(57)【要約】本発明は、未知の配列に隣接する既知の配列に基づいた、核酸配列を決定するための方法、およびそのような方法を用いるための試薬を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の配列を単離するための方法であって、
既知配列および未知配列を含む核酸の３’末端へ第一のリンカーを、かつ前記核酸の５’末端へ第二のリンカーを連結する工程、
環状核酸を形成するために、前記核酸の両末端に前記リンカーを介してアダプターを連結する工程、ならびに、
前記アダプターおよび未知配列を含む増幅産物を産出するため増幅反応を行う工程、を含むことを特徴とする、
核酸配列の単離方法。
【請求項２】
前記増幅反応が、
前記環状核酸、
既知の核酸配列にハイブリダイズするプライマー、および、
前記アダプターに相補的な配列にハイブリダイズするプライマー、
を含む、請求項１に記載の核酸配列の単離方法。
【請求項３】
前記増幅反応が、
前記環状核酸、
既知の配列に相補的な配列にハイブリダイズするプライマー、および、
アダプター配列にハイブリダイズするプライマー、
を含む、請求項１に記載の核酸配列の単離方法。
【請求項４】
核酸の配列を単離する方法であって、
既知配列および未知配列を含む核酸の３’末端へ第一のリンカーを、かつ前記核酸の５’末端へ第二のリンカーを連結する工程、
環状核酸を形成するために、前記核酸の両末端にリンカーを介してアダプターを連結する工程、
前記アダプターおよび未知配列を含む第一の増幅産物を産出するため第一の増幅反応を行う工程、
前記アダプターおよび未知配列を含む第二の増幅産物を産出するため、前記第一の増幅産物を鋳型に用いて第二の増幅反応を行う工程、ならびに
前記第二の増幅産物の配列を決定する工程、を含むことを特徴とする、
核酸配列の単離方法。
【請求項５】
前記第一の増幅反応が、
前記環状核酸、
既知の核酸配列にハイブリダイズするプライマー、および、
既知の核酸配列に相補的な配列にハイブリダイズするプライマー、
を含む、請求項４に記載の核酸配列の単離方法。
【請求項６】
前記第二の増幅反応が更に、
既知配列にハイブリダイズするプライマー、および、
アダプター配列に相補的な配列にハイブリダイズするプライマー、
を含む、請求項４に記載の核酸配列の単離方法。
【請求項７】
前記第二の増幅反応が更に、
既知の核酸配列に相補的な配列にハイブリダイズするプライマー、および、
アダプター配列にハイブリダイズするプライマー、
を含む、請求項４に記載の核酸配列の単離方法。
【請求項８】
それぞれの増幅工程が、ポリメラーゼ連鎖反応増幅である、請求項４に記載の核酸配列の単離方法。
【請求項９】
前記第一増幅の産物が、第二増幅の前に精製される、請求項４に記載の核酸配列の単離方法。
【請求項１０】
前記第一増幅の産物が、更に第二増幅の前に選別される、請求項４に記載の核酸配列の単離方法。
【請求項１１】
前記選別が、第一増幅のプライマーを用いた更なる増幅を含む、請求項１０に記載の核酸配列の単離方法。
【請求項１２】
前記選別が、第一増幅のプライマーとは異なる少なくとも１つのプライマーを用いた更なる増幅を含む、請求項１１に記載の核酸配列の単離方法。
【請求項１３】
前記第二の増幅産物を配列決定前に精製する、請求項４に記載の核酸配列の単離方法。
【請求項１４】
前記第二増幅のプライマーが、制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を含み、更に第二増幅産物が、配列決定前にベクター内にクローン化される、請求項４に記載の核酸配列の単離方法。
【請求項１５】
前記アダプターが、１５〜１０００ヌクレオチドからなるポリマーである、請求項１に記載の核酸配列の単離方法。
【請求項１６】
前記アダプターが、３０〜１００ヌクレオチドからなるポリマーである、請求項１５に記載の核酸配列の単離方法。
【請求項１７】
前記核酸が、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡからなる群より選択される、請求項１６に記載の核酸配列の単離方法。
【請求項１８】
前記核酸がｃＤＮＡであり、更に、
試料よりｍＲＮＡを調製する工程、および、
ｃＤＮＡを産出するためｍＲＮＡを逆転写する工程、
を含む方法である、請求項１７に記載の核酸配列の単離方法。
【請求項１９】
多数の核酸の配列を、それら核酸の既知配列に基づいて決定するためのハイスループット方法であって、
各々既知配列および未知配列を含む多数の核酸の、３’末端へ第一のリンカーを、かつ５’末端へ第二のリンカーを連結する工程、
核酸毎に環状核酸を形成するため、アダプターを各核酸にリンカーを介して連結する工程、
各環状核酸について第一の増幅反応を行う工程、
ここで各反応はａ）環状核酸、ｂ）環状核酸の既知配列にハイブリダイズする２つのプライマーを含み、各増幅反応により前記アダプターを含む第一の産物が生成する、
各産物について第二の増幅反応を行う工程、
ここで各反応には前記第一増幅の産物、既知の核酸配列に特異的な１つのプライマー、および前記アダプターに特異的な２番目のプライマーが含まれる、ならびに、
前記第二増幅の産物を配列決定する工程、を含むことを特徴とする、
既知の核酸配列に基づいた多数の核酸の核酸配列を決定するためのハイスループット方法。
【請求項２０】
各核酸がｍＲＮＡを含み、試料よりｍＲＮＡを調製する工程を更に含む、請求項１９に記載の既知の核酸配列に基づいた多数の核酸の核酸配列を決定するためのハイスループット方法。
【請求項２１】
各核酸がｃＤＮＡを含み、更に、試料よりｍＲＮＡを調製する工程および、ｃＤＮＡを産出するため前記ｍＲＮＡを逆転写する工程を含む、請求項１９に記載の既知の核酸配列に基づいた多数の核酸の核酸配列を決定するためのハイスループット方法。
【請求項２２】
コンピュータ読み取り可能なプログラムが組み込まれた、核酸配列を決定する方法のコンピュータ読み取り可能メディアであって、前記方法が、
既知配列および未知配列を含む核酸の３’末端へ第一のリンカーを、かつ前記核酸の５’末端へ第二のリンカーを連結する工程、
環状核酸を形成するため、前記核酸の両末端にリンカーを介してアダプターを連結する工程、
前記アダプターおよび未知配列を含む第一の増幅産物を産出するため、第一の増幅反応を行う工程、
前記アダプターおよび未知配列を含む第二の増幅産物を産出するため、鋳型として前記第一増幅産物を含む第二の増幅反応を行う工程、ならびに、
前記第二増幅産物の配列を決定する工程、を含むことを特徴とする、
核酸配列を決定する方法のコンピュータ読み取り可能なプログラムが組み込まれたコンピュータ読み取り可能メディア。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、既知の核酸配列に基づき、未知の核酸配列を同定する方法に関する。とりわけ、本発明は、既知の配列に基づき、遺伝子のコード、または調節領域を同定するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術およびその課題】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＤＮＡ配列の特異的ｉｎ　ｖｉｔｒｏ増幅を可能にする方法である（Ｍｕｌｌｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｔｈ．Ｓｙｒｕｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１：２６３−２７３（１９８６）、Ｓａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７−４９１（１９８８）、Ｓａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０−１３５４（１９８５））。ＰＣＲは、鋳型核酸へのプライマーのアニーリングと前記鋳型からのプライマー伸長により起こる。従来、ＰＣＲは、鋳型中の既知の配列に相補的な２つのプライマーを用いて行われており、それぞれのプライマーは、増幅される鋳型核酸配列のある領域に隣接する。ＰＣＲは分子生物学から法医学や親子鑑定検査までの幅広い分野で様々に応用されている。どのように応用されていても、ＰＣＲに基づくあらゆるアッセイの基本は、ＤＮＡのある領域が、莫大な数に倍加され増幅されることである。これにより、標的配列が圧倒的に優勢な反応産物となるため、他の配列から標的配列を精製する工程が不要となる。
【０００３】
ＰＣＲは、ｃＤＮＡ配列の一部分が既知である場合に、未知の隣接ｃＤＮＡ配列をクローン化するのに有用である。ｃＤＮＡ末端高速増幅（ＲＡＣＥ）、アンカードＰＣＲおよび非対称ＰＣＲのような数多くの方法が、隣接領域を同定するために使用されてきた。これらの技術は、既知配列の３’および５’配列を同定するために使用されてきた。
【０００４】
特定の配列をＰＣＲ増幅する現行の方法において、大きな障害となっているのは非特異的増幅産物が生じてしまうことである。ＰＣＲの条件下では、プライミングの厳密度（Ｓｏｍｍｅｒ　ａｎｄ　Ｔａｕｔｚ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．，１７：６７４９（１９８９））は、非常に雑多な混合物中では、１キロベース（ｋｂ）を越える純粋な産物を産出するほど十分高いわけではない。このため、反応産物の純度および増幅可能なＤＮＡの長さの両方が制限される。ネスト化プライマーの使用（Ｈａｑｑｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１６：１１８４４（１９８８））および鋳型のゲル精製による対象領域のサイズ選択（Ｏｃｈｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２０：６２１−６２３（１９８８）、Ｂｅｃｋ　ａｎｄ　Ｈｏ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１６：９０５１（１９８８））によってこの問題は減るが、ゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅する間、厳密度が不十分なために生じる高いバックグラウンドは、依然として大きな問題である。ネスト化ＰＣＲまたはゲル精製した鋳型を用いる未知の隣接ＤＮＡの増幅方法は、いまだに特異性が制限されており、これは、これらの方法を用いる最初のＰＣＲ増幅が、従来の２プライマーＰＣＲのもつ特異性レベルから向上しないのと同様である。
【０００５】
多くのＰＣＲ技術が、既知の配列に隣接するＤＮＡ断片を配列決定するために開発されてきた。これらのうち、インバースＰＣＲが、その原理の単純さゆえに、議論の的となっている（Ｈｕａｎｇ　ＳＨ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．６９：８９−９６（１９９７））。しかしながら、現在までに紹介されているインバースＰＣＲのプロトコールの手順は時間を要し、またこれらの方法は、好適な制限酵素の数および対象のＤＮＡ中の制限部位の存在により制限される。
【０００６】
バルクヒトゲノムＤＮＡからの、既知の配列に隣接する２ｋｂを超える未知のＤＮＡを、高い特異性で増幅を可能にする別の方法に、パンハンドルＰＣＲ（Ｊｏｎｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｎｉｓｔｏｒｆｅｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２０：５９５−６００（１９９２）、Ｊｏｎｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｎｉｓｔｏｒｆｅｒ、ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｐｐｌｉｃ．，２：１９７−２０３（１９９３））がある。この方法には、未知の配列を含む特定のＤＮＡ鎖の特性化されていない隣接領域へ、既知の配列をプライマーに依存して連結させることが含まれる。未知ＤＮＡを含む鎖中のその未知のＤＮＡに既知の配列が隣接することから、パンハンドル鋳型の産出により、未知のＤＮＡのＰＣＲ増幅が可能になる。しかしながら、パンハンドルＰＣＲ法においては、増幅反応の間の初期プライミングが、パンハンドル鋳型のハンドルを含む長い反転繰り返しの鎖内部アニーリングと競合しなければならず、これによってこの必須の第一工程の効率が減少する。
【０００７】
したがって、本技術分野において、特異性が大きくゲノム配列からの混在産物が少ない、既知の配列の５’および３’両方の配列を同定する方法が必要とされている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、既知の核酸配列に隣接するポリヌクレオチドを単離するための方法、およびそのような方法を用いるための試薬を提供する。
【０００９】
本発明の１つの実施形態により、１）既知および未知両方の核酸配列をもつ核酸の末端にリンカーを連結させる工程、２）前記リンカーを介して、前記核酸にアダプターを連結させ環状核酸を形成させる工程、および３）鋳型として前記環状核酸を用い、既知の核酸配列に特異的な１つのプライマーおよび前記アダプターに特異的な第二のプライマーで、増幅反応を行う工程を含む方法が提供される。本反応は、前記核酸の未知の配列を持つ産物を産出するように設計される。ついで、産物を配列決定して、未知の配列を決定する。本方法は図１にて例示している。
【００１０】
本発明の他の実施形態により、１）核酸の末端にリンカーを連結させる工程、２）リンカーを介して核酸にアダプターを連結させ、環状核酸を形成する工程、３）鋳型として前記環状核酸を、そして前記核酸の既知の領域に特異的２つのプライマーを用いて、第一の増幅反応を行い産物を得る工程、および４）鋳型として前記産物を用い、既知の核酸配列に特異的な１つのプライマーおよびアダプターに特異的な第二のプライマーで、第二の増幅反応を行う工程を含む方法が提供される。リンカーは、好ましくは、アダプターの結合およびライゲーションに適合できるが、アダプターなしでの核酸の自己ライゲーションには適合できない末端を提供する。アダプターにより、第一の増幅段階の精度が増加し、結果として、不要な増幅産物が減少し、続く増幅の効率が高まる。第二の増幅産物は、アダプターを持つ分子に特異的な産物を同定するための選別工程を提供し、したがって、増幅産物の種類を減らし、既知の配列を持つ部分に隣接する核酸配列を与える産物の数を増加させる。本方法は図２で例示している。
【００１１】
他の実施形態において、本発明は、多数の環状核酸について同時に増幅反応を行うための方法を提供する。本実施形態において、それぞれの環状核酸を増幅するために使用するプライマーは、好ましくは、それぞれの試料の増幅反応に対して最大の効率を与えるように設計される。たとえば、プライマーは、プライマーのＧ−Ｃ含量を決定する等により、同様のＴｍを持つように設計可能であり、好ましくは、プライマーの二次構造をさけるように設計される。プライマーの設計はまた、本発明で使用するのに最適なプライマーを同定可能な、コンピュータプログラムを用いて自動化することも可能である。
【００１２】
本発明の特徴は、第一の増幅産物が更に第二の増幅反応の前に選別可能であることである。
【００１３】
本発明の他の特徴は、更なる増幅を第二増幅に続いて実施し、更に所望の最終産物を選別することが可能であることである。
【００１４】
本発明の更に他の特徴は、多数の核酸用のプライマーが、例えばコンピュータプログラムのような、自動選別プロセスを用いて設計可能であることである。
【００１５】
本発明の利点は、とりわけ第一の増幅反応において、非特異的産物の産生がより少ないことである。
【００１６】
本発明の方法の他の利点は、これらの産物を、核酸の既知な配列の３’および／または５’配列を単離および特性化するために使用し得ることである。
【００１７】
本発明のまた他の利点は、既知の配列の３’および５’配列を、１つの環状鋳型を用いて決定することが可能であることである。
【００１８】
本発明のまた他の利点は、ハイスループットな多数の配列の決定のために有用であることである。
【００１９】
本発明のまた他の利点は、本方法が、対象の核酸内部の制限部位存在の必要性によって制限されないことである。
【００２０】
本発明の、これらの、そして他の目的、利点および特徴は、以下に十二分に記載されているこれら方法の詳細を読むことで、当業者とって明らかになるであろう。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本方法を記述する前に、本発明が、記述された特定の条件および方法の順序によって制限されず、もちろん変更可能であることが理解されるべきである。また、本発明の範囲は、付随する請求項によってのみ限定されるものであり、本明細書で使用した語句は、特定の実施形態を記述する目的のためだけであり、限定する意図はないことが理解されるべきである。
【００２２】
値の範囲が示される場合、他に文章内で明確に指示しない限り下限の単位の十分の一まで、その範囲の上限と下限の間にある各値も特に開示される。言及された値または言及された範囲内にある値と、他の言及された値またはその言及された範囲内にある他の値との間の、それぞれのより狭い範囲もまた本発明に含まれる。これらのより狭い範囲の上限および下限は、独立して本範囲に含まれ得るかまたは除外され得、いずれかのもしくは両方の限度がこの狭い範囲に含まれる場合の、または両方の限度がその狭い範囲に含まれない場合の任意の範囲が、本発明に含まれるが、言及された範囲内で特に限度が除外されていればそれに準じる。言及された範囲に、１つまたは両方の限度が含まれる場合、これらの含有された限度のいずれか、または両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。
【００２３】
他に定義されない限り、本明細書で使用するすべての技術的および科学的用語は、本発明が属している当該技術分野の当業者に一般的に理解されているのと同様の意味を持つ。本明細書にて記述されたものと類似した、または同等なあらゆる方法および物質が、本発明の実施または試験において使用可能であるが、好ましい方法および物質をここでは記載する。本明細書で言及されたすべての刊行物は、本明細書に参考として組み込まれており、引用された刊行物に関連する方法および／または物質を開示および記述している。
【００２４】
本明細書および付随する請求項で使用されるように、「ａ」、「ａｎｄ」そして「ｔｈｅ」を冠する単数形には、特に文章中で指示しない限り、複数形が含まれることに注意する必要がある。したがって、たとえば、語句「プライマー（ａ　ｐｒｉｍｅｒ）」には、複数のそのようなプライマーが含まれ、語句「核酸（ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）」は、核酸の１つまたはそれ以上のコピーおよび当業者に既知のその同等物が含まれ、以下同様である。
【００２５】
本明細書で議論されている刊行物は、本明細書の出願日以前にそれらが開示されているために提示されているに過ぎない。本明細書において、本発明が、先行する発明によって、そのような刊行物に先立つ権利を与えられないという承認として解釈するべきではない。更に、その示された刊行の日付は、別個に確認する必要があり得る実際の公開日とは異なる可能性がある。
【００２６】
（定義）
本明細書で使用するところの語句「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）」は、あらゆるポリヌクレオチドを意味し、（ｍＲＮＡを含む）ＲＮＡ、（ゲノムおよびｃＤＮＡを含む）ＤＮＡを含むことが意図されている。本語句はまた、核酸の所望の領域の配列を単離および／または特性化する能力を妨害することがない限り、核酸の構造に対する類似体または置換物を含むＲＮＡおよびＤＮＡを含有することを意図している。
【００２７】
本明細書で使用するところの語句「リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）」は、選択した核酸の末端に添加され、続く核酸へのアダプターのライゲーションを可能にする、ポリヌクレオチドを意味する。リンカーは好ましくは、アダプターの末端に相補的であるが、しかしその連結によって核酸の自己ライゲーションが可能とはならない、選択した核酸に隣接する配列を提供する。
【００２８】
本明細書で使用するところの語句「アダプター（ａｄａｐｔｏｒ）」は、核酸を環状化するために、核酸の末端を橋架けするために使用されるポリヌクレオチドを意味する。アダプターは、一般的には、アダプターの核酸への方向性クローニングのために、リンカー配列に相補的であるように設計される。アダプターはまた、直接核酸にクローン化され得る。
【００２９】
本明細書で使用するところ、とりわけリンカーとアダプターに関して使用される語句「連結（ａｔｔａｃｈｉｎｇ）」は、たとえば選択した核酸とリンカー、または、リンカーとアダプターのようなポリヌクレオチドの、共有的または非共有的、好ましくは共有的な結合を意味する。たとえば、連結は、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成およびライゲーションによって成され得る。連結はまた、アビジンおよびビオチンのような高親和性部位を用いて成され得る。
【００３０】
本明細書にて使用するところの語句「プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）」は、プライマー伸長産物の合成が開始される条件、すなわち好ましい緩衝液（「緩衝液（ｂｕｆｆｅｒ）」には、ｐＨ、イオン強度、コファクターなどが含まれる）中の４つの異なるヌクレオチド三リン酸およびポリメラーゼの存在下、そして適切な温度において、核酸鋳型にアニールされた場合に、ＤＮＡ合成を開始する点として機能することが可能な、ヌクレオチドのポリマーを意味する。一般的には、プライマーは、１２〜１００ヌクレオチドの間であり、より好ましくは１５〜８０ヌクレオチドの間、更により好ましくは１８〜５０ヌクレオチドの間である。プライマーは、天然に存在するヌクレオチドおよび／または改変ヌクレオチドからなり、前記改変ヌクレオチドは塩基置換（たとえば結合が改善された類似体）、改変されたヌクレオシド間結合またはリボース基の置換を含み得る。
【００３１】
配列にハイブリダイズするプライマーは、核酸の鎖および／またはアダプターの鎖に相補的であるプライマーを意味している。核酸のコード領域、またはアダプターの相当する鎖にハイブリダイズするプライマーは、「アンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）」配列を持ち、すなわち、プライマーは、コード領域とワトソン−クリック塩基対を形成することができる。ある配列と相補的な配列にハイブリダイズするプライマーは、「センス（ｓｅｎｓｅ）」配列を持ち、すなわち、核酸のコード領域またはアダプターの相当する鎖と同一の配列を持つ。増幅反応のために、一般的には１つのプライマーがセンス鎖にハイブリダイズし、第二のプライマーがセンス鎖に相補的な配列にハイブリダイズする。
【００３２】
本明細書で使用するところの語句「ハイブリッド形成（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」は、相補的な塩基対を有した２つの一本鎖核酸による二本鎖構造の形成を意味する。ハイブリッド形成は、相補的核酸鎖間、またはミスマッチ領域の少ない核酸間で起こり得る。核酸二本鎖の安定性は、融解温度、または「Ｔｍ」によって決定される。Ｔｍは、（規定のイオン強度およびｐＨ下で）５０％の塩基対が解離する温度である。核酸技術分野の当業者であれば、たとえば核酸の長さ、塩基構成および配列、イオン強度およびミスマッチ塩基対の出現頻度を含む多数の変数を考慮して、経験的に二本鎖の安定性を決定することができる。
【００３３】
本明細書で使用するところの語句「厳密なハイブリッド形成条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」は、完全に相補的な核酸鎖のみがハイブリダイズする条件を意味する。厳密なハイブリッド形成条件は、本技術分野でよく知られている（たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，１９８５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋを参照）。一般的には、厳密な条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列のＴｍより約５℃低い温度であるように選択される。通常、厳密な条件はｐＨ７にて塩濃度が少なくとも約０．２Ｍ、温度が低くとも約６０℃であるような条件であり得る。ハイブリッド形成条件の厳密度を緩めると、配列ミスマッチが許容される。免れて生じるミスマッチの程度は、ハイブリッド形成条件を適切に調整することで制御可能である。
【００３４】
本明細書で使用するところの語句「実質的に相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」は、少ないミスマッチ領域を除き相補的である２つの一本鎖核酸を意味する。実質的に相補的な配列の二本鎖が安定するのは、厳密度の低いハイブリッド形成条件下である。核酸技術分野の当業者であれば、たとえば、核酸の長さおよび塩基対濃度、イオン強度およびミスマッチ塩基対の出現頻度を含む多数の変数を考慮して、経験的に二本鎖の安定性を決定可能である。
【００３５】
本明細書で使用するところの語句「増幅反応（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）」は、核酸の標的配列のコピーを増幅するためのｉｎ　ｖｉｔｒｏ方法を意味する。このような方法にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が含まれるが、これに限定されるわけではない。
【００３６】
本明細書で使用するところの語句「増幅（ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ）」は、標的核酸配列が指数関数的に増加することを意味する。本語句は、核酸の選択した標的配列の数の、線形的および指数関数的の両方の増加を記述するために、本明細書で使用される。
【００３７】
本明細書で使用するところの語句「標的配列（ｔａｒｇｅｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」および「標的核酸配列（ｔａｒｇｅｔ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、増幅されるべき核酸の領域を意味する。標的配列は、増幅に使用する２つのプライマー配列間に存在する。
【００３８】
（本発明の概要）
本発明は、核酸の既知配列に隣接した未知の配列を決定するための改良された方法を提供する。本発明の方法は、アダプターが従来のベクター配列よりも短く設計されるので、とりわけ第一増幅工程の効率を増加させる。したがって、第一増幅工程の産物には、対象の核酸に非特異的である配列はほとんど含まれず、本発明の方法を用いて産出された産物は、全般的に、従来のインバースＰＣＲのような技術を用いた産物よりも短くなる。より短い核酸断片を増幅する方が、エラー産物（すなわち、不完全な増幅産物）が少ないことから、より短い配列の増幅は、長い配列の増幅よりも効率がよい。したがって、本方法でのアダプターの使用は、結果として、たとえばインバースＰＣＲを使用する従来のベクター中での核酸の同様な増幅と比較して、第一増幅工程での完全な産物の割合が高くなる。
【００３９】
本発明の２つの実施形態を、図１および２で例示している。これらの例示的実施例において、直鎖核酸が、核酸の太字で示した既知の配列に隣接する配列を決定するために提供される。まず、リンカー分子を核酸末端に添加する。リンカー分子は好ましくは、アダプターの末端に相補的であるが、自己相補的ではないヌクレオシドの短いポリマー、すなわち自己環状化しないリンカーを含む核酸である。リンカーを核酸とともに培養（ｉｎｃｕｂａｔｅ）してライゲートし、核酸のそれぞれの末端にリンカーを連結する。
【００４０】
リンカーの核酸への連結に続き、リンカーに相補的な末端を持つアダプターを、核酸と培養（ｉｎｃｕｂａｔｅ）およびライゲートすることで連結する。アダプターの添加により、結果として環状核酸が形成され、これは、続く増幅工程に直接、または精製後に使用され得る。
【００４１】
第一の実施形態において、環状核酸が、既知の核酸配列にハイブリダイズする１つのプライマーと、アダプター配列にハイブリダイズする第二プライマーでの増幅において、鋳型として使用される。この産物は、核酸の未知の配列を決定するために直接使用することができる。図１を参照のこと。この増幅反応の産物は、更に、同一のプライマーまたは前記核酸および前記アダプターに特異的なネスト化プライマーで、鋳型として本産物を用いることにより更に選別可能であり、また、配列決定の前に、ベクター内にクローン化することも可能である。
【００４２】
図２で例示した第二の実施形態において、環状核酸鋳型を、２つの核酸特異的プライマーでの増幅反応で使用し、第一増幅反応産物を産出することが可能である。この産物には、既知配列の任意の核酸５’配列および３’配列が含まれ得る。第一増幅反応混合物の産物は、直接第二増幅のための鋳型として使用できるし、またはこの第一増幅反応混合物は希釈できる。
【００４３】
第二増幅では、既知の核酸配列にハイブリダイズする１つのプライマーと、アダプターにハイブリダイズする１つのプライマーと共に、鋳型として第一増幅の産物が使用される。これらプライマーは、プライマー対の選択した方向性に従って、（示したような）既知の配列に対する３’または既知の配列の５’いずれかの未知配列を増幅するように選択可能である。したがって、本方法は、既知の核酸配列の３’、既知の核酸配列の５’、または両方の核酸配列を単離および／または特性化するために使用可能である。
【００４４】
既知の核酸配列の３’および５’両方の未知配列を単離するために、第一増幅産物を、２つの別個の第二増幅反応、つまり核酸のセンス鎖にハイブリダイズするプライマーと、アダプターに相補的な配列にハイブリダイズするプライマーを用いた第一反応、および、核酸に相補的な配列にハイブリダイズするプライマーおよびアダプターのセンス鎖にハイブリダイズするプライマーを用いる第二反応、のための鋳型として使用することができる。本実施形態は、図３に例示している。
【００４５】
本発明の他の実施形態において、第一増幅産物が更に、第二増幅反応の前に選別される。産物は、サイズ選別（たとえばゲル精製）や前記核酸に特異的なネスト化プライマーを用いた更なる増幅を含む多くの技術により選別可能である。
【００４６】
本方法の他の実施形態において、更なる増幅が、更に最終産物を選別するため第二増幅に続いて行われる。たとえば、１つは核酸に特異的であり、１つはアダプターに特異的であるネスト化プライマーを用いた更なる増幅のための鋳型として第二増幅の産物を使用可能である。これは図３に例示している。
【００４７】
更に他の実施形態において、方法全体を、ハイスループット方法として多数の核酸について同時に実施し、多数の核酸についての情報を得ることが可能である。異なる核酸の環状化に続き、多数の別個な増幅反応を同時に実施し、多数の既知の核酸領域の未知配列を決定することが可能である。それぞれの反応のためのプライマーは、標的核酸へのアニーリングに際し、類似した、または同一のＴｍを持つように設計可能であり、好ましくはプライマーの二次構造を避けるように設計される。プライマーの設計はまた、本発明に使用するのに適したプライマーを同定可能であるコンピュータプログラムを用いて自動化可能である。
【００４８】
手動またはプログラムを用いたプライマーの設計のための探索領域を決定するために、核酸の未知の配列の長さ、前記核酸の既知の配列内の先に設計されたプライマーの位置、プライマーの望ましい長さ、プライマーの塩基含量、および他の基準を使用可能である。たとえば、プログラムから、増幅される核酸の長さ、および対応する逆プライマーの位置に従って、予め決定した順プライマーの探索開始位置と終了位置を得ることが可能である。プライマーを、より長い核酸領域の増幅のために設計可能であるけれども、好ましくは、増幅されるべき領域は、３００ヌクレオチド以下である。典型的には、プライマーはまた、未知の配列について得ることができる情報の量を最大化するように、できるだけ未知領域に近くあるように設計される。
【００４９】
増幅反応を実施するために使用する装置は、好ましくは、パーソナルコンピュータ、または従来設計の内部マイクロプロセッサに基づくコントローラのような、望ましいプロトコールを定義しているデータを受け取ること、および必要な器具を操作するための適切な制御信号を発してプロトコールを実行するよう設計された、ユーザーがプログラム可能であるコンピュータによって制御される。
【００５０】
たとえば、本発明の方法は、鋳型核酸の構築および／または増幅反応サイクル中の各工程の温度および時間を制御するプロセッサによって制御可能である。プロセッサは、システム制御ソフトウェアを実行し、このソフトウェアはプロセッサによってアクセス可能なコンピュータで読み取ることが可能なメディア上に保存された、たとえばプロセッサと連結するメモリ中に保存された、コンピュータで読み取り可能なプログラムである。メモリは、ハードディスクドライブまたはフロッピー（登録商標）ディスク、ジップディスクもしくはＣＤ−ＲＯＭのような持ち運び可能なメモリであり得る。このシステムには、ハードディスクドライブ、フロッピー（登録商標）ディスクドライブおよび／またはカードラックが含まれ得る。プロセッサは、システム制御ソフトウェアの制御下で動作可能であり、そこには、特定の試薬の添加、時間、温度などを含む、特定の処理のパラメータを司る指令の組が含まれる。たとえばフロッピー（登録商標）ディスクまたはディスクドライブもしくは他の適切なドライブに挿入された他のコンピュータプログラム製品を含む、他のメモリ上に保存されたもののような他のコンピュータプログラムもまた、プロセッサを操作するために使用可能である。
【００５１】
（アダプター設計）
アダプターは、厳密なハイブリッド形成条件下で少なくとも１つのプライマー配列に結合するような長さおよびＧ−Ｃ含量を持つものとして設計され得る。アダプターは、好ましくは従来のベクター配列よりも短く、これにより、第一増幅反応で合成される標的核酸配列の量が最大となる。アダプターは長さにして２から３ｋｂまでであり得るが、好ましくは長さにして１５ヌクレオチドから１ｋｂの間、より好ましくは長さにして２０〜５００ヌクレオチド、更に好ましくは長さにして３０〜２５０ヌクレオチド、更に好ましくは長さにして５０〜１００ヌクレオチドである。本発明のアダプターの末端は、一般的に核酸に対して使用したリンカーの末端に相補的であるように設計される。アダプターは、天然に存在するおよび／または改変されたヌクレオチドからなり得、前記改変ヌクレオチドは、塩基置換、改変ヌクレオシド間結合、またはリボース基の置換を含み得る。
【００５２】
アダプターに対しプライマーを使用するネスト化増幅反応を実施するのが望ましい場合、アダプター配列の少なくとも一部分が、プライマー設計を可能にするために既知の配列でなければならない。ネスト化増幅反応が望ましくない場合は、アダプターの配列は、アダプターの末端がリンカーとのハイブリッド形成に適合可能である限り、既知である必要はない。
【００５３】
本発明は主として、核酸とアダプター間に連結基を持つように本明細書で記述されているが、本発明はまた、核酸に直接ハイブリダイズするように設計されたアダプターも含むように意図されている。たとえば、ゲノムＤＮＡ断片の配列の決定は、たとえば２つの別個の制限エンドヌクレア−ゼを用いたゲノム領域の消化による、異なる突出配列をもつＤＮＡを使用可能である。このような場合、アダプターは、消化された核酸に相補的な末端を持つように設計され得、またアダプターは、核酸に直接添加され得る。
【００５４】
（プライマー設計）
増幅反応に使用するプライマーの選択により、増幅反応の特異性が決定する。本発明で使用するプライマーは、ヌクレオチド、好ましくはデオキシリボヌクレオチドからなるポリマーであり、増幅反応によって鋳型特異的に伸長される。
【００５５】
プライマー配列は鋳型核酸の正確な配列を反映する必要はない。たとえば、非相補的ヌクレオチド断片（たとえば制限エンドヌクレアーゼに対する部位）を、プライマーの残りの部分が鋳型に相補的であるようにして、プライマーの５’末端に連結可能である。加えて、プライマー配列が、相補的ＤＮＡ鎖のアニーリングおよび合成のために十分相補的である限り、非相補的塩基をプライマー内に分散可能である。
【００５６】
プライマーは、重合用試薬の存在下で伸長産物の合成を開始するのに十分長く設計される。短いプライマー分子は、一般的に、鋳型と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために、より低い温度を必要とする。本発明のプライマーは、好ましくは、核酸配列またはアダプター配列と高い親和性で結合するように、好ましくは５５から６５℃で安定なワトソン−クリック塩基対を形成するように設計される。アダプターに特異的なプライマーは、アニーリング時に好ましいＴｍを持ち、予想される二次構造がほとんどないか、または存在しないように設計され得る。Ｔｍは、Ｇ−Ｃ含量、プライマーの長さなどに基づいて決定可能である。同様に、核酸に特異的なプライマーは、特定のＧ−Ｃ含量、予想される二次構造、およびＴｍを持つ核酸の、選択した領域に相補的であり得る。加えて、特定の塩基（とりわけＡまたはＴ）の伸長を、プライマーの設計において考慮可能であり、また避けることが可能である。好ましくは、単一増幅反応で使用され得るプライマー対は、鋳型へのアニーリングに際し、同一または類似のＴｍを持つように設計される。都合よいプライマー特性のプライマーを決定する他の技術は、本明細書に参考として組み込まれている、ＰＣＲ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｅｄ．Ｍｉｃｈａｅｌ　Ａ．Ｉｎｎｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（Ｍａｙ　１９９９）およびＰＣＲ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　Ｅｄ，Ｊ．Ｆ．Ｂｕｒｋｅ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎ　Ｌｔｄ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　１９９６）で見ることができる。
【００５７】
核酸配列に対するプライマーは、人手で設計可能であり、またはハイスループット実験のためには、コンピュータプログラムのような自動化システムを用いて設計することも可能である。そのようなプログラムは、所望の特性（たとえばＧ−Ｃ含量、Ｔｍなど）を持つ核酸の領域を決定するために使用可能である。したがって、もし増幅反応を、多数の核酸配列試料を用いて実施する場合、プライマーは、各核酸試料に対する反応の効率を最大化するように、厳密度に関して、すべてが同一または類似した特性を持つように設計し得る。
【００５８】
プライマーはまた、配列決定のためベクター内へ増幅産物のクローニングが可能となるよう、プライマー中に制限エンドヌクレアーゼ部位を持つように設計することもできる。制限部位は、好ましくは、プライマーの結合または増幅産物の伸長に影響を与えないように、プライマーの５’末端、またはその近くに位置する。プライマーは、制限エンドヌクレアーゼによる開裂の効率を上げるために、制限部位への５’に追加的なヌクレオチドを持ち得る。
【００５９】
（増幅反応）
本技術分野で公知である多数の増幅技術を、ＰＣＲを含む本発明で使用可能である。核酸のＰＣＲ増幅には、核酸の熱変性、増幅される核酸に隣接している配列への２つのプライマーのアニーリング、および最適なポリメラーゼによるアニールしたプライマーの伸長、これらの繰り返しサイクルが含まれる。プライマーは、標的配列の反対鎖にハイブリッド形成し、ポリメラーゼによる合成が、プライマー間の領域にわたって進むように配向し、効果的に前記領域の量を二倍にする。更に、伸長産物がまた、プライマーに相補的であり、かつ結合可能であるので、それぞれの連続サイクルにより、先のサイクルで合成された核酸の量を本質的に二倍にする。このため、およそ２ｎ／サイクルの速度にて、特定の標的断片が指数関数的に蓄積される。ここで式中ｎはサイクル数である。
【００６０】
ＤＮＡの増幅のために、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ　（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼまたはｐｆｕポリメラーゼのような熱安定性ポリメラーゼが使用可能である。Ｔａｑの調製方法は、米国特許第４，８８９，８１８号に開示されており、本明細書に参考として組み込まれている。ｐｆｕポリメラーゼの調製方法は、米国特許第４，８８９，８１８号に開示されており、本明細書に参考として組み込まれている。他のＴｈｅｒｍｕｓ種（たとえばＴｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓまたはＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ）または非Ｔｈｅｒｍｕｓ種から単離された他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７　ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌のまたはＫｌｅｎｏｗ断片のような非熱安定性ＤＮＡポリメラーゼもまた、ＤＮＡのＰＣＲにて使用可能である。
【００６１】
本発明は、既知の配列を持つ任意の核酸に連結しているか、または直接隣接している配列を単離および／または特性化するために使用可能である。たとえば、本発明は、第一増幅反応で、鋳型としてｃＤＮＡを用いることによって、ｃＤＮＡの５’および／または３’末端を決定するために使用可能である。したがって、リンカーを、一本鎖ｃＤＮＡの精製調製物、またはそのような分子（たとえば、逆転写反応のｃＤＮＡ産物、またはｃＤＮＡライブラリーからの挿入物）のプール中のいずれかで、ｃＤＮＡに加える。未知の配列が、あるゲノムＤＮＡ領域からのものである場合、このゲノム領域は好ましくは、対象の領域中でこのゲノム領域を切断すると予想されない酵素で、第一反応の前に消化される。ゲノムＤＮＡは更に、鋳型をより精製するため、および第一増幅反応の効率を増加させるために、ＤＮＡにリンカーを連結する前に、（たとえば、サイズ選別択ゲル精製またはクロマトグラフィーにより）選別可能である。
【００６２】
あるいは、ＲＮＡそれ自身が、アダプターおよびリンカーと共に環状化可能であり、逆転写および／または増幅プロセスが環状ＲＮＡ上で実施される。環状ＲＮＡを、増幅反応の鋳型として使用する場合、酵素は、プライマー伸長を用いてＲＮＡの増幅が可能な熱安定性酵素である。酵素は、ＲＮＡからＤＮＡを産出するＲＮＡポリメラーゼであり得、たとえばＭＭＬＶ−ＲＴまたはＡＬＶ−ＲＴのような逆転写酵素である得る。ｃＤＮＡへのＲＮＡの逆転写方法はよく知られており、上述のＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，ｓｕｐｒａに記述されている。この酵素は第一反応に使用可能であり、ついで、残りの増幅反応が、ＤＮＡに関して記述したように実施される。すなわち第一サイクルが逆転写であり、残りのサイクルが従来のＰＣＲである。たとえば、米国特許第５，３２２，７７０号には、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いた、ＲＮＡ鋳型の連結逆転写／増幅のための手順を記述されている。他の例として米国特許第５，９１６，７７９号には、ＲＮＡ標的配列のｃＤＮＡコピーが、産出されると同時に精製されるプロセスを記述している。
【００６３】
当業者であれば、核酸がどのような性質であっても、核酸は、使用する方法に適したよく認識されている改変を加えるだけで、増幅可能であることを認識するであろう。
【００６４】
生物学的試料からの核酸の抽出のための種々の技術が本技術分野で公知である。たとえば、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２）；Ａｒｒａｎｄ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｐｒｏｂｅｓ、ｐｐ．１８〜３０、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅｄ　Ｈａｍｅｓ　ａｎｄ　Ｈｉｇｇｉｎｓ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，１９８５）、またはＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１８から２０章（Ｉｎｎｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、１９９０）に記述されたものを参照。
【００６５】
特定のプロトコールにおいては、ｄＮＴＰ、酵素またはプライマーのような試薬の添加が、増幅反応プロトコール（たとえば後期サイクル）中で望まれるか、または試薬の連続添加が望まれることがある。増幅プロセス中の試薬の添加は人手で行われ得るが、より好ましくは、添加は試薬添加メカニズムを介してＣＰＵの制御下で自動的に行うことができる。たとえばＣＰＵは、完了したサイクルの数をプロトコールの間モニタする制御メカニズムを介して、サイクルカウンタと連結可能である。プロトコール後期で試薬を添加すると、総収率を最大にすることができる。たとえば、１０〜５０マイクロモル範囲でｄＮＴＰの濃度を維持すること厳密性は上がるが、しかしこれらのレベルは、後期サイクルでの化学量論的に限界となる恐れがある。したがって、増幅プロトコール後期でのＭｇ−ｄＮＴＰ濃度の増加は、精度に対し正味の影響なしに、収率を劇的に改善する可能性がある。同様に、プライマー濃度は、総収率を押し上げ、および／または産物純度を上げるために、後期サイクルで増加され得る。
【００６６】
ネスト化プライマーを、増幅産物の特異性を保証するために使用可能である。たとえば、米国特許第４，６８３，１９５号は、単一コピー遺伝子の増幅におけるバックグラウンドを減少させるため、ネスト化プライマーを使用することを示している。この手順は、標的配列を増幅するための第一のプライマー対、および鋳型として第一の標的配列を用いて産物を産出するための第二のプライマー対を必要とする。第一または第二増幅反応いずれかの後、反応混合物を希釈して、第一プライマー対の濃度を減少させ、第二プライマーを反応混合物中に導入する。あるいは、反応産物を増幅に続いて単離可能であり、図４に示される、鋳型として使用した精製した産物は、第二の増幅反応に続くネスト化増幅反応を示している。他の改変ネスト化増幅手順もまた使用可能である。そのような反応の例は、米国特許第５，９９４，０５６号に記述されている。
【００６７】
（追加増幅試薬）
伸長プロセスで使用するヌクレオシド−５’−三リン酸、典型的にはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰは、伸長反応の間、一般的に合計濃度にして４００μＭから４．０ｍＭの範囲で存在するが、好ましくは濃度が５００μＭから１．５ｍＭである。ＰＣＲのような増幅系はまた、標的核酸配列を増幅するために使用する酵素と適合する緩衝液を必要とする。
【００６８】
増幅混合液のｐＨは、鋳型核酸の安定性に影響を与える。反応のｐＨを増加させると、温度サイクルの間、鋳型核酸の分解を減少させることができる。ＰＣＲ増幅混合液はｐＨ緩衝化されているが、通常のＰＣＲ反応のｐＨは、反応緩衝液の温度依存性のために、温度サイクルの間に相当変化する。典型的なＰＣＲで使用される緩衝化試薬はトリスであり、これは−０．０３１／℃の△ｐＫａを持つ。温度サイクルの間のｐＨの変動は、−０．０２１／℃の△ｐＫａを持つトリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（トリシン）、および−０．０１８／℃の△ｐＫａ（双方の値は２０℃で測定）を持つ、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン）のような小さな△ｐＫａ、および０．１Ｍのイオン強度を持つ緩衝化剤を使用することによって減少させることができる（Ｇｏｏｄ　ａｎｄ　Ｉｚａｗａ、１９７２、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４、Ｐａｒｔ　Ｂ：５３−６８を参照）。高温条件の間、トリシンまたはビシン緩衝液いずれかを用いると、典型的なトリス緩衝液を用いた時よりもｐＨは高いままであり、温度サイクルに由来するｐＨの変動が減少する。
【００６９】
一価および二価カチオンともに、増幅反応で使用可能である。ＤＮＡの増幅のために好ましい二価カチオンはＭｇ２＋である。多数の一価塩もまた、本発明の方法において使用可能であり、ＫＣｌ、ＫＯＡｃ　ＮａＣｌ、（ＮＨ４）２、ＳＯ４、グルタミン酸カリウム、およびＮＨ４ＯＡｃが含まれるが、これらに限定はされない。これらそれぞれの、適切な厳密度および／または収率を与えるための最適濃度は、当業者によって経験的に決定され得る。
【００７０】
（増幅産物の解析）
最終増幅に続き、解析のための産物を、その産物の配列を決定するために直接使用するか、（たとえばゲル精製または沈降により）精製するか、または従来のベクター内にクローン化してよい。好適なベクターには、コンピテント細菌細胞中の複製のための細菌起源部位を持つプラスミドベクター、およびベクター内へクローニングするための制限部位が含まれる。ベクターの例には、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＶＰ１６（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）、およびｐｃＤＮＡベクター群（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が含まれる。
【００７１】
配列決定は、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定法に限定しないが、この方法を含む当業者に公知の任意の技術を用いて実施可能であり、好ましくは蛍光配列決定である。好ましい実施形態において、配列決定は、キャピラリー　シークエンサーにおける蛍光色素配列決定を用いて、たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃ　Ｍｅｇａｂａｓｅ　キャピラリー　シークエンサー（ファルマシア　アプジョン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｕｐｊｏｈｎ）、Ｐｅａｐａｃｋ、ＮＪ）を用いて実施される。これらの系は、通常、ＰＣまたは従来設計の内部マイクロプロセッサに基づくコントローラのようなプログラム可能コンピュータによって制御される。
【００７２】
【実施例】
以下の実施例は、本発明の作製および使用方法の完全な開示および記述を当業者に提供するために提起されるが、本発明者らが本人らの発明であると見なすものの範囲を制限する意図はなく、また、以下の実験がすべてであるとか、以下の実験のみを行ったと表明する意図はない。使用した数字（たとえば量、温度など）に関して正確さを保証するように努めているが、実験的エラーおよび偏差は考慮されるべきである。特に言及しない限り、部（ｐａｒｔ）は重量部、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。
【００７３】
（実施例１）
２１種の既知ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子を用いて本発明の方法を実施し、この方法をクローンテックマラソン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｍａｒａｔｈｏｎ）キットまたはアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）ＲＬＭ−ＲＡＣＥキットを用いた標準的なＲＡＣＥプロトコールと直接比較した。これらのＲＡＣＥプロトコールを用いる方法は製造者のプロトコールに従い、また各遺伝子について両方のＲＡＣＥキットを用いた。どちらのキットでも全く同じになった場合は、より長い伸長を得るために、２つのプロトコールのうち長い方を用いた。プロトコールは以下の遺伝子で行なった。
【００７４】
【表１】
2004511221.tif 000002
【００７５】
同一の２１種の遺伝子に関して、本発明の一つの実施形態の方法も実施した。ｍＲＮＡ調製のランダムプライミングによりｃＤＮＡを得、ｐｃＤＮＡ２．１、または本発明のアダプター中にライゲートした。第一鎖合成は、一反応あたり１０ｎｇのｐＤＮ６ランダムプライマーおよび〜１μｇのｍＲＮＡを用いた２０μｌＲＴ反応により行なった。ｍＲＮＡを２５℃にて５分間培養（ｉｎｃｕｂａｔｅ）し、ついで１μｌのＭＭＬＶ−ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ、Ｇｉｂｃｏ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を加え、温度を４２℃まで上昇させ、ｍＲＮＡを更に４５分間培養（ｉｎｃｕｂａｔｅ）した。サーモスクリプトポリメラ−ゼを１μｌ加え、反応物を５０℃にて１０分間、５５℃にて３０分間、および６０℃にて１０分間連続して培養（ｉｎｃｕｂａｔｅ）した。これらの工程はｃＤＮＡ転換を可能な限り最長にするために行なった。
【００７６】
培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）後、反応物に以下の試薬を加えた。ｄＨ２Ｏ　９１μｌ、ｄＮＴＰ　３μｌ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リガーゼ　１μｌ、ＰｏｌＩ　４μｌ、およびＲＮａｓｅＨ　１μｌ。反応物を１６℃にて２時間培養（ｉｎｃｕｂａｔｅ）した。反応物にＴ４ｐｏｌを２μｌ加え、反応物を１６℃にて更に５分間培養（ｉｎｃｕｂａｔｅ）した。二回目の培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）の後、ＥＤＴＡを１０μｌ加えて反応を停止させた。反応物をフェノール−クロロフォルム抽出し、ＥｔＯＨでｃＤＮＡを沈殿させた。
【００７７】
反応物をＢｓｔＸＩリンカー（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にライゲートし、１６℃にて一晩培養（ｉｎｃｕｂａｔｅ）した。使用したリンカーの配列は、５’ＣＴＴＴＣＣＡＧＣＡＣＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）、および３’ＧＡＡＡＧＧＴＣ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）であった。培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）後、Ｃｈｒｏｍｏｓｐｉｎ１０００（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いてｃＤＮＡを精製した。精製後、反応物の一部を本発明のアダプターにライゲートし、一次増幅工程に用いる環状鋳型を形成した。全ての生成したｃＤＮＡを、ｃＤＮＡ：アダプターのモル比が１：１になるようにアダプター配列にライゲートし、鋳型コンカテマーの形成を最小限にした。使用したアダプターは５’ｐＣＴＧＧＧＣＴＣＴＴＣＴＡＴＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴＡＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＡＣＣＡＧＴＧＴＧＧＴＧＴＧＡＣＣＣＧＡＧＡＡＧＡＴＡＴＣＡＣＡＧＴＧＧＡＴＴＴＡＣＧＣＣＧＧＣＧＣＡＴＴＡＴＧＣＴＧＡＧＴＧＡＴＡＴＣＣＣＧＣＴＧＧＴＣｐ５’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）の配列を持つオリゴヌクレオチドであった。
【００７８】
それぞれの遺伝子の環状化ＤＮＡ産物について、最終反応物量各２０μｌを９６穴プレート中で一次増幅反応を行なった。それぞれの穴の反応物２０μｌ中には次のものが含まれていた。ｄＨ２Ｏ　１５．９μｌ、１０×緩衝液　２μｌ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．１、１６ｍＭの硫酸アンモニウム、３．５ｍＭのＭｇＣｌ２および１５０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）、１０ｍＭのｄＮＴＰ　１μｌ、鋳型　１μｌ（０．５ｎｇ／μｌ）、および０．１μｌ（２５ｕ／μｌ）、ＫｌｅｎＴａｑ／ｐｆｕ　ｍｉｘ（ＫｌｅｎＴａｑ＝２５ｕ／μｌ、ｐｆｕ＝２．５ｕ／μｌ、１５０：１ｕ／ｕ：Ｋｔａｑ／ｐｆｕ　ｍｉｘ）（ＫｌｅｎＴａｑはＡｂ　ペプチズ（Ａｂ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯより入手、ｐｆｕポリメラ−ゼはストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡより入手）。プライマーおよび水の混合物を１２チャンネル　ピペッティングにより加え、パーキン　エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）サーマルサイクラーを用いて反応を行なった。サイクル条件は９５℃にて３０秒間、５７℃にて３０秒間、および６８℃にて１２分間（あるいは、ＧＭＣアダプターライゲート鋳型については１０分）を全４０サイクルであった。
【００７９】
ついで一次増幅反応の反応産物をＴＥ　ｐＨ８．０およびＨＰＬＣ水（１：２）中に希釈し、最終量を１００μｌとした。
【００８０】
二次増幅反応を、最終反応物量３０μｌを９６穴プレート中で行なった。それぞれの穴には次のものが含まれていた。１×ｌｏｎｇ　ＰＣＲ　ｍｉｘ　２５．３５μｌ、鋳型　０．５μｌ（一次反応の希釈産物）、フォワードプライマー（アダプターに相補的）　１μｌ、リバース　プライマー（核酸に相補的）　１μｌ、ＨＰＬＣグレード水　２μｌ、およびＫｌｅｎｔａｑ／ｐｆｕ　０．１５μｌ。プライマーおよび水の混合物を１２チャンネル　ピペッティングにより加え、パーキン　エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）サーマルサイクラーを用いて反応を行なった。サイクル条件は次の通りであった。９５℃にて１分、９５℃にて３０秒間、５７℃にて３０秒間、および６８℃にて５分間を全４０サイクル行い、最終伸長として６８℃にて２０分行なった。
【００８１】
二次増幅工程の後、配列決定のために反応産物をゲル精製およびクローン化した。ＰＣＲ産物２０μｌを１０×ローディング色素２μｌに加え、薄いコ−ムを備えた１．４％低溶解ゲル上にローディングした。ゲルをゆっくりと泳動し、分離した。いくらかの試料をゲラーゼ／β−アガラーゼを用いて、続いてＥｔＯＨ沈殿により精製した。その他の試料はキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ゲル抽出キット、続いてＥｔＯＨ沈殿を用いて精製した。ペレットを少量のｄＨ２Ｏ（５から１０μｌ）中に再懸濁させた。
【００８２】
試料を２から４μｌ用いてそれぞれクローン化し、化学的に反応する細胞へ形質転換させた。得られたクローンが少ない試料についてはこのプロセスを繰り返した。細胞をカナマイシンプレート上にまき、青色／白色選別により形質転換した細胞を識別した。それぞれの試料に対し１２個のコロニーを選び、挿入された配列を決定した。
【００８３】
本発明の手順および標準的なＲＡＣＥプロトコールで、以下の結果が得られた。
【００８４】
【表２】
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【００８５】
このように、本発明では、従来のＲＡＣＥプロトコールに比べ、より多くの全長遺伝子を単離でき、一次増幅においてより効果的に伸長させ、より多くの遺伝子を同定できた。本発明の手順はまた、長い転写産物すなわち、３ｋｂ以上の転写産物の伸長においても、平均伸長が標準的なＲＡＣＥプロトコールの７倍と、特に有効である。
【００８６】
本発明は特定の実施形態に関して記述しているが、本発明の意図および範囲内で様々な変更を行な得ること、および同等のものと置き換え可能であることは、当業者に理解されるであろう。更に、特定の状況、材料、物質の構成要素、プロセス、プロセス工程または複数の工程が本発明の目的、意図および範囲に合致するよう、多くの修正が可能である。そのような修正は全て本明細書に添付した請求項の範囲内であるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第一の実施形態の概略を例示しており、点線はアダプターを示し、細線は核酸の未知配列を表し、太線は核酸の既知配列を示し、プライマーは矢印で示している。
【図２】本発明の第二の実施形態の概略を例示しており、点線はアダプターを示し、細線は核酸の未知配列を表し、太線は核酸の既知配列を示し、プライマーは矢印で示している。
【図３】本発明の他の実施形態を例示しており、３’および５’未知配列両方の決定を示し、点線はアダプターを示し、細線は核酸の未知配列を表し、太線は核酸の既知配列を示し、プライマーは矢印で示している。
【図４】未知配列を含むＤＮＡの更なる選別のためのネスト化増幅反応を例示しており、点線はアダプターを示し、細線は核酸の未知配列を表し、太線は核酸の既知配列を示し、プライマーは矢印で示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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