(57)【要約】本発明は、細胞を、異常な生育状態に対して、例えば正常なｐｔｃ経路を代行し又はスムースンド若しくはヘッジホッグ経路に拮抗するのに十分な量のヘッジホッグアンタゴニスト（例えば、小分子）と接触させることを含む、ヘッジホッグ機能増進、ｐｔｃ機能喪失又はスムースンド機能増進から生じる異常な生育状態を阻止するための利用可能な方法及び試薬を作成する。
2004531458.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）で表される化合物の製薬上許容しうる塩の水溶液を含む医薬配合物：
【化１】
2004531458.tif 000037
［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、
Ｒ１及びＲ４は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ２）ｎアリール又は−（ＣＨ２）ｎヘテロアリールを表わし、
Ｌは、それぞれについて独立して、不存在であるか或いは−（ＣＨ２）ｎ−、−アルケニル−、−アルキニル−、−（ＣＨ２）ｎアルケニル−、−（ＣＨ２）ｎアルキニル−、−（ＣＨ２）ｎＯ（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｎＮＲ８（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｎＳ（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｎアルケニル（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｎアルキニル（ＣＨ２）ｐ−、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−、−ＮＲ８（ＣＨ２）ｎ−又は−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−を表わし、
Ｘ及びＤは、独立して、−Ｎ（Ｒ８）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（Ｒ８）Ｎ−Ｎ（Ｒ８）−、−ＯＮ（Ｒ８）−及び直接結合から選択され、
Ｙ及びＺは独立してＯ及びＳから選択され、
Ｅは、ＮＲ５（Ｒ５はＬＲ８又はそのアンモニウム塩を表わす）を表わし、
Ｒ８は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ２）ｎアリール又は−（ＣＨ２）ｎヘテロアリールを表わすか、或いは２個のＲ８は一緒になって４員〜８員の環を形成し、
ｐは、それぞれについて独立して、０〜３の整数を表わし、
ｎは、それぞれについて独立して、０〜５の整数を表わし、
ｑ及びｒは、それぞれについて独立して、０〜２の整数を表わす］。
【請求項２】
Ｙ及びＺが、各々、Ｏを表す、請求項１に記載の配合物。
【請求項３】
ｑ及びｒの総和が、４未満である、請求項１に記載の配合物。
【請求項４】
Ｄが、アルアルキル又はヘテロアルアルキル置換されたアミンを表す、請求項１に記載の配合物。
【請求項５】
Ｒ１が、分枝したアルキル、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキルを表す、請求項１に記載の配合物。
【請求項６】
Ｒ１に結合したＬが、Ｏ、Ｓ又はＮＲ８を表す、請求項１に記載の配合物。
【請求項８】
Ｘが、環に含まれる、請求項１に記載の配合物。
【請求項９】
ＸＬＲ４が、環状アミンを含む、請求項１に記載の配合物。
【請求項１０】
塩が、塩化物、臭化物、沃化物、コハク酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、メシレート又はマレイン酸塩である、請求項１に記載の配合物。
【請求項１１】
溶液が、溶解した生理的に許容しうる塩を含む、請求項１に記載の配合物。
【請求項１２】
生理的に塩が、酢酸ナトリウムである、請求項１１に記載の配合物。
【請求項１３】
水溶液が、デキストロース、ラクトース、マンニトール、又は他のポリヒドロキシル化化合物から選択する溶質を更に含む、請求項１に記載の配合物。
【請求項１４】
水溶液が、２００〜４００ｍＯｓｍの浸透性を有する、請求項１に記載の配合物。
【請求項１５】
溶液が、３〜６の範囲のｐＨを有する、請求項１に記載の配合物。
【請求項１６】
配合物が、局所投与に適している、請求項１に記載の配合物。
【請求項１７】
下記の一般式（ＩＩ）で表される化合物の製薬上許容しうる塩の水溶液を含む医薬配合物：
【化２】
2004531458.tif 000038
［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ２）ｎアリール又は−（ＣＨ２）ｎヘテロアリールを表わし、
Ｌは、それぞれについて独立して、不存在であるか或いは−（ＣＨ２）ｎ−、−アルケニル−、−アルキニル−、−（ＣＨ２）ｎアルケニル−、−（ＣＨ２）ｎアルキニル−、−（ＣＨ２）ｎＯ（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｎＮＲ８（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｎＳ（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｎアルケニル（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｎアルキニル（ＣＨ２）ｐ−、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−、−ＮＲ８（ＣＨ２）ｎ−又は−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−を表わし、
Ｘは、独立して、−Ｎ（Ｒ８）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（Ｒ８）Ｎ−Ｎ（Ｒ８）−、−ＯＮ（Ｒ８）−及び直接結合から選択され、
Ｙ及びＺは独立してＯ及びＳから選択され、
Ｒ８は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ２）ｎアリール又は−（ＣＨ２）ｎヘテロアリールを表わすか、或いは２個のＲ８は一緒になって４員〜８員の環を形成し、
Ｍは、存在しないか又はＬ、−ＳＯ２Ｌ−又は−（Ｃ＝Ｏ）Ｌ−を表し；
ｐは、それぞれについて独立して、０〜３の整数を表わし、
ｎは、それぞれについて独立して、０〜５の整数を表わし、
ｑ、ｒ及びｓは、それぞれについて独立して、０〜２の整数を表わす］。
【請求項１８】
Ｙ及びＺが、それぞれ、Ｏを表す、請求項１７に記載の配合物。
【請求項１９】
ｑ、ｒ及びｓの総和が、４未満である、請求項１７に記載の配合物。
【請求項２０】
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の少なくとも１つが、アリール基を含む、請求項１７に記載の配合物。
【請求項２１】
ＸＬＲ４が、環状ジアミンを含む、請求項１７に記載の配合物。
【請求項２２】
Ｘが、ジアザ炭素環に含まれる、請求項１７に記載の配合物。
【請求項２３】
Ｒ１が、分枝したアルキル、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキルを表す、請求項１７に記載の配合物。
【請求項２４】
Ｒ１に結合したＬが、Ｏ、ＳまたはＮＲ８を表す、請求項１７に記載の配合物。
【請求項２５】
塩が、塩化物、臭化物、沃化物、コハク酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、メシレート又はマレイン酸塩である、請求項１７に記載の配合物。
【請求項２６】
溶液が、溶解した生理的に許容しうる塩を含む、請求項１７に記載の配合物。
【請求項２７】
生理的に塩が、酢酸ナトリウムである、請求項２６に記載の配合物。
【請求項２８】
水溶液が、デキストロース、ラクトース、マンニトール又は他のポリヒドロキシル化化合物から選択する溶質を更に含む、請求項１７に記載の配合物。
【請求項２９】
水溶液が、２００〜４００ｍＯｓｍの浸透性を有する、請求項１７に記載の配合物。
【請求項３０】
溶液が、３〜６の範囲のｐＨを有する、請求項１７に記載の配合物。
【請求項３１】
配合物が、局所投与に適している、請求項１７に記載の配合物。
【請求項３２】
細胞中のヘッジホッグ経路の活性化を阻止する方法であって、その細胞を請求項１に記載の配合物と接触させることを含む当該方法。
【請求項３３】
細胞中のヘッジホッグ経路の活性化を阻止する方法であって、その細胞を請求項１７に記載の配合物と接触させることを含む当該方法。
【請求項３４】
基底細胞癌を治療し又は予防する方法であって、請求項１に記載の配合物を、基底細胞癌の進行を阻止するのに十分な量で患者に投与することを含む当該方法。
【請求項３５】
基底細胞癌を治療し又は予防する方法であって、請求項１７に記載の配合物を、基底細胞癌の進行を阻止するのに十分な量で患者に投与することを含む当該方法。
【請求項３６】
下記の一般式（ＩＩＩ）で表される化合物の製薬上許容しうる塩の水溶液を含む医薬配合物：
【化３】
2004531458.tif 000039
［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ２）ｎアリール又は−（ＣＨ２）ｎヘテロアリールを表わし、
Ｌは、それぞれについて独立して、不存在であるか或いは−（ＣＨ２）ｎ−、−アルケニル−、−アルキニル−、−（ＣＨ２）ｎアルケニル−、−（ＣＨ２）ｎアルキニル−、−（ＣＨ２）ｎＯ（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｎＮＲ８（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｎＳ（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｎアルケニル（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｎアルキニル（ＣＨ２）ｐ−、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−、−ＮＲ８（ＣＨ２）ｎ−又は−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−を表わし、
Ｘは、−Ｎ（Ｒ８）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（Ｒ８）Ｎ−Ｎ（Ｒ８）−、−ＯＮ（Ｒ８）−及び直接結合から選択され、
Ｙ及びＺは独立してＯ及びＳから選択され、
Ｒ８は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ２）ｎアリール又は−（ＣＨ２）ｎヘテロアリールを表わすか、或いは２個のＲ８は一緒になって４員〜８員の環を形成し、
Ｍは、存在しないか又はＬ、−ＳＯ２Ｌ−又は−（Ｃ＝Ｏ）Ｌ−を表し；
ｐは、それぞれについて独立して、０〜３の整数を表わし、
ｎは、それぞれについて独立して、０〜５の整数を表わし、
ｑ及びｒは、それぞれについて独立して、０〜２の整数を表わす］。
【請求項３７】
ｑ及びｒの総和が、４未満である、請求項３６に記載の配合物。
【請求項３８】
Ｒ１が、分枝したアルキル、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキルを表す、請求項３６に記載の配合物。
【請求項３９】
ＸＬＲ４が、環状アミンを含む、請求項３６に記載の配合物。
【請求項４０】
塩が、塩化物、臭化物、沃化物、コハク酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、メシレート又はマレイン酸塩である、請求項３６に記載の配合物。
【請求項４１】
溶液が、溶解した生理的に許容しうる塩を含む、請求項３６に記載の配合物。
【請求項４２】
生理的に塩が、酢酸ナトリウムである、請求項３６に記載の配合物。
【請求項４３】
水溶液が、デキストロース、ラクトース、マンニトール又は他のポリヒドロキシル化化合物から選択する溶質を更に含む、請求項３６に記載の配合物。
【請求項４４】
水溶液が、２００〜４００ｍＯｓｍの浸透性を有する、請求項３６に記載の配合物。
【請求項４５】
溶液が、３〜６の範囲のｐＨを有する、請求項３６に記載の配合物。
【請求項４６】
配合物が、局所投与に適している、請求項３６に記載の配合物。
【請求項４７】
下記の一般式（ＩＶ）で表される化合物の製薬上許容しうる塩の水溶液を含む医薬配合物：
【化４】
2004531458.tif 000040
［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ２）ｎアリール又は−（ＣＨ２）ｎヘテロアリールを表わし、
Ｌは、それぞれについて独立して、不存在であるか或いは−（ＣＨ２）ｎ−、−アルケニル−、−アルキニル−、−（ＣＨ２）ｎアルケニル−、−（ＣＨ２）ｎアルキニル−、−（ＣＨ２）ｎＯ（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｎＮＲ８（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｎＳ（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｎアルケニル（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｎアルキニル（ＣＨ２）ｐ−、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−、−ＮＲ８（ＣＨ２）ｎ−又は−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−を表わし、
Ｘは、独立に、−Ｎ（Ｒ８）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（Ｒ８）Ｎ−Ｎ（Ｒ８）−、−ＯＮ（Ｒ８）−及び直接結合から選択され、
Ｒ８は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ２）ｎアリール又は−（ＣＨ２）ｎヘテロアリールを表わすか、或いは２個のＲ８は一緒になって４員〜８員の環を形成し、
Ｍは、存在しないか又はＬ、−ＳＯ２Ｌ−又は−（Ｃ＝Ｏ）Ｌ−を表し；
ｐは、それぞれについて独立して、０〜３の整数を表わし；そして
ｎは、それぞれについて独立して、０〜５の整数を表わす］。
【請求項４８】
Ｒ１が、分枝したアルキル、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキルを表す、請求項４７に記載の配合物。
【請求項４９】
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が、アリール基を含む、請求項４７に記載の配合物。
【請求項５０】
ＸＬＲ４が、環状アミンを含む、請求項４７に記載の配合物。
【請求項５１】
Ｘが、ジアザ炭素環の部分である、請求項４７に記載の配合物。
【請求項５２】
塩が、塩化物、臭化物、沃化物、コハク酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、メシレート又はマレイン酸塩である、請求項４７に記載の配合物。
【請求項５３】
溶液が、溶解した生理的に許容しうる塩を含む、請求項４７に記載の配合物。
【請求項５４】
生理的に塩が、酢酸ナトリウムである、請求項５３に記載の配合物。
【請求項５５】
水溶液が、デキストロース、ラクトース、マンニトール又は他のポリヒドロキシル化化合物から選択する溶質を更に含む、請求項４７に記載の配合物。
【請求項５６】
水溶液が、２００〜４００ｍＯｓｍの浸透性を有する、請求項４７に記載の配合物。
【請求項５７】
溶液が、３〜６の範囲のｐＨを有する、請求項４７に記載の配合物。
【請求項５８】
配合物が、局所投与に適している、請求項４７に記載の配合物。
【請求項５９】
細胞中のヘッジホッグ経路の活性化を阻止する方法であって、その細胞を請求項３６に記載の配合物と接触させることを含む当該方法。
【請求項６０】
細胞中のヘッジホッグ経路の活性化を阻止する方法であって、その細胞を請求項４７に記載の配合物と接触させることを含む当該方法。
【請求項６１】
基底細胞癌を治療し又は予防する方法であって、請求項３６に記載の配合物を、基底細胞癌の進行を阻止するのに十分な量で患者に投与することを含む当該方法。
【請求項６２】
基底細胞癌を治療し又は予防する方法であって、請求項４７に記載の配合物を、基底細胞癌の進行を阻止するのに十分な量で患者に投与することを含む当該方法。
【請求項６３】
下記の一般式（Ｖ）により表される化合物の製薬上許容しうる塩の水溶液を含む医薬配合物：
【化５】
2004531458.tif 000041
［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、
Ｙは、Ｏ又はＳであり、
Ｚ’は、ＳＯ２、−（Ｃ＝Ｓ）−又は−（Ｃ＝Ｏ）−であり、
ｐは、各出現につき独立に、０〜３の整数を表し、
ｎは、各出現につき独立に、０〜５の整数を表し、
ｑ及びｒは、各出現につき独立に、０〜２の整数を表し、
Ｖは不存在であるか又はＯ、Ｓ若しくはＮＲ８を表わし、
Ｇは不存在であるか又は−Ｃ（＝Ｏ）−若しくは−ＳＯ２−を表わし、
Ｊは、それぞれについて独立して、水素又はＪに接するＮの両方の存在がＪの少なくとも一つの存在により結合されるようにＮＣ（＝Ｙ）に結合した置換若しくは非置換の低級アルキル若しくはアルキレンを表わし、
Ｒ９は、それぞれについて独立して、不存在であるか又はＨ若しくは低級アルキルを表わし、或いはＪの二つの存在又はＪの一つの存在がＲ９の一つの存在と一緒になって５〜７員の環を形成し、この環はＮの一つ又は両方の存在を含み、  Ｒ５は置換又は非置換のアルキル（分岐状又は非分岐状の）、アルケニル（分岐状又非分岐状の）、アルキニル（分岐状又非分岐状の）、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキルを表わし、
Ｒ６は置換又非置換のアリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキル（多環式基も含めて）を表わし、
Ｒ７は置換又非置換のアリール、アラルキル、ヘテロアリール又はヘテロアラルキルを表わす］。
【請求項６４】
Ｙ及びＺが、Ｏである、請求項６３に記載の配合物。
【請求項６５】
ｑ及びｒの総和が、４未満である、請求項６３に記載の配合物。
【請求項６６】
少なくとも１つのＪの出現が、５〜８員のヘテロ環の部分である、請求項６３に記載の配合物。
【請求項６７】
Ｒ５が、分枝したアルキル、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキルを表す、請求項６３に記載の配合物。
【請求項６８】
Ｒ６が、少なくとも１つのヘテロ環を含む、請求項６３に記載の配合物。
【請求項６９】
Ｒ７が、フェニルアルキルを表す、請求項６３に記載の配合物。
【請求項７０】
塩が、塩化物、臭化物、沃化物、コハク酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、メシレート又はマレイン酸塩である、請求項６３に記載の配合物。
【請求項７１】
溶液が、溶解した生理的に許容しうる塩を含む、請求項６３に記載の配合物。
【請求項７２】
生理的に塩が、酢酸ナトリウムである、請求項７１に記載の配合物。
【請求項７３】
水溶液が、デキストロース、ラクトース、マンニトール又は他のポリヒドロキシル化化合物から選択する溶質を更に含む、請求項６３に記載の配合物。
【請求項７４】
水溶液が、２００〜４００ｍＯｓｍの浸透性を有する、請求項６３に記載の配合物。
【請求項７５】
溶液が、３〜６の範囲のｐＨを有する、請求項６３に記載の配合物。
【請求項７６】
配合物が、局所投与に適している、請求項６３に記載の配合物。
【請求項７７】
細胞中のヘッジホッグ経路の活性化を阻止する方法であって、その細胞を請求項６３に記載の配合物と接触させることを含む当該方法。
【請求項７８】
基底細胞癌を治療し又は予防する方法であって、請求項６３に記載の配合物を、基底細胞癌の進行を阻止するのに十分な量で患者に投与することを含む当該方法。
【請求項７９】
下記の一般式（ＶＩ）により表される化合物の製薬上許容しうる塩の水溶液を含む医薬配合物：
【化６】
2004531458.tif 000042
［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、
Ｙは、Ｏ又はＳであり、
Ｚ’は、ＳＯ２、−（Ｃ＝Ｓ）−又は−（Ｃ＝Ｏ）−であり、
ｐは、各出現につき独立に、０〜３の整数を表し、
ｎは、各出現につき独立に、０〜５の整数を表し、
Ｖは不存在であるか又はＯ、Ｓ若しくはＮＲ８を表わし、
Ｇは不存在であるか又は−Ｃ（＝Ｏ）−若しくは−ＳＯ２−を表わし、
Ｊは、それぞれについて独立して、水素又はＪに接するＮの両方の存在がＪの少なくとも一つの存在により結合されるようにＮＣ（＝Ｙ）に結合した置換若しくは非置換の低級アルキル若しくはアルキレン、例えばメチル、エチル、メチレン、エチレンなどを表わし、
Ｒ９は、それぞれについて独立して、不存在であるか又はＨ若しくは低級アルキルを表わし、或いはＪの二つの存在又はＪの一つの存在がＲ９の一つの存在と一緒になって５〜７員の環を形成し、この環はＮの一つ又は両方の存在を含み、  Ｒ５は置換又は非置換のアルキル（分岐状又は非分岐状の）、アルケニル（分岐状又非分岐状の）、アルキニル（分岐状又非分岐状の）、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキルを表わし、
Ｒ６は置換又非置換のアリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキル（多環式基も含めて）を表わし、
Ｒ７は置換又非置換のアリール、アラルキル、ヘテロアリール又はヘテロアラルキルを表わす］。
【請求項８０】
Ｙ及びＺが、Ｏである、請求項７９に記載の製剤。
【請求項８１】
少なくとも１つのＪの出現が、５〜８員のヘテロ環の部分である、請求項７９に記載の製剤。
【請求項８２】
Ｒ５が、分枝したアルキル、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキルを表す、請求項７９に記載の製剤。
【請求項８３】
Ｒ６が、少なくとも１つのヘテロ環を含む、請求項７９に記載の製剤。
【請求項８４】
Ｒ７が、フェニルアルキルを表す、請求項７９に記載の製剤。
【請求項８５】
塩が、塩化物、臭化物、沃化物、コハク酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、メシレート又はマレイン酸塩である、請求項７９に記載の製剤。
【請求項８６】
溶液が、溶解した生理的に許容しうる塩を含む、請求項７９に記載の製剤。
【請求項８７】
生理的に塩が、酢酸ナトリウムである、請求項８６に記載の配合物。
【請求項８８】
水溶液が、デキストロース、ラクトース、マンニトール又は他のポリヒドロキシル化化合物から選択する溶質を更に含む、請求項７９に記載の製剤。
【請求項８９】
水溶液が、２００〜４００ｍＯｓｍの浸透性を有する、請求項７９に記載の製剤。
【請求項９０】
溶液が、３〜６の範囲のｐＨを有する、請求項７９に記載の製剤。
【請求項９１】
配合物が、局所投与に適している、請求項７９に記載の製剤。
【請求項９２】
細胞中のヘッジホッグ経路の活性化を阻止する方法であって、その細胞を請求項７９に記載の配合物と接触させることを含む当該方法。
【請求項９３】
基底細胞癌を治療し又は予防する方法であって、請求項７９に記載の配合物を、基底細胞癌の進行を阻止するのに十分な量で患者に投与することを含む当該方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
パターン形成は、胚細胞が分化した組織の秩序だった空間的配置を形成する活動である。高等生物の身体的複雑さは、細胞固有の系列と細胞の外からのシグナリングとの相互作用によって胚形成中に増大する。誘導的相互作用は、最初期のボディプランの確立から臓器系のパターン形成までの、脊椎動物発生における胚のパターン形成及び、組織分化中の様々な細胞型の発生に必須である（Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｅ．，（１９９０）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １０８：３６５−３８９；Ｇｕｒｄｏｎ，Ｊ．Ｂ．，（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８：１８５−１９９；Ｊｅｓｓｅｌｌ，Ｔ．Ｍ．等、（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８：２５７−２７０）。発生中の細胞の相互作用の効果は、変化する。典型的には、応答する細胞は、細胞分化の一つの経路から他の経路へ、応答する細胞の未誘導の及び誘導された状態の両方と異なる細胞を誘導することによりによりそらされる（誘導）。ときには、細胞は、それらの隣接細胞にそれらと同じに分化することを誘導し（ホメオジェネティック誘導）；他の場合には、細胞は、その隣接細胞にそれと同じに分化することを禁止する。初期発生における細胞相互作用は、順次的であり、それで、２つの細胞型間での初期の誘導は、多様性の漸進的増幅へと導く。その上、誘導的相互作用は、胚においてだけでなく、成体の細胞においても起き、形態形成パターンを確立して維持するように作用し並びに分化を誘導することができる（Ｊ．Ｂ．Ｇｕｒｄｏｎ（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８：１８５−１９９）。
【０００２】
シグナル伝達分子のヘッジホッグファミリーのメンバーは、無脊椎動物及び脊椎動物の発生中に、多くの重要な短距離及び長距離パターニング過程を媒介する。ハエにおいては、単一のヘッジホッグ遺伝子が、体節及び成虫原基のパターニングを調節する。対照的に、脊椎動物では、ヘッジホッグ遺伝子ファミリーは、左右非対称性、ＣＮＳ、体節及び肢におけるポラリティー、器官形成、軟骨形成並びに精子形成の制御に関与している。
【０００３】
最初のヘッジホッグ遺伝子は、ショウジョウバエＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおける遺伝的スクリーニングにより同定された（Ｎｕｓｓｌｅｉｎ−Ｖｏｌｈａｒｄ，Ｃ．及びＷｉｅｓｃｈａｕｓ，Ｅ．（１９８０） Ｎａｔｕｒｅ ２８７，７９５−８０１）。このスクリーニングは、胚及び幼虫の発生に影響を及ぼす突然変異を同定した。１９９２年と１９９３年に、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのヘッジホッグ（ｈｈ）遺伝子の分子的性質が報告され（Ｃ．Ｆ．，Ｌｅｅ等（１９９２）Ｃｅｌｌ ７１，３３−５０）、その後、幾つかのヘッジホッグ同族体が種々の脊椎動物種から単離された。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａと他の無脊椎動物において唯一つのヘッジホッグ遺伝子が発見されたのに対して、脊椎動物には多数のヘッジホッグ遺伝子が存在する。
【０００４】
ヘッジホッグ遺伝子の脊椎動物ファミリーには、少なくとも４つのメンバー（例えば、単一のショウジョウバエのヘッジホッグ遺伝子のパラログ）が含まれる。典型的なヘッジホッグ遺伝子及びタンパク質は、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１８８５６及びＷＯ９６／１７９２４に記載されている。これらのメンバーの内の３つ｛ここでは、デザートヘッジホッグ（Ｄｈｈ）、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）及びインディアンヘッジホッグ（Ｉｈｈ）と呼ぶ｝は、明らかに、魚類、鳥類及び哺乳類を含むすべての脊椎動物中に存在する。第４のメンバー｛ここでは、ｔｉｇｇｉｅ−ｗｉｎｋｌｅヘッジホッグ（Ｔｈｈ）と呼ぶ｝は、魚類に特徴的であるようである。デザートヘッジホッグ（Ｄｈｈ）は、マウスの胚発生並びに成体のゲッ歯動物及びヒトの両者において、主として、精巣で発現されており；インディアンヘッジホッグ（Ｉｈｈ）は、胚形成中の骨の発生及び成体における骨の形成に関与しており；そして、Ｓｈｈは、上記のように、主に、形態形成及び神経誘導活動に関与している。脊椎動物の器官の発生及び維持におけるヘッジホッグポリペプチドの臨界的な誘導的役割を仮定すれば、ヘッジホッグと相互作用するタンパク質の同定は、臨床及び研究の両方の関係において、最も重要である。
【０００５】
様々なヘッジホッグタンパク質は、シグナルペプチド、高度に保存されたＮ−末端領域、及び一層分岐したＣ末端ドメインよりなる。分泌経路でのシグナル配列の開裂に加えて（Ｌｅｅ，Ｊ．Ｊ．等（１９９２）Ｃｅｌｌ ７１：３３−５０；Ｔａｂａｔａ，Ｔ．等（１９９２）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２６３５−２６４５；Ｃｈａｎｇ，Ｄ．Ｅ．等（１９９４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２０：３３３９−３３５３）、ヘッジホッグの前駆体タンパク質は、Ｃ末端部分の保存された配列に依存する内部自己タンパク質分解性開裂を受ける（Ｌｅｅ等（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１５２８−１５３７；Ｐｏｒｔｅｒ等（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７４：３６３−３６６）。この開裂は、１９ｋＤのＮ末端ペプチドと２６〜２８ｋＤのＣ末端ペプチドへと導く（Ｌｅｅ等（１９９２）前出；Ｔａｂａｔａ等（１９９２）前出；Ｃｈａｎｇ等（１９９４）前出；Ｌｅｅ等（１９９４）前出；Ｂｕｍｃｒｏｔ，Ｄ．Ａ．等（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：２２９４−２３０３；Ｐｏｒｔｅｒ等（１９９５）前出；Ｅｋｋｅｒ，Ｓ．Ｃ．等（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．５：９４４−９５５；Ｌａｉ，Ｃ．Ｊ．等（１９９５）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１：２３４９−２３６０）。このＮ末端ペプチドは、それが合成された細胞の表面にきつく結合したままでいるが、Ｃ末端ペプチドは、イン・ビトロ及びイン・ビボの両方で自由に拡散しうる（Ｐｏｒｔｅｒ等（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７４：３６３；Ｌｅｅ等（１９９４）前出；Ｂｕｍｃｒｏｔ等（１９９５）前出；Ｍａｒｔｉ，Ｅ．等（１９９５）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１：２５３７−２５４７；Ｒｏｅｌｉｎｋ，Ｈ．等（１９９５）Ｃｅｌｌ ８１：４４５−４５５）。興味深いことに、このＮ末端ペプチドの細胞表面保持は、内部開裂の正常位置で正確に停止するＲＮＡによりコードされたＨＨの切り詰め型は、イン・ビトロ（Ｐｏｒｔｅｒ等（１９９５）前出）及びイン・ビボ（Ｐｏｒｔｅｒ，Ｊ．Ａ．等（１９９６）Ｃｅｌｌ ８６，２１−３４）において拡散しうるので、自己開裂に依存している。生化学的研究は、ＨＨ前駆体タンパク質の自己タンパク質分解性開裂が、内部チオエステル中間体を経て進行し、続いて、該中間体が親核置換にて開裂されるということを示した。親核試薬が小さい親油性分子であって、それがＮペプチドのＣ末端に共有結合して（Ｐｏｒｔｅｒ等（１９９６）前出）それを細胞表面に繋ぎ留めるということはありそうなことである。それらの生物学的意味は、深淵である。この繋ぎ留めの結果、Ｎ末端ヘッジホッグの局所的高濃度が、ヘッジホッグ産生細胞の表面に生じる。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ及び脊椎動物における短距離及び長距離のヘッジホッグシグナル伝達活性に必要且つ十分であるのは、このＮ末端ペプチドである（Ｐｏｒｔｅｒ等（１９９５）前出；Ｅｋｋｅｒ等（１９９５）前出；Ｌａｉ等（１９９５）前出；Ｒｏｅｌｉｎｋ，Ｈ．等（１９９５）Ｃｅｌｌ ８１：４４５−４５５；Ｐｏｒｔｅｒ等（１９９６）前出；Ｆｉｅｔｚ，Ｍ．Ｊ．等（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．５：６４３−６５１；Ｆａｎ，Ｃ．−Ｍ．等（１９９５）Ｃｅｌｌ ８１：４５７−４６５；Ｍａｒｔｉ，Ｅ．等（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７５：３２２−３２５；Ｌｏｐｅｚ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ等（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ ５：７９１−７９５；Ｅｋｋｅｒ，Ｓ．Ｃ．等（１９９５）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１：２３３７−２３４７；Ｆｏｒｂｅｓ，Ａ．Ｊ．等（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２：１１２５−１１３５）。
【０００６】
ＨＨは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの発生中に様々な部位で短距離及び長距離のパターニング過程に関係付けられてきた。初期胚におけるセグメントポラリティーの確立において、それは、直接媒介されるように見える短距離効果を有するが、成虫原基のパターニングにおいては、それは、二次的シグナルの誘導を介する長距離効果を誘導する。
【０００７】
脊椎動物において、幾つかのヘッジホッグ遺伝子が、過去数年間にクローン化されてきた。これらの遺伝子の内で、Ｓｈｈは、隣接組織をパターン形成するシグナルの源である種々のオーガナイズセンターで発現されるので、実験的注意の殆どを受けてきた。最近の証拠は、Ｓｈｈがこれらの相互作用に関与していることを示している。
【０００８】
Ｓｈｈの発現は、予定正中線中胚葉、マウス（Ｃｈａｎｇ等（１９９４）前出；Ｅｃｈｅｌａｒｄ，Ｙ．等（１９９３）Ｃｅｌｌ ７５：１４１７−１４３０）、ラット（Ｒｏｅｌｉｎｋ，Ｈ．等（１９９４）Ｃｅｌｌ ７６：７６１−７７５）及びニワトリ（Ｒｉｄｄｌｅ，Ｒ．Ｄ．等（１９９３）Ｃｅｌｌ ７５：１４０１−１４１６）の節板、並びにゼブラフィッシュの盾状部（Ｅｋｋｅｒ等（１９９５）前出；Ｋｒａｕｓｓ，Ｓ．等（１９９３）Ｃｅｌｌ ７５：１４３１−１４４４）における原腸形成の開始の少し後で開始する。ニワトリ胚において、節板でのＳｈｈの発現パターンは、左右非対称になり、これは、心臓の左右位置の原因であるようである（Ｌｅｖｉｎ，Ｍ．等（１９９５）Ｃｅｌｌ ８２：８０３−８１４）。
【０００９】
ＣＮＳにおいて、脊索及び底板由来のＳｈｈは、腹側細胞の運命を誘導するようである。Ｓｈｈは、異所的に発現した場合には、マウス（Ｅｃｈｅｌａｒｄ等（１９９３）前出；Ｇｏｏｄｒｉｃｈ等（１９９６）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１０：３０１−３１２）、アフリカツメガエル（Ｒｏｅｌｉｎｋ，Ｈ．等（１９９４）前出；Ｒｕｉｚ ｉ Ａｌｔａｂａ，Ａ．等（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６：１０６−１２１）、及びゼブラフィッシュ（Ｅｋｋｅｒ等（１９９５）前出；Ｋｒａｕｓｓ等（１９９３）前出；Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ，Ｍ．等（１９９６）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１０：６４７−６５８）の中脳及び菱脳の広い領域の腹側化へと導く。脊髄レベルでの中間神経外胚葉の外植片において、Ｓｈｈタンパク質は、底板及び運動ニューロンの発生を別個の濃度閾値で誘導するが、高濃度では底板を誘導し、一層低濃度では運動ニューロンを誘導する（Ｒｏｅｌｉｎｋ等（１９９５）前出；Ｍａｒｔｉ等（１９９５）前出；Ｔａｎａｂｅ，Ｙ．等（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．５：６５１−６５８）。その上、抗体ブロッキングは、脊索により生成されたＳｈｈが、脊索媒介の運動ニューロン運命の誘導に必要であることを示唆する（Ｍａｒｔｉ等（１９９５）前出）。従って、Ｓｈｈ産生正中線細胞の表面における高濃度のＳｈｈは、イン・ビトロで認められる底板の接触媒介性誘導及びイン・ビボでの脊索の直ぐ上の底板の正中線位置決めを説明するように見える（Ｐｌａｃｚｅｋ等（１９９３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１７：２０５−２１８）。脊索と底板から放出される一層低濃度のＳｈｈは、おそらく、一層遠位の腹側外側領域で運動ニューロンを、イン・ビトロで接触に依存しないように見えたプロセスにおいて誘導するのであろう（Ｙａｍａｄａ，Ｔ．等（１９９３）Ｃｅｌｌ ７３：６７３−６８６）。中脳及び菱脳レベルで採取した外植片において、Ｓｈｈは又、適当な腹側外側の神経細胞型、ドーパミン作動性（Ｈｅｙｎｅｓ，Ｍ．等（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ １５：３５−４４；Ｗａｎｇ，Ｍ．Ｚ．等（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１：１１８４−１１８８）及びコリン作動性（Ｅｒｉｃｓｏｎ，Ｊ．等（１９９５）Ｃｅｌｌ ８１：７４７−７５６）前駆細胞をもそれぞれ誘導し、これは、ＳｈｈがＣＮＳの全長にわたって腹側の特定化の一般的インデューサーであることを示唆している。これらの観察は、Ｓｈｈに対する差次的応答が特定の前後位置で、如何にして制御されているのかについての疑問を起こさせる。
【００１０】
正中線からのＳｈｈは又、脊椎動物胚の軸傍領域、体幹中の（Ｆａｎ等（１９９５）前出）体節及びそれらの体節の上部間充織吻（Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ等（１９９６）前出）をもパターン形成する。ニワトリとマウスの軸傍中胚葉外植片において、Ｓｈｈは、皮膚筋節マーカーＰａｘ３を犠牲にしてＰａｘ１及びＴｗｉｓｔのような硬節特異的なマーカーの発現を促進する。その上、フィルターバリヤー実験は、Ｓｈｈが、硬節の誘導を、二次的なシグナル伝達機構の活性化によるのではなく直接媒介することを示唆している（Ｆａｎ，Ｃ．−Ｍ．及びＴｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ，Ｍ．（１９９４）Ｃｅｌｌ ７９，１１７５−１１８６）。
【００１１】
Ｓｈｈは又、筋節遺伝子発現をも誘導する（Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ等（１９９６）前出；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．Ｌ．等（１９９４）Ｃｅｌｌ ７９：１１６５−１１７３；Ｍｕｎｓｔｅｒｂｅｒｇ，Ａ．Ｅ．等（１９９５）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．９：２９１１−２９２２；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｅ．Ｓ．等（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２：２７１−２８０）｛もっとも、最近の実験は、ＷＮＴファミリー（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｗｉｎｇｌｅｓｓの脊椎動物同族体）のメンバーが協調して必要とされることを示しているが（Ｍｕｎｓｔｅｒｂｅｒｇ等（１９９５）前出）｝。訳の分からないことに、ニワトリにおける筋節の誘導は、硬節マーカーの誘導よりも一層高濃度のＳｈｈを必要とする（Ｍｕｎｓｔｅｒｂｅｒｇ等（１９９５）前出）が、硬節は、脊索の一層近くに位置する体節細胞から生じている。同様の結果が、ゼブラフィッシュにおいて得られ、高濃度のヘッジホッグが筋節を誘導し且つ硬節マーカー遺伝子の発現を抑制した（Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ等（１９９６）前出）。しかしながら、羊膜動物と対照的に、これらの観察は、魚類胚の構成と一致して、筋節が優勢で一層軸性の構成要素である。従って、Ｓｈｈシグナリングの調節及び新規なシグナリング因子の獲得は、脊椎動物の進化において、体節構造を改変しえた。
【００１２】
脊椎動物の肢芽において、後部間充織細胞のサブセット、「極性化活性帯」（ＺＰＡ）は、前後足指の同定を調節する（Ｈｏｎｉｇ，Ｌ．Ｓ．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９１：７２−７３に総説されている）。Ｓｈｈの異所的発現又はＳｈｈペプチドに浸したビーズの適用は、前側ＺＰＡ移植片の効果を真似て、足指の鏡像複製を生じる（Ｃｈａｎｇ等（１９９４）前出；Ｌｏｐｅｚ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ等（１９９５）前出；Ｒｉｄｄｌｅ等（１９９３）前出）（図２）。従って、足指の同定は、主として、Ｓｈｈ濃度に依存しているようであるが、他のシグナルがＡＰパターニングに必要であるらしいかなりの距離（１００〜１５０μｍ）を超えて、この情報を中継するということはあり得る。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ成虫原基におけるＨＨとＤＰＰの相互作用と同様に、脊椎動物の肢芽において、Ｓｈｈは、Ｂｍｐ２（ｄｐｐ同族体）の発現を活性化する（Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｐ．Ｈ．等（１９９４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２０：２０９−２１８）。しかしながら、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａにおけるＤＰＰと異なり、Ｂｍｐ２は、ニワトリの肢芽における異所的適用に際してＳｈｈの極性化効果を真似できない（Ｆｒａｎｃｉｓ等（１９９４）前出）。前後パターニングに加えて、Ｓｈｈは又、後端外胚葉隆起における繊維芽細胞成長因子ＦＧＦ４の合成の誘導により、肢の近遠生長にも関与するらしい（Ｌａｕｆｅｒ，Ｅ．等（１９９４）Ｃｅｌｌ ７９：９９３−１００３；Ｎｉｓｗａｎｄｅｒ，Ｌ．等（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３７１：６０９−６１２）。
【００１３】
ヘッジホッグタンパク質とＢＭＰの間の近い関係が、脊椎動物のヘッジホッグの発現の多くの部位（但し、おそらく、すべてではない）で保存されてきたことは、ありそうなことである。例えば、ニワトリの後腸において、Ｓｈｈは、Ｂｍｐ４（別の脊椎動物のｄｐｐ同族体）の発現を誘導することが示されている（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．Ｊ．等（１９９５）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１：３１６３−３１７４）。更に、ＳｈｈとＢｍｐ２、４又は６は、胃、泌尿生殖器系、肺、歯蕾及び毛嚢の上皮及び間充織細胞におけるそれらの発現において、著しい相関関係を示す（Ｂｉｔｇｏｏｄ，Ｍ．Ｊ．及びＭｃＭａｈｏｎ，Ａ．Ｐ．（１９９５）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１７２：１２６−１３８）。更に、Ｉｈｈ（２つの他のマウスヘッジホッグ遺伝子の一つ）は、消化管及び発生中の軟骨において、Ｂｍｐを発現する細胞に隣接して発現される（Ｂｉｔｇｏｏｄ及びＭｃＭａｈｏｎ（１９９５）前出）。
【００１４】
最近の証拠は、Ｉｈｈが、軟骨発生の調節において重大な役割を演じるモデルを示唆している（Ｒｏｂｅｒｔｓ等（１９９５）前出）。軟骨形成中に、軟骨細胞は、増殖状態から中間、前肥大状態を経て、分化した肥大軟骨細胞に進行する。Ｉｈｈは、前肥大軟骨細胞において発現されて、軟骨細胞の分化のブロックに導くシグナル伝達カスケードを開始する。その直接の標的は、Ｉｈｈ発現ドメインの周囲の軟骨膜であり、それは、Ｇｌｉ及びパッチト（Ｐｔｃ）（ヘッジホッグシグナルの保存された転写標的）の発現により応答する（下記参照）。最もありそうなことには、これは、関節周囲の軟骨膜における副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）の合成を生じる二次的シグナリングへと導く。ＰＴＨｒＰ自体は、前肥大軟骨細胞にシグナルを返して、それらの更なる分化をブロックする。同時に、ＰＴＨｒＰは、Ｉｈｈの発現を抑制し、それにより、軟骨細胞の分化の速度を調節する負のフィードバックループを形成する。
【００１５】
パッチトは、最初、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおいて、セグメントポラリティー遺伝子（胚の前後軸に沿った同族列に生じる個々のセグメント内の細胞分化に影響を与える発生遺伝子のグループの一つ）として同定された。Ｈｏｏｐｅｒ，Ｊ．Ｅ．等（１９８９）Ｃｅｌｌ ５９：７５１；及びＮａｋａｎｏ，Ｙ．等（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５０８を参照されたい。パッチトの脊椎動物同族体の発現パターンは、それが、神経管、骨格、肢、頭蓋顔面構造及び皮膚の発生に関与することを示唆する。
【００１６】
遺伝及び機能の研究は、パッチトが、ヘッジホッグシグナリングカスケード（下流の多くの遺伝子の発現を調節する進化的に保存された経路）の部分であることを示している。Ｐｅｒｒｉｍｏｎ，Ｎ．（１９９５）Ｃｅｌｌ ８０：５１７；及びＰｅｒｒｉｍｏｎ，Ｎ．（１９９６）Ｃｅｌｌ ８６：５１３を参照されたい。パッチトは、標的遺伝子の構成的な転写の抑制に関係しており；その効果は、ヘッジホッグ又は脊椎動物の同族体にコードされる転写を活性化する分泌糖タンパク質に妨害される。この経路の制御下の遺伝子には、Ｗｎｔ及びＴＧＦβファミリーのメンバーが含まれる。
【００１７】
パッチトタンパク質は、２つの大きい細胞外ドメイン、１２の膜貫通セグメント及び幾つかの細胞質セグメントを有する。Ｈｏｏｐｅｒ前出；Ｎａｋａｏ前出；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．Ｌ．等（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：１６６８；及びＨａｈｎ，Ｈ．等（１９９６）Ｃｅｌｌ ８５：８４１を参照されたい。パッチトのヘッジホッグシグナリング経路における生化学的役割は、不明である。しかしながら、ヘッジホッグタンパク質との直接的相互作用が報告されており（Ｃｈｅｎ，Ｙ．等（１９９６）Ｃｅｌｌ ８７：５５３）、パッチトは、ヘッジホッグレセプター複合体に、スムースンド遺伝子によりコードされる他の膜貫通タンパク質と共に関係しうる。Ｐｅｒｒｉｍｏｎ，前出；及びＣｈｅｎ，前出を参照されたい。
【００１８】
パッチトのヒトの同族体が、最近、クローン化され、染色体９ｑ２２．３にマップされた。Ｊｏｈｎｓｏｎ，前出；及びＨａｈｎ，前出を参照されたい。この領域は、肋骨及び頭蓋顔面変性、手及び脚の異常、並びに二分脊椎を含む発生異常を特徴とする、基底細胞母斑症候群（ＢＣＮＳ）に関係している。
【００１９】
ＢＣＮＳは又、多数の腫瘍型にかかりやすくもし、最も高頻度なのは、身体の多くの場所に生じ生涯の最初の２０年以内に現れる基底細胞癌（ＢＣＣ）である。しかしながら、ＢＣＣの殆どの症例は、この症候群に関係なく、北欧の家系の中年又は一層年配の人々の日光にさらされる部位に少数散発的に生じる。
【００２０】
ＢＣＮＳ関連の及び散発性のＢＣＣにおける最近の研究は、パッチトの両アレルの機能欠損がＢＣＣの発生へと導くことを示唆している。Ｊｏｈｎｓｏｎ，前出；Ｈａｈｎ，前出及びＧａｉｌａｎｉ，Ｍ．Ｒ．等（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４：７８を参照されたい。染色体９ｑ２２．３の単一アレル欠損は、散発性及び遺伝性のＢＣＣの両者において頻繁に生じている。連鎖分析は、ＢＣＮＳ患者由来の腫瘍において、欠損した遺伝性のアレルが保持されて正常なアレルが失われていることを示した。
【００２１】
散発性の腫瘍も又、パッチトの両機能性アレルの喪失を示した。一本鎖コンホメーション多形スクリーニングアッセイによりパッチト変異が同定された１２の腫瘍の内で、９つが、第２アレルの染色体欠失を有し、他の３つは、両アレルに不活性化変異を有した（Ｇａｉｌａｎｉ，前出）。対応する生殖細胞系列のＤＮＡには、変化は生じなかった。
【００２２】
殆どの同定された突然変異は、時期尚早の停止コドン又はフレームシフトを生じた。Ｌｅｎｃｈ，Ｎ．Ｊ．等、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１９９７ Ｏｃｔ； １００（５−６）：４９７−５０２。しかしながら、幾つかは、細胞外又は細胞質ドメインにおけるアミノ酸置換へと導く点突然変異であった。これらの変異部位は、細胞外タンパク質又は細胞質の下流のシグナル伝達経路のメンバーとの相互作用についての機能的重要性を示しうる。
パッチトの遺伝子発現の阻止への関与及びＢＣＣにおけるパッチトの頻繁なアレル欠失の出現は、この遺伝子についての腫瘍サプレッサー機能を支持する。細胞シグナル伝達及び細胞間コミュニケーションに関与することが知られた遺伝子ファミリーの調節におけるその役割は、腫瘍抑制の可能な機構を与える。
【００２３】
発明の要約
本発明は、ヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化例えばｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進などの表現型から生じる異常型の増殖状態を阻止するために、細胞をその異常型の増殖状態を逆転させ又は制御する（例えば、正常なｐｔｃ活性を代行し、正常なヘッジホッグ活性と拮抗し又はスムースンド活性と拮抗する）のに十分な量の小型分子などの薬剤と接触させることを含む利用可能な方法及び試薬を提供する。
【００２４】
図１〜３１は、本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
図３２ａ〜ｏは、本発明の代表的な化合物を図解した図である。
図３３Ａは、ビヒクル（レーン１）；５μＭ ジャービン、ポジティブコントロール化合物（レーン２）；及び１μＭ Ｄ（レーン３）で処理した細胞におけるｇｌｉ−１ｍＲＮＡの発現を示す図である。ビヒクルと比較して、Ｄ及びジャービンは、ｇｌｉ−１ｍＲＮＡの発現を有意に減じた。
図３３Ｂは、Ｄ及びジャービンが、ｇｌｉ−１ｍＲＮＡレベルを阻止することを示す図である（定量的リアルタイムＰＣＲにより測定）。
図３４Ａは、Ｓｈｈタンパク質を培養皮膚外植片に加えることが、これらの培養物の青色染色（Ｘ−ｇａｌ）により示されるように、ｐｔｃ活性化を生じたことを示す図である。組織学的試料は、好塩基性核を有して核対細胞質比の大きい強く染色された細胞を示している（Ｈ＆Ｅ［１０×］及びＨ＆Ｅ［４０×］）。これらの構造は、それらが皮膚の層中にクラスターで配置されていて正常な外観の皮膚細胞の柵により分離されている点で、ＢＣＣに似ている。青色染色は、パッチト経路がＢＣＣ様構造内の細胞において活性であったことを示している（エオシン＋Ｘ−ｇａｌ）。
図３４Ｂは、マウス皮膚パンチ内のＢＣＣ様クラスター（その一つを矢印で示してある）が、未分化ケラチノサイトのマーカーのケラチン−１４（褐色の反応生成物）を発現したことを図解する図である。上皮中の未分化基底細胞も又、ケラチン−１４陽性であった。ヒトＢＣＣは、ケラチン−１４を発現することが報告されている。
図３５Ａは、Ｄの濃度の増大が、ｌａｃＺレポーター酵素活性の量の投与量依存性の減少と関係していることを示す図である。低レベルのｌａｃＺ活性は、Ｓｈｈタンパク質の存在下での減少したパッチト経路活性を示す。
図３５Ｂは、Ｄ処理した外植片の染色を示し又、０．２μＭ Ｄが、Ｓｈｈタンパク質だけで処理した皮膚パンチの強いＸ−ｇａｌ染色と比較して、Ｘ−ｇａｌ染色を減じたことを示す図である（これは、ｐｔｃ遺伝子の発現のダウンレギュレーションを示している）。
図３５Ｃは、Ｄで処理した皮膚パンチの組織学的試料を描いた図（下段）であり、この処理がＳｈｈ誘導されるＢＣＣ様構造の出現を阻止したことを示唆している。
図３６は、６日間外因性Ｓｈｈタンパク質だけで処理した皮膚パンチが、ビヒクルだけで処理したもの（上段）と比較して強いＸ−ｇａｌ染色を示したことを描いた図である。外因性Ｓｈｈタンパク質にさらす前に、Ｄで５時間にわたって、１０、２０及び５０μＭで予備処理した皮膚パンチは、パッチト経路のＳｈｈタンパク質誘導されたアップレギュレーションの完全な阻止を示した（下段右側の３スライド）。ビヒクルで処理した皮膚パンチを外因性Ｓｈｈタンパク質にさらした場合には強いＸ−ｇａｌ染色により示されるような如何なる阻止も見られなかった（下段左）。短期間の予備処理は、本質的に、ｐｔｃ阻止のレベルに関して、Ｄへの６日間の暴露に等しかった（上段と下段を比較されたい）。
図３７Ａは、Ｄが、１又は５μＭで、処理した皮膚パンチにおいてＳｈｈ誘導されたＢＣＣ様構造の大きさ及び数を、ビヒクルで処理した外植片と比較して有意に減少させることを示す図である。
図３７Ｂは、５μＭ Ｄ（右側）又はビヒクル（左側）にさらした２日後に、アポトーシスを起こした核（右側のスライド中で褐色により示されている）がＢＣＣ様構造内に出現したことを図解した図である。
図３８Ａは、Ｄでの短期処理が、ビヒクルと比較して、Ｘ−ｇａｌ染色の量を減じたことを示した図である（経路の活性のダウンレギュレーションを示唆している）。
図３８Ｂは、１μＭの濃度でさえ、Ｄが、ビヒクルと比較して、Ｘ−ｇａｌ陽性ＢＣＣ様構造の退行を誘導したことを示した図である。
図３８Ｃは、Ｄでの短期処理が、ｇｌｉ−１転写を完全にダウンレギュレートしたことを描いた図である（左側）。この効果は、ハウスキーピング酵素ＧＡＰＤＨの適切に一定のｍＲＮＡレベル（右側）により示されるように、パッチト経路に特異的であることが判明し、一般的な細胞障害性のためだけではなかった。
図３９Ａ：処理した外植片のＸ−ｇａｌ染色は、ビヒクルだけの存在下で培養した皮膚パンチが、強く染色された青色のフォーカスを生成したことを示したが、これは、パッチト経路及びＢＣＣ構造のアップレギュレーションを示している。ビヒクルと比較して、５μＭ Ｄは、ジャービンのポジティブコントロールと同様に、ＢＣＣ構造（青色スポット）の数と大きさを大いに減じた。
図３９Ｂ：組織学的試料は、５μＭ Ｄが、紫外線誘導されたＢＣＣ構造の数を、ビヒクルコントロールと比較して減じたことを示した。
図３９Ｃ：トランスジェニックマウス由来の皮膚パンチにおいて、Ｄは、１及び５μＭの濃度で、ｇｌｉ−１ｍＲＮＡのレベルを、ビヒクルだけで処理したマウス由来の皮膚パンチと比較して有意に阻止した（左側）。この阻止は、ハウスキーピングＧＡＰＤＨ酵素をコードする遺伝子のｍＲＮＡレベルのグループ間での統計的比較（ＡＮＯＶＡ使用）が一般的な細胞代謝活性の有意の差異を示さなかったので（右側）、非特異的な細胞障害性により引き起こされるものではないようであった。
図４０Ａ：ＢＣＣに特徴的な形態学的特徴（例えば、未分化基底細胞の島、及び幾つかの場合には、周囲の細胞の柵及び間質クレフティング）は、培養物をＨ＆Ｅで染色した場合に保持されていた。
図４０Ｂ：ＧＬＩ−１遺伝子（パッチトシグナリングの枢要な指標）は、赤色で示されるように、高レベルで活性のままであった。
図４１：定量的なイン・シトゥーハイブリダイゼーションは、ＧＬＩ−１発現のレベルが、ビヒクル処理したコントロールと比較して、Ｄ処理した試料において誘導されることを示している。
【００２５】
発明の詳細な説明
Ｉ．概観
本発明は、ヘッジホッグ、パッチト（ｐｔｃ）、ｇｌｉ及び／又はスムースンドにより調節されるシグナル変換経路が、少なくとも部分的に、小型分子によって阻害されうるという発見に関係する。如何なる特定の理論に拘束されることも望まないが、レセプターの活性化は、これらの因子が作用する機構でありうる。例えば、これらの因子の、パッチト機能欠損（ｐｔｃｌｏｆ）細胞の増殖を阻止する能力は、かかる分子のヘッジホッグ、パッチト若しくはスムースンドと相互作用し又は少なくともそれらのタンパク質のヘッジホッグ、ｐｔｃ及び／若しくはスムースンド媒介のシグナル変換経路を活性化する能力を邪魔する能力のためでありうる。
【００２６】
それ故、ヘッジホッグ、ｐｔｃ又はスムースンドシグナル変換活性の状況を邪魔するこれらの小型分子が、同様に、正常細胞及び／又はパッチト機能欠損表現型、ヘッジホッグ機能亢進表現型若しくはスムースンド機能亢進表現型を有する細胞において増殖（又は他の生物学的結果）を阻害することができるということが特に予期される。従って、ある具体例において、これらの化合物が、正常細胞例えばヘッジホッグ経路を活性化する遺伝子変異を有しない細胞におけるヘッジホッグ活性の阻害に有用でありうることが予想される。好適具体例において、主題のインヒビターは、２５００ａｍｕ未満の、一層好ましくは１５００ａｍｕ未満の、尚一層好ましくは７５０ａｍｕ未満の分子量を有して、ヘッジホッグタンパク質の生物学的活性の少なくとも幾つかを特に標的細胞において阻害することのできる有機分子である。
【００２７】
従って、本発明の方法は、正常な細胞、組織及び器官並びにｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進表現型を有するものを含む広範囲の細胞、組織及び器官の修復及び／又は機能性能の調節におけるヘッジホッグシグナル伝達のｐｔｃ阻害を例えばそのシグナル経路のスムースンド又は下流の構成要素の活性化を阻害することにより代行する小型分子の利用を含む。例えば、主題の方法は、神経組織、骨及び軟骨組織の形成及び修復の調節から、精子形成の調節、平滑筋の調節、肺、肝及び他の原始腸管から生じる臓器の調節、造血機能の調節、皮膚及び毛の成長の調節などに及ぶ治療及び化粧用応用を有する。その上、主題の方法は、培養で与えられた細胞（イン・ビトロ）においても、動物個体内の細胞（イン・ビボ）においても実施することができる。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１８８５６及びＷＯ９６／１７９２４（これらの明細書を、特に、参考として本明細書中に援用する）を参照されたい。
【００２８】
好適具体例において、主題の方法は、ｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進の表現型を有する上皮細胞を処理することであってよい。例えば、主題の方法は、基底細胞癌又は他のヘッジホッグ経路関連疾患の治療又は予防において利用することができる。
【００２９】
ある具体例において、主題のアンタゴニストは、スムースンドに結合することによりヘッジホッグ経路の活性化を阻止することができる。ある具体例においては、主題のアンタゴニストは、パッチトに結合することによりヘッジホッグ経路の活性化を阻止することができる。
【００３０】
他の好適具体例において、主題の方法は、悪性の髄芽細胞腫及び他の原発性のＣＮＳ悪性神経外胚葉性腫瘍の治療養生法の部分として利用することができる。
【００３１】
他の面において、本発明は、活性成分として、ここに記載したようなヘッジホッグアンタゴニスト、ｐｔｃアゴニスト又はスムースンドアンタゴニストを、イン・ビボで、増殖又は他のｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進の生物学的結果を阻害するのに十分な量で配合して含む医薬製剤を提供する。
【００３２】
主題のヘッジホッグアンタゴニスト、パッチトアゴニスト又はスムースンド亜アンタゴニストを用いる治療は、ヒト及び動物の患者の両者に効果的であってよい。この発明を適用しうる動物患者は、ペットとして又は商業目的で飼われている家庭の動物及び家畜の両方に及ぶ。例は、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ及びヤギである。
【００３３】
ＩＩ．定義
便宜のために、本明細書、実施例、及び添付の請求の範囲で用いている幾つかの用語を、ここに集めた。
【００３４】
遺伝子の「異常型の改変又は突然変異」なる語句は、例えば、遺伝子のヌクレオチドの欠失、置換又は付加などの遺伝子損傷並びに遺伝子の大きな染色体再配列及び／又は異常なメチル化をいう。同様に、遺伝子の誤発現は、遺伝子の発現の正常細胞におけるレベルと比較しての同様の条件下での異常型のレベル並びに遺伝子から転写されたｍＲＮＡの非野生型のスプライシングをいう。
【００３５】
「基底細胞癌」は、様々な臨床的及び組織学的形態例えば結節性潰瘍性、浅在性、着色した、限局性強皮症様、繊維上皮腫及び母斑様で存在する。基底細胞癌は、ヒトで見出される最も一般的な皮膚の新生物である。メラノーマでない皮膚癌の新たな症例の大多数は、このカテゴリーに入る。
【００３６】
「火傷創」は、熱及び／又は化学剤のために個体の皮膚の大きい表面積が除去され又は失われた症例をいう。
【００３７】
用語「癌」は、上皮細胞よりなり、周囲の組織に浸潤する傾向及び転移を生じる傾向のある悪性の新規な増殖をいう。典型的な癌には、めったに転移しないが局所的浸潤及び破壊の可能性を有する皮膚の上皮性腫瘍である「基底細胞癌」；鱗状の上皮から生じる立方体様の細胞を有する癌をいう「扁平上皮細胞癌」；癌性組織と肉腫性組織とからなる悪性腫瘍を含む「癌肉腫」；小さい上皮細胞の集団又は帯により分離され又は囲まれたヒアリン又はムチン間質のシリンダー又はバンドを特徴とし、乳腺及び唾液腺並びに気道の粘液腺に生じる癌である「腺嚢腫癌」；表皮と同様に分化する傾向がある（即ち、有棘細胞を形成し、角質化を受ける傾向がある）癌細胞をいう「類表皮癌」；鼻の後ろの空間の上皮性の内層に生じる悪性腫瘍をいう「鼻咽頭癌」；及び配置の変化する管状細胞よりなる腎臓実質組織の癌に属する「腎細胞癌」が含まれる。他の癌性上皮増殖は、上皮に由来し、パピローマウイルスを原因因子として有する良性腫瘍をいう「乳頭腫」；及び神経溝の閉じるときに外胚葉エレメントの封入により形成される脳又は髄膜の腫瘍をいう「類表皮腫」である。
【００３８】
「真皮」は、上皮の深部にある皮膚の層をいい、血管結合組織の密な層よりなり且つ神経及び末端感覚器官を含む。毛根及び皮脂腺及び汗腺は、真皮に深く埋められた表皮の構造である。
【００３９】
「歯組織」は、上皮組織と類似する口内の組織例えば歯肉組織をいう。本発明の方法は、歯周病の治療に有用である。
【００４０】
「真皮潰瘍」は、組織表面の喪失により引き起こされる皮膚の病変（通常、炎症を伴う）をいう。本発明の方法により治療することのできる真皮潰瘍には、褥瘡性潰瘍、糖尿病性潰瘍、静脈鬱血性潰瘍及び動脈性潰瘍が含まれる。褥瘡は、長時間にわたって皮膚の領域に加えられる圧力により生じる慢性的潰瘍をいう。この種の傷は、しばしば、床ずれと呼ばれる。静脈鬱血性潰瘍は、欠陥のある静脈の鬱血又は他の液体の停滞により生じる。動脈性潰瘍は、血流の乏しい動脈の周囲の領域における壊死した皮膚をいう。
【００４１】
用語「ＥＤ５０」は、最大の応答又は効果の５０％を生じる薬物の投与量を意味する。
【００４２】
主題の治療方法に関して、例えば、ヘッジホッグアンタゴニストの「有効量」は、所望の投薬養生法の部分として適用した場合に、例えば、細胞増殖速度の及び／又は細胞の分化状態の及び／又は細胞の生存率の変化を引き起こす製剤中のアンタゴニストの量（治療すべき疾患又は化粧目的について臨床的に許容し得る標準に従う）をいう。
【００４３】
用語「上皮性」及び「上皮」は、内部及び外部の体表面の細胞性の被覆（皮膚、粘膜及び漿膜）をいい、それから生じた腺その他の構造例えば角膜、食道、真皮、毛嚢及び上皮細胞を含んでいる。他の典型的な上皮組織には、鼻腔の嗅覚器領域の内表面となっている擬似層化上皮であって嗅覚のためのセンサーを含んでいる嗅覚上皮；分泌細胞よりなる上皮をいう腺上皮；平らな板状の細胞からなる上皮をいう扁平上皮が含まれる。用語上皮は又、縮小及び拡大のために大きな機械的変化を受ける中空臓器を裏打ちすることが特徴的に見出される過渡的上皮例えば層化扁平上皮と円柱上皮の間の過渡的上皮をもいう。
【００４４】
用語「上皮形成」は、剥離された表面を覆う上皮組織の増殖による治癒をいう。
【００４５】
用語「表皮腺」は、表皮と関係して、通常の代謝の必要性と関係なく物質を分泌又は排出する細胞の凝集をいう。例えば、「皮脂腺」は、油性物質と皮脂を分泌する真皮中の全分泌腺である。用語「汗腺」は、真皮又は皮下組織に位置されて管によって体表面に開口している汗を分泌する腺をいう。
【００４６】
用語「表皮」は、胚の外胚葉に由来する厚さ０．０７〜１．４ｍｍの皮膚の最も外側の非脈管層をいう。手掌及び足底表面においては、それは、内側から外側に向かって、５つの層：直立して配置された円柱細胞よりなる基底層；短い突起又はとげを有する平らな多面細胞よりなる有棘細胞又は有棘層；平らな顆粒細胞よりなる顆粒層；核がはっきりしないか又は存在しない透明な細胞の幾つかの層よりなる透明層；及び平らな角化した無核の細胞よりなる角質層よりなる。全身の体表面の表皮において、透明層は、通常、存在しない。
【００４７】
「切り出し傷」は、皮膚の上皮層中の裂き傷、擦り傷、切り傷、刺し傷又は破傷を含み、真皮層に及び得るし、皮下脂肪以下にさえ及び得る。切り出し傷は、外科的手順により生じ得るし又は不慮の皮膚貫通によって生じ得る。
【００４８】
細胞の「増殖状態」は、細胞の増殖の速度及び／又は細胞の分化状態をいう。「変化された増殖状態」は、異常な増殖速度を特徴とする増殖状態（例えば、正常細胞に比べて増大した又は減少した増殖速度を示す細胞）である。
【００４９】
用語「毛」は、糸状構造、特に、ケラチンよりなり、真皮中に埋められた乳頭状突起から発生する特殊化された表皮構造であって、哺乳動物によってのみ生成され、動物のグループに特徴的である表皮構造をいう。又、「毛」は、かかる毛の集合を指すこともある。「毛嚢」は、毛を含む表皮の管状の陥入の一つをいい、それから毛が成長する。「毛嚢上皮細胞」は、毛嚢中の真皮の乳頭状突起を囲む上皮細胞例えば幹細胞、外毛根鞘細胞、マトリクス細胞及び内毛根鞘細胞をいう。かかる細胞は、正常の非悪性細胞であっても、トランスフォームされた／不死化細胞であってもよい。
【００５０】
用語「ヘッジホッグアンタゴニスト」は、例えば標的遺伝子の転写を抑制するためにパッチトの生物学的活性を強化し又は再現する薬剤をいう。好適なヘッジホッグアンタゴニストは、ｐｔｃ機能欠損及び／又はスムースンド機能亢進を克服するために用いることができる。後者は又、スムースンドアンタゴニストとも呼ばれる。用語「ヘッジホッグアンタゴニスト」は、ここで用いる場合、ヘッジホッグタンパク質の正常機能を直接阻害することにより作用し得る何れかの薬剤のみを指すのではなく、ヘッジホッグシグナリング経路を阻害し、そうして、ｐｔｃの機能を再現する任意の薬剤をも指す。
【００５１】
用語「ヘッジホッグ機能亢進」は、細胞をヘッジホッグタンパク質と接触させた場合と似た表現型（例えば、ヘッジホッグ経路の異常な活性化）を生じるｐｔｃ遺伝子、ヘッジホッグ遺伝子若しくはスムースンド遺伝子の異常型の改変若しくは突然変異又はかかる遺伝子の発現レベルの減少（又は喪失）をいう。この機能亢進は、Ｃｉ遺伝子Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２及びＧｌｉ３の発現レベルを調節するｐｔｃ遺伝子産物の能力の喪失を含み得る。用語「ヘッジホッグ機能亢進」は又、ここでは、ヘッジホッグシグナル変換経路の何処かの変化（ヘッジホッグ自体の改変又は突然変異を含むが、それに限らない）のために生じた任意の類似の細胞表現型（例えば、過剰増殖を示すもの）を指すためにも用いる。例えば、ヘッジホッグシグナリング経路の活性化のための異常に高い増殖速度を有する腫瘍細胞は、たとえその細胞においてヘッジホッグが変異してなくても「ヘッジホッグ機能亢進」表現型を有する。
【００５２】
ここで用いる場合、「不死化細胞」は、化学的及び／又は組換え手段により、培養において無限回分裂して増殖する能力を有するように変えられた細胞をいう。
【００５３】
「内部上皮組織」は、皮膚における表皮層に類似する特徴を有する体内の組織をいう。例には、腸の内面が含まれる。本発明の方法は、ある種の内部の傷例えば外科手術により生じた傷の治癒の促進に有用である。
【００５４】
用語「角化症」は、表皮の角質層の過形成を特徴とする増殖性皮膚疾患をいう。典型的な角化症には、毛包性角化症、点状掌蹠角化症、咽頭角化症、毛髪角化症及び光線性角化症が含まれる。
【００５５】
用語「ＬＤ５０」は、試験被験者の５０％に致死的である薬物の投与量を意味する。
用語「爪」は、指又は足指の遠心端の背側表面上の角質の皮膚板をいう。
【００５６】
用語「パッチト機能欠損」は、細胞をヘッジホッグタンパク質と接触させた場合と似た表現型（例えば、ヘッジホッグ経路の異常な活性化）を生じるｐｔｃ遺伝子の異常型の改変若しくは突然変異又はこの遺伝子の減少した発現レベルをいう。同機能亢進は、Ｃｉ遺伝子例えばＧｌｉ１、Ｇｌｉ２及びＧｌｉ３の発現レベルを調節するｐｔｃ遺伝子産物の能力の喪失を含むことができる。用語「ｐｔｃ機能欠損」も又、ここでは、ヘッジホッグシグナル変換経路の何処かしらの変化（ｐｔｃ自身の修飾又は突然変異を含むが、限定はしない）のために生じた任意の同様の（例えば、過剰増殖を示す）細胞表現型を指すのに用いられる。例えば、ヘッジホッグシグナリング経路の活性化のために異常に大きい増殖速度を有する腫瘍細胞は、たとえその細胞においてｐｔｃが変異してなくても、「ｐｔｃ機能欠損」表現型を有するであろう。
【００５７】
主題の方法により治療を受ける「患者」又は「被験者」は、ヒトを意味しても、非ヒト動物を意味してもよい。
【００５８】
用語「プロドラッグ」は、生理的条件下で、本発明の治療上活性な薬剤に変換される化合物を包含することを意図している。プロドラッグを作成するための一般的方法は、生理的条件下で加水分解されて所望の分子が出現する選択した部位を含むことである。他の具体例において、プロドラッグは、宿主の動物の酵素活性により変換される。
【００５９】
ここで用いる場合、「増殖性」及び「増殖」は、有糸分裂を受ける細胞をいう。
この出願中で、用語「増殖性皮膚疾患」は、皮膚組織の望ましくない又は異常な増殖の著しい任意の皮膚の病気／疾患をいう。これらの病気は、典型的には、表皮細胞の増殖又は不完全な細胞分化により特徴付けられ、例えば、Ｘ染色体性魚鱗癬、乾癬、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、表皮剥離性角化症及び脂漏性皮膚炎を含む。例えば、表皮異形成は、表皮の不完全な発生形態である。他の例は、自発的な又は外傷部位の水疱の形成を伴う表皮のゆるんだ状態をいう「表皮剥離」である。
【００６０】
ここで用いる場合、用語「乾癬」は、皮膚の調節機構を変える増殖過剰性皮膚疾患をいう。特に、表皮の増殖における一次的及び二次的変化、皮膚の炎症性応答及び調節分子例えばリンホカイン及び炎症性因子の発現を含む病変が形成される。乾癬の皮膚は、形態的に、表皮細胞の増大したターンオーバー、肥厚した表皮、異常な角質化、真皮層への炎症性細胞浸潤及び多形核白血球の表皮層への浸潤（基底細胞サイクルの増大を生じる）を特徴とする。加えて、過角化症及び不全角化細胞が存在する。
【００６１】
用語「皮膚」は、身体の外側の保護用の被覆であり、真皮と表皮よりなり、汗腺及び皮脂腺並びに毛嚢構造を含むと理解されている。本願中で、形容詞「皮膚の」は、一般に、それらを用いる分脈において適当であれば、皮膚の属性をいうように用いられ且つ理解されるべきである。
【００６２】
用語「スムースンド機能亢進」は、細胞をヘッジホッグタンパク質と接触させた場合と似た表現型（例えば、ヘッジホッグ経路の異常な活性化）を生じるｓｍｏ遺伝子の異常型の改変若しくは突然変異又はこの遺伝子の増大した発現レベルをいう。如何なる特定の理論に拘束されることも望まないが、ｐｔｃが、直接細胞にシグナルを送ることができず、むしろ、ヘッジホッグシグナリングにおいてｐｔｃの下流に位置する他の膜結合タンパク質であるスムースンドと相互作用するということは注意される（Ｍａｒｉｇｏ等（１９９６） Ｎａｔｕｒｅ ３８４： １７７−１７９）。遺伝子ｓｍｏは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの各セグメントの正しいパターニングに必要なセグメントポラリティー遺伝子である（Ａｌｃｅｄｏ等（１９９６） Ｃｅｌｌ ８６：２２１−２３２）。ｓｍｏのヒトの同族体が同定されている。例えば、Ｓｔｏｎｅ等（１９９６） Ｎａｔｕｒｅ ３８４：１２９−１３４及びＧｅｎＢａｎｋ受理番号Ｕ８４４０１を参照されたい。スムースンド遺伝子は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質共役レセプターの特徴を有する不可欠な膜タンパク質；即ち、７回膜貫通領域をコードする。このタンパク質は、ｗｉｎｇｌｅｓｓ経路のメンバーであるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｆｒｉｚｚｌｅｄ （Ｆｚ）タンパク質に対する相同性を示す。元々、ｓｍｏは、Ｈｈシグナルのレセプターをコードすると考えられていた。しかしながら、この示唆は、その後、ｐｔｃがＨｈレセプターである証拠が得られたことにより反証が示された。Ｓｍｏを発現する細胞が、Ｈｈを結合することができず、これは、ｓｍｏがＨｈと直接には相互作用しないことを示している（Ｎｕｓｓｅ，（１９９６） Ｎａｔｕｒｅ ３８４：１１９−１２０）。むしろ、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）のそのレセプターＰＴＣＨへの結合は、７回膜貫通タンパク質であるスムースンド（ＳＭＯ）のＰＴＣＨによる正常な阻害を妨げると考えられている。
【００６３】
最近、スムースンド変異の活性化が、散発性の基底細胞癌（Ｘｉｅ等（１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９１：９０−２）及び中枢神経系の原始神経外胚葉腫瘍（Ｒｅｉｆｅｎｂｅｒｇｅｒ等（１９９８） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５８：１７９８−８０３）に生じるということが報告された。
【００６４】
用語「治療指数」は、ＬＤ５０／ＥＤ５０として規定される薬物の治療指数をいう。
【００６５】
ここで用いる場合、「トランスフォームされた細胞」は、無制限の増殖の状態に自発的に変換された（即ち、培養において無限回の分裂によって増殖する能力を得た）細胞をいう。トランスフォームされた細胞は、それらの増殖制御の喪失に関して、新生物の、未分化の及び／又は過形成の等の用語によって特徴付けられ得る。
【００６６】
用語“アシルアミノ”は斯界で認識されており、一般式：
【化７】
2004531458.tif 000003
（ここで、Ｒ９は上で定義した通りであり、Ｒ’１１は水素、アルキル、アルケニル又は−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ８（ｍ及びＲ８は上で定義した通りである）を表わす）
により表わすことができる部分である。
【００６７】
ここで、用語“脂肪族基”とは、直鎖状、分岐鎖状又は環状の脂肪族炭化水素基をいい、アルキル基、アルケニル基及びアルキニル基のような飽和及び不飽和の脂肪族基を包含する。
【００６８】
用語“アルケニル”及び“アルキニル”とは、上記のアルキルと鎖長及び可能な置換の点で類似するが、少なくとも１個の二重結合又は三重結合をそれぞれ含有する不飽和の脂肪族基をいう。
【００６９】
用語“アルコキシル”又は“アルコキシ”とは、ここで使用するときは、酸素基を結合させた上で定義したようなアルキル基をいう。代表的なアルコキシル基は、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、ｔ−ブトキシなどが包含される。“エーテル”は、酸素に共有結合した２個の炭化水素である。従って、そのアルキルをエーテルにするアルキルの置換基は、アルコキシルであり又はこれに類似し、例えば、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アルケニル、−Ｏ−アルキニル、−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ８（ｍ及びＲ８は上で定義した通りである）の一つにより表わすことができる。
【００７０】
用語“アルキル”とは、直鎖状アルキル基、分岐鎖状アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基及びシクロアルキル置換アルキル基も含めて飽和脂肪族基をいう。好ましい具体例では、直鎖状又は分岐鎖状アルキル基は、その主鎖内に３０個以下（直鎖のものについてはＣ１〜Ｃ３０、分岐鎖状のものについてはＣ３〜Ｃ３０）、好ましくは２０個以下の炭素原子を有する。同様に、好ましいシクロアルキルはその環構造内に３〜１０個の炭素原子を、好ましくは環構造内に５、６又は７個の炭素原子を有する。
【００７１】
更に、用語“アルキル”（又は、“低級アルキル”）とは、明細書、実施例及び請求の範囲を通じて使用するときは、“置換されていないアルキル”及び“置換されたアルキル”の双方を包含するものとし、後者のものは炭化水素の主鎖の１個以上の炭素上の水素を置換する置換基を有するアルキル部分をいう。このような置換基は、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル（例えば、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル又はアシル）、チオカルボニル（例えば、チオエステル、チオアセテート又はチオホルメート）、アルコキシル、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドロリル、アルキルチオ、サルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロシクリル、アラルキル、又は芳香族若しくはヘテロ芳香族部分を包含できる。炭化水素連鎖上に置換した部分が適当ならばそれ自身置換され得ることは当業者ならば理解される。例えば、置換アルキルの置換基は、置換された及び置換されていない形のアミノ、アジド、イミノ、アミド、ホスホリル（ホスホネート及びホスフィネートも含めて）、スルホニル（サルフェート、スルホンアミド、スルファモイル又はスルホネートも含めて）及びシリル基並びにエーテル、アルキルチオ、カルボニル（ケトン、アルデヒド、カルボキシレート及びエステルを含めて）、−ＣＦ３、−ＣＮなどを包含し得る。置換アルキルの例は、以下に説明する。シクロアルキルは、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノアルキル、カルボニル置換アルキル、−ＣＦ３、−ＣＮなどにより更に置換され得る。
【００７２】
炭素数が別に特定されていない限り、“低級アルキル”とは、ここで使用するときは、その主鎖構造内に１〜１０個、好ましくは１〜６個の炭素原子を有する上で定義したようなアルキル基を意味する。同様に、“低級アルケニル”及び“低級アルキニル”は、類似の鎖長を有する。明細書を通じて、好ましいアルキル基は低級アルキルである。好ましい具体例では、アルキルとしてここに示した置換基は低級アルキルである。
【００７３】
用語“アルキルチオ”は、硫黄基を結合してなる上で定義したようなアルキル基をいう。好ましい具体例では、“アルキルチオ”は、−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アルケニル、−Ｓ−アルキニル及び−Ｓ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ８（ここで、ｍ及びＲ８は上で定義した通りである）の一つにより表わされる。
【００７４】
用語“アミン”及び“アミノ”は斯界で認識されており、置換されていないアミン及び置換されたアミンの両方をいい、例えば、一般式：
【化８】
2004531458.tif 000004
（ここで、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ’１０はそれぞれについて独立して水素、アルキル、アルケニル又は−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ８を表わし、Ｒ９とＲ１０はこれらが結合しているＮ原子と一緒になって４〜８個の原子を環構造内に有する複素環を完成し、Ｒ８はアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環又は多環を表わし、ｍは０又は１〜８の整数である）
により表わされる部分である。好ましい具体例では、Ｒ９又はＲ１０の１個のみがカルボニルであることができ、例えば、Ｒ９、Ｒ１０及び窒素がイミドを形成しない。更に好ましい具体例では、Ｒ９及びＲ１０（及び随意にＲ’１０）がそれぞれ水素、アルキル、アルケニル又は−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ８を表わす。しかして、用語“アルキルアミン”は、ここで使用するときは、置換された又は置換されていないアルキル結合してなる上記のようなアミン基、即ち、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１個がアルキル基であるものを意味する。
【００７５】
用語“アミド”は、アミノ置換カルボニルとして斯界で認識されており、一般式：
【化９】
2004531458.tif 000005
（ここで、Ｒ９及びＲ１０は上で定義した通りである）
により表わすことができる部分を包含する。アミドの好ましい例は、不安定であり得るイミドを包含しない。
【００７６】
用語“アラルキル”とは、ここで使用するときは、アリール基（例えば、芳香族又はヘテロ芳香族基）により置換されたアルキル基をいう。
【００７７】
用語“アリール”は、ここで使用するときは、０〜４個の複素原子を含有できる５、６及び７員の単環式芳香族基、例えば、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、ピリミジンなどを包含する。環構造に複素原子を有するアリール基も“アリール複素環”又は“ヘテロ芳香族”ということができる。芳香族環は、１個以上の環の位置で、上記したような置換基、例えば、ハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族又はヘテロ芳香族部分、−ＣＦ３、−ＣＮなどにより置換できる。また、用語“アリール”は、２個以上の環であって２個以上の炭素が２個の接する環に共通であるもの（その環は縮合環である）を有し、しかも環の少なくとも１個が芳香族であり、他の環がシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール及び（又は）ヘテロシクリルであってよい多環式環系も包含する。
【００７８】
用語“炭素環”とは、ここで使用するときは、環のそれぞれの原子が炭素である芳香族環又は非芳香族環をいう。
【００７９】
用語“カルボニル”は、斯界で認識されており、一般式：
【化１０】
2004531458.tif 000006
（ここで、Ｘは結合であるか又は酸素若しくは硫黄を表わし、Ｒ１１は水素、アルキル、アルケニル、−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ８又は製薬上許容できる塩を表わし、Ｒ’１１は水素、アルキル、アルケニル又は−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ８（ｍ及びＲ８は上で定義した通りである）を表わす）
により表わすことができるような部分を包含する。Ｘが酸素であり且つＲ１１又はＲ’１１が水素でないときは、該式は“エステル”を表わす。Ｘが酸素であり且つＲ１１が上で定義した通りであるときは、該部分はここではカルボキシル基といい、特に、Ｒ１１が水素であるときは、該式は“カルボン酸”を表わす。Ｘが酸素であり且つＲ’１１が水素であるときは、該式は“ホルメート”である。一般に、上記の式の酸素原子が硫黄で置き換えられた場合には、該式は“チオカルボニル”基を表わす。Ｘが硫黄であり且つＲ１１又はＲ’１１が水素でないときは、該式は“チオエステル”を表わす。Ｘが硫黄であり且つＲ１１が水素であるときは、該式は“チオカルボン酸”を表わす。Ｘが硫黄であり且つＲ’１１が水素であるときは、該式は“チオールホルメート”を表わす。  他方、Ｘが結合であり且つＲ’１１が水素でない場合は、該式は“ケトン基”を表わす。Ｘが結合であり且つＲ１１が水素である場合には、上記の式は“アルデヒド”基を表わす。
【００８０】
用語“複素原子”は、ここで使用するときは、炭素又は水素以外の任意の元素を意味する。好ましい複素元素は硼素、窒素、酸素、燐、硫黄及びセレンである。
【００８１】
用語“ヘテロシクリル”又は“複素環式基”とは、３〜１０員の環構造、好ましくは３〜７員の環であって、その環構造が１〜４個の複素原子を含有するものをいう。複素環は多環であることができる。ヘテロシクリル基は、例えば、チオフェン、チアントレン、フラン、ピラン、イソベンゾフラン、クロメン、キサンテン、フェノキサチイン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、ピリミジン、フェナントロリン、フェナジン、フェナルサジン、フェノチアジン、フラザン、フェノキサジン、ピロリジン、オキソラン、チオラン、オキサゾール、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ラクトン、アゼチジノン及びピロリジノンのようなラクタム、スルタム、スルトンなどを包含する。複素環は、上で定義したような置換基、例えば、ハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族又はヘテロ芳香族部分、−ＣＦ３、−ＣＮなどにより置換できる。
【００８２】
ここで使用するとき、用語”ニトロ”とは−ＮＯ２を意味し、用語“ハロゲン”とは−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ又は−Ｉを示し、用語“スルフヒドリル”とは−ＳＨを意味し、用語“ヒドロキシル”とは−ＯＨを意味し、用語“スルホニル”とは−ＳＯ２−を意味する。
【００８３】
“ホスホンアミダイト”は、一般式：
【化１１】
2004531458.tif 000007
（ここで、Ｒ９及びＲ１０は上で定義した通りであり、Ｑ２はＯ、Ｓ又はＮを表わし、Ｒ４８は低級アルキル又はアリールを表わす）
で表わすことができる。
【００８４】
“ホスホルアミダイト”は、次式：
【化１２】
2004531458.tif 000008
（ここで、Ｒ９及びＲ１０は上で定義した通りであり、Ｑ２はＯ、Ｓ又はＮを表わす）
で表わすことができる。
【００８５】
“ホスホリル”は、次式：
【化１３】
2004531458.tif 000009
（ここで、Ｑ１はＳ又はＯを表わし、Ｒ４６は水素、低級アルキル又はアリールを表わす）
で表わすことができる。例えば、アルキルを置換するのに使用するとき、ホスホリルアルキルのホスホリル基は、一般式：
【化１４】
2004531458.tif 000010
（ここで、Ｑ１はＳ又はＯを表わし、それぞれＲ４６は水素、低級アルキル又はアリールを表わし、Ｑ２はＯ、Ｓ又はＮを表わす）
により表わすことができる。Ｑ１がＳであるときは、ホスホリル部分は“ホスホロチオエート”である。
【００８６】
用語“ポリシクリル”又は“多環式基”とは、２個以上の環（例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール及び（又は）ヘテロシクリル）であって２個以上の炭素が２個の接する環（この環は“縮合環”である）に共通するものをいう。隣接しない炭素により結合される環は“架橋環”と称する。多環式基の環のそれぞれは、上で定義したような置換基、例えば、ハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族又はヘテロ芳香族部分、−ＣＦ３、−ＣＮなどにより置換できる。
【００８７】
用語“保護基”とは、ここで使用するときは、望まない化学的変換から潜在的に反応性の官能基を保護する一次的な置換基を意味する。このような保護基の例は、カルボン酸のエステル、アルコールのシリルエーテル、アルデヒド及びケトンのそれぞれアセタール及びケタールを包含する。保護基の化学の分野は論評されている（Ｔ．Ｗ．グリーン、Ｐ．Ｇ．Ｍ．ウッツ、「有機化学における保護基」第２版、ウイリー社、ニューヨーク、１９９１）。
【００８８】
“セレノアルキル”とは、置換セレノ基を結合させてなるアルキル基をいう。アルキル上に置換基を有し得る“セレノエーテル”の例は、−Ｓｅ−アルキル、−Ｓｅ−アルケニル、−Ｓｅ−アルキニル及び−Ｓｅ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ８（ｍ及びＲ８は上で定義した通りである）の一つから選択される。
【００８９】
用語“置換”とは、ここで使用するときは、有機化合物の全ての許容できる置換基を含有させることを意図する。広い観点では、許容できる置換基は、有機化合物の非環式及び環状の、分岐状の及び分岐状でない、炭素環式及び複素環式の、芳香族及び非芳香族の置換基を包含する。置換基の例は、例えば、上で定義し通りのものを包含する。許容できる置換基は、適当な化合物について１個又はそれ以上で且つまた同一又は異なったものであることができる。本発明のためには、窒素のような複素原子は、水素置換基及び（又は）複素原子の原子価を安定化させるここに記載する有機化合物の任意の許容できる置換基を有することができる。本発明は、有機化合物のこの許容できる置換基により何ら限定されるものではない。
【００９０】
“置換”又は“置換された”は、そのような置換が置換された原子及び置換基の許された原子価と一致し並びにその置換が安定な化合物、例えば、転位、環化、脱離などのような変換を自発的に受けない安定な化合物をもたらすという暗黙の条件を包含するものと理解される。
【００９１】
用語“スルファモイル”とは、斯界で認識されており、一般式：
【化１５】
2004531458.tif 000011
（ここで、Ｒ９及びＲ１０は上で定義した通りである）
により表わされる部分を包含する。
【００９２】
用語“サルフェート”とは、斯界で認識されており、一般式：
【化１６】
2004531458.tif 000012
（ここで、Ｒ４１は上で定義した通りである）
により表わされる部分を包含する。
【００９３】
用語“スルホンアミド”とは、斯界で認識されており、一般式：
【化１７】
2004531458.tif 000013
（ここで、Ｒ９及びＲ’１１は上で定義した通りである）
により表わされる部分を包含する。
【００９４】
用語“スルホネート”とは、斯界で認識されており、一般式：
【化１８】
2004531458.tif 000014
（ここで、Ｒ４１は電子対、水素、アルキル、シクロアルキル又はアリールである）
により表わされる部分を包含する。
【００９５】
用語“スルホキシド”又は“スルフィニル”とは、ここで使用するときは、一般式：
【化１９】
2004531458.tif 000015
（ここで、Ｒ４４は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アラルキル又はアリールよりなる群から選択される）
により表わされる部分をいう。
【００９６】
類似の置換を、アルケニル及びアルキニルに対して、例えば、アミノアルケニル、アミノアルキニル、アミドアルケニル、アミドアルキニル、イミノアルケニル、イミノアルキニル、チオアルケニル、チオアルキニル、カルボニル置換アルケニル又はアルキニルを生成するように行なうことができる。
【００９７】
それぞれの表現、例えば、アルキル、ｍ、ｎなどの定義は、ここで使用するときは、それが任意の構造式において１度よりも多く現われるときは、同じ構造式において他の箇所でのその定義と独立であることが意図される。
【００９８】
用語“トリフリル”、“トシル”、“メシル”及び“ノナフリル”は、斯界で認識されており、それぞれトリフルオルメタンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル、メタンスルホニル及びナノフルオルブタンスルホニル基をいう。用語“トリフレート”、“トシレート”、“メシレート”及び“ナノフレート”は、斯界で認識されており、それぞれトリフルオルメタンスルホン酸エステル、ｐ−トルエンスルホン酸エステル、メタンスルホン酸エステル及びナノフルオルブタンスルホン酸エステル官能基並びにこのような基をそれぞれ含有する分子をいう。
【００９９】
略語Ｍｅ、Ｅｔ、Ｐｈ、Ｔｆ、Ｎｆ、Ｔｓ及びＭｓは、それぞれメチル、エチル、フェニル、トリフルオルメタンスルホニル、ナノフルオルブタンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル及びメタンスルホニルを表わす。斯界で通常の知識を有する有機化学者により利用される略号のより包括的なリストがＪｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙのそれぞれの巻の第１号に見られる。このリストは、「略号の標準リスト」の名称の表に典型的に存在する。該リストに含まれる略号並びに斯界で通常の知識を有する有機化学者により利用される略号の全てをここで引用することにより本明細書に含めるものとする。
【０１００】
本発明のある種の化合物は、特に幾何学的異性体又は立体異性体の形態で存在し得る。本発明は、ｃｉｓ−及びｔｒａｎｓ−異性体、Ｒ−及びＳ−エナンチオマー、ジアステレオマー、（Ｄ）−異性体、（Ｌ）−異性体、これらのラセミ混合物、並びにこれらの混合物を含めて、本発明の範囲に入るものとして、上記の化合物の全てを意図するものである。更に、不斉炭素原子がアルキル基のような置換基に存在し得る。このような異性体の全て並びにそれらの混合物は本願発明に包含されるものとする。
【０１０１】
例えば、本発明の化合物の特定のエナンチオマーを望むならば、それは、不斉合成により又はキラルな助剤による誘導化により製造することができ、この場合には生じたジアステレオマー混合物が分離され、助剤基が純粋な所望エナンチオマーを与えるように開裂される。別法として、分子がアミノのような塩基性の官能基又はカルボキシルのような酸性の官能基を含有するときは、適当な光学活性の酸又は塩基によりジアステレオマー塩を形成し、次いで形成されたジアステレオマーを斯界で知られた分別結晶化又はクロマトグラフィー手段によって分割し、続いて純粋なエナンチオマーを回収することができる。
【０１０２】
上記した化合物の意図される均等物には、これに対応し且つ同じ一般的性質（例えば、ヘッジホッグシグナル伝達を阻止する能力）を有し、しかも化合物の有効性に悪影響を及ぼさない置換基の簡単な変更が１回以上なされている化合物が包含される。一般に、本発明の化合物は、容易に入手できる出発物質、反応剤及び周知の合成操作を使用して、例えば、以下に説明するような一般的反応式により又はその変更によって製造することができる。これらの反応においては、それ自体知られているが、ここでは述べない別法を使用することも可能である。
【０１０３】
本発明のためには、化学元素は、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ、６７版、１９８６−８７」の表紙内の「元素の周期律表、ＣＡＳ版」に従って同定される。また、本発明のためには、用語“炭化水素”とは、少なくとも１個の水素と１個の炭素原子を有する全ての許容できる化合物を包含するものとする。広い観点では、許容できる炭化水素は、置換されていてよく又は置換されていない非環式の及び環式の、分岐した及び分岐していない、炭素環式の及び複素環式の、芳香族及び非芳香族の有機化合物を包含する。
【０１０４】
ＩＩＩ．本発明の化合物の例
以下に詳細に説明するように、主題である方法は、例えば、ここで説明するような薬物スクリーニング検定法によって容易に同定できる種々の異なった小さい分子を使用して実施できることが意図される。例えば、この主題方法に有用な化合物は、一般式（Ｉ）：
【化２０】
2004531458.tif 000016
［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ２）ｎアリール（例えば、置換又は非置換の）又は−（ＣＨ２）ｎヘテロアリール（例えば、置換又は非置換の）を表わし、
Ｌは、それぞれについて独立して、不存在であるか或いは−（ＣＨ２）ｎ−、−アルケニル−、−アルキニル−、−（ＣＨ２）ｎアルケニル−、−（ＣＨ２）ｎアルキニル−、−（ＣＨ２）ｎＯ（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｎＮＲ８（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｎＳ（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｎアルケニル（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｎアルキニル（ＣＨ２）ｐ−、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−、−ＮＲ８（ＣＨ２）ｎ−又は−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−を表わし、
Ｘ及びＤは、独立して、−Ｎ（Ｒ８）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（Ｒ８）Ｎ−Ｎ（Ｒ８）−、−ＯＮ（Ｒ８）−及び直接結合から選択され、
Ｙ及びＺは独立してＯ及びＳから選択され、
ＥはＯ、Ｓ又はＮＲ５（Ｒ５はＬＲ８又は−（Ｃ＝Ｏ）ＬＲ８を表わす）を表わし、
Ｒ８は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ２）ｎアリール（例えば、置換又は非置換の）又は−（ＣＨ２）ｎヘテロアリール（例えば、置換又は非置換の）を表わすか、或いは２個のＲ８は一緒になって４員〜８員の環を形成し、
ｐは、それぞれについて独立して、０〜１０、好ましくは０〜３の整数を表わし、
ｎは、それぞれについて独立して、０〜１０、好ましくは０〜５の整数を表わし、
ｑ及びｒは、それぞれについて独立して、０〜２の整数を表わす］
により表わすことができる。
【０１０５】
ある種の具体例では、ＤはＮ−低級アルキルを表わさない。ある種の具体例では、Ｄはアラルキル−ヘテロアラルキル−置換アミンを表わす。
ある種の具体例では、Ｒ１は、分岐状アルキルのような低級アルキル基、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキル、例えばシクロプロピル、シクロプロピルメチル、ネオペンチル、シクロブチル、イソブチル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、シクロブチルメチルなどを表わす。
ある種の具体例では、Ｙ及びＺはＯである。
ある種の具体例では、ｑとｒの和は４未満であり、例えば２又は３である。
ある種の具体例では、ＸＬＲ４は、一緒になって、環状アミン、例えばピペラジン、モルホリン、ピペリジン、ピロリジンなどを含む。
【０１０６】
ある種の具体例では、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の少なくとも１個はアリール又はヘテロアリール基を含む。ある種の関連する具体例では、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の少なくとも２個はアリール又はヘテロアリール基を含む。ある種の具体例では、Ｒ１は低級アルキルである。
ある種の具体例では、Ｒ１に結合したＬはＯ、Ｓ又はＮＲ８、例えばＮＨを表わす。
ある種の具体例では、ＥはＮＲ８である。ある種の具体例では、Ｅは、例えば多環式Ｒ８も含めて、アラルキル−又はヘテロアラルキル−置換アミンを表わす。
ある種の具体例では、ＸはＮＨではない。ある種の具体例では、Ｘは環に含まれ、又は−Ｃ（＝Ｙ）−と一緒になって第三アミドを表わす。
【０１０７】
ある種の具体例では、本発明で有用な化合物は、一般式（ＩＩ）：
【化２１】
2004531458.tif 000017
［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ８、Ｌ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは上で定義した通りであり、
Ｍは不存在であるか又はＬ、−ＳＯ２Ｌ−若しくは−（Ｃ＝Ｏ）Ｌ−を表わし、
ｓはそれぞれについて独立して、０〜２の整数である］
により表わすことができる。
【０１０８】
ある種の具体例では、Ｙ及びＺはＯである。
ある種の具体例では、Ｒ１は、分岐状アルキルのような低級アルキル基、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキル、例えばシクロプロピル、シクロプロピルメチル、ネオペンチル、シクロブチル、イソブチル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、シクロブチルメチルなどを表わす。
ある種の具体例では、ｑとｒとｓの和は５未満であり、例えば２、３又は４である。
ある種の具体例では、ＸＬＲ４は、一緒になって、環状アミン、例えばピペラジン、モルホリン、ピペリジン、ピロリジンなどを含む。
ある種の具体例では、Ｒ１に結合したＬはＯ、Ｓ又はＮＲ８、例えばＮＨを表わす。
ある種の具体例では、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の少なくとも１個はアリール又はヘテロアリール基を含む。ある種の関連する具体例では、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の少なくとも２個はアリール又はヘテロアリール基を含む。
ある種の具体例では、Ｍは不存在である。
ある種の具体例では、ＸはＮＨではない。ある種の具体例では、Ｘは環に含まれ、又は−Ｃ（＝Ｙ）−と一緒になって第三アミドを表わす。
【０１０９】
ある種の具体例では、本発明で有用な化合物は、一般式（ＩＩＩ） ：
【化２２】
2004531458.tif 000018
［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ８、Ｌ、Ｍ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ｎ、ｐ、ｑ及びｒは上で定義した通りである］
により表わすことができる。
【０１１０】
ある種の具体例では、Ｙ及びＺはＯである。
ある種の具体例では、Ｒ１は、分岐状アルキルのような低級アルキル基、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキル、例えばシクロプロピル、シクロプロピルメチル、ネオペンチル、シクロブチル、イソブチル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、シクロブチルメチルなどを表わす。
ある種の具体例では、ｑとｒの和は４未満であり、例えば２又は３である。
ある種の具体例では、ＸＬＲ４は、一緒になって、環状アミン、例えばピペラジン、モルホリン、ピペリジン、ピロリジンなどを含む。
ある種の具体例では、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の少なくとも１個はアリール又はヘテロアリール基を含む。ある種の関連する具体例では、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の少なくとも２個はアリール又はヘテロアリール基を含む。ある種の具体例では、Ｒ１は低級アルキルである。
ある種の具体例では、Ｒ１に結合したＬはＯ、Ｓ又はＮＲ８、例えばＮＨを表わす。
ある種の具体例では、Ｍは不存在である。
ある種の具体例では、ＸはＮＨではない。ある種の具体例では、Ｘは環に含まれ、又は−Ｃ（＝Ｙ）−と一緒になって第三アミドを表わす。
【０１１１】
ある種の具体例では、本発明で有用な化合物は、一般式（ＩＶ） ：
【化２３】
2004531458.tif 000019
［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ８、Ｌ、Ｍ、Ｘ、ｎ及びｐは上で定義した通りである］
により表わすことができる。
【０１１２】
ある種の具体例では、ＸＬＲ４は、一緒になって、環状アミン、例えばピペラジン、モルホリン、ピペリジン、ピロリジンなどを含む。
ある種の具体例では、Ｒ１は、分岐状アルキルのような低級アルキル基、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキル、例えばシクロプロピル、シクロプロピルメチル、ネオペンチル、シクロブチル、イソブチル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、シクロブチルメチルなどを表わす。
ある種の具体例では、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の少なくとも１個はアリール又はヘテロアリール基を含む。ある種の関連する具体例では、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の少なくとも２個はアリール又はヘテロアリール基を含む。ある種の具体例では、Ｒ１は低級アルキルである。
ある種の具体例では、Ｒ１に結合したＬはＯ、Ｓ又はＮＲ８、例えばＮＨを表わす。
ある種の具体例では、Ｍは不存在である。
ある種の具体例では、ＸはＮＨではない。ある種の具体例では、Ｘは環に含まれ、又は−Ｃ（＝Ｙ）−と一緒になって第三アミドを表わす。
ある種の具体例では、Ｌは全ての存在について直接結合を表わす。
【０１１３】
ある種の具体例では、本発明で有用な化合物は、一般式（Ｖ） ：
【化２４】
2004531458.tif 000020
［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、
Ｙ、ｎ、ｐ、ｑ及びｒは上で定義した通りであり、
Ｚ’は−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｓ）−、−（＝ＮＨ）−ＳＯ２又はＳＯ、好ましくは−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｓ）−であり、
Ｖは不存在であるか又はＯ、Ｓ若しくはＮＲ８を表わし、
Ｇは不存在であるか又は−Ｃ（＝Ｏ）−若しくは−ＳＯ２−を表わし、
Ｊは、それぞれについて独立して、水素又はＪに接するＮの両方の存在がＪの少なくとも一つの存在により結合されるようにＮＣ（＝Ｙ）に結合した置換若しくは非置換の低級アルキル若しくはアルキレン、例えばメチル、エチル、メチレン、エチレンなどを表わし、
Ｒ９は、それぞれについて独立して、不存在であるか又はＨ若しくは低級アルキルを表わし、或いはＪの二つの存在又はＪの一つの存在がＲ９の一つの存在と一緒になって５〜７員の環を形成し、この環はＮの一つ又は両方の存在を含み、  Ｒ５は置換又は非置換のアルキル（分岐状又は非分岐状の）、アルケニル（分岐状又非分岐状の）、アルキニル（分岐状又非分岐状の）、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキルを表わし、
Ｒ６は置換又非置換のアリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキル（多環式基も含めて）を表わし、
Ｒ７は置換又非置換のアリール、アラルキル、ヘテロアリール又はヘテロアラルキルを表わす］
により表わすことができる。
【０１１４】
ある種の具体例では、ＹはＯである。ある種の具体例では、Ｚ’はＳＯ２、−（Ｃ＝Ｏ）−又は−（Ｃ＝Ｓ）−を表わす。
ある種の具体例では、ｑとｒの和は４未満である。
ある種の具体例では、ＮＪ２Ｎは、一緒になって、ピペラジンなどのような環状ジアミンを表わす。このものは、例えば、オキソ、低級アルキル、低級アルキルエーテルなどのような１個以上の置換基により置換されていてよく又は非置換であってよい。ある種の具体例では、ＮＪ２又はＮＪＲ９は、一緒になって、他のＮの存在が結合している置換又は非置換の複素環式環を表わす。ある種の具体例では、Ｊの一つ又は両方上の存在は、低級アルキル、低級アルキルエーテル、低級アルキルチオエーテル、アミド、オキソなどの１種以上により置換される。ある種の具体例では、Ｊの存在を含む複素環式環は５〜８員を有する。
ある種の具体例では、Ｒ５は分岐状アルキル、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキルを表わす。
ある種の具体例では、Ｒ６は、少なくとも１個の複素環式環、例えば、チオフェン、フラン、オキサゾール、ベンゾジオキサン、ベンゾジオキソール、ピロール、インドールなどを含む。
ある種の具体例では、Ｒ７は、ベンジル基のようなフェニル基を表わし、これはハロゲン、ヒドロキシル、低級アルキル、ニトロ、シアノ、低級アルキルエーテル（例えば、ＣＨＦ２ＣＦ２Ｏのように置換されていてよい）又は低級アルキルチオエーテル（例えば、ＣＦ３Ｓのように置換されていてよい）により置換されていてよい。
ある種の具体例では、Ｒ８は、Ｖに存在するときは、Ｈ又は低級アルキルを表わし、好ましくはＨである。
【０１１５】
ある種の具体例では、本発明で有用な化合物は、一般式（ＶＩ） ：
【化２５】
2004531458.tif 000021
［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｇ、Ｊ、Ｖ、Ｙ、Ｚ’、ｎ及びｐは上で定義した通りである］
により表わすことができる。
【０１１６】
ある種の具体例では、ＹはＯである。ある種の具体例では、Ｚ’はＳＯ２、−（Ｃ＝Ｏ）−又は−（Ｃ＝Ｓ）−を表わす。
ある種の具体例では、ＮＪ２Ｎは、一緒になって、ピペラジンなどのような環状ジアミンを表わす。このものは、例えば、オキソ、低級アルキル、低級アルキルエーテルなどのような１個以上の置換基により置換されていてよく又は非置換であってよい。ある種の具体例では、ＮＪ２又はＮＪＲ９は、一緒になって、他のＮの存在が結合している置換又は非置換の複素環式環を表わす。ある種の具体例では、Ｊの一つ又は両方の存在は、低級アルキル、低級アルキルエーテル、低級アルキルチオエーテル、アミド、オキソなどの１種以上により置換される。ある種の具体例では、Ｊの存在を含む複素環式環は５〜８員を有する。
ある種の具体例では、Ｒ５は分岐状アルキル、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキルを表わす。
ある種の具体例では、Ｒ６は、少なくとも１個の複素環式環、例えば、チオフェン、フラン、オキサゾール、ベンゾジオキサン、ベンゾジオキソール、ピロール、インドールなどを含む。
ある種の具体例では、Ｒ７は、ベンジル基のようなフェニル基を表わし、これはハロゲン、ヒドロキシル、低級アルキル、ニトロ、シアノ、低級アルキルエーテル（例えば、ＣＨＦ２ＣＦ２Ｏのように置換されていてよい）又は低級アルキルチオエーテル（例えば、ＣＦ３Ｓのように置換されていてよい）により置換されていてよい。
ある種の具体例では、Ｒ８は、Ｖに存在するときは、Ｈ又は低級アルキルを表わし、好ましくはＨである。
ある種の具体例では、主題化合物は、図３２に示した化合物から選択される。
【０１１７】
ある具体例においては、主題のアンタゴニストを、それらのヘッジホッグ経路に対する選択性に基づいて選択することができる。この選択性は、他の経路に対してヘッジホッグ経路を選択するものであってよく、特定のヘッジホッグ経路（例えば、ｐｔｃ−１、ｐｔｃ−２等）の間の選択性であってよい。
【０１１８】
ある好適具体例においては、主題のインヒビターは、ｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進媒介のシグナル変換を、１ｍＭ以下の、一層好ましくは１μＭ以下の、尚一層好ましくは１ｎＭ以下のＥＤ５０で阻害する。同様に、ある好適具体例において、主題のインヒビターは、ヘッジホッグ経路の活性を、１０ｎＭより小さい好ましくは１ｎＭより小さい尚一層好ましくは０．１ｎＭより小さいＫｉで阻害する。
【０１１９】
特別の具体例において、この小分子を、それが一つのパッチトイソ型に対して隣のものより一層選択的であるので、例えば、一つのパッチト経路（ｐｔｃ−１、ｐｔｃ−２）に対して、他のものの１０倍、一層好ましくは少なくとも１００倍又は１０００倍も選択的であるので選択する。
【０１２０】
ある具体例においては、ＰＫＡ以外のプロテインキナーゼ例えばＰＫＣより一層選択的にヘッジホッグ活性と拮抗するヘッジホッグ経路のアンタゴニストである化合物を選択し、例えば、その化合物は、ヘッジホッグ経路の活性を、他のプロテインキナーゼの活性を調節する場合より少なくとも一桁強力に、好ましくは少なくとも２桁強力に、尚一層好ましくは少なくとも３桁強力に調節する。従って、例えば、ヘッジホッグ経路の好適なインヒビターは、ヘッジホッグ活性を、ＰＫＣの阻害のＫｉより少なくとも一桁低い、好ましくは少なくとも２桁低い、尚一層好ましくは少なくとも３桁低いＫｉで阻害することができる。ある具体例において、ＰＫＡ阻害のＫｉは、１０ｎＭ未満であり、好ましくは１ｎＭ未満であり、尚一層好ましくは０．１ｎＭ未満である。
【０１２１】
主題化合物の製造方法
本発明は、更に、上記したような主題化合物の製造方法を提供する。例えば、ある種の具体例では、式Ｘの化合物は、以下の反応式：
【化２６】
2004531458.tif 000022
［ここで、
ｑ、ｒ及びｓは、それぞれ独立して、ｑ＋ｒ＋ｓの和が２〜４の範囲の整数であるように、０〜２の範囲の整数を表わし、
ＬＧはハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）又はスルホン酸エステル（例えば、トシレート、メシレート、トリフレートなど）のような脱離基を表わし、
Ａは酸を保護する基に結合した酸素若しくは硫黄又は式：ＸＬＲ４を有する基を表わし、
Ｂは窒素を保護する基又は式：ＭＲ３を有する基を表わし、
Ｒ３及びＲ４は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ２）ｎアリール（置換又非置換の）又は−（ＣＨ２）ｎヘテロアリール（置換又非置換の）を表わし、
ＹはＯ及びＳから選択でき、
Ｘは−Ｎ（Ｒ８）−、−Ｏ−、−Ｓ−又は直接結合から選択され、
Ｍは不存在であるか又はＬ、−ＳＯ２Ｌ−若しくは−（Ｃ＝Ｏ）Ｌ−を表わし、
Ｌは、それぞれについて独立して、不存在であるか或いは−（ＣＨ２）ｎ−アルキル−、−アルケニル−、−アルキニル−、−（ＣＨ２）ｎアルケニル−、−（ＣＨ２）ｎアルキニル−、−（ＣＨ２）ｎＯ（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｎＮＲ８（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｎＳ（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｎアルケニル（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２）ｎアルキニル（ＣＨ２）ｐ−、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−、−ＮＲ８（ＣＨ２）ｎ−又は−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−を表わし、
Ｒ８はそれぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ２）ｎアリール（例えば、置換又非置換の）又は−（ＣＨ２）ｎヘテロアリール（例えば、置換又非置換の）を表わすか、或いは２個のＲ８は一緒になって４員〜８員の環を形成し、
ｐは、それぞれについて独立して、０〜１０、好ましくは０〜３の整数を表わし、
ｎは、それぞれについて独立して、０〜１０、好ましくは０〜５の整数を表わす］
に従って変換することができ、
工程Ａはヒドロキシルを脱離基に転化することからなり、
工程Ｂは該脱離基をアジド基で置換することからなり、
工程Ｃはアジドをアミンに還元することからなる。
【０１２２】
ある種の具体例では、ヒドロキシルの脱離基への転化は、ヒドロキシルをハロゲン化スルホニルと反応させてスルホン酸エステルを生じさせることによって、例えば、塩化トシル若しくはトシル無水物を使用してトシレートを生じさせ、又は塩化メシル若しくはメシル無水物を使用してメシレートを生じさせ、又は塩化トリフリル若しくはトリフリル無水物を使用してトリフレートを生じさせることなどにより達成することができる。ある種の具体例では、ヒドロキシルの脱離基への転化は、ヒドロキシルをハロゲン化チオニル、三ハロゲン化燐、五ハロゲン化燐、オキシハロゲン化燐などのようなハロゲン化反応剤と反応させることにより達成することができる。ヒドロキシル基を脱離基に転化するためのその他の技術は斯界で周知であり、工程Ａに使用することができる。
【０１２３】
ある種の具体例では、工程Ａは、第一脱離基を第二脱離基により置換し、脱離基を有する炭素の立体化学を逆転させることを更に含む。従って、例えば、式Ｘの化合物のヒドロキシルがＹとＡを有する基とｃｉｓ−立体化学的関係を有するならば、この化合物と塩化メシルとの反応はＹとＡを有する基とｃｉｓ−立体化学的関係でメシレートを生じさせる。このメシレートとＮａＩのような求核性ハロゲン化物反応剤との反応は、メシレートを沃化物で置き換えて、脱離基である沃素とＹとＡを有する基とがｔｒａｎｓ−立体化学的関係を有する式ＸＩの化合物を生じさせる。この技術の使用は、ジアステレオマー的に純粋な出発物質からｃｉｓ−又はｔｒａｎｓ−立体化学のいずれかを有する化合物、例えば、ヒドロキシルとＹとＡを有する基との間にｃｉｓ−立体化学的関係を有する純粋な化合物を選択的に得るのを可能にさせる。
【０１２４】
ある種の具体例では、脱離基をアジドで置換することは、斯界で周知のように、ナトリウムアジドのようなアジド陰イオンのアルカリ若しくはアルカリ土類金属塩を使用して、トリメチルシリルアジドのようなシリルアジド反応剤を使用して、又は任意のその他のアジド反応剤、例えば求核性アジド源を使用して達成することができる。
【０１２５】
ある種の具体例では、アジドからアミンへの還元は、水素化アルミニウムリチウム、トリアルキル硼水素化リチウムなどのような水素化物反応剤を使用して、亜鉛金属若しくは二沃化サマリウムと酢酸のような還元性金属と酸源を使用して、水素と白金若しくはパラジウムのような遷移金属触媒の如き接触水素化を使用して、又は任意のその他の好適な手段により達成することができる。
【０１２６】
ある種の具体例では、ｑ＋ｓ＋ｒは２〜３の整数である。ある種の具体例では、ｓは０である。ある種の具体例では、ｑ及びｒはそれぞれ１を表わす。
【０１２７】
ある種の具体例では、Ａは、酸の保護基に結合した酸素を表わす。例えば、酸保護基は、置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基であることができる。このような基には、メチル、エチル、トリメチルシリルエチル、メチルチオメチル、アリル、ベンジル、ｐ−ニトロベンジル、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、ｔ−ブチル又は任意のその他の好適な基が包含される。広範な酸保護基が斯界で知られており、本発明の範囲及び精神から離れることなくこの方法に使用することができる。他の具体例では、Ａはアルキルチオ基を表わす。
【０１２８】
ある種の具体例では、Ｂは窒素を保護する基、例えば、置換又は非置換のアシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基、或いはＮと一緒になったときにカルバメート基を形成する基を表わす。普通の窒素保護基二は、ベンジル、アリル、ｐ−メトキシベンジル、アセチル、トリフルオルアセチル、ｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルなどが包含される。広範な窒素保護基が斯界で知られており、本発明の範囲及び精神から離れることなくこの方法に使用することができる。
【０１２９】
ある種の具体例では、ＹはＯである。
ある種の具体例では、Ａは、一緒になって、環状アミン、例えばピペラジン、モルホリン、ピペリジン、ピロリジンなどを含み得るＸＬＲ４を表わす。
ある種の具体例では、Ｒ３はアリール又はヘテロアリール基を含む。
ある種の具体例では、Ｍは不存在である。
ある種の具体例では、ＸはＮＲ８であり、好ましくはＮＨではない。ある種の具体例では、Ｘは環に含まれ、又は、−Ｃ（＝Ｙ）−と一緒になって第三アミド基を表わす。
【０１３０】
ある種の具体例では、式ＸＩＩＩの化合物は、アミンとＹとＡを含む基とがｃｉｓ−関係を有する異性体のために、例えば、＞７５％、＞８５％、又は更に＞９５％＞のｃｉｓ−異性体のために濃縮される。その他の具体例では、式ＸＩＩＩの化合物は、二つの置換基がｔｒａｎｓ−関係を有する異性体のために、例えば、＞７５％、＞８５％、又は更に＞９５％のｔｒａｎｓ−異性体のために濃縮される。好ましくは、このような濃縮は、異性体的に濃縮された出発物質を使用してもたらされ、例えば、式Ｘの化合物は工程Ａを開始する前に＞７５％、＞８５％、又は更に＞９５％のｃｉｓ−又はｔｒａｎｓ−異性体のために濃縮される。
【０１３１】
同様に、他の具体例では、式ＸＩＶの化合物は、以下の反応式：
【化２７】
2004531458.tif 000023
［ここで、
ｑ及びｒは、それぞれ独立して、ｑ＋ｒの和が２〜４の範囲の整数であるように、０〜２の範囲の整数を表わし、
ＬＧはハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）又はスルホン酸エステル（例えば、トシレート、メシレート、トリフレートなど）のような脱離基を表わし、
Ａは酸を保護する基に結合した酸素若しくは硫黄又は式：ＮＪ２Ｎ（Ｒ９）２を有する基を表わし、
Ｂは窒素を保護する基又は式：ＧＲ６を有する基を表わし、
Ｇは不存在であるか又は−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−又は−ＳＯ２−を表わし、
Ｊは、それぞれについて独立して、水素又はＪに接するＮの両方の存在がＪの少なくとも一つの存在により結合されるようにＮＣ（＝Ｙ）に結合する置換若しくは非置換の低級アルキル若しくはアルキレンを表わし、
Ｒ９は、それぞれについて独立して、不存在であるか又はＨ若しくは低級アルキルを表わし、或いはＪの二つの存在又はＪの一つの存在がＲ９の一つの存在と一緒になって５〜７員の環を形成し、この環はＮの一つ又は両方の存在を含み、  Ｒ６は置換又非置換のアリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキル（多環式基も含めて）を表わし、
ＹはＯ及びＳから選択できる］
に従って変換することができ、
工程Ａはヒドロキシルを脱離基に転化することからなり、
工程Ｂは該脱離基をアジド基で置換することからなり、
工程Ｃはアジドをアミンに還元することからなる。
【０１３２】
ある種の具体例では、ヒドロキシルから脱離基への転化は、ヒドロキシルをハロゲン化スルホニルと反応させてスルホン酸エステルを生じさせることによって、例えば、塩化トシル若しくはトシル無水物を使用してトシレートを生じさせ、又は塩化メシル若しくはメシル無水物を使用してメシレートを生じさせ、又は塩化トリフリル若しくはトリフリル無水物を使用してトリフレートを生じさせることなどにより達成することができる。ある種の具体例では、ヒドロキシルから脱離基への転化は、ヒドロキシルをハロゲン化チオニル、三ハロゲン化燐、五ハロゲン化燐、オキシハロゲン化燐などのようなハロゲン化反応剤と反応させることにより達成することができる。ヒドロキシル基を脱離基に転化するためのその他の技術は斯界で周知であり、工程Ａに使用することができる。
【０１３３】
ある種の具体例では、工程Ａは、第一脱離基を第二脱離基により置換し、脱離基を有する炭素の立体化学を逆転させることを更に含む。従って、例えば、式Ｘの化合物のヒドロキシルがＹとＡを有する基とｃｉｓ−立体化学的関係を有するならば、この化合物と塩化メシルとの反応はＹとＡを有する基とｃｉｓ−立体化学的関係でメシレートを生じさせる。このメシレートとＮａＩのような求核性ハロゲン化物反応剤との反応は、メシレートを沃化物で置き換えて、脱離基である沃素とＹとＡを有する基とがｔｒａｎｓ−立体化学的関係を有する式ＸＶの化合物を生じさせる。この技術の使用は、ジアステレオマー的に純粋な出発物質からｃｉｓ−又はｔｒａｎｓ−立体化学のいずれかを有する化合物、例えば、ヒドロキシルとＹとＡを有する基との間にｃｉｓ−立体化学的関係を有する純粋な化合物を選択的に得るのを可能にさせる。
【０１３４】
ある種の具体例では、脱離基をアジドで置換することは、斯界で周知のように、ナトリウムアジドのようなアジド陰イオンのアルカリ若しくはアルカリ土類金属塩を使用して、トリメチルシリルアジドのようなシリルアジド反応剤を使用して、又は任意のその他のアジド反応剤、例えば求核性アジド源を使用して達成することができる。
【０１３５】
ある種の具体例では、アジドからアミンへの還元は、水素化アルミニウムリチウム、トリアルキル硼水素化リチウムなどのような水素化物反応剤を使用して、亜鉛金属若しくは二沃化サマリウムと酢酸のような還元性金属と酸源を使用して、水素と白金若しくはパラジウムのような遷移金属触媒の如き接触水素化を使用して、又は任意のその他の好適な手段により達成することができる。
【０１３６】
ある種の具体例では、ｑ＋ｒは２〜３の整数である。ある種の具体例では、ｑ及びｒはそれぞれ１を表わす。
【０１３７】
ある種の具体例では、Ａは、酸保護基に結合した酸素を表わす。例えば、酸保護基は、置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基であることができる。このような基には、メチル、エチル、トリメチルシリルエチル、メチルチオメチル、アリル、ベンジル、ｐ−ニトロベンジル、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、ｔ−ブチル又は任意のその他の好適な基が包含される。広範な酸保護基が斯界で知られており、本発明の範囲及び精神から離れることなくこの方法に使用することができる。他の具体例では、Ａはアルキルチオ基を表わす。
【０１３８】
ある種の具体例では、Ｂは窒素を保護する基、例えば、置換又は非置換のアシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基、或いはＮと一緒になったときにカルバメート基を形成する基を表わす。普通の窒素保護基二は、ベンジル、アリル、ｐ−メトキシベンジル、アセチル、トリフルオルアセチル、ｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルなどが包含される。広範な窒素保護基が斯界で知られており、本発明の範囲及び精神から離れることなくこの方法に使用することができる。
【０１３９】
ある種の具体例では、ＹはＯである。
ある種の具体例では、ＢはＧＲ６（ここで、Ｒ６は少なくとも１個の複素環式環、例えばチオフェン、フラン、オキサゾール、ベンゾジオキサン、ベンゾジオキソール、ピロール、インドールなどを含む）である。
【０１４０】
ある種の具体例では、Ａは、一緒になって、環状ジアミン、例えばピペラジンなどを表わし得るＮＪ２Ｎを表わす。このものは、例えば、オキソ、低級アルキル、低級アルキルエーテルなどのような１個以上の置換基により置換されていてよく又は非置換であってよい。ある種のその他の具体例では、ＮＪ２又はＮＪＲ９は、一緒になって、他のＮの存在が結合している置換又は非置換の複素環式環を表わす。ある種の具体例では、Ｊの一つ又は両方の存在は、低級アルキル、低級アルキルエーテル、低級アルキルチオエーテル、アミド、オキソなどの１種以上により置換される。ある種の具体例では、Ｊの存在を含む複素環式環は５〜８員を有する。
【０１４１】
ある種の具体例では、式ＸＶＩＩの化合物は、アミンとＹとＡを含む基とがｃｉｓ−関係を有する異性体のために、例えば、＞７５％、＞８５％、又は更に＞９５％のｃｉｓ−異性体のために濃縮される。その他の具体例では、式ＸＶＩＩの化合物は、二つの置換基がｔｒａｎｓ−関係を有する異性体のために、例えば、＞７５％、＞８５％、又は更に＞９５％のｔｒａｎｓ−異性体のために濃縮される。好ましくは、このような濃縮は、異性体的に濃縮された出発物質を使用してもたらされ、例えば、式ＸＩＶの化合物は工程Ａを開始する前に＞７５％、＞８５％、又は更に＞９５％のｃｉｓ−又はｔｒａｎｓ−異性体のために濃縮される。
【０１４２】
ある種の具体例では、式ＸＩＩＩ又はＸＶＩＩの構造を有するアミンは、例えば、式Ｉ〜ＶＩの化合物を生じさせる方に向けて追加の工程を実施することによって更に変換することができる。しかして、例えば、本発明に従う方法は、下記の工程：
Ｄ）環外アミンに基：−Ｃ（＝Ｚ）ＬＲ１又は−Ｚ’ＶＲ５をカップリングさせること、
Ｅ）環外アミンに基：−Ｒ７又は−ＬＲ２をカップリングさせること、
Ｆ）Ｙを有する基に基：−ＮＪ２Ｎ（Ｒ９）又は−ＸＬＲ４をカップリングさせること、
Ｇ）環の窒素に基：−ＭＲ３又は−ＧＲ６をカップリングさせること
Ｈ）環の窒素から保護基を除去すること、
Ｉ）Ｙを有する基から保持基を除去すること、
Ｊ）環外アミンに窒素保護基を置くこと、
Ｋ）環外アミンから保持基を除去すること
［ここで、
Ｌ、Ｊ、Ｒ９、Ｍ、Ｒ３及びＲ６は上で定義した通りであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ２）ｎアリール（置換又は非置換の）又は−（ＣＨ２）ｎヘテロアリール（置換又は非置換の）を表わし、
ＺはＯ又はＳであり、
Ｚ’は不存在であるか又は−ＳＯ２−、−（Ｃ＝Ｓ）−若しくは−（Ｃ＝Ｏ）−を表わし、
Ｖは不存在であるか又はＯ、Ｓ若しくはＮＲ８を表わし、
Ｒ５は置換又は非置換のアルキル（分岐状又は非分岐状の）、アルケニル（分岐状又非分岐状の）、アルキニル（分岐状又非分岐状の）、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキルを表わし、
Ｒ７は置換又非置換のアリール、アラルキル、ヘテロアリール又はヘテロアラルキルを表わす］
の一つ以上を含む。
【０１４３】
工程Ｄ〜Ｋのどれも、選択できるときは、斯界で周知であるように、種々の反応及び保護基に応じて、任意の順序で達成することができる。本法で使用するのに好適な種々の保護基を上で概説したが、これらは、このような保護基を結合させ及び除去するための多くの技術と同じように、斯界で周知であり、これらのどれも本法の範囲及び精神から離れることなく本法で使用することができる。
【０１４４】
ある種の具体例では、工程Ｄは、環外アミンをアシル化剤、例えば、酸ハロゲン化物、イソシアネート、イソチオシアネート、ハロホーメート、ハロチオホーメート、無水物、重炭酸エステル、ハロゲン化スルホニル、ハロゲン化スルフィニル、塩化カルバモイル、塩化チオカルバモイル又は現場で製造される活性化アシル化部分と反応させることによって達成することができる。アシル化剤は、現場で、例えば、カルボン酸を、カルボジイミド（例えば、ジイソプロピルカルボジイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドなど）、燐系反応剤（例えば、ＢＯＰ−Ｃｌ、ＰｙＢＲＯＰなど）、塩化オキサリル、ホスゲン、トリホスゲンのような活性化剤、又はカルボン酸基と反応してアミンとのカップリングに向けて該カルボン酸と比べて感受性が増大した反応性中間体をもたらす任意のその他の反応剤と反応させることによって達成することができる。有機合成、特にペプチドのカップリングの分野では広範囲のこのような反応剤が周知である。同様に、第一アミン又はアルコールを、例えば、カルボニルジイミダゾール、ホスゲン、トリホスゲン、ジホスゲンなどのようなホスゲンの均等物、又はチオホスゲン、チオカルボニルジイミダゾールなどのようなチオホスゲンの均等物により処理して、アミンと反応して尿素又はチオ尿素を形成できるアシル化剤（例えば、イソシアネート、イソチオシアネート、クロルホルムアミド又はクロルチオホルムアミド）を、その単離又は精製を必要とすることなく、発生させることができる。
【０１４５】
Ｍ又ＧがＳＯ２、Ｃ＝Ｏ又はＣ＝Ｓを表わす具体例では、工程Ｇは、上記の工程Ｄについて説明したような反応剤及び技術を強い使用して達成することができる。Ｍ又はＧが不存在である具体例では、工程Ｇは、環外アミンを親電子性反応剤、例えばハロゲン化又はスルホン酸アルキル、ハロゲン化又はスルホン酸アラルキル、ハロゲン化又はスルホン酸ヘテロアラルキル、ハロゲン化又はスルホン酸シクロアルキル、ハロゲン化又はスルホン酸シクロアルキルアルキル、ハロゲン化又はスルホン酸ヘテロシクシル、或いはハロゲン化又はスルホン酸ヘテロシクシルアルキルと反応させることによって達成することができる。別法として、工程Ｇは、還元的アルキル化、例えば、環外アミンを適当に置換されたアルデヒドと、硼水素化ナトリウムのような還元剤の存在下に反応させるころによって達成することができる。
【０１４６】
ある種の具体例では、工程Ｅは、還元的アルキル化を使用して又は環外アミンをハロゲン化物若しくはスルホン酸エステルのような求電子性試薬と反応させることによって達成することができる。
【０１４７】
ある種の具体例では、工程Ｆは、エステル、チオエステル又はキサントゲン酸エステルを、例えば、式：ＨＮＪ２Ｎ（Ｒ９）２又はＨＸＬＲ４を有する化合物と、例えば、ルイス酸の存在下に、高められた温度で反応させるなどして達成することができる。その他の具体例では、工程Ｆは、カルボン酸を活性化剤、例えば、カルボジイミド（例えば、ジイソプロピルカルボジイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドなど）、燐系反応剤（例えば、ＢＯＰ−Ｃｌ、ＰｙＢＲＯＰなど）、塩化オキサリル、ホスゲン、トリホスゲンのような活性化剤、又はカルボン酸基と反応してアミンとのカップリングの法に向けて該カルボン酸と比べて感受性が増大した反応性中間体をもたらす任意のその他の反応剤と反応させることによって達成することができる。求核性反応剤をカルボン酸又はその誘導体（例えば、エステル、チオエステル）とカップリングさせるためのその他の技術も斯界で周知であり、ここに特に列挙したものの代わりに使用することができる。
【０１４８】
ある種の具体例では、Ｙ及びＺはＯである。
ある種の具体例では、Ｒ１は、分岐状アルキルのような低級アルキル基、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキル、例えばシクロプロピル、シクロプロピルメチル、ネオペンチル、シクロブチル、イソブチル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、シクロブチルメチルなどを表わす。
ある種の具体例では、ＸＬＲ４は、一緒になって、環状アミン、例えばピペラジン、モルホリン、ピペリジン、ピロリジンなどを含む。
ある種の具体例では、Ｒ１に結合したＬはＯ、Ｓ又はＮＲ８、例えばＮＨを表わす。
ある種の具体例では、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の少なくとも１個はアリール又はヘテロアリール基を含む。ある種の関連する具体例では、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の少なくとも２個はアリール又はヘテロアリール基を含む。
ある種の具体例では、Ｍは不存在である。
ある種の具体例では、ＸはＮＨではない。ある種の具体例では、Ｘは環に含まれ、又は−Ｃ（＝Ｙ）−と一緒になって第三アミドを表わす。
【０１４９】
ある種の具体例では、ＮＪ２Ｎは、一緒になって、ピペラジンなどのような環状ジアミンを表わす。このものは、例えば、オキソ、低級アルキル、低級アルキルエーテルなどのような１個以上の置換基により置換されていてよく又は非置換であってよい。ある種の具体例では、ＮＪ２又はＮＪＲ９は、一緒になって、他のＮの存在が結合している置換又は非置換の複素環式環を表わす。ある種の具体例では、Ｊの一つ又は１個以上の存在は、低級アルキル、低級アルキルエーテル、低級アルキルチオエーテル、アミド、オキソなどの１種以上により置換される。ある種の具体例では、Ｊの存在を含む複素環式環は５〜８員を有する。
ある種の具体例では、Ｒ５は分岐状アルキル、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキルを表わす。
ある種の具体例では、Ｒ６は、少なくとも１個の複素環式環、例えば、チオフェン、フラン、オキサゾール、ベンゾジオキサン、ベンゾジオキソール、ピロール、インドールなどを含む。
ある種の具体例では、Ｒ７は、ベンジル基のようなフェニル基を表わし、これはハロゲン、ヒドロキシル、低級アルキル、ニトロ、シアノ、低級アルキルエーテル（例えば、ＣＨＦ２ＣＦ２Ｏのように置換されていてよい）又は低級アルキルチオエーテル（例えば、ＣＦ３Ｓのように置換されていてよい）により置換されていてよい。
ある種の具体例では、Ｒ８は、Ｖに存在するときは、Ｈ又は低級アルキルであり、好ましくはＨである。
【０１５０】
ＩＶ．方法及び組成物の典型的適用
本発明の他の特徴は、ｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進を有する細胞の分化状態、生存及び／又は増殖を、主題の方法に従ってヘッジホッグアンタゴニストに細胞を接触させて調節する方法に関する。
【０１５１】
例えば脊椎動物において、分化した組織が秩序だって空間的に配置されることに、ヘッジホッグ、ｐｔｃ及びスムースンドが明らか広く関与しているという発見に照らし合わせると、主題の方法はイン・ビトロ及びイン・ビボ両方において、異なる脊椎動物組織系列の作成及び／又は維持処置の一部として用いることができる。所与の組織の増殖及び分化に関して、誘導性の有無に関わらず、適当なものであれば、ヘッジホッグアンタゴニストは上記した調製物のいずれでもありうる。
【０１５２】
例えば、本発明の方法は、遺伝上又は生化学上のいずれかの理由から、細胞がｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進の表現型を有する場合、細胞培養技術に適用することができる。イン・ビトロのニューロン培養系が、ニューロン発達の研究及び神経向性因子［神経成長因子（ＮＧＦ）、毛様体向性因子（ＣＮＴＦ）及び脳誘導神経向性因子（ＢＤＮＦ）など］の同定において基本的で不可欠なものだということがわかっている。本発明の方法の使用法の一つとして、神経幹細胞の培養において用いるもの（例えば新しいニューロン及びグリアの作成を目的に、そのような培養において用いる）が挙げられる。主題の方法のそのような態様においては、培養細胞を本発明のヘッジホッグアンタゴニストと接触させて、培養中の神経幹細胞の増殖率及び／又は分化の速度を変化させるか、ある種の末期分化神経細胞の培養の完全性を保持する。例証的な態様においては、主題の方法を用いて、例えば感覚ニューロン又は運動ニューロンを培養することができる。そのようなニューロン培養を、簡易なアッセイ系並びに治療用の移植可能細胞源として用いることができる。
【０１５３】
本発明によると、大量の非腫瘍形成性神経幹細胞をイン・ビトロで永久保存することができ、本発明のヘッジホッグアンタゴニストと接触させることによってそれらの増殖率及び／又は分化率に影響を及ぼすことができる。一般に、動物から神経幹細胞を単離する段階；これらの細胞を、好ましくは成長因子の存在下に、イン・ビトロ又はイン・ビボで永久保存する段階；及びこれらの細胞をヘッジホッグアンタゴニストに接触させることによって細胞の特定の神経表現型（例えばニューロン及びグリア）への分化を調節する段階を包含する方法が提供される。
【０１５４】
幹細胞は、分化が必要とされるまで抑制した状態に保持される、持続性抑制の影響下にあると考えられる。しかし、最終的な分化にいたる（従って非分裂性の）ニューロンとは違って、これらの細胞を増殖させる方法が近年開発されている。細胞は無限に産生され、神経変性疾患を有する異種及び自己宿主内への移植に非常に好適である。
【０１５５】
「幹細胞」とは、制限無く分裂することができ、特殊な条件下で、最終的にニューロン及びグリアなどに分化する娘細胞を産生することができる、少分化能（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）又は多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）を有する細胞を意味する。これらの細胞を、異種又は自己宿主への移植に用いることができる。「異種」とは、幹細胞が由来する動物以外の宿主であることを意味する。「自己」とは、細胞が由来するのと同一の宿主であることを意味する。
【０１５６】
細胞は、神経組織を有するあらゆる動物において、胎芽、生後、幼若、又は成人の神経組織から得ることができる。より具体的には、あらゆる魚類、は虫類、鳥類、両生類又はほ乳類などが挙げられる。最も好ましいドナーはほ乳類、特にマウス及びヒトである。
【０１５７】
非ヒト異種ドナー動物を用いる場合、動物を安楽死させ、脳及び対象とする特異な領域を無菌の処理工程によって取り出す。特に対象となる脳の領域としては、宿主の脳の変質した領域の機能を回復するのに用いられる幹細胞が得られる領域であれば、どのような領域でも含まれる。そのような領域の例としては、大脳皮質、小脳、中脳、脳幹、脊髄及び脳室組織などの中枢神経系（ＣＮＳ）の領域、頸動脈小体及び副腎髄質などの末梢神経系（ＰＮＳ）の領域が挙げられる。特に、大脳基底核における領域、好ましくは尾状核及び被殻からなる線条、又は淡蒼球、視床下核などの様々な細胞群、アルツハイマー病患者中で変質がみられる核基底、又はパーキンソン病患者で変質がみられる黒質緻密部が挙げられる。
【０１５８】
ヒト異種神経幹細胞は、人工妊娠中絶から得た胎児組織に由来するものでもよいし、生後、幼若又は成人の臓器ドナーから得たものであってもよい。自己神経組織はバイオプシーによって得ることもできるし、神経外科、具体的には癲癇手術、さらに具体的には側頭葉切除術及び海馬切除術で、神経組織を除去した患者から得ることもできる。
【０１５９】
ドナー組織の連結細胞外基質から個々の細胞を解離することによって、細胞を得ることができる。解離は、公知の方法、例えばトリプシン、コラゲナーゼなどの酵素による処理によって、（先端の尖っていない器具を用いる）物理的な解離方法によって、又はメスを用いる微塵切りによって実施する。これにより組織から得た特異な細胞型の増殖が可能になる。胎児細胞の解離は、組織培養基内で行うことができるが、幼若及び成人細胞の解離に好ましい培養基は、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）である。一般的なａＣＳＦは、１２４ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１．３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、２６ｍＭ  ＮａＨＣＯ３及び１０ｍＭ  Ｄ−グルコースを含んでいる。ＭｇＣｌ２を３．２ｍＭの濃度で、ＣａＣｌ２を０．１ｍＭの濃度で含むことを除いては、低Ｃａ２＋ａＣＳＦは同じ成分を含んでいる。
【０１６０】
解離した細胞は、細胞成長を支持する公知のあらゆる培養基で培養することができる。培養基の例としては、細胞の代謝に必要な追加成分（グルタミン及び他のアミノ酸、ビタミン、ミネラルなど）及び有用な蛋白質（トランスフェリンなど）を含む、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、Ｆ−１２などが挙げられる。培養基は、酵母菌、バクテリア及び菌類などによる汚染を防ぐ抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンなど）を更に含んでいてもよい。ある場合には、培養基はウシ、ウマ、ニワトリなどに由来する血清を含んでいてもよい。特に好ましい細胞培養基は、ＤＭＥＭ及びＦ−１２の混合物である。
【０１６１】
培養条件は、生理条件に近いものでなければならない。培養基のｐＨは、生理的ｐＨに近いもの、好ましくはｐＨ６−８、より好ましくはｐＨ７、更により好ましくはｐＨ７．４に近いものでなければならない。細胞は生理的温度に近いもの、好ましくは３０−４０℃、より好ましくは３２−３８℃、更により好ましくは３５−３７℃で培養されなければならない。
【０１６２】
細胞は懸濁液中で又は固定基質上で育成することができるが、幹細胞の増殖は、多数の細胞が「凝集塊」を形成するように好ましくは懸濁液中で行われる（例えばＲｅｙｎｏｌｄｓ他（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５５：１０７０−１７０９；及びＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／０１２７５、ＷＯ９４／０９１１９、ＷＯ９４／１０２９２、及びＷＯ９４／１６７１８参照）。増殖中（又は分裂中）の懸濁細胞の場合、フラスコを十分に振盪し、凝集塊をフラスコ底角に沈殿させる。凝集塊を５０ｍｌ遠心分離管に移し、低速で遠心分離する。培養基を吸引して、成長因子を含む少量の培養基に細胞を再懸濁する。細胞を機械的に解離して、培養基の別々のアリコートに再懸濁する。
【０１６３】
培養基中の細胞懸濁液に、幹細胞の増殖を可能にする成長因子を補充し、細胞を支持することのできる容器に入れるが、上記したように、好ましくは培養フラスコ又はローラーボトルに入れる。細胞は一般に３−４日間、３７℃の保温器内に入れることで増殖する。細胞を解離し、成長因子を含む培養基中に再懸濁することによっていつでも増殖を再開することができる。
【０１６４】
基質の非存在下では、細胞はフラスコの床を離れて懸濁液中で増殖を続け、未分化細胞の中空凝集塊を形成する。イン・ビトロにて約３−１０日後から、増殖群（凝集塊）を２−７日ごと、好ましくは２−４日ごとに、緩やかな遠心分離によって供給し、成長因子を含む培養基に再懸濁する。
【０１６５】
イン・ビトロで６−７日後に、凝集塊中の個々の細胞を、先端の尖っていない器具で物理的に解離して（より具体的にはピペットで凝集塊を砕いて）分離する。解離した凝集塊からの個々の細胞を、成長因子を含む培養基に再懸濁し、ヘッジホッグアンタゴニストの存在下で細胞を培養する（又は再懸濁する）ことによって、細胞の分化を培養中で制御する。
【０１６６】
主題のヘッジホッグアンタゴニストの他の使用法をさらに例証するものとして、脳内移植が中枢神経系治療の更なる方法として用いられるようになったことを挙げておく。例えば、損傷した脳組織を修復する一つの方法として、胎児又は新生児の細胞を成人の脳に移植する方法が挙げられる（Ｄｕｎｎｅｔｔ他（１９８７）Ｊ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ１２３：２６５−２８９；及びＦｒｅｕｎｄ他（１９８５）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ５：６０３−６１６）。様々な脳領域から取った胎児ニューロンを、成人の脳にうまく組み込むことができ、その結果、行動上の欠陥を緩和することができる。例えば、脳幹神経節に対するドーパミン作用性突起物における損傷によって起こる運動障害は、胎芽のドーパミン作用性ニューロンを移植することによって避けることができる。新皮質の損傷によって起こる複雑認識機能の障害は、胎芽の皮質細胞を移植することによって部分的に回復させることができる。主題の方法を用いて培養の成長状態を調節することができ、胎児組織が用いられる場合には、特に神経幹細胞を用いて、幹細胞の分化率を調節することができる。
【０１６７】
本発明で用いることのできる幹細胞は、公知のものである。例えば、幾つかの神経冠細胞が同定されているが、そのうちの幾つかは多分化能を有しており拘束されていない（ｕｎｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）神経冠細胞を代表し、その他は一種類のみの細胞を産生する拘束された（ｃｏｍｉｉｔｔｅｄ）幹細胞を代表する。本発明の方法において、そのような幹細胞の培養に用いられるヘッジホッグアンタゴニストの役割としては、拘束されていない幹細胞の分化の調節；又は拘束された幹細胞の、神経細胞になる最終的分化へ向かう発達の更なる制限の調節が挙げられる。例えば、本発明の方法をイン・ビトロで用いて、神経冠細胞のグリア細胞、シュワン細胞、クロム親和性細胞、コリン作動性交感ニューロン又は副交感ニューロン、並びにペプチド作動性及びセロトニン作動性ニューロンへの分化を調節することができる。ヘッジホッグアンタゴニストは単独で用いることもできるし、神経幹細胞の特定の分化をさらに促進する他の神経向性因子と組み合わせて用いることもできる。
【０１６８】
本発明の主題のヘッジホッグアンタゴニストの存在下で培養した細胞の移植に加えて、本発明のさらに他の特徴は、ヘッジホッグアンタゴニストを適用して、中枢神経系と末梢神経系両方のニューロン及び他のニューロン細胞の成長状態を調節することに関する。ｐｔｃ、ヘッジホッグ及びスムースンドが、神経系発達中と、おそらくは成人期にニューロンの分化を調節する能力を有する。このことは、主題のヘッジホッグアンタゴニストがある場合において、正常細胞の保持、機能遂行及び老化；化学的又は機械的に損傷を受けた細胞の修復及び再生；及びある種の病理学上の条件下での変質の治療に関して、成人ニューロンを制御するであろうことを示している。これに鑑みて、本発明は特に主題の方法を下記に由来する神経系状態の治療プロトコル（予防及び／又は病状の低減）に適用することを企図する。（ｉ）外傷、化学的損傷、血管損傷及び欠陥（例えば脳卒中による虚血）、感染性／炎症性及び腫瘍性損傷などの神経系の急性、亜急性、又は慢性の損傷；（ｉｉ）アルツハイマー病などの神経系の老化；（ｉｉｉ）パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性などの慢性神経変性疾患；及び（ｉｖ）多発性硬化症などの、神経系の又は神経系に影響を与える慢性免疫疾患。
【０１６９】
適正に行えば、主題の方法を用いて中枢及び末梢神経損傷を修復する、人工神経を作成することができる。特に、潰れた又は切断された軸索に、人工器具を用いて管を取り付ける場合には、人工器具にヘッジホッグアンタゴニストを添加して、成長速度及び樹状突起の再生を調節することができる。神経導入経路の例は、米国特許第５，０９２，８７１号及び第４，９５５，８９２号に記載がある。
【０１７０】
他の態様においては、主題の方法を（例えば中枢神経系において起こる）悪性又は過形成性形質転換の治療に用いることができる。例えば、ヘッジホッグアンタゴニストを用いて、そのような形質転換細胞を分裂終了又は自死状態にすることができる。従って本発明の方法は、例えば悪性神経膠腫、髄膜腫、髄芽細胞腫、神経外胚葉腫及び脳室上皮腫の治療の一部に用いることができる。
【０１７１】
好ましい態様においては、主題の方法を、悪性髄芽細胞腫及び他の一次ＣＮＳ悪性神経外胚葉腫の治療養生法の一部として用いることができる。
【０１７２】
ある態様においては、主題の方法を髄芽細胞腫の治療プログラムの一部として用いることができる。一次脳腫瘍である髄芽細胞腫は、子供にみられる最も一般的な脳腫瘍である。髄芽細胞腫は後窩に発生する初期神経外胚葉腫（ＰＮＥＴ）である。これは小児脳腫瘍の原因の約２５％を占めている（Ｍｉｌｌｅｒ）。髄芽細胞腫は組織構造的には、一般にロゼット状に配置された小型の丸い細胞腫であるが、いくつかは星状細胞、上衣細胞又はニューロンに分化する（Ｒｏｒｋｅ；Ｋｌｅｉｈｕｅｓ）。ＰＮＥＴは松果体（松果体芽細胞腫）及び大脳を含む脳の他の領域に起こりうる。テント上方領域に起こるこれらは、一般にＰＦ同等物より病状が重い。
【０１７３】
髄芽細胞腫／ＰＮＥＴは切除術の後ＣＮＳのどこにでも再発し、骨にまで移転することが知られる。従って前処理評価において、「脱落（ｄｒｏｐｐｅｄ）移転」の可能性を除外するための脊髄の検査が行われる。このため一般に、脊髄造影法の代わりにガドリニウム促進ＭＲＩが行われており、術後の日常操作としてＣＳＦ細胞診断が得られる。
【０１７４】
他の態様においては、主題の方法が脳室上皮腫の治療プログラムの一部として用いられる。脳室上皮腫は、小児脳腫瘍の原因の約１０％を占めている。概して、脳室上皮腫は脳室の上衣ライニングに起こる腫瘍であり、顕微鏡的な大きさのロゼット、カナル及び血管周囲のロゼットを形成する。脳室上皮腫について報告された５１人の小児のＣＨＯＰにおいて、３／４が組織構造上は良性であった。約２／３が第４の脳室に由来した。１／３がテント上方領域に存在した。ＳＥＥＲのデータ及びＣＨＯＰのデータが示すように、０歳から４歳の間にそれらがピークに達した。中央値の年齢は５歳であった。この疾病を有する小児の多くが乳児なので、多様な治療法が必要とされる。
【０１７５】
本発明のさらに他の特徴は、ｐｔｃ、ヘッジホッグ及び／又はスムースンドが、上記した神経分化に加えて、他の脊椎動物有機物質経路に関与する形態発生シグナルに関与し、内胚葉のパターン形成、中胚葉及び内胚葉の分化過程に明らかに役割を果たしているという観察に関する。従って本発明は、ヘッジホッグアンタゴニストを包含する組成物を、非神経組織の産生及び保持に関わる細胞培養及び治療法の両方に用いることを企図する。
【０１７６】
一つの態様において、本発明はｐｔｃ、ヘッジホッグ及びスムースンドが、原腸に由来する消化管、肝臓、肺及び他の臓器の形成に関与する幹細胞の発達の制御に明らかに関与しているという発見を利用するものである。Ｓｈｈは内胚葉から中胚葉への誘導シグナルとして提供されるが、これは腸管形態形成に非常に重要である。従って、例えば本発明の方法のヘッジホッグアンタゴニストを用いて、正常な肝臓の複数の代謝機能を有する人工肝臓の発達及び維持を調節することができる。例証的な態様においては、主題の方法を用いて、消化管幹細胞の増殖及び分化を調節し、肝細胞培養を形成して、細胞外基質を稠密にさせるのに用いるかあるいは生体適合性重合体に封入して移植可能及び体外人工肝臓を形成することができる。
【０１７７】
他の態様においては、ヘッジホッグアンタゴニストの治療組成物を、人工肝臓、胎芽肝臓構造などの移植とともに用いて、腹腔内移植、血管新生及び生体内分化の取り込み並びに移植された肝臓組織の維持を調節することができる。
【０１７８】
さらに他の態様においては、主題の方法を治療に用いて、物理的、化学的又は病理学的損傷を受けた後の上記のような臓器を調節することができる。例えば、ヘッジホッグアンタゴニストを包含する治療用組成物を、肝切除術に次ぐ肝臓修復に用いることができる。
【０１７９】
胎芽の腸管からの膵臓及び小腸の形成は、腸管の内胚葉細胞と中胚葉細胞との間の細胞間シグナリングに依存している。特に、腸の中胚葉の平滑筋への分化は、隣接する内胚葉細胞からのシグナルに依存することが示唆されている。胎芽の後腸における内胚葉に由来するシグナル媒介物の候補の一つとして、Ｓｏｎｉｃヘッジホッグがある（例えばＡｐｅｌｑｖｉｓｔ他（１９９７）Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ７：８０１−４参照）。Ｓｈｈ遺伝子は胎芽の腸管内胚葉に渡って発現されるが、これには例外があって、膵臓芽内胚葉では、膵臓発達初期の必須レギュレーターであるホメオドメインタンパク質Ｉｐｆ１／Ｐｄｘ１ （インシュリンプロモーター因子１／膵臓及び十二指腸ホメオボックス１）が高レベルで発現される。Ａｐｅｌｑｖｉｓｔ他（上述）では、胎芽の腸管におけるＳｈｈの差異発現が、取り巻く中胚葉から小腸及び膵臓といった特異な中胚葉誘導体への分化を制御するかどうかを研究している。該文献ではこれを調べるために、Ｉｐｆ１／Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターを用いて、発達中の膵臓上皮におけるＳｈｈを選択的に発現している。Ｉｐｆ１／Ｐｄｘ１−Ｓｈｈトランスジェニックマウスにおいて、膵臓中胚葉は膵臓間充織及び脾臓へ分化せず、平滑筋及び腸管カハル細胞（腸管に特徴的な細胞）に発達した。さらに、Ｓｈｈに接触させた膵臓外植は、同様の腸管分化を経た。これらの結果は、内胚葉に由来するＳｈｈの差異発現が、腸管の異なる領域における隣接する中胚葉の分化を制御することを意味している。
【０１８０】
従って本発明の文脈では、主題のヘッジホッグアンタゴニストを用いて、イン・ビボ及びイン・ビトロの両方において膵臓組織の増殖及び／又は分化を制御又は調節することを企図する。
【０１８１】
本発明の阻害剤が治療効果をもたらす、様々な病理学上の細胞増殖及び分化条件がある。例えば異常なインシュリン発現の修正、又は分化の調節などが挙げられる。しかしより一般的には、本発明は、膵臓細胞を主題の阻害剤に接触させることによって、細胞の分化状態を誘導及び／又は維持し、生存を強化し及び／又は増殖へ影響を与える方法に関する。例えば、膵臓組織の秩序だった空間的配置形成にｐｔｃ、ヘッジホッグ及びスムースンドが明らかに関与していることから、イン・ビトロ及びイン・ビボの両方でそのような組織を産生及び／又は維持する方法の一部として主題の方法を用いることが本発明によって企図される。例えば、ヘッジホッグの機能の調節は、細胞及びおそらくは非膵臓組織の産生及び維持に関与する、細胞培養及び治療法の両方に（例えば原腸に由来する消化管、脾臓、肺、泌尿生殖器（例えば、膀胱）及び他の臓器からの組織の発達及び維持の制御に）用いることができる。
【０１８２】
例証的な態様においては、本発明の方法を、特に膵臓細胞の異常な増殖によって特徴づけられる、膵臓組織の過形成性及び腫瘍性疾患の治療に用いることができる。例えば膵臓癌は、膵臓のインシュリン分泌量に調節をきたす、膵臓細胞の異常な増殖によって特徴付けられる。例えば膵癌などのある種の膵臓過形成は、β細胞の機能不全又は島細胞重量の減少によって、低インシュリン血症を引き起こす。病状の進行において異常なｐｔｃ、ヘッジホッグ及びスムースンドシグナリングが示される程度まで、主題のインヒビターを用いて抗腫瘍治療の後の組織再生を促進することができる。
【０１８３】
その上さらに、異なる点でヘッジホッグシグナリング特性を操作することは、イン・ビボ及びイン・ビトロの両方における膵臓組織復元／再生技術の一部として有用である。一つの態様においては本発明は、ｐｔｃ、ヘッジホッグ及びスムースンドが膵臓組織の発達の調節に関与していることを利用する。一般に、主題の方法を治療的に用いて、物理的、化学的又は病理的傷害の後に膵臓を調節することができる。さらに他の態様において、主題の方法を細胞培養技術に適用することができ、特に人工膵臓組織の初期形成の促進に用いることができる。例えばヘッジホッグ活性を変化させることによる膵臓組織の増殖及び分化の操作は、培養組織の特徴をより注意深く制御する手段を提供する。例証的な態様においては、主題の方法を用いて、例えば下記に記載のある封入装置に用いることのできる、β島細胞を必要とする人工器官の産生を増加させることができる（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ他、米国特許第４，８９２，５３８号、Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ他、米国特許第５，１０６，６２７号、Ｌｉｍ、米国特許第４，３９１，９０９号、及びＳｅｆｔｏｎ、米国特許第４，３５３，８８８号）。膵島の初期幹細胞は多分化能を有し、最初に出現したときから、全ての島細胞特異的遺伝子を共活性化するのは明らかである。分化が進むにつれて、島細胞特異的ホルモン（例えばインシュリン）の発現は、成熟島細胞に特徴的な発現パターンに制限される。しかし、成熟β細胞における胎芽の特徴の再発が観察できるようになると、成熟島細胞の表現型は培養中では安定しない。主題のヘッジホッグアンタゴニストを利用することによって、細胞の分化経路又は増殖率を調節することができる。
【０１８４】
さらに、膵臓組織の分化状態の操作を、人工膵臓の移植と組み合わせて利用して、移植、血管新生及び生体内分化、並びに移植された組織の維持を促進することができる。例えば、組織分化に影響するヘッジホッグ機能の操作を、移植片の生存能力を維持する手段として利用することができる。
Ｂｅｌｌｕｓｃｉ他（１９９７）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２４：５３には、Ｓｏｎｉｃヘッジホッグが肺間充織細胞増殖をイン・ビボで調節することが報告されている。従って、本発明の方法を用いて、（例えば肺気腫の治療における）肺組織の再生を調節することができる。
【０１８５】
Ｆｕｊｉｔａ他（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｉｎ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ２３８：６５８には、Ｓｏｎｉｃヘッジホッグがヒト肺扁平上皮癌及び腺癌において発現することが報告されている。Ｓｏｎｉｃヘッジホッグの発現は、ヒト肺扁平上皮癌組織において検出されたが、同じ患者の正常な肺組織においては検出されなかった。上記文献は、ＳｏｎｉｃヘッジホッグがＢｒｄＵの癌細胞への取り込みを刺激し、細胞成長を刺激する一方で、抗Ｓｈｈ−Ｎが細胞成長を阻害することも報告している。これらの結果は、ｐｔｃ、ヘッジホッグ及び／又はスムースンドが、そのように形質転換した肺組織の細胞成長に関与していることを示唆し、従って主題の方法を、肺癌及び腺癌、並びに肺上皮に関する増殖疾患の治療の一部として用いることができることを示している。
【０１８６】
これらの腫瘍にヘッジホッグ経路が関与していること、又は発達の際にこれらの組織中にヘッジホッグ及びその受容体の発現が検出されることに鑑みて、主題の化合物による処置によって、他の多くの腫瘍に影響を与えうる。そのような腫瘍の例としては、ゴーリン症候群に関する腫瘍（例えば基底細胞癌、髄芽細胞腫、髄膜腫など）、ｐｃｔノックアウトマウスにみられる腫瘍（例えば血管腫、横紋筋肉腫など）、ｇｌｉ−１増幅の結果起こる腫瘍（例えば神経グリア芽細胞腫、肉腫など）、ＴＲＣ８、ｐｔｃ相同体に連結した腫瘍（例えば腎臓癌、甲状腺癌など）、Ｅｘｔ−１関連腫瘍（例えば骨癌など）、Ｓｈｈ誘導腫瘍（例えば肺癌、軟骨肉腫など）及び他の腫瘍（例えば乳癌、尿生殖器（例えば腎臓、膀胱、尿管、前立腺など）癌、副腎癌、胃腸（例えば胃、腸など）癌など）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１８７】
本発明の更に他の態様において、ヘッジホッグアンタゴニストを包含する組成物を用いて、例えば骨格形成性幹細胞から骨格組織をイン・ビトロで産生すること、並びにイン・ビボで骨格組織欠陥を治療することができる。本発明は特に、ヘッジホッグアンタゴニストを用いて軟骨形成軟骨形成及び／又は骨形成の速度を調節することを企図する。ここでいう「骨格組織欠陥」とは、欠陥がどのような由来（例えば外科手術的介入、腫瘍の除去、潰瘍形成、移植、骨折又は他の外傷あるいは変性状態）であれ、骨又は結合組織の回復が望まれる場所における、骨又は他の骨格結合組織の欠陥のことをいう。
【０１８８】
例えば本発明の方法を、結合組織の軟骨機能の回復を目的とする養生法の一部として用いることができる。そのような方法は、例えば変性摩耗（関節炎など）、並びに組織の外傷（摩耗した半月板組織の置き換え、半月板切除、靱帯の摩耗による関節の緩み、関節の悪性腫瘍、骨折などの組織の外傷により生じる、又は遺伝病により生じうるもの）などの他の機械的傷害の結果起こる、軟骨組織における欠陥又は損傷の回復において有用である。本発明の修復方法は、成形外科、再建術及び歯周手術などの、軟骨基質の再構成に有用である。本発明の方法は、半月板、靱帯又は軟骨の手術による修復に続く、前修復段階の改善に適用することができる。その上更に、本発明の方法は、外傷を受けた後の早い時期に適用された場合には、変性疾患の発症又は病状再燃を防ぎうる。
【０１８９】
本発明の一つの態様において、主題の方法は、治療上十分な量のヘッジホッグアンタゴニスト（特に、インディアンヘッジホッグシグナル変換に対して選択的なアンタゴニスト）によって疾患のある結合組織を処置し、組織の有する軟骨細胞の分化及び／又は増殖速度を操作することによって、結合組織における軟骨修復応答を調節することを包含する。関節軟骨、関節間軟骨（半月板）、肋軟骨（真肋と胸骨を連結する）、靱帯及び腱などの結合組織は、主題の方法を用いる再建及び／又は再生治療における処置に特に敏感に反応する。ここで言う「再生治療」には、組織の欠陥が明らかに現れる点まで進行した変性状態の治療、変性が初期段階又は切迫した状態である組織の予防治療が含まれる。
【０１９０】
例証的な態様において、主題の方法を、膝、足首、肘、臀部、手首、手又は足の指関節、又は上顎関節などの可動関節の軟骨の治療における治療的介入の一部として用いることができる。治療は関節の半月板、関節軟骨、又はその両方を対象とすることができる。更に例証すると、主題の方法は外傷（例えばスポーツによる傷害又は過度の摩耗）又は変性関節炎の結果起こりうる膝の変性疾患の治療に用いることができる。主題のアンタゴニストは、例えば関節鏡検査針を用いて、関節に注射して投与してもよい。ある場合には投与される薬剤は、薬剤と治療組織との接触を延長させ定常的なものとするために、ヒドロゲル又は上記した他の緩効性賦形剤の形状をとることができる。
【０１９１】
本発明は、軟骨移植及び人工器官治療の分野において主題の方法を使用することを更に企図する。しかし、例えば軟骨と繊維軟骨の特性は組織によって（例えば関節、半月板軟骨、靱帯及び腱の間で；同じ靱帯又は腱の両端の間で；そして同じ組織の表面部と深淵部との間で）異なるので、問題が生じる。これらの組織の空間的配置は、機械的特性上の緩やかな変化を反映しうるので、これらの条件下にある未分化の移植組織が、適当に応答する能力を有していない場合には、機能不全が起こる。例えば、半月板軟骨が前十字靱帯の修復に用いられる場合、組織に化生が起こり純粋な繊維組織になる。軟骨形成の速度を調節することによって、新しい環境に移植細胞を適合させ、組織の初期発達段階の肥大軟骨細胞に類似させるように制御して、主題の方法を特にこの問題を対処するように用いることができる。
【０１９２】
同様に、主題の方法を適用して、人工軟骨の作成及び移植の両方を促進することができる。改善された治療法が必要とされているため、コラーゲン−グリコサミノゲン鋳型［Ｓｔｏｎｅ他（１９９０）Ｃｌｉｎ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｌａｔ Ｒｅｄ２５２：１２９］、単離軟骨細胞［Ｇｒａｎｄｅ他（１９８９）Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ７：２０８；及びＴａｋｉｇａｗａ他（１９８７）Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ２：４４９］及び天然又は合成重合体に連結した軟骨細胞［Ｗａｌｉｔａｎｉ他（１９８９）Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｔ Ｓｕｒｇ７１Ｂ：７４；Ｖａｃａｎｔｉ他（１９９１）Ｐｌａｓｔ Ｒｅｃｏｎｓｔｒ Ｓｕｒｇ８８：７５３；ｖｏｎ Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ他（１９９１）ＪＢｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ２５：３２９；Ｆｒｅｅｄ他（１９９３）Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ２７：１１；及びＶａｃａｎｔｉ他、米国特許第５，０４１，１３８号］に基づいて、新たな軟骨の作成を目的に研究がされてきた。例えば、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、アガロースなどの重合体、あるいは重合体主鎖の加水分解機能で長期にわたって無害のモノマーに分解される他の重合体から形成される、生分解性及び生体適合性を有する多孔質の骨格上の培養基で、軟骨細胞を育成することができる。基質は、移植までに、細胞の適当な栄養供給とガス交換が可能なように設計されている。細胞は、移植する細胞の体積及び密度が適当に大きくなるまでイン・ビトロで培養することができる。基質を用いると、個々が望ましい形状に型どりでき、最終産物を患者自身の例えば耳又は鼻に似せることができるという利点がある。あるいは柔軟な基質を用いて、例えば関節に移植する際に整復することができる。
【０１９３】
主題の方法の一つの態様においては、培養工程のある段階において、移植組織片をヘッジホッグアンタゴニストに接触させて、軟骨細胞の分化の速度及び培養内の肥大軟骨細胞の形成を制御する。
【０１９４】
他の態様においては、移植された人工組織をヘッジホッグアンタゴニストで処置して、移植された基質を能動的に形作って意図する機能に好適なものとする。組織移植に関して上記したように、人工移植には、移植された実際の機械的環境との比較が可能な環境に基質が由来するものではないという、同じ欠点がある。主題の方法の有する、基質において軟骨細胞を調節する能力によって、置換される予定の組織と同様の特徴を移植片が獲得できるようになる。
【０１９５】
更に他の態様において、主題の方法は、人工器官の付着を促進するのに用いられる。例えば主題の方法を、人工歯周器官の移植に用いることができる。ここでは周辺の結合組織を処置することによって、人工器官を取り巻く歯周靱帯の形成が刺激される。
【０１９６】
更に他の態様においては、主題の方法を、動物の骨格組織の欠陥部位における骨形成を目的とした養生法の一部として用いることができる。Ｉｎｄｉａｎヘッジホッグは、最終的に骨芽細胞に置換される肥大軟骨細胞に特に関連している。例えば被験者の骨損失を調節する方法の一部として、本発明のヘッジホッグアンタゴニストを投与することができる。例えばヘッジホッグアンタゴニストを包含する調製物を用いて、例えば骨化の「モデル」形成における軟骨内骨化を制御することができる。
【０１９７】
本発明の更に他の態様において、ヘッジホッグアンタゴニストを用いて精子形成を調節することができる。ヘッジホッグタンパク質、特にＤｈｈは、精巣生殖細胞の分化及び／又は増殖及び維持に関連していることが示されている。Ｄｈｈの発現は、Ｓｒｙ（精巣決定遺伝子）活性化の直後にセルトリ細胞前駆体において誘導され、成人の精巣においても持続する。成熟精子が全く存在しないので、男性は生存可能であるが不妊である。様々な遺伝子背景において発達中の精巣を検査したところ、Ｄｈｈは精子形成の初期段階及び後期段階の両方を調節することが示唆された［Ｂｉｔｇｏｏｄ他（１９９６）Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ６：２９８］。好ましい態様においては、ヘッジホッグアンタゴニストを避妊薬として用いることができる。同様に、主題の方法のヘッジホッグアンタゴニストは、正常な卵巣機能の調節に有用である可能性がある。
【０１９８】
主題の方法は、上皮組織に起こる疾患の予防処置、化粧などに幅広く適用することができる。一般にこの方法は、処置を行った上皮組織の成長状態が変化するのに有効な量のヘッジホッグアンタゴニストを、動物に投与する段階を含むことを特徴とする。投与の方法及び用量計画は、処置される上皮組織に応じて異なる。例えば、処置される組織が表皮組織（皮膚組織又は粘膜組織）である場合には、局所的な投与が好ましい。
【０１９９】
「傷の治癒を促進する」方法で処置を行った場合には、この処置を用いない場合の傷の治癒と比較して、より速く傷が治癒する。「傷の治癒の促進」とは、とりわけケラチン合成細胞の増殖及び／又は成長を調節する方法、又はより少ない傷跡、より少ない傷収縮、より少ないコラーゲン付着及びより表層でおこるの傷の治癒を意味する。ある場合においては、「傷の治癒の促進」とは、本発明の方法を用いたときに、ある種の傷治癒の方法が改善された継代速度（例えば皮膚移植の生着速度）を有することも意味する。
【０２００】
現在まで再建術に有意な進歩があったにもかかわらず、治癒される皮膚の正常機能及び外観の回復において、傷跡は重大な障害になりうる。これは、手や顔のケロイド又は肥大性傷跡などの病理的傷跡が機能障害及び肉体的変形の原因となっている場合に特にあてはまる。最も厳しい状況においては、そのような傷跡は心理的な悩みを引き起こし、経済的な負担にもなる。傷の回復は、止血作用、炎症、増殖及び再形成の段階を含む。増殖段階は、繊維芽細胞並びに内皮及び上皮細胞の増加を含む。傷の閉鎖を促進する及び／又は瘢痕組織の形成を最小化するために、主題の方法の使用を通じて、傷内及び周辺の上皮細胞の増殖速度を制御することができる。
【０２０１】
本発明の処置は、例えば放射線療法及び／又は化学療法の結果起こる口内炎及び口腔傍炎の治療を目的とした、治療養生法の一部として有効である。そのような潰瘍は一般に化学療法又は放射線療法の後、数日以内に発達する。一般に、これらの潰瘍は始めには、灰色の壊死性膜によって覆われ炎症組織によって囲まれる、痛みを伴う、小さな不定形の傷である。多くの場合、処置を施さないでいると、炎症基部上の傷周辺の組織が増殖する。例えば、潰瘍の周縁にある上皮組織が増殖活性を示し、その結果表面上皮組織の連続性が失われる。傷が大きくなり上皮組織の保全性が失われるので、二次感染を起こす可能性がある。食物及び水を摂取する度に痛みを感じ、潰瘍が消化管を通じて増殖した場合には、様々な要因が加わり下痢が起こる。本発明によると、ヘッジホッグアンタゴニストを適用してそのような潰瘍を処置することによって、患部上皮組織の異常な増殖及び分化を低減することができ、それに続く炎症に伴う苦痛を低減することができる。
【０２０２】
主題の方法及び組成物を用いて、自己免疫疾患に由来する傷（例えば乾癬）などの皮膚科学疾患に由来する傷を治療することができる。アトピー性皮膚炎とは、花粉、食物、鱗屑、昆虫毒及び植物毒などのアレルゲンによって引き起こされる免疫応答に関連したアレルギーの結果起こる皮膚の外傷のことをいう。
【０２０３】
他の態様においては、ヘッジホッグアンタゴニストの抗増殖調製物を用いて、水晶体上皮細胞増殖を阻害して、嚢外白内障摘出の術後合併症を防ぐことができる。白内障は、難治性の眼病であり、白内障の治療について様々な研究がなされてきた。現在、白内障の治療は外科手術によって行われている。白内障の外科術は、長い間用いられており、様々な手術法が研究されてきた。嚢外水晶体摘出が、白内障除去の手段として用いられている。嚢外摘出に用いるこの方法には、無水晶体類嚢胞黄斑浮腫及び網膜剥離が起こりにくいという医療上の利点がある。嚢外摘出は、後眼房型眼内水晶体（ほとんどの場合に用いられるべき水晶体と考えられている）の移植に必要である。
【０２０４】
しかし嚢外白内障摘出には、後水晶体嚢の不透明化（後白内障と称される）が起こりやすいという欠点がある。この不透明化は術後３年以内に５０％までの確立で起こる。後白内障は、嚢外水晶体摘出の後に残る、赤道及び後嚢水晶体上皮細胞の増殖によって起こる。これらの細胞は増殖してゾンマーリング（Ｓｏｍｍｅｒｌｉｎｇ）環を形成し、同じく後嚢に蓄積する繊維芽細胞とともに後嚢の不透明化を起こして、視界を妨げる。後白内障を予防する処置をとることが好ましい。二次白内障形成を阻害するために、主題の方法は、残った水晶体上皮細胞の増殖を阻害する手段を提供する。例えば水晶体除去の後に、後眼房にヘッジホッグアンタゴニストの調製物を含む溶液を点眼することによって、そのような細胞を静止状態に保つことができる。更に、溶液の浸透圧のバランスを保つことによって、後眼房内に適用したときに効果的な投与量を最小限にすることができ、嚢下上皮の成長をある特異性で阻害することができる。
【０２０５】
主題の方法を、角膜上皮細胞の増殖に特徴付けられる角膜疾患（例えば上皮の下方成長、眼表面の扁平上皮細胞癌といった眼の上皮の疾患）治療に用いることもできる。
【０２０６】
Ｌｅｖｉｎｅ他［（１９９７）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ１７：６２７７］は、ヘッジホッグタンパク質が脊椎動物網膜における有糸分裂及び光受容体分化を調節し、Ｉｈｈが、網膜幹細胞の増殖及び光受容器の分化を促進しうる色素上皮からの要素であることを示している。同様に、Ｊｅｎｓｅｎ他［（１９９７）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２４：３６３］は、周生期のマウス網膜細胞の培養を、Ｓｏｎｉｃヘッジホッグのアミノ末端断片で処置すると、ブロモデオキシウリジンを取り込む細胞の割合が、全細胞、桿体光受容体、無軸索細胞、ミュラー神経膠細胞において増加することを示している。このことは、Ｓｏｎｉｃヘッジホッグが網膜前駆体細胞の増殖を促進することを示唆している。従って、本発明の方法を、網膜細胞の増殖疾患の治療に用いて、光受容体分化を調節することができる。
【０２０７】
本発明の更に他の特徴は、毛の成長の制御に主題の方法を使用することに関する。毛は基本的には強靱で不溶性の蛋白質ケラチンから構成される。強度はシスチンのジスルフィド結合に由来する。各毛は、円筒状の毛幹及び毛根を包含し、皮膚にフラスコ状の陥没部である毛嚢を有する。毛嚢の底部には、毛乳頭と呼ばれる指のような突起物がある。この毛乳頭を構成する結合組織から毛が成長し、結合組織を通じて血管が細胞に栄養を供給する。毛幹は皮膚表面から外部に突き出た部分であり、一方毛根とは埋没した毛の部分である。毛根の基部は毛球内で伸張し、毛乳頭上に収まっている。毛を産生する細胞は、毛嚢の毛球内で成長する。細胞が毛嚢内で増殖するにつれて、細胞は繊維の形で押し出される。毛の「成長」とは、分裂する細胞によって毛繊維が形成され伸張することをいう。
【０２０８】
当分野で知られるように、一般的な毛周期は、発育期、休止期、終止期の３つの段階に分けられる。活性期（発育期）の間、皮膚毛乳頭の表皮幹細胞は急速に分裂する。娘細胞は上方に移動し、分化して円錐状の層を形成する。移行期（休止期）は、毛嚢における幹細胞の有糸分裂の休止を特徴とする。停止段階は終止期として知られる。ここでは毛は頭皮内に数週間保持され、その下に現れる新しい毛が、終止期の毛幹を毛嚢から押し出す。このモデルから明なのは、毛細胞に分化する、分裂幹細胞の集まりが大きいほど、毛の成長が起こりやすいということである。従って、これらの幹細胞の増殖を助長する又は阻害することによって、毛の成長をそれぞれ増加又は低減する方法が得られる。
【０２０９】
ある態様においては、切断、剃毛又は脱毛などの従来の除去方法の代わりに、主題の方法をヒトの毛の成長を押さえる方法として用いることができる。例えば、本発明の方法を、異常に速い又は濃い毛の成長に特徴付けられる毛髪病（例えば多毛症）の治療に用いることができる。例証的な態様においては、ヘッジホッグアンタゴニストを用いて、異常な発毛に特徴付けられる、女性の多毛症を制御することができる。主題の方法は、脱毛期間を延長する工程を提供することもできる。
【０２１０】
その上更に、ヘッジホッグアンタゴニストは、上皮細胞に細胞毒を与えるのではなく細胞分裂を停止するので、化合物は、効能を得るために細胞周期のＳ期への進行を必要とする細胞毒剤（例えば放射線誘導死）から毛嚢細胞を保護することができる。主題の方法による処置を行うことで、毛嚢細胞を休止させることによって（例えば細胞がＳ期に入るのを阻害し、従って毛嚢細胞の有糸分裂不能とプログラム細胞死を防ぐことによって）細胞を保護することができる。例えばヘッジホッグアンタゴニストを、通常は毛喪失が起こってしまう化学療法又は放射線療法を受けている患者に用いることができる。そのような療法の間に主題の処置を用いて、通常はプログラム細胞死に結びつく細胞周期の進行を阻害することによって、毛嚢細胞死を防ぐことができる。療法の終了後、毛嚢細胞増殖の阻害の停止と同時に、本発明の処置を停止することができる。
【０２１１】
主題の方法は、脱毛性毛嚢炎、網状瘢痕性紅斑毛嚢炎又はケロイド毛嚢炎などの毛嚢炎の治療に用いることができる。例えば、ヘッジホッグアンタゴニストを化粧に調製したものを局所的に適用して、擬毛嚢炎を治療することができる。この毛嚢炎は、首の下顎領域における、髭剃りに関連して最もよく起こる慢性的疾患であり、紅斑性の丘疹及び毛が埋没した膿疱に特徴付けられる。
【０２１２】
本発明の他の特徴において、主題の方法を、上皮に由来する組織の分化を促進する及び／又は増殖を阻害するのに用いることができる。これら分子のそのような形態は、上皮組織に関する過形成性及び／又は腫瘍性状態を処置するための分化治療の基礎を提供することができる。例えばそのような調製物を、皮膚細胞の異常な増殖及び成長が起こる皮膚疾患の処置に用いることができる。
【０２１３】
例えば本発明の薬学的調製物は、角化症などの過形成性の表皮状態の処置、並びに様々な皮膚癌（扁平上皮細胞癌など）の高増殖率に特徴付けられる腫瘍性の表皮状態の処置に用いることを企図する。主題の方法は、皮膚に影響を与える自己免疫疾患、特に（乾癬又はアトピー性皮膚炎によって起こる）病的な増殖及び／又は表皮のケラチン化を含む、皮膚科学疾患の処置に用いることができる。
【０２１４】
乾癬、扁平上皮細胞癌、角化棘細胞腫及び光線性角化症などの多くの一般的な皮膚疾患は、局所的な異常増殖及び成長によって特徴付けられる。例えば皮膚上の落屑性の赤い隆起したプラークによって特徴付けられる乾癬においては、正常な細胞に比較してケラチン合成細胞が非常に速く増殖し、ほとんど分化しないことが知られている。
【０２１５】
一つの態様において、本発明の調製物は、炎症又は非炎症要素のいずれかによって特徴付けられる、異常な皮膚細胞の増殖を起こすケラチン化疾患に関連した皮膚科学的疾患の処置に好適である。例えば、ヘッジホッグアンタゴニストの治療用調製物（例えば休止又は分化を促進する）を、皮膚、粘膜又は爪などの様々な形態の乾癬の治療に用いることができる。上記したように、乾癬は一般に、「再生」経路に沿った増殖活性及び分化を示す表皮ケラチン合成細胞によって特徴付けられる。主題の方法の、抗増殖的な態様を用いた処置は、異常な表皮活性化を反転させるのに用いることができ、疾患の軽減の維持を提供することができる。
【０２１６】
他の様々な角化症損傷も、主題の方法を用いた治療の対象となりうる。例えば光線性角化症は、日光にさらされた及び光線照射を受けた皮膚に起こる表面炎症性前癌性腫瘍である。傷は、紅斑から茶色まで様々なものにわたる。現在行われている治療には、切除術及び冷凍外科手術がある。しかしこれらの処置は苦痛を伴い、しばしば化粧に不適格な傷跡を生じる。従って、光線性角化症といった角化症の処置として、損傷の表皮／類表皮腫細胞の過増殖を阻害するのに十分な量の、ヘッジホッグアンタゴニスト組成物を好ましくは局所的に適用することが挙げられる。
【０２１７】
座瘡は、主題の方法によって処置されうる、別の皮膚科学的疾患である。例えば尋常性座瘡は、十代の若者及び成人初期において最もよく見られる多因性の疾患であり、顔及び胴体上部にみられる、炎症及び非炎症性損傷として特徴付けられる。尋常性座瘡を起こす元になる欠陥は、活動過多な皮脂腺管の過角質化である。過角質化は、皮膚及び毛嚢微生物の正常な移動を妨げ、それによってバクテリアＰｒｏｐｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ及び酵母菌Ｐｉｔｒｏｓｐｏｒｕｍ ｏｖａｌｅによるリパーゼの放出が刺激される。抗増殖的なヘッジホッグアンタゴニスト、好ましくは局所用調製物で処置することが、損傷形成に結びつく管の変化（例えば過角質化）を防ぐのに有用であろう。主題の処置は、例えば抗生物質、レチノイド及び抗アンドロゲンをさらに含んでいてもよい。
【０２１８】
本発明は又、様々な形態の皮膚炎を治療する方法を提供する。皮膚炎とは、掻痒性、紅斑性、落屑性、疱疹性、湿潤性、亀裂性又は痂皮性の損傷を漠然と画定する用語である。これらの損傷は、様々な理由で起こる。最も一般的な皮膚炎はアトピー性、接触性及びおむつ皮膚炎である。脂漏性皮膚炎は慢性で通常は掻痒性の、紅斑、乾燥、湿潤又は脂様の鱗片を伴う皮膚炎で、乾燥鱗片の過度な量の剥離を伴う、様々な領域（特に頭皮）における黄色の痂皮性斑点である。主題の方法は、しばしば慢性であり通常は湿疹性皮膚炎である、鬱血性皮膚炎の処置に用いることができる。光線性皮膚炎は、太陽光線、紫外線、Ｘ又はγ放射線などの光線放射にさらされた結果起こる皮膚炎である。本発明によると、主題の方法を、上皮細胞の望まれない増殖によって起こる皮膚炎の、ある種の症状を処置及び／又は予防するのに用いることができる。様々な皮膚炎の形態に対するこうした治療法は、局所的及び全身性投与のコルチコステロイド、止痒剤及び抗生物質をさらに含むことができる。
【０２１９】
例えば、主題の方法を用いて、血管形成を阻止することができるであろうということが予想される。ヘッジホッグは、血管形成を刺激することが知られている。ヘッジホッグタンパク質を浸透させてマウスに挿入されたマトリゲル（登録商標）プラグは、実質的な新血管新生を示すが、ヘッジホッグを有しないマトリゲル（登録商標）プラグは、比較的僅かの血管新生しか示さない。ヘッジホッグタンパク質は又、通常無血管のマウス角膜の血管新生を増大させることもできる。ｐｔｃ−１遺伝子は、大動脈の内皮細胞、血管平滑筋細胞、大動脈の動脈血管外膜繊維芽細胞、心房及び心室の冠状動脈管構造及び心筋細胞を含む正常な血管組織において発現される。これらの組織も又、ヘッジホッグタンパク質に感受性である。外因性ヘッジホッグでの処理は、ｐｔｃ−１発現のアップレギュレーションを引き起こす。加えて、ヘッジホッグタンパク質は、血管平滑筋細胞の増殖をイン・ビボで刺激する。ヘッジホッグタンパク質は又、繊維芽細胞に、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、Ａｎｇ−１及びＡｎｇ−２などの血管形成成長因子の発現を増大させる。最後に、ヘッジホッグタンパク質は、虚血性の損傷からの回復を刺激すること及び側副血管の形成を刺激することが知られている。
【０２２０】
ヘッジホッグが血管形成を促進するとすれば、ヘッジホッグアンタゴニストは、特に、あるレベルのヘッジホッグシグナリングが血管形成に必要である状況において、血管形成阻害剤として作用することが予想される。
【０２２１】
血管形成は、多くの疾患にとって基本的に重要である。持続性の、無秩序な血管形成が、ある範囲の病気状態、腫瘍の転移及び内皮細胞の異常増殖において生じる。血管形成過程の結果として造られた脈管構造は、これらの病気においてみられる病的ダメージを支持するものである。無秩序な血管形成により造られた種々の病的状態は、血管形成依存性又は血管形成関連疾患としてグループにまとめられている。血管形成過程の制御に向けられた治療は、これらの疾患の排除又は緩和へと導くことができた。
【０２２２】
血管形成により引き起こされ、支持され又はそれに関係する疾患には、眼の新血管新生疾患、加齢関連黄斑変性、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植の拒絶、新血管新生性緑内障、水晶体後繊維増殖症、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクトレンズ疲労症、アトピー性角膜炎、上輪部角結膜炎、表皮爪膜乾燥症、シェーグレン酒性座瘡、、梅毒、ミコバクテリア感染症、脂質退行変性、化学的火傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染症、帯状疱疹、原虫感染症、カポジ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン辺縁変性、辺縁表皮剥離、慢性関節リウマチ、全身性狼瘡、多発性動脈炎、外傷、ウェゲナー類肉腫症、鞏膜炎、スティーヴンズ−ジョンソン病、周辺放射角膜切開、角膜移植片拒絶、慢性関節リウマチ、骨関節症慢性的炎症（例えば、潰瘍性大腸炎又はクローン病）、血管腫、遺伝性出血性毛細管拡張症及び遺伝性出血性毛細管拡張症が含まれる。
【０２２３】
加えて、血管形成は、癌においても重要な役割を演じている。腫瘍は、栄養を供給し且つ細胞老廃物を除去する血液の供給なしでは拡大できない。血管形成が重要である腫瘍には、固形腫瘍例えば横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ユーイング肉腫、神経芽細胞腫及び骨肉腫、並びに良性腫瘍例えば聴神経腫、神経繊維腫、トラコーマ及び化膿性肉芽腫が含まれる。血管形成因子は、幾つかの固形腫瘍と関連することが見出されている。血管形成の防止は、これらの腫瘍の成長及び腫瘍の存在の結果生じる動物のダメージを停止させることができるであろう。血管形成は又、血液から生じる腫瘍例えば白血病（これは、何れかの骨髄の様々な急性又は慢性の新生物疾患で、通常、貧血症、血液凝固機能障害及びリンパ節、肝臓及び脾臓の肥大を伴う）とも関係している。血管形成は、骨髄における白血病様腫瘍を生じさせる異常において役割を演じているということが考えられる。
【０２２４】
腫瘍の成長に加えて、血管形成は、転移においても重要である。初期においては、血管形成は、腫瘍の血管新生において重要であり、それは、癌細胞が血流に入って身体中を循環することを可能にする。腫瘍細胞が原発部位を離れて二次的な転移部位に定着した後は、新たな腫瘍が成長して拡大しうる前に、血管形成が起きなければならない。それ故、血管形成の防止は、腫瘍の転移の防止（おそらく原発部位の新生物成長を含む）に導くことができよう。
【０２２５】
血管形成は又、再生及び傷の治癒などの正常な生理的過程にも関与している。血管形成は、排卵において（及び受精後の胞胚の着床においても）重要なステップである。血管形成の防止は、無月経の誘導、排卵のブロック又は胞胚の着床の防止に利用することができよう。
【０２２６】
この発明は、呼吸障害症候群又は他の不適当な肺表面張力から生じる疾患の治療及び／又は予防において有用であろうということが予想される。呼吸障害症候群は、肺の肺胞における不十分な表面活性物質から生じる。脊椎動物の肺は、肺の膨張中に表面張力を上昇させ且つ肺の収縮中には減少する脂質とタンパク質の複雑な混合物である表面活性物質を含んでいる。肺の収縮中、表面活性物質は、肺胞をつぶす表面力がなくなるように減少する。呼息中つぶれなかった膨らんだ肺胞は、血液と肺胞ガスの間での連続的な酸素と二酸化炭素の輸送を可能にし、その後の吸息中に膨張するのにずっと小さい力しか必要としない。膨張中、肺の表面活性物質は、肺胞表面積が増大するにつれて表面張力を増大させる。膨張中の肺胞におけるすすぎ表面張力は、それらの空気を含んだ空間における過剰膨張に対抗し、吸入された空気を十分空気を含んでいない肺胞へそらし、それにより一様な肺の吸気を促進する傾向がある。
【０２２７】
呼吸障害症候群は、特に、未熟児に多い。肺の表面活性物質は、通常は、胎児期の最後の６週間まで非常に低速で合成される。正常な妊娠期間より６週間以上前に生まれたヒトの幼児は、不適当な量の肺表面活性物質及び不適当な表面活性物質合成速度を有して生まれるリスクが高い。生まれた幼児が未熟であるほど、表面活性物質欠乏は重症でありそうである。重い表面活性物質欠乏症は、誕生後数分から数時間以内に呼吸不全を生じうる。この表面活性物質欠乏症は、最大呼吸努力にもかかわらず、肺の広がる能力の減少の故に、進行性の肺胞崩壊（肺拡張不全）を生じる。その結果、幼児の血液に到達する酸素の量は不十分となる。ＲＤＳは、成人においても、典型的には表面活性物質の生合成不全の結果として生じうる。
【０２２８】
未熟児の肺組織は、ヘッジホッグシグナリング経路の高い活性を示す。この経路のヘッジホッグアンタゴニストを用いた阻害は、ラメラ体の形成を増大させ且つ表面活性物質の生合成に関与する遺伝子の発現を増大させる。ラメラ体は、表面活性物質の生合成に関係する細胞内構造である。これらの理由から、未熟児のヘッジホッグアンタゴニストでの処理は、表面活性物質の生合成を刺激してＲＤＳを改善するはずである。成人のＲＤＳがヘッジホッグ経路の活性化に関係している場合には、ヘッジホッグアンタゴニストでの処理はやはり有効なはずである。
【０２２９】
ヘッジホッグアンタゴニストの利用は、特に、冒された組織及び／又は細胞が高いヘッジホッグ経路の活性化を示す病気を標的としうるということが更に予想される。ｇｌｉ遺伝子の発現は、ヘッジホッグシグナリング経路により活性化される（ｇｌｉ−１、ｇｌｉ−２及びｇｌｉ−３を含む）。ｇｌｉ−１発現は、最も首尾一貫して、広範囲の組織及び病気にわたって、ヘッジホッグシグナリング活性と相関しているが、ｇｌｉ−３は、それ程でない。このｇｌｉ遺伝子は、ヘッジホッグシグナリングの完全な効果を誘出するのに必要な多くの遺伝子の発現を活性化する転写因子をコードしている。しかしながら、Ｇｌｉ−３転写因子は又、ヘッジホッグエフェクター遺伝子のリプレッサーとしても作用し得て、それ故、ｇｌｉ−３の発現は、ヘッジホッグシグナリング経路の減少した効果を引き起こすことができる。Ｇｌｉ−３が転写アクチベーターとして作用するかリプレッサーとして作用するかは、転写後事象に依存しており、それ故、Ｇｌｉ−３タンパク質の活性化型（抑制型に対して）を検出する方法がヘッジホッグ経路活性化の信頼できる測定でもあろうということが予想される。ｇｌｉ−２遺伝子発現は、ヘッジホッグ経路活性化についての信頼できるマーカーを与えることが予想される。ｇｌｉ−１遺伝子は、多くの癌において強く発現されており、ヘッジホッグ経路の相対的な活性化のマーカーとして機能する。加えて、高いｇｌｉ遺伝子発現を有する未熟な肺などの組織は、ヘッジホッグ阻害剤により強く影響される。従って、ｇｌｉ遺伝子発現の検出は、ヘッジホッグアンタゴニストでの治療から特に利益を得るであろう組織及び病気を同定するための強力な予測ツールとして用いることができるということが予想される。
【０２３０】
好適具体例において、ｇｌｉ−１発現レベルは、転写物の直接的検出により、又はタンパク質のレベル若しくは活性の検出によって検出される。転写物は、主としてプローブのｇｌｉ−１転写物又はそれから合成されたｃＤＮＡへのハイブリダイゼーションに依存する任意の広範囲の技術を用いて検出することができる。周知技術には、ノーザンブロッティング、逆転写ＰＣＲ及び転写物レベルのマイクロアレイ分析が含まれる。Ｇｌｉタンパク質レベルを検出する方法には、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（好ましくは、Ｇｌｉタンパク質の位置が決定されている標準と比較する）、及び質量分析法が含まれる。質量分析法は、一連の精製ステップと連結させて、特定の試料中の多くの異なるタンパク質レベルの高スループットの同定を可能にすることができる。質量分析法及び２Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥは又、タンパク質分解事象、ユビキチン化、リン酸化、脂質修飾などを含むタンパク質に対する転写後修飾を同定するためにも利用することができる。Ｇｌｉ活性は又、基質ＤＮＡに対する結合又は標的プロモーターのイン・ビトロ転写活性化を分析することによっても評価することができる。ゲルシフトアッセイ、ＤＮＡフットプリンティングアッセイ及びＤＮＡ−タンパク質架橋アッセイは、すべて、ＤＮＡ上のＧｌｉ結合部位に結合することのできるタンパク質の存在を評価するために利用することのできる方法である。
【０２３１】
好適具体例において、ｇｌｉ転写物レベルを測定し、異常に高いｇｌｉレベルを示す病気又は障害のある組織をヘッジホッグアンタゴニストで治療する。未熟肺組織、肺癌（例えば、腺癌、気管支肺胞腺癌、小細胞癌）、乳癌（例えば、下方腺管癌、下方小葉癌、管状癌）、前立腺癌（例えば、腺癌）、及び良性前立腺過形成は、すべて、ある場合において、強く上昇したｇｌｉ−１発現レベルを示す。従って、ｇｌｉ−１発現レベルは、これらの組織のどれをヘッジホッグアンタゴニストで処理すべきであるかを測定するための強力な診断デバイスである。加えて、ウロセリアル細胞の癌（例えば、膀胱癌、他の泌尿生殖器癌）がやはりある場合に上昇したｇｌｉ−１レベルを有するであろうという実質的な相関の形跡がある。例えば、染色体９ｑ２２上のヘテロ接合性の喪失が膀胱癌に共通していることが知られている。このｐｔｃ−１遺伝子は、この位置に位置され、ｐｔｃ−１機能欠損は、おそらく、他の多くの種類の癌におけるように、増殖過剰の部分的原因である。従って、かかる癌は又、高いｇｌｉ発現をも示し、特に、ヘッジホッグアンタゴニストでの治療に従順であろう。
【０２３２】
ｐｔｃ−１及びｐｔｃ−２の発現は又、ヘッジホッグシグナリング経路によっても活性化されるが、これらの遺伝子は、ヘッジホッグ経路活性化のマーカーとしてはｇｌｉ遺伝子に劣る。ある組織においては、ヘッジホッグ経路が高度に活性であるにもかかわらず、ｐｔｃ−１又はｐｔｃ−２の一方のみが発現される。例えば、精巣の発生において、インディアンヘッジホッグは重要な役割を演じ、そのヘッジホッグ経路が活性化されるが、ｐｔｃ−２しか発現されない。従って、これらの遺伝子は、両遺伝子の同時測定はヘッジホッグアンタゴニストで処理すべき組織の有用な指標として企図されるが、ヘッジホッグ経路活性化のマーカーとしては個別的には信頼できない。
【０２３３】
主題の方法によって処置しうる疾患としては、ヒト以外に特異に見られる疾患、例えば疥癬が挙げられる。
【０２３４】
更に他の態様において、主題の方法を、ヒトの癌、特に基底細胞癌及び例えば皮膚などの上皮組織の腫瘍の処置に用いることができる。例えばヘッジホッグアンタゴニストを、主題の方法で、ヒトの癌、特に基底細胞母斑症候群（ＢＣＮＳ）及び他のヒトの癌、腺癌、肉腫などの処置の一部として用いることができる。
【０２３５】
好ましい態様において、主題の方法を、基底細胞癌の治療（又は予防）のための予防養生法の一部として用いる。ｐｔｃ突然変異により生じる基底細胞癌の一般的な特徴と思われるのが、ヘッジホッグシグナリング経路の調節停止である。家族性及び散在性ＢＣＣ（基底細胞癌）の腫瘍において、インシトゥハイブリダイゼーションで調べたところ、ヒトｐｔｃ  ｍＲＮＡが一貫性を有して過剰発現することが報告されている。ｐｔｃは負の自己調節を示すので、ｐｔｃを不活性化する突然変異がｐｔｃ突然変異体の過剰発現を引き起こしていると考えられる。これまでの研究によると、ヘッジホッグ蛋白質の過剰発現が、腫瘍発生を引き起こしうることが示されている。皮膚発達のわずか数日後に皮膚表面全体にわたる複数のＢＣＣ様皮膚増殖を含むＢＣＮＳの特徴を発達させた皮膚内で、Ｓｈｈを過剰発現するトランスジェニックマウスにおける研究から、マウスの腫瘍発生にＳｏｎｉｃヘッジホッグ（Ｓｈｈ）が役割を担っているということが示唆されている。これまでの研究にはＢＣＣから得たＳｈｈヒト遺伝子における突然変異についての記載もあり、ヒトにおけるＳｈｈ又は他のＨｈ遺伝子が、ヒトにおける優性腫瘍誘発遺伝子として作用しうることを示唆している。散在性ｐｔｃ突然変異が、正常な個人から得たＢＣＣにおいて観察されており、そのうちのいくつかはＵＶ標識突然変異であった。散在性ＢＣＣについて行われた近年の研究の一つにおいて、ＣＴ又はＣＣＴＴのいずれかが変化した５個のＵＶ標識型突然変異が、ｐｔｃ突然変異を含む１５の腫瘍に見つかっている。近年行われた、ＢＣＣ及び神経外胚葉腫における散在性ｐｔｃ突然変異の分析によると、ＢＣＣにおいて発見された３個のｐｔｃ突然変異の一つにおいて、１個のＣＴが変化していることが示されている（例えばＧｏｏｄｒｉｃｈ他（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２７：１１０９−１３；Ｘｉｅ他（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ５７：２３６９−７２；Ｏｒｏ他（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７６：８１７−２１；Ｘｉｅ他（１９９７）Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ１８：３０５−９；Ｓｔｏｎｅ他（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ３８４：１２９−３４；及びＪｏｈｎｓｏｎ他（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７２：１６６８−７１参照）。
【０２３６】
主題の方法は、ＢＣＮＳを有する患者の処置、例えばＢＣＣ又はｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進の結果起こりうる疾患による他の影響の予防に用いることもできる。基底細胞母斑症候群は、若年期に現れる複数のＢＣＣにより特徴付けられる、希有な常染色体優性疾患である。ＢＣＮＳ患者はこれらの腫瘍を発達させやすく、１０歳から２０歳にかけて、主に日光にさらされた皮膚領域に大量に現れる。この疾患は、肋骨、頭及び顔の変性、時として多指症、合指症及び脊椎披裂を含む、多くの発達異常も引き起こす。又、これらの患者はＢＣＣに加えて卵巣及び心臓の繊維腫、皮膚及び顎の嚢腫、中枢神経系における髄芽細胞腫及び髄膜腫などの多くの腫瘍型を発達させる。主題の方法を、ＢＣＮＳ及び非ＢＣＮＳ患者におけるそのような腫瘍型の予防及び処置に用いることができる。研究によって、ＢＣＮＳ患者がｐｔｃ遺伝子に遺伝子性及び散在性突然変異の両方を有することが示されており、このことは、これらの突然変異体がこれらの疾患の根本的な要因となっていることを示唆している。
【０２３７】
他の特徴において、本発明はヘッジホッグアンタゴニストを包含する薬剤調製物を提供する。主題の方法に用いられるヘッジホッグアンタゴニストは、生物学的に許容可能な媒体［水、緩衝食塩水、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）又はそれらの好適な混合物］を用いて、投与に都合よく調合することができる。選択された媒体中での活性成分の最適濃度は、医化学者に公知の方法に従って経験的に決定することができる。ここでいう「生物学的に許容可能な媒体」には、薬剤調製物の投与経路に適したあらゆる溶媒、分散媒などが含まれる。薬学的に活性な物質におけるそのような媒体の使用は、当分野において公知のものである。従来の媒体又は薬剤がヘッジホッグアンタゴニストの活性に不適合な場合を除いて、本発明の薬剤調製物に主題の化合物を使用することが企図される。好適な賦形剤及び他の蛋白質を含む調合については、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、米国ペンシルバニア州イーストン（１９８５）］に記載がある。これらの賦形剤は、注射可能な「沈殿（ｄｅｐｏｓｉｔ）配合物」を含む。
【０２３８】
本発明の薬剤調製物は、例えば家畜や犬などのペットの処置といった獣医学的な使用に好適なヘッジホッグアンタゴニストの薬剤調製物などの、獣医学的な組成物を含むこともできる。
【０２３９】
導入の方法は、再充填可能な又は生分解性の装置を用いて提供することができる。近年、様々な緩効性重合体装置が開発され、蛋白質様生物薬剤といった薬剤の、制御された投与がイン・ビボで試されている。生分解性及び非分解性重合体の両方を含む様々な生体適合性重合体（ヒドロゲルなど）を用いて、ヘッジホッグアンタゴニストを特定の標的部位において持続的に放出する移植片を形成することができる。
【０２４０】
本発明の調製物は、経口、非経口、局所、又は直腸内で投与することができる。調製物はもちろん各投与経路に適した形状で投与される。例えば、錠剤、カプセル形状などによる注射、吸入投与；目薬、軟膏、座薬、制御された放出パッチなどによる注射、浸剤又は吸入投与；ローション剤又は軟膏による局所投与；及び座薬による直腸投与が挙げられる。経口及び局所投与が好ましい。
【０２４１】
ここでいう「非経口投与」及び「非経口に投与する」とは、腸内及び局所投与を除く投与方法、通常は注射による投与を意味する。例としては静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、髄腔内及び胸骨内注射及び浸剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２４２】
ここでいう「全身投与」「全身に投与する」「末梢投与」及び「末梢に投与する」とは、中枢神経系に直接投与するのではなく、化合物、薬剤又は他の物質を患者の系に入るように投与し、従って代謝や他の類似方法（例えば皮下投与）の影響を受ける投与のことを言う。
【０２４３】
これらの化合物は、好適な投与経路によって、治療を目的としてヒト及び他の動物に投与することができる。例えば、噴霧の形での経口、経鼻の投与、粉末、軟膏又は滴下の形での直腸内、膣内、非経口、槽内及び局所投与、並びに口腔及び舌下投与が挙げられる。
【０２４４】
選択された投与経路に関わらず、好適な水和形態で用いることのできる本発明の化合物及び／又は本発明の薬剤組成物を、下に記すような又は当業者に知られる従来法で、薬学的に許容可能な投与形態に調合することができる。
【０２４５】
本発明の薬剤組成物中の活性成分の実際の投与レベルは、患者に毒性を与えることなく、特定の患者、組成物及び投与方法について望ましい治療的応答を達成できるのに有効な量の活性成分が得られるように変えることができる。
【０２４６】
選択される投与レベルは、本発明の特定の化合物、エステル、塩又はそのアミドの活性、投与経路、投与時間、該特定の化合物の排出速度、処置時間、該特定のヘッジホッグアンタゴニストとともに用いられた他の薬剤、化合物及び／又は物質、処置を受ける患者の年齢、性別、体重、体調、健康状態及び病歴、医療分野で知られるその他の要因といった様々な要因に依存する。
【０２４７】
当分野で通常の技術を有する医者又は獣医は、必要とされる薬剤組成物の有効量を容易に決定し処方することが可能である。例えば、医者又は獣医は、薬剤組成物に用いられる本発明の化合物の用量を、必要とされる量より低いレベルから始めて、望ましい効果が達成できるまで徐々に用量を増加させることができる。
【０２４８】
一般に、好ましい一日の用量は、治療効果を生み出すのに有効な最も低い化合物量である。そのような有効な量は、一般に上記したような要因に依存する。一般に、患者に対する本発明の化合物の静脈内、脳内及び皮下投与の量は、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）／日である。
【０２４９】
望ましい場合には、活性化合物の有効な一日分の用量は、２、３、４、５、６回以上の副次用量で、一日を通じて適当な間隔をおいて（随意に回分服用の形態をとることができる）、分けて投与することができる。
【０２５０】
ここでいう「処置」とは、予防法、療法及び治療を含むことを意図する。
【０２５１】
この処置を受ける対象は、霊長類（特にヒト）及び他のほ乳類（ウマ、ウシ、ブタ及びヒツジ）、家禽類及びペットを含む、処理を必要とするあらゆる動物を含む。
【０２５２】
本発明の化合物はそのままで又は薬学的に許容でき且つ／若しくは無菌の担体との混合物として投与することができ、ペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド及びグリコペプチドなどの抗菌剤と併せて投与することもできる。従って併合治療は、最初の投与の治療効果が完全に消えないうちに次の投与を行う、活性化合物の連続的、同時及び分離投与を含む。
【０２５３】
Ｖ．製薬組成物
本発明の化合物は単独で投与することが可能であるが、これを製薬処方物（組成物）として投与することが好ましい。本発明に従うヘッジホッグアンタゴニストは、人用又は獣医用の医薬品に使用するために任意の都合のよい方法で投与するために処方することができる。ある種の具体例では、製薬製剤に含有させる化合物は、それ自体活性であってよく、又は例えば生理学的環境で活性化合物に転化できるプロドッラグであることができる。
従って、本発明の他の観点は、治療学的に有効な量の前記の化合物の１種以上を１種以上の製薬上許容できるキャリアー（添加剤）及び（又は）希釈剤と共に処方してなる製薬上許容できる組成物を提供する。以下に詳細に説明するように、本発明の製薬組成物は、以下のもの：（１）経口投与に適合した形態、例えば、飲薬（水性又は非水性の溶液又は懸濁液）、錠剤、ボーラス、粉末、顆粒、舌に適用するためのペースト、（２）例えば皮下、筋肉内又は静脈内注射による非経口的投与に適合した形態、例えば、無菌溶液又は懸濁液、（３）局所適用に適合した形態、例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏又はスプレー、（４）膣内又は直腸内投与に適合した形態、例えば、ペッサリー、クリーム又はフォームも含めて、固体又は液体形態で投与するために特に処方することができる。しかし、ある種の具体例では、主題化合物は、無菌水に単に溶解又は懸濁させることができる。ある種の具体例では、製薬製剤は発熱性ではない。即ち、患者の体温を上昇させない。
【０２５４】
語句“製薬上有効な量”とは、ここで使用するときは、少なくとも動物細胞の亜集団におけるｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進に打ち勝ち、しかして処置された細胞におけるその経路の生物学的結果を、どんな医療的処置にも適用できる合理的な利益／危険の比で持って、ブッロクすることによって何らかの所望の治療的効果を生じさせるのに有効である本発明の化合物を含む化合物、材料又は組成物についてのそのような量を意味する。
【０２５５】
語句“製薬上許容できる”とは、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応又はその他の問題若しくは合併症なしに、人間及び動物の組織と接触して使用するのに好適であり、合理的な利益／危険の比で適合する化合物、材料、組成物及び（又は）投薬の形態をいうのに使用する。
【０２５６】
語句“製薬上許容できるキャリアー”とは、ここで使用するときは、主題アンタゴニストを体の一つの器官又は一部から他の器官又は一部に運び又は輸送する際に係わる液体又は固体状の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒又はカプセル化材のような製薬上許容できる材料、組成物又はビヒクルを意味する。それぞれのキャリアーは、処方物の他の成分と適合でき且つ患者に有害でないという意味で“許容できる”ものでなければならない。製薬上許容できるキャリアーとして使用できる材料のいくつかの例には、（１）糖類、例えばラクトース、グルコース及びサッカロース、（２）でんぷん、例えばコーンスターチ及びジャガイモでんぷん、（３）セルロース及びその誘導体、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース及び酢酸セルロース、（４）粉末状トラガンタ、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）賦形剤、例えばココアバター及び座薬用ワックス、（９）油、例えばピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーンオイル及び大豆油、（１０）グリコール、例えばプロピレングリコール、（１１）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビット、マンニット及びポリエチレングリコール、（１２）エステル、例えばオレイン酸エチル及びラウリン酸エチル、（１３）寒天、（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム、（１５）アルギン酸、（１６）発熱原を含まない水、（１７）等張性塩水、（１８）リンゲル溶液、（１９）エチルアルコール、（２０）燐酸塩緩衝溶液及び（２１）製薬処方物に使用されるその他の非毒性の許容できる物質が包含される。
【０２５７】
上記したように、本発明のヘッジホッグアンタゴニストのある種の具体例は、アミノ又はアルキルアミノのような塩基性官能基を含有し、しかして、製薬上許容できる酸により製薬上許容できる塩を形成することができる。この観点で、用語“製薬上許容できる塩”とは、本発明の化合物の比較的毒性でない無機及び有機酸との付加塩をいう。これらの塩類は、本発明の化合物の最終の単離及び精製中に現場で、或いは遊離塩基の形の精製された本発明の化合物を好適な有機又は無機酸と別途反応させ、次いでそのように形成された塩を単離することによって製造することができる。代表的な塩類には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、燐酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、燐酸塩、トシレート、くえん酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、こはく酸塩、酒石酸塩、ナフタリン酸塩、メシレート、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリルスルホン酸塩などが包含される（例えば、ベルジ他による「製薬用塩類」、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（１９７７）６６：１−１９を参照）。
【０２５８】
主題化合物の製薬上許容できる塩類は、例えば、非毒性の有機又無機酸からの化合物の周知の非毒性の塩類又は第四アンモニウム塩を包含する。例えば、このような周知の非毒性の塩類には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、燐酸、硝酸などのような無機酸から誘導されるもの、酢酸、プロピオン酸、こはく酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、りんご酸、酒石酸、くえん酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、しゅう酸、イセチオン酸などのような有機酸から製造される塩類が包含される。
【０２５９】
その他の場合には、本発明の化合物は、１個以上の酸性官能基を含有することができ、しかして、製薬上許容できる塩基により製薬上許容できる塩類を形成することができる。これらの場合に、用語“製薬上許容できる塩類”とは、本発明の化合物の比較的非毒性の有機又無機塩基との付加塩をいう。これらの塩類は、同様に、本発明の化合物の最終の単離及び精製中に現場で、或いは遊離酸の形の精製された本発明の化合物を好適な塩基、例えば製薬上許容できる金属陽イオンの水酸化物、炭酸塩又は重炭酸塩と、アンモニアと又は製薬上許容できる有機第一、第二若しくは第三アミンと別途反応させることによって製造することができる。代表的なアルカリ又はアルカリ土類金属塩類には、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム塩などが包含される。塩基付加塩を形成させるのに有用な代表的な有機アミンには、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが包含される（例えば、上記のベルジ他を参照）。
【０２６０】
湿潤剤、乳化剤及び滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム、並びに着色剤、剥離剤、被覆剤、甘味剤、香料及び芳香剤、保存剤及び酸化防止剤も組成物中に存在できる。
【０２６１】
製薬上許容できる酸化防止剤の例には、（１）水溶性酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど、（２）油溶性酸化防止剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど、（３）金属キレート剤、例えばくえん酸、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビット、酒石酸、燐酸などが包含される。
【０２６２】
本発明の処方物は、経口、経鼻、局所（口腔及び舌下を含めて）、直腸、膣及び（又は）非経口投与に好適なものを包含する。これらの処方物は、単位投薬形態で具合良く提供でき、医薬品分野で周知の任意の方法により製造することができる。単位投薬形態を生じさせるためにキャリアー材料と混合できる活性成分の量は、処理する宿主、特定の投与方法によって変動する。単位投薬形態を生じさせるためにキャリアー材料と混合できる活性成分の量は、一般に、治療効果を生じさせる化合物のそういう量である。一般に、１００％からみて、この量は約１％〜約９９％の活性成分、好ましくは約５％〜約７０％、最も好ましくは約１０％〜約３０％の活性成分の範囲にある。
【０２６３】
これらの処方物又は組成物を製造するための方法は、本発明の化合物をキャリアー及び随意の１種以上の補助成分と会合させる工程を包含する。一般に、処方物は、本発明の化合物を液状キャリアー又は微細状の固体キャリアー又はこれらの両者と均質に且つ緊密に会合させ、次いで必要ならば生成物を賦形させることによって製造される。
【０２６４】
経口投与に好適な本発明の処方物は、カプセル、カシェー、ピル、錠剤、ロゼンジ（風味付けベース、例えばサッカロース及びアカシア又はトラガンタを使用）、粉末、顆粒の形態で、或いは水性又は非水性液体中の溶液又は懸濁液として、或いは水中油型又は油中水型液状エマルジョンとして、或いはエレキシル又はシロップとして、或いは香錠（不活性ベース、例えばゼラチン及びグリセリン、又はサッカロース及びアカシアを使用）として及び（又は）口腔洗浄液などであって、それぞれ活性成分として本発明の化合物を所定量で含有するものであることができる。また、本発明の化合物はボーラス、舐剤又はペーストとして投与することができる。
【０２６５】
本発明の経口投与用の固形投薬形態（カプセル、錠剤、ピル、糖剤、粉末、顆粒など）では、活性成分は、１種以上の製薬上許容できるキャリアー、例えば、くえん酸ナトリウム若しくは燐酸二カルシウム及び（又は）下記のいずれか：（１）充填剤又は増量剤、例えばでんぷん、ラクトース、サッカロース、グルコース、マンニット及び（又は）珪酸、（２）結合材、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、サッカロース及び（又は）アカシア、（３）保湿剤、例えばグリセリン、（４）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカでんぷん、アルギン酸、ある種の珪酸塩及び炭酸ナトリウム、（５）溶解遅延剤、例えばパラフィン、（６）吸収促進剤、例えば第四アンモニウム化合物、（７）湿潤剤、例えばセチルアルコール及びグリセリンモノステアレート、（８）吸収剤、例えばカオリン及びベントナイトクレー、（９）滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム及びこれらの混合物、（１０）着色剤と混合される。カプセル、錠剤及びピルの場合には、製薬組成物は、緩衝剤も含むことができる。類似のタイプの固形組成物は、ラクトース又は乳糖のような賦形剤並びに高分子量ポリエチレングリコールなどを使用する軟質及び硬質ゼラチンカプセルにおける充填剤として使用できる。
【０２６６】
錠剤は、１種以上の補助成分と共に圧縮又は成形によって製造することができる。圧縮錠剤は、結合材（例えば、ゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、でんぷんグリコール酸ナトリウム又は架橋ナトリウムカルボキシメチルセルロース）、界面活性又は分散剤を使用して製造することができる。成形錠剤は、加湿した粉末状化合物と不活性液体希釈剤との混合物を適当な機械で成形することによって製造することができる。
【０２６７】
本発明の製薬組成物の錠剤及びその他の固形投薬形態、例えば糖剤、カプセル、ピル及び顆粒は、要すれば、被覆及び外殻、例えば腸用被覆及び製薬処方分野において周知のその他の被覆で得ることができ又は調製することができる。また、それらは、例えば、所望の放出プロフィルを与えるように割合を変えてヒドロキシプロピルメチルセルロース、その他の重合体マトリックス、リプソーム及び（又は）マイクロスフェアーを使用して活性成分の遅延された又は制御された放出を与えるように処方することもできる。それらは、例えば、細菌保持性フィルターによるろ過により、又は使用直前に無菌水若しくはその他の無菌注射可能媒体に溶解できる無菌固形組成物の形で滅菌剤を配合することによって滅菌することができる。これらの組成物は随意に不透明剤も含有でき、またこれらが活性成分のみを又は優先的に、胃腸器官のある部分で、場合により遅延された態様で放出させるような組成物であることができる。使用できる包封用組成物の例は重合体物質及びワックスを包含する。また、活性成分は、適当ならば、上記した賦形剤の１種以上によりマイクロカプセル化された形態であることができる。
【０２６８】
本発明の化合物の経口投与用の液状投薬形態は、製薬上許容できるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルを包含する。液状投薬形態は、活性成分に加えて、斯界で普通に使用される不活性希釈剤、例えば、水又はその他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、グラウンドナッツ油、コーンオイル、胚芽油、オリーブ油、ひまし油及びゴマ油）、グリセリン、テトラヒドロフリルアリール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、これらの混合物を含有することができる。
【０２６９】
不活性希釈剤以外に、経口投与用組成物は、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、甘味料、風味料、着色剤、香料及び保存剤のような補助剤も含有することができる。
【０２７０】
懸濁液は、活性化合物に加えて、懸濁剤、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビット及びソルビタンエステル、微結晶質セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天及びトラガンタ並びにこれらの混合物を含有することができる。
【０２７１】
直腸又は膣投与用の本発明の製薬組成物の処方物は坐薬として提供でき、これは本発明の１種以上の化合物を、例えばココアバター、ポリエチレングリコール、座薬用ワックス又はサリチル酸エステルを含む１種以上の好適な非刺激性賦形剤又はキャリアーであって、室温で固体であるが体温で液状であり、従って直腸又は膣内で溶融して活性なヘッジホッグアンタゴニストを放出するものと混合することによって製造することができる。
【０２７２】
膣に投与するのに好適な本発明の処方物は、斯界で適切であることが知られているようなキャリアーを含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム又はスプレー処方物も包含する。
【０２７３】
本発明の化合物の局所又は経皮投与のための投薬形態は、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤を包含する。活性成分は、製薬上許容できるキャリアーと、要求されるかもしれない任意の保存剤、緩衝剤又は吸入剤とを無菌条件下で混合することができる。
軟膏、ペースト、クリーム及びゲルは、本発明の活性成分に加えて、動物性及び植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、でんぷん、トラガンタ、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、珪酸、タルク、酸化亜鉛及びこれらの混合物のような賦形剤を含有することができる。
粉末及びスプレーは、本発明の化合物に加えて、ラクトース、タルク、珪酸、水酸化アルミニウム、珪酸カルシウム、ポリアミド粉末及びこれらの物質の混合物のような賦形剤を含有することができる。スプレーは、さらにクロルフルオル炭化水素や、ブタン及びプロパンのような揮発性非置換炭化水素のような慣用の発射剤を含有することができる。
【０２７４】
経皮用パッチは、皮膚に対する本発明の化合物の制御された送出を提供するという付加的な利点を有する。このような投薬形態は、ヘッジホッグアンタゴニストを適切な媒質に溶解又は分散することによって製造することができる。皮膚を介するヘッジホッグアンタゴニストの流れを増大させるために吸収向上剤を使用することができる。このような流れの速度は、速度制御膜を備えるか又は化合物を重合体マトリックス若しくはゲルに分散させることによって制御することができる。
眼科用処方物、眼用軟膏、粉末、溶液なども本発明の範囲内にあるものとして意図される。
【０２７５】
非経口的投与のために好適な本発明の製薬組成物は、１種以上の本発明の化合物を１種以上の製薬上許容できる無菌で等張性の水溶液又は非水溶液、分散液、懸濁液又はエマルジョン、或いは使用直前に無菌注射可能溶液又は分散液に再構成できる無菌粉末と組合わせて含み、これは酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤や、処方物を意図された受容体の血液により又は懸濁若しくは増粘剤により等張性にさせる溶質を含有することができる。
【０２７６】
本発明の製薬組成物に使用できる好適な水性及び非水性キャリアーの例には、水、エタノール、ポリオール（グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）及びこれらの好適な混合物、オリーブ油のような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能有機エステルが包含される。適切な流動性は、例えば、レシチンのような被覆材を使用して、分散液の場合には所要の粒度を維持することによって、及び界面活性剤を使用することによって保持することができる。
【０２７７】
これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤のような補助剤を含有することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤及び抗菌剤、例えば、パラベン、クロルブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含有させることによって確実にすることができる。また、糖、塩化ナトリウムなどのような等張剤を組成物中に含有させることが望ましいであろう。更に、注射可能な製薬形態の持続された吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンのような吸収を遅延させる剤を含有させることによりもたらすことができる。
【０２７８】
ある場合には、薬物の効果を持続させるために、皮下又は筋肉内注射からの薬物の吸収を遅延させることが望ましい。これは、水溶解度が劣った結晶質又は非晶質材料の液状懸濁液を使用することにより達成することができる。この場合に、薬物の吸収速度はその溶解速度に依存し、後者も結晶寸法及び結晶形態に依存しよう。別法として、非経口的に投与された薬物形態の吸収の遅延は、薬物を油性ビヒクルに溶解又は懸濁させることにより達成される。
【０２７９】
注射可能なデポー剤形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドのような生分解性重合体中の主題化合物のマイクロカプセルマトリックスを形成させることにより製造される。薬物対重合体の比率及び使用された特定の重合体の種類に応じて、薬物の放出速度は制御することができる。その他の生分解性重合体の例には、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が包含される。また、デポー剤注射可能処方物も薬物を体の組織と適合性のリポソーム又はマイクロエマルジョン中に包封することによって製造される。
【０２８０】
本発明の化合物が人及び動物に薬剤として投与されるときは、それらは、それ自体で又は例えば０．１〜９９．５％（更に好ましくは０．５〜９０％）の活性成分を製薬上許容できるキャリアーと組み合わせて含有する製薬組成物として与えることができる。
【０２８１】
本発明の化合物の動物飼料への添加は、好ましくは、活性化合物を有効量で含有する適当な供給プレミックスを製造し、このプレミックスを配合して完全な糧食にすることによって達成される。
別法として、活性成分を含有する中間濃厚物又は供給補充物を飼料に配合することができる。このような供給プレミックス及び完全糧食を製造し投与できる方法は、参照文献（例えば、“応用動物栄養”（Ｗ．Ｈ．フリーマン他、サンフランシスコ、１９６９）又は“家畜飼料及び飼育”（Ｏ−Ｂブックス、コーバリス、オレゴン、１９７７））に記載されている。
【０２８２】
ある具体例において、主題の化合物例えば化合物Ｄ又はその塩は、例えば局所適用のために水溶液中に配合することができる。適当な塩には、主題の化合物の塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、メタンスルホン酸塩、マレイン酸塩又は任意の他の適当な酸（例えば、アミン塩基の存在下で製薬上許容しうるアニオンを形成するもの）の塩が含まれる。
【０２８３】
ある具体例において、この水溶液は、製薬上許容しうる塩（例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム及びカルシウムより選択するカチオン、並びにアセテート、シトレート、ホスフェート、クロリドより選択するアニオン、任意の他の適当なイオン又はこれらの組合せ）を含むことができる。
【０２８４】
ある具体例において、この水溶液は、更に又はこれらに代えて、デキストロース、ラクトース、マンニトール、又は他のポリヒドロキシル化化合物例えば製薬上許容しうる炭水化物例えば単糖類若しくは二糖類又はポリオールを含むことができる。
【０２８５】
ある具体例において、水溶液は、２００〜４００ｍＯｓｍの、好ましくは２５０〜３５０Ｏｓｍの、尚一層好ましくは２８０〜３００ｍＯｓｍ（例えば、２９０ｍＯｓｍ）の浸透性を生じる溶質を含むことができる。
【０２８６】
ある具体例において、この溶液のｐＨは、３〜６の、好ましくは、３．５〜５の、尚一層好ましくは、４〜４．５の範囲にある。
【０２８７】
従って、一般に、水溶液は、最大で約７％の炭水化物又は例えば最大で約６％の（又は、約３〜６％の、又は約４〜５％の）ポリオール例えばマンニトール、ラクトース又はデキストロース、最大で約５０ｍＭの（例えば、最大で約２０ｍＭ又は約２〜２０ｍＭ又は約５〜１５ｍＭの）酢酸ナトリウム及びクエン酸ナトリウムから選択する塩、及び約２００〜４００ｍＯｓｍの、好ましくは２５０〜３５０Ｏｓｍの、尚一層好ましくは２８０〜３００ｍＯｓｍの浸透性を生じるのに十分な製薬上許容しうる溶質例えば塩化ナトリウムを含むことができ、ある具体例において、この水溶液は、実質的に炭水化物又はポリオールを含まず、実質的に酢酸ナトリウム及びクエン酸ナトリウムを含まず、又は、両者は、例えば、本質的に、生理食塩水及び主題の化合物の塩よりなるものであってよく、又は実質的に、塩例えば塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム及びクエン酸ナトリウムを含まず且つ、本質的に炭水化物又はポリオール及び主題の化合物の塩の水溶液よりなる。
【０２８８】
こうして、例えば、主題の化合物例えば化合物Ｄの水溶液は、ｐＨ４．２の生理食塩水中に、１０ｍＭ 酢酸ナトリウムを含むことができる。或は、水溶液は、５％ デキストロース溶液中に、１０ｍＭ 酢酸ナトリウムを含むことができ、又は単に５％ デキストロース溶液を含むことができる。
【０２８９】
ＶＩ．活性アンタゴニストの合成方法及び同定
主題のアンタゴニスト及びその同族体は、Ｓｕｚｕｋｉ， Ｓｔｉｌｌｅ等の架橋カップリング技術を用いて容易に調製することができる。これらのカップリング反応は比較的緩やかな条件下で行われ、幅広い「傍観」機能性を許容することができる。
【０２９０】
ａ．組み合わせライブラリー
本発明の化合物、特に様々な置換基の代表的なクラスを有する変異体のライブラリーは、組み合わせ化学及び他の並行合成方法で扱いやすい（例えばＰＣＴＷＯ９４／０８０５１）。従って、ヘッジホッグアンタゴニストになりうる先導化合物を同定するために、並びに先導化合物の特異性、毒性及び／又は細胞毒性−速度プロファイルを細かに区別するために、関連化合物の大型ライブラリー、例えば上記した化合物の多様性ライブラリーを高処理量アッセイにおいて迅速にスクリーンする。例えば、ｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進のいずれかを有する細胞を用いるアッセイなどの、ｐｔｃ、ヘッジホッグ又はスムースンド対生物活性アッセイを用いて、ｐｔｃに対するアゴニスト活性あるいはヘッジホッグ又はスムースンドに対するアンタゴニスト活性を有するものについて、主題の化合物のライブラリーをスクリーンすることができる。
【０２９１】
本発明に用いるための組み合わせライブラリーの例として、望ましい特性に関して一緒にスクリーンすることのできる、化学的に関連する化合物の混合物が挙げられる。一つの反応において多くの関連化合物の調製することで、実施すべきスクリーニングの回数を減少し単純化する。適当な物理的特性についてのスクリーニングは、従来法によって行うことができる。
【０２９２】
ライブラリーにおける多様性は、様々に異なるレベルで作成することができる。例えば、組み合わせ反応に用いられる基質アリール基は、中心となるアリール基について（例えば環状構造について）多様性を与えることができ、及び／又は他の置換基について変えることもできる。
【０２９３】
例えば主題のヘッジホッグアンタゴニストなどの小さな有機分子の組み合わせライブラリーを作成する技術に、様々な方法を用いることができる［例えばＢｌｏｎｄｅｌｌｅ他（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．１４：８３；Ａｆｆｙｍａｘ、米国特許第５，３５９，１１５号及び第５，３６２，８９９号；Ｅｌｉｍａｎ、米国特許第５，２８８，５１４号；Ｓｔｉｌｌ他、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０８０５１；ＡｒＱｕｌｅ、米国特許第５，７３６，４１２号及び第５，７１２，１７１号；Ｃｈｅｎ他（１９９４）ＪＡＣＳ１１６：２６６１；Ｋｅｒｒ他（１９９３）ＪＡＣＳ１１５：２５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１００９２、ＷＯ９３／０９６６８及びＷＯ９１／０７０８７；並びにＬｅｒｎｅｒ他、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／２０２４２参照］。従って、約１００〜１，０００，０００以上の主題のヘッジホッグアンタゴニストの多様体（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）の、様々なライブラリーを合成し、特定の活性又は特質についてスクリーンすることができる。
【０２９４】
例証的な態様において、多様体となりうるヘッジホッグアンタゴニストのライブラリーを、Ｓｔｉｌｌ他（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０８０５１）に記載の方法に適応させた計画を用いて合成することができる。例えば、アンタゴニスト候補又は合成中間体の置換基の位置の一つに位置させることのできる、加水分解可能な又は光分解可能な基によって重合体ビーズに連結する。Ｓｔｉｌｌ他の方法によると、ライブラリーは一連のビーズ上で合成される（各ビーズはビーズ上の特定の多様体を同定する標識セットを含む）。次いでビーズライブラリーを、ヘッジホッグアンタゴニストが探されるｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進の細胞とともに「培養」することができる。多様体は、例えば加水分解によってビーズから放出することができる。
【０２９５】
本発明において有用な化合物の構造は、それら自身、容易に、効率的な合成に役立つ。式Ｉ及びＶＩにより一般的に記載されたこれらの構造の性質は、かかる化合物のアセンブリを、上記のＲ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４部分のある組合せを用いて可能にする。例えば、これらのサブユニットを一般的なアシル化又はアルキル化反応によってコアリングに結合させることができる。かかる反応の大部分は、図１１、１２、１５及び１６に描いたものを含み、極めて温和で且つ極めて確実であり、従って、コンビナトリアルケミストリーに完全に適している。試験化合物のライブラリーの生成へのかかるコンビナトリアルアプローチの容易な性質は、下記の典型的な図式において明らかであり（Ｐ＝保護基）、上記の式による化合物の様々な基は、組合せ的に結合する（例えば、上記の方法の一つを利用して）。一層大きい多様性さえも、例えば、サブユニットを追加する際にある範囲の反応性官能基を用いることにより、例えば、Ｒ１サブユニットを追加する際にＲ−Ｌ−Ｃ（Ｏ）Ｃｌ、ＰＯ−Ａｒ−Ｌ−ＮＣＯ、ＰＯ−Ａｒ−Ｌ−ＳＯ２Ｃｌなどの範囲を用いることによって達成されうる。
【化２８】
2004531458.tif 000024
【０２９６】
上記及び関連の経路についての様々な改変によって、ヘッジホッグ機能を阻止する能力について試験される化合物の様々なライブラリーを合成することができる。
【０２９７】
本発明の例示化合物の製造
ここに開示した一般的構造に従う一連の化合物を製造し、生物学的性質について試験した（以下を参照）。好適なコア構造は、以下の反応式に要約されるような商業的に入手できるｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンから容易に製造することができる。
【化２９】
2004531458.tif 000025
【０２９８】
ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンメチルエステル塩酸塩
塩化アセチル（２４９ｍｌ、３．４７モル）をメタノール（２０９０ｍＬ）に温度を３０℃以下に保持するように撹拌し冷却しながら滴下した。完全に添加した後に、さらに６０分間撹拌し続けてからｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（３２５ｇ、２．４８モル）を固体状で添加した。反応混合物を２４時間加熱還流し、０℃に冷却し、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ、５２２０ｍＬ）を３０分間でゆっくりと添加した。沈殿した固体をフィルター上に集め、氷冷ＴＢＭＥで洗浄した（２×１Ｌ）。この生成物を４０℃で終夜真空乾燥して４２４ｇの所望のエステルを得た。
【０２９９】
ｔｒａｎｓ−１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンメチルエステル
上記反応の生成物エステル（４２３ｇ、２．３２モル）をジクロルメタン（６．５Ｌ）に懸濁させた。撹拌しかつ冷却しながら、トリエチルアミン（１０１９ｍＬ、７．３２モル）を３０分間で添加し、次いで重炭酸ジ−ｔ−ブチル（５８８ｇ、２．７０モル）を３０分間で添加して内部温度を１５℃以下に保持した。完全に転化した後に、混合物を室温で３時間撹拌し、次いで１Ｍくえん酸水溶液（６５０ｍＬ）を添加する。混合物を１時間撹拌し、有機相を分離し、１ＭのＫＨＣＯ３水溶液（９２０ｍＬ）、水（２×１Ｌ）で洗浄し、活性炭（１５ｇ）の存在下にＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を真空下に除去し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（２×１８００ｇのシリカゲル、３：１〜２：１のヘキサン：ＥｔＯＡｃの溶離剤）により精製して所望のカルバメート（４８９ｇ）を得た。
【０３００】
（４Ｒ）−１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−４−［（メチルスルホニル）オキシ］−Ｌ−プロリンメチルエステル
上記のカルバメート（４７８ｇ、１．９５モル）、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、３７３ｍＬ、２．１５モル）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、２３．８ｇ、０．１９５モル）をジクロルメタン（７６５０ｍＬ）に溶解した。塩化メタンスルホニル（１６７ｍＬ、２．１５モル）をジクロルメタン（９５０ｍＬ）に溶解してなる溶液を、冷却して温度を１０℃以下に保持しながら、５０分間で滴下した。混合物を−６℃で２時間撹拌し、水（７５０ｍＬ）を添加し、混合物を１５分間以上撹拌し、層を分離させた。有機相を１ＭのＫＨＣＯ３水溶液（９５０ｍＬ）、１Ｍくえん酸水溶液（２×９５０ｍＬ）及び水（７５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を真空下に除去し、残留物をヘキサン（１．９Ｌ）で結晶化させた。結晶質のメシレートをフィルター上に集め、ヘキサンで洗浄し（２×５００ｍＬ）、４０℃で真空乾燥して６２４ｇの所期の化合物を与えた。
【０３０１】
（４Ｓ）−１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−４−アジド−Ｌ−プロリンメチルエステル
上記のメシレート（６２４ｇ、１．９３モル）とナトリウムアジド（７１６ｇ、１１．０１モル）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、３１２０ｍＬ）に溶解してなる溶液を６０℃で２２時間撹拌し、この溶液を０℃に冷却し、水（３Ｌ）を４０分間で添加して温度を２０℃以下に保持し、ＥｔＯＡｃ（３Ｌ）を添加した。混合物を約２０分間攪拌し、層を分離させ、水性相をＥｔＯＡｃ（３Ｌ）で抽出した。一緒にした有機相を水（７５０ｍＬ）、０．１ＭのＨＣｌ水溶液（４００ｍＬ）、次いで水（７５０ｍＬ）で洗浄し、次いでＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を真空下に除去し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（２×１８００ｇのシリカゲル、２：１のヘキサン：ＥｔＯＡｃ）により精製して所望のアジド（５１６ｇ）を得た。
【０３０２】
（４Ｓ）−４−アジド−Ｌ−プロリンメチルエステル塩酸塩
ＨＣｌのジオキサン飽和溶液（１９４０ｍＬ）を１０〜１６℃で調製し、アジド（５２３ｇ、１．９４モル）をジオキサン（４８０ｍＬ）に溶解してなる溶液を、３０分間撹拌しかつ冷却して温度を２５℃以下に保持しながら滴下した。完全に溶解した後に、反応混合物を室温で２時間撹拌し、ＴＢＭＥ（２Ｌ）を添加し、生じた混合物を０℃で１時間撹拌した。沈殿した固体をろ紙上に集め、ＴＢＭＥ（４×５００ｍＬ）で洗浄し、４０℃で真空下に乾燥して所望の塩酸塩（３４８ｇ）を得た。
【０３０３】
上記のコア構造から或いは関連する化合物又は誘導体から本発明の主題化合物を以下に示す反応式に示すように製造することができる。
反応式１：溶液相経路１
【化３０】
2004531458.tif 000026
【０３０４】
反応式２：溶液相経路２
【化３１】
2004531458.tif 000027
【０３０５】
反応式３：固体相経路３
【化３２】
2004531458.tif 000028
【０３０６】
これらの経路は、例示の固相経路と共に、異なった置換基及び立体化学的関係を有する広範な化合物をもたらす。当業者ならば、上記の反応式におけるピペラジンの使用が例示に過ぎず、従ってその他のアミンも更に各種の主題化合物群を得るのに使用できることを認識しよう。同様に、ＢＯＣ、ＦＭＯＣ及びその他の保護基の使用は例示に過ぎず、従って当業者は、本発明の範囲及び精神から離れることなく、官能基に好適なその他の保護基を選択し且つその後の反応条件を容易に選択することができる。更に、前記の反応式はｔｒａｎｓ−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン化合物でもって典型的に開始するが、この化合物の全ての異性体は、ｃｉｓ／ｔｒａｎｓ及び（又は）Ｄ／Ｌ化合物も含めて、商業的に入手でき、従って広範な立体化学的に純粋な中間体及び主題化合物を得ることができる。ｔｒａｎｓ−アミノプロリンコア構造は、斯界で周知のように、ｔｒａｎｓ−ヒドロキシプロリン出発物質から、中間体ｃｉｓ−ブロムプロリンを形成させ（例えば、ヒドロキシルのトリフレート又はメシレートを形成させ、そのスルホン酸エステルを臭化物イオンで置換することにより）、次いでアジドで第二の置換を行なってｔｒａｎｓ−立体化学的関係を純粋に保持することにより得ることができる。別法として、ジアステレオマー混合物も前記の反応式３におけるようにして製造し、次いで随意に異性体の分離を行なうことができる。
【０３０７】
ｂ．スクリーニングアッセイ
化合物が、ｐｔｃ機能を代行し又はスムースンド若しくはヘッジホッグ機能に拮抗する能力を有するかどうかを調べるのに、様々なアッセイを用いることができるが、その多くは高処理量フォーマットで処理することができる。化合物及び天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬剤スクリーニングプログラムにおいて、所定の期間中に生存する化合物の数量を最大化するために、高処理量アッセイを用いるのが望ましい。従って、合成及び天然生産物のライブラリーから、ヘッジホッグアンタゴニストである他の化合物について見本をとることができる。
【０３０８】
細胞を含まないアッセイに加えて、細胞に基づくアッセイで試験化合物を試験することもできる。一つの態様において、ｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進表現型を有する細胞を、例えば試験剤の存在下における細胞増殖阻害剤について評価するアッセイで、目的の試験剤に接触させることができる。
【０３０９】
多くの遺伝子産物が、パッチト媒介シグナル変換（パッチト、ｃｕｂｉｔｕｓ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｕｓ（ｃｉ）の転写因子、セリン／トレオニンキナーゼであるｆｕｓｅｄ（ｆｕ）並びにｃｏｓｔａｌ−２、スムースンド及びｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｆｕｓｅｄの遺伝子産物）において関連づけられている。
【０３１０】
ヘッジホッグ蛋白質による細胞の誘導は、下流エフェクターの活性化及び阻害に関与する一連の事象を推進し、その結果、ある場合においては遺伝子の転写又は翻訳における検出可能な変化に至る。ヘッジホッグ媒介シグナリングの転写標的となりうるものしては、パッチト遺伝子（Ｈｉｄａｌｇｏ及びＩｎｇｈａｍ、１９９０ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１１０、２９１−３０１；Ｍａｎｇｏ他、１９９６）及びショウジョウバエ科ｃｕｂｉｔｕｓ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｕｓ遺伝子の脊椎動物相同体、ＧＬＩ遺伝子（Ｈｕｉ他（１９９４）Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ１６２：４０２−４１３）が挙げられる。パッチト遺伝子発現は、Ｓｈｈ応答性の肢芽及び神経板の細胞を誘発することが示されている（Ｍａｒｉｇｏ他（１９９６）ＰＮＡＳ９３：９３４６−５１；Ｍａｒｉｇｏ他（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２２：１２２５−１２３３）。Ｇｌｉ遺伝子は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合領域を有する推定転写因子をコードする（Ｏｒｅｎｉｃ他（１９９０）Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ４：１０５３−１０６７；Ｋｉｎｚｌｅｒ他（１９９０）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ１０：６３４−６４２）。Ｇｌｉ遺伝子の転写は肢芽のヘッジホッグに応答してアップレギュレーションを受ける一方、Ｇｌｉ３遺伝子の転写はヘッジホッグ誘導に応答してダウンレギュレーションを受けることが報告されている（Ｍａｒｉｇｏ他（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２２：１２２５−１２３３）。ヘッジホッグシグナリングに応答する遺伝子のアップレギュレーション及びダウンレギュレーションを引き起こす転写調節配列を、そのような標的遺伝子（例えばパッチト又はＧｌｉ遺伝子）から選択し、そのようなプロモーターをレポーター遺伝子に操作可能に連結することによって、特異な試験化合物の有するヘッジホッグ媒介シグナリング経路を改変する能力に対して感度の高い、転写に基づくアッセイを作成することができる。従って、レポーター遺伝子の発現は、ヘッジホッグのアンタゴニストとして作用する化合物の開発に有用なスクリーニング手段を提供する。
【０３１１】
本発明のレポーター遺伝子に基づくアッセイは、上記した一連の事象の最終段階、例えば転写調節を測定する。従って、アッセイの一つの態様の実施において、ｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進、スムースンド機能亢進に依存する検出シグナルの発生又はＳＨＨ自体の刺激を得るために、レポーター遺伝子構造体を標的細胞内に挿入する。レポーター遺伝子からの転写量は、当業者に好適と知られる方法を用いて測定することができる。例えば、レポーター遺伝子からのｍＲＮＡ発現は、リボヌクレアーゼ保護又はＲＮＡに基づくＰＣＲを用いて検出することができ、あるいはレポーター遺伝子の蛋白質産物は、特徴染色又は固有の生物学的活性によって同定することができる。次いでレポーター遺伝子からの発現量を、試験化合物の非存在下において同じ細胞内で発現された量、または実質的に同一だが標的受容体蛋白質を有さない細胞内での転写量のいずれかと比較する。統計的な又は有意な転写量の減少は、試験化合物がある程度正常なｐｔｃシグナルを作動させた（又は機能亢進ヘッジホッグ又はスムースンドシグナルに拮抗した）こと、例えば試験化合物が潜在的なヘッジホッグアンタゴニストであることを意味する。
【０３１２】
例示
ここでは、本発明を一般的に説明するので、本発明は、そのある種の観点及び具体例の例示の目的のためだけで含め且つ限定とならない後記の実施例を参照することにより一層容易に理解されるであろう。
【０３１３】
模範的な抑止薬の合成
Ｎ１−［（３Ｒ，５Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−５−（ピペラジノカルボニル）テトラヒドロ−１Ｈ−３−ピロリル］−Ｎ１−（４−メトキシベンジル）−３，３−ジメチルブタンアミド、“ｔｒａｎｓ−アミノプロリン”
【化３３】
2004531458.tif 000029
【０３１４】
（２Ｓ，４Ｓ）−４−ブロムテトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（４）
（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシテトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（３）（２．０ｇ、８．１５ミリモル）をオーブン乾燥フラスコに秤量し、トルエンを使用して共沸的に乾燥した。ジクロルメタン（１６ｍｌ）と四臭化炭素（１０．８１ｇ、８．１５ミリモル）を添加し、溶液を攪拌し、０℃に冷却し、トリフェニルホスフィン（８．５ｇ、３２．４１ミリモル）で処理した。この混合物を０℃で５時間攪拌し、次いでメタノール（１．８ｍＬ）を添加し、室温で終夜攪拌し続けた。この混合物をジエチルエーテル（８０ｍＬ）で希釈し、生じた懸濁液をろ過し、ジエチルエーテル（３０ｍＬ）で洗浄した。溶媒を一緒にし、減圧下に蒸発させ、粗生成物をヘキサン／酢酸エチル（１９：１〜４：１、ｖ／ｖ）を溶離剤としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して標記の臭化物（４）（１．０ｇ、４０％）を無色油状物として得た。
δＨ（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１．４１及び１．４６（２ｘｓ、９Ｈ、ロタマー）；２．３８−２．４６（ｍ、１Ｈ）；２．７５−２．８７（ｍ、１Ｈ）；３．６７−３．７４（ｍ、１Ｈ）；３．７６（ｓ、３Ｈ）；３．９６−４．０７（ｍ、１Ｈ）；４．２４−４．４２（ｍ、２Ｈ）
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ２１０（１００）
【０３１５】
（２Ｓ，４Ｒ）−４−アジドテトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（５）
ナトリウムアジド（０．９０ｇ、１３．８４ミリモル）と（２Ｓ，４Ｓ）−４−ブロムテトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（４）（１．０ｇ、３．２４ミリモル）を無水ジメチルホルムアミド（３２ｍＬ）に加えてなる懸濁液を窒素雰囲気下に６４時間加熱した。この混合物を室温に冷却し、氷冷水に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機抽出物を一緒にし、水洗し、塩水で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下に蒸発させた。粗生成物をヘキサン／酢酸エチル（３：１〜１：１、ｖ／ｖ）を溶離剤としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して標記のアジド（５）（０．８８ｇ、９３％）を無色油状物として得た。
δＨ（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１．４１及び１．４６（２ｘｓ、９Ｈ、ロタマー）；２．１３−２．２０（ｍ、１Ｈ）；２．２７−２．３８（ｍ、１Ｈ）；３．４５−３．４９及び３．５７−３．６０（２ｘｍ、１Ｈ、ロタマー）；３．６８−３．７３（ｍ、１Ｈ）；３．７４−３．７５（２ｘｍ、３Ｈ、ロタマー）；４．１５−４．２３（ｍ、１Ｈ）；４．３０−４．３５及び４．３９−４．４３（２ｘｍ、１Ｈ、ロタマー）
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ１７１［（Ｍ＋Ｈ）＋−Ｃ５Ｈ９Ｏ２］（１００）
【０３１６】
（２Ｓ，４Ｒ）−４−アンモニオテトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル  クロリド（６）
（２Ｓ，４Ｒ）−４−アジドテトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（５）（０．８１ｇ、３．０ミリモル）を２％ｖ／ｖ塩酸エタノール溶液（８ｍＬ）に溶解してなる溶液にパラジウム炭（１０％、０．５ｇ）を添加した。この反応混合物を減圧し、窒素でパージし（３回）、次いで水素雰囲気下に置き、室温で終夜激しく撹拌した。混合物をセライトパッドでろ過し、減圧下に蒸発させて粗生成物とした。これを０℃でジエチルエーテルですり砕き、生じたスラリーをろ過し、氷冷ジエチルエーテルで洗浄し、真空乾燥した。標記の塩（６）を定量的収率で得た。
δＨ（３６０ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）：１．４６及び１．５１（２ｘｓ、９Ｈ、ロタマー）；２．３５−２．４７（ｍ、２Ｈ）；３．５０−３．５５（ｍ、１Ｈ）；３．７４−３．８６［ｍ、４Ｈ、｛３．７９及び３．８０（２ｘｍ、３Ｈ、ロタマー）を含む｝］；３．８９−３．９５（ｍ、１Ｈ）及び４．４６−４．５０（ｍ、１Ｈ）
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ２１０（１００）
【０３１７】
（２Ｓ，４Ｒ）−４−［（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（７）
（２Ｓ，４Ｒ）−４−アンモニオテトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル  クロリド（６）（０．８３ｇ、２．９６ミリモル）と３−メトキシベンズアルデヒド（０．３８ｇ、２．８ミリモル）をオルトぎ酸トリメチル（８ｍＬ）に溶解してなる溶液を室温で４５分間撹拌した。この溶液をシアノ硼水素化ナトリウム（０．２８ｇ、４．４６ミリモル）でゆっくりと処理し、反応の過程をＴＬＣ分析によりモニターした。完了した（〜１．５時間）ならば、反応を硫酸水素カリウム飽和水溶液により停止させ、ジクロルメタンにより抽出した。水性相のｐＨ値を９に調節し、ジクロルメタンにより逆抽出した。一緒にした有機抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下に蒸発させて標記のアミン（７）を定量的収率で与えた。
δＨ（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１．４０及び１．４５（２ｘｓ、９Ｈ、ロタマー）；２．０７−２．１９（ｍ、２Ｈ）；３．１８−３．２３及び３．３２−３．３６（２ｘｍ、１Ｈ）；３．４３−３．５３（ｍ、１Ｈ）；３．７０−３．７４［ｍ、４Ｈ、｛３．７２及び３．７３（２ｘｍ、３Ｈ、ロタマー）を含む｝］；３．８１（ｓ、３Ｈ）；４．３２−４．３６及び４．４０−４．４４（２ｘｍ、１Ｈ）；６．７９−６．８１（ｍ、１Ｈ）；６．８７−６．８９（ｍ、２Ｈ）及び７．２４（ｔ、１Ｈ）
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ２６５［（Ｍ＋Ｈ）＋−Ｃ５Ｈ９Ｏ２］（１００）
【０３１８】
（２Ｓ，４Ｒ）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（８）
（２Ｓ，４Ｒ）−４−［（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（７）（０．３ｇ、０．８２ミリモル）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１０６ｇ、０．８２ミリモル）を無水ジクロルメタン（０．８ｍＬ）に溶解してなる溶液を窒素雰囲気下に室温で撹拌した。この溶液を塩化ｔ−ブチルアセチル（０．１３３ｇ、０．９９ミリモル）により滴下しながら処理し、終夜撹拌した。溶媒を減圧下に蒸発させ、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル、２：１、ｖ／ｖ）により精製して標記のアミド（８）（１．０ｇ、４０％）を無色油状物として与えた。
δＨ（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１．０１及び１．０５（２ｘｓ、９Ｈ、ロタマー）；１．３７及び１．４１（２ｘｓ、９Ｈ、ロタマー）；１．８７−２．５６［ｍ、４Ｈ、（２．１６（ｓ、２Ｈ）で含む）］；３．１７−３．３５（ｍ、１Ｈ）；３．６２−３．８５［ｍ、７Ｈ、｛３．７０及び３．７９（２ｘｓ、６Ｈ）で含む）］；４．２１−４．２４及び４．２８−４．３５（２ｘｍ、１Ｈ、ロタマー）；４．４０−４．５８（ｍ、２Ｈ）；４．７３−４．９５及び５．０３−５．２１（２ｘｍ、１Ｈ、ロタマー）；６．５４−６．８８（ｍ、３Ｈ）及び７．１９−７．３１（ｍ、１Ｈ）
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ３６３（１００）
【０３１９】
２，２，２−トリフルオル酢酸（２Ｓ，４Ｒ）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシアニリノ）］−２−（メトキシカルボニル）テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロリウム（９ａ）
（２Ｓ，４Ｒ）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（８）（０．０１ｇ、２１．６μモル）を３０％トリフルオル酢酸ジクロルメタン溶液（０．５ｍＬ）に室温で添加し、３０分間攪拌する。この溶液を減圧下に蒸発乾燥させて標記のピロリウム塩（９ａ）を定量的収率で与えた。
δＨ（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１．０５（ｓ、９Ｈ）；２．３８−２．５７（ｍ、４Ｈ）；３．５９−３．６８（ｍ、２Ｈ）；３．７５（ｓ、３Ｈ）；３．７９（ｓ、３Ｈ）；４．０９−４．１５（ｍ、１Ｈ）；４．５２−４．６３（ｍ、２Ｈ）；４．７８−４．９４（ｍ、１Ｈ）；６．６６（ｓ、１Ｈ）；６．７０（ｄ、１Ｈ）；６．８６−６．８８（ｄｄ、１Ｈ）及び７．３１（ｔ、１Ｈ）
【０３２０】
（２Ｓ，４Ｒ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸メチル（１０）
（２Ｓ，４Ｒ）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（８）（０．１５ｇ、０．３２ミリモル）を３０％トリフルオル酢酸ジクロルメタン溶液（３ｍＬ）に室温で添加した。混合物を３０分間攪拌し、減圧下に蒸発乾燥させた。残留物をジクロルメタンと炭酸カリウム飽和水溶液との間で分配させ、５分間激しく振盪させた。有機相を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下に蒸発させて１４０ｍｇの粗製の（２Ｓ，４Ｒ）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）３−メトキシアニリノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸メチル（９ｂ）を得た。これは更に精製することなく次の反応に使用した。
上で製造した粗製のアミン（９ｂ）（１４０ｍｇ）、ピペロナール（７４ｍｇ、０．４９ミリモル）及び氷酢酸（２滴）を１，２−ジクロルエタン（０．５ｍＬ）に溶解してなる溶液を室温で３０分間攪拌した。９５％シアノ硼水素化ナトリウム（３２ｍｇ、０．４８ミリモル）を少量づつ添加し、１時間撹拌し続けた。反応を重炭酸ナトリウム飽和水溶液（２ｍＬ）で停止させ、ジクロルメタンで抽出し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下に蒸発させた。残留物を、ジクロルメタン−酢酸エチル（９０：１０〜７５：２５）を溶離剤としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して標記のピロール（１０）（１１５ｍｇ、７１．４％）を淡黄色油状物として与えた。
δＨ（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：０．９８−１．０８（ｍ、９Ｈ）；２．０９−２．５９［ｍ、４Ｈ、｛２．１３（ｓ、２Ｈ）で含む）］；２．９６−３．０７（ｍ、１Ｈ）；３．４７−３．８５（ｍ、１１Ｈ）；４．４６−４．６３（ｍ、１Ｈ）；４．８３−４．９４（ｍ、１Ｈ）；５．９２−５．９５（ｍ、２Ｈ）；６．６３−６．８９（ｍ、６Ｈ）及び７．１５−７．３４（ｍ、１Ｈ）
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ４９７［（Ｍ＋Ｈ）＋］（１００）
【０３２１】
（２Ｓ，４Ｒ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸（１１）
（２Ｓ，４Ｒ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸メチル（１０）（１００ｍｇ、０．２０ミリモル）を６６％ｖ／ｖメタノール水溶液（１．０ｍＬ）に溶解してなる溶液に水酸化リチウム一水和物（１７ｍｇ、０．４０５ミリモル）を添加した。この混合物を室温で終夜撹拌し、次いで溶媒を減圧下に除去し、残留物をジクロルメタン（１．０ｍＬ）と水（１．０ｍＬ）との間で分配させた。水性相を１．０Ｍくえん酸水溶液で酸性化し、二つの相を室温で１０分間激しく振盪させた。相を分離させ、水性相をジクロルメタンで逆抽出した。一緒にしたジクロルメタン抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下に蒸発させて標記の酸（１１）（７０ｍｇ、７２％）をオフホワイトの固体として与えた。
δＨ（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１．００及び１．０３（２ｘｍ、９Ｈ、ロタマー）；２．１７−２．３９（ｍ、３Ｈ）；２．６２−２．７１（ｍ、１Ｈ）；３．２８−３．３４（ｍ、１Ｈ）；３．４７−３．５６（ｍ、１Ｈ）；３．７６（ｍ、３Ｈ）；３．９６−４．１３（ｍ、１Ｈ）；４．２１−４．２６（ｍ、２Ｈ）；４．３６−４．５８（ｍ、３Ｈ）；５．９３（ｄ、２Ｈ）；６．６２−６．９０（ｍ、６Ｈ）及び７．２１−７．２５（ｍ、１Ｈ）
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ４８３［（Ｍ＋Ｈ）＋］（１００）
【０３２２】
４−（｛（２Ｓ，４Ｒ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）−３−メトキシアニリノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロリル｝カルボニル）−１−ピペラジンカルボン酸ｔ−ブチル（１２）
（２Ｓ，４Ｒ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸（１１）（６０ｍｇ、０．１２ミリモル）とテトラフルオロ硼酸Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム（４８ｍｇ、０．１５ミリモル）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５４μＬ、０．３１ミリモル）をジメチルホルムアミド（１ｍＬ）に加えてなる混合物を室温で１．５時間撹拌した。この混合物を水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。水性相を酢酸エチルで逆抽出し、一緒にした抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下に蒸発乾燥させた。残留物を、１００％ジクロルメタン、ジクロルメタン／酢酸エチル（４：１、ｖ／ｖ）及び１００％酢酸エチルを溶離剤として、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより部分的に精製してＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドで汚染された粗生成物を与えた。ジクロルメタンを添加し、生じた溶液を水洗した。水性相をジクロルメタンで逆抽出し、一緒にした有機抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下に蒸発させて標記のピペラジン（１２）（３３．１ｍｇ、４１％）を与えた。
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ６５１［（Ｍ＋Ｈ）＋］（１００）
【０３２３】
Ｎ１−［（３Ｒ，５Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−５−（ピペラジノカルボニル）テトラヒドロ−１Ｈ−３−ピロリウムイル］−Ｎ１−（３−メトキシベンジル）−３，３−ジメチルブタンアミド  ２，２，２−トリフルオル酢酸塩（１３ａ）
４−（｛（２Ｓ，４Ｒ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）−３−メトキシアニリノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロリル｝カルボニル）−１−ピペラジンカルボン酸ｔ−ブチル（１２）（２４ｍｇ、３６．９μモル）をジクロルメタン（０．８ｍＬ）に溶解してなる溶液をトリフルオル酢酸（０．１ｍＬ、１．３ミリモル）で処理した。この混合物を室温で撹拌し、反応の過程をＴＬＣ分析によりモノターした。完了したならば、溶媒を減圧下に蒸発させて標記のトリフルオル酢酸塩（１３ａ）を定量的収率で与えた。この塩は、更に精製することなく次の実験に使用した。
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ５５１［（Ｍ＋Ｈ）＋］（１００）
【０３２４】
Ｎ１−［（３Ｒ，５Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−５−（ピペラジノカルボニル）テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロリル］−Ｎ１−（３−メトキシベンジル）−３，３−ジメチルブタンアミド（１３ｂ）
２６ｍｇの粗製のＮ１−［（３Ｒ，５Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−５−（ピペラジノカルボニル）テトラヒドロ−１Ｈ−３−ピロリウムイル］−Ｎ１−（３−メトキシベンジル）−３，３−ジメチルブタンアミド  ２，２，２−トリフルオル酢酸塩（１３ａ）を含有するジクロルメタン（０．８ｍＬ）と水（０．８ｍＬ）との２相混合物を激しく撹拌し、２．０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液により、水性相のｐＨが１２に調節されるまで、滴下しながら処理した。相を分離させ、水性相をジクロルメタンで抽出した（２×１ｍＬ）。有機抽出物を一緒にし、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下に蒸発させて標記のピペラジン（１３ｂ）（１２．７ｍｇ、５９％）を与えた。
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ５５１［（Ｍ＋Ｈ）＋］（１００）
【０３２５】
Ｎ１−［（３Ｓ，５Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−５−（ピペラジノカルボニル）テトラヒドロ−１Ｈ−３−ピロリル］−Ｎ１−（４−メトキシベンジル）−３，３−ジメチルブタンアミド、“ｃｉｓ−アミノプロリン”
【化３４】
2004531458.tif 000030
【０３２６】
（２Ｓ，４Ｓ）−４−アンモニオテトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル  クロリド（１６）
パラジウム炭（１０％、０．２５ｇ）と（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジドテトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（１５）（１．００ｇ、３．７ミリモル）を、脱ガスした２％ｖ／ｖ塩酸エタノール溶液（１０ｍＬ）に加えてなる懸濁液を水素雰囲気（１気圧）下に室温で激しく撹拌した。終夜撹拌した後、混合物をセライト（登録商標）パッドでろ過し、エタノールで十分に洗浄した。ろ液を減圧下に蒸発させ、残留物を０℃でｔ−ブチルメチルエーテルですり砕いた。生じたスラリーをろ過し、氷冷ｔ−ブチルメチルエーテルで洗浄し、真空乾燥して標記の塩酸塩（１６）（０．７４ｇ、７１％）を白色固体として与えた。
δＨ（３６０ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：１．２１及び１．２６（２ｘｓ、９Ｈ、ロタマー）；１．８５−２．０３（ｍ、１Ｈ）；２．５２−２．６５（ｍ、１Ｈ）；３．２９−３．４８（ｍ、１Ｈ）；３．５８−３．８３（ｍ、５Ｈ）及び４．１４−４．３４（ｍ、１Ｈ）
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ１８９（１００）
【０３２７】
（２Ｓ，４Ｓ）−４−［（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（１７）
（２Ｓ，４Ｓ）−４−アンモニオテトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル  クロリド（１６）（３．００ｇ、１０．７０ミリモル）と３−メトキシベンズアルデヒド（１．３０ｍＬ、１０．７ミリモル）をオルトぎ酸トリメチル（８ｍＬ）に溶解してなる溶液を室温で４５分間撹拌した。この溶液にトリアセトキシ硼水素化ナトリウム（２．２６ｇ、１０．７０ミリモル）を３０分間で少量づつ添加し、反応の過程をＴＬＣ分析によりモニターした。完了した（約３０分）ならば、反応を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（１５ｍＬ）により停止させ、酢酸エチル（１５ｍＬ）により抽出した。有機抽出物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液により抽出し（２×１５ｍＬ）、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下に蒸発させた。残留物を１００％ジクロルメタン、次いで１００％酢酸エチルを溶離剤として使用してフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して標記のアミン（１７）（２．４８ｇ、６４％）を黄色油状物として与えた。
【０３２８】
（２Ｓ，４Ｓ）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（１８）
（２Ｓ，４Ｓ）−４−［（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（１７）（１．３７ｇ、３．７６ミリモル）とトリエチルアミン（０．６３ｍＬ、４．５２ミリモル）を無水ジクロルメタン（１４ｍＬ）に溶解して攪拌した溶液を塩化ｔ−ブチルアセチル（０．５３ｍＬ、３．８２ミリモル）で滴下しながら処理した。室温で終夜攪拌した後、混合物をジクロルメタン（５０ｍＬ）で希釈し、１．０Ｍくえん酸水溶液で洗浄した（２×５０ｍＬ）。相を分離させ、水性相をジクロルメタン（２５ｍＬ）で逆抽出し、一緒にした有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下に蒸発させた。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル、２：１、ｖ／ｖ）により精製して標記のアミン（１８）（１．５ｇ、８６％）を淡黄色油状物として与えた。
δＨ（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１．００及び１．０６（２ｘｓ、９Ｈ、ロタマー）；１．３８及び１．４２（２ｘｓ、９Ｈ、ロタマー）；１．８１−１．９３（ｍ、１Ｈ）；２．１５（ｓ、２Ｈ）；２．３０−２．５１（ｍ、１Ｈ）；３．１８−３．２５（ｍ、１Ｈ）；３．６２−３．８５［ｍ、４Ｈ、｛３．６９（ｓ、３Ｈ）で含む）］；３．７８（ｍ、３Ｈ）；４．１５−４．２５（ｍ、１Ｈ）；４．４５−４．６１（ｍ、２Ｈ）；５．１０−５．２３（ｍ、１Ｈ）；６．６４−６．８２（ｍ、３Ｈ）及び７．１３−７．３１（ｍ、１Ｈ）
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ３６３（１００）
【０３２９】
２，２，２−トリフルオル酢酸（２Ｓ，４Ｓ）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシアニリノ）］−２−（メトキシカルボニル）テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロリウム（１９ａ）
（２Ｓ，４Ｓ）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（１８）（５２４ｍｇ、１．１３ミリモル）を２１％ｖ／ｖトリフルオル酢酸ジクロルメタン溶液（６．６ｍＬ）に室温で添加した。この混合物を５０分間攪拌し、次いで減圧下に蒸発乾燥させて０．９８ｇの標記のピロリウム塩（１９ａ）とトリフルオル酢酸との混合物を与えた。
δＨ（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１．０８（ｓ、９Ｈ）；２．３４−２．４２（ｍ、１Ｈ）；２．４７（ｓ、３Ｈ）；２．６３−２．７２（ｍ、１Ｈ）；３．６１−３．７１（ｍ、２Ｈ）；３．８２（ｓ、３Ｈ）；３．８３（ｓ、３Ｈ）；４．０７−４．１４（ｍ、１Ｈ）；４．４３−４．５４（ｍ、１Ｈ）；４．５７−４．６７（ｍ、２Ｈ）；６．６８−６．７４（ｍ、２Ｈ）；６．９０−６．９３（ｄｄ、１Ｈ）；及び７．３４（ｔ、１Ｈ）
【０３３０】
（２Ｓ，４Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸メチル（２０）
（２Ｓ，４Ｓ）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（１８）（１３８ｍｇ、０．３８ミリモル）を３０％ｖ／ｖトリフルオル酢酸ジクロルメタン溶液（３ｍＬ）に室温で添加した。この混合物を３０分間攪拌し、減圧下に蒸発乾燥させた。残留物をジクロルメタンと炭酸カリウム飽和水溶液との間で分配させ、５分間激しく振盪させた。有機相を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下に蒸発させて１４０ｍｇの粗製の（２Ｓ，４Ｒ）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）３−メトキシアニリノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸メチル（１９ｂ）を得た。これは更に精製することなく次の反応に使用した。
（２Ｓ，４Ｓ）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸メチル（１９ｂ）（１３８ｍｇ、０．３８ミリモル）、ピペロナール（５８ｍｇ、０．３９ミリモル）及び氷酢酸（２２５μＬ、３．９３ミリモル）をテトラヒドロフラン（２．８ｍＬ）に溶解してなる溶液を室温で３０分間攪拌した。９５％シアノ硼水素化ナトリウム（１２５ｍｇ、１．８８ミリモル）を少量づつ添加し、同じ温度で４５分間撹拌し続けた。酢酸エチル（５ｍＬ）で希釈した後、反応混合物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（２×５ｍＬ）及び塩水（５ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下に蒸発させた。残留物を、１００％ジクロルメタン及びジクロルメタン−酢酸エチル（４：１、ｖ／ｖ）を溶離剤としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して標記のピロール（２０）を与えた。
δＨ（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：０．８９及び０．９９（２ｘｓ、９Ｈ、ロタマー）；１．６５−１．７９（ｍ、１Ｈ）；１．８７−２．１１［ｍ、３Ｈ、｛１．９４（ｓ、２Ｈ）で含む）］；２．２１−２．６６（ｍ、２Ｈ）；３．０４−３．１５（ｍ、２Ｈ）；３．５６（ｓ、３Ｈ）；３．６７−３．７４［ｍ、４Ｈ｛３．６７（ｓ、３Ｈ）で含む）］；４．４３−４．６４（ｍ、２Ｈ）；４．７４−４．９２（ｍ、１Ｈ）；５．１０−５．１４（ｍ、１Ｈ）；５．７４−５．８８（ｍ、２Ｈ）；６．４９−６．７８（ｍ、６Ｈ）及び７．０２−７．１０（ｍ、１Ｈ）
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ４９７［（Ｍ＋Ｈ）＋］（１００）
【０３３１】
（２Ｓ，４Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸（２１）
（２Ｓ，４Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸メチル（２０）（１００ｍｇ、０．２０ミリモル）を６％ｖ／ｖメタノール水溶液（１．０ｍＬ）に溶解してなる溶液に水酸化リチウム一水和物（１７ｍｇ、０．４０５ミリモル）を添加した。この混合物を室温で終夜撹拌し、次いで溶媒を減圧下に除去し、残留物をジクロルメタン（１．０ｍＬ）と水（１．０ｍＬ）との間で分配させた。水性相を１．０Ｍくえん酸水溶液で酸性化し、二つの相を室温で１０分間激しく振盪させた。相を分離させ、水性相をジクロルメタンで逆抽出した。一緒にしたジクロルメタン抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下に蒸発させた。残留物を、溶離剤としてジクロルメタン／酢酸エチル（１：１、ｖ／ｖ）、次いでジクロルメタン／メタノール（９：１、ｖ／ｖ）を使用してフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して標記の酸（２１）（８８ｍｇ、９１％）をオフホワイトの固体として与えた。
δＨ（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：０．９５（ｓ、９Ｈ）；２．１８［ｍ、３Ｈ、｛２．１８（ｓ、２Ｈ）で含む）；２．６２−２．８７（ｍ、１Ｈ）；３．１７−３．２８（ｍ、１Ｈ）；３．４２−３．４７（ｍ、１Ｈ）；３．７３（ｍ、３Ｈ）；３．８２−３．９３（ｍ、１Ｈ）；３．９４−４．６０（ｍ、１Ｈ）；４．４１−４．６５（ｍ、４Ｈ）；５．９０−５．９４（ｍ、２Ｈ）；６．６３−６．９３（ｍ、６Ｈ）及び７．２１−７．２５（ｍ、１Ｈ）
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ４８３［（Ｍ＋Ｈ）＋］（１００）
【０３３２】
４−（｛（２Ｓ，４Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）−３−メトキシアニリノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロリル｝カルボニル）−１−ピペラジンカルボン酸ｔ−ブチル（２２）
（２Ｓ，４Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸（２１）（９６．５ｍｇ、０．２０ミリモル）とテトラフルオロ硼酸Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム（７７ｍｇ、０．２４ミリモル）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（８７μＬ、０．５０ミリモル）をジメチルホルムアミド（１ｍＬ）に加えてなる混合物を室温で１．５時間撹拌した。この混合物を水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。水性相を酢酸エチルで逆抽出し、一緒にした有機抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下に蒸発乾燥させた。残留物を、溶離剤としてヘキサン／酢酸エチル（１：１、ｖ／ｖ）、次いで１００％酢酸エチルを使用して、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して標記のピペラジン（２２）（８９ｍｇ、６８％）を与えた。
δＨ（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：０．９５及び０．９７（２ｘｓ、９Ｈ、ロタマー）；１．４６（ｓ、９Ｈ）；１．７４（ｓ、２Ｈ）；２．０１−２．２４及び２．３８−２．４４（２ｘｍ、２Ｈ、ロタマー）；２．５５−２．５９及び２．７０−２．８１（２ｘｍ、２Ｈ）；３．０９−３．５８（ｍ、９Ｈ）；３．７４−３．８５［ｍ、３Ｈ、（３．７６及び３．７９（２ｘｓ、３Ｈ、ロタマー）で含む）］；３．９４−４．０５及び４．０６−４．１９（２ｘｍ、１Ｈ、ロタマー）；４．２４−４．４１及び４．６１−４．６９（２ｘｍ、２Ｈ、ロタマー）；４．８６−４．９６及び５．１１−５．２１（２ｘｍ、１Ｈ、ロタマー）；５．８９−６．０１（ｍ、２Ｈ、ロタマー）；６．５８−６．９８（ｍ、６Ｈ）；７．１３−７．１８及び７．２５−７．２７（２ｘｍ、１Ｈ、ロタマー）
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ６５１［（Ｍ＋Ｈ）＋］（１００）
【０３３３】
Ｎ１−［（３Ｓ，５Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−５−（ピペラジノカルボニル）テトラヒドロ−１Ｈ−３−ピロリウムイル］−Ｎ１−（３−メトキシベンジル）−３，３−ジメチルブタンアミド  ２，２，２−トリフルオル酢酸塩（２３ａ）
４−（｛（２Ｓ，４Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）−３−メトキシアニリノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロリル｝カルボニル）−１−ピペラジンカルボン酸ｔ−ブチル（２２）（２１．７ｍｇ、３３．３μモル）をジクロルメタン（０．５ｍＬ）に溶解してなる溶液を９５％ｖ／ｖトリフルオル酢酸ジクロルメタン溶液（０．１ｍＬ、１．２ミリモル）で処理した。この混合物を室温で撹拌し、反応の過程をＴＬＣ分析によりモノターした。完了した（１時間）ならば、溶媒を減圧下に蒸発させて２２．８ｍｇの標記のトリフルオル酢酸塩（２３ａ）と酢酸エチルとトリフルオル酢酸との混合物を与えた。この塩は、更に精製することなく次の実験に使用した。
δＨ（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：０．９８（ｓ、９Ｈ）；２．０８−２．１８（ｍ、１Ｈ）；２．３２（ｄ、１Ｈ）；２．４３（ｄ、１Ｈ）；２．７３−２．８２（ｍ、１Ｈ）；３．３０−３．７３（ｍ、８Ｈ）；３．７７（ｓ、３Ｈ）；３．９０−３．９６（ｍ、１Ｈ）；４．０６−４．１９（ｍ、１Ｈ）；４．３６−４．４６（ｍ、２Ｈ）；４．５７（ｄ、１Ｈ）；４．６５−４．７３（ｍ、１Ｈ）；５．５７−６．０１（ｍ、２Ｈ）；６．６１−６．６６（ｍ、２Ｈ）；６．７６−６．９１（ｍ、４Ｈ）及び７．２９（ｔ、１Ｈ）
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ５５１［（Ｍ＋Ｈ）＋］（１００）
【０３３４】
Ｎ１−［（３Ｓ，５Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−５−（ピペラジノカルボニル）テトラヒドロ−１Ｈ−３−ピロリウムイル］−Ｎ１−（３−メトキシベンジル）−３，３−ジメチルブタンアミド（２３ｂ）  ２２．８ｍｇの粗製のＮ１−［（３Ｓ，５Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−５−（ピペラジノカルボニル）テトラヒドロ−１Ｈ−３−ピロリウムイル］−Ｎ１−（３−メトキシベンジル）−３，３−ジメチルブタンアミド  ２，２，２−トリフルオル酢酸塩（２３ａ）を含有するジクロルメタン（０．５ｍＬ）と水（０．５ｍＬ）との２相混合物を２．０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液により、水性相のｐＨが１２に調節されるまで、処理した。この混合物を室温で５分間激しく撹拌し、相を分離させた。水性相をジクロルメタンで抽出し（２×１ｍＬ）、一緒にした有機抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下に蒸発させて標記のピペラジン（２３ｂ）（１４．５ｍｇ、７９％）を与えた。  δＨ（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：０．９７及び１．０９（２ｘｓ、９Ｈ、ロタマー）；１．６６−１．７９［ｍ、３Ｈ、｛１．７９（ｓ、２Ｈ）で含む）］；２．０３（ｄ、１Ｈ）；２．１３（ｄ、１Ｈ）；２．３２−２．４７（ｍ、１Ｈ）；２．５４−２．８８（ｍ、５Ｈ）；３．０５−３．１２（ｍ、１Ｈ）；３．２９−３．６７（ｍ、５Ｈ）；３．７６（ｓ、３Ｈ）；３．８６（ｄ、１Ｈ）；４．６６（ｄ、１Ｈ）；４．９７（ｄ、１Ｈ）；５．０８−５．２２（ｍ、１Ｈ）；５．８９−５．９２（ｍ、２Ｈ）；６．５９−６．８１（ｍ、６Ｈ）及び７．０９−７．１８（ｔ、１Ｈ）
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ５５１［（Ｍ＋Ｈ）＋］（１００）
【０３３５】
保護基の枠の変更は、本発明の化合物を製造し得る効率及び速度を増大させることができる。斯界で知られた方法と相まって前記した開示に基づいて、当業者により容易に実施することができる以下に説明する反応式は、ヘッジホッグ活性を示し得る化合物に対する迅速且つ有効な経路を提供する。理解されるように、特定の部分、基及び反応（例えば、アミンの求電子性又は還元的アルキル化）は、例えば、式Ｉ〜ＶＩの何れかに従う構造を有する広範な化合物を製造するように変更することができる。また、Ｊ．Ｗ．ミケルソン、Ｋ．Ｌ．ベロンガ及びＥ．Ｊ．ヤコブセン、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９５，６０；４１７７−４１８３も参照されたい。
【０３３６】
反応式１
【化３５】
2004531458.tif 000031
【０３３７】
反応式２
【化３６】
2004531458.tif 000032
【０３３８】
反応式３
【化３７】
2004531458.tif 000033
【０３３９】
反応式４
【化３８】
2004531458.tif 000034
【０３４０】
固相経路
このテンプレートでの製造を実施するのに使用される合成経路を反応式５に記載する。
反応式５
【化３９】
2004531458.tif 000035
【０３４１】
洗浄プロトコル
方法１：水（３ｘ）、アセトン（２ｘ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｘ）、水（２ｘ）、アセトン（１ｘ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｘ）、水（２ｘ）、アセトン（３ｘ）、メタノール（３ｘ）、アセトン（３ｘ）及びメタノール（３ｘ）。
方法２：ジクロルメタン、ヘキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジクロルメタン、ヘキサン、ジクロルメタン及びヘキサン。
方法３：水、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、水、１．０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、水、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、水、１．０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、水、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジクロルメタン、メタノール、ジクロルメタン及びメタノール。
方法４：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジクロルメタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジクロルメタン、メタノール、ジクロルメタン、メタノール（２×）及びエーテル（２×）。
方法５：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジクロルメタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジクロルメタン、メタノール、ジクロルメタン及びメタノール（２×）。
溶媒中の樹脂の膨潤は、樹脂１ｇ当たりの溶媒１０ｍＬの標準量に基づいていた。
【０３４２】
工程Ａ：（ニトロフェン−４’−イルオキシカルボキシ）ベンズ−４−イルオキシメチルポリスチレン（ワングのＰＮＰカーボネートポリスチレン）の製造
・ヒドロキシベンズ−４−イルオキシメチルポリスチレン（ワングの樹脂）
クロルメチルポリスチレン（２．４ｋｇ、３．６モルの官能化負荷量）と４−ヒドロキシベンジルアルコール（５８１ｇ、４．６８モル）をＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（１０Ｌ）に加えて撹拌した混合物にナトリウムメトキシド（２３３ｇ、４．３１モル）を窒素雰囲気下にゆっくりと添加した。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（１３Ｌ）を添加した後、混合物を５０℃に５時間加熱し、次いでカニューレを経てＰ−ＥＴＦＥメッシュ（７０μｍ）によりろ過した。粗生成物を方法１にリストした順序を使用して十分に洗浄し、次いで６０℃で真空乾燥して２６３０ｇの標記の樹脂を与えた。
・（ニトロフェン−４’−イルオキシカルボキシ）ベンズ−４−イルオキシメチルポリスチレン（ワングのＰＮＰカーボネートポリスチレン）
ヒドロキシベンズ−４−イルオキシメチルポリスチレン（２０００ｇ、２．５モルの官能化負荷量）と４−ニトロフェノールクロルぎ酸エステル（１２０９ｇ、６．０モル）をジクロルメタン（２２Ｌ）に加えて撹拌した混合物に４−メチルモルホリン（６６０ｍＬ、６．０モル）を０℃で窒素雰囲気下に２時間にわたり滴下した。この混合物を室温まで徐々に加温し、終夜撹拌し、カニューレを経てＰ−ＥＴＦＥメッシュ（７０μｍ）によりろ過した。粗製の樹脂を方法２にリストした順序を使用して十分に洗浄し、次いで室温で真空乾燥して２７２８ｇの標記の樹脂と４−メチルモルホリン塩酸塩との混合物を与えた。
【０３４３】
工程Ｂ：ワングの樹脂に結合されたジアミンの製造
・一般的方法（ピペラジン、ホモピペラジン及びｔｒａｎｓ−１，４−ジアミノシクロヘキサンのための）
粗製の（ニトロフェン−４’−イルオキシカルボキシ）ベンズ−４−イルオキシメチルポリスチレン（１００２．５ｇ、〜０．９モルの官能化負荷量）を無水ジクロルメタンとＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの混合物（１：１、ｖ／ｖ、９Ｌ）中で窒素雰囲気下に１５分間膨潤させた。Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミン（６２６ｍＬ、５モル当量）と適当なジアミン（５モル当量）を添加し、混合物を終夜室温で激しく撹拌した。この混合物をＰ−ＥＴＦＥメッシュ（７０μｍ）によりろ過し、方法３にリストした順序を使用して十分に洗浄し、６０℃で真空乾燥して樹脂に結合されたジアミンを得た。
・ワングの樹脂に結合されたエチレンジアミン
粗製の（ニトロフェン−４’−イルオキシカルボキシ）ベンズ−４−イルオキシメチルポリスチレン（１００２．５ｇ、〜０．９モルの官能化負荷量）をジクロルメタン（７Ｌ）に窒素雰囲気下で１５分間膨潤させ、エチレンジアミン（１８１ｍＬ、２．７モル）により処理した。生じた濃厚な黄色懸濁液をジクロルメタン（２Ｌ）で希釈し、終夜室温で激しく撹拌した。この混合物をＰ−ＥＴＦＥメッシュ（７０μｍ）によりろ過し、方法３にリストした順序を使用して十分に洗浄し、６０℃で真空乾燥して標記の樹脂に結合されたジアミンを得た。
・ワングの樹脂に結合されたｍ−キシレンジアミン
粗製の（ニトロフェン−４’−イルオキシカルボキシ）ベンズ−４−イルオキシメチルポリスチレン（１００２．５ｇ、〜０．９モルの官能化負荷量）をテトラヒドロフラン（７Ｌ）に窒素雰囲気下で１５分間膨潤させ、ｍ−キシレンジアミン（８２８ｍＬ、６．２７モル）をテトラヒドロフラン（１Ｌ）に溶解してなる溶液により処理した。生じた濃厚な黄色懸濁液をジクロルメタン（２Ｌ）で希釈し、終夜室温で激しく撹拌した。この混合物をＰ−ＥＴＦＥメッシュ（７０μｍ）によりろ過し、方法３にリストした順序を使用して十分に洗浄し、６０℃で真空乾燥して標記の樹脂に結合されたジアミンを得た。
【０３４４】
工程Ｃ：ワングのジアミンへの構成ブロックの負荷
適当な樹脂をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で１５分間膨潤させ、次いで穏やかに撹拌し、１−［９Ｈ−９−フルオレニルメトキシカルボニル］−４−オキソ−２（Ｓ）−ピロリジンカルボン酸（２当量）により処理した。３０分後に、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（２当量）とＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（２当量）を添加し、樹脂懸濁液を終夜室温で穏やかに撹拌した。ろ過した後、樹脂を方法４にリストした順序を使用して十分に洗浄し、４０℃で真空乾燥した。
【０３４５】
工程Ｄ：Ｃ−４での還元的アミノ化
適当な樹脂を無水テトラヒドロフランとメタノールとの５０％ｖ／ｖ混合物中で１５分間膨潤させ、穏やかに撹拌し、氷酢酸（１０当量）により処理した。適当なアミン（５当量）とシアノ硼水素化ナトリウム（５当量）を添加し、樹脂懸濁液を終夜室温で穏やかに撹拌した。ろ過した後、樹脂を方法４にリストした順序を使用して十分に洗浄し、４０℃で真空乾燥した。
【０３４６】
工程Ｅ：還元的アルキル化又はキャッピング
・還元的アルキル化
適当な樹脂を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で膨潤させ、次いで穏やかに撹拌し、氷酢酸（１０当量）で処理した。適当なアルデヒド（５当量）とトリアセトキシ硼水素化ナトリウム（５当量）を添加し、樹脂懸濁液を室温で１時間注意深く撹拌した。次いで、この期間中に反応容器内に発生した圧力を解放し、懸濁液の穏やかな撹拌を終夜室温で継続した。次いで、樹脂をろ過し、方法４にリストした順序を使用して十分に洗浄し、４０℃で真空乾燥した。
・酸クロリドによるキャッピング
適当な樹脂を無水テトラヒドロフランとクロロホルムとの５０％ｖ／ｖ混合物に懸濁させて穏やかに撹拌した懸濁液に、適当な酸クロリド（５当量）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１０当量）を添加した。終夜室温で穏やかに撹拌した後、樹脂をろ過し、方法４にリストした順序を使用して十分に洗浄し、４０℃で真空乾燥した。
【０３４７】
工程Ｆ：Ｎ−Ｆｍｏｃの脱保護
樹脂類似体を２０％ｖ／ｖピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液中に懸濁させ、室温で３０プ間穏やかに撹拌した。次いで、樹脂懸濁液をろ過し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドで洗浄した。ピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液によるこの処理をもう１回繰り返して完全なＮ−Ｆｍｏｃの脱保護を確実にさせた。３０分間放置した後、樹脂をろ過し、方法４にリストした順序を使用して洗浄し、４０℃で真空乾燥した。
【０３４８】
工程Ｇ：Ｎ１での還元的アルキル化又はキャッピング
・還元的アルキル化
適当な樹脂（２ｍＬのフィルターブロック内でウエル１個あたり〜６０ｍｇ）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）中で膨潤させ、次いで穏やかに撹拌し、氷酢酸（〜５０μＬ、１０当量）で処理した。適当なアルデヒド（５当量）とトリアセトキシ硼水素化ナトリウム（〜８５ｍｇ、５当量）を添加し、次いでフィルターブロックを終夜室温で穏やかに撹拌した。次いで、それぞれの樹脂をろ過し、方法５にリストした順序を使用して洗浄した。
・酸クロリドによるキャッピング
適当な樹脂（２ｍＬのフィルターブロック内でウエル１個あたり〜６０ｍｇ）を無水テトラヒドロフランとクロロホルムとの５０％ｖ／ｖ混合物（１ｍＬ）中で膨潤させ、次いで穏やかに撹拌し、適当な酸クロリド（５当量）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（〜１５０μＬ、１０当量）で処理した。フィルターブロックを終夜室温で穏やかに撹拌した後、樹脂をろ過し、方法５にリストした順序を使用して洗浄した。
【０３４９】
工程Ｈ：ＴＦＡを使用してワングの樹脂からの最終生成物の解裂
適当な樹脂をＤＣＭ中で膨潤させ、９５％ｖ／ｖＴＦＡジクロルメタン溶液を添加することにより最終生成物を解裂させた。４つの別個のＴＦＡアリコート（２×３００μＬ、７５μＬ及び５００μＬ）を添加し、これらから得られたろ液を９６個のウエルを収容するプレート内に集めた。アリコート１、２及び４の添加により得られたろ液を同じ９６個のウエルのプレートを使用して集めた。また、アリコート３（７５μＬ）の添加後に得られたろ液を分析用の９６個のウエルのプレートを使用して別個に集めた。次いで、全ての画分をジェネバック装置を使用して減圧下に蒸発させて最終生成物を得た。
【０３５０】
生物学的アッセイ
リード化合物の発見／高スループットスクリーニングアッセイ
試験すべき化合物を、ＤＭＳＯに１０ｍＭの濃度まで溶解させて、−２０℃に保存する。アッセイ用細胞中のヘッジホッグ経路を活性化させるために、オクチル化（脂質改変）型のソニックヘッジホッグタンパク質のＮ末端断片（ＯＣＴ−ＳＨＨ）を利用する。このＮ末端ＳＨＨ断片を細菌により生成する。
【０３５１】
化合物を、下記の「Ｇｌｉ−Ｌｕｃ」アッセイにて、細胞株１０Ｔ（ｓ１２）を用いて試験することができ、ここに、これらの細胞は、ルシフェラーゼをレポーター遺伝子として利用するヘッジホッグ応答性レセプター構築物を含んでいる。この方法において、ヘッジホッグ経路のシグナル伝達活性を、Ｇｌｉ−Ｌｕｃ応答により測定することができる。
【０３５２】
１０ｔ１／２（ｓ１２）細胞を、９６ウェルミクロ滴定プレート（ＭＴＰ）中の完全培地［１０％ ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ］に、２０，０００細胞／ウェルでプレートする。次いで、プレートを、３７℃で５％ＣＯ２中での一晩（Ｏ／Ｎ）のインキュベーションのためにインキュベーター中に置く。２４時間後に、培地をルシフェラーゼアッセイ用培地（０．５％ ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ）と交換する。化合物を解凍し、アッセイ用培地で３：１０００（約３００倍）に希釈して、約３０μＭの出発濃度を生じる。
【０３５３】
続いて、１５０μｌの各３０μＭの試料を第一のウェルに加える（三連で）。これらのＭＴＰ試料を、次いで、３倍希釈で、全部で７つのウェルに希釈して、最終的に、各化合物について、７つの希釈物の群を三連で生成する。次に、タンパク質リガンドＯＣＴ−ＳＨＨをルシフェラーゼアッセイ用培地中で希釈し、各ウェルに終濃度０．３μｇ／ｍｌで加える。次いで、プレートを、３７℃で、５％ＣＯ２中での更なるインキュベーション（Ｏ／Ｎ）のためにインキュベーターに戻す。２４時間後に、プレートをインキュベーターから取り出して、培地を吸引／廃棄する。ウェルをアッセイ用緩衝液［ＰＢＳ＋１ｍＭ Ｍｇ２＋及び１ｍＭ Ｃａ２＋］で一回洗う。次いで、５０μｌのアッセイ用緩衝液を各ウェルに加える。ルシフェラーゼアッセイ用試薬を、販売者（ＰａｃｋａｒｄのＬｕｃＬｉｔｅキット）により記載されたように調製し、５０μｌを各ウェルに加える。プレートを室温（ＲＴ）で、約３０分間にわたってインキュベートし、その後、シグナルを、やはりＲＴで、Ｔｏｐｃｏｕｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ）にて読む。
【０３５４】
このアッセイで同定された化合物を、図３２に描いた。上記のアッセイにおける描かれた化合物の個々のジアステレオマーの試験は、シス異性体が、一層大きい活性を示す傾向があり、ときには、トランス異性体化合物の１００倍を超えるということを示した。その上、主題の化合物のアンモニウム塩誘導体例えばＴＦＡ塩は、上記のアッセイにおいて、同等か一層大きい活性を示すことが示された。
【０３５５】
特定の化合物の活性を下記の表１に与える：
【表１】
2004531458.tif 000036
【０３５６】
Ｐｔｃ−ヌルアッセイ
方法
Ｐｔｃ−細胞を、３日間、ビヒクル；ジャービン（公知のパッチト経路のアンタゴニスト（ｉ）ここではポジティブコントロールとして使用）；又は１μＭの化合物Ｄの存在下で培養した。全リボ核酸（ＲＮＡ）を、細胞から単離して、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）用に用いた。マウスｇｌｉ−１ｍＲＮＡの検出のための特異的プライマーをこのＰＣＲにおいて用い、又、同量のｍＲＮＡ試料をこの実験において比較するためにアクチン遺伝子を用いた。これらのｇｌｉ−１及びアクチンｍＲＮＡ試料を、次いで、１．５％アガロースゲルに載せ、エチジウムブロミドを用いる染色により検出した。同じ試料を、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法により分析してｇｌｉ−１ｍＲＮＡのレベルを定量した。
【０３５７】
結果
図３３Ａは、代表的な実験結果を示している。それは、ビヒクルコントロール（レーン１）；ポジティブコントロール化合物の５μＭ ジャービン（レーン２）；及び１μＭ Ｄ（レーン３）で処理した細胞におけるｇｌｉ−１ｍＲＮＡの発現を示している。ビヒクルと比較して、Ｄ及びジャービンは、ｐｔｃ−ヌル細胞において、ｇｌｉ−１ｍＲＮＡの発現を有意に低下させた。アクチンｍＲＮＡのレベルは、すべての条件において等しかったが、これは、等量のＲＮＡがこの実験において分析されたことを示している。この定性的結果は、定量的リアルタイムＰＣＲ分析（図３３Ｂ）により確認されたが、これは、Ｄ及びジャービンがｇｌｉ−１ｍＲＮＡレベルをダウンレギュレートしたことを示している。
【０３５８】
まとめると、これらの実験は、ｇｌｉ−１ｍＲＮＡ転写物の発現の阻害により示されるように、ｐｔｃ−ヌル細胞のＤへの３日間の暴露がパッチト経路をダウンレギュレートすることを確実にするものである。
【０３５９】
マウス胎児皮膚パンチアッセイ：Ｄへの長期間の暴露の効果
方法
新規な細胞培養アッセイを確立して、皮膚におけるパッチト経路の活性化に対するＤの効果を測定した。この系においては、パッチト経路の活性化は、ｐｔｃ遺伝子の増大した発現を生じる。
【０３６０】
胎児の皮膚におけるパッチト経路の活性をモニターするために、我々は、トランスジェニックパッチト経路レポーターマウス由来の皮膚切片を培養した。これらのマウスは、外来遺伝子（ｌａｃＺ）を有するように遺伝子工学的に処理したものである。このｌａｃＺ遺伝子は、細菌のβ−ガラクトシダーゼをコードしている。この遺伝子を、ｐｔｃ遺伝子座に、正常のｐｔｃ機能が可能なように挿入した。次いで、Ｓｈｈ誘導されたパッチト経路の活性化に応答してのｐｔｃの活性化を、ｌａｃＺ遺伝子産物のβ−ガラクトシダーゼの生成によりモニターすることができる（β−ガラクトシダーゼは、基質のＸ−ｇａｌの青色反応生成物への酵素的変換により検出することができる）。
【０３６１】
１７．５日齢の胎児の皮膚を、これらのトランスジェニックレポーターマウスから２ｍｍの円形パンチとして外植して、Ｓｈｈタンパク質の存在下で５〜７日間培養した（図３４）。Ｓｈｈタンパク質は、これらの培養中のＸ−ｇａｌ染色の量を増大させるので、ｐｔｃ遺伝子の発現をアップレギュレートするはずである。Ｄの効果を試験するために、皮膚パンチを、６日間、Ｓｈｈタンパク質とＤの両者の存在下で培養した（図３５）。
【０３６２】
結果
予想されるように、Ｓｈｈタンパク質を培養皮膚外植片に加えることは、これらの培養物の青色のＸ−ｇａｌ染色により示されるように、ｐｔｃ活性化を生じた（図３４Ａ−Ｘ−ｇａｌ）。
【０３６３】
切片化皮膚パンチのヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色は、強く染色される好塩基性核及び高い核対細胞質比を有する細胞を示した（図３４Ａ − Ｈ＆Ｅ［１０×］及びＨ＆Ｅ［４０×］）。これらの構造は、皮膚層中でクラスターにて配置され且つ正常の外観の皮膚細胞の柵により分離された点においてＢＣＣに似ている。
【０３６４】
Ｘ−ｇａｌ染色は、パッチト経路が、これらのＢＣＣ様構造内の細胞において活性であることを示した（図３４Ａ − エオシン＋Ｘ−ｇａｌ）。公開された結果と一致し且つヒトＢＣＣと類似して、このマウス皮膚パンチ中のＢＣＣ様クラスターは、ケラチン１４（未分化ケラチノサイトのマーカー）を発現した（図３４Ｂ）。
【０３６５】
皮膚パンチを、６日間、Ｓｈｈタンパク質とＤの両者の存在下で培養して、Ｄの効果を試験した。図３５は、Ｓｈｈ処理した皮膚パンチにおけるパッチト経路の活性レベルに対するＤの投与量依存性の効果を示している。Ｄの増大する濃度（０．０１〜１μＭ）は、ｌａｃＺレポーター酵素活性の量によりモニターして、経路の活性の量の投与量依存性の減少へと導いた（図３５Ａ）。Ｄ処理した外植片のレポーター酵素染色は、０．２μＭ ＤがＸ−ｇａｌ染色を、Ｓｈｈタンパク質だけで処理した皮膚パンチの強いＸ−ｇａｌ染色と比較して減少させたことを示した（図３５Ｂ）。これは、Ｄが、パッチト経路の活性をブロックしてｐｔｃ遺伝子の発現をダウンレギュレートしたことを示している。
【０３６６】
次の実験は、パッチト経路をＤで阻害することは、ＢＣＣ様構造の形成を防止するであろうことを示した。図３５Ｃは、Ｄが、正常皮膚細胞の完全性に影響を与えることなくＢＣＣ様構造の形成を完全にブロックしたことを示している。これは、Ｄが、パッチト経路（ヒトの病気の根底にある同様の経路）の活性化により生成されるＢＣＣ様構造の出現を防止することができることを確実にしている。
【０３６７】
マウス胎児皮膚パンチのアッセイ：Ｄによる短期の予備処理の効果
方法
トランスジェニックマウス由来の皮膚パンチを、Ｓｈｈの非存在下で５時間にわたって、ビヒクル又はＤにより処理した。この予備処理後に、ビヒクル又はＤを除去した。これらの皮膚パンチを、２回洗い、次いで、Ｓｈｈの存在下で、６日間培養した。実験の終りに、これらの皮膚パンチを固定して、Ｘ−ｇａｌで染色してパッチト経路活性を測定した。
【０３６８】
結果
外因性Ｓｈｈタンパク質だけで６日間処理した皮膚パンチは、ビヒクルだけで処理したものと比較して、強いＸ−ｇａｌ染色（即ち、活性化）を示した（図３６、上段）。１０、２０及び５０μＭのＤにより５時間にわたって予備処理してから外因性Ｓｈｈタンパク質にさらした皮膚パンチは、Ｘ−ｇａｌ染色の存在しないことにより示されるように、パッチト経路のＳｈｈタンパク質で誘導されるアップレギュレーションの完全な阻止を示した（図３６、下段 − 右側の３スライド）。パッチト経路のアップレギュレーションを示す強いＸ−ｇａｌ染色は、ビヒクルで予備処理してからＳｈｈタンパク質にさらした皮膚パンチにおいて見られた（図３６、下段左側）。この短期間の予備処理は、本質的に、ｐｔｃ阻害のレベルに関して、６日間のＤへの暴露に等しかった（図３６の上段と下段を比較されたい）。
【０３６９】
これらの結果は、Ｄが、その標的にきつく結合すること及び解離の速度論が遅いか又は不可逆であることを示唆している。このデータは又、ＤがＢＣＣの発生を予防する能力を有しうることをも示唆している。
【０３７０】
マウス胎児皮膚パンチのアッセイ：先在性ＢＣＣ様構造のＤによる長期処理
方法
トランスジェニックパッチト経路レポーターマウス由来の、１７．５日齢胎児皮膚パンチを、Ｓｈｈタンパク質の存在下で７日間培養して、ＢＣＣ様構造の発生を可能にした。このＳｈｈタンパク質を、７日間の最後に除去した。これらの培養物を、次いで、Ｓｈｈタンパク質にビヒクル又はＤを加えたものに、３日間さらした。これらの培養物を、１０日後に組織学的に分析して、パッチト経路の活性化を示すＢＣＣ様構造の形成を評価した。
【０３７１】
結果
組織学的分析は、Ｄが、１又は５μＭで、処理した皮膚パンチにおけるＳｈｈ誘導されたＢＣＣ様構造の大きさと数を、ビヒクルで処理した外植片と比較して有意に減少させるということを示した（図３７Ａ）。従って、存在するＢＣＣ様構造をＤに３日間さらすことがこれらの構造の退行を誘導したらしい。その上、Ｄは、皮膚細胞に対しては、それらの正常な組織学により測定して、一般的な細胞障害性効果を有しているようには見えなかった。
【０３７２】
Ｄ誘導されるＢＣＣ様構造の退行の一つの可能な機構は、活性化された細胞のアポトーシスでありうる。この可能性を調べるために、同時平行的に外植片を、５μＭ Ｄに２日間さらし、次いで、アポトーシスを起こした核の検出に用いられるターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介のｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）法により染色した。５μＭＤに２日間さらした後に、ＢＣＣ様構造内のアポトーシスを起こした核（右側のスライド中の褐色により示されている）の数は、左側のビヒクルコントロールより有意に高かった（図３７Ｂ）。まとめると、これらの結果は、Ｄ誘導されたＢＣＣ様構造の退行が、少なくとも部分的に、パッチト経路が活性化される細胞自殺経路の刺激から生じることを示唆してしている。
【０３７３】
マウス胎児皮膚パンチのアッセイ：先在性ＢＣＣ様構造のＤによる短期処理
方法
トランスジェニックパッチト経路レポーターマウス由来の、１７．５日齢胎児皮膚パンチを、Ｓｈｈタンパク質の存在下で７日間培養した。このＳｈｈタンパク質は、７日間の最後に除去した。次いで、これらの皮膚パンチを、ビヒクル又は１若しくは５μＭ Ｄに、７日目と９日目にさらした。ビヒクル又はＤへの各暴露の後に、このビヒクル又はＤを洗い去り、これらの皮膚パンチを、Ｓｈｈタンパク質の存在下で再び培養した。培養物を、イン・ビトロで１０日の後に、Ｘ−ｇａｌ染色により分析して、パッチト経路の活性を評価した。
【０３７４】
結果
Ｄによる短期処理は、Ｓｈｈタンパク質への暴露と関連したＸ−ｇａｌ染色の量を減少させ（図３８Ａ）、これは、皮膚外植片における経路の活性のダウンレギュレーションを示唆している。組織学的分析は、１μＭの濃度でさえ、Ｄは、Ｘ−ｇａｌ陽性ＢＣＣ様構造の退行を誘導することを示した（図３８Ｂ）。Ｄ処理したパンチにおけるｇｌｉ−１ｍＲＮＡレベルの定量化は、Ｄによる短期処理が、ｇｌｉ−１転写を完全にダウンレギュレートすることを示した（図３８ｃ、左側）。この効果は、ハウスキーピング酵素のグリセルアルデヒドー３一ホスフェートデヒドロゲナーゼ又はＧＡＰＤＨの比較的一定のｍＲＮＡレベルにより示されるように、パッチト経路に特異的であるようであり、一般的な細胞障害性によるものではない（図３８Ｃ、右側）。
【０３７５】
これらの結果は、短期暴露のある条件下で、Ｄが、培養胎児皮膚外植片においてパッチト経路の活性を阻止する能力を有することを示している。その上、Ｄは、１及び５μＭの濃度で、先在性のＳｈｈ誘導されたＢＣＣ様構造の退行を引き起こした。
【０３７６】
成体ＢＣＣマウス皮膚パンチアッセイ
方法
ｐｔｃヘテロ接合型トランスジェニックマウスを毎週３回６ヵ月間にわたって照射したが、その間に、多くの小さい（しばしば、顕微鏡的）ＢＣＣ腫瘍が発生した。直径４ｍｍの皮膚パンチ外植片（おそらくＢＣＣ構造を含む）を。ビヒクル、ポジティブコントロール（ジャービン）又は５μＭ Ｄの存在下で６日間培養した。実験の最後に、これらの外植片を、Ｘ−ｇａｌ染色により分析してパッチト経路活性のレベルを検出し、組織学的に分析して紫外線商社誘導されたＢＣＣの形態に対する処理の効果を測定し、そしてｇｌｉ−１ｍＲＮＡの発現レベルを定量することにより分析して経路の阻害の程度を特性決定した。
【０３７７】
結果
処理した外植片のＸ−ｇａｌ染色は、ビヒクルのみの存在下で培養した皮膚パンチが、焦点のパッチト経路及びＢＣＣ構造のアップレギュレーションを示す青色に強く染色されたフォーカスを生じたことを示している（図３９Ａの青色スポット）。ビヒクルと比較して、５μＭ Ｄは、ポジティブコントロールと同様に、確立されたＢＣＣ構造の数と大きさを減じた。切片化した外植片の組織学的分析は、Ｄが、ビヒクルコントロールと比較して、紫外線照射により誘導されるＢＣＣ腫瘍の退行を誘導したことを示した（図３９Ｂ）。これらのヘテロ接合型トランスジェニックマウス由来の皮膚パンチにおいて、ｇｌｉ−１ｍＲＮＡのレベルは、ｐｔｃ標的遺伝子の活性化の故に非常に高かった。１〜５μＭの濃度のＤも又、ｇｌｉ−１ｍＲＮＡレベルを、ビヒクルだけの場合と比較して有意に阻害した。ｇｌｉ−１ｍＲＮＡレベルの定量化は、標的遺伝子活性化のＤによる殆ど完全な阻害を示している（図３９Ｃ）。この阻害は、処理した状況とビヒクルを用いた状況の間でのハウスキーピングＧＡＰＤＨ酵素のレベルの統計的比較が、一般的な細胞代謝活性のグループ間の有意の差異を示さないので、非特異的な細胞障害性により引き起こされたようには見えなかった。従って、これらの結果は、Ｄが、パッチト経路を阻害して、紫外線照射により誘導される培養皮膚外植片のＢＣＮＳ様ＢＣＣ腫瘍の退行を誘導することを示している。
【０３７８】
これらのデータは、以前の実験の結果を確実にして、ＤがＢＣＣの治療に効果的でありうることを示唆する。
【０３７９】
ヒトＢＣＣ外植片の培養
方法
外科的手順（モーズ切除法等）から得られた試料を、すべての上皮細胞をディスパーゼを用いる消化によって除去した、新鮮な、生きている、１７日目のマウス胎児真皮上で培養した。ディスパーゼ処理は、基底膜成分を消化するので、マトリゲル（市販の基底膜標品）をこの真皮とＢＣＣの間に適用した。培養を、プラスチックグリッドの先端に集めて、ヒトの皮膚の長期培養に適した培地中で３日間インキュベートした（１０μＭの濃度のＤを伴って又は伴わないで）。培養後、これらの試料を、日常的な組織学用に処理し、定量的イン・シトゥーハイブリダイゼーションにかけた。簡単に言うと、パラホルムアルデヒド固定し、パラフィン包埋した組織（大きい基底細胞島を含む）の７μｍの切片を清浄化し、再水和し、プロテイナーゼＫで消化し、アセチル化し、そして［３３Ｐ］標識したＲＮＡプローブと一晩ハイブリダイズさせた。高緊縮ハイブリダイゼーション後洗浄の後に、スライドを、暗黒中で、室温で、４〜７日間、フォトイメージャースクリーンに露出した。現像後、［３３Ｐ］シグナルを、ストームスキャナー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いてスキャンした。個々の基底細胞島を選択し、イメージクオント１．０ソフトウェアを用いてシグナルを定量して平均カウント／ピクセルで表した。
【０３８０】
結果
ＢＣＣに特徴的な形態学的特徴例えば未分化基底細胞の島及び幾らかの場合における周囲の細胞の柵及び間質クレフティング（図４０Ａ）は、ＢＣＣをこのシステムで培養した場合に保持されていた。同様に、発現された分化マーカーは、免疫組織化学的染色により測定して、予備培養コントロールのものと同じパターンである（データは示してない）。ＧＬＩ−１遺伝子（パッチトシグナリングの枢要な指標）は、未処理培養物において、３３Ｐ標識したＲＮＡプローブにさらした切片で測定して、高レベルで活性なままであった（図４０Ｂ）。定量的イン・シトゥーハイブリダイゼーションは、ＧＬＩ−１発現のレベルが、Ｄ処理した試料において、ビヒクルで処理したコントロールと比較して、大いに低減されたことを示した（図４１）。
【０３８１】
本発明の化合物の製造
ａ．合成反応式の例
本発明の方法及び組成物に有用なヘッジホッグアンタゴニストを発生させるための合成反応式の例を図１〜３１に示す。
例示した図１〜３１の反応式における反応条件は以下の通りである。
１）Ｒ１ＣＨ２ＣＮ，ＮａＮＨ２，トルエン
（Ａｒｚｎｅｉｍ−Ｆｏｒｓｃｈ １９９０，４０，１１，１２４２）
２）Ｈ２ＳＯ４，Ｈ２Ｏ，還流
（Ａｒｚｎｅｉｍ−Ｆｏｒｓｃｈ １９９０，４０，１１，１２４２）
３）Ｈ２ＳＯ４，ＥｔＯＨ，還流
（Ａｒｚｎｅｉｍ−Ｆｏｒｓｃｈ １９９０，４０，１１，１２４２）
４）ＮａＯＨ，ＥｔＯＨ，還流
５）（Ｂｏｃ）２Ｏ，２Ｍ ＮａＯＨ，ＴＨＦ
６）ＬｉＨＤＭＳ，Ｒ１Ｘ，ＴＨＦ
（メルク，特許出願ＷＯ９６／０６６０９）
７）Ｐｄ−Ｃ，Ｈ２，ＭｅＯＨ
８）ｔ−ＢｕＯＮＯ，ＣｕＢｒ，ＨＢｒ，Ｈ２Ｏ
（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４９７７，４２，２４２６）
９）ＡｒＢ（ＯＨ）２，Ｐｄ（ＰＰｈ３）４，ジオキサン
（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９６，３９，２１７−２２３）
１０）Ｒ１２（Ｈ）Ｃ＝ＣＲ１３Ｒ１４，Ｐｄ（ＯＡｃ）２，Ｅｔ３Ｎ，ＤＭＦ
（Ｏｒｇ．Ｒｅａｃｔ．１９８２，２７，３４５）
１１）Ｔｆ２Ｏ，ＴＨＦ
（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８７，１０９，５４７８−５４８６）
１２）ＡｒＳｎＢｕ３，Ｐｄ（ＰＰｈ３）４，ジオキサン
（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８７，１０９，５４７８−５４８６）
１３）ＫＭｎＯ４，Ｐｙ，Ｈ２Ｏ
（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． １９９６，３９，２１７−２２３）
１４）ＮａＯＲ１，ＴＨＦ
１５）ＮａＳＲ１，ＴＨＦ
１６）ＨＮＲ１Ｒ１３，ＴＨＦ
１７）ＨＯＮＯ，ＮａＢＦ４
（Ａｄｖ．Ｆｌｕｏｒｉｎｅ Ｃｈｅｍ．１９６５，４，１−３０）
１８）Ｐｄ（ＯＡｃ）２，ＮａＨ，ＤＰＰＦ，ＰｈＣＨ３，Ｒ１ＯＨ
（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７７，６２，５４１３−５４１８）
１９）ｉ．Ｒ１Ｘ，Ｅｔ３Ｎ，ＣＨ２Ｃｌ２，ｉｉ．Ｒ１３Ｘ
２０）ＳＯＣｌ３，触媒ＤＭＦ
２１）ＣＨ２Ｎ２，Ｅｔ２Ｏ
２２）Ａｇ２Ｏ，Ｎａ２ＣＯ３，Ｎａ２Ｓ２Ｏ３，Ｈ２Ｏ
（Ｔｅｔｒａｈｅｄ．Ｌｅｔｔ．１９７９，２６６７）
２３）ＡｇＯ２ＣＰｈ，Ｅｔ３Ｎ，ＭｅＯＨ
（Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．１９７０，５０，７７；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８７，１０９，５４３２）
２４）ＬｉＯＨ，ＴＨＦ−ＭｅＯＨ
２５）（ＥｔＯ）２Ｐ（Ｏ）ＣＨ２ＣＯ２Ｒ，ＢｕＬｉ，ＴＨＦ
２６）ＭｅＯ２ＣＣＨ（Ｂｒ）＝Ｐ（Ｐｈ）３，ベンゼン
２７）ＫＯＨ又はＫＯｔＢｕ
２８）塩基，Ｘ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｒ
２９）ＤＰＰＡ，Ｅｔ３Ｎ，トルエン
（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９８５，２２０）
３０）ＨＯＮＯ，Ｈ２Ｏ
３１）ＳＯ２，ＣｕＣｌ，ＨＣｌ，Ｈ２Ｏ
（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９６９，１−１０，６）
３２）ロウエッソン試薬，トルエン
（Ｔｅｔｒａｈｅｄ．Ａｓｙｍ．１９９６，７，１２，３５５３）
３３）Ｒ２Ｍ，溶媒
３４）３０％Ｈ２Ｏ２，氷ＣＨ３ＣＯ２Ｈ
（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．１９６８，３４９，３２３）
３５）トリホスゲン，ＣＨ２Ｃｌ２
（Ｔｅｔｒａｈｅｄ．Ｌｅｔｔ．１９９６，３７，８５８９）
３６）ｉ，（ＥｔＯ）２Ｐ（Ｏ）ＣＨＬｉＳＯ２Ｏｉ−Ｐｒ，ＴＨＦ，ｉｉ，ＮａＩ
３７）Ｐｈ３ＰＣＨ３Ｉ，ＮａＣＨ２Ｓ（Ｏ）ＣＨ３，ＤＭＳＯ
（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９８７，４９８）
３８）Ｂｒ２，ＣＨＣｌ３又は他の溶媒
（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９８７，４９８）
３９）ＢｕＬｉ，Ｂｕ３ＳｎＣｌ
４０）ＣｌＳＯ２ＯＴＭＳ，ＣＣｌ４
（Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．１９９５，１２８，５７５−５８０）
４１）ＭｅＯＨ−ＨＣｌ，還流
４２）ＬＡＨ，Ｅｔ２Ｏ又はＬｉＢＨ４，ＥｔＯＨ又はＢＨ３−ＴＨＦ
（Ｔｅｔｒａｈｅｄ．Ｌｅｔｔ．１９９６，３７，８５８９）
４３）ＭｓＣｌ，Ｅｔ３Ｎ，ＣＨ２Ｃｌ２
（Ｔｅｔｒａｈｅｄ．Ｌｅｔｔ．１９９６，３７，８５８９）
４４）Ｎａ２ＳＯ３，Ｈ２Ｏ
（Ｔｅｔｒａｈｅｄ．Ｌｅｔｔ．１９９６，３７，８５８９）
４５）Ｒ２Ｒ４ＮＨ，Ｅｔ３Ｎ，ＣＨ２Ｃｌ２
４６）Ｒ２Ｍ，溶媒
４７）ＣＨ３ＮＨ（ＯＣＨ３），ＥＤＣ，ＨＯＢｔ，ＤＩＥＡ，ＣＨ２Ｃｌ２又はＤＭＦ
（Ｔｅｔｒａｈｅｄ．Ｌｅｔｔ．１９８１，２２，３８１５）
４８）ＭｅＬｉ，ＴＨＦ
４９）ｍＣＰＢＡ，ＣＨ２Ｃｌ２
５０）ＨＯＮＯ，Ｃｕ２Ｏ，Ｃｕ（ＮＯ３）２，Ｈ２Ｏ
（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７７，４２，２０５３）
５１）Ｒ１Ｍ，溶媒
５２）ＨＯＮＯ，ＮａＳ（Ｓ）ＣＯＥｔ，Ｈ２Ｏ
（Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．１９４７，２７，８１
５３）ＨＳＲ２又はＨＳＲ４，ＣＨ２Ｃｌ２
５４）ｉ−ＢｕＯＣ（Ｏ）Ｃｌ，Ｅｔ３Ｎ，ＮＨ３，ＴＨＦ
５５）Ｒ２Ｎ４ＮＨ，ＣＨ２Ｃｌ２，ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３
５６）Ｒ２Ｎ４ＮＨ，ＭｅＯＨ／ＣＨ３ＣＯ２Ｈ，ＮａＢＨ３ＣＮ
５７）Ｒ２ＯＨ，ＥＤＣ，ＨＯＢｔ，ＤＩＥＡ，ＣＨ２Ｃｌ２又はＤＭＦ
５８）Ｒ２ＯＨ，ＨＢＴＵ，ＨＯＢｔ，ＤＩＥＡ，ＣＨ２Ｃｌ２又はＤＭＦ
５９）Ｒ２Ｎ４ＮＨ，ＥＤＣ，ＨＯＢｔ，ＤＩＥＡ，ＣＨ２Ｃｌ２又はＤＭＦ
６０）Ｒ２Ｎ４ＮＨ，ＨＢＴＵ，ＨＯＢｔ，ＤＩＥＡ，ＣＨ２Ｃｌ２又はＤＭＦ
６１）ＰＯＣｌ３，Ｐｙ，ＣＨ２Ｃｌ２
６２）Ｒ２Ｒ４ＮＣＯ，溶媒
６３）Ｒ２ＯＣ（Ｏ），Ｅｔ３Ｎ，溶媒
６４）Ｒ２ＣＯ２Ｈ，ＥＤＣ又はＨＢＴＵ，ＨＯＢｔ，ＤＩＥＡ，ＣＨ２Ｃｌ２又はＤＭＦ
６５）Ｒ２Ｘ，Ｅｔ３Ｎ，溶媒
６６）（ＣＨ３Ｓ）２Ｃ＝Ｎ（ＣＮ），ＤＭＦ，ＥｔＯＨ
（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９４，３７，５７−６６）
６７）Ｒ２ＳＯ２Ｃｌ，Ｅｔ３Ｎ，ＣＨ２Ｃｌ２
６８）Ｒ２−又はＲ３−又はＲ４−ＣＨＯ，ＭｅＯＨ／ＣＨ３ＣＯ２Ｈ，ＮａＢＨ３ＣＮ
（Ｓｙｎｔｈｔｈｅｓｉｓ １９７５，１３５−１４６）
６９）Ｂｏｃ（Ｔｒ）−Ｄ又はＬ−ＣｙｓＯＨ，ＨＢＴＵ，ＨＯＢｔ，ＤＩＥＡ，ＣＨ２Ｃｌ２又はＤＭＦ
７０）Ｂｏｃ（Ｔｒ）−Ｄ又はＬ−ＣｙｓＨ，ＮａＢＨ３ＣＮ，ＭｅＯＨ／ＣＨ３ＣＯ２Ｈ
（Ｓｙｎｔｈｔｈｅｓｉｓ １９７５，１３５−１４６）
７１）Ｓ−Ｔｒ−Ｎ−Ｂｏｃシステイナル，ＣｌＣＨ２ＣＨ２Ｃｌ又はＴＨＦ，ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３
（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９６，６１，３８４９−３８６２）
７２）ＴＦＡ，ＣＨ２Ｃｌ２，Ｅｔ３ＳｉＨ又は（３：１：１）チオアニソール／エタンジチオール／ＤＭＳ
７３）ＴＦＡ，ＣＨ２Ｃｌ２
７４）ＤＰＰＡ，Ｅｔ３Ｎ，トルエン，ＨＯＣＨ２ＣＨ２ＳｉＣＨ３
（Ｔｅｔｒａｈｅｄ．Ｌｅｔｔ．１９８４，２５，３５１５）
７５）ＴＢＡＦ，ＴＨＦ
７６）塩基，ＴｒＳＨ又はＢｎＳＨ
７７）塩基，Ｒ２Ｘ又はＲ４Ｘ
７８）Ｒ３ＮＨ２，ＭｅＯＨ／ＣＨ３ＣＯ２Ｈ，ＮａＢＨ３ＣＮ
７９）Ｎ２Ｈ４，ＫＯＨ
８０）Ｐｄ２（ｄｂａ）３，Ｐ（ｏ−ｔｏｌ）３，ＲＮＨ２，ＮａＯｔＢｕ，ジオキサン，Ｒ１ＮＨ２
（Ｔｅｔｒａｈｅｄ．Ｌｅｔｔ．１９９６，３７，７１８１−７１８４）
８１）シアナミド
８２）Ｆｍｏｃ−Ｃｌ，重炭酸ナトリウム
８３）ＢｎＣＯＣｌ，炭酸ナトリウム
８４）アリルＯＣＯＣｌ，ピリジン
８５）臭化ベンジル、塩基
８６）塩化オキサリル，ＤＭＳＯ
８７）ＲＣＯＮＨ２
８８）カルボニルジイミダゾール，中性溶媒（例えば，ＤＣＭ，ＤＭＦ，ＴＨＦ，トルエン）
８９）チオカルボニルジイミダゾール，中性溶媒（例えば，ＤＣＭ，ＤＭＦ，ＴＨＦ，トルエン）９０）臭化シアン，中性溶媒（例えば，ＤＣＭ，ＤＭＦ，ＴＨＦ，トルエン）
９１）ＲＣＯＣｌ，トリエチルアミン
９２）ＲＮＨＮＨ２，ＥＤＣ
９３）ＲＯ２ＣＣＯＣｌ，Ｅｔ３Ｎ，ＤＣＭ
９４）ＭｓＯＨ，ピリジン
（Ｊ．Ｈｅｔ．Ｃｈｅｍ．１９８０，６０７
９５）塩基，中性溶媒（例えば，ＤＣＭ，トルエン，ＴＨＦ）
９６）Ｈ２ＮＯＲ，ＥＤＣ
９７）ＲＣＳＮＨ２
９８）ＲＣＯＣＨＢｒＲ，中性溶媒（例えば，ＤＣＭ，ＤＭＦ，ＴＨＦ，トルエン）
（Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃ．Ｐｒｅｐ．Ｉｎｔｌ．１９９２，２４，１２７）
９９）ＣＨ２Ｎ２，ＨＣｌ
（Ｓｙｎｔｈｔｈｅｓｉｓ，１９９３，１９７）
１００）ＮＨ２ＮＨＲ，中性溶媒（例えば，ＤＣＭ，ＤＭＦ，ＴＨＦ，トルエン）
１０１）ＲＳＯ２Ｃｌ，ＤＭＡＰ
（Ｔｅｔｒａｈｅｄ．Ｌｅｔｔ．１９９３，３４，２７４９）
１０２）Ｅｔ３Ｎ，ＲＸ
（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９０，５５，６０３７）
１０３）ＮＯＣｌ又はＣｌ２
（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９０，５５，３９１６）
１０４）Ｈ２ＮＯＨ，中性溶媒（例えば，ＤＣＭ，ＤＭＦ，ＴＨＦ，トルエン）
１０５）ＲＣＣＲ，中性溶媒（ＤＣＭ，ＴＨＦ，トルエン）
１０６）ＲＣＨＣＨＲ，中性溶媒（ＤＣＭ，ＴＨＦ，トルエン）
１０７）Ｈ２ＮＯＨ，ＨＣｌ
１０８）チオカルボニルジイミダゾール，ＳｉＯ２又はＢＦ３ＯＥｔ２
（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９６，３９，５２２８）
１０９）チオカルボニルジイミダゾール，ＤＢＵ又はＤＢＮ
（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９６，３９，５２２８）
１１０）ＨＮＯ２，ＨＣｌ
１１１）ＣｌＣＨ２ＣＯ２Ｅｔ
（Ｏｒｇ．Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，１９５９，１０，１４３）
１１２）モルホリンエナミン
（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９８２，１７，２７）
１１３）ＲＣＯＣＨＲ’ＣＮ
１１４）ＲＣＯＣＨＲ’ＣＯ２Ｅｔ
１１５）Ｎａ２ＳＯ３
１１６）Ｈ２ＮＣＨＲＣＯ２Ｅｔ
１１７）ＥｔＯ２ＣＣＨＲＮＣＯ
１１８）ＲＣＮＨＮＨ２
１１９）ＲＣＯＣＯ２Ｈ
（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９５，３８，３７４１）
１２０）ＲＣＨＯ，ＫＯＡｃ
１２１）２−フルオルニトロベンゼン
１２２）ＳｎＣｌ２，ＥｔＯＨ，ＤＭＦ
１２３）ＲＣＨＯ，ＮａＢＨ３ＣＮ，ＨＯＡｃ
１２４）ＮＨ３，ＭｅＯＨ
１２５）２，４，６−Ｍｅ３ＰｈＳＯ２ＮＨ２
１２６）Ｅｔ２ＮＨ，ＣＨ２Ｃｌ２
１２７）ＭｅＯＣ（Ｏ）Ｃｌ，Ｅｔ３Ｎ，ＣＨ２Ｃｌ２
１２８）Ｒ２ＮＨ２，ＥＤＣ，ＨＯＢＴ，Ｅｔ３Ｎ，ＣＨ２Ｃｌ２
１２９） ＤＢＵ，ＰｈＣＨ３
１３０）ＢｏｃＮＨＣＨ（ＣＨ２ＳＴｒ）ＣＨ２ＮＨ２，ＥＤＣ，ＨＯＢＴ，Ｅｔ３Ｎ，ＣＨ２Ｃｌ２
１３１）Ｒ２ＮＨＣＨ２ＣＯ２Ｍｅ，ＨＢＴＵ，ＨＯＢＴ，Ｅｔ３Ｎ，ＣＨ２Ｃｌ２
１３２）ＢｏｃＮＨＣＨ（ＣＨ２ＳＴｒ）ＣＨ２ＯＭｓ，ＬｉＨＭＤＳ，ＴＨＦ
１３３）Ｒ２ＮＨＣＨ２ＣＯ２Ｍｅ，ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３，ＣｌＣＨ２ＣＨ２Ｃｌ又はＴＨＦ
１３４）Ｒ２ＮＨＣＨ２ＣＨ（ＯＥｔ）２，ＨＢＴＵ，ＨＯＢＴ，Ｅｔ３Ｎ，ＣＨ２Ｃｌ２
１３５）ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３，ＣｌＣＨ２ＣＨ２Ｃｌ又はＴＨＦ，ＡｃＯＨ
１３６）ピペリジン，ＤＭＦ
１３７）Ｐｄ（Ｐｈ３Ｐ）４，Ｂｕ３ＳｎＨ
１３８）ＲＣＯ２Ｈ，ＥＤＣ，ＨＯＢＴ，Ｅｔ３Ｎ，ＤＣＭ
１３９）ＲＮＨ２，中性溶媒
１４０）ＲＣＨＯ，ＮａＢＨ３ＣＮ，ＨＯＡｃ
１４１）ＲＮＣＯ，溶媒
１４２）ＲＣＯ２Ｈ，ＥＤＣ又はＨＢＴＵ，ＨＯＢｔ，ＤＩＥＡ，ＣＨ２Ｃｌ２又はＤＭＦ
１４３）ＲＣＯＣｌ，トリエチルアミン
１４４）ＲＳＯ２Ｃｌ，Ｅｔ３Ｎ，ＣＨ２Ｃｌ２
１４５）ＳｎＣｌ２，ＥｔＯＨ，ＤＭＦ
１４６）ＲＮＨ２，ＥＤＣ，ＨＯＢｔ，ＤＩＥＡ，ＣＨ２Ｃｌ２又はＤＭＦ
１４７）ジブロムメタン，Ｅｔ３Ｎ，ＣＨ２Ｃｌ２
１４８）塩化オキサリル，中性溶媒
１４９）ＬｉＯＨ，ＴＨＦ−ＭｅＯＨ
１５０）カルボニルジイミダゾール，中性溶媒（例えば，ＤＣＭ，ＤＭＦ，ＴＨＦ，トルエン）
１５１）ＲＮＨ２，Ｅｔ３Ｎ，ＣＨ２Ｃｌ２
１５２）塩基，ＲＸ
１５３）ＤＢＵ，ＰｈＣＨ３
１５４）ＤＰＰＡ，Ｅｔ３Ｎ，トルエン
（Ｓｙｎｔｈｔｈｅｓｉｓ １９８５，２２０）
１５５）ＳＯＣｌ２，触媒ＤＭＦ
１５６）ＡｒＨ，ルイス酸（ＡｌＣｌ３，ＳｎＣｌ４，ＴｉＣｌ４），ＣＨ２Ｃｌ２
１５７）Ｈ２ＮＣＨＲＣＯ２Ｅｔ，中性溶媒
１５８）ＢｏｃＨＮＣＨＲＣＯ２Ｈ，ＥＤＣ又はＨＢＴＵ，ＨＯＢｔ，ＤＩＥＡ，ＣＨ２Ｃｌ２又はＤＭＦ
１５９）ＴＦＡ，ＣＨ２Ｃｌ２
【０３８２】
引用した参考文献の全てをここで参照することここに含めるものとする。
【０３８３】
均等物
当業者であれば、ここに説明した本発明の特定の具体例に対して多くの均等なものを認識し、また日常の実験によって確認するであろう。そのような均等物は請求の範囲によって包含されるものとなる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図２】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図３】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図４】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図５】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図６】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図７】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図８】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図９】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図１０】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図１１】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図１２】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図１３】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図１４】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図１５】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図１６】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図１７】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図１８】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図１９】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図２０】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図２１】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図２２】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図２３】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図２４】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図２５】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図２６】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図２７】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図２８】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図２９】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図３０】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図３１】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図３２ａ】
本発明の代表的な化合物を図解した図である。
【図３２ｂ】
本発明の代表的な化合物を図解した図である。
【図３２ｃ】
本発明の代表的な化合物を図解した図である。
【図３２ｄ】
本発明の代表的な化合物を図解した図である。
【図３２ｅ】
本発明の代表的な化合物を図解した図である。
【図３２ｆ】
本発明の代表的な化合物を図解した図である。
【図３２ｇ】
本発明の代表的な化合物を図解した図である。
【図３２ｈ】
本発明の代表的な化合物を図解した図である。
【図３２ｉ】
本発明の代表的な化合物を図解した図である。
【図３２ｊ】
本発明の代表的な化合物を図解した図である。
【図３２ｋ】
本発明の代表的な化合物を図解した図である。
【図３２ｌ】
本発明の代表的な化合物を図解した図である。
【図３２ｍ】
本発明の代表的な化合物を図解した図である。
【図３２ｎ】
本発明の代表的な化合物を図解した図である。
【図３２ｏ】
本発明の代表的な化合物を図解した図である。
【図３３Ａ】
ビヒクル（レーン１）；５μＭ ジャービン、ポジティブコントロール化合物（レーン２）；及び１μＭ Ｄ（レーン３）で処理した細胞におけるｇｌｉ−１ｍＲＮＡの発現を示す図である。
【図３３Ｂ】
Ｄ及びジャービンが、ｇｌｉ−１ｍＲＮＡレベルを阻止することを示す図である（定量的リアルタイムＰＣＲにより測定）。
【図３４Ａ】
Ｓｈｈタンパク質を培養皮膚外植片に加えることが、これらの培養物の青色染色（Ｘ−ｇａｌ）により示されるように、ｐｔｃ活性化を生じたことを示す図である。
【図３４Ｂ】
マウス皮膚パンチ内のＢＣＣ様クラスター（その一つを矢印で示してある）が、未分化ケラチノサイトのマーカーのケラチン−１４（褐色の反応生成物）を発現したことを図解する図である。
【図３５Ａ】
Ｄの濃度の増大が、ｌａｃＺレポーター酵素活性の量の投与量依存性の減少と関係していることを示す図である。
【図３５Ｂ】
Ｄ処理した外植片の染色を示し又、０．２μＭ Ｄが、Ｓｈｈタンパク質だけで処理した皮膚パンチの強いＸ−ｇａｌ染色と比較して、Ｘ−ｇａｌ染色を減じたことを示す図である（これは、ｐｔｃ遺伝子の発現のダウンレギュレーションを示している）。
【図３５Ｃ】
Ｄで処理した皮膚パンチの組織学的試料を描いた図（下段）であり、この処理がＳｈｈ誘導されるＢＣＣ様構造の出現を阻止したことを示唆している。
【図３６】
６日間外因性Ｓｈｈタンパク質だけで処理した皮膚パンチが、ビヒクルだけで処理したもの（上段）と比較して強いＸ−ｇａｌ染色を示したことを描いた図である。
【図３７Ａ】
Ｄが、１又は５μＭで、処理した皮膚パンチにおいてＳｈｈ誘導されたＢＣＣ様構造の大きさ及び数を、ビヒクルで処理した外植片と比較して有意に減少させることを示す図である。
【図３７Ｂ】
５μＭ Ｄ（右側）又はビヒクル（左側）にさらした２日後に、アポトーシスを起こした核（右側のスライド中で褐色により示されている）がＢＣＣ様構造内に出現したことを図解した図である。
【図３８Ａ】
Ｄでの短期処理が、ビヒクルと比較して、Ｘ−ｇａｌ染色の量を減じたことを示した図である（経路の活性のダウンレギュレーションを示唆している）。
【図３８Ｂ】
１μＭの濃度でさえ、Ｄが、ビヒクルと比較して、Ｘ−ｇａｌ陽性ＢＣＣ様構造の退行を誘導したことを示した図である。
【図３８Ｃ】
Ｄでの短期処理が、ｇｌｉ−１転写を完全にダウンレギュレートしたことを描いた図である（左側）。
【図３９Ａ】
処理した外植片のＸ−ｇａｌ染色は、ビヒクルだけの存在下で培養した皮膚パンチが、強く染色された青色のフォーカスを生成したことを示したが、これは、パッチト経路及びＢＣＣ構造のアップレギュレーションを示している。
【図３９Ｂ】
組織学的試料は、５μＭ Ｄが、紫外線誘導されたＢＣＣ構造の数を、ビヒクルコントロールと比較して減じたことを示した。
【図３９Ｃ】
トランスジェニックマウス由来の皮膚パンチにおいて、Ｄは、１及び５μＭの濃度で、ｇｌｉ−１ｍＲＮＡのレベルを、ビヒクルだけで処理したマウス由来の皮膚パンチと比較して有意に阻止した（左側）。
【図４０Ａ】
ＢＣＣに特徴的な形態学的特徴（例えば、未分化基底細胞の島、及び幾つかの場合には、周囲の細胞の柵及び間質クレフティング）は、培養物をＨ＆Ｅで染色した場合に保持されていた。
【図４０Ｂ】
ＧＬＩ−１遺伝子（パッチトシグナリングの枢要な指標）は、赤色で示されるように、高レベルで活性のままであった。
【図４１】
定量的なイン・シトゥーハイブリダイゼーションは、ＧＬＩ−１発現のレベルが、ビヒクル処理したコントロールと比較して、Ｄ処理した試料において誘導されることを示している。
【図１】
2004531458.tif 000043
【図２】
2004531458.tif 000044
【図３】
2004531458.tif 000045
【図４】
2004531458.tif 000046
【図５】
2004531458.tif 000047
【図７】
2004531458.tif 000048
【図８】
2004531458.tif 000049
【図１２】
2004531458.tif 000050
【図１３】
2004531458.tif 000051
【図１４】
2004531458.tif 000052
【図１７】
2004531458.tif 000053
【図３１】
2004531458.tif 000054
【図３３Ａ】
2004531458.tif 000055
【図３３Ｂ】
2004531458.tif 000056
【図３４Ａ】
2004531458.tif 000057
【図３４Ｂ】
2004531458.tif 000058
【図３５Ａ】
2004531458.tif 000059
【図３５Ｃ】
2004531458.tif 000060
【図３６】
2004531458.tif 000061
【図３７Ａ】
2004531458.tif 000062
【図３８Ｂ】
2004531458.tif 000063
【図３９Ａ】
2004531458.tif 000064
【図３９Ｂ】
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【図４１】
2004531458.tif 000066
【国際公開パンフレット】
2004531458.tif 000067
2004531458.tif 000068
2004531458.tif 000069
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004531458.tif 000297
2004531458.tif 000298
【国際調査報告】
2004531458.tif 000299
2004531458.tif 000300
2004531458.tif 000301