(57)【要約】本発明は、支持体上のサンプルを観測又は分析するための方法及び装置に関する。更に具体的に言えば、共通のプレート（１９）上に配置された幾つかのサンプルを順に観測するための装置であって、観測軸に沿った垂直移動の自由を保ちながらも、プレート（１９）と観測軸に垂直な面にある観測軸との間の相対的な変移を許容するのに適したプレート（１９）を位置付けするステージ（１７）を観測するための対物レンズ（１５）と、サンプルを照射するための手段（２１）と、対物レンズ（１５）出力において画像を捕捉するための手段（２３，２５）とを含む装置に関する。この装置は、対物レンズ（１５）に対して固定され且つ支持体（１９）上に支持面（４５）を有しているスペーサ（４３）を持つ。前記支持面が観測軸に対して近接配置されていることにより、プレート（１９）と観測軸との間の相対的な変移中に、前記スペーサ（４３）が対物レンズ（１５）と観測面（２９）との間に一定の距離を、観測軸上で維持するように適合されている。本発明は、細胞サンプルの迅速な解析のために有用である。
2004516495.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体、特にプレート（１９）上に配置された一以上のサンプルを観測又は分析するための装置であって、支持体（１９、３１９）の観測面（２９）から観測軸（Ｘ−Ｘ）に沿ってサンプルの少なくとも一部分を観測するための対物レンズ（１５）と、観測軸に対して垂直な面で支持体（１９、３１９）と観測軸（Ｘ−Ｘ）との相対移動を保証しながらも垂直移動を自在にするように適合された、支持体を配置するためのステージ（１７）と、サンプルの少なくとも一部分を照射するための手段（２１）と、対物レンズ（１５）出力で画像を捕捉するための手段（２３、２５、５３）とを含んで成り、対物レンズ（１５）に対して固定され、且つ支持体（１９、３１９）上に支持面（４５、１４５、３４５）を有するスペーサ（４３、１４３、２４３、３４３）を含み、前記支持面が観測軸に近接して位置づけされて、そのため、前記スペーサ（４３、１４３、２４３、３４３）が、支持体（１９、３１９）と観測軸（Ｘ−Ｘ）との間の相対移動の間に、対物レンズ（１５）と観測面（２９）との間の一定の距離を観測軸（Ｘ−Ｘ）上で維持するように適合されている装置。
【請求項２】
対物レンズ（１５）と支持面（１４５）との距離を調節するための手段（１４３Ａ、１４３Ｂ、１４４）を含む、請求項１記載の装置。
【請求項３】
支持体（１９）が、９６個、３８４個、８６４個又は１５３６個のウェルを含むプレートである、請求項１又は２記載の装置。
【請求項４】
スペーサが、観測軸（Ｘ−Ｘ）に沿って延びるスリーブ（４３、１４３、２４３、３４３）を含み、支持面が、スリーブ（４３、１４３、２４３、３４３）の端部にあるリング形区域（４５、１４５、３４５）によって形成されている、請求項１〜３のいずれか１項記載の装置。
【請求項５】
捕捉手段（２３、２５、５３）及び照射手段（２１）が、サンプルを保持するプレート上に配置された基準蛍光ビーズの観測に基づいて照射ビームの均一さを補正するための自己較正手段を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の装置。
【請求項６】
照射手段（２１）が、サンプルの表面の大部分を同時に覆うように適合され、対物レンズ（１５）及び捕捉手段（２３、２５、５３）が、サンプルの表面の大部分を同時に覆う観測フィールドを提供するように適合されている、請求項１〜５のいずれか１項記載の装置。
【請求項７】
照射手段（２１）が、灯具又はレーザで構成された少なくとも一つの光源を含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の装置。
【請求項８】
照射手段が、一組の発光ダイオード（２６１）で構成された少なくとも一つの光源を含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の装置。
【請求項９】
前記光源が、少なくとも二つの異なる波長で発光する発光ダイオード（２６１）を含む、請求項８記載の装置。
【請求項１０】
光源によって発された光をサンプル又はその一部分に収束させる少なくとも一つのレンズ（２６３、２６７）を含む、請求項８又は９記載の装置。
【請求項１１】
一組の個別的なレンズ（２６３）を含み、各レンズが各ダイオード（２６１）と関連づけられている、請求項１０記載の装置。
【請求項１２】
発光ダイオード（２６１）と支持体（１９）との間に配置されたレンズ（２６７）、特にフレネルレンズを含む、請求項１０又は１１記載の装置。
【請求項１３】
少なくとも２ｍＷの出力に相当する光を被写体に当てるように適合された多数のダイオード（２６１）を含む、請求項８〜１２の１項記載の装置。
【請求項１４】
発光ダイオード（２６１）が対物レンズ（１５）の周囲にリング状に配置されている、請求項８〜１３のいずれか１項記載の装置。
【請求項１５】
前記光源（２６１）がスペーサ（２４３）につながれている、請求項７〜１４のいずれか１項記載の装置。
【請求項１６】
スペーサ（４３、１４３、２４３）が、支持体（１９）の観測面（２９）と対物レンズ（１５）との間に配置され、観測面（２９）上に支持面（４５、１４５）を有する、請求項１〜１５のいずれか１項記載の装置。
【請求項１７】
スペーサ（４３、１４３、２４３）が対物レンズ（１５）によって保持されている、請求項１６記載の装置。
【請求項１８】
対物レンズ（１５）が支持体（３１９）の上方に配置され、スペーサ（３４３）が、観測軸（Ｘ−Ｘ）中で支持体（１９）の下方に配置され、その結果、その支持面（３４５）が観測面とは反対側の支持面（３１９）に載り、対物レンズ（１５）に対して固定された一部分（３４４）につながれている、請求項１〜１４のいずれか１項記載の装置。
【請求項１９】
照射手段が、光ビームをスペーサ又はスリーブ（４３）を通して案内するための手段（５１）を含む、請求項１〜１８のいずれか１項記載の装置。
【請求項２０】
光ビームを案内するための手段が光ファイバを含む、請求項１９記載の装置。
【請求項２１】
顕微鏡（１１）、特に、並置されたいくつかのサンプルを順に観測するための顕微鏡で構成されている、請求項１〜２０のいずれか１項記載の装置。
【請求項２２】
支持体、特にプレート（１９）上に配置された一以上のサンプルの観測又は分析をするのための、支持体（１９）の観測面（２９）から観測軸（Ｘ−Ｘ）に沿ってサンプルの少なくとも一部分を観測するための対物レンズ（１５）と、サンプルの少なくとも一部分を照射する手段とを含む装置であって、前記照射手段が一組の発光ダイオード（２６１）を含む装置。
【請求項２３】
前記の組が、少なくとも二つの異なる波長で発光する発光ダイオード（２６１）を含む、請求項２２記載の装置。
【請求項２４】
前記ダイオード（２６１）の組によって発された光をサンプル又はその一部分に収束させる少なくとも一つのレンズ（２６３、２６７）を含む、請求項２２又は２３記載の装置。
【請求項２５】
一組の個別的なレンズ（２６３）を含み、各レンズが各ダイオード（２６１）と対応している、請求項２４記載の装置。
【請求項２６】
発光ダイオード（２６１）と支持体（１９）との間に配置されたレンズ（２６７）、特にフレネルレンズを含む、請求項２４又は２５記載の装置。
【請求項２７】
少なくとも２ｍＷの出力に相当する光を被写体上に生じさせるように適合された多数のダイオード（２６１）を含む、請求項２２〜２６の１項記載の装置。
【請求項２８】
発光ダイオード（２６１）が対物レンズ（１５）の周囲にリング状に配置されている、請求項２２〜２７のいずれか１項記載の装置。
【請求項２９】
共通の支持体、特にプレート（１９、３１９）上に並置されたいくつかのサンプルを順に観測する方法であって、請求項１〜２８のいずれか１項記載の装置の使用を含む方法。
【請求項３０】
一連のサンプルを分析する、特に、ポリペプチド、脂質又は核酸と反応した粒子又は細胞を分析又は検出するための、請求項１〜２８のいずれか１項記載の装置の使用。
【請求項３１】
静的又は動的モードで、計数し、生死判別試験又は抗原発現試験又は形態計測試験を実行することが望まれている、細胞集団の一連のサンプルを分析するための、請求項１〜２８のいずれか１項記載の装置の使用。
【請求項３２】
細菌を計数することが望まれている一連のサンプルを分析するための、請求項１〜２８のいずれか１項記載の装置の使用。
【請求項３３】
各カテゴリーが前記サンプルとの分析反応のための支持体として働く、異なるカテゴリーのマイクロビーズを含有する一連のサンプルを分析するための、請求項１〜２８のいずれか１項記載の装置の使用。
【請求項３４】
前記サンプルからの核酸プローブが反応したＤＮＡ付着物の配置を有し、前記プローブがハイブリダイゼーションの前又は後で蛍光性になる一連のサンプルを分析するための、請求項１〜２８のいずれか１項記載の装置の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、支持体上のサンプルを観測又は分析する方法及び装置に関する。より具体的には、本発明は、共通の支持体、とりわけ共通のプレート上に並置されたいくつかのサンプルを順に観測するための装置に関する。
【０００２】
このような装置、特に顕微鏡型の装置は、支持体の観測面から観測軸に沿ってサンプルの少なくとも一部分を観測するための対物レンズと、観測軸に対して垂直な面で支持体と観測軸との相対移動を保証するが、仮想垂直観測軸沿いの移動を自在にするように適合された、支持体を配置するためのステージとを含む。これはさらに、サンプルの少なくとも一部分を照射するための手段と、対物レンズ出力で画像を捕捉するための手段とを含む。
【０００３】
このような装置は、特に、共通の支持体、たとえばプレート上に配置された多数のサンプルを迅速に分析するために使用される。このようなサンプルは、たとえば、細胞、特に付着性の哺乳動物細胞、原核生物細胞、植物細胞など又は他の有機体、たとえば病原体（ウイルスなど）で構成される。
【０００４】
多数のサンプルに対する迅速な細胞分析は、新たな活性物質の高スループットスクリーニングのために製薬産業で不可欠であり、また、細胞モデルを使用して新たな物質を試験し、製造を制御する化粧品産業で不可欠である。これらの産業は、細胞試験をいっそう利用することを望み、その具現化が簡素化されることを求めている。
【０００５】
生物学的（特に細胞）サンプルを保持するために一般に使用される培養プレートは一般に皿形である。これらは、「ウェル」と呼ばれる一連の隣接するセルを有し、セルのすべて又は一部の中にサンプルが収容される。これらのウェルは一般に、互いに対して平行な軸に配置され、プレートの厚さ方向に延びる。ウェルは、これらは、プレートの上面で開口し、一般にはプレートの下面を形成する底によって封止されている。したがって、隣接するウェルの底は一般に互いにつながっている。このように、プレートの下面は本質的に連続的である。生物学的サンプルの分析のための他の支持体は、たとえば、膜、ガラススライド、フィルタ又は他の半透明もしくは不透明な支持体などである。
【０００６】
サンプルを顕微鏡下で観測するためには、プレート（又は他の支持体）を、軸が垂直に向く顕微鏡の対物レンズの上方又は下方に配置する。観測は、各ウェルの底を通して、すなわち、プレートの、観測面を構成する下面を通して実施するか、サンプルの上方で直接実施する。サンプルは、配置ステージによって観測軸に対して垂直な面でプレートを移動させることにより、１個ずつ対物レンズの前に運ぶ。配置ステージは、プレートを第一又は唯一にその周囲で保持し、それにより、プレートの観測面を自在にするように適合されている。加えて、ステージは、観測軸における一定範囲の移動をプレートに残すように適合されている。
【０００７】
プレートは一般に、注型又は成形材料、普通はポリスチレンでできている。この理由のため、プレートはしばしば、ウェルの底を形成するその下面の平坦さに欠陥を含む。このような欠陥のサイズは、対物レンズの被写界深度を大きく越える。下面の極限点間の差は一般に０．２〜０．３ｍｍに達する。
【０００８】
プレートの下面の平坦さの欠陥及びその変形が、対物レンズと分析されるサンプルとの距離を変化させる。したがって、プレート全体又はプレート表面の大きな部分を覆うウェルに配置されたサンプルを観測するためには、対物レンズの焦点を頻繁に調節して、この距離の変化を補正することが必要である。
【０００９】
この欠点は、たとえば、ＣＣＤカメラ及び形態計測ソフトウェアを装備した標準的な蛍光顕微鏡に見られる。特定の機器によって提案されるような位相差試験に関しても同じ問題が生じる。
【００１０】
このタイプの機器における自動合焦は遅く、信頼性を欠く。空のウェルがシステムの不安定さ又は外面の欠陥に対して誤った合焦を生じさせるおそれがある。
【００１１】
対物レンズの焦点を頻繁に調節する必要性がサンプル画像捕捉速度を落とす。
【００１２】
生化学反応のエフェクタとしてますます使用される微粒子がプレートのウェルに付着すると、そのような微粒子の分析の間に同様な問題が生じる。
【００１３】
同様に、フィルタ上の細菌の探索は、フィルタの平坦さの欠陥のせいで、対物レンズの焦点の頻繁な調節を要する。
【００１４】
もう一つの欠点は、安定で均一な照射を提供しない水銀及び／又はハロゲン灯具の使用である。
【００１５】
本発明の一つの目的は、第一の態様で、観測面が完全には平坦でない支持体とでさえ高速で作動することができる装置、特に顕微鏡型の装置を提案することにより、この画像捕捉の問題に対する解決策を提供することである。
【００１６】
これに関して、本発明は、その目的として、上記で定義した装置、より具体的には顕微鏡型の装置であって、対物レンズに対して固定され、支持体上に支持面を有するスペーサを含み、前記支持面が観測軸に近接して位置し、支持体が垂直観測軸に沿って自在であり、その結果、支持体が前記スペーサと接触したままになり、前記スペーサのサイズが、支持体と観測軸との間の相対移動の間に、対物レンズと観測面との間の一定の距離を観測軸上で維持するように適合されている装置を有する。
【００１７】
本発明はまた、信号捕捉の速度及び質を促進し、同じサンプル内で掃去（スイープ）する必要なく分析の場全体でサンプルを励起する可能性を提供することに関する。
【００１８】
第二の態様で、本発明は、高額である（レーザ）、不安定である、又は寿命が限られる（水銀灯）、従来技術で使用される特定の光源の欠点に対する解決策を等しく提供する。
【００１９】
本発明の他の特徴によると、
装置は、対物レンズと支持面との距離を調節するための手段を含み、
支持体は、プレート、特に、９６個、３８４個、８６４個又は１５３６個のウェルを含むマルチウェルプレートである。
【００２０】
プレートの使用が好ましい実施形態であるが、本発明の分析又は観測装置は、他の支持体、たとえば膜、フィルタなど、より具体的には、当業者によって使用される、生物学的サンプルが被着している支持体、特に、分析されるいくつかのサンプルが配置されている、完全には平坦でない支持体とで使用してもよいことが理解される。
【００２１】
本発明のさらに別の特徴によると、
スペーサは、観測軸に沿って延びるスリーブを含み、支持面は、そのスリーブの端部にあるリング形区域によって形成され、
捕捉手段及び照射手段は、サンプルを担持するプレート上に配置された基準蛍光ビーズの観測に基づいて照射ビームの均一さ補正を行うための自己較正手段を含み、
照射手段は、サンプルの表面の大部分を同時に覆うように適合され、対物レンズ及び捕捉手段は、サンプル表面の大部分を同時に覆う観測フィールドを与えるように適合され、
照射手段は、灯具、レーザ又は発光ダイオードのセットで構成された少なくとも一つの光源を含み、
前記光源は、少なくとも二つの異なる波長で発光する発光ダイオードを含み、
装置は、光源によって発された光をサンプル又はその一部分に収束させる少なくとも一つのレンズを含み、
装置は個々のレンズのセットを含み、各レンズが各ダイオードと対応しており、
装置は、発光ダイオードと支持体との間に配置されたレンズ、特にフレネルレンズを含み、
装置は、少なくとも２ｍＷの出力に相当する照射又は照明を被写体に当てるように適合された多数のダイオードを含み、及び／又は
発光ダイオードは対物レンズの周囲にリング状に配置されている。
【００２２】
本発明の特定の実施態様によると、
前記光源はスペーサにつながれ、
スペーサは、支持体の観測面と対物レンズとの間に配置され、観測面上に支持面を有し、
スペーサは対物レンズによって保持され、
対物レンズは支持体の上方に位置し、スペーサは観測軸中で支持体の下方に位置し、その結果、その支持面が観測面とは反対側の支持面上に載り、対物レンズに対して固定された一部分につながれ、
照射手段は、光ビームをスペーサ又はスリーブに通して誘導するための手段を含み、
光ビームを誘導する手段は光ファイバを含む。
【００２３】
本発明のもう一つの目的は、支持体上に配置された一以上のサンプルの観測又は分析のための、本明細書で上記したタイプの装置であって、照射手段が発光ダイオードのセットを含む装置である。
【００２４】
本発明の特定の実施態様によると、
前記セットは、少なくとも二つの異なる波長で発光する発光ダイオードを含み、
装置は、前記ダイオードのセットによって発された光をサンプル又はその一部分に収束させる少なくとも一つのレンズを含み、
装置は個々のレンズのセットを含み、各レンズが各ダイオードと対応しており、
装置は、発光ダイオードと支持体との間に配置されたレンズ、特にフレネルレンズを含み、
装置は、少なくとも２ｍＷの出力に相当する光を被写体上に生じさせるように適合された多数のダイオードを含み、
発光ダイオードは対物レンズの周囲にリング状に配置されている。
【００２５】
より具体的には、本発明は、その目的として、顕微鏡、特に、本明細書で上記したような、共通のプレート上に配置（並置）されたサンプルを順に観測するための顕微鏡を有する。
【００２６】
したがって、垂直軸に沿って自在であるこの観測面は、光軸に近接する対物レンズから、観測面とは反対側の面に位置する被写体の画像が検出器に合焦するように調節されるスペーサの長さによって決まる一定の距離のところにとどまる。
【００２７】
本発明はさらに、その目的として、共通の支持体、特に共通のプレート上に配置された、特に並置されたいくつかのサンプルを順に観測する方法又は、より一般的には、一以上のサンプルを分析する方法であって、本明細書で定義したような装置の使用を含む方法を有する。
【００２８】
本発明はまた、特に研究、診断、生成物バンクの工業的スクリーニングなどの用途のために一以上のサンプルを分析する、たとえば、核酸、ポリペプチド、脂質、オルガネラなどを分析又は検出するための、本明細書で定義したような装置の使用に関する。
【００２９】
本発明は、例としてのみ記す以下の記載で、図面を参照することによってさらに容易に理解されよう。
【００３０】
図１に示す分析装置１１は、より具体的には、滴定（又は培養）プレートのウェルに含まれるサンプル（特に細胞）の蛍光を観測することを意図したものである。
【００３１】
これは、主に、観測対物レンズ１５及びサンプル支持体の垂直移動を自在にする、滴定プレート１９を配置するためのステージ１７を担持するベース１３と、プレートの局部照射のための光源２１と、対物レンズ１５の背後に配置されたカメラ２３と、カメラ２３に接続されたデータ処理モジュール２５、たとえばマイクロコンピュータとを含む。
【００３２】
このような顕微鏡は、図２に見られるような、プレート１９の隣接するウェル２７に含まれるサンプルの迅速な観測に有用である。
【００３３】
図２に示すように、使用されるプレートは、好ましくは、ウェル２７の底を形成し、サンプルが観測される観測面を構成する連続した下面２９を含む。ウェル２７はプレートの上面で開口している。これらはほぼ円筒形であり、円形又は正方形の断面を有し、本質的に平坦である底（ウェルの底の下側部分）を有している。図２では、一辺約３ｍｍの正方形のウェル３８４個を収容するプレートの断面が示されているが、装置は、他いかなるサイズにも適合することができる。
【００３４】
使用されるプレートは一般に、９６個、３８４個、８６４個又は１５３６個のウェルを収容する。典型的な寸法は、たとえば１０７ｍｍ×７１ｍｍである。このようなプレートは市販されている〔Ｎｕｎｃ（デンマーク）、Ｇｒｅｉｎｅｒ（ドイツ）、Ｃｏｓｔａｒ、Ｆａｌｃｏｎ（米）など〕。
【００３５】
以下、図１に戻る。
【００３６】
ベース１３は、たとえば、エピイルミネーションのための装備を有する倒立顕微鏡のベースである。これは、対物レンズ１５の観測軸がほぼ垂直に延びるように対物レンズを支持するタレット３１を含む。
【００３７】
対物レンズ１５は、好ましくは、たとえば１．２５〜５倍の低い倍率を有する。有利には、２．５又は５倍の倍率を有する。倍率は、デフォルトとして、検出器を支持する細長いリングに配置されたレンズにより、検出器の寸法と被写体の寸法との比に近い値に調節される。対物レンズは大きな開口数を有する。特に、後者は、対物レンズの観測フィールドがウェルの底の全面積を覆うように適合される。
【００３８】
ステージ１７はベース１３につながれている。これは、対物レンズ１５に対してほぼ水平に保持される。このステージは、一般に知られるとおり、ベース１３に取り付けられた保持構造３３と、プレート１９のための支持フレーム３５とを含む。このフレームは観測軸に対してほぼ垂直な面に延びる。これはこの面で保持構造３３に対して滑ることができる。これに関して、フレームは、平面に対して垂直な二つの方向に沿って延びるスライダの対の間で保持構造に対して誘導される。２個の電気的な伝動装置がこれら二つの方向におけるフレーム３５の移動を保証する。フレームは支持体よりもいくらか大きく、たとえば０．１ｍｍ以下の余裕を有して、垂直動を自在にしている。
【００３９】
データ処理装置２５は、光源２１、カメラ２３及び配置ステージ１７を制御するプログラムを実行する。特に、これは、対物レンズの正面でプレートへの各サンプルの連続配置及び各サンプルの画像の捕捉を保証する。
【００４０】
装置２５は、各サンプルの捕捉された画像を処理し、分析するソフトウェアを実行する。この処理は、たとえば、一次処理、たとえばピクセル図及びクラスター分析ならびに二次処理、たとえば励起補正、ウェル間の比較及び統計を含む。
【００４１】
そのうえ、装置２５は、プレートの１個又はいくつかのウェルに配置された基準蛍光ビーズに基づいて励起光の均一さを補正することができる。
【００４２】
図２に示すように、フレーム３５は、プレート１９の外郭に沿って延びる四つの辺３７を有する。辺３７の寸法は、辺がプレートの縁３９と近接するが、プレート１９が観測軸の方向に自在に動くことを許すように適合されている。
【００４３】
フレーム３５は、観測期間外にプレート１９の支持面を形成する周縁４１を内側に有している。観測期間中は、プレート１９は、この支持面から離れているか、せいぜい部分的にその上に載るだけである。
【００４４】
本発明によると、スペーサを形成するスリーブ４３が対物レンズ１５につながれている。これは、後者を軸方向に刺し、その自由端で、観測されるサンプルを収容するウェルの底に近接するプレート１９の下面を支持するための面４５を形成している。スリーブ４３の他端は対物レンズ１５の端に載る。
【００４５】
スリーブ４３はほぼ切頭円錐形である。これは、対物レンズ１５からサンプルの全面の照射及び観測を可能にする軸方向通路４７を内側に形成している。通路の直径は、対物レンズに載る側のスリーブの端部から支持面４５を形成するスリーブの自由端まで徐々に減少する。その直径は、たとえば１２ｍｍ〜４．５ｍｍの範囲である。通路４７の高さは、たとえば約２０ｍｍである。これは、選択される対物レンズに依存して、たとえば１０〜３０ｍｍの範囲であることができる。
【００４６】
支持面４５は平坦であり、観測されるサンプルを含むウェルの底の周囲にリング形の支持体を形成する。
【００４７】
通路４７は、対物レンズ１５に載る側のスリーブの端部で、スリーブが対物レンズに載るところのリング形の面を形成する肩４９を有する。
【００４８】
照射源２１は、灯具、レーザ又は発光ダイオードのセットによって形成される。これは、サンプルに光を照射して後者が蛍光現象によって特定の放射線を発するようにするために適合されている。
【００４９】
使用されるフルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ）は、サンプルの細胞標識、たとえば表面標識、膜内標識、細胞質標識、代謝標識（ｐＨ、呼吸）、非特異的又は特異的ＤＮＡ及びＲＮＡ標識（Ｆｉｓｈ）又はポリペプチド標識（酵素、表面レセプタ、細胞質又は核タンパク質など）のためのフルオロフォアである。
【００５０】
光源２１に使用されるレーザは、たとえば、波長５４３ｎｍのヘリウムネオンレーザ、波長が４８８ｎｍに等しいアルゴンレーザ、波長が５３２ｎｍに等しい固体デュアル周波数レーザ又は青〜赤の領域に画定される波長を有するレーザダイオードである。
【００５１】
好ましい実施態様では、光源２１は、波長が４８８ｎｍに等しいアルゴンレーザにより、そのレーザの出力が２５ｍＷにセットされた状態で形成される。
【００５２】
光源２１によって発出された入射光を戻すためのプリズム５１が対物レンズの背後に配置されて、入射ビームを対物レンズ１５の光軸に沿ってサンプルの方向に向ける。したがって、励起ビームは対物レンズを透過して、エピフルオレセンス（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）によるサンプルの観測を保証する。図２で明確に示すため、光源２１及びカメラ２３の光軸は平行に示されているが、実際には、互いに対して垂直である。
【００５３】
一つの変形では、照射源によって発されたビームは、ミラー又は光ファイバによってサンプルに誘導され、対物レンズを透過することなくサンプルを照らすことができる。
【００５４】
カメラ２３は、有利には、一般にＣＣＤ検出器と呼ばれる、電荷結合検出器のマトリックスを含む。これは、サンプルから蛍光によって発される放射線に感受性であり、この放射線を表す画像を生成するように適合されている。
【００５５】
カメラは、サンプルの完全な画像を同時に捕捉することができるように選択される。すなわち、その観測フィールドは、対物レンズ１５によって形成されるビームの変形を考慮しても、ウェルの底を覆うのに十分な大きさである。
【００５６】
有利な方法では、カメラは、捕捉時間を調節する可能性を提供し、バックグラウンドノイズを減らすために検出器冷却装置を有する。
【００５７】
カメラは、その光軸が観測軸に対して垂直な状態で配置される。傾斜したプリズム又はミラー５３が対物レンズ１５の背後に配置されて、ビームが対物レンズを出てカメラ２３に向かうときビームを逸らせる。また、ダイクロイックフィルタを挿入して励起光を除去することもできる。
【００５８】
たとえば、カメラの軸が観測軸と合致する他のアセンブリが可能である。
【００５９】
プレートの内容物を観測するために、配置手段は、各サンプルを対物レンズの前へと連続的に動かすため、観測軸に対して平面でプレートの移動を保証する。この移動の間及びサンプルの実際の観測の間、プレートは、それ自らの重さにより、スリーブ４３の端部に当接して保持される。実際、その構造のおかげで、配置ステージは、観測軸の方向でプレートの上への自由な余裕を許す。このとき、プレートはせいぜいステージの縁４１に部分的に載るだけである。
【００６０】
配置機構の作用の下でプレートを移動させる間、プレートは、プレートが載るスリーブの端部に形成された支持面４５の上を滑る。
【００６１】
観測中、観測されるサンプルはすべて、プレートの観測面上のスリーブによって画定される支持区域、すなわち、光軸を中心にする区域の中に位置する。したがって、サンプルと対物レンズとの間で形成される距離は、プレートの観測面の平坦度にかかわりなく、プレート上のすべてのサンプルに関して同じである。実際、この距離はスリーブ４３の長さのみによって固定される。
【００６２】
この方法で、対物レンズは、サンプルごとに自動合焦機構によって合焦し直す必要はなく、これが、共通のプレート上のサンプルのセットの合計分析時間を相当に減らす。
【００６３】
さらには、カメラ２３の観測フィールドが光源２１の励起フィールドと合致し、光源がウェルの底全体、ひいてはサンプル面全体を覆うため、サンプルを掃去する必要なく、サンプルの完全な画像を同時に捕捉することができる。したがって、画像捕捉が迅速に起こる。
【００６４】
図３に示す変形では、スリーブ１４３は、第一の部分１４３Ａと第二の部分１４３Ｂとをねじで合わせたもので構成されている。スリーブ１４３の第一の部分１４３Ａは対物レンズ１５に取り付けられる。第一の部分１４３Ａは調節可能であり、対物レンズ１５に載り、それを覆う間、たとえばロックねじ１４４によって固定される。これはまた、観測軸Ｘ−Ｘを中心にしたねじ付き開口１４６を有する。ほぼ切頭円錐形を有する第二の部分１４３Ｂは、第一の部分１４３Ａのねじ付き開口１４６に適合した、より大径のねじ付きベースを有する。
【００６５】
したがって、対物レンズ１５上のスリーブ４３の第一の部分１４３Ａの支持面と、支持体の観測面上の支持体との距離は、光学系の被写界深度よりも高い精度、たとえば５０ミクロンで調節することができる。
【００６６】
ロックねじ１４４及びスリーブ１４３の二つの部分１４３Ａ、１４３Ｂのねじ接続を使用して対物レンズ１５と、支持体１９上のスリーブ１４３の支持面１４５との距離を調節するための手段を記載した。
【００６７】
スリーブ１４３の高さは、その自由端に形成される支持面１４５の位置が、スリーブ１４３の非存在でプレート１９の下面がフレームの縁４１に載るときのプレート下面の平均外面の位置よりも極わずかに高いような高さである。したがって、支持面１４５は、有利には、プレートの下面の平均面に対して０．３〜０．５ｍｍ突出する。
【００６８】
これらの条件の下でもプレート１９はスリーブの表面１４５に載る。特に、この支持は、観測されるサンプルを収容するウェルの底に近接するところで起こる。これは、観測されるウェルの底の全周で、ただしのその外側で起こり、それによって底の全面をサンプルの観測のために空けておく。
【００６９】
次に、光源が発光ダイオード２６１の群によって形成されるもう一つの好ましい実施態様を示す図４を参照する。これらのダイオードによって発される光は、個々のレンズ２６３によってほぼ平行にされたのち、案内システム、好ましくはフレネルレンズ２６７によってサンプルに送られる。発光ダイオードは、たとえば、引用例として含める、歯科学の分野における樹脂の重合のための欧州特許出願ＥＰ１０３１３２６号に記載されている。
【００７０】
驚くべきことに、このような光学アセンブリを本発明のサンプルの照射に適合させることができることが見いだされ、本明細書に記載する発明は、はじめて、分析されるサンプルに光を照射するための発光ダイオードの使用を提案する。従来技術で使用される光源に比較したこのタイプの光源の利点は数多く、たとえば、特に、発光の安定性及び単色性、光源が非干渉性であって、干渉又は縞を生じさせるおそれのあるレーザコヒーレンスの問題を回避できること、使用の簡単さ、速やかな点灯、異なる波長の使用の可能性などである。
【００７１】
従来の発光ダイオードは、一般に２〜１０ｍＷ、より典型的には３〜５ｍＷの発光出力を有する。本発明の範囲内での利用の場合、サンプルは、好ましくは、約１〜１０ｍＷの出力で照射され、そのためには、本発明のダイオードのセットは、有利には、２〜５０個、より一般的には５〜４０個、たとえば５〜２０個のダイオードを含む。ダイオード装置の出力が低め、特に０．５ｍＷのオーダであってもよいことが理解されるが、その場合、サンプルの露光時間を増す。
【００７２】
スペーサ２４３は主に、光源２６９の支持体と、フレネルレンズ２６７が取り付けられている切頭円錐形の、好ましくは金属製のキャップ２７０とで形成されている。
【００７３】
特に有利な実施態様は、光源支持体２６９上で発光ダイオード２６１を対物レンズ１５の周囲にリングの形に配置することからなる。前記支持体２６９は、対物レンズ１５の上に観測軸Ｘ−Ｘに対して直交に配置されたリング形のインサート２７１を有する。この結果、蛍光から励起光を分離しやすくする。有利には、各ダイオード２６１にはレンズ２６３が取り付けられ、ダイオード２６１によって発された光を互いに対して平行にする。
【００７４】
好ましい実施態様では、発光ダイオード２６１は異なる波長で発光し、同じサンプルを異なる波長で順に照らすことができる。たとえば、４７０±１５ｎｍで発光する第一のダイオード及び５５０±１５ｎｍで発光して種々のフルオロフォアを
励起するダイオードが選択される。この場合、装置は、各所望の波長のダイオード２〜５０個のセットを含む。
【００７５】
観測されるサンプルを収容するウェルの底に当たる入射光の幅は、ビームがウェルの全面を同時に照らすような幅である。したがって、サンプルの全面が同時に励起される。
【００７６】
光源のリング形アセンブリの場合、三つの軸―照射、観測及びカメラ―が一致することができる。
【００７７】
次に、図５を参照して、本発明のもう一つの実施態様を記載する。
【００７８】
この具体的な実施態様は、フィルタ又は他の不透明な支持体に規則的に配置された付着物の形態にあり、下からではなく上から読み取られるサンプルに関する。この場合、一定の厚さの支持体３１９を使用し、その上にサンプルを直接付着させてもよいし、その上に、サンプルを予め配置したフィルタ膜を配置する。光学装置は、前の図を参照して記載した構造を逆にした場合と同じであるが、焦点を維持するための装置は、支持体３１９の底に同じ高さに被着し、それをわずかに持ち上げる剛性の先端又はスペーサ３４３からなる。先端３４３は、対物レンズ１５に対して固着された部品、たとえばベース３４４に堅く固定されて、サンプルと対物レンズ１５との距離を不変にする。この実施態様では、支持体３１９上の先端３４３の支持面３４５は、対物レンズ１５及び観測面とは反対側の支持体面に載る。
【００７９】
観測面と対物レンズとの間に一定の距離を維持するためのスペーサは、図２を参照して記載したスペーサと類似していることが理解される。
【００８０】
本発明の装置及び方法は、当業者にはよく知られる技術によって標識された種々の性質及び起源のサンプルを分析するために使用することができる。サンプルは特に、哺乳動物細胞（動物又はヒト、たとえば神経、腫瘍、免疫細胞など）、細菌細胞、植物細胞、酵母、病原性有機体細胞、生物学的標本又はサンプルのウイルスなどを含むことができる。方法及び装置は、ポリペプチド、核酸、脂質などを分析又は検出することに適合される。これらは特に、たとえば生成物の効能、選択性又は毒性の高スループット試験において細胞集団に対する試験化合物、特に生成物バンクの効果を計測するのに有用である。
【００８１】
したがって、特定の実施態様で、本発明は、等しく、本明細書で上記したような装置を使用する高スループット分析（又はスクリーニング）の方法、より具体的には、サンプルが、細胞機能（たとえば増殖、成長、成熟、分化、死滅、生存、アポトーシスなど）を表す蛍光標識と接触して配置された細胞の集団からなり、プレートの個々のウェルの中で、試験集団の化合物と接触して配置され、これらの化合物が、観測される蛍光標識の強さの変化を生じさせる方法に関する。細胞集団は、たとえば、ニューロン、特にヒト又は動物起源のニューロンの集団である。
【００８２】
特定の実施態様では、蛍光標識を、細胞抗原と対応する抗体に接合する。このような接合した抗体は市販されており、たとえば、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社（フランス、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅｓ）によって製造されるものである。
【００８３】
もう一つの実施方法では、本発明は、一以上のサンプル中の細菌の存在（又は量）を検出する方法であって、各サンプルを細菌マーカと接触させて配置することと、本明細書で上記したような装置によって標識の存在を分析することとを含む方法に基づく。このようなマーカは、細菌に対して特異性が高いもの、たとえば、蛍光標識と対応する細菌ゲノムに特異的な核酸プローブであってもよいし、非特異性のもの、たとえばアクリジンオレンジ及びすべての核酸ステインであってもよい。これらは市場で入手しやすい。たとえばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社（米国オレゴン州Ｅｕｇｅｎｅ）のカタログを参照。
【００８４】
もう一つの実施態様によると、本発明は、一以上のサンプル中のウイルスの存在（又は量）を検出する方法であって、各サンプルをウイルスに特異的なマーカと接触させて配置することと、本明細書で上記したような装置によって標識の存在を分析することとを含む方法に基づく。
【００８５】
さらなる実施態様によると、装置は、蛍光の経路に沿って、スペクトル領域を画定するフィルタ、たとえば４種までの異なる蛍光標識を４８８ｎｍの単一励起で使用し、フローサイトメトリーを実施することを許す５３０、５８５及び６５０ナノメートルのダイクロイックフィルタを含む。このような標識は、同じ細胞でいくつかのパラメータの分析を可能にする。同様に、励起ビームは、二つの光源を、ダイクロイックミラーによって同時に、又は通常の可動ミラーによって、もしくはリング形の光源を有する装置に関して記載した励起の立体角の分離によって連続的に（マルチパラメータ分析の可能性をさらに拡大する）、関連させることができる。サンプルの移動なしに連続的な捕捉を実施するのならば、ピクセル単位の発光相関分析を実施することができる。
【００８６】
本発明は、等しく、ビーズ上の標識、特にタンパク質−タンパク質相互作用、免疫複合体、ハイブリダイゼーションなどに使用することもできる。
【００８７】
いくつかの波長における捕捉モードは、いくつかのカテゴリーの粒子を区別することができるため、ここでは特に有利である。これらの粒子の大きさが均一であるならば、たとえば約１０の異なるレベルで定量された量の蛍光標識を提示する粒子を区別することができる。このような粒子は、分析反応、たとえば免疫分析の場所であってもよい。粒子の各カテゴリーと対応する反応は、すべての反応について同様に、別の波長で発光する別のマーカによって定量することができる。このようにして、区別しうる粒子のカテゴリーの数と同じだけ多くの異なる分析反応を記録することができる。
【００８８】
このタイプの粒子のさらなる使用は、コンビナトリアル合成法と関連するときのコード化である。粒子の分析は、対応する化合物の真の反映であり、同定は、計測が実施された実験室の外で、電子データ転送によって制御される。
【００８９】
もう一つの利用方法では、蛍光粒子の均一な集団を使用して、観測フィールド全体で均一ではない励起エネルギーの補正面を画定する。特に、レーザはエネルギーのガウス分布を示す。各粒子によって再び放出されるエネルギーの計測は、その粒子が位置する点における励起エネルギーのレベルを反映する。少数の粒子が観測面上にランダムに分布している状態で、未知のサンプルで観測されたピクセルレベルを正規化するように働く面を補間によって画定することが可能である。また、均一な発光面をこの正規化に使用することもできる。この処理は、反応性粒子又は細胞における反応を定量したいとき、必要である。
【００９０】
本発明はさらに、特にチップ、マイクロアレイなどでプローブを用いるハイブリダイゼーションののち核酸付着物を分析するために使用してもよい。特に、これらは、細胞又はサンプルに由来し、蛍光分子で標識された対応するＤＮＡ又はＲＮＡシーケンスによるハイブリダイゼーションの後のＤＮＡの付着物であってもよい。このような付着物は、好ましくは、装置によってすべて一度に読むことができる５０００個までの付着物の規則的な配列である。並置された付着物のいくつかのブロックを順に読むこともできる。
【００９１】
例示的であり、決して限定的ではないとみなすべき以下の例で本発明の他の特徴及び利点が明らかになるであろう。
【００９２】
例１
以下を含む本発明の装置
ＭＷＩＢ蛍光キューブ及びＵＭＰＬＦＬ  ×５対物レンズを備えたオリンパスＩＸ−５０倒立顕微鏡シャーシ
Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ社の、４８８ｎｍ、２５ｍＷで発光するアルゴンレーザ
冷却式Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｃ５９８５カメラ及びその制御装置。このカメラは、１０−４秒〜５分の広範囲の捕捉時間を有する。本発明にしたがって通常に使用されるとき、捕捉時間は０．１〜１秒である。解像度は、０〜２５５の番号を付けた２５６のレベルで３７６，１５１ピクセルである（８ビット出力）。検出器を室温よりも２０℃低く冷却して、１０光子の感度を保証する。
Ｌａｎｇ社の、２個のＭａｒｓｈａｕｓｅｒテーブル１２０×１００ｍｍ及びそれらの制御装置のセット、
Ｎｕｎｃ社製３８４ウェルプレートを保持するようにセットされたプレートホルダーフレーム及びプレートをレーザビーム及び周囲光から遮蔽するための黒い有機ポリマープレートカバー
２個の収束レンズ、空間周波数フィルタ（コリメータ）直径３０ミクロンを含む、レーザビームを合焦させるための光学系
対物レンズを黒い有機ポリマーで覆うスリーブの形態のスペーサ
種々の部品及び開かれたときレーザビームのカットを保証する安全カウルを支える金属プレート
Ｓｏｆｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ社（ドイツ、Ｍｕｎｓｔｅｒ）のＡｎａｌｙＳＩＳソフトウェアを作動させるＰＣマイクロコンピュータ
【００９３】
例２
本発明による、３８４ウェルプレートにおけるニューロン培養及び計数
１４日齢のラット胎児から脊髄を切除したのち、欧州特許出願ＥＰ９９４０３０９２．２に記載の方法にしたがってニューロンを精製した。
【００９４】
精製したニューロンを、Ｂｉｏｍｅｋ ２０００ロボットを使用して、プロトコルで記載したように事前に処理しておいた３８４ウェルプレートに播種した。
【００９５】
ニューロンがウェルの底に被着するとすぐ（３０分〜１時間後）、ロボットが試験分子で細胞を処理した。
【００９６】
４日間の培養ののち、生きた細胞に浸透したのち蛍光を発するカルセインＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）で培養物を処理することからなる生存試験を実施した。
【００９７】
ウェル中に存在する各細胞によって発された蛍光を本発明の分析装置によって検出した。３８４個のウェルに対する画像捕捉を、自動化した手順で、ウェルあたり０．２秒の露光時間で実施したのち、自動的に分析した。全実行時間は約１４分であった。結果を表形式で表示して、ウェルあたりのニューロン計数を示した。以下の表は、プレートの外郭及び中央に対応する選択された領域における計数結果のサンプリングを、位相差顕微鏡を使用して目視で得られた計数に比較して提示する。結果の良好な一致は、自動化分析の間の合焦の規則性を証明する。
【００９８】
【表１】
2004516495.tif 000003
【００９９】
例３
本発明による蛍光ビーズの計数
直径１０μｍに較正された蛍光ビーズ「Ｆｌｏｗ ｃｈｅｃｋ ｆｌｕｏｒｏｓｐｈｅｒｅｓ」（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社、米国、Ｍｉａｍｉ）の懸濁液を使用した。Ｂｉｏｍｅｋ ２０００ロボットピペッタ（Ｂｅｃｋｍａｎ社）によって、ウェルあたり平均５０個のビーズ濃度でビーズをプレートの半分のウェル（ウェル１〜１９２）に入れ、ウェルあたり平均１００個のビーズ濃度でビーズをプレートのもう半分のウェル（ウェル１９３〜３８４）に入れた。ビーズを沈降させたのち、技術者が目視で計数した（プレートの異なる区域で濃度あたり１０ウェル）。そして、分析装置によってプレートを読み、結果を比較した。自動化計数が実際に予測平均値を出し、標準偏差がポワソン分布と完全に合致していることがわかった。目視で計数したウェルは、自動化計数結果と完璧に合致していた。
【０１００】
【表２】
2004516495.tif 000004
【０１０１】
例４
以下を含む本発明の装置
ＭＷＩＢ蛍光フィルタキューブ及びＵｐｌａｎＦｌ  ×４  ／０．１３対物レンズを備えたオリンパスＩＸ−５０倒立顕微鏡シャーシ
オリンパスが蛍光励起灯を配置する地点でシャーシの背後に配置された、Ｌｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（フランス、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅｓ）の、４７０±１５ｎｍで発光する青色発光ダイオード２０個を含む光源
例１のものと同一の、冷却式Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｃ５９８５カメラ及びその制御装置
Ｐｒｉｏｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社（英国、Ｆｕｌｂｕｒｎ）の、Ｘ−Ｙ  Ｐｒｉｏｒ Ｐｒｏｓｃａｎ  １２０×１００ｍｍモータ駆動テーブルシステム及びその制御装置
対物レンズを黒い陽極酸化アルミニウム合金で覆う調節可能なスペーサ
Ｔｒｏｐｈｏｓ社（フランス、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅｓ）の捕捉及び計数ソフトウェアを実行するＰＣマイクロコンピュータ
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明の分析装置の斜視図である。
【図２】
本発明の第一の実施態様による図１の分析装置の、培養プレートの領域における、観測軸を含む垂直断面図である。
【図３】
本発明の第二の実施態様による、対物レンズ及びスペーサを形成する対物レンズカバーを単独で示す同様な図である。
【図４】
本発明の第三の実施態様による、対物レンズ及び光源（発光ダイオード）を組み込んだ調節可能な対物レンズカバーの同様な図である。
【図５】
本発明の第四の実施態様による、顕微鏡の観測軸及び特に焦点を維持するための対応するスペーサを垂直組み立て配置（上から観測）で含む垂直断面図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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