(57)【要約】生物学的サンプルの同一のマイクロアレイを同時に多数作製するための方法および装置が提供される。本発明は、それぞれ上面と、底面と、一定パターンの貫通孔とを有する複数の基体を利用する。各貫通孔は、上部がより大きな断面積で、下部がより小さな断面積であり、それらの間の移行部にはステップまたはプラトー（平坦部）が形成されている。多数の基体を積み重ねると、貫通孔の見当が合い、積み重ねた基体のスタックを貫通するトンネルが形成される。所望の試薬をこのトンネルに流して、ステップまたはプラトー部に付着させる。隣接する貫通孔間での漏出を防止するためバリアー層を設けてもよい。所望の試薬を付着させたら、基体を分離する。こうして、それぞれが数百ないし数千のｃＤＮＡ断片といった生物学的サンプルを含むことができる、一連のマイクロアレイが同時に形成される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロアレイ作成用の基体であって、該基体は、上面と、底面と、この基体の上面と底面との間に通じる複数の貫通孔とを有し、各貫通孔が、大断面積部分と、小断面積部分と、その移行部分に形成されたプラトーとを有する基体。
【請求項２】
前記基体が、その少なくとも１つの表面上に設けられた、前記貫通孔を包囲する不透水性のシール手段を備える、請求項１記載の基体。
【請求項３】
前記シール手段が疎水性粘稠物質、弱い接着剤、および高分子エラストマーよりなる群から選ばれる、請求項２記載の基体。
【請求項４】
前記基体が１ｃｍ３ あたり少なくとも１００ 個の貫通孔を有する、請求項１記載の基体。
【請求項５】
少なくとも第１のプラトーに第１のアナライト特異性試薬が設けられ、少なくとも第２のプラトーに、前記第１のアナライト特性性試薬とは異なる第２のアナライト特異性試薬が設けられている、請求項１記載の基体。
【請求項６】
前記アナライト特異性試薬類が、ハイブリッド形成アッセイにおいて標識ｃＤＮＡを検出することができる、請求項５記載の基体。
【請求項７】
前記基体がガラスまたはシリコンである、請求項１記載の基体。
【請求項８】
マイクロアレイ作成用の請求項１記載の基体を積み重ねた基体スタックであって、該スタックは少なくとも２個の基体を含み、各基体は上面と、底面と、この基体の上面と底面との間に通じる複数の貫通孔とを有し、各貫通孔が大断面積部分と、小断面積部分と、その移行部分に形成されたプラトーとを有し、
この基体スタックにおいて、対応する位置の貫通孔は、それらが基体スタックを貫通する連続したトンネルを形成するよう見当が合っている基体スタック。
【請求項９】
前記トンネルを通る流体の流れを許すが、隣接するトンネル間の流体の流れを阻止するバリアー層を前記基体間にさらに備える、請求項８記載の基体スタック。
【請求項１０】
前記スタックが少なくとも１０枚の基体を備える、請求項８記載のスタック。
【請求項１１】
下記を備える、同一の複数のマイクロアレイからなる１セットを同時に作成する装置：
解放可能な保持手段、
該解放可能な保持手段により保持された、基体を積み重ねた基体スタックであって、該スタックは少なくとも２個の基体を含み、各基体は上面と、底面と、基体の上面と底面との間に通じる複数の貫通孔とを有し、各貫通孔が大断面積部分と、小断面積部分と、その移行部分に形成されたプラトーとを有し、この基体スタックにおいて、前記貫通孔は見当が合っていて、基体スタックを貫通する連続トンネルを形成している、基体スタック、および
該スタックの上面または底面から個々の貫通孔に試薬を導入する手段。
【請求項１２】
試薬を導入する側とは反対側の基体スタックの側に連通した減圧手段をさらに含む、請求項１１記載の装置。
【請求項１３】
個々の貫通孔に試薬を導入する前記手段が２以上の管状チャネルを備え、各チャネルが試薬を入れた供給ウェルと連通している、請求項１２記載の装置。
【請求項１４】
下記工程からなる、一連の同一のマイクロアレイを同時に作成する方法：
基体を積み重ねた基体スタックであって、該スタックは少なくとも２個の基体を含み、各基体は上面と、底面と、基体の上面と底面との間に通じる複数の貫通孔とを有し、各貫通孔が大断面積部分と、小断面積部分と、その移行部分に形成されたプラトーとを有し、この基体スタックにおいて、前記貫通孔は見当が合っていて、基体スタックを貫通する連続したトンネルを形成している、基体スタックを形成し、
少なくとも第１のトンネルに第１の試薬を、第２のトンネルに少なくとも第２の試薬をそれぞれ導入し、そして
該基体を分離する。
【請求項１５】
試薬を導入する側とは反対側の基体スタックの側に減圧を適用することをさらに含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
下記工程からなる、一連の同一のマイクロアレイを同時に作成する方法：
（ａ） スペーサーと基体を交互に積み重ねたスタックであって、該スタックは少なくとも２個のスペーサーと少なくとも２個の基体を含み、各基体は上面と、底面と、基体の上面と底面との間に通じる複数の貫通孔とを有し、各スペーサーは上面と、底面と、スペーサーの上面と底面との間に通じる複数の貫通孔とを有し、該スペーサーの貫通孔は該基体の貫通孔より径が大きく、該スペーサーの貫通孔は該基体の貫通孔と見当が合っていて、整列したスペーサーと基体の貫通孔が、交互に積み重ねたスペーサーと基体のスタックを貫通する１つの連続した流路を持つカラムを形成し、該スペーサーが隣接するカラムの貫通孔を隔てるバリアーを形成するようになっているスタックを形成し、
（ｂ） 該連続流路に試薬を流して該基体上に試薬を付着させ、そして
（ｃ） 該基体を分離して、該少なくとも２個の各基体上に試薬のマイクロアレイを現れるようにする。
【請求項１７】
前記スペーサーを前記基体から分離する工程をさらに含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも２個の異なるカラムに少なくとも２種類の異なる試薬を流す、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
前記スペーサーがプラスチック、ゴム、ワックス、ガラスおよび金属よりなる群から選ばれた材料から形成されたものである、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
前記スペーサーの貫通孔の径が前記基体の貫通孔の径の少なくとも３倍である、請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
前記スタックが少なくとも１０個ずつの交互の取り外し可能なスペーサーと基体とからなる、請求項１６記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１００ 個のカラムが前記スタックを貫通している請求項１６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、一連の同一のマイクロアレイを同時に作成することができる方法および装置に関し、各マイクロアレイは、しっかりした支持体上に数百ないし数千個のアナライト （被分析物） アッセイ領域を含み、各領域は例えば、ハイブリッド形成アッセイにおいて標識ｃＤＮＡを検出するのに有用なアナライト特異性試薬を含んでいる。
【０００２】
関連技術の説明
数百ないし数千個の生物学的アナライト・アッセイ領域からなるマイクロアレイは、生物学的分析に広く使用されている。それぞれ異なる既知の試薬、通常は既知のＤＮＡ 断片のような明確なポリヌクレオチドまたはポリペプチド型バイオポリマー、を含有する小さな液滴を、顕微鏡のガラススライドのようなしっかりした基体上の定まったアレイ（列）内に付着させて固定化する。液滴が乾いたアレイを、未知の、例えば、蛍光または放射性化学物タグで予め標識した相補性ＤＮＡ （ｃＤＮＡ）、を含有する溶液に曝す。アレイとｃＤＮＡの相補性配列ポリヌクレオチドがマッチすれば、結合反応またはハイブリッド形成 （ハイブリダイゼーション） が起こる。その後、光学的または放射線感受性走査により、どのスポットがタグを含んでいるかが確定すると、溶液中に存在する相補性化合物が同定される。
【０００３】
マイクロアレイは迅速な生物学的分析のための有用なツールとなるが、マイクロアレイを製造する方法は時間がかかり、高価なままである。
例えば、米国特許第５，８０７，５２２ 号 （Ｓｈａｌｏｎら） から、基体 （但し、一度に１つの基体） 上に液滴をプリントまたは滴下するのに各種形状のキャピラリペンを使用することが公知である。多数 （典型的には８または１６個） のペンを、しばしばロボットの制御下に、同時に使用することができるが、各ペンまたはペン群には、１個のペンに１つの試薬しか充填することができない。その後、ペンを１つの基体から次の基体へと次々にタッチさせて、各基体上にほぼ同一の液滴を付着させる。準備すべき基体のセット （典型的には数十個から数百個） の各基体に第１のセットの試薬液滴を付着させた後、ペンのセットを洗って乾かし、次のセットの試薬を再び充填し、次のセットの液滴を同じ基体上の隣接位置にプリントする。この操作手順は時間がかかり、正確さとスピードを達成するには高価で精密な装置を必要とする。
【０００４】
別の公知の方法は、長い柔軟な毛細管を使用して、液体を貯蔵ウェルの複数のセットから毛細管の先端まで運び、その毛細管の先端を、Ｓｈａｌｏｎらと同様の方法で基体に次々に当てていく。この方法はＳｈａｌｏｎらと同じ欠点のすべてがあてはまり、さらに高価な試薬のかなりの量を毛細管の中に貯めておく必要がある。
【０００５】
さらに別の公知の方法が米国特許第５，８００，９９２ 号 （Ｆｏｄｏｒ ら） に開示されており、一連の化学反応による基体上でのオリゴヌクレオチドの合成 （Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ） のための組合わせ化学に関係する。この方法はオリゴヌクレオチドに限定され、長いストランドのｃＤＮＡには適していない。また、オリゴヌクレオチドの配列が事前に既知でなければならない。この方法も複雑で高価な装置を必要とし、時間のかかる反応工程を含むという欠点がある。
【０００６】
結合反応を指示する蛍光または放射能のシグナルを増幅させるために、米国特許第５，８４３，７６７ 号 （Ｂｅａｔｔｉｅ）は、群に分かれて配置された、基体を通って走る多数の別個のチャネルを、チャネルの壁面に固定化された結合試薬と共に提供することを教えている。チャネルにより、結合に利用可能な基体の表面積の量が増大し、従って理論的には検出感度および効率が増大する。しかし、実際には、検出光学要素がいまだに投影面積からだけの直接受信に限られているため、改善は予想されたほどは大きくないことが判明した。
【０００７】
【発明の要約】
マイクロアレイの公知の製造方法および種類に固有の前述した難点を考慮して、本発明の目的は、生物学的サンプルの複数の同一マイクロアレイを同時に作成する改善された方法および装置を提供することである。
【０００８】
本発明は、それぞれ上面と、底面と、一定パターンの貫通孔とを有する複数の基体を利用する。各貫通孔は、上部がより大断面積で、下部がより小断面積であり、それらの間の移行部には好ましくは基体の上面に平行なステップまたはプラトー（平坦部）が形成されている。多数の基体を積み重ねると、対応する貫通孔は見当が合い、積み重ねた基体のスタックを貫通するトンネルを形成する。所望の試薬をトンネルに流して、ステップまたはプラトー部に付着させる。それにより、スタック内の全ての基体が正確な位置で、かつ正確な量の試薬で同時にスポッティング（液付着処理）される。隣接する貫通孔間での漏出を防止するため、基体の間にバリアー層を設けてもよい。
【０００９】
所望の試薬を付着させたら、基体を分離する。こうして、それぞれが数百ないし数千のｃＤＮＡ断片といった生物学的サンプルを含むことができる、一連のマイクロアレイが同時に形成される。
【００１０】
以下の本発明の詳細な説明がよりよく理解され、本発明の当該技術分野に対する寄与がより十分に理解されうるように、以下では本発明のより適切で重要な側面をかなり広く概説する。本発明の請求の範囲の主題を構成する本発明のそれ以外の側面については後で説明する。ここに開示した技術思想および具体的な態様は、改良や、あるいは本発明のマイクロアレイの製造と、それと同じ目的を実施するための他の方法および装置を設計するための基礎として容易に利用されうることは当業者には理解されよう。そのような均等な構成は、請求の範囲に記載する本発明の技術思想および範囲から逸脱するものではないことも当業者には容易に理解されよう。
【００１１】
本発明の性質および目的をより完全に理解するには、添付図面と共に以下の詳細な説明を参照すべきである。
【００１２】
【発明の詳しい説明】
本発明は、固体支持体上にアナライトアッセイ領域のマイクロアレイを形成する方法に関し、ここでアレイの各領域は既知量の選択されたアナライト特異性試薬を有する。より広義には、１または２以上の複数の異なる配列の固定ポリヌクレオチドへの標識されたポリヌクレオチドの結合を検出するのに用いる基体を提供する。
【００１３】
マイクロアレイとその作成に用いる試薬は当業者には周知であるので、ここでさらに詳細に説明する必要はない。試薬は、好ましくは基体に固定された別個のポリヌクレオチドまたはポリペプチド・バイオポリマーである。
【００１４】
蛍光リポーター標識ｃＤＮＡを、複数の既知ＤＮＡ 断片を表すポリヌクレオチドのマイクロアレイと、アレイ中の相補性配列ポリヌクレオチドへの標識ｃＤＮＡのハイブリッド形成を生ずる条件下で接触させた後、蛍光励起条件下で蛍光により検査を行うといったマイクロアレイの使用方法も当業者には周知であるので、ここでより詳細に説明する必要はない。この技術の説明については米国特許第５，８００，９９２ 号 （Ｆｏｄｏｒ ら） および第５，８０７，５２２ 号 （Ｂｒｏｗｎ ら） を参照できる。これらの米国特許の開示をここに援用する。
【００１５】
本発明は具体的には、生物学的サンプルの複数の同一のマイクロアレイを容易かつ迅速に作成することができる方法および装置に関する。
本発明の重要かつ顕著な特色は、それぞれ上面と、底面と、一定パターンの貫通孔とを有する複数の基体を利用することにある。各貫通孔は、上部の断面積がより大きく、下部の断面積がより小さく、それらの間の移行部には好ましくは基体の上面に平行なステップまたはプラトー（平坦部）が形成されている。多数の基体を積み重ねると、対応する貫通孔は見当が合い、積み重ねた基体のスタックを貫通するトンネルを形成する。所望の試薬をトンネルに流して、ステップまたはプラトー部に付着させる。それにより、スタック内の全ての基体が正確な位置かつ正確な量の試薬で同時にスポッティング（液付着処理）される。隣接する貫通孔間での漏出を防止するため、基体の間にバリアー層を設けてもよい。
【００１６】
所望の試薬を付着させたら、基体を分離する。こうして、それぞれが数百ないし数千のｃＤＮＡ断片といった生物学的サンプルを含むことができる、一連のマイクロアレイが同時に形成される。
【００１７】
即ち、次から次へと基体の表面だけに試薬を付着させるように設計された装置により、一度に１つの基体を処理する従来技術の平面基体のアレイに比べて、本発明は、それぞれが同じパターンの貫通孔を有する好ましくは同一の複数の基体のスタック （積み重ね） から構成され、各基体の１つの孔が最終アレイに意図されたアナライト特異性試薬の各スポットに対応する。例えば、基体当たり１アレイ （１列） で、各アレイが１０，０００個の異なるスポットを有する１００ 個の同一アレイを作成したい場合、それぞれ１０，０００個ずつの貫通孔を有するように製造された１００ 個の同一基体を使用することになろう。各貫通孔は、基体を積み重ねた時に見当が合う。
【００１８】
ここで用いた「見当が合う」とは、スタック中の隣接基体の貫通孔が連通していることを単に意味する。本発明の好適態様では、貫通孔の各カラムの水平ステップまたはプラトー部が上下に重なって見えるようにスタックが形成される。これらの水平ステップまたはプラトー部は、簡略化のために、別個のアッセイ領域または「スポットゾーン」と称する。マイクロアレイを有する基体を互いに交換可能に使用するため、各基体のスポットゾーンを同一にして、アッセイのスポッティングを特定のｘｙ座標でスポット （滴下） するようにプログラムされたロボット手段により実施できるようにすることが好ましい。断面積がより小さい部分は、好ましくはスポットゾーンの片側に、即ちスポットゾーンの一方の縁部に寄せて設ける。より好ましくは、スタック中の偶数番号のスライドの貫通孔の小断面積部分はスポットゾーンの片側 （例、右側） に設け、同じスタック中の奇数番号のスライドの貫通孔の小断面積部分はスポットゾーンの反対側 （例、左側） に設けて、トンネル内を流れる試薬が前後にスラローム （ジグザグ） に流れて、各スポットゾーン上が試薬で洗われて、気泡が確実にトンネル内で捕捉されないようにする。
【００１９】
本発明の１好適態様では、「スポットゾーン」は １８０°対称性を有するパターンで基体上にパターン化される。即ち、第１の基体を １８０°回転させてから、回転させなかった第２の基体の上に重ねた時に、貫通孔は見当があったままでトンネルが形成される。それにより、全ての基体を１つの同じ製造技術を用いて作成して、積み重ねる際に１つおきの番号のスライドを １８０°回転させるだけで、奇数番号のスライドでは片側に小断面積部分を設け、偶数番号のスライドでは反対側に小断面積部分を設けることが可能となる。
【００２０】
基体のサイズに理論的な制限はないが、横幅が ０．５〜５ ｃｍで、厚みは０．０５〜３ ｍｍでよく、通常の顕微鏡スライドのサイズでよい。異なる用途には異なるサイズが適当となることもある。スポットの数、サイズおよび間隔と基体の枚数は、マイクロアレイに使用すべき試薬の数と量とに依存しよう。
【００２１】
上下に重なった貫通孔の見当が合って、基体のスタックを貫通するトンネルを形成するように同一の基体をスタックとして配置する時に、１つのトンネルから他のいずれかのトンネルへの横方向の漏れが起こり得ないように、基体にスライド間にバリアーシールを設けることが好ましい。さらに、各基体の各貫通孔は、基体内に設けた円筒形の孔広がり部 （カウンターボア） 、円錐形の孔広がり部 （カウンターシンク） または他の形態の （偏心でもよい） ポケットを伴っていてもよい。これらのポケットにより、断面で見ると、基体を通る貫通孔の線の横（サイド）に小さな体積部分ができる。また、これらのポケットは、各基体の全体的な表面にほぼ平行な小面積の基体表面積を与える。好ましくは、各貫通孔は、上部の断面積がより広く、下部の断面積がより狭く、その移行部分には好ましくは基体の上面に平行にステップまたはプラトー部が形成されている。
【００２２】
シール手段は、グリース、ワックス、弱接着剤、またはアレイに使用される具体的な化学物質に適合性のある （不活性な） 任意の他の接合またはシール剤といった、疎水性で粘稠な物質でよい。別の応用に対しては、非常に薄いエラストマー層 （ガスケット） でも十分であろう。基体の製作のために提案された微細機械加工 （切削） 法に特有の極めて平滑な表面のため、シールが比較的簡単となることも判明した。実際、一部の応用に対しては、隣接するスライドを貫通孔以外の部分は互いに連続的に接触させることで、シールをガラススライドのような基体の超平滑な表面に完全に頼ることも可能となりうる。
【００２３】
アレイの作成に使用する個々の試薬は、各トンネルの一端、一般にはトンネルの上端に注入する。各トンネルは（一般に）異なる試薬を受け入れる。注入は、一度に１つずつ、またはグループごとに、または好ましくは全てのトンネルに同時に行うことができる。注入は、注射器（シリンジ）、チューブ、または他の手段により；手動または自動的に；各種のポンプ、毛細管作用または減圧を使用して行うことができる。
【００２４】
貫通孔の大径の部分により形成されたサイド（脇）ポケットを持つ、基体スタックを貫通するトンネルを試薬が流れるにつれて、試薬はこのサイドポケット付きのトンネルの露出表面と反応し、それに結合する。この反応や結合は、使用する試薬や表面の化学的性質に依存し、液滴を平たい表面に物理的に付着させる従来技術で起こるのに似ている。やはり従来技術で起こるのに似たようにして、付着後に乾燥を行うことができる。従って、現状技術で現在使用されているのと同じ化学反応および組合わせの全てを、本発明の方法および装置による応用に対して使用することができ、有利である。
【００２５】
スタック全体にどのような反応が望まれるにせよ、反応が完了してスタックが乾いたら、スタックをその個々の基体に分離しうる。これは、シール手段がある場合、それを剥がすだけでよい。この時点で、複数の同一の個々の基体を常法と同様にしてハイブリッド形成等に利用可能となる。しかも、数十ないし数百個のスライドのそれぞれにスポッティングしたのではなく、スポッティング操作は一度だけしか行わなかったのである。
【００２６】
同一パターンの孔（および付随するサイドポケットまたは大径部分）は、シリコンまたはガラスの微細リソグラフィーと微細機械加工技術を用いて製作することが好ましい。この方法は、所望の小サイズの多数の同一パターンの安価な製造に理想的に適している。しかし、レーザー加工、プラズマエッチング、および慣用の機械加工およびアブレーディング法を含む（これらに限定されないが）他の方法、ならびに片方が酸エッチング可能（チャネルガラス）で、形成すべき貫通孔に対応する繊維の形態であり、他方が不活性である、似ていないガラス材料を配置した後、エッチング可能なガラスを除去するための化学エッチングを行う方法、も使用できる。
【００２７】
各基体の片面、例えば、基体の上面に設けた突起（凸部）と、反対側の面、例えば、下面に設けた対応する凹部を利用して、全ての孔の見当が合ったスタックを作成するように基体を整列させてもよい。或いは、全ての基体に設けた整列用の孔にピンを通して同じ目的を達成することもできる。さらに別の方法として、機械加工が十分に精確である場合、ガイドを利用して全ての基体（層）がガイドにあたるようにして、基体をその縁部に関して整列させることができる。他の整列方法も当業者には自明であろう。
【００２８】
この初期の製作工程中にスポットの位置をロボットでのサンプル付着によらずに決定することに留意することが重要である。こうすると、量的に大きな中心の基体製作段階では比較的低コストで著しい精度を達成することができる。その後の注入工程では高価な装置は必要なく、この工程は多数の異なる研究所で異なる試薬を用いて実施することも可能である。基体製作のための中心の製作工程では、各種の試薬またはスポットの位置選択または配置を含まず、また決定もしない。それらは個々のユーザーの研究所が選択できる。
【００２９】
試薬注入手段を基体のスタックに接続するのに多様なスキームを使用することができる。単純な受動的な微小漏斗またはチャネルのアレイにより、相対的に大きな注入手段から相対的に微小なアレイ間隔への移行を媒介することができる。これに代えて、または加えて、単純であるが高精度のｘ−ｙ位置決め装置を用いて、アレイのスタックを注入手段に対して移動させることができる。数百またはそれ以上の基体が同時に注入されるので、従来技術で使用されているような速いロボットの費用をかけずに、適当な生産速度を得ることが可能である。
【００３０】
以下に本発明を添付図面に示した態様に関してより詳細に説明する。図１では、複数の基体１が中間接着剤層４により積み重ねられている。この接着剤層は、試薬がトンネルを通って流れることができるように、基体に設けた孔に対応する貫通孔を有しており、トンネル間での試薬の漏出を防止するための水平方向バリアーとして作用する。各基体層は、隣接基体の貫通孔と見当が合った貫通孔３のアレイ（列）を有する。接着剤は、基体の上下の平面の一方または両方に、接着剤が孔の位置で中断して孔を塞がないように塗布されている。或いは、接着剤層は基体に孔を形成する工程に先立って基体に形成してもよい。その場合には、接着剤は孔を形成するのと同時に、孔と同じ位置から除去される。
【００３１】
図１に示すように、各貫通孔は上部の断面積が広く、下部の断面積が小さくなっていて、好ましくは移行部分には基体の上面に平行なステップまたはプラトー２が形成されている。このステップまたはプラトー２は、最終的にはアナライトアッセイ領域の表示部分を形成する。スタックの初期整列または整列保持のために、位置決めピン１４および／またはボス （凸部） １５を使用してもよい。
【００３２】
図２に見られるように、断面積が小さい孔３の部分は互いに見当が合っていて、基体のスタックを、接着剤層４も貫通しながら、上から下まで完全に貫通するトンネルを形成するようにつながっている。サイドポケットがステップまたはプラトー２の部分に形成される。プラトー部分の基体上には接着剤はあってもなくてもよい。
【００３３】
図３は、本発明の基体１のスタックに組合わせて注入を行うのに使用できる装置を示す。基体のスタックは、アダプタープレート６と減圧マニホルド９との間にクランプ止めされている。クランプ止め圧力は、クランプ１０と枠８とにより与えられる。アダプタープレートは、上部がピペット先端のような注入手段の接近が容易になるように大径で、下部は基体の貫通孔と見当が合った小径となるように先細になっている孔７を設けた注入マスクを形成している。試薬を導入する過程で、ある量の試薬がアダプタープレートに導入され、重力または毛管作用により流下させるか、または各トンネルの下端に弱い減圧を加えることにより生起されるような差圧によって流れを助長させる。試薬のコストを考慮して、トンネルを完全に満たすのに十分な試薬がトンネルに入るが、トンネルの下部から過剰な試薬が全くまたは僅かしか流出しないように注意する。これは、通常は、減圧の強さを、試薬をトンネル内に引き込むのに十分な大きさであるが、トンネル内部に試薬を保持する傾向のある毛管力に打ち勝つほどは大きくはならないように調整することにより達成できる。
【００３４】
図４は、本発明の別の態様を表示するものであって、上部の減圧マニホルド９と下部のチューブアダプター・プレート１３との間にクランプ止めされた基体１のスタックを示す。チューブ１１はマイクロタイター・トレイ１２のウェルの間隔に合うように広がっていて、マイクロタイター・トレイ１２のウェルに入っている試薬と連通している。
【００３５】
図５は、貫通孔３のパターンがジグザグまたは一つおきになっていて、ジグザグの試薬流路を形成していることを除いて、図２に示すのと同様の別の配置の基体スタックの断面図である。貫通孔とポケットの各カラムを通って１つの連続する （つながった） 流路がある限り、それぞれの正確な位置は隣接または一つおきの層で正確に繰り返される必要はない。この交互 （ジグザグ） の流路は、充填される流れの混合の状況によっては、ポケットの底面の被覆がより良好になるという利点を与えることがある。２種類の異なるパターンの間で一つおきにするのが最も単純であるが、パターンの繰り返しをスライド３枚ごとに行ったり、ランダムなパターンとすることも可能である。また、後での観察や自動データ取得を最も単純にするには、全てのポケットを整列させることが簡単であるが、それは本発明の方法の適正な操作にとって絶対に必要というわけではない。多くの可能な変更が当業者には自明であろう。
【００３６】
本発明は、図６ａ （分解図） および６ｂ （組立図） に示した態様を用いて実施することもできる。これらの図には、恐らく数十も交互に積み重ねた基体とスペーサーのうちの２層ずつしか示していない。この態様では、基体１７ａ、１７ｂには、機械加工により貫通させた小径の貫通孔１８ａ、１８ｂしか設けていない。それにより、図１、２および５に示したステップ付きまたはさら穴つきの基体に比べて、製作プロセスが単純になる。基体上の個々の平面状の付着領域は、実際には、スペーサー１６ａ、１６ｂに設けた穴１９ａ、１９ｂにより区画される。
【００３７】
スペーサーは基体から分離しうるものでもよく、或いはスペーサー層を基体上に塗布で形成した後、エッチングにより貫通孔を形成してもよく、或いはスペーサー層を基体上にシルクスクリーン印刷、オフセット印刷等の印刷により形成してもよく、或いは貫通孔を予め形成した固体のエラストマー等のフィルムを基体層の上に積層してもよい。試薬の無駄を最小限にするには、スペーサーの構成材料を試薬を吸収しないものとすることが好ましく、プラスチック （好ましくはエラストマー性ポリマー） 、ゴム、ワックス、ガラスおよび金属といった、試薬が付着しにくいものとすることがより好ましい。本発明の第１の態様に関して上述した材料のいずれも本発明の第２の態様に使用することができる。
【００３８】
スペーサーは基体層の間に挟まれるが、この分離可能なスペーサーに設けた孔は基体１７ａ、１７ｂに設けた貫通孔１８ａ、１８ｂより大径である。スペーサー層は、通常は基体より薄い決まった厚みのものであり、こうして隣接基体間にポケットが形成され、このポケットにより、試薬が流れる間に試薬を基体と接触させて基体上に付着させることが可能となる。図５に関して上述したジグザグの基体の貫通孔のオプションは、図６ａおよび６ｂの態様にも所望により採用することができる。
【００３９】
図６ｂは、２層のスペーサーと２層の基体の断面図であり、図６ａに係る２組の層の組み立てた状態を示す。スペーサー１６ａ、１６ｂのスペーサー穴１９ａ、１９ｂと基体１７ａ、１７ｂの貫通孔１８ａ、１８ｂを通って試薬が連続的に流れることができることは明らかである。
【００４０】
図６ｃは、図６ａおよび６ｂのアセンブリを用いて作製されたマイクロアレイの一部の図面であり、スペーサー１６ａ、１６ｂを除去した後に固体支持体上に残る数百ないし数千のアナライトアッセイ領域のうちの６個を示す。スペーサーを基体への塗布または積層により形成した場合には、基体の上面または下面のいずれかに各基体に付着した１層のスペーサー層が残ることは当然である。実際には、試薬は基体の両面を被覆するので、基体のどちらの側または面を、上面または使用可能な側と考えてもよい。
【００４１】
試薬の必要量を最小限にし、かつスペーサーに付着する試薬を最小限にするため、スペーサーは可及的に薄くすることが好ましい。スペーサーおよび基体材料の選択と厚みは好みの問題であり、この分野で働く者であれば容易に決めることができる。
【００４２】
以上の説明に関して次に、サイズ、材質、形状、形態、機能と、操作、組立および使用の様式における変更を含むように、本発明の一部についても最適な寸法上の関係は当業者には容易に明らかで自明であると認められ、添付図面に示し、かつ明細書で説明したものに対して均等な関係にある全てが本発明に包含されることは理解すべきである。
【００４３】
従って、以上の説明は本発明の原理の例示としてのみ考慮される。さらに、数多くの修正および変更が当業者には容易に想起されるので、本発明を図示および説明した厳密な構成および操作に限定することを望むものではなく、全ての適当な変更例および均等例が本発明に属し、その範囲内に含まれる。
【００４４】
以上に本発明を説明した。
【図面の簡単な説明】
【図１】
孔とポケットとのマッチング（適合）を示す、基体のスタックの等角投影図である。
【図２】
基体のスタックの１列の孔の一部を通る断面図である。
【図３】
ピペットを用いて基体を充填する手段と組合わせた基体スタックの断面図である。この図はクランプ手段も示す。
【図４】
減圧吸引とマイクロタイター・トレイへのチューブ（毛細管）を用いて基体を充填する手段と組合わせた基体スタックの断面図である。
【図５】
図２と同様であるが、別の配置の基体のスタックを通る断面図である。
【図６】
図６ａは、本発明の別の態様において使用される、大孔径ガスケットと小孔径基体の交互の層からなる積み重ね配置の分解組立図であるが、層は一定拡大率では描かれていない。
図６ｂは、図６ａに従って、２層のガスケット層と２層の基体層を通る断面図である。
図６ｃは、固体支持体上に形成された数百ないし数千のアナライトアッセイ領域のうちの６個を示す、図６ａおよび６ｂのアッセンブリーを用いて調製されたマイクロアレイの一部を示す図である。
【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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