(57)【要約】本発明は、ＦＧＦ２３ポリペプチド、かかるペプチドを作るための方法および組成物、およびホスフェート消耗疾患を治療するために、当該ポリペプチドならびにそのアゴニストおよびアンタゴニストを使用する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２のアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号：２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：２のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、医薬上許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項４】
配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０および配列番号：１１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する単離ペプチド。
【請求項５】
配列番号：６のアミノ酸配列を有する、請求項４記載の単離ペプチド。
【請求項６】
配列番号：７のアミノ酸配列を有する、請求項４記載の単離ペプチド。
【請求項７】
配列番号：８のアミノ酸配列を有する、請求項４記載の単離ペプチド。
【請求項８】
配列番号：９のアミノ酸配列を有する、請求項４記載の単離ペプチド。
【請求項９】
配列番号：１０のアミノ酸配列を有する、請求項４記載の単離ペプチド。
【請求項１０】
配列番号：１１のアミノ酸配列を有する、請求項４記載の単離ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、低分子量の分泌性ヒト蛋白に、さらに詳しくはヒト線維芽細胞成長因子ファミリーの蛋白に関連するポリペプチドおよび他の組成物、ならびにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの低分子量の分泌性蛋白は、成長刺激的な役割、成長阻害的な役割または臨界代謝経路の調節のいずれかによって、健康および疾患において著しい効果を有する。そのような分子は、成長因子、サイトカイン、ペプチドホルモンおよび同様の化合物を含む。成長因子は細胞表面にある受容体と結合する蛋白であり、主に細胞増殖または分化の活性化をもたらす。多くの成長因子は多面的であり、多数の異なる細胞型における細胞分裂または他の効果を刺激する；その一方で、特定の細胞型または組織に特異な成長因子もある。多くの成長因子またはこれら由来の生成物は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターフェロンα（αＩＮＦ）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のように重要な薬剤となった。また他の多くは、例えばインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、腫瘍成長因子−α（ＴＧＦ−α）、インターロイキン、線維芽細胞成長因子蛋白等は、多数の疾患、特に癌における役割を解明するために集中的に研究されている；例えば、Jameson、pp.７３-８２、Jameson編、Principles of Molecular Medicine（Human Press,Totowa,NJ,１９９８）を参照のこと。
【０００３】
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は、数種の発育および生理現象ならびに数種の疾患に関連する広範囲に及ぶ活性を有する数十のメンバーを含有する蛋白の重要なファミリーである。Bairdら編、The Fibroblast Growth Factor Family, Annals of the New York Academy of Sciences, vol.６３８（New York Academy of Sciences, New York, １９９１）；Wilkieら、Current Biology, ５:５００-５０７（１９９５）；SzebenyiおよびFallon, Internatl. Rev. Cytol.,１８５:４５-１０６（１９９９）。最近、ＦＧＦファミリーの「ＦＧＦ２３」と命名された新しいメンバーが紹介され、それは男性のホスフェート消耗疾患に関連していると考えられている；例えば、ＡＤＨＲ Consortium, Nat. Genetics, ２６:３４５-３４８（２０００）；Whiteら、J.Clin.Endocrin. Metabol.、８６：４９７-５００（２００１）を参照のこと。しかしながら、その蛋白の活性型およびそのような疾患での正確な役割は未だ分かっていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
活性型ＦＧＦ２３ポリペプチドおよびＦＧＦ２３の生物学的効果を高める、もしくは調節する関連化合物を使用できれば、ホスフェート消耗疾患を治療する為の新しい治療戦略を提供することで、技術要求は満たされるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ヒト線維芽細胞成長因子２３（ＦＧＦ２３）ポリペプチドに関連した組成物、ＦＧＦ２３ポリペプチド抗体、およびこれら組成物の製法および使用法に関する。本発明はさらに、個人のＦＧＦ２３ポリペプチドの発現異常に関連した疾患を治療するための、抗体化合物を含めた、ＦＧＦ２３ポリペプチド化合物の使用法を含む。
一の態様では、本発明は、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは９９％の、配列番号：２の配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。最も好ましくは、本発明は配列番号：２と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
もう一つ別の態様において、本発明は、その配列が配列番号：１の配列を有する成熟ＦＧＦ２３ポリペプチドの、連続アミノ酸の下位配列と同一の６から４０個のアミノ酸よりなる単離ペプチドを含む。さらに好ましくは、本発明は、その配列が配列番号：２の成熟ＦＧＦ２３ポリペプチドの、連続アミノ酸の下位配列と同一の６から４０個のアミノ酸よりなる単離ペプチドを含む。このようなペプチドは、ＦＧＦ２３ポリペプチドに特異性のペプチド抗体を生成する際に使用される抗原組成物の生成における、有用な中間体である。
もう一つ別の態様において、本発明は、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０および配列番号：１１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む。
【０００６】
もう一つ別の態様において、本発明は、ポリペプチド、ペプチド断片または上記したペプチドのいずれかに特異的である単離抗体を含む。好ましくは、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。このような抗体は、特にＦＧＦ２３ポリペプチド関連疾患の治療の際の、診断および治療的用途を有する。治療方法は、ＦＧＦ２３ポリペプチド抗原に特異的な抗体または抗体由来化合物を利用する方法を含むが、それに限定されるものではない。特定の組織サンプルでＦＧＦ２３ポリペプチドを、および組織でＦＧＦ２３ポリペプチドの発現レベルを検出するための診断方法もまた、本発明の一部を形成する。
もう一つ別の態様において、本発明は配列番号：２のＦＧＦ２３ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを含む。
もう一つ別の態様において、本発明は、選択集団において少なくとも２％の度数を有するＦＧＦ２３ポリペプチドの天然変種を含む。より好ましくは、このような天然変種は選択集団において少なくとも５％、最も好ましくは少なくとも１０％の度数を有する。選択集団は、集団遺伝学の領域の研究で認められた集団であればどれでも可能である。好ましくは、選択集団はコーカサス人、ネグロイド、またはアジア人である。より好ましくは、選択集団はフランス人、ドイツ人、イギリス人、スペイン人、スイス人、日本人、中国人、韓国人、中国の血統を有するシンガポール人、アイスランド人、北アメリカ人、イスラエル人、アラブ人、トルコ人、ギリシャ人、イタリア人、ポーランド人、太平洋島民またはインド人である。
【０００７】
もう一つ別の様態において、本発明は、ＦＧＦ２３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。本発明はまた、このようなベクターを含む宿主細胞を含む。ＦＧＦ２３ポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養し、その細胞培養材料から当該ポリペプチドを回収することを含む、ＦＧＦ２３ポリペプチドの産生方法も提供される。
さらなる態様において、本発明は、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０および配列番号：１１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、および医薬上許容される担体化合物を含む、医薬組成物および処方を含む。
【０００８】
（図面の簡単な記載）
図１は本発明のポリペプチドアミノ酸配列の記載である。
【０００９】
定義
本明細書に記載の「ポリペプチド」、「ペプチド」または「ペプチド断片」なる語は、ペプチド結合によって結合したアミノ酸残基の、枝分かれしていない一本鎖でできている化合物をいう。このような化合物のアミノ酸残基の数は大きく異なる；しかしながら、好ましくは、本明細書に記載のペプチドは、通常、６ないし４０個のアミノ酸残基を有する。本明細書に記載のポリペプチドおよびペプチド断片は、２０、３０個の、例えば、２０から２００、３００までのアミノ酸残基、例えば２００またはそれ以上のアミノ酸残基を有する。一般に、ポリペプチドは組換えＤＮＡ法により製造されるのが都合がよい。
【００１０】
本明細書に記載の「蛋白」なる語は、「ポリペプチド」なる語と同義的に用いてもよく、または加えて、例えばジスルフィド結合で結合した、蛋白を構成するポリペプチドのように、ペプチド結合以外の結合により結合する２つまたはそれ以上のポリペプチド複合体に言及してもよい。「蛋白」なる語はまた、同一のアミノ酸配列を有するが、特にこのような蛋白が真核細胞内で発現する際に加えられるような、リン酸化、アシル化、糖鎖形成等などの、異なる翻訳後修飾を有する一連のポリペプチドを包含する。
【００１１】
アミノ酸残基は、本明細書において、標準的な一文字または三文字表記：Ａ，アラニン；Ｃ，システイン；Ｄ，アスパラギン酸；Ｅ，グルタミン酸；Ｆ，フェニルアラニン；Ｇ，グリシン；Ｈ，ヒスチジン；Ｉ，イソロイシン；Ｋ，リシン；Ｌ，ロイシン；Ｍ，メチオニン；Ｎ，アスパラギン；Ｐ，プロリン；Ｑ，グルタミン；Ｒ，アルギニン；Ｓ、セリン；Ｔ，スレオニン；Ｖ，バリン；Ｗ，トリプトファン；Ｙ，チロシンで示される。
二本鎖にいう「完全な対合」とは、二本鎖を構成するポリ−またはオリゴヌクレオチド鎖が、各鎖の各ヌクレオチドがもう一方の鎖のヌクレオチドと、ワトソン−クリックの塩基の対合となっているような二重鎖構造を形成することを意味する。この語はまた、使用されるデオキシイノシン、２−アミノプリン塩基を有するヌクレオチド等などの、ヌクレオチド類似体のペアも含む。三本鎖に関して、この語は、三本鎖が完全に対合した二本鎖と、各ヌクレオチドが、完全に対合した二本鎖の塩基対とフーグスティーン（Hoogsteen）または逆フーグスティーン結合をしている第３の鎖とからなることを意味する。反対に、二本鎖におけるタグとオリゴヌクレオチドの間での「誤対合」とは、二本鎖または三本鎖におけるペアまたはトリプレットのヌクレオチドが、ワトソン−クリックおよび、またはフーグスティーンおよび、または逆フーグスティーン結合をしていないことを意味する。
【００１２】
参照配列および他の配列（すなわち「候補」配列）の比較に関して用いられる「パーセント同一性」またはその同義語は、二つの配列の間の最適アライメントにおいて、候補配列が参照配列と示されたパーセントに等しいサブユニット位置の数だけ同じであることを意味し、サブユニットとはポリヌクレオチドの比較にはヌクレオチド、ポリペプチドの比較にはペプチドである。本明細書に用いられる、比較されている配列の「最適アライメント」とは、サブユニット間の対合を最大にし、アライメントの構築に利用されるギャップの数を最小とするものである。パーセント同一性は、NeedlemanおよびWunsch、J.Mol.Biol.、４８：４４３-４５３（１９７０）（Wisconsin Sequence Analysis Package, Genetics Computar Group, Madison, WIの「ＧＡＰ」プログラム）に記載されたアルゴリズムの市販されている装置を用いて決定することができる。アライメントを構築し、パーセント同一性を計算し、または他の類似性を測定するための当該分野における他のソフトウェアパッケージは、SmithおよびWaterman, Advances in Applied Mathematics, ２:４８２-４８９（１９８１） （Wisconsin Sequence Analysis Package, Genetics Computar Group, Madison, WI）のアルゴリズムに基づく「ＢｅｓｔＦｉｔ」プログラムを包含する。換言すれば、例えば、参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照アミノ酸配列中のアミノ酸残基を５％まで欠失または他のアミノ酸で置換されるか、または参照配列中全てのアミノ酸残基の５％までの多くのアミノ酸が参照配列に挿入される。参照配列のこれらの代替は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位またはカルボキシ末端位、またはこれら末端位の間のどこで起きてもよく、参照配列の一つまたはそれ以上の連続したグループの参照配列中でアミノ酸残基の間で個々に点在してもよい。本発明の参照配列と比較するにおいて、候補配列がより大きいポリペプチドまたはポリヌクレオチドの要素または部分である可能性のあること、およびパーセント同一性を計算することを目的とするかかる比較は関連する要素または部分に関して実行されねばならないことが理解される。
【００１３】
本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関して「単離」なる語は、その自然環境の構成要素から実質上分離されていることを意味する。好ましくは、単離ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、重量を基準とし、自然環境の構成要素と比較して、配列決定で同定されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドの少なくとも８０％よりなる組成物である。さらに好ましくは、そのような組成物は、重量を基準とし、自然環境の構成要素と比較して、配列決定で同定されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドの少なくとも９５％よりなる組成物である。さらに好ましくは、そのような組成物は、重量を基準とし、自然環境の構成要素と比較して、配列決定で同定されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドの少なくとも９９％よりなる組成物である。最も好ましくは、単離ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、分子量と等電点に基づいた二次元ゲル電気泳動によって通常通り分離した後で、単一点として分解することのできる、均質な組成物である。通常の二次元ゲル電気泳動によるそのような分析のプロトコルは当業者に周知である。例えば、HamasおよびRickwood編集者、Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach（IRL Press, Oxford, １９８１）；Scopes, Protein Purification（Springer-Verlag, New York, １９８２）；Rabilloud編集者、Proteome Research: Two-Dimensional Gel Electrophoresis and Identification Methods（Springer-Verlag, Berlin, ２０００）。
【００１４】
本明細書に記載の「オリゴヌクレオチド」なる語は、ワトソン−クリック型の塩基の対合、塩基の積み重ね、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン型の塩基の対合等などの、モノマー間相互作用の通常のパターンによってポリヌクレオチドに限定して結合可能な、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、それらのアノマー型、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等を含む、自然の直鎖オリゴマーまたは修飾されたモノマーまたは結合体を意味する。通常、数個のモノマーユニット、例えば３ないし４個から数十個のモノマーユニット、例えば４０ないし６０個の範囲の大きさを持つオリゴヌクレオチドを形成するため、モノマーはホスホジエステル結合、またはその類似結合によって結合している。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、「ＡＴＧＣＣＴＧ」のような文字の列、または等しい小文字活字ケースで表示されると、左から右へヌクレオチドは５‘→３’の順序になっているということ、および別に注釈を付けたり文脈で理解されない限り、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」はチミジンを示し、「Ｕ」はウリジンを示すということが理解されよう。通常、本発明のオリゴヌクレオチドは、４種類の天然ヌクレオチドより構成され、天然ホスホジエステル結合によって互いに結合する；しかしながら、特にアンチセンス鎖または診断組成物として使用される場合、それらはまた非天然ヌクレオチド類似体も含んでいてもよく、非天然のヌクレオシド間結合を含んでいてもよい。本発明に従って、天然または非天然のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが使用される場合、例えば酵素によるプロセシングが必要となる場面では、通常、天然のヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドが必要となることは当業者にとって明らかである。
【００１５】
本明細書に記載されるように、「ヌクレオシド」は、例えば、KornbergとBaker、DNA Replication, 第２版（Freeman, San Francisco, １９９２）に記載されるように、２’−デオキシと２’−ヒドロキシ型を含む天然のヌクレオシドを含む。例えば、Scheit, Nucleotide Analogs（John Wiley, New York, １９８０）；UhlmanとPeyman, Chemical Reviews, ９０:５４３-５８４（１９９０）に、特異なハイブリダイゼーション能を有するという但し書のみで記載されるように、ヌクレオシドに関して「類似体」とは、修飾塩基官能基および／または修飾糖官能基を有する合成ヌクレオシドを含む。そのような類似体は、結合特性を高め、複雑性を減じ、特異性を増すなどに設計された合成ヌクレオシドを包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、ＦＧＦ２３ポリペプチド、およびＦＧＦ２３ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチド、ＦＧＦ２３ポリペプチドまたはその断片の特異抗体、組換えＤＮＡ構造物、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを、ＦＧＦ２３ポリペプチド転写物の複製またはＦＧＦ２３ポリペプチドの発現に使用されるそのような構造物またはベクターを含む宿主細胞だけでなく、含むがそれに限定されない、関連物質組成物を包含する。本発明はまた、ＦＧＦ２３ポリペプチドを含む医薬組成物、およびそのアゴニストとアンタゴニスト、特にＦＧＦ２３ポリペプチド組成物に特異的なモノクローナル抗体由来のアンタゴニストも包含する。
本発明のＦＧＦ２３ポリペプチドおよびペプチド断片は、アミノ酸配列が、一つまたはそれ以上の置換、挿入または欠失により配列表の参照アミノ酸配列とは違う、天然および人の手による変種を含む。かかる変種は、通常、カセットまたはＰＣＲ変異誘発あるいは以下により完全に記載されるように変種をコードするＤＮＡを産生し、その後にＤＮＡを組換え細胞培養基中で発現させるのに当該分野にて周知の他の技法を用い、ＦＧＦ２３ポリペプチドまたはペプチド断片をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的変異誘発により調製される。ＦＧＦ２３ポリペプチド変種はまた、以下に記載されるように通常のペプチド合成技術または収斂合成技術を使用して、化学的に合成される。
【００１７】
本発明のポリペプチド天然変種は、本発明のオリゴヌクレオチドを使用した分析技術を用いて、選択集団の個々を通常のスクリーニングに付して得られる。好ましくは、全てを含むゲノム領域またはゲノム領域の一部が、ＰＣＲまたは同様の技術を使用して増幅され、その後増幅された配列は通常の方法を使用して配列決定され、または別の方法で通常の技術を使用して特有の位置で分析される。例えば、Taylor編集、Laboratory Methods for the Detection of Mutations and Polymorphisms in DNA（CRC Press, １９９７）；Landegren編集、Laboratory Protocols for Mutation Detection（Oxford University Press, １９９６）；Shi, Clinical Chem., ４７：１６４-１７２（２００１）；Pastinenら、Genome Res., １０：１０３１-１０４２（２０００）；Armstrongら、Cytometry, ４０：１０２-１０８（２０００）；Meinら、Genome Res., １０：３３０-３４３（２０００）；Liら、Electrophoresis, ２０：１２５８-１２６５（１９９９）等である。ついで、その配列を本発明のポリヌクレオチドと比較し、コードした蛋白に影響を与える変異が存在するかどうかを決定する。好ましくは、ＦＧＦ２３ポリペプチドの天然変種は選択集団の中で少なくとも２％の度数を有する。より好ましくは、このような天然変種は選択集団の中で少なくとも５％、さらに好ましくは少なくとも１０％の度数を有する。最も好ましくは、このような天然変種は選択集団の中で少なくとも２０％の度数を有する。選択集団は、集団遺伝学の領域の研究で認められた集団であればどれでも可能である。好ましくは、選択集団はコーカサス人、ネグロイド、またはアジア人である。より好ましくは、選択集団はフランス人、ドイツ人、イギリス人、スペイン人、スイス人、日本人、中国人、アイルランド人、韓国人、シンガポール人、アイスランド人、北アメリカ人、イスラエル人、アラブ人、トルコ人、ギリシャ人、イタリア人、ポーランド人、太平洋島民、フィンランド人、ノルウェー人、スウェーデン人、エストニア人、オーストラリア人、またはインド人である。より好ましくは、選択集団はアイスランド人、サーミ人、コーカサス人の血統を有するフランス人、スイス人、中国の血統を有するシンガポール人、韓国人、日本人、ケベック人、北アメリカピマインディアン、アンマン派ペンシルベニア人およびアンマン派メノー派教徒、ニューファンドランド人、またはポリネシア人である。好ましくは、一つの選択集団は少なくとも５００人のサンプルからなる。さらに好ましくは、一つの選択集団は少なくとも１０００人のサンプル、そして最も好ましくは２０００人のサンプルからなる。
【００１８】
ＦＧＦファミリーメンバーは、中胚葉由来細胞内のマイトジェン活性および胚組織内の形態発生活性を含む、例えば、Szebenyiら（前掲）；Bairdら（前掲）のような成長と発育に関わる幅広い生物学的活性によって特徴付けられる。ＦＧＦがマイトジェン作用を有する細胞型は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＢａＦ３細胞、ヒト包皮線維芽細胞、ヒトグリア細胞、ヒト羊膜線維芽細胞およびヒト表皮細胞を含む。Gospodarowiczら、In Vitro, １４：８５-１１８（１９７８）；Ornitzら、J. Biological Chemistry, ２７１：１５２９２-１５２９７（１９９６）；ＦＧＦマイトジェン活性のアッセイの記載を出典明示により本明細書の一部とする。
【００１９】
ＦＧＦ２３ポリペプチドの組換え製造
本明細書に記載のポリヌクレオチド配列は、適当な宿主細胞にて対応するポリペプチドの発現を指令する組換えＤＮＡ分子において使用されうる。遺伝暗号の縮重のため、他のＤＮＡ配列が等しいアミノ酸配列をコードする可能性があり、ＦＧＦ２３ポリペプチドをクローン化し発現するため使用されてもよい。発現の速度および／または効率が向上するように、特定の宿主細胞に望ましいコドンを選択し、自然発生的ヌクレオチド配列に置換されてもよい。望ましいＦＧＦ２３ポリペプチドをコードする核酸（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を、クローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のための複製可能なベクターに挿入してもよい。ポリペプチドは当業者に知られる方法（Ausubelら編集、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, １９９０）に従って、多数の発現系のいずれかで組換え的に発現される。適当な宿主細胞は、酵母、細菌、古細菌、真菌、ならびに昆虫および動物細胞を包含し、例えば、骨髄幹細胞を含むがそれに限定されない幹細胞を含む初期細胞のような哺乳動物の細胞を含む。より具体的には、これらは組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌、酵母発現ベクターで形質転換された酵母のような微生物を含むがそれに限定されない。組換え昆虫ウイルス（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞、および哺乳動物発現系もまた含まれる。発現される核酸配列は種々の方法によりベクターに挿入することができる。一般に、当該分野にて公知の技術を使用してＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。ベクター成分は、一般に、一つまたはそれ以上のシグナル配列、複製起点、一つまたはそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写停止配列を含むが、それに限定されない。一つまたはそれ以上のこれらの要素を含む適当なベクターの構築は、当業者に公知の標準的ライゲーション技術を使用する。
【００２０】
本発明のＦＧＦ２３ポリペプチドは、ＦＧＦ２３ポリペプチドをコードする核酸を含有する発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、蛋白の発現を誘導または引き起こすような適当な環境下で培養することで産生される。ＦＧＦ２３ポリペプチドの発現に適当な条件は、発現ベクターと宿主細胞の選択で異なり、慣用的実験操作を介して当業者であれば容易に確認するであろう。例えば、発現ベクターにて構成プロモーターを使用するには、宿主細胞の成長と増殖を最適化する必要があるが、誘導プロモーターを使用するには、誘導するための適当な成長条件が必要となるであろう。加えて、いくらか具体的には、収穫のタイミングが重要である。例えば、昆虫細胞での発現で使用されるバキュロウイルスの系は、細胞溶解ウイルスであり、収穫時の選択が産物の収率を決めるのに重要となり得る。
【００２１】
宿主細胞系は、挿入配列の発現調節能力または発現した蛋白を望ましい方法でプロセシングする能力で選択することができる。蛋白のそのような修飾は、アセチル化、カルボキシ化、糖鎖形成、リン酸化、リピド化およびアシル化を含むがそれに限定されない。蛋白の「プレプロ」型を切断する翻訳後プロセシングはまた、正確な挿入、折りたたみおよび／または機能のために重要である。一例として、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、２９３、Ｗ１３８などのような宿主細胞は、特異的な細胞機構とそのような翻訳後活性に特徴的なメカニズムを有しており、誘導された異種蛋白の正確な修飾とプロセシングを確実にするよう選択される。特に興味深いのは、Drosophila melangastev細胞、Sacchavomyces cevevisiaeおよび他の酵母、E.Coli、Bacillus subtilis、ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、アカパンカビ属、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳおよびＨｅＬａ細胞、線維芽細胞、シュワノーマ細胞系、不朽化哺乳動物骨髄およびリンパ細胞系、Ｊｕｋａｔ細胞、ヒト細胞および他の初期細胞である。
【００２２】
ＦＧＦ２３ポリペプチドをコードする核酸は、他の核酸配列と機能的な関係があるよう位置させることで「作動可能に連結し」ていなければならない。例えば、プレ配列または分泌性リーダーのＤＮＡが、ポリペプチドの分泌に関与するプレプロテインとして発現されるならば、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結しており；プロモーターまたはエンハンサーが、配列の転写に影響を与えるならば、コード配列に作動可能に連結しており；またはリボゾーム結合部位が、翻訳を促進するように位置付けられるならば、コード配列に作動可能に連結している。一般に、「作動可能に連結した」ＤＮＡ配列は連続しており、分泌性リーダーの場合、読み取り段階で連続している。しかしながら、エンハンサーは必ずしも連続する必要はない。結合は、都合のよい制限部位でライゲーションによってなされる。もしそのような部位がなければ、慣行的実務に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。プロモーター配列は構成または誘導プロモーターのどちらかをコードする。プロモーターは自然発生的プロモーターまたはハイブリッドプロモーターのいずれであってもよい。一つまたはそれ以上のプロモーターの要素を結合するハイブリッドプロモーターはまた、当該分野にて公知であり、本発明で有用である。発現ベクターは付加的要素を含んでいてもよく、例えば、発現ベクターは２種の生物、例えば哺乳動物または昆虫細胞にて発現を維持し、原核生物宿主にてクローニングおよび増幅を維持するように、複製系を２つ有していてもよい。発現およびクローニングベクターは、両方共、一つまたはそれ以上の選択宿主細胞内でベクターが複製できるような核酸配列を含有する。そのような配列は、多数の細菌、酵母およびウイルスでよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は大抵のグラム陰性菌に適しており、２：プラスミドの起点は酵母に適しており、様々なウイルスの起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。さらには、発現ベクターを組み込むために、当該発現ベクターは宿主細胞ゲノムに相同的な少なくとも一つの配列を含有し、好ましくは発現構造物の側面に位置する二つの相同配列を含有する。ベクターに含めるのに適する相同配列を選択することで、組み込みベクターを宿主細胞の特有の遺伝子座に位置付けてもよい。組み込みベクターの構造物は当業者に周知である。
【００２３】
好ましくは、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能とする選択可能マーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は当該分野において周知であり、使用される宿主細胞により異なるだろう。発現およびクローニングベクターは、典型的に、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、（ａ）例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンのように、抗体または他の毒素に耐性を与えるか、（ｂ）栄養素要求株の欠損を補足するか、または（ｃ）例えばバシラス属にとってのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子のように、複合培地からは使用できない重要な栄養分を供給する、蛋白をコードする。
【００２４】
前立腺癌抗原をコードするヌクレオチド配列で形質転換した宿主細胞は、コードされた蛋白の発現およびその細胞培養基からの回収に適する条件下で培養され得る。組換え細胞により産生される蛋白は、その配列および／または使用されるベクターに応じて、分泌されてもよく、膜結合してもよく、あるいは細胞内に含まれていてもよい。ＦＧＦ２３ポリペプチドの原核生物または真核生物の細胞膜を介する分泌を指令するシグナル配列を有する、ＦＧＦ２３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを設計し得ることを、当業者であれば理解するであろう。望ましいＦＧＦ２３ポリペプチドは、組換え技法により、直接的だけでなく、成熟蛋白またはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドであってもよい、異種のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして産生することもできる。一般に、シグナル配列はベクターの構成要素であっても、またはベクターに挿入されるＦＧＦ２３ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部であってもよい。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群より選択される原核生物シグナル配列であってもよい。酵母の分泌では、シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（サッカロミセスおよびクルイベロミセスａ因子リーダーを含む、後者は米国特許第５０１０１８２号に記載されている）、酸ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日に公開された欧州特許第３６２１７９号）または１９９０年１１月１５日に公開されたＷＯ  ９０１１３６４６に記載のシグナルとすることができる。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物のシグナル配列を用いて、同種または関連種の分泌されたポリペプチドから由来のシグナル配列、ならびにウイルス性分泌リーダーのように、蛋白の分泌を指令してもよい。選択される発現系によれば、コード配列を適当なベクターに挿入し、そのことは次にある特徴的な「制御因子」または「調節配列」の存在を必要とするかもしれない。適当な構造物は一般に当該分野にて公知であり（Ausubelら、１９９０）、多くの場合、Invitrogen（San Diego, Calif.）、Stratagene（La Jolla, Calif.）、Gibco BRL（Rockville, Md.）またはClontech（Palo Alto, Calif.）などの製造業者から入手できる。
【００２５】
細菌系での発現
細菌細胞の形質転換は、「BLUESCRIPT」Phagemid（Stratagene）または「pSPORT１」（Gibco BRL）のハイブリッドＬａｃＺプロモーターのような誘導プロモーターを使用して達成され得る。加えて、「BLUESCRIPT」（ａ−ガラクトシダーゼ；Stratagene）またはｐＧＥＸ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ；Promega, Madison, Wis）を含むが、それに限定されない、多くの発現ベクターを、細菌細胞にて用いるのに選択し、容易に検出および／または精製可能である切断可能な融合蛋白を産生してもよい。適当な細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラ−ゼとの結合能を有し、ＦＧＦ２３ポリペプチド遺伝子のコード配列をｍＲＮＡに下流（３´）方向にて転写を開始する能力を有する、いずれかの核酸配列である。細菌プロモーターは、通常、コード配列の５´末端付近に位置付けられる転写開始領域を有する。この転写開始領域は、典型的には、ＲＮＡポリメラ−ゼ結合部位および転写開始部位を含む。代謝経路酵素をコードする配列は特に有用なプロモーター配列を提供する。例えば、ガラクトース、ラクトースおよびマルトースのような糖代謝酵素由来のプロモーター配列、トリプトファンのような生合成酵素由来の配列を含む。バクテリオファージ由来のプロモーターもまた用いることができ、当該分野にて知られている。加えて、合成プロモーターおよびハイブリッドプロモーターもまた有用である；例えば、ｔａｔプロモーターはｔｒｐおよびｌａｃプロモーター配列のハイブリッドである。さらに、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合し、転写を開始する能力を有する自然発生的非細菌由来プロモーターを、細菌プロモーターは含みうる。効果的なリボゾーム結合部位もまた望ましい。発現ベクターはまた、細菌内の前立腺癌抗原蛋白の分泌をもたらすシグナルペプチド配列を含み得る。シグナル配列は、典型的には、当該分野にて周知なように、細胞からの蛋白の分泌を指令する、疎水性アミノ酸よりなる、シグナルペプチドをコードする。蛋白は、成長媒体（グラム陽性菌）または細胞（グラム陰性菌）の内膜と外膜の間に位置する周辺腔のいずれかへと分泌される。細菌発現ベクターはまた、形質転換された細菌株の選択を可能とするように選択マーカー遺伝子を含む。適当な選択遺伝子は、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンのような薬物耐性遺伝子を含む。選択可能マーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファンおよびロイシン生合成経路にある生合成遺伝子のようなものを含む。例えば抗体の誘導など、大量のＦＧＦ２３ポリペプチドを必要とする場合、容易に精製される融合蛋白の高レベルでの発現を指令するベクターが望ましいであろう。そのようなベクターは、これに限定されないBLUESCRIPT（Stratagene）のような多機能イー・コリクローニングおよび発現ベクターを含み、そこでハイブリッド蛋白を生成するため、前立腺癌抗原のコード配列を、アミノ末端Ｍｅｔおよびその後の７個のβ−ガラクトシダーゼの残基の配列で当該ベクターにイン−フレームにてライゲートしてもよい；ＰＩＮベクター［Van Heeke & Schuster Jbiol Chem ２６４:５５０３-５５０９（１９８９）］；ＰＥＴベクター（Novagen, Madison Wis.）等。細菌の発現ベクターは、上記した様々な構成要素を含み、当該分野にて周知である。例として、とりわけ、Bacillus subtilis、E.coli、Streptococcus cvemovisおよびStreptococcus lividanesのベクターが含まれる。細菌発現ベクターは、塩化カルシウム介在トランスフェクション、エレクトロポレーション等の当業者によく知られた技術を使用して、細菌宿主細胞に形質転換される。
【００２６】
酵母での発現
酵母の発現系は当業者によく知られており、Sacchavomyces cevevisiae、Candida albicansおよびC.maltosa、Hansenula polymovpha、Kluyvevomyces fvagilisおよびK.lactis、Pichia guillevimondiiおよびP pastoris、Schizosaccha-vomyces pombeならびにYavvowia lipolyticaの発現ベクターを含む。酵母宿主で使用する適当なプロモーターの例は、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセフォフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、α因子、ＡＤＨ２ＩＧＡＰＤＨプロモーター、グルコキナーゼアルコールオキシダーゼおよびＰＤＨのような３−ホスホグリセレートキナーゼ［Hitzemanら、J. Biol. Chem. ２５５:２０７３（１９８０）］または他の解糖酵素［Hessら、J. Adv. Enzyme Reg. ７:１４９（１９６８）；Holland、Biochemistry １７:４９００（１９７８）］のプロモーターを含む。［例えば、Ausubelら、１９９０；Grantら、Methods in Enzymology １５３:５１６-５４４（１９８７）を参照のこと］。誘導可能であり、成長環境により制御された転写の付加的優位性を有する他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連した分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびマルトースとガラクトース使用の原因酵素のプロモーター領域を含む。酵母発現での使用に適するベクターおよびプロモーターは、さらに、ＥＰ７３６５７において記載される。酵母選択マーカーとして、ツニカマイシンに対して耐性を与えるＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１およびＡＬＧ７；Ｇ４１８に対して耐性を与えるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子；および銅イオンの存在下で酵母の成長を可能とするＣＵＰ１遺伝子が挙げられる。酵母発現ベクターは、目的とするＦＧＦ２３ポリペプチドをコードするＤＮＡ由来のＦＧＦ２３ポリペプチドの細胞内生成または分泌のために構築することができる。例えば、選択シグナルペプチドおよび適当な構成または誘導プロモーターを、ＦＧＦ２３ポリペプチドの細胞内発現を導く選択プラスミド内の、適当な制限部位に挿入してもよい。ＦＧＦ２３ポリペプチドの分泌には、ＦＧＦ２３ポリペプチドをコードするＤＮＡが、ＦＧＦ２３ポリペプチド発現のためのプロモーター、酵母α因子分泌シグナル／リーダー配列、およびリンカー配列（必要な場合）をコードするＤＮＡと共に、選択プラスミド内にクローン化されうる。ついで、酵母細胞を上記した発現プラスミドで形質転換し、適当な発酵培地で培養することができる。かかる形質転換された酵母により生成された蛋白を１０％トリクロロ酢酸で沈殿させて濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色液によるゲルの染色による分離後に分析することができる。その後、組換えＦＧＦ２３ポリペプチドは当業者により公知の技術によって発酵培地から単離、精製することができる。
【００２７】
哺乳動物系での発現
ＦＧＦ２３ポリペプチドは哺乳動物細胞にて発現される。哺乳動物発現系は当業者に知られており、レトロウイルスベクター介在発現系を包含する。哺乳動物宿主細胞は、多数の異なるウイルスを基礎とする発現系、例えば、アデノウイルスにより形質転換することができ、その場合、コード化領域は後期プロモーターおよび三部分リーダー配列を含むアデノウイルスの転写／翻訳複合体にライゲートされ得る。ウイルスゲノムの不要なＥ１またはＥ３領域の挿入は、感染宿主細胞内で目的とするポリペプチドの発現能を有する生育可能なウイルスをもたらす。好ましい発現ベクター系は、一般にＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０１９およびＰＣＴ／ＵＳ９７／１０１０４８に記載されるようなレトロウイルスベクター系である。適当な哺乳動物発現ベクターは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼに結合可能で、ＦＧＦ２３ポリペプチドのコード化配列のｍＲＮＡへの下流（３´）転写を開始する能力を有する、いずれかのＤＮＡ配列である哺乳動物プロモーターを含む。プロモーターは、コード化配列の５´末端の近位に通常位置する転写開始領域と、転写開始部位の上流に位置する２５ないし３０塩基対を使用する、ＴＡＴＡボックスとを有している。ＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ を正しい部位でＲＮＡ合成を開始するよう導くと考えられている。哺乳動物プロモーターはまた、典型的にはＴＡＴＡボックスの上流１００ないし２００塩基対以内に位置する、上流プロモーター要素（エンハンサー要素）を含有するであろう。上流プロモーター要素は転写を開始する速度を定め、どちらかの配位で活性を持ちえる。哺乳動物のプロモーターとして特に有用なのは、ウイルス遺伝子はしばしば高度に発現され、宿主を幅広い範囲で有するため、哺乳動物ウイルス遺伝子由来のプロモーターである。一例として、プロモーターが宿主細胞系に適合するという条件で、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日に公開のＵＫ２２１１５０４）、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスゲノムより得られるプロモーター、例えばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターのような異種哺乳動物プロモーターより得られるプロモーター、および熱ショックプロモーターより得られるプロモーターが挙げられる。高度真核生物によるＦＧＦ２３ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することで強化されるだろう。エンハンサーは、通常約１０から３００ｂｐで、プロモーターに作用してその転写を増大させる、ＤＮＡのシス−作用性要素である。多くのエンハンサー配列が、現在、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、ａ−フェトプロテインおよびインスリン）からわかっている。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用するだろう。一例として、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の遠い側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサ���は、好ましくは、プロモーターより５´部位に位置する。一般に、哺乳動物細胞により認識される転写終了およびポリアデニル化配列は、転写終止コドンの３´側に位置する調節領域であり、プロモーター要素と共に、コード化配列の側面に接する。成熟ｍＲＮＡの３´終点は、部位特異的翻訳後切断およびポリアデニル化により形成される。転写ターミネータおよびポリアデニル化シグナルの一例として、例えばＳＶ４０に由来するものが挙げられる。長期間、高収率での組換え蛋白の産生は、安定した発現系において行うことができる。ウイルス複製起点または内因性の発現要素を含む発現ベクターおよび選択可能マーカー遺伝子は、この目的のために使用される。哺乳動物細胞内で使用する選択可能マーカーを含む適当なベクターは、容易に入手可能であり、当業者に知られている。このような選択可能マーカーの一例として、それぞれｔｋ−またはｈｐｒｔ−細胞内で使用する、ヘルペス単純複合体ウイルスチミジンキナーゼおよびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼが挙げられるが、それに限られない。外因性の核酸を他の宿主だけでなく哺乳動物宿主内に導く方法は、当業者によく知られており、使用される宿主により異なる。技術には、デキストラン仲介トランスフェクション、カルシウムリン酸沈殿、ポリブレン仲介トランスフェション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ウイルス感染、ポリヌクレオチドのリポソームによる被包化、および核への直接マイクロインジェクションが含まれる。
【００２８】
昆虫細胞での発現
ＦＧＦ２３ポリペプチドはまた、昆虫細胞でも生成される。昆虫細胞を形質転換するための発現ベクター、特にバキュロウイルスに基づいた発現ベクターは当業者によく知られている。そのような系においては、ＤＮＡをコードするＦＧＦ２３ポリペプチドがバキュロウイルス発現ベクターの中に含まれるエピトープタグの上流に融合している。オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa califovnica）核多面体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptevu fmgipevdu）Ｓｆ９細胞またはイラクサギンウワバ幼虫にて外来遺伝子を発現するベクターとして使用される。ＦＧＦ２３ポリペプチドをコードする配列は、多角体蛋白遺伝子などの、ウイルスの不要な領域にクローン化され、多角体蛋白プロモーターの調整下に置かれる。ＦＧＦ２３ポリペプチドをコードする配列の挿入が成功すると、多角体蛋白遺伝子が不活化し、外殻蛋白の外皮を欠く組換えウイルスを産生する。ついで、組換えウイルスを用いてスポドプテラ・フルギペルダ細胞またはイラクサギンウワバ幼虫を感染させ、ＦＧＦ２３ポリペプチドを発現させる［Smithら、J. Wol. ４６:５８４（１９９４）；Engelhard E Kら、Proc. Nat. Acad. Sci. ９１:３２２４-３２２７（１９９４）］。ＦＧＦ２３ポリペプチドをコードするＤＮＡに融合するのに適するエピト−プタグは、ポリヒスチジンタグおよび免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域など）を含む。ｐＶＬ１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）などの市販されているプラスミドを含め、種々のプラスミドを利用できる。簡単に言えば、ＦＧＦ２３ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＦＧＦ２３ポリペプチドをコードするＤＮＡの望ましい部分を５´および３´領域に相補的なプライマーを用いるＰＣＲ法により増幅する。５´プライマーは隣接する制限部位と一体化しうる。ついで、ＰＣＲ産物を選択された制限酵素で消化し、発現ベクターにサブクローン化する。組換えバキュロウイルスは、リポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬより市販で入手可能）を用い、上記したプラスミドおよびバキュロゴールド（BaculoGold）ＴＭウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をスポドプテラ・フルギペルダ（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）に共トランスフェクションすること、またはその他当業者によく知られた方法を用いて生産される。ウイルスは、Ｓｆ９細胞中、２８℃で４ないし５日培養することで産生され、さらなる増幅のために使用される。O'Reilleyら、BACUROVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL, Oxford University Press（１９９４）にさらに記載されている方法を実行する。Rupertら、Nature３６２:１７５-１７９（１９９３）に記載の組換えウイルス感染Ｓｆ９細胞より、抽出物を調製してもよい。また、発現されたエピトープタグ化ＦＧＦ２３ポリペプチドはアファニティクロマトグラフィにより精製することができ、あるいは、例えば、蛋白Ａまたは蛋白Ｇカラムクロマトグラフィを含むクロマトグラフィ技術を使用して、ＩｇＧタグを付した（またはＦｃタグを付した）ＦＧＦ２３ポリペプチドの精製を行うこともできる。
【００２９】
遺伝子発現評価
遺伝子発現は、例えば、当業者に知られる標準技術、例えば、ＤＮＡ検出のためのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を決定するノーザンブロット法、ドットブロッティング（ＤＮＡまたはＲＮＡ）または本明細書で提供された配列に基づいた適当な標識プローブを使用したイン・サイチュハイブリダイゼーションによってサンプル内で直接評価される。別法として、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖またはＤＮＡ−蛋白二本鎖を含む特異的二本鎖などの核酸を検出するアッセイにおいて抗体を使用してもよい。かかる抗体を標識化し、アッセイを行う。その場合、二本鎖が表面に結合し、その表面上に二本鎖が形成されてから、二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。遺伝子発現は、別法として、細胞または組織部分を免疫組織化学的染色に付し、細胞培養物または体液をアッセイすることによって測定され、ＦＧＦ２３ポリペプチドの発現を直接評価することができる。このような免疫学的アッセイに有用な抗体は、モノクローナルかポリクローナルのいずれかであり、本明細書で与えられるＤＮＡ配列に基づいた天然配列ＦＧＦ２３ポリペプチドに対して調製することができる。
【００３０】
発現蛋白の精製
発現ＦＧＦ２３ポリペプチドは発現後、当業者に知られる多数の方法のいずれかを使用して、精製または単離される。適当な技術は、他のどの構成要素がサンプル内に存在するかによって変わってくるだろう。単離または精製により除去された不純物構成要素は、ポリペプチドの診断上または治療上の使用に典型的に干渉する物質であり、酵素、ホルモン、および他の溶解物を含む。選択される精製工程は、例えば使用される生成工程の性質および生成される個々のＦＧＦ２３ポリペプチドに依存する。ＦＧＦ２３ポリペプチドまたは蛋白は、培地または宿主細胞溶解産物より回収される。もし膜に結合しているならば、適当な海面活性剤溶液（例えばトリトン−Ｘ１００）を使用して、または酵素切断に付すことで膜より放出されえる。また、ＦＧＦ２３ポリペプチドの発現で使用される細胞は、凍結−解凍サイクル、音波破砕、機械的破壊などの様々な物理的または化学的手段、または細胞崩壊物質を使用して破壊することができる。典型的な精製方法は、イオン交換カラムクロマトグラフィ；シリカゲルまたはＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂を使用したクロマトグラフィ；例えば、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−７５を使用したゲル濾過；ＩｇＧなどの不純物を除去する蛋白Ａセファロースカラム；ＦＧＦ２３ポリペプチドのエピトープタグ型に結合する金属キレート化カラムを使用したクロマトグラフィ；エタノール析出；逆相ＨＰＬＣ；クロマトフォーカス；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿、を含むがそれに限られない。通常、単離ＦＧＦ２３ポリペプチドは、少なくとも一つの工程により調製される。例えば、ＦＧＦ２３ポリペプチドは、標準抗ＦＧＦ２３ポリペプチド抗体カラムを使用して精製される。限外濾過および透析技術はまた、蛋白濃縮と併用すると、有用である（例えばScopes, R、 PROTEIN PURIFICATION, Springer-Verlag, New York, N.Y、 １９８２参照）。精製の必要性の度合いは、ＦＧＦ２３ポリペプチドの使用に応じて異なるであろう。精製が必要ないといった例もある。一旦発現され、必要に応じて精製されると、本発明のＦＧＦ２３ポリペプチドおよび核酸は、以下に記載の多くの用途で有用である。
【００３１】
発現蛋白の標識化
本発明の核酸、蛋白および抗体は標識することができる。本明細書における標識化とは、化合物を検出可能とするために結合された少なくとも一つの要素、アイソトープまたは化学物を、化合物が有することを意味する。一般に、標識は３つの分類に入る：ａ）放射性であるか、または重アイソトープである、アイソトープ標識；ｂ）抗体または抗原である免疫標識；およびｃ）着色または蛍光染色。標識は、生物学的活性または検出されている化合物の特徴に干渉しないなら、いずれの位置でも化合物に組み込むことができる。
【００３２】
ＦＧＦ２３ポリペプチド融合蛋白
本発明のＦＧＦ２３ポリペプチドはまた、ＦＧＦ２３ポリペプチドを別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合させることを含む、キメラ分子を形成するといった方法で修飾される。本明細書に記載の「融合蛋白」なる語は、ＦＧＦ２３ポリペプチドまたはそのドメイン領域が「標的ポリペプチド」に融合してなる、キメラポリペプチドをいう。標的ポリペプチドは、特定の細胞型または受容体への標的化を促進するのに十分な残基を有するが、ＦＧＦ２３ポリペプチドの生物学的機能に干渉しないということでは十分に短いポリペプチドである。標的ポリペプチドはまた、好ましくは、融合蛋白が実質的に他の細胞型または受容体と交差反応しないように、かなり独特でもある。適当な標的ポリペプチドは、一般に、少なくとも約１０個のアミノ酸残基、通常、約１０から約５００個の間にあるアミノ酸残基を有している。好ましい標的ポリペプチドは、約２０から約２００個のアミノ酸残基を有する。融合蛋白はまた、ＦＧＦ２３ポリペプチドが、抗タグ抗体が選択的に結合しうるエピトープを提供するタグポリペプチドと融合することを含んでいてもよい。エピトープタグは、一般に、ＦＧＦ２３ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に位置する。ＦＧＦ２３ポリペプチドのこのようなエピトープタグ型は、タグポリペプチドに対する抗体を使用して検出することができる。また、エピトープタグの提供により、抗タグ抗体またはエピトープタグに結合する親和性マトリックスの他の型を使用して、ＦＧＦ２３ポリペプチドが容易に精製されることが可能となる。別法として、融合蛋白は、ＦＧＦ２３ポリペプチドと免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域とが融合することを含んでいてもよい。二価の形態のキメラ分子の場合、ＩｇＧ分子のＦｃ領域または例えばＧＭ−ＣＳＦに対してかかる融合を行うことができる。好ましい融合蛋白は、ＦＧＦ２３ポリペプチドの免疫標的化を促進する分子を含むがそれに限られない。ＦＧＦ２３ポリペプチド融合蛋白は、当業者に知られる技術を使用して、種々の他の目的のために作られる。例えば、抗体を生成するには、望ましいエピトープが小さいならば、免疫原を形成するために部分的または完全なＦＧＦ２３ポリペプチドをキャリア蛋白に融合させてもよい。また、ＦＧＦ２３ポリペプチドは、細胞性および／または（抗体に基づく）体液性免疫反応を刺激する抗原能力を増大するため、または他の理由で、融合蛋白として作られる。
【００３３】
ＦＧＦ２３ポリペプチドの合成遺伝子
天然蛋白に、核酸配列および／またはアミノ酸配列情報が利用できるとなれば、実際、その天然配列にていずれかの変異を引き起こすために種々の技術が使用可能となる。例えば、Shortle、Science、第２２９巻、１１９３−１２０１頁（１９８５）；ZollerおよびSmith、Methods in Enzymology、第１００巻、４６８−５００頁（１９８３）；Markら、米国特許第４５１８５８４号；Wellsら、Gene、第３４巻、３１５−３２３頁（１９８５）；Estellら、Science、第２３３巻、６５９−６６３頁（１９８６）；Mullenbachら、J. Biol. Chem.、第２６１巻、７１９−７２２頁（１９８６）およびFerettiら、Proc. Natl. Acad. Sci.、第８３巻、５９７−６０３頁（１９８６）。従って、出典明示によりこれらの文献を本明細書の一部とする。
【００３４】
種々の環境下、自然ポリペプチドの変種（時に「ムテイン」と称される）が望ましい。例えば、特にもし副作用活性がポリペプチドの、望ましい活性の部分とは異なる部分と関連しているなら、望ましくない副作用は特定の変種により減少するかもしれない。いくつかの発現系では、天然ポリペプチドはプロテアーゼによる分解に感受性である可能性がある。このような場合、感受性配列を変更するアミノ酸の選択的置換および／または欠失は、収率を有意に上昇させ得る。例えば、英国特許出願２１７３−８０４−Ａでは、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターの２７５番目のＡｒｇはＧｌｙまたはＧｌｕにより置き換えられる。変種はまた、精製方法での収率を上昇させ、および／または酸化、アシル化、アルキル化または他の化学的修飾に感受性のあるアミノ酸を排除することで蛋白の貯蔵寿命を延ばす。例えば、メチオニンは容易に酸化しスルホキシドを形成するが、これは多くの蛋白において生物学的活性の減少と関連している。例えば、BrotおよびWeissbach、Arch. Biochem. Biophys.、第２２３巻、２７１頁（１９８３）。メチオニンは、生物学的活性がほとんど無い、またはまったく無い、より不活性のアミノ酸と置換できることが多い。例えば、オーストラリアの特許出願ＡＵ−Ａ−５２４５１／８６。細菌の発現系では、収率は、時々、構造的に不必要なシステイン残基を排除または置換することで上昇される。例えばMarkら、米国特許第４５１８５８４号。
【００３５】
好ましくは、カセット変異誘発を利用し、変異蛋白を生成する。合成遺伝子は、遺伝子に沿って略均一に一定間隔にある独特な（適当なベクターに挿入された場合に独特な）一連の制限エンドヌクレアーゼ部位で構築される。独特な制限部位により、遺伝子の部分は、望ましい変異をコードする合成オリゴヌクレオチド（すなわち「カセット」）で都合よく切除され、置き換えられ得る。独特な制限部位の数および分布の決定には、（１）発現に使用されるベクターの中で、前に存在する制限部位、（２）種または属特異的コドンの使用が望ましいかどうか、（３）使用できる、異なる非ベクター切断制限エンドヌクレアーゼの数（および合成遺伝子内でのそれらの多発度）および（４）独特な制限部位の間で部分を合成および／または配列決定する利便性および信頼性、を含むいくつかの因子を考慮する必要がある。
【００３６】
上記した技術は、天然蛋白配列内で、保存的アミノ酸置換等を行うのに便利である。本明細書に記載の「保存的」とは、（ｉ）改変は出来るだけ構造的に自然である、つまり天然蛋白と比較して、発生する変異ポリペプチドの三次構造の変化が最少となるように設計する、および（ｉｉ）改変は出来るだけ抗原的に自然である、つまり天然蛋白と比較して、変異ポリペプチドの抗原決定因子の変化が最少となるように設計する、ことを意味する。以下は、アミノ酸を類似の分類に分けた好ましいカテゴリーである：芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリン）、極性アミノ酸（グルタミン、アスパラギン）、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、小型アミノ酸（アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン、グリシン）。構造的に中性であることは、生物学的活性を保存するのに望ましく、抗原が中性であることは、本発明の化合物で治療されている患者または動物において免疫原性の反応を引き起こさないようにするのに望ましい。どの選択肢が構造的および抗原的に中性であるかを絶対的な確信を持って選択するのは難しいが、構造的および抗原的に中性である可能性が高い改変を作るために、当業者を指導することができる法則が存在する。例えば、Anfisen（前掲）；Berzofsky、Science、第２２９巻、９３２−９４０頁（１９８５）；およびBowieら、Science、第２４７巻、１３０６−１３１０頁（１９９０）。さらに重要ないくつかの法則には、（１）疎水性残基の置換は、かかる残基が蛋白の内側に位置するようであるため、抗原性に変化をもたらす可能性は小さいようである：例えば、Berzofsky（前掲）およびBowieら（前掲）；（２）物理学的に類似の置換、すなわち同義の残基は、置換アミノ酸が置換されたアミノ酸と構造的に同じ役割を果たしうるため、構造的な変化をもたらす可能性が小さいようである；および（３）発展的に保存された配列の改変は、発展的保存は配列が機能的に重要であることを示唆するため、有害な構造的影響をもたらす可能性がある、ということが挙げられる。変種配列を選ぶためのこのような基本的な法則に加えて、生物学的活性および設計された分子の構造を確かめるためのアッセイが利用可能である。本発明のポリペプチドの生物学的アッセイは上記により完全に記載されている。構造の変化は、少なくとも二つの周知のアッセイにより検査することができる：マイクロ補体固定方法、例えばWassermanら、J. Immunol.、第８７巻、２９０−２９５頁（１９６１）、または蛋白の三次構造の発展研究で広く使用される、Levineら、Methods in Enzymology、第１１巻、９２８−９３６頁（１９６７）；一連の構造特異的モノクローナル抗体との親和性、例えばLewisら、Biochemistry、第２２巻、９４８−９５４頁（１９８３）。
【００３７】
ＦＧＦ２３ポリペプチドの化学的製造
本発明のペプチドは、標準的な技術、例えばStewartおよびYoung、Solid Phase Peptide Synthesis、第２版（Pierce Chemical Company, Rockford, IL, １９８４）により合成される。好ましくは、例えばApplied Biosystems, Inc.（Foster City, CA）モデル４３０Ａなどの市販のペプチドシンセサイザーが使用され、本発明のポリペプチドは収斂合成技術で別々に合成され精製された複数のペプチドから組み立ててもよい。例えば、Kentら、米国特許第６１８４３４４号およびDawsonおよびKent、Annu. Rev. Biochem.、６９:９２３-９６０（２０００）。本発明のペプチドは、カルボキシ末端残基より始まり、完全なペプチドが形成されるまでアミノ酸を段階的に加えていく架橋ポリスチレン支持体での固相合成により組み立てることができる。以下の文献は合成の間に利用される化学のためのガイドである：Schnolzerら、Int. J. Peptide Protein Res.、４０:１８０-１９３（１９９２）；Merrifield、J. Amer. Chem. Soc.、第８５巻、２１４９頁（１９６３）；Kentら、１８５頁、Peptides １９８４、Ragnarsson編（AlmquistおよびWeksell、Stockholm、１９８４）；Kentら、２１７頁、Peptide Chemistry ８４、Izumiya編（Protein Research Foundation, B. H. Osaka,１９８５）；Merrifield、Science、第２３２巻、３４１−３４７頁（１９８６）；Kent、Ann. Rev. Biochem.、第５７巻、９５７−９８９頁（１９８８）およびこれらの最後二つの文献で引用される文献。
【００３８】
固相合成において、主として終止、欠失または修飾ペプチドである合成副生成物を排除することが最も重要である。大抵の副反応は、純粋な十分に特徴付けられた樹脂、純粋なアミノ酸誘導体、純粋な溶媒を使用し、適当なカップリングおよび切断方法および反応条件を選択することにより、排除または最少にすることができる。例えば、BaranyおよびMerrifield、The Peptides、CrossおよびMeienhofer編、第２巻、１−２８４頁（Academic Press, New York, １９７９）。一つまたはそれ以上の残基を失っている欠失ペプチドを避けて、完成へと進むよう決めるためにカップリング反応をモニターすることは重要である。量的ニンヒドリン反応がその目的には有用である。Sarinら、Anal. Biochem、第１１７巻、１４７頁（１９８１）。Ｎａ−ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）−アミノ酸は、鎖が集合する条件に対して安定であるが、強酸に対して不安定である適当な側鎖保護基と共に使用される。保護されたペプチド鎖を集合させた後に、保護基を除去し、ペプチド付着結合をチオエステルスカベンジャーの存在下で低濃度、ついで高濃度の無水フッ化水素を使用することで切断する。Tamら、J. Amer. Chem. Soc.、第１０５巻、６４４２頁（１９８３）。使用される側鎖保護基は、Asp（OBzl）、Glu（OBzl）、Ser（Bzl）、Thr（Bzl）、Lys（Cl-Z）、Tyr（Br-Z）、Arg（NGTos）、Cys（４-MeBzl）およびHis（ImDNP）である（Bzl、ベンジル；  Tos、トルエンスルホキシル；  DNP、ジニトロフェニル；  Im、イミダゾール；  Z、ベンジルオキシカルボニル）。残りのアミノ酸は側鎖保護基を有さない。各サイクルで、ｔＢｏｃ  Ｎａ保護ペプチド樹脂を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）（Mallenckrodt）中（使用前に蒸留された）６５％トリフルオロアセチル酸（Eastman Kodakより）に、最初に１分間、ついで１３分間曝し、Ｎａ保護基を除去する。ペプチド樹脂をＤＣＭで洗浄し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（Applied Biosystem）中１０％ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（Aldrich）で各々１分間二回中和する。中和の後、ＤＭＦで洗浄する。カップリングは、ＤＭＦの中で１６分間アミノ酸の対称性無水物でなされる。対称性無水物は、アミノ酸を２ミリモル、６ｍｌのＤＣＭに溶解し、１ミリモルのジシクロヘキシカルボジイミド（Aldrich）を２ｍｌのＤＣＭに加えることで、シンセサイザーにより調製される。５分後、活性化アミノ酸を別の容器に移し、窒素ガスを連続的に流してパージすることでＤＣＭを蒸発させる。パージの間に種々の工程でＤＣＭをＤＭＦ（全部で６ｍｌ）と置き換える。最初のカップリングの後、ペプチド樹脂を、ＤＣＭ、ＤＣＭ中１０％ＤＩＥＡ、ついでＤＣＭで洗浄する。再カップリングのために、同じアミノ酸および活性化物質、ジシクロヘキシルカルボジイミドを連続して反応容器に移す。イン・サイチュでの活性化および１０分間のカップリングの後、５０％ＤＭＦ−ＤＣＭ混合物を作るために十分なＤＭＦを加れ、１５分間カップリングを続ける。アルギニンを、ＤＭＦ中、ヒドロキシベンゾトリアドール（Aldrich）エステルとして６０分間カップリングさせ、ついで同じやり方で他のアミノ酸と再カップリングさせる。アスパラギンとグルタミンは、ＤＭＦ中、各カップリングは４０分間で、ヒドロキシベンゾトリアドールエステルとして��回カップリングされる。全ての残基について、二回目のカップリングの後に樹脂を洗浄し、量的ニンヒドリン反応により非カップリングα−アミン残基をモニターするため、サンプルを自動的に採取する。Sarinら（前掲）。
【００３９】
好ましくは、本発明のポリペプチドの化学的合成は、Dawsonら、Science、２６６:７７６-７７９（１９９４）およびKentら、米国特許第６１８４３４４号に記載されるように、自然の化学的ライゲーションによるオリゴペプチドの集合によりなされる。簡単に言えば、この方法では、最初のオリゴペプチドは非酸化スルフヒドリル側鎖を有するＮ末端システインを提供し、二番目のオリゴペプチドはＣ末端チオエステルを提供する。ついで、Ｎ末端システインの非酸化スルフヒドリル側鎖をＣ−末端チオエステルと縮合させ、β−アミノチオエステル結合で一番目と二番目のオリゴペプチドを結合する中間オリゴペプチドを生成する。ついで、中間オリゴペプチドのβ−アミノチオエステル結合は分子内再配列を受け、アミノ結合で一番目と二番目のオリゴペプチドを結合するオリゴペプチド生成物を生成する。好ましくは、内部断片のＮ末端システインは、下記のサイクリックチアゾリジン保護基によって、望ましくない循環および／または連鎖反応から防御される。好ましくは、このようなサイクリックチアゾリジン保護基は、チオプロリニル基である。
【００４０】
Ｃ末端チオエステルを有するオリゴペプチドは、以下の文献に記載されるように製造することができる；その内容を出典明示により本明細書の一部とする： Kentら、米国特許第６１８４３４４号；Tamら、Proc. Natl. Acad. Sci.、９２:１２４８５-１２４８９（１９９５）；Blake、Int. J. Peptide Protein Res.、１７:２７３（１９８１）；Canneら、Tetrahedron Letters、３６:１２１７-１２２０（１９９５）；Hackengら、Proc. Natl. Acad. Sci.、９４:７８４５-７８５０（１９９７）；またはHackengら、Proc. Natl. Acad. Sci.、９６:１００６８-１００７３（１９９９）。好ましくは、Hackengら（１９９６）に記載される方法が使用される。簡単には、Schnolzerら、Int. J. Peptide Protein Res.、４０:１８０-１９３（１９９２）（その内容を出典明示により本明細書の一部とする）で開示される、Ｂｏｃ化学のイン・サイチュ中和／ＨＢＴＵ活性化操作を用いて、典型的には０．２５ミリモルのスケールにて固相支持体（後記する）に基づいてオリゴペプチドを合成する。（ＨＢＴＵは、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−ｙｌ）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸およびＢｏｃはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルである）。各合成サイクルは、１ないし２分間ニートＴＦＡで処理することによるＮα−Ｂｏｃ除去と、１分間のＤＭＦフローウォッシュと、ＤＩＥＡの存在下で１．０ミリモルの予備活性化Ｂｏｃアミノ酸での１０ないし２０分間のカップリングと、および二回目のＤＭＦフローウォッシュとからなる。（ＴＦＡはトリフルオロ酢酸、ＤＭＦはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、およびＤＩＥＡはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンである）。Ｎα−Ｂｏｃアミノ酸（１．１ミリモル）は、過剰のＤＩＥＡ（３ミリモル）の存在下で、１．０ミリモルのＨＢＴＵ（ＤＭＦ中０．５Ｍ）で３分間、予備活性化される。各カップリング工程の後、例えばSarinら、Anal. Biochem.、１１７:１４７-１５７（１９８１）で開示されるように、通常の量的ニンヒドリンアッセイで残りの遊離アミンを測定することで、収率を決定する。Ｇｌｎ残基のカップリングの後、高温（ＴＦＡ／ＤＭＦ）触媒ピロリドン形成の可能性を妨げるため、ＴＦＡを使用して脱保護の前および後にＤＣＭフローウォッシュを使用する。鎖の集合が完了した後、オリゴヌクレオチドを脱保護し、スカベンジャーとしての４％ｐ−クレゾールと共に０℃で１時間無水ＨＦで処理することによりその樹脂より切断する。イミダゾール側鎖２，４−ジニトロフェニル（ｄｎｐ）保護基は、ｄｎｐ除去操作がＣ末端チオエステル基と適合しないので、Ｈｉｓ残基上に残る。しかしながら、ｄｎｐは、ライゲーション反応の間チオールによって次第に除去される。切断後、オリゴペプチドを氷冷ジエチルエーテルで沈殿させ、水性アセトニトリルに溶かし、凍結乾燥させる。
【００４１】
上記したチオエステルオリゴペプチドは、好ましくは、Hackengら（１９９９）によって開示されるように作られるトリチル結合メルカプトプロピオン酸ロイシン（ＴＡＭＰＡＬ）樹脂、または類似のプロトコルで合成される。簡単には、Ｎα−Ｂｏｃ−Ｌｅｕ（４ミリモル）を、６ミリモルのＤＩＥＡ存在下で、３．６ミリモルのＨＢＴＵで活性化し、２ミリモルのｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂またはその同等物に、１６分間カップリングさせる。次に、３ミリモルのＳ−トリチルメルカプトプロピオン酸を、６ミリモルのＤＩＥＡ存在下で、２．７ミリモルのＨＢＴＵで活性化し、Ｌｅｕ−ＭＢＨＡ樹脂に１６分間カップリングさせる。得られたＴＡＭＰＡＬ樹脂は、ＴＦＡ中３．５％トリイソプロピルシランおよび２．５％Ｈ２Ｏ溶液での１分間の処理を２回行い、トリチル保護基を除去した後に、ポリペプチド鎖集合の開始樹脂として用いることができる。チオエステル結合は、Schnolzerら（前掲）で開示されるように、標準的なイン・サイチュ中和ペプチドカップリングプロトコルを１時間用いることで、所望のアミノ酸のいずれかで形成することができる。最後のオリゴペプチドを無水ＨＦで処理することで、Ｃ末端活性化メルカプトプロピオン酸ロイシン（ＭＰＡＬ）チオエステルオリゴペプチドが得られる。
【００４２】
好ましくは、チアゾリジン保護チオエステルオリゴペプチド中間体は、Hackengら（１９９９）に記載の条件または同様の条件下で、自然の化学ライゲーションに使用される。簡単には、６Ｍグアニジン、４％（容量／容量）ベンジルメルカプタンおよび４％（容量／容量）チオフェノールを含有する０．１Ｍリン酸塩バッファー（ｐＨ８．５）をライゲートされる乾燥ペプチドに添加し、凍結乾燥したペプチドからのチオールおよびＴＦＡの添加のため低下した約７のｐＨで１−３ｍＭの最終ペプチド濃度を得た。好ましくは、ライゲーション反応は３７℃で熱遮断をして行われ、チオールの添加を平衡させるため周期的に攪拌する。反応は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳまたはＨＰＬＣおよび電子スプレーイオン化ＭＳによって、完了度合についてモニターしてもよい。
【００４３】
自然の化学ライゲーション反応が完了または停止した後、生成物のＮ末端チアゾリジン環を、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン（０．５Ｍ）などのシステイン脱保護化剤を用いて、ｐＨ３．５ないし４．５、３７℃で２時間処理することにより開環し、その後、慣用的な分取用ＨＰＬＣに付すことで生成物を精製する前に、いずれの酸化反応成分をも完全に還元するため１０倍過剰量のトリス−（２−カルボキシエチル）−ホスフィンを反応混合物に加える。好ましくは、ライゲーション生成物を含むフラクションを電子スプレーイオン化ＭＳによって同定し、プールして凍結乾燥させる。
【００４４】
合成が完了し、最終生成物が精製された後、最終ポリペプチド生成物を慣用的技法、例えば、Creighton、Meth. Enzymol.、１０７:３０５-３２９（１９８４）；White、Meth. Enzymol.、１１:４８１-４８４（１９６７）；Wetlaufer、Meth. Enzymol.、１０７:３０１-３０４（１９８４）等によって再生してもよい。好ましくは、最終生成物は以下の方法等による空気酸化によって再生される。還元された凍結乾燥生成物を、１００ｍＭトリス、１０ｍＭメチオニンを含む、ｐＨ８．６の１Ｍグアニジン塩酸塩（またはカオトロピック剤など）に溶かす。一晩静かに攪拌した後、再生生成物を、通常のプロトコルを用いて逆相ＨＰＬＣにより単離する。
【００４５】
抗ＦＧＦ２３ポリペプチド抗体
本発明はさらに、抗ＦＧＦ２３ポリペプチド抗体を提供する。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、二特異的抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体を含む。
ポリクローナル抗体
本発明の抗ＦＧＦ２３ポリペプチド抗体は、ポリクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体の調製法は当業者に公知である。例えば免疫化物質、好ましくはアジュバントを１回またはそれ以上注射するのに続いて、このようなポリクローナル抗体は哺乳動物で産生され得る。典型的には、免疫化物質および／またはアジュバントは、一連の皮下または腹腔内注射によって哺乳動物に注射されるであろう。免疫化物質は、ＦＧＦ２３ポリペプチドまたはその融合蛋白を含む。免疫化された哺乳動物において抗原を免疫原性で知られる蛋白にコンジュゲートすることは有用である。このような免疫原性蛋白として、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシのサイログロブリンおよび大豆トリプシンインヒビターが挙げられるが、それに限られない。アジュバントは、例えば、フロイント完全アジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピッドＡ、合成トレハロースジコリノマイコレート）を包含する。免疫化プロトコルは、標準的なプロトコルに基づいて、または慣用的実験によって、当業者が決定することができる。
【００４６】
モノクローナル抗体
別法として、抗ＦＧＦ２３ポリペプチド抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体はハイブリドーマにより産生される。ここでは、マウス、ハムスターまたは他の適当な宿主動物を免疫化物質で免疫処理し、免疫化物質と特異的に結合するであろう抗体を産生するあるいはその産生能を有するリンパ球を惹起する［KohlerおよびMilstein、Nature ２５６:４９５（１９７５）］。また、リンパ球をインビトロにて免疫化してもよい。免疫化物質は、典型的には、ＦＧＦ２３ポリペプチドまたはその融合蛋白を含む。一般に、非ヒト哺乳動物の材料が望ましいならば、脾臓細胞またはリンパ節細胞を用い、ヒト由来の細胞が望ましいならば、末梢血リンパ球（「ＰＢＬｓ」）を用いる。ハイブリドーマ細胞を生成するために、ポリエチレングリコールなどの適当な融合剤を使用して、リンパ球を不死化細胞系と融合させる［Goding、MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE, Academic Press、５９-１０３頁（１９８６）］。一般に、不死化細胞系は、例えばラット、マウス、ウシまたはヒト由来の骨髄腫細胞などの、哺乳動物形質転換細胞である。ハイブリドーマ細胞は、非融合、不死化細胞の成長または生存を阻害する好ましくは一つまたはそれ以上の物質を含む、適当な培地で培養される。例えば、もし親細胞がヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）酵素を欠く場合、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を妨げる物質である、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ）を含む。好ましい不死化細胞系は、効率的に融合し、抗体の安定した高レベルでの産生を支持し、およびＨＡＴ培地などの培地に感受的であるものである。さらに好ましい不死化細胞系は、ネズミまたはヒトの骨髄腫系であり、それは、例えば、メリーランド州、ロックビルに住所を有する、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）から得ることができる。ヒトモノクローナル抗体の産生用のヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系も記載されている［Kozbor、J. Zmmunol. １３３:３００１（１９８４）；Brodeurら、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、Marcel Dekker, Inc.、New York、５１-６３頁（１９８７）］。
【００４７】
ハイブリドーマ細胞を培養する培地（上清）は、ＦＧＦ２３ポリペプチドに拮抗するモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。好ましくは、ハイブリドーマ上清に存在するモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、または放射免疫測定（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって測定される。適当な技術およびアッセイが当該分野にて知られている。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、MusenおよびPollard、Anal. Biochem. １０７:２２０（１９８０）のScatchard分析によって測定することができる。望ましい抗体産生ハイブリドーマ細胞が同定された後に、その細胞を希釈操作を制限することでクローン化し、標準的な方法で増殖させてもよい［Goding、１９８６］。この目的のための適当な培地は、例えば、ダルベッコ修飾培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地を包含する。また、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物中、腹水としてインビボにて増殖させることもできる。選択されたクローンから分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、蛋白Ａ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析またはアファニティクロマトグラフィなどの、当業者に日常使用される免疫グロブリン精製操作によって、培地または腹水より単離または精製することができる。
【００４８】
モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ技法、例えば、米国特許第４８１６５６７号に記載される方法によって製造することもできる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、ＦＧＦ２３ポリペプチド特異的ハイブリドーマ細胞より単離され、例えばネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力を有するオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより配列決定され得る。単離した後、そのＤＮＡを発現ベクターに挿入し、ついでそれをサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または別に免疫グロブリン蛋白を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトし、組換え宿主細胞で合成モノクローナル抗体の合成を達成する。ＤＮＡはまた、例えば、ネズミの相同配列の代わりにヒトの重鎖および軽鎖不変ドメインのコード配列を用いることによって［Morrisonら、Proc. Nat. Acad. Sci. ８１:６８５１-６８５５（１９８４）；Neubergerら、Nature３１２:６０４-６０８（１９８４）；Takedaら、Nature３１４:４５２-４５４（１９８５）］、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てまたは一部を、免疫グロブリンコード配列に共有結合させることによって、修飾することができる。本発明の抗体の不変ドメインの代わりに、非免疫グロブリンポリペプチドを用いることができ、あるいは本発明の抗体の抗原結合部位の可変ドメインの代わりに非免疫グロブリンポリペプチドを用いてキメラ二価抗体を創生することができる。抗体はまた一価抗体であってもよい。一価抗体を調製するための方法は当該分野にてよく知られている。例えば、インビトロ方法が一価抗体を調製するのに適している。抗体の断片、特にＦａｂ断片を産生するための抗体の消化は、当該分野にて知られている慣用的技法を用いて達成することができる。
【００４９】
本発明のハイブリドーマに特徴的な抗体および抗体断片はまた、メッセンジャーＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡライブラリーを構築し、および抗体分子の一部をコードするクローンを選択する組換え手段により産生され得る。例えば、Wallら、Nucleic Acids Research、第５巻、３１１３−３１２８頁（１９７８）；Zakutら、Nucleic Acids Research、第８巻、３５９１−３６０１頁（１９８０）；Cabillyら、Proc. Natl. Acad. Sci.、第８１巻、３２７３−３２７７頁（１９８４）；Bossら、Nucleic Acids Research、第１２巻、３７９１−３８０６頁（１９８４）；Amsterら、Nucleic Acids Research、第８巻、２０５５−２０６５頁（１９８０）；Mooreら、米国特許第４６４２３３４号；Skerraら、Science、第２４０巻、１０３８−１０４１頁（１９８８）；およびHuseら、Science、第２４６巻、１２７５−１２８１頁（１９８９）を参照のこと。特に、かかる技法は、ある種の結合領域がもうひとつ別の種の抗体の非結合領域に結合して、免疫原性を減少させるところの、種間モノクローナル抗体を産生するために用いることができる。例えば、Liuら、Proc. Natl. Acad. Sci.、第８４巻、３４３９−３４４３頁（１９８７）を参照のこと。
【００５０】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体は共にＥＬＩＳＡによってスクリーニングすることができる。他の固相免疫アッセイと同様に、この試験は高分子が非特異的にプラスチックに吸着する傾向をベースとする。この反応の不可逆性により、免疫学的活性の低下が無く、このような複合体を非結合物質から単純に分離することで抗原−抗体複合体の形成が可能となる。抗ペプチド血清を滴定するために、免疫処置で使用されるキャリアとは異なるキャリアにコンジュゲートしたペプチドを、９６−マイクロ滴定プレートのウェルに吸着させる。ついで、吸着された抗原をウェルにて抗ペプチド血清の希釈溶液と反応させる。非結合抗体を洗浄し、残留抗原−抗体複合体を免疫化された動物のＩｇＧに特異的な抗体と反応させる。この第２抗体はアルカリホスファターゼなどの酵素にコンジュゲートする。酵素基質が加えられた際に生成される可視色反応生成物により、どのウェルに結合抗ペプチド抗体が有るかが示される。分光光度計の読取りを用いることで、ペプチド特異的抗体結合の量をさらに正確に定量化することが可能となる。抗血清の高度な滴定より、１０−３と１０−５の希釈の間で、線形滴定曲線が得られる。
【００５１】
ＦＧＦ２３ポリペプチド抗体
本発明は、ＦＧＦ２３ポリペプチド由来のペプチド、およびキャリアと本発明のペプチド間にコンジュゲートを含む免疫原を包含する。本明細書にて用いる免疫原なる語は、免疫反応の惹起能を有する物質をいう。本明細書にて用いるキャリアなる語は、本発明のペプチドに化学的にコンジュゲートする際に、得られたコンジュゲートで免疫化された宿主生物が、そのコンジュゲートペプチドに特異的な抗体を生成することを可能とするいずれかの物質をいう。キャリアは、赤血球細胞、バクテリオファージ、蛋白またはアガロース数珠状物質などの合成微粒子を含む。好ましくは、キャリアは、血清アルブミンなどの蛋白、ガンマグロブリン、キーホールリンペットヘモシアニン、サイログロブリン、卵白アルブミン、フィブリノゲン等である。
【００５２】
合成ペプチドをキャリアに結合する一般的な技術は、いくつかの文献、例えば、Setlowら編、Genetic Engineering、第５巻、６１−９１頁（Plenum Press, N. Y., １９８３）の中の、WalterおよびDoolittle、”Antibodies Against Synthetic Peptides”；Greenら、Cell、第２８巻、４７７−４８７頁（１９８２）；Lernerら、Proc. Natl. Acad. Sci.、第７８巻、３４０３−３４０７頁（１９８１）；Shimizuら、米国特許第４４７４７５４号；およびGanfieldら、米国特許第４３１１６３９号に記載されている。従って、これらの文献を出典明示により本明細書の一部とする。また、ハプテンをキャリアに結合するため使用された技術は、上記した技術、例えば、Tijsseu Practice and Theory of Enzyme Immunoasseys（Elsevier, New York, １９８５）の２０章の技術と本質的に同じである。ペプチドをキャリアに結合するために最も一般的に使用される４つのスキームは、（１）例えば、JaffeおよびBehrman編、Methods of Hormone Radioimmunoassay、３２８−３２９頁（Academic Press, N. Y., １９７９）の中のKaganおよびGlick、およびWalterら、Proc. Natl. Acad. Sci.、第７７巻、５１９７−５２００頁（１９８０）で開示される、アミノ基のカップリングのためのグルタルアルデヒド；（２）例えば、Hoareら、J. Biol. Chem.、第２４２巻、２４４７−２４５３頁（１９６７）で開示される、アミノ基にカルボキシル基をカップリングするための水溶性カルボジイミド；（３）例えば、JaffeおよびBehrman編（前掲）の中のBassiriら、４６−４７頁、およびWalterら（前掲）で開示される、チロシン側鎖にチロシンをカップリングするためのビス−ジアゾベンジジン（ＤＢＤ）；および（４）例えば、Kitagawaら、J. Biochem.（Tokyo）、第７９巻、２３３−２３９巻（１９７６）およびLernerら（前掲）で開示される、アミノ基にシステイン（または他のスルフヒドリル）をカップリングするためのマレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ＭＢＳ）である。所定のペプチドを蛋白キャリアにカップリングする適当な方法を選択する一般的な法則は、以下のように記述できる：結合に関係する基は、その配列の中で１回だけ、好ましくはその部分の適当な末端で発生するはずである。例えば、潜在的な抗原性特徴で選択された配列の主要な部分にチロシン残基が発生しているなら、ＢＤＢは使用されるべきでない。同様に、中心に位置するリシンはグルタルアルデヒド方法を除外し、アスパラギン酸およびグルタミン酸の出現はカルボジイミド方法を排除することが多い。他方、適当な残基は、「天然」蛋白配列に発生しようとそうでなかろうと、結合部位として選択された配列部分の片側に位置することができる。内側の部分は、アミノおよびカルボキシ末端と違って、ポリペプチドバックボーンが連続である天然蛋白で見られるのと同じ配列とは、「非結合末端」という点で有意に異なるであろう。α−アミノグループをアセチル化し、ついでカルボキシ末端を介してペプチドを結合することにより、問題はある程度まで解消され得る。キャリア蛋白へのカップリング効率は、都合よくは、合成の一工程で放射性アミノ酸を使用することによって、またはチロシン残基をヨウ素化して完全ペプチドを標識することのいずれかによって調製された放射能で標識されたペプチドを使用することで測定される。ペプチド内にチロシンが���在することによりまた、所望するならば、高感度の放射免疫測定を行うことが可能となる。従って、チロシンは、もしそれが天然ポリペプチドにより定義されるペプチド配列の一部でないならば、末端残基として導入され得る。
【００５３】
好ましいキャリアは蛋白であり、好ましい蛋白キャリアは、ウシ血清アルブミン、ミオグロブリン、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等を包含する。Liuら、Biochemistry、第１８巻、６９０−６９７頁（１９７９）で開示されるＭＢＳによって、システインを介してペプチドをＫＬＨに結合することができる。ペプチドをリン酸塩バッファーされた食塩水（ｐＨ７．５）、０．１Ｍホウ酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．０）または１．０Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０）に溶かす。ペプチドの溶解についてのｐＨは、ペプチドの溶解度を最適にするように選択される。可溶性ペプチドの遊離システイン含量は、Ellman法（Ellman、Arch. Biochem. Biophys.、第８２巻、７０７７頁（１９５９））により測定される。各ペプチドについて、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２）０．２５ｍｌ中の４ｍｇのＫＬＨを、０．７ｍｇのＭＢＳ（ジメチルホルムアミドに溶解）と反応させ、３０分間室温で攪拌する。ＭＢＳは、ＫＬＨは＞３０％ホルムアミドに不溶性であるので、ホルムアミドの局所濃度が高くなりすぎないように、滴下される。ついで、反応生成物であるＫＬＨ−ＭＢＳを、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）で平衡にした、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５に通し、遊離ＭＢＳを除去し、カラム溶出液のピーク部分からのＫＬＨ回収（ＯＤ２８０でモニターされた）が略８０％であると概算される。ついで、ＫＬＨ−ＭＢＳを選択バッファーの１ｍｌに溶解した５ｍｇペプチドと反応させる。ｐＨを７ないし７．５に調節し、反応物を３時間室温で攪拌する。カップリング効率を、リン酸塩バッファーされた食塩水に対するコンジュゲートのサンプルを透析することによって放射性ペプチドについてモニターし、それは８％から６０％の範囲にある。ペプチド−キャリアコンジュゲートが入手できれば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、例えば、Campbell、Monoclonal Antibody Technlogy（Elsevier, New York, １９８４）；Hurrell編、Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications（CRC Press, Boca Raton, FL, １９８２）；Schreierら、Hybridoma Techniques（Cold Spring Harbor Laboratory, New York, １９８０）；米国特許第４５６２００３号等で開示される、標準的な技術によって産生される。特に米国特許第４５６２００３号を出典明示により本明細書の一部とする。
【００５４】
ヒト化抗体
本発明の抗ＦＧＦ２３ポリペプチド抗体はさらに、ヒト化抗体またはヒト抗体を含む。「ヒト化抗体」なる語は、非ヒト抗体由来である配列のある部分を含む、キメラ抗体、免疫グロブリン鎖またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）または抗体の他の抗原結合部分配列など）である非ヒト（例えば、ネズミ）抗体のヒト化された形態をいう。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリンの相補的決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の結合特異性、親和性および能力を有しているマウス、ラットまたはウサギなど非ヒト種のＣＤＲ由来の残基により置き換えられているヒト免疫グロブリンを包含する。一般に、ヒト化抗体は、実質的に、少なくとも一つ、一般には二つの可変ドメインの全てを含むであろう。そのうちのすべてのあるいは実質的にすべてのＣＤＲ領域は、非ヒト免疫グロブリン由来のものに相当し、すべてのあるいは実質的にすべてのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリン対応配列由来のものである。ヒト化抗体は、最適にはまた、免疫グロブリン不変領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの不変領域の、少なくとも一部を含む［Jonesら、Nature ３２１:５２２-５２５（１９８６）およびPresta、Cuvv. Op. Stvuct. Biol. ２:５９３-５９６（１９９２）］。非ヒト抗体をヒト化する方法は当該分野にて周知である。一般に、ヒト化抗体は、さらにヒト抗体に密に似るように、ヒト以外の供給源からその中に導入された一つまたはそれ以上のアミノ酸を有するが、それでも抗体の元来の結合活性を保持する。抗体のヒト化方法は、Jonesら、Nature ３２１:５２２-５２５（１９８６）；Riechmannら、Nature ３３２:３２３-３２７（１９８８）；およびVerhoeyenら、Science ２３９:１５３４-１５３６（１９８８）にてさらに詳説されている。このような「ヒト化」抗体は、実質的に、無傷のヒト可変ドメインがヒト以外の種由来の対応配列によって置換されていないという点で、キメラ抗体である。
【００５５】
ヘテロコンジュゲート抗体
二つの共有結合した抗体を含むヘテロコンジュゲート抗体もまた、本発明の範囲の中にある。ヘテロコンジュゲート抗体は、架橋剤に関係するものも含めて、合成蛋白化学で知られる方法を用いてインビトロで調製される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することで、調製される。
【００５６】
二特異的抗体
二特異的抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に対する結合特異性を有する。このような抗体はモノクローナルで、好ましくはヒトまたはヒト化される。本発明の二特異的抗体の結合特異性のうち一つは、ＦＧＦ２３ポリペプチドに対して、およびもう一方は、好ましくは細胞表面蛋白または受容体、または受容体サブユニットに対してである。二特異的抗体を作るための方法は当該分野にて知られており、一般には二特異的抗体の組換え生成は、ハブリドーマ細胞内で、二つの重鎖は異なる特異性を有する、二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対が共に発現されることに基づく［MilsteinおよびCuello, Nature ３０５:５３７-５３９（１９８３）］。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせにより、ハイブリドーマが潜在的に１０個の異なる抗体分子を生成することとなると仮定すると、正確な分子の精製は、通常例えばアファニティクロマトグラフィなどの親和性精製のようなものが必要とされる。
【００５７】
抗体アンタゴニスト
好ましくは、本発明のアンタゴニストは、ＦＧＦ２３ポリペプチドに特異的な抗体に由来する。さらに好ましくは、本発明のアンタゴニストは、ＦＧＦ２３ポリペプチドに特異的な断片または結合組成物を含む。抗体は、ジスルフィド架橋によって一緒に結合されたポリペプチド鎖の集合を含む。軽鎖および重鎖と称される二つの大きなポリペプチド鎖は、抗体の全ての大きな構造分類（アイソタイプ）を作り上げる。重鎖および軽鎖は共にさらに、可変領域および不変領域と称されるサブ領域に分けられる。重鎖は一つの可変領域および三つの異なる可変領域を含み、軽鎖は一つの（重鎖のそれとは異なる）可変領域および一つの（重鎖のそれとは異なる）可変領域を含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗体の結合特異性の原因である。本明細書にて用いる「重鎖可変領域」なる語は、（１）１１０から１２５個のアミノ酸の長さであり、および（２）アミノ酸配列が本発明のモノクローナル抗体重鎖のアミノ酸配列と、重鎖Ｎ末端アミノ酸より始まって一致する、ポリペプチドを意味する。同様に、「軽鎖可変領域」なる語は、（１）９５から１１５個のアミノ酸の長さであり、および（２）アミノ酸配列が本発明のモノクローナル抗体軽鎖のアミノ酸配列と、軽鎖Ｎ末端アミノ酸より始まって一致する、ポリペプチドを意味する。本明細書にて用いる「モノクローナル抗体」なる語は、ＦＧＦ２３ポリペプチドに特異的に結合可能である免疫グロブリンの同種集団をいう。本明細書に記載の「結合組成物」なる語は、（１）機能的に結合すると、ＦＧＦ２３ポリペプチドに対して高度な結合親和性を有する構造を取り、および（２）ＦＧＦ２３ポリペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体を精製するハイブリドーマ由来である、二つのポリペプチド鎖よりなる組成物を意味する。「機能的に結合した」なる語は、二つのポリペプチド鎖が互いに、ＦａｂまたはＦｖなどの天然抗体断片内での結合、または遺伝子操作されたシステインを含むカルボキシ末端でのペプチドリンカーを含めた、種々の方法による結合を受けるよう位置し得ることを意味する。通常、二つのポリペプチド鎖は、ＦＧＦ２３ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域に一致する。好ましくは、本発明のアンタゴニストは、ＦＧＦ２３ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体由来である。ＦＧＦ２３ポリペプチドの遮断または中和能を有するモノクローナル抗体は、ＦＧＦ２３ポリペプチド誘発効果を阻害する能力によって選択される。
【００５８】
抗体断片の使用および生成もよく知られている。例えばＦａｂ断片については、Tijssen、Practice and Theory of Enzyme Immunoassays（Elsevier, Amsterdam, １９８５）；およびＦｖ断片については、Hochmanら、Biochemistry、第１２巻、１１３０−１１３５頁（１９７３）；Sharonら、Biochemistry、第１５巻、１５９１−１５９４頁（１９７６）およびEhrlichら、米国特許第４３５５０２３号；および抗体半分子については、Auditore-Hargreaves、米国特許第４４７０９２５号を参照のこと。
【００５９】
精製および医薬組成物
本発明のポリペプチドが、例えば形質転換酵母または哺乳動物細胞の分泌生成物として、可溶な形で発現される際、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過、電気泳動、アファニティクロマトグラフィ等の工程を含め、当該分野における標準的な操作に従って精製されえる。例えば、”Enzyme Purification and Related Techniques,” Methods in Enzymology、２２:２３３-５７７（１９７７）およびScopes, R.、Protein Purification：Principles and Practice（Springer-Verlag, New York, １９８２）はこのような精製における指針を提供する。同様に、本発明のポリペプチドが、例えば集合体、封入体などの不溶形態で発現される場合、遠心法による破壊宿主細胞からの封入体分離、カオトロピズムおよび還元物質での封入体可溶化、可溶化混合物の希釈、およびポリペプチドが生物学的活性構造を取るためのカオトロピズム物質および還元物質濃度の降下化を含めた、当該分野にて標準的な操作により精製される。後者の操作は出典明示により本明細書の一部とされる、以下の文献：Winklerら、Biochemistry、２５:４０４１-４０４５（１９８６）；Winklerら、Biotechnology、３:９９２-９９８（１９８５）；Kothsら、米国特許第４５６９７９０号；および欧州特許出願８６３０６９１７.５および８６３０６３５３.３で開示されている。
【００６０】
本明細書に記載の「効果的な量」とは、自己免疫疾患の症状を改善するのに十分な量を意味する。特定の患者に対して効果的な量は、治療される疾患の状態、患者の全般的な健康、投与方法、副作用の重度などの因子によって変化する。一般に、ＦＧＦ２３ポリペプチドは、効果的な量のＦＧＦ２３ポリペプチドおよび薬学的キャリアを含む医薬組成物として投与される。薬学的キャリアは、本発明の組成物を患者にデリバリーするのに適当な、適合性で、非毒性のいずれの物質とすることもできる。一般に、このような薬剤の非経口投与に有用な組成物がよく知られている。例えば、Remington's Pharmaceutical Science、第１５版（Mach Publishing Company, Easton, PA １９８０）。別法として、本発明の組成物は、移植可能または注射可能な薬剤デリバリー系によって患者の体内に導入される。例えば、Urquhartら、Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.、第２４巻、１９９−２３６頁（１９８４）；Lewis編、Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals（Plenum Press, New York, １９８１）；米国特許第３７７３９１９号；米国特許第３２７０９６０号などを参照のこと。
【００６１】
非経口的に投与された際、ＦＧＦ２３ポリペプチドは単位投薬当たり薬学的キャリアと結合した注入可能型（溶剤、懸濁剤、乳剤）で処方される。このようなキャリアの例は、正常食塩水、リンガー液、ブドウ糖溶液、およびハンクス液である。固定油およびエチルオレイン酸剤などの非水性キャリアもまた使用される。好ましいキャリアは、５％ブドウ糖／食塩水である。キャリアは、例えばバッファーおよび保存薬など、等張性および化学的安定性を高める物質などの少量の添加物を含む。ＦＧＦ２３ポリペプチドは好ましくは、約５から２０μｇ／ｍｌの範囲の濃度で、集合体および他の蛋白が実質上無い精製型で処方される。好ましくは、ＦＧＦ２３ポリペプチドは、一日当たりの量が約５０ないし８００μｇの範囲でデリバリーされるように（すなわち約１ないし１６μｇ／ｋｇ／ｄａｙ）、連続注入によって投与される。毎日の注入割合は、血液細胞数、体温などの副作用をモニター観察することに基づいて変化する。
【００６２】
ＦＧＦ２３ポリペプチドは、ＦＧＦ２３ポリペプチド遺伝子を運ぶ発現ベクターにより一過性にトランスフェクションされた、または安定な形質転換を受けた哺乳動物細胞の培養上清より精製することができる。好ましくは、ＦＧＦ２３ポリペプチドは、ｐｃＤ発現ベクターにより一過性にトランスフェクションされたＣＯＳ７細胞の培養上清より精製される。ｐｃＤでのＣＯＳ７細胞のトランスフェクションは次のように行う：トランスフェクションの一日前に、約１０６個のＣＯＳ７サル細胞を、各々１００ｍｍプレートで、１０％ウシ胎児血清および２ｍＭグルタミンを含有するダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥ）に播種する。トランスフェクションを行うため、培地を各プレートより吸引し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌｐＨ７．４，４００ｍｇ／ｍｌＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎおよび５０μｇのプラスミドＤＮＡを含む４ｍｌのＤＭＥと置き換える。プレートを３７℃で４時間インキュベートし、ついでＤＮＡ含有培地を取り除き、プレートを５ｍｌの無血清ＤＭＥで２回洗浄する。ＤＭＥをプレートに加え、ついでさらに３７℃で３時間インキュベートする。プレートをＤＭＥで１回洗浄し、その後ＤＭＥ含有４％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／Ｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／Ｌ）を標準的濃度で加える。ついで、細胞を３７℃で２７時間インキュベートし、その後成長培地をＦＧＦ２３ポリペプチドの精製のために収集する。別法として、トランスフェクションは、実施例に記載されるエレクトロポレーションによっても行うことができる。トランスフェクションのためのプラスミドＤＮＡは、CasadabanおよびCohen、J. Mol. Biol.、第１３８巻、１７９−２０７頁（１９８０）に記載のイー・コリＭＣ１０６１または類似する有機体に挿入されたＦＧＦ２３ポリペプチドｃＤＮＡを含有する、ｐｃＤ（ＳＲα）または類似する発現ベクターを増殖させることで得られる。プラスミドＤＮＡは標準的な技術で培養基より単離される。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第二版（Cold Spring Harbor Laboratory, New York, １９８９）またはAusbelら（１９９０,前掲）を参照のこと。
【００６３】
本発明のアンタゴニストを抗体から誘導する場合、そのアンタゴニストは、通常、非経口的に、好ましくは経静脈的に投与される。このような蛋白またはペプチドアンタゴニストは免疫原性であるので、それらは好ましくは、通常の経静脈的投与セットによって、または例えばTomasiら、米国特許第４７３２８６３号に教示される皮下貯蔵からのいずれかによって、ゆっくりと投与される。非経口的に投与される際、抗体および／または断片は、上述されるように、単位投薬当たり薬学的キャリアと結合した注入可能型で処方される。抗体は好ましくは、約５から３０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０から２０ｍｇ／ｍｌの濃度で、集合体、他の蛋白、エンドトキシンなどが実質上無い精製型で処方される。好ましくは、エンドトキシンレベルは２．５ＥＵ／ｍｌ以下である。
【００６４】
アンタゴニストの投与管理の選択は、アンタゴニストの血清代謝回転率、治療される疾患と関連するＦＧＦ２３ポリペプチドの血清レベル、アンタゴニストの免疫原性、標的ＦＧＦ２３ポリペプチドの影響の受け易さ（例えば、もし非血清ＦＧＦ２３ポリペプチドなら遮断することができる）、アンタゴニストへのＦＧＦ２３ポリペプチドに対する、受容体へのＦＧＦ２３ポリペプチドの相対的親和性などを含むいくつかの因子次第である。好ましくは、投与計画により、副作用の許容できるレベルと調和して患者にデリバリーされるアンタゴニストの量が最大化される。従って、デリバリーされるアンタゴニストの量は、一部、特定のアンタゴニストおよび治療される疾患の重度次第である。適当な用量の選択の指針は、抗体の薬学的使用についての文献で見られる。例えば、Ferroneら編、Handbook of Monoclonal Antibodies（Noges Publications, Park Ridge, NJ, １９８５）内のBachら、２２章；およびHaberら編、Antibodies in Human Diagnosis and Therapy（Raven Press, New York, １９７７）内のRussel、３０３−３５７頁およびSmithら、３６５−３８９頁を参照のこと。好ましくは、アンタゴニストがモノクローナル抗体またはＦａｂの大きさのその断片（結合組成物を含む）を含む時はいつでも、用量は一日当たり約１ないし２０ｍｇ／ｋｇの範囲である。さらに好ましくは、用量は一日当たり約１ないし１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【００６５】
実施例１
ＦＧＦ２３ポリペプチドの化学合成
この実施例において、図１の配列を有するポリペプチドは、天然化学ライゲーションにより合成される。全長ポリペプチドは後記する前以て合成したオリゴペプチド中間体（上付きの数字は図１の配列の断片の位置を示す）より組み立てられる。以下にさらに詳細に記載されるように、Dawsonら、Science、２６６:７７６-７７９（１９９４）およびHackengら、Proc. Natl. Acad. Sci.、９６:１００６８−１００７３（１９９９）の天然化学的ライゲーション化学操作を用いて、まず断片１を断片２にカップリングし、第１生成物を得、ついでそれを分取ＨＰＬＣ精製に付した後、第１生成物を断片３とカップリングさせ、所望のポリペプチドを得る。
【００６６】
【表１】
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【００６７】
チオエステル形成
断片２および３はチオエステル生成樹脂上で合成される。この目的のために、Ｓ−アセチルチオグリコール酸ペンタフルオロフェニルエステルまたはＳ−トリチルメルカプトプロピオン酸を、標準的な状況下でＬｅｕ−ＰＡＭ樹脂にカップリングさせる；第１のケースでは、得られた樹脂を、ＤＭＦ中１０％メルカプトエタノール、１０％ピペリジンで３０分間処理することでアセチル保護基を除去した後、０．２ミリモルの規模でペプチド鎖を伸長するための開始樹脂として使用する。チオエステルは、標準的なイン・サイチュ中和カップリング法、例えばSchnolzerら、Int. J. Peptide Protein Res.、４０:１８０-１９３（１９９２）の方法を１時間用いて、断片３の合成にはＢｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨで、断片４にはＢｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨで形成される。第２のケースにおいて、トリチル保護基の除去は、ＴＦＡ中２．５％トリイソプロピルシランおよび２．５％Ｈ２Ｏで二回、１分間処理することで行われる。第１アミノ酸（断片２のＢｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ）は、標準的なイン・サイチュ中和カップリングプロトコルを１時間用いて、直ちに手動で樹脂にカップリングさせる。断片２および３のＮ末端システイン残基のＮαは、Ｂｏｃ−チオプロリン（Ｂｏｃ−ＳＰｒ）を通常のＮαまたはＳβ保護（Brikら、J. Org. Chem.、６５:３８２９-３８３５（２０００））を有するＣｙｓの代わりに、各鎖の末端にカップリングさせることで本発明に従って保護される。
【００６８】
ペプチド合成
固相合成は、Schnolzerら、Int. Peptide Protein Res.、４０:１８０-１９３（１９９２）に記載される段階的Ｂｏｃ化学鎖伸長操作についてのイン・サイチュ中和／２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロ−リン酸塩（ＨＢＴＵ）活性化プロトコルを用いて、注文で修飾された４３３Ａペプチドシンセサイザー（Applied Biosystems製）で行う。各合成サイクルは、ニートＴＦＡで１ないし２分間処理することによってＮα−Ｂｏｃを除去すること、ＤＭＦで１分間フローウォッシュすること、過剰のＤＩＥＡの存在下で予備活性化された２．０ミリモルのＢｏｃ−アミノ酸と１０分間カップリングすること、および２回目のＤＭＦフローウォッシュよりなる。Ｎα−Ｂｏｃ−アミノ酸（２ミリモル）は、過剰のＤＩＥＡ（６ミリモル）の存在下、１．８ミリモルのＨＢＴＵ（ＤＭＦ中０．５Ｍ）で３分間予備活性化される。Ｇｌｎ残基のカップリングの後、ＴＦＡを用いて脱保護する前および後にジクロロメタンでのフローウォッシュを行い、可能性のある高温（ＴＦＡ／ＤＭＦ）触媒ピロリドンカルボン酸形成を防止する。側鎖保護されたアミノ酸はＢｏｃ−Ａｒｇ（ｐ−トルエンスルホニル）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｓｎ（キサンチル）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−シクロヘキシル）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（４−メチルベンジル）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−シクロヘキシル）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（ジニトロフェニルベンジル）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（２−Ｃｌ−Ｚ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ベンジル）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（ベンジル）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｔｒｐ（ホルミル）−ＯＨ、およびＢｏｃ−Ｔｙｒ（２−Ｂｒ−Ｚ）−ＯＨである。他のアミノ酸は側鎖保護をすることなく用いられる。断片１のＣ末端はＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｏ−ＣＨ２−Ｐａｍ樹脂（０．７１ミリモル／ｇの負荷樹脂）上で合成されるが、断片２および４については、機械補助の合成をＢｏｃ−Ｘａａ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯ−Ｌｅｕ−Ｐａｍ樹脂で、断片３については、Ｂｏｃ−Ｘａａ−Ｓ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−Ｌｅｕ−Ｐａｍ樹脂上で開始される。これらのうち後者の２つの樹脂は、Ｓ−アセチルチオグコール酸ペンタフルオロフェニルエステルまたはＳ−トリチルメルカプトプロピオン酸を、標準的な条件下で、Ｌｅｕ−Ｐａｍ樹脂にカップリングすることで得られる；第１のケースにおいては、得られた樹脂を、ＤＭＦ中１０％メルカプトエタノール、１０％ピペリジンで３０分間処理することで、アセチル保護基を除去した後、０．２ミリモルの規模でペプチド鎖伸長させるための開始樹脂として用いる。第２のケースにおいては、トリチル保護基の除去を、ＴＦＡ中２．５％トリイソプロピルシランおよび２．５％Ｈ２Ｏで二回、１分間処理することで行う。第１のアミノ酸は、標準的なイン・サイチュ中和カップリングプロトコルを１時間使用して、手動で直ちに樹脂にカップリングされる。
【００６９】
鎖の集合が完了した後、ペプチドを脱保護し、スカベンジャーとして５％ｐ−クレゾールを用い、０℃で１時間無水フッ化水素で処理することにより、樹脂より切断する。全ての場合で、イミダゾール側鎖２，４−ジニトロフェニル（ＤＮＰ）保護基は、ＤＮＰ除去操作がＣ末端チオエステル基と不適合であるので、Ｈｉｓ残基上に残る。しかしながら、ＤＮＰは、ライゲーション反応の間チオールによって徐々に除去され、非保護Ｈｉｓを生じる。切断後、両方のペプチドを氷冷ジエチルエーテルで沈殿させ、水性アセトニトリルに溶かし、凍結乾燥させる。ペプチドを、バッファーＡ（Ｈ２Ｏ／０．１％トリフルオロ酢酸）中のバッファーＢ（アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸）の直線勾配を用い、２１４ｎｍでＵＶ検出を行うことにより、Ｗａｔｅｒｓ製のＣ１８カラムを用いるＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。サンプルを、Esquire装置（Brucker, Bremen, Germany）を使用して電子スプレー質量分光法により分析する。
【００７０】
天然化学ライゲーション
非保護断片のライゲーションを次のように行う：乾燥ペプチドを、ｐＨが約７で最終ペプチド濃度が１−５ｍＭであるように、等モル量の、６Ｍ塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）、０．２Ｍリン酸塩、ｐＨ７．５に溶かし、１％ベンジルメルカプタン、１％チオフェノールを加える。通常は反応を一夜行い、ＨＰＬＣおよび電子スプレー質量分光法でモニター観察する。その後、ライゲーション生成物を処理し、まだ存在する保護基を除去する。Ｔｒｐのホルミル基は、溶液のｐＨをヒドラジンを用いて９．０までシフトさせ、１時間３７℃でのインキュベートすることで切断される。Ｎ末端チアゾリジン環の開裂はさらに、ｐＨ３．５で最終濃度が０．５Ｍまで固体メトキサミンを加え、さらに２時間３７℃でインキュベートすることを必要とする。分取ＨＰＬＣによる精製の前に、１０倍過剰なトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンを加える。ポリペプチド鎖を含む画分をＥＳＭＳにより同定し、プールし、凍結乾燥させる。
【００７１】
中間オリゴペプチドのライゲーションは、ｐＨ７．０で６Ｍ  ＧｕＨＣｌ中で行われる。各反応物の濃度は８ｍＭで、１％ベンジルメルカプタンおよび１％チオフェノールを加え、還元環境を作り、ライゲーション反応を促進する。略定量のライゲーション反応が３７℃で一夜攪拌した後に観察される。最終濃度が０．１ＭであるようにＣＨ３−Ｏ−ＮＨ２・ＨＣｌを粉末として加え、ヒドラジンを加え、Ｔｒｐ１２８のホルミル基を除去するのにｐＨをシフトさせる。１時間３７℃でインキュベートした後、ＣＨ３−Ｏ−ＮＨ２・ＨＣｌはさらに溶液に加え、最終濃度が０．５Ｍとなるようにする。その後、反応混合物を、ペプチドに対して１０倍過剰な量のトリス（２−カルボキシエチルホスフィン）で処理し、１５分後、ライゲーション生成物を、分取ＨＰＬＣ（Ｃ４、２０ないし６０％ＣＨ３ＣＮ、１分当たり０．５％）を使用して精製し、凍結乾燥させ、−２０℃で保存する。第２について同じ操作を繰り返す。
【００７２】
全長ペプチドを、還元凍結乾燥蛋白（約０．１ｍｇ／ｍＬ）を１Ｍ  ＧｕＨＣｌ、１００ｍＭトリス、１０ｍＭメチオニン、ｐＨ８．６に溶かすことで空気酸化させることによって再生する。一夜静かに攪拌した後、蛋白溶液を上記したようにＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。精製の後、全長ポリペプチドを、還元凍結乾燥蛋白（約０．１ｍｇ／ｍＬ）を１Ｍ  ＧｕＨＣｌ、１００ｍＭトリス、１０ｍＭメチオニン、ｐＨ８．６に溶かすことで空気酸化させることによって再生する。一夜静かに攪拌した後、蛋白溶液を上記したようにＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。
【００７３】
実施例２
ＦＧＦ２３ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体
雄のルイス系ラットを、ＦＧＦ２３ポリペプチド発現のＣＯＳ７細胞の半精製製剤で免疫化する。ラットは最初にフロイント完全アジュバント中のＦＧＦ２３ポリペプチド（約５０μｇ）で免疫化され、同量のフロイント不完全アジュバント中の物質で２回ブーストされる。試験血液を採取する。動物には、最後に２５μｇのブーストのリン酸バッファー食塩水溶液が与えられ、４日後、融合のための脾臓を得る。
【００７４】
約３ｘ１０８個のラット脾臓細胞を、同数のＰ３Ｘ６３ＡＧ８．６５３マウス骨髄腫細胞（受入れ番号ＣＲＬ１５８０でＡＴＣＣから入手可能）と融合させる。３８４０マイクロ滴定プレートウェルに、１ウェル当たり５．７ｘ１０４個の親骨髄腫細胞を播種する。例えば、Chretienら、J. Immunol. Meth.、第１１７巻、６７-８１頁（１９８９）に記載されるように、融合およびその後のハイブリッドの培養の標準的プロトコルを行う。融合から１２日後、上清を獲得し、ＦＧＦ２３ポリペプチドを産生するＣＯＳ７で被覆されたＰＶＣプレートを用いて間接ＥＬＩＳＡ法を行ってスクリーニングする。
【００７５】
本発明の上記した具体例の記載は、説明および記載を目的とするものである。これらは包括的であることを意図とするものではなく、本発明を開示されている形態そのものに限定することを意図とするものでもなく、上記した教示を考慮すれば、多くの修飾および変形が可能であることは明らかである。具体例は本発明の原則を説明するために選択し、記載したものであって、それにより当業者であれば、意図する特定の使用に適するように、種々の具体例において、あるいは種々の変形を行うことで、本発明を最大限利用することができる。本発明の範囲は添付した請求の範囲で定められることを意図するものである。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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