(57)【要約】試料溶液中の標的核酸の存在に関して試験するための改良型ディップスティック検定が記載される。試料溶液を接触させるための接触端、ならびに標的核酸を捕捉するための接触端から遠く離れた捕捉帯を含むディップスティックが提供される。試料溶液は接触端と接触されて、毛管作用により捕捉帯に移動される。試料溶液中の標的核酸は捕捉帯で細くされ、各々が標的核酸の異なる領域とハイブリダイズし得る複数の異なる標識化検出プローブにより検出される。検出シグナルはそれにより増強される。他の方法では、複数の異なる捕捉プローブが試料溶液に付加され、これが次に捕捉帯で捕捉部分により結合されて、標的核酸を間接的に細くする。標的核酸の捕捉は、それにより改良される。このような方法を実行するためのキットおよびディップスティックも記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料溶液中の標的核酸の存在に関する試験キットであって、以下の：
ｉ）以下の：
試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップ、
接触端から遠く離れた捕捉帯に固定された捕捉部分
を含むディップスティック、
ｉｉ）複数の捕捉プローブであって、各々が標的核酸の異なる領域とハイブリダイズし得る、そして各々が標的核酸とハイブリダイズしていた場合、捕捉部分により結合され得る捕捉プローブ、そして任意に
ｉｉｉ）標的核酸とハイブリダイズし、それにより検出プローブを利用した標的核酸の検出を可能にする検出プローブであって、クロマトグラフィーストリップの接触端および捕捉帯間に置かれたクロマトグラフィーストリップのプローブ帯に放出可能的に固定され、あるいはディップスティックから分離されている検出プローブ
を含むキット。
【請求項２】
試料溶液中の標的核酸の存在に関して試験するためのディップスティックであって、以下の：
試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップ、
接触端から遠く離れた捕捉帯に固定された捕捉部分、および
接触端および捕捉帯間に置かれたクロマトグラフィーストリップのプローブ帯に放出可能的に固定された複数の捕捉プローブであって、各々が標的核酸の異なる領域とハイブリダイズし得る、そして各々が標的核酸とハイブリダイズしていた場合、捕捉部分により結合され得る捕捉プローブ
を含むディップスティック。
【請求項３】
各捕捉プローブが捕捉プローブを捕捉部分に結合するための捕捉部分により結合され得る捕捉リガンドを含む請求項１記載のキットまたは請求項２記載のディップスティック。
【請求項４】
各捕捉プローブが、各々捕捉部分により結合され得る複数の捕捉リガンドを含む請求項３記載のキットまたはディップスティック。
【請求項５】
検出プローブが、検出プローブを利用した標的核酸の直接検出を可能にする標識を含み、あるいは検出プローブが、検出プローブを利用した標的核酸の間接的検出を可能にする検出リガンドを含む請求項１〜４のいずれかに記載のキットまたはディップスティック。
【請求項６】
検出プローブが複数の標識または複数の検出リガンドを含む請求項５記載のキットまたはディップスティック。
【請求項７】
検出プローブが複数の検出プローブであり、各検出プローブが標的核酸の異なる領域とハイブリダイズし、それにより検出プローブを利用した標的核酸の検出を可能にし得る請求項１〜４のいずれかに記載のキットまたはディップスティック。
【請求項８】
各検出プローブが複数の標識または複数の検出リガンドを含む請求項７記載のキット。
【請求項９】
試料溶液中の標的核酸の存在に関する試験キットであって、以下の：
ｉ）以下の：
試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップ、および
接触端から遠く離れた捕捉帯に固定された捕捉部分
を含むディップスティック
ｉｉ）標的核酸とハイブリダイズし得る捕捉プローブであって、各々が、標的核酸とハイブリダイズしていた場合、捕捉部分により結合され得る複数の捕捉リガンドに結合される捕捉プローブ、そして任意に
ｉｉｉ）標的核酸とハイブリダイズし、それにより検出プローブを利用した標的核酸の検出を可能にする検出プローブであって、クロマトグラフィーストリップの接触端および捕捉帯間に置かれたクロマトグラフィーストリップのプローブ帯に放出可能的に固定され、あるいはディップスティックから分離されている検出プローブ
を含むキット。
【請求項１０】
試料溶液中の標的核酸の存在に関して試験するためのディップスティックであって、以下の：
試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップ、
接触端から遠く離れた捕捉帯に固定された捕捉部分、および
接触端および捕捉帯間に置かれたクロマトグラフィーストリップのプローブ帯に放出可能的に固定された複数の捕捉プローブであって、標的核酸とハイブリダイズし得る、そして各々が、標的核酸とハイブリダイズしていた場合、捕捉部分により結合され得る複数の捕捉リガンドを含む捕捉プローブ
を含むディップスティック。
【請求項１１】
捕捉プローブが、検出プローブを利用した標的核酸の直接検出を可能にする標識を含み、あるいは検出プローブが、検出プローブを利用した標的核酸の間接的検出を可能にする検出リガンドを含む請求項９記載のキットまたは請求項１０記載のディップスティック。
【請求項１２】
検出プローブが、複数の標識または検出リガンドを含む請求項１１記載のキットまたはディップスティック。
【請求項１３】
検出プローブが複数の検出プローブであり、各検出プローブが標的核酸の異なる領域とハイブリダイズし得る、そしてそれにより検出プローブを利用した標的核酸の検出を可能にする請求項９記載のキットまたは請求項１０記載のディップスティック。
【請求項１４】
各検出プローブが複数の標識または検出リガンドを含む請求項１３記載のキットまたはディップスティック。
【請求項１５】
試料溶液中の標的核酸の存在に関する試験キットであって、以下の：
ｉ）以下の：
試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップ、および
接触端から遠く離れた捕捉帯に固定された捕捉部分であって、標的核酸と直接または間接的に結合し得る捕捉部分
を含むディップスティック、
ｉｉ）複数の検出プローブであって、各々が標的核酸の異なる領域とハイブリダイズし得る、そしてそれにより検出プローブを利用した標的核酸の検出を可能にする検出プローブ
を含むキット。
【請求項１６】
試料溶液中の標的核酸の存在に関して試験するためのディップスティックであって、以下の：
試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップ、
接触端から遠く離れた捕捉帯に固定された捕捉部分であって、標的核酸と直接または間接的に結合し得る捕捉部分、および
接触端および捕捉帯間に置かれたクロマトグラフィーストリップのプローブ帯に放出可能的に固定された複数の検出プローブであって、各々が標的核酸の異なる領域とハイブリダイズし得る、そしてそれにより検出プローブを用いた標的核酸の検出を可能にする検出プローブ
を含むディップスティック。
【請求項１７】
検出プローブが検出プローブを利用した標的核酸の直接検出を可能にする標識を含み、あるいは各検出プローブが、検出プローブを利用した標的核酸の間接的検出を可能にする検出リガンドを含む請求項１５記載のキット。
【請求項１８】
各検出プローブが複数の標識または複数の検出リガンドを含む請求項１７記載のキットまたはディップスティック。
【請求項１９】
試料溶液中の標的核酸の存在に関する試験キットであって、以下の：
ｉ）以下の：
試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップ、および
接触端から遠く離れた捕捉帯に固定された捕捉部分であって、標的核酸と直接または間接的に結合し得る捕捉部分
を含むディップスティック、
ｉｉ）標的核酸とハイブリダイズし得る検出プローブであって、検出プローブを利用した標的核酸の直接検出を可能にする複数の標識を含み、あるいは検出プローブを利用した標的核酸の間接的検出を可能にする検出リガンドを含む検出プローブ
を含むキット。
【請求項２０】
試料溶液中の標的核酸の存在に関して試験するためのディップスティックであって、以下の：
試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップ、
接触端から遠く離れた捕捉帯に固定された捕捉部分であって、標的核酸と直接または間接的に結合し得る捕捉部分、ならびに
接触端および捕捉帯間に置かれたクロマトグラフィーストリップのプローブ帯に放出可能的に固定された検出プローブであって、標的核酸とハイブリダイズし得る、そして検出プローブを利用した標的核酸の直接検出を可能にする複数の標識を含み、あるいは検出プローブを利用した標的核酸の間接的検出を可能にする複数の検出リガンドを含む検出プローブ
を含むディップスティック。
【請求項２１】
捕捉部分が標的核酸と、または標的核酸に結合されたフック捕捉プローブとハイブリダイズし得る捕捉プローブを含む前記請求項のいずれかに記載のキットまたはディップスティック。
【請求項２２】
捕捉部分が捕捉プローブの捕捉リガンドと結合し得る捕捉リガンド結合部分を含み、捕捉プローブが標的核酸とハイブリダイズし、したがって、それにより捕捉部分が標的核酸と間接的に結合し得る請求項１５〜２０のいずれかに記載のキットまたはディップスティック。
【請求項２３】
捕捉プローブをさらに含む請求項２２記載のキットまたはディップスティック。
【請求項２４】
そのまたは各々の標識が非放射性である請求項５、６、８、１１、１２、１４または１７〜２０のいずれか１項に記載のキットまたはディップスティック。
【請求項２５】
捕捉部分が当該または各捕捉リガンドと結合し得る抗体または抗体断片を含む請求項３、４、９、１０または２２のいずれかに記載のキットまたはディップスティック。
【請求項２６】
試料溶液中の標的核酸の存在に関して試験するための前記請求項のいずれか１項に記載のディップスティックの使用。
【請求項２７】
標的核酸がトラコーマクラミジアＣｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸である請求項２６記載の使用。
【請求項２８】
標的核酸とハイブリダイズし得る核酸または核酸類似体を含む標的核酸を検出または捕捉するためのプローブであって、プローブが標的核酸とハイブリダイズしていた場合に標的核酸の直接検出を可能にする複数の標識と核酸または核酸類似体が結合され、あるいはプローブが標的核酸とハイブリダイズしていた場合に標的核酸を検出または捕捉するためにリガンド結合部分により結合され得る複数のリガンドと核酸が結合されるプローブ。
【請求項２９】
複数の標識またはリガンドの各標識またはリガンドに関して、リンカー（本明細書中で定義されているような）が標識またはリガンドを核酸または核酸類似体と共有的に結合する請求項２８記載のプローブ。
【請求項３０】
複数の標識またはリガンドが分枝鎖リンカー（本明細書中で定義されているような）により核酸または核酸類似体と共有結合される請求項２８記載のプローブ。
【請求項３１】
当該または各リンカーが非ヌクレオチド、好ましくはポリエチレングリコールを含む請求項２９または３０記載のプローブ。
【請求項３２】
当該または各リンカーがスペーサーにより核酸または核酸類似体と共有結合される請求項２９〜３１のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項３３】
スペーサーがヌクレオチドまたはヘキサエチレングリコールホスフェートを含む請求項３２記載のプローブ。
【請求項３４】
標識が非放射性標識である請求項２８〜３３のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項３５】
試料溶液中の標的核酸の存在に関して試験するためのディップスティック検定における請求項２８〜３４のいずれか１項に記載のプローブの使用。
【請求項３６】
試料溶液中の標的核酸の存在に関して試験するためのディップスティック検定における複数の異なる捕捉プローブの使用であって、各捕捉プローブが標的核酸の異なる領域とハイブリダイズし、それにより捕捉プローブを結合し得る捕捉部分（ディップスティックに固定）によるディップスティックに対する標的核酸の捕捉を可能にし得る使用。
【請求項３７】
試料溶液中の標的核酸の存在に関して試験するためのディップスティック検定における複数の異なる検出プローブの使用であって、各検出プローブが標的核酸の異なる領域とハイブリダイズし、それにより検出プローブを利用した標的核酸の検出を可能にし得る使用。
【請求項３８】
試料溶液中の標的核酸の存在に関する試験方法であって、以下の：
請求項１５記載のディップスティックを提供し、
複数の検出プローブであって、各検出プローブが標的核酸の異なる領域とハイブリダイズし、それにより検出プローブを利用した標的核酸の直接または間接的検出を可能にし、検出プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションのための条件下で試料溶液とともにインキュベートされる検出プローブと試料溶液を接触させ、
ディップスティックの接触端を試料溶液と接触させて、毛管作用により試料溶液を捕捉帯に移動させ、それにより標的核酸および検出プローブが試料溶液とともに捕捉帯に移動するのを可能にして、標的核酸が捕捉帯で捕捉され、そして
捕捉帯での検出プローブの存在を確認する
ことを包含する方法。
【請求項３９】
試料溶液中の標的核酸の存在に関する試験方法であって、以下の：
請求項１６または２０記載のディップスティックを提供し、
ディップスティックの接触端を試料溶液と接触させて、毛管作用により試料溶液を捕捉帯に移動させ、それにより、当該または各検出プローブが標的核酸とハイブリダイズし得るよう、試料溶液中の標的核酸を捕捉帯で捕捉させて、当該または各検出プローブを試料溶液中に放出し、そして
捕捉帯で当該または各検出プローブを検出する
ことを包含する方法。
【請求項４０】
試料溶液中の標的核酸の存在に関する試験方法であって、以下の：
請求項１９記載のディップスティックを提供し、
標的核酸とハイブリダイズし得る検出プローブであって、検出プローブを利用した標的核酸の直接または間接的検出を可能にする複数の標識を含み、あるいは検出プローブを利用した標的核酸の間接的検出を可能にする複数の検出リガンドを含む、そして検出プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションのための条件下で試料溶液とともにインキュベートされる検出プローブと試料溶液を接触させ、
ディップスティックの接触端を試料溶液と接触させて、毛管作用により試料溶液を捕捉帯に移動させ、それにより標的核酸および検出プローブが試料溶液とともに捕捉帯に移動するのを可能にして、標的核酸が捕捉帯で捕捉され、そして
捕捉帯で検出プローブに関して検出する
ことを包含する方法。
【請求項４１】
試料溶液中の標的核酸の存在に関する試験方法であって、以下の：
ａ）試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップおよび接触端から遠く離れたクロマトグラフィーストリップの捕捉帯に固定された捕捉部分であって、標的核酸と直接または間接的に結合し得る捕捉部分を提供し、
ｂ）クロマトグラフィーストリップの接触端を試料溶液と接触させて、試料溶液中の標的核酸が捕捉部分により捕捉帯で捕捉され得るよう、毛管作用により試料溶液を捕捉帯に移動させ、
ｃ）（ｉ）複数の検出プローブであって、各々が標的核酸の異なる領域とハイブリダイズして、それにより検出プローブを利用した標的核酸の検出を可能にする検出プローブと捕捉帯を接触させるか、あるいは（ｉｉ）標的核酸とハイブリダイズし、それにより検出プローブを利用した標的核酸の検出を可能にする検出プローブであって、検出プローブを利用した標的核酸の直接検出を可能にする複数の標識を含むか、あるいは検出プローブを利用した標的核酸の間接的検出を可能にする複数の検出リガンドを含む検出プローブと捕捉帯を接触させ、
ｄ）クロマトグラフィーストリップの捕捉帯から非結合検出プローブを除去し、そして
ｅ）捕捉帯での当該または各検出プローブの存在に関して検出する
ことを包含する方法。
【請求項４２】
試料溶液中の標的核酸の存在に関する試験方法であって、以下の：
試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップおよび接触端から遠く離れたクロマトグラフィーストリップの捕捉帯に固定された捕捉部分を提供し、
複数の捕捉プローブであって、各々が標的核酸の異なる領域とハイブリダイズし得る、そして各々が標的核酸とハイブリダイズしていた場合、捕捉部分により結合され得る捕捉プローブと試料溶液を接触させ、
クロマトグラフィーストリップの接触端を試料溶液と接触させて、毛管作用により試料溶液を捕捉帯に移動させ、それにより標的核酸および捕捉プローブを含む複合体を捕捉部分と複合体の捕捉プローブとの結合により捕捉帯で捕捉させ、そして
捕捉帯で標的核酸に関して検出する
ことを包含する方法。
【請求項４３】
試料溶液中の標的核酸の存在に関する試験方法であって、以下の：
試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップおよび接触端から遠く離れたクロマトグラフィーストリップの捕捉帯に固定された捕捉部分を含むディップスティックを提供し、
標的核酸とハイブリダイズし得る捕捉プローブであって、各々が標的核酸とハイブリダイズしていた場合、捕捉部分により結合され得る複数の捕捉リガンドを含む捕捉プローブと試料溶液を接触させ、
クロマトグラフィーストリップの接触端を試料溶液と接触させて、毛管作用により試料溶液を捕捉帯に移動させ、それにより標的核酸および捕捉プローブを含む複合体を捕捉部分と捕捉プローブとの結合により捕捉帯で捕捉させ、そして
捕捉帯で標的核酸に関して検出する
ことを包含する方法。
【請求項４４】
試料溶液中の標的核酸の存在に関する試験方法であって、以下の：
試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップ、接触端から遠く離れたクロマトグラフィーストリップの捕捉帯に固定された捕捉部分、ならびに接触端および捕捉帯間のクロマトグラフィーストリップに放出可能的に固定された捕捉プローブであって、各々が標的核酸の異なる領域とハイブリダイズし、そして各々が標的核酸とハイブリダイズしていた場合に捕捉部分により結合され得る捕捉プローブを含むディップスティックを提供し、
クロマトグラフィーストリップの接触端を試料溶液と接触させて、毛管作用により試料溶液を捕捉帯に移動させ、それによりクロマトグラフィーストリップから捕捉プローブを放出させ、したがって試料溶液が捕捉帯に移動するとそれらが試料溶液中の標的核酸とハイブリダイズして、標的核酸および捕捉プローブを含む複合体を捕捉部分と捕捉プローブとの結合により捕捉帯で捕捉させ得る、そして
捕捉帯で標的核酸に関して検出する
ことを包含する方法。
【請求項４５】
試料溶液中の標的核酸の存在に関する試験方法であって、以下の：
試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップ、接触端から遠く離れたクロマトグラフィーストリップの捕捉帯に固定された捕捉部分、ならびに標的核酸とハイブリダイズし得る捕捉プローブであって、接触端および捕捉帯間のクロマトグラフィーストリップに放出可能的に固定された捕捉プローブであり、捕捉プローブが標的核酸とハイブリダイズしていた場合に各々が捕捉部分により結合され得る複数の捕捉リガンドを含む捕捉プローブを包含するディップスティックを提供し、
クロマトグラフィーストリップの接触端を試料溶液と接触させて、毛管作用により試料溶液を捕捉帯に移動させ、それによりクロマトグラフィーストリップから捕捉プローブを放出させ、したがって試料溶液が捕捉帯に移動するとそれが試料溶液中の標的核酸とハイブリダイズして、標的核酸および捕捉プローブを含む複合体を捕捉部分と捕捉プローブとの結合により捕捉帯で捕捉させ得る、そして
捕捉帯で標的核酸に関して検出する
ことを包含する方法。
【請求項４６】
試料溶液中の標的核酸の存在に関する試験方法であって、以下の：
試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップ、および接触端から遠く離れたクロマトグラフィーストリップの捕捉帯に固定された捕捉部分を含むディップスティックを提供し、
複数の捕捉プローブであって、各々が捕捉部分と結合し、そして標的核酸の異なる領域とハイブリダイズし得る捕捉プローブを提供し、
複数の捕捉プローブを捕捉部分に結合し、
クロマトグラフィーストリップの接触端を試料溶液と接触させて、毛管作用により試料溶液を捕捉帯に移動させ、それにより標的核酸と複数の捕捉プローブとの結合により捕捉帯で試料溶液中の標的核酸を捕捉させ、そして
捕捉帯で標的核酸に関して検出する
ことを包含する方法。
【請求項４７】
試料溶液中の標的核酸の存在に関する試験方法であって、以下の：
試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップ、および接触端から遠く離れたクロマトグラフィーストリップの捕捉帯に固定された捕捉部分を含むディップスティックを提供し、
複数の捕捉プローブであって、各々が捕捉部分と結合し、そして標的核酸の異なる領域とハイブリダイズし得る捕捉プローブを提供し、
複数の捕捉プローブを捕捉部分に結合し、
クロマトグラフィーストリップの接触端を試料溶液と接触させて、毛管作用により試料溶液を捕捉帯に移動させ、それにより標的核酸と複数の捕捉プローブとの結合により捕捉帯で試料溶液中の標的核酸を捕捉させ、そして
捕捉帯で標的核酸に関して検出する
ことを包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ディップスティックによる核酸検出の感度改良に関する。本発明のディップスティックは、例えばクラミジア属細菌のトラコーマクラミジアＣｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（ＣＴ）のような病原性微生物に患者が感染しているか否かを同定するために、試料溶液中の標的核酸の存在を検出するために用いられる。
【０００２】
試料溶液中の標的核酸の存在に関して試験するためのいくつかの慣用的試験は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた標的核酸の増幅によっている。この反応は少量の標的核酸の検出を可能にする一方、それは結果が得られる前に数時間を要する。これは、例えば患者の待ち時間を最小限にするために、しばしばできるだけ速く結果を得ることが望ましいため、有意の欠点を有し得る。このような方法のさらなる欠点は、反応を実施するための高価な専門家装備および相対的高価試薬に対する要件である。
【０００３】
これに対照するものとして、ディップスティックは、任意の専門家装備に対する要件を伴わずに非増幅化標的核酸を検出し得るし、結果は、ＰＣＲベースの方法より、したがって患者からの１回来院で、はるかに迅速に得られる。その場合、患者は同一来院で治療され得る。これは、患者が後日の治療のために戻ってくる見込みはありそうもなく、またはそれはできない場合に特に有益である。ディップスティック試験を実施する経費は、ＰＣＲベース試験の経費より有意に低い可能性もある。
【０００４】
米国特許第５，３１０，６５０号に記載された典型的慣用的ディップスティック検定では、一本鎖ＤＮＡ捕捉プローブは、フィルターの一端（接触端）から遠く離れた捕捉帯でニトロセルロースフィルター上に固定される。捕捉プローブの配列の一部は、検出される標的核酸の一次領域の配列と相補的である。標的化一本鎖ＤＮＡ検出プローブは、フィルターの捕捉帯および接触端間に位置するプローブ帯でニトロセルロースフィルター上に固定される。検出プローブは、標的核酸の二次領域（一次領域とは異なる）の配列と相補的な配列を有する。
【０００５】
標的ＤＮＡを含有すると思われる試料溶液中の一本鎖標的ＤＮＡを検出するために、ニトロセルロースフィルターの接触端は試料溶液と接触される。試料溶液は毛管作用によりフィルターに吸い上げられ、プローブ帯および捕捉帯を通過する。試料溶液がプローブ帯を通過すると、それは検出プローブを流動させて、それを捕捉帯に向かって試料溶液とともに上昇させる。流動化検出プローブは次に、試料溶液中に存在する任意の標的ＤＮＡの二次領域とハイブリダイズし得る。
【０００６】
ハイブリダイズ化検出プローブおよび標的ＤＮＡが捕捉帯に達すると、標的ＤＮＡの一次領域は固定化捕捉プローブとハイブリダイズし得る。それにより三成分複合体が、標的核酸、捕捉プローブおよび標識化検出プローブ間に形成される。したがって捕捉帯での標識の存在は、標的ＤＮＡが試料溶液中に存在することを示す。
【０００７】
第二の型の慣用的ディップスティックに関しては、標識化ＤＮＡ検出プローブはニトロセルロースフィルター上に固定されない。その代わり、検出プローブは、検出プローブと試料溶液中の任意の標的核酸とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で試料溶液に付加される。次にニトロセルロースフィルターが試料溶液と接触され、検出プローブとハイブリダイズされる任意の標的核酸が、捕捉プローブにより捕捉帯で捕捉され得る。
【０００８】
しかしながら慣用的ディップスティックによる核酸検出の感度は、特に標的核酸が二本鎖である場合には、低いことがある。したがって試料溶液中の標的核酸の存在は、時としては検出され得ない。環状二本鎖標的核酸は、慣用的ディップスティック試験を用いて最終的には検出可能でない、と考えられる。したがってディップスティックによる標的核酸検出の感度を改良するのが望ましい。
【０００９】
本発明の第一の局面によれば、試料溶液中の標的核酸の存在に関して試験するためのディップスティック検定における複数の異なる検出プローブであって、各々が標的核酸の異なる領域とハイブリダイズし、それにより検出プローブを利用した標的核酸の検出を可能にする検出プローブの使用が提供される。
【００１０】
「ディップスティック検定」という用語は、本明細書中で用いる場合、試料溶液がディップスティックと接触されて、毛管作用により試料溶液をディップスティックの捕捉帯に移動させ、それにより試料溶液中の標的核酸を捕捉帯で捕捉し、検出させ得るディップスティックを用いた任意の検定を意味する。
【００１１】
本発明の第一の局面によれば、試料溶液中の標的核酸の存在に関して試験するためのキットであって、以下の：
ｉ）以下の：
試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップ、および
接触端から遠く離れた捕捉帯に固定された捕捉部分であって、標的核酸と直接または間接的に結合し得る捕捉部分
を含むディップスティック、
ｉｉ）複数の検出プローブであって、各々が標的核酸の異なる領域とハイブリダイズし得る、そしてそれにより検出プローブを利用した標的核酸の検出を可能にする検出プローブ
を含むキットも提供される。
【００１２】
本発明の第一の局面によれば、試料溶液中の標的核酸の存在に関して試験するためのディップスティックであって、以下の：
試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップ、
接触端から遠く離れた捕捉帯に固定された捕捉部分であって、標的核酸と直接または間接的に結合し得る捕捉部分、および
接触端および捕捉帯間に置かれたクロマトグラフィーストリップのプローブ帯に放出可能的に固定された複数の検出プローブであって、各々が標的核酸の異なる領域とハイブリダイズし得る、そしてそれにより検出プローブを用いた標的核酸の検出を可能にする検出プローブ
を含むディップスティックも提供される。
【００１３】
検出プローブを利用して標的核酸を検出するために、各検出プローブは、検出プローブを利用した標的核酸の直接検出を可能にする標識を含み得るし、あるいは各検出プローブは、検出プローブを利用した標的核酸の間接的検出を可能にする検出リガンドを含み得る。各検出プローブは、複数の標識または複数の検出リガンドを含み得る。
【００１４】
検出プローブが検出リガンドを含む場合、検出プローブを利用した標的核酸の間接的検出は、標識化検出リガンド結合部分の使用により達成され得る。いくつかの実施態様では、検出リガンド結合部分は、多重標識化され、例えば検出リガンドを結合し得る多重標識化抗体であり得る。
【００１５】
「クロマトグラフィーストリップ」という用語は、毛管作用により溶液を輸送し得る物質の任意の多孔性ストリップを意味するために本明細書中で用いられる。
【００１６】
本発明の第一の局面のディップスティックおよびキットは、慣用的ディップスティック検定に関して前記したものと同様である標的核酸を検出するための方法に用いられ得る。その方法において、標的核酸とハイブリダイズし得る捕捉プローブは、ディップスティックの捕捉ときに固定される。しかしながら、標的核酸が捕捉帯に捕捉され得る、そして本発明の範囲内である多数のその他の配置が存在する。
【００１７】
捕捉帯に固定された捕捉部分は、塩基対合により、または非塩基対合相互作用により、標的核酸と直接または間接的に結合し得る。
【００１８】
例えば捕捉部分は、標的核酸と、または標的核酸に結合されたフック捕捉プローブと直接ハイブリダイズし得る捕捉プローブを含み得る。フック捕捉プローブは、標的核酸とハイブリダイズし得る一次領域、ならびに捕捉プローブとハイブリダイズし得る二次領域を含む。フック捕捉プローブは、それが試料溶液中の標的核酸と結合し、そして毛管作用により試料溶液がディップスティックに吸い上げられると捕捉プローブにより捕捉され得るよう、試料溶液に付加され得る。
【００１９】
捕捉部分は、あるいは標的核酸に結合された捕捉プローブに結合される捕捉リガンドと結合して、それにより捕捉部分と標的核酸との間接的結合を可能にする捕捉リガンド結合部分であり得る。例えば捕捉部分は、抗体または抗体断片であり得る。この配置では、捕捉プローブは試料溶液に付加され、そして毛管作用によりディップスティックを上昇する前に試料溶液中の標的核酸とハイブリダイズされ得る。
【００２０】
捕捉プローブ、フック捕捉プローブおよび検出プローブは各々、少なくとも１つの核酸または核酸類似体を含み得る。プローブが１つより多い核酸または核酸類似体を含む場合、それらは好ましくは一緒にハイブリダイズされる。
【００２１】
本発明の第二の局面によれば、試料溶液中の標的核酸の存在に関して試験するためのディップスティック検定における検出プローブの使用であって、検出プローブが標的核酸とハイブリダイズし得る、そして標的核酸とハイブリダイズしていた場合に標的核酸の直接検出を可能にする複数の標識を含み、あるいは検出リガンド結合部分により結合され、それにより検出プローブが標的核酸とハイブリダイズしていた場合に標的核酸の間接的検出を可能にし得る複数の検出リガンドを含む検出プローブの使用が提供される。
【００２２】
本発明の第二の局面によれば、試料溶液中の標的核酸の存在に関する試験キットであって、以下の：
ｉ）以下の：
試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップ、
接触端から遠く離れた捕捉帯に固定された捕捉部分であって、標的核酸と直接または間接的に結合し得る捕捉部分
を含むディップスティック、
ｉｉ）標的核酸とハイブリダイズし得る検出プローブであって、検出プローブを利用した標的核酸の直接検出を可能にする複数の標識を含み、あるいは検出プローブを利用した標的核酸の間接的検出を可能にする複数の検出リガンドを含む検出プローブ
を含むキットも提供される。
【００２３】
本発明の第二の局面によれば、試料溶液中の標的核酸の存在に関して試験するためのディップスティックであって、以下の：
試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップ、
接触端から遠く離れた捕捉帯に固定された捕捉部分であって、標的核酸と直接または間接的に結合し得る捕捉部分、および
接触端および捕捉帯間に置かれたクロマトグラフィーストリップのプローブ帯に放出可能的に固定された検出プローブであって、標的核酸とハイブリダイズし得る、そして検出プローブを利用した標的核酸の直接検出を可能にする複数の標識を含み、あるいは検出プローブを利用した標的核酸の間接的検出を可能にし得る複数の検出リガンドを含む検出プローブ
を含むディップスティックも提供される。
【００２４】
本発明の第二の局面の捕捉部分は、標的核酸とまたは標的核酸に結合されたフック捕捉プローブと直接的にハイブリダイズし得る捕捉プローブを含み得るし、あるいは捕捉部分は、標的核酸に結合された捕捉プローブの捕捉リガンドと結合し得る捕捉リガンド結合部分を含み得る。
【００２５】
捕捉部分が捕捉リガンドと結合し得る捕捉リガンド結合部分を含む場合、本発明のキットまたはディップスティックは、捕捉リガンドを含む捕捉プローブをさらに含み得る。
【００２６】
本発明の第三の局面によれば、試料溶液中の標的核酸の存在に関して試験するためのディップスティック検定における複数の異なる捕捉プローブの使用であって、各捕捉プローブが標的核酸の異なる領域とハイブリダイズし、それにより、ディップスティックに固定され、そして捕捉プローブを結合し得る捕捉部分によるディップスティックへの標的核酸の捕捉を可能にする使用が提供される。
【００２７】
本発明の第三の局面によれば、試料溶液中の標的核酸の存在に関する試験キットであって、以下の：
ｉ）以下の：
試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップ、および
接触端から遠く離れた捕捉帯に固定された捕捉部分
を含むディップスティック
ｉｉ）複数の捕捉プローブであって、各々が標的核酸の異なる領域とハイブリダイズし得る、そして各々が標的核酸とハイブリダイズしていた場合、捕捉部分により結合され得る捕捉プローブ、そして任意に
ｉｉｉ）標的核酸とハイブリダイズし、それにより検出プローブを利用した標的核酸の検出を可能にする検出プローブであって、クロマトグラフィーストリップの接触端および捕捉帯間に置かれたクロマトグラフィーストリップのプローブ帯に放出可能的に固定され、あるいはディップスティックから分離されている検出プローブ
を含むキットも提供される。
【００２８】
本発明の第三の局面によれば、試料溶液中の標的核酸の存在に関して試験するためのディップスティックであって、以下の：
試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップ、
接触端から遠く離れた捕捉帯に固定された捕捉部分、および
接触端および捕捉帯間に置かれたクロマトグラフィーストリップのプローブ帯に放出可能的に固定された複数の捕捉プローブであって、各々が標的核酸の異なる領域とハイブリダイズし得る、そして各々が標的核酸とハイブリダイズしていた場合、捕捉部分により結合され得る捕捉プローブ
を含むディップスティックも提供される。
【００２９】
本発明の第三の局面の各捕捉プローブは、捕捉部分により結合され得る捕捉リガンドを含み得る。
本発明の第四の局面の各捕捉プローブは、各々が捕捉部分により結合され得る複数の捕捉リガンドを含み得る。
【００３０】
本発明の第四の局面によれば、試料溶液中の標的核酸の存在に関して試験するためのディップスティック検定における捕捉プローブの使用であって、捕捉プローブが標的核酸とハイブリダイズし得る、そして捕捉プローブがディップスティックの捕捉リガンド結合部分により結合され得る複数の捕捉リガンドを含み、それによりディップスティックに対する標的核酸の捕捉を可能にし得る使用が提供される。
【００３１】
本発明の第四の局面によれば、試料溶液中の標的核酸の存在に関する試験キットであって、以下の：
ｉ）以下の：
試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップ、および
接触端から遠く離れた捕捉帯に固定された捕捉部分
を含むディップスティック
ｉｉ）標的核酸とハイブリダイズし得る捕捉プローブであって、各々が、標的核酸とハイブリダイズしていた場合、捕捉部分により結合され得る複数の捕捉リガンドに結合される捕捉プローブ、そして任意に
ｉｉｉ）標的核酸とハイブリダイズし、それにより検出プローブを利用した標的核酸の検出を可能にする検出プローブであって、クロマトグラフィーストリップの接触端および捕捉帯間に置かれたクロマトグラフィーストリップのプローブ帯に放出可能的に固定され、あるいはディップスティックから分離されている検出プローブ
を含むキットが提供される。
【００３２】
本発明の第四の局面によれば、試料溶液中の標的核酸の存在に関して試験するためのディップスティックであって、以下の：
試料溶液を接触させるための接触端を有するクロマトグラフィーストリップ、
接触端から遠く離れた捕捉帯に固定された捕捉部分、および
接触端および捕捉帯間に置かれたクロマトグラフィーストリップのプローブ帯に放出可能的に固定された複数の捕捉プローブであって、標的核酸とハイブリダイズし得る、そして各々が、標的核酸とハイブリダイズしていた場合、捕捉部分により結合され得る複数の捕捉リガンドを含む捕捉プローブ
を含むディップスティックも提供される。
【００３３】
本発明の第四の局面のキットの検出プローブは、検出プローブを利用した標的核酸の直接検出を可能にする標識を含み、あるいは検出プローブが、検出プローブを利用した標的核酸の間接的検出を可能にする検出リガンドを含み得る。
１つまたはそれ以上の検出リガンドを含む検出プローブを包含する本発明のキットおよびディップスティックは、ディップスティックの捕捉帯で標的核酸に結合された検出プローブを検出するための標識化検出リガンド結合部分をさらに含み得る。
【００３４】
好ましくは当該または各標識は、非放射性である。適切な標識の例としては、テキスタイル染料、金属ゾル、例えばコロイド金および着色粒子、例えば着色ラテックス粒子が挙げられる。適切なリガンドの例としては、ビオチン（例えば標識化抗ビオチン抗体により、または標識化ストレプタビジンまたはアビジン含有部分により検出される）、フルオロセイン（例えば標識化抗フルオレセイン抗体により検出される）、およびＤＮＰ（例えば標識化抗ＤＮＰ抗体により検出される）が挙げられる。
【００３５】
本発明のキットは、試料溶液中の標的核酸の検出に必要な任意の試薬をさらに含み得る、と理解される。
適切な場合、本発明のディップスティックおよびキットは、試料溶液中の標的核酸の存在に関して試験するための以下の種類のディップスティック検定に用いられ得る：
１）接触端を有するクロマトグラフィーストリップおよび接触端から遠く離れた捕捉帯で固定された捕捉プローブであって、標的核酸とハイブリダイズし得る捕捉プローブを含むディップスティックが提供される。検出プローブ（または複数の異なる検出プローブ）は、検出プローブ（またはプローブ）と標的核酸とのハイブリダイゼーションのための条件下で試料溶液と接触される。試料溶液は、ディップスティックの接触端と接触されて、毛管作用により試料溶液を捕捉帯に移動させ、それにより標的核酸および検出プローブ（またはプローブ）を試料溶液とともに捕捉帯に移動させ、そして標的核酸を捕捉帯で捕捉させる。検出プローブ（またはプローブ）は次に、捕捉帯で検出され得る。捕捉帯での検出プローブ（またはプローブ）の存在は、標的核酸が試料溶液中に存在したことを示す。
【００３６】
この検定の変法では、検出プローブ（またはプローブ）は、ディップスティックから分離される代わりに、接触端および捕捉帯間のディップスティックに放出可能的に固定され得る。ディップスティックの接触端が試料溶液と接触された場合、試料溶液が捕捉帯に移動すると、放出検出プローブ（またはプローブ）が試料溶液中の標的核酸とハイブリダイズし得るよう、毛管作用により試料溶液が捕捉帯に移動されて、検出プローブ（またはプローブ）が試料溶液中に放出される。
【００３７】
この検定のさらなる変法では、検出プローブ（またはプローブ）は試料溶液から分離され、そしてディップスティックの捕捉帯と接触される。これは通常は、ディップスティックの接触端が試料溶液と接触された後に実行される。検出プローブ（またはプローブ）は捕捉帯と直接接触され得るし、あるいは検出プローブ（またはプローブ）は、ディップスティックの接触端と接触されて、毛管作用によりプローブ溶液を捕捉帯に移動させる別個のプローブ溶液中に存在し得る。
【００３８】
２）接触端を有するクロマトグラフィーストリップおよび接触端から遠く離れた捕捉帯で固定された捕捉部分であって、標的核酸にハイブリダイズされた捕捉プローブを結合し得る捕捉部分を含むディップスティックが提供される。捕捉プローブ（または複数の異なる捕捉プローブ）は、捕捉プローブ（またはプローブ）と標的核酸とのハイブリダイゼーションのための条件下で試料溶液と接触される。試料溶液は、ディップスティックの接触端と接触されて、毛管作用により試料溶液を捕捉帯に移動させ、それにより標的核酸および捕捉プローブ（またはプローブ）を試料溶液とともに捕捉帯に移動させ、そして捕捉部分を捕捉プローブに結合することにより標的核酸を捕捉帯で捕捉させる。標的核酸は次に、捕捉帯で検出され得る。標的核酸は、検定（１）に関して記載したような検出プローブ（またはプローブ）を用いて検出され得る。検出プローブ（またはプローブ）は、捕捉プローブと一緒に、または捕捉プローブとは別々に（任意の順序で）、試料溶液に付加され得る。あるいは、検出プローブ（またはプローブ）は、接触端および捕捉帯間のディップスティックに放出可能的に固定され得るし、あるいは別個に、検定（１）に関して記載されたような捕捉帯と接触され得る。
【００３９】
この検定（２）の変法では、捕捉プローブ（またはプローブ）は、試料溶液と混合される代わりに、接触端および捕捉帯間のディップスティックに放出可能的に固定され得る。ディップスティックの接触端が試料溶液と接触されて、毛管作用により試料溶液が捕捉帯に移動されると、放出捕捉プローブ（またはプローブ）が試料溶液中に放出されるよう、捕捉プローブ（またはプローブ）が試料溶液中に放出され、したがって放出された捕捉プローブ（またはプローブ）は、試料溶液が捕捉帯に移動すると試料溶液中の標的核酸とハイブリダイズし得る。標的核酸は、試料溶液と接触され、接触端および捕捉帯間のディップスティックに放出可能的に固定され、または別個に捕捉帯と接触され得る検出プローブを用いて検出され得る。
【００４０】
検定（２）のさらなる変法では、捕捉プローブ（またはプローブ）は、毛管作用により試料溶液が捕捉帯に達する前に（または例外的に同時に）、捕捉帯と接触され得る。これは、標的核酸が捕捉され得るよう、捕捉帯で捕捉部分により捕捉プローブ（またはプローブ）を結合させる。捕捉プローブ（またはプローブ）は、それを捕捉帯に直接適用することにより、またはディップスティックの接触端と捕捉プローブを接触させて、毛管作用によりプローブ捕捉プローブ（またはプローブ）を捕捉帯に移動させることにより、別個に捕捉プローブと接触される別個の捕捉プローブ溶液中に存在し得る。ディップスティックの接触端の試料溶液とのその後の接触は、毛管作用により標的核酸を捕捉帯に到達させて、そこで捕捉される。さらに標的核酸は、試料溶液と接触され、接触端および捕捉帯間のディップスティックに放出可能的に固定され、あるいは別個に捕捉帯と接触される検出プローブ（またはプローブ）を用いて検出され得る。検定（２）における検出プローブ（またはプローブ）の使用に代わるものとして、標的核酸は、例えば標識と標的核酸との共有結合により、試料溶液中で直接標識され得る。これは、前駆体標識を試料溶液と接触させ、標識と標的核酸の共有結合のための条件下で試料溶液および前駆体標識をインキュベートすることにより、達成され得る。
【００４１】
検定（２）の捕捉部分は、捕捉プローブとハイブリダイズし得る普遍捕捉プローブであり得るし、あるいは捕捉部分は、捕捉プローブとの非塩基対合相互作用により結合し得る。
【００４２】
ディップスティック検定が標的核酸とハイブリダイズし得る１つより多いプローブを用いる場合、すべてのプローブが試料溶液に付加されるのが、そしてハイブリダイゼーションが単一段階で実行されるのが好ましい。これは検定を簡素化し、それを容易に且つ迅速に実施させる。一段階ハイブリダイゼーション検定を用いる標的核酸の検出感度は、ハイブリダイゼーションが多段階で実行される場合の検出感度とほぼ等しい、ということが判明した。多段階ハイブリダイゼーションは、異なるプローブと試料溶液中の標的核酸との連続ハイブリダイゼーションにより、あるいはディップスティックを、各々異なるプローブを含有する異なる溶液と接触することにより実行され得る。通常は、多段階ハイブリダイゼーションの後者の方法は、異なるプローブ溶液を用いて各接触間のディップスティックを洗浄することを包含する。多段階ハイブリダイゼーションが好ましい環境が存在し得るが、しかしより簡単且つ迅速なフォーマットの一段階ハイブリダイゼーションが通常は好ましい、と理解される。
【００４３】
試料溶液はハイブリダイゼーション反応を単一ハイブリダイゼーション段階で起こさせ、そして非塩基対合相互作用を起こさせて（例えば検出リガンドと検出リガンド結合部分との間、ならびに捕捉リガンドと捕捉リガンド結合部分との間）、そして標的核酸および１つまたはそれ以上のハイブリダイズ化プローブおよび（任意に）リガンド結合部分を含む複合体を毛管作用によりディップスティックまで押し上げるための適切な組成物を有する、というのが最も好ましい。このような試料溶液を用いて、ハイブリダイゼーション反応は次に単一段階で実行され、そして試料溶液がディップスティックの接触端と直接接触される前に（試料溶液を先ず希釈し、または変える必要性を伴わずに）、任意のリガンド−リガンド結合部分相互作用が起こり得る、と理解される。リガンド−リガンド結合部分相互作用は、試料溶液が捕捉帯に移動すると、所望によりディップスティック上で付加的にまたは代替的に起こり得る。標的核酸の簡単且つ迅速なディップスティック検出は、それにより促される。
【００４４】
このような結果は、塩、洗剤およびブロッキングタンパク質、例えばＢＳＡまたは粉乳を含有する標準ハイブリダイゼーション緩衝液（例えばＳＳＰＥ緩衝液またはトリス緩衝液）を含む試料溶液を用いて達成される、ということをわれわれは見出した。このような検定を用いた標的核酸の検出感度は、他のディップスティック検定とほぼ等しいかまたはそれより良好であることが判明した。
【００４５】
好ましくは、捕捉プローブ（単数または複数）および検出プローブ（単数または複数）が結合する標的核酸の領域は、少なくとも１０ヌクレオチド間隔である。
試料溶液中の標的核酸の存在に関して試験するための本発明のディップスティックまたはキットの使用も、本発明の方法により提供される。好ましくは標的核酸は、トラコーマクラミジアＣｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸である。
【００４６】
標的核酸とハイブリダイズし得る核酸または核酸類似体を含む標的核酸を検出または捕捉するためのプローブも提供されるが、この場合、プローブが標的核酸とハイブリダイズしていた場合に標的核酸の直接検出を可能にする複数の標識と核酸または核酸類似体が結合され、あるいはプローブが標的核酸とハイブリダイズしていた場合に標的核酸を検出または捕捉するためにリガンド結合部分により結合され得る複数のリガンドと核酸が結合される。
【００４７】
リガンドまたは標識を核酸または核酸類似体と連結するためには、核酸または核酸類似体と反応し得る一次反応基、ならびにリガンドまたは標識と反応し得る二次反応基を含む改質剤を用いることが、時として必要である。
【００４８】
例えば一次反応基は、核酸または核酸類似体のヒドロキシル基と反応し得るホスホルアミダイトを含み得る。リガンドまたは標識がカルボキシル基を含む場合、二次反応基は、第一アミノ基を含み得る。リガンドまたは標識を核酸または類似体の５’−ＯＨまたは３’−ＯＨと連結するための適切な改質剤の一例は、６−（トリフルオロアセチルアミノ）ヘキシル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイト（Ｃ６−ＴＦＡ）である。リガンドまたは標識を核酸または類似体の内部ＯＨ基に連結するのに適したいくつかのその他の改質剤の化学構造は、図５に示されている。これらの改質剤は、ホスフェート基と反応し、それにより、ホスホルアミダイトと保護化ＯＨとの反応によりヌクレオチドを一緒に連結させるための第三の反応基（保護化ＯＨ基）をさらに含む。図５は、ビオチンとの反応後の化学構造を示す。
【００４９】
一旦改質剤が核酸または核酸類似体と、そしてリガンドまたは標識と反応して、核酸または核酸類似体をリガンドまたは標識に連結する場合、反応化改質剤は、本明細書中では「リンカー」と呼ばれる。
【００５０】
複数の標識またはリガンドの各標識またはリガンドに関して、リンカーは標識またはリガンドを核酸または核酸類似体に共有結合し得る。櫛様構造が、それにより生成される（図４参照）。
【００５１】
複数の標識またはリガンドは、分枝鎖リンカーにより核酸または核酸類似体に共有結合され得る。フォーク様構造が、それにより生成される（図４参照）。
当該または各リンカーは、好ましくは非ヌクレオチド、好ましくはポリエチレングリコールを含む。
【００５２】
好ましくはリガンドまたは標識は、スペーサーにより核酸または核酸類似体と結合される。リガンドまたは標識をスペーサーに連結するためには、スペーサーと反応し得る一次反応基、ならびにリガンドまたは標識と反応し得る二次反応基を含む改質剤を用いることが、時として必要である。適切な改質剤の一例は、Ｃ６−ＴＦＡである。
【００５３】
一旦改質剤がスペーサーと、そしてリガンドまたは標識と反応して、スペーサーをリガンドまたは標識に連結する場合、反応化改質剤は、本明細書中では「リンカー」と呼ばれる。
好ましくはスペーサーはヌクレオチドまたはヘキサエチレングリコールホスフェートを含む。好ましくは標識は、非放射性標識である。
添付の図面を参照しながら、本発明の実施態様を例としてここで説明する。
【００５４】
以下の実施例は、クラミジア属細菌のトラコーマクラミジアＣｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（ＣＴ）の隠れたプラスミドのＤＮＡ断片の検出に関する。ＣＴは、性感染病の最も一般的な原因の１つである。ＣＴ感染は、不妊症を引き起こし得るし、そして妊娠中には、自然流産を、さらに出産時または出産後子宮内膜炎を生じ得る。新生児において、ＣＴ感染は失明および慢性呼吸疾患を引き起こし得る。感染男性の約１０％、および感染女性の約７０％がＣＴ感染の症状を示さない。したがって、病気の初期治療が開始され得るよう、ＣＴ感染の的確な診断が重要である。
【００５５】
以下の実施例１および３〜５では、ディップスティック１０を用いて、試料溶液１４中の二本鎖ＣＴ標的核酸１２を検出しようと試みた。ディップスティック１０は、試料溶液１４を接触するための接触端１８を有するニトロセルロースのストリップ１６、ならびに接触端１８から遠く離れたニトロセルロースストリップ１６の捕捉帯２２に固定された捕捉プローブ２０を包含する。抗ビオチン抗体染料接合体２４は、接触端１８と捕捉帯２２との間に位置するニトロセルロースストリップの接合体帯２６で放出可能的に固定される。捕捉プローブ２０は、標的核酸１２の一方の鎖（一次鎖）の一次配列とハイブリダイズし得る。
【００５６】
二本鎖標的核酸１２の一次鎖の異なる領域と各々ハイブリダイズし得る検出プローブ２８（または複数の検出プローブ）およびヘルパープローブ３０（または複数のヘルパープローブ）は次に、試料溶液１４に付加される。検出プローブ２８は、ビオチンに結合された（当業者に周知の方法を用いて）核酸を含む。検出プローブ２８およびヘルパープローブ３０を含む試料溶液１４は次に、少なくとも検出プローブ２８およびヘルパープローブ３０が結合する一次鎖の領域で互いから二本鎖標的核酸１２の相補鎖を分離するのに十分な温度に加熱され、次いで冷却されて、検出プローブ２８およびヘルパープローブ３０と二本鎖標的核酸の一次鎖とのハイブリダイゼーションを可能にする。検出プローブおよびヘルパープローブとの一次鎖のハイブリダイゼーションは、少なくとも検出プローブおよびヘルパープローブが結合される一次さの領域において、一次鎖と再アニーリングするのを妨げる。
【００５７】
ディップスティック１０の接触端１８は次に、試料溶液１４と接触される。試料溶液１４、ならびに検出プローブ２８およびヘルパープローブ３０とハイブリダイズされた任意の標的核酸１２は、毛管作用によりディップスティック１０を上昇する。試料溶液１４が接合体帯２６を通過すると、それは抗ビオチン抗体−染料接合体２４を流動化する。放出された抗ビオチン抗体−染料接合体２４は次に、標的核酸１２とハイブリダイズした検出プローブ２８のビオチンと結合する。
【００５８】
抗ビオチン抗体−染料接合体２４、検出プローブ２８、ヘルパープローブ３０および標的核酸１２間に形成される複合体は次に、ディップスティック１０に吸い上げられて捕捉帯２２まで移動し、そこで複合体の標的核酸が固定化捕捉プローブ２０とハイブリダイズし得る。検出プローブ３０は、ディップスティック上での標的核酸と捕捉プローブ２０とのハイブリダイゼーションを促すと考えられる。
【００５９】
捕捉プローブ２０は、それが捕捉帯２２を通って移動すると、試料溶液１４により流動化され得ないような方法で捕捉帯２２に固定される。その結果として、捕捉プローブに結合された複合体は捕捉帯中に残存し、捕捉帯での抗ビオチン抗体−染料接合体の染料の存在により検出され得る。
【００６０】
試料溶液中にＣＴ標的核酸が存在しない場合、検出プローブ２８は捕捉帯２２で捕捉され得ず、したがって染料は捕捉帯で可視的でない。試料溶液中にＣＴ標的核酸が存在するが、しかし不十分量の標的核酸が捕捉帯で捕捉され得る場合には、試料溶液中の標的核酸の存在は検出されない。
【００６１】
前記の標的核酸の捕捉は、直接プローブ捕捉と呼ばれる。実施例２では、抗体捕捉技法が用いられる。この技法では、抗体は、捕捉プローブの代わりにディップスティックの捕捉帯に固定される。捕捉プローブは、捕捉リガンド（例えばビオチン）に結合され、これは抗体により結合され得て、ヘルパーおよび検出プローブとともに試料溶液に付加される。捕捉プローブは、ヘルパーおよび検出プローブと同時に標的核酸とハイブリダイズする。検出プローブは、染料粒子に結合される。
【００６２】
ディップスティックの接触端は、捕捉、ヘルパーおよび検出プローブが標的核酸とハイブリダイズした後に試料溶液と接触される。標的核酸、捕捉プローブ、ヘルパープローブおよび検出プローブを含有する複合体は次に、捕捉帯に固定された抗体により捕捉帯で捕捉される。試料溶液中の標的核酸の存在は、捕捉帯での染料粒子の存在により検出される。したがって捕捉プローブと標的とのハイブリダイゼーションは、ディップスティック上というよりむしろ、試料溶液中で起こる。
【００６３】
標的核酸の検出感度は、捕捉プローブがハイブリダイズする標的核酸の領域と検出プローブがハイブリダイズする領域との間の距離が２６ヌクレオチド未満である場合、低減され得る、ということが判明した。したがって、これらの領域間の距離は少なくとも２６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２００ヌクレオチドである、というのが好ましい。
実施例に用いられるプローブは、以下のプローブ配列から選択される：
【００６４】
【表１】
2004512498.tif 000002
【００６５】
ビオチンは検出または捕捉プローブと直接的に反応しない。下記の実施例においてビオチンを検出または捕捉プローブと共有結合させるために、反応基（ホスホルアミダイト）を含むリンカーに連結されたビオチンを、検出または捕捉プローブのヌクレオチドと、あるいは検出または捕捉プローブのヌクレオチドに連結されたスペーサーと反応させた。ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９合成機を用いて、リンカーの反応基を、ヌクレオチドまたはスペーサーと反応させた。リンカーは、線状または分枝鎖構造を有し、そしてヌクレオチド、好ましくは非ヌクレオチド方のものであり得る（図５ＡおよびＢ）。さらに好ましくは、リンカーはポリエチレングリコールを含む（図５Ｃ）。
【００６６】
実施例１
実験設定：
実験設定を図２に模式的に示す。
捕捉：直接プローブ捕捉（ＢＳＡによりディップスティック上に固定されたプローブ配列番号２３を使用）；
検出フォーマット：１０１２コピーで配列番号２１、２２、２４および２５を含む１つまたはそれ以上の検出プローブ。各プローブはビオチンに結合され、抗ビオチン抗体接合体により検出される；
ヘルパープローブ：ＨＰ配列番号３およびＨＰ配列番号４（１０１２コピー）；
標的：８７２ ｂｐ二本鎖ＤＮＡ（１０１０コピー）。
【００６７】
【表２】
2004512498.tif 000003
【００６８】
これらの結果は、検出プローブの数が漸増すると、標的核酸の検出感度が増大することを示す。
【００６９】
実施例２
実験設定
捕捉フォーマット：抗体捕捉−抗ビオチン抗体（ディップスティック上に固定）。捕捉プローブ配列番号２１、２２、２３、２４および２５（１０１２コピーでビオチンに結合される）；
検出フォーマット：ＢＳＡにより染料粒子に結合された配列番号１８のプローブを含む検出プローブ；
ヘルパープローブ：ＨＰ配列番号５およびＨＰ配列番号６。これらのヘルパープローブは、配列番号１８により認識される領域に隣接する標的核酸の領域とハイブリダイズする。
標的ＤＮＡ：８７２ ｂｐｄｓＤＮＡ（１０１１〜１０８コピー）。
【００７０】
【表３】
2004512498.tif 000004
【００７１】
これらの結果は、標的核酸検出の感度が多検出プローブの使用により改良されることを示す。
【００７２】
実施例３
実験設定
捕捉フォーマット：直接プローブ捕捉（ｃｐ）（ディップスティック上に固定された配列番号２２または配列番号２３を使用）；
検出プローブ：反応（ホスホルアミダイト）基を含むリンカーに連結されたビオチン検出リガンドを、検出プローブ（ｄｐ）配列番号２１に結合されたスペーサーと、または異なる位置で検出プローブ（ｄｐ）配列番号２１に結合された２つのスペーサーの各々と反応させた。異なる長さおよび種類のスペーサーを用いた。検出プローブは、１０１２コピーで存在した；
検出フォーマット：抗ビオチン抗体染料接合体；
ヘルパープローブ：ＨＰ配列番号２およびＨＰ配列番号３（これらのヘルパープローブは、配列番号２２により認識される領域に隣接する標的核酸の領域とハイブリダイズする）、あるいはＨＰ配列番号３およびＨＰ配列番号４（これらのヘルパープローブは、配列番号２３により認識される領域に隣接する標的核酸の領域とハイブリダイズする）（１０１２コピー）。
標的ＤＮＡ：４１６ ｂｐｄｓＤＮＡ断片。
【００７３】
【表４】
2004512498.tif 000005
【００７４】
結論
これらの結果は、異なる長さおよび種類のスペーサーが用いられた場合に検出シグナルの強度のわずかな差が存在するが、しかしこれらの差は、検出感度を有意に変更するには十分でない、ということを示す。
【００７５】
他の実験は、検出感度は、複数のビオチン検出リガンドを検出プローブの異なる位置に連結するための別個のリンカーの使用と比較して、複数のビオチン検出リガンドが１つまたはそれ以上の分枝鎖リンカーを用いて検出プローブの単一位置に連結される場合に、有意に異ならないことは見出されない、ということを示した（これらの異なる種類は、それぞれ「櫛様」および「フォーク様」構造と呼ばれる−図４参照）。しかしながらフォーク様構造の使用は、複数の検出リガンドに連結されたプローブの産生が通常は櫛様構造を用いた場合より通常は低いため、あまり好ましくない。
【００７６】
実施例４
実験設定
捕捉フォーマット：直接プローブ捕捉（ｃｐ）配列番号１８（ディップスティック上に固定）；
検出プローブ：一または多ビオチン検出リガンドに結合された配列番号２１のプローブを含む検出プローブ（ｄｐ）。各ビオチン検出リガンドは、６つのヌクレオチドスペーサーによりそのプローブに結合された。検出プローブは１０１２コピーで用いた；
検出フォーマット：抗ビオチン抗体染料接合体；
ヘルパープローブ：ＨＰ配列番号５およびＨＰ配列番号６（これらのヘルパープローブは、配列番号１８により認識される領域に隣接する標的核酸の領域とハイブリダイズする）；ＨＰ配列番号１およびＨＰ配列番号２（これらのヘルパープローブは、配列番号２１により認識される領域に隣接する標的核酸の領域とハイブリダイズする）（１０１２コピー）。
標的ＤＮＡ：８７２ ｂｐｄｓＤＮＡ断片または１０１８６ ｂｐプラスミドＤＮＡ。
【００７７】
【表５】
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【００７８】
結論
これらの結果は、ビオチン検出リガンド／検出プローブの数の漸増が標的核酸検出の感度を増大することを示す。３またはそれ以上のビオチン検出リガンド／検出プローブは、単一ビオチン検出リガンド／検出プローブと比較して、検出シグナルの４倍より大きい増幅を生じる。この実施例に用いた条件下では、６および７ビオチン検出リガンド／検出プローブを用いて最大シグナル増幅を得た。
【００７９】
実施例５
実験設定
捕捉フォーマット：オリゴヌクレオチドプローブ捕捉配列：ＣＧＴ　ＣＴＧ　ＴＴＧ　ＧＡＣ　ＴＣＴ　ＧＧ（ディップスティック膜上に固定）；
検出プローブ：一または多ビオチン標識化検出体プローブ配列：ＣＴＣ　ＡＡＴ　ＡＡＡ　ＧＣＴ　ＴＧＣ　ＣＴＴ　ＧＡ；
検出フォーマット：抗ビオチン抗体−コロイド金接合体；
標的核酸：ＲＮＡアンプリコン、１２０ ｎｔ（ＨＩＶ陽性試料のＮＡＳＢＡ増幅反応により合成）。一増幅反応は、約１０１１コピーのＲＮＡ標的分子を生じる。
【００８０】
結果：図６
結論：多ビオチン標識化検出体プローブは、検定感度の２オーダーより大きい大きさの改良を生じる。
【００８１】
実施例６：トラコーマクラミジアＣｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの一段階核酸ディップスティック検定検出
実験設定：
試薬：
捕捉フォーマット：ＢＳＡ担体によりディップスティック膜上に固定されたオリゴヌクレオチドプローブ捕捉；
検出フォーマット：多ビオチン標識化検出体プローブ；抗ビオチン抗体−コロイド金接合体；
試料調製：ＰＢＳ緩衝液中の１０６コピー／μｌ〜１０３コピー／μｌの濃度で、トラコーマクラミジアＣｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｕｓ（Ｃｔ）基本小体（ＥＢ）細胞を調製し、１００℃で２０分間加熱した。
ハイブリダイゼーション／ディップスティック実行緩衝液：塩、洗剤およびブロッキングタンパク質、例えばＢＳＡまたは粉乳を含有する標準ハイブリダイゼーション緩衝液。
【００８２】
方法：
検出プローブ、ヘルパープローブおよび５ｘ１０６〜５ｘ１０３コピーのＥＢを８０μｌに作製したハイブリダイゼーション緩衝液中に希釈し、１００℃で７分間加熱した。次に混合物を手短に遠心分離して、すべての液体を収集し、２０μｌの抗ビオチンＡｂコロイド金と混合した。全１００μｌの混合物をディップスティック上に吸い上げてさせて、シグナルを発現させた。
【００８３】
結果および考察
表および図７に提示した結果は、試料調製段階を含めて１時間未満で、一段階核酸ディップスティック検定を用いてＣｔＥＢの約１０４コピーが検出され得たことを示す。
そのように提示されたディップスティック検出検定は他のサンドイッチハイブリダイゼーション検定とほぼ等しい検出感度を有するが、しかしそれは、速度および簡便性という大きい利点を有する。
【００８４】
例えばＰＣＴ ＷＯ ９３／１３２２に開示されたＣｔの検出のためのサンドイッチハイブリダイゼーション検定は、複雑な多構成成分微小滴定プレートフォーマット検定であり、これは５時間未満では成し遂げられなかった。この検定は、限定順序でのその構成成分の漸次付加を要する多段階検定であって、インキュベーションおよび洗浄段階はすべての新規の構成成分の付加後である。
【００８５】
本発明の目的の核酸ディップスティック検定は、構成成分の付加および洗浄のための異なる段階を必要とせずに、一段階で実行し得る。このサンドイッチハイブリダイゼーション検定は、ハイブリダイゼーションおよびその他の親和性対形成のためにそれらを有益にさせるために、１つより多い溶液条件を必要としない。同一溶液条件は、同様にディップスティック膜を通過する構成成分の自由移動に役立つ。
【００８６】
図面凡例
図２
２１０−捕捉プローブ
２４０−ヘルパープローブ
２５０−ディップスティック膜
２６０−抗ビオチンＡｂ／染料接合体
【００８７】
図３
３１０−ビオチンに結合された捕捉プローブ
３２０−検出プローブ−染料接合体
３３０−８７２ ｂｐｄｓＤＮＡ標的
３４０−ヘルパープローブ
３５０−ディップスティック膜に固定された抗ビオチン抗体
【００８８】
図４
Ａ）櫛様型
Ｂ）フォーク様型
中実円＝検出リガンド
Ｂｒ＝分枝生成モノマー
【００８９】
図６
感度に及ぼすプローブラベリングの作用
【００９０】
図７
トラコーマクラミジアＣｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの一段階核酸ディップスティック検定検出。
数字はトラコーマクラミジアの基本小体の数を示す。
＊ＮＣ：陰性対照。
【００９１】
図８
トラコーマクラミジアＣｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの一段階核酸ディップスティック検定検出。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、試料溶液中の標的核酸の存在に関する試験方法を示す。
【図２】
図２は、実施例１に関する実験設定を模式的に示す。
【図３】
図３は、実施例２に関する実験設定を模式的に示す。
【図４】
図４は、多検出リガンドに結合された検出プローブの２つの異なる配置を模式的に示す。
【図５】
図５は、検出プローブとの反応のためにビオチン検出リガンドに連結されたリンカーの例の化学構造を示す。
【図６】
図６は、検定感度に及ぼすプローブラベリングの作用を示す。
【図７】
図７は、一段階ハイブリダイゼーション検定の結果を示す。
【図８】
図８は、トラコーマクラミジアＣｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの一段階核酸ディップスティック検定検出結果を示す。
【図５】
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【図６】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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