(57)【要約】７−ヒドロキシエピアンドロステロンは、急性又は慢性のニューロン損傷に対する保護のために使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
７−ヒドロキシエピアンドロステロンの急性又は慢性のニューロン損傷に対する保護用薬剤の製造のための使用。
【請求項２】
前記７−ヒドロキシエピアンドロステロンが、７α−ヒドロキシエピアンドロステロンである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記７−ヒドロキシエピアンドロステロンが、７β−ヒドロキシエピアンドロステロンである、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記７−ヒドロキシエピアンドロステロンが、７α−ヒドロキシエピアンドロステロン及び７β−ヒドロキシエピアンドロステロンの混合物である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記ニューロン損傷が、発作又は脳外傷により生じる、請求項１ないし４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記ニューロン損傷が、アルツハイマー病、パーキンソン病、痴呆ではない認知欠損、脊髄損傷又は末梢神経損傷により生じる、請求項１ないし５のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ニューロンの細胞死に対する保護用の所定の７−ヒドロキシ−ステロイド化合物の使用に関するものであり、従って、これは、アルツハイマー病、パーキンソン病、痴呆ではない認知欠損（ＣＩＮＤ）、発作、脳外傷、脊髄損傷及び末梢神経損傷のような、そのような状態又はそのような状態の後遺症の治療及び予防に有用である。また、これらは、認知機能の増強のために有用である。
【０００２】
生体内でのデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の７α−ヒドロキシル化代謝産物の生成は、尿中の７α−ヒドロキシ−ＤＨＥＡの同定により、１９５９年から知られている［Ｊ Ｊ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｍ Ｌ Ｌｅｗｂａｒｔ， Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇｒ． Ｈｏｒｍ． Ｒｅｓ． １５ （１９５９） ２０１−２３０； Ｌ Ｓｔａｒｋａ ｅｔ ａｌ， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ． ７ （１９６１） ３０９−３１６］。その後、３β−ヒドロキシステロイド基質（ＤＨＥＡ及びエピアンドロステロン−ＥＰＩＡを含む）の大量の７α−ヒドロキシル化は、成人及び胎児の肝臓、精巣、精巣上体、皮膚、乳房組織、前立腺、脂肪間質細胞及び扁桃を含む多数のヒト器官からの組織調製物において報告されている。７位でのＤＨＥＡのヒドキシル化は、ラットの肝臓並びに多数のマウス組織及び器官においてもまた証明されている。全てのこれらの研究において、７α−ヒドロキシ−ＤＨＥＡは、はるかに主要な生成代謝産物であった。実際に、Ｄｏｏｓｔｚａｄｅｈら［Ｓｔｅｒｏｉｄｓ ６３ （１９９８） ６０８−６１４］は、マウス肝ミクロソームによる７α−ヒドロキシ−ＤＨＥＡの生成速度が７β−ヒドロキシ−ＤＨＥＡの生成速度の１５倍以上であることを報告した。
【０００３】
また、ＥＰＩＡ、ＤＨＥＡ及びプレグネノロンは、ラットの脳でそれらの相当する７α−ヒドロキシ代謝産物へ速やかに及び広範囲に変換することが示されている［Ｊ Ｍ Ｇｕｉｒａｕｄ ｅｔ ａｌ， Ｓｔｅｒｏｉｄｓ ３４ （１９７９） ２４１−２４８； Ｍ Ｗａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２４ （１９８９） ２６９９−２７０６； Ｙ Ａｋｗａ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２８８ （１９２２） ９５９−９６４］。
【０００４】
ＷＯ９７／３７６６４は、神経精神病、免疫性疾患又は内分泌性疾患を治療するために７α−ヒドロキシ置換ステロイドを含むある特定の化合物の使用を開示している。これらの化合物が治療のために使用され得るとＷＯ９７／３７６６４にて提示された疾患の中では、アルツハイマー病が含まれる。しかしながら、この作用のために提示された機構は、疾患が脳での７α−ヒドロキシ置換ステロイドの欠乏によるものと仮定されている。従って、ＷＯ９７／３７６６４にて提案された治療は、失った化合物と置き換わるための７α−ヒドロキシ置換ステロイドの投与により、この欠乏を修正する。従って、ＷＯ９７／３７６６４に記載された手段は、更なるニューロン損傷を予防することにより状態を予防すること又は状態の悪化を予防することというよりはむしろ現存の状態を治療する。それゆえに、ＷＯ９７／３７６６４は、神経保護効果を記載していない。また、化合物が突然及び外傷性の事態、例えば発作により生じる損傷を予防するために使用され得ることは提示されていない。
【０００５】
我々は、α、β又は混合物であろうとなかろうと７−ヒドロキシ−エピアンドロステロンが、発作、脳外傷及びクモ膜下出血により引き起され得るような脳虚血、又は心臓バイパス外科手術などの間に起こる事態により生じる急性及び慢性のニューロン損傷に対して保護するために使用できることを、驚いたことに発見した。
【０００６】
長期化低酸素症及び虚血のような事態は、低血糖症に関連しているかもしれないし、しないかもしれないが、さまざまな程度のニューロン損傷に遭遇する。
【０００７】
虚血は典型的に心臓発作の間に生じるが、それらの時間で受ける損傷は心臓組織に実質的に限定され、所定の治療が展開される。本発明について、我々は、患者の発作により生じるような又は頭部損傷の結果によるような脳でのより長時間の虚血の結果に関心がある。虚血の重篤さは、発作又は損傷の性質に依存するが、常に、脳損傷があり、これは本発明が対面する問題である。
【０００８】
種々の神経保護剤は、脳損傷の問題を軽減するために試みる当業界で知られているが、現今知られているそれらの全てが有害な副作用に関連する傾向にある。例えば、ＭＫ８０１（マレイン酸ジゾシルピン）は、全くの単分子であり、虚血患者へあるレベルの神経保護をもたらすことが知られている。しかしながら、ＭＫ８０１はまた、「警戒精神作用効果（ａｌａｒｍｉｎｇ ｐｓｙｃｈｏｔｒｏｐｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ）」（Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ）、並びに不都合な運動性効果にも関連している。神経保護効果は、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７５５（１９９７）３６−４６（Ｐｒｉｎｇｌｅ， Ａ．Ｋ． ｅｔ ａｌ）に詳述され、これは援用され本明細書に組み込まれる。同一著者はまた、早期の論文でコノトキシン（ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ）の神経保護効果を記載しているが、この化合物の神経保護効果にもかかわらず、生体内にて有害な副作用が観察されている。
【０００９】
従って、本発明は、７−ヒドロキシエピアンドロステロン（７−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ）の急性又は慢性のニューロン損傷に対する保護用薬剤の製造のための使用にある。
【００１０】
この化合物は、下記式（Ｉ）により表され得：
【００１１】
【化１】
2004501196.tif 000002
【００１２】
並びに７α及び７β異性体は下記のそれぞれである。
【００１３】
【化２】
2004501196.tif 000003
【００１４】
また、本発明は、これらの化合物及びこれらの化合物を提供するために生体内で代謝される化合物の前駆体の使用を包含する。
【００１５】
α及びβ異性体は、単独又は混ぜ合わせで使用してよいが、混ぜ合わせの場合には、如何なる割合で存在させてもよい。しかしながら、７β−異性体は、より高い活性を示すことが明らかであり、従って目下好ましい。
【００１６】
本発明の化合物は、もとのステロイドから開始する本来よく知られている種々の方法により製造してよい。例えば、上記に引用された文献に記載された方法により製造してもよく、これは７β及び対応する７α化合物の混合物を提供し、これらを次によく知られた技術により分離してもよい。
【００１７】
例示として、７α及び／又は７β−ヒドロキシＥＰＩＡは、従来の方法を使用して、３β−ヒドロキシ基及び１７−ケトン基の保護後に、アリル酸化によりＤＨＥＡから得られてもよい。次に、生成物は可溶性金属化合物触媒（例えば水素化ナトリウム）で還元され、３β−ヒドロキシ及び１７−ケトン基は脱保護される。次に、７α−ヒドロキシ及び７β−ヒドロキシエピマーは、従来の手法、例えばカラムクロマトグラフィにより分離されてもよく、７α−及び７β−ヒドロキシＥＰＩＡは純粋に結晶化させてもよい。
【００１８】
これとは別に、７α−及び７β−ヒドロキシＥＰＩＡは、下記の反応スキームにより説明されるように製造されてもよい：
【００１９】
【化３】
2004501196.tif 000004
【００２０】
この反応スキームにおいて、ＤＨＥＡ（ＩＩ）はアセチル化されて、対応する式（ＩＩＩ）のアセテートを提供し、次に、これはエチレングルコールと反応させて、式（ＩＶ）のケタールを提供する。次に、ケタール（ＩＶ）は実施例３に記載されたように酸化されて、対応する７−ケト化合物（Ｖ）を提供し、次に、これは脱アセチル化させて、式（ＶＩ）の化合物を提供する。これは還元されて、式（ＶＩＩ）の７−ヒドロキシ−１７−ケタール−ＥＰＩＡを提供し、次に、これは酸と反応させてケタール基を除去して、７−ヒドロキシ−ＥＰＩＡを提供し、最終的にこれはクロマトグラフィにより７β−及び７α−異性体に分離させて、７α−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（ＩＸ）及び７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（Ｘ）を提供する。
【００２１】
本発明の化合物は、患者が虚血発症、特に発作又は頭部損傷の危険があると疑われた場合に、或いは患者が老化した脳で頻繁に観察されるような慢性的な閾値下の脳虚血により又はニューロンのエネルギー生産が減少することにより促進されるかもしれないアルツハイマー病又はＣＩＮＤのような進行する慢性的な神経変性病と疑われた場合に、患者に適用してもよい。そのような予防薬の適用は極めて有用であり得る。しかしながら、それはまた、たとえ虚血発症後に適用されても、本発明の化合物が有用な活性を有することは実証されているが、ニューロンの変性をできる限り避けるために、できるだけ早く化合物を投与することが好ましいことは認識されるであろう。幾つかの状況では、特に患者が虚血発症の危険にまだある場合に、繰返し用量を投与することが望ましいかもしれない。
【００２２】
投与の適当な方法は、できる限り望ましい結果に到達するために、一般に注入による方法である。従って、静脈内注入が特に好ましいが、幾つかの状況では、好ましくは化合物を脳脊髄液に直接的に投与してもよい。
【００２３】
本発明の化合物の用量は、患者の年齢、体重及び全身状態、並びに投与の形式、頻度及び経路を含む多数の要因に依存して変わるであろう。しかしながら、０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重の用量が一般に好ましく、０．０５〜２０ｍｇ／ｋｇ体重がより好ましい。これは単用量又は分割量で投与してもよい。
【００２４】
本発明は、下記の非限定の実施例により更に説明され、これらの実施例１〜２０は本発明の化合物の製造を説明し、実施例２１及び２２はそれらの活性を説明する。実施例１〜２０において、ローマ数字は上記に示された反応スキームの式を引用する。
【００２５】
（実施例１）
ＤＨＥＡ−３−アセテート（ＩＩＩ）
１０ｇのＤＨＥＡ（ＩＩ）（３４．７２ｍｍｏｌ）を含む５０ｍｌのピリジン及び５０ｍｌの無水酢酸の溶液を加熱して、４時間還流した。反応液を冷却し、水に注ぎ入れ、酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、乾燥状態まで蒸発させた。エタノールから再結晶化した１１．０ｇのＤＨＥＡ−３−アセテート（ＩＩＩ）（３３．３３ｍｍｏｌ、９６％）を得た。
【００２６】
（実施例２）
１７−ケタール−ＤＨＥＡ−３−アセテート（ＩＶ）
５ｇのＤＨＥＡ−３−アセテート（ＩＩＩ）（１５．１５ｍｍｏｌ）、５ｍｌのエチレングルコール及び触媒量のｐ−トルエンスルホン酸を含む１００ｍｌのトルエン溶液を加熱して、２４時間、ディーンスターク装置を使用したスチーム蒸留により還流した。次に、反応液を１００ｍｌの１０％ｗ／ｖ炭酸カリウム水溶液へ注ぎ入れた。有機相をデカントした。水相を酢酸エチルで抽出した。有機相をあわせて、乾燥状態まで蒸発させた。エタノールから再結晶化した５．１０ｇの１７−ケタール−３−ＤＨＥＡ−アセテート（ＩＶ）（１３．６４ｍｍｏｌ、９０％）を得た。
【００２７】
（実施例３）
７−ケト−１７−ケタール−ＤＨＥＡ−３−アセテート（Ｖ）
５ｇの１７−ケタール−ＤＨＥＡ−３−アセテート（ＩＶ）（１３．３７ｍｍｏｌ）及び触媒量のベンガルローズ（Ｂｅｎｇａｌ Ｒｏｓｅ）を含む７０ｍｌのピリジン溶液を、酸素分散による中圧水銀蒸気灯を用いて照射した。触媒量の酢酸銅を２４時間後に反応液に添加した。反応液を２４時間後に、乾燥状態まで蒸発させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ２／酢酸エチル：シクロヘキサン３／７）により精製した。３．１１ｇの７−ケト−１７−ケタール−ＤＨＥＡ−３−アセテート（Ｖ）（８．０２ｍｍｏｌ、６０％）を得た。
【００２８】
（実施例４）
７−ケト−１７−ケタール−ＤＨＥＡ（ＶＩ）
１％の水酸化カリウム及び１ｇの７−ケト−１７−ケタール−ＤＨＥＡ−３−アセテート（Ｖ）（２．５８ｍｍｏｌ）を含む５０ｍｌのメタノール溶液を加熱して、２時間還流した。次に、反応液を冷却し、中和した後、酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた後、乾燥状態まで蒸発させた。メタノールから再結晶化した８０２ｍｇの７−ケト−１７−ケタール−ＤＨＥＡ５（２．３２ｍｍｏｌ、９０％）を得た。
【００２９】
（実施例５）
７−ヒドロキシ−１７−ケタール−ＥＰＩＡ（ＶＩＩ）
１０ｇの７−ケト−１７−ケタール−ＤＨＥＡ（ＶＩ）（２８．９０ｍｍｏｌ）を、−３３℃で、２．６５ｇのナトリウムを含む液体アンモニア溶液に添加した。４時間後、塩化アンモニウムを青色が消えるまで添加した。次に、２．６５ｇのナトリウムを添加した。４時間後、塩化アンモニウムを青色が消えるまで再度添加した。水を添加し、アンモニアを蒸発させた。反応液を酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた後、乾燥状態まで蒸発させた。６．０７ｇの７−ヒドロキシ−１７−ケタール−ＥＰＩＡ（ＶＩＩ）（１７．３４ｍｍｏｌ、６０％）を得た。
【００３０】
（実施例６）
７−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（ＶＩＩＩ）
５ｍｌの水、１０ｇの７−ヒドロキシ−１７−ケタール−ＥＰＩＡ（ＶＩＩ）（２８．５７ｍｍｏｌ、５０％）及び触媒量のパラトルエンスルホン酸を含む１００ｍｌのアセトン溶液を加熱して、４時間還流した。反応液を冷却し、１００ｍｌの１０％ｗ／ｖ炭酸ナトリウム水溶液に注ぎ入れた後、酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた後、乾燥状態まで蒸発させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ２／酢酸エチル）により精製した。５．２４ｇの７−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（ＶＩＩＩ）（１７．１４ｍｍｏｌ、６０％）を得た。
【００３１】
（実施例７）
７α−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（ＩＸ）及び７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（Ｘ）
比率６５／３５の７α及び７βエピマーを含む７−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（ＶＩＩＩ）（５ｇ）をフラッシュクロマトグラフィ（Ａｌ２Ｏ３／ＣＨＣｌ３）により精製した。７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（Ｘ）（２．５ｇ）を最初に得て、その後に７α−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（ＩＸ）（１．３４ｇ）を得た。７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（Ｘ）及び７α−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（ＩＸ）を酢酸エチルから再結晶化させた。
【００３２】
（実施例８）
低酸素症のニューロン損傷の研究用プロトコル
器官系海馬薄片培養物を、下記のように改変されたＰｉｎｇｌｅらの基本方法（１９９６、１９９７）を用いて調製した。
【００３３】
ウィスター幼ラット（８−１１日齢）を断頭し、海馬を直ぐに４．５ｍｇ／ｍｌグルコース補充氷冷ゲイ平衡塩溶液の中で解剖した。薄片を分けて、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ ＣＭカルチャーインサート（４ウェル毎）上に置き、１４日間３７℃／５％ＣＯ２で維持した。維持培地は、２５％熱不活性化ウマ血清、２５％ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）並びに１ｍＭグルタミン及び４．５ｍｇ／ｍｌグルコース補充添加アール塩を含む５０％最小必須培地（ＭＥＭ）からなる。培地は３−４日毎に取り替えた。
【００３４】
実験的低酸素症の既述（Ｐｒｉｎｇｌｅら、１９９６；１９９７）のように行なった。簡単に言えば、培養物を、５μｇ／ｍｌの蛍光除外染料プロピジウムヨウ化物（ＰＩ）を含む無血清培地（ＳＦＭ−７５％ＭＥＭ、１ｍＭグルタミン及び４．５ｍｇ／ｍｌグルコース補充２５％ＨＢＳＳ）へ移した。培養物を、画像化の前の６０分間、ＳＦＭ中で平衡化にさせた。ＰＩ蛍光を、ローダミンフィルターセットを備えたライカ倒立顕微鏡を用いて検出した。ＰＩ蛍光がこの段階で検出された培養物はいずれも更なる研究から外した。低酸素症を、９５％Ｎ２／５％ＣＯ２で飽和されていたＳＦＭ（＋ＰＩ）へ培養物を移すことにより誘導した。次に、密閉する前の１０分間、１０Ｌ／分にて気体を通して連続的に吹込むことにより、雰囲気が９５％Ｎ２／５％ＣＯ２で飽和された気密チャンバー中で培養プレート（ふた無し）を密閉し、１７０分間インキュベーターで培養した（低酸素症の合計時間は、これによって１８０分間であった）。低酸素症期の終わりにて、培養物を、ＰＩを含む酸素正常状態のＳＦＭへ戻し、２４時間インキュベーターで再び培養した。
【００３５】
ニューロン損傷を、アップル ＩＩｓｉ コンピュータで実行するＮＩＨイメージ１．６０又はマッキントッシュＧ４／４００で実行するＯｐｅｎＬａｂ ２．１ （改良版）のいずれかを用いて既述（Ｐｒｉｎｇｌｅら、１９９６；１９９７）のように調べた。画像をモノクロカメラを用いてとらえて、オフライン分析用の光ディスクに保存した。光透過画像（Ｌｉｇｈｔ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｉｍａｇｅ）を薬剤の添加前にとらえ、ＰＩ蛍光画像を２４時間の低酸素症後回復期の終わりにて録画した。ＣＡ１細胞層の領域を透過画像から決定した。ＣＡ１におけるＰＩ蛍光の領域をＮＩＨイメージ１．６０又はＯｐｅｎＬａｂ中の密度スライス機能を用いて測定し、ニューロン損傷をＰＩ蛍光が上記バックグラウンドとして検出されたＣＡ１のパーセントとして表した。
【００３６】
ステロイド化合物は、エタノール中で当初の１ｍｇ／ｍｌ溶液を作り、更にＳＦＭで希釈することにより調製された。化合物は、低酸素症の前４５分間、低酸素症の発生の間、及び低酸素症後回復期の間に、培養物に添加された。コントロール実験は、賦形剤のみで処理された培養物からなる。
【００３７】
結果
実験１：
初めの実験は、７αＯＨ−ＥＰＩＡ及び７βＯＨ−ＥＰＩＡが１００ｎＭの高濃度で神経保護性であるか否かを決定するために行なわれた。低酸素症は、ＣＡ１の２５．５±６．４％において損傷を生じた。下記の表Ｉに示されるように、この損傷は、低酸素症の前、その間及びその後に存在するときに、７αＯＨ−ＥＰＩＡ及び７βＯＨ−ＥＰＩＡの両方により顕著に減少した。
【００３８】
【表１】
2004501196.tif 000005
【００３９】
実験２：
７ＯＨ−ＥＰＩＡのα−及びβ異性体の両方が神経保護性であることと決定されたので、我々はこの効果の濃度依存性を調べた。コントロール低酸素症は、ＣＡ１の３１．９±４．７％にニューロン損傷を生じた。７αＯＨ−ＥＰＩＡは、１００ｎＭで顕著に保護性であった。ニューロン損傷において、低いが統計的ではない顕著な減少が１０ｎＭで観察された。１ｎＭでの効果はなかった。これに対して、７βＯＨ−ＥＰＩＡは、１０ｎＭ及び１００ｎＭで顕著に神経保護性であったが、濃度を１ｎＭに下げた場合には活性を失っていた（表２参照のこと）。
【００４０】
【表２】
2004501196.tif 000006
【００４１】
（実施例８）
ラットにおける全体脳虚血（４血管閉塞）
脳虚血を、オスのウィスターラット（２５０〜２８０ｇ）の４つの血管閉塞（４ＶＯ）により誘導した。両方の椎骨動脈をペントバルビタール麻酔（６０ｍｇ／ｋｇ、腹膜内）中で電気焼灼により閉塞した。その動物を、水は自由に飲ませたが、食物は自由に食べさせずに、２４時間で回復させた。翌日、頸動脈を３０％酸素／７０％亜酸化窒素麻酔中の２％ハロタン下に曝し、微小血管クラップを用いて１０分間閉塞した。続いて、両方のクラップを取り外して、両方の動脈を即時の再灌流のために視察した。手術中及びその後の３時間の間、動物の正常体温（３７．５±０．５℃）を、直腸体温計につなげられたサーモスタット制御式加温ブランケットを使用することにより維持させた。コントロール用の擬似手術動物では、両方の椎骨動脈を、ペントバルビタール麻酔中で焼灼し、翌日、両共通の頸動脈を３０％酸素／７０％亜酸化窒素麻酔中の２％ハロタン下に曝したが、クラップでは締めなかった。負傷をリドカインゲルで治療した後、縫合した。動物が意識を取り戻すまで、３０℃の環境温度にて、加温ランプ下で保持させた。
【００４２】
７つの群の動物を調べた：
１．（ｎ＝８）ステロイド化合物、７β−ＯＨ ＥＰＩＡ（０．１ｍｇ／ｋｇ、尾部静脈経由で静脈内、３回注入：虚血の誘導の１５分前、虚血の間及び再灌流後の５分間）；
２．（ｎ＝８）ステロイド化合物、７β−ＯＨ ＥＰＩＡ（０．３ｍｇ／ｋｇ、静脈内、上記１に記載のように３回注入）；
３．（ｎ＝８）ステロイド化合物、７β−ＯＨ ＥＰＩＡ（１ｍｇ／ｋｇ、静脈内、上記１に記載のように３回注入）；
４．基準物質として（ｎ＝８）ＮＢＱＸ（二ナトリウム塩、より水に溶けるため）及び陽性コントロール（ＴＯＣＲＩＳ、ドイツ国、３０ｍｇ／ｋｇ、腹膜内、上記１に記載のように３回注入）；
５．（ｎ＝８）容認された賦形剤（０．９％ＮａＣｌ、１００μｌエタノール含有）（上記１に記載のように３回注入）；
６．（ｎ＝８）虚血のみ；
７．（ｎ＝８）擬似手術コントロール。
【００４３】
ＮＢＱＸは、２，３−ジヒドロキシ−６−ニトロ−７−スルファモイル−ベンゾ（Ｆ）キノキサリンであり、神経保護活性を有することが知られている［Ｇｉｌｌ， Ｒ， Ｎｏｒｄｈｏｌｍ， Ｌ．， Ｌｏｄｇｅ Ｄ．：ラット集合（ｆｏｃａｌ）虚血モデルにおける ２，３−ジヒドロキシ−６−ニトロ−７−スルファモイル−ベンゾ（Ｆ）キノキサリン（ＮＢＱＸ）の神経保護作用、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ５８０， ３５−４３， １９９２］。
７β−ＯＨ ＥＰＩＡは、本発明の化合物の、７β−ヒドロキシエピアンドロステロンである。
物質は、１００μｌエタノールに溶解して、最後に０．９％ＮａＣｌで希釈した。
【００４４】
虚血後７日間の生存期間の後に、全ての動物を４％パラホルムアルデヒドで血管を通して灌流固定した。次に、脳を慎重に取り出し、２時間、同様の固定剤で後固定した。３０％スクロースで凍結保護した後、脳をイソペンタン中で急速に凍結し、−８０℃に保存した。海馬構造を含む２０μｍの低温切片を、トルイジンブルー又はニューロトレース（Ｎｅｕｒｏ Ｔｒａｃｅ）蛍光でニッスル染色した。
【００４５】
データ分析：
虚血後の海馬ＣＡ１領域におけるニューロン損傷の重篤さを、ニッスル染色を使用して生存ニューロンの数によって評価した。４００μｍ長毎に形態的に無傷のニューロンの平均数を、各群についてＣＡ１領域において算定した。細胞集計を、２０×対物レンズを備えた光学顕微鏡を用いて、１動物あたり３〜５連続切片で、且つ１切片あたり４００μｍＣＡ１領域６回で行なった。データは一組のステューデントのｔ−検定により統計的に分析した。データを平均±ＳＥＭとして示した。
【００４６】
結果及び考察：
結果を添付した図面の図１〜３に示した。
形態的に無傷の海馬ＣＡ１ニューロンは、下記の基準でニッスル染色（トルイジンブルー又はニューロトレース、図２）により特徴付けられた：即ちニューロンの核周囲部の明確な形状、陽性標識された核小体をもつ大きな核、ニッスル染色陽性の核周辺の小さな細胞質ゾーン（これは、リボソームをもつ無傷の粗面小胞体、従って無傷のタンパク質合成機構を示す）。
【００４７】
１０分間の全体虚血（軽い虚血）及び７日間の生存期間は、海馬ＣＡ１領域での選択的な錐体細胞の神経変性をもたらす（図１Ａ−１Ｃ）。擬似手術動物のＣＡ１での錐体細胞の平均数は、１２１．５±４．３であった（１００％とする）。従って、６０％のＣＡ１ニューロンは、全体虚血の１０分後に死んだ（図１Ｂ）。実験に記載されたように適用された虚血及び賦形剤（ＮａＣｌ＋１００μｌエタノール）の静脈内注入の動物群でのニューロンの数を、虚血群のみのニューロンの数と比較した（図１Ａ、１Ｂ）。ＮＢＱＸ（３０ｍｇ／ｋｇ、実験に記載されているように静脈内、３回注入）は、虚血群と比べてＣＡ１錐体細胞での顕著な（ｐ＝０．０３）神経保護を示した。虚血のみと比べてＮＢＱＸは４７．５％の神経保護をもたらしたが、擬似手術動物と比べて保護効果は６８．５％であった。ＮＢＱＸにより生じる神経保護は、我々が実験に使用した全体虚血モデルの有効性を証明するＧｉｌｌら、１９９２年及びＧｉｌｌ １９９４年と一致した。７β−ＯＨ ＥＰＩＡは、全体虚血の１０分間後及び７日間の生存期間後の海馬ＣＡ１錐体細胞の神経保護の濃度依存をもたらした（図１Ａ）。ｔ−検定分析は、０．１ｍｇ／ｋｇ（ｐ＝０．０１）及び０．３ｍｇ／ｋｇ（ｐ＝０．０００８）の濃度での７β−ＯＨ ＥＰＩＡの顕著に高い神経保護効果を表した。擬似手術群と比べて７β−ＯＨ ＥＰＩＡは、ＣＡ１錐体細胞における７４．８％（０．１ｍｇ／ｋｇ）及び８３．９％（０．３ｍｇ／ｋｇ）それぞれの神経保護効果を示した（図１Ｃ）。１．０ｍｇ／ｋｇの濃度での７β−ＯＨ ＥＰＩＡは、神経保護の傾向のみを示したが、その効果は顕著なものではなかった。
【００４８】
虚血の前、その間及びその後に、静脈内注入される７β−ＯＨ ＥＰＩＡを有する全ての実験において、我々は如何なる動物の行動異常性をも観察しなかった。
【００４９】
図の説明文：
異なる化合物の影響下及びラットの全体脳虚血後７日間のラットでの形態的に無傷の海馬ＣＡ１錐体細胞の数。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】データは、ＣＡ１領域の４００μｍ長毎の無傷のニューロンの平均数±ＳＥＭを示した。
【図１Ｂ】データは、１００％とした擬似手術動物と比較したＣＡ１領域の４００μｍ長毎の無傷のニューロンのパーセントを示した。
【図１Ｃ】データは、虚血群の生存ニューロンの数を０とし、擬似手術群の生存ニューロンの数を１００％としたときの、神経保護の絶対パーセントを示した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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