(57)【要約】少なくともＥＤＴＡの一つの塩を含む殺菌組成物を開示する。これらの組成物は広いスペクトルの抗菌活性及び抗真菌活性、並びに抗凝血性を有している。この殺菌組成物はまた、微生物スライムまたはバイオフィルムに浸透し破壊するという働きを示した。これらはまた、ヒト及び医療用途について安全であり、そして感染症を予防するために、または現存のまたは既存の感染症の増殖を低減するため及び／またはそれらの感染症を除去するために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも０．０１％ｗ／ｖの濃度のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の少なくとも一つの塩及び少なくとも一つの溶媒を含む殺菌溶液であって、前記溶液が少なくとも８．０のｐＨを有し、そして広いスペクトルの細菌に対して抗細菌活性を有する、前記溶液。
【請求項２】
前記溶液が８．５乃至１２．５のｐＨを有する、請求項１に記載の溶液。
【請求項３】
前記溶液が９．５乃至１１．５のｐＨを有する、請求項２に記載の溶液。
【請求項４】
前記溶液が１０．５乃至１１．５のｐＨを有する、請求項３に記載の溶液。
【請求項５】
前記ＥＤＴＡの少なくとも一つの塩が、二ナトリウムＥＤＴＡ、三ナトリウムＥＤＴＡ、四ナトリウムＥＤＴＡ、アンモニウムＥＤＴＡ、二アンモニウムＥＤＴＡ、カリウムＥＤＴＡ、二カリウムＥＤＴＡ、銅二ナトリウムＥＤＴＡ、マグネシウム二ナトリウムＥＤＴＡ、鉄ナトリウムＥＤＴＡ、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、請求項１に記載の溶液。
【請求項６】
前記ＥＤＴＡの少なくとも一つの塩が、三ナトリウムＥＤＴＡ、四ナトリウムＥＤＴＡ、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、請求項５に記載の溶液。
【請求項７】
前記ＥＤＴＡの少なくとも一つの塩が、０．２％ｗ／ｖ乃至１０．０％ｗ／ｖの濃度で存在している、請求項１に記載の溶液。
【請求項８】
前記ＥＤＴＡの少なくとも一つの塩が、０．２％乃至６．０％ｗ／ｖの濃度で存在している、請求項７に記載の溶液。
【請求項９】
前記ＥＤＴＡの少なくとも一つの塩が、０．２％乃至４．０％ｗ／ｖの濃度で存在している、請求項８に記載の溶液。
【請求項１０】
前記溶媒が、水；食塩水、アルコール、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、請求項１に記載の溶液。
【請求項１１】
前記溶媒が、水とエタノールの組み合わせである、請求項１０に記載の溶液。
【請求項１２】
前記溶液が、０．１％乃至１０％ｖ／ｖのエタノールを含む、請求項１１に記載の溶液。
【請求項１３】
前記溶液が、プランクトン性形態または固着形態の細菌に対して抗細菌活性を有する、請求項１に記載の溶液。
【請求項１４】
前記溶液が：
（ａ）抗凝血活性；
（ｂ）真菌性病原菌に対する抗真菌活性；
（ｃ）原生動物感染症に対する阻害活性；
（ｄ）アメーバ感染症に対する阻害活性；
（ｅ）少なくとも適度な量で患者と接触した場合の安全性及び生体適合性；
（ｄ）少なくとも適度な量で患者の血流と接触した場合の安全性及び生体適合性；及び
（ｅ）工業的対象物及び表面との安全性及び適合性、
からなる群から選択される少なくとも一つの特性を有する、請求項１に記載の溶液。
【請求項１４】
前記溶液が、無菌及び発熱物質を含まない、請求項１に記載の溶液。
【請求項１５】
溶媒との再構成によって請求項１の溶液を形成する、請求項１の殺菌溶液の乾燥形態。
【請求項１６】
表面及び対象物への局所使用に適した請求項１の溶液の製剤。
【請求項１７】
長期間にわたって殺菌活性を示す、請求項１の溶液の徐放性製剤。
【請求項１８】
溶媒及び０．０１％乃至１５％ｗ／ｖの濃度の少なくとも一つのナトリウムＥＤＴＡ塩を含む殺菌溶液であって、前記溶液が少なくとも９．０のｐＨを有し、そして広いスペクトルの細菌に対して抗細菌活性を有する、前記溶液。
【請求項１９】
前記溶媒が、水；食塩水、アルコール、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、請求項１５に記載の溶液。
【請求項２０】
本質的に、少なくとも０．０１％ｗ／ｖの濃度のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の少なくとも一つの塩及び少なくとも一つの溶剤とからなる殺菌溶液であって、前記溶液が少なくとも８．０のｐＨを有し、そして広いスペクトルの細菌に対して抗細菌活性を有する、前記溶液。
【請求項２１】
前記溶液が８．５乃至１２．５のｐＨを有する、請求項２０に記載の溶液。
【請求項２２】
前記溶液が９．５乃至１１．５のｐＨを有する、請求項２０に記載の溶液。
【請求項２３】
前記溶液が１０．５乃至１１．５のｐＨを有する、請求項２０に記載の溶液。
【請求項２４】
前記ＥＤＴＡの少なくとも一つの塩が、二ナトリウムＥＤＴＡ、三ナトリウムＥＤＴＡ、四ナトリウムＥＤＴＡ、アンモニウムＥＤＴＡ、二アンモニウムＥＤＴＡ、カリウムＥＤＴＡ、二カリウムＥＤＴＡ、銅二ナトリウムＥＤＴＡ、マグネシウム二ナトリウムＥＤＴＡ、鉄ナトリウムＥＤＴＡ、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、請求項２０に記載の溶液。
【請求項２５】
前記ＥＤＴＡの少なくとも一つの塩が、三ナトリウムＥＤＴＡ、四ナトリウムＥＤＴＡ、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、請求項２４に記載の溶液。
【請求項２６】
前記ＥＤＴＡの少なくとも一つの塩が、０．０２％ｗ／ｖ乃至１０．０％ｗ／ｖの濃度で存在している、請求項２０に記載の溶液。
【請求項２７】
前記ＥＤＴＡの少なくとも一つの塩が、０．０２％乃至６．０％ｗ／ｖの濃度で存在している、請求項２６に記載の溶液。
【請求項２８】
前記ＥＤＴＡの少なくとも一つの塩が、０．０２％乃至４．０％ｗ／ｖの濃度で存在している、請求項２７に記載の溶液。
【請求項２９】
前記溶媒が、水；食塩水、アルコール、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、請求項２０に記載の溶液。
【請求項３０】
前記溶媒が、水とエタノールの組み合わせである、請求項２９に記載の溶液。
【請求項３１】
前記溶液が、０．１％乃至１０％ｖ／ｖのエタノールを含む、請求項２９に記載の溶液。
【請求項３２】
前記溶液が、プランクトン性形態または固着形態の細菌に対して抗細菌活性を有する、請求項２０に記載の溶液。
【請求項３３】
表面または対象物を請求項１乃至３２のいずれか一項に記載の溶液と接触させることを含む、表面または対象物上若しくは対象物内部の少なくとも一つの望ましくない微生物の個体群の成長及び増殖を阻害するための方法。
【請求項３４】
前記望ましくない微生物が、細菌個体群、真菌性病原菌、原生動物個体群及びアメーバ個体群からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記望ましくない微生物がアカントアメーバである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記表面または対象物が、カテーテル；医療用チューブ及び導管；血管内器具；埋め込まれた医療用器具；医療用または獣医科用装置；コンタクトレンズ；眼用埋め込み物；歯科用、矯正歯科用または歯周用の器具；水の保存、分配及び処理施設；工業用装置；及び食品生産及び加工装置、からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
バイオフィルムを請求項１乃至３２のいずれか一項に記載の溶液と接触させることを含む、バイオフィルムの成長及び増殖を阻害するための方法。
【請求項３８】
請求項１乃至３２のいずれか一項に記載の溶液に浸漬されている、傷治療における使用のためのカバー。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、多様な医療用途並びに工業的及び環境的衛生用途を含む一般的な衛生用途における使用のための殺菌組成物、方法及びシステム、に関する。本発明の組成物は、抗微生物、抗真菌、抗ウイルス及び抗アメーバ特性を有しており、また抗凝血剤としても作用することができる。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（Ｃ１０Ｈ１２Ｎ２Ｎａ４Ｏ８）の特定の塩及び組成物が特定の濃度及びｐＨレベルで用いられる。典型的な用途は、表面上または溶液中の微生物及び／または真菌生物、またはバイオフィルム等の複雑な形態中の微生物及び／または真菌生物、の存在を阻害し、低減しまたは除去することを含む。典型的な方法は、感染症の発生率を低減するために対象物の表面に抗菌コーティングを備えること、及び、微生物群の増殖を阻害し、または微生物群を低減または除去するために、洗い流す、浸す及び／またはすすぐことによって対象物及び／または表面を殺菌溶液に接触させることを含む。
【０００２】
発明の背景及び先行技術の説明
医療分野等の衛生条件が重要である多くの分野において感染症は重大な問題である。問題となる感染症は細菌、真菌、アメーバ、原生動物及び／またはウイルスによってもたらされる。かつて確立されていた、感染症を予防すること及び／または感染症を低減または除去すること、の両面において難問に直面している。感染する環境は、対象物の表面、流動体及び流動管、及び／またはヒトまたは動物を含む。
【０００３】
アルコール溶液及びイソプロピルアルコールワイプが表面の消毒に一般に使用されており、そして抗細菌活性を持つことが示されている。最も有効な抗微生物阻害作用は７０％イソプロパノール溶液において見られる。この濃度のアルコール溶液はかなり高価でありそして容易に揮発する。そしてこのことが、実質的にそれらの有効性を損ない、またその費用を増加させている。さらに、イソプロパノール溶液はヒトの皮膚を含む表面及び多くの医療用途に対して使用することができるが、この濃度のアルコール溶液は、局所的な適用以外では医療目的でヒトに投与することができない。
【０００４】
ヘルスケア分野においては、多様な型及び原因の感染症が一般的であり、そしてしばしば入院を長期化させることになり、そのことが高い入院費用につながっている。さらに悪いことに、年間９０，０００以上の患者の死亡が院内感染−すなわち、病院または他の医療環境において獲得された感染症−に起因すると考えられている。院内感染に対する監視は医療活動の不可欠な要素になっている。疾病管理予防センター（ＣＤＣ）によって２０年以上前に行われた研究は、院内感染の発生を減少させることに対するこれらの監視活動の有効性を実証している。しかしながら、院内感染問題に向けられた注意にもかかわらず、感染症の比率が劇的に減少してはおらず、依然として院内感染は重要なリスク及び健康上の問題である。
【０００５】
医療分野及び獣医分野での感染症の原因の問題となる一つは、カテーテル、特に留置（ｉｎ−ｄｗｅｌｌｉｎｇ）カテーテルに見られる。カテーテルは救命救急患者の管理において不可欠なものとなっているが、カテーテルの内部はしばしば感染症の主要な原因である。カテーテルは流動体、血液生産物、薬剤及び栄養剤の搬送のために使用されており、また、血液透析、血液ろ過、腹膜透析、血液サンプルの返却及び患者の状態の観察等のためにも使用されている。経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）カテーテルはしばしば、カテーテルの皮膚貫通によって感染される。総ての院内血流感染の７０％が中心動脈カテーテルを使用した患者において発生していることが見つけられた：Ｄａｏｕｉｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４０：１−８（１９９９）。
【０００６】
特に、ある処置の間、比較的長期間（例えば３０日以上）、カテーテルは患者に埋め込まれ続けられなければならない。静脈内（ＩＶ）療法カテーテル及び尿道カテーテルは、通常、かなりの期間にわたって埋め込まれている。挿入部分への外傷及び患者への痛みのため、そのようなカテーテルは、高い頻度で取り出したり埋め込んだりすることができない。カテーテルで運ばれた細菌が尿路感染症の主要な原因と考えられている。妊娠中に末梢穿刺中心静脈カテーテルを経験する患者は感染合併症について重大なリスクにさらされているということがわかった：Ｏｇｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１８８（５）：１２２３−５（２００３）。さらに、カテーテルが原因の敗血症につながる中心静脈カテーテル感染症は、家庭での非経口的栄養法の間に最も頻度の高い合併症として挙げられている：Ｒｅｉｍｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，２１（１）：３３−３８（２００２）。感染症の危険のために、カテーテル法は、その処置が絶対に必要になった場合に限られるであろう。このことは患者の生命を著しく危うくする。
【０００７】
カテーテルを含む最も処方される医療手段手順の後、カテーテルは食塩水で洗い流される。そして、カテーテル内で血液が凝固することを防ぎ、患者の血液がカテーテルに逆流することを妨げ、そしてカテーテル内にガスが入ることを防ぐために、カテーテルは食塩水またはヘパリン等の液体で満たされる。カテーテルを洗い流すことに使用される液体は“ロック−フラッシュ（ｌｏｃｋ−ｆｌｕｓｈ）”と呼ばれ、そして、洗い流された後または使用しない間、カテーテルを満たすために使用される液体は“ロック（ｌｏｃｋ）”溶液と呼ばれる。
【０００８】
伝統的に、生理食塩水または抗凝血活性をもたらすヘパリン溶液によってカテーテルはロック（ｌｏｃｋｅｄ）されている。ヘパリンと食塩水は、しばしば組み合わせて使用される。生理食塩水は、一般に、末梢静脈カテーテルを短期間ロックするために使用され、そして抗凝血性または抗菌活性を有していない。ヘパリン溶液は、一般に、血管カテーテルをロックするために使用される。ヘパリンは抗凝血活性を有しているが、抗菌剤としては作用せず、そして感染を予防または改善しない。また、ロック溶液中のヘパリンがヘパリン−誘起の血小板減少症（ヘパリン注入を受けた患者の集団で発生する重大な出血性の合併症である）に関与しているであろうということについての強い示唆がある。
【０００９】
タウロリジン（Ｔａｕｒｏｌｉｄｉｎｅ）、クエン酸及びクエン酸ナトリウムを含むカテーテルロック溶液が提案されている。最近の刊行物（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２００２年９月）は、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）カテーテルポートのロック溶液として７０％アルコール溶液を使用することを記載している。抗凝血性ではなく、その溶液が血流に混入することに伴う危険があるので、ロック溶液としてのアルコールの使用は疑問である。発明者らは、また、７０％アルコール溶液がバイオフィルムを根絶する活性を有しているということを示す証拠を知らない。
【００１０】
新たな傾向及び感染症センター（ＣＩＤ）の推奨は、既存のカテーテル感染症を特定のまたは広範囲の抗生物質で体系的に処置することである。感染症を予防するためのロック溶液中での抗生物質の使用は推奨できない。既存のカテーテル感染症を処置するための抗生物質の使用はある種のリスクを含んでいる。そのリスクは、（１）抗生物質耐性菌株の発達の危険、（２）固着性（ｓｅｓｓｉｌｅ）または深層（ｄｅｅｐ−ｌａｙｅｒ）のバイオフィルム、細菌を死滅させられないという抗生物質の能力（それらを死滅するには毒となる濃度での抗生物質の使用を必要とするであろう）、及び（３）長期に及ぶ抗生物質治療の高い費用、を含む。殺菌性材料または抗生物質材料で被覆されたカテーテルも利用可能である。しかし、これらの被覆カテーテルは比較的短期間での限られた防御を提供するだけであろう。
【００１１】
一般に、浮遊性（ｆｒｅｅ−ｆｌｏａｔｉｎｇ）の微生物は抗生物質に対して弱いようである。しかしながら、細菌及び菌類は、表面上に凝集しそして粘液性の保護物質（しばしば、バイオフィルムを形成する細胞外高分子物質（ＥＰＳ）と呼ばれる）を生じることによって抗生物質に影響されなくなるようである。微生物が増殖すると、５０より多い遺伝的なアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションが起こり、そのことがより抗生物質に耐性の微生物バイオフィルムの形成につながっているようである。医師が接触する細菌性感染症の三分の二はバイオフィルムに起因すると考えられている：Ｎｅｔｔｉｎｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｎｅｗｓ，１６０：２８（２００１）。
【００１２】
バイオフィルム形成は細菌のライフサイクルにおける遺伝子的に調節された過程であり、それは、生物の細胞の生理機能に多数の変化をもたらし、その変化は、しばしば、プランクトン性（浮遊性）条件下での成長に比べて増加した（１００〜１０００倍に至る）抗生物質耐性を含む。生物が成長し、過密及び栄養素減少の問題が、新しい場所及び資源を捜し求める生物の発散（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）を引き起こす。新しく散らばった（ｓｈｅｄ）生物は速やかに元の浮遊性の段階に戻り、そして再び抗生物質に弱くなる。しかしながら、浮遊性の生物は患者の血流に入ることができ、そして、このことが、発熱等の臨床的徴候及びより重大な感染症に関連した症状を生じる血流感染症を引き起こす。バイオフィルムの固着性のラフト（ｒａｆｔｓ）ははがれ落ちそして心臓弁等の組織表面に付着する。そして、このことがバイオフィルムの増殖と心内膜炎等の重大な問題を引き起こす。
【００１３】
工業的環境において、バイオフィルムの形成はよく起こることであり、一般に生物付着と呼ばれている。例えば、ろ過装置等の機械構造上でのバイオフィルム成長は、飲料水分配システムの生物的汚染の主な要因である。工業的環境でのバイオフィルム形成は材質の劣化、生成物の汚染、機械の閉塞及び処理システムでの熱移動の障害となり得る。バイオフィルムの形成と結果として起こる汚染は、また、食品生産及び加工施設における一般的な問題である。
【００１４】
さらに事が複雑なのは、既存の感受性試験はバイオフィルム状態ではなく浮遊性の生物の抗生物質感受性だけを測定していることである。その結果、カテーテル等を通して、カテーテルに存在しているであろうバイオフィルム段階の生物に所望の効果をほとんど示さない量で抗生物質が患者に投与されることになる。バイオフィルム生物は、より浮遊性の生物を発散し続けるか、または不活発な状態となりそして明白な再発性感染症として増殖し得る。
【００１５】
抗生物質の使用によってバイオフィルムを撲滅するためには、生物の特定の遺伝子的なバイオフィルム段階を死滅させるために必要とされる抗生物質の濃度を決定しなければならない。バイオフィルム撲滅のための最小濃度を提供するには高度に特化した装置が必要とされる。さらに、現在の診断手順は時間のかかるものであり、しばしば数日間（例えば５日間）、結果を得ることができない。この時間は、感染症の迅速な治療を不可能にする。この遅延及び感染症に対する正当化できる不安が、広いスペクトルの抗生物質の過度の使用及び継続した不要なカテーテルの撤去交換手順をもたらしている。広いスペクトルの抗生物質の過度の使用は、効果的に治療できない抗生物質耐性細菌菌株の発達をもたらし得る。不要なカテーテルの除去交換は痛み及び費用を伴い、そして、カテーテル挿入部位の外傷及び組織の損傷をもたらすであろう。
【００１６】
抗生物質耐性菌株の発達のリスク等の抗生物質使用の複雑さと結びついたバイオフィルムの抗生物質耐性は、抗生物質による処置を魅力的でない選択肢としている。結果的に、抗生物質の使用は症候性の感染症に限られており、予防的抗生物質は、汚染を予防するためには一般的には使用されていない。バイオフィルムは多くの抗生物質について選択的な表現型耐性バリアー（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｂａｒｒｉｅｒ）として作用するので、カテーテルに関連する感染症を撲滅するために、カテーテルはしばしば除去されなければならない。カテーテルの除去交換は時間がかかり、患者に緊張を引き起こすものであり、そして医療手順を複雑にする。それゆえ、カテーテルを体から除去する必要なく、生物、特にカテーテルの内部に存在している生物を死滅させるための簡便で効果的な方法に対する要求がある。
【００１７】
細菌性及び真菌性の感染症に加え、アメーバ性の感染症も重大であり、苦痛を伴い、そして生命にかかわる可能性がある。例えば、アカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）のいくつかの種はヒトに感染することが知られている。アカントアメーバは、土壌及び塵中、淡水源、並びに汽水及び海水中で、世界中で見られるものである。それらは、しばしば、暖房、通気及び空調設備、加湿器、透析装置、そしてコンタクトレンズ用品においても見られる。細菌性及び真菌性の感染症に加え、アカントアメーバ性感染症はまた、他の医療器具及び、歯ブラシ、入れ歯及び他の歯科装置等を含む歯科器具と関連して、一般的なものである。アカントアメーバ性感染症はまた、しばしば、ヒトの体に接触するコンタクトレンズ及び他の医療器具の不適切な保存、取扱い及び消毒に起因し、そして、アカントアメーバは傷口及び外傷から皮膚に、そして、鼻孔及び目等に侵入し得る。
【００１８】
問題となる感染症をもたらす多数の異なった種類の病原菌（多様な細菌及び菌類を含む）が存在する。そして、感染症を撲滅するための現行の方法は、一般に、限られた数の異なった病原菌に対して効果のある溶液を使用している。Ｒｏｏｔらは、カテーテルに関連した特定の表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）病原体分離株に対するインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での二ナトリウムＥＤＴＡの使用を述べている（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，３２：１６２７−１６３３（１９８８））。
【００１９】
ＥＤＴＡは伝統的に金属キレート剤として使用されており、また、他の活性化合物と共に多様な目的のために使用されている。ＥＤＴＡは、しばしば、血液標本採集または試験のためのインビトロ抗凝血剤として、そして抗酸化剤共力剤として低濃度で使用される。また、ＥＤＴＡは、例えば、キレート剤、安定剤または医薬製剤の防腐剤として溶液に添加される。ＥＤＴＡは多様な形態で存在することができる。例えば、あるものは二ナトリウム、三ナトリウム及び四ナトリウム塩等の塩の形態であり、また、他は鉄、銅、マグネシウム等の金属キレートである。ＥＤＴＡのある種の形態は、アジュバントとしての他の物質と共に、感染したカテーテルを試験するための組成物において使用されている。臨床場面で使用される場合、またはヒトまたは動物に使用される組成物において使用される場合、その溶液は、通常、生理学的または中性のｐＨ範囲に調整される。
【００２０】
ＥＤＴＡの非ナトリウム塩形等の添加剤とアルコールとの組み合わせがＰＣＴ公報ＷＯ０２／０５１８８に述べられている。ＰＣＴ公報ＷＯ００／７２９０６Ａ１は抗生物質等の抗菌剤とカテーテル洗浄のためのキレート剤としてＥＤＴＡの非ナトリウム塩形であってもよい第二の剤との凍結乾燥混合物について記載している。米国特許Ｎｏ．５６８８５１６には、医療器具を被覆するための、及びカテーテルの感染を防ぐための、抗凝血剤、ＥＤＴＡ等のキレート剤及びミノサイクリン等の抗菌剤を含む組成物が述べられている。そのある実施例では、ＥＤＴＡの二ナトリウム塩形が生理学的ｐＨ７．４にされそしてその組成物において使用されている。ＰＣＴ公報ＷＯ９９／０９９９７は抗真菌剤とＥＤＴＡ等のキレート剤との組み合わせによる真菌感染症の治療について記載している。
【００２１】
感染症が問題となる他の分野は、コンタクトレンズ、強膜バックル（ｓｃｌｅｒａｌ  ｂｕｃｋｌｅｓ）、縫合材料及び眼内レンズ等の眼に関連して使用される医療器具及び材料である。特に、コンタクトレンズ等の義眼を消毒する方法の発達について強調されてきている。細菌性バイオフィルムが眼の感染症に関与しており、そして眼に接触するまたは眼に埋め込まれる非生物的な表面に細菌が生き残ることを可能にしていると考えられる。バイオフィルムはまた、眼の生物的な表面にも形成される：Ｚｅｇａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２１：４１５−２０（２００２）。重症型の角膜炎は、レンズ消毒液を汚染する原生動物アメーバによっても引き起こされ得る。コンタクトレンズの消毒のためのｐＨが６−８に緩衝された四ナトリウムＥＤＴＡ及びアルカリ塩の眼科用の製剤が米国特許Ｎｏ．５３００２９６に記載されている。米国特許Ｎｏ．５９９８４８８はＥＤＴＡとシクロデキストリン及びホウ酸等の他の物質との眼科用の組成物を記載している。
【００２２】
歯科の分野において、歯科器具、及び固定装置、ブリッジ及び入れ歯等の歯科装置及び歯列矯正装置、等の口の中に置かれる器具は無菌状態に維持される必要があり、特に保存中及び口中に置かれる前には無菌状態であることが必要である。そうでなければ、感染が血流中に伝わり、より深刻な問題となり得る。米国特許Ｎｏ．６０７７５０１は、入れ歯洗浄組成物において他の活性成分と共にＥＤＴＡの使用を述べている。
【００２３】
給水もまた細菌性または他のタイプに感染しがちである。貯水装置並びに給水管及び取水管も、しばしば感染する。医療オフィス及び歯科オフィスの液体を運ぶチューブの内部表面は、細菌感染及び成長に適した環境に存在しており、そして、微生物の付着及び防御性の高いバイオフィルム層の形成が、液体貯蔵及び供給装置においてしばしば問題となる。
【００２４】
多様な環境において感染症を予防及び撲滅するための、改良された方法及び組成物に対する要求がある。そのような殺菌溶液は広範な抗微生物特性を有していなければならない。特に、溶液は、バイオフィルムに浸透しバイオフィルム中の生物を撲滅できなければならない。そのような方法及び溶液は予防方法及び既存の感染症の治療方法として十分に安全でなければならない。
【００２５】
発明の要旨
本発明は、生理学的ｐＨより高いｐＨ及び処方される濃度において、ＥＤＴＡの一つまたはそれより多い塩を含む、本質的にＥＤＴＡの一つまたはそれより多い塩からなる、または、ＥＤＴＡの一つまたはそれより多い塩からなる、殺菌組成物を提供する。発明者らは、あるＥＤＴＡ組成物が強力な殺菌活性を有し、広いスペクトルの抗細菌剤として作用し、そして病原性酵母の多くの菌株に対して抗真菌剤として作用するということを発見した。本発明のＥＤＴＡ組成物は、病原性バイオフィルム生物を死滅させること、既存のバイオフィルムを減少及び撲滅すること、及びバイオフィルム形成を予防することについて非常に有効である。本発明のＥＤＴＡ組成物及び組み合わせは、また、抗原生動物活性及び抗アメーバ活性を示す。既存の報告を基にすると、本発明のＥＤＴＡ組成物にはさらに、抗ウイルス活性が期待できる。
【００２６】
本発明のＥＤＴＡ製剤はヒトに対する投与について安全であり、そして、生体適合性があり、非腐食性である。本発明の組成物はまた、抗凝血特性を有し、そしてカテーテルに関連した多様な感染症の予防及び／または治療に有用であり得る。本発明の殺菌溶液は、多様なカテーテルのためのロック溶液またはロックフラッシュ溶液としての用途を含む多くの用途を有しており、また、一連の医療、歯科及び獣医科用の装置、器具、及び他の対象物、表面などを消毒するための殺菌剤及び殺菌溶液としての用途を有している。さらに、本発明の殺菌溶液は、工業的においての、及び食品生産及び取扱い環境おいての、消毒用途を有している。
【００２７】
本発明の殺菌組成物は、感染症を予防するために予防的に使用することができ、また、現存のまたは既存の感染症を低減及び／または除去するために使用することができる。望ましくない微生物をもった対象物または表面の感染を予防または処置するための方法が提供され、そのような方法は、表面または対象物を本発明の組成物と接触させることを含む。本発明の組成物はまた、細菌群及び／または真菌性病原菌の成長および増殖を阻害するために（バイオフィルムの形成及び増殖を阻害することを含む）；原生動物個体群の成長及び増殖を阻害するために；アメーバ個体群の成長及び増殖を阻害するために；そしてアメーバ感染症（特にアカントアメーバ感染症）を予防するために、使用することができる。
【００２８】
本発明はまた、細菌個体群（プランクトン性の細菌個体群及びバイオフィルム形態の細菌個体群の双方を含む）を実質的に撲滅するための方法、及びアカントアメーバ個体群を実質的に撲滅するための方法を提供する。そのような方法は、感染した対象物または表面、または感染が疑われる対象物または表面を本発明の組成物と接触させることを含む。それらの方法に使用される殺菌組成物に依存するが、多様な個体群の形成及び増殖を阻害するために、及び／または多様な個体群を実質的に撲滅するために、多様な接触時間が要求される。いろいろの組成物に対する適切な接触時間は実施例において与えられ、そしてまた、通常の実験によって決定することができる。
【００２９】
一つの実施態様において、本発明の殺菌組成物は以下の特性の少なくとも四つ、好ましくは五つを有する。その特性は、抗凝血特性、プランクトン性形態の多様な細菌に対する阻害活性及び／または抗細菌活性、多様な真菌性病原菌に対する阻害活性及び／または抗真菌活性、固着性またはバイオフィルム形態の多様な細菌に対する阻害活性及び／または抗細菌活性、原生動物感染症に対する阻害活性、アカントアメーバ感染症に対する阻害活性、少なくとも適度な量で患者と接触した場合の安全性及び生体適合性、少なくとも適度な量で患者の血流と接触した場合の安全性及び生体適合性、及び工業的対象物及び表面との安全性及び適合性、である。
【００３０】
本発明の組成物においては、ＥＤＴＡの溶解性の塩が使用される。二ナトリウム塩、三ナトリウム塩及び四ナトリウム塩を含むＥＤＴＡのナトリウム塩が一般に入手可能であり、通常使用される。また、所望の抗菌特性、抗真菌特性、抗原生動物特性及び／または抗アメーバ特性を有しており、そして所望の溶媒に十分に溶解するのであれば、他のＥＤＴＡ塩（アンモニウム塩、二アンモニウム塩、カリウム塩、二カリウム塩、銅二ナトリウム塩、マグネシウム二ナトリウム塩、鉄ナトリウム塩、及びそれらの組み合わせを含む）を使用することもできる。ＥＤＴＡ塩のいろいろな組み合わせを使用することができ、そしてそのような組み合わせは特定の用途では好ましい。重要なことは、ほとんどの実施例において、本発明の実施例及び方法が既存の抗生物質を使用していないことであり、そのため、抗生物質耐性生物の発達に寄与しないということである。
【００３１】
本発明の殺菌組成物は、生理学的ｐＨより高いｐＨの溶液中で、一つまたはそれより多いＥＤＴＡの塩を含む、一つまたはそれより多いＥＤＴＡの塩からなる、または本質的に一つまたはそれより多いＥＤＴＡの塩からなる。好ましくは、そのような組成物は少なくとも８．０のｐＨを有する。好ましくは、本発明の組成物は８．５乃至１２．５、または９．５乃至１１．５、または１０．５乃至１１．５の範囲のｐＨを有する。ＥＤＴＡの塩は、通常、少なくとも０．０１％ｗ／ｖの量で存在する。好ましい実施態様において、本発明の組成物は、ＥＤＴＡの少なくとも一つの塩を０．２％乃至１０％ｗ／ｖ、より好ましくは０．２％乃至６．０％ｗ／ｖ、そして最も好ましくは０．２％ないし４．０％ｗ／ｖの量で含む。
【００３２】
特定の実施態様において、本発明の組成物は、溶媒及び０．０１％乃至１０％ｗ／ｖの濃度の少なくとも一つのＥＤＴＡの塩を含み、または本質的に溶媒及び０．０１％乃至１０％ｗ／ｖの濃度の少なくとも一つのＥＤＴＡの塩からなり、そしてそこにおいて、その溶液は少なくとも９．０のｐＨを有し、そして広いスペクトルの細菌に対する抗菌活性を有する。好ましくは、少なくとも一つのＥＤＴＡの塩は三ナトリウムＥＤＴＡまたは四ナトリウムＥＤＴＡである。溶媒は通常、水、食塩水、アルコール及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。一つの実施態様において、溶媒は水とエタノールの組み合わせである。
【００３３】
本発明の殺菌組成物は多様な型の留置アクセス（ｉｎ−ｄｗｅｌｌｉｎｇ  ａｃｃｅｓｓ）カテーテル（流動体、血液生産物、薬剤及び栄養剤の搬送、流動体または血液の採取、透析、患者の状態の観察等のために使用される血管カテーテルを含む）のためのロック溶液及びロックフラッシュ溶液として使用することができる。本発明の殺菌溶液はまた、尿道カテーテル、鼻腔チューブ及び気管チューブ等のためのロック溶液及びロックフラッシュ溶液として使用することができる。後述の一般的な溶液パラメータはこれらの目的に適したものである。一つの実施態様において、生理学的ｐＨより高いｐＨで、一つまたはそれより多いＥＤＴＡナトリウム塩を含む、一つまたはそれより多いＥＤＴＡナトリウム塩からなる、または本質的に一つまたはそれより多いＥＤＴＡナトリウム塩からなる、殺菌溶液が、留置血管内アクセス器具（ｉｎ−ｄｗｅｌｌｉｎｇ  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ａｃｃｅｓｓ  ｄｅｖｉｃｅｓ）の開通性を維持するために用いられる。また、カテーテル及び他の医療チューブ（鼻腔チューブ、気管チューブ等）を消毒するための方法が提供され、そしてその方法は、カテーテルまたは他の医療チューブを本発明の消毒組成物と接触させることを含む。
【００３４】
別の実施態様において、入れ歯及び他の歯科用、歯列矯正用及び／または歯周用の器具等の医療器具、コンタクトレンズ及び他の眼用の器具、医療用及び獣医科用の装置及び器具、等のための消毒溶液として、及び、表面及び対象物を消毒するための消毒溶液として、生理学的ｐＨより高いｐＨで、一つまたはそれより多いＥＤＴＡのナトリウム塩を含む、一つまたはそれより多いＥＤＴＡのナトリウム塩からなる、または本質的に一つまたはそれより多いＥＤＴＡのナトリウム塩からなる、本発明の殺菌組成物が提供される。また、そのような器具を消毒する方法が提供され、そしてその方法はそのような器具を本発明の殺菌組成物と接触させることを含む。通常、本発明の殺菌組成物は、歯ブラシを含む歯科用、歯列矯正用及び歯周用の器具のための浸漬用の溶液として使用することができる。また、本発明の殺菌組成物は、コンタクトレンズ及び他の眼用の器具、及び医療用及び獣医科用の装置等のための浸漬用の溶液として使用することができる。これらの用途のために、本発明の殺菌組成物は通例、溶液として製剤されるか、または適当な溶媒の添加によって溶液を形成するための乾燥形態として提供される。
【００３５】
さらに他の実施態様において、本発明の殺菌組成物は、殺菌剤、ワイプ及び抗細菌処置等としての局所使用のために設計された溶液、ゲル、クリーム及び他の製剤としての使用のために製剤される。本発明の殺菌組成物はまた、救急絆、包帯、創傷治癒剤及び器具等と関連して抗細菌剤として使用することができる。関連する実施態様において、本発明の組成物の一つ以上に浸漬されている、救急絆及び包帯等の傷治療における使用のためのカバーが提供される。
【００３６】
本発明の殺菌組成物はまた、浮遊形態及び固着形態の双方における微生物個体群、及び多くの真菌、アメーバ及び原生動物の個体群を、阻害、減少または実質的に除去するために、水の貯蔵及び分配システム、水の精製装置、加湿装置及び除湿装置等の工業的環境、及び食品の生産、取扱い及び包装に関する環境において、使用することができる。本発明の殺菌組成物に、工業装置及び表面を接触、洗い流し及び浸漬することができる。また、長期間にわたる処置、特に頻繁に接近することが困難な場所における長期間にわたる処置を提供するために、徐放性の殺菌組成物製剤を提供することができる。
【００３７】
発明の詳細な説明
多くの組成物において、安定剤または保存剤としての他の活性成分との組み合わせで、ＥＤＴＡは低濃度で使用される。本発明の殺菌組成物は、通常、高い濃度のＥＤＴＡを含む。好ましくは本発明の殺菌組成物は、溶液の体積分の質量（ｗ／ｖ）として、少なくとも０．０１％のＥＤＴＡ塩を含み、そして１５％（ｗ／ｖ）までのＥＤＴＡ塩を含むことができる。多くの用途に対して、本発明の殺菌組成物は、好ましくは、少なくとも０．１％（ｗ／ｖ）のＥＤＴＡ塩を含みそして１０％（ｗ／ｖ）より少ないＥＤＴＡ塩を含み、より好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）乃至８．０％（ｗ／ｖ）のＥＤＴＡ塩を含み、最も好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）乃至６．０％（ｗ／ｖ）のＥＤＴＡ塩を含む。後述の例となるな組成物は、水溶液中３．６乃至４．４％（ｗ／ｖ）のＥＤＴＡ塩を含み、または、水とエタノールの混合物中０．０１乃至０．２％（ｗ／ｖ）のＥＤＴＡを含む。
【００３８】
多様な用途に対する望ましいＥＤＴＡ塩の濃度は、使用されるＥＤＴＡ塩またはその組み合わせ、処置される感染症の型に依存し、また、殺菌組成物に使用される溶媒にもある程度依存する。例えば、エタノールを含む水性溶媒が使用された場合、所望のレベルの活性を与えるのに必要とされるＥＤＴＡ塩の濃度は、溶媒として水を使用した組成物において使用されるＥＤＴＡ塩の濃度に比較して小さくすることができる。後述の典型的なデータに示すように、一つ以上のＥＤＴＡ塩を含む殺菌組成物は、０．０１％乃至３０％またはそれより高い範囲の濃度で、阻害及び／または殺菌効果を示した。阻害、殺菌、抗真菌、バイオフィルム撲滅及び他の目的のための本発明の殺菌組成物における望ましいＥＤＴＡ塩の“有効な”濃度は、後述の実施例において述べるように通常の実験によって決定することができる。
【００３９】
英国薬局方（ＢＰ）は、二ナトリウムＥＤＴＡの５％溶液は４．０乃至５．５のｐＨを有すると明記している。ＢＰはまた、三ナトリウムＥＤＴＡの溶液について７．０乃至８．０のｐＨ範囲を明記している。水溶液中での他のＥＤＴＡ塩のｐＨ値は後の実施例１０に記載している。生理学的ｐＨにおいてＥＤＴＡのナトリウム塩は二ナトリウムＥＤＴＡ及び三ナトリウムＥＤＴＡの混合物として存在しており、そしてＥＤＴＡの三ナトリウム塩が優勢である。米国においては、注射のために調製される薬剤の“二ナトリウム”ＥＤＴＡは、一般に、水酸化ナトリウムでの滴定で６．５乃至７．５のｐＨである。このｐＨにおいて、ＥＤＴＡ溶液は、実質的には、より少ない割合の二ナトリウム塩と共に、主に三ナトリウムＥＤＴＡを含む。医療またはヘルスケア用途で使用されるＥＤＴＡのナトリウム塩を含む他の組成物は、通常、実質的に生理学的なｐＨに調節されている。
【００４０】
ある実施態様において、本発明の殺菌組成物は、生理学的ｐＨより高いｐＨ、好ましくは８．０より大きいｐＨ、８．５より大きいｐＨ、９より大きいｐＨ、９．５より大きいｐＨまたは１０より大きいｐＨの溶液中で、ＥＤＴＡのナトリウム塩（または複数のＥＤＴＡのナトリウム塩の組み合わせ）を含む、本質的にＥＤＴＡのナトリウム塩（または複数のＥＤＴＡのナトリウム塩の組み合わせ）からなる、またはＥＤＴＡのナトリウム塩（または複数のＥＤＴＡのナトリウム塩の組み合わせ）からなる。別の実施態様において、本発明の殺菌組成物は、８．５乃至１２．５のｐＨ、または９．５乃至１１．５のｐＨ、または１０．５乃至１１．５のｐＨの溶液中で、ＥＤＴＡのナトリウム塩（または複数のＥＤＴＡのナトリウム塩の組み合わせ）を含む、本質的にＥＤＴＡのナトリウム塩（または複数のＥＤＴＡのナトリウム塩の組み合わせ）からなる、またはＥＤＴＡのナトリウム塩（または複数のＥＤＴＡのナトリウム塩の組み合わせ）からなる。本明細書において、“ＥＤＴＡ塩”との語は二ナトリウム塩、三ナトリウム塩または四ナトリウム塩、または他のＥＤＴＡ塩等の単一の塩を意味することができ、また、それらの塩の組み合わせを意味することができる。ＥＤＴＡ塩の組成は、その組成物を製剤するために使用されるＥＤＴＡ塩及びその組成物のｐＨの双方に依存する。所望のｐＨ範囲（上述）でＥＤＴＡのナトリウム塩を含む本発明の殺菌組成物については、ＥＤＴＡのナトリウム塩は主に二ナトリウム塩形及び三ナトリウム塩形の両方で存在している。
【００４１】
一つの実施態様において、本発明の殺菌組成物は、ＥＤＴＡの少なくとも三ナトリウム塩及び四ナトリウム塩の組み合わせを含む、または本質的にＥＤＴＡの少なくとも三ナトリウム塩及び四ナトリウム塩の組み合わせからなる。別の実施態様において、本発明の殺菌組成物は、ＥＤＴＡの少なくとも三ナトリウム塩及び四ナトリウム塩の組み合わせを含み、または本質的にＥＤＴＡの少なくとも三ナトリウム塩及び四ナトリウム塩の組み合わせからなり、そしてその組成物においてＥＤＴＡの少なくとも１０％は四ナトリウム塩の形で存在している。また他の実施態様において、本発明の殺菌組成物は、ＥＤＴＡの少なくとも三ナトリウム塩及び四ナトリウム塩の組み合わせを含み、または本質的にＥＤＴＡの少なくとも三ナトリウム塩及び四ナトリウム塩の組み合わせからなり、そしてその組成物においてＥＤＴＡの少なくとも５０％、または少なくとも６０％は三ナトリウム塩の形で存在している。別の実施態様において、本発明の殺菌組成物は、ＥＤＴＡの二ナトリウム塩、三ナトリウム塩及び四ナトリウム塩の組み合わせを含み、または本質的にＥＤＴＡの二ナトリウム塩、三ナトリウム塩及び四ナトリウム塩の組み合わせからなり、そしてその組成物において１０％より少ないＥＤＴＡが二ナトリウム塩の形で存在している。
【００４２】
殺菌組成物は、ＥＤＴＡのナトリウム塩以外のまたはＥＤＴＡのナトリウム塩に加えて、異なった“有効な”ｐＨ範囲を有するＥＤＴＡの塩を含み、または本質的にそのような塩からなり、またはそのような塩からなる。阻害、殺菌、抗真菌、バイオフィルム撲滅及び他の目的のための本発明の殺菌組成物における望ましいＥＤＴＡ塩に対する“有効な”ｐＨ範囲は、通常の実験で決定することができる。
【００４３】
いくつかの実施態様において、本発明の殺菌組成物は上述のようにＥＤＴＡ塩からなり、そして、殺菌溶液は溶媒（通例、水及び食塩水等の水性溶媒）に溶解したＥＤＴＡ塩からなる。他の実施態様において、本発明の殺菌組成物は上述のように、本質的に、通例、水または食塩水中のＥＤＴＡ塩からなる。本質的にＥＤＴＡ塩またはＥＤＴＡ塩の組み合わせからなる本発明の殺菌組成物は、実質的に、実質的な抗細菌活性及び／または抗真菌活性を有する他の活性物質を含まない。この観点において、実質的な抗細菌活性及び／または抗真菌活性は、ｐＨ１０．５、濃度４．０％（ｗ／ｖ）の水溶液でのＥＤＴＡのナトリウム塩の抗細菌活性及び／または抗真菌活性の少なくとも５０％の抗細菌活性及び／または抗真菌活性を意味する。
【００４４】
いくつかの実施態様において、本発明の殺菌組成物は、特定のｐＨ範囲で特定の濃度のＥＤＴＡ塩を含み、そして、上述のＥＤＴＡ塩に加えて、活性成分を含む他の物質を含むことができる。本発明の殺菌組成物に他の抗細菌成分または殺生物成分を含むことができるが、既存の抗生物質及び抗生物剤の使用は、通例、抗生物質耐性及び殺生物剤耐性生物の発達という良くない結果の帰結のため薦められない。いくつかの実施態様において、特定のｐＨ範囲及び濃度のＥＤＴＡ塩を含む本発明の殺菌組成物は、実質的に、実質的な抗細菌活性及び／または抗真菌活性を有する他の活性物質を含まない。
【００４５】
ＥＤＴＡ塩の活性及び／または安定性に悪い影響を与えないという条件で、本発明の殺菌組成物に他の活性成分及び不活性成分を含めることができる。いくつかの用途のために、タンパク質分解剤を殺菌組成物に含めることができる。局所用途のために製剤された殺菌組成物は、例えば、多様なクリーム、エモルーメント（ｅｍｏｌｕｍｅｎｔｓ）及びアロエなどのスキンケア組成物を含むことができる。溶液の製剤で提供される本発明の殺菌組成物は、また、ＥＤＴＡ塩の活性及び／または安定性を妨害しないという条件で、他の活性成分及び不活性成分を含むことができる。
【００４６】
本発明の組成物は溶液の形態または乾燥した形態で使用することができる。溶液において、ＥＤＴＡ塩は好ましくは溶媒に溶解しており、そして、その溶媒は水及び食塩水等の水溶液、またはＥＤＴＡ塩が溶解する他の生体適合性のある溶液を含むことができる。アルコール溶液を含む別の溶媒を使用することもできる。一つの実施態様において、本発明のＥＤＴＡ塩組成物は水とエタノールの混合物中で製剤される。そのような溶液は非常に有効であり、そして、そのような溶液は、ＥＤＴＡ塩の濃縮保存水溶液を調製し、そしてそれを所望の濃度のエタノールに加えることによって調製することができる。約０．０１％乃至１０％（ｗ／ｖ）のＥＤＴＡ塩濃度が適しており、そして約０．１％乃至約１０％（ｖ／ｖ）のエタノール濃度が効果的な殺菌組成物を提供する。いくつかの実施態様において、約１％（ｖ／ｖ）濃度のエタノールを含む水中の約２ｍｇ／ｍｌ（０．２％ｗ／ｖ）の濃度のＥＤＴＡ塩が、広いスペクトルの細菌菌株に対して非常に有効である。ＥＤＴＡのナトリウム塩が使用された場合、これらの殺菌組成物のｐＨ範囲は上述の通りである。ＥＤＴＡ塩が溶解し、保存及び使用中においても溶液状態であるのであれば、生体適合性の非水溶媒を使用することもできる。
【００４７】
本発明のＥＤＴＡ溶液は、好ましくは無菌のそして非発熱性の（ｎｏｎ−ｐｙｒｏｇｅｎｉｃ）状態で提供され、そして、それらは既存の方法で包装することができる。いくつかの実施態様において、本発明の殺菌性ＥＤＴＡ組成物は医療器具（例えば事前に充填されたシリンジまたは他の器具等）と関連して、またはその一部として提供されることができる。本発明の組成物は消毒された無菌の条件下で調製することができ、または、調製及び／または包装の後、適切な無菌化方法によって無菌化されることもできる。ＥＤＴＡ溶液の一回使用または複数回使用のバイアル、シリンジまたは容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒｓ）が提供される。本発明のシステムは、本発明のＥＤＴＡ溶液を含むそのようなバイアル、シリンジまたは容器を含む。
【００４８】
本発明の組成物はまた、実質的に乾燥した形態、例えば、チューブまたは導管、またはカテーテル、導管、容器等の医療用または工業用器具、等の表面の実質的に乾燥した被膜等、で提供することができる。本発明のＥＤＴＡ組成物の実質的に乾燥した形態は、溶媒の添加によって溶液の形態に戻すことができる粉末または凍結乾燥された形態で提供することができる。ＥＤＴＡ組成物の実質的に乾燥した形態は、また被膜として提供することができ、または、ゲルまたは他の型の担体に取り込まれることができ、またはカプセル化することができ、または包装することができ、そして被膜として表面にまたは容器内に提供することができる。本発明のＥＤＴＡ組成物そのような実質的に乾燥した形態は溶液の存在下で製剤することができ、それによって、実質的に乾燥した組成物は上述の組成及び特性を有するＥＤＴＡ溶液を形成する。ある実施態様において、異なったカプセル化または保存技術を使用することができ、それによって引き伸ばされた溶液への暴露においてＥＤＴＡの効果的な徐放が達成される。この実施態様において、実質的に乾燥したＥＤＴＡの溶液は、長期間及び／または複数回の溶液への暴露において殺菌活性を示すことができる。
【００４９】
ＥＤＴＡを含む組成物は、医療用途及びヒトへの投与に関連して確立された安全性の特徴を有している。ヒトの高カルシウム血症の治療のために、一日当たり、３０００ｍｇまでの二ナトリウムＥＤＴＡが三時間にわたって注入されており、そしてよく容認されている。ＥＤＴＡ塩はまた、医療用途及びヒトの健康用途に使用される多くの溶液において他の構成成分との組み合わせで存在しており、そして、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）及びインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の双方で、ヒトに対して安全であることが確立されている。ＥＤＴＡ塩は適当な価格で容易に入手でき、そして溶液中で長期にわたって安定である。
【００５０】
本発明の殺菌組成物の製剤と製造は、通常、容易である。一つの実施態様において、本発明の所望の殺菌組成物は、少なくとも一つのＥＤＴＡ塩を精製水等の水性溶媒に所望の濃度で溶解し、そしてそのＥＤＴＡ塩溶液を所望のｐＨに調節することによって製剤することができる。他の実施態様においては、本発明の所望の殺菌組成物は、ＥＤＴＡ塩またはその組み合わせが溶解して、高濃度で溶解しているＥＤＴＡ塩溶液を与えるように、溶媒に少なくとも一つのＥＤＴＡ塩を溶解することによって製剤することができる。追加の溶媒または構成成分を添加することもできる。また、溶解したＥＤＴＡ塩組成物を溶液以外の形態（例えば、局所用製剤）として製剤することもできる。殺菌溶液はオートクレーブ、ＵＶ照射、ろ過、限外ろ過及び／または他の方法等の既存の手段によって無菌化することができる。ＥＤＴＡ溶液の好ましい浸透圧の範囲は２４０乃至５００ｍＯｓＭ／Ｋｇであり、より好ましくは３００乃至４２０ｍＯｓｍ／Ｋｇである。その溶液は、好ましくはＵＳＰ（米国薬局方）材料を使用して製剤することができる。
【００５１】
三ナトリウム塩または四ナトリウム塩、またはそれらの混合物を含む、三ナトリウム塩または四ナトリウム塩、またはそれらの混合物からなる、または本質的に三ナトリウム塩または四ナトリウム塩、またはそれらの混合物からなる、殺菌組成物が多くの用途について好ましく、そして、容易に入手できる二ナトリウムＥＤＴＡ等の三ナトリウム塩及び四ナトリウム塩以外のＥＤＴＡのナトリウム塩を使用して調製することができる。二ナトリウムＥＤＴＡの溶液は、本発明の組成物の所望のｐＨ範囲より低いｐＨを有している。しかしながら、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウムまたは他の既知のｐＨ調節材料を使用してｐＨを所望の範囲に調節することによって、二ナトリウム塩を使用して調製されたＥＤＴＡ溶液は、好ましい本発明の二ナトリウム、三ナトリウム及び／または四ナトリウム塩のＥＤＴＡ組成物に変換される。すなわち、組成物のｐＨが使用前に所望のｐＨ範囲に調節されるのであれば、ＥＤＴＡ塩の異なった形態及び組み合わせを本発明のＥＤＴＡ組成物の製造に使用することができる。一つの実施態様において、水溶液中で質量／体積基準で３％乃至５％量で二ナトリウムＥＤＴＡを溶解し、そして８．５乃至１２．０の所望のｐＨを与えるに十分な量の水酸化ナトリウムを添加することによって、主に三ナトリウムＥＤＴＡ及び四ナトリウムＥＤＴＡの混合物からなる殺菌組成物が提供される。
【００５２】
上述した、少なくとも一つのＥＤＴＡ塩を含む、本質的に少なくとも一つのＥＤＴＡ塩からなる、または少なくとも一つのＥＤＴＡ塩からなる、本発明の殺菌組成物は、他の多くの用途に対しても有用である。ＥＤＴＡ溶液は、医療用、歯科用及び獣医科用の表面及び対象物を浸漬、洗浄または接触するための殺菌溶液として使用することができる。本発明のＥＤＴＡ溶液は、例えば、コンタクトレンズ及び他の眼用器具を保存及び／または消毒するために；入れ歯、ブリッジ、固定装置及び歯ブラシ等の歯科用器具を保存及び／または消毒するために；そして、医療用、歯科用及び獣医科用の器具及び装置を保存及び／または消毒するために、使用することができる。これらの用途において、器具及び表面は、細菌及び／または真菌の感染を実質的に除去するに十分な時間、本発明のＥＤＴＡ溶液と接触し、またはＥＤＴＡ溶液に浸漬することができる。本発明のＥＤＴＡ組成物は、さらに、水及び他の流動体供給ラインを消毒するために使用することができる。流動体供給ラインの消毒は、本発明のＥＤＴＡ組成物によってラインを断続的に洗い流すことによって行うことができる。同様に、本発明のＥＤＴＡ組成物は、水の供給及び保存装置中のバイオフィルム、微生物（ある種のウイルス及び原生動物を含む）及び真菌の個体群を撲滅するために使用することができる。
【００５３】
殺菌組成物としての特性及び効果を確証するために、本発明のＥＤＴＡを含む組成物を用いて数多くの試験及び手順を行った。いくつかの実験手順を以下に述べる。これらの手順及び実験結果は説明目的として提供されるものであって、本発明の態様を限定する意図ではない。
【００５４】
実施例１
寒天希釈法を使用した、ＥＤＴＡの異なった製剤に対する生物の最小阻止濃度（ＭＩＣ）及び最小殺菌濃度（ＭＢＣ）データ
以下に述べる寒天希釈法を使用して、ＥＤＴＡのいくつかの異なった製剤に対する多様なグラム陽性菌、グラム陰性菌及び酵母生物の最小阻止濃度（ＭＩＣ）及び最小殺菌濃度（ＭＢＣ）を確立した。また、ＥＤＴＡ塩の組み合わせについても、多様な生物に対するＭＩＣ及びＭＢＣの試験を行った。
【００５５】
細菌菌株が活性な病原菌であり、そしてカテーテルに関連したヒトの細菌感染症の典型的なものであるということを確かにするために、グラム陽性菌及びグラム陰性菌は、カテーテルに関連した感染症を持つヒトの患者から単離した。酵母生物は、重大な敗血症感染を持つ患者から採集した。その生物は、カタログに入れられており、そしてリーズ大学のＰｅｔｅｒ  Ｋｉｔｅの研究室で保存されている。
【００５６】
所望のＥＤＴＡ塩濃度（ｗ／ｖ）になるように蒸留水に適切な試薬等級のＥＤＴＡ塩を溶解することによって、ＥＤＴＡ塩及びＥＤＴＡ塩の組み合わせの多様な溶液を調製した。各々のＥＤＴＡ塩及びＥＤＴＡ塩の組み合わせについて高濃度保存用ＥＤＴＡ塩溶液が調製され、そして多様な生物のＭＩＣ及びＭＢＣの決定に使用された。二ナトリウムＥＤＴＡではなくＥＤＴＡの四ナトリウム塩及び三ナトリウム塩を用い、そして所望のｐＨ範囲になるように溶液のｐＨを調節して、四ナトリウムＥＤＴＡ及び三ナトリウムＥＤＴＡの溶液を調製した。ＥＤＴＡ塩の溶液は使用前に無菌化し、そして４℃で保存した。
【００５７】
寒天希釈法の手順
寒天の作成
・２リットルの寒天培地をスチームバスに入れ、約１時間（溶けるまで）そのままにした。
・その寒天を５０℃に冷却した。
・２０個の無菌ガラスビン（１２５ｍＬ）に、それぞれ１００ｍＬの寒天培地を配分した。２００ｍｇ／ｍＬの保存溶液を使用して、これらに０．５、１．０、１．５、２．０、４、６、８、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０及び１００ｍｇ／ｍＬの四ナトリウムＥＤＴＡ（または試験される他のＥＤＴＡ塩またはＥＤＴＡ塩の組み合わせ）を加えた。
・無菌のペトリ皿に２０ｍＬの寒天を注ぎ、放置した。さらに三つのプレートに注いだ。それらが含んでいるＥＤＴＡの濃度をプレートにラベルした。これを各濃度について行った。
・必要になるまで、これらのプレートを４℃の冷蔵庫で保存した。
プレートへの接種
・栄養培養液中で２３のグラム陽性菌及び１９のグラム陰性菌の培養物を、一晩成長させた。
・リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて、各培養物を１０６ｃｆｕ／ｍＬに希釈した。
・自動プレート接種機を用いて、各プレートに２１の菌を接種した。
・プレートを３７℃で培養した。
・翌日、成長について＋または−で記録した。
・ＭＢＣを決定するために、無菌ろ紙を使用して、成長したものを最初のプレートから新しいＣｌｅｄ寒天プレートに移動した。
・そのレプリカプレートを３７℃で一晩、培養した。
・翌日、成長について＋または−で記録した。ＭＩＣ及びＭＢＣを、成長が無かった最も低い濃度として記載した。
【００５８】
結果を図１Ａ乃至５Ｃに示す。図１Ａ乃至１Ｄは、本質的に、二カリウムＥＤＴＡ；二アンモニウムＥＤＴＡ；二ナトリウムＥＤＴＡ；三ナトリウムＥＤＴＡ；及び四ナトリウムＥＤＴＡ；からなるＥＤＴＡ塩の溶液に対する多くのグラム陽性菌及びグラム陰性菌のＭＩＣ及びＭＢＣデータ（ＥＤＴＡ溶液（ｗ／ｖ）のｍｇ／ｍｌとして示されている）を示している。
【００５９】
図２は、本質的に、四ナトリウムＥＤＴＡ；二カリウムＥＤＴＡ；及び二アンモニウムＥＤＴＡ；からなるＥＤＴＡ塩の溶液に対する酵母のＭＩＣ及びＭＢＣデータ（ＥＤＴＡ溶液（ｗ／ｖ）のｍｇ／ｍｌとして示されている）を示している。
【００６０】
図３Ａ及び３Ｂは、本質的に、銅二ナトリウムＥＤＴＡ；マグネシウム二ナトリウムＥＤＴＡ；及び鉄ナトリウムＥＤＴＡ；からなるＥＤＴＡ塩の溶液に対するグラム陽性菌及びグラム陰性菌のＭＩＣ及びＭＢＣデータ（ＥＤＴＡ溶液（ｗ／ｖ）のｍｇ／ｍｌとして示されている）を示している。
【００６１】
図４Ａ乃至４Ｃは、本質的に、銅二ナトリウムＥＤＴＡと四ナトリウムＥＤＴＡ；銅二ナトリウムＥＤＴＡと二カリウムＥＤＴＡ；及び銅二ナトリウＥＤＴＡと二アンモニウムＥＤＴＡ；からなるＥＤＴＡ塩の組み合わせの溶液に対するグラム陽性菌及びグラム陰性菌のＭＩＣ及びＭＢＣデータ（ＥＤＴＡ溶液（ｗ／ｖ）のｍｇ／ｍｌとして示されている）を示している。
【００６２】
図５Ａ乃至５Ｃは、本質的に、四ナトリウムＥＤＴＡと二アンモニウムＥＤＴＡ；四ナトリウムＥＤＴＡと二カリウムＥＤＴＡ；及び二アンモニウムＥＤＴＡと二カリウムＥＤＴＡ；からなるＥＤＴＡ塩の組み合わせの溶液に対するグラム陽性菌及びグラム陰性菌のＭＩＣ及びＭＢＣデータ（ＥＤＴＡ溶液（ｗ／ｖ）のｍｇ／ｍｌとして示されている）を示している。
【００６３】
いくつかのＥＤＴＡ塩及びＥＤＴＡ塩の組み合わせが、適度な濃度において、広いスペクトルの細菌菌株を阻害及び／または除去することに有効であった。他のＥＤＴＡ塩の生体適合性はまだ確立されていないが、これまでの医療での試験及び使用は、ヒト及び動物でのＥＤＴＡナトリウム塩の使用のための良好な生体適合性を確立している。ＥＤＴＡの四ナトリウム塩及び三ナトリウム塩は、広いスペクトルの病原性細菌に対して最も有効であった。さらに、それらのヒト及び獣医科での使用のための生体適合性は確立されている、または容易に確立されると考えられ、そして、それらは費用効果がよく、そして安定である。四ナトリウムＥＤＴＡ塩は、さらに抗凝血剤として活性であり、そして水性溶媒によく溶解する。これらの要因及び上記の実験を基にして、四ナトリウムＥＤＴＡ塩及び三ナトリウムＥＤＴＡ塩が、本発明の殺菌組成物の最も有望な候補として選択された。
【００６４】
実施例２
修飾したカルガリー装置法（Ｃａｌｇａｒｙ  ｄｅｖｉｃｅ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用した、四ナトリウムＥＤＴＡに対する生物の最小バイオフィルム撲滅濃度（ＭＢＥＣ）データ
細菌汚染において、バイオフィルム形成は重要な要因である。実効的な殺菌組成物は、好ましくはバイオフィルムの増殖を低減する能力、またはバイオフィルムの形成を予防または阻害する能力を有している。そのため、発明者らは、候補の四ナトリウムＥＤＴＡ殺菌溶液がバイオフィルムの形成を予防または阻害するかどうかを決定するための試験を行った。四ナトリウムＥＤＴＡに対する多様な生物の最小バイオフィルム撲滅濃度（ＭＢＥＣ）を修飾したカルガリー装置法を使用して測定した。カルガリー法についてはＯｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．のＣａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６６：８６−９２（２００２）及び米国特許６５９９７１４に記載されている。方法と結果を以下に述べる。
【００６５】
所望のＥＤＴＡ塩の濃度（ｗ／ｖ）になるように蒸留水に試薬等級の四ナトリウムＥＤＴＡ塩を溶解して四ナトリウムＥＤＴＡ塩の溶液を調製した。固着性のまたはバイオフィルム形態の多様な生物に対するＭＢＥＣを測定するために、高濃度の保存四ナトリウムＥＤＴＡ塩の溶液を調製した。四ナトリウムＥＤＴＡ溶液は使用前に無菌化し、４℃で保存した。
【００６６】
方法
バイオフィルムの形成
・必要とする生物のミュラーヒントンの一晩の培養液（Ｍｕｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  ｂｒｏｔｈ）１００ｍＬを使用した。
・９６ウエルのマイクロタイタートレイの総てのウエルに２００μｌをピペットで加えた。９６のピンを持った蓋を設置した。２００ｒｐｍの速度、３７℃で２４時間、オービタルシェイカー（ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｅｒ）で培養した。
【００６７】
感受性試験
・上記で形成したバイオフィルムを使用した。
・必要な濃度の試験用薬剤２５０μｌを含んだ新しい９６ウエルのマイクロタイタートレイに蓋（ピンを持った）を設置した。３７℃で１乃至２４時間培養した（シェイカーを使用しない）。
・１、３、６及び２４時間の間隔で、ねじ回しを挿入してピンをウエルの中に折ることによって、各濃度において蓋から四つのピンを除いた。
・各濃度において、三つのピンをＰＢＳの５ｍｌ洗浄液に入れ、そして一度反転させた。
・その三つのピンを３ｍＬのＰＢＳに入れ、そして１５分間超音波をあてた。２μｌを３ｘＣＬＥＤプレート上に移し、無菌のプラスチック製スプレッダーを使用して引き延ばした。３７℃で一晩培養した。翌日、コロニーの数を記録した。
・ＳＥＭのために、残っているルーズピン（ｌｏｏｓｅ  ｐｉｎ）を４％生理食塩水６００μｌに置いた。
【００６８】
多様な生物に対するＭＢＥＣの値が図６に示している（この方法によって決定された四ナトリウムＥＤＴＡ（ｗ／ｖ）のｍｇ／ｍｌで表している）。この結果は、試験された総ての微生物個体群について、４０ｍｇ／ｍｌの四ナトリウムＥＤＴＡ（４％ｗ／ｖ）がバイオフィルムを撲滅する有効な濃度であることを示している。
【００６９】
多様な微生物に対するＭＢＥＣ実験によって得られた例となるデータを以下に示す。総ての実験で四ナトリウムＥＤＴＡが使用され、そして三回実施された。
【００７０】
【表１】
2006526664.tif 000002
【００７１】
【表２】
2006526664.tif 000003
【００７２】
【表３】
2006526664.tif 000004
【００７３】
【表４】
2006526664.tif 000005
【００７４】
【表５】
2006526664.tif 000006
【００７５】
【表６】
2006526664.tif 000007
【００７６】
実施例３
患者の陽性なカテーテルに対するインビトロカテーテルロック処理手順
候補の４０ｍｇ／ｍｌ（４％ｗ／ｖ）四ナトリウムＥＤＴＡ溶液を用いたカテーテルロック処理手順を発展させ、そして、様々な微生物感染について陽性であったサンプルの患者の血液透析カテーテルに対して使用した。微生物感染が確認されたカテーテルに対して四ナトリウムＥＤＴＡを用いたカテーテルロック処理を行い、そして様々な時間でコロニー数を数えた。第一の実験で、総てのカテーテルを４％ｗ／ｖ四ナトリウムＥＤＴＡ溶液で処理した。一方、第二の実験では、カテーテルを様々な濃度の四ナトリウムＥＤＴＡ溶液で処理した。四ナトリウムＥＤＴＡ溶液は、実施例１及び２で述べたようにして調製、保存した。手順と結果を以下に示す。
【００７７】
方法：
・１ｍＬの無菌のリン酸緩衝食塩水で各管腔を洗い流すことによって、感染の疑いのために取り除かれた腎臓血液透析カテーテルを選別した。血液寒天プレート上に広げられた１μＬ及び１０μＬのアリコートを用いて定量培養を行い、そして培養した。
・選別の後まで４℃でカテーテルを保存し、そして外部管腔をアルコールワイプで消毒した。
・ロック処理試験の前に、バイオフィルムの生育を確実にし、そして感染生物による総ての管腔内表面の全体的なコロニー化を確実にするために、選別された陽性のカテーテルを５ｍＬシリンジを用いて栄養培養液でロックし、そして３７℃で一晩培養した。
・一晩培養後、各カテーテル管腔５ｍＬの無菌食塩水で洗い流し、その末端から二つの１ｃｍの片を切り取り、そして各片を１ｍＬの１Ｍ無菌塩化カルシウム中に置いた（薬剤の中和のため）。片の一つは走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）のため、そして他の片は無菌のユニバーサル（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）容器内での培養のためである。
・培養手順のため、そのユニバーサル容器を室温で１５分間、超音波処理用バスに設置し、その後２０秒間、ボルテックス撹拌（ｖｏｒｔｅｘｅｄ）した。
・１μｌ及び１０μｌのアリコートを血液寒天プレート上に加え、無菌のプラスチック製Ｌ形ロッド（ｒｏｄｓ）で引き延ばし、そして３７℃で一晩培養して定量培養を行った。そして、翌日、コロニーを数えた。
・適当な濃度の四ナトリウムＥＤＴＡロック溶液でカテーテルを洗い流し、ロックし、そして３７℃で１８時間培養した。
・３時間、６時間及び１８時間培養後に、カテーテル末端から二つの１ｃｍの片を切り取り１ｍＬの１Ｍ無菌塩化カルシウム溶液で中和した。
・各時間間隔で、上記のようにして定量的に数を数えた。そして、一つの片はＳＥＭのために保存した。
【００７８】
１７の感染した腎臓血液透析カテーテルを濃度４０ｍｇ／ｍｌ（４％ｗ／ｖ）の四ナトリウムＥＤＴＡからなる殺菌組成物で処理した。結果を図７に示す。また、１０の感染した腎臓血液透析カテーテル、一つの動脈カテーテル及び一つの静脈カテーテルを濃度２０乃至１００ｍｇ／ｍｌ（２乃至１０％ｗ／ｖ）の四ナトリウムＥＤＴＡからなる殺菌組成物で処理した。結果を図８に示す。
【００７９】
これらの結果は、２４時間処理後にほとんどの生物の個体群を死滅または劇的に減少させるのに４０ｍｇ／ｍｌ（４％ｗ／ｖ）の四ナトリウムＥＤＴＡが有効であることを示している。四ナトリウムＥＤＴＡのこの濃度は、ヒトまたは他の動物に関する使用に対して安全であり、そして有効であると考えられる。そのため、四ナトリウムＥＤＴＡのこの濃度は、本発明の殺菌組成物及び方法において望ましい濃度である。
【００８０】
実施例４
四ナトリウムＥＤＴＡのアカントアメーバに対する効果、及び四ナトリウムＥＤＴＡ処理クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）のアカントアメーバに対する効果
数種類のアカントアメーバがヒトに感染する。ヒトに接触するコンタクトレンズ及び他の医療器具の不適切な保存の結果として、しばしばアカントアメーバ感染症が起こる。アカントアメーバは細菌個体を餌にしており、多くの処置に対して耐性である。上記のようにして調製した四ナトリウムＥＤＴＡのアカントアメーバ個体群に対する効果を以下のようにして試験した。また、溶媒としてページ食塩水（Ｐａｇｅｓ  ｓａｌｉｎｅ）及び生理食塩水を使用して四ナトリウムＥＤＴＡ組成物を調製した。クレブシエラと処理した四ナトリウムＥＤＴＡのアカントアメーバに対する効果についても、以下の方法によって実験的に試験した。
【００８１】
四ナトリウムＥＤＴＡのアカントアメーバに対する効果
方法：
・試験前に、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｅｄｗａｒｄｓｉｉを持った新しい血液寒天プレートを３７℃で１８時間培養した。
・四ナトリウムＥＤＴＡ（１００ｍｇ／ｍＬ）の保存溶液を用いてページ食塩水中で２２ｍｇ／ｍＬ及び４４ｍｇ／ｍＬの濃度の溶液を調製した。
・各濃度の溶液９ｍＬを無菌ガラス試験管に入れた。コントロールとして別の無菌ガラス試験管に無菌のページ食塩水９ｍＬを入れた。
・無菌のページ食塩水６ｍＬにＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｅｄｗａｒｄｓｉｉを懸濁した。マクファーランド標準（ＭｃＦａｒｌａｎｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）５に調節した。
・連続した各希釈液及びコントロールに懸濁液１ｍＬを加えた。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ懸濁液での希釈のため、各濃度は２０ｍｇ／ｍＬ及び４０ｍｇ／ｍＬである。コントロールは四ナトリウムＥＤＴＡを含んでいない。生理食塩水についても総ての濃度で行った。
・ボルテックスで撹拌した。各試験管はマクファーランド０．５でＫｌｅｂｓｉｅｌｌａの懸濁を含んでいる。
・アカントアメーバプレート全体の表面を削り取り、１．５ｍＬのページ食塩水に懸濁し、ボルテックスで撹拌した。
・アカントアメーバ懸濁液２００μｌを各連続した希釈液及びコントロールに加えた。
・試験管を２４時間、３０℃の培養器に置いた。
・培養後、各ユニバーサル（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
・上澄みを捨て、沈殿物を再懸濁した。
・各希釈液及びコントロール１０μｌを、二組、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ地の非栄養寒天プレートに加えた。移動を防ぐために各プレートの中心に溝を作り、そして各サイドに試験を行う希釈液１０μｌを加えた。
・各培養の個所に黒のマーカーペンで印をした。
・プレートを３０℃で７２時間培養した。
・各培養個所で、１０倍の接眼レンズの光学顕微鏡を用いたプレートの直接可視化によってアカントアメーバの成長を観察した。
【００８２】
【表７】
2006526664.tif 000008
【００８３】
【表８】
2006526664.tif 000009
【００８４】
【表９】
2006526664.tif 000010
【００８５】
この結果は、ページ食塩水及び生理食塩水中の２０乃至４０ｍｇ／ｍｌ（２乃至４％ｗ／ｖ）の四ナトリウムＥＤＴＡが、４８時間の処理後、アカントアメーバ個体群を減少させること、または実質的に除去することに有効であるということを示している。溶媒として水を使用して調製した四ナトリウムＥＤＴＡ組成物も有効であった（データは示していない）。これらの結果は、本発明の殺菌組成物が、コンタクトレンズ、及び歯科用、矯正歯科用及び／または歯周用器具を含む多様な医療用装置及び器具のための浸漬用溶液としての用途に適しているということを示している。本発明の殺菌組成物はまた、純粋及び海水の保存及び分配システム、暖房、通気及び空調設備、加湿器及び透析装置等を含む他の場面でアカントアメーバの個体群を実質的に除去することにも有効である。
【００８６】
アカントアメーバは細菌を餌にする。そのため、発明者らは、本発明の殺菌性ＥＤＴＡ組成物と処理した細菌個体群が、処理した細菌に対するアカントアメーバの摂食行動に影響があるかどうかを試験した。
【００８７】
四ナトリウムＥＤＴＡ処理Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａのアカントアメーバに対する効果
方法：
・試験前に、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｅｄｗａｒｄｓｉｉを持った新しい血液寒天プレートを３７℃で１８時間培養した。
・四ナトリウムＥＤＴＡ（１００ｍｇ／ｍＬ）の保存溶液を用いてページ食塩水中で２２ｍｇ／ｍＬ及び４４ｍｇ／ｍＬの濃度の溶液を調製した。
・各濃度の溶液９ｍＬを無菌ガラス試験管に入れた。コントロールとして別の無菌ガラス試験管に無菌のページ食塩水９ｍＬを入れた。
・無菌のページ食塩水６ｍＬにＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｅｄｗａｒｄｓｉｉを懸濁した。マクファーランド標準５に調節した。
・連続した各希釈液及びコントロールに懸濁液１ｍＬを加えた。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ懸濁液での希釈のため、各濃度は２０ｍｇ／ｍＬ及び４０ｍｇ／ｍＬである。コントロールは四ナトリウムＥＤＴＡを含んでいない。生理食塩水についても総ての濃度で行った。
・ボルテックスで撹拌した。各試験管はマクファーランド０．５でＫｌｅｂｓｉｅｌｌａの懸濁を含んでいる。
・試験管を３７℃で一晩培養した。
・翌日、３００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。上澄みを捨て、新しい１０ｍｌの生理食塩水またはページ食塩水を加え、再懸濁し、そして再び遠心分離した。上澄みを捨て、１ｍｌの生理食塩水またはページ食塩水に懸濁した。
・アカントアメーバプレート全体の表面を削り取り、１．５ｍＬのページ食塩水に懸濁し、ボルテックスで撹拌した。
・アカントアメーバ懸濁液２００μｌを食塩水９ｍｌの入った試験管３本及びページ食塩水３ｍｌの入った試験管３本に加えた。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａとの培養で使用されたＥＤＴＡ濃度のように、各試験管に印を付けた。
・Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａの再懸濁液１ｍｌをアカントアメーバを含む適切な試験管に加えた。
・試験管を３０℃で２４時間、培養器中に置いた。
・試験管の別のセットを準備し、上述のようにして、３７℃で一晩、ＥＤＴＡとＫｌｅｂｓｉｅｌｌａを培養した。
・培養後、アカントアメーバを含む各試験管を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
・上澄みを捨て、沈殿物を再懸濁した。
・各希釈液及びコントロール１０μｌを、二組、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ（ＥＤＴＡと培養していない）地の非栄養寒天プレートに加えた。移動を防ぐために各プレートの中心に溝を作り、そして各サイドに試験を行う希釈液１０μｌを加えた。
・各培養の個所に黒のマーカーペンで印をした。
・プレートを３０℃で培養した。
・各培養個所で、１０倍の接眼レンズの光学顕微鏡を用いたプレートの直接可視化によってアカントアメーバの成長を観察した。
・アカントアメーバ懸濁液の残りを、新しい生理食塩水または新しいページ食塩水の入った試験管の新しいセットに加えた。
・事前にＥＤＴＡと一晩培養したＫｌｅｂｓｉｅｌｌａを洗浄し、再懸濁し、そしてアカントアメーバの入った適切な試験管に加えた。
・試験管を３０℃で一晩培養した。
・培養後、各ユニバーサルを３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
・上澄みを捨て、そして沈殿物を再懸濁した。
・各希釈液及びコントロール１０μｌを、二組、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ（ＥＤＴＡと培養していない）地の非栄養寒天プレートに加えた。移動を防ぐために各プレートの中心に溝を作り、そして各サイドに試験を行う希釈液１０μｌを加えた。
・各培養の個所に黒のマーカーペンで印をした。
・プレートを３０℃で培養した。
・各培養個所で、１０倍の接眼レンズの光学顕微鏡を用いたプレートの直接可視化によってアカントアメーバの成長を観察した。
【００８８】
【表１０】
2006526664.tif 000011
【００８９】
【表１１】
2006526664.tif 000012
【００９０】
これらの結果は、アカントアメーバの成長を抑止することができ、そして、アカントアメーバが餌にする細菌個体を本発明の殺菌性ＥＤＴＡ組成物で処理することによってアカントアメーバ個体群を実質的に除去することができるということを示している。濃度２０乃至４０ｍｇ／ｍＬ（２乃至４％ｗ／ｖ）の四ナトリウムＥＤＴＡを含む殺菌性ＥＤＴＡ組成物が有効であった。これらの結果は、コンタクトレンズ、及び歯科用／矯正歯科用／歯周用器具を含む多様な医療用装置及び器具のための浸漬用溶液としての用途、及び純粋及び海水の保存及び分配システム、暖房、通気及び空調設備、加湿器及び透析装置等を含む他の用途に対する本発明の殺菌組成物の実用性を立証している。
【００９１】
実施例５
四ナトリウムＥＤＴＡ組成物が、微生物のシリコンチューブへの付着または密着を予防するかどうかの確認を行った。シリコンチューブへの微生物の付着及び密着を予防することができれば、バイオフィルムの形成を低減することができる。実験方法と得られた結果を以下に示す。
【００９２】
方法：
・管腔内部をふさぐために１ｃｍ片のシリコンチューブを溶融したワックスで満たし、そして４℃で固めた。
・コントロールとして、無菌のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）３０ｍＬに４片のシリコンチューブを入れた。４％四ナトリウムＥＤＴＡ３０ｍＬに８片のシリコンチューブを入れた。
・３０分後、ＰＢＳ中の４片及び４％四ナトリウムＥＤＴＡ中の４片を熱ブロック上のきれいな容器に移し、乾燥した。
・残りの４片を３０ｍＬの無菌ＰＢＳに移して洗浄し、そしてこれまでのように空気乾燥した。
・乾燥後、１２片総てを１０５ｃｆｕ／ｍＬの生物の混合物（栄養培養液中、３７℃でＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＣＮＳ細胞を一晩培養したもの）に移し、３７℃で培養した。
・３０分後、各型の２片を分離し、３０ｍＬの無菌ＰＢＳで２回洗浄した。これまでのように空気乾燥した。各型の汚染を予防するために、別々に洗浄し別々の乾燥容器を使用した。
・各片を遠心分離管の１ｍＬのＰＢＳに移し、超音波水浴で１５分間超音波処理した。
・各試験管を、二組、自動プレート培養器上、プレートに加えた、対数希釈の５０μｌ
・１／１０希釈の各試験管を、二組、プレートに加えた
・プレートを３７℃で一晩培養した。自動プレート読取器ＰｒｏｔｏＣＯＬでコロニー数を読み取った。６時間後についても行った。
【００９３】
コントロールのカテーテル片及びＥＤＴＡで処理したカテーテル片の結果を以下に示す。
【００９４】
【表１２】
2006526664.tif 000013
【００９５】
ニート（ｎｅａｔ）のＥＤＴＡ溶液の結果がより再現性があることが判明したので、これらの結果をさらに分析した。各片は１ｍＬの溶液に置かれたので、ｍＬ当たりの数は片当たりの数に等しい。
【００９６】
【表１３】
2006526664.tif 000014
【００９７】
【表１４】
2006526664.tif 000015
【００９８】
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ＋ＣＮＳで２４時間で繰り返した。
【００９９】
【表１５】
2006526664.tif 000016
【０１００】
【表１６】
2006526664.tif 000017
【０１０１】
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に対する結果。
【０１０２】
【表１７】
2006526664.tif 000018
【０１０３】
【表１８】
2006526664.tif 000019
【０１０４】
これらの結果は、空気乾燥のカテーテル片及び洗浄したカテーテル片の双方において、細菌個体群の少なくとも短時間の減少を実証している。
【０１０５】
実施例６
四ナトリウムＥＤＴＡをエタノールと組み合わせた場合のＭＢＣ値の変化
単独のＥＤＴＡ溶液、単独のアルコール溶液及びＥＤＴＡ/アルコール溶液の効果を試験するために、四ナトリウムＥＤＴＡの濃度（０、０．１、０．５、１、２、３、４及び８ｍｇ／ｍｌ、ｗ／ｖ）の溶液を水及びエタノールを用いて（最終のエタノール濃度が、水中、０、０．１、０．５、１、５、１０、２０及び４０％になるように）調製した。蒸留水で四ナトリウムＥＤＴＡの高濃度の保存溶液を調製し、そして適当なエタノール濃度になるようにその高濃度の保存水溶液にエタノールを加えた。
【０１０６】
方法：
・栄養培養液中、３７℃で一晩、生物を培養した。
・アルコールと四ナトリウムＥＤＴＡの保存溶液で９６ウエルプレート（一つの培養につき一つ）のグリッドパターンを満たした。０、０．１、０．５、１、５、１０、２０及び４０％のアルコール濃度（ｖ／ｖ）でイソプロピルアルコールを含む水溶液中で、０、０．１、０．５、１、２、３、４及び８ｍｇ／ｍｌの四ナトリウムＥＤＴＡ濃度（ｗ／ｖ）のＥＤＴＡ溶液を使用した。
・各ウエルは各希釈液１５０μｌと５０μｌの１ｘ１０８ｃｆｕ／ｍＬの生物を含む。
・５分、６時間及び２４時間後、９６ピンの蓋をプレート上（そして各ウエル内に）に置き、そしてその蓋を各ウエルに３００μＬの新しい栄養培養液が入った９６ウエルに移動することによって、各ウエルを培養した。３７℃で一晩培養した。その培養の間、微生物を接種した各プレートを３７℃で培養した。
・２４時間後、各ウエルの濁度を記録した。
【０１０７】
いくつかの生物に対する結果を以下に示す。
【０１０８】
【表１９】
2006526664.tif 000020
【０１０９】
四ナトリウムＥＤＴＡ水溶液がエタノール（単独）溶液より効果的に試験した微生物を死滅させた。四ナトリウムＥＤＴＡのアルコール溶液との組み合わせが最も低い濃度で試験した微生物を死滅させた。１％アルコール溶液中の２ｍｇ／ｍｌ（０．２ｗ／ｖ）四ナトリウムＥＤＴＡが優れた結果を与え、試験した総ての生物に抗細菌効果を示した。この殺菌溶液は、四ナトリウムＥＤＴＡとエタノールの低濃度において、四ナトリウムＥＤＴＡ水溶液単独またはエタノール単独より効果的であった。さらに、それは費用効果が高く、安全で、そして製造及び使用が容易である。局所使用のための本発明の殺菌組成物は水性溶媒及びエタノールの混合溶媒中のＥＤＴＡ塩を含む。
【０１１０】
実施例７
エタノール中の四ナトリウムＥＤＴＡの溶解度及びｐＨに及ぼす影響
エタノール中の四ナトリウムＥＤＴＡの溶解度が試験され、そしてアルコール溶媒中の多様な四ナトリウムＥＤＴＡ溶液のｐＨが測定された。
【０１１１】
方法：
・１．５ｍＬサイズのエッペンドルフチューブに１０乃至１００ｍｇの四ナトリウムＥＤＴＡを、二組、量り分けた。７４％エタノール１ｍＬを各チューブに加えそして３０秒管ボルテックスで撹拌した。
・量り分けた四ナトリウムＥＤＴＡの二組のセットに、０．５ｍｌ無菌蒸留水を加えボルテックスで撹拌し、そして７４％エタノール０．５ｍｌを加えた。
・四ナトリウムＥＤＴＡのチューブのそれぞれで、溶解度が観察された時点のｐＨの試験を行った。
【０１１２】
実験結果は、四ナトリウムＥＤＴＡが７４％エタノール溶液に完全に不溶であることを示した。実験結果はさらに、四ナトリウムＥＤＴＡが１０乃至１００ｍｇ／ｍｌ、ｗ／ｖの濃度で蒸留水に溶解された場合、エタノールの添加によっても四ナトリウムＥＤＴＡが溶液中にとどまっていることを示した。好適な技術は、まずＥＤＴＡ塩を水溶液に溶解し、それからＥＤＴＡ塩が溶解しにくいまたは不溶のエタノールまたは別の溶媒を添加することを含む。この方法で調製されたＥＤＴＡ塩の溶液は、長期間安定であることが期待される。多様な溶液について測定されたｐＨ値は以下の通りであった。
【０１１３】
７４％エタノール単独                    ｐＨ７．８
水                                      ｐＨ７．１
＋１０ｍｇ四ナトリウムＥＤＴＡ          ｐＨ９．０
＋２０ｍｇ四ナトリウムＥＤＴＡ          ｐＨ１０．８
＋４０ｍｇ四ナトリウムＥＤＴＡ          ｐＨ１１
＋８０ｍｇ四ナトリウムＥＤＴＡ          ｐＨ１１．１５
＋１００ｍｇ四ナトリウムＥＤＴＡ        ｐＨ１１．２５
【０１１４】
実施例８
四ナトリウムＥＤＴＡ溶液に対する１２１℃でのオートクレーブ処理の影響
使用前に四ナトリウムＥＤＴＡ溶液を無菌化するためにオートクレーブを使用できるかどうかを判断するために、四ナトリウムＥＤＴＡ溶液に対するオートクレーブ処理の影響についての試験を行った。
【０１１５】
方法：
・無菌水中の０、２０、８０及び１００ｍｇ／ｍＬの四ナトリウムＥＤＴＡ溶液、及び５０℃の無菌溶融寒天培地中の０、２０、８０及び１００ｍｇ／ｍＬの四ナトリウムＥＤＴＡ溶液を、二組、作成した。
・一組を室温に置き（加熱しない）、他方をオートクレーブした（加熱した）。
・翌日、総ての寒天容器を蒸し器に設置し、４０分間で溶融した。
拡散区域の測定：
・穿孔器を使用して、新しい１６の血液寒天プレートに二つの穴を開けた。
・０．５マクファーランドのＣＮＳの懸濁液を調製し、無菌綿棒でプレート上に引き延ばして培地を作成した。
・それぞれの四ナトリウムＥＤＴＡ溶液１５０μｌを、二組、打ち抜いた穴に入れ、３７℃で一晩培養した。
・翌日、拡散した区域を測定し、記録した。
【０１１６】
区域の大きさ（ｍｍ）で測定された結果を以下に示す。コントロールの区域の大きさを濃度に対してプロットし、試験サンプルの実際のＥＤＴＡ濃度を決定した。以下に示す。これらの結果は、無菌水中であろうと寒天中であろうと、四ナトリウムＥＤＴＡ組成物をオートクレーブ処理することは、四ナトリウムＥＤＴＡ組成物の抗菌活性に実質的に影響しないことを示している。
【０１１７】
【表２０】
2006526664.tif 000021
【０１１８】
実施例９
ＥＤＴＡの異なった製剤に対する１２１℃でのオートクレーブ処理の影響
使用前に多様なＥＤＴＡ溶液を無菌化するためにオートクレーブを使用できるかどうかを判断するために、ＥＤＴＡ溶液の異なった製剤に対するオートクレーブ処理の影響についての試験を行った。使用された方法と結果を以下に示す。
【０１１９】
方法：
寒天の作成
・５０ｍＬの寒天培地溶液を７つの１００ｍＬ無菌ガラスボトルに加えた。
・第一のボトルにはＥＤＴＡ粉末を加えない（０とラベルした）。
・第二のボトルに２０００ｍｇのＥＤＴＡ粉末を加えた（４０ｍｇ／ｍＬ オートクレーブとラベルした）。
・第三のボトルに４０００ｍｇのＥＤＴＡ粉末を加えた（８０ｍｇ／ｍＬ オートクレーブとラベルした）。
・第四のボトルに５０００ｍｇのＥＤＴＡ粉末を加えた（１００ｍｇ／ｍＬ オートクレーブとラベルした）。
・第五乃至七のボトルにはＥＤＴＡを加えない（しかし４０、８０及び１００ｍｇ／ｍＬ 非オートクレーブとラベルした）。室温に置いた。
・これらの各ＥＤＴＡ製剤について試験した。オートクレーブとラベルした総てのボトルを、１２１℃で２０分間、オートクレーブ処理した。
・翌日、総てのボトルをスチームバスに入れ、寒天を注げるように溶融した。
・溶融後、５０℃に冷却し、そして非オートクレーブとラベルしたボトルに適切な量のＥＤＴＡを加え、総てのボトルについて試験の準備をした。
拡散区域の測定
・穿孔器を使用して、新しい７の血液寒天プレートに二つの穴を開けた。
・０．５マクファーランドのＣＮＳの懸濁液を調製し、無菌綿棒でプレート上に引き延ばして培地を作成した。
・各ボトルの１５０μｌを、２つの別々の打ち抜いた穴に入れ、３７℃で一晩培養した。
・各ＥＤＴＡ製剤について実施した。
・翌日、拡散した区域を測定し、記録した。二組の穴を使用し、区域当たり二つの測定を行った。
【０１２０】
銅及び鉄ＥＤＴＡ溶液は区域を生じなかった。そのため、これらの溶液に対する熱の効果はこの方法では測定できない。二アンモニウムＥＤＴＡ、二カリウムＥＤＴＡ及びマグネシウムＥＤＴＡ溶液について測定した区域の大きさを以下に示す。コントロール（加熱なし）の区域の大きさを濃度に対してプロットし、試験サンプル（加熱）の実際のＥＤＴＡ濃度を決定した。以下に示す。
【０１２１】
【表２１】
2006526664.tif 000022
【０１２２】
【表２２】
2006526664.tif 000023
【０１２３】
これらの結果は、オートクレーブ処理がほとんどのＥＤＴＡ塩組成物の効果を減じていないことを示している。そのため、無菌の殺菌組成物を提供するため、調製後、本発明の殺菌組成物のオートクレーブ処理を行うことができる。
【０１２４】
実施例１０
ＥＤＴＡ塩、塩化カルシウム及びクエン酸ナトリウムのｐＨ値
溶媒として蒸留水を用い、特定の濃度において、多様なＥＤＴＡ塩、塩化カルシウム及びクエン酸ナトリウムのｐＨ値を測定した。結果を以下に示す。
【０１２５】
ＥＤＴＡの遊離酸  １０％                   ｐＨ４．７
二アンモニウムＥＤＴＡ  １０％             ｐＨ４．３８
カルシウムナトリウムＥＤＴＡ  １０％       ｐＨ６．６８
二カリウムＥＤＴＡ  １０％                 ｐＨ４．５
銅ＥＤＴＡ  １０％                         ｐＨ６．１５
四ナトリウムＥＤＴＡ  １０％               ｐＨ１１．６
四ナトリウムＥＤＴＡ  ２％                 ｐＨ１１
ＴＳ ＥＤＴＡ中和塩化カルシウム            ｐＨ７．３
塩化カルシウム  １モル濃度                 ｐＨ３．８
クエン酸ナトリウム  ５０％、２５％         ｐＨ８．５
【０１２６】
実施例１１
ＥＤＴＡ溶液の抗凝血特性の確認
以下の方法によってＥＤＴＡ溶液の抗凝血特性を確認した。
【０１２７】
方法：
・ｐＨが１１．０乃至１１．６に調節された、濃度０．５乃至１００ｍｇ／ｍＬの四ナトリウムＥＤＴＡ溶液または二ナトリウムＥＤＴＡ溶液の１００μｌアリコートをプラスチック製キャップ付チューブに加えた。
・健康なボランティアから採取した新鮮な血液９００μＬをＥＤＴＡ溶液の各アリコートに加え、一定間隔でチューブを反転させることによって穏やかに混合した。
【０１２８】
ＥＤＴＡ溶液を含まない、血液を含むコントロールのチューブは、１０乃至２３分という凝固時間であった。二ナトリウムＥＤＴＡ溶液を含むチューブの凝固時間は、総て５日を超えていた。１ｍｇ／ｍＬより大きい濃度の四ナトリウムＥＤＴＡのチューブの凝固時間は、５日を超えていた。０．５ｍｇ／ｍＬ濃度の四ナトリウムＥＤＴＡのチューブは２８分で凝固した。それゆえ、四ナトリウムＥＤＴＡは１ｍｇ／ｍｌ（１％ｗ／ｖ）を超える濃度で抗凝血剤として有効である。
【０１２９】
実施例１２
四ナトリウム塩懸濁液の浸透圧
標準的な実験室技術を用いて、水及び生理食塩水中の多様な濃度の四ナトリウムＥＤＴＡ溶液の浸透圧と赤血球溶解の試験を行った。各濃度のＥＤＴＡ溶液２ｍｌに５０μｌの血液を２時間加えることによって赤血球溶解の試験を行った。血漿浸透圧は２７５乃至２９５ｍ／ｏｓｍｏｌであった。
【０１３０】
【表２３】
2006526664.tif 000024
【０１３１】
実施例１３
人工尿結晶（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｕｒｉｎｅ  Ｃｒｙｓｔａｌ：ＡＵＣ）の溶解に対する三つのＥＤＴＡ塩の効果
尿道カテーテルについての一つの問題は、カテーテル表面に尿結晶が堆積することである。尿結晶の堆積物は微生物のコロニー化及び／またはバイオフィルムの形成、並びにカテーテルの流量の減少、を促進し得る。そのため、尿道カテーテルに関連して、尿結晶の形成を低減する消毒組成物を使用することが好ましい。標準的な実験室技術を用いて、人工尿結晶の溶解に対する三つのＥＤＴＡ塩溶液の効果について試験を行った。
【０１３２】
材料：
・２５ｍｌプラスチック製ユニバーサル容器内に人工尿及びウレアーゼを加えて４５℃で７日間培養した。
・１００ｍｇ／ｍｌの二アンモニウムＥＤＴＡ、二カリウムＥＤＴＡ及び四ナトリウムＥＤＴＡの溶液。
【０１３３】
方法：
・４０００ｒｐｍ、２分間で人工尿結晶を遠心分離する。
・上澄みをデカントし、結晶を水で洗浄し、そして遠心分離した。
・結晶を水１ｍｌに再懸濁し、そして２００μｌのアリコートを四つのユニバーサル容器に加えた。
・１００ｍｇ／ｍｌの各ＥＤＴＡの溶液４ｍｌ及びコントロールとしての水４ｍｌを各ユニバーサル容器に室温で加えた。
・１、２、及び３時間後にコントロールに対する結晶の溶解を目視観察した。
【０１３４】
結果を以下に示す。水溶液に比べて総てのＥＤＴＡ塩溶液が尿結晶堆積物を減少させた。それゆえ、ＥＤＴＡ塩溶液は尿道カテーテルへの使用に適している。
【０１３５】
【表２４】
2006526664.tif 000025
【０１３６】
特許及び非特許文献を含む、本明細書で引用した総ての参考文献を、その全体を参考資料として本明細書に取り込む。
上述の明細書において本発明はある好ましい実施態様との関係で記述し、そして多くの詳細を例証目的で説明しているが、本発明はその他の実施態様を許容し、そしてここで記述したある種の詳細を本発明の基本原理から外れることなく大きく変えることができるということが、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１Ａ】図１Ａは、寒天希釈法を使用した、本質的に二カリウムＥＤＴＡ；二アンモニウムＥＤＴＡ；二ナトリウムＥＤＴＡ；三ナトリウムＥＤＴＡ；及び四ナトリウムＥＤＴＡ、からなるＥＤＴＡ塩溶液に対する多様なグラム陽性菌及びグラム陰性菌の最小阻止濃度（ＭＩＣ）及び最小殺菌濃度（ＭＢＣ）を示している。細菌はヒトの患者のカテーテルに関連した感染症から単離した。実験方法は実施例１に記載した。
【図１Ｂ】図１Ｂは、寒天希釈法を使用した、本質的に二カリウムＥＤＴＡ；二アンモニウムＥＤＴＡ；二ナトリウムＥＤＴＡ；三ナトリウムＥＤＴＡ；及び四ナトリウムＥＤＴＡ、からなるＥＤＴＡ塩溶液に対する多様なグラム陽性菌及びグラム陰性菌の最小阻止濃度（ＭＩＣ）及び最小殺菌濃度（ＭＢＣ）を示している。細菌はヒトの患者のカテーテルに関連した感染症から単離した。実験方法は実施例１に記載した。
【図１Ｃ】図１Ｃは、寒天希釈法を使用した、本質的に二カリウムＥＤＴＡ；二アンモニウムＥＤＴＡ；二ナトリウムＥＤＴＡ；三ナトリウムＥＤＴＡ；及び四ナトリウムＥＤＴＡ、からなるＥＤＴＡ塩溶液に対する多様なグラム陽性菌及びグラム陰性菌の最小阻止濃度（ＭＩＣ）及び最小殺菌濃度（ＭＢＣ）を示している。細菌はヒトの患者のカテーテルに関連した感染症から単離した。実験方法は実施例１に記載した。
【図１Ｄ】図１Ｄは、寒天希釈法を使用した、本質的に二カリウムＥＤＴＡ；二アンモニウムＥＤＴＡ；二ナトリウムＥＤＴＡ；三ナトリウムＥＤＴＡ；及び四ナトリウムＥＤＴＡ、からなるＥＤＴＡ塩溶液に対する多様なグラム陽性菌及びグラム陰性菌の最小阻止濃度（ＭＩＣ）及び最小殺菌濃度（ＭＢＣ）を示している。細菌はヒトの患者のカテーテルに関連した感染症から単離した。実験方法は実施例１に記載した。
【図２】図２は、寒天希釈法を使用した、ＥＤＴＡの異なった製剤に対する多様な真菌生物のＭＩＣ及びＭＢＣを示している。実験方法は実施例１に記載した。真菌生物はヒトの患者から採集した。
【図３Ａ】図３Ａは、本質的に銅二ナトリウムＥＤＴＡ；マグネシウム二ナトリウムＥＤＴＡ；及び鉄ナトリウムＥＤＴＡ、からなるＥＤＴＡ塩溶液に対するグラム陽性菌及びグラム陰性菌のＭＩＣ及びＭＢＣデータを示している。細菌はヒトの患者のカテーテルに関連した感染症から単離した。実験方法は実施例１に記載した。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本質的に銅二ナトリウムＥＤＴＡ；マグネシウム二ナトリウムＥＤＴＡ；及び鉄ナトリウムＥＤＴＡ、からなるＥＤＴＡ塩溶液に対するグラム陽性菌及びグラム陰性菌のＭＩＣ及びＭＢＣデータを示している。細菌はヒトの患者のカテーテルに関連した感染症から単離した。実験方法は実施例１に記載した。
【図４Ａ】図４Ａは、本質的に銅二ナトリウムＥＤＴＡと四ナトリウムＥＤＴＡ；銅二ナトリウムＥＤＴＡと二カリウムＥＤＴＡ；及び銅二ナトリウＥＤＴＡと二アンモニウムＥＤＴＡ、からなるＥＤＴＡ塩の組み合わせの溶液に対する多様なグラム陽性菌及びグラム陰性菌のＭＩＣ及びＭＢＣデータを示している。細菌はヒトの患者のカテーテルに関連した感染症から単離した。実験方法は実施例１に記載した。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本質的に銅二ナトリウムＥＤＴＡと四ナトリウムＥＤＴＡ；銅二ナトリウムＥＤＴＡと二カリウムＥＤＴＡ；及び銅二ナトリウＥＤＴＡと二アンモニウムＥＤＴＡ、からなるＥＤＴＡ塩の組み合わせの溶液に対する多様なグラム陽性菌及びグラム陰性菌のＭＩＣ及びＭＢＣデータを示している。細菌はヒトの患者のカテーテルに関連した感染症から単離した。実験方法は実施例１に記載した。
【図４Ｃ】図４Ｃは、本質的に銅二ナトリウムＥＤＴＡと四ナトリウムＥＤＴＡ；銅二ナトリウムＥＤＴＡと二カリウムＥＤＴＡ；及び銅二ナトリウＥＤＴＡと二アンモニウムＥＤＴＡ、からなるＥＤＴＡ塩の組み合わせの溶液に対する多様なグラム陽性菌及びグラム陰性菌のＭＩＣ及びＭＢＣデータを示している。細菌はヒトの患者のカテーテルに関連した感染症から単離した。実験方法は実施例１に記載した。
【図５Ａ】図５Ａは、本質的に四ナトリウムＥＤＴＡと二アンモニウムＥＤＴＡ；四ナトリウムＥＤＴＡと二カリウムＥＤＴＡ；及び二アンモニウムＥＤＴＡと二カリウムＥＤＴＡ、からなるＥＤＴＡ塩の組み合わせの溶液に対する多様なグラム陽性菌及びグラム陰性菌のＭＩＣ及びＭＢＣデータを示している。細菌はヒトの患者のカテーテルに関連した感染症から単離した。実験方法は実施例１に記載した。
【図５Ｂ】図５Ｂは、本質的に四ナトリウムＥＤＴＡと二アンモニウムＥＤＴＡ；四ナトリウムＥＤＴＡと二カリウムＥＤＴＡ；及び二アンモニウムＥＤＴＡと二カリウムＥＤＴＡ、からなるＥＤＴＡ塩の組み合わせの溶液に対する多様なグラム陽性菌及びグラム陰性菌のＭＩＣ及びＭＢＣデータを示している。細菌はヒトの患者のカテーテルに関連した感染症から単離した。実験方法は実施例１に記載した。
【図５Ｃ】図５Ｃは、本質的に四ナトリウムＥＤＴＡと二アンモニウムＥＤＴＡ；四ナトリウムＥＤＴＡと二カリウムＥＤＴＡ；及び二アンモニウムＥＤＴＡと二カリウムＥＤＴＡ、からなるＥＤＴＡ塩の組み合わせの溶液に対する多様なグラム陽性菌及びグラム陰性菌のＭＩＣ及びＭＢＣデータを示している。細菌はヒトの患者のカテーテルに関連した感染症から単離した。実験方法は実施例１に記載した。
【図６】図６は、実施例２に記載した方法を使用して四ナトリウムＥＤＴＡ（ｍｇ／ｍｌ）（ｗ／ｖ）中で発現された多様な生物に対する最小バイオフィルム撲滅濃度（ＭＢＥＣ）を示している。
【図７】図７は、本質的に４０ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖ）濃度の四ナトリウムＥＤＴＡからなる殺菌組成物を用いた、感染した腎臓血液透析カテーテルの処置の実験結果を示している。
【図８】図８は、本質的に２０乃至１００ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖ）濃度の四ナトリウムＥＤＴＡからなる殺菌組成物を用いた、感染した腎臓血液透析カテーテル、動脈カテーテル及び静脈カテーテルの処置の実験結果を示している。
【図１Ａ】
2006526664.tif 000026
【図１Ｂ】
2006526664.tif 000027
【図１Ｃ】
2006526664.tif 000028
【図１Ｄ】
2006526664.tif 000029
【図２】
2006526664.tif 000030
【図３Ａ】
2006526664.tif 000031
【図３Ｂ】
2006526664.tif 000032
【図４Ａ】
2006526664.tif 000033
【図４Ｂ】
2006526664.tif 000034
【図４Ｃ】
2006526664.tif 000035
【図５Ａ】
2006526664.tif 000036
【図５Ｂ】
2006526664.tif 000037
【図５Ｃ】
2006526664.tif 000038
【図６】
2006526664.tif 000039
【図７】
2006526664.tif 000040
【図８】
2006526664.tif 000041
【手続補正書】
【提出日】平成18年2月27日(2006.2.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも０．０１％ｗ／ｖの濃度のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の少なくとも一つの塩及び少なくとも一つの溶媒を含む殺菌溶液であって、前記溶液が少なくとも８．０のｐＨを有し、そして広いスペクトルの細菌に対して抗細菌活性を有する、前記溶液。
【請求項２】
前記溶液が８．５乃至１２．５のｐＨを有する、請求項１に記載の溶液。
【請求項３】
前記溶液が９．５乃至１１．５のｐＨを有する、請求項２に記載の溶液。
【請求項４】
前記溶液が１０．５乃至１１．５のｐＨを有する、請求項３に記載の溶液。
【請求項５】
前記ＥＤＴＡの少なくとも一つの塩が、二ナトリウムＥＤＴＡ、三ナトリウムＥＤＴＡ、四ナトリウムＥＤＴＡ、アンモニウムＥＤＴＡ、二アンモニウムＥＤＴＡ、カリウムＥＤＴＡ、二カリウムＥＤＴＡ、銅二ナトリウムＥＤＴＡ、マグネシウム二ナトリウムＥＤＴＡ、鉄ナトリウムＥＤＴＡ、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、請求項１に記載の溶液。
【請求項６】
前記ＥＤＴＡの少なくとも一つの塩が、三ナトリウムＥＤＴＡ、四ナトリウムＥＤＴＡ、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、請求項５に記載の溶液。
【請求項７】
前記ＥＤＴＡの少なくとも一つの塩が、０．２％ｗ／ｖ乃至１０．０％ｗ／ｖの濃度で存在している、請求項１に記載の溶液。
【請求項８】
前記ＥＤＴＡの少なくとも一つの塩が、０．２％乃至６．０％ｗ／ｖの濃度で存在している、請求項７に記載の溶液。
【請求項９】
前記ＥＤＴＡの少なくとも一つの塩が、０．２％乃至４．０％ｗ／ｖの濃度で存在している、請求項８に記載の溶液。
【請求項１０】
前記溶媒が、水；食塩水、アルコール、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、請求項１に記載の溶液。
【請求項１１】
前記溶媒が、水とエタノールの組み合わせである、請求項１０に記載の溶液。
【請求項１２】
前記溶液が、０．１％乃至１０％ｖ／ｖのエタノールを含む、請求項１１に記載の溶液。
【請求項１３】
前記溶液が、プランクトン性形態または固着形態の細菌に対して抗細菌活性を有する、請求項１に記載の溶液。
【請求項１４】
前記溶液が：
（ａ）抗凝血活性；
（ｂ）真菌性病原菌に対する抗真菌活性；
（ｃ）原生動物感染症に対する阻害活性；
（ｄ）アメーバ感染症に対する阻害活性；
（ｅ）少なくとも適度な量で患者と接触した場合の安全性及び生体適合性；
（ｄ）少なくとも適度な量で患者の血流と接触した場合の安全性及び生体適合性；及び
（ｅ）工業的対象物及び表面との安全性及び適合性、
からなる群から選択される少なくとも一つの特性を有する、請求項１に記載の溶液。
【請求項１５】
前記溶液が、無菌及び発熱物質を含まない、請求項１に記載の溶液。
【請求項１６】
溶媒との再構成によって請求項１の溶液を形成する、請求項１の殺菌溶液の乾燥形態。
【請求項１７】
表面及び対象物への局所使用に適した請求項１の溶液の製剤。
【請求項１８】
長期間にわたって殺菌活性を示す、請求項１の溶液の徐放性製剤。
【請求項１９】
溶媒及び０．０１％乃至１５％ｗ／ｖの濃度の少なくとも一つのナトリウムＥＤＴＡ塩を含む殺菌溶液であって、前記溶液が少なくとも９．０のｐＨを有し、そして広いスペクトルの細菌に対して抗細菌活性を有する、前記溶液。
【請求項２０】
前記溶媒が、水；食塩水、アルコール、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、請求項１６に記載の溶液。
【請求項２１】
本質的に、少なくとも０．０１％ｗ／ｖの濃度のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の少なくとも一つの塩及び少なくとも一つの溶剤とからなる殺菌溶液であって、前記溶液が少なくとも８．０のｐＨを有し、そして広いスペクトルの細菌に対して抗細菌活性を有する、前記溶液。
【請求項２２】
前記溶液が８．５乃至１２．５のｐＨを有する、請求項２１に記載の溶液。
【請求項２３】
前記溶液が９．５乃至１１．５のｐＨを有する、請求項２１に記載の溶液。
【請求項２４】
前記溶液が１０．５乃至１１．５のｐＨを有する、請求項２１に記載の溶液。
【請求項２５】
前記ＥＤＴＡの少なくとも一つの塩が、二ナトリウムＥＤＴＡ、三ナトリウムＥＤＴＡ、四ナトリウムＥＤＴＡ、アンモニウムＥＤＴＡ、二アンモニウムＥＤＴＡ、カリウムＥＤＴＡ、二カリウムＥＤＴＡ、銅二ナトリウムＥＤＴＡ、マグネシウム二ナトリウムＥＤＴＡ、鉄ナトリウムＥＤＴＡ、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、請求項２１に記載の溶液。
【請求項２６】
前記ＥＤＴＡの少なくとも一つの塩が、三ナトリウムＥＤＴＡ、四ナトリウムＥＤＴＡ、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、請求項２５に記載の溶液。
【請求項２７】
前記ＥＤＴＡの少なくとも一つの塩が、０．０２％ｗ／ｖ乃至１０．０％ｗ／ｖの濃度で存在している、請求項２１に記載の溶液。
【請求項２８】
前記ＥＤＴＡの少なくとも一つの塩が、０．０２％乃至６．０％ｗ／ｖの濃度で存在している、請求項２７に記載の溶液。
【請求項２９】
前記ＥＤＴＡの少なくとも一つの塩が、０．０２％乃至４．０％ｗ／ｖの濃度で存在している、請求項２８に記載の溶液。
【請求項３０】
前記溶媒が、水；食塩水、アルコール、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、請求項２１に記載の溶液。
【請求項３１】
前記溶媒が、水とエタノールの組み合わせである、請求項３０に記載の溶液。
【請求項３２】
前記溶液が、０．１％乃至１０％ｖ／ｖのエタノールを含む、請求項３０に記載の溶液。
【請求項３３】
前記溶液が、プランクトン性形態または固着形態の細菌に対して抗細菌活性を有する、請求項２１に記載の溶液。
【請求項３４】
表面または対象物を請求項１乃至３３のいずれか一項に記載の溶液と接触させることを含む、表面または対象物上若しくは対象物内部の少なくとも一つの望ましくない微生物の個体群の成長及び増殖を阻害するための方法。
【請求項３５】
前記望ましくない微生物が、細菌個体群、真菌性病原菌、原生動物個体群及びアメーバ個体群からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記望ましくない微生物がアカントアメーバである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記表面または対象物が、カテーテル；医療用チューブ及び導管；血管内器具；埋め込まれた医療用器具；医療用または獣医科用装置；コンタクトレンズ；眼用埋め込み物；歯科用、矯正歯科用または歯周用の器具；水の保存、分配及び処理施設；工業用装置；及び食品生産及び加工装置、からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
バイオフィルムを請求項１乃至３３のいずれか一項に記載の溶液と接触させることを含む、バイオフィルムの成長及び増殖を阻害するための方法。
【請求項３９】
請求項１乃至３３のいずれか一項に記載の溶液に浸漬されている、傷治療における使用のためのカバー。                                                                
【国際調査報告】
2006526664.tif 000042
2006526664.tif 000043