(57)【要約】後期糖化最終生成物（AGEs）は、糖尿病、アテローム性動脈硬化、アルツハイマー病および慢性関節リウマチなどの様々な衰弱性疾患の病因において、並びに正常な老化プロセスにおいて関与している。7種の化合物が、AGE-タンパク質架橋を破壊する際に活性であることをここで報告した。これらの化合物は、1,4-ベンゼン-bis［4-メチレンアミノ-フェノキシイソ酪酸］（LR102）；4-［（3,5-ジクロロフェニルウレイドフェノキシイソブチリル］-4-アミノ安息香酸（LR99）；L-bis-［4-（4-クロロベンズアミドフェノキシイソブチリル）シスチン］（LR20）；4-（3,5-ジクロロフェニルウレイド）フェノキシイソブチリル-1-アミドシクロヘキサン-1-カルボン酸（LR23）；メチレンbis［4,4'-（2-クロロフェニルウレイドフェノキシイソ酪酸）］（LR90）；5-アミノサリチル酸（5-ASA）；およびメトホルミンである。これらの化合物を使用して、AGEsが形成される疾患の衰弱性作用を逆転させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物において糖化最終生成物または架橋タンパク質を切断するための方法であって、前記方法が有効量の化合物または前記化合物の薬学的に許容可能な塩を前記生物に対して投与することを含み、前記化合物が以下のもの：
1,4-ベンゼン-bis［4-メチレンアミノフェノキシイソ酪酸］；
4-［（3,5-ジクロロフェニルウレイドフェノキシイソブチリル］-4-アミノ安息香酸；
L-bis-［4-（4-クロロベンズアミドフェノキシイソブチリル）シスチン］；
4-（3,5-ジクロロフェニルウレイド）フェノキシイソブチリル-1-アミドシクロヘキサン-1-カルボン酸；
メチレンbis［4,4'-（2-クロロフェニルウレイドフェノキシイソ酪酸）］；
1,1-ジメチルビグアニド；および
5-アミノサリチル酸；
からなる群から選択される、前記方法。
【請求項２】
前記化合物が、1,4-ベンゼン-bis［4-メチレンアミノ-フェノキシイソ酪酸］である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物が4-［（3,5-ジクロロフェニルウレイドフェノキシイソブチリル］-4-アミノ安息香酸である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
生物において老化の有害作用を逆転させる方法であって、前記効果が糖化最終生成物またはタンパク質架橋の形成であり、前記方法は、有効量の化合物または前記化合物の薬学的に許容可能な塩を前記生物に対して投与することを含み、前記化合物は、以下のもの：
1,4-ベンゼン-bis［4-メチレンアミノフェノキシイソ酪酸］；
4-［(3,5-ジクロロフェニルウレイドフェノキシイソブチリル］-4-アミノ安息香酸；
L-bis-［4-（4-クロロベンズアミドフェノキシイソブチリル）シスチン］；
4-（3,5-ジクロロフェニルウレイド）フェノキシイソブチリル-1-アミドシクロヘキサン-1-カルボン酸；
メチレンbis［4,4'-（2-クロロフェニルウレイドフェノキシイソ酪酸）］；
1,1-ジメチルビグアニド；および
5-アミノサリチル酸；
からなる群から選択される、前記方法。
【請求項５】
前記化合物が1,4-ベンゼン-bis［4-メチレンアミノフェノキシイソ酪酸］である、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物が、4-［（3,5ジクロロフェニルウレイドフェノキシイソブチリル］-4-アミノ安息香酸である、請求項4に記載の方法。
【請求項７】
糖尿病の結果として生じる合併症を逆転させる方法であって、ここで前記合併症が糖化最終生成物またはタンパク質架橋の形成から生じ、前記方法は、有効量の化合物または前記化合物の薬学的に許容可能な塩を前記生物に対して投与することを含み、前記化合物は以下のもの：
1,4-ベンゼン-bis［4-メチレンアミノフェノキシイソ酪酸］；
4-［（3,5-ジクロロフェニルウレイドフェノキシイソブチリル］-4-アミノ安息香酸；
L-bis-［4-（4-クロロベンズアミドフェノキシイソブチリル）シスチン］；
4-（3,5-ジクロロフェニルウレイド）フェノキシイソブチリル-1-アミドシクロヘキサン-1-カルボン酸；
メチレンbis［4,4'-(2-クロロフェニルウレイドフェノキシイソ酪酸）］；
1,1-ジメチルビグアニド；および
5-アミノサリチル酸；
からなる群から選択される、前記方法。
【請求項８】
前記化合物が1,4-ベンゼン-bis［4-メチレンアミノフェノキシイソ酪酸］である、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物が4-［（3,5ジクロロフェニルウレイドフェノキシイソブチリル］-4-アミノ安息香酸である、請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
患者において慢性関節リウマチ、アルツハイマー病、尿毒症、神経毒性、またはアテローム性動脈硬化の進行を逆転させる方法であって、ここで前記方法は、有効量の化合物または前記化合物の薬学的に許容可能な塩を前記生物に対して投与することを含み、前記化合物は以下のもの：
1,4-ベンゼン-bis［4-メチレンアミノフェノキシイソ酪酸］；
4-［（3,5-ジクロロフェニルウレイドフェノキシイソブチリル］-4-アミノ安息香酸；
L-bis-［4-（4-クロロベンズアミドフェノキシイソブチリル）シスチン］；
4-（3,5-ジクロロフェニルウレイド）フェノキシイソブチリル-1-アミドシクロヘキサン-1-カルボン酸；
メチレンbis［4,4'-（2-クロロフェニルウレイドフェノキシイソ酪酸）］；
1,1-ジメチルビグアニド；および
5-アミノサリチル酸；
からなる群から選択される、前記方法。
【請求項１１】
前記化合物が1,4-ベンゼン-bis［4-メチレンアミノフェノキシイソ酪酸］である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物が4-［（3,5ジクロロフェニルウレイドフェノキシイソブチリル］-4-アミノ安息香酸である、請求項10に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本発明は、1999年4月5日に出願した仮出願シリアルNo. 60/127,835に関連する2000年4月5日に出願した出願シリアルNo. 09/543,703の一部継続出願である2001年3月8日に出願した出願シリアルNo. 09/800,976の一部継続出願であり、そして本出願は、1999年4月5日に出願した出願シリアルNo. 60/127,835に関連する2000年4月5日に出願した出願シリアルNo. 09/543,703の一部継続出願である2000年7月27日に出願した出願シリアルNo. 09/626,859の一部継続出願であり、そして本出願は、1999年4月29日に出願した出願シリアルNo. 60/131,675に関連する2000年4月28日に出願した出願シリアルNo. 09/559,913の一部継続出願であり、これらのすべては、本明細書中に参考文献として援用し、そしてこれらのすべては優先権書類として主張される。
【０００２】
発明の背景
グルコースおよびその他の還元糖は、タンパク質、リポタンパク質、およびDNAと、非-酵素的糖化として既知のプロセスにより反応し、そしてそれらと共有結合する。そのカルボニル基をリジン上に見られるような側鎖アミノ基に結合させることにより、グルコースは組織タンパク質上にしっかりと結合する。時間をかけて、これらの付加物は、後期糖化最終生成物（AGEs）（タンパク質-老化）と呼ばれる構造を形成する。これらの架橋タンパク質は結合組織を硬直化し、そして腎臓、網膜、血管壁および神経において組織損傷を引き起こす。長寿命の結合組織上でのAGEs形成は、糖尿病において、加速された速度で生じる正常な老化と同時に起こる、コラーゲン架橋の増加の原因となる。
【０００３】
発明の背景を説明するためにもしくはその実施に関するさらに詳細な事項を提供するために、本明細書中で使用する刊行物およびその他の材料は、参考文献として援用され、そして便宜上それぞれを添付する参考文献リスト中にグループ分けしている。
【０００４】
後期糖化最終生成物（AGEs）は、糖尿病、アテローム性動脈硬化、アルツハイマー病および慢性関節リウマチなどの様々な衰弱性の疾患の病理および正常な老化プロセスに関与している。最も最近、研究者たちは、心臓血管の老化のコンプライアンスの減少を促進する際における、AGE架橋の蓄積の重要な役割を確認している（Asif et al., 2000；Vaitkevicius et al., 2001）。動脈壁マトリックスタンパク質上でのAGE形成のプロセスは、糖化プロセス中のフリーラジカル（ROS）の生成、AGE蓄積によるコラーゲン中の正常ネットワーク形成の阻害（Brownlee, 1994）、そして単球の接着増加（Gilcrease and Hoover, 1992）など、多数の様々な様式で、アテローム性動脈硬化の発症と関連している様である。
【０００５】
Diabetic Control and Complications Trial（DCCT）の検証により、集中的なインスリン治療による血中グルコース調節の正常化により、糖尿病合併症の発症リスクが減少することが示された（Diabetic Control and Complications Trial Research Group, 1993）。しかしながら、集中的なインスリン治療により、合併症は予防することもできなければ治癒させることもできない。したがって、多数の患者が、いまだに血管合併症を引き起こしやすく、そしてこれらの合併症を防止するための追加的な薬理学的アプローチが望ましい。
【０００６】
より最近には、組織および細胞中のAGE架橋を阻害しまたは破壊することができ、そしてしたがってこれらの合併症を防止する、いくつかの有望な治療薬が報告された。AGE形成の阻害剤およびAGE-破壊物質は両方とも、これらの合併症を減少させる際に有益な作用を有するだけでなく、AGE-破壊物質は損傷を受けた組織および細胞からAGEsを取り除くことにより、疾患を治癒させることができる。
【０００７】
アミノグアニジンは、“糖化阻害剤”のプロトタイプである。これらの阻害剤は、糖尿病合併症を予防する際および正常な老化を遅延させる際における治療用途を見出すことができる。アミノグアニジンに加えて、多数のさらにずっと強力な阻害剤化合物が、本発明者により、および他の研究者により、最近紹介された（Rahbar et al., 1999；Rahbar et al., 2000a；Rahbar et al., 2000b；Kochakian et al., 1996；Khalifah et al., 1999；Soulis et al., 1999；Forbes et al., 2001）。
【０００８】
薬理学的戦略により組織タンパク質上に存在するAGE-由来架橋を選択的に切断しそして切り離すための研究は、ごく最近になって始まった。N-臭化フェナシルチアゾリウム（PTB）およびALT 711が、AGE架橋をin vitroおよびin vivoで破壊することが報告された。1996年に紹介されたはじめてのAGE-破壊物質であるPTBが紹介されたことにより、この分野における研究者のあいだで興奮が引き起こされた。しかしながら、PTBは非生理学的濃度（10〜30 mM）で使用され、そしてin vitroで急速に分解することが観察された（Thornalley and Minhas, 1999）。さらに、PTBを同一濃度の10 mg/kgで毎日使用して処置した糖尿病ラットについて、対照的な結果が観察された（Cooper et al., 2000；Oturai et al., 2000）。より安定なPTB誘導体であるALT711が、in vitroおよびin vivoの両方ともで、AGE-破壊活性を示したが（Vasan et al., 1996；Rahbar et al., 1999）、Yangたちの最近の研究（2000）では、ALT711は糖尿病ラットの皮膚および尾コラーゲンにおいて形成された架橋を切断する際に効果的でなかったことが見いだされた。
【０００９】
糖尿病コントロールおよび合併症試験（The Diabetic Control and Complications Trial；DCCT）は、高血糖症を、糖尿病合併症の発症の原因となる主要なリスク因子として特定した（The Diabetic Control and Complications Trial, 1993）。これまでの増加しつつある証拠から、後期糖化最終生成物（AGEs）の形成を、高血糖症および糖尿病の長期合併症、すなわち腎臓病、神経障害および網膜症、の主要な病原性関連として特定した（Makita et al., 1994；Koschinsky et al., 1997；Makita et al., 1993；Bucala et al., 1994；Bailey et al., 1998）。
【００１０】
非酵素的糖化は、褐変、蛍光、および架橋を引き起こす、還元糖とタンパク質、脂質およびDNAのアミノ基との一連の複合体化反応である（Bucala and Cerami, 1992；Bucala et al., 1993；Bucala et al., 1984）。この反応は、シッフ塩基の可逆的な形成により開始され、それが再構成を受けて、安定なアマドリ生成物を形成する。シッフ塩基およびアマドリ生成物は両方とも、さらに一連の反応を受け、ジカルボニル中間体を経て後期糖化最終生成物（AGEs）を形成する。
【００１１】
ヒト糖尿病患者および糖尿病の動物モデルにおいて、これらの非酵素的反応が加速され、そしてコラーゲン、フィブロネクチン、チューブリン、レンズクリスタリン、ミエリン、ラミニンおよびアクチンなどの長寿命の構造タンパク質上の糖化生成物の蓄積を引き起こし、加えてヘモグロビン、アルブミン、LDL結合脂質およびアポタンパク質などのいくつかのその他の重要な生物学的分子上の糖化生成物の蓄積を引き起こす。最も最近の報告では、糖化により代謝酵素を不活性化されることが示される（Yan and Harding, 1999）。細胞機能において主要な役割をしばしば果たす影響を受けた分子の構造的および機能的完全性はこれらの修飾により混乱させられ、腎臓、眼および神経、および微小血管などの影響を受けた器官に対して重大な結果を伴う（Boel et al., 1995；Silbiger et al., 1993；Vlassara et al., 1995；Horie et al., 1997；Matsumoto et al., 1997；Soulis-Liparota et al., 1991；Bucala, 1997；Bucala and Rahbar, 1998；Park et al., 1998）。最近の報告では、糖化が代謝酵素、高密度リポタンパク質およびIgG分子に対して影響を与えることが示される（Yan and Harding, 1999；Lapolla et al., 2000；Lucey et al., 2000；Schalkwijk et al., 1998；Hedrick et al., 2000）。糖化により誘導されたイムノグロブリンGの変化は、特に興味深い。糖尿病患者のIgGのFabフラグメントの糖化に関する最近の報告では、これらの患者において見られる免疫不全が、この現象により説明しうることが示唆される（Lapolla et al., 2000）。さらに、糖化により損傷を受けたIgGに対するIgM反応と慢性関節リウマチにおける疾患の活性とのあいだの関連が、最近報告された（Lucey et al., 2000）。同様に、糖化による高密度リポタンパク質機能の障害が、最近報告された（Hedrick et al., 2000）。
【００１２】
腎臓、ラットレンズ、およびアテローム性動脈硬化での様々な病変の糖尿病合併症の進行におけるAGEsの寄与を示す直接的な証拠が、最近報告された（Vlassara et al., 1995；Horie et al., 1997；Matsumoto et al., 1997；Soulis Liparota et al., 1991；Bucala, 1997；Bucala and Rahbar, 1998；Park et al., 1998）。いくつかの系統の証拠から、反応性カルボニル中間体（メチルグリオキサル、グリオキサル、3デオキシグルコソン、マロンジアルデヒド、およびヒドロキシノネナール）の増加が、糖尿病における高血糖症の結果であることが示される。この“カルボニルストレス”により、タンパク質および脂質の修飾の増加が引き起こされ、その後“酸化ストレス”および組織損傷が引き起こされる（Baynes and Thorpe, 1999；Onorato et al., 1999；McLellan et al., 1994）。
【００１３】
メチルグリオキサル（MG）は、AGEsを形成するための共通メディエーターとしてかなりの注目を最近集めている。インスリン-依存性糖尿病および非-インスリン依存性糖尿病の両方を有する患者において、MGの濃度が2〜6倍に増加していることが見いだされた（Phillips and Thornalley, 1993；Beisswenger et al., 1998）。さらに、MGが、タンパク質の架橋における最も反応性のジカルボニルAGE-中間体であることが見出されたばかりでなく、最近の報告では、MGが糖化反応の過程において反応性酸素種（ROS）（フリーラジカル）を生成させることが見出された（Yim et al., 1995）。
【００１４】
糖化反応と“酸化ストレス”とのあいだの複雑な関係が主張された（Baynes and Thorpe, 1999）。自然は、“カルボニルストレス”およびAGEs蓄積の有害作用から組織を保護するためのいくつかの体液性および細胞性防御メカニズムを考案した。これらには、グリオキシラーゼシステム（IおよびII）が含まれ、そしてアルドースレダクターゼはAGEsの最も共通する反応性中間体であるメチルグリオキサル（MG）のD-乳酸塩への脱糖化を触媒する（Phillips and Thornalley, 1993; Beisswenger et al., 1998; Yim et al., 1995）。さらに、Aspergillusにおいて見出されたアマドリアーゼと呼ばれる新規クラスの酵素が、アマドリ生成物の脱糖化を触媒することが見出された（Takahashi et al., 1997）。さらに、いくつかのAGE-受容体は、単球、マクロファージ、内皮細胞、メサンギウム細胞そして肝細胞の表面膜上に同定された。これらの受容体のうちの一つ、イムノグロブリンスーパーファミリーのメンバーであるRAGE、は、組織中に広く分布していることが見出された（Schmidt et al., 1994；Yan et al., 1997）。MGは、タンパク質におけるアルギニン残基およびリジン残基に対して結合しそしてそれを不可逆的に修飾する。MGにより修飾されたタンパク質は、AGE受容体に対するリガンドとして見出され（Westwood et al., 1997）、このことから、MGで修飾されたタンパク質はAGEsにおいて見出されるものと類似していることが示唆される（Schalkwijk et al., 1998）。糖化およびAGE形成に対する様々な天然の防御メカニズムの発見から、糖尿病における血管損傷および末梢神経損傷の病因においてAGEsが重要な役割を果たすことが示唆される。最も最近では、MGのLDLに対する作用が、in vivoおよびin vitroで同定された（Bucala et al., 1993）。
【００１５】
アラキドン酸などのポリ不飽和脂肪酸（PUFA）の脂質過酸化もまた、カルボニル化合物を生じる。あるものはMGおよびグリオキサル（GO）などの炭水化物から形成されるものと同一であり（Al-Abed et al., 1996）、そしてその他のものはマロンジアルデヒド（MDA）および4-ヒドロキシノネナール（HNE）などの脂質に特有である（Requena et al., 1997）。カルボニル化合物の後者のものは、脂質過酸化（lipoxidation）生成物を産生する（Al-Abed et al., 1996；Requena et al., 1997）。最近の報告では、修飾されたコラーゲンの架橋および真性糖尿病における脂質-誘導性MDAの重要性が強調されている（Slatter et al., 2000）。タンパク質架橋に関与する多数の蛍光および非蛍光AGE化合物が同定された（Baynes and Thorpe, 1999）（表1を参照）。グルコース誘導性のAGE-タンパク質架橋に加えて、AGE架橋もまた、組織タンパク質とAGE-タンパク質消化およびターンオーバーから形成されるAGE-含有性ペプチドフラグメントとのあいだで生じる。これらの反応性AGE-ペプチドは、現在ではグリコトキシン（糖毒素、glycotoxins）と呼ばれるが、正常では腎臓により排出される。糖尿病患者において、これらのグリコトキシンが血清タンパク質と反応し、そして幅広い組織損傷の原因となる（Schmidt et al., 1994）。しかしながら、架橋構造の化学的性質の詳細な情報はいまだ未知である。化学的解析およびスペクトロスコープ解析に基づいて現在までに特定された架橋構造（表1）は、in vivoで生じるAGE架橋の小さな断片のみを構成するものであり、主要な架橋構造はいまだ未知である。最近、新規な酸-不安定性AGE-構造である、N-オメガ-カルボキシメチルアルギニン（CMA）、が、コラーゲンの酵素的加水分解により同定され、そしてその濃度は、ペントシジン濃度の100倍であることが見出され（Iijima et al., 2000）、そしてそれは、主要なAGE架橋構造であると考えられた。
【００１６】
【表１】
2004529126.tif 000002
【００１７】
発明の概要
AGE-タンパク質架橋を破壊する際に活性な7種の化合物が見出された。これらの化合物は：
1,4-ベンゼン-bis［4-メチレンアミノフェノキシイソ酪酸］（LR102）；
4［（3,5-ジクロロフェニルウレイドフェノキシイソブチリル］-4-アミノ安息香酸（LR99）；L-bis-［4-（4-クロロベンズアミドフェノキシイソブチリル）シスチン］（LR20）；
4-（3,5-ジクロロフェニルウレイド）フェノキシイソブチリル-1-アミドシクロヘキサン-1-カルボン酸（LR23）；
メチレンbis［4,4'-(2-クロロフェニルウレイドフェノキシイソ酪酸）］（LR90）；
5-アミノサリチル酸（5-ASA）（本明細書中では、SMR-5とも呼ぶ）；そして
メトホルミン（本明細書中ではSMR-12とも呼ぶ）；
である。
【００１８】
本発明の第一の観点において、これらのAGE-破壊性化合物を使用して、有効量の1またはそれ以上のAGE-破壊物質を生物に投与することにより、生物における糖化最終生成物または架橋タンパク質を破壊する。
【００１９】
本発明の第二の観点において、有効量のAGE-破壊物質を生物に投与することにより、生物における老化の有害作用を逆転させる。
本発明の第三の観点において、有効量のAGE-破壊物質を生物に対して投与することにより、生物において糖尿病の結果として生じる合併症を逆転させる。
【００２０】
本発明のさらなる観点において、有効量のAGE-破壊物質を患者に対して投与することにより、患者における疾患の進行を逆転させる。ここで、前記疾患は、慢性関節リウマチ、アルツハイマー病、尿毒症、神経毒性、またはアテローム性動脈硬化を含むことができる。
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明者らは、糖化およびAGE形成阻害剤として、新規クラスの化合物、アリール（およびヘテロ環式）ウレイドおよびアリール（およびヘテロ環式）カルボキシアミドフェノキシイソ酪酸、を報告した（Rahbar et al., 1999；Rahbar et al., 2000a）。多数の非常に有効な阻害剤は、試験した92種の化合物の中にある（Rahbar et al., 1999; Rahbar et al., 2000a）。これらは、ストレプトゾトシン（STZ）誘導性糖尿病ラットにおけるin vivo実験に関して選択された。確立されたAGE-タンパク質架橋をin vitroおよびin vivoで選択的に切断することができる、臭化フェナシルチアゾリウム（PTB）（Vasan et al., 1996）およびALT 711（Wolffenbuttel et al., 1998）などの新規化合物を最近発見したことは、興味深いものであった（Cooper et al., 2000）。さらに、ALT 711は、老齢イヌおよびサルにおけるin vivoでの年齢-関連性increase of の心筋硬直の増加を逆転させることが報告された（Asif et al., 2000；Vaitkevicius et al., 2001）。糖化およびAGE-形成の強力な阻害剤として最近本発明者らが開発した多数の化合物のAGE-破壊性特性の研究の結果を、ここに開示する（Rahbar et al., 1999；Rahbar et al., 2000a）。本発明者の化合物をスクリーニングするための特異的ELISA技術およびその他のin vitroアッセイを使用して、7種の化合物が強力なAGE-架橋破壊物質であることを見出した。これらの化合物は：
1,4-ベンゼン-bis［4-メチレンアミノフェノキシイソ酪酸］（LR102）；
4-［（3,5-ジクロロフェニルウレイドフェノキシイソブチリル］-4-アミノ安息香酸（LR99）；
L-bis［4-（4-クロロベンズアミドフェノキシイソブチリル）シスチン（LR20）；
4-（3,5-ジクロロフェニルウレイド）フェノキシイソブチリル-1-アミドシクロヘキサン-1-カルボン酸（LR23）；
メチレンbis［4,4'-（2-クロロフェニルウレイドフェノキシイソ酪酸）］（LR90）；
1,1-ジメチルビグアニド（メトホルミン）；および
5-アミノサリチル酸（5-ASA）；
である。LR20、LR23、LR90、LR99およびLR102の構造は：
【００２２】
【化１】
2004529126.tif 000003
【００２３】
【化２】
2004529126.tif 000004
【００２４】
【化３】
2004529126.tif 000005
【００２５】
【化４】
2004529126.tif 000006
【００２６】
【化５】
2004529126.tif 000007
【００２７】
以下の実施例において記載するように、本研究において、化合物LR20、LR23、LR90、LR99およびLR102は、それぞれ最終濃度0.1〜10 mMで使用し、そしてそれらは図1Aおよび1Cにおいて示すような非常に有効なAGE破壊物質であった。5-ASAは20μM、50μMおよび1 mMで使用し、そしてそれは図1Bに示すように用量依存性AGE-破壊活性を示した。5-ASAのこの特徴は、“潰瘍性大腸炎（ulceritis colitis）”およびクローン病の治療において、この薬物が有効である理由の一つである可能性がある。さらに、この薬物は、慢性関節リウマチにおけるAGE架橋を逆転させる際に有益な作用を有する可能性があり、この場合コラーゲン中のAGE蓄積および糖化・酸化反応により損傷を受けたIgG（AGE-IgG）に対する免疫反応が最近報告された（Lucey et al., 2000）。結局、5-ASAは、アルツハイマー斑のβ-アミロイド内容物の損傷を減少させる何らかの効果を有しているようである。メトホルミンは、2型糖尿病を治療するための非常に一般的な薬物であるが、本発明者により糖化の強力な阻害剤であることが見い出された（Rahbar et al., 2000b）。以下の実施例において、メトホルミンが適度なAGE-破壊物質でもある証拠を提示している。
【００２８】
本発明者のAGE-破壊物質化合物の作用メカニズムは、いまだ確認されていない。しかしながら、ELISAにより免疫化学的に検出されるようにこれらの化合物はあらかじめ形成されたAGE-BSA-コラーゲン複合体からBSAを放出するため、本発明者らは、これらのAGE-破壊物質がPTBの作用メカニズムと同様に、カルボニル基間の化学結合を破壊することにより、化学的にα-ジケトンを切断することができると、推定する（Ulrich and Zhang, 1997）。
【００２９】
本発明は、以下の実施例においてさらに詳細に記載され、この実施例は説明の目的で提供されるものであって、どのような意味においても本発明を制限することを目的とするものではない。当該技術分野において周知である標準的な技術、または以下に具体的に記載する技術を使用する。
【００３０】
実施例1  化合物および材料
LR20、LR23、LR90、LR99およびLR102は、本発明者らの研究室で合成した。これらの化合物は、当業者により容易に合成される。これらは、本発明者らが糖化およびAGE形成の阻害剤として開発した102種の化合物の中のものである（Rahbar et al., 1999；Rahbar et al., 2000a）。メトホルミン（1,1-ジメチルビグアニド）および5-アミノサリチル酸（5 ASA）は、Sigmaから購入した。
【００３１】
ラット尾腱-コラーゲンで被覆した96ウェルマイクロタイタープレートは、Biocoat（Collaborative Research, Bedford, MA）から購入し、そして製造者の指示に従って使用した。ストレプトゾトシン、ウサギポリクローナル抗-BSA抗体、ラット尾-コラーゲン（VII型、酸可溶性）、ウシ血清アルブミン、グルコース、ヒトIgG、ウサギ-抗-ラットIgG、抗-ヒトIgG、メチルグリオキサル、ペプシン、パパイン、1-プロパノール、クロラミン-T三水和物、EDTA、PMSF、ヨードアセトアミド、ベンズアミジンヒドロクロリド、p-ジメチルアミノ-ベンズアルデヒド、トランス-4-ヒドロキシプロリン（結晶）、チオフラビンT（ThT）およびコンゴレッド（CR）は、Sigma Chemical co.（St. Louis, MO）から入手した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ-結合型ヤギ抗-ウサギIgGおよび色素原としての過酸化水素基質ABTS（2,2'アジノ-ジ-3-エチルベンズチアゾリンスルホン酸）は、Zymed（San Francisco, CA）から購入した。過塩素酸（70％ACS）、氷酢酸（99.5％、ASA）および12 N塩化水素酸は、J. T. Baker（Phillipsburg, NJ）から購入した。β-アミロイド（1-40）ペプチドは、Bachem（Torrance, CA）から入手した。アミコンフィルター（カットオフ値、10,000 Da）は、アミコン（Beverly, MA）から入手した。Spectra/Por CE 透析膜（分子カットオフ値、1000 Da）は、Spectrum Inc.（Houston, TX）から入手した。すべての使用したその他の試薬は、解析グレードであった。
【００３２】
実施例2  糖化BSAのAGE-破壊物質化合物による切断の評価
AGE-破壊物質化合物が糖化BSAのラット-尾-腱-コラーゲンに対する架橋（AGE-BSA）（文献（Rahbar et al., 1999）に記載されるように調製）を切断しそして破壊する能力のIn vitro評価は、特別なELISAによった（Vasan et al., 1996）。ラット-尾-腱コラーゲンで被覆したプレートを、初めに300μLのSuperblockブロッキングバッファー（Pierce Chemicals, Rockford, IL）により1時間ブロッキングした。プレートをPBS-0.05％Tween 20（PBS-T）により、Dynatech ELISA-プレート洗浄機を用いて2回洗浄することにより、ブロッキング溶液をウェルから取り除いた。様々な濃度のAGE-BSA（ウェル当たり、0、0.01、0.05、0.1、0.25、0.50、および1.0μg）のラット-尾-コラーゲンで被覆したプレートに対する架橋を、試験化合物が存在しない条件下で行い、そしてプレートを37℃にて5時間、インキュベートした。ウェルをPBS-Tを用いて3回洗浄して非接着AGE-BSAを取り除いた後、PBS中に溶解した化合物の試験濃度（50μL/ウェル）を3重にしたウェルに対して添加し、そしてインキュベーションを37℃にて一晩継続させた。
【００３３】
PBS-Tを用いて洗浄した後、ウサギ抗-BSAポリクローナル抗体（50μL/ウェル）を37℃にて1時間添加することにより、尾コラーゲンプレートに対して接着したままになっているBSAの量を定量した。次いでウェルは、PBS-Tを用いて3回洗浄し、そして発色性基質ABTS（100μL/ウェル）を用いて発色させた。吸光度は、マイクロプレートリーダーを用いて、410 nmで測定した（BioRad, Hercules, CA）。
【００３４】
破壊活性の％が、以下の式：
100×［（A410、PBS対照）−（A410、AGE-破壊物質化合物）］／［A410、PBS対照］
により計算される。
【００３５】
実施例3  β-アミロイド微小繊維のin vitroでの分解
グルコースをβ-AP（アミノ酸1〜40、Bachem, Torrance, CAから購入）と共にインキュベーションすることにより調製したAGE-修飾β-アミロイドペプチドは、β-APがin vitroでアミロイド微小繊維中への凝集およびポリマー化することを効率的に開始することが示された。
【００３６】
もともとは、このアッセイはPTBのために使用され（Al-Abed et al., 1999）そして20 mMの濃度のPTBがこの様式で凝集したβ-アミロイド微小繊維を分解することを示した。このアッセイのもともとの様式では、AGE-β-アミロイドを放射性ヨウ素化しその後透析して、取り込まれなかった放射性ヨウ素125Iを取り除かなければならず、そして4〜10％勾配ゲル中でのSDS-PAGEにより分離しなければならず、このアッセイを非常に面倒なものとする。
【００３７】
このアッセイの新しいバージョンにおいて、BucalaとCallaway（Bucala、私信；Tjernberg et al., 1999）は、AGE-β-アミロイドペプチドをAGE-破壊物質化合物により分解することを示す以下のアプローチを提示した。チオフラビンT（ThT）蛍光アッセイおよびコンゴレッド結合アッセイは、コンゴレッドおよびThTが、前駆体ポリペプチドおよびモノマーに対する結合上では生じない様々なアミロイド微小繊維（β-シート構造）に対する結合での特徴的な構造変化を受ける。これらの色素は両方とも、アミロイド微小繊維形成および定量のin vitro測定に適用された。β-アミロイドに対するThT結合は、ThTに対して結合したアミロイド微小繊維の選択的励起を可能にする大幅な蛍光励起スペクトルシフトを引き起こす（Tjernberg et al., 1999）。本発明においては、本発明者らは天然の（修飾されていない）β-アミロイドおよび糖化β-アミロイド（1〜40）ペプチドの両方を、ここで紹介したAGE-破壊物質化合物により分解することを研究した。
【００３８】
実施例4  糖化β-アミロイド（AGE-アミロイド）の調製（Loske et al., 2000；Munch et ai.. 1997）
ペプチドのストック溶液を、1 mg/mLの濃度で脱イオン水中に溶解した。AGE架橋実験に関して、それらを4 mLポリプロピレンチューブ中で50 mMリン酸ナトリウムバッファー（pH 7.9）中、250μg/mL（60μM）および50 mM グルコースの濃度で、50℃にて5日間、暗黒下でインキュベートした。アジ化ナトリウム（0.01％ w/v）を添加して、微生物増殖を防止した。長期的な実験において、溶媒の蒸発を補完するため、水を12時間ごとに添加した。次いで、AGE-β-アミロイドをSpectra/Por CE透析膜（分子量カットオフ値：1000 Da）を用いて2重蒸留水に対して透析し、その後凍結乾燥した。
【００３９】
実施例5 AGE-β-アミロイドまたは天然β-アミロイドの、AGE-破壊物質化合物による処理（Asif et al. 2000）
それぞれの化合物溶液に関して、2セットの実験を用意した。第1の実験のための溶液には、50 mM Tris-緩衝塩類溶液（TBS）pH 7.4中に100μMのβ-アミロイドおよび50 mMの一つの化合物を含有した（薬物はDMSO中に溶解し、そして溶液を希釈用にこのDMSOストックから調製した）。第二のセットには、TBS中100μMのβ-アミロイドおよび100μMのひとつの化合物を含有した。反応物を、37℃にて24時間、攪拌することなくインキュベートした（停滞性アッセイ）。対照実験を、チューブにAGE-破壊物質化合物を何も添加しなかったことを除いて、同様に調製した。同一のプロトコルを天然および糖化β-アミロイドペプチドに関して使用した。
【００４０】
実施例6  チオフラビンT（ThT）蛍光アッセイ（Tjernberg et al. 1999）
インキュベートしたサンプルをボルテックスにかけ、そして40μLのアリコートを取り出し、そして960μLの10 mMリン酸ナトリウムバッファー中10μMのThTと混合した。蛍光測定は、437 nmの励起光および485 nmの放射光により行った。スリット幅は、5 nmに設定する。
【００４１】
実施例7  電子顕微鏡
処理および非処理AGE-β-アミロイドペプチド凝集物のための調製を、Vasanら（1996）に従って行った。これらの調製物を、透過型電子顕微鏡で調べた。
【００４２】
実施例8  in vivoで形成されるAGE架橋の切断
in vitroでのAGE-破壊物質処理により、糖尿病ラットのラット-尾-腱コラーゲンにおいて、in situで形成されるAGE架橋を減少させることもできる。この研究に関して、体重約150〜175 gのオスSprague-Dawleyラット（Charles River, Wilmington, MA）において、ストレプトゾトシン（65 mg/kg, i.p.）の注入により、糖尿病をまず誘導した。その後、血漿グルコース測定により、1週間後に高血糖症を確認した（≧250 mg/dL）。32週間後、ラットを犠死させ、そしてKochakianら（1996）により記載されたように、コラーゲンを糖尿病動物および正常対照動物から単離した。尾腱を付着組織が存在しないように切断し、プロテアーゼ阻害剤を含有するPBS（それぞれ1 mMのEDTA、PMSF、ヨードアセトアミドおよび塩酸ベンズアミド）中で完全に洗浄し、紙タオル上で軽くたたいて乾燥させ、球状に丸めて、凍結乾燥し、そして使用するまでシールした容器に入れて-20℃で保存した。
【００４３】
実施例9  ラット尾コラーゲンのAGE-破壊物質化合物による処理
尾腱コラーゲンの代表的なサンプルを、動物の体から取り出し、そして約20〜25 mmのサイズに切断した。次いで、サンプルを1.5 mL微小遠心管の内部に入れ、0.02 g/L NaN3を含有するPBSバッファー（pH 7.4）中の所望の濃度のAGE-破壊物質化合物、1 mLを用いて懸濁した。非処理対照チューブは、尾腱コラーゲンおよびPBSバッファーのみを含む。チューブは、37℃で24時間インキュベートした。インキュベーション後、チューブを10,000 rpmで遠心分離し、そして上清を廃棄した。コラーゲンサンプルをPBSですすぎ、完全にボルテックスをかけ、簡単に遠心分離し、そして上清を廃棄した。このすすぎを2回繰り返した。最後のすすぎのとき、上清を廃棄し、そしてチューブを1分間逆向きにし、サンプルを風乾させる。これらのコラーゲンサンプルを酸溶解性および消化の研究においてすぐに使用した。
【００４４】
実施例10  弱酸における腱コラーゲン溶解度（Sajitwal et al.. 1998）
AGE-破壊物質化合物で処理したおよび処理していないサンプル中の酸-不溶性コラーゲン量を測定するため、すべてを二重にした糖尿病ラットおよび非糖尿病ラット由来の乾燥尾-腱コラーゲンのアリコート、5 mgを、2 mLの0.05 M酢酸に添加し、および4℃にて24時間攪拌した。混合物をポリトロンホモジナイザー中でホモジナイズし、そして4℃にてさらに24時間攪拌した。次いで、懸濁液を、9000×gで60分間、4℃にて遠心分離した。透明な上清中のコラーゲンを、酸溶解性コラーゲンとして、そしてゲル様ペレットを酸不溶性コラーゲンとして定義した。ペレットを凍結乾燥しそして秤量し、そして％酸不溶性コラーゲンを以下のように計算した：100×（ペレットの凍結乾燥重量／尾腱コラーゲンの新鮮重量）。溶解度の％上昇を以下のように計算した：
100×（非処理糖尿病コラーゲンの酸不溶性コラーゲン重量−処理糖尿病コラーゲンの酸不溶性コラーゲン重量）／非処理糖尿病コラーゲンの酸不溶性コラーゲン重量。
【００４５】
実施例11  全ペプシン消化アッセイ（Stefek et aL 2000）
上述したようにAGE-破壊物質化合物で処理および非処理の糖尿病および非-糖尿病の尾腱由来の各10ミリグラムのコラーゲンサンプルを、1 mLの新鮮に調製したペプシン（0.5 M酢酸中50μg/mL）中で、37℃で24時間、ボルテックスにかけた。消化の後、サンプルを3,000 rpmで15分間遠心分離した。消化したコラーゲンを含有した透明な上清を回収し、それをコラーゲン-結合蛍光のために使用した。100μLの上清を、900μLの200 mMリン酸バッファー（pH 7.5）と混合し、そして励起および放射蛍光をHitachi F-2000蛍光分光光度計で記録し、最大励起および最大放射の波長値を測定した。サンプルの蛍光を、365 nmの励起および418 nmの放射で定量した。すべての蛍光値をリン酸バッファー中のペプシンの蛍光に関して補正し、そしてコラーゲンサンプルのヒドロキシプロリン含量のマイクロモルあたり任意の単位として表現した。それぞれのコラーゲンサンプルのヒドロキシプロリン含量を、記載されたマイクロアッセイ方法（Creemers et al., 1997）を使用して、酸加水分解により測定した。蛍光の減少％は、以下のように計算した：
100×（蛍光／ヒドロキシプロリン非処理コラーゲンμmol−蛍光／ヒドロキシプロリン処理したコラーゲンμmol）／蛍光／非処理コラーゲンのヒドロキシプロリンμmol。
【００４６】
実施例12  パパイン消化可能性アッセイ（Verzijl et al., 2000）
AGE-破壊物質化合物で処理のおよび非処理の糖尿病ラットおよび非-糖尿病ラットの尾コラーゲンのコラーゲン-結合蛍光を、以下のように測定した：それぞれ約5 mgのコラーゲンを、500μLのパパインバッファー（50 mM リン酸バッファー（pH 6.5）、2 mM L-システインそして2 mM EDTA）中2.5 units/mLのパパインを用いて、65℃にて2時間消化した。消化物を10,000 rpmで4℃にて60分間、遠心分離し、そして上清をペレットから分離した。励起光370 nmおよび放射光440 nmでの蛍光測定を、上述したとおり行った。上清消化物のアリコートを、酸加水分解に供し、その後ヒドロキシプロリン測定を行った。結果を、それぞれのサンプルのヒドロキシプロリン含量マイクロモル当たりの蛍光単位としてあらわした。蛍光の減少％を、上述したとおり計算した。
【００４７】
実施例13  酸加水分解およびヒドロキシプロリン測定
ペプシンまたはパパイン消化物のアリコート（100μL）を、12×35 mmのTFEで覆われたスクリューキャップチューブ（Fisher Scientific Co., Pittsburgh, PA）中、6 N HClにより加水分解した。蒸気滅菌機中で、250°Fにて3.5時間、チューブをオートクレーブした。サンプルを加熱とともにSavant Speed Vac濃縮機を使用して乾燥させ、そしてアッセイするまで4℃で保存した。乾燥させたサンプルを200μLの脱イオン化水により再水和し、そしてアリコートを、Creemers et al.（1997）に記載されたように、96-ウェルマイクロタイタープレート中でそれらのヒドロキシプロリン含量をアッセイした。
【００４８】
実施例14  ラットRBC表面に対して架橋されたIgG-AGEの切断の抗-IgG ELISAアッセイを用いた測定
RBC表面に対して架橋されたIgGを、Vasan et al.（1996）に記載された方法を改良することにより、抗-IgGを用いて測定した。簡単に述べれば、ヘパリン化血液を毛細管中に尾静脈から採取し、数分間反転させ、その後200×gで5分間、室温で遠心分離した。RBCを0.5 mL微小遠心管中でPBSを用いて3回洗浄し、そして500×gで最終遠心分離によりパックした。赤血球細胞をグルコースに関して通常のDulbecco's改変イーグル培地中で1：10から1：100に希釈した。実験的化合物を所望の濃度で添加し、そして37℃にてCO2インキュベーター中で24時間、無菌条件下でインキュベートした。対照インキュベーションは、RBCおよびPBSのみを含有した。インキュベーション後、RBCをPBS中で3回洗浄し、そして細胞を1：200〜1：500に希釈してパックした。RBC懸濁物を穏やかにボルテックスし、そして50μLアリコートに450μLのアルカリホスファターゼ結合ポリクローナルウサギ抗-ラットIgGを添加した（PBS中1：2500に希釈）。その後チューブを室温にて2時間インキュベートし、次いでRBCをPBSで3回、Tris緩衝化塩類溶液（50 mM Tris、pH 8.0）で1回、そして0.5 mL〜1 mLのリン酸p-ニトロフェニル基質を添加し（0.1 Mジエチルアミン緩衝化塩類溶液、pH 9.5中、2 mM Mg2+を含むもの1 mg/mL）、ボルテックスにかけ、そして室温にて30分間インキュベートした。RBCをペレットにし、そして上清を従来型の分光計またはELISAリーダーのいずれかで、410 nmで読み取った。チューブを細胞を含まずにインキュベートすることにより、ブランクの読み取りを得た。
【００４９】
実施例15  データ解析
データを、平均±S.D.またはS.E.M.として表現した。対応のないスチューデントt-検定を使用して、処理サンプルと対照とのあいだの相違を比較した。P値＜0.05を、統計的に有意とみなした。
【００５０】
実施例16  結果
コラーゲン-被覆マイクロプレートと架橋形成するAGE-BSAを使用する特別のELISA法は、架橋形成および破壊のin vitro迅速スクリーニングのためのアッセイとして適している。この技術を使用して、本発明者らは、本発明者らが以前に報告した多数の阻害剤化合物が、AGE-BSA-コラーゲン架橋を切断しそして破壊することができることも観察した（図1A〜C）。LR20、LR23およびLR90のようないくつかの化合物は、より高い濃度でより有効な破壊物質であるが（図1A）、一方LR102、5-ASAおよびメトホルミンなどのその他のものは、より低い濃度でより強力である（図1Bおよび1C）。本発明者らはこれらの化合物を使用して、老齢糖尿病ラット（32ヶ月齢および血中グルコース＞25 mmol/L）の尾腱コラーゲンにおいてin vivoで形成されるAGE架橋に対するそれらの作用を調べた。
【００５１】
in vivoで形成される尾腱コラーゲンのAGE架橋の範囲は、酸不溶性および蛍光測定により評価した（図2〜5）。表2は、これらの化合物のラット-尾腱コラーゲンに対する作用をまとめたものである。これらの試験すべてから、解析した様々な化合物について、様々な結果が得られた。概して、具体的には1.0および10 mMの濃度の化合物によりコラーゲンを処理することにより、コラーゲン溶解度の増大およびAGE架橋に伴う蛍光の減少が引き起こされる（図2〜5、表2）。これらの試験のすべてにおいて、LR23の処理により、溶解度が顕著に増大し、そして糖尿病ラットのコラーゲンのAGEに関連する蛍光が顕著に減少した（P＜0.05、図2B、3Bおよび4B）。AGE-ELISA試験において低濃度で有効であることが見出された5-ASAは、これらの濃度でパパイン試験において切断活性を示すのみであった（図5）。それにもかかわらず、これらの研究において使用された限定数のコラーゲンサンプル（2〜3サンプル）は、統計学的に非有意のその他の化合物の結果に寄与したが、それらの実際の反応には寄与しなかった。
【００５２】
これらの化合物のAGE-破壊性作用を、RBCの表面に対して架橋したIgG-AGEに対して、さらに評価した。糖尿病対照と比較した場合、化合物で処理したRBCは、より少ない量のIgG-AGEをそれらの表面に対して結合させた（図6）。5-ASAおよびLR102処理の結果、非-糖尿病対照のものとほとんど同一のIgG-AGE含量を引き起こした（P＜0.05）。
【００５３】
【表２】
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【００５４】
本発明の発明者らは、本発明の化合物が天然の微小繊維および糖化β-アミロイド（AGE-βA）を分解できるかどうかを、ThT結合アッセイおよび電子顕微鏡を用いて試験した。ThTアッセイの結果は、天然および糖化β-アミロイドの両方の微小繊維型の分解に対するLR90、LR102および5-ASAの有効性を明確に確認した。同様に、化合物で処理したおよび処理していないβ-アミロイド微小繊維調製物の電子顕微鏡試験により、AGE-破壊物質による処理の前および後でのβ-アミロイド凝集物の微小繊維型の顕著な変化を示した。対照（非処理）調製物において、β-アミロイドは、密度の高い微小繊維凝集物を示す。対照的に、AGE-破壊物質で処理したβ-アミロイドでは、微小繊維はそれほど密度が高くなく、そして非均一である。これらの結果から、本発明の新規のAGE-破壊物質化合物は、β-アミロイド微小繊維構造を分解する能力を有することが示唆される。
【００５５】
AGE-BSA-コラーゲンELISA法を使用して、本発明者らは、本発明の阻害剤化合物の多くが、AGE架橋を切断しそして破壊することも可能であることを見出した。それらの多くは、用量-依存的なAGE-破壊性活性を示し、そして5-ASAやメトホルミンなどの少数のものが、低濃度で高い有効性を有するものである。興味深いことに、本発明者らは、5-ASAが20μMでもAGE-BSA架橋を破壊することを見出した。5-ASAのこの特徴は、この薬物が“潰瘍性大腸炎”およびクローン病の治療において有効である理由のひとつである可能性がある。さらに、5-ASAは、アルツハイマー斑のβ-アミロイド含有物の損傷を減少させる何らかの作用を有する可能性がある。β-アミロイド試験に関するデータ（New YorkのPicower医学研究所で行われた）から、この化合物が天然および糖化β-アミロイドの両方の微小繊維型を分解できることが示された。結局、この薬物は、コラーゲンにおけるAGEの蓄積および糖化・酸化により損傷を受けたIgG（AGE-IgG）に対する免疫学的反応が最近報告された（Lucey et al., 2000）慢性関節リウマチにおけるAGE架橋を逆転させる際に有益な作用を有する可能性がある。IgG-AGE試験の結果から、5-ASA処理により、RBC表面上のIgG-AGEを有意に減少させることができることが示された。
【００５６】
本発明者らの研究室において開発されたAGE破壊物質は、ペプシンおよびパパイン消化の後に行った酸溶解性および蛍光測定により示されるように、糖尿病ラットの尾におけるAGE架橋を切断する際に有効であった。さらに、いくつかの化合物は、赤血球細胞表面上のIgG-AGE架橋を破壊することができただけでなく、天然および糖化β-アミロイドの微小繊維型の両方ともを分解することができた。本発明者らは、LRシリーズの化合物の中で、LR-23およびLR-102が、最も効果的なAGE-破壊物質であることを見いだした。メトホルミンは、2型糖尿病の治療における非常に一般的な薬物であり、本発明者らは以前にAGE形成を阻害することを報告したが、これもまた適度なAGE-破壊性特性を示した。したがって、本発明者らの結果に基づいて、様々な官能基を有する化合物がAGE架橋を切断しそして破壊することができると考えられる。
【００５７】
本発明は、本発明の好ましい態様の詳細に関して参照することにより、本特許出願中に開示されているが、本発明の思想および添付の請求の範囲の中で、修飾は当業者に容易に生じうるものであることが企図されているため、この開示は説明を目的としてものであって、限定的な意味をもつものではないと理解されるべきである。
【００５８】
参考文献のリスト
【００５９】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図1Aは、LR20、LR23およびLR90による架橋コラーゲン-AGE-BSAの切断を示す。AGEは、いずれかのAGE-破壊物質の非存在下における、コラーゲン-AGE-BSAを意味する。図1Bは、架橋コラーゲン-AGE-BSAの切断を測定することによる、5-ASAの用量依存的AGE-破壊性活性を示す。AGEは、5-ASAの非存在下における、コラーゲン-AGE-BSAを意味する。図1Cは、LR102、5-ASA（SMR-5）、およびメトホルミン（SMR-12）による架橋コラーゲン-AGE-BSAの切断を示す。AGEは、いずれかのAGE-破壊物質の非存在下における、コラーゲン-AGE-BSAを意味する。
【図２】図2A〜Dは、弱酢酸中で新規のAGE-破壊物質（LR20、LR23、LR99およびLR102）により処理したコラーゲンの溶解度を示す。値は、2〜3コラーゲンサンプルの平均±S.D.である。P値は、対応のないスチューデントのt-検定を使用して計算した。それぞれの図に関して、*は、非-糖尿病対照との対比でP＜0.05であることを示し、そして**は、糖尿病対照との対比でP＜0.05であることを示す。
【図３】図3A〜Dは、新規のAGE破壊物質（LR20、LR23、LR99およびLR102）を用いて処理したコラーゲンのペプシン消化の結果を示す。値は、2〜3コラーゲンサンプルの平均±S.D.である。P値は、対応のないスチューデントのt-検定を使用して計算した。それぞれの図に関して、*は、非-糖尿病対照との対比でP＜0.05であることを示し、そして**は、糖尿病対照との対比でP＜0.05であることを示す。
【図４】図4A〜Dは、新規のAGE破壊物質（LR20、LR23、LR99およびLR102）を用いて処理したコラーゲンのパパイン消化の結果を示す。値は、2〜3コラーゲンサンプルの平均±S.D.である。P値は、対応のないスチューデントのt-検定を使用して計算した。それぞれの図に関して、*は、非-糖尿病対照との対比でP＜0.05であることを示し、そして**は糖尿病対照との対比でP＜0.05であることを示す。
【図５】図5A〜Cは、ラット尾コラーゲンに対する5-ASA（SMR-5）処理の作用を示す。図5Aは、弱酸中での溶解度を示し、図5Bはペプシン消化による結果を示し、そして図5Cはパパイン消化による結果を示す。値は、2〜3コラーゲンサンプルの平均±S.D.である。P値は、対応のないスチューデントのt-検定を使用して計算した。それぞれの図に関して、*は、非-糖尿病対照との対比でP＜0.05であることを示し、そして**は、糖尿病対照との対比でP＜0.05であることを示す。
【図６】図6は、ラットRBCs上に架橋したIgG-AGEを新規AGE破壊物質（5-ASA（SMR-5）およびLR102）で処理した結果を示す。値は、3つの異なる測定の平均±SEMである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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