(57)【要約】本発明はヘモグロビン測定方法に関し、この方法は未希釈全血のサンプルを、サンプルを受容するための少なくとも一つのキャビティを有する使い捨てマイクロキュベットの中に、毛管作用によって導入する工程を含む。キャビティは本質的に非吸湿性の溶血剤を乾燥形態で含んでおり、溶血剤は血液によって溶解され、赤血球を溶血させ、そして血球中に含有されていたヘモグロビンを解放する。それから、４９０〜５２０ｎｍの波長範囲における第一吸収測定を直接にマイクロキュベット中のサンプルに対して行い、そして背景干渉を補償するために第二吸収測定を行う。
2004502167.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
未希釈全血中のヘモグロビン量測定方法であって、
未希釈全血のサンプルを、サンプル受容するための少なくとも一つのキャビティを有する使い捨てマイクロキュベットの中に、毛管作用によって導入し、キャビティは本質的に非吸湿性の溶血剤を乾燥形態で含んでおり、それによって、溶血剤が溶解され赤血球を溶血させ血球中に含有されていたヘモグロビンを解放し；
第一吸収測定を４９０〜５２０ｎｍの波長範囲において直接にキュベット中の溶血サンプルに対して行い、そして
さらに、バックグランドの干渉を補償するための第二吸収測定を行う、
諸工程を含む前記方法。
【請求項２】
溶血剤が有機溶剤に可溶性である、請求項１の方法。
【請求項３】
有機溶剤がメタノールのようなアルコールである、請求項２の方法。
【請求項４】
溶血剤はすぐ使用できるマイクロキュベットの中に乾燥形態で存在するこの薬剤がキュベットの中への全血の迅速な導入を許すというような観点で選択される、請求項１〜３のいずれか一項の方法。
【請求項５】
マイクロキュベットの中への全血の導入時間は溶血剤を溶解するのに必要な時間より短い、請求項４の方法。
【請求項６】
溶血剤がイオン性および非イオン性の界面活性物質からなる群から選ばれる、請求項１〜５のいずれか一項の方法。
【請求項７】
溶血剤がデオキシコール酸の塩および第四アンモニウム塩からなる群から選ばれる、請求項１〜６のいずれか一項の方法。
【請求項８】
溶血剤がデオキシコール酸ナトリウム、デオキシコール酸カリウム、デオキシコール酸カルシウム、デオキシコール酸モルホリン、デオキシコール酸シクロヘキシルアンモニウム、およびデオキシコール酸アンモニウムまたはそれらの混合物からなる群から選ばれる、請求項１〜７のいずれか一項の方法。
【請求項９】
溶血剤が本質的にデオキシコール酸ナトリウムとデオキシコール酸アンモニウムの混合物からなる、請求項１〜８のいずれか一項の方法。
【請求項１０】
デオキシコール酸アンモニウムの量が２０〜８０重量％である、請求項９の方法。
【請求項１１】
第一吸収測定が４９０〜５２０ｎｍ、好ましくは５００〜５１０ｎｍ、の範囲内で行われる、請求項１〜１０のいずれか一項の方法。
【請求項１２】
第二吸収測定が８５０〜９１０ｎｍ、好ましくは８６０〜９００ｎｍ、の範囲内で行われる、請求項１〜１１のいずれか一項の方法。
【請求項１３】
未希釈全血中のヘモグロビンを分光光度測定するための使い捨てマイクロキュベットであって、キャビティが本質的にアジ化物と亜硝酸塩を含まないことを条件にキャビティが乾燥した非吸湿性の溶血剤またはその組合せを含んでいることを特徴とする前記マイクロキュベット。
【請求項１４】
溶血剤が請求項２〜１０のいずれか一項に定義されている通りである、請求項１３のマイクロキュベット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は分析方法およびこの分析を行うためのキュベット（ｃｕｖｅｔｔｅ）に関する。特に、本発明は未希釈全血の中のヘモグロビンを測定する方法およびこの測定に使用できる使い捨てキュベットに関する。
【０００２】
背景技術
流体をサンプリングし、サンプルを試薬と混合し、そして試薬と混合されたサンプルの光学分析を直接に行うための使い捨てキュベットは以前から米国特許第４，０８８，４４８号から知られている。この既知キュベットは幾つかの利点を有する、すなわち、それはサンプリングを簡単にし、用具の数を減らし、かつ分析を行うオペレーターの操作技術から分析の手続を独立させることによって、分析の正確さをかなり改良する。同じ原理に基づく改良されたフロー特性を有するキュベット構造は米国特許第５ ６７４ ４５７号に開示されている。
【０００３】
これら特許に従って開発された使い捨てキュベットは未希釈全血のヘモグロビン測定（Ｈｂ測定）用に現在では広く使用されている。この目的のために、キュベットキャビティは試薬によって予め処理されているので、血液サンプルがキュベットの中へ吸い込まれると、赤血球の壁が崩壊されそして化学反応が開始される。反応の結果は光学ウィンドウとも呼ばれる測定ゾーンに互いに対向する平坦壁の内面間の予め定められた正確に規定された距離を有しているキュベットの透明壁を介して直接に吸収測定によるＨｂ測定を可能にする。測定方法はＶａｎｚｅｔｔｉ， Ｇ．， Ａｍ． Ｊ． Ｌａｂ． ＆ Ｃｌｉｎ． Ｍｅｄ． ６７， １１６ （１９６６）による変形アジドメトヘモグロビン法に基づいている。
【０００４】
分光光度測定は５７０と８８０ｎｍで行われている。乾式化学に基づいたこの定量法は、Ｈｂを測定するための標準化された湿式法によって得られた結果に比べて同等以上の結果を与え、例えばＣｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ ３２， Ｎｏ ３， １９８６におけるｖｏｎ Ｓｃｈｅｎｃｋ他による記事の中に見出せる通りかなりの成功をみている。使用される試薬は赤血球を溶血させるデオキシコール酸ナトリウムと、アジ化ナトリウムと亜硝酸ナトリウムとから構成されており、それはヘモグロビンをアジドヘモグロビンに転化させる。
【０００５】
使用される試薬の吸湿性のせいで、貯蔵寿命は制限され、そして乾燥剤を含む密封包装内でのキュベットの貯蔵が要求される。更なる問題は高湿の気候ではキュベットを包装から取り出した後数分以内に使用しなければならず、さもないと試薬が破壊されて測定が不正確になり従って役にたたないものになるという事実である。
【０００６】
発明の目的
本発明の目的は全血中のヘモグロビンを測定するための迅速な定量方法を提供することである。
【０００７】
第二の目的は使い捨てマイクロキュベットの中で遂行されてもよい全血中ヘモグロビン測定方法を提供することである。
【０００８】
第三の目的は試薬の吸湿性から生じる問題が解消されている未希釈全血中ヘモグロビン測定用マイクロキュベットを提供することである。
【０００９】
他の目的は以下の記述および図面から明らかになろう。
【００１０】
発明の概要
本発明によれば、かかるヘモグロビン測定を提供する方法は、未希釈全血のサンプルを、サンプルを受容するための少なくとも一つのキャビティを有する使い捨てマイクロキュベットの中に、毛管作用（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ａｃｔｉｏｎ）によって導入する工程を含む。キャビティは乾燥した本質的に非吸湿性の溶血剤を含んでおり、溶血剤は血液によって溶解され、赤血球を溶血させ、そして血球中に含有されていたヘモグロビンを解放する。次いで、波長範囲４９０〜５２０ｎｍでの第一吸収測定が直接にマイクロキュベット中のサンプルに対して行われ、そして第二吸収測定がバックグランドの干渉を補償するために遂行される。
【００１１】
従って、ヘモグロビン量測定が予想外にも上記の化学試薬アジ化ナトリウムと亜硝酸ナトリウムを用いずに遂行できるということが判明した。より詳しくは、適切な溶血剤またはそれらの混合物が選ばれることを条件に定量測定は直接に溶血血液に対して遂行できるということが判明した。
【００１２】
従って、本発明によれば、吸湿性試薬を省略できるということが判明した。さらに、分析測定を得るための時間が削減されることが判明した。分析はたとえば病院や血液銀行では大量に行われるので、時間的側面は重要である。
【００１３】
発明の詳細
本発明に従って使用される使い捨てマイクロキュベットは本願明細書の中に組み入れられる米国特許第４ ０８８ ４４８号または好ましくは米国特許第５ ６７４ ４５７号に開示されたタイプのものであってもよい。それはキャビティに面して２つの平坦なまたは湾曲した表面が互いから予め定められた距離で配置されている従って予め定められた光路長（ｏｐｔｉｃａｌ ｐａｔｈ ｌｅｎｇｔｈ）を規定しているところの光学ウィンドウ（測定ゾーン）をもつ少なくとも一つのキャビティを含む統一された本体部材として規定されてもよい。測定ゾーンを規定しているこの表面間距離はヘモグロビン測定に適する光路長の提供には臨界的なパラメーターであり、そして好ましい態様においては、この距離は０．０５〜０．２ｍｍである。キャビティの残りの内面間距離は好ましくは０．１〜２ｍｍのオーダーであり、それは本体部材の外部と連絡しているキャビティ入口から毛管力（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｆｏｒｃｅ）によってサンプルがキャビティの中へ入るのを許すのに有効である。また、キャビティは約２５μＬ未満の予め定められた固定容積を有する。乾燥溶血剤がキャビティ表面に塗布されている。溶血剤は好ましくは溶血反応に必要な量より過剰に存在する。他の添加剤は本発明の方法による測定には必要ない。
【００１４】
本発明によるキュベットは必要な厳格な許容差レベルの形成を可能にするいずれか適する材料によって形成されてもよい。好ましくは、キュベットは透明な高分子材料の射出成形によって製造される。
【００１５】
本発明の臨界的特徴は溶血剤である。特に、この薬剤は本質的に非吸湿性で且つ水またはより厳密には未希釈全血の中に易溶性であるべきである。さらに、方法が再現可能な結果を与えることは重要であるので、好ましくは、この薬剤は十分に規定された化学的構造を有すべきである。溶血剤は後で好ましくは熱を使用することによって注意深く乾燥される溶液としてキュベットキャビティの中へ好ましく導入されるので、溶血剤は溶血剤を破壊せず且つ低温で容易に蒸発できる有機溶剤の中に易溶性であるということも適している。従って、溶血剤がメタノールのようなアルコールの中に易溶性であるべきであるということは好ましい。
【００１６】
溶血剤を選択するときのもう一つの重要な側面は直ぐ使用できるマイクロキュベットの中に存在する乾燥形態でのこの薬剤がキュベットの中への全血の急速かつ一様な導入を可能にするということである。特に、マイクロキュベットの中へ全血を導入するための時間はこの血がマイクロキュベットの中の溶血剤を溶解するのに要する時間よりも短くすべきである。
【００１７】
溶血剤の特に好ましい群は溶血特性を有するイオン性および非イオン性の界面活性物質である。かかる物質の例は、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ベンズアルコニウムクロリド、セチルピリジウムクロリドおよびその他の第四アンモニウム塩からなる、アルキルトリエチルアンモニウム塩、アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩およびアルキルピリジウム塩からなる群から選ばれた第四アンモニウム塩、ラウリル硫酸ナトリウム、およびデオキシコール酸の塩である。本発明に従って使用されるべき特に適する溶血剤はデオキシコール酸ナトリウム、デオキシコール酸カリウム、デオキシコール酸カルシウム、デオキシコール酸モルホリン、デオキシコール酸シクロヘキシルアンモニウムおよびデオキシコール酸アンモニウムまたはそれらの組合せである。ヘモグロビンの定量的かつ迅速な測定を提供する要件を満たす現時点で最も好ましい溶血剤はデオキシコール酸ナトリウムとデオキシコール酸アンモニウムの組合せである。デオキシコール酸アンモニウムの量は好ましくは、この組合せの２０〜８０重量％である。
【００１８】
本発明を生じる実験中に、次のことが判明した： 血液を溶血させるための薬剤の多分最も普遍的に使用されてきた群、すなわち、植物に中に広く分布されている天然産物であって様々な化学構造の混合物であるサポニン類、は本発明の方法では再現できる結果を与えない。サポニン類は非常に低濃度でさえ強力な溶血剤である。
【００１９】
本発明の臨界的特徴およびマイクロキュベットでＨｂを測定するための既知の現在商業的に使用されている方法と比較しての重大な差異は吸収測定が別の波長で行われなければならないということでもある。従って、吸収測定は４９０〜５２０ｎｍ、好ましくは５００〜５１０ｎｍ、の範囲内で実施されるべきであるということが判明した。第二の補償吸収測定は８５０〜９１０ｎｍ、好ましくは８６０〜９００ｎｍ、の範囲内で好ましく遂行される。
【００２０】
これら波長における血液の測定のための測定法は米国特許第５ ０６４ ２８２号に開示されている。この特許によれば、測定はサポニンによって前もって溶血された血液を含有する再使用可能なキュベットで行われている。特に、この方法はガラススライド上に１滴の血液を置き、サポニンをその上につけた棒で血液を半透明になるまで攪拌し、そして溶血血液をキュベットの中に導入することを伴う。
【００２１】
本発明によるメトヘモグロビンの存在による測定障害の可能性に関しては、かかる障害が非常に稀な先天性酵素異常を有する患者に起こったり、正常ヘモグロビンのいくつかの稀な変異体に起こったり、および特定の薬物や化学物質たとえばフェナセチン、硝酸塩類、キノン類、塩素酸塩に曝露された後に起こったりするであろうということは認められる。これら事例における血中には多分１０〜２０％もの高いメトヘモグロビンが存在するであろうが、それらが起こるときには、アジ化物法すなわち広くマイクロキュベットで使用される方法、またはヘモグロビンシアン化物法（参照ＩＣＳＨ法）を代わりに使用する必要があることは客観的に十分明白であろう。この関連では、この問題はあるとしてもそれは伝統的かつ普遍的に許容されているオキシヘモグロビン法をもってしても存在するということが付け加えられるべきである。また、ヘビースモーカーの高濃度カルボキシヘモグロビン、およびスルファヘモグロビンも障害の原因になるかも知れない。
【００２２】
これら測定を行うのに適する光度計は存在する光度計を適切なフィルターおよび発光ダイオードで改造することによって得てもよい。本発明の好ましい態様によれば、光度計は２つの波長における吸収を測定し、そして内臓マイクロプロセッサーはプログラムされたアルゴリズムに従って血中ヘモグロビンの総濃度を算出する。
【００２３】
次の非限定的な実施例は本発明の方法を例証する。
【００２４】
デオキシコール酸ナトリウムとアンモニウムの等量からなる溶血剤をメタノールの中に溶解し、そして上記構造を有する使い捨てマイクロキュベットの中に導入した。それから、メタノールを蒸発させた。
【００２５】
デオキシコール酸ナトリウムとアンモニウムの乾燥混合物だけを含有するマイクロキュベットで遂行された本発明と、デオキシコール酸ナトリウムばかりでなく亜硝酸ナトリウム／アジ化ナトリウム試薬を含有する既知の広く使用されているＨｅｍｏＣｕｅマイクロキュベットでのヘモグロビン測定方法との比較では、溶血に要した時間は本発明による好ましい溶血剤では約１５秒も短かったことが判明した。特に、マイクロキュベットの中に存在する乾燥溶血剤が溶血を起こさせる時間は４０秒未満であるべきである。これはヘモグロビン測定の全時間の２５％までの更なる減少を可能し、それは多忙な病院において及び測定が行われるであろうその他状況において有益であろう。
【００２６】
湿度に関しての安定性に関する対応比較において、上記のデオキシコール酸塩混合物を含有するマイクロキュベットの安定性は４５℃および相対湿度８０％の空気中で２４時間であったことが判明し、それは同じ条件下での市販のＨｅｍｏＣｕｅマイクロキュベットでの約２秒と比較されるべきである。
【００２７】
この溶血性混合物を用いた（そして他の化学薬品を全く用いない）新規方法の、基準ＩＣＳＨ法との比較における評価が図１に開示されている。評価は実験室条件下で行われた。理解できる通り、方法間の一致は非常によい。
【００２８】
分光光度吸収測定は既知方法では約５７０ｎｍで、そして新規方法では約５０５ｎｍで行われた。両方法とも、補償測定は８８０ｎｍで行われた。
【００２９】
以上、本発明の或る好ましい態様を記述したが、本発明をいかなる仕方でも限定することは意図されていない。むしろ、本発明の範囲内で、多数の修飾、変形および細部変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】
基準ＩＣＳＨ法との比較における本発明の方法の溶血評価を示すグラフである。
【図１】
2004502167.tif 000003
【国際公開パンフレット】
2004502167.tif 000004
2004502167.tif 000005
2004502167.tif 000006
2004502167.tif 000007
2004502167.tif 000008
2004502167.tif 000009
2004502167.tif 000010
2004502167.tif 000011
2004502167.tif 000012
2004502167.tif 000013
2004502167.tif 000014
2004502167.tif 000015
2004502167.tif 000016
【国際調査報告】
2004502167.tif 000017
2004502167.tif 000018
2004502167.tif 000019
2004502167.tif 000020