(57)【要約】脂質およびコレステロールの取り込みを調節するための方法が、記載されており、この方法は、ＳＲ−ＢＩ  ＨＤＬレセプターの発現または機能を調節することに基づく。実施例は、エストロゲンは、ＬＤＬレセプターの絶大なアップレギュレーション条件下で、ＳＲ−ＢＩを劇的にダウンレギュレートすることを示す。実施例はまた、エストロゲンで処理したラット副腎膜およびエストロゲンで処理した動物由来の他の非胎盤ステロイド産生組織におけるＳＲ−ＢＩのアップレギュレーションを示すが、他の非胎盤非ステロイド産生組織（肺、肝臓、および皮膚）ではＳＲ−ＢＩのアップレギュレーションはないことを示す。実施例はさらに、動物の肝臓細胞中への蛍光標識ＨＤＬの取り込みを示す。これは、その動物をエストロゲンで処理した場合には生じない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
処置される必要があるヒトまたは動物を処置するために有効な量で、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わされた、ＳＲ−ＢＩの結合活性を特異的に変化させる化合物であって、該化合物は、ＳＲ−ＢＩ結合活性またはＳＲ−ＢＩ発現の変化について化合物ライブラリーをスクリーニングすることによって得られる、化合物。
【請求項２】
表Ｉに示される群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
請求項１に記載の化合物であって、ＢＬＴ−１（ＭＩＴ９９５２−５３）、ＢＬＴ−２（ＭＩＴ９９５２−６１）、ＢＬＴ−３（ＭＩＴ９９５２−１９）、ＢＬＴ−４（ＭＩＴ９９５２−２９）、およびＢＬＴ−５（ＭＩＴ９９５２−６）からなる群より選択される、化合物。
【請求項４】
細胞内または細胞外へとコレステロール輸送を変化させるための方法であって、ＳＲ−ＢＩ発現またはＳＲ−ＢＩ活性を阻害する工程を包含し、該阻害は、請求項１〜３に記載の組成物を、該阻害を必要とする動物またはヒトに投与することを包含する、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記組成物は、ＨＤＬに対するＳＲ−ＢＩの結合親和性を増加することによって、ＨＤＬ結合を増強する、方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法であって、前記阻害されたＳＲ−ＢＩ結合活性は、ＳＲ−ＢＩ媒介性脂質輸送をブロックする、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記阻害されたＳＲ−ＢＩ結合活性は、ＳＲ−ＢＩ媒介性の選択的脂質取り込みをブロックする、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記脂質は、ＨＤＬコレステリルエーテルである、方法。
【請求項９】
請求項４に記載の方法であって、前記阻害されたＳＲ−ＢＩ結合活性は、細胞コレステロールのＨＤＬへの流出をブロックする、方法。
【請求項１０】
ＳＲ−ＢＩ結合活性またはＳＲ−ＢＩ発現を変化させる化合物を同定する方法であって、
化合物ライブラリーをスクリーニングする工程
を包含する、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記ＳＲ−ＢＩ発現は、ノーザン分析によって決定される、方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法であって、前記ライブラリーは、化学物質ライブラリーである、方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の方法であって、前記ＳＲ−ＢＩ結合活性が、阻害される、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、前記阻害されたＳＲ−ＢＩ結合活性は、ＳＲ−ＢＩ媒介性脂質輸送をブロックする、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記阻害されたＳＲ−ＢＩ結合活性は、ＳＲ−ＢＩ媒介性の選択的脂質取り込みをブロックする、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記脂質は、ＨＤＬコレステリルエーテルである、方法。
【請求項１７】
請求項１０に記載の方法であって、前記阻害されたＳＲ−ＢＩ結合活性は、細胞コレステロールのＨＤＬへの流出をブロックする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の援用）
本出願は、２００２年１０月８日に出願した米国特許仮出願番号６０／４１７，０８３に対する優先権を主張する。
【０００２】
米国政府は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ−Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｒｔ，Ｌｕｎｇ  ａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅからの助成金ＨＬ５２２１２、ＨＬ６６１０５およびＨＬ６４７３７によって、本発明の特定の権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、一般に、ＳＲ−ＢＩスカベンジャーレセプターを介して媒介されるコレステロール輸送の調節および脂質調節のための、化合物の領域にある。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
循環系を通る脂質の細胞間輸送には、これらの疎水性分子を水溶性キャリア（リポタンパク質と呼ばれる）中のパッケージングすること、およびレセプター媒介性経路によって適切な組織へのこれらのリポタンパク質の調節された標的化が必要である。最も良く特徴付けられているリポタンパク質レセプターは、ＬＤＬレセプターである。ＬＤＬレセプターは、アポリポタンパク質Ｂ−１００（ａｐｏＢ−１００）およびアポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）に結合する。これらのアポリポタンパク質は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）（ヒト血漿中の主要なコレステリルエステル輸送体）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）（肝臓により合成されるトリグリセリドがリッチなキャリア）、中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）および代謝されたカイロミクロンの構成成分である。
【０００５】
Ｋｒｅｉｇｅｒら、ＷＯ９６／００２８８「Ｃｌａｓｓ  ＢＩ  ａｎｄ  ＣＩ  Ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国特許第６，３５９，８５９号および同第６，４２９、２８９号（「Ｋｒｉｅｇｅｒら」は、ＳＲ−ＢＩ（ＡｃＬＤＬおよびＬＤＬに結合するスカベンジャーレセプター）のハムスターホモログおよびマウスホモログを特徴付けでクローン化した。Ｋｒｅｉｇｅｒによって、ＳＲ−ＢＩレセプターは、ステロイド産生組織および肝臓において主に発現され、ＨＤＬ輸送およびコレステロール取り込みを媒介するようであることが、報告された。競合結合研究によって、ＳＲ−ＢＩが、ＬＤＬ、改変型ＬＤＬ、負に荷電したリン脂質、およびＨＤＬに結合することが示される。直接結合研究によって、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞の改変体）において発現したＳＲ−ＢＩが、ＨＤＬ−アポリポタンパク質の細胞分解を伴わずにＨＤＬに結合し、脂質が、このレセプターを発現する細胞内に蓄積されることが示される。これらの研究は、ＳＲ−ＢＩが、末梢組織から、ＨＤＬを介する、肝臓およびステロイド産生組織へのコレステロールの輸送において主要な役割を果たし得ること、および肝臓または他の組織における発現の増加もしくは減少は、ＳＲ−ＢＩを発現する細胞によるコレステロールの取り込みを調節し、それによって泡沫細胞におけるレベルおよびアテローム発生に関与する部位における沈着を減少するために、有用であり得ることを示した。
【０００６】
その後の研究によって、ＳＲ−ＢＩは、脂質に結合するだけではなく、細胞内および細胞外へとコレステロールを輸送もすることが、Ｋｒｉｅｇｅｒらに対する米国特許第５，９６２，３２２号および同第５，９２５，３３３号に記載されるように、確認された。さらに、ＳＲ−ＢＩは、ステロイド産生組織において主に発現され、脂質調節において一定の役割を果たし、コレステロールレベルだけではなく、雌の受胎能に対しても、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙによるＷＯ９９／１１２８８に記載されるように、影響を与える。
【０００７】
コレステロールの取り込み及び輸送におけるＳＲ−ＢＩの役割は、例えば、Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎら（２００１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８（１１）：１７１７〜１７２２により記載されるように、雌の受胎能を回復するためにプロブコール処置を使用することによって、示されるようにＳＲ−ＢＩを介して操作され得る。この研究は、ＳＲ−ＢＩ媒介性の脂質取り込みおよび脂質代謝を刺激または阻害するさらなる薬物の必要性を、明らかに示す。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＳＲ−ＢＩへの結合およびＳＲ−ＢＩにより媒介される脂質移動を刺激または阻害し得、かつ細胞による脂質およびコレステロールの取り込みおよび代謝を変更（ｒｅｄｉｒｅｃｔ）し得る、薬物ならびにその薬物を設計するための方法および試薬を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ＳＲ−ＢＩの発現または機能の調節に基づいて、コレステロール輸送を調節するための化合物が、記載される。ＳＲ−ＢＩは、脂質（主にコレステロールエステル）のＨＤＬから細胞への選択的取り込み、および細胞からリポタンパク質へのコレステロールの流出の両方を媒介する。これらの脂質輸送の基礎となる機構は、古典的なレセプター媒介性エンドサイトーシスとは別個であるが、不十分にしか理解されていないままである。ＳＲ−ＢＩの作用機構およびインビボでの機能を調査するために、ハイスループットスクリーニングが、インタクトな細胞におけるＳＲ−ＢＩ媒介性脂質輸送の低分子インヒビターを同定するために開発された。低ナノモル濃度〜マイクロモル濃度の範囲で、脂質輸送（選択的取り込みおよび流出の両方）をブロックする２００個の化合物（ＢＬＴ）が、同定された。これらの化合物の効果は、ＳＲ−ＢＩ経路に高度に特異的であった。なぜなら、これらの化合物は、クラスリンベースのレセプターが媒介するエンドサイトーシスに干渉することも、細胞内小胞輸送に干渉することもなかったからである。実施例により示されるように、５つのＢＬＴ（ＢＬＴ−１［ＭＩＴ９９５２−５３］；ＢＬＴ−２［ＭＩＴ９９５２−６１］；ＢＬＴ−３［ＭＩＴ９９５２−１９］；ＢＬＴ−４［ＭＩＴ９９５２−２９］およびＢＬＴ−５［ＭＩＴ９９５２−６］）は、ＨＤＬに対するＳＲ−ＢＩの結合親和性を増加する（解離速度の減少）ことによって、ＨＤＬ結合を阻害するどころかむしろ増強した。他のものは、ＨＤＬ結合を阻害した。これらは、アテローム性動脈硬化症の管理、不妊症の処置において、または逆に、避妊薬として、およびタンジアー病の処置において、有用であるはずである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．コレステロールのＳＲ−ＢＩ輸送の調節因子）
化合物ライブラリーが、ＨＤＬ結合の変化について、下記のアッセイのようなアッセイを使用してスクリーニングされた。これらの化合物は、タンパク質、ＤＮＡ配列、多糖、または合成有機化合物であり得る。活性を有すると同定された約２００個が、下記表Ｉに列挙される。
【００１１】
（ＩＩ．ＳＲ−ＢＩ活性を阻害または増強する化合物のスクリーニング）
上記ＳＲ−ＢＩタンパク質および抗体ならびにそれらのＤＮＡは、ＳＲ−ＢＩの活性および／または発現を調節する薬物のスクリーニングにおいて使用され得る。ＳＲ−ＢＩをコードするｃＤＮＡは、クローン化されており、米国特許第６，３５９，８５９号および同第６，４２９，２８９号において報告されており、ＧｅｎＢａｎｋにおいて列挙されている。ＳＲ−ＢＩをコードするｃＤＮＡは、５０９アミノ酸の推定タンパク質配列を生じる。ＳＲ−ＢＩ活性を増強する薬物は、アテローム性動脈硬化症、脂肪細胞による脂肪取り込み、およびいくつかの種類の内分泌障害を処置または予防する際に有用である。ＳＲ−ＢＩ活性を阻害する薬物は、避妊薬として、およびタンジアー病の処置において、有用である。
【００１２】
下記のアッセイは、特定の化合物（例えば、放射標識した改変型ＨＤＬおよびＬＤＬ、またはポリイオン）の結合に対する阻害効果について化合物が試験され得る、慣用的方法論を明らかに提供する。その後、上記レセプターに対する選択的結合を阻害するようである化合物のインビトロ研究が、動物試験によって確認され得る。それらの分子は、非常に進化上保存されているので、実験室動物（例えば、マウス）における研究を行ってヒトにおける影響を予測することが、可能である。
【００１３】
結合の阻害に基づく研究は、レセプター結合の変化の間接的影響について予測的である。例えば、ＳＲ−ＢＩレセプターへのコレステロール−ＨＤＬ結合の阻害は、細胞にりょうコレステロールの取り込みの減少をもたらし、従って、そのＳＲ−ＢＩレセプターを発現する細胞によるコレステロール輸送を阻害する。細胞へのコレステロール−ＨＤＬ結合を増加すると、血流からの脂質除去が増加し、それにより、血流中の脂質沈着が減少する。コレステロールのマクロファージ取り込みを増強するために刺激因子を使用し、それによりアテローム性動脈硬化症を処置する研究が、Ｍ−ＣＳＦを使用して実行された（Ｓｃｈａｕｂら、１９９４、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．１４（１）、７０〜７６；Ｉｎａｂａら、１９９３、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２（２）７５０〜７５７）。
【００１４】
以下のアッセイが、ＳＲ−ＢＩ発現、ＳＲ−ＢＩ濃度、またはコレステロール輸送を変化させるための方法において有効な化合物についてスクリーニングするために使用され得る。
【００１５】
（ＳＲ−ＢＩ結合またはＳＲ−ＢＩ発現の変化についてのアッセイ）
マウス組織のノーザンブロット分析は、ＳＲ−ＢＩが、副腎、卵巣、肝臓、精巣、および脂肪において最も発現されること、およびＳＲ−ＢＩが、他のいくつかの組織においてはより低レベルで存在することを、示す。ＳＲ−ＢＩ  ｍＲＮＡの発現は、３Ｔ３−Ｌ１細胞から脂肪細胞への分化の際に誘導される。ＳＲ−ＢＩおよびＣＤ３６の両方が、アセチル化ＬＤＬについての高い親和性結合を示し、見かけの解離定数は、約５μｇタンパク質／ｍｌの範囲にある。競合アッセイにより決定されるＣＤ３６およびＳＲ−ＢＩのリガンド結合特異性は、類似するが、同一ではない。両方とも、改変型タンパク質（アセチル化ＬＤＬ、メチル化ＢＳＡ）に結合するが、クラスＡレセプターのリガンドである広範囲の他のポリアニオン（例えば、フコイジン、ポリイノシン酸、ポリグアノシン酸）には結合しない。ＳＲ−ＢＩは、ＨＤＬの細胞分解を付随しないＨＤＬの高親和性かつ飽和可能な結合を示す。ＨＤＬは、ＣＤ３６に対するＡｃＬＤＬの結合を阻害する。これは、ＳＲ−ＢＩと同様に、ＣＤ３６が、ＨＤＬに結合することを示唆する。ネイティブＬＤＬ（これは、クラスＡレセプターまたはＣＤ３６のいずれかに対するアセチル化ＬＤＬの結合について競合しないｎ）は、ＳＲ−ＢＩへの結合について競合する。
【００１６】
（１２５Ｉ−ＡｃＬＤＬの結合、取り込み、および分解のアッセイ）
３７℃におけるスカベンジャーレセプター活性は、Ｋｒｉｅｇｅｒ、Ｃｅｌｌ  ３３、４１３〜４２２、１９８３；およびＦｒｅｅｍａｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９１  Ｊｕｎ  １；９９（１１）４９３〜５により記載されるような、リガンドの結合、取り込み、および分解のアッセイによって、測定される。結合についての値および取り込みについての値は、合わされ、そして５時間のインキュベーション後に観察される結合＋取り込みとして提示され、そして、細胞タンパク質１ｍｇ当たりの５時間当たりの１２５Ｉ−ＡｃＬＤＬタンパク質のｎｇとして、表される。分解活性は、細胞タンパク質１ｍｇ当たりの５時間に分解された１２５Ｉ−ＡｃＬＤＬのｎｇとして表される。特定の高親和性値は、過剰な非標識競合リガンドの存在下（単回測定）で得られた結果と、その非存在下（二連測定）で得られた結果との間の差を示す。細胞表面での４℃での結合は、示されるような方法Ａまたは方法Ｂのいずれかを使用してアッセイされる。方法Ａにおいて、細胞は、氷上で１５分間事前冷却され、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清を補充して７５〜２００μｇ／ｍｌの非標識Ｍ−ＢＳＡを含むかまたは含まない氷冷した培地Ｂ中で１２５Ｉ−ＡｃＬＤＬを再供給され、振盪機にて４℃で２時間インキュベートされる。その後、細胞は、２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含むＴｒｉｓ洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）で迅速に３回洗浄され、その後、ＢＳＡを含まないＴｒｉｓ洗浄緩衝液を用いる５分間の洗浄を２回、迅速な洗浄を２回行われる。これらの細胞は、振盪機において、室温で２０分間、１ｍｌの０．１Ｎ  ＮａＯＨ中で可溶化され、タンパク質測定用に３０μｌが取り出され、残りにおける放射能が、ＬＫＢγカウンターを使用して測定される。方法は、細胞が４５分間事前冷却され、培地が１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含みかつ５％（ｖ／ｖ）ヒトリポタンパク質欠損血清（ウシ胎仔血清ではなく）を含み、硫酸デキストランを用いる処理により放出される細胞関連放射能がＫｒｉｅｇｅｒ（１９９３）Ｃｅｌｌ  ３３、４１３〜４２２；Ｆｒｅｅｍａｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  ＡｃａｄＳｃｉ  ＵＳＡ．１９９１  Ｊｕｎ  １；８８（１１）：４９３１〜５により記載されるように測定されるという点が、方法Ａと異なる。
【００１７】
（ノーザンブロット分析）
Ｂａｌｄｉｎｉら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８９，５０４９〜５０５２により記載されるように、種々のマウス組織からか、または脂肪細胞への分化を開始した０日間後、２日間後、４日間後、６日間後、または８日間後に、３Ｔ３−Ｌ１細胞から、調製した０．５μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡが、ホルムアルデヒド／アガロースゲル（１．０％）上で分画され、その後、ＢｉｏｔｒａｎｓＴＭナイロン膜上にブロットされ固定される。このブロットに、３２Ｐ標識（２×１０６ｄｐｍ／ｍｌ、ランダムプライム標識システム）されたプローブを用いてハイブリダイズされる。４２℃および５０℃それぞれにおけるハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、Ｃｈａｒｒｏｎら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６、２５３５〜２５３９により記載されるように実施される。ＳＲ−ＢＩ  ｍＲＮＡ分析のためのプローブは、そのｃＤＮＡコード領域からの０．６ｋｂ  ＢａｍＨＩフラグメントであった。マウスサイトゾルｈｓｐ７０遺伝子のコード領域（ＨｕｎｔおよびＣａｌｄｅｒｗｏｏｄ、１９９０、Ｇｅｎｅ  ８７、１９９〜２０４）が、等しいｍＲＮＡローディングについてのコントロールプローブとして使用される。
【００１８】
組織におけるＳＲ−ＢＩタンパク質は、ＳＲ−ＢＩに対するポリクローナル抗体を用いてブロッティングすることによって検出される。
【００１９】
（ＨＤＬ結合研究）
ＳＲ−ＢＩおよびＣＤ３６に対する、ＨＤＬおよびＶＬＤＬの結合が、ＬＤＬおよび改変型ＬＤＬについて記載されるように実行される。
【００２０】
ＳＲ−ＢＩに結合しているＨＤＬが分解または再利用されるか否か、およびＨＤＬに結合している脂質が細胞中に輸送されるか否かを決定するために実行される研究は単一濃度（１０μｇタンパク質／ｍｌ）でトランスフェクト細胞または非トランスフェクト細胞の培養物に添加される、蛍光脂質標識ＨＤＬ、３Ｈ−コレステリルエステル標識ＨＤＬおよび１２５Ｉ−ＨＤＬを使用して実施される。上記細胞に結合したＨＤＬが、経時的に測定される。定常状態には、約３０分間〜１時間で達する。蛍光リガンドであるＤｉＩまたは３Ｈ−コレステロールエステルが、細胞による脂質（例えば、コレステロールまたはコレステロールエステル）取り込みについてのマーカーとして使用される。漸増濃度のＤｉＩは、脂質が、ＨＤＬからレセプターへと輸送され、その後、細胞によりインターナライズされることを示す。その後、ＤｉＩ欠如ＨＤＬが、放出され、別のＨＤＬ分子により置換される。
【００２１】
（ＳＲ−ＢＩへのＨＤＬ結合）
競合結合研究は、ＨＤＬおよびＶＬＤＬ（４００μｇ／ｍｌ）が、ＳＲ−ＢＩに対する１２５Ｉ−ＡｃＬＤＬの結合を競合的に阻害することを示す。ＳＲ−ＢＩを発現する１２５Ｉ−ＨＤＬの直接的結合もまた、測定される。
【００２２】
（ＳＲ−ＢＩの組織分布）
ＳＲ−ＢＩの生理学的機能を探索するために、ＳＲ−ＢＩの組織分布が、マウス組織（コントロール動物およびエストロゲン処理動物の両方において）において、以下の実施例に記載されるようにして、測定された。各レーンに、種々のマウス組織（腎臓、肝臓、副腎、卵巣、脳、精巣、脂肪、横隔膜、心臓、肺、脾臓、または他の組織）から調製された０．５μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡがローディングされる、そのブロットに、ＳＲ−ＢＩのコード領域の７５０塩基対フラグメントを用いてハイブリダイズされる。ＳＲ−ＢＩ  ｍＲＮＡは、副腎、卵巣、および肝臓において最も高度に発現され、供給源に依存して脂肪において中程度または高度に発現され、そして他の組織においてより低レベルで発現される。ＳＲ−ＢＩの細胞質領域に対するポリクローナル抗体を使用するブロットは、非常に高レベルのタンパク質が、マウスの肝臓、副腎組織および卵巣において存在するが、非常にわずかまたは検出不能なレベルでしか、白色脂肪および褐色脂肪、筋肉、または種々の他の組織において存在しないことを示す。ラット組織におけるバンドは、約８２ｋＤにて存在した。マウス組織において、肝臓およびステロイド産生組織において観察される９２ｋＤ形態は、ＳＲ−ＢＩでトランスフェクトした培養細胞において観察されるのと同じサイズである。
【００２３】
有用な活性について化合物を試験するためのアッセイは、このレセプタータンパク質（好ましくは、上記の細胞のような、トランスフェクト細胞の表面上に発現される）との相互作用のみに基づき得るが、その指標がリポタンパク質の結合の阻害または増加である場合には、溶液中のタンパク質または不活性基材上に固定されたタンパク質もまた、利用され得る。
【００２４】
あるいは、上記アッセイは、上記レセプタータンパク質をコードする遺伝子配列（好ましくは、上記レセプタータンパク質の発現を指示する調節配列）との相互作用に基づき得る。例えば、上記調節配列および／または上記タンパク質コード配列に結合する、アンチセンスが、標準的オリゴヌクレオチド合成化学を使用して合成され得る。このアンチセンスは、標準的方法（リポソームもしくはミクロスフェア中へのカプセル化；分解に対して抵抗性の改変型ヌクレオチドまたはエンドヌクレアーゼに対する抵抗性を増加する基（たとえば、ホスホロチオエートおよびメチル化）の導入）を使用して、薬学的用途のために安定化され得、その後、上記レセプターを発現するトランスフェクト細胞または天然に存在する細胞においてまず、その後、実験室動物においてインビボで、レセプター活性の変化についてまずスクリーニングされ得る。代表的には、上記アンチセンスは、発現を阻害する。しかし、合成を「オフにする」配列をブロックする配列もまた、標的とされ得る。
【００２５】
（ＩＩ．ＳＲ−ＢＩコレステロール輸送の調節方法）
ＨＤＬレセプターであるＳＲ−ＢＩは、ＨＤＬの構造および代謝の制御において重要な役割を果たす（Ａｃｔｏｎら（１９９６）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１、５１８〜２０；Ｋｒｉｅｇｅｒ，Ｍ．（１９９９）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６８、５２３〜５８）。マウスにおける研究は、ＳＲ−ＢＩ発現の変化が、いくつかの生理学的系（胆コレステロール分泌、雌不妊症、赤血球発生、アテローム性動脈硬化症、および冠状心疾患の発症を含む）に大いに影響を与え得ることを示した（Ｔｒｉｇａｔｔｉら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６、９３２２〜７；Ｋｏｚｒｓｃｋｙら（２０００）Ａｒｔｅｒｉｏ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２０、７２１〜７；Ａｒａｉら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４、２３６６〜７１；Ｈｏｌｍら（２００２）Ｂｌｏｏｄ  ９９、１８１７〜２４；Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎら（２００１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８，１７１７〜２２；Ｕｅｄａら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５、２０３６８〜７３；Ｋｏｚａｒｓｋｙら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８７、４１４〜７；Ｂｒａｕｎら（２００２）Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．９０、２７０〜２７６；Ｍａｒｄｏｎｅｓら（２００１）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４２、１７０〜１８０））。ＳＲ−ＢＩは、血漿ＨＤＬからのコレステリルエステルおよび他の脂質の選択的細胞取り込みを媒介することによって、ＨＤＬ代謝を制御する。選択的取り込みの間に（Ｇｌａｓｓら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０、５４３５〜９；Ｇｌａｓｓら（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０，７４４〜５０；Ｓｔｅｉｎら（１９８３）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  ７５２、９８〜１０５）、ＨＤＬは、ＳＲ−ＢＩに結合し、その粒子コアにあるその脂質（主に、中性脂質（例えば、コレステリルエステル）は、細胞へと輸送される。脂質が欠如した粒子は、その後、細胞外空間へと戻る。ＳＲ−ＢＩ媒介性選択的脂質取り込みとその後のこれらの脂質の細胞内輸送の機構は、探索され始めたばかりに過ぎない（Ｋｒｉｅｇｅｒ  １９９９；Ｋｒｉｇｅｒ，Ｍ．（２００１）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｅｖｓｔ  １０８、７９３〜７；Ｕｉｔｔｅｎｂｏｇａｒｒｄら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，４９２５〜４９３１）が、この機構は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプターによってＬＤＬから細胞へとコレステロールエステルを送達するために使用されるクラスリンコートされた小窩（ｐｉｔ）および小胞を介するレセプター媒介性エンドサイトーシス経路（Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｓ．およびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２、３４〜４７）とは、明らかに基本的に異なる。ＳＲ−ＢＩはまた、細胞からＨＤＬへとコレステロール流出を媒介し得るＴｅｍｅｌら（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ８、８）。
【００２６】
ＳＲ−ＢＩは、ＨＤＬ脂質代謝およびコレステロール輸送において重要な役割を果たすことが、現在示されている。ＳＲ−ＢＩは、ステロイド産生組織および肝臓へのコレステロール送達を担うようであり、実際、ＨＤＬ粒子から肝臓細胞を通して胆カニキュリ（ｃａｎｎｉｃｕｌｉ）へとコレステロールを輸送し、ここで、コレステロールは腸へと通り抜ける。データは、ＳＲ−ＢＩはまた、腸粘膜においても発現されることを示す。コレステロール取り込みが増加され得る細胞においてＳＲ−ＢＩの発現を増加して、ＨＤＬがコレステロールを貯蔵細胞（例えば、泡沫細胞（ここで、ＨＤＬは、アテローム性動脈硬化症において一定の役割を果たし得る）から取り出すための手段として自由に役立たせることは、有用である。
【００２７】
レセプタータンパク質結合を変化させる化合物は、好ましくは、薬学的に受容可能なビヒクル中で投与される。適切な薬学的ビヒクルは、当業者にとって公知である。非経口投与のために、上記化合物は、滅菌水、リン酸緩衝化生理食塩水、または生理食塩水中に、通常は溶解または懸濁される。経腸投与のために、上記化合物は、錠剤、液体、またはカプセルの形態で、不活性キャリア中に組み込まれる。適切なキャリアは、デンプンであっても、糖であってもよく、これは、潤滑剤、矯味矯臭剤、結合剤、および同じ性質の他の物質を含み得る。上記化合物はまた、溶液、クリーム、ゲル、またはポリマー性物質（例えば、ＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭ、ＢＡＳＦ）の局所適用によって、局所投与され得る。上記化合物はまた、徐放または遅延放出のために処方され得る。
【００２８】
あるいは、上記化合物は、リポソームまたはミクロスフェア（または微粒子）中で投与され得る。患者に投与されるリポソームおよびミクロスフェアを調製するための方法は、当業者にとって公知である。米国特許第４，７８９，７３４号は、リポソーム中に生物学的物質をカプセル化するための方法を記載する。本質的には、上記物質は、水溶液中に溶解され、適切なリン脂質および脂質が（必要な場合には、界面活性剤とともに）添加され、必要な場合には、上記物質は、透析または超音波処理され得る。公知の方法の概説は、Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，第１４章、「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ」Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｐ．２８７〜３４１（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９７９）。ポリマーからかまたはタンパク質から形成されるミクロスフェアは、当業者にとって周知であり、胃腸管を通って血流中に直接通るために調整され得る。あるいは、上記化合物は、一定期間（数日間〜数ヶ月間）にわたる徐放のために移植されたミクロスフェア中またはミクロスフェア複合体に組み込まれ得る。例えば、米国特許第４，９０６，４７４号、同第４，９２５，６７３号および同第３，６２５，２１４号を参照のこと。
【００２９】
本発明は、以下の非限定的実施例を参照することによって、さらに理解される。
【実施例】
【００３０】
（実施例１：ＨＤＬレセプターであるＳＲ−ＢＩにより媒介される脂質の選択的輸送の化学的インヒビターの同定）
（略語）
ＨＤＬ        高密度リポタンパク質
ｍＳＲ−ＢＩ  マウススカベンジャーレセプター（クラスＢ、Ｉ型）
ＬＤＬ        低密度リポタンパク質
ＢＬＴ        脂質輸送をブロックする
ＤｉＩ        １’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンパークロレート
ＣＥ          コレステリルエーテル
ＤＭＳＯ      ジメチルスルホキシド
ＰＢＳ        リン酸緩衝化生理食塩水
ＥＧＦ        上皮増殖因子
ＶＳＶ−Ｇ    水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質
ＥＧＦＰ      増強型緑色蛍光タンパク質
ＩＣ          阻害濃度
ＥＣ          有効濃度
ＡＣＴＨ      副腎皮質刺激ホルモン
ＦＣ          遊離コレステロール。
【００３１】
ＳＲ−ＢＩ媒介性脂質輸送の強力な低分子インヒビターを同定するための化学物質ライブラリーのハイスループットスクリーニング。脂質輸送をブロックする（ｂｌｏｃｋ  ｌｉｐｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）（ＢＬＴ−１は、ＭＩＴ９９５２−５３に対応する；ＢＬＴ−２は、ＭＩＴ９９５２−６１に対応する；ＢＬＴ−３は、ＭＩＴ９９５２−１９似対応する；ＢＬＴ−４は、ＭＩＴ９９５２−２９に対する；ＢＬＴ−５は、ＭＩＴ９９５２−６に対応する）、ならびに培養細胞におけるＳＲ−ＢＩ活性に対するそれらの影響を試験した。５つすべてが、ＨＤＬからのＳＲ−ＢＩ媒介性選択的脂質取り込み、およびＨＤＬへの細胞コレステロールの流出を阻害した。これらのうちの１つであるＢＬＴ−１は、特に強力であり、低ナノモル濃度の範囲において、脂質輸送を阻害した。予期せぬことに、５つすべてのＢＬＴは、ＳＲ−ＢＩへのＨＤＬ結合を、その結合親和性を増加することによって、増強した。
【００３２】
（方法）
（リポタンパク質および細胞）
ヒトＨＤＬを、単離し、１２５Ｉ（１２５Ｉ−ＨＤＬ）、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’、３’−テトラメチルインドカルボシアニンパークロレート（ＤｉＩ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；ＤｉＩ−ＨＤＬ）または［３Ｈ］コレステリルオレイルエーテル［３Ｈ］ＣＥ、［３Ｈ］ＣＥ−ＨＤＬ）のいずれかで標識した（Ｇｕら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２６３３８〜４８；Ｇｕら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，２９９９３〜３０００１；Ａｃｔｏｎら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２１００３〜９；Ｐｉｔａｓら（１９８１）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  １、１７７〜８５）。低レベルの内因性ＳＲ−ＢＩを発現するＬＤＬレセプター欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞、ｌＤｌＡ−７細胞（Ｋｉｎｇｓｌｅｙら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１、５４５４〜８）、高レベルのマウスＳＲ−ＢＩを発現するように安定にトランスフェクトされたＩｄＩＡ−７細胞（ｌＤｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］）（Ａｃｔｏｎら、１９９６）、ＡＣＴＨを用いて誘導した後に高レベルのＳＲ−ＢＩを発現するＹ１−ＢＳ１マウス副腎皮質細胞（Ｒｉｇｏｔｔｉら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，３３５４５〜９）、サル腎臓ＢＳ−Ｃ１細胞（Ｋａｐｏｏｒら（２０００）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５０、９７５〜８８）およびＨｅＬａ細胞（Ｔｅｍｅｌら（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ８、８）を、以前に記載されたように維持した。
【００３３】
（ハイスループットスクリーニング）
０日目に、ｌＤｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞を、底が透明で壁が黒い３８４ウェル黒色アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ）中に、培地Ａ（２ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸、５０単位／ｍｌのペニシリン／５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充した、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２）に、１０％ウシ胎仔血清を補充したもの（培地Ｂ）５０μｌ中にて１５，０００細胞／ウェルでプレートした。１日目に、細胞を、培地Ｃ（培地Ａに、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を含むがＧ４１８は含まない）で１回洗浄し、４０μｌの培地Ｃを再供給した。１００％  ＤＭＳＯ中に溶解した化合物（ＤｉｖｅｒＳｅｔ  Ｅ，Ｃｈｅｍｂｒｉｄｅｇｅ  Ｃｏｒｐ．ｋａｒａｎｏ１６，３２０）を、上記ウェルに個々にロボットにより「ピン（ｐｉｎ）」で移し（４０ｎｌ）（ｈｔｔｐ：／／ｉｃｃｂ．ｍｅｄ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ）、名目上の濃度１０μＭ（０．０１％  ＤＭＳＯ）を得た。３７℃において１時間のインキュベーションの後、２０μｌの培地Ｃ中のＤｉＩ−ＨＤＬ（最終濃度１０μｇタンパク質／ｍｌ）を、添加した。２時間後、蛍光を、室温にて、Ａｎａｌｙｓｔプレートリーダー（ローダミンＢ二色性フィルター、発光５２５ｎｍおよび励起５８０ｎｍ；ＬＪＬ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、インキュベーション培地を除去する前（自己蛍光および消光について試験するため）および培地除去して８０μｌのＰＢＳ／１ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２で４回洗浄した後（ＤｉＩの細胞取り込みを測定するため）の両方で測定した。すべての化合物を、異なるプレート上にて二連でサンプリングした。各スクリーニングは、４０倍過剰の非標識ＨＤＬの存在下および／または非存在下で、ｌＤｌＡ−７細胞およびＩｄＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞を含んだが、コントロールとして化合物は添加しなかった。
【００３４】
（アッセイ）
上記アッセイのために、すべての培地および緩衝液は、化合物の可溶性を維持するために、０．５％  ＤＭＳＯおよび０．５％ウシ血清アルブミンを含んだ。細胞を、ＢＬＴとともに１時間（またはトランスフェリン、ＥＧＦおよびコレラ毒素の取り込み実験のためには２．５時間）、プレインキュベートした。すべての実験は、３７℃にて実施した。ＢＬＴおよびその影響の詳細な特徴付けを、ＬＣ−ＭＳによってその正体および純度を確認した化合物を用いて実施した。
【００３５】
（（ｉ）ＨＤＬからの脂質取り込みアッセイ、ＨＤＬへのコレステロール流出アッセイ、およびＨＤＬ結合アッセイ）
ＤｉＩ−ＨＤＬおよび［３Ｈ］ＣＥ−ＨＤＬからの脂質取り込みアッセイ、標識細胞からの［３Ｈ］コレステロールの流出アッセイ、および１２５Ｉ−ＨＤＬ結合を、Ａｃｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６）Ｊａｎ  ２６；２７１（５２４８）：５１８〜２０；Ｇｕら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．（２０００）Ｓｅｐ  ２９；２７５（３９）：２９９９３〜３０００１；およびＪｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）２７２、２０９８２〜５により記載されるとおりに実施した。いくつかの実験において、値を正規化して、コントロールの１００％が、化合物の非存在下での活性を示し、０％が、４０倍過剰な非標識ＨＤＬの存在下で決定した活性、またはＹ１−ＢＳ１細胞についてはＬＬＢ−１処断抗体の１：５００希釈物の存在下で決定した活性を示すようにした（Ｇｕら（２０００）、Ｋａｒｅｎ  Ｋｚａｒｓｋｙからの寛大な贈り物）。細胞結合［３Ｈ］コレステリルエーテルの量は、１２５Ｉ−ＨＤＬ結合の相対量と［３Ｈ］ＣＥ取り込みの相対量との直接比較を可能にする［３Ｈ］ＣＥ−ＨＤＬタンパク質の等価量（ｎｇ）として表される。
【００３６】
細胞からのＨＤＬ解離速度を、その細胞を１２５Ｉ−ＨＤＬ（１０μｇ／タンパク質、２時間、３７℃）とともに、かつＢＬＴとともにかまたはＢＬＴを伴わずに、インキュベーションすることによって、測定した。その後、培地を、同じ培地（１２５Ｉ−ＨＤＬを、４０倍過剰な非標識ＨＤＬで置換した）または同じ培地（４０倍過剰な非標識ＨＤＬを、標識インキュベーション培地に添加した）のいずれかで置換した。その後、細胞結合型１２５Ｉ−ＨＤＬを、時間の関数として決定した。上記２つの方法は、同様の結果を生じた。
【００３７】
（（ｉｉ）細胞内輸送および細胞骨格組織化の蛍光顕微鏡分析）
ＨｅＬａ細胞（Ｓｐｉｒｏら（１９９６）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  ７、３５５〜６７）によるＡｌｅｘａ−５９４標識トランスフェリンもしくはＦＩＴＣ標識上皮増殖因子（ＥＧＦ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）のレセプター媒介性エンドサイトーシス、およびＢＳＣ−１細胞によるＡｌｅｘａ−５９４標識ホロコレラ毒素（Ｗａｙｅｒ  Ｌｅｎｃｅｒ博士、Ｃｈｉｌｄｒｅｎｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，ＨＭＳからの親切な贈り物）を、蛍光顕微鏡によって検出した。水疱性口内炎ウイルスの温度感受性糖タンパク質（ＶＳＶＧｔｓ０４５）がカルボキシル末端でＥＧＦＰに融合したもの（ＶＳＶＧｔｓ０４５−ＥＧＦＰ）が、４０℃から３２℃へと２時間シフトした後に、小胞体から形質膜への細胞内輸送を、蛍光顕微鏡によって測定した。ローダミン標識ファロイジンを使用するアクチンの分布に対する上記化合物の影響、およびＦＩＴＣ標識ＤＭ１αモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．）を使用するチューブリンの分布に対する上記化合物の影響を、ｌＤｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞において、Ｒｉｇｏｔｔｉら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，３３５４５〜９により記載される通りに、空中６３×対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ）を使用する蛍光顕微鏡によって、測定した。
【００３８】
（（ｉｉｉ）ＳＲ−ＢＩ細胞表面発現のフローサイトメトリー分析）
細胞を、ＩＣＣＥ９５濃度のＢＬＴとともにかまたはそれを伴わずに、３時間（培地Ｃ）インキュベートし、２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび化合物および含むＰＢＳを用いて収集し、非固定細胞におけるＳＲ−ＢＩ表面発現レベルを、ＫＫＢ−１抗体（Ｇｕら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２６３３８〜４８）を用いるフローサイメトリーによって測定した。
【００３９】
（結果）
（ＳＲ−ＢＩ媒介性選択的脂質取り込みのインヒビターについてのハイスループットスクリーニング）
ＤｉＩ標識ＨＤＬ（ＤｉＩ−ＨＤＬ）からの蛍光二色性色素ＤｉＩの細胞取り込みおよび細胞蓄積は、ＨＤＬにおけるコレステリルエステルのＳＲ−ＢＩ依存性選択的取り込みの信頼できる代理である。ＳＲ−ＢＩ媒介性選択的脂質取り込みの低分子インヒビターを同定するために、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのＤｉｖｅｒＳｅｔ  Ｅを示す１６，３２０個の化合物を、ＤｉＩ−ＨＤＬからのＤｉＩの細胞取り込みをブロックするそれらの化合物の能力についてスクリーニングした。上記化合物を、高レベルでｍＳＲ−ＢＩを発現するｌＤｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］を使用して、３８４ウェルプレートアッセイにおいて、名目濃度１０μＭにて試験した。
【００４０】
図１は、コントロール（化合物なし、過剰な非標識ＨＤＬの添加、または非トランスフェクトｌＤｌＡ−７細胞の使用）とともに、代表的アッセイプレートの結果を示す。この図は、第１回のハイスループットスクリーニングの間の１つの３８４ウェルプレートから得た蛍光読み取りの例である。ＳＲ−ＢＩ発現ｌＤｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞を、３８４ウェルプレート中にプレートし、ＤｉＩ−ＨＤＬ（１０μｇタンパク質／ｍｌ）からのＤｉＩの取り込みに対する約１０μＭ化合物の影響を、高速蛍光プレートリーダーを使用して測定した。カラム１〜２０は、１つのプレートからの１つのカラム（別々の色の記号）当たり１６個の独立したウェルからの結果（蛍光（任意単位））を示し、合計３２０個の化合物を示す。化合物を用いないコントロールは、４０倍過剰な非標識ＨＤＬの非存在下もしくは存在下でｌＤｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞を含むウェル、またはｌＤｌＡ−７細胞（非常に低いＳＲ−ＢＩ発現）を含むウェルのいずれかである。ＢＬＴ−１と名づけた阻害化合物を含むウェル、およびＤｉＩ−ＨＤＬ蛍光を消光する化合物（Ｑ）を含むウェルが、示される。
【００４１】
ＤｉＩ−ＨＤＬの固有の蛍光を消光する化合物（「Ｑ」）または増強する化合物は、さらには試験しなかった。最初の回のスクリーニングにおいてＤｉＩ取り込みを再現的にブロックした約２００個の化合物を、再試験した。これらが、表Ｉに示される。
【００４２】
（表Ｉ：ＳＲ−ＢＩインヒビターの構造）
【００４３】
【表１−１】
2006515274.tif 000002
【００４４】
【表１−２】
2006515274.tif 000003
【００４５】
【表１−３】
2006515274.tif 000004
【００４６】
【表１−４】
2006515274.tif 000005
【００４７】
【表１−５】
2006515274.tif 000006
【００４８】
【表１−６】
2006515274.tif 000007
【００４９】
【表１−７】
2006515274.tif 000008
【００５０】
【表１−８】
2006515274.tif 000009
【００５１】
【表１−９】
2006515274.tif 000010
【００５２】
【表１−１０】
2006515274.tif 000011
【００５３】
【表１−１１】
2006515274.tif 000012
μＭまたはより低い範囲のＩＣＤｉＩ５０を有する最も有効な化合物のうちの５つ（図２Ａ）を、ＢＬＴ１〜ＢＬＴ５と名づけて、さらに特徴付けた。著しいことに、これらのうちの最も強力なＢＬＴ−１およびＢＬＴ−２は、ｎＭ範囲にて阻害し、これらは、構造的に関連する（表ＩＩ）。ＤｉＩ取り込みの阻害は、新規なタンパク質合成を必要としなかった。なぜなら、１００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドで３０分間細胞を事前処理すると、その阻害効果を消滅しなかったからである。最後に、上記ＢＬＴのうちのいずれも、最少量のＳＲ−ＢＩしか発現しない非トランスフェクｌｄｌＡ−７細胞によるＤｉＩまたは［３Ｈ］ＣＥの低いバックグラウンドレベルの取り込みを、実質的に阻害しなかった。
【００５４】
ｌｄｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞により［３Ｈ］ＣＥ−ＨＤＬからのより生理的脂質である［３Ｈ］コレステリルエーテル（［３Ｈ］ＣＥ）の取り込みの阻害についてのＩＣＣＥ５０は、ＤｉＩ取り込みについてのＩＣＣＥ５０と同様であった（図２Ｂおよび表ＩＩ）。［３Ｈ］ＣＥ取り込みの阻害は、可逆的であった（化合物との１時間のインキュベーション、その後３〜６時間の洗浄期間）。さらに、上記化合物はまた、高レベルのＳＲ−ＢＩを発現するＹ１−ＢＳ１副腎皮質細胞（Ｒｉｇｏｔｔｉら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，３３５４５〜９）による［３Ｈ］ＣＥの取り込みをブロックした（表ＩＩ）。このことは、上記化合物による阻害効果は、細胞型特異的ではないことを示す。上記細胞または標識ＨＤＬを上記化合物とともにプレインキュベートする実験は、上記ＨＤＬよりも上記細胞が、上記化合物の標的であることを示した。
【００５５】
（表２：ＳＲ−ＢＩ結合についての試験の結果）
【００５６】
【表２−１】
2006515274.tif 000013
【００５７】
【表２−２】
2006515274.tif 000014
【００５８】
【表２−３】
2006515274.tif 000015
【００５９】
【表２−４】
2006515274.tif 000016
【００６０】
【表２−５】
2006515274.tif 000017
【００６１】
【表２−６】
2006515274.tif 000018
【００６２】
【表２−７】
2006515274.tif 000019
【００６３】
【表２−８】
2006515274.tif 000020
【００６４】
【表２−９】
2006515274.tif 000021
【００６５】
【表２−１０】
2006515274.tif 000022
【００６６】
【表２−１１】
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【００６７】
【表２−１２】
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（ＢＬＴにより選択的脂質取り込みの阻害は、特異的である）
ＢＬＴ阻害の特異性を、［３Ｈ］ＣＥ取り込みを９５％阻害する濃度（ＩＣＣＥ９５）でいくつかの他の細胞特性に対するそれらのＢＬＴの影響を試験することによって、試験した（図３）。上記ＢＬＴのうちのいずれも、アクチンネットワークおよびチューブリンネットワークの完全性を破壊しなかった。これらはまた、蛍光標識したエンドサイトーシスレセプターリガンドであるトランスフェリンおよび上皮増殖因子の取り込みを阻害することも、それらの細胞内分布を変化させることもなかった。上記ＢＬＴはまた、細胞表面から、部分的にコレステロールリッチな脂質漂流物（ｒａｆｔ）およびスフィンゴ脂質リッチな脂質漂流物（ｒａｆｔ）に依存すると考えられる経路（Ｌｅｎｃｅｒら（１９９９）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４５０、１７７〜１９０）を通る、核周囲領域への、蛍光標識コレラ毒素の取り込みを阻害しなかった。さらに、ＢＬＴは、増強型緑色蛍光タンパク質−標識した内在性ウイルス膜糖タンパク質であるＶＳＶＧ（ＶＳＶＧｔｓ０４５−ＥＧＦＰ）の輸送の分析によって評価した場合、その分泌経路を妨害しなかった。従って、ＢＬＴは、クラスリン依存性細胞内膜輸送およびクラスリン非依存性細胞内膜輸送においても、細胞骨格の組織化においても、一般的欠損を誘導せず、これらの基準によって、ＳＲ−ＢＩ依存性脂質取り込みの特異的インヒビターである。
【００６８】
（ＢＬＴは、細胞からＨＤＬへのＳＲ−ＢＩ媒介性コレステロール流出を阻害する）
ＨＤＬからの選択的脂質取り込みを媒介することに加えて、ＳＲ−ＢＩは、細胞からＨＤＬ粒子への非エステル化コレステロールの流出を促進し得る（Ｊｉａｎら（１９９８）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３、５５９９〜６０６、Ｊｉら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２０９８２〜５）。上記ＢＬＴがこのＳＲ−ＢＩ媒介性脂質輸送経路を阻害し得るか否かを決定するために、細胞を、［３Ｈ］コレステロールで標識し、非標識ＨＤＬへのその流出を、上記ＢＬＴの存在下または非存在下で測定した。（図２Ｃ、表ＩＩ）。細胞を、５０μＭ  ＢＬＴ−１（ＭＩＴ９９５２−５３）の非存在下（上図）または存在下（下図）で３時間インキュベートし、エピ蛍光顕微鏡を使用して、蛍光標識したトランスフェリン（Ａ、Ｂ；ＨｅＬａ細胞）およびＥＧＦ（Ｃ，Ｄ；ＨｅＬａ細胞）のクラスリン依存性エンドサイトーシス；蛍光標識したコレラ毒素のクラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｅ，Ｆ；ＢＳＣ−１細胞）、ならびにＥＲから細胞表面への温度感受性蛍光膜タンパク質ＶＳＶＧｔｓ０４５−ＥＧＦＰの輸送（Ｇ、Ｈ；ＢＳＣ−１細胞）といった、細胞活性をモニターした。さらに、アクチン細胞骨格の細胞内分布（ローダミン標識ファロイジンを用いて可視化した）およびチューブリンネットワークの細胞内分布（γ−チューブリンに特異的な蛍光標識抗体を用いて可視化。Ｋ，Ｌ；ＢＳＣ−１細胞）を測定した。ＢＬＴ−１（ＭＩＴ９９５２−５３）および他のＢＬＴ（示さず）は、これらの細胞特性または細胞活性のいずれに対しても、影響を有さなかった。
【００６９】
表ＩＩＩにおいて示されるように、すべてのＢＬＴは、ＳＲ−ＢＩ媒介性コレステロール流出を、［３Ｈ］ＣＥ取り込みについての相対能力と類似する相対能力（ＩＣＦＣ５０）で阻害した。しかし、ＢＬＴ−３（ＭＩＴ９９５２−１９）、ＢＬＴ−４（ＭＭＩＴ９９５２−２９）およびＢＬＴ−５（ＭＩＴ９９５２−６）の場合には、流出のＩＣＦＣ５０は、取り込みについてよりも高かった。このことは、上記ＢＬＴは、取り込み機構と流出機構との間に差があり得ることを明らかにし得ることを示唆する。上記ＢＬＴは、ＳＲ−ＢＩ非依存性流出（特異的抗ＳＲ−ＢＩ遮断抗体ＫＫＢ−１によって阻害されなかった）（Ｋａｐｏｏｒら（２０００）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５０、９７５〜８８）に対してほとんど影響を有さなかった。比較的低レベルの内因性ＳＲ−ＢＩを発現する非トランスフェクトｌｄｌＡ−７細胞において、全コレステロール流出およびＳＲ−ＢＩ依存性（例えば、ＫＫＢ−１により阻害可能な）コレステロール流出は、ｌｄｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞においてよりもかなり低かった（約５〜１０分の１）。上記ＢＬＴは、ｌｄｌＡ−７細胞における低いＳＲ−ＢＩ依存性コレステロール流出を阻害可能であったが、同様に低いＳＲ−ＢＩ非依存性流出に対しては、何ら阻害効果を有さなかった。
【００７０】
（表ＩＩＩ）
【００７１】
【表３】
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（ＢＬＴは、ＳＲ−ＢＩの表面発現を変化させない）
ＢＬＴがその細胞表面発現を減少することによりＳＲ−ＢＩ機能を阻害したか否かを決定するために、本発明者らは、ＫＫＢ−１抗ｍＳＲ−ＢＩ抗体およびフローサイトメトリーを使用して、表面発現を測定した。図４は、ＩＣＣＥ９５（ＢＬＴ１（ＭＩＴ９９５２−５３）およびＢＬＴ２（ＭＩＴ９９５２−６１）については１μＭ、ＢＬＴ３〜５（ＭＩＴ９９５２−１９、ＭＩＴ９９５２−２９、およびＭＩＴ９９５２−６）については５０μＭに対応する）での３時間のインキュベーションの後に、ＢＬＴは、ｌｄｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞の表面上でのｍＳＲ−ＢＩの発現を変化しなかったことを示す。
【００７２】
（ＢＬＴは、ＳＲ−ＢＩに対するＨＤＬの結合を増強する）
上記ＢＬＴは、ＳＲ−ＢＩに対するＨＤＬの結合を阻害することにより機能することが、まず予期された。しかし、細胞を、亜飽和濃度の［３Ｈ］ＣＥ−ＨＤＬまたは１２５Ｉ標識ＨＤＬ（１２５Ｉ−ＨＤＬ）のいずれか（１０μｇタンパク質／ｍｌ）および漸増量の化合物（図５）とともにインキュベートした場合、［３Ｈ］ＣＥ取り込み（実線、記号なし、図２Ｂからのデータ）の減少および［３Ｈ］コレステロール流出（破線、図２Ｃからのデータ）の減少には、対応する１２５Ｉ−ＨＤＬ結合の増加（実線、四角の記号）が付随した。１２５Ｉ−ＨＤＬ結合の濃度依存性を、ＩＣＣＥ９５濃度でのＢＬＴの存在下または非存在下で測定した（図６および表ＩＩ）。上記ＢＬＴは、結合部位の数（Ｂｍａｘ）を実質的には変化させなかったが、むしろ、ＨＤＬについてのＳＲ−ＢＩの親和性の小さいが有意な増加（より低い見かけのＫｄ）を誘導した。さらに、上記ＢＬＴは、ＳＲ−ＢＩからの１２５Ｉ−ＨＤＬの解離速度を減少させた（表ＩＩ）。このことは、上記ＢＬＴにより誘導されるより緊密な結合は、少なくとも部分的には、上記解離速度の減少に起因したことを示す。
【００７３】
（考察）
表Ｉに示される、ＳＲ−ＢＩ媒介性脂質輸送を変化させる２００個の化合物が、インビトロアッセイを使用して同定された。試験の結果が、表ＩＩに示される。ＢＬＴ−１（ＭＩＴ９９５２−５３）〜ＢＬＴ−５（ＭＩＴ９９５２−６）は、ＨＤＬレセプターであるＳＲ−ＢＩによって媒介される、ＨＤＬと細胞との間の脂質輸送を阻害する低分子として同定された。ＢＬＴは、ＨＤＬコレステリルエーテルの選択的な細胞脂質取り込みおよびＨＤＬへの細胞コレステロールの流出の両方を阻害した。上記ＢＬＴの阻害効果は、特異的（例えば、これらは、ＳＲ−ＢＩ結合を特異的に変化させる）である。なぜなら、これらは、活性ＳＲ−ＢＩレセプターの発現を必要とし、かつこれらは、いくつかのクラスリン依存性エンドサイトーシス経路およびクラスリン非依存性エンドサイトーシス経路を妨害せず、その分泌経路も、アクチン細胞骨格ネットワークもチューブリン細胞骨格ネットワークも妨害しなかったからである。顕著なことに、ＢＬＴによる脂質輸送の阻害は、増強されたＨＤＬ結合親和性（減少した解離速度）を伴った。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１Ａ】図１Ａ〜図１Ｃは、ＨＤＬと細胞との間のＳＲ−ＢＩ媒介性脂質輸送の、ＢＬＴによる阻害の濃度依存性のグラフである。ｌＤｌＡ[ｍＳＲ−ＢＩ]細胞を、指示した濃度のＢＬＴとともにインキュベートした。（Ａ）ＤｉＩ−ＨＤＬからのＤｉＩ取り込み、（Ｂ）[３Ｈ]ＣＥ−ＨＤＬからの[３Ｈ]ＣＥ取り込み、および（Ｃ）細胞からＨＤＬへの[３Ｈ]コレステロールの流出に対する、ＢＬＴの影響が、決定された。コントロール値の１００％は、（Ａ）５０．６ｎｇ  ＨＤＬタンパク質等価物／ウェル（３８４ウェルプレート）、および（Ｂ）３９０８ｎｇ  ＨＤＬタンパク質等価物／ｍｇ細胞タンパク質であった。（Ｃ）において、データは正規化されて、化合物の非存在下での細胞からＨＤＬへと輸送された[３Ｈ]コレステロールの最大量（合計の５５．７％）が、１００％に設定された。０％値は、ＢＬＴがなく、かつ飽和阻害量の特異的抗ＳＲ−ＢＩ遮断モノクローナル抗体ＫＫＢ−１の存在下で、ｌＤｌＡ[ｍＳＲ−ＢＩ]細胞からＨＤＬへと輸送された[３Ｈ]コレステロールの流出（合計の１５％）に対応する。ＫＫＢＩの非存在下または存在下で測定されたｌＤｌＡ−７細胞からの[３Ｈ]コレステロールの流出は、それぞれ、全細胞[３Ｈ]コレステロールの１５％および１５％であった。
【図１Ｂ】図１Ａ〜図１Ｃは、ＨＤＬと細胞との間のＳＲ−ＢＩ媒介性脂質輸送の、ＢＬＴによる阻害の濃度依存性のグラフである。ｌＤｌＡ[ｍＳＲ−ＢＩ]細胞を、指示した濃度のＢＬＴとともにインキュベートした。（Ａ）ＤｉＩ−ＨＤＬからのＤｉＩ取り込み、（Ｂ）[３Ｈ]ＣＥ−ＨＤＬからの[３Ｈ]ＣＥ取り込み、および（Ｃ）細胞からＨＤＬへの[３Ｈ]コレステロールの流出に対する、ＢＬＴの影響が、決定された。コントロール値の１００％は、（Ａ）５０．６ｎｇ  ＨＤＬタンパク質等価物／ウェル（３８４ウェルプレート）、および（Ｂ）３９０８ｎｇ  ＨＤＬタンパク質等価物／ｍｇ細胞タンパク質であった。（Ｃ）において、データは正規化されて、化合物の非存在下での細胞からＨＤＬへと輸送された[３Ｈ]コレステロールの最大量（合計の５５．７％）が、１００％に設定された。０％値は、ＢＬＴがなく、かつ飽和阻害量の特異的抗ＳＲ−ＢＩ遮断モノクローナル抗体ＫＫＢ−１の存在下で、ｌＤｌＡ[ｍＳＲ−ＢＩ]細胞からＨＤＬへと輸送された[３Ｈ]コレステロールの流出（合計の１５％）に対応する。ＫＫＢＩの非存在下または存在下で測定されたｌＤｌＡ−７細胞からの[３Ｈ]コレステロールの流出は、それぞれ、全細胞[３Ｈ]コレステロールの１５％および１５％であった。
【図１Ｃ】図１Ａ〜図１Ｃは、ＨＤＬと細胞との間のＳＲ−ＢＩ媒介性脂質輸送の、ＢＬＴによる阻害の濃度依存性のグラフである。ｌＤｌＡ[ｍＳＲ−ＢＩ]細胞を、指示した濃度のＢＬＴとともにインキュベートした。（Ａ）ＤｉＩ−ＨＤＬからのＤｉＩ取り込み、（Ｂ）[３Ｈ]ＣＥ−ＨＤＬからの[３Ｈ]ＣＥ取り込み、および（Ｃ）細胞からＨＤＬへの[３Ｈ]コレステロールの流出に対する、ＢＬＴの影響が、決定された。コントロール値の１００％は、（Ａ）５０．６ｎｇ  ＨＤＬタンパク質等価物／ウェル（３８４ウェルプレート）、および（Ｂ）３９０８ｎｇ  ＨＤＬタンパク質等価物／ｍｇ細胞タンパク質であった。（Ｃ）において、データは正規化されて、化合物の非存在下での細胞からＨＤＬへと輸送された[３Ｈ]コレステロールの最大量（合計の５５．７％）が、１００％に設定された。０％値は、ＢＬＴがなく、かつ飽和阻害量の特異的抗ＳＲ−ＢＩ遮断モノクローナル抗体ＫＫＢ−１の存在下で、ｌＤｌＡ[ｍＳＲ−ＢＩ]細胞からＨＤＬへと輸送された[３Ｈ]コレステロールの流出（合計の１５％）に対応する。ＫＫＢＩの非存在下または存在下で測定されたｌＤｌＡ−７細胞からの[３Ｈ]コレステロールの流出は、それぞれ、全細胞[３Ｈ]コレステロールの１５％および１５％であった。
【図２Ａ】図２Ａ〜図２Ｄは、ＳＲ−ＢＩの細胞表面発現のグラフである。ｌＤｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞およびｌＤｌＡ−７細胞を、ＢＬＴ（その対応するＩＣＣＥ９５濃度）（ＢＬＴ−１［ＭＩＴ９９５２−５３］およびＢＬＴ−２［ＭＩＴ９９５２−６１］について、１μＭ；ＢＬＴ−３［ＭＩＴ９９５２−１９］；ＢＬＴ−４［ＭＩＴ９９５２−２９］およびＢＬＴ−５［ＭＩＴ９９５２−６］について、５０μＭ）で３時間処理したか、または処理せず、その後、フローサイトメトリーによってＳＲ−ＢＩの表面発現レベルを決定した。図Ａ〜Ｃは、それぞれ、ＢＬＴを用いないｌＤｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞についての表面発現、１μＭ  ＢＬＴ−１（ＭＩＴ９９５２−５３）で処理したｌＤｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞についての表面発現、およびＢＬＴを用いないｌＤｌＡ−７細胞についての表面発現のヒストグラムを示す。図Ｄは、５つのすべてのＢＬＴについてのｌＤｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞における結果を要約しており、化合物を用いずに決定した値を１００％に設定した。ｎは、独立した測定の数であり、ＳＤは、標準偏差である。
【図２Ｂ】図２Ａ〜図２Ｄは、ＳＲ−ＢＩの細胞表面発現のグラフである。ｌＤｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞およびｌＤｌＡ−７細胞を、ＢＬＴ（その対応するＩＣＣＥ９５濃度）（ＢＬＴ−１［ＭＩＴ９９５２−５３］およびＢＬＴ−２［ＭＩＴ９９５２−６１］について、１μＭ；ＢＬＴ−３［ＭＩＴ９９５２−１９］；ＢＬＴ−４［ＭＩＴ９９５２−２９］およびＢＬＴ−５［ＭＩＴ９９５２−６］について、５０μＭ）で３時間処理したか、または処理せず、その後、フローサイトメトリーによってＳＲ−ＢＩの表面発現レベルを決定した。図Ａ〜Ｃは、それぞれ、ＢＬＴを用いないｌＤｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞についての表面発現、１μＭ  ＢＬＴ−１（ＭＩＴ９９５２−５３）で処理したｌＤｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞についての表面発現、およびＢＬＴを用いないｌＤｌＡ−７細胞についての表面発現のヒストグラムを示す。図Ｄは、５つのすべてのＢＬＴについてのｌＤｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞における結果を要約しており、化合物を用いずに決定した値を１００％に設定した。ｎは、独立した測定の数であり、ＳＤは、標準偏差である。
【図２Ｃ】図２Ａ〜図２Ｄは、ＳＲ−ＢＩの細胞表面発現のグラフである。ｌＤｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞およびｌＤｌＡ−７細胞を、ＢＬＴ（その対応するＩＣＣＥ９５濃度）（ＢＬＴ−１［ＭＩＴ９９５２−５３］およびＢＬＴ−２［ＭＩＴ９９５２−６１］について、１μＭ；ＢＬＴ−３［ＭＩＴ９９５２−１９］；ＢＬＴ−４［ＭＩＴ９９５２−２９］およびＢＬＴ−５［ＭＩＴ９９５２−６］について、５０μＭ）で３時間処理したか、または処理せず、その後、フローサイトメトリーによってＳＲ−ＢＩの表面発現レベルを決定した。図Ａ〜Ｃは、それぞれ、ＢＬＴを用いないｌＤｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞についての表面発現、１μＭ  ＢＬＴ−１（ＭＩＴ９９５２−５３）で処理したｌＤｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞についての表面発現、およびＢＬＴを用いないｌＤｌＡ−７細胞についての表面発現のヒストグラムを示す。図Ｄは、５つのすべてのＢＬＴについてのｌＤｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞における結果を要約しており、化合物を用いずに決定した値を１００％に設定した。ｎは、独立した測定の数であり、ＳＤは、標準偏差である。
【図２Ｄ】図２Ａ〜図２Ｄは、ＳＲ−ＢＩの細胞表面発現のグラフである。ｌＤｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞およびｌＤｌＡ−７細胞を、ＢＬＴ（その対応するＩＣＣＥ９５濃度）（ＢＬＴ−１［ＭＩＴ９９５２−５３］およびＢＬＴ−２［ＭＩＴ９９５２−６１］について、１μＭ；ＢＬＴ−３［ＭＩＴ９９５２−１９］；ＢＬＴ−４［ＭＩＴ９９５２−２９］およびＢＬＴ−５［ＭＩＴ９９５２−６］について、５０μＭ）で３時間処理したか、または処理せず、その後、フローサイトメトリーによってＳＲ−ＢＩの表面発現レベルを決定した。図Ａ〜Ｃは、それぞれ、ＢＬＴを用いないｌＤｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞についての表面発現、１μＭ  ＢＬＴ−１（ＭＩＴ９９５２−５３）で処理したｌＤｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞についての表面発現、およびＢＬＴを用いないｌＤｌＡ−７細胞についての表面発現のヒストグラムを示す。図Ｄは、５つのすべてのＢＬＴについてのｌＤｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞における結果を要約しており、化合物を用いずに決定した値を１００％に設定した。ｎは、独立した測定の数であり、ＳＤは、標準偏差である。
【図３Ａ】図３Ａ〜図３Ｅは、ＨＤＬからのＳＲ−ＢＩ媒介性コレステロールエーテル取り込み、ＨＤＬへの細胞コレステロール流出、およびＨＤＬ結合に対する、ＢＬＴの影響を示す。［３Ｈ］ＣＥ−ＨＤＬからの［３Ｈ］ＣＥのＳＲ−ＢＩ媒介性取り込み（実線、記号なし）、細胞からＨＤＬへの［３Ｈ］コレステロールの流出（破線）、または細胞への１２５Ｉ−ＨＤＬの結合（実線、黒塗り記号）に対する、示した濃度のＢＬＴの影響（図Ａ〜Ｅ）を、ｌＤｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞を使用して決定した。比較を単純にするために、観察された最小の［３Ｈ］ＣＥ取り込み値および［３Ｈ］コレステロール流出値（図２から）を０％として、ＢＬＴの非存在下での値を１００％として、比較した。ＢＬＴの非存在下での１２５Ｉ−ＨＤＬ結合についての１００％コントロール値は、４０３ｎｇ  ＨＤＬタンパク質／ｍｇ細胞タンパク質であった。
【図３Ｂ】図３Ａ〜図３Ｅは、ＨＤＬからのＳＲ−ＢＩ媒介性コレステロールエーテル取り込み、ＨＤＬへの細胞コレステロール流出、およびＨＤＬ結合に対する、ＢＬＴの影響を示す。［３Ｈ］ＣＥ−ＨＤＬからの［３Ｈ］ＣＥのＳＲ−ＢＩ媒介性取り込み（実線、記号なし）、細胞からＨＤＬへの［３Ｈ］コレステロールの流出（破線）、または細胞への１２５Ｉ−ＨＤＬの結合（実線、黒塗り記号）に対する、示した濃度のＢＬＴの影響（図Ａ〜Ｅ）を、ｌＤｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞を使用して決定した。比較を単純にするために、観察された最小の［３Ｈ］ＣＥ取り込み値および［３Ｈ］コレステロール流出値（図２から）を０％として、ＢＬＴの非存在下での値を１００％として、比較した。ＢＬＴの非存在下での１２５Ｉ−ＨＤＬ結合についての１００％コントロール値は、４０３ｎｇ  ＨＤＬタンパク質／ｍｇ細胞タンパク質であった。
【図３Ｃ】図３Ａ〜図３Ｅは、ＨＤＬからのＳＲ−ＢＩ媒介性コレステロールエーテル取り込み、ＨＤＬへの細胞コレステロール流出、およびＨＤＬ結合に対する、ＢＬＴの影響を示す。［３Ｈ］ＣＥ−ＨＤＬからの［３Ｈ］ＣＥのＳＲ−ＢＩ媒介性取り込み（実線、記号なし）、細胞からＨＤＬへの［３Ｈ］コレステロールの流出（破線）、または細胞への１２５Ｉ−ＨＤＬの結合（実線、黒塗り記号）に対する、示した濃度のＢＬＴの影響（図Ａ〜Ｅ）を、ｌＤｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞を使用して決定した。比較を単純にするために、観察された最小の［３Ｈ］ＣＥ取り込み値および［３Ｈ］コレステロール流出値（図２から）を０％として、ＢＬＴの非存在下での値を１００％として、比較した。ＢＬＴの非存在下での１２５Ｉ−ＨＤＬ結合についての１００％コントロール値は、４０３ｎｇ  ＨＤＬタンパク質／ｍｇ細胞タンパク質であった。
【図３Ｄ】図３Ａ〜図３Ｅは、ＨＤＬからのＳＲ−ＢＩ媒介性コレステロールエーテル取り込み、ＨＤＬへの細胞コレステロール流出、およびＨＤＬ結合に対する、ＢＬＴの影響を示す。［３Ｈ］ＣＥ−ＨＤＬからの［３Ｈ］ＣＥのＳＲ−ＢＩ媒介性取り込み（実線、記号なし）、細胞からＨＤＬへの［３Ｈ］コレステロールの流出（破線）、または細胞への１２５Ｉ−ＨＤＬの結合（実線、黒塗り記号）に対する、示した濃度のＢＬＴの影響（図Ａ〜Ｅ）を、ｌＤｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞を使用して決定した。比較を単純にするために、観察された最小の［３Ｈ］ＣＥ取り込み値および［３Ｈ］コレステロール流出値（図２から）を０％として、ＢＬＴの非存在下での値を１００％として、比較した。ＢＬＴの非存在下での１２５Ｉ−ＨＤＬ結合についての１００％コントロール値は、４０３ｎｇ  ＨＤＬタンパク質／ｍｇ細胞タンパク質であった。
【図３Ｅ】図３Ａ〜図３Ｅは、ＨＤＬからのＳＲ−ＢＩ媒介性コレステロールエーテル取り込み、ＨＤＬへの細胞コレステロール流出、およびＨＤＬ結合に対する、ＢＬＴの影響を示す。［３Ｈ］ＣＥ−ＨＤＬからの［３Ｈ］ＣＥのＳＲ−ＢＩ媒介性取り込み（実線、記号なし）、細胞からＨＤＬへの［３Ｈ］コレステロールの流出（破線）、または細胞への１２５Ｉ−ＨＤＬの結合（実線、黒塗り記号）に対する、示した濃度のＢＬＴの影響（図Ａ〜Ｅ）を、ｌＤｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞を使用して決定した。比較を単純にするために、観察された最小の［３Ｈ］ＣＥ取り込み値および［３Ｈ］コレステロール流出値（図２から）を０％として、ＢＬＴの非存在下での値を１００％として、比較した。ＢＬＴの非存在下での１２５Ｉ−ＨＤＬ結合についての１００％コントロール値は、４０３ｎｇ  ＨＤＬタンパク質／ｍｇ細胞タンパク質であった。
【図４】図４は、ｌＤｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞への１２５Ｉ−ＨＤＬ結合の濃度依存性に対する、ＢＬＴ−１（ＭＩＴ９９５２−５３）の影響のグラフである。ｌＤｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞への１２５Ｉ−ＨＤＬの結合を、１μＭ  ＢＬＴ−１（ＭＩＴ９９５２−５３；ＩＣＣＥ９５）の存在下（青色）または非存在下（黒色）において、示したＨＤＬ濃度にて、二連で決定した。各値は、ＢＬＴ−１（ＭＩＴ９９５２−５３）の存在下でのｌＤｌＡ［ｍＳＲ−ＢＩ］細胞に対する、４０倍過剰な非標識ＨＤＬの疎な時下での１２５Ｉ−ＨＤＬの結合について、補正した。
【図１Ａ】
2006515274.tif 000026
【図１Ｂ】
2006515274.tif 000027
【図１Ｃ】
2006515274.tif 000028
【図２Ａ】
2006515274.tif 000029
【図２Ｂ】
2006515274.tif 000030
【図２Ｃ】
2006515274.tif 000031
【図２Ｄ】
2006515274.tif 000032
【図３Ａ】
2006515274.tif 000033
【図３Ｂ】
2006515274.tif 000034
【図３Ｃ】
2006515274.tif 000035
【図３Ｄ】
2006515274.tif 000036
【図３Ｅ】
2006515274.tif 000037
【図４】
2006515274.tif 000038
【国際調査報告】
2006515274.tif 000039