(57)【要約】本発明は、1)リン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの一つ以上のセリン残基及び/またはスレオニン残基を脱リン酸化させる工程;2)前記工程1の脱リン酸化されたアミノ酸残基をR-L-Gの構造からなるペプチド反応性標識物質で標識させる工程であって、Rは脱リン酸化されたアミノ酸部位と選択的に結合する親核性作用基、Gは陽イオン形成を誘発させる親陽性子性作用基、Lは前記親核性作用基と親陽性子性作用基とを連結させるリンカーである、工程;及び3)工程2で標識されたタンパク質またはペプチド誘導体を陽イオン質量分析方法で検出する工程を含むリン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの質量分析方法またはリン酸化位置分析方法であって、前記工程2の標識物質に、グアニジノ基を親陽性子性作用基(G)として使用することを特徴とする、リン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの質量分析方法またはリン酸化位置分析方法及び前記分析方法の標識反応用標識物質に関するものである。本発明の標識物質の利用により、既存の分析方法に比べて分析感度が優れ、ペプチド内部のリン酸化位置も正確に分析できるため、タンパク質のリン酸化状態による細胞シグナル伝達経路等様々なタンパク質の生体内での機能に対する研究及び数々の疾病の診断に有用に使用できる。2006515674.tif 000006
2006515674.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
1)リン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの一つ以上のセリン残基及び/またはスレオニン残基を脱リン酸化(dephosphorylation)する工程;
2)工程1の脱リン酸化されたアミノ酸残基をR-L-Gの構造からなるペプチド反応性標識物質(tag)で標識する工程であって、Rは脱リン酸化されたアミノ酸部位と選択的に結合する親核性作用基、Gは陽イオン形成を誘発させる親陽性子性作用基、Lは前記親核性作用基と親陽性子性作用基とを連結させるリンカー(linker)である、工程;及び 
3)工程2で標識されたタンパク質またはペプチド誘導体を質量分析方法で検出する工程
を含む、リン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの質量分析方法またはリン酸化位置分析方法であって、
工程2の標識物質に、モノ-N-保護グアニジノ基、ジ-N-保護グアニジノ基、N'-保護グアニジノ基及びアミンが保護されていないグアニジノ基からなる群より選択される基を親陽性子性作用基(G)として使用する、リン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの質量分析方法またはリン酸化位置分析方法。
【請求項２】
工程1のリン酸化ペプチドが、多様な臓器組織、細胞内分割または膜タンパク質から得られるリン酸化タンパク質を酵素的方法または化学的方法で加水分解して製造されることを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項３】
工程1のリン酸化ペプチドが、一つ以上の互いに異なる疾病状態で、互いに異なる化学的、物理的条件で、または互いに異なる環境的、栄養学的条件で発現されるリン酸化タンパク質各々を、酵素的方法または化学的方法で加水分解することによって製造されることを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項４】
工程2の標識物質の親核性作用基(R)が、スルフヒドリル(sulfhydryl)であることを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項５】
スルフヒドリル基が、脱リン酸化アミノ酸残基に対する標識反応直前にまたは標識反応中に、スルフヒドリル基の二硫化物をトリス(2-シアノエチル)ホスフィン(tris(2-cyanoethyl)phosphine,TCNEP)、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(tris(2-carboxyethyl)phosphine,TCEP)、トリス(ヒドロキシプロピル)ホスフィン(tris(hydroxypropyl)phosphine,THPP)及びトリブチルホスフィン(tributylphosphine,TBP)からなる群より選択されるトリアルキルホスフィン(trialkylphosphine)製剤で還元させることによって製造されることを特徴とする、請求項4記載の方法。
【請求項６】
スルフヒドリル基が、脱リン酸化アミノ酸残基に対する標識反応直前にまたは標識反応中に、保護スルフヒドリル基を塩基加水分解または親核性置換で脱保護させることによって製造されることを特徴とする、請求項4記載の方法。
【請求項７】
工程2の標識物質のリンカー(linker,L)が、炭化水素(hydrocarbon)、エチレンオキシド(ethylene oxide)またはペプチド(peptide)からなる群より選択されることを基本骨格を含むことを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項８】
工程3の標識されたタンパク質が、質量分析を実施する前に酵素的方法または化学的方法で標識されたペプチドで加水分解されて分析されることを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項９】
標識物質をさらに2H、13C、15N、17O、18O及び34Sからなる群より選択される同位元素で置換させることにより、前記同位元素で置換されていない標識物質と前記同位元素で置換した標識物質各々を一つ以上の試料に各々標識反応させた後、標識化された両試料を合わせて質量分析を実施することにより、各々の試料に存在するリン酸化タンパク質またはペプチドに対する相対的定量を実施する方法及びリン酸化位置を確認する、請求項1記載の分析方法。
【請求項１０】
請求項1記載のリン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの質量分析方法またはリン酸化位置分析方法の標識反応用標識物質。
【請求項１１】
標識物質が、グアニジノアルカンチオールまたはグアニジノエタンチオールであることを特徴とする、請求項10記載の標識物質。
【請求項１２】
標識物質が、グアニジノアルカンジスルフィド及びグアニジノアルキルチオエステルからなる標識物質の前駆体から還元反応または脱保護反応によって製造されることを特徴とする、請求項10記載の標識物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン酸化タンパク質の質量分析及びリン酸化位置分析に使用される標識物質に関するもので、詳細には、タンパク質のリン酸化されたアミノ酸の位置を分析する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、細胞内で進行するほとんど全ての作用に関与する非常に重要な細胞構成要素であるため、細胞に存在するタンパク質に対する全般的な分析と動静は、細胞及び生物における様々な生命活動を理解し、さらに、新しい疾病治療法を求めるにおいても非常に重要な役割を果たす。
【０００３】
一般的にタンパク質は、生体内で翻訳後修飾(post-translational modification)が行われる。タンパク質の翻訳後修飾反応の中で、最も代表的なものがタンパク質のリン酸化(phosphorylation)である。タンパク質のリン酸化は、主にチロシン(tyrosine)、セリン(serine)、スレオニン(threonine)、ヒスチジン(histidine)及びリジン(lysine)等のアミノ酸の位置で行われる。
【０００４】
タンパク質の可逆的リン酸化は、細胞内外間のシグナル伝達において重要な役割を担当する。細胞シグナル伝達経路(cell signaling pathway)に関わる多くのタンパク質は、キナーゼ(kinase)という酵素によってリン酸化され、ホスファターゼ(phosphatase)という酵素によって脱リン酸化される。多くの疾病が特定タンパク質の非正常的リン酸化/脱リン酸化と関連していることが証明されている。
【０００５】
タンパク質のリン酸化状態においての異常(irregularity)に対する迅速で正確なスクリーニングは、細胞内または細胞間のシグナル伝達事象を理解するのに大きく役立ち、様々な疾病状態を効果的に診断できる方法の開発にも寄与すると考えられる。
【０００６】
現在、タンパク質を分析できる最も強力な方法の中の一つは、タンデムマススぺクトロメトリー(tandem mass(MS/MS) spectrometry)で、タンパク質をより小さい質量のペプチド状態に加水分解した後、分析を実施する。しかし、前記マススぺクトロメトリー法を利用してリン酸基を含有したリン酸化ペプチドを分析する場合、非リン酸化ペプチドの分析の場合に比べて幾つかの問題点がある。
【０００７】
第1に、タンパク質のリン酸化は通常可逆的に行われ、この場合、リン酸化可能な部位は部分的にリン酸化されるため、タンパク質切断後に生成されるリン酸化ペプチドの量は 非当量的に少なく存在する場合が多い。第2に、リン酸化ペプチドは内部に存在するリン酸基の存在により、ペプチドの分析で一般的に使用する陽イオン方式の質量分析で深刻なイオン化抑制効果がある。その結果、質量分析においてリン酸化ペプチドの検出感度が非リン酸化ペプチドに比べて非常に劣る。第3に、リン酸基の化学的不安定性により、リン酸化ペプチドの質量分析過程中にリン酸基の部分的脱リン酸化が誘発され得る。これは、リン酸化タンパク質の質量分析感度を劣下させ、マススペクトルの解析を複雑にし、MS/MS配列分析(sequencing)を利用したアミノ酸配列分析を不完全にする結果をもたらす。
【０００８】
このような問題点を解決する方法として、リン酸基をβ離脱(elimination)させる反応を利用する方法がある。リン酸基のβ離脱反応は、塩基性溶媒下でリン酸化ペプチドまたはリン酸化タンパク質のホスホセリン(phosphoserine)及びホスホスレオニン(phosphothreonine)に存在するリン酸基を定量的にβ離脱させ、前記アミノ酸残基が各々ジヒドロアラニン(dehydroalanine)及びβ-メチルジヒドロアラニン(β-methyldehydroalanine)に変換させる反応で、質量分析をする前に試料ペプチドまたはタンパク質でリン酸基を予め除去することである。試料ペプチドまたはタンパク質でリン酸基を除去すると、既存のリン酸化ペプチドの質量分析過程で提起された問題点、即ち酸性リン酸基の存在によるイオン化抑制及びリン酸基の化学的不安定性に起因した部分的脱リン酸化等の問題点を解決することができる。しかし、このような脱リン酸化の結果、生成されたペプチド、即ちジヒドロアラニン及びβ-メチルジヒドロアラニンは化学的に不安定であるため、意図的に適当にデザインされた様々な求核剤(nucleophile)と付加反応(Michael addition)を起こして安定化されたペプチド状態に変換させることができる。したがって、脱リン酸化反応を通じて、質量分析におけるリン酸化ペプチドが有する問題点を解決すると同時に、リン酸化されたアミノ酸位に特定の質量数等多様な情報及び機能を有する標識物質(tag)を導入してリン酸化ペプチドの分析を容易にできる。
【０００９】
リン酸基のβ離脱/標識物質の付加反応を通じて導入される標識物質(tag)は、付加反応をよく起こすチオール基を含み、一般的に中性作用基またはペプチド内に陽イオンの生成を促進するアミン基のような塩基性作用基を有するように選択できるため、基本的にリン酸化ペプチドの質量分析感度を画期的に増加させることができる。その理由は、質量分析過程で簡単に部分的に脱リン酸化される従来のリン酸化ペプチドとは異なり、リン酸基のβ離脱/標識物質の付加反応を通じて導入された標識物質を含むペプチド誘導体は、一般的な質量分析条件で相対的に化学的安定度が高くてMS/MS実験を利用してより良好なアミノ酸配列分析を可能にする。
【００１０】
リン酸基のβ離脱/標識物質の付加反応のもう一つの長所は、β離脱反応と付加反応には影響を与えないで、標識されたペプチドの質量分析では質量差による区分ができるように、安定した同位元素で置換された標識物質(stable isotope coded tag)を共に使用することにより、互いに異なる源(source)から得た試料間の相対的な定量が可能であるという点である。即ち、安定した同位元素で置換された標識物質は、リン酸基のβ離脱/標識物質付加反応において本来の標識物質と同一の反応性を有し、質量分析においての分析感度も差がない。但し、マススペクトル上に記録される各ペプチド誘導体の質量値においてのみ差が表れるため、試料間の相対的な定量を可能にする。
【００１１】
リン酸基のβ離脱/標識物質付加反応におけるもう一つの重要な長所は、標識物質に適当な親和相互作用を有する作用基を導入することにより、リン酸化ペプチドの標識物質誘導体だけを選択的に精製、濃縮できるという点である。その例として、オダらは、エタンジチオール(ethanedithiol)を、脱リン酸化されたペプチドとビオチン(biotin)構造を有するリガンド標識物質を連結するリンカー(linker)として使用した(非特許文献1)。エタンジチオールを通じてリン酸化ペプチドのリン酸化された位置に連結されたビオチン基と相互親和作用するストレプトアビジン(streptavidin)を利用すると、本来リン酸化されていたペプチドだけをペプチド試料から選択的に分離、濃縮できる。また、リンカーに異なる質量の同位元素で置換されたエタンジチオールを使用する場合、これらの同位元素間の質量差を利用して互いに異なる源(source)から得た試料間の相対的な定量も可能である。その以外にも様々な種類のチオール基を含む求核剤がリン酸化ペプチド及びタンパク質を標識するため使用された。
【００１２】
それにも関わらず、時々生体内に極微量で存在する、または部分的リン酸化によって非当量的(substoichiometric amount)に存在するリン酸化タンパク質の分析及びリン酸化部位の効果的分析のためには、より改善された質量分析方法の開発が必要である。
【００１３】
それで、本発明者らは、極微量のリン酸化タンパク質及びタンパク質内のリン酸化されたアミノ酸位置の正確な分析のため、新しい標識物質とそれを利用した分析方法を開発することによって本発明を完成した。
【非特許文献１】Oda,Y.ら、Nature Biotechnology、2001年、第19巻、379-382頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、リン酸化タンパク質を高感度で分析し、タンパク質内のリン酸化位置を効率的に解明するため、リン酸化されたアミノ酸残基を選択的に標識することができる新しい標識物質、前記標識物質を利用してリン酸化タンパク質のリン酸化アミノ酸残基を選択的に標識して分析する方法及びタンパク質のリン酸化程度を相対的に定量する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記目的を達成するため、本発明は 
1)リン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの一つ以上のセリン残基及び/またはスレオニン残基を脱リン酸化(dephosphorylation)する工程;
2)前記工程1の脱リン酸化されたアミノ酸残基をR-L-Gの構造からなるペプチド反応性標識物質(tag)で標識する工程であって、Rは脱リン酸化されたアミノ酸部位と選択的に結合する親核性作用基、Gは陽イオン形成を誘発させる親陽性子性作用基、Lは前記親核性作用基と親陽性子性作用基とを連結させるリンカー(linker)である、工程;及び
3)工程2で標識されたタンパク質またはペプチド誘導体を陽イオン質量分析方法で検出する工程
を含むリン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの質量分析方法またはリン酸化位置分析方法であって、
前記工程2の標識物質に、モノ-N-保護グアニジノ基、ジ-N-保護グアニジノ基、N'-保護グアニジノ基及びアミンが保護されていないグアニジノ基からなる群より選択される基を親陽性子性作用基(G)として使用する、リン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの質量分析方法またはリン酸化位置分析方法を提供する。
【００１６】
また、本発明は、前記分析方法において同位元素で置換された標識物質及び同位元素で置換されていない標識物質を、互いに異なる源(source)から得た一つ以上のペプチド試料に、各々標識反応させて分析することにより、これらの各試料に存在するリン酸化ペプチド間の相対的なリン酸化程度またはリン酸化位置を比較する方法を提供する。
【００１７】
また、本発明は、前記分析方法に使用できる標識反応用標識物質を提供する。
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
本発明は、
1)リン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの一つ以上のセリン残基及び/またはスレオニン残基を脱リン酸化(dephosphorylation)する工程;
2)前記工程1の脱リン酸化されたアミノ酸残基をR-L-Gの構造からなるペプチド反応性標識物質(tag)で標識する工程であって、Rは脱リン酸化されたアミノ酸部位と選択的に結合する親核性作用基、Gは陽イオン形成を誘発させる親陽性子性作用基、Lは前記親核性作用基と親陽性子性作用基とを連結させるリンカー(linker)である、工程;及び 
3)工程2で標識されたタンパク質またはペプチド誘導体を陽イオン質量分析方法で検出する工程
を含むリン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの質量分析方法またはリン酸化位置分析方法であって、
前記工程2の標識物質に、モノ-N-保護グアニジノ基、ジ-N-保護グアニジノ基、N'-保護グアニジノ基及びアミンが保護されていないグアニジノ基からなる群より選択される基を親陽性子性作用基(G)として使用することを特徴とするリン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドの質量分析方法またはリン酸化位置分析方法を提供する。
【００２０】
本発明の分析方法において、前記工程1の分析しようとするリン酸化タンパク質またはリン酸化ペプチドは、臓器の組織、細胞内の組織部位、時間の経過、環境及び栄養状態によって、または疾病の有無及び進行程度によって、各々別に準備することが好ましい。前記準備されたタンパク質は、その大きさに特定の制限がないため、オリゴペプチド(oligopeptide)、ポリペプチド(polypeptide)またはタンパク質がすべて可能である。前記タンパク質は精製の便宜によって、当業者に公知の方法である変性(denaturation)、還元(reduction)、システインアルキル化(cysteine alkylation)または脱糖化(deglycosylation)のような試料前処理過程を経ることができる。また、一般的に知られた方法(例;2D PAGE、アフィニティークロマトグラフィー等)によって全体タンパク質試料は、部分的に分離または精製することができる。
【００２１】
また、高分子量のリン酸化タンパク質は、前記記載された適切な試料前処理後、多様なタンパク質加水分解酵素を利用してより小さい分子量のペプチドに加水分解することが好ましい。一般的にタンパク質をペプチドに加水分解するためには、リジン(lysine)とアルギニン(arginine)のアミド(amide)結合を切断するトリプシン(trypsin)またはリジンとアルギニン位置だけを切断する酵素等を選択的に使用できる。
【００２２】
前記工程1において、前記脱リン酸化は、下記スキーム1で示したβ離脱反応を通じて実施することが好ましい(図1参照)。
2006515674.tif 000003
式中、XがHである場合はセリンであり、CH3である場合にはスレオニンである。
【００２３】
β離脱反応を通じたリン酸化アミノ酸残基の脱リン酸化は、塩基性水溶液または水溶性有機溶媒を一定量含む水溶液を利用して実施することが好ましく、前記塩基性水溶液は、脱リン酸化を誘発させることができる塩基として多様なものを含む。この中で、ヒドロキシド(hydroxide)、メトキシド(methoxide)及びエトキシド(ethoxide)溶液のようなアルコキシド(alkoxide)塩基を含むことがより好ましい。また、前記塩基性反応条件下で意図しないペプチドの分解及び変形を防止し、脱リン酸化反応を促進させるため、追加に反応を触媒できる金属陽イオンを添加することが好ましく、触媒の役割をする添加物として前記金属陽イオンは、第2族陽イオンがより好ましい。前記第2族陽イオンとしては、Mg2+、Ca2+、Sr2+及びBa2+からなる群より選択することが好ましい。
【００２４】
前記第2族金属陽イオンを触媒として使用すると、反応溶液の温度を大きく高めず、強すぎない塩基条件で、DMF(ジメチルホルムアミド)、DMSO(ジメチルスルホキシド)等のような非揮発性極性有機溶媒を使用しなくても、効果的に脱リン酸化反応を進行させることができる。また、非揮発性極性有機溶媒を使用すると、脱リン酸化反応以後に進行される標識物質付加反応の後に実施できるクロマトグラフィーを通じた精製または質量分析過程で、複雑な問題を引き起こす可能性があるため、第2族金属陽イオンを利用した触媒反応で進行させることが好ましい。本発明の好ましい実施例では、β離脱反応を実施するため、塩基性溶液としてはNaOH溶液を使用し、追加的に触媒の役割をする第2族陽イオン溶液としてBaCl2溶液を使用した。
【００２５】
工程1でβ離脱反応によってリン酸化アミノ酸のリン酸基が除去されるため、リン酸化セリンはジヒドロアラニンに、リン酸化スレオニンはβ-メチルジヒドロアラニンに変化する。前記リン酸基が除去された部位は、チオール基を含む標識物質の親核性作用基(求核剤)に対して良好な受容体(receptor)として作用し、以後の付加反応(Michael addition)を通じて、標識物質で標識されたタンパク質またはペプチドに変換される。
【００２６】
また、本発明の分析方法において、前記工程2のR-L-Gの構造を有するペプチド反応性標識物質で標識させる工程は、下記のスキーム2に示した付加反応で進行させるのが好ましい(図1参照)。
2006515674.tif 000004
式中、XがHである場合はジヒドロアラニンであり、CH3である場合にはβ-メチルジヒドロアラニンであり、Tagは標識物質を示す。
【００２７】
前記工程2において、標識物質付加反応に使用するペプチド反応性標識物質(tag)は、脱リン酸化されたアミノ酸部位と選択的に結合する親核性作用基(R)、陽イオン形成を誘発させる親陽性子性作用基(G)及び前記親核性作用基と親陽性子性作用基とを連結させるリンカー(L)が連結されたR-L-Gの構造からなる物質である。前記でペプチド反応性標識物質というのは、標識物質がペプチドと結合または反応できることを示す。
【００２８】
本発明の標識物質は、工程1のβ-離脱反応によってリン酸化アミノ酸の脱リン酸化で生成されたα,β共役系(α,β-conjugate system)部位に付加反応をよく引き起こす強い求核剤として作用できる親核性作用基(R)を含む。親核性作用基は、強い親核性を示す多様な作用基をすべて使用できるが、チオール基を含む求核剤を使用するのが好ましい。本発明の標識物質に使用される親核性作用基であるチオール基は、スルフヒドリル(sulfhydryl)基、スルフヒドリル基の二硫化物(disulfide)または保護(protected)スルフヒドリル基状態で存在できる。
【００２９】
スルフヒドリル(sulfhydryl)基は、標識物質の好ましい形態として次のような構造式で示される:HS-リンカー-NHCNH(NH2)。
【００３０】
スルフヒドリル基の二硫化物は、標識物質の好ましい形態として次のような構造式で示される:(H2N)HNCHN-リンカー-S-S-リンカー-NHCNH(NH2)。
【００３１】
ここで、前記チオール基が一般的に市販される二硫化物(disulfide)状態で存在する場合は親核性がないため、付加反応のためには酸化状態の標識物質を、親核性を有するチオール状態の標識物質に還元させなければならない。このため、本発明では親核性を有しない二硫化物を、リン酸化タンパク質の付加反応直前または付加反応と共に還元させることにより、それ以上の精製過程を行わずに、直ちにチオール求核剤として作用するようにする。ここで、使用する親核性を有しない二硫化物を還元させることができる還元剤は、特別な除去過程なく、そのまま標識物質と共に付加反応に使用するため、付加反応に否定的な影響を及ばしてはならない。したがって、有機還元剤として多く使用されるチオール系の還元剤(例えば、エタンジチオール(ethanedithiol)、メルカプトエタノール(mercaptoethanol)、ジチオスレイトール(dithiothreitol)等)は、これら自体が標識物質のような求核剤として作用するため、還元剤として使用するのは好ましくない。その代わりに、前記要件を満たす還元剤は、トリス(2-シアノエチル)ホスフィン(tris(2-cyanoethyl)phosphine,TCNEP)、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(tris(2-carboxyethyl)phosphine,TCEP)、トリス(ヒドロキシプロピル)ホスフィン(tris(hydroxypropyl)phosphine,THPP)及びトリブチルホスフィン(tributylphosphine,TBP)からなる群より選択された有機ホスフィン系のトリアルキルホスフィン(trialkylphosphine)製剤を使用するのが好ましく、または、これが高分子物質に固定された形態(immobilized form)のものを使用するのが好ましい。また、前記還元剤は、標識物質を還元させるだけではなく、続けて起こる付加反応及び分析過程での標識されたペプチドまたはタンパク質の酸化を防止する機能もする。
【００３２】
さらに、前記二硫化物形態の親核性作用基以外に求核剤のチオール基及びグアニジノ(guanidino)基が、適切な保護基(PG1、PG2)によって保護された形態の親核性作用基を有する標識物質を出発物質として使用することもできる。保護スルフヒドリル基は、標識物質に好ましい形態として次の構造式で示される:PG1-S-リンカー-NHCNH(NH)-PG2。
【００３３】
また、前記保護スルフヒドリル基は、工程2直前または同時に遊離(free)スルフヒドリル基で脱保護されることが好ましく、前記スルフヒドリル基の脱保護は、塩基加水分解(base hydrolysis)または親核性置換(nucleophile displacement)によって行なうことがさらに好ましい。
【００３４】
チオール基、即ちスルフヒドリル基の保護基には、チオエステル(thio ester)、ジチオエステル(dithio ester)、チオエーテル(thio ether)等があり得る。特にチオエステルの場合(例、チオアセテート(thioacetate))は、付加反応条件である塩基性条件で予め脱保護(deprotection)される可能性があるため、別途の活性化過程なしでも付加反応に使用できる長所がある。また、前記構造式でPG2は一般的なグアニジノ(guanidino)保護基として、塩基性で不安定な場合は付加反応前に、酸性条件で不安定な場合は付加反応後に脱保護させることができる。
【００３５】
次に、前記工程2で使用した標識物質を構成する親陽性子性作用基(G)は、陽イオン質量分析過程で標識物質が結合したタンパク質またはペプチドの検出感度を増加させるため、陽イオン形成を誘発させるグアニジノ作用基を使用するのが好ましい。前記グアニジノ作用基は、必要に応じてモノ-N-保護グアニジノ基、ジ-N-保護グアニジノ基及びN'-保護グアニジノ基からなる群より選択することができ、アミンが保護されていないグアニジン(guanidine, -NHCNH(NH2)を使用するのが最も好ましい。
【００３６】
一般的に電子供与体(donor)として作用するアミノ基(-NH2)は、陽イオンの形成を容易にする。したがって、質量分析過程でペプチドの検出感度を増加させる傾向がある。最近、トンプソンらは、アミノエタンチオール(aminoethanethiol)を化学標識物質として使用してリン酸化ペプチドを分析した(Thompson,A.J.ら、Analytical Chemistry、2003年、第75巻、3232-3243頁)。また、リン酸化ペプチドではないC末端がリジン(lysine)である一般非リン酸化ペプチドを分析するのに、リジンの側鎖(side chain)に存在するアミノ基を化学試薬を使用してグアニジノ基に置換することにより、ペプチドの質量分析感度を画期的に増加させた(Hale,J.E.ら、Analytical Biochemistry、2000年、第２８７巻、110-117頁)。
【００３７】
しかし、本発明では、リン酸化ペプチドのリン酸化アミノ酸位を標識するため、グアニジノ基が予め導入された標識物質を使用することにより、この標識物質で標識されたペプチドの陽イオン化傾向が極大化されるようにし、これによってこのペプチドの質量分析感度も大きく増加されるようにするのが大きい特徴である。
【００３８】
また、強い求核剤として作用するチオール基と強い親陽性子性作用基であるグアニジノ基は、適当な大きさ及び構造を有するリンカー(linker, L)で互いに連結することが好ましい。前記リンカーは、多様な構造を含むことができるが、基本的に炭化水素(hydrocarbon)、エチレンオキシド(ethylene oxide)、ペプチド(peptide)等の基本骨格を含み、標識されたペプチドの分離、分析技法によって多様に選択できる。
【００３９】
また、親陽子性作用基であるグアニジノ基と連結されたリンカー部分は、リン酸化ペプチドの相対的定量のため、安定した同位元素(stable isotope)で標識物質を置換させる空間を確保してくれる。例えば、同位元素的に置換された部分を含むリンカーで標識物質を構成することにより、化学的な差がなく、ただ標識物質の質量差に起因したマススペクトル上の一定の質量差を示すことができるため、リン酸化タンパク質の相対定量を容易にする。安定した同位元素としては、2H、13C、15N、17O、18O及び34Sからなる群より選択されるものを使用するのが好ましい。リン酸化ペプチドに対する高感度質量分析のためには、リンカーの大きさ(質量)は大きすぎてはならず、付加反応に立体因子(steric factor)等の否定的作用が少なく、付加反応等の反応条件及び質量分析条件で化学的に安定していなければならない。
【００４０】
本発明の分析方法において、最大の特徴は、前記工程2の標識物質にモノ-N-保護グアニジノ基、ジ-N-保護グアニジノ基、N'-保護グアニジノ基及びアミンが保護されていないグアニジノ基で構成されたグアニジノ基から選択される親陽性子性作用基(G)であることを特徴とする標識物質を使用することである。前記標識物質は、グアニジノアルカンチオール(guanidinoalkanethiol)またはグアニジノエタンチオール(guanidinoethanthiol)を使用するのが好ましい。本発明の標識物質は、前記標識物質を直接合成するか購入して使用してもよく、前記標識物質の前駆体を使用して還元反応または脱保護反応を実施して製造した標識物質を使用しても構わない。前記標識物質の前駆体としては、グアニジノアルカンジスルフィド(guanidinoalkanedisulfide)またはグアニジノアルキルチオエステル(guanidinoalkyl thioester、例えば、アルキル-CO-S-(CH2)nNHCNH(NH2)またはアリール-CO-S-(CH2)nNHCNH(NH2))であるのが好ましい。本発明の標識物質としては、グアニジノエタンチオール(GET)を使用するのがより好ましい。本発明の好ましい実施例では、前駆体としてグアニジノエタンジスルフィド(guanidinoethanedisulfide, GEDS)を反応溶液上で還元剤で還元させた後、製造されたグアニジノエタンチオール(GET)を標識物質に使用した。前記グアニジノエタンチオールのチオール基は、一般的なチオール試薬と同様、空気に露出した場合、簡単にグアニジノエタンジスルフィド(guanidinoethanedisulfide, GEDS)に酸化される。
【００４１】
本発明の方法で使用したリン酸化されたペプチドの標識のため使用した標識物質を含む試薬は、標識反応後に別途の除去過程なしに質量分析を実施でき、必要に応じて多様なクロマトグラフィーで精製後分析を進行することもできる。標識物質を含む標識反応に使用した試薬は、無機物であるか極性が大きくて水溶性であるため、例えば、逆相クロマトグラフィーに基づいた多様な分析技法を利用すると、ペプチドから簡単に標識物質を含む過剰量の反応試薬を除去できる。
【００４２】
また、本発明の分析方法において、脱リン酸化されたペプチドに対する標識物質の付加反応は、脱リン酸化反応と同一の条件下でも良好に進行されるため、脱リン酸化反応(工程1)と同時に脱リン酸化されたペプチドに対する標識物質の付加反応(工程2)を進行させるのが好ましい。
【００４３】
本発明の分析方法において、前記工程3の標識物質で標識されたペプチドを検出する工程は、公知のクロマトグラフィー及び質量分析方法を利用して分析するのが好ましい。ここで、比較しようとする各々の互いに異なる試料に化学的には同一であるが、ただ質量数だけが異なる安定した同位元素で置換された標識物質(stable isotopically labelled tag)を使用して試料各々を標識した後、両試料を合わせて質量分析を実施すると、一定の質量差を有する対で表れるピーク(peak)を得られ、このピークの強度(intensity)から各々の試料に存在するリン酸化ペプチドを相対的に定量することもできる。
【００４４】
リン酸化タンパク質を酵素を使用して加水分解を実施すると、リン酸化ペプチドは、リン酸化アミノ酸残基がない一般ペプチドとの混合物として存在するようになる。このような状態でも標識化反応を実施することもできるが、分析データの複雑性を減らす等の必要に応じて、リン酸化ペプチドから固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(immobilized metal affinity chromatography, IMAC)等のような多様な方法によって非リン酸化されたペプチドを除去した後、リン酸化ペプチドだけで標識化反応を実施することができる。前記方法は、リン酸化タンパク質に対する分析過程において質量分析を実施する前に適用され、従来のペプチドの分離、精製及び分析に適用されるクロマトグラフィー、アフィニティー濃縮法(affinity enrichment)、質量分析(mass analysis)、MS/MSペプチド配列分析(peptide sequencing)等の多様な技法と共に活用される。
【００４５】
化学Tagにビオチン(biotin)等のような特定親和相互作用ができる作用基を導入すると、Tagで標識されたペプチドだけを選択的に分離、濃縮できる。Tagに蛍光染色剤(fluorescent dye)を導入した蛍光Tagを利用すると、標識されたペプチドの高感度分光学的検出及び定量も可能である。
【００４６】
リン酸化ペプチドのリン酸基を除去してその位置に陽イオン化を促進できる能力がある作用基を含んだ化学Tagを導入することにより、酸性のリン酸基に起因して陽イオン質量分析過程で表れる試料のイオン化抑制効果による分析感度低下現状が克服され、さらに特定の質量数の変化からリン酸化位置分析も容易にできる。
【００４７】
また、本発明は、前記分析方法で同位元素で置換された標識物質及び同位元素で置換されていない標識物質を、互いに異なる源(source)から得た一つ以上のペプチド試料に各々標識反応させて分析することにより、これらの各試料に存在するリン酸化ペプチド間の相対的なリン酸化程度またはリン酸化位置を比較する方法を提供する。
【００４８】
本発明の方法は、互いに異なる源(source)がら得た試料間の定量的比較または互いに異なる発現状態を有する試料間の相対的定量等に有用に応用することができる。即ち、各々互いに異なる質量数を有する安定した同位元素で置換されたTagを利用し、互いに異なる二つの試料を各々ペプチド標識させた後、二つの試料を混ぜて合わせた試料に対して質量分析等を実施することにより、互いに異なる臓器組織間の、互いに異なる細胞内部の組織部位間の、発現時間の経過による、互いに異なる環境または栄養状態による、疾病の有無及び進行状態によるタンパク質の翻訳後修飾状態の差異を相対的に定量できる。化学的な差がなく単にTagの質量差に起因した質量スペクトル上の差のみを誘導できる同位元素の例としては、2H、13C、15N、17O、また34S等が挙げられ、これらの互いに異なる同位元素で置換された標識物質は、Tagの構造によって一定の質量差を示す。
【００４９】
したがって、本発明の分析方法は、互いに異なる臓器組織、互いに異なる細胞内下位構造体において、発現時間の経過による、互いに異なる環境または栄養状態による、疾病の有無及び進行状態による、タンパク質の翻訳後修飾の程度の差異を追跡するのに応用できる。また、本発明の分析方法は、タンパク質のリン酸化状態に影響を及ぼす物質を同定するための研究にも適用でき、それによって多様な疾病の診断及び治療剤開発研究に応用できる。
【００５０】
また、本発明は、前記分析方法に使用できる標識反応用標識物質を提供する。
【００５１】
本発明の標識反応用標識物質は、グアニジノアルカンチオールまたはグアニジノエタンチオールを使用するのが好ましく、前記標識物質の前駆体であるグアニジノアルカンジスルフィドまたはグアニジノアルキルチオエステルを使用して還元反応または脱保護反応を実施して製造した標識物質を使用するのが好ましい。本発明の標識物質は、グアニジノエタンチオールがより好ましい。
【００５２】
本発明で製造した標識物質試薬及びそれを利用したリン酸化タンパク質のリン酸化位置分析方法は、多様なタンパク質においてリン酸化状態を把握するのに効果的に使用できる。特に、不安定なリン酸基を除去する代わりに、相対的に安定して陽イオン質量分析での感度を増加させることができる標識物質を導入させたため、標識されたペプチドのMS/MS配列分析を容易にするのみならず、質量分析感度も大きく増加させる。また、標識物質の導入によるリン酸化ペプチドにおける特徴的な質量の変化は、非リン酸化ペプチドからリン酸化ペプチドを容易に区別できるようにする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。但し、下記実施例は、本発明の例示にすぎず、本発明は下記実施例に限定されない。
【実施例】
【００５４】
<実施例1> 試料調製
分析しようとする標準タンパク質またはタンパク質抽出物は、精製の便宜のため公知の方法によって試料前処理過程を経た。詳細には、タンパク質試料は、6M塩酸グアニジン(guanidine hydrochloride)で変性(denaturation)させ、TCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine)・HClを加えて37℃で1時間反応させてシステイン(cysteine)位置の二硫化物結合(disulfide bonde)を還元させた。また、タンパク質に存在できるO-連結オリゴ糖(O-linked oligosaccharide)は、塩基性の標識反応条件でリン酸基のようにβ離脱化反応を起こすことができるため、O-グリカナーゼ(O-glycanase)等を使用して標識反応前に予め除去した。しかし、本発明で標準タンパク質として使用した配列番号:1に記載されるβ-カゼイン(β-casein)の場合、O-連結オリゴ糖が存在するにも関わらず、最適化された標識反応条件でO-連結オリゴ糖の離脱化副反応は観察されなかった。還元されたシステインの位置は、ヨードアセトアミド(iodoacetamide)等のアルキル化試薬を使用して保護(blocking)するかまたは過ギ酸(performic acid)を使用して酸化させた。使用した過剰量の試薬は、ゲル濾過(gel filtration)または透析(dialysis)等の方法で除去し、トリプシン(trypsin)等の加水分解酵素を使用してタンパク質を切断した(digestion)。バリウム(barium)陽イオンを触媒に使用してヒドロキシド(hydroxide)イオンを塩基として使用して標識反応を実施した。また、標識反応を実施する前に、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(immobilized metal affinity chromatography, IMAC)方法でリン酸化ペプチドだけを濃縮した後、標識反応を実施することもできる。
【００５５】
<実施例2> 標識化反応 
グアニジノエタンチオール(guanidinoethanethiol、以下「GET」と略称する)20μmolを蒸溜水30μlに溶解して標識試薬溶液を準備した。または、標識試薬としてGETの二硫(disulfide)前駆体を使用する場合には、GEDS・2HCl (guanidinoethanedisulfide 2hydrochloride)10μmolを蒸溜水10μlに溶解した後、TCNEP(tris(2-cyanoethyl)phosphine)(500mM)20μlを加え、45℃で約30分間放置して前駆体を活性化させた後、標識試薬溶液として使用した。前記実施例1で前処理したタンパク質試料を真空乾燥した試料ペプチド(約20μl)を蒸溜水13μlに溶解した後、これを前記で準備した標識試薬溶液43μlと混合した。前記混合した溶液に5.0N NaOH溶液6μl、1.0M BaCl2溶液2μlを続けて加え、45℃で約2〜3時間反応させた。前記反応溶液の温度を5℃以下に冷却し、1.0%酢酸水溶液を加えて中和させた。0.1%酢酸またはトリフルオロ酢酸(trifluoroacetic acid)水溶液で適切に希釈してペプチドの分析を進行した。
【００５６】
<実施例3> GET(グアニジノエタンチオール)で標識されたペプチドの分析 
液体クロマトグラフィー/マトリックス補助レーザー脱着イオン化質量分析法(Liquid chromatography/The matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry、以下「LC/MALDI MS」と略称する)及び液体クロマトグラフィー/電子噴霧イオン化質量分析法(Liquid chromatography/The electrospray ionization mass spectrometry,LC/ESI MS)等は、標識されたペプチドの分析に非常に有用である。標識反応に使用したすべての試料は、小さい分子量で極性が非常に大きい有機物質かまたは無機塩であるため、逆相クロマトグラフィー法を応用して標識ペプチド試料を精製することができる。続いて、ペプチド誘導体を濃度勾配溶出法(gradient elution)を利用して直ちにESI質量分析機に導入して質量分析を実施するか、またはMALDI試料プレートに連続的にローディング(loading)することによって質量分析(mass spectrometry, MS)及びMS/MS分析を実施できる。試料の精製及び分離のために、LCパッキング社のLCパッキングプロボト(Packings Probot)をLCパッキングウルチメートマイクロ-キャピラリー(Packing Ultimate micro-capillary)HPLCシステムに連結し、試料を連続的にMALDIプレートにローディングした。その後、AB 4700 プロテオミクス分析機(AB 4700 Proteomics Analyzer)(Applied Biosystems,Framingham,MA,米国)を使用してMALDI TOF/TOF(time-of-flight/time-of-flight)質量分析を実施した。
【００５７】
その結果、配列番号:1に記載のリン酸化タンパク質β-カゼイン(β-casein)をトリプシンで加水分解した後に得たリン酸化ペプチド(FQSPEEQQQTEDELQDK,SPは、リン酸化セリン(phosphoserine)を示す)をGET-TAGで標識した場合(図2b、m/z 2083.0002ピーク)は、GET-TAGで標識していないペプチド(図2a、m/z 2062.0083ピーク)に比べて質量数が21ほど増加して検出された。したがって、このような特定のペプチドの質量値の変化は、非リン酸化ペプチドからリン酸化ペプチドを区別するのに非常に有用であることが分かる。
【００５８】
また、リン酸化ペプチドに対して標識化反応を実施せず、10pmolの試料を使用して分析したもの(図2a)と、標識化反応後1pmolの試料を使用して分析したもの(図2b)を比較した結果、標識化反応を実施して分析した場合の方がより少ない試料を使用して分析したにも関わらず、ピークの強度は非常に大きく増加した。これを通じて、本発明の分析方法は、ペプチドに対する検出感度を大きく増加させることが分かる。
【００５９】
また、リン酸化セリンが標識化反応によってグアニジノエチルシステイン(guanidinoethylcysteine、以下「GEC」と略称する)に変わるにつれて、GECの断片イオン(fragment ion)に相当するm/z 188.0の質量差程度のb2ピークとb3ピーク間隔が現れるのを確認した(図3)。したがって、MS/MS分析法を通じてペプチド内部のリン酸化位置を容易に解明できることが分かる。
【００６０】
また、他のリン酸化タンパク質である配列番号:2に記載のα-カゼインのリン酸化ペプチド(VPQLEIVPNSPAEER)をMS/MS分析した結果、GECの断片イオンに相当するm/z 188.0の質量差程度のy4ピークとy5ピーク間隔が現れるのを確認した(図4)。
【００６１】
以上の例から分かるように、本発明を通じて開発された新しい標識物質及びその標識化方法は、リン酸化ペプチドの高感度分析と、ペプチド内部のリン酸化アミノ酸位置の正確な解明において非常に有用な方法であることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
前記で詳しく述べたように、本発明の分析方法及びそれに使用した標識物質は、生体内のタンパク質のリン酸化状態及びリン酸化程度を効果的に分析するのに有用であり、多様な疾病の診断及び治療剤の開発等に応用することができ、タンパク質の生体内での役割等をより詳しく理解するのに寄与しうる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】ホスホセリン(phosphoserine)(X=H)及びホスホスレオニン(phosphothreonine)(X=CH3)の脱リン酸化を誘発するβ離脱反応(β-elimination)及び標識物質付加反応(Michael addition reaction)を通じたリン酸化ペプチドの標識化過程を示した模式図である。
【図２ａ】配列番号:1に記載のβ-カゼイン(casein)一リン酸化ペプチド(monophosphopeptide)(10pmol)のマススペクトル(mass spectrum)である(この時、前記ペプチドの3番目の残基であるセリンがリン酸化)。
【図２ｂ】配列番号:1に記載のβ-カゼイン一リン酸化ペプチド(1pmol)を脱リン酸化させて標識物質で標識させた試料のマススペクトルである(この時、前記ペプチドの3番目の残基であるセリンが脱リン酸化及び標識化)。
【図３】配列番号:1に記載のβ-カゼイン一リン酸化ペプチドを脱リン酸化させ、GET(guanidinoethanethiol)で標識させた試料のMS/MSスペクトルである(この時、GECは前記GETと脱リン酸化されたセリン残基が結合して生成されるグアニジノエチルシステイン(guanidinoethylcysteine)を示す)。
【図４】配列番号:2に記載のα-カゼイン一リン酸化ペプチドを脱リン酸化させ、GETで標識させた試料のMS/MSスペクトルである(この時、GECは前記GETと脱リン酸化されたセリン残基が結合して生成されるグアニジノエチルシステインを示す)。
【配列表】
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【図１】
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【図２ａ】
2006515674.tif 000008
【図２ｂ】
2006515674.tif 000009
【図３】
2006515674.tif 000010
【図４】
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【国際調査報告】
2006515674.tif 000012
2006515674.tif 000013