(57)【要約】対象由来のサンプル、好ましくは血清サンプルまたは腫瘍組織抽出物中のｈＫ１０を検出することによる、対象における卵巣癌の診断、予後、およびモニタリングの方法。ｈＫ１０は、ｈＫ１０を検出または結合する試薬、好ましくはｈＫ１０またはその一部に特異的に反応性である抗体、を使用して測定し得る。腫瘍イメージング用の標識を有するｈＫ１０に結合する試薬を使用する、ｈＫ１０に関連する腫瘍のイメージング方法も記載される。
2004512540.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象中の卵巣癌に関連するｈＫ１０を検出する方法であって、
（ａ）対象由来のサンプルを採取すること；
（ｂ）サンプル中のｈＫ１０を検出または同定すること；および
（ｃ）検出される量を基準で検出される量と比較すること、
を含む方法。
【請求項２】
段階（ｂ）に、ヒト角質層キモトリプシン酵素（ＨＳＣＣＥ）、カリクレイン４、カリクレイン５、カリクレイン６、カリクレイン８、カリクレイン９、カリクレイン１１、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＯＶＸ１、リソホスファチジン酸（ＬＰＡ）または癌胚抗原（ＣＥＡ）の１種またはそれ以上を検出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階（ｂ）に、ＣＡ１２５、カリクレイン６およびカリクレイン９の１種またはそれ以上を検出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
対象由来のサンプル中のｈＫ１０を定量することにより対象中の卵巣癌を診断またはモニタリングする方法であって、
（ａ）対象由来の生体サンプルを、検出可能な物質で直接または間接的に標識されたｈＫ１０特異的抗体と接触させること；
（ｂ）検出可能な物質を検出してサンプル中のｈＫ１０を定量すること；
（ｃ）定量されたｈＫ１０を基準のレベルと比較すること、
を含む方法。
【請求項５】
卵巣癌を診断またはモニタリングする方法であって、
（ａ）生体サンプルを、検出可能な物質で直接または間接的に標識された第一のｈＫ１０特異的抗体、および固定された第二のｈＫ１０特異的抗体とインキュベートすること；
（ｂ）第一抗体を第二抗体から分離させ、第一抗体相と第二抗体相を生じさせること；
（ｃ）第一または第二抗体相中の検出可能な物質を検出することにより、生体サンプル中のｈＫ１０を定量すること；および
（ｄ）定量されたｈＫ１０を基準のレベルと比較すること、
を含む方法。
【請求項６】
生体サンプルが血清または腫瘍組織抽出物である、請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
生体サンプルが血清である、請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
基準が非卵巣癌の対象または良性疾病の対象で検出されるｈＫ１０レベルである、請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
基準のものより大きいｈＫ１０量の検出が、後期の疾病または疾病進行および死亡のリスクの増大を示すものである、請求項１ないし請求項８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
段階（ａ）で、第一および第二抗体を同時または連続的に生体サンプルと接触させる、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、免疫学的に活性な抗体断片、ヒト化抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、遺伝子的に加工した一本鎖Ｆｖ分子、またはキメラ抗体である、請求項４ないし請求項１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
検出可能な物質がアルカリフォスファターゼである、請求項４ないし請求項１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
アルカリフォスファターゼが蛍光基質を使用して検出される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ｈＫ１０が時間分解蛍光を使用して測定される、請求項１ないし請求項１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ｈＫ１０に関連する腫瘍をイメージングする方法であって、
（ａ）腫瘍を、ｈＫ１０に結合する試薬と、腫瘍に関連するｈＫ１０に試薬を結合させるのに十分な時間インキュベートすること、但し、試薬は腫瘍イメージング用の標識を帯びている；
（ｂ）腫瘍に局在化した標識の存在を検出すること、
を含む方法。
【請求項１６】
段階（ａ）に、ヒト角質層キモトリプシン酵素（ＨＳＣＣＥ）、カリクレイン４、カリクレイン５、カリクレイン６、カリクレイン８、カリクレイン９、カリクレイン１１、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＯＶＸ１、リソホスファチジン酸（ＬＰＡ）または癌胚抗原（ＣＥＡ）、好ましくはＣＡ１２５に結合する試薬の１種またはそれ以上とインキュベートすることをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
各試薬が段階（ｂ）で区別できるように標識されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
卵巣癌をイメージングするためのインビボの方法であって、
（ａ）ｈＫ１０に結合する試薬を患者に注射すること、但し、試薬は卵巣癌イメージング用の標識を帯びている；
（ｂ）試薬をインビボでインキュベートし、卵巣癌に関連するｈＫ１０に結合させること；および
（ｃ）卵巣癌に局在化した標識の存在を検出すること、
を含む方法。
【請求項１９】
試薬がｈＫ１０を認識する抗体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
標識が放射性標識、蛍光標識、核磁気共鳴活性標識、陽電子放出断層撮影（「ＰＥＴ」）スキャナーで検出可能な陽電子放出同位元素、化学発光物質または酵素マーカーである、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１ないし請求項２０のいずれかに記載の方法を実行するためのキット。
【請求項２２】
酵素で標識されたｈＫ１０特異的抗体；および酵素の基質を含む、請求項１ないし請求項２０のいずれかに記載の方法を実行するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、卵巣癌の診断、予後およびモニタリングの方法に関するものである。
【０００２】
発明の背景
ヒトカリクレイン遺伝子ファミリーは、染色体１９ｑｌ３．３−ｑｌ３．４にクラスターを形成し、ヌクレオチドとアミノ酸の両レベルで有意な相同性を共有する遺伝子群である（１−５）。最近まで、このファミリーは、ＫＬＫ１（膵臓／腎臓カリクレインとしても知られるヒトカリクレイン１、ｈＫ１をコードする）、ＫＬＬ２（ヒトカリクレイン２、ｈＫ２をコードする）およびＫＬＫ３（前立腺特異的抗原、ＰＳＡとしても知られるヒトカリクレイン３、ｈＫ３をコードする）を含む３遺伝子のみを含むと考えられていた。ここ２、３年にわたって、新しい遺伝子が同じ染色体領域で同定され、今やカリクレイン遺伝子ファミリーの構成員であると考えられている（６）。これらの新カリクレイン遺伝子は、現在様々な経験的名称で知られている。研究者の国際的グループは、最近新しいヒトカリクレイン遺伝子命名法に同意した（７）。この遺伝子ファミリーは、今や少なくとも１５種の遺伝子を含み、これらはＫＬＫ１．．．ＫＬＫ１５と称され、一方これらがコードするタンパク質は、ｈＫ１．．．ｈＫ１５と称される。
【０００３】
正常上皮細胞特異的１（ＮＥＳ１）遺伝子は、これらの新しく同定された遺伝子の１つである。新命名法では、ＮＥＳ１はＫＬＫ１０と、そしてコードされるタンパク質はｈＫ１０と称される。ＫＬＫ１０は、放射線形質転換と非形質転換の乳房上皮細胞の差引きハイブリダイゼーション（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）で同定された（８）。ＫＬＫ１０は染色体１９ｑｌ３．４にあり、約５．５ｋｂのゲノムＤＮＡ配列にわたり、６個のエクソン（１個は翻訳されない）と５個のイントロンを含む（９）。ｈＫ１０は、分泌セリンプロテアーゼであり、そのアミノ酸配列は、ＰＳＡを含むヒトカリクレイン遺伝子ファミリーの他の構成員と３５−４０％の同一性と５０−５５％の類似性を有する。ｈＫ１０の生理的機能はまだ解明されていない。ＫＬＫ１０遺伝子は乳癌細胞系では下方調節されるので、正常な細胞増殖の調節に関与すると考えられる。Ｇｏｙａｌ らは、最近、ＫＬＫ１０が腫瘍抑制遺伝子をコードし得ることを示唆した（１０）。ＫＬＫ１０遺伝子を腫瘍形成性の乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１にトランスフェクションすると、その足場非依存的時増殖が低減され、その細胞系をヌードマウスに接種すると、腫瘍形成が有意に減少した。
【０００４】
卵巣癌は、女性の生殖器系の他のいかなる癌よりも死を引き起こしやすい、深刻な疾病である（１３）。この疾病は、早期に診断されれば生存率が劇的に改善されるので（１４）、早期検出を助け、悪性度（ｇｒａｄｅ）および／または病期（ｓｔａｇｅ）分けを容易にするバイオマーカーの同定に大きな関心がある（１５）。不幸なことに、ＣＡ１２５（１６−１９）、インヒビン（２０−２３）、ＯＶＸ１（２４）並びに他のマーカー（２５に概説）を含む現在の卵巣癌腫血清マーカーは、幾許かの見込みを示したが、広範な臨床的好評を博してはいない。もう１つの見込みある卵巣癌マーカーである、リソホスファチジン酸（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）も、この目的のためには同じ価値を有するようである（２６）。
【０００５】
卵巣癌腫の新しい血清バイオマーカーの発見と確認に、至急の要望がある。特に、血清分析による卵巣癌の早期診断は、効果的な処置の適用を介して臨床成果を改善し得る。
【０００６】
発明の概要
種々の体液中のｈＫ１０を測定するための高感度ｈＫ１０免疫アッセイが開発された（実施例１）。この鋭敏なアッセイを使用して、卵巣癌患者の大部分で血清中のｈＫ１０濃度が有意に増大していることが見出された。ｈＫ１０は卵巣癌細胞質抽出物中でも測定され、正常および良性卵巣組織と比較して上昇しているとわかった。レベルの増大は、後期の疾病病期、漿液性の組織タイプ、最適下限の減容積（ｄｅｂｕｌｋｉｎｇ）および大きい残存腫瘍により強く関連した。
【０００７】
従って、ｈＫ１０は、卵巣癌の予後、診断およびモニタリング用の新しいバイオマーカーを構成する。ｈＫ１０は、後期卵巣癌の診断およびモニタリングに使用し得、手術前または再発後のバイオマーカーとしても使用し得る。
【０００８】
ｈＫ１０およびｈＫ１０に結合する試薬は、卵巣癌の検出に使用し得、特に、それらは卵巣癌の診断的評価およびかかる疾患の素因のある患者の同定に使用できる。
【０００９】
本発明は、対象由来のサンプル中のｈＫ１０を測定することを含む、対象の卵巣癌腫を診断およびモニタリングする方法に関連する。ｈＫ１０は、ｈＫ１０を検出または結合する試薬、好ましくはｈＫ１０またはその一部に特異的に反応性である抗体を使用して測定し得る。
【００１０】
本発明のある態様では、
（ａ）患者由来のサンプルを採取すること；
（ｂ）サンプル中のｈＫ１０を検出または同定すること；および
（ｃ）検出される量を基準で検出される量と比較すること、
を含む、患者の卵巣癌に関連するｈＫ１０を検出するための方法が提供される。
【００１１】
本発明はまた、（ａ）対象から生体サンプルを入手すること；（ｂ）該サンプル中のｈＫ１０量を検出すること；および（ｃ）検出された該ｈＫ１０量を、予め決定された基準と比較すること、但し、基準のものよりも高いレベルのｈＫ１０の検出は、卵巣癌、特に後期の卵巣癌の存在を示すものである、を含む、卵巣癌について対象を調べる方法にも関連する。
【００１２】
「検出」または「検出する」の用語は、標的であるｈＫ１０、そのサブユニット、または試薬に結合した標的の組合せなどの有無を、アッセイすること、イメージングすることまたはその他の方法で確立すること、並びに卵巣癌、転移、病期、または類似する状態の１つまたはそれ以上の事実に基づく特徴について、アッセイすること、イメージングすること、確認すること、確立すること、またはその他の方法で判定することを含む。この用語は、ｈＫ１０についての診断、予後、モニタリングの適用を包含する。
【００１３】
ある実施態様では、本発明は、（ａ）生体サンプルを、検出可能な物質で直接または間接的に標識されたｈＫ１０特異的抗体と反応させること；および（ｂ）検出可能な物質を検出すること、を含む、対象由来の生体サンプル中のｈＫ１０を定量することにより対象中の卵巣癌を検出する方法に関連する。
【００１４】
ある実施態様では、本発明は、（ａ）生体サンプルを、検出可能な物質で直接または間接的に標識されたｈＫ１０特異的抗体と反応させること；および（ｂ）検出可能な物質を検出すること、を含む、対象由来の生体サンプル中のｈＫ１０を定量することにより対象中の卵巣癌腫を診断およびモニタリングする方法に関連する。
【００１５】
本発明の方法の実施態様は、（ａ）対象由来の生体サンプルを、酵素で直接または間接的に標識されたｈＫ１０特異的抗体と反応させること；（ｂ）酵素の基質を添加すること、但し、基質は、基質または酵素と基質の反応生成物が蛍光複合体を形成するように選択する；（ｃ）蛍光複合体の蛍光を測定することにより、サンプル中のｈＫ１０を定量すること；および（ｄ）定量したレベルを基準のものと比較すること、を含む。
【００１６】
本発明の好ましい実施態様は、以下の段階を含む。
（ａ）生体サンプルを、検出可能な物質で直接または間接的に標識された第一のｈＫ１０特異的抗体、および固定された第二のｈＫ１０特異的抗体とインキュベートすること；
（ｂ）第一抗体を第二抗体から分離させ、第一抗体相と第二抗体相を生じさせること；
（ｃ）第一または第二抗体相中の検出可能な物質を検出することにより、生体サンプル中のｈＫ１０を定量すること；および
（ｄ）定量されたｈＫ１０を基準と比較すること。
【００１７】
本発明の方法で使用する基準は、健康な対照対象由来、良性疾病の対象、早期疾病の対象由来、または対象のその他のサンプル由来のサンプルについて定量されるｈＫ１０レベルに相応し得る。基準と比較して増大したｈＫ１０レベルは、卵巣癌、特に後期の卵巣癌を示すものである。
【００１８】
本発明は、複数の卵巣癌マーカーを使用する本明細書に記載の方法も企図している。従って、本発明は、ｈＫ１０および卵巣癌特異的インジケーターである他のマーカーの存在について、生体サンプルを分析する方法を企図している。他のマーカーには、ヒト角質層キモトリプシン酵素（ＨＳＣＣＥ）、カリクレイン４、カリクレイン５、カリクレイン６、カリクレイン８、カリクレイン９、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＯＶＸ１、リソホスファチジン酸（ＬＰＡ）および癌胚抗原（ＣＥＡ）などのカリクレインに対するマーカーが含まれる。好ましくは、他のマーカーはカリクレインマーカーである。好ましい実施態様では、マーカーは、ｈＫ６およびＣＡ１２５の２種またはそれ以上である。本明細書に記載の方法は、さらなるマーカーまたはマーカーの核酸を検出するための試薬を含めることにより改変してもよい。
【００１９】
本発明はまた、
（ａ）腫瘍を、ｈＫ１０に結合する試薬と、腫瘍に関連するｈＫ１０に試薬を結合させるのに十分な時間インキュベートすること、但し、試薬は腫瘍イメージング用の標識を帯びている；
（ｂ）腫瘍に局在化した標識の存在を検出すること、
を含む、ｈＫ１０に関連する腫瘍のイメージング方法にも関連する。
【００２０】
本発明は、イメージング用の標識を帯び、かつカリクレイン、好ましくはｈＫ１０、に結合する１種またはそれ以上の試薬を哺乳動物に投与し、次いで哺乳動物をイメージングすることを含む、インビボの方法を企図している。
【００２１】
発明の好ましい態様によると、
（ａ）カリクレイン１０に結合する試薬を患者に注射すること、但し、試薬は卵巣癌イメージング用の標識を帯びている；
（ｂ）試薬をインビボでインキュベートさせ、卵巣癌に関連するカリクレイン１０に結合させること；および
（ｃ）卵巣癌に局在化した標識の存在を検出すること、
を含む、卵巣癌をイメージングするためのインビボ方法が提供される。
【００２２】
発明のある実施態様では、試薬はカリクレインを認識する抗体である。発明の別の実施態様では、試薬はカリクレインを認識する化学物質である。
【００２３】
試薬は、カリクレインをイメージングするための標識を帯びている。イメージングに有用な標識の例は、放射性標識、蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、核磁気共鳴活性標識、陽電子放出断層撮影（「ＰＥＴ」）スキャナーで検出可能な陽電子放出同位元素、ルシフェリンなどの化学発光物質、およびペルオキシダーゼやフォスファターゼのような酵素マーカーである。短距離検出器プローブで検出可能な短距離放射線放射物質も採用できる。
【００２４】
本発明はまた、複数の卵巣癌マーカーを使用する、本明細書に記載の局在化またはイメージングの方法も企図している。例えば、卵巣癌イメージング用の方法は、ヒト角質層キモトリプシン酵素（ＨＳＣＣＥ）、カリクレイン４、カリクレイン５、カリクレイン６、カリクレイン８、カリクレイン９、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＯＶＸ１、リソホスファチジン酸（ＬＰＡ）または癌胚抗原（ＣＥＡ）、好ましくはＣＡ１２５、に結合する１種またはそれ以上の試薬を患者に注射することをさらに含み得る。
【００２５】
本発明はまた、発明の方法を実行するためのキットにも関連する。
【００２６】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明白になる。しかしながら、本発明の精神と範囲の内での様々な変更や改変は、この詳細な説明から当業者に明らかになるので、詳細な説明と特定の実施例は、発明の好ましい実施態様を示す一方で、例示説明のみに供されると理解すべきである。
【００２７】
図面の説明
ここで、図面に関して発明を説明する。
図１．Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ 酵母発現系を用いる組換えｈＫ１０タンパク質の産生。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クマシーブルーで染色した。Ａ：レーン１、分子量マーカー；２、ＫＬＫ１０ｃＤＮＡを含むｐＰＩＺαＡベクターをトランスフェクションした酵母クローンから得られた培養上清；３、空のｐＰＩＺαＡベクターをトランスフェクションした酵母クローンから得られた培養上清。Ｂ：酵母発現系由来の精製した組換えｈＫ１０。レーン１、分子量マーカー；２、精製した組換えｈＫ１０。精製は、陽イオン交換、続いて逆相クロマトグラフィーにより達成した。レーン２で、３１と２２ｋＤａのマーカーの間の強いバンドは、ｈＫ１０を表す。
【００２８】
図２．逆相ＨＰＬＣによる酵母培養上清由来組換えｈＫ１０の精製を示す典型的なクロマトグラム。組換えｈＫ１０は、３５分くらいで溶出した（４１−４２％アセトニトリル）。
【００２９】
図３．図１Ｂ、レーン２で同定されたバンドから単離した、ｈＫ１０とそのトリプシン処理によるペプチドの質量分析の特徴。（ａ）ゲルから抽出したペプチドのナノエレクトロスプレー質量分析。３０Ｖのオフセット、Ｎ２標的ガスの衝突エネルギーを使用する、前駆ｍ／ｚ８５３．４の生成物イオンスペクトル。（ｂ）ｙタイプ断片イオンは、Ｃ末端に電荷保持のあるペプチド結合の切断を表す（Ｒｏｅｐｓｔｏｒｆｆ Ｐ ａｎｄ Ｆｏｈｌｍａｎ Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ １９８４； １１： ６０１． ［ｌｅｔｔｅｒ］）。１文字コードを使用してアミノ酸に注釈を付けた。ペプチド配列ＶＧＤＤＨＬＬＬＬＱＧＥＱＬＲは、参照文献８で報告されたように、ｈＫ１０配列のアミノ酸９６−１１０を表す。
【００３０】
図４．ｈＫ１０免疫アッセイの典型的な較正曲線。バックグラウンドの蛍光（ゼロ較正）を、他の全測定値から差引いた。アッセイのダイナミック・レンジは０．０５−２０μｇ／Ｌであった。
【００３１】
図５．ｈＫ１０免疫アッセイの特異性と、ｈＫ１０とＰＳＡ、ｈＫ２およびｈＫ６との間の交差反応を示す棒図解。Ａ：□マウスおよびウサギ抗ｈＫ１０抗血清；■免疫前マウス血清プラスウサギ抗ｈＫ１０抗血清；＼（斜線）マウス抗ｈＫ１０抗血清プラス免疫前ウサギ血清。ｈＫ１０抗血清を免疫前血清に置き換えたときの免疫反応性の欠如に注目されたい。Ｂ：標準的なｈＫ１０免疫アッセイによるＰＳＡ、ｈＫ１０およびｈＫ６の交差反応性。検出可能な交差反応性は見られなかった。
【００３２】
図６．ｈＫ１０免疫アッセイの線形性。精漿サンプル（試験した様々な臨床サンプルの一例）を、２、４、８、１６および３２倍に連続的に希釈した。線形回帰を実施した（ｒ＝０．９９９、傾きｓｌｏｐｅ＝２４．６４）。ｈＫ１０免疫アッセイに非常に良好な希釈線形性があった。
【００３３】
図７．様々なヒト組織由来の細胞質抽出物中のｈＫ１０含量（総タンパク質１ｇ当りのｈＫ１０のｎｇで表記）。
【００３４】
図８．輸卵管（ホルマリン固定パラフィン包埋組織）におけるｈＫ１０の免疫組織化学染色。輸卵管の上皮内張り（ｌｉｎｉｎｇ）細胞からなる内腔表面に陽性（灰色）があり、いくつかの細胞の細胞質内に焦点の強い陽性がある（元の倍率ｘ４００）。
【００３５】
図９．サイズ排除高速液体クロマトグラフィーによる、乳汁、精漿および血清の分別。様々な画分中のｈＫ１０の存在を、ｈＫ１０免疫アッセイで測定した。３種全部のサンプルで、単一のピーク（画分４０）が検出された。分子量基準も同じカラムで分離した。それらの相応する画分をグラフの上部に示す。免疫反応のピークは３種全部の臨床サンプルにおいて３０ｋＤａ周辺で溶出した。
【００３６】
図１０：８０人の卵巣癌患者の血清中のｈＫ１０濃度の度数分布。表３でカットオフとして使用した１．５μｇ／Ｌのレベルを矢印で示す。約５７％の卵巣癌患者は、このカットオフ値より高い血清ｈＫ１０を有した。
【００３７】
図１１：卵巣癌患者由来の７９の血清サンプルにおける、ＣＡ１２５とｈＫ１０の濃度間の相関。ピアソンの相関係数Ｒ＝０．２３。
図１２：初期処置後にモニタリングされた卵巣癌患者からの連続的血清サンプルにおける、ｈＫ１０とＣＡ１２５の分析。
図１３は、卵巣腫瘍細胞質におけるｈＫ１０濃度の度数分布を示すグラフである。最適カットオフ値の１．３５ｎｇ／ｍｇ総タンパク質（３３番目の百分位）を、腫瘍を高ｈＫ１０と低ｈＫ１０として分類するのに使用した。
【００３８】
図１４は、正常卵巣組織（正常）、良性疾病の卵巣組織（良性）および卵巣癌（癌）からの抽出物のｈＫ１０濃度の比較を示すグラフである。各グループの測定された患者の数（Ｎ）を示す。水平の棒は、平均ｈＫ１０濃度である。クラスカル・ワリス検定により、ｈＫ１０濃度は、卵巣腫瘍細胞質で有意に上昇したことが示された（Ｐ＜０．００１）。
【００３９】
図１５は、病期Ｉ／ＩＩおよび病期ＩＩＩ／ＩＶの卵巣癌患者由来の抽出物におけるｈＫ１０濃度の分布を示すグラフである。各グループの患者数（Ｎ）を示す。水平の棒は、ｈＫ１０濃度の平均値である。マン・ホイットニー検定により、ｈＫ１０濃度は、病期ＩＩＩ／ＩＶの卵巣癌患者において有意に上昇したことが示された（Ｐ＜０．０５）。
【００４０】
図１６は、カプラン・マイヤーの生存曲線である。上、ＰＦＳ；下、ＯＳ。各グループの患者数（ｎ）およびＰを示す。高ｈＫ１０でＰＦＳとＯＳの率がより低いことは、統計的に有意である。
【００４１】
図１７は、腫瘍病期で層化した高ｈＫ１０と低ｈＫ１０の卵巣癌を有する患者の、ＰＦＳとＯＳを示すグラフである。各グループの患者数（ｎ）およびＰを示す。病期ＩＩＩ／ＩＶの疾病の患者では、高ｈＫ１０は低いＰＦＳとＯＳの率に関連した。この関連は、病期Ｉ／ＩＩの疾病の患者では観察されなかった。
【００４２】
図１８は、卵巣腫瘍組織におけるｈＫ１０の免疫組織化学的局在を示すブロットである。ＡおよびＣ、乳頭内張りの上皮細胞（Ａ）および侵襲性乳頭漿液性癌腫の侵襲性成分における細胞質内染色（ｘ４００）。ＢおよびＤ、境界のムチン性腫瘍の上皮細胞における細胞質内染色（ｘ４００）。ＥおよびＦ、漿液性嚢胞線維腫の上皮成分（Ｅ）および同じ腫瘍の上皮とストロマの両細胞（Ｆ）における細胞質内染色（ｘ４００）。
【００４３】
発明の詳細な説明
前述のように、本発明は対象由来の生体サンプル中のｈＫ１０を検出することにより、対象の卵巣癌腫をモニタリング、診断または予後する方法を提供する。ある実施態様では、本方法は、検出可能な物質で直接または間接的に標識されたｈＫ１０特異的抗体とサンプルを反応させること、および検出可能な物質を検出することを含む。
【００４４】
本発明の方法は、非疾患状態と比べて過剰量または不足量のｈＫ１０、または疾患状態（例えば、卵巣癌）もしくは疾患状態への進行に相応する、修飾されたｈＫ１０（例えば、全長に満たない）の存在の検出に使用してもよい。本明細書に記載した方法は、例えば宿主から新たに取出した細胞グループ中の、悪性または前悪性細胞の存在可能性を評価するのに使用してもよい。かかる方法は、腫瘍の検出、その成育の定量、および疾病の診断および予後の補助に使用できる。本方法は、癌転移の存在の検出、並びに手術、癌化学療法、および／または放射線療法後の、全腫瘍の非存在または除去の確認に使用できる。それらはさらに、癌化学療法および腫瘍の再出現のモニタリングに使用できる。
【００４５】
本発明の方法は、後期卵巣癌の診断、および卵巣癌の疾病進行と致死性の予後に特に有用である。本明細書に例示説明するように、基準（例えば、正常または良性組織）と比較して増大したレベルのｈＫ１０がサンプル（例えば、血清、腫瘍組織またはその抽出物）中に検出されることは、後期疾病、漿液性の組織タイプ、最適下限の減容積、大きい残存腫瘍、および／または疾病進行および致死性のリスクの増大を示すものである。
【００４６】
「サンプル」「生体サンプル」などの用語は、ｈＫ１０を発現または含有すると分かっているか、または疑われる材料を意味する。試験サンプルは、供給源から得たまま直接か、あるいはサンプルの特性を改変する予処理に続いて、使用できる。サンプルは、細胞（例えば腫瘍細胞）を含む組織または抽出物、および例えば血液全体、血漿、血清、唾液、眼のレンズ液、汗、尿、乳汁、腹水、滑液、腹水などの、生理的液体などのいかなる生体供給源にも由来することができる。サンプルは、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトから入手できる。サンプルは、血液から血漿を調製する、粘性の液を希釈するなど、使用前に処理できる。処理方法は、濾過、蒸留、抽出、濃縮、妨害物質の不活性化、試薬の添加などを含むことができる。
【００４７】
ｈＫ１０の存在は、例えば細胞や液を含む組織またはその抽出物を含む、様々な生体サンプルで検出し得る。好ましくは、ｈＫ１０は血清または腫瘍組織抽出物、より好ましくは血清で検出される。
【００４８】
本発明の実施態様では、本明細書に記載の方法を、対象由来の生体サンプル中のｈＫ１０を定量することによる、卵巣癌の診断およびモニタリングに適合させる。これらの適用は、試験される対象に由来するサンプル中で定量されるｈＫ１０の量を、他のサンプルまたは対象由来の以前のサンプルで定量されるレベル、または対照サンプルで定量されるレベルと比較することを要する。健康な対象に由来する対照サンプルのレベルは、予期的および／または遡及的な統計的研究により確立し得る。臨床的に明らかな疾病または異常を持たない健康な対象を、統計的研究のために選択し得る。診断は、対照サンプルまたは同一対象で定量された過去のレベルと比較して、統計的に異なるｈＫ１０レベルを見出すことによってなされ得る。
【００４９】
「ｈＫ１０」の用語は、ヒトカリクレイン１０（ＮＥＳ−１としても知られる）を表し、それは、ＰＳＡを含む他のヒトカリクレイン遺伝子ファミリーと３５−４０％の同一性と５０−５５％の類似性を有する分泌セリンプロテアーゼである。この用語は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ８１６０２およびＮＰ＿００２７６７のヒトカリクレイン１０の全ての相同体、天然産生対立遺伝子変異体、アイソフォームおよび前駆体を包含する。一般的に、例えば、ヒトカリクレイン１０の天然産生対立遺伝子変異体は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ８１６０２およびＮＰ＿００２７６７に示される配列と有意な相同性（７０−９０％）を共有する。対立遺伝子変異体は、ＫＬＫ１０配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０２４６０５およびＮＭ＿００２７７６）からの保存的アミノ酸置換を含有し得、あるいは、例えばマウスカリクレイン６相同体などのｈＫ１０相同体中の相応する位置からのアミノ酸置換を含有するであろう。
【００５０】
「対象」の用語は、卵巣癌に冒されているか、または本明細書に記載の症状に冒されている、哺乳動物などの温血動物を表す。好ましくは、「対象」はヒトを表す。
【００５１】
本発明の方法で使用するｈＫ１０特異的抗体は、科学的または商業的供給源から入手し得る。あるいは、単離した天然のｈＫ１０または組換えｈＫ１０を、抗体、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、および免疫学的に活性な断片（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２断片）、抗体重鎖、抗体軽鎖、ヒト化抗体、遺伝子的に加工した一本鎖Ｆｖ分子（Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ， 米国特許第４，９４６，７７８号）、または、例えばマウス抗体の結合特異性を有するが、残りの部分はヒト由来である、キメラ抗体の調製に使用してもよい。モノクローナルおよびポリクローナル抗体、断片およびキメラを含む抗体は、当業者に既知の方法を使用して調製し得る。好ましくは、本発明の方法で使用する抗体は、１０−７Ｍより大きいか、または等しいＫａで結合する場合、ｈＫ１０に対して反応性である。本発明のサンドイッチ免疫アッセイでは、マウスポリクローナル抗体とウサギポリクローナル抗体を利用する。
【００５２】
ｈＫ１０と特異的に反応する抗体、または酵素結合もしくは標識誘導体などの誘導体は、様々な生体サンプル中のｈＫ１０の検出に使用し得る。それらは例えば、タンパク質の抗原決定因子と抗体との結合相互作用に依存するいかなる既知の免疫アッセイにも使用し得る。かかるアッセイの例は、放射性免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光、免疫沈降、ラテックス凝集反応、血球凝集反応および組織学的試験である。
【００５３】
ｈＫ１０特異的抗体は、検出可能な物質で標識され、検出可能な物質の存在に基づいて生体サンプル中で局在化されてもよい。検出可能な物質の例には、以下のもの：放射性同位元素（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、ルミノールなどの発光標識；酵素標識（例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ）、ビオチン基（これは、例えば蛍光マーカーまたは光学的方法や熱量測定方法で検出できる酵素活性を含むストレプトアビジンなどの、マークしたアビジンで検出できる）、二次レポーターに認識される、予め決定したポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。ｈＫ１０に反応する抗体に対する特異性を有する二次抗体の導入により一次抗原抗体反応が増幅される、間接的方法も採用し得る。例えば、ｈＫ１０に特異性を有する抗体がウサギＩｇＧ抗体ならば、二次抗体は、本明細書に記載の検出可能な物質で標識されたヤギ抗ウサギガンマグロブリンであり得る。
【００５４】
上記の抗体を結合または標識する方法は、当業者に容易に達成される（例えば、Ｉｎｍａｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ３４， Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐａｒｔ Ｂ， Ｊａｋｏｂｙ ａｎｄ Ｗｉｃｈｅｋ （ｅｄｓ．）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐ． ３０， １９７４； および Ｗｉｌｃｈｅｋ ａｎｄ Ｂａｙｅｒ， ”Ｔｈｅ Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，” Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １７１：１−３２， １９８８ ｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ｏｒ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｅｎｚｙｍｅ ｏｒ ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐａｒｔｎｅｒ 参照）。
【００５５】
時間分解蛍光分析を、シグナルの検出に使用し得る。例えば、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ ＴＫ ａｎｄ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ １９９２：６４：３４２−３４６ に記載の方法を、従来の時間分解蛍光光度計を用いて使用してもよい。
【００５６】
従って、本発明の実施態様に従うと、ｈＫ１０抗体を酵素で標識し、酵素の基質を添加する方法が提供される。但し、基質は基質または酵素と基質の反応生成物がランタニド金属と蛍光錯体を形成するように選択する。ランタニド金属を添加し、蛍光錯体の蛍光を測定することにより、サンプル中のｈＫ１０を定量する。ｈＫ１０特異的抗体は、直接または間接的に酵素で標識し得る。酵素は、酵素の基質または酵素と基質の反応生成物がユーロピウムやテルビウムなどのランタニド金属と錯体形成する能力に基づいて選択される。適する酵素の例には、アルカリフォスファターゼおよびβ−ガラクトシダーゼが含まれる。好ましくは、酵素はアルカリフォスファターゼである。ｈＫ１０抗体は、間接的に酵素で標識してもよい。例えば、抗体をリガンド結合対の１パートナーと結合させ、酵素をリガンド結合対のもう一方のパートナーと共役させてもよい。代表例には、アビジン−ビオチンおよびリボフラビン−リボフラビン結合タンパク質が含まれる。好ましくは、抗体をビオチン化し、酵素をストレプトアビジンと共役させる。
【００５７】
本方法では、サンプル中のｈＫ１０に結合した抗体を、酵素の基質を添加することにより検出する。基質は、ランタニド金属（例えば、ユーロピウム、テルビウム、サマリウムおよびジスプロシウム、好ましくはユーロピウムおよびテルビウム）の存在下で、基質または酵素と基質の反応生成物がランタニド金属と蛍光錯体を形成するように選択する。かかる蛍光錯体をもたらす酵素と酵素の基質の例は、Ｄｉａｍａｎｄｉｓ の米国特許第５，３１１２，９２２号に記載されている。一例として、抗体が直接または間接的にアルカリフォスファターゼで標識されているとき、本方法で採用する基質は、リン酸４−メチルウンベリフェリルまたはリン酸５−フルオロサリチルである。錯体の蛍光強度は、典型的には、例えば ＣｙｂｅｒＦｌｕｏｒ ６１５ Ｉｍｕｎｏａｎａｌｙｚｅｒ （Ｎｏｒｄｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｋａｎａｔａ， Ｏｎｔａｒｉｏ）などの時間分解蛍光強度計を使用して測定する。
【００５８】
サンプル、ｈＫ１０特異的抗体またはｈＫ１０は、固定化してもよい。適する担体の例は、アガロース、セルロース、デキストラン、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、リポソーム、カルボキシメチルセルロースポリスチレン、濾紙、イオン交換樹脂、プラスチックフィルム、プラスチックチューブ、ガラスビーズ、ポリアミン−メチルビニルエーテル−マレイン酸コポリマー、アミノ酸コポリマー、エチレン−マレイン酸コポリマー、ナイロン、絹などである。担体は、例えば、チューブ、試験プレート、ウェル、ビーズ、ディスク、球体などの形状であってもよい。固定化抗体は、例えば臭化シアン共役などの既知の化学または物理学的方法を使用して、材料を適する不溶担体と反応させることにより調製し得る。
【００５９】
ある実施態様によると、免疫アッセイでｈＫ１０を測定することにより、本発明は血液サンプル中のｈＫ１０を測定する手段を提供する。ｈＫ１０の測定に様々な免疫アッセイ法を使用できることは、当業者に明らかである。一般に、ｈＫ１０免疫アッセイ法は、競合または非競合的であり得る。典型的に、競合的方法には、固定化または固定可能なｈＫ１０の抗体（抗ｈＫ１０）と、標識化形態のｈＫ１０を採用する。サンプルのｈＫ１０と標識化ｈＫ１０が抗ｈＫ１０への結合を競合する。生じる抗ｈＫ１０に結合した標識化ｈＫ１０（結合画分）を、非結合のままのもの（非結合画分）から分離した後、結合または非結合画分のいずれかの標識の量を測定し、例えば標準曲線との比較によるなど、任意の従来の方法で試験サンプル中のｈＫ１０量と相関させ得る。
【００６０】
好ましくは、ｈＫ１０の測定に非競合的方法を使用する。最も一般的な方法は、「サンドイッチ」方法である。このアッセイでは、２種の抗ｈＫ１０抗体を採用する。抗ｈＫ１０抗体の一方は、直接または間接的に標識化し（「検出抗体」と呼ばれることもある）、他方を固定化または固定可能にする（「捕獲抗体」と呼ばれることもある）。捕獲および検出抗体を同時または連続的に試験サンプルと接触させることができる。連続的方法は、捕獲抗体をサンプルとインキュベートし、予め決定した時間の後、検出抗体を添加すること（「順行」方法と呼ばれることもある）により達成される；または、最初に検出抗体をサンプルとインキュベートし、次いで捕獲抗体を添加することもできる（「逆行」方法と呼ばれることもある）。必要なインキュベーションが起こった後、アッセイを完了するために、捕獲抗体を液状試験混合物から分離し、分離した捕獲抗体相または液状試験混合物の残りの少なくとも一部で標識を測定する。一般に、捕獲と検出抗体とに結合された（間に「サンドイッチ」された）ｈＫ１０を含むので、それは捕獲抗体相で測定する。
【００６１】
典型的な２部位のｈＫ１０免疫測定アッセイでは、捕獲および検出抗体の一方または両方は、ポリクローナル抗体である。検出抗体で使用する標識は、当分野で従来既知のいずれのものからも選択できる。標識は、酵素または化学発光部分であり得るが、放射性同位元素、発蛍光団、検出可能なリガンド（例えば、標識化されたリガンドの結合パートナーによる二次的結合により検出可能）などであってもよい。好ましくは、抗体は酵素で標識し、酵素と基質の反応生成物が蛍光錯体を形成するように選択された基質を添加することによって検出される。捕獲抗体は、試験混合物の残部から分離される手段を提供するように選択される。従って、捕獲抗体は、既に固定された形態または不溶形態でアッセイに導入でき、あるいは固定可能形態、つまりアッセイに捕獲抗体を導入した後で固定化を達成させられる形態であり得る。固定化捕獲抗体は、磁気粒子、ラテックス粒子、マイクロタイタープレートのウェル、ビーズ、キュベットまたは他の反応容器などの固相に、共有結合または非共有結合的に結合した抗体を含み得る。固定可能捕獲抗体の例は、例えばハプテン、ビオチンなどのリガンド部分で化学的に修飾され、固定化形態のリガンドの結合パートナー、例えば抗体、アビジンなど、との接触により後で固定化できる抗体である。ある実施態様では、固相に結合した捕獲抗体の種特異的抗体を使用して、捕獲抗体を固定化し得る。
【００６２】
本発明の特定のサンドイッチ免疫アッセイ方法は、ｈＫ１０に対して反応性である２種の抗体、ｈＫ１０に対して反応性である抗体に対する特異性を有する、酵素標識で標識化された二次抗体、および酵素の蛍光基質を採用する。ある実施態様では、酵素はアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）であり、基質はリン酸５−フルオロサリチルである。ＡＬＰは蛍光基質のリン酸５−フルオロサリチルからリン酸を切取り、５−フルオロサリチル酸（ＦＳＡ）を産生する。次いで、５−フルオロサリチル酸は、強い蛍光を発する三重複合体ＦＳＡ−Ｔｂ（３＋）−ＥＤＴＡを形成でき、これはＴｂ３＋蛍光を時間分解様式で測定することにより定量できる。蛍光強度は、典型的には、本明細書に記載のように時間分解蛍光光度計を使用して測定する。
【００６３】
上記の免疫アッセイ方法と構成は、例示を意図しており、限定的意味ではなく、一般的に、本発明ではいかなる免疫アッセイ方法または構成も使用できることが理解される。
【００６４】
本発明の方法は、サンプル中のｈＫ１０を定量するための診断キットを使用して実行できる。一例として、キットは、ｈＫ１０特異的抗体、酵素で標識されたその抗体に対する抗体；および酵素の基質を含み得る。キットはまた、マイクロタイタープレートのウェル、基準、アッセイ希釈剤、洗浄緩衝液、粘着性プレートカバー、および／またはキットを使用して本発明の方法を実行するための指示書も含み得る。
【００６５】
ｈＫ１０特異的抗体はまた、卵巣癌の管理におけるイメージング方法論で使用し得る。本発明は、ｈＫ１０に関連する腫瘍をイメージングするための方法を提供する。
【００６６】
本発明はまた、複数の卵巣癌マーカーを使用する、本明細書に記載のイメージング方法も企図している。例えば、卵巣癌をイメージングする方法は、ヒト角質層キモトリプシン酵素（ＨＳＣＣＥ）、カリクレイン４、カリクレイン５、カリクレイン６、カリクレイン８およびカリクレイン９、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＯＶＸ１、リソホスファチジン酸（ＬＰＡ）または癌胚抗原（ＣＥＡ）、好ましくはＣＡ１２５に結合する、１種またはそれ以上の試薬を使用することをさらに含み得る。好ましくは、イメージング中に区別できるように、各試薬を標識化する。
【００６７】
ある実施態様では、本方法はインビボの方法であり、対象または患者は、イメージング標識を帯び、かつカリクレインを標的化または結合する能力のある１種またはそれ以上の試薬を投与される。試薬をインビボでインキュベートし、腫瘍、好ましくは卵巣腫瘍に関連するカリクレイン（類）に結合させる。標識の存在は卵巣癌に局在化し、そして当業者に既知のイメージング装置を使用して局在化した標識を検出する。
【００６８】
試薬は、カリクレイン（類）を認識する抗体または化学物質であり得る。発明のある態様では、試薬は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、またはそれらの断片、または一本鎖抗体、二価抗体、分子認識ユニット、およびペプチドまたはペプチドを模倣する成分を含むがこれらに限定されるわけではない、それらの構成要素である。本発明の方法で使用するカリクレイン特異的抗体は、科学的または商業的供給源から入手し得、あるいは単離した天然カリクレインまたは組換えカリクレインを、本明細書に記載のように抗体などを調製するのに利用してもよい。
【００６９】
試薬は、カリクレイン特異的抗体のエピトープを模倣し、かつカリクレインに結合するペプチドであってもよい。ペプチドは、従来の固相化学を使用して、合成業者で産生され得る。一例として、Ｎ２Ｓ２キレートが錯体形成するチロシン、リジンまたはフェニルアラニンのいずれかを含むペプチドを調製し得る（米国特許第４，８９７，２５５参照）。抗カリクレインペプチド結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を、次いで放射性標識（例えば、９９ｍＴｃ過テクネチウム酸ナトリウムまたは１８８Ｒｅ過レニウム酸ナトリウム）と組合せ、それをカリクレイン産生腫瘍の位置を知るのに使用し得る。
【００７０】
試薬は、カリクレインをイメージングするための標識を帯びる。試薬は、放射性核種イメージングで使用するために標識化し得る。特に、試薬は直接または間接的に放射性同位元素で標識化し得る。本発明で使用し得る放射性同位元素の例は、以下のものである：２７７Ａｃ、２１１Ａｔ、１２８Ｂａ、１３１Ｂａ、７Ｂｅ、２０４Ｂｉ、２０５Ｂｉ、２０６Ｂｉ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、８２Ｂｒ、１０９Ｃｄ、４７Ｃａ、１１Ｃ、１４Ｃ、３６Ｃｌ、４８Ｃｒ、５１Ｃｒ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、１６５Ｄｙ、１５５Ｅｕ、１８Ｆ、１５３Ｇｄ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ｇａ、１９８Ａｕ、３Ｈ、１６６Ｈｏ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１１５ｍＩｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８９Ｉｒ、１９１ｍＩｒ、１９２Ｉｒ、１９４Ｉｒ、５２Ｆｅ、５５Ｆｅ、５９Ｆｅ、１７７Ｌｕ、１５Ｏ、１９１ｍ−１９１Ｏｓ、１０９Ｐｄ、３２Ｐ、３３Ｐ、４２Ｋ、２２６Ｒａ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、８２ｍＲｂ、１５３Ｓｍ、４６Ｓｃ、４７Ｓｃ、７２Ｓｅ、７５Ｓｅ、１０５Ａｇ、２２Ｎａ、２４Ｎａ、８９Ｓｒ、３５Ｓ、３８Ｓ、１７７Ｔａ、９６Ｔｃ、９９ｍＴｃ、２０１Ｔｌ、２０２Ｔｌ、１１３Ｓｎ、１１７ｍＳｎ、１２１Ｓｎ、１６６Ｙｂ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、８８Ｙ、９０Ｙ、６２Ｚｎおよび６５Ｚｎ。好ましくは、放射性同位元素は１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉ、９９ｍＴｃ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、３２Ｐ、１５３Ｓｍ、６７Ｇａ、２０１Ｔｌ、７７Ｂｒ、または１８Ｆであり、光学スキャン装置でイメージングされる。
【００７１】
生体試薬を放射性同位元素で標識化する手法は、当分野で一般的に知られている。米国特許第４，３０２，４３８号は、トリチウム標識化の手法を記載している。特にマウスのモノクローナル抗体に適合させた、ヨウ化物化、トリチウム標識化、および３５Ｓ標識化の手法は、Ｇｏｄｉｎｇ， Ｊ． Ｗ． （前出、ｐｐ １２４−１２６）およびそこで引用されている文献に記載されている。抗体、その結合部分、プローブ、またはリガンドなどの生体試薬をヨウ化物化する他の手法は、科学文献に記載されている（Ｈｕｎｔｅｒ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ， Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５ （１９６２）， Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：１０１４−１０２１ （１９７４） および 米国特許第３，８６７，５１７号および第４，３７６，１１０号参照）。試薬のヨウ化物化手法は、Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ８９：１１４−１２３ （１９６３）； Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ， Ｊ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １１３：２９９−３０５ （１９６９）； および Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２８９−２９７ （１９７１） に記載されている。９９ｍＴｃ−標識化手法は、Ｒｈｏｄｅｓ， Ｂ． ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｂｕｒｃｈｉｅｌ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ： Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｍａｓｓｏｎ １１１−１２３ （１９８２） およびこれらで引用されている文献に記載されている。抗体または断片のテクネチウム−９９ｍによる標識化はまた、例えば米国特許第５，３１７，０９１号、米国特許第４，４７８，８１５号、米国特許第４，４７８，８１８号、米国特許第４，４７２，３７１号、米国特許第Ｒｅ３２，４１７号および米国特許第４，３１１，６８８号に記載されている。１１１Ｉｎ−標識化生体試薬に適する手法は、Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ， Ｄ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ６５：１４７−１５７ （１９８３）， Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ， ３５：５５４−５５７ （１９８４）， および Ｂｕｃｋｌｅｙ， Ｒ． Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｆ．Ｅ．Ｂ．Ｓ． １６６：２０２−２０４ （１９８４）に記載されている。
【００７２】
本発明のインビボ方法のために、試薬はまた、常磁性同位元素で標識化してもよい。磁気共鳴イメージングで有用な要素の例には、ガドリニウム、テルビウム、スズ、鉄、またはこれらの同位元素が含まれる（インビボ核磁気共鳴イメージングについての考察には、例えば Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） ＪＡＣＣ １４， ４７２−４８０； Ｓｈｒｅｖｅ ｅｔ ａｌ．， （１９８６） Ｍａｇｎ． Ｒｅｓｏｎ． Ｍｅｄ． ３， ３３６−３４０； Ｗｏｌｆ， Ｇ Ｌ．， （１９８４） Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓ． Ｍｅｄ． ＮＭＲ １６， ９３−９５； Ｗｅｓｂｅｙ ｅｔ ａｌ．， （１９８４） Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓ． Ｍｅｄ． ＮＭＲ １６， １４５−１５５； Ｒｕｎｇｅ ｅｔ ａｌ．， （１９８４） Ｉｎｖｅｓｔ． Ｒａｄｉｏｌ． １９， ４０８−４１５ を参照）。
【００７３】
放射性標識化試薬の場合、試薬を患者に投与してもよく、それはその試薬が結合するカリクレインを有する腫瘍に局在化し、例えばガンマカメラやエミッション・トモグラフィを使用する放射性核種スキャニングなどのインビボの既知技法を使用して、検出または「イメージング」される（例えば　Ａ． Ｒ． Ｂｒａｄウェル ｅｔ ａｌ．， ”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｍａｇｉｎｇ”， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｒ． Ｗ． Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．， （ｅｄｓ．）， ｐｐ． ６５−８５ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）参照）。Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ にある Ｐｅｔ ＶＩ と呼ばれるような、陽電子放出軸横断トモグラフィスキャナー（ｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｒａｎｓａｘｉａｌ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ｓｃａｎｎｅｒ）も、放射性標識が陽電子を放出する場合（例えば、１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏ、および１３Ｎ）に使用できる。
【００７４】
放射性同位元素標識化試薬を使用する全身イメージング技法を、一次腫瘍と転移した腫瘍の両方の位置を知るために使用できる。カリクレイン特異的抗体、または同じエピトープ特異性を有するその断片を、適する放射性核種またはその組合せに結合させ、非経口的に投与する。卵巣癌には、投与は、好ましくは静脈注射である。標識の生体分布をシンチグラフィーでモニタリングし、標識の蓄積を卵巣癌細胞の存在と関連付ける。全身イメージング技法は、米国特許第４，０３６，９４５号および第４，３１１，６８８号に記載されている。診断および治療的使用に有用な、抗体および抗体断片と対になれる試薬の他の例には、金属結合性タンパク質および断片（例えば、米国特許第４，７３２，８６４号）が含まれる。これらの試薬は、癌、特に卵巣癌の病期診断（ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｓｔａｇｉｎｇ）および可視化に有用であり、手術および／または放射線処置計画をより効果的に使用できるようにする。
【００７５】
本発明は、本発明の方法を実行するためのキットも企図している。キットは、抗体またはカリクレインのエピトープに特異的に結合する抗体断片、および腫瘍細胞に伴うエピトープへの抗体の結合を検出する手段を、使用前にさらに希釈され得る濃縮物（凍結乾燥組成物を含む）として、あるいは使用時の濃度で含み、バイアルは１またはそれ以上の用量を含み得る。キットがインビボでの使用を企図されている場合、所望の量と濃度の試薬を有する単用量を滅菌容器内に提供してもよい。直接的使用のための製剤を提供する容器は、通常他の試薬を必要としない。例えば、キットがインビボイメージング用の放射性標識抗体の調製物を含有する場合である。
以下の非限定的実施例は、本発明の例示説明である。
【００７６】
実施例１
ヒトカリクレイン１０の免疫蛍光測定アッセイ
材料と方法
組換えｈＫ１０の産生と生成
酵母発現ベクターへのＫＬＫ１０ｃＤＮＡのクローニング
組換えｈＫ１０を産生するために、Ｅａｓｙｓｅｌｅｃｔ（登録商標）Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｓ 酵母発現系 （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ） を使用した。アミノ酸４３ないし２７６（ｈＫ１０のアミノ酸の番号付けは、参照文献８で報告されている）をコードするＫＬＫ１０ｃＤＮＡ配列を増幅するために、２種のプライマーを設計した。それらは、次の通りである：順行プライマー：５’ＡＡＣＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＴＧＧＡＣＣＣＣＧＡＡＧＣＣＴ３’（配列番号１）、逆行プライマー：５’ＣＧＴＡＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＡＧＴＴＧＧＡ３’（配列番号２）。ヒト卵巣ｃＤＮＡを鋳型として使用した。１μＬ ｃＤＮＡ、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣ１、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰｓ（デオキシヌクレオシド三リン酸）、１００ｎｇプライマーおよび２．５ユニットのｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ） を含有する２０μＬの反応混合物中で、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ９６００ サーマルサイクラーによりＰＣＲを実行した。ＰＣＲ条件は、９４℃で５分間、続いて９４℃で３０秒、６２℃で３０秒、７２℃で３０秒の３０サイクル、そして７２℃で５分間の最終伸長であった。次いで、標準的な分子生物学的技法を使用してＰＣＲ産物を酵母発現ベクターｐＰＩＺαＡにクローニングした（１３）。
【００７７】
酵母におけるｈＫ１０の産生
ＫＬＫ１０ｃＤＮＡを含むｐＰＩＺαＡベクターを、酵母株Ｘ−３３に導入し、安定なクローンを製造業者の指示に従って選択した。１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．０）、１３．４ｇ／Ｌ酵母窒素ベース、４０ｍｇ／Ｌビオチンおよび５ｍｌ／Ｌメタノールを含む培地中で、３０℃の震盪インキュベーター中（２５０ｒｐｍ）で５日間、安定酵母クローンを増殖させることにより、ｈＫ１０を産生した。次いで、細胞を回転させて沈ませ、上清を収集した。
【００７８】
陽イオン交換クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーによるｈＫ１０の精製
ＣＭセファロース・ファスト・フロー（ＣＭ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を用いる陽イオン交換クロマトグラフィーおよびＣ４カラム（０．４５ｘ５ｃｍ） （Ｖｙｄａｃ， Ｈｅｓｐｅｒｉａ， ＣＡ）を用いる逆相液体クロマトグラフィーで、酵母培養上清から組換えｈＫ１０タンパク質を精製した。簡単に述べると、１Ｍ ＫＣｌで予め活性化したＣＭセファロースビーズを、１０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化した。４℃で一晩激しく撹拌しながらインキュベートすることにより、酵母培養上清を最初にＣＭセファロースビーズに吸収させた。次いで、ビーズを１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）で洗浄し、ｈＫ１０を１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中の３００ｍＭ ＫＣ１で抽出した。この抽出物に、イオン対合剤（ｉｏｎ−ｐａｉｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）としてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加し（終濃度１０ｍｌ／Ｌ）、次いでＣ４カラムに載せ、水中の１ｍｌ／Ｌトリフルオロ酢酸で平衡化した。１ｍｌ／Ｌ ＴＦＡ中で、１５から５０％へのアセトニトリル線状勾配（１％／分）を実施した。ｈＫ１０は４２％アセトニトリルで溶出した。次いで、ｈＫ１０含有画分を、ＳｐｅｅｄＶａｃ （Ｓａｖａｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．， Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ， ＮＹ）で速やかに蒸発させた。次いで、精製した物質をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離し、クマシーブルーで染色してその精製度と分子量を評価した。精製したｈＫ１０のタンパク質濃度は、ビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ）法（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）で測定した。
【００７９】
質量分析によるｈＫ１０の同定
タンパク質分解による切断：
ポリアクリルアミドゲルを可視化のためにクマシーＧ−２５０で染色し、続いて選択したバンドを切出し、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム中の３０％アセトニトリルで脱染色した。一晩のトリプシン切断（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）に先立ち、各バンドを還元し（５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中の１０ｍＭジチオスレイトール、ｐＨ８．３）、そしてアルキル化した（５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中の５５ｍＭヨードアセトアミド、ｐＨ８．３）。次いでペプチド断片を５％酢酸で抽出し、Ｓａｖａｎｔ 濃縮器で乾燥するまで蒸発させ、１０μＬの５０％水性メタノール（０．５％酢酸）中で再構成した。
【００８０】
質量分析：
全ナノエレクトロスプレー質量分析（ｎＥＳＭＳ）実験は、高分解能かつオンライン・タンデムの質量分析実験のために、Ｑ−Ｓｔａｒ （ＰＥ／Ｓｃｉｅｘ， Ｃｏｎｃｏｒｄ， Ｏｎｔ． Ｃａｎａｄａ．）ハイブリッド四重極／飛行時間型機器で実行した（１４）。従来のマススペクトルは、四重極をＲＦ限定モードで操作し、一方加速（ｐｕｓｈｅｒ）電極をパルス（周波数〜７ｋＨｚ）して全イオンを飛行時間分析機へ移動させることで得た。測量走査（ｓｕｒｖｅｙ ｓｃａｎ）で同定されたトリプシン処理によるペプチドのタンデム質量分析実験を、ナノエレクトロスプレー源を使用して実行した。前駆イオンを最初の四重極により選択し、一方加速電極をパルス（周波数〜７ｋＨｚ）して、ＲＦ限定四重極セルで形成された断片イオンを飛行時間分析機へ移動させた。質量分析の分解能は、典型的に９，０００−１０，０００であった。従来型およびＭＳ−ＭＳ質量分析捕捉機に、各々１秒および２秒の走査期間を設定した。窒素衝突ガスを使用して、典型的には入射（ｅｎｔｒａｎｃｅ）四重極のＤＣ電圧とＲＦ限定四重極セルとの間に３０Ｖのオフセットで、衝突活性化を実施した。データを取得し、ＰＥ／Ｓｃｉｅｘ の ＬＣ Ｔｕｎｅ および Ｂｉｏｍｕｌｔｉｖｉｅｗ のプログラムで解析した。
【００８１】
ｈＫ１０に対するポリクローナル抗体の産生
ウサギとマウスを免疫するのに、精製した組換えｈＫ１０を抗原として使用した。１００μｇのｈＫ１０を雌のＢａｌｂ／ｃマウスとニュージーランド白色ウサギに皮下注射した。タンパク質は、初回の注射には完全フロインドアジュバント中で、その後の注射には不完全フロインドアジュバント中で、１：１に希釈した。注射は３週間ごとに６回繰返した。動物から血液を抜き取り、抗体生成について試験した。抗ｈＫ１０ポリクローナル抗体の産生を試験するために、次の免疫アッセイを使用した。ヒツジ抗マウスまたはヤギ抗ウサギＩｇＧ （Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ） を９６ウェル白色ＥＬＩＳＡプレートに固定した。次いで、１：５００ないし１：５０，０００の範囲の様々な希釈率で、マウス／ウサギ血清をプレートに加えた。次いで、ビオチン化組換えｈＫ１０を添加した（５−１０ｎｇ／ウェル）。最後に、アルカリフォスファターゼ結合ストレプトアビジンを添加し、アルカリフォスファターゼ活性を時間分解蛍光（詳細は下記参照）で検出した。
【００８２】
ｈＫ１０の免疫蛍光測定アッセイ
標準的なアッセイ手法
５０ｍモル／Ｌのトリス緩衝液、ｐＨ７．８０で希釈した被覆抗体１００μＬ／５００ｎｇ／ウェルで一晩インキュベートすることにより、白色ポリスチレンマイクロタイタープレートを、ヒツジ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的抗体 （Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で被覆した。次いで、洗浄緩衝液（９ｇ／Ｌ ＮａＣｌおよび０．５ｇ／Ｌ Ｔｗｅｅｎ ２０ を、１０ｍモル／Ｌトリス緩衝液、ｐＨ７．４０中に含む）でプレートを６回洗浄した。マウス抗ｈＫ１０抗血清を一般希釈剤（６０ｇ／Ｌ ＢＳＡ、５０ｍモル／Ｌトリス、ｐＨ７．８０、および０．５ｇ／Ｌアジ化ナトリウムを含む）で５，０００倍に希釈し、１００μＬを各ウェルに加えた。１時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄緩衝液で６回洗浄した。１００μＬのｈＫ１０基準またはサンプルを各ウェルにピペットで移し、震盪しながら１時間インキュベートし、次いで洗浄緩衝液で６回洗浄した。続いて、緩衝液Ａ（一般希釈剤の成分プラス、１リットルにつき２５ｍＬの正常マウス血清、１００ｍＬの正常ヤギ血清および１０ｇのウシＩｇＧを含有する）中で５，０００倍に希釈したウサギ抗ｈＫ１０抗血清１００μＬを各ウェルに加え、３０分間インキュベートし、上記のように洗浄した。最後に、緩衝液Ａで３，０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的 （Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）でプレートをインキュベートし、上記のように洗浄した。基質緩衝液（０．１Ｍトリス、ｐＨ９．１、０．１Ｍ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＭｇＣｌ２）で希釈した１ｍＭジフルーニサルリン酸塩（ＤＦＰ）１００μＬを各ウェルに添加し、１０分間インキュベートした。１００μＬの現像溶液（１Ｍトリスベース、０．４Ｍ ＮａＯＨ、２ｍＭ ＴｂＣｌ３および３Ｍ ＥＤＴＡ）を各ウェルにピペットで移し、１分間混合した。時間分解蛍光測定器の Ｃｙｂｅｒｆｌｕｏｒ ６１５ Ｉｍｍｕｎｏａｎａｌｙｚｅｒ （ＭＤＳ Ｎｏｒｄｉｏｎ， Ｋａｎａｔａ， ＯＮ， Ｃａｎａｄａ） で蛍光を測定した。較正とデータ換算は、自動的に実施した。これらの手法の詳細は、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ ＴＫ ａｎｄ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ．， Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ １９９２； ６４： ３４２−６ を参照されたい。
【００８３】
ｈＫ１０免疫アッセイの感度の判定
標準曲線の生成に組換えｈＫ１０を使用した。一般希釈液中で精製組換えｈＫ１０を希釈することにより、様々なｈＫ１０基準を調製した。これらの基準をアッセイの検出限界を定義するのに使用した。
【００８４】
ｈＫ１０免疫アッセイの特異性の判定
乳汁と精漿のサンプルおよび組換えｈＫ１０を、開発した免疫アッセイの特異性を判定するのに使用した。これらのサンプルを、上記の標準的アッセイ手法で最初に測定した。次いで、マウスおよびウサギ抗ｈＫ１０抗血清を、免疫前に得られた同じ動物由来の血清（免疫前血清）と連続的に置き換えた。次いで、サンプルを再度測定し、蛍光カウントを標準的アッセイで得られたカウントと比較した。精製組換えＰＳＡ、ｈＫ２およびｈＫ６（所内で入手可能）を使用して、他の相同タンパク質の交差反応性を調べた。組換えｈＫ１０（０．０２５ないし２ｎｇの範囲）、ＰＳＡ（２０ｎｇないし１μｇの範囲）、ｈＫ２（２ないし１０ｎｇの範囲）およびｈＫ６（１１ないし５５ｎｇの範囲）をサンプルとして使用し、上記の標準的手法で測定し、そしてそれらの蛍光カウントを比較した（全特定量は、アッセイ毎の分析物の量を表す）。
【００８５】
ｈＫ１０免疫アッセイの線形性
ｈＫ１０免疫アッセイの線形性を判定するために、様々な臨床サンプルを一般希釈剤中で２、４、８、１６および３２倍に連続的に希釈し、それらのｈＫ１０濃度を標準的アッセイで測定した。
【００８６】
ヒト組織細胞質抽出物および体液
ヒト組織細胞質抽出物は、以下のように調製した：様々な凍結ヒト組織（０．２ｇ）をドライアイス上で微細粉末に粉砕した。１ｍｌの抽出緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｇ／ＬのＮＰ−４０界面活性剤、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｇ／Ｌのアプロチニン、１ｇ／Ｌのロイペプチン）を組織粉末に添加し、氷上で３０分間インキュベートし、その間１０分ごとに震盪とボルテックスを繰返した。次いで、混合物を１４，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。次いで、上清（細胞質抽出物）を収集した。体液は、日常の生化学試験に供されたサンプルの残りであった。全ての組織細胞質抽出物および体液は、使用まで−８０℃で保存した。
【００８７】
回収
組換えｈＫ１０を一般希釈液、血清、脳脊髄液、乳汁、精漿および羊水に様々な濃度で添加し、開発されたｈＫ１０免疫アッセイで測定した。次いで、本来存在する濃度を差引いた後、回収率を計算した。
【００８８】
サイズ除去高速液体クロマトグラフィーによる体液の分別
血清、乳汁および精漿を、本質的に別に記載された通りに（Ｙｕ Ｈ ａｎｄ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ．， Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９３； ３９： ２１０８−１４．）シリカベースのゲル濾過カラムで分別した。画分を収集し、開発した免疫アッセイでｈＫ１０について分析した。
【００８９】
結果
ｈＫ１０組換えタンパク質の産生と精製
ｈＫ１０は、分泌されるセリンプロテアーゼである。疎水性および構造相同性分析により、ｈＫ１０の活性形態はアミノ酸４３から始まると予想される（１−４２の部分は、シグナルペプチド（３３アミノ酸）と活性化ペプチド（９アミノ酸）に当る）ことが示唆された（Ｌｉｕ ＸＬ， Ｗａｚｅｒ ＤＥ， Ｗａｔａｎａｂｅ Ｋ ａｎｄ Ｂａｎｄ Ｖ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９６； ５６： ３３７１−９）。この活性形態のｈＫ１０をコードするｃＤＮＡを、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ 酵母発現系にクローニングした。２６ｋＤａの組換えｈＫ１０タンパク質が産生され、酵母培養上清に分泌され（図１Ａ）、次いで、イオン交換および逆相クロマトグラフィーで精製された（図１Ｂおよび２）。この組換えタンパク質の配列を、質量分析で確認した（図３）。
【００９０】
ｈＫ１０免疫蛍光測定アッセイの感度、特異性、線形性および精度
感度
ｈＫ１０免疫蛍光測定手法の典型的な較正曲線を図４に示す。ゼロ較正プラス２つの標準偏差の蛍光に相応する濃度として定義される検出限界は、０．０５μｇ／Ｌであった。
【００９１】
特異性
免疫アッセイがｈＫ１０を特異的に測定することを保証するために、マウスおよびウサギ抗ｈＫ１０抗血清を免疫前マウスおよびウサギ血清で各々置き換えた。乳汁と精漿のサンプルおよび組換えｈＫ１０を測定した。標準的な手法で、これらのサンプルは全て比較的高いカウントを奏した（＞１００，０００任意蛍光単位）。しかしながら、マウスまたはウサギ抗ｈＫ１０ポリクローナル抗体のいずれかを免疫前血清で置き換えると、これらのサンプルの蛍光カウントはほぼゼロに低減した（図５）。ｈＫ１０はヒトカリクレイン遺伝子ファミリーの構成員であるので、それは他の構成員とかなりのアミノ酸配列相同性を共有する。これらの相同タンパク質からの妨害がないことをさらに論証するために、ｈＫ１０、ＰＳＡ、ｈＫ２およびｈＫ６の交差反応性を調べた。図５に示すように、組換えＰＳＡ、ｈＫ２およびｈＫ６を開発した標準的ｈＫ１０アッセイで測定すると、ｈＫ１０より５−５００倍多い量で存在するときでさえ、それらはカウントを生じなかった。これらの結果は、免疫アッセイがｈＫ１０を他の高度に相同なタンパク質から効果的に区別でき、ｈＫ１０を高い特異性で測定することを示唆する。
【００９２】
線形性
このアッセイの線形性を評価するために、様々なサンプルを連続的に希釈し、ｈＫ１０を測定した。一例を図６に示す。このアッセイには、非常に良好な希釈線形性があった。
【００９３】
精度
作動（ｒｕｎ）中および作動間の精度を、様々なｈＫ１０基準および臨床サンプルで評価した。全件で、変動係数（ＣＶ）は２ないし９％であり、典型的なマイクロタイタープレートベースの免疫アッセイの精度と一致した（データ非掲載）。
【００９４】
様々なヒト組織抽出物および体液におけるｈＫ１０の分布
開発したｈＫ１０免疫アッセイで、様々なヒト組織抽出物および体液におけるｈＫ１０の分布を調べた。図７に示すように、ｈＫ１０は、唾液腺、皮膚、結腸、輸卵管、前立腺、精巣、下垂体、子宮内膜および肺などの多くの組織に存在した。ｈＫ１０はまた、乳汁、精漿、血清、脳脊髄液および羊水を含む様々な体液でも検出可能であった（表１）。ｈＫ１０は、免疫組織化学的には、図８に示すように輸卵管の上皮細胞に局在した。ｈＫ１０は、内腔を内張りする上皮細胞の細胞質に存在した。
【００９５】
様々な体液におけるｈＫ１０の回収
これらのデータ（表２）は、ＣＳＦ（回収率８８−１００％）を除き、回収は不完全であり、血清で５０−８０％、乳汁で０−７７％、精漿で６４−１００％、そして羊水で１８−５３％の範囲であることを示した。
【００９６】
サイズ除去高速液体クロマトグラフィーによる体液の分別
体液中で検出されるタンパク質の分子量を調べるために、乳汁、精漿および血清を含む３種のサンプルをゲル濾過で分別した。様々な画分におけるｈＫ１０の存在を、開発した免疫アッセイで測定した。蛍光カウントを様々な画分に対してプロットすると、約３０ｋＤａに相当する単一のピーク（画分４０）が検出された（図９）。それ以上の分子量の複合体は見られなかった。これらの結果は、ｈＫ１０免疫アッセイで検出されるタンパク質が分子量３０ｋＤａの単一の種であることを示し、これは遊離ｈＫ１０の分子量と一致した。
【００９７】
考察
ヒトカリクレイン１０（ＫＬＫ１０）遺伝子は、最初は正常上皮細胞特異的１遺伝子（ＮＥＳ１）と命名され、腫瘍形成性と非腫瘍形成性の乳房細胞系の間の差引きハイブリダイゼーションでクローニングされた （Ｌｉｕ ＸＬ， Ｗａｚｅｒ ＤＥ， Ｗａｔａｎａｂｅ Ｋ ａｎｄ Ｂａｎｄ Ｖ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９６； ５６： ３３７１−９．）。この遺伝子の遺伝子構成は最近決定され、他のヒトヒトカリクレインと同じ染色体の遺伝子座にマッピングされた （Ｌｕｏ Ｌ， Ｈｅｒｂｒｉｃｋ ＪＡ， Ｓｃｈｅｒｅｒ ＳＷ， Ｂｅａｔｔｙ Ｂ， Ｓｑｕｉｒｅ Ｊ ａｎｄ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９８； ２４７： ５８０−６）。これらのデータと、ＮＥＳ１と他のヒトカリクレインとの間の数々の他の類似性に基づき（Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ， Ｙｏｕｓｅｆ ＧＭ， Ｌｕｏ Ｌ， Ｍａｇｋｌａｒａ Ｉ ａｎｄ Ｏｂｉｅｚｕ ＣＶ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２０００； １１： ５４−６０ に概説）、この遺伝子はヒトカリクレイン遺伝子ファミリーの新構成員として分類された。最近、拡張されたヒトカリクレイン遺伝子ファミリーに均一の命名法が開発され、ＮＥＳ１はＫＬＫ１０と改名された （Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ， ｅｔ ａｌ， Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ， ２０００）。
【００９８】
ｈＫ１０は分泌タンパク質であると予想されたが （Ｌｉｕ ＸＬ， Ｗａｚｅｒ ＤＥ， Ｗａｔａｎａｂｅ Ｋ ａｎｄ Ｂａｎｄ Ｖ．， １９９６； ５６： ３３７１−９）、高い感度と特異性でそのタンパク質を検出する方法は現在のところ存在しない。従って、非競合的免疫アッセイの原理に基づいて、かかる方法を開発する仕事がなされた。検出には、時間分解蛍光測定法を使用して高感度を達成した （Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ ＴＫ ａｎｄ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ．， Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ １９９２ ； ６４： ３４２−６）。既知の大量のｈＫ１０の天然供給源は無かったので、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ 中で発現させた。次いで、イオン交換および逆相クロマトグラフィーを組合せて、タンパク質を均質になるまで精製した。この技法により、相同タンパク質や他の混入物が最終調製物中に完全に存在しないことが保証された。組換えｈＫ１０タンパク質は質量分析法で明確に同定された。そのタンパク質は、おそらく糖鎖形成の差異のために、天然ｈＫ１０よりもわずかに短く見えた。
【００９９】
開発されたアッセイは高感度であり、０．０５μｇ／Ｌまたはそれ以上のレベルでｈＫ１０を検出した。さらに、このアッセイは非常に特異的であると考えられる。なぜなら、相同性の高いカリクレインタンパク質であるＰＳＡ（ｈＫ３）、ｈＫ２およびｈＫ６で、検出可能な交差反応性が論証されなかったからである。また、抗体を同じ動物の免疫前血清で置換すると、シグナルは完全に無くなった。サイズ除去高速液体クロマトグラフィーは、試験した３種の体液（血清、乳汁、精漿）が、期待される分子量（〜３０ｋＤａ）の免疫反応性ピークをただ１つだけ有することをさらに示した。これらのデータは、免疫アッセイがこれらの体液中のｈＫ１０の遊離画分を検出することをさらに示唆する。ＰＳＡのように、ｈＫ１０が部分的にプロテアーゼ阻害因子と複合体を形成する可能性は、排除できなかった （Ｓｔｅｎｍａｎ ＵＨ， ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９１； ５１： ２２２−６； Ｌｉｊｉａ Ｈ， ｅｔ ａｌ， Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９１； ３７： １６１８−２７； Ｚｈａｎｇ ＷＭ， ｅｔ ａｌ．； Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９８； ４４ ： ２４７１−９ ； および Ｚｈｏｕ Ａ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９３； ３９： ２４８３−９１）。
【０１００】
ｈＫ１０は様々な組織抽出物で検出されたが、主に唾液腺、皮膚および結腸で検出された。授乳女性の乳汁、精漿、羊水、男女の血清、および脳脊髄液を含む多くの体液で、比較的高レベルのｈＫ１０が同定された（表１）。ｈＫ１０は分泌タンパク質であるので、血清におけるこのバイオマーカーの濃度は、癌を含む様々な疾病の発症および進行の間に変化し得る。現在、乳癌細胞系におけるＫＬＫ１０の下方調節（Ｌｉｕ ＸＬ， ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９６； ５６： ３３７１−９）と、悪性形態の前立腺癌におけるＫＬＫ１０ｍＲＮＡの下方調節を記載した要旨（Ｌｕｏ ＬＹ ａｎｄ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ．， Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０００； ３３： ２３７． ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］）を除き、ヒトの疾病に伴うｈＫ１０の発現に関する文献報告はない。
【０１０１】
輸卵管におけるｈＫ１０の免疫組織化学的局在は、この抗原が輸卵管を内張りする内腔の上皮細胞により産生されることを示す。免疫反応性は、細胞質および内腔で検出され、このプロテアーゼが分泌されることをさらに示唆する。さらに、乳汁、精漿、羊水および脳脊髄液における高レベルのｈＫ１０の存在は、乳房、男性の生殖器官、胎児胎盤部および脳細胞でこのタンパク質が活発に分泌されることを示唆する。
【０１０２】
ＣＦＳを除いて、試験した体液からのｈＫ１０の回収（表２）は不完全であった。血清では、ＰＳＡの回収（Ｙｕ Ｈ ａｎｄ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ， Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９３； ３９： ２１０８−１４）と似た状況で、回収は５０−８２％の範囲であった。精漿では、回収は６４−１００％の範囲であった。最低の回収率は乳汁と羊水で見られた。回収率の低さは、ＰＳＡで起こるようなプロテアーゼ阻害因子（例えば、α２−マクログロブリン）によるｈＫ１０の封鎖、または乳汁および羊水に存在する脂質へのｈＫ１０の取込みのいずれかに起因する。
【０１０３】
結論として、体液および組織抽出物中のｈＫ１０を測定するための、高い感度と特異性の免疫蛍光測定アッセイが記載された。
【０１０４】
実施例２
材料と方法
血清サンプル
この研究で使用した血清サンプルは、様々な悪性腫瘍の患者に由来する、日常的な試験の残りであった。血清におけるｈＫ１０の変化を検出する可能性を増大させるために、この研究に含まれる患者は、（正常の上限より少なくとも１０倍高い腫瘍マーカーレベルで示されるように）比較的高い腫瘍負荷を有した。全血清サンプルは、分析まで最長１年間−２０℃で保存した。手法は、１９８３年に改訂された、１９７５年のヘルシンキ宣言の倫理基準に従い、施設内倫理委員会で承認された。
【０１０５】
腫瘍マーカーの分析
腫瘍マーカーＣＡ１２５、ＰＳＡ、ＣＥＡおよびＡＦＰを、Ｅｌｅｃｓｙｓ 免疫アッセイ分析機 （Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）で分析した。ＣＡ１５．３、ＣＡ１９．９およびｈＣＧは、Ｉｍｍｕｎｏ １ 免疫アッセイ分析機（Ｂａｙｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ， ＮＹ）で分析し、カルシトニンは、Ｄｉａｓｏｒｉｎ， Ｉｔａｌｙ の放射性免疫アッセイキットで測定した。これらの腫瘍マーカーの正常値の上限は、３５ＫＵ／Ｌ（ＣＡ１２５）、４μｇ／Ｌ（ＰＳＡ）、１０μｇ／Ｌ（ＡＦＰ）、５μｇ／Ｌ（ＣＥＡ）、３５ＫＵ／Ｌ（ＣＡ１５．３）、３７ＫＵ／Ｌ（ＣＡ１９．９）、１０ＩＵ／Ｌ（ｈＣＧ）および１００ｎｇ／Ｌ（カルシトニン）であった。
【０１０６】
ｈＫ１０の免疫蛍光測定アッセイ
ｈＫ１０免疫アッセイは、一方はマウスで生成させ、他方はウサギで生成させた２種のｈＫ１０特異的ポリクローナル抗体を利用した。このアッセイの詳細は実施例１に記載されている。簡単に述べると、９６ウェル白色ポリスチレンマイクロタイタープレートに固定したヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体 （Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ）でマウス抗ｈＫ１０抗血清を捕獲した。次いで、５０μＬの血清サンプル（予処理なし）を各ウェルに添加し、続いてインキュベートし、洗浄した。その後ウサギ抗ｈＫ１０抗血清を加え、インキュベートし、洗浄した。最後に、アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ （Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ） を添加し、インキュベートし、洗浄した。シグナルを検出するために、本質的に別に記載された通りに（１８）、時間分解蛍光測定を使用した。このアッセイの測定範囲は、１０％以下の精度で０．０５−２０μｇ／Ｌであった。
【０１０７】
結果
正常個体または様々な悪性腫瘍の患者のいずれかに由来する全部で３７４個の血清サンプルを、最近記載された敏感かつ特異的なｈＫ１０免疫アッセイで分析した。結果を表３に示す。卵巣癌患者の大部分（５６％）が、１．５μｇ／Ｌ（任意に選択されたカットオフ）より高い血清ｈＫ１０レベルであった。しかしながら、正常対照、乳癌、髄様甲状腺癌腫および前立腺癌の患者は、いずれもこの値より高い血清ｈＫ１０を有さなかった。スクリーニングした他の悪性腫瘍では、低い割合の患者のみがこのカットオフよりも高い血清ｈＫ１０レベルであり、これには胃腸の癌（１５％）、肺癌（１３％）、および精巣癌（２％）が含まれる。カットオフ値が０．８μｇ／Ｌ（正常男女の１００番目の百分位）のとき、卵巣癌の陽性率は７８％に上昇するが、表３に示すように、かなりの数の他の悪性腫瘍の患者もまた陽性であった。卵巣癌患者の血清におけるｈＫ１０の分布を、図１０に示す。
【０１０８】
卵巣癌患者の血清におけるｈＫ１０とＣＡ１２５との相関を調べるために、線形回帰を実施した。図１１に示すように、卵巣癌患者における血清ｈＫ１０とＣＡ１２５との間には、弱い相関があった（ｒ＝０．２３、ｐ＝０．０４）。
【０１０９】
患者モニタリングにおいてｈＫ１０血清濃度に価値があるか否かをさらに調べるために、４人の卵巣癌患者由来の連続的な血清サンプルもＣＡ１２５と共に分析した。図１２に示すように、ほとんどの症例で血清ｈＫ１０濃度はＣＡ１２５と平行して変化した。これらのデータは、ｈＫ１０が初期処置後の卵巣癌モニタリングに潜在能力を有することを示唆する。
【０１１０】
考察
この研究では、正常個体または様々な悪性腫瘍の患者に由来する３７４個の血清サンプルを分析した。卵巣癌患者の大部分において、血清ｈＫ１０濃度は有意に上昇（１．５μｇ／Ｌ以上）したが、正常個体または他のタイプの癌の患者では上昇しなかった（表３）。この上昇はＣＡ１２５と弱く相関した（図１１）。また、ＣＡ１２５の分析で評価されたように、ｈＫ１０血清濃度は腫瘍負荷に従って変化した（図１２）。これらの結果は、ｈＫ１０が卵巣癌の新しい血清マーカーを構築し得ることを示す。
【０１１１】
結果は、ｈＫ１０が潜在的な卵巣癌バイオマーカーとしての価値を有し得ることを示唆する。ｈＫ１０は、卵巣癌患者の大部分で上昇した。表３に示すように、適切なカットオフを選択することにより、特異度を操作できる。しかしながら、胃腸の癌、肺癌、前立腺癌、甲状腺癌、精巣癌および乳癌の患者を含む他の悪性腫瘍の患者から陽性サンプルが見付かった。この欠点は多くの他の癌バイオマーカーについて知られている（２３）。ｈＫ１０はＣＡ１２５と良好に相関しなかった。このことは、これをＣＡ１２５と共に使用して、より敏感で特異的な卵巣癌検出を達成し得ることを示す。さらに、ｈＫ１０は腫瘍負荷に伴って変化した。このことは、これが疾病のモニタリングにも有用であり得ることを示唆する。この研究で使用したサンプルは、比較的高いＣＡ１２５値を有した（上限参照値より少なくとも１０倍高い）。
【０１１２】
これは、血清ｈＫ１０が卵巣癌患者の大部分と他の癌患者の少数において有意に増大する最初の証拠に当る。ｈＫ１０は、卵巣癌の診断とモニタリングのための新しい血清バイオマーカーを構築し得る。
【０１１３】
実施例３
ＫＬＫ１０ヒト卵巣組織
方法
卵巣癌患者
１４２人の一次卵巣癌患者がこの研究に含まれた。これらの患者は、イタリアのトリノ大学婦人科で卵巣癌の手術を受けた。これらの患者の年齢は２５ないし８２歳の範囲であり、中央値は５９歳であった。病期、悪性度、組織タイプ、残存腫瘍、減容積の成功、閉経状態および化学療法への反応を含む、臨床および病理学的情報を手術時に記録した。腫瘍の病期分類は、国際産科婦人科連合（ＦＩＧＯ）の基準に従った。組織タイプの分類は、世界保健機関およびＦＩＧＯの勧告に基づいた。この研究に含まれたほとんどの腫瘍（８１）は漿液乳頭性組織タイプであり、一方、残りの腫瘍は、子宮内膜性（３０）、未分化性（２７）、ムチン性（１１）、透明細胞（１３）、ミュラー管性（１２）、肉腫（２）、他の非上皮性（４）および未詳（２）であった。残存腫瘍の大きさは０ないし９ｃｍの範囲であり、中央値は１．０ｃｍであった。
【０１１４】
追跡情報（追跡期間の中央値６２ヶ月）には、生存状態（生存または死亡）と疾病状態（無進行または再発）が含まれ、１６３人の患者について入手可能であった。これらの患者のうち、５８人が死亡し、８５人が再発した。
【０１１５】
細胞質抽出物の調製
手術直後に液体窒素中で腫瘍組織を凍結し、抽出するまで−８０℃で保存した。２００ｍｇの凍結組織をまずドライアイス上で微細粉末に粉砕した。次いで、１ｍｌの抽出緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｇ／ＬのＮＰ−４０界面活性剤、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフッ化物、１ｇ／Ｌのアプロチニン、１ｇ／Ｌのロイペプチン）を組織粉末に添加し、１０分ごとに震盪とボルテックスを繰返しながら氷上で３０分間インキュベートした。最後に、混合物を１４，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、上清（細胞質抽出物）を収集した。全ての組織細胞質抽出物は、分析するまで−８０℃で保存した。細胞質抽出物のタンパク質濃度を、アルブミン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）を基準としてビシンコニン酸法で測定した。
【０１１６】
卵巣細胞質抽出物中のｈＫ１０の測定
細胞抽出物中のｈＫ１０濃度を、高い感度と特異性の非競合ｈＫ１０免疫アッセイで定量した。このアッセイは、実施例１と２で詳細に記載および評価した。アッセイは、マウスとウサギの抗ｈＫ１０抗血清を組込んだ。簡単に述べると、９６ウェルポリスチレンマイクロタイタープレート上のヒツジ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的抗体 （Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ）でマウス抗ｈＫ１０ポリクローナル抗血清を捕獲した。次いで、２５μＬの細胞質抽出物と１００μＬのＢＳＡを各ウェルに添加し、穏かに震盪しながら１時間インキュベートし、洗浄した。その後ウサギ抗ｈＫ１０ポリクローナル抗血清を加え、インキュベートし、洗浄した。最後に、アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ （Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ） を添加し、インキュベートし、前記のように洗浄した。シグナルを検出するために、時間分解蛍光測定法を使用した。このアッセイの検出範囲は、０．０５−２０μｇ／Ｌであった。全腫瘍抽出物は２部で測定し、μｇ／Ｌ表記のｈＫ１０濃度をｍｇ総タンパク質当りのｈＫ１０のｎｇに換算して抽出された腫瘍組織の量について補正した。
【０１１７】
免疫組織化学による卵巣腫瘍試料中のｈＫ１０の局在
酵母細胞中で産生されたｈＫ１０全長組換えタンパク質に対して、ウサギポリクローナル抗体を生成させた。標準的な免疫ぺルオキシダーゼ法に従って、ｈＫ１０の免疫組織化学染色を実施した。概略を述べると、パラフィン包埋組織切片（４μｍ）を固定し、パラフィンを取り除いた。内在性ペルオキシダーゼ活性を３％水性過酸化水素で１５分間ブロックした。次いで、切片を０．４％ペプシンで、ｐＨ２．０で５分間、４２℃で処理し、２０％タンパク質ブロッカー（Ｓｉｇｎｅｔ Ｌａｂｓ） で１０分間ブロックした。次いで、一次抗体を１：４００の希釈で、１時間室温で添加した。洗浄後、抗体希釈緩衝液（ＤＡＫＯ）で４倍に希釈したビオチン化二次抗体（Ｓｉｇｎｅｔ）を添加した。次いで、ストレプトアビジン・ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体を３０分間室温で添加した。検出は、５−１０分間のアミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）で達成した。ヘマトキシリンで対比染色した後、スライドをカバースリップでマウントした。
【０１１８】
統計解析
統計解析は、ＳＰＳＳソフトウェアで実施した（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ． Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， ＣＡ）。データを解析するために、臨床および病理学的パラメーターに従って、患者を異なるグループに分けた。卵巣腫瘍細胞質中のｈＫ１０タンパク質濃度の分布がガウス分布ではなかったので、ノンパラメトリックのマン・ホイットニーＵ検定により２グループ間の差異を判定し、２グループ以上の間の差異の解析はクラスカル・ワリス検定で実施した。ここでは、ｈＫ１０を連続変量とみなした。ｈＫ１０値は、２つのカテゴリー（ｈＫ１０陽性とｈＫ１０陰性）にも分類し、様々な臨床病理的変量に対するこれらの関係を、χ２検定またはフィッシャーの直接法で（適用可能な方で）解析した。患者の生存（無進行および全生存）に対するｈＫ１０の影響を、一変量および多変量のコックス比例ハザード回帰モデル（２８）で計算したハザード比（再発または死亡の相対的リスク）で評価した。多変量解析では、疾病の病期、腫瘍の悪性度、残存腫瘍、組織タイプおよび年齢を含む、生存に影響し得る臨床および病理学的変量を補正した。ｈＫ１０陽性とｈＫ１０陰性の患者の間の生存率の差異を立証するために、カプラン・マイヤーの無進行生存率および全生存率の曲線（２９）を構築した。ログランク検定（３０）を使用して、生存曲線間の差異の有意さを調べた。さらに、疾病の病期、腫瘍の悪性度および減容積の成功に基づいて患者を異なるサブグループに分けた。生存率解析を各患者グループに対して個別に繰返した。
【０１１９】
結果
卵巣腫瘍細胞質におけるｈＫ１０濃度の分布
１８２人の患者からの卵巣腫瘍細胞質中のｈＫ１０濃度は、０ないし８４ｎｇ／ｍｇ総タンパク質の範囲にあった。平均値は７．１ｎｇ／ｍｇ、中央値は２．６ｎｇ／ｍｇであった。度数分布曲線を図１３に示す。正常卵巣組織または良性卵巣疾病の組織から調製した細胞質と比較して、ｈＫ１０濃度は卵巣腫瘍細胞質で有意に上昇していた（図１４）。平均値、標準誤差および値の範囲は以下の通りであった：正常卵巣組織、０．２７±０．０６、０−０．６２；良性卵巣疾病、０．６１±０．３３、０−３；卵巣癌、７．１±０．７、０−８４。さらなる解析のための最適ｈＫ１０カットオフ値は、この値が研究集団の全生存率を予測する能力に基づいて、χ２検定により選択した。１．３５ｎｇ／ｍｇ総タンパク質の値が、最適なカットオフであると分かり（χ２＝６．３；Ｐ＝０．０１２）、３３番目の百分位に当った。次いで、腫瘍を高ｈＫ１０と低ｈＫ１０に二分法的に分類した（図１３）。
【０１２０】
ｈＫ１０状態と他の臨床病理学的変量との関係
高ｈＫ１０と低ｈＫ１０の患者の間の、様々な臨床病理学的変量の分布を表４にまとめた。ｈＫ１０とこれらの変量との関係を、χ２検定およびフィッシャーの直接法で調べた。ｈＫ１０状態と、腫瘍の悪性度、閉経状態および化学療法への反応との間に関係は観察されなかった。しかしながら、高ｈＫ１０患者は、進行した疾病（病期ＩＩ−ＩＶ）、漿液性組織タイプ、より大きい残存腫瘍（＞１ｃｍ）および最適下限の減容積を有する頻度が高かった（全てＰ＜０．０５）。マン・ホイットニーＵ検定により、ｈＫ１０濃度は、病期ＩＩＩ／ＩＶの卵巣癌由来の細胞質において、病期Ｉ／ＩＩ由来のそれよりも有意に高かいことが示された。このことは、高いｈＫ１０濃度が進行した病期に関連することを示す（図１５）。
【０１２１】
一変量および多変量生存解析
生存率解析の結果を表５に示す。一変量解析では、高ｈＫ１０の患者は、有意に上昇した再発（ハザード比、ＨＲ＝１．９３）および死亡（ＨＲ＝２．４２）のリスクを有した（Ｐ＜０．０５）。ｈＫ１０を連続変量とみなしても、類似の結果が観察された。カプラン・マイヤーの生存曲線は、高ｈＫ１０と低ｈＫ１０の患者の間の生存率の差異を論証した。図１６に示すように、無進行および全生存の可能性は、低ｈＫ１０患者よりも高ｈＫ１０患者で低かった。多変量解析では、高ｈＫ１０患者における無進行および全生存率は、低ｈＫ１０患者の生存率と異ならなかった（表５）。疾病の病期、悪性度および残存腫瘍の大きさは、一変量解析では予後的有意性を有すると同定されたが、多変量解析では、病期と残存腫瘍のみが有意なままであった。
【０１２２】
患者のサブグループにおける一変量および多変量生存解析
病期、腫瘍悪性度、および減容積の成功に基づいて、患者を異なるサブグループに分けた。次いで、一変量および多変量生存解析を実施した。結果を表６に示す。一変量解析により、病期ＩＩＩ／ＩＶの疾病を有する患者の中で、高ｈＫ１０患者は、低ｈＫ１０患者よりも約２倍再発および死亡しやすいことが示された。この生存率の差異は、データを多変量解析に処した後でさえ有意なままであった。しかしながら、このことは病期Ｉ−ＩＩの疾病を有する患者では観察されなかった。異なる腫瘍悪性度または減容積の成功を有する患者サブグループの間では、ｈＫ１０状態は再発と生存に影響しなかった。カプラン・マイヤーの生存曲線を構築すると、それらは同様の結果を示した（図１７）。
【０１２３】
卵巣腫瘍におけるｈＫ１０の免疫組織化学的局在
図１８に、卵巣癌患者由来のいくつかの代表的試料におけるｈＫ１０タンパク質の免疫組織化学的局在を提示する。
【０１２４】
考察
この研究では、ｈＫ１０タンパク質は卵巣の上皮細胞で発現され、その発現は、正常組織に対して癌組織で劇的に上昇することが判明した。この上昇は、疾病後期、漿液性組織タイプ、最適下限の減容積、および大きい残存腫瘍により強く関連した。病期ＩＩＩ／ＩＶの卵巣癌を有する患者では、ｈＫ１０の過剰発現は、乏しい無進行および全生存に相関する独立的予後インジケーターである。
【０１２５】
卵巣癌は、最も致死的な婦人科系悪性腫瘍である（３１）。これは、この疾病が早期では隠れていて無症候性であるという事実のためである。診断がなされるときまでに、患者の半数以上が病期ＩＩＩ−ＩＶの疾病を有する。さらに、この疾病は再発する傾向がある（３２）。より良好な治療戦略のために、ここ１０年で全生存に幾分かの改善が観察された（３３）。卵巣癌の臨床結果は、患者によって変動する。発病を予測できるバイオマーカーは、個別の要望に合う様々な治療戦略を用意するのを助ける。結果は、ｈＫ１０がかかる予後的バイオマーカーの１つであることを示す。他の予後インジケーターと組合せて、この新バイオマーカーは、患者のサブクラス分類に貢献し得る。その目的は、より効果的な処理をかかるサブグループに個別に与えることである。
【０１２６】
進行した病期、漿液性組織タイプ、および大きい残存腫瘍は、卵巣癌の攻撃性と乏しい成果のインジケーターとして知られている（３４）。この研究では、同じ関連が観察され（表５）、ｈＫ１０発現がこれらの臨床病理学的特徴に相関することが示された。ｈＫ１０の過剰発現と、卵巣癌における攻撃性との関連の基礎をなす生物学理論的根拠は、次のように説明し得る。腫瘍の攻撃性は、隣接組織に侵襲し、遠位に転移する能力に大きく依存することが知られている。癌の侵襲と転移のプロセスでは、間質性の結合組織や基底膜などの天然の障壁が分解されなければならない。プロテアーゼはこれらのプロセスに関わると広く考えられている（３５、３６）。従って、一次腫瘍により放出されるプロテアーゼの量は、腫瘍が広がる能力に反映し得る。ウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子（３７、３８）、カテプシンＤ（３９）およびマトリックスメタロプロテアーゼ（４０）などの他の数々のプロテアーゼの過剰発現が、他の多くの癌において乏しい成果に関連すると報告されてきた。病期ＩＩＩ／ＩＶの卵巣癌では、腫瘍細胞は既に卵巣を超えて広がっている。ｈＫ１０は、細胞外障壁の崩壊を触媒するカスケード反応に参加し得、従って、ｈＫ１０の過剰発現は、卵巣腫瘍の移動を補助し得る。
【０１２７】
卵巣癌の早期検出は、高い敏感度と特異度のバイオマーカーの欠如により妨げられている。現在のところ、ＣＡ１２５は卵巣癌に広く使用される血清マーカーの１つであるが、診断に十分なほどの敏感度または特異度ではない（４１−４３）。インヒビン（４５、４６）やＯＶＸ１（４７）などの他の新たに導入された血清マーカー（４４）は、幾許かの見込みを示したが、広範な好評を博してはいない。血清ｈＫ６（４８）および血清ｈＫ１０の濃度は、正常個体と比較して卵巣癌患者で有意に高い。卵巣腫瘍におけるｈＫ１０の過剰発現は、血清におけるその上昇を説明し得る。
【０１２８】
まとめると、本研究は、ｈＫ１０が後期卵巣癌の独立の予後的バイオマーカーであることを示す。
【０１２９】
好ましい実施例であると現在考えられるものを参照して本発明を説明したが、本発明は開示した実施例に限定されないことを理解すべきである。反対に、本発明は、添付の請求の範囲の精神と範囲内にある様々な修正および均等物の取合せを包含することを意図している。
【０１３０】
全刊行物、特許および特許出願は、各個別の刊行物、特許または特許出願を特別かつ個別に出典明示により全体を本明細書の一部とすると指示するのと同程度に、出典明示により全体を本明細書の一部とする。
以下の詳細な引用は、明細書中で参照した参照文献を示す。
【０１３１】
表１−様々な体液中のｈＫ１０の分析
【表１】
2004512540.tif 000003
１．ＳＤ、標準偏差
【０１３２】
表２−様々な体液におけるｈＫ１０の回収率
【表２】
2004512540.tif 000004
【０１３３】
表３−正常個体および様々な悪性腫瘍患者の血清におけるヒトカリクレイン１０（ｈＫ１０）の濃度
【表３】
2004512540.tif 000005
１．血清ＣＡ１５．３レベル＞４１４ＫＵ／Ｌ（上限レファレンス・レンジ３５ＫＵ／Ｌ）
２．カルシトニンレベル＞１．１３５ｎｇ／Ｌ（上限レファレンス・レンジ１００ｎｇ／Ｌ）
３．ｈＣＧレベル＞６９ＩＵ／Ｌ（上限レファレンス・レンジ１０ＩＵ／Ｌ）またはＡＦＰレベル＞１１０μｇ／Ｌ（上限レファレンス・レンジ１０μｇ／Ｌ）
４．ＣＡ１９．９レベル＞６２９ＫＵ／Ｌ（上限レファレンス・レンジ３７ＫＵ／Ｌ）およびＣＥＡレベル＞１．０００μｇ／Ｌ（上限レファレンス・レンジ５μｇ／Ｌ）
５．ＰＳＡレベル＞１０００μｇ／Ｌ（上限レファレンス・レンジ４μｇ／Ｌ）
６．ＣＡ１２５レベル＞３７２ＫＵ／Ｌ（上限レファレンス・レンジ３５ＫＵ／Ｌ）
【０１３４】
表４：１８２人の卵巣癌患者におけるｈＫ１０状態と他の変量との関係
【表４】
2004512540.tif 000006
ａ χ２検定
ｂ Ｘ、状態は未詳
ｃ フィッシャーの直接法
ｄ ＯＤ；最適の減容積（０−１ｃｍ）、ＳＯ；最適下限の減容積（＞１ｃｍ）
ｅ ＣＴＸ；化学療法、ＮＣ；変化なし、ＰＤ；進行性疾病、ＣＲ；完全な反応、ＰＲ；部分的な反応、ＮＥ；評価せず
Ｘ 状態は未詳
【０１３５】
表５：無進行および全生存に関するｈＫ１０発現の一変量および多変量解析
【表５】
2004512540.tif 000007
ａ ハザード比（ＨＲ）はコックス比例ハザード回帰モデルにより評価した
ｂ 評価したＨＲの信頼区間
ｃ 子宮内膜性、未分化およびその他、対漿液性
【０１３６】
表６．患者サブグループのコックス比例ハザード回帰分析
【表６】
2004512540.tif 000008
ａ ハザード比（ＨＲ）はコックス比例ハザード回帰モデルにより評価した
ｂ 評価したＨＲの信頼区間
ｃ 多変量モデルは、腫瘍の悪性度、残存腫瘍、組織学的タイプおよび年齢について補正した
ｄ 多変量モデルは、疾病の病期、残存腫瘍、組織学的タイプおよび年齢について補正した
ｅ 多変量モデルは、疾病の病期、腫瘍の悪性度、組織学的タイプおよび年齢について補正した
【０１３７】
明細書中で参照した参照文献の詳細な引用
１． Ｂｈｏｏｌａ Ｋ， Ｆｉｇｕｅｒｏａ Ｃ ａｎｄ Ｗｏｒｔｈｙ Ｋ． Ｂｉｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｋｉｎｉｎｓ： ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎｓ， ｋｉｎｉｎｏｇｅｎｓ， ａｎｄ ｋｉｎｉｎａｓｅｓ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ １９９２； ４４： １−８０． ［Ｒｅｖｉｅｗ］．
２． Ｃｌｅｍｅｎｔｓ ＪＡ． Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ． Ｉｎ： Ｆａｒｍｅｒ ＳＧ （ｅｄ） Ｔｈｅ Ｋｉｎｉｎ Ｓｙｓｔｅｍ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９７； ５，７１−９７． ［Ｒｅｖｉｅｗ］．
３． Ｒｉｅｇｍａｎ ＰＨ， Ｖｌｉｅｔｓｔｒａ ＲＪ， Ｓｕｕｒｍｅｉｊｅｒ Ｌ， Ｃｌｅｕｔｊｅｎｓ ＣＢ ａｎｄ Ｔｒａｐｍａｎ Ｊ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ｌｏｃｕｓ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９９２； １４： ６−１１．
４． ＭｃＣｏｒｍａｃｋ ＲＴ， Ｒｉｔｔｅｎｈｏｕｓｅ ＨＧ， Ｆｉｎｌａｙ ＪＡ， Ｓｏｋｏｌｏｆｆ ＲＬ， Ｗａｎｇ ＴＪ， Ｗｏｌｆｅｒｔ ＲＬ， Ｌｉｌｊａ Ｈ ａｎｄ Ｏｅｓｔｅｒｌｉｎｇ ＪＥ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ： ａ ｎｅｗ ｅｒａ． Ｕｒｏｌｏｇｙ １９９５； ４５： ７２９−４４． ［Ｒｅｖｉｅｗ］．
５． Ｒｉｔｔｅｎｈｏｕｓｅ ＨＧ， Ｆｉｎｌａｙ ＪＡ， Ｍｉｋｏｌａｊｃｚｙｋ ＳＤ ａｎｄ Ｐａｒｔｉｎ ＡＷ． Ｈｕｍａｎ Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ２ （ｈＫ２） ａｎｄ ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ （ＰＳＡ）： ｔｗｏ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ， ｂｕｔ ｄｉｓｔｉｎｃｔ， ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ． Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｓｃｉ １９９８； ３５： ２７５−３６８． ［Ｒｅｖｉｅｗ］．
【０１３８】
６． Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ， Ｙｏｕｓｅｆ ＧＭ， Ｌｕｏ Ｌ， Ｍａｇｋｌａｒａ Ｉ ａｎｄ Ｏｂｉｅｚｕ ＣＶ． Ｔｈｅ ｎｅｗ ｈｕｍａｎ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２０００； １１ ： ５４−６０． ［Ｒｅｖｉｅｗ］．
７． Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ， Ｙｏｕｓｅｆ Ｇ， Ｃｌｅｍｅｎｔｓ Ｊ， Ａｓｈｗｏｒｔｈ Ｌ， Ｙｏｓｈｉｄａ Ｓ， Ｅｇｅｌｒｕｄ Ｔ， Ｎｅｌｓｏｎ Ｐ， Ｓｈｉｏｓａｋａ Ｓ， Ｌｉｔｔｌｅ Ｓ， Ｌｉｌｊａ Ｈ， Ｓｔｅｎｍａｎ Ｕ−Ｈ， Ｒｉｔｔｅｎｈｏｕｓｅ Ｈ ａｎｄ Ｗａｉｎ Ｈ． Ｎｅｗ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ （ｉｎ ｐｒｅｓｓ）．
８． Ｌｉｕ ＸＬ， Ｗａｚｅｒ ＤＥ， Ｗａｔａｎａｂｅ Ｋ ａｎｄ Ｂａｎｄ Ｖ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｌｉｋｅ ｇｅｎｅ， ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９６； ５６： ３３７１−９．
９． Ｌｕｏ Ｌ， Ｈｅｒｂｒｉｃｋ ＪＡ， Ｓｃｈｅｒｅｒ ＳＷ， Ｂｅａｔｔｙ Ｂ， Ｓｑｕｉｒｅ Ｊ ａｎｄ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ １ ｇｅｎｅ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９８； ２４７： ５８０−６．
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【０１３９】
１１． Ｌｕｏ ＬＹ， Ｇｒａｓｓ Ｌ， Ｈｏｗａｒｔｈ ＤＪＣ， Ｔｈｉｂａｕｌｔ Ｐ， Ｏｎｇ Ｈ ａｎｄ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ． Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ １０ （ｈＫ１０ ； ＮＥＳ１） ａｎｄ ｉｔｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄｓ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅｓ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ［ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ］．
１２． Ｌｕｏ ＬＹ ａｎｄ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ． Ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ １ （ＮＥＳ１） ｇｅｎｅ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｕｎｆａｖｏｒａｂｌｅ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ． Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０００； ３３： ２３７． ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］．
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２６． Ｂｕｒｇｅｒ ＨＧ， Ｂａｉｌｌｉｅ Ａ， Ｄｒｕｍｍｏｎｄ ＡＥ， ｈｅａｌｙＤＬ， Ｊｏｂｌｉｎｇ Ｔ， Ｍａｍｅｒｓ Ｐ， Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ＤＭ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｈｉｂｉｎ ａｎｄ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８ ； ３９： ７７−８７．
２７． Ｘｕ ＦＪ， Ｙｕ ＹＨ， Ｄａｌｙ Ｌ， ＤｅＳｏｍｂｒｅ Ｋ， Ａｎｓｅｌｍｉｎｏ Ｌ， Ｈａｓｓ ＧＭ， Ｂｅｒｃｈｕｃｋ Ａ， ｅｔ ａｌ． ＯＶＸ１ ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｓ ＣＡ−１２５ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｔ ｓｅｃｏｎｄ−ｌｏｏｋ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １９９３； １１： １５０６−１５１０．
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３１． Ｐｉｓａｎｉ， Ｐ．， Ｐａｒｋｉｎ， Ｄ． Ｍ．， ａｎｄ Ｆｅｒｌａｙ， Ｊ． Ｅｓｔｉｍａｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｅｉｇｈｔｅｅｎ ｍａｊｏｒ ｃａｎｃｅｒｓ ｉｎ １９８５． Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆｕｔｕｒｅ ｂｕｒｄｅｎ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ５５： ８９１−９０３， １９９３．
３２． Ｏｚｏｌｓ， Ｒ． Ｆ．， Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｐ． Ｅ．， ａｎｄ Ｅｉｆｅｌ， Ｐ． Ｊ． Ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ， ｆａｌｌｏｐｉａｎ ｔｕｂｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｄ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｉｎ： Ｖ． Ｔ． Ｄｅｖｉｔａ， Ｓ． Ｈｅｌｌｍａｎ， ａｎｄ Ｓ． Ａ． Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ （ｅｄｓ．）， Ｃａｎｃｅｒ： ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ， ３ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｖｏｌ． ２， ｐｐ． １５０２−１５３４． Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ： Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， １９９４．
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３５． Ａｚｎａｖｏｏｒｉａｎ， Ｓ．， Ｍｕｒｐｈｙ， Ａ． Ｎ．， Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ， Ｗ． Ｇ．， ａｎｄ Ｌｉｏｔｔａ， Ｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ． Ｃａｎｃｅｒ， ７１ ： １３６８−１３８３，１９９３．
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３６． Ｄｕｆｆｙ， Ｍ． Ｊ． Ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ． Ｃｌｉｎ． ＆ Ｅｘｐ． Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ， １０ ： １４５−１５５，１９９２．
３７． Ｄｕｆｆｙ， Ｍ． Ｊ．， Ｒｅｉｌｌｙ， Ｄ．， Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ， Ｃ．， Ｏ’Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｎ．， Ｆｅｎｎｅｌｌｙ， Ｊ． Ｊ．， ａｎｄ Ａｎｄｒｅａｓｅｎ， Ｐ． Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ， ａ ｎｅｗ ａｎｄ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５０： ６８２７−６８２９， １９９０．
３８． Ｆｏｅｋｅｎｓ， Ｊ． Ｓ．， Ｓｃｈｍｉｔｔ， Ｍ．， Ｐａｃｈｅ， Ｌ．， Ｖａｎ Ｐｕｔｔｏｎ， Ｗ．， Ｐｅｔｅｒｓ， Ｈ． Ａ．， Ｂｏｎｔｅｎｂａｌ， Ｍ．， Ｊａｎｉｃｋｅ， Ｆ．， ａｎｄ Ｋｌｉｊｉｎ， Ｊ． Ｇ． Ｍ． Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎ ６７１ ｐｒｉｍａｒｙ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５２： ６１０１−６１０５， １９９２．
３９． Ｔｈｏｒｐｅ， Ｓ．， Ｒｏｃｈｅｆｏｒｔ， Ｈ．， Ｇａｒｃｉａ， Ｍ．， Ｆｒｅｉｓｓ， Ｇ．， Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， Ｉ． Ｊ．， Ｋｈａｌａｆ， Ｓ．， Ｐａｕｌｕｃｃｉ， Ｆ．， Ｐａｕ， Ｐ．， Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ， Ｂ． Ｂ．， ａｎｄ Ｒｏｓｅ， Ｃ． Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｉｇｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｒ ５２，０００ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｄ ａｎｄ ｐｏｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ４９： ６００８−６０１４， １９８９．
４０． Ｄａｉｄｏｎｅ， Ｍ． Ｇ．， Ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｎｉ， Ｒ．， Ｄ’Ｅｒｒｉｃｏ， Ａ．， Ｄｉ Ｆｒｏｎｚｏ， Ｇ．， Ｂｅｎｉｎｉ， Ｅ．， Ｍａｎｃｉｎｉ， Ａ． Ｍ．， Ｇａｒｂｉｓａ， Ｓ．， Ｌｉｏｔｔａ， Ｌ． Ａ．， ａｎｄ Ｇｒｉｇｉｏｎｉ， Ｗ． Ｆ． Ｌａｍｉｎｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ， ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ＩＶ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｉｎ ｎｏｄｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ４８： ５２９−５３２， １９９１．
【０１４５】
４１． Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ， Ａ． Ｎ．， Ｊａｃｏｂｓ， Ｉ． Ｊ． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＣＡ １２５ ｉｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｍａｒｋｅｒｓ， １９９８； １３： ２１６−２２０．
４２． Ｍａｇｇｉｎｏ， Ｔ．， Ｇａｄｄｕｃｃｉ， Ａ． Ｓｅｒｕｍ ｍａｒｋｅｒｓ ａｓ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ： ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｇｙｎａｅｃｏｌ． Ｏｎｃｏｌ．， ２０００； ２１： ６４−６９．
４３． Ｂａｓｔ， Ｒ． Ｃ． Ｊｒ．， Ｘｕ， Ｆ． Ｊ．， Ｙｕ， Ｙ． Ｈ．， Ｂａｒｎｈｉｌｌ， Ｓ．， Ｚｈａｎｇ， Ｚ．， Ｍｉｌｌｓ， Ｇ． Ｂ． ＣＡ １２５： ｔｈｅ ｐａｓｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｍａｒｋｅｒｓ， １９９８； １３： １７９−１８７．
４４． Ｂｅｒｅｋ， Ｊ． Ｓ．， Ｂａｓｔ， Ｒ． Ｃ． Ｊｒ． Ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ． Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｓｅｒｉａｌ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ． Ｃａｎｃｅｒ， １９９５； ７６： ２０９２−２０９６．
４５． Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｍｅｓｓｅｒｌｉａｎ， Ｇ． Ｍ． Ｉｓ ｉｎｈｉｂｉｎ ａ ｓｅｒｕｍ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ？ Ｅｕｒ． Ｊ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．， ２０００； ４２： ３３１−３３３．
【０１４６】
４６． Ｂｕｒｇｅｒ， Ｈ． Ｇ．， Ｂａｉｌｌｉｅ， Ａ．， Ｄｒｕｍｍｏｎｄ， Ａ． Ｅ．， Ｈｅａｌｙ， Ｄ． Ｌ．， Ｊｏｂｌｉｎｇ， Ｔ．， Ｍａｍｅｒｓ， Ｐ， Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， Ｄ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｈｉｂｉｎ ａｎｄ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９８； ３９： ７７−８７．
４７． Ｘｕ， Ｆ． Ｊ．， Ｙｕ， Ｙ． Ｈ．， Ｄａｌｙ， Ｌ．， ＤｅＳｏｍｂｒｅ， Ｋ．， Ａｎｓｅｌｍｉｎｏ， Ｌ．， Ｈａｓｓ， Ｇ． Ｍ．， Ｂｅｒｃｈｕｃｋ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． ＯＶＸ１ ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｓ ＣＡ−１２５ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｔ ｓｅｃｏｎｄ ｌｏｏｋ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．， １９９３； １１ ：１５０６−１５１０．
４８． Ｌｕｏ， Ｌ． Ｙ．， Ｂｕｎｔｉｎｇ， Ｐ．， Ｓｃｏｒｉｌａｓ， Ａ．， ａｎｄ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ， Ｅ． Ｐ． Ｈｕｍａｎ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ １０： Ａ ｎｏｖｅｌ ｔｕｍｏｒ−ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ？ Ｃｌｉｎ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ， ２００１ ； ３０６： １１１−１１８
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ 酵母発現系を用いる組換えｈＫ１０タンパク質の産生。
【図２】逆相ＨＰＬＣによる酵母培養上清由来組換えｈＫ１０の精製を示す典型的なクロマトグラム。
【図３】ｈＫ１０とそのトリプシン処理によるペプチドの質量分析の特徴。
【図４】ｈＫ１０免疫アッセイの典型的な較正曲線。
【図５】ｈＫ１０免疫アッセイの特異性と、ｈＫ１０とＰＳＡ、ｈＫ２およびｈＫ６との間の交差反応を示す棒図解。
【図６】ｈＫ１０免疫アッセイの線形性。
【図７】様々なヒト組織由来の細胞質抽出物中のｈＫ１０含量
【図８】輸卵管におけるｈＫ１０の免疫組織化学染色。
【図９】サイズ排除高速液体クロマトグラフィーによる、乳汁、精漿および血清の分別。
【図１０】８０人の卵巣癌患者の血清中のｈＫ１０濃度の度数分布。
【図１１】卵巣癌患者由来の７９の血清サンプルにおける、ＣＡ１２５とｈＫ１０の濃度間の相関。
【図１２】初期処置後にモニタリングされた卵巣癌患者からの連続的血清サンプルにおける、ＣＡ１２５とｈＫ１０の分析。
【図１３】卵巣腫瘍細胞質におけるｈＫ１０濃度の度数分布を示すグラフ。
【図１４】正常卵巣組織（正常）、良性疾病の卵巣組織（良性）および卵巣癌（癌）からの抽出物中のｈＫ１０濃度の比較を示すグラフ。
【図１５】病期Ｉ／ＩＩおよび病期ＩＩＩ／ＩＶの卵巣癌患者由来の抽出物におけるｈＫ１０濃度の分布を示すグラフ。
【図１６】カプラン・マイヤーの生存曲線。
【図１７】腫瘍病期で層化した高ｈＫ１０と低ｈＫ１０の卵巣癌を有する患者の、ＰＦＳとＯＳを示すグラフ。
【図１８】卵巣腫瘍組織におけるｈＫ１０の免疫組織化学的局在を示すブロット。
【図２】
2004512540.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
2004512540.tif 000015
【図１０】
2004512540.tif 000016
【図１２】
2004512540.tif 000017
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004512540.tif 000078
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