(57)【要約】本発明は、目的のタンパク質をコードするＤＮＡの内在性のシグナルペプチド配列をヒトｈＧＨのシグナルペプチド配列に置換することによって、哺乳動物細胞において発現される目的の組換えタンパク質の均質性および／または分泌を改良する方法に関する。本発明はまた、ｈＧＨのシグナルペプチド配列に融合されたそのようなタンパク質をコードする配列を含有するＤＮＡ発現ベクター、およびそのようなベクターを含有する細胞に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物系において発現される目的の組換えタンパク質の均質性および／または分泌を改良する方法であって、目的のタンパク質をコードするＤＮＡの内在性シグナルペプチド配列をｈＧＨのシグナルペプチド配列に置換することからなる方法。
【請求項２】
目的のタンパク質がＩＬ−１８ＢＰである請求項１記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物系がＣＨＯ細胞からなる請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＣＨＯ細胞が血清を補充した培地で培養される請求項３記載の方法。
【請求項５】
ＣＨＯ細胞が血清のない条件下で培養される請求項３記載の方法。
【請求項６】
哺乳動物系において発現される目的の組換えタンパク質の均質性および／または分泌を改良するための発現ベクターであって、ｈＧＨのシグナルペプチド配列および目的のタンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクター。
【請求項７】
均質なタンパク質の発現を導く請求項６記載の発現ベクター。
【請求項８】
目的のタンパク質の効率的な発現を導く請求項６記載の発現ベクター。
【請求項９】
目的のタンパク質の効率的な翻訳を導く請求項６記載の発現ベクター。
【請求項１０】
シグナルペプチドが最適なコザック配列をコードしている請求項６記載の発現ベクター。
【請求項１１】
目的のタンパク質の効率的な分泌を導く請求項６記載の発現ベクター。
【請求項１２】
目的のタンパク質を構成的に発現する請求項６記載の発現ベクター。
【請求項１３】
目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現がＣＭＶプロモーターにより調節される請求項６記載の発現ベクター。
【請求項１４】
目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現がヒト成長ホルモンのポリアデニル化シグナルにより調節される請求項６記載の発現ベクター。
【請求項１５】
目的のタンパク質がＩＬ−１８ＢＰである請求項６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４記載の発現ベクター。
【請求項１６】
請求項６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５記載のベクターを含有する細胞。
【請求項１７】
約１２ピコグラムのＩＬ−１８ＢＰ／細胞／２４時間を産生する請求項１６記載の細胞。
【請求項１８】
１１．８ピコグラムのＩＬ−１８ＢＰ／細胞／２４時間を産生する請求項１６記載の細胞。
【請求項１９】
少なくとも４ピコグラムのＩＬ−１８ＢＰ／細胞／２４時間を産生する請求項１６記載の細胞。
【請求項２０】
少なくとも１１．８ピコグラムのＩＬ−１８ＢＰ／細胞／２４時間を産生する請求項１６記載の細胞。
【請求項２１】
血清のない培地で成育できる請求項１６記載の細胞。
【請求項２２】
少なくとも４ピコグラムのＩＬ−１８ＢＰ／細胞／２４時間を産生する請求項２１記載の細胞。
【請求項２３】
約１２ピコグラムのＩＬ−１８ＢＰ／細胞／２４時間を産生する請求項２１記載の細胞。
【請求項２４】
１１．８ピコグラムのＩＬ−１８ＢＰ／細胞／２４時間を産生する請求項２１記載の細胞。
【請求項２５】
少なくとも１１．８ピコグラムのＩＬ−１８ＢＰ／細胞／２４時間を産生する請求項２１記載の細胞。
【請求項２６】
請求項１記載の方法により取得し得るタンパク質。
【請求項２７】
ＩＬ−１８ＢＰである請求項２６記載のタンパク質。
【請求項２８】
請求項２６または２７記載のタンパク質を含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、目的のタンパク質をコードするＤＮＡの内在性シグナルペプチド配列をヒトｈＧＨのそれと置換することによって、哺乳動物細胞で発現される目的の組換えタンパク質の均質性および／または分泌を改良する方法に関する。本発明はまた、ｈＧＨのシグナルペプチド配列に融合したそのようなタンパク質をコードする配列を含有するＤＮＡ発現ベクター、ならびにそのようなベクターを含有する細胞に関する。
【０００２】
［発明の背景］
タンパク質分泌は、生物工学の分野におけるタンパク質生産の最も重要な問題の１つである。分泌の過程はつぎの工程からなる：第１に、小胞体（ＥＲ）膜透過；第２に、Ｎ−糖鎖付加およびＥＲ内腔での折りたたみ；第３に、ＥＲからの脱出；第４に、ゴルジ体での修飾；および最後に、分泌顆粒から細胞外空間への放出（サカグチ１９９７）。タンパク質が細胞から分泌されるか否かは、主に、タンパク質が膜透過され得るかどうか、およびタンパク質がＥＲ内腔で正しく折りたたまれ得るかどうかに依存している。膜透過は哺乳動物細胞では必然的に連想される。膜透過ののち、新生ペプチドは内腔空間内に放出され、様々なシャペロンとフォールディング酵素の助けで折りたたまれる。誤って折りたたまれたタンパク質はＥＲ内に捕捉され、したがって分泌区画へと進むことができない。大量のタンパク質発現が生じる生物工学的方法では、分泌が妨げになり得るとともに、発現速度を制限し得る。
【０００３】
シグナルペプチドまたはリーダー配列は、新生ポリペプチドのアミノ末端に位置している。それらはタンパク質を分泌経路へと方向づけ、そして小胞体膜内に一旦透過されると新生鎖から切断される。
【０００４】
シグナルペプチドは３つの領域からなる：アミノ末端極性領域（Ｎ領域）、ここでは正に荷電したアミノ酸残基がたびたび観察される；７〜８より多くの疎水性アミノ酸残基からなる中央疎水性領域（Ｈ領域）；およびシグナルペプチド切断部位を含むカルボキシ末端領域（Ｃ領域）（サカグチ１９９７）。真核生物のＨ領域は、Ｌｅｕが優位を占め、Ｖａｌ、Ａｌａ、ＰｈｅおよびＩｌｅがいくつか存在する。成熟タンパク質からのシグナルペプチドの切断は特定の部位で起き、切断特異性はシグナル配列の最後の残基に存する（ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、１９９７）。切断部位−３と−１の近くでは、アラニンがより優勢である。この部位はプロセッシング特異性を与える。成熟タンパク質の最初のいくつかの位置でのさらなる特異的パターンは真核生物には見られない（ニールセンら、１９９７）。したがって、「不適切な（ｂａｄ）」シグナルペプチドは２つ以上の特異的切断を促してタンパク質の非均質的発現を引き起し得る。すなわち、タンパク質は異なったＮ末端アミノ酸をもって発現される。
【０００５】
多くのタンパク質は生理学的条件の下で調節されているので、哺乳動物系において過剰発現させるために天然の調節シグナルを使用することは望ましくない。たとえば、このような系において、ＣＭＶやＳＶ４０などの効率的なプロモーターが、目的の組換えタンパク質の発現を制御するために使用される。同様に、組換え分泌タンパク質を過剰発現するために、ＳＶ４０やｈＧＨポリＡなどの効率的なシグナルペプチドを、内在する対応部の代わりに使用することは有利であろう。
【０００６】
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のシグナルペプチドは、細胞内の膜結合タンパク質およびシグナルペプチドで支配されているものとは異なるメカニズムで分泌されるタンパク質の分泌を標的とするのに有効であることが記載されている。
【０００７】
たとえば、国際公開第２６５６２号パンフレットは、細胞内タンパク質ｉｃＩＬ−１ｒａ−ＩＩの配列にｈＧＨのシグナルペプチドを融合させることによる該ｉｃＩＬ−１ｒａ−ＩＩの分泌を記載している。この発明は、ヒト分泌タンパク質のシグナルペプチド、好ましくはｈＧＨの２６アミノ酸シグナルペプチドがｉｃＩＬ−１ｒａ−ＩＩをコードするＤＮＡと適切なリーディングフレームで融合している融合物であるベクターを使用することにより、組換え細胞発現系において、天然のｉｃＩＬ−１ｒａ−ＩＩのアミノ酸配列を有するタンパク質を組換え発現させるための方法に関する。その方法は、選択されたシグナルペプチド、好ましくは２６アミノ酸ｈＧＨシグナルペプチド（図１、配列番号２）をコードするＤＮＡと適切なリーディングフレームで融合されている、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのいずれかの形態でｉｃＩＬ−１ｒａ−ＩＩをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを製造することからなる。発現ベクターはついでＣＨＯ細胞などの適当な発現宿主に挿入される。形質転換された宿主細胞は、ついでコードタンパク質を発現ベクターに発現させるように培養され、発現しかつ分泌したｉｃＩＬ−１ｒａ−ＩＩタンパク質はついで培養培地から採取され精製される。
【０００８】
モリス（Ｍｏｒｒｉｓ） ら（１９９９）は、主として膜に固定した分子として天然に存在するタンパク質ＣＤＬ４０Ｌを分泌させるために、ｈＧＨシグナルペプチドを使用することを記載している。いくつかの報告は、可溶型のＣＤ４０Ｌが生物学的に活性であることを示している（ファンスロウ（Ｆａｎｓｌｏｗ）ら  １９９４、ホレンバウ （Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ）ら  １９９２、およびマッツェイ（Ｍａｚｚｅｉ）ら  １９９５）。ＣＤ４０Ｌを可能性のある治療薬として使用するために、この分子の可溶型の最適化が進められた。この研究で、可溶型のＣＤ４０Ｌの活性と可溶性で多量化したＣＤ４０Ｌ  ＴＮＦ相同領域の活性が比較された。可溶型のＣＤ４０Ｌは、ヒトＣＤ４０Ｌの全細胞外ドメインまたはＴＮＦ配列に相同なＣＤ４０Ｌ領域を、ｈＧＨのシグナルペプチド配列に融合させることによって調製された。ＣＤ４０Ｌの多量化体は、イソロイシンジッパー（ＩＺ）に融合させることによって調製された。その結果、多量化により可溶性ＣＤ４０Ｌの活性が増大することが示された。
【０００９】
ペチュウ（Ｐｅｃｃｅｕ）ら（１９９１）は、成熟型のＩＬ−１βを発現させかつ分泌させるために、ｈＧＨシグナルペプチドを使用することを記載している。体内では、合成後、プロＩＬ−１βは、それが切断され細胞外へ輸送されるまでは、主としてサイトゾルに残存する。配列の検討により、古典的なＮ末端のあるいは内部疎水性のシグナルペプチドの欠如が明らかになっている。成熟ＩＬ−１βの放出は、変換酵素（ＩＣＥ）によるアスパラギン酸−アラニンペプチド開裂でのプロセッシングに関連しているようである（ディナレロ（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ）  １９９６）。ＩＣＥはほとんどの細胞で構成的に発現しているけれども、全ての細胞がプロＩＬ−１βをプロセッシングして成熟ＩＬ−１βを分泌しているわけではない。したがって、成熟ＩＬ−１βの分泌は細胞依存的である。ペチュウは、いかなるシグナルペプチドも、またｈＧＨシグナルペプチドに結合した成熟型ＩＬ−１βをコードするＤＮＡを含むベクターも用いることのない、成熟型のＩＬ−１βをコードするＤＮＡのみを含む組換えベクターの使用を開示している。結果によれば、最初の構築物を用いるとタンパク質の５２％が分泌されるだけであるが、ｈＧＨシグナルペプチドを有する構築物を用いると９７％の分泌となることが示されている。
【００１０】
翻訳開始のための最初のＡＴＧコドンは、転写機構により確認されなければならない。非常に弱いコンテキスト（ａ ｖｅｒｙ ｗｅａｋ ｃｏｎｔｅｘｔ）中のＡＴＧコドンは、翻訳のための開始部位でない可能性がある。脊椎動物のｍＲＮＡにおける翻訳開始のための最適なコンテキストは、ＡＴＧコドンにつづくＧ残基（コード領域で位置＋４）および、３塩基上流（非コード領域−３）のプリン、好ましくはＡであり、このコンセンサス配列は、コザック（Ｋｏｚａｋ）配列と呼ばれている（コザック  １９９６、１９９９）。最初のＡＴＧコドンがこれらキーとなるフランキング位置の両方で好ましいヌクレオチドを欠くメッセンジャーＲＮＡ（「不適切な」または最適でないコザック配列）は、最初と２番目のＡＴＧコドンで翻訳を開始する特別な性質を有し、それにより１つのＲＮＡから２つのタンパク質が生成する。ｈＧＨシグナルペプチドの開始部位のＡＴＧは、そのあとに、最適なコザック配列を得るために必要なＧ（位置＋３）がつづき（図１および２  配列番号３）、このことにより最初のＡＴＧ部位のみでの翻訳の開始と生成物の均質性が保証される。
【００１１】
ＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ１８−ＢＰ）は、ＩＬ−１８を用いてヒト尿からアフィニティー精製され、配列決定されそしてクローン化された。ＩＬ−１８ＢＰは、前炎症性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインＩＬ−１８の活性をインビトロで失わせることが見出された（ノビック（Ｎｏｖｉｃ）ら  １９９９）。そのＤＮＡはＮ末端部分でシグナルペプチドをコードしている。シグナルペプチドの内部でコードされているコザック配列の一部は適切なコンテキストのものではない。
【００１２】
【表１】
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【００１３】
したがって、一般的には目的のタンパク質を、特別にはＩＬ−１８ＢＰを、均質なタンパク質としておよび／または哺乳動物細胞で多量に、分泌させ得る方法または系を提供する必要性が存在する。
【００１４】
［発明の要約］
本発明は、異なる哺乳動物系で発現される、均質な目的の組換えタンパク質の産生および／またはその効率的な分泌のための改良法であって、目的のタンパク質をコードするＤＮＡの内在的なシグナルペプチド配列をｈＧＨのそれで置きかえることからなる改良法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、目的のタンパク質をコードするＤＮＡに結合したｈＧＨのシグナルペプチド配列からなる、哺乳動物系で発現される目的の組換えタンパク質の均質性および／または分泌を改良するための発現ベクターを提供する。
【００１６】
１つの側面では、本発明は、１つの開始コドンのみからの翻訳を保証する最適なコザック配列をコードする前記ベクターを提供する。そのような配列の一部は、ｈＧＨシグナルペプチドのコーディングに含まれており、成熟タンパク質からのシグナルペプチドの正確な切断を保証する。
【００１７】
本発明の１つの態様において、ベクターはＩＬ−１８ＢＰをコードする遺伝子を含む。そのようなベクターは、均質なＩＬ−１８ＢＰ（Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌで始まる）の産生を可能にする。
【００１８】
本発明はまた、ＩＬ−１８ＢＰなどの、前記ベクターを用いかつ前記方法によって産生される目的のタンパク質を提供する。
【００１９】
他の側面では、本発明は、血清を含まない培地中で成育でき、かつ少なくとも４ピコグラムのＩＬ−１８ＢＰ／細胞／２４時間、好ましくは少なくとも１１．８ピコグラムのＩＬ−１８ＢＰ／細胞／２４時間、最も好ましくは約１２ピコグラムのＩＬ−１８ＢＰ／細胞／２４時間を産生することができる細胞を提供する。
【００２０】
［詳細な説明］
本発明は、天然のシグナルペプチド配列の代わりにｈＧＨのシグナルペプチド配列を使用する組換えタンパク質の産生および分泌に関する。本発明はまた、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのいずれかの形態で、ｈＧＨシグナルペプチドをコードするＤＮＡに適切なリーディングフレームで融合されている目的のタンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを提供する。発現ベクターはついで適当な発現宿主、すなわち哺乳動物細胞中に挿入される。形質転換された宿主細胞は、ついでコードされたタンパク質を発現ベクターに発現させるように培養され、発現しかつ分泌したタンパク質はついで分離、精製される。目的のタンパク質の発現は安定であるかまたは一過性であり得る。
【００２１】
ＣＨＯ細胞が好ましい宿主細胞であるが、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などの他の哺乳動物細胞を使用することもできる。当業者には、発現ベクターを作製し、それを発現系に挿入し、目的のタンパク質を発現するクローンを選択する技術は、増幅技術を含めてよく知られている。
【００２２】
当業者により評価されるように、組換えタンパク質の転写を制御するために使用されるプロモーターのタイプは、宿主細胞中で機能するいかなるものでもよい。哺乳動物細胞中で機能するプロモーターの例としては、ＳＶ４０早期（ｅａｒｌｙ）プロモーター、アデノウイルスメジャー後期（ｌａｔｅ）プロモーター、単純ヘルペス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼプロモーター、ラウス肉腫（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時早期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）プロモーター、マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）ＬＴＲプロモーター、インターフェロン−βプロモーター、熱ショックタンパク質７０（ｈｓｐ７０）プロモーターおよび当分野でよく知られている他の多くのプロモータが含まれる。これらプロモーターは構成的であっても調節可能であってもよい。構成的プロモーターからの発現には、温度シフト、化学薬品または誘導物質の添加などの余分の処理工程が必要でないので、構成的プロモーターが好ましい。ＳＶ４０プロモーターと比較すると、ＣＭＶプロモータを用いてＩＬ−１８ＢＰ発現を制御することにより、より高い生産性が得られることが、１つの態様で示された。
【００２３】
哺乳動物細胞において、３つの要素、すなわち、切断部位から１０〜３０ヌクレオチド上流に見出される高度に保存されたヘキサヌクレオチドＡＡＵＡＡＡ、切断部位の下流に位置する高度には保存されていないＵ−リッチまたはＧＵ−リッチのエレメント、および開裂部位それ自体が、コアのポリアデニル化シグナルを規定しており、このシグナルはポリ（Ａ）付加の点となり、したがって一般にポリ（Ａ）部位と呼ばれている（ツァオ（Ｚｈａｏ）ら  １９９９）。このコアの外側のさらなる配列は、調節因子を集め、あるいは開かれた接近可能な構造中にコアシグナルを維持する。異種発現のための異なる発現ベクターは、ＳＶ４０やｈＧＨのポリアデニル化シグナルなどの効率的なポリアデニル化シグナルを含むように設計された。好ましい態様では、ＩＬ−１８ＢＰはヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルを用いて産生される。
【００２４】
とくに、本発明はｈＧＨのシグナルペプチドをコードするＤＮＡに融合したＩＬ−１８ＢＰ  ＤＮＡを含有する発現ベクター、およびそのような発現ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
【００２５】
使用されるｈＧＨシグナルペプチドのＤＮＡ配列は、イントロン（図１、配列番号１）を含むゲノム配列であってもよく、またイントロンを除いたシグナルペプチドのｃＤＮＡ配列であってもよい。
【００２６】
本発明によれば、ｈＧＨのシグナルペプチドを用いる哺乳動物発現系で、ＩＬ−１８ＢＰおよび他の分泌タンパク質を均質にかつ効率的に発現させることが可能である。
【００２７】
くわえて、本発明は、ｈＧＨシグナルペプチドを用いて均質な組換えタンパク質を発現しかつ効率的に分泌する哺乳動物細胞に関する。
【００２８】
他の側面において、本発明は、本発明にしたがって、相同の組換えタンパク質を効率的に分泌し、血清を含まない培地（ＳＦＭ）で成育、製造され得る細胞に関する。より詳しくは、好ましい態様において、本発明によれば、細胞は、血清を含む条件および血清を含まない条件で、４〜１１．８ピコグラムのＩＬ−１８ＢＰ／細胞／２４時間、および約１２ピコグラムのＩＬ−１８ＢＰ／細胞／２４時間を産生することが示された。
【００２９】
本発明はまた、本明細書に記載された方法にしたがって製造される目的のタンパク質に関する。他の側面において、本発明は、このような発現系において産生されるＩＬ−１８ＢＰのような目的のタンパク質を、任意的に薬学的に許容し得る賦形剤と共に含有してなる医薬組成物に関する。
【００３０】
さて、本発明をつぎの非限定的な実施例により説明する。
【００３１】
実施例１  ＩＬ−１８ＢＰを産生するクローンＳ１０−２１の樹立
ＩＬ−１８ＢＰタンパク質の天然シグナルペプチドのＤＮＡは、＋４がＡであってＧではないので、最適化されていないコザック配列をコードしており、したがって、最適化されたコザック配列を示すｈＧＨシグナルペプチドにより置換された（図２  配列番号３）。ＩＬ−１８ＢＰタンパク質に融合したｈＧＨシグナルペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを、哺乳動物の発現ベクターのＳＶ−４０プロモーターおよびポリアデニル化シグナルの制御下に挿入した。
【００３２】
発現ベクターの製造のために、ｈＧＨシグナルペプチド（イントロンなし、図１参照）を成熟ｈＩＬ−１８ＢＰタンパク質（変異体Ａ、ＮＣＢＩ公共データベースにおける登録番号ＡＦ１１０７９９）をコードしているｃＤＮＡに、ＰＣＲによって直接融合させた（図３は使用したプライマーを記載している）。
【００３３】
ｈＧＨシグナルペプチド（イントロンなし）を、ｐＸＧＨ５（セルデン（Ｓｅｌｄｅｎ）ら  １９８６）を鋳型として用い、かつ２つのプライマー、すなわち、ａ）ｈＧＨｓｐの始めの配列を含むプライマー（５′ｈＧＨ−ＩＬ−１８ＢＰ融合アウトプライマー  配列番号４）、およびｂ）ｈＧＨｓｐの末端の配列と成熟ＩＬ−１８ＢＰｃＤＮＡの最初の１９ヌクレオチドをコードする配列とをコードするプライマー（３′ｈＧＨ−ＩＬ―１８ＢＰ融合インプライマー  配列番号５）を用いて、ＰＣＲにより増幅した。
【００３４】
成熟ＩＬ−１８ＢＰをコードするｃＤＮＡを、ＩＬ−１８ＢＰｃＤＮＡをコードするプラスミドを鋳型として、かつ２つのプライマー、すなわち、ａ）ｈＧＨシグナルペプチド末端と成熟ＩＬ−１８ＢＰｃＤＮＡの最初に重複する配列をコードするプライマー（５′ｈＧＨ−ＩＬ１８ＢＰ融合インプライマー  配列番号６）、およびｂ）ＩＬ−１８ＢＰｃＤＮＡ配列の末端を含むプライマー（３′ｈＧＨ−ＩＬ−１８ＢＰ融合アウトプライマー  配列番号７）を用いて、ＰＣＲにより増幅した。
【００３５】
前記ＰＣＲ増幅により生じたフラグメントを、２つのプライマー、すなわち、ａ）５′ｈＧＨ−ＩＬ−１８ＢＰ融合アウトプライマー、およびｂ）３′ｈＧＨ−ＩＬ−１８ＢＰ融合アウトプライマーを用い、両フラグメントに存在する重複する配列をアニーリングすることにより、第３のＰＣＲで融合させた。
【００３６】
得られたＰＣＲ  ＤＮＡフラグメントを、通常使用される調節シグナル、すなわちＳＶ４０プロモーターおよびＳＶ４０ポリＡシグナルをコードする哺乳動物発現ベクターｐＳＶＥ３（ハートマン（Ｈａｒｔｍａｎ）ら  １９８２）にクローン化した（５′および３′融合アウトプライマーはまた、クローニングのために必要な特異的な制限部位配列を含んでいた）。
【００３７】
構築されたプラスミド（ＰＳＩＬ１８ＢＰ）は、ＣＨＯ（ＤＨＦＲ−）細胞をトランスフェクションするために、選択マーカーとしてマウスＤＨＦＲ遺伝子を含むプラスミドと一緒に用いた。
【００３８】
選択培地で個々の分離株を分離し、ＥＬＩＳＡアッセイによりＩＬ−１８ＢＰ産生を測定した。
【００３９】
ＭＴＸ濃度を増大させながら、数回の遺伝子増幅を実施した。増幅後、クローンを限界希釈により分離した。サブクローニング後、選択されたクローンＳ１０−２１は、１ピコグラム／細胞／２４時間の特異的で安定した生産性を示した。
【００４０】
実施例２  ＩＬ−１８ＢＰを産生するクローン２２Ｃ２−１１の樹立
ＩＬ−１８ＢＰタンパク質の天然シグナルペプチドのＤＮＡは、＋４がＡであってＧではないため、最適でないコザック配列をコードしており、したがって最適のコザック配列を示すｈＧＨシグナルペプチドで置換された（図２  配列番号３）。ＩＬ−１８ＢＰタンパク質に融合したｈＧＨシグナルペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを、哺乳動物発現ベクターのＣＭＶプロモーターおよびヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルの制御下に挿入した。
【００４１】
発現ベクターの調製のために、実施例１で製造した発現ベクター（ＰＳＩＬ１８ＢＰ）を鋳型として用い、かつ２つのプライマー、すなわちａ）ＳａｌＩ制限部位およびｃＤＮＡ  ｈＧＨシグナルペプチドをコードする最初の２１塩基からなる、フォワードプライマーＡＣＧＣＧＴＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＣＣＣＧＧＡＣＧ（配列番号８）、ならびにｂ）ＩＬ−１８ＢＰの最後の１８塩基、２つの終止コドンおよびＢａｍＨＩ制限部位からなる、リバースプライマーＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＡＡＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧ（配列番号９）を用いるＰＣＲにより、ｈＧＨシグナルペプチドをコードするＤＮＡ（イントロンなし、図１参照）を、成熟ｈＩＬ−１８ＢＰタンパク質をコードするｃＤＮＡ（変異体Ａ  登録番号ＡＦ１１０７９９）に、直接融合させた。
【００４２】
得られたＰＣＲ  ＤＮＡフラグメントを、既知の分子遺伝学的操作を用いて、哺乳動物発現ベクターに挿入した。ここで、哺乳動物ベクターは、ＩＬ−１８ＢＰを発現させるために使用される通常使用される調節シグナル：すなわちＣＭＶプロモーターおよびｈＧＨポリＡシグナルを含む（アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９８７−１９９５；サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９）。
【００４３】
構築されたプラスミド（ｐＣＭＶ−ＩＬ１８ｂｐ２）は、ＣＨＯ（ＤＨＦＲ−）細胞をトランスフェクションするために、選択マーカーとしてマウスＤＨＦＲ遺伝子を含むプラスミドと一緒に用いた。
【００４４】
個々の分離株を選択培地で分離し、ＩＬ−１８ＢＰ生産性をＥＬＩＳＡアッセイで測定した。
【００４５】
選択した高生産性の分離株に関して、ＭＴＸ濃度を増大させながら数回の遺伝子増幅を実施した（１０００ｎＭまで）。増幅につづいて、ＭＴＸを除去し、限界希釈と活性スクリーニングにより高生産性のクローンを分離した。クローニング後、選択されたクローン２２Ｃ２−１１は、４ピコグラム／細胞／２４時間の特異的な高生産性と血清中３７℃での安定性を示した。２２Ｃ２−１１クローンは血清がない条件下でも成育しＩＬ−１８ＢＰを産生することがわかった。クローン２２Ｃ２−１１の生産性をより低い温度で試験した。３２〜３３℃で、血清ありおよびなしのいずれの条件下でも、生産性が１１．８ピコグラムのＩＬ−１８ＢＰ／細胞／２４時間にまで増加することがわかった。
【００４６】
これらの結果は、ＣＭＶプロモーターおよびｈＧＨポリＡシグナルで発現を制御する構築物を用いることにより、ＳＶ４０プロモーターおよびＳＶ４０ポリＡシグナルで制御される発現レベル（実施例１）と比べて、ＩＬ−１８ＢＰの発現が増大したことを示している。
【００４７】
実施例３  産生されたＩＬ―１８ＢＰの精製とＮ末端分析
すべての産生細胞（Ｓ１０−２１および２２Ｃ２−１１  それぞれ実施例１および２）の上清中のＩＬ−１８ＢＰをイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ｈＧＨのシグナルペプチドとともに発現されたＩＬ−１８ＢＰのＮ末端分析により、つぎのＮ末端アミノ酸配列ＴＰＶＳＱＴＴＴＡＡＴＡＳＶＲ（配列番号１０）を有するＩＬ−１８Ｂの正しい種のみが表わされた。これらの結果は、ＩＬ−１８ＢＰの天然シグナルペプチドとは異なって、コザックシグナルが最適のコンテキストになっているｈＧＨシグナルペプチドを用いることにより、様々な発現ベクターから、ＩＬ−１８ＢＰが均質的に産生されることを示している。
【００４８】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ｈＧＨシグナルペプチドをコードするゲノム配列および翻訳されたアミノ酸配列を示す。
【図２】
図２は、コンセンサスおよびｈＧＨシグナルペプチドに存在するコザック配列を示す。
【図３】
図３は、ｈＨＧシグナルペプチド（イントロンなし）配列とＩＬ−１８ＢＰ配列との融合のために使用されるプライマーを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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