(57)【要約】抗微生物活性を有する化合物の生物学上の標的を特定する新規な方法を開示する。さらに、抗微生物活性を有しうる化合物を特定する新規な方法もまた開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オキサゾリジノン−タイプの抗生物質の生物学上の標的を特定するための方法であって、
感受性細胞をオキサゾリジノンフォトアフィニティープローブと接触させること；
当該フォトアフィニティープローブを光にさらし、当該フォトアフィニティープローブと前記生物学上の標的の間に錯体を形成すること；および
当該錯体を検出すること、の工程を含む前記方法。
【請求項２】
前記フォトアフィニティープローブが検出可能となるように標識化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検出可能な標識が酵素的、化学発光的、蛍光性、または放射性である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記錯体の検出がオートラジオグラフィーによるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記フォトアフィニティープローブが、式
【化１】
2004537265.tif 000066
［式中、
ＸおよびＹは、独立に、Ｆ、ＨまたはＣＨ3であり；
Ｒ8はＨ、ＦまたはＩであり；
Ｒ9はＨ、ＦまたはＯＨであり；
Ｒ18はＨまたはＦであり；
Ｒ19はＨまたはＦであり；
Ｒ10はＨまたはＣ1−Ｃ8アルキルであり；
Ｌは結合または−ＯＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）であり；および
Ｑは
【化２】
2004537265.tif 000067
（式中、Ｒ11はＨ、ＣＨ3、ＣＨ2ＣＨ3またはシクロプロピルであり；および
ＺはＯまたはＳである。）である。］
またはその薬学的に許容な塩を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＸがＦであり、ＹがＨであり、Ｒ10がＨであり、およびＲ11がＣＨ3である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記フォトアフィニティープローブが、２−［４−［４−［（５Ｓ）−５−［（アセチルアミノ）メチル］−２−オキソ−３−オキサゾリジニル］−２−フルオロフェニル］−１−ピペラジニル］−２−オキソエチル  ４−アジド−２−ヒドロキシ−５−ヨード−125Ｉ−ベンゾエートである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記フォトアフィニティープローブが、Ｎ−［［（５Ｓ）−３−［４−［４−（４−アジド−２−ヒドロキシ−５−ヨード−125Ｉ−ベンゾイル）−１−ピペラジニル］−３−フルオロフェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］アセトアミドである、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記フォトアフィニティープローブが、２−［４−［４−［（５Ｓ）−５−［（アセチルアミノ）メチル］−２−オキソ−３−オキサゾリジニル］−２−フルオロフェニル］−１−ピペラジニル］−２−オキソエチル  ４−アジド−３−ヨード−125Ｉ−ベンゾエートである、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記フォトアフィニティープローブが、Ｎ−［［（５Ｓ）−３−［４−［４−（４−アジド−３−ヨード−125Ｉ−ベンゾイル）−１−ピペラジニル］−３−フルオロフェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］アセトアミドである、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記フォトアフィニティープローブが式
【化３】
2004537265.tif 000068
［式中、
ＸおよびＹは、独立に、Ｆ、ＨまたはＣＨ3であり；
Ｒ12はＮ3または
【化４】
2004537265.tif 000069
（式中、Ｒ8はＨ、ＦまたはＩであり；
Ｒ9はＨ、ＦまたはＯＨであり；
Ｒ18はＨまたはＦであり；
Ｒ19はＨまたはＦである。）であり；および
Ｑは、
【化５】
2004537265.tif 000070
（式中、Ｒ11はＨ、ＣＨ3、ＣＨ2ＣＨ3またはシクロプロピルであり；および
ＺはＯまたはＳである。）である。］
またはその薬学的に許容な塩を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＸがＦであり、ＹがＨであり、Ｒ11がＣＨ3であり、およびＲ12が
【化６】
2004537265.tif 000071
である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記フォトアフィニティープローブが、Ｎ−［［（５Ｓ）−３−（４’−アジド−２−フルオロ［１，１’−ビフェニル］−４−イル）−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］−Ｔ3−アセトアミドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記フォトアフィニティープローブが、Ｎ−［［（５Ｓ）−３−（４’−アジド−２−フルオロ−３’−ヨード［１，１’−ビフェニル］−４−イル）−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］−Ｔ3−アセトアミドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記フォトアフィニティープローブが、Ｎ−［［（５Ｓ）−３−（４’−アジド−２−フルオロ−３’−ヨード［１，１’−ビフェニル］−４−イル）−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］エタン−35Ｓ−チオアミドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記フォトアフィニティープローブが、Ｎ−［［（５Ｓ）−３−（４’−アジド−２−フルオロ−３’−ヨード−125Ｉ−［１，１’−ビフェニル］−４−イル）−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］アセトアミドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記フォトアフィニティープローブが式
【化７】
2004537265.tif 000072
［式中、
ＸおよびＹは、独立に、Ｆ、ＨまたはＣＨ3であり；
Ｒ13は、
【化８】
2004537265.tif 000073
（式中、Ｒ14はＨ、Ｎ3、ハロゲン、ＮＨ2，ＯＨ、ＳＨ、Ｃ1−Ｃ4アルキルアミノ、Ｃ1−Ｃ4ジアルキルアミノ、Ｃ1−Ｃ4アルキル、ニトリル、カルボキサミド、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、Ｃ1−Ｃ4アルキルチオ、またはＣ1−Ｃ4アルコキシカルボニルである。）であり；および
Ｐは、
【化９】
2004537265.tif 000074
［式中、ＺはＯまたはＳであり；および
Ｒ15は、
【化１０】
2004537265.tif 000075
（式中、Ｒ8はＨ、ＦまたはＩであり；
Ｒ9はＨ、ＦまたはＯＨであり；
Ｒ18はＨまたはＦであり；および
Ｒ19はＨまたはＦである。）である。］である。］
またはその薬学的に許容な塩を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ＸがＦであり、ＹがＨであり、Ｒ14がＨである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記フォトアフィニティープローブが、（２Ｅ）−３−（４−アジド−３−ヨード−125Ｉ−フェニル）−Ｎ−［［（５Ｓ）−３−［３−フルオロ−４−（４−ピリジニル）フェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］−２−プロペンアミドである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記フォトアフィニティープローブが、４−アジド−Ｎ−［［（５Ｓ）−３−［３−フルオロ−４−（４−ピリジニル）フェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］−２−ヒドロキシ−５−ヨード−125Ｉ−ベンズアミドである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記フォトアフィニティープローブが、Ｎ−（４−アジドフェニル）−Ｎ’−［［（５Ｓ）−３−［３−フルオロ−４−（４−ピリジニル）フェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］−35Ｓ−チオウレアである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
プローブとその生物学上の標的との結合を阻害する化合物の特定方法であって、
前記生物学上の標的にプローブを接触させること（ここで当該生物学上の標的はリボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ＬｅｐＡタンパク質、Ｌ２７タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせである。）；
前記生物学上の標的に試験化合物を接触させること；および
前記試験化合物の存在下および非存在下における前記プローブと前記生物学上の標的との間の結合の量を比較すること（ここで、試験化合物の存在下においてのプローブおよび生物学上の標的の間の結合の量の減少は、当該試験化合物が当該生物学上の標的への当該プローブの結合を阻害することを意味する。）、の工程を含む前記方法。
【請求項２３】
前記生物学上の標的が固相に結合している、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記固相がシンチレーション近接ビーズである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記生物学上の標的が２３ＳリボソームＲＮＡである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記生物学上の標的がペプチジルトランスフェラーゼ領域を含む２３ＳリボソームＲＮＡのフラグメントである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記生物学上の標的がｔＲＮＡである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記生物学上の標的がｔＲＮＡfMetである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記生物学上の標的がＬｅｐＡタンパク質である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記生物学上の標的がＬ２７リボソームタンパク質である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
前記プローブが検出可能となるように標識化されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
前記検出可能な標識が酵素的、化学発光的、蛍光性、または放射性である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記プローブがオキサゾリジノン化合物である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
前記オキサゾリジノン化合物がリネゾリドまたはエペレゾリドである、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一つには、感受性細胞内における、関連性のある抗生物質の結合部位の所在を確認するために、フォトアフィニティープローブ（ｐｈｏｔｏａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｒｏｂｅ）の使用の新規な方法を指向する。特に、該フォトアフィニティープローブは、抗生物質のオキサゾリジノン類の生物学上の標的の特定に使用される、オキサゾリジノンフォトアフィニティープローブである。本発明は、一つには、プローブの生物学上の標的に対する結合を阻害する化合物を特定する方法もまた指向する。
【０００２】
発明の背景技術
近年、いくつかの化合物が開発され、抗微生物剤（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔ）または抗細菌剤（ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｇｅｎｔ）としての作用を示している。国際公開ＷＯ９９／４１２４４は、抗微生物剤として有用な置換アミノフェニルイソキサゾリン化合物を開示している。米国特許第５，９１０，５０４号は、ヘテロ芳香環で置換されたフェニルオキサゾリジノン抗微生物剤を記載している。さらに、国際公開ＷＯ００／１０５６６は、イソキサゾリノン抗細菌剤を開示している。ここで取り上げたような新たな抗微生物剤または抗細菌剤の開発における重要な工程の一つは、作用のメカニズムの決定である。例えばスパルソマイシンのような、タンパク質の翻訳を異なる、有用性の低い、かつ直接的なメカニズムで阻害する、非選択的抗生物質／抗腫瘍剤の相互作用の特異的部位は報告されている（Ｐｏｒｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９９、９６、９００３−９００８）。単離された無細胞系を用いた化学プローブによるこれまでの研究は、オキサゾリジノン類の抗生物質である化合物のこれらのタイプの相互作用の関連部位を明らかにすることができていなかった（Ｍａｔａｓｓｏｖａら、ＲＮＡ、１９９９、５、９３９−９４６）。これは、一つには、これまでの方法では、抗生物質のこの重要な１分類の、特殊で独特な作用のメカニズムの部位を明らかにすることができないことが理由である。抗微生物剤および／または抗細菌剤の作用メカニズムを決定するための助けとなるプローブ、およびそれを用いた方法は強く求められている。
【０００３】
本発明は、特に、オキサゾリジノン−タイプの抗生物質の生物学上の標的に対するプローブの結合を阻害する化合物の特定方法と同様に、そのような生物学上の標的を特定する新規な方法を指向する。本発明は、感受性細胞内の特異的なオキサゾリジノン相互作用部位の特定を可能にする研究の新規なメカニズムによる化合物／プローブの使用を含む。出願人の方法は、無傷の細胞において特定の化合物を用い、当該化合物の活性および不活性なエナンチオマーによる特定部位への架橋結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ）についての競合（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）を用いることを含む。本発明のこれらの側面および他の側面について以下に記載する。
【０００４】
発明の概要
本発明は、特に、例えば哺乳類の細胞、およびグラム陽性およびグラム陰性バクテリアなどの細胞の中のオキサゾリジノン結合部位の特定を指向する。本発明は、抗微生物活性のための化合物のスクリーニングも指向する。
【０００５】
特に、本発明は、オキサゾリジノンフォトアフィニティープローブを感受性細胞に接触させる工程、フォトアフィニティープローブと少なくとも一つの生物学上の標的の錯体を形成するためにフォトアフィニティーラベルに光を当てる工程、ならびに錯体を検出する工程を含む、オキサゾリジノン−タイプ抗生物質の生物学上の標的を特定するための方法を指向する。
【０００６】
本発明の別の実施態様は、プローブを生物学上の標的に接触させる工程（ここで生物学上の標的は、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ＬｅｐＡ、Ｌ２７、またはそれらの任意の組み合わせである。）、生物学上の標的に試験化合物を接触させる工程、および試験化合物の存在および非存在下におけるプローブと生物学上の標的の間の結合の量を比較する工程（ここで、プローブと生物学上の標的の間の結合の量の減少は、試験化合物が生物学上の標的へプローブの結合を阻害することを示す。）を含む、生物学上の標的へのプローブの結合を阻害する化合物の特定の方法を指向する。
【０００７】
好ましい実施態様の詳細な説明
本明細書の全体にわたって、種々の定義付けがなされている。ほとんどの言葉は、当該技術分野における当業者によってこれらの言葉が持っていると考えられるであろう意味を有する。これ以降の記載または本明細書のどこかに特に定義されている言葉は、全体としての、および当該技術分野の当業者によって通常理解されるような発明の文脈においてもたらされる意味を有する。
【０００８】
本発明は、これらの特定の抗生物質の相互作用の特異的部位を、タンパク質翻訳の他の阻害剤について報告されているものとは異なる様式の相互作用を伴う、リボソームのペプチジル転移反応中心の近傍であると特定した。これらのオキサゾリジノン抗生物質の相互作用は、ｔＲＮＡ、および６４ｋＤａ（ＬｅｐＡ）および１１ｋＤａ（Ｌ２７）の２つのタンパク質とともに、２３Ｓ  ＲＮＡの中心領域Ｖに関連している。この新規なアプローチ（化合物および技術）による当該部位の同定により、これらの特定の標的を用いた相互作用のスクリーニングを伴う構造を基本とした設計を用いた直接的な探索手段が、まさに可能となる。特に、本発明の方法は、オキサゾリジノン−タイプの抗生物質と結合し、オキサゾリジノン−タイプの抗生物質の標的となる細胞の構成要素を特定するために使用されうる。さらに、本発明の方法は、例えば化合物のライブラリーについて、例えば前記の生物学上の標的に、フォトアフィニティープローブが結合することを阻害する化合物を特定するためのスクリーニングに使用されうる。そのような化合物はそれ自身が抗細菌活性または抗微生物活性を有しうるか、もしくは抗細菌活性または抗微生物活性を有する化合物の設計に使用されうる。
【０００９】
本明細書で用いられる「生物学上の標的（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔ）」という語句は、細胞の中の任意のタンパク質、核酸、脂質などを意味する。生物学上の標的は、限定はされないが、細胞質、核、細胞膜、細胞壁などの内容物を含む。特に、生物学上の標的は、限定はされないが、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ＬｅｐＡタンパク質およびＬ２７を含む。生物学上の標的はプローブを結合する能力がある。
【００１０】
本明細書で用いられる用語「接触（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」は、細胞内、細胞上または細胞に対して、もしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの細胞由来の生物学上の標的に対しての、プローブまたは試験化合物の直接的または非直接的な適用を意味する。試験化合物およびプローブは、バッファー、塩、溶液などの中に存在しうる。
【００１１】
本明細書で用いられる用語「架橋結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ）」または「結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、プローブと、細胞内または細胞由来の生物学上の標的またはその組み合わせの少なくとも一つの間の物理的相互作用を意味する。結合は、イオン性、非イオン性、水素結合、ファン・デル・ワールス、疎水性相互作用などを含む。物理的相互作用である結合は、他のタンパク質または化合物を通して、もしくは他のタンパク質または化合物のために、直接的または非直接的であり得る。直接的結合は、他のタンパク質または化合物を通して、もしくは他のタンパク質または化合物のために生じるものではなく、実質的な化学中間体なしに生じる相互作用を意味する。
【００１２】
本明細書で用いられる用語「オキサゾリジノン」は、米国出願番号０７／４３８，７５９、０７／５５３，７９５、０７／７８６，１０７、０７／８３１，２１３、０８／３２９，７１７、０７／９０９，３８７、６０／０１５，４９９、０９／１３８，２０９、６０／００８，５５４、６０／０６４，７３８、６０／０６５，３７６、６０／０６７，８３０、６０／０８９，４９８、６０／１００，１８５、６０／０８８，２８３、６０／０９２，７６５、０７／２４４，９８８、０７／２５３，８５０；ヨーロッパ特許ＥＰ０５００６８６、ＥＰ０６１０２６５、ＥＰ０６７３３７０；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９０／０６２２０、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０８９０４、ＰＣＴ／ＵＳ９４／１０５８２、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０２９７２、ＰＣＴ／ＵＳ９５／１０９９２、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０４８５０、ＰＣＴ／ＵＳ９５／１２７５１、ＰＣＴ／ＵＳ９６／００７１８、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３５７０、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０９５８９、ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５２０２、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０３４５８、ＰＣＴ／ＵＳ９６／１２７６６、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１９７０、ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４１３５、ＰＣＴ／ＵＳ９６／１９１４９、ＰＣＴ／ＵＳ９６／１７１２０、ＰＣＴ／ＵＳ９８／０９８８９、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１３４３７；および米国特許番号５，７００，７９９、５，７１９，１５４、５，５４７，９５０、５，５２３，４０３、５，６６８，２８６、５，６５２，２３８、５，６８８，７９２、５，２４７，０９０、５，２３１，１８８、５，６５４，４２８、５，６５４，４３５、５，７５６，７３２、５，１６４，５１０、５，１８２，４０３、５，２２５，５６５、５，６１８，９４９、５，６２７，１９７、５，５３４，６３６、５，５３２，２６１、５，７７６，９３７、５，５２９，９９８、５，６８４，０２３、５，６２７，１８１、５，６９８，５７４、５，２２０，０１１、５，２０８，３２９、５，０３６，０９２、４，９６５，２６８、４，９２１，８６９、４，９４８，８０１、５，０４３，４４３、５，１３０，３１６、５，２５４，５７７、４，８７７，８９２、４，７９１，２０７、４，６４２，３５１、４，６６５，１７１、４，７３４，４９５、４，７７５，７５２、４，８７０，１６９、４，６６８，５１７、４，３４０，６０６、４，３６２，８６６、４，１９３，９１８、４，０００，２９３、３，９４７，４６５、４，００７，１６８、３，６７４，７８０、３，６８６，１７０、３，９０６，１０１、３，６７８，０４０、３，１７７，１１４、３，１４１，８８９、３，１４９，１１９、３，１１７，１２２、５，７１９，１５４、５，２５４，５７７、４，８０１，６００、４，７０５，７９９、４，４６１，７７３、４，２４３，８０１、３，７９４，６６５、３，６３２，５７７、３，５９８，８３０、３，５１３，２３８、３，５９８，８１２、３，５４６，２４１、３，３１８，８７８、３，３２２，７１２、５，５６５，５７１、５，８８０，１１８、５，９５２，３２４、５，９１０，５０４、６，１６６，０５６、５，９６８，９６２、６，０９０，８２０、５，７３６，５４５、６，２７７，９８５、５，９５５，４６０、５，９２２，７０７、６，２５５，３０４、６，２１８，４１３、５，９７７，３７３、６，２５１，８６９、５，９２９，２４８、および５，８０１，２４６に記載された化合物を含む、オキサゾリジノン類として知られている分類の化合物を意味する。これらの出願の各々の開示はすべて参照文献として本明細書に援用される。好ましいオキサゾリジノンにはリネゾリド（ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ）およびエペレゾリド（ｅｐｅｒｅｚｏｌｉｄ）が含まれる。
【００１３】
本明細書で用いられる用語「オキサゾリジノン−タイプ抗生物質」は、抗微生物活性を有し、オキサゾリジノン抗生物質の生物学上の標的（タンパク質、核酸など）に結合するか相互作用する任意の化合物を意味する。従って、オキサゾリジノン−タイプ抗生物質は、オキサゾリジノン抗生物質と同じ作用メカニズムを有する場合がある。あるいは、オキサゾリジノン−タイプ抗生物質は、オキサゾリジノン抗生物質と同様に、同じ生物学上の標的のいくつかと相互作用するか結合する場合がある。さらに、オキサゾリジノン−タイプ抗生物質は、オキサゾリジノン抗生物質と異なる化学構造を有する場合がある。
【００１４】
本明細書で用いられる「プローブ」という用語は、生物学上の標的に結合することができる任意の化合物、タンパク質、核酸分子、有機低分子などを意味する。プローブは、限定はされないが、フォトアフィニティー化合物、抗体、オリゴヌクレオチド、オキサゾリジノン抗生物質などを含む。プローブは標識化されうるものであり、またはされていなくてもよい。
【００１５】
本明細書で用いられる語句「感受性細胞」は、フォトアフィニティープローブがその中で生物学上の標的に結合しうる任意の細胞を意味する。感受性細胞は、限定はされないが、細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）、真菌、および哺乳類の細胞を含む。
【００１６】
本明細書で用いられる用語「試験化合物」は、細胞の中または細胞由来の生物学上の標的と潜在的に相互作用する、または架橋結合においてプローブと競合すると推定される、特定可能な任意の化学物質または分子、低分子、ペプチド、糖、天然物または合成物を意味する。
【００１７】
本発明は、オキサゾリジノン抗生物質の生物学上の標的を決定および／または特定するための、オキサゾリジノンフォトアフィニティープローブを使用する方法を指向する。本発明は、特定の試験化合物がオキサゾリジノン抗生物質の生物学上の標的に相互作用することができるかどうかを決定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイをもまた指向する。そのような方法により、特に、オキサゾリジノン抗生物質の抗細菌活性のメカニズムに基づいた新規な抗生物質のための、分子に基づく医薬発見方法の創製を可能にする。
【００１８】
本発明の一つの実施態様は、オキサゾリジノン−タイプ抗生物質の生物学上の標的を特定するための方法を指向する。感受性細胞は、オキサゾリジノンフォトアフィニティープローブなどのプローブと接触させられる。本発明の感受性細胞は、限定はされないが、例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（Ａ、Ｂ、Ｃバイオタイプ）；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｅｏｌｙｔｉｃｕｓ；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｍｉｎｉｓ；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ；  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（グループＢ）；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ／ｒａｔｔｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（グループＡ）；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ；Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐｓ．；Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｉｓｔｉｄｉｎｏｌｏｖｏｒａｎｓ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｌｅ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐｓ．；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ；Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ；Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐｓ．；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ；Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐｐｓ．；Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓおよびＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含むグラム陽性細菌の病原体を含む。
【００１９】
感受性細胞は、限定はされないが、例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ；Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ；Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ；Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ；Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ；Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ；Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ；Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ；Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ；Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ；Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ；Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｔｉ；Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ；Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｈｏｓｈｉｎａｅ；Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ；Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ  （グループＡおよびＢ）；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（すべての病原性のサブタイプを含む）；Ｅｈｒｌｉｃｉａ ｓｐｐｓ．；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｏｃｏｍｉｔａｎｓ；  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ；  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｔｉｆｌｕｅｎｚａｅ；Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ；Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ；Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ；Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐｐｓ．；Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｓｐｐｓ．；Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔｔａｒｈａｌｉｓ；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ；Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ；Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ；Ｐｒｏｔｅｕｓ ｐｅｎｎｅｒｉ；Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｐｐｓ．；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｅｃｉｅｓ；Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ；Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ；Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ；Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｓｐｐｓ．；サルモネラサブグループ１セロタイプ（Ｓ． ｐａｒａｔｙｐｈｉおよびＳ． ｔｙｐｈｉを含む）；サルモネラサブグループ２、３ａ、３ｂ、４、および５；Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓａｎｓ；Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐｐｓ．；Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｂｏｙｄｉｉ；Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ；Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ；Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ；Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ；Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ；Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ；Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ；およびＶｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓを含むグラム陰性細菌の病原体もまた含む。
【００２０】
感受性細胞は、限定はされないが、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ；およびその他のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐｓを含むマイコバクテリアル種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｐｅｃｉｅｓ）もまた含む。
【００２１】
感受性細胞は、限定はされないが、例えば、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；およびその他のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐｓを含むマイコプラズマ（または、胸膜肺炎菌様微生物（ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ−ｌｉｋｅ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ））もまた含む。
【００２２】
感受性細胞は、限定はされないが、例えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ；その他のＢｏｒｒｅｌｉａ種；  Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｓｐｐｓ．；Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍを含むトレポネマ科細菌類（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｔａｃｅａｅ）（螺旋菌：ｓｐｉｒａｌ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）もまた含む。
【００２３】
感受性細胞は、限定はされないが、哺乳類の細胞もまた含む。
感受性細胞がフォトアフィニティープローブと接触させられた後に、フォトアフィニティープローブと生物学上の標的の間の錯体を形成するため、例えば、感受性細胞の中の少なくとも一つの生物学上の標的に対してフォトアフィニティープローブが架橋結合を形成するために、フォトアフィニティープローブは光、好ましくは紫外線光を当てられる。フォトアフィニティープローブと生物学上の標的の間に形成される錯体は、標準的な方法論により検出される。好ましくは、フォトアフィニティープローブは検出可能な標識化がなされる。検出可能な標識は、限定はされないが、多くのものが購入可能である、酵素的、蛍光の、化学発光の、または放射性標識を含む。好ましくは放射性標識は、限定はされないが、3Ｈ、35Ｓ、および125Ｉを含む。フォトアフィニティープローブと生物学的標的の間の錯体は、例えばオートラジオグラフィー、酵素活性検出、化学シフト／測定、蛍光強度、抗−フォトアフィニティープローブ抗体を用いたＥＬＩＳＡなどを含む、用いた検出可能な特定の標識に対応する、任意の数の周知の検出方法により検出される。同時に複数のフォトアフィニティープローブをもまた使用しうる。出願人は上述の方法により、２３Ｓ  ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ＬｅｐＡおよびＬ２７を含むオキサゾリジノン化合物のいくつかの生物学上の標的を特定した。
【００２４】
本発明の別の実施態様は、プローブのその生物学上の標的との結合を阻害する化合物の特定の方法を指向する。当該方法は、例えば、オキサゾリジノンと類似の作用メカニズムを有する抗微生物化合物の特定に用いることができる。生物学上の標的は、例えばオキサゾリジノン化合物などのプローブと、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させられる。好ましくは、該プローブは、リネゾリドまたはエペレゾリド、もしくはそれらの誘導体である。生物学上の標的は、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ＬｅｐＡタンパク質、Ｌ２７リボソームタンパク質、またはそれらの任意の組み合わせである。生物学上の標的もまた、試験化合物と接触させられる。試験化合物の存在下および非存在下でのプローブと生物学上の標的との間の結合の量が比較される。試験化合物の存在下のプローブと生物学上の標的の間の結合の量の減少は、試験化合物がプローブの生物学上の標的に対する結合を阻害することを示す。
【００２５】
本発明のいくつかの実施態様において、生物学上の標的は、限定はされないが、細孔が制御されたガラス、マイクロタイタープレート、カラム、シンチレーション近接ビーズ、セファロース、ポリアクリルアミドなどを含む固層に結合される。従って、例えば、感受性の供給源由来のＬｅｐＡ、またはＬｅｐＡの生物学上活性なフラグメントは、シンチレーション近接ビーズ（ＳＰＡビーズ）において、例えば、当該ビーズに付着した抗体によって付着し、ＬｅｐＡペプチド配列を認識する抗体によって誘導される。試験の標的もまた、ヒスチジン−銅（Ｈｉｓ−ｃｏｐｐｅｒ）、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）などの他の標準的な方法で付着する。その後、ＳＰＡビーズを含むマイクロタイタープレートは、（本明細書で記載したような）追加の標的を含んで、または含まないで、3Ｈ−ｅｐｅｒｅｚｏｌｉｄなどの標識化された基準プローブとともにインキュベートされる。試験化合物は、オキサゾリジノン抗生物質についての標的または標的の集合に対する標識化プローブの結合を減少させる能力を評価される。標的上の同じ部位を認識することができる化合物は、有用な抗生物質としての活性、または抗微生物活性を有しうる。同様に、本明細書で記載したその他の標的（例えば、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡまたはＬ２７）も、ＳＰＡビーズに対して第１に付着させられ得るものであり、そしてアッセイは、同様の方法で構築および実施されうる。標識化していないプローブ（例えば、本実施例中のエペレゾリド）と同様の様式で、標識化されたプローブ（例えば、本実施例中の3Ｈ−エペレゾリド）の結合を減少させる化合物は、有用な抗生物質としての活性、または抗微生物活性を有しうる。
【００２６】
本発明のいくつかの実施態様において、生物学上の標的は２３ＳリボソームＲＮＡまたはそのフラグメントである。好ましくは、２３Ｓ  ＲＮＡのフラグメントは、中心のペプチジルトランスフェラーゼループ（ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｌｏｏｐ）を含む。２３Ｓ  ＲＮＡのフラグメントは、長さにおいて、約１０〜約１０００のヌクレオチド、より好ましくは約２５〜約７５０のヌクレオチド、より好ましくは約５０〜５００のヌクレオチド、より好ましくは約１００〜２５０のヌクレオチドであり得る。好ましくは当該フラグメントは、２３ＳリボソームＲＮＡのヌクレオチド配列の近接のヌクレオチドを含む。中心のペプチジルトランスフェラーゼ領域および本技術で特定される接点を含むＲＮＡには、上述の生物のいずれかから単離される、対応する配列を有する類似の２３Ｓ  ＲＮＡ領域が含まれる。２３ＳリボソームＲＮＡは、上述の方法で単離することができ、もしくは標準的な方法で単離または構築することができる。例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの２３Ｓ  ＲＮＡのヌクレオチド配列は、Ｌｕｄｗｉｇら、Ｓｙｓｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９２、１５、４８７−５０１およびＢｒｏｓｉｕｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８０、７７、２０１−４に記載されており、これらの各々はその全体を参照することにより本明細書に援用される。２３Ｓ  ＲＮＡは、例えば、Ｍｏａｚｅｄら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９８６、１８７、３９９−４１６に記載されているように単離されうる。この文献はその全体を参照することにより本明細書に援用される。
【００２７】
本発明のいくつかの実施態様において、生物学上の標的はｔＲＮＡ分子である。好ましくは、ｔＲＮＡはｔＲＮＡfMetである。ｔＲＮＡは上述の方法により単離されうるものであり、または例えばＥ．ｃｏｌｉなどの細胞から単離されうるものであり、または標準的方法により構築されうるものである。ｆＭｅｔ  ｔＲＮＡのヌクレオチド配列および単離は、例えば、Ｓｅｏｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８７、８４、３３４−８に記載されており、この文献はその全体を参照することにより本明細書に援用される。
【００２８】
本発明のいくつかの実施態様において、生物学上の標的はＬｅｐＡタンパク質、またはそのフラグメントである。ＬｅｐＡは、ＹｑｅＱ遺伝子のタンパク質生産物としても知られている。ＬｅｐＡのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）は以下に示すとおりである。
【００２９】
【化１】
2004537265.tif 000002
【００３０】
ＬｅｐＡのフラグメントは、長さにおいて、約１０〜約５５０のアミノ酸、より好ましくは約２５〜約５００のアミノ酸、より好ましくは約５０〜約４００のアミノ酸、より好ましくは約１００〜約３００のアミノ酸およびより好ましくは約１５０〜約２５０のアミノ酸であり得る。好ましくは、フラグメントはＬｅｐＡのアミノ酸配列の近接のアミノ酸を含む。ＬｅｐＡは、上述した方法により単離されうるものであり、または上述の生物のいずれかから単離されうるものである。ＬｅｐＡは、例えば、Ｍａｒｃｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８５、２６０、７２０６−１３に記載されているように単離されうる。この文献はその全体を参照することにより本明細書に援用される。
【００３１】
本発明のいくつかの実施態様において、生物学上の標的はＬ２７（１１ｋＤａリボソームタンパク質）またはそれらのフラグメントである。Ｓ．ａｕｒｅｕｓにおいて、Ｌ２７は以下の代表的なアミノ酸配列：
【００３２】
【化２】
2004537265.tif 000003
【００３３】
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を含む。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて、Ｌ２７は以下の代表的なアミノ酸配列：
【００３４】
【化３】
2004537265.tif 000004
【００３５】
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を含む。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、Ｌ２７は以下の代表的なアミノ酸配列：
【００３６】
【化４】
2004537265.tif 000005
【００３７】
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を含む。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅにおいて、Ｌ２７は以下の代表的なアミノ酸配列：
【００３８】
【化５】
2004537265.tif 000006
【００３９】
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）を含む。Ｌ２７を記載した代表的な参考文献は、Ｃｈｅｎら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、１９７５、５９、９６−９９であり、本文献はその全体を参照することにより本明細書に援用される。Ｌ２７のフラグメントは、長さにおいて、約１０〜約９０のアミノ酸、より好ましくは約１５〜約７５のアミノ酸、より好ましくは約２０〜約５０のアミノ酸、より好ましくは約２５〜約４０のアミノ酸、そしてより好ましくは約３０〜約３５のアミノ酸であり得る。好ましくは、フラグメントはＬ２７のアミノ酸配列の近接のアミノ酸を含む。Ｌ２７は上記の方法により単離されうるものであり、または標準的方法により単離または製造されうるものであり、および上記の生物のいずれかから単離されうるものである。
【００４０】
本発明のいくつかの実施態様において、プローブは、上記の生物学上の標的のいずれかの組み合わせを含む、複数の異なる生物学上の標的と接触させられる。
生物学上の標的は、試験化合物とも接触させられる。試験化合物の存在下および非存在下でのプローブと生物学上の標的の間の結合の量が比較される。結合は
、当該技術分野の当業者に知られている多数の方法により、定量的または定性的に測定されうる。試験化合物の存在下でのプローブと生物学上の標的の間の結合の量の減少は、プローブの生物学上の標的に対する結合を試験化合物が阻害することを示している。複数の試験化合物を一度にスクリーニングすることも可能である。
【００４１】
本発明のいくつかの実施態様において、試験化合物は、哺乳類の細胞を用いてさらに試験されうる。非哺乳類の細胞（例えば、細菌、菌類など）における生物学上の標的に対するプローブの結合を阻害することができるが、哺乳類の細胞における生物学上の標的に対するプローブの結合を阻害しえないか、または阻害してもとるに足らない程度である試験化合物は、哺乳類の治療における理想的な候補となりうる。このような場合には、試験化合物は、宿主の哺乳類の細胞に対して、たとえあるとしてもほんのわずかな影響しか与えない一方で、微生物または細菌に対して活性を有する化合物であろう。本明細書に記載した方法は、特に、真核細胞における抗生物質としての活性のある化合物の毒性の性質についての分子的説明に有用である。特別な場合においては、感受性の真核細胞または細胞内器官が、細菌細胞について定義したのと同様にインキュベートおよび処理され、関連する標的が特定される。このことにより、活性のある抗生物質の発見のための、以下に述べるスクリーニング、アッセイおよび構造に基づく設計の限定が可能となり、否定的な選択を行うための手法（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）として使用される場合は、新しい抗細菌剤またはその他の治療剤の最適化が可能になる。
【００４２】
本明細書に記載されるいずれかの方法において使用されうるフォトアフィニティープローブは以下に示され、限定はされないが、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖ、または式ＶＩ、またはそれらの任意の組み合わせを含むフォトアフィニティープローブを包含する。Ｃ−５における好ましい立体配置は（Ｓ）である。本発明の化合物が更なる不斉中心を有しうること、および光学活性体として、またはラセミ体として単離されうることは、当該技術分野の当業者には理解されるであろう。本発明は、本発明の化合物のいかなるラセミ体、光学活性体（例えば、エナンチオマー、ジアステレオマーなど）互変異性体、立体異性体、またはそれらの混合物をも包含する。本発明の好ましい化合物としては、3Ｈ（Ｔ3）、35Ｓ、または125Ｉのいずれかひとつの放射性元素を有する。しかし、化学構造式は描かれる化合物のすべての同位体型を含むものと理解される。
【００４３】
本発明のいくつかの実施態様において、フォトアフィニティープローブは以下に示す式Ｉを含む。
【００４４】
【化６】
2004537265.tif 000007
【００４５】
式中、ＸおよびＹは、独立に、種々の置換様式において、Ｆ、ＨまたはＣＨ3である。好ましい化合物は、１個のフッ素原子と１個のＨを有する。Ｒ1は、Ｈ、ＦまたはＩである。Ｒ2は、Ｈ、ＦまたはＯＨである。Ｒ16は、ＨまたはＦである。Ｒ17は、ＨまたはＦである。Ｒ3は、ＨまたはＣ1−Ｃ8アルキルである。Ｌは結合または−ＯＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）である。Ｑは、
【００４６】
【化７】
2004537265.tif 000008
【００４７】
であり、式中、Ｒ4は、Ｈ、ＣＨ3，ＣＨ2ＣＨ3またはシクロプロピルである。Ｚは、ＯまたはＳである。式Ｉを含む化合物には、その薬学的に許容な塩も含まれる。
式Ｉを含む好ましい化合物は次のような置換基を有する：すなわち、ＸはＦ、ＹはＨ、Ｒ3はＨ、Ｒ4はＣＨ3である。より好ましくは、式Ｉの化合物は、限定はされないが、２−［４−［４−［（５Ｓ）−５−［（アセチルアミノ）メチル］−２−オキソ−３−オキサゾリジニル］−２−フルオロフェニル］−１−ピペラジニル］−２−オキソエチル  ４−アジド−２−ヒドロキシ−５−ヨード−l25Ｉ−ベンゾエート、Ｎ−［［（５Ｓ）−３−［４−［４−（４−アジド−２−ヒドロキシ−５−ヨード−125Ｉ−ベンゾイル）−１−ピペラジニル］−３−フルオロフェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］アセトアミド、２−［４−［４−［（５Ｓ）−５−［（アセチルアミノ）メチル］−２−オキソ−３−オキサゾリジニル］−２−フルオロフェニル］−ｌ−ピペラジニル］−２−オキソエチル  ４−アジド−３−ヨード−125Ｉ−ベンゾエート、およびＮ−［［（５Ｓ）−３−［４−［４−（４−アジド−３−ヨード−125Ｉ−ベンゾイル）−１−ピペラジニル］−３−フルオロフェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］アセトアミドを含む。
【００４８】
本発明の他の実施態様において、フォトアフィニティープローブは以下に示す式ＩＩを含む。
【００４９】
【化８】
2004537265.tif 000009
【００５０】
式中、ＸおよびＹは、独立に、種々の置換様式において、Ｆ、ＨまたはＣＨ3である。好ましい化合物は、１個のフッ素原子と１個のＨを有する。Ｒ1は、Ｈ、ＦまたはＩである。Ｒ2は、Ｈ、ＦまたはＯＨである。Ｒ16は、ＨまたはＦである。Ｒ17は、ＨまたはＦである。Ｑは、
【００５１】
【化９】
2004537265.tif 000010
【００５２】
である。式中、Ｒ4は、Ｈ、ＣＨ3、ＣＨ2ＣＨ3またはシクロプロピルである。Ｚは、ＯまたはＳである。式ＩＩを含む化合物は、その薬学的に許容な塩もまた含む。
式ＩＩを含む好ましい化合物は、次のような置換基を有する：すなわち、ＸはＦ、ＹはＨ、およびＲ4はＣＨ3である。より好ましくは、式ＩＩの化合物は、限定はされないが、Ｎ−［［（５Ｓ）−３−（４’−アジド−２−フルオロ［１，１’−ビフェニル］−４−イル）−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］−Ｔ3−アセトアミド、Ｎ−［［（５Ｓ）−３−（４’−アジド−２−フルオロ−３’−ヨード［１，１’−ビフェニル］−４−イル）−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］−Ｔ3−アセトアミド、Ｎ−［［（５Ｓ）−３−（４’−アジド−２−フルオロ−３’−ヨード［１，１’−ビフェニル］−４−イル）−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］エタン−35Ｓ−チオアミド、およびＮ−［［（５Ｓ）−３−（４’−アジド−２−フルオロ−３’−ヨード−125Ｉ−［１，１’−ビフェニル］−４−イル）−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］アセトアミドを含む。
【００５３】
本発明の他の実施態様において、フォトアフィニティープローブは以下に示す式ＩＩＩを含む。
【００５４】
【化１０】
2004537265.tif 000011
【００５５】
式中、ＸおよびＹは、独立に、種々の置換様式において、Ｆ、ＨまたはＣＨ3である。好ましい化合物は１個のフッ素原子と１個のＨを有する。Ｒ5は、
【００５６】
【化１１】
2004537265.tif 000012
【００５７】
である。式中、Ｒ6は、Ｈ、Ｎ3、ハロゲン、ＮＨ2，ＯＨ、ＳＨ、Ｃ1−Ｃ4アルキルアミノ、Ｃ1−Ｃ4ジアルキルアミノ、Ｃ1−Ｃ4アルキル、ニトリル、カルボキサミド、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、Ｃ1−Ｃ4アルキルチオ、またはＣ1−Ｃ4アルコキシカルボニルである。Ｐは、
【００５８】
【化１２】
2004537265.tif 000013
【００５９】
である。式中、ＺはＯまたはＳである。Ｒ7は、
【００６０】
【化１３】
2004537265.tif 000014
【００６１】
である。式中、Ｒ1はＨ、ＦまたはＩである。Ｒ2は、Ｈ、ＦまたはＯＨである。Ｒ16は、ＨまたはＦである。Ｒ17は、ＨまたはＦである。式ＩＩＩを含む化合物は、その薬学的に許容な塩をもまた含む。
【００６２】
式ＩＩＩを含む好ましい化合物は、次の置換基を有する：すなわち、ＸはＦ、ＹはＨ、およびＲ6はＨである。より好ましくは、式ＩＩＩの化合物は、限定はされないが、（２Ｅ）−３−（４−アジド−３−ヨード−125Ｉ−フェニル）−Ｎ−［［（５Ｓ）−３−［３−フルオロ−４−（４−ピリジニル）フェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］−２−プロペンアミド、４−アジド−Ｎ−［［（５Ｓ）−３−［３−フルオロ−４−（４−ピリジニル）フェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］−２−ヒドロキシ−５−ヨード−125Ｉ−ベンズアミド］、およびＮ−（４−アジドフェニル）−Ｎ’−［［（５Ｓ）−３−［３−フルオロ−４−（４−ピリジニル）フェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］−35Ｓ−チオウレアを含む。
【００６３】
本発明の他の実施態様において、フォトアフィニティープローブは以下に示す式ＩＶ：
【００６４】
【化１４】
2004537265.tif 000015
【００６５】
（式中、ＸおよびＹは、独立に、Ｆ、ＨまたはＣＨ3であり；Ｒ8はＨ、ＦまたはＩであり；Ｒ9はＨ、ＦまたはＯＨであり；Ｒ18は、ＨまたはＦであり；Ｒ19は、ＨまたはＦであり；Ｒ10は、ＨまたはＣ1−Ｃ8アルキルであり；Ｌは結合または−ＯＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）であり；Ｑは、
【００６６】
【化１５】
2004537265.tif 000016
【００６７】
（式中、Ｒ11は、Ｈ、ＣＨ3、ＣＨ2ＣＨ3またはシクロプロピルであり；およびＺは、ＯまたはＳである。）である。）、もしくは、その薬学的に許容な塩を含む。
本発明の他の実施態様において、フォトアフィニティープローブは以下に示す式Ｖ：
【００６８】
【化１６】
2004537265.tif 000017
【００６９】
（式中、ＸおよびＹは、独立に、Ｆ、ＨまたはＣＨ3であり；Ｒ12はＮ3または
【００７０】
【化１７】
2004537265.tif 000018
【００７１】
（式中、Ｒ8は、Ｈ、ＦまたはＩであり；Ｒ9は、Ｈ、ＦまたはＯＨであり；Ｒ18は、ＨまたはＦであり；Ｒ19は、ＨまたはＦである。）であり；およびＱは
【００７２】
【化１８】
2004537265.tif 000019
【００７３】
（式中、Ｒ11は、Ｈ、ＣＨ3、ＣＨ2ＣＨ3またはシクロプロピルであり；Ｚは、ＯまたはＳである。）である。）、もしくはその薬学的に許容な塩を含む。
本発明のいくつかの実施態様において、フォトアフィニティープローブは以下に示す式ＶＩ：
【００７４】
【化１９】
2004537265.tif 000020
【００７５】
（式中、ＸおよびＹは、独立に、Ｆ、ＨまたはＣＨ3であり；Ｒ13は、
【００７６】
【化２０】
2004537265.tif 000021
【００７７】
（式中、Ｒ14は、Ｈ、Ｎ3、ハロゲン、ＮＨ2，ＯＨ、ＳＨ、Ｃ1−Ｃ4アルキルアミノ、Ｃ1−Ｃ4ジアルキルアミノ、Ｃ1−Ｃ4アルキル、ニトリル、カルボキサミド、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、Ｃ1−Ｃ4アルキルチオ、またはＣ1−Ｃ4アルコキシカルボニルである。）であり；およびＰは、
【００７８】
【化２１】
2004537265.tif 000022
【００７９】
（式中、Ｚは、ＯまたはＳであり；およびＲ15は、
【００８０】
【化２２】
2004537265.tif 000023
【００８１】
（式中、Ｒ8は、Ｈ、ＦまたはＩであり；およびＲ9は、Ｈ、ＦまたはＯＨであり；Ｒ18は、ＨまたはＦであり；およびＲ19は、ＨまたはＦである。）である。）である。）、もしくはその薬学的に許容な塩を含む。
【００８２】
式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、およびＶＩで示されるフォトアフィニティープローブを調製する方法は、以下の合成式で表される。示される合成方法は、事実上単なる代表例にすぎず、別法も存在し、場合によってはより好ましい場合もあり得ることは、当該技術分野の当業者には明らかであろう。
【００８３】
式ＩおよびＩＶの非放射性化合物は、反応式ＡおよびＢに示される方法により調製される。反応式Ａに示されるように、安息香酸部分（Ａ1）の適当なヒドロキシアセチルピペラジンフラグメント（Ａ2）とのカップリングにより、式ＩにおいてＬが−ＯＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）である化合物Ａ3が合成されうる。カップリングは、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩または当該技術分野の当業者によく知られているそのほかの試薬により達成される。適当な安息香酸フラグメントは文献において既知の方法で製造されうる（Ｄｕｐｕｉｓ、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．、１９８７、６５、２４５０−２４５３；Ｓｈｕ、Ｊ．Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、１９９６、３８、２２７−２３７。これらの文献の各々はその全体を参照することにより本明細書に援用される。）。適当なヒドロキシアセチルピペラジンフラグメントもまた、文献において既知の方法で製造されうる（Ｂａｒｂａｃｈｙｎ、米国特許Ｎｏ．５，５４７，９５０；Ｂａｒｂａｃｈｙｎ、米国特許Ｎｏ．５，９９０，１３６；Ｓｎｙｄｅｒ、国際公開ＷＯ００／１０５６６−Ａ１。これらの文献の各々はその全体を参照することにより本明細書に援用される。）。化合物Ａ3への125Ｉの取り込みのための方法は、反応式ＣおよびＤに示される。化合物Ａ1およびＡ3が、酸の置換基のオルト位にＲ16およびＲ17の置換基を有する場合（式Ｉおよび式ＩＶのように）にも、反応式Ａは用いることができる。
【００８４】
反応式Ａ：
【００８５】
【化２３】
2004537265.tif 000024
【００８６】
式中のＬが結合である、式ＩおよびＩＶの非放射性化合物は、反応式Ｂに示す合成経路によって調製される。適当な安息香酸フラグメント（反応式ＡのＡ1）は、適当なピペラジン（Ｂ2）とテトラヒドロフラン中で１，１−カルボニルジイミダゾールを用いてカップリングされ、目的の化合物（Ｂ3）を与える。当該技術分野の当業者によって知られているその他のカップリングの方法も使用可能である。ピペラジンフラグメントは、文献既知の方法により作られる（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ、米国特許Ｎｏ．５，７００，７９９、この文献は全体を参照することにより本明細書に援用される；Ｂａｒｂａｃｈｙｎ、米国特許Ｎｏ．５，９９０，１３６；およびＳｎｙｄｅｒ、国際公開ＷＯ００／１０５６６−Ａ１。）。化合物Ｂ3への125Ｉの取り込みのための方法は、反応式ＣおよびＤに示される。化合物Ｂ3が、アミド置換基のオルト位にＲ16およびＲ17の置換基を有する場合（式Ｉおよび式ＩＶのように）にも、反応式Ｂは用いることができる。
【００８７】
反応式Ｂ：
【００８８】
【化２４】
2004537265.tif 000025
【００８９】
放射性ヨウ素は、反応式ＣおよびＤに示される方法により、式ＩおよびＩＶの化合物に取り込まれる。式Ｉの化合物Ｃ2（式中、Ｒ1はＯＨであり、およびＲ2は125Ｉである。）は、式Ｉの化合物Ｃ1（反応式ＡおよびＢの方法に従って調製される。）とＮａ125Ｉおよびクロラミン−Ｔとの反応により調製される。
【００９０】
反応式Ｃ：
【００９１】
【化２５】
2004537265.tif 000026
【００９２】
あるいは、式ＩおよびＩＶの化合物Ｄ3（式中、Ｒ1はＨであり、およびＲ2は125Ｉである。）は、反応式Ｄに示されるように調製される。化合物Ｄ1（反応式ＡおよびＢに示される方法により調製される）のヘキサメチルジチンとの反応により、スタナンＤ2が得られる。Ｄ2とＮａ125Ｉおよびクロラミン−Ｔとの反応によりＤ3が導かれる。
【００９３】
反応式Ｄ：
【００９４】
【化２６】
2004537265.tif 000027
【００９５】
式ＩＩおよびＶの非放射性化合物は、反応式Ｅに示される方法により調製される。適当なビフェニルニトロフラグメント（Ｅ1）は、水素ガスおよびパラジウム触媒存在下還元され、適当なビフェニルアニリンフラグメント（Ｅ2）を与える。当該技術分野の当業者によく知られている他の還元方法もまた使用できる。アジド部分（Ｅ3）への変換は、当該技術分野の当業者によく知られた条件を用いての、適当なジアゾニウム塩のアジ化ナトリウムによる置換反応によって達成される。適当なニトロフラグメント（Ｅ1）は、文献において既知の方法（Ｂａｒｂａｃｈｙｎ、米国特許Ｎｏ．５，６５４，４３５、この文献はその全体を参照することにより本明細書に援用される；Ｂａｒｂａｃｈｙｎ、米国特許Ｎｏ．５，９９０，１３６；およびＳｙｎｄｅｒ、国際公開ＷＯ００／１０５６６−Ａ１）、または当該技術分野の当業者によく知られた他の方法により調製されうる。式ＩＩおよびＶの化合物への放射性元素の導入は、反応式Ｆ、ＧおよびＨに示される。化合物Ｅ1、Ｅ2およびＥ3が、オルト位にＲ16およびＲ17、またはＲ18およびＲ19の置換基を有する場合（式ＩＩおよび式Ｖのように）にも、反応式Ｅは用いることができる。
【００９６】
反応式Ｅ：
【００９７】
【化２７】
2004537265.tif 000028
【００９８】
反応式Ｆは、式ＩＩおよびＶの化合物（式中、Ｑはオキサゾリジノンであり、ＺはＯであり、およびＲ4はＣＨ3である。）へのトリチウムの取り込みのための方法を示す。Ｆ1（反応式Ｅに従って調製される）と６Ｎ  ＨＣｌおよびメタノールとの反応により、遊離のアミンＦ2が得られる。Ｆ2と、トリチウム化した酢酸ナトリウムおよびカップリング試薬との反応により、トリチウム化アセトアミドＦ3が得られる。適したカップリング試薬は、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロフホスフェートおよびＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  ヘキサホスフェートを含む。他の許容なカップリング試薬は、当該技術分野の当業者によって知られている。あるいは、トリチウム化された無水酢酸および適当な塩基は、トリチウム化された酢酸ナトリウムおよびカップリング試薬の代わりに使用することができる。式ＩＩおよびＶ（式中、Ｑはイソキサゾールである。）の化合物へのトリチウムの取り込みは、同様に行われる。化合物Ｆ1、Ｆ2およびＦ3が、オルト位にＲ16およびＲ17、またはＲ18およびＲ19の置換基を有する場合（式ＩＩおよび式Ｖのように）にも、反応式Ｆは用いることができる。
【００９９】
反応式Ｆ：
【０１００】
【化２８】
2004537265.tif 000029
【０１０１】
反応式Ｇは、式ＩＩおよびＶの化合物（式中、Ｑはオキサゾリジノンであり、ＺはＳであり、およびＲ4はＣＨ3である。）への35Ｓの取り込みのための方法を示す。Ｆ2（反応式Ｆ由来）と、エチル  35Ｓ−ジチオアセテートとの反応により、35Ｓ−チオアセトアミド、Ｇ2が得られる。式ＩＩおよびＶの化合物（式中、Ｑはイソキサゾールである。）への35Ｓの取り込みは、同様に行われる。化合物Ｇ2が、オルト位にＲ16およびＲ17、またはＲ18およびＲ19の置換基を有する場合（式ＩＩおよび式Ｖのように）にも、反応式Ｇは用いることができる。
【０１０２】
反応式Ｇ
【０１０３】
【化２９】
2004537265.tif 000030
【０１０４】
放射性ヨウ素は、反応式Ｈに示した方法により、式ＩＩおよびＶの化合物へ取り込まれうる。Ｈ1（反応式Ｅに示した経路に従って調製される）とヘキサメチルジチンとの反応により、有機スタナンＨ2が得られる。Ｈ2とＮａ125Ｉおよびクロラミン−Ｔとの反応により、放射性ヨウ素化された化合物Ｈ3が得られる。
【０１０５】
反応式Ｈ：
【０１０６】
【化３０】
2004537265.tif 000031
【０１０７】
式Ｖ（式中、Ｒ12はＮ3である。）の化合物は、米国特許Ｎｏ．５，９１０，５０４、実施例１７に記載された方法に従って作成される。当該文献は、その全体を参照することにより本明細書に援用される。
【０１０８】
反応式Ｉは、式ＩＩＩおよびＶＩ（式中、Ｐはオキサゾリジノンであり、ＺはＯであり、およびＲ7は場合によっては置換されていてもよいアジドフェニルまたはアジドシンナモイルである。）の非放射性化合物の調製のための合成方法を示す。適当なアセトアミドフラグメント（Ｉ1）を、塩化水素メタノール溶液中で還流することにより、遊離のアミンＩ2が得られる。当該アセトアミドフラグメント（Ｉ1）は、文献既知の方法（Ｂａｒｂａｃｈｙｎ、米国特許Ｎｏ．５，５６５，５７１、この文献はその全体を参照することにより本明細書に援用される；Ｂａｒｂａｃｈｙｎ、米国特許Ｎｏ．５，９９０，１３６；およびＳｙｎｄｅｒ、国際公開ＷＯ００／１０５６６−Ａ１）により調製される。Ｉ2と、適当な安息香酸フラグメント（Ｉ3、ｎ＝０）またはケイ皮酸フラグメント（Ｉ3、ｎ＝１）とのカップリングにより、アミドＩ4へと導かれる。カップリングは、ＥＤＣまたは当該技術分野の当業者によく知られた他の試薬を用いて達成される。適当な安息香酸フラグメント（Ｉ3、ｎ＝０）は、反応式ＡのＡ1を調製するために用いたのと同じ方法で調製される。適当なケイ皮酸フラグメント（Ｉ3、ｎ＝１）は、適当なベンズアルデヒドとウィッテッィヒ−ホルナー（Ｗｉｔｔｉｇ−Ｈｏｒｎｅｒ）試薬とのカップリングにより調製されうる。ベンズアルデヒドフラグメントは、文献既知の方法（Ｓｈｕ、Ｊ．Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、１９９６、３８、２２７−２３７）または当該技術分野の当業者によく知られた他の方法により調製されうる。式ＩＩＩおよびＶＩの化合物（式中、Ｐはイソオキサゾリンまたはイソオキサゾリノンである。）は同様の方法により作成される。化合物Ｉ3およびＩ4が、オルト位にＲ16およびＲ17、またはＲ18およびＲ19の置換基を有する場合（式ＩＩＩおよび式ＶＩのように）にも、反応式Ｉは用いることができる。
【０１０９】
反応式Ｉ：
【０１１０】
【化３１】
2004537265.tif 000032
【０１１１】
式ＩＩＩおよびＶＩの化合物（式中、Ｐはオキサゾリジノンであり、ＺはＯであり、およびＲ7は場合によっては置換されていてもよいアジドフェニルまたはアジドシンナモイルである。）への125Ｉの取り込みは、反応式Ｊに示した方法により達成される。Ｉ4（反応式Ｉ（式中、Ｒ1はＨであり、およびＲ2はＯＨである。）由来）とＮａ125Ｉおよびクロラミン−Ｔとの反応により、放射性ヨウ素化された化合物Ｊ2が得られる。125Ｉの式ＩＩＩおよびＶＩの化合物（式中、Ｐは、イソキサゾリンまたはイソキサゾリノンである。）への取り込みは、同様の方法により達成される。
【０１１２】
反応式Ｊ：
【０１１３】
【化３２】
2004537265.tif 000033
【０１１４】
あるいは、式ＩＩＩおよびＶＩの化合物（式中、Ｐはオキサゾリジノンであり、ＺはＯであり、およびＲ7は場合によっては置換されていてもよいアジドフェニルまたはアジドシンナモイルである。）への125Ｉの取り込みは、反応式Ｋに示した方法により達成される。Ｉ4（反応式Ｉ（式中、Ｒ1はＩであり、およびＲ2はＨである。）由来）とヘキサメチルジチンとの反応により、有機スタナンＫ2が得られる。Ｋ2とＮａ125Ｉおよびクロラミン−Ｔとの反応により、放射性ヨウ素化された化合物Ｋ3が得られる。式ＩＩＩおよびＶＩの化合物（式中、Ｐは、イソキサゾリンまたはイソキサゾリノンである。）の放射性ヨウ素化は、同様の方法により達成される。
【０１１５】
反応式Ｋ：
【０１１６】
【化３３】
2004537265.tif 000034
【０１１７】
反応式Ｌは、式ＩＩＩおよびＶＩの放射性化合物（式中、Ｐはオキサゾリジノンであり、Ｚは35Ｓであり、およびＲ7は場合によっては置換されていてもよいアジドアニリンである。）の調製のための合成方法を示す。適当な35Ｓ−イソチオシアネートＬ2を、ＴＨＦ還流下、適当なアミノメチルフラグメントＩ2（反応式Ｉ）と反応させることにより、目的の35Ｓ−チオウレア（Ｌ3）が得られる。必要となる35Ｓ−イソチオシアネートＬ2は、適当なアニリンと35Ｓ−チオホスゲンとの反応により調製される。式ＩＩＩおよびＶＩの化合物（式中、Ｐはイソキサゾリンまたはイソキサゾリノンである。）への35Ｓの取り込みは、同様に行われる。化合物Ｌ2およびＬ3が、オルト位にＲ16およびＲ17、またはＲ18およびＲ19の置換基を有する場合（式ＩＩＩおよび式ＶＩのように）にも、反応式Ｌは用いることができる。
【０１１８】
反応式Ｌ：
【０１１９】
【化３４】
2004537265.tif 000035
【０１２０】
本発明は、当該発明を明らかにすることを意図された以下の実施例により、さらに説明される。これらの実施例は、開示の範囲を制限するものとは意図されていないし、そのように解されるべきでもない。
【０１２１】
実施例
実施例１：合成
２−［４−［４−［（５Ｓ）−５−［（アセチルアミノ）メチル］−２−オキソ−３−オキサゾリジニル］−２−フルオロフェニル］−１−ピペラジニル］−２−オキソエチル  ４−アジド−２−ヒドロキシ−５−ヨード−125Ｉ−ベンゾエート（反応式Ｃの化合物Ｃ2（式中、Ｌは−ＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）であり、ＸはＦであり、ＹはＨであり、Ｑはオキサゾリジノンであり、ＺはＯでありおよびＲ4はＣＨ3である。）は、以下のように調製される。
【０１２２】
【化３５】
2004537265.tif 000036
【０１２３】
工程１
ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）およびピリジン（１ｍｌ）中の（Ｓ）−Ｎ−［［３−［３−フルオロ−４−［４−（ヒドロキシアセチル）−１−ピペラジニル］フェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］アセトアミド（５１５．８ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ）の攪拌中の溶液に、１−［３−ジメチルアミノ］プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（５０９．９ｍｇ、２．６６ｍｍｏｌ）を加え、続いて４−アジドサリチル酸（Ｄｕｐｕｉｓ、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．、１９８７、６５、２４５０−２４５３）および触媒量の４−ジメチルアミノピリジンを加える。反応混合物を室温で７２時間攪拌し、その後濃縮する。残渣をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）で希釈し、Ｈ2Ｏ（２ｘ３０ｍｌ）、１Ｎ  ＨＣｌ（２ｘ３０ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ3（１ｘ３０ｍｌ）で連続的に洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ4）、ろ過および濃縮する。残渣をＣＨ3ＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、シリカゲル上に吸着させ、ＳＩＭによるＢｉｏｔａｇｅ  ４０Ｓカラムで、２．５％ＣＨ3ＯＨを含むＣＨ2Ｃｌ2を溶離液として精製し、１８６．５ｍｇ（０．３３ｍｍｏｌ、２５％）の安息香酸エステルを得る。融点１７７−１７８℃（分解）。
【０１２４】
【化３６】
2004537265.tif 000037
【０１２５】
工程２
別段の特定がなければ、すべての試薬は、０．１Ｎ  ＮａＰＯ4バッファー中で調製される。バッファー（７０μｌ）、クロラミン−Ｔ（１ｍＭの原液の７０μｌ）、および工程１のアジドフェノール（ＤＭＳＯ中の５０μＭの原液の１０μｌ）を、１．５ｍｌガラス反応容器に加える。ゴム製のセプタムキャップで反応容器にふたをし、１ｍＣｉを含む、水酸化ナトリウム中の125Ｉ2の溶液（１０μｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＃ＩＭＳ３０）を加える。反応は、室温で２時間暗所にて緩やかに攪拌され、その後亜硫酸水素ナトリウムの１０％水溶液（１００μｌ）によりクエンチする。クエンチ後、反応をバッファー（８００μｌ）で希釈し、１８ゲージの針を装着した１ｍｌのツベルクリンシリンジ（ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ  ｓｙｒｉｎｇｅ）を用いて、反応容器から移す。反応液（１ｍｌ）を調整前のＣ１８  ｓｅｐ−ｐａｋカートリッジ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に注入し、取り込まれなかった125Ｉ2を、ＨＰＬＣグレードの０．１％のトリフルオロ酢酸を含む水（２０ｍｌ）を用いてＣ１８樹脂から洗い流す。生成物は、８０％ＣＨ3ＣＮ／０．１  ＴＦＡ（３ｍｌ）を使用して溶出する。ヨウ素化された生成物の典型的な収率は、反応に加えた全125Ｉ2の約３０％である。
【０１２６】
実施例２：合成
Ｎ−［［（５Ｓ）−３−［４−［４−（４−アジド−２−ヒドロキシ−５−ヨード−125Ｉ−ベンゾイル）−１−ピペラジニル］−３−フルオロフェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］アセトアミド（反応式Ｃの化合物Ｃ2（式中、Ｌは結合であり、ＸはＦであり、ＹはＨであり、Ｑはオキサゾリジノンであり、ＺはＯでありおよびＲ4はＣＨ3である。））は、以下のように調製される。
【０１２７】
【化３７】
2004537265.tif 000038
【０１２８】
工程１
ＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍｌ）中の（Ｓ）−Ｎ−［［３−［４−［３−フルオロ−４−（１−ピペラジニル）フェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］アセトアミド（４９８．０ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）の攪拌中の溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（０．７０ｍｌ、４．０ｍｍｏｌ）を加え、続いてＣＨ2Ｃｌ2（７ｍｌ）中の４−アジドサリコイルクロリド（４−ａｚｉｄｏｓａｌｉｃｏｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（３４２．６ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を室温で１８時間攪拌し、その後ＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍｌ）およびＨ2Ｏ（１０ｍｌ）の間で分配する。層を分離する。有機層を、Ｈ2Ｏ（１０ｍｌ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ4）、ろ過および濃縮する。残渣をＣＨ3ＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、シリカゲル上に吸着させ、ＳＩＭによるＢｉｏｔａｇｅ  ４０Ｓカラムで、３％ＣＨ3ＯＨを含むＣＨ2Ｃｌ2を溶離液として精製し、４１２．３ｍｇ（０．８３ｍｍｏｌ、６２％）の目的のベンズアミドを黄褐色の固体として得る。融点１８８−１８９℃（分解）。
【０１２９】
【化３８】
2004537265.tif 000039
【０１３０】
工程２
工程１で調製したフェノールを用いて出発し、実施例１の工程２に記載の方法に従って、125Ｉを導入する。
【０１３１】
実施例３：合成
２−［４−［４−［（５Ｓ）−５−［（アセチルアミノ）メチル］−２−オキソ−３−オキサゾリジニル］−２−フルオロフェニル］−１−ピペラジニル］−２−オキソエチル  ４−アジド−３−ヨード−125Ｉ−ベンゾエート（反応式Ｄの化合物Ｄ3（式中、Ｌは−ＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）であり、ＸはＦであり、ＹはＨであり、Ｑはオキサゾリジノンであり、ＺはＯでありおよびＲ4はＣＨ3である。））
【０１３２】
【化３９】
2004537265.tif 000040
【０１３３】
工程１
無水ＴＨＦ（２．０ｍｌ）中の４−アジド−３−ヨード安息香酸（１０３．８ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ（Ｓｈｕ、Ｊ．ｏｆ  Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、１９９６、３８、２２７−２３７））の攪拌中の溶液に、１，１−カルボニルジイミダゾール（５８．２ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を室温で１時間攪拌し、その後（Ｓ）−Ｎ−［［３−［３−フルオロ−４−［４−（ヒドロキシアセチル）−１−ピペラジニル］フェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］アセトアミド（１４１．９ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を加え、その後触媒量のＤＭＡＰを加える。反応混合物を７２時間加熱還流する。反応混合物を室温まで冷却し、ＣＨ2Ｃｌ2（３０ｍｌ）中に注ぎ込み、Ｈ2Ｏ（１５ｍｌ）、１Ｎ  ＨＣｌ（１５ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（１５ｍｌ）、食塩水（１５ｍｌ）で連続的に洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ4）、ろ過および濃縮した。残渣を、２％ＣＨ3ＯＨを含むＣＨ2Ｃｌ2を溶離液として用いて、Ｂｉｏｔａｇｅ  １２Ｍカラムにより精製し、１１９．６ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ、５０％）の安息香酸エステルを得る。融点１３７−１３９℃。
【０１３４】
【化４０】
2004537265.tif 000041
【０１３５】
工程２
無水ＴＨＦ（３ｍｌ）中の工程１で調製したヨードベンゾエート（６２．７ｍｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）およびヘキサメチルジチン（４６．３ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）の攪拌中の溶液に、ジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）（２．０ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を脱気し、３時間加熱還流する。反応混合物を冷却し、セライトの一塊りを通してろ過する。濾液をシリカゲル上に吸着させ、ＳＩＭを用い、２％ＣＨ3ＯＨのＣＨ2Ｃｌ2を溶離液として使用してＢｉｏｔａｇｅ  １２Ｍカラムで精製し、２８．６ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ、４３％）のスタナンを得る。
【０１３６】
【化４１】
2004537265.tif 000042
【０１３７】
工程３
無水アセトニトリル中の工程２で調製したスタナンの攪拌中の溶液に、１ＭのＮａ125Ｉ水溶液を、続いてクロラミン−Ｔ水和物を加える。室温で３０分間攪拌の後、反応混合物を飽和Ｎａ2Ｓ2Ｏ3水溶液でクエンチし、精製し、放射性ヨウ素化された物質を得る。
【０１３８】
実施例４：合成
Ｎ−［［（５Ｓ）−３−［４−［４−（４−アジド−３−ヨード−125Ｉ−ベンゾイル）−１−ピペラジニル］−３−フルオロフェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］アセトアミド（反応式Ｄの化合物Ｄ3（式中、Ｌは結合であり、ＸはＦであり、ＹはＨであり、Ｑはオキサゾリジノンであり、ＺはＯでありおよびＲ4はＣＨ3である。））
【０１３９】
【化４２】
2004537265.tif 000043
【０１４０】
工程１
無水ＴＨＦ（４ｍｌ）中の４−アジド−３−ヨード安息香酸（２７２．０ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）の攪拌中の溶液に、１，１−カルボニルジイミダゾール（１５２．６ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を室温で１時間攪拌し、その後（Ｓ）−Ｎ−［［３−［４−［３−フルオロ−４−（１−ピペラジニル）］フェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］アセトアミド（３１５．９ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を加え、その後ＤＭＦ（２ｍｌ）を加える。反応混合物を１８時間加熱還流する。反応混合物を冷却し、ＣＨ2Ｃｌ2（４０ｍｌ）中に注ぎ込み、Ｈ2Ｏ（２０ｍｌ）、１Ｎ  ＨＣｌ（２０ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（２０ｍｌ）、食塩水（２０ｍｌ）で連続的に洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ4）、ろ過および濃縮する。残渣を、ＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、シリカゲル上に吸着させ、２．５％ＣＨ3ＯＨのＣＨ2Ｃｌ2を溶離液として用いて、ＳＩＭによるＢｉｏｔａｇｅ  ４０Ｓカラムにより精製し、３７６．７ｍｇ（０．６２ｍｍｏｌ）のベンズアミドを黄色の固体として得る。
【０１４１】
【化４３】
2004537265.tif 000044
【０１４２】
工程２
無水ＴＨＦ（６ｍｌ）中の工程１で調製したヨードベンズアミド（８２．４ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）およびヘキサメチルジチン（７１．１ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）の攪拌中の溶液に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）を加える。反応混合物を脱気し、１２時間加熱還流する。冷却した反応混合物を、詰め込んだセライトを通してろ過し、濾液をシリカゲル上に吸着させ、ＳＩＭを用い、２％ＣＨ3ＯＨの４９％ＣＨ2Ｃｌ2および４９％ＥｔＯＡｃを溶離液として使用してＢｉｏｔａｇｅ  １２Ｍカラムで精製し、２８．２ｍｇ（０．０４４ｍｍｏｌ、３４％）のスタナンを得る。
【０１４３】
【化４４】
2004537265.tif 000045
【０１４４】
工程３
無水アセトニトリル中の工程２で調製したスタナンの攪拌中の溶液に、１ＭのＮａ125Ｉ水溶液を加え、続いてクロラミン−Ｔ水和物を加える。室温で３０分間攪拌の後、反応混合物を飽和Ｎａ2Ｓ2Ｏ3水溶液でクエンチし、精製し、放射性ヨウ素化された物質を得る。
【０１４５】
実施例５：合成
Ｎ−［［（５Ｓ）−３−（４’−アジド−２−フルオロ−［１，１’−ビフェニル］−４−イル）−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］−Ｔ3−アセトアミド（反応式Ｆの化合物Ｆ3（式中、Ｒ1はＨであり、Ｒ2はＨであり、ＸはＦであり、およびＹはＨである。））
【０１４６】
【化４５】
2004537265.tif 000046
【０１４７】
工程１
無水ＤＭＦ（２３０ｍｌ）中の４−ヨードニトロベンゼン（６．８６ｇ、２７．５ｍｍｏｌ）の攪拌中の溶液に、ビス（ピナコレート）ジボロン（８．２４ｇ、３２．４ｍｍｏｌ）を加え、続いて酢酸カリウム（８．６８ｇ、８８．５ｍｍｏｌ）および［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）（６２４．６ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を脱気し、２時間８５℃に加熱する。冷却した黒っぽい反応混合物に、（Ｓ）−Ｎ−［［３−（３−フルオロ−４−ヨードフェニル）−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］アセトアミド（５．８ｇ、１５．３ｍｍｏｌ）を加え、続いて２Ｎ  Ｎａ2ＣＯ3水溶液（１４３ｍｌ）および［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）（３１２．０ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を脱気し、３時間８５℃に加熱する。冷却した反応混合物を、ＥｔＯＡｃ（５００ｍｌ）およびＨ2Ｏ（３００ｍｌ）間で分配する。層を分離する。水層をＥｔＯＡｃ（３００ｍｌ）で抽出する。有機層をあわせ、Ｈ2Ｏ（５００ｍｌ）、食塩水（５００ｍｌ）で連続的に洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ4）、ろ過および濃縮する。残渣をＣＨ3ＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、シリカゲル上に吸着させ、ＳＩＭによるＢｉｏｔａｇｅ  ４０Ｍカラム（２ロット）で、７５％ＥｔＯＡｃを含むＣＨ2Ｃｌ2から１００％ＥｔＯＡｃを溶離液として精製し、３．７４ｇ（１０．０ｍｍｏｌ、６５％）の目的のニトロビフェニル化合物を得る。
【０１４８】
【化４６】
2004537265.tif 000047
【０１４９】
工程２
ＴＨＦ（１００ｍｌ）、ＣＨ3ＯＨ（１００ｍｌ）およびＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）中の、工程１で調製したニトロビフェニル化合物（３．７４ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）、１０％のカーボン上担持のパラジウムの混合物を、水素風船下、１８時間水素化する。反応混合物は、セライトの一塊りを通してろ過し、ろ液を濃縮し、２．５０ｇ（７．３ｍｍｏｌ、７３％）の目的のアミノビフェニルを得る。
【０１５０】
【化４７】
2004537265.tif 000048
【０１５１】
工程３
ＣＨ3ＯＨ（４０ｍｌ）および１Ｍ  ＨＣｌ（４０ｍｌ）中の、工程２で調製したアミノビフェニル（５０８．９３ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ）の攪拌中の溶液に、０℃の冷却しながら、１．２Ｍ  ＮａＮＯ2水溶液（１．４８ｍｌ、１．７８ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を０℃で９０分間攪拌し、その後スルファミン酸（１４３．５ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ）を加え、続いてＨ2Ｏ（１．５ｍｌ）中のアジ化ナトリウム（１１５．４ｍｇ、１．７８ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を０℃で４５分間攪拌し、その後ＣＨ2Ｃｌ2（２００ｍｌ）希釈する。層を分離する。水層をＣＨ2Ｃｌ2（７５ｍｌ）で抽出する。あわせた有機層を乾燥（ＭｇＳＯ4）、ろ過および濃縮する。残渣をＣＨ3ＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、シリカゲル上に吸着させ、１０％ＣＨ3ＯＨのＣＨ2Ｃｌ2を溶離液として用いて、ＳＩＭによるＢｉｏｔａｇｅ  ４０Ｓカラムにより精製し、２６２．９ｍｇ（０．７１ｍｍｏｌ、４８％）の目的のアジドビフェニルを淡黄色の固体として得る。
【０１５２】
【化４８】
2004537265.tif 000049
【０１５３】
工程４
６Ｎ  ＨＣｌ（２ｍｌ）およびＣＨ3ＯＨ（６ｍｌ）中の工程３で調製したアジドビフェニル（１０２．４ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を１８時間加熱還流する。ＣＨ3ＯＨを減圧下除去し、固体の沈殿物をろ過により単離し、Ｈ2Ｏ（１０ｍｌ）、エーテル（２ｘ１５ｍｌ）で連続的に洗浄し、その後乾燥することにより、８２．１ｍｇ（０．２３ｍｍｏｌ、８２％）の目的のアミン塩酸塩を得る。
【０１５４】
【化４９】
2004537265.tif 000050
【０１５５】
工程５
１ｍｌの乾燥ＤＭＦおよび２．７１ｍｇ（２１μｍｏｌ）のジイソプロピルエチルアミン中のトリチウム化された酢酸ナトリウム塩（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ロット番号ＡＲＣ９９０５１９）０．５７ｍｇ（６．９４μｍｏｌ、２５０ｍＣｉ）の攪拌中の溶液に、室温で、無水ＤＭＦ中の０．４５ＭのＯ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）６．９４μｍｏｌを加える。溶液はすぐに淡黄色に変化する。そして、１０分間室温で攪拌する。その後、活性化した［3Ｈ］酢酸ナトリウム塩を、２ｍｌの無水ＤＭＦ中の２．７３ｍｇ（７．５μｍｏｌ）の工程４で調製したアミン塩酸塩の攪拌中の溶液に加える。反応を室温で４．５時間攪拌し、その後すべての溶媒を室温での減圧蒸留で除去する。反応混合物を、８％のメタノールのジクロロメタン溶液を用いて溶離する分取ＴＬＣプレート（Ａｎａｌｔｅｃｈ  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ＧＦ、５００ミクロン、２０ｃｍｘ２０ｃｍ）により精製する。目的のバンドをかき取りする。２０％のメタノールのジクロロメタン溶液を用い、シリカゲルから生成物を溶出し、ろ過する。減圧下、ろ液を濃縮し、残渣を６５．５ｍｌのメタノールに溶解し、９４．４ｍＣｉの目的のトリチウム化物質（１．４４ｍＣｉ／ｍｌメタノール、比放射能５７．３７ｍＣｉ／ｍｇ（５７．３７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、ＨＰＬＣによる放射化学純度９９．５％）を得る。
【０１５６】
実施例６：合成
Ｎ−［［（５Ｓ）−３−（４’−アジド−２−フルオロ−３’−ヨード［１，１’−ビフェニル］−４−イル）−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］−Ｔ3−アセトアミド（反応式Ｆの化合物Ｆ3（式中、Ｒ1はＨであり、Ｒ2はＩであり、ＸはＦであり、およびＹはＨである。））
【０１５７】
【化５０】
2004537265.tif 000051
【０１５８】
工程１
酢酸３ｍｌ中の実施例５の工程２で調製したアニリン（２８４．９ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）の攪拌中の溶液に、酢酸（０．２５ｍｌ）中の一塩化ヨウ素（１３４．５ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を室温で１．５時間攪拌する。反応混合物をＥｔＯＡｃとＮａ2Ｓ2Ｏ3水溶液の間で分配する。層を分離する。水層をＥｔＯＡｃ（２０ｍｌ）で抽出する。あわせた有機層を乾燥（ＭｇＳＯ4）、ろ過および濃縮する。残渣をＣＨ3ＯＨに溶解し、シリカゲル上に吸着させ、１０−２５％のアセトンのＣＨ2Ｃｌ2溶液を溶離液として使用する、ＳＩＭによるＢｉｏｔａｇｅ  ４０Ｓカラムにより精製し、４８．４ｍｇ（０．１０ｍｍｏｌ、１２％）の目的のヨードアニリンを黄色の油状物として得る。
【０１５９】
【化５１】
2004537265.tif 000052
【０１６０】
工程２
０℃に冷却したＣＨ3ＯＨ（２ｍｌ）および１Ｎ  ＨＣｌ（２ｍｌ）中の工程１で調製したヨードアニリン（４７．２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）の攪拌中の溶液に、Ｈ2Ｏ（１ｍｌ）中のＮａＮＯ2（８．５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）の溶液を加える。黄色の反応混合物を０℃で３０分間攪拌し、その後、Ｈ2Ｏ（１ｍｌ）中のＮａＮ3（８．０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）の溶液を加える。反応溶液を０℃で１時間攪拌し、その間に黄色の沈殿が形成する。固体をろ過により単離し、Ｈ2Ｏで洗浄し、乾燥することにより、４１．０ｍｇ（０．０８３ｍｍｏｌ、８３％）の目的のヨードアジドビフェニルを黄色の固体として得る。融点１７３−１７５℃（分解）。
【０１６１】
【化５２】
2004537265.tif 000053
【０１６２】
工程３
工程２で調製したヨードアジドビフェニル（１２９．０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、ＣＨ3ＯＨ（６ｍｌ）および１Ｎ  ＨＣｌ（２ｍｌ）の混合物を４８時間加熱還流する。冷却した反応混合物を濃縮し、定量的収率で目的のアミン塩酸塩を黄褐色の固体として得る。
【０１６３】
【化５３】
2004537265.tif 000054
【０１６４】
工程４
５．１ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ、２５ｍＣｉ）のトリチウム化された無水酢酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂａｔｃｈ  Ｂ７７、同位体＃００−０３１６）に、ＣＨ2Ｃｌ2中の２Ｎ  ＰＣｌ3（２５μｌ）を加える。反応混合物を室温で５時間断続的な攪拌を加えながら放置する。この混合物に、ピリジン（０．２５ｍｌ）中の工程３で調製したアミン塩酸塩（４７．７ｍｇ、０．１０４ｍｍｏｌ）の溶液を加え、続いてＤＭＡＰ（４．６ｍｇ）を加える。３０分後、反応混合物をＨ2ＯおよびＣＨ2Ｃｌ2の間で分配する。層を分離する。水層をＣＨ2Ｃｌ2で徹底的に抽出し、その後濃縮する。残渣を、２０％アセトンを含むトルエンを溶離液として用いてシリカゲル（４ｇ）で精製し、３８．２ｍｇ（０．０７７ｍｍｏｌ、７４％）の目的のトリチウム化されたアセトアミドを得る。
【０１６５】
実施例７：合成
Ｎ−［［（５Ｓ）−３−（４’−アジド−２−フルオロ−３’−ヨード［１，１’−ビフェニル］−４−イル）−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］エタン−35Ｓ−チオアミド（反応式Ｇの化合物Ｇ2（式中、Ｒ1はＨであり、Ｒ2はＩであり、ＸはＦであり、およびＹはＨである。））
【０１６６】
【化５４】
2004537265.tif 000055
【０１６７】
工程１
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中のメチルマグネシウムクロリドを４０℃で35Ｓ標識化二硫化炭素により処理し、続いてヨウ化エチルにより処理する。反応を６０℃で１．５時間攪拌する。水およびエチルエーテルで後処理をした後に、目的のエチル  35Ｓ−ジチオアセテートを得る。
【０１６８】
工程２
実施例６の工程３で調製したアミン塩酸塩および工程１で調製したエチル  ［35Ｓ］ジチオアセテートを、塩化メチレン、メタノールおよびトリエチルアミン中で攪拌し、目的の35Ｓ標識化チオアミドを得る。
【０１６９】
実施例８：合成
Ｎ−［［（５Ｓ）−３−（４’−アジド−２−フルオロ−３’−ヨード−125Ｉ−［１，１’−ビフェニル］−４−イル）−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］アセトアミド（反応式Ｈの化合物Ｈ3（式中、ＸはＦであり、ＹはＨであり、Ｑはオキサゾリジノンであり、ＺはＯであり、およびＲ4はＣＨ3である。））
【０１７０】
【化５５】
2004537265.tif 000056
【０１７１】
工程１
トルエン（５ｍｌ）中の実施例６の工程２で調製したヨードビフェニル（５６．２ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）およびヘキサメチルジチン（７３．９ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）の攪拌中の溶液に、酢酸パラジウム（ＩＩ）（２．６ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）を加え、続いてトリフェニルホスフィン（６．５ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を脱気し、８０℃で２０時間加熱する。冷却した反応混合物を容積で半分に濃縮し、その後、１０−２０％アセトンのＣＨ2Ｃｌ2溶液を溶離液として使用してＢｉｏｔａｇｅ  １２Ｓカラムで精製し、５３．５ｍｇ（０．１０ｍｍｏｌ、８９％）の目的のスタナンを得る。
【０１７２】
【化５６】
2004537265.tif 000057
【０１７３】
工程２
無水アセトニトリルおよびｐＨ７のリン酸バッファー中の工程１で調製したスタナンの攪拌中の溶液に、クロラミン−Ｔを加え、続いて１ＭのＮａ125Ｉ水溶液を加える。３０分後、反応混合物を飽和Ｎａ2Ｓ2Ｏ3水溶液でクエンチし、精製し、表題の化合物を得る。
【０１７４】
実施例９：合成
（２Ｅ）−３−（４−アジド−３−ヨード−125Ｉ−フェニル）−Ｎ−［［（５Ｓ）−３−［３−フルオロ−４−（４−ピリジニル）フェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］−２−プロペンアミド（反応式Ｉの化合物Ｉ4（式中、Ｒ5は４−ピリジルであり、ＸはＦであり、ＹはＨであり、ｎは１であり、Ｒ1は125Ｉであり、およびＲ2はＨである。））
【０１７５】
【化５７】
2004537265.tif 000058
【０１７６】
工程１
ＣＨ2Ｃｌ2（１．５ｍｌ）中の塩化オキサリル（０．１０ｍｌ、１．２ｍｍｏｌ）の攪拌中の溶液を、−７８℃まで冷却し、無水ＤＭＳＯ（０．１４ｍｌ、１．９７ｍｍｏｌ）を加える。１０分後、ＣＨ2Ｃｌ2（２．５ｍｌ）中の４−アジド−３−ヨードベンジルアルコール（２１７．０ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ（Ｓｈｕ、Ｊ．ｏｆ  Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、１９９６、３８、２２７−２３７））を加える。１５分後、トリエチルアミン（０．３３ｍｌ、２．３７ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温まで昇温する。反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2（３０ｍｌ）中に注ぎ込み、Ｈ2Ｏ（２０ｍｌ）、食塩水（２０ｍｌ）で連続的に洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ4）、ろ過および濃縮する。残渣をＢｉｏｔａｇｅ  １２Ｍカラムで、１０％ＥｔＯＡｃを含むヘキサンを用いて精製し、１９５．５ｍｇ（０．７２ｍｍｏｌ、９１％）の目的のアルデヒドを得る。
【０１７７】
【化５８】
2004537265.tif 000059
【０１７８】
工程２
無水ＴＨＦ（１ｍｌ）中の工程１で調製したアルデヒド（１９０．０ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）の攪拌中の溶液に、トリエチルホスホノアセテート（０．１５ｍｌ、０．７６ｍｍｏｌ）を加え、水酸化リチウム１水和物（３２．１ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を室温で４８時間攪拌する。反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2（４０ｍｌ）中に注ぎ込み、Ｈ2Ｏ（２０ｍｌ）、食塩水（２０ｍｌ）で連続的に洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ4）、ろ過および濃縮する。残渣をＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、シリカゲル上に吸着させ、ＳＩＭを用いてＢｉｏｔａｇｅ  ４０Ｓカラムで、５％ＥｔＯＡｃを含むヘキサンを溶離液として使用して精製し、１６５．１ｍｇ（０．４８ｍｍｏｌ、７０％）の目的のエステルを得る。融点９３−９４℃。
【０１７９】
【化５９】
2004537265.tif 000060
【０１８０】
工程３
ＣＨ3ＯＨ（２ｍｌ）中の工程２で調製したエステル（６６．７ｍｌ、０．１９ｍｍｏｌ）の攪拌中の溶液に、１Ｎ  ＬｉＯＨ（０．１９ｍｌ、０．１９ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を１２時間加熱還流する。冷却した反応混合物を濃縮し、すぐに使用する。
【０１８１】
工程４
ＣＨ3ＯＨ（６２ｍｌ）および６Ｎ  ＨＣｌ（３１ｍｌ）中の（Ｓ）−Ｎ−［［３−［３−フルオロ−４−（４−ピリジニル）フェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］アセトアミド（１．４０ｇ、４．２５ｍｍｏｌ）を１８時間加熱還流する。反応混合物を濃縮し、１．４８ｇのアミン二塩酸塩を得る。
【０１８２】
【化６０】
2004537265.tif 000061
【０１８３】
工程５
アミン二塩酸塩（工程４由来）（６８．２ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）、工程３で調製したカルボン酸リチウム、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（７２．８ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシベンズトリアゾール水和物（３０．８ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）をピリジン（２ｍｌ）中に溶解し、室温で７２時間攪拌する。反応混合物を濃縮する。残渣をＣＨ2Ｃｌ2（４０ｍｌ）に溶解し、Ｈ2Ｏ（２０ｍｌ）、食塩水（２０ｍｌ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ4）、ろ過および濃縮する。残渣をＣＨ3ＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、シリカゲル上に吸着させ、２％のＣＨ3ＯＨ（ＮＨ3により飽和されている）のＣＨ2Ｃｌ2溶液を溶離液として使用する、ＳＩＭによるＢｉｏｔａｇｅ  １２Ｍカラムにより精製し、５６．２ｍｇ（０．０９６ｍｍｏｌ、５１％）の目的のシンナミド得る。
【０１８４】
【化６１】
2004537265.tif 000062
【０１８５】
工程６
無水ＴＨＦ（６ｍｌ）中の工程４で調製したヨードシンナミドおよびヘキサメチルジチン（７１．１ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）の攪拌中の溶液に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）を加える。反応混合物を脱気し、１２時間加熱還流する。冷却した反応混合物を、詰め込んだセライトを通してろ過し、濾液をシリカゲル上に吸着させ、ＳＩＭを用い、Ｂｉｏｔａｇｅ  １２Ｍカラムで精製し、スタナンを得る。
【０１８６】
工程７
無水アセトニトリル中の工程５で調製したスタナンの攪拌中の溶液に、１ＭのＮａ125Ｉ水溶液を、続いてクロラミン−Ｔ水和物を加える。室温で３０分間攪拌の後、反応混合物を飽和Ｎａ2Ｓ2Ｏ3水溶液でクエンチし、精製し、放射性ヨウ素化された物質を得る。
【０１８７】
実施例１０：合成
４−アジド−Ｎ−［［（５Ｓ）−３−［３−フルオロ−４−（４−ピリジニル）フェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］−２−ヒドロキシ−５−ヨード−125Ｉ−ベンズアミド（反応式Ｊの化合物Ｊ2（式中、Ｒ5は４−ピリジルであり、ＸはＦであり、ＹはＨであり、およびｎは０である。））
【０１８８】
【化６２】
2004537265.tif 000063
【０１８９】
工程１
ピリジン（４ｍｌ）およびＣＨ2Ｃｌ2（１ｍｌ）中の実施例９の工程４で調製したアミン二塩酸塩（１７２．４ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）の攪拌中の懸濁液に、４−アジドサリチル酸（１２８．９ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を加え、続いて１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（１８４．０ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシベンズトリアゾール水和物（７７．８ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を室温で７２時間し、その後濃縮する。残渣をＣＨ3ＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2（４０ｍｌ）に溶解し、シリカゲル上に吸着させ、ＥｔＯＡｃを溶離液として使用する、ＳＩＭによるＢｉｏｔａｇｅ  ４０Ｓカラムにより精製し、４４．８ｍｇ（０．１０ｍｍｏｌ、２１％）のベンズアミドを黄褐色の固体として得る。融点２００−２０２℃（分解）。
【０１９０】
【化６３】
2004537265.tif 000064
【０１９１】
工程２
工程１で調製したフェノールより出発して、実施例１の工程２に記載した方法に従って、125Ｉを導入する。
【０１９２】
実施例１１：合成
Ｎ−（４−アジドフェニル）−Ｎ’−［［（５Ｓ）−３−［３−フルオロ−４−（４−ピリジニル）フェニル］−２−オキソ−５−オキサゾリジニル］メチル］−35Ｓ−チオウレア（反応式Ｌの化合物Ｌ3（式中、Ｒ5は４−ピリジルであり、ＸはＦであり、ＹはＨであり、Ｒ1はＨでありおよびＲ2はＨである。））
【０１９３】
【化６４】
2004537265.tif 000065
【０１９４】
無水ＴＨＦ中のアミン二塩酸塩（実施例９の工程４由来）の攪拌中の溶液に、ヒューニッヒ塩基（Ｈｕｎｉｇ‘ｓ  ｂａｓｅ）を加え、続いてＴＨＦ中の35Ｓ−４−アジドフェニルイソチオシアネートを加える。反応混合物を１時間加熱還流する。冷却した反応混合物を精製し、目的のチオウレアを得る。
【０１９５】
実施例１２：生物学上の標的の特定
もとの抗生物質に対して感受性を有する細菌（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓもしくは他の感受性のグラム陽性またはグラム陰性細菌）を、ミュラー−ヒントン完全培地（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ）において指数期の半ば（ｍｉｄ−ｅｘｐｎｅｎｔｉａｌ  ｐｈａｓｅ）まで増殖させる。培養物の適当な部分の一部をとって、ＲＮアーゼを除去したチューブ（１．５ｍｌの容量）の中で簡単に沈降させ、その後、新たなミュラー−ヒントン培地中に再び懸濁させる。競争的化合物（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（抗生物質としては活性または不活性）を、ＤＭＳＯを含む保存液（全体の最終濃度＝０．２％）から加える。活性なフォトアフィニティープローブ（例えば、明細書中の式で表される化合物などの化合物；非標識化および125Ｉ−標識化、3Ｈ−標識化、またはその他の適当な放射性標識化または非放射性標識化で検出可能な任意の化合物の混合物）を、抗細菌作用についての最小阻止濃度（ＭＩＣ）付近の最終濃度となるまで加える。この露光は３７℃で暗所にて３０分間続けられる。
【０１９６】
その後細菌を、フォトプローブを活性化するために、紫外線光に直接さらすか、または簡単に沈降させリン酸緩衝食塩水中（ＰＢＳ）に再懸濁させその後紫外線にさらす（エネルギー設定を１８０，０００マイクロジュールとしたＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ）。その後標識化細胞をＰＢＳで洗浄し、バッファーＡ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、３０ｍＭのＮＨ4Ｃｌ、３０ｍＭのＭｇＣｌ2）に再懸濁し、リソスタフィンにより溶解する（３７℃で１５分間、リソスタフィンの最終濃度は５μｇ／ｍｌ）。その後、細胞壁および大型の膜のフラグメントを、１５分間１８，０００ｘｇの遠心分離で除去する。得られた上澄み液を６０分間、４５０，０００ｘｇで沈降させ、細胞膜およびリボソームを含むペレットを得る。当該ペレットをバッファーＢ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．５％のＳＤＳおよび６ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁し、標準的なフェノール抽出法によりＲＮＡを抽出する。ＲＮＡ抽出物は、エタノールにより沈殿させ、ＲＮＡの電気泳動のために適当なバッファーに再懸濁させる。粗物のペレットはタンパク質についての電気泳動に付す。例えば、リボソームＲＮＡ（２３Ｓ、１６Ｓ、５ＳサイズのリボソームＲＮＡ）またはトランスファーＲＮＡとの標識化フォトプローブの架橋結合は、ＲＮアーゼ  Ｈ  消化およびそれに続くプライマー伸長法アッセイにより検出され、架橋結合が生じた正確な塩基が得られる。特異的な架橋結合の発生は、生物学上活性な抗生物質である化合物の使用を通して、架橋結合の量の減少という結果により、確認されうる。架橋結合の発生のさらなる確認は、生物学上不活性な（抗生物質としての活性に欠けている）競争的抗生物質が、ＲＮＡおよび／またはタンパク質の標的との特異的な架橋結合の量を減少させないことを観察することにより達成される。
【０１９７】
この手法の使用により、ＲＮＡ（Ａ２６０２、Ｕ２５０６、Ａ２４５１を含む２３Ｓ  ＲＮＡペプチジルトランスフェラーゼ領域）の部分、６４ｋＤａ  ＬｅｐＡおよび１１ｋＤａ  Ｌ２７と一緒になったｔＲＮＡは、生物学上の標的と特定された。そしてこれらはこの機構に基づくタンパク質翻訳のユニークな阻害剤の発見において使用されうる。
【０１９８】
実施例１３：抗生物質活性を有する化合物の特定
放射性または非放射性（例えば、酵素的、化学発光または蛍光）のどちらかの手段により標識化されている、例えばオキサゾリジノンフォトアフィニティープローブまたは等価の化合物などの代表的なフォトアフィニティープローブの結合の検出のための認識アッセイにおいて、タンパク質（例えば、６４ｋＤａおよび１１ｋＤａタンパク質（各々ＬｅｐＡおよびＬ２７））および／またはＲＮＡの構成要素は、単独または組み合わせのどちらかで使用される。試験化合物の相互作用についての妨害の能力を測定する。潜在的な治療薬の最適化において、これらの部位における相互作用の増加は、正の選択基準として用いられ、それに対して、真核細胞の部位における相互作用は負の選択基準として用いられる。
【０１９９】
リボソームＲＮＡは、例えば、シンチレーション近接ビーズ（ＳＰＡ）などの固体表面に電荷相互作用により結合させられる。当該アッセイにおけるそれとは別の添加物には、上述した方法により特定された他の生物学上の標的と同様に、ｔＲＮＡおよび会合した６４ｋＤａ  ＬｅｐＡおよびＬ２７タンパク質が含まれる。生物学上の標的および／または試験化合物は、単独でまたは任意の組み合わせにおいて試験されうる。代表的なオキサゾリジノンまたは等価の化合物（例えば、エペレゾリド）は上述したような標識体（例えば、3Ｈ−エペレゾリド）として加えられ、試験化合物の標識化化合物の結合と拮抗する、または結合を減少させる能力を測定する。トリチウム化ＳＰＡの例においては、液体シンチレーションによる測定が可能である。しかしながら、その他の測定方法（例えば、連結酵素活性（ｃｏｕｐｌｅｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）、化学シフト／測定、蛍光）を伴う他のプローブも使用可能である。上述のように特定される標的との結合を特異的に減少させる化合物の効果的な濃度は、潜在的な治療薬についての肯定的な選択条件として解釈される。そのようにして特定される興味ある化合物については、その後、真核細胞の標的分子を用いる以外は同様の技術による、標的の真核細胞中において特定された毒性についての標的に関する選抜のための試験がなされる。これらの目的のために、特定された標的に取り付けられた抗体または周知の化学タグ（例えば、ヒスチジン−金属、ストレプトアビジン−ビオチン、など）によって、タンパク質もまた、選抜のための基質（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍａｔｒｉｘｅｓ）に結合させられうる。
【０２００】
特に、エペレゾリドの活性および非活性の両方のエナンチオマーによる架橋結合との拮抗を伴うヨウ素化プローブは、この特別な実施態様を説明するのに使用されうる。Ｓ．ａｕｒｅｕｓの菌株を指数的増加率で生育する。細胞の一定量（１ｍｌ／１．５ｍｌチューブ）を穏やかに沈殿させ、３０分間、４０μＭの活性なエペレゾリド（Ｓ）または非活性なエナンチオマー（Ｒ）および８μＭの125Ｉ−プローブ（２μＣｉ／チューブ）をふくむ、もしくは含まない新鮮な培地中に再懸濁させる。その後サンプルを実施例１２において上述した様に処理する。そのような方法によるＲＮＡの検定は、２３Ｓ  ＲＮＡが特異的な様式、例えば、架橋結合は活性なエナンチオマー（Ｓ）によって妨害されるが、不活性なエナンチオマーによっては妨害されないことが示される。１％アガロースゲル上のＲＮＡの分離により、２３Ｓ  ＲＮＡが特異的に架橋結合を形成することが示される（データ非開示）。１０％ＴＢＥウレア電気泳動ゲル上の分離により、ｔＲＮＡもまた架橋結合を形成することが示される（データ非開示）。リボソーム沈殿の１０−２０％トリストリシンポリアクリルアミド分析のオートラジオグラムにより、６４ｋＤａタンパク質（ＬｅｐＡ）および１１ｋＤａタンパク質（Ｌ２７）の架橋結合形成が示される（データ非開示）。
【０２０１】
架橋結合形成についての研究により得られる情報は、構造に基づいたデザインのために使用することもできる。つまり、オキサゾリジノンまたは等価体分子と共に、特定されたまたは上述した相互作用の１またはそれ以上の鍵構成要素を伴う共結晶（ｃｏ−ｃｒｙｓｔａｌｓ）を調製する。関連する結合部位との直接的な相互作用の概要は、新たな潜在的治療剤の構築において肯定的な指針として使用される。同じ試験化合物の真核細胞の標的との共結晶は否定的な選択として使用されうる。
【０２０２】
同様の原理により、ＮＭＲは、架橋結合形成研究によって特定された対応する標的分子のいずれかまたはすべてに対して、適した試験化合物（オキサゾリジノンまたは等価の分子）の相互作用を研究するために使用されうる。この場合、試験化合物および／または生物学上の標的のいずれかは、標準的な技術により相互作用の部位の測定を可能にするために、適切な修飾がなされる。
【０２０３】
当該技術分野の当業者であれば認識するように、無数の変法および改良法が、本発明の要点から逸脱することなく、本発明の好ましい実施態様として作成されうる。そのようなすべての変法は本発明の技術範囲に属することを意図する。本明細書で引用した各刊行物の開示全体は、参照することにより本明細書に援用される。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004537265.tif 000169
2004537265.tif 000170
2004537265.tif 000171