(57)【要約】本開示は、試料から溶出した生体分子の「カーボンコピー」を作製して、対象となる生体分子に対して特異的親和性を有する一つまたは複数の検出子分子（例えば抗体またはＤＮＡプローブ）を用いて、コピー上の生体分子を可視化することによって、組織切片または他の実質的に二次元の試料（例えば、電気泳動ゲルまたはｃＤＮＡマイクロアレイ）において生体分子を検出する装置、アレイ、キットおよび方法に関する。試料中の生体分子のパターンを同定するために特定の方法が提供される。細胞および／または組織、特にヒトの細胞および／または組織によって産生される生体分子を同定および分析するための他の特異的方法を提供する。本開示はまた、上記の方法によって用いるために異なるように調製および／または処理され、それによって生体分子の同定および分析を行うことができる複数のメンブレンを提供する。例えば、図１は、ウィック（２０）を用いて分子が組織切片（１１）から移動するメンブレンアレイ（１３）を示す。
2004518949.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、試料中の生体分子を検出する方法：
少なくとも２層のメンブレンの積み重ねを提供する段階；
積み重ねの多層のメンブレンの中を生体分子が移動可能であり、メンブレン上で生体分子の少なくとも一部が直接捕獲される条件下で、試料を積み重ねに適用する段階；および
一つまたは複数の多数のメンブレン上で生体分子を検出する段階。
【請求項２】
積み重ねが、それぞれ厚さ３０ミクロン未満の複数の多孔性基板を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
一つまたは複数の基板が、生体分子に対するメンブレンの親和性を増加させる材料を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
材料が一つまたは複数のメンブレンにコーティングされる、請求項３記載の方法。
【請求項５】
多孔性基板が、ポリカーボネート、酢酸セルロース、およびその混合物からなる群より選択される材料を含む、請求項２記載の方法。
【請求項６】
多孔性基板が、ポリカーボネート基板を含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
親和性を増加させる材料が、ニトロセルロース、ポリ−Ｌ−リジン、およびその混合物からなる群より選択される、請求項５記載の方法。
【請求項８】
親和性を増加させる材料が、生体分子特異的リガンドである、請求項５記載の方法。
【請求項９】
多孔性基板がポリカーボネート基板を含み、親和性を増加させる材料がニトロセルロースを含む、請求項５記載の方法。
【請求項１０】
試料が組織切片である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
生体分子を検出する段階が、一つまたは複数のメンブレンを積み重ねから分離する段階、および一つまたは複数の分離されたメンブレン上で生体分子を検出する段階を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
多数のメンブレンの中に生体分子を移動させる条件が、層状のメンブレンの中に移動液体を通過させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
一つまたは複数のメンブレンの中に生体分子を移動させる条件が、層状のメンブレンの積み重ねの中の所望の移動方向への生体分子の移動を促進するウィックを提供することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
層状のメンブレンの積み重ねが、５個またはそれ以上のメンブレンを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
層状のメンブレンの積み重ねが、２０個またはそれ以上のメンブレンを含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
層状のメンブレンの積み重ねが、５０個またはそれ以上のメンブレンを含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
試料が、核酸、蛋白質、脂質、糖質、またはその組み合わせもしくは混合物を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
試料が実質的に二次元の試料である、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
実質的に二次元の試料が、組織切片、組織マイクロアレイ、ＬＣＭ採取試料、「一次元」電気泳動ゲル、「二次元」電気泳動ゲル、構造的に変形した試料、またはその二つもしくはそれ以上の組み合わせからなる群より選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
一つまたは複数のメンブレン上で検出された生体分子を試料の生物学的特徴に相関させる段階をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
以下の段階を含む、生体試料の多数の実質的なコピーを作製する方法：
メンブレンによって、積み重ねに適用された生体分子が複数のメンブレンの中を移動することができ、その間に多数のメンブレン上で生体分子の少なくとも一部を直接捕獲する、層状のメンブレンの積み重ねを提供する段階；および
多数のメンブレンが試料から生体分子を直接捕獲することができ、生体試料の多数の実質的なコピーを作製可能な条件下で、生体試料を積み重ねに適用し、それによって生体試料の多数の実質的なコピーを作製する段階。
【請求項２２】
生体試料が、核酸、蛋白質、脂質、糖質、またはその組み合わせもしくは混合物を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
生体試料が、組織切片、組織マイクロアレイ、ＬＣＭ採取試料、「一次元」電気泳動ゲル、「二次元」電気泳動ゲル、構造的に変形した試料、またはその二つもしくはそれ以上の組み合わせからなる群より選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
多数の実質的なコピーの少なくとも一つの上で対象となる一つまたは複数の生体分子を検出する段階をさらに含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
対象となる生体試料を検出する段階が、複数の多数のメンブレンを少なくとも一つの検出子分子に曝露する段階を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２５】
生体試料が、層状のメンブレンの積み重ね上に配置される組織標本であって、組織標本からの生体分子が多数のメンブレンの中を移動する際に、組織標本からの生体分子が層状のメンブレンによって直接捕獲される、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
対象となる生体分子を検出する前に多数のメンブレンを分離する段階をさらに含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
積み重ねに適用された生体分子そのものが、分析される生体標本に曝露される検出子を含み、生体標本を検出子によって分析可能な条件下で、多数のメンブレンの一つまたは複数を生体標本に曝露する段階をさらに含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
多数のメンブレン上の対象となる少なくとも一つの生体分子が核酸分子であって、対象となる生体分子を検出する段階が、メンブレン上の核酸分子と、生体標本における核酸分子とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、分析される生体標本に、多数のメンブレン上の核酸分子を曝露する段階を含む、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
以下の段階を含む、一組のマイクロアレイコピーを作製する方法：
層状のメンブレンの積み重ねを提供する段階；および
層状のメンブレンの積み重ねが、複数の基板中をプローブまたは核酸が移動して、プローブまたは抗体の一部が一つまたは複数の基板によって直接捕獲される複数の基板を含む、複数のＤＮＡプローブ、抗体、またはその組み合わせを層状のメンブレンの積み重ねに適用する段階。
【請求項３０】
基板のそれぞれの対応する位置において、複数のＤＮＡプローブ、抗体、またはその組み合わせを有する対応する基板を提供するために基板を分離する段階をさらに含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
複数のＤＮＡプローブ、抗体、またはその組み合わせを適用する段階が、それぞれ異なるＤＮＡプローブまたは抗体を含む複数のウェルを有するプレートから積み重ねに適用され、ＤＮＡプローブまたは抗体が、実質的に複製物のマイクロアレイの組を作製するように、ウェルから積み重ねに移動する、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
以下の段階を含む、組織試料中の生体分子を分析する方法：
少なくとも一つのメンブレンを提供する段階；
少なくとも一つのメンブレンを組織試料に接して配置する段階；
組織試料に熱および／または圧力を適用し、それによって生体分子が組織試料から少なくとも一つのメンブレン上に移動する段階；および
少なくとも一つのメンブレン上で生体分子を分析する段階。
【請求項３３】
組織試料が、保管された組織試料、凍結保存された組織試料、新鮮な組織試料、ＬＣＭ採取組織試料、または組織マイクロアレイである、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
複数のメンブレンを提供する段階を含み、および二つまたはそれ以上の複数のメンブレン上で生体分子を分析する段階をさらに含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
メンブレンが、コア基板およびコーティングを含む、厚さ３０ミクロン以下の多孔性のメンブレンである、請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
コア基板がポリカーボネートを含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
コーティングがニトロセルロースを含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
以下の段階を含む、組織マイクロアレイの生体分子内容物を複製する方法：
組織マイクロアレイを提供する段階；および
組織マイクロアレイの生体分子内容物の少なくとも一つの複製物を作製するために、生体分子を組織マイクロアレイから複数のメンブレン上に移動させる段階。
【請求項３９】
生体分子を移動させる段階が以下の段階を含む、請求項３８記載の方法：
複数のメンブレンを組織マイクロアレイに接して配置する段階；および
組織マイクロアレイに熱および／または圧力を適用し、それによって生体分子が、組織マイクロアレイから複数のメンブレンの少なくとも一つのメンブレン上に移動する段階。
【請求項４０】
以下の段階を含む、ＬＣＭ転写フィルムに抱埋された細胞材料を分析する方法：
一つまたは複数のメンブレンを提供する段階；
一つまたは複数のメンブレンをＬＣＭ転写フィルムに隣接して配置する段階；
生体分子を細胞材料から一つまたは複数のメンブレンに移動させる段階；および
メンブレン上の生体分子を検出する段階。
【請求項４１】
生体分子を移動させる段階が以下の段階を含む、請求項４０記載の方法：
メンブレンおよび／またはＬＣＭ転写フィルムに熱および／または圧力を適用し、それによって、生体分子がＬＣＭ転写フィルムから一つまたは複数のメンブレン上に移動する段階。
【請求項４２】
以下の段階を含む、生体試料のプロテオームを分析する方法：
生体試料中に存在するもう一つの蛋白質から少なくとも一つの蛋白質を分離する段階；
分離した蛋白質の一部を積み重ねた形状の複数のメンブレンに移動させる段階；
分離した蛋白質と、そのような蛋白質に結合することができるリガンドとを結合させるために十分な条件下で、メンブレンのそれぞれを、一つまたは複数の種の既定のリガンド分子の存在下でインキュベートする段階；および
蛋白質と任意の種の既定のリガンド分子との結合の発生を決定することによってプロテオームを分析する段階。
【請求項４３】
試料中に存在する他の蛋白質から少なくとも一つの蛋白質を分離する段階が電気泳動を含む、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
電気泳動が二次元電気泳動である、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
試料が哺乳類細胞または組織から得られる、請求項４２記載の方法。
【請求項４６】
哺乳類がヒトである、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
分離された蛋白質の一部を移動する段階がゲル移動を含む、請求項４２記載の方法。
【請求項４８】
分離された蛋白質の一部を移動する段階が、接触移動を含む、請求項４２記載の方法。
【請求項４９】
哺乳類細胞または組織がヒト細胞または組織である、請求項４２記載の方法。
【請求項５０】
分離された蛋白質が、ヒト遺伝子の産物である、請求項４２記載の方法。
【請求項５１】
少なくとも一つの種のリガンドが、抗体、抗体断片、一本鎖抗体、受容体蛋白質、可溶化受容体誘導体、受容体リガンド、金属イオン、ウイルス、ウイルス蛋白質、酵素基質、毒素、毒素候補、薬物、および薬物候補からなる群より選択される、請求項４２記載の方法。
【請求項５２】
少なくとも一つの種のリガンドが、抗体または抗体断片である、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
少なくとも一つの種のリガンドが、受容体蛋白質、可溶化受容体誘導体、または受容体リガンドである、請求項５１記載の方法。
【請求項５４】
少なくとも一つの種のリガンドが、薬物または薬物候補である、請求項５１記載の方法。
【請求項５５】
少なくとも一つの種のリガンドの結合が、分離された蛋白質の構造に依存する、請求項５１記載の方法。
【請求項５６】
少なくとも一つの種のリガンドの結合が、分離された蛋白質の生物学的機能に依存する、請求項５１記載の方法。
【請求項５７】
少なくとも一つのメンブレンが一つより多くの種のリガンドと共にインキュベートされる、請求項４２記載の方法。
【請求項５８】
複数のメンブレンが少なくとも二つのメンブレンを含む、請求項４２記載の方法。
【請求項５９】
複数のメンブレンが少なくとも１０個のメンブレンを含む、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
複数のメンブレンが少なくとも２０個のメンブレンを含む、請求項５８記載の方法。
【請求項６１】
一つまたは複数のリガンド種が少なくとも二つのリガンド種を含む、請求項４２記載の方法。
【請求項６２】
一つまたは複数のリガンド種が少なくとも１０個のリガンド種を含む、請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
一つまたは複数のリガンド種が少なくとも２０個のリガンド種を含む、請求項６１記載の方法。
【請求項６４】
メンブレンのそれぞれをインキュベートする段階が、少なくとも一つの蛋白質を分離する前に行われる、請求項４２記載の方法。
【請求項６５】
以下の段階を含む、生体試料中に存在する場合に、所望の既定の蛋白質を独自に可視化する方法；
試料中に存在する蛋白質を互いに分離する段階；
試料の分離した蛋白質の一部を、積み重ねた形状の複数のメンブレンに移動させる段階；
所望の既定の蛋白質と、そのような蛋白質に結合可能なリガンドとを結合させるために十分な条件下で、一つまたは複数の種の既定のリガンド分子の存在下で、メンブレンのそれぞれをインキュベートする段階；および
蛋白質と任意の種の既定のリガンド分子との任意の結合を可視化する段階。
【請求項６６】
以下の段階を含む、固相支持体上で分離された生体分子を同定する方法：
分離された生体分子を含む固相支持体にメンブレンの積み重ねを接触させる段階；
生体分子を固相支持体から積み重ねの多数のメンブレンに移動させる段階；
積み重ねからメンブレンを分離する段階；および
少なくとも一つのメンブレンに移動した一つまたは複数の生体分子を同定する段階。
【請求項６７】
蛋白質を同定する方法であって、生体分子が蛋白質を含む、請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
メンブレンが、少なくとも一つのクラスの生体分子に対して高親和性を有するが、低い保持能を有する、請求項６６記載の方法。
【請求項６９】
メンブレンが、蛋白質に対して高親和性を有するが、低い保持能を有する、請求項６７記載の方法。
【請求項７０】
少なくともいくつかの生体分子が積み重ねのそれぞれのメンブレンに移動する、請求項６６記載の方法。
【請求項７１】
生体分子を支持体から積み重ねの多数のメンブレンに移動させる段階によって、多数の複製メンブレンが作製される、請求項６６記載の方法。
【請求項７２】
生体分子がゲル上で分離される、請求項６６記載の方法。
【請求項７３】
分離が電気泳動を含む、請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
電気泳動がＳＤＳ ＰＡＧＥである、請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
３０マイクログラムより多くの蛋白質がゲルのウェルにローディングされる、請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
約５０〜約１００マイクログラムの蛋白質がゲルのウェルにローディングされる、請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
メンブレンがポリカーボネートを含む、請求項６９記載の方法。
【請求項７８】
メンブレンがセルロース誘導体を含む、請求項６９記載の方法。
【請求項７９】
セルロース誘導体が酢酸セルロースである、請求項７８記載の方法。
【請求項８０】
メンブレンがポリオレフィンを含む、請求項６６記載の方法。
【請求項８１】
積み重ねが少なくとも５個のメンブレンを含む、請求項６６記載の方法。
【請求項８２】
積み重ねが少なくとも１０個のメンブレンを含む、請求項８１記載の方法。
【請求項８３】
それぞれのメンブレンの厚さが約３０ミクロン未満である、請求項６６記載の方法。
【請求項８４】
それぞれのメンブレンの厚さが約８〜１０ミクロンである、請求項８３記載の方法。
【請求項８５】
メンブレンの少なくとも片面が、蛋白質の特異的結合を増加させるように処置される、請求項６９記載の方法。
【請求項８６】
メンブレンの少なくとも片面が、蛋白質または他の標的蛋白質の特異的結合を増加させるように処置される、請求項８５記載の方法。
【請求項８７】
処置がニトロセルロースのコーティングを含む、請求項８５記載の方法。
【請求項８８】
処置がポリ−Ｌ−リジンのコーティングを含む、請求項８５記載の方法。
【請求項８９】
メンブレンがメンブレンの周囲に取り付けられているフレーム中に存在し、該フレームがメンブレンと隣接するメンブレンの中間の空間から液体または空気を通過させるためのチャンネルを定める、請求項６６記載の方法。
【請求項９０】
以下の段階を含む、固相支持体上で分離された生体分子を同定する方法：
支持体が上面と下面とを有する、分離された生体分子を含む固相支持体を提供する段階；
メンブレンの第一の積み重ねを上面に、メンブレンの第二の積み重ねを下面に適用する段階；
生体分子を支持体から第一および第二のメンブレンの積み重ねに移動させる段階；
メンブレンを分離する段階；ならびに
少なくとも一つのメンブレンに移動した一つまたは複数の生体分子を同定する段階。
【請求項９１】
生体分子が蛋白質を含む、請求項９０記載の方法。
【請求項９２】
以下を含むキット：
複数のメンブレンを含むアレイであって、複数のメンブレンのそれぞれが生体分子に対して実質的に同じ親和性を有する、試料中の生体分子を検出するためのメンブレンアレイ；および
それぞれのメンブレン上で捕獲された生体分子を検出するための検出子分子の容器。
【請求項９３】
検出子分子が抗体またはプローブである、請求項９２記載のキット。
【請求項９４】
メンブレンが、生体分子に対する基板の親和性を増加させる材料でコーティングされたポリマー基板を含む、請求項９２記載のキット。
【請求項９５】
コーティング材料がニトロセルロースを含む、請求項９４記載のキット。
【請求項９６】
抗体またはプローブが、アレイの特定のメンブレン上で検出を試みる生体分子に対する特異的捕獲分子である、請求項９３記載のキット。
【請求項９７】
それぞれの容器が抗体カクテルを含み、それぞれの抗体カクテルが、異なる結合特異性を有する少なくとも二つの抗体を含む、請求項９６記載のキット。
【請求項９８】
複数のメンブレンが生体分子に対して低い保持能を有する、請求項９２記載のキット。
【請求項９９】
複数のメンブレンの厚さがそれぞれ約３０ミクロン未満である、請求項９２記載のキット。
【請求項１００】
複数のメンブレンが、ポリカーボネートを含むコア基板およびニトロセルロースを含むコーティングを含む、請求項９９記載のキット。
【請求項１０１】
組織試料の分子プロフィールを比較するためのキットであって、
少なくとも一つの組織マイクロアレイ；および
組織マイクロアレイの少なくとも一つの複製物
を含むキット。
【請求項１０２】
組織マイクロアレイの少なくとも一つの複製物が、請求項３８記載の方法を用いて作製される、請求項１０１記載のキット。
【請求項１０３】
組織試料から生体分子のパターンを複製するためのキットであって、
それぞれが標的生体分子の特異的結合を増加させるためにその上面および／または下面にコーティングを有する複数のメンブレン；
一定量の移動緩衝液；および
液体不浸透性の封入物
を含むキット。
【請求項１０４】
請求項３２記載の方法を行うための説明書をさらに含む、請求項１０３記載のキット。
【請求項１０５】
プロテオームを分析するためのキットであって、
それぞれが少なくとも一つの蛋白質に対して親和性を有する複数のメンブレン；および
それぞれがメンブレンに結合した一つまたは複数の特異的蛋白質を検出するように適合された複数の試薬種
を含むキット。
【請求項１０６】
それぞれのメンブレンに適用される特定の群の試薬を示す説明書をさらに含む、請求項１０５記載のキット。
【請求項１０７】
メンブレンが、厚さが約３０ミクロン未満である多孔性の基板を含む、請求項１０４記載のキット。
【請求項１０８】
メンブレンが、生体分子に対するメンブレンの親和性を増加させる材料でコーティングされたポリカーボネートメンブレンである、請求項１０７記載のキット。
【請求項１０９】
メンブレンが、ニトロセルロースによってコーティングされる、請求項１０８記載のキット。
【請求項１１０】
試薬種が、抗体、抗体断片、一本鎖抗体、受容体蛋白質、可溶化受容体誘導体、受容体リガンド、金属イオン、ウイルス、ウイルス蛋白質、酵素基質、毒素、毒素候補、薬物、および薬物候補からなる群より選択される、請求項１０５記載のキット。
【請求項１１１】
生体試料中に存在する場合に、所望の既定の蛋白質を独自に可視化するためのキットであって、
それぞれが、少なくとも一つの蛋白質に対して特異的親和性を有する複数のメンブレン；および
メンブレンに結合する場合に、それぞれが所望の既定の蛋白質を検出するように適合された、複数の試薬種
を含むキット。
【請求項１１２】
ブロッティングのためのメンブレン単位であって、
厚さが約３０ミクロン以下である少なくとも二つの多孔性のメンブレンの積み重ね；および
厚さが約３００ミクロン以下である、メンブレンに取り付けられたフレーム
を含むメンブレン単位。
【請求項１１３】
単位が二つ以上のメンブレンを含む、請求項１１２記載のメンブレン単位。
【請求項１１４】
単位がメンブレンの周囲に取り付けられたフレームを含み、該フレームがメンブレンと隣接するメンブレンとの中間の空間から液体または空気を通過させるためのチャンネルを定める、請求項１１２記載のメンブレン単位。
【請求項１１５】
メンブレンが、蛋白質に対して高親和性を有するが低い保持能を有する、請求項１１２記載のメンブレン単位。
【請求項１１６】
メンブレンがポリカーボネートを含む、請求項１１５記載のメンブレン単位。
【請求項１１７】
メンブレンがセルロース誘導体を含む、請求項１１５記載のメンブレン単位。
【請求項１１８】
セルロース誘導体が酢酸セルロースである、請求項１１７記載のメンブレン単位。
【請求項１１９】
メンブレンがポリオレフィンを含む、請求項１１５記載のメンブレン単位。
【請求項１２０】
積み重ねが少なくとも５個のメンブレンを含む、請求項１１２記載のメンブレン単位。
【請求項１２１】
積み重ねが少なくとも１０個のメンブレンを含む、請求項１２０記載のメンブレン単位。
【請求項１２２】
メンブレンの厚さが約３０ミクロン未満である、請求項１１２記載のメンブレン単位。
【請求項１２３】
メンブレンの厚さが約８〜１０ミクロンである、請求項１２２記載のメンブレン単位。
【請求項１２４】
メンブレンの少なくとも片面が、生体分子の特異的結合を増加させるように処置される、請求項１１２記載のメンブレン単位。
【請求項１２５】
メンブレンの少なくとも片面が、蛋白質または他の標的蛋白質の特異的結合を増加させるように処置される、請求項１１５記載のメンブレン単位。
【請求項１２６】
処置がニトロセルロースのコーティングを含む、請求項１２５記載のメンブレン単位。
【請求項１２７】
処置がポリ−Ｌ−リジンのコーティングを含む、請求項１１５記載のメンブレン単位。
【請求項１２８】
請求項１１２記載のメンブレン単位において用いられるメンブレン。
【請求項１２９】
メンブレンの少なくとも片面が、標的生体分子の特異的結合を増加させるように処置される、請求項１２８記載のメンブレン。
【請求項１３０】
コア基板およびコーティングを含む、生体分子に対して高親和性を有するが低保持能を有する多孔性メンブレンであって、厚さが約３０ミクロン以下のメンブレン。
【請求項１３１】
コア基板が、ポリカーボネート、酢酸セルロース、ポリオレフィン、またはその二つもしくはそれ以上の組み合わせを含む、請求項１３０記載のメンブレン。
【請求項１３２】
コーティングが、ニトロセルロース、ポリ−Ｌ−リジン、またはその混合物を含む、請求項１３０記載のメンブレン。
【請求項１３３】
コア基板がポリカーボネートを含み、コーティングがニトロセルロースを含む、請求項１３０記載のメンブレン。
【請求項１３４】
メンブレンの厚さが約８〜１０ミクロンである、請求項１３０記載のメンブレン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、２０００年７月２６日に提出された米国特許出願番号第００／２０３５４号の一部継続出願（ＣＩＰ）であって、英語で公表され、米国特許仮出願第６０／１４５，６１３号（１９９９年７月２６日提出）の恩典を主張する米国特許出願第０９／７１８，９９０号（２０００年１１月２０日提出）のＣＩＰである、米国特許出願第０９／７５３，５７４号（２００１年１月４日提出）の一部継続出願である。本出願はさらに、米国特許仮出願第６０／２８６，２５８号（２００１年４月２５日提出）、第６０／３０４，０３１号（２００１年７月９日提出）、および第６０／２９６，４７５号（２００１年６月８日提出）の恩典を主張する。これらの関連出願はそれぞれ、その全文が参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府の権利に関する声明
本発明者の少なくとも１人は、米国政府当局者であり、政府は本発明に一定の権利を有する可能性がある。
【０００３】
開示の分野
本開示は、生体試料のような試料において多数の生体分子を同定および分析するための方法、装置、アレイ、およびキットに向けられる。本開示はさらに、疾患における生体分子の機能および役割を決定するために役立つようにこれらの方法、装置、アレイ、およびキットを用いること、ならびに生体分子の組み合わせの存在、非存在、または量と、特定の疾患、予後、または治療に対する反応とを相関させることに関する。
【０００４】
開示の背景
現在では、ヒトゲノムを構成する５０，０００個ほどの遺伝子がシークエンシングされているが、特に疾患におけるそれらの機能および役割を確認するために、それらの遺伝子がいつ、そしてどのようなタイプの組織において活性であるかを決定するためのツールが必要である。この取り組みはしばしば、「機能的ゲノム学」および「プロテオミクス」と呼ばれ、新しい薬剤が特定の酵素、受容体、および他の蛋白質を標的とするようにデザインされることから、新薬を発見するための取り組みにおいて特に重要である。最終的にプロテオミクスの情報は、「個人に合わせた医学」の新しい時代において治療選択の指標として役立てるために臨床診断において用いられるであろう。
【０００５】
１００，０００個のヒト遺伝子は、翻訳後およびその他の改変のために１００万個までの異なる蛋白質変種を生成することが判明する可能性があると考えている人がいる。今後１０年間に、製薬工業は蛋白質を最大１０，０００個同定すると予想され、それに対してヒトの治療を向けることができる。さらなる治療薬、遺伝子改変剤、発現改変剤、および貴重な生体分子も同様に、プロテオミクスをヒト以外の動物および植物の分析に広げることによって開発または同定されると予想される。
【０００６】
ヒトには最大で１００万個もの異なる蛋白質変種が存在する可能性があるが、如何なる特定の細胞タイプにおいても発現されているのは、蛋白質のほんの約１０，０００〜１５，０００個に過ぎない。このように、例えば、肝細胞は同じ個体から採取した皮膚細胞と本質的に同じゲノムを有するが、２つの細胞集団は実質的に異なる組の蛋白質を発現する。したがって、薬剤の標的を同定するために、異なる細胞集団（例えば、疾患および正常組織；胎児および成熟組織；ヒトおよびヒト以外の組織等）における蛋白質（すなわち、細胞の「プロテオーム」）のパターンのプロフィールを調べ、比較することが望ましい。
【０００７】
遺伝子の活性と疾患との関連を確立または確認するための一つの一般的なアプローチは、発現分析である。ＤＮＡマイクロアレイは、様々な疾患を示す組織の試料から採取した抽出物から何千もの遺伝子の異なる発現パターンを調べるために用いられる。特定の遺伝子が、疾患組織において発現されるが正常組織において発現されなければ、それらは診断マーカーとして、そして薬学的介入の標的として適切であるかも知れない。このアプローチの一つの短所は、調べる試料がそれが単離された組織から分離されており、それによって遺伝子が活性である組織の状況において遺伝子発現パターンを観察することができない点である。形態学的関係はマイクロアレイ分析では保存されないため、試料のどの成分が遺伝子発現において認められる変化に関与するかを知ることは難しい。同様に、マイクロアレイ分析は通常、ホモジナイズした組織試料について行われ、そのため発現を特定の細胞は言うまでもなく特定の細胞タイプに帰することは、実質的に不可能である。
【０００８】
蛋白質のインサイチュー検出および可視化は、これまで免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いて行われてきた。この技術は、薄い組織切片をスライドガラスに載せること、および標的蛋白質に対して特異的な結合親和性を有する検出可能な抗体によって対象となる蛋白質を可視化することを含む。ＩＨＣの特定の技術的制限のために、１つの組織切片から得ることができるのは、蛋白質ほんの１個または２個に過ぎない。同様に、蛋白質はなおも組織に抱埋しており、最も適当な（蛋白質があまり変性されない）方法でも抗体に提示されず、抗体反応性の成功率を低下させる。
【０００９】
組織試料から採取した蛋白質および核酸を同定および測定する最も広く用いられている方法は、ゲル電気泳動である。電気泳動は一般的に、適用した電場の影響下で、混合物中の分子を分離または分解する技術を意味する。分離は、（通常）分子の大きさおよび／または荷電の差に基づく。電気泳動によって分離された分子はしばしば、クーマシーブルー（蛋白質の場合）またはエチジウムブロマイド（核酸の場合）のような非特異的な色素による染色によって可視化される。そのような色素染色は、個々の分子を特異的に同定するわけではない。さらに、広布の色素染色は一般的にあまり感度がよくない。
【００１０】
蛋白質に関する抗体に基づく検出のようなより感度のよい検出法が存在する。特に、「ウェスタンブロッティング」としても知られるイムノブロッティングは、しばしば、ゲル上で分離した蛋白質を検出するために用いられる。この技術は、広布の染色の代わりに、対象となる蛋白質に対して特異的な検出可能な抗体を利用する。この技術の重要な限界はその処理量が低いことである；バンドパターンが重なり合うため、そして試料中の異なる蛋白質との抗体の交叉反応性のために、単一のブロット上でイムノブロットの１本のレーンからせいぜい一握りの蛋白質が同定できるに過ぎない。このように、イムノブロッティングは典型的に、特異性を確保するためにメンブレン１枚あたり一つのみの抗体を用いて行われる。
【００１１】
イムノブロットを剥がして再度プロービングすることは可能であるが、剥がせばメンブレンに結合している試料の蛋白質が除去され、このため試料の定量的分析が妨害される。その上、そのような処置によってメンブレンから除去されたそれぞれの個々の蛋白質の比率は、蛋白質の特性に応じて変化し、試料に当初存在する蛋白質の相対量を定量しようとする試みはさらに曖昧となる。多数の抗原を単一の試験試料から同時に検出できるようにするブロッティング技術を開発することが明らかに必要である。
【００１２】
比較的安価で、通常の研究者が用いることができ、そしてそれによって生成されたデータの捕獲、構築、および分析を容易に行うことができる多数のバイオマーカーを検出、同定、および比較するための高処理能アプローチを有することが望ましいであろう。
【００１３】
開示の概要
本開示は、試料から溶出した生体分子の実質的なコピーを作製することによって、実質的に二次元の試料（例えば、組織切片、組織アレイ、電気泳動ゲル等）において生体分子を検出する装置および方法に向けられる。次に、生体分子は検出子、例えば対象となる生体分子に対して特異的親和性を有する抗体またはＤＮＡプローブを用いてコピー上で可視化することができる。
【００１４】
本開示は、組織試料において発現された生体分子（例えば、蛋白質および核酸）のパターンを同定するための、ならびに発現パターンを例えば様々な疾患、予後、または治療に対する反応に相関させるための方法および装置にさらに向けられる。
【００１５】
本明細書において、試料中の生体分子を検出する方法を提供し、方法は、少なくとも２層のメンブレンの積み重ねを提供する段階；積み重ねにおける多層のメンブレンの中を生体分子が移動することができ、生体分子の少なくとも一部をメンブレン上に捕獲可能な条件下で、試料を積み重ねに適用する段階；および一つまたは複数の多数のメンブレン上で生体分子を検出する段階を含む。そのような方法の特定の例において、生体分子はメンブレンによって直接捕獲される。そのような方法において用いられる特定のメンブレンは、生体分子、例えば蛋白質、核酸、脂質、糖質、またはその組み合わせに対して高い親和性を有するが低い保持能を有する。
【００１６】
本開示のもう一つの態様は、生体試料の多数の実質的なコピー（同一である必要はない）を作製する方法である。これらの方法は、メンブレンが多数のメンブレン上で生体分子の少なくとも一部を捕獲（例えば、直接）しながら、積み重ねに適用された生体分子が複数のメンブレンの中を通って移動することができる、層状のメンブレンの積み重ねを提供する段階、および多数のメンブレンが試料から生体分子の少なくとも一部を捕獲可能な条件下で、生体試料を積み重ねに適用する段階を含む。これによって、生体試料の多数の実質的なコピーが形成される。
【００１７】
提供された方法の例において用いられる試料は、実質的に二次元である、または（二次元に作製することができる）；代表的な非制限的なタイプの試料には、組織切片、組織マイクロアレイ、組織マクロアレイ、レーザー捕獲法による顕微解剖組織試料、および電気泳動ゲル（例えば、一次元または二次元電気泳動ゲル）が含まれる。
【００１８】
なおさらなる態様は、一組のマイクロアレイコピーを作製する方法であり、方法は層状のメンブレンの積み重ねを提供する段階、および複数の分子（例えば、ＤＮＡプローブ、抗体、またはその組み合わせ）を層状のメンブレンの積み重ねに適用する段階を含む。そのような方法の例において、層状のメンブレンの積み重ねには、その中を分子が移動する、そしてその中で分子の一部が一つまたは複数の基板によって直接捕獲される、複数の基板が含まれる。
【００１９】
もう一つの特定の態様は、組織試料において生体分子を分析する方法であり、方法は、少なくとも一つのメンブレン（いくつかの態様において、複数のメンブレン）を提供する段階、少なくとも一つ（または複数）を組織試料に接して配置する段階、および組織試料に熱および／または圧力を適用する段階を含み、これによって、生体分子は、組織試料から少なくとも一つのメンブレン上に移動する（一般的に接触移動と呼ばれる）。次に、一つまたは複数の生体分子を、少なくとも一つのメンブレン上で分析することができる。
【００２０】
提供した方法のもう一つの例は、組織アレイ（マイクロまたはマクロアレイのような）の生体分子内容物を複製する方法であり、方法は、組織アレイを提供する段階、および組織アレイの生体分子内容物の少なくとも一つの複製物を生成するために、生体分子を組織アレイから複数のメンブレン上に移動させる段階を含む。
【００２１】
本開示はまた、ＬＣＭ転写フィルム上に抱埋された細胞材料を分析する方法を提供し、方法は、一つまたは複数のメンブレンを提供する段階、一つまたは複数のメンブレンをＬＣＭ転写フィルムに隣接して配置する段階、生体分子を細胞材料から一つまたは複数のメンブレンに移動させる段階、およびメンブレン上の生体分子を検出する段階を含む。
【００２２】
さらに含まれる方法には、生体試料のプロテオームを分析する方法が含まれる。そのような方法の例は、少なくとも一つの蛋白質を生体試料中に存在するもう一つの蛋白質から分離する段階、分離した蛋白質の一部が積み重なった形状の複数のメンブレンに移動させる段階、分離した蛋白質とそのような蛋白質に結合可能なリガンド／検出子とを結合させるために十分な条件下で、一つまたは複数の異なる種の既定のリガンド分子（または検出子分子）の存在下でメンブレンのそれぞれをインキュベートする段階；および蛋白質と任意の種の既定のリガンド分子との結合の発生を決定することによってプロテオームを分析する段階を含む。
【００２３】
もう一つの態様は、固相支持体（例えば、一次元または二次元ゲル）上で分離された生体分子を同定する方法である。そのような方法は、支持体が上面と下面とを有する、分離された生体分子を含む固相支持体を提供する段階、第一のメンブレンの積み重ねを上面に適用し、第二のメンブレンの積み重ねを下面に適用する段階、生体分子を支持体から第一および第二のメンブレンの積み重ねに移動させる段階、ならびにメンブレンを分離する段階を含む。次に、移動した生体分子は、少なくとも一つのメンブレン上で検出、同定、またはそうでなければ分析することができる。
【００２４】
本開示はまたキットを提供する。キットの例には、試料中の生体分子を検出するためのメンブレンアレイ、およびアレイのメンブレン上に捕獲された分子を検出する検出分子の一つまたは複数の容器が含まれる。そのようなキットに含まれるアレイは複数のメンブレンを含み、そのそれぞれは、キットを用いて分析してもよい生体分子に対して実質的に同じ親和性を有する。
【００２５】
もう一つのキットの態様は、組織試料の分子プロフィールを比較するためのキットである。そのようなキットは少なくとも一つの組織マイクロアレイと、組織マイクロアレイの少なくとも一つの複製物を含む。そのようなキットに含まれる複製物は、例えば、本明細書に記載の方法を用いて作製してもよい。
【００２６】
それぞれが、標的生体分子の特異的結合を増加させるためのその上面および／または下面のコーティング、一定量の移動緩衝液、ならびに液体不浸透性の封入体（例えば、熱密封可能なバッグ）を有する複数のメンブレンを含み、組織試料から生体分子のパターンを複製するためのキットも同様に提供される。
【００２７】
記述のキットのもう一つの例は、プロテオームを分析するためのキットであり、キットは、それぞれが少なくとも一つの蛋白質に対して親和性を有する複数のメンブレン、それぞれの種がメンブレンに結合した一つまたは複数の特異的蛋白質を検出するように適合された複数の試薬種（検出子分子、特に標識検出子）を含む。
【００２８】
さらなる態様はブロッティングにおいて用いられるメンブレンユニットであり、ユニットは、少なくとも２つの多孔性のメンブレンの積み重ね（その例は、厚さ約３０ミクロンを超えない）と、メンブレンに取り付けられた厚さが約３００ミクロンを超えないフレームとを含む。
【００２９】
同様に、生体分子に対して高い親和性を有するが低い保持能を有する多孔性のメンブレンが提供される。そのようなメンブレンの例には、コア基板とコーティングとが含まれ、一般的に厚さは約３０ミクロン以下である。そのようなメンブレンの特定の例は、コア基板にポリカーボネート、そしてコーティングにニトロセルロースを含む。
【００３０】
上記および他の長所および特徴は本明細書下文において明らかとなり、以下の開示の詳細な説明、添付の特許請求の範囲、および図面に説明したいくつかの図を参照することによってより明らかに理解されるであろう。
【００３１】
配列表の簡単な説明
配列番号：１は、４３残基の合成ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドの核酸配列を示す。
【００３２】
開示の詳細な説明
１．特定の用語に関する説明
「位置特定可能」とは、アレイまたはゲル上での位置特定可能な位置として信頼性があり、一貫して位置を示し、同定することができることを意味する。
【００３３】
「親和性」とは、分子間の化学的誘引または力を意味する。
【００３４】
「抗体カクテル」は、２〜約１００個の異なる検出子抗体の混合物を意味する。
【００３５】
「アレイ」は２つまたはそれ以上を意味する。
【００３６】
「生体試料」とは、生きている生物（微生物、植物、動物、およびヒトを含む）から得られる、排泄される、または分泌される如何なる固体または液体試料も意味する。
【００３７】
「生体分子」は、ペプチド、蛋白質、糖蛋白質、核酸、脂肪酸、および糖質を含む生きている生物によって典型的に産生される分子である。
【００３８】
「保持能」とは、試料から生体分子を受領、保持、または吸収する能力を意味する。
【００３９】
「捕獲者」とは、メンブレンに固定され、生体分子の一つに対して親和性（特異的親和性のような）を有する抗体またはＤＮＡプローブのような分子を意味する。生体分子はメンブレンに直接結合していない。
【００４０】
「ｃＤＮＡ」は、内部の非コードセグメント（イントロン）および転写を決定する調節配列が欠如するＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、研究所において細胞から抽出したメッセンジャーＲＮＡからの逆転写によって合成してもよい。
【００４１】
「対比リガンド染色」とは、生体試料の蛋白質に結合していないリガンドの存在を検出して、これにより、生体試料の蛋白質に結合したリガンドの存在を明らかにする（例えば、染色が存在しないことによって、等）如何なる検出技術も意味すると解釈される。
【００４２】
「検出子」とは、溶液中で遊離して存在し（すなわち、メンブレンに固定されていない）、試料成分の一つに対して親和性を有する抗体またはＤＮＡプローブのような分子を意味する。
【００４３】
「直接捕獲」とは、捕獲抗体等の助けを借りないメンブレンの表面上への生体分子の直接的な接合または結合を意味する。
【００４４】
「ＤＮＡ」とは、ほとんどの生きている生物の遺伝材料を含む長鎖ポリマーである（いくつかのウイルスの遺伝子はリボ核酸（ＲＮＡ）で構成される）。ＤＮＡポリマーにおける複製単位は４つの異なるヌクレオチドであり、そのそれぞれが、それに対して燐酸基が結合しているデオキシリボース糖に結合した４つの塩基（アデニン、グアニン、シトシン、およびチミン）の一つを含む。ヌクレオチドトリプレット（コドンと呼ばれる）は、ポリペプチドにおけるそれぞれのアミノ酸、または終了シグナルをコードする。「コドン」という用語はまた、その中にＤＮＡ配列が転写されるｍＲＮＡにおける３つのヌクレオチドの対応する（そして相補的な）配列に関しても用いられる。
【００４５】
「ＥＳＴ」（発現配列タグ）は、そのライブラリにおいて認められる遺伝子のｍＲＮＡに対応する、選択された細胞、細胞タイプ、組織、または組織タイプ、臓器、または生物から調製されたゲノムまたはｃＤＮＡライブラリから得られる、典型的に５００〜２０００個の連続ヌクレオチドの部分的ＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列である。ＥＳＴは一般的に、それが得られるｃＤＮＡからシークエンシングされ、それが得られるｃＤＮＡより短いＤＮＡ分子である。
【００４６】
「蛍光体」とは、特定の波長の光への曝露によって励起されると、例えば異なる波長で光（すなわち蛍光）を放射する化学化合物を意味する。蛍光体は、その放出プロフィール、または「色」に関して記述することができる。緑色蛍光体、例えばＣｙ３、ＦＩＴＣ、およびオレゴングリーンは、一般的に波長５１５〜５４０λの範囲での放射を特徴とする。赤色蛍光体、例えばテキサスレッド、Ｃｙ５、およびテトラメチルローダミンは、一般的に波長５９０〜６９０λの範囲での放射を特徴とする。
【００４７】
用いてもよい蛍光体の例は、ナザレンコ（Ｎａｚａｒｅｎｋｏ）らの米国特許第５，８６６，３６６号に提供され、それらには例えば：４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、アクリジンならびにアクリジンおよびアクリジンイソチオシアネートのような誘導体、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタリミド−３，５−ジスルホネート（ルシファーイエローＶＳ）、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、ブリリアントイエロー、クマリンおよびクマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクルアリン（７−ａｍｉｎｏ−４−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｃｏｕｌｕａｒｉｎ）（クマラン１５１）のような誘導体；シアノシン；４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’，５”−ジブロモピロガロール−スルホネフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミン五酢酸；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオジンならびにエオジンおよびエオジンイソチオシアネートのような誘導体、エリスロシンならびにエリスロシンＢおよびエリスロシンイソチオシアネートのような誘導体；エチジウム、フルオレセインならびに５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、およびＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）のような誘導体；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロン；オルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラロサニリン；フェノールレッド；Ｂフィコエリスリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンならびにピレン、ピレンブチレート、およびスクシニミジル−１−ピレンブチレートのような誘導体；リアクティブレッド４（シバクロン、ＲＴＭ、ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）；ローダミンならびに６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１およびスルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）のような誘導体；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸、ならびにテルビウムキレート誘導体が含まれる。その他の適した蛍光体には、ＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）、リサミン（商標）、ジエチルアミノクマリン、フルオレセインクロロトリアジニル、ナフトフルオレセイン、４，７−ジクロロローダミンおよびキサンチンならびにその誘導体が含まれる。当業者に既知であるその他の蛍光体も同様に用いてもよい。
【００４８】
「高処理能ゲノム学」とは、多数の遺伝子もしくは蛋白質を迅速に同定するために、または正常もしくは異常な細胞もしくは組織からその構造、発現、もしくは機能を区別するために、ゲノムもしくは遺伝子データまたはマイクロアレイを利用する分析技術またはその他のゲノム学技術の適用を意味する。
【００４９】
「ハイブリダイゼーション」とは、互いに相補的である核酸分子間の相互作用を意味する。ハイブリダイゼーションは、相補的なヌクレオチド単位間のワトソンクリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合を含む水素結合に基づいている。例えば、アデニンとチミンは、水素結合の形成によって対を形成する相補的核酸塩基である。「相補的」とは、二つのヌクレオチド単位間の配列相補性を意味する。例えば、オリゴヌクレオチドの特定の位置でのヌクレオチド単位がＤＮＡまたはＲＮＡ分子の同じ位置でヌクレオチド単位と水素結合を形成することができるならば、オリゴヌクレオチドは、その位置で互いに相補的である。オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡは、それぞれの分子における対応する位置の十分な数が、互いに水素結合することができるヌクレオチド単位によって占有されている場合に互いに相補的である。
【００５０】
「特異的にハイブリダイズする」および「相補的」とは、オリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡ標的とのあいだに安定な特異的結合が起こるように、十分な程度の相補性を示す用語である。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能となるために、その標的配列に対して１００％相補性である必要はない。
【００５１】
特定の程度のストリンジェンシーが起こるハイブリダイゼーション条件は、選択するハイブリダイゼーション法の性質ならびに用いるハイブリダイズするＤＮＡの組成および長さに応じて変化するであろう。一般的に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（特にＮａ＋濃度）は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを左右するであろう。特定の程度のストリンジェンシーを得るために必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算は、参照として本明細書に組み入れられる、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らの「分子のクローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、コールドスプリングハーバー研究所出版（１９８９）、第９章および１１章によって検討されている。
【００５２】
「間接的捕獲」とは、捕獲抗体等の上に生体分子が接合または結合して、それが次にメンブレン表面に結合することを意味する。このように、間接的捕獲では生体分子はメンブレンに直接結合しない。
【００５３】
「同一」は、生体分子に対して実質的に同じ親和性を有することを意味する。
【００５４】
「標識」とは、例えば、特定の生体分子（例えば、蛋白質または核酸）に結合することができる検出可能なマーカーまたはレポーター分子を意味する。典型的な標識には、蛍光体、放射性同位元素、リガンド、化学発光剤、金属ゾルおよびコロイド、ならびに酵素が含まれる。標識法および様々な目的にとって有用な標識を選択するための手引きは、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子のクローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、コールドスプリングハーバー研究所出版（１９８９）、およびアウスユベール（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、「分子生物学の現行プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、グリーンパブリッシングアソシエーツ＆ウィリーインターサイエンシズ（１９８７）において考察されている。
【００５５】
「核酸」とは、一本鎖または二本鎖型のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを意味し、特に制限がなければ、天然に存在するヌクレオチドと同じように核酸にハイブリダイズする天然のヌクレオチドの既知の類似体を含む。
【００５６】
「メンブレン」とは、多孔性またはそうでなければ少なくとも部分的に生体分子透過性である天然または合成材料の薄いシートを意味する。
【００５７】
「マイクロアレイ」は、肉眼的評価のために顕微鏡検査を必要とするように微小化されたアレイである。
【００５８】
「ポリペプチド」とは、長さまたは翻訳後改変（例えば、グリコシル化または燐酸化）によらないアミノ酸の如何なる鎖も意味する。
【００５９】
「プロテオミクス」とは、プロテオームの同定または分析を意味する。プロテオームは生体試料中に発現されるおよび／または存在する蛋白質の群である。
【００６０】
「試料」とは、組織、ゲル、体液、および浮遊液または沈殿物としての個々の細胞と共にマイクロタイタープレートのような生体分子の容器中の材料を含む、生体分子を含む材料を意味する。
【００６１】
「積み重ね（ｓｔａｃｋ）」とは、水平方向、垂直方向、角度をなして、または他の方向を向いた隣接する基板を意味する。基板（例えば、メンブレン）は、空間的に離れていてもよく、または接触して、例えば隣接していてもよい。
【００６２】
「被験者」とは、例えば、哺乳類、鳥類、およびより詳しくは霊長類のヒトおよび獣医学被験体の双方を含む、生きている多細胞の脊椎動物の範疇を意味する。
【００６３】
ＩＩ．いくつかの態様の一般的な説明
特定の態様は、例えばパラフィンにおいて固定および抱埋されている保管組織試料に関連して特に有用である。全組織切片、組織マクロアレイ、および例えば、組織マイクロアレイの形での微細な組織切片のアレイは全て、そこから生体分子が検出される他の試料と同様に、開示の方法に従って分析してもよい（例えば、蛋白質または核酸の一次元または二次元分離によって生成されたゲル）。コピー上の生体分子は、対象となる生体分子に対して特異的親和性を有する検出子分子（「プローブ」、）例えば、抗体、レクチン、またはＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを用いて可視化することができる。
【００６４】
本明細書に提供した特定の態様には、如何なる特定の標的分子に対しても特異的でない「ブランク」メンブレンの積み重ねを利用する直接層化発現走査技術が含まれる。その代わりに、試料中の全て（またはサブセット、例えば蛋白質または核酸）の生体分子が、オープンフォーマットで広い範囲の生体分子を検出する柔軟性をユーザーに提供するように、そのようなメンブレンに広く結合する。
【００６５】
積み重ねまたは層状の形の薄いメンブレンを、組織切片、または蛋白質もしくは核酸ゲルのような試料に適用し、試薬および反応条件は、生体分子の少なくとも一部が試料から溶出され、積み重ねた複数のメンブレン上に移動するように提供される。これによって、試料の生体分子内容物の多数の実質的な複製物が得られる。次に、得られたローディングした（処置した）メンブレン（または層）を分離する。それぞれのメンブレンは、対象となる特定の生体分子（蛋白質のような）に対して特異的な一つまたは複数の異なる検出子（例えば、抗体）と共にインキュベートしてもよい。用いる検出子は、多様な如何なる技術も用いて、例えば化学発光を用いて標識するか、またはそうでなければ検出可能にする。
【００６６】
蛋白質を検出する例において、それぞれのメンブレンは、それに結合する蛋白質の実質的に同じパターンを有するが、適用することが選択される特定の検出子（例えば、抗体）のために、異なる組み合わせの蛋白質がそれぞれのメンブレン上で可視化される（検出可能にする）。例えば、１つのメンブレン層は、プログラムされた細胞死（アポトーシス）に関係する蛋白質を示してもよく、隣接する層はチロシンキナーゼのような細胞分裂に関係する酵素を表示してもよい。
【００６７】
蛋白質の他に、抗体の代わりの検出子として標識ＤＮＡプローブを用いることによって、核酸をターゲティングしてもよい。その上、異なるタイプの標的生体分子を異なる層に検出してもよい。例えば、蛋白質特異的検出子（例えば、抗体）と核酸検出子（例えば、ハイブリダイゼーションプローブ）とをアレイの異なる層に適用することによって、蛋白質と核酸標的の双方を同時に検出することができる。
【００６８】
本開示の特定の方法に従って、生体分子を移動させる試料（例えば、組織切片またはゲル）は、メンブレンの積み重ねの面に接して配置され、試料と積み重ね（構築された「接触移動用の積み重ね」）の双方を、プラスチック製のバッグ等のような液体不浸透性の封入体の中に入れる。特定の態様において、試料は、スライドガラスのような実質的に液体不浸透性の支持体によって指示される；これらの態様において、メンブレンの積み重ねは試料の他の面に配置される。他の態様において、生体分子を移動させる試料は、不浸透性の支持体によって支持されず、試料は、一つまたは複数のメンブレンが試料の二つの面のそれぞれに隣接して配置されるように、メンブレンの積み重ねの部材のあいだに配置する。
【００６９】
同様に、液体移動試薬も本開示に含まれる。蛋白質および他の分子が試料からメンブレンの積み重ねに移動することができるように、封入体の内容物（片面または両面から）に熱および／または圧力を適用する。これによって、組織試料の生体分子内容物の多数のコピーまたは複製物が得られる。処置したメンブレン（または層）を分離して、対象となる特定の標的に対して特異的な一つまたは複数の異なるプローブ（例えば、核酸ハイブリダイゼーションプローブまたは抗体）と共にインキュベートする。用いたプローブは、化学発光のような任意の多様な技術を用いて標識するか、またはそうでなければ検出可能にする。
【００７０】
それぞれのメンブレンは、それに結合した生体分子（蛋白質および／または核酸を含む）の本質的に同じパターンを有するが、適用することが選択される特定のプローブまたは抗体のために、そのような生体分子の異なる組み合わせがそれぞれのメンブレン上で可視化される。例えば、一つのメンブレン層を、プログラムされた細胞死（アポトーシス）に関係する蛋白質を検出するために用いてもよく、一方隣接する層は、チロシンキナーゼのような細胞分裂に関係する酵素を検出するために用いてもよい。蛋白質の他に、抗体の代わりの検出子として標識ＤＮＡプローブを用いることによって、核酸をターゲティングしてもよい。さらに、生体分子が移動するメンブレンのアレイの異なる層に抗体とプローブの双方を適用することによって、蛋白質と核酸標的の双方を同時に検出することができる。
【００７１】
一つの態様において、開示の方法は、例えば異なる疾患、異なる結果、または異なる治療反応を有する患者からの、保管された異なる組織試料において蛋白質発現パターンを並べて比較するために用いてもよい。このように、例えば、特定の薬剤に対する患者の反応が疾患臓器からの特異的蛋白質発現パターンに相関しうる場合、これは、将来患者がその薬剤によって利益を得るか害を得るかを予測するための有用なツールを提供する。
【００７２】
都合がよいことに、提供された方法は、通常ホルマリン固定してパラフィン抱埋される保管組織をスクリーニングするために用いてもよい。提供された方法はまた、インサイチューで抗体によって検出できないが、メンブレンに移動した後に検出できる蛋白質を試験するために用いてもよい。さらに、提供された方法によって、組織における標的の定量的分析、例えば、悪性細胞上での細胞表面受容体密度の定量を行うことができる。
【００７３】
有益なことに、本明細書に提供した方法、装置、アレイ、およびキットは、レーザー捕獲法による顕微解剖組織について用いることができ、これによって予め必要な蛋白質または核酸の精製を行わずに組織の分子分析を行うことができる。これらの態様は、解剖された組織間の空間的関係を保存するために同じ組織切片において異なる細胞集団の二次元的関係を保持し、それによって異なる細胞タイプを同時に処理および分析することができる。
【００７４】
このように、生体分子を顕微解剖試料から溶出して、それらを層状または積み重ねた形状の一つまたは複数のメンブレンに結合させ、次に生体分子をメンブレン上で可視化することによって、ＬＣＭによって採取した試料において生体分子を検出する方法が提供される。
【００７５】
そのような方法の例において、ＬＣＭ転写フィルム（等）に抱埋した細胞試料を一つまたは複数のメンブレンの積み重ねに隣接して配置し、生体分子が細胞試料から溶出されてメンブレン上に移動するように、試薬および反応条件を提供する。次に、メンブレン上の生体分子を、対象となる生体分子に対して特異的親和性を有する検出子分子（例えば、抗体またはＤＮＡプローブ）を用いて検出および可視化することができる。
【００７６】
電気泳動、クローニング、または分画手段によって分解された生体分子を同定および分析する方法も同様に提供される。そのような方法の例は、量の少ない蛋白質を検出するには十分な感度だが、それでも、好ましくは高価で複雑な研究機器を必要とすることなく高処理能で大量の蛋白質を検出することができる。
【００７７】
このように、本開示の方法の一つの局面に従って、ゲル上で電気泳動によって分離された生体分子（例えば、蛋白質または核酸）をゲルからメンブレンの積み重ねに移動させる。特定の例において、これらのメンブレンは、生体分子に対して高い親和性を有するが低い保持能を有するように構築および／または化学的に処置される。これによって、ゲルの分子内容物の多数の複製物を作製することができる。移動後、メンブレンを分離して、それぞれを、検出子（例えば、蛋白質の特定のサブセットに対して特異的な抗体、核酸プローブ等）の一つまたは独自の混合物（「カクテル」とも呼ばれる）と共にインキュベートする。このように、それぞれのメンブレンは、それに結合する生体分子と本質的に同じパターンを有するが、特定の層に対応するように選択された特定の検出子（または検出子の組）のために、それぞれのメンブレン上で異なる組み合わせが可視化される。特定の例において、検出子カクテルは、カクテル中の二つの抗体が重なり合うまたは隣接する蛋白質スポットに結合しないように注意深く調製された抗体カクテルである。このように、単一のメンブレンにおいて識別するには互いに近すぎる蛋白質のスポットは、本明細書に記載の本発明に従って異なるメンブレン上で検出される。
【００７８】
特定の開示された方法に従って、ゲル、組織または他の支持体において分離された（インサイチュー合成、電気泳動、クロマトグラフィー等によって）蛋白質を、ゲル／支持体の蛋白質内容物の多数の複製物またはインプリントが作製されるように、ゲル／支持体からメンブレンの積み重ねに移動させる。ゲルに関して、ウェルにローディングされる量は、蛋白質が積み重ねの中をより均等に均一に分布できるように、従来のローディング量より多い。
【００７９】
抗体は多くの翻訳後蛋白質改変（例えば、燐酸化）を検出するために用いることができるため、開示の方法の特定の例を用いて、構造と共に蛋白質の機能を同定または分析することができる。二次元ゲルの他に、ゲルシフトアッセイ法によって分離された転写因子の同定のような記載された方法を、一次元ゲルに関して用いることができる。
【００８０】
詳しく述べると、一つの特定の態様は、生体試料のプロテオームを分析する方法である。そのような方法は、試料中に存在するもう一つの蛋白質から蛋白質を分離すること；積み重ねた形状で、分離した蛋白質の一部を複数のメンブレン（例えば、２、１０、２０、またはそれ以上）に移動させること；分離した蛋白質と、そのような蛋白質に結合可能なリガンドとの結合が起こるために十分な条件下で、メンブレンのそれぞれを一つまたは複数の種の既定のリガンド分子（例えば、２、１０、２０個、またはそれ以上）の存在下でインキュベートすること；および蛋白質と既定の如何なる種のリガンド分子との結合の発生を決定することによってプロテオームを分析することを含む。
【００８１】
もう一つの態様は、二つまたはそれ以上の試料のプロテオームのあいだの類似性の程度を分析する方法である。そのような方法は、それぞれのそのような試料に関して、試料中に存在するもう一つの蛋白質からそのような試料の蛋白質を分離する段階；分離した蛋白質の一部を積み重ねた形状の複数のメンブレン（例ええば、２、１０、２０個、またはそれ以上）に移動させる段階；分離した蛋白質と、そのような蛋白質に結合可能なリガンドとの結合が起こるために十分な条件下で、二つまたはそれ以上のメンブレンを一つまたは複数の種の既定のリガンド分子（例えば、２、１０、２０個、またはそれ以上）の存在下でインキュベートする段階；および分離した蛋白質と既定の如何なる種のリガンド分子との結合の発生に関して、それぞれのそのような試料の分離した蛋白質と、もう一つのそのような試料の分離した蛋白質とを比較することによって、プロテオーム間の類似性の程度を分析する段階を含む。
【００８２】
もう一つの態様は、生体試料中に存在する場合、所望の既定の蛋白質を独自に可視化する方法である。この方法は、試料中に存在する蛋白質を互いに分離する段階；試料の分離した蛋白質の一部を、積み重ねた形状の複数のメンブレン（例えば、２、１０、２０個、またはそれ以上）に移動させる段階；所望の既定の蛋白質と、そのような蛋白質に結合可能なリガンドとの結合が起こるために十分な条件下で、二つまたはそれ以上のメンブレンを一つまたは複数の種の既定の検出子／リガンド分子（例えば、２、１０、２０個、またはそれ以上）の存在下でインキュベートする段階；および蛋白質と既定の如何なる種のリガンド分子との如何なる結合も可視化する段階を含む。
【００８３】
同様に、試料中に存在するもう一つの蛋白質から蛋白質の分離が電気泳動（例えば、二次元ゲル電気泳動）によって行われる、そのような全ての方法の態様が提供される。
【００８４】
さらなる態様には、試料が哺乳類細胞または組織、特にヒトの細胞または組織から得られるような全ての方法が含まれ、哺乳類細胞または組織がヒト細胞または組織であって、分離された蛋白質がヒト遺伝子産物である態様が含まれる。
【００８５】
検出子／リガンド種は、多様な任意の分子タイプとなりうると予期される。このように、少なくとも一つの種の検出子／リガンドが抗体、抗体断片、一本鎖抗体、受容体蛋白質、可溶化受容体誘導体、受容体リガンド、金属イオン、ウイルス、ウイルス蛋白質、酵素基質、毒素、毒素候補、薬物、薬物候補、ハイブリダイゼーションプローブ、オリゴヌクレオチド、および本明細書に記載の他のものである、そのような全ての方法の態様も同様に提供される。
【００８６】
その他の態様には、少なくとも一つの種の検出子／リガンド種の結合が分離された生体分子（例えば、蛋白質または核酸）の構造に依存する、そのような全ての方法が含まれる。少なくとも一つの種の検出子／リガンドの結合が分離された生体分子（例えば蛋白質または核酸）の機能に依存する、そのような全ての方法の態様をなおさらに提供する。
【００８７】
本開示はまた、少なくとも一つのメンブレンが一つより多くの種のリガンドまたは検出子分子と共にインキュベートされるような全ての方法を提供する。同様に、少なくとも二つのメンブレンが用いられる、少なくとも１０個のメンブレンが用いられる、または少なくとも２０個のメンブレンが用いられるそのような全ての方法の態様が提供される。
【００８８】
さらに、少なくとも二つの種のリガンドまたは検出子分子が用いられる、少なくとも１０個が用いられる、または少なくとも２０個もしくはそれ以上が用いられるような全ての方法の態様が提供される。
【００８９】
さらなる態様は、ゲルから溶出された蛋白質の多数の複製物またはインプリントを作製することができるように、蛋白質および／または他の生体分子に対して高い親和性を有するが低い保持能を有するメンブレンである。これらのメンブレンの例は、ブロッティングに従来用いられているものより実質的に薄い。メンブレンは選択的に、その積み重ねから分離した場合に、それらを容易に取り扱って操作されるようにするため、フレームと共に（またはフレームの中で）提供される。フレームは選択的に、隣接するメンブレンのあいだに捕獲された空気と液体とが放出されるようにチャンネルを明確に定める。取り外し可能なタブ等も同様に、それがゲルに適用された場合に積み重ねが共に固定されるようにそれぞれのフレーム上に提供してもよい。
【００９０】
ローディングしたメンブレンは、いくつかの市販の科学的造影装置の一つを用いて走査するか、またはデジタル式に造影してもよい。試料（例えば、組織試料またはゲルのようなその他の二次元試料）からの発現パターンの観察、分析、および／または解釈を行うために、本明細書に記載のような造影機器およびソフトウェアを用いてもよい。ソフトウェアは、メンブレンの像のそれぞれに対応する鋳型の像によって提供されてもよい。これによって、その垂直および水平の位置に基づいてそれぞれの既定の座（例えば、二次元ゲル上のスポット、一次元ゲル状のバンド、または組織試料における局所分子沈着物）における生体分子の同一性を確認することができる。ソフトウェアによってまた、定量的読み取りを提供するためにそれぞれの座の密度を計算することができる。ソフトウェアはまた、異なる疾患を有する試料と正常試料とを比較することができるように、他のゲルから生成した像のデータベースとリンクさせてもよい。メンブレンのコンピューターによる分析の他に、デジタル分析を確認または比較するために、起源となる試料（例えば、実際の組織切片、または他の実質的に二次元の起源）、または実質的に類似の試料（例えば、隣接する組織切片）を従来の技術（例えば、組織化学技術）によって分析してもよい。
【００９１】
本明細書において、積み重なった、または積み重ねることができる他の形状の複数のメンブレン（例えば、３個もしくはそれ以上、例えば、５、１０、１５、２５、５０、もしくは１００個、またはそれ以上のメンブレン）を含むキットも同様に提供される。選択的に、提供されたキットは、生体分子検出／分析のために処置したメンブレンに適用される抗体のカクテルまたはハイブリダイゼーションプローブのような一つまたは複数の異なる検出子をさらに含んでもよい。キットはまた、一定容積の移動試薬、液体不浸透性の封入体（例えば、密封可能なバッグ）、一つまたは複数の濾紙片、および／またはスライドガラス上もしくは他の比較試料もしくは対照試料上に含まれる組織アレイのような一つまたは複数のさらなる成分を提供してもよい。選択的に、そのようなキットは、一つまたは複数の生体分子を検出、分析、および／または同定するためにキットを用いる方法の説明書を含んでもよい。キットと共に提供される、または他のキットの成分と共に用いられることが期待される検出子分子と一致するように合わせて作製した検出化学物質を含めてもよい。上記のスフトウェアは、キットに含まれもよく、またはモデムまたはインターネットを通してアクセスしてもよい。
【００９２】
特定の態様において、本開示に従う方法およびキットは、数千個までの別個の生体分子（例えば、蛋白質）の座を同定、注釈をつけ、そしてユーザーの選択肢としてデータベースに保存された他の試料から生成された座のパターンと比較することができる。
【００９３】
プロテオームを分析するための提供されたキットの一つの特定の例には、それぞれが少なくとも一つの蛋白質に対して特異的親和性を有する複数のメンブレン、およびそれぞれがメンブレンに結合した一つまたは複数の特異的蛋白質を検出するように適合された複数の検出子／リガンド種（例えば、抗体、抗体断片、一本鎖抗体、受容体蛋白質、可溶化受容体誘導体、受容体リガンド、金属イオン、ウイルス、ウイルス蛋白質、酵素基質、薬物、および薬物候補）が含まれる。
【００９４】
もう一つの態様において、生体試料に存在する場合に、所望の既定の蛋白質を独自に可視化するためのキットも同様に提供される。そのようなキットには、それぞれが少なくとも一つの蛋白質に対して特異的親和性を有する複数のメンブレン、およびそれぞれがメンブレンに結合すれば所望の既定の蛋白質を検出するように適合された複数の検出子／リガンド種（例えば、抗体、抗体断片、一本鎖抗体、受容体蛋白質、可溶化受容体誘導体、受容体リガンド、金属イオン、ウイルス、ウイルス蛋白質、酵素基質、薬物、および薬物候補のような種）が含まれる。
【００９５】
特定の態様において、本明細書に記載のキットにおいて提供されるメンブレンには、厚さが約３０ミクロン未満の多孔性基板が含まれる。そのようなキットの特定の例には、ポリカーボネートメンブレンであるメンブレン、特に生体分子に対するメンブレンの親和性を増加させるための物質、例えば、ニトロセルロース、ポリ−Ｌ−リジン、またはその混合物によってコーティングしたポリカーボネートメンブレンであるメンブレンが含まれる。
【００９６】
ＩＩＩ．移動様式
本明細書において、一般的に実質的に二次元である試料からの生体分子を、通常積み重ねて配置される一つまたは複数の薄いメンブレンに移動させる多数の方法が提供される。いくつかの異なる特異的移動様式が提供される。これらの様式のいくつかは、ウィッキング（ｗｉｃｋｉｎｇ）または接触移動を用いて組織およびゲルに基づく試料の双方から生体分子を移動させることができるという点において一致する。おそらく、明確に列挙していなくとも、記述の方法の全ての変更および組み合わせが本発明に含まれる。
【００９７】
ウィッキング移動
特定の態様において、移動液体（緩衝液のような）は、試料からメンブレンへの、そしてそれらの中への生体分子の移動を促進するためにメンブレンの中を通過する。所望の移動方向へのメンブレン中の液体（緩衝液のような）の移動に役に立つように遠位または下流のウィックも同様に提供してもよい。
【００９８】
図１において、一般的に参照番号１０によって示される代表的な開示のメンブレンアレイ移動装置の透視図を示す。装置１０には、アレイ１３のような層状または積み重ねた形状で示される複数のメンブレン１２が含まれる。図１のアレイ１３には約１ダースのメンブレンを示しているに過ぎないが、同定を試みる標的数、試料中に存在する生体分子の量、およびメンブレン１２を構築するために用いる材料の厚さに応じて、より多くのメンブレン（例えば１０、５０、１００個またはそれ以上）を用いてもよいと認識されるであろう。選択的に、メンブレン１２は例えばその完全性を維持するため、および／または混入を防止するために適した密封封入体またはフレーム（示していない）に一括してもよい。
【００９９】
メンブレンアレイ１３は、一つまたは複数のシートのブロッティング紙１４の積み重ねの上に置き、ブロッティング紙１４は図１に示す矢印の方向に、緩衝液チャンバー１８から上部のウィック（ｗｉｃｋ）２０およびメンブレンアレイ１２を通して緩衝液を吸い込む下部のウィックとして作用する。移動が起こったか否かおよび／またはどの程度移動が起こったかをユーザーが確認するために役立つように、生体分子のトラップ２２をメンブレンアレイ１２とブロッティング紙１４の中間に配置してもよい。
【０１００】
使用および操作する場合、装置１０は、積み重ねに適用した試料の生体分子内容物の「カーボンコピー」または実質的な複製物を作製するために用いてもよい。メンブレン１２は、図１において参照番号１３として示す層状または積み重ね形状に配列する。特定の態様において、実質的に二次元の試料１１（図示された従来の凍結組織切片のような）を支持基板（例えば、ポリカーボネート層）に載せた後、２枚の２％アガロース片の間に挟む（示していない）。調製物全体をメンブレンアレイ１３に隣接して配置する。緩衝液１６は、緩衝液チャンバー１８および上部ウィック２０を用いて適用して、凍結切片から蛋白質を溶出させて移動させる。緩衝液約５０〜１００ ｍｌ／ｃｍ２をそれぞれの移動に用い、移動の平均時間は約１〜２時間である。
【０１０１】
移動後、メンブレンを分離して、検出子抗体と共にインキュベートする。抗体は、求める標的のタイプに基づいて選択する。メンブレンを緩衝液中で洗浄して、蛋白質／検出子複合体を、ＥＣＬ、直接蛍光、または比色反応のような多くの技術を用いて可視化することができる。ユーザーの好みに応じて、市販の平板式スキャナおよびデジタル画像ソフトウェアを用いて、画像を表示することができる。
【０１０２】
図１に示す特定の実施例は、試料から溶出した生体分子の「カーボンコピー」（必ずしも同一なコピーではない実質的なコピー、それらはわずかな違いを有してもよいが同一またはほぼ同一となりうる）を作製すること、および対象となる生体分子に対して特異的親和性を有する抗体または他の分子を用いてコピー上の生体分子を可視化することによって、組織切片１１または他の二次元試料（例えば、電気泳動ゲル）において生体分子を検出する装置および方法を示す。積み重ねたまたは層状の形状の薄いメンブレン１２を試料および試薬と接触させて、生体分子が試料からメンブレンに溶出して、そこで生体分子が本明細書に記載する多様な技術を用いて可視化することができるように反応条件を提供する。
【０１０３】
本開示の特定の態様には、一つまたは複数のメンブレン上で生体分子を直接捕獲しながら、複数のメンブレンの中を生体分子が移動することができる、積み重ねた連続する層状のメンブレンを用いて、生体試料中の分析物を検出する方法が含まれる。試料からの生体分子は、一つまたは複数のメンブレンが生体分子を直接捕獲可能な条件下でメンブレンの中を移動し、対象となる生体分子は、例えば、対象となる生体分子を、特異的捕獲分子（例えば抗体または核酸プローブ）のような検出子に曝露することによってメンブレン上で同時または連続的に検出される。
【０１０４】
または、生体分子自身が、試料を曝露させるものに対する検出子（核酸プローブのような）であってもよい。この場合、生体試料は、積み重ねの表面上の割り当てられた位置に存在する一つまたは複数の精製核酸プローブであり、これは、メンブレンの中を（例えば、層を横切る移動方向に）移動し、多数のメンブレン上の対応する位置において当初のプローブの多数の実質的な「コピー」を作製することができる。次に、層を分離して、プローブとハイブリダイズする核酸分子を有しうる標的生体標本に曝露することができる。
【０１０５】
いくつかの例において、生体試料は、層状のメンブレンの積み重ねの上に配置される組織標本であり、組織標本からの生体分子は、生体分子が膜の中を移動するとメンブレンによって直接捕獲される。メンブレンは、例えば対象となる生体分子を検出する前に分離してもよく、分離したメンブレンを検出子に曝露する。または、対象となる生物学的分子は、それに対してメンブレンが曝露される生体標本に含まれてもよい。例えば、メンブレンによって直接捕獲される生体分子はそれ自身核酸プローブまたは抗体であってもよく、メンブレンを、その中で核酸またはペプチド（蛋白質のような）が検出される生体標本に曝露してもよい。
【０１０６】
メンブレンコピー上で検出される生体分子は、試料の生物学的特徴と相関する可能性がある。例えば、組織標本を積み重ねの上部の位置に配置してもよく、対象となる生体分子（特定の蛋白質のような）は、組織標本（またはオルガネラのようなその小構造の一つ）が配置される位置に対応する位置でメンブレンコピーの一つで検出される可能性がある。次に、組織標本におけるその生体分子の存在を、試料の生物学的特徴に相関させることができる。例えば、非常に悪性の組織標本がある蛋白質を含むことが判明する可能性があり、したがってこのタンパク質は標本の高度に悪性の表現型に関連する可能性がある。
【０１０７】
特定の例において、この方法は、ＤＮＡプローブ、抗体、またはその組み合わせのような複数の検出子を層状のメンブレンの積み重ねに適用することによって、マイクロアレイの実質的な「コピー」の組を作製するために用いることができる。層状のメンブレンの積み重ねは、その中をプローブまたは抗体（一般的に、検出子分子）が移動する、そしてその中でプローブまたは抗体の一部が一つまたは複数の基板によって直接捕獲される複数の基板を提供する。基板をその後分離して、上記の基板のそれぞれの対応する位置において、複数のＤＮＡプローブ、抗体、またはその組み合わせを有する対応する基板を提供することができる。多数のメンブレンは、基板の中をプローブおよび／または抗体が移動する際にプローブ間および／または抗体間の実質的に首尾一貫した関係を維持する。この首尾一貫した関係は、直接の空間的一致であってもなくてもよいが、生体分子間の相対的関係は、生体分子が層状のメンブレンの積み重ねの上に配置される関係からメンブレン上の生体分子の同一性を知ることができるように維持してもよい。
【０１０８】
接触移動
図２Ａにおいて、実質的に二次元の試料１１から生体分子をメンブレンの積み重ね１３に移動させるための装置１０のもう一つの態様を示し、いくつかの態様において積み重ねはキットの形で提供される。装置１０は一般的に、その上に試料１１（組織切片として示す）を配置してもよいメンブレンの積み重ね１３、フィルターパッド２４および２６の対、およびプラスチックバッグのような液体不浸透性の封入体２８等を含む。選択的に、試料１１（例えば、組織切片）は、支持体３０（図２Ｂに示すように）上に示してもよい。特定の態様において、支持体３０は、顕微鏡用スライドガラスまたはテープ片のような他の液体不浸透性の支持体である。
【０１０９】
より詳しく述べると、第一の態様において、メンブレンの積み重ね１３は、本明細書に記載されるように一般的に構築される一つまたは複数の、例えば５個までのメンブレン１２を含む。積み重ね１３におけるメンブレン１２は、蛋白質および他の生体分子に対して高い親和性を有するがそのような分子の保持能は低くなければならない。この特徴によって、分子はごく限られた数の分子が連続した層のそれぞれに捕獲されるようにメンブレンの積み重ねの中を通過することができ、それによって多数の「カーボンコピー」（必ずしも同一のコピーでない実質的なコピー、それらはわずかな差があってもよいが同一またはほぼ同一となりうる）を作製することができる。言い換えれば、保持能が低いことによって、それぞれの層に捕獲される生体分子の量がごく限られるため、多数の複製物を作製することができる。
【０１１０】
第一および第二のフィルターパッド２４、２６は、好ましくはシュライヒャー＆シュエル社（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）から入手できるＧＢ００４ブロッター紙で構築される。フィルターパッド２４、２６は、トリスまたは燐酸基剤の緩衝液のような移動緩衝液によって飽和する。
【０１１１】
封入体２８は、試料１１、メンブレンの積み重ね１３、およびフィルターパッド２４、２６を包むように適合した如何なる分解可能な液体不浸透材料を含んでもよく、これらはキットの成分であってもよい。封入体２８は好ましくは、熱密封可能な小袋のようなプラスチックバッグである。例として、そのようなバッグは、ポリエステルまたは他の樹脂のような樹脂製であってもよい。特定の態様において、封入体２８は、カパク社（Ｋａｐａｋ Ｃｏｒｐ．）（ミネアポリス、ミネソタ州）から入手可能なもののような熱密封可能な小袋である。
【０１１２】
用途および操作する場合、構築された接触移動用積み重ねに関して、試料１１（例えば、図３に示す組織切片試料または組織マイクロアレイ３１）をメンブレンの積み重ね１３の面に接して配置して、試料と積み重ねの双方を、移動用緩衝液で満たした２つのフィルターパッド２４、２６のあいだに配置する。構築した接触移動用積み重ねを、プラスチックバッグのような液体不浸透性の封入体２８の内部に置く。メンブレンを上記の移動溶液中で予め湿らせる。
【０１１３】
液体不浸透性の封入体２８を実質的に平坦な表面対３２のあいだに置き、その少なくとも一面を熱源とする。例として、実質的に平坦な表面対３２は、バイオラドラボラトリーズ社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ハーキュルズ、カリフォルニア州）が製造したゲル乾燥器に提供されるもののように加熱要素の表面対となりうる。他の態様において、その表面対３２は、蓋の高さおよび圧力を調節しそれによって圧力を提供するために、分離した加熱された蓋とサムウィール（ｔｈｕｍｂｗｅｅｌ）とを提供するＰＴＣ−２００ペルティエ（Ｐｅｌｔｉｅｒ）サーマルサイクラーのようなＭＪリサーチ装置によって提供してもよい。
【０１１４】
熱が組み立てられた試料および積み重ねの一面からに限って適用される態様において、熱は好ましくは試料の面に適用された熱によって熱勾配が形成されるように、メンブレンの積み重ねの面ではなくて試料の面から適用する。
【０１１５】
移動を行うために、バッグとその内容物を６０〜９５℃に、いくつかの態様において６０〜８０℃に、またはより詳しくはいくつかの態様において７０℃に加熱する。バッグおよびその内容物を少なくとも約１時間加熱して、いくつかの態様において、約２時間またはそれ以上加熱する。生体分子のメンブレンの積み重ねへの移動を促進するために、試料とメンブレンの積み重ねのあいだが確実に適切に接触するように、加熱プロセスを通して十分な圧力を適用する。例として、そのような圧力は０．５〜２ポンドのおもり３４を用いて提供することができ、これは選択的にキットの成分に含めてもよい。圧力を適用することができるバネ、クランプ、またはクリップをおもりの代わりに用いてもよい。
【０１１６】
適用される熱と圧力の組み合わせによって、蛋白質および／または核酸および／または糖質および／または脂質を含む生体成分が、試料１１からメンブレンの積み重ね１３に移動する。これによって、少なくとも部分的にメンブレンの結合特徴により、組織試料の生体分子内容物の多数のコピーまたは複製物が生成される。
【０１１７】
大量の試料の捕獲を防止するために、メンブレンの結合容量が確実に十分に低くなるように、いくつかの態様において、メンブレン基板の厚さは、３０ミクロン未満、いくつかの態様において、４〜２０ミクロン、特定の態様において８〜１０ミクロンでなければならない。基板の孔サイズは、０．１〜５．０ミクロン、特定の態様において０．４ミクロンでなければならない。そのような薄いメンブレンを用いるもう一つの長所は、側方への拡散現象を弱めることである。メンブレンの積み重ねがより厚くなれば、積み重ねの中を移動する生体分子の拡散はより大きくなる。
【０１１８】
基板には、蛋白質または他の標的生体分子の特異的結合を増加させるための上面および／または下面のコーティングが含まれる。特定の態様におけるコーティングはニトロセルロースであるが、ポリ−Ｌ−リジンのような他の材料も用いてもよい。
【０１１９】
組織切片試料１１は、新鮮／凍結組織またはホルマリン（または他の固定剤）およびパラフィン抱埋切片において固定されている組織に由来してもよい。切片は、例えば、ミクロトームを用いて従来の方法によって作成する。組織切片の厚さは、作製されるメンブレンの複製物の所望の数に応じて３〜３０ミクロンまで変化しうる。一般論として、切片の厚さは、求めるそれぞれの複製物あたり１ミクロンとなるべきである。このように、例えば、１０ミクロンの切片を用いればメンブレンコピー１０個が作製されるであろう。
【０１２０】
本明細書において用いられるように、「組織」とは、植物、動物、およびヒト材料を含む細胞、蛋白質、または核酸を含む如何なる材料も意味する。組織切片試料１１の代わりに、組織マイクロアレイ３１（図３）を用いてもよい。組織マイクロアレイは、コノネンら（Ｋｏｎｏｎｅｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ４：８４４〜８４７、１９９８）において記述され、リサーチジェネティクス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）（ハンツビル、アリゾナ州）から入手可能なバストアレイ（Ｖａｓｔ Ａｒｒａｙ）（商標）組織アレイのようないくつかの市販のアレイによって提供される。組織マクロアレイは、それらが一般的にマイクロアレイ試料より大きい組織切片を含むことを除き、同様に構築され、組織マクロアレイにおいて用いられる組織試料は選択的に手で切断してもよい。または、いくつかの態様において、ゲル（例えば、電気泳動ゲル）または他の実質的に二次元の試料における生体分子は、組織切片１４の代わりに類似の方法を用いてメンブレンの積み重ねに移動させる。
【０１２１】
ゲルに基づく移動
生体分子を同定および測定するために最も広く用いられる方法は、ゲル電気泳動、すなわち（通常）その大きさおよび／または荷電の差に基づいて適用した電場の影響下で、混合物中の分子を分離または分解する一連の技術である。電気泳動による分離は多孔性のポリマーゲルを用いて最も一般的に行われる。一次元電気泳動のあいだ、蛋白質の混合物をゲルに適用して、それらを電流の流れに曝露する。より小さい蛋白質はより大きい蛋白質よりゲルの中を速く移動するため、その大きさに基づく分離が得られる。例として、この一次元アプローチは、異なる蛋白質のバンド約１００個を生成できるに過ぎず、これは、典型的な哺乳類細胞において発現される蛋白質の推定数が約１０，０００〜１５，０００個のあいだであることから、多くの応用にとって不適当である。
【０１２２】
電気泳動ゲルの分解能を改善するために、二次元ゲル技術が１９７０年代に導入され、この場合、その大きさに基づく蛋白質の電気泳動による分離の前に荷電に基づく分離を行う。その荷電（ｐＨ）に従って蛋白質を分離する等電点フォーカシング（ＩＥＦ）電気泳動を一方向に行い、質量による分離はその垂直方向に行う。そのような二次元ゲル電気泳動（しばしば、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動は「２−Ｄ ＰＡＧＥ」と省略される）は、プロテオミクスの骨格となった。この技術は日常的に、異なるクラスの組織、細胞、細胞溶解物、体液、または滲出物のプロテオームの特徴を調べるために用いられる。２−Ｄ ＰＡＧＥの最終的な結果は、それぞれのスポットの座標が荷電および分子量によって表される二次元のデカルト平面における様々な蛋白質の「スポット」の生成および分離である。しかし、２−Ｄ電気泳動の主な課題は、それらがゲル上で分離された後の蛋白質の同定である。
【０１２３】
ゲル上で分離された蛋白質は通常、いくつかの異なる技術の一つによって同定、検出、および分析される。蛋白質のスポットが未知蛋白質を表す場合、最も一般的なアプローチは、スポットをゲルから物理的に採取または切除すること、それを酵素によって処置すること、そして蛋白質の特徴を質量分析によって調べることである。コンピューターは、その質量に従って蛋白質断片のプロットを作製し、このプロットは当初の蛋白質の同定を容易にするために用いてもよいフィンガープリントとして作用する。実際のフィンガープリントの分析の場合のように、質量分析が検出された蛋白質を同定できるか否かは、その断片が検出された蛋白質の断片にマッチする参照蛋白質が既に回収および分析されていることに依存する。真に新しい蛋白質を質量分析によって同定することは依然として課題である。
【０１２４】
質量分析は、最も明白なデータを提供するが、方法は時間がかかり、費用が高く、高価なコア施設と高度に訓練された人員がなければ行うことができない。さらに、この技術は、クーマシーブルーのような広布の色素によって染色することができる蛋白質を分析する場合に限って用いられる。残念なことに、広布の色素は感受性が低く、試料中のごく小さい分画の蛋白質を可視化できるに過ぎない。言い換えれば、広布に染色されたゲルの質量分析は、量は少ないがおそらく重要な特定の蛋白質を同定することができないために、広い「ダイナミックレンジ」を生じない。これらの技術によって置き去りにされる可能性がある量の少ない蛋白質は、多くの疾患において重要な役割を果たすチロシンキナーゼ、サイトカイン、および転写因子である。
【０１２５】
ゲル分離蛋白質を同定するためのもう一つのアプローチは、広布の染色の代わりに、対象となる蛋白質に対して特異的な検出抗体を用いるイムノブロット分析である。蛋白質を、典型的にニトロセルロースまたはポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）のいずれかで構築されるメンブレンに転写して、抗体をメンブレンに適用する。イムノブロットは迅速で１日未満で行うことができる。また、クーマシーブルー染色より約１０００倍感度が高いと推定され、量の少ない蛋白質であっても同定することができる。これはまた有意により特異的でもある。しかし、イムノブロッティングの重要な限界は、重なり合うスポットと試料中の異なる蛋白質との交叉反応性のために、一つのブロット上で同定できる蛋白質は多くてごく一握りに過ぎない点である。２−Ｄゲルプロセスは終了するまでに約２４時間を要するため、ほとんどのプロテオミクス適用にとって必要な大量の蛋白質を同定するために十分なイムノブロットを作製するには、極端に時間がかかるであろう。
【０１２６】
このように、広いダイナミックレンジにわたって多数の蛋白質を同時に同定できる技術を開発することが明らかに必要である。この必要性に取り組むための試みにおそらく関連した情報は、以下の参考文献に認められうる：サンチェスら（Ｓａｎｃｈｅｚ、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：６３８〜６４１、１９９７）；ニューマン＆ムルナー（Ｎｅｕｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｕｌｌｎｅｒ、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１９：７５２〜７５７、１９９８）；マナベら（Ｍａｎａｂｅ、Ａｎｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １４３：３９〜４５、１９８４）；レゴッキ＆バーマ（Ｌｅｇｏｃｋｉ ａｎｄ Ｖｅｒｍａ、Ａｎｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１１：３８５〜３４５）；およびＰＣＴ国際出願国際公開公報第００ ０４５１６８号、その全てが参照として本明細書に組み入れられる。
【０１２７】
しかし、これらの参考文献に記述されるそれぞれの技術は、以下の短所を一つまたは複数有する：（ｉ）量の少ない蛋白質を検出するには十分な感度でない、（ｉｉ）多数の蛋白質を高処理能で同定できない、（ｉｉｉ）専門または複雑なハードウェアを必要とし、それによって蛋白質の喪失および移動のあいだの蛋白質スポットの分解能の減少が起こる。
【０１２８】
本明細書に記載の方法に従って、ゲル上で電気泳動、またはクロマトグラフィー等によって分離された生体分子は、ゲルからメンブレンの積み重ねに移動する。そのようなメンブレンの例は、高親和性であるが蛋白質に対する保持能が低いように構築および化学的に処置されたメンブレンである。適したメンブレンならびにその構築および調製方法を本明細書に記載する。そのようなメンブレンを用いることによって、ゲルの蛋白質内容物の多数の複製物を作製することができる。
【０１２９】
次に、メンブレン上の生体分子の検出および／または分析を補助、および行うことができるように、メンブレンを独自のリガンド種（検出子分子）またはそのような種の混合物もしくはカクテルと共にインキュベートする。メンブレンは一般的に、そのようなインキュベーションを行う前に互いに分離される。検出子分子／リガンドは、対象となる標的分子に対して結合特異性を有する多数の分子の如何なるものともなりえ、これには抗体（モノクローナル抗体のような）、抗体断片（例えば、ＦＡＢ、Ｆ（ＡＢ）２、一本鎖抗体、受容体蛋白質、可溶化受容体誘導体、受容体リガンド、金属イオン（特に常磁性または放射活性イオン）、ウイルス、ウイルス蛋白質（例えば、ヒトライノウイルスまたはＩＣＡＭ−１に結合するその蛋白質、またはＨＩＶもしくはＣＤ４４に結合するその蛋白質）、酵素基質、毒素、毒素候補体、薬物、薬物候補、特異的蛋白質に結合する他の低分子と共に、核酸等に結合またはハイブリダイズする分子（例えば、核酸プローブ、または特異的結合蛋白質もしくはその断片）が含まれる。それぞれのメンブレンはそれに結合する本質的に同じパターンの生体分子を有するが、特定の層に対応するように選択された特定のリガンドまたはリガンドカクテルのために、そのような生体分子の異なる組み合わせをそれぞれのメンブレン上で検出することができる。
【０１３０】
メンブレンに提供されたカクテルにおけるリガンド種の特性は、そのメンブレンから得ることができる情報の特性を左右する。例えば、メンブレンを抗体または抗体断片と共にインキュベートすることによって、そのような分子に結合する蛋白質分子が試料中に存在するか否かを同定することができる。このようにして、例えば、特定の蛋白質が蛋白質キナーゼであるか、または蛋白質キナーゼを模倣するエピトープを有するか否かを決定するために、メンブレンを蛋白質キナーゼに特異的に結合する抗体と共にインキュベートすることができる。同様に、細胞受容体蛋白質、可溶化受容体誘導体、または受容体リガンドをリガンドとして用いることによって、メンブレン上で、特定の蛋白質が受容体または受容体リガンドであるか否かを同定することができる。ウイルスおよび他の病原体は、細胞受容体蛋白質に結合することができるため、ウイルスまたはウイルス蛋白質を含むカクテルを、特定の蛋白質が細胞受容体または受容体リガンドであるか否かを同定するための受容体リガンドとして同じように用いることができるであろう。もう一つの態様において、カクテルは、そのような物質と相互作用する蛋白質を同定するために一つまたは複数の薬物を含みうる。同様に、薬物候補をメンブレンと共にインキュベートすると、それによって、そのような候補分子が特異的蛋白質に結合できるか否かが判明されうるであろう。例えば、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤またはモノアミンオキシダーゼ阻害剤（ＭＡＯＩ）をメンブレンと共にインキュベートすると、阻害剤に結合して、このように阻害剤のさらなる治療標的である可能性がある蛋白質を同定することができるであろう。同様に、治療能を有することが疑われる化合物をメンブレンと共にインキュベートすると、それが例えば、肝臓または腎臓において発現される蛋白質に結合するか否かが明らかとなり、それによってこれらの臓器に影響を及ぼす疾患を治療できるか否かが判明するであろう。方法およびキットの例によって、例えば、そのような蛋白質が他の臓器および組織（例えば、脳）において発現されるか否かを決定するために、そのような結合をさらに分析することができる。
【０１３１】
一つの態様において、メンブレンを単一のリガンド、または異なるリガンドもしくは同じクラスのリガンドのカクテル（例えば、抗体、受容体、ハイブリダイズプローブ等）の存在下でインキュベートする。または、メンブレンを異なるクラスのリガンドと共にインキュベートしてもよい。例えば、蛋白質キナーゼに結合する抗体および治療候補と共にインキュベートしたメンブレンを用いて、蛋白質キナーゼに結合する治療候補物を明らかにすることができる。リガンドの混合物またはカクテルを用いる場合、カクテルは好ましくは、２つのリガンドが重なり合うまたは隣接する蛋白質スポットに結合しないように調製する。このように、例えば、一つのメンブレンにおいて識別するには近すぎる蛋白質スポットを異なるメンブレン上で検出してもよい。
【０１３２】
もう一つの態様において、リガンドは、メンブレンに移動する前に試料の蛋白質に結合させる。このように、いくつかの例において、リガンドを、蛋白質の分画または分離前に、生きているもしくは死亡した被験者、組織もしくは細胞、組織もしくは細胞調製物、または組織もしくは細胞抽出物に提供する。次に、蛋白質をメンブレンに移動させて、蛋白質とリガンドとを可視化する。そのような態様において、リガンドと試料中の蛋白質との結合が、インサイチューおよび／または生理的条件下で起こるか否かを検出することができる。選択的に、結合部位に関してリガンドのあいだ、またはリガンドにおける競合を検出するために、結合の結合力を評価するため、３つまたはそれ以上の分子の結合複合体を調べる等のために、メンブレンをさらなるリガンドの存在下でインキュベートすることができる。
【０１３３】
特定の態様は、ゲル電気泳動によって分離される一群の蛋白質（示していない）を同定するため（すなわち、検出、注釈、および／または特徴を調べる）ための方法およびキット３６を提供する。図４Ａに示すように、一つの例において、キット３６は、一般的に以下の成分を含む：（ｉ）蛋白質が移動されるメンブレンの積み重ね１３、（ｉｉ）一次抗体カクテル３８、例えばメンブレン１３のそれぞれについて１つ、および（ｉｉｉ）蛋白質移動緩衝液４２と抗体検出化学物質４４を含む（キット３６に示すように）他の試薬４０。キット３６にはまた、調べる生体試料の「プロテオーム像」を得て、そしてそれをデータベースにおける他の試料からのプロテオーム像と比較するために、ユーザーが得られた像を分析および操作することができるソフトウェア４６が含まれてもよい。または、ソフトウェアは、キットとは独立して獲得またはアクセスしてもよい。
【０１３４】
特定の態様において、そして図４Ａを参照して、メンブレンの積み重ね１２は、図示するように互いに取り外し可能に積み重なるように適合させた複数のメンブレン１３を含む。
【０１３５】
特定の態様の方法に従って（図５に示すように）、ゲル５０上で電気泳動によって分離された蛋白質４８は、メンブレンの積み重ね１３の中を通ってゲルに移動する。これによって、ゲルの蛋白質内容物の多数の複製物ブロット５２が作製される。次に、メンブレンを分離して、リガンド、例えば抗体の独自のカクテル３８（ａ〜ｃ）の一つと共にインキュベートする。用いた抗体は、増強化学発光（ＥＣＬ）のようないくつかの技術の如何なるものによっても標識またはそうでなければ検出可能にする。これによってメンブレンのそれぞれの上に独自のスポットパターン５４（ａ〜ｃ）が得られる。次に、独自のスポットパターン５４を有するメンブレンは、スポットの密度を計算し、他の試料と比較し、本明細書に記載するようにソフトウェア４６を用いてコンピューター上に表示されるように、造影機器（示していない）を用いて走査またはデジタル式に造影する。
【０１３６】
本明細書に提供した特定の態様の一つの長所は、それらが生体試料に関して三次元、すなわち２−Ｄゲルから得ることができる大きさと荷電による分離の他にさらにもう１次元の蛋白質分離を提供することである。層状のメンブレンは、同じメンブレン上で蛋白質のサブセットを検出するために用いることができる適合性の抗体の群を選択するために費用効果の高いツールを提供する。選択すると、これらのリガンドの組み合わせをキットに一まとめにし、積み重ねたメンブレン上に示されるプロテオームの制御された分析を行うために繰り返し用いることができる。１つのゲルから複製物またはコピー１５〜２０個を作製することができ、１０個またはそれ以上のリガンドをそれぞれのメンブレンに適用することができることから、本明細書に記載の方法に従って数千個の異なる蛋白質を単一のゲルから同定することができる。
【０１３７】
リガンドは、蛋白質の多くの翻訳後改変（例えば、燐酸化）を検出するために用いることができるため、本開示は、構造と共に蛋白質の機能を同定するために用いることができる。
【０１３８】
これらの態様は、２−Ｄゲルに関して記述してきたが、同様に、記述の方法および装置は一次元ゲルを用いることができること（例えば、ゲルシフトアッセイ法によって分離された転写因子の同定に関して）、または蛋白質は、クロマトグラフィーのような他の手段によって、試料の他の蛋白質から分離してもよいと意図される。同様に、これらの方法は、核酸、脂質、糖（多糖類のような）、および二つまたはそれ以上のタイプの生体分子の組み合わせまたは複合体のような蛋白質以外の生体分子の複製コピーを作製するために用いることができる。
【０１３９】
特定の態様において、ゲルからメンブレンの積み重ねに蛋白質を溶出させるための緩衝液試薬は、本明細書に記載するように、グリシン、メタノール、およびＳＤＳの混合物を含む。１−Ｄゲル分析に関して、蛋白質染色はファストブルー染色（ＦａｓｔＢｌｕｅ Ｓｔａｉｎ）（ケミコン社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））を用いて行うことができる。
【０１４０】
双方向移動
提供した方法の他の態様において、そこから生体分子を移動させる試料は、不浸透性の支持体によって支持されず、試料は、メンブレンの積み重ねの部材のあいだに配置される。このように、そのような態様において、一つまたは複数のメンブレンは実質的に二次元の試料の二つの面のそれぞれに隣接して配置され、試料からメンブレンへの生体分子の移動は二次元で起こる（双方向移動）。
【０１４１】
例として、この技術を図６に略図で示す。ここに、第一および第二のメンブレンの積み重ね１３ａおよび１３ｂは、試料１１を含むゲルスラブ５４を挟む。好ましくはシュライヒャー＆シュエル社から入手できるＧＢ００４ブロッティング紙で構築されたフィルターパッド２４および２６の対を、図示するようにメンブレンの積み重ねに隣接して提供する。フィルターパッド２４および２６は、トリスまたは燐酸に基づく緩衝液のような移動用緩衝液によって飽和する。
【０１４２】
図７に示すようにパッド、メンブレンの積み重ね、およびゲルを封入するために崩壊可能な液体不浸透封入体２８が提供される。封入体２８（いくつかの場合においてプラスチックバッグ）は、好ましくはカパク社（ミネアポリス、ミネソタ州）から入手可能なもののような熱密封可能な小袋／バッグである。好ましくは空気のほとんどを、軽く押し出すおよび／または真空吸引によって封入体２８から除去して、インパスルシーラー（Ｉｍｐｕｌｓｅ Ｓｅａｌｅｒ）（アメリカンインターナショナルエレクトリック社）のような熱密封器によって密封する。次に、封入体２８は、バイオラドラボラトリーズ（ハーキュルズ、カリフォルニア州）によって製造されたゲルドライヤーにおいて提供されたもののように、加熱要素５６ａおよび５６ｂの対のあいだに配置する。封入体２８およびその内容物は選択的に、約５０〜９０℃の温度、好ましくは約８０℃で約２〜４時間加熱する。いくつかの態様において、おもり３４を用いて加熱プロセスの際に圧力を適用する。
【０１４３】
封入体の内容物に適用した熱および圧力によって、蛋白質および他の分子は、ゲルまたは他の二次元試料からメンブレンの積み重ねに移動させることができる。これによって、試料の生体分子の内容物の多数のコピーまたは複製物が得られる。
【０１４４】
レーザー捕獲法による顕微解剖試料からの移動
顕微鏡下で、組織は、形態学的単位にからみあった何百もの異なる細胞タイプを有する不均一で複雑な構造であり、隣接する細胞、結合間質、血管、腺および筋肉成分、脂肪細胞ならびに炎症細胞または免疫細胞と強い接着相互作用を示す。正常または発達途中の臓器において、特定の細胞は、内部制御シグナル、隣接する細胞からのシグナル、および液性の刺激に反応して異なる遺伝子を発現し、複雑な分子変化を受ける。疾患組織において、前癌様細胞または浸潤性の癌細胞群のような対象となる細胞は、典型的に、これらの異種組織要素に取り囲まれている。疾患進行の最も決定的なものであると考えられる変化のような類似の分子変化を受ける細胞タイプは、組織生検試料の容積の５％未満を占める可能性がある。したがって、実際の組織における疾患病変の分子的分析を行うために、周辺の正常細胞から疾患細胞を「顕微解剖」する必要がある。
【０１４５】
この必要性に取り組むために、米国国立衛生研究所の研究者らは、組織切片の特異的顕微鏡領域から純粋な細胞を調達するために「レーザー捕獲法による顕微解剖（Ｌａｓｅｒ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）」（「ＬＣＭ」）として知られる技術を開発した。その全文が参照として本明細書に組み入れられる、エマート−バックら（Ｅｍｍｅｒｔ−Ｂｕｃｋ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９９８〜１００１、１９９６）；ボナーら（Ｂｏｎｎｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：１４８１〜１４８３、１９９７）を参照のこと。ＬＣＭによって、小さい群の細胞を組織切片から単離することができ、それによって研究者は高い純度の試料を得られるよう対象となる細胞のみを回収することができる。回収した後、細胞をホモジナイズして、ゲノムＤＮＡ、総細胞ＲＮＡまたは総蛋白質を単離することができる。ＬＣＭの詳細は、例えば、参照として本明細書に組み入れられ、図７に示されるように、ＰＣＴ国際特許出願国際公開公報第０９９１７０９４Ａ２号および国際公開公報第０９８３５２Ａ１号に記載されている。
【０１４６】
簡単に説明すると、レーザービームは、組織切片において顕微鏡によって同定およびターゲティングされた細胞に対して特異的に結合する特異的な転写フィルムを局所的に活性化する。結合した細胞を有する転写フィルムを薄い組織切片から持ち上げて、望ましくない細胞（その後の分析の分子純度を汚染によって低下させる）を全て残す。これによって、組織切片または細胞学調製物内の多数の均一な試料を、分子の抽出および分析のためにターゲティングしてプールすることができる。
【０１４７】
転写フィルムを取り扱うプロセスを単純にするために、フィルムは、アークツルスエンジニアリングインク社（Ａｒｃｔｕｒｕｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｃ．）（マウンテンビュー、カリフォルニア州）から入手できるもののように透明なバイアルキャップの下側に永続的に結合させてもよい。ターゲティングした細胞をキャップ表面に移した後、生体分子をキャップから抽出するために、キャップを遠心管に直接入れて、例えば、電気泳動ゲル、ＤＮＡマイクロアレイ等を用いてその後の分析のために生体分子を精製する。
【０１４８】
残念なことに、時間単位当たりに採取した材料の量は非常に少ないため、ウェスタンブロッティングのような多くの分子生物学アッセイは、ＬＣＭ−採取試料上で行うことが難しい。ＬＣＭ採取材料からの核酸の分析は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅技術によって補助されるが、蛋白質増幅は可能ではない。ＬＣＭ採取試料でのプロテオミクス研究はこのように、特に難しい。
【０１４９】
ＬＣＭの現在のもう一つの限界は、異なる細胞サブタイプ（例えば、上皮および結合組織）を、異なるキャップに移動させなければならない点である。生体分子（蛋白質および核酸）は、さらなる分析のためにキャップから除去されるため、どの細胞タイプに特定の生体分子が由来するかを決定することができないため、異なる細胞タイプを同じキャップ上で混合することはできない。このように、ＬＣＭのユーザーは、典型的に組織切片においてそれぞれの細胞タイプに関して異なるキャップを処理しなければならず、時間がかかり、実験デザインの変動を引き起こす技法である。
【０１５０】
本明細書に提供した態様には、試料から生体分子を溶出し、それらを層状または積み重ねた形状の一つまたは複数のメンブレンに結合させた後メンブレン上で生体分子を可視化することにより、ＬＣＭによって回収された試料中の生体分子を検出および分析するための方法および装置が含まれる。
【０１５１】
一般的に、ＬＣＭ転写フィルム等の中／上に埋もれた細胞試料は、一つまたは複数のメンブレンの積み重ねに隣接して配置され、生体分子が細胞試料から溶出されてメンブレンに移動するように、反応条件が提供される。次に、メンブレン上の生体分子を、一つまたは複数の検出子分子、例えば、対象となる生体分子に対して特異的親和性を有する抗体またはＤＮＡプローブを用いて検出および可視化する。
【０１５２】
図８に示すように、一つの態様の横断面は、好ましくは参照番号５８によって一般的に示されるキットの形で存在する。キット５８は一般的に、メンブレンの積み重ね１３、ＬＣＭキャップホルダー集合体６０、フィルターパッド２４および２６の対、およびプラスチックバッグ等のような液体不浸透性の封入体２８を含む。
【０１５３】
いくつかの態様において、メンブレンの積み重ね１３は、本明細書に記載するように一般的に構築されたメンブレン２０個までを含む。積み重ね１３における代表的なメンブレン１２は、蛋白質および他の生体分子に対して高い親和性を有するが、そのような分子を保持する能力が低い。もう一つの態様において、複数のメンブレンの代わりに単一のメンブレンを用いる。メンブレン１枚のみを用いる場合、特定の他の態様の低い保持能の要件を有する必要がなく、これはニトロセルロースまたはＰＶＤＦのようなブロッティング膜として従来用いられる多様な材料の如何なるものによっても構築することができる。
【０１５４】
ＬＣＭキャップホルダー集合体６０は、好ましくは金属のような熱伝導性材料で構成され、一般的に長方形の形状を有する。複数の開口部６２は、アークツルスエンジニアリング社（マウンテンビュー、カリフォルニア州）から入手可能なもののような標準的なＬＣＭキャップ６４または改変ＬＣＭキャップ６６（図１０）に適合したそれぞれの開口部を有するキャップホルダーアセンブリ６０によって定義される。キャップ６４（または６６）に標準的なＬＣＭ転写フィルム６８を取り付けて、これにＬＣＭ技法後組織試料から移動試料１１として作用する選択された細胞材料７０を接着させる。例として、ＬＣＭは、アークツルスエンジニアリング社によって推奨されたような、既知の方法に従って図７に示すような装置を用いて組織切片（凍結または固定／パラフィン抱埋切片）上で行う。
【０１５５】
第一および第二のフィルターパッド２４、２６は、好ましくはシュライヒャー＆シュエルから入手可能なＧＢ００４ブロッター紙のようなブロッティング紙で構築する。フィルター２４、２６は、トリスまたは燐酸塩に基づく緩衝液のような移動緩衝液によって飽和する。
【０１５６】
封入体２８は、他のキット成分を封入するように適合された如何なる分解性の液体不浸透材料を含んでもよい。プラスチックバッグ２８は、好ましくは、カパク社（ミネアポリス、ミネソタ州）から入手可能なもののような熱密封可能な小袋である。
【０１５７】
顕微解剖後、キャップ２６は、分子の移動が望ましい時期まで凍結保存することができる。転写フィルム６８内に埋もれた細胞材料７０を、エタノール勾配によって水和して、選択的にプロテアーゼによって軽く消化する。次に、キャップ６４（または６６）をキャップホルダー集合体６０において境界を定められた開口部６２内に挿入して、転写フィルム６８がメンブレンに直接接触するように、キャップホルダーをメンブレンの積み重ね１３に隣接して配置する。第一のフィルターパッド２４をキャップホルダー集合体６２の上に配置して、第二のフィルターパッド２６をメンブレンの積み重ね１３の下に配置する。（双方のパッドは移動緩衝液に浸す）。キット５８の組み立てた積み重ねの他の成分を挟むパッド２４および２６を封入体２８内に配置する。ほとんどの空気は、軽く押し出すか、真空吸引によって封入体２８から除去され、これをインパルスシーラー（アメリカンインターナショナルエレクトリック社）のような加熱密封器によって密封する。
【０１５８】
図９を参照して、プラスチックバッグ２８を、バイオラドラボラトリーズ（ハーキュルズ、カリフォルニア州）が製造したゲルドライヤーにおいて提供されるもののような加熱要素５６の対のあいだに配置する。バッグおよびその内容物を約６０〜８０℃の温度、好ましくは約７０℃で約２時間加熱する。おもり３４を用いて加熱プロセスの際に圧力を適用し、おもりはキットの成分として選択的に加えてもよい。
【０１５９】
他の態様において、単一の細胞タイプから多数のキャップを作製して、生体分子（蛋白質および／または核酸）を本明細書に記載のように単一のメンブレンまたはメンブレンの積み重ねに移動させる。次に、それぞれのキャップからの生体分子内容物を個別に異なる検出子分子または検出系と共にインキュベートすることができるように、１つのメンブレン（または複数）をキャップの数に対応する小片に切断することができる。
【０１６０】
細胞試料の位置がメンブレンと比較して固定されたままであるように移動プロセスの際にＬＣＭキャップの回転を防止することが望ましいかも知れない。これは、フィルム６８の特定の領域を特定の細胞タイプ（例えば、上皮対結合組織または疾患細胞対正常細胞）に割付する場合に有用となるであろう。ＬＣＭキャップの回転を防止することによって、ユーザーは、メンブレン上の生体分子の位置をフィルム６８の領域および生体分子が由来する細胞タイプに相関させることができる。このプロセスにおいてユーザーを助けるために、メンブレンおよびキャップ６４の上に線または他の印（示していない）を提供してもよい。回転を防止するために、標準的なＬＣＭキャップを図１０のように改変してもよい。改変されたキャップ６６は、ＬＣＭキャップホルダー集合体（示していない）における類似の形状の開口部にかみ合うように適合させた平坦な表面７４（図１０Ｂに示す）を定義する胴体部分７２を有する。キャップ６６および対応する転写フィルムの大きさは大きくてもよく、そのため完全な組織切片からの対象となる細胞が顕微解剖されるかまたはそうでなければ単一のキャップ上に転写され、それによって現在用いられているようなそれぞれの細胞タイプに関して異なるキャップを用いる場合と比較して時間が節約され、実験のばらつきをが減少する。
【０１６１】
「マイクロアレイ」の移動
本明細書に提供するメンブレンアレイのもう一つの用途は、ロボットシステムより安価で労力を要しないような、ｃＤＮＡまたは他のマイクロアレイの多数のコピーを作製することである。特定の態様において、複数のＤＮＡプローブ、抗体、またはその組み合わせを、複数のウェルを有するプレート（例えば、マイクロタイター等のプレート）からメンブレンの積み重ねに適用する。実質的に複製物のマイクロアレイの組を作製するために、ＤＮＡプローブまたは抗体をウェルから積み重ねに移動させる。
【０１６２】
図１１を参照して、異なる遺伝子を表すＤＮＡ配列をマイクロタイタープレート８２（例えば、９６ウェルプレート）の個々のマイクロタイターウェル８０に配置する。マイクロタイタープレート８２をメンブレン１２の積み重ね１３に隣接して配置し、マイクロタイターウェル８０の内容物をそれぞれのウェルからメンブレンの積み重ね１３に移動させる。説明した態様において、内容物がウェルのパターンに対応するパターンで適用されるように、ウェルの内容物はウェル８０からメンブレンの積み重ね１３の上部表面に移動する。
【０１６３】
ＤＮＡは、ウェルからウィック部材８４に移動する方向でメンブレンの中を移動し、試料の空間的な方向が維持される。核酸が捕獲メンブレンの積み重ね１３を横切る際に、メンブレン１２の親和性が高く、保持能が低いという特徴のために、小さい割合のＤＮＡがそれぞれのメンブレンにハイブリダイズして、それぞれがマイクロタイタープレートにおけるＤＮＡ試料の方向とマッチするＤＮＡスポットのグリッドを含む一連の複製コピーを作製する。このように、ｃＤＮＡアレイの組が、非常に迅速かつ安価に作製される可能性がある。抗体および組織溶解物アレイも同様に、この方法によって作製することができる。
【０１６４】
ＩＶ．試料のタイプ
放出可能な生体分子を含む如何なる二次元試料材料も提供された移動プロセスにおける生体分子源として用いることができる。「二次元」とは、材料が実質的に平坦で比較的薄いように調製される、または調製されうることを意味する。実質的に二次元の試料の代表的な例には、薄片（例えば、保管または凍結組織試料）のような組織試料、組織アレイ、ｃＤＮＡまたは他の核酸マイクロアレイ、蛋白質マイクロアレイ、１−Ｄ蛋白質ゲル、１−Ｄ核酸ゲル、２−Ｄ蛋白質ゲル等が含まれる。
【０１６５】
記述の移動方法、アレイ、および装置は、体液のような生体材料を検出および調べるため；食品または他の物質への生物（例えば、微生物）の混入を検出するため等の法医学技法において用いることができる。実質的に平坦および薄い形で試料を提供するために、物質を液体またはガスにおいて懸濁した後、濾紙のシートのようなフィルターの中を移動させて、選択的に固定し、次にこのフィルターを移動試料として用いる。例として、土壌試料または液体試料を移動のためにそのように調製することができる。いくつかの物質は、例えば、ローラーまたは別の伸展機械によって実質的に平坦な形に圧縮してもよい；例として、食品試料（例えば、すりつぶした肉）をそのように調製することができる。一般的にこれらの試料は、メンブレンの積み重ねに移動させる前にそれらが実質的に二次元となるようにその様式が改変されているために、構造的に変形した試料と呼ぶことができる。
【０１６６】
本明細書に提供した態様は、体液（例えば、血液、血漿、血清、尿、胆汁、脳脊髄液、房水もしくはガラス体液、または如何なる体の分泌物）、漏出液、浸出液（例えば、膿瘍または他の如何なる感染もしくは炎症部位からの液体）、関節から得られた液体等を含む如何なる生体試料において、生体分子（例えば、蛋白質または核酸）を同定するために用いてもよい。さらに、生体試料は、如何なる臓器もしくは組織（剖検標本を含む）から得ることができ、または細胞を含んでもよい。
【０１６７】
Ｖ．メンブレン
同様に本明細書において、生体分子の分離に関して記述された方法において用いることができるメンブレンが提供される。
【０１６８】
特定の態様において、メンブレンは、メンブレンの中を移動する生体分子（または蛋白質もしくは核酸のようなクラスの生体分子）に対するメンブレンの親和性を非特異的に増加させる材料を含む。例えば、メンブレンは、ニトロセルロース、ポリ−Ｌ−リジン、またはその混合物に浸す、コーティングする、または含浸してもよい。特定の実施例において、メンブレンは、生体分子がメンブレンの中を少なくとも移動しているあいだ、メンブレンに対する生体分子の非特異的結合を防止する材料による処置をしない。しかし、他の態様において、一定量ブロッキング剤が結合を全く遮断することなく、結合する生体分子の量を最小限にする限り、いくつかのそのようなブロッキング剤をメンブレンに加えることができる。特定の例において、ブロッキング剤は生体分子がメンブレンの中を移動した後、検出子に曝露する前または曝露のあいだにメンブレンに加えてもよい。
【０１６９】
特定の例において、メンブレンは、生体分子が積み重なった複数のメンブレン（例えば、１０、５０、１００個、またはそれ以上）の中を移動することができるように十分に薄い。例えば、そのようなメンブレンは、厚さが３０ミクロン未満である。メンブレンは、ポリカーボネート、酢酸セルロース、またはその混合物のようなメンブレンの中への生体分子の移動を実質的に妨害しない材料で構成してもよい。
【０１７０】
メンブレンの材料は、同一の生体分子（または生体分子の群）が、対応する位置で複数のメンブレンの中を移動するよう、生体分子がメンブレンの中を移動する際、生体分子の相対的な関係を維持してもよい。そのような例において、相対的関係のこの干渉性によって、異なるメンブレンは、「カーボンコピー」がそうであるように、互いの実質的な「コピー」となることができる。しかし、「カーボンコピー」と同様に、異なるメンブレンに存在する異なる「コピー」のあいだには何らかの差があってもよい。
【０１７１】
いくつかの態様において、メンブレンの積み重ねは、多数の個々のメンブレン、例えば少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、または場合によってそれ以上を含むであろう。積み重ねのメンブレンは一般的に本明細書に記載のように構築する。メンブレンの例は、移動される生体分子に対するメンブレンの親和性を増加させる材料でコーティングした多孔性基板で構成される。基板は、多孔性で非常に薄いにもかかわらず、十分な構造上の完全性を維持するポリカーボネートまたは類似のポリマー材料で構成してもよい。方法、装置、および機器において用いられる代表的なメンブレンは、蛋白質および／または他の生体分子に対して高い親和性を有するが、そのような分子の保持能は低い。結合プロフィールによって、生体分子はメンブレンの積み重ねの中を移動して、ごく限られた数がそれぞれの連続層上に捕獲され、それによって、試料中の生体分子の多数の「カーボンコピー」を作製することができる。言い換えれば、保持能が低いことによって、ごく限られた量の生体分子がそれぞれの層に捕獲されるために多数の複製物を作製することができる。
【０１７２】
図１２を参照して、個々のメンブレン１２は、移動される生体分子に対するメンブレンの親和性を増加させる材料でコーティングした多孔性の基板９０で構成される。基板９０は、例えば、多孔性で非常に薄いにもかかわらず十分な構造上の完全性を維持するポリカーボネートまたは類似のポリマー材料で構成される。しかしポリカーボネートの代わりに、基板９０はポリオレフィン（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン等）と同様例えば酢酸セルロースのようなセルロース誘導体で構成してもよい。
【０１７３】
説明したメンブレン１２には、蛋白質または他のターゲティング生体分子の非特異的結合を増加させるためにその上面および下面にコーティング９２が含まれる。コーティングに対する結合は、それが特定の蛋白質または特定の核酸のような他の生体分子を認識しないという意味において、「非特異的」であるが、それが、蛋白質または核酸、またはその組み合わせのようなクラスの生体分子を認識して特異的に結合するという点において特異的であってもよい。特定の開示された態様におけるコーティング９２は、ニトロセルロースであるが、ポリ−Ｌ−リジンのような他の材料も同様に用いてもよい。
【０１７４】
基板９０に適用する前に、ニトロセルロースをメタノールまたは他の適当な溶媒に０．１％〜１．０％の濃度で溶解する。メンブレンを、下記の実施例においてより詳細に説明するようにこの溶液に浸す。コーティング９２の代わりに、ニトロセルロースまたは生体分子に対する親和性を有する他の材料をポリカーボネートと混合してから、基板を形成することができ、それによって、メンブレンの所望の特徴を全て有するコーティングしていない基板が提供される。当技術分野で既知である他のコーティング法を、ラミネーションを含むディップコーティングの代わりに用いてもよい。または、両面の代わりに試料に面する表面のような一面のみをコーティングしてもよい。
【０１７５】
メンブレン１２は蛋白質および他の生体分子に対して高い親和性を有するが、そのような分子の保持能が低いことは特定の態様の特定の特徴である。この特徴によって、分子がメンブレンの積み重ねの中を移動する際に、ごく限られた数が連続する層のそれぞれで捕獲され、それによって多数の「カーボンコピー」を作製することができる。言い換えれば、低い保持能によって、ごく限られた量の生体分子がそれぞれの層に捕獲されるために、多数の実質的な複製物を作製することができる。ゲルブロッティングにおいて通常用いられるニトロセルロースメンブレンのような生体分子に対する結合能が高いメンブレンを用いる場合、多数の複製物は容易には作製できないであろう。より詳しく述べると、メンブレン１２の親和性と保持能とは、本開示の方法に従って、少なくとも５個、好ましくは１０個以上のメンブレンを積み重ねて試料に適用した場合に、対象となる生体分子のほとんどを、試料から最も遠い位置に存在するメンブレンを含む任意のおよび全てのメンブレン上で検出できるようでなければならない。
【０１７６】
図１３の参照により、上記の技術は標的生体分子１００がメンブレンに適用された結合物質（抗体または核酸プローブのような）によって間接的に捕獲される代わりにメンブレンの表面上（またはメンブレン内）で直接捕獲されるため、「直接捕獲」として記述してもよい。この開示のプロセスのあいだ、試料の異なる成分は同じ親和性であるが、その試料中の濃度に正比例してメンブレンに結合する（濃度が高い成分は、それぞれのメンブレン上でより多くの分子を残し、濃度が低い成分はそれぞれのメンブレン上でより少ない分子を残すであろう）。生体分子１００に対して図に示すエピトープ１０２で特異的に結合する標識抗体のような検出子分子１０４を利用して、メンブレンに結合した生体分子を検出してもよい。メンブレンに結合した成分の量が試料中の成分の量に比例する例では、検出子分子の量は、検出された生体分子の量（または相対量）に相関させることができる。
【０１７７】
試料から特定の群の生体分子に対する高親和性、高保持能を得るために、捕獲分子１０６によるメンブレンのコーティングを、エングラートら（Ｅｎｇｌｅｒｔ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６０：１５２６〜１５３０、２０００）に記載の方法を用いて行う。これは、「間接的捕獲」とも呼ばれ、図１４に図示する。捕獲子１０６は、ｃＤＮＡ、抗体、または対象となる標的に対して特異的な他の如何なる蛋白質ともなりうる。多くの手段（ポリメラーゼ連鎖反応、ニックトランスレーション、逆転写、オリゴヌクレオチド合成）によって作製した一本鎖ｃＤＮＡ分子または蛋白質（免疫グロブリンのような）は、メンブレンに直接結合させることができる。または、捕獲子結合を空間的に制御することができるリンカーアーム（ｌｉｎｋｅｒ−ａｒｍｓ）をメンブレンに直接結合させた後、それらに捕獲子を結合させることができる。これは、間接的捕獲能をそのように増加させる活性標的認識部位の大多数を露出する。ストレプトアビジンコーティングしたメンブレンを用いて、末端をビオチン標識した核酸および無作為にビオチン標識した蛋白質に結合させてもよく、またはプロテインＡおよびプロテインＧを用いて免疫グロブリンに結合させてもよい。
【０１７８】
もう一つの態様において（図１５に示すように）、それぞれのメンブレン１０８は、蛋白質化学の特定の特徴（例えば、疎水性、炭化水素含有量等）に基づいて生体試料中の蛋白質に選択的に結合するリガンドコーティング（例えば、それが積み重ねにおける他のものとは異なるという意味において独自のリガンドコーティング）を含む。その結果、メンブレン１０８は他の記述の態様におけるメンブレン１２の場合のようにそれらを複製するよりむしろ蛋白質を分画するように機能する。コーティングは、それぞれのメンブレンが試料中の総蛋白質内容物の選択的なサブセットに結合するように多くの異なる方法で作成することができる。例えば、小さい炭素分子から開始して長さが増加した炭素鎖をコーティングに用いることができる。炭素数が増加すると、蛋白質に対する結合能が増加する。このように、例えば、第一の層は６炭素鎖のコーティングを有し、試料中の最も疎水性の蛋白質に限って結合するが、残りの蛋白質は次の層まで通過するであろう；第二の層は８炭素鎖コーティングを有し、わずかに疎水性の低い蛋白質を引き抜くが、残りの蛋白質は通過する；第３の層は１０炭素鎖を有する等。
【０１７９】
このように、もう一つの態様において、メンブレンのそれぞれは蛋白質を３次元で；荷電および質量によってＸおよびＹ方向に、そして次に、さらなる化学特徴によってＺ方向に分離させることによって、「３−Ｄゲル電気泳動」を本質的に可能にする蛋白質の異なる群に結合するであろう。第二の態様に従うメンブレン上の蛋白質は、下記の免疫染色および造影法によって可視化されうる。それらはまた、さらなる切断をせずに、もしくはそのような切断（例えば、国際公開公報第００ ０４５１６８号を参照のこと）後の質量分析、または他の手段によって都合よく分析してもよい。方法およびキットの例は、異なるメンブレンによる層化が、標準的な２−Ｄゲル上では検出不可能な中等度から量の少ない蛋白質スポットの曝露に役立つために、そのような分析を容易にする。分析に利用できるスポットがより多ければ、質量分析またはそのような他のアプローチによって生成できるデータはより多くなる。
【０１８０】
他のメンブレンの特徴
移動のために用いられるメンブレンが蛋白質および／または他の生体分子に対して高親和性を有するが、そのような分子の保持能が低いことは、いくつかの態様の特有の特徴である。この特徴によって、分子がメンブレンの積み重ねの中を移動する際に一連の層のそれぞれの上でごく限られた数が捕獲され、それによって多数の複製の「カーボンコピー」を作製することができる。言い換えれば、それぞれの層の上で捕獲される生体分子（例えば、蛋白質）の量がごく限られているために、メンブレン材料の保持能が低いことによって、多数の複製物を作製することができる。
【０１８１】
より詳しく述べると、特定の態様において、メンブレンの親和性と保持能は、提供された方法の一つに従って少なくとも５個、好ましくは１０個以上のメンブレンを積み重ねて試料に適用した場合に、対象となる生体分子のほとんどを、試料から最も遠い位置に存在するものを含む任意のおよび全てのメンブレン上でも検出できるようでなければならない。従来のゲルブロッティングに用いられる転写メンブレンのような高い結合能を有するメンブレンを用いる場合、多数の複製物は、メンブレンに適用した生体分子の量がメンブレンの結合能を上回るのでなければ、このようにして行うことはできないであろう。
【０１８２】
大量の試料を捕獲しないようメンブレンの結合能を十分に低い状態で維持するために、基板の厚さは例えば、約３０ミクロン未満であり、特定の態様において約４〜２０ミクロン、例えば約８〜１０ミクロンである。基板の孔の大きさは、例えば、約０．４〜０．６ミクロンのような、約０．１〜５．０ミクロン、より具体的には０．４ミクロンである。薄いメンブレンを用いるもう一つの長所は、側方拡散現象を弱めることである。全体的な積み重ねの厚さが大きければ、積み重ねの中を移動する生体分子の側方拡散はより大きくなる。
【０１８３】
積み重ね／アレイにおけるメンブレンの大きさは変更することができるため、ユーザーは、多数の異なる試料を同時に分析して、それによって異なる患者の試料（例えば、異なる患者の試料、患者の試料と参照標準物質、または異なる組織もしくは種の試料等）を直接比較することができるという選択肢を有することは認識されるであろう。例えば、同じ患者からの異なる疾患段階の異なる試料を、同じ疾患を有する異なる患者の試料と同様に、並べて比較することができる。他の例として、ほとんどの２−Ｄゲルから得られた蛋白質分離領域は一般的に、約１０×１０ ｃｍ〜２０×２０ ｃｍのあいだであり；２−Ｄゲルの移動のために用いられるメンブレンは、それに従って変化する可能性がある。
【０１８４】
メンブレンの構築
メンブレン基板には、蛋白質または他のターゲティング蛋白質の特異的結合を増加させるためのその上面および下面上でのコーティングが含まれる。コーティングは好ましくはニトロセルロースであるが、ポリ−Ｌ−リジンのような他の材料も用いてもよい。基板に適用する前に、ニトロセルロースをメタノールまたは他の適当な溶媒に０．１％〜１．０％の濃度で溶解する。下記の実施例においてより詳細に説明するように、メンブレンをこの溶液に浸す。コーティングの代わりに、ニトロセルロースまたは蛋白質に対して親和性を有する他の材料をポリカーボネートと混合してから、基板を形成すると、それによってメンブレンの所望の特徴の全てを有する非コーティング基板が得られる。ラミネーションを含むディップコーティングの代わりに、当技術分野で既知の他のコーティング法を用いてもよい。全ての場合において、好ましくは、両面の代わりに、一面のみ試料に面する表面をコーティングまたは処置すると理解すべきである。
【０１８５】
フレームを取り付けたメンブレン
もう一つの態様において、図１６〜１８を参照して、フレームを取り付けたメンブレンの積み重ね１１０は、互いに取り外し可能に固定された複数の個々のメンブレン単位１１２を含む。それぞれのメンブレン単位１１２は、そのほぼ末端にフレーム１１４を取り付けたメンブレン１２を含む。メンブレン単位１１２の大きさは多様となりうるが、メンブレン１２を典型的な電気泳動ゲルの上に重ねることができるように十分に大きくなければならない。
【０１８６】
積み重ね１１０に含まれるメンブレン単位１１２の数は、ゲルから検出される蛋白質の数に応じて変化しうる。ほとんどの適用に関して、３〜２５個またはそれ以上のメンブレン、好ましくは５〜１５個、最も好ましくは約１０〜１２個のメンブレンが十分であろう。積み重ね１１０の全体的な厚さＴｓ（図１６）は、いくつかの態様において約０．２５ ｃｍ以下である。
【０１８７】
いくつかの態様において、積み重ね１１０において他のメンブレンから分離して個々に処理することができるために十分な硬度をそれぞれのメンブレンに与えるために、フレーム１１４をメンブレン１２の端部に取り付けて、それによってメンブレン単位１１２を形成する。フレーム１１４は、好ましくは記載のように空気ポケットまたは液体を手動で除去させるためのチャンネルとして機能する開いた空間またはギャップ１２０の範囲を定めながら、メンブレンの３つの面を覆う「Ｚ」形の形状を含む。
【０１８８】
フレーム１１４の組成および大きさは、ユーザーが片方の手でフレームを握り、必要に応じてメンブレンを操作するために十分な硬度を提供するようでなければならない。同時に、フレームは、積み重ねた場合に、ゲルからメンブレンの積み重ね１１０への蛋白質の移動を妨害しないように十分に薄くなければならない。積み重ね１１０におけるそれぞれのメンブレン１２は、本明細書に記載の移動プロセスの際に隣接するメンブレンと直接接触することができなければならない。
【０１８９】
フレーム１１４の幅Ｗ（図１８）は、好ましくは約０．３〜０．７ ｃｍであり、フレームの厚さＴｆは約０．００５〜０．０３ ｃｍ、最も好ましくは厚さ約０．０１ ｃｍである。このように、フレーム１１４はメンブレン１２より約１０倍厚みがある。特定の態様において、フレーム１４を含む材料は、温度８０℃までその構造を維持して機能することができるが、典型的な熱密封装置に適用すると融解することができる。当業者は、フレーム１１４の多様な組成および形状がこれらの要件を満たしうることを容易に認識するであろう。フレーム１１４を作製するために用いてもよい材料の例は、キャノン社（Ｃａｎｏｎ）から入手できる透明フィルム、またはポリカーボネート、ポリエステル、ポリ塩化ビニル、またはポリ塩化ビニレ（ｐｏｌｙｖｉｎｉｌｅｃｈｌｏｒｉｄｅ）製の他の薄いプラスチックシートである。
【０１９０】
図１７に最もよく認められるように、外側にはみ出しているタブ１１６の対は、フレーム１１４によって境界を定められている。それぞれのタブは、ゲル移動プロセスのあいだに積み重ね１１０を共に保持するために隣接するメンブレン上で対応するタブに密封されるように適合される。蛋白質がメンブレンに移動した後、タブ１１６を鋏で切断し、メンブレンを分離して異なる検出溶液においてインキュベートする。
【０１９１】
フレーム１１４の少なくとも片面は、その上に印を印刷してもよい表面１１８の境界を定める。印には、製品もしくは製造者の名称、またはメンブレンの番号が含まれてもよい。バーコード等（示していない）のような機械読み取り可能な印も同様に提供してもよい。
【０１９２】
フレーム１１４は、ゴムのりもしくは３Ｍ接着剤、または従来の熱密封もしくはラミネーション技術を用いることを含む、当業者に容易に周知の様々な手段によってメンブレン１２の周囲に取り付けてもよい。
【０１９３】
ＶＩ．メンブレン複製物の分析
移動後、処理したメンブレン（または層）を分離して、それぞれを、対象となる特定の標的に対して特異的な一つまたは複数の異なる検出子分子（核酸ハイブリダイゼーションプローブ、レクチン、または抗体のような）と共にインキュベートする。特定の態様において、用いた検出子／プローブは、標識して、またはそうでなければ化学発光のような任意の多様な技術を用いて検出可能にする。このように、それぞれのメンブレンはそれに結合した生体分子の本質的に同じパターンを有するが、適用および検出される特定のプローブを選択することによって、異なる組み合わせの生体分子をそれぞれのメンブレン上で観察することができる。
【０１９４】
例として、一つのメンブレン層は、プログラムされた細胞死（アポトーシス）に関係する蛋白質を示してもよく、隣接する層は、チロシンキナーゼのような細胞分裂に関係する酵素を示してもよい。
【０１９５】
蛋白質の他に、抗体ではなくて標識ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを用いて、核酸をターゲティングおよび検出してもよい。さらに抗体と核酸プローブの双方を積み重ねの異なる層に適用することによって、蛋白質と核酸標的の双方を同時に検出することができる。同様に、糖質は、レクチンのような糖質結合分子を用いて検出することができる。
【０１９６】
メンブレンのデジタル画像は、コダックサイエンティフィックイメージング（Ｋｏｄａｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ）（ニューヘブン、コネチカット州）から入手可能なイメージステーション（Ｉｍａｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ）（登録商標）ＣＣＤ装置を含む多様な機器を用いて作製してもよい。または、画像は、フィルム（Ｘ線フィルム）上に記録して平板スキャナによってデジタル化してもよい。ソフトウェアは好ましくは、画像を配置して密度測定機能を行うために提供される。ユーザーは、分析のために対象となる領域を選択して、シグナル強度を記録し標準化することができる。次に、数値化された強度の値を比較する。
【０１９７】
移動した蛋白質の分析に関して、本明細書記載の如何なる蛋白質移動技術による移動の後も、メンブレンを積み重ねから分離して、それぞれを所望の蛋白質に対して特異的な一次抗体の分離溶液中でインキュベートする。この蛋白質を含むバンドのみが抗体に結合し、抗体分子の層を形成する。約１〜８時間インキュベートした後、メンブレンを通常、緩衝液中で洗浄して未結合の抗体を除去する。
【０１９８】
メンブレン上の蛋白質を検出するために（バンド、スポットの形で、または組織転写物から「インサイチュー」で）、ローディングしたメンブレンを、一次抗体に結合する二次抗体中でインキュベートする。二次抗体は、基質を触媒するホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）のような酵素に共有結合させてもよく、蛋白質／抗体複合体は、ＥＣＬ、直接蛍光、または比色反応のような多くの技術によって可視化することができる。ＥＣＬが好ましい。市販の平板スキャナをフィルムと共に用いてもよい。または、ＮＥＮ社から入手可能なコダックイメージステーションのようなＥＣＬのための特殊な造影装置を利用してもよく、デジタル造影ソフトウェアを用いて、ユーザーの好みに従って画像を表示することができる。
【０１９９】
抗体の代わりに、他のリガンドを検出子として用いてもよい。リガンドは、抗体断片、受容体、受容体リガンド、酵素、ウイルスもしくはウイルス粒子、酵素基質、または特定の蛋白質に結合する他の低分子となりうる。さらに対象となる蛋白質を構造的に同定することの他に、キットはまた、蛋白質の機能的状態を同定するために用いることができる。それを行う一つの方法は、対象となる蛋白質の燐酸化状態を決定するために燐特異的抗体を用いることである。蛋白質機能を同定するもう一つのアプローチは、トライトン−Ｘ（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）（登録商標）（エチレンオキサイドと共に重合化したオクチルフェノール）中でメンブレンをインキュベートするような、当技術分野で既知の多くの技術のうち任意のものにもよって、メンブレン上で蛋白質をまず復元することである。一度復元すると、蛋白質は、その酵素活性を回復し、当技術分野で既知のいくつかの基質分解アッセイの一つを用いることができる。このアプローチによって、キナーゼ、ホスフェート、およびメタロプロテナーゼの活性を決定することができる。
【０２００】
科学研究のためのパネルを、アポトーシス、細胞周期、シグナル伝達等のような特定の細胞現象に関係する蛋白質ごとに分類してもよい。臨床診断のパネルは、アルツハイマー病、前立腺癌等のような特定の疾患に関連した蛋白質ごとに分類してもよい。
【０２０１】
多くの態様において、用いる検出子／リガンドは、増強化学発光（ＥＣＬ）、蛍光、対比リガンド染色、放射活性、常磁性、酵素活性、示差染色、核酸増幅を含む蛋白質アッセイ等のようないくつかの任意の技術を用いて標識またはそうでなければ検出可能にする。メンブレンのブロットは好ましくは走査する、より好ましくはその保存、透過、および参照を可能にするためにデジタル造影する。そのような走査および／またはデジタル化はいくつかの市販の科学造影装置の任意のものを用いて行ってもよい（例えば、パットン（Ｐａｔｔｏｎ）ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １４：６５０〜６５８、１９９３；チエツ（Ｔｉｅｔｚ）ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １２：４６〜５４、１９９１；スプラグ（Ｓｐｒａｇｇ）ら、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １２９：２５５〜２６８、１９８３；ガリソン（Ｇａｒｒｉｓｏｎ）ら、Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５７：１３１４４〜１３１４９、１９８２を参照のこと；全て参照として本明細書に組み入れられる）。
【０２０２】
検出子カクテルによる例としての検出化学
特定の態様において、蛋白質をメンブレンの積み重ねから移動させた後、個々のメンブレン層を分離して、それぞれを異なる抗体（または他の検出子分子）カクテルにおいてインキュベートする。多数の複製ブロットを作製する重要な長所は、全ての検出子が単一のブロット上に混み合わなければならない場合より多くの検出子分子（例えば、抗体）を有用に用いることができる点である。
【０２０３】
リガンドカクテルをデザインするための、そしてそれぞれのメンブレンの層上でどの蛋白質が同定されるかを決定するための例としてのプロセスを下記に提供する。第一に、対象となる蛋白質のパネルを選択する。これらは、互いに直接関係していない無作為に選択された蛋白質および／または複数の蛋白質となりうる、または一つもしくは複数の特定の細胞現象（例えば、アポトーシス、細胞周期進行）または特定の疾患（例えば、前立腺癌特異的抗原、ＰＳＡ）において役割を有することがこれまで暗示されている既知の蛋白質の群であってもよい。これらは、配列または２−Ｄゲル上での座標によって特徴が調べられている蛋白質、またはそれに対してリガンドが作製されている、もしくは作製されうる蛋白質でなければならない。注釈をつけた２−Ｄゲルのデータベースには、クエスト蛋白質データベースセンター（Ｑｕｅｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｃｅｎｔｅｒ）（ｈｔｔｐ：／／ｓｉｖａ．ｃｓｈｌ．ｏｒｇ）、スイス２−Ｄ ＰＡＧＥデータベース（Ｓｗｉｓｓ ２−Ｄ ＰＡＧＥ ｄａｔａｂａｓｅ）（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｎｓｙ．ｃｂｒ．ｎｒｃ．ｃａ／ｃｈ２ｄ）、アッペルら（Ａｐｐｅｌ、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １４（１１）：１２３２〜１２３８、１９９３）；デンマークヒトゲノム研究センター（Ｄａｎｉｓｈ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｂａｓｅ．ｄｋ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃｅｌｉｓ）、セリスら（Ｃｅｌｉｓ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３９８（２−３）：１２９〜１３４、１９９６）等が含まれる。抗体はＢＤトランスダクションラボラトリーズ（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（レキシントン、ケンタッキー州）、またはサンタクルズバイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（サンタクルズ、カリフォルニア州、アメリカ）のような多様な販売元から得てもよい。
【０２０４】
上記のように、如何なる広いクラスのリガンドも用いてもよいが、単純にするために、抗体リガンドを用いることに関連して態様を説明する。このように、メンブレン上での蛋白質の免疫学的同定は、好ましくはその標的に対して高い親和性および特異性を有する抗体の選択を含む。しかし、抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の双方がしばしば、ウェスタンブロッティング検出において一つより多くの蛋白質を認識する。この交叉反応性現象は、試料蛋白質の濃度に対して抗体濃度が増加するにつれて、ますます明白になる。したがって、抗体選択プロセスにおける第一段階は、同じメンブレン上で好ましくは蛋白質１個であるが、５個以下の蛋白質を一貫して可視化する抗体（およびその作用濃度）を選択することを含む。検出子抗体が一つより多くのスポットに結合する場合、望ましくない蛋白質（「偽スポット」）は、メンブレン上のＸ−Ｙ位置に基づいて消失させることができる。所定の蛋白質の分子量および荷電（ｐＩ）は一般的に一定であるため、移動するたびにゲル上のほぼ同じ座標で出現するはずである。
【０２０５】
試料中の２つまたはそれ以上の蛋白質が類似の大きさおよび荷電であれば、そしてしたがってゲル上で同じ一般的近位性に移動する場合、それらは同じメンブレン上で検出されればおそらく重なり合うスポットを作製するであろう。好ましい態様において、方法の例は隣接または重なり合う蛋白質を異なるメンブレン上で検出するように抗体カクテルをデザインすることによってこの問題を回避する。
【０２０６】
カクテルデザインプロセスは、以下の仮説的な例（図１９に説明）を参照して容易に理解することができる。本実施例において単純にするために、図１９ＡにおいてＡ−Ｍとして注釈をつけた蛋白質１３個を、３層のメンブレンの積み重ねのみを用いて同定しようとする。実施例において用いたリガンドは抗体であり、それぞれの積み重ねに一つずつ、それぞれが４〜６個の異なる抗体を含む３つのカクテルを用いる。
【０２０７】
第一のメンブレンカクテル（層１に対応する）では、抗体を蛋白質スポットＡに関してスクリーニングして、最も特異的な抗体を選択する。スポットＢ−Ｅに対する抗体を同じように選択する。スポットＦおよびＧはスポットＥと重なり合うため、これらを他の層のために残しておく。第二および第三のカクテル（メンブレン層２および３に対応する）は、同じ検討を用いて作製する：（１）任意の２つの抗体によって生じたスポットの位置が容易に区別することができなければ、抗体は同じカクテルにおいて用いない；（２）如何なる抗体も、もう一つの抗体によって生じたスポットの近傍にバックグラウンドのスポットを生成する場合、２つの抗体は、バックグラウンドのスポットがその層上の他のスポットから離れていなければ（例えば、他のスポットに対する抗体からの交叉反応性のために作製された層２上のスポットＢおよびＤ）、同じカクテルに含めず、その場合、そのような交叉反応性はメンブレンのスポットを鋳型と比較した場合に単純に無視される。これらの検討を仮説の例に適用すると、図１９Ｂ〜Ｄに示した層に対応する３つのカクテルが得られる。
【０２０８】
組み合わせた後、抗体カクテルの特異性を２つの異なる対照試験によってさらに調べる。第一の試験において、単一のゲルの移動から（または同じ試料を含み、同じように調製したいくつかのゲルから）作製されたメンブレンは、一つのみの抗体成分が異なるカクテルによってプロービングされる（それぞれのカクテルは抗体の一つを欠損する）。この技法の結果として、イムノブロットしたメンブレンは、一つのみのスポットが互いに異なるはずである。第二の試験において、抗体カクテルは、免疫のために用いられるエピトープ（ペプチドまたは蛋白質）の混合物と共に４〜２５℃で０．５〜１２時間インキュベートする。このインキュベーションのあいだ、遊離の抗体は適当なエピトープに結合して固定され、機能的に不活性となる。カクテルは、遊離の抗体を枯渇するようになるため、その後メンブレンをこの遊離の抗体枯渇混合物と共にインキュベートしても特異的シグナルを生じないはずである。
【０２０９】
それぞれのカクテルにはまた、「ハウスキーピング」蛋白質（すなわち、アクチン、チューブリン等のような全ての真核細胞において認められる豊富な構造蛋白質）に対する一つまたは複数の抗体が含まれる。このように、例えば、図１９のメンブレン層＃１に関して用いられる抗体は、アクチンに対する抗体を含み、スポットの産生を生じるであろう。これらの抗体は、ローディングの差に関して試料を標準化するための、そしてゲル移動プロセスによって引き起こされた如何なるひずみも代償するための内部標準として作用する。カクテルをデザインした後、それらは、試料の起源にかかわらず、カクテルを作製するために同定された同じパネルの蛋白質を同定しようとする如何なるキットにおいても再利用することができる。
【０２１０】
本開示は、多数の異なる蛋白質の特徴を同時に調べるのみならず、異なる多数の特徴に基づいて単一の蛋白質の多数の特徴を調べることができると認識される。例えば、細胞増殖および細胞周期進行にとって必要な蛋白質ｐ７０ Ｓ６キナーゼは、蛋白質の２２９位および／または３８９位のトレオニンへの燐酸基結合（燐酸化）によって活性化される。このキナーゼの同定は、その有無の決定のみならずその活性の証明を提供するであろう。例として、少なくともメンブレン４個の積み重ねを含むキットでは、４つのコピーを２−Ｄゲルから作製することができる。第一のメンブレンは、この酵素が試料中に存在するか否かを決定するために全ての蛋白質に対して特異的な抗体中でインキュベートされるであろう。第二のメンブレンは、酵素が活性であるか否かを決定するためにキナーゼアッセイにおいて用いることができる。第三のメンブレンは、酵素の活性がこの部位の活性化によるか否かを決定するためにホスホ−ｐ７０ Ｓ６キナーゼ（Ｔｈｒ ２２９）抗体によってプロービングすることができる。第四のメンブレンは、酵素の活性がこの部位の活性化によるか否かを決定するためにホスホ−ｐ７０ Ｓ６キナーゼ（Ｔｈｒ ３８９）によってプロービングすることができる。これらの試験は全て、単一の試料について行われるため（同じ試料の異なるバッチよりむしろ）、得られた情報はより信頼できる。
【０２１１】
抗体カクテル（図４および５において参照番号３８によって示される）は、好ましくはバイアルに保存し、バイアルは好ましくはプラスチックまたはガラス製であり、選択的に対象となる蛋白質標的の「パネル」を作製するためのキットに含まれる。科学研究のためのパネルは、アポトーシス、細胞周期、シグナル伝達等のような特定の細胞現象に関係する蛋白質ごとに分類してもよい。臨床診断のパネルは、アルツハイマー病、前立腺癌等のような特定の疾患に関連した蛋白質ごとに分類してもよい。
【０２１２】
ＶＩＩ．キット
開示の他の態様には、試料中の生体分子（蛋白質または核酸のような）を検出するためのメンブレンアレイを含むキットが含まれる。アレイには、そのそれぞれが生体分子に対して非特異的または実質的に同じ親和性を有する複数のメンブレンが含まれる。特定の提供されたキットには、少なくとも一つのメンブレン上で捕獲された生体分子を検出するために、抗体またはプローブ（または抗体混合物、プローブ混合物、もしくは抗体とプローブとの混合物）のような検出子分子の一つまたは複数の容器が含まれる。キットの特定の例において、メンブレンは、生体分子に対する基板の親和性を増加させるための材料（ニトロセルロースのような）を含むまたはそれによってコーティングされたポリマー基板である。
【０２１３】
キットはさらに、検出子／リガンド生体分子結合の検出を行うための試薬、および／または特定の検出子もしくは検出子カクテルを特定のメンブレンに適用することを表示する説明書もしくはラベルを含む。本明細書において検討したソフトウェアのようなソフトウェアもキットに含めてもよく、またはモデム、インターネット、郵送、もしくは他の手段によってアクセスしてもよい。
【０２１４】
生化学経路のような特定の群の蛋白質に対する一次抗体を、選択的にキットに含めてもよい。または、ユーザーは一次抗体を供給することができる。
【０２１５】
方法およびキットによって、数千個までの異なる蛋白質スポットを、同定、注釈、およびユーザーの選択肢としてデータベースに保存された他の生体試料から生じた蛋白質スポットのパターンと比較することができる。
【０２１６】
第一のキット３６および第二のキット５８を含む特定のキットの態様を上記に記述してきた。同様に、ゲル電気泳動によって分離された蛋白質の群を同定する（すなわち、検出、注釈、および／または特徴を調べる）ための方法およびキット１２２に向けられるもう一つの態様を提供する。図２０に示すように、代表的なキット１２２は、以下の成分を含む：（ｉ）その上に蛋白質を移動させるメンブレンの積み重ね１３、またはフレームを取り付けたメンブレンの積み重ね１１０（図のように）、（ｉｉ）蛋白質移動試薬１２４、および（ｉｉｉ）染料１２６および蛋白質特異的検出子分子１２８のような蛋白質検出子分子。キットにはまた、調べる生体試料の「プロテオーム画像」を作製して、それをデータベースにおける他の試料からのプロテオーム画像と比較するために、ユーザーが作製された画像を分析および操作することができるソフトウェア４６（図２０において示していない）が含まれてもよい。または、ソフトウェアはキットとは無関係に獲得またはアクセスしてもよい。
【０２１７】
いくつかの態様において、移動試薬はまたキットと共に提供される。移動試薬の例には、アルカリｐＨ（例えば、８．０〜９．５）で、メタノール（通常、２０％もしくはそれ未満）および／またはＳＤＳ（いくつかの態様において、０．０５％もしくはそれ未満、特定の態様において０．０２５％もしくはそれ未満）を含むまたは含まないトリス、燐酸塩、トリス／グリシンまたは燐酸塩／グリシン緩衝液が含まれる。そのようなキットの例において用いることが適している移動試薬の特定の例を実施例に説明する。
【０２１８】
対象となる蛋白質を同定する他に、蛋白質の機能的状態を同定するために用いることができるキットが提供される。それを行う一つの方法は、対象となる蛋白質の燐酸化状態を決定するために燐特異的抗体を用いることである。蛋白質の機能を同定するためのもう一つのアプローチは、トライトンＸ−１００（登録商標）（オクチルフェノールエチレンオキサイド縮合物）中でメンブレンをインキュベートするような、当技術分野で既知の多くの技術によってメンブレン上の蛋白質をまず復元することである。復元されると、いくつかの蛋白質は、その機能的活性を回復して、当技術分野で既知のいくつかの基質の分解または改変アッセイ法の一つを用いることができる。このアプローチによって、キナーゼ、ホスフェート、およびメタロプロテナーゼ等の活性を決定することができる。
【０２１９】
ＶＩＩＩ．装置と機器
特定の提供された態様において、特に接触移動を用いる態様において、移動は、積み重ねに熱および／または圧力を適用するゲル乾燥器型の機器に、組み立てたメンブレンの積み重ねを配置することによって行うことができる。適用された熱と圧力の組み合わせによって、蛋白質および／または核酸および／または糖質および／または脂質を含む生体成分は、試料１１からメンブレンの積み重ね１３に移動する。これによって、少なくとも部分的にメンブレンの結合特徴によって、組織試料の生体分子内容物の多数のコピーまたは複製物が作製される。
【０２２０】
ゲル乾燥器の代わりに、特殊な機器１３０（図２１）を用いて試料およびメンブレンの積み重ねに熱および／または圧力を提供してもよい。この機器は、それぞれが実質的に平坦な表面１３２の一部として作用する面１３２ａ、１３２ｂを有する本体１３４、および蓋１３６を含む。表面は、本体１３４の上面１３２ｂと蓋１３６の下面１３２ａによって直接提供してもよく、または本体１３４もしくは蓋１３６の面１３２ａ、１３２ｂに配置された実質的に平坦なパネルもしくは他の平坦な物体によって提供してもよい。
【０２２１】
実質的に平坦な表面の一方または双方は、それらのあいだに圧力を提供するために確実に適当に接触するように突出してもよい。説明した態様において、例えば、上部の実質的に平坦な面１３２ａは、蓋１３６の下面１３２ａから突出する部材の表面である。いくつかの態様において、一つまたは他方、または双方の実質的に平坦な面１３２ａ、１３２ｂは、試料およびメンブレンの積み重ねに適用された圧力が、積み重ねの表面上で比較的完全で均一であることをさらに確保するために圧縮可能であってもよい（例えば、いくぶんスポンジ様）。
【０２２２】
図２１に説明したものを含むいくつかの提供した態様において、蓋１３６は、本明細書に記載の生体分子の移動を促進するように、蓋１３６の下に配置した試料とメンブレンの積み重ねとに対して十分な圧力を提供するために十分なおもりであってもよい。そのようなおもりは必要ではないが、蓋１３６が十分な重さを提供しないそれらの態様では、圧力を適用する別の仕組みを含める。そのような手段には、例えば、蓋１３６の上面に配置したおもり３４のような異なるおもり（示していない）、または移動を促進するために必要な圧力の量を提供するために十分な力で基部１３４に向けて蓋１３６を駆り立てるクリップ、バネ、クランプ等が含まれる。
【０２２３】
いくつかの態様において、蓋１３６は、蓋１３６を持ち上げた場合にそれが本体３４から完全に外れないで、少なくとも１カ所で繋がったままであるように、本体１３４に蝶番によって結合してもよい。説明の例において（図２１）、本体１３４と蓋１３６とのあいだの結合を維持するために２つの蝶番１３８が提供される。特定の態様において、単独または複数の蝶番１３８は、それらが蓋１３６および本体１３４のあいだに何らかの遊びが許容されるという点において、「緩い」、または「浮いている」。この遊びによって、装置は、積み重ねに対してなおも適当に十分かつ均等な圧力を適用しながら、構築された異なる厚さの接触移動積み重ねに適応することができる。いくつかの態様は、アレイを並べて多数の積み重ねをそれに適合させるために十分に大きいが、実質的により厚みのある積み重ねが面１３２ａ、１３２ｂのあいだに存在する場合、適用した圧力がより薄い積み重ね上では適当でない可能性があるため、実質的に異なる厚さの積み重ねを同じ装置で同時に移動させることは推奨されない。
【０２２４】
装置１３０のいくつかの態様は、接触移動積み重ねに圧力と共に熱を供給することができる。これらの態様は、例えば、実質的に平坦な面１３２ａ、１３２ｂの片面または両面に熱を提供するヒーター要素（示していない）を本体１３４または蓋１３６またはその双方に含んでもよい。そのような加熱される装置１３０の例は、内部または外部電源、例えば、バッテリー（示していない）または交流電流源との接続（示していない）を備える。表面に熱を提供するための方法および仕組みは、提供された熱のレベルを制御するためのサーモスタットと同様に周知である。加熱された装置１３０の特定の例には、熱が発生するか否かを制御するための仕組み（例えば、図２１に示す「オン／オフ」スイッチ１４０）、産生した熱のレベルを調節するための仕組み（例えば、ユーザーの制御を伴うまたは伴わないサーモスタット）、および／または装置が加熱しているまたは加熱された時期を示す指示器が含まれる。説明の態様において、表示光１４２が提供され、これは装置が工場設定温度（例えば、８０℃）に達して、このように使用する準備ができたことを知らせることができる。
【０２２５】
蓋１３６と本体１３４の両方にヒーター要素を含む加熱された装置１３０の特定の例には、装置のスイッチを入れた場合に一つ、もう一方、または双方のヒーター要素が連動するか否かを選択するための仕組みまたは制御装置（ダイアル１４４のような）が含まれてもよい。
【０２２６】
ＩＸ．適用
封入体の内容物に適用された熱および圧力によって、蛋白質および他の分子は抱埋された細胞材料からメンブレンの積み重ねに移動することができる。これによって、細胞試料の生体分子内容物の多数のコピーまたは複製物が得られる。次に、処理したメンブレン（または層）を分離して、それぞれを、対象となる特定の標的に対して特異的な一つまたは複数の異なるプローブまたは抗体と共にインキュベートする。用いたプローブは、化学発光のような多様な任意の技術を用いて標識するかまたはそうでなければ検出可能にする。このように、それぞれのメンブレンは、それに結合した蛋白質の本質的に同じパターンを有するが、適用するように選択された特定のプローブまたは抗体のために、蛋白質の異なる組み合わせがそれぞれのメンブレンにおいて可視化される。例えば、一つのメンブレン層は、プログラムされた細胞死（アポトーシス）に関係する蛋白質を表示してもよく、隣接する層は、チロシンキナーゼのような細胞分裂に関係する酵素を表示してもよい。蛋白質の他に、抗体の代わりに標識ＤＮＡプローブを用いて核酸をターゲティングしてもよい。さらに積み重ねの異なる層に抗体とプローブの双方を適用することによって、蛋白質と核酸標的の双方を同時に検出することができる。市販の平板スキャナおよびデジタル造影ソフトウェアは、ユーザーの好みに従って画像を表示するために用いることができる。
【０２２７】
図２０を参照して、キット１２２は、二次元ゲルおよび一次元ゲルの双方のゲル電気泳動上で分離された蛋白質を同定するために用いてもよい。蛋白質を生体試料から単離して、本明細書において記述される技術およびマナベら（Ｍａｎａｂｅ、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２１（６）：１１１６〜１１２２、２０００）；オウら（Ｏｈ， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２０：７６６〜７７４、１９９９）；ダン（Ｄｕｎｎ、Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． ４１８：１４５〜１８５、１９８７）において記述される技術のような、当技術分野で周知の技術に従ってゲル上で分離する。
【０２２８】
いくつかの態様において、ゲル５０を泳動した後これを電気泳動装置から取り外し、ウェスタンブロットを作製する場合に典型的に用いられるタイプのような転写装置に挟んで配置する。そのような装置は、例えばバイオラドラボラトリーズ社、ノベックス社（Ｎｏｖｅｘ， Ｉｎｃ．）、およびアマシャムファルマシア社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から入手可能である。メンブレンの積み重ね１３は、図２２に示すように、ゲル５０に隣接する電極のあいだに配置する。図２２では約半ダースのメンブレンを示しているに過ぎないが、パネルにおいて同定を試みる標的数、試料中に存在する蛋白質の量、およびメンブレン１２を構築するために用いられる材料の厚みに応じて１００個までののメンブレンを用いてもよいと認識されるであろう。選択的に、メンブレン１２は、その完全性を維持して汚染を防止するのに適した密封封入体またはフレーム（示していない）に一括してもよい。好ましくはフォーム、ゴム、または濾紙および濾紙の層１４で構築されるスポンジパッド１３０も同様に、図２２に示すように電極のあいだに挟まれる。
【０２２９】
移動緩衝液（２５ ｍＭトリス ｐＨ ８．３、１９２ ｍＭグリシン、０．０２５％ＳＤＳ、および２０％メタノール）を適用して、蛋白質をゲル５０からメンブレン１２に溶出させて移動させる。湿式タンク移動、および半乾燥移動を含む、そのような移動を行うための如何なる多様な従来の方法も用いてもよい。湿式タンク移動の場合、メンブレンを緩衝液を含むタンクに浸す；半乾燥移動の場合、メンブレンは湿らせたパッドによってブロッティングする。いずれの場合も、メンブレンに電圧（例えば、１２５〜１５０ ｍＡｍｐｓを１〜１０時間）を適用する。そのような移動において、メンブレンとゲルのあいだがきっちりと接触していることが重要である。湿式タンク移動が好ましい。１０×１０ ｃｍ２のメンブレンの場合、緩衝液４００〜５００ ｍｌを含むタンクを用いてもよい。好ましい移動条件は６０〜１１０ ｍＡｍｐｓで１〜２時間である。
【０２３０】
移動後、メンブレンを分離して検出子抗体と共にインキュベートする。抗体は、求める標的分子のタイプに基づいて選択する。メンブレンを緩衝液中で洗浄し、蛋白質／検出子複合体は、ＥＣＬ、直接蛍光、または比色もしくは熱量測定反応のような多数の技術を用いて可視化することができる。シグナルを検出または記録するために、市販の平板スキャナをフィルムと共に用いてもよい。または、コダックイメージステーション（ＮＥＮ）のような特殊な造影機器（例えば、ＥＣＬに関して）を用いてもよい。デジタル造影ソフトウェアは、本明細書に記載するように、ユーザーの好みに従って画像を表示するために用いることができる。
【０２３１】
２−Ｄゲルを用いる他に、提供された方法は、大きさによって蛋白質を分離する従来のゲルのような１−Ｄゲルおよびゲルシフトアッセイ法によって分離された蛋白質を同定するために用いてもよい。ゲルシフトアッセイ法（「移動度シフトアッセイ法」としても知られる）は、蛋白質とＤＮＡとの相互作用を調べるために最も一般的に用いられているツールである。アッセイは、推定の蛋白質結合部位を含むＤＮＡ断片の標識およびその部位に結合する蛋白質と共に標識断片をインキュベートすることに基づく。それらが相互作用する場合、複合体が形成されると思われる。蛋白質源が細胞抽出物の場合（インビトロで合成した蛋白質溶液ではなく）、複合体は、互いに相互作用する同一性が未知の多くの蛋白質を含む可能性がある。結合後、ＤＮＡと蛋白質の混合物を非変性ポリアクリルアミドゲルにローディングして、蛋白質をその大きさに基づいて分離する。ＤＮＡ−蛋白質複合体は、Ｘ−線フィルムへの露出、または他の手段によって可視化される。ゲルにおけるバンドが高ければ、ＤＮＡ−蛋白質複合体の大きさはより大きくなる。ほとんどの場合、このタイプの分析では、複合体における蛋白質の同一性は判明しない。
【０２３２】
図２３に示すように、メンブレンの積み重ね１１０は、一次元（１−Ｄ）ゲル１３２または二次元（２−Ｄ）ゲル（この図に示していない５０のような）上で分離された蛋白質と共に、アガロースゲル上で分離された核酸を含む、電気泳動ゲル上で分離された生体分子を同定するために用いてもよい。以下の説明は、１−Ｄゲルの蛋白質検出に関連した態様を用いることに関する。
【０２３３】
蛋白質を生体試料から単離して、ゲル１３２、例えば厚みが０．５〜２．０ ｍｍの四角形のスラブゲルとして成形された、典型的にドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルに適用して分離する。本開示にとって有用な成形前のゲルは、インビトロジェン社（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）（カールスバッド、カリフォルニア州）を含む多様な販売元から得ることができる。
【０２３４】
蛋白質３０ μｇ未満をゲルのそれぞれのウェルにローディングする従来のブロッティングとは異なり、本明細書に記載の特定の方法に従って、蛋白質約５０〜１００ μｇをそれぞれのウェルにローディングする。ローディングした量は、作製されるメンブレンの「コピー」数および検出したい蛋白質の大きさに依存すると思われる（実施例１１を参照のこと）。
【０２３５】
いくつかの態様において、移動緩衝液１２４の成分は異なる容器で提供し、これを組み合わせて適用して、ゲル１３２からメンブレン１２に蛋白質を溶出および移動させる。それぞれの移動において約５００ ｍｌを用いてもよく、移動の平均的な時間は約１〜２時間である。図２３、２４および６を参照して、いくつかの代わりの技術の一つによって、ゲル１３２上の分離した蛋白質をフレームを取り付けたメンブレンの積み重ね１１０に移動させる（フレームを取り付けていないメンブレンの積み重ねを用いることもできる）。
【０２３６】
図２４に示す第一の技術は、ミニセルユニット（バイオラドラボラトリーズ、カリフォルニア州）のような標準的なゲル電気ブロッティング装置を用いる電気的泳動を含む。ゲル１３２を電気泳動装置から取り外してメンブレンの積み重ね１１０に隣接して配置する。ゲル１３２およびメンブレンの積み重ね１１０を、図示するようにスポンジパッド１３０を配置した電気ブロッティング装置１３８の陽極１３４と陰極１３６とのあいだに配置する。電気ブロッティング装置１３８は、約５９〜６３ボルトの電圧で約６０〜７０分間活性化する。
【０２３７】
第二の移動技術（双方向接触移動と呼ばれる）を図６において説明する。第一および第二のメンブレンの積み重ね１３ａおよび１３ｂは、ゲルスラブ５４を挟む。例えば、シュライヒャー＆シュエル社から入手可能なＧＢ００４ブロッター紙のようなブロッティング紙で構築されたフィルターパッド２４と２６の対を、図示するようにメンブレンの積み重ねに隣接して提供する。フィルターパッド２４および２６は、トリスまたは燐酸基剤の緩衝液のような移動緩衝液によって飽和する。
【０２３８】
図６に示すように、パッド、メンブレンの積み重ね、およびゲルを封入するために、崩壊可能な液体不浸透性の封入体２８を提供する。プラスチックバッグ封入体２８は、好ましくはカパク社（ミネアポリス、ミネソタ州）から入手可能なもののような熱密封可能な小袋である。多くの態様において、例えば、軽く押し出すおよび／または真空吸引によってバッグ２８から空気の大半を除去することが最善である。次に、バッグをインパルスシーラー（アメリカインターナショナルエレクトリック社）のような加熱密封器によって密封する。次に、封入体２８を、バイオラドラボラトリーズ（ハーキュルズ、カリフォルニア州）社が製造したゲル乾燥器に提供されたもののように加熱要素５６ａおよび５６ｂの対のあいだに配置する。バッグおよびその内容物は、好ましくは約５０〜９０℃の温度で、好ましくは約８０℃で約２〜４時間加熱する。圧力は好ましくはおもり３４を用いて加熱プロセスのあいだ適用する。または熱および／または圧力を適用するための特殊な装置（図２１に示すような）を用いることができる。
【０２３９】
封入体の内容物に適用された熱および圧力によって、蛋白質および他の分子はゲルからメンブレンの積み重ねに移動する。これによって、ゲルの生体分子内容物の多数のコピーまたは複製物が得られる。
【０２４０】
プロテオームの蛋白質を同定するために用いる他に、本明細書に提供した方法およびキットは、蛋白質の濃度を測定するために用いることができる（絶対値として、または他の蛋白質の濃度に対して）。同様にそれらの方法およびキットは、蛋白質の変種の分布を測定するため、同定された（例えばヒト）蛋白質に対して構造もしくは機能が類似である蛋白質を同定するため、または特定の蛋白質もしくは蛋白質変種（形質または表現型に連鎖するまたは関連する可能性がある）を発現する植物クローンまたはトランスジェニック動物を同定するために用いることができる。
【０２４１】
Ｘ．画像分析ソフトウェア
ソフトウェア４６は、キット（例えば、キット３６、５８、または１２２）に含まれるディスケット上で提供することによって、またはインターネットもしくは私的なイントラネットワークでダウンロードするためにアクセスできるようにすることによって、または他の手段によって、提供されたキットの如何なるユーザーも利用できる。ソフトウェア４６の機能は、検出子分子（抗体カクテル３８のような）によって作製された目に見えるスポットを、調べる試料のプロテオームに関する有用な情報に翻訳することである。この情報には主に、対照と比較して試験試料中の蛋白質の量、および場合によってはこれらの蛋白質の特定の機能的局面に関する情報が含まれる。適したソフトウェアは、多様な情報源（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．２ｄｇｅｌｓ．ｃｏｍ／ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌおよびｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｐｒｏｔｅｏｍｅ．ｏｒｇ．ａｕ）から得ることができる、またはそれらから適合させることができる。
【０２４２】
所定のパネル／キットに関してどの分子（例えば、蛋白質）がそれぞれの層上で同定されたかを決定した後、２−Ｄゲルに関して示されるような鋳型画像（参照番号１４０）をそれぞれの層に対応して（図２５）作製して、ソフトウェア４６に保存する。この例において、それぞれの蛋白質の２−ＤゲルＸ−Ｙ座標は、多くの如何なる引用文献およびデータベースからも確認することができる。このように、図２５に関して、鋳型画像１４０は、層に割付された全ての標的化分子が標識「ハウスキーピング」蛋白質１４２ａ、１４２ｂ、１４２ｃと共に調べる試料中に存在する場合、メンブレンはどのように見えるかという画像である。それぞれの抗体カクテルは、先に概要した選択プロセスの結果として、それが適用される対応するメンブレン上に独自のドットパターンを生成する。鋳型メンブレン１４０は、ユーザーによって作製された実験メンブレンを分析するために、画像プロセシングソフトウェアによって用いられる。鋳型の重要な特徴は、内部目標１４２の存在である。これらのスポットは、起源にかかわらず、あらゆる試料に存在するハウスキーピング蛋白質に対してターゲティングされる抗体の組を起源とする。その関係は常に同じであるため、これらの目標はローディングの差に関して試料を標準化するように、そしてゲル移動プロセスによって引き起こされた如何なるゆがみも代償するように作用する。
【０２４３】
画像分析は、実験的メンブレンのデジタル化画像から開始する。第一段階として、ユーザーは、鋳型をメンブレンとマッチさせる。次に、ソフトウェアは、鋳型の像とメンブレンの像とを比較して、スポット／バンドの配置を行う。ユーザーは、肉眼での配置を制御する選択肢を有し、軽微な相違を手で修正することができる。分析の第二段階は、実験メンブレン上でのスポットの密度測定読み取りが含まれるであろう。このデータをデータベースに保存する。第三段階には、数値データ操作が含まれる。メンブレン上のそれぞれの実験スポットの強度の値を、目標スポットの値で除する。この段階は、メンブレン上のそれぞれのスポットに関して標準化した強度の値を生成する。このように、関係する全てのスポットは、互いに比較することができる。
【０２４４】
ソフトウェア４６によって、好ましくは、ユーザーは行うべき比較分析の種類を選択することができる（すなわち、一つの試料に存在するスポットもしくはバンドをもう一つの試料におけるスポットもしくはバンドと比較する、または一つのメンブレン上に存在するスポットもしくはバンドを同じメンブレンの積み重ね内のもう一つのメンブレンのそれと比較する）。分析結果は、例えば表の形で表示され、ユーザーには、戻って関係する像の拡大部分を比較する選択肢が与えられる。
【０２４５】
一つの態様において、ソフトウェアにメンブレンの画像のそれぞれに対応する鋳型の画像を提供する。そのようなソフトウェアによって、ゲル上の蛋白質のスポットの垂直および水平の位置に基づいてそれぞれのスポットにおける蛋白質の同一性を確認することができる。そのようなソフトウェアの例によってまた、本明細書に記載の定量的または半定量的読み出しを提供するために、それぞれのスポットの密度を計算することができる。そのようなソフトウェアはまた、異なる疾患試料と正常試料との比較を行うことができるように他のゲルから作製された画像のデータベースにリンクさせてもよく、または画像もしくはデータとリンクさせてもよい（構造、配列、機能等）。
【０２４６】
いくつかの態様において、ソフトウェアはまた、広布に染色する試料またはゲルの原版画像に、バンド、スポット、または細胞の画像を重ねるために提供される。そのようなソフトウェアの例の重要な特徴は、バンドまたはスポットの密度を決定してそれらを対照と比較することによって生体分子を定量できることである。このプロセスは、「標準化」として知られる。１−Ｄゲルの分析に関して、イーストマンコダック社（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．）から入手できる１−Ｄ画像分析ソフトウェアのような多様な市販のプログラムを用いてもよい。
【０２４７】
本発明を一般的に説明したが、本発明は、説明するために提供するのであって、特に明記していない限り本発明を制限すると解釈されない、以下の実施例を参照することによってより容易に理解されるであろう。
【０２４８】
実施例
実施例１
蛋白質結合のためのポリカーボネートメンブレンの構築
未変性の非コーティングポリカーボネートメンブレン（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マサチューセッツ州）は、蛋白質に対する親和性が低く、蛋白質の結合能が低い。この蛋白質結合特徴を改善するために、ポリカーボネートメンブレンをポリ−Ｌ−リジン（図２６においてＰＣ＋リジンと呼ぶ）またはニトロセスロース（図２６においてＰＣ＋ＮＣと呼ぶ）のいずれかによってコーティングした。メンブレン（１７７ ｃｍ２）を０．１％ポリ−Ｌ−リジン水溶液または０．１〜１．０％ニトロセルロースの１００％メタノール溶液のいずれか５ｍｌに１分間浸した。コーティング後、メンブレンを垂直にして吊し、室温で５〜１０分間空気乾燥させた。ポリ−Ｌ−リジン処置メンブレンは使用前に５０℃で２時間さらに焼いた。処置および非処置メンブレンの小さい四角片（０．２５ ｃｍ２）をＴＢＳＴ溶液（５０ ｍＭトリス ｐＨ ８．０、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、および０．０５％ツイーン−２０）において、Ｃｙ３蛍光色素（アマシャムファルマシアバイオテック社、アメリカ）によって標識した１．０〜１００．０ ｎｇ／μｌヤギ免疫グロブリンと共に室温で０．５〜２時間インキュベートした。
【０２４９】
メンブレンをＴＢＳＴにおいて洗浄して、ＳＴＯＲＭスキャナ（モレキュラーダイナミクス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）、アメリカ）上で調べた。結果を図２６Ａに示す。シグナル強度はイメージクアント（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ）（モレキュラーダイナミクス社、アメリカ）によって定量し、異なる５実験からのデータポイントをマイクロソフト社（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）のエクセル（Ｅｘｃｅｌ）を用いてプロットした。図２６Ｂに示す結果は、ポリカーボネートメンブレンが低い蛋白質結合能を有し、これはポリ−Ｌ−リジン（ＰＣ＋リジン）またはニトロセスロース（ＰＣＮＣ）によってメンブレンをコーティングすることによってかなり増強できることを示している。
【０２５０】
実施例２
調製したポリカーボネートメンブレン層の多孔性の試験
製造した層の多孔性を調べるために、未変性のポリ−Ｌリジンまたはニトロセスロースによってコーティングしたメンブレンを、如何なる蛋白質結合も防止するために、５０ ｍＭトリスｐＨ ８．０中で５％ウシ血清アルブミン溶液においてブロッキングした。５１ ｃｍ２の小片を切断して、共に重ね合わせて積み重ねを作製した。蛋白質を捕獲するために（ＮＣ−トラップ）ブロッキングしていない純粋なニトロセルロース層を底に用いた。正常な乳腺組織の隣接する３つの厚さ２０ μｍの凍結切片を、孔径５．０ｕｍ のポリカーボネートメンブレン上に採取して、２％アガロースゲルに抱埋し、それぞれの積み重ねを通して並べて移動させた。ＴＢＳＴ緩衝液５０〜１００ ｍｌをメンブレンの積み重ね１平方センチメートル当たり用いて、移動の平均時間は１時間であった。移動後、組織切片に残っている蛋白質およびＮＣ−トラップ上の総蛋白質をポンソーＳ染色（シグマ社（ＳＩＧＭＡ）、ミズーリ州）によって可視化した。
【０２５１】
図２７に示すように、積み重ねの中を移動してニトロセルロース層に捕獲された総蛋白質の概要は、適用した組織切片の概要に非常に類似していた。このことは、蛋白質が移動するためにメンブレンが十分に多孔性であるのみならず、少なくとも５０個までのポリカーボネートメンブレンを、側方拡散のために画像が明らかに歪むことなく、この種のアッセイにおいて用いることができることを示唆している。
【０２５２】
実施例３
ニトロセルロースコーティングポリカーボネート層に対する低い蛋白質結合能の証明
実施例１および２は、蛋白質溶液が単一のニトロセルロースコーティングポリカーボネート層に結合できること、そして層を蛋白質によって完全に飽和してもその多孔性に影響を及ぼさないことを証明する。どれほど多くの総蛋白質が組織切片移動のあいだに個々の層上で捕獲されたかを確認するために、正常および腫瘍乳腺組織の厚さ２０ミクロンの凍結切片を、孔径５．０ｕｍのポリカーボネートメンブレン上で互いに隣接して配置して、２％アガロースゲルに抱埋して、２５ ｍＭトリスｐＨ ８．３、１９２ ｍＭグリシン、０．０５％ＳＤＳおよび２０％メタノールを含む緩衝液１００ ｍｌ／ｃｍ２において、ニトロセルロースコーティングポリカーボネート層１４層の中を、底のＮＣ−トラップまで移動させた。移動後、組織切片に残った蛋白質をポンソーＳ（Ｐｏｎｃｅａｕ Ｓ）染色（シグマ社、アメリカ）によって可視化し、ＮＣ−トラップ上で捕獲された溶出した総蛋白質をＢＬＯＴファストステイン（ＢＬＯＴ ＦａｓｔＳｔａｉｎ）（ケミコン社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、アメリカ）を用いて可視化した。トラップ上で作製された像は、メンブレンの中を蛋白質が首尾よく移動したことを証明した。
【０２５３】
移動の際に各メンブレン上で十分な総蛋白質が捕獲されたか否かを決定し、免疫学的検出を行うために任意に選択した抗体１４個を用いた。抗体は：抗ＧＡＰＤＨ、１：１００（ケミコン社、ＭＡＢ３７４）；抗Ｒｓｋ、１：１，０００（トランスダクションラボラトリーズ社（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｒ２３８２０）；抗Ｓｔａｔ５ａ、１：５００（サンタクルズバイオテクノロジー社、ｓｃ−１０８１）；抗ＩＦＮα、１：５００（バイオソース社（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）、ＡＨＣ４８１４）；抗ＲＡＲα、１：１，０００倍希釈（バイオモル社（Ｂｉｏｍｏｌ）、ｓａ−１７８）；抗ホスホＥＧＦＲ、１：１，０００（アップステート社（Ｕｐｓｔａｔｅ）、０５−４８３）；抗非ホスホＥＧＦＲ、１：１，０００（アップステート社、０５−４８４）；抗ホスホＮＲ１、１：５００（アップステート社、０６−６５１）；抗Ｓｔａｔ１、１：２，０００（トランスダクションラボラトリーズ社、Ｇ１６９２０）；抗Ｒｂ、１：１，０００（サンタクルズバイオテクノロジー社、ｓｃ−５０）；抗Ｊａｋ１、１：５００（サンタクルズバイオテクノロジー社、ｓｃ−２９５）；抗チューブリンα、１：５００（サンタクルズバイオテクノロジー社、ｓｃ−５５４６）；抗βアクチン、１：２，０００（シグマ、Ａ５４４１）であった。
【０２５４】
ポリカーボネート層をまず、１×カゼイン溶液（ベクターラボラトリーズ社（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）、アメリカ）において室温で１時間ブロッキングして、図２８に記載する一次抗体中で４℃で一晩インキュベートした後、ＴＢＳＴによって洗浄して、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合二次抗体（１：２，０００）（ロックランド（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）、アメリカ）においてインキュベートした。次に、メンブレンを増強化学発光（ＥＣＬ）基質（ベクターラボラトリーズ、アメリカ）において５分間インキュベートした後、メンブレンをＸ−線フィルム（コダック社、アメリカ）に露出して蛋白質を可視化した。
【０２５５】
結果は、本明細書において提供した方法が、多数の異なる蛋白質を検出できることを示した。総蛋白質の量に関してメンブレンがどのように捕獲するかを確認するために、メンブレンをそれぞれ同じ抗体と共にインキュベートして、それぞれの上での蛋白質内容物の定量を行った。抗ＧＡＰＤＨ抗体を室温で３時間用いて、ＴＢＳＴによって洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合した抗マウス二次抗体と共にインキュベートして、ＨＲＰ（ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ）、アメリカ）に限って特異的な増強化学発光基質において可視化した。ＥＣＬ反応後、メンブレンを先に記述したようにフィルムに露出した。結果から、メンブレンの全てが総蛋白質の類似の部分を捕獲したこと、そして実験の最初の部分において認められた差はメンブレンの「ローディング」の差の結果ではないことが確認された。報告目的のために、Ｘ線フィルムを平板スキャナ（ラシエ社（Ｌａｃｉｅ）、アメリカ）上で走査して、画像をＡＤＯＢＥフォトショップ（ＰｈｏｔｏＳｈｏｐ）４．０を用いて処理した。
【０２５６】
実施例４
組織マイクロアレイからの蛋白質の移動
米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）組織アレイ研究プログラム（ＴＡＲＰ）に由来する組織アレイの厚さ５ミクロン（５μＭ）のパラフィン切片をテープ上に回収して、上記のようにメンブレン４個の中を移動させた。メンブレンは上記の通りであった。移動溶液は、５０ ｍＭトリスおよび３８０ ｍＭグリシンを含んだ。これによって、ｐＨおよそ８．６の緩衝液が得られるが、これはｐＨ ８．０〜９．５の範囲の如何なるｐＨにも調節することができる。
【０２５７】
メンブレンの積み重ねおよび組織アレイを封入するプラスチック製の小袋をゲル乾燥器（バイオラド社）の中に配置して、乾燥器の蓋を圧力および加熱（８０℃）源として用いた。熱および圧力は２時間適用した。
【０２５８】
移動後、メンブレンをＴＢＳＴ緩衝液（５０ ｍＭトリス ｐＨ ８．０、１５０ ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０５％ツイーン２０）において軽く洗浄し、製造元の説明書に従ってファストブルー染色（ケミコン社）によって染色した。アストラ（Ａｓｔｒａ）２２００スキャナ（ユーマックス社（ＵＭＡＸ））上での走査は、個々の層の画像をデジタル化した。染色後、メンブレンをＴＢＳＴ緩衝液においてすすぎ、１×カゼイン溶液（ベクターラボラトリーズ社）中で１５分間ブロッキングして、一次抗体（抗サイトケラチン（１：５，０００、シグマ社）、または抗ＰＳＡ（１：５００、スクリプト社（Ｓｃｒｉｐｔ）））中で４℃で一晩インキュベートした。次に、メンブレンをＴＢＳＴ中で洗浄して、二次抗体およびアルカリホスファターゼの複合体においてインキュベートして、再度洗浄した。標的蛋白質（サイトケラチンまたはＰＳＡ）の局在は、増強化学発光（ＥＣＬ）（デュオラックス（ＤｕｏＬｕｘ）、ベクターラボラトリーズ社）およびバイオマックスＭＲ（Ｂｉｏｍａｘ ＭＲ）フィルム（コダック社）によって可視化した。画像は、アストラ２２００スキャナ（ユーマックス社）上での走査によってデジタル化した。
【０２５９】
図２９に示した結果は、空間的な分解能を失うことなく記述の技術を用いて、組織アレイからメンブレンの複製物を作製できることを証明する。同様に、単一の蛋白質の免疫検出がこれらのメンブレン上で可能であることを証明する。
【０２６０】
実施例５
異なる腫瘍における示差蛋白質発現
ＴＡＲＰアレイのメンブレンコピーを、先の実施例に記載したように調製してアッセイした。検出のために、以下の一次抗体を用いた：抗サイトケラチン（１：５，０００、シグマ社）、抗ＰＳＡ（１：５００、スクリプト社）、抗ｐ５３（１：１，０００、トランスダクションラボラトリーズ社）、および抗ｐ３００（１：５００、トランスダクションラボラトリーズ社）。
【０２６１】
図３０に示す結果は、腫瘍タイプが異なれば同じ蛋白質の発現量が異なること（例えば、ＰＳＡは前立腺癌試料において主に発現される）、そして同じ腫瘍タイプでも同じ蛋白質の異なる量を発現できること（例えば、ｐ５３およびｐ３００は結腸癌試料のサブセットに限って発現される）を示している。
【０２６２】
実施例６
ＩＨＣにおいて無効な抗体を用いたメンブレンの免疫検出
正常なヒト扁桃組織、正常ヒト腎組織、およびＴＡＲＰ組織アレイの移動から得られたメンブレンコピーは、先の実施例に記載した通りに生成した。場合によっては、１０ ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ ８を含む０．１ Ｍクエン酸ナトリウム溶液にメンブレンを９５℃で５分間浸すことによって、抗原検索を行った。
【０２６３】
１×カゼイン溶液（ベクターラボラトリーズ）において３０分間ブロッキングした後、メンブレンを１：２０〜１：５０希釈したモノクローナル抗体と共に４℃で１６時間インキュベートした。一次抗体は、本質的に製造元の説明書に指示された通りに用いた；選択した抗体のそれぞれは、ホルマリン保存組織試料において蛋白質を検出するために用いる場合、試料に抗原検索を行う場合でも無効であることが製造元によって記されている。以下の抗原を用いた：抗−ＣＤ３（カルタグ社（ＣＡＬＴＡＧ））；抗ＥＧＦＲ；抗プロゲステロン受容体（ダコ社（Ｄａｋｏ））；および抗ｅｒｂＢ２（ザイメッド社（Ｚｙｍｅｄ））。ＴＢＳＴによって洗浄後、蛋白質を実施例４に記載のように可視化した。
【０２６４】
それぞれの場合において、抗体は、移動したメンブレン上で明確なシグナルを生じたが、隣接する切片上でＩＨＣに用いた場合には、対応するマイクロアレイ上で直接シグナルを生じないと思われる。このように、記述の接触移動法を用いて、メンブレンに生体分子を移動させることは、ＩＨＣにおいて無効である抗体を用いて免疫検出の可視化を行うために有効である。
【０２６５】
実施例７
ＬＣＭによって採取された細胞からメンブレンへの蛋白質の移動
頭頚部扁平上皮癌の厚さ５ミクロンの凍結切片を通常のスライドガラス上で採取した。スライドガラスを１００％エタノールにおいて３分間固定して、アズールブルー（Ａｚｕｒｅ Ｂｌｕｅ）（シグマ社）の０．５％エタノール溶液に１分間浸した後、キシレン中で５分間インキュベートした。ＬＣＭは、製造元（アークツルス社（Ａｒｃｔｕｒｕｓ））の推奨通りに行った。それぞれのＬＣＭキャップは、約５０のレーザーヒットを受け、これは１５〜２０分間のあいだに細胞２５０〜３００個に対応する。この直後、キャップを移動するまで−８０℃で保存した。
【０２６６】
移動の直前に、キャップをエタノール勾配の中で水和させて、図８に示すように移動を構築した。異なる５個のメンブレン層を用いた。移動緩衝液は、２５ ｍＭトリス、１９２ ｍＭグリシンおよび０．０２５％ＳＤＳを含んだ。構築したパッケージをゲル乾燥器（バイオラド社）に配置して、乾燥器の蓋を圧力および温度（８０℃）源として用いた。移動プロセスは約２時間かかった。
【０２６７】
移動後、積み重ねを分解して、メンブレンをＴＢＳＴ緩衝液（５０ ｍＭトリス ｐＨ ８．０、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、および０．０５％ツイーン−２０）において洗浄した後、製造元の説明書に従ってファストブルー染色（ケミコン社）によって染色した。アストラ２２００スキャナ（ＵＭＡＸ社）上で走査すると、層のデジタル化画像が得られた。染色後、メンブレンをＴＢＳＴ緩衝液においてすすぎ、１×カゼイン溶液（ベクターラボラトリーズ社）において１５分間ブロッキングし、抗サイトケラチン抗体（１：５，０００、シグマ社）において＋４℃で一晩インキュベートして、ＴＢＳＴにおいて洗浄し、第二抗体とアルカリホスファターゼとの複合体においてインキュベートして、再度洗浄し、蛋白質の位置をＥＣＬ（デュオラックス、ベクターラボラトリーズインク）およびバイオマックスＭＲフィルム（コダック社）によって可視化した。得られた画像をアストラ２２００スキャナ（ＵＭＡＸ社）上で走査することによってデジタル化した。図３１は、メンブレン５個の上で作製された「コピー」を示し、抗体は、それぞれの層上で蛋白質を検出するために有効に用いられたことを示している。
【０２６８】
実施例８
１−Ｄゲルからの蛋白質の移動および捕獲
本実施例は、ゲルから溶出した蛋白質に対して高い結合親和性を有するが、保持能が低いポリカーボネートコーティングニトロセルロース（ＰＣＮＣ）メンブレンを用いてゲルの多数のコピーを作製できることを証明する。
【０２６９】
ビオチン結合蛋白質マーカー（ベクターラボラトリーズ社）１．０μｇ／レーンを、１５％ＰＡＧＥによって分離して、２５ ｍＭトリス、１９２ ｍＭグリシン、０．０２５％ＳＤＳ、および２０％メタノール（６０〜１１０ Ｖで１〜２時間）中においてＰＣＮＣメンブレンの積み重ねの中を電気的に移動させた。積み重ね当たりのメンブレンの数は、実験に応じて５〜２０個であった。積み重ねの末端において、一つの純粋なニトロセルロースメンブレンを用いて、ＰＣＮＣ層に結合していない蛋白質を捕獲した（ＮＣ−トラップ）。移動は、レディゲルセル（Ｒｅａｄｙ Ｇｅｌ Ｃｅｌｌ）装置（バイオラド社）において６０〜１１０ Ｖで０．５〜３時間行った。
【０２７０】
移動後、メンブレンを５０ ｍＭトリス ｐＨ ８．０および１５０ ｍＭ ＮａＣｌ（ＴＢＳ緩衝液）中ですすぎ、１×カゼイン溶液（ベクターラボラトリーズ社）において１０〜６０分間ブロッキングし、ベクタステイン（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ）ＡＢＣ−ＡｍＰ試薬（ベクターラボラトリーズ社）中で３０分間インキュベートした。メンブレンをＴＢＳＴにおいて再度洗浄し、０．１ ＭトリスｐＨ ９．５中ですすぎ、デュオラックス試薬（ベクターラボラトリーズ社）中で３〜５分間インキュベートした後、バイオマックスＭＲフィルム（コダック社）に露出した。一つの代表的な実験の例を図３２に示す。
【０２７１】
結果は以下を証明した：
１．  ＰＣＮＣメンブレンの積み重ねは、移動後のウェスタンブロッティング技術を妨害せず、蛋白質はゲルから積み重ねの中をＮＣトラップまで移動した；
２．  広範囲の大きさの蛋白質が積み重ねの中を非常に類似の移動効率で移動し、７ｋＤａ〜２００ ｋＤａの蛋白質がＮＣトラップ上で検出された；および
３．  ＰＣＮＣ層はその大きさによらず、蛋白質を捕獲した。
【０２７２】
ＰＣＮＣメンブレンと免疫検出との適合性を決定するために、ジャーカット細胞を緩衝液（５０ ｍＭトリス ｐＨ ８．０および１％ＳＤＳ）において溶解して、総蛋白質２０μｇ／レーンを１５％ＰＡＧＥによって分離した。得られたゲルを２５ ｍＭトリス、１９２ ｍＭグリシン、０．０２５％ＳＤＳ、および２０％メタノールにおいて、ＰＣＮＣメンブレンの積み重ねの中を電気的に移動させた。移動は、６０〜１１０ Ｖで１〜２時間行った。
【０２７３】
メンブレンは全て、一次抗Ｒｓｋ（１：１００、トランスダクションラボラトリーズ社）、および抗ｐ３００（１：５００、トランスダクションラボラトリーズ社）抗体と共にインキュベートし、ＴＢＳＴ緩衝液において洗浄し、二次抗体とアルカリホスファターゼとの複合体と共にインキュベートして、再度洗浄した。ブロット上の蛋白質の位置は、ＥＣＬ（デュオラックス、ベクターラボラトリーズ社）およびバイオマックスＭＲフィルム（コダック社）を用いて可視化した。図３３に示す結果は、ＰＣＮＣメンブレンがこのタイプの蛋白質検出に適していることを証明した。それぞれのメンブレンは、免疫学的方法によって検出されるために十分な蛋白質を捕獲したが、それぞれの単一のメンブレンはあまり多くの蛋白質を捕獲せず、同じゲルの多数のコピーを作製することができた。
【０２７４】
実施例９
２−Ｄゲルからの蛋白質の移動と捕獲
２−Ｄ蛋白質ゲルは、１−Ｄゲルより分離能が大きい。二次元分離によって、同じゲル上で何百または何千もの蛋白質を同定することができる。２−Ｄゲルによって分離された蛋白質は、蛋白質シークエンシングまたは免疫学的特徴によって同定される。シークエンシングは、高価な機器、高度に訓練されたオペレータを必要とし、その利用は少数の特権グループに限られる。免疫検出は実施が容易であるが、従来のブロッティング技法はゲルあたり一つのメンブレンを生じるに過ぎないため、処理能が低い技術である。
【０２７５】
上記のように、ＰＣＮＣメンブレンを用いて１０個またはそれ以上の１−Ｄゲルを作製することができる。２−Ｄゲルが同じように「コピー」されうるかを発見するために、ジャーカット細胞蛋白質溶解物５００ μｇ中に存在する蛋白質を２−Ｄ ＰＡＧＥによって分離した。ｐＨ ３．０〜１０．０の市販の固定ｐＨ勾配（ＩＰＧ）（ファルマシアバイオテック社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、アップサラ、スウェーデン）を一次元分離のために用いた。蛋白質をローディングするために、ゲル内で試料の８〜１２時間の再水和を用いた。蛋白質は全体で１５，０００〜３０，０００ Ｖｈｒｓのあいだ分離した。平衡後、第二の方向への分離のために、ＩＰＧ片を垂直勾配ゲル（４〜２０％、ノベックス社）に移した。
【０２７６】
電気泳動後、２−Ｄゲルを２５ ｍＭトリス、１９２ ｍＭグリシン、０．０２５％ＳＤＳ、および２０％メタノール（６０〜１１０ Ｖで１〜２時間）においてＰＣＮＣメンブレン５個の積み重ねの中を移動させた。次に、メンブレンをＴＢＳＴ緩衝液においてすすいだ後、１×カゼイン溶液（ベクターラボラトリーズインク）において１０〜６０分間ブロッキングしてから、特異的抗体によってプロービングした。個々のメンブレンは、それらを抗ＧＡＰＤＨ（１：５，０００、ケミコン社）、抗βアクチン（１：５，０００、シグマ社）、および／または抗αチューブリン（１：１，０００、カルビオケム社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））抗体と共に４℃で一晩インキュベートすることによってブローピングした。次に、メンブレンをＴＢＳＴにおいて洗浄し、二次抗体とアルカリホスファターゼとの複合体と共にインキュベートし、再度洗浄した。蛋白質の位置はＥＣＬ（デュオラックス、ベクターラボラトリーズ社）およびバイオマックスＭＲフィルム（コダック社）によって可視化した。
【０２７７】
２−Ｄゲルにおいて特異的蛋白質の正確な空間的位置を発見するために、抗体をまず３つの異なるメンブレンに（異なる３つのゲルから）個々に適用した。これらの３つの蛋白質（ＧＡＰＤＨ、アクチン、およびチューブリン）は、その大きさおよび荷電が異なり、互いにゲル上で空間的に離れていた。
【０２７８】
免疫検出の処理能を増加させるために、３つ全ての抗体を共に混合して、同じゲルから５つのメンブレン全てに対して検出子カクテルとして適用した。この実験の結果を図３４に示す。同じゲルの多数の複製物を作製することおよび、抗体カクテルアプローチを用いることは、２−Ｄゲル上での免疫学的な蛋白質同定の処理能を増加させた。
【０２７９】
実施例１０
蛋白質−ＤＮＡ複合体を同定するための層状メンブレンの利用
以下の実施例は、本発明の層状メンブレンが蛋白質−ＤＮＡ複合体の蛋白質の同定の速度を増加させて単純にすることができることを証明する。本実施例は、ゲルのコピーを作製して、それぞれのメンブレンが、対象となる異なる抗体によって首尾よく免疫プロービングされたことを示す。
【０２８０】
組み換え型ｈｉｓ６−ｃ−ｒｅｌ ２５０ ｎｇおよび精製組換え型ｈｉｓ６−ＣＲＥＢ １２０ ｎｇを単独で、または３２Ｐ−５’標識二本鎖オリゴヌクレオチド（配列番号：１）０．２ ｎｇと共に、１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、および４ｍＭβＭＥを含む緩衝液１０ μｌ中でインキュベートした。ハイブリダイゼーション反応は室温で３０分間進行させた。試料を４％ポリアクリルアミドゲル上で１８０ボルトで１時間の電気泳動によって分離した後、２５ ｍＭトリス、１９２ ｍＭグリシン、０．０２５％ＳＤＳ、および２０％メタノールにおいて４つのＰＣＮＣメンブレンの積み重ね（本明細書に記載の通り）と１つのＮＡ４５ ＤＥＡＥメンブレン（シュライヒャー＆シュエル社）の中を移動させた（６０〜１１０Ｖで１〜２時間）。この荷電セルロースの最後の層は、積み重ねの厚みの全てを移動してゲルから放出されたＤＮＡを捕獲するために用いた。移動後、登録（方向）の印を１９Ｇの針を用いて作製した。ＤＥＡＥメンブレンを乾燥させて、ホスホイメージャースクリーンに一晩露出して、ホスホイメージャー（Ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）：ＳＩ（モレキュラーダイナミクス社）上で可視化した。
【０２８１】
第一および第二のＰＣＮＣメンブレンをＴＢＳＴ緩衝液中ですすぎ、１×カゼイン溶液（ベクターラボラトリーズ社）において１０〜６０分間ブロッキングして、抗ラット抗体（１：２００、ＮＣＩ病理研究所、転写調節ユニットチーフ、ケビン・ガードナー博士（Ｄｒ． Ｋｅｖｉｎ Ｇａｒｄｎｅｒ））および抗Ｈｉｓ（１：１０，０００、ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））と共に４℃で一晩インキュベートした。メンブレンをＴＢＳＴにおいて洗浄し、第二抗体とアルカリホスファターゼとの複合体と共にインキュベートした後、再度洗浄した。特異的蛋白質の位置は、ＥＣＬ（デュオラックス、ベクターラボラトリーズ社）およびバイオマックスＭＲフィルム（コダック社）によって可視化した。全てのメンブレンの画像をアドブフォトショップ（Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ）（図３５）において配置した。
【０２８２】
結果は、層状のメンブレンアレイが、蛋白質複合体から蛋白質の迅速かつ信頼のおける同定を提供することを証明した。
【０２８３】
実施例１１
多数のメンブレン上での蛋白質捕獲の均一性
電気的移動のあいだ、蛋白質はゲルからメンブレン基板に押し出される（または）引っ張り出される。その移動速度は、電流と蛋白質の大きさによって影響を受ける。電圧が高いと、電圧が低い場合よりゲルから蛋白質を速く押し出すであろう。固定電流の場合でも、より小さい蛋白質は一般的により大きい蛋白質より速く移動する。移動の距離は、メンブレンコピーの量に影響を及ぼしうるもう一つの変数である。移動が短すぎる場合、十分な蛋白質がゲルから移動せず、メンブレン上に結合するために接近することができないであろう。
【０２８４】
本明細書に記載の方法および材料によって得られた結果の分析は、ゲルに存在する蛋白質の量にかかわらず、より高い電圧でより短い時間で移動を行えば、より均一なメンブレンのコピーを生成できることを示している。本実施例における移動は全て５９〜６３ボルトで６０〜７０分行う。移動条件を一定に維持して、メンブレンのコピーの作製能に及ぼす蛋白質ローディング量の影響を調べた。
【０２８５】
ジャーカット細胞株（リンパ由来細胞）、ＨＮ１２細胞株（ケラチノサイト起源の上皮細胞）、およびＳＷ４８０細胞株（腺上皮起源の細胞）から抽出した総蛋白質を本実施例において用いた。全ての細胞株は、１０％血清を加えたＤＭＥＭ培地において３７℃の湿潤インキュベーター内で培養した。約８０〜９０％コンフルエンスで、細胞を培養皿から剥離させて回収し、次に細胞を、１％ＳＤＳを加えた燐酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）に再懸濁させた。総蛋白質の濃度はＢＣＡ蛋白質アッセイ試薬（ピアス社）によって決定した。総蛋白質約３０〜１００ μｇを４〜２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）（バイオラド社）によって分離した。蛋白質を分離するために適した蛋白質ゲル移動緩衝液（例えば、２５ ｍＭトリス ｐＨ ８．３、１９２ ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ）を電気泳動に用いた。さらに、蛋白質の大きさのマーカー（バイオラドカレイドスコープ標準物質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｉｃ Ｓｔａｎｄａｒｄ）、カタログ番号１６１−０３２４）をゲルにローディングした。
【０２８６】
電気泳動による分離後、電気的ブロッティング（バイオラド社カタログ番号１７０−３９３０）によって蛋白質を１０層のアレイの中に移動させた。一つの繊維パッドまたは一つ以上の繊維パッドを、電気的ブロッティングのあいだ陽極および陰極に用いた。このように、電気的ブロッティングカセットの陰極側から開始して、繊維パッド（サンドイッチの底）、濾紙、ゲル、およびメンブレンの積み重ねを順に層状にして、メンブレン１つ（第一のメンブレン、メンブレン「１」と呼ぶ）をゲルに接触させる。組み立てた後、電気的ブロッティングカセットは、「移動サンドイッチ」（単一のメンブレン移動とは異なり、軽く絞り出すことができる）を強く絞り出す。繊維パッドは、カセットが「過剰充填された」ように思われるまで、サンドイッチの外側に加えてもよい。サンドイッチが適当な厚みを有する場合、カセットを閉じる力を加える必要があるかも知れない。
【０２８７】
電気的ブロッティング技法は、用いるシステム（バイオラド装置の場合、移動は５９〜６３ボルトで６０〜７０分間で得られる；ノベックス装置の場合、移動は２５ボルトで１２０分間で得られる）に応じて変更してもよい。個々のメンブレンの後の標識を容易にするため、それぞれの蛋白質標準物質の中心、および各ウェルの中心のような識別可能な位置で、穴を開けることができる（例えば、２３ｇ〜２５ｇ針を用いて）。
【０２８８】
移動後、メンブレンの積み重ねを一つの角を軽くめくることによってゲルから取り外して、フレームを開くかまたは外した。次に、メンブレンの積み重ねをトリスまたは燐酸緩衝液中で洗浄して、メンブレンを溶液中で分離した。免疫検出の前に、メンブレンをブロッキング試薬（２０／２０ジーンシステムズ社（２０／２０ ＧｅｎｅＳｙｓｔｅｍｓ））に１５分間浸す。
【０２８９】
メンブレンは、製造元の推奨に従って個々にシプロルビー（Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ）（モレキュラープローブス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））によって染色し、イメージステーション４４０ＣＦ（コダック社）上で可視化した。蛍光強度はコダック１−Ｄ画像分析ソフトウェアを用いてあらゆるメンブレン上であらゆる試料の３つの異なる領域から採取した。第一の領域には、大きさが２０〜４０ ｋＤａの蛋白質が含まれた。第二の領域には、大きさ４０〜１００ ｋＤａの蛋白質が含まれた。第三の領域には、大きさ１００〜１５０ ｋＤａの蛋白質が含まれた。異なる群のあいだの関係は、マイクロソフトエクセル（登録商標）を用いて分析した。
【０２９０】
データプロット（図３６）は、メンブレン当たりにローディングした総蛋白質の最小の変動が、大きさ４０〜１００ ｋＤａの蛋白質について認められたことを示している。データはまた、ローディングした蛋白質の量がこの系において重要な変数であることを示唆している。大きさが４０〜１００ ｋＤａである蛋白質に関して、１レーン当たり７０〜１００ μｇをローディングすると、メンブレン間の変動は１０％未満の範囲内に維持されることが決定された。
【０２９１】
実施例１２
単一のゲル上で分離した多数の蛋白質の有無および機能的状態の検出
同じゲルから多数の蛋白質の有無および機能的状態を検出する実現可能性を決定するために、ＥＧＦＲおよびｃ−ｍｙｃ蛋白質の有無および機能的状態を同時にチェックした。用いた試料はジャーカット細胞株、ＨＮ１２細胞株、およびＳＷ４８０細胞株であった；細胞は実施例１１に記載した通りに培養して回収した。４〜２０％ポリアクリルアミドゲル（バイオラド社）の１レーンあたり総蛋白質３０ μｇをローディングして、５０ Ｖで２時間分離した。電気泳動後、ゲルを２０／２０ジーンシステムズ社の１×移動緩衝液において１０分間平衡にして、７層のメンブレンの積み重ねによって電気的移動を構築した（２０／２０ジーンシステムズ社）。電気的移動のためにミニセルブロッター（ＭｉｎｉＣｅｌｌ ｂｌｏｔｔｅｒ）（バイオラド社）を用いた。移動は５９〜６３ Ｖで６０〜７０分間行った。移動後、メンブレンを５０ ｍＭトリス ｐＨ ８．０、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、および０．０５％ツイーン−２０（ＴＢＳＴ）において分離し、１×カゼイン溶液（ベクター社）において室温で１５分間ブロッキングした後、表１に示すようにＴＢＳＴにおいて希釈した抗体と共に４℃で１２時間インキュベートした。
【０２９２】
【表１】
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【０２９３】
一次抗体と共にインキュベートした後、それぞれのメンブレンをＴＢＳＴ中でそれぞれ５分間を３回個々に洗浄して、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体（アマシャム社）の１×カゼイン溶液による１：４，０００希釈液と共に室温で３０分間インキュベートした。次に、メンブレンをＴＢＳＴ中で５分間洗浄して、５０ ｍＭトリス ｐＨ ８．０、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ（ＴＢＳ）においてそれぞれ５分間を２回洗浄して、ＥＣＬ ＰＬＵＳ基質（アマシャム社）において５分間インキュベートした後、バイオマックスＭＲフィルム（コダック社）に１〜４５分間露出した。
【０２９４】
フィルムの画像をアストラ２２００スキャナ（ユーマックス社）上でデジタル化して、アドブフォトショップ５．０において操作した。第一の組の抗体と共にインキュベートした後、全てのメンブレンを抗αチューブリン抗体と共に室温で２時間インキュベートし、二次抗体をアルカリホスファターゼ（ＡＰ）（ベクター社）に結合させ、ＥＣＬ試薬がデュオラックス（ベクター社）であったことを除いて上記のようにシグナルを可視化した。
【０２９５】
図３７に示す本実施例の結果は、同じゲルから作製された多数のメンブレンのコピーを用いて、同じ試料からの多数の蛋白質の有無および機能的状態を決定することができることを証明した。本実施例において、全てかつ活性型であるＥＧＦＲおよびｃ−ｍｙｃ蛋白質は、ＳＷ４８０細胞株から調製した抽出物において検出された。結果はまた、総蛋白質の存在を明らかにするために異なる試料を互いに比較できること（例えば、ＥＧＦＲは、ＨＮ１２およびＳＷ４８０細胞において発現されるが、ジャーカット細胞には発現されなかった）、そして総蛋白質の存在が必ずしも機能的活性を意味しないことを証明した（ｃ−ｍｙｃは、ジャーカット細胞株およびＳＷ４８０細胞株の双方に存在するが、ジャーカット細胞のみが活性な機能的な形で存在した）。
【０２９６】
実施例１３
上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）シグナル伝達経路に関係する蛋白質の検出
本発明に含まれる態様の特定の長所は、それらによって、多数の試料から異なる多数の蛋白質を同時に分析および比較できることが含まれる。この同時アプローチの価値は、対象となる蛋白質が単一の生物学的系に属する場合にさらに大きくなる（例えば、全てが受容体シグナル伝達経路の成分である）。全ての蛋白質の分析は単一の試料について行われるため、比較試験を行うことはより容易であり、結果はより一貫して信頼できると予想される。
【０２９７】
本実施例において、ＥＧＦＲ経路によるシグナル伝達に関係する蛋白質９個の機能的状態を分析して比較した。異なるケラチノサイト細胞株４個を、上記のように培養して回収した（実施例１１を参照のこと）。それぞれの細胞株からの総蛋白質１００ μｇを勾配４〜２０％のアクリルアミドゲル（バイオラド社）上で分離し、上記のように１０層のアレイの中を移動させた（実施例１１を参照のこと）。
【０２９８】
メンブレンは、広布の色素であるシプロルビー（モレキュラープローブス社）によって染色して、画像を記録し、イメージステーション４４０ＣＦ（コダック社）上で保存した。総蛋白質の可視化後、メンブレンを１×カゼイン溶液（ベクター社）中で室温で１５分間ブロッキングした後、表２に記載したようにＴＢＳＴによって希釈した抗体と共に４℃で１２時間インキュベートした。対照メンブレン層は一次抗体を含まずにインキュベートした。
【０２９９】
【表２】
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一次抗体とインキュベートした後、メンブレンは上記のように処理した（実施例１２を参照のこと）。
【０３００】
図３８は、調べた蛋白質９個中８個がこの方法を用いて積み重ねたメンブレン上に検出されうることを示している。ＰＫＣの燐酸化型は、これらの試料において検出されなかった。追跡実験も同様に、同量の試料が単一のニトロセルロースメンブレン上にブロッティングされた場合にこの形の蛋白質を検出することができず、陽性対照細胞抽出物は陽性であった（ＰＤＧＦ処置３Ｔ３細胞、１０ μｇ／レーン、セルシグナリング社によって提供）。このことは、ＰＫＣの燐酸化型を検出できないことは、移動システムの欠陥によるのではなく、調べた細胞株に存在するこの蛋白質が（あったとしても）非常に少量であったためであることを示唆している。結果はまた、調べた蛋白質の全てに関して細胞株が異なれば発現が異なることを明らかに示している。
【０３０１】
実施例１４
１−Ｄゲルからの蛋白質の接触移動
アクリルアミドゲルから単一のメンブレン基板への蛋白質の拡散に基づく移動は、ボーエンら（Ｂｏｗｅｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、８：１〜２０、１９８０）によって既に検討された。この系の明らかな長所は、特殊なブロッティング装置を必要としない点である。本実施例は、提供されたメンブレンアレイによって接触移動（電流を適用せずに）を用いることが可能か否かを決定するために実施した。
【０３０２】
総蛋白質２５μｇおよび５０ μｇを含む１０％ゲル（バイオラド社）を、図６に示すように、２つの５層のメンブレンの積み重ねの間に、ゲルのそれぞれの側にメンブレンが５個となるように挟んだ。２０／２０ジーンシステムズ社の１×移動緩衝液に浸したホワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）（登録商標）濾紙３層をサンドイッチのそれぞれの面に加えて、構築した積み重ね全体をプラスチックバッグの中に密封した。平行な試料の積み重ね３個を構築して、蓋をして８０℃でゲル乾燥器（バイオラド社）の中に入れた。個々の試料の積み重ねを移動の３０、６０、または１２０分後に除去した。移動後、メンブレンをＴＢＳＴ中で洗浄し、製造元の推奨に従って、ファストブルー染色（カルビオケム社）によって染色した。染色したメンブレンをアストラ２２００スキャナ（Ｕｍａｘ社）を用いて走査し、移動した総蛋白質を検出して、画像をアドブフォトショップ５．０において操作した。
【０３０３】
この技法の結果を図３９に示す。蛋白質は、ゲルの両面においてゲルからメンブレンに効率よく移動した（双方向移動）。移動した蛋白質の量は、移動時間（３０分と比較すると２時間後ではより多くの蛋白質が移動した）および蛋白質の大きさ（大きい蛋白質の移動はあまり効率的ではなかった）に依存した。このように、接触移動は、蛋白質および他の生体分子のメンブレンの積み重ねへの電気的移動に対する有効な代用法である。
【０３０４】
本明細書において特定の態様を記述してきたが、本発明は、記載の態様の変更および改変を行うことができ、それらも本開示の精神および範囲に含まれることは、本発明が属する技術分野の当業者に明らかであると思われる。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲および適用される法律によって必要とされる程度に限って制限されると解釈される。上記に引用した参考文献はその全文が参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ウィッキング移動を用いた組織切片からの分子の移動を示すメンブレンアレイの透視図である。
【図２】図２Ａは、組織切片からメンブレンの積み重ねに分子が移動することを示す、装置の斜めから見た図である。図２Ｂは、図２Ａに示した装置において移動のために調製した、組み立てた接触移動積み重ねの正面図である。
【図３】スライドガラス上の典型的な組織マイクロアレイの写真である。
【図４】図４Ａは、一つの態様に従うキットの構成要素を示す略図である。
図４Ｂはメンブレンの積み重ねの透視図である。
【図５】一つの提供されたゲル移動態様に従う方法を示す略図である。
【図６】蛋白質をゲルからメンブレンに転写させるための装置に機能的に接続していることを示すメンブレンの積み重ねの断面図である。
【図７】図７Ａは、典型的な先行技術のＬＣＭ装置の透視図である。図７Ｂは、輸送用アームによってスライドガラスに接続していることを示すＬＣＭキャップの拡大透視図である。図７Ｃおよび７Ｄは、スライドガラス上の組織切片からの細胞材料がＬＣＭキャップに転写されることを示す側面立面図である。
【図８】メンブレンの積み重ねの中を移動させるためにＬＣＭ試料が調製される一つの態様の長軸方向の断面図である。
【図９】使用および操作を示す一つのＬＣＭ移動態様の透視図である。
【図１０】図１０Ａは、提供された態様に従う改変されたＬＣＭの側面立面図である。図１０Ｂは図４Ａの線Ｂ−Ｂに沿った断面図である。
【図１１】マイクロタイタープレートを用いて示される移動アレイの透視図である。
【図１２】提供された一つの態様に従う個々のメンブレンの長軸方向の断面図である。
【図１３】直接捕獲を示す略図である。
【図１４】間接的捕獲を示す略図である。
【図１５】もう一つのゲル移動態様に従う方法を示す略図である。
【図１６】代表的なフレームをつけたメンブレンの積み重ねの透視図である。
【図１７】１つのフレームをつけたメンブレンの正面立面図である。
【図１８】図１７の線１１５−１１５に沿った１枚のメンブレンの断面図である。
【図１９】抗体カクテルを作製する方法を示す仮説的実施例を示す略図である。ゲル（Ａ）は、移動の前にクーマシーブルー染色によって検出した蛋白質を示す。メンブレン−層＃１（Ｂ）、メンブレン−層＃２（Ｃ）、およびメンブレン−層＃３（Ｃ）は、抗体によってメンブレン上で検出した蛋白質を示す。
【図２０】一つの態様に従うキットの構成要素を示す略図である。
【図２１】圧力ヒーター装置の斜めから見た図である。
【図２２】蛋白質をゲルからメンブレンに転写するための装置と共に示すメンブレンの積み重ねの長軸方向の断面図である。
【図２３】ゲルの蛋白質内容物の多数の複製物を作製するために、蛋白質をゲルからメンブレンの積み重ねに転写することを示す、使用および操作に関する一つの態様の略図である。
【図２４】蛋白質がゲルからメンブレンに転写するための装置に機能的に接続していることを示す、メンブレンの積み重ねの断面図である。
【図２５】鋳型の像と試料のメンブレンとの比較を示す略図である。
【図２６】コーティングしたおよびコーティングしていない、ニトロセルロースとポリカーボネートとで構成されたメンブレンの結合能を比較する略図である。図２６Ａはシグナルの強度を比較する蛋白質中でインキュベートしたメンブレンの走査像を示す。図２６Ｂは、異なるメンブレン材料に結合した蛋白質の量をプロットするチャートである。
【図２７】生体分子全体の一部が、トラップ上のポリカーボネート（ＰＣ）層の積み重ねの中を首尾よく移動することができることを示す組織切片の像を示す。図２７Ａは、ポリカーボネートメンブレンの中の移動を示す。図２７Ｂは、ニトロセルロースによってコーティングしたポリカーボネートの中の移動を示す。図２７Ｃは、ポリ−Ｌ−リジンによってコーティングしたポリカーボネートメンブレンの中の移動を示す。
【図２８】メンブレンアレイを用いた乳腺組織の２つの領域（健康および癌様）からの異なる蛋白質の免疫学的検出を示す一連の像である。
【図２９】組織マイクロアレイの４つのメンブレン複製物の一連の写真である。上の列は広布の染色によって複製物を染色した総蛋白質を示す；下の列は２つの特異的蛋白質、ケラチンと前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の免疫学的検出を示す。
【図３０】移動前の組織マイクロアレイ（ヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）によって染色）と、表記のように４つの異なる蛋白質（ケラチン、ＰＳＡ、ｐ５３、およびｐ３００）に対する抗体によって免疫学的に検出したその４つの複製物を示す一連の写真である。
【図３１】メンブレン上に捕獲された総蛋白質（最初のカラム）およびサイトケラチンの免疫学的検出（２番目のカラム）を示す一連の写真である。
【図３２】ビオチン結合蛋白質が結合したメンブレンの像の写真である。蛋白質を一次元ＰＡＧＥによって分離して、メンブレンの積み重ねの中を移動させて、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ複合体（ｓｔｒｅｐ−ＡＰ）および増強化学発光（ＥＣＬ）試薬によって可視化した。
【図３３】Ｒｓｋおよびｐ３００蛋白質が結合したメンブレンの像の写真である。蛋白質の分離およびブロッティングは、図１５に記載したとおりに実施した。
【図３４】ＧＡＰＤＨ、αチューブリン、およびβアクチンが結合したメンブレンの像の写真である。蛋白質は二次元ＰＡＧＥによって分離して、メンブレンの積み重ねの中を移動させて、一次二次抗体アルカリホスファターゼ複合体およびＥＣＬ試薬によって可視化した。
【図３５】蛋白質またはＤＮＡが結合したメンブレンの像の写真と、異なる蛋白質とＤＮＡとの複合体と、そのゲルにおける位置との関係を説明する図である。
【図３６】ゲルへの蛋白質適用量、蛋白質の大きさ、およびメンブレンへの移動の均一性の関係を示す折れ線グラフである。
【図３７】メンブレンの７層の積み重ね上にブロッティングした３つの細胞試料（ジャーカット、ＨＮ１２、およびＳＷ４８０）からのゲル分離蛋白質の異なる発現を示す写真である。
【図３８】メンブレンの１０層の積み重ね上にブロッティングした４つの細胞試料からのゲル分離蛋白質の異なる発現を示す写真である。上の列（「総染色」と記す）は色素によって広布に染色したメンブレンを示す。下の列（「ＥＣＬ」と記す）は、表記の抗体によってプロービングしたメンブレンを示す。
【図３９】本明細書において提供した方法によって移動した総蛋白質の分布を示す写真である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004518949.tif 000145
2004518949.tif 000146
【国際調査報告】
2004518949.tif 000147