(57)【要約】本発明は、異なった位置に注目の遺伝子の少なくとも１つのコピーをすでに含んで成る、細菌宿主株染色体における条件付きで必須の遺伝子に隣接する、十分に定義された位置中への相同組換えによる注目の遺伝子の複数コピーを組み込む問題を解決する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色体中の異なった位置に安定して組み込まれる注目の遺伝子の少なくとも２つのコピーを含んで成る細胞を構成するための方法であって、　ａ）注目の遺伝子の少なくとも１つの染色体コピーを含み且つ遺伝子を非機能的にするために変更されている１又は複数の条件付きで必須の染色体遺伝子を含む宿主細胞を供給し；
ｂ）ｉ）段階ａ）の条件付で必須の遺伝子の変更された非機能的
コピー、及び
ｉｉ）上記 ｉ）を１つの側に有し、そして段階ａ）の遺伝子に隣接する宿主細胞染色体に位置する宿主細胞ＤＮＡ配列に対して相同のＤＮＡフラグメントを他の側に有する注目の遺伝子の少なくとも１つのコピー、
を含んで成るＤＮＡ構造体を供給し；ここで前記ｉ）の変更されたコピーと前記段階ａ）の変更された染色体遺伝子との間の第１の組換えが前記条件付きで必須の染色体遺伝子を機能的に戻し、そして前記細胞を選択性にし；
ｃ）前記宿主細胞中に前記のＤＮＡ構造体を導入し、そして前記細胞を、条件付きで必須の機能的遺伝子を必要とする選択的条件下で培養し；そして
ｄ）前記段階の選択的条件下で増殖する宿主細胞を選択し；ここで前記注目の遺伝子の少なくとも１つのコピーが段階ａ）の遺伝子に隣接する宿主細胞染色体中に組み込まれており；そして任意には、
ｅ）個々の反復において、段階ａ）における異なった染色体遺伝子を用いて少なくとも１度、段階ａ）〜ｄ）を反復する；
ことを含んで成る方法。
【請求項２】
染色体中の異なった位置に安定して組み込まれる注目の遺伝子の少なくとも２つのコピーを含んで成る細胞を構成するための方法であって、
ａ）注目の遺伝子の少なくとも１つの染色体コピーを含んで成る宿主細胞を供給し；
ｂ）前記宿主細胞の条件付で必須の染色体遺伝子を変更し、それにより前記遺伝子が非機能的になり；
ｃ）ｉ）段階ｂ）の染色体遺伝子の変更された非機能的
コピー、及び
ｉｉ）上記 ｉ）を１つの側に有し、そして段階ｂ）の遺伝子に隣接する宿主細胞ＤＮＡ配列に対して相同のＤＮＡフラグメントを他の側に有する注目の遺伝子の少なくとも１つのコピー、
を含んで成るＤＮＡ構造体を製造し；ここで前記ｉ）の変更されたコピーと前記段階ｂ）の変更された染色体遺伝子との間の第１の組換えが前記条件付きで必須の染色体遺伝子を機能的に戻し、そして前記細胞を選択性にし；
ｄ）前記宿主細胞中に前記のＤＮＡ構造体を導入し、そして前記細胞を、段階ｂ）の機能的遺伝子を必要とする選択的条件下で培養し；そして
ｅ）段階ｄ）の選択的条件下で増殖する宿主細胞を選択し；ここで前記注目の遺伝子の少なくとも１つのコピーが段階ｂ）の遺伝子に隣接する宿主細胞染色体中に組み込まれており；そして任意には、
ｆ）個々の反復において、段階ｂ）における異なった染色体遺伝子を用いて少なくとも１度、段階ａ）〜ｅ）を反復する；
ことを含んで成る方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ構造体を導入し、そして選択的条件下で前記細胞を培養する段階に続いて、又は宿主細胞を選択する段階に続いて、第２の組換えが前記ＤＮＡフラグメントと前記相同宿主細胞ＤＮＡ配列との間で起こる、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡ構造体がさらに、第２の組換えにより染色体から組換えられるように、前記構造体に位置する少なくとも１つのマーカー遺伝子を含んで成る、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つのマーカー遺伝子が、好ましくはクロラムフェニコール、カナマイシン、アンピシリン、エリトロマイシン、スペクチノマイシン及びテトラサイクリンから成る群から選択された抗生物質に対する耐性を付与する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記選択的条件下で増殖し、そして染色体に前記少なくとも１つのマーカー遺伝子を含まない宿主細胞が選択される、請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡ構造体がさらに、前記変更されたコピーとＤＮＡフラグメントとの間に位置する少なくとも１つのマーカー遺伝子を含んで成り、そして前記少なくとも１つのマーカー遺伝子が特定のレゾルバーゼにより認識されるヌクレオチド配列を端に有し、好ましくは前記ヌクレオチド配列がｒｅｓである、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つのマーカー遺伝子が、選択的条件下で増殖する宿主細胞の選択に続いて、レゾルバーゼ酵素の作用により染色体から切除される請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記注目の遺伝子が前記宿主細胞に起因する請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記注目の遺伝子が、酵素、好ましくはデンプ分解酵素、脂肪分解酵素、タンパク質分解酵素、セルロース分解酵素、オキシドレダクターゼ又は植物細胞壁分解酵素、及びより好ましくは、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カルボヒドロラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、ガラクトシダーゼ、β−ガラクロシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ヘミセルラーゼ、インバーターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、フェノールオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼから成る群から選択された活性を有する酵素をコードする請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
選択的条件下で増殖する前記選択された宿主細胞は、実質的に外因性ＤＮＡを含まず、好ましくは注目の組み込まれる遺伝子当たり５００以下の塩基対、より好ましくは３００個以下のｂｐ、さらにより好ましくは１００個以下のｂｐ、さらにより好ましくは５０個以下のｂｐ、より好ましくは２５個以下のｂｐ、又は最も好ましくは外因性ＤＮＡを含まない請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
選択条件下で増殖する前記選択された宿主細胞が、内因性起源のみのＤＮＡを含んで成る請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記宿主細胞の条件付に必須の染色体遺伝子が、前記遺伝子を部分的に欠失することによって、又は前記遺伝子に１又は複数の突然変異を導入することによって変更される請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、Ｄ−アラニンラセマーゼをコードし、好ましくは前記遺伝子はバチルス細胞からのｄａｌ相同体であり、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのｄａｌに相同であり、そして最も好ましくは、前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスのｄａｌ遺伝子である請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、Ｄ−アラニンラセマーゼをコードし、そして配列番号１２における位置１３０３〜２４６９に示されるバチルス・リケニホルミスのｄａｌ配列に対して、少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９５％及び最も好ましくは少なくとも９７％同一である請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、１種の特定の主要炭素源のみにより補充された最少培地上での前記宿主細胞の増殖のために必要とされる１又は複数の遺伝子である請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、キシロースオペロンのものであり、好ましくは前記遺伝子はバチルス・サブチリスからのｘｙｌＡ遺伝子に相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスのキシロースイソメラーゼオペロンの１又は複数の遺伝子に相同である請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、ガラクトキナーゼ（ＥＣ２． ７． １． ６）、ＵＴＰ−依存性ピロホスホリラーゼ（ＥＣ２． ７． ７． １０）、ＵＤＰ−グルコース−依存性ウリジルイルトランスフェラーゼ（ＥＣ２． ７． ７． １２）又はＵＤＰ−ガラクトースエピメラーゼ（ＥＣ５． １． ２． ３）をコードし、好ましくは前記遺伝子はＵＤＰ−ガラクトースエピメラーゼ（ＥＣ５． １． ２． ３）をコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルスのｇａｌＥに相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスのｇａｌＥである請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、グルコネートオペロンの１又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はグルコネートキナーゼ（ＥＣ２． ７． １． １２）又はグルコネートペルミアーゼ、又は両者をコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのｇｎｔｋ又はｇｎｔＰ遺伝子に対して相同の１又は複数の遺伝子であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスからのｇｎｔＫ又はｇｎｔＰ遺伝子である請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、グルコネートオペロンの１又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はグルコネートキナーゼ（ＥＣ２． ７． １． １２）又はグルコネートペルミアーゼ、又は両者をコードし、そしてバチルス・リケニホルミスのｇｎｔＫ及びｇｎｔＰのいずれかに対して、少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９５％及び最も好ましくは少なくとも９７％同一である請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、グリセロールオペロンの１又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はグリセロール摂取促進体（ペルミアーゼ）、グリセロールキナーゼ又はグリセロールデヒドログナーゼをコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのｇｌｐＰ， ｇｌｐＦ， ｇｌｐＫ及びｇｌｐＤ遺伝子に対して相同の１又は複数の遺伝子であり、そして最も好まくは前記遺伝子は配列番号２６で示されるバチルス・リケニルホルミスからのｇｌｐＰ， ｇｌｐＦ， ｇｌｐＫ及びｇｌｐＤ遺伝子の１又は複数の遺伝子である請求項１６記載の方法。
【請求項２２】
変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、グリセロールオペロンの１又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はグリセロール摂取促進体（ペルミアーゼ）、グリセロールキナーゼ又はグリセロールデヒドログナーゼをコードし、そして配列番号２６で示されるバチルス・リケニホルミスのｇｌｐＰ， ｇｌｐＦ， ｇｌｐＫ及びｇｌｐＤ配列のいずれかに対して、少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９５％及び最も好ましくは少なくとも９７％同一である請求項１６記載の方法。
【請求項２３】
変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、アラビノースオペロンの１又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はアラビノースイソメラーゼをコードし、より好ましくは前記遺伝子は、バチルス・スブチリスからのａｒａＡ遺伝子に対して相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子は配列番号３８で示されるバチルス・リケニホルミスからのａｒａＡ遺伝子である請求項１６記載の方法。
【請求項２４】
変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、アラビノースオペロンの１又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はアラビノースイソメラーゼをコードし、そして配列番号３８で示されるバチルス・リケニホルミスのａｒａＡ配列に対して、少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９５％及び最も好ましくは少なくとも９７％同一である請求項１６記載の方法。
【請求項２５】
前記宿主細胞の条件付で必須の染色体遺伝子が、アミノ酸合成に関与する１又は複数のポリペプチドをコードし、そして前記遺伝子の非機能性が細胞を１又は複数のアミノ酸のために栄養要求性にし、そして前記遺伝子の機能性の回復が前記細胞を前記アミノ酸のため原栄養性にする請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
前記宿主細胞の条件付きで必須の染色体遺伝子が、リシン又はメチオニン合成に関与する１又は複数のポリペプチドをコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのｍｅｔＣ又はｌｙｓＡ遺伝子に対して相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスからのｍｅｔＣ又はｌｙｓＡ遺伝子である請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記宿主細胞の条件付きで必須の染色体遺伝子が、配列番号４２で示されるバチルス・リケニホルミスのｍｅｔＣ配列、又は配列番号４８で示されるバチルス・リケニホルミスのｌｙｓＡ配列に対して、少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９５％、及び最も好ましくは少なくとも９７％同一である請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記宿主細胞が、グラム陽性細菌細胞、好ましくはバチルス細胞及び最も好ましくは、バチルス・アルカロフィラス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・サーキュランス、バチルス・クラウジ、バチルス・コアギランス、バチルス・ラクタス、バチルス・レンタス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・スブチリス及びバチルス・スリンギエンシスから成る群から選択されたバチルス細胞である請求項１〜２７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
前記ＤＮＡ構造体がプラスミドである請求項１〜２８のいずれか１項記載の方法。
【請求項３０】
ｉ）宿主細胞からの条件付きで必須の染色体遺伝子の変更された非機能的コピー、好ましくは部分的に欠失されたコピー；及び
ｉｉ）上記ｉ）を１つの側に有し、そしてｉ）の条件付きで必須の遺伝子に隣接する宿主細胞染色体に位置する宿主細胞ＤＮＡ配列に対して相同のＤＮＡフラグメントを他の側に有する注目の遺伝子の少なくとも１つのコピーを含んで成るＤＮＡ構造体。
【請求項３１】
ｉ）において変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、Ｄ−アラニンラセマーゼをコードし、好ましくは前記遺伝子はバチルス細胞からのｄａｌ相同体であり、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのｄａｌに相同であり、そして最も好ましくは、前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスのｄａｌ遺伝子である請求項３０記載のＤＮＡ構造体。
【請求項３２】
ｉ）において変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、Ｄ−アラニンラセマーゼをコードし、そして配列番号１２における位置１３０３〜２４６９に示されるバチルス・リケニホルミスのｄａｌ配列に対して、少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９５％及び最も好ましくは少なくとも９７％同一である請求項３０記載のＤＮＡ構造体。
【請求項３３】
宿主細胞からの条件付きに必須の染色体遺伝子の変更された非機能的コピーが、１種の特定の主要炭素源のみにより補充された最少培地上での前記宿主細胞の増殖のために必要とされる１又は複数の遺伝子である請求項３０記載のＤＮＡ構造体。
【請求項３４】
条件付きに必須の染色体遺伝子が、キシロースオペロンの１又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はバチルス・サブチリスからのｘｙｌＡ遺伝子に相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスのキシロースイソメラーゼオペロンの１又は複数の遺伝子に相同である請求項３３記載のＤＮＡ構造体。
【請求項３５】
条件付きに必須の染色体遺伝子が、ガラクトキナーゼ（ＥＣ２． ７． １． ６）、ＵＴＰ−依存性ピロホスホリラーゼ（ＥＣ２． ７． ７． １０）、ＵＤＰ−グルコース−依存性ウリジルイルトランスフェラーゼ（ＥＣ２． ７． ７． １２）又はＵＤＰ−ガラクトースエピメラーゼ（ＥＣ５． １． ２． ３）をコードし、好ましくは前記遺伝子はＵＤＰ−ガラクトースエピメラーゼ（ＥＣ５． １． ２． ３）をコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルスのｇａｌＥに相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスのｇａｌＥである請求項３３記載のＤＮＡ構造体。
【請求項３６】
条件付きに必須の染色体遺伝子が、グルコネートオペロンの１又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はグルコネートキナーゼ（ＥＣ２． ７． １． １２）又はグルコネートペルミアーゼ、又は両者をコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのｇｎｔｋ又はｇｎｔＰ遺伝子に対して相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスからのｇｎｔＫ又はｇｎｔＰの１又は複数の遺伝子である請求項３３記載のＤＮＡ構造体。
【請求項３７】
条件付きに必須の染色体遺伝子が、グリセロールオペロンの１又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はグリセロール摂取促進体（ペルミアーゼ）、グリセロールキナーゼ又はグリセロールデヒドログナーゼをコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのｇｌｐＰ， ｇｌｐＦ， ｇｌｐＫ及びｇｌｐＤ遺伝子にに対して相同の１又は複数の遺伝子であり、そして最も好まくは前記遺伝子は配列番号２６で示されるバチルス・リケニルホルミスからのｇｌｐＰ， ｇｌｐＦ， ｇｌｐＫ及びｇｌｐＤ遺伝子の１又は複数の遺伝子である請求項３３記載のＤＮＡ構造体。
【請求項３８】
条件付きに必須の染色体遺伝子が、グリセロールオペロンの１又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はグリセロール摂取促進体（ペルミアーゼ）、グリセロールキナーゼ又はグリセロールデヒドログナーゼをコードし、そして配列番号２６で示されるバチルス・リケニホルミスのｇｌｐＰ， ｇｌｐＦ， ｇｌｐＫ及びｇｌｐＤ配列のいずれかに対して、少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９５％及び最も好ましくは少なくとも９７％同一である請求項３３記載のＤＮＡ構造体。
【請求項３９】
条件付きに必須の染色体遺伝子が、アラビノースオペロンの１又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はアラビノースイソメラーゼをコードし、より好ましくは前記遺伝子は、バチルス・スブチリスからのａｒａＡ遺伝子に対して相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子は配列番号３８で示されるバチルス・リケニホルミスからのａｒａＡ遺伝子である請求項３３記載のＤＮＡ構造体。
【請求項４０】
条件付きに必須の染色体遺伝子が、アラビノースオペロンの１又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はアラビノースイソメラーゼをコードし、そして配列番号３８で示されるバチルス・リケニホルミスのａｒａＡ配列に対して、少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９５％及び最も好ましくは少なくとも９７％同一である請求項３３記載のＤＮＡ構造体。
【請求項４１】
条件付で必須の染色体遺伝子が、アミノ酸合成に関与する１又は複数のポリペプチドをコードし、そして前記遺伝子の非機能性が、遺伝子の他の機能的コピーを有さない細胞に存在する場合、細胞を１又は複数のアミノ酸のために栄養要求性にし、そして前記遺伝子の機能性の回復が前記細胞を前記アミノ酸のため原栄養性にする請求項３３記載のＤＮＡ構造体。
【請求項４２】
条件付きで必須の染色体遺伝子が、リシン又はメチオニン合成に関与する１又は複数のポリペプチドをコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのｍｅｔＣ又はｌｙｓＡ遺伝子に対して相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスからのｍｅｔＣ又はｌｙｓＡ遺伝子である請求項４１記載のＤＮＡ構造体。
【請求項４３】
条件付きで必須の染色体遺伝子が、配列番号４２で示されるバチルス・リケニホルミスのｍｅｔＣ配列、又は配列番号４８で示されるバチルス・リケニホルミスのｌｙｓＡ配列に対して、少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９５％、及び最も好ましくは少なくとも９７％同一である請求項４１記載のＤＮＡ構造体。
【請求項４４】
染色体中に安定して組み込まれる注目の遺伝子の少なくとも２個のコピーを含んで成る宿主細胞であって、少なくとも１つのコピーが条件付で必須の遺伝子座に隣接して組み込まれ、そして前記細胞が請求項１〜２９のいずれか１項記載の方法により得ることができる宿主細胞。
【請求項４５】
前記注目の遺伝子が、前記条件付きで必須の遺伝子座から、１０００個以下の塩基対、好ましくは７５０個の以下の塩基対、より好ましくは５００個以下の塩基対、さらにより好ましくは２５０個以下の塩基対、及び最も好ましくは１００個以下の塩基対、分離される請求項４４記載の細胞。
【請求項４６】
実質的に外因性ＤＮＡを含まず、好ましくは興味ある組み込まれる遺伝子当たり５００個以下の塩基対、より好ましくは３００以下のｂｐ、さらにより好ましくは１００以下のｂｐ、さらにより好ましくは５０個以下のｂｐを含み、又は最も好ましくは外因性ＤＮＡを含まない請求項４４又は４５記載の細胞。
【請求項４７】
内因性ＤＮＡのみを含む請求項４４又は４５記載の細胞。
【請求項４８】
前記宿主細胞が、グラム陽性細菌細胞、好ましくはバチルス細胞及び最も好ましくは、バチルス・アルカロフィラス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・サーキュランス、バチルス・クラウジ、バチルス・コアギランス、バチルス・ラクタス、バチルス・レンタス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・スブチリス及びバチルス・スリンギエンシスから成る群から選択されたバチルス細胞である請求項４４〜４７のいずれか１項記載の細胞。
【請求項４９】
注目の遺伝子のコピーが、Ｄ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子、好ましくはバチルス・スブチリスからのｄａｌ遺伝子に相同の遺伝子、より好ましくは配列番号１２における位置１３０３〜２４６９に示されるバチルス・リケニホルミスのｄａｌ配列に対して少なくとも７５％同一である遺伝子、さらにより好ましくは、配列番号１２における位置１３０３〜２４６９に示されるバチルス・リケニホルミスのｄａｌ配列に対して少なくとも９５％及び最も好ましくは少なくとも９７％同一である請求項４４〜４８のいずれか１項記載の細胞。
【請求項５０】
注目の遺伝子のコピーが、１種の特定の主要炭素源のみにより補充された最少培地上での前記宿主細胞の増殖のために必要とされる遺伝子に隣接して組み込まれる請求項４４〜４９のいずれか１項記載の細胞。
【請求項５１】
注目の遺伝子のコピーが、キシロースオペロンの遺伝子に隣接して、好ましくはバチルス・スブチリスからのｘｙｌＲ又はｘｙｌＡ遺伝子に相同の遺伝子に隣接して、及び最も好ましくは、バチルス・リケニホルミスからのｘｙｌＲ又はｘｙｌＡに隣接して組み込まれる請求項５０記載の細胞。
【請求項５２】
注目の遺伝子のコピーが、ガラクトキナーゼ（ＥＣ２． ７． １． ６）、ＵＴＰ−依存性ピロホスホリラーゼ（ＥＣ２． ７． ７． １０）、ＵＤＰ−グルコース−依存性ウリジルイルトランスフェラーゼ（ＥＣ２． ７． ７． １２）又はＵＤＰ−ガラクトースエピメラーゼ（ＥＣ５． １． ２． ３）をコードする遺伝子、好ましくは前記遺伝子はＵＤＰ−ガラクトースエピメラーゼ（ＥＣ５． １． ２． ３）をコードする遺伝子、より好ましくは前記遺伝子はバチルスのｇａｌＥに相同である遺伝子、そして最も好ましくはバチルス・リケニホルミスのｇａｌＥに隣接して組み込まれる請求項５０記載の細胞。
【請求項５３】
注目の遺伝子のコピーが、グルコネートオペロンの遺伝子に隣接して、好ましくはグルコネートキナーゼ（ＥＣ２． ７． １． １２）又はグルコネートペルミアーゼをコードする遺伝子に隣接して、より好ましくはｇｎｔＲ， ｇｎｔＫ， ｇｎｔｐ及びｇｎｔＺから成る群から選択されたバチルス・スブチリス遺伝子に相同の遺伝子に隣接して、及び最も好ましくはバチルス・リケニホルミスからのｇｎｔＲ， ｇｎｔＫ， ｇｎｔＰ又はｇｎｔＺに隣接して組み込まれる請求項５０記載の細胞。
【請求項５４】
注目の遺伝子のコピーが、グリセロールオペロンの１又は複数の遺伝子、好ましくは前記遺伝子はグリセロール摂取促進体（ペルミアーゼ）、グリセロールキナーゼ又はグリセロールデヒドログナーゼをコードする遺伝子、より好ましくはバチルス・スブチリスからのｇｌｐＰ， ｇｌｐＦ， ｇｌｐＫ及びｇｌｐＤ遺伝子に対して相同の遺伝子、及び最も好まくは配列番号２６で示されるバチルス・リケニルホルミスからのｇｌｐＰ， ｇｌｐＦ， ｇｌｐＫ及びｇｌｐＤ遺伝子に隣接して組み込まれる請求項５０記載の細胞。
【請求項５５】
注目の遺伝子のコピーが、アラビノースオペロンの遺伝子であり、好ましくはアラビノースイソメラーゼをコードする遺伝子に隣接して組み込まれ、より好ましくは前記遺伝子は、バチルス・スブチリスからのａｒａＡ遺伝子に対して相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子は配列番号３８で示されるバチルス・リケニホルミスからのａｒａＡ遺伝子である請求項５０記載の細胞。
【請求項５６】
注目の遺伝子のコピーが、アミノ酸合成に関与する１又は複数のポリペプチドをコードする遺伝子に隣接して組み込まれ、そして前記遺伝子の非機能性が細胞を１又は複数のアミノ酸のために栄養要求性にし、そして前記遺伝子の機能性の回復が前記細胞を前記アミノ酸のため原栄養性にする請求項４４〜５０のいずれか１項記載の細胞。
【請求項５７】
注目の遺伝子のコピーが、リシン又はメチオニン合成に関与する１又は複数のポリペプチドをコードする遺伝子に隣接して組み込まれ、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのｍｅｔＣ又はｌｙｓＡ遺伝子に対して相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスからのｍｅｔＣ又はｌｙｓＡ遺伝子である請求項５６記載の細胞。
【請求項５８】
注目の遺伝子のコピーが、配列番号４２で示されるバチルス・リケニホルミスのｍｅｔＣ配列、又は配列番号４８で示されるバチルス・リケニホルミスのｌｙｓＡ配列に対して、少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９５％、及び最も好ましくは少なくとも９７％同一である遺伝子に隣接して組み込まれる請求項５６記載の細胞。
【請求項５９】
前記注目の遺伝子が、酵素、好ましくはデンプ分解酵素、脂肪分解酵素、タンパク質分解酵素、セルロース分解酵素、オキシドレダクターゼ又は植物細胞壁分解酵素、及びより好ましくは、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カルボヒドロラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、ガラクトシダーゼ、β−ガラクロシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ヘミセルラーゼ、インバーターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、フェノールオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼから成る群から選択された活性を有する酵素をコードする請求項４４〜５８のいずれか１項記載の細胞。
【請求項６０】
注目の遺伝子が、抗微生物ペプチド、好ましくは抗真菌ペプチド又は抗菌ペプチドをコードする請求項４４〜５８のいずれか１項記載の細胞。
【請求項６１】
前記注目の遺伝子が、ヒト身体において生物学的活性を有するペプチド、好ましくは医薬的活性ペプチド、より好ましくはインスリン／プロ−インスリン／プレ−プロ−インスリン又はそれらの変異体、成長ホルモン又はその変異体、又は血液凝固因子ＶＩＩ又はＶＩＩＩ又はそれらの変異体をコードする請求項４４〜５８のいずれか１項記載の細胞。
【請求項６２】
抗生物質マーカーが存在しない請求項４４〜６１のいずれか１項記載の細胞。
【請求項６３】
少なくとも２種の条件付きに必須の遺伝子が非機能的にされ、好ましくは前記遺伝子がｘｙｌＡ， ｇａｌＥ， ｇｎｔＫ， ｇｎｔＰ， ｇｌｐＰ， ｇｌｐＦ， ｇｌｐＫ， ｇｌｐＤ， ａｒａＡ， ｍｅｔＣ， ｌｙｓＡ及びｄａｌから成る群から選択されるバチルス・リケニホルミス細胞。
【請求項６４】
請求項１〜２９のいずれか１項記載の方法への請求項６３記載の細胞の使用。
【請求項６５】
請求項３０〜４５のいずれか１項記載のＤＮＡ構造体を含んで成る細胞。
【請求項６６】
注目の酵素の生成方法であって、請求項４４〜６２のいずれか１項記載の細胞を、前記酵素を生成するために適切な条件下で培養し、そして任意には、前記酵素を精製することを含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、細菌株の染色体中に遺伝子を挿入するための方法、及びその得られる菌株に関する。バイオテク産業においては、菌株に耐抗生物質性マーカー遺伝子を残さないで、安定して染色体に組み込まれる注目の遺伝子のいくつかのコピーを有するポリペプチド生成株を構成することが所望される。
【０００２】
発明の背景：
ポリペプチドの産業的生成においては、生成物収率をできるだけ高く達成することが注目の対象である。収率を高めるための１つの手段は、注目のポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を高めることである。これは、高いコピー数プラスミド上に遺伝子を配置することによって行われ得るが、しかしながらプラスミドは不安定性であり、そしてしばしば、宿主細胞の培養の間、選択的アッセイが存在しない場合、宿主細胞から失われる。注目の遺伝子のコピー数を高めるためのもう１つの手段は、それを宿主細胞染色体中に複数コピーで組み込むことである。抗生物質マーカーを用いないで、二重相同組換えにより染色体中に遺伝子をいかにして組み込むかはこれまで記載されており（Ｈｏｎｅなど．， Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ １９８８， ５： ４０７−４１８）；２種の遺伝子の組み込みもまた記載されている（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ： ＷＯ９１／０９１２９号及びＷＯ９４／１４９６８号）。
【０００３】
宿主細胞の染色体への遺伝子のいくつかのコピーの組み込みに関する問題は、不安定性である。選択マーカー又は他の必須ＤＮＡがコピー間に含まれず、そして選択圧力が培養の間、適用されない場合、特に遺伝子がお互い相対的に隣接して位置する場合、コピーの配列同一性のために、宿主細胞の培養の間、コピー及び再び染色体から組換えする高い傾向が存在する。より良好な安定性を達成するために、逆平行の一列に並んで、密接した間隔で存在する２種の遺伝子をいかにして組み込むかは記載されている（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ： ＷＯ９９／４１３５８号）。
【０００４】
組換えＤＮＡ技法の産業的使用に関する今日の公的データベースはいくつかの問題、及び抗生物質マーカー遺伝子の使用についての関心を提供して来た。抗生物質マーカー遺伝子が、マーカー遺伝子、及び産業的興味のポリペプチドをコードする付随する発現カセットの両者の複数コピーを担持する株を選択するための手段として従来使用されている。抗生物質マーカーを欠いている組換え生成宿主株のための現在の要求を満たすためには、非抗生物質マーカー遺伝子による、今日使用されている抗生物質マーカーの置換を可能にするであろう、現在の技法に代わる可能な技法を見出す必要がある。従って、抗生物質耐性マーカーを欠いている組換え生成株を供給するためには、宿主細胞染色体中に遺伝子を複数コピーで安定して組み込むための新規方法を見出すことが、産業的に興味あることである。
【０００５】
発明の要約：
本発明は、異なった位置に注目の遺伝子の少なくとも１つのコピーをすでに含む細菌宿主株の十分に定義された染色体位置中に、相同組換えにより注目の遺伝子の複数コピーを組み込むことの問題を解決する。これは、注目の遺伝子の少なくとも１つのコピーをすでに含む株の宿主染色体において１又は複数の条件付きで必須の遺伝子（この後、“組み込み遺伝子”と称する）の一部の欠失を行うことによって、又は他方では、遺伝子を非機能的にするためにそれを変更することによって；又は得られる株が欠失（例えば、特異的炭素源利用）、又は増殖必要条件（例えば、アミノ酸栄養要求性）を有するか、又は所定のストレスに対して敏感であるよう、宿主染色体中に少なくとも１つの一部の非機能的な、条件付で必須の遺伝子を組み込むことによって行われ得る。
【０００６】
次に、注目の遺伝子の次の（すなわち、第２又は第３、等）コピーが、ベクター上に導入され、ここで前記遺伝子は、組み込み遺伝子の部分フラグメントをその上流端に有し、そして下流端には、宿主染色体上の組み込み遺伝子の下流のＤＮＡ配列に対して相同のフラグメントを有する。従って、宿主染色体も入って来るベクターのいずれも、組み込み遺伝子の完全なバージョンを含まない。非制限的な例においては、宿主染色体は、組み込み遺伝子の最初の２／３を含み、そしてベクターは最後の２／３を含むことができ、ベクター及び染色体上で組み込み遺伝子の１／３の配列オーバーラップを効果的に確立する。
【０００７】
組み込み遺伝子の完全なバーションの発現は、ベクターと宿主染色体との間の相同組換えが一部の組み込み遺伝子配列を通して起こる場合、単に発生し、そしてこの特定の組換え現象は、すでに染色体上に含まれる同一の遺伝子中に注目の遺伝子により向けられる染色体中への相同組み込みバックグラウンドに対してさえ、効果的に選択され得る。
【０００８】
この方法は、拡張された相同性が入って来るベクター上の注目の遺伝子と染色体における他の位置でのこの遺伝子の他のコピーとの間に存在したとしても、そして注目の遺伝子が宿主において１又は複数のコピーにすでに存在する場合、この遺伝子の発現に起因する定性的な表現型に基づいて所望する組み込み体を同定することが実施できないとしても、方向づけられた遺伝子組み込みを予定された遺伝子座での相同組換えにより可能にするであろう。
【０００９】
本明細書における非制限的な例においては、市販のアミラーゼＴｅｒｍａｍｙｌ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ， Ｄｅｎｍａｒｋ）をコードする遺伝子の２個の逆平行コピー（逆転された配向）を含んで成るバチルス酵素生成株が供給される。Ｄ−アラニンラセマーゼをコードする、バチルス・スブチリスのｄａｌ遺伝子に相同の遺伝子がバチルス生成株において同定され、それが配列決定され、そして部分的欠失がバチルス２−コピーＴｅｒｍａｍｙｌ（商標）株のｄａｌ遺伝子において行われた。上記方法に従って、安全なｄａｌ遺伝子を効果的に戻す方法において、ｄａｌ遺伝子座に隣接する第３のＴｅｒｍａｍｙｌ（商標）遺伝子コピーの安定した非タンデム染色体挿入をもたらすベクターが構成された。
【００１０】
本明細書におけるもう１つの非制限的な例においては、アミラーゼコードの遺伝子の追加のコピーが、染色体上の他の場所に位置するアミラーゼ遺伝子の少なくとも第２のコピーをすでに含んでいるバチルス酵素生成株のキシロースイソメラーゼオペロン中に導入された。
また非制限的な例においては、本発明者は、バチルス酵素生成株のグルコネートオペロン中に追加のアミラーゼコードの遺伝子を組み込むことによって本発明の方法を示す。条件付で必須の遺伝子中への組み込みの他の非制限的例が下記に与えられる。
【００１１】
従って、第１の観点においては、本発明は、染色体中の異なった位置に安定して組み込まれる注目の遺伝子の少なくとも２つのコピーを含んで成る細胞を構成するための方法に関し、ここで前記方法は、
ａ）注目の遺伝子の少なくとも１つの染色体コピーを含み、且つ遺伝子を非機能的にするために変更されている１又は複数の条件付きで必須の染色体遺伝子を含む宿主細胞を供給し；
ｂ）ｉ）段階ａ）の条件付で必須の遺伝子の変更された非機能的
コピー、及び
ｉｉ） 上記ｉ）を１つの側に有し、そして段階ａ）の遺伝子に隣接する宿主細胞染色体に位置する宿主細胞ＤＮＡ配列に対して相同のＤＮＡフラグメントを他の側に有する注目の遺伝子の少なくとも１つのコピー、
を含んで成るＤＮＡ構造体を供給し；ここで前記ｉ）の変更されたコピーと前記段階ａ）の変更された染色体遺伝子との間の第１の組換えが前記条件付きで必須の染色体遺伝子を機能的に戻し、そして前記細胞を選択性にし；
ｃ）前記宿主細胞中に前記のＤＮＡ構造体を導入し、そして前記細胞を、条件付きで必須の機能的遺伝子を必要とする選択的条件下で培養し；そして
ｄ）前記段階の選択的条件下で増殖する宿主細胞を選択し；ここで前記注目の遺伝子の少なくとも１つのコピーが段階ａ）の遺伝子に隣接する宿主細胞染色体中に組み込まれており；そして任意には、
ｅ）個々の反復において、段階ａ）における異なった染色体遺伝子を用いて少なくとも１度、段階ａ）〜ｄ）を反復する；
ことを含んで成る。
【００１２】
本発明の第１の観点を記載するもう１つの手段は、染色体中の異なった位置に安定して組み込まれる注目の遺伝子の少なくとも２つのコピーを含んで成る細胞を構成するための方法に関し、ここで前記方法は、
ａ）注目の遺伝子の少なくとも１つの染色体コピーを含んで成る宿主細胞を供給し；
ｂ）前記宿主細胞の条件付で必須の染色体遺伝子を変更し、それにより前記遺伝子が非機能的になり；
ｃ）ｉ）段階ｂ）の染色体遺伝子の変更された非機能的
コピー、及び
ｉｉ） 上記ｉ）を１つの側に有し、そして段階ｂ）の遺伝子に隣接する宿主細胞ＤＮＡ配列に対して相同のＤＮＡフラグメントを他の側に有する注目の遺伝子の少なくとも１つのコピー、
を含んで成るＤＮＡ構造体を製造し；ここでｉ）の変更されたコピーと段階ｂ）の変更された染色体遺伝子との間の第１の組換えが前記条件付きで必須の染色体遺伝子を機能的に戻し、そして前記細胞を選択性にし；
ｄ）前記宿主細胞中に前記のＤＮＡ構造体を導入し、そして前記細胞を、段階ｂ）の機能的遺伝子を必要とする選択的条件下で培養し；そして
ｅ）段階ｄ）の選択的条件下で増殖する宿主細胞を選択し；ここで前記注目の遺伝子の少なくとも１つのコピーが段階ｂ）の遺伝子に隣接する宿主細胞染色体中に組み込まれており；そして任意には、
ｆ）個々の反復において、段階ｂ）における異なった染色体遺伝子を用いて少なくとも１度、段階ａ）〜ｅ）を反復する；
段階を含んで成る。
【００１３】
本明細書における遺伝的手段はまた、本発明の方法を実施するために必要なＤＮＡ構造体の形で記載される。
従って、第２野観点においては、本発明は、
ｉ）宿主細胞からの条件付きで必須の染色体遺伝子の変更された非機能的コピー、好ましくは部分的に欠失されたコピー；及び
ｉｉ）上記ｉ）を１つの側に有し、そしてｉ）の条件付きで必須の遺伝子に隣接する宿主細胞染色体に位置する宿主細胞ＤＮＡ配列に対して相同のＤＮＡフラグメントを他の側に有する注目の遺伝子の少なくとも１つのコピー、
を含んで成るＤＮＡ構造体に関する。
【００１４】
本発明は、条件付で必須の遺伝子座に隣接して染色体上に安定して組み込まれる注目の遺伝子の少なくとも２つのコピーを含んで成る宿主細胞を得るための方法を提供する。
従って、第３の観点においては、本発明は、染色体中に安定して組み込まれる注目の遺伝子の少なくとも２つのコピーを含んで成る宿主細胞に関し、ここで少なくとも１つのコピーが条件付で必須の遺伝子座に隣接して組み込まれ、そして前記細胞は第１の観点で定義される方法のいずれかにより得られる。
【００１５】
本発明の観点を記載するもう１つの手段は、染色体中に安定して組み込まれる注目の遺伝子の少なくとも２つのコピーを含んで成る宿主細胞に関し、ここで個々のコピーは条件付で必須の異なった遺伝子座に隣接して組み込まれ、そして前記細胞は第１の観点に定義される方法のいずれかにより得られる。
本発明の方法は、非機能にされた、条件付で必須の遺伝子の補充に依存し、そしてそのような非機能的遺伝子を含んで成る多くの適切な宿主細胞は本明細書に記載されている。本発明の複数回の遺伝子組み込みを実施するためには、いくつかの非機能的な、条件付で必須の遺伝子を含んで成る宿主細胞を供給することが好都合である。
【００１６】
第４の観点においては、本発明は、バチルス・リケニホルミスに関し、ここで少なくとも２種の条件付きに必須の遺伝子が非機能的にされ、好ましくは前記遺伝子がｘｙｌＡ， ｇａｌＥ， ｇｎｔＫ， ｇｎｔＰ， ｇｌｐＰ， ｇｌｐＦ， ｇｌｐＫ， ｇｌｐＤ， ａｒａＡ， ｍｅｔＣ， ｌｙｓＡ及びｄａｌから成る群から選択される。
本発明の方法に使用するための、本明細書に記載されるような宿主細胞は、本発明の範囲により包含される予定である。
本発明のもう１つの観点は、前記第１の観点に定義されるような方法への前記観点に定義されるような細胞の使用に関する。
【００１７】
上記で言及されるように、本発明の遺伝的手段が、本明細書に記載され、そして本発明の範囲は、当業界において通常であるように、宿主細胞に存在するが又はそこにおいて増殖される場合、そのような構造体を含んで成る。
本発明のさらにもう１つの観点は、前記第２の観点において定義されるようなＤＮＡ構造体を含んで成る細胞に関する。
最終の観点においては、本発明は、前記観点のいずれかに定義されるような細胞を、酵素を生成するために適切な条件下で培養し、そして任意には、前記酵素を精製することを含んで成る、興味ある酵素を生成するための方法に関する。
【００１８】
定義：
本発明によれば、従来の分子生物学、微生物学、及び当業者の範囲内の組換えＤＮＡ技法が使用され得る。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （ｈｅｒｅｉｎ “Ｓａｍｂｒｏｏｋ など．， １９８９”） ＤＮＡ Ｖｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ／Ｄ．Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ． １９８５）； Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｅｓｉｓ （Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｔ ｅｄ． １９８４）； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ （Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ （１９８５））； Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ （Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ， ｅｄｓ． （１９８４））； Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ （Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｄ． （１９８６））； Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， （１９８６））； Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８４） を参照のこと。
【００１９】
“ポリヌクレオチド”は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーであり、前記ポリヌクレオチドの配列は、前記ポリマーの５’末端から３’末端に読み取られる塩基の実際の配列である。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ及びＤＮＡを包含し、そして天然源から単離され、インビトロで合成され、又は天然及び合成分子の組合せから調製され得る。
【００２０】
“核酸分子”、又は“ヌクレオチド配列”とは、一本鎖形又は二本鎖ヘリックスのいずれかでのリボヌクレオチド（アデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジン；“ＲＮＡ分子”）又はデオキシリボヌクレオチド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン又はデオキシシチジン；“ＤＮＡ分子”）のリン酸エステルポリマー形を言及する。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡヘリックスが可能である。
【００２１】
用語、核酸分子及び特にＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、分子の一次及び二次構造のみを言及し、そしてそれを、いずれかの特定の三次又は四次形に制限しない。従って、この用語は、中でも、線状又は環状ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、プラスミド及び染色体に見出される二本鎖ＤＮＡを包含する。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を論じる場合、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡに対して相同の配列を有する鎖）にそって、５’側から３’側の方向に配列を単に供給する通常の慣例に従って本明細書に記載され得る。“組換えＤＮＡ分子”は、分子生物学的操作をうけたＤＮＡ分子である。
【００２２】
ＤＮＡ“コード配列”又は“読み取り枠（ＯＲＦ）”は、適切な調節配列の制御下に置かれる場合、インビトロ又はインビボで細胞において転写され、そしてポリペプチド翻訳される二本鎖のＤＮＡ配列である。ＯＲＦは、ポリペプチドを“コードする”。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端での開始コドン及び３’（カルボキシル）末端での翻訳停止コドンにより決定される。コード配列は、原核配列、真核ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核（例えば、哺乳類）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列及び合成ＤＮＡ配列を包含するが、但しそれらだけには限定されない。コード配列が真核細胞における発現のために意図される場合、ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列は、通常３’コード配列に位置するであろう。
【００２３】
発現ベクターは、その転写を提供する追加のセグメントに操作可能的に連結される興味あるポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る、直鎖又は環状ＤＮＡ分子である。そのような追加のセグメントは、プロモーター及びターミネーター配列、及び任意には１又は複数の複製起点、１又は複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル及び同様のものを包含するであろう。発現ベクターは一般的に、プラスミド又はウィルスＤＮＡに起因し、又は両要素を含むことができる。
【００２４】
転写及び翻訳制御配列は、宿主、例えば真核細胞においてコード配列の発現を提供する、ＤＮＡ調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター及び同様のものであり、ポリアデニル化シグナルは制御配列である。
“分泌シグナル配列”は、それが合成される細胞の分泌経路を通して、より大きなポリペプチドの成分として、その大きなポリペプチドを方向づけるポリペプチド（“分泌ペプチド”）をコードするＤＮＡ配列である。前記大きなポリペプチドは、分泌経路を通して、遷移の間、分泌ペプチドを除去するために切断される。
【００２５】
用語“プロモーター”とは、ＲＮＡポリメラーゼの結合、及び転写プロモーターの開始を提供するＲＮＡ配列を含む遺伝子の部分を示すためのその技術的に認識される手段のために本明細書において使用される。プロモーター配列は通常、遺伝子の５’側の非コード領域に見出されるが、但し必ずしもそうではない。
染色体遺伝子は、その遺伝子がコードするポリペプチドが機能的形でもはや発現され得ない場合、“非機能的”にされる。遺伝子のそのような非機能性は、当業界において知られている広範囲の種類の遺伝子操作又は変更により誘発され得、それらのいくつかは、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど． （上記）に記載されている。遺伝子のＯＲＦ内の部分的欠失はしばしば、突然変異、例えば置換、挿入、フレームシフト、等のように、遺伝子を非機能的にするであろう。
【００２６】
“操作可能的に連結される”とは、ＤＮＡセグメントを言及する場合、そのＤＮＡセグメントが、それらが協力して機能し、例えば転写工程が、プロモーターセグメントへのＲＮＡ−ポリメラーゼ結合を通して起こり、そしてポリメラーゼが、転写ターミネーターセグメントに遭遇する場合、停止するまで、前記コードセグメントを通して転写を続行するよう整列されることを示す。
本明細書においては、宿主細胞における“異種”ＤＮＡとは、前記細胞に起因しない外因性ＤＮＡを言及する。
【００２７】
本明細書において使用される場合、用語“核酸構造体”とは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又はＲＮＡ起源のいずれかの核酸分子を示すことを意図する。用語“構造体”とは、一本鎖又は二本鎖であり得、そして興味あるポリペプチドをコードする、完全な又は部分的な天然に存在するヌクレオチド配列に基づかれ得る核酸セグメントを示すことを意図する。構造体は任意には、他の核酸セグメントを含むことができる。
【００２８】
本発明のポリペプチドをコードする本発明の核酸構造体は、適切には、ゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを調製し、そして標準の技法（Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．， 前記）に従って、合成オリゴヌクレオチドプローブを用いてのハイブリダイゼーションにより、ポリペプチドのすべて又は一部をコードするＤＮＡ配列についてスクリーニングすることによって得られるゲノム又はｃＤＮＡ起源のものであり得る。
【００２９】
前記ポリペプチドをコードする本発明の核酸構造体はまた、確立された標準の方法、例えばＢｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２ （１９８１）， １８５９−１８６９により記載されるホスホアミジット方法、又はＭａｔｔｈｅｓなど．， ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ３ （１９８４）， ８０１−８０５により記載される方法により合成的に調製され得る。ホスホアミジット方法によれば、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成機により合成され、精製され、アニーリングされ、連結され、そして適切なベクターによりクローン化される。
【００３０】
さらに、核酸構造体は、標準の技法に従って、合成、ゲノム又はｃＤＮＡ起源（適切な場合）のフラグメント（完全な核酸構造体の種々の部分に対応する）を連結することによって調製される、混合された合成及びゲノム、混合された合成及びｃＤＮＡ、又は混合されたゲノム及びｃＤＮＡ起源のものであり得る。核酸構造体はまた、例えばアメリカ特許第４，６８３，２０２号又はＳａｉｋｉなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９ （１９８８） ４８７−４９） に記載のように、特定のプライマーを用いてのポリメラーゼ鎖反応により調製され得る。
用語“核酸構造体”は、核酸構造体が本発明のコード配列の発現のために必要な制御配列を含む場合、用語“発現カセット”と同じ意味である。
【００３１】
用語“制御配列”とは、核酸配列のコード配列の発現のために必要であるか、又はそのために好都合であるすべての成分を包含するよう定義される。個々の制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して生来であっても又は外来性であっても良い。そのような制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーターシグナル配列、及び転写ターミネーターを包含するが、但しそれらだけには限定されない。最少で、制御配列は、プロモーター、及び転写及び翻訳停止シグナルを包含する。制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域と制御配列との連結を促進する特定の制限部位を導入するためにリンカーを提供され得る。
【００３２】
制御配列は、適切なプロモーター配列、すなわち核酸配列の発現のために宿主細胞により認識される核酸配列であり得る。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を仲介する転写及び翻訳制御配列を含む。プロモーターは、選択の宿主菌細胞において転写活性を示すいずれかの核酸配列であり得、そして宿主細胞に対して相同であるか又は異種である細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。
【００３３】
制御配列はまた、適切な転写ターミネーター配列、すなわち転写を終結するよう宿主細胞により認識される配列でもあり得る。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’側末端に操作可能的に連結される。選択の宿主細胞において機能的であるいずれかのターミネーターが、本発明において使用され得る。
制御配列はまた、ポリアデニル化配列、すなわち核酸配列の３’末端に操作可能的に連結され、そして転写される場合、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するためにシグナルとして宿主細胞により認識される配列であり得る。選択の宿主細胞において機能するいずれかのポリアデニル化配列が、本発明において使用され得る。
【００３４】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に連結されるアミノ酸配列をコードし、そしてそのコードされたポリペプチドを宿主細胞の分泌路中に方向づけるシグナルペプチドコード領域でもあり得る。核酸配列のコード配列の５’側末端は、本来、分泌されたポロペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳読み取り枠を整合して、天然において連結されるシグナルペプチドコード領域を含むことができる。他方では、コード配列の５’側末端は、分泌されたポリペプチドをコードするそのコード配列に対して外来性であるシグナルペプチドコード領域を含むことができる。
【００３５】
通常、そのコード配列がシグナルペプチドコード領域を含まない外来性シグナルペプチドコード領域が必要とされる。他方では、外来性シグナルペプチドコード領域は、コード配列に通常関連する天然のシグナルペプチドコード領域に対して、ポリペプチドの増強された分泌を得るために、天然のシグナルペプチドコード領域を単純に置換することができる。シグナルペプチドコード領域は、アスペルギラス種からのグルコアミラーゼ又はアミラーゼ遺伝子、リゾムコル種からのリパーゼ又はプロテイナーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシアエからのα−因子のための遺伝子、バチルス種からのアミラーゼ又はプロテアーゼ、又はウシプロプレキモシン遺伝子から得られ得る。しかしながら選択の宿主細胞の分泌路中に発現されたポリペプチドを方向づけるいずれかのシグナルペプチドコード領域が、本発明に使用され得る。
【００３６】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端で位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域であり得る。得られるポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（又は多くの場合、チモーゲン）として知られている。プロポリペプチドは一般的に不活性であり、そしてプロポリペプチドからプロペプチドの触媒又は自己触媒分解により成熟した活性ポリペプチドに転換され得る。プロペプチドコード領域は、バチルス・スブチリスアルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｐｒＥ）、バチルス・スブチリス中性プロテアーゼ遺伝子（ｎｐｒＴ）、サッカロミセス・セレビシアエα−因子遺伝子、又はミセリオプソラ・サーモフィリア　ラッカーゼ遺伝子から得られる（ＷＯ９５／３３８３６号）。
【００３７】
宿主細胞の増殖に関して、ポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を付加することがまた所望される。調節システムの例は、調節化合物の存在を包含する、化学的又は物理的刺激に応答して、遺伝子の発現の開始又は停止を引き起こすそれらのシステムである。原核生物系における調節システムは、ｌａｃ， ｔａｃ及びｔｒｐオペレーターシステムお包含する。調節配列の他の列は、遺伝子増幅を可能にするそれらの配列である。真核システムにおいては、それらはメトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、及び重金属と共に増幅されるメタロチオネイン遺伝子を包含する。それらの場合、ポリペプチドをコードする核酸配列が、調節配列によりタンデムに配置される。
【００３８】
特に細胞宿主細胞において本発明の核酸構造体の転写を方向づけるための適切なプロモーターの例は、Ｅ．コリｌａｃオペロン、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｌバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトゲン性アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｇｕｅｆａｃｉｅｎｓ） α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、
【００３９】
バチルス・アミロリケファシエンスＢＡＮ ＡＭＹＬＡＳＥ ＧＥＮＥ（ａｍｙＭ）、バチルス・リケニホルミスペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルス・サブチリスｘｙｌＡ及びｚｙｌＢ遺伝子及び原生動物のβ−ラクタマーゼ遺伝子から得られるプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆなど．， １９７８， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ７５： ３７２７−３７３１）、及びｔａｃ プロモーター（Ｄｅ Ｂｏｅｒ など．， １９８３， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＵＳＡ ８０： ２１−２５）である。さらなるプロモーターは、“Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ” ｉｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ， １９８０， ２４２： ７４−９４； 及びＳａｍｂｒｏｏｋなど．， １９８９， 前記に記載される。
【００４０】
本発明はまた、本発明の核酸配列、プロモーター、及び転写及び翻訳停止シグナルを含んで成る組換え発現ベクターにも関する。上記に記載される種々の核酸及び制御配列が、そのような部位でポリペプチドをコードする核酸配列の挿入又は置換を可能にするために１又は複数の便利な制限部位を包含することができる組換え発現ベクターを生成するために一緒に連結され得る。他方では、本発明の核酸配列は、前記核酸配列又はその配列を含んで成る核酸構造体を、発現のための適切なベクター中に挿入することによって発現され得る。発現ベクターを創造する場合、コード配列は、そのコード配列が発現及びたぶん分泌のための適切な制御配列と操作可能的に連結されるよう、ベクターに位置する。
【００４１】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ方法に便利にゆだねられ得、そして核酸配列の発現をもたらすことができるいずれかのベクター（たとえば、プラスミド又はウィルス）であり得る。ベクターの選択は典型的には、ベクターが導入される予定である宿主細胞とベクターとの適合性に依存するであろう。ベクターは、線状又は閉環された環状プラスミドであり得る。ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち染色体存在物として存在するベクター（その複製は染色体複製には無関係である）、たとえばプラスミド、染色体外要素、ミニクロモソーム又は人工染色体であり得る。
【００４２】
ベクターは自己複製を確かめるためのいずれかの手段を含むことができる。他方では、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、ゲノム中に組み込まれ、そしてそれが組み込まれている染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。ベクターシステムは、宿主細胞のゲノム中に導入される全ＤＮＡ又はトランスポゾンを一緒に含む、単一のベクター又はプラスミド、又は複数のベクター又はプラスミドであり得る。
【００４３】
本発明のベクターは好ましくは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする１又は複数の選択マーカーを含む。選択マーカーは、１つの遺伝子であり、その生成物は、殺生物剤、抗生物質又はウィルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求性に対する原栄養要求性、及び同様のものを提供する。
【００４４】
“条件付きで必須の遺伝子”は、“非抗生物質選択マーカー”として機能することができる。条件付きで必須の細菌性選択マーカーの非制限的例は、細菌がＤ−アラニンの不在下で培養される場合、唯一必須である、バチル・スブチリス又はバチルス・リケニホルミスからのｄａｌ遺伝子である。また、ＵＤＰ−ガラクトースのターンオーバーに関与する酵素をコードする遺伝子は、細胞がガラクトースの存在下で増殖されるか、ガラクトースの存在下で生じる場合、細胞において条件付きで必須のマーカーとして機能することができる。
【００４５】
そのような遺伝子の非制限的な例は、ＵＴＰ−依存性ホスホリラーゼ（ＥＣ２． ７． ７． １０）、ＵＤＰ−グルコース−依存性ウリジルイルトランスフェラーゼ（ＥＣ２． ７． ７． １２）又はＵＤＰ−ガラクトースエピメラーゼ（ＥＣ５． １． ３． ２）をコードするＢ． スブチリス又はＢ．リケニホルミスからのそれらの遺伝子である。また、バチルスのキシロースイソメラーゼ遺伝子、例えばｘｙｌＡが、単一の炭素源としてキシロースを含む最少培地において増殖される細胞において選択マーカーとして使用され得る。グルコネートを利用するために必須な遺伝子、すなわちｇｎｔＫ及びｇｎｔＰがまた、単一の炭素源としてグルコネートを含む最少培地において増殖される細胞において選択マーカーとして使用され得る。条件付きで必須の遺伝子の他の非制限的例は、下記に与えられる。
【００４６】
抗生物質選択マーカーは、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、エリトロマイシン、テトラサイクリン、ネオマイシン、ヒグロマイシン又はメトトレキセートのような抗生物質に対する抗生物質耐性を付与する。
さらに、選択は、選択マーカーが別々のベクター上に存在する場合、ＷＯ９１／１７２４３号に記載されるように、同時−形質転換により達成され得る。
【００４７】
本発明のベクターは好ましくは、ベクター、又はそのベクターの小さな部分の宿主細胞ゲノム中への安定した組み込み、又は細胞のゲノムに関係なく細胞におけるベクターの自律的複製を可能にする要素を含む。
ベクター、又はそのベクターの小さな部分は、宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞ゲノム中に込みこまれ得る。染色体組み込みに関しては、ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列、又は相同又は非相同組換えによるゲノム中へのベクターの安定した組み込みのためのベクターのいずれか他の要素に依存する。
【００４８】
他方では、ベクターは、宿主細胞のゲノム中への相同組換えによる組み込みを方向づけるための追加の核酸配列を含むことができる。その追加の核酸配列は、染色体における正確な位置での宿主細胞ゲノム中へのベクターの組み込みを可能にする。正確な位置での組み込みの可能性を高めるために、組み込み要素は好ましくは、相同組換えの可能性を高めるために対応する標的配列と高い相同性を示す十分な数の核酸、たとえば１００〜１，５００個の塩基対、好ましくは４００〜１，５００個の塩基対、及び最も好ましくは８００〜１，５００個の塩基対を含むべきである。組み込み要素は、宿主細胞のゲノムにおける標的配合と相同であるいずれかの配列であり得る。さらに、組み込み要素は、非コード又はコード核酸配列であり得る。
【００４９】
ベクター、発現カセット、増幅単位、遺伝子、又は実際、いずれかの定義されるヌクレオチド配列のコピー数は、いずれの時点ででも宿主細胞に依存する同一のコピーの数である。遺伝子又はもう１つの定義される染色体ヌクレオチド配列は、染色体上に１，２又はそれよりも多くのコピーで存在することができる。自律的に複製するベクターは、宿主細胞当たり１、又は数百のコピーで存在することができる。
【００５０】
自律複製に関しては、ベクターはさらに、問題の宿主細胞におけるベクターの自律的複製を可能にする複製の起点を含むことができる。複製の細菌起点の例は、プラスミド、ｐＢＲ３２２、ＰＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７， ｐＡＣＹＣ１８４， ｐＵＢ１１０， ｐＥ１９４， ｐＴＡ１０６０及びｐＡＭβ１の複製の起点である。複製の起点は、宿主細胞においてその機能を感温性にする突然変異を有する起点であり得る（例えば、Ｅｈｒｌｉｃｈ， １９７８， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ７５： １４３３を参照のこと）。　本発明はまた、ポリペプチドの組換え生成に都合良く使用される、本発明の核酸配列を含んで成る組換え宿主細胞に関する。用語“宿主細胞”は、複製の間に生じる突然変異のために、親細胞とは同一でない、親細胞のいずれかの子孫を包含する。
【００５１】
細胞は好ましくは、本発明の核酸配列を含んで成るベクターにより形質転換され、続いて宿主染色体中にベクターが組み込まれる。“形質転換”とは、本発明の核酸配列を含んで成るベクターの宿主細胞中への導入を意味し、その結果、前記ベクターは、染色体組み込み体として、又は自己複製する染色体外ベクターとして維持される。組み込みは一般的に、核酸配列が細胞において安定して維持される傾向があるので、好都合であると思われる。宿主染色体中のベクターの組み込みは、上記のように、相同又は非相同組換えにより生じることができる。
【００５２】
宿主細胞の選択は、ポリペプチド及びその源をコードする遺伝子にかなりの程度、依存するであろう。宿主細胞は、単細胞微生物、例えば原核生物、又は非単細胞微生物、例えば真核生物であり得る。有用な単細胞生物は、細菌、例えばグラム陽性細菌、例えばバチルス細胞、例えばバチルス・アルカロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｉｌｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・コーギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・ランタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｎｔｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、
【００５３】
バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）；又はストレプトミセス細胞、例えばストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）又はストレプトミセス・ムリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）；又はグラム陰性細菌、例えばＥ．コリ及びシュードモナスｓｐ． （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） である。好ましい態様においては、細菌宿主細胞は、バチルス・レンタス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・ステアロサーモフィラス又はバチルス・スブチリス細胞である。
【００５４】
細菌宿主細胞の形質転換は、プロトプラス形質転換（例えば、Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ， １９７９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６８： １１１−１１５を参照のこと）、コンピテント細胞の使用（例えば、Ｙｏｕｎｇ ａｎｄ Ｓｐｉｚｉｚｉｎ， １９６１， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ８１： ８２３−８２９， 又はＤｕｂｎａｒ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ， １９７１， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５６： ２０９−２２１を参照のこと）、エレクトロポレーション（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ ａｎｄ Ｄｏｗｅｒ， １９８８， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６： ７４２−７５１を参照のこと）、又は接合（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｅ， １９８７， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １６９： ５７７１−５２７８を参照のこと）によりもたらされ得る。
【００５５】
上記に記載される、形質転換された又はトランスフェクトされた宿主細胞は、所望するポリペプチドの発現を可能にする条件下で適切な栄養培地において培養され、この後、得られるポリペプチドが細胞ブイヨンから回収される。
細胞を培養するために使用される培地は、宿主細胞を増殖するために適切ないずれかの従来の培地、例えば適切な補充物を含む最少又は複合培地であり得る。適切な培地は、商業的供給者から入手でき、又は公開された処方（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ）に従って調製され得る。培地は、当業界において知られている方法を用いて調製される（例えば、細菌及び酵母についての文献、例えばＢｅｎｎｅｔｔ， Ｊ．Ｗ． ａｎｄ Ｌａｓｕｒｅ， Ｌ．， ｅｄｉｔｏｒｓ， Ｍｏｒｅ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｕｎｇｉ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ＣＡ， １９９１を参照のこと）。
【００５６】
ポリペプチドが栄養培地中に分泌される場合、ポリペプチドはその培地から直接的に回収され得る。ポリペプチドが分泌されない場合、それは細胞溶解物から回収される。ポリペプチドは、培養培地から、従来の方法、例えば遠心分離又は濾過により培地から宿主細胞を分離し、上清液又は濾液のタンパク質性成分を塩、例えば硫酸アンモニウムにより沈殿せしめることにより回収され、問題のポリペプチドの型に依存して、種々のクロマトグラフィー方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過のクロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィー又は同様の方法により精製される。
【００５７】
ポリペプチドは、ポリペプチドに対して特異的である当業界において知られている方法を用いて検出され得る。それらの検出方法は、特異的抗体の使用、酵素生成物の形成又は酵素基質の消出を包含する。例えば、酵素アッセイは、ポリペプチドの活性を検出するために使用され得る。
【００５８】
本発明のポリペプチドは、当業界において知られている種々の方法、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除）、電気泳動方法（例えば、分離用等電点電気泳動（ＩＥＦ））、示差溶解性（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、又は抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｊ． Ｃ． Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｌａｒｓ Ｒｙｄｅｎ， ｅｄｉｔｏｒｓ， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９を参照のこと）により精製され得る。
【００５９】
発明の特定の記載：
本発明の第１の観点に従っての、異なった位置で染色体中に安定して組み込まれる注目の遺伝子の少なくとも２つのコピーを含んで成る細胞を構成するための方法：
本発明の方法においては、第１の相同組換えによる宿主細胞の染色体中へのＤＮＡ構造体の方向付けられ、そして選択可能組み込みの後、第２の組換えが、構造体に含まれるＤＮＡフラグメントと、第１の観点の方法の段階ｂ）の遺伝子に隣接して位置する相同宿主細胞ＤＮＡ配列との間で起こる（ここで前記構造体のＤＮＡフラグメントは前記宿主細胞ＤＮＡ配列に対して相同である）ことが構想される。
【００６０】
従って、本発明の好ましい態様は、ＤＮＡ構造体を導入し、そして選択的条件下で細胞を培養する段階に続いて、又は宿主細胞を選択する段階に続いて、第２の組換えが前記ＤＮＡフラグメントと前記相同宿主細胞ＤＮＡ配列との間で起こる、第１の観点の方法に関する。
本発明の好ましい態様は、段階ｄ）に続いて、及び段階ｅ）の前、第２の組換えが前記ＤＮＡフラグメントと前記相同宿主細胞配列との間で起こる、第１の観点の方法に関する。
さらに、第１の組換え組み込み体の選択を容易にするマーカー遺伝子を前記ＤＮＡ構造体に付加することが構想され、ここで前記マーカー遺伝子は上記に記載されるように第２の組換えにより再び前記宿主細胞染色体から切除される。
【００６１】
好ましい態様においては、本発明は、ＤＮＡ構造体がさらに、第２の組換えにより染色体から組換えされるよう、前記構造体に位置する少なくともマーカー遺伝子を含んで成る、第１の観点の方法に関し；好ましくは、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子は耐抗生物質性を付与し、より好ましくは前記抗生物質は、クロラムフェニコール、カナマイシン、アンピシリン、エリトロマイシン、スペクチノマイシン及びテトラサイクリンから成る群から選択され；そして最も好ましくは、選択条件下で増殖し、そして染色体に少なくとも１つのマーカー遺伝子を含まない宿主細胞が選択される。
【００６２】
本発明の方法はまた、第２の組換え現象の後、染色体に組み込まれたまま存続するＤＮＡ構造体のその部分にマーカー遺伝子を含むことによって行われ得る。しかしながら、染色体にマーカー遺伝子を有さないことが好ましいので、マーカー遺伝子を除去する他の手段が、組み込みが行われた後、用いられるべきである。ＤＮＡの一部がレゾルバーゼ部位又はｒｅｓ−部位として知られている一定の認識配列を両端に有する場合、そのＤＮＡの部分を切除する特定の制限酵素又はレゾルバーゼは、当業界において良く知られている。例えば、引用により本明細書に組み込まれるＷＯ９６／２３０７３号（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）を参照のこと。
【００６３】
本発明の好ましい態様は、ＤＮＡ構造体がさらに、変更されたコピーとＤＮＡフラグメントとの間に位置する少なくとも１つのマーカー遺伝子を含み、そして前記少なくとも１つのマーカー遺伝子が、特定のレゾルバーゼにより認識されるヌクレオチド配列を両端に有し、好ましくは前記ヌクレオチド配列がｒｅｓであり；さらにより好ましくは、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子が、選択条件下で増殖される宿主細胞の選択に続いて、レゾルバーゼ酵素の作用により染色体から除去される、第１の観点の方法に関する。
【００６４】
注目の遺伝子は宿主細胞により天然において生成される酵素をコードすることができ、実際、宿主細胞に対して内因性の遺伝子のコピーの数を高めることが単純に所望される。
従って、本発明の好ましい態様は、注目の遺伝子が宿主細胞に起因する第１の観点の方法に関する。
【００６５】
もう１つの好ましい態様においては、本発明は第１の観点の方法に関し、ここで注目の遺伝子は酵素、好ましくはデンプ分解酵素、脂肪分解酵素、タンパク質分解酵素、セルロース分解酵素、オキシドレダクターゼ又は植物細胞壁分解酵素、及びより好ましくは、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カルボヒドロラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、ガラクトシダーゼ、β−ガラクロシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ヘミセルラーゼ、インバーターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、フェノールオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼから成る群から選択された活性を有する酵素をコードする。
【００６６】
上記で言及されるように、注目の遺伝子は宿主細胞に対して内因性であるがしかしながら、本発明の方法により得られる生成細胞は、組み込み工程が完結される場合、できるだけ小さな外因性の外来性又は異種ＤＮＡを含むことが好都合である。
従って、本発明の好ましい態様は、選択的条件下で増殖する前記選択された宿主細胞は、実質的に外因性ＤＮＡを含まず、好ましくは興味ある組み込まれる遺伝子当たり５００以下の塩基対、より好ましくは３００個以下のｂｐ、さらにより好ましくは１００個以下のｂｐ、さらにより好ましくは５０個以下のｂｐ、より好ましくは２５個以下のｂｐ、又は最も好ましくは外因性ＤＮＡを含まない、第１の観点の方法に関する。
【００６７】
本発明のさらに好ましい態様は、選択条件下で増殖する前記選択された宿主細胞が、内因性起源のみのＤＮＡを含んで成る、第１の観点の方法に関する。
もう１つの態様は、第１の観点の段階ｅ）において選択される宿主細胞が内因性起源のＤＮＡのみを含んで成る方法に関する。
変更又は操作、例えば遺伝子又はその遺伝子のプロモーターを部分的に欠失することにより、又は遺伝子又はその遺伝子のプロモーター領域に突然変異を導入することにより遺伝子を非機能的にする多くの手段は、当業界に存在する。
本発明の好ましい態様は、宿主細胞の条件付に必須の染色体遺伝子が、前記遺伝子を部分的に欠失することによって、又は前記遺伝子に１又は複数の突然変異を導入することによって変更される、第１の観点の方法に関する。
【００６８】
本発明は、宿主細胞における少なくとも１つの条件付きで必須の染色体遺伝子を１つの段階において非機能的にすることに関し、そして特に、非機能的にされるべき多くの条件付で必須の遺伝子に関する。前記遺伝子は当業界において知られているような部分的欠失又は突然変異により非機能的にされ得；特に、前記遺伝子は、下記非制限的な例に示されるように、“欠失プラスミド”の使用を通して非機能的にされ得る。第１の観点の方法の段階ｂ）の変更された染色体遺伝子に関するそれぞれの好ましい態様に関しては、最も好ましい態様は本明細書における非制限的例に示され、そしてこの目的のために構成される遺伝子手段、例えば“欠失プラスミド”を構成するために使用されるＰＣＲプライマー配列が言及される。
【００６９】
従って、本発明の好ましい態様は、変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、Ｄ−アラニンラセマーゼをコードし、好ましくは前記遺伝子はバチルス細胞からのｄａｌ相同体であり、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのｄａｌに相同であり、そして最も好ましくは、前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスのｄａｌ遺伝子である、第１の観点の方法に関する。
【００７０】
本発明のもう１つの好ましい態様は、変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、Ｄ−アラニンラセマーゼをコードし、そして配列番号１２における位置１３０３〜２４６９に示されるバチルス・リケニホルミスのｄａｌ配列に対して、少なくとも７５％、好ましくは８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、又はより好ましくは９５％及び最も好ましくは少なくとも９７％同一である、第１の観点の方法に関する。
【００７１】
条件付きで必須の遺伝子は特定の炭素源、例えばキシロース又はアラビノースの使用に関与するポリペプチドをコードすることができ、この場合、宿主細胞は、前記遺伝子が非機能的である場合、特定の炭素源のみにより補充された最少培地においては増殖することができない。
本発明の好ましい態様は、変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、１種の特定の主要炭素源のみにより補充された最少培地上での前記宿主細胞の増殖のために必要とされる１又は複数の遺伝子である、第１の観点の方法に関する。
【００７２】
本発明の好ましい態様は、変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、キシロースオペロンのものであり、好ましくは前記遺伝子はバチルス・サブチリスからのｘｙｌＡ遺伝子に相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスのキシロースイソメラーゼオペロンの１又は複数の遺伝子に相同である、第２の観点の方法に関する。
【００７３】
本発明の好ましい態様は、変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、ガラクトキナーゼ（ＥＣ２． ７． １． ６）、ＵＴＰ−依存性ピロホスホリラーゼ（ＥＣ２． ７． ７． １０）、ＵＤＰ−グルコース−依存性ウリジルイルトランスフェラーゼ（ＥＣ２． ７． ７． １２）又はＵＤＰ−ガラクトースエピメラーゼ（ＥＣ５． １． ２． ３）をコードし、好ましくは前記遺伝子はＵＤＰ−ガラクトースエピメラーゼ（ＥＣ５． １． ２． ３）をコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルスのｇａｌＥに相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスのｇａｌＥである、第１の観点の方法に関する。
【００７４】
本発明の好ましい態様は、変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、グルコネートオペロンの１又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はグルコネートキナーゼ（ＥＣ２． ７． １． １２）又はグルコネートペルミアーゼ、又は両者をコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのｇｎｔｋ又はｇｎｔＰ遺伝子に対して相同の１又は複数の遺伝子であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスからのｇｎｔＫ又はｇｎｔＰ遺伝子である、第１の観点の方法に関する。
【００７５】
本発明のもう１つの好ましい態様は、変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、グルコネートオペロンの１又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はグルコネートキナーゼ（ＥＣ２． ７． １． １２）又はグルコネートペルミアーゼ、又は両者をコードし、そしてバチルス・リケニホルミスのｇｎｔＫ及びｇｎｔＰのいずれかに対して、少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９５％及び最も好ましくは少なくとも９７％同一である、第１の観点の方法に関する。
【００７６】
本発明のもう１つの好ましい態様は、変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、グリセロールオペロンの１又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はグリセロール摂取促進体（ペルミアーゼ）、グリセロールキナーゼ又はグリセロールデヒドログナーゼをコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのｇｌｐＰ， ｇｌｐＦ， ｇｌｐＫ及びｇｌｐＤ遺伝子に対して相同の１又は複数の遺伝子であり、そして最も好まくは前記遺伝子は配列番号２６で示されるバチルス・リケニルホルミスからのｇｌｐＰ， ｇｌｐＦ， ｇｌｐＫ及びｇｌｐＤ遺伝子の１又は複数の遺伝子である、第１の観点の方法に関する。
【００７７】
本発明のもう１つの好ましい態様は、変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、グリセロールオペロンの１又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はグリセロール摂取促進体（ペルミアーゼ）、グリセロールキナーゼ又はグリセロールデヒドログナーゼをコードし、そして配列番号２６で示されるバチルス・リケニホルミスのｇｌｐＰ， ｇｌｐＦ， ｇｌｐＫ及びｇｌｐＤ配列のいずれかに対して、少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９５％及び最も好ましくは少なくとも９７％同一である、第１の観点の方法に関する。
【００７８】
本発明のもう１つの好ましい態様は、変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、アラビノースオペロンの１又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はアラビノースイソメラーゼをコードし、より好ましくは前記遺伝子は、バチルス・スブチリスからのａｒａＡ遺伝子に対して相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子は配列番号３８で示されるバチルス・リケニホルミスからのａｒａＡ遺伝子である、第１の観点の方法に関する。
【００７９】
本発明の好ましい態様は、変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、アラビノースオペロンの１又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はアラビノースイソメラーゼをコードし、そして配列番号３８で示されるバチルス・リケニホルミスのａｒａＡ配列に対して、少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９５％及び最も好ましくは少なくとも９７％同一である、第１の観点の方法に関する。
【００８０】
他の条件付きで必須の遺伝子、例えば１又は複数のアミン酸を合成するために細胞に必要とされる遺伝子は、文献において十分に記載されており、ここでアミノ酸の合成のために必要とされるポリペプチドをコードする非機能的遺伝子は、そのアミノ酸のために細胞を栄養要求性にし、そして前記細胞は、前記アミノ酸が増殖培地に供給される場合、増殖することができる。そのような遺伝子の機能性の回復は、その細胞によるアミノ酸のそれ自体での合成を可能にし、そしてそれは栄養要求細胞のバックグラウンドに対して選択できるようになる。
【００８１】
従って、本発明の好ましい態様は、前記宿主細胞の条件付で必須の染色体遺伝子が、アミノ酸合成に関与する１又は複数のポリペプチドをコードし、そして前記遺伝子の非機能性が細胞を１又は複数のアミノ酸のために栄養要求性にし、そして前記遺伝子の機能性の回復が前記細胞を前記アミノ酸のため原栄養性にする、第１の観点の方法に関する。
【００８２】
本発明の特に好ましい態様は、前記宿主細胞の条件付きで必須の染色体遺伝子が、リシン又はメチオニン合成に関与する１又は複数のポリペプチドをコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのｍｅｔＣ又はｌｙｓＡ遺伝子に対して相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスからのｍｅｔＣ又はｌｙｓＡ遺伝子である、第１の観点の方法に関する。
【００８３】
本発明のもう１つの特に好ましい態様は、前記宿主細胞の条件付きで必須の染色体遺伝子が、配列番号４２で示されるバチルス・リケニホルミスのｍｅｔＣ配列、又は配列番号４８で示されるバチルス・リケニホルミスのｌｙｓＡ配列に対して、少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９５％、及び最も好ましくは少なくとも９７％同一である、第１の観点の方法に関する。
【００８４】
本明細書のおいて記載される場合、本発明の方法は、バイオテク産業のために非常に適切であり、そして次の多くの好ましい生物はこの産業において非常に良く知られている：特にグラム陽性宿主細胞、及びバチルス属の一定の宿主細胞、特にバチルス・アルカロフィラス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・サーキュランス、バチルス・クラウジ、バチルス・コアギランス、バチルス・ラクタス、バチルス・レンタス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・スブチリス及びバチルス・スリンギエンシス。
【００８５】
本発明の好ましい態様は、前記宿主細胞が、グラム陽性細菌細胞、好ましくはバチルス細胞及び最も好ましくは、バチルス・アルカロフィラス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・サーキュランス、バチルス・クラウジ、バチルス・コアギランス、バチルス・ラクタス、バチルス・レンタス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・スブチリス及びバチルス・スリンギエンシスから成る群から選択されたバチルス細胞である、第１の観点の方法に関する。
【００８６】
本発明のもう１つの好ましい態様は、ＤＮＡ構造体がプラスミドである、第１の観点の方法に関する。
本明細書において他で記載されるように、本発明は、本発明の方法を実施するための遺伝的手段、例えば宿主細胞及び本発明のＤＮＡ構造体、例えば次のものを含んで成る第２の観点のＤＮＡ構造体を供給する：
ｉ）宿主細胞からの条件付きで必須の染色体遺伝子の変更された非機能的コピー、好ましくは部分的に欠失されたコピー；及び
ｉｉ）上記ｉ）を１つの側に有し、そしてｉ）の条件付きで必須の遺伝子に隣接する宿主細胞染色体に位置する宿主細胞ＤＮＡ配列に対して相同のＤＮＡフラグメントを他の側に有する注目の遺伝子の少なくとも１つのコピー。
【００８７】
本発明の好ましい態様は、ｉ）において変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、Ｄ−アラニンラセマーゼをコードし、好ましくは前記遺伝子はバチルス細胞からのｄａｌ相同体であり、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのｄａｌに相同であり、そして最も好ましくは、前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスのｄａｌ遺伝子である、第２の観点のＤＮＡ構造体に関する。
【００８８】
本発明のもう１つの好ましい態様は、ｉ）において変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、Ｄ−アラニンラセマーゼをコードし、そして配列番号１２における位置１３０３〜２４６９に示されるバチルス・リケニホルミスのｄａｌ配列に対して、少なくとも７５％、好ましくは８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、又はより好ましくは９５％及び最も好ましくは少なくとも９７％同一である、第２の観点のＤＮＡ構造体に関する。
本発明のさらにもう１つの好ましい態様は、宿主細胞からの条件付きに必須の染色体遺伝子の変更された非機能的コピーが、１種の特定の主要炭素源のみにより補充された最少培地上での前記宿主細胞の増殖のために必要とされる１又は複数の遺伝子である、第２の観点のＤＮＡ構造体に関する。
【００８９】
本発明の好ましい態様は、ｉ）において変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、キシロースオペロンの１又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はバチルス・サブチリスからのｘｙｌＡ遺伝子に相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスのキシロースイソメラーゼオペロンの１又は複数の遺伝子に相同である、第２の観点のＤＮＡ構造体に関する。
【００９０】
本発明のもう１つの好ましい態様は、ｉ）において変更される前記宿主細胞の染色体遺伝子が、ガラクトキナーゼ（ＥＣ２． ７． １． ６）、ＵＴＰ−依存性ピロホスホリラーゼ（ＥＣ２． ７． ７． １０）、ＵＤＰ−グルコース−依存性ウリジルイルトランスフェラーゼ（ＥＣ２． ７． ７． １２）又はＵＤＰ−ガラクトースエピメラーゼ（ＥＣ５． １． ２． ３）をコードし、好ましくは前記遺伝子はＵＤＰ−ガラクトースエピメラーゼ（ＥＣ５． １． ２． ３）をコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルスのｇａｌＥに相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスのｇａｌＥである、第２の観点のＤＮＡ構造体に関する。
【００９１】
本発明の１つのより好ましい態様は、条件付きに必須の染色体遺伝子が、グルコネートオペロンの１又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はグルコネートキナーゼ（ＥＣ２． ７． １． １２）又はグルコネートペルミアーゼ、又は両者をコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのｇｎｔｋ又はｇｎｔＰ遺伝子に対して相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスからのｇｎｔＫ又はｇｎｔＰの１又は複数の遺伝子である、第２の観点のＤＮＡ構造体に関する。
【００９２】
本発明のさらにもう１つの好ましい態様は、条件付きに必須の染色体遺伝子が、グリセロールオペロンの１又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はグリセロール摂取促進体（ペルミアーゼ）、グリセロールキナーゼ又はグリセロールデヒドログナーゼをコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのｇｌｐＰ， ｇｌｐＦ， ｇｌｐＫ及びｇｌｐＤ遺伝子にに対して相同の１又は複数の遺伝子であり、そして最も好まくは前記遺伝子は配列番号２６で示されるバチルス・リケニルホルミスからのｇｌｐＰ， ｇｌｐＦ， ｇｌｐＫ及びｇｌｐＤ遺伝子の１又は複数の遺伝子である、第２の観点のＤＮＡ構造体に関する。
【００９３】
本発明の特に好ましい態様は、条件付きに必須の染色体遺伝子が、アラビノースオペロンの１又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はアラビノースイソメラーゼをコードし、より好ましくは前記遺伝子は、バチルス・スブチリスからのａｒａＡ遺伝子に対して相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子は配列番号３８で示されるバチルス・リケニホルミスからのａｒａＡ遺伝子である、第２の観点のＤＮＡ構造体に関する。
【００９４】
本発明の１つのより好ましい態様は、条件付きに必須の染色体遺伝子が、アラビノースオペロンの１又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はアラビノースイソメラーゼをコードし、より好ましくは前記遺伝子は、バチルス・スブチリスからのａｒａＡ遺伝子に対して相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子は配列番号３８で示されるバチルス・リケニホルミスからのａｒａＡ遺伝子である、第２の観点のＤＮＡ構造体に関する。
【００９５】
本発明の好ましい態様は、条件付きに必須の染色体遺伝子が、アラビノースオペロンの１又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はアラビノースイソメラーゼをコードし、そして配列番号３８で示されるバチルス・リケニホルミスのａｒａＡ配列に対して、少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９５％及び最も好ましくは少なくとも９７％同一である、第２の観点のＤＮＡ構造体に関する。
【００９６】
本発明のさらにもう１つの好ましい態様は、条件付で必須の染色体遺伝子が、アミノ酸合成に関与する１又は複数のポリペプチドをコードし、そして前記遺伝子の非機能性が、遺伝子の他の機能的コピーを有さない細胞に存在する場合、細胞を１又は複数のアミノ酸のために栄養要求性にし、そして前記遺伝子の機能性の回復が前記細胞を前記アミノ酸のため原栄養性にし；好ましくは、条件付きで必須の染色体遺伝子が、リシン又はメチオニン合成に関与する１又は複数のポリペプチドをコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのｍｅｔＣ又はｌｙｓＡ遺伝子に対して相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスからのｍｅｔＣ又はｌｙｓＡ遺伝子である、第２の観点のＤＮＡ構造体に関する。さらにより好ましくは、条件付きで必須の染色体遺伝子が、配列番号４２で示されるバチルス・リケニホルミスのｍｅｔＣ配列、又は配列番号４８で示されるバチルス・リケニホルミスのｌｙｓＡ配列に対して、少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９５％、及び最も好ましくは少なくとも９７％同一である。
【００９７】
本発明は、バイオテク産業において非常に有用である生成宿主細胞、例えば染色体中に安定して組み込まれる注目の遺伝子の少なくとも２つのコピーを含んで成り、その少なくとも１つのコピーは条件付きで必須の遺伝子座に隣接して組み込まれている、第３の観点の宿主細胞を構成するための方法を提供し、ここで前記細胞は第１の観点に定義されるいずれかの方法により得ることができる。
【００９８】
第１の観点の方法は、宿主細胞の染色体中への注目の遺伝子の組み込みを記載し、その結果、前記注目の遺伝子は、条件付きで必須の遺伝子座に隣接して存在する位置に組み込まれる。注目の遺伝子及び遺伝子座の正確な相対的位置は、前記方法のために主要な関連性のものではないが、しかしながら一般的に言及すると、より安定した組み込みを達成するためにではあるが、しかしまた、宿主細胞ゲノム中への不必要なＤＮＡ配列の組み込みを最少にするために、前記２種の遺伝子及び遺伝子座を分離する塩基対での距離を最少にすることが興味の対象である。
【００９９】
従って、本発明の好ましい態様は、前記注目の遺伝子が、前記条件付きで必須の遺伝子座から、１０００個以下の塩基対、好ましくは７５０個の以下の塩基対、より好ましくは５００個以下の塩基対、さらにより好ましくは２５０個以下の塩基対、及び最も好ましくは１００個以下の塩基対、分離される、第３の観点の宿主細胞に関する。
【０１００】
上記に言及されるように、宿主細胞ゲノムにおける組み込まれているか又は不必要なＤＮＡ配列、特に外因性起源のＤＮＡの存在を最少にすることが興味ある対象であり、そして理想的な宿主細胞は、内因性起源のＤＮＡ、例えば異なった十分に定義される染色体位置に組み込まれる興味ある内因性遺伝子の複数のコピーのみを含む。
【０１０１】
従って、本発明の好ましい態様は、実質的に外因性ＤＮＡを含まず、好ましくは興味ある組み込まれる遺伝子当たり５００個以下の塩基対、より好ましくは３００以下のｂｐ、さらにより好ましくは１００以下のｂｐ、さらにより好ましくは５０個以下のｂｐを含み、又は最も好ましくは外因性ＤＮＡを含まない、第３の観点の宿主細胞に関する。
本発明のもう１つの好ましい態様は、内因性ＤＮＡのみを含む、第３の観点の宿主細胞に関する。
一定の細菌株が、前記に言及されるようにバイオテク産業において宿主細胞として好ましい。
【０１０２】
本発明の好ましい態様は、前記宿主細胞が、グラム陽性細菌細胞、好ましくはバチルス細胞及び最も好ましくは、バチルス・アルカロフィラス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・サーキュランス、バチルス・クラウジ、バチルス・コアギランス、バチルス・ラクタス、バチルス・レンタス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・スブチリス及びバチルス・スリンギエンシスから成る群から選択されたバチルス細胞である、第３の観点の宿主細胞に関する。
【０１０３】
本発明のもう１つの好ましい態様は、注目の遺伝子のコピーが、Ｄ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子、好ましくはバチルス・スブチリスからのｄａｌ遺伝子に相同の遺伝子、より好ましくは配列番号１２における位置１３０３〜２４６９に示されるバチルス・リケニホルミスのｄａｌ配列に対して少なくとも７５％同一である遺伝子、さらにより好ましくは、配列番号１２における位置１３０３〜２４６９に示されるバチルス・リケニホルミスのｄａｌ配列に対して少なくとも９５％及び最も好ましくは少なくとも９７％同一である、第３の観点の宿主細胞に関する。
【０１０４】
本発明の特に好ましい態様は、注目の遺伝子のコピーが、１種の特定の主要炭素源のみにより補充された最少培地上での前記宿主細胞の増殖のために必要とされる遺伝子に隣接して組み込まれる、第３の観点の宿主細胞に関する。
本発明のもう１つの好ましい態様は、注目の遺伝子のコピーが、キシロースオペロンの遺伝子に隣接して、好ましくはバチルス・スブチリスからのｘｙｌＲ又はｘｙｌＡ遺伝子に相同の遺伝子に隣接して、及び最も好ましくは、バチルス・リケニホルミスからのｘｙｌＲ又はｘｙｌＡに隣接して組み込まれる、第３の観点の宿主細胞に関する。
【０１０５】
本発明の１つのより好ましい態様は、注目の遺伝子のコピーが、ガラクトキナーゼ（ＥＣ２． ７． １． ６）、ＵＴＰ−依存性ピロホスホリラーゼ（ＥＣ２． ７． ７． １０）、ＵＤＰ−グルコース−依存性ウリジルイルトランスフェラーゼ（ＥＣ２． ７． ７． １２）又はＵＤＰ−ガラクトースエピメラーゼ（ＥＣ５． １． ２． ３）をコードする遺伝子、好ましくは前記遺伝子はＵＤＰ−ガラクトースエピメラーゼ（ＥＣ５． １． ２． ３）をコードする遺伝子、より好ましくは前記遺伝子はバチルスのｇａｌＥに相同である遺伝子、そして最も好ましくはバチルス・リケニホルミスのｇａｌＥに隣接して組み込まれる、第３の観点の宿主細胞に関する。
【０１０６】
本発明の追加の好ましい態様は、注目の遺伝子のコピーが、グルコネートオペロンの遺伝子に隣接して、好ましくはグルコネートキナーゼ（ＥＣ２． ７． １． １２）又はグルコネートペルミアーゼをコードする遺伝子に隣接して、より好ましくはｇｎｔＲ， ｇｎｔＫ， ｇｎｔｐ及びｇｎｔＺから成る群から選択されたバチルス・スブチリス遺伝子に相同の遺伝子に隣接して、及び最も好ましくはバチルス・リケニホルミスからのｇｎｔＲ， ｇｎｔＫ， ｇｎｔＰ又はｇｎｔＺに隣接して組み込まれる、第３の観点の宿主細胞に関する。
【０１０７】
本発明のさらに追加の好ましい態様は、注目の遺伝子のコピーが、グリセロールオペロンの１又は複数の遺伝子、好ましくは前記遺伝子はグリセロール摂取促進体（ペルミアーゼ）、グリセロールキナーゼ又はグリセロールデヒドログナーゼをコードする遺伝子、より好ましくはバチルス・スブチリスからのｇｌｐＰ， ｇｌｐＦ， ｇｌｐＫ及びｇｌｐＤ遺伝子に対して相同の遺伝子、及び最も好まくは配列番号２６で示されるバチルス・リケニルホルミスからのｇｌｐＰ， ｇｌｐＦ， ｇｌｐＫ及びｇｌｐＤ遺伝子に隣接して組み込まれる、第３の観点の宿主細胞に関する。
【０１０８】
本発明のもう１つの特に好ましい態様は、注目の遺伝子のコピーが、アラビノースオペロンの遺伝子であり、好ましくはアラビノースイソメラーゼをコードする遺伝子に隣接して組み込まれ、より好ましくは前記遺伝子は、バチルス・スブチリスからのａｒａＡ遺伝子に対して相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子は配列番号３８で示されるバチルス・リケニホルミスからのａｒａＡ遺伝子である、第３の観点の宿主細胞に関する。
【０１０９】
本発明のさらに好ましい態様は、注目の遺伝子のコピーが、アミノ酸合成に関与する１又は複数のポリペプチドをコードする遺伝子に隣接して組み込まれ、そして前記遺伝子の非機能性が細胞を１又は複数のアミノ酸のために栄養要求性にし、そして前記遺伝子の機能性の回復が前記細胞を前記アミノ酸のため原栄養性にし；好ましくは、注目の遺伝子のコピーが、リシン又はメチオニン合成に関与する１又は複数のポリペプチドをコードする遺伝子に隣接して組み込まれ、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのｍｅｔＣ又はｌｙｓＡ遺伝子に対して相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスからのｍｅｔＣ又はｌｙｓＡ遺伝子である、第３の観点の宿主細胞に関する。
【０１１０】
また好ましくは、注目の遺伝子のコピーが、配列番号４２で示されるバチルス・リケニホルミスのｍｅｔＣ配列、又は配列番号４８で示されるバチルス・リケニホルミスのｌｙｓＡ配列に対して、少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９５％、及び最も好ましくは少なくとも９７％同一である遺伝子に隣接して組み込まれる。
【０１１１】
前記第３の観点の宿主細胞は、ポリペプチド、例えば酵素の産業的生成のために特に興味あるものである。
【０１１２】
本発明の好ましい態様は、前記注目の遺伝子が、酵素、好ましくはデンプ分解酵素、脂肪分解酵素、タンパク質分解酵素、セルロース分解酵素、オキシドレダクターゼ又は植物細胞壁分解酵素、及びより好ましくは、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カルボヒドロラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、ガラクトシダーゼ、β−ガラクロシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ヘミセルラーゼ、インバーターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、フェノールオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼから成る群から選択された活性を有する酵素をコードする、第３の観点の宿主細胞に関する。
【０１１３】
また好ましくは、前記注目の遺伝子が、ヒト身体において生物学的活性を有するペプチド、好ましくは医薬的活性ペプチド、より好ましくはインスリン／プロ−インスリン／プレ−プロ−インスリン又はそれらの変異体、成長ホルモン又はその変異体、又は血液凝固因子ＶＩＩ又はＶＩＩＩ又はそれらの変異体をコードする。　本発明のさらに好ましい態様は、抗生物質マーカーが存在しない第３の観点の宿主細胞に関する。
【０１１４】
本発明は、第１の観点の方法への使用のために適切である宿主細胞、特に１，２又はそれ以上の条件付きで必須の遺伝子が非機能的にされている宿主細胞の構成を教授する。下記非制限的な例においては、本発明の好ましい、条件付きで必須の遺伝子が、本発明の特定の欠失プラスミドを用いることによる部分的欠失を通して、いかにして非機能的にされるかが示される。特に、本発明は、少なくとも２種の条件付きに必須の遺伝子が非機能的にされ、好ましくは前記遺伝子がｘｙｌＡ， ｇａｌＥ， ｇｎｔＫ， ｇｎｔＰ， ｇｌｐＰ， ｇｌｐＦ， ｇｌｐＫ， ｇｌｐＤ， ａｒａＡ， ｍｅｔＣ， ｌｙｓＡ及びｄａｌから成る群から選択される、第４の観点のバチルス細胞、好ましくはバチルス・リケニホルミスサイブに関する。
【０１１５】
前記第３の観点のそのような宿主細胞の使用は、同様に、第１の観点の方法において構想される。
第１の観点の方法のための本発明により提供されるもう１つの遺伝子的手段は、第２の観点のＤＮＡ構造体を含んで成る宿主細胞である。
本発明の最終観点は、第３の観点の細胞を、興味ある酵素を生成するために適切な条件下で培養し、そして任意には、前記酵素を精製することを含んで成る、興味ある酵素の生成方法に関する。
【０１１６】
実施例
例１：
バチルス・リケニホルミスＳＴ４６７１（ＷＯ９９／４１３５８号）は、Ｂ．リケニホルミスのα−アミラーゼ遺伝子、ａｍｙＬの領域に対向する相対的配向で挿入される、その染色体に２つの安定して組み込まれるａｍｙＬ遺伝子コピーを含んで成る。次の例は、ａｍｙＬ遺伝子の３個の安定して染色体コピーを含んで成るが、しかし外来性ＤＮＡを欠いている株をもたらすＢ．リケニホルミス染色体のもう１つの定義される領域中への選択できる、意図された組み込みによる第３のａｍｙＬ遺伝子コピーのこの株中への挿入を記載する。
キシロースイソメラーゼ欠失／組み込み概略（図１）：
バチルス・リケニホルミスキシロースイソメラーゼ領域の配列は、受託番号Ｚ８０２２２として、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬから入手できる。
【０１１７】
“欠失プラスミド”と称するプラスミドを、感温性親プラスミド上にキシロースイソメラーゼ領域からの２種のＰＣＲ増幅されたフラグメントをクローニングすることによって構成した。ＰＣＲフラグメントを、“Ａ”及び“Ｂ”と示し、ここでＡはｘｙｌＲプロモーター及びｘｙｌＲ遺伝子の一部を含んで成り；そしてＢはプロモーター及び遺伝子の最初の７０個の塩基対を欠いているｚｙｌＡの内部フラグメントを含んで成る。レゾルバーゼ（ｒｅｓ）部位を両端に有するスペクチノマイシン耐性遺伝子を、プラスミド上のフラグメントＡとＢとの間に導入した。このスペクチノマイシン耐性遺伝子は後で、レゾルバーゼ−介在性部位特異的組換えにより除去され得る。
【０１１８】
キシロースイソメラーゼ欠失を、感温性プラスミドの組み込み及び切除により介在される、フラグメントＡ及びＢを通しての二重相同組換えにより欠失プラスミドからバチルス標的株の染色体にトランスファーした。得られる株は、“欠失株”と称した。この株は、単独の炭素源としてキシロースを含む最少培地上で増殖することはできない。
【０１１９】
“組み込みプラスミド”を、欠失株のキシロースイソメラーゼ領域中への遺伝子の挿入のために構成した。ＸｙｌＡプロモーター及び約１ｋｂのｘｙｌＡ遺伝子を含んで成る“Ｃ”と称するフラグメントをＰＣＲ−増幅した。しかしながら、後で記載されるように、ｘｙｌＡプロモーター及びｘｙｌＡ遺伝子の最初の２５０塩基対を含んで成る、“Ｄ”と称する小さな方のフラグメントのみを都合良く増幅し、そしてクローン化した。組み込みプラスミドは、感温性ベクター上のフラグメントＡ及びＤを含んで成る。発現カセットをまた、フラグメントＡとＤとの間の組み込みプラスミドにクローン化した。
【０１２０】
感温性組み込みプラスミドを、Ｂ．リケニホルミス欠失株にトランスファーし、そしてそれを染色体に組み込み；感温性ベクターの続く切除を確保し、そして次に単一の炭素源としてキシロースを有する最少培地上で増殖する“組み込み株”を単離した。そのような組み込み株は、フラグメントＡ及びＤを通しての二重相同組換えにより、染色体ｘｙｌＡ遺伝子を戻した。この工程においては、発現カセットは、染色体中に組み込まれた。
プラスミド構造体：
ＰＣＲ増幅を、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＢｉｏｔｅｃｈからのＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇ０ ＰＣＲ Ｂｅａｄｓによりその製造業者の説明書に記載のようにして、５５℃のアニーリング温度を用いて行った。
【０１２１】
プラスミドｐＳＪ５１２８及びｐＳＪ５１２９：
Ａフラグメント（ｘｙｌＲプロモーター、及びｘｙｌＲ遺伝子の一部）を、バチルス・リケニホルミスＰＬ１９８０染色体ＤＮＡから、下記プライマーを用いて増幅した：
＃１８３２３５：［ＨｉｎｄＩＩＩ←Ｚ８０２２２ １２４２−１２６１→］（配列番号１）：
５’−ＧＡＣＴＡＡＧＣＴＴＣＴＧＣＡＴＡＧＴＧＡＧＡＧＡＡＧＡＣＧ；
＃１８３２３４：［ＥｃｏＲＩ； ＢｇｌＩＩ； ＮｏｔＩ； ＭｌｕＩ； ＳａｌＩ； ＳｃａＩ←Ｚ８０２２２ ２１３７−２１１３→］（配列番号２）：
５’−ＧＡＣＴＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＣＧＴＧＴＣＧＡＣＡＧＴＡＣＴＧＡＡＡＴＡＧＡＧＧＡＡＡＡＡＡＴＡＡＧＴＴＴＴＣ。
【０１２２】
ＰＣＲフラグメントをＣｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、そして精製し、次にＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化されたｐＵＣ１９に連結した。その連結混合物をエレクトロポレーションによりＥ．コリＳＪ２中に形質転換し、そして形質転換をアンピシリン耐性（２００μｇ／ｍｌ）について選択した。３個のそのようなアンピシリン耐性形質転換体のＰＣＲ−フラグメントを配列決定し、そしてすべては正しかったことが見出された。ＳＪ５１２８（ＳＪ２／ｐＳＪ５１２８）及びＳＪ５１２９ （ＳＪ２／ｐＳＪ５１２９） と称するクローンを保持した。
【０１２３】
プラスミドｐＳＪ５１２４， ｐＳＪ５１２５：
Ｂフラグメント（プロモーター及びコード領域の最初の７０個の塩基対を欠いているｘｙｌＡの内部部分）を、Ｂ．リケニルホルミスＰＬ１９８０染色体ＤＮＡから下記プライマーを用いて増幅した：
＃１８３２３０［ＥｃｏＲＩ←Ｚ８０２２２ ３３２８−３３０６→］（配列番号３）：
５’−ＧＡＣＴＧＡＡＴＴＣＣＧＴＡＴＣＣＡＴＴＣＣＴＧＣＧＡＴＡＴＧＡＧ；
＃１８３２２７［ＢａｍＨＩ； ＢｇｌＩＩ←ｚ８０２２２ ２３１８−２３４２→］（配列番号４）：
５’−ＧＡＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＴＴＡＴＴＡＣＡＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＴＴＴＧＴＣＧ。
【０１２４】
ＰＣＲフラグメントをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにより消化し、そして精製し、次にＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにより消化されたｐＵＣ１９に連結し、そしてエレクトロポレーションによりＥ．コリＳＪ２を形質転換した。形質転換体をアンピシリン耐性（２００μｇ／ｍｌ）について選択した。２種のクローンは、ＤＮＡ配列決定により確かめる場合、正しく、そしてＳＪ５１２４（ＳＪ２／ｐＳＪ５１２４）及びＳＪ５１２５（ＳＪ２／ｐＳＪ５１２５）として保持した。
【０１２５】
プラスミドｐＳＪ５１３０：
Ｃフラグメント（ｘｙｌＡプロモーター及び約１ｋｂのｚｙｌＡ遺伝子を含む）を、Ｂ．リケニホルミスＰＬ１９８０染色体ＤＮＡから、下記プライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
＃１８３２３０（上記参照のこと、配列番号３）；
＃１８２３３９［ＢａｍＨＩ；ＢｇｌＩＩ；ＮｈｅＩ；ＳａｃＩＩ←Ｚ８０２２２ ２１３１−２１５６←］（配列番号５）：
５’−ＧＡＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＴＧＣＴＡＧＣＡＴＣＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＴＡＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＡＡＧＣＧＡＴＴＡＡＴＴＧ。
【０１２６】
ＰＣＲフラグメントをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにより消化し、そして精製し、次にＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにより消化されたｐＵＣ１９に連結し、そしてエレクトロポレーションによりＥ．コリＳＪ２中に形質転換した。形質転換体を、アンピシリン耐性（２００μｇ／ｍｌ）について選択した。十分な長さのＰＣＲフラグメントを含んで成る１つのクローンが、−３５〜−１０の配列間のプロモーター領域に単一の塩基対欠失を有することが見出された。この形質転換体は、ＳＪ５１３０（ＳＪ２／ｐＳＪ５１３０）として保持された。
【０１２７】
プラスミドｐＳＪ５１３１；
このプラスミドは上記のように、ｐＳＪ５１３０として構成されたが、しかしｘｙｌＡプロモーター、及びｘｙｌＡコード配列の最初の２５０個の塩基対を含んで成る、４００塩基対のＰＣＲフラグメントのみ（Ｄフラグメント）を含むことが分かっている。ＤＮＡ配列決定は、配列誤差がそのフラグメントに存在しなかったことを確認した。形質転換体をＳＪ５１３１（ＳＪ１／ｐＳＪ５１３１）として保持した。
【０１２８】
プラスミドｐＳＪ５１９７， ｐＳＪ５１９８：
それらのプラスミドを、感温性、移動性ベクター上のＡ（ｚｙｌＲ）フラグメントを含んで成る。それらは、ｐＳＪ５１２９からの０．９ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ｐＳＨ２７８９からの５．４ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントに連結し、そして前記結合混合物によりＢ．スブチリスＤＮ１８８５コンピテント細胞を形質転換することによって構成し、続いてエリトロマイシン耐性（５μｇ／ｍｌ）について選択する。２種のクローンＳＪ５１９７（ＤＮ１８８５／ｐＳＪ５１９７）及びＳＪ５１９８（ＤＮ１８８５／ｐＳＪ５１９８）を保持した。
【０１２９】
プラスミドｐＳＪ５２１１， ｐＳＪ５２１２：
それらのプラスミドを、Ｂフラグメントに続いて挿入されるｒｅｓ−ｓｐｃ−ｒｅｓカセットを含む。それらは、ｐＳＪ３３５８からの１．５ｋｂのＢｃｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＳＪ５１２４のＢｇｌＩＩ部位中に連結し、そしてその連結混合物を用いて、Ｅ．コリＳＪ２を形質転換することによって構成し、そしてアンピシリン耐性（２００μｇ／ｍｌ）及びスペクチノマイシン耐性（１２０μｇ／ｍｌ）について選択する。ｒｅｓ−ｓｐｃ−ｒｅｓカセットが可能な配向で挿入されている２種のクローンＳＪ５２１１ （ＳＪ２／ｐＳＪ５２１１）及びＳＪ５２１２ （ＳＪ２／ｐＳＪ５２１２） を保持した。
【０１３０】
欠失プラスミド：
プラスミドｐＳＪ５２１８：
このプラスミドは、Ａ及びＢフラグメントを両端に有するｒｅｓ−ｓｐｃ−ｒｅｓカセットを含む。それは、ｐＳＪ５２１１からの２．５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＳＪ５１９７からの５．３ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントに連結し、そしてその連結混合物を用いてＥ．スブチリスＤＮ１８８５を形質転換し、そして３０℃で、エリトロマイシン耐性（５μｇ／ｍｌ）及びスペクチノマイシン耐性（１２０μｇ／ｍｌ）について選択することによって構成された。１つの形質転換体ＳＪ５２１８（ＤＮ１８８５／ｐＳＪ５２１８）を保持した。
【０１３１】
組み込みプラスミド：
プラスミドｐＳＪ５２４７， ｐＳＪ５２４８：
それらのプラスミドは、短い４００ｂｐのＤフラグメント（ＰｘｙｌＡ−ｘｙｌＡ）、及び感温性の移動性ベクター上のＡフラグメント（ｘｙｌＲ）を含んで成る。それらは、ｐＳＪ５１３１からの０．４ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＳＪ５１９７からの５．３ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントに連結し、そしてその連結混合物を用いて、Ｂ．スブチリスＤＮ１８８５を形質転換し、そして３０℃でエリトロマイシン耐性（５μｇ／ｍｌ）について選択することによって製造された。２種の形質転換体ＳＪ５２４７（ＤＮ１８８５／ｐＳＪ５２４７）及びＳＪ５２４８（ＤＮ１８８５／ｐＳＪ５２４８）を保持した。
【０１３２】
染色体ｘｙｌＡ欠失を有する株の構成：
欠失プラスミドｐＳＪ５２１８を用いて、Ｂ．スブチリス接合ドナー株ＰＰ２８９−５（染色体ｄａｌ−欠失及びプラスミドｐＢＣ１６及びｐＬＳ２０を含む）のコンピテント細胞を形質転換し、形質転換体を、３０℃で、Ｄ−アラニン（１００μｇ／ｍｌ）を含むプレート上で、スペクチノマイシン（１２０μｇ／ｍｌ）、エリトロマイシン（５μｇ／ｍｌ）及びテトラサイクリン（５μｇ／ｍｌ）に対する耐性について選択した。２種の形質転換体ＳＪ５２１９及びＳＪ５２２０を保持した。
【０１３３】
ＷＯ９９／４１３５８号に記載される２−コピーＢ．リケニルホルミスα−アミラーゼ株ＳＪ４６７１を、接合において受容体として使用した。
ドナー株ＳＪ５２１９及びＳＪ５２２０を、Ｄ−アラニン（１００μｇ／ｍｌ）、スペクチノマイシン（１２０μｇ／ｍｌ）、エリトロマイシン（５μｇ／ｍｌ）及びテトラサイクリン（５μｇ／ｍｌ）により補充されたＬＢＰＳＧプレート（リン酸塩（０．０１ＭのＫ３ＰＯ４）、グルコース（０．４％）及びスターチ（０．５％）を有するＬＢプレート）上で３０℃で一晩、増殖した。受容体株を、ＬＢＰＳＧプレート上で一晩、増殖した。
【０１３４】
接種針上のドナー及び受容体を、Ｄ−アラニン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢＰＳＧプレートの表面上で混合し、そして３０℃で５時間インキュベートした。次に、このプレートを、エリトロマイシン（５μｇ／ｍｌ）及びスペクチノマイシン（１２０μｇ／ｍｌ）を有するＬＢＰＳＧ上で複製し、そして３０℃で２日間インキュベートした。それらの４種の接合は、１３〜２５のトランス接合体をもたらした。
【０１３５】
テトラサイクリン感受性（ｐＢＣ１６の不在を示す）トランス接合体を、エリトロマイシン（５μｇ／ｍｌ）及びスペクチノマイシン（１２０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢＰＳＧ上で５０℃で再単離し、一晩インキュベートし、そして５０℃でのプレートからの単一のコロニーを、１０ｍｌのＴＹ液体培養物中に接種し、そして２６℃で３日目、振盪しながらインキュベートした。次に、アリコートを、新鮮な１０ｍｌのＴＹ培養物に移し、そして３０℃で一晩インキュベートした。培養物を、１２０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを有するＬＢＰＳＧ上にプレートし、３０℃での一晩のインキュベーションの後、それらのプレートを、それぞれスペクチノマイシン及びエリトロマイシン上にレプリカ培養し、そしてエリトロマイシン感受性、スペクトロマイシン耐性単離物を、すべての株接合から得た。
【０１３６】
染色体ｘｙｌＡプロモーター、及びｒｅｓ−ｓｐｃ−ｒｅｓカセットにより置換されたｘｙｌＡコード配列の最初の７０個の塩基対を含む次の株を保持した：
ＳＪ５２３１：ＳＪ４６７１受容体、ＳＪ５２１９ドナー；
ＳＪ５２３２：ＳＪ４６７１受容体、ＳＪ５２２０ドナー。
株表現型を、次の通りにして調製されたＴＢＳ最少培地寒天プレート上でアッセイした。４００ｍｌの水及び１０ｇの寒天を１２１℃で２０分間、オートクレーブし、そして６０℃に冷却した。次の無菌溶液を添加する：
【０１３７】
１Ｍのトリス、ｐＨ７．５　　　　　　　　　　 ２５ｍｌ；
２％のＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　 １ｍｌ；
２％のクエン酸三ナトリウム・２Ｈ２Ｏ　　　　１ｍｌ；
１ＭのＫ２ＨＰＯ４　　　　　　　　　　　　　１．２５ｍｌ；
１０％のＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　 １ｍｌ；
１０％のグルタミン　　　　　　　　　　　 １０ｍｌ；及び
２０％のグルコース　　　　　　　　　　 １２．５ｍｌ；又は
１５％のキシロース　　　　　　　　　　 １６．７ｍｌ
【０１３８】
バチルス・リケニホルミスＳＪ４６７１は、グルコース及びキシロースＴＳＳプレート上で良く増殖し、褐色のコロニーを形成した。
ｘｙｌＡ欠失株ＳＪ５２３１−ＳＪ５２３２は、グルコースＴＳＳプレート上で良く増殖するが、しかし非常に薄く、透明な増殖が、長期のインキュベーションの後でさえ、ＴＳＳキシロースプレート上に形成される。それらの株は、単独の炭素源としてキシロースを明らかに使用することができない。
【０１３９】
ｘｙｌ領域中への指図され、且つ選択可能な組み込み：
組み込みプラスミドｐＳＪ５２４７（Ｄ及びＡフラグメントを含む）、及び負の対照としてのｐＳＪ５１９８（Ａフラグメントのみを含む）を用いて、Ｂ．スブチリス接合ドナー株ＰＰ２８９−５（染色体ｄａｌ−欠失、及びプラスミドｐＢＣ１６及びｐＬＳ２０を含む）のコンピテント細胞を形質転換し、形質転換体を、Ｄ−アラニン（１００μｇ／ｍｌ）を有するプレート上でエリトロマイシン（５μｇ／ｍｌ）及びテトラサイクリン（５μｇ／ｍｌ）に対する耐性について３０℃で選択した。
【０１４０】
保持される形質転換体は次のものであった。
ＳＪ５２５５：ＰＰ２８９−５／ｐＳＪ５１９８；
ＳＪ５２５７：ＰＰ２８９−５／ｐＳ５２４８；
ドナー株ＳＪ５２５５及びＳＪ５２５７を、受容体ＳＪ５２３１への接合に使用した。トランス接合体の選択を、３０℃でエリトロマイシン（５μｇ／ｍｌ）に対して行った。トランス接合体をキシロースを含むＴＳＳプレート上に５０℃で画線培養した。同時に、ＳＴ５２２１を、キシロースイソメラーゼ陽性対照株として画線培養した（また、５０℃で）。
【０１４１】
一晩のインキュベーションの後、すべての株は非常に薄く、透明な増殖を形成した。しかしながら、対照は良好に増殖し、そしてコロニーは褐色であった。
５０℃でのもう１日のインキュベーションの後、いくつかの褐色コロニーが、ＳＪ５２５７、すなわちＰｘｙｌＡ−ｘｙｌＡフラグメント（Ｄ）を有する組み込みプラスミドを含む株に由来するトランス接合体において、薄い、透明な増殖のバックグラウンド上に出現した。それらのコロニーは着実に増殖し、そして追加のコロニーが、５０℃での継続したインキュベーションの間、出現した。
褐色コロニー（及び最初の一晩のインキュベーションの後に見られる薄く、透明な増殖よりもさらなる増殖は存在しない）は、ＳＪ５２５５（染色体ｘｙｌＡ遺伝子を回復することができない負の対照）由来のトランス接合体から観察されなかった。
【０１４２】
ｘｙｌ領域中へのα−アミラーゼ遺伝子の意図された組み込み：
ａｍｙＬ含有の組み込みプラスミドの指図された構成：
プラスミドｐＳＪ５２９１及びｐＳＪ５２９２を、組み込みベクタープラスミドｐＳＪ５２４７から、このプラスミドのＢｇｌＩＩによる消化、及びｐＳＪ４４５７からのＢｇｌＩＩ−ＢｃｌＩフラグメントを含む１．９ｋｂのａｍｙＬの挿入により構成した（ＷＯ９９／４１３５８号に記載される）。この連結混合物を用いて、Ｂ．スブチリスＤＮ１８８５を形質転換し、そして２種の形質転換体をＳＪ５２９１及びＤＪ５２９２として保持した。
【０１４３】
接合性ドナー株の構成、Ｂ．リケニホルミス宿主へのトランスファー及び染色体組み込み：
プラスミドｐＳＪ５２９１及びｐＳＪ５２９２を用いて、Ｂ．スブチリス接合ドナー株ＰＰ２８９−５（染色体ｄａｌ−欠失及びプラスミドｐＢＣ１６及びｐＬＳ２０を含む）のコンピテント細胞を形質転換し、形質転換体を、Ｄ−アラニン（１００μｇ／ｍｌ）を含むプレート上で３０℃でエリトロマイシン（５μｇ／ｍｌ）及びテトラサイクリン（５μｇ／ｍｌ）に対する耐性について選択した。
【０１４４】
保持される形質転換体は、ＳＪ５２９３（ＰＰ２９８−５／ｐＳＪ５２９１）及びＳＪ５２９４（ＰＰ２８９−５／ｐＳＪ５２９２）であった。それらの２種の株は、キシロースイソメラーゼ欠失株ＳＪ５２３１及びＳＪ５２３２への接合においてドナーとして使用された。トランス接合体を、エリトロマイシン（５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢＰＧＡプレート上で選択し、そして個々の接合からの１又は２種のテトラサイクリン−感受性トランス接合体を、ＴＳＳ−キシロースプレート上に画線培養し、これを５０℃でインキュベートした。
【０１４５】
２日のインキュベーションの後、良く増殖するコロニーを、抗生物質を有さない液体ＴＹ培地（１０ｍｌ）中に接種し、そしてそれらの培養物を３０℃で振盪しながらインキュベートした。一晩のインキュベーションの後、個々の培養物１００μｌを、新しい１０ｍｌのＴＹ培養物に移し、そしてインキュベーションを反復した。この方法をさらに２回、反復し、そしてさらに、培養物を３０℃でＴＳＳ−キシロースプレート上にプレートした。約１週間後、すべてのプレートを、ＴＳＳ−キシロース、及びエリトロマイシン（５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢＰＳＧ上に複製した。次の日、推定上のＥｍ−感受性株を、同じプレート型上に再画線培養した。
【０１４６】
すべてＴＳＳ−キシロースプレート上で良く増殖する次のＥｍ感受性株を保持した：
ＳＪ５３０８（接合ドナーＳＪ５２９３、宿主ＳＪ５２３１からの）；
ＳＪ５３０９（接合ドナーＳＪ５２９３、宿主ＳＪ５２３１からの）；
ＳＪ５３１０（接合ドナーＳＪ５２９３、宿主ＳＪ５２３２からの）；
ＳＪ５３１５（接合ドナーＳＪ５２９４、宿主ＳＪ５２３１からの）。
【０１４７】
サザン分析：
２−コピーａｍｙＬ株ＳＪ４６７１、及び株ＳＪ５３０３， ＳＪ５３０９， ＳＪ５３１０及びＳＪ５３１５を、ＴＹ−グルコースにおいて一晩、増殖し、そして染色体ＤＮＡを抽出した。染色体ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、アガロースゲル電気泳動により分離されたフラグメントを、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｎ（商標）フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標））に移し、そしてＨｉｎｄＩＩＩにより消化されたｐＳＪ５２９２に基づいてビオチニル化されたプローブにハイブリダイズした（ＮＥＢｌｏｔ Ｐｈｏｔｏｐｅ Ｋｉｔ 及びＰｈｏｔｏｐｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ ６ｋを用いて）。
【０１４８】
前記２−コピー株においては、２種のａｍｙｌ遺伝子コピーが、約１０ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメント上に存在する。さらに、ｘｙｌ領域へのハイブリダイゼーションのためである約２．８ｋｂのフラグメントがハイブリダイズする。キシロース遺伝子領域中への第３のａｍｙＬ遺伝子の挿入を有する４種の株にいては、約２．８ｋｂのフラグメントが欠失しており、そして約４．６ｋｂのフラグメントにより置換されていた。これは、キシロース遺伝子領域中へのａｍｙＬ遺伝子の組み込みに基づいて完全に予測される。２−コピー挿入のために約１０ｋｂのフラグメントが保持される。
結論として、サザン分析は、株ＳＪ５３０８， ＳＪ５３０９， ＳＪ５３１０及びＳＪ５３１５がそれらの染色体に、正しく挿入された第３ａｍｙＬ遺伝子コピーを有することを示す。
【０１４９】
振盪フラスコ評価：
キシロースイソメラーゼ領域に組み込まれるａｍｙＬ遺伝子を有する株、及びいくつかの対照株を、振盪フラスコにおける１００ｍｌのＢＰＸ培地中に接種し、そして３００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で７日間インキュベートした。
培養物ブイヨンにおけるα−アミラーゼ活性をＰｈａｄｅｂａｓアッセイにより決定した：
【０１５０】
相対的α−アミラーゼ
株　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　単位／ｍｌ
────────────────────────────────────
ＳＪ４２７０（１−コピーａｍｙＬ株）　　　　　　　　　　　　　１００
ＳＪ４６７１（２−コピーａｍｙＬ株）　　　　　　　　　　　　　１６１
ＳＪ５２３１（ｘｙｌＡ遺伝子欠失を有する２−コピーａｍｇＬ）　　　１４８
ＳＪ５３０８（３−コピーａｍｙＬ株）　　　　　　　　　　　　　２００
ＳＪ５３０９（３−コピーａｍｙＬ株）　　　　　　　　　　　　　２４５
ＳＪ５３１０（３−コピーａｍｙＬ株）　　　　　　　　　　　　　２００
ＳＪ５３１５（３−コピーａｍｙＬ株）　　　　　　　　　　　　　２００
────────────────────────────────────
【０１５１】
個々の振盪フラスコからのアリコートを、アミラーゼインジケータープレート上にプレートした。すべてのコロニーはアミラーゼ陽性であった。ＳＪ４６７１， ＳＪ５３０９およびＳＪ５３１５の個々からの４個の単一コロニーを、新鮮なＢＰＸ振盪フラスコ中に接種し、これを上記のようにして培養した。培養物ブイヨンにおけるα−アミラーゼ活性をＰｈａｄｅｂａｓアッセイにより決定した。
【０１５２】
相対的α−アミラーゼ
株　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　単位／ｍｌ
────────────────────────────────────
ＳＪ４６７１（２−コピーａｍｙＬ株）　　　　　　　　１００
ＳＪ４６７１　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０２
ＳＪ４６７１　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ８８
ＳＪ４６７１　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ８４
ＳＪ５３０９（３−コピーａｍｙＬ株）　　　　　　　　１４９
ＳＪ５３０９　　　　　　　　　　　　　　　　　　１４１
ＳＪ５３０９　　　　　　　　　　　　　　　　　　１３５
ＳＪ５３０９　　　　　　　　　　　　　　　　　　１４９
ＳＪ５３１５（３−コピーａｍｙＬ株）　　　　　　　　１３５
ＳＪ５３１５　　　　　　　　　　　　　　　　　　１４７
ＳＪ５３１５　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５９
ＳＪ５３１５　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５３
────────────────────────────────────
それらの振盪フラスコ条件下で、３−コピーａｍｙＬ株は、２−コピー株よりも約５０％、よりα−アミラーゼを生成するように思われる。
【０１５３】
例２：
Ｂ．リケニホルミスα−アミラーゼ遺伝子ａｍｙＬの領域において反対方向に相対的配向で挿入されている、その染色体に２つの安定して組み込まれたａｍｙＬ遺伝子コピーを有するバチルス・リケニホルミスの株は、ＳＪ４６７１として、ＷＯ９９／４１３５８号に記載されている。ａｍｙＬ遺伝子の第３コピーを、上記のようにしてｘｙｌＲＡに挿入した。
これは、Ｂ．リケニホルミス染色体のもう１つの領域中への選択可能な指図された組み込みによる第４のａｍｙＬ遺伝子コピーのこの３−コピー株中への挿入を記載する。
【０１５４】
グルコネート欠失／組み込み概略（図２）：
グルコネート利用のためのｇｎｔＲ， ｇｎｔＫ， ｇｎｔＰ， ｇｎｔＺ遺伝子を含んで成るバチルス・リケニホルミスグルコネートオペロンの配列領域は、受託番号Ｄ３１６３１としてＧｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬから入手できる。前記領域は、図２に示されるように図解され得る。
【０１５５】
欠失を、“Ａ”（ｇｎｔＫの一部及びｇｎｔＰ遺伝子の一部を含む）及び“Ｂ”（ｇｎｔＺの内部フラグメントを含む）として示される、ＰＣＲ増幅されたフラグメントを、感温性プラスミド上にクローニングすることによって導入した。欠失株の選択における助力として、レゾルバーゼ部位を両端に有するカナマイシン耐性遺伝子を、フラグメント“Ａ”と“Ｂ”との間に導入し、図２における“欠失プラスミド”と称するプラスミドをもたらした。このカナマイシン耐性遺伝子は、ＷＯ９６／２３０７３号に記載されるように、レゾルバーゼ介在性部位特異的組換えにより、後で除去された。
【０１５６】
欠失を、感温性プラスミドの組み込み及び切除により介在されるフラグメント“Ａ”及び“Ｂ”を通しての二重相同組換えにより標的株の染色体にトランスファした。その結果は、図２において“欠失株”と称する株であった。この株は、単独の炭素源としてグルコネートを含む最少培地上で増殖することはできない。
【０１５７】
プラスミド構成体：
遺伝子挿入のために使用される組み込みプラスミドを構成するために、ＰＣＲフラグメント“Ｃ”を増幅した。このフラグメントは、約１ｋｂのｇｎｔＰの内部フラグメントを含んだ。組み込みプラスミドは、感温性ベクター上でのフラグメント“Ｂ”及び“Ｃ”から成る。組み込みのために予定される発現カセットを、“Ｂ”と“Ｃ”との間にクローン化した。Ｂ．リケニホルミス欠失株へのトランスファ−及び感温性ベクターの組み込み及び切除に基づいて、単独の炭素源としてグルコネートを含む最少培地上で増殖した株を単離した。
【０１５８】
そのような株は、フラグメント“Ｂ”及び“Ｃ”を通しての二重相同組換えにより染色体ｇｎｔＰ遺伝子を回復した。この工程において、発現カセットは、染色体中に組み込まれ、図２の“組み込み株”がもたらされた。
ＰＣＲ増幅を、５５℃のアニーリング温度を用いて、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＢｉｏｔｅｃｈからのＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ ＰＣＲ Ｂｅａｄｓにより、その製造業者の説明書に記載のようにして行った。
【０１５９】
欠失プラスミドｐＭＯＬ１７８９及びｐＭＯＬ１７９０：
“Ｂ”フラグメント（ｇｎｔＺの内部部分を含む）を、バチルス・リケニホルミスからの染色体ＤＮＡから、下記プライマーを用いて増殖した：
＃１８７３３８［ＡｖａＩ←Ｄ３１６３１ ４９０３−４９２２→］（配列番号６）：
５’−ＴＡＴＴＴＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＴＧＴＴＡＴＣＧＡＣＴＣＧＣＴＣ；
＃１８７３３９［ＥａｇＩ←Ｄ３１６３１ ５５５３−５５３８→］（配列番号７）：
５’−ＧＴＴＴＴＣＧＧＣＣＧＣＴＧＴＣＣＧＴＴＣＧＴＣＴＴＴ。
【０１６０】
フラグメントを、ＡｖａＩ及びＥａｇＩにより消化し、ＡｖａＩ及びＥａｇＩにより消化されたｐＭＯＬ１６４２に連結し、そしてその連結されたプラスミドを、形質転換により、Ｂ．スブチリスＪＡ５７８中に導入し、エリトロマイシン耐性（５μｇ／ｍｌ）について選択した。３種のクローンの挿入体を配列決定し、そしてすべては正しいことが見出された。ＭＯＬ１７８９（ＪＡ５７８（ｒｅｐＦ＋）／ｐＭＯＬ１７８９）及びＭＯＬ１７９０（ＪＡ５７８／ｐＭＯＬ１７９０）を保持した。ｇｎｔＺに対する“Ｂ”フラグメントのエンドポイントが、図２に示される。
【０１６１】
プラスミドｐＭＯＬ１８２０及びｐＭＯＬ１８２１：
“Ａ”フラグメント（ｇｎｔＫの一部及びｇｎｔＰ遺伝子の一部を含む）を、バチルス・リケニホルミスの染色体ＤＮＡから、下記プライマーを用いて増幅した：
＃１８４７３３［←Ｄ３１６３１ ３７３８−３７１２→］（配列番号８）：
５’−ＧＴＧＴＧＡＣＧＧＡＴＡＡＧＧＣＣＧＣＣＧＴＣＡＴＴＧ；
＃１８４７８８［←Ｄ３１６３１ ３０４１−３０６８→］（配列番号９）：
５’−ＣＴＣＴＴＧＴＣＴＣＧＧＡＧＣＣＴＧＣＡＴＴＴＴＧＧＧＧ。
【０１６２】
前記フラグメントを、ＣｌａＩ及びＥｃｏＲＩにより消化し、ＥｃｏＲＩ及びＣｌａＩにより消化されたｐＭＯＬ１７８９に連結し、そしてＢ．スブチリスＰＬ１８０１を形質転換により形質転換し、エリトロマイシン耐性（５μｇ／ｍｌ）について選択した。３種のクローン上の挿入体を配列決定し、そしてすべては正しいことが見出された。ＭＯＬ１８２０（ＪＡ５７８／ｐＭＯＬ１８２０）及びＭＯＬ１８２１（ＪＡ５７８／ｐＭＯＬ１８２１）を保持した。ｇｎｔＺに対する“Ａ”フラグメントのエンドポイントを図２に示す。
【０１６３】
組み込みプラスミドｐＭＯＬ１９１２及びｐＭＯＬ１９１３：
それらのプラスミドは、ｇｎｔＫの短いＣ−末端部分、及び感温性、移動可能ベクター上のｇｎｔＰの完全な読み取り枠（“Ｃ”フラグメント）を含む。それらを、下記プライマーを用いて、バチルス・リケニホルミスの染色体ＤＮＡから増幅された０．９ｋｂのフラグメントを連結することによって製造した：
＃１６５６Ｄ０７［←Ｄ３１６３１ ３６１７−３６４２→］（配列番号１０）：
５’−ＡＧＣＡＴＴＡＴＴＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣＧＣＡＴＴＧＧ；
＃Ｂ１６５９Ｆ０３［ＢｇｌＩＩ←Ｄ３１６３１ ４６３７−４６０２→］（配列番号１１）：
５’−ＴＴＡＡＧＡＴＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＣＡＡＡＴＡＧＧＣＴＴＡＡＣＡＡＴＡＡＡＧＴＡＡＡＴＣＣ。
【０１６４】
前記フラグメントを、ＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩにより消化し、ＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩにより消化されたｐＭＯＬ１８２０に連結し、そしてその連結混合物を用いて、形質転換によりＢ．スブチリスＰＬ１８０１を形質転換し、エリトロマイシン耐性（５μｇ／ｍｌ）について選択した。３種のクローン上の挿入体を配列決定し、そしてすべては正しいことが見出された。ＭＯＬ１９１２（ＰＬ１８０１／ｐＭＯＬ１７８９）及びＭＯＬ１９１３（ＰＬ１８０１／ｐＭＯＬ１９１３）を保持した。ｇｎｔＺに対する“Ｃ”フラグメントのエンドポイントは、図２に示される。
【０１６５】
それらのフラグメントは、それらがｇｎｔＰ遺伝子のすぐ上流にプロモーター配列を有さない場合でさえ、機能的ｇｎｔＰを発現することが見出された。グルコネートに基づいての増殖について選択することによって、ｇｎｔＰ領域における直接的な組み込みを可能にするためには、組み込みプラスミドｐＭＯＬ１９１２上のｇｎｔＰ遺伝子のＮ−末端配列の一部を欠失することが必要であった。
【０１６６】
プラスミドｐＭＯＬ１９７２及びｐＭＯＬ１９７３：
それらのプラスミドは、Ｎ−末端の５３個のアミノ酸をコードする最初の１５８ｋｂを除いて、全ｇｎｔＰ遺伝子を含むｐＭＯＬ１９１２の欠失誘導体である。プラスミドｐＭＯＬ１９１２を、ＳｔｕＩ及びＥｃｏＲＶにより消化し、そして再連結した。連結混合物を用いて、Ｂ．スブチリスＰＬ１８０１を形質転換し、エリトロマイシン耐性（５μｇ／ｍｌ）について選択した。欠失を、制限消化により確証した。ＭＯＬ１９７２（ＰＬ１８０１／ｐＭＯＬ１９７２）及びＭＯＬ１９７３（ＰＬ１８０１／ｐＭＯＬ１９７３）を保持した。
【０１６７】
それらのプラスミドは、ｇｎｔＰ欠失されたバックグラウンドにおいて遊離プラスミドとして導入される場合、ＴＳＳグルコネートプレート上で増殖を維持しない。染色体ｇｎｔＰ欠失を有する株の構成：
欠失プラスミドｐＭＯＬ１９２０を用いて、Ｂ．スブチリス接合ドナー株ＰＰ２８９−５（染色体ｄａｌ−欠失、及びプラスミドｐＢＣ１６及びｐＬＳ２０を含む）のコンピテント細胞を形質転換し、Ｄ−アラニン（１００μｇ／ｍｌ）を有するプレート上で３０℃で、カナマイシン耐性（１０μｇ／ｍｌ）、エリトロマイシン耐性（５μｇ／ｍｌ）及びテトラサイクリン耐性（５μｇ／ｍｌ）について選択した。２種の形質転換体ＭＯＬ１８２２及びＭＯＬ１８２３を保持した。
【０１６８】
ＷＯ９９／４１３５８号に記載される２−コピーＢ．リケニホルミスα−アミラーゼ株ＳＪ４６７１を、接合における受容体として使用した。
ドナー株ＭＯＬ１８２２及びＭＯＬ１８２３を、Ｄ−アラニン（１００μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（１０μｇ／ｍｌ）、エリトロマイシン（５μｇ／ｍｌ）及びテトラサイクリン（５μｇ／ｍｌ）により補充されたＬＢＰＳＧプレート（リン酸塩（０．０１ＭのＫ３ＰＯ４）、グルコース（０．４％）及び澱粉（０．５％）を有するＬＢプレート）上で３０℃で一晩、増殖した。受容体株を、ＬＢＰＳＧプレート上で一晩、増殖した。
【０１６９】
ループいっぱいのドナー及び受容体を、Ｄ−アラニン（１００μｇ／ｍｌ）を有するＬＢＰＳＧプレートの表面上で混合し、そして３０℃で５時間インキュベートした。次に、このプレートを、エリトロマイシン（５μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢＰＳＧ上で複製し、そして３０℃で２日間インキュベートした。それらの４回の接合は、２５〜５０個のトランス接合体をもたらした。
【０１７０】
テトラサイクリン感受性（ｐＢＣ１６の不在を示す）トランス接合体を、エリトロマイシン（５μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢＰＳＧ上で５０℃で再単離し、一晩インキュベートし、そして５０℃でのプレートからの単一のコロニーを、１０ｍｌのＴＹ液体培養物に接種し、そして振盪しながら、２６℃で３日間インキュベートし、次にアリコートを新鮮な１０ｍｌのＴＹ培養物に移し、そしてインキュベーションを３０℃で一晩続けた。次に、培養物を、１０μｇ／ｍｌのカナマイシンを有するＬＢＰＳＧ上にプレートし、３０℃での一晩のインキュベーションの後、それらのプレートを、それぞれ、カナマイシン及びエリトロマイシン上にレプリカ培養し、そしてエリトロマイシン感受性、カナマイシン耐性単離物を、すべての株の組合せから得た。Ｃ−末端をコードするｇｎｔＰ遺伝子の一部がｒｅｓ−ｋａｎａ−ｒｅｓカセットイより置換される次の株と維持した：
【０１７１】
ＭＯＬ１８７１：ＳＪ４６７１受容体、ＭＯＬ１８２２ドナー；
ＭＯＬ１８７２：ＳＪ４６７１受容体、ＭＯＬ１８２３ドナー。
株表現型を、次の通りにして調製されたＴＢＳ最少培地寒天プレート上でアッセイした：
４００ｍｌの水及び１０ｇの寒天を１２１℃で２０分間、オートクレーブし、そして６０℃に冷却した。次の無菌溶液を添加する：
【０１７２】
１Ｍのトリス、ｐＨ７．５　　　　　　　　　２５ｍｌ；
２％のＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　１ｍｌ；
２％のクエン酸三ナトリウム・２Ｈ２Ｏ　　 １ｍｌ；
１ＭのＫ２ＨＰＯ４　　　　　　　　　　　 １．２５ｍｌ；
１０％のＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　１ｍｌ；
１０％のグルタミン　　　　　　　　　　１０ｍｌ；及び
２０％のグルコース　　　　　　　　　１２．５ｍｌ；又は
１５％のグルコネート　　　　　　　　１６．７ｍｌ
【０１７３】
バチルス・リケニホルミスＳＪ４６７１は、グルコース及びグルコネートＴＳＳプレート上で良く増殖し、褐色のコロニーを形成した。ｇｎｔＰ欠失株ＭＯＬ１８７１及びＭＯＬ１８７２は、グルコースＴＳＳプレート上で良く増殖するが、しかし非常に薄く、透明な増殖が、長期のインキュベーションの後でさえ、ＴＳＳグルコネートプレート上に形成される。それらの株は、単独の炭素源としてグルコネートを明らかに使用することができない
同じｇｎｔＰ欠失方法を、アミラーゼ発現カセットの第４コピーの組み込みを調製するために、前記に記載される３−コピー株ＳＪ５３０９に対して行う。
【０１７４】
ｇｎｔ領域中への指図され、且つ選択可能な組み込み：
組み込みプラスミドｐＭＯＬ１９７２（“Ｂ”及び“Ｃ”フラグメントを含む）、及び負の対照としてのｐＭＯＬ１７８９（“Ｂフ”ラグメントのみを含む）を用いて、Ｂ．スブチリス接合ドナー株ＰＰ２８９−５（染色体ｄａｌ−欠失、及びプラスミドｐＢＣ１６及びｐＬＳ２０を含む）のコンピテント細胞を形質転換し、形質転換体を、Ｄ−アラニン（１００μｇ／ｍｌ）を有するプレート上でエリトロマイシン（５μｇ／ｍｌ）及びテトラサイクリン（５μｇ／ｍｌ）に対する耐性について３０℃で選択した。
【０１７５】
保持される形質転換体は次のものであった。
ＭＯＬ１９７４：ＰＰ２８９−５／ ｐＭＯＬ１９７２；
ＭＯＬ１９７５：ＰＰ２８９−５／ ｐＭＯＬ１９７３；
ドナー株ＭＯＬ１９７４及びＭＯＬ１９７５を、受容体ＭＯＬ１８７１及びＭＯＬ１８７２への接合に使用した。トランス接合体の選択を、３０℃でエリトロマイシン（５μｇ／ｍｌ）に対して行った。トランス接合体をグルコネートを含むＴＳＳプレート上に５０℃で画線培養した。同時に、ＳＪ４６７１を、グルコネート陽性対照株として画線培養した（また、５０℃で）。
【０１７６】
一晩のインキュベーションの後、すべての株は非常に薄く、透明な増殖を形成した。しかしながら、対照は良好に増殖し、そしてコロニーは褐色であった。５０℃でのもう１日のインキュベーションの後、いくつかの褐色コロニーが、ＭＯＬ１８７１及びＭＯＬ１８７２に由来するトランス接合体において、薄い、透明な増殖のバックグラウンド上に出現した。それらのコロニーは着実に増殖し、そして追加のコロニーが、５０℃での継続したインキュベーションの間、出現した。
コロニーは、ｇｎｔＰ欠失株ＭＯＬ１８７１及びＭＯＬ１８７２から観察されなかった。
【０１７７】
α−アミラーゼ遺伝子のｇｎｔ領域中への指図された組み込み：
ａｍｙＬ含有組み込みプラスミドの構成：
次のことが上記の選択原理を用いて、ｇｎｔ領域にα−アミラーゼ遺伝子を有する発現カセットを組み込むための構成計画である。組み込みプラスミドｐＭＯＬ１９７２をＢｇｌＩＩにより消化し、そしてｐＳＪ４４５７（ＷＯ９９／４１３５８号に記載される）からのａｍｙＬを含む１．９ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＢｃｌＩフラグメントを、連結により挿入する。次にその連結混合物を用いて、Ｂ．スブチリスＤＮ１８８５を形質転換し、そしてエリトロマイシン（５μｇ／ｍｌ）を有するＬＢＰＳＧプレート上で選択された形質転換体を、プラスミドＤＮＡの制限消化により確かめた。
【０１７８】
接合性ドナー株、Ｂ．リケニホルミスへのトランスファー及び染色体組み込み：　発現カセットを有する組み込みプラスミドを用いて、Ｂ．スブチリス接合ドナー株ＰＰ２８９−５（染色体ｄａｌ−欠失、及びプラスミドｐＢＣ１６及びｐＬＳ２０を含む）のコンピテント細胞を形質転換し、Ｄ−アラニン（１００μｇ／ｍｌ）を含むプレート上でエリトロマイシン（５μｇ／ｍｌ）及びテトラサイクリン（５μｇ／ｍｌ）に対する耐性について５℃で選択した。
発現カセットを含む組み込みプラスミドを含んで成る形質転換体を保存し、そして上記欠失株ＭＯＬ１８７１及びＭＯＬ１８７２について記載されるようにして構成された３−コピー株ＳＪ５３０９のｇｎｔＰ欠失受容体との接合においてドナーとして使用される。
【０１７９】
トランス接合体を、エリトロマイシン（５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢＰＧＡプレート上で選択し、そして個々の接合からの１又は２種のテトラサイクリン−感受性トランス接合体を、ＴＳＳ−グルコネートプレート上に画線培養し、これを５０℃でインキュベートした。２日のインキュベーションの後、良く増殖するコロニーを、抗生物質を有さない液体ＴＹ培地（１０ｍｌ）中に接種し、そしてそれらの培養物を３０℃で振盪しながらインキュベートした。一晩のインキュベーションの後、個々の培養物１００μｌを、新しい１０ｍｌのＴＹ培養物に移し、そしてインキュベーションを反復した。この方法をさらに２回、反復し、そしてさらに、培養物を３０℃でＴＳＳ−グルコネートプレート上にプレートした。
【０１８０】
約１週間後、すべてのプレートを、ＴＳＳ−グルコネート、及びエリトロマイシン（５μｇ／ｍｌ）を有するＬＢＰＳＧ上にレプリカ培養し、そしてインキュベートする。次の日、推定上のＥｍ感受性株を、同じプレート型に再画線培養する。
前述のキシロース領域における組み込みに関して、サザン分析及び振盪フラスコ評価を行い、α−アミラーゼ発現カセットのｇｎｔ領域における組み込みの部位、及びこの４−コピー株からの高められた収率を確かめる。
【０１８１】
例３：
バチルス・リケニホルミスＳＴ４６７１（ＷＯ９９／４１３５８号）は、Ｂ．リケニホルミスのα−アミラーゼ遺伝子、ａｍｙＬの領域に対向する相対的配向で挿入される、その染色体に２つの安定して組み込まれるａｍｙＬ遺伝子コピーを含んで成る。次の例は、Ｂ．リケニホルミス染色体のもう１つの定義される領域中への選択できる、意図された組み込みによる第３のａｍｙＬ遺伝子コピーのこの株中への挿入を記載する。
【０１８２】
Ｄ−アラニンラセマーゼ欠失／組み込みの概略：
バチルス・リケニホルミスＤ−アラニンラセマーゼ領域のＤＮＡ配列をこの研究において決定し、そして配列番号１２における位置１３０３−２４６９に示される。“Ｄａｌ−欠失プラスミド”と称するプラスミドを、感温性親プラスミド上にバチルス・リケニホルミスのＤ−アラニンラセマーゼ領域からの１つの２２８１ｂｐのＰＣＲ増幅されたフラグメントをクローニングすることによって構成した。２２８１ｂｐのＰＣＲフラグメントを“Ａ”と称し、ここでＡは、ｄａｌ遺伝子のＡＴＧ開始コドンの上流の２４５塩基対〜ｄａｌ遺伝子の下流の８６７塩基対の配列を含んで成る。
【０１８３】
クローン化されたフラグメントＡ上のｄａｌ遺伝子のＣ−末端部分の５８６塩基対の欠失を行い、下記に示されるようなフラグメント“Ｂ”及び“Ｃ”を含むプラスミドをもたらした。レゾルバーゼ（ｒｅｓ）部位を両端に有するスペクチノマイシン耐性遺伝子を、プラスミド上のフラグメント“Ｂ”と“Ｃ”との間に導入した。このスペクチノマイシン耐性遺伝子は後で、レゾルバーゼ介在性部位特異的組換えにより除去する。
【０１８４】
Ｄ−アラニンラセマーゼ欠失を、感温性Ｄａｌ−欠失プラスミドの組み込み及び切除により介在される、フラグメント“Ｂ”及び“Ｃ”を通しての二重相同組換えによりＤａｌ−欠失プラスミドからバチルス標的株の染色体にトランスファーした。得られる株は、“Ｄａｌ−欠失株”と称した。この株は、単独の炭素源としてＤ−アラニンを含まない培地上で増殖することはできない。
【０１８５】
組み込みプラスミドを、欠失株のＤ−アラニン領域中への遺伝子の挿入のために構成した。ＡＴＧ開始コドンの下流の４１塩基対から出発してｄａｌ遺伝子の１１１７塩基対を含んで成る、“Ｄ”と称するフラグメントをＰＣＲ−増幅することが意図された。プロモーター領域を、Ｅ．コリｒｒｎＢリボソームＲＮＡオペロン（ＥＭＢＬ／ｅ０９０２３：塩基対１９７−２９５）の３’−末端配列からのＴ１及びＴ２ターミネーターにより置換した。
【０１８６】
組み込みプラスミドは、感温性ベクター上のフラグメントＤ及びＣを含んで成る。組み込みのために意図される発現カセットを、フラグメントＤとＣとの間にクローン化した。感温性ベクターのＢ．リケニホルミス欠失株へのトランスファー、組み込み及び切除に基づいて、Ｄ−アラニンを有さない培地上で増殖する株を単離した。そのような“組み込み株”は、フラグメントＤ及びＣを通しての二重相同組換えにより、染色体ｄａｌ遺伝子を回復した。
【０１８７】
プラスミド構成：
ＰＣＲ増幅を、５５℃のアニーリング温度を用いて、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＢｉｏｔｅｃｈからのＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ ＰＣＲ Ｂｅａｄｓにより、その製造業者の説明書に記載のようにして行った。
【０１８８】
プラスミドｐＪＡ７４４：
Ａフラグメント（ｄａｌ−領域）を、バチルス・リケニホルミスＳＪ４６７１染色体ＤＮＡから次のプライマーを用いて増幅した：
＃１４８７７９：［ｄａｌ領域におけるＳｐｈＩ部位の上流］（配列番号１４）：
５’−ＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＡＴＧＧＴＴＧＣ；
＃１４８７８０：［ＢａｍＨＩ＜ｄａｌ］ （配列番号１５）：
５’−ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＣＣＣＴＧＡＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＣ。
【０１８９】
ＰＣＲフラグメントを、ＳｐＨＩ及びＢａｍＨＩにより消化し、そして精製し、次に、ＳｐｈＩ及びＢａｍＨＩにより消化されたｐＰＬ２４３８に連結した。Ｂ．スブチリスＪＡ６９１（ｒｅｐＦ＋， ｄａｌ−）コンピテント細胞の前記連結混合物による形質転換に続いて、カナマイシン耐性（１０μｇ／ｍｌ）について選択した。正しいクローンは、ＪＡ６９１ ｄａｌ表現型を補充することができた。
【０１９０】
プラスミドｐＪＡ７７０：
このプラスミドは、ＢとＣとのフラグメント間に挿入されたｒｅｓ−ｓｐｃ−ｒｅｓカセットを含む。それは、ｐＪＡ７４４のＢｃｌＩ−ＢｃｌＩ部位中にｐＳＪ３３５８からの１．５ｋｂのＢｃｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを連結することによって構成された。連結混合物によるＢ．スブチリスＪＡ６９１コンピテント細胞の形質転換に続いて、カナマイシン耐性（１０μｇ／ｍｌ）及びスペクチノマイシン耐性（１２０μｇ／ｍｌ）について選択した。スペクチノマイシン耐性遺伝子の配向を、ＢｃｌＩ及びＢａｍＨＩにより切断することによって決定することができた。
【０１９１】
Ｄａｌ欠失プラスミド：
プラスミドｐＪＡ８５１：
フラグメント（ｅｒｍＣ遺伝子及びｐＥ１９４の複製起点を含んで成る）を、下記プライマーを用いて、ｐＳＪ２７３９プラスミドＤＮＡからＰＣＲ増幅した：
＃１７００４６ ［ＮｏｔＩ；＜ｅｒｍＣ遺伝子及びｐＥ１９４の複製起点］（配列番号１６）：
５’−ＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＧＡＣＴＧＴＧＡＣＧＧＡＴＧＡＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＣ；
＃１７００４７［ＥｃｏＲＩ；←ｅｒｍＣ遺伝子及びｐＥ１９４の複製起点→］（配列番号１７）：
５’−ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＧＴＧＡＡＡＴＣＡＧＣＴＧＧＡＣＴＡＡＡＡＧＧ。
ＰＣＲフラグメントを、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩにより消化し、そして精製し、次にＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩにより消化されたｐＪＡ７７０に連結した。その連結混合物によるＳ．スブチリスＪＡ６９１コンピテント細胞の形質転換に続いて、エリトロマイシン耐性（５μｇ／ｍｌ）及びスペクチノマイシン耐性（１２０μｇ／ｍｌ）について選択した。
【０１９２】
プラスミドｐＪＡ７４８：
フラグメント（プロモーター領域を伴なわないで、ｄａｌ遺伝子を含んで成る）を、バチルス・リケニホルミスＳＪ４６７１ ＤＮＡから下記プライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
＃１５０５０６［ＢａｍＨＩ；＜ｄａｌ遺伝子］（配列番号１８）：
５’−ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＡＡＧＴＴＧＴＴＴＴＴＣＣＧＣ；
＃１５０５０７［ｋｐｎＩ；＜−ｄａｌ遺伝子］（配列番号１９）：
５’−ＡＡＡＧＧＴＡＣＣＧＡＡＡＧＡＣＡＴＧＧＧＣＣＧＡＡＡＴＣＧ。
ＰＣＲフラグメントを、ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩにより消化し、そして精製し、次にＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩにより消化されたｐＰＬ２４３８に連結した。Ｂ．スブチリスＪＡ６９１コンピテント細胞の前記連結混合物による形質転換に続いて、カナマイシン耐性（１０μｇ／ｍｌ）について選択した。
【０１９３】
プラスミドｐＪＡ７６２：
フラグメント（ｂｐ１９７〜２９５のＥ．コリｒｒｎＢ末端配列ＥＭＢＬ［ｅ０９０２３］からのＴ１及びＴ２ターミネーターを含んで成る）を、Ｅ．コリＳＪ２ ＤＮＡから下記プライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
＃１５８０８９［ｋｐｎＩ；＜ｒｒｎＢのＴ１及びＴ２ターミネーター］（配列番号２０）：
５’−ＡＡＡＧＧＴＡＣＣＧＧＴＡＡＴＧＡＣＴＣＴＣＴＡＧＣＴＴＧＡＧＧ；
＃１５８０９０［ＣｌａＩ；ｒｒｎＢのＴ１及びＴ２ターミネーター］（配列番号２１）：
５’−ＣＡＡＡＴＣＧＡＴＣＡＴＣＡＣＣＧＡＡＡＣＧＣＧＧＣＡＧＧＣＡＧＣ。
ＰＣＲフラグメントを、ＫｐｎＩ及びＣｌａＩにより消化し、そして精製し、次にＫｐｎＩ及びＣｌａＩにより消化されたｐＪＡ７４８に連結した。Ｂ．スブチリスＪＡ６９１コンピテント細胞の前記連結混合物による形質転換に続いて、カナマイシン耐性（１０μｇ／ｍｌ）について選択した。
【０１９４】
プラスミドｐＪＡ７６７：
フラグメント（ｄａｌ（ＤＦＳ）の下流の０．７ｋｂｐのＤＮＡ配列を含んで成る）を、Ｂ．リケニホルミスＳＪ４６７１（ＷＯ９９／４１３５８）ＤＮＡから、下記プライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
＃１５０５０８［ＨｉｎｄＩＩＩ；＜ＤＦＳ］（配列番号２２）：
５’−ＡＴＴＡＡＧＣＴＴＧＡＴＡＴＧＡＴＴＡＴＧＡＡＴＧＧＡＡＴＧＧ；
＃１５０５０９［ＮｈｅＩ：＜ＤＦＳ］（配列番号２３）：
５’−ＡＡＡＧＣＴＡＧＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＡＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＣ。
ＰＣＲフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｈｅＩにより消化し、そして精製し、次にＫｐｎＩ及びＣｌａＩにより消化されたｐＪＡ７６２に連結した。前記連結混合物によるＢ．スブチリスＪＡ６９１コンピテント細胞の形質転換に続いて、カナマイシン耐性（１０μｇ／ｍｌ）について選択した。
【０１９５】
プラスミドｐＪＡ７７６：
このプラスミドは、Ｄ及びＣフラグメントを両端に有するａｍｙＬカセットを含む。それは、ｐＳＪ４４５７からの２．８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｈｅＩフラグメントを、ｐＪＡ７６７からの４．２ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントに連結し、そしてその連結混合物によりＢ．スブチリスＪＡ６９コンピテント細胞を形質転換し、続いてカナマイシン耐性（１０μｇ／ｍｌ）について選択することによって構成された。
【０１９６】
Ｄａｌ組み込みプラスミド：
プラスミドｐＪＡ１０２０：
このプラスミドは、Ｄ及びＣフラグメントを両端に有するａｍｙＬカセットを含む。さらに前記プラスミドは、プラスミドｐＥ１９４複製起点、ｒｅｐＦ及びＥｍｒ−遺伝子を含む。それは、ｐＪＡ７７６の２．７ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＮｈｅＩフラグメントを、ｐＪＡ８５１の３．８ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＮｈｅＩフラグメントに連結し、そしてその連結混合物を用いて、Ｂ．スブチリスＪＡ６９１コンピテント細胞を形質転換し、続いてエリトロマイシン耐性（５μｇ／ｍｌ）について選択することによって構成された。
【０１９７】
染色体ｄａｌ欠失の構成：
欠失プラスミドｐＪＡ８５１を用いて、Ｂ．スブチリス接合ドナー株ＰＰ２８９−５（染色体ｄａｌ−欠失及びプラスミドｐＢＣ１６及びｐＬＳ２０を含む）を形質転換し、そして形質転換体を、Ｄ−アラニンを有するプレート上でスペクチノマイシン（１２０μｇ／ｍｌ）、エリトロマイシン（５μｇ／ｍｌ）及びテトラサイクリン（５μｇ／ｍｌ）に対する耐性について３０℃で選択した。形質転換体をＪＡ９５４として維持し、そして次の接合実験においてドナーとして使用した。
【０１９８】
２−コピーａｍｙＬ Ｂ．リケニホルミスＳＪ４６７１（ＷＯ９９／４１３５８号）を、次の接合実験において受容体として使用した。
ドナー株ＪＡ９５４を、Ｄ−アラニン（１００μｇ／ｍｌ）、スペクチノマイシン（１２０μｇ／ｍｌ）、エリトロマイシン（５μｇ／ｍｌ）及びテトラサイクリン（５μｇ／ｍｌ）により補充されたＬＢＰＳＧプレート（リン酸塩（０．０１ＭのＫ３ＰＯ４）、グルコース（０．４％）及び澱粉（０．５％）を有するＬＢプレート）上で３０℃で一晩、増殖した。受容体株ＳＪ４６７１を、ＬＢＰＳＧプレート上で一晩、増殖した。
【０１９９】
ドナー及び受容体の接種針のほぼ１ループを、Ｄ−アラニン（１００μｇ／ｍｌ）を有するＬＢＰＳＧプレートの表面上で混合し、そして３０℃で５時間インキュベートした。次に、このプレートを、エリトロマイシン（５μｇ／ｍｌ）及びスペクチノマイシン（１２０μｇ／ｍｌ）を有するＬＢＰＳＧ上に複製し、そして３０℃で２日間インキュベートした。それらの４回の接合は、１３〜２５のトランス接合体をもたらした。
【０２００】
テトラサイクリン感受性（ｐＢＣ１６の不在を示す）トランス接合体を、エリトロマイシン（５μｇ／ｍｌ）及びスペクチノマイシン（１２０μｇ／ｍｌ）を有するＬＢＰＳＧプレート上で５０℃で再単離し、そして一晩インキュベートした。５０℃でのプレートからの単一のコロニーを、Ｄ−アラニン（１００μｇ／ｍｌ）を含む１０ｍｌのＴＹ液体培地中に接種し、そして２６℃で３日間、振盪しながらインキュベートし、この後、アリコートを新鮮な１０ｍｌのＴＹ培養に移し、そしてインキュベーションを３０℃で一晩、続けた。その培養物を、１２０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン及び１００μｇ／ｍｌのＤ−アラニンを含むＬＢＰＳＧ上でプレートし、３０℃での一晩インキュベーションの後、それらのプレートを、それぞれＤ−アラニン（１００μｇ／ｍｌ）、スペクチノマイシン及びエリトロマイシンを有する／有さないＬＢＰＳＧ上にレプリカ培養した。
【０２０１】
Ｄ−アラニン栄養要求性、エリトロマイシン感受性及びスペクチノマイシン耐性単離物を、すべての株の組合せから得た。染色体ｄａｌプロモーター、及びｒｅｓ−ｓｐｃ−ｒｅｓカセットにより置換されるｄａｌコード配列の最初の６７２塩基を含んで成る次の株を保持した：
【０２０２】
Ｂ．リケニホルミスＪＡ９６７：ＳＪ４６７１受容体、ＪＡ９５４ドナー。
株表現型を、Ｄ−アラニン（１００μｇ／ｍｌ）を補充されているか又はそれを補充されていない、１２０μｇのスペクチノマイシンを有するＬＢＰＧ上でアッセイした。
バチルス・リケニホルミスＳＪ４６７１は、Ｄ−アラニンを有するか又はそれを有さないブイヨンプレート上で良く増殖する。ｄａｌ欠失株ＪＡ９６７は、Ｄ−アラニンを有するＬＢＰＧ上では良く増殖するが、しかしＤ−アラニンを有さないＬＢＰＧプレート上では増殖しない。それらの株は、培地にＤ−アラニンを添加しないでは、明確に増殖することができない。
【０２０３】
Ｂ．リケニホルミスｄａｌ−領域の配列（配列番号１２）：
ｄａｌ−領域（ｙｄｃＣ遺伝子、ターミネーター、及びｄａｌの下流の配列（ＤＦＳ）を含んで成る）を、バチルス・リケニホルミスＡＴＣＣ１４５８０染色体ＤＮＡから下記プライマーを用いてＰＣＲ増殖した：
＃１４５５０７［＜ｙｄｃＣ−ｄａｌ−ＤＦＳ＞］（配列番号２４）：
５’−ＧＣＧＴＡＣＣＧＴＴＡＡＡＧＴＣＧＡＡＣＡＧＣＧ；
＃１５０５０９［ＮｈｅＩ；＜ｙｄｃＣ−ｄａｌ−ＤＦＳ＞］（配列番号２５）：
５’−ＡＡＡＧＣＴＡＧＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＡＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＣ。
【０２０４】
配列番号１２の位置１３０３−２４６９に示されるバチルス・リケニホルミスの配列をコードするＤ−アラニンの配列決定及び公的なデータベースにおける続く相同性の研究は、新しく単離されたｄａｌ遺伝子がバチルス・スブチリスのｄａｌ遺伝子とわずか約６７％の配列同一性を有し、他のＤ−アラニンラセマーゼコードの遺伝子がこの新規のＢ．リケニホルミスｄａｌ遺伝子に対して高い相同性を示すことを表した。
【０２０５】
接合性ドナー株、Ｂ．リケニホルミスへのトランスファー及び染色体組み込み：　発現カセットを有する組み込みプラスミドｐＪＡ１０２０を用いて、Ｂ．スブチリス接合ドナー株ＰＰ２８９−５（染色体ｄａｌ−欠失、及びプラスミドｐＢＣ１６及びｐＬＳ２０を含む）のコンピテント細胞を形質転換し、Ｄ−アラニン（１００μｇ／ｍｌ）を含むプレート上でエリトロマイシン（５μｇ／ｍｌ）及びテトラサイクリン（５μｇ／ｍｌ）に対する耐性について５℃で選択した。
発現カセットを含む組み込みプラスミドを含んで成る形質転換体を保存し、そして２−コピー株ＪＡ９６７のｄａｌ欠失受容体との接合においてドナーとして使用される。
【０２０６】
トランス接合体を、エリトロマイシン（５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢＰＧプレート上で選択し、そして個々の接合からの１又は２種のテトラサイクリン−感受性トランス接合体を、ＴＳＳ−グルコネートプレート上に画線培養し、これを５０℃でインキュベートした。２日のインキュベーションの後、良く増殖するコロニーを、抗生物質を有さない液体ＴＹ培地（１０ｍｌ）中に接種し、そしてそれらの培養物を３０℃で振盪しながらインキュベートした。一晩のインキュベーションの後、個々の培養物１００μｌを、新しい１０ｍｌのＴＹ培養物に移し、そしてインキュベーションを反復した。この方法をさらに２回、反復し、そしてさらに、培養物を３０℃でＬＢＰＧプレート上にプレートした。
【０２０７】
すべてのプレートを、ＬＢＰＧＳ、スペクチノマイシン（１２０μｇ）を有するＬＢＰＧＳ及びエリトロマイシン（５μｇ／ｍｌ）を有するＬＢＰＳＧ上にレプリカ培養し、そしてインキュベートする。次の日、推定上のスペクチノマイシン−エリトロマイシン感受性株を、同じプレート型に再画線培養する。
キシロース領域における組み込みに関して、サザン分析及び振盪フラスコ評価を行い、α−アミラーゼ発現カセットのｄａｌ領域における組み込みの部位、及びこの３−コピー株からの高められた収率を確かめる。
【０２０８】
例４：
この研究においては、バチルス・スブチリスゲノム及びＢ．リケニホルミス染色体の特定の領域（配列番号２６）に対する相同性研究が行われ、そしてＢ．リケニホルミス領域が遺伝子ｇｌｐＰ， ｇｌｐＦ， ｇｌｐＫ及びｇｌｐＤを含むことが見出された。分析された領域のサイズは、５７６１個のヌクレオチドであり、そしてそのＤＮＡ配列番号２６で示される。
【０２０９】
ｇｌｐＰコード領域は、配列番号２６における位置２６１〜位置８１８である。ブラストプログラムを用いてのＥＭＢＬ及びＳｗｉｓｓ−ｐｒｏｔデータベースの研究は、Ｂ．スブチリスｇｌｐＰ遺伝子（ＤＮＡレベルに基づいて）及びＢ．スブチリスＧｌｐＰタンパク質（タンパク質レベルに基づいて）との最も接近した相同性を示した。Ｂ．スブチリスｇｌｐＰコード領域とのＤＮＡレベルに基づいての同一性は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．０， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ （ＧＣＧ）， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃ．）におけるＧＡＰプログラムを用いて構成された一列整列において７２．４％であった。Ｂ．スブチリスＧｌｐＰタンパク質に対する推定されるＧｌｐＰタンパク質の同一性は７８．９％であった。
【０２１０】
ｇｌｐＦコード領域は、配列番号２６における位置１０４８〜位置１８６３である。ブラストアルゴリズムを用いてＥＭＢＬ及びＳｗｉｓｓ−ｐｒｏｔデータベースの研究は、Ｂ．スブチリスｇｌｐＦ遺伝子（ＤＮＡレベルに基づいて）及びＢ．スブチリスＧｌｐＦタンパク質（タンパク質レベルに基づいて）に対して最も接近した相同性を示した。Ｂ．スブチリスｇｌｐＦコード領域に対するＤＮＡレベルに基づいて同一性は、７２．８％であた。Ｂ．スブチリスＧｌｐＦタンパク質に対する推定されるＧｌｐＦタンパク質の同一性は、７９．３％であった。
【０２１１】
ｇｌｐＫコード領域は、配列番号２６における位置１９０５〜位置３３９５である。ブラストアルゴリズムを用いてＥＭＢＬ及びＳｗｉｓｓ−ｐｒｏｔデータベースの研究は、Ｂ．スブチリスｇｌｐＫ遺伝子（ＤＮＡレベルに基づいて）及びＢ．スブチリスｇｌｐＫタンパク質（タンパク質レベルに基づいて）に対して最も接近した相同性を示した。Ｂ．スブチリスｇｌｐＫコード領域に対するＤＮＡレベルに基づいて同一性は、７５．６％であた。Ｂ．スブチリスｇｌｐＫタンパク質に対する推定されるｇｌｐＫタンパク質の同一性は、８５．９％であった。
【０２１２】
ｇｌｐＤコード領域は、配列番号２６における位置３５４２〜位置５２０９である。ブラストアルゴリズムを用いてＥＭＢＬ及びＳｗｉｓｓ−ｐｒｏｔデータベースの研究は、Ｂ．スブチリスｇｌｐＤ遺伝子（ＤＮＡレベルに基づいて）及びＢ．スブチリスｇｌｐＤタンパク質（タンパク質レベルに基づいて）に対して最も接近した相同性を示した。Ｂ．スブチリスｇｌｐＤコード領域に対するＤＮＡレベルに基づいて同一性は、７２．９％であた。Ｂ．スブチリスｇｌｐＤタンパク質に対する推定されるｇｌｐＤタンパク質の同一性は、８１．９％であった。
さらに、Ｂ．リケニホルミス領域は、ｙｈｘＢ遺伝子の一部を含み、そしてそのコード領域は位置５３９４で開始し、そして配列番号２６に示される配列決定されたフラグメントの末端を越えて延長する。
【０２１３】
指図された染色体組み込みのためへのｇｌｐＤ遺伝子の使用：
前述の例の方法に類似して、ｇｌｐＤ遺伝子のセグメント及びその下流の領域を、Ｂ．リケニホルミスの染色体ＤＮＡからＰＣＲ増幅し、そして組合し、第１段階において、ｇｌｐＤ遺伝子の３’末端の欠失、及び第２段階において、ｇｌｐＤ遺伝子の回復及び染色体中への注目の遺伝子のための発現カセットの同時挿入のために有用なベクターを提供する。
【０２１４】
“ｇｌｐＤ”と称するｇｌｐＤ遺伝子の内部ブラグメントを、本明細書における他の場所にも記載されている標準のＰＣＲプロトコールに従って、下記２種のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
（配列番号２７）５’−ＧＡＣＴＧＡＡＴＴＣＧＣＡＡＴＴＴＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＴＧＧＴＡＧＣ；及び
（配列番号２８）５’−ＧＡＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＴＣＡＴＣＴＴＴＴＣＧＧＧＡＡＧＴＣ。
得られるフラグメントを精製し、そしてＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにより消化し、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにより消化されたｐＵＣ１９に連結し、そしてその連結混合物を用いて、Ｅ．コリＳＪ２を形質転換し、そしてアンピシリン耐性（２００μｇ／ｍｌ）について選択した。正しい配列を有するクローンを保持し、そしてＳＪ５７６７（ＳＪ２／ｐＳＪ５７６７）と命名した。
【０２１５】
ｇｌｐＤ遺伝子の３’末端の下流のＢ．リケニホルミス染色体５５〜５５５塩基対に由来するＤＮＡのフラグメントを、下記プライマーを用いて増幅した：
（配列番号２９）：
５’−ＧＡＣＴＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＣＧＴＡＧＴＡＣＴＣＣＣＧＧＣＧＴＧＡＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧ；及び
（配列番号３０）：
５’−ＧＡＣＴＡＡＧＣＴＴＣＡＧＴＴＡＣＧＣＴＣＡＡＡＣＡＣＧＴＡＣＧ。
得られるフラグメントを精製し、そしてＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化されたｐＵＣ１９に連結し、そしてその連結混合物を用いて、Ｅ．コリＳＪ２を形質転換し、そしてアンピシリン耐性（２００μｇ／ｍｌ）について選択した。正しい配列を有するクローンを保持し、そしてＳＪ５７８９（ＳＪ２／ｐＳＪ５７８９）と命名した。
【０２１６】
次に、ｇｌｐＤ遺伝子の内部フラグメントを、ｐＳＪ３３５８からの１．５ｋｂのＢｃｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントの切除及びＢｇｌＩＩにより消化されているｐＳＪ５７６７中へのそれの挿入により、レゾルバーゼ部位を両端に有するスペクチノマイシン耐性遺伝子と組合した。その連結混合物を用いて、Ｅ．コリＳＪ２を形質転換し、アンピシリン（２００μｇ／ｍｌ）及びスペクチノマイシン（１２０μｇ／ｍｌ）耐性について選択した。正しい配列を有するクローンを保持し、そしてＳＪ５７７９（ＳＪ２／ｐＳＪ５７７９）と命名した。
【０２１７】
Ｂ．リケニホルミス染色体におけるｇｌｐＤの３’末端の欠失のための最終プラスミドを構成するために、ｐＳＪ５７８９をＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇｌＩＩにより消化し、そして０．５ｋｂのフラグメントを、ｐＳＪ２７３９の５．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントに連結した。その連結混合物を用いて、Ｂ．スブチリスＤＮ１８８５を形質転換し、３０℃でエリトロマイシン（５μｇ／ｍｌ）耐性について選択した。その得られるプラスミドを、ＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩにより消化し、４．８ｋｂのフラグメントを、ｐＳＪ５７７９から切除された２．４ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントに連結し、そしてその連結混合物を用いて、Ｂ．スブチリスＤＮ１８８５を形質転換し、エリトロマイシン耐性（５μｇ／ｍｌ）について３０℃で選択した。
【０２１８】
欠失プラスミドを、前記例に記載のようにして、Ｂ．スブチリス接合ドナー株ｐｐ２８９−５の使用によりＢ．リケニホルミス中にトランスファーし、そして欠失を、前記例に記載されるのと実質的に同じ方法を用いて、染色体にトランスファーする。
得られるｇｌｐＤ欠失株を、単独の炭素源としてグリセロールを有するＴＳＳ最少培地寒天プレート上での増殖について試験する。
【０２１９】
組み込みプラスミドを、相同組換えにより染色体ｇｌｐＤ遺伝子を修復でき、そしてｇｌｐＤ遺伝子の完全な３’末端を含むフラグメントを担持するよう企画した。ｇｌｐＤタンパク質のアミノ酸配列を保持するよう企画された部位特異的突然変異によりｇｌｐＤ遺伝子内に存在するＢｇｌＩＩ部位を除去することが有用であった。この突然変異には、次の通りに、ＰＣＲにより導入された。
ｇｌｐＤ遺伝子の内部フラグメントを、プライマー（配列番号２７及び配列番号２８）を用いて増幅した。
【０２２０】
ｇｌｐＤ遺伝子の３’末端を、下記プライマーを用いて増幅した：
（配列番号３１）：
５’−ＣＣＧＡＧＡＴＴＴＣＣＣＧＡＡＡＡＧＡＴＧＡＡＡＴＴＴＧＧＡＣＴＴＣＴＧＡＡＴＣＣＧＧＡＣＴＧ及び；
（配列番号３２）：
５’−ＧＡＣＴＡＡＧＣＴＴＡＧＡＴＣＴＧＣＴＡＧＣＡＴＣＧＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＡＡＣＧＡＡＡＡＴＴＣＡＣＣ。
２種の増幅されたフラグメントを混合し、そしてその混合物を、プライマー（配列番号２７及び配列番号３２）を用いてＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。
【０２２１】
得られるフラグメントを、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化されたｐＵＣ１９に連結し、そしてその連結混合物を用いて、Ｅ．コリＳＪ２を形質転換し、そしてアンピシリン耐性（２００μｇ／ｍｌ）について選択した。正しい配列を有するクローンを保持し、そしてＳＪ５７７５（ＳＪ２／ｐＳＪ５７７５）と命名した。
【０２２２】
最終組み込みベクタープラスミドを構成するために、ｐＳＪ５７８９をＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇｌＩＩにより消化し、そしてその０．５ｋｂのフラグメントを、ｐＳＪ２７３９の５．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントに連結した。その連結混合物を用いて、Ｂ．スブチリスＤＮ１８８５を形質転換し、３０℃でエリトロマイシン耐性（５μｇ／ｍｌ）について選択した。得られるプラスミドを、ＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩにより消化し、ｐＳＪ５７７５から切除された１．５ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントに連結し、そして連結混合物を用いて、Ｂ．スブチリスＤＮ１８８５を形質転換し、エリトロマイシン耐性（５μｇ／ｍｌ）について３０℃で選択した。
【０２２３】
この組み込みベクタープラスミドは、発現カセットが挿入される、ｇｌｐＤ遺伝子の３’末端からすぐ下流に多くの制限酵素部位を有する。
得られる組み込みプラスミドを、前記例に記載のようにして、Ｂ．スブチリス接合ドナー株ＰＰ２８９−５の使用により、Ｂ．リケニホルミスｇｌｐＤ欠失株中にトランスファーした。
【０２２４】
組み込みプラスミドがｇｌｐＤ配列を通して染色体中に込み込まれている細胞を、５０℃でグリセロール最少培地上で増殖するそれらの能力により単離する。そのような細胞を、第２組換え現象により、組み込まれたプラスミドを失っているが、しかし染色体上の発現カセットと一緒に、ｇｌｐＤ遺伝子の修復されたバージョンを保持している株の単離のための開始点として使用する。
そのような株を得るための方法は、染色体のキシロースイソメラーゼ領域で組み込まれる発現カセットを有する株を単離するために使用される前記例に記載される方法に相当する。
【０２２５】
指図された染色体組み込みのためへのｇｌｐＦＫ遺伝子の使用：
前述の例の方法に類似して、ｇｌｐＦ遺伝子のセグメント及びその上流のｇｌｐＰ領域を、Ｂ．リケニホルミスの染色体ＤＮＡからＰＣＲ増幅し、そして組合し、第１段階において、ｇｌｐＦ遺伝子のプロモーター及び５’末端の欠失、及び第２段階において、プロモーター及びｇｌｐＦ遺伝子の回復及びｇｌｐＦプロモーターの上流の染色体中への注目の遺伝子のための発現カセットの同時挿入のために有用なベクターを提供する。ｇｌｐＦプロモーターの欠失は、ｇｌｐＦ遺伝子及びその下流のｇｌｐＫ遺伝子の発現を破壊することが予測される。ＰＣＲ増幅を、前記のようにして行った。
【０２２６】
ｇｌｐＰ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを、下記プライマーを用いて増幅した：
（配列番号３３）：
５’−ＧＡＣＴＡＡＧＣＴＴＧＴＧＡＡＧＧＡＧＡＴＧＧＡＡＣＡＴＧＡＧ；及び
（配列番号３４）：
５’−ＧＡＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＧＴＡＣＴＡＴＴＴＴＴＡＧＴＴＣＣＡＧＴＡＴＴＴＴＴＴＣＣ。 得られるフラグメントを精製し、そしてＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩにより消化し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩにより消化されたｐＵＣ１９に連結し、そしてその連結混合物を用いて、Ｅ．コリＳＪ２を形質転換し、そしてアンピシリン耐性（２００μｇ／ｍｌ）について選択した。正しい配列を有するクローンを保持し、そしてＳＪ５７５３（ＳＪ２／ｐＳＪ５７５３）と命名した。
【０２２７】
ｇｌｐＦ遺伝子のほとんどを含むが、しかしコード配列の最初の１６０塩基対を欠いているＤＮＡフラグメントを、下記プライマーを用いて増幅した：
（配列番号３５）：５’−ＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＣＧＧＡＧＣ；及び
（配列番号３６）：５’−ＧＡＣＴＧＡＡＴＴＣＣＴＴＴＴＧＣＧＣＡＡＴＡＴＧＧＡＣ。
得られるフラグメントを、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩにより消化し、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩにより消化されたｐＵＣ１９に連結し、そしてその連結混合物を用いて、Ｅ．コリＳＪ２を形質転換し、そしてアンピシリン耐性（２００μｇ／ｍｌ）について選択した。正しい配列を有するクローンを保持し、そしてＳＪ５７６５（ＳＪ２／ｐＳＪ５７６５）と命名した。
【０２２８】
ｇｌｐＦ遺伝子プロモーター及び５’末端の欠失のために有用なプラスミドを構成するために、ｇｌｐＰ含有フラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントとしてｐＳＪ５７５３から切除し、ｇｌｐＦフラグメントを、ＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＳＪ５７６５から切除し、そしてそれらのフラグメントを、ｐＳＪ２７３９のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントに連結する。その連結混合物を用いて、Ｓ．スブチリスＤＮ１８８５を形質転換し、３０℃でエリトロマイシン耐性（５μｇ／ｍｌ）について選択する。
【０２２９】
得られるプラスミドを、ＢｇｌＩＩにより消化し、そしてレゾルバーゼ認識部位を両端に有するスペクトロマイシン耐性遺伝子を含む、ｐＤＪ３３５８からの１．５ｋｂのＢｃｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントに連結する。その連結混合物を用いて、Ｂ．スブチリスＤＮ１８８５を形質転換し、エリトロマイシン耐性（５μｇ／ｍｌ）及びスペクチノマイシン耐性（１２０μｇ／ｍｌ）について３０℃で選択する。
このようにして構成された欠失を、前記例に記載のようにして、Ｂ．スブチリス接合ドナー株ＰＰ２８９−５の使用によりＢ．リケニホルミス中にトランスファーし、そして欠失を、前記例に記載されるのと実質的に同じ方法を用いて、染色体にトランスファーする。
【０２３０】
得られるｇｌｐＦ欠失株を、単一の炭素源としてグリセロールを有するＴＳＳ最少培地寒天プレート上での増殖について試験する。
組み込みプラスミドを、相同組換えによりｇｌｐＦＫ遺伝子領域を修復でき、そしてｇｌｐＦプロモーター及び損なわれていないｇｌｐＦ遺伝子を担持するよう企画する。このフラグメントを、染色体Ｂ．リケニホルミスＤＮＡから、下記プラスミドを用いて増幅する：
（配列番号３６）；及び
（配列番号３７）：
５’−ＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＴＧＣＴＡＧＣＡＴＣＧＡＴＣＣＧＣＧＧＴＴＡＡＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＡＴＴＡＴＴＧＡＣＡＡＣＧ。
【０２３１】
得られるフラグメントを、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩにより消化し、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩにより消化されたｐＵＣ１９に連結し、そしてその連結混合物を用いて、Ｅ．コリＳＪ２を形質転換し、アンピシリン耐性（２００μｇ／ｍｌ）について選択する。続いて、増幅されたフラグメントを、ＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてこのプラスミドから切除し、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩフラグメントとしてｐＳＪ５７５３から切除されるｇｌｐＰ包含フラグメントに、及びｐＳＪ２７３９のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントに連結される。この連結混合物を用いて、Ｂ．スブチリスＤＮ１８８５を形質転換し、３０℃でエリトロマイシン耐性（５μｇ／ｍｌ）について選択する。続いて、興味ある発現カセットを、ｇｌｐＰ遺伝子の末端とｇｌｐＦプロモーターとの間のリンカー領域中に挿入する。
【０２３２】
その得られる組み込みプラスミドを、前記例に記載のようにして、Ｂ．スブチリス接合ドナー株ｐｐ２８９−５の使用によりＢ．リケニホルミスｇｌｐＦ欠失株中にトランスファーする。
組み込みプラスミドがｇｌｐＦ配列を通して染色体中に組み込まれているコロニーを、５０℃でグリセロール最少培地プレート上で増殖するそれらの能力により単離する。そのようなコロニーを、第２の組換え現象により、組み込まれたプラスミドを失っているが、しかし発現カセットと共に、ｇｌｐＦ遺伝子の修復されたバージョンを保持している株の単離のための開始点として使用する。
そのような株を得るための方法は、染色体のキシロースイソメラーゼ領域で組み込まれた発現カセットを有する株を単離するための前記方法に相当する。
【０２３３】
染色体組み込みのためへのｇｌｐＤ及びｇｌｐＦＫの連続的使用：
この方法は、開始株として、ｇｌｐＤ遺伝子欠失及びｇｌｐＦ遺伝子欠失の両者を有する株の使用を認識し、そしてグリセロール−３−リン酸により補充された最少培地上で増殖する、ｇｌｐＫ遺伝子生成物を発現することができない株の能力を利用するが、ところが、ｇｌｐＤを欠いている株はこの基質上で増殖することはできない。　次に、前記方法は、ｇｌｐＤ遺伝子を修復するよう企画された組み込みプラスミドをまず導入し、そしてグリセロール−３−リン酸を含む最少培地上での増殖を用いて正しい組み込みについて選択することである。これは、ｇｌｐＤ遺伝子に続いて発現カセットのコピーを挿入する。
【０２３４】
第２段階においては、発現カセットのもう１つのコピーが、ｇｌｐＦ遺伝子を修復するよう企画された組み込みベクターを用いて、ｇｌｐＰとｇｌｐＦ遺伝子との間に挿入され得、そしてグリセロールを有する最少培地上での増殖を用いて適切な組み込みを選択する。
２種の発現カセットが同一である（又は、強い相同性であるか、又は相同領域を含む）場合、それらが、最終株において、お互いに対して反対の配向で組み込まれ、従って、グリセロール上での増殖に関する選択が存在しない条件下で相同組換えにより株からのそれらの欠失を妨げるような配向でベクタープラスミド中にそれらの発現カセットを挿入することが好都合である。
【０２３５】
例５：
この研究においては、バチルス・スブチリスゲノム及びＢ．リケニホルミス染色体の第２の特定の領域（配列番号３８）に対する相同性研究が行われ、そして前記領域がＢ．リケニホルミスのａｂｎＡ遺伝子の３’−末端、及びａｒａＡ遺伝子の５’−末端を含むことが見出された。分析された領域のサイズは、１５００個のヌクレオチドであり、そしてそのＤＮＡ配列番号３８で示される。
【０２３６】
ａｂｎＡコード領域の３’−末端は、配列番号３８における位置１〜位置５９２である。ブラストプログラムを用いてのＥＭＢＬ及びＳｗｉｓｓ−ｐｒｏｔデータベースの研究は、Ｂ．スブチリスａｂｎＡ遺伝子（ＤＮＡレベルに基づいて）及びＢ．スブチリスａｂｎＡタンパク質（タンパク質レベルに基づいて）との最も接近した相同性を示した。その対応するＢ．スブチリスａｂｎＡコード領域とのＤＮＡレベルに基づいての同一性は、６８．９％であった。その対応するＢ．スブチリスａｂｎＡタンパク質に対する推定されるａｂｎＡタンパク質の同一性は７５．８％であった。
【０２３７】
ａｂｎＡコード領域の５’−末端は、配列番号３８における位置８５９〜位置１５００である。ブラストアルゴリズムを用いてＥＭＢＬ及びＳｗｉｓｓ−ｐｒｏｔデータベースの研究は、Ｂ．スブチリスａｂｎＡ遺伝子（ＤＮＡレベルに基づいて）及びＢ．スブチリスａｂｎＡタンパク質（タンパク質レベルに基づいて）に対して最も接近した相同性を示した。その対応するＢ．スブチリスａｂｎＡコード領域に対するＤＮＡレベルに基づいて同一性は、６８．２％であた。その対応するＢ．スブチリスａｂｎＡタンパク質に対する推定されるａｂｎＡタンパク質フラグメントの同一性は、６２．６％であった。バチルス・ステアロサーモフィラスＡｒａＡタンパク質フラグメントに対する、一列整列で得られる同一性は７５．８％であった。
【０２３８】
指図された染色体組み込みのためへのａｂｎＡ遺伝子の使用：
前述の例の方法に類似して、ａｂｎＡ遺伝子のセグメント及びその下流の領域を、Ｂ．リケニホルミスの染色体ＤＮＡからＰＣＲ増幅し、そして組合し、第１段階において、プロモーター及びａｂｎＡ遺伝子の５’末端の欠失、及び第２段階において、プロモーター及びａｂｎＡ遺伝子の回復及びａｂｎＡプロモーターの上流の染色体中への注目の遺伝子のための発現カセットの同時挿入のために有用なベクターを提供する。ＰＣＲ増幅は前記のようにして行われた。
【０２３９】
ａｒａＡの上流のａｂｎＡ遺伝子のフラグメントを、下記プライマーを用いて増幅した：
（配列番号３９）：
５’−ＧＡＣＴＡＡＧＣＴＴＣＡＴＣＣＧＧＣＧＡＴＣＡＧＴＴＴＡＡＴＧＣ；及び
（配列番号４０）：
５’−ＧＡＣＴＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＧＴＡＣＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＧＡＡＣ。
【０２４０】
得られるフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩにより消化し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩにより消化されたｐＵＣ１９に連結し、そしてその連結混合物を用いて、Ｅ．コリＳＪ２を形質転換し、そしてアンピシリン耐性（２００μｇ／ｍｌ）について選択した。正しい配列を有するクローンを保持し、そしてＳＪ５７５１（ＳＪ２／ｐＳＪ５７５１）と命名した。　ａｒａＡ遺伝子の内部部分を含むフラグメントを、下記プライマーを用いて増幅した：
（配列番号４１）：
５’−ＧＡＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＴＡＧＴＣＧＡＧＴＡＣＡＡＡＧＣＧＧＴＧＧＣ；及び
（配列番号４２）：
５’−ＧＡＣＴＧＡＡＴＴＣＧＡＣＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＴＣＴＧＣ。
【０２４１】
得られるフラグメントを、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにより消化し、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにより消化されたｐＵＣ１９に連結し、そしてその連結混合物を用いて、Ｅ．コリＳＪ２を形質転換し、そしてアンピシリン耐性（２００μｇ／ｍｌ）について選択した。正しい配列を有するクローンを保持し、そしてＳＪ５７５２（ＳＪ２／ｐＳＪ５７６０）と命名した。
ａｂｎＡ遺伝子フラグメントを、ｐＳＪ５７５１からＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントとして切除し、ｐＳＪ２７３９の５．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩＩフラグメントに連結し、そしてその連結混合物を用いて、Ｂ．スブチリスＤＮ１８８５を形質転換し、３０℃でエリトロマイシン耐性（５μｇ／ｍｌ）について選択した。保持される形質転換体は、ＳＪ５７５６（ＤＮ１８８５／ｐＳＪ５７５６）であった。
【０２４２】
プラスミドｐＳＪ５７６０をＢｇｌＩＩにより消化し、そしてレゾルバーゼ認識部位を両者に有するスペクチノマイシン耐性遺伝子を含む、ｐＳＪ３３５８からの１．５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢｃｌＩフラグメントを挿入した。クローンは、ＳＪ５７７７（ＳＪ２／ｐＳＪ５７７７）として保持された。
最終欠失プラスミドを、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとしてのｐＳＪ５７７７からのａｒａＡ−ｒｅｓ−ｓｐｃ−ｒｅｓフラグメントの切除、及びｐＳＪ５７５６の大きなＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントへのこの連結により構成した。その連結混合物を用いて、Ｂ．スブチリスＤＮ１８８５を形質転換し、３０℃でエリトロマイシン耐性（５μｇ／ｍｌ）及びスペクトロマイシン耐性（１２０μｇ／ｍｌ）について選択した。保持される正しい形質転換体は、ＳＪ５８０３（ＳＪ２／ｐＳＪ５８０３）であった。
【０２４３】
欠失プラスミドｐＳＪ５８０３を、前記例に記載のようにして、Ｂ．スブチリス接合ドナー株ＰＰ２８９−５の使用によりＢ．リケニホルミス中にトランスファーし、そして欠失を、前記例に記載されるのと実質的に同じ方法を用いて、染色体中にトランスファーする。
得られるａｒｅＡ欠失株を、単一の炭素源をしてアラビノースを有するＴＢＳ最少培地寒天プレートでの増殖について試験する。
【０２４４】
組み込みベクタープラスミドを、相同組換えによりａｒａＡ遺伝子領域を修復でき、そしてｐＳＪ５７５６のａｂｎＡ遺伝子フラグメントの他に、ａｒａＡプロモーター及びａｒａＡ遺伝子の５’末端を担持するよう企画する。ａｒａＡプロモーターフラグメントを、配列番号２６として与えられる配列に基づいて合成されたプライマーを用いて、染色体Ｂ．リケニホルミスから増幅する。前記プラスミドを、注目の遺伝子のための発現カセットがａｂｎＡ遺伝子から下流にではあるが、しかしａｒａＡプロモーターの上流に挿入され得るよう構成する。
【０２４５】
得られる組み込みプラスミドを、前記例に記載のようにして、Ｂ．スブチリス接合ドナー株ＰＰ２８９−５の使用により、Ｂ．リケニホルミスａｒａＡ欠失株中にトランスファーする。組み込みプラスミドａｒａＡ配列を通して染色体中に組み込まれているコロニーを、５０℃でアラビノース最少培地プレート上で増殖するそれらの能力により単離する。そのようなコロニーは、第２の組換え現象により、組み込まれたプラスミドを失っているが、しかし発現カセットと共に、ａｒａＡ遺伝子の修復されたバージョンを保持している株の単離のための出発点として使用される。
そのような株を得るための方法は、染色体のキシロースイソメラーゼ領域で組み込まれる発現カセットを有する株を単離する前記方法に相当する。
【０２４６】
例６：
この研究においては、バチルス・スブチリスゲノム及びＢ．リケニホルミス染色体の第３の特定の領域（配列番号４２）に対する相同性研究が行われ、そしてＢ．リケニホルミス領域がＢ．リケニホルミスのｉｓｐＡ遺伝子及びｍｅｔＣ遺伝子を含むことが見出された。分析された領域のサイズは、４０７８個のヌクレオチドであり、そしてそのＤＮＡ配列番号４２で示される。
【０２４７】
ｉｓｐＡコード領域の３’−末端は、配列番号４２における位置１〜位置６４７である。この特定の配列を用いてのＥＭＢＬ及びＳｗｉｓｓ−ｐｒｏｔデータベースのＢＬＡＳＴ研究は、Ｂ．スブチリスｉｓｐＡ遺伝子（ＤＮＡレベルに基づいて）及びＢ．スブチリスｉｓｐＡタンパク質（タンパク質レベルに基づいて）との最も接近した相同性を示した。その対応するＢ．スブチリスｉｓｐＡコード領域とのＤＮＡレベルに基づいての同一性は、ＡｌｉｇｎＸＴＭプログラム（Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩＴＭ ６．０ プログラムパッケージ、ＩｎｆｏｒｍａｘＴＭ，Ｉｎｃ．）を用いて構成された一列整列において７２．６％であった。その対応するＢ．スブチリスｉｓｐＡタンパク質に対する推定されるｉｓｐＡタンパク質の同一性は８２．３％であった。
【０２４８】
ｍｅｔＣコード領域の５’−末端は、配列番号４２における位置１１２１〜位置３４０６である。この特定の配列を用いてＥＭＢＬ及びＳｗｉｓｓ−ｐｒｏｔデータベースの研究は、Ｂ．スブチリスｍｅｔＣ遺伝子（ＤＮＡレベルに基づいて）及びＢ．スブチリスＭｅｔＣタンパク質（タンパク質レベルに基づいて）に対して最も接近した相同性を示した。Ｂ．スブチリスｍｅｔＣコード領域に対するＤＮＡレベルに基づいて同一性は、７２．６％であた。Ｂ．スブチリスＭｅｔＣタンパク質に対する推定されるＭｅｔＣタンパク質の同一性は、８４．６％であった。
【０２４９】
指図された染色体組み込みのためへのｍｅｔＣ遺伝子の使用：
ｍｅｔＣ遺伝子のセグメント及びその下流の領域を、Ｂ．リケニホルミスの染色体ＤＮＡからＰＣＲ増幅し、そして組合し、ｍｅｔＣ遺伝子の３’末端の欠失のために有用なベクターを提供する。
ｍｅｔＣ遺伝子の３’末端の下流の４〜６７１塩基対の、Ｂ．リケニホルミス染色体に由来するＤＮＡのフラグメントを、次のプライマーを用いて増幅した：
（配列番号４４）：
５’−ＡＡＡＡＡＡＣＣＣＧＡＧＴＴＴＣＡＣＡＡＡＡＡＡＴＣＣＡＣＴＡＣＡＡＡＣＧＣＣＧＣＣ；及び
（配列番号４５）：
５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＧＣＴＴＡＴＧＣＣＧＣＡＴＧＴＴＣＣＴＴＧＣＴＧＴＴＴＴＣＡＣ。
【０２５０】
得られるフラグメントをＡｖａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、ＡｖａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化されたｐＭＯＬ１８８７に連結し、そしてその連結混合物を用いて、Ｂ．スブチリスＰＬ１８０１を形質転換し、そして３０℃でエリトロマイシン（５μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（１０μｇ／ｍｌ）耐性について選択した。１つのクローンを、ＣＬＯ５７（ＰＬ１８０１／ｐＣＬＯ５７）として保持した。
【０２５１】
ｍｅｔＣ読み取り枠中への２４７〜７５４塩基対の、Ｂ．リケニホルミス染色体の由来のｍｅｔＣ遺伝子の内部フラグメントを、下記プライマーを用いて増幅した。
（配列番号４６）：
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＴＣＧＡＴＴＣＡＧＧＧＡＴＡＴＡＡＡＣＧＡＴＣＣＧ；及び
（配列番号４７）：
５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＡＴＣＧＣＡＣＴＧＧＧＡＴＡＴＣＡＧＣＴＣＴＴＣＡＴＡＡＧＣＡＴＣ。
【０２５２】
得られるフラグメントをＣｌａＩ及びＢｓｔＸＩにより消化し、ＣｌａＩ及びＢｓｔＸＩにより消化されたｐＣＬＯ５７に連結し、そしてその連結混合物を用いて、Ｂ．スブチリスＰＬ１８０１を形質転換し、そして３０℃でエリトロマイシン（５μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（１０μｇ／ｍｌ）耐性について選択した。１つのクローンを、ＣＬＯ５８（ＰＬ１８０１／ｐＣＬＯ５８）として保持した。
【０２５３】
得られる欠失プラスミドｐＣＬＯ５８は、内部ｍｅｔＣフラグメント、続いてレゾルバーゼ部位を両端に有するカナマイシン耐性遺伝子、続いて最終的に、ｍｅｔＣ遺伝子の下流のＤＮＡフラグメントから成るカセットを有する。欠失プラスミドｐＣＬＯ５８を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子が染色対上に組み込まれていることを除いて、前記に記載されているＰＰ２８９−５と同系遺伝子である接合ドナー株ＰＰ１０６０−１にトランスファーした。得られる株ＣＬＯ７１（ＰＰ１０６０−１／ｐＣＬＯ５８）を、３０℃でのエリトロマイシン耐性について選択した。ドナー株ＣＬＯ７１を、Ｂ．リケニホルミス受容体ＳＪ３０４７と接合し、３０℃でエリトロマイシン及びｄａｌ＋表現型について接合体を選択した。
【０２５４】
１つの接合体ＣＬＯ７４を、カナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）上に画線培養し、染色体中に組み込まれるプラスミドを有する細胞について選択した。得られる株ＣＬＯ７８のＳＭＳ−グルコース最少プレート上へのプレート化は、プラスミドがｍｅｔＣ遺伝子の内部部分に組み込まれ、メチオニンの必要性をもたらしたことを示した。ＣＬＯ７８を、第２組換え現象により、前記組み込まれたプラスミドを失ったが、しかしｍｅｔＣ遺伝子の欠失されたバージョンを保持している株の単離のための開始点として使用した。
【０２５５】
ＣＬＯ８０と称するそのような株は、損なわれていないｍｅｔＣ遺伝子について選択的条件下で、前記例に実質的に記載されるようなｍｅｔＣ遺伝子座での組み込みのために指図され得るカセットを担持するプラスミドのための受容体として使用されることが適切である。
【０２５６】
例７：
この研究においては、バチルス・スブチリスゲノム及びＢ．リケニホルミス染色体の第４の特定の領域（配列番号４８）に対する相同性研究が行われ、そしてＢ．リケニホルミス領域がＢ．リケニホルミスのｓｐｏＶＡＦ遺伝子の３’及びｌｙｓＡ遺伝子を含むことが見出された。分析された領域のサイズは、３９５２個のヌクレオチドであり、そしてそのＤＮＡ配列番号４８で示される。
ｓｐｏＶＡＦコード領域の３’−末端は、配列番号４８における位置１〜位置３１０である。Ｂ．スブチリスｓｐｏＶＡＦコード領域に対する、ＤＮＡレベルに基づいての同一性は６２．７％であった。Ｂ．スブチリスｓｐｏＶＡＦタンパク質に対する推定されるｓｐｏＶＡＦタンパク質の同一性は５５．２％であった。
【０２５７】
ｌｙｓＡコード領域は、配列番号４８における位置１０４８〜位置２３６７である。この特定の配列を用いてＥＭＢＬ及びＳｗｉｓｓ−ｐｒｏｔデータベースの研究は、Ｂ．スブチリスｌｙｓＡ遺伝子（ＤＮＡレベルに基づいて）及びＢ．スブチリスＬｙｓＡタンパク質（タンパク質レベルに基づいて）に対して最も接近した相同性を示した。Ｂ．スブチリスｌｙｓＡコード領域に対するＤＮＡレベルに基づいて同一性は、７３．０％であた。Ｂ．スブチリスＬｙｓＡタンパク質に対する推定されるＬｙｓＡタンパク質の同一性は、８２．２％であった。
【０２５８】
指図された染色体組み込みのためへのｌｙｓＡ遺伝子の使用：
前述の例の方法に類似して、ｌｙｓＡ遺伝子のセグメントを、Ｂ．リケニホルミスの染色体ＤＮＡからＰＣＲ増幅し、そして組合し、第１段階において、リシンのための細胞を栄養要求性にするｌｙｓＡ遺伝子の部分的欠失、及び第２段階において、ｌｙｓＡ遺伝子の回復及び染色体中への注目の遺伝子のための発現カセットの同時挿入のために有用なベクターを提供する。ＰＣＲ増幅は前記のようにして行われた。　前記例の方法に基づけば、この方法を行うための必要なプライマー及び選択的条件を決定することは、当業者の範囲内である。
【０２５９】
一般的な材料及び方法：
インビトロＤＮＡ研究、細菌株の形質転換、等は、分子生物学の標準の方法を用いて行われた（Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ．， Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， １９８２： Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ．， など． （ｅｄｓ．） “Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， １９９５； Ｈａｒｗｏｏｄ， Ｃ． Ｒ．， ａｎｄ Ｃｕｔｔｉｎｇ， Ｓ． Ｍ． （ｅｄｓ．） “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ”． Ｊｏｈｎ ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， １９９０）。
特にことわらない限り、ＤＮＡ操作のための酵素は、その供給者の規格に従って使用された。使用される培地（ＴＹ、ＢＰＸ及びＬＢ寒天）は、ヨーロッパ特許０５６７８０号に記載されている。
【０２６０】
アミラーゼ活性は、その供給者により記載されるように、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ ＵｐｊｏｈｎからのＰｈａｄｅｂａｓ（商標）Ａｍｙｌａｓｅ Ｔｅｓｔにより決定された。
容易な欠失のための部位特異的組換え酵素のための認識部位（プラスミドｐＡＭｂｅｔａｌからのレゾルバーゼにより認識されるｒｅｓ部位）を両端に有する耐性遺伝子、例えばスペクチノマイシン耐性又はカナマイシン耐性遺伝子の使用は、アメリカ特許第５，８８２，８８８号に記載されている。その特許においては、プラスミドｐＳＪ３３５８及び株Ｂ．スブチリスＰＰ２８９−５が記載されている。
【０２６１】
ｐＵＣ１９は、Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ， Ｃ．， Ｖｉｅｉｒａ， Ｊ．， Ｍｅｓｓｉｎｇ， Ｊ． （１９８５） Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍ１３ ｐｈａｇｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｓｔｒａｉｎｓ： ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｍ１３ｍｐ１８ ａｎｄ ｐＵＣ１９ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｇｅｎｅ３３， １０３−１１９に記載されている。
ｐＥ１９４は、Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ， Ｓ．， ａｎｄ Ｗｅｉｓｂｌｕｍ， Ｂ． （１９８２）． Ｎｕｃｌｅｏ ｔｉｄｅ ｓｅｑｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍａｐ ｏｆ ｐＥ１９４， ａ ｐｌａｓｍｉｄ ｔｈａｔ ｓｐｅｃｉｆｉｅｓ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｍａｃｒｏｌｉｄｅ， ｌｉｎｃｏｓａｍｉｄｅ， ａｎｄ ｓｔｒｅｐｔｏｇｒａｍｉｎ ｔｙｐｅ Ｂ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １５０， ８０４−８１４に記載されている。
プラスミドｐＳＪ２７３９は、アメリカ特許第６，１００，０６３号に記載されている。
プラスミドｐＭＯＬ１６４２は、配列番号４９及び次の表に示されている：
【０２６２】
【表１】
2004501651.tif 000002
【０２６３】
株Ｅ．コリＳＪ２及びバチルス・スブチリスＤＮ１８８５は、Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎ， Ｂ．， Ｗｅｄｓｔｅｄ， Ｕ．， Ｈｅｄｅｇａａｒｄ， ｌ．， Ｊｅｎｓｅｎ， Ｂ． Ｒ．， Ｓｊｏｈｏｌｍ， Ｃ． （１９９０）． Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａｌｄＢ， Ｗｈｉｃｈ ｅｎｃｏｄｅｓ ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ， ａｎ ｅｘｏｅｎｚｙｍｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７２， ４３１５−４３２１に記載されている。
バチルス・スブチリスＰＬ１８０１は、破壊されたａｐｒ及びｎｐｒ遺伝子を有するＢ．スブチリスＤＮ１８８５である。
バチルス・リケニホルミスＰＬ１９８０は、アルカリプロテアーゼ遺伝子中へのクロラムフェニコール耐性遺伝子の挿入によりアルカリプロテアーゼを生成することができなくされた、Ｂ．リケニホルミスの株である。
【０２６４】
バチルス・スブチリスＪＡ５７８は、染色体上のｄａｌ遺伝子（ＥＭＢＬ：ＢＳＤＡＬ， 受容体Ｍ１６２０７）の下流に挿入されているｒｅｐＦ発現カセット（配列番号５０）を有するＢ．スブチリス１６８ ｓｐｏ， ａｍｙＥである。配列番号５０で示されるｒｅｐＦ発現カセットは、バチルス・ステアロテルモフィラス（ＥＭＢＬ： ＢＳＡＭＹＬ０２， 受託番号Ｍ３６５３９）からのマルトース生成性アミラーゼプロモーターＰａｍｙＭ（配列番号５０における位置１−１８１）、プラスミドｐＥ１９４ （ＥＭＢＬ： ＰＰＣＧ２， 受託番号Ｊ０１７５５） からのｒｅｐＦ遺伝子（配列番号５０における位置２１２−８０８）に融合される、ＲＢＳを含むリンカー（配列番号５０における位置１８２−２１１）、配列番号５０における位置２１２でのＲｅｐＦ開始コドン、及び配列番号５０における位置８０９での停止コドンを含んで成る。
バチルス・スブチリスＪＡ６９１は、Ｂ．スブチリスＪＡ５７８ ｄａｌ−である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｂ．リケニホルミスキシロースイソメラーゼ領域、ＰＣＲフラグメント、欠失及び組み込みプラスミド、及び株の図示である。
【図２】図２は、Ｂ．リケニホルミスグルコネート領域、ＰＣＲフラグメント、欠失及び組み込みプラスミド、及び株の図示である。
【図３】図３は、Ｂ．リケニホルミスＤ−アラニンラセマーゼコード領域、ＰＣＲフラグメント、欠失及び組み込みプラスミド、及び株の図示である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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