(57)【要約】本発明は、目的被着物をあるパターンで表面に付着させて分子単位で表面にパターニングするための方法及び手段に関する。好適実施例では目的被着物は生体細胞であるが、より一般的には、特定の部位に付着させる必要のある生体物質や化学種であり得る。この方法では、スタンプを用いて第１のタイプの分子を前記表面上にマイクロコンタクトプリンティングする。次に、表面上に残ったスタンプを用いて、選択されたスタンプの凹部と表面によって画定された選択された開口を通して第２のタイプの分子を流体パターニングする。目的被着物に対するこの第２のタイプの分子の付着特性は、前記第１のタイプの分子の付着特性と補完的でなければならない。スタンプは、第１の分子と第２の分子の両方が表面に移ってから初めて取り除かれる。
2006515417.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的被着物をあるパターンで表面に付着させる表面パターニング方法であって、
側面を有する凸部と凹部とを有するスタンプを準備する過程と、
付着抑制タイプの分子と付着促進タイプの分子とを準備する過程であって、前記付着抑制タイプの分子は目的被着物がそれに付着するのを抑制する付着特性を有し、前記付着促進タイプの分子は目的被着物がそれに付着するのを促進する付着特性を有し、前記付着抑制タイプの分子は前記付着促進タイプの分子と補完的な付着特性を有する、該過程と、
前記スタンプの前記凸部に第１のタイプの分子をインク付け式に付ける過程であって、前記第１のタイプの分子は前記付着抑制タイプの分子か前記付着促進タイプの分子の何れかである、該過程と、
前記スタンプで前記表面にスタンピング処理する過程と、
選択された開口部を通して第２のタイプの分子を流す過程であって、前記選択された開口部は、前記表面の選択された部分、前記スタンプの選択された凹部、及び前記スタンプの選択された凸部の側面によって画定され、前記第２のタイプの分子は前記第１のタイプの分子と補完的な付着特性を有する、該過程と、
前記スタンプを取り除く過程とを有することを特徴とする方法。
【請求項２】
第２のタイプの分子を選択された開口部を通して流す前記過程が、前記スタンプを再度位置合わせすることなく行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記選択された開口部を通して洗浄用溶液を流す過程であって、前記第２のタイプの分子を流す前に行われる、該過程をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記表面の前記選択された部分まで伸展する前記第１のタイプの分子の量が許容量を超えるか否かを推定する過程と、
前記表面の前記選択された部分まで伸展する前記第１のタイプの分子の量が前記許容量を超えると推定された場合、前記第２のタイプの分子を流す前に前記選択された開口部を通して洗浄用溶液を流す過程をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記表面の前記選択された部分まで伸展する前記第１のタイプの分子の量が許容量を超えるか否かを推定する前記過程が、何れかの前記選択された開口部の前記表面に沿った最小の距離を求める過程を含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記選択された開口部の前記表面に沿った前記最小の距離が２０μｍ未満である場合に、前記表面の前記選択された部分まで伸展する前記第１のタイプの分子の量が前記許容量を超えると推定されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記スタンプの前記凸部に前記第１のタイプの分子をインク付け式に付ける前記過程の前に、前記スタンプの親水性を高める過程をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記スタンプの親水性を高める過程が、前記スタンプを酸素プラズマに曝すことによって行われることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第１及び第２のタイプの分子で覆われた前記表面を前記目的被着物に曝す過程をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記表面上の前記付着促進タイプの分子で覆われた部分に前記目的被着物を選択的に成長させる過程をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記付着抑制タイプの分子が、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、及びウシ血清アルブミンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記付着促進タイプの分子が、タンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記付着促進タイプの分子が、ポリＤリジン、ラミニン、及びフィブロネクチンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記目的被着物が、生物細胞を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記表面にスタンピング処理する前記過程の前に、前記表面を架橋分子で処理する過程をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記架橋分子がグルタルアルデヒドであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記架橋分子がSulfo-GMBSであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記表面がガラスであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記表面がプラスチックであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記スタンプの前記凸部に第１のタイプの分子をインク付け式に付ける前記過程の後で、かつ前記表面にスタンピング処理する前記過程の前に、前記スタンプを乾燥させる過程をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記選択された開口部を通して洗浄用溶液を流す過程であって、前記第２のタイプの分子を流した後に行われる、該過程をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記選択された開口部を通して第２のタイプの分子を流す前記過程の後で、かつ前記スタンプを取り除く前記過程の前に、前記表面を乾燥させる過程をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
表面上に付着促進タイプの分子とそれに隣接させて付着抑制タイプの分子をあるパターンで表面に付着させるための表面パターナであって、
前記付着抑制タイプの分子は目的被着物がそれに付着するのを抑制する付着特性を有し、前記付着促進タイプの分子は目的被着物がそれに付着するのを促進する付着特性を有し、前記付着抑制タイプの分子は前記付着促進タイプの分子と補完的な付着特性を有し、
前記表面パターナは、
側面を有する凸部と凹部とを有するスタンプであって、前記凸部には第１のタイプの分子をインク付け式に付けることができ、前記第１のタイプの分子は前記付着抑制タイプの分子か前記付着促進タイプの分子の何れかである、該スタンプと、
前記スタンプを再度位置合わせすることなく選択された開口部を通して第２のタイプの分子を流すための手段であって、前記選択された開口部は、前記表面の選択された部分、前記スタンプの選択された凹部、及び前記スタンプの選択された凸部の側面によって画定され、前記第２のタイプの分子は前記第１のタイプの分子と補完的な付着特性を有する、該手段とを有することを特徴とする表面パターナ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は表面上での分子パターン形成に関する。本発明は特に、複雑な位置合わせ技術が不要なスタンプを１個のみ用いたマイクロコンタクトプリンティングと流体パターニングとの組み合わせによるパターニングに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的及び非生物学的な診断用・センシング用機器の開発においては様々な利用目的で、表面上に異なる分子を選択的にパターニングする必要がでてくる。その例としては、以下に限定されないが、化学診断デバイス、細胞やタンパク質をセンサとして用いる生物学的解析システムの製造、人工神経／神経インタフェース、人工組織、ＤＮＡプローブ／センサまたはタンパク質チップ、及びコンビナトリアル（組み合わせ）スクリーニング法等が挙げられる。細胞の付着及び増殖を空間的に制御することによって、それらの用途で並行して用いることができるようになるだけでなく、これを用いて細胞やタンパク質の機能を調べて基本的な科学上の疑問への解答を得ることもできる。またこの能力によって神経細胞の機能を調べるための神経ネットワークの形成も可能となる。
【０００３】
現在の、生体分子またはタンパク質を表面にパターニングする方法としては、例えば、マイクロコンタクトプリンティング及び流体をマイクロ流体ネットワークに流すことによる流体パターニングがある。
【０００４】
マイクロコンタクトプリンティングでは、目的の分子がスタンプ上にインク付け式に付着される。スタンプは一般的にはレリーフ構造（浮き彫り構造）を有する柔軟なポリマーである。このようなスタンプは通常、微細加工された型にポリマーをコーティングすることにより形成される。次に分子を付着されたスタンプを表面上に押し、目的の分子を表面に移す。
【０００５】
Kumarらによる米国特許第5512131号には、マイクロコンタクトプリンティング法の例が記載されている。Kumarらは、スタンプを用いて１種以上の化学種をスタンプの凸部から材料の表面に移すことによって表面にパターン形成する方法を開示している。この特許明細書には、安定したスタンプの形成及び使用のための有用な方法について記載されている。多種の化学種を表面上に付着させるため、Kumarらの方法では複数回のスタンピング操作を行う。この場合、高い解像度を達成するために、その後のパターニングが前のパターンに対して適切な位置関係で行われるようにスタンプは注意深く位置合わせされなければならない、という点に注意されたい。
【０００６】
異なる分子を表面に移すための上記とは異なるマイクロコンタクトプリンティング法が、Turner、Martin及びGaberによる米国特許第5948621号に記載されている。この米国特許には、ポリマーゲルを用いて作成されたマイクロ分子スタンプの使用について記載されている。ポリマーゲルの一方の面は固体の基板に結合される。ポリマーゲルの他方の面は露出され、凸部と凹部を有するようにパターン形成される。凸部はポリマーゲルで形成されるが、凹部にはポリマーゲルがあってもなくてもよい。ポリマーゲルは分子の溶液または懸濁液のためのスポンジの役目を果たす。パターン形成された表面の凸部は分子の溶液または懸濁液の入った１以上の容器内に浸漬される。必要ならば、それぞれ別種の分子の入った複数の容器で複数種の分子のアレイを形成してもよい。パターニングされた表面上のポリマーゲルが容器から分子を吸収した後、パターニングされた表面を固体表面に押し付けることによって、その固体表面上にパターニングされた表面と同じパターンとなるように吸収した分子が移される。
【０００７】
流体パターニングは、上記のものとは根本的に異なる、分子を表面に移すためのプロセスである。流体パターニングでは、レリーフ構造を有する材料を表面形状にあわせて表面に接触させるように配置し、目的の分子を溶液の形でレリーフ構造によって形成された微細な溝に流す。目的の分子は微細な溝内の表面に物理的または化学的相互作用によって付着する。
【０００８】
Schuellerらによる米国特許出願公開第2002/0050220号には、マイクロコンタクトプリンティング及び流体パターニングのためのスタンプについて記載されている。流体パターニングについては、この文献には、連続した溝のパターンを有するスタンプが表面上に配置されることが記載されている。溝は流体源に接続され、流体は流体源から溝を通して流れ、第２の位置においてスタンプから流出する。流体は管を通して溝に出入りしてもよい。スタンプの凸部は、流体を溝によって形成された表面上の流路内に規制する。加えて、この文献には、スタンピング、流体パターニング、またはその両方によって表面がパターン形成され得ることが記載されている。スタンプは、コンタクトプリンティングによって１種類の材料を付着させ、同時に流体パターニング用の流路を形成する。
【０００９】
Bernardら（Bernard, Renault, Michel, Bosshard, and Delamarche, "Microcontact Printing of Proteins," Adv. Mater. 12, (14), July, 19, 2000）には、タンパク質を優先的に吸収する表面もあればタンパク質を弾く表面もあり、従って表面特性を調整すると、溶液内のタンパク質をパターンを形成するように付着させるという興味深い能力を与えられることが記載されている。
【００１０】
詳述すると、Bernardらは、金の表面が自己組織化分子（SAM）によってパターニングされ得ることに着目した。実際のBernardらの方法では、疎水性のアルカンチオールのパターンをマイクロコンタクトプリンティングして、金の基板のプリンティングされていない部分を溶液から吸収されたチオール化ポリエチレングリコール（PEG）でブロックした後、溶液からタンパク質を付着させられる部位を形成することについて記載している。文献のその後の部分には、イムノアッセイにおいては、目的のタンパク質を固定した後の表面上の利用可能な全ての部位をブロックするためにウシ血清アルブミンや他のタンパク質を用いることが一般的であることが記載されている。
【００１１】
この方法を一般化すると、表面を付着促進分子と付着抑制分子の両方でパターン形成することができる。付着促進分子は、細胞の分子への付着を促進する。逆に、付着抑制分子は、細胞の分子への付着を阻害する。表面が付着促進分子でパターン形成され、かつその表面に細胞が播種されている場合、その細胞は表面上の付着促進分子に優先的に付着する。表面が付着抑制分子でパターン形成されている場合には、播種された細胞は表面上のその分子でパターン形成されていない全ての部分に付着しやすくなる。表面上の細胞が付着することが望ましい部位を付着促進分子で、望ましくない部位を付着抑制分子で覆うことによって、選択性を向上させることができる。付着促進・抑制分子の利用は、細胞でパターン形成することのみならず、センサやプローブの用途において使用するための他の細胞を選択的に付着させることにも拡張することができる。
【００１２】
Bernardらに記載されているような付着促進・抑制分子の両方で表面をパターニングすることは、さまざまな方法によって達成される。例えば、それぞれに補完的な付着特性を有する分離をインク付け式に付着させた２種類の補完的なスタンプを用いたマイクロプリンティングを利用することができる。この方法では、第１のスタンプによって分子が付着されていない表面上の領域のみに第２のスタンプの分子が接触するように、第２のスタンプを正確に位置合わせする必要がある。或いは、Bernardらに記載のように、１つの種類の分子で表面をコーティングし、スタンプを用いて分子が付着することが望ましくない領域の分子を剥がし、次にそのスタンプ（または別のスタンプ）に所望の分子をインク付け式に付着させて再度スタンピングする。この方法でも、第２のスタンピングは第１のスタンピングと正確に位置合わせする必要がある。
【００１３】
さらに別の方法は、第１のタイプの分子を表面に移すためにマイクロコンタクトプリンティングを利用し、次にその表面を補完的なタイプの分子に単に曝す。この方法は、単純であるという利点を有するが、第１の分子でパターン形成された領域内の何も付着していない部位に第２の分子を付着させてしまう可能性がある。このことは当然有害である。なぜなら２種類の分子の混合度は予期される以上に高まってしまい、一方の分子の付着抑制特性が、他方の分子の付着促進能力に対してその能力を相殺する以上の作用を与えてしまうこともあるからである。
【００１４】
以上述べた全ての補完的な付着特性を有する分子を付着させる方法においては、一方の分子をその分子に対して補完的な特性の分子のために取ってある領域に付着させてしまうような加工プロセス上の誤りが、大部分は気づかれないままになってしまうことになり得る。そして、製品の歩留まりの低下や製品の性能が最適状態に及ばないものとなる理由が誤認されやすくなる。従って、この分野においてまだあまり認識されていないニーズは、補完的な付着特性を有する分子を表面上の正確な位置に移し、表面上に正しくない付着特性を有する分子を付着させてしまう可能性を最小限にするようなプロセスを開発することである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の実施形態は、表面に互いに補完的な付着特性を有する分子をパターン形成する新規な方法及び手段を提供する。好ましい実施形態では、補完的な付着特性（目的被着物に対する付着促進または付着抑制の何れかの特性）を有する分子が、複雑でコストの嵩む位置合わせ技術を用いることなく表面上にパターニングされる。好ましい実施形態では、補完的な付着特性の分子同士の混合が発生しないか、極めて少なくする。
【００１６】
本発明の一般的な実施形態は以下の過程を有する。
１．凹凸部分を有するスタンプに第１のタイプの分子をインク付け式に付着する。
２．第１のタイプの分子を付けたスタンプを表面上に押して、スタンプの凸部によって形成されたパターンをなすように第１のタイプの分子を表面上に移す。
３．第１のタイプの分子のパターンを表面または基板上に移した後、スタンプを表面上に残したままにする。
４．選択に応じて、その表面、そのスタンプの選択された凹部、及びそのスタンプの選択された凸部の側面によって画定された選択された開口部を通して洗浄用溶液を流す。好ましい実施形態では、この開口部は狭い寸法で、スタンプと表面との間に形成された毛管状構造とみなせるものである。選択された開口部内に、インク付け式の付着プロセスまたはスタンピングプロセスの何れかまたは両方の結果存在している第１のタイプの分子を、この洗浄用溶液が洗い流す。
５．次に第２のタイプの分子を前記選択された開口を通して流す。第２のタイプの分子は、前記第１のタイプの分子の付着特性に対して補完的な付着特性を有する。或る実施形態では、全ての開口部が選択され、第２のタイプの分子は表面上の前記スタンプの凸部が接触していない全領域に規制される。
６．次にスタンプを取り除くと、第１のタイプの分子及び第２のタイプの分子で選択的にパターニングされた表面が形成される。好ましい実施形態では、これらの２つの種類の分子は単層で完全に位置合わせされて配置される
本発明の別の側面では、上述のプロセスステップに対応する方法で、付着促進タイプの分子と、それに隣接するように付着抑制タイプの分子とを表面上に塗付するための表面パターナが提供される。この表面パターナは、凸部及び凹部を有するスタンプを有する。またこの表面パターナは、スタンプを再度位置合わせすることなく、選択された開口部を通して第２のタイプの分子を流すための手段を有する。第２のタイプの分子は、第１の種類の分子の付着特性に対して補完的な付着特性を有していなければならない。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のさまざまな実施形態の利点は以下の通りである。
・複数回位置合わせをする必要がなくなる点。
・或る分子のための場所における他の種類の分子による汚染が最小限となる点。
・高いスループットが得られるようになる点。
・特に高価な位置合わせ装置を用いる方法と比較して低コスト化が図れる点。
・一般的に入手可能な材料を利用できる点。
【００１８】
本発明のさらなる特徴及び利点は、以下の説明に直接記載されているか、またはその説明の記載から明白なものであり、本発明を実施することによりよりよく理解されよう。本発明の種々の実施形態は、ここに記載した利点の全てを達成するためにここに記載の特徴の全てを備えている必要はない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
添付の図面に記載のものは、本発明の原理を実地に利用するために現在までに開発された最良の形態による本発明の実施形態を示したものである。図面（類似の要素には同じ符号を付して示した）において、図１Ａ及び図１Ｂはスタンプ２００の側面図及び底面図である。図１Ａに示す側面図は、図１Ｂに示す切断面Ａ−Ａに対応する断面図を表す。スタンプ２００は凸部２１０及び凹部２２０を有する。凸部２１０は側面２１２を有する。図面が見づらくなるのを避けるため、凸部２１０、側面２１２、及び凹部２２０の全てに符号付けはされていない。実際に使用されるスタンプは、スタンプ２００よりも複雑な形状であり得、ここに示すスタンプは説明の便宜で選択されたものであることを理解されたい。スタンプ２００にはさまざまな形状やサイズの凸部２１０及び凹部２２０を有していることが図示されている。凹部２２０は、ここに示すように独立したものでも、相互に連結された形状でもよい。
【００２０】
本発明においては、スタンプは特定の材料からなるものである必要もなければ、特定の方法で作成されたものである必要もない。スタンプ２００のための適切な材料やスタンプ２００を作成する方法には種々のものが当業者に知られている。例えば、限定を意図しないが、Kumar及びWhitesidesに付与された米国特許第5512131号及びSchueller, Kim, 及びWhitesidesによる米国特許出願公開第2002/0050220号に記載の方法が挙げられ、これらの文献はここで引用したことによりその全内容を本明細書の一部とする。簡単に説明すると、１組の実施形態では、スタンプ２００が原型にエラストマー材料を注型することによって形成される。スタンプ２００の凹部２２０は原型の凸部に対応し、スタンプ２００の凸部２１０は原型の凹部に対応する。注型の後、原型からスタンプ２００が取り除かれる。原型からスタンプ２００を取り除くのを容易にするために様々な技術を用いることができる。例えば、スタンプ２００を溶媒で膨張させることができる。或いは、原型を分解または溶解させてスタンプ２００を遊離させることができる。さらに別の方法として、スタンプ２００の注型の前に、原型を非粘着性のポリ（テトラフルオロエタン）（PTFE）のような非粘着性の材料でコーティングすることができる。スタンプ２００を形成するための他の方法も当業者の知るところである。
【００２１】
スタンプは幅広く様々な材料から形成され得る。好ましくは、スタンプ２００はエラストマー材料から形成される。そのような材料としては、例えば、ポリ（ブタジエン）、ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（ブチルスチレン）、重合クロロシラン（例えばメチルクロロシラン、エチルクロロシラン、及びフェニルクロロシラン）、及びこれらのエラストマー材料のランダム共重合体またはブロック共重合体などが挙げられる。スタンプ２００の材料としては、一般にエポキシ基と称される三員環エーテルによって特徴付けられるエポキシポリマー、1,2-エポキシド、またはオキシランも用いることができる。また、例えば、ビスフェノールＡのジグリシジルエーテルや、芳香族アミン、トリアジン、または脂環式バックボーンをベースにした化合物も同様に用いることができる。これらの材料を組み合わせでスタンプ２００を形成してもよい。
【００２２】
或いは、米国特許第5948621号に記載のように、スタンプ２００それ自体をポリマーゲルから形成してもよい。前記米国特許は、ここで引用したことによりその内容全体を本発明の一部とする。或る好ましい実施形態では、約５ｎｍ〜約２００ｎｍの孔径を有するポリマーゲルを用いて、スタンプされるべき材料をゲルの内部に流すことを可能としている。そのゲル組成物を、スタンプされる材料の化学的特性に適合させ得ることは理解されよう。例えば、親水性の分子をスタンピングするために、糖にエステル化されたアクリル酸及び架橋されたポリアクリルアミドをベースにしたもののようなヒドロゲルを用いることができる。さらに、表面上にポリマーやタンパク質のような巨大分子をスタンピングするために、ポリマー及び液体の担体を選択してもよい。
【００２３】
このスタンプ２００は、目的被着物をあるパターンで付着させるための表面のパターニングを容易にするために用いられる。目的被着物は、好ましくは生物細胞であるが、別の実施形態では目的被着物は生物または非生物の分子または分子群である。目的被着物をあるパターンで付着させることは、その表面を目的被着物の付着を促進する分子及び目的被着物の付着を抑制する分子でパターニングすることによって行われる。目的被着物を促進するタイプの分子は、付着促進タイプの分子と考えられる。多くの実施形態では、目的被着物の付着を促進するために、種々のタンパク質が用いられる。生物細胞の付着を促進するために用いられることが分かった付着促進タイプの分子の例としては、以下に限定されないが、ポリ-D-リジン、（神経細胞からの神経突起の成長を助ける）ラミニン、及びフィブロネクチン等が挙げられる。目的被着物の付着を抑制するタイプの分子は、不付着抑制タイプの分子と考えられる。目的被着物が生物細胞の場合、付着抑制タイプの分子の例としては、以下に限定されないが、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、及びウシ血清アルブミン（BSA）等が挙げられる。付着抑制タイプの分子が、付着促進タイプの分子の付着特性に対して補完的な付着特性を有することは明らかである。両タイプの分子を組み合わせて用いることによって選択性を向上させることができ、これは多くの場合望ましいことである。
【００２４】
ここで図２を参照すると、スタンプ２００の凸部２１０に第１のタイプの分子３１０をインク付け式に付着されている。第１のタイプの分子３１０は、図面上で菱形の模様で示されており、目的被着物に対して付着促進か付着抑制する付着特性を有する。本明細書の全体にわたって、第１のタイプの分子３１０、後述する第２のタイプの分子とは、分子自体かその分子を含む溶液または懸濁液の何れかを指すものとする。本明細書で何れかのタイプの分子の溶液といった場合は、溶液（分子が溶解されているもの）か、懸濁液（分子が溶解されていないもの）の何れかを意味するものとする。加えて、本明細書で凸部２１０は複数存在する例が記載さているが、凸部２１０を１つだけ備えたスタンプ２００を用いてもよく、その場合は本明細書の凸部２１０という記載は１個の凸部２１０を指すものと理解されたい。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態の大部分では、インク付け式に被着物を付ける前にスタンプ２００の親水性が高めるれる。最も好ましくは、この処理はスタンプ２００を酸素プラズマ中に置くことによって達成される。親水性を高めておくことによって、第１のタイプの分子の溶液をスタンプ全体に広げることが容易になる。
【００２６】
スタンプ２００に好ましい態様で被着物をインク付け処理することによって、第１のタイプの分子の溶液を約３０分間でスタンプに吸収させることができる。スタンプ２００のインク付け処理方法として他の方法を用いてもよい。図２には示されていないが、このインク付けプロセスによって、スタンプ２００の凸部２１０の側面及び凹部２２０まで第１のタイプの分子が伸展することがある。この分子の伸展は通常は問題とはならない。なぜなら、通常は非常に薄い層の分子、好ましくは分子１個分の厚さしかない層がスタンプ上に形成されるからである。実質的にスタンプ２００の凸部２１０の上の分子のみが最終的に表面に移される。
【００２７】
スタンプ２００を第１のタイプの分子でインク付け処理した後、好ましくはそのスタンプを乾燥させる。さまざまな実施形態で、この乾燥は、真空状態の下で窒素を吹き付けることにより、或いは単にスタンプを空気中に放置することによって行われる。しかし、Bernardら（Bernard, Renault, Michel, Bosshard, 及びDelamarche, "Microcontact Printing of Proteins," Adv. Mater. 12, (14), July, 19, 2000）に記載のように、好ましい実施形態ではスタンプの乾燥は過剰であってはならない。何故ならスタンプが湿度５５％の環境中で１分間を超えて長時間乾燥されると、分子が表面に移りにくくなってしまうからである。乾燥プロセスによって分子の立体構造に大きな変化が生じ、付着特性に悪影響を及ぼすこともある。乾燥プロセスの詳細は、第１のタイプの分子の性質、スタンプの性質、表面の性質、及びその他の因子等の種々の因子に応じて、実施形態により様々に変更される。
【００２８】
図３に示すように、表面１１０は、スタンプ２００でスタンピングされる。図に示す実施形態では、表面１１０は基板１１０の露出された部分である。好ましい実施形態の多くでは、基板１００はガラスかプラスチック製であり、好ましい実施形態では、表面１１０はガラスまたはプラスチックの露出された表面である。しかし、基板１００用として様々な異なる材料も使用でき、表面１１０は基板１００とは別の材料であってもよい。例えば、別の実施形態として、基板１００上に堆積された金の薄層を用いてもよい。この場合、パターニングされる表面１１０はその下側の基板１００とは別の材料となる。
【００２９】
好ましい実施形態では、スタンプ２００から第１のタイプの分子３１０を表面１１０上に移すために、スタンプ２００上に概ね均一に約１０００Ｐａの圧力を約５分間にわたって加える。このプロセスの間、実際には第１のタイプの分子３１０の層がスタンプ２００を表面１１０から隔てているが、一般的にはスタンプ２００は表面１１０に接触していると考えられる。
【００３０】
図３に見られるように、開口部２３０は表面１１０、スタンプ２００の凸部２１０の側面２１２、及びスタンプ２００の凹部２２０によって画定される。スタンプ２００から表面１１０に第1のタイプの分子３１０を移すことによって、第1のタイプの分子３１０が開口部２３０を画定する面である表面の部分１２０の上まで多少広がる。そのような分子の伸展は通常は望ましくない。このような現象は、表面に結合しない分子の移動に因るものとされている。また特に、開口部２３０を画定する表面の部分１２０の少なくとも一方向の寸法が小さい領域で生じやすい。
【００３１】
実施形態によっては、表面の選択された部分１２０、スタンプ２００の選択された凹部２２０、及びスタンプ２００の選択された凸部２１０の側面２１２によって画定された選択された開口部２３０について、第1のタイプの分子３１０が表面の選択された部分１２０に広がった量が推定される。伸展の推定量が、許容範囲を超える場合には洗浄用溶液が選択された開口部２３０に流される。伸展した量の推定は、表面の選択された部分１２０に関連する最も小さい長さを求めることによって行うことができる。この最小の長さは、表面の選択された部分１２０を取り囲む側面２１２どうしの最小の距離に対応する。実施形態によっては、この最小の距離が２０μｍ未満である場合、第1のタイプの分子３１０の伸展量は許容範囲を超えると推定される。全ての開口部について考慮する必要はなく、選択された開口部２３０について考慮すればよいことに注意されたい。これによって、他のものより注意深く取り扱うべき開口部２３０を使用者が選択できることになる。但し、最も好ましい実施形態では、全ての開口部２３０が選択される。
【００３２】
図４Ａ及び図４Ｂは、選択された開口部２３０を通して洗浄用溶液を流すところを示す。図４Ａは側面図であり、図４Ｂは図４Ａの切断面Ｂ−Ｂで切った表面１１０の断面図である。洗浄用溶液３３０は、図面において点で示されている。洗浄用溶液は好ましくは水であるが、別の実施形態では他の洗浄用溶液も使用される。好ましい実施形態では、図４Ａ及び図４Ｂに示すように、選択された開口部２３０のそれぞれが少なくとも２つのポート２４０を有する。２つのポート２４０を設けることにより、洗浄用溶液３３０を一方のポート２４０に流し込み、他方のポート２４０から流出させることが可能となる。別の実施形態では、２つのポート２４０を設けず、洗浄用溶液３３０は１本のポート２４０を通して注入され除去される。別の実施形態（図示せず）は、選択された開口部に洗浄用溶液を出し入れするための１本以上のポートが、スタンプの上側を通す形で設けられる。
【００３３】
図５Ａ及び図５Ｂでは、第２のタイプの分子３２０が選択された開口部２３０を通して流される。第２のタイプの分子３２０は、第１のタイプの分子３１０に対して補完的な付着特性を有している。例えば、第１のタイプの分子３１０が付着抑制タイプの分子である場合、第２のタイプの分子３２０は付着促進タイプの分子である。逆に、第１のタイプの分子３１０が付着促進タイプの分子である場合は、第２のタイプの分子３２０は付着抑制タイプの分子である。選択された開口部２３０を通して洗浄用溶液を流す場合のポート２４０に関連することは、選択された開口部２３０を通して第２のタイプの分子３２０を流す場合にも当てはまる。
【００３４】
一般的に、より粘性の高い溶液となる分子のタイプを第１のタイプの分子３１０とし、より粘性の低い溶液となる分子のタイプを第２のタイプの分子３２０とするのが好ましい。この選択により、第２のタイプの分子を選択された開口部２３０を通して流すことが容易なる。しかし、多くの実施形態では、両溶液が低濃度のタンパク質を含み、その溶液は、何れの分子を選択された開口部２３０を通して流すかを決定する際に重要となるためには不十分な粘性しか有していない。特に、スタンプ２００の親水性が、例えば酸素プラズマに曝すこと等によって高められている場合、選択された開口部２３０における毛管作用が、選択された開口部２３０に溶液を引き込ませるために有益な効果をもたらす。毛管作用が不十分である場合には、選択された開口部２３０に溶液が流入するような正の圧力を溶液に加えるか、選択された開口部２３０から溶液が出るのを助けるような負の圧力を溶液に加えるか、或いはこれらの操作を組み合わせることによって選択された開口部２３０を通して溶液を流すことができる。好ましい実施形態では、第２のタイプの分子３２０が選択された開口部２３０に流されてから５〜１０分間で吸収され得る。好ましい実施形態では、溶液が吸収された後に、第２の洗浄用溶液が選択された開口部を通して流される。この第２の洗浄用溶液は好ましくは水であり、その目的は表面１１０に結合しなかった第２のタイプの分子３２０の非結合分子を洗い流すことにある。これは、スタンプ２００が取り除かれた後に、非結合分子が望ましくない領域に結合するのを防止する助けとなる。好ましくは、次に表面１００を、スタンプ２００を置いたままの状態で乾燥する。実施形態によっては、この乾燥は乾燥機において減圧状態で好ましく行われる。この乾燥が、窒素を吹き付けることによって行われる実施形態もある。さらに、別の実施形態では、乾燥は大気中で行われる。
【００３５】
図６Ａ及び図６Ｂに示すように、スタンプを取り除くと、表面１１０が第１のタイプの分子３１０と第２のタイプの分子３２０の両方で覆われた状態にある。この方法を用いて、異なるタイプの分子の間のはっきりした境界を得ることができる。本発明の好ましい実施形態では、第１のタイプの分子３１０及び第２のタイプの分子３２０が単分子層を形成する形で位置合わせされる。
【００３６】
スタンプを取り除いた後、表面１１０をコーティングする分子に目的被着物を付着させることができる。実施形態によっては、この操作は、単に、第１のタイプの分子３１０と第２のタイプの分子３２０でコーティングされた表面を目的被着物に曝すことによって行われる。目的被着物が生物細胞である実施形態では、第１のタイプの分子３１０及び第２のタイプの分子３２０でコーティングされた表面を、何らかの成長用培養液と混合させた目的被着物に曝す。次に生物細胞は、付着促進特性を有するタイプの分子でコーティングされた領域において優先的に成長する（大きくなるか、増殖するか、或いは大きくなりかつ増殖する）。付着抑制特性を有するタイプの分子でコーティングされた領域においては生物細胞は成長しない。図７Ａ及び図７Ｂでは、目的被着物３００が、付着促進タイプの分子を介して表面１１０に付着しているところが示されている。図７Ａでは、第２のタイプの分子３２０が成長促進タイプの分子であり、第１のタイプの分子３１０が付着抑制タイプの分子である。従って、目的被着物３００は、第１のタイプの分子３１０がパターニングされた部位でなく第２のタイプの分子３２０がパターニングされた部位において選択的に表面に付着する。図７Ｂは、逆の状況を示している。即ち、第１のタイプの分子３１０が付着促進タイプの分子であり、第２のタイプの分子が付着抑制タイプの分子である。従って、目的被着物３００は、第２のタイプの分子３２０がパターニングされた部位でなく第１のタイプの分子３１０がパターニングされた部位において選択的に表面に付着する。目的被着物３００は、物理的及び／または化学的相互作用によって付着分子及び基板の両方に付着し得、かつ時間の経過とともにパターニングされた表面１１０上で成長し得る。
【００３７】
別の実施形態では、第１及び第２の分子の物理的吸収のみに頼ることなく、よりしっかりとしたパターニングを達成することができる。この実施形態では、ペプチドと分子の共有結合による結合を利用する。これらの実施形態では、上記の手順において、スタンプを用いて表面にスタンピングする前に、表面を架橋分子で処理する過程を加える。有効であることが分かった特定の架橋の分子としては、グルタルアルデヒド（アミノ基に２官能的に結合するもの）、及びsulfo-GMBS（アミノ基と硫黄を２官能的に結合するもの）等が挙げられる。アミノ基は、タンパク質における全てのアミノ酸から外されて、アミノ基または硫黄はアミノプロピトリエトキシシランまたはメルカプトプロピルトリエトキシシランを用いたシラン化（silanization）反応を介してガラスまたはプラスチックの表面に結合され得る。
【００３８】
好ましい実施形態では、スタンプを表面に置いた後に、表面が付着促進分子及び付着抑制分子の両方でパターニングされるまでそのスタンプを取り除いたり、再度の位置合わせを行うことはない。このことは、複数回のスタンピング過程が必要な方法と比較して極めて有利となり得る。
【００３９】
本発明の別の態様は、上記したプロセスステップに沿った方式で付着抑制タイプの分子を表面上に塗付し、それに隣接した形で付着促進タイプの分子を表面上に塗付するための表面パターナを提供する。この表面パターナは、図１Ａ及び図１Ｂに示すようなスタンプを備える。スタンプ２００は、凸部２１０及び凹部２２０を有し、凸部２１０は側面２１２を有する。図２に示すように、凸部２１０には第１のタイプの分子３１０をインク付け式に付着できる。ここで第１のタイプの分子３１０は、付着促進特性か付着抑制特性の何れかを有する。図５Ａ及び図５Ｂに示すように、この表面パターナは、スタンプの再度の位置合わせを行うことなく選択された開口部２３０を通して第２のタイプの分子３２０ための手段を有する。第２のタイプの分子３２０は、第１のタイプの分子３１０に対して補完的な付着特性を有しているべきである。第２のタイプの分子３２０を選択された開口部２３０を通して流すための手段として種々のものが用いることができる。この手段は、毛管作用によって選択された開口部２３０を通して第２のタイプの分子３２０を引き込むための毛細管ポンプまたはそれに類似した装置を含み得る。しかし、別の実施形態では、第２のタイプの分子３２０の溶液が選択された開口部２３０内に入るように溶液に正の圧力を加えるためのポンプを用いるか、或いは減圧状態を利用して、第２のタイプの分子３２０の溶液を選択された開口部２３０から引き出すように溶液に負の圧力を加えることもできる。更に別の実施形態として、第２のタイプの分子３２０の溶液自体に働く力を生じさせる装置を用いて、選択された開口部２３０を通しての流れを引き起こすこともできる。
【００４０】
以上の説明及び図面に示したもののは好ましい実施形態の例示に過ぎず、本発明は上記の実施形態に限定されない。請求項に記載の範囲内で本発明にさまざまな変更を加えて実施することができ、それも本発明の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１Ａ】凸部及び凹部を有するスタンプを示す、図１Ｂの線Ａ−Ａの切断面に対応する断面図。
【図１Ｂ】凸部及び凹部を有するスタンプを示す、スタンプの底面図。
【図２】第１のタイプの分子のインク付け式に付着したスタンプを示す図。
【図３】パターニングされる表面に第１にタイプの分子を移すスタンプを示す図。
【図４Ａ】選択された開口部を通して洗浄用溶液を流すところを示す、側面図。
【図４Ｂ】選択された開口部を通して洗浄用溶液を流すところを示す、図４Ａの線Ｂ−Ｂの切断面に対応する断面図。
【図５Ａ】選択された開口部を通して第２のタイプの分子を流すところを示す、側面図。
【図５Ｂ】選択された開口部を通して第２のタイプの分子を流すところを示す、図５Ａの線Ｂ−Ｂの切断面に対応する断面図。
【図６Ａ】スタンプを取り除いてパターン形成された表面を示す、側面図。
【図６Ｂ】スタンプを取り除いてパターン形成された表面を示す、図６Ａの線Ｂ−Ｂの切断面に対応する断面図。
【図７Ａ】第２のタイプの分子に付着した目的被着物を示す図。
【図７Ｂ】第１のタイプの分子に付着した目的被着物を示す図。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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