(57)【要約】本発明は、化学の分野であり、標的化学合成により組織特異的な活性を有するペプチドを得る方法に関する。本発明は、薬物中に種々の臓器及び組織の機能を正常化するこれらのペプチドをベ−スにした医薬品を獲得するのに利用可能である。請求項に記載の方法は、組織由来の酢酸抽出物の定量的なアミノ酸分析、その試験組織中で主要な２つのアミノ酸（ＧｌｕとＡｓｐ）をベ−スにした選別、これらのアミノ酸からなる中心結合の合成、及びその試験組織の残りのアミノ酸の間で主要なアミノ酸のＮ末端及びＣ末端への結合を包含している。本請求項に記載の方法により得られるペプチドは、組織特異的な活性を有する。組織特異的な活性を有し、本請求項に記載の方法で得られたペプチドの１つ又はその塩、及び薬学的に許容される担体を活性のベ−スとして含有する医薬組成物が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物組織由来の酢酸抽出物のアミノ酸分析、その試験組織中で主要なアミノ酸の選択、該ペプチドの中心結合の合成、及びその試験組織の残りのアミノ酸の間で主要なアミノ酸の両末端部への結合を包含する、組織特異的な活性を有するペプチドを得る方法。
【請求項２】
該アミノ酸分析が、骨端組織由来の酢酸抽出物に関して実施されることにより特徴付けられる、請求項１に記載のペプチドを得る方法。
【請求項３】
該アミノ酸分析が、大脳皮質組織由来の酢酸抽出物に関して実施されることにより特徴付けられる、請求項１に記載のペプチドを得る方法。
【請求項４】
該アミノ酸分析が、肝組織由来の酢酸抽出物に関して実施されることにより特徴付けられる、請求項１に記載のペプチドを得る方法。
【請求項５】
該中心結合が、グルタミン酸（Ｇｌｕ）及びアスパラギン酸（Ａｓｐ）により提供されることにより特徴付けられる、請求項１に記載のペプチドを得る方法。
【請求項６】
当該アミノ酸が、Ｎ及びＣ末端で中心結合に繋がっていることにより特徴付けられる、請求項１に記載のペプチドを得る方法。
【請求項７】
組織特異的な活性を有し、活性ベ−ス及び薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物であって、その活性ベ−スとして請求項１−６により得られるペプチドの１つを含有する、組成物。
【請求項８】
アミノ基、カルボキシル基からなる塩、有機及び無機のカチオンからなる塩を含有することにより特徴付けられる、請求項７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、化学の分野であり、標的化学合成により組織特異的な活性を有するペプチドを得る方法に関する。本発明は、薬物中に種々の臓器及び組織の機能を正常化するこれらのペプチドをベ−スにした医薬品を獲得するのに利用可能である。
【０００２】
発明の背景
組織特異的な活性を有する複合ペプチド基質を得る方法が既知である：ジマリン（Ｔｈｙｍａｌｉｎ）（１）、エピ−タラミン（Ｅｐｉｔｈａｌａｍｉｎ）（２）、プロスタチレン（Ｐｒｏｓｔａｔｉｌｅｎ）（３）、コ−テクシン（Ｃｏｒｔｅｘｉｎ）（４）、レチナラミン（Ｒｅｔｉｎａｌａｍｉｎ）（５）。これらの基質は、３％酢酸中で塩化亜鉛を用いた抽出、及びその析出物のアセトンをによる更なる処置により動物の臓器及び組織から得られる低分子ポリペプチドの複合体である（６）。ペプチド基質を得る特定の方法は、その抽出されたペプチドの物理化学的特性の非常な多様性、及びそれらの中のバラスト（ｂａｌｌａｓｔ）成分により特徴付けられる。必要とされる有機原材料の蓄えには限りがあること及び製造による高い労力及びエネルギ−の消費が、複合ペプチド基質を得る当該方法の問題点であり、そのことが工業的生産がの妨げとなっている。
【０００３】
ジマリン、Ｇｌｕ−Ｔｒｐ（ジモゲン（Ｔｈｙｍｏｇｅｎ））（８）、ジモポイエチン（Ｔｈｙｍｏｐｏｉｅｎｔｉｎ）ＩＩ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（ジモペンチン（ｔｈｙｍｏｐｅｎｔｉｎ））（９）、スプレニン（Ｓｐｌｅｎｉｎ）、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（スプレノペンチン（Ｓｐｒｅｎｏｐｅｎｔｉｎ））（１０）、免疫グロブリンＧ、Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（タフシン（Ｔａｐｈｃｉｎ））（１１）、その他から単離された活性フラクションをベ−スにして溶液中で従来のペプチド合成（７）によりペプチドを得る方法が既知である。しかしながら、その特定の方法により得られる基質は、１本で示される生理活性（免疫調整）スペクトルを有し、溶液及び高用量の適用において基質は不安定である。
【０００４】
溶液中での従来のペプチド合成（７）による修飾構造からなるペプチド：末端アルギニンにより伸長された鎖を有するアミノ酸置換体の存在によりジモペンチンと構造的に区別される、Ａｒｇ−α−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ（イムノファン）（１２）、γ結合によりジモペンチンと構造的に区別される、γ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ（ベスチム（Ｂｅｓｔｉｍ））（１３）を得る方法が知られている。これらの基質は、狭い範囲の免疫生理活性及び複雑な手順の化学合成によっても特徴付けられる。
【０００５】
細胞免疫応答を阻害する合成ポリマ−（Ｃｏｐ１）もまた既知であり、それは化学合成により得られ、アミノ酸Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒを次に示すモル比：６．０：１．９：４．７：１．０（１４）で含有する。この活性基質を得る方法は、広範に及ぶものではなく、ポリマ−Ｃｏｐ１のデザインのみに関する。
【０００６】
発明の開示
本発明は、本分野において許容されている以下に示す特定の用語を用いる。
本明細書の特許請求の範囲における「小さな調節ペプチド」なる用語は、タンパク質分解の工程において形成される内因性の小さなペプチド及び既知のアミノ酸配列（最大１０個のアミノ酸）からなるその合成類似物の存在を意味し、このペプチドは生理活性特性を示す（７、１５）。
本明細書の特許請求の範囲におけるペプチドの「組織特異的な活性」なる用語は、ペプチドが特定の組織だけに影響を及ぼし、そのペプチドアミノ酸組成が、その獲得のベ−スとして機能する（６、１６、１７）。
【０００７】
本明細書の特許請求の範囲における「医薬組成物」なる用語は、請求項に記載の方法より得られた活性ペプチド、又はそのアミノ基、カルボキシル基の塩、有機及び無機の塩、及び薬学的に許容される担体を意味する。
本明細書の特許請求の範囲における「有効量」なる用語は、活性及び毒性の定量的指標に応じて、そして有用な知見に関しても、特定の薬物形態で有効となるような量の活性塩基の使用を意味する。
【０００８】
本明細書の特許請求の範囲の目的は、最小コストで工業的利用を可能にする標的化学合成により組織特異的な活性を有するペプチドを得る方法を生み出し、そして組織特異的効果を示し請求項に記載の方法により得られたペプチドをベ−スにした医薬組成物を産生することからなる。
本明細書の特許請求の範囲は、動物の組織由来の酢酸抽出物の定量的なアミノ酸分析、その試験組織中で主要な２つのアミノ酸（ＧｌｕとＡｓｐ）をベ−スにした選別、これらのアミノ酸からなる中心結合の合成、及びその試験組織の残りのアミノ酸の間で主要なアミノ酸のＮ末端及びＣ末端への結合を包含している。
【０００９】
本明細書の請求項に記載の方法により得られたペプチドは、組織特異的な活性を有する。すなわちそれらは、特定の組織だけに影響を及ぼし、そのペプチドアミノ酸組成が、その獲得のベ−スとして機能する
本明細書の特許請求の範囲は、活性ベ−スとして請求項に記載の方法により得られたペプチドの１つ、又はそのアミノ酸基、カルボキシル基からなる塩、有機及び無機のカチオンからなる塩、及び薬学的に許容される担体、例えば等張塩化ナトリウム溶液を有効量含有する組織特異的に活性な医薬組成物を示している。
【００１０】
本発明を満たす医薬組成物を得るために、目的のペプチド又は薬学的に許容される担体を、塩の形態で医薬品中に認容される配合方法に従って活性のベ−スとして薬学的に許容される担体と混合する。該担体は、体内への投与に好ましい剤形次第で種々の形態となり得る。
【００１１】
工業的適用
本発明は、以下に示す実施例より説明される。
骨端、大脳皮質、脳、及び肝臓の組織由来の酢酸抽出物のアミノ酸分析（実施例１）；
Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドの合成（実施例２）；
脳皮質下構造の外植片の成長に対するＡｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドの明らかな組織特異的特性を明確に示す効果（実施例３）；
Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏテトラペプチドの合成（実施例４）；
大脳皮質の外植片の成長に対するＡｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏテトラペプチドの明らかな組織特異的特性を明確に示す効果（実施例５）；
Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａテトラペプチドの合成（実施例６）；
様々な齢数のラットの単層培養肝細胞におけるタンパク質合成度に対するＬｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａテトラペプチドの明らかな組織特異的特性を明確に示す効果（実施例７）
肝臓の外植片の成長に対するＬｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａテトラペプチドのテトラペプチドの明らかな組織特異的特性を明確に示す効果（実施例８）
【００１２】
実施例１．骨端、大脳皮質、及び肝臓組織由来の酢酸抽出物のアミノ酸分析
【表１】
2004501932.tif 000002
【００１３】
動物の組織由来の酢酸抽出物のアミノ酸分析により、各組織に対して４個の主要なアミノ酸を明らかにすることが可能となった。アミノ酸の数がより少なくなると（例えば２個又は３個）、必然的に特定の組織に対して特異性の低いアミノ酸セットとなることから、まさにこの数のアミノ酸を選択することとした。従って選択された４個のアミノ酸は、組成物の多様性を最小とするのに十分であることが分かる。
【００１４】
目的の組織特異的なテトラペプチドをモデリングする場合、我々は一般式Ｈ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｙ−ＯＨに相当する多くの既知の組織オリゴペプチド（１８）中の親水性及び疎水性アミノ酸残基の配置も考慮した。このケ−スでは、部分的な陰性電荷は、分子中心で最大可能濃度に達する。Ｘ及びＹが脂肪族疎水性アミノ酸（Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ）であれば、この部位は親水性が最大となる。これは、細胞内タンパク質分解酵素が疎水性アミノ酸により形成される特定の優先結合により特徴付けられることを示すデ−タと一致する（１９）。別の極端なケ−スとしてＸ−Ｌｙｓ変異体が提供される。この場合、部分的な正電荷は、分子のＮ末端で最大可能濃度に達する（疎水性の性質が増すことも指摘される）。同時に、これによりＧｌｕ又はＡｓｐのイオン化γ及びβ−ＣＯＯ（−）基の、それぞれＬｙｓのε又はα−ＮＨ３（＋）との電気的相互作用の結果、細胞内擬環構造を形成する潜在性が確保される。Ｃ末端のＰｒｏの存在により、Ｇｌｙ又はＡｌａ変異体に比べてこの部位の親水性特性が著しく上昇する。
【００１５】
従って、以下に示すアミノ酸配列が選択され、これは骨端、大脳皮質、及び肝臓の組織由来の酢酸抽出物のアミノ酸分析に基づいてデザインされるテトラペプチドの一部となる。
・Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−ＯＨ；
・Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＯＨ；
・Ｈ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−ＯＨ；
【００１６】
実施例２．Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドの合成
１．製品名：アラニル−グルタミル−アスパルチル−グリシン
【化１】
2004501932.tif 000003
２．構造式：Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−ＯＨ
３．イオン対なしの分子式：Ｃ１４Ｈ２２Ｎ４Ｏ９
４．イオン対なしの分子量：３９０．３５
５．イオン対：アセテ−ト
６．外観：無臭の白色アモルファス粉末
７．合成法：ペプチドをスキ−ムＡにより溶液中で従来の合成法から得る：
【表２】
2004501932.tif 000004
【００１７】
Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドを溶媒として使用した。アスパラギン酸を添加するとき、α−ＣＯＯＨ基の保護には、トリエチルアミンを用いた塩化を適用した。ＢＯＣ−保護基はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液により、Ｚ−保護基は触媒作用的に水素付加により除去した。生成物を抽出して、逆層カラム上での分取用高速液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）法により精製した。
最終生成物の特性は以下に示す通りである：
・アミノ酸分析
【表３】
2004501932.tif 000005
・ペプチド含有率：９８．４５％（ＨＰＬＣ、２２０ｎｍにより）；
・薄層クロマトグラフィ−（ＴＬＣ）−単一、Ｒｆ＝０．７３（アセトニトリル−酢酸−水、５：１：３）；
・含水率：５％；
・０．００１％溶液のｐＨ：４．３７；
・特定旋回度：［α］Ｄ２２：−３２°（ｃ＝１、Ｈ２Ｏ）
「Ｐｏｌａｍａｔ Ａ」、Ｃａｒ Ｚｅｉβ Ｊｅｎａ
【００１８】
合成の実施例
１．ＢＯＣ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−ＯＨ（Ｉ）、Ｎ−ｔｅｒｔブチルオキシカルボニル−（γ−ベンジル）グルタミル−（β−ベンジル）アスパルテ−ト
４．３４ｇ（０．０１００モル）のＮ−ｔｅｒｔブチルオキシカルボニル−（γ−ベンジル）グルタミン酸のＮ−オキシスクシンイミドエステル（ＢＯＣ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＯＳｕ）を２０ｍｌのジメチルホルムアミド中に溶解して、１．７２ｍｌ（０．０１２５モル）のトリエチルアミン及び２．８０ｇ（０．０１２５モル）のβ−ベンジルアスパルテ−トを添加する。混合物を室温で２４時間攪拌する。その後生成物を０．５Ｎ 硫酸溶液（１５０ｍｌ）を用いて沈殿させ、エチルアセテ−ト（３ｘ３０ｍｌ）により抽出し、０．５Ｎ 硫酸溶液（２ｘ２０ｍｌ）、水、５％ 重炭酸ナトリウム溶液（１ｘ２０ｍｌ）、水、０．５Ｎ 硫酸溶液（２ｘ２０ｍｌ）、水中で洗浄する。生成物を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させる。エチルアセテ−トを濾取し、真空中４０℃で除去する。残渣を真空中、Ｐ２Ｏ５上で乾燥させる。５．６８ｇの油（≒１００％）が得られる。Ｒｆ＝０．４２（ベンゼン−アセトン、２：１；Ｓｏｒｂｆｉｌプレ−ト、シリカゲル８−１２μｍ、ＵＶ及び塩素／ベンジジン）。
【００１９】
２．ＴＦＡ・Ｈ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−ＯＨ（ＩＩ）、（γ−ベンジル）−グルタミル−（β−ベンジル）アスパルテ−トのトリフルオロ酢酸塩
５．６８ｇ（≒０．０１モル）のＮ−ｔｅｒｔブチルオキシカルボニル−（γ−ベンジル）グルタミル−（β−ベンジル）アスパルテ−ト（Ｉ）を２０ｍｌのジクロロメタン−トリフルオロ酢酸混合物（３：１）中に溶解する。２時間後、その溶媒を真空中４０℃で除去する。除去は、別々にジクロロメタン（２ｘ２０ｍｌ）を用いて繰り返される。その残渣を真空中ＮａＯＨ上で乾燥させる。５．８０ｇ（≒１００％）の油が得られる。Ｒｆ＝０．６３（ｎ−ブタノ−ル−ピリジン−酢酸−水、１５：１０：３：１２）。
【００２０】
３．Ｚ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−（ＯＢｚｌ）−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−ＯＨ（ＩＩＩ）、Ｎ−カルボベンゾキシアラニル−（γ−ベンジル）−グルタミル−（β−ベンジル）アスパルテ−ト
５．６５ｇ（０．０１モル）の（γ−ベンジル）−グルタミル−（β−ベンジル）アスパルテ−ト（ＩＩ）のトリフルオロ酢酸塩を１０ｍｌのジメチルホルムアミド中に溶解し、２．８０ｍｌ（０．０２モル）のトリエチルアミン及び４．１４ｇ（０．０１３モル）のＮ−カルボベンゾキシアラニンのＮ−オキシスクシンイミドエステルを添加する。混合物を室温で２４時間攪拌する。その生成物を０．５Ｎ 硫酸溶液（１５０ｍｌ）を用いて沈殿させ、エチルアセテ−ト（３ｘ３０ｍｌ）により抽出し、０．５Ｎ 硫酸溶液（２ｘ２０ｍｌ）、水、５％ 重炭酸ナトリウム溶液（１ｘ２０ｍｌ）、水、０．５Ｎ 硫酸溶液（２ｘ２０ｍｌ）、水中で洗浄する。生成物を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させる。エチルアセテ−トを濾取し、真空中４０℃で除去する。残渣をエチルアセテ−ト／ヘキサン系中で結晶化させる。その生成物を濾過して、真空中、Ｐ２Ｏ５上で乾燥させる。収量は４．１０ｇ（６６％）である。融解温度（Ｔｍｌ）は１５４℃である。Ｒｆ＝０．４８（ベンゼン−アセトン、１：１）、Ｒｆ＝０．７２（Ｎ−ブタノ−ル−ピリジン−酢酸−水、１５：１０：３：１２）。
【００２１】
４．Ｚ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−（ＯＢｚｌ）−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−ＯＨ（ＩＩＩ）、Ｎ−カルボベンゾキシアラニル−（γ−ベンジル）グルタミル−（β−ベンジル）アスパルチルグリシンベンジルエステル
１．０１ｇ（３ミリモル）のグリシンベンジルエ−テルトシレ−ト（ＴｏｓＯＨ・Ｈ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ）を１５ｍｌのテトラヒドロフラン中に懸濁し、攪拌しながら０．４ｍｌ（３ミリモル）のトリエチルアミンを添加する。５分内に１．２８ｇ（２ミリモル）のＮ−カルボベンゾキシアラニル−（γ−ベンジル）グルタミル−（β−ベンジル）アスパルテ−ト（ＩＩＩ）及び０．２７ｇ（２ミリモル）のＮ−カルボベンゾトリアゾを添加して、その混合物を０℃まで冷却する。０℃まで冷却した０．４２ｇ（２ミリモル）のＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド溶液を５ｍｌのテトラヒドロフラン中に添加する。混合物をこの温度で２時間攪拌して、室温で一晩混合させておく。ジシクロヘキシルウレアの沈殿を濾取して、溶媒を真空中で除去し、残渣を３０ｍｌのエチルアセテ−ト中に溶解する。生成物を１Ｎ 塩酸溶液、水、５％ 重炭酸ナトリウム、水、１Ｎ 塩酸溶液、水中で洗浄して、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させる。その溶媒を真空中で除去して、生成物をエチルアセテ−ト／ヘキサン系で結晶化させる。収量は１．３０ｇ（８２％）である。Ｔｍｌ＝１４６−１４８℃。Ｒｆ＝０．７５（ベンゼン−アセトン、２：１）。
【００２２】
５．Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−ＯＨ（ＩＶ）、アラニル−グルタミル−アスパルチル−グリシンン
１．２５ｇのＮ−カルボベンゾキシアラニル−（γ−ベンジル）グルタミル−（β−ベンジル）アスパルチルグリシン（ＩＩＩ）のベンジルエステルをメタノ−ル／水／酢酸系（３：１：１）中においてＰｄ／Ｃ触媒上で水素付加する。非ブロッキング反応が完全であることは、ベンゼン／アセトン（２：１）及びアセトニトリル／酢酸／水（５：１：３）系においてＴＬＣによりモニタ−される。その反応が終了すると、触媒を濾取し、濾液を真空中で除去して、残渣を水／メタノ−ル系中で結晶化させる。生成物を真空中、ＫＯＨ上で乾燥させる。収量は５２０ｍｇ（９５％）である。Ｒｆ＝０．７３（アセトニトリル−酢酸−水、５：１：３）。
【００２３】
精製に対して、その調製品の３９０ｍｇを４ｍｌの０．０１％ トリフルオロ酢酸中に溶解して、５０ｘ２５０ｍｍ（Ｄｉａｓｏｒｂ−１３０−Ｃ１６Ｔ、７μ）の長さの逆層カラム上でＨＰＬＣを実施する。使用したクロマトグラフは、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ、１２６ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｍｏｄｕｌｅ、１６８ Ｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｍｏｄｕｌｅである。クロマトグラフィ−条件は、Ａ：０．１％ ＴＦＡ；Ｂ：５０％ ＭｅＣＮ／０．１％ ＴＦＡ、グラジエント、８０分でＢ０→５％である。サンプル容量は５ｍｌであり、１９０−６００ｎｍ、流速１０ｍｌ／分でスキャンしながら、２１５ｎｍで検出した。フラクションを５４．０−６６．０分内で選択する。溶媒を真空中、４０℃を超えない温度で除去する。１０ｍｌの１０％ 酢酸溶液を用いて複数回（５回）、除去を繰り返す。残渣を最終的に２０ｍｌの純水中で溶解し、凍結乾燥する。精製された調製物２９０ｍｇが無臭の白色アモルファス粉末形態で得られる。
【００２４】
アセテ−トの形態で得られたペプチドを、ＩＲＡアニオン樹脂（ａｎｉｏｎｉｔｅ）又は（ＯＨ−）形態のその類似物で処置することにより遊離形態に変換した。その後、それぞれ等量の酸（塩酸、シュウ酸）を添加して、アミノ酸基の塩を得る。得られた水溶性溶液を凍結乾燥して、最終生成物として分析する。
カルボキシル基に相当する塩を得るために、遊離したテトラペプチドに、相当する金属水酸化物（ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｚｎ（ＯＨ）２、ＬｉＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）２、Ｍｇ（ＯＨ）２、ＮＨ４ＯＨ）の計算された量の水溶液を加える。トリエチルアンモニウム塩を得るために、その工程が同様に実施され、トリエチルアミンがその塩基として使用される。
【００２５】
６．最終生成物の分析
・活性ベ−ス（ペプチド）の含有率は、Ｓｕｐｅｌｃｏ ＬＣ−１８−ＤＢカラム、４．６ｘ２５０ｎｍ、グラジエント、ＬＣ−１８−ＤＢ上でのＨＰＬＣにより決定される。Ａ：０．１％ ＴＦＡ；Ｂ：５０％ ＭｅＣＮ／０．１％ ＴＦＡ、グラジエント、２０分でＢ０→２０％である。流速は１ｍｌ／分である。１９０−６００ｎｍでスキャンしながら２２０ｎｍで検出し、サンプル容量は２０μｌである。ペプチド含有率は、９８．４５％である。
・１２５℃で６Ｎ ＨＣｌ中での加水分解の２４時間後、アナライザ−上でアミノ酸含有率を決定する。
【表４】
2004501932.tif 000006
・ＴＬＣ：単一、Ｒｆ＝０．７３（アセトニトリル−酢酸−水、５：１：３）。Ｓｏｒｂｆｉｌプレ−ト、８−１２μｍシリカゲル、塩素／ベンジジン中で展開する。
・含水率：５％（重量測定により、乾燥による質量の減少により１００℃で−２０ｍｇとなる）
・０．００１％溶液のｐＨ：４．３７（電位差滴定により）
・特定旋回度：［α］Ｄ２２：−３２°（ｃ＝１、Ｈ２Ｏ）
「Ｐｏｌａｍａｔ Ａ」、Ｃａｒ Ｚｅｉβ Ｊｅｎａ
【００２６】
活性ベ−スとして当該テトラペプチドを含有する注射形態の医薬品ペプチド基質は、次に示す方法で得る：上記の方法により得られたテトラペプチドを０．９％ 等張塩化ナトリウム溶液中に溶解する。１つのバイアルは、１ｍｌのテトラペプチド溶液を１０μｇ／ｍｌの濃度で含有する。
【００２７】
実施例３．脳皮質下構造の外植片の成長に対するＡｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドの効果
ニワトリの１０−１１日齢胚の脳皮質下構造からなる６９個のフラグメント上で実験を実施した。培養用の栄養培地は、３５％ イ−グル溶液、２５％ ウシ胎仔血清、３５％ ハンクス溶液、５％ ニワトリ胚抽出物からなる。該培地には、グルコ−ス（０．６％）、インシュリン（０．５ ｕｎｉｔ／ｍｌ）、ペニシリン（１００ ｕｎｉｔ／ｍｌ）、グルタミン（２ｍＭ）も添加した。脳皮質下構造フラグメントをこの培地中に置いて、サ−モスタット内のペトリ皿中で４８時間、３６．７℃で培養した。試験培地にＡｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチド及び２、１０、２０、５０、１００、２００、４００ｎｇ／ｍｌの濃度のエピ−タラミンを添加した。面積指標（ｓｑｕａｒｅ ｉｎｄｅｘ、ＳＩ）は生理活性の基準を考慮した。それは成長域を含む外植片の総面積と皮質下構造フラグメントの最初の面積と間の比とみなした。ＳＩの平均値の間の有意差は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ判定により評価した。ＳＩ値は％で表し、コントロ−ルのＳＩ値を１００％とみなした。
コントロ−ルの脳皮質下構造の外植片の成長域としては、短い神経突起、遊走性グリア、及び線維芽様細胞が挙げられる。
当該基質の脳皮質構造フラグメントに与える直接的な影響を以下に示す実験系で検定した。
【００２８】
ニワトリ胚皮質下構造の外植片の栄養培地に、様々な濃度のエピ−タラミンに添加した。培養３日目に、２０及び２００ｎｇ／ｍｌの濃度において外植片のＳＩにおいてコントロ−ルのＳＩ値に比べて有意に上昇（それぞれ２０％及び２６％まで）が示された。図１は、脳皮質下構造の外植片の成長に対するＡｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドの効果を示している。他のエピ−タラミン濃度においては、皮質下構造の有意なＳＩ値は示されなかった。試験外植片のＳＩがコントロ−ルフラグメントのＳＩよりも２４％高くなったときに、Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙテトラペプチドを１００ｎｇ／ｍｌの濃度で適用することにより、脳皮質下構造外植片の成長の顕著な活性化が示された。
【００２９】
長期間（最大７日まで）の培養による皮質下構造外植片の検定により、同じ濃度で類似の栄養活性化効果が示された。場合によっては、長期培養による神経繊維の退縮のために、外植片のＳＩに統計的に有意差のない減少が示された。
【００３０】
実施例４．Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏテトラペプチドの合成
１．製品名：Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−プロリン
２．構造式：Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＯＨ
【化２】
2004501932.tif 000007
３．イオン対なしの分子式：Ｃ１７Ｈ２６Ｎ４Ｏ９
４．イオン対なしの分子量：４３０．４１
５．イオン対：アセテ−ト
６．外観：無臭の白色アモルファス粉末
７．合成法：ペプチドをスキ−ムＢにより溶液中で従来の合成法から得る：
【表５】
2004501932.tif 000008
【００３１】
Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドを溶媒として使用した。アスパラギン酸を添加するとき、α−ＣＯＯＨ基の保護には、トリエチルアミンを用いた塩化を適用した。ＢＯＣ−保護基はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液により、Ｚ−保護基は触媒作用的な水素付加により除去した。生成物を抽出して、逆層カラム上での分取用高速液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）法により精製した。
最終生成物の特性は以下に示す通りである：
・アミノ酸分析
【表６】
2004501932.tif 000009
・ペプチド含有率：９８．５６％（ＨＰＬＣ、２００ｎｍにより）；
・薄層クロマトグラフィ−（ＴＬＣ）−単一、Ｒｆ＝０．６７（アセトニトリル−酢酸−水、５：１：３）；
・含水率：７％；
・０．００１％溶液のｐＨ：４．２４；
・特定旋回度：［α］Ｄ２５：−７８．９°（ｃ＝１．９０、Ｈ２Ｏ）、「Ｐｏｌａｍａｔ Ａ」、Ｃａｒ Ｚｅｉβ Ｊｅｎａ
【００３２】
実施例５．大脳皮質の外植片に対するＡｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏテトラペプチドの効果
ニワトリの１０−１１日齢胚の大脳皮質外植片からなる７３個のフラグメント上で実験を実施した。培養用の栄養培地は、３５％ イ−グル溶液、２５％ ウシ胎仔血清、３５％ ハンクス溶液、５％ ニワトリ胚抽出物からなる。培地には、グルコ−ス（０．６％）、インシュリン（０．５ ｕｎｉｔ／ｍｌ）、ペニシリン（１００ ｕｎｉｔ／ｍｌ）、グルタミン（２ｍＭ）も添加した。大脳皮質フラグメントをこの培地中に置いて、サ−モスタット内のペトリ皿中で４８時間、３６．７℃で培養した。試験培地にＡｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏテトラペプチド及び２、１０、２０、５０、１００、２００、４００ｎｇ／ｍｌの濃度のコ−テクシンを添加した。面積指標（ＳＩ）は生理活性の基準を考慮した。それは成長域を含む外植片の総面積と大脳皮質フラグメントの最初の面積と間の比とみなした。ＳＩの平均値の間の有意差は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ判定により評価した。ＳＩ値は％で表し、コントロ−ルのＳＩ値を１００％とみなした。
コントロ−ルの大脳皮質の外植片の成長域としては、短い神経突起、遊走性グリア、及び線維芽様細胞が挙げられる。
当該基質の大脳皮質フラグメントに与える直接的な影響を以下に示す実験系で検定した。
【００３３】
ニワトリ胚皮質下構造の外植片の栄養培地を様々な濃度のコ−テクシンに添加した。培養３日目に、１００ｎｇ／ｍｌの濃度において外植片のＳＩがコントロ−ルのＳＩ値に比べて３０±２％まで有意に上昇することが示された。図２は、Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏテトラペプチド脳皮質下構造外植片の成長に与える影響を示している。他のコ−テクシン濃度において皮質下構造の有意なＳＩ値は表われなかった。実験的外植片のＳＩがコントロ−ルのフラグメントよりも４０±７％まで高くなったときに２０ｎｇ／ｍｌの濃度でＡｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏテトラペプチド適用することにより、脳皮質下構造外植片の成長の明白な活性化が示された。
【００３４】
長期間（最大７日まで）の培養による大脳皮質外植片の検定により、同じ濃度で類似の栄養活性化効果が示された。場合によっては、長期培養による神経繊維の退縮のために、外植片のＳＩに統計的に有意差のない減少が示された。
【００３５】
従って、当該皮質の組織に関しては、コ−テクシンと比較してＡｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏテトラペプチドの有効濃度の閾値は低くなることが示された。例えば、コ−テクシンは、１００ｎｇ／ｍｌの濃度で培養された大脳皮質フラグメントを活性化させる一方、テトラペプチドでは２０ｎｇ／ｍｌの濃度で活性化させた。このことより、大脳皮質ニュ−ロンに対するＡｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏテトラペプチドの作用がより明白で直接的であることが明らかになる。
実施された試験及び実験により、提示された方法により得られるペプチド及びそれをベ−スにした医薬組成物は、組織特異的な活性を有する。すなわち、それらは特定の組織だけに影響を及ぼし、そのアミノ酸成組成はそれらの獲得のベ−スとして機能する。
【００３６】
実施例６．Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａテトラペプチドの合成
１．製品名：リシル−グルタミル−アスパルチル−アラニン
２．構造式：Ｈ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−ＯＨ
【化３】
2004501932.tif 000010
３．イオン対なしの分子式：Ｃ１８Ｈ３１Ｎ５Ｏ９
４．イオン対なしの分子量：４６１．４８
５．イオン対：アセテ−ト
６．外観：無臭の白色アモルファス粉末
７．合成法：ペプチドを次に示すスキ−ムにより溶液中で従来の合成法から得る：
【表７】
2004501932.tif 000011
【００３７】
Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドを溶媒として使用した。アスパラギン酸を添加するとき、α−ＣＯＯＨ基の保護には、トリエチルアミンを用いた塩化を適用した。ＢＯＣ−保護基はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液により、Ｚ−保護基は触媒作用的に水素付加により除去した。生成物を抽出して、逆層カラム上での分取用高速液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）法により精製した。
最終生成物の特性は以下に示す通りである：
・アミノ酸分析
【表８】
2004501932.tif 000012
・ペプチド含有率：９８．７５％（ＨＰＬＣ、２２０ｎｍにより）；
・薄層クロマトグラフィ−（ＴＬＣ）−単一、Ｒｆ＝０．７１（アセトニトリル−水、１：１）；
・含水率：７％；
・０．００１％溶液のｐＨ：５．５４；
・特定旋回度：［α］Ｄ２３：−２８．０°（ｃ＝１．０；Ｈ２Ｏ）、「Ｐｏｌａｍａｔ Ａ」、Ｃａｒ Ｚｅｉβ Ｊｅｎａ
【００３８】
合成は、実施例２に従って実施して、分子のＣ末端にはアラニンのベンジルエ−テルを使用し、分子のＮ末端にはＮ−ベンジルオキシカルボニルアラニンのオキシスクシンイミドエステルの代わりにＮα，Ｎβ−ジベンジルオキシカルボニルリジンのオキシスクシンイミドエステルを使用することにより区別される。
医薬組成物は、実施例２に従って得られる。
【００３９】
実施例７．様々な齢数のラットの単層培養肝細胞におけるタンパク質合成度に対するＬｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａテトラペプチドの効果
タンパク質合成度を、４、８、及び１８月齢のラットの単層培養肝細胞において検定した。
肝細胞を単離するために、ラット肝を培地１９９中で０．５ｍＭ ＥＤＴＡを添加したカルシウムフリ−のハンクス溶液、及びその後０．０５％ コラゲナ−ゼ溶液を用いて貫流した。その細胞懸濁液を濾取して遠心分離した。５ｘ１０５の濃度の肝細胞懸濁液をペトリ皿に導入し、その底にコラ−ゲン被覆したガラスを表面に付した。使用した培地１９９はウシ血清を含有していないが、０．２ｍｇ／ｍｌ アルブミン及び５μｇ／ｍｌ インシュリンを加えた。底をガラスで被覆した当該皿をサ−モスタット中に３７℃で配置し、通気してＣＯ２を加えた。２時間で細胞が接着したガラスを洗浄してその培地を同じものに交換した。２４時間後で培地を洗浄後、その培地におけるタンパク質合成を検定した。２４時間以内に、高密度に充填した肝細胞を有する単層培地を、上述の特定濃度で細胞懸濁液にした。
【００４０】
タンパク質合成は、同じ培地内にある標識していないロイシンを標準誤差とみなして［３Ｈ］ロイシンの含量により評価した。適用したロイシンのモル活性は、１５０Ｃｉ／ｍＭである。標識化したロイシンと１０分間インキュベ−ションした。インキュベ−ション後、その標識化したロイシン含有培地を培地で洗浄して、冷却した（４℃）硫酸で９０分間処置してロイシンを含んでいないものを単離した。同じ培地をエチルアルコ−ルで濯ぎ、その後ハイアミン（Ｈｙａｍｉｎｅ）を用いてタンパク質を溶解した。シンチレ−タ−に相当するものを添加後、誘導された遊離の細胞内ロイシン及び細胞タンパク質（ハイアミンフラクション中）の放射活性を、放射活性カウンタ−ＳＬ−３０上で測定した。
【００４１】
タンパク質合成度は、次の式により計算した：
Ｉｃｏｒｒ＝ＩｉｘＰａｖ／Ｐｉ（ｃｐｍ）、で式中、
Ｉｃｏｒｒ−フリ−のロイシンの誘導を標準誤差とみなしたロイシン含量、Ｉｉ−ｉ−培地に対して測定されたタンパク質の放射活性、Ｐａｖ−タンパク質及びこの実験において試験された培地に対する誘導の平均放射活性、Ｐｉ−タンパク質及び同じ培地の誘導の総放射活性。
【００４２】
肝細胞培地を０．００５μｇ／ｍｌ Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａテトラペプチドと一緒に４時間インキュベ−トした。
図３（ａ、ｂ、ｃ）は、様々な齢数のラットの単層培養肝細胞におけるタンパク質合成度に対するＬｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａテトラペプチドの効果を示している。
肝細胞培地のタンパク質合成量は、加齢とともに減少することが見いだされた（図３ａ、ｂ、ｃ）。Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａテトラペプチドを該培地へ添加することにより、様々な齢数のラットの肝細胞において、タンパク質合成度は上昇した。それにより、齢数の高い動物において最大の効果が見られた。更に、合成の上昇幅は齢数の高いラットの肝細胞において著しく増大し、これは、細胞集団活性の同調化の上昇度についての結果とすることが可能である（図３ａ、ｂ、ｃ）。
【００４３】
実施例８．肝臓の外植片の成長に対するＬｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａテトラペプチドの効果
ニワトリの１０−１１日齢胚の肝臓からなる５３個のフラグメント上で実験を実施した。培養用の栄養培地は、３５％ イ−グル溶液、２５％ ウシ胎仔血清、３５％ ハンクス溶液、５％ ニワトリ胚抽出物からなる。培地には、グルコ−ス（０．６％）、インシュリン（０．５ ｕｎｉｔ／ｍｌ）、ペニシリン（１００ ｕｎｉｔ／ｍｌ）、グルタミン（２ｍＭ）も添加される。肝臓のフラグメントをこの培地中に置いて、サ−モスタット内のペトリ皿中で４８時間、３６．７℃で培養する。試験培地にＬｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａテトラペプチドを２、１０、２０、５０、１００、２００、４００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加する。面積指標（ＳＩ）は生理活性の基準を考慮し、肝臓フラグメントの最初の面積に対する成長域を含む外植片の総面積の相関関係として計算する。ＳＩ値は％で表し、コントロ−ルのＳＩ値を１００％とみなす。
図４は、肝臓の外植片の成長に対するＬｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａテトラペプチドの効果を示している。
【００４４】
培養２４時間で、コラ−ゲン被覆上の外植片が平面状になった。増殖及び遊走細胞がその外植片の周囲に沿って移動し始めた。培養３日目に２０ｎｇ／ｍｌの濃度のテトラペプチドにより、外植片のＳＩにおいてコントロ−ル値に比べて２４％の有意な上昇が見られた（図４）。更に長期間の肝臓外植片の培養の場合には（最大７日まで）、同じ濃度で当該テトラペプチドの類似の活性効果が示された。
その結果、Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａテトラペプチドは、外植成長活性に示される肝臓組織に対する組織特異的な効果を示した。
【００４５】
実施した試験及び実験系により、以下のように結論付けることが可能である：請求項に記載の方法により得られたペプチド及びこれらのペプチド又はその塩を活性のベ−スとして含有する医薬組成物は、組織特異的な活性を有する。すなわち、それらは特定の組織だけに影響を及ぼし、そのアミノ酸成組成はそれらの獲得のベ−スとして機能する。更に種々の臓器及び組織の機能を正常化して、本発明の請求項に記載の方法により得られる組織特異的な活性を有するペプチドを含有する医薬品を創り出すことが可能となる。
【００４６】
参照文献
１．ロシア連邦共和国特許第１１１２６０６号「Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ａｎ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｈｙｍｕｓ」１９８２年
２．ロシア連邦共和国特許第９４４１９１号「Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ａ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｐｏｓｓｅｓｓｉｎｇ ａｎ ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒ ｅｆｆｅｃｔ」１９８０年
３．ロシア連邦共和国特許第１４１７２４４号「Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ａ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｒｅｓｔｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ」１９８６年
４．ロシア連邦共和国特許第２１０４７０２号「Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ｒａｗ ｍａｔｅｒｉａｌ ｏｆ ａ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｎｏｒｍａｌｉｓｉｎｇ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ， ａ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」１９９６年
５．ロシア連邦共和国特許第２０７３５１８号「Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｒｅｓｔｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｔｉｎａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ」１９９３年
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１３．Ｐｉｇａｒｅｖａ Ｎ． Ｖ．， Ｋａｌｉｎｉｎ Ｎ． Ｍ．， Ｓｉｍｂｉｒｔｓｅｖ Ａ． Ｓ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ＜＜ｂｅｓｔｉｍ＞＞ ／／ Ｍｅｄｉｃａｌ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． −１９９９．− Ｖｏｌ． １， Ｎｏ． ３−４．− １２７ｐ．
１４．Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ Ｄ．， Ａｈａｒｏｎｉ Ｒ．， Ａｒｎｏｎ Ｒ．， Ｓｅｌａ Ｍ． Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｍｙｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｐ １ ／／ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．− １９８８．− Ｖｏｌ． ８５， Ｎｏ． ２４．− ｐｐ．９７２４−９７２８．
【図１】
2004501932.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
2004501932.tif 000016
【国際公開パンフレット】
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2004501932.tif 000039
2004501932.tif 000040
2004501932.tif 000041
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004501932.tif 000042
【国際調査報告】
2004501932.tif 000043
2004501932.tif 000044
2004501932.tif 000045