請求項８２−８４のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項８９】
前記遺伝子がプレセニリン（ｐｓ−２）である，請求項８２−８４のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項９０】
前記酵素的核酸分子が，ベータ部位ＡＰＰ−切断酵素（ＢＡＣＥ），テロメラーゼリバーストランスクリプターゼ（ＴＥＲＴ），蛋白質−チロシンホスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ），メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭｅｔＡＰ−２），Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ），ホスホランバン（ＰＬＮ），およびプレセニリン（ｐｓ−２）遺伝子からなる群より選択される遺伝子の発現に関連する疾病および状態の治療に用いるよう適合されている，請求項７９または８３のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項９１】
前記核酸分子が，蛋白質−チロシンホスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ），メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭｅｔＡＰ−２），Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ），ホスホランバン（ＰＬＮ），およびプレセニリン（ｐｓ−２）遺伝子からなる群より選択される遺伝子の発現に関連する疾病および状態の治療に用いるよう適合されている，請求項８２記載の核酸分子。
【請求項９２】
前記酵素的核酸分子が，前記ベータ部位ＡＰＰ−切断酵素（ＢＡＣＥ），テロメラーゼリバーストランスクリプターゼ（ＴＥＲＴ），蛋白質−チロシンホスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ），メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭｅｔＡＰ−２），Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ），ホスホランバン（ＰＬＮ），およびプレセニリン（ｐｓ−２）遺伝子によりコードされるＲＮＡを切断するエンドヌクレアーゼ活性を有する，請求項７９または８３のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項９３】
前記酵素的核酸分子の結合アームが，表３−３０，および３６−４３において標的または基質配列として規定されている配列のいずれかに相補的な配列を含む，請求項７９または８３のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項９４】
前記酵素的核酸分子が，表３−２９，および３７−４３においてリボザイムまたはＤＮＡｚｙｍｅ配列として規定されているいずれかの配列を含む，請求項７９または８３のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項９５】
前記アンチセンス核酸分子が，表３−１２，２４−３０，および３６−４３において標的または基質配列として規定されている配列のいずれかに相補的な配列を含む，請求項８４記載の核酸分子。
【請求項９６】
前記酵素的核酸分子がハンマーヘッド（ＨＨ）モチーフのものである，請求項７９または８３のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項９７】
前記酵素的核酸分子がチンザイム（クラスＩＩ）モチーフのものである，請求項７９または８３のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項９８】
前記酵素的核酸分子がアンバーザイム（クラス１）モチーフのものである，請求項７９または８３のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項９９】
前記酵素的核酸分子が，ヘアピン，デルタ肝炎ウイルス，グループ１イントロン，ＶＳ核酸，またはＲＮＡｓｅＰ核酸モチーフのものである，請求項７９または８３のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項１００】
前記チンザイムモチーフが，表２１，２７および４０に示される基質配列のいずれかに相補的な配列を含む，請求項９７記載の酵素的核酸分子。
【請求項１０１】
前記アンバーザイムモチーフが，表２３，２９，および４２に示される基質配列のいずれかに相補的な配列を含む，請求項９８記載の酵素的核酸分子。
【請求項１０２】
前記酵素的核酸分子がＮＣＨモチーフのものである，請求項７９または８３のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項１０３】
前記酵素的核酸分子がＧ−切断剤モチーフのものである，請求項７９または８３のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項１０４】
前記酵素的核酸分子がＤＮＡｚｙｍｅである，請求項７９または８３のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項１０５】
前記酵素的核酸分子が，ベータ部位ＡＰＰ−切断酵素（ＢＡＣＥ），テロメラーゼリバーストランスクリプターゼ（ＴＥＲＴ），蛋白質−チロシンホスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ），メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭｅｔＡＰ−２），Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ），ホスホランバン（ＰＬＮ），およびプレセニリン（ｐｓ−２）遺伝子からなる群より選択される遺伝子のＲＮＡに相補的な１２−１００塩基を含む，請求項７９または８３のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項１０６】
前記酵素的核酸分子が，ベータ部位ＡＰＰ−切断酵素（ＢＡＣＥ），テロメラーゼリバーストランスクリプターゼ（ＴＥＲＴ），蛋白質−チロシンホスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ），メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭｅｔＡＰ−２），Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ），ホスホランバン（ＰＬＮ），およびプレセニリン（ｐｓ−２）遺伝子からなる群より選択される遺伝子のＲＮＡに相補的な１４−２４塩基を含む，請求項７９または８３のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項１０７】
前記酵素的核酸が化学的に合成されたものである，請求項７９または８３のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項１０８】
前記酵素的核酸が少なくとも１つの２’−糖修飾を含む，請求項７９または８３のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項１０９】
前記酵素的核酸が少なくとも１つの核酸塩基修飾を含む，請求項７９または８３のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項１１０】
前記酵素的核酸が少なくとも１つのリン酸骨格修飾を含む，請求項７９または８３のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項１１１】
請求項７９または８３のいずれかに記載の酵素的核酸分子を含む哺乳動物細胞であって，生きているヒトではない哺乳動物細胞。
【請求項１１２】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である，請求項１１１記載の哺乳動物細胞。
【請求項１１３】
前記アンチセンス核酸が化学的に合成されたものである，請求項８４記載のアンチセンス核酸分子。
【請求項１１４】
前記アンチセンス核酸が少なくとも１つの２’−糖修飾を含む，請求項８４記載のアンチセンス核酸分子。
【請求項１１５】
前記アンチセンス核酸が少なくとも１つの核酸塩基修飾を含む，請求項８４記載のアンチセンス核酸分子。
【請求項１１６】
前記アンチセンス核酸が少なくとも１つのリン酸骨格修飾を含む，請求項８４記載のアンチセンス核酸分子。
【請求項１１７】
請求項８４記載のアンチセンス核酸分子を含む哺乳動物細胞であって，生きているヒトではない哺乳動物細胞。
【請求項１１８】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である，請求項１１７記載の哺乳動物細胞。
【請求項１１９】
細胞においてＢＡＣＥ活性を減少させる方法であって，前記細胞を前記阻害に適した条件下で請求項８０記載の酵素的核酸分子に接触させる工程を含む方法。
【請求項１２０】
細胞においてＴＥＲＴ活性を減少させる方法であって，前記細胞を前記阻害に適した条件下で請求項８１記載の酵素的核酸分子と接触させる工程を含む方法。
【請求項１２１】
細胞においてＰＴＰ−１Ｂ活性を減少させる方法であって，前記細胞を，前記阻害に適した条件下で請求項８５記載の核酸分子と接触させる工程を含む方法。
【請求項１２２】
細胞においてＭｅｔＡＰ−２活性を減少させる方法であって，前記細胞を，前記阻害に適した条件下で請求項８６記載の核酸分子と接触させる工程を含む方法。
【請求項１２３】
細胞においてＨＢＶ活性を減少させる方法であって，前記細胞を，前記阻害に適した条件下で請求項８７記載の核酸分子と接触させる工程を含む方法。
【請求項１２４】
細胞においてホスホランバン（ＰＬＮ）活性を減少させる方法であって，前記細胞を，前記阻害に適した条件下で請求項８８記載の核酸分子と接触させる工程を含む方法。
【請求項１２５】
細胞においてプレセニリン−２（ｐｓ−２）活性を減少させる方法であって，前記細胞を，前記阻害に適した条件下で請求項８９記載の核酸分子と接触させる工程を含む方法。
【請求項１２６】
ＢＡＣＥのレベルに関連する状態を有する患者を治療する方法であって，前記患者の細胞を，前記治療に適した条件下で請求項８０記載の酵素的核酸分子と接触させることを含む方法。
【請求項１２７】
ＴＥＲＴのレベルに関連する状態を有する患者を治療する方法であって，前記患者の細胞を，前記治療に適した条件下で請求項８１記載の酵素的核酸分子と接触させることを含む方法。
【請求項１２８】
ＰＴＰ−１Ｂのレベルに関連する状態を有する患者を治療する方法であって，前記患者の細胞を，前記治療に適した条件下で請求項８５記載の核酸分子と接触させることを含む方法。
【請求項１２９】
ＭｅｔＡＰ−２のレベルに関連する状態を有する患者を治療する方法であって，前記患者の細胞を，前記治療に適した条件下で請求項８６記載の核酸分子と接触させることを含む方法。
【請求項１３０】
ＨＢＶのレベルに関連する状態を有する患者を治療する方法であって，前記患者の細胞を，前記治療に適した条件下で請求項８７記載の核酸分子と接触させることを含む方法。
【請求項１３１】
ホスホランバン（ＰＬＮ）のレベルに関連する状態を有する患者を治療する方法であって，前記患者の細胞を，前記治療に適した条件下で，請求項８８記載の核酸分子と接触させることを含む方法。
【請求項１３２】
プレセニリン−２（ｐｓ−２）のレベルに関連する状態を有する患者を治療する方法であって，前記患者の細胞を，前記治療に適した条件下で請求項８９記載の核酸分子と接触させることを含む方法。
【請求項１３３】
前記治療に適した条件下で１またはそれ以上の薬剤療法を用いることをさらに含む，請求項１２６−１３２のいずれかに記載の方法。
【請求項１３４】
ＢＡＣＥ遺伝子のＲＮＡを切断する方法であって，請求項８０記載の酵素的核酸分子を，前記ＲＮＡの切断に適した条件下で前記ＲＮＡと接触させることを含む方法。
【請求項１３５】
ＴＥＲＴ遺伝子のＲＮＡを切断する方法であって，請求項８１記載の酵素的核酸分子を，前記ＲＮＡの切断に適した条件下で前記ＲＮＡと接触させることを含む方法。
【請求項１３６】
ＰＴＰ−１Ｂ遺伝子のＲＮＡを切断する方法であって，請求項８５記載の酵素的核酸分子を，前記ＲＮＡの切断に適した条件下で前記ＲＮＡと接触させることを含む方法。
【請求項１３７】
ＭｅｔＡＰ−２遺伝子のＲＮＡを切断する方法であって，請求項８６記載の酵素的核酸分子を，前記ＲＮＡの切断に適した条件下で前記ＲＮＡと接触させることを含む方法。
【請求項１３８】
ＨＢＶ遺伝子のＲＮＡを切断する方法であって，請求項８７記載の酵素的核酸分子を，前記ＲＮＡの切断に適した条件下で前記ＲＮＡと接触させることを含む方法。
【請求項１３９】
ホスホランバン（ＰＬＮ）遺伝子のＲＮＡを切断する方法であって，請求項８８記載の酵素的核酸分子を，前記ＲＮＡの切断に適した条件下で前記ＲＮＡと接触させることを含む方法。
【請求項１４０】
プレセニリン−２（ｐｓ−２）遺伝子のＲＮＡを切断する方法であって，請求項８９記載の酵素的核酸分子を，前記ＲＮＡの切断に適した条件下で前記ＲＮＡと接触させることを含む方法。
【請求項１４１】
前記切断が二価カチオンの存在下で行われる，請求項１３４−１４０のいずれかに記載の方法。
【請求項１４２】
前記二価カチオンがＭｇ２＋である，請求項１４１記載の方法。
【請求項１４３】
前記酵素的核酸がキャップ構造を含み，キャップ構造が５’−末端または３’−末端または５’−末端および３’−末端の両方に存在する，請求項７９または８３のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項１４４】
前記アンチセンス核酸がキャップ構造を含み，キャップ構造が５’−末端または３’−末端または５’−末端および３’−末端の両方に存在する，請求項８４記載のアンチセンス核酸分子。
【請求項１４５】
前記ハンマーヘッドモチーフが，表３，９，１３，１８，２４，および３７において標的または基質配列として規定される配列のいずれかに相補的な配列を含む，請求項９６記載の酵素的核酸分子。
【請求項１４６】
前記ＮＣＨモチーフが，表４，１０，１４，１９，２５，および３８において標的または基質配列として規定される配列のいずれかに相補的な配列を含む，請求項１０２記載の酵素的核酸分子。
【請求項１４７】
前記Ｇ−切断剤モチーフが，表５，１１，１５，２０，２６，および３９において標的または基質配列として規定される配列のいずれかに相補的な配列を含む，請求項１０３記載の酵素的核酸分子。
【請求項１４８】
前記ＤＮＡｚｙｍｅが，表６，１６，２２，２８，および４１において標的または基質配列として規定される配列のいずれかに相補的な配列を含む，請求項１０４記載の酵素的核酸分子。
【請求項１４９】
前記酵素的核酸分子がハンマーヘッドモチーフのものである，請求項１１９−１２５または１３３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５０】
前記核酸分子がＤＮＡｚｙｍｅである，請求項１１９−１２５または１３３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５１】
請求項７９または８３のいずれかに記載の少なくとも１つの酵素的核酸分子をコードする核酸配列を，酵素的核酸分子の発現を可能とする様式で含む発現ベクター。
【請求項１５２】
請求項８４記載の少なくとも１つのアンチセンス核酸分子をコードする核酸配列を，そのアンチセンス核酸分子の発現を可能とする様式で含む発現ベクター。
【請求項１５３】
請求項１５１または１５２のいずれかに記載の発現ベクターを含む哺乳動物細胞であって，生きているヒトではない哺乳動物細胞。
【請求項１５４】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である，請求項１５３記載の哺乳動物細胞。
【請求項１５５】
前記酵素的核酸分子がハンマーヘッドモチーフのものである，請求項１５１記載の発現ベクター。
【請求項１５６】
前記発現ベクターが，ベータ部位ＡＰＰ−切断酵素（ＢＡＣＥ），テロメラーゼリバーストランスクリプターゼ（ＴＥＲＴ），蛋白質−チロシンホスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ），メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭｅｔＡＰ−２），Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ），ホスホランバン（ＰＬＮ），およびプレセニリン（ｐｓ−２）遺伝子からなる群より選択される遺伝子のＲＮＡに相補的なアンチセンス核酸分子の配列をさらに含む，請求項１５１記載の発現ベクター。
【請求項１５７】
前記発現ベクターが，同じであっても異なっていてもよい少なくとも２つの前記酵素的核酸分子をコードする配列を含む，請求項１５１記載の発現ベクター。
【請求項１５８】
前記発現ベクターが，ベータ部位ＡＰＰ−切断酵素（ＢＡＣＥ），テロメラーゼリバーストランスクリプターゼ（ＴＥＲＴ），蛋白質−チロシンホスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ），メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭｅｔＡＰ−２），Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ），ホスホランバン（ＰＬＮ），およびプレセニリン（ｐｓ−２）遺伝子からなる群より選択される遺伝子のＲＮＡに相補的なアンチセンス核酸分子をコードする配列をさらに含む，請求項１５７記載の発現ベクター。
【請求項１５９】
アルツハイマー病を治療する方法であって，請求項８０記載の酵素的核酸分子を前記治療に適した条件下で患者に投与する工程を含む方法。
【請求項１６０】
アルツハイマー病の前記治療が痴呆の治療である，請求項１５９記載の方法。
【請求項１６１】
アルツハイマー病を治療する方法であって，請求項８９記載のアンチセンス核酸分子を前記治療に適した条件下で患者に投与する工程を含む方法。
【請求項１６２】
糖尿病を治療する方法であって，請求項８５記載の核酸分子を前記治療に適した条件下で患者に投与する工程を含む方法。
【請求項１６３】
前記糖尿病がＩ型糖尿病である，請求項１６２記載の方法。
【請求項１６４】
前記糖尿病がＩＩ型糖尿病である，請求項１６２記載の方法。
【請求項１６５】
糖尿病を治療する方法であって，請求項８５記載のアンチセンス核酸分子を前記治療に適した条件下で患者に投与する工程を含む方法。
【請求項１６６】
肥満を治療する方法であって，請求項８５記載の核酸分子を前記治療に適した条件下で患者に投与する工程を含む方法。
【請求項１６７】
肥満を治療する方法であって，請求項８５記載のアンチセンス核酸分子を前記治療に適した条件下で患者に投与する工程を含む方法。
【請求項１６８】
心臓疾患を治療する方法であって，請求項８８記載の核酸分子を前記治療に適した条件下で患者に投与する工程を含む方法。
【請求項１６９】
前記心臓疾患が心不全である，請求項１６８記載の方法。
【請求項１７０】
前記心臓疾患がうっ血性心不全である，請求項１６８記載の方法。
【請求項１７１】
圧過負荷肥大，または拡張型心筋症，またはその両方を治療する方法であって，請求項８８記載の核酸分子を前記治療に適した条件下で患者に投与する工程を含む方法。
【請求項１７２】
請求項８６記載の核酸分子を治療に適した条件下で患者に投与する工程を含む，癌を治療する方法。
【請求項１７３】
請求項８７記載の核酸分子を治療に適した条件下で患者に投与する工程を含む，肝炎を治療する方法。
【請求項１７４】
請求項８７記載の核酸分子を治療に適した条件下で患者に投与する工程を含む，肝細胞癌を治療する方法。
【請求項１７５】
前記酵素的核酸分子がハンマーヘッドモチーフのものである，請求項１５９記載の方法。
【請求項１７６】
前記方法が，酵素的核酸分子を１またはそれ以上の他の治療と組み合わせて前記患者に投与することをさらに含む，請求項１５９記載の方法。
【請求項１７７】
前記核酸分子が酵素的核酸分子である，請求項１６２，１６５−１６８，または１７１−１７４のいずれかに記載の方法。
【請求項１７８】
前記核酸分子がアンチセンス核酸分子である，請求項１６２，１６６−１６８，または１７１−１７４のいずれかに記載の方法。
【請求項１７９】
前記方法が，核酸分子を１またはそれ以上の他の治療と組み合わせて前記患者に投与することをさらに含む，請求項１６２，１６５−１６８，または１７１−１７４のいずれかに記載の方法。
【請求項１８０】
前記酵素的核酸分子が，少なくとも５個のリボース残基；少なくとも１０個の２’−Ｏ−メチル修飾，および３’−末端修飾を含む，請求項７９または８３のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項１８１】
前記酵素的核酸分子が，５’−末端ヌクレオチドの少なくとも３個においてホスホロチオエート結合をさらに含む，請求項１８０記載の酵素的核酸分子。
【請求項１８２】
前記３’−末端修飾が３’−３’反転無塩基成分である，請求項１８０記載の酵素的核酸分子。
【請求項１８３】
前記ＤＮＡｚｙｍｅが，少なくとも１０個の２’−Ｏ−メチル修飾および３’−末端修飾を含む，請求項１０４記載の酵素的核酸分子。
【請求項１８４】
前記ＤＮＡｚｙｍｅが，５’−末端ヌクレオチドの少なくとも３個においてホスホロチオエート結合をさらに含む，請求項１８３記載の酵素的核酸分子。
【請求項１８５】
前記３’−末端修飾が３’−３’反転無塩基成分である，請求項１８３記載の酵素的核酸分子。
【請求項１８６】
式１：
【化４】
2004512810.tif 000487
［式中，Ｎは，独立して，ヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーを表し，これは同じであっても異なっていてもよく；ＤおよびＥは，独立して，標的ＲＮＡ分子と安定して相互作用するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり；ｏおよびｎは，独立して，１以上の整数であり，ここで，（Ｎ）ｏおよび（Ｎ）ｎがヌクレオチドであるとき，（Ｎ）ｏおよび（Ｎ）ｎは，任意に，水素結合相互作用により相互作用することができ；・は塩基対相互作用を表し；Ｌは存在してもしていなくてもよいリンカーであるが，存在する場合には，ヌクレオチドリンカー，非ヌクレオチドリンカー，またはヌクレオチドリンカーと非ヌクレオチドリンカーとの組み合わせであり；ｐは０または１の整数であり；−は化学結合を表し；およびＡ，Ｕ，Ｉ，ＣおよびＧは，それぞれ，アデノシン，ウリジン，イノシン，シチジンおよびグアノシンヌクレオチドを表す］
を有する酵素的核酸分子。
【請求項１８７】
式２：
【化５】
2004512810.tif 000488
［式中，Ｎは，独立して，ヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーであり，これらは同じであっても異なっていてもよく；ＤおよびＥは，独立して，標的ＲＮＡ分子と安定に相互作用するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり；ｏおよびｎは，独立して，０以上の整数であり，ここで，（Ｎ）ｏおよび（Ｎ）ｎがヌクレオチドであるとき，（Ｎ）ｏおよび（Ｎ）ｎは任意に水素結合相互作用により相互作用することができ；・は，塩基対相互作用を示し；Ｌは存在してもしていなくてもよいリンカーであるが，存在する場合にはヌクレオチドリンカー，非ヌクレオチドリンカー，またはヌクレオチドリンカーと非ヌクレオチドリンカーとの組み合わせであり；ｐは０または１の整数であり；−は化学結合を表し；およびＡ，Ｕ，Ｉ，ＣおよびＧは，それぞれアデノシン，ウリジン，イノシン，シチジンおよびグアノシンヌクレオチドを表す］
を有する酵素的核酸分子。
【請求項１８８】
前記ＤおよびＥが，独立して，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１７および２０ヌクレオチドからなる群より選択される長さのものである，請求項１８６または１８７のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項１８９】
前記ＤおよびＥが同じ長さのものである，請求項１８６または１８７のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項１９０】
前記ＤおよびＥが異なる長さのものである，請求項１８６または１８７のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項１９１】
前記ｏおよびｎが，独立して，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１５，２０，２５，３０，３５，および５０からなる群より選択される整数である，請求項１８６記載の酵素的核酸分子。
【請求項１９２】
前記ｏおよびｎが，独立して，１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１５，２０，２５，３０，３５，および５０からなる群より選択される整数である，請求項１８７記載の酵素的核酸分子。
【請求項１９３】
前記（Ｎ）ｏおよび（Ｎ）ｎが，互いに相補的なヌクレオチドを含む，請求項１８６または１８７のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項１９４】
前記（Ｎ）ｏおよび（Ｎ）ｎが同じ長さのものである，請求項１８６または１８７のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項１９５】
前記（Ｎ）ｏおよび（Ｎ）ｎが異なる長さのものである，請求項１８６または１８７のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項１９６】
前記Ｌがヌクレオチドリンカーである，請求項１８６または１８７のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項１９７】
前記ヌクレオチドリンカーが，３−５０ヌクレオチドの長さである，請求項１９６記載の酵素的核酸分子。
【請求項１９８】
前記ヌクレオチドリンカーがアプタマーである，請求項１９６記載の酵素的核酸分子。
【請求項１９９】
前記ヌクレオチドリンカーが，５’−ＧＡＡＡ−３’および５’−ＧＵＵＡ−３’からなる群より選択される，請求項１９６記載の酵素的核酸分子。
【請求項２００】
前記Ｌが非ヌクレオチドリンカーである，請求項１８６または１８７のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項２０１】
前記化学結合が，リン酸エステル結合，アミド結合，ホスホロチオエート，アラビノ，アラビノフルオロ，およびホスホロジチオエートからなる群より独立してまたは組み合わせて選択される，請求項１８６または１８７のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項２０２】
前記ｐが１である，請求項１８６または１８７のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項２０３】
（Ｎ）ｐの前記Ｎが，独立して，アデノシン，ウリジン，およびシチジンからなる群より選択される，請求項２０２記載の酵素的核酸分子。
【請求項２０４】
前記酵素的核酸分子が化学的に合成されたものである，請求項１８６または１８７のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項２０５】
前記酵素的核酸分子が少なくとも３個のリボヌクレオチド残基を含む，請求項１８６または１８７のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項２０６】
前記酵素的核酸分子が，少なくとも４個のリボヌクレオチド残基を含む，請求項１８６または１８７のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項２０７】
前記酵素的核酸分子が，少なくとも５個のリボヌクレオチド残基を含む，請求項１８６または１８７のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項２０８】
前記Ｉが，リボ−イノシンおよびキシロ−イノシンからなる群より選択される，請求項１８６または１８７のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項２０９】
前記酵素的核酸分子が，少なくとも１つの糖修飾を含む，請求項１８６または１８７のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項２１０】
前記酵素的核酸分子が少なくとも核酸塩基修飾を含む，請求項１８６または１８７のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項２１１】
前記酵素的核酸分子が，少なくとも１つのリン酸骨格修飾を含む，請求項１８６または１８７のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項２１２】
前記糖修飾が，２’−Ｈ，２’−Ｏ−メチル，２’−Ｏ−アリル，および２’−デオキシ−２’−アミノからなる群より選択される，請求項２０９記載の酵素的核酸分子。
【請求項２１３】
前記リン酸骨格修飾が，ホスホロチオエート，ホスホロジチオエートおよびアミドからなる群より選択される，請求項２１１記載の酵素的核酸分子。
【請求項２１４】
前記酵素的核酸分子が，５’−キャップまたは３’−キャップまたは５’−キャップと３’−キャップの両方を含む，請求項１８６または１８７のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項２１５】
前記５’−キャップが，前記酵素的核酸分子の少なくとも１つの５’−末端ヌクレオチドのホスホロチオエート修飾である，請求項２１４記載の酵素的核酸分子。
【請求項２１６】
前記５’−キャップが，前記酵素的核酸分子の少なくとも２個の５’−末端ヌクレオチドのホスホロチオエート修飾である，請求項２１４記載の酵素的核酸分子。
【請求項２１７】
前記５’−キャップが，前記酵素的核酸分子の少なくとも３個の５’−末端ヌクレオチドのホスホロチオエート修飾である，請求項２１４記載の酵素的核酸分子。
【請求項２１８】
前記３’−キャップが３’−３’反転無塩基成分である，請求項２１４記載の酵素的核酸分子。
【請求項２１９】
前記３’−キャップが３’−３’反転ヌクレオチド成分である，請求項２１４記載の酵素的核酸分子。
【請求項２２０】
細胞において遺伝子の発現を阻害する方法であって，請求項１８６または１８７のいずれかに記載の酵素的核酸分子を前記阻害に適した条件下で前記細胞に投与する工程を含む方法。
【請求項２２１】
別個のＲＮＡ分子を切断する方法であって，請求項１８６または１８７のいずれかに記載の酵素的核酸分子を，前記別個のＲＮＡ分子の切断に適した条件下で前記別個のＲＮＡ分子と接触させることを含む方法。
【請求項２２２】
前記切断が，二価カチオンの存在下で行われる，請求項２２１記載の方法。
【請求項２２３】
前記二価カチオンがＭｇ２＋である，請求項２２２記載の方法。
【請求項２２４】
前記酵素的核酸分子が，ＨＥＲ２遺伝子に由来するＲＮＡを切断するエンドヌクレアーゼ活性を有する，請求項１８６または１８７のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項２２５】
前記酵素的核酸分子が，表３４のＮＣＨ基質配列のいずれかに相補的な配列を含む，請求項２２４記載の酵素的核酸分子。
【請求項２２６】
前記酵素的核酸分子が，表３４に示されるＮＣＨリボザイム配列のいずれかを含む，請求項２２４記載の酵素的核酸分子。
【請求項２２７】
前記酵素的核酸分子が癌を治療するために用いられる，請求項２２４記載の酵素的核酸分子。
【請求項２２８】
前記癌が乳癌である，請求項２２４記載の酵素的核酸分子。
【請求項２２９】
前記酵素的核酸分子が，ＨＥＲ２遺伝子のレベルに関連する状態を治療するために用いられる，請求項２２４記載の酵素的核酸分子。
【請求項２３０】
表３１においてＮＣＨリボザイム配列として示されるいずれかの配列を含む酵素的核酸分子。
【請求項２３１】
前記酵素的核酸分子が，ＲＮＡに相補的な５−３０ヌクレオチドを有する基質結合領域を含む，請求項２２４記載の酵素的核酸分子。
【請求項２３２】
前記酵素的核酸分子が，ＲＮＡに相補的な７−１２ヌクレオチドを有する基質結合領域を含む，請求項２２４記載の酵素的核酸分子。
【請求項２３３】
請求項２２４記載の酵素的核酸分子を含む哺乳動物細胞であって，生きているヒトではない哺乳動物細胞。
【請求項２３４】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である，請求項２３３記載の哺乳動物細胞。
【請求項２３５】
請求項１８６または１８７のいずれかに記載の酵素的核酸分子を含む哺乳動物細胞であって，生きているヒトではない哺乳動物細胞。
【請求項２３６】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である，請求項２３５記載の哺乳動物細胞。
【請求項２３７】
細胞においてＨＥＲ２遺伝子の発現を阻害する方法であって，請求項２２４記載の酵素的核酸分子を前記阻害に適した条件下で前記細胞に投与する工程を含む方法。
【請求項２３８】
ＨＥＲ２遺伝子に由来するＲＮＡを切断する方法であって，請求項２２４記載の酵素的核酸分子を，前記ＲＮＡ分子の切断に適した条件下で前記ＲＮＡ分子と接触させることを含む方法。
【請求項２３９】
請求項１８６または１８７のいずれかに記載の酵素的核酸分子を含む医薬組成物。
【請求項２４０】
請求項２２４記載の酵素的核酸分子を含む，医薬組成物。
【請求項２４１】
ＨＥＲ２のレベルに関連する状態を有する患者を治療する方法であって，請求項２２４記載の酵素的核酸分子を前記治療に適した条件下で前記患者に投与することを含む方法。
【請求項２４２】
前記方法が，１またはそれ以上の他の治療と組み合わせて行われる，請求項２４１記載の方法。
【請求項２４３】
前記酵素的核酸分子が，１またはそれ以上の他の治療と組み合わせて用いられる，請求項２２７記載の酵素的核酸分子。
【請求項２４４】
前記核酸分子が，少なくとも５個のリボース残基；前記酵素的核酸の位置４における２’−Ｃ−アリル修飾；少なくとも１０個の２’−Ｏアルキル修飾，および３’−キャップ構造を含む，請求項１８６または１８７のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項２４５】
前記２’−Ｏ−アルキル修飾が，２’−Ｏ−メチルおよび２’−Ｏ−アリルからなる群より選択される，請求項２４４記載の酵素的核酸分子。
【請求項２４６】
前記３’−キャップが３’−３’反転無塩基成分である，請求項２４４記載の酵素的核酸分子。
【請求項２４７】
前記３’−キャップが３’−３’反転ヌクレオチドである，請求項２４４記載の酵素的核酸分子。
【請求項２４８】
前記酵素的核酸が，５’−末端ヌクレオチドの少なくとも３個においてホスホロチオエート結合を含む，請求項２４４記載の酵素的核酸分子。
【請求項２４９】
前記核酸分子が，少なくとも５個のリボース残基；前記酵素的核酸の位置４および７における２’−デオキシ−２’−アミノ修飾；少なくとも１０個の２’−Ｏ−アルキル修飾，および３’−キャップ構造を含む，請求項１８６または１８７のいずれかに記載の酵素的核酸分子。
【請求項２５０】
前記２’−Ｏ−アルキル修飾が，２’−Ｏ−メチルおよび２’−Ｏ−アリルからなる群より選択される，請求項２４９記載の酵素的核酸分子。
【請求項２５１】
前記３’−キャップが３’−３’反転無塩基成分である，請求項２４９記載の酵素的核酸分子。
【請求項２５２】
前記３’−キャップが３’−３’反転ヌクレオチドである，請求項２４９記載の酵素的核酸分子。
【請求項２５３】
前記酵素的核酸が，５’−末端ヌクレオチドの少なくとも３個においてホスホロチオエート結合を含む，請求項２４９記載の酵素的核酸分子。
【請求項２５４】
前記酵素的核酸分子が，少なくとも１つの糖修飾を含む，請求項２２４記載の酵素的核酸分子。
【請求項２５５】
前記酵素的核酸分子が，少なくとも１つの核酸塩基修飾を含む，請求項２２４記載の酵素的核酸分子。
【請求項２５６】
前記酵素的核酸分子が，少なくとも１つのリン酸骨格修飾を含む，請求項２２４記載の酵素的核酸分子。
【請求項２５７】
前記リン酸骨格修飾が，ホスホロチオエート，ホスホロジチオエートおよびアミドからなる群より選択される，請求項２２４記載の酵素的核酸分子。
【請求項２５８】
前記核酸分子が，少なくとも５個のリボース残基；前記酵素的核酸の位置４における２’−Ｃ−アリル修飾；少なくとも１０個の２’−Ｏ−アルキル修飾，および３’−キャップ構造を含む，請求項２２４記載の酵素的核酸分子。
【請求項２５９】
前記２’−Ｏ−アルキル修飾が，２’−Ｏ−メチルおよび２’−Ｏ−アリルからなる群より選択される，請求項２５８記載の酵素的核酸分子。
【請求項２６０】
前記３’−キャップが３’−３’反転無塩基成分である，請求項２５８記載の酵素的核酸分子。
【請求項２６１】
前記３’−キャップが３’−３’反転ヌクレオチドである，請求項２５８記載の酵素的核酸分子。
【請求項２６２】
前記酵素的核酸が，５’−末端ヌクレオチドの少なくとも３個においてホスホロチオエート結合を含む，請求項２５８記載の酵素的核酸分子。
【請求項２６３】
前記核酸分子が，少なくとも５個のリボース残基；前記酵素的核酸の位置４および７における２’−デオキシ−２’−アミノ修飾；少なくとも１０個の２’−Ｏ−アルキル修飾，および３’−キャップ構造を含む，請求項２２４記載の酵素的核酸分子。
【請求項２６４】
前記２’−Ｏ−アルキル修飾が，２’−Ｏ−メチルおよび２’−Ｏ−アリルからなる群より選択される，請求項２６３記載の酵素的核酸分子。
【請求項２６５】
前記３’−キャップが３’−３’反転無塩基成分である，請求項２６３記載の酵素的核酸分子。
【請求項２６６】
前記３’−キャップが３’−３’反転ヌクレオチドである，請求項２６３記載の酵素的核酸分子。
【請求項２６７】
前記酵素的核酸が，５’−末端ヌクレオチドの少なくとも３個においてホスホロチオエート結合を含む，請求項２６３記載の酵素的核酸分子。
【請求項２６８】
前記酵素的核酸分子が，蛋白質キナーゼＣアルファ（ＰＫＣアルファ）遺伝子の発現をダウンレギュレートしうる，請求項１８６記載の酵素的核酸分子。
【請求項２６９】
細胞においてＰＫＣアルファ遺伝子の発現を阻害する方法であって，請求項２６８記載の酵素的核酸分子を前記阻害に適した条件下で前記細胞に投与する工程を含む方法。
【請求項２７０】
ＰＫＣアルファＲＮＡ分子を切断する方法であって，請求項２６８記載の酵素的核酸分子を，前記ＰＫＣアルファＲＮＡ分子の切断に適した条件下で前記別のＰＫＣアルファＲＮＡ分子と接触させることを含む方法。
【請求項２７１】
前記切断が二価カチオンの存在下で実施される，請求項２７０記載の方法。
【請求項２７２】
前記二価カチオンがＭｇ２＋である，請求項２７１記載の方法。
【請求項２７３】
前記酵素的核酸分子が，ＰＫＣアルファ遺伝子に由来するＲＮＡを切断するエンドヌクレアーゼ活性を有する，請求項２６８記載の酵素的核酸分子。
【請求項２７４】
前記酵素的核酸分子が，表６３に示されるＮＣＨ基質配列のいずれかに相補的な配列を含む，請求項２７３記載の酵素的核酸分子。
【請求項２７５】
前記酵素的核酸分子が，表６３に示されるＮＣＨリボザイム配列のいずれかを含む，請求項２７３記載の酵素的核酸分子。
【請求項２７６】
前記酵素的核酸分子が癌を治療するために用いられる，請求項２６８記載の酵素的核酸分子。
【請求項２７７】
前記癌が，肺，乳，結腸，前立腺，膀胱，卵巣，黒色腫，および神経膠芽細胞腫癌からなる群より選択される，請求項２７６記載の酵素的核酸分子。
【請求項２７８】
前記酵素的核酸分子が，ＰＫＣアルファ遺伝子のレベルに関連する状態を治療するために用いられる，請求項２６８記載の酵素的核酸分子。
【請求項２７９】
前記ＤおよびＥが，独立して，ＲＮＡに相補的な５−３０ヌクレオチドを有する，請求項２６８記載の酵素的核酸分子。
【請求項２８０】
前記ＤおよびＥが，独立して，ＲＮＡに相補的な７−１２ヌクレオチドを有する，請求項２６８記載の酵素的核酸分子。
【請求項２８１】
請求項２６８記載の酵素的核酸分子を含む哺乳動物細胞であって，生きているヒトではない哺乳動物細胞。
【請求項２８２】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である，請求項２８１記載の哺乳動物細胞。
【請求項２８３】
請求項２３８記載の酵素的核酸分子を含む医薬組成物。
【請求項２８４】
請求項２７３記載の酵素的核酸分子を含む医薬組成物。
【請求項２８５】
ＰＫＣアルファのレベルに関連する状態を有する患者を治療する方法であって，前記患者に請求項２６８記載の酵素的核酸分子を前記治療に適した条件下で投与することを含む方法。
【請求項２８６】
前記方法が，１またはそれ以上の他の治療と組み合わせて行われる，請求項２８５記載の方法。
【請求項２８７】
前記酵素的核酸分子が，１またはそれ以上の他の治療と組み合わせて用いられる，請求項２８６記載の酵素的核酸分子。
【請求項２８８】
表１３−２３のいずれかの基質配列に相補的な配列を含むアンチセンス核酸分子。
【請求項２８９】
前記酵素的核酸が化学的に合成されたものである，請求項２８８記載のアンチセンス核酸分子。
【請求項２９０】
前記アンチセンス核酸が，少なくとも１つの２’−糖修飾を含む，請求項２８８記載のアンチセンス核酸分子。
【請求項２９１】
前記アンチセンス核酸が，少なくとも１つの核酸塩基修飾を含む，請求項２８８記載のアンチセンス核酸分子。
【請求項２９２】
前記アンチセンス核酸が少なくとも１つのリン酸骨格修飾を含む，請求項２８８記載のアンチセンス核酸分子。
【請求項２９３】
請求項２８８記載のアンチセンス核酸分子を含む哺乳動物細胞であって，生きているヒトではない哺乳動物細胞。
【請求項２９４】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である，請求項２９３記載の哺乳動物細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明は，疾病，例えば癌，糖尿病，肥満，アルツハイマー病，心臓疾患，加齢性疾病，および／またはＢ型肝炎感染および関連する状態に関連する遺伝子発現の阻害剤として有用な薬剤に関する。
【０００２】
発明の概要
本発明は，新規な核酸に基づく技術［例えば，ＲＮＡ切断化学基を含む酵素的核酸分子（リボザイム），アンチセンス核酸，２−５Ａアンチセンスキメラ，トリプレックスＤＮＡ，アンチセンス核酸（例えば，Ｃｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許５，３５９，０５１）］，および癌，糖尿病，肥満，アルツハイマー病，心臓疾患，加齢性疾病，および／またはＢ型肝炎感染および関連する状態の発達および進行に影響を与える分子標的の発現を調節するためにこれを用いる方法を特徴とする。
【０００３】
好ましい態様においては，本発明は，新規な核酸［例えば，酵素的核酸分子（リボザイム），アンチセンス核酸，２−５Ａアンチセンスキメラ，トリプレックスＤＮＡ，ＲＮＡ切断化学基を含むアンチセンス核酸（例えば，Ｃｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許５，３５９，０５１）］に基づく技術，およびこれを用いて疾病関連遺伝子，例えば，蛋白質−チロシン−ホスファターゼ−１ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ００２８２７），メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭｅｔＡＰ２，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ２９６０７），ベータ−セクレターゼ（ＢＡＣＥ，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１９０７２５），プレセニリン−１（ｐｓ−１，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｌ７６５１７），プレセニリン−２（ｐｓ−２，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｌ４３９６４），ヒト表皮成長因子レセプター−２（ＨＥＲ２／ｃｅｒｂ２／ｎｅｕ，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ０３３６３），ホスホランバン（ＰＬＮ，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２６６７），テロメラーゼ（ＴＥＲＴ，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号．ＮＭ＿００３２１９）およびＢ型肝炎ウイルス遺伝子（ＨＢＶ，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１００３０８．１）の発現を阻害する方法を特徴とする。このようなリボザイムは，ヒトおよび他の動物，例えば他の霊長類において，これらの遺伝子の発現により引き起こされる疾病を治療する方法において用いることができる。
【０００４】
すなわち，別の好ましい態様においては，本発明は，新規な核酸，例えば，酵素的核酸分子およびアンチセンス分子に基づく技術，および蛋白質−チロシン−ホスファターゼ−ｌｂ（ＰＴＰ−１Ｂ），メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭｅｔＡＰ−２），ベータ−セクレターゼ（ＢＡＣＥ），プレセニリン−１（ｐｓ−１），プレセニリン−２（ｐｓ−２），ヒト表皮成長因子レセプター−２（ＨＥＲ２／ｃ−ｅｒｂ２／ｎｅｕ），ホスホランバン（ＰＬＮ），テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）ＰＫＣアルファおよびＢ型肝炎（ＨＢＶ）蛋白質をコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートまたは阻害するためにこれらを用いる方法を特徴とする。特に，本出願人は，これらの遺伝子によりコードされるＲＮＡを切断しうる核酸分子の選択および機能，およびこれらを用いて，種々の組織においてＰＴＰ−１Ｂ，ＭｅｔＡＰ−２，ＢＡＣＥ，ｐｓ−１，ｐｓ−２，ＨＥＲ２，ＰＬＮ，ＴＥＲＴ，および／またはＨＢＶ蛋白質のレベルを低下させて本明細書において議論される疾病を治療することを記述する。このような核酸分子はまた診断用途にも有用である。
【０００５】
好ましい態様においては，本発明は，１またはそれ以上の核酸に基づく技術を独立してまたは組み合わせて用いて，ＰＴＰ−１Ｂ，ＭｅｔＡＰ−２，ＢＡＣＥ，ｐｓ−１，ｐｓ−２，ＨＥＲ２，ＰＬＮ，ＴＥＲＴ，および／またはＨＢＶをコードする遺伝子の発現を阻害することを特徴とする。より詳細には，本発明は，核酸に基づく技術を用いて，ＰＴＰ−１Ｂ，ＭｅｔＡＰ−２，ＢＡＣＥ，ｐｓ−１，ｐｓ−２，ＨＥＲ２，ＰＬＮ，ＴＥＲＴ，ＰＫＣアルファ，および／またはＨＢＶ遺伝子の発現を特異的に阻害することを特徴とする。
【０００６】
さらに別の好ましい態様においては，本発明は，酵素的核酸分子，好ましくはハンマーヘッド，ＮＣＨ（Ｉｎｏｚｙｍｅ），Ｇ−切断剤，アンバーザイム，チンザイム，および／またはＤＮＡｚｙｍｅモチーフのものを用いて，ＰＴＰ−１Ｂ，ＭｅｔＡＰ−２，ＢＡＣＥ，ｐｓ−１，ｐｓ−２，ＨＥＲ２，ＰＬＮ，ＴＥＲＴ，ＰＫＣアルファおよび／またはＨＢＶ　ＲＮＡの発現を阻害することを特徴とする。
【０００７】
本出願人は，これらの核酸分子がＰＴＰ−１Ｂ，ＭｅｔＡＰ−２，ＢＡＣＥ，ｐｓ−１，ｐｓ−２，ＨＥＲ２，ＰＬＮ，ＴＥＲＴ，ＰＫＣアルファ，および／またはＨＢＶ遺伝子の発現を阻害しうることを示す。当業者は，記載される例から，標的ＰＴＰ−１Ｂ，ＭｅｔＡＰ−２，ＢＡＣＥ，ｐｓ−１，ｐｓ−２，ＨＥＲ２，ＰＬＮ，ＴＥＲＴ，および／またはＨＢＶをコードするｍＲＮＡを阻害する他の核酸分子を容易に設計することができ，これらも本発明の範囲内であることが明らかであることを理解するであろう。
【０００８】
”阻害する”とは，標的遺伝子の活性または標的遺伝子をコードするｍＲＮＡもしくは同等のＲＮＡのレベルが，本発明の核酸分子（ｅ．ｇ．，酵素的核酸分子），アンチセンス核酸，２−５Ａアンチセンスキメラ，トリプレックスＤＮＡ，ＲＮＡ切断化学基を含有するアンチセンス核酸）の非存在下において観察されるレベルより減少することを意味する。１つの態様においては，酵素的核酸分子による阻害は，好ましくは，ｍＲＮＡ上の同じ部位に結合することができるがそのＲＮＡを切断することができない，酵素的に弱体化された核酸分子の存在下で観察されるレベルより低い。別の態様においては，酵素的核酸およびアンチセンス分子等の核酸分子による阻害は，好ましくは，例えば，スクランブル配列を有するオリゴヌクレオチドまたはミスマッチを有するオリゴヌクレオチドの存在下で観察される阻害より大きい。別の態様においては，本発明の核酸分子を用いる標的遺伝子の阻害は，核酸分子の存在下において，存在しない場合よりも大きい。本発明にしたがえば，テロメラーゼ酵素の活性またはテロメラーゼ酵素の１またはそれ以上の蛋白質サブユニットをコードするＲＮＡのレベルは，本発明の核酸の存在下で，そのような核酸の非存在下におけるレベルに対して，少なくとも１０％少ない，２０％少ない，５０％少ない，７５％少ないかまたは活性ではないかまたは全く存在しない場合，阻害されている。
【０００９】
”酵素的核酸分子”とは，特定の遺伝子標的の基質結合領域において相補性を有し，かつ標的ＲＮＡを特異的に切断する作用をする酵素的活性を有する核酸分子を意味する。すなわち，酵素的核酸分子は，分子間でＲＮＡを切断し，このことにより標的ＲＮＡ分子を不活性化することができる。このような相補性は，酵素的核酸分子が標的ＲＮＡに十分にハイブリダイズし，したがって切断が起こることを可能にする。１００％の相補性が好ましいが，５０−７５％程度の低い相補性もまた本発明において有用である。核酸は塩基，糖および／またはリン酸基で修飾されていてもよい。酵素的核酸との用語は，リボザイム，触媒的ＲＮＡ，酵素的ＲＮＡ，触媒的ＤＮＡ，アプタザイムまたはアプタマー結合リボザイム，制御可能リボザイム，触媒的オリゴヌクレオチド，ヌクレオザイム，ＤＮＡザイム，ＲＮＡ酵素，エンドリボヌクレアーゼ，エンドヌクレアーゼ，ミニザイム，リードザイム，オリゴザイムまたはＤＮＡ酵素のような句と相互交換的に使用される。これらすべての用語は酵素的活性を有する核酸分子を記述する。本出願に記載されている特定の酵素的核酸分子は本発明において限定的なものではない。当業者は，本発明の酵素的核酸分子において重要なことは，１またはそれ以上の標的核酸領域に相補的な特異的基質結合部位を有し，かつ分子に核酸切断活性を与えるヌクレオチド配列を基質結合部位内または周辺に有することであることを認識するであろう（Ｃｅｃｈ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許４，９８７，０７１，Ｃｅｃｈ　ｅｔ　ａｌ．，１９８８，ＪＡＭＡ　２６０：２０　３０３０−４）。
【００１０】
本明細書において用いる場合，”核酸分子”とは，ヌクレオチドを有する分子を意味する。核酸は，一本鎖，二本鎖または多数の鎖であることができ，修飾または非修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドまたはこれらの種々の混合物および組み合わせを含むことができる。本発明にしたがう核酸分子の例は，高分子，例えば蛋白質をコードする遺伝子である。
【００１１】
”酵素的部分”または”触媒ドメイン”とは，その酵素的核酸分子の核酸基質の切断に必須の部分／領域を意味する（例えば図１−５を参照）。
【００１２】
”基質結合アーム”または”基質結合ドメイン”とは，その基質の一部分に相補的な（即ち，塩基対を形成できる）リボザイムの部分／領域を意味する。一般に，そのような相補性は１００％であるが，所望の場合にはそれ未満でもよい。例えば，１４の内の１０程度でも塩基対を形成しうる。そのようなアームは一般に図１−５に示される。すなわち，これらのアームは，相補的塩基対形成相互作用によりリボザイムと標的ＲＮＡとを一緒にすることが意図される配列をリボザイム中に含む。本発明のリボザイムは連続または非連続的な，種々の長さの結合アームを有していてもよい。結合アームの長さは，好ましくは４ヌクレオチド以上であり標的ＲＮＡと安定に相互作用するのに十分な長さであり，特に，１２−１００ヌクレオチド；より特別には１４−２４ヌクレオチドの長さである。２つの結合アームが選択される場合，結合アームの長さは対称的（即ち，各々の結合アームは同じ長さである；例えば，５および５ヌクレオチド，６および６ヌクレオチドまたは７および７ヌクレオチド長）または非対称的（即ち，結合アームは異なった長さである；例えば，６および３ヌクレオチド；３および６ヌクレオチド長；４および５ヌクレオチド長；４および６ヌクレオチド長；４および７ヌクレオチド長など）であるように設計される。結合アームは，特定の基質に，示される基質の一部に，示される基質配列および追加の隣接する配列に，または示される配列および追加の隣接する配列に相補的であることができる。
【００１３】
”ＮＣＨ”または”イノザイム”モチーフとは，Ｌｕｄｗｉｇ　ｅｔ　ａｌ．（米国特許出願０９／４０６，６４３，１９９９年９月２７日出願，表題”ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ　ＨＡＶＩＮＧ　ＲＮＡ　ＣＬＥＡＶＩＮＧ　ＡＣＴＩＶＩＴＹ”）および国際ＰＣＴ公開ＷＯ９８／５８０５８およびＷＯ９８／５８０５７（図面を含めこれらの全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるモチーフを含む酵素的核酸分子を意味する。
【００１４】
”Ｇ−切断剤”モチーフとは，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．（国際公開９９／１６８７１；図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるモチーフを含む酵素的核酸分子を意味する。
【００１５】
”チンザイム”モチーフとは，本明細書およびＢｅｉｇｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．（国際公開９９／５５８５７；図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるモチーフを含むクラスＩＩ酵素的核酸分子を意味する。
【００１６】
”アンバーザイム”モチーフとは，本明細書およびＢｅｉｇｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．（国際公開９９／５５８５７；図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるモチーフを含むクラスＩ酵素的核酸分子を意味する。
【００１７】
”ＤＮＡｚｙｍｅ”とは，リボヌクレオチド（２’−ＯＨ）基を欠失している酵素的核酸分子を意味する。特定の態様においては，酵素的核酸分子は，２’−ＯＨ基を有する１またはそれ以上のヌクレオチドを有する，結合したリンカーまたは他の結合したまたは付随する基，成分，または鎖を含んでいてもよい。ＤＮＡｚｙｍｅは化学的に合成してもよく，または一本鎖ＤＮＡベクターまたはその同等物を用いて発現させてもよい。
【００１８】
”十分な長さ”とは，予測される条件下で意図する機能を提供するのに十分な長さの，３ヌクレオチド以上のオリゴヌクレオチドを意味する。例えば，酵素的核酸の結合アームについては，”十分な長さ”とは，結合アーム配列が，予測される結合条件下で標的部位に対して安定な結合を提供するのに十分に長いことを意味する。好ましくは，結合アームは，有用なターンオーバーを妨害するほど長くはない。
【００１９】
”安定に相互作用する”とは，オリゴヌクレオチドが標的核酸と相互作用すること（例えば，生理学的条件下で標的中の相補的なヌクレオチドと水素結合を形成することによる）を意味する。
【００２０】
ＰＴＰ−１Ｂ，ＭｅｔＡＰ−２，ＢＡＣＥ，ｐｓ−１，ｐｓ−２，ＨＥＲ２，ＰＬＮ，ＴＥＲＴ，および／またはＨＢＶと”同等の”ＲＮＡとは，ヒト，齧歯類，霊長類，ウサギ，ブタ，原生動物，真菌，植物，および他の微生物または寄生体等の種々の生物において，ＰＴＰ−１Ｂ，ＭｅｔＡＰ−２，ＢＡＣＥ，ｐｓ−１，ｐｓ−２，ＨＥＲ２，ＰＬＮ，ＴＥＲＴ，および／またはＨＢＶ蛋白質に対してホモロジー（部分的または完全）を有するか，またはＰＴＰ−１Ｂ，ＭｅｔＡＰ−２，ＢＡＣＥ，ｐｓ−１，ｐｓ−２，ＨＥＲ２，ＰＬＮ，ＴＥＲＴ，および／またはＨＢＶと類似の機能を有する蛋白質をコードする，天然に生ずるＲＮＡ分子を含むことを意味する。同等のＲＮＡ配列はまた，コーディング領域に加えて，ＨＢＶ中の５’−非翻訳領域，３’−非翻訳領域，イントロン，イントロン−エクソン接合部等の領域を含む。
【００２１】
”ホモロジー”とは，２またはそれ以上の核酸分子のヌクレオチド配列が部分的にまたは完全に同一であることを意味する。
【００２２】
”アンチセンス核酸”とは，ＲＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＰＮＡ（蛋白質核酸；Ｅｇｈｏｌｍ　ｅｌ　ａｌ．，１９９３　Ｎａｔｕｒｅ　３６５，５６６）相互作用により標的ＲＮＡに結合して，標的ＲＮＡの活性を変化させる非酵素的核酸分子を意味する（概説については，Ｓｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｃｈｅｎｇ，１９９３　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６１，１００４および米国特許５，８４９，９０２を参照）。典型的には，アンチセンス分子は，アンチセンス分子の１つの連続する配列に沿って標的配列に相補的であろう。しかし，ある態様においては，アンチセンス分子は，基質分子がループを形成するように基質に結合することができ，および／またはアンチセンス分子はアンチセンス分子がループを形成するように結合することができる。すなわち，アンチセンス分子が２つの（またはさらにそれ以上の）非連続的基質配列にに相補的であってもよく，またはアンチセンス分子の２つの（またはさらにそれ以上の）非連続的配列部分が標的配列に相補的であってもよく，その両方でもよい。現在のアンチセンス戦略の概要については，Ｓｃｈｍａｊｕｋ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，２１７８３−２１７８９，Ｄｅｌｉｈａｓ　ｅ　ｔａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ，１５，７５１−７５３，Ｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｎ．Ａ．Ｄｒｕｇ　Ｄｅｖ．，７，１５１，Ｃｒｏｏｋｅ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ　Ｒｅｖ．，１５，１２１−１５７，Ｃｒｏｏｋｅ，１９９７，Ａｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４０，１−４９を参照。さらに，アンチセンスＤＮＡを用いてＤＮＡ−ＲＮＡ相互作用によりＲＮＡをターゲティングして，このことによりデュープレックス中の標的ＲＮＡを消化するＲＮａｓｅＨを活性化してもよい。アンチセンスＤＮＡは，化学的に合成することができ，または一本鎖ＤＮＡ発現ベクターまたはその同等物を用いて発現させることができる。
【００２３】
”２−５Ａアンチセンスキメラ”とは，５’リン酸化２’−５’結合アデニル酸部分を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを意味する。これらのキメラは配列特異的様式で標的ＲＮＡに結合し，細胞性２−５Ａ依存性リボヌクレアーゼを活性化し，それは次に標的ＲＮＡを切断する（Ｔｏｒｒｅｎｃｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０，１３００）。
【００２４】
”トリプレックスＤＮＡ”とは，二本鎖ＤＮＡに配列特異的様式で結合して，三重螺旋を形成することができるオリゴヌクレオチドを意味する。そのような三重らせん構造の形成は，標的とする遺伝子の転写を阻害することが示されている（Ｄｕｖａｌ−Ｖａｌｃｎｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９，５０４）。
【００２５】
”遺伝子”とは，ＲＮＡをコードする核酸を意味する。
【００２６】
”相補性”とは，核酸が，伝統的なワトソン−クリックまたは他の非伝統的なタイプのいずれかにより，別のＲＮＡ配列と水素結合を形成することができることを意味する。本発明の核酸分子に関して，核酸分子とその標的または相補的配列との結合自由エネルギーは，核酸の関連する機能，例えば，リボザイム切断，アンチセンスまたは三重らせん阻害が進行するのに十分である。核酸分子についての結合自由エネルギーの決定は当該技術分野においてよく知られている（例えば，Ｔｕｒｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９８７，ＣＳＨ　Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ　ｐｐ．１２３−１３３；Ｆｒｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８３：９３７３−９３７７；Ｔｕｒｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５を参照。相補性のパーセンテージは，核酸分子中の，第２の核酸配列と水素結合（例えば，ワトソン−クリック塩基対形成）を形成しうる連続する残基のパーセンテージを示す（例えば，１０塩基中の５，６，７．８，９，１０塩基は，５０％，６０％，７０％，８０％，９０％，および１００％の相補性である）。”完全な相補性”とは，核酸配列の連続する残基がすべて第２の核酸配列中の同じ数の連続する残基と水素結合するであろうことを意味する。
【００２７】
現在，天然に生ずる酵素的ＲＮＡの少なくとも７つの基本的変種が知られている。それぞれは，生理学的条件下で，ＲＮＡのホスホジエステル結合をトランスで加水分解することを触媒することができる（したがって，他のＲＮＡ分子を切断しうる）。表Ｉは，これらのリボザイムのいくつかの特性をまとめたものである。一般に，酵素的核酸は，最初に標的ＲＮＡに結合することにより作用する。そのような結合は，標的ＲＮＡを切断する作用をする分子の酵素的部分に近接して保持された，酵素的核酸の標的結合部分により生ずる。すなわち，酵素的核酸は，まず標的ＲＮＡを認識し，次に相補的塩基対形成によりこれに結合し，いったん正しい部位に結合したら，酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断する。そのような標的ＲＮＡの戦略的切断は，コードされる蛋白質の合成を指示するその能力を破壊するであろう。酵素的核酸は，そのＲＮＡ標的を結合し切断した後，そのＲＮＡから離れて別の標的を探し，新たな標的に繰り返し結合して切断することができる。すなわち，１つのリボザイム分子が多くの標的ＲＮＡ分子を切断することができる。さらに，リボザイムは，高度に特異的な遺伝子発現の阻害剤であり，その阻害の特異性は，標的ＲＮＡへの結合の塩基対形成メカニズムのみならず，標的ＲＮＡ切断のメカニズムにも依存する。切断の部位の近くにおける１つのミスマッチまたは塩基置換は，リボザイムの触媒活性を完全に排除することができる。
【００２８】
ＰＴＰ−１Ｂ，ＭｅｔＡＰ−２，ＢＡＣＥ，ｐｓ−１，ｐｓ−２，ＨＥＲ２，ＰＬＮ，ＴＥＲＴ，および／またはＨＢＶ−特異的ＲＮＡ中の特定の部位を切断する酵素的核酸分子は，種々の病因の適応症を治療する新規な治療方法である。これには，例えば，ＨＢＶ感染，肝炎，肝細胞癌，腫瘍形成，肝硬変，肝不全，癌，例えば乳，卵巣，前立腺，および食道癌，腫瘍形成，網膜症，関節炎，乾癬，女性生殖，再狭窄，ある種の感染性疾病，移植拒絶および自己免疫疾患，例えば多発性硬化症，狼瘡，およびＡＩＤＳ，加齢関連疾患，例えば黄斑変性および皮膚潰瘍，アルツハイマー病，痴呆，糖尿病，肥満，および細胞または組織中におけるＰＴＰ−１Ｂ，ＭｅｔＡＰ−２，ＢＡＣＥ，ｐｓ−１，ｐｓ−２，ＨＥＲ２，ＰＬＮ，ＴＥＲＴ，および／またはＨＢＶのレベルに関連する他の任意の疾患が含まれる。
【００２９】
本明細書に記載される本発明の好ましい態様の１つにおいては，酵素的核酸分子はハンマーヘッドまたはヘアピンのモチーフで形成されるが，デルタ肝炎ウイルス，グループＩイントロン，グループＩＩイントロンまたはＲＮａｓｅＰ　ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列を伴う），Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ＶＳ　ＲＮＡ，ＤＮＡザイム，ＮＣＨ切断モチーフ，またはＧ−切断剤のモチーフで形成してもよい。そのようなハンマーヘッドモチーフの例は，Ｄｒｅｙｆｕｓ，（上掲），Ｒｏｓｓｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，ＡＩＤＳ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　８，１８３により；ヘアピンモチーフの例は，Ｈａｍｐｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，ＥＰ０３６０２５７，Ｈａｍｐｅｌ　ａｎｄ　Ｔｒｉｔｚ，１９８９　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２８，４９２９，Ｆｅｌｄｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ　８２，５３，Ｈａｓｅｌｏｆｆ　ａｎｄ　Ｇｅｒｌａｃｈ，１９８９，Ｇｅｎｅ，８２，４３，Ｈａｍｐｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９９０　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１８，２９９，Ｃｈｏｗｒｉｒａ　＆　ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，米国特許５，６３１，３５９により；デルタ肝炎ウイルスモチーフの例は，Ｐｅｒｒｏｔｔａ　ａｎｄ　Ｂｅｅｎ，１９９２　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ　３１，１６により；ＲＮａｓｅＰモチーフの例は，Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａ　ｅｔ　ａｌ．，１９８３　Ｃｅｌｌ　３５，８４９；Ｆｏｒｓｔｅｒ　ａｎｄ　Ａｌｔｍａｎ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９，７８３；Ｌｉ　ａｎｄ　Ａｌｔｍａｎ，１９９６，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２４，８３５により；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ＶＳ　ＲＮＡリボザイムモチーフの例は，Ｃｏｌｌｉｎｓ（Ｓａｖｉｌｌｅ　ａｎｄ　Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９０　Ｃｅｌｌ　６１，６８５−６９６；Ｓａｖｉｌｌｅ　ａｎｄ　Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９１　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８８，８８２６−８８３０；Ｃｏｌｌｉｎｓ　ａｎｄ　Ｏｌｉｖｅ，１９９３　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ　３２，２７９５−２７９９；Ｇｕｏ　ａｎｄ　Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９５，ＥＭＢＯ．Ｊ．１４，３６３）により；グループＩＩイントロンの例は，Ｇｒｉｆｆｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２，７６１；Ｍｉｃｈｅｌｓ　ａｎｄ　Ｐｙｌｅ，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３４，２９６５；Ｐｙｌｅ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／２２６８９により；グループＩイントロンの例は，Ｃｅｃｈ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許４，９８７，０７１により；ＤＮＡｚｙｍｅの例は，Ｕｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開ＷＯ９５／１１３０４；Ｃｈａｒｔｒａｎｄ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５，ＮＡＲ　２３，４０９２；Ｂｒｅａｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．２，６５５；Ｓａｎｔｏｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，ＰＮＡＳ　９４，４２６２により；ＮＣＨ切断モチーフの例は，Ｌｕｄｗｉｇ＆Ｓｐｒｏａｔ，国際公開ＷＯ９８／５８０５８により；およびＧ−切断剤の例は，Ｋｏｒｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２６，４１１６−４１２０，およびＥｃｋｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開ＷＯ９９／１６８７１に，それぞれ記載されている。さらに別のモチーフには，アプタザイム（Ｂｒｅａｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，ＷＯ９８／４３９９３），アンバーザイム（クラスＩモチーフ；図３；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開９９／５５８５７）およびチンザイム（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開９９／５５８５７）が含まれる。これらの文献はすべて，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用し，本発明において用いることができる。これらの特定のモチーフは本発明において限定的なものではなく，当業者は，本発明の酵素的核酸分子において重要なすべては，それが標的遺伝子のＲＮＡ領域の１またはそれ以上に相補的な特異的基質結合部位を有し，かつその基質結合部位の中または周辺に，分子にＲＮＡ切断活性を付与するヌクレオチド配列を有することであることを認識するであろう（Ｃｅｃｈ　ｅｔ　ａｌ，米国特許４，９８７，０７１）。
【００３０】
本発明の好ましい態様においては，核酸分子，例えば，アンチセンス分子，トリプレックスＤＮＡ，またはリボザイムは，１３−１００ヌクレオチドの長さであり，例えば，特定の態様においては，３５，３６，３７，または３８ヌクレオチドの長さ（例えば特定のリボザイムについて）である。特定の態様においては，核酸分子は，１５−１００，１７−１００，２０−１００，２１−１００，２３−１００，２５−１００，２７−１００，３０−１００，３２−１００，３５−１００，４０−１００，５０−１００，６０−１００，７０−１００，または８０−１００ヌクレオチドの長さである。上で特定された長さの範囲においてはその上限は１００ヌクレオチドであるが，長さの範囲の上限は，例えば，３０，４０，５０，６０，７０，または８０ヌクレオチドでありうる。すなわち，長さの範囲の任意のものについて，特定の態様についての長さの範囲は，特定された下限，および，下限より大きい上限を有する。例えば，特定の態様においては，長さの範囲は３５−５０ヌクレオチドの長さでありうる。そのような範囲の全てが明示的に含まれる。また，特定の態様においては，核酸分子は，上で特定された長さの任意の長さ，例えば２１ヌクレオチドの長さを有することができる。
【００３１】
好ましい態様においては，本発明は，所望の標的のＲＮＡに対して高い特異性を示す，核酸に基づく一群の遺伝子阻害剤を製造する方法を提供する。例えば，酵素的核酸分子は，好ましくは，本発明の１つのまたはいくつかの核酸分子により疾病または状態の特異的治療が与えられるように，ＰＴＰ−１Ｂ，ＭｅｔＡＰ２，ＢＡＣＥ，ｐｓ−１，ｐｓ−２，ＨＥＲ２，ＰＬＮ，ＴＥＲＴ，および／またはＨＢＶ蛋白質をコードする標的ＲＮＡ（特にＰＴＰ−１Ｂ，ＭｅｔＡＰ−２，ＢＡＣＥ，ｐｓ−１，ｐｓ−２，ＨＥＲ２，ＰＬＮ，ＴＥＲＴ，および／またはＨＢＶ　ＲＮＡ）の高度に保存された配列領域を標的とする。そのような核酸分子は，特定の組織または細胞標的に必要に応じて外的に輸送することができる。あるいは，核酸分子（例えば，リボザイムおよびアンチセンス）は，特定の細胞に輸送されるＤＮＡおよび／またはＲＮＡベクターから発現させることができる。
【００３２】
本明細書において用いる場合，”細胞”とは，その通常の生物学的意味において用いられ，多細胞生物全体を表さず，例えば特にヒトを表さない。細胞は，ヒトであってもよい生物中に存在することができるが，好ましくは非ヒト多細胞生物，例えば，鳥，植物および哺乳動物，例えばウシ，ヒツジ，無尾猿，有尾猿，ブタ，イヌ，およびネコに存在する。細胞は原核生物（例えば細菌細胞）または真核生物（例えば哺乳動物または植物細胞）であってもよい。
【００３３】
”ＰＴＰ−１Ｂ，ＭｅｔＡＰ−２，ＢＡＣＥ，ｐｓ−１，ｐｓ−２，ＨＥＲ２，ＰＬＮ，ＴＥＲＴ，および／またはＨＢＶ蛋白質”とは，それぞれ，ＰＴＰ−１Ｂ，ＭｅｔＡＰ−２，ＢＡＣＥ，ｐｓ−１，ｐｓ−２，ＨＥＲ２，ＰＬＮ，ＴＥＲＴ，遺伝子および／またはＨＢＶゲノムにより発現され，および／またはコードされる配列を含む，蛋白質またはその変異体蛋白質誘導体を意味する。
【００３４】
”高度に保存された配列領域”とは，標的遺伝子中の１またはそれ以上の領域のヌクレオチド配列が，１つの世代と他の世代において，または１つの生物学的システムと他の生物学的システムにおいて，有意に異ならないことを意味する。
【００３５】
酵素的核酸に基づくＰＴＰ−１Ｂ，ＭｅｔＡＰ−２，ＢＡＣＥ，ｐｓ−１，ｐｓ２，ＨＥＲ２，ＰＬＮ，ＴＥＲＴ，および／またはＨＢＶ発現の阻害剤は，疾病および状態，例えば，ＨＢＶ感染，肝炎，肝細胞癌，腫瘍形成，肝硬変，肝不全，癌，例えば乳，卵巣，前立腺，および食道癌，腫瘍形成，網膜症，関節炎，乾癬，女性生殖，再狭窄，ある種の感染性疾病，移植拒絶および自己免疫疾病，例えば多発性硬化症，狼瘡，およびＡＩＤＳ，加齢関連疾病，例えば黄斑変性および皮膚潰瘍，アルツハイマー病，痴呆，糖尿病，肥満，および細胞または組織におけるＰＴＰ−１Ｂ，ＭｅｔＡＰ−２，ＢＡＣＥ，ｐｓ−１，ｐｓ−２，ＨＥＲ２，ＰＬＮ，ＴＥＲＴ，および／またはＨＢＶのレベルに関連する他の任意の状態の予防に有用である。
【００３６】
”関連する”とは，ＰＴＰ−１Ｂ，ＭｅｔＡＰ−２，ＢＡＣＥ，ｐｓ−１，ｐｓ−２，ＨＥＲ２，ＰＬＮ，ＴＥＲＴ，および／またはＨＢＶ発現（特にＰＴＰ−１Ｂ，ＭｅｔＡＰ−２，ＢＡＣＥ，ｐｓ−１，ｐｓ−２，ＨＥＲ２，ＰＬＮ，ＴＥＲＴ，および／またはＨＢＶ遺伝子）のＲＮＡレベルの減少，したがって，それぞれの蛋白質のレベルの減少が，疾病または状態の症状をある程度軽減するであろうことを意味する。
【００３７】
本発明の核酸に基づく阻害剤は，直接加えてもよく，またはカチオン性脂質と複合体化して，リポソーム中に封入して，または他の方法により，核酸または核酸複合体を生物学的ポリマー中に組み込んでまたは組み込まずに，関連する組織にエクスビボでまたはインビボで標的細胞または組織に輸送することができる。。好ましい態様においては，酵素的核酸阻害剤は，表３−３１，３３，３４，３６−４３，５６，５８，５９，６２，６３の基質配列に相補的な配列を含む。そのような酵素的核酸分子の例はまた，表３−２９，３１，３３，３４，３７−４３，５６，５８，５９，６２，６３に示される。そのような酵素的核酸分子の例は，本質的に，これらの表に記載される配列からなる。
【００３８】
さらに別の態様においては，本発明は，表３−３１，３３，３４，３６，３７−４３，５６，５８，５９，６２，６３に示される基質配列に相補的な配列を含むアンチセンス核酸分子を特徴とする。そのような核酸分子は，表３−２９，３１，３３，３４，３７−４３，５６，５８，５９，６２，６３において酵素的核酸分子の結合アームについて示される配列を含むことができる。同様に，対応するＤＮＡ標的領域を標的とし，標的配列または特定される標的（基質）配列に相補的な配列と同等のＤＮＡを含むトリプレックス分子を提供することができる。典型的には，アンチセンス分子は，アンチセンス分子の１つの連続する配列に沿って標的配列に相補的であろう。しかし，ある態様においては，アンチセンス分子は，基質分子がループを形成するように基質に結合することができ，および／またはアンチセンス分子はアンチセンス分子がループを形成するように結合することができる。すなわち，アンチセンス分子が２つの（またはさらにそれ以上の）非連続的基質配列にに相補的であってもよく，またはアンチセンス分子の２つの（またはさらにそれ以上の）非連続的配列部分が標的配列に相補的であってもよく，その両方でもよい。
【００３９】
別の観点においては，本発明は，１またはそれ以上の本発明の核酸分子および／または発現ベクターを含む哺乳動物細胞を提供する。１またはそれ以上の核酸分子は，独立して，同じまたは異なる部位を標的とすることができる。
【００４０】
”本質的に・・・からなる”とは，本発明の活性な核酸分子，例えば酵素的核酸分子が，標的部位における切断が生ずるように，実施例に記載されるものと同等の酵素中心，もしくはコア，およびｍＲＮＡに結合することができる結合アームを含むことを意味する。そのような切断を有意に妨害しない他の配列が存在していてもよい。すなわち，コア領域は，例えば，酵素的活性を妨害しない１またはそれ以上のループまたはステム−ループ構造を含んでいてもよい。表３，４，９，１０，１３，１４，１８，１９，２４，２５，３３，３４，３７，３８，６３の配列中の”Ｘ”は，そのようなループでありうる。ハンマーヘッドリボザイムのコア配列は，ＣＵＧＡＵＧＡＧＸＣＧＡＡ（式中，Ｘは，ＧＣＣＧＵＵＡＧＧＣまたは当該技術分野において特にまたは一般に知られる他のステムＩＩ領域である）を含む。
【００４１】
本発明の別の観点においては，標的ＲＮＡ分子と相互作用し，ＰＴＰ−１Ｂ，ＭｅｔＡＰ−２，ＢＡＣＥ，ｐｓ−１，ｐｓ−２，ＨＥＲ２，ＰＬＮ，ＴＥＲＴ，および／またはＨＢＶ（特にＰＴＰ−１Ｂ，ＭｅｔＡＰ−２，ＢＡＣＥ，ｐｓ−１，ｐｓ−２，ＨＥＲ２，ＰＬＮ，ＴＥＲＴ，および／またはＨＢＶ　ＲＮＡ）活性を阻害するリボザイムまたはアンチセンス分子は，ＤＮＡまたはＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから発現される。組換えベクターは，好ましくはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。ウイルスベクターを発現するリボザイムまたはアンチセンスは，アデノ随伴ウイルス，レトロウイルス，アデノウイルスまたはアルファウイルスに基づいて構築することができるが，これらに限定されない。好ましくは，リボザイムまたはアンチセンスを発現しうる組換えベクターを上述のように輸送し，標的細胞中に残留させる。あるいは，リボザイムまたはアンチセンスの過渡的発現を与えるウイルスベクターを用いることができる。そのようなベクターは，必要に応じて繰り返し投与することができる。いったん発現されれば，リボザイムまたはアンチセンスは標的ＲＮＡに結合し，その機能または発現を阻害する。リボザイムまたはアンチセンスを発現するベクターの輸送は，全身的（例えば，静脈内または筋肉内投与により），患者から外植された標的細胞に投与した後，患者に再導入することにより，または所望の標的細胞中への導入を可能とする他のいずれかの手段により行うことができる。アンチセンスＤＮＡは，一本鎖ＤＮＡ細胞内発現ベクターを用いて発現させることができる。
【００４２】
ＲＮＡとは，少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。”リボヌクレオチド”とは，β−Ｄ−リボ−フラノース成分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。
【００４３】
”ベクター”とは，所望の核酸を輸送するために用いられる任意の核酸系および／またはウイルス系技術を意味する。
【００４４】
”患者”とは，外植した細胞のドナーまたはレシピエントである生物，または細胞それ自体を意味する。”患者”とはまた，本発明の核酸分子を投与することができる生物を表す。好ましくは，患者は哺乳動物または哺乳動物細胞である。より好ましくは，患者はヒトまたはヒト細胞である。
【００４５】
本発明の核酸分子は，個別に，または他の薬剤と組み合わせるか結合させて，上述した疾病または状態を治療するために用いることができる。例えば，ＰＴＰ−１Ｂ，ＭｅｔＡＰ−２，ＢＡＣＥ，ｐｓ−１，ｐｓ−２，ＨＥＲ２，ＰＬＮ，ＴＥＲＴ，および／またはＨＢＶに関連する疾病または状態を治療するためには，当業者には明らかなように，治療に適した条件下で，個別にまたは１またはそれ以上の薬剤と組み合わせて，患者を治療するかまたは他の適当な細胞を処理することができる。
【００４６】
さらに別の態様においては，本明細書に記載される分子，例えばアンチセンスまたはリボザイムを他の既知の治療と組み合わせて用いて，上述の状態または疾病を治療することができる。例えば，本明細書に記載される分子を１またはそれ以上の既知の治療剤と組み合わせて用いて，ＨＢＶ感染，肝炎，肝細胞癌，腫瘍形成，肝硬変，肝不全，癌，例えば乳，卵巣，前立腺，および食道癌，腫瘍形成，網膜症，関節炎，乾癬，女性生殖，再狭窄，ある種の感染性疾病，移植拒絶および自己免疫疾病，例えば多発性硬化症，狼瘡，およびＡＩＤＳ，加齢関連疾病，例えば黄斑変性および皮膚潰瘍，アルツハイマー病，痴呆，糖尿病，および／または肥満を治療することができる。
【００４７】
別の好ましい態様においては，本発明は，核酸に基づく阻害剤（例えば，酵素的核酸分子（リボザイム），アンチセンス核酸，トリプレックスＤＮＡ，ＲＮＡ切断化学基を含むアンチセンス核酸），およびこれらを用いて，ＨＢＶ感染，肝炎，肝細胞癌，腫瘍形成，肝硬変，肝不全，癌，例えば乳，卵巣，前立腺，および食道癌，腫瘍形成，網膜症，関節炎，乾癬，女性生殖，再狭窄，ある種の感染性疾病，移植拒絶および自己免疫疾病，例えば多発性硬化症，狼瘡，およびＡＩＤＳ，加齢関連疾病，例えば黄斑変性および皮膚潰瘍，アルツハイマー病，痴呆，糖尿病，および／または肥満を進行および／または維持させることができるＲＮＡ（例えば，ＰＴＰ−１Ｂ，ＭｅｔＡＰ−２，ＢＡＣＥ，ｐｓ−１，ｐｓ−２，ＨＥＲ２，ＰＬＮ，ＴＥＲＴ，および／またはＨＢＶ）の発現をダウンレギュレートまたは阻害する方法を特徴とする。
【００４８】
別の好ましい態様においては，本発明は，核酸に基づく技術（例えば，酵素的核酸分子（リボザイム），アンチセンス核酸，トリプレックスＤＮＡ，ＲＮＡ切断化学基を含むアンチセンス核酸），およびこれらを用いてＰＴＰ−１Ｂ，ＭｅｔＡＰ−２，ＢＡＣＥ，ｐｓ−１，ｐｓ−２，ＨＥＲ２，ＰＬＮ，ＴＥＲＴの発現および／またはＨＢＶのＲＮＡ発現をダウンレギュレートまたは阻害する方法を特徴とする。
【００４９】
”・・を含む”とは，”・・を含む”の単語の前にあるものを含むがそれには限定されないことを意味する。すなわち，”・・を含む”との用語の使用は，挙げられる要素が必要または強制的なものであるが，他の要素は任意であり，存在しても存在しなくてもよいことを示す。”・・からなる”とは，”・・からなる”の語句の前にあるものをすべて含みかつそれに限定されることを意味する。すなわち，”・・からなる”との語句は，挙げられる要素が必要または強制的なものであり，他の要素は存在しないことを示す。”本質的に・・からなる”とは，この語句の前に挙げられるすべての要素を含み，挙げられる要素についての開示において特定される活性または作用を妨害せずまたはそれに貢献する他の要素に限定されることを意味する。すなわち，”本質的に・・からなる”との語句は，挙げられる要素は必要または強制的なものであるが，他の要素は任意であり，それらが挙げられる要素の活性または作用に影響を及ぼすか否かによって，存在しても存在しなくてもよいことを示す。
【００５０】
本発明の他の特徴および利点は，以下の本発明の好ましい態様の説明および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【００５１】
好ましい態様の説明
まず図面を簡単に説明する。
図面：
図１は，７つの異なる種類の酵素的核酸分子の二次構造モデルを示す。矢印は切断の部位を示す。−−−−−−−−−は標的配列を示す。点が散在する線は，三次相互作用を示す。−は塩基対形成相互作用を示す。グループＩイントロン：Ｐ１−Ｐ９．０は種々のステム−ループ構造を表す（Ｃｅｃｈ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ　Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏ．，１，２７３）。ＲＮａｓｅ　Ｐ（Ｍ１ＲＮＡ）ＥＧＳは外部ガイド配列を表す（Ｆｏｒｓｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，７８３；Ｐａｃｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，３５８７）。グループＩＩイントロン：５’ＳＳは５’スプライシング部位を意味する；３’ＳＳは３’−スプライシング部位を意味する；ＩＢＳはイントロン結合部位を意味する；ＥＢＳはエクソン結合部位を意味する（Ｐｙｌｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ，３３，２７１６）。ＶＳ　ＲＮＡ：Ｉ−ＶＩは，６つのステム−ループ構造を示す；陰領域は三次相互作用を示す（Ｃｏｌｌｉｎｓ，国際公開ＷＯ９６／１９５７７）。ＨＤＶリボザイム：Ｉ−ＩＶは４つのステム−ループ構造を示す（Ｂｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許５，６２５，０４７）。ハンマーヘッドリボザイム：Ｉ−ＩＩＩは，３つのステム−ループ構造を示す；ステムＩ−ＩＩＩは，任意の長さであってもよく，対称でも非対称でもよい（Ｕｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏ．，１，５２７）。ヘアピンリボザイム：ヘリックス１，４および５は任意の長さでありうる；ヘリックス２は３−８塩基対の長さである；Ｙはピリミジンである；ヘリックス２（Ｈ２）は少なくとも４塩基対で与えられ（すなわち，ｎは１，２，３または４），ヘリックス５は任意に２塩基またはそれ以上の長さでありうる（好ましくは３−２０塩基，すなわち，ｍは１−２０またはそれ以上）。ヘリックス２およびヘリックス５は，１またはそれ以上の塩基により共有結合していてもよい（すなわち，ｒは１塩基以上）。ヘリックス１，４または５はまた，リボザイム構造を安定化するために，２塩基対またはそれ以上長くてもよく（すなわち４−２０塩基対），好ましくは蛋白質結合部位である。それぞれの例において，各ＮおよびＮ’は，独立して，任意の正常または修飾塩基であり，各ダッシュは潜在的塩基対相互作用を表す。これらのヌクレオチドは，糖，塩基またはリン酸で修飾されていてもよい。ヘリックス中では完全な塩基対形成は必要ではないが，好ましい。ヘリックス１および４は，ある程度の塩基対形成が保持される限り，任意のサイズでありうる（すなわち，ｏおよびｐは，それぞれ独立して，０から任意の数，例えば２０である）。必須塩基は，構造中に特定の塩基として示されるが，当業者は，１またはそれ以上が化学的に修飾（脱塩基，塩基，糖および／またはリン酸修飾）されていてもよく，または著しい影響なしで他の塩基で置き換えられていてもよいことを認識するであろう。ヘリックス４は，２つの別々の分子から，すなわち接続ループなしで形成してもよい。接続ループは，存在する場合，その塩基，糖またはリン酸に修飾を有するかまたは有しないリボヌクレオチドでありうる。ｑは２塩基以上である。接続ループはまた，非ヌクレオチドリンカー分子で置き換えられていてもよい。Ｈは塩基Ａ，Ｕ，またはＣを表す。Ｙはピリミジン塩基を表す。”＿＿”は，共有結合を表す（Ｂｕｒｋｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ＆Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１０，１２９；Ｃｈｏｗｒｉｒａ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許５，６３１，３５９）。
【００５２】
図２は，化学的に安定化されたリボザイムモチーフの例を示す。ＨＨ　Ｒｚはハンマーヘッドリボザイムモチーフを表す（Ｕｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏ．，１，５２７）；ＮＣＨ　ＲｚはＮＣＨリボザイムモチーフを表す（本明細書およびＬｕｄｗｉｇ＆Ｓｐｒｏａｔ，国際公開９８／５８０５８に記載される）；Ｇ−切断剤はＧ切断剤リボザイムモチーフを表す（Ｋｏｒｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６，４１１６−４１２０）。Ｎまたはｎは，独立して，ヌクレオチドを表し，これらは同じでも異なっていてもよく，互い相補性を有していてもよい；ｒＩはリボ−イノシンヌクレオチドを表す；矢印は標的中の切断の部位を表す。ＨＨ　ＲｚおよびＮＣＨ　Ｒｚの位置４は，２’−Ｃ−アリル修飾を有するものとして示されているが，当業者は，修飾がリボザイムの活性を有意に阻害しない限り，この位置を当該技術分野においてよく知られる他の修飾で修飾することができることを認識するであろう。
【００５３】
図３は，化学的に安定化されたアンバーザイムリボザイムモチーフ（例えば，Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開９９／５５８５７を参照；クラスＩモチーフとも称される）の例を示す。アンバーザイムモチーフは，活性にリボヌクレオチド（２’−ＯＨ）基の存在を必要としない一群の酵素的核酸分子である。
【００５４】
図４は，化学的に安定化されたチンザイムＡリボザイムモチーフ（例えば，国際公開９９／５５８５７を参照；クラスＡモチーフとも称される）の例を示す。チンザイムモチーフは，活性にリボヌクレオチド（２’−ＯＨ）基の存在を必要としない一群の酵素的核酸分子である。
【００５５】
図５は，Ｓａｎｔｏｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，ＰＮＡＳ，９４，４２６２により記載されるＤＮＡｚｙｍｅモチーフの例を示す。
【００５６】
図６は，当該技術分野において知られるハンマーヘッドリボザイムモチーフおよびＮＣＨモチーフの概略図である。ステムＩＩは２塩基対以上の長さ，好ましくは，２，３，４，５，６，７，８，および１０塩基対の長さでありうる。各ＮおよびＮ’は，独立して，任意の塩基または本明細書に記載される非ヌクレオチドであり；Ｘは，アデノシン，シチジンまたはウリジンであり；ステムＩ−ＩＩＩは３つのステム−ループ構造を示すことを意味し；ステムＩ−ＩＩＩは任意の長さであることができ，対称でも非対称でもよい（Ｕｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏ．，１，５２７）；矢印は標的ＲＮＡ中の切断の部位を示し；Ｒｚはリボザイムを表し；ループＩＩは存在してもしなくてもよい。ループＩＩが存在する場合，これは３ヌクレオチド以上であり，好ましくは４ヌクレオチドである。ループＩＩ配列は好ましくは５’−ＧＡＡＡ−３’または５’−ＧＵＵＡ−３’である。
【００５７】
図７は，化学的に安定化されたリボザイムモチーフの例を示す。ＨＨ　Ｒｚはハンマーヘッドリボザイムモチーフを表す（Ｕｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏ．，１，５２７）；ＮＣＨ−イノシンＲｚは１５．１位置においてリボイノシンを有するＮＣＨリボザイムモチーフを表す；ＮＣＨ−キシロＲｚは位置１５．１においてキシロイノシンを有するＮＣＨリボザイムを表す。Ｎまたはｎは，独立してヌクレオチドであり，これは同じでも異なって胃もよく，互いに相補性を有していてもよい；ｒＩはリボ−イノシンヌクレオチドを表す；ｘＩはキシロイノシンを表す；矢印は標的中の切断の部位を表す。ＨＨ　ＲｚおよびＮＣＨ　Ｒｚの位置４は２’−Ｃ−アリル修飾を有するものとして示されているが，当業者は，修飾がリボザイムの活性を有意に阻害しない限り，この位置は当該技術分野においてよく知られる他の修飾で修飾されていてもよいことを認識するであろう。
【００５８】
図８は，ＨＥＲ２／ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２遺伝子を標的とするＮＣＨおよびＨＨリボザイムにより媒介される細胞増殖の阻害を示すデータをグラフ表示したものである。未処理は，リボザイムで処理していない細胞を表す；ＨＨ　ＲＺは，ハンマーヘッドリボザイムを表す；ＮＣＸ　ＲＺは本発明のＮＣＨリボザイムを表す；ＩＡは対照として用いた触媒的に不活性なまたは減弱化リボザイムを表す。
【００５９】
図９は，ベータ−Ｄ−キシロフラノシルヒポキサンチン３’−ホスホルアミダイトの合成方法の概略図である。
【００６０】
図１０は，ヌクレオシド基質を用いるＮＴＰ合成の概略図を示す。
【００６１】
図１１は，インビトロ選択方法のスキームを示す。ランダムコア領域および規定配列を有する１またはそれ以上の領域を有する核酸分子のプールを生成する。これらの核酸分子を，規定配列を有する固定化オリゴヌクレオチドを含むカラムに結合させる。ここで，規定配列はプール中の核酸分子の規定された配列の領域に相補的である。カラム中の固定化オリゴヌクレオチド（標的）を切断しうる核酸分子を単離し，相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換し，次にＮＴＰを用いて転写して新たな核酸プールを形成する。
【００６２】
図１２は，２カラムインビトロ選択方法のスキームを示す。ランダムコアおよび規定配列の２つのフランキング領域（領域Ａおよび領域Ｂ）を有する核酸分子のプールを生成する。プールを，それぞれプール中の核酸分子の領域ＡおよびＢに相補的な領域Ａ’およびＢ’を有する固定化されたオリゴヌクレオチドを有するカラムに通す。カラムを，固定化オリゴヌクレオチド標的の切断を促進するのに十分な条件にする。標的を切断するプール中の分子（活性な分子）は，そのＡ領域に結合する標的のＡ’領域を有し，Ｂ領域はフリーである。カラムを洗浄して，結合した標的のＡ’領域を有する活性な分子を単離する。この活性な分子のプールはまた，標的を切断する活性を有しないがカラムから解離したある種の分子（不活性分子）を含むかもしれない。夾雑する不活性な分子を活性な分子から分離するため，プールをＡ’配列を有するがＢ’配列を有しない固定化オリゴヌクレオチドを含む第２のカラム（カラム２）に通す。不活性な分子はカラム２に結合するであろうが，活性な分子はそのＡ領域がカラム１からの標的オリゴヌクレオチドのＡ’領域によって占められているためカラム２に結合しないであろう。カラム２を洗浄して活性な分子を単離し，図１１に示されるスキームに記載されるようにさらに加工する。
【００６３】
図１３は，本明細書において記載されるインビトロ方法を用いて同定された新規な４８ヌクレオチドの酵素的核酸モチーフの図解である。示される分子は例示にすぎない。５’および３’−末端ヌクレオチド（５’および３’末端の１つの末端ヌクレオチドではなく基質結合アームのヌクレオチドを指す）は，これらの部分が標的基質配列と塩基対形成する限り，様々でありうる。さらに，基質の切断部位に示されるグアノシン（Ｇ）は，その変更が酵素的核酸分子が標的配列を切断する能力を排除しない限り，他のヌクレオチドに変更することができる。核酸分子中および／または基質配列中における置換は，例えば，本明細書に記載されるように，容易に試験することができる。
【００６４】
図１４は，クラスＩ酵素的核酸分子モチーフの有効性を示すために用いられたＨＣＶルシフェラーゼアッセイの概略図である。
【００６５】
図１５は，ＨＣＶ　ＲＮＡの部位１４６を標的とする酵素的核酸分子の用量曲線を示すグラフである。
【００６６】
図１６は，ＨＣＶ　ＲＮＡ中の４つの部位を標的とする酵素的核酸分子が細胞においてＲＮＡレベルを減少させることができることを示す棒グラフである。
【００６７】
図１７は，特性決定されたクラスＩＩ酵素的核酸モチーフの二次構造および切断速度を示す。
【００６８】
図１８は，本明細書に記載されるインビトロ方法を用いて同定された新規な３５ヌクレオチドの酵素的核酸モチーフの図解である。示される分子は例示にすぎない。５’および３’−末端ヌクレオチド（５’および３’末端の１つの末端ヌクレオチドではなく基質結合アームのヌクレオチドを指す）は，これらの部分が標的基質配列と塩基対形成する限り，様々でありうる。さらに，基質の切断部位に示されるグアノシン（Ｇ）は，その変更が酵素的核酸分子が標的配列を切断する能力を排除しない限り，他のヌクレオチドに変更することができる。核酸分子中および／または基質配列中における置換は，例えば，本明細書に記載されるように，容易に試験することができる。
【００６９】
図１９は，クラスＩＩ（チンザイム）リボザイムの基質特異性を示す棒グラフである。
【００７０】
図２０は，細胞増殖スクリーニングにおける，ＨＥＲ２　ＲＮＡ中の１０個の代表的な部位を標的とするクラスＩＩ酵素的核酸分子を示す棒グラフである。
【００７１】
図２１は，５−［３アミノプロピニル（プロピル）］ウリジン５’−三リン酸および４−イミダゾール酢酸コンジュゲートの合成の概略を示す合成スキームである。
【００７２】
図２２は，５−［３−（Ｎ−４−イミダゾールアセチル）アミノプロピニル（プロピル）］ウリジン５’−三リン酸の合成の概略を示す合成スキームである。
【００７３】
図２３は，カルボキシレートテザー付きウリジン５’−三リン酸の合成の概略を示す合成スキームである。
【００７４】
図２４は，５−（３−アミノアルキル）および５−［３−（Ｎ−スクシニル）アミノプロピル］官能化シチジンの合成の概略を示す合成スキームである。
【００７５】
図２５は，クラスＩリボザイムのステム切断型およびループ置換分析の図解である。
【００７６】
図２６は，切断型ステムおよび／またはループ構造において用いられる非ヌクレオチドリンカーを有するクラスＩリボザイムの図解である。
【００７７】
図２７は，”リボなし”クラスＩＩリボザイムの図解である。
【００７８】
図２８は，クラスＩＩリボザイムを用いる種々の二価金属の濃度における切断反応を示すグラフである。
【００７９】
図２９は，種々のリボ含量を有する様々なクラスＩＩリボザイムおよびこれらの触媒作用の相対速度の図解である。
【００８０】
図３０は，ＳＫＢＲ３乳癌腫細胞におけるＨＥＲ２　ＲＮＡのクラスＩＩリボザイム（チンザイム）媒介性減少を示すグラフである。２．５μｇ／ｍｌの脂質とともに複合体化したＨＥＲ２　ＲＮＡの部位９７２を標的とする１００ｎｍ，および２００ｎｍのチンザイム（ＲＰＩ１８６５６）および対応するスクランブル化減弱対照で細胞を処理した。処置の２４時間後に活性なチンザイムおよびスクランブル化減弱対照を未処理細胞と比較した。
【００８１】
図３１は，ＳＫＢＲ３乳癌腫細胞におけるクラスＩＩリボザイム（チンザイム）に媒介される用量応答抗増殖アッセイを示すグラフである。２．０μｇ／ｍｌの脂質とともに複合体化したＨＥＲ２　ＲＮＡの部位９７２を標的とする１００ｎｍ，および２００ｎｍのチンザイム（ＲＰＩ１８６５６）および対応するスクランブル化減弱対照で細胞を処理した。処置の２４時間後に活性なチンザイムおよびスクランブル化減弱対照を未処理細胞と比較した。
【００８２】
図３２は，０−１００ｎＭのＲＰＩ１９２９３および５．０μｇ／ｍｌのカチオン性脂質で処理したＳＫＯＶ−３細胞におけるＨＥＲ２　ＲＮＡの用量依存的減少を示すグラフである。
【００８３】
図３３は，０−４００ｎＭのＲＰＩ１９２９３および５．０μｇ／ｍｌのカチオン性脂質で処理したＳＫＢＲ−３細胞におけるＨＥＲ２　ＲＮＡの用量依存的減少および細胞増殖の阻害を示すグラフである。
【００８４】
図３４は，クラスＩＩ（チンザイム）モチーフ中でリボＧを２’−Ｏ−メチル５’−ＣＡ−３’で置換する非限定的例を示す。図の目的のために示される代表的なモチーフは，”７リボ”チンザイムモチーフであるが，クラスＩＩ（チンザイム）モチーフの図２５に示される位置におけるＧとＣＡの互換性は，２−Ｏ−メチルとリボ残基との任意の組み合わせに拡張される。例えば，２’−Ｏ−メチルＧを２’−Ｏ−メチル５’−ＣＡ−３’で置き換えることができ，その逆も可能である。
【００８５】
図３５は，ＨＥＲ２　ＲＮＡの部位９７２を標的とする，リボ−Ｇの減少を含むクラスＩＩリボザイム（チンザイム）（ＲＰＩ１９７２７＝リボなし，ＲＰＩ１９７２８＝１リボ，ＲＰＩ１９２９３＝２リボ，ＲＰＩ１９７２９＝３リボ，ＲＰＩ１９７３０＝４リボ，１９７３１＝５リボ，およびＲＰＩ１９２９２＝７リボ）の，ＳＫＢＲ３細胞における抗増殖活性についてのスクリーニングを示すグラフである。
【００８６】
図３６は，ＮＣＨリボザイムモチーフの種々のヌクレオシド類似体の活性を試験した官能基修飾実験の結果をまとめたものである。Ｋｒｅｌ値は，位置１５．１における所定の置換基の，位置１５．１（Ｉ−１５．１）におけるイノシンに対する切断の値を記述する。
【００８７】
図３７は，ＮＵＨ切断リボザイムの状況においてＡ１５．１残基において行った官能基修飾実験の報告をまとめたものである。Ｋｒｅｌ値は，位置１５．１における所定の置換基の，位置１５．１（Ａ−１５．１）におけるアデノシンに対する切断の値を記述する。
【００８８】
本発明の核酸分子の作用のメカニズム
アンチセンス：アンチセンス分子は，修飾されたまたは修飾されていないＲＮＡ，ＤＮＡ，または混合ポリマーのオリゴヌクレオチドであることができ，主として，マッチする配列に特異的に結合することにより機能し，ペプチド合成を阻害する（Ｗｕ−Ｐｏｎｇ，Ｎｏｖ　１９９４，Ｂｉｏ　Ｐｈａｒｍ，２０−３３）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは，標的ＲＮＡにワトソンクリック塩基対形成により結合し，立体的障害によりまたはＲＮａｓｅＨ酵素を活性化することにより結合した配列のリボソーム翻訳を防止することにより遺伝子発現を妨害する。アンチセンス分子はまた，ＲＮＡのプロセシングまたは核から細胞質への輸送を妨害することにより蛋白質合成を変化させることができる（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ＆Ｒｏｔｈ，１９９６，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．ｉｎ　Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ　７，１５１−１９０）。
【００８９】
さらに，一本鎖ＤＮＡのＲＮＡへの結合により，ヘテロデュープレックスがヌクレアーゼ分解される（Ｗｕ−Ｐｏｎｇ，（上掲），Ｃｒｏｏｋｅ，（上掲））。これまでのところ，ＲＮａｓｅＨの基質として作用する，主鎖を化学的に修飾したＤＮＡは，ホスホロチオエート，ホスホロジチオエートおよびボロントリフルオリデートのみである。最近，２’−アラビノおよび２’−フルオロアラビノ含有オリゴもまたＲＮａｓｅＨ活性を活性化することが報告された。
【００９０】
化学的に修飾されたヌクレオチドの新規なコンフィギュレーション，二次構造，および／またはＲＮａｓｅＨ基質ドメインを利用する多数のアンチセンス分子が記載されている（Ｗｏｏｌｆ　ｅｔ　ａ　ｌ；国際公開ＷＯ９８／１３５２６；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開９９／５４４５９；Ｈａｒｔｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開００／１７３４６）（これらはその全体を本明細書の一部としてここに引用する）。
【００９１】
アンチセンスＤＮＡを用いて，ＤＮＡ−ＲＮＡ相互作用によりＲＮＡを標的化して，このことによりデュープレックス中の標的ＲＮＡを消化するＲＮａｓｅＨを活性化することができる。アンチセンスＤＮＡは，化学的に合成することができ，または一本鎖ＤＮＡの細胞内発現ベクターまたはその同等物を用いて発現させることができる。
【００９２】
トリプレックス形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）：配列特異的様式でゲノムＤＮＡに結合するように一本鎖ＤＮＡを設計することができる。ＴＦＯは，フーグスティーン塩基対形成を介してＤＮＡらせんに結合するピリミジンリッチオリゴヌクレオチドから構成される（Ｗｕ−Ｐｏｎｇ，（上掲））。得られるＤＮＡセンス，ＤＮＡアンチセンス，およびＴＦＯからなる三重らせんは，ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成を破壊する。結合が不可逆的であるため，ＴＦＯメカニズムにより遺伝子発現または細胞死が生ずることができる（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ＆Ｒｏｔｈ，（上掲））。
【００９３】
２’−５’オリゴアデニル酸：２−５Ａシステムは，高等脊椎動物に見いだされるＲＮＡ分解のインターフェロン媒介性メカニズムである（Ｍｉｔｒａ　ｅｔ　ａｌ；１９９６，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９３，６７８０−６７８５）。ＲＮＡ切断には，２種類の酵素，すなわち，２−５ＡシンセターゼおよびＲＮａｓｅＬが必要である。２−５Ａシンセターゼは，二本鎖ＲＮＡが２’−５’オリゴアデニル酸（２−５Ａ）を形成することを必要とする。次に，２−５Ａは，一本鎖ＲＮＡを切断する能力を有するＲＮａｓｅＬを利用するためのアロステリックエフェクターとして作用する。二本鎖ＲＮＡとともに２−５Ａ構造を形成する能力のため，このシステムはウイルス複製の阻害に特に有用である。
【００９４】
（２’−５’）オリゴアデニル酸構造は，アンチセンス分子に共有結合で結合して，ＲＮＡ切断が可能なキメラオリゴヌクレオチドを形成することができる（Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，（上掲））。これらの分子は，おそらくは，２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅに結合してこれを活性化し，次にオリゴヌクレオチド／酵素複合体が標的ＲＮＡ分子に結合し，これは次にＲＮａｓｅ酵素により切断されることができる。２’−５’オリゴアデニル酸構造の共有結合は，アンチセンス用途に限定されず，本発明の核酸分子への結合を含むようさらに作り上げることができる。
【００９５】
酵素的核酸：現在，天然に生ずる酵素的ＲＮＡの７つの基本的変種が知られている。さらに，いくつかのインビトロ選択（進化）戦略（Ｏｒｇｅｌ，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ，Ｂ２０５，４３５）を用いて，ホスホジエステル結合の切断およびライゲーションを触媒しうる新たな核酸触媒が発展してきた（Ｊｏｙｃｅ，１９８９，Ｇｅｎｅ，８２，８３−８７；Ｂｅａｕｄｒｙ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５７，６３５−６４１；Ｊｏｙｃｅ，１９９２，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　２６７，９０−９７；Ｂｒｅａｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４，ＴＩＢＴＥＣＨ　１２，２６８；Ｂａｒｔｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６１：１４１１−１４１８；Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９３，ＴＩＢＳ　１７，８９−９３；Ｋｕｍａｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５，ＦＡＳＥＢ　Ｊ．，９，１１８３；Ｂｒｅａｋｅｒ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７，４４２；Ｓａｎｔｏｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４，４２６２；Ｔａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，ＲＮＡ　３，９１４；Ｎａｋａｍａｙｅ＆Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９４，（上掲）；Ｌｏｎｇ＆Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９９４，（上掲）；Ｉｓｈｉｚａｋａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５，（上掲）；Ｖａｉｓｈ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ　３６，６４９５；（これらのすべてを本明細書の一部としてここに引用する）。それぞれは，生理学的条件下で，ホスホジエステル結合をトランスで加水分解することを含む一連の反応を触媒することができる（したがって，他のＲＮＡ分子を切断しうる）。
【００９６】
一般に，酵素的核酸は，最初に標的ＲＮＡに結合することにより作用する。そのような結合は，標的ＲＮＡを切断する作用をする分子の酵素的部分に近接して保持された，酵素的核酸の標的結合部分により生ずる。すなわち，酵素的核酸は，まず標的ＲＮＡを認識し，次に相補的塩基対形成によりこれに結合し，いったん正しい部位に結合したら，酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断する。そのような標的ＲＮＡの戦略的切断は，コードされる蛋白質の合成を指示するその能力を破壊するであろう。酵素的核酸は，そのＲＮＡ標的を結合し切断した後，そのＲＮＡから離れて別の標的を探し，新たな標的に繰り返し結合して切断することができる。
【００９７】
本発明の核酸分子は，ＰＴＰ−１Ｂ，ＭｅｔＡＰ−２，ＢＡＣＥ，ｐｓ−１，ｐｓ−２，ＨＥＲ２，ＰＬＮ，ＴＥＲＴ，および／またはＨＢＶ蛋白質発現をある程度妨害し，ＰＴＰ−１Ｂ，ＭｅｔＡＰ−２，ＢＡＣＥ，ｐｓ−１，ｐｓ−２，ＨＥＲ２，ＰＬＮ，ＴＥＲＴ，および／またはＨＢＶのレベルに関連する疾病の治療または疾病の診断に用いることができる。
【００９８】
リボザイムの酵素的性質は，治療を行うのに必要なリボザイムの濃度がより低い等の著しい利点を有する。この利点は，リボザイムが酵素的に作用する能力を反映している。すなわち，１つのリボザイム分子が多くの標的ＲＮＡ分子を切断することができる。さらに，リボザイムは，高度に特異的な阻害剤であり，その阻害の特異性は，標的ＲＮＡへの結合の塩基対形成メカニズムのみならず，標的ＲＮＡ切断のメカニズムにも依存する。切断の部位の近くにおける１つのミスマッチまたは塩基置換を選択して，リボザイムの触媒活性を完全に排除することができる。
【００９９】
エンドヌクレアーゼ酵素活性を有する核酸分子は，ヌクレオチド塩基配列に特異的な様式で他の別のＲＮＡ分子を繰り返し切断することができる。そのような酵素的核酸分子は，事実上すべてのＲＮＡ転写産物を標的とすることができ，インビトロで有効な切断を達成することができる（Ｚａｕｇ　ｅｔ　ａｌ．，３２４，Ｎａｔｕｒｅ　４２９　１９８６；Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９８７　Ｎａｔｕｒｅ　３２８，５９６；Ｋｉｍ　ｅｔ　ａｌ．，８４　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８７８８，１９８７；Ｄｒｅｙｆｕｓ，１９８８，Ｅｉｎｓｔｅｉｎ　Ｑｕａｒｔ．Ｊ．Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．，６，９２；Ｈａｓｅｌｏｆｆ　ａｎｄ　Ｇｅｒｌａｃｈ，３３４　Ｎａｔｕｒｅ　５８５，１９８８；Ｃｅｃｈ，２６０　ＪＡＭＡ　３０３０，１９８８；Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，１７　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１３７１，１９８９；Ｓａｎｔｏｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７（上掲））。
【０１００】
その配列特異性のため，トランス切断リボザイムは，ヒトの疾患の治療剤として有望である（Ｕｓｍａｎ＆ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，１９９５　Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０，２８５−２９４；Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ　ａｎｄ　Ｍａｒｒ，１９９５　Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８，２０２３−２０３７）。リボザイムは，細胞性ＲＮＡのバックグラウンド中で特定のＲＮＡ標的を切断するよう設計することができる。そのような切断事象は，ＲＮＡを非機能性にし，そのＲＮＡからの蛋白質発現を排除する。このようにして，疾患状態に関連する蛋白質の合成が選択的に阻害される（Ｗａｒａｓｈｉｎａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ．６，２３７−２５０）。
【０１０１】
本発明の核酸分子は，ＧｅｎｅＢｌｏｃ（登録商標）試薬とも称され，これは本質的に，遺伝子発現をダウンレギュレートしうる核酸分子（例えば，リボザイム，アンチセンス）である。
【０１０２】
標的部位
有用なリボザイムおよびアンチセンス核酸の標的は，Ｄｒａｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，ＷＯ９３／２３５６９；Ｓｕｌｌｉｖａｎ　ｅｔ　ａｌ．，ＷＯ９３／２３０５７；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，ＷＯ９４／０２５９５；Ｄｒａｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，ＷＯ９５／０４８１８；ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許５，５２５，４６８（すべて本明細書の一部としてここに引用する）に開示されるように決定することができる。他の例には，以下のＰＣＴ出願が含まれ，これらは疾病に関連する遺伝子の発現の不活性化に関連する：ＷＯ９５／２３２２５，ＷＯ９５／１３３８０，ＷＯ９４／０２５９５（すべて本明細書の一部としてここに引用する）。ここでは，これらの文献に提供される指針を繰り返さずに，以下にそのような方法の特定の例を提供するが，これらは限定ではない。そのような標的に対するリボザイムおよびアンチセンスは，これらの出願に記載のように設計し，合成して，やはり記載されるようにインビトロおよびインビボで試験する。ヒトＰＴＰ−１Ｂ，ＭｅｔＡＰ−２，ＢＡＣＥ，ｐｓ−１，ｐｓ−２，ＨＥＲ２，ＰＬＮ，ＴＥＲＴ，および／またはＨＢＶ　ＲＮＡの配列（例えば，ＧｅｎＢａｎｋ受託番号（ＰＴＰ−１Ｂ，ＮＭ＿００２８２７），（ＭｅｔＡＰ−２，Ｕ２９６０７），（ＢＡＣＥ，ＡＦ１９０７２５），（ｐｓ−１，Ｌ７６５１７），（ｐｓ−２，Ｌ４３９６４），（ＨＥＲ２／ｃ−ｅｒｂ２／ｎｅｕ，Ｘ０３３６３），（ＰＬＮ，ＮＭ＿００２６６７），（ＴＥＲＴ，ＮＭ＿００３２１９）および（ＨＢＶ，ＡＦ１００３０８．１，ＨＢＶ２−１８株；さらに当業者は他のＨＢＶ株をスクリーニングすることができる。他の可能な株については表３５を参照）を，コンピュータ折り畳みアルゴリズムを用いて，最適な酵素的核酸およびアンチセンス標的部位についてスクリーニングした。アンチセンス，ハンマーヘッド，ＤＮＡｚｙｍｅ，ＮＣＨ（イノザイム），アンバーザイム，チンザイムまたはＧ−切断剤リボザイムの結合／切断部位を同定した。これらの部位は表３−３１，３３，３４，３７−４３，５６，５８，５９，６２，６３に示される（表中，すべての配列は５’から３’方向である；Ｘは任意の塩基対形成配列でありうる，実際の配列はここでは重要ではない）。表中，ヌクレオチド塩基の位置は，示される種類の酵素的核酸分子により切断されるべき部位として示される。表３６は，Ｒｅｎｂｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉ．Ｓｉｎ．，３０，５０７から選択され，Ｄｒａｐｅｒ，米国特許６，０１７，７５６，”ＭＥＴＨＯＤ　ＡＮＤ　ＲＥＡＧＥＮＴＳＦ　ＯＲ　ＩＮＨＩＢＩＴＩＮＧ　ＨＥＰＡＴＩＴＩＳ　Ｂ　ＶＩＲＵＳ　ＲＥＰＬＩＣＡＴＩＯＮ”およびＤｒａｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開９３／２３５６９，１９９３年４月２９日出願，”ＭＥＴＨＯＤ　ＡＮＤ　ＲＥＡＧＥＮＴＳ　ＦＯＲ　ＩＮＨＩＢＩＴＩＮＧ　ＶＩＲＡＬ　ＲＥＰＬＩＣＡＴＩＯＮ”において用いられた基質位置を示す。ヒト配列をスクリーニングし，その後に酵素的核酸分子および／またはアンチセンスを設計することができるが，Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ　ｅｔ　ａｌ．，ＷＯ９５／２３２２５に議論されているように，マウスを標的とするリボザイムも，ヒトで試験する前に酵素的核酸分子および／またはアンチセンスの作用の有効性を試験するのに有用であろう。
【０１０３】
アンチセンス，ハンマーヘッド，ＤＮＡｚｙｍｅ，ＮＣＨ（イノザイム），アンバーザイム，チンザイムまたはＧ切断剤リボザイムの結合／切断部位は，上述したように同定した。核酸分子はコンピュータ折り畳みにより個々に分析して（Ｊａｅｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，７７０６），配列が適切な二次構造に折り畳まれるか否かを評価した。例えば結合アームと触媒コアとの間に望ましくない分子内相互作用を有する核酸分子は考慮から除外した。結合アームの長さを変化させて最適活性を選択することができる。
【０１０４】
アンチセンス，ハンマーヘッド，ＤＮＡｚｙｍｅ，ＮＣＨ，アンバーザイム，チンザイムまたはＧ−切断剤リボザイムの結合／切断部位を同定し，ＲＮＡ標的中の種々の部位にアニーリングするよう設計した。結合アームは，上述の標的部位配列に相補的である。核酸分子は化学的に合成した。用いた合成方法は，以下に，およびＵｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９８７Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５；Ｓｃａｒｉｎｇｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９０　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１８，５４３３；Ｗｉｎｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４；ａｎｄＣａｒｕｔｈｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　２１１，３−１９に記載される通常のＤＮＡ／ＲＮＡ合成の方法にしたがう。
【０１０５】
核酸分子の合成
１００ヌクレオチドを越える長さの核酸の合成は，自動化方法を用いては困難であり，そのような分子の治療的コストは非常に高くなる。本発明においては，好ましくは，小さい核酸モチーフ（”小さい”とは，１００ヌクレオチド以下の長さ，好ましくは８０ヌクレオチド以下の長さ，最も好ましくは５０ヌクレオチド以下の長さの核酸モチーフ，例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド，ハンマーヘッドまたはＮＣＨリボザイムを表す）が外的輸送に用いられる。これらの分子は構造が簡単であるため，核酸がＲＮＡ構造の標的領域に進入する能力が高い。本発明の例示的分子は化学的に合成したが，他の分子も同様に合成することができる。
【０１０６】
オリゴヌクレオチド（例えば，アンチセンスＧｅｎｅＢｌｏｃｓ）は，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　２１１，３−１９，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開９９／５４４５９，Ｗｉｎｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４，Ｗｉｎｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９，Ｂｒｅｎｎａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｅｎｇ．，６１，３３−４５，およびＢｒｅｎｎａｎ，米国特許６，００１，３１１に記載されるような，当該技術分野において知られるプロトコルを用いて合成する。これらの文献はすべて本明細書の一部としてここに引用する。オリゴヌクレオチドの合成には，一般の核酸保護基およびカップリング基，例えば５’−末端にジメトキシトリチル，および３’−末端にホスホルアミダイトを用いる。非限定的例においては，３９４　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成器で，０．２μｍｏｌスケールのプロトコルで，２’−Ｏメチル化ヌクレオチドについては２．５分間のカップリング工程，および２’−デオキシヌクレオチドについては４５秒間のカップリング工程で，小スケールの合成を行う。表ＩＩは，合成サイクルで用いる試薬の量および接触時間の概要を示す。あるいは，０．２μｍｏｌスケールでの合成は，９６ウエルプレート合成機，例えば，Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）により製造される装置で，サイクルに最少の改変を加えて行うことができる。２’−Ｏ−メチル残基の各カップリングサイクルにおいて，ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して３３倍過剰（６０μＬの０．１１Ｍ＝６．６μｍｏｌ）の２’−Ｏ−メチルホスホルアミダイトおよび１０５倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（６０μＬの０．２５Ｍ＝１５μｍｏｌ）を用いることができる。デオキシ残基の各カップリングサイクルにおいて，ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して２２倍過剰（４０μＬの０．１１Ｍ＝４．４μｍｏｌ）のデオキシホスホルアミダイトおよび７０倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（４０μＬの０．２５Ｍ＝１０μｍｏｌ）を用いることができる。３９４Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機における平均カップリング収率は，トリチル画分の比色定量により決定して，典型的には９７．５−９９％である。３９４Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成器で用いる他のオリゴヌクレオチド合成試薬は以下のとおりである：脱トリチル化溶液は塩化メチレン中３％ＴＣＡ（ＡＢＩ）であり；キャッピングは，ＴＨＦ中１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）およびＴＨＦ中１０％無水酢酸／１０％２，６−ルチジン（ＡＢＩ）中で行い；酸化溶液は，１６．９ｍＭ　Ｉ２，４９ｍＭピリジン，ＴＨＦ中９％水（ＰＥＲＳＥＰＴＩＶＥ（登録商標））である。Ｂｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎ合成等級アセトニトリルは，試薬瓶から直接用いる。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（アセトニトリル中０．２５Ｍ）は，Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．から入手し���固体から作成する。あるいは，ホスホロチオエート結合の導入のために，Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬（３Ｈ１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド，アセトニトリル中０．０５Ｍ）を用いる。
【０１０７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの脱保護は以下のように行う：ポリマー結合トリチルオンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬのガラスねじ蓋バイアルに移し，４０％水性メチルアミン（１ｍＬ）の溶液中で６５℃で１０分間懸濁した。−２０℃に冷却した後，上清をポリマー支持体から除去した。支持体を１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ／３：１：１で３回洗浄し，ボルテックスし，次に上清を最初の上清に加えた。オリゴリボヌクレオチドを含む合わせた上清を乾燥して，白色粉末を得る。
【０１０８】
ある種の酵素的核酸分子を含む通常のＲＮＡについて用いられる合成方法は，Ｕｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９８７　Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５；Ｓｃａｒｉｎｇｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９０　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１８，５４３３；Ｗｉｎｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４；Ｗｉｎｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９；に記載の方法にしたがい，慣用の核酸保護基およびカップリング基，例えば，５’末端にジメトキシトリチル，および３’末端にホスホルアミダイトを用いる。非限定的例においては，小スケールの合成は，３９４　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機で，改変した０．２μｍｏｌスケールのプロトコルを用いて，アルキルシリル保護ヌクレオチドについては７．５分間のカップリング工程を，２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドについては２．５分間のカップリング工程を行った。表ＩＩは，合成サイクルにおいて用いた試薬の量および接触時間の概要を示す。あるいは，０．２μｍｏｌスケールでの合成は，９６ウエルプレート合成機，例えば，Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）により製造される装置で，サイクルに最少の改変を加えて行うことができる。２’−Ｏ−メチル残基の各カップリングサイクルにおいて，ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して３３倍過剰（６０μＬの０．１１Ｍ＝６．６μｍｏｌ）のホスホルアミダイトおよび７５倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（６０μＬの０．２５Ｍ＝１５μｍｏｌ）を用いた。リボ残基の各カップリングサイクルにおいて，ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して６６倍過剰（１２０μＬの０．１１Ｍ＝１３．２μｕｍｏｌ）のアルキルシリル（リボ）保護ホスホルアミダイトおよび１５０倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（１２０μＬの０．２５Ｍ＝３０μｍｏｌ）を用いることができる。３９４　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機における平均カップリング収率は，トリチル画分の比色定量により決定して，９７．５−９９％であった。３９４　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成器で用いた他のオリゴヌクレオチド合成試薬は以下のとおりである：脱トリチル化溶液は塩化メチレン中３％ＴＣＡ（ＡＢＩ）であり；キャッピングは，ＴＨＦ中１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）およびＴＨＦ中１０％無水酢酸／１０％２，６−ルチジン（ＡＢＩ）中で行い；酸化溶液は，１６．９ｍＭ　Ｉ２，４９ｍＭピリジン，ＴＨＦ中９％水（ＰＥＲＳＥＰＴＩＶＥ（登録商標））であった。Ｂｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎ合成等級アセトニトリルは，試薬瓶から直接用いた。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（アセトニトリル中０．２５Ｍ）は，Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．から入手した固体から作成した。あるいは，ホスホロチオエート結合の導入のために，Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド，アセトニトリル中０．０５Ｍ）を用いる。
【０１０９】
ＲＮＡの脱保護は，２ポットプロトコルまたは１ポットプロトコルのいずれかを用いて行う。２ポットプロトコルについては，ポリマー結合トリチルオンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬのガラスねじ蓋バイアルに移し，４０％水性メチルアミン（１ｍＬ）の溶液中で６５℃で１０分間懸濁する。−２０℃に冷却した後，上清をポリマー支持体から除去する。支持体を１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ／３：１：１で３回洗浄し，ボルテックスし，次に上清を最初の上清に加える。オリゴリボヌクレオチドを含む合わせた上清を乾燥して，白色粉末を得る。塩基脱保護オリゴリボヌクレオチドを無水ＴＥＡ／ＨＦ／ＮＭＰ溶液（１．５ｍＬ　Ｎ−メチルピロリジノン，７５０μＬ　ＴＥＡおよび１．０ｍＬ　ＴＥＡ・３ＨＦの溶液３００μＬ，ＨＦ濃度１．４Ｍ）に再懸濁し，６５℃に加熱する。１．５時間後，オリゴマーを１．５Ｍ　ＮＨ４ＨＣＯ３で急冷する。
【０１１０】
あるいは，１ポットプロトコルのためには，ポリマー結合トリチルオンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬのガラスねじ蓋バイアルに移し，３３％エタノール性メチルアミン／ＤＭＳＯ：１／１（０．８ｍＬ）の溶液中で，６５℃で１５分間懸濁する。バイアルを室温にする。ＴＥＡ・３ＨＦ（０．１ｍＬ）を加え，バイアルを６５℃で１５分間加熱する。試料を−２０℃に冷却し，次に１．５Ｍ　ＮＨ４ＨＣＯ３で急冷する。
【０１１１】
トリチルオンオリゴマーの精製のためには，急冷したＮＨ４ＨＣＯ３溶液を，アセトニトリル，続いて５０ｍＭ　ＴＥＡＡで予備洗浄したＣ−１８含有カートリッジに負荷する。負荷したカートリッジを水で洗浄した後，ＲＮＡを０．５％ＴＦＡで１３分間脱トリチル化する。次にカートリッジを水で再び洗浄し，１Ｍ　ＮａＣｌで塩交換し，再び水で洗浄する。次に，３０％アセトニトリルでオリゴヌクレオチドを溶出する。
【０１１２】
不活性ハンマーヘッドリボザイムまたは減弱結合対照（ＢＡＣ）オリゴヌクレオチド）は，Ｇ５をＵで，Ａ１４をＵで置換することにより合成する（番号付けは，Ｈｅｒｔｅｌ，Ｋ．Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２０，３２５２による）。同様に，他の酵素的核酸分子に１またはそれ以上のヌクレオチド置換を導入して分子を不活性化し，そのような分子は負の対照として働くことができる。
【０１１３】
平均段階カップリング収率は，典型的には＞９８％である（Ｗｉｎｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４）。当業者は，合成のスケールは，上述の例より大きくまたは小さく，例えば，限定されないが，９６ウエルのフォーマットに適合させることができること，および，重要なすべては，反応において用いられる化学物質の比率であることを認識するであろう。
【０１１４】
あるいは，本発明の核酸分子は，別々に合成して，ライゲーションにより一緒につなげてもよい（Ｍｏｏｒｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５６，９９２３；Ｄｒａｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ．国際公開ＷＯ９３／２３５６９；Ｓｈａｂａｒｏｖａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１９，４２４７；Ｂｅｌｌｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｂｅｌｌｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．８，２０４）。
【０１１５】
本発明の核酸分子は，広範囲に修飾して，ヌクレアーゼ耐性基，例えば，２’−アミノ，２’−Ｃ−アリル，２’−フルオロ，２’−Ｏ−メチル，２’−Ｈによる修飾により安定性を高める（概説としてはＵｓｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，ＴＩＢＳ１７，３４；Ｕｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３を参照）。リボザイムは，一般的な方法を用いてゲル電気泳動により精製するか，または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；Ｗｉｎｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，（上掲）を参照，その全体を本明細書の一部としてここに引用する）により精製し，水に再懸濁する。
【０１１６】
化学的に合成した，本研究で有用なリボザイムおよびアンチセンス構築物の配列は，表３−３１，３３，３４，３７−４３，５６，５８，５９，６２，６３に示される。当業者は，これらの配列がリボザイムの酵素的部分（結合アーム以外のすべて）が活性を生ずるように変更されている多くの他のそのような配列の代表例にすぎないことを認識するであろう。表３−３１，３３，３４，３７−４３，５６，５８，５９，６２，６３に挙げられるリボザイムおよびアンチセンス構築物の配列は，リボヌクレオチドまたは他のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドから構成されてもよい。酵素的活性を有するそのようなリボザイムは，表に特に記載されるリボザイムの同等物である。
【０１１７】
本発明の核酸分子の活性の最適化
血清リボヌクレアーゼによる分解を防止する修飾（塩基，糖および／またはリン酸）を有する，化学的に合成された核酸分子は，その抗力が高まるであろう（例えば，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ　ｅｔ　ａｌ．，１９９０　Ｎａｔｕｒｅ　３４４，５６５；Ｐｉｅｋｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９１　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５３，３１４；Ｕｓｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７，３３４；Ｕｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開ＷＯ９３／１５１８７；Ｒｏｓｓｉ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開ＷＯ９１／０３１６２；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許５，３３４，７１１；およびＢｕｒｇｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，（上掲）を参照；これらはすべて本明細書に記載される核酸分子の塩基，リン酸および／または糖成分になしうる種々の化学修飾を記載し，そのすべてを本明細書の一部としてここに引用する）。細胞中におけるその抗力を増強する修飾，およびオリゴヌクレオチドの合成時間を短縮し化学物質の必要性を減少するために核酸分子から塩基を除去することが望ましい。
【０１１８】
当該技術分野には，触媒活性に有意に影響を与えることなくそのヌクレアーゼ安定性および効力を有意に増強することができる，核酸分子（例えば酵素的核酸分子）中に導入することができる糖，塩基およびリン酸修飾を記述するいくつかの例がある。酵素的核酸分子は，ヌクレアーゼ耐性基，例えば，２’−アミノ，２’−Ｃ−アリル，２’−フルオロ，２’−Ｏ−メチル，２’−Ｏ−アリル，２’−Ｈ，ヌクレオチド塩基修飾で修飾することにより，安定性を高め，および／または触媒活性を増強するために修飾される（総説については，Ｕｓｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２　ＴＩＴＢＳ　１７，３４；Ｕｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３；Ｂｕｒｇｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ　３５，１４０９０を参照）。酵素的核酸分子の糖修飾は，当該技術分野において広く記載されている（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ　１９９０，３４４，５６５−５６８；Ｐｉｅｋｅｎ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９９１，２５３，３１４−３１７；Ｕｓｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９２，１７，３３４−３３９；Ｕｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．国際公開ＷＯ９３／１５１８７；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許５，３３４，７１１，Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２５７０２；を参照，これらの参考文献はすべて，その全体を本明細書の一部としてここに引用する）。これらの刊行物は，触媒活性を阻害することなく，糖，塩基および／またはリン酸修飾等を酵素的核酸分子中に組み込む位置を決定する一般的方法および戦略を記載しており，本明細書の一部としてここに引用する。これらの教示に基づいて，同様の修飾を本明細書に記載されるように用いて，本発明の核酸触媒を修飾することができる。本発明の核酸分子中に存在するヌクレオチドの糖の，置換することができる２’−位は，Ｈ，−ＯＨ，−ＣＯＯＨ，−ＣＯＮＨ２，−ＣＯＮＨＲ１，−ＣＯＮＲ１Ｒ２，−ＮＨ２，−ＮＨＲ１，−ＮＲ１Ｒ２，−ＮＨＣＯＲ１，−ＳＨ，−ＳＲ１，−Ｆ，−ＯＮＨ２，−ＯＮＨＲ１，−ＯＮＲ１Ｒ２，−ＮＨＯＨ，−ＮＨＯＲ１，−ＮＲ２ＯＨ，−ＮＲ２ＯＲ’，置換または非置換のＣ１−Ｃ１０の直鎖または分枝鎖のアルキル，置換または非置換のＣ２−Ｃ１０の直鎖または分枝鎖のアルケニル，置換または非置換のＣ２−Ｃ１０の直鎖または分枝鎖のアルキニル，置換または非置換のＣ１−Ｃ１０の直鎖または分枝鎖のアルコキシ，置換または非置換のＣ２−Ｃ１０の直鎖または分枝鎖のアルケニルオキシ，および置換または非置換のＣ２−Ｃ１０の直鎖または分枝鎖のアルキニルオキシからなる群より選択される。糖の２’位の置換基は，好ましくは，独立して，ハロゲン，シアノ，アミノ，カルボキシ，エステル，エーテル，カルボキサミド，ヒドロキシ，またはメルカプトである。Ｒ１およびＲ２は，置換または非置換のアルキル，アルケニル，またはアルキニル基であることができ，ここで，置換基は，独立して，ハロゲン，シアノ，アミノ，カルボキシ，エステル，エーテル，カルボキサミド，ヒドロキシ，またはメルカプトである。
【０１１９】
このような教示の観点から，本明細書に記載されるものと同様の修飾を用いて，本発明の核酸分子を修飾することができる。そのような刊行物は，触媒作用を阻害せずに糖，塩基および／またはリン酸修飾等をリボザイム中に組み込む位置を決定する一般的な方法および戦略を記載しており，本明細書の一部としてここに引用する。そのような教示の観点から，本明細書に記載されるものと同様の修飾を用いて，本発明の核酸分子を修飾することができる。
【０１２０】
その触媒活性に有意に影響することなく酵素的核酸中に導入することができる塩基修飾の非限定的例には，イノシン，プリン，ピリジン−４−オン，ピリジン−２−オン，フェニル，シュードウラシル，２，４，６−トリメトキシベンゼン，３−メチルウラシル，ジヒドロウリジン，ナフチル，アミノフェニル，５−アルキルシチジンｓ（例えば，５−メチルシチジン），５−アルキルウリジン（例えば，リボチミジン），５−ハロウリジン（例えば，５−ブロモウリジン）または６−アザピリミジンまたは６−アルキルピリミジン（例えば，６−メチルウリジン）および他のもの（Ｂｕｒｇｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０）が含まれる。この観点において”修飾塩基”とは，１’位におけるアデニン，グアニン，シトシンおよびウラシル以外のヌクレオチド塩基またはその同等物を意味する。このような塩基は，酵素の触媒コア中でおよび／または基質結合領域中で用いることができる。
【０１２１】
核酸塩基は，リボザイムの位置１５．１におけるヒポキサンチン−９−イル，またはその機能的同等物でありうる。他の位置の塩基は，リボザイムの位置５，８および１２のグアニン−９−イル，ヒポキサンチン−９−イルまたは７−デアザグアニン−９−イル；位置６，９，１３および１４のアデニン−９−イル，２，６−ジアミノプリン−９−イル，プリン−９−イルまたは７−デアザアデニン−９−イル；位置４のウラシル−１−イル，ウラシル−５−イル，チミン−１−イルまたは５−プロピニルウラシル−１−イル；位置３のシトシン−１−イル，５−メチルシトシン−１−イルまたは５−プロピニルシトシン−１−イル；および位置７のアデニン−９−イル，シトシン−１−イル，グアニン−９−イル，ウラシル−１−イル，ウラシル−５−イル，ヒポキサンチン−９−イル，チミン−１−イル，５−メチルシトシン−１−イル，２，６−ジアミノプリン−９−イル，プリン−９−イル，７−デアザアデニン−９−イル，７−デアザグアニン−９−イル，５プロピニルシトシン−１−イル，５−プロピニルウラシル−１−イル，イソグアニン−９−イル，２−アミノプリン−９−イル，６メチルウラシル−１−イル，４−チオウラシル−１−イル，２−ピリミドン−１−イル，キナゾリン−２，４−ジオン−１−イル，キサンチン−９−イル，Ｎ２−ジメチルグアニン−９−イルまたはそれらの機能的同等物でありうる。位置１５．１の遠位は好ましくはヒポキサンチン−９−イル，または塩基の２位の任意の基とＣ１６．１の２−オキソ基との間に水素結合を形成することができない類似体である。好ましくは，位置１５．１のＢはグアニン−９−イルではない。
【０１２２】
特に，本発明は，ピリジン−４−オン，ピリジン−２−オン，フェニル，シュードウラシル，２，４，６−トリメトキシベンゼン，３−メチルウラシル，ジヒドロウラシル，ナフチル，６−メチル−ウラシルおよびアミノフェニルから選択される塩基置換を有する修飾リボザイムを特徴とする。
【０１２３】
オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合をホスホロチオエート，ホスホロチオエート，および／または５’−メチルホスホネート結合で化学的に修飾すると安定性が増加するが，これらの修飾が多すぎると毒性を引き起こすかもしれない。したがって，核酸分子の設計においては，これらのヌクレオチド間結合の量は最小限にすべきである。これらの結合の濃度の減少は，これらの分子の毒性を低下させ，効力を増加させ，特異性を高めるはずである。
【０１２４】
活性を維持または増強する化学修飾を有する核酸分子が提供される。そのような核酸分子はまた，一般に非修飾核酸よりヌクレアーゼに対して耐性が高い。すなわち，細胞および／またはインビボにおいて，活性は有意に低下しない。外的に輸送された治療用核酸分子は，最適には，望ましくない蛋白質のレベルが減少するのに十分長い間標的ＲＮＡの翻訳が阻害されるまで，細胞中で安定でなければならない。この期間は疾病状態により，数時間から数日まで様々である。明らかに，有効な細胞内治療剤として機能するためには，これらの核酸分子はヌクレアーゼに対して耐性でなければならない。ＲＮＡおよびＤＮＡの化学合成の改良（Ｗｉｎｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２３，２６７７；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　２１１，３−１９（すべて本明細書の一部としてここに引用する）は，上述したように，ヌクレオチド修飾を導入してそのヌクレアーゼ安定性を高めることにより核酸分子を修飾する能力を拡大した。
【０１２５】
これらの本発明の核酸に基づく分子の使用は，組み合わせ治療（例えば，異なる遺伝子を標的とする多数のアンチセンスまたは酵素的核酸分子，既知の小分子阻害剤とカップリングさせた核酸分子，または分子（異なるモチーフを含む）および／または他の化学的または生物学的分子と組み合わせた間欠的治療）の可能性を提供することにより，疾病の進行のよりよい治療につながるであろう。核酸分子を用いる患者の治療はまた，異なる種類の核酸分子の組み合わせを含んでいてもよい。
【０１２６】
外的に輸送された治療用核酸分子（例えば，酵素的核酸分子およびアンチセンス核酸分子）は，最適には，望ましくない蛋白質のレベルが減少するのに十分長い間標的ＲＮＡの翻訳が阻害されるまで，細胞中で安定でなければならない。この期間は疾病状態により，数時間から数日まで様々である。明らかに，有効な細胞内治療剤として機能するためには，これらの核酸分子はヌクレアーゼに対して耐性でなければならない。本発明におよび当該技術分野において記載される核酸分子の合成の改良は，上述したように，ヌクレオチド修飾を導入してそのヌクレアーゼ安定性を高めることにより核酸分子を修飾する能力を拡大した。
【０１２７】
”増強された酵素的活性”とは，細胞および／またはインビボで測定した活性を含むことを意味し，ここで，活性は，触媒活性とリボザイム安定性との両方を反映する。本発明においては，全ＲＮＡリボザイムまたは全ＤＮＡ酵素と比較して，インビボでこれらの特性の積が増加するかまたは有意に減少しない（１０倍未満）。
【０１２８】
さらに別の好ましい態様においては，化学修飾を有し，酵素的活性が維持または増強されている核酸触媒が提供される。そのような核酸触媒はまた，一般に，非修飾核酸よりもヌクレアーゼに対する耐性が高い。すなわち，細胞中および／またはインビボにおいて，活性は有意に低下しないであろう。本明細書に例示されるように，そのようなリボザイムは，全体の活性が１０倍低下しても細胞および／またはインビボで有用である（Ｂｕｒｇｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０）。そのようなリボザイムは，本明細書において，全ＲＮＡリボザイムの酵素的活性”を維持する”と言われる。
【０１２９】
別の観点においては，核酸分子は５’および／または３’−キャップ構造を含む。
【０１３０】
”キャップ構造”とは，オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に組み込まれている化学修飾を意味する（例えば，Ｗｉｎｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，ＷＯ９７／２６２７０を参照，本明細書の一部としてここに引用する）。これらの末端修飾は，核酸分子をエキソヌクレアーゼ分解から保護し，輸送および／または細胞中の局在化を助けるであろう。キャップは，５’−末端（５’−キャップ）または３’−末端（３’−キャップ）のいずれに存在していてもよく，両末端に存在していてもよい。非限定的例においては，５’−キャップは，反転無塩基残基（成分）；４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド，４’−チオヌクレオチド；炭素環式ヌクレオチド；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環状３’，４’−セコヌクレオチド；非環状３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環状３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド，３’−３’反転ヌクレオチド成分；３’−３’−反転無塩基成分；３’−２’−反転ヌクレオチド成分；３’−２’−反転無塩基成分；１，４−ブタンジオールリン酸；３’−ホスホルアミデート；ヘキシルリン酸；アミノヘキシルリン酸；３’−リン酸；３’−ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；または架橋または非架橋メチルホスホネート成分からなる群より選択される（詳細については，Ｗｉｎｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開９７／２６２７０を参照，本明細書の一部としてここに引用する）。
【０１３１】
さらに別の好ましい態様においては，３’−キャップは，４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド，炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルリン酸；１，３−ジアミノ−２−プロピルリン酸；３−アミノプロピルリン酸；６−アミノヘキシルリン酸；１，２−アミノドデシルリン酸；ヒドロキシプロピルリン酸；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環状３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド，５’−５’−反転ヌクレオチド成分；５’−５’−反転無塩基成分；５’−ホスホルアミデート；５’−ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールリン酸；５’−アミノ；架橋および／または非架橋５’−ホスホルアミデート，ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート，架橋または非架橋メチルホスホネートおよび５’−メルカプト成分からなる群より選択される（詳細については，Ｂｅａｕｃａｇｅ　ａｎｄ　Ｉｙｅｒ，１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　４９，１９２５を参照；本明細書の一部としてここに引用する）。
【０１３２】
”アルキル”基，飽和脂肪族炭化水素を表し，直鎖，分枝鎖，および環状アルキル基が含まれる。好ましくは，アルキル基は１−１２個の炭素を有する。より好ましくは，これは１−７個の炭素，より好ましくは１−４個の炭素を有する低級アルキルである。アルキルは置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合，置換基は，好ましくは，ヒドロキシル，シアノ，アルコキシ，＝Ｏ，＝Ｓ，Ｎ０２またはＮ（ＣＨ３）２，アミノ，またはＳＨである。この用語は，また，少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む不飽和炭化水素基であるアルケニル基を含み，直鎖，分枝鎖，および環状基を含む。好ましくは，アルケニル基は１−１２個の炭素を有する。より好ましくは，これは１−７個の炭素原子，より好ましくは１−４個の炭素原子の低級アルケニルである。アルケニルは置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合，置換基は，好ましくは，ヒドロキシル，シアノ，アルコキシ，＝Ｏ，＝Ｓ，ＮＯ２，ハロゲン，Ｎ（ＣＨ３）２，アミノ，またはＳＨから選択される。”アルキル”との用語はまた，少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む不飽和の炭化水素基を有するアルキニル基を含み，直鎖，分枝鎖，および環状基でありうる。好ましくは，アルキニル基は１−１２個の炭素を有する。より好ましくは，これは１−７個の炭素，より好ましくは１−４個の炭素を有する低級アルキニルである。アルキニル基は，置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合，置換基は，好ましくは，ヒドロキシル，シアノ，アルコキシ，＝Ｏ，＝Ｓ，ＮＯ２またはＮ（ＣＨ３）２，アミノまたはＳＨから選択される。
【０１３３】
そのようなアルキル基はまた，アリール，アルキルアリール，炭素環式アリール，複素環アリール，アミドおよびエステル基を含むことができる。”アリール”基とは，共役したパイ電子系を有する少なくとも１つの環を有する芳香族基を表し，炭素環式アリール，複素環アリールおよび二アリール基が含まれる。これらはすべて任意に置換されていてもよい。アリール基の好ましい置換基は，ハロゲン，トリハロメチル，ヒドロキシル，ＳＨ，ＯＨ，シアノ，アルコキシ，アルキル，アルケニル，アルキニル，およびアミノ基である。”アルキルアリール”基は，アリール基（上述）に共有結合したアルキル基（上述）を表す。炭素環式アリール基は，芳香族環の環原子がすべて炭素原子である基である。炭素原子は任意に置換されていてもよい。複素環アリール基は，芳香族環中の環原子として１−３個の複素原子を有し，環原子の残りが炭素原子である基である。適当な複素原子には，酸素，イオウ，および窒素が含まれ，例えば，フラニル，チエニル，ピリジル，ピロリル，Ｎ−低級アルキルピロロ，ピリミジル，ピラジニル，イミダゾリル等が挙げられる。これらはすべて任意に置換されていてもよい。”アミド”とは，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ（式中，Ｒはアルキル，アリール，アルキルアリールまたは水素のいずれかである）を表す。”エステル”とは，−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ’（式中，Ｒはアルキル，アリール，アルキルアリールまたは水素のいずれかである）を表す。
【０１３４】
本明細書において用いる場合，”ヌクレオチド”とは，当該技術分野において認識されているように，天然の塩基（標準的な），および当該技術分野においてよく知られる修飾塩基を含む。そのような塩基は，一般に，ヌクレオチド糖成分の１’位に位置する。ヌクレオチドは，一般に，塩基，糖およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは，糖，リン酸および／または塩基成分において，修飾されていても修飾されていなくてもよい（ヌクレオチド類似体，修飾ヌクレオチド，非天然ヌクレオチド，非標準的ヌクレオチドおよび他のものとして互換的に称される。例えば，Ｕｓｍａｎ　ａｎｄ　ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，（上掲）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開９２／０７０６５；Ｕｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開９３／１５１８７；Ｕｈｌｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ，（上掲）を参照，すべて本明細書の一部としてここに引用する）。修飾核酸塩基のいくつかの例が当該技術分野において知られるており，Ｌｉｍｂａｃｈ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２２，２１８３にまとめられている。核酸分子中に導入することができる塩基修飾の非限定的例には，イノシン，プリン，ピリジン−４−オン，ピリジン−２−オン，フェニル，シュードウラシル，２，４，６−トリメトキシベンゼン，３メチルウラシル，ジヒドロウリジン，ナフチル，アミノフェニル，５−アルキルシチジン（例えば，５−メチルシチジン），５−アルキルウリジン（例えば，リボチミジン），５−ハロウリジン（例えば，５−ブロモウリジン）または６−アザピリミジンまたは６−アルキルピリミジン（例えば，６−メチルウリジン），プロピン，および他のものが含まれる（Ｂｕｒｇｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０；Ｕｈｌｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ，（上掲））。
【０１３５】
この観点において”修飾塩基”とは，１’位におけるアデニン，グアニン，シトシンおよびウラシル以外のヌクレオチド塩基またはその同等物を意味する。このような塩基は，任意の位置で，例えば酵素的核酸分子の触媒コア中でおよび／または核酸分子の基質結合領域中で用いることができる。そのような修飾ヌクレオチドには，当該技術分野においてよく知られる薬学的有用性ならびに基礎的分子生物学の方法，例えば配列決定における有用性を有するジデオキシヌクレオチドが含まれる。
【０１３６】
好ましい態様においては，本発明はリン酸骨格修飾を有する修飾リボザイムを特徴とし，これは１またはそれ以上のホスホロチオエート，ホスホロジチオエート，メチルホスホネート，モルホリノ，アミデート，カルバメート，カルボキシメチル，アセトアミデート，ポリアミド，スルホネート，スルホンアミド，スルファメート，ホルムアセタール，チオホルムアセタール，および／またはアルキルシリル置換を含む。オリゴヌクレオチド骨格修飾の概説については，Ｈｕｎｚｉｋｅｒ　ａｎｄ　Ｌｅｕｍａｎｎ，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｍｏｄｅｒｎ　Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＶＣＨ，３３１−４１７，およびＭｅｓｍａｅｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ｎｏｖｅｌ　Ｂａｃｋｂｏｎｅ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ　ｆｏｒ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＡＣＳ，２４−３９を参照。これらの参考文献は本明細書の一部としてここに引用する。
【０１３７】
”無塩基”とは，１’位置において塩基を欠失しているか，または塩基の代わりに他の化学基を有する糖成分を意味する（詳細については，Ｗｉｎｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開９７／２６２７０を参照）。
【０１３８】
”非修飾ヌクレオシド”または”非修飾ヌクレオチド”とは，β−Ｄ−リボ−フラノースの１’炭素に結合した塩基，アデニン，シトシン，グアニン，チミン，ウラシルの１つを意味する。
【０１３９】
”修飾ヌクレオシド”または”修飾ヌクレオチド”とは，非修飾ヌクレオチドの塩基，糖および／またはリン酸の化学構造中に修飾を含む任意のヌクレオチド塩基を意味する。
【０１４０】
本発明において記載される２’−修飾ヌクレオチドに関して，”アミノ”とは，２’−ＮＨ２または２’−Ｏ−ＮＨ２を意味し，これは修飾されていてもされていなくてもよい。そのような修飾基は，例えば，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許５，６７２，６９５およびＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ　ｅｔ　ａｌ．，ＷＯ９８／２８３１７（いずれも本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。
【０１４１】
核酸（例えば，アンチセンスおよびリボザイム）構造に対する種々の修飾を作成して，これらの分子の有用性を高めることができる。このような修飾は，製品寿命，インビトロの半減期，安定性，およびそのようなオリゴヌクレオチドを標的部位に導入する容易さを高め，例えば，細胞膜の透過性を高め，標的とする細胞を認識し結合する能力を付与するであろう。
【０１４２】
これらの分子の使用は，組み合わせ療法の可能性を提供することにより，疾病の進行のよりよい治療につながるであろう（例えば，異なる遺伝子を標的とする多重リボザイム，既知の小分子阻害剤とカップリングさせたリボザイム，またはリボザイム（異なるリボザイムモチーフを含む）および／または他の化学的または生物学的分子の組み合わせによる間欠的治療）。核酸分子を用いる患者の治療にはまた，異なる種類の核酸分子の組み合わせが含まれる。１またはそれ以上の標的に対するリボザイム（異なるリボザイムモチーフを含む），アンチセンスおよび／または２−５Ａキメラ分子の混合物を含む療法を案出して，疾病の症状を軽減することができる。
【０１４３】
核酸分子の投与
核酸分子の輸送の方法は，Ａｋｈｔａｒ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏ．，２，１３９）およびＤｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｅｄ．Ａｋｈｔａｒ，１９９５（いずれも本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。Ｓｕｌｌｉｖａｎ　ｅｔ　ａｌ．，ＰＣＴ　ＷＯ９４／０２５９５は，さらに，酵素的ＲＮＡ分子を輸送するための一般的な方法を記載する。これらのプロトコルを用いて，事実上いかなる核酸分子も輸送することができる。核酸分子は当業者に知られる種々の方法によって細胞に投与することができ，これにはリポソームへの封入，イオントホレシス，または他のベヒクル，例えば，ヒドロゲル，シクロデキストリン，生分解性ナノカプセル，および生体接着性小球体への組み込みが含まれるが，これらに限定されない。ある適応症に対しては，核酸分子をエクスビボで，上述のベヒクルを用いてまたは用いずに，細胞または組織に直接輸送することができる。あるいは，核酸／ベヒクルの組み合わせを，直接注入により，またはカテーテル，注入ポンプもしくはステントを用いることにより局所的に輸送する。当該技術分野においては，多くの例が浸透圧ポンプ（Ｃｈｕｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，２５７，１３５−１３８，Ｄ’Ａｌｄｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５５，１５１−１６４，Ｄｒｙｄｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１５７，１６９１７５，Ｇｈｉｒｎｉｋａｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，２４７，２１−２４を参照），または直接注入（Ｂｒｏａｄｄｕｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｆｏｃｕｓ，３，ａｒｔｉｃｌｅ　４）によるオリゴヌクレオチドのＣＮＳ輸送方法を記載する。他の輸送経路には，限定されないが，経口（錠剤またはピル形態）および／または包膜内輸送（Ｇｏｌｄ，１９９７，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，７６，１１５３−１１５８）が含まれる。ＣＮＳ輸送についても広く記載した薬剤輸送戦略の総説については，Ｊａｉｎ，Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ　Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ，Ｄｅｃｉｓｉｏｎ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，１９９８を参照。他の輸送経路には，静脈内，筋肉内，皮下または関節注射，エアロゾル吸入，経口（錠剤またはピル形態），局所，全身，眼，腹腔内および／またはくも膜下腔内輸送が含まれるが，これらに限定されない。核酸の輸送および投与のより詳細な説明はＳｕｌｌｉｖａｎ　ｅｔ　ａｌ．，（上掲）；Ｄｒａｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，ＰＣＴ　ＷＯ９３／２３５６９；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，ＰＣＴ　Ｗ０９９／０５０９４，およびＫｌｉｍｕｋ　ｅｔ　ａｌ．，ＰＣＴ　Ｗ０９９／０４８１９に提供されており，これらを本明細書の一部としてここに引用する。
【０１４４】
本発明の分子は医薬として用いることができる。医薬は患者の疾患状態を予防し，発症を阻害し，またはそれを治療する（症状をある程度，好ましくは全ての症状を緩和する）。
【０１４５】
本発明の負に荷電したポリヌクレオチド（例えば，ＲＮＡ，ＤＮＡまたは蛋白質）は，医薬組成物を形成するために安定化剤，緩衝剤等を用いて，または用いることなく，任意の標準的手段により患者に投与および導入することができる。リポソーム輸送メカニズムを用いることが望ましい場合，リポソームの処方のための標準的プロトコルに従うことができる。本発明の組成物はまた，経口投与用の錠剤，カプセルまたはエリキシル；直腸投与用の座剤；無菌溶液；注射投与用の懸濁液および当該技術分野において知られた組成物等として，処方して用いることもできる。
【０１４６】
本発明はまた，記載される化合物の薬学的に許容しうる処方を含む。これらの処方には，上述の化合物の塩，例えば，酸付加塩（例えば，塩酸，シュウ酸，酢酸およびベンゼンスルホン酸の塩）が含まれる。
【０１４７】
医薬組成物または処方は，細胞または患者への投与（例えば全身投与），好ましくはヒトへの投与に適当な形態の組成物または処方を表す。適当な形態は，部分的には，使用する投与経路（例えば経口，経皮，または注射）に依存する。そのような形態は，組成物または処方が標的細胞（すなわち，負に荷電したポリマーが輸送されることが望まれる細胞）に到達することを妨害してはならない。例えば，血流中に注入される医薬組成物は可溶性でなければならない。他の因子は当該技術分野において知られており，例えば，毒性，および組成物または処方がその効果を発揮することを妨害する形態等を考慮することが含まれる。
【０１４８】
”全身投与”とは，インビボでの全身吸収，または血流中における薬剤の蓄積の後に全身に分配されることを意味する。全身的吸収をもたらす投与経路には，静脈内，皮下，腹腔内，吸入，経口，肺内および筋肉内が含まれるが，これらに限定されない。これらの投与経路のそれぞれは，所望の負に荷電したポリマー（例えば核酸）をアクセス可能な疾患組織に暴露する。薬剤が循環中に入る速度は，分子量またはサイズの関数であることが示されている。本発明の化合物を含むリポソームまたは他の薬剤担体を使用することにより，薬剤を，例えば，あるタイプの組織（例えば網状内皮系（ＲＥＳ）の組織）に局在化させることが可能である。薬剤と細胞（例えば白血球およびマクロファージ）の表面との会合を容易にすることができるリポソーム処方もまた有用である。この方法は，マクロファージおよび白血球による異常な細胞（例えば癌細胞）の免疫認識の特異性を利用することにより，薬剤の標的細胞への輸送を増強するであろう。
【０１４９】
薬学的に許容しうる処方とは，本発明の核酸分子をその所望の活性に最も適した物理学的位置に有効に分布させることができる組成物または処方を意味する。本発明の核酸分子とともに処方するのに適した薬剤の非限定的例には以下のものが含まれる：ＣＮＳ中への薬剤の侵入を促進することができるＰ−糖蛋白質阻害剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｐ８５等）（Ｊｏｌｌｉｅｔ−Ｒｉａｎｔ　ａｎｄ　Ｔｉｌｌｅｍｅｎｔ，１９９９，Ｆｕｎｄａｍ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１３，１６−２６）；大脳内移植後の徐放輸送用の生分解性ポリマー，例えばポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏグリコリド）微小球（Ｅｍｅｒｉｃｈ，ＤＦｅｔａｌ，１９９９，Ｃｅｌｌ移植，８，４７−５８）Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ；および薬剤を脳血管関門を越えて輸送することができ，神経の取り込みメカニズムを変更しうる，例えばポリブチルシアノアクリレートから作成される充填されたナノ粒子（ＰｒｏｇＮｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｂｉｏｌ　Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２３，９４１−９４９，１９９９）。本発明の核酸分子の輸送戦略の他の非限定的例には，Ｂｏａｄｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８７，１３０８−１３１５；Ｔｙｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．，４２１，２８０−２８４；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５，ＰＮＡＳ　ＵＳＡ．，９２，５５９２−５５９６；Ｂｏａｄｏ，１９９５，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｒｅｖ．，１５，７３−１０７；Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２６，４９１０−４９１６；およびＴｙｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，ＰＮＡＳ　ＵＳＡ．，９６，７０５３−７０５８に記載されるものが含まれる。
【０１５０】
本発明はまた，ポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ−修飾，または長期間循環リポソームまたはステルスリポソーム）を含む，表面修飾リポソームを含む組成物の使用を特徴とする。これらの処方は，標的組織における薬剤の蓄積を増加させる方法を提供する。この種類の薬剤担体は，単核食細胞システム（ＭＰＳまたはＲＥＳ）によるオプソニン作用および排除に抵抗性であり，したがって，封入された薬剤の血流循環時間を長くし，組織への暴露を増強する（Ｌａｓｉｃ　ｅｔ　ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９５，９５，２６０１−２６２７；Ｉｓｈｉｗａｔａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９５，４３，１００５−１０１１）。そのようなリポソームは，おそらくは脈管新生標的組織における溢出および捕獲のため，腫瘍中に選択的に蓄積することが示されている（Ｌａｓｉｃ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９９５，２６７，１２７５−１２７６；Ｏｋｕ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３８，８６−９０）。長期間循環リポソームは，特に，ＭＰＳの組織で蓄積することが知られている慣用のカチオン性リポソームと比べて，ＤＮＡおよびＲＮＡの薬物動態学および薬力学を増強する（Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，４２，２４８６４−２４８７０；Ｃｈｏｉ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１０３９１；Ａｎｓｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１０３９０；Ｈｏｌｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１０３９２；これらをすべて本明細書の一部としてここに引用する）。長期間循環リポソームはまた，代謝的に攻撃的なＭＰＳ組織，例えば肝臓および脾臓における蓄積を回避するその能力に基づいて，カチオン性リポソームと比較して薬剤をヌクレアーゼ分解からより強く保護するようである。
【０１５１】
本発明はまた，薬学的に有効量の所望の化合物を薬学的に許容しうる担体または希釈剤中に含む，保存または投与用に調製される組成物を含む。治療用途に用いるための許容しうる担体または希釈剤は，医薬の技術分野においてよく知られており，例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ　ｅｄｉｔ．１９８５）（本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。例えば，保存剤，安定剤，染料，および風味剤を用いることができる（同，１４４９）。これらには，安息香酸ナトリウム，ソルビン酸，およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。さらに，抗酸化剤および懸濁剤を用いてもよい（同）。
【０１５２】
薬学的に有効な用量とは，疾患状態の予防，発症の阻害または治療（症状をある程度緩和し，好ましくはすべての症状を緩和する）に必要な用量である。薬学的に有効な用量は，疾患の種類，用いる組成物，投与の経路，治療する哺乳動物の種類，考慮中の特定の哺乳動物の物理学的特性，同時投与される薬剤，および医薬の分野の当業者が認識するであろう他の因子によって異なる。一般に，負に荷電したポリマーの効力に依存して，０．１ｍｇ／ｋｇ−１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の活性成分を投与する。
【０１５３】
本発明の核酸分子はまた，全体の治療効果を増加させるため，他の治療化合物と組み合わせて患者に投与してもよい。適応症を処置するための多数の化合物の使用は有益な効果を増加させ，一方副作用を減少させるであろう。
【０１５４】
あるいは，本発明のある種の核酸分子は，細胞中で真核生物プロモーターから発現させることもできる（例えば，Ｉｚａｎｔ　ａｎｄ　Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９，３４５；ＭｃＧａｒｒｙ　ａｎｄ　Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，１９８６　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８３，３９９；Ｓｃａｎｌｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　，８８，１０５９１−５；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｄｒｏｐｕｌｉｃ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２　Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６６，１４３２−４１；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９１　Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６５，５５３１−４；Ｏｊｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｓａｒｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９０　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４７，１２２２−１２２５；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２３，２２５９；Ｇｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ　１９９７　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ，４，４５（これらの文献はその内容の全てを本明細書の一部としてここに引用する））。当業者は，真核生物細胞中で適当なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから任意の核酸を発現させることができることを理解するであろう。そのような核酸の活性は，リボザイムによってそれらを一次転写産物から放出させることにより増大させることができる（Ｄｒａｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，ＰＣＴ　ＷＯ９３／２３５６９，Ｓｕｌｌｉｖａｎ　ｅｔ　ａｌ．，ＰＣＴ　ＷＯ９４／０２５９５；Ｏｈｋａｗａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，２７，１５−６；Ｔａｉｒａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９１，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１９，５１２５−３０；Ｖｅｎｔｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２１，３２４９−５５；Ｃｈｏｗｒｉｒａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２５８５６（いずれもその全体を本明細書の一部としてここに引用する））。
【０１５５】
本発明の別の観点においては，本発明のＲＮＡ分子は，好ましくは，ＤＮＡまたはＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから発現される（例えばＣｏｕｔｕｒｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照）。組換えベクターは，好ましくはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。リボザイムを発現するウイルスベクターは，限定されないが，アデノ随伴ウイルス，レトロウイルス，アデノウイルス，またはアルファウイルスに基づいて構築することができる。好ましくは，核酸分子を発現しうる組換えベクターは，上述のように輸送され，標的細胞中に残留する。あるいは，核酸分子の過渡的発現を与えるウイルスベクターを用いることもできる。そのようなベクターは，必要に応じて繰り返し投与することができる。いったん発現されれば，核酸分子は標的ｍＲＮＡに結合する。核酸分子を発現するベクターの輸送は，全身的（例えば，静脈内または筋肉内投与により），患者から外植された標的細胞に投与した後，患者に再導入することにより，または所望の標的細胞中への導入を可能とする他のいずれかの手段により行うことができる（総説については，Ｃｏｕｔｕｒｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照）。
【０１５６】
本発明の１つの観点においては，少なくとも１つの本発明の核酸分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターが開示される。本発明の核酸分子をコードする核酸配列は，その核酸分子の発現を可能とする様式で，動作可能なように連結されている。
【０１５７】
本発明の別の観点においては，発現ベクターは，転写開始領域（例えば真核生物ｐｏｌ　Ｉ，ＩＩまたはＩＩＩの開始領域）；ｂ）転写終止領域（例えば真核生物ｐｏｌ　Ｉ，ＩＩまたはＩＩＩの終止領域）；ｃ）本発明の核酸触媒の少なくとも１つをコードする核酸配列を含む。ここで，前記配列は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域および前記終止領域に動作可能なように連結されている。ベクターは，任意に，本発明の核酸触媒をコードする遺伝子の５’側または３’側に動作可能なように連結された蛋白質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）；および／またはイントロン（介在配列）を含んでいてもよい。
【０１５８】
核酸分子配列の転写は，真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ　Ｉ），ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ　ＩＩ），またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ　ＩＩＩ）のプロモーターにより駆動される。ｐｏｌ　ＩＩまたはｐｏｌ　ＩＩＩプロモーターからの転写産物は，すべての細胞において高いレベルで発現されるであろう。所定の細胞タイプ中における所定のｐｏｌ　ＩＩプロモーターのレベルは，近くに存在する遺伝子制御配列（エンハンサー，サイレンサー等）の性質に依存するであろう。原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素が適当な細胞中で発現される限り，原核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモーターもまた用いられる（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｍｏｓｓ，１９９０　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　，８７，６７４３−７；Ｇａｏ　ａｎｄ　Ｈｕａｎｇ　１９９３　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２１，２８６７−７２；Ｌｉｅｂｅｒｅｔ．ａｌ．，１９９３　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１７，４７−６６；Ｚｈｏｕ　ｅｔ　ａｌ．，１９９０　Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０，４５２９−３７；これらの参考文献はすべて本明細書の一部としてここに引用する）。何人かの研究者が，そのようなプロモーターから発現した核酸分子，例えばリボザイムが哺乳動物細胞中で機能しうることを示している（例えば，Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｏｊｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　，８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　，９０，６３４０−４；Ｌ’Ｈｕｉｌｌｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２　ＥＭＢＯ　Ｊ．１１，４４１１−８；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０，８０００−４；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２３，２２５９；Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ＆Ｃｅｃｈ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２，１５６６）。より詳細には，転写ユニット，例えばＵ６小核（ｓｎＲＮＡ），転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびアデノウイルスＶＡ　ＲＮＡをコードする遺伝子に由来するものは，細胞中において高濃度の所望のＲＮＡ分子（例えばリボザイム）を生成するのに有用である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，（上掲）；Ｃｏｕｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，（上掲）；Ｎｏｏｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．，２２，２８３０；Ｎｏｏｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許５，１６２４，８０３；Ｇｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．４，４５；Ｂｅｉｃｒｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１８７３６；（これらのすべての刊行物を本明細書の一部としてここに引用する）。上述のリボザイム転写ユニットは，哺乳動物細胞中に導入するために種々のベクター中に組み込むことができる。ベクターとしては，限定されないが，プラスミドＤＮＡベクター，ウイルスＤＮＡベクター（例えばアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクター），またはウイルスＲＮＡベクター（例えばレトロウイルスまたはアルファウイルスベクター）が挙げられる（総説については，Ｃｏｕｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，（上掲）を参照）。
【０１５９】
さらに別の観点においては，本発明は，本発明の核酸分子の少なくとも１つをコードする核酸配列を，その核酸分子の発現を可能とする様式で含む発現ベクターを特徴とする。１つの態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ）前記核酸分子の少なくとも１つをコードする遺伝子を含み；前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域および前記終止領域に動作可能なように連結されている。別の好ましい態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ）オープンリーディングフレーム；ｄ）前記核酸分子の少なくとも１つをコードする遺伝子を含み，前記遺伝子は，前記オープンリーディングフレームの３’末端に動作可能なように連結されており，前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域，前記オープンリーディングフレームおよび前記終止領域に動作可能なように連結されている。さらに別の態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ）イントロン；ｄ）前記核酸分子の少なくとも１つをコードする遺伝子を含み；前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域，前記イントロンおよび前記終止領域に動作可能なように連結されている。別の態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ）イントロン；ｄ）オープンリーディングフレーム；ｅ）前記核酸分子の少なくとも１つをコードする遺伝子を含み，前記遺伝子は，前記オープンリーディングフレームの３’末端に動作可能なように連結されており，前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域，前記イントロン，前記オープンリーディングフレームおよび前記終止領域に動作可能なように連結されている。
【０１６０】
実施例：
以下は，本発明の核酸の選択，単離，合成および活性を示す非限定的例である。
【０１６１】
実施例１：テロメラーゼ
リボヌクレオ蛋白質酵素であるテロメラーゼは，ＲＮＡテンプレートサブユニットおよびテロメラーゼリバーストランスクリプターゼ（ＴＥＲＴ）を含む１またはそれ以上の蛋白質サブユニットから構成され，これらは一緒に機能して，テロメアの合成を指示する。テロメアは，非ヌクレオソームＤＮＡ／蛋白質複合体として，真核生物染色体の物理学的末端に存在する。これらのキャッピング構造は，染色体の安定性および複製能力を維持する（Ｚａｋｉａｎ，Ｖ．Ａ．，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０，１６０１−１６０７）。テロメア構造は，Ｇ−Ｃ塩基対に富む保存ＤＮＡ配列のタンデム反復により特徴づけられる。追加の保存テロメア要素には，Ｇリッチ鎖中の末端３’−オーバーハングおよび核中においてテロメアＤＮＡと複合体化した非ヒストン構造蛋白質が含まれる（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，”Ｅ．，１９９０，ＪＢＣ．，２６５，５９１９−５９２１．）。テロメラーゼの有意なレベルを欠失しているほとんどの体細胞株において，観察されるテロメアの短縮化は細胞の老化の開始と同時に起こる。この知見は，老化，加齢関連疾病，および癌のメカニズムに関する我々の考察に深い衝撃を与えた。
【０１６２】
一般的なＤＮＡポリメラーゼは，直線状の染色体の末端を完全に複製することができない（Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，１９７２，Ｎａｔｕｒｅ，２３９，１９７−２０１）。この不能は，ＤＮＡ複製において用いられるＲＮＡプライマーのリボヌクレアーゼ切断の産物である３’Ｇリッチオーバーハングから生ずる。凹型のＣリッチの親鎖はテンプレートとして用いることができないため，オーバーハングはＤＮＡポリメラーゼ複製を妨害する。テロメラーゼは，デオキシリボヌクレオチドを基質として，テロメラーゼＲＮＡサブユニット中の配列をテンプレートとして用いて染色体の３’末端を伸長することによりこの制限を克服している（Ｌｉｎｇｎｅｒ，Ｊ．，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９，１５３３−１５３４）。このように，テロメラーゼは，テロメア維持を担うリバーストランスクリプターゼであると考えられる。
【０１６３】
テロメラーゼは，１９８５年にＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａにおいて最初に発見された（Ｇｒｅｉｄｅｒ，Ｃ．Ｗ．，１９９５，Ｃｅｌｌ，４３，４０５−４１３）。ＲＮＡサブユニットおよびそのそれぞれの遺伝子が後に発見され，原生動物，発芽酵母および哺乳動物において特性決定された。これらの遺伝子の遺伝的研究によって，テロメアＲＮＡをコードする遺伝子を変異させることによりテロメア配列の決定におけるテロメラーゼＲＮＡ（ＴＲ）の役割が確認された（Ｙｕ，Ｇ．Ｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ，３４４，１２６−１３２），（Ｓｉｎｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６，４０４−４０９），（Ｂｌａｓｃｏ，Ｍ．Ａ．，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９，１２６７−１２７０）。これらの研究は，原生動物，酵母およびマウスにおいてテロメラーゼ活性がＴＲ発現と平行していることを示した。しかし，ヒトテロメラーゼＲＮＡ（ｈＴＲ）の発現は，哺乳動物細胞におけるテロメラーゼ活性とよく相関しない。多くのヒト組織はｈＴＲを発現するが，テロメラーゼ活性はない（Ｆｅｎｇ，Ｊ．，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９，１２３６−１２４１）。生殖細胞からｍＴＲ遺伝子が除かれているノックアウトマウスは，少なくとも６世代にわたり生存可能であることが示されている。これらのマウスの後の世代からの細胞は，テロメア分解と一致する染色体異常を示し，このことは，ｍＴＲはテロメア長さの維持に必要であるが，マウスにおける胚発生，発癌性トランスフォーメーション，または腫瘍形成には必要でないことを示す（Ｂｌａｓｃｏ，Ｍ．Ａ．，１９９７，Ｃｅｌｌ，９１，２５−３４）。
【０１６４】
テロメラーゼの最初の触媒的に活性なサブユニット（ｐｌ２３）は，Ｅｕｐｌｏｔｅｓ　ａｅｄｉｃｕｌａｔｕｓから，他のサブユニット（ｐ４３）および６６−ｋＤ　ＲＮＡサブユニットとともに単離された。（Ｌｉｎｇｅｒ，Ｊ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９３，１０７１２−１０７１７）。続く研究は，分裂酵母（Ｅｓｔ２ｐ）およびヒト遺伝子（ＴＲＴ１）からのテロメラーゼ触媒サブユニットのホモログを明らかにした。ヒトホモログである，ｈＴＥＲＴをコードするＴＲＴ１は，ヒト細胞においてテロメラーゼ活性と強い相関を有するｍＲＮＡを発現した（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．Ｍ．，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７，９５５−９５９）。インビトロで転写され翻訳されたｈＴＥＲＴおよびｈＴＲ（共に合成または単に混合のいずれか）を用いるテロメラーゼ活性の再構築は，ｈＴＥＲＴおよびｈＴＲがテロメラーゼの最小成分であることを示した。さらに，正常二倍体ヒト細胞におけるｈＴＥＲＴの過渡的発現はテロメラーゼ活性を復元し，このことは，ｈＴＥＲＴが正常ヒト細胞においてテロメラーゼ活性を復元するのに必要な唯一の成分であることを示す（Ｗｅｉｎｒｉｃｈ，Ｓ．Ｌ．，１９９７，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，１７，４９８−５０２）。トランスフェクションによるｈＴＥＲＴ発現を用いてテロメラーゼを正常ヒト細胞中に導入すると，これらの細胞の寿命が延長された。このような知見は，テロメラーゼの非存在下におけるテロメア喪失が，老化に先立って細胞の複製能力を制御する”有糸分裂時計”であることを示す（Ｂｏｄｎａｒ，Ａ．Ｇ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７９，３４９−３５２）。
【０１６５】
テロメラーゼの発現は，生殖細胞およびほとんどの癌細胞株において観察される。これらの”不死化”細胞株においては，これらのテロメアの短縮化なしに分裂し続ける（Ｋｉｍ，Ｎ．Ｗ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６，２０１１−２０１５）。これらの知見から腫瘍進行のモデルが発展し，このことは悪性トランスフォーメーションにおけるテロメラーゼ発現の役割を示唆する。ヒト細胞の悪性トランスフォーメーションは，ｈＴＥＲＴとＳＶ４０ラージＴおよびＨｒａｓの２つのオンコジンの組み合わせを異所性発現させることにより初めて成功した。ヌードマウスにこれらのオンコジンおよびｈＴＥＲＴを発現する細胞を注射することにより，腫瘍が急激に成長した。これらの知見は，ｈＴＥＲＴ媒介性テロメア維持がヒト腫瘍細胞の形成に必須であることを示す（Ｈａｈｎ，Ｗ．Ｃ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ，４００，４６４−４６８）。
【０１６６】
インビトロでテロメラーゼ活性をアッセイする種々の方法が開発されている。テロメラーゼ活性を特性決定するために最も広く用いられている方法は，テロメア反復増幅プロトコル（ＴＲＡＰ）である。ＴＲＡＰは，細胞抽出物のＲＴ−ＰＣＲを利用して，ＰＣＲ標的の量を酵素の生化学的活性に依存させることにより，テロメラーゼ活性を測定する（Ｋｉｍ，Ｎ．Ｗ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５，２５９５−２５９７（本明細書の一部としてここに引用する））。
【０１６７】
Ｋｉｍに基づく方法は以下の通りである。簡単には，テロメラーゼアッセイのためには，２μｇの蛋白質を用いる。抽出物を，０．１μｇのＴＳ基質プライマー（５−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ−３’，アルファ−３２Ｐ−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて末端標識），０．１μｇのＡＣＸリターンプライマー（５’−ＧＣＧＣＧＧ［ＣＴＴＡＣＣ］３ＣＴＡＡＣＣ−３’），０．１μｇのＮＴ内部対照プライマー（５’−ＡＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＧＣＣＴＴＴＴ−３’），０．０１μｍｏｌのＴＳＮＴ内部対照テンプレート（５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴＡＡＡＡＧＧＣＣＧＡＧＡＡＣＧＡＴ−３），５０μＭの各デオキシヌクレオシド三リン酸，２ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ，および２μｌのＣＨＡＰＳ蛋白質抽出物を１ＸＴＲＡＰ緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３），６８ｍＭ　ＫＣｌ，１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１ｍＭ　ＥＧＴＡ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中に含む５０μｌの反応混合物中でアッセイする。各反応を３０℃に予熱したサーモサイクラーブロック中に置き，３０℃で１０分間インキュベートし，次に９４℃で３０秒間，６０℃で３０秒間を２７サイクル行う。反応生成物を変性８％ポリアクリルアミドゲルで分離し，次にゲルを乾燥し，オートラジオグラフィーを行う。内部対照（Ｔａｑポリメラーゼ阻害の可能性を調節する）は３６ｎｔのバンドを生成する。テロメラーゼにより伸長されたバンドの積分した（例えば，ホスファーイメージャー分析による）放射活性シグナルを，既知の量の定量標準テンプレート（Ｒ８と称される；５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴＡＧ［ＧＧＴＴＡＧ］７−３’）を用いて行った反応からの放射活性シグナルと比較すると，テロメラーゼ活性の発現が絶対値として得られる。
絶対値＝ＴＰＧ（総生成物）
＝［（ＴＰ−ＴＰｉ）／ＴＩ］／［（Ｒ８−Ｂ）／ＲＩ）］ｘ１００，
［式中，ＴＰ＝試験抽出物からのテロメラーゼ産物，ＴＰｉ＝熱不活性化（７５℃，１０分間）抽出物反応からのテロメラーゼ産物，ＴＩ＝内部対照からのシグナル，Ｒ８＝Ｒ８定量標準テンプレート反応からのシグナル，Ｂ＝溶解緩衝液のみのブランク反応からのシグナル，およびＲＩ＝Ｒ８テンプレートおよびＮＴおよびＴＳＮＴ対照プライマーを含む反応の内部対照値］
０−１０，０００のＴＰＧ値が可能であり，直線範囲は約１−１０００ＴＰＧである。１−１０００ＴＰＧの範囲は，試験するほとんどの腫瘍試料におけるテロメラーゼ活性の最小および最大レベルを包含するが，非腫瘍細胞はしばしばテロメラーゼ活性を有しない（ＴＰＧは約０）。
【０１６８】
テロメラーゼ活性はまた，以下のようにしてアッセイすることができる。テロメラーゼ活性についてアッセイすべき試料は，ＣＨＡＰＳ溶解緩衝液（１０ｍＭ　ＴｒｉｓｐＨ７．５，ｌｍＭ　ＭｇＣｌ２，１ｍＭＥＧＴＡ，０．１ｍＭＰＭＳＦ，５ｍＭ−メルカプトエタノール，１ｍＭ　ＤＴＴ，０．５％３−［（３−クロルアミドプロピル）−ジメチル−アミノ］−ｌ−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ），１０％グリセロールおよび４０Ｕ／ｍｌＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）中に抽出することにより調製する。細胞をＣＨＡＰＳ溶解緩衝液中に懸濁し，氷上で３０分間インキュベートして，９０−１００％の細胞を溶解させる。次に溶解物をポリアロマー遠心管に移し，１００，０００ｘｇで１時間，４℃で遠心分離する。上清は蛋白質抽出物であり，４−１０μｇ／ｍｌの濃度範囲がテロメラーゼアッセイに適している。抽出物は，必要ならばＭｉｃｒｏｃｏｎ　Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｅｒ３０（Ａｍｉｃｒｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡＵ．Ｓ．Ａ．）を用いて，製造元の指針にしたがって濃縮することができる。抽出物はアッセイするまで−８０℃で凍結保存することができる。インビボでテロメラーゼ活性をアッセイする種々の動物モデルが設計されている。テロメラーゼ活性の阻害は，ラットにおいて，ＭＮＵ（Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア）誘導性乳癌腫を用いる４−（ヒドロキシフェニル）レチナミド（４−ＨＰＲ）（動物モデルおよび更年期前の女性における乳癌発生の既知の阻害剤）による処理に応答した細胞増殖実験により分析されている（Ｂｅｄｎａｒｅｋ，Ａ．，１９９９，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２０，８７９−８８３）。別の研究は，動物およびヒトモデル系からの，トランスフォームした細胞株におけるテロメラーゼのアップレギュレーションに焦点をあてている（Ｚｈａｎｇ，Ｐ．Ｂ．，１９９８，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．，２２，５０９−５１６），（Ｃｈａｄｅｎｅａｕ，Ｃ．，１９９５，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１１，８９３−８９８），（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｒ．，１９９９，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８，１２１９−１２２６）。
【０１６９】
ヒト癌腫における種々の治療剤に応答したテロメラーゼ活性の阻害をアッセイするためのヒト細胞培養研究が確立されている。テロメラーゼ阻害剤を研究するためのヒト乳癌モデルが記載されている（Ｒａｙｍｏｎｄ，Ｅ．，１９９９，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８０，１３３２−１３４１）。種々の他の癌，例えば，子宮頸癌（Ｎａｋａｎｏ，Ｋ．，１９９８，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ，１５３，８５７−８６４），子宮内膜癌（Ｋｙｏ，Ｓ．，１９９９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８０，６０−６３），髄膜癌腫（Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ−ＤｅＭａｓｔｅｒｓ，Ｂ．Ｋ．，１９９８，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．，１６１，１２４−１３４），肺癌腫（Ｙａｓｈｉｍａ，Ｋ．，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｃｈ，５７，２３７２−２３７７），シスプラチンに応答した精巣癌（Ｂｕｒｇｅｒ，Ａ．Ｍ．，１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３３，６３８−６４４），および卵巣癌腫（Ｃｏｕｎｔｅｒ，Ｃ．Ｍ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１，２９００−２９０４）と関連したヒトのテロメラーゼ発現の研究が記載されている。
【０１７０】
テロメラーゼ発現の調節に関連しうる特定の変性および疾病状態には，限定されないが，以下のものが含まれる。
【０１７１】
癌：ほとんど全てのヒト腫瘍は検出可能なテロメラーゼ活性を有する。（Ｓｈａｙ，Ｊ．Ｗ．，１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３３，７８７−７９１）。テロメラーゼ阻害剤による治療は，テロメラーゼ活性を欠失した正常体細胞における副作用が最小である有効な癌治療を提供するかもしれない。広範な種類の癌の治療について，治療の可能性が存在する。
【０１７２】
再狭窄：血管平滑筋細胞におけるテロメラーゼ阻害は，これらの細胞の増殖を制限することにより，再狭窄を阻害するかもしれない。
【０１７３】
感染性疾病：テロメラーゼ活性を発現する感染性タイプの細胞におけるテロメラーゼ阻害は，選択的抗感染活性を与えるかもしれない。そのような治療は，原生動物，例えばＧｉａｒｄｉａおよびＬｅｓｈ　Ｍｅｎｉｅｓｉｓに基づく感染において特に有効であることが判明するかもしれない。
【０１７４】
移植拒絶：内皮タイプの細胞におけるテロメラーゼ阻害は，選択的免疫抑制活性を示すかもしれない。移植細胞におけるテロメラーゼの活性化は，増殖能の増加による移植の成功に有益であるかもしれない。
【０１７５】
自己免疫疾病：種々の免疫細胞におけるテロメラーゼの調節は，多発性硬化症，狼瘡，およびＡＩＤＳ等の疾病の治療において有益であることが判明するかもしれない。
【０１７６】
加齢関連疾病：加齢または早期老化の結果としての，老化したまたは老化に近い細胞におけるテロメラーゼ発現の活性化は，黄斑変性，皮膚潰瘍，および慢性関節リウマチ等の病状に有益であるかもしれない。
【０１７７】
テロメラーゼ研究の現在の主要な知識は，テロメラーゼ活性をアッセイする方法いおよび研究，診断，特性変更，動物の健康および治療用途のための，テロメラーゼ発現を制御しうる化合物が必要であることを示す。
【０１７８】
ゲムシタビンおよびシクロホスファミドは，本発明の核酸分子（例えば，リボザイムおよびアンチセンス分子）と組み合わせてまたはこれとともに用いることができる化学療法剤の非限定的例である。当業者は，他の薬剤，例えば抗癌化合物および療法を同様に本発明の核酸分子（例えば，リボザイムおよびアンチセンス分子）と容易に組み合わせることができ，したがって本発明の範囲内であることを認識するであろう。そのような化合物および治療剤は当該技術分野においてよく知られており（例えば，Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｎｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ　１　ａｎｄ　２，ｅｄｓ　Ｄｅｖｉｔａ，Ｖ．Ｔ．，Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｓ．，ａｎｄ　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＵＳＡを参照；本明細書の一部としてここに引用する），例えば，限定されないが，葉酸代謝拮抗薬；フルオロピリミジン；シタラビン；プリン類似体；アデノシン類似体；アムサクリン；トポイソメラーゼＩ阻害剤；アントラピラゾール；レチノイド；抗生物質，例えばブレオマイシン，アントラサイクリン，マイトマイシンＣ，ダクチノマイシン，およびミスラマイシン；ヘキサメチルメラミン；ダカルバジン；１−アスパラギナーゼ；白金類似体；アルキル化試薬，例えばナイトロゲンマスタード，メルファラン，クロラムブシル，ブスルファン，イフォスファミド，４−ヒドロペルオキシシクロホスファミド，ニトロソウレア，チオテパ；植物由来化合物，例えばビンカアルカロイド，エピポドフィルトキシン，タキソール；トマキシフェン；放射線療法；外科手術；栄養補給；遺伝子療法；放射線療法，例えば３Ｄ−ＣＲＴ；イムノトキシン療法，例えばリシン，モノクローナル抗体ハーセプチン等が含まれる。組み合わせ治療のためには，本発明の核酸を２つの方法のいずれかにより調製する。第１に，核酸および化学療法剤の調製物中で薬剤を物理学的に組み合わせる。例えば，静脈内投与用の，リポソーム中に封入した本発明の核酸と溶液中のイフォスファミドとの混合物においては，両方の薬剤が治療上有効な濃度で存在する（例えば，溶液中のイフォスファミドは溶液中で１０００−１２５０Ｍｇ／ｍ２／ｄａｙで輸送し，リポソームと会合した本発明の核酸は同じ溶液中で０．１−１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで輸送する）。あるいは，薬剤をそれぞれの有効量で別々にかつ同時に投与する（例えば，１０００−１２５０ｍｇ／ｍ２／ｄのイフォスファミドおよび０．１−１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの本発明の核酸）。
【０１７９】
Ｇａｅｔａ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許５，７６０，０６２；５，７６７，２７８；５，７７０，６１３は，ヒトテロメラーゼＲＮＡ（ｈＴＲ）サブユニットの小分子阻害剤を記載する。
【０１８０】
Ｂｌａｓｃｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９，１２６７−１２７０は，マウステロメラーゼＲＮＡ（ｍＴＲ）サブユニットの特定の領域を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの合成および試験を記載し，マウスにおけるテロメラーゼ活性の減少を報告している。
【０１８１】
Ｂｉｓｏｆｆｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３４，１２４２−１２４９は，ｈＴＲ　ＲＮＡを標的とするアンチセンスＲＮＡを発現するレトロウイルスベクターによるヒトテロメラーゼ活性のダウンレギュレーションを研究した。
【０１８２】
Ｎｏｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４，６１５−６１９は，ｈＴＲ　ＲＮＡを標的とするペプチド核酸（ＰＮＡ）分子を用いてヒト不死化乳上皮細胞におけるテロメラーゼ活性をダウンレギュレートすることを報告している。
【０１８３】
Ｙｏｋｏｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５８，５４０６−５４１０は，ｈＴＲ　ＲＮＡを標的とするハンマーヘッドリボザイム構築物を合成し試験して，イシカワ細胞においてテロメラーゼ活性が減少したことを報告している。
【０１８４】
Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，欧州特許出願６６６，３１３−Ａ２は，トランスフェクトしたヒト腫瘍細胞において異常型のテロメア配列を作成する遺伝子治療法において用いるためにｈＴＲ遺伝子を同定しクローニングする方法を記載する。ｈＴＲ遺伝子の発現を阻害するための，リボザイムに基づく遺伝子治療法も記載される。そのような治療法の意図する結果は，非天然テロメア配列に基づいて遺伝的不安定性が生じ，処置した細胞の速い細胞死が得られることである。
【０１８５】
Ｗｅｓｔ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許５，４８９，５０８は，細胞においてテロメア長さおよびテロメラーゼ活性を決定する方法を記載する。ｈＴＲ　ＲＮＡの阻害剤，例えばオリゴヌクレオチドおよび／または小分子が記載される。
【０１８６】
Ｆｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，（Ｆｅｎｇ，Ｊ．，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９，１２３６−１２４１）に示されるように，ヒトにおけるテロメラーゼ活性はｈＴＲ濃度とよく相関していないため，これらのテロメラーゼＲＮＡサブユニット（ＴＲ）を標的とする以前の方法は，あまり有益ではないかもしれない。
【０１８７】
Ｃｏｌｌｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開９８／０１５４２は，テロメラーゼ活性を検出するアッセイを記載する。ｐｌ４０，ｐｌ０５，ｐ４８およびｐ４３と称される４個のヒトテロメラーゼサブユニット蛋白質が記載される。さらに，テロメラーゼ遺伝子機能の阻害剤としてハイブリダイズプローブおよびプライマーが記載されている。抗体に基づくテロメラーゼ蛋白質サブユニットの阻害剤が記載されている。
【０１８８】
テロメラーゼ制御のより魅力的な方法は，酵素の蛋白質サブユニット，好ましくはリバーストランスクリプターゼ（ｈＴＥＲＴ）サブユニットの発現を調節することにより，ヒトテロメラーゼを制御することを含むであろう。再構成実験に基づけば，ｈＴＥＲＴおよびｈＴＲは，テロメラーゼの最小成分である。ヒト細胞においてはｈＴＲ発現はテロメラーゼ活性とよく相関しておらず，多くのヒト細胞はテロメラーゼ活性を有しないｈＴＲを発現するため，ｈＴＥＲＴを標的とすることはｈＴＲを標的とするよりも有益であることが証明されるであろう。正常なヒト細胞においては，ｈＴＥＲＴがテロメラーゼ活性を復元するのに必要な唯一の成分である。テロメラーゼの３つの主要なサブユニット（ｈＴＲ，ＴＰ１，およびｈＴＥＲＴ）を正常および悪性の子宮内膜組織においてアッセイした実験により，ｈＴＥＲＴがヒトテロメラーゼの酵素的活性の律速因子であることが決定された（Ｋｙｏ，Ｓ．，１９９９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８０，６０−６３）。単離された別の蛋白質サブユニットは，おそらくはテロメラーゼ活性において構造的な役割しか果たさないが，これはテロメラーゼ酵素の活性の増強において重要であるかもしれない。そのように，ｈＴＥＲＴは，テロメラーゼ活性の異所性制御のより優れた標的の１つである。
【０１８９】
Ｃｅｃｈ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開９８／１４５９３は，細胞および生物における増殖能力を変更するための，およびヒトの治療剤として用いる可能性を有する化合物および治療をスクリーニングするための，ヒト疾病の診断，予測および治療用のｈＴＥＲＴに関連する組成物および方法を記載する。
【０１９０】
Ｃｅｃｈ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開９８／１４５９２は，Ｅｕｐｌｏｔｅｓ　ａｅｄｉｃｕｌａｔｕｓの種々のテロメラーゼ蛋白質サブユニットおよびモチーフをコードする核酸およびアミノ酸配列，およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ配列，およびヒトテロメラーゼからの関連する配列を記載する。テロメアサブユニットおよび機能的ポリペプチドおよびこれらのサブユニットを含むリボヌクレオ蛋白質を含むポリペプチドもまた記載されている。Ｃｅｃｈ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開９８／１４５９２は，一般的記載として，アンチセンスおよびリボザイムを用いてヒトテロメラーゼリバーストランスクリプターゼ酵素の発現をダウンレギュレートする可能性に言及している。
【０１９１】
ヒトＴＥＲＴ　ＲＮＡにおける潜在的標的部位の同定
コンピュータ折り畳みアルゴリズムを用いて，ヒトＴＥＲＴの配列を，アクセス可能な部位についてスクリーニングした。二次折り畳み構造を形成せず，潜在的リボザイムおよび／またはアンチセンス結合／切断部位を含むＲＮＡの領域を同定した。これらの切断部位の配列は表１３−１７に示される。
【０１９２】
ヒトＴＥＲＴ　ＲＮＡにおける酵素的核酸の切断部位の選択
コンピュータに基づくＲＮＡ折り畳みアルゴリズムにより予測された部位が，ＴＥＲＴ　ＲＮＡのアクセス可能部位に対応するか否かを試験するために，１０個のハンマーヘッドリボザイムおよび３個のＧ切断剤リボザイム部位を選択してさらに分析した（表１７）。リボザイム標的部位は，ヒトＴＥＲＴの配列（Ｎａｋａｍｕｒａ　ｅ　ｔａｌ．，１９９７　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７７，９５５−９５９；Ｇｅｎｂａｎｋ配列受託番号ＮＭ＿００３２１９）を分析し，折り畳みに基づいて部位を順位づけることにより選択した。各標的に結合することができるリボザイムを設計し，コンピュータ折り畳みにより個々に分析して（Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．Ｔｈｅｏｃｈｅｍ，３１１，２７３；Ｊａｅｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，７７０６），リボザイム配列が適切な二次構造に折り畳まれるか否かを評価した。結合アームと触媒コアとの間に望ましくない分子内相互作用を有するリボザイムは考慮から除外した。以下に示されるように，種々の結合アームの長さを選択して，活性を最適化することができる。一般に，各アームに少なくとも５塩基あれば，標的ＲＮＡに結合するか，さもなくば相互作用することができる。
【０１９３】
ＴＥＲＴ　ＲＮＡの効率的な切断用のリボザイムの化学合成および精製
リボザイムは，ＲＮＡメッセンジャーの種々の領域にアニーリングするよう設計した。結合アームは，上述した標的部位配列に相補的である。リボザイムは化学的に合成した。用いた合成の方法は，上述し，Ｕｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８７Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５），Ｓｃａｒｉｎｇｅ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９０Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１８，５４３３）およびＷｉｎｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，（上掲）に記載される通常のＲＮＡ合成の方法にしたがい，一般的な核酸保護基およびカップリング基，例えば５’−末端にジメトキシトリチル，および３’−末端にホスホルアミダイトを用いた。平均段階カップリング収率は，＞９８％であった。
【０１９４】
リボザイムはまた，バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡテンプレートから合成した（Ｍｉｌｌｉｇａｎ　ａｎｄ　Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９８９，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８０，５１）。リボザイムは，一般的な方法を用いてゲル電気泳動により精製するか，または高速液体クロマトグラフィーにより精製し（ＨＰＬＣ；Ｗｉｎｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，（上掲）を参照；その全体を本明細書の一部としてここに引用する），水に再懸濁した。この実験に用いられた化学的に合成されたリボザイムの配列は以下の表１３−１７に示される。
【０１９５】
ＴＥＲＴ　ＲＮＡ標的のインビトロでのリボザイム切断
ヒトＴＥＲＴ　ＲＮＡをとする標的リボザイムを上述のように設計し合成する。これらのリボザイムはインビトロで，例えば以下の方法を用いて切断活性を試験することができる。ＴＥＲＴ　ＲＮＡ中の標的配列およびヌクレオチド位置は表１３−１７に示される。
【０１９６】
切断反応：リボザイム切断アッセイ用の全長または部分全長の，内部標識した標的ＲＮＡは，［アルファ−３２Ｐ］ＣＴＰの存在下でインビトロ転写により調製し，スピンクロマトグラフィーによりＧ５０セファデックスカラムを通し，さらに精製することなく，基質ＲＮＡとして用いた。あるいは，Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて基質を５’−３２Ｐ−末端標識した。アッセイは，以下のように行った。１５μｌの２Ｘ濃度の精製リボザイムをリボザイム切断緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，３７℃，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２）中であらかじめ暖め，２Ｘリボザイム混合物を，これもあらかじめ暖めた緩衝液中の等量（１５μｌ）の基質ＲＮＡ（最大１−５ｎＭ；５ｘ１０５から１ｘ１０７ｃｐｍ）に加えることにより切断反応を開始した。最初のスクリーニングとして，アッセイは，４０ｎＭまたは１ｍＭリボザイムの最終濃度を用いて，すなわちリボザイム過剰で，３７℃で１時間行った。等量（３０μｌ）の９５％ホルムアミド，２０ｍＭ　ＥＤＴＡ，０．０５％ブロモフェノールブルーおよび０．０５％キシレンシアノールを加えることにより反応を急冷し，その後，試料を９５℃で２分間加熱し，急冷し，変性ポリアクリルアミドゲルに負荷した。基質ＲＮＡおよびリボザイム切断により生成した特異的ＲＮＡ切断生成物は，ゲルのオートラジオグラフィーにより可視化した。切断のパーセントは，無傷の基質および切断産物を示すバンドをホスファーイメージャー（登録商標）で定量することにより決定した。
【０１９７】
実施例２：ＰＴＰ−１Ｂ
蛋白質チロシンリン酸化および脱リン酸化は，細胞成長，増殖，および分化のプロセスを制御するシグナル伝達経路の制御における重要なメカニズムである（Ｆａｎｔｌ，Ｗ．Ｊ．，１９９３，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６２，４５３−４８１）。一群の一緒に作用する酵素が蛋白質チロシンリン酸化および脱リン酸化事象を制御している。これらの広い一群の酵素は，蛋白質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）および蛋白質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）から構成される。ＰＴＫおよびＰＴＰは，いずれも，レセプター型貫膜蛋白質として，および細胞質蛋白質酵素として存在することができる。レセプターチロシンキナーゼは，細胞外レセプター−リガンド相互作用を介してシグナル伝達を伝播し，その結果，ＰＴＫの細胞質ドメイン中のチロシンキナーゼ部分が活性化される。レセプター様貫膜ＰＴＰは，細胞質ホスファターゼドメインによる細胞内ホスホチロシン蛋白質の脱リン酸化を調節する細胞外リガンドとの結合を介して機能する。細胞質ＰＴＫおよびＰＴＰは，レセプター媒介性リガンド相互作用なしで酵素的活性を示すが，リン酸化は，これらの酵素の活性を制御することができる。
【０１９８】
細胞質ＰＴＰである蛋白質チロシンホスファターゼ１Ｂは，均一な形で単離され（Ｔｏｎｋｓ，Ｎ．Ｋ．，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，６７２２−６７３０），特性決定され（Ｔｏｎｋｓ，Ｎ．Ｋ．，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，６７３１−６７３７），配列決定された（Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕ，Ｈ．，１９８９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８６，５２５２−５２５６），最初のＰＴＰである。細胞質およびレセプター様ＰＴＰは，いずれも，ホスファターゼ活性に必須であるシステインおよびアルギニン残基を含む１１個の保存アミノ酸により特徴づけられる触媒ドメインを共有する（Ｓｔｒｅｕｌｉ，Ｍ．，１９９０，ＥＭＢＯ，９，２３９９−２４０７）。位置２１５のシステイン残基は，リン酸の酵素への共有結合を担う（Ｇｕａｎ，Ｋ．，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１７０２６−１７０３０）。ヒトＰＴＰ１Ｂの結晶構造は，酵素のリン酸結合部位が，分子の表面のグリシンリッチな裂け目であり，この裂け目の底にシステイン２１５が位置することを規定した。システイン２１５の位置および裂け目の形が，チロシン残基に対するがセリンまたはトレオニン残基に対するものではないＰＴＰａｓｅ活性の特異性を与える（Ｂａｒｆｏｒｄ，Ｄ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６３，１３９７−１４０４）。
【０１９９】
レセプターチロシンキナーゼおよび蛋白質チロシンホスファターゼの局在は，ホスホチロシン媒介性シグナル伝達の制御において鍵となる役割を果たしている。ＰＴＰ−１Ｂ活性およびレセプターチロシンキナーゼのパネルに対する特異性は，基質間で明らかな相違を示し，このことは，細胞内コンパートメント化が酵素の活性および機能を規定する決定因子であることを示唆する（Ｌａｍｍｅｒｓ，Ｒ．，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２４５６−２２４６２）。実験は，ＰＴＰ−１Ｂがその３５アミノ酸のカルボキシ末端配列により主として小胞体に局在することを示した。ＰＴＰ−１Ｂはまた，細胞質に向いているその触媒ホスファターゼドメインを介してミクロソーム膜にぴったりと会合している（Ｆｒａｎｇｉｏｎｉ，Ｊ．Ｖ．，１９９２，Ｃｅｌｌ，６８，５４５−５６０）。
【０２００】
ＰＴＰ−１Ｂは，インスリン応答の負の調節剤として同定された。ＰＴＰ−１Ｂは，インスリン感受性組織において広く発現されている（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｂ．Ｊ．，１９９３，Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，３，１−１５）。単離されたＰＴＰ−１Ｂは，インビトロでインスリンレセプターを脱リン酸化する（Ｔｏｎｋｓ，Ｎ．Ｋ．，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，６７３１−６７３７）。インスリンレセプターの多数のホスホチロシン残基のＰＴＰ−１Ｂによる脱リン酸化は，順番に進行し，レセプター自己活性化に重要な３つのチロシン残基に対する特異性がある（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ，Ｃ．，１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１，４２３２−４２３８）。インスリンレセプターの脱リン酸化に加えて，ＰＴＰ−１Ｂはまた，インスリンレセプターの主要な基質であるインスリン関連基質１（ＩＲＳ−１）を脱リン酸化する（Ｌａｍｍｅｒｓ，Ｒ．，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２４５６−２２４６２）。
【０２０１】
ＰＴＰ１Ｂをアフリカツメガエル卵母細胞にマイクロインジェクションすると，内因性蛋白質，例えばインスリンのβ−サブユニットおよびインスリン様成長因子レセプター蛋白質のインスリン刺激チロシンリン酸化が阻害される。得られる内因性ＰＴＰａｓｅ活性に対して３−５倍の増加はまた，Ｓ６ペプチドキナーゼの活性化を妨害する（Ｃｉｃｉｒｅｌｌｉ，Ｍ．Ｆ．，１９９０，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７，５５１４−５５１８）。組換えラットＰＴＰ−１Ｂを抗体免疫沈澱で不活性化すると，インスリン刺激性ＤＮＡ合成およびホスファチジルイノシトール３’−キナーゼ活性が劇的に増加する。ＰＴＰ−１Ｂ阻害によりインスリン刺激性レセプター自己リン酸化およびインスリンレセプター基質１チロシンリン酸化も劇的に増加した（Ａｈｍａｄ，Ｆ．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２０５０３−２０５０８）。
【０２０２】
増加したＰＴＰ−１Ｂ発現は，高血糖症培養繊維芽細胞においてインスリン抵抗性と相関する。この研究においては，レセプターのインスリン誘導性自己リン酸化の欠陥により減感作されたインスリンレセプター機能が観察された。インスリン感受性を正常化するチアゾリジン誘導体で処理すると，ＰＴＰ−１Ｂ発現の正常化を通して高血糖症インスリン抵抗性が改善された（Ｍａｅｇａｗａ，Ｈ．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，７７２４−７７３０）。ヘテロ三量体ＧＴＰ結合蛋白質サブユニットＧｉａ２がノックアウトされているインスリン抵抗性のネズミモデルは，ＰＴＰ−１Ｂの発現の増加と相関する２型糖尿病の表現型を与える（Ｍｏｘａｍ，Ｃ．Ｍ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ，３７９，８４０−８４４）。
【０２０３】
ＰＴＰ−１Ｂは，活性化インスリンレセプターβ−サブユニットと直接相互作用する。ＰＴＰ−１Ｂの不活性の類似体を用いて，精製したレセプター調製物および全細胞溶解物の両方において，活性化インスリンレセプターが沈澱した。ＰＴＰ−１Ｂ相互作用にはインスリンレセプターのキナーゼドメイン中の３つのチロシン残基のリン酸化が必要である。さらに，インスリンは，ＰＴＰ−１Ｂのチロシンリン酸化を刺激する（Ｓｅｅｌｙ，Ｂ．Ｌ．，１９９６，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４５，１３７９−１３８５）。同様の研究により，ＰＴＰ−１Ｂとインスリンレセプターβ−サブユニットとの間の直接の相互作用，ならびにレセプターおよびＰＴＰ−１Ｂ中の必要な多数のリン酸化部位が確認された（Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙ，Ｄ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１６３９−１６４５）。
【０２０４】
ＰＴＰ−１Ｂ遺伝子を欠失するノックアウトマウス（ホモ接合体ＰＴＰ−１Ｂ−／−およびヘテロ接合体ＰＴＰ−１Ｂ＋／−の両方）を用いて，インビボでインスリン作用に関連するＰＴＰ−１Ｂの特定の役割が研究されている。得られたＰＴＰ−１Ｂ欠損マウスは健康であり，給餌状態で，ＰＴＰ−１Ｂ＋／＋発現同腹子の半分の低い血中グルコースおよび循環インスリンレベルを有する。これらのＰＴＰ−１Ｂ欠損マウスは，グルコース試験およびインスリン耐性試験において増強されたインスリン感受性を示した。生理学的レベルにおいて，ＰＴＰ−１Ｂ欠損マウスはインスリン投与後にインスリンレセプターのリン酸化の増加を示した。高脂肪食を与えたとき，ＰＴＰ−１Ｂ欠損マウスは体重増加に抵抗性であり，インスリン感受性のままであった。これに対し，正常ＰＴＰ−１Ｂ発現マウス急速に体重が増加し，インスリン抵抗性となった（Ｅｌｃｈｅｂｌｙ，Ｍ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８３，１５４４−１５４８）。このように，ＰＴＰ−１Ｂ発現の調節は，インビボでインスリンレセプターの自己リン酸化を制御し，インスリン感受性を増加させるために用いることができるかもしれない。この調節は，インスリン関連性疾病状態の治療において有益であることが証明されるかもしれない。
【０２０５】
上述の知見からみて，ＰＴＰ−１Ｂ発現が関与する特定の疾病状態には，限定されないが，以下のものが含まれる：
糖尿病：ＰＴＰ−１Ｂ発現の調節により１型および２型糖尿病の両方を治療することができるであろう。２型糖尿病は，減感作されたインスリンレセプター機能と相関する（Ｗｈｉｔｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４）。インスリンレセプターのインビボでのＰＴＰ−１Ｂ脱リン酸化の破壊は，インスリン感受性および増加したインスリンレセプター自己リン酸化として現れる（Ｅｌｃｈｅｂｌｙ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９）。インスリン依存性糖尿病である１型は，増加したインスリン感受性によりＰＴＰ−１Ｂ調節に応答するかもしれない。
肥満：Ｅｌｃｈｅｂｌｙ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９は，高脂肪食を与えたとき，ＰＴＰ−１Ｂ欠損マウスは正常ＰＴＰ−１Ｂを発現するマウスと比較して，体重増加に抵抗性であることを示した。この知見は，肥満の治療においてＰＴＰ−１Ｂ調節が有益であるかもしれないことを示唆する。Ａｈｍａｄ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．，４６，１１４０−１１４５は，肥満患者における，体重減少の後の脂肪組織における低下したＰＴＰおよび改良されたインスリン感受性を記載する。
【０２０６】
トログリタゾンは，本発明の核酸分子（例えば，リボザイムおよびアンチセンス分子）と組み合わせてまたは一緒に用いることができる医薬品の非限定的例である。当業者は，他の薬剤，例えば抗糖尿病および抗肥満化合物および治療剤を単に容易に本発明の核酸分子（例えば，リボザイムおよびアンチセンス分子）と組み合わせることができ，これらも本発明の範囲内であることを認識するであろう。
【０２０７】
ＰＴＰ−１Ｂ活性をアッセイする方法が開発されている。
【０２０８】
Ｍａｅｇａｗａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，７７２４−７７３０，は，ヒトインスリンレセプターを発現するＲａｔ１繊維芽細胞を高血糖症誘導性インスリン耐性のモデルとして用いることができる組織培養モデルを記載する。Ｍａｅｇａｗａ　ｅｔ　ａｌ．はまた，標識したリン酸化インスリンレセプターを用いて，および免疫酵素的手法によりＰＴＰａｓｅ活性を測定するアッセイを記載する。
【０２０９】
Ｍｏｘｈａｍ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ，３７９，８４０−８４４は，Ｇｉａ２欠失を用いて高インスリン血症，グルコース耐性障害およびインスリン耐性をインビボで研究するネズミ動物および組織培養モデルを記載する。ＰＴＰａｓｅ活性およびインスリン−レセプター基質１のチロシンリン酸化のアッセイが記載される。
【０２１０】
Ｋｈａｎｄｅｌｗａｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１５３，８７−９４は，インスリン依存性およびインスリン耐性糖尿病の４種類の異なる動物モデルを記載する。これらのモデルを用いて，バナジン酸（インスリン模倣物およびＰＴＰａｓｅ阻害剤）がインスリンレセプターのインスリン刺激性リン酸化およびそのチロシンキナーゼ活性に及ぼす影響を研究した。
【０２１１】
Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４３１，１４−２３は，ＰＴＰの蛍光発生基質としてのフルオレセイン一リン酸を記載する。
【０２１２】
蛋白質チロシンホスファターゼ活性を阻害する種々の方法および化合物が開発されている。
【０２１３】
Ｗｒｏｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４２，３１９９−３２０２は，ｏｂ／ｏｂマウスモデルにおける，１１−アリールベンゾ［ｂ］ナフト［２，３ｄ］フランおよびアリールベンゾ［ｂ］ナフト［２，３−ｄ］チオフェンによるＰＴＰ−１Ｂ阻害および抗高血糖活性を記載する。
【０２１４】
Ａｎｄｅｒｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開９８／ＤＫ４０７は，ＰＴＰａｓｅの調節剤としてのチエノプリジノンおよびチエノクロメノンの製造を記載する。
【０２１５】
Ｔａｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８，３７９３−３８０３は，一連のビス（アリールジフルオロホスホネート）を含むＰＴＰ−１Ｂの強力かつ高度に選択的な阻害剤を記載する。
【０２１６】
Ｈａｍ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，９，１８５−１８６は，ナフトキノンのスルホン類似体によるＰＴＰ−１Ｂの選択的不活性化を記載する。
【０２１７】
Ｄｅｓｍａｒａｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｊ．，３３７，２１９−２２３は，［ジフルオロ（ホスホノ）メチル］フェニルアラニンを含有するＰＴＰのペプチド阻害剤を記載する。
【０２１８】
Ｔａｙｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，６，２２３５は，ＰＴＰ−１Ｂの強力な非ペプチド性阻害剤を記載する。
【０２１９】
Ｋｏｔｏｒｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，８，３２７５−３２８０は，ＰＴＰの非ペプチド性阻害剤を設計するための新規なリン酸模倣体を記載する。
【０２２０】
Ｇｒｏｖｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７，１７７７３−１７７８３は，ホスホチロシンペプチド模倣体（ジフルオロナフチルメチル）ホスホン酸および複雑な結晶構造を有するフルオロマロニルチロシンによるＰＴＰ−１Ｂ阻害の構造的基礎を記載する。
【０２２１】
Ｙａｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｏｒｇｌ　Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，６，１７９９−１８１０は，新規なナフチルジフルオロメチルホスホン酸１および２を含む小分子ＰＴＰ−１Ｂ阻害剤の構造に基づく設計および合成を記載する。
【０２２２】
Ｔａｙｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，６，１４５７−１４６８は，ＰＴＰ−１Ｂの強力な非ペプチド性阻害剤を記載する。
【０２２３】
Ｄｅｓｍａｒａｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３５４，２２５−２３１は，スルホチロシルペプチドによるＰＴＰ−１ＢおよびＣＤ４５の阻害を記載する。
【０２２４】
Ｍｊａｌｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許出願９６−７６６１１４（米国特許５４３，６３０の一部継続出願）は，ホスホチロシン認識ユニットを有する蛋白質の調節剤としての複素環化合物の製造を記載する。
【０２２５】
Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，８，３４５−３５０は，ＰＴＰの強力な阻害剤としてのナフタレンビス［α，α−ジフルオロメチレンホスホネート］を記載する。
【０２２６】
Ｒｉｃｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６，１５９６５−１５９７４は，合理的コア設計からのランダムな側鎖変種を有する，チロシンおよび二重特異性ホスファターゼ阻害剤の小分子の標的化ライブラリを記載する。
【０２２７】
Ｏｌｅｆｓｋｙ，国際公開９７／ＵＳ２７５２は，ＰＴＰ−１Ｂと活性化インスリンレセプターとの関連に基づく，インスリン抵抗性の治療に用いる方法およびホスホペプチドを記載する。また，化合物がＰＴＰ−１Ｂのインスリンレセプターへの結合を阻害するか否かを判定する方法も含まれる。
【０２２８】
Ｈｕｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，８４３−８５１は，バナジン酸および過バナジン酸によるＰＴＰａｓｅの阻害のメカニズムを記載する。
【０２２９】
Ｂｕｒｋｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１５９８９−１５９９６は，構造に基づくＰＴＰ−１Ｂ阻害剤の設計を記載する。
【０２３０】
Ｔｏｎｋｓ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開９７／ＵＳ１３０１６は，チロシンリン酸化蛋白質基質の同定のための，基質トラッピング蛋白質ＰＴＰａｓｅ変異体およびその臨床応用を記載する。
【０２３１】
ヒトゲノムは，それぞれ化学的にわずかに異なるが機能が大きく異なる１００に及ぶＰＴＰａｓｅｓを含むと考えられている。ＰＴＰ−１Ｂに共有結合するかこれを修飾することによりＰＴＰ−１Ｂ活性を特異的に阻害するよう設計された化合物は，多くの副作用の可能性を有する。ＰＴＰ−１Ｂ活性を強力に抑制するであろうが他のＰＴＰとの相互作用からの副作用がほとんどまたは全くない一般的な薬剤物質を想像することは困難である。ＰＴＰ−１Ｂの調節のより魅力的な方法は，オリゴヌクレオチドを用いるＰＴＰ−１Ｂ発現の特異的制御を含むであろう。
【０２３２】
ヒトＰＴＰ−１ＢＲＮＡにおける潜在的標的部位の同定
コンピュータ折り畳みアルゴリズムを用いて，ヒトＰＴＰ−１Ｂの配列を，アクセス可能な部位についてスクリーニングした。二次折り畳み構造を形成せず，潜在的リボザイムおよび／またはアンチセンス結合／切断部位を含むＲＮＡの領域を同定した。これらの切断部位の配列は表３−８に示される。
【０２３３】
ヒトＰＴＰ−１Ｂ　ＲＮＡにおける酵素的核酸の切断部位の選択
コンピュータに基づくＲＮＡ折り畳みアルゴリズムにより予測された部位が，ＰＴＰ−１Ｂ　ＲＮＡのアクセス可能部位に対応するか否かを試験するために，１０個のハンマーヘッドリボザイム，５個のＮＣＨおよび３個のＧ切断剤リボザイム部位を選択してさらに分析した（表８）。リボザイム標的部位は，ヒトＰＴＰ−１Ｂ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ３３６８９）を分析し，折り畳みに基づいて部位を順位づけることにより選択した。各標的に結合することができるリボザイムを設計し，コンピュータ折り畳みにより個々に分析して（Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．Ｔｈｅｏｃｈｅｍ，３１１，２７３；Ｊａｅｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，７７０６），リボザイム配列が適切な二次構造に折り畳まれるか否かを評価した。結合アームと触媒コアとの間に望ましくない分子内相互作用を有するリボザイムは考慮から除外した。以下に示されるように，種々の結合アームの長さを選択して，活性を最適化することができる。一般に，各アームに少なくとも５塩基あれば，標的ＲＮＡに結合するか，さもなくば相互作用することができる。
【０２３４】
ＰＴＰ−１Ｂ　ＲＮＡの効率的な切断用のリボザイムの化学合成および精製
リボザイムは，ＲＮＡメッセンジャーの種々の領域にアニーリングするよう設計した。結合アームは，上述した標的部位配列に相補的である。リボザイムは化学的に合成した。用いた合成の方法は，上述し，Ｕｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８７Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５），Ｓｃａｒｉｎｇｅ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９０Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１８，５４３３）およびＷｉｎｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，（上掲）に記載される通常のＲＮＡ合成の方法にしたがい，一般的な核酸保護基およびカップリング基，例えば５’−末端にジメトキシトリチル，および３’−末端にホスホルアミダイトを用いた。平均段階カップリング収率は，＞９８％であった。
【０２３５】
リボザイムはまた，バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡテンプレートから合成した（Ｍｉｌｌｉｇａｎ　ａｎｄ　Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９８９，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８０，５１）。リボザイムは，一般的な方法を用いてゲル電気泳動により精製するか，または高速液体クロマトグラフィーにより精製し（ＨＰＬＣ；Ｗｉｎｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，（上掲）を参照；その全体を本明細書の一部としてここに引用する），水に再懸濁した。この実験に用いられた化学的に合成されたリボザイムの配列は以下の表３−８に示される。
【０２３６】
ＰＴＰ−１ＢＲＮＡ標的のインビトロでのリボザイム切断
ヒトＰＴＰ−１ＢＲＮＡを標的とするリボザイムは上述のように設計し合成する。これらのリボザイムは，インビトロで，例えば以下の方法を用いて切断活性を試験することができる。ＰＴＰ−１ＢＲＮＡ中の標的配列およびヌクレオチド位置は表３−８に示される。
【０２３７】
切断反応：リボザイム切断アッセイ用の全長または部分全長の，内部標識した標的ＲＮＡは，［α−３２Ｐ］ＣＴＰの存在下でインビトロ転写により調製し，スピンクロマトグラフィーによりＧ５０セファデックスカラムを通し，さらに精製することなく，基質ＲＮＡとして用いる。あるいは，Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて基質を５’−３２Ｐ−末端標識する。アッセイは，以下のように行う。１５μｌの２Ｘ濃度の精製リボザイムをリボザイム切断緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，３７℃，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２）中であらかじめ暖め，２Ｘリボザイム混合物を，これもあらかじめ暖めた緩衝液中の等量の基質ＲＮＡ（最大１−５ｎＭ）に加えることにより切断反応を開始する。最初のスクリーニングとして，アッセイは，４０ｎＭまたは１ｍＭリボザイムの最終濃度を用いて，すなわちリボザイム過剰で，３７℃で１時間行う。等量の９５％ホルムアミド，２０ｍＭ　ＥＤＴＡ，０．０５％ブロモフェノールブルーおよび０．０５％キシレンシアノールを加えることにより反応を急冷し，その後，試料を９５℃で２分間加熱し，急冷し，変性ポリアクリルアミドゲルに負荷する。基質ＲＮＡおよびリボザイム切断により生成した特異的ＲＮＡ切断生成物は，ゲルのオートラジオグラフィーにより可視化する。切断のパーセントは，無傷の基質および切断産物を示すバンドをホスファーイメージャーで定量することにより決定する。
【０２３８】
実施例３：ＭｅｔＡＰ−２
メチオニルアミノペプチダーゼは，発生期ペプチド基質から非プロセシング様式でアミノ末端メチオニン残基を加水分解的に切断することにより翻訳後酵素的活性を有することが知られているメタロプロテアーゼである（Ｋｅｎｄａｌｌ，Ｒ．Ｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２０６６７−２０６７３）。この酵素のファミリーは，配列の相違に基づいて２種類に分類される（１型および２型）が，２つの種類の全体的な構造は類似している（Ｌｉｕ，Ｓ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２，１３２４−１３２７）。メチオニンアミノペプチダーゼ発現は，細胞増殖の制御に関与しているようである。ＭｅｔＡＰ遺伝子をＥ．Ｃｏｌｉからを欠失させると致死的である（Ｃｈａｎｇ，Ｓ．Ｙ．，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１，４０７１−４０７２）。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいては，ＭｅｔＡＰ−１または２のいずれかをコードする遺伝子を欠失させると，遅い成長の表現型が得られ，両方の遺伝子を欠失させると致死的である（Ｌｉ，Ｘ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９２，１２３５７−１２３６１）。（ヒトメチオニンアミノペプチダーゼ１，ＭｅｔＡＰ−１，受託番号Ｐ５３５８２）。
【０２３９】
この種類の酵素のアミノペプチダーゼ機能は，Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ（ＮＭＴ）活性とともに，シグナルペプチドの活性化において制御的役割を果たしているかもしれない。ＮＭＴは，酵母において致死的遺伝子から発現される（Ｄｕｒｏｎｉｏ，Ｒ．Ｊ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３，７９６８００）。ＮＭＴは，ミリスチン酸のアミノ末端を発生期ペプチドにライゲーションすることを担っており，アミノ末端メチオニン残基を有するペプチドには作用することができない（Ｒｅｓｈ，Ｍ．Ｄ．，１９９６，Ｃｅｌｌ．Ｓｉｇｎａｌ．，８，４０３−４１２）。蛋白質のミリストイル化は細胞内局在化事象と相関しており，何故ある種のシグナリング蛋白質の活性がＮＭＴに依存性であるかを決定するかもしれない（Ｔａｕｎｔｏｎ，Ｊ．，１９９７，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ，４，４９３−４９６）。蛋白質チロシンキナーゼＳｒｃは，その活性がミリストイル化に依存しており，固形腫瘍における低酸素症の誘導を介するヒト血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）発現の上流のレギュレータであると同定されている（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，Ｄ．，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ，３７５，５７７５８１）。したがって，ＭｅｔＡＰｓは，ＮＭＴによる発生期ペプチドの翻訳時修飾によりシグナルペプチド（例えばＶＥＧＦ）の活性化を制御するかもしれない。ＭｅｔＡＰの阻害により蛋白質のミリストイル化を混乱させると，シグナリング蛋白質が不適切に局在化し，細胞成長が阻害される。（ヒトＮ−ミリストイルトランスフェラーゼ，ｈＮＭＴ，受託番号ＡＦ０４３３２４）。
【０２４０】
真菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔｕｓのセスキテルペンジエポキシド代謝産物であるフマギリンおよび関連化合物ＴＮＰ−４７０は，培養内皮細胞の成長の強い阻害剤である。フマギリンの抗増殖およびおよび血管抑制（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃ）活性は，内皮細胞の培養皿へのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔｕｓの思いがけない夾雑により最初に発見され，このとき真菌のコロニーに最も近い細胞は成長阻害を示した。後にフマギリンの合成類似体が合成され，ＴＮＰ４７０が発見された。これはフマギリンより５０倍強力な阻害剤であり，マウスにおいて毒性がより低い（Ｉｎｇｂｅｒ，Ｄ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ，３４８，５５５−５５７）。内皮細胞をこれらの化合物で処理すると，後期Ｇ１期休止が生ずる。ＴＮＰ−４７０は，網膜芽細胞腫遺伝子産物のリン酸化，サイクリン依存性キナーゼｃｄｋ２およびｃｄｋ４の活性化，およびサイクリンＥおよびＡの発現のシグナリング経路を阻害する（Ａｂｅ，Ｊ．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，５４，３４０７−３４１２）。ＴＮＰ−４７０はまた，成長因子ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦにより誘導される内皮細胞増殖を強力に阻害することが示されている（Ｔｏｉ，Ｍ．，１９９４，ＯｎｃｏｌｏｇｙＲｅｐｏｒｔｓ，１，４２３−４２６）。
【０２４１】
二官能性蛋白質ＭｅｔＡＰ−２は，内皮細胞において抗増殖活性を示すフマギリンおよび関連化合物の分子標的として同定された。フマギリン−ビオチンコンジュゲートのアフィニティークロマトグラフィーを用いると，結合した基質との共有結合相互作用により６７−ｋＤａ哺乳動物蛋白質が単離された。単離された蛋白質から消化したペプチドフラグメントの分析は，ＭｅｔＡＰ−２が共有結合した基質であることを明らかにした。続く，ＭｅｔＡＰ−１およびＭｅｔＡＰ−２欠失株を用いる酵母における成長阻害研究により，ＭｅｔＡＰ−２がインビボでフマギリンにより選択的に阻害されることが示された（Ｓｉｎ，Ｎ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４，６０９９−６１０３）。新生血管形成の別の強力な阻害剤であるＴＮＰ−４７０およびオバリシンを用いる同様の研究は，ＭｅｔＡＰ−２がこれらのフマギリン関連化合物の分子標的であることを示した（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｅ．Ｃ．，１９９７，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ，４，４６１−４７１）。
【０２４２】
ＭｅｔＡＰ−２発現は，細胞成長と相関する。培養中の非分裂細胞は，イムノアッセイによって検出可能なレベルの６７−ｋＤａＭｅｔＡＰ−２蛋白質を有しない。ＭｅｔＡＰ−２は，真核生物開始因子２ａ（ｅＩＦ−２ａ）と会合することにより翻訳の開始に影響を与えることが示されている（Ｒａｙ，Ｍ．Ｋ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８９，５３９−５４３）。ＭｅｔＡＰ−２のｅＩＦ−２ａとの結合は，インビトロで網状赤血球溶解物中でｅＩＦ−２ａのヘム制御阻害剤キナーゼ（ＨＲＩ）リン酸化を阻害する（Ｄａｔｔａ，Ｂ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５，３３２４３３２８）。ＭｅｔＡＰ−２／ｅＩＦ−２ａ結合により，インビボで二本鎖ＲＮＡ依存性キナーゼ媒介性リン酸化による蛋白質合成阻害が部分的に逆転する（Ｗｕ，Ｓ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，８２７５−８２８０）。Ｇｒｉｆｆｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ．はまた，ＴＮＰ−４７０およびオバリシンの共有結合が，メチオニンアミノペプチダーゼ２型の活性を特異的に強力に阻害するが，ＭｅｔＡＰ−２のｅＩＦ−２ａに及ぼす制御活性に影響を及ぼさないことを示した。Ｇｒｉｆｆｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ．によるこの知見は，ＭｅｔＡＰ−２によるｅＩＦ−２ａリン酸化の制御がフマギリン関連化合物による内皮細胞増殖の阻害を担っている可能性を排除する。
【０２４３】
ＭｅｔＡＰ発現の調節と関連するかもしれない，新脈管形成に関連する特定の変性および疾病状態には，例えば，限定されないが，以下のものが含まれる。
【０２４４】
癌：固形腫瘍は，新たな血管の形成なしでは成長または転移することができない（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，１９９６，Ｃｅｌｌ，８６，３５３−３６４）。ＭｅｔＡＰの調節による新脈管形成の阻害は，広範な種類の癌の治療に用いることができる可能性がある。
【０２４５】
糖尿病性網膜症および加齢関連黄斑変性：糖尿病性網膜症においては眼の新生血管形成が観察され，これは，ＶＥＧＦのアップレギュレーションにより媒介される（Ａｄａｍｉｓ，Ａ．Ｐ．，１９９４，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌ．，１１８，４４５−４５０）。低酸素症誘導性ＶＥＧＦの発現に蛋白質キナーゼＳｒｃが必要であること（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，Ｄ．，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ，３７５，５７７−５８１）は，眼の新生血管形成を含む状態の治療にアミノペプチダーゼ活性のＭｅｔＡＰ調節を用いることができる可能性を示す。
【０２４６】
関節炎：関節炎における血管パンヌスの内方成長は，浸潤性炎症細胞，マクロファージ，および免疫細胞からの脈管形成因子の過剰発現により媒介されるかもしれない（Ｐｅａｃｏｃｋ，Ｄ．Ｊ．，１９９２，Ｊ．ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５，１１３５−１１３８）。ＭｅｔＡＰの調節による新脈管形成阻害は，関節炎の治療に用いることができる可能性がある。
【０２４７】
乾癬：新脈管形成は，脈管形成ポリペプチドであるインターロイキン−８の過剰発現および新脈管形成阻害剤であるスロンボスポンジンの発現の減少により乾癬に関与することが示唆されている（Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，Ｂ．Ｊ．，１９９４，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．４４，８２０−８２８）。ＭｅｔＡＰの調節による新脈管形成阻害は，乾癬の治療に用いることができる可能性がある。
【０２４８】
女性生殖：女性生殖器における新脈管形成は，生殖管のいくつかの疾患に関与することが示唆されている（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｌ．Ｐ．，１９９２，ＦＡＳＥＢ，６，８８６−８９２）。ＭｅｔＡＰの制御による新脈管形成の調節は，女性生殖および受胎能の分野で種々の用途を有するであろう。
【０２４９】
ＭｅｔＡＰ活性をアッセイするための種々の方法が開発されている。
【０２５０】
Ｇｒｉｆｆｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９５，１５１８３−１５１８８は，インビトロでのＭｅｔＡＰ−２活性の酵素的アッセイおよびインビボでのＭｅｔＡＰ−２活性の培養内皮細胞増殖アッセイを記載する。
【０２５１】
Ｗｅｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，国際公開９８／ＵＳ−２１２３１は，薬剤スクリーニングおよび化学療法剤を用いる治療に対するヒト癌細胞の化学的感受性を決定するために用いることができる，ＭｅｔＡＰ−２の活性を決定するのに用いることができる新規な蛍光レポーター分子および酵素的アッセイを記載する。
【０２５２】
Ｌａｒｒａｂｅｅ，Ｊ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，２６９，１９４−１９８は，酵素の不活性化の研究に用いるための，ＭｅｔＡＰ−２活性をアッセイするための高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の使用を記載する。
【０２５３】
脈管形成療法の有効性をアッセイするための定量方法が開発されている。
【０２５４】
Ｗａｎｔａｎａｂｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，３，３２４ａは，乳癌の予後の試験としてのヒト血清中の脈管形成ペプチド（ｂＦＧＦ）の定量を記載する。
【０２５５】
Ｎｇｕｙｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｎａｔｎ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．，８６，３５６−３６１は，広い範囲の癌を有する患者の尿における脈管形成ペプチド（ｂＦＧＦ）の定量を記載する。
【０２５６】
Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４，ＴｈｅＬａｎｃｅｔ，３４４，８２−８６は，脳腫瘍を有する小児の脳脊髄液における脈管形成ペプチド（ｂＦＧＦ）の定量を記載する。この仕事はまた，微細血管の計数を用いることにより組織学的切片における新生血管形成の程度を決定することを記載する。
【０２５７】
新脈管形成研究における現在の知識は，研究，診断，特性変更，動物の健康および治療上の使用のために，ＭｅｔＡＰ活性を調節することができる化合物が必要であることを示す。
【０２５８】
Ｇｒｉｆｆｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開９８５６３７２は，ＭｅｔＡＰ２の小分子阻害剤およびその使用を記載する。
【０２５９】
Ｄ’Ａｍａｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開９８０５２９３は，女性生殖系の制御および生殖組織の疾病の治療に用いるための，新脈管形成阻害剤としてのＡＧＭ−１４７０（ＴＮＰ−４７０）の使用を記載する。
【０２６０】
Ｄａｖｉｄｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許５，８０１，１４６は，哺乳動物クリングル５蛋白質を用いて新脈管形成を阻害するための化合物および方法を記載する。
【０２６１】
Ｃａｏ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許５，８５４，２２１は，蛋白質に基づく内皮細胞増殖阻害剤およびその使用方法を記載する。
【０２６２】
Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許５，８８８，７９６は，メチオニンアミノペプチダーゼ活性および抗ｅＩＦ−２リン酸化活性の２つの機能を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列のクローンを記載する。
【０２６３】
Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，３９，９８（ａｂｓｔｒ．）は，ヒトＭｅｔＡＰ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドによるヒト内皮細胞の妨害された増殖を記載する。
【０２６４】
ＶＥＧＦレセプター媒介性新脈管形成のリボザイム阻害を研究するためのラット角膜モデルが開発されている（Ｐａｖｃｏ，Ｐ．Ａ．，１９９９，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７，２５６９−２５７７）。ＭｅｔＡＰ−２阻害を用いる同様の研究を用いて，リボザイムに基づくＭｅｔＡＰ−２誘導性新脈管形成の阻害をインビボで研究することができるであろう。
【０２６５】
ヒトＭｅｔＡＰ−２ＲＮＡにおける潜在的標的部位の同定
コンピュータ折り畳みアルゴリズムを用いて，ヒトＭｅｔＡＰ−２の配列を，アクセス可能な部位についてスクリーニングした。二次折り畳み構造を形成せず，潜在的リボザイムおよび／またはアンチセンス結合／切断部位を含むＲＮＡの領域を同定した。これらの切断部位の配列は表９−１２に示される。
【０２６６】
ヒトＭｅｔＡＰ−２　ＲＮＡにおける酵素的核酸の切断部位の選択
コンピュータに基づくＲＮＡ折り畳みアルゴリズムにより予測された部位が，ＭｅｔＡＰ−２　ＲＮＡのアクセス可能部位に対応するか否かを試験するために，１１個のハンマーヘッドリボザイム、４個のＮＣＨおよび３個のＧ切断剤リボザイム部位を選択してさらに分析した（表１２）。リボザイム標的部位は，ヒトＭｅｔＡＰ−２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＨＳＵ２９６０７）を分析し，折り畳みに基づいて部位を順位づけることにより選択した。各標的に結合することができるリボザイムを設計し，コンピュータ折り畳みにより個々に分析して（Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．Ｔｈｅｏｃｈｅｍ，３１１，２７３；Ｊａｅｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，７７０６），リボザイム配列が適切な二次構造に折り畳まれるか否かを評価した。結合アームと触媒コアとの間に望ましくない分子内相互作用を有するリボザイムは考慮から除外した。以下に示されるように，種々の結合アームの長さを選択して，活性を最適化することができる。一般に，各アームに少なくとも５塩基あれば，標的ＲＮＡに結合するか，さもなくば相互作用することができる。
【０２６７】
ＭｅｔＡＰ−２　ＲＮＡの効率的な切断用のリボザイムの化学合成および精製
リボザイムは，ＲＮＡメッセンジャーの種々の領域にアニーリングするよう設計した。結合アームは，上述した標的部位配列に相補的である。リボザイムは化学的に合成した。用いた合成の方法は，上述し，Ｕｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８７Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５），Ｓｃａｒｉｎｇｅ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９０Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１８，５４３３）およびＷｉｎｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，（上掲）に記載される通常のＲＮＡ合成の方法にしたがい，一般的な核酸保護基およびカップリング基，例えば５’−末端にジメトキシトリチル，および３’−末端にホスホルアミダイトを用いた。平均段階カップリング収率は，＞９８％であった。
【０２６８】
リボザイムはまた，バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡテンプレートから合成した（Ｍｉｌｌｉｇａｎ　ａｎｄ　Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９８９，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８０，５１）。リボザイムは，一般的な方法を用いてゲル電気泳動により精製するか，または高速液体クロマトグラフィーにより精製し（ＨＰＬＣ；Ｗｉｎｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，（上掲）を参照；その全体を本明細書の一部としてここに引用する），水に再懸濁した。この実験に用いられた化学的に合成されたリボザイムの配列は以下の表９−１２に示される。
【０２６９】
ＭｅｔＡＰ−２　ＲＮＡ標的のインビトロでのリボザイム切断
ヒトＭｅｔＡＰ−２　ＲＮＡを標的とするリボザイムを上述のように設計し合成する。これらのリボザイムは，インビトロで，例えば以下の方法を用いて切断活性を試験することができる。ＭｅｔＡＰ−２　ＲＮＡ中の標的配列およびヌクレオチド位置は表９−１２に示される。
【０２７０】
切断反応：リボザイム切断アッセイ用の全長または部分全長の，内部標識した標的ＲＮＡは，［α−３２ｐ］ＣＴＰの存在下でインビトロ転写により調製し，スピンクロマトグラフィーによりＧ５０セファデックスカラムを通し，さらに精製することなく，基質ＲＮＡとして用いた。あるいは，Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて基質を５’−３２Ｐ−末端標識した。アッセイは，以下のように行った。２Ｘ濃度の精製リボザイムをリボザイム切断緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，３７℃，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２）中であらかじめ暖め，２Ｘリボザイム混合物を，これもあらかじめ暖めた緩衝液中の等量（１５μｌ）の基質ＲＮＡ（最大１−５ｎＭ）に加えることにより切断反応を開始した。最初のスクリーニングとして，アッセイは，４０ｎＭまたは１ｍＭリボザイムの最終濃度を用いて，すなわちリボザイム過剰で，３７℃で１時間行う。等量の９５％ホルムアミド，２０ｍＭ　ＥＤＴＡ，０．０５％ブロモフェノールブルーおよび０．０５％キシレンシアノールを加えることにより反応を急冷し，その後，試料を９５℃で２分間加熱し，急冷し，変性ポリアクリルアミドゲルに負荷する。基質ＲＮＡおよびリボザイム切断により生成した特異的ＲＮＡ切断生成物は，ゲルのオートラジオグラフィーにより可視化する。切断のパーセントは，無傷の基質および切断産物を示すバンドをホスファーイメージャー（登録商標）で定量することにより決定する。
【０２７１】
実施例４：ＢＡＣＥ，ｐｓ−１，ｐｓ−２
アルツハイマー病（ＡＤ）は，脳の進行性の変性性疾病であり，米国だけで約４００万人に影響を及ぼす。この疾病の治癒または最終的な予防が見いだされなければ，次世紀までに１４００万人の米国人がアルツハイマー病を有するであろうと見積もられている。６５歳以上の１０人に１人近く，８５歳以上の半分近くがアルツハイマー病を有する。アルツハイマー病は老齢者に限られるわけではなく，３０代および４０代の人々の少ない割合が早期開始ＡＤに罹患している。アルツハイマー病は，痴呆の最も一般的な形態であり，米国では心臓疾患および癌についで３番目に費用のかかる疾病である。年間１兆ドルがアルツハイマー病に費やされていると見積もられる（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９９）。
【０２７２】
アルツハイマー病は，不溶性プラークの進行的形成および４ｋＤのアミロイドβペプチド（Ａβ）から構成される脳血管の沈着により特徴づけられる。これらのプラークは，深いシナプス喪失，神経細線維もつれの形成，および神経膠症を示す異栄養性神経突起を特徴とする。Ａβは，大きなＩ型貫通膜蛋白質であるβ−アミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）の蛋白質分解性切断から生ずる（Ｋａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ，３２５，７３３）。ＡＰＰがプロセシングされてＡβを生成するためには，β−セクレターゼおよびγ−セクレターゼによる切断の２つの部位が必要である。ＡＰＰのβ−セクレターゼ切断により，１００ｋＤの可溶性アミノ末端フラグメントであるＡＰＰｓβが細胞質に放出されて，後に１２ｋＤの貫膜カルボキシ末端フラグメントであるＣ９９が残る。あるいは，ＡＰＰはα−セクレターゼにより切断されて，細胞質ＡＰＰｓαおよび貫膜Ｃ８３フラグメントを生成することができる。残った貫膜フラグメントＣ９９およびＣ８３はいずれも，γ−セクレターゼによりさらに切断されて，それぞれ，アルツハイマー関連Ａβおよび非病原性ペプチドｐ３が放出され分泌される（Ｖａｓｓａｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，７３５−７４１）。家族制アルツハイマー病の早期開始は，”スウェーデン型”家族制変異である，位置Ｐ１におけるＭｅｔからＬｅｕへの置換を有する変異体ＡＰＰ蛋白質により特徴づけられる（Ｍｕｌｌａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．，１，３４５）。このＡＰＰ変異は，β−セクレターゼ切断の劇的な増強を特徴とする（Ｃｉｔｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ，３６０，６７２）。
【０２７３】
β−アミロイド蛋白質の放出に関与するβ−セクレターゼおよびγ−セクレターゼの構成成分の同定は，アルツハイマー病治療戦略の開発において第一に重要である。この点に関して，α−セクレターゼの特性決定もまた重要である。これは，α−セクレターゼ切断はβ−セクレターゼ切断と競合して，病原性蛋白質に対する非病原性蛋白質が産生されるかもしれないためである。ＡＡＰのα−切断においては２つのメタロプロテアーゼＡＤＡＭ１０およびＴＡＣＥの関与が示されている（Ｂｕｘｂａｕｍ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，２７７６５，およびＬａｍｍｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６，３９２２）。γ−セクレターゼ活性の研究は，プレセニリン依存性を示し（ＤｅＳｔｏｏｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，３８７，およびＤｅＳｔｏｏｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ，３９８，５１８），このように，プレセニリンは蛋白質分解活性を示さないにもかかわらず，プレセニリンはγ−セクレターゼであると提唱されている（Ｗｏｌｆｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ，３９８，５１３）。
【０２７４】
最近，Ｖａｓｓａｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，（上掲）は，貫膜アスパラギン酸プロテアーゼベータ部位ＡＰＰ切断酵素であるＢＡＣＥによるＡＡＰのβ−セクレターゼ切断を報告する。一方，β−セクレターゼの他の潜在的な候補も提唱されている（概説として，Ｅｖｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６，３９２２を参照）。いずれも，この酵素から予測される完全な範囲の特徴を示していない。Ｖａｓｓａｒ　ｅｔ　ａｌ，（上掲）は，ＢＡＣＥ発現および局在化はβ−セクレターゼについて予測されたとおりであり，細胞におけるＢＡＣＥの過剰発現によりＡＰＰおよびスウェーデン型ＡＰＰのβ−セクレターゼ切断が増加すること，単離されたＢＡＣＥはＡＰＰ由来ペプチド基質に対して部位特異的蛋白質分解活性を示すこと，およびアンチセンス媒介性の内因性ＢＡＣＥ阻害によりβ−セクレターゼ活性が劇的に減少することを示す。
【０２７５】
アルツハイマー病の現在の治療戦略は，症状の予防または軽減および／または疾病進行の遅延のいずれかに依存する。アルツハイマーの治療において認可されている２つの薬剤であるドネペジル（Ａｒｉｃｅｐｔ（登録商標））およびタクリン（Ｃｏｇｎｅｘ（登録商標））はいずれも，脳において利用可能なアセチルコリンの量を増加させることにより，認識能力の喪失を遅らせることを目的とするコリン作動性薬である。抗酸化化合物，例えばアルファ−トコフェロール（ビタミンＥ），メラトニン，およびセレゲリン（Ｅｌｄｅｐｒｙｌ（登録商標））を用いる抗酸化剤療法により，フリーラジカルの障害を最小限にすることにより疾病の進行を遅らせることが試みられている。エストロゲン置換療法は，限定されたデータに基づいて，アルツハイマー病の発達に予防的有益性を有する可能性があると考えられている。抗炎症剤の使用は，アルツハイマーのリスクの減少とも関連するであろう。ニモジピン（登録商標）などのカルシウムチャネルブロッカーは，神経細胞をカルシウムの過負荷から保護し，このことにより神経細胞の生存を長くするため，アルツハイマー病の治療に有益である可能性があると考えられている。神経親和性（ｎｏｏｔｒｏｐｉｃ）化合物，例えばアセチル−Ｌ−カルニチン（Ａｌｃａｒ（登録商標）；）およびインスリンは，細胞代謝に基づく認識および記憶機能の増強のため，アルツハイマーの治療にある程度有益であると提唱されている。
【０２７６】
上述の治療戦略はすべて，アルツハイマー患者における生活の質を向上させるかもしれないが，この疾病の包括的な治療および予防が必要とされている。このように，アルツハイマー病に伴う生理学的変化を逆転させるのに効果的な治療剤，特にアミロイドβペプチドの沈着を排除および／または逆転させることができる治療剤が必要とされている。アミロイドβペプチドの放出を助けるプロテアーゼ，すなわちβ−セクレターゼ（ＢＡＣＥ）およびγ−セクレターゼ（プレセニリン）の発現を調節する化合物の使用は治療上重要である。
【０２７７】
Ｔｓａｉ　ｅｔ　ａｌ，１９９９，Ｂｏｏｋ　ｏｆ　Ａｂｓｔｒａｓｔｓ，２１８　ｔｈ　ＡＣＳ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｎｅｗ　Ｏｒｌｅａｎｓ，Ａｕｇ　２２−２６は，γ−セクレターゼ阻害によるアミロイドβペプチドのペプチド模倣阻害剤である，基質に基づくジフルオロケトンのアルファアミノイソ酪酸誘導体を記載する。
【０２７８】
Ｃｚｅｃｈ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開／９９２１８８６は，プレセニリンとβ−アミロイドペプチドまたはその前駆体との間の相互作用を阻害しうる，治療に用いるためのペプチドを記載する。
【０２７９】
Ｆｏｕｒｎｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開／９９１６８７４は，治療における使用を目的とする，プレセニリンと相互作用しうるヒト脳蛋白質およびこれらをコードするｃＤＮＡを記載する。
【０２８０】
Ｓｔ．Ｇｅｏｒｇｅ−Ｈｙｓｌｏｐ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開／９７２７２９６は，治療用途を目的として，プレセニリンと相互作用する蛋白質の遺伝子およびアルツハイマー病におけるこれらの役割を記載する。
【０２８１】
Ｖａｓｓａｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，７３５−７４１は，脂質媒介性トランスフェクションにより１０１細胞およびＡＰＰｓｗ細胞において内因性ＢＡＣＥ発現の阻害を研究するために用いられる，ＢＡＣＥを標的とする特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを記載する。
【０２８２】
Ｖａｓｓａｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，７３５−７４１は，ＢＡＣＥ阻害を研究するための細胞培養モデルを記載する。ＢＡＣＥｍＲＮＡを標的とする特異的アンチセンス核酸分子を用いて，脂質媒介性トランスフェクションにより，１０１細胞およびＡＰＰｓｗ（スウェーデン型アミロイド前駆体蛋白質を発現）細胞において内因性ＢＡＣＥ発現の阻害研究を行った。アンチセンス治療により，ＢＡＣＥ　ｍＲＮＡ（ノザンブロット分析による），およびＡＰＰｓｐｓｗ（”スウェーデン”型ｐ−セクレターゼ切断産物）（ＥＬＩＳＡによる）の両方が劇的に減少し，いずれのパラメータも最大阻害は７５−８０％であった。またこのモデルを用いてＡＰＰｓｗ細胞におけるアミロイドβ−ペプチドの産生に及ぼすＢＡＣＥ阻害の影響を研究した。
【０２８３】
Ｇａｍｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ，３７３，５２３−５２７は，変異体ヒト家族性型ＡＰＰ（Ｖａｌの代わりにＰｈｅ７１７）が過剰発現しているトランスジェニックマウスモデルを記載する。このモデルにより，アルツハイマー病の多くの病理学的特徴の多くを進行的に発生するマウスが得られ，そのようにして治療用薬剤を試験するモデルを提供している。
【０２８４】
ＢＡＣＥ発現の調節と関連しうる特定の変性および疾病状態には，限定されないが，アルツハイマー病および痴呆が含まれる。
【０２８５】
ドネペジル，タクリン，セレゲリン，およびアセチル−Ｌ−カルニチンは，本発明の核酸分子（例えば，リボザイムおよびアンチセンス分子）と組み合わせてまたはこれとともに用いることができる医薬品の非限定的例である。当業者は，利尿剤および抗高血圧化合物等の他の薬剤および療法を本発明の核酸分子（例えば，リボザイムおよびアンチセンス分子）と同様に容易に組み合わせることができ，したがって本発明の範囲内であることを認識するであろう。
【０２８６】
ヒトＢＡＣＥ　ＲＮＡにおける潜在的標的部位の同定
コンピュータ折り畳みアルゴリズムを用いて，ヒトＢＡＣＥの配列を，アクセス可能な部位についてスクリーニングした。二次折り畳み構造を形成せず，潜在的リボザイムおよび／またはアンチセンス結合／切断部位を含むＲＮＡの領域を同定した。これらの切断部位の配列は表１８−２３に示される。
【０２８７】
ヒトＢＡＣＥ　ＲＮＡにおける酵素的核酸の切断部位の選択
リボザイム標的部位は，ヒトＢＡＣＥ（Ｇｅｎｂａｎｋ配列受託：ＡＦ１９０７２５）を分析し，折り畳みに基づいて部位を順位づけることにより選択した。各標的に結合することができるリボザイムを設計し，コンピュータ折り畳みにより個々に分析して（Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．Ｔｈｅｏｃｈｅｍ，３１１，２７３；Ｊａｅｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，７７０６），リボザイム配列が適切な二次構造に折り畳まれるか否かを評価した。結合アームと触媒コアとの間に望ましくない分子内相互作用を有するリボザイムは考慮から除外した。以下に示されるように，種々の結合アームの長さを選択して，活性を最適化することができる。一般に，各アームに少なくとも５塩基あれば，標的ＲＮＡに結合するか，さもなくば相互作用することができる。
【０２８８】
ＢＡＣＥ　ＲＮＡの効率的な切断および／または妨害用のリボザイムおよびアンチセンスの化学合成および精製
リボザイムおよびアンチセンス構築物は，ＲＮＡメッセンジャーの種々の領域にアニーリングするよう設計した。リボザイムの結合アームは，上述した標的部位配列に相補的であり，アンチセンス構築物は上述した標的部位配列に完全に相補的である。リボザイムおよびアンチセンス構築物は化学的に合成した。用いた合成の方法は，上述し，Ｕｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８７Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５），Ｓｃａｒｉｎｇｅ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９０　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１８，５４３３）およびＷｉｎｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，（上掲）に記載される通常のＲＮＡ合成の方法にしたがい，一般的な核酸保護基およびカップリング基，例えば５’−末端にジメトキシトリチル，および３’−末端にホスホルアミダイトを用いた。平均段階カップリング収率は，＞９８％であった。
【０２８９】
リボザイムおよびアンチセンス構築物はまた，バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡテンプレートから合成した（Ｍｉｌｌｉｇａｎ　ａｎｄ　Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９８９，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８０，５１）。リボザイムおよびアンチセンス構築物は，一般的な方法を用いてゲル電気泳動により精製するか，または高速液体クロマトグラフィーにより精製し（ＨＰＬＣ；Ｗｉｎｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，（上掲）を参照；その全体を本明細書の一部としてここに引用する），水に再懸濁した。この実験に用いられた化学的に合成されたリボザイムおよびアンチセンス構築物の配列は以下の表１８−２３に示される。
【０２９０】
ＢＡＣＥ　ＲＮＡ標的のインビトロでのリボザイム切断
ヒトＢＡＣＥ　ＲＮＡを標的とするリボザイムを上述のように設計し合成する。これらのリボザイムは，インビトロで，例えば以下の方法を用いて切断活性を試験することができる。ＢＡＣＥ　ＲＮＡ中の標的配列およびヌクレオチド位置は表１８−２３に示される。
【０２９１】
切断反応：リボザイム切断アッセイ用の全長または部分全長の，内部標識した標的ＲＮＡは，［α−３２Ｐ］ＣＴＰの存在下でインビトロ転写により調製し，スピンクロマトグラフィーによりＧ５０セファデックスカラムを通し，さらに精製することなく，基質ＲＮＡとして用いる。あるいは，Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて基質を５’−３２Ｐ−末端標識する。アッセイは，以下のように行う。２Ｘ濃度の精製リボザイムをリボザイム切断緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，３７℃，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２）中であらかじめ暖め，２Ｘリボザイム混合物を，これもあらかじめ暖めた緩衝液中の等量の基質ＲＮＡ（最大１−５ｎＭ）に加えることにより切断反応を開始する。最初のスクリーニングとして，アッセイは，４０ｎＭまたは１ｍＭリボザイムの最終濃度を用いて，すなわちリボザイム過剰で，３７℃で１時間行う。等量の９５％ホルムアミド，２０ｍＭ　ＥＤＴＡ，０．０５％ブロモフェノールブルーおよび０．０５％キシレンシアノールを加えることにより反応を急冷し，その後，試料を９５℃で２分間加熱し，急冷し，変性ポリアクリルアミドゲルに負荷する。基質ＲＮＡおよびリボザイム切断により生成した特異的ＲＮＡ切断生成物は，ゲルのオートラジオグラフィーにより可視化する。切断のパーセントは，無傷の基質および切断産物を示すバンドをホスファーイメージャー（登録商標）で定量することにより決定する。
【０２９２】
実施例５：ホスホランバン
心不全につながる心臓疾患は，先進国において罹患率および死亡率の組み合わせの主な原因である。世界で２０００万人近くが心不全関連疾病に罹患している。５００万人の米国人がうっ血性心不全（ＣＨＦ）に苦しめられていると見積もられており，毎年４００，０００人が新たに診断される。米国においては，心臓疾患に関連する機能不全により，毎年約４０，０００人が死亡しており，さらに２５０，０００人の死亡がこれに伴う（Ｈａｒｎｉｓｈ，１９９９，Ｄｒｕｇ＆Ｍａｒｋｅｔ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１０，１１４−１１９）。心不全関連疾病は，老齢の集団における罹患率および発症率が全体的に増加しており，急性心筋梗塞形成（ＡＭＩ）の生存者が多いため，主要な公共衛生問題である（Ｋａｎｎｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ｂｒ．Ｈｅａｒｔ．Ｊ．，７２（ｓｕｐｐｌ），３）。米国においては，心不全関連疾病は，老齢患者の入院の最も一般的な理由である。これらの患者の期待生存年数は多くの一般的な癌より短く，男性および女性の５年生存率はそれぞれわずか２５％および３８％であり，重篤な心不全の１年死亡率は５０％である（Ｈｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８８，１０７）。
【０２９３】
心臓疾患は，障害を有する心臓の不十分なポンピング活性から生ずる心臓出力の進行的な減少により特徴づけられる。その結果としての血管背圧により，末梢および肺の機能不全性うっ血が生ずる。心臓は，心臓出力の増加の要求に応えて筋肉質量を増加させることにより，種々の機械的，血流力学的，ホルモン的および病原的刺激に応答する。これによる心臓組織の変質（心筋肥大）は，遺伝的，生理学的，および環境的因子の結果として生ずる可能性がある。これは，臨床的心臓疾患の初期徴候であり，その後の心不全の重要なリスク因子である（Ｈｕｎｔｅｒ　ａｎｄ　Ｃｈｉｅｎ，１９９９，Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊ．ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，９９，３１３−３２２）。
【０２９４】
冠状心臓疾患は，心臓疾患状態の発達の主要な因子であり，その前にＡＭＩ，高血圧，糖尿病，および心臓弁疾患を伴う。心臓疾患の診断には，心エコーイメージングによる，冠状心臓疾患に伴う左心室収縮期機能不全（ＬＶＳＤ）および／または左心室拡張期機能不全（ＬＶＤＤ）の判定が含まれる（Ｃｌｅｌａｎｄ，１９９７，Ｄｉｓ　Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｏｕｔｃｏｍｅｓ，１，１６９）。有望な診断はまた，心房ナトリウム排泄促進性ペプチド（ＡＮＰ）および脳ナトリウム排泄促進性ペプチド（ＢＮＰ）濃度のアッセイにしたがうことができる。ＡＮＰおよびＢＮＰのレベルは，心室機能不全のレベルを示す（Ｄａｖｉｄｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，７７，８２８）。
【０２９５】
心臓疾患に関連する不全の現在の治療戦略は様々である。利尿剤は，液性過負荷を有する患者において肺浮腫および呼吸困難を減少させるためにしばしば用いられており，通常は血管拡張用のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤とともに用いられる。ジゴキシンは心臓疾患の治療用の向イオン剤としての別の一般的な選択であるが，ジゴキシンの長期間の有効性および安全性に関しては疑問が残っている（Ｈａｒｎｉｓｈ，１９９９，Ｄｒｕｇ＆Ｍａｒｋｅｔ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１０，１１４−１１９）。心臓疾患の進行を遅らせるために，ベータブロッカーであるカルベジオールを導入して上述の治療を補足する。心臓疾患に罹患した患者における突然死のリスクを低下させるために，抗不整脈剤を用いることができる。最後に，心臓移植は進行した段階の心臓疾患を有する患者の治療に有効であるが，ドナー心臓の供給が限定されているために，この治療の範囲を広い集団に広げることは非常に制限されている（Ｈａｒｎｉｓｈ，１９９９，Ｄｒｕｇ＆Ｍａｒｋｅｔ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１０，１１４−１１９）。
【０２９６】
上述の治療戦略はすべて心臓疾患に関連する罹患率および死亡率を改善することができるが，疾病状態の心臓を治癒するための現存する唯一の決定的な方法は移植による置き換えである。健康な移植された心臓であっても，機械的，血流力学的，ホルモン的および外因性のリスク因子に関連する病原的刺激の種々のストレスに応答して疾病になりうる。そのように，心臓疾患に関連する生理学的変化の軽減に有効な治療剤が必要とされている。
【０２９７】
心筋肥大およびアポトーシスは，心臓肥大および機能不全に伴う基礎的な変性性過程である。種々のシグナリング経路が心筋肥大および心筋アポトーシスの進行に関与している。遺伝的研究は，心臓筋肉細胞のインビトロアッセイおよび遺伝子工学処理された動物のインビボ研究により，これらの経路および心臓疾患における関与を解明する手段である。
【０２９８】
心筋細胞において特定の遺伝子の発現を変化させる研究は，特定のペプチドホルモン，成長因子，およびサイトカインが肥大性応答の種々の特徴を活性化しうることを示している（Ｈｕｎｔｅｒ　ａｎｄ　Ｃｈｉｅｎ，１９９９，Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，９９，３１３−３２２）。これらの研究から特徴づけられている特定の物質には，心不全に関与する潜在的な治療標的および分子標的が含まれる。Ｈｕｎｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｈｉｅｎ，ＫＲ，ｅｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂａｓｉｓ　ｏｆ　ｈｅａｒｔ　ｄｉｓｅａｓｅ：ａ　ｃｏｍｐａｎｉｏｎ　ｔｏ　Ｂｒａｕｎｗａｌｄ’ｓ　Ｈｅａｒｔ　Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，１９９９：２１１−２５０は，心不全に関与する一群の治療の標的および分子標的を記載しており，これには以下のものが含まれる：
１．病原的肥大を阻害するためのエンドセリン１およびアンジオテンシンＩＩレセプターアンタゴニスト，およびｒａｓ，ｐ３８，およびｃ−ｊｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）のアンタゴニスト
２．生理学的肥大の促進のためのインスリン様成長因子Ｉおよび成長ホルモンレセプター刺激
３．神経液性過剰刺激の阻害のためのベータ−１−アドレナリン作動性レセプターブロッカー
４．筋小胞体カルシウムＡＴＰａｓｅ阻害を軽減して心筋収縮および弛緩応答の増強を与えるための，ホスホランバンおよびサルコリピン小分子阻害剤
５．Ｇ蛋白質共役レセプターキナーゼの脱感作を妨げて心筋の収縮および弛緩応答の増強を与えるための，β−アドレナリン作動性レセプターキナーゼの小分子阻害剤
６．心臓組織におけるエネルギー欠乏を軽減するための脈管形成性成長因子（ＶＥＧＦ，ＦＧＦ−５）の増強
７．筋細胞生存の促進剤，例えばｇｐ１３０リガンド（カルジオトロピン１），および筋細胞のアポトーシスの阻害のためのニューレギュリン
８．筋細胞のアポトーシスの阻害のためのアポトーシス阻害剤，例えばカスパース阻害剤
９．筋細胞のアポトーシスの阻害のためのサイトカイン，例えばＴＮＦ−アルファの阻害剤
【０２９９】
うっ血性心不全，心不全，拡張型心筋症および圧力過負荷肥大は，上述の一群の分子標的に関連しうる疾患および疾病状態の非限定的例である。
【０３００】
心臓疾患および疾病につながる心臓収縮能力の機能不全は，心臓の興奮／収縮の連結の障害により支配され，この過程に関与するシグナリング経路の重要性を指摘する。筋小胞体によるサイトゾルＣａ２＋の放出および取り込みは，心臓の収縮および興奮の核サイクルにおいて不可欠な役割を果たす（Ｍｉｎａｍｉｓａｗａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｃｅｌｌ，９９，３１３−３２２）。Ｃａ２＋の再取り込みの過程は，心臓の筋小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ２ａ）により媒介される。ＳＥＲＣＡ２ａ活性は，ホスホランバン（ｐ５２筋特異的筋小胞体リン蛋白質）により制御される（Ｋｏｓｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，７９，１０５９−１０６３，およびＳｉｍｍｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．，７８，９２１−９４７）。ホスホランバンは，その活性なリン酸化されていない状態において，ＳＥＲＣＡ２ａ活性の強力な阻害剤である。ホスホランバンのセリン１６におけるサイクリックＡＭＰ依存性蛋白質キナーゼ（ＰＫＡ）またはカルモジュリンキナーゼによるリン酸化により，ホスホランバンのＳＥＲＣＡ２ａとの相互作用が阻害される。このリン酸化事象は，主として，筋小胞体中へのＣａ２＋の取り込みの速度の比例的上昇およびその結果としての心室弛緩によるものである（Ｔａｄａ　ｅｔ　ａｌ．，１９８２，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４６，７３−９５，ａｎｄＬｕｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，４７３４−４７３９）。
【０３０１】
Ｃａ２＋取り込みの比例的減少は，心不全に特徴的であるため（Ｓｏｒｄａｈｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９７３，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２２４，４９７−５０２），およびホスホランバンのＳＥＲＣＡ２ａに対する相対的比率の増加は心不全における筋小胞体の機能不全の重要な決定因子であるため（Ｈａｓｅｎｆｕｓｓ，１９９８，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．，３７，２７９−２８９），ホスホランバンおよび関連する制御因子を心臓疾患の治療の標的とすることは，心臓適応症において価値があるはずである。
【０３０２】
Ｐｙｓｔｙｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開９９／００１３２は，冠状動脈を直接拡張することにより冠動脈の流れを増加させるためのホスホランバンの小分子阻害剤として，１−オキサ，アザおよびチアナフタレン−２−オンのビスエーテルを記載する。
【０３０３】
Ｐｙｓｔｙｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開９９／１５５２３は，心不全の治療に有用なホスホランバンの小分子阻害剤として，１−オキサ，アザおよびチアナフタレン−２−オンのビスエーテルを記載する。
【０３０４】
上述の治療戦略の効力は限定的である。分子標的の小分子阻害は，投与量および全体の効力を制限する毒性のため，しばしば限定的である。
【０３０５】
Ｈｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１００，９７４−９８０は，変異体ホスホランバンの内因性発現およびホスホランバンアンチセンスＲＮＡを用いて，ＳＥＲＣＡ２ａ活性および心筋細胞収縮性に及ぼす対応する効果を調べることを記載する。
【０３０６】
心臓疾患の治療に対するより魅力的な方法には，心不全に関与する標的分子の発現を調節するリボザイムおよび／またはアンチセンス構築物の使用が含まれるであろう。本発明の核酸分子の使用により，目的とする分子標的，例えばホスホランバン（ＰＬＮ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２６６７），サルコリピン（ＳＬＮ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３０６３），アンジオテンシンＩＩレセプター（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ２０８６０），エンドセリン１レセプター（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１９５７），Ｋ−ｒａｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４９８５），ｐ３８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０９２５３５），ｃ−ｊｕｎＮ末端キナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２７５０，Ｌ３１９５１，ＮＭ＿００２７５３），成長ホルモンレセプター（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００１６３），インスリン様成長因子Ｉレセプター（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００８７５），ベータ−１−アドレナリン作動性レセプター（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００２４），ｐｌ−アドレナリン作動性レセプターキナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１６１９，ＮＭ＿００５１６０），ＶＥＧＦレセプター（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ４３３６８，Ｍ２７２８１Ｘ１５９９７），繊維芽細胞成長因子５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４４６４），カルジオトロピンＩ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１３３０），ニューレギュリン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ００９２２７），ＴＮＦ−アルファ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０２９１０Ｘ０２１５９），ＰＩ３キナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６２１８，ＮＭ＿００６２１９，Ｕ８６４５３，ＮＭ＿００２６４９，Ｍ６１９０６），およびＡＫＴキナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５１６３，Ｍ７７１９８）の高度に特異的な制御が可能である。
【０３０７】
インビトロおよびインビボでホスホランバン活性をアッセイする種々の方法が開発されている。Ｈｏｌｔ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，３１，６４５−６５６は，収縮の甲状腺ホルモン制御およびＣａ２＋−ＡＴＰａｓｅ／ホスホランバン複合体を成人ラット心室筋細胞において研究する細胞培養モデルを記載する。Ｓｌａｃｋ　ｅｔ　ａｌ．１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１８８６２−１８８６８は，マウス単収縮骨格筋細胞におけるホスホランバンの異所性発現が筋小胞体Ｃａ２＋輸送および筋肉弛緩を変化させる研究を記載する。ＭａｃＬｅｎｎａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｓｏｃ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｅｒ．，５１，８９−１０３は，カルシウムＡＴＰａｓｅｓとホスホランバンとの間の制御的相互作用の総説において，異種細胞培養実験において発現されている蛋白質におけるホスホランバン／Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ相互作用を記載する。Ｃｏｒｎｗｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９９１，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４０，９２３−９３１は，血管平滑筋細胞における局在化したサイクリックＧＭＰ依存性蛋白質キナーゼによる筋小胞体蛋白質リン酸化の制御を記載する。
【０３０８】
Ｍｉｎａｍｉｓａｗａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｃｅｌｌ，９９，３１３−３２２は，誘導性拡張型心筋症からの保護を与えるホスホランバンノックアウトマウスモデルを記載する。Ｄｉｌｌｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，８３，８９Ｈ−９１Ｈは，カルシウム制御蛋白質，例えばホスホランバンの発現の変化，および筋細胞収縮応答に及ぼすこれらの影響を研究するためのトランスジェニックラットモデルを記載する。Ｌｅｋａｎｎｅ　Ｄｅｐｒｅｚ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，３０，１８７７−１８８８は，ホスホランバン，心房性ナトリウム尿排泄亢進ペプチド（ＡＮＰ），筋小胞体カルシウムＡＴＰａｓｅ２（ＳＥＲＣＡ２），コラーゲンＥａｌ，およびカルセケストリン（ＣＳＱ）の遺伝子発現の変化を調べるためのラット圧力過負荷モデルを記載する。Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０１，１３８５−１３９３は，カルセケストリンを過剰発現するトランスジェニックマウス心筋細胞においてカルシウムシグナリングの制御を研究するためのマウスモデルを記載する。この研究においては，カルシウム取り込みおよび放出蛋白質，例えばホスホランバンのアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションを測定した。Ｌｏｒｅｎｚ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，ＡｍＪ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７３，６は，無傷のマウスにおける心臓機能に及ぼすホスホランバンの制御効果を研究するためのマウスモデルを記載する。この研究においては，ホスホランバンのレベルを変化させてホスホランバンの生理学的役割のインビボ評価を可能とした動物モデルが用いられている。Ａｒａｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｓａｉｓｈｉｎ　Ｉｇａｋｕ，５１，１０９５−１１０４は，心臓欠陥の異常を発現する動物モデルを標的とする遺伝子の総説を示す。マウスにおけるホスホランバンおよび他の蛋白質発現の改変の影響の研究が記載されている。Ｗａｎｋｅｒｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，４８７−４９６は，機能不全および機能不全でない心臓におけるカルシウム輸送蛋白質の研究を記載する総説を示す。主要なカルシウム統御心筋蛋白質，例えばホスホランバンを研究する動物モデルが記載される。これらのモデル，ならびに他のモデルを用いて，本発明の核酸分子による治療が心臓機能に及ぼす影響を評価することができる。エンドポイントは，限定されないが，左心室圧，時間の関数としての左心室圧（ＬＶｄＰ／ｄｔ），および平均動脈血圧であろう。エンドポイントは，基底状態および刺激状態（心臓負荷）において評価されるであろう。
【０３０９】
ホスホランバン発現の調節に関連しているかもしれない特定の変性状態および疾病状態には，限定されないが，うっ血性心不全，心不全，拡張型心筋症および圧力過負荷肥大が含まれる。
【０３１０】
本発明の核酸分子（例えば，リボザイムおよびアンチセンス分子）と組み合わせてまたはこれとともに用いることができる医薬品の非限定的例は，ジゴキシン，ベンドロフルアジド，ドフェチリド，およびカルベジオールである。当業者は，利尿剤および抗高血圧化合物等の他の薬剤および療法を本発明の核酸分子（例えば，リボザイムおよびアンチセンス分子）と同様に容易に組み合わせることができ，したがって本発明の範囲内であることを認識するであろう。
【０３１１】
ヒトホスホランバンＲＮＡにおける潜在的標的部位の同定
コンピュータ折り畳みアルゴリズムを用いて，ヒトホスホランバンの配列を，アクセス可能な部位についてスクリーニングした。二次折り畳み構造を形成せず，潜在的リボザイムおよび／またはアンチセンス結合／切断部位を含むＲＮＡの領域を同定した。これらの切断部位の配列は表２４−３０に示される。
【０３１２】
ヒトホスホランバンＲＮＡにおける酵素的核酸の切断部位の選択
リボザイム標的部位は，ヒトホスホランバン（Ｇｅｎｂａｎｋ配列受託番号：ＮＭ＿００２６６７）を分析し，折り畳みに基づいて部位を順位づけることにより選択した。各標的に結合することができるリボザイムを設計し，コンピュータ折り畳みにより個々に分析して（Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．Ｔｈｅｏｃｈｅｍ，３１１，２７３；Ｊａｅｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，７７０６），リボザイム配列が適切な二次構造に折り畳まれるか否かを評価した。結合アームと触媒コアとの間に望ましくない分子内相互作用を有するリボザイムは考慮から除外した。以下に示されるように，種々の結合アームの長さを選択して，活性を最適化することができる。一般に，各アームに少なくとも５塩基あれば，標的ＲＮＡに結合するか，さもなくば相互作用することができる。
【０３１３】
ホスホランバンＲＮＡの効率的な切断および／または妨害用のリボザイムおよびアンチセンスの化学合成および精製
リボザイムおよびアンチセンス構築物は，ＲＮＡメッセンジャーの種々の領域にアニーリングするよう設計した。リボザイムの結合アームは，上述した標的部位配列に相補的であり，アンチセンス構築物は上述した標的部位配列に完全に相補的である。リボザイムおよびアンチセンス構築物は化学的に合成した。用いた合成の方法は，上述し，Ｕｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８７Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５），Ｓｃａｒｉｎｇｅ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９０Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１８，５４３３）およびＷｉｎｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，（上掲）に記載される通常のＲＮＡ合成の方法にしたがい，一般的な核酸保護基およびカップリング基，例えば５’−末端にジメトキシトリチル，および３’−末端にホスホルアミダイトを用いた。平均段階カップリング収率は，＞９８％であった。
【０３１４】
リボザイムおよびアンチセンス構築物はまた，バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡテンプレートから合成した（Ｍｉｌｌｉｇａｎ　ａｎｄ　Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９８９，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８０，５１）。リボザイムおよびアンチセンス構築物は，一般的な方法を用いてゲル電気泳動により精製するか，または高速液体クロマトグラフィーにより精製し（ＨＰＬＣ；Ｗｉｎｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，（上掲）を参照；その全体を本明細書の一部としてここに引用する），水に再懸濁した。この実験に用いられた化学的に合成されたリボザイムおよびアンチセンス構築物の配列は以下の表２４−３０に示される。
【０３１５】
ホスホランバンＲＮＡ標的のインビトロでのリボザイム切断
ヒトホスホランバンＲＮＡを標的とするリボザイムを，上述のように設計し合成する。これらのリボザイムは，インビトロで，例えば以下の方法を用いて切断活性を試験することができる。ホスホランバンＲＮＡ中の標的配列およびヌクレオチドの位置は表２４−３０に示される。
【０３１６】
切断反応：リボザイム切断アッセイ用の全長または部分全長の，内部標識した標的ＲＮＡは，［α−３２Ｐ］ＣＴＰの存在下でインビトロ転写により調製し，スピンクロマトグラフィーによりＧ５０セファデックスカラムを通し，さらに精製することなく，基質ＲＮＡとして用いる。あるいは，Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて基質を５’−３２Ｐ−末端標識する。アッセイは，以下のように行う。１５μｌの２Ｘ濃度の精製リボザイムをリボザイム切断緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，３７℃，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２）中であらかじめ暖め，２Ｘリボザイム混合物を，これもあらかじめ暖めた緩衝液中の等量の基質ＲＮＡ（最大１−５ｎＭ）に加えることにより切断反応を開始する。最初のスクリーニングとして，アッセイは，４０ｎＭまたは１ｍＭリボザイムの最終濃度を用いて，すなわちリボザイム過剰で，３７℃で１時間行う。等量の９５％ホルムアミド，２０ｍＭ　ＥＤＴＡ，０．０５％ブロモフェノールブルーおよび０．０５％キシレンシアノールを加えることにより反応を急冷し，その後，試料を９５℃で２分間加熱し，急冷し，変性ポリアクリルアミドゲルに負荷する。基質ＲＮＡおよびリボザイム切断により生成した特異的ＲＮＡ切断生成物は，ゲルのオートラジオグラフィーにより可視化する。切断のパーセントは，無傷の基質および切断産物を示すバンドをホスファーイメージャー（登録商標）で定量することにより決定する。
【０３１７】
マウスにおけるＢｒｄＵ標識アンチセンスの組織分布
ＣＤ１マウスに１回ボーラス（３０ｍｇ／ｋｇ）のＢｒｄＵ標識アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは同様のモル量のＢｒｄＵ（対照として）を注入した。種々の時点（３０分，２時間および６時間）において，マウスを犠牲にし，主要な組織を単離し，固定した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの分布は，抗ＢｒｄＵ抗体での探索および免疫組織学的染色により決定した。組織切片を抗ＢｒｄＵ抗体で，次にレポーター酵素コンジュゲート化第二抗体で，最後に酵素基質で探索した。発色した産物を顕微鏡下で可視化したところ，核染色が示され，このことは，アンチセンスオリゴヌクレオチドが心臓組織中で有効に分布していることを示す。
【０３１８】
サルにおけるＢｒｄＵ標識リボザイムの組織分布
ＢｒｄＵ標識リボザイムを０．１，１．０，および１０ｍｇ／ｋｇで１日１回５日間の静脈内ボーラス注射によりアカゲザルに投与した。対照動物には食塩水を注射した。動物を犠牲にし，主要な組織を単離し，固定した。組織試料を抗ＢｒｄＵ抗体で，次にレポーター酵素コンジュゲート化第二抗体で，最後に酵素基質で探索した。この投与養生計画の後，心臓組織において有意な量の化学的に修飾したリボザイムが検出される。
【０３１９】
実施例６：ＨＢＶ
慢性Ｂ型肝炎は，Ｂ型肝炎ウイルスまたはＨＢＶとして一般に知られている，エンベロープを有するウイルスにより引き起こされる。ＨＢＶは，感染した血液または他の体液，特に唾液および精液，出産中，性的行動，または感染した血液が夾雑した針の共有により伝染する。個人は，”キャリア”であるかもしれず，疾病の症状を体験することなく他人に感染を伝染させるかもしれない。最も高いリスクを有する者は，多数の性的パートナーを有する者，性伝染性疾病の病歴を有する者，非経口薬剤の使用者，感染した母親から生まれた新生児，感染者と”密接な”接触を有するかその性的パートナーである者，および医療施設の従業者または血液と接触する他の職場の従業員である。刺青，耳または身体の穿刺，鍼による伝染もありうる。ウイルスはまた，かみそり，歯ブラシ，ほ乳瓶，食事道具，および人工呼吸装置，測定器および装置などのある種の病院の機器上で安定である。ＨＢｓＡｇ陽性の食事取扱者が職業上の設定において健康上のリスクを与えるという証拠も，これらの者が仕事から除外されるべきであるという証拠もない。Ｂ型肝炎は，食物伝達性疾病であるという証拠が示されたことはない。平均潜伏期間は６０−９０日間であり，４５−１８０日間の範囲である。日数は，その者が暴露されたウイルスの量に関係するようである。しかし，症状の開始が潜行性であるため，潜伏期の長さを判定することは困難である。約５０％の患者が急性肝炎の症状を発症し，これは１−４週間続く。これらの患者の２％またはそれ以下が激症肝炎を発症し，肝不全となり死亡する。
【０３２０】
重篤度の決定因子には以下のものが含まれる：（１）患者が暴露された量の多さ；（２）患者の年齢，より若い患者はより軽い形の疾病を有する；（３）免疫系の状態，免疫抑制されている患者はより軽い症例である；および（４）デルタウイルス（Ｄ型肝炎）との共感染が存在するかしないか，共感染によってより重篤な症例となる。徴候的な症例においては，臨床上の兆候には，食欲喪失，悪心，嘔吐，右上腹部の痛み，関節痛，および疲れ／エネルギー喪失が含まれる。黄疸はすべての症例では見られないが，黄疸は感染が輸血または経皮的血清輸送によるものである場合にはより起こりやすく，患者によっては軽いかゆみを伴う。暗色の尿および黄褐色の便においてビリルビンの上昇が示され，右上部の痛みを伴う肝臓の肥大が生ずる。疾病の急性期には，重症のうつ病，髄膜炎，ギヤン−バレー症候群，脊髄炎，脳炎，顆粒球減少症，および／または血小板減少症を伴う。
【０３２１】
Ｂ型肝炎は一般に自己制限疾患であり，約６か月で消散する。ウイルスの存在により血中に大量のＨＢｓＡｇが産生されるため，徴候的な症例は，血清試験により検出することができる。この抗原は活動性の感染の最初のかつ最も有用な診断マーカーである。しかし，ＨＢｓＡｇが２０週間またはそれ以上陽性のままである場合，その者はおそらく永久に陽性のままであり，すなわちキャリアである。ＨＢＶにかかる６歳以上の者の１０％のみがキャリアになるが，１歳までに感染した新生児の９０％はキャリアになる。
【０３２２】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は，世界で３億人以上が感染している（Ｉｍｐｅｒｉａｌ，１９９９，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．，１４（ｓｕｐｐｌ），Ｓ１−５）。米国においては，約１２５万人が血中に測定可能なＢ型肝炎ウイルス表面抗原ＨＢｓＡｇを有することからＨＢＶの慢性キャリアである。慢性ＨＢｓＡｇキャリアになるリスクは，感染を獲得した様式，ならびに感染時の年齢に依存する。高いレベルのウイルス複製を有する者については，慢性の活動性の肝炎が肝硬変，肝不全および肝細胞癌（ＨＣＣ）に移行することが一般的であり，ＨＢＶによる末期肝疾患を有する患者には肝臓移植が唯一の治療法である。
【０３２３】
慢性ＨＢＶ感染は１０−２０年の期間にわたり自然に進行して，２０−５０％の患者が肝硬変になり，ＨＢＶ感染の肝細胞癌への進行は詳細に解明されている。おそらく肝硬変および／または肝細胞癌に進行するであろう亜集団を判定した研究はないため，すべての患者が進行の等しいリスクを有する。
【０３２４】
肝細胞癌であると診断された患者の生存率は最初の診断からわずか０．９−１２．８か月であることに注目することが重要である（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３，Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，８８，２４０−２４３）。肝細胞癌の化学療法剤による治療は有効であることが証明されておらず，肝臓の広範囲の腫瘍侵襲のため，患者の１０％しか外科手術の恩恵を受けられない（Ｔｒｉｎｃｈｅｔ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ｐｒｅｓｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２３，８３１−８３３）。原発性肝細胞癌の攻撃的な性質のため，外科手術に代わる唯一の実行可能な治療は肝臓移植である（Ｐｉｃｈｌｍａｙｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．，２０，３３Ｓ−４０Ｓ）。
【０３２５】
肝硬変への進行に際して，慢性ＨＣＶ感染を有する患者は，最初の原因にかかわらず，臨床的肝硬変に共通する臨床上の特徴を示す（Ｄ’Ａｍｉｃｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９８６，Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　ａｎｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，３１，４６８−４７５）。これらの臨床上の特徴には，出血性食道静脈瘤，腹水，黄疸，および脳障害（Ｚａｋｉｍ　Ｄ，ＢｏｙｅｒＴ　Ｄ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　ａ　ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　ｌｉｖｅｒ　Ｄｅｓｅａｓｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　Ｖｏｌｕｍｅ　１．１９９０Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）が含まれる。肝硬変の初期においては，患者は代償性であると分類され，これは肝臓組織の障害は生じているが，患者の肝臓はまだ血流中の代謝産物を解毒することができることを意味する。さらに，代償性肝臓疾病を有するほとんどの患者は無症候性であり，症状を有するわずかの者は，軽い症状，例えば消化不良および虚弱のみをうったえる。肝硬変の後期においては，患者は代償不全であると分類され，これは血流中の代謝産物を解毒する能力が減少することを意味し，上述した臨床上の特徴が存在するのはこの段階である。
【０３２６】
１９８６年，Ｄ’Ａｍｉｃｏらは，アルコール性およびウイルス関連性肝硬変の両方を有する１１５５人の患者における臨床的発現および生存率を記載した（Ｄ’Ａｍｉｃｏ（上掲））。１１５５人の患者のうち，４３５（３７％）が代償性疾病を有したが，７０％は研究の開始時には無症候性であった。残りの７２０人の患者（６３％）は，代償不全肝臓疾病を有しており，７８％が腹水，３１％が黄疸，１７％が出血，および１６％が脳障害の病歴を示した。肝細胞癌は，代償性疾病を有する６人（０．５％）の患者および代償不全疾病を有する３０人（２．６％）の患者に観察された。
【０３２７】
６年間の経過のあいだに，代償性肝硬変を有する患者は１年に１０％の割合で，代償不全疾病の臨床的特徴を発達させた。ほとんどの場合，腹水が代償不全の最初の表示であった。さらに，６年間の実験の終了までに，最初に代償性疾病を示した５９人の患者で肝細胞癌が発達した。
【０３２８】
生存に関しては，Ｄ’Ａｍｉｃｏ研究は，研究したすべての患者の５年生存率がわずか４０％であることを示した。最初に代償性肝硬変を有していた患者の６年生存率は５４％であったが，最初に代償不全疾病を示した患者の６年生存率はわずか２１％であった。アルコール性肝硬変を有した患者とウイルス関連性肝硬変を有した患者との間には，生存率の有意な相違はなかった。Ｄ’Ａｍｉｃｏ研究における患者の死亡の主要な原因は，肝不全が４９％；肝細胞癌が２２％；および出血が１３％であった（Ｄ’Ａｍｉｃｏ（上掲））。
【０３２９】
Ｂ型肝炎ウイルスは，二本鎖の環状ＤＮＡウイルスである。これは，Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅファミリーのメンバーである。ウイルスは，コア抗原（ＨＢｃＡｇ）を含む中心コアおよびこれを囲む表面蛋白質／表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を含むエンベロープから構成され，直径４２ｎｍである。これはまたｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）を含み，これはＨＢｃＡｇおよびＨＢｓＡｇとともにこの疾病の同定において有用である。
【０３３０】
ＨＢＶビリオンにおいては，ゲノムは不完全な二本鎖形として見いだされる。ＨＢＶは，リバーストランスクリプターゼを用いてそのゲノムの正センスの全長ＲＮＡ版をＤＮＡに逆転写する。このリバーストランスクリプターゼはまたＤＮＡポリメラーゼ活性を含み，したがって，新たに合成されたマイナスセンスＤＮＡ鎖を複製し始める。しかし，コア蛋白質はこれが複製を完了する前にリバーストランスクリプターゼ／ポリメラーゼをカプシド化するようである。
【０３３１】
ウイルスは，自由浮遊形態から，最初にそれ自身を宿主細胞の膜に特異的に付着させなければならない。ウイルスの付着は宿主および組織の特異性を決定する非常に重要な工程の１つである。しかし，現在のところ，ＨＢＶで感染させることができるインビトロ細胞株はない。ＨＢＶ　ＤＮＡを用いる過渡的または安定なトランスフェクションの際にのみウイルス複製を支持することができるいくつかの細胞株，例えばＨｅｐＧ２が存在する。
【０３３２】
付着した後，ウイルスエンベロープと宿主の膜との融合が生じて，ゲノムおよびポリメラーゼを含むウイルスコア蛋白質が細胞に入ることが可能とならなければならない。いったん内部に入ると，ゲノムは核に移動し，ここで修復されて環化される。
【０３３３】
ＨＢＶの完全な閉環状ＤＮＡゲノムは核内に残り，４つの転写産物を生ずる。これらの転写産物は独特の部位で始まるが，同じ３’−末端を共有する。３．５−ｋｂのプレゲノムＲＮＡは逆転写のテンプレートとして働き，これもヌクレオカプシド蛋白質およびポリメラーゼをコードする。この転写産物の５’−末端の延長を有するサブクラスは，プロセシング後にＨＢＶｅ抗原として分泌されるプレコア蛋白質をコードする。２．４−ｋｂのＲＮＡは，大きな表面蛋白質をコードするｐｒｅ−Ｓ１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を包含する。２．１−ｋｂのＲＮＡは，それぞれ中程度のおよび小さい表面蛋白質をコードするｐｒｅ−Ｓ２およびＳＯＲＦを包含する。最も小さい転写産物（約０．８ｋｂ）は，転写アクチベータであるＸ蛋白質をコードする。
【０３３４】
ＨＢＶゲノムの増殖は感染細胞の核中で始まる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩは，環状のＨＢＶ　ＤＮＡを転写して，全長より長いｍＲＮＡを生成する。ｍＲＮＡは実際の完全な環状ＤＮＡより長いため，余分の末端が形成される。プレゲノムＲＮＡは，いったん生成されると，核に存在し，細胞質に入る。
【０３３５】
プレゲノムＲＮＡのコア粒子中へのパッケージングは，ＨＢＶポリメラーゼが５’イプシロンステム−ループに結合することにより開始される。ＲＮＡのカプシド化は，結合が生じてすぐに生ずると考えられている。ＨＢＶポリメラーゼはまた，機能するためには付随するコア蛋白質を必要とするようである。ＨＢＶポリメラーゼは５’イプシロンステム−ループの３−４塩基対から逆転写を開始させ，この点においてポリメラーゼおよび結合している発生期ＤＮＡはＤＲ１領域の３’コピーに移る。いったんここに移ると，（−）ＤＮＡはＨＢＶポリメラーゼにより伸長され，一方ＲＮＡテンプレートはＨＢＶポリメラーゼＲＮＡｓｅＨ活性により分解される。ＨＢＶポリメラーゼが５’末端に到達したとき，ＲＮＡの小さいストレッチはＲＮＡｓｅＨ活性により消化されずに残る。このＲＮＡのセグメントは，すぐ上流の小さい配列から構成され，ＤＲ１領域を含む。次に，ＲＮＡオリゴマーが移動し，（−）ＤＮＡの５’末端でＤＲ２領域にアニーリングする。これは，やはりＨＢＶポリメラーゼにより生成される（＋）ＤＮＡ合成のプライマーとして用いられる。逆転写ならびにプラス鎖合成は完成したコア粒子中で生ずるようである。
【０３３６】
プレゲノムＲＮＡはＤＮＡ合成のテンプレートとして必要であるため，このＲＮＡは，リボザイム切断の優れた標的である。ＨＢＶ複製を阻害することが示されているヌクレオシド類似体は，プレゲノムＲＮＡをＤＮＡに変換するのに必要なリバーストランスクリプターゼ活性を標的とする。プレゲノムＲＮＡテンプレートのリボザイム切断により，ＨＢＶ複製が同様に阻害されると予測される。さらに，プレゲノムＲＮＡのすべてのＨＢＶ転写産物に共通する３’−末端を標的とすることにより，すべてのＨＢＶ遺伝子産物が減少し，ＨＢＶ複製のさらなるレベルの阻害が得られるであろう。
【０３３７】
上述したように，ＨＢＶは培養細胞に感染しない。しかし，ＨＢＶ　ＤＮＡをＨｕＨ７またはＨｅｐＧ２肝細胞にトランスフェクション（頭−尾型ダイマーまたは１００％より大きい”オーバーレングス”ゲノムのいずれかとして）すると，ウイルス遺伝子が発現され，ＨＢＶビリオンが産生されて培地中に放出される。すなわち，ＨＢＶ複製能を有するＤＮＡを，リボザイムとともに培養細胞にコトランスフェクトすることができる。そのような方法を用いて，ＨＢＶに対する細胞内リボザイム活性が報告されている（ｚｕＰｕｔｌｉｔｚ，　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３，５３８１−５３８７，およびＫｉｍ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２５７，７５９−７６５）。さらに，ＨＢＶを発現する安定な肝細胞細胞株が作成されている。これらの細胞においては，リボザイムのみを輸送することが必要であるが，輸送スクリーニングを行うことが必要であろう。さらに，ＨＢＶを発現する安定な肝細胞細胞株が作成されている。
【０３３８】
細胞内ＨＢＶ遺伝子発現は，ＨＢＶ　ＲＮＡのＴａｑｍａｎ（登録商標）アッセイによりまたはＨＢＶ蛋白質のＥＬＩＳＡによりアッセイすることができる。細胞外ウイルスは，ＤＮＡ用のＰＣＲまたは蛋白質用のＥＬＩＳＡによりアッセイすることができる。抗体は，ＨＢＶ表面抗原およびコア蛋白質について市販されている。分泌性アルカリホスファターゼ発現プラスミドを用いて，トランスフェクション効率および試料回収率の相違を標準化することができる。
【０３３９】
ＨＢＶ複製を研究するための小さい動物モデルがいくつか存在する。その１つはＨＢＶ感染肝臓組織を放射性照射マウスに移植することである。ウイルス血症（ＰＣＲによりＨＢＶ　ＤＮＡを測定することにより証明しうる）は移植の８日後に最初に検出され，ピークは１８−２５日である（Ｉｌａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２９，５５３−５６２）。
【０３４０】
ＨＢＶを発現するトランスジェニックマウスもまた，潜在的抗ウイルスを評価するためのモデルとして用いられている。ＨＢＶ　ＤＮＡは肝臓および血清の両方で検出可能である（Ｍｏｒｒｅｙ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ａｎｔｉｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ．，４２，９７−１０８）。
【０３４１】
別のモデルは，ＨＢＶでトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞を用いてヌードマウスに皮下腫瘍を樹立することである。腫瘍は，接種後約２週間で発達し，ＨＢＶ表面抗原およびコア抗原を発現する。ＨＢＶ　ＤＮＡおよび表面抗原はまた，腫瘍含有マウスの循環中でも検出することができる（Ｙａｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｊ．ＶｉｒａｌＨｅｐａｔ．，３，１９−２２）。
【０３４２】
ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）は，そのウイルス構造，遺伝的構成，および複製のメカニズムにおいてＨＢＶと密接に関連する。ヒトにおけるＨＢＶと同様に，持続性のＷＨＶ感染は天然のウッドチャック集団に一般的であり，慢性肝炎および肝細胞癌（ＨＣＣ）と関連している。実験的研究により，ウッドチャックにおいてＷＨＶがＨＣＣを引き起こすことが確立されており，慢性的にＷＨＶに感染したウッドチャックは，多数の抗ウイルス剤を試験するモデルとして用いられてきた。例えば，ヌクレオシド類似体３Ｔ３は，ウイルスの用量依存性減少を引き起こすことが観察されている（最高用量での２回の毎日治療の後に５０％減少）（Ｈｕｒｗｉｔｚ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，４２，２８０４−２８０９）。
【０３４３】
治療の現在の目標は３点である：ＨＢＶの感染性および他人への伝達を排除する，肝臓疾病の進行を休止させ，臨床的予後を改良する，および肝細胞癌（ＨＣＣ）の発生を予防する。
【０３４４】
インターフェロンアルファの使用は，ＨＢＶの最も一般的な療法である。しかし，最近，ラミブジン（３ＴＣ）がＦＤＡにより認可された。インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−アルファ）は，慢性Ｂ型肝炎の１つの治療法である。ＩＦＮ−アルファ療法の標準的な期間は１６週間であるが，最適な治療期間の長さはまだよくわかっていない。完全な応答（ＨＢＶ　ＤＮＡネガティブＨＢｅＡｇネガティブ）は，患者の約２５％に生ずる。治療に対する望ましい応答を予測するいくつかの因子が同定されており，これには，高ＡＬＴ，低ＨＢＶ　ＤＮＡ，女性であること，および異性愛指向であることが含まれる。
【０３４５】
応答に成功した後であっても，Ｂ型肝炎ウイルスの再活性化の危険がある。これは応答した者の約５％に，通常は１年以内に生ずる。
【０３４６】
１型インターフェロンを用いる治療から生ずる副作用は，４つの一般的なカテゴリーに分類することができる：インフルエンザ様症状，神経精神医学的副作用，実験室的異常，および他の種々の副作用。インフルエンザ様症状の例には，疲労，発熱；筋肉痛，倦怠感，食欲喪失，頻拍，硬直，頭痛および関節痛が含まれる。インフルエンザ様症状は，通常は短期間であり，投与の最初の４週間までには弱まる傾向にある（Ｄｕｓｈｅｉｋｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒａｌ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ，１，３−５）。神経精神医学的副作用には，被刺激性，無関心，気分変化，不眠，認識変化，および抑うつが含まれる。実験室的異常には，骨髄性細胞，例えば顆粒球，血小板およびより程度は低いが赤血球の減少が含まれる。これらの血液細胞数の変化は，有意な臨床的後遺症につながることはほとんどない。さらに，トリグリセリド濃度の増加および血清アラニンおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ濃度の上昇が観察されている。最後に，甲状腺異常が報告されている。これらの甲状腺異常は，通常はインターフェロン療法の休止後には可逆的であり，療法の間の適切な投薬により管理することができる。その他の副作用には，悪心，下痢，腹痛および背痛，かゆみ，脱毛，および鼻漏が含まれる。一般に，ほとんどの副作用は，４−８週間の療法の後には弱まるであろう（Ｄｕｓｈｉｅｋｏ　ｅｔ　ａｌ．，（上掲））。
【０３４７】
ラミブジン（３ＴＣ）は，ＨＢＶ　ＤＮＡ合成の非常に強力かつ特異的な阻害剤であるヌクレオシド類似体である。ラミブジンは，最近慢性Ｂ型肝炎の治療用に認可された。インターフェロンを用いる治療とは異なり，３ＴＣを用いる治療は患者からＨＢＶを排除しない。その代わりに，ウイルス複製を制御して，慢性的な投与により患者の５０％において肝臓組織学が改良される。３ＴＣによる第ＩＩＩ相試験は，１年間の治療が肝臓の炎症の減少および肝臓の瘢痕の遅延を伴うことを示した。さらに，ラミブジン（１００ｍｇ／ｄａｙ）で処置した患者は，Ｂ型肝炎ＤＮＡの９８％の減少および有意に高い比率のセロコンバージョンを有しており，このことは，治療の完了後に疾病が改良されたことを示唆する。しかし，治療を中止すると，ほとんどの患者においてＨＢＶ複製が再活性化される。さらに，最近の報告は，患者の約３０％に３ＴＣ耐性が生ずることを示した。
【０３４８】
ＨＢＶ発現の調節に関連しうる特定の変性および疾病状態には，限定されないが，ＨＢＶ感染，肝炎，癌，腫瘍形成，肝硬変，肝不全等が含まれる。
【０３４９】
ラミブジン（３ＴＣ），Ｌ−ＦＭＡＵ，アデフォビル，ジピボキシル，１型インターフェロン，治療用ワクチン，ステロイド，および２’−５’オリゴアデニル酸は，本発明の核酸分子（例えば，リボザイムおよびアンチセンス分子）と組み合わせてまたはこれとともに使用することができる医薬品の非限定的例である。当業者は，利尿剤および抗高血圧化合物等の他の薬剤および療法を本発明の核酸分子（例えば，リボザイムおよびアンチセンス分子）と同様に容易に組み合わせることができ，したがって本発明の範囲内であることを認識するであろう。
【０３５０】
ＨＢＶ感染を治療するための現在の療法，例えばインターフェロンおよびヌクレオシド類似体は，部分的に有効であるにすぎない。さらに，現在ヌクレオシド類似体に対する薬剤耐性が現れており，慢性Ｂ型肝炎の治療をさらに困難にしている。したがって，急性および慢性Ｂ型肝炎感染の療法の治療において現在用いられているものとは異なるメカニズムにより作用する抗ウイルス阻害剤を用いる，この疾病の有効な治療が必要とされている。
【０３５１】
Ｄｒａｐｅｒ，米国特許６，０１７，７５６は，Ｂ型肝炎ウイルスの阻害のためのリボザイムの使用を記載する。
【０３５２】
Ｐａｓｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２６８（３），７２８−７３３．；Ｇａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｏｌｌ．ＰＬＡ，１３（３），１５７−１５９．；Ｌｉ　ｅ　ｔａｌ．，１９９９，Ｊｉｅｆａｎｇｉｕｎ　Ｙｉｘｕｅ　Ｚａｚｈｉ，２４（２），９９−１０１．；Ｐｕｔｌｉｔｚ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３（７），５３８１−５３８７．；Ｋｉｍ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２５７（３），７５９−７６５．；Ｘｕ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｂｉｎｇｄｕ　Ｘｕｅｂａｏ，１４（４），３６５−３６９．；Ｗｅｌｃｈ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．，４（７），７３６−７４３．；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，国際公開９７／０８３０９，Ｗａｎｄｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｊ．ｏｆ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１２（ｓｕｐｐｌ．），Ｓ３５４−Ｓ３６９．；Ｒｕｉｚ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２２（２），３３８−３４５．；Ｇａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｏｌｌ．ＰＬＡ，１１（３），１７１−１７５．；Ｂｅｃｋ　ａｎｄ　Ｎａｓｓａｌ，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２３（２４），４９５４−６２．；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，１９９５，国際公開９５／２２６００．；Ｘｕ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３，Ｂｉｎｇｄｕ　Ｘｕｅｂａｏ，９（４），３３１−６．；Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３，Ｂｉｎｇｄｕ　Ｘｕｅｂａｏ，９（３），２７８−８０はすべて，特定のＨＢＶ標的部位を切断することを標的とするリボザイムを記載する。
【０３５３】
本発明の酵素的核酸分子は，感染細胞中のウイルスｍＲＮＡにのみ高い特異性を示す。高度に保存された配列領域を標的とする本発明の核酸分子は，単一の化合物で多くの株のヒトＨＢＶを治療することが可能である。現在，ＨＢＶによる肝細胞のトランスフォーメーションを担うウイルス遺伝子の発現を特異的に攻撃する治療は存在しない。
【０３５４】
本発明の方法を用いて，ヒトＢ型肝炎ウイルス感染を治療することができる。これには，増殖性ウイルス感染，不顕性または持続性ウイルス感染，およびＨＢＶ誘導性肝細胞トランスフォーメーションが含まれる。この用途は，非ヒト動物に感染し，そのような感染が獣医学的に重要であるＨＢＶの他の種に拡張することができる。
【０３５５】
好ましい標的部位は，ウイルス複製に必要な遺伝子であり，その非限定的例には，蛋白質合成のための遺伝子，例えばＨＢＶプレゲノムｍＲＮＡの最も５’側の１５００ヌクレオチドが含まれる。配列の参照のためには，Ｒｅｎｂａｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉ．Ｓｉｎ．，３０，５０７を参照。この領域は，リバーストランスクリプターゼのテンプレートとして働くことにより，コア蛋白質（Ｃ），Ｘ蛋白質（Ｘ）およびＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ）遺伝子の翻訳発現を制御し，ウイルスＤＮＡの複製において役割を果たす。ＲＮＡ中のこの領域を破壊すると，不十分な蛋白質合成，ならびに不完全なＤＮＡ合成（および不完全なゲノムからの転写の阻害）が生ずる。カプシド化部位の５’側の配列を標的とすると，コアビリオン構造中に破壊された３’ＲＮＡを封入することができ，カプシド化部位の３’側の配列を標的とすると，３’および５’フラグメントの両方からの蛋白質発現を減少させることができる。
【０３５６】
プレゲノムｍＲＮＡの最も５’側の１５００ヌクレオチドの外側の別の領域もまた，ＨＢＶ複製の酵素的核酸媒介性阻害の適当な標的である。そのような標的には，ウイルスＳ遺伝子をコードするｍＲＮＡ領域が含まれる。特定の標的領域の選択は，プレゲノムｍＲＮＡの二次構造に依存するであろう。また，特にこれらの他のＲＮＡにおける折り畳みおよびアクセス可能性のアッセイから，プレゲノムｍＲＮＡ種中では利用可能ではない追加の標的配列が明らかになった場合には，小さいｍＲＮＡ中の標的も用いることができる。
【０３５７】
プレゲノムＲＮＡ中の望ましい標的は，ウイルス複製に重要であると考えられている，プレゲノムＲＮＡの３’−末端における提唱される二裂ステム−ループ構造である（Ｋｉｄｄ　ａｎｄ　Ｋｉｄｄ−Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ，１９９６．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．２４：３２９５−３３０２）。ＨＢＶプレゲノムＲＮＡの５’末端には，シス作用カプシド化シグナルがあり，これは二裂ステム−ループ構造を形成すると考えられている反転反復配列を有する。プレゲノムＲＮＡの余分の末端のため，３’−末端においても推定ステム−ループが生ずる。ポリメラーゼ結合およびカプシド化において機能するものは５’コピーであるが，逆転写は実際には３’ステム−ループから開始される。逆転写を開始するには，５’カプシド化シグナル中のバルジをテンプレートとして用いて，ポリメラーゼに共有結合した４ｎｔプライマーが作成される。次に，このプライマーは未知のメカニズムにより３’ステム−ループ構造中のＤＲ１プライマー結合部位にシフトし，この点から逆転写が進行する。３’ステム−ループ，および特にＤＲ１プライマー結合部位は，リボザイムによる介在の非常に有効な標的であるようである。
【０３５８】
プレゲノムＲＮＡの配列は，表面，コア，ポリメラーゼ，およびＸ蛋白質のｍＲＮＡで共通である。ＨＢＶ転写産物の重複する性質のため，すべてが共通の３’−末端を有する。したがって，この共通の３’−末端を標的とするリボザイムは，プレゲノムＲＮＡならびに表面，コア，ポリメラーゼおよびＸ蛋白質のｍＲＮＡのすべてを切断するであろう。
【０３５９】
好ましい態様においては，本発明は，ＨＢＶ蛋白質を分析する方法を特徴とする。この方法は，ＨＢＶ阻害剤の効力を測定するのに有用である。詳細には，本発明は，ＨＢｓＡｇ蛋白質および分泌性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）対照蛋白質を分析して，ＨＢＶ発現を調節するのに用いられる薬剤の効力を決定するためのアッセイを特徴とする。
【０３６０】
この方法は，マイクロタイタープレートを，緩衝液（例えば，炭酸緩衝液，例えばＮａ２ＣＯ３　１５ｍＭ，ＮａＨＣＯ３　３５ｍＭ，ｐＨ９．５）中０．１−１０ｐｇ／ｍｌの抗体，例えば抗ＨＢｓＡｇＭａｂ（例えば，Ｂｉｏｓｔｒｉｄｅ　Ｂ８８−９５−３ｌａｄ，ａｙ）を４℃で一夜コーティングすることからなる。次にマイクロタイターをＰＢＳＴまたはその同等物（例えば，ＰＢＳ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し，ＰＢＳＴ，１％ＢＳＡまたはその同等物で３７℃で０．１−２４時間ブロッキングする。上述のように洗浄した後，ウエルを乾燥（例えば，３７℃で３０分間）させる。ビオチニル化ヤギ抗ＨＢｓＡｇまたは同等の抗体（例えば，Ａｃｃｕｒａｔｅ　ＹＶＳ１８０７）をＰＢＳＴ中に希釈（例えば１：１０００で）し，ウエル中でインキュベートする（例えば，３７℃で１時間）。ウエルをＰＢＳＴで洗浄する（例えば，４回）。コンジュゲート（例えば，ストレプトアビジン／アルカリホスファターゼコンジュゲート，Ｐｉｅｒｃｅ２１３２４）をＰＢＳＴ中に１０−１０，０００ｎｇ／ｍｌで希釈し，ウエル中でインキュベートする（例えば，３７℃で１時間）。上述のように洗浄した後，基質（例えば，ｐ−ニトロフェニルリン酸基質，Ｐｉｅｒｃｅ３７６２０）をウエルに加え，次にこれをインキュベートする（例えば，３７℃で１時間）。次に，光学密度を測定する（例えば，４０５ｎｍで）。次に例えばＧｒｅａｔ　ＥｓｃＡＰｅ（登録商標）検出キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｋ２０４１−１）を用いて，製造元の指針にしたがって，ＳＥＡＰレベルをアッセイする。上述の例においては，インキュベーション時間および試薬濃度を変化させて最適な結果を得ることができる。実施例６に非限定的例が記載される。
【０３６１】
このＨＢｓＡｇＥＬＩＳＡ法をＷｏｒｌｄＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．１５２７１　ＮＷ　６０ｔｈ　Ａｖｅ，＃；２０１，Ｍｉａｍｉ　Ｌａｋｅｓ，ＦＬ　３３０１４（３０５）８２７３３０４（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＥＬ１００１８）の市販のアッセイと比較すると，感度（シグナル：ノイズ）が３−２０倍増加する。
【０３６２】
ヒトＨＢＶ　ＲＮＡにおける潜在的標的部位の同定
コンピュータ折り畳みアルゴリズムを用いて，ヒトＨＢＶの配列を，アクセス可能な部位についてスクリーニングした。二次折り畳み構造を形成せず，潜在的リボザイムおよび／またはアンチセンス結合／切断部位を含むＲＮＡの領域を同定した。これらの切断部位の配列は表３６−４３に示される。
【０３６３】
ヒトＨＢＶ　ＲＮＡにおける酵素的核酸の切断部位の選択
リボザイム標的部位は，ヒトＨＢＶの配列（付託番号：ＡＦ１００３０８．１）を分析し，折り畳みに基づいて部位を順位づけることにより選択した。各標的に結合することができるリボザイムを設計し，コンピュータ折り畳みにより個々に分析して（Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．Ｔｈｅｏｃｈｅｍ，３１１，２７３；Ｊａｅｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，７７０６），リボザイム配列が適切な二次構造に折り畳まれるか否かを評価した。結合アームと触媒コアとの間に望ましくない分子内相互作用を有するリボザイムは考慮から除外した。以下に示されるように，種々の結合アームの長さを選択して，活性を最適化することができる。一般に，各アームに少なくとも５塩基あれば，標的ＲＮＡに結合するか，さもなくば相互作用することができる。
【０３６４】
ＨＢＶ　ＲＮＡの効率的な切断および／または妨害用のリボザイムおよびアンチセンスの化学合成および精製
リボザイムおよびアンチセンス構築物は，ＲＮＡメッセンジャーの種々の領域にアニーリングするよう設計した。リボザイムの結合アームは，上述した標的部位配列に相補的であり，アンチセンス構築物は上述した標的部位配列に完全に相補的である。リボザイムおよびアンチセンス構築物は化学的に合成した。用いた合成の方法は，上述し，Ｕｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８７Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５），Ｓｃａｒｉｎｇｅ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９０　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１８，５４３３）およびＷｉｎｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，（上掲）に記載される通常のＲＮＡ合成の方法にしたがい，一般的な核酸保護基およびカップリング基，例えば５’−末端にジメトキシトリチル，および３’−末端にホスホルアミダイトを用いた。平均段階カップリング収率は，＞９８％であった。
【０３６５】
リボザイムおよびアンチセンス構築物はまた，バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡテンプレートから合成した（Ｍｉｌｌｉｇａｎ　ａｎｄ　Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９８９，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８０，５１）。リボザイムおよびアンチセンス構築物は，一般的な方法を用いてゲル電気泳動により精製するか，または高速液体クロマトグラフィーにより精製し（ＨＰＬＣ；Ｗｉｎｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，（上掲）を参照；その全体を本明細書の一部としてここに引用する），水に再懸濁した。この実験に用いられた化学的に合成されたリボザイムの配列は以下の表４３に示される。
【０３６６】
ＨＢＶ　ＲＮＡ標的のインビトロでのリボザイム切断
ヒトＨＢＶ　ＲＮＡを標的とするリボザイムを上述のように設計し合成する。これらのリボザイムは，インビトロで，例えば以下の方法を用いて切断活性を試験することができる。ＨＢＶ　ＲＮＡ中の標的配列およびヌクレオチドの位置は表３６−４３に示されている。
【０３６７】
切断反応：リボザイム切断アッセイ用の全長または部分全長の，内部標識した標的ＲＮＡは，［α−３２Ｐ］ＣＴＰの存在下でインビトロ転写により調製し，スピンクロマトグラフィーによりＧ５０セファデックスカラムを通し，さらに精製することなく，基質ＲＮＡとして用いる。あるいは，Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて基質を５’−３２Ｐ−末端標識する。アッセイは，以下のように行う。２Ｘ濃度の精製リボザイムをリボザイム切断緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，３７℃，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２）中であらかじめ暖め，２Ｘリボザイム混合物を，これもあらかじめ暖めた緩衝液中の等量の基質ＲＮＡ（最大１−５ｎＭ）に加えることにより切断反応を開始する。最初のスクリーニングとして，アッセイは，４０ｎＭまたは１ｍＭリボザイムの最終濃度を用いて，すなわちリボザイム過剰で，３７℃で１時間行う。等量の９５％ホルムアミド，２０ｍＭ　ＥＤＴＡ，０．０５％ブロモフェノールブルーおよび０．０５％キシレンシアノールを加えることにより反応を急冷し，その後，試料を９５℃で２分間加熱し，急冷し，変性ポリアクリルアミドゲルに負荷する。基質ＲＮＡおよびリボザイム切断により生成した特異的ＲＮＡ切断生成物は，ゲルのオートラジオグラフィーにより可視化する。切断のパーセントは，無傷の基質および切断産物を示すバンドをホスファーイメージャー（登録商標）で定量することにより決定する。
【０３６８】
ｐｓＨＢＶ−１およびリボザイムを用いるＨｅｐＧ２細胞のトランスフェクション
ヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２は，１０％ウシ胎児血清，２ｍＭグルタミン，０．１ｍＭ非必須アミノ酸，１ｍＭピルビン酸ナトリウム，２５ｍＭＨｅｐｅｓ，１００単位のペニシリン，および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地で成長させた。複製能力のあるｃＤＮＡを生成するために，トランスフェクション前にｐｓＨＢＶ−１ベクター中に含まれるＨＢＶゲノム配列を細菌プラスミド配列から切り出した（当業者は他の方法を用いて複製能力のあるｃＤＮＡを生成しうることを理解するであろう）。これは，ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素消化により行った。消化の完了後，薄い条件（２０μｇ／ｍｌ）下でライゲーションを行って分子内ライゲーションに好都合なようにした。次に，全ライゲーション混合物をＱｉａｇｅｎスピンカラムを用いて濃縮した。
【０３６９】
分泌性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を用いて，ＨＢｓＡｇレベルを標準化して，トランスフェクションの変動を調節した。ｐＳＥＡＰ２−ＴＫ対照ベクターは，ｐＲＬ−ＴＫベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）の，ヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼプロモーター領域を含有するＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをＢｇｌＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断ｐＳＥＡＰ２Ｂａｓｉｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中にライゲーションすることにより構築した。ＨｅｐＧ２細胞を９６−ウエルマイクロタイタープレートに播種し（３ｘ１０４細胞／ウエル），一夜インキュベートした。カチオン性脂質（１５μｇ／ｍｌ），調製したｐｓＨＢＶ−１（４．５μｇ／ｍｌ），ｐＳＥＡＰ２−ＴＫ（０．５ｇ／ｍｌ），およびリボザイム（１００ｐＭ）を含む（最終濃度）脂質／ＤＮＡ／リボザイム複合体を形成した。３７℃で１５分間インキュベーションした後，複合体をプレート上のＨｅｐＧ２細胞に加えた。トランスフェクションの９６時間後に細胞から培地を除去し，ＨＢｓＡｇおよびＳＥＡＰを分析した。
【０３７０】
ヒト肝細胞癌細胞株，ＨｅｐＧ２を複製能力のあるＨＢＶ　ＤＮＡでトランスフェクションすると，ＨＢＶ蛋白質が発現され，ビリオンが産生される。慢性ＨＢＶ感染の治療におけるリボザイムの使用の可能性を調べるため，ＨＢＶゲノムの３’末端を標的とする一連のリボザイムを合成した。この領域を標的とするリボザイムは，４つすべての主要なＨＢＶ　ＲＮＡ転写産物を切断する可能性，ならびにプレゲノムＲＮＡの切断によりＨＢＶ　ＤＮＡの産生を妨害する可能性を有する。これらのＨＢＶリボザイムの効力を試験するため，リボザイムをＨＢＶゲノムＤＮＡとともにＨｅｐＧ２細胞にコトランスフェクトし，分泌されるＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のレベルをＥＬＩＳＡにより分析した。トランスフェクション効率の変動を調節するため，分泌性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を発現する対照ベクターもコトランスフェクトした。ＨＢＶリボザイムの効力は，ＨＢｓＡｇ：ＳＥＡＰおよび／またはＨＢｅＡｇ：ＳＥＡＰの比率をスクランブル化減弱化対照（ＳＡＣ）リボザイムのものと比較することにより決定した。対応するＳＡＣリボザイムと比較してＨＢｓＡｇおよび／またはＨＢｅＡｇのレベルの減少を引き起こす２５個のリボザイム（ＲＰＩ１８３４１，ＲＰＩ１８３５６，ＲＰＩ１８３６３，ＲＰＩ１８３６４，ＲＰＩ１８３６５，ＲＰＩ１８３６６，ＲＰＩ１８３６７，ＲＰＩ１８３６８，ＲＰＩ１８３６９，ＲＰＩ１８３７０，ＲＰＩ１８３７１，ＲＰＩ１８３７２，ＲＰＩ１８３７３，ＲＰＩ１８３７４，ＲＰＩ１８３０３，ＲＰＩ１８４０５，ＲＰＩ１８４０６，ＲＰＩ１８４０７，ＲＰＩ１８４０８，ＲＰＩ１８４０９，ＲＰＩ１８４１０，ＲＰＩ１８４１１，ＲＰＩ１８４１８，ＲＰＩ１８４１９，およびＲＰＩ１８４２２）が同定された。
【０３７１】
実施例６：リボザイム処理後のＨＢｓＡｇおよびＳＥＡＰレベルの分析
Ｉｍｍｕｌｏｎ４（Ｄｙｎａｘ）マイクロタイターウエルを，炭酸緩衝液（Ｎａ２ＣＯ３１５ｍＭ，ＮａＨＣＯ３３５ｍＭ，ｐＨ９．５）中１μｇ／ｍｌの抗ＨＢｓＡｇＭａｂ（Ｂｉｏｓｔｒｉｄｅ　Ｂ８８−９５−３１ａｄ，ａｙ）で，４℃で一夜コーティングした。次にウエルをＰＢＳＴ（ＰＢＳ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）で４回洗浄し，ＰＢＳＴ，１％ＢＳＡで３７℃で１時間ブロッキングした。上述のように洗浄した後，ウエルを３７℃で３０分間乾燥した。ビオチニル化ヤギ抗ＨＢｓＡｇ（Ａｃｃｕｒａｔｅ　ＹＶＳ１８０７）をＰＢＳＴ中に１：１０００で希釈し，ウエル中で３７℃で１時間インキュベートした。ウエルをＰＢＳＴで４回洗浄した。ストレプトアビジン／アルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｐｉｅｒｃｅ２１３２４）をＰＢＳＴ中で２５０ｎｇ／ｍｌに希釈し，ウエル中で３７℃で１時間インキュベートした。上述のように洗浄した後，ｐ−ニトロフェニルリン酸基質（Ｐｉｅｒｃｅ３７６２０）をウエルに加え，次にこれを３７℃で１時間インキュベートした。次に４０５ｎｍの光学密度を測定した。ＳＥＡＰレベルは，ＧｒｅａｔＥｓｃＡＰｅ（登録商標）検出キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｋ２０４１−１）を用いて，製造元の指針にしたがってアッセイした。
【０３７２】
実施例７：Ｘ−遺伝子レポーターアッセイ
リボザイム処理が，ＨＢＶＸ−蛋白質によるＳＶ４０プロモーター駆動性蛍ルシフェラーゼ遺伝子のトランス活性化のレベルに及ぼす影響を，トランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞において分析した。トランスフェクション効率の変動の対照として，ＴＫプロモーターにより駆動され，Ｘ蛋白質によりトランス活性化されないウミシイタケルシフェラーゼレポーターを用いた。ＨｅｐＧ２細胞を３ｘ１０４細胞／ウエルで９６−ウエルマイクロタイタープレートに播種し，一夜インキュベートした。カチオン性脂質（２．４μｇ／ｍｌ），Ｘ−遺伝子ベクターｐＳＢＤＲ（２．５μｇ／ｍｌ），蛍レポーターｐＳＶ４０　ＨＣＶ　ｌｕｃ（０．５μｇ／ｍｌ），ウミシイタケルシフェラーゼ対照ベクターｐＲＬ−ＴＫ（０．５μｇ／ｍｌ），およびリボザイム（１００μＭ）（最終濃度）を含むよう，脂質／ＤＮＡ／リボザイム複合体を形成した。３７℃で１５分間インキュベーションした後，播種したＨｅｐＧ２細胞に複合体を加えた。トランスフェクション後４８時間後，Ｐｒｏｍｅｇａのデュアルルシフェラーゼアッセイシステムを用いて，蛍およびウミシイタケルシフェラーゼのレベルを分析した。
【０３７３】
ＨＢＶＸ蛋白質は，多くのウイルスおよび細胞性遺伝子のトランスアクチベータである。Ｘ領域を標的とするリボザイムを，ＨｅｐＧ２細胞において，ＳＶ４０プロモーターにより駆動される蛍ルシフェラーゼ遺伝子のＸ蛋白質トランス活性化の減少を引き起こす能力について試験した。トランスフェクションの変動の対照として，ＴＫプロモーターにより駆動され，Ｘ蛋白質により活性化されないウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を含むベクターをコトランスフェクションに含めた。ＨＢＶリボザイムの有効性は，蛍ルシフェラーゼ：ウミシイタケルシフェラーゼの比率をスクランブル化減弱化対照（ＳＡＣ）リボザイムのものと比較することにより決定した。対応するＳＡＣリボザイムと比較してＸ蛋白質によるレポーター遺伝子のトランス活性化のレベルの減少を引き起こす１１個のリボザイム（ＲＰＩ１８３６５，ＲＰＩ１８３６７，ＲＰＩ１８３６８，ＲＰＩ１８３７１，ＲＰＩ１８３７２，ＲＰＩ１８３７３，ＲＰＩ１８４０５，ＲＰＩ１８４０６，ＲＰＩ１８４１１，ＲＰＩ１８４１８，ＲＰＩ１８４２３）が同定された。
【０３７４】
実施例８：ＨＢＶトランスジェニックマウス実験
ＨＢＶ　ＲＮＡを発現し，ＨＢＶウイルス血症を形成するトランスジェニックマウス株（Ｃ５７Ｂ１／６バックグラウンドを有する創設株１．３．３２）（Ｍｏｒｒｅｙ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ａｎｔｉｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ．，４２，９７１０８；Ｇｕｉｄｏｔｔｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６９，１０，６１５８−６１６９）を用いて，本発明のリボザイムのインビボ活性を研究した。このモデルは，抗ＨＢＶ薬剤のスクリーニングにおいて予言的である。リボザイムまたは等量の食塩水をＡｌｚｅｔ（登録商標）ミニ浸透圧ポンプを用いる連続皮下注入により１４日間投与した。試験物質は，製造元の指針にしたがって，Ａｌｚｅｔ（登録商標）ポンプに無菌的に充填した。インビボ移植の前に，ポンプを３７℃で一夜（１８時間以上）インキュベートして，フローモジュレータを用意した。外科手術の日に，ケタミン／キシラジンカクテル（それぞれ９４ｍｇ／ｋｇおよび６ｍｇ／ｋｇ；０．３ｍｌ，ＩＰ）で動物を軽く麻酔した。各動物から後部眼窩採血により基底状態血液試料（２００μｌ）を採取した。尾部の基底部に近い２ｃｍの領域を剃り，ベタジン外科ブラシで，次に７０％アルコールで清浄にした。＃１５のメスまたは短いハサミで尾の基底部に近い皮膚に１ｃｍの切開を作成した。ピンセットを用いて皮下結合組織を広げることによりポケットを嘴のように開いた（すなわち頭に向かって）。輸送ポートが切開と反対側を向くようにポンプを挿入した。滅菌９−ｍｍステンレスクリップまたは滅菌４−０縫合糸で創傷を閉じた。次に動物を暖かい加熱パッド上で麻酔から回復させ，その後にケージに戻した。創傷は毎日調べた。クリップまたは糸は必要に応じて取り替えた。切開部は典型的には手術の７日後までに完全に癒合した。次に，ポンプ移植の１４日後に動物をケタミン／キシラジンカクテル（それぞれ１５０ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ，０．５ｍｌ，ＩＰ）で深く麻酔した。正中開胸／側腹切開を行って腹腔および胸腔を暴露した。左心室の底部にカニューレを挿入し，２３Ｇの針および１ｍｌのシリンジを用いて動物を放血させた。血清を分離し，凍結し，ＨＢＶ　ＤＮＡおよび抗原レベルについて分析した。第０日から第１４日の変化のパーセントについて，実験群を食塩水対照群と比較した。ＨＢＶ　ＤＮＡは，定量的ＰＣＲによりアッセイした。
【０３７５】
結果
表４４は，ＨＢＶトランスジェニックマウス研究において用いた群の名称および投与量のレベルの概要である。後部眼窩から基底状態血液試料を得，動物（Ｎ＝１０／群）に抗ＨＢＶリボザイム（１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を連続皮下注入として投与した。１４日後，ＨＢＶ　ＲＮＡの部位２７３を標的とするリボザイム（ＲＰＩ．１８３４１）で処理した動物は，定量的ＰＣＲアッセイにより測定して，食塩水処理動物と比較して血清ＨＢＶ　ＤＮＡ濃度の有意な低下を示した。より詳細には，食塩水処置動物においては，この２週間の期間に血清ＨＢＶ　ＤＮＡ濃度が６９％増加したが，２７３リボザイム（ＲＰＩ．１８３４１）による治療は血清ＨＢＶ　ＤＮＡ濃度を６０％低下させた。部位１８３３（ＲＰＩ．１８３７１），１８７３（ＲＰＩ．１８４１８），および１８７４（ＲＰＩ．１８３７２）に向けられたリボザイムは，血清ＨＢＶ　ＤＮＡ濃度をそれぞれ４９％，１５％および１６％低下させた。
【０３７６】
実施例７：ＨＥＲ２遺伝子発現を阻害するＮＣＨリボザイムの活性
ＨＥＲ２（ｎｅｕ，ｅｒｂＢ２およびｃ−ｅｒｂＢ２としても知られる）は，１８５ｋＤの貫膜チロシンキナーゼレセプターをコードするオンコジンである。ＨＥＲ２は表皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）ファミリーのメンバーであり，ファミリーの他のメンバーと部分的なホモロジーを共有する。正常成人組織においては，ＨＥＲ２発現は低い。しかし，ＨＥＲ２は，乳癌（ＭｃＧｕｉｒｅ＆Ｇｒｅｅｎｅ，１９８９）および卵巣癌（Ｂｅｒｃｈｕｃｋ，　ｅｔ　ａｌ．，１９９０）の少なくとも２５−３０％において過剰発現されている。さらに，悪性乳腫瘍におけるＨＥＲ２の過剰発現は，転移の増加，化学療法耐性および低い生存率と相関している（Ｓｌａｍｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９８７　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３５：１７７−１８２）。ＨＥＲ２発現は攻撃的なヒト乳癌および卵巣癌において高いが，正常成人組織においては低いため，これはリボザイム媒介性治療の魅力的な標的である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，（上掲））。
【０３７７】
最も大きいＨＥＲ２特異的効果は，高いレベルのＨＥＲ２蛋白質（ＥＬＩＳＡにより測定して）を発現する癌細胞株において観察されている。詳細には，５種類のヒト乳癌細胞株をＨＥＲ２抗体（抗ｅｒｂＢ２−ｓＦｖ）で処理した１つの実験においては，高いレベルのＨＥＲ２蛋白質を発現する３つの細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−３６１，ＳＫＢＲ−３およびＢＴ−４７４）において，細胞成長の最も大きい阻害が見られた。低いレベルのＨＥＲ２蛋白質を発現する２つの細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＣＦ−７）においては細胞成長の阻害は観察されなかった（Ｗｒｉｇｈｔ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７）。別のグループは，ＳＫＢＲ−３細胞を用いてＨＥＲ２蛋白質発現のＨＥＲ２アンチセンスオリゴヌクレオチド媒介性阻害およびＨＥＲ２　ＲＮＡのノックダウンを示すことに成功した（Ｖａｕｇｈｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５）。他のグループもまた，抗ＨＥＲ２リボザイムまたはアンチセンス分子を用いて培養細胞においてＨＥＲ２蛋白質，ＨＥＲ２　ｍＲＮＡおよび／または細胞増殖のレベルの減少を示した（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，１９９７；Ｗｅｉｃｈｅｎ，　ｅｔ　ａｌ．，１９９７；Ｃｚｕｂａｙｋｏ，Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，１９９７；Ｃｏｌｏｍｅｒ，　ｅｔ　ａｌ．，１９９４；Ｂｅｔｒａｍ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４）。より高いレベルのＨＥＲ２を発現する細胞株は，抗ＨＥＲ２剤に対してより感受性であったため，高発現細胞株，例えばＳＫＢＲ−３およびＴ４７Ｄに対して，細胞培養におけるリボザイムスクリーニングのためのいくつかの培地を追跡している。
【０３７８】
細胞培養モデルにおいて抗ＨＥＲ２剤を用いる処理後にＨＥＲ２媒介性の効果を見るために種々のエンドポイントが用いられている。表現型エンドポイントには，細胞増殖の阻害，アポトーシスアッセイおよびＨＥＲ２蛋白質発現の減少が含まれる。ＨＥＲ２の過剰発現は乳および卵巣腫瘍細胞の増殖の増加と直接関係するため，細胞培養アッセイの増殖エンドポイントが我々の一次スクリーニングであろう。このエンドポイントを測定することができるいくつかの方法がある。リボザイムによる細胞の処置の後，細胞を成長させ（典型的には５日間），その後，細胞の生存性，［３Ｈ］チミジンの細胞ＤＮＡ中への取り込みおよび／または細胞密度のいずれかを測定することができる。細胞密度のアッセイは非常に簡単であり，市販の蛍光核酸染色（例えばＳｙｔｏ１３またはＣｙＱｕａｎｔ）を用いて９６−ウエルフォーマットで行うことができる。ＣｙＱｕａｎｔを用いるアッセイはＲＰＩで進行中であり，現在ＨＥＲ２を標的とする約１００個のリボザイムをスクリーニングするのに用いている（詳細は以下に記載）。
【０３７９】
二次的確認的エンドポイントとして，ＨＥＲ２特異的ＥＬＩＳＡを用いてＨＥＲ２蛋白質発現のレベルのリボザイム媒介性減少を評価することができる。
【０３８０】
細胞株の確認およびリボザイム処理条件
それぞれ中程度から高いレベルのＨＥＲ２蛋白質を発現することが知られている２種類のヒト乳癌細胞株（Ｔ４７ＤおよびＳＫＢＲ−３）をリボザイムスクリーニングについて考慮した。これらの細胞株をＨＥＲ２媒介性感受性について確認するために，両方の細胞株をＨＥＲ２特異的抗体であるハーセプチン（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）で処理し，細胞増殖に及ぼすその影響を測定した。ハーセプチンは，血清を含まない（ＯｐｔｉＭｅｍ）かまたは０．１％または０．５％のＦＢＳを含む培地中で，０−８μＭの範囲の濃度で細胞に加え，細胞増殖により効力を測定した。いずれの細胞株においても，増殖の最大の阻害（〜５０％）は，０．１％ＦＢＳまたはＦＢＳを含まない培地中で０．５ｎＭのハーセプチンを加えた後に観察された。両方の細胞株が抗ＨＥＲ２剤（ハーセプチン）に感受性であるという事実は，抗ＨＥＲ−２リボザイムを試験する実験においてこれらを用いることを支持する。
【０３８１】
リボザイムスクリーニングの前に，リボザイム輸送に最適な脂質および条件の選択を各細胞株について経験的に行った。本出願人は，リボザイムを培養細胞に輸送するのに用いることができ，典型的に３−５日間の長さの細胞増殖アッセイにおいて非常に有用な，自己所有の脂質のパネルを確立した。最初に，あらかじめ確立した対照オリゴヌクレオチドを用いて，この自己所有の脂質輸送ベヒクルのパネルをＳＫＢＲ−３およびＴ４７Ｄ細胞においてスクリーニングした。各細胞株について，これらのスクリーニングに基づいて最適な輸送のための特定の脂質および条件を選択した。これらの条件を用いて，一次（細胞増殖の阻害）および二次（ＨＥＲ２蛋白質の減少）の効力のエンドポイントのために，ＨＥＲ２特異的リボザイムを細胞に輸送した。
【０３８２】
一次スクリーニング：細胞増殖の阻害
２つの細胞株について最適リボザイム輸送条件を決定したが，ＳＫＢＲ−３細胞株はより高いレベルのＨＥＲ２蛋白質を有しており，ＨＥＲ２特異的リボザイムに最も影響を受けやすいはずであるため，これを最初のスクリーニングに用いた。必要に応じて，Ｔ４７Ｄ細胞において追跡実験を行い，先の結果を確認することができる。
【０３８３】
リボザイムのスクリーニングは，自動化ハイスループット９６−ウエル細胞増殖アッセイを用いて行った。細胞密度の測定に核酸染色ＣｙＱｕａｎｔを用いて，細胞増殖を５日間の処理期間にわたり測定した。リボザイム／脂質複合体で処理した細胞の成長を，未処理細胞またはスクランブル化アーム減弱化コア対照（ＳＡＣ；またはＩＡ；図８）で処理した細胞の両方と比較した。ＳＡＣは，スクランブル化アーム配列のために標的部位には結合できず，コア中にリボザイム切断を大きく減少させるヌクレオチド変更を有する。これらのＳＡＣを用いて，リボザイム化学（すなわち，多数の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド，１個の２’Ｃ−アリルウリジン，４個のホスホロチオエートおよび３’反転無塩基）により引き起こされる細胞成長の非特異的阻害を決定した。特異的様式で細胞増殖を阻害する能力に基づいて，一次スクリーニングからリードリボザイムを選択した。これらのリードについて用量応答アッセイを行い，サブセットをエンドポイントとしてＨＥＲ２蛋白質のレベルを用いる二次スクリーニングに進んだ。
【０３８４】
二次スクリーニング：ＨＥＲ２蛋白質の減少
予備的知見を支持するために，抗ＨＥＲ２リボザイムがＨＥＲ２蛋白質レベルに及ぼす影響を測定する二次スクリーニングを用いる。Ｔ４７ＤおよびＳＫＢＲ−３細胞の両方についての強力なＨＥＲ２ＥＬＩＳＡが確立されており，次のエンドポイントとして利用可能である。
【０３８５】
リボザイムのメカニズムのアッセイ
ＨＥＲ２　ＲＮＡのリボザイム媒介性減少を測定するためのＴａｑｍａｎアッセイもまた確立されている。このアッセイは，ＰＣＲ技術に基づいており，標準的な細胞性ｍＲＮＡ，例えばＧＡＰＤＨに対するＨＥＲ２　ｍＲＮＡの産生を実時間で測定することができる。このＲＮＡアッセイを用いて，リードリボザイムがＲＮＡ切断メカニズムにより作用して，ＨＥＲ２　ｍＲＮＡのレベルを減少させ，このことにより，細胞表面ＨＥＲ２蛋白質レセプターの減少，続いて腫瘍細胞増殖の減少につながることの証拠を確立する。
【０３８６】
動物モデル
動物モデルにおける抗ＨＥＲ２薬剤の有効性の評価は，ヒト臨床試験の重要な前提条件である。細胞培養モデルにおける場合と同様に，ほとんどのＨＥＲ２感受性マウス腫瘍異種移植片は，高いレベルのＨＥＲ２蛋白質を発現するヒト乳癌腫細胞に由来するものである。最近の研究において，ＢＴ−４７４異種移植片を有するヌードマウスは，抗ＨＥＲ２ヒト化モノクローナル抗体であるハーセプチンに感受性であり，１ｍｇ／ｋｇの用量（ｉｐ，週２回，４−５週間）で腫瘍成長の８０％が阻害された。このように処置した８匹のマウスのうち３匹において腫瘍の根絶が観察された（Ｂａｓｅｌｇａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）。この同じ実験により，ハーセプチン単独または一般に用いられる化学療法剤であるパクリタキセルまたはドキソルビシンとの組み合わせの有効性を比較した。３種類すべての抗ＨＥＲ２剤は，腫瘍成長の中程度の阻害を引き起こしたが，最も高い抗腫瘍活性はハーセプチンとパクリタキセルとの組み合わせにより得られた（腫瘍成長の９３％阻害，パクリタキセル単独では３５％）。上述の研究は，動物において抗ＨＥＲ２剤によるＨＥＲ２発現の阻害が腫瘍成長の阻害を引き起こす証拠を提供する。インビトロアッセイから選択されたリード抗ＨＥＲ２リボザイムをマウス異種移植片モデルにおいてさらに試験する。リボザイムは最初に単独で，次に標準的な化学療法と組み合わせて試験する。
【０３８７】
動物モデルの開発
３種類のヒト乳腫瘍細胞株（Ｔ４７Ｄ，ＳＫＢＲ−３およびＢＴ−４７４）を特性決定して，マウスにおけるその成長曲線を確立した。これらの３つの細胞株をヌードマウスおよびＳＣＩＤマウスの両方の乳頭に移植して，１週間に３回，原発性腫瘍の体積を測定する。マトリゲル移植フォーマットを用いるこれらの腫瘍株の成長の特徴決定もまた確立することができる。さらに，高いレベルのＨＥＲ２を発現するよう工学処理されている２つの他の乳細胞株を用いることもできる。最も堅実かつ信頼性のある腫瘍成長を支持する腫瘍細胞株および移植方法をリードＨＥＲ２リボザイムを試験する動物実験において用いる。リボザイムは，腫瘍移植の３日後から開始し，実験期間中連続して，毎日の皮下注射またはＡｌｚｅｔミニ浸透圧ポンプからの連続皮下注入により投与することができる。少なくとも１０匹の動物の大きさの群を用いる。効力は，リボザイム処置動物と食塩水のみで処置した対照群動物の腫瘍体積の統計学的比較により決定する。これらの腫瘍の成長は一般に遅い（４５−６０日）ため，最初のエンドポイントは，リボザイム治療の存在または非存在下において容易に測定可能な原発性腫瘍（すなわち５０−１００ｍｍ３）が確立されるのに必要な日数であろう。
【０３８８】
臨床的概要
乳癌は，女性に一般的な癌であり，より低い程度で男性にも生ずる。米国における乳癌の発生率は１年に約１８０，０００件であり，毎年約４６，０００人がこの疾病で死亡する。さらに，１年に２１，０００件の新たな卵巣癌が発生し，約１３，０００人が死亡する（データはＨｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５およびｔｈｅ　Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｎｄ　Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｐｒｏｇｒａｍ，ＮＣＩよる）。卵巣癌は，抗ＨＥＲ２リボザイム療法の可能性のある第２の適応症である。
【０３８９】
乳癌の完全な総説はｔｈｅ　ＮＣＩ　ＰＤＱ　ｆｏｒ　Ｂｒｅａｓｔ　Ｃａｎｃｅｒに与えられる。ここでは簡単な概要を説明する。乳癌は，腫瘍サイズ，およびリンパ節および／または身体の他の部分に広がっているか否かに基づいて評価または”期”が決められる。Ｉ期の乳癌においては，癌は２センチ以下であり，乳の外には広がっていない。ＩＩ期においては，患者の腫瘍は２−５センチであるが，癌は腋窩リンパ節に広がっているであろう。ＩＩＩ期までには，リンパ節への転移が典型的であり，腫瘍は５センチである。別の組織の関与（皮膚，胸壁，肋骨，筋肉等）も示すかもしれない。癌がいったん身体の別の臓器に広がれば，これはＩＶ期であると分類される。
【０３９０】
乳癌のほとんどすべて（＞９０％）は，Ｉ期またはＩＩ期で発見されるが，これらの３１％は既にリンパ節ポジティブである。リンパ節ネガティブの患者の５年生存率（標準的な外科手術／放射線照射／化学療法／ホルモン投与計画による）は９７％である。しかし，リンパ説が関与する場合は５年生存率はわずか７７％である。他の臓器の関与（ＩＩＩ期）は総生存率を５年で２２％に劇的に低下させる。したがって，乳癌からの快復の確率は，初期発見に非常に依存する。乳癌の１０％までは遺伝性であるため，家族歴を有する者は乳癌の高いリスクを有すると考えられ，非常に厳密に監視すべきである。
【０３９１】
乳癌は，非常に治療可能であり，早期に検出された場合にはしばしば治癒可能である。（乳癌治療の完全な総説については，ｔｈｅ　ＮＣＩ　ＰＤＱ　ｆｏｒ　Ｂｒｅａｓｔ　Ｃａｎｃｅｒを参照）。一般的な療法には，外科手術，放射線療法，化学療法およびホルモン療法が含まれる。多くの因子，例えば腫瘍サイズ，リンパ節の関与および病巣の位置に依存して，外科的除去は，腫瘍摘除（腫瘍およびある程度の周囲組織の切除）から乳房切除（乳，リンパ節および下にある胸筋の一部または全部の切除）まで様々である。外科的切除が成功したとしても，２１％程度の患者は最終的に再発する（１０−２０年）。したがって，いったん局所的な疾病が外科手術により管理されても，再発率を低下させて生存率を改善するために，典型的には補助的な治療，化学療法および／またはホルモン療法が用いられる。用いられる治療計画は，切除時点における癌の期のみならず，他の変数，例えば癌の種類（管または小葉），リンパ節が関与し切除されたか，患者の年齢および一般的健康状態および他の臓器が関与しているかによって異なる。
【０３９２】
一般的な化学療法には，癌細胞を殺すための細胞毒性薬剤の種々の組み合わせが含まれる。これらの薬剤には，パクリタキセル（タキソール），ドセタキセル，シスプラチン，メトトレキセート，シクロホスファミド，ドキソルビシン，フルオロウラシル等が含まれる。これらの細胞毒性療法には，重大な毒性が伴う。よく特徴決定された毒性には，悪心および嘔吐，骨髄抑制，脱毛および粘液性が含まれる。また，ある種の組み合わせ，例えば，ドキソルビシンとパクリタキセルとの組み合わせには深刻な心臓の問題が伴うが，あまり一般的ではない。
【０３９３】
エストロゲンおよびプロゲステロンレセプターの試験は，ある種の抗ホルモン療法が腫瘍成長の阻害に有用であるか否かをを判定することを助ける。レセプターのいずれかまたは両方が存在する場合には，ホルモンリガンドの作用を妨害する療法を化学療法と組み合わせて与えることができ，一般にはこれを数年続ける。これらの補助的療法は，ＳＥＲＭ（選択的エストロゲンレセプター調節剤）と称され，これらは骨および脂質代謝にエストロゲンと同様の有益な効果を与えることができるが，生殖組織においてはエストロゲンと競合する。タモキシフェンはそのような化合物の１つである。タモキシフェンの使用に伴う主な毒性効果は，子宮内膜癌の比率が２−７倍増加することである。別の副作用は足および肺の血栓および発作の可能性である。しかし，タモキシフェンは，高リスク患者において乳癌の発症率を４９％低下させると決定されており，タモキシフェンの予防的用途を拡大するための大規模な幾分論争のある臨床試験が行われている。別のＳＥＲＭであるラロキシフェンもまた，これを骨粗鬆症の治療に用いる大規模な臨床試験において，乳癌の発症率を低下させることが示されている。別の研究においては，卵巣の切除および／または卵巣の働きを押さえる薬剤が試験されている。
【０３９４】
骨髄移植は，伝統的な化学療法に耐性になったかまたは３つより多いリンパ節が関与する乳癌について，臨床試験において研究されている。高用量の化学療法の前に患者から骨髄を取り除いてこれが破壊されないよう保護し，化学療法の後に戻す。別の種類の”移植”は，末梢血体細胞を外的に薬剤で処理して癌細胞を殺した後，処理細胞を血流に戻すことを含む。
【０３９５】
１つの生物学的治療であるヒト化モノクローナル抗ＨＥＲ２抗体ハーセプチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は，ＨＥＲ２陽性腫瘍の別の治療としてＦＤＡにより認可されている。ハーセプチンは，高い親和性をもってＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合し，このことによりそのシグナリング作用を妨害する。ハーセプチンは，単独でも化学療法（すなわち，パクリタキセル，ドセタキセル，シスプラチン等）（Ｐｅｇｒａｍ，　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）との組み合わせにおいても使用することができる。第ＩＩＩ相試験においては，ハーセプチンは化学療法に対する応答率を有意に改良し，ならびに進行の時間を改良した（Ｒｏｓｓ＆Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，１９９８）。ハーセプチンに起因する最も一般的な副作用は熱および悪寒，痛み，無力症，悪心，嘔吐，咳の増加，下痢，頭痛，呼吸困難，感染，鼻炎，および不眠である。ハーセプチンと化学療法（パクリタキセル）との組み合わせは，心臓毒性（Ｓｐａｒａｎｏ，１９９９），白血球減少症，貧血，下痢，腹部の痛みおよび感染を引き起こしうる。
【０３９６】
患者スクリーニング用の，および可能性のあるエンドポイントとしてのＨＥＲ２蛋白質レベル
乳癌の少なくとも３０％で上昇したＨＥＲ２レベルを検出することができるため，乳癌患者は，抗ＨＥＲ２リボザイムを試験する最初の臨床試験に入る前に，上昇したＨＥＲ２についてあらかじめスクリーニングすることができる。腫瘍生検または切除腫瘍試料から最初のＨＥＲ２レベルを決定することができる（ＥＬＩＳＡにより）。
【０３９７】
臨床試験の間，ＥＬＩＳＡにより循環ＨＥＲ２蛋白質をモニターすることが可能であろう（Ｒｏｓｓ　ａｎｄ　Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，１９９８）。抗ＨＥＲ２リボザイム治療期間の経過にわたる一連の血液／血清試料の評価は，有効性を早期に示すために有用でありうる。実際，ＩＶ期乳癌の臨床経過は，用量強化パクリタキセル単独療法後に低下したＨＥＲ２蛋白質フラグメントと相関していた。すべてのレスポンダーにおいて，ＨＥＲ２の血清レベルは検出限界以下に低下した（Ｌｕｆｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）。
【０３９８】
２つの癌関連抗原であるＣＡ２７．２９およびＣＡ１５．３もまた血清中で測定することができる。これらの糖蛋白質は両方とも乳癌の診断マーカーとして用いられている。乳癌患者においてはＣＡ２７．２９レベルはＣＡ１５．３より高く，健康な個体においてはこの逆である。これらの２つのマーカーのうち，ＣＡ２７．２９の方が，原発性癌を健康な被験者からよく区別することが見いだされている。さらに，ＣＡ２７．２９と大対小腫瘍，およびリンパ節ポジティブ対リンパ節ネガティブ疾病の間に統計学的に有意な直接の相関が見いだされている（Ｇｉｏｎ，　ｅｔ　ａｌ．，１９９９）。さらに，いずれの癌抗原も，継続管理の間に可能性のある転移を検出するのに適していることが見いだされている（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ　ｄｅ　Ｐａｔｅｒｎａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９）。すなわち，乳腫瘍成長の妨害は，対照群と比較して低いＣＡ２７．２９および／またはＣＡ１５．３レベルに反映されるかもしれない。転移性乳癌患者を監視するためのＣＡ２７．２９およびＣＡ１５．３の使用がＦＤＡに提出された（Ｂｅｖｅｒｉｄｇｅ，１９９９により概説）。これらのマーカーのいずれかを測定するための完全に自動化された方法が市販されている。
【０３９９】
参考文献
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【０４００】
ＨＥＲ２　ＲＮＡを標的とするいくつかのＮＣＨリボザイムおよびＨＨリボザイムを設計し，合成し，細胞増殖アッセイにおいて試験した（例えば表３１および３４を参照）。
【０４０１】
増殖アッセイ：
この実験において用いたモデル増殖アッセイは，９６−ウエルプレート中で２０００細胞／ウエルの細胞播種密度および５日の処理期間の間に少なくとも２回の細胞倍加を必要とする。増殖アッセイ用に細胞密度を計算するために，当該技術分野においてよく知られるＦＩＰＳ（フルオロイメージングプロセシングシステム）方法を用いた。この方法により，核酸をＣｙＱｕａｎｔ染料で染色した後に細胞密度の測定が可能であり，９６−ウエルフォーマットで１，０００−１００，０００細胞／ウエルの非常に広い範囲にわたって細胞密度を正確に測定するという利点を有する。
【０４０２】
リボザイム（５０−２００ｎＭ）を２．０μｇ／ｍＬのカチオン性脂質の存在下で輸送し，処理の５日後に増殖の阻害を決定した。２回の完全なリボザイムスクリーニングを完了して，４個のリードＨＨおよび１１個のリードＮＣＨリボザイムをさらなる試験のために選択した。一次スクリーニングから選択された１５個のリードＲｚのうち，４個のＮＣＨおよび１個のＨＨ　Ｒｚが，続く実験において細胞増殖を阻害し続けた。部位２００１（ＲＰＩ　Ｎｏ．１７２３６），２７８３（ＲＰＩ　Ｎｏ．１７２４９），２９３９（ＲＰＩ　Ｎｏ．１７２５１）または３９９８（ＲＰＩ　Ｎｏ．１７２６２）に対するＮＣＨ　Ｒｚは，スクランブル対照Ｒｚ（ＩＡ；ＲＰＩ　Ｎｏ．１７２６３）と比較して，２５−６０％の範囲の増殖の阻害を引き起こした。５個のリードＲｚのうち，最も効率の高いものはＨＥＲ２　ＲＮＡの部位２９３９に対するＮＣＨ　Ｒｚ（ＲＰＩ　Ｎｏ．１７２５１）である。細胞培養アッセイからの結果の例が図８に示される。図８を参照すると，ＨＥＲ２　ＲＮＡを標的とするＮＣＨリボザイムおよびＨＨリボザイムが細胞の増殖の有意な阻害を引き起こすことが示される。このことは，リボザイム，例えばＮＣＨリボザイムが，哺乳動物細胞においてＨＥＲ２遺伝子発現を阻害しうることを示す。
【０４０３】
実施例８：クラスＩＩ（チンザイム）核酸触媒がＨＥＲ２遺伝子発現を阻害する活性
本出願人は，ＨＥＲ２　ＲＮＡを標的とするいくつかのクラスＩＩ（チンザイム）リボザイムを設計し，合成し，細胞増殖ＲＮＡ減少アッセイにおいて試験した（例えば，表５８，５９，および６２を参照）。
【０４０４】
増殖アッセイ：
この実験において用いたモデル増殖アッセイは，９６−ウエルプレート中で２０００−１００００細胞／ウエルの細胞播種密度および５日の処理期間の間に少なくとも２回の細胞倍加を必要とする。増殖実験において用いた細胞は，ヒト乳癌または卵巣癌細胞（それぞれ，ＳＫＢＲ−３およびＳＫＯＶ−３細胞）のいずれかである。増殖アッセイ用に細胞密度を計算するために，当該技術分野においてよく知られるＦＩＰＳ（フルオロイメージングプロセシングシステム）方法を用いた。この方法により，核酸をＣｙＱｕａｎｔ染料で染色した後に細胞密度の測定が可能であり，９６−ウエルフォーマットで１，０００−１００，０００細胞／ウエルの非常に広い範囲にわたって細胞密度を正確に測定するという利点を有する。
【０４０５】
リボザイム（５０−２００ｎＭ）を２．０−５．０μｇ／ｍＬのカチオン性脂質の存在下で輸送し，処理の５日後に増殖の阻害を決定した。２つの完全なリボザイムスクリーニングを完了して，１４個のリボザイムを選択した。部位３１４（ＲＰＩ　Ｎｏ．１８６５３），４４３（ＲＰＩ　Ｎｏ．１８６８０），５９７（ＲＰＩ　Ｎｏ．１８６９７），６５９（ＲＰＩ　Ｎｏ．１８６８２），８７８（ＲＰＩ　Ｎｏｓ．１８６８３および１８６５４），８８１（ＲＰＩＮｏｓ．１８６８４および１８６８５）９３４（ＲＰＩ　Ｎｏ．１８６５１），９７２（ＲＰＩ　Ｎｏ．１８６５６，１９２９２，１９７２７，１９７２８および１９２９３），１２９２（ＲＰＩ　Ｎｏ．１８７２６），１５４１（ＲＰＩ　Ｎｏ．１８６８７），２１１６（ＲＰＩ　Ｎｏ．１８７２９），２９３２（ＲＰＩ　Ｎｏ．１８６７８），２５４０（ＲＰＩ　Ｎｏ．１８７１５），および３５０４（ＲＰＩ　Ｎｏ．１８７１０）に対するクラスＩＩ（チンザイム）リボザイムは，スクランブル対照リボザイムと比較して，２５−８０％の範囲の増殖の阻害を引き起こした。細胞培養アッセイからの結果の例が図２０に示される。図２０を参照すると，ＨＥＲ２　ＲＮＡを標的とするクラスＩＩリボザイムは，細胞の増殖の有意な阻害を引き起こすことが示される。このことは，リボザイム，例えばクラスＩＩ（チンザイム）リボザイムが，哺乳動物細胞においてＨＥＲ２遺伝子発現を阻害しうることを示す。
【０４０６】
ＲＮＡアッセイ：
ＲＮＡは，処理の２４時間後に，Ｑｉａｇｅｎ　ＲＮｅａｓｙ９６法を用いて回収した。精製したＲＮＡ試料について，標的ＨＥＲ２　ＲＮＡまたは対照のアクチンＲＮＡ（細胞播種または試料回収による差異を標準化するため）のいずれかに特異的な別々のプライマー／プローブの組を用いて，実時間ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ）を行った。結果は，処理後のＨＥＲ２対アクチンＲＮＡレベルの３回の測定の平均として示される。図３０は，部位９７２を標的とするクラスＩＩリボザイム（チンザイム）により媒介される，スクランブル化減弱化対照に対するＨＥＲ２　ＲＮＡの減少を示す。
【０４０７】
容量応答アッセイ：
活性なリボザイムを結合アーム減弱化対照（ＢＡＣ）リボザイムと混合して，１００，２００または４００ｎＭのいずれかの最終オリゴヌクレオチド濃度とし，５．０μｇ／ｍＬのカチオン性脂質の存在下で細胞に輸送した。活性なリボザイムおよびＢＡＣをこのように混合することにより，容量応答曲線全体を通して脂質対リボザイムの電荷比を一定に維持した。処理の２４時間後にＨＥＲ２　ＲＮＡの減少を測定し，処理の５日後に増殖の阻害を決定した。用量応答性の抗増殖の結果は，図３１にまとめられており，ＨＥＲ２　ＲＮＡの用量依存性減少の結果は図３２にまとめられている。図３３は，ＨＥＲ２　ＲＮＡ（ＲＰＩ１９２９３）の部位９７２を標的とするクラスＩＩリボザイムの抗増殖およびＲＮＡ減少データを両方組み合わせた用量応答プロットを示す。
【０４０８】
実施例９：ＲＮＡ切断活性を有する組成物
ハンマーヘッドリボザイムは，所定の特定のＲＮＡ基質を認識し切断しうる酵素的ＲＮＡ分子の一例である。（Ｈｕｔｃｈｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９８６，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１４：３６２７；Ｋｅｅｓｅ　ａｎｄ　Ｓｙｍｏｎｓ，Ｖｉｒｏｉｄｓ　ａｎｄ　ｖｉｒｏｉｄ−ｌｉｋｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ（Ｊ．Ｊ．Ｓｅｍａｎｃｈｉｋ，ｐｕｂｌ．，ＣＲＣ−Ｐｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９８７，ｐａｇｅｓ１−４７）。ハンマーヘッドリボザイムの触媒中心は，３つのステムにより挟まれており，ＲＮＡの隣接する配列領域により，または多くのヌクレオチドにより互いに分離されている領域により形成することができる。図６は，そのような触媒的に活性なハンマーヘッド構造の図解を示す。ステムはＩ，ＩＩおよびＩＩＩで示される。ヌクレオチドはハンマーヘッドリボザイムの標準的な命名法にしたがって番号付けされている（Ｈｅｒｔｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２０：３２５２）。この命名法においては，塩基は番号で示され，これは切断部位の５’側に対するその位置に関係する。さらに，ステムまたはループ領域に関与する各塩基は，その塩基のステムまたはループ中の位置を規定する別の名称（これは小数点およびその後の別の数字により示される）を有する。Ａ１５．１との名称は，この塩基が塩基対形成領域に含まれ，これたそのステム中のコア領域から離れている最初のヌクレオチドであることを示す。ハンマーヘッド由来のリボザイムを記述するこの一般に容認された慣行により，酵素のコアに関与するヌクレオチドは常に他のすべてのヌクレオチドに対して同じ番号を有することができる。基質結合またはコア形成に関与するステムのサイズは任意のサイズの任意の配列であることができ，例えば，Ａ９の位置は，他のすべてのコアヌクレオチドに対して同じままである。例えば，Ｎ＾１２またはＮ９＾と称されるヌクレオチドは，挿入されたヌクレオチドを表し，ここで，番号に対する脱字記号（＾）の位置は，挿入が示されるヌクレオチドの前であるか後であるかを示す。すなわち，Ｎ＾１２はヌクレオチド位置１２の前に挿入されたヌクレオチドを表し，Ｎ９＾はヌクレオチド位置９の後に挿入されたヌクレオチドを表す。
【０４０９】
触媒コア構造のコンセンサス配列は，Ｒｕｆｆｎｅｒ　ａｎｄ　Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１８：６０２５−６０２９により記載されている。一方，Ｐｅｒｒｉｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，Ｇｅｎｅ　１１３：１５７１６３は，この構造が変種，例えば，Ｎ９＾およびＮ＾１２等の天然に生ずるヌクレオチド挿入をも含むことができることを示した。すなわち，タバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡの＋鎖は，２つのヌクレオチド挿入のいずれも含まないが，アルファルファの過渡的条斑ウイルス（ｖＬＴＳＶ）のウイルソイドの＋ＲＮＡ鎖は，Ｎ９＾＝Ｕの挿入を含み，これは活性の喪失なしにＣまたはＧに変異することができる（Ｓｈｅｌｄｏｎ　ａｎｄ　Ｓｙｍｏｎｓ，１９８９，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１７：５６７９−５６８５）。さらに，この特定の場合においては，Ｎ７＝ＡおよびＲ１５．１＝Ａである。一方，カーネーション発育阻害に関連するウイロイド（−ＣａｒＳＶ）のマイナス鎖は，両方のヌクレオチド挿入物を含む，すなわちＮ＾１２＝ＡでありＮ９＾＝Ｃであるため，非常にめずらしい（Ｈｅｍａｎｄｅｚ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２０：６３２３−６３２９）。このウイロイドにおいては，Ｎ７＝ＡでありＲ１５．１＝Ａである。さらに，この特定のハンマーヘッド構造は，よりオープンな中心ステムにもかかわらず，非常に効率的な自己触媒的切断を示す。
【０４１０】
ハンマーヘッドリボザイムの可能な用途には，例えば，ＲＮＡ制限酵素の作成，および例えば，動物，ヒトまたは植物細胞および原核生物，酵母および原虫における遺伝子の発現の特異的不活性化が含まれる。生物医学的に特に興味深い点は，多くの疾病，例えば多くの形の腫瘍が，特定の遺伝子の過剰発現と関連しているという事実に基づく。関連するｍＲＮＡを切断することによりそのような遺伝子を不活性化することは，そのような疾病を管理し最終的には治療する可能性のある方法である。さらに，抗ウイルス剤，抗菌剤，および抗真菌剤等の医薬品を開発することが求められている。リボザイムは，生物の生存に必須のＲＮＡ分子を選択的に破壊することができるため，そのような抗感染剤としての可能性がある。
【０４１１】
基質結合のための正しいハイブリダイズ配列の必要性に加えて，ハンマーヘッドリボザイムの基質は，トリプレットＮ１６．２Ｕ１６．１Ｈ１７（ＮＵＨ）（式中，Ｎは任意のヌクレオチドであることができ，Ｕはウリジンであり，Ｈはアデノシン，シチジン，またはウリジンのいずれかである）に強い優先性を有することが示されている（Ｋｏｉｚｕｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９８８，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．２２８，２２８−２３０；Ｒｕｆｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２９，１０６９５−１０７０２；Ｐｅｒｒｉｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，Ｇｅｎｅ　１１３，１５７−１６３）。ＮＵＨは時々ＮＵＸとも称される。この基質特異性の一般則を変更すると機能的でない基質が得られるという事実は，規定の要件からはずれた基質が与えられたときに形成される”コア非適合性”構造が存在することを示唆する。この線に沿った証拠は，Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋおよび共同研究者により最近報告された（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３６：１１０８−１１１４）。彼らは，位置１７におけるＧの置換により，Ｇ１７とＣ３との間に機能的に破滅的な塩基対が形成され，切断用の切れやすい結合の正しい配向およびＣ３の必要な三次相互作用が妨害されることを示した（Ｍｕｒｒａｙ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１１：４８７−４９４）。同様の理由により，位置１６．１におけるＵに対する強い優先性が存在する。位置１６．１におけるＵの必要性を効率的に軽減するリボザイムを単離するために多くの実験が試みられてきたが，位置１６．１においてＵ以外の塩基を有する基質を切断することができるハンマーヘッドタイプのリボザイムを見いだす試みは不可能であったことが証明されている（Ｐｅｒｒｉｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，Ｇｅｎｅ　１１３，１５７−１６３）。
【０４１２】
切断領域において減少したまたは変更された要求性を有する効率的な触媒分子は非常に望ましい。これは，そのような分子が単離されれば，このタイプの分子が切断することができる利用可能な標的配列の数が非常に増加するであろうからである。潜在的な標的切断部位の数が増加するため，例えば，Ｎ１６．２Ｕ１６．１Ｈ１７以外のトリプレットを含む基質を効率的に切断しうるリボザイム変種を有することが望ましい。
【０４１３】
分子の中程の領域にデオキシリボヌクレオチドのブロックを含む，化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドは，遺伝子の発現の特異的不活性化のための医薬品としての可能性を有する（Ｇｉｌｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２０：７６３−７７０）。これらのオリゴヌクレオチドは，ハイブリッドＤＮＡ−ＲＮＡデュープレックスを形成することができ，ここで，ＲＮＡ鎖に結合したＤＮＡはＲＮａｓｅＨにより切断される。そのようなオリゴヌクレオチドは，ＲＮＡの切断を促進すると考えられており，したがって，ＲＮＡ切断活性を有するともＲＮＡ分子を切断するとも特徴づけることができない（ＲＮａｓｅＨが切断的である）。これらのオリゴヌクレオチドのインビボでの用途における重要な欠点は，特異性が低いことである。これは，ハイブリッド形成およびそれによる切断が，ＲＮＡ分子上の望ましくない位置においても生じうるからである。
【０４１４】
非修飾リボザイムは，ＲＮａｓｅｓによる分解に感受性であるため，ハンマーヘッドリボザイムを外的に輸送するためには，化学的に修飾された活性な物質を用いなければならない（例えば，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２１３１−２１３８；Ｋｉｅｈｎｔｏｐｆ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ　Ｊ．１３：４６４５−４６５２；Ｐａｏｌｅｌｌａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，ＥＭＢＯ　Ｊ．１１：１９１３−１９１９；およびＵｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１：１６３−１６４により議論されている）。
【０４１５】
Ｓｐｒｏａｔ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許５，３３４，７１１は，合成触媒オリゴヌクレオチド構造に基づく，３５−４０ヌクレオチドの長さのそのような化学的に修飾された活性な物質を記載する。これは，核酸標的配列の切断に適当であり，リボースの２’−Ｏ原子に１−１０個の炭素原子の任意に置換されたアルキル，アルケニルまたはアルキニルを含む修飾ヌクレオチドを含む。これらのオリゴヌクレオチドは，修飾ヌクレオチド構築ブロックを含み，ハンマーヘッド構造に似た構造を形成する。これらのオリゴヌクレオチドは，特定のＲＮＡ基質を切断することができる。
【０４１６】
Ｕｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許Ｎｏ．５，８９１，６８４は，基質結合アーム中に１またはそれ以上のヌクレオチド塩基修飾を有する酵素的核酸分子を記載する。
【０４１７】
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許５，５９９，７０４は，ＥｒｂＢ２／ｎｅｕ／ＨＥＲ２　ＲＮＡを標的とする酵素的ＲＮＡ分子を記載する。
【０４１８】
Ｓｕｌｌｉｖａｎ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許５，６１６，４９０は，蛋白質キナーゼＣ（ＰＫＣ）ＲＮＡを標的とする酵素的ＲＮＡ分子を記載する。
【０４１９】
Ｓｉｏｕｄ，国際公開９９／６３０６６は，蛋白質キナーゼＣアルファ（ＰＫＣアルファ），ＶＥＧＦ，およびＴＮＦアルファＲＮＡの特定の部位を標的とするハンマーヘッドリボザイムを記載する。
【０４２０】
Ｊａｒｖｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開９８／５０５０３０は，キシロ−リボヌクレオシドおよびキシロ修飾を含むオリゴヌクレオチドの合成を記載する。
【０４２１】
本発明は，ＲＮＡ切断活性を有する新規な酵素的核酸分子，ならびにこれを用いてインビトロおよびインビボでＲＮＡ基質を切断することに関する。組成物は，サブユニットがヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体から選択される活性中心，ならびにＲＮＡ基質との特異的ハイブリダイゼーションの形成に寄与するフランキング領域を含む。ＲＮＡ基質と組み合わせた好ましい組成物の形は，ハンマーヘッド構造に似た構造である。開示される組成物の活性中心は，Ｃｌ６．１を有するＲＮＡ基質を切断することができるＩ１５．１の存在により特徴付けられる。したがって，本発明の目的は，ＲＮＡを切断する組成物，特に，同時に高い安定性，活性，および特異性を有するＲＮＡ切断オリゴマーを提供することである。本発明は，特にＲＮＡまたはＤＮＡまたはそれらの組み合わせの切断に有用な，触媒活性を有する新規な核酸分子に関する。本発明の核酸触媒は，当該技術分野において知られる他の核酸触媒とは異なる。特に，本発明の核酸触媒は，分子間または分子内エンドヌクレアーゼ反応を触媒することができる。
【０４２２】
本発明の別の目的は，Ｎ１６．２Ｕ１６．１Ｈ１７（ＮＵＨ；図６）以外の切断部位トリプレットを有するＲＮＡ基質を切断する組成物を提供することである。ここで，Ｎはヌクレオチドであり，Ｕはウリジンであり，Ｈはアデノシン，ウリジンまたはシチジンである。Ｈは，Ｘと互換的に用いられる。特に，本発明の酵素的核酸分子は，切断トリプレットＮ１６．２Ｃ１６．１Ｈ１７（ＮＣＨ；図６）を有するＲＮＡ基質を切断するエンドヌクレアーゼ活性を有する。ここで，Ｎはヌクレオチドであり，Ｃはシチジンであり，Ｈはアデノシン，ウリジンまたはシチジンである。ＨはＸと互換的に用いられる。別の観点においては，本発明は，本発明の酵素的核酸分子が切断トリプレットＮ１６．２Ｃ１６．１Ｎ１７（ＮＣＮ；図６）を有するＲＮＡ基質を切断するエンドヌクレアーゼ活性を有することを特徴とする。ここで，Ｎはヌクレオチドであり，Ｃはシチジンである。
【０４２３】
好ましい態様においては，本発明は，式１：
【化６】
2004512810.tif 000002
［式中，Ｎは，独立して，ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーを表し，これは同じでも異なっていてもよく；ＤおよびＥは，独立して，標的核酸分子（標的は，ＲＮＡ，ＤＮＡまたは混合ポリマーでありうる）と安定に相互作用（例えば，標的中の相補的なヌクレオチドと水素結合を形成することにより）するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり，好ましくは，ＤおよびＥの長さは，独立して，３−２０，特に３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１７，および２０ヌクレオチドの長さであり；ｏおよびｎは，独立して，１以上の整数であり，好ましくは約１００より小さく，特に２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１５，２０，２５，３０，３５，５０であり，（Ｎ）ｏおよび（Ｎ）ｎがヌクレオチドであるとき，（Ｎ）ｏおよび（Ｎ）ｎは，任意に水素結合相互作用により相互作用することができてもよく，特に，ｎ＝１でありｏ＝１であるとき，（Ｎ）ｎは好ましくはプリン（例えば，Ｇ，およびＡ）であり，（Ｎ）ｏは好ましくはピリミジン（例えば，ＣおよびＵ）であり，（Ｎ）ｎは，好ましくはを形成し；・は塩基対相互作用を示し；Ｌはリンカーであり，これは存在してもしなくてもよく（すなわち，分子は２つの別々のオリゴヌクレオチドから組み立ててもよく），存在する場合には，これはヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチドリンカーであり，一本鎖および／または二本鎖領域であることができ；ｐは，０または１の整数であり，ｐ＝ｌであるとき，（Ｎ）ｐは好ましくはＡまたはＵであり；−は化学結合（例えば，リン酸エステル結合，アミド結合，ホスホロチオエート結合または当該技術分野において知られる他の結合）を表す］
を有する酵素的核酸分子を特徴とする。Ａ，Ｕ，Ｉ，ＣおよびＧは，それぞれアデノシン，ウリジン，イノシン，シチジンおよびグアノシンヌクレオチドを表す。式１の５’−ＣＵＧＡＮＧＡ−３’領域のＮは，好ましくはＵである。式１のヌクレオチドは，当該技術分野において知られるように，糖，塩基，および／またはリン酸において修飾されていてもされていなくてもよい。
【０４２４】
好ましい態様においては，本発明は，式２：
【化７】
2004512810.tif 000003
［式中，Ｎは，独立して，ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーを表し，これは同じであっても異なっていてもよく；ＤおよびＥは，独立して，標的核酸分子（標的は，ＲＮＡ，ＤＮＡ，または混合ポリマーでありうる）と安定に相互作用（例えば，標的中の相補的なヌクレオチドと水素結合を形成することにより）するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり，好ましくは，ＤおよびＥの長さは，独立して，３−２０，特に３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１７，および２０ヌクレオチドの長さであり；ｏおよびｎは，独立して０以上の整数であり，好ましくは約１００より小さく，特に，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１５，２０，２５，３０，３５，５０であり，（Ｎ）ｏおよび（Ｎ）ｎがヌクレオチドである場合，（Ｎ）ｏおよび（Ｎ）ｎは任意に水素結合相互作用により相互作用することができてもよく；・は塩基対相互作用を示し；Ｌはリンカーであり，これは存在してもしなくてもよく（すなわち，分子は２つの別々のオリゴヌクレオチドから組み立ててもよく），ただし存在する場合には，これはヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチドリンカーであり，一本鎖および／または二本鎖領域であることができ；ｐは０または１の整数であり，ｐ＝ｌであるとき，（Ｎ）ｐは好ましくはＡ，ＣまたはＵであり；−は化学結合（例えば，リン酸エステル結合，アミド結合，ホスホロチオエート結合または当該技術分野において知られる他の結合）を表す］
を有する酵素的核酸分子と特徴とする。Ａ，Ｕ，Ｉ，ＣおよびＧは，それぞれアデノシン，ウリジン，イノシン，シチジンおよびグアノシンヌクレオチドを表す。式２の５’−ＣＵＧＡＮＧＡ−３’領域中のＮは好ましくはＵである。式２のヌクレオチドは，当該技術分野において知られるように，糖，塩基，および／またはリン酸において修飾されていてもされていなくてもよい。
【０４２５】
好ましい態様においては，式１および２のＩ（イノシン）は，好ましくはリボイノシンまたはキシロ−イノシンである。
【０４２６】
さらに別の態様においては，ヌクレオチドリンカー（Ｌ）は核酸アプタマー，例えばＡＴＰアプタマー，ＨＩＶＲｅｖアプタマー（ＲＲＥ），ＨＩＶ　Ｔａｔアプタマー（ＴＡＲ）等でありうる（概説については，Ｇｏｌｄ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４，７６３；およびＳｚｏｓｔａｋ＆Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，１９９３，Ｔｈｅ　ＲＮＡ　Ｗｏｒｌｄ，ｅｄ．Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ　ａｎｄ　Ａｔｋｉｎｓ，ｐｐ５１１，ＣＳＨ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓを参照）。本明細書において用いられる場合，”核酸アプタマー”とは，リガンドと相互作用しうる核酸配列を示すことを意味する。リガンドは，任意の天然のまたは合成の分子であることができ，例えば，限定されないが，樹脂，代謝産物，ヌクレオシド，ヌクレオチド，薬剤，トキシン，遷移状態の類似体，ペプチド，脂質，蛋白質，アミノ酸，核酸分子，ホルモン，炭水化物，レセプター，細胞，ウイルス，細菌等でありうる。好ましい態様においてはＬは，配列５’−ＧＡＡＡ−３’または５’−ＧＷＡ−３’を有する。
【０４２７】
さらに別の態様においては，非ヌクレオチドリンカー（Ｌ）は，本明細書において定義されるとおりである。
【０４２８】
本明細書において用いる場合，”非ヌクレオチド”との用語には，無塩基ヌクレオチド，ポリエーテル，ポリアミン，ポリアミド，ペプチド，炭水化物，脂質，またはポリ炭化水素化合物が含まれる。特定の例には，Ｓｅｅｌａ　ａｎｄ　Ｋａｉｓｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．６３５３およびＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．３１１３；Ｃｌｏａｄ　ａｎｄ　Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．６３２４；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ　ａｎｄ　Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：５１０９；Ｍａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５８５およびＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９３，３２：１７５１；Ｄｕｒａｎｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．６３５３；ＭｃＣｕｒｄｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　２８７；Ｊｓｃｈｋｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．３０１；Ｏｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９９１，３０：９９１４；Ａｒｎｏｌｄ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開ＷＯ８９／０２４３９；Ｕｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開ＷＯ９５／０６７３１；Ｄｕｄｙｃｚ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開ＷＯ９５／１１９１０ａｎｄＦｅｒｅｎｔｚ　ａｎｄ　Ｖｅｒｄｉｎｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：４０００（すべて本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるものが含まれる。非ヌクレオチドリンカーは，オリゴマー配列ではないがオリゴマー配列と共有結合することができる任意の分子であってもよい。好ましい非ヌクレオチドリンカーは，非ヌクレオチドサブユニットから形成されるオリゴマー分子である。そのような非ヌクレオチドリンカーの例は，Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ　ａｎｄ　Ｗｕ，（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：７３２３−７３２８（１９９５）），Ｂｅｎｓｅｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：８４８３−８４８４（１９９３））ａｎｄＦｕ　ｅｔ　ａｌ．，（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：４５９１−４５９８（１９９４））に記載されている。好ましい非ヌクレオチドリンカー，または非ヌクレオチドリンカーのサブユニットには，置換または非置換のＣ１−Ｃ１０の直鎖または分枝鎖のアルキル，置換または非置換のＣ２−Ｃ１０の直鎖または分枝鎖のアルケニル，置換または非置換のＣ２−Ｃ１０の直鎖または分枝鎖のアルキニル，置換または非置換のＣ１−Ｃ１０の直鎖または分枝鎖のアルコキシ，置換または非置換のＣ２−Ｃ１０の直鎖または分枝鎖のアルケニルオキシ，および置換または非置換のＣ２−Ｃ１０の直鎖または分枝鎖のアルキニルオキシが含まれる。これらの好ましい非ヌクレオチドリンカー（またはサブユニット）の置換基は，ハロゲン，シアノ，アミノ，カルボキシ，エステル，エーテル，カルボキサミド，ヒドロキシ，またはメルカプトでありうる。すなわち，好ましい態様においては，本発明は，１またはそれ以上の非ヌクレオチド成分を有し，ＲＮＡまたはＤＮＡ分子を切断する酵素的活性を有する酵素的核酸分子を特徴とする。”非ヌクレオチド”との用語は，核酸鎖中の１またはそれ以上のヌクレオチドユニットの位置に組み込むことができ，糖および／またはリン酸置換のいずれかを含み，残りの塩基がその酵素的活性を示すことを可能とする，任意の基または化合物を意味する。基または化合物は，一般に認識されているヌクレオチド塩基，例えばアデノシン，グアニン，シトシン，ウラシルまたはチミンを含まない点において，無塩基である。本明細書において用いられる場合，”無塩基”または”無塩基ヌクレオチド”との用語は，塩基を欠失しているか，１’位においてヌクレオチド塩基の代わりに他の化学基を有する糖成分を包含する。
【０４２９】
好ましい態様においては，本発明は，１またはそれ以上のホスホロチオエート，ホスホロジチオエート，メチルホスホネート，モルホリノ，アミデート，カルバメート，カルボキシメチル，アセトアミデート，ポリアミド，スルホネート，スルホンアミド，スルファメート，ホルムアセタール，チオホルムアセタール，および／またはアルキルシリル置換を含む，リン酸骨格修飾を有する修飾リボザイムを特徴とする。オリゴヌクレオチド骨格修飾の概説については，Ｈｕｎｚｉｋｅｒ　ａｎｄ　Ｌｅｕｍａｎｎ，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ａｎａｌｏｕｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｍｏｄｅｒｎ　Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＶＣＨ，３３１−４１７，およびＭｅｓｍａｅｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ｎｏｖｅｌ　Ｂａｃｋｂｏｎｅ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ　ｆｏｒ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＡＣＳ，２４−３９を参照。
【０４３０】
本発明のさらに別の好ましい態様においては，酵素的核酸分子の３’末端において反転デオキシ無塩基成分が用いられる。
【０４３１】
”ピリミジン”とは，６員のピリミジン環の，修飾されているかされていない誘導体を含むヌクレオチドを意味する。ピリミジンの例は，修飾されているかされていないウリジンである。
【０４３２】
好ましい態様においては，本発明のヌクレオシドには，２’−Ｏ−メチル−２，６−ジアミノプリンリボシド；２’−デオキシ−２’アミノ−２，６−ジアミノプリンリボシド；２’−（Ｎ−アラニル）アミノ−２’−デオキシ−ウリジン；２’−（Ｎ−フェニルアラニル）アミノ−２’−デオキシ−ウリジン；２’−デオキシ−２’（Ｎ−ベータ−アラニル）アミノ；２’−デオキシ−２’−（リシル）アミノウリジン；２’−Ｃ−アリルウリジン；２’−Ｏ−アミノウリジン；２’−Ｏ−メチルチオメチルアデノシン；２’−Ｏ−メチルチオメチルシチジン；２’−Ｏ−メチルチオメチルグアノシン；２’−Ｏ−メチルチオメチル−ウリジン；２’−デオキシ−２’−（Ｎ−ヒスチジル）アミノウリジン；２’−デオキシ−２’−アミノ−５−メチルシチジン；２’−（Ｎ−β−カルボキシアミジン−ベータ−アラニル）アミノ−２’−デオキシ−ウリジン；２’−デオキシ−２’−（Ｎ−ベータ−アラニル）−グアノシン；２’−Ｏ−アミノ−アデノシン；２’−（Ｎ−リシル）アミノ−２’−デオキシ−シチジン；２’−デオキシ−２’−（Ｌ−ヒスチジン）アミノシチジン；および５−イミダゾール酢酸２’−デオキシ−５’−三リン酸ウリジンが含まれる。
【０４３３】
本明細書において用いる場合，”オリゴヌクレオチド”とは，２またはそれ以上のヌクレオチドを有する分子を意味する。ポリヌクレオチドは，一本鎖，二本鎖または多数の鎖であることができ，修飾されたまたは修飾されていないヌクレオチドまたは非ヌクレオチドまたはそれらの種々の混合物および組み合わせを有することができる。
【０４３４】
好ましい態様においては，式１または２の酵素的核酸分子は，少なくとも３つのリボヌクレオチド残基，好ましくは４，５，６，７，８，９，および１０個のリボヌクレオチド残基を含む。
【０４３５】
好ましい態様においては，本発明の酵素的核酸は，１またはそれ以上のＲＮＡのストレッチを含み，これは非ヌクレオチド成分に連結した分子の酵素的活性を提供する。必要なＲＮＡ成分は当該技術分野において知られている（例えば，Ｕｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，（上掲）を参照）。
【０４３６】
すなわち，１つの好ましい態様においては，本発明は，インビトロまたはインビボで（例えば，患者において）遺伝子発現および／または細胞増殖を阻害する酵素的核酸分子を特徴とする。これらの化学的にまたは酵素的に合成した核酸分子は，特定の標的核酸分子のアクセス可能な領域に結合する基質結合ドメインを含む。核酸分子はまた，標的の切断を触媒するドメインを含む。酵素的核酸分子は，標的分子に結合するとこれを切断し，例えば，翻訳および蛋白質の蓄積を防止する。標的遺伝子の発現がないため，例えば，細胞増殖が阻害される。
【０４３７】
別の好ましい態様においては，本発明において記載される分子の触媒活性は，Ｄｒａｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，（上掲）に記載されるように最適化することができる。ここでは詳細は繰り返さないが，リボザイム結合アームの長さを変化させること，または血清リボヌクレアーゼによる分解を防止し，および／またはその酵素的活性を増強する修飾（塩基，糖および／またはリン酸）を有するリボザイムを化学的に合成することが含まれる（例えば，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ　ｅｔ　ａｌ．，１９９０　Ｎａｔｕｒｅ　３４４，５６５；Ｐｉｅｋｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９１　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５３，３１４；Ｕｓｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７，３３４；Ｕｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開ＷＯ９３／１５１８７；およびＲｏｓｓｉ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開ＷＯ９１／０３１６２；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許５，３３４，７１１；およびＢｕｒｇｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，（上掲）を参照；これらはすべて，酵素的ＲＮＡ分子の塩基，リン酸および／または糖成分に行うことができる種々の化学修飾を記載する）。細胞におけるその有効性を増強する修飾，およびステムループ構造から塩基を助してＲＮＡ合成時間を短くし，化学物の必要性を減少させることが望ましい（これらの刊行物はすべて本明細書の一部としてここに引用する）。
【０４３８】
本明細書において用いる場合，”核酸触媒”とは，種々の反応を触媒する（早さおよび／または速度を変更する）ことができ，ヌクレオチド塩基配列特異的様式で別個の核酸分子を繰り返し切断する能力（エンドヌクレアーゼ活性）を含む核酸分子（例えば，式１および２の分子）を意味する。そのようなエンドヌクレアーゼ活性を有する分子は，基質結合領域において特定の遺伝子標的に対する相補性を有していてもよく，その標的中のＲＮＡまたはＤＮＡを特異的に切断する酵素的活性をも有する。すなわち，エンドヌクレアーゼ活性を有する核酸分子は，ＲＮＡまたはＤＮＡを分子内または分子間で切断することができ，このことにより標的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子を不活性化することができる。この相補性は酵素的ＲＮＡ分子の標的ＲＮＡまたはＤＮＡに対する十分なハイブリダイゼーションを可能とするよう機能し，切断が生ずることを可能とする。１００％の相補性が好ましいが，５０−７５％程度の低い相補性も本発明においては有用であろう。核酸は，塩基，糖，および／またはリン酸基で修飾されていてもよい。本明細書において用いる場合，酵素的核酸との用語は，例えば，リボザイム，触媒的ＲＮＡ，酵素的ＲＮＡ，触媒的オリゴヌクレオチド，ヌクレオザイム，ＲＮＡ酵素，エンドリボヌクレアーゼ，エンドヌクレアーゼ，ミニザイム，オリゴザイム，フィンデロンまたは核酸触媒等の用語と互換的に用いられる。これらの用語はすべて，酵素的活性を有する本発明の核酸分子を記述する。本明細書に記載される酵素的核酸分子の特定の例は，本発明を限定するものではなく，当業者は，本発明の酵素的核酸分子において重要なことは，これが１またはそれ以上の標的核酸領域に相補的な特異的基質結合部位を有し，かつ分子に核酸切断活性を与えるヌクレオチド配列を基質結合部位内または周辺に有することであることを認識するであろう（Ｃｅｃｈ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許４，９８７，０７１，Ｃｅｃｈ　ｅｔ　ａｌ．，１９８８，２６０　ＪＡＭＡ　３０３０）。
【０４３９】
式１または２の酵素的核酸分子は，独立してキャップ構造を含んでいてもよく，これは独立して存在してもしなくてもよい。
【０４４０】
”キメラ核酸分子”または”混合ポリマー”とは，分子が修飾ヌクレオチドまたは非修飾ヌクレオチドの両方から構成されていてもよいことを意味する。
【０４４１】
さらに別の好ましい態様においては，３’−キャップは，４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド，炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルリン酸；１，３−ジアミノ−２−プロピルリン酸，３−アミノプロピルリン酸；６−アミノヘキシルリン酸；１，２−アミノドデシルリン酸；ヒドロキシプロピルリン酸；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環状３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド，５’−５’−反転ヌクレオチド成分；５’−５’−反転無塩基成分；５’−ホスホルアミデート；５’ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールリン酸；５’−アミノ；架橋および／または非架橋５’ホスホルアミデート，ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート，架橋または非架橋メチルホスホネートおよび５’−メルカプト成分からなる群より選択される（詳細については，Ｂｅａｕｃａｇｅ　ａｎｄ　Ｉｙｅｒ，１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　４９，１９２５を参照；本明細書の一部としてここに引用する）。”非ヌクレオチド”との用語は，１またはそれ以上のヌクレオチド単位の位置に核酸鎖中に組み込むことができ，糖および／またはリン酸置換のいずれかを有し，残りの塩基がその酵素的活性を示すことを可能とする，任意の基または化合物を意味する。このような基または化合物は，一般に認識されているヌクレオチド塩基，例えばアデノシン，グアニン，シトシン，ウラシルまたはチミンを含まない点において，無塩基である。本明細書において用いる場合，”無塩基”または”無塩基ヌクレオチド”との用語は，塩基を欠失しているかまたは１’位置において塩基の代わりに他の化学基を有する糖成分を包含する。
【０４４２】
好ましい態様においては，本発明は，１−（ベータ−Ｄ−キシロフラノシル）−ヒポキサンチンホスホルアミダイトおよびその合成方法，およびオリゴヌクレオチド，例えば酵素的核酸分子中への組み込みを特徴とする。
【０４４３】
さらに別の好ましい態様においては，本発明は，ＨＥＲ２　ＲＮＡを標的とする酵素的核酸分子，特にハンマーヘッドおよびＮＣＨモチーフのリボザイムを特徴とする。
【０４４４】
好ましい態様においては，本発明は，ＰＫＣアルファＲＮＡを標的とする酵素的核酸分子，特に，ハンマーヘッドおよびＮＣＨモチーフのリボザイムを特徴とする。
【０４４５】
有用なリボザイムおよびアンチセンス核酸の標的，例えばＰＫＣアルファＲＮＡは，例えば，Ｄｒａｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，ＷＯ９５／０４８１８；ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許５，５２５，４６８および５，６４６，０４２（すべてその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載のように決定することができる。他の例には，疾病関連遺伝子の発現の不活性化に関する以下のＰＣＴ出願が含まれる：ＷＯ９５／２３２２５，ＷＯ９５／１３３８０，ＷＯ９４／０２５９５（すべて本明細書の一部としてここに引用する）。
【０４４６】
本発明に記載される特定の酵素的核酸分子は，本発明において限定的なものではなく，当業者は本発明の酵素的核酸分子において重要なことは，これが標的核酸領域の１またはそれ以上に相補的な特異的基質結合部位（例えば，上述の式１のＤおよびＥ）を有し，かつその基質結合部位の中または周りに分子に核酸切断活性を付与するヌクレオチド配列を有することであることを認識するであろう。
【０４４７】
すべての天然に生ずるハンマーヘッドリボザイムは，Ａ１５．１−Ｕ１６．１塩基対を有する。さらに，コンセンサスハンマーヘッド配列に基づくリボザイムの基質は，Ｎ１６．２Ｕ１６．１Ｈ１７トリプレット（ここでＨ１７はグアノシンではない）を含む基質を非常に好むことが知られている（Ｋｏｉｚｕｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．２２８，２２８−２３０（１９８８）；Ｒｕｆｆｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２９，１０６９５−１０７０２（１９９０）；Ｐｅｒｒｉｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ　１１３，１５７−１６３（１９９２））。位置１６．１におけるＵの要件を効率的に軽減することができるリボザイムを単離しようとして多くの実験が行われてきたが，位置１６．１においてＵ以外の塩基を有する基質を切断しうるリボザイムを見いだす試みは，ほとんど成功しないことが証明されている（Ｐｅｒｒｉｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ　１１３，１５７−１６３１９９２，Ｓｉｎｇｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ６：１６５−１６８（１９９６））。
【０４４８】
しかし，最近公表されたＸ線結晶構造（Ｐｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３７２：６８−７４（１９９４），Ｓｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ８１：９９１−１００２（１９９５），およびＳｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７４：２０６５−２０６９（１９９６））を調べると，Ａ１５．１−Ｕ１６．１相互作用がアデノシンの環外アミン（Ｎ６）とウリジン４−オキソ基の間に１個の水素結合を有する非標準的な塩基対であることが理解される。次に，モデリング実験（結晶構造に基づく）により，野生型Ａ１５．１−Ｕ１６．１塩基対の相互作用は，異なる構造的配向に適合し，Ｃ１６．１の２−ケト基とウリジンターンのＡ６との必要な接触を保存するＩ１５．１−Ｃ１６．１塩基対で置き換えることにより，空間的に模倣することができることが発見された。このモデルにおいては，位置１５．１と１６．１との間の安定化水素結合の極性は，Ｉ１５．１−Ｃ１６．１相互作用においては逆転しているが，この結合のまわりの塩基の正しい配向は維持されている。
【０４４９】
位置１５．１にイノシンを含むハンマーヘッドリボザイム類似体がＮ１６．２Ｃ１６．１Ｈ１７トリプレットを含むＲＮＡ基質を容易に切断することが発見された。このことに基づいて，トリプレットＮ１６．２Ｃ１６．１Ｈ１７を含む核酸標的配列を切断する組成物，好ましくは合成オリゴマーが開示される。Ｈ１７がグアノシンでないことが好ましいが，ある種の状況下では，本発明のリボザイムによりＮＣＧトリプレット含有ＲＮＡを切断することができる。Ｎ１６．２Ｃ１６．１Ｘ１７トリプレットを有する基質を切断する能力は，開示されるタイプの組成物により切断することができる標的の数を効率よく倍加する。
【０４５０】
実施例１０：１−（ベータ−Ｄ−キシロフラノシル）−ヒポキサンチンホスホルアミダイトの合成
図９を参照すると，イノシン（１）を標準的な条件下で５’−Ｏ−モノメトキシトリチル化し，２’−Ｏ−シリル化して，２を得る（Ｃｈａｒｕｂａｌａ，Ｒ；Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ，Ｗ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ，１９９０，３０，１１４１）。酸化／還元により，３が中程度の収率で得られる（Ｍａｔｕｌｉｃ　Ａｄａｍｉｃ，Ｊ．；Ｄａｎｉｈｅｒ，Ａ．Ｔ．；Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｃ．；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ，Ｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．．１９９９，９，１５７）：
【化８】
2004512810.tif 000004
【０４５１】
３の標準的なホスフィチル化により，所望のホスホルアミダイト４を得る。
【０４５２】
この特定の場合には，より酸安定性の高い５’−Ｏ−ＭＭＴ基を用いる。これは，一連のキシロヌクレオシドにおいては一連のリボヌクレオシドにおけるより５’−Ｏ−ＤＭＴ保護がより不安定であることが見いだされたためである。
【０４５３】
キシロ−イノシンは，当該技術分野において知られ本明細書に記載される標準的な方法を用いてオリゴヌクレオチド中に組み込んだ。
【０４５４】
実施例１１：キシロ−イノシン−修飾ＮＣＨリボザイムの活性
位置１５．１にキシロ−イノシンを有するいくつかのＮＣＨリボザイムを設計して（図７），ＧＣＡ，ＡＣＡ，ＵＣＡまたはＣＣＡトリプレットを含むＲＮＡを切断した。これらのリボザイムを合成し，本明細書に記載されるように精製し，標準的なＲＮＡ切断反応条件を用いて試験した（例えば表３１および下記を参照）。
【０４５５】
リボザイムは化学的に合成した。用いた合成方法は，上述した，Ｕｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８７Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５），Ｓｃａｒｉｎｇｅ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９０　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１８，５４３３）およびＷｉｎｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，（上掲）に記載される通常のＲＮＡ合成の方法にしたがい，一般の核酸保護基およびカップリング基，例えば５’−末端にジメトキシトリチル，および３’−末端にホスホルアミダイトを用いた。平均段階カップリング収率は＞９８％であった。
【０４５６】
リボザイムは，一般的な方法を用いてゲル電気泳動により精製するかまたは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；Ｗｉｎｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，（上掲）を参照；その全体を本明細書の一部としてここに引用する）により精製し，水に再懸濁した。この実験において用いた化学的に合成したリボザイムの配列は以下の表３３に示される。
【０４５７】
切断反応：リボザイム切断アッセイ用の全長または部分全長の，内部標識した標的ＲＮＡは，［アルファ−３２Ｐ］ＣＴＰの存在下でインビトロ転写により調製し，スピンクロマトグラフィーによりＧ５０セファデックスカラムを通し，さらに精製することなく，基質ＲＮＡとして用いた。あるいは，Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて基質を５’−３２Ｐ−末端標識した。アッセイは，以下のように行った。２Ｘ濃度の精製リボザイムをリボザイム切断緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，３７℃，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２）中であらかじめ暖め，２Ｘリボザイム混合物を，これもあらかじめ暖めた緩衝液中の等量の基質ＲＮＡ（最大１−５ｎＭ）に加えることにより切断反応を開始した。最初のスクリーニングとして，アッセイは，４０ｎＭまたは１ｍＭリボザイムの最終濃度を用いて，すなわちリボザイム過剰で，３７℃で１時間行った。等量の９５％ホルムアミド，２０ｍＭ　ＥＤＴＡ，０．０５％ブロモフェノールブルーおよび０．０５％キシレンシアノールを加えることにより反応を急冷し，その後，試料を９５℃で２分間加熱し，急冷し，変性ポリアクリルアミドゲルに負荷した。基質ＲＮＡおよびリボザイム切断により生成した特異的ＲＮＡ切断生成物は，ゲルのオートラジオグラフィーにより可視化した。切断のパーセントは，無傷の基質および切断産物を示すバンドをホスファーイメージャー（登録商標）で定量することにより決定した。
【０４５８】
実験の結果は表３２にまとめられている。この表は，ＮＣＨキシロリボザイムが標的ＲＮＡの切断において触媒的に活性であることを示す。
【０４５９】
実施例１２：ＮＣＨリボザイム変種の活性
本発明の核酸分子は，新規な組の１２ＮＣＨトリプレットを切断する能力を可能とする。これらのリボザイムの全リボ型についてｐＨ６における１回ターンオーバー速度定数を決定したところ，ＮＣＡタイプのトリプレットでは，切断速度はＮＵＡ部位におけるより高いことが示された。ＮＣＣおよびＮＵＣ部位の速度は同様であり，ＮＣＵ部位はＮＵＵ部位よりやや低かった。さらに，５ｎＭのリボザイムを用いて非飽和条件下で，実施した全リボリボザイムの多数回ターンオーバーパラメータを測定した。基質濃度を５０−５００ｎＭに変化させ，３７℃でｐＨ７．４で１０ｍＭ　Ｍｇ＋＋を用いたとき，ＧＣＡについてはＫｍ＝１００ｎＭでありｋｃａｔ＝６．５ｍｉｎ−１であり，ＧＵＡ切断全リボリボザイムについてはＫｍ＝３０ｎＭ，ｋｃａｔ＝２．０ｍｉｎ−１であった。これらのデータにより，Ｉ・Ｃ塩基対を有するリボザイムは，多数回ターンオーバー反応において有効な触媒であり，ｐＨ６で確立したＮＣＨとＮＵＨ切断剤の活性の相対値（Ｌｕｄｗｉｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２６，２２７９−２２８５）は変化しないことが確認された。
【０４６０】
本発明のリボザイムの１５．１−１６．１塩基対の構造的要件についてのより多くの洞察を得るために，本出願人は，活性なＩ−１５．１・Ｃ−１６．１構造のいくつかの変種を合成し，これらのリボザイム類似体をその対応する基質とともに試験した。いくつかのコア安定化戦略がＮＣＨ切断リボザイムの活性に及ぼす影響も調べた。
【０４６１】
種々のヌクレオシド類似体をリボザイムの位置１５．１に組み込んだ。切断活性は，相補的なＦｌ＊標識基質を用いて，ｐＨ７．４で１０ｍＭ　Ｍｇ＋＋の存在下でリボザイム過剰の条件下（すなわち１回のターンオーバー条件）で試験した。修飾オリゴヌクレオチドは，標準的なオリゴヌクレオチド合成方法により合成した。キサントシンはＯ−２，Ｏ−４ピバロイルオキシメチル基を用いて保護し；Ｎ，Ｎ−ジメチルグアノシンは６−Ｏ−（２−ニトロフェニル−）エチルで，および６−チオ−イノシンはＳ−シアノエチル保護基で保護した。１５．１類似体を含むリボザイムの切断活性は図３６にまとめられている。比較のため，図３７は，ＮＵＨ切断リボザイムのＡ−１５．１・Ｕ１６．１の状況におけるＡ１５．１残基において行った官能基修飾実験の報告をまとめる。
【０４６２】
プリン１５．１Ｎ１および／またはＣ６位置（図３６Ａ，Ｂ，Ｃ）における修飾
６−チオ−イノシン（Ａ）（ｓＩ）１５．１置換リボザイムにおいては，元の（Ｉ−１５．１）位置の６Ｏ・Ｈ−Ｎ（Ｃ−１６．１）の結合はより弱い（ｓＩ−１５．１）位置の６Ｓ・Ｈ−Ｎ（Ｃ−１６．１）水素結合で置き換えられており，他のすべての官能基は変更されていない。位置１５．１（Ａ−１５．１）にアデノシンを有するリボザイム（Ｂ）はＣ−１６．１基質では不活性である。これは，リボザイムの幾何学が，［Ａ−１５．１］位置６のアミノ基および［Ｃ−１６．１］位置４のアミノ基の水素結合ドナー官能基が近くに位置することを必要とするからである。同様に，Ｉ−１５．１リボザイムおよびＵ−１６．１基質では低い活性が観察され，ここでは，［Ｉ−１５．１］位置６のケトおよび［Ｃ−１６．１］位置４のケトの水素結合アクセプタ基が反対側にある（図３７，Ｂ）。イノシンはＲＮＡデュープレックス中またはｔＲＮＡアンチコドン−ｍＲＮＡ相互作用においてウリジンと安定なミスマッチ対を形成することができるが，これらの結果は，Ｉ・Ｕミスマッチにおける幾何学が活性なＮＵＨリボザイムのＡ・Ｕ（またはＩ・Ｃ）塩基対における幾何学と異なることを示唆する。Ｎ１−メチル−イノシン（Ｃ）で位置１５．１のイノシンを置き換えると切断活性は完全に失われる。
【０４６３】
プリン１５．１Ｃ２および／またはＮ３位置（図３６Ｄ，Ｅ，Ｆ）における修飾
Ｇ−１５．１（Ｄ）置換類似体において観察された非常に低い活性は，Ｇ・Ｃワトソン−クリック塩基対の形成により説明することができる。Ｉ・Ｃ対をＧ・Ｃ対で置き換えると，１５．１−１６．１位置の幾何学を著しくゆがめることができる。Ｇ−１５．１Ｎ２−アルキル化（Ｅ）は，Ｇ１５．１と比較して触媒活性をほとんど回復させず，このことは，嵩高いＮ−メチル基により導入された立体的な問題がスタッキング相互作用を妨害するかもしれないことを示唆する。この構築物の活性は，標準的なＡ−Ｕの状況のリボザイムを含むイソ−Ｇ−１５．１（図３７，Ｅ）より著しく低い。キサントシン１５．１（Ｆ）は，Ｎ１およびＣ６部位においてイノシンと同じ官能基を含むが，Ｃ２カルボニル基に加えて位置Ｎ３において追加の水素結合ドナー部位を含む。この構築物で見られる活性の完全な喪失は，遷移状態形成におけるプリンＮ３アクセプター官能基の重要性を補強する。同様に，３−デアザ−アデノシン（図３７，Ｆ）含有リボザイムもまた不活性であった。１５．１プリンのＣ２カルボニルは，イソ−グアノシン含有１５．１リボザイムにおいて有意な負の干渉を示さない。
【０４６４】
修飾コア変種の活性
Ｉ・Ｃ対含有リボザイムの特性決定を完成させるために，種々のコア置換パターンの許容性を試験した。３個の異なる修飾リボザイムを用いて，ＧＣＨおよびＧＵＨ（Ｈ＝Ｇ以外）トリプレットを含む短い基質を比較した。ＧＣＡトリプレットを有するＵ−４　２’−Ｏ−アルキル置換基の許容性が最も高く，Ｕ−４＝２’−デオキシ−２’−アミノウリジンおよびＵ−４＝リボウリジン置換リボザイムはＮＣＨおよびＮＵＨトリプレットと同様のレベルの活性を示した。この比較の結果は表６４にまとめられている。さらに，位置１４および１５．１においてリボイノシンでアデノシンが置き換えられているリボザイム構築物を試験したところ，切断活性を示した。
【０４６５】
リボザイム構造中の重要なＨ−結合の極性を逆転させるＡ−１５．１・Ｕ−１６．１からＩ−１５．１・Ｃ−１６．１への変化を除いて，１５．１プリン残基における他の官能基の変更は，有効な触媒作用の要件と一致しないようである。Ｉ−１５．１およびＡ−１５．１リボザイムは，安定化残基の許容性にわずかの相違しかないため，実用的な応用には同等に適している。
【０４６６】
実施例１３：ＮＣＨリボザイムがＨＥＲ２遺伝子発現を阻害する活性
本出願人は，ＨＥＲ２　ＲＮＡを標的とするいくつかのＮＣＨリボザイムおよびＨＨリボザイムを設計し，合成し，細胞増殖アッセイにおいて試験した（例えば，表３１および３４を参照）。
【０４６７】
増殖アッセイ：この実験において用いたモデル増殖アッセイは，９６−ウエルプレート中で２０００細胞／ウエルの細胞播種密度および５日の処理期間の間に少なくとも２回の細胞倍加を必要とする。増殖アッセイ用に細胞密度を計算するために，当該技術分野においてよく知られるＦＩＰＳ（フルオロイメージングプロセシングシステム）方法を用いた。この方法により，核酸をＣｙＱｕａｎｔ（登録商標）染料で染色した後に細胞密度の測定が可能であり，９６−ウエルフォーマットで１，０００−１００，０００細胞／ウエルの非常に広い範囲にわたって細胞密度を正確に測定するという利点を有する。
【０４６８】
リボザイム（５０−２００ｎＭ）を２．０μｇ／ｍＬのカチオン性脂質の存在下で輸送し，処置の５日後に阻害を決定した。２つの完全なリボザイムスクリーニングを完了し，４個のリードＨＨおよび１１個のリードＮＣＨリボザイムを選択して次の試験を行った。一次スクリーニングにおいて選択された１５個のＲｚのうち，４個のＮＣＨおよび１個のＨＨ　Ｒｚは，次の実験においても細胞増殖を阻害し続けた。部位２００１（ＲＰＩ　Ｎｏ．１７２３６），２７８３（ＲＰＩ　Ｎｏ．１７２４９），２９３９（ＲＰＩ　Ｎｏ．１７２５１）または３９９８（ＲＰＩ　Ｎｏ．１７２６２）に対するＮＣＨ　Ｒｚは，スクランブル化対照Ｒｚ（ＩＡ；ＲＰＩ　Ｎｏ．１７２６３）と比較して２５−６０％の範囲の増殖の阻害を引き起こした。５個のリードＲｚのうち，最も効力の高いものはＨＥＲ２　ＲＮＡの部位２９３９に対するＮＣＨ　Ｒｚ（ＲＰＩ　Ｎｏ．１７２５１）である。細胞培養アッセイの結果の一例が図３に示されている。図３を参照すると，ＨＥＲ２　ＲＮＡを標的とするＮＣＨリボザイムおよびＨＨリボザイムは，細胞の増殖の有意な阻害を引き起こすことが示される。これは，リボザイム，例えばＮＣＨリボザイムが哺乳動物細胞においてＨＥＲ２遺伝子発現を阻害しうることを示す。
【０４６９】
実施例１４：ＮＣＨリボザイムがＰＫＣアルファ遺伝子発現を阻害する活性
蛋白質キナーゼＣファミリーは，１２個のこれまでに知られているアイソザイムを含み，これらは３つの群に分類される：伝統的な，Ｃａ＋＋依存性（ＰＫＣα，βＩ，βＩＩ，γ），新規なＣａ＋＋非依存性（ＰＫＣδ，ε，μ，η，θ）および典型的でないもの（ＰＫＣξ，ｉ／λ）。これらはすべて，セリン／トレオニンキナーゼである。これらのアイソザイムは，区別されるが重複する組織，細胞，および細胞内分布を示す。これらは脂質代謝の第二メッセンジャー産物に応答することにより細胞成長および分化の制御を助ける（Ｂｌｏｂｅ，　ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｕｒｖｅｙｓ，２７，２１３−２４８）。これらの第二メッセンジャーには，直接またはＣａ＋＋濃度の変化に加えて作用するジアシルグリセロール（ＤＡＧ），イノシトール−三リン酸（ＩＰ３），リゾリン脂質，遊離脂肪酸，およびホスファチデートが含まれる。ＰＫＣα活性化の簡単なモデルは，２段階のメカニズムにしたがう。第１に，ＰＫＣαがＣａ＋＋およびリン脂質の相互作用により膜と会合し，第２に，ＤＡＧとの相互作用によりキナーゼが活性化される。ＰＫＣ活性化後のシグナルカスケードの例は，ＰＫＣがｃ−Ｒａｆをリン酸化し，これがＭＥＫをリン酸化し，これがＭＡＰをリン酸化し，これがＪｕｎ等の転写因子をリン酸化し，このことにより核において有糸分裂プログラムを活性化させる。種々のＰＫＣについて多くの基質が存在し，ＰＫＣαの基質は，最終的にはＰ糖蛋白質（Ｐ−ｇｐ）を活性化する転写因子を刺激して，多剤耐性表現型（ＭＤＲ）を引き起こす（Ｂｌｏｂｅ，　ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ　ａｎｄ　Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　Ｒｅｖｉｅｗｓ，１３，４１１−４３１）。
【０４７０】
培養細胞の概要
ＰＫＣは，これらの分子が腫瘍促進性ホルボルエステルのレセプターとして働くことができるという発見以来，腫瘍促進に関与することが示唆されている。多くの腫瘍細胞株および腫瘍組織におけるＰＫＣの過剰発現の増加も示されている。ＰＫＣの過剰発現は，マウスルイス肺癌腫，マウスＢ１６黒色腫（Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１８，４４−５３），マウス乳腺癌，マウス線維肉腫，ヒト肺癌腫（ＷａｎｇａｎｄＬｉｕ，１９９８，Ａｃｔａ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ　Ｓｉｎｉｃａ，１９，２６５−２６８），ヒト膀胱癌腫，ヒト膵臓癌（Ｄｅｎｈａｍ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｓｕｒｇｅｒｙ，１２４，２１８−２２３），およびヒト胃癌（Ｄｅａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６，３４９９−３５０７）における侵襲および転移の増加と関連することが示されている。挙げられた証拠は，ＰＫＣαが接着分子の発現を刺激し，これらの膜結合種に対して基質として直接作用し，このことにより細胞外マトリクスへの細胞接着を調節し，転移能力を増加させることを示唆する。さらに，ヒトの外科手術標本は，乳癌，甲状腺癌腫および黒色腫においてＰＫＣが上昇していることを示した（Ｂｅｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９０，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，５，１１３３−１１３９）。
【０４７１】
Ｕｔｚ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５７，１０４−１１０は，ＰＫＣの小分子阻害剤が多剤耐性（ＭＤＲ）表現型を有するＣＣＲＦ−ＶＣＲ１０００およびＫＢ−８５１１細胞において抗増殖活性を示す細胞増殖アッセイを記載する。ＰＫＣαは，ＭＤＲ表現型を示す腫瘍組織において過剰発現されている。この表現型は，１７０ｋＤａの特異性の広い薬剤流出ポンプであるＰ−ｇｐの発現と関連する。Ｐ−ｇｐのＰＫＣαリン酸化がインビトロで示されている。さらに，ＰＫＣ発現は，ヒト腎臓癌腫および非小細胞肺癌腫において，ドキソルビシンに対する耐性および高いＰ−ｇｐレベルと相関している。ＰＫＣの阻害剤は，ＭＤＲ表現型を部分的に逆転させ，Ｐ−ｇｐのリン酸化を減少させる（Ｃａｐｏｎｉｇｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇｓ，８，２６−３３）。
【０４７２】
Ｄｅａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６９，１６４１６−２４，は，ヒト肺癌腫（Ａ５４９）細胞において，ＰＫＣのアンチセンスターゲティングによりｍＲＮＡおよび蛋白質発現が強力に阻害された細胞培養実験を記載する。この実験においては，ＰＫＣα阻害により，ホルボルエステルによる細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）ｍＲＮＡの誘導が減少した。
【０４７３】
Ｙａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４０，４６２２−４６３２は，異なるＰＫＣのアイソフォーム（例えばＰＫＣα）のダウンレギュレーションによりインスリン様成長因子Ｉ誘導性の血管平滑筋細胞の増殖，移動および遺伝子発現が阻害される細胞増殖実験を記載する。
【０４７４】
Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５０，２５３−２６３は，ヒト肺癌腫（ＬＴＥＰａ−２）細胞においてＰＫＣαのアンチセンス阻害によりトランスフォームした表現型が逆転した細胞培養実験を記載する。この実験においては，対照細胞と比較してＰＫＣα蛋白質の量および総ＰＫＣ活性が減少した。
【０４７５】
Ｓｉｏｕｄ　ａｎｄ　Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，５５６−５６１は，神経膠腫細胞株（ＢＴ４ＣおよびＢＴ４Ｃｎ）におけるＰＫＣαのハンマーヘッドリボザイム阻害を記載する。この実験は，悪性神経膠腫細胞増殖の阻害ならびに調節Ｂｃｌ−ｘＬ蛋白質発現の阻害を示した。Ｂｃｌ−ｘＬは神経膠腫細胞中で過剰発現されており，アポトーシス阻害剤である。細胞増殖のリボザイム媒介性阻害は，おそらくは，ＰＫＣαおよびＢＣｌ−ＸＬの抑制を介するトランスフォームした神経膠腫細胞のアポトーシスの誘導によるものであろう（Ｌｅｉｒｄａｌ　ａｎｄ　Ｓｉｏｕｄ，１９９９，Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊ．ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ，８０，１５５８−１５６４）。
【０４７６】
動物モデル
動物モデルにおける抗ＰＫＣα剤の効力の評価は，ヒト臨床試験の重要な先行条件である。高いレベルのＰＫＣα蛋白質を発現する細胞株を用いて，ヒト腫瘍細胞株を用いる種々のマウス異種移植片モデルが開発されてきた。ＭｃＧｒａｗ　ｅｔ　ａｌ，１９９７，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ，１２，３１５−３２６は，ヒト乳（ＭＤＡＭＢ−３２１），前立腺（Ｄｕ−１４５），結腸（Ｃｏｌｏ２０５，ＷｉＤｒ），肺（ＮＣＩＨ６９，Ｈ２０９，Ｊ４６０，Ｈ５２０，Ａ５４９），膀胱（Ｔ−２４），および黒色腫（ＳＫ−ｍｅｌ１）癌腫細胞を用いるマウス異種移植片モデルを記載する。腫瘍細胞を皮下移植した後にＰＫＣαを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを静脈内投与すると，ほとんどの場合，対照と比較して腫瘍のサイズが容量依存的に減少した。Ｔ−２４膀胱癌腫，非小細胞肺癌腫（Ａ５４９），およびＣｏｌｏ２０５結腸癌腫のマウス異種移植片を用いる同様の実験が，Ｄｅａｎ　ｅｔ　ａｌ，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，２４，６２３に記載されている。Ｓｉｏｕｄ　ａｎｄ　Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，５５６−５６１は，同系ＢＤＩＸラットの皮下にＢＴ４Ｃｎ神経膠腫細胞を接種したラットモデルを記載する。約３週間後，ラットをＰＫＣαを標的とするリボザイムの１回注射で処置したところ，腫瘍サイズおよび／または重量により決定して，対照と比較して腫瘍成長が阻害された。上述の実験は，動物において抗ＰＫＣα薬剤によるＰＫＣα発現の阻害が腫瘍成長の阻害を引き起こすことの証拠を抵抗する。インビトロアッセイから選択されたリード抗ＰＫＣαリボザイムをマウス異種移植片モデルにおいてさらに試験することができる。最初にリボザイムを単独で試験して，次に標準的な化学療法と組み合わせて試験することができる。
【０４７７】
動物モデルの開発
ヒト肺（Ａ５４９，ＮＣＩＨ５２０）腫瘍および乳（ＭＤＡ−ＭＢ２３１）細胞株を特性決定して，マウスにおけるその成長曲線を確立させることができる。これらの細胞株をヌードマウスおよびＳＣＩＤマウスの両方に移植して，１週間に３回，原発性腫瘍の体積を測定する。マトリゲル移植フォーマットを用いるこれらの腫瘍株の成長の特徴決定もまた確立することができる。さらに，高いレベルのＰＫＣαを発現するよう工学処理されている他の細胞株を用いることもできる。最も堅実かつ信頼性のある腫瘍成長を支持する腫瘍細胞株および移植方法を動物実験において用いて，有望なＰＫＣαリボザイムを試験することができる。リボザイムは，腫瘍移植の３日後から開始し，実験期間中連続して，毎日の皮下注射またはＡｌｚｅｔミニ浸透圧ポンプからの連続皮下注入により投与することができる。少なくとも１０匹の動物の大きさの群を用いる。効力は，リボザイム処置動物と食塩水のみで処置した対照群動物の腫瘍体積の統計学的比較により決定する。これらの腫瘍の成長は一般に遅い（４５−６０日）ため，最初のエンドポイントは，リボザイム治療の存在または非存在下において容易に測定可能な原発性腫瘍（すなわち５０−１００ｍｍ３）が確立されるのに必要な日数であろう。
【０４７８】
臨床的概要
概説
ＰＫＣａを標的とするリボザイムは，多くの癌の種類に向けられる有用な医薬として開発しうる大きな可能性を有する。肺癌は，米国において，男性および女性の両方について癌による死亡の主原因である。米国における肺癌の罹患率は１年に約１７２，０００件であり，癌診断の１４％を占める。毎年約１５８，０００人が肺癌で死亡しており，これはすべての癌死亡の２８％を占める。多くの他の適応症，例えば，膀胱，結腸，乳，前立腺，および卵巣の癌，ならびに黒色腫および神経膠芽細胞腫が存在する。
【０４７９】
ＭｃＧｒａｗ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ，１２，３１５−３２６はＩＳＩＳ３５２１／ＣＧＰ６４１２８Ａ（ＰＫＣアルファアンチセンス構築物）の第Ｉ相試験を記載する。この臨床試験においては，ＩＳＩＳ３５２１／ＣＧＰ６４１２８Ａは，週に３回，連続する３週間の２時間静脈内注入として，または連続する２１日間の連続静脈内注入のいずれかとして投与された。著者は，患者が２時間静脈内注入による２．５ｍｇ／ｋｇまでの用量および連続静脈内注入による１．５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量までで投与したとき，アンチセンス化合物に対して優れた許容性を示したことを報告している。２時間静脈内注入スケジュールで投与した患者においては，化合物の注入後の血漿濃度が用量に比例して増加し，代謝産物は，血漿から速やかに除かれ，半減期が３０−４５分間であったことがわかった。これらの代謝産物は，鎖が短くなったオリゴヌクレオチドから構成され，これはエキソヌクレアーゼ媒介性分解と一致する。反復投与の後，代謝の蓄積，誘導または阻害の証拠は見いださなかった。
【０４８０】
療法
肺癌治療の選択肢は，癌のタイプおよび期により決定され，例えば，外科手術，放射線療法，および化学療法が含まれる。多くの局所性癌については，外科手術が選択すべき治療である。この疾病は通常は発見されるまでに時間とともに広がっているため，放射線療法および化学療法を外科手術と組み合わせることがしばしば必要である。小細胞肺癌については，外科手術の代わりに化学療法単独または放射線との組み合わせが選択すべき治療である。この治療計画においては，患者の大部分が寛解し，これは場合によっては長期間持続する。肺癌の１年相対生存率は１９７３年の３２％から１９９４年の４１％に上昇しており，これは主として外科手術の技術の改良のためである。すべての期を合わせると，５年相対生存率はわずか１４％である。疾病がまだ局所的であるときに検出された場合には生存率は５０％であるが，このように初期に発見されるものは肺癌のわずか１５％である。
【０４８１】
一般的な化学療法は，癌細胞を殺す細胞毒性薬剤の種々の組み合わせを含む。これらの薬剤には，パクリタキセル（タキソール），ドセタキセル，シスプラチン，メトトレキセート，シクロホスファミド，ドキソルビシン，フルオロウラシル等が含まれる。これらの細胞毒性療法には，重大な毒性が伴う。よく特徴決定された毒性には，悪心および嘔吐，骨髄抑制，脱毛および粘液性が含まれる。また，ある種の組み合わせ，例えば，ドキソルビシンとパクリタキセルとの組み合わせには深刻な心臓の問題が伴うが，あまり一般的ではない。
【０４８２】
本出願人は，ＰＫＣαＲＮＡ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２７３７）を標的とするいくつかのＮＣＨリボザイムを設計した（例えば，表６３を参照）。これらのリボザイムは最初に，リードリボザイムを選択するために用いる増殖アッセイにおいて用いた。
【０４８３】
増殖アッセイ：研究において有用なモデル増殖アッセイは，９６−ウエルプレート中２０００細胞／ウエルの細胞播種密度および５日の処置期間の間に少なくとも２回の細胞倍加を必要とする。増殖アッセイ用の細胞密度を計算するためには，当該技術分野においてよく知られるＦＩＰＳ（フルオロイメージング加工システム）方法を用いることができる。この方法によれば，核酸をＣｙＱｕａｎｔ（登録商標）染料で染色した後に細胞密度を測定することが可能であり，９６−ウエルフォーマットで１，０００−１００，０００細胞／ウエルという非常に広範な範囲の細胞密度が正確に測定されるという利点を有する。
【０４８４】
リボザイム（５０−２００ｎＭ）をカチオン性脂質の存在下で２．０ｇ／ｍＬで輸送し，処置の５日後に増殖の阻害を判定した。通常は２回の完全なリボザイムスクリーニングが完了し，リードリボザイムがさらなる試験のために選択される。一次スクリーニングから選択されたリードリボザイムのうち，次の実験においても細胞増殖を阻害し続けるリボザイムを，ＰＫＣαＲＮＡおよび蛋白質阻害実験のために選択する。
【０４８５】
実施例１５：ヌクレオシド三リン酸およびそのオリゴヌクレオチド中への取り込み
ヌクレオチド三リン酸の合成，およびそのポリメラーゼ酵素を用いる核酸中への取り込みは，核酸研究の進歩により大いに助けられた。ポリメラーゼ酵素はヌクレオチド三リン酸を前駆体分子として使用してオリゴヌクレオチドを組み立てる。各ヌクレオチドは，オリゴヌクレオチドの最後のヌクレオチドの３’ヒドロキシル基による次のヌクレオチドの５’三リン酸への求核攻撃を介して形成されるホスホジエステル結合により結合される。ヌクレオチドは，オリゴヌクレオチド中に１回に１個，５’から３’方向に取り込まれる。この工程により，事実上いかなるＤＮＡまたはＲＮＡテンプレートからでもＲＮＡを生成し，増幅することができる。
【０４８６】
ほとんどの天然のポリメラーゼ酵素は，標準的なヌクレオチド三リン酸を核酸中に取り込む。例えば，ＤＮＡポリメラーゼは，ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，およびｄＧＴＰをＤＮＡ中に取り込み，ＲＮＡポリメラーゼは一般にＡＴＰ，ＣＴＰ，ＵＴＰ，およびＧＴＰをＲＮＡ中に取り込む。しかし，標準的ではないヌクレオチド三リン酸を核酸中に取り込むことができるある種のポリメラーゼが存在する（Ｊｏｙｃｅ，１９９７，ＰＮＡＳ　９４，１６１９−１６２２，Ｈｕａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３６，８２３１−８２４２）。
【０４８７】
ポリメラーゼ酵素を用いてＲＮＡ転写産物中にヌクレオシドを取り込むことができる前に，ヌクレオシドをまずこれらの酵素により認識されることができるヌクレオチド三リン酸に変換しなければならない。ＰＯＣｌ３およびトリアルキルリン酸で処理することにより，ブロックされていないヌクレオシドをリン酸化して，ヌクレオシド５’ホスホロジクロリデートが得られることが示されている（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ　ｅｔ　ａｌ．，１９６９，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（Ｊａｐａｎ）４２，３５０５）。アデノシンまたは２’−デオキシアデノシン５’−三リン酸は，ＤＭＦ中で過剰のトリ−ｎ−ブチルアンモニウムピロリン酸で処理し，次に加水分解する追加の工程を加えることにより合成した（Ｌｕｄｗｉｇ，１９８１，Ａｃｔａ　Ｂｉｏｃｈｉｍ．ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｈｕｎｇ．１６，１３１−１３３）。
【０４８８】
標準的でないヌクレオチド三リン酸は伝統的なＲＮＡポリメラーゼによってはＲＮＡ転写産物中に容易に取り込まれない。デオキシリボヌクレオチドのＲＮＡ中への取り込みを容易にするために，ＲＮＡポリメラーゼに変異が導入されている（Ｓｏｕｓａ＆Ｐａｄｉｌｌａ，１９９５，ＥＭＢＯ　Ｊ．１４，４６０９−４６２１，Ｂｏｎｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，ＥＭＢＯ　Ｊ．１１，３７６７−３７７５，Ｂｏｎｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４２，２５１２０−２５１２８，Ａｕｒｕｐ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３１，９６３６−９６４１）。
【０４８９】
ＭｃＧｅｅら（国際公開９５／３５１０２）は，バクテリオファージＴ７ポリメラーゼを用いて，２’−ＮＨ２−ＮＴＰ，２’−Ｆ−ＮＴＰ，および２’−デオキシ−２’−ベンジルオキシアミノＵＴＰをＲＮＡ中に取り込ませることを記載する。
【０４９０】
Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋら（１９９４，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ４，９８７−９９４）は，バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて７−デアザ−アデノシン三リン酸をＲＮＡ転写産物中に取り込ませることを記載する。
【０４９１】
Ｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２２，５２２９−５２３４は，バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼおよびポリエチレングリコール含有緩衝液を用いて，２’−ＮＨ２−ＣＴＰおよび２’−ＮＨ２−ＵＴＰをＲＮＡ中に取り込ませることを報告している。この文献は，ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）に対するアプタマーのインビトロ選択のために，ポリメラーゼにより合成されたＲＮＡを用いることを記載する。
【０４９２】
本発明は，新規ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）分子，およびその核酸分子，例えば核酸触媒への取り込みに関する。本発明のＮＴＰは，当該技術分野において知られる他のＮＴＰとは異なるものである。本発明はさらに，ＲＮＡポリメラーゼを用いてこれらのヌクレオチド三リン酸をオリゴヌクレオチド中に取り込ませることに関する。本発明はさらに，修飾（標準的でない）および非修飾ＮＴＰを核酸分子中に取り込ませる新規な転写条件に関する。さらに，本発明は，新規ＮＴＰを合成する方法に関する。
【０４９３】
第１の観点においては，本発明は，式：三リン酸−ＯＲ，例えば以下の式３：
【化９】
2004512810.tif 000005
［式中，Ｒは任意のヌクレオシドであり；特に，２’−Ｏ−メチル−２，６−ジアミノプリンリボシド；２’−デオキシ−２’アミノ−２，６−ジアミノプリンリボシド；２’−（Ｎ−アラニル）アミノ−２’−デオキシ−ウリジン；２’−（Ｎ−フェニルアラニル）アミノ−２’−デオキシ−ウリジン；２’−デオキシ−２’−（Ｎ−β−アラニル）アミノ；２’−デオキシ−２’−（リシル）アミノウリジン；２’−Ｃ−アリルウリジン；２’−Ｏ−アミノ−ウリジン；２’−Ｏ−メチルチオメチルアデノシン；２’−Ｏ−メチルチオメチルシチジン；２’−Ｏ−メチルチオメチルグアノシン；２’−Ｏ−メチルチオメチル−ウリジン；２’−デオキシ−２’−（Ｎ−ヒスチジル）アミノウリジン；２’−デオキシ−２’−アミノ−５−メチルシチジン；２’−（Ｎ−β−カルボキシアミジン−β−アラニル）アミノ−２’−デオキシ−ウリジン；２’−デオキシ−２’−（Ｎ−β−アラニル）−グアノシン；２’−Ｏ−アミノアデノシン；２’−（Ｎ−リシル）アミノ−２’−デオキシ−シチジン；２’−デオキシ−２’−（Ｌ−ヒスチジン）アミノシチジン；５−イミダゾール酢酸２’−デオキシウリジン，５−［３−（Ｎ−４−イミダゾールアセチル）アミノプロピニル］−２’−Ｏ−メチルウリジン，５−（３−アミノプロピニル）−２’−Ｏ−メチルウリジン，５−（３−アミノプロピル）−２’−Ｏ−メチルウリジン，５−［３−（Ｎ−４−イミダゾールアセチル）アミノプロピル］２’−Ｏ−メチルウリジン，５−（３−アミノプロピル）−２’−デオキシ−２−フルオロウリジン，２’−デオキシ−２’−（β−アラニル−Ｌ−ヒスチジル）アミノウリジン，２’−デオキシ−２’−β−アラニンアミド−ウリジン，３−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピペラジノ［２，３−Ｄ］ピリミジン−２−オン，５−［３−（Ｎ−４−イミダゾールアセチル）アミノプロピル］−２’−デオキシ−２’−フルオロウリジン，５−［３−（Ｎ−４−イミダゾールアセチル）アミノプロピニル］−２’−デオキシ−２’−フルオロウリジン，５−Ｅ−（２−カルボキシビニル−２’デオキシ−２’−フルオロウリジン，５−［３−（Ｎ−４−アスパルチル）アミノプロピニル−２’−フルオロウリジン，５−（３−アミノプロピル）−２’−デオキシ−２−フルオロシチジン，および５−［３−（Ｎ−４−スクシニル）アミノプロピル−２’−デオキシ２−フルオロシチジンのヌクレオシドである］
を有するＮＴＰを特徴とする。
【０４９４】
第２の観点においては，本発明は，本発明のヌクレオシド三リン酸の無機および有機塩を特徴とする。
【０４９５】
第３の観点においては，本発明は，ピリミジンヌクレオチド三リン酸（例えばＵＴＰ，２’−Ｏ−ＭＴＭ−ＵＴＰ，ｄＵＴＰ等）を合成する方法を特徴とする。該方法は，ピリミジンヌクレオシドをピリミジン一リン酸の形成に適した条件下で，リン酸化試薬（例えばオキシ塩化リン，ホスホ−トリス−トリアゾリドホスホ−トリス−トリイミダゾリド等），トリアルキルリン酸（例えばトリエチルリン酸またはトリメチルリン酸等）および妨害塩基（例えばジメチルアミノピリジン，ＤＭＡＰなど）を有する混合物と接触させる一リン酸化の工程，およびピリミジン一リン酸をピリミジン三リン酸の形成に適した条件下でピロリン酸化試薬（例えば，トリブチルアンモニウムピロリン酸）と接触させるピロリン酸化の工程を含む。
【０４９６】
”ヌクレオチド三リン酸”または”ＮＴＰ”とは，修飾または非修飾リボースまたはデオキシリボース糖の５’ヒドロキシル基で３つの無機リン酸基に結合したヌクレオシドを意味する。ここで，糖の１’位は，核酸塩基または水素を含んでいてもよい。三リン酸部分は，基の機能を破壊しない（すなわち，ＲＮＡ分子中への取り込みを可能とする）化学成分を含むように修飾されていてもよい。
【０４９７】
別の好ましい態様においては，本発明のヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）は，ＲＮＡポリメラーゼ酵素を用いてオリゴヌクレオチド中に組み込む。ＲＮＡポリメラーゼには，例えば，限定されないが，バクテリオファージＴ７，ＳＰ６，またはＴ３ＲＮＡポリメラーゼの変異型および野生型が含まれる。本出願人はまた，ある種のＤＮＡポリメラーゼ，例えばＴａｑポリメラーゼを用いて，本発明のＮＴＰをオリゴヌクレオチド中に取り込ませることができることを見いだした。
【０４９８】
さらに別の好ましい態様においては，本発明は，修飾ＮＴＰをオリゴヌクレオチド中に取り込ませる方法を特徴とする。該方法は，ＤＮＡテンプレート，ＲＮＡポリメラーゼ，ＮＴＰ，および修飾ＮＴＰ取り込みのエンハンサーを有する混合物を，修飾ＮＴＰをオリゴヌクレオチド中に取り込ませるのに適した条件下でインキュベートする工程を含む。
【０４９９】
”修飾ＮＴＰ取り込みのエンハンサー”とは，ＲＮＡポリメラーゼによる修飾ヌクレオチドの核酸転写産物中への取り込みを容易にする試薬を意味する。そのような試薬には，例えば，限定されないが，メタノール，ＬｉＣｌ，ポリエチレングリコール（ＰＥＧ），ジエチルエーテル，プロパノール，メチルアミン，エタノール等が含まれる。
【０５００】
別の好ましい態様においては，修飾ヌクレオチド三リン酸は，転写により核酸分子，例えば酵素的核酸，アンチセンス，２−５Ａアンチセンスキメラ，オリゴヌクレオチド，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ），アプタマー等に取り込ませることができる（Ｓｔｕｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｒｅｓ．１２，４６５）。
【０５０１】
”トリプレックス形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）”とは，配列特異的様式で二本鎖ＤＮＡに結合して，三重鎖ヘリックスを形成することができるオリゴヌクレオチドを意味する。そのような三重ヘリックス構造の形成は，標的とする遺伝子の転写を阻害することが示されている（Ｄｕｖａｌ−Ｖａｌｅｎｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９，５０４）。
【０５０２】
さらに別の好ましい態様においては，本発明の修飾ヌクレオチド三リン酸を用いて，コンビナトリアル化学または新規な機能を有する核酸分子のインビトロ選択を行うことができる。修飾オリゴヌクレオチドは，酵素的に合成して，スクリーニング用のライブラリを生成することができる。
【０５０３】
別の好ましい態様においては，本発明は，本明細書に記載される方法を用いて単離される核酸に基づく技術（例えば，酵素的核酸分子），アンチセンス核酸，２−５Ａアンチセンスキメラ，トリプレックスＤＮＡ，ＲＮＡ切断化学基を含有するアンチセンス核酸）および遺伝子発現を診断，ダウンレギュレートまたは阻害する方法を特徴とする。
【０５０４】
さらに別の好ましい態様においては，本発明は，ＨＥＲ２　ＲＮＡを標的とする酵素的核酸分子，例えばクラスＩＩ（チンザイム）モチーフのリボザイムを特徴とする。
【０５０５】
有用なリボザイムおよびアンチセンス核酸のための標的，例えばＨＥＲ２　ＲＮＡは，例えば，Ｄｒａｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，ＷＯ９３／２３５６９；Ｓｕｌｌｉｖａｎ　ｅｔ　ａｌ．，ＷＯ９３／２３０５７；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，ＷＯ９４／０２５９５；Ｄｒａｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，ＷＯ９５／０４８１８；ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許５，５２５，４６８および５，６４６，０４２（これらはすべてその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるようにして決定することができる。他の例には，疾病関連遺伝子の発現の不活性化に関する以下のＰＣＴ出願が含まれる：ＷＯ９５／２３２２５，およびＷＯ９５／１３３８０（これらはすべて本明細書の一部としてここに引用する）。
【０５０６】
さらに別の好ましい態様においては，本発明は，式３の複数の化合物を取り込ませる方法を特徴とする。
【０５０７】
さらに別の態様においては，本発明は，式４：
【化１０】
2004512810.tif 000006
［上述の式において，Ｘ，Ｙ，およびＺは，独立して，ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーを表し，これは同じでも異なっていてもよく；・は２つの隣接するヌクレオチド間の水素結合形成を表し，これは存在してもしなくてもよく；Ｙ’はＹに相補的なヌクレオチドであり；Ｚ’はＺに相補的なヌクレオチドであり；ｌは３以上の整数であり，好ましくは２０より小さく，特に４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，または１５であり；ｍは１より大きい整数であり，好ましくは１０より小さく，特に２，３，４，５，６，または７であり；ｎは１より大きい整数であり，好ましくは１０より小さく，特に３，４，５，６，または７であり；ｏは３以上の整数であり，好ましくは２０より小さく，特に３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，または１５であり；ｌおよびｏは，同じ長さ（ｌ＝ｏ）であっても異なる長さ（ｌ≠ｏ）であってもよく；各Ｘ（ｌ）およびＸ（ｏ）は，独立して標的核酸配列と安定に相互作用するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり（標的はＲＮＡ，ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ混合ポリマーでありうる）；Ｗは２ヌクレオチド以上の長さののリンカーであるか，または非ヌクレオチドリンカーであってもよく；Ａ，Ｕ，Ｃ，およびＧはヌクレオチドを表し；Ｇは，ヌクレオチドであり，好ましくは２’−Ｏ−メチルまたはリボであり；Ａは，好ましくは２’−Ｏ−メチルまたはリボヌクレオチドでありであり；Ｕは，好ましくは２’−アミノ（例えば，２’−ＮＨ２または２’−Ｏ−ＮＨ２），２’−Ｏ−メチルまたはリボヌクレオチドであり；Ｃはヌクレオチドを表し，好ましくは２’−アミノ（例えば，２’−ＮＨ２または２’−ＯＮＨ２）であり，−は化学結合（例えば，リン酸エステル結合，アミド結合，ホスホロチオエート，ホスホロジチオエートまたは当該技術分野において知られる他の結合）を表す］
を有する，触媒活性を有する核酸分子を特徴とする。
【０５０８】
さらに別の態様においては，本発明は，式５：
【化１１】
2004512810.tif 000007
を有する触媒活性を有する核酸分子を特徴とする。上述の式において，Ｘ，Ｙ，およびＺは，独立して，ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーを表し，これは同じであっても異なっていてもよく；・は２つの隣接するヌクレオチド間の水素結合形成を表し，これは存在してもしなくてもよく；Ｚ’はＺに相補的なヌクレオチドであり；ｌは３以上の整数であり，好ましくは２０より小さく，特に４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，または１５であり；ｎは，１より大きい整数であり，好ましくは１０より小さく，特に３，４，５，６，または７であり；ｏは３以上の整数であり，好ましくは２０より小さく，特に３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，または１５であり；ｌおよびｏは，同じ長さ（ｌ＝ｏ）であっても異なる長さ（ｌ≠ｏ）であってもよく；各Ｘ（ｌ）およびＸ（ｏ）は独立して標的核酸配列と安定に相互作用するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり（標的はＲＮＡ，ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ混合ポリマーでありうる）；Ｘ（ｏ）は，好ましくは３’−末端にＧを有し，Ｘ（ｌ）は，好ましくは５’−末端にＧを有し；Ｗはある長さのヌクレオチドのリンカーであるか，または非ヌクレオチドリンカーであってもよく；Ｙは２１ヌクレオチド以上の長さのリンカーであり，好ましくはＧ，５’−ＣＡ−３’，または５’−ＣＡＡ−３’であり，または非ヌクレオチドリンカーであってもよく；Ａ，Ｕ，Ｃ，およびＧはヌクレオチドを表し；Ｇはヌクレオチドであり，好ましくは２’−Ｏ−メチル，２’−デオキシ−２’−フルオロ，または２’−ＯＨであり；Ａはヌクレオチドであり，好ましくは２’−Ｏ−メチル，２’−デオキシ−２’−フルオロ，または２’−ＯＨであり；Ｕはヌクレオチドであり，好ましくは２’−Ｏ−メチル，２’−デオキシ−２’−フルオロ，または２’−ＯＨであり；Ｃはヌクレオチド，好ましくは２’−アミノ（例えば，２’−ＮＨ２または２’−Ｏ−ＮＨ２）を表し，−は化学結合（例えば，リン酸エステル結合，アミド結合，ホスホロチオエート，ホスホロジチオエートまたは当該技術分野において知られる他の結合）を表す。
【０５０９】
式４および式５の酵素的核酸分子は，独立してキャップ構造を含み，これは独立して存在してもしなくてもよい。
【０５１０】
さらに別の好ましい態様においては，３’−キャップは，４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド；炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルリン酸；１，３−ジアミノ−２−プロピルリン酸；３−アミノプロピルリン酸；６−アミノヘキシルリン酸；１，２−アミノドデシルリン酸；ヒドロキシプロピルリン酸；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環状３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド；５’−５’反転ヌクレオチド成分；５’−５’−反転無塩基成分；５’−ホスホルアミデート；５’−ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールリン酸５’−アミノ；架橋および／または非架橋５’−ホスホルアミデート，ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート；架橋または非架橋メチルホスホネートおよび５’−メルカプト成分を含む群より選択される（より詳細には，Ｂｅａｕｃａｇｅ　ａｎｄ　Ｉｙｅｒ，１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　４９，１９２５（本明細書の一部としてここに引用する）を参照）。
【０５１１】
別の観点においては，本発明は，本発明の１またはそれ以上の核酸分子および／または発現ベクターを含む哺乳動物細胞を提供する。１またはそれ以上の核酸分子は，独立して，同じまたは異なる部位を標的とすることができる。
【０５１２】
ヌクレオチド合成
ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を当該技術分野において知られるリン酸化プロトコルに加えることにより，反応時間を減少させて，ヌクレオチド一リン酸の収率を非常に増加させることができる。本発明のヌクレオシドの合成は，いくつかの刊行物および本出願人の先の出願に記載されている（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開９６／１８７３６；Ｄｕｄｚｃｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｔ．ＰＣＴＰｕｂ．Ｎｏ．ＷＯ９５／１１９１０；Ｕｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｔ．ＰＣＴＰｕｂ．Ｎｏ．ＷＯ９５／１３３７８；Ｍａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．３８，２０３；Ｍａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．３８，１６６９；これらはすべて本明細書の一部としてここに引用する）。これらのヌクレオシドをトリエチルリン酸に溶解し，氷浴中で冷却する。次にオキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）を加え，次にＤＭＡＰを導入する。。次に反応液を室温まで暖め，５時間進行させる。この反応により，ヌクレオチド一リン酸が形成され，次にこれをヌクレオチド三リン酸の形成に用いる。トリブチルアミンを加え，次に無水アセトニトリルおよびトリブチルアンモニウムピロリン酸を加える。次に反応をＴＥＡＢで急冷し，室温（約２０℃）で一夜撹拌する。三リン酸は，セファデックスカラム精製または同等物および／またはＨＰＬＣを用いて精製し，ＮＭＲ分析を用いて化学構造を確認する。当業者は，試薬，反応温度，および精製方法は，容易に他の置換物および同等物と変更することができ，なお所望の生成物を得ることができることを認識するであろう。
【０５１３】
ヌクレオチド三リン酸
本発明は，多数の異なる機能に用いることができるヌクレオチド三リン酸を提供する。表４５に見られるヌクレオシドから形成されるヌクレオチド三リン酸は，独特であり，当該技術分野において知られる他のヌクレオチド三リン酸とは異なる。修飾ヌクレオチドをＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドに組み込むと，分子の性質を変更させることができる。例えば，修飾ヌクレオチドはヌクレアーゼの結合を隠し，したがって，分子の化学的半減期を増加させる。このことは，分子を培養細胞にまたはインビボで用いる場合には特に重要である。これらの分子に修飾ヌクレオチドを導入することにより，安定性を，したがって分子の有効性を非常に高めることができることが当該技術分野において知られている（Ｂｕｒｇｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３５，１４０９０−１４０９７；Ｕｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６，５２７−５３３）。
【０５１４】
修飾ヌクレオチドは，野生型または変異体ポリメラーゼのいずれかを用いて取り込ませる。例えば，変異体Ｔ７ポリメラーゼを修飾ヌクレオチド三リン酸，ＤＮＡテンプレートおよび適当な緩衝液の存在下で用いる。当業者は，他のポリメラーゼおよびそのそれぞれの変異体型も，本発明のＮＴＰの取り込みに用いることができることを認識するであろう。核酸転写産物は，放射性標識ヌクレオチド（α−３２Ｐ　ＮＴＰ）の取り込みにより検出した。放射性標識したＮＴＰは，試験した修飾三リン酸と同じ塩基を含んでいた。メタノール，ＰＥＧおよびＬｉＣｌの影響は，これらの化合物を独立してまたは組み合わせて加えることにより試験した。核酸転写産物の検出および定量は，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓホスファーイメージャーを用いて行った。転写の効率は，修飾ヌクレオチド三リン酸の取り込みを全リボヌクレオチド取り込み対照と比較することにより評価した。野生型ポリメラーゼを用いて，製造元の緩衝液および指針を用いてＮＴＰを取り込ませた（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）。
【０５１５】
転写条件
修飾ヌクレオチド三リン酸のオリゴヌクレオチド中への取り込みの速度は，伝統的な緩衝液条件にいくつかの異なる修飾ＮＴＰ取り込みのエンハンサーを加えることにより増加させることができる。本出願人は，ＲＮＡポリメラーゼを用いるｄＮＴＰの取り込み速度を増加させようとして，メタノールおよびＬｉＣｌを用いた。これらの修飾ＮＴＰ取り込みのエンハンサーは，異なる組み合わせおよび比率で用いて，転写を最適化することができる。最適反応条件は，ヌクレオチド三リン酸によって異なり，標準的な実験により容易に決定することができる。しかし，全体として，本出願人は，修飾ＮＴＰ取り込みのエンハンサー，例えばメタノールまたは塩化リチウム等の無機化合物を組み込むと平均転写速度が増加することを見いだした。
【０５１６】
本出願人は，反応においてＤＭＡＰを用いてピリミジンヌクレオチド三リン酸を合成した。プリンについては，本出願人は，当該技術分野において先に記載されている標準的なプロトコル（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ　ｅ　ｔａｌ（上掲）；．Ｌｕｄｗｉｇ，（上掲））を用いた。以下に記載されるものは，ピリミジンヌクレオチド三リン酸の一例およびプリンヌクレオチド三リン酸合成の一例である。
【０５１７】
プリンヌクレオチド三リン酸の合成：２’−Ｏ−メチル−グアノシン−５’−三リン酸
１００℃で５分間加熱することにより，２’−Ｏ−メチルグアノシンヌクレオシド（０．２５ｇ，０．８４ｍｍｏｌ）をトリエチルリン酸（５．０）ｍｌに溶解した。得られた無色透明な溶液を，アルゴン雰囲気下で氷浴を用いて０℃に冷却した。次に激しく撹拌しながらオキシ塩化リン（１．８当量，０．１４１ｍｌ）を反応混合物に加えた。反応はＨＰＬＣにより，過塩素酸ナトリウム勾配を用いてモニターした。０℃で５時間後，トリブチルアミン（０．６５ｍｌ）を加え，次に無水アセトニトリル（１０．０ｍｌ）を加え，５分後（０℃で再平衡化）トリブチルアンモニウムピロリン酸（４．０当量，１．５３ｇ）を加えた。０℃で１５分後，反応混合物を２０ｍｌの２Ｍ　ＴＥＡＢで急冷し（上述の条件のＨＰＬＣ分析は一リン酸が１０分間で消費されたことを示した），次に室温で一夜撹拌し，混合物をメタノール共蒸発（４ｘ）により真空下で蒸発させ，次に５０ｍｌの０．０５Ｍ　ＴＥＡＢで希釈した。０．０５−０．６Ｍ　ＴＥＡＢの勾配によるＤＥＡＥセファデックス精製を用いて，純粋な三リン酸（０．５２ｇ，６６．０％収率）を得た（０．３Ｍ　ＴＥＡＢ付近に溶出）。純度はＨＰＬＣおよびＮＭＲ分析により確認した。
【０５１８】
ピリミジンヌクレオチド三リン酸の合成：２’−Ｏ−メチルチオメチル−ウリジン−５’−三リン酸
２’−Ｏ−メチルチオメチルウリジンヌクレオシド（０．２７ｇ，１．０ｍｍｏｌ）をトリエチルリン酸（５．０ｍｌ）に溶解した。得られた無色透明溶液をアルゴン雰囲気下で氷浴で０℃に冷却した。次に激しく撹拌しながらオキシ塩化リン（２．０当量，０．１９０ｍｌ）を反応混合物に加えた。ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ，０．２当量，２５ｍｇ）を加え，溶液を室温に暖め，反応をＨＰＬＣにより過塩素酸ナトリウム勾配を用いてモニターした。２０℃で５時間後，トリブチルアミン（１．０ｍｌ）を加え，次に無水アセトニトリル（１０．０ｍｌ）を加え，５分後にトリブチルアンモニウムピロリン酸（４．０当量，１．８ｇ）を加えた。２０℃で１５分後，反応混合物を２０ｍｌの２Ｍ　ＴＥＡＢで急冷し（上述の条件を用いるＨＰＬＣ分析は，１０分で一リン酸の消費を示した），次に室温で一夜撹拌した。混合物を真空下でメタノールとともに蒸発させ（４ｘ），次に５０ｍｌの０．０５Ｍ　ＴＥＡＢ中に希釈した。０．０５−１．０Ｍ　ＴＥＡＢの勾配でＤＥＡＥファストフローセファロース精製を用いて，ＨＰＬＣおよびＮＭＲ分析により決定して純粋な三リン酸（０．４０ｇ，４４％収率）を得た（０．３Ｍ　ＴＥＡＢ付近で溶出）。
【０５１９】
ウリジン５’−三リン酸合成におけるＤＭＡＰの使用
反応は，１ｍｌのトリエチルリン酸および１９μｌのオキシ塩化リンに溶解した２０ｍｇのヌクレオシドのアリコートで行った。反応は，ＨＰＬＣにより４０分の間隔で自動的にモニターし，１８時間までの時間における生成物収率カーブを作成した。逆相カラムおよび酢酸アンモニウム／酢酸ナトリウム緩衝液系（それぞれ５０ｍＭおよび１００ｍＭ，ｐＨ４．２）を用いて，５’，３’，２’一リン酸（一リン酸はこの順序で溶出される）を５’−三リン酸および出発ヌクレオシドから分離した。データは表４６に示される。これらの条件は，生成物収率を倍にし，反応時間を１０倍改良して，最大の収率が得られた（１２００分間が１２０分間で９０％の収率に減少）。５’−一リン酸化についての選択性はすべての反応について認められた。続く三リン酸化はほぼ定量的な収率で生じた。
【０５２０】
バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ反応において用いた材料
緩衝液１：試薬を一緒に混合して，緩衝液１の１０Ｘ保存溶液（４００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ［ｐＨ８．１］，２００ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１００ｍＭ　ＤＴＴ，５０ｍＭスペルミジン，および０．１％ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）を作成する。ポリメラーゼ反応を開始する前に，メタノール，ＬｉＣｌを加え，条件１の最終反応条件が４０ｍＭ　ｔｒｉｓ（ｐＨ８．１），２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ　ＤＴＴ，５ｍＭスペルミジン，０．０１％　ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）；Ｘ−１００，１０％メタノール，および１ｍＭ　ＬｉＣｌから構成されるように緩衝液を希釈する。
【０５２１】
緩衝液２：試薬を一緒に混合して，緩衝液２の１０Ｘ保存溶液（４００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ［ｐＨ８．１］，２００ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１００ｍＭ　ＤＴＴ，５０ｍＭスペルミジン，および０．１％ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）；Ｘ−１００）を作成する。ポリメラーゼ反応を開始する前に，ＰＥＧ，ＬｉＣｌを加え，緩衝液２の最終反応条件が４０ｍＭ　ｔｒｉｓ（ｐＨ８．１），２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ　ＤＴＴ，５ｍＭスペルミジン，０．０１％ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００，４％ＰＥＧ，および１ｍＭ　ＬｉＣｌから構成されるように緩衝液を希釈する。
【０５２２】
緩衝液３：試薬を一緒に混合して，緩衝液３の１０Ｘ保存溶液（４００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ［ｐＨ８．０］，１２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ　ＤＴＴ，１０ｍＭスペルミジンおよび０．０２％ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）；Ｘ−１００）を作成する。ポリメラーゼ反応を開始する前に，ＰＥＧを加え，緩衝液の３最終反応条件が４０ｍＭ　ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），１２ｍＭ　ＭｇＣｌ２，５ｍＭ　ＤＴＴ，１ｍＭスペルミジン，０．００２％ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）；Ｘ−１００，および４％ＰＥＧから構成されるように緩衝液を希釈する。
【０５２３】
緩衝液４：試薬を一緒に混合して，緩衝液４の１０Ｘ保存溶液（４００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ［ｐＨ８．０］，１２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ　ＤＴＴ，１０ｍＭスペルミジンおよび０．０２％ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）を作成する。ポリメラーゼ反応を開始する前に，ＰＥＧ，メタノールを加え，緩衝液４の最終反応条件が４０ｍＭ　ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），１２ｍＭ　ＭｇＣｌ２，５ｍＭ　ＤＴＴ，１ｍＭスペルミジン，０．００２％ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）；Ｘ１００，１０％メタノール，および４％ＰＥＧから構成されるように緩衝液を希釈する。
【０５２４】
緩衝液５：試薬を一緒に混合して，緩衝液５の１０Ｘ保存溶液（４００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ［ｐＨ８．０］，１２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ　ＤＴＴ，１０ｍＭスペルミジンおよび０．０２％ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）；Ｘ−１００）を作成する。ポリメラーゼ反応を開始する前に，ＰＥＧ，ＬｉＣｌを加え，緩衝液５の最終反応条件が４０ｍＭ　ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），１２ｍＭ　ＭｇＣｌ２，５ｍＭ　ＤＴＴ，１ｍＭスペルミジン，０．００２％ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）；Ｘ−１００，１ｍＭ　ＬｉＣｌおよび４％ＰＥＧから構成されるように緩衝液を希釈する。
【０５２５】
緩衝液６：試薬を一緒に混合して，緩衝液６の１０Ｘ保存溶液（４００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ［ｐＨ８．０］，１２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ　ＤＴＴ，１０ｍＭスペルミジンおよび０．０２％ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）；Ｘ−１００）を作成する。ポリメラーゼ反応を開始する前に，ＰＥＧ，メタノールを加え，緩衝液６の最終反応条件が４０ｍＭ　ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），１２ｍＭ　ＭｇＣｌ２，５ｍＭ　ＤＴＴ，１ｍＭスペルミジン，０．００２％ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）；Ｘ１００，１０％メタノール，および４％ＰＥＧから構成されるように緩衝液を希釈する。
【０５２６】
緩衝液７：試薬を一緒に混合して，緩衝液６の１０Ｘ保存溶液（４００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ［ｐＨ８．０］，１２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ　ＤＴＴ，１０ｍＭスペルミジンおよび０．０２％ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）；Ｘ−１００）を作成する。ポリメラーゼ反応を開始する前に，ＰＥＧ，メタノールおよびＬｉＣｌを加え，緩衝液６の最終反応条件が４０ｍＭ　ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），１２ｍＭ　ＭｇＣｌ２，５ｍＭ　ＤＴＴ，１ｍＭスペルミジン，０．００２％ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）；Ｘ−１００，１０％メタノール，４％ＰＥＧ，および１ｍＭ　ＬｉＣｌから構成されるように緩衝液を希釈する。
【０５２７】
変異体Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる修飾ヌクレオチド三リン酸のスクリーニング
修飾ヌクレオチド三リン酸を，緩衝液１−６において２つの異なる温度（２５および３７℃）で試験した。２５℃で試験した緩衝液１−６は，条件１−６と名付け，３７℃で試験した緩衝液１−６は条件７−１２と名付けた（表４７）。各条件において，Ｙ６３９Ｆ変異体Ｔ７ポリメラーゼ（Ｓｏｕｓａ　ａｎｄ　Ｐａｄｉｌｌａ，（上掲））（０．３−２ｍｇ／２０ｍｌ反応），ＮＴＰ’ｓ（各２ｍＭ），ＤＮＡテンプレート（１０ｐｍｏｌ），無機ピロホスファターゼ（５Ｕ／ｍｌ）およびα−３２Ｐ　ＮＴＰ（０．８ｍＣｉ／ｐｍｏｌテンプレート）を合わせ，指定される温度で１−２時間加熱した。用いた放射性標識ＮＴＰは，試験している修飾三リン酸とは異なるものであった。試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。ホスファーイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて，全長転写産物の量を定量し，全ＲＮＡ対照反応と比較した。データは表４８に示される。各反応の結果は，全リボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰ）対照に対するパーセントで表す。対照は，市販のポリメラーゼ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて変異体Ｔ７ポリメラーゼで反応させた。
【０５２８】
野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる修飾ＮＴＰの取り込み
バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼは，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍから０．４Ｕ／μＬ濃度で購入した。酵素とともに供給される市販の緩衝液および５０μＬ反応中０．２μＣｉ　アルファ３２Ｐ　ＮＴＰおよび各２ｍＭのヌクレオチド三リン酸を用いた。テンプレートは先のスクリーニングにおいて用いた二本鎖ＰＣＲフラグメントである。反応は，３７℃で１時間行った。１０μＬの試料を７．５％分析ＰＡＧＥにかけ，ホスファーイメージャーを用いてバンドを定量した。結果は，”全リボ”対照（非修飾ヌクレオチド三リン酸）と比較して計算し，結果は表４９に示される。
【０５２９】
多重修飾ヌクレオチド三リン酸のオリゴヌクレオチド中への取り込み
修飾ヌクレオチド三リン酸の組み合わせを上述の転写プロトコルを用いて試験して，２またはそれ以上のこれらの三リン酸の取り込みの速度を決定した。２’−デオキシ−２’−（Ｌ−ヒスチジン）アミノウリジン（２’−ｈｉｓ−ＮＨ２−ＵＴＰ）の取り込みは，非修飾シチジンヌクレオチド三リン酸，ｒＡＴＰおよびｒＧＴＰを用いて，反応条件９で試験した。データは，全ｒＮＴＰ対照と比較した修飾ＮＴＰの取り込みのパーセントとして示され，表５０ａに示される。
【０５３０】
２つの修飾シチジン（２’−ＮＨ２−ＣＴＰまたは２’ｄＣＴＰ）は，２’−ｈｉｓ−ＮＨ２−ＵＴＰとともに，同一の効率で取り込まれた。次に，２’−ｈｉｓ−ＮＨ２−ＵＴＰおよび２’−ＮＨ２−ＣＴＰを同じ緩衝液で種々の非修飾および修飾アデノシン三リン酸を用いて試験した（表５０ｂ）。２’−ｈｉｓ−ＮＨ２−ＵＴＰおよび２’−ＮＨ２−ＣＴＰの両方の取り込みについて最良の修飾アデノシン三リン酸は２’−ＮＨ２−ＤＡＰＴＰであった。
【０５３１】
修飾ヌクレオチド三リン酸の取り込みの反応条件の最適化
２’−ｈｉｓ−ＮＨ２−ＵＴＰ，２’−ＮＨ２−ＣＴＰ，２’−ＮＨ２−ＤＡＰ，およびｒＧＴＰの組み合わせを，上述の取り込みプロトコルを用いていくつかの反応条件（表５１）で試験した。結果は，試験した緩衝液条件のうち，これらの修飾ヌクレオチド三リン酸の取り込みはメタノールおよびＬｉＣｌの両方の存在下で生じたことを示す。
【０５３２】
２’−デオキシ−２’アミノ修飾ＧＴＰおよびＣＴＰを用いる新規酵素的核酸分子モチーフの選択
新規な酵素的核酸分子モチーフの選択のためには，酵素的核酸分子のプールは，２つの基質結合アーム（５および１６ヌクレオチドの長さ）および中程にランダム領域を有するように設計した。基質は，５’末端にビオチン，プールの短い結合アームに相補的な５ヌクレオチド，対を形成しないＧ（所望の切断部位），およびプールの長い結合アームに相補的な１６ヌクレオチドを有する。基質はアビジン−ビオチン複合体によりカラム樹脂に結合させた。選択の一般的方法は図１１に示される。以下に記載されるプロトコルは，酵素的核酸分子の選択に用いることができる１つの可能な方法を表し，コンビナトリアルライブラリを用いる酵素的核酸分子の選択の非限定的な例として与えられる。
【０５３３】
ライブラリの作成：
以下に挙げられるオリゴヌクレオチドは，Ｏｐｅｒｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）により合成した。テンプレートはゲル精製し，次に製造元のプロトコルを用いてＳｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を通した。プライマー（ＭＳＴ３，ＭＳＴ７ｃ，ＭＳＴ３ｄｅｌ）は精製せずに用いた。
【０５３４】
プライマー：
ＭＳＴ３ （３０ ｍｅｒ）： ５’−ＣＡＣ ＴＴＡ ＧＣＡ ＴＴＡ ＡＣＣ ＣＴＣ ＡＣＴ ＡＡＡ ＧＧＣ ＣＧＴ−３’
ＭＳＴ７ｃ （３３ ｍｅｒ）： ５’−ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＧＡＡ ＡＧＧ ＴＧＴ ＧＣＡ ＡＣＣ−３’
ＭＳＴ３ｄｅｌ （１８ ｍｅｒ）： ５’−ＡＣＣ ＣＴＣ ＡＣＴ ＡＡＡ ＧＧＣ ＣＧＴ−３’
テンプレート ：
ＭＳＮ６０ｃ （９３ ｍｅｒ）： ５’−ＡＣＣ ＣＴＣ ＡＣＴ ＡＡＡ ＧＧＣ ＣＧＴ （Ｎ） ６０ ＧＧＴ ＴＧＣ ＡＣＡ ＣＣＴ
ＴＴＧ−３’
ＭＳＮ４０ｃ （７３ ｍｅｒ）： ５’−ＡＣＣ ＣＴＣ ＡＣＴ ＡＡＡ ＧＧＣ ＣＧＴ （Ｎ） ４０ ＧＧＴ ＴＧＣ ＡＣＡ ＣＣＴ ＴＴＧ−３’
ＭＳＮ２０ｃ （５３ ｍｅｒ）： ５’−ＡＣＣ ＣＴＣ ＡＣＴ ＡＡＡ ＧＧＣ ＣＧＴ （Ｎ） ２０ ＧＧＴ ＴＧＣ ＡＣＡ ＣＣＴ ＴＴＧ−３’
【０５３５】
Ｎ６０ライブラリは，ＭＳＮ６０ｃをテンプレートとして，ＭＳＴ３／ＭＳＴ７ｃをプライマーとして用いて作成した。Ｎ４０およびＮ２０ライブラリは，ＭＳＮ４０ｃ（またはＭＳＮ２０ｃ）をテンプレートとして，ＭＳＴ３ｄｅｌ／ＭＳＴ７ｃをプライマーとして作成した。
【０５３６】
一本鎖のテンプレートは，以下のプロトコルにしたがって二本鎖ＤＮＡに変換した：１０ｍｌ反応容量中，５ｎｍｏｌテンプレート，１０ｎｍｏｌの各プライマーで，標準的なＰＣＲ緩衝液，ｄＮＴＰ’ｓ，およびｔａｑＤＮＡポリメラーゼ（すべての試薬はＢｏｅｒｈｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍより）を用いた。合成サイクル条件は，９４℃，４分間；（９４℃，１分間；４２℃，１分間；７２℃，２分間）ｘ４；７２℃，１０分間であった。生成物はアガロースゲルで調べて，各フラグメントの長さを確認し（Ｎ６０＝１２３ｂｐ，Ｎ４０＝９１ｂｐ，Ｎ２０＝７１ｂｐ），次にフェノール／クロロホルム抽出し，エタノール沈澱した。二本鎖生成物の濃度は２５μＭであった。
【０５３７】
最初のプールの転写は，以下を含む１ｍｌ容量中で行った：５００ｐｍｏｌ二本鎖テンプレート（３ｘ１０１４分子），４０ｍＭ　ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１２ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１ｍＭスペルミジン，５ｍＭ　ＤＴＴ，０．００２％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００，１ｍＭ　ＬｉＣｌ，４％ＰＥＧ８０００，１０％メタノール，２ｍＭＡＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ），２ｍＭＧＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ），２ｍＭ２’−デオキシ−２’アミノ−ＣＴＰ（ＵＳＢ），２ｍＭ２’−デオキシ−２’−アミノ−ＵＴＰ（ＵＳＢ），５Ｕ／ｍｌ無機ピロホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ），５Ｕ／μｌのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（ＵＳＢ；場合によりＹ６３９Ｆ変異体を０．１ｍｇ／ｍｌで用いた（Ｓｏｕｓａ　ａｎｄ　Ｐａｄｉｌｌａ，（上掲））），３７℃，２時間。転写されたライブラリを変性ＰＡＧＥ（Ｎ６０＝１０６ｎｔｄｓ，Ｎ４０＝７４，Ｎ２０＝５４）で精製し，得られた生成物をＳｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）カラムを用いて脱塩し，次にエタノール沈澱した。
【０５３８】
最初のカラム選択
以下のビオチニル化基質を標準的なプロトコル（Ｕｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９８７Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５；Ｓｃａｒｉｎｇｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９０　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１８，５４３３；およびＷｉｎｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４）を用いて合成した：
５’−ビオチン−Ｃ１８スペーサー−ＧＣＣＧＵＧＧＧＵＵＧＣＡＣＡＣＣＵＵＵＣＣ−Ｃ１８スペーサー−チオール修飾剤Ｃ６Ｓ−Ｓ−反転無塩基−３’
【０５３９】
基質は変性ＰＡＧＥで精製しエタノール沈澱した。１０ｎｍｏｌの基質を以下のプロトコルを用いてＮｅｕｔｒ　Ａｖｉｄｉｎ（登録商標）カラムに結合させた：４００μｌのＵｌｔｒａ　Ｌｉｎｋ　Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）スラリー（２００μｌビーズ，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）をポリスチレンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）中に負荷した。カラムを１ｍｌの結合緩衝液（２０ｍＭＮａＰＯ４（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）で２回洗浄し，次にキャップで止めた（すなわち，流れを止めるためにカラムの底にキャップをはめた）。結合緩衝液中に懸濁した２００μｌの基質を適用し，ときどきボルテックスして一様な結合および溶液の樹脂に対する分配を確実にしながら，室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後，キャップを除去し，カラムを１ｍｌの結合緩衝液で，次に１ｍｌのカラム緩衝液（５０ｍＭ　ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．５），１００ｍＭ　ＮａＣｌ，５０ｍＭ　ＫＣｌ）で洗浄した。この時点でカラムは使用可能であり，キャップで止めた。１ｎｍｏｌの最初のプールＲＮＡを２００μｌカラム緩衝液の容量でカラムに負荷した。ときどきボルテックスしながら室温で３０分間インキュベートすることにより基質を結合させた。インキュベーション後，キャップを除去し，カラムを１ｍｌのカラム緩衝液で２回洗浄し，キャップで止めた。２００μｌの溶出緩衝液（５０ｍＭ　ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），１００ｍＭ　ＮａＣｌ，５０ｍＭＫＣＩ，２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２）をカラムに適用し，次にときどきボルテックスしながら室温で３０分間インキュベーションした。キャップを除去し，溶出緩衝液を用いて４つの２００μｌ画分を回収した。
【０５４０】
第２カラム（カウンター選択）：
第２カラムにおける事象の図解は一般に図１２に示され，用いた基質オリゴヌクレオチドは以下に示される：
５’−ＧＧＵＵＧＣＡＣＡＣＣＵＷＣＣ−Ｃ１８スペーサー−ビオチン−反転無塩基−３’
このカラム基質を，先に記載されるようにＵｌｔｒａ　Ｌｉｎｋ　ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）樹脂に結合させ（４０ｐｍｏｌ），これを溶出緩衝液で２回洗浄した。次に第１カラム精製からの溶出液を第２のカラムに流した。このカラムの使用により，第１のカラムから非特異的に希釈されるＲＮＡの結合が可能となり，一方，触媒事象を行いそれに結合する生成物を有するＲＮＡは第２カラムを通って流れる。画分をグリコゲンを担体としてエタノール沈澱させ，滅菌水中に再水和させて増幅に用いた。
【０５４１】
増幅：
ＲＮＡおよびプライマーＭＳＴ３（１０−１００ｐｍｏｌ）を水中で９０℃で３分間変性し，次に氷上で１分間急冷した。管に以下の試薬を加えた（最終濃度が示される）：１ＸＰＣＲ緩衝液（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ），１ｍＭ　ｄＮＴＰ’ｓ（ＰＣＲ用，Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ），２Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ−阻害剤（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ），１０Ｕ／μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩリバーストランスクリプターゼ（ＢＲＬ）。反応駅を４２℃で１時間，次にＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）を破壊するために９５℃で５分間インキュベートした。次に以下の試薬を管に加えて，ＰＣＲ工程用に容量を５倍に増加させた（最終濃度／量が示される）：ＭＳＴ７ｃプライマー（１０−１００ｐｍｏｌ，ＲＴ工程と同じ量），１ＸＰＣＲ緩衝液，ｔａｑＤＮＡポリメラーゼ（０．０２５−０．０５Ｕ／μｌ，Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）。反応は，以下のサイクルで行った：９４℃，４分間；（９４℃，３０秒間；４２−５４℃，３０秒間；７２℃，１分間）ｘ４−３０サイクル；７２℃，５分間；３０℃，３０分間。サイクルの数およびアニーリング温度は，各回ごとに決定した。ヘテロデュープレックスが観察された場合には，反応を新たな試薬で５倍に希釈し，さらに２回の増幅サイクルを進行させた。得られた生成物をアガロースゲルでサイズについて分析し（Ｎ６０＝１２３ｂｐ，Ｎ４０＝１０３ｂｐ，Ｎ２０＝８３ｂｐ），次にエタノール沈澱した。
【０５４２】
転写：
増幅産物の転写は，上述した条件を用いて，以下のように改変して行った：増幅反応の１０−２０％をテンプレートとして用い，反応容量は１００−５００μｌであり，生成物のサイズはやや異なっていた（Ｎ６０＝１０６ｎｔｄｓ，Ｎ４０＝８６，Ｎ２０＝６６）。定量の目的で少量の３２Ｐ−ＧＴＰを反応液に加えた。
【０５４３】
次のラウンド：
選択の次のラウンドにおいては，２０ｐｍｏｌｓの入力ＲＮＡおよびカラム上で４０ｐｍｏｌの２２ヌクレオチド基質を用いた。
【０５４４】
プールの活性：
プールは，３−４ラウンドごとに，１回ターンオーバー条件下で活性についてアッセイした。活性アッセイの条件は以下のとおりであった：５０ｍＭ　ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１００ｍＭ　ＮａＣｌ，５０ｍＭ　ＫＣｌ，痕跡量の３２Ｐ標識基質，１０ｎＭＲＮＡプール。緩衝液中の２Ｘプール，およびこれとは別に緩衝液中の２Ｘ基質を９０℃で３分間，次に３７℃で３分間インキュベートした。次に２Ｘプール管に等量の２Ｘ基質を加えた（ｔ＝０）。最初のアッセイ時点は，４および２４時間であった：５μｌを取り出し，８μｌの冷ストップ緩衝液（９６％ホルムアミド，２０ｍＭ　ＥＤＴＡ，０．０５％ブロモフェニルブルー／キシレンシアノール）中で急冷した。試料を９０℃で３分間加熱し，２０％シークエンシングゲルに負荷した。定量はＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ＤｙｎａｍｉｃｓホスファーイメージャーおよびＩｍａｇｅＱｕａＮＴ（登録商標）ソフトウエアを用いて実施した。データは表５２に示される。
【０５４５】
標準的なプロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）を用いて，オリゴヌクレオチドのプールからの試料をベクター中にクローニングし，配列決定した。酵素的核酸分子は代表的な数のこれらのクローンから，本明細書に記載される方法を用いて転写した。クローンからの酵素的核酸分子を５／１６基質とともに２ｍＭ　ＭｇＣｌ２，ｐＨ７．５，１０ｍＭ　ＫＣｌ中で３７℃でインキュベートすることにより，各プールからの個々のクローンを，Ｎ６０およびＮ４０からのＲＮＡ切断について試験した。表５４のデータは，プールから単離された酵素的核酸分子が独立して活性を有することを示す。
【０５４６】
速度論的活性：
表５４に示される酵素的核酸分子の速度論的活性は，酵素的核酸分子（１０ｎＭ）を切断緩衝液（ｐＨ８．５，２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１００ｍＭ　ＮａＣｌ，５０ｍＭ　ＫＣｌ）中で３７℃で基質とインキュベートすることにより決定した。
【０５４７】
マグネシウム依存性：
ＭｇＣｌ２を変化させ他の条件を一定に保持（５０ｍＭ　ｔｒｉｓ［ｐＨ８．０］，１００ｍＭ　ＮａＣｌ，５０ｍＭ　ＫＣｌ，１回ターンオーバー，１０ｎＭプール）することにより，Ｎ２０のラウンド１５のマグネシウム依存性を試験した。データは表５５に示され，これはマグネシウム濃度が増加するにつれて活性が増加することを示す。
【０５４８】
２’−デオキシ−２’−（Ｎ−ヒスチジル）アミノＵＴＰ，２’−フルオロ−ＡＴＰおよび２’−デオキシ−２’−アミノＣＴＰおよびＧＴＰを用いる新規酵素的核酸分子モチーフの選択
２’−デオキシ−２’アミノ修飾ＧＴＰおよびＣＴＰを用いる新規酵素的核酸分子モチーフの選択において用いた方法を，２’−デオキシ−２’−（Ｎ−ヒスチジル）アミノＵＴＰ，２’−フルオロ−ＡＴＰ，および２’−デオキシ−２’−アミノＣＴＰおよびＧＴＰを用いて繰り返した。ただし，最初のカラムでＭｇＣｌ２により切断する代わりに，最初のランダム修飾−ＲＮＡプールを以下の緩衝液中で基質−樹脂に負荷した；５ｍＭ　ＮａＯＡｃ　ｐＨ５．２，１Ｍ　ＮａＣｌ，４℃。十分に洗浄した後，樹脂を２２℃にし，緩衝液を２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．４，１４０ｍＭ　ＫＣｌ，１０ｍＭ　ＮａＣｌ，１ｍＭ　ＣａＣｌ２，１ｍＭ　ＭｇＣｌ２に変更した。Ｎ６０オリゴヌクレオチドの１つの選択においては，二価カチオン（ＭｇＣｌ２，ＣａＣｌ２）を用いなかった。樹脂を１０分間インキュベートして，反応を行わせ，溶出液を回収した。
【０５４９】
酵素的核酸分子プールは，二価カチオンの非存在下であっても存在する基質の１−３％を切断することができ，バックグラウンド（修飾プールの非存在下）は０．２−０．４％であった。
【０５５０】
５−置換２’−修飾ヌクレオシドの合成
モノマー性ヌクレオシド三リン酸を治療用触媒的ＲＮＡの選択用に設計する場合，生物学的血清中におけるそのような分子のヌクレアーゼ安定性を考慮しなければならない。ＲＮＡ安定性を増加させる一般的な方法は，糖の２’−ＯＨ基を他の基，例えば２’−フルオロ，２’−Ｏ−メチルまたは２’−アミノで置き換えることである。幸運なことに，そのような２’−修飾ピリミジン５’三リン酸は，ＲＮＡポリメラーゼの基質であることが示されている（Ａｕｒｕｐ，Ｈ．；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ｍ．；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｐａｄｉｌｌａ，Ｒ．；Ｓｏｕｓａ，Ｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９９９，２７，１５６１）。一方，ピリミジンの５−位置における種々の置換基はＴ７ＲＮＡポリメラーゼに対して非常に耐性であることが示されている（Ｔａｒａｓｏｗ，Ｔ．Ｍ．；Ｅａｔｏｎ，Ｂ．Ｅ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ　１９９８，４８，２９）。これはおそらくは，これらのヌクレオチドの天然の水素結合パターンが保存されているためであろう。我々は，塩基の５−位置に異なる官能基を結合させるための出発物質として２’−フルオロおよび２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオシドを選択した。硬性の（アルキニル）および可撓性の（アルキル）スペーサーを用いた。イミダゾール，アミノおよびカルボキシレートペンダント基の選択は，一般酸，一般塩基，求核剤および金属リガンドとして作用する能力に基づいて行い，これらはすべて選択された核酸の触媒的抗力を改良することができる。図２１−２４は，これらの化合物の合成に関する。
【０５５１】
２’−Ｏ−メチルウリジンをピリジン中の無水酢酸を用いて３’，５’−ビス−アセチル化し，次にＩ２／セリウム硝酸アンモニウム試薬を用いてその５−ヨード誘導体１ａに変換した（Ａｓａｋｕｒａ，Ｊ．；Ｒｏｂｉｎｓ，Ｍ．Ｊ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（スキーム１））。いずれの反応も，定量的収率で進行し，クロマトグラフィーによる精製は不要であった。Ｈｏｂｂｓ（Ｈｏｂｂｓ，Ｆ．Ｗ．，Ｊｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ）に記載されるような，ヨウ化銅（Ｉ）およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）触媒を用いる１とＮ−トリフルオロアセチルプロパルギルアミンとのカップリングにより，２ａを８９％の収率で得た。水性ＮａＯＨを用いる選択的Ｏ−デアシル化により３ａを得，これを１，８−ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン（プロトン−スポンジ）の存在下でＰＯＣｌ３／トリエチルリン酸（ＴＥＰ）でリン酸化した（方法Ａ）（Ｋｏｖａｃｚ，Ｔ；Ｏｔｖｏｓ，Ｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．）。中間体ヌクレオシドホスホロジクロリデートを，インシトゥーでトリ−ｎ−ブチルアンモニウムピロリン酸と縮合した。最後に，濃アンモニアを用いてＮ−ＴＦＡ基を除去した。５’−三リン酸は，溶出に０．１−０．８Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）の直線勾配を用いてセファデックス（登録商標）ＤＥＡＥＡ−２５イオン交換カラムで精製した。痕跡量の夾雑無機ピロリン酸を，Ｃ−１８ＲＰ　ＨＰＬＣで除去して，分析的に純粋な物質を得た。Ｎａ＋塩への変換は，三リン酸の水性溶液をＮａ＋型のＤｏｗｅｘ５０ＷＸ８イオン交換樹脂を通すことにより行い，４ａを４５％の収率で得た。最初のリン酸化工程でプロトンスポンジを省略した場合，収率は１０−２０％に低下した。３ａの触媒的水素化により５−アミノプロピル誘導体５ａを得，これをプロピニル誘導体３ａについて記載したものと同じ条件下でリン酸化して，三リン酸６ａを５０％の収率で得た。
【０５５２】
イミダゾール誘導化三リン酸９ａおよび１１ａの製造のためには，我々はＮ−ジフェニルカルバモイル４−イミダゾール酢酸（ＩｍＡＡＤＰＣ）の効率的な合成を開発した。ＴＭＳＣｌ／ピリジンを用いてカルボキシル基をＴＭＳ−エステルとして過渡的に保護し，次にＤＰＣ−Ｃｌを用いて４−イミダゾール酢酸（ＩｍＡＡ）をそのＮ−ＤＰＣ保護誘導体にきれいに定量的に変換した。
【０５５３】
２ａを完全に脱アシル化して５−（３−アミノプロピニル）誘導体８ａを得，これを１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下で４−イミダゾール酢酸と縮合させて，９ａを６８％の収率で得た。８ａの触媒的水素化により５−（３−アミノプロピル）誘導体１０ａを得，これをＩｍＡＡＤＰＣと縮合させて，コンジュゲート１１ａを３２％の収率で得た。これらのカップリングの収率は，５’−ＯＨをＤＭＴ基で保護したときに非常に改良され（示さず），したがって，望ましくない５’−Ｏ−エステル化が効率的に防止された。９ａおよび１１ａのいずれも，ＰＯＣｌ３／ＴＥＰ／プロトンスポンジとの反応においては三リン酸生成物を生じなかった。
【０５５４】
これに対し，３’−Ｏ−アセチル化誘導体１２ａおよび１３ａを２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンでリン酸化し，続いてピロリン酸付加および酸化（方法Ｂ，スキーム２；Ｌｕｄｗｉｇ，Ｊ．，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９，５４，６３１）すると，所望の三リン酸１４ａおよび１５ａがそれぞれ５７％の収率で得られた。
【０５５５】
アミノ−（４ｂ，６ｂ）およびイミダゾール−（１４ｂ，１５ｂ）結合基を含む２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオシド５’−三リン酸は，２’−Ｏ−メチルヌクレオシド５’−三リン酸（スキーム１および２）の製造について記載したものと同様に合成した。ここでも，４−イミダゾールアセチル誘導化三リン酸の製造にはＬｕｄｗｉｇ−Ｅｃｋｓｔｅｉｎリン酸化のみが働いた。
【０５５６】
５ｂの”ワンポットツーステップ”リン酸化反応（Ｋｏｖａｃｚ，Ｔ；Ｏｔｖｏｓ，Ｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．）をＴＥＡＢまたはＨ２Ｏの代わりに４０％水性メチルアミンで急冷すると，唯一の検出可能な生成物としてγ−アミデート７ｂが生成したことに注意すべきである。同様の反応は，ｐｐｐＡ２’ｐ５’Ａ２’ｐ５’Ａのγ−アミデートの製造について最近報告されている（１２）。
【０５５７】
ヌクレオシドレベルで，および合成後の両方でウリジンの５位にカルボキシレート基を導入した（方法Ｃ）（スキーム３）。改変ヘック反応（ｌ３）を用いて５−ヨード−２’−デオキシ−２’−フルオロウリジン（１６）をアクリル酸メチルとカップリングさせて，１７を８５％の収率で得た。５’−Ｏ−ジメトキシトリチル化し，次にインシトゥーで３’−Ｏ−アセチル化し，続いて脱トリチル化することにより，３’−保護誘導体１８を得た。２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサ−ホスホリン−４−オンを用いてリン酸化し，続いてピロリン酸を付加し酸化（Ｌｕｄｗｉｇ，Ｊ．；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）して，所望の三リン酸を５４％の収率で得た。一方，５−（３−アミノプロピル）ウリジン５’−三リン酸６ｂをＦｍｏｃ−Ａｓｐ−ＯＦｍのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとカップリングさせ，ジエチルアミンでＦｍｏｃおよびＦｍ基を除去した後に，所望のアミノアシルコンジュゲート２０を５０％の収率で得た。
【０５５８】
３−アミノプロピルおよび３（Ｎ−スクシニル）アミノプロピル基を含むシチジン誘導体は，スキーム４にしたがって合成した。過アシル化５−（３−アミノプロピニル）ウラシル誘導体２ｂを触媒的水素化を用いて還元し，次に７工程で５％の合計収率で３’−アセチル化シチジン誘導体２５に変換する。この合成は，中間体の溶解性が低いことおよび４−トリアゾリル中間体のアンモニア処理の間にＮ４−環化副生成物が形成することにより苦しめられた。参考文献１１に記載されるような２５のリン酸化により，三リン酸２６およびＮ４−環化生成物２７が１：１の比率で得られた。これらはセファデックスＤＥＡＥＡ−２５イオン交換カラムで０．１−０．８Ｍ　ＴＥＡＢ勾配を用いることにより容易に分離した。塩基性条件下で遊離の第１アミンは残りの無傷の４−ＮＨＢｚ基のいずれかと置き換わり，環化生成物が生ずるようである。これは上述した第１アミンによる４−トリアゾリル基の置換と類似する。
【０５５９】
Ｎ４−非保護シチジンの使用がこの問題を解決するであろうと考えられた。これから２６の改良された合成が導かれる：２’−デオキシ−２’−フルオロシチジン（２８）をヨウ素化すると，５−ヨード誘導体２９が５８％の収率で得られた。次にこの化合物を円滑に５−（３−アミノプロピニル）誘導体３０に変換した。水素化により５−（３−アミノプロピル）誘導体３１が得られ，これをＰＯＣｌ３／ＰＰｉで直接リン酸化して，２６を３７％の収率で得た。５’−三リン酸２６を無水コハク酸とカップリングさせて，スクシニル化誘導体３２を３６％の収率で得た。
【０５６０】
５−イミダゾール酢酸２’−デオキシ−５’−三リン酸ウリジンの合成
５−ジニトロフェニルイミダゾール酢酸２’−デオキシウリジンヌクレオシド（８０ｍｇ）をアルゴン下で撹拌しながら５ｍｌのリン酸トリエチルに溶解し，反応混合物を０℃に冷却した。オキシ塩化リン（１．８ｅｑ，２２ｍｌ）を反応混合物に０℃で加え，さらに３アリコートを室温で４８時間かけて加えた。次に反応混合物を無水ＭｅＣＮ（５ｍｌ）で希釈し，０℃に冷却し，次にトリブチルアミン（０．６５ｍｌ）およびトリブチルアンモニウムピロリン酸（４．０ｅｑ，０．２４ｇ）を加えた。４５分後，反応を１０ｍｌ水性メチルアミンで４時間急冷した。ＭｅＯＨ（３ｘ）と共蒸発させた後，物質をＤＥＡＥセファデックスで，次にＲＰクロマトグラフィーで精製して，１５ｍｇの三リン酸を得た。
【０５６１】
２’−（Ｎ−リシル−アミノ−２’−デオキサ−シチジン三リン酸の合成
２’−（Ｎ−リシル）−アミノ−２’−デオキシシチジン（０．１８０ｇ，０．２２ｍｍｏｌ）をＡｒ下でトリエチルリン酸（２．００ｍｌ）に溶解した。溶液を氷浴中で０℃に冷却した。オキシ塩化リン（９９．９９９％，３当量，０．０６７２ｍＬ）を溶液に加え，反応液を０℃で２時間撹拌した。トリブチルアンモニウムピロリン酸（４当量，０．４００ｇ）を３．４２ｍＬのアセトニトリルおよびトリブチルアミン（０．１６５ｍＬ）に溶解した。アセトニトリル（１ｍＬ）を一リン酸溶液に加え，次にピロリン酸溶液を滴加した。得られた溶液は透明であった。反応を室温まで暖めた。４５分間撹拌した後，メチルアミン（５ｍＬ）を加え，反応を室温で２時間撹拌した。二相混合物が生じた（フラスコの底にわずかのビーズがあった）。ＴＬＣ（７：１：２ｉＰｒＯＨ：ＮＨ４ＯＨ：Ｈ２Ｏ）は，三リン酸物質の出現を示した。溶液を濃縮し，水に溶解し，新たに調製したＤＥＡＥセファデックスＡ−２５カラムに負荷した。カラムを０．６Ｍ　ＴＥＡＢ緩衝液までの勾配で洗浄し，生成物は画分９０−９５に溶出された。画分をイオン交換ＨＰＬＣにより分析した。各画分は，約４．０００分に溶出された１つの三リン酸ピークを示した。画分を合わせ，メタノールからポンプダウンして，緩衝液塩を除去して，１５．７ｍｇの生成物を得た。
【０５６２】
２’−デオキシ−２’−（Ｌ−ヒスチジン）アミノシチジン三リン酸の合成
２’−［Ｎ−Ｆｍｏｃ，Ｎｉｍｉｄ−ジニトロフェニル−ヒスチジル］アミノ−２’−シチジン（０．３１０ｇ，４．０４ｍｍｏｌ）をＡｒ下でリン酸トリエチル（３ｍｌ）に溶解した。溶液を０℃に冷却した。オキシ塩化リン（１．８当量，０．０６８ｍＬ）を溶液に加え，冷凍庫で一夜保存した。翌朝，ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２中１０％ＭｅＯＨ）はかなりの出発物質を示し，さらに１当量のＰＯＣｌ３を加えた。２時間後，ＴＬＣは依然として出発物質を示した。６．３ｍＬのアセトニトリルに溶解した（滴加）トリブチルアミン（０．３０３ｍＬ）およびトリブチルアンモニウムピロリン酸（４当量，０．７３４ｇ）を一リン酸溶液に加えた。反応液を室温まで暖めた。１５分間撹拌した後，メチルアミン（１０ｍＬ）を室温で加え，撹拌を２時間続けた。ＴＬＣ（７：１：２ｉＰｒＯＨ：ＮＨ４ＯＨ：Ｈ２Ｏ）は，三リン酸物質の出現を示した。溶液を濃縮し，水に溶解し，ＤＥＡＥセファデックスＡ−２５カラムに負荷した。カラムを０．６Ｍ　ＴＥＡＢ緩衝液までの勾配で洗浄し，生成物は画分１７０−１７９に溶出された。画分はイオン交換ＨＰＬＣにより分析した。各画分は−６．７７分に溶出された１つの三リン酸ピークを示した。画分を合わせ，メタノールからポンプダウンして緩衝液塩を除去して，１７ｍｇの生成物を得た。
【０５６３】
修飾ＮＴＰを用いる新規酵素的核酸分子モチーフのスクリーニング（クラスＩモチーフ）
我々の最初のプールは，２’−アミノ−ｄＣＴＰ／２’−アミノ−ｄＵＴＰ　ＲＮＡの３ｘ１０１４の個々の配列を含んでいた。我々は，ＲＮＡ生成物の量を増加させるために，メタノールおよび塩化リチウムを含ませることにより転写条件を最適化した。２’−アミノ−２’デオキシヌクレオチドは選択の逆転写および増幅工程を妨害せず，ヌクレアーゼ耐性を付与する。我々は，ランダムな４０ヌクレオチド領域により分離された，基質に相補的な２つの結合アームを有するようにプールを設計した。１６ｍｅｒ基質は，塩基対形成しないグアノシンにより分離された，プールに結合する５および１０ヌクレオチドの長さの２つのドメインを有していた。基質の５’末端にはＣ１８リンカーにより結合したビオチンを有していた。このことにより，カラムフォーマットにおいて基質をＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）樹脂に結合させることができた。所望の反応は，マグネシウム補因子を加えたときに塩基対形成していないＧで切断され，次に５塩基対ヘリックスの安定性によりカラムから解離させるものである。詳細なプロトコルは以下のとおりである：
【０５６４】
酵素的核酸分子プールの調製：最初のプールＤＮＡは，以下のテンプレートオリゴヌクレオチドをｔａｑポリメラーゼでフィルインして二本鎖ＤＮＡに変換することにより調製した（テンプレート＝５’−ＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＣＣＧＴ（Ｎ）４０ＧＧＴＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＴＣ−３’；プライマー１＝５’−ＣＡＣＴＴＡＧＣＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＣＣＧＴ−３’；プライマー２＝５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＡＡＧＧＴＧＴＧＣＡＡＣＣ−３’）
すべてのＤＮＡオリゴヌクレオチドは，オペロン技術を用いて合成した。テンプレートオリゴは変性ＰＡＧＥおよびＳｅｐ−ｐａｋクロマトグラフィーカラムｓ（Ｗａｔｅｒｓ）により精製した。ＲＮＡ基質オリゴは，標準的な固相化学を用いて合成し，変性ＰＡＧＥおよびエタノール沈澱により精製した。インビトロ切断アッセイの基質をガンマ−３２Ｐ−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで５’末端標識し，次に変性ＰＡＧＥ精製およびエタノール沈澱を行った。
【０５６５】
５ｎｍｏｌｅのテンプレート，１０ｎｍｏｌｅの各プライマーおよび２５０Ｕのｔａｑポリメラーゼを１０ｍｌ容量中で１ＸＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ　ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，５０ｍＭＫＣｌ）および各０．２ｍＭ　ｄＮＴＰ中で，以下のようにインキュベートした：９４℃，４分間；（９４℃，１分間；４２℃，１分間；７２℃，２分間）を４サイクル；次に７２℃，１０分間。生成物は２％Ｓｅｐａｒｉｄｅ（登録商標）アガロースゲルでサイズを分析し，次に緩衝化フェノールで２回抽出し，次にクロロホルム−イソアミルアルコールで抽出し，エタノール沈澱した。最初のＲＮＡプールは，５００ｐｍｏｌｅ（３ｘ１０１４分子）のこのＤＮＡを以下のように転写することにより作成した。４０ｍＭ　ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１２ｍＭ　ＭｇＣｌ２，５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ），１ｍＭスペルミジン，０．００２％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００，１ｍＭ　ＬｉＣｌ，４％ＰＥＧ−８０００，１０％メタノール，２ｍＭＡＴＰ，２ｍＭＧＴＰ，２ｍＭ２’−アミノ−ｄＣＴＰ，２ｍＭ２’アミノ−ｄＵＴＰ，５Ｕ／ｍｌ無機ピロホスファターゼ，および５Ｕ／μｌのＴ７ＲＮＡポリメラーゼにテンプレートＤＮＡを室温で加えて，総容量１ｍｌとした。別の反応は，検出のために２倍量のアルファ−３２Ｐ−ＧＴＰを含んでいた。転写は，３７℃で２時間インキュベートし，次に等量のＳＴＯＰ緩衝液（９４％ホルムアミド，２０ｍＭ　ＥＤＴＡ，０．０５％ブロモフェノールブルー）を加えた。得られたＲＮＡを６％変性ＰＡＧＥゲル，Ｓｅｐｐａｋ（登録商標）クロマトグラフィーで精製し，エタノール沈澱した。
【０５６６】
最初の選択：２ｎｍｏｌｅの１６ｍｅｒ５’−ビオチニル化基質（５’−ビオチン−Ｃ１８リンカー−ＧＣＣＧＵＧＧＧＵＵＧＣＡＣＡＣ−３’）を，結合緩衝液（２０ｍＭ　ＮａＰＯ４（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）中で，２００μｌのＵｌｔｒａ　Ｌｉｎｋ　Ｉｍｍｏｂｉｌｉｅｄ　ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）樹脂（４００μｌのスラリー，Ｐｉｅｒｃｅ）に，室温で３０分間結合させた。得られた基質カラムを２ｍｌの結合緩衝液で，次に２ｍｌのカラム緩衝液（５０ｍＭ　ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），１００ｍＭ　ＮａＣｌ，５０ｍＭＫＣｌ）で洗浄した。流れをキャップで止め，２００μｌのカラム緩衝液中の１０００ｐｍｏｌｅの最初のプールＲＮＡをカラムに加え，室温で３０分間インキュベートした。カラムのキャップをはずし，２ｍｌのカラム緩衝液で洗浄し，キャップで止めた。２００μｌの溶出緩衝液（＝カラム緩衝液＋２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２）をカラムに加え，室温で３０分間インキュベートした。カラムのキャップをはずし，溶出液を回収し，次に２００μｌの溶出緩衝液で３回洗浄した。溶出液／洗浄液は，グリコゲンを担体として用いてエタノール沈澱し，５０μｌの滅菌Ｈ２Ｏ中で再水和した。溶出されたＲＮＡは，標準的な逆転写／ＰＣＲ増幅手法により増幅した。５−３１μｌのＲＮＡを２０ｐｍｏｌのプライマー１とともに，１４μｌ容量９０℃で３分間インキュベートし，次に氷上に１分間置いた。以下の試薬を加えた（最終濃度で示される）：１ＸＰＣＲ緩衝液，１ｍＭの各ｄＮＴＰ，２Ｕ／ｌＲＮａｓｅ阻害剤，１０Ｕ／μｌ　ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）リバーストランスクリプターゼ。反応を４２℃で１時間インキュベートし，リバーストランスクリプターゼを失活させるために続いて９５℃で５分間インキュベートした。次に水およびＰＣＲ用の試薬：１ＸＰＣＲ緩衝液，２０ｐｍｏｌプライマー２，および２．５ＵのｔａｑＤＮＡポリメラーゼを加えて，容量を１００μｌに増やした。反応はＨｙｂａｉｄサーモサイクラーでサイクルさせた：９４，４分間；（９４℃，３０秒間；５４℃，３０秒間；７２℃，１分間）Ｘ２５；７２℃，５分間。生成物はアガロースゲルでサイズを分析し，エタノール沈澱した。ＰＣＲ　ＤＮＡの１／３から１／４を用いて，上述したように，１００μｌ容量中で次の世代を転写した。続くラウンドにおいては，４０ｐｍｏｌの基質を有するカラムについて２０ｐｍｏｌのＲＮＡを用いた。
【０５６７】
２カラム選択：第８世代（Ｇ８）において，カラム選択を２カラムフォーマットに変更した。２００ｐｍｏｌｅの２２ｍｅｒ５’−ビオチニル化基質（５’−ビオチン−Ｃ１８リンカー−ＧＣＣＧＵＧＧＧＵＵＧＣＡＣＡＣＣＵＷＣＣ−Ｃ１８リンカー−チオール修飾剤Ｃ６Ｓ−Ｓ−反転無塩基−３’）を，上述したように選択カラムにおいて用いた。溶出は２００μｌの溶出緩衝液で行い，次に１ｍｌの溶出緩衝液で洗浄した。１２００μｌの溶出物を重力により生成物トラップカラムに通した。生成物トラップカラムは，以下のように製造した：２００ｐｍｏｌの１６ｍｅｒ５’−ビオチニル化”生成物”（５’−ＧＧＵＵＧＣＡＣＡＣＣＵＷＣＣ−Ｃ１８リンカー−ビオチン−３’）を上述したようにカラムに結合させ，カラムを溶出緩衝液で平衡化した。生成物カラムからの溶出物を上述のように沈澱させた。生成物は，２．５倍多い容量および１００ｐｍｏｌの各プライマーのみを用いて上述のように増幅した。１００μｌのＰＣＲ反応を用いて，サイクル過程を行った。残りの画分は，生成物に必要な最小数のサイクルで増幅した。３ラウンド後（Ｇ１１），１回ターンオーバー切断アッセイにおいて活性が認められた。第１３世代までに，基質の４５％が４時間で切断された。プールのｋｏｂｓは２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２中で０．０３７ｍｉｎ−１であった。第１３世代をサブクローニングし配列決定した。プールは依然として非常に多様であった。我々の目標は生理学的環境中で作用する酵素的核酸分子であったため，我々は，Ｇ１３の目録を徹底的に作成せずに，選択圧を変更することに決定した。
【０５６８】
Ｎ４０プールの再選択は，Ｇ１２ＤＮＡから出発した。Ｇ１２ＤＮＡの一部を超変異性ＰＣＲ（Ｖａｒｔａｎｉａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ２４，２６２７−２６３１）に供して，１つの位置について１０％の変異頻度を導入し，これをＮ４０Ｈと命名した。ラウンド１９において，ＤＮＡの一部を再び超変異させ，Ｎ４０ＭおよびＮ４０ＨＭを得た（合計４種類のプール）。カラム基質は同じであった。緩衝液は変化させ，結合および溶出の温度は３７℃に上昇させた。カラム緩衝液を生理学的緩衝液（５０ｍＭ　ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１４０ｍＭ　ＫＣｌ，１０ｍＭ　ＮａＣｌ）で置き換え，溶出緩衝液を１ｍＭ　Ｍｇ緩衝液（生理学的緩衝液＋１ｍＭ　ＭｇＣｌ２）で置き換えた。プールをカラムに結合させる時間は，最終的に１０分間に減少させ，溶出時間は３０分間から２０秒間まで徐々に減少させた。ラウンド１８と２３との間では，Ｎ４０プールのｋｏｂｓは０．０３５−０．０４ｍｉｎ−１で比較的一定であった。４つのプールのそれぞれからの第２２世代をクローニングし配列決定した。
【０５６９】
クローニングおよび配列決定：ＮｏｖａｇｅｎのＰｅｒｆｅｃｔｌｙＢｌｕｎｔ（登録商標）クローニングキット（ｐＴ７Ｂｌｕｅ−３ベクター）を用い，キットのプロトコルにしたがって，第１３世代および第２２世代をクローニングした。ベクター特異的プライマーを用いるＰＣＲ増幅により挿入物についてクローンをスクリーニングした。ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ７７００配列検出システムおよびベクター特異的プライマーを用いてポジティブクローンを配列決定した。配列はＭａｃＶｅｃｔｏｒソフトウエアを用いてアラインメントした。二次元折り畳みは，Ｍｕｌｆｏｌｄソフトウエア（Ｚｕｋｅｒ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４，４８−５２；Ｊａｅｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ８６，７７０６−７７１０；Ｊａｅｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９，Ｒ．Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅｅｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，２８１−３０６）を用いて行った。１００μｌ容量中１ＸＰＣＲ緩衝液，０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ，および２．５Ｕのｔａｑポリメラーゼで５０ｐｍｏｌの各プライマー１およびプライマー２でＰＣＲ増幅することにより個々のクローンの転写ユニットを作成した。サイクルは以下のとおりである：９４℃，４分間；（９４℃，３０秒間；５４℃，３０秒間；７２℃，１分間）Ｘ２０；７２℃，５分間。転写ユニットをエタノール沈澱し，３０μｌのＨ２Ｏ中で再水和し，１０μｌを１００μｌ容量中で転写させ，先に記載したように精製した。
【０５７０】
各プールからの３６個のクローンを配列決定し，同じコンセンサスモチーフの変種であることが見いだされた。ユニークなクローンを１ｍＭ　ＭｇＣｌ２中で生理学的条件下で活性についてアッセイした。９個のクローンがコンセンサス配列を示し，これを次の実験に用いた。活性を有意に上昇させる変異はなかった。変異のほとんどは，提唱される二次構造に基づいてデュープレックスであると考えられる領域中であった。モチーフをより短くするために，増幅のためにプライマーに結合するのに必要な３’−末端の２５ヌクレオチドを削除した。全長および切断型分子の測定された速度はいずれも０．０４ｍｉｎ−１であった。すなわち，モチーフのサイズを８６から６１ヌクレオチドに減少させることができた。ステムループ構造ならびに基質認識アーム中の塩基対を切断することにより分子をさらに短くして，４８ヌクレオチド分子を得ることができた。さらに，多くのリボヌクレオチドを２−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドで置き換えて，分子を安定化した。新規なモチーフの例は図１３に示される。当業者は，分子は図に示される化学修飾に限定されず，これは１つの可能な化学修飾分子を表すにすぎないことを認識するであろう。
【０５７１】
速度論的分析：
痕跡量の５’−３２Ｐ−標識基質および１０−１０００ｎＭプールの酵素的核酸分子を用いて，１回ターンオーバー速度論を実施した。１Ｘ緩衝液中の２Ｘ基質および１Ｘ緩衝液中の２Ｘプール／酵素的核酸分子を別々に９０℃で３分間インキュベートし，次に３７℃で３分間平衡化させた。ｔ０で等量の２Ｘ基質をプール／酵素的核酸分子に加え，反応液を３７℃でインキュベートした。各時点において，１．２容量のＳＴＯＰ緩衝液で氷上で急冷した。試料を９０℃で３分間加熱し，１５％シークエンスゲルで分離した。ゲルはホスファーイメージャーを用いて画像化し，ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（登録商標）ソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて定量した。ほとんどの場合，曲線は二次指数減衰に適合したが，場合によっては直線に適合させることが必要であった。
【０５７２】
安定性：血清安定性アッセイは，先に記載されるように行った（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２５７０２−２５７０８）。１μｇの５’−３２Ｐ標識合成酵素的核酸分子を１３μｌの非標識物に加え，ヒト血清中における減衰についてアッセイした。ゲルおよび定量は，速度論の節において記載した通りである。
【０５７３】
基質要求性：表６０はクラスＩモチーフの基質要求性の概要を示す。基質は，変異体クラスＩ構築物との間に，ワトソン−クリックまたは動揺塩基対を維持していた。１回ターンオーバー速度論アッセイにおける活性が，野生型クラスＩおよび２２ｍｅｒ基質に対して示されている（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．５），１４０ｍＭＫＣＩ，１０ｍＭ　ＮａＣｌ，１ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１００ｎＭリボザイム，５ｎＭ基質，３７℃）。
【０５７４】
ランダム領域変異アラインメント：表６１は，第２２世代からの１３４個のクローンのランダム領域アラインメントの概要を示す（１．ｘ＝Ｎ４０，２．ｘ＝Ｎ４０Ｍ，３．ｘ＝Ｎ４０Ｈ，４．ｘ＝Ｎ４０ＨＭ）。各変異体のコピー数は表中で括弧内に示され，コンセンサスからのずれが示されている。塩基対Ｕ１９：Ａ３４を保持する変異はイタリック体で示される。Ｇ２２プール速度に対する１回ターンオーバー速度論アッセイにおける活性が示されている（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬｐＨ７．５，１４０ｍＭ　ＫＣｌ，１０ｍＭ　ＮａＣｌ，１ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１００ｎＭリボザイム，痕跡量基質，３７℃）。
【０５７５】
ステム切断型およびループ置換分析：図２５は，クラスＩリボザイムのステム切断型およびループ置換分析を示す。Ｋｒｅｌは，上述したように測定した６１ｍｅｒクラスＩリボザイムと比較する。図２６は，切断型ステムおよび／または非ヌクレオチドリンカー置換ループ構造を有するクラスＩリボザイムの例である。
【０５７６】
クラスＩ（アンバーザイム）モチーフを用いるＨＣＶの阻害
ＨＣＶ感染の間，ウイルスＲＮＡは，いくつかのプロセスにおいて酵素的核酸分子切断の潜在的標的として存在する：アンコーティング，翻訳，ＲＮＡ複製およびパッケージング。標的ＲＮＡはこれらの工程のいずれかにおいて酵素的核酸分子の切断に多かれ少なかれアクセス可能であろう。ＨＣＶの最初のリボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）と翻訳装置との間の関連性はＨＣＶ　５’ＵＴＲ／ルシフェラーゼレポーターシステムにおいて模倣することができるが，これらの他のウイルスのプロセスは，ＯＳＴ７システムには存在しない。標的ウイルスＲＮＡに付随するＲＮＡ／蛋白質複合体も存在しなかった。さらに，これらの工程は，ＨＣＶ感染細胞において組み合わせることができ，これは標的ＲＮＡのアクセス可能性にさらに影響を与えるかもしれない。したがって，我々は，ＨＣＶ　５’ＵＴＲを切断するよう設計した酵素的核酸分子が複製ウイルスシステムに影響を及ぼしうるか否かを試験した。
【０５７７】
最近，ＬｕおよびＷｉｍｍｅｒは，ポリオウイルスＩＲＥＳがＨＣＶからのＩＲＥＳで置き換えられているＨＣＶポリオウイルスキメラを特徴決定した（Ｌｕ＆Ｗｉｍｍｅｒ，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３，１４１２−１４１７）。ポリオウイルス（ＰＶ）は，ＨＣＶと同様に＋鎖のＲＮＡウイルスであるが，ＨＣＶとは異なり，エンベロープ化されておらず，培養細胞中で効率的に複製する。ＨＣＶ−ＰＶキメラは，野生型ＰＶと比較して安定な小さいプラークの表現型を示す。
【０５７８】
新規な酵素的核酸分子モチーフが細胞内でＨＣＶ　ＲＮＡを阻害する能力を，蛍およびウミシイタケルシフェラーゼの両方を用いるデュアルレポーターシステムを用いて試験した（図１４）。新規なクラスＩモチーフ（アンバーザイム）を有する多数の酵素的核酸分子を設計し試験した（表５６）。５’ＨＣＶ　ＵＴＲ領域を標的とするアンバーザイムリボザイムは，切断されたとき，転写産物のルシフェラーゼへの翻訳を妨害する。ＯＳＴ−７細胞を黒壁９６−ウエルプレート（Ｐａｃｋａｒｄ）に１２，５００細胞／ウエルで播種し，１０％ウシ胎児血清，１％ペニシリン／ストレプトマイシン，および１％Ｌ−グルタミンを含有するＤＭＥＭ培地中で３７℃で一夜培養した。Ｔ７プロモーターを含み５’ＨＣＶ　ＵＴＲおよび蛍ルシフェラーゼを発現するプラスミド（Ｔ７Ｃ１−３４１（Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３，Ｊ．ｏｆ　Ｖｉｒｏｌ．６７，３３３８−３３４４））をｐＲＬＳＶ４０ウミシイタケ対照プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と混合し，次に酵素的核酸分子およびカチオン性脂質と混合して，５Ｘ濃度の試薬（Ｔ７Ｃ１−３４１（４ｇ／ｍｌ），ｐＲＬＳＶ４０ウミシイタケルシフェラーゼ対照（６μｇ／ｍｌ），酵素的核酸分子（２５０ｎＭ），トランスフェクション試薬（２８．５μｇ／ｍｌ））を作成した。
【０５７９】
複合体混合物を３７℃で２０分間インキュベートした。培地を細胞から除去し，１２０μｌのＯｐｔｉ−ｍｅｍ培地をウエルに加え，次に３０μｌの５Ｘ複合体混合物を加えた。未処理細胞を有するウエルには１５０μｌのＯｐｔｉ−ｍｅｍを加えた。複合体混合物をＯＳＴ−７細胞上で４時間インキュベートし，受動的溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で溶解し，デュアルルシフェラーゼアッセイキットを用いて，製造元のプロトコルを用いて発光シグナルを定量した（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。図１５に示されるデータは，ＨＣＶ　ＲＮＡの位置１４６を標的とする酵素的核酸分子の用量曲線であり，蛍ルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼの蛍光の比率で表される。酵素的核酸分子は，すべての酵素的核酸分子濃度においてＨＣＶ　ＲＮＡの量を減少させることができ，ＩＣ５０は約５ｎＭであった。他の部位もまた有効であり（図１６），特に，部位１３３，２０９，および２７３を標的とする酵素的核酸分子も，無関係（ＩＲＲ）対照と比較してＨＣＶ　ＲＮＡを減少させた。
【０５８０】
完全に修飾したクラスＩ（アンバーザイム）酵素的核酸分子を用いる基質の切断
すべての２’位で修飾した酵素的核酸が標的ＲＮＡを切断する能力を試験して，アンバーザイムモチーフ中のいずれかのリボヌクレオチド位置が必要であるか否かを判定した。酵素的核酸分子を２’−Ｏ−メチル，および２’−アミノ（ＮＨ２）ヌクレオチドを有するかまたはリボヌクレオチドを含まないよう（表５６；遺伝子名：リボなし）を作成し，実施例１３に記載されるように速度論的分析を行った。１００ｎＭの酵素的核酸を生理学的条件下で１ｍＭ　ＭｇＣｌ２の存在下で（３７℃）痕跡量の基質と混合した。その中にリボヌクレオチドが存在しないアンバーザイムは，表５６にに示される（リボ）数個のリボヌクレオチドが分子中に存在する酵素的核酸と比較して，０．１３のＫｒｅｌを有していた。このことは，アンバーザイム酵素的核酸分子は，活性のためには分子中に２’−ＯＨ基が存在することを必要としないことを示す。
【０５８１】
クラスＩＩ（チンザイム）酵素的核酸分子の基質認識ルール
クラスＩＩ（チンザイム）リボザイムを，バルジ切断部位Ｇのすぐ５’側および３’側に隣接した塩基の１６個の可能なすべての組み合わせを有する，塩基対形成した基質を切断するその能力について試験した。リボザイムは，その７塩基対結合アームの残りのすべての位置で同一であった。活性は，２時間および２４時間の時点で標準的な反応条件下［２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．４，１４０ｍＭ　ＫＣｌ，１０ｍＭ　ＮａＣｌ，１ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１ｍＭ　ＣａＣｌ２，３７℃］で評価した。図１９は，この実験の結果を示す。塩基対形成した基質ＵＧＧ（図に示さず）は，図に示されるＣＧＧと同程度にあまり切断しなかった。図は，切断部位の基質トリプレットを５’−３’方向で示し，２および２４時間の時点はそれぞれ上から下に示されている。結果は，切断部位のトリプレットは，５’−Ｙ−Ｇ−Ｈ−３’（式中，ＹはＣまたはＵであり，ＨはＡ，ＣまたはＵであり，切断はＧとＨとの間である）が最も活性が高いことを示す。しかし，活性は，ほとんどの対形成基質について特に２４時間の時点で検出される。切断トリプレットの外側のすべての位置は，任意の塩基対でよいことが見いだされた（データ示さず）。
【０５８２】
バルジ切断部位Ｇの５’側および３’側に隣接した可能なすべてのミスマッチ対を，５’−Ｃ−Ｇ−Ｃ−３’を切断するよう設計されたクラスＩＩリボザイムに対して試験した。５’側および３’側に隣接した部位は，Ｇ：Ｕの動揺対と同様に活性であることが認められた。さらに，５’側に隣接した部位は，ミスマッチに対して許容性であり，活性はわずかしか減少しなかった［データ示さず］。
【０５８３】
新規酵素的核酸分子モチーフ（クラスＩＩモチーフ）のスクリーニング
選択は，以下の配列の＞１０１４個の修飾ＲＮＡのプールから開始した：５’−ＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＵＧＣＣＵ（Ｎ）３５ＵＧＣＣＧＣＧＣＵＣＧＣＵＣＣＣＡＧＵＣＣ−３’。ＲＮＡは，Ｒｕｉ　Ｓｏｕｚａにより作成された変異体Ｔ７Ｙ６３９ＦＲＮＡポリメラーゼを用いて酵素的に生成した。以下の修飾ＮＴＰを取り込ませた：２’−デオキシ−２’−フルオロアデニン三リン酸，２’−デオキシ−２’−フルオロ−ウリジン三リン酸または２’−デオキシ−２’−フルオロ−５−［（Ｎ−イミダゾール−４アセチル）プロピルアミン］ウリジン三リン酸，および２’−デオキシ−２’−アミノ−シチジン三リン酸。プールＲＮＡを標識するためにアルファ−３２Ｐ　ＧＴＰを用いることができるように，すべての選択において天然のグアニジン三リン酸を用いた。ＲＮＡプールは，変性ゲル電気泳動，８％ポリアクリルアミド，７Ｍ尿素により精製した。
【０５８４】
以下の標的ＲＮＡ（樹脂Ａ）を合成し，供給元の方法によりヨードアセチルＵｌｔｒａｌｉｎｋ（登録商標）樹脂（Ｐｉｅｒｃｅ）に結合させた：５’−ｂ−Ｌ−ＧＧＡＣＵＧＧＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＧＣＧＣＡＧＧＣＡＣＵＧＡＡＧ−Ｌ−Ｓ−Ｂ−３’；ここでｂはビオチンであり（Ｇｌｅｎｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｃａｔ＃；１０−１９５３−ｎｎ），Ｌはポリエチレングリコールスペーサーであり（Ｇｌｅｎｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｃａｔ＃；１０−１９１８ｎｎ），Ｓはチオール修飾剤Ｃ６Ｓ−Ｓであり（Ｇｌｅｎｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｃａｔ＃；１０−１９３６−ｎｎ），Ｂは標準的な反転デオキシ無塩基である。
【０５８５】
ＲＮＡプールを，緩衝液Ａ（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．４，１４０ｍＭ　ＫＣＬ，１０ｍＭ　ＮａＣｌ）中の１００μｌの５μＭのＲｅｓｉｎＡ中に加え，２２℃で５分間インキュベートした。次に温度を３７℃に上昇させ１０分間インキュベートした。樹脂を５ｍｌの緩衝液Ａで洗浄した。反応は，緩衝液Ｂ（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．４，１４０ｍＭ　ＫＣＬ，１０ｍＭ　ＮａＣｌ，１ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１ｍＭ　ＣａＣｌ２）を加えることにより開始した。インキュベーションは，第１世代では２０分間行い，漸進的に減少させて，最後の世代では１分間行った。全体で１３世代を実施した。反応溶出液を５Ｍ　ＮａＣｌ中に回収して，最終濃度２Ｍ　ＮａＣｌとした。ここに，１００μｌの５０％スラリーＵｌｔｒａｌｉｎｋ　ＮｅｕｔｒａＡｖｉｄｉｎ（登録商標）（Ｐｉｅｒｃｅ）を加えた。２２℃で２０分間インキュベートすることにより，切断したビオチン生成物をアビジン樹脂に結合させた。次に樹脂を５ｍｌの２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，２Ｍ　ＮａＣｌで洗浄した。所望のＲＮＡは，１．２ｍｌの１Ｍ　ＮａＣｌ，１０Ｍ尿素，９４℃で１０分間の変性洗浄により除去した。ＲＮＡは，０．３Ｍ酢酸ナトリウムで２回沈澱させて，逆転写に阻害的なＣｌ−イオンを除いた。逆転写およびＰＣＲ増幅の標準的なプロトコルを実施した。ＲＮＡは再び，上述した修飾ＮＴＰで転写した。１３世代のクローニングおよび配列決定により，標的基質を切断しうる１４個の配列が得られた。６個の配列を特性決定して，二次構造および速度論的切断速度を決定した。構造および速度論的データは図１７に示される。８個の他の酵素的核酸分子配列の配列は表５７に示される。これらの分子のサイズ，配列および化学組成は，以下に記載されるように，または当該技術分野においてよく知られる手法を用いて修飾することができる。
【０５８６】
核酸触媒の工学処理
クラスＩおよびクラスＩＩ酵素的核酸分子の配列，化学的および構造的変種を工学的に操作し，本明細書に記載される技術および当該技術分野において知られる技術により再操作することができる。例えば，当該技術分野において知られる技術を用いて，リボザイムの全体的な触媒活性が有意に減少しない程度に，クラスＩおよびクラスＩＩ酵素的核酸分子のサイズを減少または増加させることができる（Ｚａｕｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２４，４２９；Ｒｕｆｆｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２９，１０６９５；Ｂｅａｕｄｒｙ　ｅｔ　ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２９，６５３４；ＭｃＣａｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，８９，５７１０；Ｌｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４，（上掲）；Ｈｅｎｄｒｙ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４，ＢＢＡ　１２１９，４０５；Ｂｅｎｓｅｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３，ＪＡＣＳ，１１５，８４８３；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，Ｍｉｃｈｅｌｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３４，２９６５；Ｂｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１，１１８４３；Ｇｕｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ．Ｊ．，１４，３６８；Ｐａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３３，９５６１；Ｃｅｃｈ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏ．，２，６０５；Ｓｕｇｉｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．，３９２，２１５；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，Ｓａｎｔｏｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，ＰＮＡＳ９４，４２６２；すべてその全体を本明細書の一部としてここに引用する）。
【０５８７】
本明細書に記載されるインビトロ選択戦略のさらなるラウンドおよびその変種を用いて，当業者は容易に追加の核酸触媒を進化させることができ，そのような新規な触媒も本発明の範囲内に含まれる。
【０５８８】
実施例１６：クラスＩＩ（チンザイム）核酸触媒がＨＥＲ２遺伝子発現を阻害する活性
本出願人は，ＨＥＲ２　ＲＮＡを標的とするいくつかのクラスＩＩ（チンザイム）リボザイムを設計し，合成し，細胞増殖においてＲＮＡ減少アッセイで試験した（例えば，表５８，５９，および６２を参照）。
【０５８９】
増殖アッセイ：
この実験において用いたモデル増殖アッセイは，９６−ウエルプレート中で２０００−１００００細胞／ウエルの細胞播種密度および５日の処理期間の間に少なくとも２回の細胞倍加を必要とする。増殖実験において用いた細胞は，ヒト乳癌または卵巣癌細胞（それぞれ，ＳＫＢＲ−３およびＳＫＯＶ−３細胞）のいずれかである。増殖アッセイ用に細胞密度を計算するために，当該技術分野においてよく知られるＦＩＰＳ（フルオロイメージングプロセシングシステム）方法を用いた。この方法により，核酸をＣｙＱｕａｎｔ（登録商標）染料で染色した後に細胞密度の測定が可能であり，９６−ウエルフォーマットで１，０００−１００，０００細胞／ウエルの非常に広い範囲にわたって細胞密度を正確に測定するという利点を有する。
【０５９０】
リボザイム（５０−２００ｎＭ）は，カチオン性脂質の存在下で２．０−５．０ｇ／ｍＬで輸送し，処理後第５日に増殖の阻害を測定した。２回の完全なリボザイムスクリーニングを完了して，１４のリボザイムを選択した。部位３１４（ＲＰＩ　Ｎｏ．１８６５３），４４３（ＲＰＩ　Ｎｏ．１８６８０），５９７（ＲＰＩ　Ｎｏ．１８６９７），６５９（ＲＰＩ　Ｎｏ．１８６８２），８７８（ＲＰＩ　Ｎｏｓ．１８６８３および１８６５４），８８１（ＲＰＩ　Ｎｏｓ．１８６８４および１８６８５）９３４（ＲＰＩ　Ｎｏ．１８６５１），９７２（ＲＰＩ　Ｎｏ．１８６５６，１９２９２，１９７２７，１９７２８，および１９２９３），１２９２（ＲＰＩ　Ｎｏ．１８７２６），１５４１（ＲＰＩ　Ｎｏ．１８６８７），２１１６（ＲＰＩ　Ｎｏ．１８７２９），２９３２（ＲＰＩ　Ｎｏ．１８６７８），２５４０（ＲＰＩ　Ｎｏ．１８７１５），および３５０４（ＲＰＩ　Ｎｏ．１８７１０）に対するクラスＩＩ（チンザイム）リボザイムは，スクランブル対照リボザイムと比較して２５−８０％の範囲の増殖の阻害を引き起こした。細胞培養アッセイからの結果の例が図２０に示される。図２０を参照すると，ＨＥＲ２　ＲＮＡを標的とするクラスＩＩリボザイムは，細胞の増殖の有意な阻害を引き起こすことが示される。このことは，リボザイム，例えばクラスＩＩ（チンザイム）リボザイムが，哺乳動物細胞においてＨＥＲ２遺伝子発現を阻害しうることを示す。
【０５９１】
ＲＮＡアッセイ：
ＲＮＡは，処理の２４時間後に，Ｑｉａｇｅｎ　ＲＮｅａｓｙ（登録商標）９６法を用いて回収した。精製したＲＮＡ試料について，標的ＨＥＲ２　ＲＮＡまたは対照のアクチンＲＮＡ（細胞播種または試料回収による差異を標準化するため）のいずれかに特異的な別々のプライマー／プローブの組を用いて，実時間ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ）を行った。結果は，処理後のＨＥＲ２対アクチンＲＮＡレベルの３回の測定の平均として示される。図３０は，部位９７２を標的とするクラスＩＩリボザイム（チンザイム）により媒介される，スクランブル化減弱化対照に対するＨＥＲ２　ＲＮＡの減少を示す。
【０５９２】
容量応答アッセイ：
活性なリボザイムを結合アーム減弱化対照（ＢＡＣ）リボザイムと混合して，１００，２００または４００ｎＭのいずれかの最終オリゴヌクレオチド濃度とし，５．０μｇ／ｍＬのカチオン性脂質の存在下で細胞に輸送した。活性なリボザイムおよびＢＡＣをこのように混合することにより，容量応答曲線全体を通して脂質対リボザイムの電荷比を一定に維持した。処理の２４時間後にＨＥＲ２　ＲＮＡの減少を測定し，処理の５日後に増殖の阻害を決定した。用量応答性の抗増殖の結果は図３１にまとめられており，ＨＥＲ２　ＲＮＡの用量依存性減少の結果は図３２にまとめられている。図３３は，ＨＥＲ２　ＲＮＡ（ＲＰＩ１９２９３）の部位９７２を標的とするクラスＩＩリボザイムの抗増殖およびＲＮＡ減少データを両方組み合わせた用量応答プロットを示す。
【０５９３】
実施例１７：クラスＩＩ（チンザイム）核酸触媒におけるリボース残基の減少
クラスＩＩ（チンザイム）核酸触媒を，リボヌクレオチド含有量の関数としてのその活性について試験した。Ｋ−Ｒａｓ部位５２１に対する，リボヌクレオチド残基を含まないチンザイム（すなわちヌクレオチド糖の２’位に，２’−ＯＨを含まない）を設計した。この分子を図２７ａに示される化学を用いて試験した。インビトロ触媒活性チンザイム構築物は有意に影響されなかった（切断速度はわずか１０倍しか低下しなかった）。
【０５９４】
図２７に示されるＫｒａｓチンザイムを生理学的緩衝液中で図２８の凡例に示される２価の濃度で（高ＮａＣｌは示される変更された１価条件である）試験した。１ｍＭＣａ＋＋条件では０．００５ｍｉｎ−１の速度が得られ，１ｍＭＭｇ＋＋条件では０．００２ｍｉｎ−１の速度が得られた。リボース含有野生型は０．０５ｍｉｎ−１の速度であり，基質はチンザイムの非存在下で，示される反応条件下では最長の時点で２％未満の分解を示した。このことは，リボース非含有触媒により良好な切断反応が得られたことを示す。リボヌクレオチド含有チンザイムと比較して切断はわずか１０倍減少したのみであり，非触媒的分解より非常に高かった。
【０５９５】
ＨＥＲ２部位９７２の状況において，クラスＩＩ（チンザイム）モチーフ中のリボース位置の役割をさらに詳細に調べた（本出願人は，さらに，図２７ｂに示されるように，ＨＥＲ２　ＲＮＡの部位９７２を標的とする完全に修飾されたチンザイムを設計した）。図２９は，試験した別のフォーマットおよびその触媒作用の相対速度の図解である。Ｋｒａｓ標的でアッセイしたとき，チンザイムのループ中でリボースＧの２’−Ｏ−メチル，Ｃ−２’−Ｏ−メチルＡによる置換の影響は有意ではなかったが（図３４を参照），ＨＥＲ２アッセイにおいては中程度の速度促進を示した。完全に安定化した”０リボース”（ＲＰＩ１９７２７）を含むすべてのチンザイムモチーフの活性は，バックグラウンドのノイズレベルの分解より十分に高かった。２つのリボース位置（ＲＰＩ１９２９３）のみを有するチンザイムが，”野生型”活性に復帰させるのに十分である。３（ＲＰＩ１９７２９），４（ＲＰＩ１９７３０）または５個のリボース（ＲＰＩ１９７３１）位置を含むモチーフは，非常に高い切断を示し，プロファイルは２リボースモチーフとほぼ同一であった。すなわち，本出願人は，いずれの位置にもリボヌクレオチドが存在しないチンザイムが有効なＲＮＡ切断活性を触媒しうることを示した。
【０５９６】
実施例１８：縮小リボース含有クラスＩＩ（チンザイム）核酸触媒がＨＥＲ２遺伝子発現を阻害する活性
ＨＥＲ２部位９７２を標的とする縮小リボクラスＩＩ（チンザイム）核酸触媒（５０−４００ｎＭ）を試験する細胞増殖アッセイを，実施例１９に記載のように実施した。この実験の結果は図３５にまとめられている。これらの結果は，２つのリボ（ＲＰＩ１９２９３）または１つのリボ（ＲＰＩ１９７２８）を含むかリボを含まない（ＲＰＩ１９７２７）核酸触媒を含む安定化クラスＩＩ（チンザイム）モチーフを用いてＨＥＲ２遺伝子発現が有意に阻害されたことを示す。
【０５９７】
用途
本明細書に記載されるＮＴＰの使用は，いくつかの研究および商業的用途を有する。これらの修飾ヌクレオチド三リン酸は，新規な機能を有するオリゴヌクレオチドのインビトロ選択（進化）に用いることができる。インビトロ選択プロトコルは，本明細書の一部としてここに引用する（Ｊｏｙｃｅ，１９８９，Ｇｅｎｅ，８２，８３−８７；Ｂｅａｕｄｒｙ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７，６３５−６４１；Ｊｏｙｃｅ，１９９２，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ２６７，９０−９７；Ｂｒｅａｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４，ＴＩＢ　ＴＥＣＨ　１２，２６８；Ｂａｒｔｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１：１４１１−１４１８；Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９３，ＴＩＢＳ１７，８９−９３；Ｋｕｍａｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５，ＦＡＳＥＢＪ．，９，１１８３；Ｂｒｅａｋｅｒ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７，４４２）。
【０５９８】
さらに，これらの修飾ヌクレオチド三リン酸を用いて，修飾オリゴヌクレオチドコンビナトリアル化学ライブラリを生成することができる。この技術に関していくつかの参考文献が存在する（Ｂｒｅｎｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，ＰＮＡＳ８９，５３８１−５３８３，Ｅａｔｏｎ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１，１０−１６，これらはすべて本明細書の一部としてここに引用する）。
【０５９９】
診断用途
本発明の核酸分子を診断手段として使用し，疾病に罹患した細胞内の遺伝的浮動および変異を検査するか，または細胞において特定のＲＮＡの存在を検出することができる。例えば，酵素的核酸分子活性と標的ＲＮＡの構造との間の密接な関係により，分子のいずれの領域においても，標的ＲＮＡの塩基対形成および３次元構造を変更する変異を検出することができる。本発明に記載される酵素的核酸分子を複数使用することにより，インビトロならびに細胞および組織におけるＲＮＡの構造および機能に重要なヌクレオチド変化をマッピングすることができる。酵素的核酸分子による標的ＲＮＡの切断を使用して，遺伝子の発現を阻害し，疾病の進行における特定の遺伝子産物の役割を（本質的に）明らかにすることができる。このようにして，他の遺伝子標的を疾病の重要な介在物として明らかにすることができる。これらの実験は，組み合わせ療法の可能性を提供することにより，疾病進行のよりよい治療につながるであろう（例えば，異なる遺伝子を標的とする多数の酵素的核酸分子，既知の小分子阻害剤とカップリングさせた酵素的核酸分子，酵素的核酸分子および／または他の化学的または生物学的分子と組み合わせた放射性または間欠的治療）。本発明の酵素的核酸分子の他のインビトロにおける使用は当該技術分野においてよく知られており，これには，関連する状態に関係するｍＲＮＡの存在の検出が含まれる。そのようなＲＮＡは，標準的な方法論を使用して酵素的核酸分子で処理した後，切断産物の存在を判定することにより検出する。
【０６００】
特定の例においては，標的ＲＮＡの野生型または変異型のみしか切断できない酵素的核酸分子をアッセイに使用する。第１の酵素的核酸分子を用いて試料中の野生型ＲＮＡの存在を同定し，第２の酵素的核酸分子を用いて試料中の変異型ＲＮＡを同定する。反応対照として野生型および変異型の両方のＲＮＡの合成基質を両方の酵素的核酸分子で切断し，反応における酵素的核酸分子の相対効率および“非標的”ＲＮＡ種を切断しないことを明らかにする。合成基質からの切断産物は，試料集団中の野生型および変異型ＲＮＡの分析のためのサイズマーカーの生成にも役立つ。従ってそれぞれの分析は２つの酵素的核酸分子，２つの基質，および１つの未知の試料を必要とし，これらを組み合わせて６つの反応を行う。切断産物の存在をＲＮａｓｅ保護アッセイを使用して確認し，各ＲＮＡの完全長および切断フラグメントをポリアクリルアミドゲルの１レーンで分析できるようにする。標的細胞における変異体ＲＮＡの発現および所望の表現型の変化の推定されるリスクへの洞察を得るために，必ずしも結果を定量する必要はない。その蛋白質産物が表現型の発生に関与することが示唆されるｍＲＮＡの発現はリスクを確立するのに十分である。同等の比活性のプローブを両方の転写産物に使用すれば，ＲＮＡレベルの定性的比較で十分であり，初期の診断のコストが低減する。ＲＮＡレベルを定性的に比較するにしても定量的に比較するにしても，より高い変異型と野生型の比率はより高いリスクと相関関係があるであろう。
【０６０１】
さらなる用途
本発明の配列特異的酵素的核酸分子の潜在的な有用性は，ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼがＤＮＡの研究のために有するもの同様の多くの適用をＲＮＡの研究のために有する（Ｎａｔｈａｎｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９７５　Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４：２７３）。例えば，制限フラグメントのパターンを使用して２つの関連するＲＮＡ間の配列の関係を確立することができ，大型のＲＮＡを研究のためにより有用なサイズのフラグメントに特異的に切断することができる。酵素的核酸分子の配列特異性を操作できることは未知の配列のＲＮＡの切断に理想的である。出願人は，細菌，微生物，真菌，ウイルス，および真核生物系，例えば植物または哺乳動物細胞において，標的遺伝子の遺伝子発現をダウンレギュレートするために核酸分子を用いることを記載する。
【０６０２】
本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は，本発明の属する技術分野の技術者のレベルを示す。本明細書において引用されるすべての参考文献は，それぞれの参考文献が個々にその全体が本明細書の一部としてここに引用されることと同じ程度に，本明細書の一部として引用される。
【０６０３】
当業者は，本発明が，その目的を実施し，記載される結果および利点，ならびに本明細書に固有のものを得るためによく適合していることを容易に理解するであろう。本明細書に記載される方法および組成物は，現在のところ好ましい態様の代表的なものであり，例示的なものであって，本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は，特許請求の範囲において定義される本発明の精神の中に包含される変更および他の用途をなすであろう。
【０６０４】
当業者は，本発明の範囲および精神から逸脱することなく，本明細書に開示される本発明に対して種々の置換および改変をなすことが可能であることを容易に理解するであろう。すなわち，そのような追加の態様は，本発明および特許請求の範囲の範囲内である。
【０６０５】
本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されていない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち，例えば，本明細書における各例において，”・・・を含む”，”・・・から本質的になる”および”・・・からなる”との用語は，他の２つのいずれかと置き換えることができる。本明細書において用いられる用語および表現は，説明の用語として用いるものであり，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては，示されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図するものではなく，特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能であることが理解される。すなわち，好ましい態様および任意の特徴により本発明を特定的に開示してきたが，当業者には本明細書に記載される概念の変更および変種が可能であり，そのような変更および変種も特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【０６０６】
さらに，発明の特徴および観点がマーカッシュグループまたは他の代替グループの用語で記載されている場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループまたは他のグループの個々のメンバーまたはサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。
【０６０７】
従って他の態様も本発明および特許請求の範囲の範囲内である。
【０６０８】
表１
天然に存在するリボザイムの特徴
グループＩイントロン
・サイズ：約１５０〜１０００以上のヌクレオチド。
・標的配列中の切断部位の５’側に隣接してＵを必要とする。
・切断部位の５’側で４〜６のヌクレオチドと結合する。
・反応メカニズム：グアノシンの３’−ＯＨによって攻撃し，３’−ＯＨおよび５’グアノシンを有する切断産物を生成する。
・活性構造の折り畳みおよび維持を助けるために，場合により，蛋白質の補因子をさらに必要とする。
・このクラスには３００以上の種類が知られている。テトラヒメナ・サーモフィラのｒＲＮＡ，真菌ミトコンドリア，葉緑体，ファージＴ４，らん藻類，その他において，介在配列として見出されている。
・主要な構造上の特徴は，系統発生比較，突然変異原性および生化学的研究によってほぼ確立されている［１，２］。
・１つのリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが立証されている［３，４，５，６］。
・リボザイムの折り畳みおよび基質ドッキングに関する研究が進行中［７，８，９］。
・重要な残基の化学修飾検討は十分確立されている［１０，１１］。
・このリボザイムは，結合部位が小さい（４〜６ヌクレオチド）ため，標的ＲＮＡ切断に対して非常に非特異的になる場合があるが，テトラヒメナのグループＩイントロンは，「欠損」β−ガラクトシダーゼのメッセージに新たなβ−ガラクシダーゼ配列を結合することによってこのメッセージを修復するのに利用されている［１２］。
【０６０９】
ＲＮａｓｅＰ　ＲＮＡ（Ｍ１ＲＮＡ）
・サイズ：約２９０〜４００のヌクレオチド。
・偏在するリボ核蛋白質酵素のＲＮＡ部分。
・ｔＲＮＡ前駆体を切断し，成熟ｔＲＮＡを形成する［１３］。
・反応メカニズム：恐らくはＭ２＋−ＯＨによって攻撃し，３’−ＯＨおよび５’リン酸を有する切断産物を生成する。
・ＲＮａｓｅＰは原核生物および真核生物全体に見出されている。このＲＮＡサブユニットは，細菌，酵母，げっ歯類および霊長類から配列決定されている。
・外部ガイド配列（ＥＧＳ）と標的ＲＮＡのハイブリダイゼーションによって，内因性ＲＮａｓｅＰを治療応用に活用することが可能である［１４，１５］。
・リン酸と２’ＯＨとの接触の重要性が最近判明した［１６，１７］。
【０６１０】
グループＩＩイントロン
・サイズ：１０００以上のヌクレオチド。
・標的ＲＮＡのトランス切断であることが最近実証された［１８，１９］。
・配列要求性は完全には決定されていない。
・反応メカニズム：内部アデノシンの２’−ＯＨが３’−ＯＨ，および３’−５’および２’−５’分岐点を含む「ラリアット（ｌａｒｉａｔ）」ＲＮＡを有する切断産物を生成する。
・ＲＮＡの切断および結合に加えて，ＤＮＡ切断への関与が実証された［２０，２１］唯一の天然リボザイムである。
・主要な構造上の特徴は，系統発生比較によってほぼ確立されている［２２］。
・２’ＯＨ接触の重要性が判明しはじめている［２３］。
・力学的フレームワークは検討中である［２４］。
【０６１１】
Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ＶＳ　ＲＮＡ
・サイズ：約１４４ヌクレオチド。
・ヘアピン標的ＲＮＡのトランス切断であることが最近実証された［２５］。
・配列要求性は完全には決定されていない。
・反応メカニズム：２’−ＯＨが切れやすい結合の５’側を攻撃し，２’，３’−サイクリックリン酸および５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する。
・結合部位および構造上の要求性は完全には決定されていない。
・このクラスは１種しか知られていない。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ＶＳ　ＲＮＡに見出されている。
【０６１２】
ハンマーヘッド・リボザイム（本文を参照のこと）
・サイズ：約１３〜４０ヌクレオチド。
・切断部位の５’に隣接した標的配列ＵＨを必要とする。
・切断部位の両側で可変数のヌクレオチドと結合する。
・反応メカニズム：２’−ＯＨによって切れやすい結合の５’側を攻撃し，２’，３’−サイクリックリン酸および５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する。
・このクラスには１４種が知られている。ＲＮＡを感染体として利用する多くの植物病原体（ウィルソイド）において見出されている。
・２つの結晶構造を含め，本質的な構造上の特徴がほぼ明確にされている。［２６，２７］
・（インビトロ選択による工学的処理に対し）ごくわずかなライゲーション活性が実証された。［２８］
・２つまたはそれ以上のリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが確立されている。［２９］
・重要な残基の化学修飾検討は十分確立されている。［３０］
【０６１３】
ヘアピンリボザイム
・サイズ：約５０ヌクレオチド。
・切断部位の３’に隣接した標的配列ＧＵＣを必要とする。
・切断部位の５’側で４〜６のヌクレオチドと，切断部位の３’側で可変数のヌクレオチドと結合する。
・反応メカニズム：２’−ＯＨによって切れやすい結合の５’側を攻撃し，２’，３’−サイクリックリン酸および５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する。
・このクラスには３種が知られている。ＲＮＡを感染体として利用する３種の植物病原体（タバコ・リングスポット・ウィルス，アラビス・モザイク・ウィルスおよびチコリー黄色斑ウィルスのサテライトＲＮＡ）に見出されている。
・本質的な構造上の特徴がほぼ明確にされている［３１，３２，３３，３４］。
・（切断活性に加えて）ライゲーション活性があるためにこのリボザイムはインビトロ選択による工学処理が可能である［３５］。
【０６１４】
・１つのリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが確立されている［３６］。
・重要な残基の化学修飾検討が着手された［３７，３８］。
【０６１５】
デルタ肝炎ウィルス（ＨＤＶ）リボザイム
・サイズ：約６０ヌクレオチド。
・標的ＲＮＡのトランス切断であることが実証されている［３９］。
・結合部位および構造上の要求性は完全には決定されていないが，切断部位の５’側の配列は要求されない。折りたたまれたリボザイムはシュードノット構造を含む［４１］。
・反応メカニズム：２’−ＯＨによって切れやすい結合の５’側を攻撃し，２’，３’−サイクリックリン酸および５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する。
・このクラスは２種しか知られていない。ヒトＨＤＶに見出されている。
・環状のＨＤＶは活性があり，ヌクレアーゼ安定性が増加している［４２］。
【０６１６】
【表１】
2004512810.tif 000008
【０６１７】
【表２】
2004512810.tif 000009
【０６１８】
【表３】
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【１０５１】
【表４３６】
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【１０５２】
【表４３７】
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【１０５３】
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【１０５４】
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【１０５５】
【表４４０】
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【表４４１】
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【１０５７】
【表４４２】
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【表４４３】
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【１０５９】
【表４４４】
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【１０６０】
【表４４５】
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【１０６１】
【表４４６】
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【１０６２】
【表４４７】
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【表４４８】
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【表４４９】
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【表４５０】
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【表４５１】
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【表４５２】
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【表４５３】
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【１０６９】
【表４５４】
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【１０７０】
【表４５５】
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【表４５６】
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【表４６４】
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【１０８０】
【表４６５】
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【表４６６】
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【１０８２】
【表４６７】
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【表４６８】
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【１０８４】
【表４６９】
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【１０８５】
【表４７０】
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【１０８６】
【表４７１】
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【１０８７】
【表４７２】
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【１０８８】
【表４７３】
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【１０８９】
【表４７４】
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【１０９０】
【表４７５】
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【表４７６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は，７つの異なる種類の酵素的核酸分子の二次構造モデルを示す。
【図２】図２は，化学的に安定化されたリボザイムモチーフの例を示す。
【図３】図３は，化学的に安定化されたアンバーザイムリボザイムモチーフの例を示す。
【図４】図４は，化学的に安定化されたチンザイムＡリボザイムモチーフの例を示す。
【図５】図５は，ＤＮＡｚｙｍｅモチーフの例を示す。
【図６】図６は，当該技術分野において知られるハンマーヘッドリボザイムモチーフおよびＮＣＨモチーフの概略図である。
【図７】図７は，化学的に安定化されたリボザイムモチーフの例を示す。
【図８】図８は，ＨＥＲ２／ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２遺伝子を標的とするＮＣＨおよびＨＨリボザイムにより媒介される細胞増殖の阻害を示すデータをグラフ表示したものである。
【図９】図９は，ベータ−Ｄ−キシロフラノシルヒポキサンチン３’−ホスホルアミダイトの合成方法の概略図である。
【図１０】図１０は，ヌクレオシド基質を用いるＮＴＰ合成の概略図を示す。
【図１１】図１１は，インビトロ選択方法のスキームを示す。
【図１２】図１２は，２カラムインビトロ選択方法のスキームを示す。
【図１３】図１３は，本明細書において記載されるインビトロ方法を用いて同定された新規な４８ヌクレオチドの酵素的核酸モチーフの図解である。
【図１４】図１４は，クラスＩ酵素的核酸分子モチーフの有効性を示すために用いられたＨＣＶルシフェラーゼアッセイの概略図である。
【図１５】図１５は，ＨＣＶ　ＲＮＡの部位１４６を標的とする酵素的核酸分子の用量曲線を示すグラフである。
【図１６】図１６は，ＨＣＶ　ＲＮＡ中の４つの部位を標的とする酵素的核酸分子が細胞においてＲＮＡレベルを減少させることができることを示す棒グラフである。
【図１７】図１７は，特性決定されたクラスＩＩ酵素的核酸モチーフの二次構造および切断速度を示す。
【図１８】図１８は，本明細書に記載されるインビトロ方法を用いて同定された新規な３５ヌクレオチドの酵素的核酸モチーフの図解である。
【図１９】図１９は，クラスＩＩ（チンザイム）リボザイムの基質特異性を示す棒グラフである。
【図２０】図２０は，細胞増殖スクリーニングにおける，ＨＥＲ２　ＲＮＡ中の１０個の代表的な部位を標的とするクラスＩＩ酵素的核酸分子を示す棒グラフである。
【図２１】図２１は，５−［３アミノプロピニル（プロピル）］ウリジン５’−三リン酸および４−イミダゾール酢酸コンジュゲートの合成の概略を示す合成スキームである。
【図２２】図２２は，５−［３−（Ｎ−４−イミダゾールアセチル）アミノプロピニル（プロピル）］ウリジン５’−三リン酸の合成の概略を示す合成スキームである。
【図２３】図２３は，カルボキシレートテザー付きウリジン５’−三リン酸の合成の概略を示す合成スキームである。
【図２４】図２４は，５−（３−アミノアルキル）および５−［３−（Ｎ−スクシニル）アミノプロピル］官能化シチジンの合成の概略を示す合成スキームである。
【図２５】図２５は，クラスＩリボザイムのステム切断型およびループ置換分析の図解である。
【図２６】図２６は，切断型ステムおよび／またはループ構造において用いられる非ヌクレオチドリンカーを有するクラスＩリボザイムの図解である。
【図２７】図２７は，”リボなし”クラスＩＩリボザイムの図解である。
【図２８】図２８は，クラスＩＩリボザイムを用いる種々の二価金属の濃度における切断反応を示すグラフである。
【図２９】図２９は，種々のリボ含量を有する様々なクラスＩＩリボザイムおよびこれらの触媒作用の相対速度の図解である。
【図３０】図３０は，ＳＫＢＲ３乳癌腫細胞におけるＨＥＲ２　ＲＮＡのクラスＩＩリボザイム（チンザイム）媒介性減少を示すグラフである。
【図３１】図３１は，ＳＫＢＲ３乳癌腫細胞におけるクラスＩＩリボザイム（チンザイム）に媒介される用量応答抗増殖アッセイを示すグラフである。
【図３２】図３２は，０−１００ｎＭのＲＰＩ１９２９３および５．０μｇ／ｍｌのカチオン性脂質で処理したＳＫＯＶ−３細胞におけるＨＥＲ２　ＲＮＡの用量依存的減少を示すグラフである。
【図３３】図３３は，０−４００ｎＭのＲＰＩ１９２９３および５．０μｇ／ｍｌのカチオン性脂質で処理したＳＫＢＲ−３細胞におけるＨＥＲ２　ＲＮＡの用量依存的減少および細胞増殖の阻害を示すグラフである。
【図３４】図３４は，クラスＩＩ（チンザイム）モチーフ中でリボＧを２’−Ｏ−メチル５’−ＣＡ−３’で置換する非限定的例を示す。
【図３５】図３５は，ＨＥＲ２　ＲＮＡの部位９７２を標的とする，リボ−Ｇの減少を含むクラスＩＩリボザイム（チンザイム）の，ＳＫＢＲ３細胞における抗増殖活性についてのスクリーニングを示すグラフである。
【図３６】図３６は，ＮＣＨリボザイムモチーフの種々のヌクレオシド類似体の活性を試験した官能基修飾実験の結果をまとめたものである。
【図３７】図３７は，ＮＵＨ切断リボザイムの状況においてＡ１５．１残基において行った官能基修飾実験の報告をまとめたものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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