(57)【要約】抗原に対する適応免疫応答を誘発するための、フラジェリンタンパク質またはそのペプチド断片の有効量の患者への投与を含んで成る抗原に対する患者の適応免疫応答を誘発するための方法を供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における標的抗原に対する適応免疫応答を誘発する方法であって、上記応答を誘発するための有効量において、上記患者への、フラジェリンタンパク質、またはそのペプチド断片の投与を含んで成る方法。
【請求項２】
上記フラジェリンまたはそのペプチド断片が直接的に樹状細胞の免疫応答を誘発することが可能な、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記樹状細胞の成熟度が増加される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記フラジェリンまたはそのペプチド断片が粘膜経路で投与される、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
上記フラジェリンまたはそのペプチド断片が経口または鼻腔内投与である、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
上記フラジェリンタンパク質がフラジェリンのＮ末端配列およびＣ末端配列の、１以上の保護領域を含む、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
上記フラジェリンタンパク質が、図８においてアンダーラインで示した、ネズミチフス菌（S.typhimurium）の残基１-１９０および３５４-４９４の１以上の保護領域を含む、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
上記フラジェリンタンパク質またはペプチド断片および上記標的抗原が共-投与される、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
適応免疫応答の誘発のための薬剤の製造におけるフラジェリンタンパク質またはそのペプチド断片の使用。
【請求項１０】
前記薬剤が適応免疫反応を誘発するような粘膜的予防接種における未成熟樹状細胞の漸増を誘発するためのものとして特徴づけられる請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
上記薬剤がアジュバントであることにより特徴づけられる、請求項９または１０に記載の使用。
【請求項１２】
上記免疫応答を誘発するための能力を保持することを許容する、上記タンパク質またはペプチド断片が、切断され、突然変異され、またはその中に欠損を有することにより特徴づけられる治療における使用のためのフラジェリンタンパク質またはそのペプチド断片。
【請求項１３】
腸内または上皮細胞のフラジェリン受容体と結合する能力を保持し、そして免疫シグナリングを保持することを特徴とする、請求項１２に記載のフラジェリンタンパク質またはペプチド断片。
【請求項１４】
上記フラジェリンタンパク質が、図８においてアンダーラインで示した、ネズミチフス菌（S.typhimurium）の残基１-１９０および３５４-４９４の１以上の保護領域を含むことを特徴とする、請求項１２または請求項１３に記載のフラジェリンタンパク質またはペプチド断片。
【請求項１５】
医薬的に受容可能な担体、添加剤もしくは希釈剤を伴う、または無菌の発熱物質のない形態における請求項１２から１４のいずれか１項に記載のフラジェリンタンパク質またはそのペプチド断片を含んで成るアジュバント組成物。
【請求項１６】
請求項１５に記載のアジュバント組成物および標的抗原を含んで成るワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗原に対する患者の免疫応答、特に、腸内上皮細胞のような粘膜組織における適応免疫応答の刺激または誘発に関する。また、本発明は新規な、変異および切頭したフラジェリンタンパク質およびそれらをコードしている核酸を供する。
【背景技術】
【０００２】
腸管は通常のフローラの細菌および、同様に腸内病原性微生物にとって特有な最適な場所である。腸内上皮はホストの環境から内腔の環境を分ける物理的障壁を構成するだけでなく、腸内面において損傷を検知するセンチネルとして振舞う。腸内病原細菌は上皮にコロニーを形成し、そしてその上皮細胞との密接な相互作用は前炎症シグナル経路を活性化する（１-３）。この先天的な反応は細菌の素早い除去に必要である。適応免疫はまた、再感染を防止するために刺激されるが、腸管上皮における、この反応の開始機構は未だ解明されていない。
【０００３】
樹状細胞（ＤＣ）は最初の免疫応答を誘発するための特有の能力を有する骨髄由来の抗原を提示する細胞である。そのため、ＤＣの上皮への漸増は、適応応答を開始するために不可欠である。ＤＣの往来はＣＣＲ６およびＣＣＲ７ケモカイン受容体の特異的な発現に依存する（４-７）。ＣＣＬ２０ケモカインはＬＡＲＣ，ＭＩＰ-３アルファとしても知られており、ＥｘｏｄｕｓはＣＣＲ６受容体のリガンドである（８）。未成熟なＤＣはＣＣＲ６を発現し、効果的に可溶で微粒な抗原を受け取る（９を参照のこと）。ＤＣの成熟化は危険シグナル、すなわち、細菌、ウイルス、または細胞の構成要素によって誘発され、そして抗原の提示、共通の刺激分子およびその排出しているリンパ節への活性化ＤＣの移動を媒介するＣＣＲ７ケモカイン受容体の上昇調節により特徴づけられる。ＣＣＬ２０遺伝子はネズミのパイエル板および結腸並びに人の結腸、虫垂、扁桃腺および皮膚ケラチノサイト上の上皮において発現する（４、６-８、１０、１１）。ＣＣＲ６-発現ＤＣはＣＣＬ２０-発現上皮細胞またはケラチノサイトに近い組織において発見される（６、７、１０）。ＣＣＲ６-ノックアウトマウスにおいて、上皮下の骨髄のＤＣはパイエル板のドームにおいて不在であり、粘膜系免疫応答は機能しない（７）。それらの発見は腸管における適応応答の誘発において往来しているＣＣＬ２０-依存ＤＣの役立つ役割を強調している。
【０００４】
腸内病原細菌は通常のフローラと競合し、そして先天的な防衛に打ち勝つために特定の毒性要因を生産する。腸内進入性細菌（例えば、サルモネラ（Salmonella）、シゲラ（Shigella）、イェルシニア（Yersinia）、リステリア（Listeria)）はパイエル板のＭ 細胞を経由して上皮に付着し、そして進入する（１２）。上皮下に移動後、それらはエンテロサイトまたは食細胞に進入し、および/または複製する。進入する細菌はタイプIII 分泌系を経由して細胞の細胞質に注入された毒を使用して、細胞表面の受容体またはサイトゾルのターゲットとの相互作用により、細胞のシグナリングの経路を変える（３、１３）。哺乳類において腸炎を引き起こす様々な血清型サルモネラエンテリカ（Salmonella enterica）は粘膜の炎症と下痢によって特徴づけられる。サルモネラ（Salmonella）は小嚢腺に沿って小腸の絨毛軸まである腸の内側細胞の先端まで侵入することができる唯一の細菌である（１４）。人の腸内上皮細胞において、サルモネラ（Salmonella）-誘発炎症性応答はＩＬ-８（ＣＸＣＬ８）および上皮下区画において好中性白血球を漸増する様々な前炎症性ケモカインの基礎分泌によって特徴づけられる（１、１５、１６）。ＩＬ-８分泌の誘発はサルモネラ（Salmonella）の毒性要因および上皮ＮＦ-ｋＢシグナリングに依存する（１、２、１７、１８）。
【０００５】
本発明者は細菌に対する応答において、腸内上皮ケモカインの放出が、適応免疫を開始する免疫細胞を漸増できるかを調査してきた。彼らは以前にネズミチフス菌（S.typhimurium ）のフラジェリンが上皮細胞からＣＣＬ２０ケモカインの分泌を刺激し、それがＤＣ走化性の引き金となることを報告している（ PNAS 98 (24) 13722-13727,Nov 20th 2001 )。彼らはまた、前炎症性ケモカインＩＬ-８の発現が腸内上皮細胞におけるフラジェリンによって誘発されることを観察した（Gewirtz 他)。
【０００６】
本発明者は補助刺激分子の上昇調節およびＭＨＣクラスII制限応答のための機能を示すことにより示されたように、フラジェリン、および特にサルモネラ（Salmonella）のフラジェリンが樹状細胞の直接の成熟化を誘発することを示した。樹状細胞はリンパ球に対する、抗原の最適および有効な提示のための必須条件として成熟する。
【０００７】
本発明者はフラジェリン、および特にサルモネラ（Salmonella）のフラジェリンが免疫応答を誘発するために使用することができることを示した。彼らは、皮下および鼻腔内の免疫経路の後、周辺および粘膜組織においてこれを示した。本発明は上皮細胞および直接的に樹状細胞においてシグナリングを刺激するための、全身および粘膜部において、抗体ならびに細胞媒介の免疫応答の増加をもたらすフラジェリンおよびそのホモログ（変異もしくは切断した、またはその断片であるペプチド）の使用を供する。
【０００８】
本発明はさらに修飾した、すなわち、突然変異または切頭したフラジェリンを供する。このような修飾したフラジェリンは、活性化部位、すなわち樹状細胞および上皮細胞上のＴｏｌｌ-Ｌｉｋｅ受容体（ＴＬＲｓ）またはＴＬＲ関連補受容体）と結合してそれらを活性化し、これらの受容体のシグナル分子としてふるまうだろう。
【０００９】
本発明者はサルモネラ（Salmonella）のフラジェリンが特に上皮腸内細胞によって、未成熟の樹状細胞の走化性をもたらすＣＣＬ２０ケモカインの発現および分泌を刺激することを示した。このようなＤＣの移動は、鞭毛のある腸内病原細菌の摂取、しかる後の腸管における適応免疫応答の誘発に必要な、抗原プロセシングおよび提示のために不可欠であろう。
【００１０】
さらに、ＭＨＣクラスＩエピトープで皮下注射した場合、フラジェリンはＩＦＮ-γを生産するためにＣＤ８+リンパ球を刺激し、樹状細胞上の補助刺激性分子の上昇調節は樹状細胞上のＭＨＣクラスＩ分子上に表出されたペプチドに対して向けられる細胞障害性Ｔリンパ球(ＣＴＬ）の機能を活性化するのに十分であることを示唆している。そのため、フラジェリンは特に、共投与したＭＨＣクラスＩ制限ペプチドに対するＣＤ８免疫応答のアジュバントとして有用である。
【００１１】
フラジェリンは種々の細菌株中に広く分布し、そして保存されている（２５）。細胞シグナリングに関するドメインは、保存領域、すなわち１７０アミノ-および９０カルボキシ-末端残基に存在することを示しているネズミチフス菌（S.typhimurium ）のFliCおよびFljBならびにゲルトネル菌（S.enteritidis）のFliC分子により共有される。
【００１２】
遺伝学および生物化学的ストラテジーを使うことにより、本発明者はこの度、アミノおよびカルボキシ末端領域は細胞シグナリングに必要であることを明らかにした。中央領域（１９１から３５３残基のあいだ）（それは様々なサルモネラ（Salmonella）血清型および様々な細菌株由来のフラジェリン中で不定である）は細胞シグナリングの役割を果たさない。
【００１３】
リステリア・モノシトゲネス（L.monocytogenes ）を含むグラム陰性および陽性菌由来のフラジェリンはピコモル範囲において前炎症性である（発明者の観察および（２１、２４、２６-２８））。このため、フラジェリンは病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）のすべての特徴を供する。
【００１４】
Ｔｏｌｌ-Ｌｉｋｅ受容体（ＴＬＲ）は哺乳類、植物および昆虫ＰＡＭＰのシグナル伝達に関係する（２９）。最近、ＴＬＲ５はトランスフェクションされた哺乳類の細胞におけるフラジェリン依存シグナリングを媒介することが示された（２８）。ＴＬＲ５はＣａｃｏ-２細胞において発現し（３０）、腸管においてフラジェリンがＴＬＲ５を介してケモカイン発現の引き金となりうることを示唆している。さらに、人の腸内において、ＴＬＲ５はエンテロサイトの頂上および基部の表面で検出される（３０）。ＬＰＳ（周辺組織または無菌の粘膜組織における損傷をシグナルする）は、グラム陰性菌が豊富な腸管の内腔において不活性である。腸管は他のＰＡＭＰを使用して、危険のための発達した検出系を有する。フラジェリンはひとつのＰＡＭＰ候補であるが、他の細菌要素は粘膜の細胞シグナリングに関係する。例えば、大腸菌（E.coli P）の泌尿器の上皮におけるフィムブリエはＴＬＲ４を介して炎症の引き金となる（３１）。
【００１５】
発明者は様々な腸内病原ではあるが、共生細菌ではない細菌はＣＣＬ２０およびＩＬ-８遺伝子発現を刺激することを示した。病原菌において、鞭毛は感染の間に発現し、そしてそれに関連した運動性は感染力にとって必須である（３）。また、病原細菌は特有の付着および/または進入、および/または上皮細胞の損傷のために毒性要因を生産する（３）。共生細菌もまた鞭毛を備えうる。しかしながら、たとえin vivoで発現したとしても、おそらく共生細菌の鞭毛は上皮細胞と接触しないであろう。その細菌フローラはルミナルコンパートメントおよび粘膜層に制限される（３２）。我々は、in vivoにおいて、腸内病原細菌だけが、フラジェリンを上皮細胞表面に密着させて、細胞シグナリングの誘発をもたらすことを提案する。あるいは、非病原細菌は上皮、フラジェリン媒介シグナリングの欠如ももたらし得るメカニズムである前炎症的カスケードを下降調節することが示された（３３）。
【００１６】
腸管は在住細菌を含むほとんどの内腔物質に対して耐性がある。安定した条件下で、未成熟なＤＣは、おそらく恒常的に形成されるＣＣＬ２０-依存メカニズムを介して継続的に腸管に入っており、抗原を採取している（４、７）。補刺激の欠如においてＤＣによる抗原提示が起きるので、耐性を誘発するため（３４を参照のこと）に腸管の損傷の欠如および/または抗炎症性の環境が提案された。ＣＣＬ２０およびＩＬ-８の転写の活性化カップリングは腸管中の保護的免疫応答の誘発のために不可欠であろう。フラジェリンは上皮細胞において前炎症性ＩＬ-８ケモカインの発現を誘発することがすでに知られている（２１、２４、２７）。もたらされた炎症は、ＤＣの成熟のために必要とされる危険シグナル、特にＴＮＦ-アルファおよびＩＬ-１サイトカインを供する。このため、フラジェリン刺激を得たＤＣは完全に活性化され、そして適応応答のための有力な刺激物となることができる。ＣＣＬ２０によるメモリーＣＤ４およびＢリンパ球の漸増もまた、腸管における免疫の一因となることができる（３５）。
【００１７】
ＩＬ-８およびＣＣＬ２０遺伝子の転写活性化はＮＦ-ｋＢ（ｐ６５/ｐ６５およびｐ５０/ｐ６５）によって媒介される。（１１、１８）。ｐ６５結合部位はＩＬ-８およびＣＣＬ２０の両方の調節性配列に存在する（ＡＴＧから-150 bp のコンティグNT022115.2,)。これはフラジェリン依存のＴＬＲ５-媒介ＮＦ-ｋＢシグナリングに一致する（２８）。しかしながら、ＩＬ-８およびＣＣＬ２０の発現のカップリングは完全ではない。ＩＬ-８遺伝子の転写は、熱滅菌した細菌またはフラジェリンに対してさらされた上皮細胞と比べ、生きたサルモネラにさらされた上皮細胞において有意に高く、一方ＣＣＬｍＲＮＡは一定のままであった。そのためＣＣＬ２０発現の活性化は特異的にフラジェリンに依存しているように見える。一方、ＩＬ-８転写は前述したように生きた細菌によって伝達される他の構成要素によって調節される（１、２、３３）。
【００１８】
腸内病原微生物と上皮細胞との相互作用において漸増した未成熟ＤＣは、細菌の生存および散在のために最適な場所を構成しうる。ネズミチフス菌（S.typhimurium）はパイエル板において上皮下のＤＣに取り込まれる（３６）。ＤＣにおけるネズミチフス菌（S.typhimurium）の生存はマクロファージにおける細胞内の生存に必要な毒性要因には依存しない（３７）。このため、上皮下の未成熟ＤＣは細菌を腸からより深い器官、例えば腸間膜リンパ節、脾臓または肝臓（そこでマクロファージに送達される）へと運ぶための最も有力な候補である。フラジェリンのケモカイン-刺激活性はＤＣのパイエル板および絨毛の上皮下部への移動を増強するために不可欠なはずである。ＤＣを介した散在はリステリア・モノシトゲネス（L.monocytogenes ）で説明されている（３８）。
【００１９】
サルモネラ（Salmonella）と同様にリステリア・モノシトゲネス（L.monocytogenes ）は、他の毒性要因と同等に発現される鞭毛を生産する。リステリア（Listeria）の鞭毛がＣＣＬ２０の誘発因子であるか否か、未成熟ＤＣがこれらの細菌のための媒体であるか否かは病原性を明らかにするための重要な問題である。最近、Rescignoおよび共同者はin vitoro およびin vivoの両方において、内腔の細菌を採取するために、マウスのＤＣが腸内上皮に浸透することを報告した（３９）。ＤＣの急速な移動が、Ｃａｃｏ-２細胞において観察されるＣＣＬ２０誘発と並行しないため、このプロセスがフラジェリン-およびＣＣＬ２０-媒介であるか否かを試験すべき事項が残されている。しかしながら、回腸をくくったマウスにおいて、フラジェリンの投与はパイエル板および絨毛におけるＣＣＬ２０遺伝子の転写の誘発をもたらす（図１０）。これらの観察は腸管上皮でのフラジェリンの効果は生理的な関連があることを示す。
【００２０】
先天的および適応的免疫において、フラジェリンシグナリングの能力は粘膜のワクチン接種において新しい可能性を供する。
【００２１】
単量体フラジェリンは、ＣＣＬ２０-媒介の樹状細胞の漸増をもたらす上皮腸内細胞において信号を送る。粘膜部位における樹状細胞の漸増は、排出しているリンパ節において、抗原およびワクチンの有効な取り込み、プロセシングおよび提示を行う。そのため、共投与した抗原への免疫応答を増強するように機能する。
【００２２】
ＣＣＲ６（未成熟樹状細胞において発見されるＣＣＬ２０の受容体）ノックアウトマウスがこれらの反応において損なわれていることから、ＣＣＬ２０は粘膜免疫応答において役立つようにみえる。さらに、ＤＣの往来は適応免疫応答を高めるために不可欠であることが知られている。
【発明の開示】
【００２３】
このように、このたび、本発明者は、フラジェリンまたはフラジェリン断片が、上皮細胞および樹状細胞経由での適応免疫応答を誘発ために使用できることを示した。例えば、抗原に対する適応免疫応答を刺激し、増大し、または開始する。上記抗原は免疫応答を誘発または増強するために所望される、いかなる標的抗原であってよく、上記抗原は例えば、病原微生物として患者の体内に存在してもよい。または、例えばワクチンの形態として患者に投与してもよい。
【００２４】
このように、本発明は上記応答を誘発するための有効量におけるフラジェリンタンパク質またはそのペプチド断片の患者への投与を含んで成る、標的抗原に対する患者における適応免疫応答の誘発方法を供する。
【００２５】
好ましい第一の観点はまた、直接的にまたは上皮細胞の刺激を介する粘膜表面における樹状細胞の漸増によって、間接的に樹状細胞-依存適応免疫応答を誘発できる、フラジェリンタンパク質またはそのペプチド断片の有効量の患者への投与を含んで成る、標的抗原に対する患者の適応免疫応答の誘発方法を供する。さらに好ましい、第一の観点は、直接的に樹状細胞-依存適応免疫応答（上記において樹状細胞の成熟化は誘発されており、さらに好ましくは増大されている）を誘発できるフラジェリンタンパク質またはそのペプチド断片の有効量の患者への投与を含んで成る標的抗原に対する患者の細胞適応免疫応答を誘発する方法を供する。
【００２６】
本発明の第二の好ましい観点は腸管粘膜、さらに一般的には、患者のいかなる粘膜上皮において、患者へのＣＣＬ２０の放出における競合的な効果を有するフラジェリンタンパク質またはそのペプチド断片の有効量の投与を含んで成る、標的抗原に対する適応免疫応答の誘発方法を供する。
【００２７】
特に、本発明の第一および第二の好ましい観点は、標的抗原に対する適応免疫応答の誘発の方法を供する。ここで、誘発は未成熟樹状細胞の漸増による。好ましくは、第一および第二の好ましい観点において使用されるフラジェリンまたはそのペプチド断片は非経口的にまたは経皮的に投与される。さらに好ましくは、第一および第二の好ましい観点において使用されるフラジェリンまたはそのペプチド断片は粘膜経路（口腔内伝達は特に好ましく、さらに好ましくは鼻腔内伝達）を経由して投与される。フラジェリンまたはそのペプチド断片は、例えば単独で、もしくは数種で標的抗原とともに、特にワクチンアジュバントの形態において投与または共投与できる。
【００２８】
本発明の第一および第二の観点の最初のサブセットにおいて、上記反応を誘発することの所望される抗原をと一緒にフラジェリンタンパク質またはそのペプチド断片を投与することを含んで成る、例えば、適応免疫応答の誘発ための、経口ワクチン接種または鼻腔内ワクチン接種における未成熟な樹状細胞の漸増の誘発方法を供する。
【００２９】
好ましくは、本発明の第一および第二の観点において使用されるフラジェリンタンパク質フラジェリンのＮ末端配列またはＣ末端配列の保存領域の少なくとも一方を含む。さらに好ましくは、本発明の第一および第二の観点において使用されるフラジェリンタンパク質はサルモネラ（Salmonella）フラジェリンの１７０Ｎ末端配列および９０Ｃ末端配列の保存領域、特にゲルトネル菌（S.enteritidis）またはネズミチフス菌（S.typhimurium）によって共有される保存領域を含む。予備結果はこの活性を有するその領域がネズミチフス菌（S.typhimurium）の１-１９０および３５４-４９４残基に制限されうることを示唆する。
【００３０】
特に、ワクチンアジュバントとしてのこのようなフラジェリンタンパク質の使用を供する。
【００３１】
最初のサブセットにおける使用のための薬剤の好ましいペプチド配列は１０から６０アミノ酸長、より好ましくは、２０から４５アミノ酸長であり、且つ、Ｃａｃｏ-２細胞中のシグナリングに関与している、本明細書に記載した配列の対応部位（図８）に対し高いホモロジー、例えば７０％以上、より好ましくは９０％以上を有する。さらに好ましい配列は上記配列部位に対して７０％以上の同一性を有する。
【００３２】
ホモロジー（相同性）およびアイデンティティ（同一性）の説明並びにこの調査方法はこれらの当業者にとって周知であろう。特に、説明は引用により本明細書際に組み入れるPCT/EP00/09325、およびそれに由来する対応の米国出願において記載されている。相同性および同一性はまた、ギャップまたは欠失を適宜導入しながら、配列間のアミノ酸を順次対合させることにより決定できる。
【００３３】
本発明の第三の観点において、例えば、適応免疫応答を誘発するための粘膜のワクチン接種、より好ましくは経口または鼻腔内ワクチン接種における未成熟樹状細胞の漸増を誘発するための医薬の製造におけるフラジェリンタンパク質またはそのペプチド断片の使用を供する。このように好ましい使用は、例えば、経口または鼻腔内ワクチンにおけるアジュバントとしてである。第三の観点におけるサブセットは、皮下のワクチン接種における、ＭＨＣクラスＩ制限ペプチドに対する適応免疫応答を誘発するためのフラジェリンまたはそのペプチド断片の使用を供する。
【００３４】
本発明の第四の観点は、治療における使用のための（ａ)腸管上皮細胞からのＣＣＬ２０の放出および（ｂ）樹状細胞の成熟化、の１つまたは双方におけるアゴニスト効果を有するフラジェリンタンパク質またはそのペプチド断片を供する。ここでのタンパク質またはペプチドは免疫応答を誘発する能力を保持することを許容するように切断され、突然変異され、または欠損を有することを特徴とする。
【００３５】
第四の観点のある好ましいタンパク質またはペプチド断片は、腸内または樹状フラジェリン受容体、例えば、ＴＬＲおよび関連受容体と結合する能力を保持し、そして免疫シグナリングを保持する。
【００３６】
第二、第三およびさらなる観点のための好ましいタンパク質およびペプチドは上記の第一および第二の観点で説明したものとして存在するであろう。
【００３７】
本発明の第五の観点は医薬受容担体、添加剤もしくは希釈剤と共に本発明のタンパク質もしくはペプチド断片を、または無菌および発熱遊離形態におけるこれらのタンパク質もしくはその断片を含んで成る組成物を供する。
【００３８】
本発明の第六の観点は、ネズミチフス菌（S.typhimurium ）のフラジェリンのアミノ酸配列に対応するが、突然変異、欠失または切頭され、腸内フラジェリン受容体結合特性を保持しながら、活性免疫シグナリング特性をも有するタンパク質またはそのペプチド断片の生産を含んで成る腸内上皮免疫応答の誘発剤の生産方法を供する。
【００３９】
第六の観点の好ましい方法は、例えば、部位特異的突然変異ＰＣＲプライマーの使用により、上記突然変異、欠失または切断したフラジェリンをコードするＤＮＡの生産を含んで成る。
【００４０】
本発明はこのたび、以下の制限のない実施例への言及による例示のみで説明されるであろう。本発明の意図する範囲内にあるさらなる態様は、これらの観点から当業者により行われるであろう。
【実施例】
【００４１】
方法
細菌株および培養条件：細菌株は表１に掲載する。ＳＩＮ株はファージ P22 HT105/int-1 の形質導入により得た。サルモネラ（Salmonella）または大腸菌（E.coli）はLuria-Bertani(ＬＢ）培養液中で２４時間３７℃で培養し、それからＬＢ培養液中で１/１０００に希釈して、スタンディング状態で３７℃で１８時間培養した（１９）。細菌濃度は６００ｎｍで１０9細菌毎ｍｌ毎ＯＤユニットであり、プレーティングにより計算した。アンピシリンおよびカナマイシンをそれぞれ１００および４０μｇ/ｍｌ加えた。リステリア・モノシトゲネス（L.monocytogenes ） はブレインハートインフュージョン培地（ＢＨＩ）中３７℃で培養し、ビフィズス菌（B.bifidum） およびバクテロイデス・ブルガータス（B.vulgatus）はグリセロール凍結接種物を使用して嫌気性 GasPakTM（Becton Dickinson,Cockeysville)ビンにおいてＢＨＩ中、３７℃で培養した。残留細菌を排除するために上澄み液をろ過し、トリプシン（Worthington Biochemical Corporation,Lakewood)１０μｇ/ｍｌにより３７℃で３０分間タンパク質分解を行った。具体的には、細菌または上澄み液を６５℃で２０分間熱処理した。補完のために ネズミチフス菌（S.typhimurium）fliC 遺伝子を伴う EcoRI フラグメントを宿すアンピシリン耐性プラスミドｐＲＰ２（K.Hughes提供）をサルモネラ（Salmonella）に導入した。フラジェリンの発現は（ｉ）ウサギサルモネラ（Salmonella） Ｈ抗血清ポリa-z(Difco laboratories,Detroit)での凝集、（ii）０．３５％アガロース中での運動性、および（iii ）上澄み液のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析ならびにポリa-z 血清およびペルオキシダーゼ標識抗ウサギ血清（Sigma,St Louis)でのイムノブロットによりチェックした。
【００４２】
細胞培養および刺激：人の結腸腺癌細胞株Ｃａｃｏ-２クローン１を glutamax、１０％ＦＣＳ、１％非必須アミノ酸および４μｇ/ｍｌのトランスフェリン（Gibco BRL,Rockvilleの細胞培養生成物）を伴うＤＭＥＭ中で培養した。Ｔ-８４腸内上皮細胞株は５０％ＤＭＥＭ、５０％Ham’s Ｆ１２培地、１０％ＦＣＳおよび２ｍＭ のＬ-グルタミン中で培養した。細胞はTranswell（直径６ｍｍ、３μｍ孔、Corning Inc.,Action)上で５％ＣＯ2下において３７℃で１０日間培養した。
【００４３】
上皮横断（transepithelial)の電気抵抗の平均値はＣａｃｏ-２およびＴ-８４細胞でそれぞれ、４５０Ωｃｍ2および１０００Ωｃｍ2であった。分化はまた、電子および共焦顕微鏡を使用して、末端の微絨毛の存在および特異性抗体（A.Zweibaum提供）を伴う末端のスクラーゼイソマルターゼの上昇調節によりチェックした。細菌および生物活性材料を完全にＤＭＥＭに懸濁し、上端部（３００μｌ）または基底部（１ｍｌ）のいずれかを加えた。感染させるため、細胞を１０8の細菌，すなわち〜１００の感染多重度（ｍｏｉ）で４５分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、そして細胞内の細菌を殺すために、５０μｇ/ｍｌのゲンタマイシン（リステリア（Listeria）のために５μｇ/ｍｌ）を含む培地でインキュベートした。あるいは、実験の継続のため、細胞を上澄み液、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）またはフラジェリンに暴露させた。提示時間で、全ＲＮＡを調製し、および/または培地を回収した。
【００４４】
ｍＲＮＡレベルの分析のためのリアルタイム定量ＰＣＲ：全ＲＮＡを３つのTranswellフィルター（Rneasy,Quiagen,Switzerland)の細胞から単離し、Sperscript II（Gibco BRL)を使用して１００ｎｇで逆転写を行った。生じたｃＤＮＡ（１ｎｇ）をＳＹＢＲ（登録商標）-ＧｒｅｅｎＰＣＲアッセイでトリプケートで増幅し、そして生産物をＰｒｉｓｍ５７００検出システム（ＳＤＳ、ＡＢＩ/Perkin-Elmer,Fooster City)で検出した。ＰＣＲ反応を５０℃で２分間および９５℃で１０分間インキュベートし、６０℃において１分間アニーリング/伸長および９５℃において１５秒の変性で４０増幅サイクルにより行った。ｃＤＮＡの総量を標準化するために１８ＳリボゾーマルＲＮＡを使用した。配列（ＮＭ００４５９１、Ｙ００７８７、およびＸ０３２０５）からデザインされたＣＣＬ２０のためのプライマー（ＣＣＡＡＧＡＧＴＴＴＧＣＴＣＣＴＧＧＣＴおよびＴＧＣＴＴＧＣＴＧＣＴＴＣＴＧＡＴＴＣＧ）ＩＬ-８のためのプライマー（ＣＡＣＣＧＧＡＡＧＧＡＡＣＣＡＴＣＴＣＡおよびＧＧＡＡＧＧＣＴＧＣＣＡＡＧＡＧＡＧＣ）および１８Ｓのためのプライマー（ＡＣＡＴＣＣＡＡＧＧＡＡＧＧＣＡＧＣＡＧおよびＴＴＴＴＣＧＴＣＡＣＴＡＣＣＴＣＣＣＣＧ）はそれぞれ、７５、７２および６５ ｂｐのＰＣＲ生成物を生成した。ＰＣＲの特異性は融解曲線分析チェックし、そしてシークエンシングした。相対ｍＲＮＡレベル（２ΔΔC）は（ｉ）注目の遺伝子および１８Ｓ ｒＲＮＡ（ΔＣ）のｃＤＮＡ間の立ち上がりＰＣＲサイクル数（Ｃ）、（ii）処理および未処理コンディション（ΔΔＣ）間のΔＣ値を比較することにより測定し、相対ｍＲＮＡレベルのＳＤは以下に従い計算した。
；２(ΔΔC±√{SD[ΔC(処理)]2+SD[ΔC(未処理)]2})２倍以下のＲＮＡレベルの増大は有意であるとは考えない。
【００４５】
ＣＣＬ２０-特異性 ＥＬＩＳＡ 法：３μｇ/ｍｌの人のＣＣＬ２０-特異性ｍＡｂ（クローン67310.111,Ｒ＆Ｄ Systems,Minneapolis)でコートしたマイクロプレートを、培養培地においてＣＣＬ２０を捕らえるために使用した。１μｇ/ｍｌに希釈したヤギの抗-人ＣＣＬ２０（Ｒ＆Ｄ Systems）をＡｂの検知として使用し、そして１/２０００に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗-ヤギＡｂ（Sigma)で発色を行った。ＣＣＬ２０濃度は遺伝子組み換え人（ｒｈ）ＣＣＬ２０（Ｒ＆Ｄ Systems）を使用したスタンダードカーブから計算した。立ち上がり検出は０．５ｎｇ/ｍｌだった。
【００４６】
ＬＰＳおよびフラジェリンの精製：前述したように、ＬＰＳを熱フェノール抽出により精製した（２０）。あるいは、ネズミチフス菌(S.typhimurium) ＬＰＳ製品を使用する（L-6511,Sigma)。前述したように、フラジェリンは、ＬＢ中で撹拌しながら３７℃で１６時間培養したサルモネラ（Salmonella）株ＳＥＦＫ３２（ｐＲＰ２）から調製した。簡潔に言うと、鞭毛は表層から剥ぎ取り、超遠心分離によりペレットにし、そしてフラジェリンモノマーを放出させるために酸性化した。フラジェリンはＰＢＳにおいて濃縮し、−８０℃で保管した。
【００４７】
ＣＤ３４+-由来ＤＣの世代：原種は抗-ＣＤ３４ ｍＡｂ（Immu-133.3,Immunotech,France)、ヤギ抗-マウスＩｇＧ-コートミクロビーズおよびMidiMacsカラム（Miltenyi Biotec,Germany)を使用したポジティブセレクションにより、臍帯血から単離した。ＣＤ３４+細胞はＲＰＭＩ-１６４０、１０％ＦＣＳ、２００Ｕ/ｍｌのｒｈＧＭ-ＣＳＦ（Schering-Plough Research Institute,Kenilworth)、５０Ｕ/ｍｌのｒｈＴＮＦα（PeproTech Inc.,Rocky Hill)および１０Ｕ/ｍｌのｒｈＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ Systems）中で培養した。７日後、その細胞（３０-５０％ＣＤｌａ+ＤＣ、２５-３５％ＣＤｌａ-ＣＤ１４+ＤＣ前駆体および分化していないＣＤ３４+細胞）を採取した。
【００４８】
走化性アッセイ：完全ＤＭＥＭ（２％ＦＣＳ）で培養されたＣａｃｏ-２細胞由来の上澄み液、またはｒｈＣＣＬ２０を２４ウェルプレートに加え、また５×１０5ＤＣをTranswellインサート（５μｍ孔、Corning Inc.)に加えた。プレートは３７℃で１．５時間インキュベートした。遊走した細胞はＦＩＴＣ-ラベル抗-ＣＤｌａ ｍＡｂおよびＰＥ-ラベル抗-ＣＤ１４ ｍＡｂで染色し、そしてフローサイトメトリーにより数えた。中和のため、サンプルは１０μｇ/ｍｌのヤギ抗-ＣＣＬ２０Ａｂとともに３７℃で３０分間インキュベートした。
【００４９】
マウスの免疫化のためのフラジェリンの精製：ＦｌｉＣ-生産性ネズミチフス菌（S.typhimurium）株ＳＩＮ２２（fljB5001::MudJ)およびフラジェリン欠損ＳＩＮ４１（fliC5050::MudJ fljB5001::Mud-Cam)をそれぞれ、ドナーとしてＴＨ７１４およびＴＨ２７９５株（K.Hughes提供）ならびにレシピエントとして野生型株ＡＴＣＣ１４０２８を使用し、ファージＰ２２ ＨＴ１０５/int-１の形質導入により得た（４３、４７）。フラジェリンは、前述したようにLuria Bertani培地において撹拌しながら３７℃で１６時間培養したＳＩＮ２２株から調製した（４８）。簡潔に言うと、鞭毛は表層から剥ぎ取り、超遠心分離によりペレットにし、そしてフラジェリンモノマーを放出させるために６５℃で３０分間熱した（５ｍｇ/ｌ培養）。フラジェリンはＰＢＳにおいて濃縮し、１００ｋＤカットオフデバイスでろ過し、Detoxi-Gel Affinity Colum（Pierce)を使用してエンドトキシン活性を枯渇させ、そして-２０℃で保管した。エンドトキシンの夾雑は Limulus 変形細胞溶解産物のPyrochromeアッセイ（Cape Codが組み込まれた）を使用して定量した；本実験において４つの独立したバッチを使用し、エンドトキシン量は２０ｐｇ毎μｇフラジェリン以下だった。エンドトキシンの枯渇を除くＳＩＮ４１株からの同様の調製はフラジェリンとは関係ない微生物の生産物による汚染を制御するために行った。具体的には、７０℃で１時間不活性化した細胞培養クオリティートリプシン、０．０５％ＥＤＴＡ、０．０２％溶液（Biochrom AG)とともにフラジェリンを３７℃で３０分間完全に消化した。フラジェリン純度はＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析並びにフラジェリン特異マウスのポリクローナル血清およびペルオキシダーゼ-標識抗-マウスＩｇＧ（Biorad)でのイムノブロットにより分析した。フラジェリン-特異血清は、３５日目に皮下の免疫化したＣ５７ＢＬ/６から、４０μｇのフラジェリン+ＣＦＡおよび２０μｇのフラジェリン+ＩＦＡは０および２６日目に、それぞれ得た。
【００５０】
オブアルブミン（ＯＶＡ、Grade VII 、Sigma)およびニワトリの卵リゾチーム（ＨＥＬ、Appligen)はまた、ポリミキシンカラム（＜２０ｐｇエンドトキシン毎μｇタンパク質）を使用して解毒した。タンパク質濃度はBradfordマイクロアッセイ法（Biorad)により検出した。
【００５１】
抗体とフローサイトメトリー：ＦＡＣＳ（登録商標）呈色分析は以下のｍＡｂを使用して行った。：抗-ＣＤ１１ｃ-ＦＩＴＣまたは-ＰＥまたは-ビオチン（クローンＨＬ３）、抗-ＭＨＣII-ＰＥ（クローン２Ｇ９）、抗-Ｂ２２０-Ｃｙ５または-ＣｙＣｈｒｏｍｅ（クローンＲＡ３．６Ｂ２）、抗-ＣＤ８α-ＣｙＣｈｒｏｍｅ（クローン５３．６．７）、抗-ＣＤ４-ＣｙＣｈｒｏｍｅまたは-ビオチン（クローンＬＴ４）、抗-ＣＤ８０-ビオチン（クローン１６-１０Ａ１）、抗-ＣＤ８６-ビオチン（クローンＧＬ-１）、抗-ＣＤ４０-ビオチン（クローン３/２３）（PharMingen)。抗-Ｆ４/８０-ＦＩＴＣまたは-ビオチン（クローンＦ４/８０）および抗-ＭＨＣII-ビオチン（クローン１１．５４．３）は実験室において精製し、標識した。
【００５２】
Ｉ-Ａｋとの関係でペプチドＨＥＬ46-61を認識するビオチン化したＣ４Ｈ３ ｍＡｂは Pr.R.Steinman (Yale University,USA)から提供された。ビオチン化抗体はＰＥ（Serotec)、CyChrome (PharMingen)またはアロフィコシアミン（Molecular Probes)のいずれかに接合したストレプトアビジンで明らかにした。フローサイトメトリーは３または４色のＦＡＣＳＣaliburTMサイトマーを使用して行い、ＣＥＬＬQuestTMソフトウェア（Becton Dickinson)を使用して分析した。
【００５３】
ＴＬＲ５ ｍＲＮＡのＲＴ-ＰＣＲ分析：全ＲＮＡを単離し、ＤＮaseＩ（Quiagen)により処理した。逆転写（ＲＴ）はSuperscriptII（Gibro BRL)を使用して行った。マウスＢＭまたは脾臓細胞のために、前述したように、ｃＤＮＡをＴＬＲ５に特異的なプライマー（ＣＧＣＡＣＧＧＣＴＴＴＡＴＣＴＴＣＴＣＣ，ＧＧＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＣＡＡ）および１８Ｓ ＲＮＡの全量を標準化するために１８ＳリボソーマルＲＮＡに特異的なプライマーを使用してＳＹＢＲ（商標登録）-Green ＰＣＲアッセイを行った（４７）。ＰＣＲの特異性は融解曲線の分析によりチェックし、そしてシークエンシングした。相対ｍＲＮＡレベル（２ΔΔC）は（ｉ）注目の遺伝子および１８Ｓ ｒＲＮＡ（ΔＣ）のｃＤＮＡ間の立ち上がりＰＣＲサイクル数（Ｃ）、（ii）全脾臓部のために得られたΔＣ値を控除したΔＣ値であって、任意の関係（ΔΔＣ）として選ばれた値を比較することにより測定した。
【００５４】
（ヒト細胞のために、スタンダードＰＣＲは４０サイクル（９４℃４５秒、５３℃４５秒、７２℃１分）で、人のＴＬＲ５のための以下のプライマー；ＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＧＴＡＴＧおよびＧＡＡＴＣＴＧＴＴＴＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＡＴ（２５９ｂｐ）ならびに人のβ-アクチンのためのプライマー；ＴＧＡＣＧＧＧＧＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧＴＧＣＣＣＡＴＣＴＡおよびＣＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＧＡＴＧＧＡＧＧＧ（６６０ｂｐ）を使用して行った。）
【００５５】
免疫化した動物の血清におけるフラジェリン-およびＯＶＡ-特異抗体の検出：血清を採取し、前述したように、ＥＬＩＳＡ法により分析した（４２）。ＩｇＧの測定のために、ＰＢＳ中でマイクロプレート（Maxisorp Nunc,Life Technologies)を１００ｎｇのフラジェリンまたは１ｇのＯＶＡ毎ウェルをコートした。プレイムノ血清および模擬免疫化マウス由来の血清をネガティブコントロールとして使用した。全ＩｇＧの検出はペルオキシダーゼ標識ヤギ抗-マウスＩｇＧ（Biorad)で行った。力価は０．１の吸収を示した最高希釈として表した。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ力価の絶対定量化は対照血清およびペルオキシダーゼ（Serotec)で標識したウサギ抗-マウスＩｇＧ１もしくは羊抗-マウスＩｇＧ２ａまたはビオチン−標識ヤギ抗-マウスＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ（Caltag)のいずれかを使用して行った。
【００５６】
マウスの骨髄由来の樹状細胞の調製：骨髄由来のＤＣをマウスの大腿骨および脛骨から培養した（４４）。簡潔に言うと、骨髄細胞をＲＢＣ中で枯渇させ、１０％ＦＣＳ（Myoclone supreplus)、２ｍＭのＬ-グルタミン１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Gibro BRL)を含む完全ＲＰＭＩ１６４０培地中の１０ｎｇ/ｍｌのＧＭ-ＣＳＦ（Biosource)の存在下において培養処理した６-ウェルプレート（Nunc)において２×１０5で培養した。３日後、ＧＭ-ＣＳＦで補った新鮮な培地を加えた。６日後、全細胞または浮遊細胞のいずれかを上記のように刺激した。その細胞の表現型を、様々な表面マーカーに特異的な抗体を使用してフローサイトメトリーにより分析した。
【００５７】
ＴＬＲ５の発現を分析するため、骨髄ＣＤ１１ｃ+細胞をＣＤ１１ｃ抗体（Ｎ４１８，Miltenyi Biotech)に結合したＭＡＣＳマグネチックビーズを使用したポジティブセレクションにより単離した。ＤＣの純度は〜９０％だった。
【００５８】
スプレノサイト（splenocyte)およびサイトカインの放出の分析：血清中のスプレノサイト（splenocyte)およびサイトカインの放出を分析するため、フラジェリン、ネズミチフス菌（S.typhimurium）ＬＰＳ（Ｌ-６５１１、Sigma)またはホスホロチオエートＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＴＣＣＡＴＧＡＣ  ＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ，Eurogentec)を尾の血管に注射した。スプレノサイト（splenocyte)を単離するために脾臓を摘出し、および/または実験により、異なる時期に血清を採取した。
【００５９】
免疫化したマウスの脾臓由来の細胞の調製：脾臓のＤＣを前述したように単離した（４１）。簡潔に言うと、脾臓の小断片を、５％ＦＣＳで補ったＲＰＭＩ１６４０培地中の０．５ｍｇ/ｍｌCollagenase D(Roche)および４０μｇ/ｍｌＤnase Ｉ(Roche)とともに３７℃で１０分間インキュベートした。機械的に解離後、５％ＦＣＳおよび５ｍＭのＥＤＴＡで補ったＰＢＳ中で広範囲に洗浄し、そして５ｍＭのＥＤＴＡを含んだ冷えた等浸透性のOptipurepTM溶液（Nycomed)において再懸濁した。遠心分離において、低密度分画（ＬＤＦ）は通常、脾臓中１％と比較して２０-３０％のＤＣを含む。ＴＬＲ５の発現を評価するため、適当な抗体で呈色した後、ＤＣ（ＣＤ１１ｃ+ Ｆ４/８０-/low Ｂ２２０-）、Ｂリンパ球（Ｂ２２０+ ＣＤ１１ｃ-）およびマクロファージ（Ｆ４/８０high)をＦＡＣＳtarTMフローサイトメーター（Becton Dickinson)におけるＦＡＣＳソーティングにより単離した。
【００６０】
サイトカイン特異ＥＬＩＳＡ法：サイトカイン（ＩＬ−１２ ｐ４０、ＩＬ−１２ ｐ７０およびＴＮＦ-α）は血清および培養上澄み液において製造業者の推薦によるPharmingen 製のサンドイッチＥＬＩＳＡキットにより定量した。
【００６１】
人の樹状細胞の調製：人のＤＣの調製のために、前駆細胞をへその緒の血液から、抗-ＣＤ３４ ｍＡｂ（Immu-133.3,Immunotech)、ヤギ抗-マウスＩｇＧマイクロビーズおよびＭＡＣＳ（登録商標）（Miltenyi Biotec)を使用したポジティブセレクションにより単離した。ＣＤ３４+細胞はＲＰＭＩ-１６４０、１０％ＦＣＳ、２００Ｕ/ｍｌのｒｈＧＭ-ＣＳＦ（Schering-Plough Research)、５０Ｕ/ｍｌのｒｈＴＮＦ（PeproTech Inc.)および１０Ｕ/ｍｌのｒｈＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ System)中で培養した。７日後、その細胞（３０-５０％ＣＤｌａ+ＤＣ、２５-３５％ＣＤｌａ-ＣＤ１４+ＤＣ前駆体および分化していないＣＤ３４+細胞）を採取した。
【００６２】
Adoptive transfer（養子移植法）実験：ＯＶＡ-特異性ＣＤ４+Ｔ細胞を、ＤＯ１１．１０ ＳＣＩＤマウスの脾臓およびリンパ管から純度＞９８％のＭＡＣＳ ＣＤ４ビーズ（Miltenyi Biotech)を使用して単離した。その細胞を５μＭのカルボキシフルオレスセインジアセテートサクシニニルエステル（carboxyflluorescein diacetate succininyl ester)（ＣＦＳＥ、Molecular Probes)で染色し、そして４-５×１０6細胞をＢＡＬＢ/ｃレシピエントマウスに静脈注射した。１日後、マウスをＰＢＳ、フラジェリンおよび/またはＯＶＡのいずれかで免疫化し、そして免疫化した動物由来のスプレノサイトをフローサイトメトリーにより７２時間後に分析した。ＣＦＳＥ陽性細胞を検出し、そしてＶβ８+（トランスジェニックＴＣＲに存在）ＣＤ４+細胞中でカウントした。
【００６３】
実施例１
ネズミチフス菌（S.typhimurium）は腸内上皮細胞においてＣＣＬ２０遺伝子の発現を誘発する：様々な刺激に応答する、透過性のあるフィルター上で増殖させた人の腸内上皮Ｃａｃｏ-２細胞株におけるＣＣＬ２０ケモカイン遺伝子の発現はリアルタイムＲＴ-ＰＣＲおよびＥＬＩＳＡ法により決定した。未処理細胞において、すべての約１．８±１．０×１０6のＣＣＬ２０コピー毎μｇが１細胞あたり〜１０コピーであることを検出した。頂端および基底の培地においてＣＣＬ２０の濃度は０．５ｎｇ/ｍｌを決して超えなかった。これらの観察は他者により報告されたＣａｃｏ-２細胞において形成されるＣＣＬ２０遺伝子の発現を裏付けた（１１）。
【００６４】
Ｃａｃｏ-２細胞の頂端部を伝染力の強いネズミチフス菌（S.typhimurium ）ＡＴＣＣ１４０２８にさらすと０．２５％の細菌が２時間以内に内在化したことから、効果的な感染をもたらした（補助的材料）。ＣＣＬ２０の転写は感染後、２から３．５時間の間に [１５．２±６．９倍（ｎ＝２０）]最大に増大した（図ｌａ）。これらの条件下において、ＩＬ-８転写は以前報告したように、２７．６±７．８倍増加した（１、１５）。ＣＣＬ２０分泌は感染２時間後に有意に増大し、そして６時間でプラトーに達した。感染から２０時間後、基底区画において６４．８％±６．９％（ｎ＝７）回収したためにＣＣＬ２０の分泌は、局在していた。
【００６５】
実施例２
ＣＣＬ２０応答は病原体によって誘発される：ＣＣＬ２０の誘発の特異性を腸管において出会う様々な細菌に対する応答において分析した。大腸菌(E.coli)株、ＤＨ５-αおよび共生細菌 E.coli ＥＭＯ、ビフィズス菌（B.bifigum）、またはバクテロイデス・ブルガータス（B.vulgatus） はＣＣＬ２０の発現を誘発することができない（図２aおよびｂ）。対照的に、ゲルトネル菌（S.enteritidis） およびリステリア・モノシトゲネス（L.monocytogenes ）を含む病原性細菌はネズミチフス菌（S.typhimurium）のようにＣＣＬ２０の転写を活性化する（図２ｃ）。
【００６６】
実施例３
ＣＣＬ２０の誘発は上皮細胞への進入を必要としない：上皮細胞の侵入はＳｏｐＥのように、上皮細胞の細胞質中に毒素を注入するサルモネラ（Salmonella）病原性アイランド１（ＳＰＩ-１）によってコードされるタイプIII 分泌系に依存している（１３、２２）。これらの毒素は、細菌の内在化およびシグナリング経路の阻害をもたらす細胞膜のしわを誘発する。ＳＰＩ-１遺伝子の活性化因子をコードするｈｉｌＡ遺伝子の不活性化は侵入を弱める。ネズミチフス菌（S.typhimurium）のｈｉｌＡ変異ＳＩＮ１４およびsopE-不活性化種ＳＩＮ１８は上皮Ｃａｃｏ-２細胞においてＣＣＬ２０の発現を誘発するためのＡＴＣＣ１４０２８として有用であることが発見された（図３a)。熱殺したおよび生きた細菌によるＣＣＬ２０の誘発は有意な相違はなく（図３a)、このように細菌侵入の機能を排除している。このため、我々の実験はＣＣＬ２０の刺激は上皮細胞の侵入もＳｏｐＥ毒素の注入も必要としないことを示した。
【００６７】
実施例４
ＣＣＬ２０-誘発要素は熱に安定な分泌タンパク質である：ネズミチフス菌（S.typhimurium）の上澄み液は、上皮細胞の表面に塗布すると、強くＣＣＬ２０の発現を誘発した（図３ｃ）。ＬＰＳは細胞シグナリングに関するグラム陰性菌由来の外側の細胞膜の熱-耐性分子である。市販のネズミチフス菌（S.typhimurium）のＬＰＳまたはＡＴＣＣ１４０２８から精製したＬＰＳを伴うＣａｃｏ-２細胞の頂端部または基底部の処理は、ＣＣＬ２０遺伝子の転写を活性化しなかった（図３ｂ）。このように、ＬＰＳそれ自体はＣＣＬ２０刺激のための誘発要因ではない。
【００６８】
すべての細菌で観察されたように、熱処理は上澄み液の活性を消失させなかった（図３ｃ）。しかしながら、上澄み液のトリプシン消化は、完全にＣＣＬ２０の誘発を無効にした。要するに、これらの実験はＣＣＬ２０-特異性誘発要因が熱に安定な誘発タンパク質であることを示した。
【００６９】
実施例５
フラジェリンはＣＣＬ２０誘発要因である：鞭毛のフラグメントを構成しているサブユニットであるフラジェリンは、ネズミチフス菌（S.typhimurium）またはゲルトネル菌（S.enteritidis）の上澄み液から回収された主なタンパク質である（図４ｃ）（２３）。ネズミチフス菌（S.typhimurium）は２つの５２ＫＤaのフラジェリン：ＦｌｉＣまたはＦｌｊＢを生産するのに対し、ゲルトネル菌（S.enteritidis）は１つの５６ＫＤaのフラジェリンＦｌｉＣを生産する。ＦｌｉＣ-欠損ゲルトネル菌（S.enteritidis） ＳＥＦＫ３２は前駆種ＳＥ８５７に対して、ＣＣＬ２０遺伝子の発現を誘発することができない（図４a)。ネズミチフス菌（S.typhimurium）由来のＦｌｉＣ遺伝子によるＦｌｉＣ変異の補完は完全にＣＣＬ２０誘発を回復させた。付け加えると、ネズミチフス菌（S.typhimurium）変異のＦｌｊＢまたはＦｌｉＣのいずれかを生産するＳＩＮ２０またはＳＩＮ２２は、野生型細菌と同様のレベルまでＣＣＬ２０転写を刺激した（データ不掲載）。最後に、精製したネズミチフス菌（S.typhimurium）のＦｌｉＣフラジェリンはＣａｃｏ-２細胞においてＣＣＬ２０転写を活性化した（ＥＤ50〜２０ｐＭおよび図４ｂ）。同様の結果はＴ-８４上皮細胞種の使用により得られた（表）。最近の報告によると（２１、２４）、フラジェリンはＣａｃｏ-２細胞において、ＩＬ-８遺伝子の転写を誘発することが発見された（図４a-b)。我々の実験はフラジェリンが、上皮腸内細胞において、ＣＣＬ２０およびＩＬ-８遺伝子の発現の誘発に必要とされることを示した。
【００７０】
実施例６
フラジェリン-処理細胞からの培地は未成熟ＤＣの遊走を誘発する：人の未成熟ＤＣはｒｈＣＣＬ２０に応答して遊走することができる（図５）。遊走はＣＣＬ２０-特異性抗体とのインキュベーションにより阻害される。ＤＣの低い遊走は未処理細胞からの基底の培地で観察された。おそらくＣａｃｏ-２細胞によって形成されるＣＣＬ２０の分泌を反映している。さらに、ＣＣＬ２０-特異性ｍＡｂでの培地のインキュベーションは、完全に走化性を無効とした。結論として、フラジェリン-刺激Ｃａｃｏ-２からの未成熟ＤＣ培地の遊走は特に、ＣＣＬ２０活性に依存する。
【００７１】
フラジェリンの配列１９０および３５７-４９４は上皮細胞シグナリングのために必要である：ホタルのルシフェラーゼ受容体遺伝子と結合したｃｃｌ２０プロモーターを含むプラスミドを伴うＣａｃｏ-２細胞（人の腸内上皮細胞）の安定トランスフェクタントを、９６ウェルマイクロプレートにおいて、様々な濃度のフラジェリン、フラジェリン断片または遺伝子操作したフラジェリン変異で処理した。（切頭したフラジェリン分子はプラスミドＦｌｉＣの遺伝子操作により、または、ネズミチフス菌（S.typhimurium）由来のflicC フラジェリンのトリプシン消化により生産した。）１８時間のインキュベーション後、細胞を溶解し、Stedy-Glo 試薬（Progema)を使用してルシフェラーゼ活性をアッセイした。ｃｃｌ２０遺伝子転写における上昇倍率はＰＢＳで処理した細胞の化学発光に対するサンプルの化学発光の割合として測定した。
【００７２】
図１９、２０および２１に示した結果はアミノおよびカルボキシ末端領域が、細胞シグナリングに必要であることを示す。中央の領域（１９１から３５３残基の間）（様々なサルモネラ（Salmonella）血清型および様々な細菌株由来のフラジェリンの中で不定である）はシグナリングにおいて役割を担わない。このため、不可欠な領域は２つの領域（１から１９０までの残基および３５４から４４６までの残基）に制限されているように見える。
【００７３】
実施例８
皮下的に投与されたフラジェリンおよびＭＨＣクラスＩ-制限ペプチドによるＣＤ８+リンパ球を生産する抗原-特異性ＩＦＮ-γの刺激：
リンパ組織においてＩＦＮ-γを生産するリンパ球の個体数を測定するため、ＩＦＮ-γ ＥＬＩＳＰＯＴを使用した。オブアルブミンＭＨＣクラスＩ-制限ペプチドを使用することにより、発明者はこの度、フラジェリンの存在下において、上記ペプチドを皮下的（尾の基底）に投与した場合にペプチドに応答するリンパ球の数の増加を示す。ネガティブコントロールとして、ペプチドを単独で注入した。ポジティブコントロールとして、破傷風菌の毒素由来のユニバーサルヘルパーペプチドおよび不完全なFreund's アジュバント（ミネラルオイル）（これは強いＣＤ８応答の引き金になることが知られている）と共に注入した。
【００７４】
手順は以下に従う：ＩＦＮ-γ ＥＬＩＳＰＯＴ
-２番目のＩＦＮ-γ抗体を加えるまで、無菌に保つ。
-数日前に、実験に十分な細胞を得るために、ＡＰＣ細胞を分裂させる。
-それぞれの条件で少なくとも４重にする。
【００７５】
ＤＡＹ-１
１-コートは一昼夜、ＲＴマルチスクリーンマイクロプレートにおいて、７．３ｍｌ毎プレートにおいて＞４４μｌのＰＢＳ６μｇ/ｍｌで希釈した７５μｌ/ウェルの捕獲抗体（３４．１）で行う。
２-設計はペーパー上のプレートで行う。
【００７６】
ＤＡＹ０
３-マウスにおける組織およびエフェクター細胞の採取
-エフェクター細胞は脾臓または他のリンパ組織から得ることができる。リンパ管もしくは脾臓をホモジェナイズまたは温侵し、そして赤血球を溶解する。
-ＲＰＭＩ-１０においてプレートを３回洗浄し、インキュベーター（１時間以上）において、１００μl／ウェルで満たす。
【００７７】
４-エフェクター細胞のカウント
-ＲＰＭＩ-１０においてエフェクター細胞を洗浄し、そして１０ｍｌで再懸濁する。
-細胞をカウントし、そして１００μｌ/ウェルをディスパッチするために適当な細胞濃度および容量のチューブを用意する。
通常：スプレノサイトまたはＬＮ細胞は、最初のポイントとして６００μｌで１０6とカウントされる。それから倍々希釈（１：１０）する。それぞれのポイントは３回ずつ行う。
【００７８】
５-細胞の分配
-プレートから完全ＲＰＭＩを捨てる。
-１００μｌのＰＲＭＩ-１０/ウェル中の１００μｌ/ウェルのエフェクター細胞＋ペプチド２０-１００μｌを加える。
-３７℃５％ＣＯ2で１５-２４時間インキュベートする。
【００７９】
ＤＡＹ＋１
６-エリスポット（Elispot）の開発
-１回水で洗浄する。
-４回ＰＢＳ-Ｔｗｅｅｎ０．０５％で洗浄する。
-７．３ｍｌ毎プレートにおいて２μｇ/ｍｌのＰＢＳ-０．０５-＞３０μｌで希釈した抗体（３５．１）の７５μｌ/ウェルの検出で３７℃で２時間（または４℃で一昼夜）インキュベートする。
-ＰＢＳ-Ｔ０．０５で４回洗浄する。
-１００μｌ/ウェルのアルカリンファスファターゼ（ＡＰ）-Extravidin番号１１８（ＰＢＳ-Ｔ中１：５０００で希釈）でＲＴで１時間インキュベートする。
-ＰＢＳ-Ｔにおいて４回洗浄する。
-ＰＢＳにおいて２回洗浄する。Ｔｗｅｅｎ無し。
-１００μｌ/ウェルのＡＰ試薬を加え、そしてＲＴで暗室において１５-２０分間インキュベートする（ブルースポット）。
-水道水でよく洗浄することにより、反応を止め、乾燥させる。
材料
-マルチスクリーンマイクロプレート９６ウェル（ＨＡ無菌プレート ０．４５μｍ、Millipore°MAHAS4510)。
-捕獲抗体：ラット抗-マウスＩＦＮ-ｇ Ｒ４-６Ａ２（Phrmingen°18181D)。
-検出抗体：ビオチン-標識ラット抗-マウスＩＦＮ-ｇ ＸＭＧ１．２（Phrmingen°18182D)。
-Extravidin-ＡＰ＝Extravidin がアルカリンフォスファターゼで標識している(Sigma、Ｅ２６-３６、４℃でｎ°１１８）。
-ＡＰ試薬：
バッファー：-トリス-ＨＣｌ ｐＨ９．５ １００ｍＭ
-ＮａＣｌ １００ｍＭ
-ＭｇＣｌ2 ５０ｍＭ
１０ｍｌのバッファーとして、
-５０ｍｇ/ｍｌで１００％メタノール中の６７μｌのニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ＮＩＢＴ）（Sigma Ｎ-５５１４）-＞最終濃度：０．３３ｍｇ/ｍｌ
-５０ｍｇ/ｍｌで１００％ジメチル-ホルムアミド（ＤＭＥＦ）中の２０μｌの５-ブロモ-４-クロロ-３インドリルフォスフェート（ＢＣＩＰ）ｐ-トルイジン塩（Sigma Ｂ-８５０３）-＞最終濃度：０．１ｍｇ/ｍｌ
を加える。
【００８０】
実施例９
樹状細胞はフラジェリンにより特異的に活性化される：マウスにＰＢＳ、フラジェリンまたはＬＰＳ（S.typhimurium)静脈注射（尾の血管）。注射６時間後、脾臓を摘出し、そしてスプレノサイトを単離する。単離した細胞はフローサイトメトリーにより分析した。図１３Ａおよび１３Ｂに示すように、樹上細胞はフラジェリンにより特異的に活性化される。
【００８１】
実施例１０
フラジェリンは全身アジュバントである：０および２１日において、マウスを皮下的にＰＢＳ、フラジェリン、フラジェリンまたはオブアルブミンを伴うＬＰＳで処理したトリプシンで免疫化する（尾の基部）。血清を２８/３５日目において採取し、そして血清抗体応答をＥＬＩＳＡ法を使用して測定する。
【００８２】
実施例１１
フラジェリンの全身投与は血清抗体応答を増強する：マウス（同系交配ＢＡＬＢ/ｃおよび異系交配ＮＭＲＩ）を皮下経路により、フラジェリン（０．１から３０ｇ）および/または２００ｌのエンドトキシンがないＰＢＳにおいて調製したＯＶＡ（１０-１００ｇ）で免疫化した。注射は０および２１日目に行った。血清は２および５週間後に採取し、フラジェリンまたはＯＶＡに特異的な抗体反応をＥＬＩＳＡ法により分析した。
【００８３】
実施例１２
フラジェリンはin-vitroで樹状細胞の成熟を誘発する：骨髄由来ＤＣを、前述したようにマウスの大腿骨および脛骨から培養した（４）。簡潔に言うと、骨髄細胞をＲＢＣ中で枯渇させ、１０％ＦＣＳ（Myoclone supreplus)、２ｍＭのＬ-グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Gibro BRL)を含む完全ＲＰＭＩ１６４０培地中の１０ｎｇ/ｍｌのＧＭ-ＣＳＦ（Biosource)の存在下において培養処理した６-ウェルプレート（Nunc)において２×１０5で培養した。３日後、ＧＭ-ＣＳＦで補った新鮮な培地を加えた。６日後、全細胞または浮遊している細胞のいずれかを、言及したように刺激した。その細胞の表現型を、様々な表面マーカーに特異的な抗体を使用してフローサイトメトリーにより分析した。
【００８４】
参考文献
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】上皮細胞におけるＣＣＬ２０遺伝子のネズミチフス菌（S.typhimurium ）で調整された発現。Transwell培養においてＣＣＬ２０細胞の頂端はネズミチフス菌（S.typhimurium ）ＡＴＣＣ１４０２８（moi=100)に４５分間感染させ、洗浄し、そしてゲンタマイシン補助培地で支持時間インキュベートした。（a)ＣＣＬ２０遺伝子の転写活性：全ＲＮＡを抽出し、逆転写した。ＣＣＬ２０ ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲおよびスタンダードとしての１８Ｓ ｒＲＮＡを使用して定量した。値は感染していないＣａｃｏ-２細胞と比較したＣＣＬ２０ ｍＲＮＡ量の関連した増加として表した。（ｂ）基底培養培地におけるＣＣＬ２０キモカインの分泌。ＣＣＬ２０濃度はＣａｃｏ-２細胞の細胞培地において、ＣＣＬ２０-特異性ＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００８６】
【図２】上皮細胞における病原体-特異性ＣＣＬ２０転写の誘発。Ｃａｃｏ-２細胞の単分子層の頂端を４５分間細菌株（moi=100)にさらし、ゲンタマイシンを含む培地において２．５時間インキュベートした。ＣＣＬ２０発現はリアルタイムＰＣＲで定量した。ＡＴＣＣ１４０２８をＣＣＬ２０誘発のポジティブコントロールとして使用した。結果は２以上の独立した実験を代表する。ＣＣＬ２０転写は（a)実験室用Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α、（ｂ）人の結腸フローラ由来の細菌：Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＭＯ、バクテロイデス・ブルガータス（B.vulgatus）、および ビフィズス菌（B.bifidum）、および（ｃ）腸内侵入細菌：ゲルトネル菌（S.enteritidis） ＳＥ８５７および リステリア・モノシトゲネス（L.monocytogenes ） ＬＯ２８にさらして分析した。
【００８７】
【図３】サルモネラ（Salmonella）のＣＣＬ２０発現のための誘発因子は熱に安定な分泌タンパク質である。分裂したＣａｃｏ-２細胞の頂端を４５分間、細菌（moi=100)にさらした（a)。それからゲンタマイシン補助培地において、細胞を２．５時間インキュベートした。あるいは、細胞を表示された濃度における細菌生産物に３．２５時間さらした（ｂ、ｃ）。ＣＣＬ２０遺伝子の転写の活性化はリアルタイムＲＴ-ＰＣＲにより定量した。結果は３以上の独立した実験を代表する。（a)ＣＣＬ２０転写の誘発はサルモネラ（Salmonella）-媒介侵入に依存しない。（ｂ）ＬＰＳ-独立ＣＣＬ２０転写。上皮細胞の頂端または基底部をネズミチフス菌（S.typhimurium）由来の１０μｇ/ｍｌのＬＰＳで処理した。（ｃ）誘発因子はサルモネラ（Salmonella）が分泌したタンパク質である。細胞の頂端をネズミチフス菌（S.typhimurium）からの上澄み液、熱処理上澄み液、またはトリプシン温侵および熱処理の上澄みにさらした。同じ状態において処理したＬＢブロスはコントロールとして使用した。
【００８８】
【図４】サルモネラ（Salmonella）のフラジェリンは上皮細胞における、ＣＣＬ２０およびＩＬ-８の転写の誘発因子である。分裂したＣａｃｏ-２細胞を頂端的に細菌（moi=100)またはフラジェリンで処理した。ＣＣＬ２０およびＩＬ-８遺伝子の転写はリアルタイムＲＴ-ＰＣＲにより定量した（a、ｂ）。結果は３以上の独立した実験を代表する。(a)細胞は４５分間、ゲルトネル菌（S.enteritidis）、fliC 変異ＳＥＦＫ３２、またはＳＥＦＫ３２（ｐＲＰ２）（ネズミチフス菌（S.typhimurium）のＦｌｉＣフラジェリンで補足された）で感染させ、ゲンタマイシンを含んだ培地において２．５時間インキュベートした。（ｂ）フラジェリンによるＣＣＬ２０およびＩＬ-８発現の用量依存誘発。細胞は頂端的に３．２５時間、表示された濃度において精製したネズミチフス菌（S.typhimurium）のＦｌｉＣフラジェリンにさらした。（ｃ）サルモネラ（Salmonella）株におけるフラジェリンの発現。サルモネラ（Salmonella）の培養からの上澄み（０．５ｍｌ）または精製したネズミチフス菌（S.typhimurium）のＦｌｉＣフラジェリン（１μｇ）をクマシーブルー呈色（上）およびフラジェリン-特異性Ａｂでのイムノブロッティング（下）によるＳＤＳ-ＰＡＧＥ後に分析した。矢印およびアステリスクは、それぞれＡＴＣＣ１４０２８（５２ＫＤa）およびＳＥ８５７（５６ＫＤa）由来のフラジェリンの位置を示す。フラジェリン-特異性抗体での凝集は同じ状態で培養した細菌において行った。
【００８９】
【図５】フラジェリン処理上皮細胞からの培地に対する応答における未成熟ＤＣの遊走。ｒｈＣＣＬ２０（７ｎｇ/ｍｌ）、コントロール培地または未処理のもしくは、フラジェリン処理Ｃａｃｏ-２細胞の基底培地（７ｎｇ/ｍｌのＣＣＬ２０）を未成熟ＤＣの遊走アッセイにおいて使用した。具体的には、ＣＣＬ２０を中和するために、アッセイの３０分前に、ＣＣＬ２０-特異性ｍＡｂを培地と混合した。結果は２つの独立した実験を代表する。
【００９０】
【図６】ＴＬＲ-５の発現については図面上の凡例を参照のこと。
【００９１】
【図７】上皮細胞におけるサルモネラ（Salmonella）のフラジェリンによるＣＣＬ２０の転写の誘発。
【００９２】
【図８】サルモネラ（Salmonella）ネズミチフス菌（typhimurium）由来のフラジェリンＦｌｉＣのアミノ酸配列。太字の下線部の残基は提示されたシグナリング領域を示す。ＥＭＢＬに記載された全フラジェリン配列の数はＤ１３６８９であり、それからコードしているＤＮＡも利用できる。
【００９３】
【図９】ＲＴ-ＰＣＲにより測定された、マウスの脾臓から単離した様々な細胞型のＴＬＲ５ ｍＲＮＡレベルのヒストグラム。
【００９４】
【図１０】フラジェリンはマウスの小腸の絨毛およびパイエル板においてin vivoでＣＣＬ２０転写を誘発する。ＢＡＬＢ/ｃマウスを麻酔し、そして縛った小腸の係蹄（回腸）を準備した。係蹄の内腔に１００μｇのフラジェリンまたは１００μｇのオブアルブミンをネガティブコントロールとして注入した（２００μｌのＰＢＳ中）。２時間後、殺したマウスおよび腸閉塞の係蹄を組織の薄い断片を調製するために冷凍した。放射線ラベルしたアンチセンスＣＣＬ２０ＲＮＡでハイブリダイゼーションを行った。成長後、断片を対比染色し、そして光学顕微鏡で観察した。パイエル板または絨毛を含む領域が観察された。
【００９５】
【図１１】フラジェリン、油、およびＴヘルパーペプチドを伴うコントロールアジュバントに対する応答におけるリンパ細胞によるＩＦＮ-γの放出。
【００９６】
【図１２Ａ】フローサイトメトリーは樹状細胞がフラジェリンにより特異的に活性化されることを示す。
【図１２Ｂ】フローサイトメトリーは樹状細胞がフラジェリンにより特異的に活性化されることを示す。
【００９７】
【図１３】フラジェリンは in-vitro で樹状細胞の成熟を誘発する。フラジェリンは低濃度、１０ｎｇ/ｍｌで活性である。
【００９８】
【図１４】フローサイトメトリーはフラジェリンに対する応答において in-vivo で樹状細胞の成熟を示す。
【００９９】
【図１５】フラジェリン、ＯＶＡ、ＬＰＳまたはトリプシン消化フラジェリンで免疫化したマウス由来の血清における抗-オブアルブミンおよび抗-フラジェリン抗体価のヒストグラム。
【０１００】
【図１６Ａ】ＢＡＬＢ Ｃマウス（図１６Ａ）およびＮＭＲＩマウス（図１６Ｂ）におけるフラジェリンおよびＯＶＡに対する血清抗体応答のヒストグラム。
【図１６Ｂ】ＢＡＬＢ Ｃマウス（図１６Ａ）およびＮＭＲＩマウス（図１６Ｂ）におけるフラジェリンおよびＯＶＡに対する血清抗体応答のヒストグラム。
【０１０１】
【図１７】オブアルブミン、オブアルブミンとフラジェリンおよびオブアルブミンとＩＦＡ中のＴヘルパーペプチドに対する応答における脾臓細胞によるＩＮＦ-γの放出のヒストグラム。
【０１０２】
【図１８】粘膜経路（鼻腔内）を介したフラジェリンで免疫化されたマウス由来の血清サンプルにおけるオブアルブミン特異性抗体価を示すグラフ。マウスはオブアルブミンまたはフラジェリンで鼻腔内経路を介して、０日目および２１日目に免疫化された。オブアルブミン特異性抗体応答はＥＬＩＳＡ法により２８日目の血清サンプルで測定した。
【０１０３】
【図１９】ＣＣＬ２０ルシフェラーゼ受容体構成物で安定的にトランスフェクトしたＣａｃｏ-２細胞におけるシグナル（ＣＣＬ２０の誘発を介する）に対するフラジェリンの能力を示すグラフ。保存された末端領域１-５２および４５１-４９４から欠損したすべてのトリプシン断片はシグナリング活性を欠いている。
【０１０４】
【図２０】ＣＣＬ２０ルシフェラーゼ受容体構成物で安定的にトランスフェクトしたＣａｃｏ-２細胞におけるフラジェリンのトリプシン断片の細胞シグナリングの定量分析を示すグラフ。保存された末端領域１-５８、４６２-４９４および４８７-４９４のどれかが欠損したトリプシン断片はシグナリング活性において強く阻害される。
【０１０５】
【図２１】ＣＣＬ２０ルシフェラーゼ受容体構成物で安定的にトランスフェクトされたＣａｃｏ-２細胞における、変異フラジェリン（通常切断された形態で設計される）の阻害されたシグナリングを示すグラフ。遺伝子工学により遺伝子操作された切断した変異体の分子中の１９１-３５３のみがシグナリングしている。
【０１０６】
【図２２】フラジェリンの部分変異体および欠損形態の細胞シグナリングの定量分析を示すグラフ。保存された領域におけるすべてのフラジェリンの部分変異体および欠損形態は、野生型分子のように同じ濃度範囲においてシグナリングしている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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2006503825.tif 000032
2006503825.tif 000033
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