(57)【要約】本発明は治療用タンパク質および核酸の送出を調節する方法およびシステムを提供する。具体的には、本発明は、治療用遺伝子配列に作用可能にリンクされる遺伝子操作電気的反応性プロモーターを使用することを含み、該配列の発現は電気パルス発生器により制御される。
2004516274.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の組織中の遺伝子操作細胞に作用可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）結合する電気パルス発生器を備える治療用送出システムであって、前記遺伝子操作細胞は、電気的反応性プロモーターに作用可能に結合される標的遺伝子をさらに備える治療用送出システム。
【請求項２】
前記電気パルス発生器は閾下刺激を供給する、請求項１に記載の治療用送出システム。
【請求項３】
前記電気パルス発生器は閾刺激を供給する、請求項１に記載の治療用送出システム。
【請求項４】
前記電気パルス発生器は、取り付けられた電極から前記組織に刺激を供給する、請求項１に記載の治療用送出システム。
【請求項５】
前記電気パルス発生器は、電極を取り付けることなく、時間変化する磁界により誘導される渦電流を用いて前記組織に刺激を供給する、請求項１に記載の治療用送出システム。
【請求項６】
前記電気パルス発生器は、電極を取り付けることなく、体外から印加される時間変化する電界により誘導される変位電流を用いて前記組織に刺激を供給する、請求項１に記載の治療用送出システム。
【請求項７】
前記電気パルス発生器はペースメーカーである、請求項１に記載の治療用送出システム。
【請求項８】
前記電気パルス発生器は埋め込まれる、請求項１に記載の治療用送出システム。
【請求項９】
前記電気パルス発生器は体外にある、請求項１に記載の治療用送出システム。
【請求項１０】
前記電気パルス発生器は体外から制御される、請求項１に記載の治療用送出システム。
【請求項１１】
前記電気的反応性プロモーターは、コード配列（ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）とは異種の電気的反応性エンハンサー要素を含む、請求項１に記載の治療用送出システム。
【請求項１２】
前記電気的反応性プロモーターは、プロモーター配列とは異種の電気的反応性エンハンサー要素を含む、請求項１に記載の治療用送出システム。
【請求項１３】
前記電気的反応性プロモーターは閾下刺激に対して反応する、請求項１に記載の治療用送出システム。
【請求項１４】
前記電気的反応性プロモーターは閾刺激に対して反応する、請求項１に記載の治療用送出システム。
【請求項１５】
前記電気的反応性プロモーターは、ＡＮＦ  ５’非コード領域から選択される電気的反応性エンハンサー要素を含む、請求項１に記載の治療用送出システム。
【請求項１６】
前記電気的反応性プロモーターは、組織特異的プロモーターに作用可能にリンクされるＥＲＥを備える、請求項１に記載の治療用送出システム。
【請求項１７】
前記プロモーターは心特異的プロモーターである、請求項１に記載の治療用送出システム。
【請求項１８】
前記プロモーターは、ＡＮＦプロモーター、α−ＭＨＣ５．５プロモーター、α−ＭＨＣ８７プロモーター、およびヒト心臓アクチンプロモーターからなる群から選択される、請求項１７に記載の治療用送出システム。
【請求項１９】
前記プロモーターは腎特異的プロモーターである、請求項１に記載の治療用送出システム。
【請求項２０】
前記プロモーターは脳特異的プロモーターである、請求項１に記載の治療用送出システム。
【請求項２１】
前記プロモーターは、アルドラーゼＣプロモーター、およびチロシンヒドロキシラーゼプロモーターからなる群から選択される、請求項１に記載の治療用送出システム。
【請求項２２】
前記プロモーターは血管内皮特異的プロモーターである、請求項１に記載の治療用送出システム。
【請求項２３】
前記電気的反応性プロモーター、またはそのフラグメントは、ＡＮＦ、ＶＥＧＦ、アセチルコリン受容体、トロポニン、ＮＯＳ３、シトクロムｃ、ＣＯＸ、ＣＰＴ−１、ｈｓｐ７０、およびｓｋｍ２からなる群から選択される、請求項１に記載の治療用送出システム。
【請求項２４】
前記遺伝子操作細胞は哺乳類細胞である、請求項１に記載の治療用送出システム。
【請求項２５】
前記遺伝子操作細胞はＣ２Ｃ１２の群から選択される、請求項１に記載の治療用送出システム。
【請求項２６】
前記コード配列は、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）、Ｂｃｌ−２、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、およびカタラーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の治療用送出システム。
【請求項２７】
電気的反応性エンハンサー要素、該要素とは異種の組織特異的プロモーター、およびコード配列を備える発現ベクターであって、前記プロモーターは前記コード配列に作用可能にリンクされ、前記要素は前記コード配列の発現を引き起こすのに有効である発現ベクター。
【請求項２８】
前記発現ベクターはプラスミドである、請求項２７に記載の発現ベクター。
【請求項２９】
前記発現ベクターはアデノウィルスベクターである、請求項２７に記載の発現ベクター。
【請求項３０】
前記発現ベクターはレトロウィルスベクターである、請求項２７に記載の発現ベクター。
【請求項３１】
前記コード配列はウィルス性チミジンキナーゼコード配列である、請求項２７に記載の発現ベクター。
【請求項３２】
前記ウィルス性チミジンキナーゼコード配列は単純ヘルペスウィルス性チミジンキナーゼをコードする、請求項３１に記載の発現ベクター。
【請求項３３】
前記コード配列はルシフェラーゼをコードする、請求項２７に記載の発現ベクター。
【請求項３４】
上側プレート電極、下側プレート電極、および動作中に前記上側プレート電極と前記下側プレート電極の間に配置される多孔質膜を備える、細胞を試験する装置。
【請求項３５】
前記上側プレート電極は前記下側プレート電極と同じサイズである、請求項３４に記載の装置。
【請求項３６】
前記下側プレート電極は前記多孔質膜のための収容手段を形成する、請求項３４に記載の装置。
【請求項３７】
前記多孔質膜は前記上側プレート電極と下側プレート電極の間に細胞を支持する、請求項３４に記載の装置。
【請求項３８】
パルス発生器に作用可能に結合される、請求項３４に記載の装置。
【請求項３９】
患者を治療する方法であって、患者組織中の遺伝子操作細胞に作用可能に結合される電気パルス発生器を前記患者に取り付けることを含み、前記遺伝子操作細胞は、電気的反応性プロモーターに作用可能に結合される標的遺伝子をさらに備える方法。
【請求項４０】
患者組織中で遺伝子操作細胞に作用可能に結合される電気パルス発生器を前記患者に取り付ける方法であって、前記遺伝子操作細胞は、電気的反応性プロモーターに作用可能に結合される標的遺伝子をさらに備える方法。
【請求項４１】
遺伝子操作細胞は前記患者組織に移植される、請求項１、３９または４０のいずれかに記載の遺伝子操作細胞。
【請求項４２】
遺伝子操作細胞は前記患者組織の細胞をトランスフェクトすることにより得られる、請求項１、３９または４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
トランスフェクトされる組織は独立に、上皮組織、内皮組織、または中胚葉組織から選択される、請求項１、３９または４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、多能性幹細胞、中胚葉性幹細胞、筋芽細胞、繊維芽細胞、心筋細胞、コリン作動性ニューロン、アドレナリン作動性ニューロン、およびペプチド作動性ニューロン、グリア細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞、血管内皮細胞、滑膜細胞、腺房細胞、肝細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨原芽細胞（ｏｓｔｅｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）、髄核細胞、ならびに椎間板の細胞からなる群から独立に選択される、請求項１、３９または４０のいずれかに記載の遺伝子操作細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、治療用産物の生成を制御し調節する新規なシステム、コンポーネント、および方法を提供する。より具体的には、本発明は、治療的に有益な産物を生成する電気パルス発生器に作用可能に結合される電気的反応性プロモーターと、それに関係するデバイスとを提供する。
【０００２】
［発明の背景］
長い間にわたり、治療用タンパク質を外因的に産生するために、いくつもの組み換えシステムが開発されている。組み換えにより産生されたタンパク質が単離および精製された後、全身的に患者に送出された。この手法により、いくつかの重要な治療用タンパク質（例えば、エリスロポエチン、インターフェロン、インスリン）の送出がなされたが、一般的に適用可能な手法となることはできなかった。その最も大きな理由は、タンパク質の安定性に関連する問題である。局所的なタンパク質または遺伝子の送出のための流体送出システム（カテーテル、シリンジ）に的を絞ることによってこの問題に取り組んできた人々もいる。細胞移植を用いて治療的に有益な産物のｉｎ  ｖｉｖｏ送出を実現しようとしてきた人々もいる。また、ｉｎ  ｖｉｖｏで所望の治療用遺伝子またはタンパク質を直接産生するためにウィルスによる遺伝子送出システムを開発してきた人々もいる。
【０００３】
この目的のため、多くの細胞型において効果的に遺伝子を導入し発現させるために、組み換えベクターおよびウィルスが開発されてきた。遺伝子治療の成功のための要件には、安定かつ安全なベクター、長期発現を促進する要素、ならびに標的治療用産物の用量および持続時間を制御する目的で当該遺伝子の発現を調節する能力がある。遺伝子送出の分野では広範な研究が続けられているが、遺伝子発現をｉｎ  ｖｉｖｏで制御し調節する方法はほんのわずかしか報告されていない。
【０００４】
遺伝子の上流に見出され、相異なる生理的条件下でその遺伝子の発現を調節する固有のＤＮＡ配列を研究者たちは利用してきた。薬理学に基づく遺伝子発現の制御に集中したいくつかのプロトコールが発表されている。一般に、これらの方法の基礎は、ＤＮＡプロモーター配列の活性化を制御する薬剤の存在に依存している。この例として、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから市販されているＴｅｔ−Ｏｎ／Ｔｅｔ−Ｏｆｆ遺伝子発現システムがある。テトラサイクリンまたはドキシサイクリンの有無が、遺伝子発現を開始させる原因となるプロモーターを活性化させる。活性化薬剤の投与は一般に、転写に影響する薬剤を作用部位に送出しようとして全身的に行われる。遺伝子発現を誘導するには技術的に有効であるが、ｉｎ  ｖｉｖｏでの薬剤の全身的投与は、周辺の組織に望ましくない副作用または毒性を生じる可能性がある。さらに、ある期間（しばしば数日間）にわたって薬剤が体内に存在するため、遺伝子プロモーター配列の調節は、活性化剤が与えられた時点からそれが体外に除去されるまで、密に結合されない。
【０００５】
本発明までは、治療用遺伝子産物の制御された送出は、患者において電気デバイスを介して調節されたことはなかった。本発明においては、所与の治療用産物の時間、頻度、および送出量を精密に調整し、送出の位置を精密に確定するために、電気パルス発生器（例えばペースメーカー）が使用される。本発明のもとでは、電気的反応性プロモーター要素を受容した遺伝子操作細胞を含む組織が、電気刺激を受けるとすぐに治療用産物の発現を指令する。本発明は、哺乳類の組織に移植されたか、あるいは組み込まれた電気的反応性プロモーター（ＥＲＰ）の発現を制御する手段として、（電気パルス発生器により供給される）電気刺激を利用する新規なシステムを記載する。当該標的遺伝子は、電気刺激を精密に調節する能力によって制御された発現を提供するために、電気的反応性プロモーター配列に作用可能にリンクされる。ＥＲＰ遺伝子コンストラクトは、培地で成長した細胞に標準的な遺伝子トランスフェクション方法により送出され得た後に患者に移植されるか、または適当な遺伝子送出ベクター（ウィルス性または非ウィルス性）の使用によりｉｎ  ｖｉｖｏで組織または細胞に直接送出されることが可能である。その後、トランスフェクトまたは移植された細胞内の電気的反応性プロモーターを確定した位置で電気的に刺激するために、パルス発生器に作用可能に結合される埋め込み可能な電極を使用することが可能であり、その結果、作用可能にリンクされるＤＮＡ配列の制御された発現がもたらされる。
【０００６】
［発明の概要］
本発明は、治療的に重要な産物の制御された局所的送出に関して従来技術に存在する問題点を解決するいくつかの目的を有する。本発明のさまざまな実施形態は、治療用産物の送出に関して従来技術に存在する１つまたは複数の問題点に対する解決法および利点を提供する。それぞれの実施形態に対して、本発明は、本明細書で教示され、あるいはさらに例示される１つまたは複数の具体的特徴を提供する。
【０００７】
本発明は、治療的に有益な遺伝子またはタンパク質産物の産生のための新規な電気的反応性システムを提供する。もう１つの態様では、本発明は、産物を開発するだけでなく、既存の産物のための新しい送出手段を提供する。
【０００８】
本発明はまた、電気的反応性プロモーター要素を必要としている患者内のパルス発生器にリンクされる電気的反応性プロモーター要素も提供する。一態様では、本発明は、治療用タンパク質の送出手段を提供することにより、組織傷害を減らし、または修復する方法を含む。送出システムは、虚血性傷害のような組織傷害を修復するのに有効である。本方法は、電気的反応性プロモーターに作用可能にリンクされる治療用遺伝子を提供することによって、損傷した心組織、腎組織、脳組織、または内皮組織に適用され得る。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、細胞内の治療用遺伝子の転写を制御するためにプロモーターに作用可能にリンクされる電気的反応性要素を含むキメラ遺伝子を少なくとも１つの細胞に導入する方法を提供する。ここで電気的反応要素は、治療用産物を産生するために電気刺激にさらされると治療用遺伝子の遺伝子発現を調整することが可能である。
【００１０】
本発明はまた、送出システムも提供する。この送出システムによれば、電気刺激の配置を統制する（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ことにより、治療用作用物質が標的組織の位置に送出される。本発明はまた、電気的反応性プロモーターを含む細胞の配置を統制することにより、治療用産物の直接送出を実現する。
【００１１】
一態様では、電気的反応性システムは、遺伝子に作用可能にリンクされる電気的反応性プロモーター要素を含む遺伝子操作細胞に作用可能に結合される電気パルス発生器を提供する。一特徴では、パルス発生器は、一定期間の閾下刺激を標的組織に供給することが可能である。
【００１２】
一実施形態では、本発明は、治療的に有益な遺伝子およびタンパク質配列の制御された発現のために細胞を刺激することが可能なシステムを提供する。関連態様では、本発明は、治療用遺伝子とは異種の電気的反応要素を含むキメラ遺伝子を含む。別法として、電気的反応要素はプロモーターとは異種である。いずれの場合でも、電気的反応要素は、治療用遺伝子の発現を効果的に調整するために、プロモーターに作用可能にリンクされる。本方法は、さまざまな細胞型および対応するプロモーターとともに使用され得る。好ましい一実施形態では、細胞は筋細胞であり、より好ましくは、心筋または骨格筋細胞である。本発明の別の態様は、発現ベクターで運ばれる上記のキメラ遺伝子を含む。発現ベクターは、プラスミド、アデノウィルスベクター、レトロウィルスベクターなどであってよい。
【００１３】
他の実施形態では、本発明は、電気的反応性プロモーターを試験し発見するための新規な試験デバイスおよび方法を提供する。
【００１４】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の詳細な説明を添付図面とともに読むときに、さらに十分に明らかとなるであろう。
【００１５】
添付図面は本発明のいくつかの実施形態を図示する。それらは単に例示であり、本明細書に別途に開示されている本発明を限定するものではない。
【００１６】
［配列の簡単な説明］
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は、ｐＡＮＦ−６３８ＬｕｃのＡＮＦプロモーター領域のヌクレオチド配列である。
【００１７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２は、ラットαＭＨＣプロモーターフラグメントのヌクレオチド配列である。
【００１８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３は、ＧＡＴＡ４エンハンサー要素のセンス鎖のヌクレオチド配列である。
【００１９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４は、ラット心臓α−ミオシン重鎖プロモーター領域フラグメントのヌクレオチド配列である。
【００２０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５は、マウス心臓α−ミオシン重鎖プロモーター領域のヌクレオチド配列である。
【００２１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６は、ヒト心臓アクチンプロモーター領域のヌクレオチド配列である。
【００２２】
［発明の詳細な説明］
定義
分子および細胞生物学
「遺伝子操作細胞（複数可）」という用語は、細胞に意図的に導入された、確定した核酸のセグメントを有する細胞を指す。「遺伝子操作細胞」という用語は、特に指示されない限り、核酸の導入の手段によって限定されることを意味しない。
【００２３】
「宿主細胞」とは、外因的に提供される電気的反応要素に作用可能にリンクされる遺伝子を発現させるのに適した任意の真核または原核細胞を指す。電気的反応要素は、培地中の細胞または標的組織に見出される細胞のいずれの形質転換またはトランスフェクションによっても提供され得る。
【００２４】
「単離された核酸複合体」とは、どのように構成または合成されたものであろうとも、その自然な場所から取り出された任意のＲＮＡまたはＤＮＡ配列を指す。
【００２５】
本明細書で用いられる「成熟タンパク質」または「成熟ポリペプチド」という用語は、哺乳類細胞において発現により産生されるタンパク質の形態（複数可）を指す。一般的な仮説であるが、粗面小胞体を通って成長中のタンパク質鎖の移出が開始された後、哺乳類細胞により分泌されるタンパク質はシグナル配列を有し、これが完全ポリペプチドから切断されて、タンパク質の「成熟」形態を産生する。しばしば、分泌タンパク質の切断は一様でなく、複数種の成熟タンパク質を生じることがある。分泌タンパク質の切断部位は、完全タンパク質の一次アミノ酸配列によって決まり、一般に完全な精度で予測することはできない。しかし、分泌タンパク質の切断部位は、そのタンパク質の精製された調製品中に見出される１種または複数種の成熟タンパク質のアミノ末端シーケンシングにより実験的に決定可能である。
【００２６】
「作用可能にリンクされる」という用語は、本明細書で用いられる場合、遺伝子の調節領域（通常はプロモーター要素であるが、エンハンサー要素を含むこともある）とコード領域との間にあり、そのためコード領域の転写が調節領域の制御下にあるという関係を示す。本明細書で用いられる場合、「作用可能にリンクされる」とは、リンクされているコンポーネントの転写機能が実行されることが可能であるような、転写調節要素の並置を指す。したがって、コード配列に「作用可能にリンクされる」ＥＲＰプロモーター配列とは、プロモーター配列が電気刺激時に遺伝子配列の発現を促進する（または、負の調節要素の場合には発現を抑制する）ような配置を指す。
【００２７】
「作用可能に結合される」とは、電気パルス発生器による組織への電気刺激の転移を指す。本発明の遺伝子操作細胞に作用可能に結合されるパルス発生器とは、電気刺激が遺伝子操作細胞を含む組織領域に送出され、作用可能にリンクされる治療用産物の発現を引き起こすような配置を指す。通常、刺激はパルス発生器からリード線を通り組織に取り付けられた電極に送出される。
【００２８】
「電気的反応性プロモーター」すなわち「ＥＲＰ」は、電気刺激の送出時に細胞内の作用可能にリンクされる治療用産物の転写を調整する遺伝子操作された電気的反応性要素を含むプロモーターである。転写の調整は正または負のいずれでもよく、経時による相対転写量を、非刺激細胞に比べて２、４、６、１０、２０、５０、１００、または１０００倍にちょうどもしくは略等しいかまたはそれより大きい量だけ、１、２、４、８、１６、２４、４８、または７２時間にわたり変化させ得る。一実施形態では、ＥＲＰプロモーターはＡＮＦプロモーターである。
【００２９】
「プロモーター」という用語は、転写（例えばＤＮＡからＲＮＡへの）を指令する核酸配列を指す。本明細書で述べるように、プロモーターは、転写を促進させる５’フランキング配列を含む。プロモーターはいくつかの調節配列を含み得る。構成性プロモーターは一般に一定レベルで作用し（ｏｐｅｒａｔｅ）、調節可能でない。本発明のＥＲＰプロモーターは電気刺激により誘導され得る。
【００３０】
本明細書で用いられる「組み換えＤＮＡクローニングベクター」とは、その中に１つまたは複数の追加ＤＮＡセグメントが組み込まれ得る、または組み込まれた、ＤＮＡ分子を含む任意の自律的に複製する作用物質（プラスミドおよびファージを含むが、これらには限定されない）を指す。
【００３１】
本明細書で用いられる「組み換えＤＮＡ発現ベクター」あるいは「発現ベクター」という用語は、その中にプロモーターまたは他の調節要素が存在することにより、挿入されたＤＮＡ（ポリペプチドをコードし得る）の転写を可能にする任意の（プラスミドまたはファージのような）組み換えＤＮＡクローニングベクターを指す。
【００３２】
本明細書で用いられる「ベクター」という用語は、ＤＮＡを宿主細胞内に導入するために用いられる核酸複合体を指す。ベクターは、１つまたは複数のタンパク質分子をコードし得るヌクレオチド配列を含む。自然状態における、または組み換え操作を受けた後におけるプラスミド、コスミド、ウィルス、およびバクテリオファージは、一般によく使用されるベクターの例である。「ベクター」という用語はまた、本明細書でさらに説明されるもののようなウィルス性ベクターの使用にも適用される。
【００３３】
「プラスミド」という用語は、染色体外の遺伝要素を指す。本明細書に開示されるプラスミドは、市販されているか、公的に無制限に入手可能であるか、または容易に入手可能なプラスミドから、公開されている手順に従って構成され得る。
【００３４】
「要素」とは、核酸コンストラクトとの関連で用いられるときには、確定した機能を有するそのコンストラクトの領域または核酸フラグメントを指す。例えば、電気的反応エンハンサー（ＥＲＥ）要素は、プロモーターに作用可能にリンクされる遺伝子と関連づけられるとき、組織の細胞が適当な電気刺激を供給されるという条件下でその遺伝子の転写を促進するＤＮＡの領域である。
【００３５】
２つの核酸要素が「異種」であるというのは、それらの要素が２つの異なる遺伝子に、あるいは２つの異なる種に由来している場合である。例えば、ヒトＡＮＦ遺伝子からの電気的反応エンハンサー要素は、ヒトミオシン遺伝子からのプロモーターとは異種である。同様に、ヒトＡＮＦ遺伝子からの電気的反応エンハンサー要素は、例えばマウスＡＮＦ遺伝子からのプロモーターとは異種である。
【００３６】
「キメラ遺伝子」とは、「キメラＤＮＡコンストラクト」とも呼ばれるが、治療用遺伝子に作用可能にリンクされるプロモーターおよびエンハンサー要素のような、異種ＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを指す。例えば、ヒトｂｃｌ−２遺伝子に作用可能にリンクされるヒトα−ミオシン重鎖（α−ＭＨＣ）プロモーターフラグメントを含み、かつヒトエリスロポエチン遺伝子低酸素反応要素を含むコンストラクトは、例示的なキメラ遺伝子である。
【００３７】
「標的遺伝子」とは、その転写が電気的反応性プロモーターに作用可能にリンクされる遺伝子を指す。
【００３８】
「哺乳類組織」とは、一般的に科学者に周知である脊椎動物の組織を指す。それらの組織としては、心筋、血管、神経、骨、筋肉、皮膚、膵臓のような構造を構成する内胚葉、外胚葉、または中胚葉起源の細胞、およびこれらの組織を構成する分化した細胞（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ ｃｅｌｌｓ）があるが、これらには限定されない（Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｃｅｌｌ、３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９４年、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、第１１８８〜１１８９ページを参照されたい）。例えば、収縮細胞を形成する中胚葉起源の細胞には、骨格筋細胞、心筋細胞、および平滑筋細胞とともに、多能性幹細胞、中胚葉性幹細胞、筋芽細胞、繊維芽細胞、および心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）のようなそれらの細胞の前駆細胞がある。神経組織を構成するのに寄与する内胚葉起源の細胞には、自律ニューロン、コリン作動性ニューロン、アドレナリン作動性ニューロン、およびペプチド作動性ニューロン、グリア細胞（アストロサイト、およびオリゴデンドロサイト）とともに、シュワン細胞のような末梢神経系の支持細胞があるが、これらには限定されない。上皮細胞には、血管およびリンパ系の血管内皮細胞、滑膜細胞などがあるが、これらには限定されない。腺房細胞のような膵臓のいくつかの分化した細胞、および肝臓の細胞（肝細胞）、ならびに骨組織を構成する細胞またはその周囲の細胞（軟骨細胞、骨芽細胞、骨原芽細胞、椎間板の髄核細胞）もまた、本発明の範囲内に具体的に含まれる。
【００３９】
医学および他の用語
「処置」、「療法」および「治療」という用語は、本明細書で用いられる場合、治癒的治療、防御的治療、および予防的治療を指す。「予防的治療」の例は、標的疾患またはそれに関係する症状の予防または緩和である。治療を必要とする者には、すでにその疾患または症状にある者とともに、予防されるべき疾患または症状にかかりやすい者も含まれる。「処置」、「療法」および「治療」という用語はまた、本明細書で用いられる場合、疾患、または関係する症状に対抗する目的での患者の管理および介護も記述し、また当該疾患、または症状の症候または合併症を軽減するための、治療用産物に作用可能にリンクされるＥＲＰ  ＤＮＡの投与を含む。
【００４０】
「慢性」投与とは、長期間にわたり初期の治療効果（活性）を維持するように、急性モードとは対照的に連続モードで電気刺激を投与することを指す。
【００４１】
「電気パルス発生器」は、１つの電気刺激または一連の電気刺激すなわちパルス（ペーシング）を供給することが可能であるという本質的特徴を有する医療デバイスである。本明細書で例示されるように、電気パルス発生器は、電気的反応性プロモーターの転写を誘導するために少なくとも１つの有効な電気刺激すなわちパルスを供給するように作用可能に結合される。
【００４２】
「間欠的」投与とは、中断なく連続的に行われるのではなく経時に反復される治療である。
【００４３】
「虚血」は、特定の器官または組織への血液の不十分な補給として定義される。血液補給の減少の結果は、その器官または組織への酸素の不十分な補給である（低酸素症）。長期の低酸素症は、影響される器官または組織に傷害を生じることがある。「無酸素症」とは、器官または組織における酸素の実質的に完全な欠如を指し、これは、長引く場合、器官または組織の死をもたらすことがある。
【００４４】
「低酸素状態」は、特定の器官または組織が酸素の不十分な補給を受けている状態として定義される。
【００４５】
「無酸素状態」とは、特定の器官または組織への酸素の補給が遮断された状態を指す。
【００４６】
「再灌流」とは、ある期間の虚血の後の、組織中の血流の再開を指す。
「虚血性傷害」とは、ある期間の虚血および／または虚血後の再灌流の結果としての、器官または組織への細胞および／または分子の損傷を指す。
【００４７】
本明細書で用いられる「患者」という用語は、ヒトを含む任意の哺乳類を指し、ウシ（例えば乳牛）、ウマ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、ヤギ、ネコのような飼育用および農業用の家畜ならびに動物園、スポーツ、またはペット用動物、マウスおよびラットのような家畜化されていない動物を含む。本発明の好ましい実施形態では、哺乳類はヒトまたはマウスである。
【００４８】
１つまたは複数のさらなる治療用作用物質「と併用して」の投与は、任意の順序での同時（並行）かつ連続的な投与を含む。
【００４９】
「治療的に有効な量」は、治療的利益または所望の生物学的効果を患者に与えるのに必要な電気刺激の最小量である。例えば、疾患にかかっている、もしくはかかりやすい、またはかからないように予防されている患者に対する「治療的に有効な量」は、治療用産物の転写の増加に伴う、病理学的症候、疾患の進行、生理的状態の改善、または主としてその増加により特徴づけられる、障害に負けることに対する抵抗性を、誘導し、向上させ、もしくは引き起こすような量である。例えば、「治療的に有効な刺激」は、治療的利益を提供するための量として、治療的に有効な量の遺伝子配列またはタンパク質を発現させるのに必要な電気刺激の量である。
【００５０】
本明細書で用いられる「ペーシング」という用語は、パルス発生器から送出された細胞組織に送出される電気刺激を放出する作用である。
【００５１】
本明細書で用いられる「担体」は、薬剤的許容担体、賦形剤、または安定剤を含み、それらは、使用される用量および濃度でそれにさらされる細胞または哺乳類にとって無毒なものである。しばしば、生理的に許容可能な担体は、ｐＨ緩衝水溶液である。生理的に許容可能な担体の例としては、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸を含む抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成対イオン；および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）のような非イオン界面活性剤がある。
【００５２】
「薬剤的に許容可能な塩」としては、塩化物塩、硫酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、臭化水素酸塩、および硝酸塩のような、無機酸で調製された塩、またはリンゴ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、エチルコハク酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、メタンスルホン酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、パラ−トルエンスルホン酸塩、パモ酸塩、サリチル酸塩およびステアリン酸塩、ならびにエストレート、グルセプテートおよびラクトビオン酸塩のような有機酸で調製された塩があるが、これらには限定されない。同様に、薬剤的に許容可能なカチオンを含む塩としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム、リチウム、およびアンモニウム（置換アンモニウムを含む）があるが、これらには限定されない。
【００５３】
「薬理学的に有効な刺激」または「生理学的に有効な刺激」は、ＥＲＰが刺激またはペーシングされるときに、予期される生理学的反応を与えるために、治療されるべき患者において所望のレベルの治療用産物を提供するのに必要とされる刺激の量である。必要とされる刺激またはペーシングの正確な量は、例えば産物の比活性、使用される送出刺激、産物の物理特性、その意図される用法、および患者の考慮事項のようないくつもの因子に左右されるであろう。これらの判断事項は、本明細書に提供される情報に基づいて、当業者により容易に決められる。「薬理学的に有効な刺激」とは、患者において治療的レベルの産物を産生することが可能な、ＥＲＰに提供される刺激の量を意味する。
【００５４】
「電気刺激を投与する」という用語は、電気刺激を組織に送出することを意味する。本発明に適用される場合、電気刺激は、ＥＲＰプロモーターの転写を調節するために組織に送出される。
【００５５】
「産物」という用語の用法は、タンパク質および核酸の産生を包含することを意味することが意図されている。結果として得られる産物は、所望の治療的結果を産生するために、一次または二次細胞で作用する。「閾」または「閾下」刺激とは、印加される刺激の相対的なレベルを指す。「閾」刺激は、興奮される組織においてさらなる電気的または機械的反応を誘発する刺激のレベル、例えば、振幅（ボルト、ミリアンペア）およびパルス幅（ミリ秒（ｍｓｅｃ））、またはエネルギー（マイクロジュール）の単位で表すことができる心臓脱分極を一貫して誘発するのに必要とされる最小の電気刺激、を指す。これに対して、閾下刺激は、心臓脱分極または筋収縮を引き起こさないような、組織からの肉眼的な電気的または機械的反応を引き起こさないくらい十分に低いレベルでの組織への電気刺激の印加を指す。閾下刺激は、電気パルスの振幅または持続時間のいずれかを肉眼的な運動または神経反応のための閾反応レベルより低く保つことによって達成することができる。この方式により、不要な収縮や不快な触感等のような、神経細胞または筋細胞の刺激による不要な副作用を有することなく、電気的反応性プロモーターからの反応を誘導するために組織に電気刺激を送出することが可能となる。本発明は、閾または閾下刺激の送出により実施可能であることが認識される。
【００５６】
本明細書で用いられる場合、「一次細胞」という用語は、脊椎動物組織源から単離され培養された細胞の懸濁物中に存在する細胞を含み、または、取り出されていない脊椎動物の組織に存在する細胞を指すこともある。一次細胞は、遺伝子操作細胞の１つの潜在的な源である。
【００５７】
説明
遺伝要素の詳細
本発明は、治療用タンパク質および核酸の送出を調節する方法およびシステムを提供する。具体的には、本発明は治療用遺伝子配列に作用可能にリンクされる遺伝子操作電気的反応性プロモーターを使用することを含み、上記配列の発現は電気パルス発生器によって制御される（図１〜図３を参照されたい）。
【００５８】
本発明はまた、少なくとも以下の３つの機能要素、すなわち（ｉ）治療用遺伝子、（ｉｉ）プロモーター、および（ｉｉｉ）電気的反応性エンハンサー（ＥＲＥ）要素を有するキメラ遺伝子を提供する。ここでＥＲＥは、少なくとも１つの他の機能要素と異種である。随意選択的に、適当な電気刺激が与えられるときに、選択された組織における治療用遺伝子の発現を指令するために、他の反応要素（例えば、サイレンサー、組織特異的要素、またはエンハンサー）がＥＲＥ要素と併用して使用され得る。
【００５９】
プロモーター
プロモーターとは、本明細書との関連では、プロモーターの下流（３’）に隣接する遺伝子の転写を促進することが可能なポリヌクレオチド要素を指す。プロモーターは、それが由来する遺伝子の完全な５’調節配列の全部、またはその一部のみ、を含み得る。プロモーター領域内の配列は通常、ＲＮＡ合成を開始するＲＮＡポリメラーゼ分子によって認識される。
【００６０】
プロモーターは、さまざまな組織型において、およびいくつかの異なる生物種において機能的である可能性があり、またその機能は、特定の種および／または特定の組織に制限されることもある。さらに、プロモーターは、構成的に活性である可能性があり、または特定の組織型に対して選択的であることもあり（例えば、組織特異的要素）、またはある一定の生理的状態に対して反応することもあり（例えば、低酸素症）、またはある一定の細胞発達段階に対して反応することもある（例えば、分化細胞に対する幹細胞）。
【００６１】
ＥＲＰプロモーター
前に定義したように、「電気的反応性プロモーター」すなわち「ＥＲＰ」は、電気刺激の送出時に細胞内のプロモーターの転写を調整する遺伝子操作電気的反応性要素（ＥＲＥ）を含むプロモーターである。少なくとも１つのＥＲＥが所与のプロモーターに作用可能にリンクされ得るが、比較的多数のＥＲＥが使用されることが可能であり、２個、３個、４個、またはそれより多くのＥＲＥが作用可能にリンクされ得る。転写の調整は正または負のいずれでもよく、経時による相対転写量を、非刺激細胞に比べて２、４、６、１０、２０、５０、１００、または１０００倍にちょうどもしくは略等しいかまたはそれより大きい量だけ、１、２、４、８、１６、２４、４８、または７２時間にわたり変化させ得る。
【００６２】
一般的に１つまたは複数のＥＲＥが、プロモーターの５’側の、転写開始部位からおよそ２０〜３０塩基上流、３０〜４０塩基上流、４０〜６０塩基上流、６０〜９０塩基上流、９０〜１５０塩基上流、１５０〜３００塩基上流、３００〜６００塩基上流、および６００より多くの塩基だけ上流の位置に配置される。反応性要素の最適位置の決定および転写に対するその効果の決定は当業者に周知である。特定のプロモーターの制御下における遺伝子の発現のレベルは、相異なる転写要素に関してプロモーター領域を操作することにより調整され得る。例えば、プロモーター領域内の相異なるドメインが、異なる遺伝子調節活性により特徴づけられ得る。これらの異なる領域の役割は通常、特定の領域を欠失したプロモーターのさまざまな変種を有するベクターコンストラクトを用いて評価される（すなわち、欠失分析）。このような実験のために用いられるベクターは通常、レポーター遺伝子を含み、これは異なる条件下でそれぞれのプロモーター変種の活性を決定するために使用される。このような欠失分析の適用により、望ましい活性を含むプロモーター配列の同定が可能となる。この手法は、例えば、組織特異性を付与することが可能な最小の領域、または低酸素感受性を付与する最小の領域を同定するために使用され得る。
【００６３】
本発明は、電気的反応性のある心房性ナトリウム利尿因子プロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の構成を実証する。本明細書におけるさらなる教示とともに同じく適切に使用され実施され得る以下のようないくつかのＥＲＰプロモーターが、電気刺激に対して反応するとして同定されている：ＡＮＦプロモーター（Ｓｐｒｉｎｋｌｅ， Ａ． Ｂ．他（１９９５年）；ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ， Ｐ． Ｍ．他（１９９２年）；ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ， Ｐ． Ｍ．他（１９９４年）；ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ， Ｐ． Ｍ．他（１９９７年））；ＶＥＧＦプロモーター（Ａｎｎｅｘ， Ｂ． Ｈ．他（１９９８年）；Ｈａｎｇ， Ｊ．他（１９９５年）；Ｋａｎｎｏ（１９９９年））；アセチルコリン受容体（Ｂｅｓｓｅｒｅａｕ， Ｊ−Ｌ他（１９９４年））；トロポニンＩ（Ｃａｌｖｏ， Ｓ．他（１９９６年））；ＩＧＦ−ＩＩ（Ｆｉｔｚｓｉｍｍｏｎｓ， Ｒ． Ｊ．他（１９９２年））；ＮＯＳ３（Ｋａｙｅ， Ｄ． Ｍ．他１９９６年））；ＭＣＡＤ（Ｃｒｅｓｉ， Ｓ．他（１９９６年））；シトクロムｃ（Ｃｒｅｓｉ， Ｓ．他（１９９６年）；Ｘｉａ， Ｙ．他（１９９８年））；ＣＯＸ（Ｘｉａ， Ｙ．他（１９９７年））；ＣＰＴ−Ｉ（Ｘｉａ， Ｙ．他（１９９６年））；ｈｓｐ７０（Ｙａｎａｇｉｄ， Ｙ．他（２０００年））；ｓｋｍ２（Ｚｈａｎｇ， Ｈ．他（１９９９年））。
【００６４】
特定の転写因子が、電気刺激のいかなる特定の機序によっても束縛されないが、ＥＲＥを通じて転写を促進することに関与し得ると認識されている。これらの因子としては、ＮＦＡＴ３（Ｘｉａ， Ｙ．他（２０００年））；ＧＡＴＡ４（Ｘｉａ， Ｙ．他（２０００年））；ＭＥＦ２（Ｃａｌｖｏ， Ｓ．他（１９９６年）；Ｍａｏ， Ｚ．他（１９９９年））；ｃ−Ｍｙｃ（Ｌｉｎ， Ｈ．他（１９９４年））；ｃＪｕｎ  Ｎ−末端キナーゼ（ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ， Ｐ． Ｍ．他（１９９７年））；ｃＪｕｎ  ＳＲＦ（ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ， Ｐ． Ｍ．他（１９９７年））；ＳＰ１（Ｚｈａｎｇ， Ｈ．他（１９９９年）；ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ， Ｐ． Ｍ．他（１９９７年）；Ｓｐｒｉｎｋｌｅ， Ａ． Ｂ．他（１９９３年））；ＢＤＮＦ（Ｔａｂｕｃｈｉ， Ａ．他（２０００年））；ＪｕｎＢ（Ｘｉａ， Ｙ．他（１９９７年））；ＮＲＦ−１（Ｘｉａ， Ｙ．他（１９９７年））；ＡＰ１（Ｘｉａ， Ｙ．他（１９９７年））；ＣＲＥ−１（Ｘｉａ， Ｙ．他（１９９７年））があるが、これらには限定されない。
【００６５】
組織特異的要素
本発明の実施において有益な電気的反応性プロモーターは、好ましくは組織特異的である。すなわち、ある組織において遺伝子の転写を駆動することが可能であるが、他の組織型においては概ね「サイレント」のままにとどまる。しかし、組織特異的プロモーターは、それらがサイレントである組織において、検出可能な量の「バックグラウンド」あるいは「ベース」活性を有し得ることが理解されるであろう。プロモーターが標的組織で選択的に活性化される程度は、選択比（標的組織における活性／対照組織における活性）として表現され得る。この点に関して、本発明の実施において有益な組織特異的プロモーターは通常、約２、好ましくは約５より大きい選択比を有し、さらに好ましくは、選択比は約１５より大きい。
【００６６】
いくつかのプロモーターでは、活性において単一の組織型に制限されないが、それにもかかわらず、ある組織群では活性があり、別の群では活性が低いかまたはサイレントであるというような選択性を示すものがあり得ることがさらに理解されるであろう。このようなプロモーターもまた「組織特異的」と呼ばれ、本発明とともに使用することが考慮される。例えば、さまざまな中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンで活性であるプロモーターは、脳のいくつかの異なる領域のいずれかに影響し得る卒中に起因する損傷に対して保護する際に治療的に有益であり得る。一応用例では、電気的反応性プロモーターは、脳におけるエンケファリンの制御された産生および放出において有益であろう。エンケファリンの制御された産生は、痛みの管理において有益であろう。電気的反応性プロモーターの他の用途としては、自然類似体またはそれらの受容体（Ｄ３受容体のような）の発現を電気的反応性プロモーターに結合することによる、自然ドパミンのアゴニストおよびアンタゴニストの制御された産生があるだろう。治療的であり得る他の関連する神経タンパク質または神経向性因子は、ＢＤＮＦ、ＴＮＢ、ＧＤＮＦ、ＮＧＦ（神経成長因子）および１つまたは複数のカスパーゼ（例えば、カスパーゼ１−９）である。理想的には、神経学的因子は神経細胞から産生されるであろう。神経細胞は、電気的反応性プロモーターの制御下で、関連する遺伝子でｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでトランスフェクトされ得る。神経細胞がｅｘ  ｖｉｖｏでトランスフェクトされる場合、それは神経組織内の所望の部位に移植される。移植される神経細胞の範囲内には、成熟ニューロン細胞、グリア細胞（例えば、アストロサイト、オリゴデンドロサイト）、ならびに神経幹細胞などが含まれる。
【００６７】
他の組織特異的プロモーターは、例えば、異なる組織で差次的に発現する遺伝子のプロモーター領域に由来し得る。例えば、心組織における発現のアップレギュレーションに適したさまざまなプロモーターが同定されている。それらのうちには、心臓α−ミオシン重鎖（ＡＭＨＣ）プロモーターおよび心臓α−アクチンプロモーターがある。適当な腎特異的プロモータとしては、レニンプロモーターがある。適当な脳特異的プロモーターとしては、アルドラーゼＣプロモーターおよびチロシンヒドロキシラーゼプロモーターがある。適当な血管内皮特異的プロモーターとしては、Ｅｔ−１プロモーターおよびｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子プロモーターがある。
【００６８】
下記の複数の組織特異的プロモーターは、本発明を実施する際に特に有利である。組織特異的プロモーターは、組織特異的要素を有する機能的プロモーターに関係すると理解される。ほとんどの場合、これらのプロモーターは、選択されたベクター内にクローニングするのに適した従来の制限消化フラグメントとして単離され得る。別法として、プロモーターフラグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，１９５号）を用いて単離され得る。増幅されたフラグメントのクローニングは、プライマーの５’末端に制限部位を組み込むことによって容易化され得る。
【００６９】
心特異的発現に適した組織特異的プロモーターの例としては、ネズミ心臓α−ミオシン重鎖遺伝子からのプロモーターがある。この遺伝子は、ネズミα−ＭＨＣ遺伝子からの５．５ｋｂｐ  ＳａｃＩ／ＳａｌＩフラグメントとして得られる５．５ｋｂｐプロモーター領域を含む（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ， Ａ．他（１９９３年））。この５．５ｋｂｐ  α−ＭＨＣプロモーターを利用したレポーター遺伝子コンストラクトは、心組織で選択的に比較的高いレベルで発現する（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ， Ａ．他（１９９３年））。ラットα−ＭＨＣプロモーターの、より小さいフラグメントが、１．２ｋｂｐ  ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして得られる（Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ， Ｔ．Ａ．他（１９８７年））。ラットα−ＭＨＣプロモーターの８６ｂｐフラグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）は、レポーター遺伝子の発現を心筋および骨格筋に制限する（米国特許第５，８３４，３０６号）。追加の心特異性が、心特異的ＧＡＴＡ４エンハンサー要素を含む３５ｍｅｒオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を塩基対−８６のすぐ上流に連結（例えば、平滑末端連結）することにより、フラグメントに付与され得る（Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎ， Ｊ．Ｄ．他（１９８４年））。このプロモーターフラグメントは、追加的なエンハンサーがない場合にも低レベルの発現を生じる。
【００７０】
ラットおよびマウスのＡＭＨＣ遺伝子からの例示的な心特異的プロモーター領域の配列は、本明細書にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５としてそれぞれ提示されている。両方の配列とも、それらのそれぞれの遺伝子のＡＴＧ開始コドンのすぐ上流で終わっている。他の心特異的プロモーターとしては、心臓α−アクチンプロモーター（ヒト心臓α−アクチン（ＨＣＡ）プロモーターから得られる１１８ｂｐフラグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６））、および心特異的ミオシン軽鎖−２プロモーター（ラット心臓ミオシン軽鎖−２（ＭＬＣ−２）遺伝子からの２．１ｋｂｐ  ＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント）（Ｆｒａｎｚ，Ｗ−Ｍ．他（１９９３年））がある。
【００７１】
当技術分野で知られている他の組織特異的プロモーターは、ＥＲ要素を組み込むために適応され得る。前立腺特異的プロモーターとしては、ヒト腺性カリクレイン−１（ｈＫＬＫ２）遺伝子および前立腺特異的抗原（ｈＫＬＫ３；ＰＳＡ）遺伝子の５’フランキング領域がある（Ｍｕｒｔｈａ， Ｐ．他（１９９３年）；Ｌｕｋｅ， Ｍ． Ｃ．他（１９９４年））。レニンプロモーターは、腎特異的発現を指令するのに適しているが（Ｆｕｋａｍｉｚｕ， Ａ．他（１９９４））、アルドラーゼ−Ｃプロモーター（Ｖｉｂｅｒｔ， Ｍ．他（１９８９年））またはチロシンヒドロキシラーゼプロモーター（Ｓａｓａｏｋａ， Ｔ．他（１９９２年））は、脳における発現を指令するために使用され得る。血管内皮細胞に特異的なプロモーターとしては、Ｅｔ−１プロモーター（Ｉｎｏｕｅ， Ａ．他（１９８９年））およびｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（Ｊａｈｒｏｎｄｉ， Ｎ．他（１９９４年））プロモーターがある。腫瘍特異的プロモーターとしては、マウスＡＦＰ遺伝子からの５’フランキングＤＮＡの７．６ｋｂｐフラグメントに含まれるα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーターがある（Ｍａｒｃｉ， Ｐ．他（１９９４年））。このプロモーターは通常、胎生期肝臓でＡＦＰ遺伝子の発現を指令し、成体組織では転写的にサイレントである。しかし、それは肝細胞癌（ＨＣＣ）で異常に再活性化される可能性があり、成体組織において腫瘍特異的発現を付与する（Ｍａｒｃｉ， Ｐ．他（１９９４年））。
【００７２】
上記のプロモーターは、本発明とともに使用するための例示的なプロモーターである。本発明とともに使用するのに適した他のプロモーターは、本明細書の指針に従って当業者によって選択され得る。
【００７３】
プラスミドレポーターコンストラクト
ＡＮＦ  ５’フランク／ルシフェラーゼ・レポーターベクターは、−３００３ＬＵＣ、−６３８ＬＵＣなど（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＮＦ  ５’フランキング領域のさまざまなトランケーション）、またはＡＮＦ−３００３ＧＬ、ＡＮＦ−６３８ＧＬと称されていた。後者のベクターの構成を図５に示す。これらのベクターは以下のように作成された。プラスミドｐＡＮＦ３００３（Ｋｎｏｗｌｔｏｎ， Ｋ． Ｕ．他（１９９１年））のＫｐｎＩ／ＳｐｅＩフラグメントが、ｐＧｅｎｅＬｉｇｈｔ２−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ｐＧＬ２−Ｐ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングされ、ベクターのＳＶ−４０プロモーターをラットＡＮＦ  ５’フランキング配列（ＦＳ）で−３００３から＋６５まで置換して、ＡＮＦ−３００３ＧＬを産生した。同様のトランケーションが、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｅＩ（ＡＮＦ−１３４ＧＬ）、ＥｃｏＲＩ／ＳｐｅＩ（ＡＮＦ−６３８ＧＬ）およびＮｌａＩＶ／ＳｐｅＩ（ＡＮＦ−６５ＧＬ）フラグメントで産生された。ＮｌａＩＶ／ＳｐｅＩフラグメントは、ＢｇｌＩＩ（ｆｉｌｌｅｄ）／ＨｉｎｄＩＩＩ部位を利用してｐＧＬ２−Ｐに挿入された。これにより、最小のＡＮＦプロモーターの上流でエンハンサー挿入のための複数のクローニング部位の使用が可能となった。完全長ＡＮＦフランキング領域の内部欠失は、ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを−６９１から−１３４まで除去することによって作成された。−１３４と−６５の間のさらなるトランケーションが、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化された−３００３ＡＮＦＧＬを開始テンプレートとして使用し、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅｒａｓｅ−ａ−ｂａｓｅキットを製造元の使用説明書に従って使用して、作成された。ＡＮＦ−１３４ＧＬおよびＡＮＦ−６３８ＧＬの指定部位突然変異誘発が、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発キットを製造元の使用説明書に従って使用して、実行された。すべてのプラスミド構成は、制限マッピングおよびジデオキシシーケンシングにより確認された。
【００７４】
細胞
いくつかの適当な永久細胞系が、トランスフェクトされたＥＲＰとともに使用され、試験され得る。これらの細胞系のクローンは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手することができる。好ましい細胞系としては、ＱＢＩ−２９３Ａ、Ｃ２Ｃ１２細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＮＧ１０８、Ｐ１９などがある。
【００７５】
脊椎動物組織からの一次細胞は、穿刺生検または他の外科的方法のような知られている手法を用いて単離される。例えば、穿刺生検は、繊維芽細胞または角化細胞の源として皮膚を入手するために使用される。一次細胞の混合物は、酵素消化または外植のような知られている方法を用いて組織から得られる。酵素消化が使用される場合、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ディスパーゼ、プロナーゼ、トリプシン、エラスターゼおよびキモトリプシンのような酵素が、知られている単離の方法とともに使用され得る。
【００７６】
一態様では、本発明は、電気的反応性システムを組織に導入するために、移植（すなわちグラフト）細胞を使用する。心組織のための移植（すなわちグラフト）細胞は、成体心筋細胞、小児心筋細胞、胎生期心筋細胞、成体繊維芽細胞、胎生期繊維芽細胞、成体平滑筋細胞、胎生期平滑筋細胞、内皮細胞、および骨格筋芽細胞からなる群から選択され得る。
【００７７】
移植細胞すなわちグラフトは、自己体、同種他個体、または異種起源に由来し得る。さらに、移植細胞は、その上に細胞が支持される適当な生物分解性または非生物分解性足場を含み得る。さまざまな一次細胞型を単離するためのいくつかの手順が当技術分野で知られている。成体心筋細胞、小児心筋細胞、胎生期心筋細胞、成体繊維芽細胞、胎生期繊維芽細胞、成体平滑筋細胞、胎生期平滑筋細胞、内皮細胞、および骨格筋芽細胞の単離については、例えば米国特許第６，０９９，８３２号および本明細書に記載される手順を参照されたい。
【００７８】
ＥＲＰ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ構成
ＥＲＰは、広範囲の細胞に導入され得る。本明細書に記載されるように、出願人は、ＥＲＰが哺乳類起源の一次および二次細胞に導入され得ること、ならびにＥＲＰプロモーターが広範囲のベクターを用いて外因性遺伝子に安定に組み込まれ作用可能にリンクされ得ることを実証した。
【００７９】
一次細胞は、直接にトランスフェクトされることも可能であり、また、まず培養されてからトランスフェクトされることも可能である。一次細胞は、遺伝子配列に作用可能にリンクされる外因性ＥＲＰ  ＤＮＡでトランスフェクトされるか、または外因性ＥＲＰと宿主遺伝子が作用可能にリンクされるように宿主遺伝子配列にその組み込みを適切に指令するために、ＥＲＰ  ＤＮＡが適当なフランキングＤＮＡ配列に接合されることが可能である。随意選択的に、選択可能なマーカーをコードするＤＮＡがＥＲＰ  ＤＮＡを備えるか、または選択可能なマーカーがＥＲＰ  ＤＮＡとともにコトランスフェクトされる。
【００８０】
ＥＲＰ  ＤＮＡを所望の細胞に導入する１つの方法は、電気穿孔法によるものである。電気穿孔法は、広範囲の電圧（例えば、５０〜２０００ボルト）および対応する静電容量にわたり実行され得る。総量で約０．１〜５００μｇのＤＮＡが一般に使用される。別法として、ＥＲＰ  ＤＮＡは、顕微注射法、リン酸カルシウム沈澱法、改良リン酸カルシウム沈澱法、ポリブレン沈澱法、リポソーム融合法、受容体仲介遺伝子送出法などを用いて細胞に導入され得る。トランスフェクションがｅｘ  ｖｉｖｏ（本明細書では、細胞が患者の体外でトランスフェクトされることを指す）で行われる場合、安定にトランスフェクトされた細胞が単離および培養され、適当な培養条件下で継代培養（ｓｕｂｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ）される。別法として、複数のトランスフェクトされた細胞が培養および継代培養され、結果として不均一な細胞株が産生される。
【００８１】
さらに、本発明は、米国特許第６，０６３，６３０号に記載されているように、宿主のゲノムＤＮＡに存在する遺伝子の発現を促進する外因性ＥＲＰの組み込みを包含することが意図されている。ＥＲＰプロモーターまたはＥＲＥは、宿主組織の内因性細胞、または組織から採取されたもしくは知られている細胞系における一次培養細胞に組み込まれ得る。外因性ＥＲＰプロモーターは、治療用タンパク質またはＲＮＡのような治療用産物の転写が組織細胞または培養細胞で発現するよう指令することができるように配置される。ＥＲＥの相同挿入は、自然プロモーターが電気刺激に対して反応性になるように、ＥＲＥが内因性プロモーターに対して配置されるようなものである。
【００８２】
一次またはクローン細胞系をトランスフェクトするのに必要な細胞の数は、さまざまな因子に左右される。それらの因子としては、トランスフェクトされた細胞の用法、トランスフェクトされた細胞内のＥＲＰ発現産物の機能レベル、トランスフェクトされた細胞の埋め込みの部位、ならびに患者の年齢、表面積、および臨床症状があるが、これらには限定されない。例えば、患者における心筋梗塞を矯正する（ｃｏｒｒｅｃｔ）ためには、約１００万〜５億個のトランスフェクトされた筋芽細胞、より好ましくは約１０００万〜５０００万個の筋芽細胞、および最も好ましくは約５０００万個の筋芽細胞が使用される。
【００８３】
治療用産物
本発明において使用される（または本明細書で教示される手順により同定される）ＥＲＰは、酵素、ホルモン、サイトカイン、抗原、抗体、凝固因子、アンチセンスＲＮＡ、調節タンパク質、転写タンパク質および核酸産物、ならびに操作ＤＮＡのような、広範囲の治療用産物のために、本送出システムの一部として広い適用可能性を有する。例えば、ＥＲＰは、ＶＥＧＦ、酸化窒素合成酵素、組織プラスミノゲンアクチベーター、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、エリスロポエチン、α−１抗トリプシン、カルシトニン、グルコセレブロシダーゼ、成長ホルモン、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、ＩＬ−２受容体、インスリン、グロビン、免疫グロブリン、触媒抗体、インターロイキン、インスリン様成長因子、スーパーオキシドジスムターゼ、免疫反応修飾物質（ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）、副甲状腺ホルモン、インターフェロン、神経成長因子、およびコロニー刺激因子を含む治療用タンパク質を供給するために使用され得るが、これらには限定されない。
【００８４】
広範囲の送出される治療法は、さらに、主に全身効果を有する分泌タンパク質、主に局所効果を有する分泌タンパク質、新たなまたは促進された細胞反応性を与える膜タンパク質、毒性産物の除去を容易にする膜タンパク質、細胞をマーキングまたはターゲティングする膜タンパク質、細胞内タンパク質、遺伝子発現に直接影響する細胞内タンパク質、自己分解効果を有する細胞内タンパク質、調節タンパク質に結合し、もしくはそれを封鎖する遺伝子産物操作ＤＮＡ、リボザイム、または遺伝子発現を抑制するアンチセンス操作ＲＮＡ、を含む産物によって分類され得る。
【００８５】
治療
本発明の一特徴では、本システムは、治療的に関連する遺伝子の送出によって、末梢動脈閉塞疾患（ＰＡＯＤ）または冠状動脈疾患（ＣＡＤ）もしくは発作を治療するために使用され得る。末梢動脈閉塞疾患（ＰＡＯＤ）または冠状動脈疾患（ＣＡＤ）の治療は、ＶＥＧＦおよびＦＧＦのような脈管形成タンパク質の送出により達成され、それにより脈管形成タンパク質の送出が局所血管形成を促進するために使用されると想定される。治療の別の態様では、心臓麻痺または発作の治療が、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）の局所送出によって、より効果的に治療されることが可能となり得る。
【００８６】
その最も単純な形態では、患者の細胞内の電気的反応性要素を刺激するためには、単に刺激デバイスを作動させるだけであろう。電気刺激の振幅が遺伝子を作動させるのに十分であることを確実にするために、プログラミングが要求されるであろう。適当な振幅は、治療成果を誘発する最低振幅（または最低振幅の２倍、３倍、４倍もしくは５倍、または場合に応じて）として決まるであろう。検出可能な治療結果がない場合、ペーシング振幅は、生成されるタンパク質のアッセイを用いて、または刺激に影響する、細胞からの距離に対する振幅に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏデータを経験的に用いて、設定されなければならないであろう。
【００８７】
患者への細胞の投与
ＥＲＰを含む遺伝子操作細胞は、知られている方法を用いて患者に導入され得る。上記のように産生された組み換えＥＲＰ細胞は、知られている方法を用いて、さまざまな投与の経路を用いて（例えば、直接注射、カテーテルを通じての注射）およびさまざまな部位において、治療用産物が送出されるべき個人に導入される。本発明の一特徴では、細胞が、心筋または骨格筋の筋組織、腎組織、骨組織、腸組織、神経組織、肝組織、皮膚組織、表皮組織などに送出される。もう１つの特徴では、遺伝物質が、心筋または骨格筋の筋組織、腎組織、骨組織、腸組織、神経組織、肝組織、皮膚組織、表皮組織などの細胞に直接導入される。個人に埋め込まれた後、トランスフェクトされた細胞は、電気パルス発生器に作用可能に結合される。一般にこれは、電気パルス発生器から電気刺激を伝える電極およびリードの埋め込みによって実現される（図１は心臓で用いられるシステムを表している）。
【００８８】
一態様では、トランスフェクトされた一次または培養ＥＲＰ細胞は、連合電気刺激治療とともに送出されるときに、細胞移植により治療用産物を投与するために使用される。本発明のＥＲＰトランスフェクトされた一次または培養細胞の使用の利点は、細胞の数およびそれらの送出の場所が制御され得ることである。さらに、治療用産物の送出は、電極の場所および電気刺激の期間により制御され得る。
【００８９】
遺伝子またはその部分は、薬剤的に許容可能な担体中の完全な発現ベクターの一部として、標的組織への直接投与（例えば、標的組織への注射）によって、または全身投与（例えば、静脈内注射）によってのいずれでも、標的組織に導入され得る。後者の場合、例えば、選択された、すなわち標的組織からの細胞で優先的に発現する受容体に結合するように設計された修飾されたエンベロープタンパク質を発現させるウィルス内に遺伝子を組み込むことによって、遺伝子は、選択された組織を標的とし得る。別法として、ＥＲＥは、組織適合細胞型に導入された後、薬剤的に許容可能な担体で直接投与により標的組織に移植される。選択の場合には、ＥＲＰ細胞は全身的に送出され得る。さらに本明細書に記載されるように、さまざまな治療用遺伝子、プロモーター、およびＥＲＥが、本発明の実施において使用され得る。
【００９０】
患者細胞へのＥＲＰ  ＤＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏでの導入
レトロウィルス、アデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）を含むいくつかのタイプのウィルスが、本発明のキメラ遺伝子コンストラクトを有するベクターとして使用するために扱いやすい可能性がある。それぞれのタイプのウィルスは固有の利点および欠点を有するが、それらは当業者により理解される。ウィルスベクターを操作する方法もまた当技術分野で知られている（例えば、ＧｒｕｎｈａｕｓとＨｏｒｏｗｉｔｚ；ＨｅｒｔｚとＧｅｒａｒｄ；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ他）。別法として、ＤＮＡは、標的組織に直接注射され得る。
【００９１】
レトロウィルスは、アデノ関連ウィルスと同様に、そのＤＮＡを標的細胞の染色体ＤＮＡに安定に組み込む。しかし、ＡＡＶとは異なり、レトロウィルスは通常、プロウィルス組み込みが起こるためには標的細胞の複製を必要とする。したがって、レトロウィルスベクターによる遺伝子移入の成功は、標的細胞の増殖を少なくとも一時的に誘導することができるかどうかに左右される。
【００９２】
アデノ関連ウィルスは、細胞分裂しない細胞に効率的に感染し、大量の遺伝子産物を発現させることができる。さらに、ウィルス粒子は比較的安定で、精製および濃縮をしやすい。ウィルスゲノムのＥ１領域の部分を欠いた複製欠損アデノウィルスは、Ｅ１遺伝子を発現させるように操作された細胞における成長により伝搬され得る（ＪｏｎｅｓとＳｈｅｎｋ；Ｂｅｒｋｎｅｒ；ＧｒａｈａｍとＰｒｅｖｅａ）。ほとんどの現在使用されているアデノウィルスベクターは、ウィルスゲノムのＥ１Ａ−Ｅ１ＢおよびＥ３領域に欠失がある。アデノウィルスベクターを用いた多数の前臨床研究によれば、ベクターはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞の大部分を効率的に形質転換し、ベクター媒介遺伝子発現は相当期間持続することができることが実証されている（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ他；Ｑｕａｎｔｉｎ他；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ他、１９９２ａ；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ他；Ｌ．Ｄ．Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ他、１９９２ｂ；Ｊａｆｆｅ他）。いくつかの研究は、心筋細胞へのアデノウィルス媒介遺伝子移入の有効性を記述している（Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒ他；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ他）。
【００９３】
治療用遺伝子に作用可能にリンクされるＥＲＰを送出する１つの手法は、所望の組織への送出のためにアデノウィルス複製欠損ベクターを利用する。このようなベクターの１つは、ＡｄｅｎｏＱｕｅｓｔ（商標）アデノウィルス発現系（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）である。この組み換えアデノウィルスは、ヒトまたは非ヒト起源の多くの異なる細胞系または組織に感染することができる。このウィルスは細胞に入るが複製しない。この不稔感染は、遺伝子に作用可能にリンクされるＥＲＰを導入するための「トランスフェクション系」と見ることができる。
【００９４】
本発明のキメラ遺伝子を運ぶプラスミドは、精製され、標的組織に直接注射され得る。例えば、塩類緩衝液中に懸濁したプラスミドの直接注射は、心細胞におけるプラスミドの発現を起こすのに有効である。同様の手法は、他の人々によって、例えば、齧歯類の心筋および骨格筋で外因性遺伝子を発現させるために、成功裏に使用されている（Ｗｏｌｆ他；Ａｓｃａｄｉ他、１９９１ａ；Ａｓｃａｄｉ他、１９９１ｂ；Ｌｉｎ他；Ｋｉｔｓｉｓ他）。
【００９５】
リポソームは、当技術分野で知られている方法を用いて、標的組織に遺伝子を送出するために使用され得る。リポソームは、適当な組織への送出を容易にするために、それらの表面に抗原、抗体、またはウィルスのようなターゲティング部分またはリガンドを含むように構成され得る。
【００９６】
電気パルス発生器の詳細
細胞を試験する装置
試験装置の主な目的は、任意の所与のプロモーターを、それが印加電界により調節される能力について試験することである。構成された装置（図９）を用いて、任意の所与のプロモーターまたは反応性要素は、電気刺激へのその反応性を試験するために、または他の機能的転写配列とともに転写されるときの１つまたは複数のＥＲＥを配置した効果を決定するために、レポータープラスミドに挿入され得る。
【００９７】
図９の試験装置は、部分的には、動作中に端子３および４に作用可能に結合される分離可能な１対のプレート電極１および２からなる。端子３および４は、パルス発生器（図示せず）に作用可能に結合する。プレート電極３および４は多孔質膜５を通じてエネルギーを伝達する役割を果たす。多孔質膜は、電極１と２の間の試験物質を支持し、支持される試験物質および膜を通して一様に電流を流す役割を果たす。
【００９８】
本出願人は、この試験装置とともにｐ６３８ＡＮＦｌｕｃ（図５）を使用することが、ＥＲＰについて試験し、任意の所与の電気刺激ルーチンによる細胞に対する効果を判定するための機能的アッセイを提供する、ということを実証した。構成された装置で細胞が試験され得ることの一例として、図１０は、電気的反応性プロモーター（ＥＲＰ）の反応が検出される電気刺激（端子３から端子４へと印加される）の１つのタイプを示す。この刺激は、１０Ｈｚのレートで２０ｍｓｅｃパルスの列からなる（あるパルスから次のパルスまで１００ｍｓｅｃ）。パルスは単相（電荷平衡化されていない）であるが、パルスの極性は１．３ｓｅｃごとに反転される。記載されている装置において、ＥＲＰ駆動発現に関する電気刺激のさまざまな条件（振幅（ボルト、ミリアンペア）およびパルス幅（ミリ秒（ｍｓｅｃ））、またはエネルギー（マイクロジュール）、または波形（単相、二相など））を試験するために、他のパルス形態も使用され試験され得る。
【００９９】
装置は、試験されているすべての細胞が同じ電界強度を受けるように、空間的に一様な電界を生成するよう設計される。この装置における電極１および２の平行プレートはこのタイプの電界を生成する。この装置の一実施形態は、多孔質膜よりわずかに小さい上側電極１からなり、さらに多孔質膜は下側電極２よりわずかに小さい。もう１つの実施形態では、電極１および２は同じサイズであり、多孔質膜５は２つの電極よりわずかに小さいであろう。この実施形態は、平行プレートの縁に生じる電界フリンジ効果を最小化するであろう。このフリンジ効果は、電界の一様性を低下させる。しかし、電極および膜の、いくつかの異なるサイズおよび形状が選択され得ることが認められる。
【０１００】
この装置の一実施形態は、電極材料としてチタンを使用する。しかし、白金、金、銀などのような、使用可能な多くの他の導電性材料がある。チタンまたは白金電極はイオン性溶液において反応性が低いという利点を有する。しかし、印加される電気刺激のタイプ、緩衝溶液の量などに応じて、より反応性の高い金属も選択され得る。
【０１０１】
この装置の一実施形態は、固体電極を使用する。しかし、他の可能な電極構成もある。代替実施形態では、金属はメッシュに形成される。この実施形態は、電極材料が高価である場合（例えば、白金または金）には、電極を形成するのに必要な材料が少なくなるので、特に望ましい。もう１つの実施形態では、図９に示すように、下側電極が多孔質膜５および上側電極１のための収容容器を形成する。同様に、多孔質膜５は、上側電極１のための収容容器の一部となるように形成され得る。
【０１０２】
この装置の一実施形態では、哺乳類細胞が多孔質膜の上に置かれ、多孔質膜は電極プレート間に置かれる。膜は一般に、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）のような多孔質ポリマー材料から構成される。一般に、孔サイズは、約４０〜０．００４ミクロンの間で、好ましくは約４〜０．０４ミクロンの間でさまざまであり得るが、最も好ましくは、孔サイズは約０．４ミクロンであり、孔密度は約１，６００，０００孔／平方センチメートルである。
【０１０３】
他の実施形態では、哺乳類細胞の代わりに代替物質が使用され、電界に対するそれらの反応が分析され得る。例えば、実効電荷を有する部分をもつ酵素は、電界強度に基づいてそれらの立体配座を変えるであろう。この立体配座変化は、酵素の反応速度に影響し得る。こうして、いくつかの酵素の反応速度に対する異なるタイプの電界の効果が、この装置で分析され得る。代替実施形態では、電界は、組織に接触した電極を使用せずに印加され得る。一実施形態では、体は、細胞の平面に垂直な方向に向いた交番磁界を受けることができる。磁界ベクトルを取り巻く電流および電界が、ファラデーの誘導法則により誘導されることになる。この電流（渦電流としても知られる）の強度は、磁界の励磁周波数および強度に比例するが、磁界源からの距離が増大するにつれて減少する。この実施形態は、ＥＲＰを含む細胞が皮膚に近い場合に実用的となり、埋め込み可能な刺激器および電極システムが不要になる。
【０１０４】
もう１つの代替実施形態では、体内に変位電流を誘導するために、平行プレートを、皮膚に接触して、または好ましくは皮膚に接触せずに、単に体外に置くことができる。プレートに印加される電圧の極性の周期的変化により、変位電荷が体を横切って掃引され、ＥＲＰに必要な電気刺激を生成するであろう。この実施形態は、ＥＲＰを含む細胞が組織内深くにあるときに好ましい。この実施形態も、埋め込み可能な刺激器および電極を不要にする。
【０１０５】
電気パルス発生器
本発明の１つの本質的要素は、電気パルス発生器の提供である。電気パルス発生器は、１つの電気刺激または一連の電気刺激すなわちパルス（ペーシング）を供給することが可能であるという本質的特徴を有する。電気刺激すなわちパルスは、電気的反応性プロモーターの転写を誘導するために使用され得る。一実施形態では、電気刺激器は、治療用産物の転写を活性化するために閾下刺激を提供する。閾下刺激の目的は、機械的収縮のために組織を興奮させることではなく、治療用産物、例えば酵素、タンパク質、成長因子、または、他の生物学的活性を調節し得る他の核酸もしくはタンパク質のような他の生物学的活性物質、の合成を選択的に活性化することである。しかし、他の電気刺激治療とともに、異なる刺激パターンが与えられ得る。時には、特に他の電気刺激治療とともに考慮されるとき、閾電気刺激が与えられることも可能であり、または有利なこともある。
【０１０６】
電気パルス発生器からの制御された出力電圧は、３５Ωから無限大までのような広範囲の組織インピーダンスに対して調整され得る。電気パルス発生器は、閾下刺激または閾刺激を送出するために使用され得る。一実施形態では、閾下刺激が供給され、刺激デバイスは、５０〜６０Ｈｚのレートで、０．１ボルトのピーク振幅で、電荷平衡化された電気パルスを送出することができる。この設定の組合せは、転写の増大を誘発することが示されている。
【０１０７】
提供されるシステムの一特徴は、電気パルス発生器が、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＥＲＰの空間的制御とともに時間的制御も有することが可能なことである。一般にこれは、所与の刺激で最大のＥＲＰ反応を誘発するために行われる。
【０１０８】
電気パルス発生器は、埋め込まれることも可能であり、また、体外にあることも可能であると想定される。ほとんどの場合、刺激は、パルス発生器からのリードおよび電極のセットを通じて、ＥＲＰを含む組織細胞に供給される。
【０１０９】
パルス発生器へのリード線および電極の取り付けは、少なくとも１つのＥＲＰの転写を刺激するように設計される。いくつかの適当な電極が、ＥＲＰを有する組織に電気刺激を供給するために機能することが可能である。一特徴では、電極は表面コイル電極である。表面電極は、白金合金または他の生体適合性金属から構成され得る。電極はコイル、シリンダ、ワイヤ、または他のいかなる形状であることも可能である。
【０１１０】
本発明の送出システムは、当技術分野で知られているペースメーカーおよび除細動器と多くの点で類似した、パルス発生器（ＰＧ）のような刺激要素を有するパルス発生器（すなわち刺激デバイス）を含む。図１１に示すパルス発生器２２は、出力回路１２に電流を供給するために、電圧調整器１３を通じて制御される電気化学電池（例えばバッテリ１１）を含む。パルス発生器は、さまざまな要素を含み得る密封エンクロージャ１４と、デバイス動作を制御するマイクロプロセッサおよびメモリ回路１５と、トランシーバアンテナならびに遠隔測定コマンドを受信し、記憶し、および送信する回路を有する遠隔測定要素１６と、患者の物理的および化学的状態を監視する検知要素１７とを有する。
【０１１１】
遠隔測定要素が使用される場合、それはパルス発生器の出力を調整することが可能な方式でデバイスと患者または医師との間で無線周波数コマンドおよび情報を送受信する手段を含む。
【０１１２】
検知要素が使用される場合、検知要素は、１つまたは複数の治療用作用物質の放出をトリガするように細胞に刺激が送られる必要があるときを検出するために、患者を監視する。この監視は、例えば、ＳＴセグメント上昇または冠状静脈洞における血流の減少を検出するための心電図（ＥＣＧ）の形態であることが可能である。検知要素は、治療用産物を送出する必要性を検出すると、パルス発生器に信号を送り、治療用遺伝子を転写するＥＲＰプロモーターに１個の電気刺激または電気刺激のセットを供給する。例えば、血餅が心臓に形成されると、それにより血流が減少し異常なＥＣＧが生じる。このＥＣＧが検知され、それによりＰＧがＥＲＰプロモータをトリガしてｔＰＡを転写させる。ｔＰＡが合成され、排出されて、血餅に到達することにより、血餅が心筋梗塞につながることを防止し、またはその可能性を低下させる。
【０１１３】
閾刺激
一形態では、パルス発生器（ＰＧ）は、心筋組織を刺激するように設計される。パルス発生器は、本発明の教示に従って、ＥＲＰ細胞を刺激するために当業者によって容易に修正され得る。本発明による刺激デバイスは、米国特許第５，１５８，０７８号（Ｂｅｎｎｅｔｔ他）、同第５，３１２，４５３号（Ｓｈｅｌｔｏｎ他）、および同第５，１４４，９４９号（Ｏｌｓｏｎ）に開示されているようなペースメーカー、ならびに米国特許第５，５４５，１８６号（Ｏｌｓｏｎ他）、同第５，３５４，３１６号（Ｋｅｉｍｅｌ）、同第５，３１４，４３０号（Ｂａｒｄｙ）、同第５，１３１，３８８号（Ｐｌｅｓｓ）、および同第４，８２１，７２３号（Ｂａｋｅｒ他）に開示されているようなペースメーカー／カーディオバータ／ディフィブリレータ（ＰＣＤ）で用いられるものに類似の、広範囲のマイクロプロセッサに基づくパルス発生器を含み得る。別法として、パルス発生器デバイスは、米国特許第５，１９９，４２８号（Ｏｂｅｌ他）、同第５，２０７，２１８号（Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ他）、および同第５，３３０，５０７号（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）に開示されているもののような、埋め込み可能な神経または筋刺激器で用いられるものと類似の刺激要素を含み得る。
【０１１４】
図１２は、体外プログラミングユニット（図示せず）によってプログラム可能な、刺激デバイス２２のさまざまなコンポーネントを図示しているブロック図である。本発明の目的に容易に適応可能なこのようなプログラマの１つは、市販のＭｅｄｔｒｏｎｉｃ  Ｍｏｄｅｌ  ９７９０プログラマである。プログラマは、例えば米国特許第５，３１２，４５３号（Ｗｙｂｏｒｎｙ他）に記載されているもののように、遠隔測定システムによって無線周波数符号化信号を送信するプログラミングヘッドにより、一連の符号化信号を刺激デバイス２２に供給するマイクロプロセッサデバイスである。刺激デバイス２２は、例示的実施形態として図１２に図示されているが、リード線またはアンテナ２４に電気的に結合される。リード線２４は、刺激のためにのみ使用されてもよく、または刺激および検知の両方のために使用されてもよい。リード線２４は、入力コンデンサ６０を通じて刺激デバイス２２の回路内のノード６２に結合される。入出力回路６８は、刺激デバイス２２とインタフェースするための回路、アンテナ６６、および、マイクロコンピュータユニット７８内のソフトウェアで実施されるアルゴリズムの制御下でリード線２４に刺激信号を印加するための回路７４も含む。
【０１１５】
マイクロコンピュータユニット７８は、オンボード回路８０を備え、オンボード回路８０は、システムクロック８２、マイクロプロセッサ８３、ならびにオンボードのＲＡＭ８４およびＲＯＭ８６を有する。この例示的実施形態では、オフボード回路８８はＲＡＭ／ＲＯＭユニットを備える。オンボード回路８０およびオフボード回路８８はそれぞれデータ通信バス９０によりデジタルコントローラ／タイマ回路９２に結合される。図１２に示される電気的コンポーネントは、当技術分野での通例に従って、適当な埋め込み可能なバッテリ電源９４により電源供給される。明確にするため、バッテリ電源から刺激要素２２のさまざまなコンポーネントへの結合は図示していない。
【０１１６】
アンテナ６６は、ＲＦ送信器および受信器ユニット５５を通じてのアップリンク／ダウンリンク遠隔測定を可能にするために、入出力回路６８に接続される。ユニット５５は、米国特許第４，５５６，０６３号（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ他）に開示されている遠隔測定およびプログラムロジック、または上に引用したＷｙｂｏｒｎｙ他の特許に開示されているものに対応し得る。電圧基準（ＶＲＥＦ）およびバイアス回路６１は、入出力回路６８のアナログ回路のための安定な電圧基準およびバイアス電流を発生する。アナログ−デジタル変換器（ＡＤＣ）およびマルチプレクサユニット５８は、「リアルタイム」の遠隔測定信号およびバッテリ寿命末期（ＥＯＬ）置換機能を提供するために、アナログ信号および電圧をデジタル化する。
【０１１７】
センスアンプ５３は、検知された信号を増幅し、増幅された信号をピーク検知および閾測定回路５７に供給する。回路５７は、ピーク検知された電圧および測定されたセンスアンプ閾電圧の指示を、パス６４によりデジタルコントローラ／タイマ回路９２に供給する。増幅されたセンスアンプ信号はその後、コンパレータ／閾検出器５９に供給される。センスアンプ５３は、いくつかの点で、米国特許第４，３７９，４５９号（Ｓｔｅｉｎ）に開示されたものに対応し得る。
【０１１８】
回路９２はさらに、好ましくは、リード線２４上に配置された電極により検知された信号を増幅し処理した上で受け取るために、電位図（ＥＧＭ）増幅器７６に結合される。ＥＧＭ増幅器７６により供給される電位図信号は、埋め込まれたデバイスが体外プログラマ（図示せず）により呼びかけられているときに、アップリンク遠隔測定により、患者の電気的心活動のアナログ電位図の表示を送信するために使用される。このような機能は、例えば、前に引用した米国特許第４，５５６，０６３号に示されている。なお、リード線またはアンテナ２４は、心臓内部以外の位置に配置されてもよいことに留意されたい。
【０１１９】
出力パルス発生器７４は、デジタルコントローラ／タイマ回路９２により供給される刺激トリガ信号に反応して、結合コンデンサ６５を通じてリード線２４に刺激を供給する。出力増幅器７４は、例えば、米国特許第４，４７６，８６８号（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）に開示されている出力増幅器に概して対応し得る。
【０１２０】
理解されるべきであるが、図１２は本発明に適用を見出し得るか、または当業者により本発明において使用するために変更され得る、例示的なタイプの刺激デバイスの図示であり、本発明の範囲を限定することは意図していない。電気刺激は、所定のタイミングおよび波形を有する電気インパルスを生成することが可能なパルス発生器を用いて送出され得る。この埋め込み可能なパルス発生器は、化学バッテリである電源を有し、これは内部電子回路に電力を供給するとともに、出力回路に電源供給し、組織に送出される電気パルスを発生する。随意選択的に、一特徴では、パルス発生器は、電気的反応性プロモーターに起因する治療を開始させるために、医師によりプログラムされることおよび／または患者アクティベータによりトリガされることを可能にする遠隔測定デバイスも含み得る。代替実施形態では、刺激器は、入力を制御アルゴリズムに提供するために使用可能な生理的パラメータおよび生化学的作用物質を測定するためのセンサを含むことも可能であり、それにより埋め込み可能な刺激器が自律的に治療を開始する。
【０１２１】
閾下刺激
一態様では、本発明は、操作ＥＲＰを含む組織に閾下刺激を供給する（図１３および図１４）ことが可能な電気パルス発生器を提供する。具体的には、パルス発生器は、約１０〜１００Ｈｚ、より好ましくは約３０〜８０Ｈｚ、さらに好ましくは約５０〜６０Ｈｚのレートで電荷平衡化された電気パルスを送出することができる。好ましくは、刺激のピーク振幅は約０．３ボルトであり、より好ましくは約０．２ボルトであり、最も好ましくは０．１ボルトである。刺激の好ましい振幅は、刺激閾より低い、すなわち閾下刺激であるようなものである。
【０１２２】
一特徴では、本発明は、５０Ｈｚのパルスを供給する。各パルスは０．３ｍｓｅｃの刺激と、電荷平衡のための逆極性を有する６．７ｍｓｅｃの再充電とを含み、パルスサイクルの残りの１３ｍｓｅｃの間は電極はフローティング状態である。図１５は、電気刺激パルスのタイミング図とともに、このパルス列を供給する回路の内部タイミングを示す。
【０１２３】
閾下パルス発生器のための出力回路の回路図を図１３に示す。例えば、コンポーネント値は以下のように選択され得る：ＶＳ＝２．８ボルト、Ｒ＝２５Ω、ＣＣ＝ＣＨ＝１０μＦ。これらの値の１つは、図１５に示すように、１０ｍｓｅｃの充電段階の終わりにＣＨが０．１１０ボルトとなるように選択される。この図により当業者は、任意の所与の設定電圧でＣＨを供給するいくつかの設定を選択することができるであろう。図１４は、刺激段階中の出力段の等価回路を示す。ＶＣはＣＨに対する初期条件を表す。この場合、ＣＨ、ＣＣおよびＲＴｉｓｓｕｅは直列接続である。ＣＨとＣＣをまとめてＣＥｑ＝５μＦにすることができる。電極に現れる電圧は、ＶＴｉｓｓｕｅ（ｔ）＝ＶＣＨ（０）｛１−ｅｘｐ［−ｔ／（ＣＥｑＲＴｉｓｓｕｅ）］｝、により与えられる。例えば、出力電圧が１０％だけ変化することが許容される場合、ＶＴｉｓｓｕｅ（ｔ）は０．１１０ボルトと０．０９０ボルトの間で変化することになる。これは、ＶＣＨ（０）＝０．１１０、およびＶＴｉｓｓｕｅ（ｔ）（０．３ｍｓｅｃ）＝０．０９０であることを示すであろう。組織電圧に対する式を書き直すと、０．０９０＝０．１１０｛１−ｅｘｐ［−ｔ／（ＣＥｑＲＴｉｓｓｕｅ）］｝、ｔ＝０．３ｍｓｅｃ、すなわち０．０９０＝０．１１０｛１−ｅｘｐ［−０．３×１０−３／（５×１０−６×ＲＴｉｓｓｕｅ）］｝となり、ＲＴｉｓｓｕｅについて解くとＲＴｉｓｓｕｅ＝３５Ωと求めることができる。換言すれば、出力電圧が９０〜１１０ｍＶの範囲にとどまる場合に、駆動可能な最小組織インピーダンスは３５Ωとなる。パルス発生器の上記の設定を使用することは、（１）閾下刺激のためのパルス発生器；（２）広範囲の組織インピーダンス（３５Ω〜∞）に対する制御された出力電圧；（３）目的が機械的収縮のために組織を興奮させることではなくＥＲＰプロモーターから治療用産物を放出させることである場合の閾下刺激のためのペーシング出力；および（４）細胞機構の時間的制御、のための一例を提供する。
【０１２４】
付随するリード線システムは、ＥＲＰプロモーターから最大反応を導出するため、および、心筋の興奮／収縮のような望ましくない細胞刺激（これは５０ＨｚでＶｆｉｂを誘導し得る）を最小にするために、選択された組織床にこの刺激を送出するためのものである。
【０１２５】
電極配置は、以下の２つの方法のうちの１つでなされ得る。好ましい実施形態では、電極は、トランスフェクトされた細胞が静脈系を用いて配置され適所に残された組織の付近に進められる。別法として、侵襲が最小限の外科的手法を用いて電極を適所に配置することも可能である。これは、血管系内のカテーテルの到達範囲を超えた場所へのアクセスを可能にするであろう。いずれの場合でも、電気的反応性プロモーターをトリガするために、双極または単極の刺激を印加して組織に電界を発生させることができる。双極刺激が好ましい方法である。
【０１２６】
電極の配置は、主として電極を埋め込むために使用される方法によって決まるであろう。電極が経静脈経路を介して配置される場合、修飾された細胞への電極の接近を患者の解剖学的構造が許容しないかもしれないことを了解した上で、電極は埋め込まれた細胞のできるだけ近くに配置されるべきである。非経静脈的埋め込み技法が使用される場合、刺激電極は通常、修飾された細胞の非常に近くに配置され得る。タンパク質生成を作動させるためにデバイスによって使用されるエネルギーを最小にするため、電極は、修飾された細胞のできるだけ近くに配置されるべきである。
【０１２７】
随意選択的な検知要素
刺激デバイス２２内の刺激要素に加えて、本発明のシステムは、少なくとも１つの生理的特性を監視して生理的状態の変化（通常、不安定プラークの破綻に起因する閉塞による血流の減少により引き起こされる虚血の開始）を検出するための検知要素を有することが可能である。例えば、皮下電極アレイを用いた擬似表面心電図（ＥＣＧ）が、血流の減少を検出するために使用され得る。これは、Ｔ波（すなわち、心室再分極すなわち回復に起因するＥＣＧパターンの部分）の異常モフォロジー（例えば、逆転した形状）により表される。このような擬似表面ＥＣＧは、埋め込みのために修正された標準ＥＣＧに類似している。この検知要素において、例えば、約１センチメートル間隔の３個の電極を有する埋め込み可能なパルス発生器が、患者の胸部内の胸筋に埋め込まれ得る。その場合、標準ＥＣＧのものと類似のＥＣＧパターンが、Ｔ波の異常モフォロジーの指示について監視されることになる。
【０１２８】
検知要素は、１つまたは複数の生理的特性を監視するために１つまたは複数の個別のセンサを有し得る。擬似表面ＥＣＧに加えて、このようなセンサとしては、例えば、血液ガス（例えば、ＣＯ２）センサ、ｐＨセンサ、冠状静脈洞内の血流センサなどがある。センサにおいて使用され得る他の検出メカニズムとしては、例えば、流れの結果としての音響飛行時間変化、ドップラー効果（受信周波数が送信周波数と異なる）を利用した音響ドップラー、熱希釈（血流および心拍出量を測定するための臨床的技法）、および閉塞動脈からの駆動圧力の欠如に起因する静脈圧降下がある。本発明の刺激デバイスで使用するために修正され得るセンサまたは埋め込み可能な監視デバイスの例は、例えば、米国特許第５，４０９，００９号（Ｏｌｓｏｎ）、同第５，７０２，４２７号（Ｅｃｋｅｒ他）、および同第５，３３１，９６６号（Ｂｅｎｎｅｔ他）に開示されている。適当なセンサおよび検知技法は当業者に既知であり、本発明において使用するために容易に適応され得る。
【０１２９】
［実施例］
本発明が、以下の実施例によりさらに記載される。実施例は、特定の実施形態を参照することにより本発明を説明するためにのみ提供される。これらの例示は、本発明のいくつかの特定の態様を説明しているが、限定を表現したものでも、本発明の範囲を制限するものでもない。
材料およびアッセイ
本明細書に開示され記載されるさまざまな制限酵素は市販されており、活性のための反応条件、補因子、および他の要件を含む当該酵素の使い方は当業者に既知である。特定の酵素に対する反応条件は、製造元の勧告に従って実行される。
【０１３０】
われわれは、トランスフェクトされた細胞におけるルシフェラーゼの発現を定量するために、デュアルルシフェラーゼアッセイ（ＤＲＬ）を利用した。従ったプロトコールは本質的に、Ｐｒｏｍｅｇａ製品情報データに記載されているものであった。
β−ガラクトシダーゼ：［このプロトコールは何に対してもうまく働くか？］
細胞、凍結切片、または組織サンプルを、４分間、４℃で、４％パラホルムアルデヒド、０．２５％グルタルアルデヒド、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４）中で固定した後、６時間、３７℃で、１ｍＭ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトシド、５ｍＭ  フェリシアン化カリウム、５ｍＭ  フェロシアン化カリウム、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を入れたリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中でインキュベートする。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ｇｅｌｖａｔｏｌ中で計数した後、サンプルを顕微鏡法により評価する。
【０１３１】
実施例１：細胞培養
ＱＢＩ−２９３Ａ（ヒト腎細胞系、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＣ２Ｃ１２（マウス骨格筋芽細胞、ＡＴＣＣ）細胞系を、６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に入れた３５ｍｍ細胞培養インサート上でベンダープロトコールに従って培養した。遺伝子トランスフェクションのために、細胞を約６０〜８０％コンフルエントまで成長させた。
【０１３２】
実施例２：細胞トランスフェクション
Ｆｕｇｅｎｅ  ６（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を、ｐＧＬ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）／ｐＲＬＳＶ４０（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）またはｐ６３８ＡＮＦｌｕｃ／ｐＲＬＳＶ４０のいずれかのプラスミドＤＮＡとともに使用して細胞をコトランスフェクトした。各プラスミドコンストラクトは、ＳＶ４０構成性プロモーター（ｐＧＬ２、ｐＲＬＳＶ４０）またはトランケートされた心房性ナトリウム利尿因子プロモーター（ｐ６３８ＡＮＦｌｕｃ、図５）のいずれかに融合されたルシフェラーゼプロモーター遺伝子をコードしていた。簡単に述べれば、１〜２μｇのそれぞれのプラスミド（全部で４μｇ）を、１５μｌのＦｕｇｅｎｅ  ６および８５μｌのＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｍ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）成長培地と混合し、その混合物を１滴ずつ細胞に加えた。細胞を３７℃の加湿ＣＯ２インキュベーターに一晩入れた後、電気刺激実験のために採取した。
【０１３３】
実施例３：電気的反応性プロモーターを試験するデバイス
記載される本デバイスは、任意の所与のプロモーターが電気刺激に対して反応するかどうかを試験するために使用され得る。当該標的プロモーターは、実施例１〜２に記載したようにレポーター遺伝子配列と融合される。トランスフェクトされた細胞の入った細胞培養インサートを試験デバイスに入れる。試験デバイスは、付着した細胞を均一に電気刺激するように設計されている。
装置の物理的説明：
刺激装置は、修正された６ウェルポリスチレン細胞培養プレートに基づいている。図９は、ウェルのうちの１つを横から見た概略図である。
【０１３４】
一特徴では、刺激装置の上側プレート電極１は、ポリマー（Ｄｅｌｒｏｎ）シリンダに取り付けられたチタン円板からなり、さらにこれが細胞培養プレートのカバーに取り付けられる。上側電極１は、電気端子３に（チタンワイヤで）接続される。
【０１３５】
もう１つの特徴では、下側プレート電極２は、細胞培養プレートのウェルの底に取り付けられたチタン円板からなる。下側電極は、電気端子４に（チタンワイヤで）接続される。
【０１３６】
装置により刺激されるべき細胞を多孔質膜５上で成長させる。試験時に、インサートは、細胞インサートのベースに取り付けられた薄い多孔質膜を備えていた。細胞の刺激の準備が整った後、膜に付着した細胞を刺激装置のウェルに入れ、カバー８（これに上側電極１が取り付けられている）を、細胞が付いた膜の上に置いた。これにより図９に示した構成が得られる。単層の細胞が、およそ下側電極（端子２）から１ｍｍかつ上側電極（端子１）から２ｍｍに吊り下げられる。
【０１３７】
細胞を、（そのイオン性内容のゆえに）導電性である細胞成長培地により包囲する。細胞をその上で成長させる膜は多孔質であるため、端子３から端子４へ印加される電気刺激は、付着している細胞の膜層を通じて伝導する。
【０１３８】
２個の電極は短い距離（約３ｍｍ）だけ離れた平行円板であるため、刺激により発生する電界はほとんどの細胞にわたり一様であろう。例外は、円板の周囲近くの少数の細胞であるが、そこではフリンジ効果が起こり、非一様な電界を生じる。
【０１３９】
図１０は、電気的反応性プロモーター（ＥＲＰ）の最適（最大）反応を生じるタイプの電気刺激（端子Ａから端子Ｂへ印加される）を示す。この刺激は、１０Ｈｚのレートでの２０ｍｓｅｃパルスの列からなる（あるパルスから次のパルスまで１００ｍｓｅｃ）。パルスは単相（電荷平衡化されていない）であるが、パルスの極性は１．３ｓｅｃごとに反転される。パルス振幅は、パルスの電圧ではなく電流を測定することにより判定された。例示される実験では、この装置におけるＡＮＦ  ＥＲＰ（電気的反応性プロモーター）の最適反応は２ｍＡであると判定された。しかし、認識されるように、最適設定は、電極、細胞までの距離、ならびに電極の形状、サイズおよび配置とともに、細胞密度および細胞型にも依存して、大きく変動する。したがって、認識されるように、ある範囲の振幅が、ｉｎ  ｖｉｖｏ性能パラメータを設定するために判定され得る。
【０１４０】
実施例４：ＥＲＰ転写に対する試験
ヒト冠状動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）を、試験チャンバー（図９）内で電気刺激した。細胞を１０、２０、および６０分間刺激した後、２４時間後に採取した。時間経過分析も行い、細胞を刺激の８、１３、および２５時間後に採取した。採取した細胞からＲＮＡを単離し、逆転写（ＲＴ）反応からのＲＴ  ｃＤＮＡ産物を、競合的ＰＣＲ（ｔＰＡ）、または半定量的ＰＣＲ（ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＴＧＦ−１）のいずれかにより、Ｇ３ＰＤＨを対照として定量した。ｔＰＡタンパク質レベルもまたＥＬＩＳＡにより定量した。
【０１４１】
時間経過分析では、ｔＰＡ発現レベルは、８時間および１３時間の刺激後時間点に対して２．４倍まで増大し、２４時間後には基礎レベル近くまで戻った。ｔＰＡタンパク質レベルの随伴した増大が、８時間および１３時間の時間点において見られた。刺激の長さの分析では、６０分の刺激がｔＰＡ遺伝子発現の最大の増大を生じた（対照に比べて１７倍）。ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢおよびＴＧＦ−１発現の測定では、電気刺激はＴＧＦ−１発現に対して最大効果を生じ、その発現は２４時間後に１０倍まで促進された。ＢＦＧＦおよびＰＤＧＦ−Ｂの発現レベルは、非刺激対照で見られるものと同様であった。
【０１４２】
実施例５：異種遺伝子にリンクされるＥＲＰプロモーター
遺伝子操作された２９３細胞すなわちＥＲＰプロモーターを含むＱＢＩ−２９３細胞が電気刺激に反応するかどうかを試験するため、心房性ナトリウム利尿因子由来の電気的反応性プロモーターに取り付けられたルシフェラーゼレポーター遺伝子で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞に、前述の試験デバイスを用いて、さまざまな期間、３７℃で電界をかけた。
【０１４３】
細胞を採取し、市販のデュアルルシフェラーゼプロモーター（ＤＬＲ）アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびＴＤ−２０／２０ルミノメータ（Ｔｕｒｎｅｒ ｄｅｓｉｇｎｓ）を用いてルシフェラーゼ発現により定量した。刺激ウェル間の細胞トランスフェクション効率の差は、ｐＲＬＳＶ４０の構成性発現から生じるもので正規化することができる。
【０１４４】
図６は、ｐ６３８ＡＮＦｌｕｃでトランスフェクトしたＱＢＩ−２９３Ａ細胞において、電気刺激がルシフェラーゼの発現を促進したことを示している。細胞を、本明細書に記載されているように、ｐ６３８ＡＮＦｌｕｃでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を以下のさまざまな条件下で２４時間刺激した：（１）１０Ｈｚ、２０ｍｓ、１ｍＡ、１．３ｓ極性反転；（２）１０Ｈｚ、１０ｍｓ、４ｍＡ、６．０ｓ極性反転；（３）１０Ｈｚ、２０ｍｓ、１ｍＡ、６．０ｓ極性反転；（４）５Ｈｚ、５ｍｓ、２ｍＡ、ＡＣ結合；（５）１０Ｈｚ、２０ｍｓ、１ｍＡ、ＡＣ結合。２４時間の刺激後、細胞を採取し、ルシフェラーゼ発現を定量した。
【０１４５】
図７は、ｐ６３８ＡＮＦｌｕｃでトランスフェクトしたＱＢＩ−２９３Ａ細胞における電気刺激後のルシフェラーゼ発現の時間経過を示す。細胞を１０Ｈｚ、２０ｍｓ、１ｍＡ、１．３ｓ極性反転で電気刺激した。電気刺激は、２４時間後にルシフェラーゼ発現の最大２．４倍の促進を誘発したが、促進された発現は１時間の刺激の後には明らかであった。
【０１４６】
図８は、Ｃ２Ｃ１２細胞における電気刺激後のルシフェラーゼの活性化の時間経過を示す。ｐ６３８ＡＮＦｌｕｃでトランスフェクトした細胞を、２４時間までのさまざまな時間点に対して電気刺激した（１０Ｈｚ、２０ｍｓ、１ｍＡ、１．３ｓｅｃ極性反転）。Ｃ２Ｃ１２細胞は、２０分間の刺激でルシフェラーゼ発現の最大に近い促進を示した。
【０１４７】
実施例６：衛星細胞の単離および培養
麻酔したイヌから無菌条件下で咬筋サンプルを採取した。筋サンプルを７０％エタノールですすいだ後、カルシウムおよびマグネシウムを含まないが１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含むハンクス基礎塩溶液中で３回すすいだ。組織を刻んだ（〜１ｍｍ３）後、２５ｍｌの酵素溶液（緩衝培地１９９；１％コラゲナーゼ；および０。２％ヒアルロニダーゼを０．２μフィルタで濾過し９５％Ｏ２：５％ＣＯ２で平衡化）で、滅菌５０ｍｌプラスチック遠心チューブ内でインキュベートした。振盪水槽中で１５分間、３７℃でインキュベートした後、数層の滅菌ガーゼを通して溶液を滅菌容器に注ぎ、遠心によりペレット化することによって、衛星細胞を採取した。残った組織を、１％プロテアーゼを含む緩衝培地１９９中で、３７℃で１５分間インキュベートし、筋からの衛星細胞の酵素的離脱を完了させ、加工処理した。パックされた細胞を、血清（１０％ウシ胎児血清）および１％抗真菌性抗生物質溶液（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を含む培地１９９で遠心（６５０  Ｘ  Ｇで１０分間）により３回洗浄し、再懸濁させた。細胞生育力をトリパンブルー排除法によりチェックし、細胞数を血球計算により判定した。細胞を、２５ｃｍ２培養フラスコ中の８ｍｌの増殖培地で１×１０６細胞に希釈した。
【０１４８】
培養された衛星細胞を、分化せずに継続して増殖するように、３〜４日ごとに低密度にして継代培養した。回収した細胞を培地１９９ですすいだ後、１％プロテアーゼを含む同培地で、３７℃で１０分間インキュベートした。回収した細胞をその手順で培養した。多核筋管を形成するために、衛星細胞を、２％ウマ血清（Ｇｉｂｃｏ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）および１％抗真菌性抗生物質溶液を含む培地１９９で、筋管が形成されるまで培養した。
【０１４９】
通常、９０％より高い生育性を有する４×１０６個の衛星細胞を筋から単離した。単離された細胞は、２０〜２２時間の倍加時間を有することが観察され、少なくとも２０細胞周期を経過してもなおその増殖および分化能力を保持することができた。
【０１５０】
実施例７：培養衛星細胞の標識
β−ガラクトシダーゼをコードしている、ｌａｃＺ遺伝子を含む哺乳類レポーターベクターｐＣＭＶβを、もともとＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）から購入し、リポフェクトアミン試薬をＧｉｂｃｏ ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）から入手した。
【０１５１】
５０μｇのｐＣＭＶβ  ＤＮＡおよび２２０μｌ（２ｍｇ／ｍｌ）のリポフェクトアミンを１０ｍｌの培地中に含むトランスフェクション培地を４５分間インキュベートした後、培地１９９で５０ｍｌに希釈する。培養衛星細胞（約６０％コンフルエント）をトランスフェクトするため、細胞を培地１９９で２回すすいだ後、３ｍｌのＤＮＡ−リポソームトランスフェクション培地をかける。３７℃で８時間ＣＯ２インキュベーターに入れた後、３ｍｌの２Ｘ血清を加える。トランスフェクションの２４時間後、トランスフェクション培地を成長培地と交換する。トランスフェクションの４８〜７２時間後、Ｘ−ｇａｌ組織化学染色を用いてトランスフェクションを監視する。９０％より多くの細胞がβ−ガラクトシダーゼを産生することを見出した。出願人および他の研究から、ｌａｃＺ遺伝子の導入は衛星細胞の増殖または分化と干渉しない。
【０１５２】
実施例８：虚血性傷害後の心筋層への標識細胞の埋め込み
完全麻酔および無菌外科条件下で正中線胸骨切開術により心臓を露出する。心膜および胸壁に付着した縁を開いて左心室を露出する。ヘパリン（１００Ｕ／ｋｇ）およびリドカイン（２ｍｇ／ｋｇ）の投与後、左前下行冠状動脈（ＬＡＤ）を一時的に２時間閉塞した後、再灌流する。閉塞部位は、心尖から約３分の２にあるＬＡＤの最初の分岐の直下である。これは一般に、低死亡率（＜５％）の、再現性のある心筋梗塞を生じる。虚血心筋層は、チアノーゼおよび減動により同定することができる。虚血域は、後の同定のために、５−０ポリプロピレン縫合糸で囲まれる。
【０１５３】
閉塞したＬＡＤを解放した後、心機能が安定化してから、細胞を埋め込んだ。５体の動物を以下の治療のうちの１つにランダムに割り当てた：（１）心筋梗塞に２５ゲージ針で衛星細胞を注射；（２）傷害した心筋にＭｅｄｔｒｏｎｉｃカテーテルを用いて衛星細胞を送出；（３）梗塞心筋に培地を注射。
【０１５４】
新生心筋層の組織構造
心組織を４％アガロースに入れ、５ｍｍ薄片に切り、Ｘ−ｇａｌと反応させた。切片をスキャンし、正常、Ｘ−ｇａｌ陽性、および瘢痕組織の分画を定量した。組織学的および免疫組織学的評価も実行した。
【０１５５】
実施例９：骨格筋芽細胞の単離および培養
骨格筋芽細胞の単離および培養において以下の溶液および材料を使用した：１）単離培地：８０．６％  Ｍ１９９（Ｓｉｇｍａ，Ｍ−４５３０）、７．４％  ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ，Ｍ−４６５５）、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｃａｔ．＃Ａ−１１１５−Ｌ）、２Ｘ（２％）ペニシリン／ストレプトマイシン（最終濃度２００，０００Ｕ／Ｌ  ペニシリン／２０ｍｇ／Ｌ  ストレプトマイシン、Ｓｉｇｍａ，Ｐ−０７８１）；２）筋芽細胞成長培地：８１．６％  Ｍ１９９（Ｓｉｇｍａ，Ｍ−４５３０）、７．４％  ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ，Ｍ−４６５５）、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｃａｔ．＃Ａ−１１１５−Ｌ）、１Ｘ（１％）ペニシリン／ストレプトマイシン（最終濃度１００，０００Ｕ／Ｌ  ペニシリン／１０ｍｇ／Ｌ  ストレプトマイシン、Ｓｉｇｍａ，Ｐ−０７８１）；３）洗浄溶液：Ｍ１９９、２ｘペニシリン／ストレプトマイシン；４）酵素溶液：１．０ｇｍのコラゲナーゼおよび０．２ｇｍのヒアルロニダーゼを１００ｍｌのＭ１９９に加えることにより、酵素溶液を、使用するのと同じ日に調製する（４０〜５０ｇｍの骨格筋を消化するには１００ｍｌの酵素／分散溶液で十分である）。酵素溶液をまず０．４５μｍフィルタに通してから０．２２μｍフィルタに通して濾過滅菌し、使用の準備ができるまで４℃に保つ；４）分散溶液：１ｇｍのプロテアーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓからのプロテアーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｐ−８８１１））を１００ｍｌのＭ１９９に加えることにより、使用するのと同じ日に調製する。０．２２μｍフィルタに通して濾過滅菌し、使用の準備ができるまで４℃に保つ。
【０１５６】
以下の特製試薬を同じベンダーから入手した：コラゲナーゼ（粗製：タイプＩＡ、Ｓｉｇｍａ，Ｃ−２６７４）；ヒアルロニダーゼ（タイプＩ−Ｓ、Ｓｉｇｍａ，Ｈ−３５０６）；パーコール（Ｓｉｇｍａ，Ｐ−４９３７）；トリプシン溶液（Ｓｉｇｍａ，Ｔ−３９２４）；ＢＩＯＣＯＡＴ  Ｌａｍｉｎｉｎ  Ｃｅｌｌｗａｒｅ（２５ｃｍ２および７５ｃｍ２フラスコ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ（ｓ）．４０５３３，４０５２２）；トリプシン処理溶液：０．５ｇ／ｌのトリプシン（Ｓｉｇｍａ，Ｔ−３９２４）を含むＨＢＳＳ；ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋不含（Ｓｉｇｍａ，Ｈ−６６４８）。
【０１５７】
骨格筋芽細胞の単離
骨格筋生検、好ましくは筋腹からのものを、滅菌遠心チューブまたは培地びん内の単離培地に入れ（約３０〜５０ｍｌの単離培地を、約１０グラム以下の生検を含む滅菌遠心チューブに加えた；２５グラムまでの生検を使用する場合、５０ｍｌの単離培地を１２５ｍｌ滅菌培地びんに加えた）、氷上に置いた（約４℃）。組織を刻むため、組織を取り出し、滅菌ペトリ皿に置き、結合組織を切除した。組織を滅菌７０％ＥｔＯＨで３０秒間すすいだ後、ＥｔＯＨを組織から吸引除去した。組織を２Ｘ  ＨＢＳＳですすぎ、鋏とピンセットで細かく刻んだ。刻んだ生検を５０ｍｌ滅菌遠心チューブに移した。チューブあたり２０ｇｍ以下の組織を入れた。約２５ｍｌのＨＢＳＳを各チューブに加え、混合し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、ＧＳ−６で短時間２０００ＲＰＭで遠心することによりペレット化した。ＨＢＳＳをデカンテーションにより除去し、組織を再びすすぎ、遠心することをさらに２回繰り返した。酵素溶液をチューブに加え（約２５ｍｌ／もとの生検１５〜２０ｇｍ）、インキュベーターシェーカー内で２０分間、３７℃、３００ＲＰＭでインキュベートした。次に組織を２０００ＲＰＭで５分間遠心し、上澄みを捨てた。分散溶液をチューブに加え（約２５ｍｌ／もとの生検１５〜２０グラム）、インキュベーターシェーカー内で１５分間、３７℃、３００ＲＰＭでインキュベートした。次にサンプルを２０００ＲＰＭで５分間遠心し、上澄みを採取し、ウシ胎児血清を加えることにより不活化して、最終濃度を１０％にし（１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｃａｔ．＃Ａ１１１５−Ｌ））、４℃で保存した。第２の酵素的消化、インキュベーション、および単離のために分散溶液をチューブに加えた。分散消化ステップからの細胞懸濁スラリーを２４００ＲＰＭで１０分間遠心した。細胞ペレットを最小体積の洗浄溶液で再懸濁し、ペレットを５０ｍｌ遠心チューブにまとめ、最終体積を洗浄溶液で４０ｍｌに調節した。細胞を再び２４００ＲＰＭで１０分間遠心して細胞を単離した。細胞を洗浄溶液でさらに２回洗浄し、最後に、出発した組織が２５ｇｍより多いか少ないかに応じて、２〜４ｍｌのＭＥＭ中に再懸濁した。約２ｍｌの細胞を、５ｍｌの６０％パーコール／ＭＥＭ上の１０ｍｌの２０％パーコール／ＭＥＭの上に重層した。細胞を１１９４７ＲＰＭ（１５０００ｘｇ）で５分間８℃で遠心し、２０％と６０％のパーコール層の間に生じる細胞のバンドを単離した。このバンドは筋芽細胞を含む。収集した細胞のバンドを５容の成長培地で希釈し、３０００ＲＰＭで１０分間、再び遠心した。上澄みを除去し、細胞を成長培地中に再懸濁させ、計数し、ＢＩＯＣＯＡＴ  ＬａｍｉｎｉｎでコートしたＴ−フラスコに約１×１０４細胞／ｃｍ２でプレーティングした（最初のプレーティングは、細胞の付着を助けるために、ラミニンでコートした表面上になされるべきである）。細胞を６０％〜８０％コンフルエントまで培養した後、細胞が最終分化する前に継代した。
【０１５８】
骨格筋芽細胞の培養
成長培地配合物は、８１．６％  Ｍ１９９（Ｓｉｇｍａ，Ｍ−４５３０）、７．４％  ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ，Ｍ−４６５５）、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｃａｔ．＃Ａ−１１１５−Ｌ）、および１Ｘ（１％）ペニシリン／ストレプトマイシン（最終濃度１００，０００Ｕ／Ｌ  ペニシリン／１０ｍｇ／Ｌ  ストレプトマイシン、Ｓｉｇｍａ，Ｐ−０７８１）からなる。概ね細胞を播種密度１×１０４細胞／ｃｍ２で継代した。通常これは、約９６時間で８０％コンフルエント単層を生じるであろう。同様に、細胞を１：４〜１：６の比で分割することができ、これは９６時間以内にコンフルエント単層を生じるであろう。効果的に細胞を継代するためには、細胞がコンフルエントになることは許されない。細胞間接触は細胞を筋管に分化するさせるであろう。
【０１５９】
細胞を継代するため、まず培地をＴ−フラスコから除去した。適当量のハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）を再びフラスコに加え、約５分間室温でインキュベートした。ＨＢＳＳを除去し、トリプシン溶液で置換して、最大５分間、３７℃で、５％ＣＯ２インキュベータ内でインキュベートした。穏やかな攪拌は細胞の離脱を助ける。フラスコを少なくとも等容の成長培地で希釈し、トリプシンを中和した。サンプルを取り出し、計数した後、細胞を８００〜１０００ＲＰＭで１０分間遠心した。細胞を再計数し、細胞培地中に再懸濁して、適当なフラスコに播種した。健全な培養を維持するため、培地を２〜３日ごとに交換した。
【０１６０】
実施例１０：筋梗塞組織における移植細胞の電気刺激
１５体のイヌにおいて、一時的な冠状動脈閉塞（ＬＡＤ）に続く再灌流により、心筋梗塞を誘発した。梗塞／再灌流の後、対照群の動物は培地の注射を受け、試験群１の動物はシリンジで直接注射された５×１０７個の骨格筋芽細胞を受け、試験群２の動物はプロトタイプＭｅｄｔｒｏｎｉｃカテーテルにより送出された５×１０７個の骨格筋芽細胞を受けた。最初の手術から６週間後、動物にセンサを装着してその心機能を測定し、屠殺した。動物のうちの８体は、心血管機能分析中にさらに電気刺激された。
【０１６１】
梗塞領域の組織切片をマッソン三色染色法で染色した。移植細胞をＸ−ｇａｌ組織化学染色により可視化した。結果は、試験群１および試験群２の両方の動物が、埋め込み部位で健全に見える筋組織を発育させていることを示した。さらに、針で注射した細胞と、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃカテーテルで注射した細胞とで、新たな筋構造に識別可能な差はなかった。対照動物では、梗塞領域は、フィブリンおよびコラーゲンにより形成された豊富な結合組織を有し、心細胞の証拠はなかった。
【０１６２】
圧力−セグメント長ループを用いて心機能を評価した。細胞置換治療を受けた心臓の梗塞域は弾性構造を維持したが、対照心臓の梗塞はより塑性的な性質を獲得した。３体の対照動物については電気刺激は有意な利益を有しなかったが、細胞置換治療を受けた５体の動物のうちの３体は、電気刺激の印加で少なくとも４０％の心機能の増大を示した。
【０１６３】
組織病理学的方法および結果
移植された骨格筋細胞が２週間の期間の終わりに存在していたことを確認するため、保存された組織切片を免疫組織化学により抗ミオシン抗体（モノクローナル抗骨格筋ミオシン（速筋）、クローンＭＹ−３２、Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ−４２７６）を用いて分析した。剥離された部位の２つの異なる領域における陽性（緑色）染色は、心筋層の剥離領域における注射された骨格筋細胞の、その導入２週間後の存在を示した。この免疫染色分析は、心筋層における骨格筋細胞の存在の明確な証拠を提供した。
【０１６４】
本明細書に列挙された特許、特許出願、および刊行物の完全な開示は、あたかもそれぞれ個別に参照により援用されているかのごとく、参照により本明細書に援用される。上記の実施例および開示は、例示的であることを意図しており網羅的ではない。これらの実施例および説明は、多くの変形例および代替例を当業者に示唆するであろう。これらのすべての代替例および変形例は、併記の特許請求項の範囲内に含まれることが意図されている。当業者は、本明細書に記載した特定の実施形態の他の等価物を認識するかもしれないが、その等価物もまた併記の特許請求項により包含されることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】
治療用産物の産生のためにトランスフェクトされた組織における電気的反応性プロモーターの電気刺激
図１は、治療用産物を産生するための電気的反応性プロモーターの１つの作用モードの概観である。電気刺激時に治療用産物を産生する電気的反応性プロモーターを含むトランスフェクトまたは移植された心細胞が概略的に示されている。
【図２】
ステントに担持された電気的反応性プロモーター細胞の電気刺激
図２は、コイル状ステントと通信して電流を発生させるために無線周波数（ＲＦ）信号を使用することを含む、本発明による埋め込み可能なシステムの図示である。挿入図２Ａは、ステントに付随する電気的反応性プロモーター細胞を電気刺激するための、コイル状ステント内の回路の図式的表示である。
【図３】
足場上の電気的反応性プロモーター細胞の送出
図３は、足場上に成長させた操作細胞に印加電界を送出するための２つの代替構成を示し、（Ａ）は平行電極を有する導電性マトリクスであり、（Ｂ）は導電性ステントマトリクスである。
【図４】
電気的反応性ベクター
図４は、電気的反応性プロモーターに作用可能にリンクされる治療用遺伝子の全体的ベクター構成を示す。ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡテールおよびエンハンサーと、細菌性伝搬のためのアンピシリン耐性遺伝子も示されている。
【図５】
発現ベクターｐＡＮＦ−６５ＧＬ
図５は、ｐＡＮＦ−６５ＧＬのベクターマップである。ｐＡＮＦ−６５ＧＬを、親ベクターであるｐＧＬ２プロモーターから、ウィルス性プロモーターをＡＮＦ転写開始部位（＋１）およびさまざまな長さの５’フランキング配列で置換することによって作成した。ＡＮＦ−６５の上流の、そこに（随意選択的に、組織特異的および／またはサイレンサー要素とともに）電気的反応性要素をクローニングすることが可能な複数のクローニング部位と、ルシフェラーゼコード領域の３’側であるとともにプロモーター（Ａｎ）の５’側にある、ポリアデニル化シグナルを提供するＳＶ４０の３’非翻訳領域と、細菌細胞における伝搬のためのアンピシリン耐性遺伝子とが示されている。特定のコンストラクトでは、括弧内に現れている制限エンドヌクレアーゼ部位は、挿入ＤＮＡにより作成される修飾のためにもはや利用可能でない。例えば、ＮｈｅＩは−１３４ＧＬのために利用不能である。プラスミドｐ６３８ＡＮＦｌｕｃを、親ベクターｐＧＬ２から、ＳＶ４０プロモーターをＡＮＦプロモーターで５’フランキング配列の開始部位（＋１）から−６３８まで置換することによって構成した。
【図６】
電気的反応性プロモーターからの促進された発現
図６は、ｐ６３８ＡＮＦｌｕｃでトランスフェクトしたＱＢＩ−２９３Ａ細胞において、電気刺激がルシフェラーゼの発現を促進したことを示す。細胞を、本明細書に記載されるように、ｐ６３８ＡＮＦｌｕｃでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を以下のさまざまな条件下で２４時間刺激した：（１）１０Ｈｚ、２０ｍｓ、１ｍＡ、１．３ｓ極性反転；（２）１０Ｈｚ、１０ｍｓ、４ｍＡ、６．０ｓ極性反転；（３）１０Ｈｚ、２０ｍｓ、１ｍＡ、６．０ｓ極性反転；（４）５Ｈｚ、５ｍｓ、２ｍＡ、ＡＣ結合；（５）１０Ｈｚ、２０ｍｓ、１ｍＡ、ＡＣ結合。２４時間の刺激後、細胞を採取し、ルシフェラーゼ発現を定量した。
【図７】
活性化の時間経過：ＱＢＩ−２９３細胞
図７は、ｐ６３８ＡＮＦｌｕｃでトランスフェクトしたＱＢＩ−２９３細胞における電気刺激後のルシフェラーゼ発現の時間経過を示す。細胞を１０Ｈｚ、２０ｍｓ、１ｍＡ、１．３ｓ極性反転で電気刺激した。電気刺激は、２４時間後にルシフェラーゼ発現の最大２．４倍の促進を誘発したが、促進された発現は１時間の刺激の後には明らかであった。
【図８】
活性化の時間経過：Ｃ２Ｃ１２細胞
図８は、Ｃ２Ｃ１２細胞における電気刺激後のルシフェラーゼの活性化の時間経過を示す。ｐ６３８ＡＮＦｌｕｃでトランスフェクトした細胞を、２４時間までのさまざまな時間点に対して電気刺激した（１０Ｈｚ、２０ｍｓ、１ｍＡ、１．３ｓｅｃ極性反転）。Ｃ２Ｃ１２細胞は、２０分間の刺激でルシフェラーゼ発現の最大に近い促進を示した。
【図９】
電気刺激のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ装置
プロモーターコンストラクトを試験するための試験装置は、修正された６ウェルポリスチレン細胞培養プレートに基づいている。図９は、横から見たウェルの１つの概略図である。
【図１０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験のための電気刺激系列
図１０は、電気的反応性プロモーター（ＥＲＰ）を試験するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験装置を示す。この刺激系列は、１０Ｈｚのレートでの２０ｍｓｅｃパルスの列からなる（あるパルスから次のパルスまで１００ｍｓｅｃ）。パルスは単相（電荷平衡化されていない）であるが、パルスの極性は１．３ｓｅｃごとに反転される。
【図１１】
遠隔測定およびセンサ機能を有するパルス発生器
図１１は、遠隔測定およびセンサ機能を有するパルス発生器を概略的に示す。
【図１２】
閾刺激のためのパルス発生器
図１２は、電気刺激を標的組織細胞に送出することが可能なパルス発生器のための回路のブロック図である。
【図１３】
閾下刺激のための出力回路の簡略化された回路図
図１３は、パルス発生器のための閾下刺激デバイスの出力回路の回路図を示す。
【図１４】
出力段階中の閾下刺激の等価回路
図１４は、出力段階中のパルス発生器のための閾下デバイスの出力回路の回路図を示す。
【図１５】
閾下刺激系列
図１５は、一連の閾下刺激を提供するペーシング方式を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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