(57)【要約】本発明は、緑色植物における絹（複数）および絹様タンパク質（ＳＬＰ’ｓ）の産生方法を提供する。ＳＬＰ’ｓの発現は、緑色植物の種子および葉組織の両方において達成される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）以下の構造：
Ｐ−ＳＬＰ−Ｔ
式中、Ｐは絹様タンパク質遺伝子の発現を駆動するのに適切なプロモーターであり；
ＳＬＰは成熟絹様タンパク質をコードする導入遺伝子であり；そしてＴは５’ターミネーターであり；
式中、Ｐ、ＳＬＰおよびＴのそれぞれはカセットの発現によって絹様タンパク質の翻訳が生じるように操作可能に連結されている、
を有するＳＬＰ発現カセットを含有する緑色植物を提供し、
ｂ）該導入遺伝子が発現され、そして絹様タンパク質が産生される条件下で該緑色植物を生育し、
ｃ）任意に該絹様タンパク質を回収する
ことを含むことを特徴とする、緑色植物において絹様タンパク質を生産する方法。
【請求項２】
プロモーターは植物構成および植物組織特異的プロモーターからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
構成プロモーターは、ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、オクトピンシンターゼプロモーター、リブロース１，５ビスリン酸カルボキシラーゼプロモーター、Ａｄｈ１に基づくｐＥｍｕ、Ａｃｔ１、ＳＡＭシンターゼプロモーター、およびＵｂｉプロモーターならびにクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質からなる群より選択されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
組織特異的プロモーターは、ナピン、クルシフェリン、β−コングリシニン、ファセオリン、ゼイン、オレオシン、アシルキャリヤータンパク質、ステアロイルＡＣＰ不飽和化酵素、脂肪酸不飽和化酵素、グリシニン、Ｂｃｅ４、ビシリン、およびパタチンからなる群より選択されたタンパク質をコードする遺伝子から単離されるプロモーターであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
該導入遺伝子は、カイコおよびアメリカジョロウグモ由来の絹様タンパク質を発現することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
絹様タンパク質は、一般式：
［（Ａ）ｎ−（Ｅ）ｑ−（Ｓ）ｑ−（Ｘ）ｐ−（Ｅ）ｑ−（Ｓ）ｑ］ｉ
式中、ＡまたはＥは、少なくとも５５％のＧｌｙを有する約１０〜２５アミノ酸の異なる非結晶ソフトセグメントであり；
Ｓは少なくとも３３％のＡｌａ、および５０％のＧｌｙを有する約６〜１２アミノ酸の半結晶セグメントであり；
Ｘは少なくとも３３％のＡｌａ、および５０％のＧｌｙを有する約６〜１２アミノ酸の結晶ハードセグメントであり；そして
式中、ｎ＝２、４、８、１６、３２、６４、または１２８；
ｑ＝０、１、２、４、８、１６、３２、６４、または１２８；
ｐ＝２、４、８、１６、３２、６４、または１２８；
ｉ＝１〜１２８であり；そして、
式中、ｐ≧ｎまたはｑである、
を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
［（Ａ）４−（Ｘ）８］８、［（Ａ）４−（Ｘ）８−（Ｓ）］８、［（Ａ）４−（Ｘ）８−（Ｅ）］８、［（Ａ）８−（Ｘ）８］８、［（Ａ）４−（Ｓ）−（Ｘ）８］８、［（Ａ）４−（Ｓ）２−（Ｘ）８］８、［（Ａ）４−（Ｅ）−（Ｘ）８−（Ｅ）］８、［（Ａ）４−（Ｅ）−（Ｘ）８］８、［（Ａ）４−（Ｓ）−（Ｘ）８−（Ｅ）］８、および［（Ａ）４−（Ｓ）２−（Ｘ）８−（Ｅ）］８からなる群より選択された式を有することを特徴とする、請求項６に記載の絹様タンパク質。
【請求項８】
Ａ＝ＳＧＧＡＧＧＡＧＧ；
Ｅ＝ＧＰＧＱＱＧＰＧＧＹ；
Ｓ＝ＧＡＧＡＧＹ；および
Ｘ＝ＳＧＡＧＡＧであることを特徴とする、請求項６に記載の絹様タンパク質。
【請求項９】
一般式：
［ＡＣＧＱＧＧＹＧＧＬＧＸＱＧＡＧＲＧＧＬＧＧＱＧＡＧＡｎＧＧ］ｚ
式中、Ｘ＝Ｓ、ＧまたはＮ；ｎ＝０〜７およびｚ＝１〜７５であり、そして、式中、ｚの値は変異タンパク質における反復数を決定し、そして、ここで、式は：
（ａ）ｎ＝０のとき、ＡＧＲＧＧＬＧＧＱＧＡＧＡｎＧＧを包含する配列が欠失される；
（ｂ）ｎの数値で制限されるポリアラニン配列以外の欠失は整数倍の３連続残基を包含する；
（ｃ）任意の反復におけるＧＹＧの欠失は同じ反復におけるＧＲＧの欠失を伴う；および
（ｄ）第１の反復、ここでｎ＝０、が欠失される場合、第１の反復は、第２の反復、ここでｎ＝６、の前に配置される；
からなる群より選択された変体を包含し、そして、
ここで、全長タンパク質は１つの遺伝子または複数の遺伝子によってコードされ、そしてここで、該遺伝子または複数の遺伝子はアメリカジョロウグモのゲノムに対し内因性ではないことを特徴とする、クモ絹変異体である請求項６に記載の全長絹様タンパク質。
【請求項１０】
絹様タンパク質は約０．１％〜約９．２％のレベルで発現されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
絹様タンパク質は葉および種子組織において発現されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
緑色植物は単子葉植物であることを特徴とすることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
緑色植物はトウモロコシ、小麦、大麦、カラスムギ、モロコシ、イネ、ライムギ、シバおよびバナナからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
緑色植物は双子葉植物であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
緑色植物は、ダイズ、アブラナ、ヒマワリ、ワタ、タバコ、アルファルファ、アラビドプシス、テンサイ、サトウキビ、セイヨウアブラナ、キビ、マメ、エンドウ、アマ、および飼草からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
一般式：
［（Ａ）ｎ−（Ｅ）ｑ−（Ｓ）ｑ−（Ｘ）ｐ−（Ｅ）ｑ−（Ｓ）ｑ］ｉ
式中、ＡまたはＥは、少なくとも５５％のＧｌｙを有する約１０〜２５アミノ酸の異なる非結晶ソフトセグメントであり；
Ｓは少なくとも３３％のＡｌａ、および５０％のＧｌｙを有する約６〜１２アミノ酸の半結晶セグメントであり；
Ｘは少なくとも３３％のＡｌａ、および５０％のＧｌｙを有する約６〜１２アミノ酸の結晶ハードセグメントであり；そして
式中、ｎ＝２、４、８、１６、３２、６４、１２８；
ｑ＝０、１、２、４、８、１６、３２、６４、１２８；
ｐ＝２、４、８、１６、３２、６４、１２８；
ｉ＝１〜１２８であり；そして、
式中、ｐ≧ｎまたはｑである、
を有することを特徴とする、絹様タンパク質を発現する緑色植物。
【請求項１７】
絹様タンパク質は、［（Ａ）４−（Ｘ）８］８、［（Ａ）４−（Ｘ）８−（Ｓ）］８、［（Ａ）４−（Ｘ）８−（Ｅ）］８、［（Ａ）８−（Ｘ）８］８、［（Ａ）４−（Ｓ）−（Ｘ）８］８、［（Ａ）４−（Ｓ）２−（Ｘ）８］８、［（Ａ）４−（Ｅ）−（Ｘ）８−（Ｅ）］８、［（Ａ）４−（Ｅ）−（Ｘ）８］８、［（Ａ）４−（Ｓ）−（Ｘ）８−（Ｅ）］８、および［（Ａ）４−（Ｓ）２−（Ｘ）８−（Ｅ）］８からなる群より選択される一般式を有することを特徴とする、請求項１６に記載の緑色植物。
【請求項１８】
Ａ＝ＳＧＧＡＧＧＡＧＧ；
Ｅ＝ＧＰＧＱＱＧＰＧＧＹ；
Ｓ＝ＧＡＧＡＧＹ；および
Ｘ＝ＳＧＡＧＡＧであることを特徴とする、請求項１７に記載の緑色植物。
【請求項１９】
絹様タンパク質が、一般式：
［ＡＣＧＱＧＧＹＧＧＬＧＸＱＧＡＧＲＧＧＬＧＧＱＧＡＧＡｎＧＧ］ｚ
を有するクモ絹変異体であり、
式中、Ｘ＝Ｓ、ＧまたはＮ；ｎ＝０〜７およびｚ＝１〜７５であり、ここで、ｚの数値は変異タンパク質における反復数を決定し、そして、ここで、式は：
（ａ）ｎ＝０のとき、ＡＧＲＧＧＬＧＧＱＧＡＧＡｎＧＧを包含する配列が欠失される；
（ｂ）ｎの数値で制限されるポリアラニン配列以外の欠失は整数倍の３連続残基を包含する；
（ｃ）任意の反復におけるＧＹＧの欠失は同じ反復におけるＧＲＧの欠失を伴う；および
（ｄ）第１の反復、ここでｎ＝０、が欠失される場合、第１の反復は、第２の反復、ここでｎ＝６、の前に配置される；
からなる群より選択された変体を包含し、そして、
ここで、全長タンパク質は１つの遺伝子または複数の遺伝子によってコードされ、そしてここで、該遺伝子または複数の遺伝子はアメリカジョロウグモのゲノムに対し内因性ではないことを特徴とする、請求項１８に記載の緑色植物。
【請求項２０】
単子葉植物および双子葉植物からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１６に記載の緑色植物。
【請求項２１】
ダイズ、アブラナ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、小麦、大麦、カラスムギ、モロコシ、イネ、アラビドプシス、テンサイ、サトウキビ、セイヨウアブラナ、キビ、マメ、エンドウ、ライムギ、アマ、シバおよびバナナからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１６に記載の緑色植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、分子生物学および植物遺伝学の領域に関する。より具体的には、本発明は、絹様タンパク質植物発現系を生成するための技術について記載している。
【０００２】
発明の背景
強度および耐久性の両方を損なわずに軽量かつ可撓性である材料ならびに布に対する需要が高まり、弾性、デニール、引張り強度および率などの特性に対してより高い寛容を有する新規の繊維に対する必要性が生じている。より良好な繊維の探索では、天然に産生される繊維であって、そのいくつかは顕著な品質を有する繊維が調査される。それらの繊維の１つは、外部に紡糸された繊維タンパク質分泌物の１群である絹である。
【０００３】
絹は、３０，０００種を超えるクモおよび他の多くの昆虫、特に鱗翅（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）目において産生される（フォエリス（Ｆｏｅｌｉｘ，　Ｒ．　Ｆ．）（１９９２）　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｓｐｉｄｅｒｓ，　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，　ＭＡ　Ｈａｒｖａｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ）。これらのうち、詳細に研究されている絹はほとんどない。飼養化された蚕であるカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ）の繭絹および円形の巣を作るクモであるアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）の引き糸絹は最も特徴付けられている部類である。繭絹および引き糸絹由来の構造タンパク質は、それらの主なアミノ酸配列において相互にかなり異なるが、それらは多くの局面で顕著な類似点を共有する。それらは、極端なグリシンおよびアラニン−リッチタンパク質である。繭絹の構造タンパク質であるフィブロインは４２．９％のグリシンおよび３０％のアラニンを含有する。引き糸絹の主な成分であるスピドロイン１（Ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１）は３７．１％のグリシンおよび２１．１％のアラニンを含有する。それらも高度な反復タンパク質である。フィブロインの重鎖において保存された結晶ドメインおよびスピドロイン１におけるポリアラニンのストレッチは、分子全体を通して多数回反復されている。これらの結晶ドメインは、フィブロインの重鎖において１〜２キロベースごとに認められるより大きな非反復アモルファスドメイン、およびスピドロイン１においてタンデムに認められるより短い反復性ＧＸＧアモルファスドメインに囲まれている。それらはまた、高コピー数の結晶ドメインを有するため、感受性を共有する。繊維を紡ぐ間、結晶反復は、非パラレルβプリーツシートを形成することが可能であるため、絹タンパク質は、強力かつ堅い結晶で強化されたアモルファスの可撓性鎖を有する半結晶繊維になる（カプレンら（Ｋａｐｌａｎ　ｅｔ　ａｌ．）（１９９７）　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｂａｓｅｄ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，　ＭｃＧｒａｔｈ，　Ｋ．，　ａｎｄ　Ｋａｐｌａｎ，　Ｄ．　Ｅｄｓ，　Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，　Ｂｏｓｔｏｎ，　ｐｐ　１０４−１３１）。
【０００４】
蚕からの従来の絹の生産には、桑の葉を増殖し、蚕を育成し、繭を収穫し、そして絹の繊維を処理することが必要である。それには労力および時間を要し、従って、極端に費用が掛かる。縮れに対する傾向および繊維の直径の不規則性など蚕絹には本質的な欠点があるためその応用もさらに制限されている。同様に、クモからの引き糸絹の大量生産は、それぞれのクモから利用可能な量が極少量でしかないため、妥当ではないと思われる。さらに、クモの絹は、任意の所定のクモによって多くの形態で産生される。異なるクモの絹タンパク質は異なる特性を有し、分離が容易でないため、得られる混合物は単一の単離された絹よりも応用範囲が狭い。従って、天然の供給源から商業的量のクモの絹を生産する見込みが実用的なものではなく、代替的生産態様が必要とされている。
【０００５】
分子組換え技術を使用することによって、所望のタンパク質産物を商業的に有用な量で発現させる目的で、外来遺伝子または人工的に合成されたＤＮＡフラグメントを異なる宿主生物に導入することができる。そのような方法では、通常、ＤＮＡの適切なフラグメントをベクター分子に接続し、次いで、形質転換によってレシピエント生物に導入する必要がある。形質転換体は、ベクター上の選択マーカーを使用するか、またはクローン化されたフラグメントを同定するための遺伝子もしくは生化学的選別によって選択される。
【０００６】
宿主細胞における外来遺伝子発現の技術は当該分野において周知でありかつ広範に実施されているが、高い反復単位数を含有する外来性ポリペプチドを形成する繊維の合成は独特な問題を提起する。この種類のタンパク質をコードする遺伝子は、全サイズのタンパク質の代わりに切断型産物を生じる反復配列ために遺伝的不安定を呈する傾向がある。
【０００７】
上記の困難点にもかかわらず、繊維形成タンパク質の発現は当該分野において公知である。フェラリーら（Ｆｅｒｒａｒｉ　ｅｔ　ａｌ．）（米国特許第５，７７０，６９７号）は、絹様タンパク質（ＳＬＰ）およびエラスチン様タンパク質において見出されるような反復オリゴマー単位を有するポリペプチドの合成構造遺伝子による産生のための方法および組成物について開示している。フェラリー（Ｆｅｒｒａｒｉ）のＤＮＡ配列は、少なくとも３つの異なるアミノ酸および合計で４〜３０アミノ酸を含有するオリゴペプチド反復単位（ペプチド内に少なくとも２つの反復単位およびそれぞれの反復単位に少なくとも２つの同一アミノ酸が存在する）を含有するペプチドをコードする。
【０００８】
カイコ（Ｂ．　ｍｏｒｉ）絹タンパク質のクローン化および発現も公知である。オオシマら（Ｏｈｓｈｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．）（Ｐｒｏｃ，　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７４，　５３６３　（１９７７））は、カイコ（Ｂ．　ｍｏｒｉ）の隣接配列を有する絹フィブロイン遺伝子完全配列の大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ）へのクローン化について報告した。ぺティ−サフォンら（Ｐｅｔｔｙ−Ｓａｐｈｏｎ　ｅｔ　ａｌ．）（欧州特許第３２０７０２号）は、大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ）、サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シュードモナス種菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）、紅色非硫黄細菌（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）、バチルス細菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）、およびストレプトマイセス菌（Ｓｔｒｅｐｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．）を含むさまざまな宿主からの絹フィブロインおよび絹セリシンの組換え産生について開示している。
【０００９】
クモの絹タンパク質のクローン化および発現も進行している。スーら（Ｘｕ　ｅｔ　ａｌ．）（Ｐｒｏｃ，　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８７，　７１２０　（１９９０））は、部分ｃＤＮＡクローンに基づいてクモであるアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来の引き糸様タンパク質、スピドロイン１の反復配列の一部の配列の決定について報告している。
【００１０】
ルイスら（Ｌｅｗｉｓ　ｅｔ　ａｌ．）（欧州特許第４５２９２５号）は、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）の（タンパク質フラグメントおよび変異体を含む）クモの絹タンパク質（スピドロイン１ならびに２）形質転換された大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ）からの発現について開示している。
【００１１】
ロンバーディら（米国特許第５，２４５，０１２号）は、アモルファスドメインまたはサブユニット、結晶ドメインまたはサブユニットを含む組換えクモ絹タンパク質であって、ここで、特定の機械構造特性を提供するドメインまたはサブユニットは反復アミノ酸配列を含有するタンパク質の一部を指す、の産生について教示している。
【００１２】
繭絹および引き糸絹のｃＤＮＡ配列決定が最近進んだことによって、生来のタンパク質に対する配列および構造類似性を有する絹様タンパク質（ＳＬＰｓ）の人工遺伝子の合成が可能である。これらの人工遺伝子は、カイコ（Ｂ．　ｍｏｒｉ）由来の天然の繭絹およびアメリカジョロウグモ（Ｎ．　ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来の引き糸絹の配列アレイに類似し、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、酵母（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）、およびパン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの微生物に導入されている。ＳＬＰは、醗酵によりこれらの微生物において産生されている［カペロ（Ｃａｐｐｅｌｌｏ，　Ｊ．）、クリスマン（Ｃｒｉｓｓｍａｎ，　Ｊ．　Ｗ．）（１９９０）　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ　３１：１９３−１９４；カペロら（Ｃａｐｐｅｌｌｏ　ｅｔ　ａｌ．）（１９９０）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｐｒｏｇ．　６：１９８−２０２；フェンストック（Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ）およびアーウィン（Ｉｒｗｉｎ）Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　（１９９７），　４７（１），　２３−３２；　Ｐｒｉｎｃｅ　ｅｔ　ａｌ，　（１９９５）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３４：１０８７９−１０８８５；フェンストック（Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ）およびベドジック（Ｂｅｄｚｙｋ）１９９７，　Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　（１９９７），　４７（１），　３３−３９ならびに権利者の同じＷＯ９４２９４５０］。
【００１３】
植物は、外来遺伝子発現のための好ましい宿主となってきている。多くの組換えタンパク質がトランスジェニック植物で産生されている（フランケンら（Ｆｒａｎｋｅｎ　ｅｔ　ａｌ．）Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　８：４１１−４１６，　（１９９７）；ホワイトラムら（Ｗｈｉｔｅｌａｍ　ｅｔ　ａｌ．）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｇｅｎｅｔ．　Ｅｎｇ．　Ｒｅｖ．　１１：１−２９，　（１９９３））。植物の遺伝子操作は、現代の分子組換え技術と農作物の生産とを組み合わせている。さまざまな絹様および繊維形成タンパク質が微生物系で発現されているが、同様の発現系は植物では開発されていない。チャンら（Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．）は、トランスジェニックタバコ植物におけるエラスチンに基づくタンパク質ポリマーの発現について教示している（チャンら（Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ．　（１９９６），　１６（３−４），　１７４−１７９）。これは植物における反復配列の発現を表しているが、エラスチンポリペプチドは絹様ペプチドにほとんど類似しておらず、従って、この研究に基づいて植物におけるＳＬＰ発現の可能性を予測することはできない。
【００１４】
現在までのところ、組換え絹の発現または植物におけるＳＬＰ産生の報告例はない。このことに対する１つの可能な説明は、絹類およびＳＬＰ’ｓと生来の植物タンパク質との間の顕著な組成的および構造的差異にある。例えば、ＳＬＰタンパク質は、非常なグリシンおよびアラニン−リッチ、高度な反復、および構造において半結晶である。これらは、ほとんどの植物タンパク質において見出される特徴ではない。従って、植物細胞におけるＳＬＰ遺伝子の導入および発現は、多くの困難を提起するかもしれない。例えば、ＳＬＰ遺伝子の反復配列は、植物細胞におけるＤＮＡ欠失および再配列の標的であってもよい。あるいは、グリシンおよびアラニン−リッチＳＬＰの翻訳は、かなり早くから植物細胞のグリシンおよびアラニンならびにｔＲＮＡプールを消耗し得る。最後に、半結晶ＳＬＰの蓄積は、植物のハウスキーピング機構によって認識されそして減損され得る。
【００１５】
絹およびＳＬＰの発現のための上記の方法は、微生物系における産生に有用であるが、植物における絹またはＳＬＰの産生を教示することは成功していない。絹および絹様タンパク質の産生のために植物基盤を使用することには、微生物基盤よりも幾らかの利点がある。例えば、更新可能な供給源として、植物基盤では、必要とするエネルギーおよび材料の消費が微生物法よりもはるかに少ない。同様に、植物基盤では、タンパク質の産生に利用可能なバイオマスが微生物系よりもはるかに大きい。最後に、絹が天然のタンパク質であるという事実より、高レベルの絹の産生は宿主に対して毒性ではないことが示唆される。
【００１６】
従って、解決すべき問題は、商業的に有用な量の合成絹またはＳＬＰを比較的安価で産生する方法を提供することである。出願人らは、植物発現系を使用することにより絹またはＳＬＰを発現および産生させる方法を提供することによって、上記の問題を解決している。
【００１７】
発明の概要
本発明は、ａ）以下の構造：
Ｐ−ＳＬＰ−Ｔ
式中、Ｐは絹様タンパク質遺伝子の発現を駆動するのに適切なプロモーターであり；
ＳＬＰは成熟絹様タンパク質をコードする導入遺伝子であり；そしてＴは５’ターミネーターであり；
式中、Ｐ、ＳＬＰおよびＴのそれぞれはカセットの発現によって絹様タンパク質の翻訳が生じるように操作可能に連結されている、
を有するＳＬＰ発現カセットを含有する緑色植物を提供し、
ｂ）該導入遺伝子が発現され、そして絹様タンパク質が産生される条件下で該緑色植物を生育し、
ｃ）任意に該絹様タンパク質を回収する
ことを含んでなる緑色植物において絹様タンパク質を生産する方法を提供する。
【００１８】
さらに、本発明は、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ）およびアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）から産生される絹に由来する絹様タンパク質を発現する発現カセットを含んでなる植物を提供する。具体的には、本発明の絹および絹様タンパク質は天然であってもまたは改変体であってもよく、そして、一般式：
［（Ａ）ｎ−（Ｅ）ｑ−（Ｓ）ｑ−（Ｘ）ｐ−（Ｅ）ｑ−（Ｓ）ｑ］ｉ
式中、ＡまたはＥは、少なくとも５５％のＧｌｙを有する約１０〜２５アミノ酸の異なる非結晶ソフトセグメントであり；
Ｓは少なくとも３３％のＡｌａ、および５０％のＧｌｙを有する約６〜１２アミノ酸の半結晶セグメントであり；
Ｘは少なくとも３３％のＡｌａ、および５０％のＧｌｙを有する約６〜１２アミノ酸の結晶ハードセグメントであり；そして
式中、ｎ＝２、４、８、１６、３２、６４、または１２８；
ｑ＝０、１、２、４、８、１６、３２、６４、または１２８；
ｐ＝２、４、８、１６、３２、６４、または１２８；
ｉ＝１〜１２８であり；そして、
式中、ｐ≧ｎまたはｑである、を有する。
【００１９】
出願人らは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、以下の生物学的寄託を行った。
【００２０】
受託者の識別符号　　　国際寄託受理番号　　　　　　　　　　　寄託日
ｐＧＹ４０１　　　　ＡＴＣＣ　ＰＴＡ−１９１２　　　２０００年５月２４日
ｐＬＳ３　　　　　　ＡＴＣＣ　ＰＴＡ−１９１１　　　２０００年５月２４日
【００２１】
出願人（ら）は、米国特許法施行規則第１．８２１〜１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則」）に従い、そして世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに実施細則第２０８号および付属書Ｃ）に一致する２９配列を提供している。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用した記号および形式は、米国特許法施行規則第１．８２２に記載の規則に従う。
【００２２】
【表１】
2004511429.tif 000002
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、緑色植物における絹および絹様タンパク質の産生のための方法を提供する。該方法により、これまで天然または微生物供給源から得られなかった絹のより費用効果の高い産生が可能である。本発明の絹および絹様タンパク質は、布に適切な特性を有することができ、あるいは、物質の構築に有用であり得る。例えば、クモ引き糸絹は、２００ｋｓｉを超える張力を有し、ほぼ３５％の弾性を伴うため、ＫＥＶＬＡＲ（登録商標）繊維またはスチールのいずれよりも切断することが困難である。繊維に紡糸する場合、クモ絹は、バルク衣料産業におけるアプリケーションを有し、ならびにロープ、外科用縫合糸、特定の電気構成成分および移植のための生体材料（例えば、人工靭帯または大動脈帯具）などの特定の種類の高強度用途に適用可能であり得る。さらに、これらの繊維は、さまざまなプラスチックおよび／または樹脂と混合して、繊維補強プラスチックおよび／または樹脂製品を調製することができる。
【００２４】
本開示では、多くの用語および省略記号が使用されている。以下の定義を定める。
【００２５】
「オープンリーディングフレーム」は、ＯＲＦと省略する。
【００２６】
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと省略する。
【００２７】
用語「絹様タンパク質」はＳＬＰと省略し、そして天然の絹タンパク質および次の３つの基準を有するそれらの合成類似体を指す：（１）分子のアミノ酸組成はグリシンおよび／またはアラニンで主に占められている；（２）分子全体を通してコンセンサス結晶ドメインが反復して整列している；（３）分子は剪断感受性でありそして半結晶繊維に紡糸することができる。ＳＬＰ’ｓはまた、天然の絹タンパク質の修飾された変異体および上記で規定したそれらの合成類似体である分子も含む。
【００２８】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は互換可能に使用される。
【００２９】
用語「クモ絹変異タンパク質」は、デザインされたタンパク質を指し、そのアミノ酸は、反復配列モチーフおよび既知の天然クモ絹において見出されるその変体に基づく。
【００３０】
用語「ＤＰ−１Ｂ」は、配列番号１に記載のアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）の天然タンパク質１（スピドロイン１）のアミノ酸配列に由来する任意のクモ絹変異体を指す。
【００３１】
本明細書において使用される「単離された核酸フラグメント」は、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであり、任意に、合成、非天然または改変されたヌクレオチド塩基を含む。ＤＮＡのポリマーの形態の単離された核酸フラグメントは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントからなり得る。
【００３２】
「遺伝子」は、コーディング配列の前（５’非コーディング配列）および後（３’非コーディング配列）に調節配列を含む特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを指す。「生来の遺伝子」は、それ自体の調節配列と共に天然に見出されるような遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然には一緒に見出されない調節およびコーディング配列を含んでいる、生来の遺伝子ではないあらゆる遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる起源から由来する調節配列およびコーディング配列、または同じ起源から由来するが、しかし天然に見出されるものとは異なる様式で配列される調節配列およびコーディング配列を含んでいてもよい。「内因性遺伝子」は、生物体のゲノム内の天然の位置にある生来の遺伝子を指す。「外来」遺伝子または「導入遺伝子」は、宿主生物体内に通常は見出されない遺伝子を指すが、しかしこれは遺伝子導入により宿主生物体内に導入される。外来遺伝子は、非生来の生物体内に挿入された生来の遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことができる。「導入遺伝子」は、形質転換操作によりゲノム中に導入された遺伝子である。
【００３３】
「合成遺伝子」は、当業者に既知の手順を使用して化学合成されたオリゴヌクレオチド構成単位から組み立てることができる。これらの構成成分を連結し、アニーリングして、遺伝子セグメントを形成し、次いで、酵素的に組み立てて遺伝子全体を構築する。ＤＮＡの配列に関して「化学合成された」とは、成分ヌクレオチドがインビトロで組み立てられたことを意味する。ＤＮＡの手動化化学合成は、良好に確立された手順を使用して達成してもよく、または自動化化学合成は多くの市販の機械の１つを使用して実施することもできる。従って、ヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適遺伝子発現のために遺伝子を整えて、宿主細胞のコドンの偏りを反映することができる。当業者は、コドンの使用が宿主に好ましいコドンに偏る場合、遺伝子が告げんが成功する可能性を理解している。好適なコドンの決定は、配列情報が利用可能である宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づくことができる。
【００３４】
「コーディング配列」は、特定のアミノ配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な調節配列」は、コーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、内、または下流（３’非コーディング配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定、または関連するコーディング配列の翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列を含んでもよい。
【００３５】
「プロモーター」は、コーディング配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コーディング配列は、プロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、それらの全体が生来の遺伝子から誘導することができるか、または天然に見いだされる異なるプロモーターから誘導される異なるエレメントからなるか、または合成ＤＮＡセグメントを含み得る。当業者であれば、異なるプロモーターは異なる組織もしくは細胞タイプ、または異なる発生段階において、あるいは異なる環境条件に応答して遺伝子の発現を指令することができることを理解する。ほとんどの時期におけるほとんどの細胞タイプにおいて遺伝子を発現させるプロモーターを、通常、「構成プロモーター」と呼ぶ。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全に規定されていないため、異なる長さのＤＮＡフラグメントが同一のプロモーター活性を有することができることがさらに理解される。
【００３６】
「調節されたプロモーター」は、非構成的であるが、時間的および／または空間的に調節された方法で遺伝子発現を指令し、そして、組織特異的かつ誘導性プロモーターの両方を含むプロモーターを指す。該プロモーターは、天然および合成配列ならびに合成および天然の配列の組み合わせであり得る配列を含む。異なるプロモーターは、異なる組織もしくは細胞タイプ、または異なる発生段階において、あるいは異なる環境条件に応答して遺伝子の発現を指令することができる。植物細胞において有用なさまざまなタイプの新規のプロモーターが絶えず発見されており；オクマら（Ｏｋａｍｕｒｏ　ｅｔ　ａｌ．）による編集Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ　１５：１−８２，　１９８９に多くの例を見出すことができる。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全に規定されていないため、異なる長さのＤＮＡフラグメントが同一のプロモーター活性を有することができる。
【００３７】
「組織特異的プロモーター」は、すべての植物細胞においてだけではなく、（葉または種子などの）特定の器官、（胚または子葉などの）特定の組織、または（葉実質または種子貯蔵細胞などの）特定の細胞タイプにおける１つ以上の細胞タイプにおいて発現される調節されたプロモーターを指す。これらはまた、種子または果実の発生、十分に分化した葉、あるいは老化の発生において果実が熟する間の初期もしくは後期胚形成などにおいて時間的に調節されるプロモーターを含む。
【００３８】
用語「相補的」は、相互にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表現するために使用される。例えば、ＤＮＡについて、アデノシンはチミンに相補的であり、そしてシトシンはグアニンに相補的である。
【００３９】
「３’非コーディング配列」は、コーディング配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指し、そしてポリアデニル化認識配列およびｍＲＮＡまたは遺伝子発現に影響することが可能な調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸域の添加に影響することを特徴とする。
【００４０】
用語「操作可能に連結される」は、一方の機能が他方の機能の影響を受けるような単一の核酸フラグメントに対する核酸配列の関連を指す。例えば、プロモーターがコーディング配列の発現に影響することが可能である（即ち、コーディング配列はプロモーターの転写制御下にある）場合、プロモーターはコーディング配列に操作可能に連結される。コーディング配列は、センスまたはアンチセンス方向で調節配列に操作可能に連結することができる。
【００４１】
本明細書で使用される用語「発現」は、本発明の核酸フラグメントに由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すことができる。
【００４２】
「成熟」タンパク質は、翻訳後にプロセシングされたポリペプチド；即ち、主な翻訳産物中に存在する任意のプレまたはプロペプチドが除去されているポリペプチドを指す。
【００４３】
「形質転換」は、遺伝的に安定に遺伝する核酸フラグメントの宿主生物のゲノムへの伝達を指す。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物を「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物と呼ぶ。
【００４４】
用語「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」は、しばしば細胞の中心的代謝の部分ではない遺伝子を担持する染色体外エレメントを指し、通常は、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である。そのようなエレメントは、任意の供給源から誘導される一本鎖あるいは二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの自律的反復配列、ゲノム組込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列で、線状あるいは環状であってもよく、ここで、プロモーターフラグメントおよび適切な３’非翻訳配列を伴う選択された遺伝子産物に対するＤＮＡ配列を細胞に導入することが可能である独特な構築物に、多くのヌクレオチド配列が接続または組換えられる。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含有し、該外来遺伝子に加えて特定の宿細胞の形質転換を可能にするエレメントを有する特定のベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含有し、該外来遺伝子に加えて外来宿主の遺伝子の発現の増強を可能にするエレメントを有する特定のベクターを指す。
【００４５】
本明細書に使用される以下の省略記号は、特定のアミノ酸を同定するために使用される：
【００４６】
【表２】
2004511429.tif 000003
【００４７】
ここで使用する標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローン化技術は当該分野において周知であり、そしてサンブロックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．，　Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｅ．　Ｆ．　ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＮＹ　（１９８９）（以下「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；およびシルハビーら（Ｓｉｌｈａｖｙ，　Ｔ．　Ｊ．，　Ｂｅｎｎａｎ，　Ｍ．　Ｌ．　ａｎｄ　Ｅｎｑｕｉｓｔ，　Ｌ．　Ｗ．）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　Ｇｅｎｅ　Ｆｕｓｉｏｎｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｃｏｌｄ　Ｐｒｅｓｓ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＮＹ　（１９８４）；およびオズベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃ．　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ出版（１９８７）により説明されている。
【００４８】
発現カセット
本発明は、植物における絹様タンパク質の産生方法を提供する。該方法は、プロモーター、絹様タンパク質をコードする導入遺伝子および５’ターミネーター領域を含むＤＮＡ構築物を有する植物発現カセットを提供することによって進行する。導入遺伝子の発現は構成的であってもまたは調節されてもよい。
【００４９】
植物宿主における外来遺伝子の発現を駆動するのに有用なプロモーターは多くあり、そして当該分野において周知である。該プロモーターは本発明のＳＬＰ導入遺伝子を構成的または調節された様式で発現させるのに有用である。構成植物プロモーターは周知である。いくつかの適切なプロモーターとしては、ノパリンシンターゼプロモーター、オクトピンシンターゼプロモーター、ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーター、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼプロモーター、Ａｄｈ１に基づくｐＥｍｕ、Ａｃｔ１、ＳＡＭシンターゼプロモーター、およびＵｂｉプロモーターならびにクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
あるいは、調節された様式でＳＬＰ導入遺伝子を発現させることも所望され得る。ＳＬＰ’ｓの調節された発現は、絹様タンパク質を、組織特異的、発生特異的、または誘導性であるプロモーターの制御下に配置することによって可能である。
【００５１】
幾らかの組織特異的調節された遺伝子および／またはプロモーターは、植物において報告されている。これらには、（ナピン、クルシフェリン、β−コングリシニン、グリシニンおよびファセオリンなどの）種子貯蔵タンパク質、ゼインもしくは（オレオシンなどの）油体タンパク質をコードする遺伝子、または（アシルキャリヤータンパク質、ステアロイルＡＣＰ不飽和化酵素、および脂肪酸不飽和化酵素（ｆａｄ２−１）を含む）脂肪酸生合成に関与する遺伝子、ならびに胚発生中に発現される他の遺伝子（Ｂｃｅ４、例えば、欧州特許第２５５３７８号およびクリドルら（Ｋｒｉｄｌ　ｅｔ　ａｌ．）Ｓｅｅｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　（１９９１）　１：２０９−２１９など）が含まれる。種子特異的発現に特に有用なのは、エンドウビシリンである［クザコら（Ｃｚａｋｏ　ｅｔ　ａｌ．）Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　（１９９２），　２３５（１），　３３−４０］。成熟葉における発現に有用な他のプロモーターは、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来のＳＡＧなどの老化の発生時にスイッチが入るプロモーターである［ガンら（Ｇａｎ　ｅｔ　ａｌ．）サイトキニンの自己調節された産生による葉老化の阻害、Ｓｃｉｅｎｃｅ　（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，　ＤＣ）　（１９９５），　２７０　（５２４４），　１９８６−８］。
【００５２】
果実発生（少なくとも果実の成熟の開始まで）を介して開花時または開花中に発現される果実特異的プロモーターのクラスについては、米国特許第４，９４３，６７４号において考察されており、この開示内容は、本明細書において参考として援用されている。綿繊維において優先的に発現されるｃＤＮＡクローンは単離されている［ジョンら（Ｊｏｈｎ　ｅｔ　ａｌ．）綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ　ｈｉｒｓｕｔｕｍ　Ｌ．）繊維における遺伝子発現：ｍＲＮＡのクローン化、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　（１９９２），　８９　（１３），　５７６９−７３］。果実発生中の分化発現を示すトマト由来のｃＤＮＡが単離され、そして特徴付けられている［マンソンら（Ｍａｎｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．）Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　（１９８５）　２００：３５６−３６１；スラターら（Ｓｌａｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　（１９８５）　５：１３７−１４７］。ポリガラクツロナーゼ遺伝子のプロモーターは、果実の成熟時に活性である。ポリガラクツロナーゼ遺伝子については、米国特許第４，５３５，０６０号（１９８５年８月１３日出願）、米国特許第４，７６９，０６１号（１９８８年９月６日出願）、米国特許第４，８０１，５９０号（１９８９年、１月３１日出願）および米国特許第５，１０７，０６５号（１９９２年４月２１日出願）に記載されており、これらの開示内容は、本明細書において参考として援用されている。
【００５３】
ｐｓｂＡ（光化学系ＩＩの成分の１つ）の成熟プラスミドｍＲＮＡは、果実の発生の後半において最も高いレベルに達するが、これとは対照的に、光化学系ＩおよびＩＩの他の成分に対するプラスミドｍＲＮＡは、果実成熟の発生後、有色体において検出不可能なレベルにまで低下する［ピエチュラら（Ｐｉｅｃｈｕｌｌａ　ｅｔ　ａｌ．）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　（１９８６）　７：３６７−３７６］。最近、トマト花粉［マコーミックら（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ．）Ｔｏｍａｔｏ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（１９８７）　Ａｌａｎ　Ｒ．　Ｌｉｓｓ，　Ｉｎｃ．，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ］および雌ずい［ガッセルら（Ｇａｓｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　（１９８９），　１：１５−２４］相互作用に明らかに関与する遺伝子を提示するｃＤＮＡクローンも単離され、そして特徴付けされている。
【００５４】
組織特異的プロモーターの他の例としては、（例えば、昆虫の咀嚼による）葉損傷後の葉細胞、塊茎（例えば、パタチン遺伝子プロモーター）、および繊維細胞（発生調節繊維細胞タンパク質の例はＥ６である［ジョンら（Ｊｏｈｎ　ｅｔ　ａｌ．）綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ　ｈｉｒｓｕｔｕｍ　Ｌ．）繊維における遺伝子発現：ｍＲＮＡのクローン化、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　（１９９２），　８９　（１３），　５７６９−７３］）における発現を指令するプロモーターが挙げられる。Ｅ６遺伝子は繊維において最も活性であるが、葉、胚珠および花での転写レベルは低い。
【００５５】
終止領域は比較的互換可能であるようであるため、発現カセットで使用される終止領域は、主に便宜的に選択される。使用される終止領域は、転写開始領域と同じ由来であってもよく、目的のＤＮＡ配列と同じ由来であってもよく、または別の起源に由来するものであってもよい。終止領域は天然に存在するものであっても、またはすべてもしくは部分的に合成されたものであってもよい。簡便な終止領域は、オクトピンシンターゼおよびノパリンシンターゼ終止領域などのＡ．　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミド、またはβファセオリンの遺伝子、化学誘導性ｌａｎｔ遺伝子、ｐＩＮ（ハーシーら（Ｈｅｒｓｈｅｙ　ｅｔ　ａｌ．）トウモロコシにおいて置換されたベンゼンスルホンアミドによって誘導されるＲＮＡ種のＤＮＡクローンの単離および特徴付けＰｌａｎｔ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　（１９９１），　１７（４），　６７９−９０；　Ｕ．Ｓ．　Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ．　５，３６４，７８０）
【００５６】
絹またはＳＬＰタンパク質をコードする導入遺伝子は、天然に存在するものであっても、または合成されたものであってもよい。本発明の導入遺伝子は、一般的に、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ）を含む鱗翅（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）目の昆虫およびアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）などの絹産生生物から誘導される。主題ポリペプチドをコードする遺伝子は、一般に、少なくとも約９００ヌクレオチドの長さ、通常、少なくとも１２００ヌクレオチドの長さ、好ましくは少なくとも１５００ヌクレオチドの長さである。主題発明の遺伝子は、一般に、同じアミノ酸配列をコードするＤＮＡの鎖状化したモノマーを含んでなり、ここで、ただ１つの反復単為が存在してホモポリマーを形成し、ここで、異なるアミノ酸単反復単為をコードするすべてまたは一部の２つ以上の異なるモノマーが共に接続して、ブロックもしくはランダムコポリマーをコードする新たなモノマーを形成する。個々のアミノ酸反復単位は、３〜２０アミノ酸（９〜６０ヌクレオチド）、一般に３〜１５アミノ酸（９〜４５ヌクレオチド）、通常は３〜１２アミノ酸（９〜３６ヌクレオチド）、より通常には３〜９アミノ酸（９〜２７ヌクレオチド）を有し、アミノ酸は、通常、同じ単位において少なくとも２回同じアミノ酸が出現し、一般に、少なくとも１つのアミノ酸によって分離されている。場合により、アミノ酸の最少数は４である。モノマー内では、同じアミノ酸反復単位をコードするｄｓＤＮＡは、同じアミノ配列を達成するコドン重複性に依存して、２つ以上のヌクレオチド配列を必要とする。
【００５７】
主題発明の遺伝子は、反復単位の反復、通常、少なくとも２つのブロック、および全領域の反復単位までを含む領域を含む。反復単位のブロックの間には、個々もしくはブロックの他の反復単位、または介在配列が散在してもよい。反復単位は同じ配列を有してもよく、または配列を変動するために特定のアミノ酸についてコドン重複性を使用し、反復単位をコードするために用いる２つ以上の異なる配列が存在してもよい。
【００５８】
絹様タンパク質（ＳＬＰ）遺伝子は、上記の約５〜２５反復単位、より通常的には、約６〜１５反復単位のオリゴマーまたはマルチマーを提供することによって、生成することができる。粘着末端を有することによって、オリゴマーは、鎖状化されて、２つ以上のオリゴマー単位、通常、約５０を超えないオリゴマー単位、より通常的には、約３０を超えないオリゴマー単位、および頻繁には約２５を超えないオリゴマー単位を有するポリマーを提供し得る。
【００５９】
絹およびＳＬＰポリペプチド
本発明は、植物基盤からの発現のためにさまざまな絹および絹様タンパク質を提供する。特に興味深いのは、反復単位としてＳＧＡＧＡＧ（配列番号２）およびＧＡＧＡＧＳ（配列番号３）を有するポリペプチドである。この反復単位は、天然の絹フィブロインタンパク質に見出され、ＧＡＧＡＧ（ＳＧＡＧＡＧ）８ＳＧＡＡＧＹ（配列番号４）として提示され得る。本発明に特に適切なものは、一般式：
［（Ａ）ｎ−（Ｅ）ｑ−（Ｓ）ｑ−（Ｘ）ｐ−（Ｅ）ｑ−（Ｓ）ｑ］ｉ
式中、ＡまたはＥは、少なくとも５５％のＧｌｙを有する約１０〜２５アミノ酸の異なる非結晶ソフトセグメントであり；
Ｓは少なくとも３３％のＡｌａ、および５０％のＧｌｙを有する約６〜１２アミノ酸の半結晶セグメントであり；
Ｘは少なくとも３３％のＡｌａ、および５０％のＧｌｙを有する約６〜１２アミノ酸の結晶ハードセグメントであり；そして
式中、ｎ＝２、４、８、１６、３２、６４、１２８；
ｑ＝０、１、２、４、８、１６、３２、６４、１２８；
ｐ＝２、４、８、１６、３２、６４、１２８；
ｉ＝１〜１２８であり；そして、
式中、ｐ≧ｎまたはｑである、
を有する絹様タンパク質である。
【００６０】
非結晶、半結晶またはハードセグメントの好適な組み合わせとしては、［（Ａ）４−（Ｘ）８］８、［（Ａ）４−（Ｘ）８−（Ｓ）］８、［（Ａ）４−（Ｘ）８−（Ｅ）］８、［（Ａ）８−（Ｘ）８］８、［（Ａ）４−（Ｓ）−（Ｘ）８］８、［（Ａ）４−（Ｓ）２−（Ｘ）８］８、［（Ａ）４−（Ｅ）−（Ｘ）８−（Ｅ）］８、［（Ａ）４−（Ｅ）−（Ｘ）８］８、［（Ａ）４−（Ｓ）−（Ｘ）８−（Ｅ）］８、および［（Ａ）４−（Ｓ）２−（Ｘ）８−（Ｅ）］８が挙げられるが、これらに限定されない。最も好適な組み合わせは、非結晶、半結晶またはハードセグメントが次のように規定されている組み合わせである：Ａ＝ＳＧＧＡＧＧＡＧＧ（配列番号５）、Ｅ＝ＧＰＧＱＱＧＰＧＧＹ（配列番号６）、Ｓ＝ＧＡＧＡＧＹ（配列番号７）、およびＸ＝ＳＧＡＧＡＧ（配列番号２）。
【００６１】
好適な実施態様において、絹またはＳＬＰは、クモ絹であってもよい。植物における発現に適切であり得るさまざまなクモ絹が存在する。これらの多くは、ジョロウグモ属に属する円形の巣を作るクモに由来する。これらのクモの絹は、大膨大（ｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ）、小膨大（ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ）、および鞭毛状絹に分けることができ、それぞれ異なる物性を有する。適切なクモ絹に関する再検討については、例えば、ハヤシら（Ｈａｙａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．）Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｍａｃｒｏｍｏｌ．　（１９９９），　２４（２，３），　２７１−２７５を参照すること。大膨大の絹は最も完全に特徴付けされており、そして、しばしばクモ引き糸絹と呼ばれる。天然のクモ引き糸は、クモの大膨大腺から共紡糸された２つの異なるタンパク質からなる。両引き糸タンパク質のアミノ酸配列は、スーら（Ｘｕ　ｅｔ　ａｌ．）Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ，　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　８７，　７１２０，　（１９９０）およびヒンマンら（Ｈｉｎｍａｎ　ａｎｄ　Ｌｅｗｉｓ）Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６７，　１９３２０　（１９９２）によって開示されており、以後、引き糸タンパク質１（ＤＰ−１）および引き糸タンパク質２（ＤＰ−２）として同定する。本発明では、引き糸タンパク質１（ＤＰ−１）および引き糸タンパク質２（ＤＰ−２）を中心としてクモ絹変異デザインを行った。
【００６２】
クモ絹変異タンパク質のデザインは、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）の天然のクモ絹引き糸タンパク質の繊維形成領域に由来するコンセンサスアミノ酸配列に基づいた。ＤＰ−１のフラグメントのアミノ酸配列は反復性であり、グリシンおよびアラニンに富むが、これまでの既知のいずれのアミノ酸配列にも類似しない。単一の反復の「コンセンサス」配列は、次の通りである：
Ａ　ＧＱＧ　ＧＹＧ　ＧＬＧ　ＸＱＧ　Ａ　ＧＲＧ　ＧＬＧ　ＧＱＧ　Ａ　ＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧ（配列番号８）
式中、ＸはＳ、ＧまたはＮである。
【００６３】
個々の反復は、次のように一般化することができるパターンに従うコンセンサスとは異なる：（１）ポリアラニン配列の長さは０〜７残基変動する。（２）全ポリアラニン配列を欠失させる場合、ＡＧＲＧＧＬＧＧＱＧＡＧＡｎＧＧ（配列番号９）を包含する周囲配列である。（３）ポリアラニン配列以外の欠失は、一般に３連続残基の整数倍を包含する。（４）ＧＹＧの欠失は一般に同じ反復におけるＧＲＧの欠失を伴う。（５）全ポリアラニン配列が欠失される反復は、一般に６アラニン残基を含有する反復の前に配置される。
【００６４】
天然タンパク質の反復コンセンサス配列および個々の反復間の変体のパターンの両方を擬態するＤＰ−１の合成類似体をデザインした。ＤＰ−１の２つの類似体をデザインし、そしてＤＰ−１ＡおよびＤＰ−１Ｂと命名した。ＤＰ−１Ａは配列番号１０に記載のタンデム反復１０１アミノ酸配列からなる。１０１アミノ酸「モノマー」は、上記のパターン（１）〜（５）とは異なる４つの反復を含んでなる。この１０１アミノ酸長ペプチドモノマーは、一連の類似タンパク質の中で１〜１６回反復する。ＤＰ−１Ｂは、ＤＰ−１Ａのモノマー内に４つの反復を再追加することによってデザインした。配列番号１１に示されるこのモノマー配列は、上記の（１）〜（５）のすべての規則性を呈する。さらに、該配列は、ＤＰ−１Ａにはない天然の配列の規則性を呈し、即ち、ＧＹＧおよびＧＲＧの両方が欠失された配列が一般に全ポリアラニン配列を欠き１つの介在配列を伴う反復の前に配置されている。ＤＰ−１Ｂは、さらに伸張されたセグメントによってＤＰ−１Ａよりも天然の配列に緊密に一致する。
【００６５】
従って、本発明の目的は、全長変異タンパク質が以下の式によって規定される、クモ引き糸変異タンパク質を提供することである：
［ＡＣＧＱＧＧＹＧＧＬＧＸＱＧＡＧＲＧＧＬＧＧＱＧＡＧＡｎＧＧ］ｚ（配列番号１２）
式中、Ｘ＝Ｓ、ＧまたはＮ；ｎ＝０〜７およびｚ＝１〜７５であり、そして、式中、ｚの値は変異タンパク質における反復数を決定し、そして、ここで、式は：
（ａ）ｎ＝０のとき、ＡＧＲＧＧＬＧＧＱＧＡＧＡｎＧＧ（配列番号９）を包含する配列が欠失される；
（ｂ）ｎの数値で制限されるポリアラニン配列以外の欠失は整数倍の３連続残基を包含する；
（ｃ）任意の反復におけるＧＹＧの欠失は同じ反復におけるＧＲＧの欠失を伴う；および
（ｄ）第１の反復、ここでｎ＝０、が欠失される場合、第１の反復は、第２の反復、ここでｎ＝６、の前に配置される；
からなる群より選択される変体を包含し、そして、
ここで、全長タンパク質は１つの遺伝子または複数の遺伝子によってコードされ、そしてここで、該遺伝子または複数の遺伝子はアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）のゲノムに対し内因性ではない。
【００６６】
本発明の絹変体およびＳＬＰ’ｓは、天然のタンパク質に共通に関連する物性を有する。例えば、絹およびＳＬＰ’ｓは、約２．８〜約５．２のテナシティ（ｇ／デニール）、約４５，０００〜約８３，０００の張力（ｐｓｉ）および約１３〜約３１の伸び（％）を有することが予想される。
【００６７】
植物宿主
事実上、絹およびＳＬＰ遺伝子の発現を支持する能力があるいずれの植物も本発明の宿主として適切である。適切な植物は、単子葉植物または双子葉植物のいずれでもよく、そして頑健でかつ１年あたり数回の収穫が可能である種類が好ましい。適切な緑色植物としては、ダイズ、アブラナ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、小麦、大麦、カラスムギ、モロコシ、イネ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、テンサイ、サトウキビ、セイヨウアブラナ、キビ、マメ、エンドウ、ライムギ、アマ、シバおよびバナナが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
植物細胞宿主に構築物を導入するためのさまざまな技術が利用可能であり、当業者に公知である。これらの技術には、形質転換因子としてアグロバクテリウムツメファシエンス（Ａ．　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはアグロバクテリウムリゾゲネス（Ａ．　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を用いるＤＮＡの形質転換、エレクトロポレーション、粒子加速法などが含まれる［例えば、欧州特許第２９５９５９号および欧州特許第１３８３４１号を参照のこと］。アグロバクテリウム種（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐｐ．）のＴｉおよびＲｉプラスミドのバイナリータイプベクターを使用するのが特に好ましい。Ｔｉ由来ベクターは、ダイズ、ワタ、セイヨウアブラナ、タバコ、およびイネなどの単子葉植物および双子葉植物を含む広範な高等植物を形質転換する［パシオッティら（Ｐａｃｃｉｏｔｔｉ　ｅｔ　ａｌ．）（１９８５）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３：２４１；ビルネら（Ｂｙｒｎｅ　ｅｔ　ａｌ．）（１９８７）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，　Ｔｉｓｓｕｅ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　８：３；シュクハピンダら（Ｓｕｋｈａｐｉｎｄａ　ｅｔ　ａｌ．）（１９８７）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　８：２０９−２１６；ローズら（Ｌｏｒｚ　ｅｔ　ａｌ．）　（１９８５）　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　１９９：１７８；ポトリクス（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ）（１９８５）　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　１９９：１８３；パークら（Ｐａｒｋ　ｅｔ　ａｌ．）Ｊ．　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌ．　（１９９５），　３８（４），　３６５−７１；ヒエイら（Ｈｉｅｉ　ｅｔ　ａｌ．）Ｐｌａｎｔ　Ｊ．　（１９９４），　６：２７１−２８２］。植物細胞を形質転換するためのＴ−ＤＮＡの使用は、広範な研究が受容しており、そして詳細に記載されている［欧州特許第１２０５１６号；ホエケマ（Ｈｏｅｋｅｍａ）Ｔｈｅ　Ｂｉｎａｒｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ，　Ｏｆｆｓｅｔ−ｄｒｕｋｋｅｒｉｊ　Ｋａｎｔｅｒｓ　Ｂ．Ｖ．；Ａｌｂｌａｓｓｅｒｄａｍ　（１９８５），　Ｃｈａｐｔｅｒ　Ｖ、クナウフら（Ｋｎａｕｆ，　ｅｔ　ａｌ．）アグロバクテリウムによる宿主範囲発現の遺伝解析Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ−Ｐｌａｎｔ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ、ピューラー編（Ｐｕｈｌｅｒ，　Ａ．　ｅｄ．）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　１９８３，　ｐ．　２４５；およびアンら（Ａｎ，　ｅｔ　ａｌ．）ＥＭＢＯ　Ｊ．　（１９８５）　４：２７７−２８４］。植物変導入については、本発明のキメラ遺伝子をバイナリーベクターに挿入することができ、実施例に記載されている。
【００６９】
他の形質転換方法も当業者が利用することができ、外来ＤＮＡ構築物の直接取り込み［欧州特許第２９５９５９号を参照のこと］、エレクトロポレーションの技術［フロムら（Ｆｒｏｍｍ　ｅｔ　ａｌ．）（１９８６）　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３１９：７９１を参照のこと］または核酸構築物を被覆した金属粒子による高速弾道衝撃［クラインら（Ｋｌｉｎｅ　ｅｔ　ａｌ．）（１９８７）　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３２７：７０を参照および米国特許第４，９４５，０５０号を参照のこと］などがある。一旦形質転換すると、細胞は、当業者によって再生することができる。アブラナ［デブロックら（Ｄｅ　Ｂｌｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ．）（１９８９）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　９１：６９４−７０１を参照のこと］、ヒマワリ［エベレットら（Ｅｖｅｒｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ．）（１９８７）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５：１２０１］、ダイズ［マッカベら（ＭｃＣａｂｅ　ｅｔ　ａｌ．）（１９８８）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：９２３；ヒンチーら（Ｈｉｎｃｈｅｅ　ｅｔ　ａｌ．）（１９８８）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：９１５；チーら（Ｃｈｅｅ　ｅｔ　ａｌ．）（１９８９）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　９１：１２１２−１２１８；クリストら（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ　ｅｔ　ａｌ．）（１９８９）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８６：７５００−７５０４；欧州特許第３０１７４９号］、イネ［ヒエイら（Ｈｉｅｉ　ｅｔ　ａｌ．）Ｐｌａｎｔ　Ｊ．　（１９９４），　６：２７１−２８２］、およびトウモロコシ［ゴールデン−カムら（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ　ｅｔ　ａｌ．）（１９９０）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　２：６０３−６１８；フロム（Ｆｒｏｍｍ　ｅｔ　ａｌ．）（１９９０）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：８３３−８３９］などの商業的に重要な穀物に外来遺伝子を形質転換するための最近記載された方法が特に妥当である。
【００７０】
次いで、トランスジェニック細胞の選択ために、トランスジェニック植物細胞を適切な選択培地に配置し、次いで、カルスに成長させる。カルスから苗条を生育させ、そして発根培地で生育させることによって、苗条から苗木を発生させる。さまざまな構築物が、通常、植物細胞の選択マーカーに接続される。簡便に、マーカーは、生物致死剤（特に、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ヒグロマイシン、クロラムフェニコール、除草剤など）に耐性であってもよい。使用される特定のマーカーにより、導入されているＤＮＡを欠く細胞と比較して、形質転換された細胞を選択することが可能である。本発明の転写カセットを含むＤＮＡ構築物の成分は、宿主に対して生来（内因性）または外来（外因性）である配列から調節することができる。「外来」とは、構築物が導入される野生型宿主には配列が認められないことを意味する。異種構築物は、転写開始領域が誘導される遺伝子に対して生来ではない少なくとも１つの領域を含有する。
【００７１】
トランスジェニック細胞および植物に導入遺伝子が存在することを確認するために、当業者に期の方法を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅またはサザンブロット分析を実施することができる。産物の性質に依存し、ウェスタンブロットおよびエンザイムアッセイを含むさまざまな方法で、導入遺伝子の発現産物を検出することができる。タンパク質の発現を定量し、そして異なる植物組織において増幅を検出するための１つの特に有用な方法は、ＧＵＳなどのレポーター遺伝子を使用することである。一旦トランスジェニック植物が得られたら、それらを生育させて、所望の表現型を有する植物組織または部分を産生させることができる。植物組織または植物部分を収穫し、および／または種子を回収することができる。種子は、所望の特徴を有する組織または部分を伴うさらなる植物を生育させるための供給源としての役割を果たし得る。
【００７２】
回収方法
本発明のＳＬＰ’ｓは、さまざまな方法で植物組織から抽出し、そして精製することができる。本発明においては、ｐＨの低下および加熱により、続いて、硫酸アンモニウム分画によって、ホモジナイズした植物組織から生来の植物タンパク質を取り出すことに関与する方法が好適である。簡単に説明すると、種子および葉などの植物組織をホモジナイズすることによって、全可溶性タンパク質をトランスジェニック植物から抽出する。ｐＨ４．７、次いで６０℃での精製によって、生来の植物タンパク質を取り出す。硫酸アンモニウムにより、４０％飽和で得られる上清を分画する。得られるタンパク質は９５％純度のオーダーである。従来のゲルまたはアフィニティークロマトグラフィーによってさらなる精製を達成することができる。
【００７３】
好適な実施態様の説明
本発明では、植物をＳＬＰの産生ための産生基盤として利用する。引き糸絹に基づくＳＬＰは、（１）引き糸絹の構造的特徴は一般にＳＬＰの構造的特徴を提示するため、その発現は植物において他の同様なＳＬＰ遺伝子の運命に反映すべきであること、および（２）引き糸絹の繊維は、次世代の繊維の基準を良好に満たす多くの優れた特性を有することから、特に興味深い。
【００７４】
２つの植物系（アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）およびダイズ胚組織培養物）において本発明を実証した。ＤＰ−１Ｂクモ引き糸変異体の８マーまたは１６マーのいずれかをコードする遺伝子を、３５Ｓ構成プロモーターまたはβ−コングリシン種子特異的プロモーターの制御下にあり、ＮＯＳターミネーター領域を有する発現カセットに操作した。カセットをアクロバクテリウムに形質転換し、次いで、これを使用してアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）に感染させた。８マーおよび１８マーのクモ絹の両方の存在を免疫学的に確認した。タンパク質の決定は、葉組織において８マーでは０．３４％の全可溶性タンパク質（約０．０７％の乾燥重量）および葉組織において１６マーでは０．０３％の全可溶性タンパク質（約０．００６％の乾燥重量）で平均発現レベルを示した。同様に、種子において１．２％の全タンパク質（約０．２４％の乾燥重量）の平均レベルで８マーを発現させ、そして種子において０．７８％の全タンパク質（約０．１６％の乾燥重量）の平均レベルで１６マーを発現させた。
【００７５】
ダイズ胚組織培養の形質転換のために、同じ８マーおよび１６マー構築物を使用した。ダイズは包括的に主要な穀物の１つであり、それ自体効率が高く、低コストなタンパク質合成機械であるため、ダイズにおけるＳＬＰの発現は極めて関心が高い。ダイズ体細胞胚における遺伝子発現はダイズ種子に等価であるため、胚におけるＳＬＰ遺伝子の発現は、ＳＬＰがトランスジェニックダイズ種子で産生され得る可能性を実証した。形質転換は弾道衝撃によって行った。ダイズ胚系における８マーＳＬＰの平均発現レベルは１．０％の全可溶性タンパク質（約０．４％の乾燥重量）であった。
【００７６】
トランスジェニック植物からの産業規模でのＳＬＰ産生には、主として沈殿、濾過、および遠心分離などの簡単な方法に基づく精製スキームが必要である。それらの空間的構造およびアミノ酸組成のため、ＤＰ−１Ｂタンパク質は水溶液中で極めて安定であり、従って、上記の簡単な方法を利用することによって、それらを他の植物タンパク質から精製することが可能であり得る。この目的のため、精製スキームを展開する際に、より高いレベルのＤＰ−１Ｂ．８Ｐタンパク質を発現するｐＧＹ４０１トランスジェニックアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物を使用した。大量の出発材料を得るために、直接土壌生育についてホモ接合性トランスジェニック植物を選択した。Ｔ４ホモ接合性種子を発芽させ、そして生育させた。植物を収穫し、そして全タンパク質を分画した。ＤＰ−１Ｂタンパク質の存在について、それぞれの画分を確認した。大部分のＤＰ−１Ｂタンパク質が（ＮＨ４）２ＳＯ４沈殿画分にあることを見出した。このような簡単な方法で約９５％の植物タンパク質を取り出し、同時にＤＰ−１Ｂタンパク質を濃縮することができる。
【００７７】
実施例
以下の実施例において本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明の好適な実施態様を示すと同時に例示のみの方法によって与えられることを理解すべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者であれば、本発明の本質的特徴を確かめることができ、そして本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明にさまざまな変更および改変を加えて、さまざまな用途および条件に適応することができる。
【００７８】
一般的方法
実施例で使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローン化技術は当該分野において周知であり、サンブロックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．，　Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｅ．　Ｆ．　ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ；　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ：　　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　（１９８９）　（Ｍａｎｉａｔｉｓ）およびシルハビーら（Ｔ．　Ｊ．　Ｓｉｌｈａｖｙ，　Ｍ．　Ｌ．　Ｂｅｎｎａｎ，　ａｎｄ　Ｌ．　Ｗ．　Ｅｎｑｕｉｓｔ）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　Ｇｅｎｅ　Ｆｕｓｉｏｎｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＮＹ　（１９８４）およびアスベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃ．　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅより出版　（１９８７）により記載されている。
【００７９】
細菌培養の維持または増殖に適切な材料および方法は当該分野において周知である。以下の実施例での使用に適切な技術は、Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　（フィリップゲルハートら編（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ　Ｇｅｒｈａｒｄｔ，　Ｒ．　Ｇ．　Ｅ．　Ｍｕｒｒａｙ，　Ｒａｌｐｈ　Ｎ．　Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，　Ｅｕｇｅｎｅ　Ｗ．　Ｎｅｓｔｅｒ，　Ｗｉｌｌｉｓ　Ａ．　Ｗｏｏｄ，　Ｎｏｅｌ　Ｒ．　Ｋｒｉｅｇ　ａｎｄ　Ｇ．　Ｂｒｉｇｇｓ　Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，　ｅｄｓ）），　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，　ＤＣ　（１９９４））またはトーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ　Ｄ．　Ｂｒｏｃｋ）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：　　Ａ　Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｓｉｎａｕｅｒ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，　Ｉｎｃ．，　Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，　ＭＡ　（１９８９）において見ることができる。すべての試薬、制限酵素ならびに細菌細胞の増殖および維持のために使用した材料は、特に特定しない限りアルドリッヒケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，　ＷＩ）、ＤＩＦＣＯラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（Ｄｅｔｒｏｉｔ，　ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ　（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，　ＭＤ）、またはシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）（Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，　ＭＯ）から入手した。
【００８０】
植物の形質転換および生育に適切な材料および方法は当該分野において周知である。以下の実施例での使用に適切な技術は、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（メロディーＳ．クラーク編（Ｍｅｌｏｄｙ　Ｓ．　Ｃｌａｒｋ，　ｅｄｓ．）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，　Ｂｅｒｌｉｎ，　Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，　１９９７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｃｏｕｒｓｅ　Ｍａｎｕａｌ　（パルマリガら編（Ｐａｌ　Ｍａｌｉｇａ，　Ｄａｎｉｅｌ　Ｆ．　Ｆｌｅｓｓｉｎｇ，　Ａｎｔｈｏｎｙ　Ｒ．　Ｃａｓｈｍｏｒｅ，　Ｗｉｌｈｅｌｍ　Ｃｒｕｉｓｓｅｍ，　Ｊｏｓｅｐｈ　Ｅ．　Ｖａｒｎｅｒ，　ｅｄｓ．）Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１９９５）、およびＭｅｔｈｅｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｖｏｌｕｍｅ　８２、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）手順（ジョーＭ．マーチンズ−ザッパターら編（Ｊｏｓｅ　Ｍ．　Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｚａｐａｔｅｒ，　Ｊｕｌｉｏ　Ｓａｌｉｎａｓ，　ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｔｏｔｏｗａ，　ＮＪ　１９９８）　において見ることができる。すべての試薬、制限酵素ならびに細菌細胞の増殖および維持のために使用した材料は、特に特定しない限りアルドリッヒケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，　ＷＩ）、ＤＩＦＣＯラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（Ｄｅｔｒｏｉｔ，　ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ　（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，　ＭＤ）、またはシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）（Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，　ＭＯ）から入手した。
【００８１】
略語の意味は次のようである：「ｈ」は時間（単数および複数）を意味し、「ｍｉｎ」は分（単数および複数）を意味し、「ｓｅｃ」は秒（単数および複数）を意味し、「ｄ」は日（単数および複数）を意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味する。
【００８２】
実施例１
アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）における発現のためのアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）スピドロイン１の類似体の合成遺伝子を含有するプラスミドの構築
８マーおよび１６マーＤＰ−１Ｂ．３３の合成遺伝子をデュポン社（ＤｕＰｏｎｔ　Ｃｏｍｐａｎｙ）Ｃｏｍｐａｎｙ　（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，　ＤＥ　１９８９８）　（ＷＯ９４２９４５０）より入手した。これらの遺伝子は、それぞれ、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）スピドロイン１の本質的構造エレメントおよび反復パターンを提示する８０９（配列番号１３）および１６１７（配列番号１４）アミノ酸タンパク質配列をコードする。それらの合成遺伝子を担持するプラスミドｐＦＰ７１７およびｐＦＰ７２３（ＷＯ９４２９４５０に詳細に記載されている）は、これらの実験から入手した。
【００８３】
Ｎ末端の開始コドン、６ヒスチジンコーディング配列、続いて合成遺伝子のＣ末端の終止コドンを追加するために、アダプターＧＹＳを作製した。標準的な方法によって、オリゴヌクレオチド配列ＧＹＳ［＋］（５’ＧＡＴ　ＣＴＣ　ＣＡＴ　ＧＧＣ　ＴＡＧ　ＡＴＣ　ＴＡＧ　ＡＧＧ　ＡＴＣ　ＣＣＡ　ＴＣＡ　ＣＣＡ　ＴＣＡ　ＣＣＡ　ＴＣＡ　ＣＴＡ　ＡＧ３’）（配列番号１５）およびＧＹＳ［−］（５’ＡＡＴ　ＴＣＴ　ＴＡＧ　ＴＧＡ　ＴＧＧ　ＴＧＡ　ＴＧＧ　ＴＧＡ　ＴＧＧ　ＧＡＴ　ＣＣＴ　ＣＴＡ　ＧＡＴ　ＣＴＡ　ＧＣＣ　ＡＴＧ　ＧＡ３’）（配列番号１６）を合成した。オリゴヌクレオチドをＴＥ（１０ｍ　ｔｒｉｓ、１ｍ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で１μｇ／μＬに希釈し、等容積でチューブに混合した。混合物を５分間煮沸し、次いで、室温で徐々に冷却した。このプロセスで形成したアダプターＧＹＳを以下に示す。アダプターは、それぞれＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ消化部位に相補的な粘着末端を有し、開始コドン、ＡＲＳＲＧＳ（配列番号１７）６ヒスチジン（６−ｉｓｔｉｄｉｎｅ）タグ、および終止コドンを含む小さなペプチドをコードする。該アダプターはまた、ＮｃｏＩ、Ｂａｇｌｌ、ＸｂａＩ、およびＢａｍＨＩなどの少数の制限部位を導入する。Ｔ４リガーゼ（ライフテクノロジー（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，　ＭＤ）アダプターをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，　ＣＡ）の制限部位ＢａｍＨ１とＥｃｏＲ１との間にクローン化した。得られたプラスミドをｐＧＹ００１（図１）と呼び、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ　Ｅ．　ｃｏｌｉ細胞（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，　ＣＡ）中で増幅し、ＱＩＡプレップスピンミニプレップキット（ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）Ｖａｌｅｎｃｉａ，　ＣＡ）を使用して調製した。アダプターの配列を標準的な配列決定によって確認した。
【００８４】
【化１】
2004511429.tif 000004
【００８５】
２μｇのプラスミドＰｆｐ７１７およびＰｆｐ７２３を、ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩの３７℃制限消化に２時間供した。８マーおよび１６マーＤＰ−１Ｂ．３３遺伝子を０．８％アガロースゲル上で分離し、そしてＱＩＡクイックゲル抽出キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔ　Ｋｉｔ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）Ｖａｌｅｎｃｉａ，　ＣＡ）を使用して抽出した。２μｇのｐＧＹ００１も、同酵素により５０μＬ反応液中で消化した。脱リン酸化ｐＧＹ００１を作製するために、１０μＬの脱リン酸化緩衝液および２μＬのＣＩＡＰ（ライフテクノロジー（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，　ＭＤ）を反応液に添加し、そして水を満たして１００μＬの最終容積にした。反応混合物を３７℃で３０分間置き、そしてさらなる２μＬのＣＩＡＰを添加してさらに３０分間インキュベーションした。ＱＩＡクイック精製キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）Ｖａｌｅｎｃｉａ，　ＣＡ）を使用することによって、ＤＮＡを洗浄した。次いで、Ｔ４リガーゼを使用することによって、ｐＦＰ７１７およびｐＦＰ７２３由来の８マーおよび１６マーＤＰ−１Ｂ．３３をｐＧＹ００１のＢｇｌＩＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間にクローン化し、それぞれｐＧＹ１０１およびｐＧＹ１０２を得た（図２Ａ、２Ｂ）。プラスミド（ｐＧＹ１０１、ｐＧＹ１０２）をＸＬ１−Ｂｌｕｅ　Ｅ．　ｃｏｌｉ中で増幅し、ＱＩＡプレップスピンミニプレップキット（ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ）を使用して精製した。これら２つのプラスミドは、Ｎ末端開始コドンおよびＣ末端１６ヒスチジンコーディング配列および以後の終止コドンが追加された８マー（ｐＧＹ１０１中）および１６マー（ｐＧＹ１０２中）ＤＰ−１Ｂ．３３のコーディング領域を含有する。従って、プラスミドは、２つの完全な合成遺伝子、８１８アミノ酸残基ポリペプチド（配列番号２２）をコードする植物のＤＰ−１Ｂ８マーおよび１６２６アミノ酸残基（配列番号２４）をコードする植物のＤＰ−１Ｂ１６マーを含有した。挿入の正確さは、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００８６】
実施例２
発現カセットの構築
ＤＰ−１Ｂ遺伝子の構成および種子特異的発現のための５’プロモーターおよび３’ターミネーター（ポリアデニル化配列）を有するカセットを組み立てるために、デュポンアグリカルチャルプロダクツ（ＤｕＰｏｎｔ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ　ＤＥ，１９８９８）よりプラスミドｐＭＬ６３およびｐＣＷ１０９が提供された。ｐＣＷ１０９については、米国特許第５，９５５，６５０号およびＷＯ９４／１１５１６に詳細に記載されている。ベクターｐＭＬ６３は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよび３’ＮＯＳ配列に操作可能に連結されたｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ酵素をコードする）を含有する。ｐＭＬ６３は、最小３’ＮＯＳターミネーターフラグメントを産生するように、ｐＭＨ４０から修飾されている。ｐＭＨ４０については、ＷＯ９８／１６６５０に記載されており、その開示内容は本明細書において参考として援用されている。当業者によく知られている標準的な技術を使用して、ｐＭＨ４０に含有されている７７０塩基対のターミネーター配列を、デピカーら（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）（１９８２，　Ｊ．　Ａｐｐｌ．　Ｇｅｎｅｔ．　１：５６１−５７４）が公開した配列のヌクレオチド１２７７〜１５５６を含む新たな３’ＮＯＳターミネーター配列と置き換えた。
【００８７】
図３Ａに示されているように、ｐＭＬ６３は、５’ＣａＭＶ３５Ｓ／Ｃａｂ２２Ｌプロモーターおよび３’ＮＯＳターミネーター（３５Ｓ／Ｃａｂ２２Ｌ　Ｐｒｏ：：ＧＵＳ：：ＮＯＳ　Ｔｅｒ）を有するＧＵＳ発現カセットを含む。ＧＵＳをＤＰ−１Ｂ．８Ｐで置き換えるために、ｐＭＬ６３およびｐＧＹ１０１を、制限酵素ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。先に記載の方法によって、ｐＧＹ１０１からＤＰ−１Ｂ．８Ｐを含有するＤＮＡフラグメントをｐＭＬ６３にクローン化した。得られたプラスミドをｐＧＹ２０１と命名し、これは、３５Ｓ／Ｃａｂ２２Ｌ　Ｐｒｏ：：ＤＰ−１Ｂ．８Ｐ：：ＮＯＳ　Ｔｅｒの発現カセットを含有した。ＤＰ−１Ｂ．１６ＰもｐＭＬ６３中のＧＵＳに対して置換したが、ここでは、ｐＧＹ１０１の代わりにｐＧＹ１０２を使用した。３５Ｓ／Ｃａｂ２２Ｌ　Ｐｒｏ：：ＤＰ−１Ｂ．１６Ｐ：：ＮＯＳ　Ｔｅｒの発現カセットを含有するプラスミドをｐＧＹ２０２と命名した。両ｐＧＹ２０１およびｐＧＹ２０２の詳細な構造を図４Ａおよび４Ｂに示す。
【００８８】
ｐＣＷ１０９の配列は、該配列が５’β−コングリシニンプロモーターおよび３’ファオセリンターミネーターを有する空の発現カセットを含有することを示す（図３Ｂ）。β−コングリシニンプロモーターの直ぐ下流のポリリンカー領域にＤＰ−１Ｂ．８Ｐを挿入するために、制限酵素ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩでｐＣＷ１０９およびｐＧＹ１０１を消化し、次いで、ｐＧＹ１０１からＤＰ−１Ｂ．８Ｐを含有するＤＮＡフラグメントをｐＣＷ１０９のこれらの酵素の制限部位の間にクローン化した。新たなプラスミドをｐＧＹ２１１と命名し、これは、β−コングリシニン　Ｐｒｏ：：ＤＰ−１Ｂ．８Ｐ：：ファセオリン　Ｔｅｒの発現カセットを含有した（図５Ａ）。ポリリンカー内で利用できる制限部位を制限するために、１μｇのｐＧＹ２１１を３０μＬ反応混合液中において制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで３７℃で２時間消化した。次いで、２μＬの２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ、１７μＬ水、および１μＬクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントを反応混合液に添加し、そして室温で１０分間インキュベートして、平滑末端を作製した。ＱＩＡクイック精製キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ）を使用することによって、反応物を洗浄した。反応の１０分の１の自己連結反応によって、新たなプラスミドを得た。発現カセットに隣接する領域にさらなる制限部位を作製するために、発現カセット全体を含有するプラスミド由来のＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋）のＨｉｎｄＩＩＩ部位にプラス方向でクローン化した。このプラスミドをｐＧＹ２１３（図５Ｂ）と命名し、その方向を制限消化パターンで確認した。
【００８９】
実施例３
バイナリーベクターに基づくプラスミドの構築
バイナリーベクターｐＺＢＬ１は、デュポンアグリカルチャルプロダクツ（ＤｕＰｏｎｔ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ　ＤＥ，　１９８９８）より提供されたが、これについては米国特許第５，９６８，７９３号に詳細に記載されており、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ２０９１２８）より入手可能である。ベクターは、細菌選択のためにＴ−ＤＮＡ領域の外側にカナマイシン体制遺伝子、ならびに植物細胞のカナマイシン耐性選択のためにＴ−ＤＮＡ領域の内側、右ボーダー（ＲＢ）および左ボーター（ＬＢ）の配列の間にＮＰＴＩＩ遺伝子発現カセット（ＮＯＳＰｒｏ：：ＮＰＴＩＩ：：ＯＣＳ　Ｔｅｒ）を含む（図６）。本実施例に記載のすべてのプラスミドは、断りがない限りＸＬ１−Ｂｌｕｅ　Ｅ．　ｃｏｌｉ細胞において作製したものである。
【００９０】
ＤＰ−１Ｂタンパク質の構成発現のためのバイナリーベクターに基づくプラスミドを構築するために、制限酵素ＸｂａＩおよびＳａｌＩによりプラスミドｐＧＹ２０１およびｐＧＹ２０２を消化した。ＤＰ−１Ｂ．８ＰおよびＤＰ−１Ｂ．１６Ｐ発現カセットを含有するＤＮＡフラグメントを単離し、そしてバイナリーベクターのＮＰＴＩＩ発現カセットの蒸留のポリリンカー領域のＸｂａＩおよびＳａｌＩ部位間にそれぞれクローン化した。挿入によりプラスミドｐＧＹ４０１（発現カセット３５Ｓ／Ｃａｂ２２Ｌ　Ｐｒｏ：：ＤＰ−１Ｂ．８Ｐ：：ＮＯＳ　Ｔｅｒを有する）およびｐＧＹ４０２（発現カセット３５Ｓ／Ｃａｂ２２Ｌ　Ｐｒｏ：：ＤＰ−１Ｂ．１６Ｐ：：ＮＯＳ　Ｔｅｒを有する）を生じた。両プラスミドの構造については、図７Ａおよび図７Ｂに詳細に示している。それらの配列は、独特な制限部位の消化によって確認した。
【００９１】
上記と同様なアプローチを使用して、ＤＰ−１Ｂ．８Ｐタンパク質の種子特異的発現のためのプラスミドｐＧＹ４１１を構築した。制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化することによって、ｐＧＹ２１３よりＤＰ−１Ｂ．８Ｐ発現カセットを含有するＤＮＡフラグメントを入手し、これらの２つの部位の間でｐＺＢＬ１に挿入した。ＤＰ−１Ｂ．１６Ｐの種子特異的発現のための構築物を作製するために、ＤＰ−１Ｂ．１６Ｐコーディング領域（ｐＧＹ１０２の制限部位ＫｐｎＩ〜ＢｇｌＩＩのＤＮＡフラグメント）でＤＰ−１Ｂ．８Ｐコーディング領域（ｐＧＹ４１１の同じ制限部位間のＤＮＡフラグメント）を置換することによってｐＧＹ４１２を構築した。両プラスミドのＤＮＡを、ＤＮＡ再配列を回避するためにＳＴＢＩＩ　Ｅ．　ｃｏｌｉ細胞中で増幅し、そして独特な制限部位の消化によって構築物を確認した。図８Ａおよび８Ｂに示されるように、ｐＧＹ４１１およびｐＧＹ４１２は、それぞれβ−コングリシニン　Ｐｒｏ：：ＤＰ−１Ｂ．８Ｐ：：ファセオリン　Ｔｅｒおよびβ−コングリシニン　Ｐｒｏ：：ＤＰ−１Ｂ．１６Ｐ：：ファセオリン　Ｔｅｒからなる種子特異的発現カセットを含む。プラスミドを表１にまとめて示す。
【００９２】
実施例４
アグロバクテリウム介在アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）形質転換
アグロバクテリウム形質転換
コンピテントなアグロバクテリウム細胞を調製するために、Ｃ５８Ｃ１（ｐＭＰ９０）アグロバクテリウム株（コンクズら（Ｋｏｎｃｚ　ｅｔ　ａｌ．）Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．，　（１９８６）　２０４　（３），　３８３−３９６）のコロニーを、１０ｇバクト（Ｂａｃｔｏ）ペプトン、１０ｇ酵母エキス、および５ｇ　ＮａＣｌを含む１ＬのＹＥＰ培地中で、１．０のＯＤ６００が認められるまで増殖させた。培養物を氷上で冷却し、そして細胞を遠心分離で回収した。コンピテント細胞を氷冷２０ｍＭ　ＣａＣｌ２溶液に再懸濁し、そして０．１ｍＬアリコート中−８０℃で貯蔵した。
【００９３】
凍結融解法を使用して、ｐＧＹ４０１、ｐＧＹ４０２、ｐＧＹ４１１、およびｐＧＹ４１２をアグロバクテリウムに導入した。第１に、これらの構築物のそれぞれからの１μｇのプラスミドＤＮＡを凍結アリコートアグロバクテリウム細胞に添加した。混合物を３７℃で５分間融解し、１ｍＬのＹＥＰ培地に添加し、次いで、２８℃で２時間穏やかに振盪した。遠心分離で細胞を回収し、そして２５ｍｇ／Ｌゲンタマイシンおよび５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有するＹＥＰ寒天プレート上で、２８℃で２〜３日間増殖させた。アグロバクテリウム形質転換体は、ミニ調製およびルーチン方法（但し、細胞溶解を増強するためにＤＮＡ調製前にリゾチーム（Ｓｉｇｍａ，　Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，　ＭＯ）を細胞懸濁液に適用した）によるプラスミドＤＮＡの制限酵素消化によって確認した。対照として空のバイナリーベクターｐＺＢＬ１もアグロバクテリウムに導入した。
【００９４】
アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）形質転換
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）を、メトロミックス（Ｍｅｔｒｏ　Ｍｉｘ）（スコット−シーラ（Ｓｃｏｔｔｓ−Ｓｉｅｒｒａ）Ｍａｒｙｖｉｌｌｅ，　ＯＨ）土壌の３インチ平方ポットにおいて、ポットあたり５植物の密度で、２２℃の制御された温度および１６時間明／８時間暗の照明下、抽薹まで生育させた。形質転換の４日前に、植物の頂部を取り出した。ｐＺＢＬ１（対照）、ｐＧＹ４０１、ｐＧＹ４０２、ｐＧＹ４１１、またはｐＧＹ４１２プラスミドを担持するアグロバクテリウムを、２５ｍｇ／Ｌゲンタマイシンおよび５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有するＬＢ培地（１％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中、２８℃で、培養物が１．２のＯＤ６００値に達するまで増殖させた。細胞を遠心分離で回収し、そして浸透培地（１／２×ＭＳ塩、１×Ｂ５ビタミン、５％ショ糖、０．５ｇ／Ｌ　ＭＥＳ、ｐＨ５．７、０．０４４μＭベンジルアミノプリン）に約０．８のＯＤ６００となるように再懸濁した。
【００９５】
減圧浸透法を用いて、上記の５つのバイナリーベクターに基づくプラスミドを担持するアグロバクテリア株でアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物をトランスフェクトした。簡単に説明すると、５００ｍＬマゲンタボックス（Ｍａｇｅｎｔａ　Ｂｏｘ）にアグロバクテリウムの浸透培地を満たし、そして５つのアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物を含有する３インチ平方ポットで倒置位で覆い、植物全体が懸濁液中に沈水するようにした。組立体をアイソテム減圧オーブンモデル２８１（Ｉｓｏｔｅｍｐ　Ｖａｃｕｕｍ　Ｏｖｅｎ　ｍｏｄｅｌ　２８１）（フィッシャーサイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，　ＰＡ）中に配置し、５分間、３０ｍｍ　Ｈｇ減圧かで浸透に供した。少なくとも３ポットの植物にそれぞれのアグロバクテリウム株を浸透させた。次いで、感染植物を、サランラップで平坦にシールされた状態で横向きに配置し、１晩室温でインキュベートした。トランスフェクトされたアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物を通常条件（２２℃、１６時間明／８時間暗）で成熟まで生育させた。形質転換された植物から得られる種子をＴ１種子と規定する。Ｔ１種子を各ポットの植物から回収し、１週間乾燥し、そして室温で貯蔵した。
【００９６】
実施例５
アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）におけるＤＰ−１Ｂタンパク質の発現
アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）形質転換体の選択
形質転換体を選択するために、１，０００個のＴ１種子を１ｍＬの５０％Ｃｌｏｒｏｘ（登録商標）（クロラールは約１０％の漂白剤）および０．０２％トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）溶液中で７分間滅菌し、続いて、滅菌蒸留水で５回濯いだ。種子を２ｍＬの０．１％アガロースに再懸濁し、一次選択培地（１×ＭＳ塩、１×Ｂ５ビタミン、１％ショ糖、０．５ｍｇ／ｍＬ　ＭＥＳ、ｐＨ５．７、３０μｇ／ｍＬカナマイシン、１００μｇ／ｍＬカルベニシリン、１０μｇ／ｍＬベノミル、および０．８％フィトアガー（ｐｈｙｔａｇａｒ））を含有する９０×２０ｍｍプレートの頂部で広げた。４℃で３日間冷処理後、１週間、２２℃、連続照明下で種子を発芽させた。ＮＴＰＩＩ遺伝子の発現により、すべての形質転換種子（通常、種子回収物の約１％と予期される）が発芽し、そして緑色苗にまで生育する。しかし、非形質転換種子は発芽しなかったかまたは苗が迅速に白色化した。Ｔ１植物として規定される形質転換体苗を選択し、１５％フィトアガーを除いて一次選択培地と同じ成分を有する二次選択培地を含有する別の９０×２０ｍｍプレート上で生育させた。形質転換体を１週間生育させて根の発生を増強した。最後に、苗を個々のメトロミックス土壌の１インチ平方ポットに移し、２２℃で、１６時間明／８時間暗サイクルで成熟するまで生育させた。Ｔ１より産生されたＴ２種子をそれぞれの個々の植物から回収し、そして個別に貯蔵した。
【００９７】
ｐＺＢＬ１、ｐＧＹ４０１、ｐＧＹ４０２、ｐＧＹ４１１、およびｐＧＹ４１２のすべてのＴ１種子回収物を上記の形質転換体選択に供した。このプロセスにより、ｐＺＢＬ１では２２、ｐＧＹ４０１では４４、ｐＧＹ４０２では６９、ｐＧＹ４１１では２１、およびｐＧＹ４１２では２９トランスジェニック植物が得られた。
【００９８】
ＤＰ−１Ｂタンパク質発現の試験
ｐＧＹ４０１およびｐＧＹ４０２構築物を担持するＴ１トランスジェニック植物を選択し、そして上記のように抽薹まで土壌中で生育させた。各植物の葉（約２０ｍｇの葉組織）の半分を５０μＬタンパク質抽出緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１２．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２ｍＭ　ＤＴＴ、５％グリセロール）と共に１．５ｍＬ氷冷エッペンドルフチューブ中で粉砕した。混合液を遠心分離し、そして構成的に発現されたＤＰ−１Ｂタンパク質の試験のために、上清を葉タンパク質抽出物として回収した。上記のように選択されたＴ１トランスジェニック植物から収穫されているｐＧＹ４１１およびｐＧＹ４１２構築物を担持するＴ２種子から、種子タンパク質抽出物を調製した。各トランスジェニック植物から得た１００〜２００個の種子を４００μｌのタンパク質抽出緩衝液中で抽出した。種子タンパク質抽出物を使用して、ＤＰ−１Ｂタンパク質の種子特異的発現を試験した。これらの抽出物における全単タンパク質濃度は、バイオ−ラドタンパク質アッセイ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ）（バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，　ＣＡ）を使用することにより決定した。
【００９９】
Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．アスベルら編（Ｆ．　Ｍ．　Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，　ｅｄｔ）Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）に記載のタンパク質イムノブロットアッセイを用いて、ＤＰ−１Ｂタンパク質の発現を決定した。バイオ−ラドミニゲル電気泳動装置を使用して、葉タンパク質抽出物または種子タンパク質抽出物中のタンパク質をミニポリアクリルアミドゲル（５％濃縮ゲルおよび１０％分離ゲル）中で分離した。ファルマシア−ＬＫＢ２１１７マルチフォアＩＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ　２１１７　ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ　ＩＩ）（アマシャム・ファルマシア・バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，　ＮＪ）を使用し、製造者が推奨する半乾燥転移方法を使用して、０．８ｍＡ／ｃｍ２で１時間、ゲル中のタンパク質を０．２μＭニトロセルロース膜（シュライヒャー＆シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　Ｓｃｈｕｅｌｌ）Ｋｅｅｎｅ，　ＮＨ）に移した。１リットルの半乾燥ウエスタン転移緩衝液は、２．９３ｇのグリシン、５．８１ｇのＴｒｉｓ、０．３７５ｇのＳＤＳ、および２００ｍＬのメタノールを含んだ。ニトロセルロース膜を５％脱脂肪乳ＴＴＢＳ（０．１％トゥウィーン−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）、２．４２ｇのＴｒｉｓ、２９．２ｇのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）でブロックし、一次抗体−ＴＴＢＳ溶液と共に３時間インキュベートし、次いで、抗ウサギＩｇＧ　ＨＲＰ−複合体（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩ）を含有するＴＴＢＳ中で１時間インキュベートした。０．２ｍＭ　Ｐ−クマリン酸（Ｐ−ｃｏｕｍａｒｉｃ　ａｃｉｄ）、２．５ｍＭ　３−アミノフタルヒドラジドおよび０．０１％Ｈ２Ｏ２を含有する１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）からなる化学発光基質溶液によって、膜上でのタンパク質−抗体相互作用を検出した。Ｘ線フィルムに暴露することによって、結果を視覚化した。
【０１００】
ＤＰ−１Ｂタンパク質の発現を試験するために、ｐＧＹ４０１およびｐＧＹ４０２トランスジェニックアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来の１０μＬの葉タンパク質抽出物ならびにｐＧＹ４１１およびｐＧＹ４１２トランスジェニックアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来の１０μＬの種子タンパク質抽出物をタンパク質イムノブロットアッセイに供した。ｐＺＢＬ１トランスジェニックアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来の１０μＬの葉および種子タンパク質抽出物も対照として使用した。一次抗体であるＤＰ−１Ｂ　Ａｂｓはデュポン（ＤｕＰｏｎｔ）から入手したが、該抗体の調製についてはＷＯ９４２９４５０に詳細に記載されている。これらの抗体は、ＤＰ−１Ｂ分子の高度に保存された配列ＣＧＡＧＱＧＧＹＧＧＬＧＳＧＧＡＧＲＧ（配列番号２５）を認識するが、これらは１：１，０００倍希釈で使用した。図９Ａは、タンパク質イムノブロットアッセイの結果を示し、これは、それぞれ、ｐＧＹ４０１およびｐＧＹ４０２トランスジェニックアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の葉組織において６４ｋＤのＤＰ−１Ｂ．８Ｐおよび１２７ｋＤのＤＰ−１Ｂ．１６Ｐタンパク質が産生され、そして蓄積したこと、ならびに両タンパク質はｐＧＹ４１１およびｐＧＹ４１２トランスジェニックアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の種子においても産生され、そして蓄積したことを示す。ｐＧＹ４０２植物の葉およびいくつかのｐＧＹ４１２植物の種子に蓄積したＤＰ−１Ｂ．１６Ｐタンパク質のフラグメントが小さいほど割合が高いことから、これは、トランスジェニックアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）におけるＤＰ−１Ｂの産生には、１６マーよりも８マーが好ましいことを示す。このアッセイを使用して、カナマイシン耐性の表現型を有する１６３トランスジェニックアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（ｐＧＹ４０１では４４、ｐＧＹ４０２では６９、ｐＧＹ４１１では２１、およびｐＧＹ４１２では２９）をＤＰ−１Ｂ発現について試験した。２５のｐＧＹ４０１植物（５１％）、４つのｐＧＹ４０２（６％）、４つのｐＧＹ４１１（１９％）、および７つのｐＧＹ４１２（２４％）のみが、予想された分子量でＤＰ−１Ｂタンパク質を産生しそして蓄積した。
【０１０１】
【表３】
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【０１０２】
抗生物質耐性表現型によって選択されている残りのトランスジェニックアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）は、以下の３つのカテゴリーに属した：
（１）植物は、アッセイにおいて目視可能なＤＰ−１Ｂタンパク質の蓄積を示さなかった；（２）植物は、ＤＰ−１Ｂタンパク質を発現したが、成熟しなかったかまたは成熟前に死滅した；（３）植物は、誤った分子量でＤＰ−１Ｂタンパク質を蓄積したかまたは／および複数の主要産物を蓄積した。ＤＰ−１Ｂタンパク質の産生に成功したトランスジェニック植物はほとんどなかったという事実は、植物におけるＳＬＰ’ｓの発現の獲得が困難であったことを反映するが、おそらく、高反復および高グリシン／アラニンが富化されたクモ絹の性質によると思われる。
【０１０３】
抗Ｈｉｓ（Ｃ−末端）−ＨＲＰ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）Ｃａｒｌｓｂａｄ，　ＣＡ）もまた、タンパク質イムノブロットアッセイの一時抗体として使用した。６×ヒスチジンタグは、すべての構築物においてＤＰ−１Ｂタンパク質のＣ末端に構成されたため、抗Ｈｉｓタグ複合体により、本発明者らは、簡便に、ＤＰ−１Ｂタンパク質の質を決定し、収量を見積もることが可能であった。イムノブロットのために抗体を使用する場合、二次抗体は必要ではなく、化学発光試薬によって、タンパク質−抗体相互作用を直接検出することができた。
【０１０４】
トランスジェニックアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）において産生されるＤＰ−１Ｂタンパク質の量を決定するために、ＤＰ−１Ｂタンパク質の予想される発現を実証したそれらの４０の植物由来の葉または種子タンパク質抽出物をイムノブロットアッセイに供した。抗Ｈｉｓ（Ｃ−末端）−ＨＲＰを、一次抗体として１：４，０００倍希釈で使用した。図９Ｂは、このアッセイの結果を示す。結果は、該植物において発現されたＤＰ−１Ｂタンパク質が正確な分子量を有しただけではなく、それらのＣ末端Ｈｉｓタグは抗Ｈｉｓ（Ｃ−末端）−ＨＲＰに認識されたことから、該タンパク質は完全なＣ末端を有したことを示した。図９Ａの４０２（９２）、４０２（９４）、および４１２（４１）などのいくつかのタンパク質抽出物においてＤＰ−１Ｂ　Ａｂｓによって検出されたＤＰ−１Ｂ．１６Ｐタンパク質のより短いフラグメントラダーは、ＨｉｓタグＡｂによって認識されなかったことから、いくつかの未成熟な末端化はＤＰ−１Ｂ．１６Ｐの翻訳中に発生した可能性があることが示唆される。種子タンパク質と相互作用する場合、抗Ｈｉｓ（Ｃ−末端）−ＨＲＰはまた、図９Ｂの右側のパネルに示されたような若干のより小さなタンパク質分子を認識した。これらのタンパク質は対照とも区別され得ることから、それらは導入遺伝子の産物ではなく、むしろ種子のタンパク質であると思われる。
【０１０５】
抗Ｈｉｓ（Ｃ−末端）−ＨＲＰを使用する同様のイムノブロットアッセイでは、大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ）で産生され、そしてアフィニティーカラムで精製されたＣ末端で６×Ｈｉｓタグを有する１４ｋＤの組換えタンパク質を、標準的なタンパク質として使用した。標準タンパク質およびトランスジェニック植物由来のタンパク質抽出物のシグナルを比較することによって、ほとんどの該４０植物におけるＤＰ−１Ｂタンパク質の収量を推定した。ｐＧＹ４０１トランスジェニック植物の葉におけるＤＰ−１Ｂ．８Ｐタンパク質の収量は、全可溶性葉タンパク質の０．０１％〜１．６５％（約０．００２％〜０．３３％の乾燥重量）であり、平均収量では全可溶性葉タンパク質の０．３４％（約０．０７％の乾燥重量）を提示した。ｐＧＹ４０２トランスジェニック植物の葉におけるＤＰ−１Ｂ．１６Ｐタンパク質の収量は、全可溶性葉タンパク質の０．０１％〜０．０６％（約０．００２％〜０．０１％の乾燥重量）であり、平均収量では全可溶性葉タンパク質の０．０３％（約０．０６％の乾燥重量）を提示した。ｐＧＹ４１１トランスジェニック植物の種子におけるＤＰ−１Ｂ．８Ｐタンパク質の収量は、全可溶性種子タンパク質の１％〜４％（約０．２％〜０．２８％の乾燥重量）であり、平均収量では全可溶性葉タンパク質の１．２％（約０．２４％の乾燥重量）を提示した。ｐＧＹ４１２トランスジェニック植物の種子におけるＤＰ−１Ｂ．１６Ｐタンパク質の収量は、全可溶性種子タンパク質の０．５％〜１％（約０．１％〜０．２％の乾燥重量）であり、平均収量では全可溶性種子タンパク質の０．７８％（約０．１６％の乾燥重量）を提示した。発現結果の概要を表２に示す。
【０１０６】
【表４】
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【０１０７】
ｐＧＹ４０１トランスジェニックアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）についてスクリーニングの範囲を拡張して行ったところ、表２には示されていない、全可溶性葉タンパク質の９．２％（約１．８％の乾燥重量）まで６５ｋＤのＤＰ−１Ｂ．８Ｐタンパク質を蓄積した１つの植物が同定された。これらの結果は、一般に、種子特異的発現（ｐＧＹ４１１およびｐＧＹ４１２）が、葉における構成発現（ｐＧＹ４０１およびｐＧＹ４０２）よりも、種子においてより高いレベルの両ＤＰ−１Ｂ．８ＰおよびＤＰ−１Ｂ．１６Ｐタンパク質をもたらすことを示唆した。
【０１０８】
アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）へのＴ−ＤＮＡ挿入の確認
アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）形質転換の間、ＮＰＴＩＩ発現カセットおよびＤＰ−１Ｂ．８ＰまたはＤＰ−１Ｂ．１６Ｐを含んだＴ−ＤＮＡ配列全体を植物ゲノムに挿入した。該４０トランスジェニックアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）におけるＤＰ−１Ｂタンパク質の発現を導入遺伝子にさらに関連付けるために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、該植物のゲノム由来Ｔ−ＤＮＡ領域内におけるＤＮＡフラグメントを検出した。この目的のために、２つの葉（約１００ｍｇ）をそれぞれのトランスジェニックアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）から回収した。次いで、ＤＮイージー植物ミニキット（ＤＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ）を使用し、キット製造者（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）Ｖａｌｅｎｃｉａ，　ＣＡ）によって提供されたプロトコルに従ってＤＮＡを単離し、５０μＬのＤＮＡ溶液を得た。各調製物のＤＮＡ濃度および純度は、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＤＵ６４０分光光度計（ベックマンインスツルメンツ（Ｂｅｃｈｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，　ＣＡ）でＯＤ２６０およびＯＤ２８０値を測定することによって推定した。ＤＰ−１Ｂコーディング領域の直接増幅は、高度な反復性質のために困難であることから、標準的な手段によってプライマーＮＰＴＩＩ−Ｆ２（５’ＧＣＴ，ＣＧＡ，ＣＧＴ，ＴＧＴ，ＣＡＣ，ＴＧＡ，ＡＧ３’）（配列番号２６）およびＮＰＴＩＩ−Ｒ２（５’ＴＣＧ，ＴＣＣ，ＡＧＡ，ＴＣＡ，ＴＣＣ，ＴＧＡ，ＴＣ３’）（配列番号２７）を合成し、これらを使用して、２４０ｂｐセグメントのＮＰＴＩＩ遺伝子を増幅した。１つの２５μＬのＰＣＲ反応は、１μＬのＤＮＡ、２．５μＬの１０×ＰＣＲ反応緩衝液（ライフテクノロジー（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，　ＭＤ）、０．２５ｍＭの各ｄＮＴＰ、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、ＮＰＴＩＩ−Ｆ２に対する１０ｐｍｏｌｅプライマー、ＮＰＴＩＩ−Ｒ２に対する１０ｐｍｏｌｅプライマー、および１．２５単位のＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（ライフテクノロジー（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，　ＭＤ）を含んだ。反応は、ジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）ＰＣＲシステム９６０（パーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）Ｎｏｒｗａｌｋ，　ＣＴ）上で、９４℃で４５秒、５８℃で４５秒、および７２℃で４５秒を３５サイクルを行い、次いでエチジウムブロミドを含有する電気泳動アガロースゲル上で分離した。結果は、ＵＶ光下で可視化した。ゲルの分析は、予想通り、Ｔ−ＤＮＡはすべての４０トランスジェニックアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のゲノムＤＮＡに挿入されていたことを示した。結果を図９Ｃに示す。対照のＤＮＡサンプルは、ＮＰＴＩＩ遺伝子を担持するが、ＤＰ−１Ｂ遺伝子を担持しないｐＺＢＬ１トランスジェニック植物より調製するため、２４０ｂｐのＮＰＴＩＩフラグメントを該サンプルからＰＣＲによって増幅した。従って、本アッセイでは、陰性対照として、野生型（ＷＴ）アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来のＤＮＡサンプルを使用した。
【０１０９】
導入遺伝子遺伝力の実証
導入遺伝子の遺伝力を試験するために、ｐＧＹ４０１、ｐＧＹ４０２、ｐＧＹ４１１、およびｐＧＹ４１２構築物のそれぞれを含有する２つのトランスジェニックアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物を選択した。Ｔ２種子を３日間冷処理し、次いで、一次選択培地上で１０日間発芽させた。導入遺伝子を含有することが予測された３０の健常なカナマイシン耐性Ｔ２苗を移し、上記の条件下で、メトロミックス（Ｍｅｔｒｏ　Ｍｉｘ）土壌において生育させた。タンパク質抽出物を、ｐＧＹ４０１およびｐＧＹ４０２の苗植物の葉ならびにｐＧＹ４１１およびｐＧＹ４１２形質転換体由来の成熟植物の種子から抽出した。ＤＰ−１Ｂタンパク質の高度に保存されたペプチド配列に対するポリクローナル抗体（ＤＰ−１Ｂ　Ａｂｓ）を使用するイムノブロットアッセイにより、トランスジェニック植物のＴ２子孫においてＤＰ−１Ｂ．８ＰおよびＤＰ−１Ｂ．１６Ｐタンパク質が組織特異的方法で産生され、そして蓄積されることが実証された（図１０Ａ）。ＤＰ−１Ｂ．１６Ｐタンパク質のより小さなペプチドフラグメントもまた、Ｔ１パターンに見られるのと同様のパターンで、４０２（９２）、４０２（９４）、および４１２（４１）のＴ２植物に蓄積する。
【０１１０】
これらのＴ２子孫の葉からもＤＮＡを単離した。上記のプロトコルに従い、各ＤＮＡサンプルについて、２４０ｂｐ　ＮＰＴＩＩフラグメントのＰＣＲ増幅を行った。ｐＺＢＬ１トランスジェニック植物の対照ＤＮＡはＮＰＴＩＩ配列を含有したため、野生型（ＷＴ）アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来のＤＮＡサンプルを陰性対照として使用した。次いで、ＰＣＲ反応物を、エチジウムブロミドを含有するアガロースゲル上の電気泳動に供した。ゲルをＵＶ光下で可視化した（図１０Ｂ）ところ、これらのすべてのＴ２子孫のゲノムは依然として導入遺伝子を担持していることが示された。
【０１１１】
導入遺伝子発現に伴って、これらのＴ２植物の発芽および発生についても分析した。生育中のＴ２植物と対照植物（ｐＺＢＬ１）とを比較したところ、導入遺伝子の発現にもかかわらず、Ｔ２植物間では表現型の異常は認められなかった。
【０１１２】
結論として、これらの結果は、構築物ｐＧＹ４０１、ｐＧＹ４０２、ｐＧＹ４１１、およびｐＧＹ４１２を使用して、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ゲノムに導入されたＤＰ−１Ｂ遺伝子は、有性生殖を介しても遺伝可能であり、そして安定であることを実証した。
【０１１３】
実施例６
ダイズ体細胞胚における発現のためのアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）スピドロイン１の類似体の合成遺伝子を含有するプラスミドの構築
プラスミドｐＺＢＬ１０２は、デュポンアグリカルチャルプロダクツ（ＤｕＰｏｎｔ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ　ＤＥ，　１９８９８）より提供された。このプラスミドを使用して、ダイズ体細胞胚におけるＤＰ−１Ｂタンパク質発現のための構築物を作製した。このｐＳＰ７２（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩ）に基づくプラスミドは、図１１Ａに示されるように、細菌においてＴ７プロモーター（Ｔ７　Ｐｒｏ：：ＨＰＴ：：Ｔ７　Ｔｅｒ）によって指令されるヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）遺伝子および植物におけるヒグロマイシンＢ耐性のための３５Ｓ　Ｐｒｏ：：ＨＰＴ：：ＮＯＳ　Ｔｅｒの発現カセットを含有する。ＤＰ−１Ｂコーディング配列の高度な反復性質のために、本実施例のすべてのプラスミドは、ＳＴＢＩＩ　Ｅ．　ｃｏｌｉ細胞において作製した。
【０１１４】
ダイズ体細胞胚におけるＤＰ−１Ｂ．８タンパク質のタンパク質の発現のための構築物を作製するために、プラスミドｐＺＢＬ１０２をＮｏｔＩおよびＳａｌＩで消化した。線状化されたベクターを、アガロースゲル上で短いＮｏｔＩ／ＳａｌＩ　ＤＮＡフラグメントから分離し、ＱＩＡクイックゲル抽出キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔ　Ｋｉｔ）を使用して精製した。同じ方法を使用して、プラスミドｐＧＹ２１３もＮｏｔＩおよびＳａｌＩで消化し、β−コングリシニン　Ｐｒｏ：：ＤＰ−１Ｂ．８Ｐ：：ファセオリン　Ｐｒｏからなる種子特異的発現カセットを含有する４３５７塩基対ＤＮＡフラグメントを単離した。このＤＮＡフラグメントを、ＮｏｔＩおよびＳａｌＩ部位の間で、３５Ｓ　Ｐｒｏ：：ＨＲＰ：：ＮＯＳ　Ｔｅｒ発現カセットと同じ方向において、線状化したｐＺＢＬ１０２に連結した。新たな構築物をｐＬＳ３と命名した。その構造を図１２Ａに示す。
【０１１５】
ダイズ体細胞胚におけるＤＰ−１Ｂ．１６タンパク質の発現のためのプラスミドの構築には、修飾されたプラスミドｐＧＹ４１２が必要である。この目的のために、ｐＧＹ４１２のＫｐｎＩ（１２８２）およびＥｃｏＲＩ（１３３０）部位間のＤＮＡフラグメントを、ＳｍａＩ部位のみを含む短い配列で置き換えた。次いで、この修飾されたｐＧＹ４１２をＳａｌＩおよびＮｃｏＩで消化し、ＤＰ−１Ｂ．１６コーディング領域およびファセオリンターミネーター配列を含有するＤＮＡフラグメント単離し、そしてｐＧＹ２１３のＳａｌＩおよびＮｃｏＩの間に連結した。従って、このフラグメントでＤＰ−１Ｂ．８コーディング領域を置換し、その結果プラスミドｐＧＹ２００を得た。図１１Ｂは、β−コングリシニン　Ｐｒｏ：：ＤＰ−１Ｂ．１６Ｐ：：ファセオリン　Ｔｅｒからなる種子特異的発現カセットを含有するプラスミドｐＧＹ２００の構造を示す。
【０１１６】
同様の方法で、プラスミドｐＧＹ２００をＮｏｔＩおよびＳａｌＩで消化した。β−コングリシニン　Ｐｒｏ：：ＤＰ−１Ｂ．１６Ｐ：：ファセオリン　Ｔｅｒからなる種子特異的発現カセットを含有する６７７４塩基対ＤＮＡフラグメントを単離し、そして線状化されたｐＺＢＬ１０２のＮｏｔＩおよびＳａｌＩの間に連結した。新たなプラスミド、ｐＬＳ４は、ＤＰ−１Ｂ．８Ｐ領域の代わりにＤＰ−１Ｂ．１６Ｐコーディング領域を含有していることを除いて、ほとんどｐＬＳ３と同一であった。その構造を図１２Ｂに示す。
【０１１７】
実施例７
粒子銃衝撃によるダイズ体細胞胚細胞におけるＤＰ−１Ｂ遺伝子の形質転換および発現
それぞれ、８マーおよび１６マーのＤＰ−１Ｂを発現させるために、プラスミドｐＬＳ３およびｐＬＳ４を、ダイズ体細胞胚細胞形質転換に使用した。形質転換の前に、両プラスミドを増幅し、そしてＳＴＢＩＩ　Ｅ．　ｃｏｌｉ細胞から大規模で精製した。ｐＬＳ３またはｐＬＳ４を担持するＳＴＢＩＩ細胞を５００ｍＬのＬＢ−ヒグロマイシンブロス（１０ｇ／Ｌバクトトリプシン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１５０ｍｇ／ＬのヒグロマイシンＢ）中で、３７℃で１晩培養し、遠心分離で回収した。次いで、細胞を６ｍＬの溶液Ｉ（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７．５、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１５％ショ糖、２ｍｇ／Ｌリゾチーム）に再懸濁し、１２ｍＬの溶液ＩＩ（０．２Ｍ　ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ）を添加することによって溶解し、次いで、７．５ｍＬの３Ｍ　ＮａＡｃ、ｐＨ４．６を添加することによって中和した。溶解液の上清を遠心分離によって回収し、３７℃で、３０分間の５０μｇのＲＮアーゼ　Ａ処理に供した。ＤＮＡペレットを１ｍＬのＨ２Ｏに再懸濁し、そして１ｍＬの１．６Ｍ　ＮａＣｌおよび２ｍＬの１３％ＰＥＧ−８００と混合することによって再度沈殿させた。純粋なＤＮＡを７０％エタノールで洗浄し、そしてＨ２Ｏに再懸濁して１μｇ／Ｌの最終濃度とした。
【０１１８】
粒子銃衝撃（米国特許第５，９５５，６５０号）を使用して、ダイズ体細胞胚細胞であるＡｓｇｒｏ　２８７２／８２１の２週齢培養物をプラスミドｐＬＳ３およびｐＬＳ４で形質転換した。衝撃は、デュポンバイオリスティックＰＤＳ１０００／ＨＥ（ＤｕＰｏｎｔ　Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ　ＰＤＳ１０００／ＨＥ）装置（ヘリウム装填）において、１１００ｐｓｉ膜破壊圧および２７〜２８インチＨｇチャンバ減圧で行った。１０個の細胞プレートを、二重衝撃によりそれぞれの構築物について形質転換した。衝撃後、細胞をＳＢ１７２（４．６ｇ／Ｌのデュフェファ（Ｄｕｃｈｅｆａ）ＭＳ塩、１ｍＬの１，０００×Ｂ５ビタミン、１０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、６０ｇ／Ｌのショ糖、６６７ｍｇ／Ｌのアスパラギン、ｐＨ５．７）中で１１日間インキュベートし、そして形質転換クローンを、５０ｍｇ／ＬのヒグロマイシンＢを含有するＳＢ１７２中、次の２ヶ月の間に選択した。以下の３段階のスケジュールに従い、連続的に該クローンを培養することによって、胚組織のさらなる成熟のために６０個のｐＬＳ３および３０個のｐＬＳ４形質転換クローンを選択した：（１）ＳＢ１６６（３４．６ｇ／Ｌ　ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ　ＭＳ塩、１ｍＬ／Ｌの１，０００×Ｂ５ビタミン、６０ｇ／Ｌのマルトース、７５０ｍｇ／ＬのＭｇＣｌ２６水和物、５ｇ／Ｌ活性炭、２ｇ／Ｌゲルライト（ｇｅｌｒｉｔｅ）、ｐＨ５．７）上で１週間；（２）ＳＢ１０３（ＳＢ１６６と同じ、但し活性炭を含まない）上で３週間；（３）ＳＢ１４８（７ｇ／Ｌのアガロースを２ｇ／Ｌゲルライトの代わりに使用したことを除いてＳＢ１０３と同じ）上で２週間。実験経過中は、２６℃の制御された条件、１６：８時間での日／夜光照射期間、および３０〜３５μＥ／ｍ２ｓの光度下で、両液体および固体培地中の組織培養を維持した。
【０１１９】
ダイズ体細胞胚におけるＤＰ−１Ｂタンパク質発現の試験
成熟ダイズ体細胞胚集団をｐＬＳ３およびｐＬＳ４で形質転換した。それぞれの集団は、独立した形質転換事象を提示し、そしてヒグロマイシンＢ耐性表現型を示した。衝撃を受けたプラスミドはほとんどの形質転換事象において胚細胞の染色体に組み込むと考えら得ているため、ｐＬＳ３およびｐＬＳ４の種子特異的ＤＰ−１Ｂ発現カセットは、該染色体に存在し、従って、ＤＰ−１Ｂタンパク質を発現すべきである。
【０１２０】
トランスジェニックダイズ体細胞胚においてＤＰ−１Ｂタンパク質発現を試験するために、生体材料粉砕機（ｂｉｏｐｕｌｖｅｒｉｚｅｒ）（ファストプレップ（ＦａｓｔＰｒｅｐ）ＦＰ１２０，　ＢＩＯ１０１，　Ｖｉｓｔａ，　ＣＡ）において、２００μＬのタンパク質抽出緩衝液中で、約２００ｍｇのｐＬＳ３およびｐＬＳ４トランスジェニック胚組織からタンパク質抽出物を調製した。遠心分離によって上清を回収し、そしてバイオ−ラドタンパク質アッセイ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ）を使用することによってタンパク質濃度を決定した。野生型ダイズ胚組織を実験の対照として用いた。これらのタンパク質をタンパク質イムノブロットアッセイで使用し、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）形質転換のセクションで記載した方法に従って、トランスジェニックダイズ胚組織におけるＤＰ−１Ｂタンパク質発現の質および量を決定した。
【０１２１】
イムノブロットアッセイのために、１０μＬの胚タンパク質抽出物由来の可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に移し、次いで、ＤＰ−１Ｂ　Ａｂｓを使用して検出した。抗体と胚タンパク質との間には交差反応があるため、形質転換体のタンパク質抽出物からの抗体および対照によって、多くの非ＤＰ−１Ｂタンパク質を検出した。しかし、結果は、６５ｋＤのＤＰ−１Ｂ．８Ｐタンパク質は、７個のｐＬＳ３胚形質転換体において有意なレベルまで蓄積したことを明確に示した。３０個のいずれのｐＬＳ４形質転換体からも１２７ｋＤのＤＰ−１Ｂ．１６Ｐタンパク質の蓄積は検出されなかった。さらに、若干のＤＰ−１Ｂ．８Ｐトランスジェニックダイズ体細胞胚もまた、ＤＰ−１Ｂ　Ａｂｓで認識されたより小さなタンパク質を蓄積したことから、導入遺伝子の発現中にＤＮＡ組換えおよび他の分子修飾が起きた可能性が示唆される。該７個のｐＬＳ３胚形質転換体におけるＤＰ−１Ｂ．８Ｐの発現レベルは、イムノブロットアッセイによって推定し、先に記載のように、抗Ｈｉｓ（Ｃ末端）−ＨＲＰ　Ａｂでプローブ探査した。結果を表３にまとめる。
【０１２２】
【表５】
2004511429.tif 000007
【０１２３】
表３に示すように、ＤＰ−１Ｂ．８Ｐ発現レベルは、全可溶性ダイズ胚タンパク質のうち０．５４％〜１．６４％の範囲（約０．２２％〜０．６６％の乾燥重量）であり、平均収量では全可溶性ダイズ胚タンパク質の１．０％（約０．４％の乾燥重量）であった。（著者注：乾燥重量の４０％はタンパク質であり、すべてのタンパク質は胚組織に可溶であるとする。）
【０１２４】
抗体−生来のタンパク質の交差反応を克服するために、イムノブロットアッセイの前に、トランスジェニックおよび野生型（対照）ダイズ体細胞胚組織のタンパク質抽出物を、Ｎｉ−ＮＴＡスピンキット（Ｎｉ−ＮＴＡ　Ｓｐｉｎ　Ｋｉｔ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）Ｖａｌｅｎｃｉａ，　ＣＡ）を使用して部分精製した。簡単に説明すると、４００μＬの溶解緩衝液を添加することによって、２００ｍｇの胚組織から作製されるタンパク質を希釈し、次いで、予め平衡化したＮｉ−ＮＴＡスピンカラムに充填する。７００×ｇで２分間遠心分離して、抽出物中のＤＰ−１Ｂタンパク質をカラムに結合させ、６００μＬの洗浄緩衝液で２回洗浄し、そして最終的に２００μＬの溶出緩衝液で溶出させた。２０μＬの部分精製タンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上を走行させ、そしてイムノブロットアッセイによって試験した。ＤＰ−１Ｂ　Ａｂｓで探査されるアッセイにより、ダイズ体細胞胚の該選択された７個のｐＬＳ３形質転換体において、６５ｋＤのＤＰ−１Ｂ．８Ｐタンパク質の蓄積を確認した。該アッセイでは、１２７ｋＤのＤＰ−１Ｂ．１６Ｐタンパク質は、ｐＬＳ４トランスジェニック胚では検出可能なレベルにまでには蓄積しないことも確認された。結果を図１３Ａに示す。抗Ｈｉｓ（Ｃ末端）−ＨＲＰの探査によるイムノブロットアッセイは、さらに、Ｎ末端の６×Ｈｉｓタグが認識されたことから、すべての蓄積されたＤＰ−１Ｂ．８Ｐが全長分子からなることを実証した（図１３Ｂ）。さらに、抗Ｈｉｓ（Ｃ末端）−ＨＲＰはまた、胚タンパク質抽出物中の若干のより短いタンパク質分子を認識したが、これは図１３Ｂの右側のパネルに示してある。これらのタンパク質は、野生型の胚のタンパク質抽出物からも検出されたことから、それらは、導入遺伝子の産物ではなく、むしろ生来の胚タンパク質であるはずであると結論される。
【０１２５】
ダイズ体細胞胚のゲノムにおける導入遺伝子挿入の確認
ヒグロマイシンＢ選択に対して生存しているダイズ胚コロニーのほとんどは、トランスジェニック胚であると予想されたが、それらの多くはＤＰ−１Ｂタンパク質を蓄積しなかった。ＤＰ−１Ｂ．８ＰおよびＤＰ−１Ｂ．１６Ｐ導入遺伝子が胚の染色体に組み込むことをさらに実証するために、該胚組織および対照野生型胚から、ＤＮイージー植物ミニキット（ＤＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）Ｖａｌｅｎｃｉａ，　ＣＡ）を使用して、ＤＮＡサンプルを調製した。調製では、１００μＬのＤＮＡ溶液中１００ｍｇ胚組織を、製造者の指示に従って使用した。各調製物のＤＮＡ濃度および純度は、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＤＵ６４０分光光度計でＯＤ２６０およびＯＤ２８０値を測定することによって推定した。ＤＮＡサンプルを先に記載の通りにＰＣＲ反応に供した。プライマー５’コングリシニン−Ｆ（５’ＣＣＣ，ＧＴＣ，ＡＡＡ，ＣＴＧ，ＣＡＴ，ＧＣＣ，ＡＣ３’）（配列番号２８）およびプライマー５’コングリシニン−Ｒ（５’ＴＡＧ，ＣＣＡ，ＴＧＧ，ＴＴＡ，ＧＴＡ，ＴＡＴ，ＣＴＴ３’）（配列番号２９）を使用して、β−コングリシニンプロモーターの１６０ｂｐフラグメントを増幅した。反応物を、エチジウムブロミドを含有するアガロースゲル上で分離し、結果をＵＶ光で視覚化した。結果を図１３Ｃに示す。図１３Ｃは、予想されるＤＮＡ産物を示し、ＤＰ−１Ｂ導入遺伝子の組込みを確認した。
【０１２６】
実施例８
アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ホモ接合性植物選択および大規模生育からのＤＰ−１Ｂタンパク質の精製
大量の出発物質を得るために、ホモ接合性トランスジェニック植物を、直接土壌生育を対象に選択した。Ｔ１植物は形質転換された花から回収した種子として定義される。Ｔ１植物はＴ１種子から発芽した植物である。Ｔ２種子は、Ｔ１植物から回収したものである。Ｔ２種子が発芽する場合、得られる植物をＴ２植物と呼ぶ。第１に、実施例５に記載のように、Ｔ２種子を、葉組織において全可溶性タンパク質の９．２％までのＤＰ−１Ｂ．８Ｐタンパク質を発現するｐＧＹ４０１トランスジェニックアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）から回収した。アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の自家受精性のため、ヘテロ接合性およびホモ接合性子孫は、Ｔ２種子回収物のうちそれぞれ５０％および２５％の集団を示す。これらのＴ２種子は、Ｔ２植物として一次選択培地上で発芽し、そのうちの１２個は、先に記載の方法で成熟するまでメトロミックス（Ｍｅｔｒｏ　Ｍｉｘ）土壌内で生育させた。１２植物のそれぞれからＴ３種子を収穫し、一次選択培地上で個別に発芽させた。ホモ接合性Ｔ３種子のみがＴ３植物として、分裂を示すことなく第２選択培地上で発芽し得る。従って、Ｔ４種子はさらなる使用のために、該ホモ接合性Ｔ３植物から回収した。
【０１２７】
より大規模な生育のために、上記で調製したＴ４ホモ接合性種子を発芽させ、２０×１０インチ平面、１平面あたり約１，０００個の種子の密度でメトロミックス（Ｍｅｔｒｏ　Ｍｉｘ）土壌の頂部で生育させた。より大きなロゼットを確実にするために、１０時間未満の天然採光を備えた植物を２２℃に温度制御された温室内で育成させた。抽薹前に植物を収穫し、液体窒素で処理し、そして−８０℃で貯蔵した。先に記載のように、イムノブロットならびにＰＣＲアッセイによって、それぞれＤＰ−１Ｂ．８Ｐ導入遺伝子挿入およびトランスジェニック植物におけるタンパク質合成を確認した。
【０１２８】
ＤＰ−１Ｂ．８Ｐタンパク質の精製
ＤＰ−１Ｂタンパク質精製プロトコルを展開した。該プロトコルでは、ＳＬＰの特別な沈殿特性を利用して、下記のように、植物の生来のタンパク質からＤＰ−１Ｂタンパク質を分離する：
（１）植物ロゼットを５×容積の氷冷タンパク質抽出緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ　ｐＨ８．０、１２．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭ　ＤＴＴ、５％グリセロール）中、料理用ミキサーを使用してホモジナイズした。６層のチーズクロスを通してホモジネートを濾過し、次いで、１０，０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。上清をタンパク質抽出物とした。
（２）撹拌しながらタンパク質抽出物に濃ＨＣｌをｐＨ４．７まで少量ずつ添加した。抽出物を４℃で３０分間置き、次いで、１０，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、タンパク質沈殿物を取り出した。１０Ｎ　ＮａＯＨを少量ずつ添加することによって、上清のｐＨ値を８．０に戻した。得られた溶液をｐＨ４．７の上清として保存した。
（３）ｐＨ４．７の上清を６０℃水浴中で６０分間熱処理に供し、次いで１０，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離して、タンパク質沈殿物を取り出した。単層の２０μｍナイロンメッシュを通して上清を濾過し、保存した。上清を「６０℃上清」と命名した。
（４）氷冷水浴中で撹拌しながら６０℃上清に４０％飽和まで（ＮＨ４）２ＳＯ４を少量ずつ添加し、溶解した。溶液を４℃で１晩置き、次いで１０，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。上清を「（ＮＨ４）２ＳＯ４上清」と命名し、保存した。タンパク質沈殿物を再懸濁し、そしてタンパク質抽出緩衝液に対して透析することにより、本来の容積の１５分の容積でＤＰ−１Ｂ．８Ｐタンパク質溶液を得た。
【０１２９】
精製過程中の全タンパク質プロフィールを試験するために、各工程のタンパク質サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ここで、該ＳＤＳ−ＰＡＧＥは２０μＬタンパク質抽出物（図１４Ａ、レーン１）、２０μＬ　ｐＨ４．７上清（図１４Ａ、レーン２）、２０μＬ６０℃の上澄み（図１４Ａ、レーン３）、１０μＬ（ＮＨ４）２ＳＯ４沈殿再懸濁物（図１４Ａ、レーン４）、および２０μＬ（ＮＨ４）２ＳＯ４上清を含んだ。ゲルをクーマシーブルー染色溶液（０．２５％クーマシーブルーＲ−２５０、２０％メタノール）で１晩染色し、次いで、７％酢酸および５％メタノールで脱染色した（図１４Ａ）。独特なアミノ酸組成のため、ＤＰ−１Ｂタンパク質はクーマシーブルー染色または他の従来の染色方法で可視化することができなかった。しかし、図１４Ａはプロトコルの各工程が抽出物から有意な量の植物生来タンパク質を取り出すことを示している。（ＮＨ４）２ＳＯ４沈殿画分（図１４Ａ、レーン４）では、９５％を超える植物生来タンパク質が除去されている。
【０１３０】
ＤＰ−１Ｂタンパク質の精製をモニターするために、同一のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲルをニトロセルロース膜に移し、先に記載の方法でイムノブロットアッセイに供した。ＤＰ−１Ｂ抗体を一次抗体および抗ウサギＩｇＧ　ＨＲＰを二次抗体として使用した。図１４Ｂの結果は、６４ｋＤのＤＰ−１Ｂ．８Ｐタンパク質が、精製工程中の（ＮＨ４）２ＳＯ４上清を除く試験したすべての画分に存在することを示す。それは、４０％（ＮＨ４）２ＳＯ４タンパク質沈殿物の再懸濁液中に極端に富化されている（図１４Ａ、レーン４）。本発明者らは、ｐＨ６．７および６０℃タンパク質沈殿画分についても試験したところ、ＤＰ−１Ｂ．８Ｐタンパク質は検出されなかった（データ示さず）。従って、ＤＰ−１Ｂタンパク質は、ＮＨ４）２ＳＯ４沈殿画分に濃縮されている。
【０１３１】
結論として、本発明者らは、ＤＰ−１Ｂタンパク質を濃縮する一方、９５％を超える植物生来タンパク質を取り出す簡単なＤＰ−１Ｂ精製プロトコルを開発した。６×ヒスチジンタグがＤＰ−１Ｂタンパク質のＣ末端に付着しているため、Ｎｉカラムクロマトグラフィーによってタンパク質をより高い純度でさらに精製することができるかもしれない。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＧＹＳアダプターを担持するｐＧＹ００１のプラスミド地図である。
【図２Ａ】ＤＰ−１Ｂ．８Ｐ遺伝子を担持するｐＧＹ１０１のプラスミド地図である。
【図２Ｂ】ＤＰ−１Ｂ．１６Ｐ遺伝子を担持するｐＧＹ１０２のプラスミド地図である。
【図３Ａ】ＧＵＳレポーターを駆動する３５Ｓ／Ｃａｂ２２１プロモーターを担持するｐＭＬ６３のプラスミド地図である。
【図３Ｂ】β−コングリシニンプロモーターを担持するｐＣＷ１０９のプラスミド地図である。
【図４Ａ】３５Ｓ／Ｃａｂ２２１プロモーターの制御下でＤＰ−１Ｂ．８Ｐ遺伝子を担持するｐＧＹ２０１のプラスミド地図である。
【図４Ｂ】３５Ｓ／Ｃａｂ２２１プロモーターの制御下でＤＰ−１Ｂ．１６Ｐ遺伝子を担持するｐＧＹ２０２のプラスミド地図である。
【図５Ａ】β−コングリシニンプロモーターの制御下でＤＰ−１Ｂ．８Ｐ遺伝子を担持するｐＧＹ２１１のプラスミド地図である。
【図５Ｂ】少数の制限部位を有するβ−コングリシニンプロモーターの制御下でＤＰ−１Ｂ．８Ｐ遺伝子を担持するｐＧＹ２１３のプラスミド地図である。
【図６】ＮＯＳプロモーター駆動性ＮＰＴＩＩ遺伝子を有するＴ−ＤＮＡ領域を担持するバイナリーベクターｐＺＢＬ１のプラスミド地図である。
【図７Ａ】Ｔ−ＤＮＡ領域が、ＮＯＳ駆動性ＮＰＴＩＩに接続した３５Ｓ／Ｃａｂ２２１プロモーターの制御下でＤＰ−１Ｂ．１６Ｐを含んでなる発現カセットを含む、ｐＧＹ４０１のプラスミド地図である。
【図７Ｂ】Ｔ−ＤＮＡ領域内に３５Ｓ／Ｃａｂ２２１プロモーターの制御下でＤＰ−１Ｂ．１６Ｐを含有する発現カセットを含むｐＧＹ４０２のプラスミド地図である。
【図８Ａ】Ｔ−ＤＮＡ領域が、β−コングリシニンプロモーターの制御下でＤＰ−１Ｂ．８Ｐ遺伝子を含む、ｐＧＹ４１１のプラスミド地図である。
【図８Ｂ】Ｔ−ＤＮＡ領域内にβ−コングリシニンプロモーターの制御下でＤＰ−１Ｂ．１６Ｐを担持するｐＧＹ４１２のプラスミド地図である。
【図９Ａ】Ｔ１トランスジェニックアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の葉および種子におけるＤＰ−１Ｂタンパク質の蓄積を示すイムノブロットである。
【図９Ｂ】ＤＰ−１Ｂタンパク質の完全Ｃ末端を示すイムノブロットである。
【図９Ｃ】アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）染色体における導入遺伝子を示すＤＮＡアガロースゲルである。
【図１０Ａ】Ｔ２トランスジェニックアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の葉および種子におけるＤＰ−１Ｂタンパク質の蓄積を示すイムノブロットである。
【図１０Ｂ】Ｔ２アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の染色体における導入遺伝子を示すＤＮＡアガロースゲルである。
【図１１Ａ】３５Ｓプロモーターの制御下でＨＰＴ遺伝子を担持するｐＺＢＬ１０２のプラスミド地図である。
【図１１Ｂ】β−コングリシニンプロモーターの制御下でＤＰ−１Ｂ．１６Ｐを担持するｐＧＹ２２０のプラスミド地図である。
【図１２Ａ】ダイズ胚の形質転換のためにβ−コングリシニンプロモーター−ＤＰ−１Ｂ．８Ｐ構築物を担持するｐＬＳ３のプラスミド地図である。
【図１２Ｂ】ダイズ胚の形質転換のためにβ−コングリシニンプロモーター−ＤＰ−１Ｂ．１６Ｐ構築物を担持するｐＬＳ４のプラスミド地図である。
【図１３Ａ】トランスジェニックダイズ体細胞胚におけるＤＰ−１Ｂタンパク質の蓄積を示すイムノブロットである。
【図１３Ｂ】ＤＰ−１Ｂタンパク質の完全Ｃ末端を示すイムノブロットである。
【図１３Ｃ】ダイズ体細胞胚の染色体における導入遺伝子を示すＤＮＡアガロースゲルである。
【図１４Ａ】実施例８で使用したアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物ロゼットの精製画分における総タンパク質プロフィールのクーマシーブルー染色である。
【図１４Ｂ】図１４Ａに記載の精製画分におけるＤＰ−１Ｂタンパク質のイムノブロット検出である。
【図３Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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