(57)【要約】本発明は、患者のインスリンＨｐｈＩ座および体脂肪値の両方を調べることによって、被験者においてインスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭまたはＩＩ型糖尿病）の発症リスクを決定する方法を特徴とする。関連する局面では、本発明はＮＩＤＤＭの亜型を診断する方法、ならびにＮＩＤＤＭ患者の合理的な治療および管理を容易にするのための方法を特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、個体においてインスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）を発症するリスクを決定する方法：
ａ） 個体のインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にある少なくとも１つのマーカーの多型塩基のアイデンティティを決定する段階；
ｂ） 該個体の体脂肪値を決定する段階；および
ｃ） 段階ａ）のアイデンティティ、段階ｂ）の体脂肪値、ならびに該アイデンティティ、該体脂肪値、およびＮＩＤＤＭ発症リスクを相関させる事前に決められた値に基づいて、リスク値を割り当てる段階。
【請求項２】
以下の段階を含む、個体においてインスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）を発症するリスクを決定する方法：
ａ） 個体のインスリン遺伝子のＶＮＴＲクラスを決定する段階；
ｂ） 該個体の体脂肪値を決定する段階；ならびに
ｃ） 段階ａ）のＶＮＴＲクラス、段階ｂ）の体脂肪値、ならびに該ＶＮＴＲクラス、該体脂肪値、およびＮＩＤＤＭ発症リスクを相関させる事前に決められた値に基づいて、リスク値を割り当てる段階。
【請求項３】
以下の段階を含む、個体のインスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の亜型を診断する方法：
ａ） 個体のインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にある少なくとも１つのマーカーの多型塩基のアイデンティティを決定する段階；
ｂ） 該個体の体脂肪値を決定する段階；ならびに
ｃ） 段階ａ）のアイデンティティ、段階ｂ）の体脂肪値、ならびに該アイデンティティ、該体脂肪値、およびＮＩＤＤＭの特定の亜型を持つ可能性を相関させる事前に決められた値に基づいて、亜型を割り当てる段階。
【請求項４】
以下の段階を含む、個体のインスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の亜型を診断する方法：
ａ） 個体のインスリン遺伝子のＶＮＴＲクラスを決定する段階；
ｂ） 該個体の体脂肪値を決定する段階；ならびに
ｃ） 段階ａ）のＶＮＴＲクラス、段階ｂ）の体脂肪値、および該ＶＮＴＲクラス、該体脂肪値、ならびにＮＩＤＤＭの特定の亜型を持つ可能性を相関させる事前に決められた値に基づいて、亜型を割り当てる段階。
【請求項５】
以下を含む、個体のインスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の治療または予防方法：
ａ） 請求項１または２に記載のＮＩＤＤＭの発症リスクの決定法；および
ｂ） 食事制限、カロリー消費の増加、胃腸管手術、薬物療法、および食物脂質の吸収低下からなる群より選択される減量療法の実施。
【請求項６】
以下の段階を含む、インスリン関連疾患に関する臨床試験または相関解析に含まれるものについて個体を選択する方法：
ａ） 個体のインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にある少なくとも１つのマーカーの多型の塩基のアイデンティティを決定する段階；
ｂ） 該個体の体脂肪値を決定する段階；ならびに
ｃ） 段階ａ）のアイデンティティ、段階ｂ）の体脂肪値、ならびに該アイデンティティ、該体脂肪値、およびインスリン関連疾患発症リスクを相関させる事前に決められた値に基づいて、該個体を試験において選択する段階。
【請求項７】
以下の段階を含む、インスリン関連疾患に関する臨床試験または相関解析に個体を選択する方法：
ａ） 個体のインスリン遺伝子のＶＮＴＲクラスを決定する段階；
ｂ） 該個体の体脂肪値を決定する段階；ならびに
ｃ） 段階ａ）のＶＮＴＲクラス、段階ｂ）の体脂肪値、ならびに該ＶＮＴＲクラス、該体脂肪値、およびインスリン関連疾患発症リスクを相関させる事前に決められた値に基づいて、該個体を試験において選択する段階。
【請求項８】
マーカーの多型塩基のアイデンティティが、個体のゲノム中に存在するマーカーの両方のコピーについて決定される、請求項１、請求項３、または請求項６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
インスリン遺伝子のＶＮＴＲクラスが、個体のゲノム中に存在するＶＮＴＲの両方のコピーについて決定される、請求項２、請求項４、または請求項７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
以下の段階を含む、若年性肥満患者群における遺伝子マーカーセットに関するハプロタイプの頻度の推定方法：
ａ） 患者群の各個体のゲノムに存在するマーカーの両方のコピーについて、該マーカーにおけるヌクレオチドのアイデンティティを決定することにより、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にあるマーカーの遺伝子型同定をする段階；
ｂ） 該患者群の各個体のゲノムに存在する第２のマーカーの両方のコピーについて、該第２の遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドのアイデンティティを決定することにより、該第２のマーカーの遺伝子型同定をする段階；
ｃ） 段階ａ）およびｂ）で決定されたヌクレオチドのアイデンティティにハプロタイプ決定法を適用し、頻度の推定を行なう段階。
【請求項１１】
ハプロタイプ決定方法が、非対称ＰＣＲ増幅、特定のアリルの二重ＰＣＲ増幅、クラーク法、または期待値最大化アルゴリズムからなる群より選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
以下の段階を含む、個体においてインスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）を発症するリスクを決定する方法：
ａ） 個体のゲノムに存在するマーカーの両方のコピーについて、マーカーにおけるヌクレオチドのアイデンティティを決定することにより、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にあるマーカーの遺伝子型同定を行なう段階；
ｂ） 個体の体脂肪値を決定する段階；ならびに
ｃ） 段階ａ）のアイデンティティ、段階ｃ）の体脂肪値、ならびに該アイデンティティ、該体脂肪値、およびＮＩＤＤＭ発症リスクを相関させる事前に決められた値に基づいて、リスク値を割り当てる段階。
【請求項１３】
以下の段階を含む、個体のインスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の亜型を診断する方法：
ａ） 個体のゲノムに存在するマーカーの両方のコピーについて、マーカーにおけるヌクレオチドのアイデンティティを決定することにより、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にあるマーカーの遺伝子型同定を行なう段階；
ｂ） 個体の体脂肪値を決定する段階；ならびに
ｃ） 段階ａ）のアイデンティティ、段階ｂ）の体脂肪値、ならびに該アイデンティティ、該体脂肪値、およびＮＩＤＤＭの特定の亜型を持つ可能性を相関させる事前に決められた値に基づいて、亜型を割り当てる段階。
【請求項１４】
以下の段階を含む、インスリン関連疾患に関する臨床試験または相関解析に含まれるものについて個体を選択する方法：
ａ） 個体のゲノムに存在するマーカーの両方のコピーについて、マーカーにおけるヌクレオチドのアイデンティティを決定することにより、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にあるマーカーの遺伝子型同定を行なう段階；
ｂ） 個体の体脂肪値を決定する段階；ならびに
ｃ） 段階ａ）のアイデンティティ、段階ｂ）の体脂肪値、ならびに該アイデンティティ、該体脂肪値、およびインスリン関連疾患発症リスクを相関させる事前に決められた値に基づいて、該個体を該試験において選択する段階。
【請求項１５】
第２のマーカーがインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にある、請求項１０、請求項１２、請求項１３、または請求項１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
以下の段階を含む、ハプロタイプとインスリン関連疾患との間の関連を検出する方法：
ａ） 請求項１０の方法にしたがって、インスリン関連疾患の患者集団における少なくとも１つのハプロタイプの頻度を推定する段階；
ｂ） 請求項１０の方法にしたがって、対照群におけるハプロタイプの頻度を推定する段階；ならびに
ｃ） 該ハプロタイプとインスリン関連疾患の間に統計的に有意な関連があるかどうかを決定する段階。
【請求項１７】
インスリン関連疾患が、高インスリン血症または高インスリン血症の素因である、請求項６、請求項７、または請求項１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にあるマーカーが、表Ｃに記載のマーカーからなる群より選択される、請求項１、請求項３、請求項６、請求項１０、請求項１２、請求項１３、または請求項１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にあるマーカーが、−４２１７ ＰｓｔＩ、−２２２１ ＭｓｐＩ、−２３ ＨｐｈＩ、＋１４２８ ＦｏｋＩ、＋１１０００ ＡｌｕＩ、および＋３２０００ ＡｐａＩからなる群より選択される、請求項１、請求項３、請求項６、請求項１０、請求項１２、請求項１３、または請求項１４のいずれかに一項に記載の方法。
【請求項２０】
インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にあるマーカーが、−２３ ＨｐｈＩである、請求項１、請求項３、請求項６、請求項１０、請求項１２、請求項１３、または請求項１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は真性糖尿病の診断および予後診断、ならびに臨床試験の包含基準の確立方法に関する。
【０００２】
発明の背景
真性糖尿病は世界中で１億人以上もの患者がいる深刻な疾病である。米国では、１２００万人を超える患者があり、毎年６０万人超える患者が新しく診断される。
【０００３】
真性糖尿病はブドウ糖のホメオスタシスの異常によって血糖値が上昇するという特徴を持つ一群の障害の診断用語である。糖尿病には多くの種類があるが、最も一般的なのはＩ型（インスリン依存型糖尿病またはＩＤＤＭとも呼ばれる）およびＩＩ型（インスリン非依存型糖尿病またはＮＩＤＤＭとも呼ばれる）である。
【０００４】
異なる種類の糖尿病の原因は同じではない。しかし、すべての糖尿病患者には２つの共通点がある：肝臓におけるブドウ糖の過剰生産、およびブドウ糖が血中から体の主要な燃料になる細胞へ、ブドウ糖を移動させる能力が、ほとんどまたは全く欠如していること。
【０００５】
糖尿病でない人では、膵臓で生産されるホルモンであるインスリンが、血中から何十億という体の細胞へブドウ糖を運搬する。しかし、糖尿病患者の場合は、インスリンを生産できないか、または生産したインスリンを効率的に使用できないので、ブドウ糖を細胞へ運搬できない。血中にブドウ糖が蓄積すると、高血糖と呼ばれる状態になり、時間が経つ深刻な健康上の問題を生じうる。
【０００６】
糖尿病は代謝、血管、および神経障害的な要素が相互に関連した症候群である。一般に高血糖という特徴を持つ代謝症候群は、欠如または著しく低下したインスリン分泌、および／または非効率的インスリン作用によって引き起こされる、炭化水素、脂肪、および蛋白質代謝の変化を含む。血管症候群は、心血管、網膜、および腎臓の合併症を引き起こす血管の異常からなる。末梢および自律神経系の異常も糖尿病症候群の一部である。
【０００７】
ＩＤＤＭの患者は、糖尿病患者の約５−１０％を占めるが、インスリンを生産しないため、血糖値を正常に保つためにインスリンの注射が必要となる。ＩＤＤＭは膵臓のインスリン生産β細胞が破壊されているために内因性のインスリン生産レベルが低いまたは検出できないという特徴を持ち、これはＩＤＤＭをＮＩＤＤＭから最も容易に区別できる特徴である。以前は若年発症型糖尿病とも呼ばれたＩＤＤＭは、若年と高齢の成人に同様に発症する。
【０００８】
糖尿病患者の９０−９５％はＩＩ型（またはＮＩＤＤＭ）である。ＮＩＤＤＭ患者はインスリンを生産するが、体の細胞がインスリン抵抗性である。このホルモンに対して細胞が正しく応答しないため、ブドウ糖が血中に蓄積する。ＮＩＤＤＭは、内因性のインスリン生産とインスリン必要量が相対的に不釣り合いなために、血糖値レベルが上昇するという特徴を持つ。ＩＤＤＭと異なり、ＮＩＤＤＭでは、常にいくらかの内因性のインスリン生産がある。多くのＮＩＤＤＭ患者は血中インスリンレベルは正常または高いが、ＮＩＤＤＭ患者の中にはインスリン生産が不十分な患者もいる（Ｒｏｔｗｅｉｎ， Ｐ．ら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ３０８、６５−７１ （１９８３））。ＮＩＤＤＭと診断される患者の大部分は３０歳またはそれ以上で、新症例の半分は５５歳またはそれ以上である。白人およびアジア人と比較すると、ＮＩＤＤＭはアメリカ先住民、アフリカ系アメリカ人、ラテン系アメリカ人、ヒスパニックにより共通して見られる。さらに、発症は潜伏性、または臨床的に不顕性であるので、診断は困難な場合がある。
【０００９】
ＮＩＤＤＭの原発性の病原性病変は、とらえにくい。多くの研究者は末梢組織の原発性インスリン抵抗性が、最初の現象であると示唆している。遺伝的な疫学研究は、この見解を支持している。同様に、ＮＩＤＤＭではインスリン分泌の異常が、原発性の欠陥であるとも主張されてきた。ＮＩＤＤＭの発症においてはこの両方の現象が重要である可能性が高く、この両方を生じやすい遺伝的欠陥は、疾病の過程に重要な寄与をする可能性が高い（Ｒｉｍｏｉｎ， Ｄ．Ｌ．ら、ＥｍｅｒｙおよびＲｉｍｏｉｎの遺伝医学の原理と実際（Ｅｍｅｒｙ ａｎｄ Ｒｉｍｏｉｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ） 第３版、１：１４０１−１４０２ （１９９６））。
【００１０】
家族的集団および双生児の研究結果では、糖尿病の病因における遺伝的要素の重要性は明らかであるが、関与する遺伝的要素の性質については、意見の一致があまりない。この混乱は主に、糖尿病に存在することが既知である遺伝的不均一性のためである。
【００１１】
インスリン遺伝子、インスリン受容体遺伝子、およびインスリン感受性グルコーストランスポーター（ＧＬＵＴ ４）遺伝子を含む、いくつかの候補遺伝子の、ＮＩＤＤＭの病因における可能性のある役割が検討されてきたが、だいたいは相反する結果が得られている。初期の研究では、ヒトの１１番染色体の短腕上のインスリン遺伝子の５’隣接領域に、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）が同定された。この領域は、インスリンのｍＲＮＡ転写開始部位の約５００塩基対上流から始まっており、インスリン遺伝子の発現を調節すると考えられる。この多型は、様々な縦列反復数の（ＶＮＴＲ）配列によって生成する。白人では、ＶＮＴＲはクラスＩ（０−６００ ｂｐのサイズ）およびクラスＩＩＩ（１６００−２４００ ｂｐのサイズ）のアリルに分けられうる（Ｂｅｌｌ Ｇ．Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９８１； ７８：５７５９−６３）。これらのアリルは、ＲＦＬＰ分析を用いて容易に同定できる。ＨｐｈＩ座の「＋」アリル（Ｔ）（「＋」はその部位が制限酵素で切断されることを示す）は、隣接するインスリンＶＮＴＲのクラスＩアリルと完全な連鎖不平衡にあり、「−」アリルはクラスＩＩＩアリルと完全な連鎖不平衡にある。クラスＩアリルおよびクラスＩＩＩアリルは、オウワーバッハ（Ｏｗｅｒｂａｃｈ Ｄ．）、ポールセン（Ｐｏｕｌｓｅｎ， Ｓ．）ら、Ｌａｎｃｅｔ １：８８０−８８３ （１９８２）により、それぞれ「Ｌ」アリルおよび「Ｕ」アリルとも呼ばれる。さらに染色体１１ｐ１５．５に１９個の多型が同定されているが（Ｌｕｃａｓｓｅｎ， Ａ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ４、３０５−３１０ （１９９３））、この開示はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。このゲノム領域には、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、インスリン様成長因子ＩＩ （ＩＧＧ２）およびインスリン遺伝子が含まれる。
【００１２】
オウワーバッハ（Ｏｗｅｒｂａｃｈ Ｄ．）ら（Ｌａｎｃｅｔ １：８８０−８８３ （１９８２）は、６人の糖尿病患者を含む５３人の大家族において、インスリン遺伝子の５’隣接領域の制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析を行なった。大きい方の（クラスＩＩＩ）アリルと、加齢に伴う空腹時グルコースレベルの上昇およびインスリン応答の低下との間に、関連が見つかった。したがって、オウワーバッハらは、大きい方のアリルはＮＩＤＤＭ感受性の遺伝子マーカーであると見出した。同様に、ロットウェイン（Ｒｏｔｗｅｉｎ， Ｐ．）ら（Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ３０８：６５−７１ （１９８３））は、非糖尿病患者よりも、ＮＩＤＤＭ患者において長い挿入がより頻繁にあることを見いだし、インスリン遺伝子の５’隣接領域における多型（長さの差）がＮＩＤＤＭの遺伝子マーカーを提供する可能性があると結論づけた。しかし、パーマット（Ｐｅｒｍｕｔｔ， Ａ．）ら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ． ３４：３１１−３１４ （１９８５））は、同様な実験を行ない、インスリン遺伝子多型状態に対して、非糖尿病患者とＮＩＤＤＭ患者では、空腹時インスリン、ブドウ糖濃度、またはインスリン分泌応答に差がないことを見出した。したがって、インスリン遺伝子の５’隣接領域におけるアリル変異を、ＮＩＤＤＭに結びつけようという研究結果は、相反するものであり、決定的ではない。
【００１３】
ＮＩＤＤＭ患者の多くは、座業的なライフスタイルを持ち、肥満である。身長および体格を考慮した推奨体重を少なくとも２０％超過している。さらに、肥満は高インスリン血症およびインスリン抵抗性という特徴を持つが、これはＮＩＤＤＭ，高血圧、およびアテローム性動脈硬化とも共通する特徴である。上半身肥満（中心性）および高インスリン血症の分子遺伝学を探るために、ウィーバー（Ｗｅａｖｅｒ， Ｊ．Ｕ．）ら（Ｅｕｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ２２：２６５−２７０ （１９９２））は、５６人の重度肥満、非糖尿病女性において、インスリン遺伝子ＲＦＬＰと人体計測的測定およびインスリン分泌と抵抗性の指標との関連を調べた。ウィーバーらは、クラスＩＩＩアリルが、中心性肥満、空腹時高インスリン血症、インスリン分泌の刺激、およびインスリン抵抗性と関連することを発見した。したがって、彼らはインスリン遺伝子の５’隣接領域の多型が、遺伝子発現に影響を与え、それによって重度肥満の女性患者におけるインスリン生産を変化させることができると結論づけた。しかし、低出生体重およびＮＩＤＤＭを持つ２１８人の男性におけるインスリンＶＮＴＲを分析した研究、オング（Ｏｎｇ， Ｋ．Ｋ．Ｌ）ら、（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ２１：２６２−２６３ （１９９９））では、インスリンＶＮＴＲおよび出生体重は、ＮＩＤＤＭのリスクに独立した影響を持つことを見いだした。肥満とＮＩＤＤＭとの関係を明らかにしようという試みは、また相反する結果を生じ、糖尿病の遺伝的要素を探るための新しい手段が必要であった。
【００１４】
ＮＩＤＤＭの遺伝学の研究の最も問題となる局面は、おそらくこの疾病の根底にある、病因の高度な不均一性である。遺伝的欠陥は、ブドウ糖の調節に関与する多くの段階のいずれにも影響を与える可能性がある。これらの欠陥はそれぞれ、単独または他の欠陥と組み合わさって、ＮＩＤＤＭを引き起こす可能性がある。そのような病因の複雑さによって、遺伝的研究が不可能になるわけではないが、病因の高度な不均一性は、特定の病原機構を理解するためには、ブドウ糖不耐性という総体的表現型よりも具体的なレベルで生理的「欠陥」を測定できなけらばならないことを意味する（Ｒａｆｆｅｌら、「エメリーとリモインの遺伝医学の原理と実際（Ｅｍｅｒｙ ａｎｄ Ｒｉｍｏｉｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」 第３版、１４２１ （１９９６））。測定可能な生理的欠陥または前兆についてのこのような例の１つは、本明細書で考察される肥満である。
【００１５】
肥満と糖尿病は、工業化社会で最も広く見られる健康問題である。工業化諸国では、人口の３分の１が少なくとも２０％過体重である。米国では、肥満人口は７０年代末の２５％から９０年代初期の３３％までに増加した。肥満はＮＩＤＤＭの最も重要な危険因子の１つである。肥満の定義には色々あるが、一般に、身長と体格を考慮した推奨体重よりも少なくとも２０％超過すると肥満と考えられる。３０％体重超過するとＮＩＤＤＭの発症リスクは３倍になり、ＮＩＤＤＭ患者の４分の３は過体重である。
【００１６】
摂取カロリーとエネルギー消費の間の不均衡の結果である肥満は、実験動物およびヒトにおいて、インスリン抵抗性および糖尿病と高い相関がある。しかし、肥満・糖尿病症候群に関与する分子機構は明らかではない。肥満の初期段階では、インスリン分泌の上昇がインスリン抵抗性とつり合い、患者の高血糖を予防する（Ｌｅ Ｓｔｕｎｆｆら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ． ４３、６９６−７０２ （１９９４））。しかし、数十年すると、β細胞の機能が低下し、肥満人口の約２０％でインスリン非依存型糖尿病が発症する（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ， Ｐ．、Ｄｉａｂ． Ｍｅｔａｂ． Ｒｅｖ． ５、５０５−５０９ （１９８９））および（Ｂｒａｎｃａｔｉ， Ｆ．Ｌ．ら、Ａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ． １５９、９５７−９６３ （１９９９））。現代社会に肥満が多いことを考慮すると、肥満はＮＩＤＤＭの最大のリスクになっている（Ｈｉｌｌ， Ｊ．Ｏ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２８０、１３７１−１３７４ （１９９８））。しかし、患者の一部が、脂肪の蓄積に応答してインスリン分泌の変化を生じることの素因になる要素は不明である。
【００１７】
肥満は心血管疾患の発症リスクも上昇させる。冠不全、アテローム疾患、および心不全は、肥満によって誘導される心血管合併症の中心である。全人口が理想体重を保っていたら、冠不全のリスクは２５％低下し、心不全と脳血管発作のリスクは３５％低下すると見られている。３０％過体重の５０歳未満の被験者では、冠動脈疾患の発症率は、倍になる。糖尿病患者の寿命は３０％低下している。４５歳以降では、糖尿病患者は非糖尿病患者よりも、重大な心疾患を持つ可能性が約３倍、脳卒中の可能性が５倍までになる可能性がある。これらの所見は、ＮＩＤＤＭと冠動脈性心疾患の危険因子の間の相関、および肥満予防に基づいてこのような状態を予防する統合的な手法の潜在的価値を強調するものである（Ｐｅｒｒｙ， Ｉ．Ｊ．ら、ＢＭＪ． ３１０、５６０−５６４ （１９９５））。
【００１８】
糖尿病は腎疾患、眼疾患、および神経系の異常の発生にも関与している。腎症とも呼ばれる腎疾患では、腎臓の「濾過機構」が損なわれ、過剰量の蛋白質が尿中に漏れ出て起こり、最終的に腎臓が機能不全に陥る。糖尿病はまた、目の後ろ側の網膜の障害の最大の原因となり、白内障および緑内障のリスクを上昇させる。最後に、糖尿病は特に脚および足における神経障害に関連しており、これにより痛みを感じる能力が損なわれ、重篤な感染が起きる。これらを合わせると、糖尿病の合併症は、米国における死亡原因の第１位になる。
【００１９】
現在、糖尿病は治癒できないが、疾病の管理はできる。ＮＩＤＤＭの既存の治療法は長年の間、実質的に変わってはいないが、これらにはすべて限界がある。身体の運動および摂取カロリーの減少によって糖尿病の状態は劇的に改善するが、座業的なライフスタイルや食物の過剰摂取、特に高脂肪食物が定着しているため、この治療法のコンプライアンスは非常に悪い。膵臓β細胞のインスリン分泌を刺激するスルホニル尿素（例えば、トルブタミド、グリピジド）の投与により、またはスルホニル尿素へ応答しなくなった後にはインスリン注射により、インスリンの血漿濃度を上昇させると、インスリン抵抗性組織を刺激するために十分なインスリン濃度が得られる。しかし、これらの２つの治療法により、血漿ブドウ糖値レベルが危険なほど低くなる可能性があり、またより高い血漿インスリンレベルのおかげでインスリン抵抗性が理論的には高まる可能性もある。ビグアニドはインスリン感受性を高め、高血糖がある程度矯正される。しかし、フェンホルミンとメトホルミンの２つのビグアニドは、それぞれ乳酸性アシドーシスおよび悪心／下痢を誘導し得る。
【００２０】
発明の概要
本発明は患者のインスリンＨｐｈＩ座および体脂肪値の両方を調べることによって、患者のインスリン非依存型真性糖尿病（ＮＩＤＤＭまたはＩＩ型糖尿病）の発症リスクを決定する方法を特徴とする。関連する局面では、本発明はＮＩＤＤＭの亜型を診断する方法、およびＮＩＤＤＭ患者の合理的な治療法および維持を容易にする方法を特徴とする。
【００２１】
本発明は、インスリン遺伝子のＨｐｈＩ座の同型接合体および体脂肪測定を合わせると、ＮＩＤＤＭの感受性の良好な指標になるという発見の結果である。発明者は、肥満の少年少女における肥満とインスリンレベルの間の関係に対するＨｐｈＩ遺伝型の影響を調べ、ＨｐｈＩ ［＋／＋］同型接合体（インスリンＶＮＴＲ Ｉ／Ｉ）が、同等の肥満症のＨｐｈＩ ［＋／−］または［−／−］遺伝型（それぞれインスリンＶＮＴＲ Ｉ／ＩＩＩおよびインスリンＶＮＴＲ ＩＩＩ／ＩＩＩ）である少年少女よりも、インスリンとＢＭＩとの間に強い相関を示すことを発見した。したがって、ＨｐｈＩ ［＋／−］または［−／−］遺伝型を持つ肥満個体は、ＨｐｈＩ ［＋／＋］遺伝型を持つ肥満個体よりも、ＮＩＤＤＭを有意に発症しやすい。
【００２２】
第１の態様では、本発明はａ） 個体のインスリンＨｐｈＩ座との連鎖不平衡における少なくとも１つのマーカーの多型の塩基のアイデンティティを決定する段階；ｂ） 個体の体脂肪値を決定する段階；ならびにｃ） 該マーカーアイデンティティ、該体脂肪値、ならびに 該アイデンティティ、該体脂肪値、および 該ＮＩＤＤＭ発症リスクを相関させる事前に決められた値に基づいて、リスク値を割り当てる段階を含む、個体におけるＮＩＤＤＭの発症リスクの決定方法を特徴とする。別の局面では、本発明はａ） 個体のインスリン遺伝子のＶＮＴＲクラスを決定する段階；ｂ） 個体の体脂肪値を決定する段階；ならびにｃ） 該ＶＮＴＲクラス、該体脂肪値、ならびに 該ＶＮＴＲクラス、該体脂肪値、および 該ＮＩＤＤＭ発症リスクを相関させる事前に決められた値に基づいて、リスク値を割り当てる段階を含む、個体におけるＮＩＤＤＭの発症リスクの決定方法を特徴とする。さらに別の局面では、本発明はａ） 個体のゲノムに存在するマーカーの両方のコピーについて、該マーカーにおけるヌクレオチドを同定することにより、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にある該マーカーの遺伝子型同定をする段階；ｂ） 個体のゲノムに存在する第２のマーカーの両方のコピーについて、該第２の 遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドを同定することにより、該第２の マーカーの遺伝子型同定をする段階；ｃ） 個体の体脂肪値を決定する段階；およびｄ） 段階ａ）およびｂ）の 該アイデンティティ、段階ｃ）の 該体脂肪値、ならびに 該アイデンティティ、該体脂肪値、および 該ＮＩＤＤＭ発症リスクを相関させる事前に決められた値に基づいて、リスク値を割り当てる段階を含む、個体におけるＮＩＤＤＭの発症リスクの決定方法を特徴とする。さらに、個体におけるＮＩＤＤＭの発症リスクの決定方法は、本開示または以下に単独または任意の組み合せで記述される任意のさらなる限定を持つ方法を含む。選択的に、マーカーにおける多型塩基のアイデンティティは、個体のゲノムに存在するマーカーの両方のコピーについて決定される。選択的に、インスリン遺伝子のＶＮＴＲクラスは、該個体のゲノムに存在するＶＮＴＲの両方のコピーについて決定される。選択的に、第２の該マーカーはインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にある。選択的に、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡の該マーカーは、表Ｃに提供されるマーカー、好ましくはマーカー−４２１７ ＰｓｔＩ、−２２２１ ＭｓｐＩ、−２３ ＨｐｈＩ、＋１４２８ ＦｏｋＩ、＋１１０００ ＡｌｕＩ、および＋３２０００ ＡｐａＩ、またはより好ましくは−２３ ＨｐｈＩから選択できる。選択的に、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡のマーカーは、さらに当技術分野で周知のインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にある任意の他のマーカー、および本明細書に記述される方法によってインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にあることが決定される任意のマーカーを含み得る。
【００２３】
第２の態様では、本発明はａ） 個体のインスリンＨｐｈＩ座との連鎖不平衡における少なくとも１つのマーカーの多型の塩基のアイデンティティを決定する段階；ｂ） 個体の体脂肪値を決定する段階；ならびにｃ） 該マーカーアイデンティティ、該体脂肪値、ならびに該アイデンティティ、該体脂肪値、およびＮＩＤＤＭの特定の亜型を持つ可能性を相関させる事前に決められた値に基づいて、亜型を割り当てる段階を含む、個体のＮＩＤＤＭの亜型を診断する方法を特徴とする。別の局面では、本発明はａ） 個体のインスリン遺伝子のＶＮＴＲクラスを決定する段階；ｂ） 個体の体脂肪値を決定する段階；ならびにｃ） 該ＶＮＴＲクラス、該体脂肪値、および該ＶＮＴＲクラス、該体脂肪値、ならびにＮＩＤＤＭの特定の亜型を持つ可能性を相関させる事前に決められた値に基づいて、亜型を割り当てる段階を含む、個体のＮＩＤＤＭの亜型を診断する方法を特徴とする。さらに別の局面では、本発明はａ） 個体のゲノムに存在するマーカーの両方のコピーについて、該マーカーにおけるヌクレオチドを同定することにより、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にある該マーカーの遺伝子型同定をする段階；ｂ） 個体のゲノムに存在する第２のマーカーの両方のコピーについて、第２の遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドを同定することにより、該第２のマーカーの遺伝子型同定をする段階；ｃ） 該個体の体脂肪値を決定する段階；およびｄ） 段階ａ）およびｂ）の該アイデンティティ、段階ｃ）の該体脂肪値、ならびに該アイデンティティ、該体脂肪値、およびＮＩＤＤＭの特定の亜型を持つ可能性を相関させる事前に決められた値に基づいて、亜型を割り当てる段階を含む、個体のＮＩＤＤＭの亜型を診断する方法を特徴とする。さらに、個体のＮＩＤＤＭの亜型を診断する方法は、本開示または以下に単独または任意の組み合せで記述される任意のさらなる限定を持つ方法を含む。選択的に、該マーカーにおける多型塩基の該アイデンティティは、該個体のゲノムに存在するマーカーの両方のコピーについて決定される。選択的に、インスリン遺伝子の該ＶＮＴＲクラスは、該個体のゲノムに存在する該ＶＮＴＲの両方のコピーについて決定される。選択的に、該第２のマーカーはインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にある。選択的に、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡の該マーカーは、表Ｃに提供されるマーカー、好ましくはマーカー−４２１７ ＰｓｔＩ、−２２２１ ＭｓｐＩ、−２３ ＨｐｈＩ、＋１４２８ ＦｏｋＩ、＋１１０００ ＡｌｕＩ、および＋３２０００ ＡｐａＩ、またはより好ましくは−２３ ＨｐｈＩから選択できる。選択的に、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡のマーカーは、さらに当技術分野で周知のインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にある任意の他のマーカー、および本明細書に記述される方法によってインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にあることが決定される任意のマーカーを含み得る。
【００２４】
第３の態様では、本発明は、本発明の予後診断法、ならびに食事制限、カロリー消費の増加、胃腸管手術、薬物療法、および食物脂質の吸収低下からなる群より選択される減量療法の実施を含む、個体のＮＩＤＤＭの治療または予防方法を特徴とする。また、個体のＮＩＤＤＭの治療または予防方法は、本開示または以下に単独または任意の組み合せで記述される任意のさらなる限定を持つ方法を含む。
【００２５】
第４の態様では、本発明はａ） 個体のインスリンＨｐｈＩ座との連鎖不平衡における少なくとも１つのマーカーの多型の塩基のアイデンティティを決定する段階；ｂ） 個体の体脂肪値を決定する段階；ならびにｃ） 該マーカーアイデンティティ、該体脂肪値、ならびに該アイデンティティ、該体脂肪値、およびインスリン関連疾患を持つ可能性を相関させる事前に決められた値に基づいて、個体を含める段階を含む、インスリン関連疾患の臨床または相関解析における選択方法を特徴とする。別の局面では、本発明はａ） 個体のインスリン遺伝子のＶＮＴＲクラスを決定する段階；ｂ） 個体の体脂肪値を決定する段階；ならびにｃ） 該ＶＮＴＲクラス、該体脂肪値、および該ＶＮＴＲクラス、該体脂肪値、ならびにインスリン関連疾患を持つ可能性を相関させる事前に決められた値に基づく試験において、個体を含める段階を含む、インスリン関連疾患の臨床または相関解析における選択方法を特徴とする。さらに別の局面では、本発明はａ） 各個体のゲノムに存在するマーカーの両方のコピーについて、該マーカーにおけるヌクレオチドを同定することにより、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にあるマーカーの遺伝子型同定をする段階；ｂ） 個体のゲノムに存在する該第２のマーカーの両方のコピーについて、該第２の遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドを同定することにより、該第２のマーカーの遺伝子型同定をする段階；ｃ） 該個体の体脂肪値を決定する段階；およびｄ） 段階ａ）およびｂ）の該アイデンティティ、段階ｃ）の該体脂肪値、ならびに該アイデンティティ、該体脂肪値、およびインスリン関連疾患を持つ可能性を相関させる事前に決められた値に基づく試験において、個体を含める段階を含む、インスリン関連疾患の臨床または相関解析のための個体を同定する方法を特徴とする。さらに、この態様の方法は、本開示または以下に単独または任意の組み合せで記述される任意のさらなる限定を持つ方法を含む。選択的に、該マーカーにおける多型塩基の該アイデンティティは、該個体のゲノムに存在する該マーカーの両方のコピーについて決定される。選択的に、インスリン遺伝子の該ＶＮＴＲクラスは、該個体のゲノムに存在する該ＶＮＴＲの両方のコピーについて決定される。選択的に、該第２のマーカーはインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にある。選択的に、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡の該マーカーは、表Ｃに提供されるマーカー、好ましくはマーカー−４２１７ ＰｓｔＩ、−２２２１ ＭｓｐＩ、−２３ ＨｐｈＩ、＋１４２８ ＦｏｋＩ、＋１１０００ ＡｌｕＩ、および＋３２０００ ＡｐａＩ、またはより好ましくは−２３ ＨｐｈＩから選択できる。選択的に、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡の該マーカーは、さらに当技術分野で周知のインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にある任意の他のマーカー、および本明細書に記述される方法によってインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にあることが決定される任意のマーカーを含み得る。
【００２６】
第５の態様では、本発明はａ） 該患者群の各個体のゲノムに存在するマーカーの両方のコピーについて、該マーカーにおけるヌクレオチドを同定することにより、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にある該マーカーの遺伝子型同定をする段階；ｂ） 該患者群の各個体のゲノムに存在する第２のマーカーの両方のコピーについて、該第２の遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドを同定することにより、該第２のマーカーの遺伝子型同定をする段階；およびｃ）段階ａ）およびｂ）で決定されたヌクレオチドのアイデンティティにハプロタイプ決定法を適用し、該頻度の推定を行なう段階を含む、若年性肥満患者群における遺伝子マーカーセットに関するハプロタイプの頻度の推定方法を含む。さらに、本発明のハプロタイプ頻度の推定方法は、本開示または以下に単独または任意の組み合せで記述される任意のさらなる限定を持つ方法を含む。選択的に、該ハプロタイプ決定法は、非対称ＰＣＲ増幅、特定のアリルの二重ＰＣＲ増幅、クラーク法、または期待値最大化アルゴリズムからなる群より選択される。選択的に、第２のマーカーはインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にある。選択的に、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡のマーカーは、表Ｃに提供されるマーカー、好ましくはマーカー−４２１７ ＰｓｔＩ、−２２２１ ＭｓｐＩ、−２３ ＨｐｈＩ、＋１４２８ ＦｏｋＩ、＋１１０００ ＡｌｕＩ、および＋３２０００ ＡｐａＩ、またはより好ましくは−２３ ＨｐｈＩから選択できる。選択的に、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡の該マーカーは、さらに当技術分野で周知のインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にある任意の他のマーカー、および本明細書に記述される方法によってインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にあることが決定される任意のマーカーを含み得る。
【００２７】
第６の態様では、本発明は、ａ） 本発明のハプロタイプの頻度の推定方法にしたがって、インスリン関連疾患の患者群における少なくとも１つのハプロタイプの頻度を推定する段階；ｂ） 本発明のハプロタイプの頻度の推定方法にしたがって、対照群における該ハプロタイプの頻度を推定する段階；ならびにｃ） 該ハプロタイプと該インスリン関連疾患の間に統計的に有意な関連があるかどうかを決定する段階を含む、該ハプロタイプと該インスリン関連疾患との間の関連を検出する方法を含む。さらに、本発明のハプロタイプと形質の間の関連の検出方法は、本開示または以下に単独または任意の組み合せで記述される任意のさらなる限定を持つ方法を含む。選択的に、該インスリン関連疾患は高インスリン血症または高インスリン血症の素因である。選択的に、該ハプロタイプは、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡のマーカーからなり、これは表Ｃに提供されるマーカー、好ましくはマーカー−４２１７ ＰｓｔＩ、−２２２１ ＭｓｐＩ、−２３ ＨｐｈＩ、＋１４２８ ＦｏｋＩ、＋１１０００ ＡｌｕＩ、および＋３２０００ ＡｐａＩ、またはより好ましくは−２３ ＨｐｈＩから選択できる。選択的に、該ハプロタイプはインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡のマーカーからなり、これはさらに当技術分野で周知のインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にある任意の他のマーカー、および本明細書に記述される方法によってインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にあることが決定される任意のマーカーを含み得る。
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明を説明する前に、本発明は記述された特定の方法に制限されず、当然変わり得ることを理解する必要がある。本明細書で使用される用語は、特定の態様を説明する目的のためのみであり、添付する請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を制限する意図はないことも理解する必要がある。
【００２９】
本明細書および添付の請求の範囲で使用される単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかにそうでないことを示す場合以外は、指示対象の複数形も含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「個体」は１人または複数の個体を含み、「その方法」は当業者に周知の同等な段階および方法を含む。
【００３０】
他に記載がないかぎり、本明細書中のすべての専門的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって共通に理解されているものと同じ意味を持つ。本発明の実施または試験には、本明細書に記載したものと類似または同等の任意の方法および材料が使用できるが、本明細書中には好ましい方法および材料が記載されている。本明細書中に引用される全ての出版物は、その出版物が引用された特定の方法および／または材料を開示および説明するために、参照として本明細書に組み入れられる。
【００３１】
本明細書で開示される出版物は、本出願の出願日以前のその開示のためのみに提供される。本明細書において、本発明が先行発明があるためにかかる出版物に先行する資格がないと認めるものであると、解釈することはできない。さらに、提供される出版物の日付は、実際の出版日とは異なる可能性があり、これは独立して確認する必要がある。
【００３２】
定義
本発明を詳細に説明する前に、本発明を説明するために使用する用語の意味および範囲を説明および定義するために、以下の定義を定める。
【００３３】
本明細書で使用される「インスリン遺伝子」という用語は、ゲノムＤＮＡの非翻訳調節領域を含め、ポリペプチドホルモンインスリンをコードするゲノム、ｍＲＮＡ、およびｃＤＮＡ配列を含む。
【００３４】
「単離された」という用語は、その物質が元の環境（例えば、天然に存在するもの場合には、天然の環境）から除去されていることを必要とする。例えば、生きている動物中に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、同じポリヌクレオチドまたはＤＮＡまたはポリペプチドが天然系において共存する物質の一部または全てから分離されている場合には、単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部、および／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であっても、ベクターまたは組成物がその天然環境の一部ではないという点で、やはり単離されているといえる。
【００３５】
「単離された」という用語は、さらにその物質が元の環境（例えば、天然に存在するもの場合には、天然の環境）から除去されていることを必要とする。例えば、生きている動物中に存在する天然のポリヌクレオチドは単離されていないが、同じポリヌクレオチドが天然系において共存する物質の一部または全てから分離されている場合には、単離されている。インビトロ核酸調製物またはトランスフェクト／形質転換された宿主細胞調製物として存在する、天然に存在する染色体（染色体スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）など）、人工染色体ライブラリー、ゲノムライブラリー、およびｃＤＮＡライブラリーで、宿主細胞がインビトロの不均一調製物であるか、単一コロニーの不均一集団として播種されたものは、「単離された」という定義から特に除外される。また、本発明の特定のポリヌクレオチドが、ベクター分子中の核酸挿入断片の数の５％未満である上述ライブラリーも特に除外される。さらに全細胞ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡ調製物（機械的剪断または酵素消化した全細胞調製物を含む）も、除外される。さらに、インビトロ調製物または電気泳動（そのブロットトランスファーを含む）によって分離された不均一混合物としての上述の全細胞調製物で、本発明のポリヌクレオチドが電気泳動媒体中の不均一ポリヌクレオチドからさらに分離（例えば、アガロースゲルまたはナイロンブロット中の不均一バンド群から単一のバンドを切り出すことによるさらなる分離）されていないものも、除外される。
【００３６】
「精製された」という用語は、絶対的純度を必要とはせず、むしろ、相対的な定義である。開始物質または天然物質の、少なくとも１桁、好ましくは２−３桁、およびさらに好ましくは４桁または５桁の精製が、予期されている。例えば、濃度０．１％から濃度１０％への精製は、２桁の精製である。本明細書では「精製ポリヌクレオチド」という用語は、他の核酸、炭化水素、脂質、および蛋白質（ポリヌクレオチドの合成に使用された酵素など）を含むがこれらに限定されない他の化合物から分離された、本発明のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドベクター、または線状ポリヌクレオチドからの共有結合で閉じたポリヌクレオチドの分離を指す。試料の少なくとも５０％、好ましくは６０−７５％が単一のポリヌクレオチド配列および構造（線状か共有結合で閉じているか）を示す場合に、ポリヌクレオチドは実質的に純粋である。実質的に純粋なポリヌクレオチドは、典型的には核酸試料の約５０％ｗ／ｗ、好ましくは６０−９０％ｗ／ｗ、より普通には約９５％、および好ましくは約９９％以上、純粋である。ポリヌクレオチドの純度および均一性は、試料のアガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動後にゲル染色で単一ポリヌクレオチドバンドを可視化することなど、当技術分野で周知のいくつもの手段により、示される。特定の目的のためには、ＨＰＬＣまたは当技術分野で周知の他の手段を用いて、より高い解像度が提供できる。
【００３７】
「ポリペプチド」という用語は、ポリマーの長さには関わらず、アミノ酸のポリマーを指す。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、および蛋白質がポリペプチドの定義には含まれる。この用語は、ポリペプチドの発現後修飾を指定または排除しない。例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基等の共有結合を含むポリペプチドは、ポリペプチドという用語に明らかに含まれる。また、アミノ酸類似体（例えば、非天然アミノ酸、無関係の生物系にのみ存在するアミノ酸、哺乳類系由来の修飾アミノ酸等を含む）、結合が置換されたポリペプチド、ならびに天然および非天然の当技術分野で周知の他の修飾を１つまたは複数含むポリペプチドも、この定義に含まれる。
【００３８】
本明細書で使用される「組換えポリペプチド」という用語は、もとの天然環境では隣接するポリペプチド配列としては見られない、少なくとも２つのポリペプチド配列を含む、人工的に設計されたポリペプチドを指すか、組換えポリヌクレオチドから発現されたポリペプチドを指す。
【００３９】
本明細書で使用される「精製ポリペプチド」という用語は、核酸、脂質、炭化水素、および他の蛋白質を含むがこれらに限定されない他の成分から分離された本発明のポリペプチドを指す。ポリペプチドは、試料の少なくとも約５０％、好ましくは６０−７５％が単一のポリペプチド配列を示す場合に、実質的に純粋である。実質的に純粋なポリペプチドは、典型的には蛋白質試料の約５０％ｗ／ｗ、好ましくは６０−９０％ｗ／ｗ、より普通には約９５％、および好ましくは約９９％を超える割合で、純粋である。ポリペプチドの純度および均一性は、試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動後にゲル染色で単一ポリペプチドバンドを可視化することなど、当技術分野で周知のいくつもの手段により、示される。特定の目的のためには、ＨＰＬＣまたは当技術分野で周知の他の手段を用いて、より高い解像度が提供できる。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「非ヒト動物」という用語は、任意の非ヒト脊椎動物、鳥類およびより普通には哺乳類、好ましくは霊長類、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、およびウマのような家畜、ウサギ、または齧歯類、より好ましくはラットまたはマウスを指す。本明細書では「動物」という用語は、任意の脊椎動物、好ましくは哺乳類を指す。「動物」および「哺乳類」という用語のいずれも、前に「非ヒト」という言葉がついていなければ、明らかにヒトも含む。
【００４１】
本明細書全体を通して「ヌクレオチド配列」という表現は、ポリヌクレオチドまたは核酸を指すために区別なく使用される。より正確には、「ヌクレオチド配列」という表現は、核酸物質自身を含み、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を生化学的に特徴づける配列情報（４つの塩基文字から選択された文字の並び）に限定されない。
【００４２】
本明細書では互換的に使用される「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖の形の、１ヌクレオチドを超えるＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含む。本明細書で使用される「ヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖の形の任意の長さのＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含む分子を記述する形容詞である。本明細書では「ヌクレオチド」という用語は、個々のヌクレオチドまたはヌクレオチド変種を指す名詞としても使用され、プリンまたはピリミジン、リボースまたはデオキシリボース糖部分、およびリン酸基、またはオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド内のヌクレオチドの場合にはリン酸ジエステル結合を含む、より大きな核酸分子中の個々のユニット、または１つの分子を意味する。しかしながら「ヌクレオチド」という用語は本明細書では、少なくとも１つの修飾、（ａ） 別の結合基、（ｂ） プリンの類似型、（ｃ） ピリミジンの類似型、または （ｄ） 糖類似体を含む「修飾ヌクレオチド」を含む。結合基、プリン、ピリミジン、および糖の類似体の例は、国際公開公報第９５／０４０６４号参照。本発明のポリヌクレオチド配列は、合成、組換え、エクスビボ生成、またはその組み合せを含む任意の既知の方法、ならびに当技術分野で周知の任意の精製方法を用いて調製できる。
【００４３】
「プロモーター」は遺伝子の特異的転写を開始するために必要な、細胞の合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を指す。
【００４４】
プローモーターのような調節配列に「機能的に連結した」配列は、調節配列がＲＮＡポリメラーゼ開始および対象核酸の発現を制御するために、核酸に対して正しい位置および方向にあることを意味する。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「機能的に連結した」という用語は、機能的な関係にあるポリヌクレオチド要素の連結を指す。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を与える場合に、そのコード配列に機能的に連結している。より正確には、２つのＤＮＡ分子（プロモーター領域を含むポリヌクレオチドおよび所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）は、２つのポリヌクレオチドの連結の性質が、（１） フレームシフト変異を導入しない、または （２） プロモーターを含むポリヌクレオチドの、コードしているポリヌクレオチドの転写を指示する能力に干渉しない場合に、「機能的に連結している」と言われる。
【００４６】
「プライマー」という用語は、標的ヌクレオチド配列に相補的で、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするために使用される、特異的なオリゴヌクレオチド配列を指す。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素によって触媒されるヌクレオチド重合の開始点となる。
【００４７】
「プローブ」という用語は、試料中に存在する特異的なポリヌクレオチド配列を同定するために使用できる定義された核酸セグメント（またはヌクレオチド類似体セグメント、例えば、本明細書で定義されるポリヌクレオチド）で、同定され特異的なポリヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を持つ核酸セグメントを指す。
【００４８】
「形質」および「表現型」という用語は本明細書では互換的に使用され、例えば疾病の症状または感受性のような、生物体の任意の可視的、検出可能、または測定可能な性質を指す。本明細書では「形質」または「表現型」という用語は、疾病の症状またはその感受性、治療に対する有益な応答またはその副作用を指す。好ましくは、形質は、肥満関連の疾病および／または真性糖尿病であるが、これらに限定されない。
【００４９】
本明細書では「アリル」という用語は、ヌクレオチド配列の変種を指す。２アリル性の多型には、２つの形がある。二倍体生物は、アリルの形について、同型接合または異型接合であり得る。
【００５０】
本明細書では「異型接合率」という用語は、集団中で、特定のアリルが異型接合である個体の出現率を指す。２アリル系では、異型接合率は平均で２Ｐａ（１−Ｐａ）に等しく、ここでＰａは少ない方の共通のアリルの頻度である。遺伝子マーカーは、遺伝学研究に有用であるために、適当な確率を可能にするために無作為に選択された個体が異型接合であるような、適切な異型接合率を持つ必要がある。
【００５１】
本明細書で使用される「遺伝型」という用語は、個体または試料中に存在するアリルのアイデンティティを指す。本発明の状況では、遺伝型は好ましくは個体または試料中に存在する遺伝子マーカーアリルの記述を指す。遺伝子マーカーに関する試料または個体の「遺伝子型同定」には、遺伝子マーカーにおいて、個体が持っている特定のアリルまたは特定のヌクレオチドを決定することが含まれる。
【００５２】
本明細書で使用される「変異」という用語は、異なるゲノムまたは個体の間における、ＤＮＡ配列の差で、頻度が１％未満のものを指す。
【００５３】
「ハプロタイプ」という用語は、個体または試料中に存在するアリルの組み合せを指す。本発明の状況では、ハプロタイプは好ましくは特定の個体中に見られる遺伝子マーカーの組み合せで、表現型と関連する可能性のあるものを指す。
【００５４】
本明細書で使用される「多型」という用語は、異なるゲノムまたは個体の間で、２つまたはそれ以上の別のゲノム配列またはアリルが存在することを指す。「多型」とは、１つの集団に見出される特定のゲノム配列の２つまたはそれ以上の変種が見られる状態を指す。「多型部位」とは、変種が起こる座位である。一塩基多型は、多型部位において、１つのヌクレオチドを別のヌクレオチドによって置換することである。一塩基の欠失または一塩基の挿入も、一塩基多型を生じる。本発明の状況では、「一塩基多型」は好ましくは一塩基の置換を指す。通常は、異なる個体の間で、多型部位は２つの異なるヌクレオチドが占める可能性がある。
【００５５】
「２アリル多型」および「遺伝子マーカー」は本明細書では互換的に使用され、集団中でかなりの高頻度で２つのアリルを持つ一塩基多型を指す。「遺伝子マーカーアリル」とは、遺伝子マーカー部位に存在するヌクレオチド変種を指す。通常は、本発明の遺伝子マーカーの頻度の低い方のアリルの頻度は、１％を超え、好ましくは１０％を超え、より好ましくは少なくとも２０％（少なくとも０．３２の異型接合率）、さらに好ましくは少なくとも３０％（少なくとも０．４２の異型接合率）であると確認されている。頻度の低いほうのアリルの頻度が３０％またはそれ以上の遺伝子マーカーは、「高品質遺伝子マーカー」と呼ばれる。
【００５６】
本発明は、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にあるマーカーにも関する。「インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にあるマーカー」という用語は、表Ｃに提供される遺伝子マーカー、好ましくはマーカー−４２１７ ＰｓｔＩ、−２２２１ ＭｓｐＩ、−２３ ＨｐｈＩ、＋１４２８ ＦｏｋＩ、＋１１０００ ＡｌｕＩ、および＋３２０００ ＡｐａＩ、またはより好ましくは−２３ ＨｐｈＩに関する。「インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にあるマーカー」という用語は、当技術分野で周知のインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にある任意の他のマーカー、および本明細書に記述される方法によってインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にあることが決定される任意のマーカーを含み得る。
【００５７】
ポリヌクレオチドの中央に関するポリヌクレオチドのヌクレオチド位置は、本明細書では以下の様に記載される。ポリヌクレオチドが奇数のヌクレオチドを持つ場合には、ポリヌクレオチドの３’末端および５’末端から等距離にあるヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの「中央に」あると考えられ、中央にあるヌクレオチドに直接隣接する任意のヌクレオチド、または中央にあるヌクレオチド自身が「中央から１ヌクレオチド以内」である等と考えられる。ポリヌクレオチド中のヌクレオチドが奇数であれば、ポリヌクレオチドの中央にある任意の５つのヌクレオチド位置は、中央から２ヌクレオチド以内である等と考えられる。ポリヌクレオチドが偶数のヌクレオチドを持つ場合には、ポリヌクレオチドの中央にはヌクレオチドではなく結合がある。したがって、２つの中央のヌクレオチドのいずれもが、「中央から１ヌクレオチド以内」と考えられ、ポリヌクレオチドの中央の４つのヌクレオチドのいずれかが「中央から２ヌクレオチド以内」である等と考えられる。１つまたは複数のヌクレオチドの置換、挿入、または欠失を含む多型の場合は、多型の置換、挿入、または欠失したポリヌクレオチドからポリヌクレオチドの３’末端までの距離、および多型の置換、挿入、または欠失したポリヌクレオチドからポリヌクレオチドの５’末端までの距離の差がゼロまたは１ヌクレオチドの場合に、多型、アリル、または遺伝子マーカーはポリヌクレオチドの「中央に」ある。この差が０−３の場合には、多型は「中央から１ヌクレオチド以内」にあると考えられる。この差が０−５の場合には、多型は「中央から２ヌクレオチド以内」にあると考えられる。この差が０−７の場合には、多型は「中央から３ヌクレオチド以内」にある等と考えられる。
【００５８】
本明細書では「上流」という用語は、特定の参照点から、ポリヌクレオチドの５’末端方向の場所を指す。
【００５９】
本明細書では「塩基対」および「ワトソン・クリック塩基対」は互換的に使用され、チミン残基またはウラシル残基が２つの水素結合でアデニン残基に結合し、シトシン残基が３つの水素結合でグアニン残基に結合している二重らせんＤＮＡ中と同様に、配列のアイデンティティのために互いに水素結合し得るヌクレオチドを指す（Ｓｔｒｙｅｒ， Ｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４版、１９９５参照）。
【００６０】
本明細書では「相補的」または「その相補鎖」という用語は、相補的な領域全体を通して、別の特定のポリヌクレオチドとワトソン・クリック塩基対を形成する能力のある、ポリヌクレオチド配列を指す。本発明では、第１のポリヌクレオチド中の各塩基が、その相補的な塩基と対を作れば、第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドに相補的であると考えられる。一般的に、相補的な塩基は、ＡとＴ（またはＡとＵ）、またはＣとＧである。本明細書で使用される「相補鎖」は、「相補的ポリヌクレオチド」、「相補的核酸」および「相補的ヌクレオチド配列」と同義である。これらの用語は、２つのポリヌクレオチドが実際に結合するような特定の条件ではなく、その配列のみに基づいてポリヌクレオチドの対に対して使用される。
【００６１】
「インスリン関連疾患」という用語は、個体においてインスリンの生産、分泌、または機能（インスリン抵抗性）が変化している、当技術分野で周知の任意の疾病を指す。「インスリン関連疾患」という用語は、特にインスリン依存型真性糖尿病（ＩＤＤＭまたはＩ型糖尿病）、またはインスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭまたはＩＩ型糖尿病）、妊娠性糖尿病、自己免疫性糖尿病、高インスリン血症、高血糖、低血糖、β細胞障害、インスリン抵抗性、異常脂質血症、アテローマ、およびインスリノーマを指す。「インスリン関連疾患」という用語は、さらに肥満関連ＮＩＤＤＭ，肥満関連アテローム性動脈硬化、心疾患、肥満関連インスリン抵抗性、肥満関連高血圧、肥満関連ＮＩＤＤＭに起因する微小血管障害病変、肥満関連ＮＩＤＤＭの肥満患者における微小血管障害に起因する眼病変、および肥満関連ＮＩＤＤＭの肥満患者における微小血管障害に起因する腎病変のような、肥満関連疾患および肥満も指す。
【００６２】
「インスリン関連疾患に作用する薬剤」という用語は、インスリン生産、インスリン分泌、インスリン機能の活性を調節する、肥満個体の体重を減少させる、またはＩＤＤＭ、ＮＩＤＤＭ、妊娠性糖尿病、自己免疫性糖尿病、高インスリン血症、高血糖、低血糖、β細胞障害、インスリン抵抗性、異常脂質血症、アテローマ、インスリノーマ、肥満、および本明細書で定義される肥満関連疾患からなる群より選択される、インスリン関連の疾病を治療する、薬剤または化合物を指す。
【００６３】
「インスリン関連疾患に作用する薬剤への応答」という用語は、個体における、化合物を代謝する能力、プロドラッグを活性のある薬剤に変換する能力、および薬剤の薬物動態（吸収、分布、排出）および薬力学（受容体関連）を含むがこれらに限定されない、薬効を指す。
【００６４】
「インスリン関連疾患に作用する薬剤の副作用」という用語は、薬剤の主な薬理学的作用の延長に起因する治療の有害効果、または特有の宿主要素と薬剤の間の相互作用に起因する特異体質性有害反応を指す。
【００６５】
本明細書で使用される「ＮＩＤＤＭ」という用語は、インスリン非依存型糖尿病またはＩＩ型糖尿病（本明細書全体で、この２つの用語は互換的に使用される）を指す。ＮＩＤＤＭは内因性インスリン生産と、インスリン必要量との間に相対的な差があるために、血糖値が上昇する状態を指す。
【００６６】
本明細書で使用される「減量療法」は、体重を減少させることを目的とした、当技術分野で周知の任意の治療法を指す。減量療法には、食事制限、カロリー消費の増加、胃腸管手術、薬物療法、および食物脂質の吸収低下が含まれる。
【００６７】
本明細書で使用される「患者」という用語は、動物、好ましくはマウス、ラット、イヌ、ウシ、ヒツジ、または霊長類を含む哺乳類を、最も好ましくは治療を必要とするヒトを指す。本明細書では「そのような治療を必要とする」という用語は、ヒトの場合には、この患者が治療を必要とするという、医師による判断を指す。この判断は、医師の専門知識の範囲内の種々の要素に基づいて行われるが、それには、本発明の化合物によって治療可能な状態の結果として患者が病気であるまたは病気になると思われるという知識が含まれる。
【００６８】
本明細書で使用される「個体」という用語も、動物、好ましくはマウス、ラット、イヌ、ウシ、ヒツジ、または霊長類を含む哺乳類を、最も好ましくは減量の必要性を認識している（または誰かがその人には減量の必要性があると認識する）ヒトを指す。「必要性を認識する」というのは、典型的には臨床的肥満の基準未満の体重の変化（増加）を指すが、臨床的肥満も含んでも良い。「体重の変化」は上記に定義されている。
【００６９】
ＮＩＤＤＭと肥満
摂取カロリーとエネルギー消費の間の不均衡の結果である肥満は、実験動物およびヒトにおいて、インスリン抵抗性および糖尿病と高い相関がある。しかし、肥満・糖尿病症候群に関与する分子機構は明らかではない。肥満の初期段階では、インスリン分泌の上昇がインスリン抵抗性とつり合い、患者の高血糖を予防する（Ｌｅ Ｓｔｕｎｆｆら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ． ４３、６９６−７０２ （１９９４））。しかし、数十年すると、β細胞の機能が低下し、肥満人口の約２０％でＮＩＤＤＭの肥満関連亜型（妊娠性糖尿病）が発症する（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ， Ｐ． Ｄｉａｂ． Ｍｅｔａｂ． Ｒｅｖ． ５、５０５−５０９ （１９８９））および（Ｂｒａｎｃａｔｉ， Ｆ．Ｌ．、Ｗａｎｇ， Ｎ．Ｙ、Ｍｅａｄ， Ｌ．Ａ、Ｌｉａｎｇ， Ｋ．Ｙ、Ｋｌａｇ， Ｍ．Ｊ． Ａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ． １５９、９５７−９６３ （１９９９））および（Ａｒｎｅｒ， Ｐ．ら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ． ３４、４８３−４８７ （１９９１））。現代社会に肥満が多いことを考慮すると、肥満はＮＩＤＤＭの最大のリスクになっている（Ｈｉｌｌ， Ｊ．Ｏ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２８０、１３７１−１３７４ （１９９８））。
【００７０】
脂肪蓄積に応答して、患者の一部でインスリン分泌を変化させる素因となる要素は、不明である。この問題に取り組むために、発明者は若年型肥満の動的段階において、インスリンレベルを検討した。成人患者におけるインスリン分泌の研究には、偏向がある可能性がある：年齢関連の差、人種、不明の肥満歴、時間に依存するβ細胞不全、食事および薬剤による変化、および変化する血糖状態。しかし、肥満の小児は、最初は正常な空腹時インスリンおよびインスリン感受性を持ち（Ｌｅ Ｓｔｕｎｆｆら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ． ４３、６９６−７０２ （１９９４））、肥満が数年続いた後にのみ、高インスリン血症を発症するため、肥満関連のシグナルに対する初期のβ細胞応答について、より信頼性の高い研究ができる。
【００７１】
肥満患者は、インスリン遺伝子の翻訳開始コドンに隣接する多型である（Ｌｕｃａｓｓｅｎ， Ａ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ４、３０５−３１０ （１９９３））、−２３ ＨｐｈＩ座（多型はインスリン遺伝子の開始コドンＡＴＧ （＋１）の最初の塩基に対する位置で示されている）で遺伝子型同定された。このＲＦＬＰは、隣接するインスリンＶＮＴＲと強い連鎖不平衡にある。ＨｐｈＩ座の「＋」アリル（Ｔ）は、隣接するインスリンＶＮＴＲのクラスＩアリルと完全な連鎖不平衡にあり、「−」アリル（Ａ）はクラスＩＩＩアリルと完全な連鎖不平衡にある。したがって、本研究では、代理マーカーとして−２３ ＨｐｈＩ多型を通して、インスリンＶＮＴＲを調べる。ＶＮＴＲの多型は、インスリン遺伝子の転写を調節すると考えられる（Ｋｅｎｎｅｄｙ， Ｃ．Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ９、２９３−２９８ （１９９５））。
【００７２】
若年の肥満患者ではＨｐｈＩアリルおよび遺伝型の頻度は、痩せた白人患者と同等である。しかし、ＨｐｈＩ遺伝型は空腹時インスリンレベルの差と関連していた。ＨｐｈＩ ［＋／＋］遺伝型の患者は、若くても同等の肥満症のＨｐｈＩ ［＋／−］または ［−／−］の遺伝型の患者よりもインスリンレベルが高いことを示した。この差は、空腹時インスリンレベルがＨｐｈＩ ［＋／＋］個体で約６０−７０％高い、過度の肥満の小児でさらに大きかった。肥満コホート全体では、血漿インスリンおよびＢＭＩ値は相関していた（ｒ＝０．５４、ｐ＜０．０００１）。共分散分析では、ＨｐｈＩ遺伝型がインスリンとＢＭＩ値との関係に主要な影響を与えることが示された（ｐ＜０．０００１）。ＨｐｈＩ ［＋／＋］同型接合体（インスリンＶＮＴＲ Ｉ／Ｉ）は、他の２つの遺伝型よりも、インスリンとＢＭＩの間に強い相関を示した。ＢＭＩに対するインスリンレベルの高度な有意の関連は、すべてＨｐｈＩアリルと強い連鎖不平衡にある近隣マーカー（−４２１７ ＰｓｔＩ、−２２２１ ＭｓｐＩ、＋１４２８ ＦｏｋＩ、＋１１０００ ＡｌｕＩ）でも観察された（Ｌｕｃａｓｓｅｎ， Ａ．Ｍら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ４、３０５−３１０ （１９９３））。
【００７３】
また、発明者は異型接合体ＨｐｈＩ ［＋／−］またはＨｐｈＩ ［−／−］、すなわちＶＮＴＲ Ｉ／ＩＩＩおよびＩＩＩ／ＩＩＩの女性は、妊娠中の肥満に応答して低いインスリン応答を示し、Ｉ／ＩＩＩおよびＩＩＩ／ＩＩＩの胎児の大きさに潜在的影響のある高血糖になるといいう仮説を立てた。しかし、この仮説は、受胎産物の出生体重に対する親アリルの影響を除外するものではない。
【００７４】
発明者は、ＨｐｈＩ座からわずか３６０ ｂｐにあり、そのアリルとほぼ完全な連鎖不平衡にある（Ｂｅｎｎｅｔｔ， Ｓ．Ｔ．ら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ． ３０、３４３−３７０ （１９９６））インスリンＶＮＴＲの関与する、インスリン遺伝型およびインスリンレベルの間の関連を発見した。さらに、インスリン遺伝子の転写に対するその影響は（Ｌｕｃａｓｓｅｎ， Ａ．Ｍ．ら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ． ４、５０１−５０６ （１９９５））、インスリンＶＮＴＲがこの実験結果を説明するものである可能性があることを示唆する。発明者による観察に基づくと、ＨｐｈＩ多型および近隣ＶＮＴＲは、ヒトにおける遺伝性が０．２０と０．５２の間だと見積もられている（Ｓｎｉｅｄｅｒ， Ｈ．ら、Ｇｅｎｅｔ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ． １６、４２６−４４６ （１９９９））形質である、空腹時インスリンレベルの遺伝的調節に関与する最初の座位を表す。
【００７５】
本明細書に記述されるデータによると、インスリンＶＮＴＲおよびＨｐｈＩ多型は、若年の肥満患者において、β細胞がインスリン抵抗性に対応できないことおよびＮＩＤＤＭ感受性の遺伝子マーカーである。したがって、本発明は、個体のインスリンＨｐｈＩ座との連鎖不平衡にある少なくとも１つのマーカーの遺伝子型同定を行なう段階；個体の体脂肪値を決定する段階；ならびに遺伝子型同定、体脂肪値、ならびに遺伝子型同定、体脂肪値、およびＮＩＤＤＭの発症リスクを相関させる事前に決められた値に基づいて、リスク値を割り当てる段階を含む、個体におけるＮＩＤＤＭの発症リスクを決定する方法を特徴とする。
【００７６】
別の局面では、本発明は上述の個体において、ＮＩＤＤＭの発症リスクを決定する方法を特徴とする。しかし、インスリン遺伝子のＶＮＴＲクラスが決定されリスクの決定に使用される。例えば、ＮＩＤＤＭの発症リスクは、下記のように、ＶＮＴＲクラス、体脂肪値、ならびにＶＮＴＲクラス、体脂肪値、およびＮＩＤＤＭの発症リスクを相関させる事前に決められた値に基づく。
【００７７】
表ＩＡ： ＮＩＤＤＭの発症リスクの値
2004512842.tif 000002
＊＊＊ ＮＩＤＤＭ発症のリスクが高いことを示す
＊＊ ＮＩＤＤＭ発症のリスクが中程度であることを示す
＊ ＮＩＤＤＭ発症のリスクが低いことを示す
【００７８】
表ＩＢ： ＮＩＤＤＭの発症リスクの値
2004512842.tif 000003
＊＊＊ ＮＩＤＤＭ発症のリスクが高いことを示す
＊＊ ＮＩＤＤＭ発症のリスクが中程度であることを示す
＊ ＮＩＤＤＭ発症のリスクが低いことを示す
【００７９】
ＮＩＤＤＭの亜型
おそらくＮＩＤＤＭの遺伝学の研究の最も問題となる局面は、この疾病の根底にある、原因の広範な不均一性である可能性が高い。遺伝的欠陥はブドウ糖調節に関与する多くの段階のいずれにも影響を与える。これらの欠陥の各々が、単独または他の欠陥と共に、ＮＩＤＤＭを引き起こす可能性がある。そのような病因の複雑さによって、遺伝的研究が不可能になるわけではないが、病因の広範な不均一性は、特定の病原機構を理解するためには、ブドウ糖不耐性という総体的表現型よりも具体的なレベルで生理的「欠陥」を測定できる必要があることを意味する（Ｒａｆｆｅｌら、「エメリーとライモインの遺伝医学の原理と実際（Ｅｍｅｒｙ ａｎｄ Ｒｉｍｏｉｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」 第３版、１４２１ （１９９６））。
【００８０】
本発明では、発明者は若年型肥満の動的段階において、インスリンレベルを検討した。脂肪組織量が増加すると、インスリンの作用に対する体全体の感受性および耐糖能に悪影響があることが知られている。脂質分解の速度が上昇する（脂肪分解）と、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の放出が起きる。これは肝臓によるインスリンの取り込みに有害な作用を持ち、それにより糖生成（アミノ酸の分解およびブドウ糖への変換）の増加、肝臓によるブドウ糖の生産、および全身の異常脂質血症が起きる。これらの要素は、全身の高インスリン血症（循環インスリン濃度の上昇）およびブドウ糖の取り込みの低下を伴う骨格のインスリン感受性の低下に貢献する。最初は、膵臓のβ細胞がインスリンの生産量を増加させることによって、これらの過程を埋め合わせる。しかし、時間が経つと、β細胞障害が起き、循環する血糖濃度が上昇し（高血糖）、それによりＮＩＤＤＭが発症する（Ｋｏｐｅｌｍａｎ Ｐ．Ｇ． Ｎａｔｕｒｅ． ４０４；６３９ （２０００））。肥満でないＮＩＤＤＭ個体はしばしば分泌障害（β細胞障害）を示すのみだが、肥満のＮＩＤＤＭ患者は、インスリン分泌欠損に合わせて末梢インスリン抵抗性に苦しんでいる。したがって、肥満のＮＩＤＤＭ個体と肥満でないＮＩＤＤＭ個体は、高血糖の原因の異なる２つの形を示す可能性がある：肥満関連ＮＩＤＤＭおよび非肥満関連糖尿病。
【００８１】
本発明は、個体のＮＩＤＤＭの亜型の診断方法を特徴とする。すなわち、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡のマーカーのアイデンティティおよび体脂肪値に基づいて、個体を糖尿病の亜型に分別する。そのような方法には、個体のインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡の少なくとも１つのマーカーを遺伝子型同定する段階；個体の体脂肪値を決定する段階；ならびに遺伝型、体脂肪値、ならびに遺伝型、体脂肪値、および特定のＮＩＤＤＭ亜型を持つ可能性を相関させる、事前に決められた値に基づいて、亜型を割り当てる段階が含まれる。
【００８２】
別の局面では、本発明は上記のようにして個体のＮＩＤＤＭの亜型を診断する方法を特徴とする。しかし、インスリン遺伝子のＶＮＴＲクラスが決定され、亜型の決定に使用される。例えば、亜型は、下記のように、ＶＮＴＲクラス、体脂肪値、ならびにＶＮＴＲクラス、体脂肪値、および特定のＮＩＤＤＭ亜型を持つ可能性を相関させる、事前に決められた値に基づく。
【００８３】
表ＩＩＡ： ＮＩＤＤＭの亜型の診断
2004512842.tif 000004
ＯＲは肥満関連ＮＩＤＤＭを示す
ＮＯＲは非肥満関連ＮＩＤＤＭを示す
【００８４】
表ＩＩＢ： ＮＩＤＤＭの亜型の診断
2004512842.tif 000005
ＯＲは肥満関連ＮＩＤＤＭを示す
ＮＯＲは非肥満関連ＮＩＤＤＭを示す
【００８５】
肥満関連ＮＩＤＤＭの治療
肥満関連ＮＩＤＤＭは治癒できないが、減量およびブドウ糖のホメオスタシスの維持のための努力をすることにより、疾病の管理はできる。
【００８６】
減量のために提案されている治療法には５つの種類がある。（１） 食事制限は最も頻繁に使用される。肥満個体は食事習慣を変えて摂取カロリーを低下させる、すなわち、超低カロリー（ＶＬＣ）ダイエット（４００および８００ ｋｃａｌ／日）にするように助言される。この種の治療法は短期的には有効であるが、再発率は非常に高い。（２） 身体の運動による消費カロリーの増加も提案されている。この治療法は単独では有効ではないが、低カロリーダイエットの患者の減量を促進する。合わせると、食事制限および消費カロリーの増加は、単一の行動修正療法と考えられることがある。（３） 摂取カロリーの吸収を低下させる胃腸管手術は有効であるが、その副作用のためにほとんど廃止されている。（４） 消化管の内腔に食物脂質を隔離することによって、その吸収を低下させる手法も用いられる。しかしこれは、脂溶性ビタミンの吸収不良、鼓脹、および脂肪便を含む忍容しがたい生理的不均衡を誘導する。どのような治療法を考えて、肥満の治療には非常に高い再発率という特徴がある。（５） かなりの減量を可能にする薬物戦略が５つある：
ａ） 食欲不振誘発性のシグナルまたは因子（食物摂取を抑制するもの）の阻害効果を増幅する、または食欲促進シグナルまたは因子（食物摂取を刺激するもの）を阻止することにより、食物摂取を減少させる、すなわちシブトラミン；
ｂ） 消化管における栄養の吸収（特に脂質）を阻害する、すなわちオルリスタット；
ｃ） ＡＴＰの生成から燃料代謝を脱共役させることにより、熱発生を増加させ、それにより食物エネルギーを熱として消費する、すなわちエフェドリンおよびカフェイン；
ｄ） 脂肪合成／脂肪分解または脂肪分化／アポトーシスを調節することにより、脂肪または蛋白質の代謝または貯蔵を変化させる；および
ｅ） コントローラーが調べる内部標準値を変化させるか、コントローラーが分析する脂肪貯蔵に関する１次求心性シグナルを調節することにより、体重を調節する中枢コントローラーを変化させる（Ｂｒａｙ Ｇ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ． ４０４：６７２−６７４ （２０００）およびＨｅａｌｔｈｅｏｎ／ＷｅｂＭＤ （１９９９））。
【００８７】
身体の運動および摂取カロリーの減少によって糖尿病の症状は劇的に改善するが、座業的なライフスタイルや食物の過剰摂取、特に高脂肪食物が定着しているため、この治療法のコンプライアンスは非常に悪い。膵臓β細胞のインスリン分泌を上昇させるスルホニル尿素（例えば、トルブタミド、グリピジド）の投与により、またはスルホニル尿素へ応答できなくなった後にはインスリン注射により、インスリンの血漿濃度を上昇させると、インスリン抵抗性組織を刺激するために十分高いインスリン濃度が得られる。しかし、これらの２つの治療法によると、血漿ブドウ糖レベルが危険なほど低くなる可能性があり、またより高い血漿インスリン濃度のおかげでインスリン抵抗性が高まる可能性も理論的にはある。ビグアニドはインスリン感受性を高めるために、高血糖がある程度矯正される。しかし、フェンホルミンとメトホルミンの２つのビグアニドは、それぞれ乳酸性アシドーシスおよび悪心／下痢を誘導し得る。
【００８８】
体脂肪値の決定方法
肥満は健康を維持するために必要な量以上の過剰な脂肪として大まかに定義されるが、正式には、寿命を最大にすると定義される理想体重を大きく上回ることとして定義される（Ｆｒｉｅｄｍａｎ， Ｊ．Ｍ． Ｎａｔｕｒｅ． ４０４：６３３ （２０００））。脂肪過多の簡便な臨床および疫学的尺度は、肥満指数（ＢＭＩ）であり、これは体重を身長の二乗で割って計算される（ｋｇ／ｍ２）。ＢＭＩは本明細書で説明されるような、より複雑な体脂肪の尺度と高い相関を示すが、極端な身長分布の場合には正確さは低下する（Ｈｅａｌｔｈｅｏｎ／ＷｅｂＭＤ １９９９）。
【００８９】
肥満指数
臨床の場では、体脂肪は体重と身長を組み合せた公式を用いて、最も一般的かつ簡便に見積もられる。その根底にある前提は、身長が同一の人間の体重の変動の大部分は、体脂肪によるというもので、研究に最も頻繁に使用される公式は、肥満指数（ＢＭＩ）である。ＢＭＩ値を用いた肥満度の分類は、体脂肪の増加に関して、貴重な情報を与える。集団内部および集団間で体重に関して意味のある比較をしたり、疾病や死亡のリスクのある個体や集団を同定したりできる。また、個体または地域社会レベルで介入の優先順位を決定したり、そのような介入の有効性の評価ができる。しかし、ＢＭＩは異なる集団間では、肥満の度合いに同じように相関しない場合がある。また異なる個体および集団間での肥満の性質の大きな違いも説明できない（Ｋｏｐｅｌｍａｎ Ｐ．Ｇ． Ｎａｔｕｒｅ． ４０４：６３５ （２０００））。
【００９０】
世界保健機構は以下のようなＢＭＩを用いた過体重の分類を提供している。
表Ａ
2004512842.tif 000006
【００９１】
体脂肪値を測定する他の方法
ＢＭＩの他にも、胴囲、胴囲対腰回りの比、皮下脂肪厚、およびバイオインピーダンスを含めた、いくつかの脂肪測定方法がある（Ｈｅｙｍｓｆｉｅｌｄ Ｓ．Ｂ．ら、Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ． ６４：４７８−８４ （１９９６））および（Ｃａｌｌｅ Ｅ．Ｃ．ら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ３４１：１０９７−１１０４ （１９９９））および（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ Ｄ．ら、Ａｍ Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ． １４３：２２８−３９ （１９９６））。本明細書の表Ｂにこれらの方法を示す。
【００９２】
表Ｂ
2004512842.tif 000007
（Ｋｏｐｅｌｍａｎ Ｐ．Ｇ． Ｎａｔｕｒｅ． ４０４：６３５ （２０００））
【００９３】
遺伝子マーカーに関する個体の遺伝子型同定法
本発明の１つまたは複数の遺伝子マーカーについて、全てインビトロで行なえる生物試料の遺伝子型同定の方法が提供される。そのような遺伝子型同定法には、当技術分野で周知の任意の方法により、インスリン関連遺伝子マーカー部位のヌクレオチドを同定することが含まれる。インスリン関連遺伝子マーカーは、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にある任意のマーカーである。これには、インスリン遺伝子のＶＮＴＲの代理である、当技術分野で周知の任意のマーカーが含まれる。インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡のマーカーのリストは、本明細書の表Ｃに提供される。
【００９４】
これらの方法は、相関解析における患者−対照群の遺伝子型同定、および特定の形質と相関することが既知の遺伝子マーカーのアリルの個体における検出に使用できる。後者では、個体のゲノムに存在する遺伝子マーカーの両方のコピーを決定し、特定のアリルに関して個体を同型接合体または異型接合体に分類する。
【００９５】
これらの遺伝子型同定法は、単一の個体またはプールされたＤＮＡ試料から得られた核酸試料で行なえる。
【００９６】
遺伝子型同定は、遺伝子マーカーの同定に関して上記に説明した方法と同様な方法、または以下にさらに説明される他の遺伝子型同定法を用いて行なえる。好ましい態様では、異なる個体から得た増幅されたゲノム断片の配列を比較して、新しい遺伝子マーカーを同定するが、診断および相関解析では既知の遺伝子マーカーの遺伝子型同定のために微量配列決定が用いられる。
【００９７】
遺伝子型同定のためのＤＮＡ供給源
所望の特異的核酸を含んでいるまたは含んでいると考えられる場合には、精製または非精製の任意供給源の核酸が、開始核酸として使用できる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、上述のような細胞、組織、体液等から抽出できる。本発明の遺伝子型同定で使用される核酸は、任意の哺乳類供給源から得られるが、核酸試料を抽出する試験対象または個体は、通常はヒトだと理解される。
【００９８】
遺伝子マーカーを含むＤＮＡ断片の増幅
本発明の遺伝子マーカーを１つまたは複数含む核酸セグメントを増幅する方法およびポリヌクレオチドが提供される。遺伝子マーカーを含むＤＮＡ断片の増幅は、種々の方法で種々の目的のために使用され、遺伝子型同定に限定されるものではない。しかし、全てではないが多くの遺伝子型同定法が、対象遺伝子マーカーを持つＤＮＡ領域をあらかじめ増幅することを必要とする。そのような方法は、遺伝子マーカーを含むか、その遠位または近位側にある部位および配列を含む配列の濃度または総数を増加させる。診断アッセイ法も、本発明の遺伝子マーカーを持つＤＮＡセグメントの増幅に依存する可能性がある。ＤＮＡの増幅は、当技術分野で周知の方法で実施できる。増幅技術は、上記のインスリン遺伝子の増幅という項で説明されている。
【００９９】
これらの増幅方法の中には、一塩基多型の検出に特に適しており、下記のように、標的配列の増幅と多型ヌクレオチドの同定を同時に行なえるものがある。
【０１００】
上述のようにして遺伝子マーカーを同定すると、適当なオリゴヌクレオチドの設計が可能になり、これを本発明の遺伝子マーカーを含むＤＮＡ断片の増幅のためのプライマーとして使用できる。増幅は、まず本明細書に記述される新しい遺伝子マーカーの発見に使用されたプライマー、または本発明の遺伝子マーカーを含むＤＮＡ断片の増幅を可能にする任意のプライマーセットを用いて実施できる。
【０１０１】
一部の態様では、本発明は本発明の遺伝子マーカーを１つまたは複数含むＤＮＡ断片の増幅のためのプライマーを提供する。好ましい増幅プライマーは、表Ｃおよび表・増幅プライマーに列挙されている。列挙されたプライマーは、単なる例であり、任意の他のプライマーセットが本発明の遺伝子マーカーを１つまたは複数含む増幅産物を生成することがわかる。
【０１０２】
プライマーの間隔が、増幅するセグメントの長さを決定する。本発明の状況では、遺伝子マーカーを持つ増幅されたセグメントのサイズは、少なくとも約２５ ｂｐから３５ ｋｂｐの範囲であり得る。２５−３０００ ｂｐの増幅断片が典型的であり、５０−１０００ ｂｐの断片が好ましく、１００−６００ ｂｐが非常に好ましい。遺伝子マーカーのための増幅プライマーは、マーカーを含む任意のＤＮＡ断片の特異的増幅を可能にする任意の配列で良いことがわかる。
【０１０３】
表Ｃ
2004512842.tif 000008
2004512842.tif 000009
（Ｌｕｃａｓｓｅｎ， Ａ．Ｍら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ４、３０５−３１０（１９９３））
【０１０４】
遺伝子マーカーに関するＤＮＡ試料の遺伝子型同定法
遺伝子マーカー部位に存在するヌクレオチドの同定には、当技術分野で周知の任意の方法が使用できる。検出する遺伝子マーカーアリルは本発明で同定および指定されているので、当業者はいくつかの手法の任意のものを使用して容易に検出を行なえると考えられる。多くの遺伝子型同定方法は、対象遺伝子マーカーを持つＤＮＡ領域をあらかじめ増幅することを必要とする。標的またはシグナルの増幅が現在ではしばしば好まれるが、増幅または配列決定を必要としない超高感度検出法も本発明の遺伝子型同定法の範囲内である。遺伝子多型を検出するために使用できる当業者に周知の方法には、通常のドットブロット分析、オリタ（Ｏｒｉｔａ）ら（１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：２７７６−２７７９に記述された一本鎖立体配座多型（ＳＳＣＰ）、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、ヘテロ二本鎖分析、ミスマッチ開裂検出、およびシェフィールド（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ， Ｖ．Ｃ．）ら（１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ４９：６９９−７０６、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ， Ｍ．Ｂ．．）ら（１９９２） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． １２：３０１−３０６、グロンプ（Ｇｒｏｍｐｅ， Ｍ． ）（１９９３） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ． ５：１１１−１１７に記述されたような他の通常の手法が含まれる。特定の多型部位に存在するヌクレオチドのもう１つの同定方法は、米国特許第４，６５６，１２７号に記述されるように、特殊なエクソヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチド誘導体を用いる。
【０１０５】
好ましい方法は、配列決定アッセイ法、アリル特異的増幅アッセイ法、またはハイブリダイゼーションアッセイ法により、遺伝子マーカー部位に存在するヌクレオチドを直接同定することを含む。以下にいくつかの好ましい方法を説明する。非常に好ましい方法は、微量配列決定手法である。本明細書で使用される「配列決定」という用語は、二本鎖プライマー／鋳型複合体のポリメラーゼ伸長反応に関するもので、従来型の配列決定および微量配列決定の両方を含む。
【０１０６】
１） 配列決定アッセイ法
多型部位に存在するヌクレオチドは、配列決定法により決定できる。好ましい態様では、上述のように、配列決定の前にＤＮＡ試料をＰＣＲ増幅する。
【０１０７】
好ましくは、増幅されたＤＮＡはダイプライマーサイクル配列決定プロトコールを用いて、自動化ジデオキシターミネーター配列決定反応にかける。配列分析により、遺伝子マーカー部位に存在する塩基が同定できる。
【０１０８】
２） 微量配列決定アッセイ法
微量配列決定法では、標的ＤＮＡの多型部位のヌクレオチドは、一塩基プライマー伸長反応によって検出される。この方法では、標的核酸中の関心のある多型塩基のすぐ上流にハイブリダイズする、適当な微量配列決定プライマーを使用する。多型部位のヌクレオチドに相補的な１つの単一ｄｄＮＴＰ（チェーンターミネーター）を用いて、プライマーの３’末端を特異的に伸長するために、ポリメラーゼが使用される。次に、取り込まれたヌクレオチドが、任意の適当な方法で決定される。
【０１０９】
通常、微量配列決定反応は蛍光ｄｄＮＴＰを用いて行い、欧州特許第４１２ ８８３号に記述されるように、伸長した微量配列決定プライマーはＡＢＩ３７７配列決定装置上の電気泳動によって分析し、取り込まれたヌクレオチドを同定する。または、キャピラリー電気泳動法を用いて、同時により多数のアッセイ法を処理することもできる。本発明の状況で使用できる典型的な微量配列決定手順の例は、実施例２に提供されている。
【０１１０】
ｄｄＮＴＰの標識および検出には、様々な手法が使用できる。蛍光共鳴エネルギー移動に基づく均一相検出法は、チェン（Ｃｈｅｎ）およびクォック（Ｋｗｏｋ） （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２５：３４７−３５３およびチェンら（１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４（２９）：１０７５６−１０７６１に記述されており、この開示はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。この方法では、多型部位を含む増幅したゲノムＤＮＡ断片を、アリル性色素標識ジデオキシリボヌクレオシド３リン酸および修飾Ｔａｑポリメラーゼの存在下で、５’フルオレセイン標識プライマーとインキュベートする。色素標識プライマーは、鋳型に存在するアリルに特異的な色素ターミネーターによって、１塩基伸長される。遺伝子型同定反応の最後に、反応混合液の２つの色素の蛍光強度を、分離または精製なしに直接分析した。これらの段階は全て、同じチューブの中で行い、蛍光の変化はリアルタイムでモニターできる。または、伸長したプライマーはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって分析しても良い。多型部位における塩基は、微量配列決定プライマーに付加された質量によって同定できる（Ｈａｆｆ Ｌ．Ａ．およびＳｍｉｒｎｏｖ Ｉ．Ｐ （１９９７） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７：３７８−３８８参照）、この開示はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【０１１１】
微量配列決定は、確立された微量配列決定法またはそれを発展または派生させた方法によって行なえる。別の方法には、いくつかの固相微量配列決定手法が含まれる。基本的な微量配列決定プロトコールは、上述のものと同じであるが、プライマーまたは標的分子が固相支持体上に固定または捕獲されている、不均一相アッセイ法として行われるという違いがある。プライマーの分離および末端のヌクレオチド付加分析を簡略化するために、オリゴヌクレオチドは固相支持体に結合されるか、ポリメラーゼ伸長と共に親和性による分離も可能なように修飾されている。合成オリゴヌクレオチドの５’末端および内部のヌクレオチドは、例えばビオチン化のような親和性による異なる分離法を可能にするように、いくつかの異なる方法によって修飾できる。オリゴヌクレオチド上に単一の親和性基が使用される場合には、オリゴヌクレオチドは組み込まれたターミネーター試薬から分離できる。これにより、物理的またはサイズによる分離が不要になる。複数の親和性基が使用されれば、ターミネーター試薬からは複数のオリゴヌクレオチドが分離でき、同時に分析できる。これにより、１回の伸長反応あたり、いくつかの核酸種またはより多くの核酸配列情報が分析できる。親和性基はプライミングするオリゴヌクレオチド上である必要はないが、その代わり鋳型上にあることができる。例えば、固定化は、ビオチン化ＤＮＡおよびストレプトアビジンコートのマイクロタイトレーションウェルまたはアビジンコートのポリスチレン粒子の間の相互作用によって行なえる。同様に、オリゴヌクレオチドまたは鋳型は、高密度フォーマットで固相支持体に結合できる。そのような固相微量配列決定反応では、取り込まれたｄｄＮＴＰは放射標識（Ｓｙｖａｎｅｎ、Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ２２６：２２５−２３６、１９９４）、またはフルオレセインへの結合（ＬｉｖａｋおよびＨａｉｎｅｒ、Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ３：３７９−３８５、１９９４）されていても良い。放射標識されたｄｄＮＴＰの検出は、シンチレーションに基づく手法によって行なえる。フルオレセイン結合ｄｄＮＴＰの検出は、アルカリ性フォスファターゼ結合抗フルオレセイン抗体の結合に基づき、発色性基質（ｐ−ニトロフェニルフォスフェートなど）とインキュベーションすることによって行なえる。他に可能なレポーター検出の組み合せには、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）に結合したｄｄＮＴＰおよび抗ＤＮＰアルカリ性フォスファターゼ結合体（Ｈａｒｊｕら、Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ３９／１１ ２２８２−２２８７ （１９９３））、またはビオチン化ｄｄＮＴＰならびに西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンおよび基質としてのｏ−フェニレンジアミン（国際公開公報第９２／１５７１２号）が含まれる。さらに別の固相微量配列決定手法として、Ｎｙｒｅｎら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０８：１７１−１７５ （１９９３））は、酵素発光測定無機ピロリン酸検出アッセイ法（ＥＬＩＤＡ）によるＤＮＡポリメラーゼ活性の検出に依存する方法を記述した。
【０１１２】
パステシン（Ｐａｓｔｉｎｅｎ）ら（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７：６０６−６１４、１９９７）は、固相ミニ配列決定原理がオリゴヌクレオチドアレイの形に応用された、一塩基多型の多重検出法を記述している。固相支持体（ＤＮＡチップ）に結合したＤＮＡプローブの高密度アレイを、下記にさらに説明する。
【０１１３】
３） アリル特異的増幅アッセイ法
本発明の１つの局面では、アリル特異的増幅アッセイ法により、生体試料中で本発明の１つまたは複数の遺伝子マーカーのアリルを決定するポリヌクレオチドおよび方法が提供される。本発明の遺伝子マーカーを含むＤＮＡ断片を増幅する方法、プライマー、および種々のパラメーターは、上記「遺伝子マーカーを含むＤＮＡ断片の増幅」にさらに記述されている。
【０１１４】
アリル特異的増幅プライマー
遺伝子マーカーの２つのアリルの区別は、選択的な戦略であるアリル特異的増幅によっても実施でき、これによって片方のアリルを増幅せずに、もう一方のアリルのみを増幅する。これは１つの増幅プライマーの３’末端に多型塩基を配置することによって行なう。プライマーの３’末端から伸長が行われるので、この位置またはその近くにミスマッチがあると、増幅が阻害的影響が与えられる。したがって、適当な増幅条件下では、これらのプライマーは相補的アリルでの増幅のみを指示する。ミスマッチの正確な位置および対応するアッセイ条件の決定は、当技術分野に周知である。
【０１１５】
連結／増幅に基づく方法
「オリゴヌクレオチド連結アッセイ法」（ＯＬＡ）は、標的分子の単一の鎖の隣接する配列にハイブリダイズする能力を持つように設計された、２つのオリゴヌクレオチドを使用する。オリゴヌクレオチドの１つはビオチン化され、他方は検出可能なように標識されている。標的分子中に、完全に相補的な配列が見つかれば、オリゴヌクレオチドは、その末端が隣接するようにハイブリダイズし、捕獲および検出できるような連結基質を形成する。ＯＬＡは一塩基多型を検出可能で、ニッカーソン（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ Ｄ．Ａ．）ら（１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：８９２３−８９２７に記述されるように、都合よくＰＣＲと組み合せることができる。この方法では、ＰＣＲを使用して、標的ＤＮＡの指数的増幅を行い、これをＯＬＡを用いて検出する。
【０１１６】
一塩基多型の検出に特に適している他の増幅方法には、上記「インスリン遺伝子の増幅」に説明されているＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、ギャップＬＣＲ （ＧＬＣＲ）が含まれる。ＬＣＲは特定の標的を指数関数的に増幅するために、２対のプローブを使用する。各オリゴヌクレオチド対の配列は、対が標的の同一の鎖の隣接配列にハイブリダイズするように選択される。そのようなハイブリダイゼーションにより、鋳型に依存したリガーゼの基質が形成される。本発明により、遺伝子マーカー部位の同一の鎖の近位および遠位配列を持つオリゴヌクレオチドを用いてＬＣＲを実施できる。１つの態様では、いずれのオリゴヌクレオチドも遺伝子マーカー部位を含むように設計される。そのような態様では、オリゴヌクレオチド上の遺伝子マーカーに相補的な特異的なヌクレオチドを、標的分子が含むか含まないかのどちらかの場合にのみ、オリゴヌクレオチドが共に連結できるような反応条件が選択される。別の態様では、オリゴヌクレオチドは遺伝子マーカーを含まず、国際公開公報第９０／０１０６９号に記述されるように、これらが標的分子にハイブリダイズすると「ギャップ」が形成される。このギャップは、その後、相補的ｄＮＴＰ（ＤＮＡポリメラーゼを介するように）を用いて、または別のオリゴヌクレオチド対により「充填」される。このようにして、各サイクルの終わりには、各一本鎖は、次のサイクルで標的となり得る相補鎖を持ち、所望の配列のアリル特異的な指数関数的増幅が行われる。
【０１１７】
リガーゼ／ポリメラーゼを介した遺伝子ビット解析（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ）（商標）は、核酸分子中のあらかじめ選択された部位におけるヌクレオチドを同定するためのもう１つの方法である（国際公開公報第９５／２１２７１号）。この方法では、あらかじめ選択された部位に存在するヌクレオチドに相補的なヌクレオシド３リン酸を、プライマー分子の末端に組み込み、その後、これは第２のオリゴヌクレオチドに連結することを含む。この反応は反応の固相に結合された特異的標識の検出、または溶液中での検出によってモニターされる。
【０１１８】
４） ハイブリダイゼーションアッセイ法
遺伝子マーカー部位に存在するヌクレオチドの同定のための１つの好ましい方法は、核酸ハイブリダイゼーションを使用する。そのような反応で都合良く使用できるハイブリダイゼーションプローブは、好ましくは本明細書に定義されるプローブを含む。サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーションおよび固相ハイブリダイゼーションを含む、任意のハイブリダイゼーションアッセイ法が使用できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．およびＴ． Ｍａｎｉａｔｉｓ （１９８９） 「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ参照）。
【０１１９】
ハイブリダイゼーションは、相補的な塩基対のために２本の一本鎖核酸が二本鎖構造を形成することである。ハイブリダイゼーションは、完全に相補的な核酸鎖、またはミスマッチ領域をわずかに含む核酸鎖の間で起こり得る。遺伝子マーカーの１つの形にはハイブリダイズするが、別の形にはハイブリダイズせず、したがって異なるアリルの形を区別できるような、特異的なプローブが設計できる。アリル特異的プローブは、しばしば対で使用され、その片方が元のアリルを含む標的配列に完全な一致をし、もう一方が別のアリルを含む標的配列に完全な一致をする。ハイブリダイゼーション条件は、アリル間でハイブリダイゼーション強度にかなりの差があり、好ましくは本質的には２つの反応で、これによりプローブがアリルの片方のみにハイブリダイズするために十分なストリンジェントな条件で必要がある。プローブが厳密に相補的な標的配列のみにハイブリダイズするような、ストリンジェントな配列特異的ハイブリダイゼーション条件は、当技術分野で周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。ストリンジェントな条件は配列に依存し、異なる状況では異なる条件になる。一般に、決められたイオン強度およびｐＨにおいて、その特定の配列の融点（Ｔｍ）よりも約５℃低い温度のストリンジェントな条件が選択される。そのようなハイブリダイゼーションは溶液中でも可能だが、固相ハイブリダイゼーションアッセイ法を使用するのが好ましい。本発明の遺伝子マーカーを含む標的ＤＮＡは、ハイブリダイゼーション反応の前に増幅できる。試料中の特異的アリルの存在は、プローブと標的ＤＮＡとの間に形成される安定なハイブリッド二本鎖の存在または欠如を検出することで、決定される。ハイブリッド二本鎖の検出は、いくつかの方法で行われる。ハイブリッド二本鎖の検出を可能にするために、標的またはプローブのいずれかに結合した検出可能な標識を使用した、種々の検出アッセイ法が周知である。通常は、ハイブリダイゼーション二本鎖を、ハイブリダイズしなかった核酸から分離し、その後、二本鎖に結合した標識を検出する。当業者は、過剰の標的ＤＮＡまたはプローブ、ならびに結合しなかった結合体を洗い流すために、洗浄段階も行なうことができることを認識すると思われる。さらに、プライマーおよびプローブに存在する標識を用いたハイブリッドの検出のためには、標準的な不均一アッセイ形式が適当である。
【０１２０】
最近開発された２つのアッセイ法では、分離または洗浄なしにハイブリダイゼーションに基づくアリルの区別が可能である（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ Ｕ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、８：７６９−７７６、１９９８参照）。タックマン（ＴａｑＭａｎ）アッセイ法は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を使用して、蓄積する増幅産物に特異的にアニーリングするＤＮＡプローブを消化する。タックマンプローブは蛍光エネルギー移動を介して相互作用をするドナー−アクセプター色素対によって標識される。増幅の際に進んでくるポリメラーゼによってタックマンプローブが切断されると、消光するアクセプター色素から、ドナー色素が解離し、ドナーの蛍光が大きく上昇する。２つのアリル変種を検出するために必要な全ての試薬は、反応の最初に集め、結果はリアルタイムでモニターできる（Ｌｉｖａｋら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、９：３４１−３４２、１９９５参照）。別の均一ハイブリダイゼーションに基づく手法では、分子ビーコンを用いてアリルの区別をする。分子ビーコンは、均質溶液中で、特異的核酸の存在を報告するヘアピン型のオリゴヌクレオチドプローブである。標的に結合すると、立体配座が再編成して、内部で消光された蛍光体の蛍光が回復する（Ｔｙａｇｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６：４９−５３、１９９８）。
【０１２１】
本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、生物試料中の遺伝子マーカーアリルの検出のためのハイブリダイゼーションアッセイ法に使用できる。これらのプローブは、好ましくは８−５０ヌクレオチドを含み、本発明の遺伝子マーカーを含む配列にハイブリダイズするために十分な相補性を持ち、好ましくは１ヌクレオチドのみの差の標的配列を区別できるほど十分に特異的であるという特徴を持つ。本発明のプローブのＧＣ含有量は、通常１０−７５％の間で、好ましくは３５−６０％、およびさらに好ましくは４０−５５％の間である。これらのプローブの長さは、１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、または３０ヌクレオチドから少なくとも１００ヌクレオチド、好ましくは１０ヌクレオチドから５０ヌクレオチド、より好ましくは１８ヌクレオチドから３５ヌクレオチドである。特に好ましいプローブの長さは２５ヌクレオチドである。好ましくは、遺伝子マーカーは、ポリヌクレオチドプローブの中央から４ヌクレオチドの範囲にある。特に好ましいプローブでは、遺伝子マーカーはポリヌクレオチドの中央にある。より短いプローブは標的核酸に対する特異性を欠如する可能性があり、一般に鋳型と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためには、より低い温度を必要とする。より長いプローブは、生産するのが高価であり、自己ハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する場合がある。オリゴヌクレオチドプローブの合成方法は、上記にあり、本発明のプローブに適用できる。
【０１２２】
アリル特異的プローブへのハイブリダイゼーションを分析することにより、所定の試料中で遺伝子マーカーアリルの存在または欠如を検出できる。アレイ形式の、ハイスループットのパラレルハイブリダイゼーションは、「ハイブリダイゼーションアッセイ法」に明確に含まれ、以下に説明されている。
【０１２３】
５） オリゴヌクレオチドのアドレス指定可能なアレイへのハイブリダイゼーション
オリゴヌクレオチドアレイに基づくハイブリダイゼーションアッセイ法は、完全にマッチした標的配列と、ミスマッチした標的配列への、短いオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの安定性の差に依存する。選択された位置で固相支持体（例えば、チップ）に結合したオリゴヌクレオチドプローブの高密度アレイを含む基本的構造から、多型情報が効率良く得られる。各ＤＮＡチップは、格子型のパターンに配列され、１０セント硬貨の大きさに縮小した、個々の合成ＤＮＡプローブを数千から数百万含み得る。
【０１２４】
チップ技術は、すでに数多くの場合に応用されている。例えば、出芽酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）変異株におけるＢＲＣＡ１遺伝子、およびＨＩＶ−１ウイルスのプロテアーゼ遺伝子の変異のスクリーニングが行われている（Ｈａｃｉａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１４（４）：４４１−４４７、１９９６； Ｓｈｏｅｍａｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１４（４）：４５０−４５６、１９９６、Ｋｏｚａｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２：７５３−７５９、１９９６）。遺伝子多型を検出するために使用する種々の形式のチップは、アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ） （ジーンチップ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ）（商標））、ハイシーク（Ｈｙｓｅｑ） （ＨｙＣｈｉｐおよびＨｙＧｎｏｓｔｉｃｓ）、およびプロトジーンラボラトリース（Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により、特注生産できる。
【０１２５】
一般に、これらの方法は、個体の標的核酸配列セグメントに相補的なオリゴヌクレオチドプローブのアレイを使用し、標的配列には多型マーカーが含まれている。欧州特許第７８５２８０号は、一塩基多型の検出のためのタイリング（ｔｉｌｉｎｇ）戦略を記述している。簡単に述べると、アレイは、通常、多数の特定の多型に関してタイリングが可能である。「タイリング」というのは、関心のある標的配列およびその配列のあらかじめ選択された変種、例えば、１つまたは複数の所定の位置における１つまたは複数のモノマーの基本セット、すなわち、ヌクレオチドによる置換の、相補的な配列から構成される規定のオリゴヌクレオチドプローブセットの合成を意味する。タイリング戦略は、国際公開公報第９５／１１９９５号にさらに説明されている。特定の局面では、いくつかの特異的な同定された遺伝子マーカー配列に関して、アレイはタイリングされる。特に、アレイは、それぞれ特定の遺伝子マーカーまたは遺伝子マーカーセットに特異的な検出ブロックをいくつか含むようにタイリングされる。例えば、ある検出ブロックは、ある特定の多型を含む配列セグメントを含む、いくつかのプローブを含むようにタイリングされ得る。プローブが各アリルに確実に相補的であるように、プローブは遺伝子マーカーのところが異なる対として合成される。多型塩基においてプローブに加えて、通常は１置換プローブも検出ブロック内にタイリングされる。これらの１置換プローブは、多型部分からいずれの方向にも、ある数までの塩基が残りのヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＵから選択する）で置換された塩基を持つ。典型的には、タイリングされた検出ブロック中のプローブは、遺伝子マーカーから５塩基までの配列位置の置換を含む。１置換プローブは、実際のハイブリダイゼーションを人工的な交差ハイブリダイゼーションから区別するための、タイリングされたアリルについての内部対照となる。標的配列とのハイブリダイゼーションおよびアレイの洗浄後、アレイをスキャンして、標的配列がハイブリダイズしたアレイの位置を決定する。そしてスキャンされたアレイのハイブリダイゼーションデータを分析し、試料中に遺伝子マーカーのどのアリルが存在するかを同定する。ハイブリダイゼーションおよびスキャンは、国際公開公報第９２／１００９２号および国際公開公報第９５／１１９９５号ならびに米国特許第５，４２４，１８６号に記述されるようにして実施できる。
【０１２６】
したがって、いくつかの態様では、チップは長さ約１５ヌクレオチドの断片の核酸配列のアレイを含む。別の態様では、チップは、９−２７、９９−１４３８７、９−１２、９−１３、９９−１４４０５、および９−１６からなる群より選択される配列、ならびにその相補配列またはその断片を少なくとも１つ含むアレイを含むが、断片は少なくとも約８つの連続するヌクレオチド、好ましくは１０個、１５個、２０個、より好ましくは２５個、３０個、４０個、４７個、または５０個の連続するヌクレオチドを含み、かつ多型塩基を含む。好ましい態様では、多型塩基はポリヌクレオチドの中央から５ヌクレオチド、４ヌクレオチド、３ヌクレオチド、２ヌクレオチド、１ヌクレオチドの範囲であり、より好ましくはポリヌクレオチドの中央にある。いくつかの態様では、チップは本発明のこれらのポリヌクレオチドのうち少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個またはそれ以上のアレイを含む。
【０１２７】
６） 一体型システム
多型の分析に使用できる別の手法は、複数の成分の一体化システムであり、ＰＣＲおよびキャピラリー電気泳動反応のようなプロセスを微小化し、単一の機能的装置中で区画化するものである。そのような手法の例は、ＰＣＲ増幅とキャピラリー電気泳動のチップ上での一体化を記述する米国特許第５，５８９，１３６号に開示されている。
【０１２８】
一体化システムは、主にマイクロ流体システムが使用される場合に考えられる。これらのシステムは、ガラス、シリコン、石英、またはプラスチックウェーハ上に設計されたマイクロチャネルのパターンがマイクロチップに含まれるシステムである。試料の移動は、マイクロチップの種々の部分に適用された電子的、電気浸透的、または静水力学的な力によって制御され、動く部分のない機能的な微小バルブおよびポンプが形成される。電圧を変化させると、微細加工されたチャネルの交差点での流体の流れが制御され、マイクロチップの異なる部分に対する流体輸送の流速が変化する。
【０１２９】
マイクロ流体システムは、遺伝子マーカーの遺伝子型同定のために、核酸増幅、微量配列決定、キャピラリー電気泳動、およびレーザー誘発蛍光検出のような検出方法を一体化したものである。
【０１３０】
最初の段階では、好ましくはＰＣＲによりＤＮＡ試料が増幅される。その後、増幅産物をｄｄＮＴＰ（各ｄｄＮＴＰに特異的な蛍光）および標的多型塩基のすぐ上流にハイブリダイズする適切なオリゴヌクレオチド微量配列決定プライマーを用いた自動微量配列決定反応にかける。３’末端の伸長が完了したら、キャピラリー電気泳動によって取り込まれなかった蛍光ｄｄＮＴＰからプライマーを分離する。キャピラリー電気泳動に使用される分離媒体は、例えばポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、またはデキストランで良い。一塩基プライマー伸長産物に取り込まれたｄｄＮＴＰは、蛍光検出により同定される。このマイクロチップは少なくとも９６検体から３８４検体を平行して処理するために使用される。ｄｄＮＴＰに通常使用される４色のレーザー誘発蛍光検出が使用できる。
【０１３１】
本発明の遺伝子マーカーを使用した遺伝子分析方法
複雑な形質の遺伝子分析のために、種々の方法が使用できる（ＬａｎｄｅｒおよびＳｃｈｏｒｋ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６５、２０３７−２０４８、１９９４参照）。疾病感受性遺伝子の探索には、主に２つの方法が使用される：家系調査を用いたある遺伝子座と推定形質の遺伝子座の間の共分離の証拠を探す連鎖手法、およびアリルと形質または形質の原因となるアリルとの間の統計的に有意な相関の証拠を探る相関解析（Ｋｈｏｕｒｙ Ｊ．ら、「遺伝疫学の基礎（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ）」、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９９３）。一般に、本発明の遺伝子マーカーは遺伝型および表現型の間に統計的に有意な相関を示す当技術分野で周知の任意の方法に使用できる。遺伝子マーカーは、パラメトリックおよびノンパラメトリックの連鎖分析法に使用できる。好ましくは、本発明の遺伝子マーカーは、相関解析を用いて検出可能な形質に関連した遺伝子の同定に使用されるが、この手法では罹患家系を使用する必要がなく、複雑および散発性の形質に関連した遺伝子の同定も可能である。
【０１３２】
本発明の遺伝子マーカーを使用した遺伝子分析は、任意のスケールで実施できる。本発明の遺伝子マーカーセット全体、または候補遺伝子に対応する本発明の遺伝子マーカーの任意のサブセットが使用できる。さらに、本発明の遺伝子マーカーを含む、任意の遺伝子マーカーセットが使用できる。本発明の遺伝子マーカーと組み合せて遺伝子マーカーとして使用できる遺伝子多型セットは、国際公開公報第９８／２０１６５号に記述されている。上述のように、本発明の遺伝子マーカーはヒトゲノムの任意の完全なまたは部分的な遺伝子マップに含まれることができる。これらの異なる使用法は、本発明および請求の範囲で特に考慮されている。
【０１３３】
本発明は、ａ） 本発明の遺伝子型同定法により、形質陽性群においてインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にある少なくとも１つのマーカーの遺伝子型同定を行なう段階；ｂ）本発明の遺伝子型同定法により、対照群群においてインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にある該マーカーの遺伝子型同定を行なう段階；およびｃ） 遺伝型および形質型の間に統計的に有意な関連が存在するかどうかを決定する段階を含む、遺伝型および表現型の間の関連を検出する方法も含む。さらに、本発明の遺伝型および表現型の間の関連を検出する方法は、本開示または以下に単独または組み合せで記述される任意のさらなる限定を持つ方法を含む。選択的に、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡のマーカーは、表Ｃに提供されるマーカー、好ましくはマーカー−４２１７ ＰｓｔＩ、−２２２１ ＭｓｐＩ、−２３ ＨｐｈＩ、＋１４２８ ＦｏｋＩ、＋１１０００ ＡｌｕＩ、および＋３２０００ ＡｐａＩ、またはより好ましくは−２３ ＨｐｈＩから選択できる。選択的に、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡のマーカーは、さらに当技術分野で周知のインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にある任意の他のマーカー、および本明細書に記述される方法によってインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にあることが決定される任意のマーカーを含み得る。選択的に、対照群は形質陰性または無作為群で良い。選択的に、遺伝子型同定段階ａ）およびｂ）のいずれも、各々の集団から得られたプールされた生体試料で行なってよい。選択的に、遺伝子型同定段階ａ）およびｂ）は、集団の各個体または集団の副試料から得られた生体試料を用いて別々に行なっても良い。
【０１３４】
本発明はａ） 本発明の遺伝子型同定法にしたがって、集団またはその副試料の各個体について、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にある少なくとも２つのマーカーの遺伝子型同定をする段階；およびｂ） 段階ａ）で決定されたヌクレオチドのアイデンティティにハプロタイプ決定法を適用し、頻度の推定を行なう段階を含む、集団中の遺伝子マーカーセットについてのハプロタイプの頻度の推定方法を含む。さらに、本発明のハプロタイプ頻度の推定方法は、本開示または以下に単独または組み合せで記述される任意のさらなる限定を持つ方法を含む。選択的に、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡のマーカーは、表Ｃに提供されるマーカー、好ましくはマーカー−４２１７ ＰｓｔＩ、−２２２１ ＭｓｐＩ、−２３ ＨｐｈＩ、＋１４２８ ＦｏｋＩ、＋１１０００ ＡｌｕＩ、および＋３２０００ ＡｐａＩ、またはより好ましくは−２３ ＨｐｈＩから選択できる。選択的に、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡のマーカーは、さらに当技術分野で周知のインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にある任意の他のマーカー、および本明細書に記述される方法によってインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にあることが決定される任意のマーカーを含み得る。選択的に、ハプロタイプ決定法は、非対称ＰＣＲ増幅、特定のアリルの二重ＰＣＲ増幅、クラークアルゴリズム、または期待値最大化アルゴリズムにより実施される。
【０１３５】
本発明の別の態様は、ａ） 本発明のハプロタイプの頻度の推定方法にしたがって、形質陽性群において少なくとも１つのハプロタイプの頻度を推定する段階；ｂ） 本発明のハプロタイプの頻度の推定方法にしたがって、対照群においてハプロタイプの頻度を推定する段階；ならびにｃ） ハプロタイプと表現型の間に統計的に有意な関連があるかどうかを決定する段階を含む、ハプロタイプと表現型との間の関連を検出する方法を含む。さらに、本発明のハプロタイプと表現型の間の関連の検出方法は、本開示または以下に記述される任意のさらなる限定を持つ方法を含む。選択的に、遺伝子マーカーは、表Ｃに提供されるマーカー、好ましくはマーカー−４２１７ ＰｓｔＩ、−２２２１ ＭｓｐＩ、−２３ ＨｐｈＩ、＋１４２８ ＦｏｋＩ、＋１１０００ ＡｌｕＩ、および＋３２０００ ＡｐａＩ、またはより好ましくは−２３ ＨｐｈＩから選択できる。選択的に、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡のマーカーは、さらに当技術分野で周知のインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にある任意の他のマーカー、および本明細書に記述される方法によってインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にあることが決定される任意のマーカーを含み得る。選択的に、対照群は形質陰性または無作為群で良い。選択的に、表現型はインスリン関連疾患である。選択的に、本方法は段階ｃ）の前に形質陽性群および対照群において表現型を決定する段階をさらに含む。選択的に、インスリン関連疾患は、高インスリン血症である。
【０１３６】
連鎖分析
連鎖分析は、家系の中の世代を通した、遺伝子マーカーの伝達と特定の形質の伝達の間の相関の確率に基づく。したがって、連鎖分析の目的は、家系の中で、関心のある形質と共分離するマーカー遺伝子座を検出することである。
【０１３７】
パラメトリック法
継続的な世代のデータがある場合は、遺伝子座の対の間の連鎖の程度を調べる機会がある。組換え割合を見積もると、遺伝子座を遺伝子地図上に並べて置くことが可能になる。遺伝子マーカーである遺伝子座があると、遺伝子地図を確立し、マーカーと形質の間の連鎖強度を計算し、それを用いてマーカーおよびそれに影響を与える遺伝子の間の相対的位置を示すことができる（Ｗｅｉｒ， Ｂ．Ｓ．、「遺伝子データ解析ＩＩ：離散的集団遺伝学データの方法（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄａｔａ Ａｎａｌｙａｉｓ ＩＩ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｃｒｅｔｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄａｔａ）」 Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃ．， Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ、ＵＳＡ、１９９６）。連鎖分析の古典的方法は、オッズ対数（ｌｏｄ）スコア法である（Ｍｏｒｔｏｎ Ｎ．Ｅ．、Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．、７：２７７−３１８、１９９５； Ｏｔｔ Ｊ．、「ヒト遺伝子連鎖の分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｌｉｎｋａｇｅ）」 Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、１９９１）。ｌｏｄ値の計算には、疾病の遺伝様式を指定する必要がある（パラメトリック法）。一般に、連鎖分析を用いて同定する候補領域の長さは、２−２０ Ｍｂである。候補領域が上述のように同定されれば、別のマーカーを用いた組換え個体の分析により、候補領域のさらなる解析ができる。連鎖分析研究は、一般に最高５，０００のマイクロサテライトマーカーを使用してきたため、最大の理論的に実現可能な連鎖分析の解像度は、平均約６００ ｋｂに限定される。
【０１３８】
連鎖分析は、明らかなメンデルの遺伝パターンを持ち、高い浸透度（すなわち、集団中でアリルａのキャリアの総数に対する、形質陽性のａのキャリアの数の比）の、簡単な遺伝形質のマッピングに適用されてきた。しかし、パラメトリック連鎖分析法には、種々の短所がある。まず、研究する形質に適した遺伝モデルの選択に依存するために限定される。さらに、既に述べたように、連鎖分析を用いて実現できる解像度には限界があり、連鎖分析でまず同定した通常２ Ｍｂ−２０ Ｍｂの領域の分析をさらに正確にするために、補完的研究が必要である。さらに、パラメトリック連鎖分析法は、複数の遺伝子および／または環境要因の作用の組み合せに起因するような、複雑な遺伝形質に適用するのは困難なことが分かっている。ｌｏｄ値分析においてこれらの要素を適切にモデル化するのは、非常に困難である。最近リッシュ（Ｒｉｓｃｈ， Ｎ．）およびメリカンガス（Ｍｅｒｉｋａｎｇａｓ Ｋ．） （Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７３：１５１６−１５１７、１９９６）によって記述されたように、そのような場合に、連鎖分析を行なうために必要な適切な数の罹患家系を採用するためには、労力と費用がかかりすぎる。
【０１３９】
ノンパラメトリック法
連鎖分析のためのいわゆるノンパラメトリック法の利点は、疾病の遺伝様式を指定する必要がないことで、複雑な形質の分析により有用である場合が多い。ノンパラメトリック法では、罹患した親族が、確率によって期待される以上の頻度で、その領域の同一のコピーを受け継ぐことを示すことにより、染色体領域の遺伝パターンは、無作為なメンデル分離とは一致しないことを証明する。罹患した親族は、不完全な浸透および多遺伝子の遺伝の存在下でも、過剰な「アリル共有」を示すはずである。ノンパラメトリック連鎖分析では、２人の個体のマーカー遺伝子座における一致の度合いは、同質（ＩＢＳ）アリルの数、または同祖（ＩＢＤ）アリルの数によって、測定できる。罹患同胞対分析は、周知の特別な場合であり、これらの方法の中で最も単純な形である。
【０１４０】
本発明の遺伝子マーカーは、パラメトリックおよびノンパラメトリック連鎖分析の両方に使用できる。好ましくは、遺伝子マーカーは複雑な形質に関与している遺伝子のマッピングの可能なノンパラメトリック法で使用できる。本発明の遺伝子マーカーは、複雑な形質に関与している遺伝子のマッピングのために、ＩＢＤおよびＩＢＳの両方の方法に使用できる。そのような研究では、遺伝子マーカーの密度が高いことを使用して、いくつかの隣接する遺伝子マーカー座をプールして、複数アリルマーカーによって得られる効率を実現することができる（Ｚｈａｏら、Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．、６３：２２５−２４０ （１９９８））。
【０１４１】
集団相関解析
本発明は、本発明の遺伝子マーカーを用いて、インスリン遺伝子またはその特定のアリル変異体が、検出可能な形質と関連しているかどうかを決定する方法を含む。１つの態様では、本発明は遺伝子マーカーアリルまたは遺伝子マーカーハプロタイプと、形質との関連を検出する方法を含む。さらに、本発明は本発明の任意の遺伝子マーカーアリルと連鎖不均衡にある形質の原因となるアリルを同定する方法を含む。
【０１４２】
上述のように、相関解析を行なうためには、種々の手法が使用できる：ゲノム全体の相関解析、候補領域の相関解析、および候補遺伝子の相関解析。好ましい態様では、本発明の遺伝子マーカーは、候補遺伝子の相関解析に使用される。候補遺伝子の解析は、形質の生物学に関していくらかの情報を利用できる場合に、明らかに、特定の形質に関連する遺伝子または遺伝子多型の同定への近道を提供する。さらに、本発明の遺伝子マーカーは、ゲノム全体の相関解析を行なうために、ヒトゲノムの遺伝子マーカーの任意の地図に組み入れることができる。高密度の遺伝子マーカー地図を作製する方法は、国際公開公報第００／２８０８０号に記述されている。本発明の遺伝子マーカーは、さらにゲノムの特定の候補領域（例えば、特定の染色体または特定の染色体セグメント）の任意のマップに組み入れることができる。
【０１４３】
上述のように、相関解析は一般の母集団の中で行なうことができ、罹患家系の血縁個体について行われるの解析に限定されない。相関解析は、散発的または多因子的形質の解析も可能なので、非常に価値がある。さらに、相関解析は、連鎖解析よりも、形質の原因となるアリルのはるかに細かいマッピングを可能にする、微細マッピングの強力な方法である。家系に基づく解析は、しばしば形質の原因となるアリルの場所を狭く絞り込むのみである。本発明の遺伝子マーカーを用いた相関解析は、連鎖解析法によって同定された候補領域中の、形質の原因となるアリルの位置を、詳細に決めるために使用され得る。さらに、関心のある染色体セグメントが同定されたら、関心のある領域中の、本発明の候補遺伝子のような候補遺伝子の存在は、形質の原因となるアリルの同定への近道を提供し得る。本発明の遺伝子マーカーは、候補遺伝子が形質と相関していることを示すために使用できる。そのような使用法は、本発明で特に考慮されている。
【０１４４】
集団中の遺伝子マーカーアリルまたは遺伝子マーカーハプロタイプの頻度の決定　相関解析は、遺伝子座の間で、アリルのセットの頻度の関係を探る。
【０１４５】
集団中のアリル頻度の決定
集団中の遺伝子マーカーのアリル頻度は、上記「遺伝子マーカーに関する個体の遺伝子型同定法」の項、またはこの意図された目的に適した任意の遺伝子型同定手順の方法を用いて、決定できる。プールされた試料または個体の試料の遺伝子型同定は、集団中の遺伝子マーカーアリルの頻度を決定できる。必要な遺伝子型同定の数を減らす１つの方法は、プールされた試料を使用することである。プールされた試料を使うための１つの大きな障害は、プールの作製時に正確なＤＮＡ濃度を決定するための精度および再現性の点である。個体試料の遺伝子型同定は、感度、再現性、精度がより高く、本発明での好ましい方法である。好ましくは、各個体は別々に遺伝子型同定し、遺伝子マーカーのアリル頻度または特定の集団における遺伝型の頻度の決定には、単純な遺伝子計数が用いられる。
【０１４６】
集団中のハプロタイプの頻度の決定
ハプロタイプの配偶子相は、二倍体個体が複数の遺伝子座で異型接合の場合には、不明である。家族の家系情報を用いて、配偶子相が推測される場合がある（Ｐｅｒｌｉｎら、Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．、５５：７７７−７８７、１９９４）。家系情報が利用できない場合、異なる戦略が使用され得る。１つの可能性は、複数部位の異型接合二倍体を分析から除去し、同型接合および１つの部位の異型接合個体のみを保持するものであるが、この手法は試料組成に潜在的な偏向ができ、低頻度のハプロタイプを過小評価する可能性がある。もう１つの可能性は、例えば、非対称ＰＣＲ増幅（Ｎｅｗｔｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１７：２５０３−２５１６、１９８９； Ｗｕら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：２７５７、１９８９参照）、または限界希釈後のＰＣＲ増幅（Ｒｕａｎｏら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：６２９６−６３００、１９９０参照）によって１つの染色体を単離することにより、単一の染色体を独立して解析することである。さらに、特定のアリルの二重ＰＣＲ増幅によって、十分に近い遺伝子マーカーに関して、試料のハプロタイピングを行なうことができる（Ｓａｒｋａｒ， Ｇ．およびＳｏｍｍｅｒ Ｓ．Ｓ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９１）。これらの手法は、技術的に複雑で、費用がかかり、大規模に一般化できず、偏りを導入する可能性があるため、完全に満足できるものではない。これらの困難を克服するために、クラーク（Ｃｌａｒｋ Ａ．Ｇ．） （Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｅｖｏｌ．、７：１１１−１２２、１９９０）によって導入されたＰＣＲ増幅ＤＮＡ遺伝型の相を推定するためのアルゴリズムが使用できる。簡単に述べると、原理は、明白な個体、すなわち、完全な同型接合および単一部位の異型接合体を調べることによって、試料中に存在するハプロタイプの予備リストを作成し始める。その後、同一試料中の他の個体について、以前に認識されたハプロタイプのある出現についてを持つ可能性をスクリーニングする。陽性が同定されるごとに、すべての個体に関する相の情報が分析または未分析として同定されるまで、認識されたハプロタイプのリストに、相補的なハプロタイプが追加される。この方法は、各複数部位での異型接合個体に対して、単一のハプロタイプを割り付けるが、複数の異型接合部位が存在すると、いくつかのハプロタイプが可能である。または、各個体にハプロタイプを割り付けることなく、集団中のハプロタイプ頻度を見積もる方法を使用できる。好ましくは、期待値最大化（ＥＭ）アルゴリズム（Ｄｅｍｐｓｔｅｒら、Ｊ．Ｒ． Ｓｔａｔ． Ｓｏｃ．、３９Ｂ： １−３８、１９７７）に基づく方法が使用され、ハーディ‐ワインベルク平衡（無作為接合）の仮定を用いて、ハプロタイプ頻度の最大尤度の見積もりが得られる（Ｅｘｃｏｆｆｉｅｒ Ｌ．およびＳｌａｔｋｉｎ Ｍ．、Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｅｖｏｌ．、１２（５）：９２１−９２７、１９９５参照）。ＥＭアルゴリズムは、データが不明瞭および／または不完全の場合に有用な、一般化された反復性の最大尤度アプローチである。ＥＭアルゴリズムは、異型接合体をハプロタイプに分離するために使���される。ハプロタイプの見積もりは、「統計的方法」という項にさらに詳述されている。集団中のハプロタイプ頻度を決定または見積もるための、当技術分野で周知の任意の他の方法も、使用できる。
【０１４７】
連鎖不均衡分析
連鎖不均衡は、２つまたはそれ以上の遺伝子座のアリルの非無作為的な関連で、疾病形質に関与する遺伝子のマッピングの強力な道具となる（Ａｊｉｏｋａ Ｒ．Ｓ．ら、Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．、６０：１４３９−１４４７、１９９７）。遺伝子マーカーはヒトゲノム中で密な間隔にあり、他の種類の遺伝子マーカー（ＲＦＬＰまたはＶＮＴＲマーカーなど）よりも多数遺伝子型同定できるので、連鎖不均衡に基づく遺伝子解析に特に有用である。
【０１４８】
疾病の変異が最初に集団に導入された場合（新しい変異または変異の保有者の移入による）には、変異は必ず単一の染色体上にあり、したがって、連鎖したマーカーの単一の「バックグラウンド」または「先祖の」ハプロタイプ上にある。したがって、これらのマーカーと疾病変異の間には、完全な不均衡が存在する。疾病変異は、マーカーアリルの特定のセットの存在下にのみ見つかる。後代の世代で疾病変異およびこれらの多型マーカーの間の組み換えが起こり、不均衡は次第に消失する。この消失の速度は、組換え頻度の関数であるので、疾病遺伝子に最も近いマーカーは、遠いマーカーよりも高いレベルの不均衡を示す。組み換えで破られなければ、「先祖の」ハプロタイプおよび異なる遺伝子座にあるマーカーアリル間の連鎖不均衡は、家系のみならず、集団を通して追跡できる。通常、連鎖不均衡は１つの遺伝子座の１つの特定のアリルと、第２の遺伝子座の別の特定のアリルの間の関連として観察される。
【０１４９】
疾病とマーカー遺伝子座の間の不均衡のパターンまたは曲線は、これらの遺伝子座で起こる最大値を示すと期待される。したがって、疾病アリルと密接に連鎖した遺伝子マーカーの間の連鎖不均衡は、疾病遺伝子の位置に関して貴重な情報を与える。疾病遺伝子座の詳細なマッピングには、対象領域にあるマーカー間に存在する連鎖不均衡のパターンに関する知識があると役立つ。上述のように、連鎖不均衡分析によるマッピングの解像度は、連鎖解析よりもはるかに高い。連鎖不均衡分析と組み合せた高密度の遺伝子マーカーは、詳細なマッピングの強力な道具となる。連鎖不均衡を計算するための種々の方法は下記の「統計的方法」という項で説明されている。
【０１５０】
形質−マーカー関連の集団を用いた患者−対照研究
上述のように、同一の染色体上の異なる遺伝子座において特定のアリルの対が発生する頻度は無作為ではなく、無作為との差は連鎖不均衡と呼ばれる。相関解析は集団頻度に注目し、連鎖不均衡の現象に依存する。所定の遺伝子の特定のアリルが特定の形質の原因に直接関与していれば、その頻度は、形質陰性集団または無作為の対照集団における頻度と比較して、罹患（形質陽性）集団で、統計的に上昇していると思われる。連鎖不均衡の存在の結果、形質の原因となるアリルを持つハプロタイプにおける他の全てのアリルの頻度も、形質陰性個体または無作為対照と比較して、形質陽性個体では上昇していると思われる。したがって、形質の原因となるアリルとの連鎖不均衡における、形質および任意のアリル（特に遺伝子マーカーアリル）の間に相関は、特定の領域において形質関連遺伝子が存在することを示唆するのに十分であると思われる。形質の原因となるアリルの位置を狭く絞り込む相関を同定するために、遺伝子マーカーに関して患者−対照集団の遺伝子型同定が行なえる。形質と関連する１つの所定のマーカーと連鎖不均衡にある任意のマーカーは、形質と関連していると思われる。連鎖不均衡があると、形質の原因となるアリルを見つけるために、限定された数の遺伝子多型（特に遺伝子マーカー）の患者−対照集団における相対的頻度を分析して、全ての可能な機能的多型のスクリーニングをするための代わりとする事ができる。相関解析は、無関係の患者−対照集団におけるマーカーアリルの頻度を比較するもので、複雑な形質の解析に強力な道具となる。
【０１５１】
患者−対照集団（含有基準）
集団を用いる相関解析は、家族性の遺伝を検討しないが、患者−対照集団において、特定の遺伝子マーカーまたはそのセットの頻度を比較する。これは無関係の患者（罹患または形質陽性）個体と、無関係の対照（非罹患、形質陰性、または無作為）個体の比較に基づく、患者−対照研究である。好ましくは、対照群は非罹患または形質陰性個体からなる。さらに、対照群は患者群と民族的に一致している。さらに、対照群は好ましくは研究する形質に関して、主たる既知の混乱要素に関して、患者群と一致している（例えば、年齢依存的な形質に関して年齢が一致）。理想的には、２つの試料の個体は、その疾病状態のみが異なるように対を形成する。「形質陽性集団」「患者集団」および「罹患集団」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【０１５２】
相関解析を用いて複雑な形質を解析するための重要な段階は、患者−対照集団の選択である（ＬａｎｄｅｒおよびＳｃｈｏｒｋ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６５、２０３７−２０４８、１９９４参照）。患者−対照集団の選択における大きな段階は、与えられた形質または表現型の臨床的な定義である。形質陽性および形質陰性表現型群に含まれる個体を注意深く選択することによって、本明細書で提案される相関方法によって、任意の遺伝形質が解析できる。４つの基準がしばしば重要である：臨床的表現型、発病年齢、家族歴、および重症度。連続的または定量的形質（例えば血圧など）の選択手順は、非重複表現型を持つこれらの形質陽性および形質陰性集団に含めるように、解析する形質の表現型の分布の両端にある個体を選択することを含む。好ましくは、患者−対照集団は、表現型の均一な集団である。形質陽性および形質陰性集団は、各々研究する集団全体の、および好ましくは非重複表現型を示す個体から選択された集団全体の１−９８％、好ましくは１−８０％、より好ましくは１−５０％、およびより好ましくは１−３０％、最も好ましくは１−２０％の間を代表する、表現型が均一な個体集団からなる。２つの形質の表現型の差が明確であればあるほど、遺伝子マーカーの相関を検出する可能性が高くなる。研究する集団の試料サイズが十分に大きければ、大きな差があるが比較的均一な表現型を選択すると、相関解析において効率良く比較ができ、遺伝子レベルでの著しい差の可能性のある検出が可能である。
【０１５３】
好ましい態様では、５０−３００個、好ましくは約１００個の形質陽性個体群を、表現型にしたがって採用する。そのような研究には、同様な数の形質陰性個体も含まれる。
【０１５４】
本発明では、含有基準の典型的な例には、肥満、糖尿病、人種、単調な体重増加、年齢、性別、および思春期が含まれる。
【０１５５】
本発明の遺伝子マーカーを含めた遺伝子マーカーを用いた相関解析の適切な例は、以下の集団を用いた研究である：
若年性肥満の患者集団および痩せた対照集団、または
若年性肥満およびインスリン関連疾患の患者集団および若年性肥満であるがインスリン関連疾患ではない患者集団、または
肥満関連ＮＩＤＤＭの患者集団および非糖尿病の対照集団。
【０１５６】
１つの態様では、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡のマーカーを用いてインスリン関連疾患にかかりやすい個体を同定できる。これには、脂肪の蓄積に応答したインスリン分泌の変化の素因となる要素を持つ個体を同定するための診断および予後診断アッセイ法、ならびにこれらのアッセイ法を用いた臨床試験および治療方法が含まれる。薬物治療は、肥満の治療またはインスリン関連疾患の対照に使用されると当技術分野で考えられるまたは周知の任意の薬剤を含む。
【０１５７】
相関解析
候補遺伝子を持つ領域に由来する遺伝子マーカーを用いた相関解析を行なう一般的な戦略は、両方の群で本発明の遺伝子マーカーのアリル頻度を測定し統計的に比較するために、２つの個体群（患者−対照集団）をスキャンすることである。
【０１５８】
分析された遺伝子マーカーのうち１つまたは複数で形質と統計的に有意な相関を持つものが同定されれば、相関のあるアリルが形質の直接の原因となっている（すなわち、相関のあるアリルが形質の原因となるアリル）か、より可能性が高い相関のあるアリルが形質の原因となるアリルと連鎖不平衡にあると考えられる。候補遺伝子機能に関しての相関のあるアリルの特異的な性質は、通常、相関のあるアリルと形質の間の関係について、さらに情報を与える（因果関係、または連鎖不平衡）。候補遺伝子の中の相関のあるアリルが、おそらく形質の原因となるアリルではなく、真の形質の原因となるアリルと連鎖不平衡にあることを証拠が示していれば、相関のあるマーカーの近隣の配列を決定し、繰り返し明らかになる多型との相関解析をさらに行なうことによって、形質の原因となるアリルが見つかる。
【０１５９】
相関解析は、通常、２つの連続的な段階で行われる。最初の段階では、形質陽性および形質陰性集団において、候補遺伝子からの減少した数の遺伝子マーカーの頻度を決定する。解析の第２段階では、関連する領域から得られるさらに高密度のマーカーを用いて、所定の形質を担う遺伝子座の位置をさらに正確に知る。
【０１６０】
本発明の実施例３に基づき、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にある少なくとも１つのマーカーのアイデンティティ、またはインスリン遺伝子のＶＮＴＲクラス、および患者の体脂肪値に基づいて、臨床試験または相関解析の亜群が同定できる。具体的には、ＨｐｈＩ ［＋／＋］同型接合体（インスリンＶＮＴＲ Ｉ／Ｉ）は、肥満度が同等のＨｐｈＩ ［＋／−］またはＨｐｈＩ ［−／−］遺伝型（各々インスリンＶＮＴＲ Ｉ／ＩＩＩとインスリンＶＮＴＲＩＩＩ／ＩＩＩ）よりも、インスリンとＢＭＩの相関が強いことが示される。したがって、ＨｐｈＩ ［＋／−］または［−／−］遺伝型の肥満個体は、ＨｐｈＩ ［＋／＋］の遺伝型の肥満個体よりも、ＮＩＤＤＭを発症する可能性が有意に高いため、臨床試験または相関解析において選択できる可能性がある。
【０１６１】
本発明は、ａ） 個体のインスリンＨｐｈＩ座との連鎖不平衡における少なくとも１つのマーカーの多型の塩基のアイデンティティを決定する段階；ｂ） 個体の体脂肪値を決定する段階；ならびにｃ） 多型塩基のアイデンティティ、体脂肪値、ならびにアイデンティティ、体脂肪値、およびインスリン関連疾患の発症リスクを相関させる事前に決められた値に基づいて個体を試験に含める段階を含む、インスリン関連疾患に関する臨床試験または相関解析に含めることについての個体の選択方法を特徴とする。別の局面では、本発明はａ） 個体のインスリン遺伝子のＶＮＴＲクラスを決定する段階；ｂ） 個体の体脂肪値を決定する段階；ならびにｃ） ＶＮＴＲクラス、体脂肪値、ならびにＶＮＴＲクラス、体脂肪値、およびインスリン関連疾患の発症リスクを相関させる事前に決められた値に基づいて、個体を試験に含める段階を含む、インスリン関連疾患に関する臨床試験または相関解析に含めることについての個体の選択方法を特徴とする。インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にある少なくとも１つのマーカーの多型塩基のアイデンティティ、体脂肪値、およびインスリン関連疾患の発症リスクを相関させる事前に決められた値については、表ＩＡを参照。ＶＮＴＲクラス、体脂肪値、およびインスリン関連疾患の発症リスクを相関させる事前に決められた値については、表ＩＢ参照。
【０１６２】
ハプロタイプ解析
上述のように、疾病アリルを持つ染色体が変異または移入の結果、初めてある集団に現れる場合には、変異アリルは必ず連鎖マーカーセットを持つ染色体上に存在する：先祖ハプロタイプ　。このハプロタイプは、集団を通して追跡し、特定の形質との統計的相関を解析することができる。ハプロタイプ解析とも呼ばれる多点相関解析によって一点（アリル）相関解析を補うと、相関解析の統計力が増加する。したがって、ハプロタイプ相関解析によって、先祖のキャリアハプロタイプの頻度および種類を決定できる。ハプロタイプ解析は、個々のマーカーに関する分析の統計力を増加させるという点で、重要である。
【０１６３】
ハプロタイプ頻度解析の最初の段階では、本発明の同定された遺伝子マーカーの種々の組み合せに基づいて、可能性のあるハプロタイプの頻度を決定する。その後、形質陽性および対照個体の別個の集団について、ハプロタイプ頻度を比較する。統計的に有意な結果を得るためにこの解析を行うべき形質陽性個体の数は、通常３０−３００個の範囲で、好ましい個体数は５０−１５０個の範囲である。この解析で使用する非罹患個体（または無作為対照）の数も、同じである。この最初の解析結果は、患者−対照集団におけるハプロタイプ頻度を提供し、評価されたハプロタイプ頻度ごとに、ｐ−値およびオッズ比が計算される。統計的に有意な相関が見つかれば、研究している形質に影響されている所定のハプロタイプを持つ個体の相対リスクを見積もることができる。
【０１６４】
相互作用解析
本発明の遺伝子マーカーは、多遺伝子性相互作用の結果である検出可能な形質と関連する遺伝子マーカーのパターンを同定するためにも使用できる。連鎖していない遺伝子座におけるアリル間の遺伝子相互作用の解析には、本発明に記述される技術を用いた個々の遺伝子型同定が必要である。適切なレベルの統計的有意性を持つ選択された遺伝子マーカーセットの間のアリル相互作用の解析は、ハプロタイプ解析であると考えられうる。相互作用解析は、第１の遺伝子座の所定のハプロタイプに関しての患者−対照集団の層別化、および各亜集団で第２の遺伝子座のハプロタイプ解析の実施である。
【０１６５】
相関の存在における連鎖の検定
本発明の遺伝子マーカーは、さらにＴＤＴ（伝達／不平衡試験）に使用できる場合がある。ＴＤＴは、連鎖および相関の両方を検定するもので、集団の層別化には影響を受けない。ＴＤＴには罹患個体およびその両親のデータ、または両親の代わりに非罹患同胞のデータが必要である（Ｓｐｉｅｌｍａｎｎ Ｓ．ら、１９９３； Ｓｃｈａｉｄ Ｄ．Ｊ．ら、１９９６、Ｓｐｉｅｌｍａｎｎ Ｓ．およびＥｗｅｎｓ Ｗ．Ｊ．、１９９８参照）。そのような組み合せた試験は、一般に別々の分析によって生じる偽陽性エラーを減少させる。
【０１６６】
統計的方法
一般に、ある形質と遺伝型が統計的に有意な相関を示すかどうかを検定するための、当技術分野で周知の任意の方法が使用できる。
【０１６７】
１） 連鎖解析における方法
連鎖解析に有用な統計的方法およびコンピュータプログラムは、当技術分野で周知である（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ Ｊ．Ｄ．およびＯｔｔ Ｊ．、「ヒトの遺伝子連鎖ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｌｉｎｋａｇｅ）」Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９９４； Ｏｔｔ Ｊ．、「ヒトの遺伝子連鎖の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｌｉｎｋａｇｅ）」、Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、１９９１参照）。
【０１６８】
２） 集団におけるハプロタイプ頻度の推定方法
上述のように、遺伝型を評価する場合には、しばしば、異型接合体を区別することが不可能なので、ハプロタイプ頻度は簡単に推測できない。配偶子相が未知の場合には、ハプロタイプ頻度は多遺伝子座の遺伝型データから見積もることができる。ハプロタイプ頻度の推定には、当業者に周知の任意の方法が使用できる（Ｌａｎｇｅ Ｋ．「遺伝解析のための数学的および統計的方法（Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ）」Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９７； Ｗｅｉｒ， Ｂ．Ｓ．「遺伝データ解析ＩＩ：不連続集団遺伝データの方法（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＩＩ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｃｒｅｔｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄａｔａ）」Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃ．， Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ、ＵＳＡ、１９９６参照）。好ましくは、ハプロタイプ頻度の最大尤度は期待値最大化（ＥＭ）アルゴリズムを用いて計算される（Ｄｅｍｐｓｔｅｒら、Ｊ．Ｒ． Ｓｔａｔ． Ｓｏｃ．、３９Ｂ：１−３８、１９７７； Ｅｘｃｏｆｆｉｅｒ Ｌ．およびＳｌａｔｋｉｎ Ｍ．、Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｅｖｏｌ．、１２（５）：９２１−９２７、１９９５参照）。この手順は、配偶子相が未知の場合に、多遺伝子座の遺伝型データから、ハプロタイプ頻度の最尤推定値を得るための、反復過程である。ハプロタイプの推定は、通常、たとえばイーエム−ハプロ（ＥＭ−ＨＡＰＬＯ）プログラム（Ｈａｗｌｅｙ Ｍ．Ｅ．ら、Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ａｎｔｈｒｏｐｏｌ．、１８：１０４、１９９４）またはアーレクイン（Ａｒｌｅｑｕｉｎ）プログラム（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、「アーレクイン：集団の遺伝子データ解析用のソフトウェア（Ａｒｌｅｑｕｉｎ： ａ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ）」、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｖａ、１９９７）を用いてＥＭアルゴリズムを適用することによって行われる。ＥＭアルゴリズムは、推定のための、一般化された反復の最大尤度手法であるが、以下に簡単に説明する。
【０１６９】
以下では、表現型は未知のハプロタイプ相を持つ多遺伝子座の遺伝型を指す。遺伝型は、既知のハプロタイプ相を持つ多遺伝子座の遺伝型を指す。
【０１７０】
Ｋ個のマーカーに関して同定したＮ人の無関係な個体試料があるとする。観察されるデータは、Ｆ個の異なる表現型に分類され得る、未知相Ｋ遺伝子座の表現型である。さらに、Ｈ個の可能なハプロタイプがあるとする（Ｋ個の遺伝子マーカーの場合には、最大数Ｈ＝２Ｋの可能なハプロタイプが考えられる）。
【０１７１】
ｃｊ個の可能な遺伝子型が考えられる表現型ｊについては：
2004512842.tif 000010
ここで、Ｐｊはｊ番目の表現型の確率、Ｐ（ｈｋ， ｈｌ）は、ハプロタイプｈｋおよびｈｌからなるｉ番目の遺伝型の確率（すなわちハーディ・ワインバーグ平衡）で、Ｐ（ｈｋ， ｈｌ）は次のように示される：
2004512842.tif 000011
【０１７２】
ＥＭアルゴリズムは、以下の段階からなる。まず、ハプロタイプ頻度の最初の値のセットから、遺伝型頻度が推定される。これらのハプロタイプ頻度は、Ｐｌ（０）、Ｐ２（０）、Ｐ３（０）、．．．ＰＨ（０）と表される。ハプロタイプ頻度の最初の値は、乱数発生または当技術分野で周知のある他の方法で得られる。この段階は、期待段階と呼ばれる。この方法の次の段階は最大化段階と呼ばれ、遺伝型頻度の推定値を用いて、ハプロタイプ頻度を再計算する。最初の繰り返しのハプロタイプ頻度の推定値は、Ｐｌ（１）、Ｐ２（１）、Ｐ３（１）、．．．、ＰＨ（１） と表される。一般に、ｓ番目の繰り返しにおける期待段階は、前回の繰り返し
2004512842.tif 000012
のハプロタイプ頻度に基づいて各表現型を、異なる可能な遺伝型とおく確率を計算することからなり、ｎｊはｊ番目の表現型を持つ個体数、Ｐｊ（ｈｋ， ｈｌ）（ｓ）は表現型ｊにおける遺伝型ｈｋ， ｈｌの確率である。遺伝子計数法（Ｓｍｉｔｈ、Ａｎｎ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．、２１：２５４−２７６、１９５７）と同等な最大化段階では、ハプロタイプ頻度は遺伝型頻度
2004512842.tif 000013
に基づいて、再推定される。ここでは、δｉｔはハプロタイプｔがｉ番目の遺伝型に存在する発生数を数える指標変数であり、０、１、および２の値をとる。
【０１７３】
Ｅ−Ｍ繰り返しは、以下の基準が満たされると終了する。最尤推定法（ＭＬＥ）理論を用いて、表現型ｊは多項分布していると仮定する。各繰り返しｓにおいて、尤度関数Ｌが計算できる。２つの連続する繰り返しの間のログ尤度の差が、ある小さな数、好ましくは１０−７未満になった場合、収束は達成される。
【０１７４】
３） マーカー間の連鎖不平衡を計算する方法
任意の２つの遺伝子位置の間の連鎖不平衡を計算するために、いくつかの方法が使用できる。現実には、連鎖不平衡は集団から得られたハプロタイプデータに統計的相関検定を適用して、測定される。
【０１７５】
マーカーＭｉでアリル（ａｉ／ｂｉ）、マーカーＭｊでアリル（ａｊ／ｂｊ）を持つ、本発明の遺伝子マーカーを少なくとも１つ含む任意の遺伝子マーカー対（Ｍｉ， Ｍｊ）の間の連鎖不平衡は、全てのアリルの組み合せ（ａｉ， ａｊ； ａｉ， ｂｊ； ｂｉ， ａｊおよびｂｉ， ｂｊ）について、ピアザの公式
2004512842.tif 000014
にしたがって、計算できる。ここで、
θ４＝− −＝Ｍｉにアリルａｉを持たず、Ｍｊにアリルａｊを持たない遺伝型の頻度
θ３＝−＋＝Ｍｉにアリルａｉを持たず、Ｍｊにアリルａｊを持つ遺伝型の頻度
θ２＝＋−＝Ｍｉにアリルａｉを持ち、Ｍｊにアリルａｊを持たない遺伝型の頻度である。
【０１７６】
遺伝子マーカー対（Ｍｉ， Ｍｊ）間の連鎖不平衡（ＬＤ）は、全てのアリルの組み合せ（ａｉ， ａｊ； ａｉ， ｂｊ； ｂｉ， ａｊおよびｂｉ， ｂｊ）について、ワイア（Ｗｅｉｒ） （Ｗｅｉｒ Ｂ．Ｓ．、１９９６）に記述されるように、デルタ（複合遺伝型不平衡係数）についても、最尤推定法（ＭＬＥ）にしたがって計算できる。複合連鎖不平衡のＭＬＥは：
Ｄａｉａｊ＝（２ｎ１ ＋ ｎ２ ＋ ｎ３ ＋ ｎ４／２）／Ｎ − ２（ｐｒ（ａｉ）． ｐｒ（ａｊ））であり、ここで
2004512842.tif 000015
、およびＮは試料中の個体数である。
【０１７７】
この公式により、遺伝型のデータのみがありハプロタイプのデータはない場合に、アリル間の連鎖不平衡が計算できる。
【０１７８】
マーカー間の連鎖不平衡を計算する別の方法は、次の通りである。２つの遺伝子マーカーＭｉ（ａｉ ／ ｂｉ）およびＭｊ（ａｊ ／ ｂｊ）について、ハーディ−ワインバーグ平衡を当てはめて、上述の手法によって所定の１つの集団において可能性のある４つのハロタイプ頻度を推定できる。ａｉとａｊの配偶子不平衡の推定は、単に：
Ｄａｉａｊ ＝ ｐｒ（ハプロタイプ（ａｉ， ａｊ）） − ｐｒ（ａｉ）．ｐｒ（ａｊ）である。
ここで、ｐｒ（ａｉ）はアリルａｉの確率、ｐｒ（ａｊ）はアリルａｊの確率で、ｐｒ（ハプロタイプ（ａｉ， ａｊ））は上記等式３での推定値である。
【０１７９】
２つの遺伝子マーカーについて、ＭｉとＭｊの相関を記述するためには、１つの不平衡の測定のみが必要である。
すると、上記の正規化された値は、次のように計算される
Ｄ’ａｉａｊ ＝ Ｄａｉａｊ ／ ｍａｘ （−ｐｒ（ａｉ）． ｐｒ（ａｊ）， −ｐｒ（ｂｉ）． ｐｒ（ｂｊ））、Ｄａｉａｊ ＜０
Ｄ’ａｉａｊ ＝ Ｄａｉａｊ ／ ｍａｘ （ｐｒ（ｂｉ）． ｐｒ（ａｊ）， ｐｒ（ａｉ）． ｐｒ（ｂｊ））、Ｄａｉａｊ ＞０
当業者は、他のＬＤの計算方法も使用できることを容易に理解すると思われる。
【０１８０】
適切な異型接合率を持つ遺伝子マーカーのセットでの連鎖不平衡は、５０−１０００人、好ましくは７５−２００人、より好ましくは約１００人の無関係の個体を遺伝子型同定して決定できる。
【０１８１】
４） 相関の検定
表現型と遺伝型、この場合は遺伝子マーカーにおけるアリルまたはそのようなアリルからなるハプロタイプの間の相関の統計的有意性を決定する方法は、当技術分野で周知の任意の統計的検定、および必要な統計的有意性の受け入れられている閾値を用いて、決定できる。特定の方法の適用と有意性の閾値は、当技術分野の範囲内で周知である。
【０１８２】
相関の検定は、患者および対照集団における遺伝子マーカーアリルの頻度を決定し、これらの頻度を統計的検定と比較して、研究している遺伝子マーカーアリルと形質との間の相関を示すような頻度の統計的に有意な差があるかどうかを決定することによって行われる。同様に、ハプロタイプ解析は、患者および対照集団において、所定の遺伝子マーカーセットの全ての可能なハプロタイプの頻度を推定し、これらの頻度を統計的検定と比較して、研究している表現型（形質）とハプロタイプとの間の統計的に有意な相関があるかどうかを決定することによって行われる。遺伝型と形質の間の統計的に有意な相関を検定するために有用な任意の統計的なツールが使用できる。好ましくは、使用される統計的検定は、１度の自由度を持ったカイ二乗検定である。Ｐ値が計算される（Ｐ値は、観察されたものと同じまたはこれより大きい統計値が偶然発生する確率である）。
【０１８３】
統計的有意性
好ましい態様では、さらなる診断検査を行なうための正バイアスまたは初期の予防的治療を開始するための予備的開始点としての診断のための有意性である、遺伝子マーカーの相関に関するＰ値は、単一の遺伝子マーカー解析で、好ましくは約１ ｘ １０−２またはそれ未満、より好ましくは約１ ｘ １０−４またはそれ未満、２つまたはそれ以上のマーカーを含むハプロタイプ解析で、約１ ｘ １０−３またはそれ未満、さらに好ましくは１ ｘ １０−６またはそれ未満、および最も好ましくは約１ ｘ １０−８またはそれ未満である。これらの値は、単一または複数のマーカーの組み合せに関する任意の相関解析に適用できると考えられる。
【０１８４】
当業者は、上述の値の範囲を、本発明の遺伝子マーカーを用いた相関解析を行なうための、開始点として使用できる。それにより、本発明の遺伝子マーカーと、肥満または肥満関連の疾患の間の有意な相関が明らかになり、診断および薬剤のスクリーニングに使用できる。
【０１８５】
表現型の置換
上述の第１段階のハプロタイプ解析の統計的有意性を確認するために、患者−対照個体の遺伝子型同定データをプールし、形質の表現型に関して無作為化し、さらなる解析を実行することが適切な可能性がある。各個体の遺伝子型同定データは、無作為に２つの群に割り付け、２つの群が、第１段階で得られたデータを収集するために使用した患者−対照集団と同じ数の個体数を持つようにする。第２段階のハプロタイプ解析は、好ましくはこれらの人工的な群で、好ましくは最大の相対リスク係数を示した、第１段階の解析のハプロタイプに含まれるマーカーについて、行われる。この実験は、好ましくは少なくとも１００−１００００回繰り返される。繰り返しによって、有意性のＰ値が約１ ｘ １０−３未満で、得られたハプロタイプの割合を決定できる。
【０１８６】
統計的相関の評価
偽陽性の問題に対処するために、無作為なゲノム領域において、同じ患者−対照集団を用いて、同様な分析を行なうことができる。無作為な領域および候補領域における結果は、国際公開公報第００／２８０８０号に記述されるようにして比較する。
【０１８７】
５） リスク因子の評価
リスク因子（遺伝疫学では、リスク因子はマーカー遺伝子座における特定のアリルまたはハプロタイプの存在または欠如である）と疾患の相関は、オッズ比（ＯＲ）および相対リスク（ＲＲ）によって測定される。Ｐ（Ｒ＋）がＲを持つ個体の疾患の発症確率で、Ｐ（Ｒ−）がリスク因子を持たない個体の確率だとすると、相対リスクは、２つの確率の比、すなわち
ＲＲ ＝ Ｐ（Ｒ＋）／（ＰＲ−） である。
【０１８８】
患者−対照研究では、試料抽出法の設計のために、相対リスクは直接測定できない。しかし、オッズ比によって発病率の低い疾患に関しては相対リスクの良い近似ができ、これは
ＯＲ ＝ （Ｆ＋／（１−Ｆ＋））／（Ｆ−／１−Ｆ−））で計算できる。
Ｆ＋は患者におけるリスク因子への曝露の頻度、Ｆ−は対照におけるリスク因子への曝露の頻度である。Ｆ＋およびＦ−は、研究におけるアリル頻度またはハプロタイプ頻度を用いて計算でき、基礎となる遺伝モデル（優性、劣性、相加的）に依存する。
【０１８９】
さらに、集団において所定のリスク因子のためにある形質を示す集団個体の割合を表す寄与危険度（ＡＲ）を推定することができる。この尺度は、疾病の原因における特定の因子の役割を定量する上で、およびリスク因子の公衆衛生への影響という点で、重要である。対照の曝露がなかった場合に、集団中で予防できる症例の割合を見積もるという点で、この尺度は公衆衛生に関連している。ＡＲは
ＡＲ ＝ ＰＥ（ＲＲ−１） ／ （ＰＥ （ＲＲ−１）＋１）として計算される。
ＡＲは遺伝子マーカーアリルまたは遺伝子マーカーハプロタイプが寄与するリスクである。ＰＥは集団全体で、アリルまたはハプロタイプに曝露した頻度、およびＲＲは一般の集団において研究している形質の発生率が比較的低い場合に、オッズ比を用いて近似される相対リスクである。
【０１９０】
本発明の遺伝子マーカーと連鎖不均衡にある遺伝子マーカーの同定
関心のあるゲノム領域で最初の遺伝子マーカーが同定されたら、当業者は本発明の教示を用いて、この最初のマーカーと連鎖不均衡にある別の遺伝子マーカーを容易に同定できる。上述のように、形質と関連する第１のマーカーと連鎖不均衡にある任意のマーカーは、形質と関連する。したがって、所定の遺伝子マーカーおよび形質の間に関連が示されれば、この形質と関連する別の遺伝子マーカーの発見は、この特定の領域において遺伝子マーカーの密度を上昇させるために非常に興味深い。原因となる遺伝子または変異は、形質と最も高い相関を示すマーカーまたはマーカーのセットの近隣に見つかると思われる。
【０１９１】
所定のマーカーと連鎖不均衡にある別のマーカーの同定には、（ａ） 複数の個体から第１の遺伝子マーカーを含むゲノム断片を増幅する段階；（ｂ） 第１の遺伝子マーカーを持つゲノム領域中で第２の遺伝子マーカーを同定する段階；（ｃ） 第１の遺伝子マーカーと第２の遺伝子マーカーの間の連鎖不均衡解析を行なう段階；および（ｄ） 第１のマーカーと連鎖不均衡にあるとして第２の遺伝子マーカーを選択する段階が含まれる。段階（ｂ）と（ｃ）を含む組み合せも、考慮される。
【０１９２】
遺伝子マーカーの同定方法および連鎖不均衡解析の方法は、本明細書に記述され、当業者は過度の実験なしに実施できる。本発明は、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不均衡にある遺伝子マーカーにも関し、これは所定の形質とのそれぞれの関連という点で、類似した特性を示すと期待される。ＨｐｈＩ座は近隣のインスリンＶＮＴＲと強い連鎖不均衡を示す。ＨｐｈＩ座の「＋」アリル（Ｔ）は、近隣のインスリンＶＮＴＲのクラスＩアリルと、「−」アリル（Ａ）はクラスＩＩＩアリルと、完全な連鎖不均衡にある。したがって、連鎖不均衡解析は、−２３ ＨｐｈＩ多型を代理マーカーとして、インスリンＶＮＴＲも試験する。選択的に、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不均衡にあるマーカーは、表Ｃに記載されるマーカー、好ましくはマーカー−４２１７ ＰｓｔＩ、−２２２１ ＭｓｐＩ、−２３ ＨｐｈＩ、＋１４２８ ＦｏｋＩ、＋１１０００ ＡｌｕＩ、および＋３２０００ ＡｐａＩ、またはより好ましくは−２３ ＨｐｈＩからなる群より選択される。選択的に、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡のマーカーは、さらに当技術分野で周知のインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にある任意の他のマーカー、および本明細書に記述される方法によってインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にあることが決定される任意のマーカーを含み得る。
【０１９３】
マッピング試験：機能的変異の同定
本発明の遺伝子マーカーを用いて正の関係が確認されたら、関連する候補領域（インスリン遺伝子の連鎖不平衡の中）の配列について、いくつかの形質陽性および形質陰性個体の配列を比較することによって、変異のスキャンができる。好ましい態様では、インスリン遺伝子のエクソンおよびスプライス部位のような機能的領域、プロモーター、ならびに他の調節領域で、変異のスキャンをする。好ましくは、形質陽性個体は、その形質と関連することが示されたハプロタイプを持ち、形質陰性個体は、その形質と関連するハプロタイプまたはアリルを持たない。変異検出手順は、２アリル部位の同定に用いられるものと本質的に同じである。
【０１９４】
そのような変異の検出に使用する方法は、一般的に以下ので段階を含む：（ａ） 形質陽性患者および形質陰性対照のＤＮＡ試料から、形質と関連する遺伝子マーカーまたは遺伝子マーカー群を含む候補遺伝子の領域を増幅する段階；（ｂ） 増幅された領域の配列を決定する段階；（ｃ） 形質陽性患者と形質陰性対照のＤＮＡ配列を比較する段階；および（ｄ） 形質陽性患者に特異的な変異を決定する段階。段階（ｂ）と（ｃ）を含む組み合せも、特に考慮される。
【０１９５】
好ましくは、その後、本明細書に開示されるような任意の遺伝子型同定手順、好ましくは個々の試験形式で微量配列決定手順を用いて、患者と対照のより大きな集団をスクリーニングすることによって、候補多型を確認する。多型は、期待される関連の結果と一致する頻度で患者および対照に存在すれば、候補変異と見なされる。
【０１９６】
遺伝子診断法における本発明の遺伝子マーカー
本発明の遺伝子マーカーは、特定の遺伝型の結果として検出可能な形質を発現する個体、または後にその遺伝型のために検出可能な形質を発生するリスクを持つ個体を、同定することのできる診断検査を開発するためにも使用できる。
【０１９７】
本発明が、誰が肥満を含む特定の疾患及び肥満関連疾患を発症するリスクを持つかという個体の絶対的な同定をするのではなく、疾患を発症するある程度または可能性を示すものであることは、肥満および肥満関連疾患の治療または診断を実施する当業者には当然理解されると思われる。しかし、この情報は、予防的治療を開始したり、重要なハプロタイプを持つ個体が小さな症状のような前兆となる徴候を予知することができるので、特定の状況では非常に貴重である。非常に強く攻撃し適時に治療しないと致死的になる場合があるような疾病では、絶対的なものではなくても潜在的な素因に関する知識は、有効な治療に非常に重要な貢献をする可能性がある。
【０１９８】
本発明の診断技術は、家系研究、単一精子のＤＮＡ解析、または体細胞ハイブリッドのような、個々の染色体のハプロタイプの解析を可能にする方法を含め、種々の方法を使用して、被験者が検出可能な形質の発症リスクの上昇と関連した遺伝子マーカーパターンを持つかどうか、または個体が特定の変異の結果として検出可能な形質に侵されているかどうかを決定できる可能性がある。本発明の診断法で解析される形質は、肥満および肥満関連疾患を含む、任意の検出可能な形質であることができる。
【０１９９】
本発明の別の局面は、個体が形質を発症するリスクを持つかどうか、または個体が形質の原因となる特定のアリルを持つ結果として形質を発現するかどうかを決定する方法に関する。本発明は、個体が複数の形質を発症するリスクを持つかどうか、または個体が形質の原因となる特定のアリルを持つ結果として、複数の形質を発現するかどうかを決定する方法にも関する。これらの方法には、個体から核酸試料を得て、核酸試料に形質の発症リスクを示す、または形質の原因となる特定のアリルを持つ結果として個体が形質を発現することを示す、１つまたは複数の遺伝子マーカーの１つまたは複数のアリルを含むかどうかを決定することが含まれる。これらの方法は、個体から核酸試料を得て、核酸試料が形質の発現のリスクを示す、または個体が特定のインスリン多型または変異（形質の原因となるアリル）を持つ結果として形質を発現することを示す、少なくとも１つのアリルまたは少なくとも１つの遺伝子マーカーハプロタイプを含むかどうかを決定することも含む。
【０２００】
好ましくは、そのような診断方法では、個体から核酸試料を得て、この試料を上記の「遺伝子マーカーに関するＤＮＡ試料の遺伝子型同定法」に記述される方法を用いて、遺伝子型同定する。診断法は、単一の遺伝子マーカー、または遺伝子マーカー群に基づくもので良い。これらの各々の方法では、被験者から核酸試料を得て、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不均衡にある１つまたは複数のマーカーの遺伝子マーカーパターンを決定する。または、１つまたは複数の遺伝子マーカーは、表Ｃに提供されるマーカー、好ましくはマーカー−４２１７ ＰｓｔＩ、−２２２１ ＭｓｐＩ、−２３ ＨｐｈＩ、＋１４２８ ＦｏｋＩ、＋１１０００ ＡｌｕＩ、および＋３２０００ ＡｐａＩ、またはより好ましくは−２３ ＨｐｈＩからなる群より選択される。選択的に、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡のマーカーは、さらに当技術分野で周知のインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にある任意の他のマーカー、および本明細書に記述される方法によってインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にあることが決定される任意のマーカーを含み得る。
【０２０１】
１つの態様では、核酸試料のＰＣＲ増幅を行ない、検出可能な表現型と関連する多型が同定された領域を増幅する。増幅産物の配列を決定し、個体が検出可能な表現型に関連したインスリン多型を１つまたは複数持つかどうかを決定する。増幅産物の作製に使用されるプライマーは、表Ｃおよび表・増幅プライマーに列挙されるプライマーを含む可能性がある。または、核酸試料に上述のような微量配列決定反応を行ない、個体がインスリン遺伝子の変異または多型の結果として検出可能な表現型と関連するインスリン多型を１つまたは複数持つかどうかを決定する。
【０２０２】
別の態様では、検出可能な表現型と関連する１つまたは複数のインスリンアリルに特異的にハイブリダイズする１つまたは複数のアリル特異的オリゴヌクレオチドプローブを核酸試料に接触させる。別の態様では、増幅反応でアリル特異的オリゴヌクレオチドとともに使用すると増幅産物を生産する能力のある第２のインスリンオリゴヌクレオチドを核酸試料に接触させる。増幅反応中に増幅産物が存在すると、個体が検出可能な表現型と関連する１つまたは複数のインスリン関連アリルを持つことを示す。
【０２０３】
上述のように、診断方法は単一の遺伝子マーカーまたは遺伝子マーカー群に基づく可能性がある。好ましくは、遺伝子マーカーまたは遺伝子マーカーの組み合せは、表Ｃに記述されるインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にあるマーカー、好ましくはマーカー−４２１７ ＰｓｔＩ、−２２２１ ＭｓｐＩ、−２３ ＨｐｈＩ、＋１４２８ ＦｏｋＩ、＋１１０００ ＡｌｕＩ、および＋３２０００ ＡｐａＩ、またはより好ましくは−２３ ＨｐｈＩからなる群より選択される。選択的に、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡のマーカーは、さらに当技術分野で周知のインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にある任意の他のマーカー、および本明細書に記述される方法によってインスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にあることが決定される任意のマーカーを含み得る。診断キットは、本発明の任意のポリヌクレオチドを含み得る。
【０２０４】
これらの診断方法は、予防的治療を開始したり、重要な遺伝型またはハプロタイプを持つ個体が小さな症状のような前兆となる徴候を予知することができるので、特定の状況では非常に貴重である。例えば、実施例３に記述される研究では、被験者はすべてまだＮＩＤＤＭを発症していない肥満の少年少女である。しかし、インスリン関連疾患、特に肥満関連ＮＩＤＤＭのリスクを持つ肥満少年少女を同定することによって、後に重症な疾患の発症を予防するために、現在、より強力な治療の対象とすることができる。
【０２０５】
薬剤への応答または薬剤の副作用を分析および予測する診断法は、個体を特定の薬剤で治療するべきかどうかを決定するために使用できる。例えば、診断法により、個体が特定の薬剤による治療にプラスの応答をする可能性が示されれば、その個体にその薬剤を投与できる。逆に、診断法により、個体が特定の薬剤による治療にマイナスの応答をする可能性が高ければ、別の治療方法を処方できる。マイナスの応答とは、有効な応答がないこと、または有毒な副作用があることとして定義される。例えば、実施例３に説明される研究では、インスリンＨｐｈＩ座と連鎖不平衡にある同定されたマーカーは、肥満者の集団の遺伝子型同定に有用で、インスリン関連疾患の管理のために設計された薬剤に、どの患者が感受性かを決定する。インスリンＨｐｈＩ座およびインスリン関連疾患に関連する他の形質と連鎖不平衡にあるマーカーの間の他の関連も、過度な実験なしに本発明の方法を用いて決定でき、これらの形質を標的とする薬剤に感受性（または非感受性）の可能性の高い人々の亜集団を同定するために有用な他のマーカーが示される。さらに、薬剤の転帰（治療／副作用）に注目して特異的な関連付けを行い、リスク／治療の成功を予測する他の有用なマーカーが同定できる。
【０２０６】
臨床薬剤試験は、本発明のマーカーのもう１つの応用法である。上述の方法を用いて、インスリン関連疾患に作用する薬剤への応答、またはインスリン関連疾患に作用する薬剤への副作用を示す１つまたは複数のマーカーが同定され得る。その後、そのような薬剤の臨床試験の参加候補者をスクリーニングして、薬剤に好都合な反応をする可能性の高い個体を同定したり、および／または副作用を経験しそうな個体を除外したりできる。そのようにして、プラスの反応をする可能性の低い個体を試験に含める結果として測定値が低下することもなく、および／または望ましくない安全性の問題のリスクなしに、薬剤にプラスの反応をする可能性のある個体において、薬剤の有効性を評価できる。
【０２０７】
実施例
実施例１
遺伝子マーカーの新規の同定
本願における遺伝子マーカーは、ヒトゲノム配列から単離された。遺伝子マーカーの同定のために、ゲノム断片を増幅し、配列決定し、複数の個体で比較した。
【０２０８】
配列決定
表・増幅プライマーに列挙されるプライマーを用いて、ＰＣＲ産物が得られた。ゲンバンクから入手した配列、および以前に配列決定されていないＤＮＡ領域を、隣接する既知の配列におけるプライマーを用いて増幅することにより、１２．５ ｋｂの範囲の染色体の連続区間の配列決定ができた。プライマーは、特有の制限部位を形成するヌクレオチドの５’非鋳型区間を含むか、配列でそのような部位に隣接するように、設計された。ＩＧＦ２エクソンＩおよびＡｌｕリピートの間の５．３ ｋｂの領域の配列を得るために、以前に記述されたようにして、ｇｐ−３２を用いて、この領域をカバーするクローン（λＩＮＳ−２）の増幅が行われた。患者のゲノムＤＮＡのより小さな断片の増幅のためのＰＣＲプライマーを設計するために、この断片を消化し、Ｍ１３にサブクローニングし、配列決定をした。ＰＣＲ産物は適当な酵素で消化し、ゲル精製し、Ｍ１３ ｍｐ１８およびＭ１３ ｍｐ１９にクローニングした。これらをジデオキシ法（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ＵＳＢ）を用いて配列決定した。配列は、４個体のそれぞれから得られた８つのクローンで比較した。８クローン中、１クローンのみにおける塩基対の変化は、Ｔａｑポリメラーゼエラーによるものと考えられた。２つまたはそれ以上のクローンで違いが見られたら、多型の可能性があるとして、さらに検討した。
【０２０９】
表・増幅プライマー
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【０２１０】
実施例２
遺伝子マーカーの遺伝子型同定
新しい多型について、配列中の制限酵素部位を変化させるかどうかを決定した。その後、表・遺伝子型同定プライマーに列挙されるプライマーを用いて、無作為な糖尿病患者および対照においてこれらの部位を増幅し、多型のサブセットを家族において増幅した。典型的なＰＣＲ条件は、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｐｅｒｋｉｎ）、２００ ｎｇ ＤＮＡ、１．５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、５μｌ １０Ｘ反応緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、１０％ ＤＭＳＯ （Ｐｓｔ１）、０．２ ｍＭずつのｄＮＴＰ、１μＭずつのプライマー、および１．２５ Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を含む５０μｌの反応液だった。９７００ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒサーモサイクラーを用いて、３０−３５サイクルが行われた。ＰＣＲ産物１０μｌを１−２．５ Ｕの適当な酵素で切断し、ゲル電気泳動によって遺伝型を決定した。制限部位が変化しない部分では、アリル特異的増幅が行われた。５’ ＶＮＴＲ遺伝子型同定は、プローブｐＩＮＳ３１０を用いたサザンブロッティングおよびハイブリダイゼーション、−４２１７／ＰｓｔＩ遺伝子型同定はプローブｐＪ２．４を用いたサザンブロッティングおよびハイブリダイゼーション、またはＰＣＲによって行なった。
【０２１１】
表・遺伝子型同定プライマー
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【０２１２】
［＋］アリルは制限酵素が配列を切断すること、［−］アリルは切断しないことを示す。各部位で得られたバンドの長さは以下の通りである。
表・アリル頻度
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【０２１３】
実施例３
肥満少年少女におけるインスリン遺伝子ＶＮＴＲおよび空腹時インスリンレベルの間の相関解析
被験者および方法
父系祖先の名前の分析および家族歴に基づいて、２つの白人肥満患者のコホートが採用された。１つ（ｎ＝２０１）は地中海系の家族（イタリア、スペイン、ポルトガル、アルジェリア）で、１つ（ｎ＝２５７）は祖先が中欧系（フランス、ベルギー、ドイツ、ポーランド）である。これらの２つのコホートは、同等な多点インスリン遺伝子領域ハプロタイプを持っており（ハプロタイプ推定による隣接する６つのＳＮＰの研究およびハプロタイププロファイルの間の同等性の尤度比検定によって決定、データは示さず）、遺伝的起源が近いことを反映していた。２つのコホートで、インスリン対体脂肪値（ＢＭＩ）の関係が類似しているので、ジェコブ（Ｇｅｎｏｂ）コホートＩとしてプールして１つの分析にした。これらの４５８人の白人少年は、６歳までに体重が＞８５パーセンタイルで、単調な体重増加を示し、減量の試みをしたことはなかった。ブドウ糖およびインスリンは空腹時に測定した。患者は、本明細書の実施例２のようにして、−２３ ＨｐｈＩで遺伝子型同定した。白人では、ＨｐｈＩ座の「＋」アリル（Ｔ）は隣接するインスリンＶＮＴＲのクラスＩアリルと、「−」アリルはクラスＩＩＩと、完全な連鎖不均衡にある。インスリン領域ハプロタイプのわずか０．２３％のみが、ＨｐｈＩ「＋」とＶＮＴＲクラスＩアリルの間の不一致がある。したがって、この試験は−２３ ＨｐｈＩ多型を代理マーカーとして、インスリンＶＮＴＲを検定する。
【０２１４】
結果
若い肥満患者では、ＨｐｈＩアリルおよび遺伝型頻度は、５６８人の痩せた白人被験者と同等だった（表・遺伝型頻度）。したがって、この多型および隣接するＶＮＴＲは、若年性肥満の一般的な形とは関連していないことが示唆される。しかし、他の要素を考慮した場合や、他の集団では、この可能性は排除されない。
【０２１５】
表・遺伝型頻度
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【０２１６】
ＨｐｈＩ遺伝型は、空腹時インスリンレベル（表１）の差と関連していた。ＨｐｈＩ ［＋／＋］遺伝型の患者は、若いにも関わらず、同等な肥満度のＨｐｈＩ ［＋／−］または［−／−］遺伝型の患者よりもインスリンレベルが高かいことが示された（表１）。この差は、空腹時インスリンレベルがＨｐｈＩ ［＋／＋］個体で６０−７０％高い、過度の肥満の小児でさらに大きかった（表１）。肥満コホート全体では、予想通り、血漿インスリンおよびＢＭＩ値は相関していた（ｒ＝０．５４、ｐ＜０．０００１）。共分散分析では、ＨｐｈＩ遺伝型がインスリンとＢＭＩ値との関係に主要な影響を与えることが示された（ｐ＜０．０００１）。ＨｐｈＩ ［＋／＋］同型接合体（インスリンＶＮＴＲ Ｉ／Ｉ）は、他の２つの遺伝型よりも、インスリンとＢＭＩの間に強い相関を示した（図２Ａ）。
【０２１７】
表１：２つのコホートの肥満小児の主な特徴
2004512842.tif 000020
【０２１８】
遺伝型群の差は、ＢＭＩに対するインスリンの回帰に対する、年齢、性別、および思春期のような別の要素の影響を測定するために、一般線形モデルとして状況の再計算をすることによって、検定した（表２）。このモデルにおけるＢＭＩ−インスリンの関係に対するＨｐｈＩ遺伝型の影響の有意性は、空腹時インスリンの予測に寄与するＢＭＩ＊ＨｐｈＩの相互作用の点において反映される（ｐ＜０．０００１）。ＢＭＩに対するインスリンレベルの非常に有意な（ｐ＜０．００１）相関が、すべてＨｐｈＩアリルと強いＬＤにある隣接マーカー（−４２１７ ＰｓｔＩ、−２２２１ ＭｓｐＩ、＋１４２８ ＦｏｋＩ、＋１１０００ ＡｌｕＩ）でも観察された。わずかに弱い相関（ｐ＝０．０３）が、−２３ ＨｐｈＩとより弱いＬＤを示す＋３２０００ ＡｐａＩ多型との間に観察された。
【０２１９】
表２：２つのコホートの過度の肥満の小児（ＢＭＩ≧９６パーセンタイル）の主な特徴
2004512842.tif 000021
【０２２０】
インスリン遺伝型に加えて、インスリンとＢＭＩの間の関係に、性別が強い影響を持っていた。肥満少年（ｎ＝１９２、ｒ＝０．６５、ｐ＜０．０００１）は少女（ｎ＝２６６、ｒ＝０．４７、ｐ＜０．０００１）よりも強い相関を示し、回帰勾配（図２Ｂ）が急であることが示された。この差は、表１Ｂのモデルにおいて、ＢＭＩ＊性別相互作用の点について、有意だった（ｐ＜０．０００２）。ＢＭＩ−インスリンの関係に対する遺伝型と性別の組み合わさった影響の可能性も、回帰分析モデルで検討した。４つの性別および遺伝型の亜群には、相関の強さに差が見られるが、２つの主要な要素の相互作用ではなく別々の差を反映している（表３）。すなわち、ＢＭＩ−インスリンの関係に対する遺伝型の相対的影響は、少年と少女の間では違わない。
【０２２１】
相関解析において再現コホートは重要なので、フランスの多施設プログラムから、さらに１５７人の若い肥満患者（ＧｅｎＯｂコホートＩＩ）のグループが採用された。これらの患者は、ヨーロッパ（ｎ＝１２７）またはアルジェリア（ｎ＝３０）家系の混合した起源の白人であった。患者は、コホートＩと同様な含有基準および方法で調べられた。コホートＩＩの患者の主な特徴は、表１および２に示されている。遺伝型普及の分布は同等で、最初のコホートの結果を確認するような結果が観察された。具体的には、空腹時インスリンとＢＭＩの関係に対するＨｐｈＩ遺伝型の影響は有意で（表３）、コホートＩで報告された回帰パラメータと同等なパラメータに適合した（値の比較は「図の説明」参照）。ＢＭＩは、［＋／−］または［−／−］遺伝型の患者（コホートＩＩの８％）のわずか２％に対して、ＨｐｈＩ ［＋／＋］の肥満小児（コホートＩの４８％）の血漿インスリンの変動の約５３％を説明した。
【０２２２】
表３：空腹時インスリンレベルに対するＢＭＩおよび検定因子の回帰の一般線形モデル
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【０２２３】
図の説明
図２Ａは、ＨｐｈＩ遺伝型に関するＧｅｎＯｂコホートＩの４５８人の肥満小児における空腹時血漿インスリンと肥満度の関係を示す２つのグラフよりなる。報告されたように、患者はＨｐｈＩ座において遺伝子型同定された。ＨｐｈＩ ［＋／−］または［−／−］の群は非常に類似した回帰および相関係数を示したので、ＨｐｈＩ ［＋／−］または［−／−］の小児は１つのグループとしてプールされた。ＨｐｈＩ ［＋／＋］患者（ＶＮＴＲ Ｉ／Ｉ同型接合体に対応）におけるインスリンとＢＭＩの回帰は、線形方程式Ｙ ＝ １．３ Ｘ − ２０ （ｒ＝０．６６、ｐ＜０．０００１）で記述できた。地中海および中欧起源の最初の２つのコホートにおける対応する方程式は、それぞれＹ ＝ １．３ Ｘ − ２１ （ｒ＝０．６５）およびＹ ＝ １．３ Ｘ − ２２ （ｒ＝０．７０）であった。ＨｐｈＩ ［＋／−］または［−／−］の肥満小児（それぞれＶＮＴＲ Ｉ／ＩＩＩまたはＩＩＩ／ＩＩＩの遺伝型に対応）における方程式はＹ ＝ ０．４ Ｘ ＋ ３ （ｒ＝０．２９、ｐ＜０．０００１）で、相関の度合いはより低く、勾配は緩かった。最初の２つのコホートでは、対応する回帰方程式は非常に類似していた：Ｙ ＝ ０．２５ Ｘ ＋ ７．５ （ｒ＝０．２）およびＹ ＝ ０．５ Ｘ − １．６ （ｒ＝０．３）。特定の肥満度では、ＨｐｈＩ ［＋／−］または［−／−］の遺伝型の小児は、インスリンの値がより低かった。これらの遺伝型の影響の有意性を確認するために、１０００の無作為化が用いられた（ｐ＜０．０００１）。
【０２２４】
再現コホートＩＩの患者では、ＨｐｈＩ ［＋／＋］患者におけるインスリンとＢＭＩの回帰方程式はＹ ＝ １．５５ Ｘ − ２８ （ｒ＝０．７３、ｐ＜０．０００１）で、ＨｐｈＩ ［＋／−］または［−／−］の肥満小児ではＹ ＝ ０．１６ Ｘ ＋ １０．５ （ｒ＝０．１４、ｐ＜０．２３）である（データは示さず）。
【０２２５】
図２Ｂは、２つのＨｐｈＩ（インスリンＶＮＴＲ）遺伝型同型接合の亜群の肥満少年における空腹時血漿インスリンと肥満指数の関係を示す２つのグラフよりなる。ＨｐｈＩ ［＋／＋］少年（ＶＮＴＲ Ｉ／Ｉ同型接合体に対応）におけるインスリンとＢＭＩの回帰は、線形方程式Ｙ ＝ １．５ Ｘ − ２８ （ｒ＝０．７４、ｐ＜０．０００１）に適合する。この遺伝型亜群では、空腹時インスリンレベルの変動の５５％はＢＭＩによって説明された。ＨｐｈＩ ［＋／−］または［−／−］の肥満少年（それぞれＶＮＴＲ Ｉ／ＩＩＩまたはＩＩＩ／ＩＩＩの遺伝型に対応）における方程式はＹ ＝ ０．５ Ｘ ＋ ０ （ｒ＝０．３１、ｐ＜０．００５）で、インスリンの変動の１０％未満がＢＭＩで説明される。所定の肥満度では、後者の遺伝型の少年は、より調節されていない低いインスリン値を示した。
【０２２６】
コホートＩＩでは、ＨｐｈＩ ［＋／＋］肥満少年におけるインスリンとＢＭＩの回帰方程式はＹ ＝ １．７ Ｘ − ３２ （ｒ＝０．７５、ｐ＜０．０００１）で、ＨｐｈＩ ［＋／−］または［−／−］の肥満少年ではＹ ＝ ０．３５ Ｘ ＋ ３．３ （ｒ＝０．０９、ｐ＜０．０８）である（データは示さず）。
【０２２７】
図３は肥満小児の２つの遺伝型群における、年齢に対する平均化縦方向の体重（年齢および身長に対する正常体重値に正規化）の曲線である。曲線は、健康個人報告（Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎｓ）から出生時から試験時までの毎年の体重が収集できた３３２人の患者のサブセットの試験により作製された。反復測定ＡＮＯＶＡおよび無作為化置換検定を用いた統計分析は、遺伝型群の間で高度に有意な差を示し（ｐ＜０．００１）、ＨｐｈＩ ［＋／＋］の肥満患者では、後期小児期にさらなる体重増加が見られた。
【０２２８】
実施例４
リスクのある遺伝型を持つ肥満少年におけるＩＩ型糖尿病リスクの評価
インスリンクランプ法、最小モデルの静脈内糖負荷試験、およびＨＯＭＡインスリン感受性指数を用いて検出すると、肥満の若年患者の７０−８０％を超える人がすでにインスリン抵抗性（ＩＲ）を持っている。この割合は、患者の加齢および肥満状態の進行に伴い、上昇すると予測される。
【０２２９】
若年肥満者の約５０％がインスリンＨｐｈＩ ［＋／−］または［−／−］遺伝型（ＶＮＴＲ Ｉ／ＩＩＩまたはＩＩＩ／ＩＩＩ）を持っている。これらの遺伝型の患者の約８０％は、本明細書に記述されるデータによると、肥満の進行の初期からインスリン分泌が不足している。したがって、長期的にはＩＲにはうまくつり合わず、その一部がＩＩ型糖尿病を発症すると予想される。これとは対照的に、インスリンＨｐｈＩ ［＋／＋］遺伝型（ＶＮＴＲ Ｉ／Ｉ）の若い肥満者の＞８０％は、ＩＲとつり合うと予測され、十分なインスリン分泌のために長期的に正常血糖を維持できると予想される。
【０２３０】
したがって、ＩＩ型糖尿病の絶対的発症リスクは、インスリンＨｐｈＩ ［＋／−］または［−／−］遺伝型（ＶＮＴＲ Ｉ／ＩＩＩまたはＩＩＩ／ＩＩＩ）の若年肥満者では約８０％で、他の遺伝型では約２０％である。これは、遺伝型の差によるリスクの４倍の上昇に対応する。
【０２３１】
若年肥満者に関して本明細書に記載されたデータは、初期の個体のインスリン分泌能力は、ＢＭＩ、インスリン遺伝型、および相互に作用するＢＭＩ＊遺伝型に依存することを示す。これから、若年肥満者の一生において、インスリン分泌不全およびその結果としてのＩＩ型糖尿病の発症リスクも、同じ要素に依存すると考えられうる。
【０２３２】
ＨｐｈＩ ［−］アリル（同型または異型接合状態）を持つ若年肥満者におけるＩＩ型糖尿病の約８０％というリスクの推定値は、肥満患者および非肥満患者が同じ割合である、一般のＩＩ型糖尿病集団におけるこれらの遺伝型の観察される普及と一致している（Ｊ． Ｔｏｄｄ、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ （１９９６）参照）。この一致は、ＨｐｈＩ ［−］アリル（ＶＮＴＲクラスＩＩＩアリル）が本明細書に提供される観察から示唆されるように、肥満患者においてのみ（または大部分は肥満患者において）糖尿病誘発性であるという仮定に依存している。
【０２３３】
長期の肥満または若年発症の患者において、ＨｐｈＩ ［−］アリル（ＶＮＴＲ ＩＩＩアリル）がＩＩ型糖尿病の前兆となるという仮説を証明するための研究が進行中である。２５歳より前に撮影された写真で証明される、長期の若年発症の成人肥満患者の２つの亜群において、ＶＮＴＲ遺伝型が研究されている。亜群１はＩＩ型糖尿病の肥満成人、亜群２は全ての点（性別分布、年齢、肥満年数など）で同等だが、正常に近い血糖値を維持し続けてきた肥満成人を含む。ＨｐｈＩ ［−］アリル（ＶＮＴＲクラスＩＩＩアリル）の濃縮が、ＩＩ型糖尿病の亜群Ｉに観察されると期待される。以下の表は、期待される結果をまとめている。
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＊文献（Ｎｏｋｄａｄら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ２３：１２７８−１２８３ （２０００）参照）から推定、全ての遺伝型を混合
＊＊ ［−］アリルを持つ患者での相対リスクが３−４．５倍に上昇と推定（我々の結果より推定）
【図面の簡単な説明】
【図１】染色体１１ｐ１５．５のＴＨ−ＩＮＳ−ＩＧＦ２領域の模式図で、ゲノムＤＮＡ中の多型の位置を表す。白抜きの四角はイントロン、黒い四角はエクソン、斜線部は非翻訳領域を示す。三角はＩＮＳ ＶＮＴＲ座を示す。多型はＩＮＳの開始コドンＡＴＧ （＋１）の最初の塩基に対する位置で示されている。
【図２】図２Ａは、ＨｐｈＩ遺伝型に関ｓするＧｅｎＯｂコホートＩの４５８人の肥満小児における空腹時血漿インスリンおよび肥満度の間の関係を示す２つのグラフである。図２Ｂは、２つのＨｐｈＩ（インスリンＶＮＴＲ）遺伝型同型接合亜群の肥満少年の空腹時血漿インスリンと肥満指数との関係を示す２つのグラフである。
【図３】肥満小児の２つの遺伝型群における暦年に対する平均体重曲線（年齢および身長に対する正常体重に正規化してある）を示すグラフである。曲線は出生時から試験時まで健康個人報告から毎年収集できた３３２人の患者のサブセットの試験から作製された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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