(57)【要約】有効量のＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩を経口投与することによって、ヒトへグルタミン補足を与えるための方法および組成物。Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩は、ヒトの消費に適したあらゆる液体組成物中に組み込むことができる。適切な組成物の例には、例えば経口再水和溶液としての使用のための水溶液、および液体栄養調合物（腸調合物、経口調合物、成人用調合物、子供用調合物、および乳児用調合物を包含する）が含まれる。Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩の量は、広く様々であってもよいが、典型的にはこれらの組成物は、一日につき体重１ｋｇあたり少なくとも１４０ｍｇの総グルタミンを供給するのに十分なＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩を含有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩の有効量の経口投与を含む、ヒトへのグルタミン補足の提供方法。
【請求項２】
前記ヒトには、少なくとも０．７ミリモル／ｋｇ／日のＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうる塩が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒトには、少なくとも１．０モル／ｋｇ／日のＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうる塩が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒトには、少なくとも１．５ミリモル／ｋｇ／日のＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうる塩が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記栄養的に許容しうる塩が、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、およびアルミニウム、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルフェネチルアミン、１−エフェナミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、ピペラジン、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ヒトが、胃腸外科手術、胃腸切除、小腸移植、外科手術後外傷、飢餓、重症疾患および負傷、多発外傷、短腸症候群、火傷、骨髄移植、エイズ、口腔粘膜炎、がん、小児脂肪便症（Ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、壊死性全腸炎、腸早熟（ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｕｔ）、日和見感染症（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙ）、特別な治療に関連した腸の悪化、経口食物摂取の制限、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される状態を患っている、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ａ）１リットルあたり３０ｍＥｑから９５ｍＥｑのナトリウム；
ｂ）１リットルあたり１０ｍＥｑから３０ｍＥｑのカリウム；
ｃ）１リットルあたり１０ｍＥｑから４０ｍＥｑのシトレート；
ｄ）１つの炭水化物３．０重量／重量％未満；および
ｅ）溶液１リットルあたり少なくとも５．０ミリモルのＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に同等なこの塩
を含有する水溶液。
【請求項８】
溶液１リットルあたり２０ミリモルから３００ミリモルのＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に同等なこの塩を含有する、請求項７に記載の水溶液。
【請求項９】
溶液１リットルあたり２５ミリモルから２００ミリモルのＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に同等なこの塩を含有する、請求項７に記載の水溶液。
【請求項１０】
前記栄養的に許容しうる塩が、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、およびアルミニウム、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルフェネチルアミン、１−エフェナミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、ピペラジン、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項７に記載の水溶液。
【請求項１１】
前記水溶液が、塩化物をさらに含有する、請求項７に記載の水溶液。
【請求項１２】
前記炭水化物が、デキストロースとフルクトースとの混合物である、請求項７に記載の水溶液。
【請求項１３】
前記炭水化物が、３．０重量／重量％未満の量で存在する、請求項７に記載の水溶液。
【請求項１４】
前記ナトリウムが、３０ｍＥｑ／Ｌから９５ｍＥｑ／Ｌの量で存在する、請求項７に記載の水溶液。
【請求項１５】
前記ナトリウムが、塩化ナトリウム、ナトリウムシトレート、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項７に記載の水溶液。
【請求項１６】
前記カリウムが、１０ｍＥｑ／Ｌから３０ｍＥｑ／Ｌの量で存在する、請求項７に記載の水溶液。
【請求項１７】
前記カリウムが、カリウムシトレート、塩化カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項７に記載の水溶液。
【請求項１８】
前記塩化物が、３０ｍＥｑ／Ｌから８０ｍＥｑ／Ｌの量で存在する、請求項１１に記載の水溶液。
【請求項１９】
前記塩化物が、塩化カリウム、塩化ナトリウム、および塩化亜鉛からなる群から選択される、請求項１１に記載の水溶液。
【請求項２０】
前記シトレートが、２０ｍＥｑ／Ｌから４０ｍＥｑ／Ｌの量で存在する、請求項７に記載の水溶液。
【請求項２１】
前記シトレートが、カリウムシトレート、ナトリウムシトレート、およびクエン酸からなる群から選択される、請求項７に記載の水溶液。
【請求項２２】
少なくとも１つのフレーバーをさらに含んでいる、請求項７に記載の水溶液。
【請求項２３】
少なくとも１つの人工甘味料をさらに含んでいる、請求項７に記載の水溶液。
【請求項２４】
寒天、アルギニン酸および塩、アラビアゴム（ｇｕｍ  ａｒａｂｉｃ）、アカシアゴム（ｇｕｍ  ａｃａｃｉａ）、タルハゴム（ｇｕｍ  ｔａｌｈａ）、セルロース誘導体、カードラン（ｃｕｒｄｌａｎ）、発酵ゴム、フルセララン（ｆｕｒｃｅｌｌａｒａｎ）、ゼラチン、ゲランゴム（ｇｅｌｌａｎ  ｇｕｍ）、ガッティガム（ｇｕｍ  ｇｈａｔｔｉ）、グアールガム、イオタカラゲナン、アイルランドコケ（ｉｒｉｓｈ  ｍｏｓｓ）、カッパカラゲナン、コンニャク粉、カラヤゴム、ラムダカラゲナン、カラマツゴム（ｌａｒｃｈ  ｇｕｍ）／アラビノガラクタン、イナゴマメゴム、ペクチン、タマリンド種子ゴム、タラゴム、トラガカントゴム、天然および変性デンプン、キサンタンガムからなる群から選択された少なくとも１つのゲル化剤を、自立三次元構造支持を補助するのに十分な量でさらに含んでいる、請求項７に記載の水溶液。
【請求項２５】
米粉をさらに含んでいる、請求項７に記載の水溶液。
【請求項２６】
消化しにくいオリゴ糖をさらに含んでいる、請求項７に記載の水溶液。
【請求項２７】
液体栄養調合物であって
ａ）該液体栄養調合物の総カロリー含量（ｃａｌｏｒｉｃ  ｃｏｎｔｅｎｔ）の８から３５％を構成するタンパク質成分；
ｂ）該液体栄養調合物の総カロリー含量の３６から７６％を構成する炭水化物成分；
ｃ）該液体栄養調合物の総カロリー含量の６から５１％を構成する脂質成分；および
Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩の形態で、カロリーを基準にして１から２３％のタンパク質成分を含む、液体栄養調合物。
【請求項２８】
成人用液体栄養調合物であって
ａ）該液体栄養調合物の総カロリー含量の１４から３５％を構成するタンパク質成分；
ｂ）該液体栄養調合物の総カロリー含量の３６から７６％を構成する炭水化物成分；
ｃ）該液体栄養調合物の総カロリー含量の６から５１％を構成する脂質成分；および
栄養調合物１，０００ｋｃａｌあたり、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩を少なくとも３５ミリモル含む、成人用液体栄養調合物。
【請求項２９】
前記調合物が、栄養調合物１，０００ｋｃａｌあたり、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩を３５ミリモルから１６０ミリモル含む、請求項２８に記載の栄養調合物。
【請求項３０】
非成人患者用液体栄養調合物であって
ａ）該液体栄養調合物の総カロリー含量の８から２５％を構成するタンパク質成分；
ｂ）該液体栄養調合物の総カロリー含量の３９から４４％を構成する炭水化物成分；
ｃ）該液体栄養調合物の総カロリー含量の４５から５１％を構成する脂質成分；および
栄養調合物１，０００ｋｃａｌあたり、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩を少なくとも５．０ミリモル含む、非成人患者用液体栄養調合物。
【請求項３１】
前記調合物が、栄養調合物１，０００ｋｃａｌあたり、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩を５．０ミリモルから３２ミリモル含む、請求項３０に記載の栄養調合物。
【請求項３２】
前記栄養的に許容しうる塩が、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、およびアルミニウム、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルフェネチルアミン、１−エフェナミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、ピペラジン、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項２７に記載の液体栄養調合物。
【請求項３３】
調合物１，５００ｋｃａｌあたり１．０ｇ未満のピログルタミン酸を含有する、請求項２７に記載の液体栄養調合物。
【請求項３４】
前記調合物が、成人用調合物であり、タンパク質成分が、前記液体栄養調合物の総カロリー含量の１４から３５％を構成し、炭水化物成分が、前記液体栄養調合物の総カロリー含量の３６から７６％を構成し、脂質成分が、前記液体栄養調合物の総カロリー含量の６から４１％を構成し、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩が、カロリーを基準にしてタンパク質カロリーの１から２５％を構成する、請求項２７に記載の液体栄養調合物。
【請求項３５】
この調合物が非成人用であり、タンパク質成分が、前記液体栄養調合物の総カロリー含量の８から２５％を構成し、炭水化物成分が、前記液体栄養調合物の総カロリー含量の３９から４４％を構成し、脂質成分が、前記液体栄養調合物の総カロリー含量の４５から５１％を構成し、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩が、カロリーを基準にしてタンパク質カロリーの１から１２％を構成する、請求項２７に記載の液体栄養調合物。
【請求項３６】
前記液体栄養調合物が、経口投与される、請求項２７に記載の液体栄養調合物。
【請求項３７】
前記液体栄養調合物が、経腸投与される、請求項２７に記載の液体栄養調合物。
【請求項３８】
カルシウム、リン、ナトリウム、塩化物、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、セレン、ヨウ素、クロム、モリブデン、ｍ−イノシトール、カルニチン、タウリン、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、およびＢ複合体、およびこれらの混合物からなる群から選択されるビタミンおよびミネラルをさらに含む、請求項２７に記載の液体栄養調合物。
【請求項３９】
前記脂質成分が、ヤシ油、大豆油（ｓｏｙ  ｏｉｌ）、コーン油、オリーブ油、サフラワー油、高オレインサフラワー油、ＭＣＴ油（中鎖トリグリセリド）、ひまわり油、高オレインひまわり油、パーム油、パームオレイン、キャノーラ油、魚油、パーム核油、メンハーデン油、大豆油（ｓｏｙｂｅａｎ  ｏｉｌ）、綿実油、レシチン、アラキドン酸およびドコサヘキサエン酸の脂質源、構造脂質、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項２７に記載の液体栄養調合物。
【請求項４０】
前記タンパク質成分が、大豆ベースのタンパク質、ミルクベースのタンパク質、カゼインタンパク質、乳漿タンパク質、コメタンパク質、ビーフコラーゲン、豆タンパク質、ジャガイモタンパク質、およびこれらの混合物からなる群から選択される自然のままのタンパク質を含む、請求項２７に記載の液体栄養調合物。
【請求項４１】
前記タンパク質成分が、大豆タンパク質水解物、カゼインタンパク質水解物、乳漿タンパク質水解物、コメタンパク質水解物、ジャガイモタンパク質水解物、魚タンパク質水解物、卵白水解物、ゼラチンタンパク質水解物、動物および植物タンパク質水解物の組み合わせ、およびこれらの混合物からなる群から選択される加水分解タンパク質を含む、請求項２７に記載の液体栄養調合物。
【請求項４２】
前記タンパク質成分が、トリプトファン、チロシン、システイン（シスチン）、メチオニン、アルギニン、ロイシン、バリン、リシン、フェニルアラニン、イソロイシン、トレオニン、ヒスチジン、カルニチン、タウリン、グリシン、アラニン、セリンシスチン、チロキシンアスパラギン酸、アスパラギングルタミン酸グルタミンヒドロキシリシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、およびこれらの混合物からなる群から選択される遊離アミノ酸を含む、請求項２７に記載の液体栄養調合物。
【請求項４３】
前記炭水化物成分が、ろう状または非ろう状形態にあるコーン、タピオカ、コメ、またはジャガイモ起源の、加水分解されているか、自然のままの、または天然および化学的に変性されたデンプン；糖、例えばグルコース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、高フルクトースコーンシロップ、コーンシロップ固体；およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項２７に記載の液体栄養調合物。
【請求項４４】
小児脂肪便症を患っている患者へ、請求項７に記載の水溶液を投与することによって、前記患者における腸粘膜炎症を減少させる方法。
【請求項４５】
小児脂肪便症を患っている患者へ、請求項２７に記載の液体栄養調合物を投与することによって、前記患者における腸粘膜炎症を減少させる方法。
【請求項４６】
小児脂肪便症を患っている患者へ、請求項２８に記載の液体栄養調合物を投与することによって、前記患者における腸粘膜炎症を減少させる方法。
【請求項４７】
小児脂肪便症を患っている患者へ、請求項３０に記載の液体栄養調合物を投与することによって、前記患者における腸粘膜炎症を減少させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩の有効量の経口投与を介した、グルタミン補足の提供方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタミンは、人体における最も豊富なアミノ酸である。これは、骨格筋中の遊離アミノ酸の６０％超および総循環アミノ酸の２０％超を構成する。グルタミンは、多くの体の機能に関わっており、これには、糖新生、ヌクレオチド合成、酸−塩基バランス、およびほかの重要な代謝プロセスが含まれる。研究は、グルタミンが、急速に複製する細胞、特に胃腸管および粘膜細胞によって用いられる重要な代謝基質であるということ指摘している。グルタミンは、生体内でヒトの空腸（小腸の一部）中に効率的に吸収されうる。
【０００３】
グルタミンは、必須アミノ酸とは考えられていないが、その理由は、これが体のほとんどすべての組織によって合成されうるからである。体が正常な生理状態にある時、体のニーズ（すなわちグルタミン消費組織）に適切に供給するのに十分な量で産生されると考えられる。しかしながら多くの研究は、異常な生理条件（すなわち病気および代謝ストレス）の間、グルタミン産生は、体のニーズを満たすには不十分になることがあることを示している。従ってグルタミンは、より正確には条件付必須アミノ酸と考えることができる。例えばいくつかの研究は、腸外傷の場合、グルタミンをそのようなものとして分類している。Ｓｏｕｂａ，Ｗ．Ｗ．；Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｊ．；およびＷｉｌｍｏｒｅ，Ｄ．Ｊ．：「腸管によるグルタミン代謝（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｔｒａｃｔ）」、ＪＰＥＮ９（５）：６０８−６１７（１９８５年）；Ｆｕｒｓｔ，Ｐ．；Ａｌｂｅｒｓ，Ｓ、およびＳｔｅｈｌｅ，Ｐ．：「異化患者におけるグルタミンへの栄養的ニーズの証拠（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｅｄ  ｆｏｒ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｉｎ  Ｃａｔａｂｌｉｃ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ）」、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｌ．３６（Ｓｐｐｌ．２７）：Ｓ−２８７−Ｓ−２９２（１９８９年）；Ｋｌｉｍｂｅｒｇ，Ｖ．Ｓ．ら：「経口グルタミンは、小腸の治癒を加速し、全腹部照射後の予後を改善する（Ｏｒａｌ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  Ｈｅａｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ａｎｄ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｏｕｔｃｏｍｅ  ａｆｔｅｒ  Ｗｈｏｌｅ  Ａｂｄｏｍｉｎａｌ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ）」。グルタミンはまた、培養されたヒーラ細胞への主要エネルギー源として示唆されてきた。Ｒｅｉｔｚｅｒ，Ｌ．Ｊ．：Ｗｉｃｅ，Ｂ．Ｍ．；およびＫｅｎｎｅｌｌ，Ｄ．：「糖ではなく、グルタミンが、培養されたヒーラ細胞への主要エネルギー源である証拠（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，ｎｏｔ  Ｓｕｇａｒ，ｉｓ  ｔｈｅ  Ｍａｊｏｒ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ＨｅＬａ  Ｃｅｌｌｓ）」。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４（８）：２６６９−２６７６（１９７９年）。またグルタミンは、優先的に腫瘍細胞によって使用されることがあり、その結果、がん患者における進行的なグルタミン枯渇が生じることが示唆されている。Ｓｏｕｂａ，Ｗ．Ｗ．：「グルタミンおよびがん（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ）」、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２１８（６）：７１５−７２８（１９９３年）。
【０００４】
栄養調合物に、以前はグルタミンが補足されていた。補足されているとは、追加グルタミン（遊離アミノ酸として、または別の比較的濃縮した形態、例えば加水分解コムギグルテンにおいて）この調合物に添加されることを意味する。自然発生アミノ酸として、グルタミンは、ある程度まですべてのタンパク質中に存在するから、従ってタンパク質を含有するあらゆる栄養調合物中に、ある程度まで存在するだろう。しかしながらグルタミンは、大部分の自然に発生するタンパク質をある少量だけ含み、従ってあるレベル以上のグルタミンを有する調合物を生産するためには、グルタミンは、補足的形態で添加されなければならない。これらのグルタミン補足された調合物のいくつかは、代謝ストレスを受けた患者、損傷したＧＩ機能（例えば重症の多重外傷、下痢、炎症性腸疾患、ＧＩ外科手術、または化学療法または放射線療法による重症の火傷または傷害による）を有する患者、吸収不良状態（例えばクローン病）、および／または急性外傷を有する患者に向けて市販されている。
【０００５】
このようなグルタミン−強化サプリメントを生産するための最も容易な方法は、グルテンの加水分解によるものであるが、それは、ポリペプチドの複合混合物が、グルタミンの大きい含量によって特徴規定されているからである。これらの生成物は、グルテンが小さい断片に加水分解されるので、取扱い上はグルテンフリーであると考えられる。しかしながら、これらのグルタミン強化「グルテンフリー」化合物を用いるには潜在的なリスクが存在する。その理由は、グルテンが、小児脂肪便症の誘因となる環境要因であり、グリアジンの小さい断片が、小児脂肪便症患者に対して毒性効果を有することが証明されているからである。
【０００６】
小児脂肪便症は、敏感な個人においてグルテン含有穀物の摂取によって誘因された自己免疫腸疾患である。腸損傷の発生の原因となる環境要因であるのは、コムギグルテンのグリアジンフラクションおよびほかの穀物における同様なアルコール溶解性タンパク質である。今や、小児脂肪便症は、摂取されたグルテンに対する不適切なＴ細胞媒介免疫応答の結果であることは明らかである。この病気はまた、主要な組織適合性複合体のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも関連し、グルテンの続行された存在下に、この病気は自己永続性である。吸収性絨毛の損失および腺窩の過形成を特徴とする典型的な腸損傷は、患者の食餌からグルテン含有穀物を除去した時に完全に消滅する。最近の推算は、一般的な世界中の人口において１００から３００人のうちのひとりまでが、この状態に罹患されうることを指摘している。小児脂肪便症はさらに、生活の質を著しく阻害し、多くの場合、例えば粘膜リンパ腫のように命にかかわる一連の合併症を特徴とする。
【０００７】
上記の医療的効果によって、グルタミンを栄養製品中に組み込む試みがなされてきた。これらの努力を複雑にする１つの問題は、水溶液中のグルタミンの限定された安定性である。遊離グルタミンは、水性媒質中で分解することが知られており、ピログルタミン酸およびグルタミン酸が形成される。いくつかの研究は、ピログルタミン酸は、げっ歯類において神経毒であることを証明している。Ｃ．Ｆ．ｄｅＭｅｌｌｏら：「Ｌ−ピログルタミン酸の神経化学的効果（Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｌ−Ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｉｃ  Ａｃｉｄ）」。Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２０（１２）：１４３７−１４４１（１９９５年）；ＭｃＧｒｅｅｒ，Ｅ．Ｇ．およびＳｉｎｇｈ，Ｅ．：「内生物質の神経毒効果：キノリン酸、Ｌ−ピログルタミン酸、および甲状腺放出ホルモン（ＴＲＨ）（Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ：Ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｃ  Ａｃｉｄ，Ｌ−Ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｉｃ  Ａｃｉｄ，ａｎｄ  Ｔｈｙｒｏｉｄ  Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ｈｏｒｍｏｎｅ（ＴＲＨ）」。Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１６（３−４）：４１０−４１３（１９８４年）；Ｒｉｅｋｅ，Ｇ．Ｋ．ら、「Ｌ−ピログルタメート：ハンチントン病のげっ歯類モデルのための代替神経毒（Ｌ−Ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍａｔｅ：ａｎ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  ｆｏｒ  ａ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）」。Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１０４（２）：１４７−１５４（１９８９年）。ピログルタミン酸を生じるのみならず、このような分解はまた、栄養調合物が供給された時、体にとって利用可能なグルタミンの量も減少させる。従って栄養源における補足的グルタミン源としての遊離グルタミンの使用は、大部分、粉末調合物に限定されてきた。粉末調合物は、採食の直前またはほぼ直前（２４から４８時間）、水で再構成され、最適には再構成後、冷蔵保存される。このような粉末調合物には、アリトラ（Ａｌｉｔｒａ）Ｑ（登録商標）（ロス・プロダクツ・ディビジョン・オブ・アボット・ラボラトリーズ（Ｒｏｓｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｎｕ−Ｉｍｍｕ（登録商標）（エンジョイ・フーズ（Ｅｎｊｏｙ  Ｆｏｏｄｓ））、およびヴィボネックス・プラス（Ｖｉｖｏｎｅｘ  Ｐｌｕｓ）（登録商標）（サンド（Ｓａｎｄｏｚ））が含まれる。これらの調合物は、それぞれ（分析された時）１，５００キロカロリーあたり、グルタミン約２５．４、２０．１、および１４．５ｇを供給する。さらには、Ｍａｗａｔａｒｉらの欧州特許出願第ＥＰ１０９７６４６号は、グルタミンおよび／またはグルタミンを含有するペプチドを含有する、変性ミルク粉末組成物の使用を開示している。このような製品は、患者の治療に有意な貢献をなしたが、粉末製品は、米国の大部分の医療施設によって、けっして最適ではないと考えられている。多くの米国の共同体における訓練を受けた医療従事者不足のために、医療施設は、すぐに摂取できる栄養物（ＲＴＦ）の方をはるかに好む。さらには、これらの栄養物は、市場において許容しうるには、少な��とも１２ヶ月の貯蔵寿命を有していなければならない。従って遊離グルタミンは、その限定された安定性によって、これらのＲＴＦ製品においては許容できない。
【０００８】
研究者らは、溶液中の長期間安定性を有するグルタミン源を探し続けてきた。例えばＧｕｅｒｒａｎｔらの、発明の名称が「経口および静脈内再水和用の安定グルタミン誘導体および栄養療法（Ｓｔａｂｌｅ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  Ｏｒａｌ  ａｎｄ  Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  Ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」という米国特許第５，５６１，１１１号は、この役割のためのアラニン−グルタミンの使用を開示している。Ｇｕｅｒｒａｎｔらは総括的に、アシル保護基はグルタミン上に配置することができると記載しているが、この主張を立証するための生物データをまったく提供していない。さらにはこの引例は、このような誘導体をこのような量で含有するあらゆる経口または静脈内化合物の特別な調合物に関して、ガイダンスを与えることに失敗している。
【０００９】
この失敗は、Ｇａｎｄｉｎｉらの「腸管外アミノ酸製剤における分解生成物としてのピログルタミン酸のＨＰＬＣ測定（ＨＰＬＣ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｓ  ａ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｎ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）」クロマトグラフィア（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ）、第３６巻、ｐｐ．７５−７８（１９９３年）によって指摘されているような溶液を用いた場合の配合の問題の観点から、特に重要である。ここで著者らは、グルタミンのピログルタミン酸への分解の問題を克服するために、ジペプチドの使用が提案されたが、このようなものは、その結果生じた溶液を、アミノ酸含量において定性的に不均衡にするという欠点を有することに言及した。著者らはまた、グルタミン誘導体アセチル−グルタミンの低いバイオアベイラビリティーにも注目している。
【００１０】
Ｇｕｒｒａｎｔらの生物データの欠如は、この分野のほかの研究者の研究から考えて、非常に実際的な意味がある。Ｐａｌｍｅｒｉｎｉらは、放射線標識されたＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンをラットに経口投与した。「生体内のラットの大脳および腸粘膜中への二重標識されたＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンの取り込み（Ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  Ｄｏｕｂｌｙ−Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｉｎ  Ｒａｔ  Ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｍｕｃｏｓａ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ）」、ファルマコ（Ｆａｒｍａｃｏ）、第３６（７）巻、ｐｐ．３４７−３５５（１９８１年７月）。Ｐａｌｍｅｒｉｎｉらは、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン（ＮＡＱ）が、腸粘膜を通って自然のままで吸収されることを証明した。アセチル機能の腸内加水分解の欠如から、当業者は、栄養製品におけるグルタミンの潜在源としてのＮＡＱを軽視することになる。その理由は、グルタミンの主要な活性の１つが、腸上皮に栄養を与えることであるからである。この機能は、アミノ酸の腸吸収の間、優勢的に発生する。
【００１１】
栄養調合物中のＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンの使用の欠点は、Ｍａｇｎｕｓｓｏｎらの「ヒトにおける静脈内投与されたＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンの利用（Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ）」、代謝（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）、第３８（８）巻、補遺１（８月）、ｐｐ．８２−８８（１９８９年）によって議論された。これらの研究者らは、静脈内投与されたＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンの用量の２０から４０％が、尿中に排出されたことを発見した。特にラットにおけるほかの潜在的問題は、Ｗａｌｌａｃｅらによって注目された。これらの研究者らは、食欲不振（ｉｎａｐｐｅｔａｎｃｅ）、およびアセチル化ペプチド、例えばＮ−アセチル−（アラニン）２の非効率的な使用に関する問題があるであろうと結論した。「ヒツジにおける小腸からのアセチル化ペプチドの取り込み、およびラットにおけるこれらの栄養価（Ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｉｎ  Ｓｈｅｅｐ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｎｕｔｒｉｔｉｖｅ  Ｖａｌｕｅ  ｉｎ  Ｒａｔｓ）」、英国栄養ジャーナル（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）」、第８０巻、ｐｐ．１０１−１０８（１９９８年）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明によれば、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンは、ヒトにおける経口グルタミンサプリメントとして有用性を有することが発見された。本発明者らは、ヒトの腸組織が、グルタミン源としてＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンを利用しうることを発見した。従ってＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンは、ヒトの消費のために設計された液体栄養物中に組み込むことができる。これらの組成物は長期安定性を有し、ヒトに対してバイオアベイラブルな形態でＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンを提供する。Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンは、酸として、または栄養的に許容しうるこの塩として投与されうる。この発見は、ヒト以外のほかの哺乳動物においてなされた、より初期の研究から考えて意外であった。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩は、ヒトの消費に適したあらゆる液体組成物中に組み込むことができる。適切な組成物の例には、水溶液、例えば経口再水和溶液、液体栄養調合物（経腸調合物、経口調合物、成人用調合物、小児患者用調合物、および乳児用調合物などを包含する）などが含まれる。Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩の量は、広く様々であってもよいが、典型的にはこれらの組成物は、あらゆるヒトについて、一日につき体重１ｋｇあたり総グルタミン少なくとも約１０ｍｇを供給するのに十分なＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩を含有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
この出願において用いられている次の用語は、下記の意味を有する：
ａ）「総グルタミン」は、グルタミンとして表示されたあらゆる源から生物学的に利用可能な、または潜在的に利用可能なグルタミンの総量のことを言う。これには、遊離グルタミンとして供給されたグルタミン、ペプチドまたは自然のままのタンパク質の一部として発見されたグルタミン、およびほかの生物学的に利用可能なグルタミン源、例えばＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンを含めることができる。グルタミン分解の副生物（例えばピログルタミン酸など）は含まれない。この計算法の一例として、仮定的な製品が下に記載される。
【００１５】
栄養製品は、自然のままのタンパク質、およびわずかに加水分解されたタンパク質を含有する、６０グラム／リットルのタンパク質系を含有する。これには、次のものが含まれる：
ｉ．当業者によく知られている方法によって測定された場合、１．１グラム／リットルでの遊離グルタミン。
【００１６】
ｉｉ．５０．０グラム／リットルのタンパク質を含有する、自然のままのタンパク質とわずかに加水分解されたタンパク質とのブレンド。これは、公開された方法（例えば、Ｆｏｕｑｕｅｓらの「アミノ酸測定前の、［ビス（トリフルオロアセトキシ）ヨード］ベンゼンを用いた、タンパク質のアスパラギンおよびグルタミンの、ジアミノプロピオン酸およびジアミノ酪酸への転換の研究（Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ  ａｎｄ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｔｏ  Ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｎｄ  Ｄｉａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｕｓｉｎｇ  ［Ｂｉｓ（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏｘｙ）ｉｏｄｏ］Ｂｅｎｚｅｎｅ  Ｐｒｉｏｒ  ｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）」、Ａｎａｌｙｓｔ、第１１６巻、（５月）、ｐｐ．５２９−５３１（１９９１年））によって分析され、３．４グラムグルタミン／１００グラムのタンパク質を含有していた。
【００１７】
ｉｉｉ．１１．６グラム／リットルでのＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン。これは、下で計算された場合、グルタミン９．０グラムを含有する。
【００１８】
【数１】
2006515832.tif 000002
従って「総グルタミン」は、これら３つの源の合計である。１．１グラム／Ｌ（遊離）＋（３．４ｇ／１００ｇタンパク質×５０ｇタンパク質／Ｌ）＋９．０グラム／Ｌ（ＮＡＱ）＝１１．８グラム。
【００１９】
ｂ）「ｍｍｏｌｅ」は、ミリモルのことを言う（すなわち、１モルの１／１，０００である）。
【００２０】
ｃ）「栄養的に許容しうる塩」という用語は、ヒトへの投与に適した液体組成物中の使用に対して許容しうるＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンの塩を意味する。Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンの栄養的に許容しうる塩は、カルボキシル基の水素が、もう１つの正カチオンで置換されている塩である。このような塩は、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンの最終単離および精製の間に、またはカルボン酸基と適切な塩基、例えば金属カチオンの水酸化物、炭酸塩、または炭酸水素塩とを、またはアンモニアまたは有機第一、第二、または第三アミンとを反応させることによって別個に調製することができる。栄養的に許容しうる塩カチオンは、アルカリ金属、またはアルカリ土類金属、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、およびアルミニウム、および非毒性第四アンモニア、およびアミンカチオン、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルフェネチルアミン、１−エフェナミン、およびＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンをベースとしていてもよい。塩基付加塩の形成のために有用なほかの代表的な有機アミンには、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、およびピペラジンが含まれる。
【００２１】
ｄ）明細書または特許請求の範囲における多量の電解質へのあらゆる言及は、経口再水和溶液中の電解質の最終濃度のことを言うと考えるべきである。水道水は多くの場合、残留ナトリウム、塩素などを含有する。この出願におけるナトリウム４０ｍＥｑの値は、経口再水和溶液中に存在する総ナトリウムが、添加されたナトリウム、ならびに経口再水和溶液を製造するために用いられた水中に存在するナトリウムの両方を考慮に入れた場合、４０ｍＥｑに等しいことを意味する。
【００２２】
ｅ）この出願における数字範囲へのあらゆる言及は、形容詞「約」によって修飾されていると考えるべきである。さらにはあらゆる数字範囲は、この範囲の部分集合に対して向けられたクレームへ支持を与えると考えるべきである。例えば１から１０の範囲の開示は、明細書および特許請求の範囲において、この範囲（すなわち、２から９、３から６、４から５、２．２から３．６、２．１から９．９などの範囲）におけるあらゆる部分集合を支持すると考えるべきである。
【００２３】
本発明は、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩の有効量の経口投与による、ヒトへのグルタミン補足を与えるための方法および組成物を提供する。栄養調合物における使用に適したＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンは、十分に確立された標準的化学合成技術、例えば適切な塩基触媒（例えばピリジン）の存在下における無水酢酸での遊離Ｌ−グルタミンのインキュベーションを用いて生成することができ、合成後、再結晶化による適切な精製は、食品−グレードステータスに適した純粋化合物を生成する。実際、アミノ酸化学に精通したいくつかの化学会社は、食品−グレードのＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンを提供している（日本国東京の協和発酵工業株式会社、またはイタリア国のフランマ社（Ｆｌａｍｍａ，ｓ．ｐ．ａ．）である）。あるいはまた、ほかの方法（例えば微生物発酵、第ＪＰ５１０３８７９６号、第ＪＰ５７００１９９４号、第ＪＰ５７０１６７９６号参照）も、適切な食品−グレードのＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンを生成するために利用することができる。Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンの栄養的に許容しうる塩は、カルボキシル基の水素が、別の正カチオンによって置換されている塩である。このような塩は、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンの最終単離および精製の間に、またはカルボン酸基と適切な塩基、例えば金属カチオンの水酸化物、炭酸塩、または炭酸水素塩とを、またはアンモニアまたは有機第一、第二、または第三アミンとを反応させることによって別個に調製することができる。栄養的に許容しうる塩カチオンは、アルカリ金属、またはアルカリ土類金属、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、およびアルミニウム、および非毒性第四アンモニアおよびアミンカチオン、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルフェネチルアミン、１−エフェナミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンをベースとしていてもよい。塩基付加塩の形成のために有用なほかの代表的な有機アミンには、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、およびピペラジンが含まれる。所望であれば、シグマ（Ｓｉｇｍａ）からの医薬グレードのＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンを用いることができる。
【００２４】
ヒトへのグルタミン補足を与える方法は、Ｎ−アセチル−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩の有効量の経口投与を含む。典型的には、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンは、液体、例えば経口再水和溶液、スポーツドリンク、または経腸調合物の一部を介して投与される。
【００２５】
Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩の有効量は好ましくは、一日につき総グルタミン約１０から５０ｇ、あるいはまた、一日につき体重１ｋｇあたり少なくとも約１４０ｍｇの総グルタミン、より好ましくは一日につき体重１ｋｇあたり少なくとも２５０ｍｇの総グルタミン（ｍｇ／ｋｇ／日）を提供するのに十分な量である。Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンは、患者が一日を基準として消費する総グルタミンの約１から１００％、好ましくは約１０から９５％、より好ましくは患者が一日を基準として消費する総グルタミンの約７５から９０％を提供する。
【００２６】
Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩が、患者が消費するグルタミンの唯一の源を提供する時、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩の有効量は、好ましくは少なくとも約０．７ミリモル／ｋｇ／日である。より好ましくは、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩の有効量は、少なくとも約１．０ミリモル／ｋｇ／日であってもよい。さらにより好ましくは、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンの有効量は、少なくとも約１．５ミリモル／ｋｇ／日であってもよい。
【００２７】
上に記載されているように、２５０ｍｇ／ｋｇ／日の総グルタミンを提供するのに必要とされるＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩の量は、患者が消費しているあらゆるほかのタンパク質成分中に存在するグルタミンの量に応じて様々である。一般的なガイドラインとして、患者は、この発明の完全な効果を得るためには、一日につき１ｋｇあたりＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩を少なくとも約０．７から約４．０ミリモル消費すべきである。タンパク質系のその他の成分の総グルタミン含量に応じて、より少量も効果があることがある。一般に、一日につき１ｋｇあたり総グルタミンを少なくとも約１４０ｍｇ、より好ましくは一日につき１ｋｇあたり総グルタミンを少なくとも約２５０ｍｇ送達するのに十分なＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンが、患者に与えられるべきである。
【００２８】
この方法は、成人、子供、および乳児へ、グルタミン補足を与えるために利用することができる。子供という用語は、１歳から約１６歳（すなわち成人期）までの年齢のヒトのことを言う。乳児という用語は、年齢が１歳未満のすべてのヒトを包含するものであり、早産児および超未熟（ｍｉｃｒｏ−ｐｒｅｅｍｉｅ）児を包含する。早産児という用語は、３７週の妊娠期間の前に生まれた、および／または誕生時に２，５００ｇ未満の乳児について記載するものであり、超未熟児という用語は、妊娠期間２３から２８週の間に生まれた乳児について記載するものである。本明細書に用いられている、非成人という用語は、子供および乳児を包含する。
【００２９】
成人、子供、および乳児に供給されるグルタミン当量の濃度は、様々であってもよい。このことの１つの理由は、様々にストレスを受けた状況におけるカロリー密度の必要量の幅広いバリエーションである。この状況の一例は、非常に小さい容積の経腸栄養のみを許容することができる時、例えば重症の外傷または早産児の場合に生じる。このような症例では、栄養の大部分は当初、非経口栄養を介して与えられてもよい。このような場合、非常に少量の経腸栄養が許容しえ、できるだけ多くのグルタミン当量を補足することが有利である。従って、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩の非常に高い濃度が用いられてもよい。別の適用において、標準的な乳児調合物には、腸機能を支えるために、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩が補足されてもよい。この場合、実質的により低い濃度が用いられる。
【００３０】
Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンは、グルタミンが効果的になりうるあらゆる健康状態のために利用されてもよい。このような健康状態には、少なくとも次のものが含まれる。すなわち、胃腸外科手術、胃腸切除、小腸移植、ほかの外科手術後外傷からの回復の強化、飢餓、重症疾患および負傷、例えば多発外傷、短腸症候群、火傷、骨髄移植、エイズ、口腔粘膜炎、小児脂肪便症、クローン病、壊死性全腸炎、腸早熟、日和見感染症、例えば敗血症の予防および重症度の低下である。グルタミン補足はまた、特別な治療（例えば化学療法または放射線療法）と関連した腸の悪化の予防、または経口栄養供給が厳しく制限されている（例えば極端な早産）ような状況においても有用になりうる。同様に、上記のもののいずれの組み合わせも含まれる。
【００３１】
この発明のＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンは、ヒトの消費に適したあらゆる液体溶液を用いて投与することができる。例えばＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンは、単純に水中に溶解されてもよい。所望であれば、これはその口当たりの良さを高めるために、味が付いた飲料中に組み込むことができる。例えば、これは、クール−エイド（Ｋｏｏｌ−Ａｉｄ）、またはソーダ、例えばペプシまたはコーラ中に組み込むことができる。もう１つのほかの実施態様において、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンは、スポーツドリンク、例えばゲイターエイド（Ｇａｔｏｒ−Ａｉｄ）中に組み込むこともできる。
【００３２】
しかしながら典型的には、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンは、経口再水和溶液（ＯＲＳ）または液体栄養調合物を介して投与される。水溶液、例えばＯＲＳ中に組み込むことができるＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンの量は、幅広く様々であってもよい。典型的にはＯＲＳは、溶液１リットルあたり、少なくとも約５．０ミリモルのＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩を含有し、さらには最小限に、水、グルコース、およびナトリウムを含有する。より好ましくはＯＲＳは、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩１リットルあたり、約２０から約３００ミリモル、より典型的には約２５から約２００ミリモルを含有する。液体、例えばクールエイドまたはゲイターエイドが利用されるならば、その場合にはＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンの量は、ＯＲＳについて記載されたものに匹敵しうる。
【００３３】
経口再水和溶液は、当業者によく知られている。この発明において利用されているＯＲＳは典型的には、米国で販売されている経口再水和製剤について食品薬品局によって要求されるすべての電解質およびこれらのレベルを含有する。ナトリウム（Ｎａ＋）、カリウム（Ｋ＋）、塩化物（Ｃｌ−）、およびシトレートイオンに加えて、経口再水和溶液は、炭水化物源、例えばグルコース、フルクトース、またはデキストロースを含有する。
【００３４】
典型的にはＯＲＳは、水、炭水化物、ナトリウムイオン、カリウムイオン、塩化物イオン、およびシトレートイオンを含んでいる。
【００３５】
ＯＲＳ中に用いられるナトリウムイオンの量は、当業者に知られているように、幅広く様々であってもよい。典型的にはＯＲＳは、約３０ｍＥｑ／Ｌから約９５ｍＥｑ／Ｌのナトリウムを含む。さらにもう１つの実施態様において、ナトリウム含量は、約３０ｍＥｑ／Ｌから約７０ｍＥｑ／Ｌ、最も好ましくは約４０ｍＥｑ／Ｌから約６０ｍＥｑ／Ｌの様々なものであってもよい。適切なナトリウム源には、塩化ナトリウム、ナトリウムシトレート、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、およびこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されるわけではない。本明細書において用いられている、１ミリ当量（ｍＥｑ）とは、所定の容積におけるこれらの濃度によって測定された場合の、溶液中のイオン数のことである。この尺度は、１リットルあたりのミリ当量の数として表示される（ｍＥｑ／Ｌ）。ミリ当量は、ｍＥｑにこのミネラルの原子量を掛け、ついでこの数をミネラルの原子価で割って、ミリグラムに転換することができる。
【００３６】
ＯＲＳはまた、カリウムイオン源も含有する。カリウムの量は、幅広く様々であってもよい。しかしながら一般的なガイドラインとして、ＯＲＳは典型的に、約１０ｍＥｑ／Ｌから約３０ｍＥｑ／Ｌのカリウムを含有する。さらにほかの１つの実施態様において、これらは、約１５ｍＥｑ／Ｌから約２５ｍＥｑ／Ｌのカリウムを含有してもよい。適切なカリウム源には、カリウムシトレート、塩化カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、およびこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００３７】
ＯＲＳはまた、炭水化物源も含有する。使用される炭水化物の量は、上記のように重要である。この量は、約３％ｗ／ｗ未満、より好ましくは約２．５％ｗ／ｗ未満に維持されなければならない。約３％ｗ／ｗから約２．０％ｗ／ｗの量が適切である。過剰な炭水化物は、下痢に関連した液体および電解質損失を悪化させる。
【００３８】
先行技術の経口再水和溶液中に用いられたあらゆる炭水化物が用いられてもよい。適切な炭水化物には、単純および複合炭水化物、グルコース、デキストロース、フルクトオリゴ糖、フルクトース、およびグルコースポリマー、コーンシロップ、高フルクトースコーンシロップ、スクロース、マルトデキストリン、およびこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００３９】
ＯＲＳはまた典型的に、下痢による損失を元に戻すための塩基源も含む。典型的にはシトレートが、この結果を得るために、経口再水和溶液中に組み込まれる。シトレートは、炭酸水素塩の当量まで代謝される。これは、酸塩基平衡の維持を助ける血中の塩基である。シトレートが好ましい塩基源であるが、再水和溶液中に日常的に組み込まれるあらゆる塩基が用いられてもよい。
【００４０】
シトレートの量は、当分野において知られているように様々であってもよい。典型的には、シトレート含量は、約１０ｍＥｑ／Ｌから約４０ｍＥｑ／Ｌ、より好ましくは約２０ｍＥｑ／Ｌから約４０ｍＥｑ／Ｌ、最も好ましくは約２５ｍＥｑ／Ｌから約３５ｍＥｑ／Ｌである。適切なシトレート源には、カリウムシトレート、ナトリウムシトレート、クエン酸、およびこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００４１】
ＯＲＳはまた典型的には、塩化物源も含有する。塩化物の量は、当分野において知られているように様々であってもよい。典型的にはＯＲＳは、約３０ｍＥｑ／Ｌから約８０ｍＥｑ／Ｌ、より好ましくは約３０ｍＥｑ／Ｌから約７５ｍＥｑ／Ｌ、最も好ましくは約３０ｍＥｑ／Ｌから約７０ｍＥｑ／Ｌの量で塩化物を含有する。適切な塩化物源には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、およびこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００４２】
場合により、消化しにくいオリゴ糖が、ＯＲＳ中に組み込まれてもよい。消化しにくいオリゴ糖は、ＧＩ管の微生物フロラに対して有利な衝撃を有する。これらは、病原性生物、例えばＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの成長を抑制するのを助ける。これらのオリゴ糖は、非病原性微生物フロラの成長を選択的に促進する。このような経口再水和溶液は、１９９５年４月５日に出願された米国特許第５，７３３，７５９号に記載されている。この特許の内容は、参照して本明細書に組み込まれる。典型的には、オリゴ糖は、フルクトオリゴ糖、イヌリン、例えばラフティロース、またはキシロオリゴ糖である。この量は、幅広く様々であってもよいが、水溶液１リットルあたり１から１００グラム、より典型的には１リットルあたり３から３０グラムであってもよい。
【００４３】
ＯＲＳはまた典型的に、特に小児集団においてその口当たりの良さを高めるために、フレーバーを含んでいる。フレーバーは、これらの水溶液のしょっぱい感じを隠す方がよい。有用な香料添加剤には、ピーチ、バターペカン、ブルーベリー、バナナ、チェリー、オレンジ、グレープ、フルーツポンチ、バブルガム、リンゴ、ラズベリー、およびイチゴが含まれるが、これらに限定されるわけではない。フレーバーを補い、しょっぱい味を隠すために人工甘味料が添加されてもよい。有用な人工甘味料には、サッカリン、ニュートラスイート（ｎｕｔｒａｓｗｅｅｔ）、スクラロース、およびアセスルファン−Ｋ（アセ−Ｋ）などが含まれる。
【００４４】
貯蔵寿命を延ばすのを助けるために、保存料が添加されてもよい。当業者なら、この結果を得るために、適切な保存料を適切な量で選択することができる。典型的な保存料には、カリウムソルベートおよびナトリウムベンゾエートが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００４５】
上記の炭水化物に加えて、ＯＲＳはまた、米粉、または下痢の治療に有利なコメのあらゆるほかの成分を含有してもよい。多くのコメが補足された経口再水和溶液が、文献に記載されてきた。このようなコメが補足された経口再水和溶液を用いる方法は、当業者によく知られている。このようなコメが補足された経口再水和溶液の例には、１９９６年２月６日に発行された米国特許第５，４８９，４４０号に記載されているものが含まれる。
【００４６】
ＯＲＳは、当業者によく知られている技術を用いて製造することができる。一般的なガイドラインとして、すべての成分は、互いにドライブレンドされ、攪拌しつつ水中に分散され、場合によってはすべての成分を溶解するために適切な温度に加熱されてもよい。ＯＲＳはついで包装され、当分野において知られているように食品グレード基準に合わせて滅菌される。
【００４７】
ＯＲＳは、当分野において知られているように、患者の好みに応じて異なる形態で投与されてもよい。例えば、経口再水和溶液を、例えばポプシクル（Ｐｏｐｓｉｃｌｅ）の形態のように冷凍されているならば、より容易に消費する子供もいる。経口再水和溶液ポプシクルは、米国特許第５，８６９，４５９号に詳細に記載されている。経口再水和溶液はまた、特に小児集団において、患者の薬剤服用順守を高めるために、ゲルとして形成されてきた。ゲル化された再水和組成物は、１９９９年８月４日に出願された米国特許出願番号第０９／３６８，３８８号に記載されている。これらのゲルはまた、ＰＣＴ出願第９９／１５８６２号にも記載されている。総括として、これらの水溶液は、流動性ゲルとして形成されてもよい。あるいはまた、これは自立性ゲル構造として形成されてもよい。このような結果は、適切なゲル化剤を水溶液中に組み込むことによって達成されてもよい。
【００４８】
この水溶液における使用に適したゲル化剤には、次のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。すなわち、寒天、アルギニン酸および塩、アラビアゴム、アカシアゴム、タルハゴム、セルロース誘導体、カードラン、発酵ゴム、フルセララン、ゼラチン、ゲランゴム、ガッティガム、グアールガム、イオタカラゲナン、アイルランドコケ、カッパカラゲナン、コンニャク粉、カラヤゴム、ラムダカラゲナン、カラマツゴム／アラビノガラクタン、イナゴマメゴム、ペクチン、タマリンド種子ゴム、タラゴム、トラガカントゴム、天然および変性デンプン、キサンタンガム、およびこれらの混合物である。前記ゲル化剤の使用率は、約０．０５から約５０ｗｔ／ｗｔ％である。
【００４９】
上記のように、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩は、液体栄養製品を介して投与されてもよい。液体栄養物中に組み込まれるＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンの量は、幅広く様々であってもよいが、上記の投薬量ガイドラインに適合するものである。液体栄養調合物において使用されるＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩の量は、様々な要因による。この要因には、調合物が大部分の栄養源または唯一の栄養源を提供するかどうか、この調合物が、ほかのグルタミン源を含有するかどうか、一日を基準にして消費される調合物の量、およびこの調合物が対象とする患者の型（これはまた、毎日消費される調合物の量に影響を与えるであろう）が含まれる。この調合物は好ましくは、ほかのタンパク質成分中に含有されたグルタミンと組合わされた時、一日につき体重１ｋｇあたり少なくとも１４０ｍｇの総グルタミンを提供するのに十分な量でＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩を含有する。Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩の量はまた、タンパク質カロリーのパーセンテージを与えるものとして表示することもできる。このような表示によれば、栄養調合物は、タンパク質カロリーの約１から約１００％として、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩を含有する。これらのパーセンテージは、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩のタンパク質部分（すなわちグルタミン部分）を基準にして計算され、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩の非タンパク質部分（すなわち、アセテートまたは塩部分）からのカロリー貢献をまったく考慮に入れない。好ましくは栄養調合物が成人用である時、これは、タンパク質カロリーの約１０から約９５％を供給するのに十分なＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩を含有する。この栄養調合物が、非成人用に設計されているならば、その場合にはＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンは、タンパク質カロリーの約１から約１２％を供給するのに十分な量で存在する。
【００５０】
液体栄養調合物には、経腸調合物、経口調合物、成人用調合物、小児患者用調合物、および乳児用調合物が含まれる。経腸調合物および栄養調合物は例えば、救急病院および長期療養施設（すなわちナーシングホーム）の両方において、患者の治療の重要な要素である。これらの調合物は、次善的な栄養状態を高めるための補足的使用が一般的ではあるが、長期間にわたって人間用の唯一の栄養源として役立ちうる。従ってこの調合物は、これらが栄養不良を防ぐという主要目的を満たすことになっているならば、有意量のタンパク質、脂肪、ミネラル、電解質などを含有しなければならない。これらの調合物は典型的に、液体として患者に投与されるが、その理由は、標的とされる患者の大部分が、固体食品を消費することができないからである。調合物を飲むことができる患者もいるが、鼻腔栄養チューブ（ＮＧ管またはチューブ栄養供給）を介して経腸調合物を受けるかなり多数の人がいる。
【００５１】
液体栄養調合物は、この調合物の総カロリー含量の１４から３５％を提供するタンパク質成分、総カロリー含量の３６から７６％を提供する炭水化物成分、および総カロリー含量の６から５１％を提供する脂質成分を含有する。液体栄養調合物は、成人用調合物、小児用調合物、または乳児用調合物であってもよい（ちょうど水溶液が、成人、小児患者、または乳児に投与されてもよいように）。高いグルタミン用途のためには、液体栄養調合物は好ましくは、少なくとも大部分の栄養源を提供する。しかしながら本明細書に記載されている液体栄養調合物は、特に大部分は中心静脈栄養法が実施基準である場合（例えば、子宮外での最初の数週間にわたって、経口栄養供給へとゆっくりと離乳される極端な早産児において）、少なくとも大部分の栄養源以外として用いられてもよい。少なくとも大部分の栄養源という用語は、この調合物が、この調合物を受けている患者に対する総カロリーおよび栄養的必要量の少なくとも半分を提供するのに十分な量で、栄養供給されるものとすることを意味する。この定義には、単一栄養源としての調合物および調合物の供給が包含され、これによって、この調合物を受けている患者に対する総カロリーおよび栄養的必要量のすべてを提供する。必要とされるカロリーおよび栄養素の量は、例えば年齢、体重、および生理的状態などの変数に応じて、患者毎に様々である。カロリーおよび栄養素の適量を供給するのに必要とされる栄養調合物の量は、このような調合物中に組み込むのに適した量のカロリーおよび栄養素の量のように、当業者によって決定されうる。例として、この調合物が成人用調合物である時、タンパク質成分は、前記液体栄養調合物の総カロリー含量の約１４から約３５％を構成しうる；炭水化物成分は、前記液体栄養調合物の総カロリー含量の約３６から約７６％を構成しうる；脂質成分は、前記液体栄養調合物の総カロリー含量の約６から約４１％を構成しうる。この栄養調合物は、経口栄養供給用調合物であってもよく、経腸栄養供給用調合物であってもよい。もう１つの例として、この調合物が、非成人用調合物である時、このタンパク質成分は、前記液体栄養調合物の総カロリー含量の約８から約２５％を構成しうる；炭水化物成分は、前記液体栄養調合物の総カロリー含量の約３９から約４４％を構成しうる；脂質成分は、前記液体栄養調合物の総カロリー含量の約４５から約５１％を構成しうる。これらの範囲は、例としてのみ示されており、限定的なものとされているわけではない。
【００５２】
実際問題として、このような製品は、総グルタミン含量の約半分またはそれ以上を提供するのに十分な量のＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩を含有する。あるいはまた、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩の有効量は、１，０００ｋｃａｌあたりのミリモルで表示することができる。このような表示によれば、グルタミンの標的量が、日／ｋｇ／日あたり約３００ｍｇのグルタミンであるならば、栄養調合物は好ましくは、成人の場合、栄養調合物１，０００ｋｃａｌあたり、少なくとも約３５ミリモルのＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩、および子供、乳児、または早産児（非成人）の場合、栄養調合物１，０００ｋｃａｌあたり、少なくとも約５．０ミリモルのＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩を含有する。より好ましくはこのような栄養調合物は成人用の場合、栄養調合物１，０００ｋｃａｌあたり、約３５から約１６０ミリモルのＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩、子供用の場合、栄養調合物１，０００ｋｃａｌあたり、約５．０から約３２ミリモルのＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩、および乳児または早産児の場合、栄養調合物１，０００ｋｃａｌあたり、約５．０から約２６ミリモルのＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または栄養的に許容しうるこの塩を含有する。
【００５３】
Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンに加えて、この栄養調合物は、栄養調合物製造業者に知られているように、適切な炭水化物、脂質、およびタンパク質を含有する。適切な炭水化物には、ワックス状または非ワックス形態における、コーン、タピオカ、コメ、またはジャガイモ源からの、加水分解されているか、自然のままの、または天然および／または化学変性されたデンプン；および糖、例えばグルコース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、高フルクトースコーンシロップ、コーンシロップ固体、フルクトオリゴ糖、およびこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されるわけではない。マルトデキストリンは、デンプン（例えばコーンまたはコメからのデンプン）の酸または酵素による加水分解から得られた多糖類である。これらの分類は、加水分解の程度に基づき、デキストロース当量（ＤＥ）として報告されている。栄養調合物中に使用されているあらゆるマルトデキストリンのＤＥは、好ましくは約１８から２０未満である。
【００５４】
適切な脂質には、次のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。すなわち、ヤシ油、大豆油、コーン油、オリーブ油、サフラワー油、高オレインサフラワー油、ＭＣＴ油（中鎖トリグリセリド）、ひまわり油、高オレインひまわり油、パーム油、パームオレイン、キャノーラ油、綿実油、魚油、パーム核油、メンハーデン油、大豆油、レシチン、アラキドン酸およびドコサヘキサエン酸の脂質源、およびこれらの混合物である。アラキドン酸およびドコサヘキサエン酸の脂質源には、海産油（ｍａｒｉｎｅ  ｏｉｌ）、卵黄油、およびかび（ｆｕｎｇａｌ）油、または藻類油が含まれるが、これらに限定されるわけではない。これらの脂肪の多くの商品源は容易に入手でき、当業者に知られている。例えば大豆油およびキャノーラ油は、イリノイ州デカターのアーチャー・ダニエルズ・ミッドランド（Ａｒｃｈｅｒ  Ｄａｎｉｅｌｓ  Ｍｉｄｌａｎｄ，Ｄｅｃａｔｕｒ）から入手しうる。コーン油、ヤシ油、パーム油、およびパーム核油は、オレゴン州ポートランドのプレミア・エディブル・オイルズ・コーポレーション（Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｅｄｉｂｌｅ  Ｏｉｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ）から入手しうる。分留ヤシ油は、イリノイ州ラグランジのヘンケル・コーポレーション（Ｈｅｎｋｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＬａＧｒａｎｇｅ）から入手しうる。高オレインサフラワーおよび高オレインひまわり油は、オハイオ州イーストレイクのＳＶＯスペシャルティー・プロダクツ（ＳＶＯ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅａｓｔｌａｋｅ）から入手しうる。海産油は、日本国東京のモチダ・インターナショナルから入手しうる。オリーブ油は、英国ノース・ハンバーサイドのアングリア・オイルズ（Ａｎｇｌｉａ  Ｏｉｌｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｈｕｍｂｅｒｓｉｄｅ）から入手しうる。ひまわり油および綿実油は、ミネソタ州ミネアポリスのカーギル（Ｃａｒｇｉｌ）から入手しうる。サフラワー油は、カリフォルニア州リッチモンドのカリフォルニア・オイルズ・コーポレーション（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｏｉｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から入手しうる。
【００５５】
これらの食品グレード油に加えて、所望であれば、構造脂質が、栄養物に組み込まれてもよい。構造脂質は、当分野において知られている。構造脂質の簡潔な記載は、「構造脂質が、脂肪のテーラーメードを可能にする（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  Ｌｉｐｉｄｓ  Ａｌｌｏｗ  Ｆａｔ  Ｔａｉｌｏｒｉｎｇ）」（１９９７年１０月）というタイトルの、ＩＮＦＯＲＭ、第８巻、１０号、１００４ページにおいて見ることができる。同様に、米国特許番号第４，８７１，７６８号も参照されたい。構造脂質は優勢的に、同じグリセロール核上の中および長鎖脂肪酸の混合物を含有するトリアシルグリセロールである。構造脂質および経腸調合物におけるこれらの使用もまた、米国特許第６，１９４，３７号および第６，１６０，００７号に記載されている。
【００５６】
適切なタンパク質源には、次のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。すなわち、ミルク、乳漿および乳漿フラクション、大豆、コメ、肉（例えば牛肉）、動物および植物（例えば豆、ジャガイモ）、卵（卵アルブミン）、ゼラチン、および魚である。適切な自然のままのタンパク質源には、次のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。すなわち、大豆ベース、ミルクベース、カゼインタンパク質、乳漿タンパク質、コメタンパク質、牛肉コラーゲン、豆タンパク質、ジャガイモタンパク質、およびこれらの混合物である。適切なタンパク質水解物には、次のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。すなわち、大豆タンパク質水解物、カゼインタンパク質水解物、乳漿タンパク質水解物、コメタンパク質水解物、ジャガイモタンパク質水解物、魚タンパク質水解物、卵白水解物、ゼラチンタンパク質水解物、動物および植物タンパク質水解物の組み合わせ、およびこれらの混合物である。加水分解されたタンパク質（タンパク質水解物）は、より短いペプチド断片およびアミノ酸に加水分解または破壊されているタンパク質である。このような加水分解されたペプチド断片および遊離アミノ酸は、より容易に消化される。最も広い意味において、タンパク質は、１つまたはそれ以上のアミド結合が破壊された時、加水分解されてしまう。アミド結合の破壊は、例えば加熱またはせん断によって、製造の間に無意図的に、または偶然に発生することがある。この開示の目的のためには、加水分解されたタンパク質とは、アミノ結合を破壊するように意図された方法で加工または処理されているタンパク質を意味する。意図的な加水分解は、例えば酵素または酸での自然のままのタンパク質の処理によって影響を受けることがある。本明細書に記載されている液体栄養調合物中に好ましくは使用されている加水分解タンパク質は、アミノ窒素（ＡＮ）対総窒素の比が、約０．１ＡＮから約１．０ＴＮから約０．４ＡＮから約１．０ＴＮ、好ましくは約０．２５ＡＮから１．０ＴＮから約０．４ＡＮから約１．０ＴＮになるような程度まで加水分解される。（ＡＮ：ＴＮ比は、単独の水解物タンパク質について示され、最終栄養調合物におけるＡＮ：ＴＮ比を表わしていない。）
タンパク質はまた、遊離アミノ酸の形態で提供されてもよい。この栄養調合物には、栄養的により完全でバランスの取れた調合物を提供するために、様々なアミノ酸が補足されてもよい。適切な遊離アミノ酸の例には、次のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。すなわち、タンパク質系の一部と通常考えられているすべての遊離Ｌ−アミノ酸であるが、特に栄養的な観点から、必須、または条件付きで必須であると考えられているものである。すなわち、トリプトファン、チロシン、システイン（シスチン）、メチオニン、アルギニン、ロイシン、バリン、リシン、フェニルアラニン、イソロイシン、トレオニン、およびヒスチジンである。栄養製品に典型的に添加されるほかの（非タンパク質）アミノ酸には、カルニチンおよびタウリンが含まれる。いくつかの場合、アミノ酸のＤ−形態は、Ｌ−形態と栄養的に同等と考えられ、異性体混合物が用いられると、より低コストになる（例えば、Ｄ，Ｌ−メチオニン）。
【００５７】
栄養調合物は好ましくはまた、この調合物を受けている患者の一日の栄養的必要量を供給するように設計された量で、ビタミンおよびミネラルも含有する。当業者は、栄養調合物が、この製品の貯蔵寿命にわたって一日の栄養的必要量を確実に満たすように、あるいくつかのビタミンおよびミネラルで過剰強化される必要があることが多いことを認めている。これらの同じ個々の当業者はまた、患者が罹っている、根底にあるあらゆる病気または疾患に応じて、あるいくつかの微小成分が、人々に対して潜在的な効果を有しうることも認めている。例えば糖尿病患者は、例えばクロム、カルニチン、タウリン、およびビタミンＥなどの栄養素から恩恵を受ける。調合物は好ましくは、次のビタミンおよびミネラルを含むが、これらに限定されるわけではない。すなわち、カルシウム、リン、ナトリウム、塩化物、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、セレン、ヨウ素、クロム、モリブデン、条件付必須栄養素のｍ−イノシトール、カルニチン、およびタウリン、およびビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、およびＢ複合体、およびこれらの混合物である。
【００５８】
液体栄養物が、乳児を対象としているならば、その場合にはそのための特別な栄養的ガイドラインを、乳児調合物法令、２１Ｕ．Ｓ．Ｃ．セクション３５０（ａ）において見ることができる。これらの法律に見られる栄養ガイドラインは、栄養的必要性に関するさらなる研究が完了するにつれて、引き続き洗練されて行く。特許請求されている栄養調合物は、現在はリストに挙げることができないビタミンおよびミネラルを含有する調合物を包含するものとする。
【００５９】
この液体栄養調合物はまた、繊維および安定剤を含有してもよい。繊維および／または安定剤の適切な源には、次のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。すなわち、キサンタンガム、グアールガム、アラビアゴム、ガッティガム、カラヤゴム、トラガカントゴム、寒天、フルセララン、ゲランゴム、イナゴマメゴム、ペクチン、低および高メトキシペクチン、オートおよび大麦グルカン、カラゲナン、オオバコ、ゼラチン、微晶質セルロース、ＣＭＣ（ナトリウムカルボキシメチルセルロース）、メチルセルロースヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ＤＡＴＥＭ（モノ−およびジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル）、デキストラン、カラゲナン、ＦＯＳ（フルクトオリゴ糖）、およびこれらの混合物である。可溶性食物繊維の多くの商品源が入手可能である。例えばアラビアゴム、加水分解されたカルボキシメチルセルロース、グアールガム、ペクチン、および低および高メトキシペクチンは、メリーランド州ベルキャンプのＴＩＣガムズ社（ＴＩＣ  Ｇｕｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｌｃａｍｐ）から入手しうる。オートおよび大麦グルカンは、ネブラスカ州オマハのマウンテン・レイク・スペシャルティー・イングリーディエンツ社（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｌａｋｅ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｍａｈａ）から入手しうる。オオバコは、ニュージャージー州ノース・バーゲンのメア・コーポレーション（Ｍｅｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈ  Ｂｅｒｇｅｎ）から入手することができ、一方、カラゲナンは、ペンシルベニア州フィラデルフィアのＦＭＣコーポレーションから入手しうる。
【００６０】
組み込まれる繊維はまた、不溶性食物繊維であってもよく、この代表例には、オート外皮繊維、豆外皮繊維、大豆外皮繊維、大豆子葉繊維、砂糖大根繊維、セルロースおよびコーンブランが含まれる。不溶性食物繊維の多くの源もまた入手しうる。例えばコーンブランは、イリノイ州シカゴのクエーカー・オーツ（Ｑｕａｋｅｒ  Ｏａｔｓ）から入手することができ；オート外皮繊維は、ミネソタ州ケンブリッジのカナディアン・ハーベスト（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｈａｒｖｅｓｔ）から；豆外皮繊維は、カナダ国ウイニペグのウッドストーン・フーズ（Ｗｏｏｄｓｔｏｎｅ  Ｆｏｏｄｓ，Ｗｉｎｎｉｐｅｇ）から；大豆外皮繊維およびオート外皮繊維は、メリーランド州ラベイルのザ・フィブラド・グループ（Ｔｈｅ  Ｆｉｂｒａｄ  Ｇｒｏｕｐ，ＬａＶａｌｅ）から；大豆子葉繊維は、ミズーリ州セントルイスのプロテイン・テクノロジーズ・インターナショナル（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）から；砂糖大根繊維は、ミネソタ州ミネアポリスのデルタ・ファイバー・フーズ（Ｄｅｌｔａ  Ｆｉｂｅｒ  Ｆｏｏｄ）から、およびセルロースは、ニュージャージー州サドルブルックのジェームズ・リバー社（Ｊａｍｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｄｄｌｅ  Ｂｒｏｏｋ）から入手しうる。
【００６１】
繊維の例および調合物へのこれらの組み込みのより詳細な考察は、Ｇａｒｌｅｂらに発行された米国特許第５，０８５，８８３号において見ることができる。
【００６２】
この調合物中に使用される繊維の量は、様々であってもよい。使用される繊維の特別な型は、決定的ではない。栄養調合物のマトリックス中で安定な、ヒトの消費に適したあらゆる繊維を使用することができる。
【００６３】
繊維に加えて、これらの栄養物はまた、オリゴ糖、例えばフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）またはグルコオリゴ糖（ＧＯＳ）を含有してもよい。オリゴ糖は、大腸に生息する嫌気性微生物によって、迅速かつ広範囲に短鎖脂肪酸に発酵される。これらのオリゴ糖は、大部分のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種にとって好ましいエネルギー源であるが、潜在的な病原性生物、例えばＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、または大腸菌によって利用されない。
【００６４】
液体栄養調合物はまた、その口当たりの良さを高めるためにフレーバーを含有してもよい。有用な香料添加剤には、チョコレート、バニラ、コーヒー、ピーチ、バターペカン、ブルーベリー、バナナ、チェリー、オレンジ、グレープ、フルーツポンチ、バブルガム、リンゴ、ラズベリー、およびイチゴが含まれるが、これらに限定されるわけではない。フレーバーを補い、しょっぱい味を隠すために人工甘味料が添加されてもよい。有用な人工甘味料には、サッカリン、ニュートラスイート、スクラロース、およびアセスルファン−Ｋ（アセ−Ｋ）などが含まれる。
【００６５】
液体栄養調合物は、当業者によく知られている技術を用いて製造することができる。様々な加工技術が存在する。典型的にはこれらの技術には、水、および次のもの：炭水化物、タンパク質、脂質、安定剤、ビタミン、およびミネラルのうちの１つまたはそれ以上を含有していてもよい、１つまたはそれ以上の溶液からのスラリーの形成が含まれる。このスラリーは、乳化され、均質化され、冷却される。様々なほかの溶液も、加工前、加工後、および両方の時点でスラリーに添加されてもよい。ついでこの加工された調合物は、滅菌され、すぐに与えることができるというベースで使用されるように希釈されるか、または濃縮液体形態で貯蔵されてもよい。その結果生じた調合物が、すぐに与えることができる液体または濃縮液体になるよう意図されている時、適量の水が、滅菌前に添加される。
【００６６】
本発明はまた、小児脂肪便症を患っている患者の腸粘膜炎症の減少方法であって、上記の水溶液および液体栄養物中に組み込まれたＮＡＱを投与することによる方法を目的とする。実施例５において、本発明者らは、上皮アポトーシスを監視するためにマーカーのＴＵＮＥＬを使用し、上皮下炎症を監視するためにＣＤ２５を使用した。本発明者らは、これらのマーカーの両方またはそのうちの１つを誘発した化合物／生成物を発見し、これらの化合物／生成物が、小児脂肪便症患者の粘膜にとって毒性があると考えた。しかしながらＮ−アセチル−グルタミンは、未治療小児脂肪便症患者の生検に対して明らかな栄養効果を有した。この栄養効果（ｔｒｏｐｈｉｓｍ）は、特に、ほかのサンプルと比較して有意に改良された上皮の粘膜の全身的改善によって規定された。Ｎ−アセチル−グルタミンの栄養活性のこの意外な側面は、負の対照（媒質単独）と比較した場合でさえ、粘膜の全体的な状態を改善するように見えた。
【００６７】
（実施例）
液体栄養調合物の調製方法
特許請求の範囲内に入る液体栄養調合物は、次の手順によって調製することができる。これらの実施例は、例証として提示されており、限定的であると解釈されるべきではない。ほかの炭水化物、脂質、タンパク質、安定剤、ビタミン、およびミネラルは、本発明の範囲から逸脱することなく、用いることができる。
【実施例１】
【００６８】
Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンを含有する液体栄養調合物の調製方法
表１に記載された物質を用いて、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンを含有する、すぐに与えることができる液体製品を製造した。この製品を生産するために用いられた手順について、下に概略を示す。
【００６９】
【表１】
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手順：上記の液体栄養製品は、３つのスラリーを調製し、これらを互いにブレンドし、海産油／ＭＣＴ構造脂質と組み合わせ、熱処理し、標準化し、包装し、滅菌することによって製造する。製造方法を、下に詳細に記載する。
【００７０】
炭水化物／ミネラルスラリーは、まず、適量の水を、攪拌しつつ約６５℃から約７１℃の温度まで加熱して調製する。ついでミネラルの必要量を、記載された順序で、高攪拌下に添加する。すなわち、ナトリウムシトレート、微量ミネラルプレミックス、カリウムシトレート、塩化マグネシウム、リン酸マグネシウム、リン酸トリカルシウム、およびヨウ化カリウムである。次に、必要量のマルトデキストリン（アイオワ州マスカティーンのグレイン・プロセシング・コーポレーション（Ｇｒａｉｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｕｓｃａｔｉｎｅ）によって販売されているマルトリン（Ｍａｌｔｒｉｎ（登録商標）Ｍ−１００）を、高攪拌下、スラリーに添加し、温度を約７１℃に維持しつつ溶解させておく。必要量のスクロースおよびフルクトオリゴ糖（コロラド州ゴールデンのゴールデン・テクノロジーズ社（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｇｏｌｄｅｎ）によって販売されているニュートリフローラ（Ｎｕｔｒｉｆｌｏｒａ）−Ｐ（登録商標）フルクト−オリゴ糖粉末）を、ついで高攪拌下添加する。必要量のゲランガム（カリフォルニア州サンディエゴのメルク・アンド・カンパニー・インコーポレイティッド（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）のケルコ（Ｋｅｌｃｏ）ディビジョンによって販売されているケルコゲル（Ｋｅｌｃｏｇｅｌ）（登録商標））を、ついでスクロースと１：５（ゲランガム／スクロース比）においてドライブレンドし、高攪拌下スラリーに添加する。次に、温水中に溶解されているナトリウムセレナイトを、攪拌下、スラリーに添加する。完成された炭水化物／ミネラルスラリーを、その他のスラリーとブレンドされるまで、１２時間を超えない時間、約６５℃から約７１℃の温度に高攪拌しつつ維持する。
【００７１】
オイルブレンドは、必要量の大豆油およびキャノーラ油を組み合わせ、攪拌しつつ約５５℃から約６５℃の温度に加熱することによって調製する。必要量の乳化剤、モノジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル（カンザス州ニューセンチュリーのグラインドステッド・プロダクツ・インコーポレイティッド（Ｇｒｉｎｄｓｔｅｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）によって販売されているパノダン（Ｐａｎｏｄａｎ）（登録商標））を、ついで攪拌下に添加し、溶解させておく。ビタミンＤ、Ｅ、Ｋプレミックス、５５％ビタミンＡパルミテート、Ｄ−アルファ−ａ−トコフェロールアセテート（Ｒ，Ｒ，Ｒ形態）、フィロキノン、および３０％ベータカロテンを、ついで攪拌しつつ添加する。完成されたオイルブレンドを、その他のスラリーとブレンドされるまで、１２時間を超えない時間の間、穏やかな攪拌下、約５５℃から約６５℃の温度に保持する。
【００７２】
水スラリー中のタンパク質を、まず適量の水を攪拌しつつ約６０℃から約７１℃の温度まで加熱して調製する。大豆タンパク質水解物（デンマーク国ビビイＪのＭＤフーズ（ＭＤ  Ｆｏｏｄｓ，ＶｉｂｙＪ）によって販売されている）を、攪拌しつつ添加する。必要量のＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン（味の素から入手した）を、攪拌しつつ添加する。水酸化カリウム溶液（４５％）を添加して、ｐＨ約５．６に上げる。Ｌ−アルギニンを、攪拌しつつゆっくりと添加し、溶液を、透明になるまで攪拌する（ｐＨ＞６．２）。必要量の一部加水分解されたナトリウムカゼイン塩（カリフォルニア州サンタローザのニュージーランド・ミルク・プロダクツ（Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｍｉｌｋ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）によって販売されているアラネート（Ａｌａｎａｔｅ）（登録商標）１６７）を、ついでスラリー中にブレンドする。この完成された水中タンパク質スラリーを、その他のスラリーとブレンドされるまで、２時間を超えない時間の間、穏やかな攪拌下、約６０℃から約７１℃の温度に保持する。
【００７３】
水中タンパク質スラリーおよびオイルブレンドを、攪拌しつつ混合し、その結果生じた混合されたスラリーを、約５５℃から約６５℃の温度に維持する。少なくとも１分間待った後、炭水化物／ミネラルスラリーを、攪拌しつつ添加し、その結果生じたブレンドされたスラリーを、約５５℃から約６５℃の温度に維持する。ついで海産油／ＭＣＴ構造脂質を、攪拌しつつブレンドされたスラリーに添加する。望ましくは、海産油／ＭＣＴ構造脂質を、このブレンドが一定の速度で導管を通過するようにゆっくりと計量して生成物中に入れる。１分以上で、２時間以下の間待った後、このブレンドスラリーを、当業者に知られている技術を用いて、脱気、超高温処理、および均質化に付す。ついでこのブレンドを、約１℃から約７℃の温度まで冷却し、攪拌しつつ約１℃から約７℃の温度で貯蔵する。好ましくは上記工程が完了した後、品質管理に適した分析テストを実施する。品質管理テストの分析結果に基づいて、適量の水を、最終希釈のために攪拌しつつバッチに添加する（標準化）。
【００７４】
ビタミン溶液を、少量の水を攪拌しつつ約４３℃から約６６℃の温度まで加熱し、その後、攪拌しつつ次の成分：アスコルビン酸、４５％水酸化カリウム、タウリン、水溶性ビタミンプレミックス、コリン塩化物、およびＬ−カルニチンを添加することによって調製する。ついでこのビタミンスラリーを、攪拌下、ブレンドされたスラリーに添加する。
【００７５】
フレーバー溶液は、天然および人工バニラフレーバーおよび人工カラメルフレーバーを、攪拌しつつ適量の水に添加して調製する。ついでこのフレーバースラリーを、攪拌下、ブレンドされたスラリーに添加する。
【００７６】
この生成物のｐＨは、最適な生成物安定性を達成するために調節されてもよい。ついでこの完成された生成物を、適切な容器（この場合、８オンス金属カン）に入れ、最終滅菌（この場合、レトルト滅菌）に付す。
【実施例２】
【００７７】
水性Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン安定性調査
様々なｐＨ値において、および液体栄養物型製品に見られるマトリックスと同様なマトリックス中で、加熱時の水性Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンの安定性を評価するために調査を実施した。
【００７８】
水性Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンおよびグルタミン熱安定性
加熱時の水性Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンの安定性をテストするために、次の手順に従った。約１ｍｇ／ｍＬ（それぞれ５．３ｍＭおよび６．８ｍＭ）の、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン（シグマより入手。カタログ番号Ａ−９１２５）およびグルタミン（オルドリッチから入手。カタログ番号Ｇ−３２０−２）の水溶液を、ｐＨ調節を行なわずに調製した。その結果生じたＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン溶液のｐＨは、２．９であり、グルタミン溶液のｐＨは、６．０であった。これらの溶液を、密封４ｍＬ容器を有するリアクティ−サーム（Ｒｅａｃｔｉ−Ｔｈｅｒｍ）（商標）攪拌熱ブロックを用いて、１００℃で加熱した。これは、各時点、すなわち１５分、３０分、１時間、および２時間について１つずつである。これらのサンプルを、熱ブロックから取り出し、直ちに冷却するまで氷中に入れた。各サンプルのアリコートを、ＨＰＬＣによる評価のために、０．４５マイクロメートルフィルター（ミリポア・ミレックス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｅｘ）（登録商標）−ＨＶ、２５ｍｍ）を通して濾過した。
【００７９】
ＨＰＬＣ分析は、イナートシル（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ）（登録商標）Ｃ８、５マイクロメートル、４．６×２５０ｍｍカラム（ペンシルベニア州ベルフォントのキーストーン・サイエンティフィック社（Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ）から入手した）を用いて実施した。移動相を、ＨＣｌでｐＨ２．２に調節した（１ｍＬ／分で無勾配）。注入容積は、１０マイクロリットルであった。紫外線検出は、２１４ｎｍにおいてであった。
【００８０】
結果を表２に示す。グルタミンは、１００℃で２時間のインキュベーションの間安定でなかった。ｐＨ６．０グルタミン溶液を１時間煮沸した後の主要分解生成物は、ピログルタミン酸であった。このグルタミン溶液を２時間煮沸した後、ピログルタミン酸が依然として主要な分解生成物であったが、グルタミン酸も検出された。
【００８１】
Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンは、グルタミンよりもはるかに安定であった。主要分解生成物は暫定的に、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンとしての保持時間によって特定した。この特定は、質量分析法（ＭＳ）および核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）によって確認した。ＭＳおよびＮＭＲによって特定された第二の最大ピークは、２，６−ジオキソピペリジニルアセトアミドであった。Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン溶液において、ピログルタミン酸は、２時間サンプルにおいてのみ検出され、しかも０．２面積（ａｒｅａ）パーセントの非常に低いレベルにすぎなかった。
【００８２】
【表２】
2006515832.tif 000004
【００８３】
様々なｐＨ値における水性Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンおよびグルタミン安定性
様々なｐＨ値において、水溶液中のＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンの安定性をテストするために、次の手順に従った。Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンの水溶液を、ｐＨ２．０から８．０の１ｐＨ単位インクリメントにおいて調製した。これらの溶液のｐＨは、最終希釈の直前、必要に応じて、塩酸または水酸化ナトリウムのどちらかによって調節した（最終濃度＝１ｍｇ／ｍＬまたは５．３ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン）。グルタミンの単一溶液は、ｐＨ調節せず（測定されたｐＨ＝６．０）、１ｍｇ／ｍＬまたは６．８ｍＭグルタミンで調製した。すべての溶液は、オートサンプラーガラスビン中に滅菌濾過し（ミリポアミレックス（登録商標）−ＧＳ、２５ｍｍ、０．２２マイクロメートル細孔サイズ、滅菌）、周囲温度（１７から２５℃）で保存のために蓋をした。Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンサンプルを、１から１８０日の様々な時点においてＨＰＬＣによって評価した。グルタミンサンプルは、１から４５日の類似した時点においてＨＰＬＣによって評価した。
【００８４】
Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンの安定性は、ｐＨ依存性であることが発見された。結果を図１および２に報告する。すべてのｐＨ値において、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンは、７日間を通して分解を示さなかった。ｐＨ５．０から８．０において、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンは、６ヶ月以上安定であった。Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンの９９．６％超が残留した。唯一の一貫して検出された分解生成物は、６ヶ月を通じて０．５％未満でのＮ−アセチル−グルタミン酸であった。ｐＨ４．０において、６ヶ月までに、Ｎ−アセチル−グルタミン酸および２，６−ジオキソピペリジニルアセトアミドの各々が検出され、９７．９％のＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンが残留した。ｐＨ３．０において、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンは、９０日間を通じて＞９５％で残留し、４ヶ月の時点で９４．２％に低下し、６ヶ月の時点で９０．４％に低下した。Ｎ−アセチル−グルタミン酸および２，６−ジオキソピペリジニルアセトアミドは、１５日の時点で約０．１５％で出発し、３０日の時点で約１％まで、６ヶ月の時点で約５％まで増加し、ｐＨ３．０サンプル中で、ほぼ等しいレベルで検出された。６ヶ月の時点で、ピログルタミン酸が、０．５％で検出された。ｐＨ２．０において、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンは、１５日の時点で９７．０％であったが、６ヶ月の時点でわずか５５．７％まで減少した。Ｎ−アセチル−グルタミン酸は、ｐＨ２．０サンプル中の主要な分解生成物であり、１５日サンプル中で２．５％、６ヶ月サンプル中で３７．２％であった。２，６−ジオキソピペリジニルアセトアミドは、１５日時点での０．５％から、６ヶ月時点での４．９％まで増加した。ｐＨ２．０のＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンサンプルは、ピログルタミン酸について増加値を示す唯一のサンプルであった。すなわち、３０日時点での０．２％から６ヶ月時点での２．２％である。
【００８５】
グルタミン溶液（ｐＨ６．０）中で、ピログルタミン酸が、サンプル中に、３日後、室温で０．２％で見られた。４５日後、これは３．３％で見られ、グルタミンは、９６．７％であった。ＨＰＬＣ分析からの結果を、表３において高さパーセントとして報告する。
【００８６】
【表３】
2006515832.tif 000005
【００８７】
液体栄養物型製品中のＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンおよびグルタミン安定性
液体栄養物型製品中に見られたマトリックスと同様なマトリックス中のＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンの安定性をテストするために、次の手順に従った。３つの調査物質を調合した。１つがＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン（Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンは味の素から入手した）を含有するもの、１つがグルタミン（味の素から入手した）を含有するもの（それぞれ１６．５ｍｇ／ｍＬおよび１２．８ｍｇ／ｍＬの理論的濃度において、および重量ベースでタンパク質の部分を置き換える）、および対照（オプティメンタル（Ｏｐｔｉｍｅｎｔａｌ）（登録商標）、ロス・プロダクツ・ディビジョン、アボット・ラボラトリーズ（Ｒｏｓｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ａｂｂｏｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））である。Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンを含有する物質は、実施例１において上に示されている手順に従って製造した。グルタミンを含有する物質は、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンの代わりにグルタミン（７．７９ｋｇ）を用いたこと以外、同様な方法で製造した。これらの物質は、レトルト滅菌プロセスの前後に、分解について評価した。この滅菌プロセスは、液体栄養物加工に典型的なものである（ここでは１２８℃、５分）。これらの物質を室温（２０から２２℃）で貯蔵し、１、２、および３ヶ月の時点で分解の証拠について評価した。グルタミン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン、およびピログルタミン酸（存在するとすれば）を、各プロセスおよび各時点において定量化した。
【００８８】
グルタミン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン、およびピログルタミン酸についてＨＰＬＣによって分析するために、サンプルを次のように濾過した。５．０ｍＬアリコートを、５０ｍＬ容積フラスコに移し替えた。１Ｍ塩酸２０滴を添加し、サンプルを、脱イオン水で容積まで（ｔｏ  ｖｏｌｕｍｅ）希釈した。アリコートを、０．４５ミクロンフィルター（ミリポア、ミレックス（登録商標）−ＨＶ、２５ｍｍ）を通して濾過した。これらのサンプルを、上記のように（熱安定性セクション）ＨＰＬＣによって分析した。
【００８９】
遊離ピログルタミン酸およびＮ−末端ピログルタミン酸の両方を含む、タンパク質調合物中に存在するピログルタミン酸の総量は、次の方法によって決定することができる。最初、サンプルを、約１８ｇ総タンパク質／Ｌの濃度まで水溶液として調製した。この調製されたサンプル物質の２０マイクロリットルアリコートを、１．５ｍＬネジ蓋ガラスビンに入れ、新たに調製された酵素溶液９８０マイクロリットル（０．０５Ｍトリス、０．００５ジチオトレイトール、０．００１Ｍジナトリウムエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ８．０、１１単位のピログルタメートアミノペプチダーゼ／ｍＬを含有する）を添加した。ガラスビンの蓋をきつく閉め、室温（２１から２４℃）で２４時間インキュベーションした。ついでこの溶液を、下に詳細に記載されているように、Ｃ−１８ＳＰＥカートリッジを通して加工した。遊離ピログルタミン酸測定のために、最初のサンプル溶液を、脱イオン水中２から３ｇ／Ｌの総タンパク質含量まで希釈し、Ｃ−１８ＳＰＥカートリッジを通して加工した。
【００９０】
Ｃ−１８ＳＰＥ（固相抽出）カートリッジ（１００ｍｇ／１ｍＬサイズ）は、ミシガン州マスケゴンのバーディック・アンド・ジャクソン（Ｂｕｒｄｉｃｋ  ＆  Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｍｕｓｋｅｇｏｎ）から入手した。ＳＰＥカートリッジは、２×５容積のメタノールとともに用いるために準備し、ついで脱イオン水２×５容積で濯ぎ洗いをした。ついで１ｍＬサンプルをゆっくりと加え、１グラムネジ蓋ガラスビン中に、流動（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）物質を収集した。溶離は、２×５００マイクロリットルの脱イオン水を加え、同じガラスビン中に通過（ｐａｓｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ）容積を収集して完了した。溶離液を混合し、ついでアリコートを、ＨＰＬＣ分析前に、０．４５マイクロメートルフィルターを通して濾過した（２５ｍｍ、０．４５マイクロメートルフィルターを、ミシガン州アン・アーバーのゲルマン（Ｇｅｌｍａｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）から入手した）。用いられたＨＰＬＣ系は、次のパラメーターを有した：ポンプモデルＧ１３１２Ａ、オートサンプラーモデルＧ１３１３Ａ、サーモスタットカラム区画モデルＧ１３１６Ａ、ダイオードアレー検出器モデルＧ１３１５Ａ、およびピークインテグレーター／データプロセッサーモデルＧ２１７０ＡＡである。これらすべてを、カリフォルニア州パロアルトのアジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）から入手した。カラム：６．５×１５０ｍｍイオン（ＩＯＮ）−３１０、カリフォルニア州サンジョゼのインタラクション・クロマトグラフィー（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）からの８マイクロメートルのもの。この系を、使用前、４０℃で０．３ｍＬ／分で移動相（５ｍＮ  Ｈ２ＳＯ４）中に予め平衡にした。
【００９１】
分析のために、サンプルまたは標準の１０マイクロリットルアリコートを注入し、カラムを、０．３ｍＬ／分で、４０℃において移動相で溶離した。溶離物質を、２１０ｎｍおよび２２０ｎｍでＵＶ吸収によって検出した。運転時間は４５分であった。
【００９２】
未知のサンプル濃度は、標準との比較によって決定した。ピログルタミン酸の３つの水溶液は通常、標準として十分である。すなわち、１０、２０、および４０ｍｇ／Ｌである（ウイスコンシン州ミルウォーキーのフルカ（Ｆｌｕｋａ）から入手したピログルタミン酸）。
【００９３】
液体栄養物型製品中のＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンは、滅菌中または３ヶ月の室温貯蔵後、分解を示さなかった。結果を表４に報告する。Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンに対応する小さいピークが、すべての時点で検出されたが、ほぼ同じレベルに留まり、これは、Ｎ−アセチル−グルタミン酸への測定可能な分解を示していない。
【００９４】
グルタミンが補足された製品において、グルタミンは、滅菌プロセスによって、もとの濃度の約１／３まで減少され、２ヶ月までにはグルタミンは検出されなかった。この製品において、ピログルタミン酸は、グルタミンの完全な変換と矛盾しない濃度において検出された。
【００９５】
【表４】
2006515832.tif 000006
【実施例３】
【００９６】
グルタミンおよびＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンバイオアベイラビリティー
ブタモデルにおいて、グルタミンと比較した、バイオアベイラブルなＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンの割合を決定するために調査を実施した。腸係蹄（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｌｏｏｐ）モデルは、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンおよびグルタミンの吸収および代謝を評価するために、分離された腸の切片を用いる。栄養供給モデルは、典型的な食餌として給餌された時、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンおよびグルタミンの吸収を評価した。
【００９７】
腸係蹄モデル
体重１５から２０ｋｇの２２匹の家畜用のブタを、４日間にわたって実験室条件に順化させた。ブタに、これらの動物のエネルギーの必要条件（「ブタの栄養的必要条件（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｗｉｎｅ）」、第９版、１９９８年、ブタの栄養に関する小委員会（Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｓｗｉｎｅ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ）に従う標準的なブタ用の餌、および無制限な水を供給した。動物を、次のグループに無作為に割当てた。すなわち、グループＣ［グルコサリン溶液（ｇｌｕｃｏｓａｌｉｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ブラウン（Ｂｒａｕｎ）カタログ番号６２２６４７）、５％グルコース、０．９％ＮａＣｌを受ける６匹のブタ］、グループＧ［８ｇ／ＬのＧｌｎで強化された同じグルコサリン溶液（シグマカタログ番号Ｇ−３１２６）を受ける８匹のブタ］、およびグループＮ［１０ｇ／ＬのＮＡＱ（シグマカタログ番号Ａ−９１２５）で強化された同じグルコサリン溶液を受ける８匹のブタ］である。外科手術前、動物を１５時間断食させた。実験当日、動物の体重を測り、ストレスニル（Ｓｔｒｅｓｎｉｌ）（登録商標）およびペントタールを用いて麻酔した。麻酔されたブタは、腹部正中矢状切開（ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  ｓａｇｉｔａｌ  ｉｎｃｉｓｉｏｎ）によって切開した。トライツ靭帯から約１メートルのほぼ１メートルの近位空腸に、両端を締め付け、近位フィステル（ｆｉｓｔｕａｌ）を挿入した後、５０から７５ｍＬ／分において調査溶液１２５ｍＬを充填した。腸注入溶液サンプルを、０、１５、３０、６０、９０、１２０、１５０、および１８０分の時点で、注入された腸の穿刺によって取り出した。サンプルを液体窒素中に冷凍し、分析まで−８０℃に維持した。門静脈血サンプルを、抗凝血剤を有する管において、０、１５、３０、６０、９０、１２０、１５０、および１８０分の時点で、門静脈穿刺によって取り出した。サンプルを、血漿および赤血球分離のために、１，５００×ｇで１５分間遠心分離するまで４℃に維持した。血漿を、分析するまで−２０℃で冷凍した。頚静脈血サンプルを、抗凝血剤を有する管において、０、６０、１２０、および１８０分の時点で穿刺によって取り出し、血漿を得、門静脈の場合のように貯蔵した。３時間後、ブタを犠牲にし、粘膜サンプルを、注入した腸のセグメント２５ｃｍから得た。このセグメントを、氷冷生理食塩水で完全に濯ぎ洗いし、縦に切開し、乾燥ブロッティングした。ガラスカバースリップを用いて内腔（ｌｕｍｉｎａｌ）表面全体をこすって粘膜を除去し、ついで液体窒素中に冷凍し、−８０℃で貯蔵した。
【００９８】
Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンの分析は、次のように実施した。腸注入溶液サンプルおよび血漿サンプルについては、アリコートを、水中０．０５％パークロロ酢酸（ＰＣＡ）溶液で１：１０（ｗ／ｖ）希釈した。粘膜サンプルについては、湿潤粘膜サンプル０．２ｍｇを、水中０．０５％ＰＣＡ溶液５ｍＬでホモジナイズした。遠心分離（１５，０００×ｇ、３分、周囲温度）後、サンプルを、０．４５マイクロメートルフィルターを通して濾過し、２６９０分離モジュール、ＰＤＡ検出器、およびリクロカート（ＬｉｃｈｒｏＣａｒｔ）２５０−４カートリッジ（ピュロスファー（Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ）ＲＰ１８ｅ、２５０×４ｍｍ、５マイクロメートル）からなるＨＰＬＣクロマトグラフ系中に注入した。移動相は、流量１ｍＬ／分でｐＨ２．７のリン酸緩衝液０．１Ｍからなっていた。Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンの検出および定量化は、２１０ｎｍで監視した。
【００９９】
グルタミンおよびグルタメートについての分析は、次のように実施した。腸注入溶液サンプルおよび血漿サンプルは、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンの分析についてのように（上記）調製したが、ただしサンプルを、水中０．０５％ＰＣＡ溶液で１：４００（ｗ／ｖ）希釈した。サンプルを０．４５マイクロメートルフィルターを通して濾過した後、この混合物２０マイクロリットルを、ＡｃｃＱ−Ｔａｇ方法（ウォーターズ社）に従って誘導体化し、水で１ｍＬまで希釈した。簡単に言えば、サンプルを、ボレート溶液で緩衝化し、反応性物質２０マイクロリットルで誘導体化した。１分後、サンプルを１ｍＬに希釈し、ＨＰＬＣ系中に注入した。これは、２６９０分離モジュール、蛍光検出器、およびスペルコシル（ＳｕｐｅｌｃｏＳｉｌ）ＬＣ−１８カラム（２５０×４ｍｍ、３マイクロメートル）からなる。移動相は、１ｍＬ／分の流量において、０．２５％トリエチルアミンおよび９％アセトニトリルを有する、ｐＨ７．５のリン酸緩衝液０．１Ｍからなっていた。グルタメートおよびグルタミンの検出および定量化は、２５０ｎｍの励起波長を用い、３９５ｎｍにおける発光（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）を監視して達成された。
【０１００】
グルコースを、十分に確立された結合酵素アッセイを用いて分析した。簡単に言えば、サンプルグルコースは、ヘキソキナーゼおよびＡＴＰ（アデノシントリホスフェート）を用いてホスホリル化し、その結果生じたグルコース−６−ホスフェートを、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼを用いて、６−ホスホグルコネートに転換する。後の反応の間、ＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）は、ＮＡＤＨ（ＮＡＤの還元型）に転換され、その結果、３４０ｎｍにおける吸光度の増加を生じる。これは、もとのサンプル中のグルコース濃度に比例する。このアッセイは、ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパニーからの臨床化学キットとして購入することができる（現在のカタログ番号１６−２０）。
【０１０１】
結果
注入された溶液の導入後の時間に対する腸内腔中に残留するグルタミンまたはＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン
等量のグルタミンまたはＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンを含有する溶液が注入されたブタの腸内容物中のグルタミンまたはＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンの残留パーセンテージは、最初の９０分間同様であった。１２０分および１８０分の時点で、グループ間に統計的有意差があった。ｔ１／２（約４５分）では、グルタミンまたはＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン間に有意差はなかった。図３は、検体の導入後、時間に対する腸内腔中に残留する検体（グルタミンまたはＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン）の量をグラフによって示している。残留検体は、ゼロ時点で存在する検体のパーセンテージとして表示される。
【０１０２】
注入された溶液の導入後の時間に対する腸内腔中に残留するグルコース
どの時点でも、ＣグループとＧグループとの間に有意差はなかった。１５分の時点以外、ＣとＮとの間に有意差はなかった。ＧおよびＮグループは、１２０分の時点からは異なる傾向があった。ただし、ボンフェローニの補正によりペナルティーを科すと、唯一の有意差は１８０分の時点であった。図４は、これらの溶液の導入後の時間に対する腸内腔中に残留するグルコースの量をグラフによって示している。残留グルコースは、ゼロ時点で存在する量のパーセンテージとして表示される。
【０１０３】
腸係蹄中へのテスト溶液の導入後の門脈血（ｐｏｒｔａｌ  ｂｏｌｌｄ）中のグルタミン
結果が、当初濃度のパーセンテージとして表示された時、対照（Ｃ）とグルタミン（Ｇ）との間、およびＣとＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン（Ｎ）グループとの間に有意差があった（９０分および１５０分の時点で、Ｃ対Ｇ；および９０、１２０、１５０、および１８０分の時点で、Ｃ対Ｎ）。ＧとＮとの間には有意差はなかった。結果が絶対値として表示された時、ＣとＮとの間の１２０分の時点以外、グループ間に有意差はなかった。まとめると、ＧおよびＮは、１２０分から実験の最後まで、Ｃとは異なる傾向があった。図５は、腸係蹄中へのテスト溶液の導入後、時間に対する門脈血中のグルタミンの量（ｍｃｇ／ｍＬ）をグラフによって示す。
【０１０４】
門脈血中のグルコースについてのグループ間、および末梢血中のグルタミンまたはグルコースについてのグループ間に有意差はなかった。実験中のどの時点でも、門脈血または末梢血中のどちらかにおいて検出された、自然のままのＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンの無視しうる（ｐｐｍ）レベルしかなかった。
【０１０５】
空腸粘膜におけるグルタミン酸（ＧＬＵ）およびグルタミン（ＧＬＮ）
グループＧよりもグループＮおよびＣにおいて、より高いグルタメート濃度があり、ＮおよびＧグループのどちらも、粘膜中により高いグルタミンを示したが、グループＧは、グループＮよりも実質的に高かった。しかしながらグルタミン＋グルタメート濃度の合計は、グループＧおよびＮにおいて同様であった。このことは、粘膜代謝系へのグルタミン炭素骨格の送達が、これら２つの食餌を用いた場合匹敵しうることを示唆している。自然のままのＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンは、粘膜サンプル中では検出することができなかった。図６は、実験の完了直後における空腸粘膜におけるグルタミンおよびグルタメートの量（およびこれらの合計）をグラフによって示している（ｍｃｇ／グラム湿潤粘膜で表示される）。
【０１０６】
要するに、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンは、グルコースへの同様なバイオアベイラビリティーを示すが、グルタミンよりごくわずかに低い。Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンは、吸収後の利用において、グルタミンと非常に類似しているように見える。吸収された後、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンは、エンテロサイト（ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅ）アシラーゼによって迅速に加水分解され、正常なグルタミン代謝に入り、同等のグルタミン食によって得られるものと同程度に高い、粘膜中のグルタミン＋グルタメート濃度が達成される。過剰なグルタミンは、門脈静脈へ排出される。ここでは、グルタミン濃度は、食餌グルタミンの同等の用量後に見られるものと同様である。門静脈血漿中のＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンの濃度は、わずか数ｐｐｍにすぎず、このことは、血流への最小限の自然のままの吸収を示唆している。Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンの高い吸収率、ならびにグルタミンへの同様な代謝は、両方の栄養素が、生物の異化段階下に同じ生物挙動を有しうることを示唆した。
【０１０７】
ブタモデルへの給餌
体重１５から２０ｋｇの１５匹のブタが、認可を受けた飼育場から供給された。これらのブタを、２日間実験室に順化させた。標準的ブタ食および水を、無制限に与えた。順化後、これらのブタを、次のグループに無作為に割当てた。すなわち、グループＣ［標準的なブタ食＋３ｇ／ｋｇのＣｒ２Ｏ３（メルクカタログ番号１．０２４８３）を受ける５匹のブタ］、グループＧ［食餌Ｃ＋８ｇ／ｋｇのＧｌｎ（味の素）を受ける５匹のブタ］、およびグループＮ［食餌Ｃ＋１０．５ｇ／ｋｇのＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン（フランマ）を受ける５匹のブタ］である。この調査の実験段階の間、各グループは、３つのポーションに分けて給餌され、１日につき１匹あたりこれらのそれぞれの餌１，０００グラムを受け、水は無制限に与えられた。この給餌実験段階は、５日間続いた。
【０１０８】
実験当日、動物の体重を測り、動物は、午前７時に標準的な食餌摂取（１匹あたり３３３ｇ食）を受けた。給餌の３時間後、動物の体重を測り、沈静させ、頚静脈穿刺によって出血させた。動物を、腹部正中矢状切開によって迅速に切開し、十二指腸、中間空腸（トライツ靭帯から約２メートル）、および回腸（回盲弁から３０ｃｍ）の内容物を取り出し、液体窒素中に冷凍し、凍結乾燥し、分析まで−８０℃で貯蔵した。肝臓および腎臓のサンプルを除去し、可視脂肪および結合組織を解剖し、迅速に液体窒素中に冷凍し、分析まで−８０℃で貯蔵した。腸粘膜のサンプルを、単離した腸係蹄の実験について記載されているように入手し、分析前に上記のように貯蔵した。
【０１０９】
腸内容物を、グルタミン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン、および酸化クロム（ＩＩＩ）について分析した。Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンの分析のために、腸内容物の凍結乾燥サンプルを、水中に０．０５％ＰＣＡを用いて１：２０（ｗ／ｖ）溶解し、ついで上記腸係蹄モデルにおいて記載されているようにＨＰＬＣ分析を行なった。
【０１１０】
グルタミンの分析のために、凍結乾燥された腸内容物を処理し、上記腸係蹄モデルにおいて記載されているように分析した。
【０１１１】
もとの食餌１ｋｇあたりの含量を反映するための補正因子を与えるように、クロムを、これらの食餌中に組み込んだ。酸化クロム（ＩＩＩ）の分析のために、次の手順を利用した。代表的な凍結乾燥腸内容物サンプルの重量を測って、ニッケルるつぼに入れ、マッフル炉に入れた。温度を５００℃に上げ、さらに２時間維持した。冷却後、溶融混合物（Ｎａ２ＣＯ３  Ｋ２ＣＯ３  ＫＮＯ３、１０：１０：４ｗ／ｗ／ｗ）を、サンプル灰の重量の約１０倍添加し、完全に混合した。余分な量の溶融混合物を添加し、上に薄層を形成し、透明な溶融物が得られるまで、ガスバーナーを用いて直火上で３０分間溶融した。このるつぼをバーナーから除去し、冷ましておき、この溶融物を、約２０ｍＬの水で壁を洗浄することによって完全に抽出し、ついでホットプレート上で約３０分間静かに加熱した。外皮（ｃｒｕｓｔ）が十分に緩んだ時、るつぼを水で４回濯ぎ洗いし、すべての洗浄物を、１００ｍＬ容積フラスコ水に添加し、容積まで希釈した。ブランクとしての脱塩水に対する３７２ｎｍにおける吸光度を決定した。吸光度の読み取り値は、標準的クロム溶液（２．９０３４ｇのＫ２Ｃｒ２Ｏ７／Ｌ、これは１．５ｇ／ＬのＣｒ２Ｏ３に等しい）の０、５０、１００、２００、および５００マイクロリットルを分析することによって作成された標準曲線の等式を用いることによって、Ｃｒ２Ｏ３のｍｇに転換された。
【０１１２】
アシラーゼの分析を、次の手順に従って実施した。湿潤粘膜、肝臓、または腎臓２００ｍｇを、ホモジナイズして５ｍＬの冷水中に入れ、５℃で５分間４００×ｇで遠心分離した。Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン溶液（５ｇ／Ｌ、シグマカタログ番号Ａ−９１２５）１００マイクロリットルを、粘膜ホモジェネート１００マイクロリットルと混合し、３７℃で１時間インキュベーションした。粘膜１００マイクロリットルおよび水１００マイクロリットルを用いて、ブランクを行なった。０．５ＩＵアシラーゼ／ｍＬから１００ＩＵアシラーゼ／ｍＬを用い、上記のようなＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンとともにインキュベーションを行なって、酵素校正曲線を構成した（アシラーゼＩ、Ｅ．Ｃ．３．５．１．１４、シグマカタログ番号８３７６）。遊離グルタミン（酵素活性によって放出された）は、上記腸係蹄モデルにおいて記載されているように測定した。各サンプルについて、アシラーゼ活性は、酵素についての標準応答曲線と比較して決定し、この値は、適切な希釈因子によって補正した。
【０１１３】
結果
吸収データを下記の表５に示す。十二指腸からのサンプルは、定量化を可能にするには不十分なレベルの酸化クロム（ＩＩ）を含有していた。分析結果は、もとの食餌１ｋｇあたりの含量を反映するように補正することはできなかった。中間空腸は、本質的に同一レベルのグルタミン（食餌Ｇの場合）およびＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン（食餌Ｎの場合）を含有しており、これは、十二指腸および近位空腸における同様な吸着を示唆している。しかしながらこれらの食餌はまた、自然のままのタンパク質も含有し、このタンパク質の消化はまた、対照食の分析結果によって示されているように、有意な遊離グルタミンを産生することができた。このことは、もとの食餌の遊離グルタミン含量が、中間空腸の前にほぼ完全に吸収されることを示唆する。遠位回腸の内容物の分析は、遊離グルタミンの吸収が、中間空腸と遠位回腸との間で続行しうるが、Ｎ−アセチル−グルタミンの吸収が観察されないことを示唆している。しかしながら全体的な吸収データは、このモデルにおいて高レベルで投与されたＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンの約７７％の吸収を示している。
【０１１４】
【表５】
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【０１１５】
腸粘膜、肝臓、および腎臓におけるアシラーゼの活性  −  対照ブタにおけるいくつかの興味のある組織（栄養的重要性の可能性から考えて）中のアシラーゼ活性を測定した。アシラーゼ活性は、空腸粘膜、肝臓、および腎臓を包含する、テストされたすべての組織中に見られた。決定されたレベルは、空腸粘膜において９４８±３００ＩＵ／ｇ湿潤組織（１７．３±７．０ＩＵ／ｍｇタンパク質）、肝臓において１２，７７０±，１１００ＩＵ／ｇ湿潤組織（１５９±３０ＩＵ／ｍｇタンパク質）、および腎臓において１９，６３０±３０２０ＩＵ／ｇ湿潤組織（３０２±４７ＩＵ／ｍｇタンパク質）であった。
【０１１６】
要するに、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンは、主として十二指腸および上部空腸において吸収された。この場合、用量の少なくとも７７％が吸着された。Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンとグルタミンとの間に２つの主な差があった。すなわち、初期のＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン取り込み飽和、およびより低い回腸吸収である。
【実施例４】
【０１１７】
栄養不良によって引起こされた腸損傷に対するＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンの効果
ブタにおいてタンパク質エネルギー栄養不良によって引起こされた腸損傷に対する、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン対遊離グルタミンの潜在的効果を評価するために、調査を実施した。この調査において、生後５週間の家畜用のブタが、認可を受けた飼育場によって供給された。これらのブタを、２つのグループの１つに無作為に割当てた。１つのグループにおいて３匹のブタに、３０日間エンシュアプラス（ＥＮＳＵＲＥＰＬＵＳ）（登録商標）（ロス・プロダクツ・ディビジョン、アボット・ラボラトリーズ）を制限なく給餌した。第二グループにおいて、９匹のブタにも同様にエンシュアプラス（登録商標）を給餌したが、第一グループの一日の摂取の２０％にすぎなかった。この第二グループは、各々６匹のブタを有する３つのサブグループに分けられ、カルシウムカゼイン塩、グルタミン、またはＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンの毎日のサプリメントを受けた。対照グループに供給された一日の平均エネルギーおよびタンパク質は、調査の開始時の３，３００ｋｃａｌ、１３８ｇタンパク質から、調査の終了時の４，５００ｋｃａｌ、１８７ｇタンパク質に及んだ。第二グループにおいて、カゼイン塩、グルタミン、およびＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンのサプリメントは、一日あたり追加の１．３２グラム窒素当量を与えた（基本的には、６．８９グラムのＬ−グルタミン、または８．８７グラムのＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン、または８．４２グラムのカゼイン塩タンパク質が、一日あたり補足される）。３０日後、すべてのブタを１６時間絶食させた。ついでこれらの動物の体重を測り、沈静化し、麻酔し、頚部穿刺による末梢出血（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ）によって犠牲にした。
【０１１８】
小腸全体を迅速に除去した。トライツ靭帯からの小腸の６０ｃｍセグメントは、近位空腸と考えられた。トライツ靭帯からの５ｃｍ長さのセグメントを、空腸の組織分析のために選択した。回盲弁に最も近い６０ｃｍの長さが、遠位回腸と考えられた。回盲弁から５ｃｍのセグメントを、回腸の組織分析のために選択した。腸セグメントは、氷冷生理食塩水で完全に濯ぎ洗いし、縦に切開し、乾燥ブロッティングした。粘膜は、ガラススライドを用いてこそげ落とし、冷たいペトリ皿に載せ、重さを測り、直ちに液体窒素下に冷凍し、生化学分析まで−８０℃で貯蔵した。
【０１１９】
空腸および回腸粘膜を、タンパク質およびＤＮＡアッセイのために、機械的ポッターホモジナイザーを用いて、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で均質化した。傷害の酵素マーカー、すなわち機能性および抗酸化防御系の決定のために、粘膜ホモジネートを、３，０００ｇで１０分間遠心分離し、その結果生じた上澄み液を、酵素アッセイのために用いた。総グルタチオンの決定のため、粘膜を５％トリクロロ酢酸中にホモジナイズし、８，０００ｇで５分間遠心分離した。
【０１２０】
生化学分析および免疫分析を、標本に対して実施した。腸粘膜タンパク質およびＤＮＡの濃度は、それぞれブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法（分析生化学（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第７２巻、２４８−２５４ページ、１９７６年）およびＬａｂａｒｃａおよびＰａｉｇｅｎ（分析生化学、第１０２（２）巻、３４４−３５２ページ、１９８０年）を用いて決定した。栄養不良によって引起こされた腸損傷の程度は、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎの方法（Ｒ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｔ．Ｋｌｅｉｎ、Ｓ．Ｆｒｅｉｅｒ、およびＪ．Ｍｅｎｃｚｅｌ、「臨床栄養のアメリカン・ジャーナル（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）」、２４：１２２４−１２３１、１９７０年）を用いて、アルカリホスファターゼ活性を測定することによって評価した。
【０１２１】
酸化的損傷に対する防御系は、グルタチオンレダクターゼ（ＧＲ）、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＴ）、およびグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰＯＸ）の活性を測定することによって、ならびに非タンパク質スルフヒドリル基（大部分還元されたグルタチオン（ＧＳＨ））の濃度によって評価した。グルタチオンレダクターゼ活性は、ＣａｒｌｂｅｒｇおよびＭａｎｎｅｒｖｉｋの方法（Ｉ．ＣａｒｌｂｅｒｇおよびＢ．Ｍａｎｎｅｒｖｉｋ、酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１１３巻、ｐｐ４８４−４９０、１９８５年）によって評価した。グルタチオントランスフェラーゼ活性は、Ｈａｂｉｇらの方法（Ｗ．Ｈ．Ｈａｂｉｇ、Ｍ．Ｊ．Ｐａｂｓｔ、およびＷ．Ｂ．Ｊａｋｏｂｙ、生物化学のジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２９４：７１３０−７１３９、１９８４年）を用いて測定した。グルタチオンペルオキシダーゼ活性は、ＦｌｏｈｅおよびＧｕｎｚｌｅｒの方法（Ｌ．ＦｌｏｈｅおよびＷ．Ａ．Ｇｕｎｚｌｅｒ、酵素学における方法、第１０５巻、ｐｐ１１４−１２１、１９８４年）によってアッセイし、非タンパク質スルフヒドリル含量（減少したグルタチオン当量として報告された）は、Ａｎｄｅｒｓｏｎの方法（Ｍ．Ｅ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ、酵素学における方法、１３３：５４８−５５４、１９８５年）によって決定した。
【０１２２】
腸リンパ球を、下に詳細に記載されているように修正されたＧａｕｔｒｅａｕｘらの手順（Ｍ．Ｄ．Ｇａｕｔｒｅａｕｘ、Ｅ．Ａ．Ｄｅｉｔｃｈ、およびＲ．Ｄ．Ｂｅｒｇ、感染および免疫（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）、６２（７）：２８７４−２８８４、１９９４年）に従って単離した。それぞれ空腸および回腸からの２つの小腸セグメントを単離し、内腔内容物を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、米国ミズーリ州セントルイス、シグマ）を用いて流した。可視パイエル斑を切除し、腸を縦方向に切開し、小片にカットした。小腸上皮を単離するために、これらの小片を、振とう水浴（１分あたり１２０ストローク）中で、５ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ；米国インディアナ州インディアナポリスのロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（米国ミズーリ州セントルイスのシグマ）、および２５ｍＭトリス緩衝液（米国ミズーリ州セントルイスのシグマ）を有する、２５ｍｌのハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；米国ミズーリ州セントルイスのシグマ）中で３７℃で３０分間インキュベーションした。上澄み液をデカントし、新鮮なＨＢＳＳ−ＤＴＴ−ＥＤＴＡ−トリスを添加し、インキュベーション手順を繰り返した。２つのインキュベーションからの上皮細胞を含有する上澄み液をプールし、これらの細胞を、５％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎児血清（米国ミズーリ州セントルイスのシグマ）、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（米国ミズーリ州セントルイスのシグマ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５００Ｕペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（米国ミズーリ州セントルイスのシグマ）を含有するｒｐｍｉ１６４０培養培地（完全培地）での遠心分離によって洗浄した。１分あたり１２０ストロークでの３７℃振とう水浴中で、１２０分間、コラゲナーゼ０．０５Ｕ／ｍｌ、ディスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）０．３０Ｕ／ｍｌ（米国ミズーリ州セントルイスのシグマ）、およびＤＮアーゼＩ５００Ｕ／ｍｌ（米国インディアナ州インディアナポリスのロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ）を有する４０ｍｌの完全培地中に腸残骸を入れて、固有層リンパ球（ＬＰＬ）を、残留沈殿物から放出した。切除されたパイエル斑を完全培地中に入れ、一組の外科用メスで解剖した。ついで、洗浄されたパイエル斑を、パイエル斑リンパ球（ＰＰＬ）を放出するためにＬＰＬ単離について上記されているように、コラゲナーゼ処理した（インキュベーション時間を６０分に減少した）。
【０１２３】
上皮、固有層、およびパイエル斑から単離された細胞型の各々を、不連続パーコル（Ｐｅｒｃｏｌｌ）（商標）（米国ミズーリ州セントルイスのシグマ）密度勾配遠心分離に付し、リンパ球について濃縮した。商用パーコル（商標）溶液を、９％ＮａＣｌで９：１０希釈すると、等張パーコル（商標）溶液を生じ、これを完全培地で希釈し、パーコル（商標）濃度が異なる３つの溶液（７５％、４０％、および３０％）を得た。これらを降順に用いた。これらの細胞を、４ｍｌの完全培地中に再縣濁し、３０％フラクション上に置いた。６５０ｇで２０分間の遠心分離後、７５％層と４０％層との間の界面を除去し、これらの細胞を、完全培地２５ｍｌ中で遠心分離によって洗浄した。ついでこれらの細胞を、４ｍｌの４０％パーコル（商標）中に再縣濁し、６５０ｇで遠心分離した。リンパ球（ＩＥＬ、ＬＰＬ、およびＰＰＬ）について濃縮された細胞ペレットを収集し、ＰＢＳでの遠心分離によって洗浄した。
【０１２４】
単離されたリンパ球を、モノクローナル抗体で染色し、次のようにフローサイトメトリーによって定量化した。各リンパ球調製物（２×１０６細胞／ｍｌ）１００μｌを、異なる濃度のモノクローナル抗体（抗ＣＤ１ＦＩＴＣ、抗ＣＤ３εＦＩＴＣ、抗ＣＤ４ａＰＥ、抗ＣＤ８ａＰＥ、抗ＣＤ１１ｂ／Ｍａｃ−１ＡＰＣ、抗ＣＤ２１ＡＰＣ）を有する３ｍｌ管中に入れ、暗室において４℃で３０分間インキュベーションした。これらの細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離（５００ｇ、５分）によってペレット化し、３５０μｌＰＢＳ中に再縣濁した。
【０１２５】
細胞調製物の蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析を、ファクスカリバー（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ）（商標）フローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））で実施した。非特異的蛍光は、各細胞調製物に対して調製された３つの対照（フルオレセインイソチオシアネート−ＦＩＴＣ、フィコエリトリン−ＰＥ、およびアロフィコシアニン−ＡＰＣ）を通して決定した。
【０１２６】
小腸サンプルの組織分析を、透過型電子顕微鏡法によって実施した。空腸および回腸のサンプルを、０．１モル／Ｌナトリウムカコジレート緩衝液、ｐＨ７．３中の３０ｇ／Ｌグルタルアルデヒド中に固定し、１５ｇ／Ｌオスミウム四酸化物中に後固定（ｐｏｓｔｆｉｘ）した。ついでサンプルをアセトン中に脱水し、エポン（Ｅｐｏｎ）８１２樹脂中に埋め込んだ。極薄切片を、ウラニルアセテートおよび鉛シトレートで二重染色し、ツアイス９０２透過型電子顕微鏡（ドイツ国オーバーコッヘンのツアイス（Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ））下で調べた。
【０１２７】
生化学結果
対照の２０％へ食餌摂取の削減の結果、完全な成長不全を生じた。栄養不良ブタは、総体重の平均２から３ｋｇを減少したが、一方、対照豚は、３０日の試験の間、１８ｋｇ増加した。肝臓重量、および空腸および回腸粘膜の両方の長さあたりの重量も、栄養不良の結果としてひどく減少した（表６）。
【０１２８】
【表６】
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【０１２９】
粘膜の長さあたりのＤＮＡおよびタンパク質の量は、対照と比較して、栄養不良ブタにおいて有意に低かった（２から３倍）（データは示されていない）。しかしながらタンパク質／ＤＮＡ比は、どの腸セグメントにおいてもＰＥＭによって影響を受けなかった。これらの結果は、栄養不良ブタの小腸におけるタンパク質およびＤＮＡ合成の全体のプロセスが損なわれることを示唆している。タンパク質（空腸および回腸）およびＤＮＡ（回腸）の腸における含量は、カゼイン塩またはグルタミンを消費したブタよりも、ＮＡＱサプリメントを消費した栄養不良ブタにおいて、より高くなる傾向があった。これらの結果は、ＮＡＱが、栄養不良期間の間、タンパク質およびＤＮＡ合成プロセスを部分的に保持することを示唆している。
【０１３０】
腸傷害のマーカーとしてのアルカリホスファターゼセグメント活性は、空腸セグメントにおいて、対照よりも栄養不良ブタにおいて有意に低かった（２から３倍）（データは示されていない）。回腸セグメントにおいて、アルカリホスファターゼ活性は、栄養不良プロセスによって、あまり影響を受けなかった。さらには、グルタミンまたはＮＡＱサプリメントを消費した栄養不良ブタは、カゼイン塩サプリメントを消費したブタよりも、空腸においてより高いＡＰ活性を有する傾向があった。
【０１３１】
グルタチオンは、全酸化防止防御系の中心成分である。これは効果的なフリーラジカル捕捉剤であり、これはまた、ほかの代謝機能の範囲内にも含まれ、これには、還元状態におけるタンパク質スルフヒドリル基の維持、ＧＴおよびＧＰＸについての補助因子、アミノ酸輸送、およびタンパク質およびＤＮＡ合成が含まれる。総グルタチオン濃度は、対照グループと比較して、栄養不良ブタの両方の小腸セグメントにおいて有意に低下した。しかしながら、ＮＡＱを消費した栄養不良ブタの腸粘膜におけるＧＳＨの量は、カゼイン塩またはグルタミンサプリメントを消費したブタよりもわずかに高くなる傾向があった。ただしこの差は、有意差には達しなかった。
【０１３２】
ぞれぞれアルデヒド解毒およびグルタチオン還元の原因であるグルタチオントランスフェラーゼおよびグルタチオンレダクターゼ酵素活性は、栄養不良の結果として小腸において低下している（ここでもまた２から３倍）ことが分かった。グルタチオントランスフェラーゼ活性における下降は、アルデヒド、エポキシド、および求電子中心を含有するほかの物質の粘膜中の蓄積によって、腸機能不全を悪化させうる。この活性は、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンサプリメントを消費したブタにおける栄養不良プロセスによってあまり影響を受けないように見えた。グルタチオンレダクターゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼの活性もまた、両方の小腸セグメントにおいて栄養不良によって２から３倍低下した。
【０１３３】
グルタチオンレダクターゼは、その酸化型からのグルタチオン再生に関わっており、グルタチオンペルオキシダーゼは、２つの還元グルタチオン分子を酸化して、過酸化物を解毒する。Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンサプリメントが給餌されたブタの腸粘膜において還元グルタチオンがより高くなる傾向は、同じグループにおいてグルタチオンペルオキシダーゼ活性がより高くなる傾向と関連していた。
【０１３４】
要約すれば、酸化防止防御系に対する栄養不良の有害な効果は、カゼイン塩またはグルタミンサプリメントを消費した動物よりも、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンサプリメントを消費した動物の腸においての方が、より顕著でないように見えた。
【０１３５】
免疫学的結果
栄養不良の結果として、小腸パイエル斑リンパ球の総数の減少があった。回腸において、パイエル斑リンパ球の総数は、Ｎ−アセチル−グルタミン補足されたグループまたは対照グループにおいてよりも、カゼイン塩およびグルタミン補足されたブタにおいて、有意に低かった。空腸においても同様に、パイエル斑リンパ球の総数は、カゼイン塩またはグルタミン補足されたグループにおいてよりも、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミングループにおいての方が、より高くなる傾向があった。他方、空腸上皮内リンパ球の総数は、対照グループと比較して、すべての栄養不良グループにおいて有意に高かった。あらゆる実験グループについて、小腸の固有層のリンパ球の数には差は見られなかった。
【０１３６】
すべての栄養不良グループにおいて、Ｂ細胞マーカー（ＣＤ１およびＣＤ２１）を発現するパイエル斑リンパ球の数は、健康なグループにおけるよりも低かった。これは、ＣＤ１＋リンパ球の場合に特に有意であった。回腸において対照グループと比較して、ＣＤ２１＋パイエル斑リンパ球の数の低下は、カゼイン塩およびグルタミン補足グループにおいて有意に異なっていたが、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン補足グループにおいてはそうではなかった。空腸において同じ傾向があったが、統計差に達しなかった。空腸および回腸におけるＣＤ１１ｂ＋パイエル斑リンパ球の数の低下もまた、カゼイン塩またはグルタミン補足グループにおいてよりも、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン補足グループにおいての方が、より低くなる傾向を示した。
【０１３７】
空腸および回腸パイエル斑リンパ球中のＴ細胞（ＣＤ３＋細胞）の数は、栄養不良とともに減少した。この減少は、ヘルパー（ＣＤ４＋）および細胞傷害性（ＣＤ８＋）Ｔ細胞の両方によるものであった。しかしながら、カゼイン塩またはグルタミン補足グループにおいてよりも、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン補足グループにおいての方が、ＰＰＬ中のＴ細胞のこの減少がより低くなるという一般的な傾向があった。いくつかの場合、例えば回腸におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞において、対照グループとカゼイン塩またはグルタミン補足グループと間に有意差が検出されたが、対照グループとＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン補足グループと間には検出されなかった。
【０１３８】
上記のように栄養不良は、空腸中の上皮内リンパ球の総数の増加を促進した。この増加は、両方の集団、すなわちＢ細胞（ＣＤ２１＋）およびＴ細胞（ＣＤ３＋）において検出された。Ｂ細胞において、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン補足グループのＣＤ１＋リンパ球の数は、残りのグループのものにおいてよりも有意に高かった。Ｔ細胞において、Ｔ細胞傷害性部分母集団（ＣＤ８＋）は、対照グループよりも全ての栄養不良グループにおいての方が、有意により高かった。しかしながらＴヘルパー（ＣＤ４＋）部分母集団は、対照グループよりも、グルタミンおよびＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン補足グループの方が、有意に高かった（カゼイン塩補足グループではそうでなかった）。このことは、Ｔヘルパー（ＣＤ４＋）部分母集団に対する、グルタミンおよびＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンの選択的効果を示している。回腸上皮内リンパ球中のリンパ球部分母集団のどれについても、有意差は検出されなかった。
【０１３９】
栄養不良による、固有層リンパ球における実質的に重要な変化はなかった。対照グループと比較して、カゼイン塩補足グループにおいて、ＣＤ２１＋細胞（Ｂ細胞）の数の低下があった。これは、グルタミン−またはＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン補足グループにおいて検出されなかった。さらには、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン補足グループは（グルタミン−補足グループではなく）、カゼイン塩補足グループとは有意に異なっていた。
【０１４０】
要約すれば、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン補足グループは、グルタミン−またはカゼイン塩補足グループよりも良好に機能し、このことは統計的有意差を示すが、特に総細胞数およびＢおよびＴヘルパー部分集団において、栄養不良によって促進された小腸免疫変化を減少させた。
【０１４１】
組織学的結果
健康なブタおよび栄養不良ブタからの空腸エンテロサイトの透過型電子顕微鏡写真が、図７に示されている。対照ブタ（Ａ、Ｂパネル）において、空腸エンテロサイトは、規則的微絨毛、狭い細胞間空間、規則的な核、および高レベルのムチンを含有する杯細胞を示した。カゼイン塩が補足されたエンシュアプラス調合物を消費した栄養不良ブタの腸粘膜（Ｃ、Ｄパネル）は、重症の萎縮および微絨毛の損失、細胞間空間の開き、不規則な核、および多小胞体を有する透明な細胞質ゾーンを示した。細胞落屑および物質の腸内腔中への押し出しも、このグループにおいて明白であった。栄養不良期間の間、グルタミンが補足されたエンシュアプラスで給餌されたブタの空腸粘膜（Ｅ、Ｆパネル）は、短縮された微絨毛、拡大した細胞間空間、および不規則な小葉核を示した。豊富な上皮内リンパ球浸潤も、栄養不良のグルタミンブタの空腸粘膜に見られた。ＮＡＱが補足されたエンシュアプラス調合物を消費したブタの空腸粘膜（Ｇ、Ｈパネル）は、タンパク質−エネルギー栄養不良によってあまり影響されなかった。このグループにおいて、空腸エンテロサイトは、対照ブタの空腸エンテロサイトに近い微絨毛サイズ、核形状、および細胞間空間を示した。上皮内リンパ球浸潤は、栄養不良のカゼイン塩およびグルタミングループと比較して、栄養不良のＮＡＱグループの空腸粘膜中では少なかった。図８は、健康なブタおよび栄養不良ブタからの回腸エンテロサイトの透過型電子顕微鏡写真を示している。対照ブタ（Ａ、Ｂパネル）において、回腸エンテロサイトは、規則的に分配された微絨毛、可視膨張がない細胞間空間、均質かつ濃密な細胞質、および多量の分泌顆粒を有する杯細胞を示した。カゼイン塩が補足されたエンシュアプラス調合物を消費した栄養不良ブタの回腸粘膜（Ｃ、Ｄパネル）は、微絨毛の損失、いくつかの細胞間空間の膨張、多小胞体を有する透明な細胞質ゾーン、および放出プロセス中の細胞を示した。このグループにおいて、幅広いリンパ球の浸潤も、回腸上皮において明白であった。栄養不良期間中に、グルタミンが補足されたエンシュアプラス調合物で給餌されたブタの回腸粘膜（Ｅ、Ｆパネル）は、微絨毛の損失、広い細胞間空間、および強いリンパ球浸潤を示した。空腸粘膜の場合と同様、ＮＡＱが補足されたエンシュアプラス調合物を消費したブタの回腸粘膜（Ｇ、Ｈパネル）は、タンパク質−エネルギー栄養不良によってあまり影響を受けなかった。これは、頂点微絨毛の低い変化、可視膨張をともなわない細胞間空間、腸上皮の頂点部分における少ないリンパ球浸潤、および高い量の分泌顆粒を有する豊富な杯細胞を示した。
【０１４２】
結論
正常な生理条件下、酸素由来フリーラジカルの生成と、細胞酸化防止系によるこれらの破壊との間に定常状態バランスがある。本調査において、腸バランスは、タンパク質−エネルギー栄養不良によって覆され、還元グルタチオンおよび酵素酸化防止防御系における減少を生じた。さらには腸免疫応答は、タンパク質−エネルギー栄養不良によってひどく損なわれた。
【０１４３】
おそらくは栄養不良が特に重症であるという事実によって、小腸の栄養不良によって誘発された生化学的および免疫学的変化の予防に対するグルタミンの明白な効果は検出されなかったが、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンがこれらの変化の重症度を低下させるプラスの効果があった。
【０１４４】
この調査は、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンが、小腸の細胞に対してプラスの効果を有し、グルタミンの効果以上でさえあることを示唆している。さらには図７および図８に示されている、健康なブタおよび栄養不良ブタからのエンテロサイト細胞質の透過型電子顕微鏡写真は、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンが、胃腸管の上皮裏層における炎症の明白な徴候の予防においてグルタミンよりも効果的であることを示している。
【実施例５】
【０１４５】
未治療小児脂肪便症患者の器官培養物を用いた、小児脂肪便症の環境におけるグルタミン強化調製物の毒性のテスト
この調査の目的は、小児脂肪便症において粘膜変性を誘発することが知られている、グルテンのペプシン−トリプシン調製物を用いて、グルテンフリーグルタミン強化製品のいくつかの潜在的毒性を評価することであった。グルテンに由来しない、グルタミンリッチであるかまたはグルタミン変性製品もまた、これらの後者の製品が、小児脂肪便症患者の粘膜に損傷を誘発しえたかどうかを評価するために調査された。
【０１４６】
この調査は、ブラインド方法で実施された。この調査のために、小児脂肪便症におけるグルテン毒性および粘膜損傷を調査するために広く用いられ、正当であることが確認されている、小児脂肪便症の器官培養モデルを利用した。この計画の目的のために、未治療小児脂肪便症患者の小腸生検的断片を用いた。未治療小児脂肪便症患者の生検は、上皮アポトーシスの誘発および粘膜炎症の増加を包含する粘膜損傷の側面を監視するのに理想的である。
【０１４７】
潜在的未治療小児脂肪便症患者として診断された１２人の成人患者を登録した。これらの患者の病気は、臨床的症状、高タイターの抗組織トランスグルタミナーゼの存在、および小腸生検の組織分析によって確認された。
【０１４８】
器官培養エンドポイントの説明
器官培養は、Ｍａｉｕｒｉ，Ｌら、胃腸病学（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）、１１０、１３６８−１３７８（１９９６年）に記載されている標準的方法を用いて実施した。簡単に言えば、小さい生検断片（約１ｍｍ×１ｍｍ）を、ステンレス鋼メッシュに載せ、２４時間の間、異なる化合物が補足された培地中で培養した。小児脂肪便症患者および生検の試験管内抗原投与（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に関わる調査に用いられた、標準的な正の対照および負の対照を利用した。正の対照は、１ｍｇ／ｍｌのグリアジンペプシン−トリプシン消化液（ｄｉｇｅｓｔ）であった。負の対照は、培地単独であった。テストされるすべての化合物は、４０μｇ／ｍｌの最終濃度で用いた。テストされた化合物／生成物は、Ｎ−アラニル−グルタミン；Ｎ−アセチル−グルタミン；フロリダ州ボカレイトンのニュートリシア（Ｎｕｔｒｉｃｉａ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ）からのストレソン（Ｓｔｒｅｓｓｏｎ）（登録商標）（Ｐ１）；英国チェシャー、ランコーンのフレセニウス・カビ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｋａｂｉ，Ｒｕｎｃｏｒｎ，Ｃｈｅｓｈｉｒｅ）からのレコンヴァン（Ｒｅｃｏｎｖａｎ）（登録商標）（Ｐ２）；ペンシルベニア州ベツレヘムのＢ．ブラウン（Ｂ．Ｂｒａｕｎ，Ｂｅｔｈｌｅｈａｍ）からのニュートリコンプ・イミュン（Ｎｕｔｒｉｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎ（登録商標）（Ｐ３）；ミネソタ州プリマスのホーメル・ヘルス・ラブス（Ｈｏｒｍｅｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｌａｂｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ）からのグルタソーブ（Ｇｌｕｔａｓｏｒｂ）（登録商標）（Ｐ４）；ニューヨーク州ホワイトプレインズのノバルティス（Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｗｈｉｔｅ  Ｐｌａｉｎｓ）からのインパクト（登録商標）（Ｐ５）；オハイオ州コロンバスのロス・プロダクツ（Ｒｏｓｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ）からのオプティメンタル（Ｏｐｔｉｍｅｎｔａｌ）（登録商標）プラスＮＡＱ（Ｐ６）；オハイオ州コロンバスのロス・プロダクツからのオプティメンタル（登録商標）プラス加水分解コムギグルテン（Ｐ７）であった。２４時間後、これらの培養を停止し、生検断片を配向させ、Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物（米国インディアナ州エルクハートのティシューテック、マイルズ・ラボラトリーズ（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ，Ｍｉｌｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｅｌｋｈａｒｔ））中に埋め込み、液体窒素中に冷却されたイソペンタン中に急激冷却（ｓｎａｐ  ｆｒｏｚｅｎ）し、低温切片化（ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ）まで−７０℃で貯蔵した。ついでクリオスタットを用いて、５ミクロン切片を調製した。
【０１４９】
免疫組織化学
この調査のために、次のマーカーを用いた：すなわち上皮アポトーシスを監視するためのＴＵＮＥＬ、および上皮下炎症の監視のためのＣＤ２５である。次の試薬を、次の手順とともに用いた。
【０１５０】
ＤＮＡ断片化の検出
組織切片のＤＮＡ断片化を、Ｍａｉｕｒｉ，Ｌ．らの「ＤＮＡ断片化は、不適切なアポトーシスを有する病気である嚢胞性線維症上皮細胞の特徴であるか？（ＤＮＡ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｉｏｎ  ｉｓ  ａ  Ｆｅａｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｉｎａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ？）」、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ  ４０８、２２５−３１（１９９７年）、およびＭａｉｕｒｉ，Ｌ．ら、「ＦＡＳ結合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）は、小児脂肪便症患者のエンテロサイトのアポトーシスを駆動する（ＦＡＳ  Ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  Ｄｒｉｖｅｓ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｉａｃ  Ｐａｔｅｎｔｓ）」、Ｇｕｔ  ４８，４１８−２４（２００１年）に記載されているように、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）−媒介ｄＵＴＰ−ジゴキシゲニンニックエンド標識（ＴＵＮＥＬ）によってアッセイした。
【０１５１】
ＣＤ２５＋細胞の検出
冷凍組織切片に対する抗原検出を、Ｍａｉｕｒｉ，Ｌ．らの「Ｔ細胞共刺激の遮断は、小児脂肪便症においてＴ細胞作用を阻害する（Ｂｌｏｃｋａｇｅ  ｏｆ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｉａｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１５、５６４−７２（１９９８年）に記載されているように、同じ参考文献に既に記載されている方法によるアルカリホスファターゼ染色技術によって、ｍＡｂｓ抗−ＣＤ２５（ダコ（Ｄａｃｏ）１：３０）を用いて、免疫組織化学によって実施した。各サンプルについて少なくとも５つのスライドを、ブラインド評価した。特異性対照実験を、不適切な血液型抗原に対するマウスＩｇＧまたはＩｇＭを用い、同時に同じ個人に属する異なる培養サンプルを分析して実施した。
【０１５２】
形態計測分析
ＴＵＮＥＬ＋エンテロサイトの総数は、エンテロサイトのパーセンテージとして言及された。固有層中のＣＤ２５＋細胞の総数は、１ｍｍ２の比較基準面積内で決定された。これらの計数は、粘膜筋肉層（ｍｕｓｃｏｌａｒｉｓ  ｍｕｃｏｓａｅ）に平行に整列された、校正された目盛り付き接眼レンズを有する顕微鏡で実施され、２人の観察者によって独立して分析された。これらの結果を、その後比較した。
【０１５３】
結果
図９に示されているように、これらの化合物は、上皮下区画におけるＴＵＮＥＬおよびＣＤ２５上方調節（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）によって規定されるような、異なるパターンの上皮損傷を誘発した。いくつかの調製物は、上皮下区画におけるＣＤ２５発現の強い増加、ならびに上皮アポトーシスの誘発の両方を誘発した。従ってこれらの化合物は、ポジティブコントロールとして挙動した（１ｍｇ／ｍｌで用いられたペプシン−トリプシングルテン調製物）。ほかの化合物は、上皮アポトーシス、または上皮下区画におけるＣＤ２５の誘発のいくつかの選択的修正を誘発した。ほかのものは、培地単独（負の対照）に暴露されただけの培養物中に観察されたアポトーシスまたはＣＤ２５誘発のパターンと異なっていなかった。図１０において、ａおよびｂは、化合物Ｎ−アセチル−グルタミン、またはグルタミン（ｐ５）を含有する製品インパクトを用いた、上皮アポトーシスの誘発例を示している。図１１ａおよびｂは、同じ化合物によるＣＤ２５誘発のパターンを記載している。
【０１５４】
結論
この調査の成果は、テストされた化合物の多くが、未治療小児脂肪便症の小腸中に有意な変更を生じたことを示している。上皮アポトーシスを誘発することができ、かつ上皮下炎症を増加させえたものもあり、一方、粘膜炎症の誘発においてより効果的なものもあった。これらのマーカーの両方または１つを誘発した化合物は、小児脂肪便症患者の粘膜に対して毒性があると考えられる。これらの化合物のいくつか、特に化合物Ｎ−アセチル−グルタミンは、何の効果も誘発しなかった。この化合物はまた、未治療小児脂肪便症の生検に対して明白な栄養効果を有していた。この栄養効果は、その他のサンプルと比較して、有意に改良された、粘膜、特に上皮の一般的改善によって規定された。
【０１５５】
この調査は、テストされた化合物の大部分が、未治療小児脂肪便症患者の粘膜中に実質的な変化を生じるという明白な指摘を与える。予期せぬことではあるが、最も興味深いことは、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミンの栄養活性の側面である。まず第一の例として、この物質は、培地単独と比較した場合でさえ、粘膜の全体的な状態を改善するように見える。
【０１５６】
特許請求の範囲に示されている本発明の範囲内に入る特別な実施態様が、上に記載されている。これらの実施態様は、本発明の範囲を、開示されている特別な形態に限定するものではない。本発明は、本発明の精神および範囲内に入るすべての修正例および代替形態をカバーするものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】図１は、様々なｐＨ値および周囲温度におけるＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンの水性安定性をグラフ形態で示している。ｐＨ５．０からｐＨ８．０サンプルについてのすべての値は同じであった。
【図２】図２は、ｐＨ２．０から８．０の水性Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン溶液中に形成された分解生成物であって、これらの溶液が１８０日間室温に保持された時のものをグラフ形態で示している。
【図３】図３は、本明細書に記載されている外科手術内（Ｉｎｔｒａ−Ｓｕｒｇｅｒｙ）実験の間の、単離されたブタの腸係蹄への物質の導入後、時間の関数としての、腸内腔中に残留する添加されたグルタミンまたはＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンの量を、グラフ形態で示している。残留する検体は、ゼロ時点で存在する検体のパーセンテージとして表示される。
【図４】図４は、上記のような外科手術内実験の間の単離されたブタの腸係蹄への物質の導入後、時間の関数としての、腸内腔中に残留する添加されたグルコースの量を、グラフ形態で示している。残留するグルコースは、ゼロ時点で存在する量のパーセンテージとして表示される。
【図５】図５は、様々な物質（グルコサリン対照、グルコサリン中のグルタミン、またはグルコサリン中のＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン）が、単離された腸係蹄へ導入された、ブタの門脈血中のグルタミンの量（ｍｃｇ／ｍＬ）を、投与後の時間に対してグラフ形態で示している。
【図６】図６は、本明細書に記載されている外科手術内実験後に測定された、ブタの腸の空腸粘膜中のグルタミンおよびグルタメートの量（ｍｃｇ／グラム湿潤粘膜で表示された）をグラフ形態で示している。
【図７】図７は、３０日間エンシュアプラス調合物が給餌された健康なブタ（Ａ、Ｂパネル）、およびカゼイン塩（Ｃ、Ｄパネル）、グルタミン（Ｅ、Ｆパネル）、またはＮＡＱ（Ｇ、Ｈパネル）が補足された同じ調合物が給餌された、タンパク質−エネルギー栄養不良ブタからの空腸エンテロサイトであって、炎症の徴候、例えば透明な細胞質空間およびリンパ球浸潤について分析されたものの透過型電子顕微鏡写真を示す。
【図８】図８は、３０日間エンシュアプラス調合物が給餌された健康なブタ（Ａ、Ｂパネル）、およびカゼイン塩（Ｃ、Ｄパネル）、グルタミン（Ｅ、Ｆパネル）、またはＮＡＱ（Ｇ、Ｈパネル）が補足された同じ調合物が給餌されたタンパク質−エネルギー栄養不良ブタからの回腸エンテロサイトであって、炎症の徴候、例えば透明な細胞質空間およびリンパ球浸潤について分析されたものの透過型電子顕微鏡写真を示す。
【図９】図９は、未治療小児脂肪便症患者の粘膜上のアポトーシスおよび炎症の発生に対する、様々な物質／化合物の効果を示す。
【図１０】図１０は、Ｎ−アセチルグルタミン（Ａ）およびＰ５（Ｂ）で処理された粘膜サンプル中の上皮ＴＵＮＥＬ発現のパターンを示す。
【図１１】図１１は、Ｎ−アセチルグルタミン（Ａ）およびＰ５（Ｂ）で処理された粘膜サンプル中の上皮下区画におけるＣＤ２５発現のパターンを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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2006515832.tif 000021
2006515832.tif 000022
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