(57)【要約】本発明は、ティシュエンジニアリングで使用するための細胞を展開する改善した方法を提供する。特に、本方法は、構造的及び機能的の両方において自然の組織に似ている組織の等価物の再生という目的を持って、胚発生の間に発生する事象を反復するために、展開工程の間に細胞培養培地を補うために特定の生化学的因子を供給する。これらの特定の生化学的因子は、細胞の増殖を改善し、かつ、細胞の分化潜在能力が維持されるように、組織から単離された成熟細胞の脱分化が可能である。生物活性分子はまた、その他の生物活性分子に対する細胞の応答性を維持する。特に、本発明は、軟骨組織の再生に使用する線維芽細胞成長因子２の存在下で軟骨組織を展開させるための方法を提供する。【選択図】図１Ａ
2004502401.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）細胞を用意すること、
（ｉｉ）少なくとも１つの生化学的因子を含む細胞培養培地中で該細胞を展開すること、及び
（ｉｉｉ）ティシュエンジニアリングのために該展開した細胞を使用すること、
の段階を含むティシュエンジニアリングのために細胞を展開する方法。
【請求項２】
細胞を用意する段階が、ティシュエンジニアリングにおいて使用されうる細胞を用意することを含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞を用意する段階が、軟骨細胞を用意することを含む請求項１記載の方法。
【請求項４】
細胞を用意する段階が、哺乳動物の軟骨細胞を用意することを含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの生化学的因子を含む細胞培養培地中で細胞を展開する段階が、胚発生の間に起きる事象を反復する少なくとも１つの生化学的因子を含む細胞培養培地中で細胞を展開することを含む請求項１記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの生化学的因子を含む細胞培養培地中で細胞を展開する段階が、分化刺激に応答するために前記細胞の能力を維持する少なくとも１つの生化学的因子を含む細胞培養培地中で細胞を展開することを含む請求項１記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つの生化学的因子を含む細胞培養培地中で細胞を展開する段階が、前記細胞の倍加時間を減少しかつ及び前記細胞を脱分化する少なくとも１つの生化学的因子を含む細胞培養培地中で細胞を展開することを含む請求項１記載の方法。
【請求項８】
細胞を展開する段階が、少なくとも１つの成長因子を含む細胞培養培地中で細胞を展開することを含む請求項１記載の方法。
【請求項９】
細胞を展開する段階が、線維芽細胞成長因子２，形質転換成長因子β、インスリン様成長因子類、骨形態形成タンパク類、表皮成長因子、血小板由来成長因子類及びそれらの組み合わせから成る群から選択される少なくとも１つの因子を含む細胞培養培地中で細胞を展開することを含む請求項１記載の方法。
【請求項１０】
細胞を展開する段階が、展開する間に核酸を細胞にトランスフェクションすることをさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項１１】
（ｉ）軟骨細胞を用意すること、
（ｉｉ）少なくとも１つの生化学的因子を含む細胞培養培地中で該軟骨細胞を展開すること、及び
（ｉｉｉ）ティシュエンジニアリングのために該展開した軟骨細胞を使用すること、
の段階を含むティシュエンジニアリングのために軟骨細胞を展開する方法。
【請求項１２】
軟骨細胞を用意する段階が、哺乳動物の軟骨細胞を用意することを含む請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
軟骨細胞を用意する段階が、ウシの軟骨細胞を用意することを含む請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
軟骨細胞を用意する段階が、ヒトの軟骨細胞を用意することを含む請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つの生化学的因子を含む培養培地中で軟骨細胞を展開する段階が、少なくとも１つの成長因子を含む培養培地中で軟骨細胞を展開することを含む請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
培養培地中で軟骨細胞を展開する段階が、線維芽細胞成長因子２，形質転換成長因子β、インスリン様成長因子類、骨形態形成タンパク質類、表皮成長因子、血小板由来成長因子類及びそれらの組み合わせから成る群から選択される少なくとも１つの因子を含む培養培地中で軟骨細胞を展開することを含む請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
（ｉ）細胞を用意すること、
（ｉｉ）少なくとも１つの生化学的因子を含む第１の細胞培養培地中で該細胞を展開すること、
（ｉｉｉ）第２の細胞培養培地中で、該展開した細胞を再分化すること、及び
（ｉｖ）ティシュエンジニアリングのために該展開した細胞を使用すること、
の段階を含むティシュエンジニアリングのための細胞を展開する方法。
【請求項１８】
細胞を用意する段階が、哺乳動物の細胞を用意することを含む請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
細胞を用意する段階が、ヒトの細胞を用意することを含む請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
細胞を用意する段階が、軟骨細胞を用意することを含む請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
細胞を用意する段階が、哺乳動物の軟骨細胞を用意することを含む請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
細胞を用意する段階が、ヒトの軟骨細胞を用意することを含む請求項１７記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも１つの生化学的因子を含む第１の培養培地中で細胞を展開する段階が、２又はそれ以上の生化学的因子を含む第１の細胞培養培地中で細胞を展開することを含む請求項１７記載の方法。
【請求項２４】
２又はそれ以上の生化学的因子が、線維芽細胞成長因子２，形質転換成長因子β、インスリン様成長因子類、骨形態形成タンパク質類、表皮成長因子、血小板由来成長因子類及びそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１つの生化学的因子を含む第１の細胞培養培地中で細胞を展開する段階が、少なくとも２つ成長因子を含む細胞培養培地中で細胞を展開することを含む請求項１７記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも１つの生化学的因子を含む第１の細胞培養培地中で細胞を展開する段階が、線維芽細胞成長因子２及び形質転換成長因子βを含む第１の細胞培養培地中で細胞を展開することを含む請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
第２の細胞培養培地中で細胞を再分化させる段階が、無血清細胞培地中で細胞を再分化することを含む請求項１７記載の方法。
【請求項２８】
第２の細胞培養培地中で細胞を再分化させる段階が、少なくとも１つの成長因子を含む無血清細胞培地中で細胞を再分化することを含む請求項１７記載の方法。
【請求項２９】
第２の細胞培養培地中で細胞を再分化させる段階が、インスリン、形質転換成長因子β及びデキサメタゾンを含む無血清細胞培地中で細胞を再分化することを含む請求項１７記載の方法。
【請求項３０】
第２の細胞培養培地中で細胞を再分化させる段階が、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、リノール酸、アルブミン、アスコルビン酸、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）及びデキサメタゾンを含む無血清細胞培地中で細胞を再分化することを含む請求項１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本明細書は、マーチン等により１９９８年９月１８日に提出された「哺乳動物細胞の展開及びティシュエンジニアリングのための成長因子及びホルモンの使用」と題する米国特許仮出願番号６０／１０１，０４７号及びマーチン等により１９９９年９月１７日に提出された「哺乳動物細胞の展開及びティシュエンジニアリングのための成長因子及びホルモンの使用」と題する米国特許仮出願番号　　　　　の優先権を主張する。
【発明の属する技術分野】
ほぼ８百万の外科処置が、組織及び臓器の機能不全を治療するためだけに、米国で毎年行われている。ティシュエンジニアリングは、組織機能を回復、維持又は改善するための生物学的代替品の開発である。特に、ティシュエンジニアリングは、新しい生きた組織が病的な又は傷ついた組織を置換するために実験室で作られる方法である（Ｌａｎｇｅｒ ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６０： ９２０〜９２６， １９９３年）。
【０００２】
【従来の技術】
新しい組織を再生するために考案された１つの特別の方法は、（ｉ）組織より特定の細胞を分離すること、（ｉｉ）インビトロで分離した細胞を展開すること、及び（ｉｉｉ）移植した細胞がインビボで増殖しそして組織の欠損をやがては置き換え又は修復するように、病的な又は傷ついた組織中に展開した細胞を移植することである（Ｌａｎｇｅｒ ら，前記）。この技術は、様々な細胞の種類及び組織欠損に適用されている（例えば、参照 Ｂｒｉｔｔｂｅｒｇ ら， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３３１： ８８９〜８９５， １９９４年；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ ら， Ｃｅｌｌ， ６： ３３１〜３４４， １９７５年；Ｌａｎｇｅｒ ら，前記）。単離した細胞は、特定の組織からの分化した細胞又は未分化の原種細胞（幹細胞）のいずれかでありうる。両方の場合に、細胞の展開にとって適切な培養条件の確立は、構造的及び機能的な組織等価物を再生するためにそれらの潜在能力を維持又は改善するために極めて需要である（Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ ら， 前記）。
【０００３】
組織再生技術の開発のための特別重点分野は、軟骨質組織中の欠損の修正である。他の組織と違い、軟骨組織は外傷、病気の後又は老齢の後にそれ自身を再生するための能力をほとんどもっていない。このことは、正常な関節の軟骨組織の無血管の性質によるものである。表面の軟骨板への損傷は一般的に回復しないけれども、下軟骨は血管再生する。それ故、この部位への損傷は、限られた程度まで回復する。損傷した関節の軟骨組織の部位で成長する新しい軟骨組織は、線維軟骨と呼ばれる。線維軟骨は、元々の硝子軟骨の耐久度及びより望ましい機械的性質を欠く。関節傷害を患う人々は、その後は関節変質の傾向にある（Ｆｒｅｅｄ ら，Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔ． Ｒｅｓ．， ２８： ８９１〜９９， １９９４年；Ｍｉｎａｓ ら，Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ， Ｊｕｎｅ， ２０（６） ： ５２５〜５３８， １９９７年）。
【０００４】
幾つかの異なる取り組みが、軟骨組織を回復するために講じられてきた。軟骨組織の外移植を利用する方法では、軟骨組織は身体から取られ、かつ関節の軟骨組織欠損中に移植するために、インビトロで培養される（Ｓａｈ ら，Ｊ． Ｏｒｔｈｏｐ． Ｒｅｓ．， １月号， １４（１）： ４４〜５２， １９９６年）。関節の軟骨組織の修復のための他のより最近の取り組みは、損傷部位への置換組織の移植前に、軟骨質の組織から軟骨細胞を採取し、そして軟骨細胞を３次元の移植基質物質の上に直接に接種することから典型的に成っている（Ｆｒｅｅｄ ら，前記）。再生が完全であれば、この技術は高い質の軟骨組織を結果とする。しかしながら、この技術は、患者から採取されるべき大量の開始物質を要求し、患者の外傷の増加を結果する。
【０００５】
軟骨細胞は、生検材料から分離され、十分な数の細胞が得られるまで単層培養中で展開され、そして組織の損傷部位中へ移植される。移植は、細胞がゲル中に埋め込まれているか又は生分解性ポリマーの足場を伴うかのどちらかを最初に要求する（Ｂｒｉｔｔｂｅｒｇ ら，Ｃｌｉｎ． Ｏｒｔｈｏｐ．， ５月号 ３２６： ２７０〜２８３，１９９６年； Ｍｉｎａｓ ら，前記；Ｆｒｅｅｄ ら，前記）。これらの基質の３次元的特性は、移植片に構造的な一体性を与え、かつ軟骨組織中に軟骨細胞の成長のための堅い支持を供給する。このシステムは、開始物質としてより少ない細胞を要求する利点を有するが、もしその細胞が骨格的に成熟した供与者（大人）から採取され又は得られるとすれば、この方法により得られる軟骨組織は、しばしば質が劣悪である。その代わりに、骨髄からの原種細胞が展開され、そして関節の表面及び下層にある下軟骨の両方を含む完全な厚さの欠損を修復するために使用される（Ｗａｋｉｔａｎｉ ら， Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ， ７６−Ａ： ５７９〜５９２，１９９４年： Ｂｕｔｎａｒｉｕ−Ｅｐｈｒａｔ ら， Ｃｌｉｎ． Ｏｒｔｈｏｐ， ３３０： ２３４〜２４３， １９９６年）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
このシステムによりもたらされる明確な課題は、成功した再生を生じる様式で、展開の間に細胞の増殖速度を増加することである。
【０００７】
ティシュエンジニアリングで使用されるべき細胞のための改善された展開技術への必要性が存在する。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ティシュエンジニアリングでの使用のための細胞を展開する改善された方法に関する。成長因子及びホルモンの存在下で細胞を展開することが、高品質の組織を再生するために必要な細胞の性質を保持しながら、細胞数の増殖を刺激することが本発明の一つの局面である。胚発生の間に起きる事象を反復することによりより良い構造上の及び機能上の特質をもつ組織を再生する方法を提供することが本発明のもう一つの局面である。さらに、展開された細胞がインビトロ及びインビボで新しい組織を再生する時に、分化刺激に応答するための展開した細胞の能力を維持し又は改善する方法を提供することが本発明の他の外観である。
【０００９】
本発明の方法は、（ｉ）細胞集団を用意すること、（ｉｉ）特定の生化学的因子の存在下で該細胞集団を展開すること、及び（ｉｉｉ）ティシュエンジニアリングのためにその細胞を使用すること、を含む。様々なタイプの細胞が本発明で使用し得る。本発明に従い、単離され得る、ティシュエンジニアリングでの使用のために望ましい任意のタイプの細胞が組織の再生に使用される。限定されない例は、内皮細胞、筋細胞、軟骨細胞及びメラニン形成細胞を含む。加えて、細胞の品質を損なうことなしに細胞の増殖を増加させる任意の種類の生化学的因子が、細胞展開の過程において使用され得る。本発明で使用してもよい生化学的因子の限定されない例は、軟骨モジュリン（コンドロモジュリン）、血小板由来成長因子類、表皮成長因子類、線維芽細胞成長因子２、形質転換成長因子β、インスリン様成長因子類、骨形態形成タンパク類、表皮成長因子、血小板由来成長因子類である。
【００１０】
本発明の好ましい実施態様において、ティシュエンジニアリングのための軟骨組織は、本発明の教示を使用して再生される。本発明は、成熟した軟骨組織から単離された軟骨細部は、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）の存在下で展開され、そして軟骨組織を再生するために使用されうることを示す。詳しくは、細胞展開の間に培養培地に添加されたＦＧＦ−２は、細胞が軟骨組織を再生するためのそれらの潜在能力を維持することを助ける。詳しくは、ＦＧＦ−２は、均質の脱分化した状態を有する細胞集団を産出し及びインスリン様成長因子の応答のような環境変化に反応するそれらの能力を保持しながら、細胞集団の倍加時間を減少する。
【００１１】
他の好ましい実施態様において、軟骨細胞（好ましくは哺乳動物、及びより好ましくはヒト軟骨細胞）が、成熟した軟骨組織から単離され、そして線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）及び形質転換成長因子β１（ＴＧＦβ）の存在下インビトロで展開される。この展開は、環境の変化に応じる再分化のためのそれらの完全な潜在能力を維持しながら、細胞の脱分化を可能にする。
【００１２】
他の好ましい実施態様において、ヒト軟骨細胞の展開及び脱分化は、ティシュエンジニアリングでの使用のための初期の軟骨細胞へと再分化され得る細胞を結果する。再分化は、好ましくは無血清培地中で行われる。より好ましくは、再分化はインスリン、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）及びデキサメタゾンを含む無血清培地中で行われる。最も好ましくは、再分化はインスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、リノール酸、アルブミン、アスコルビン酸、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）及びデキサメタゾンを含む無血清培地中で行われる。
【００１３】
他の好ましい実施態様において、ティシュエンジニアリングでの使用のための生化学的成長因子の存在下での細胞の展開は、細胞の中への核酸のトランスフェクションの効率をまた改善する。典型的に、遺伝子転移は、単層の展開の間に実行される。それ故に、ティシュエンジニアリング技術が遺伝子治療と結びつけられるところの応用は、本発明の教示に従い利用されてもよい。
【発明の実施の形態】
「脱分化」：「脱分化」は、本明細書において、分化の機能を欠く細胞を記述し、かつ初期の二能性又は多能性の胚の状態への退行を意味するために使用される。例えば、軟骨組織からの軟骨細胞が軟骨基質から遊離され、そして単層培養におかれた場合、それらは、それらを分化されていると定義する特徴的な標識を生産することを中止する。分化した軟骨細胞の２つのそのような標識は、２つのよく知られた特徴づけられた構造の高分子、すなわち、軟骨プロテオグリカン及びＩＩ型コラーゲンである。
【００１４】
「生物活性分子」又は「生化学的因子」：「生物活性分子」又は「生化学的因子」は、本明細書において、細胞から何らかの代謝応答を引き出すことができる何らかの化学品又はタンパク質に言及するために使用される。生化学的因子は、タンパク質、例えば、細胞中の特定の生化学経路を刺激するホルモン又は成長因子であり得る。生化学的因子は、化学治療剤のような単純な化学品でまたありうる。「生物活性分子」は、何らかの流体力学因子又はシグナルをまた包含する。
【００１５】
「展開」：「展開する」、「展開された」又は「展開」は、本明細書において、インビトロで細胞を成長するプロセスを言及するために使用される。
【００１６】
移植されるべき細胞
本発明は、ティシュエンジニアリングの改良された方法を提供する。特に、本発明は、ティシュエンジニアリング適用における使用のために細胞を展開するための改良されたアプローチを提供する。本発明の基礎となる基本的な理論は、よりよい構造的及び機能的特徴を有する組織を再生するために、胚発生の間に起こる事象を反復することが望ましいということである。一つの好ましい実施態様において、成熟した組織から単離された細胞は、それらの分化の潜在能力を保持するために特定の生化学的因子の存在下で、展開されかつ脱分化される。このようにして、細胞がインビトロ又はインビボで新しい組織を再生するときに、分化の刺激によりよく応答することができるかもしれない。
【００１７】
詳しくは、本発明は、ティシュエンジニアリングに使用でき得る様々な細胞の種類の改善された展開の方法を提供する。一つの好ましい実施態様において、本発明は細胞の分化の潜在能力を維持しながら、細胞の増殖を促進するために、成長因子を細胞培養培地に供給する。少数の例を示すとと、本発明で使用され得る成長因子は、軟骨モジュリン類、血小板由来成長因子類、表皮成長因子類、ヘパリン結合因子、形質転換成長因子α及びβ、α線維芽細胞成長因子、線維芽細胞成長因子２、インスリン様成長因子類、骨形態形成タンパク質類、及び血管内皮成長因子を含む。他の実施態様において、本発明は、細胞の分化潜在能力を維持しながら、細胞の分裂を促進するためにホルモン（例えば、インスリン、グルカゴン又はエストロゲン）を細胞培養培地に供給する。さらに他の好ましい実施態様において、脈管形成因子がインビトロでの展開のために使用されても良い。
【００１８】
当業者は、細胞展開のこの方法が適用されうる様々な細胞の種類を理解するであろう。ティシュエンジニアリングの技術は、無数の異なる細胞の種類において欠損を修復するために用いられてきた。ティシュエンジニアリングは、病気や外傷から起こる軟骨組織又は骨中における欠損のような堅い組織の欠損の修復に適用されうる。ティシュエンジニアリングは、柔軟な組織構造の修復に、また適用されてきた。例として、本発明に使用される細胞は、代謝器官（例えば、肝臓又は膵臓）、表皮組織（例えば火傷の被害の）を再生するために、又は乳房組織を修復又は増大するために使用されうる（例えば、筋細胞は、乳癌、先天的欠損、又は外傷から生じる損傷で悩まされている女性の乳房を修復するために使用されうる；参照　米国特許明細書第５，５１２，６００号及び国際公開公報ＷＯ／９６／１８４２４号、これの両方は、引用することによりここに取り込まれる。）。その上、膀胱尿管逆流又は膀胱尿管失調のような先天性欠損は、尿の通過に対する必要な制御を供給し又はそうでなければ欠損を修復する筋肉面積を与えるべく効果的な量の筋肉細胞を藩種されたゲル又は足場基質の移植により修復されうる（米国特許明細書第５，６６７，７７８号；引用することによりここに取り込まれる）。
【００１９】
本発明によると、特定の肉体的部位を再構築する又は増大するために使用される細胞は、身体中のその組織を通常構成する細胞と異なり得る。例えば、軟骨細胞は、充填剤として供給することにより柔軟な組織の欠損を修復するために使用され得る（米国特許出願、第０８／６５４，８４４号）。ある好ましい実施態様において、複数のタイプの細胞が、単一の再生組織を産出するために使用される。各々の場合において、成功した組織再生に要求される細胞特性を失うことなしに、本発明の細胞が、特定の生化学的因子の存在下で展開されかつ脱分化されることが重要である。
【００２０】
多くの異なる生化学的因子は、本発明において使用され得る。特定の生化学的因子は、好ましくはインビトロで関連のある細胞の増殖を刺激することができ、かつ成熟した組織から単離された分化細胞の脱分化を促進することができる。本発明によると、単離した細胞の展開の間に組織培養培地に添加された時にその細胞集団の倍加時間を減少する因子が好ましい。本発明は、組織培養培地に添加された時に、特定の成熟細胞タイプの分化過程を逆転する効果、又は未成熟細胞タイプの分化の潜在能力を維持する効果を有する因子をまた提供する。特に好ましいのは、特定の細胞集団の倍加時間を減少するのみならず、かつ分化の潜在能力を保持する生化学的因子である。そのような特徴は、細胞のための胚環境を再生産し、かつ前記したような応用のための高品質の組織の再生を促進する。本発明を限定することを望まないが、本発明で使用され得る生化学的因子のいくつかの例は、軟骨モジュリン類、血小板由来成長因子類、表皮成長因子、線維芽細胞成長因子２，形質転換成長因子β、インスリン様成長因子類及び骨形態形成タンパク質類である。
【００２１】
展開した細胞の状態は、高品質組織の成功した再生に有意に影響を及ぼす。それゆえ、インビトロでの細胞の展開の間における細胞の成長環境は、好ましくは展開過程の最適化を促進する。本発明において、展開した細胞は、それらの分化の過程に関して均質であることが好ましい。本発明によると、成長環境は、脱分化細胞の均質集団を達成するために成長因子及び／又はホルモンの添加により巧みに操作されうる。
【００２２】
特に好ましい実施態様において、軟骨細胞が、軟骨組織の再生のために本発明の方法により展開される。詳しくは、被験者から単離された軟骨細胞は、移植のための高い質の軟骨組織の成功した再生を保証するために細胞の適切な分化の特性を保持しながら、軟骨細胞の増殖速度を増加する成長因子の存在下で展開される。
【００２３】
本発明より前に、軟骨組織は２つの方法の１つの組織培養中で維持された。すなわち、（ｉ）軟骨組織は、身体から単離され、そしてインビトロで組織培養中で増殖された（組織エキスプラント）、又は（ｉｉ）軟骨組織から単離された初代の軟骨細胞は、３次元のポリマー足場上に接種され、そして軟骨組織を形成するために足場上で増殖及び分化することを許容された（組織インプラント）。３次元のポリマー足場に接種する前に、インビトロでの単層培養中で軟骨細胞を初めに展開する努力は、そのような努力から得られる軟骨組織は、新鮮に単離された初代の軟骨細胞でポリマー足場に接種することにより得られる軟骨組織に比較して劣等な質であったという点で一般に成功しなかった。
【００２４】
３次元環境下での哺乳動物細胞（例えば、軟骨細胞及び骨）は、単層培養中の細胞より、刺激（例えば、生化学的因子及び流体力学因子、又はシグナル）に対し大いに異なって反応することが知られている。軟骨細胞の分化した表現型は、単層培養から３次元の環境の中へそれらを移すことにより安定化されうることが示されている（Ｂｅｎｙａ ら， Ｃｅｌｌ， ３０： ２１５〜２２４， １９８２年； 引用することによりここに取り込まれる）。単層培養中の軟骨細胞は、分化した線維芽細胞を典型的に形成する（Ｋａｔｏ ら，　Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ２月号 １００（２）： ４７７〜４８５， １９８５年）。単層培養中での軟骨性の表現型のこの喪失は、展開された細胞を成功裡に接種しそしてポリマーの基質上に直接的に接種された新鮮に単離された初代の軟骨細胞により形成された軟骨組織と等価である軟骨組織を再生することができない原因となる。特別な挑戦は、細胞及びまた得られた再生された軟骨組織の品質を失うことなしに、細胞の量を増加することである。
【００２５】
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−２）は、単層培養及び３次元環境の両方で、軟骨細胞にインビトロで適用されてきた。線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）（基本的線維芽細胞成長因子とも呼ばれる）は、単層培養において及びインビボで軟骨細胞のための有能なミトゲンであることが確立されている（Ｗｒｏｂｌｅｗｓｋｉ ら， Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ． Ｒｅｓ．， ５月号， （５）： ７３５〜７４２， １９９５年； Ｋａｔｏ ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６５： ５９０３〜５９０９， １９９０年）。しかしながら、３次元の環境において、インビトロで軟骨組織を培養するためにＦＧＦ−２の使用についての報告は、矛盾している。例えば、ＦＧＦ−２は、（ｉ）軟骨エキスプラントに典型的な成熟した表現型の特徴の欠損をもたらす（Ｓａｈ ら， 前記）、及び（ｉｉ）ＦＧＦ−２の存在下、軟骨細胞を接種されたインプラントの成熟した表現型の特徴に影響を与えることなしに増殖速度を増加する、の両方が報告されている（Ｔｏｏｌａｎ ら， Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ． ６月号 ３１（２）： ２７３〜２８０，１９９６）。
【００２６】
軟骨細胞はＦＧＦ−２の存在下で培養され、かつＦＧＦ−２は軟骨細胞を接種されたインプラントを培養するために使用されてきたが、ＦＧＦ−２で展開された軟骨細胞は従来、ティシュエンジニアリング又は再生のために使用されていない。ＦＧＦ−２が単層培養中の軟骨細胞対ポリマー足場について種々の効果を与えたとして、３次元の基質に接種するためのＦＧＦ−２中で展開された細胞を使用することは成功であるとする合理的な予想がなかった。
【００２７】
本発明は、哺乳動物の軟骨細胞のインビトロ展開を最適化するために培養培地の補助剤としてのＦＧＦ−２の使用に関する。本発明はＦＧＦ−２が、展開期の間に培養培地に添加された場合、軟骨細胞がより早く増殖するだけでなく、それらは軟骨組織と同等物を再生するより高い潜在能力を保持することを示している（実施例１参照）。より早い増殖は、足場若しくはゲル構造の上に接種するために十分な量の細胞を得るため必要とされる組織の初期量及び／又は必要とされる時間を減少する。いかなる特定の理論に拘束されることを望まないが、我々は、ＦＧＦ−２が、再生する組織の軟骨の分化を誘発するのではなくて、軟骨細胞のインビトロでの展開の間に軟骨細胞の軟骨性分化の潜在能力を保持するのに効果的であることを提案する。
【００２８】
これらの結果は、ＦＧＦ−２を含む培地中での軟骨細胞の展開は、軟骨組織を再生するためのそれらの潜在能力を保持することに役に立つことを示唆する。それゆえ、ＦＧＦ−２で展開された軟骨細胞は、ＦＧＦ−２の欠けている培養培地中で展開された軟骨細胞よりも、軟骨欠損を修復するためのより高い潜在能力を有する細胞集団を表す。基質上での更なる増殖がＦＧＦ−２の存在又は不存在下で演じられ得る時点である移植基質を接種するより先に軟骨細胞がＦＧＦ−２の存在下で展開されることが特に好ましい。
【００２９】
本発明の他の好ましい実施態様において、哺乳動物の軟骨細胞（好ましくはヒト）は、線維芽成長因子−２（ＦＧＦ−２）を含む及び好ましくは形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）をもまた含む培地中で展開される。前に述べたように、細胞培養培地中の軟骨細胞の展開は、環境の変化に応答して再分化のためのそれらの完全な潜在能力を維持しながら、細胞の脱分化を許容し、かつティシュエンジニアリングを通じて軟骨細胞を再生するために有用である細胞を生産する。
【００３０】
その上、ＦＧＦ−２及びＴＧＦβを含む細胞培養培地中で展開されたヒトの軟骨細胞は、実質上無血清である細胞培養培地中で初代の軟骨細胞へと優先的に再分化される。好ましくは、無血清細胞培養培地は、インスリン、ＴＧＦβ及びデキサメタゾンをまた含む。さらにより好ましくは、無血清細胞培養培地は、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、リノール酸、アルブミン、アスコルビン酸、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）及びデキサメタゾンを含む。実施例２に記載されている実験は、最も高い増殖速度を誘導するために単層で細胞培養培地で展開されるヒトの軟骨細胞は、もしＴＧＦβ及びＦＧＦ−２の存在下で展開されるならば、すると再分化標識の最も高いレベルを生産することを示している。その上、展開されたヒトの軟骨細胞の再分化は、インスリン、ＴＧＦβ及びデキサメタゾンを含む無血清の細胞培養培地で培養されると、最も高いレベルの分化標識を産出する。
【００３１】
本発明の他の面において、移植基質を接種するために用意された細胞は、その他の生化学的因子やシグナルに応答することが望ましい。軟骨組織から新鮮に分離された軟骨細胞は、インスリンに通常応答し、これは軟骨細胞の増加した増殖をもたらす。本発明は、ＦＧＦ−２の存在下で初代に展開された軟骨細胞は、軟骨組織から直接に採取されそして展開段階の介在なしに移植基質上に直接に接種された軟骨細胞と同じ様式でインスリンに応答する。ＦＧＦ−２で展開された軟骨細胞は、新鮮に採取した軟骨細胞と同様にインスリンに高く敏感である故に、それらは、さらに組織の再生を刺激するための追加のホルモン及び成長因子の使用を含むそれらの治療における軟骨再生のための適切な細胞集団を表しうる。
【００３２】
一般的に、本発明の実施において使用される任意の細胞の種類は、組織再生の過程の間にインビトロまたはインビボで存在する環境刺激を受け、かつ応答することができることが好ましい。好ましくは、細胞は異質な細胞である。代わりに、細胞が近接親類から又は同じ種の個体から分離される。増殖又は分化の細胞刺激に応答する細胞集団がティシュエンジニアリングでの使用のために有利であることが当業者に理解されるであろう。そのような刺激に対しより良く応答できる細胞集団は、より早くより高い信頼性で移植のための組織を再生し、かつその結果としてより高い品質の組織与えるだろう。ある本発明のある実施態様では、再生過程の間に生物活性分子を細胞に添加することが望ましい。様々な生物活性分子が、例えば、米国特許明細書第５，７１６，４０４号に記載されている基質を使用して加えられ得る（後記参照）。本発明の１つの特に好ましい実施態様において、ＦＧＦ−２は様々な細胞の種類（例えば、内皮細胞、筋細胞、メラニン形成細胞、肝細胞、間様幹細胞）の展開を改善するために使用される。
【００３３】
他の好ましい実施態様において、ＦＧＦ−２以外のタンパク質（例えば、軟骨モジュリン）が軟骨細胞の展開をさらに改善するために使用される。増殖、分化の潜在能力又は得られる再生した組織の品質を改善する任意の生物活性分子が、本発明に従い使用されうる。
【００３４】
また他の好ましい実施態様において、ティシュエンジニアリングでの使用のための生化学的成長因子の存在下での細胞の展開が、細胞内への核酸のトランスフェクションの効率をまた改善する。典型的に、遺伝子転移は単層の展開の間に行われる。それ故、ティシュエンジニアリング技術が遺伝子治療を組み合わされる適用は、本発明の教示に従い利用されても良い。限定されない例として、細胞は、様々な生物学的及び化学化合物に対する抵抗を付与するベクターを移入されてもよい。これらの化合物は、抗生物質、サイトカイン及び炎症剤を含むがこれらに限られるものではない。
【００３５】
移植
分離された細胞は、新しい組織を形成するために適切な生物分解性の、重合体状基質と組み合わせて移植される。使用され得る２つの形態の基質がある。すなわち、その中に縣濁された細胞を有するアルギネートのような物質で形成されたポリマー状のヒドロゲル、及び約１００から３００ミクロンの間に隙間空間を有する繊維状の基質である。好ましい重合体状基質は、ポリ乳酸−グリコール酸共重体のような約１〜２ヶ月で分解されるものである。基質は、移植される前に接種され得、あるいは移植され、血管新生を可能ならしめ、その後細胞で接種されうる。ヒドロゲルポリマー溶液及びポリマー状基質及び移植の他の方法の詳細な記述のために、米国特許明細書第５，７１６，４０４号を参照せよ。これは、引用することにより明細書に取り込まれる。代謝器官及び他の組織、例えば軟骨組織、を再生するための生物分解性ポリマーを使用するその他の方法のために、例えば（Ｃｉｍａ ら， Ｂｉｏｔｅｃｈｎ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ３８： １４５〜１５８， １９９１年； Ｌａｎｇｅｒ ら， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， １１： ７３８〜７４５， １９９０年； Ｖａｃａｎｔｉ ら， Ｊ． Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｓｕｒｇ．， ２３： ３〜９， １９９８年； Ｖａｃａｎｔｉ ら， Ａｒｃｈ． Ｓｕｒｇ．， １２３： ５４５〜５４９， １９８８年を見よ）、これらすべての文献が、引用することにより明細書に取り込まれる。
【００３６】
いくつかの実施例において、細胞−基質構造は、組織拡張装置と組み合わされて移植される。細胞−基質が移植されると、又は細胞が増殖して新しい組織を形成すると、拡張装置が除かれ得るまで、その大きさは減少し、そして望ましい再構築又は増大が得られる。
【００３７】
前にも述べたように、移植された組織の血管新生を高め及び／又は線維組織の内方生長を阻害する生物活性分子のようなその他の物質は、より正常な組織の発達を加速するために基質と共に移植され得る。
【００３８】
本発明は、以下で次の実施例により例示されるが、本発明の範囲を制限することを意味しない。本発明の範囲内の他の局面、利点及び変更は、発明が属する分野の当業者に明らかである。次の実施例は、当業者に本発明の新規な方法を製造し使用するための完全な開示及び記述を提供することを意図するものであり、発明者がそれらの本発明と見なす範囲をいか様にも制限する意図ではない。
【００３９】
【実施例】
【実施例１】
（哺乳動物の軟骨細胞のインビトロでの展開の最適化においてＦＧＦ−２の使用）
ＦＧＦ−２が、展開期の間に培養培地に添加されたとすれば、軟骨細胞の増殖がより早くなるだけでなく（これは必要とされる組織の初期の量及び／又は要求される時間を減少する）、それらは軟骨組織の等価物を再生するためのより高い潜在能力を維持するということを結果が示す。
【００４０】
ウシの関節の軟骨細胞は、単層で展開された。培養培地への５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２の添加により、増殖速度は有意に増加した（ＦＧＦ−２のあり及びなしで展開される細胞のための倍加時間はそれぞれ１３．９±０．６及び１８．９±１．０時間であった。）。ＦＧＦ−２（５ｎｇ／ｍｌ）のあり及びなしで約１０倍加にまで展開されたウシの軟骨細胞ならびに新鮮に採取された初期の軟骨細胞は、前記したように生物分解性のポリマー足場（ポリ（グリコール酸），ＰＧＡで作られた不織布網）の上に接種された（Ｆｒｅｅｄ ら，前記）。得られた細胞−ポリマー構造物は、インスリン５ｎｇ／ｍｌの添加のなし（対照）又はありで１０％の胎児ウシ血清を含む培地中で培養された。ＦＧＦ−２は、この段階ではいかなる群においても培地に補給されなかった。培養６週間後、構造物は吸い取り紙で乾燥され、重量がはかられ、軟骨組織の細胞外基質の主な構成成分であるグリコサミノグリカンの含量について生化学的に評価された（ＧＡＧ；図１）。繰り返しのサンプルが組織学的に処理され、コラーゲンＩＩ型について染色された（図２及び図４）。
【００４１】
ＦＧＦ−２で展開した軟骨組織は、対照の培地で展開された軟骨組織を基礎としたものよりもサイズで優位に大きい軟骨組織構造物を再生することができ、かつ新鮮に採取した軟骨細胞に基づく構造物の大きさに近づいた（図１Ａ）。培養培地へのインスリンの添加は、新鮮に採取した軟骨細胞及びＦＧＦ−２で展開した軟骨細胞を基礎とした構造物の最終的な重量の有意な増加をもたらした。一方、対照の培地で展開された軟骨細胞は、有意にインスリンに敏感ではなかった。
【００４２】
新鮮に採取された軟骨細胞を基礎とした構造物中のＧＡＧ画分（構造物の湿重量のパーセント）は、ＦＧＦ−２で展開され軟骨細胞を基礎とした構造物中のそれと匹敵し、かつ対照の培地中で展開された軟骨細胞を基礎とした構造物中のそれよりも有意に高かった。同じ傾向が、インスリンが培養培地に加えられた場合に観察された（図１Ｂ）。コラーゲンＩＩ型は、初代及びＦＧＦ−２で展開した軟骨細胞を基礎とした構造物中に豊富であり、ＦＧＦ−２なしに展開された細胞の場合では検知できなかった。
【００４３】
軟骨細胞の展開の間のＦＧＦ−２の存在は、最初の経過の間の増殖速度を増加し（表１）、ＡＰ（表１）及びコラーゲンＩＩ型（図２）の減少した発現により評価された様に、脱分化の過程を加速した。ＡＰ活性は、継続的な過程と共に、かつＦＧＦ−２の存在下より高い速度で減少した（表１）。コラーゲンＩＩ型は、一般的にＰ１軟骨細胞中に検出された。しかし、陽性である細胞の画分及び染色の強度は、両方ともＦＧＦ−２なしに展開された細胞について高かった（図２Ａ及び図２Ｂ）。コラーゲンＩＩ型は、ＦＧＦ−２なしに展開されたほんのわずかなＰ２細胞により表現され（図２Ｃ）、ＦＧＦ−２ありで展開されたいかなるＰ２細胞中で検出されなかった（図２Ｄ）。コラーゲンＩ型はＦＧＦ−２のあり又はなしで展開された細胞中に同様のレベルで表現されていた（データは示さず）。
【００４４】
ＦＧＦ−２なしに展開された軟骨細胞は、長く、太いＦ−アクチン繊維を示し、これは第２経過で後に特に明らかであった（図３Ａ）。一方、ＦＧＦ−２の存在下に展開された軟骨細胞は、Ｆ−アクチンについて拡散した標識を示した（図３Ｂ）。加えて、最初の継代中のみにＦＧＦ−２ありでかつ第２継代中ではＦＧＦ−２なしで展開された軟骨細胞は太いＦ−アクチン繊維を発達した（図３Ｃ）。一方、最初の継代の間にＦＧＦ−２なしでかつその後第２継代の間にＦＧＦ−２ありで展開された軟骨細胞は、Ｆ−アクチンについて拡散した細胞質染色を示した（図３Ｄ）。大きく、広がった細胞の形態学は、太いＦ−アクチン繊維の存在と関連するようであった（図３）。
【００４５】
【実施例２】
（ヒト軟骨細胞の展開）
ヒト軟骨細胞が、大腿頸部骨折又は柔軟組織の腫瘍切除に続いて接合置換を受けている２５才から６６才の患者の股及びくるぶしの関節表面から単離された。細胞は、ＦＢＳ１０％を含むＤＭＥＭ中で１６日間単層で展開され（２経過、約５〜９倍加）、ＦＧＦ−２、形質転換成長因子−β１（ＴＧＦβ），表皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板誘導成長因子−ｂｂ（ＰＤＧＦ）、又はＴＧＦβ及びＦＧＦ−２の組み合わせ（Ｔ＋Ｆ）を補給された。軟骨細胞の倍加時間は、前記した通りに得られた。各々の継代後、特定の遺伝子の表現（コラーゲンＩ型及びＩＩ型、アグレカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）及びベルシカン（ｖｅｒｓｉｃａｎ））が、タックマン（ＴａｑＭａｎ）蛍光に基づく実時間の、定量的なＰＣＲ分析を使用し、転写レベルで研究された。分化の程度は、ｍＲＮＡレベルでコラーゲンＩＩ型対コラーゲンＩ型（ＣＩＩ／ＣＩ）又はアグレカン対ベルシカン（ＡＧＧ／ＶＥＲ）の比として評価された。ＦＧＦ−２のあり及びなしで展開された初期の及びＰ２軟骨細胞は、ＰＧＡ網の上に接種され、培養されそしてウシの軟骨細胞について上記したように評価された。試験された種々の因子の存在下で展開された初期の及びＰ２軟骨細胞はまた、ポリプロピレン製コニカルチューブ中で遠心されて球状のペレット（５×１０５　細胞／ペレット）を形成した。ペレットは、血清及びインスリンを含むＤＭＥＭ中、又はインスリン、ＴＧＦβ、及びデキサメタゾンを含むＤＭＥＭからなる規定された培地（無血清）中のいずれかで２週間の間培養された。ペレットは、組織学的に、生化学的に、及び定量ＰＣＲ法を使用して評価された。３つの独立した実験由良の重複したサンプルが、解析された。
【００４６】
単層中で展開期の間に試験された因子のすべてのうち、ＦＧＦ−２は、特にＴＧＦβと組み合わせて使用されたとすれば、ヒトの軟骨細胞の増殖速度を最も増加させた一つである（対照、ＦＧＦ−２及びＴＧＦβ＋ＦＧＦ−２を補給された培地で培養された細胞の倍加時間は、それぞれ７６．６±３．９，４７．４±２．０及び３８．２±２．９時間であった）。細胞の増殖速度は、分化の段階と反対の関係であった。対照条件下で展開されたＰ２軟骨細胞は、展開の前の初期の軟骨細胞で測定されたものの平均２％であるＣＩＩ／ＣＩ及びＡＧＧ／ＶＥＲ比を有し、かつこれらの比は、細胞がＦＧＦ−２又はＴＧＦβ＋ＦＧＦ−２の存在下で展開されたとすれば、０．３％及び０．００２％に各々さらに減少した。ペレット培養中の展開された軟骨細胞の再分化は、ペレットが規定された培地中で培養されたとすれば、血清を含む培地と対照的に、細胞展開の条件に関わりなくＣＩＩ／ＣＩ比が約４倍高かったことを示した。最も高い分化の程度は、ＴＧＦβ＋ＦＧＦ−２（ＣＴＲ）を基礎とするペレット中で検出された。ＴＧＦβ＋ＦＧＦ−２のペレット中では、ＣＩＩ／ＣＩ及びＡＧＧ／ＶＥＲ比は、ＣＴＲペレット中よりそれぞれ５０倍及び３倍高く、かつ両比は初期の軟骨細胞を基礎とするペレット中で測定された価の５０％という高さであった。
【００４７】
結果は、最も高い増殖速度及び最も加速された脱分化を誘発する条件下で展開された軟骨細胞は、３次元環境に移転された際、分化プログラムに再入する最も良い能力を示している軟骨細胞であることを示した。特に、ＰＧＡ網上で培養された継続的に継代されたウシ軟骨組織は、ＦＧＦ−２の存在下で展開されさえすれば、初期の軟骨細胞で観察されるそれらに匹敵する速度程度まで、軟骨組織を再生した。加えて、ペレットとして規定された培地中で培養された継続的に継代された大人のヒト軟骨細胞は、ＴＧＦβ＋ＦＧＦ−２の存在下で展開されたとすれば、初期の軟骨細胞について測定されたレベルのほぼ５０％という、最も高いレベルの分化標識を発現した。
【００４８】
【図面の簡単な説明】
【図１】
（図１Ａ）図１Ａは、初期の軟骨細胞又はインスリンの存在又は不存在下で、ＦＧＦ−２のあり又はなしで展開された軟骨細胞のいずれかから成長されたエンジニアアリングされた構造物の重量を表したグラフである。
（図１Ｂ）図１Ｂは、初期の軟骨細胞又はインスリンの存在又は不存在下で、ＦＧＦ−２あり又はなしで展開された軟骨細胞のいずれかから成長された構造物のグリコサミノグリカンの湿重量％を表したグラフである。
【図２】軟骨細胞の単層のコラーゲンＩＩ型染色。軟骨細胞は、初代（Ａ，Ｂ）及び第２代（Ｃ，Ｄ）の継代後に、ＦＧＦ−２なし（Ａ，Ｃ）又はあり（Ｂ、Ｄ）で展開された。ＦＧＦ−２で展開された軟骨細胞は、ＩＩ型コラーゲンのより低いレベルを示し、これはより早くかつより均質な脱分化を示唆する。尺度棒＝１００μｍ。
【図３】軟骨細胞の単層のＦ−アクチン染色。軟骨細胞は、ＦＧＦ−２なし（Ａ）、ＦＧＦ−２あり（Ｂ）の培地中、及び初代継代の間のみ（Ｃ）又は第２世代継代の間のみ（Ｄ）のＦＧＦ−の入った培地中で、２継代間にわたり展開された。ＦＧＦ−２なしで展開された軟骨細胞は、太いＦ−アクチン繊維を示した。尺度棒＝１０μｍ。
【図４】軟骨細胞ポリマー構造物のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）及びコラーゲンＩＩ型染色。初代軟骨細胞を基礎とする構造物（Ｉ）、及び培養の１週間後（Ａ，Ｂ，Ｃ）及び６週間後（Ｄ，Ｅ，Ｆ）の、ＦＧＦ−２なし（ＩＩ）及びＦＧＦ−２あり（ＩＩＩ）で２継代間展開された軟骨細胞を基礎とする構造物。組織的断片は、ＧＡＧ（Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｅ）のためにサフラニンＯで、又はＩＩ型コラーゲン（Ｃ，Ｆ）に対するモノクロナール抗体で染色された。初代及びＦＧＦ−２で展開した軟骨細胞は、高濃度のＧＡＧ及びＩＩ型コラーゲンを含む連続的なＥＣＭを沈着した。一方、ＦＧＦ−２なしに展開された軟骨細胞は、ポリマー足場の収縮を誘導し、かつ低量のＣＡＧ及び検出できない量のＩＩ型コラーゲンを有する構造物を結果した。矢印はポリマー繊維を示している。尺度棒＝２ｍｍ（Ａ，Ｄ）又は１００μｍ（Ｂ，Ｃ，Ｅ，Ｆ）。
【図５】軟骨細胞−ポリマー構造物のＦ−アクチン染色。初代の軟骨細胞を基礎とする構造物（Ａ）、及び１週間の間培養されたＦＧＦ−２なし（Ｂ）及びＦＧＦ−２あり（Ｃ）で２継代間展開された軟骨細胞を基礎とする構造物。初代の及びＦＧＦ−２で展開された細胞は、分化した軟骨細胞の典型的な球状の形態を有していた。一方、ＦＧＦ−２なしで展開された細胞は、細胞質中に豊富なＦ−アクチン構造を有する、細長い、線維芽細胞様の外観を有していた。矢印は、残余のポリマー繊維を示す。縮尺棒＝２０μｍ。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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