(57)【要約】癌を治療し、毒性を減少させ、転移を抑制するための修飾糖類化合物と、少なくとも１種の抗癌剤と併用したその利用法が解説されている。修飾糖類は、５％以下でエステル化されており、反復部位を有している糖バックボーンを含んでいる。それぞれの反復部位は複数のウロン酸分子と、少なくとも１つの中性単糖類を連結して有しており、バックボーンに連結された少なくとも１本の糖類側鎖は複数の中性糖類または糖類誘導体を有し、修飾多糖類は平均分子量１５ｋＤから６０ｋＤを有している。化学治療薬と併用された多糖類は運搬体として作用し、副作用を低減させながら化学治療薬の効果を改善させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗癌剤と併用される修飾多糖類であって、５％以下でエステル化されており、反復部位を有した糖類バックボーンを含んでおり、各反復部位は複数のウロン酸分子を有し、さらに、少なくとも１つの中性単糖類が連結されており、前記バックボーンに連結された少なくとも１本のオリゴ糖側鎖は複数の中性オリゴ糖またはオリゴ糖誘導体を含んでおり、本修飾多糖類は平均分子量５ｋＤから６０ｋＤを有していることを特徴とする修飾多糖類。
【請求項２】
バックボーンのウロン酸糖類は、キシロース、アラビノース、リボース、リキソース、グルコース、アロース、アルトロース、イドース、タロース、ガラクトース、グロース、マンノース、フルクトース、プシコース、ソルボースまたはタガトースをさらに含んでいることを特徴とする請求項１記載の修飾多糖類。
【請求項３】
ウロン酸糖類はガラクトウロン酸をさらに含んでいることを特徴とする請求項１記載の修飾多糖類。
【請求項４】
中性単糖類はラムノースをさらに含んでいることを特徴とする請求項１記載の修飾多糖類。
【請求項５】
平均分子量は５ｋＤから６０ｋＤであることを特徴とする請求項１記載の修飾多糖類。
【請求項６】
平均分子量は１５ｋＤから３５ｋＤであることを特徴とする請求項１記載の修飾多糖類。
【請求項７】
バックボーンは実質的に脱エステル化されていることを特徴とする請求項１記載の修飾多糖類。
【請求項８】
少なくとも１本のオリゴ糖側鎖は中性単糖類を介してバックボーンに連結されていることを特徴とする請求項１記載の修飾多糖類。
【請求項９】
少なくとも１本のオリゴ糖側鎖はラムノース単糖類を介してバックボーンに連結されていることを特徴とする請求項１記載の修飾多糖類。
【請求項１０】
少なくとも１本のオリゴ糖側鎖は、ガラクトース、マンノース、グルコース、アロース、アルトロース、イドース、タロース、グロース、アラビノース、リボース、リキソース、フルクトース、プシコース、ソルボース、タガトース、ラムノース、フコース、キノボース、２−デオキシ−リボースまたはそれらの誘導体をさらに含んでいることを特徴とする請求項１記載の修飾多糖類。
【請求項１１】
少なくとも１本のオリゴ糖側鎖はガラクトース、アラビノース、ラムノース、グルコースまたはそれらの誘導体を末端に有していることを特徴とする請求項１記載の修飾多糖類。
【請求項１２】
少なくとも１本のオリゴ糖側鎖はガラクトースを末端に有していることを特徴とする請求項１記載の修飾多糖類。
【請求項１３】
少なくとも１本のオリゴ糖側鎖はフェルロイル基を末端に有していることを特徴とする請求項１記載の修飾多糖類。
【請求項１４】
少なくとも１本のオリゴ糖側鎖は糖類の枝分かれを実質的に有しないことを特徴とする請求項１から１３のいずれかに記載の修飾多糖類。
【請求項１５】
少なくとも１本のオリゴ糖側鎖は糖類の複数の枝分かれを有することを特徴とする請求項１から１３のいずれかに記載の修飾多糖類。
【請求項１６】
請求項１の修飾多糖類の製造方法であって、ウロン酸糖類と中性単糖類をさらに含み、５％から９５％エステル化されており、少なくともその１本のオリゴ糖側鎖が派生枝を有した複数の側鎖を有した糖類バックボーンを有し、平均分子量が４５ｋＤから４００ｋＤである組成物を選択するステップと、修飾多糖類を製造するため、前記糖類バックボーンを脱ポリマー化させるステップ、側鎖を枝打ちするステップ及び糖酸エステルを脱エステル化するステップで成る３ステップ化学反応を実行するステップとを含んでいることを特徴とする方法。
【請求項１７】
組成物の脱ポリマー化ステップは３ステップ化学反応の一部であって、該組成物をアルカリ溶液で処理して略ｐＨ１０．０とするステップをさらに含んでいることを特徴とする請求項１６記載の修飾多糖類。
【請求項１８】
枝打ちステップと脱エステル化ステップは脱ポリマー化ステップに続いて実行され、脱ポリマー化された組成物を略ｐＨ１０．０で時間と温度の管理下で化学反応処理するステップと、その後に略ｐＨ３．０で時間と温度の管理下で酸性溶液で処理するステップとをさらに含んでいることを特徴とする請求項１７記載の修飾多糖類。
【請求項１９】
アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、デカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デキサメタソン、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドクソルビシン、エピルビシン、エストラムスチン、エトポシド、エクセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ、インターフェロンアルファ、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲステロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メタマイシンズ、メトトレキセート、ミトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、パントスタチン、プリカマイシン、ポルフィメル、プロカルバジン、ラルチトレキシド、リトウキシマブ、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トラストウズマム、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ダウノマイシン、ドキソルビシン、ビンブラスチン等の抗癌剤と併用される修飾多糖類。
【請求項２０】
タキシン薬は、タキソール、タキソテレ、スピカチン、アセトンでのタキサン−２，１３−ジオン,５β,９β,１０β−トリヒドロキシ−,環式９，１０−アセタール,アセテート、アセトンでのタキサン−２，１３−ジオン,５β,９β,１０β−トリヒドロキシ−トリヒドロキシ−,環式９，１０−アセタール、アセトンでのタキサン−２β,５β,９β,１０β−テトロール,環式９，１０−アセタール、セファロマニン−７−キシロシド、７−エピ−１０−デアセチルセファロ−マニン、１０−デアセチルセファロマニン、セファロマニン、タキソールＢ、１３−（２’,３’−ジヒドロキシ−３’−フェニルプロピオニル）バカチンＩＩＩ、ユンナンキソール、７−（４−アジゾベンゾイル）バカチンＩＩＩ、Ｎ−デベンゾイルタキソールＡ、Ｏ−アセチルバカチンＩＶ、７−（トリエチルシリル）バカチンＩＩＩ、７,１０−ジ−Ｏ−［（２,２,２−トリクロロエトキシ）カルボニル］バカチンＩＩＩ、バカチンＩＩＩ  １３−Ｏ−アセテート、バカチンジアセテート、バカチン、バカチンＶＩＩ、バカチンＶＩ、７−エピ−バカチンＩＩＩ、バカチンＶ、バカチンＩ、バカチンＩＩＩ、バカチンＡ、１０−デアセチル−７−エピタキソール、エピタキソール、１０−デアセチルタキソールＣ、７−キシロシル−１０−デアセチルタキソール、１０−デアセチルタキソール−７−キシロシド、７−エピ−１０−デアセチルタキソール、１０−デアセチルタキソール、及び１０−デアセチルタキソールＢから選択されることを特徴とする請求項１９記載の修飾多糖類。
【請求項２１】
癌治療法であって、治療効果量の請求項１記載の修飾多糖類を請求項１９記載の抗癌治療薬と併用して投与することを特徴とする治療法。
【請求項２２】
癌は腎臓癌、肉腫、カポジ肉腫、慢性白血病、乳癌、乳腺癌、卵巣癌、直腸癌、結腸癌、膀胱癌、前立腺癌、黒腫、肥満細胞腫、肺癌、咽喉癌、咽頭扁平細胞癌、腸癌、または胃癌であることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
併用した治療効果量の修飾多糖類と抗癌剤を経口投与、静脈注射、局所投薬、腹腔内投与、または筋肉内投与形態で投与するステップをさらに含んでいることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
高い癌の可能性を有した対象の癌発症を予防する方法であって、請求項１記載の治療効果量の修飾多糖類と抗癌剤とを併用して投与するステップを含んでいることを特徴とする予防法。
【請求項２５】
抗癌剤と併用した修飾多糖類を経口、経静脈、経皮下、局所、腹腔内、筋肉内投与またはそれらの併用形態で投与するステップをさらに含んでいることを特徴とする請求項２２記載の予防法。
【請求項２６】
請求項１記載の治療効果量の修飾多糖類と抗癌剤とを併用して投与することを特徴とする転移予防法。
【請求項２７】
癌は腎臓癌、肉腫、カポジ肉腫、慢性白血病、乳癌、乳腺癌、卵巣癌、直腸癌、結腸癌、膀胱癌、前立腺癌、黒腫、肥満細胞腫、肺癌、咽喉癌、咽頭扁平細胞癌、腸癌、または胃癌であることを特徴とする請求項２４記載の転移予防法。
【請求項２８】
修飾多糖類と抗癌剤とを経口、経静脈、経皮下、局所、腹腔内、筋肉内投与またはそれらの併用形態で投与するステップをさらに含んでいることを特徴とする請求項２４記載の予防法。
【請求項２９】
癌治療調剤物であって、抗癌剤と併用された平均分子量５ｋＤから６０ｋＤの効果量修飾多糖類を含んでおり、該修飾多糖類は複数のウロン酸糖類で形成されたバックボーンと、該バックボーンに連結された略５％の中性単糖類と、少なくとも１本の中性糖類側鎖または該中性単糖類を介して連結された糖誘導体側鎖とを含んでおり、本調剤物はさらに薬学的に利用できるキャリアを含んでいることを特徴とする調剤物。
【請求項３０】
癌治療は転移を抑制するステップをさらに含んでいることを特徴とする請求項２９記載の調剤物。
【請求項３１】
修飾多糖類の平均分子量は１５ｋＤから３５ｋＤであることを特徴とする請求項２９記載の調剤物。
【請求項３２】
修飾多糖類の平均分子量は略２５ｋＤであることを特徴とする請求項２９記載の調剤物。
【請求項３３】
ウロン酸糖類はキシロース、アラビノース、リボース、リキソース、ガラクトース、グルコース、アロース、アルトロース、イソース、タロース、グロース、マンノース、フルクトース、プシコース、ソルボース、タガトース、またはそれらの誘導体をさらに含んでいることを特徴とする請求項２９記載の調剤物。
【請求項３４】
中性単糖類はラムノースを含んでいることを特徴とする請求項２９記載の調剤物。
【請求項３５】
少なくとも１本のオリゴ糖側鎖は糖類の派生枝を実質的に有しないことを特徴とする請求項２９から３２のいずれかに記載の調剤物。
【請求項３６】
少なくとも１本のオリゴ糖側鎖は糖類の複数の派生枝を有していることを特徴とする請求項２９から３２のいずれかに記載の調剤物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は化学的に修飾され、分子量５ｋＤから６０ｋＤを有した多糖体と、悪性癌の治療と予防のための抗癌剤の搬送とそれを利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人口の高齢化に伴って多様な形態の癌の発生率が増大することが知られている。例えば、前立腺癌は米国男性の最も多発する癌であり、癌による死亡原因の第二位である。約５０％の前立腺癌と診断された患者は前立腺からの転移症状または転移性を有する。前立腺癌は骨に転移し、患者は重大な骨変質病で死亡することが多い。それでも転移した患者の効果的な治療法は限られており、緩和治療も限定されている。
【０００３】
従来から腫瘍細胞変性は、細胞が元腫瘍から離れ、基礎粘膜を侵し、腫瘍細胞塞栓から血流を介して移動し、標的臓器の血管内皮と相互作用して浸出させ、増殖して転移腫瘍コロニーを形成することであるのが知られている（コーン  Ｅ.,Anticancer Research,(1993),vol.3,pp.2553-2560,及びリオッタ  Ｌ.他,Cell,(1991),vol.6,pp.327-336）。
【０００４】
転移進行の多くの段階が、ガラクトシド結合レクチン（ガレクチン）を含有した炭水化物結合タンパク質のごとき細胞表面成分で仲介される細胞相互作用が関与していることは一般的に受け入れられている（ラズ  Ａ他、Cancer Metastasis Rev.,(1987),vol.6,p.433；ガビウス  Ｈ、Biochimica et Biophysica Acta,(1991),vol.1071,pp.1-18）。先天性マウスの尾静脈への注射に先立って、体外での抗ガレクチンモノクローナル抗体でのＢ１６メラノーマ（黒腫）及びＵＶ−２２３７線維肉腫細胞の治療は腫瘍肺コロニー拡大防止に効果を発揮した（メロムスキー  Ｌ他,Cancer Research,(1986),vol.46,pp.5270-5275）。ガラクチン−３ｃＤＮＡでの低転移性、低ガラクチン−３発現ＵＶ−２２３７−ｃ１１５線維肉腫細胞のトランスフェクション（遺伝子導入）は、遺伝子導入された細胞の転移表現型を増加させた（ラズ  Ａ他,Int.J.Cancer,(1990),vol.46,pp.871-877）。さらに、ヒトの乳頭甲状癌のガラクチン−３発現レベルと、ヒトの結腸直腸癌及び胃癌との間で相関関係が確立されている（チアリオッチ  Ｌ他,Oncogene,(1992),vol.7,pp.2507-2511；イリムラ  Ｔ他,Cancer Res.(1991),vol.51,pp.387-393；ロタン  Ｒ他、Int.J.Cancer,(1994),vol.56,pp.1-20,；ロツ  Ｍ他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1993),vol.90,pp.3466-3470)。
【０００５】
メチル−α−Ｄ−ラクトシド及びラクト−Ｎ−テトロースのごとき単糖類がＢ１６メラノーマ細胞の転移を抑制し、Ｄ−ガラクトース及びアラビノガラクトースがＬ−１肉腫細胞の肝臓転移を抑制することは知られている（ビュース  Ｊ他,J.Cancer Res.Clin.Oncol.,(1987),vol.113,pp.51-55）。
【０００６】
腫瘍部位への非特定搬送並びに正常組織に対する副作用のために大抵の一般的な抗癌剤は細胞毒性である。望ましい治療のための併用は多糖類が細胞毒性薬剤を可逆的に拘束し、多糖類が結合する腫瘍部位に搬送して薬剤を放出させることである。この標的搬送によって抗癌剤の治療効果が増幅し、不都合な毒性の影響を大きく低減させることができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は化学修飾により得られる多糖類に関する。この多糖類は抗癌化学療法剤と可逆的に相互作用し、多糖類自身と共に抗癌剤を効果的に癌の転移した部位に搬送し、化学治療剤単独の場合よりも薬理効果を高める。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によれば、この多糖類は、約５％以下でエステル化しており、それぞれが複数のウロン酸または他のグリコシド酸残基を有した反復部位（ユニット）を含んだ糖類バックボーン（中枢部）を含んでいる。それぞれの反復連続ユニットは少なくとも１体の中性単糖類残基と、中性単糖類へのグルコシド結合を介してそのバックボーンに取り付けられた少なくとも１体の側鎖状オリゴ糖を有している。さらに、複数の中性糖類または糖類誘導体を含み、大多数の末端ガラクトースユニットと平均分子量５ｋＤから６０ｋＤを有している。多糖類の立体構造は疎水性、親水性及び弱く負に帯電した成分の併用を有しており、この成分は抗癌剤と相互作用し、抗癌剤をガレクチンレセプターとの相互作用で転移性癌に効果的に運搬する。よって、この抗癌剤は癌細胞に対して効果的に適用され、正常細胞に対して毒性を弱める。
【０００９】
本発明の別実施例は前述のごとき多糖類を含んでいる。そのウロン酸糖類バックボーンはガラクトウロン酸を含んでおり、反復ユニットに接続された中性単糖類はラムノースである。別のさらに特殊な実施例は、少なくとも１つの側鎖が中性糖類及びラムノース単糖類を介してバックボーンに接続したそれらの誘導体を含んだ多糖類を提供する。この複数形態は副作用を減少させつつさらに搬送を効率的とするように、様々な抗癌剤とのポリマー連関性を増強することができる。
【００１０】
本発明によるさらに別な実施例は癌患者の癌の治療法を含む。この治療法は、多糖類と組み合わされた治療効果量の知られた抗癌剤を患者に同時投与する。この投与法は、以下のごとき複数の経路のいずれであっても構わない。それら投与形態とは、静脈経路、皮下経路、局所経路、腹腔経路、および筋肉経路等である。本発明の別実施例は術後または癌の可能性が高い症状の予防措置法であり、治療効果量の多糖類と抗癌剤が組み合わされ、投与される。それら多糖類と抗癌剤は静脈経路、皮下経路、局所経路、腹腔経路、および筋肉経路等で投与される。別実施例では転移を抑制する方法が提供される。この転移抑制法では治療効果量の多糖類と抗癌剤とが組み合わされて投与される。これら多糖類と抗癌剤は静脈経路、皮下経路、局所経路、腹腔経路、および筋肉経路等で投与される。
【００１１】
本発明のさらに別な実施例は癌治療用の薬剤を含む。薬剤は効果量の多糖類と知られた抗癌剤とを含む。この多糖類は複数のウロン酸糖類で形成されたバックボーンと、バックボーンに接続された１/７から１/２５の中性単糖類と、中性糖類または中立単糖類を介して接続された糖類誘導体の少なくとも１つの側鎖と、平均分子量５ｋＤから６０ｋＤを含んでいる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書中で使用される略字を解説する。ＰＳは多糖類、ＥＨＳはイーグルブレス−ホルム  スワーム、ＤＭＥＭはダルベッコ修飾イーグル最小エッセンシャル培地、ＣＭＦ−ＰＢＳはＣa2+とＭg2+非含有リン酸塩緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．２）、ＢＳＡはウシ血清アルブミン、GalＵＡはガラクトピラノシルウロン酸（ガラクトウロン酸）、galはガラクトース、manはマンノース、glcはグルコース、allはアロース、altはアルトロース、idoはイドース、talはタロース、gulはグロース、araはアラビノース、ribはリボース、lyxはリクソース、xylはキシロース、fruはフルクトース、psiはプシコース、sorはソルボース、tagはタガトース、rhaはラムノース、fucはフコース、quinはキノボース、2-d-ribは２−デオキシ−リボースである。
【００１３】
“投与”とは経口、または経静脈、経皮下、経局所、経皮、経粘膜、経腹腔及び経筋肉を含む投与のことである。
【００１４】
“対象”とはヒト等の哺乳動物のことである。
【００１５】
“癌治療”とは癌発症の可能性が高い対象並びに腫瘍を有する対象の予後治療のことである。”治療”には他の部位に細胞が拡散（転位）し、細胞凝集し、細胞分化の異常を減少させたり予防することも含まれる。
【００１６】
“癌”とは、例えば、腎細胞癌、カポジ肉腫、慢性白血病、乳癌、肉腫、卵巣癌、直腸癌、咽喉癌、黒腫、結腸癌、膀胱癌、肥満細胞腫、肺癌、乳腺癌、咽頭鱗細胞癌、胃腸または胃癌のごとき細胞異常を含んだ新生物症のことである。
【００１７】
“脱ポリマー化”とは、例えば、多糖類が化学的に処理され、サイズが減少したときに発生する多糖類バックボーンの部分的または完全な加水分解のことである。
【００１８】
“効果量”とは癌を患う、あるいは癌の可能性が高い対象の症状を改善させる、または延命効果がある薬剤量のことである。
【００１９】
“糖類”とは少糖類や多糖類の個別ユニットを形成するものを含んだ単糖類、単糖類誘導物、単糖類類似物、糖類を含んだ単純炭水化物のことである。
【００２０】
“単糖類”とはポリヒドロキシアルデヒド（アルドース）またはポリヒドロキシケトン（ケトース）並びにその誘導物及び類似物のことである。
【００２１】
“オリゴ糖”とはグリコシド結合を介して結合した約２０までの糖類ユニットを含んだ直鎖状または分枝鎖状の単糖類のことである。
【００２２】
“多糖類”とはヘミアセタールまたはグリコシド結合で相互結合された約２０から約１００００及びそれ以上の糖類ユニットで形成されたポリマーのことである。多糖類は直鎖状、単枝状または複枝状であり、それぞれの枝はさらに派生枝を有することがあり、単糖類はピラノース（６成分環）またはフラノース（５成分環）形態であるＤ−フルコトースやＤ−ガラクトース等の標準Ｄ−またはＬ−環状糖類でもよく、あるいはＤ−グルコサミン等のアミノ糖類、Ｄ−フコースまたはＬ−ラムノース等のデオキシ糖類、Ｄ−リボース−５−リン酸塩等の糖リン酸塩、Ｄ−ガラクトウロン酸等の糖酸、またはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）またはＮ−スルファト−Ｄ−グルコサミン等の複誘導糖類等の環状糖類誘導物でもよい。
【００２３】
“バックボーン”とは多糖類の主鎖または開始多糖類の主鎖から発生する鎖で、αまたはβグリコシド結合で連続的に結合した糖類部分を有したものである。バックボーンは連続鎖に沿った様々な部位で接続された追加単糖類部分を含むことができる。
【００２４】
“エステル化”とは糖類のウロン酸部分のカルボキシル酸部位でのメチルエステルまたは他のエステル基の存在をいう。
【００２５】
“実質的に脱エステル化”とは本明細書においては多糖類のバックボーンのエステル化の程度が約１％から５％以下であることをいう。
【００２６】
“糖類の派生枝を実質的に欠く”とは多糖類バックボーンが反復ユニットごとに約１本から２本以下の派生枝を有することを意味する。
【００２７】
本発明の１実施例では、修飾多糖類は２０から２５バックボーンユニットごとにバックボーンに接続された中性単糖類を有したウロン酸糖類バックボーンあるいはウロンエステル糖類バックボーンを有している。得られる多糖類はほとんどが中性である糖類と６から２５の中性単糖類ごとにバックボーンに接続された糖類誘導体を含んだ少なくとも１側鎖を有している。好適多糖類の中には糖類の少なくとも１つの側鎖を有するものがあり、実質的に派生枝を有せず、末端の糖類はガラクトース、グルコース、アラビノース、またはそれらの誘導体を含む。他の好適多糖類はフェルロイル基で修飾された糖類の末端を有する糖類の少なくとも１つの側鎖を有することができる。
【００２８】
修飾多糖類の製造方法
本発明の１実施例では、天然ポリマーの化学修飾による癌治療用の共同治療剤として使用する修飾多糖類を製造した。化学修飾前にこの多糖類は約４００００から４０００００ダルトンの分子量範囲を有することができ、例えば、グルコース、アラビノース、ガラクトース等を含んだ糖類の複数枝を有することができる。これらの枝はラムノース等の中性単糖類を介してバックボーンに接続できる。これら分子はさらにウロン酸糖類バックボーンを含むことができる。これは１０％程度から９０％程度のウロン酸残基でエステル化できる。複枝自身は糖類の複枝を有することができ、それら複枝はオプションで中性糖類と中性糖類誘導体を含むことができる。
【００２９】
本明細書では連続的に制御されたｐＨ、温度及び時間、例えば、ｐＨ１０．０、３７℃、３０分間や、ｐＨ３．５、２５℃、１２時間のごとき条件で、小さくて脱枝状多糖類分子へのｐＨ依存脱ポリマー化が関与する化学修飾法が解説されている（実施例１）。オプションの別変質法はポタシウムボロヒドリドのごとき還元剤の存在下でアルカリ性溶液内の多糖類を加水分解し、反復サブユニットに対応するサイズの断片を形成することである（米国特許５５５４３８６）。化学的に変質された多糖類の分子量範囲は５から６０ｋＤであり、さらに特定すれば、１５から４０ｋＤであり、さらに特定すれば、例えば２０ｋＤである。
【００３０】
体外及び体内分析を利用した抗癌剤との共同投与多糖類の生物学効果の実証
知られた抗癌剤と併用して投与される化学的に修飾された多糖類の効果を示すため、いくつかの生体内と生体外分析を選択した。転移の抑制は通常は培養基内で凝集し、化学治療剤と組み合わされた多糖類の存在下で分散状態であり、抗癌剤に対してさらに感受性が高い癌細胞系を使用して示すことができる。（実施例３はＢ１６−Ｆ１細胞、ＵＶ２２３７−１０−３ネズミ線維肉腫細胞、ＨＴ１０８０ヒト線維肉腫細胞及びＡ３７５ヒト黒腫細胞を使用）転移の抑制は転移分析（実施例４）を使用しても示せる。そのＭＬＬ細胞は細胞表面でガレクチン−３の増強レベルを有し、腫瘍内皮細胞癒着が関与する。
【００３１】
脊椎ガラクトシド結合レクチンは様々な組織や細胞で発生する。レクチンはサイズに基づいて２類に分類される。それらの分子量は約１４ｋＤと約３０ｋＤであり、それぞれガレクチン−１及びガレクチン−３として指定される。ガレクチン−３は広範囲な分子、すなわち、ネズミ３４ｋＤ（ｍＬ−３４）とヒト３１ｋＤ（ｈＬ−３１）腫瘍関連ガラクトシド結合レクチン、３５ｋＤ線維芽細胞炭水化物結合タンパク質（ＣＢＰ３５）、ＩｇＥ結合タンパク質（ｃＢＰ）、３２ｋＤマクロファージノンインテグリンラミニン結合タンパク質（Ｍａｃ−２）を表し、ラット、マウス及びヒト形態の２９ｋＤガラクトシド結合レクチン（Ｌ−２９）を表す。分子クローニング研究はこれらレクチンの多糖類が同一アミノ酸配列を共有することを証明している。
【００３２】
ガレクチン−３は活性化マクロファージで強力に発現され、腫瘍学的に転移細胞に変換される。ＭＬＬ細胞等の多くの癌細胞は細胞面にガレクチン−３を発現し、その発現は腫瘍細胞の転移プロセスに関与してきた。ポリペプチドの増強された発現は係留独立成長、同形凝集及び腫瘍細胞肺臓集落化の増強能力と関連する。これはガレクチン−３が循環における腫瘍細胞塞栓を促進させ、転移を増大させることを暗示する。腫瘍内皮細胞癒着は転移プロセスにおける重要な現象であると考えられている。ガレクチンはポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン配列を含んだ少糖類に対して高い親和性を有して結合できる。さらに、特殊糖依存形態でラミニンの炭水化物側鎖にも結合できる。基底膜の主要な非コラーゲン成分であるラミニンはポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン配列を有したＮ−結合グリコプロテインであり、細胞癒着、移動、成長、分化、侵略及び転移に関与する。
【００３３】
腫瘍細胞は細胞表面ガレクチン−３を介してグリコプロテインの炭水化物残基と反応できる。これはアガロースのガラクトース残基（Ｄ−ガラクトースとＬ−アンヒドロ−ガラクチトースのポリマー）と作用し、この半固形培養質での細胞増殖に必要な最低サポートを提供する能力と関係することができる。抗ガレクチン−３モノクローナル抗体はアガロース内の腫瘍細胞の成長を抑制できる。さらに、マウスガレクチン−３ｃＤＮＡでの正常マウス線維芽細胞のトランスフェクションで係留独立成長が得られる。実施例１の多糖類に関して報告されている生体内結果はガレクチン−３を使用したヒトの前立腺癌組織で実行された以前の研究結果（米国特許５８９５７８４）と合致している。ここで解説されている多糖類が抗癌剤と組み合わせられて投与されると、ヒトにおける抗転移薬の搬送性向上、標的攻撃性向上及び全体的な効果増強を提供する。
【００３４】
多糖類と抗癌剤の同時投薬
多糖類と抗癌剤は経口、経静脈、経皮膚、局所、経腹腔、筋肉内等のいくつかの投与経路を介して、例えば約１０から約１０００ｍｇ/ｋｇを２４時間ごと、及び/又は約２．５から約２５０ｍｇ/ｋｇを６時間ごとに同時投薬できる。
【００３５】
化学的に修飾された多糖類と知られた抗癌剤は経口投与用に単独または共同で製薬できる。他の投薬経路は、局所、経皮、経腹腔、頭蓋内、脳室内、脳内、膣内、子宮内、経口、経直腸、非経口（例えば、経静脈、経脊椎、皮下または筋肉内）がある。さらに、修飾多糖類と抗癌剤を生分解性ポリマーに封じ込め、化合物の放出を遅延させることができる。このポリマーを腫瘍のごとき薬剤が対象とする部位近辺に埋め込み、修飾多糖類を系統的にゆっくりと放出させることができる。小型浸透ポンプも、転移成長部位や腫瘍への血管のごとき対象部位に対してカニューレを介した高密度修飾多糖類の制御搬送に利用できる。生分解性ポリマーとそれらの利用は、例えばブレム他の脳外科学会誌（１９９１年）７４巻、４４１から４４６ページで解説されている。
【００３６】
多糖類と抗癌剤の効果量と投与形態は、患者の年齢、体重、病歴、その他の要因に左右される。修飾多糖類成分の分子量（キャリアを無視）と抗癌剤とに基づく好適投与量と投与形態は、例えば、１日に約１０から約１０００ｍｇ/ｋｇ体重の投薬を含む。修飾多糖類と抗癌剤の投与量は症状や患者の体重、体調、投薬形態等による。体内での修飾多糖類や抗癌剤の有効作用期間に応じて１日に数回から１週間に１回程度の投薬頻度となる。本発明は人に対してでも動物に対してでも利用できる。本発明の方法は、同時的、または長時間にわたる単独または複合同時投薬を想定する。
【００３７】
修飾多糖類と抗癌剤の調剤物は経口、経直腸、経眼（硝子体内または眼房内を含む）、経鼻、局所（頬や舌下を含む）、子宮内、経膣または非経口（皮下、経腹腔、筋肉内、静脈内、皮内、頭蓋内、気管内、硬膜外を含む）形態で投与される。好適には、これら調剤物は１回分の投薬形態で提供され、通常の製薬技術で製造される。このような製薬技術には活性成分と薬剤キャリアまたは賦形剤とを一体化させるステップが含まれる。一般的に、調剤物は活性成分を液体キャリアまたは微分割固形キャリアと一体化させ、必要に応じて成型して提供される。
【００３８】
非経口投与に適した調剤物には水性及び非水性の無菌注射用液が含まれる。それらは調剤物を投与対象者の血液と等調性とする抗酸化剤、バッファ、制菌剤、溶質を含むことができる。さらに、縣濁剤や膨張剤を含むような水性及び非水性の無菌縣濁液が含まれる。調剤物は１回の投与用または複数回の投与用の容器、例えば、アンプルや薬瓶に収容したり、使用直前に、例えば水のごとき無菌液を追加する等により利用できるようにフリーズドライ状態にして保存できる。注射溶液や縣濁液を無菌粉末、顆粒、錠剤等の形態物から準備させることもできる。
【００３９】
好適な投与調剤物は１日分、１日の分与分、またはさらにその分与分である。前出の成分に加えて本発明の調剤物に一般的な複数の薬剤を含ませ、相助効果を持たせることができる。オプションで、患者に対する平行治療のために細胞毒性薬を含ませる等で修飾多糖体と組み合わせることができる。
【００４０】
適した消化性薬剤キャリアは多糖類が乾燥状態で封入されたゼラチンカプセルや、多糖類がヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、微小結晶セルロース、プロピレングリコール、ステアリン酸亜鉛、二酸化チタン、並びに他の適した結合剤と添加剤と混合された錠剤を含む。この組成物は蒸留水、風味剤、甘味剤等を使用した液体としても製剤でき、風味や味を向上させることもできる。
【００４１】
放出遅延構造体とはポリマー等の材料による構造体のことであり、酵素または酸/塩基性加水分解又は溶解で劣化するものである。身体内に注入されると、この構造体は酵素と体液により影響を受ける。この溶解速度制御構造体は好適にはリポゾーム、ポリラクチド（ポリ乳酸）、ポリグリコリド（グリコール酸の重合体）、ポリラクチドコグリコリド（乳酸とグリコール酸の共重合体）ポリアンヒドリド、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルウロン酸、コラーゲン、コンドロイチンスルフェート、カルボキシル酸、脂肪酸、燐脂質、多糖類、核酸、ポリアミノ酸、フェニルアラニン等のアミノ酸、チロシン、イソロイシン、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン、シリコン等の生物利用可能な材料から選択される。好適な生分解性構造体はポリラクチド、ポリグリコリド、またはポリラクチドコグリコリド（乳酸とグリコール酸の共重合体）の構造体である。
【００４２】
本発明の転移変性治療組成物は固体、液体、エアゾール形態でよく、どのような投与形態でもよい。固体治療組成物の例には丸薬、クリーム、埋め込み形態物が含まれる。丸薬は経口形態で、治療クリームは局所的に投与される。埋め込み形態物は局所的、例えば腫瘍部位に投与される。または、例えば皮下における治療用脈管形成変性組成物の放出目的で皮下に埋め込むことができる。液体組成物の例は皮下注射用、静脈注射用あるいは動脈注射用の薬液や、局所投与用及び眼内投与用の調剤液である。エアゾール調剤物の例は肺臓投薬用の吸引用調剤物である。
【００４３】
非経口投与用の調剤物には水性及び非水性の無菌注射液が含まれる。この注射液は抗酸剤、バッファ、制菌剤及び患者の血液と等張性とする溶質を含有でき、縣濁剤や増粘剤を含むことができる水性及び非水性の無菌縣濁液を含むことができる。これら調剤物は１回用や複数回用の投与形態、例えば、密閉アンプルや薬瓶に収容したり、使用直前に例えば水のごとき無菌液を追加する等により利用できるフリーズドライ状態で保存できる。注射溶液や縣濁液は無菌粉末、顆粒、錠剤から準備できる。
【００４４】
好適な投与形態の調剤物とは１日分、１日の分与分、またはさらにその分与分である。前出の成分に加えて本発明の調剤物は他の従来薬剤を含むことができる。オプションで、細胞毒性剤を含ませたり、アンギオスタチンプロテインまたはその生物機能性ペプチド部分と併用して平行治療を施すことができる。
【００４５】
治療剤投与用の他の知られた調剤物も利用できる。
【実施例１】
【００４６】
天然多糖類の修飾
開始多糖類は紫外線処理または７０％アルコールで約４８時間処理して殺菌される。以降の全ステップは無菌状態で実行される。殺菌処理後、多糖類は蒸留水内でゆっくりと溶解される。全炭水化物量はフェノール硫酸法で決定される（フィドラー他,Cancer Res.,(1973),vol.41,pp.3642-3956）。
【００４７】
多糖類溶液のｐＨは、例えば３Ｎ  ＮaＯＨでｐＨ１０．０に増加される。例えば３０分から２４時間、３７℃で保管後、溶液は３Ｎ  ＨＣｌで、例えばｐＨ３．０に酸性化され、３０分から２４時間２５℃で維持される。溶液はｐＨ６からｐＨ７に調整される。条件は、得られた修飾多糖類が分子量５ｋＤ、１０ｋＤ、１５ｋＤ、２０ｋＤ、２５ｋＤ、３０ｋＤ、３５ｋＤ、４０ｋＤを有するように選択される。得られた修飾多糖類生成物は７０％エタノールで洗浄され、９５％エタノールから乾燥される。その後、修飾多糖類は水中に再溶解され、約５重量％から１５重量％の最終濃度とされる（アルバースカイム他,Carbohydrate Research,(1967),vol.5,pp.340-346）。修飾多糖類は本発明の実施例に従ってさらに希釈できる。濃度０．０１から５％は細胞に提供される。原料材料と望む修飾多糖類組成物並びに分子量によって、反応条件をさらに調整することができる。
【実施例２】
【００４８】
多糖類と抗癌剤の腫瘍を有する動物への投与
多糖類製剤は、癌に有効な知られた抗癌剤の治療有効量にて、知られた抗癌剤と共に投与される。１実施例として、５−ＦＵが２から２０ｍｇ/ｍＬで６０から６００ｍｇ/ｍ2/日のペースで投与される。別実施例ではパクリタキセルが１から１０ｍｇ/ｍＬで３０から３００ｍｇ/ｍ2/日のペースで投与される。腫瘍を有する動物での最良の結果は、例えば５−ＦＵやパクリタキセル等の抗癌剤が２から２０ｍｇ/ｍＬの多糖類と６０から６００ｍｇ/ｍ2で組み合わされたときに得られる。特に、併用治療は無処置のコントロールと比べて結腸腫瘍を有したネズミ類においては８０％までの改善が見られた。さらに、５−ＦＵ投与のみと比べて４０％までの改善が見られた。
【実施例３】
【００４９】
抗癌剤と共に投与された修飾多糖類の抗癌効果の決定のための体外分析
(a)特に明記されないかぎり、以下の分析評価は実施例１の修飾多糖類を使用して実施される。異なるサイズの分子は実施例１のごとく５ｋＤ、１０ｋＤ、１５ｋＤから４０ｋＤで、２０ｋＤ、２５ｋＤ、３０ｋＤ、３５ｋＤを含んで試験される。修飾多糖類の量ｗ/ｖは生理溶液中で０．０１から１％ｗ/ｖの範囲で変動する。コントロールは他の薬剤を含まない多糖類のみ、非修飾多糖類、ガル−、アラ−またはフェルロイル−置換単糖類、並びに抗癌剤のみの条件である。
【００５０】
ラミニンとアシアログリコプロテイン癒着分析：
生体外での同型凝集する腫瘍細胞間の性向と生体内でのそれらの転移可能性の相関関係が確立されている。Ｂ１６メラノーマ細胞凝集塊は単細胞の場合よりも静脈注入後にさらに多くの肺臓コロニーを発生させる。さらに、抗−ガレクチン−３抗体はアシアロフェツェインによる同型凝集を抑制することが示された（フィドラー，J.Natl.Cancer Inst.,(1970),45:77）。これは細胞表面ガレクチン−３ポリペプチドが、グリコプロテインの側鎖との相互反応に続いて同型凝集を発生させることを暗示する。
【００５１】
実施例１の修飾多糖類は抗癌剤の存在下で、ラミニンコートされた基質への細胞の癒着性の変動とアシアロフェツイン誘導同型凝集ならびに細胞成長の抑制力の変動の測定を含むＢ１６−Ｆ１ネズミメラノーマ細胞癒着分析での細胞−細胞及び細胞−マトリックス相互作用の制御性能が試験される。
【００５２】
Ｂ１６−Ｆ１系（肺臓コロニー化の低出現率）はＢ１６メラノーマ細胞の静脈注射で発生した肺臓転移から導かれる（ロータン他、J.Cancer、(1994),vol.56,pp.1-20）。試験可能な他の細胞系にはＵＶ−２２３７−１０−３メズミ線維肉腫細胞、ＨＴ１０８０ヒト線維肉腫細胞及びＡ３７５ヒトメラノーマ細胞が含まれる。
【００５３】
細胞はグルタミン、必須アミノ酸、ビタミン類、抗体及び１０％の熱不活化胎児ウシ血清（ＦＣＳ１０％）が補充されたダルベッコの修飾イーグル最低エッセンシャル培養液（ＤＭＥＭ）内でプラスチック上の単層にて成長する。この細胞は７％ＣＯ2と９３％空気の湿気雰囲気内にて３７℃に維持される。再現性を確実にするため、全実験はストック回収後６週間以内の培養液成長条件で実施すべきである。
【００５４】
ラミニン（ＥＨＳラミニン）は米国ミズーリ州セントルイス市のシグマ社から購入でき、本発明の修飾多糖類は前述のように準備できる。アジアノフェトウインはギブコラボラトリー社から入手できるフェトウインから準備できる。フェトウインは０．０５Ｎ  Ｈ2ＳＯ4を使用して８０℃で１時間、弱酸加水分解処理に供される（米国ニューヨークグランドアイランドのグランドアイランドバイロジカル社のスパイア法）。放出シアル酸は透析によってフェトウインから除去される。
【００５５】
ラミニンに対する細胞癒着
９６ウェルプレートの組織培養ウェルが４℃のｐＨ７．２（ＣＭＦ−ＰＢＳ）のＣa2+とＭg2+非含有燐酸バッファ液内でＥＨＳラミニン（２μｇ/ウェル）にて予備コーティング処理され、残りのタンパク質結合部位は室温にて２時間、ＣＭＦ−ＰＢＳ内の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックされる。細胞はＣＭＦ−ＰＢＳ内の０．０２％のＥＤＴＡで回収され、無血清ＤＭＥＭで縣濁される。全５ｘ１０4細胞がＤＭＥＭ内でそれぞれのウェルに加えられる。その際、１）修飾多糖類と抗癌薬、２）種々な濃度の修飾多糖類と非変動量の抗癌薬、または３）非変動濃度の修飾多糖類と変動量の抗癌薬を有する、あるいは有しない。３７℃での２時間１５分間の培養後に非癒着細胞はＣＭＦ−ＰＢＳで洗浄され、接着細胞はメタノールで固定されて写真撮影される。接着細胞の相対数はゾルナー他のAnti-cancer Research,(1993),vol.13,pp.923-930の手法により決定される。細胞はメチレンブルーで染色され、ＨＣｌ−エタノールを加えて染料を放出させる。吸光強度（６５０ηｍ）はプレートリーダで測定される。
【００５６】
アシアロフェツインによる同種凝集
細胞はＣＭＦ−ＰＢＳ内にて０．０２％ＥＤＴＡで剥離され、２０μｇ/ｍＬのアシアロフェツインまたは０％から０．５％の修飾多糖類を有した状態、または有しない状態で、ＣＭＦ−ＰＢＳ内の１ｘ１０6の細胞/ｍＬ濃度にて縣濁される。０．５ｍＬの細胞縣濁液を含んだ部分標本はシリコン処理されたガラス管に入れられ、８０ｒｐｍで６０分間、３７℃にて撹拌される。凝集はＣＭＦ−ＰＢＳ内にて１％のホルムアルデヒドで細胞を固定することで終了する。サンプルは単細胞の数を数えるのに使用され、結果の凝集は次の式で得られる。（１−Ｎt/Ｎc）ｘ１００（ＮtとＮcはそれぞれ試験化合物とコントロールバッファ（ＣＭＦ−ＰＢＳ）の存在下の単細胞数）。
【実施例４】
【００５７】
ガレクチンー３に結合する修飾多糖類
ガレクチンへの結合は膜透過性の変動が関与する膜表面変動と相関されている。組み換えガレクチン−３はアシアロフェツイン親和カラムを介した単ステップ純化処理によってバクテリア細胞から抽出できる。ラクトースで溶離した組み換えガレクチン−３は使用前にＣＭＦ−ＰＢＳに対して透析される。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合ラビット抗ラットＩgＧ＋ＩgＭと２，２’−アジノ−ジ（３−エチルベンズチアゾリンスルフォン酸）（ＡＢＴＳ）基質キットは米国カルフォルニア州南サンフランシスコのザイムド社から購入できる。Ｂ１６−Ｆ１ネズミメラノーマ細胞はダルベッコ修飾イーグル最小エッセンシャル培地（ＤＭＥＭ）内で培養組織として成長する。
【００５８】
９６ウェルプレートの組織培養ウェルは０．５％ＭＣＰと１％ＢＳＡを含有したＣＭＦ−ＰＢＳでコーティングされ、乾燥される。５０ｍＭのラクトースの存在下、または非存在下で０．５％ＢＳＡと０．０５％ツイーン２０を含有したＣＭＦ−ＰＢＳ（溶液Ａ）で連続的に希釈された組み換えガレクチン−３が加えられ、１２０分間培養される。その後、ウェルは排液処理され、０．１％ＢＳＡと０．０５％ツイーン２０を含有したＣＭＦ−ＰＢＳ（溶液Ｂ）で洗浄される。溶液Ａ内のラット抗ガレクチン−３が加えられて６０分間培養され、溶液Ｂで洗浄されて、溶液Ａ内で３０分間、ＨＲＰ−接合ラビット抗ラットＩgＧ＋ＩgＭで培養される。洗浄後に、各ウェル内で接合している結合酵素の相対量はＡＢＴＳの添加で確認される。加水分解の程度は４０５ηｎで測定される。
【００５９】
半固形培地でのコロニー形成
細胞はＣＦＭ−ＰＢＳ内にて０．０２％ＥＤＴＡで乖離され、完全ＤＭＥＭ内で１ｘ１０3細胞/ｍＬにて縣濁される。その場合、１）修飾多糖類と抗癌剤、２）変動濃度の修飾多糖類と、非変動量の抗癌剤、３）変動量の抗癌剤との非変動濃度内の修飾多糖類を有する、または有しない。細胞は３０分間３７℃で培養され、１：１（ｖ/ｖ）で４５℃に温められた蒸留水−完全ＤＭＥＭの１％アガロース溶液と混合される（１：４、ｖ/ｖ）。続いて、２μＬの混合物部分標本が６ｃｍ径皿の１％アガロースプレキャスト層の上に置かれる。細胞は１４日間、３７℃で培養され、形成コロニー数はＣＭＦ−ＰＢＳに２．６％グルテルアルデヒドを添加して固定後に逆相顕微鏡を使用して決定される。
【００６０】
溶解性組み換えガレクチン−３と抗マック−２モノクローナル抗体を利用した比較結合分析も可能であり、ラミニンへの細胞癒着に対する効果が比較され、抗癌剤と組み合わされた修飾多糖類がどのように作用するかのデータを提供する。
【００６１】
ガレクチン−３異形凝集転移分析
ＭＡＴ−ＬｙＬｕ（ＭＬＬ）サブ系は急成長する差別化が困難な腺癌細胞系である。修飾多糖類の存在下あるいは非存在下におけるＣｒラベル化されたＭＬＬ細胞のラット大動脈内皮（ＲＡＥ）細胞の交会単層への癒着が研究される。まず、ＭＬＬとＲＡＥ細胞は１０％のウシ胎児血清が補給されたＲＰＭＩ１６４０培養質内で成長される。ＲＡＥ細胞は組織培養ウェル内で交会体に成長する。全２．４Ｘ１０6ＭＬＬ細胞が５μＣiＮa5ＣrＯ4で３０分間３７℃にて０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）により２ｍＬの血清非含有培養質内にて培養される。洗浄後に、ウェルあたり１Ｘ１０3ＭＬＬ細胞がＲＡＥ細胞単層に４倍にて加えられる。９０分間、４℃にて、独立的に変動する濃度の組み合わせられた修飾多糖類と抗癌剤の存在下または非存在下でＭＬＬ細胞の接着は次のように評価される。細胞は冷却リン酸バッファ液で３回洗浄されて非結合細胞が取り除かれ、０．１ＮのＮaＯＨで３０分間、３７℃にて溶解処理される。各ウェル内の放射能はベータカウンターで測定される。独立的変動濃度の抗癌剤と組み合わせられた修飾多糖類の存在下または非存在下でＲＡＥ細胞の交会単層へのＭＬＬ細胞の接着に要する時間がモニターされる。ＭＬＬ細胞のＲＡＥ細胞への癒着に対する修飾多糖類/抗癌剤による抑制レベルが決定される。
【００６２】
あるいは、この分析の別なバリエーションではＲＡＥ細胞へのＭＬＬ細胞癒着は蛍光法でモニターされる。まず、１Ｘ１０5のＭＬＬ細胞が３０分間、０．１％のＦＩＴＣで培養され、蛍光的に細胞をラベル化する。洗浄後に、細胞は０．５％ＢＳＡのＲＡＥ細胞単層に加えられる。独立変動濃度の多糖類と抗癌剤の併用が３０分間から６０分間加えられる。培地は洗浄され、非接着細胞が除去される。接着レベルは蛍光測定に基づいて評価される。
【００６３】
ガレクチン−３への修飾多糖類の結合に対処するため、酵素結合した免疫ソルベント分析が採用され、組み換えガレクチン−３が固定修飾多糖類を投与量に応じて拘束できるか、及びその拘束がラクトースで阻止できるか否かが決定される。そのような分析の結果は本発明に従って抗癌剤と組み合わされて投与される修飾多糖類の単型凝集に関する抑制効果を評価させ、修飾多糖類結合が細胞表面ガレクチン−３分子に対して発生するか否かが決定される。
【００６４】
半固形培地転移擬似分析
０．５％アガロースでのＭＬＬコロニー形成に対する修飾多糖類と抗癌剤の併用の効果を決定するため、ＭＬＬ細胞はまずＣa2+とＭg2+非含有（ＣＭＦ）−ＰＢＳ内の０．０２％ＥＤＴＡで単層培養から遊離され、様々な濃度での修飾多糖類の存在下または非存在下で完全ＲＰＭＩ培地で４Ｘ１０3細胞/ｍＬ濃度にて縣濁される。細胞は３０分間、３７℃で培養され、４５℃に予熱されているＲＰＭＩ１：４（ｖ/ｖ）の１％アガロース溶液と１：１で混合される。続いて、混合物の２ｍＬ部分標本が６ｃｍ径皿の１％アガロースプレキャスト層の上面に置かれる。細胞は８日間、３７℃で培養され、固定され、数えられ、写真に撮られる。相コントラストマイクロ写真が準備され、０．１％（ｗ/ｖ）の修飾多糖類を含む抗癌剤との併用条件と修飾多糖類を含まない条件で成長したＭＬＬ細胞を示す。
【００６５】
生体外での培養単層内のＭＬＬ細胞成長速度に対する修飾多糖類と抗癌剤の併用効果を調査するのに類似の実験が実行できる。その結果は生体内実験で得られたものと比較できる。このように、修飾多糖類/抗癌剤共同治療が細胞毒性の結果をもたらすか否かの情報も得られる。
【００６６】
修飾多糖類と抗癌剤の存在下でB１６−Fメラノーマ、UV−２２３７線維肉腫、HT１０８０ヒト線維肉腫、及びA３７５ヒトメラノーマを含んだ他の腫瘍細胞が軟質寒天にコロニーを形成する能力も調査できる。実験はMLL細胞の場合と同様に実行できる。
【実施例５】
【００６７】
抗癌剤と組み合わされた修飾多糖類の効果を調査する生体内分析
(a)生体内でのＲ３３２７−ＭＬＬ細胞の転移抑制
前立腺癌のダニング（Ｒ３３２７）ラット前立腺癌モデルはダニングが解説したように雄ラットで発見された自然発生的腺癌からダニングが開発した（Natl.Cancer Inst.Mono.,(1963),vol.12,pp.351-369）。アイザック他,Cancar Res.,(1978),vol.38,pp.4353-4393で解説されている分化や転移特性を有したいくつかのサブ系が種々な元腫瘍から発生した。１Ｘ１０6ＭＬＬ細胞のラット大腿への注射は２５日程度内での死亡に導く（アイザック他,The Prostate,(1986),vol.9,pp.261-281，及びピエンタ他,The Prostate,(1992),vol.20,pp.233-241）。元のＭＬＬ腫瘍は腫瘍細胞接種後約１２日後に転移を開始し、それまでにその腫瘍の切断による除去によって治癒する。切断が１２日目以後に実施されたら、ほとんどの実験動物は肺臓とリンパ腺転移によって４０日以内に死亡する（アイザック他、The Prostate,(1986),vol.9,pp.261-281）。
【００６８】
知られた抗癌剤との併用による溶解性修飾多糖類は経口でラットに水と一緒に継続的に投与され、これら腫瘍における自然発生的転移に対する効果が調査される。初日にラットは後脚に１Ｘ１０6ＭＬＬ細胞が注射される。４日目に元の腫瘍が約１ｃｍ3の大きさになったとき、０．０１％、０．１％または１％（ｗ：ｖ）の修飾多糖類と抗癌剤がラットの飲料水に加えられる。１４日目にラットは麻酔され、後脚を切断して腫瘍が除去される。ラットは３０日目に解剖される。動物はこの間中、飲料水によって修飾多糖類と抗癌剤を摂取する。コントロールと治療動物は毒性に関してモニターされる。
【００６９】
３０日目に肺臓が取り出されて水洗され、ブーアン液で固定される。肺臓転移のラット数はコントロールと比較され、記録される。ＭＬＬ腫瘍コロニー数は解剖顕微鏡で数えられる。修飾多糖類と抗癌剤による治療の効果も飲料水の濃度の関数としてモニターされる。研究を通じて、治療動物は毒性と体重増加に関してモニターされる。結果は多糖類を摂取しないコントロール群と比較される。毎日の水摂取量は両方の群とも３０±４ｍＬ/ラットとする。治療期間中に治療動物とコントロール動物の毛並み、行動及び便色もモニターされ、記録される。
【００７０】
コントロールと共治療動物は体重が適切に増加し、修飾多糖類と抗癌剤治療動物における毒性は予期されず、抗癌剤のみのコントロール治療と比較される。肺臓転移のラット数は、知られた抗癌剤のみ、多糖類のみ、個別の単糖類残基または多糖類も抗癌剤もないものと比較して実施例１のタイプの修飾多糖類を摂取する動物で減少する。同様な効果はリンパ腺症状の場合にも観測される。この実施例の治療は、自然発生的な癌転移を予防する目的で、知られた抗癌剤との併用による無毒性経口投与用の修飾多糖類を使用した改良治療法である。
【国際調査報告】
2006515647.tif 000002
2006515647.tif 000003