(57)【要約】本発明は、野生型ＨＢｓＡｇ抗原および少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、有利には３つ以上のＨＢｓＡｇ抗原の突然変異体型に結合可能なモノクローナル抗体に関し、このモノクローナル抗体は、ＨＢｓＡｇ抗原の１９９〜２０８領域中の少なくとも６個の隣接するアミノ酸からなるペプチド配列に結合し、有利にはＨＢｓＡｇ抗原の１９９〜２０８領域によって形成されるペプチド配列と結合する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型ＨＢｓＡｇ抗原および少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、有利には３つ以上のＨＢｓＡｇ抗原の突然変異体型に結合可能なモノクローナル抗体であって、前記モノクローナル抗体が、ＨＢｓＡｇ抗原の１９９〜２０８領域中の少なくとも６個の連続するアミノ酸からなるペプチド配列に結合し、有利にはＨＢｓＡｇ抗原の１９９〜２０８領域により構成されるペプチド配列に結合する、モノクローナル抗体。
【請求項２】
ＨＢｓＡｇ抗原の「ａ」決定基中に少なくとも１個のアミノ酸置換を含むＨＢｓＡｇ抗原の突然変異体型の少なくとも１つに結合可能な、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
ＨＢｓＡｇ抗原の「ａ」決定基中の１２７、１３３、１３４、１４２、１４３、１４４または１４５位における少なくとも１個のアミノ酸置換、および場合によりＨＢｓＡｇ抗原の１００、１１８、１２０、１２２位における少なくとも１個の他のアミノ酸置換を含むＨＢｓＡｇ抗原の突然変異体型の少なくとも１つに結合可能な、請求項２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
ＨＢｓＡｇ抗原の１４３位におけるセリンのロイシンによる置換えに相当する少なくとも１個の置換を含むＨＢｓＡｇ抗原の突然変異体型に結合可能な、請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
ＨＢｓＡｇ抗原の１４４位におけるアスパラギン酸のアラニンによる置換えに相当する少なくとも１個の置換を含むＨＢｓＡｇ抗原の突然変異体型に結合可能な、請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
ＨＢｓＡｇ抗原の１４５位におけるグリシンのアルギニンによる置換えに相当する少なくとも１個の置換を含むＨＢｓＡｇ抗原の突然変異体型に結合可能な、請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
ＨＢｓＡｇ抗原の１２７位におけるプロリンのアラニンによる置換えに相当する少なくとも１個の置換およびＨＢｓＡｇ抗原の１４３位におけるセリンのロイシンによる置換えに相当する少なくとも１個の置換を含むＨＢｓＡｇ抗原の突然変異体型に結合可能な、請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
ＨＢｓＡｇ抗原の１２０位におけるプロリンのセリンによる置換えに相当する少なくとも１個の置換およびＨＢｓＡｇ抗原の１４３位におけるセリンのロイシンによる置換えに相当する少なくとも１個の置換を含むＨＢｓＡｇ抗原の突然変異体型に結合可能な、請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
ＨＢｓＡｇ抗原の１００位におけるチロシンのセリンによる置換えに相当する置換、ＨＢｓＡｇ抗原の１１８位におけるトレオニンのバリンによる置換えに相当する置換、ＨＢｓＡｇ抗原の１２２位におけるアルギニンのリシンによる置換えに相当する置換、ＨＢｓＡｇ抗原の１３３位におけるメチオニンのイソロイシンによる置換えに相当する置換、ＨＢｓＡｇ抗原の１３４位におけるチロシンのアスパラギンによる置換えに相当する置換、ＨＢｓＡｇ抗原の１４２位におけるプロリンのセリンによる置換えに相当する置換、ＨＢｓＡｇ抗原の１４３位におけるセリンのロイシンによる置換えに相当する置換およびＨＢｓＡｇ抗原の１４５位におけるグリシンのリシンによる置換えに相当する置換を含むＨＢｓＡｇ抗原の突然変異体型に結合可能な、請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
野生型ＨＢｓＡｇ抗原およびＨＢｓＡｇ抗原の１２７、１３３、１３４、１４２、１４３、１４４および１４５位のアミノ酸をコードする１つ以上のコドンのレベルで点突然変異を有する配列によってコードされる「ａ」決定基を保持する突然変異ＨＢｓＡｇの少なくとも１つに結合可能なモノクローナル抗体であって、前記モノクローナル抗体が、ＨＢｓＡｇ抗原の１９９〜２０８領域またはエピトープに結合するモノクローナル抗体。
【請求項１１】
モノクローナル抗体が、イムノグロブリンのクラスＧに属することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１２】
モノクローナル抗体が、２Ｇ２Ｇ１０または８Ｂ４Ｈ７モノクローナル抗体からなることを特徴とする、請求項１１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１３】
ヒト化された形態である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体のフラグメントまたは誘導体。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を産生しうるハイブリドーマの製造方法であって、
哺乳動物、好ましくはネズミ動物を、場合によりフラグメントもしくは適当な抗原性誘導体の形態の野生型ＨＢｓＡｇ抗原またはＨＢｓＡｇ抗原の突然変異体型で免疫化すること、
ハイブリドーマを形成するために抗体産生細胞を不死化させること、
場合によりフラグメントまたは適当な抗原性誘導体の形態の野生型ＨＢｓＡｇ抗原および請求項２〜１０のいずれか１項に記載の少なくとも１つの突然変異体型でハイブリドーマ培養物をスクリーニングすること、および
野生型ＨＢｓＡｇ抗原および請求項２〜１０のいずれか一項で定義した少なくとも１つの突然変異体型に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択すること
からなる製造方法。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を産生しうるハイブリドーマ。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体の製造方法であって、
請求項１６に記載のハイブリドーマまたは請求項１５に記載の方法によりインビボまたはインビトロで得られやすいハイブリドーマを培養すること、および
培養培地からモノクローナル抗体を回収すること
からなる製造方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法により得ることができるモノクローナル抗体。
【請求項１９】
検体中のＨＢｓＡｇ抗原の検出方法であって、請求項１〜１２または請求項１８のいずれか１項に記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体または請求項１４および請求項１３に記載のフラグメントもしくは誘導体と該検体とを接触させること、および
少なくとも１つの抗原／抗体、フラグメントまたは誘導体の複合体の存在を同定すること
からなる検出方法。
【請求項２０】
請求項１〜１２または請求項１８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、または請求項１４および請求項１３に記載のフラグメントもしくは誘導体、およびポリクローナルまたはモノクローナル抗ＨＢｓＡｇ抗体から選択される少なくとも１つの他の抗体と該検体を接触させることからなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
「サンドイッチ」法または「競合」法により実施される、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＨＢｓＡｇ抗原の検出を抗ＨＢｃ抗体の検出と同時に行う、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜１２または請求項１８のいずれか１項に記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体、または請求項１４および請求項１３に記載のフラグメントもしくは誘導体を、場合により抗ＨＢｃ抗体検出用の少なくとも１つの試薬と組合わせて含む、診断用組成物。
【請求項２４】
ＨＢｓＡｇ抗原の検出のための少なくとも１つの他のモノクローナルまたはポリクローナル抗体をさらに含む、請求項２３に記載の診断用組成物。
【請求項２５】
請求項１〜１２または請求項１８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、または請求項１４および請求項１３に記載のフラグメントもしくは誘導体、またはそれらの組合せを含む抗血清。
【請求項２６】
請求項１〜１２または請求項１８のいずれか１項記載のモノクローナル抗体または請求項１４および請求項１３に記載のフラグメントもしくは誘導体以外の、少なくとも１つのモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体または抗ＨＢｓＡｇモノクローナルおよびポリクローナル抗体の混合物をさらに含む、請求項２５に記載の抗血清。
【請求項２７】
ＨＢＶに対する受動免疫を目的とする治療または予防的使用のための適当な組成物であって、薬学的に許容されうる支持体との混合において、請求項１〜１２または請求項１８のいずれか１項記載のモノクローナル抗体または請求項１４および請求項１３に記載のフラグメントもしくは誘導体またはそれらの組合せを含む、組成物。
【請求項２８】
ＨＢＶに対する受動免疫を目的とする治療または予防的使用のための適当な組成物であって、請求項１〜１２または請求項１８のいずれか１項記載のモノクローナル抗体または請求項１４および請求項１３に記載のフラグメントもしくは誘導体以外の、少なくとも１つのモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体または抗ＨＢｓＡｇモノクローナルおよびポリクローナル抗体の混合物をさらに含む、組成物。
【請求項２９】
請求項１〜１２または請求項１８のいずれか１項記載のモノクローナル抗体または請求項１４および請求項１３に記載のフラグメントもしくは誘導体に対する抗イディオタイプ抗体。
【請求項３０】
ＨＢｓＡｇ抗原の１９９〜２０８領域を認識する抗−抗イディオタイプ抗体の産生を動物において誘導する請求項２９に記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体または前記抗イディオタイプ抗体のＦａｂフラグメントまたはそれらの混合物を含む生物学的に活性な組成物の動物をＨＢＶに対して免疫化させるために十分な量および薬学的に許容されうるアジュバントを含むワクチン組成物。
【請求項３１】
ペプチド配列が、ＨＢｓＡｇ抗原の１９９位のアミノ酸で始まり２０８位のアミノ酸で終わり、かつ配列番号１で示されるＨＢｓＡｇ抗原のエピトープ。
【請求項３２】
請求項３１に記載のエピトープを含むか、または前記エピトープからなる、免疫原性ペプチド。
【請求項３３】
ペプチド配列が、請求項３１に記載のエピトープのペプチド配列のアミノ酸に相同または同一な少なくとも３個のアミノ酸を含む、免疫原性ペプチド。
【請求項３４】
ペプチド配列が、配列番号２からなる、請求項３３に記載の免疫原性ペプチド。
【請求項３５】
ペプチド配列が、請求項３１に記載のエピトープのペプチド配列のアミノ酸に相同または同一な少なくとも４個のアミノ酸を含む、免疫原性ペプチド。
【請求項３６】
ペプチド配列が配列番号３の配列からなる、請求項３５に記載の免疫原性ペプチド。
【請求項３７】
請求項３２〜３６のいずれか１項に記載の免疫原性ペプチドを使用することにより、請求項１７に記載のモノクローナル抗体、モノクローナル抗体のフラグメントまたはモノクローナル抗体の誘導体を得る方法。
【請求項３８】
特定のストリンジェントな条件下で、請求項３１のエピトープをコードするＤＮＡヌクレオチド配列、請求項３１のエピトープをコードする前記ヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡヌクレオチド配列、または前記ＤＮＡヌクレオチド配列のＲＮＡ転写産物にハイブリダイズしうる、核酸プローブまたはプライマー。
【請求項３９】
特定のストリンジェントな条件下で、請求項３１のエピトープをコードする配列番号４で示されるＤＮＡヌクレオチド配列、配列番号４に相補的なＤＮＡヌクレオチド配列、または前記ＤＮＡヌクレオチド配列のＲＮＡ転写産物にハイブリダイズしうる、請求項３８に記載の核酸プローブまたはプライマー。
【請求項４０】
生物学的検体中のＨＢＶウイルスの検出および／または定量のための、請求項３８または請求項３９に記載の少なくとも１つのプローブまたは少なくとも１つのプライマーを含む、診断用組成物。
【請求項４１】
生物学的検体中のＨＢＶウイルスＤＮＡおよび／またはＲＮＡのインビトロ診断のための方法であって、血清、血漿または組織検体などの生物学的検体を少なくとも１つのＨＢＶウイルスの感染が疑われる患者から採取し、必要ならば前記検体を、それから上記ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを抽出するために処理し、前記検体を請求項３８に記載の少なくとも１つのプローブまたは少なくとも１つのプライマーと特定のストリンジェントな条件下で接触させ、前記ウイルスＤＮＡおよび／またはＲＮＡと少なくとも１つのプローブとのハイブリダイゼーションを確認すること、または前記ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの増幅により該検体中の該ウイルスＤＮＡおよび／またはＲＮＡを検出および／または定量する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
５つの型のウイルス性肝炎、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎は、現在かなりよく知られている。それぞれの場合、ウイルスは肝臓に侵入し、肝細胞の破壊を伴う炎症状態を引き起こす。
【０００２】
Ｂ型肝炎はウイルスの一種、ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）によって引き起こされる。ＨＢＶウイルスは、Ｂｌｕｍｂｅｒｇらにより発見された（Ａ“ｎｅｗ”ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｓｅｒａ， ＪＡＭＡ １９１： ５４１， （１９６５））。ウイルスは血液経由、性的接触または周産期ルートによって伝播する。
【０００３】
ＨＢＶは、感染しても大多数の症例において、まったく症状を発現することがなく、無症候性急性肝炎の原因となる。急性肝炎は、消化異常、腹痛、尿の異常着色および便の変色、無気力ならびに黄疸を特徴とする。急性肝炎は、肝臓の急速な壊死を伴う劇症型へと進展しうる。
【０００４】
ウイルス感染は、また、急性肝炎であった患者または感染が無症候性であった患者において、慢性型へと移行しうる。慢性キャリアは様々なサイズの肝病変を有し、肝硬変および初期癌を発症する危険性が増大している。感染の慢性化がしばしば起こるアジアやアフリカでは、肝臓の初期癌は重大な公衆の健康問題となっている。さらに、慢性キャリアはウイルスの保有宿主となり、そのウイルスを蔓延させるものであり、世界的レベルでの公衆の健康問題へと変化しつつある。
【０００５】
ＨＢＶ感染は、ヒトにおける最も一般的なウイルス感染の一種である。これは、地理的に特徴的な発生率を有する遍在的な疾患である。欧州および北米では、人口の約０．１％〜１％が感染しているが、アジアおよびアフリカでは人口の２０％までがキャリアである。全世界におけるＨＢＶ感染者の数は、約３億５千万人と推定される。
【０００６】
輸血後のウイルス感染を順に列挙すると、第一番目がＨＢＶであり、次いでＨＣＶ、ＨＩＶがこれに続く。
【０００７】
ＨＢＶは、肝親和性のＤＮＡウイルス（ヘパドナウイルス）である直径４２ｎｍのＤＮＡを有する小ウイルスであり、ヘパドナウイルス科のファミリーに分類される。その遺伝子構造は、著しく小型なものである。ウイルスは、外殻およびヌクレオキャプシドからなる。殻は主として３つの表面抗原（ＨＢｓＡｇ、すなわちＢ型肝炎表面抗原）からなり、これらがＨＢＶ感染の診断において大きな役割を果たしている。ヌクレオキャプシドは、コア抗原（ＨＢｃＡｇ）、ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素およびウイルスゲノムを含有する。ウイルスの核がウイルスの感染要素を構成し、外膜はウイルスの主要な抗原決定基であるＨＢｓ抗原を担っている。ウイルスの核はヌクレオカプシド内にとどまる。ヌクレオカプシドの直径は約２８ｎｍである。
【０００８】
サイズは小さいが（３２００塩基対）、環状で、部分的に二重鎖となっているＨＢＶのＤＮＡは、重複するＳ、Ｃ、ＰおよびＸ遺伝子から４つの型のウイルス生成物をコードしている。
【０００９】
Ｓ遺伝子は、ビリオンの外表面上に発現されるＨＢｓＡｇ殻タンパク質をコードしている。ＨＢｓＡｇ殻タンパク質は、２４ｋＤａのポリペプチドおよびそれがグリコシル化された２８ｋＤａのポリペプチドの２つの主要ポリペプチドで構成される。ＨＢｓＡｇは、１２４〜１４７位のアミノ酸に対応し、ＨＢＶのすべての分離株に共通する「ａ」決定基と呼ばれるＨＢＶの主要中和エピトープを含む。「ａ」決定基は、診断および予防接種において最も重用な標的である。急性または慢性感染後に抗ＨＢｓ抗体が産生されると、通常は回復し予後も好ましい。抗ＨＢｓ抗体には、ワクチン接種後には中和抗体の産生が伴う。回復期の個体の血清またはワクチン接種後の血清中に見出される抗ＨＢｓ抗体の大部分は、その「ａ」決定基の領域に結合する。ＨＢｓ抗原の三次構造は未だ決定されていないが、構造−機能研究の結果、「ａ」決定基がＨＢｓＡｇ抗原（残基９９から１６９）の主要親水性領域中に位置することが示されている。「ａ」決定基が高次構造を有することは明らかである。というのも、アルキル化または還元によりこの領域を変性させると、ＨＢｓＡｇ粒子を生じ、そのＨＢｓＡｇ粒子の抗原性が劇的に低下しているからである。おそらく、システイン間のジスルフィド架橋が適正なコンフォーメーションに関与している。「ａ」決定基（残基１２４〜１４７）は５つのシステインを含むが、「ａ」決定基の可能な構造には、第一のループを形成する１２４位と１３７位のアミノ酸の間および第二のループを形成する１３９位と１４７位のアミノ酸の間のジスルフィド架橋の存在が関与する。おそらく「ａ」決定基の配列全体が抗原構造に寄与している。さらに、ＨＢｓＡｇ抗原は、１２２位にそれぞれリシンまたはアルギニンが存在するｄまたはｙ決定基のいずれか、および１６０位にそれぞれリシンまたはアルギニンが存在するｗまたはｒ決定基を含む。したがって、ａｄｗ、ａｙｗ、ａｄｒおよびａｙｒの４つの主要なＨＢｓＡｇの抗原サブタイプがあり、それぞれが、地理的な分布に関連する。Ｓ遺伝子の上流、プレＳ遺伝子は種々のＨＢＶ表面抗原をコードする。
【００１０】
Ｐ遺伝子は、ウイルスの複製メカニズムにきわめて重要なＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素をコードする。
【００１１】
Ｃ遺伝子は、可溶性で分泌されるタンパク質であるＨＢｅＡｇおよび細胞内のコアタンパク質であるＨＢｃＡｇの２つのヌクレオカプシドタンパク質をコードする。ＨＢｅＡｇは、ウイルス複製が増大していることの血清学的マーカーである。
【００１２】
Ｘ遺伝子は、異なる生物学的効果を有し、特にウイルスおよび細胞の遺伝子の転写をトランスに活性化しうるＨＢｘＡｇをコードする。
【００１３】
ＨＢＶが個体に感染すると、ウイルスＤＮＡは、完全に宿主の肝細胞内で複製される。
【００１４】
ＨＢＶの感染後、患者の血清中で最初に検出可能なマーカーは、ＨＢｓＡｇ抗原であるが、このマーカーが、６ヶ月以上持続することは稀である。ＨＢｓ抗原が血清から消失した後、抗ＨＢｓＡｇ抗体が検出可能となり、持続する。ＨＢｃ抗原はＨＢｓ殻抗原によって隔離されているので、通常では、患者の血清中に検出することはできないが、抗ＨＢｃ抗体の存在は、ＨＢｓ抗原の出現後１〜２週間以内に容易に確認される。
【００１５】
しかし、上記のマーカーを用いる標準的な血清学的試験では、ＨＢＶの変異体の検出が可能にならないことは、現在明白である。ＨＢＶのキャリアであり、進展した慢性Ｂ型肝炎を有する患者が存在するという事実は、標準的な血清学的マーカーを用いてＨＢＶ感染を同定することができないで、最も重大な問題であり、より良い試験法の開発の必要があることを示す。
【００１６】
ＨＢＶ変異体の存在は、長年にわたり疑われていた。この仮定は、慢性肝炎の患者の血清中および／または肝臓中に、標準的な血清学的マーカー（ＨＢｓＡｇおよび抗ＨＢｃ）が確認されなかったにもかかわらず、ウイルスＤＮＡが検出されたことに基づいている。
【００１７】
ウイルスのＤＮＡ配列のキャリアである患者においてＨＢｓＡｇが検出できないことについては、表面抗原の低発現またはＳタンパク質の抗原決定基のレベルでの突然変異の存在など、いくつかの説明が可能である。第一には、ウイルスの共感染がＨＢＶの複製を抑制しうる（Ｊｉｌｇ Ｗ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｌ， １９９５， ２３： １４−２０， Ｊｙｌｂｅｒｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ， １９９６， ２３： １１１７−１１２５， Ｕｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． ｏｆ Ｍｅｄ． Ｖｉｒｏｌ． １９９７， ５２： ３９９−４０５， Ｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ．Ｊ． Ｃｌｉｎ； Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．， １９９８， １７： ６−１３）。別の説明は、インビボにおける抗ＨＢｓ抗体との免疫複合体形成の間にＨＢｓ抗原がマスクされたということであろう。
【００１８】
しかし、さらに最近になって、ＨＢｓＡｇの存在が、患者の抗ＨＢｓ血清中に観察されるようになってきた。これらの患者におけるＨＢｓＡｇ抗原の存在は、その抗原が存在する抗ＨＢｓによって中和されていないという事実と関連しており、変異体の存在を示唆している。
【００１９】
変異体または突然変異体の存在は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いるワクチン接種および治療に関連してきている。突然変異体の分析は、突然変異体が混合したポピュレーションから選択されてきたものであり、「ａ」決定基中のアミノ酸置換を起こす点突然変異を有することを示しているようである。突然変異体は、遺伝子型のプールとなる、遺伝子中の任意の突然変異の産物であるらしい。さらに、免疫反応は、突然変体の選択における主な因子であると考えられる。一般に、インビトロでウイルス感染した細胞にモノクローナル抗体を添加すると、その抗体によって中和されない分離株が選択される。したがって、ウイルス複製が活性である患者に与えられたモノクローナル抗体が、エスケープ突然変異体（ｅｓｃａｐｅ ｍｕｔａｎｔ）を選択することになっても驚くにはあたらない。臨床的に重要な数種のエスケープ突然変異体の分離株が、ワクチン接種を受けた個体中に見出されている。いくつかの場合では、ＨＢｓＡｇ抗原の「ａ」決定基内の１４５位のアミノ酸をコードするコドンのレベルで点突然変異を有し、グリシンがアルギニンに変化している。そのような突然変異体を含有する血清のチンパンジーへの投与は、これらの因子が伝播性であることを示している。「ａ」決定基の１４１位のリシンのグルタミン酸での置換を誘導する別の点突然変異も、ワクチン接種した患者において見出されている。したがって、野生型ＨＢＶのみならず突然変異体または変異体も、確実な方法で、検出可能とすることが重要である。実際、ＨＢｓＡｇエピトープのレベルで重要な突然変異が起こり、抗ＨＢｓ抗体がそれを認識しない場合には、その突然変異体が検出されないか、その試験が十分な感度を有するものではないということになる。現在、エスケープ突然変異体が検出されていないという事実は、そのキャリアに影響を与えるのみならず、血液、血液製剤および臓器の提供による感染の伝播にもつながりうる。さらに、突然変異体ＨＢｓＡｇは、個体が以前に免疫化されており、抗ＨＢｓタイプの応答を有していたとしても、その個体に感染しうる。国際公開公報第９４／２６９０４号には、１２２位での突然変異を含むエスケープ突然変異体からＨＢｓＡｇの野生型を区別することが可能なモノクローナル抗体が記載されている。しかし、確実な診断試験を開発するために、ＨＢｓＡｇの野生型および突然変異体型の両方を検出しうるモノクローナル抗体の特徴付けを求める深刻な必要性がある（Ｃｏｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９）， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５９： １９−２４； Ｉｒｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ． （２０００）， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３１； １１７６−１１８１）。実際、あるケースでは、「ａ」決定基をコードする殻遺伝子の領域に影響を及ぼすＨＢＶ変異体が、市販の診断試験で使用されるモノクローナル抗体では認識されない（Ｃａｒｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９０）， Ｌａｎｃｅｔ ３３６： ３２５−３２９； Ｓｅｄｄｉｇｈ−Ｔｏｎｃｋａｂｏｎｉ ｅｔ ａｌ． （２０００）， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６０： １１３−１２１； Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （２０００）， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８１： １１６５−１１７４）。
【００２０】
したがって、本発明の主題は、野生型ＨＢｓＡｇ抗原、および少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つおよび有利には３つ以上の突然変異体型ＨＢｓＡｇ抗原に結合可能なモノクローナル抗体であり、このモノクローナル抗体は、ＨＢｓＡｇ抗原の１９９〜２０８領域中の少なくとも６個の連続するアミノ酸からなるペプチド配列に結合し、有利にはＨＢｓＡｇ抗原の１９９〜２０８領域により構成されるペプチド配列に結合する。
【００２１】
さらに、本発明の主題は、野生型ＨＢｓＡｇ抗原、および少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つおよび有利には３つ以上の突然変異体型ＨＢｓＡｇ抗原に特異的に結合可能なモノクローナル抗体であり、このモノクローナル抗体は、ＨＢｓＡｇ抗原の１９９〜２０８領域に特異的に結合する。
【００２２】
本発明のモノクローナル抗体が野生型および突然変異型ＨＢｓＡｇ抗原に特異的に結合する能力は、以下の事実に関係する。すなわち、本発明の発明者がエピトープ「マッピング」によって初めて明らかにしたように、本発明のモノクローナル抗体の能力は、ＨＢＶの野生型およびＨＢｓＡｇ抗原の１９９位と２０８位のアミノ酸の間に位置する領域またはエピトープに相当する突然変異型の両方において、ＨＢｓＡｇ抗原の「ａ」決定基のレベルまたは「ａ」決定基の近接部分で起こりうる他の突然変異またはアミノ酸置換の有無とは無関係に、表面抗原の高度に保存された領域を認識するとの事実につながる。したがって、本発明のモノクローナル抗体は、ＨＢｓＡｇ抗原の「ａ」決定基中に少なくとも１個のアミノ酸置換を含む少なくとも１つのＨＢｓＡｇ抗原の突然変異型、および具体的にはＨＢｓＡｇ抗原の「ａ」決定基中の１２７、１３３、１３４、１４２、１４３、１４４および１４５位での少なくとも１個のアミノ酸置換、および場合によりＨＢｓＡｇ抗原の１００、１１８、１２０、１２２位での少なくとも１個の他のアミノ酸置換を有するＨＢｓＡｇ抗原の突然変異型を認識し、特異的に結合することが可能である。明らかにされた突然変異または置換は、野生型ＨＢｓＡｇ抗原のアミノ酸配列に関して位置付けられる。
【００２３】
本発明のモノクローナル抗体によって特異的に認識される突然変異型は、以下の実施例において確認される。より具体的には、以下の突然変異体がある：
−１０４３Ｓｐ：ＨＢｓＡｇ抗原の１４３位のセリンがロイシンで置換されている
−ＡＰ３．１：ＨＢｓＡｇ抗原の１４４位のアスパラギン酸がアラニンによって置換されている
−Ａｒｇ１．２：ＨＢｓＡｇ抗原の１４５位のグリシンがアルギニンによって置換されている
−１１５７Ｓｐ：ＨＢｓＡｇ抗原の１２７位のプロリンがアラニンで置換されており、ＨＢｓＡｇ抗原の１４３位のセリンがロイシンで置換されている
−１０５６Ｓｐ：ＨＢｓＡｇ抗原の１２０位のプロリンがセリンで置換されており、ＨＢｓＡｇ抗原の１４３位のセリンがロイシンで置換されている
−Ｍ５：ＨＢｓＡｇ抗原の１００位のチロシンがセリンで置換されており、ＨＢｓＡｇ抗原の１１８位のトレオニンがバリンで置換されており、ＨＢｓＡｇ抗原の１２２位のアルギニンがリシンで置換されており、ＨＢｓＡｇ抗原の１３３位のメチオニンがイソロイシンで置換されており、ＨＢｓＡｇ抗原の１３４位のチロシンがアスパラギンで置換されており、ＨＢｓＡｇ抗原の１４２位のプロリンがセリンで置換されており、ＨＢｓＡｇ抗原の１４３位のセリンがロイシンで置換されており、ＨＢｓＡｇ抗原の１４５位のグリシンがリシンで置換されている。
【００２４】
上記の突然変異体は、モノクローナル抗体のスクリーニングに使用することができる。本発明の抗体を、たとえば、野生型ＨＢｓＡｇ抗原および１つ以上の上記のような突然変異体でスクリーニングすることができる。具体的には、本発明の抗体は、野生型ＨＢｓＡｇ抗原、およびＨＢｓＡｇ抗原の１２７、１３３、１３４、１４２、１４３、１４４および１４５位の少なくとも１つで、さらに具体的にはＨＢｓＡｇ抗原の１４３、１４４および１４５位の少なくとも１つで１個以上の置換を、および場合によりＨＢｓＡｇ抗原の１００、１１８、１２０、１２２位の少なくとも１つで少なくとも１個の他の置換をそれぞれが有する１つ以上のＨＢｓＡｇ突然変異体でスクリーニングすることができる。
【００２５】
具体的には、本発明のモノクローナル抗体は、野生型ＨＢｓＡｇ抗原、およびＨＢｓＡｇ抗原の１２７、１３３、１３４、１４２、１４３、１４４および１４５位のアミノ酸をコードする１つ以上のコドンのレベルで点突然変異を有する配列によってコードされる「ａ」決定基を保持する少なくとも１つのＨＢｓＡｇ突然変異体に結合することができる。本発明の好ましい抗体は、イムノグロブリンのクラスＧに属する、２Ｇ２Ｇ１０および８Ｂ４Ｈ７と呼ばれる抗体である。２Ｇ２Ｇ１０モノクローナル抗体は、ＩｇＧ２ｂイムノグロブリンクラスに属する。８Ｂ４Ｈ７モノクローナル抗体は、ＩｇＧ２ａクラスに属し、２Ｇ２Ｇ１０抗体をＵＶ処理することによって得られた。
【００２６】
本発明は、本発明のモノクローナル抗体のフラグメントおよび誘導体、具体的にはＦａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ）２およびｓＦｖフラグメント（Ｂｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５９： ５８２１−５８３３およびＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２： ４２３−４２６）およびそのコンジュゲートをも含む。本発明のモノクローナル抗体誘導体は特にヒト化抗体を含む。モノクローナル抗体のフラグメント、およびヒト化誘導体を含むモノクローナル抗体の誘導体の製造方法は、当業者には周知である。非ヒト、例えばネズミの「ヒト化」型抗体は、非ヒトイムノグロブリンに由来する最小の配列を含むキメラ抗体である。ほとんどのヒト化抗体は、レセプターの超可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの所望の特異性、親和性および容量を有する非ヒトドナー種（ドナー抗体）の超可変領域の残基によって置き換えられているヒトイムノグロブリン（レセプター抗体）である。ある種の場合には、ヒトイムノグロブリンのＦｖ領域の（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基で置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体中には見出されない残基を含みうる。これらの修飾は、抗体の機能を改善するために実施される。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つおよび好ましくは２つの可変ドメインを含み、その中では、すべてまたはほとんどすべての超可変ループは非ヒトイムノグロブリンに相当し、すべてのまたはほとんどすべてのＦＲ領域はヒトイムノグロブリンのものである。ヒト化抗体は、場合によっては、ヒトイムノグロブリンなどのイムノグロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分をも含みうる（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２１： ５２２−５２５ （１９８６）； Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２： ３２３−３２９ （１９８８）； およびＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２： ５９３−５９６ （１９９２））。
【００２７】
本発明のモノクローナル抗体、具体的には、２Ｇ２Ｇ１０および８Ｂ４Ｈ７抗体は、下記の実施例１に記載のプロトコール、または実施例１に記載のプロトコールに由来するプロトコールに従いハイブリドーマ系により産生される。さらに、哺乳動物、好ましくはネズミ動物を、野生型ＨＢｓＡｇ抗原または場合によりフラグメントまたは適当な抗原誘導体の形態のＨＢｓＡｇ抗原の突然変異体型で免疫化し、ハイブリドーマを形成させるために抗体産生細胞を不死化させ、野生化ＨＢｓＡｇ抗原および場合によりフラグメントまたは適当な抗原誘導体の形態の少なくとも１つの上記突然変異体型でハイブリドーマ培養物をスクリーニングし、さらに野生型ＨＢｓＡｇおよび少なくとも１つの上記突然変異体型に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択することによってハイブリドーマ系を作製することからなる、本発明のモノクローナル抗体の製造方法も本発明の主題である。
【００２８】
本発明は、本発明のモノクローナル抗体を産生しうるハイブリドーマ、上記方法に従ってインビボまたはインビトロで得られやすいハイブリドーマを培養することおよび培養培地からモノクローナル抗体を回収することからなる本発明のモノクローナル抗体の製造方法、ならびにこのハイブリドーマ培養方法によって得られそうなモノクローナル抗体をも含む。
【００２９】
本発明のモノクローナル抗体は、ＨＢｓＡｇ抗原を含有すると思われる検体中のＨＢｓＡｇ抗原の検出および／または定量のための、したがって（野生型および／または突然変異体）ＨＢＶウイルスの検出のためのイムノアッセイにおける使用が可能である。このようなアッセイは、臨床診断においておよび血液製剤のスクリーニングにおいて使用可能である。さらに、本発明は、検体中のＨＢｓＡｇ抗原の検出および／または定量方法にも関し、その方法は、本発明の少なくとも１つのモノクローナル抗体またはそのようなモノクローナル抗体のフラグメントもしくは誘導体に検体を接触させること、および少なくとも１つの抗原／抗体、フラグメントまたは誘導体の複合体の存在を確認することからなる。
【００３０】
本発明の方法の一実施態様においては、本発明のモノクローナル抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体、および本発明のモノクローナル抗体、フラグメントまたは誘導体により認識されるものとは異なる領域またはエピトープに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗ＨＢｓＡｇ抗体から選ばれる少なくとも１つの他の抗体と検体を接触させる。
【００３１】
このような方法は、当業者に周知の「サンドイッチ」法または「競合」法に従って一または二段階で、均質または不均質相で実施される。さらに、本発明の方法は、同じアッセイにおいて、分析されるべき検体中の抗ＨＢｃ抗体の検出と関連付けることも可能である。
【００３２】
対応する診断組成物は、少なくとも１つの本発明のモノクローナル抗体、またはそのフラグメントもしくは誘導体を、場合により、抗ＨＢｃ抗体の検出のための少なくとも１つの試薬との組み合わせで含み、さらに本発明のモノクローナル抗体、フラグメントまたは誘導体によって認識されるものとは異なる領域またはエピトープを認識する、ＨＢｓＡｇ抗原検出用の少なくとも１つの他のモノクローナルまたはポリクローナル抗体を含みうる。本発明の抗体、フラグメントまたは誘導体は、ＨＢｓＡｇ抗原捕獲抗体として固相上に固定化することが可能であり、または、あらゆる適当なマーカーで標識した場合には検出に使用することが可能である。また、本発明の抗体、フラグメントまたは誘導体をＨＢｓＡｇ抗原捕獲相として使用し、本発明の抗体により認識されるものとは異なるエピトープに対する少なくとも１つの他のモノクローナルまたはポリクローナル抗体を検出コンジュゲートとして使用すること、またはその逆の使用も考えられる。同様に、本発明の抗体、フラグメントまたは誘導体、および本発明の抗体により認識されるエピトープとは異なるエピトープに対する少なくとも１つの他のモノクローナルまたはポリクローナル抗体を同じ固相に固定化することが可能である。さらに、検体中の抗ＨＢｃ抗体を捕獲しうる試薬は、この同じ固相上、あるいは本発明の抗体、フラグメントまたは誘導体、および場合により本発明の抗体により認識されるエピトープとは異なるエピトープを認識する少なくとも１つの他の抗ＨＢｓＡｇモノクローナルまたはポリクローナル抗体が固定化されている固相とは異なる固相上に固定化し、本発明の組成物に含ませることが可能である。
【００３３】
本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはそのような抗体のフラグメントもしくは誘導体またはその組合わせを含む、ＨＢＶに対する受動免疫のための治療または予防的使用に適した抗血清にも関する。その抗血清は、さらに、本発明のモノクローナル抗体、フラグメントまたは誘導体以外の、少なくとも１つのモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体または抗ＨＢｓＡｇモノクローナルおよびポリクローナル抗体の混合物を含みうる。
【００３４】
ＨＢＶに対する受動免疫のための治療または予防的使用のための適当な組成物は、薬学的に許容されうるビークルとの混合物の中に、本発明のモノクローナル抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体またはその組合わせを含む。
【００３５】
「薬学的に許容されうるビークル」とは、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．に記載されるようなヒトまたは動物に投与しうる支持体およびビークルを意味する。
【００３６】
本発明はしたがって、本発明のモノクローナル抗体、そのフラグメントもしくは誘導体またはその組合わせの治療的または予防的に効果的な量を個体に投与することからなる、治療または予防目的のＨＢＶに対する受動免疫方法をさらに含む。本発明のモノクローナル抗体、フラグメントまたは誘導体により認識されるエピトープとは異なるエピトープに対する１つ以上の他の抗ＨＢｓＡｇモノクローナルまたはポリクローナル抗体も投与しうる。
【００３７】
本発明は、上記に定義した本発明の抗体に対する抗イディオタイプまたは抗イディオタイプ抗体をも含む。抗イディオタイプ抗体は、別の抗体に対して産生され、別の抗体の特異的抗原結合部位またはイディオタイプと反応する抗体である。抗イディオタイプ抗体は、イディオタイプにより認識される抗原として機能する。このような抗体は、コンフォーメーション依存エピトープの場合には特に有用である。ウイルスなどの外部病原体の内部イメージを表す抗イディオタイプ抗体は、ワクチン接種用の抗原の「代替物」として使用される。インビボにおける抗イディオタイプ抗体の重要性は、多数の実験において明らかにされている。インビボにおける抗イディオタイプ抗体の投与は、特異的イディオタイプに対する応答の抑制または増強という効果をもたらす。本発明の抗イディオタイプ抗体は、ＨＢｓＡｇの１９９〜２０８エピトープを認識する抗−抗イディオタイプ抗体を産生することにより動物における応答を誘導し、それにより動物をＨＢＶに対して免疫化し、さらにはＨＢＶ感染を中和することさえできる。したがって、本発明の主題は、ＨＢｓＡｇ抗原の１９９〜２０８領域を認識する抗−抗イディオタイプ抗体の産生を動物において誘導する抗イディオタイプモノクローナル抗体または前記抗イディオタイプ抗体のＦａｂフラグメントまたはその混合物を、動物のＨＢＶへの免疫化に十分な量で含む活性組成物、および例えば水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムといった薬学的に許容されうるアジュバントを含むワクチン組成物である。薬学的に許容されうるアジュバントは当業者に周知であり、参考としてＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．に記載のアジュバントを挙げることができる。所望ならば、ワクチンは湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの少量の補助的物質を含有しうる。動物をＨＢＶに対して免疫化する方法は、上記に定義されたワクチン組成物を１回以上の投与において投与することからなる。無論、動物に対するインビボ試験の後には、ＨＢＶに対するワクチン接種の最終目的は、ヒトにおける感染予防である。したがって、上記に使用された「動物」という語は、動物およびヒトの両方を意味する。ワクチンは、適当な希釈剤（特に、リン酸緩衝液でありうる）の中に、タンパク質が１ｍｇ／ｍｌのオーダーの最終濃度になるように、本発明の抗イディオタイプ抗体またはそのＦａｂフラグメントを混合することにより製造する。通常のサイズのヒトに対しては、例えばその溶液の５０μｌ（５０μｇ）〜１００μｌ（１００μｇ）を４５００μｌ中に希釈し、５００μｌの薬学的に許容されうるアジュバントと混合する（ｐＨ６．０±０．１）。用量は、動物、その年齢および体重により変わる。
【００３８】
本発明のイディオタイプモノクローナル抗体は、当業者に周知の方法で製造される。ＨＢｓＡｇの１９９〜２０８エピトープまたは領域を得て、現在利用可能なあらゆる技術により精製する。イディオタイプ抗体（Ａｂ１）は、動物、好ましくはネズミ、具体的にはマウスを、抗原として上記エピトープで免疫化することにより製造する。次いで、動物の脾臓細胞を確認し、単離し、ポリエチレングリコールなどの融合剤の存在下でリンフォーマまたはミエローマ細胞と融合させる（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４５９ （１９７５））。次に、融合させた細胞を、非融合悪性細胞の増殖を阻害する選択培地中でインキュベートする。ハイブリドーマ細胞を限界希釈法によりクローニングし、求める特異性を有するモノクローナル抗体の分泌を試験する。モノクローナル抗体は、腹水での増殖によりインビボでも得られる。イディオタイプ抗体Ａｂ１は、ＨＢＶに対し免疫化し、中和さえする性質を有する抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）を産生させるために使用される。抗イディオタイプ抗体Ａｂ２は、抗体Ａｂ１の製造に用いた方法と同じ方法で得られるが、このときは抗体Ａｂ１が使用される免疫原となる。
【００３９】
本発明の主題はさらに、本発明者が同定した配列番号１の配列中に示すＨＢｓＡｇ抗原の１９９位のアミノ酸から始まり２０８位のアミノ酸で終了するペプチド配列のＨＢｓＡｇ抗原の保存されたエピトープおよびその免疫原性ペプチドとしての使用であり、さらには、ペプチド配列が、配列番号１に示すエピトープのアミノ酸と相同または同一の少なくとも３個および少なくとも４個のアミノ酸をそれぞれ含むことで特徴付けられる免疫原性ペプチド、具体的には配列番号２および配列番号３に示す免疫原性ペプチドでもある。添付の図に示した配列番号１と配列番号２の配列を比較したところ、配列番号２の配列は、配列番号１の対応アミノ酸と厳密に相同あるいは同一である、Ｗ（トリプトファン）、Ｐ（プロリン）、Ｓ（セリン）の３個のアミノ酸および配列番号１のＬ（ロイシン）に等価（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）なＩ（イソロイシン）を含む。添付の図に示した配列番号１と配列番号３の配列を比較したところ、配列番号３の配列は、配列番号１の対応アミノ酸と厳密に相同あるいは同一である、Ｗ（トリプトファン）、Ｐ（プロリン）、Ｙ（チロシン）、Ｓ（セリン）の４個のアミノ酸および配列番号１のＳ（セリン）およびＩ（イソロイシン）にそれぞれ等価なＴ（トレオニン）およびＬ（ロイシン）の２個のアミノ酸を含む。前記の等価なアミノ酸とは、ペプチドの免疫原性としての効率に影響を及ぼすことなく相互に置換しうるアミノ酸である。このような免疫原性ペプチドは、上記の定義に対応し、ＨＢｓＡｇ抗原の野性型および少なくとも１つの突然変異体型の両者を認識可能なモノクローナル抗体、モノクローナル抗体のフラグメントまたはモノクローナル抗体の誘導体の製造に使用することができる。モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体のフラグメントもしくは誘導体の製造は当業者には周知である。例として、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４５−４７ （１９７５）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６： ５１１−５１９ （１９７６）、およびＧａｌｆｒｅ Ｇ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ， ２６６： ５２２−５５０ （１９７７）が挙げられる。エピトープは、化学的合成、遺伝子組換えまたは異なる方法の組み合わせにより製造しうる。本発明のエピトープをコードする配列はしたがって、適当な宿主細胞内で適当なプロモーターの制御下で発現させることができる。宿主細胞には、哺乳類細胞、酵母および細菌を含む原核または真核生物に由来する細胞などの、組換えＤＮＡ分子を転写および翻訳することが可能で、かつ発現に必要な因子の制御下に置かれた、本発明のエピトープをコードするＳ遺伝子のフラグメントを発現させることができるあらゆる単細胞生物が含まれる。さらに、配列番号２および配列番号３の免疫原性ペプチドは、化学的合成により容易に得ることができる。
【００４０】
最後に本発明は、特定のストリンジェントな条件下で、配列番号１に示すエピトープをコードするＤＮＡヌクレオチド配列、配列番号１に示すエピトープをコードする前記ヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡヌクレオチド配列または前記ＤＮＡヌクレオチド配列のＲＮＡ転写産物にハイブリダイズしうる核酸プローブまたはプライマーに関する。
【００４１】
本発明は、特定のストリンジェントな条件下で、配列番号１に示すエピトープをコードする配列番号４に示すＤＮＡヌクレオチド配列、配列番号４の相補的ＤＮＡヌクレオチド配列または前記ヌクレオチドＤＮＡ配列のＲＮＡ転写産物にハイブリダイズしうる核酸プライマーまたはプローブ；生物学的検体中の（野性型および／または突然変異体）ＨＢＶウイルスの検出および／または定量のための、上記定義の少なくとも１つのプローブまたは少なくとも１つのプライマーを含む診断組成物；ならびに生物学的検体中の（野性型および／または突然変異体）ＨＢＶウイルスのＤＮＡおよび／またはＲＮＡ診断の方法にも関する。この方法によれば、血清、血漿または組織検体などの生物学的検体を、少なくとも１つのＨＢＶウイルスによる感染が疑われる患者から採取し、必要ならば上記検体を、検体からＤＮＡおよび／またはＲＮＡを抽出するために処理し、上記検体を特定のストリンジェントな条件下で少なくとも１つのプローブまたは少なくとも１つのプライマーと接触させ、上記ウイルスＤＮＡおよび／またはＲＮＡと少なくとも１個のプローブとのハイブリダイゼーションまたは上記ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの増幅を確認することにより検体中のウイルスＤＮＡおよび／またはＲＮＡを検出および／または定量する。核酸プローブを使用する場合には、ハイブリダイゼーション複合体の形成の確認は、標的配列に相補的またはほぼ相補的で、あらゆる適当なマーカーによって標識したプローブを使用することにより直接行うことが可能であり、または標的配列の一部に相補的またはほぼ相補的な捕獲プローブおよび適当なマーカーで標識したプローブまたは標的配列の別の部分に相補的またはほぼ相補的な検出プローブを使用することからなる、１または２段階の「サンドイッチ」法の実施によっても行うことが可能である。プライマーを使用する場合には、プライマーを、標識増幅産物の同定のために、直接標識することも可能であり、または標識しないことも可能であり、後者の場合には、生成した増幅産物は、アクリルアミドゲルを通過させることにより予測した大きさとの関係で選択したり、または適当な検出プローブを用いて分析しうる。
【００４２】
Ｇａｌｉｂｅｒｔら（Ｎａｔｕｒｅ ２８０： ６４６−６５０ （１９７９））によるＨＢＶゲノムの７５１〜７８０位のヌクレオチドに相当する、配列番号４に示す本発明の１９９〜２０８エピトープをコードするＤＮＡヌクレオチド配列の選択、それに相補的な配列および対応するＲＮＡ配列を選択することに始まり、配列番号４、それに相補的な配列または対応するＲＮＡにハイブリダイズ可能なヌクレオチドプローブまたはプライマーを決定し、それを得ることは当業者の能力の範囲内である。オリゴヌクレオチドの製造の例として、制限酵素の使用および自動合成装置を用いる化学合成が挙げられる。特定のストリンジェント条件下で本発明のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能なプローブおよびプライマーは、この定義の一部を形成する。適当なストリンジェント条件を定義することも当業者の能力の範囲内である。特徴的なストリンジェント条件は、試験されたハイブリッドのＴｍ（「融解温度」）以下の約１２℃と２０℃との間から選択される温度と食塩液濃度の組合わせに対応するものである。これらはすべて当業者の一般的知識の一部をなすものであり、説明のために「ＤＮＡ ＰＲＯＢＥＳ」（Ｇｅｏｒｇｅ Ｈ． Ｋｅｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍａｒｋ Ｍ． Ｍａｎａｋ著、 ２ｎｄ Ｅｄ． （１９９３） Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， ４９ Ｗｅｓｔ ２４ｔｈ Ｓｔ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ． １００１０， ＵＳＡ（さらに具体的には、１〜２１ページの第１節“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”を参照））と題する書籍を挙げることができる。
【００４３】
図１
添付の図１は、ＨＢｓＡｇ抗原のアミノ酸配列を示す。この図では、１９９〜２０８エピトープは、下記の実施例に説明するようにエピトープ「マッピング」により位置付けられ、確認されている。ＨＢｓＡｇ抗原のアミノ酸配列の１９４〜２０９のアミノ酸からなる領域中の野性型ＨＢｓＡｇ抗原の配列のアミノ酸と共通または相同もしくは同一のアミノ酸、および等価なアミノ酸を有する２つのクローンＨＷＷＫＨＰＴＲＹＳＬＧおよびＨＰＬＫＱＹＷＷＲＰＳＩを、野性型ＨＢｓＡｇ抗原の配列の下に示す。共通または相同もしくは同一および等価なアミノ酸は図１において太字で示す。
【００４４】
実施例
実施例１：モノクローナル抗体の作製および特徴付け
４〜６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ ＪＹｃｏマウス（ＩＦＦＡ Ｃｒｅｄｏ）を、等容量のフロイント完全アジュバントで乳化させた組換えＨＢｓＡｇ ａｙ５０μｇを腹腔内投与により免疫化した。組換えＨＢｓＡｇ ａｙタンパク質は、Ｐａｓｔｅｕｒ Ｍｅｒｉｅｕｘ Ｃｏｎｎａｕｇｈｔから入手した。このタンパク質は、Ｇａｌｉｂｅｒｔら（Ｎａｔｕｒｅ ２８０： ６４６−６５０ （１９７９））により配列決定されたａｙｗ系統に相当し、ＣＨＯ細胞で発現している（Ｍｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ８１／７７０８−７７１２ （１９８４））。このタンパク質は、プレＳおよびＳ領域から構成される。ＮＨ２末端位に位置する５５アミノ酸がプレＳ２領域に相当する。
【００４５】
３回の注射を、２週ごとに、不完全アジュバントの存在下で行った。最後の注射から４日後に、脾臓細胞を取り出し、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４５−４７ （１９７５）； Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６： ５１１−５１９ （１９７６））の方法に従って、Ｓｐ ２／０−Ａｇ１４マウスのミエローマ細胞系と融合させた。細胞を１２〜１４日間培養した後、固相上に固定化した血漿組換えａｙＨＢｓＡｇ抗原を用いて間接ＥＬＩＺＡ試験により培養上清をスクリーニングした。１０５８個の培養上清を１／１０に希釈し、そのようにスクリーニングした。４０５ｎｍのＯＤが約２、すなわち同じ波長における閾値である０．３の６倍高い値を示す、６６個の陽性クローンが選択された。１／１０に希釈した６６個の陽性クローンの培養上清を、天然の血漿ａｙＨＢｓＡｇ抗原を用いて間接ＥＬＩＳＡでスクリーニングした。４０５ｎｍのＯＤが２を超える、すなわち同じ波長における閾値である０．１の２４倍高い値を示す２０個のクローンが選択された。これら２０個のクローンの中から１２個の培養上清を１／１０に希釈し、その後、固相に固定化した天然のａｙＨＢｓＡｇ抗原および天然のａｄＨＢｓＡｇ抗原をそれぞれ用いて間接ＥＬＩＳＡ試験により試験を行った。これらの試験の各々から、１／１６００に希釈した場合の４０５ｎｍのＯＤが天然のａｙＨＢｓＡｇ抗原による試験では１．２以上であり、そして天然のａｄＨＢｓＡｇ抗原による試験では約１．１、すなわち閾値である０．１の約１０倍高いＯＤを有する６個のクローンが選択された。これら６個の陽性クローンのうち４個を、限界希釈法により２回サブクローニングし、腹水の形態で作製した。予めＰｒｉｓｔａｎｅ（商品名）を注射したマウスから腹水を得て、１０６個のハイブリドーマ細胞を注射した。
【００４６】
上記のように得られた４つのＩｇＧを、製造元（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から供給されたプロトコールに従って、Ａ ４ＦＦタンパク質と結合させたセファロースのカラムで精製し、以下の実験に用いた。最後に、イムノグロブリン類のＩｇＧ２ｂクラスに属する２Ｇ２Ｇ１０モノクローナル抗体は、優れた機能を有するため保持された。
【００４７】
実施例２：２Ｇ２Ｇ１０抗体のクラス変換
Ｒｏｓｅｎ ａｎｄ Ｋｌｅｉｎ （Ｎａｔｕｒｅ ３０６： １８９−１９０ （１９８３））のプロトコールに従ったＵＶ処理により、２Ｇ２Ｇ１０モノクローナル抗体のクラスをＩｇＧ２ｂからＩｇＧ２ａに変換した。修飾された抗体を８Ｂ４Ｈ７と命名した。
【００４８】
実施例３：ファージに担持されたペプチドバンクのスクリーニング
Ｇｒｅｔｃｈら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６３： ２７０−２７７ （１９８７））の方法に従い、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．から市販されているＰｈ．Ｄ．−１２（登録商標）バンクを、ビオチン化２Ｇ２Ｇ１０および８Ｂ４Ｈ７モノクローナル抗体によりスクリーニングした。これは、Ｍ１３ファージのマイナーエンベロープタンパク質（ｐＩＩＩ）のＮ末端で発現されるドデカペプチドのコンビナトリアルバンクである。このバンクは、４×１０１２ファージ／ｍｌを含み、１．９×１０９個の様々な配列を表す。
【００４９】
最初の「バイオパニング」の間には、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．６）中の１０μｇのストレプトアビジンを一晩、４℃で加湿チャンバー内で撹拌しながら直径３５ｍｍのペトリ皿に固定化した。その後、ペトリ皿を、飽和溶液［０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．６）中の５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ；０．０２％  ＮａＮ３］により２時間、４℃で飽和させた。ＴＢＳ（トリス緩衝食塩液）［０．５Ｍ  トリス；０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５］−０．１％Ｔｗｅｅｎ中で６回洗浄した後、ビオチン化２Ｇ２Ｇ１０または８Ｂ４Ｈ７モノクローナル抗体を、０．０２％ ＮａＮ３およびＢＳＡ１ｍｇ／ｍｌを含むＴＢＳ  ０．１％Ｔｗｅｅｎ中１７０ｎＭの濃度で一晩、４℃で加湿チャンバー内で撹拌しながらインキュベートした。抗体により占められない部位をブロックするために、ビオチン４０μｇを加え、１時間、４℃で加湿チャンバー内で撹拌しながらインキュベートした。ＴＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎで６回洗浄した後、ＴＢＳ  ０．１％Ｔｗｅｅｎ−０．１ｎＭビオチン中に希釈したバンク１０μｌ（４×１０９ファージ）を、１時間、周囲温度で撹拌しながらインキュベートした。未固定化ファージはその後、ＴＢＳ  ０．１％Ｔｗｅｅｎで１０回洗浄して除去した。固定化されたファージは、溶出緩衝液［０．１Ｍ  ＨＣｌ−グリシン；ｐＨ２．２；１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ；０．１ｍｇ／ｍｌ  フェノールレッド］で７分間インキュベートすることにより溶出した。溶出物は、１Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）２００μｌで中和した。
【００５０】
２Ｇ２Ｇ１０または８Ｂ４Ｈ７のいずれかによるバンクのスクリーニングに対応する溶出物は、ＬＢ培地［トリプトン  １０ｇ／ｌ；酵母抽出物  ５ｇ／ｌ；ＮａＣｌ  １０ｇ／ｌ；ｐＨ７．５］中の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＥＲ２５３７株への感染により個別に増幅した。３７℃、２５０ｒｐｍで４時間３０分インキュベートした後、溶出物残渣は、２回連続の１０分間の遠心を１０，０００ｒｐｍで行うことにより除去した。上清に含まれるファージは、１／６のポリエチレングリコール／ＮａＣｌ［１６．７％  ポリエチレングリコール、３．３Ｍ  ＮａＣｌ］で２回沈殿させた。１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心した後、ペレットをＴＢＳ−０．０２％  ＮａＮ３２００μｌに取った。これらの増幅溶出物の１００μｌを２回目のバイオパニングに使用した。
【００５１】
２回目、３回目および４回目のバイオパニングのために、その前の回の増幅溶出物の１００μｌを、それぞれ１００Ｍ、１ｎＭおよび０．１ｎＭのビオチン化２Ｇ２Ｇ１０または８Ｂ４Ｈ７抗体とともに一晩、４℃でプレインキュベートし、その間に、前記のようにストレプトアビジン１０μｇをペトリ皿上に固定化した。１５分間、周囲温度でペトリ皿を飽和させた後、ファージ／抗体混合物を加えた。以下のプロトコールは、１回目の「バイオパニング」のプロトコールと同様である。
【００５２】
実施例４：ファージクローンのクローニングおよび増幅
大腸菌の培養物を、光学密度（ＯＤ）が０．５に達するまで、２５０ｒｐｍ、３７℃でインキュベートした。細菌を増殖させる間に、上層アガロース［ＬＢ  １ｌ；バクト−ペプトン１０ｇ；酵母抽出物５ｇ；ＮａＣｌ５ｇ；ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ１ｇ；アガロース７ｇ］を溶かして３ｍｌずつ分注し、５５℃で保存した。細胞の準備が整ったときに、培養物２００μｌを、４回目のバイオパニングの後得られ、そしてＬＢ培地で希釈した溶出物１０μｌとともに、１〜５分間、周囲温度でインキュベートした。混合物は、アガロースの入った２本のチューブに移し、撹拌し、迅速にＬＢ  ＩＰＴＧ／ＸＧａｌのペトリ皿上に注いだ。ペトリ皿は、一晩、３７℃でインキュベートする。
【００５３】
２Ｇ２Ｇ１０または８Ｂ４Ｈ７によるスクリーニングに対応するペトリ皿から無作為に選択した３６個のコロニーは、大腸菌培養物１ｍｌに４〜５時間、３７℃で感染させることにより増幅させ、その後、１４，０００ｒｐｍで３０秒間遠心して細胞を除去した。上清５００μｌをスクリーニングに用い、その残余を再び遠心し、グリセロールで１：１に希釈し、−２０℃で保存した。
【００５４】
ＬＢ／グリセロール中に保存されたファージ２μｌを、大腸菌培養物１．７ｍｌに３７℃、２５０ｒｐｍで２４時間感染させることにより増幅させた。１４，０００ｒｐｍで５分間遠心して細胞を除去した。上清は、ＰＥＧ／ＮａＣｌにより沈殿させた。１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心した後、ペレットをＴＢＳ５００μｌに取った。２６９ｎｍの吸収スペクトロメトリによりこれらのファージ溶液をアッセイし、ＥＬＩＳＡ試験に用いた。
【００５５】
実施例５：ファージクローン中に挿入された配列のシークエンシング
ＰＥＧ／ＮａＣｌ２００μｌにより１０分間、周囲温度で沈殿させた上清５００μｌから始めて、種々のクローンのＤＮＡの抽出および精製を行った。１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、ペレットをトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００μｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、４Ｍ  ＮａＩおよび無水エタノール２５０μｌに取り、次いで１０分間、周囲温度でインキュベートした。１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、ペレットを７０％エタノール５００μｌを用いて１回洗浄し、その後真空下で１０分間乾燥させる。それを最終的には３０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）３０μｌ、１ｍＭＥＤＴＡに取った。
【００５６】
挿入物のヌクレオチドシークエンシングは、「Ｂｉｇ Ｄｙｅ（登録商標）ターミネーター・サイクル・シークエンシング・レディ・リアクション」（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）シークエンシングキットおよびファージの野性型配列に相当する５’ＨＯ−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−ＯＨ３’プライマーを用いて自動シークエンサー（３７７Ａ型、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用するＳａｎｇｅｒの改変方法に従って行った。反応混合物は、配列決定すべきＤＮＡ５μｌ、水２．５μｌ中の２．５ｐｍｏｌｅのオリゴヌクレオチド、ジデスオキシリボヌクレオチドおよびＴａｑ（登録商標）ポリメラーゼを含有する「Ｂｉｇ Ｄｙｅ（登録商標）」混合物ならびに水４．５μｌを含んだ。２５回のシークエンシングサイクル（９６℃で３０秒、５０℃で１５秒、６０℃で４分間）は、ＢｉｏｍｅｔｒａのＴｒｉｏｂｌｏｃｋ ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）装置中で実施した。配列画分は、ＴＥ［１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ］緩衝液で平衡化したセファデックスＧ５０カラムにより精製し、乾燥させ、シークエンシングを行うまで−２０℃で保存した。タンパク質の配列は、Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓソフトウェアを用いてヌクレオチドの配列から推定した。
【００５７】
実施例６：ファージクローンの免疫学的解析
０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３緩衝液中１００μｇ／ｍｌの最終濃度で用いる２Ｇ２Ｇ１０もしくは８Ｂ４Ｈ７抗ＨＢｓＡｇ抗体または無関係の抗体（陰性対照として使用）１００μｌを、一晩、４℃で加湿チャンバー内で、ＥＬＩＳＡ「Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｂ」ウェルプレートの各列に固定化下。次いでそのプレートを２時間、４℃で飽和溶液［０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３；ＢＳＡ  ５０ｍｇ／ｍｌ；ＮａＮ３  ０．０２％］中で飽和させた。ＴＢＳ−０．５％Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した後、ＴＢＳＴｗｅｅｎ中に希釈した種々の濃度のファージ（１×１０１２、２．５×１０１１、６．２×１０１０および４×１０９ファージ／ｍｌ）の１００μｌを各ウェルに加え、撹拌しながら２時間、周囲温度でインキュベートする。ＴＢＳ−０．５％Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した後、ペルオキシダーゼを結合させ、飽和溶液中に１／５０００に希釈した１００μｌ／ウェルの抗Ｍ１３抗体を撹拌しながら２時間、周囲温度でインキュベートした。１時間、３７℃でインキュベートしたのち、プレートをＴＢＳ−０．５％Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した。発色のために、プレートをフェニレンジアミンおよび過酸化水素（カラーＥＩＡキット、ｂｉｏＭｉｅｒｉｅｕｘ）の溶液とともに暗所で１０分間インキュベートする。１．８Ｎ硫酸により反応を停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ａｘｉａマイクロリーダー）を用いてプレートの４９２ｎｍでの吸収を読む。各クローンの各希釈について、結果は、抗ＨＢｓＡｇ抗体と対照抗体の差の値により表す。次いで、その結果は、至適希釈を３回試験することにより確認した。
【００５８】
２Ｇ２Ｇ１０抗体では、免疫反応性クローンはまったく選択することができなかった。一方、同じパラトープを有するがＩｇＧ２ａクラスに属する、同等な８Ｂ４Ｈ７抗体は、免疫反応性クローンの選択を可能にした（表１）。さらに、これらのクローンのうち２個（ＨＷＷＫＨＰＴＲＹＳＬＧおよびＨＰＬＫＱＹＷＷＲＰＳＩ）は、２Ｇ２Ｇ１０抗体によっても認識される。
【００５９】
【表１】
2004516824.tif 000002
【００６０】
クローンの免疫反応性は、固相に固定化した８Ｂ４Ｈ７ａまたは２Ｇ２Ｇ１０ｂおよび８×１０１０ファージ／ｍｌｃおよび２×１０１０ファージ／ｍｌｄの最終濃度で添加されたファージクローンを用いて、実施例６に記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００６１】
実施例７：ＨＢｓＡｇ配列上の免疫反応性ファージクローン配列の位置
Ｍａｃ ＶｅｃｔｏｒソフトウェアＶｅｒ．４．５（Ｋｏｄａｋ）を使用して、ペプチドのアミノ酸配列を、モノクローナル抗体を得るために用いたＨＢｓＡｇ組換えタンパク質の配列と比較した（Ｇａｌｉｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９７９）。簡潔に述べると、高度な類似性を有する領域を最適局所同一性を検索するＬＦＡＳＴＡプログラムにより検出する（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， ＰＮＡＳ ８５： ２４４４−２４４８ （１９８８））。２Ｇ２Ｇ１０に対して免疫反応性の２個のクローンにより、２Ｇ２Ｇ１０および８Ｂ４Ｈ７により認識されるエピトープのＨＢｓＡｇの１９９〜２０８領域内における明らかな位置付けが可能になった（図１）。実際、ＨＷＷＫＨＰＴＲＹＳＬＧは、１９９〜２０８配列と同一の４残基および類似の３残基を有し、ＨＰＬＫＱＹＷＷＲＰＳＩは、２０１〜２０５配列と３個の同一残基および１個の類似の残基を有する。
【００６２】
実施例８：２Ｇ２Ｇ１０および８Ｂ４Ｈ７モノクローナル抗体を用いた野生型ＨＢｓＡｇ抗原およびＨＢｓＡｇ変異体の検出
使用した形式は、２Ｇ２Ｇ１０または８Ｂ４Ｈ７モノクローナル抗体を捕獲に、そしてヤギ抗ＨＢｓポリクローナル抗体を検出に使用するサンドイッチタイプの形式である。
【００６３】
患者血清中の野生型ＨＢｓＡｇ抗原の検出：
Ｓｏｃｉｅｔｅ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｓａｎｇｕｉｎｅ ｏｆ Ｌｉｌｌｅから供給された、いくつかのサブタイプを含む患者血清（希釈された検体）を、２Ｇ２Ｇ１０モノクローナル抗体を捕獲に、そしてヤギ抗ＨＢｓポリクローナル抗体を検出に用いて検査した。結果を下記の表２に示す。試験をした検体を、そのサブタイプおよび由来に従って同定する。結果は、閾値に対するシグナルとして表す。閾値は、陰性検体のシグナルの５倍に相当する。シグナル／閾値の値が１を超えるものを陽性とする。
【００６４】
【表２】
2004516824.tif 000003
【００６５】
血漿中の野生型ＨＢｓＡｇ抗原の検出：
２Ｇ２Ｇ１０モノクローナル抗体および８Ｂ４Ｈ７モノクローナル抗体を捕獲に用いて、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ ｓｅｒｏｔｈｅｑｕｅからの血漿を上記と同じ条件下で試験した。結果を下記の表３に示す。結果は、シグナル／閾値の値で表す。閾値は、陰性検体のシグナルの５倍に相当する。シグナル／閾値の値が１を超えるものを陽性とする。
【００６６】
【表３】
2004516824.tif 000004
【００６７】
ＨＢｓＡｇ変異体の検出：
２Ｇ２Ｇ１０抗体について、Ｃａｒｍｅｎ博士から入手しＩｒｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．， （Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３１： １１７６−１１８１ （２０００））により以前報告された方法に従って調製した組換えＨＢｓＡｇ変異体の培養上清からのＨＢｓＡｇ変異体を検出する能力を試験した。
【００６８】
アッセイは、Ｖｉｄａｓ（登録商標）自動分析機上で行う蛍光免疫酵素定性試験法を用いて行った（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４２： ６３−７４ （１９９３）； Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ４１： ３５−４０ （１９９６））。この２段階捕獲試験法は、以下のように実施した。
【００６９】
２Ｇ２Ｇ１０抗体を、固相容器（ＳＰＲ）上に１０μｇ／ｍｌの最終濃度で固定化した。その後、ＳＰＲを種々の変異体に相当する組換えタンパク質および抗ＨＢｓＡｇビオチン化ヤギポリクローナル抗体を含む培養上清と同時にインキュベートした。次いで第２段階では、蛍光測定反応にアルカリ性ストレプトアビジン−フォスファターゼ複合体を用いた。
【００７０】
表４に示すように、別の抗ＨＢｓＡｇ抗体である６Ｈ６Ｂ６と比べて、２Ｇ２Ｇ１０抗体は、試験した種々の変異体の検出が可能であった。実際には、ＢＡ３．２およびＴ５Ｎ検体は、Ｉｒｅｌａｎｄら（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３１： １１７６−１１８１ （２０００））の報告があるように試験した培養上清中への抗原の分泌に影響を与えるＣ１２４ＲおよびＴ２３Ｎ突然変異をそれぞれ有する。したがって、これら２つの上清において検出されなかったことは、考慮に入れることはできない。
【００７１】
【表４】
2004516824.tif 000005
【００７２】
ＭＨＲ：主要親水性領域（ｍａｊｏｒ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｒｅｇｉｏｎ）を示す。
結果は、シグナル／閾値の２回の平均で示す。各抗体について、閾値は、精製された血漿ＨＢｓＡｇサブタイプａｄ／ａｙの０．１６ｎｇ／ｍｌで得られたシグナルの２回の平均で定義した。
ａ非希釈検体
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＨＢｓＡｇ抗原のアミノ酸配列を示す図である。
【国際公開パンフレット】
2004516824.tif 000006
2004516824.tif 000007
2004516824.tif 000008
2004516824.tif 000009
2004516824.tif 000010
2004516824.tif 000011
2004516824.tif 000012
2004516824.tif 000013
2004516824.tif 000014
2004516824.tif 000015
2004516824.tif 000016
2004516824.tif 000017
2004516824.tif 000018
2004516824.tif 000019
2004516824.tif 000020
2004516824.tif 000021
2004516824.tif 000022
2004516824.tif 000023
2004516824.tif 000024
2004516824.tif 000025
2004516824.tif 000026
2004516824.tif 000027
2004516824.tif 000028
2004516824.tif 000029
2004516824.tif 000030
2004516824.tif 000031
2004516824.tif 000032
2004516824.tif 000033
2004516824.tif 000034
2004516824.tif 000035
2004516824.tif 000036
2004516824.tif 000037
2004516824.tif 000038
【国際調査報告】
2004516824.tif 000039
2004516824.tif 000040
2004516824.tif 000041
2004516824.tif 000042
2004516824.tif 000043
2004516824.tif 000044