(57)【要約】新規なヒトＧタンパク共役型受容体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５および配列番号７からなる群から得られるヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
【請求項２】
（ａ）配列番号：２に示すアミノ酸配列をコードし；かつ
（ｂ）ストリンジェントな条件下で配列番号：１のヌクレオチド配列またはその相補配列にハイブリダイズする
ヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
【請求項３】
前記分子がｃＤＮＡである、請求項１記載の単離核酸分子。
【請求項４】
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６および配列番号：８からなる群から得られるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
【請求項５】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５および配列番号：７からなる群から得られるヌクレオチド配列を含む、単離発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、米国仮出願６０／２４４，２８５（２０００年１０月３０日出願）の優先権を主張し、その全体を本明細書に参照として援用する。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、膜結合タンパク質および受容体をコードする新規なヒトポリヌクレオチドの知見、同定および解明に関する。本発明は、本明細書に記載するポリヌクレオチド、宿主細胞発現系、コードされるタンパク質、融合タンパク質、ポリペプチドおよびペプチド、コードされるタンパク質またはペプチドに対する抗体、ならびに遺伝子工学的に処理された、開示遺伝子を欠如または過剰発現する動物、もしくはそれらのタンパク質のアンタゴニストおよびアゴニスト、ならびに開示遺伝子によりコードされるタンパク質の発現または活性を調節する他の化合物であって、診断、薬物スクリーニング、臨床試験モニタリング、生理的または行動障害の処置、および／または化粧品用途あるいは自然食品用途に使用できる化合物を包含する。
【０００３】
２．発明の背景
膜受容体タンパク質は、細胞がそれらの周囲を感知し、細胞がその恒常性および機能を維持する細胞機序のための統合された成分としての役割を有する。したがって膜受容体タンパク質は、細胞の生理、化学的コミュニケーションおよび遺伝子発現を制御するトランスダクション経路（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ）に関与することがしばしばある。特に関連のある一群の膜受容体は、一般に非保存親水性ループにより連結した保存７回膜貫通ドメインの存在を特色とするものである。このような”７ＴＭ受容体”には、Ｇタンパク質と共役する受容体（ＧＰＣＲ）として知られる受容体のスーパーファミリーが含まれる。ＧＰＣＲは一般にＧタンパク質またはＰＰＧタンパクを伴うトランスダクション経路に関与する。したがってＧＰＣＲファミリーには療法薬の薬剤ターゲットとして既知である多数の受容体が含まれる。
【０００４】
３．発明の概要
本発明は、新規ＧＰＣＲおよび対応する新規ＧＰＣＲ（ＮＧＰＣＲ）アミノ酸配列の知見、同定および解明に関する。本明細書に初めて記載するＧＰＣＲは、細胞膜にまたがる膜貫通タンパク質であり、リガンド結合後の信号伝達に関与する。本明細書に記載するＮＧＰＣＲは、７ＴＭ受容体ファミリーにみられる構造モチーフをもつ。記載するＮＧＰＣＲの発現は、さまざまなヒト細胞において検出される。記載する新規ヒトＧＰＣＲ配列は、１，２１０、７３３、１，１３８および６６２のアミノ酸長のタンパク質をコードする（それぞれ、配列番号２、４、６および８参照）。記載するＮＧＰＣＲは、７ＴＭタンパクに特徴的な（約２０−３０アミノ酸の）複数の膜貫通領域、並びにいくつかの推定細胞質ドメインを有している。
【０００５】
更に考慮されるのは、慣用的な方法により作られるノックアウトＥＳ細胞である（参照、例えばここに参照として援用する１９９８年２月２０日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／０３２４３）。記載する配列のマウス相同体において、ノックアウトＥＳ細胞系が調製される。従って、本発明の更なる側面は、記載したＮＧＰＣＲをコードする配列中に遺伝子操作による変異を有するノックアウト細胞および動物を含む。
【０００６】
本発明は下記のものを包含する：配列表に示したヌクレオチド、配列表に示した一つまたはそれ以上のヌクレオチドを挿入するように操作された発現ベクター、それらのヌクレオチドを発現する宿主、およびそれらのヌクレオチドの発現生成物、ならびに：（ａ）本明細書に記載するＧＰＣＲの哺乳動物相同体（具体的に記載したヒトＮＧＰＣＲ、およびヒトＮＧＰＣＲ遺伝子生成物が含まれる）をコードするヌクレオチド；（ｂ）ＮＧＰＣＲの機能性ドメインに相当する１以上の部分をコードするヌクレオチド、およびそれらのヌクレオチド配列により特定されるポリペプチド生成物［新規領域である細胞外ドメイン（１以上）（ＥＣＤ）、本明細書に初めて記載した１以上の膜貫通ドメイン（１以上）（ＴＭ）、および細胞質ドメイン（１以上）（ＣＤ）が含まれるが、これらに限定されない］；（ｃ）前記ＮＧＰＣＲの少なくとも１つのドメインの全部または一部が欠失または変化した遺伝子工学的に形成した変異体または天然変異体をコードする単離ヌクレオチド、およびそれらのヌクレオチド配列により特定されるポリペプチド生成物（ＴＭの全部または一部が欠失した可溶性受容体（記載した７ＴＭの場合、すべての下流のＴＭが欠失するようなものでは、最初のＴＭより上流の領域のみ含むようにタンパク質を操作することにより可溶性産物を得ることができる）、および一つまたはそれ以上のＣＤの全部または一部が欠失した非機能性受容体が含まれるが、これらに限定されない）；（ｄ）他のペプチドまたはポリペプチドに融合した融合タンパク質またはそのドメインの１つ（たとえば細胞外ドメイン）をコードする、ＮＧＰＣＲ由来のコード領域のすべてもしくは一部を含むヌクレオチド；（ｅ）配列表に新規に開示した一つまたはそれ以上の配列を含む、前記ポリヌクレオチドの治療または診断用派生物、たとえばオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、二重鎖ＲＮＡ、または遺伝子治療用構築体。
【０００７】
本発明は下記のものをも包含する：前記ＮＧＰＣＲのアゴニストおよびアンタゴニスト（天然ＮＧＰＣＲと競合する、小型分子、大型分子、変異ＮＧＰＣＲタンパク、またはその一部が含まれる）、抗体、ならびに前記ＮＧＰＣＲの発現を阻害するために、または前記ＮＧＰＣＲ遺伝子の発現を高めるために（たとえば、前記配列を強力なプロモーター系の制御下におく発現構築体）使用できるヌクレオチド配列（たとえばアンチセンス分子およびリボザイム分子、ならびに遺伝子または調節配列の置換構築体）、ならびにＮＧＰＣＲトランスジーンを発現するトランスジェニック動物、または機能性ＮＧＰＣＲを発現しない”ノックアウト体”。ノックアウトマウスはいくつかの方法で調製することができ、その内のひとつには、記載したＮＧＰＣＲの少なくとも一つのマウス相同体中に遺伝子トラップ変異を含むマウス胚幹細胞（「ＥＳ細胞」）株の使用が含まれる。配列番号１〜９に記載のユニークなＮＧＰＣＲ配列が“ノックアウト”であるときは、それらはその特別な遺伝子の形質発現を同定する方法並びにそれまで未知の遺伝子の機能を調べる方法を提供する。更に、配列番号１〜９記載のユニークなＮＧＰＣＲ配列が“ノックアウト”されている動物は、免疫系により“自己”とみなされ、そしてそれゆえ顕著な抗体反応を誘発しなかった相同およびオルソロガスなタンパク質に対する抗体を誘発するユニークな提供源となる。最後には、前記ＮＧＰＣＲのマウス相同体において、遺伝子トラップノックアウトＥＳ細胞が生じる。
【０００８】
さらに配列番号１〜９に記載のユニークなＮＧＰＣＲ配列は、タンパクコード配列の同定およびユニークな遺伝子を一つまたはそれ以上の特定の染色体へマッピングするのに有用である（前記ＮＧＰＣＲをコードする遺伝子は明らかにＸ連鎖上にある。ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＡＬ１６１７７８参照）。そのような配列は、ゲノム配列のみからバイオインフォマチックスに基づいて推定されるものとは対照的に、実際的、生物学的に関連したエキソンスプライシングジャンクション（ｅｘｏｎ  ｓｐｌｉｃｅ  ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ）を同定する。本発明の配列は、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）解析の追加的ＤＮＡマーカーとして、および法生物学において有用である。
【０００９】
さらに本発明は、ＮＧＰＣＲ遺伝子の発現および／またはＮＧＰＣＲ遺伝子産物活性を調節する化合物、すなわちそのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化合物の同定のための、前記ＮＧＰＣＲヌクレオチド配列および／またはＮＧＰＣＲ遺伝子産物の使用方法に関する。そのような化合物は、生物学的障害または平衡異常の多様な症状の処置のための療法薬として使用できる。
【００１０】
４．配列表および図面の説明
配列表に、記載したＮＧＰＣＲ  ＯＲＦの配列、およびそれによりコードされるアミノ酸配列を示す。配列番号９は、ＮＧＰＣＲ  ＯＲＦとフランキング領域を示す。
【００１１】
５．発明の詳細な記述
本明細書に初めて記載するヒトＮＧＰＣＲは、ヒト精巣、小腸、および子宮細胞において発現する新規な受容体タンパクである。記載するＮＧＰＣＲ配列は、ヒト精巣、小腸、および子宮由来のｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡに関連したヒトゲノム配列を用いて得られた（ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇａｉｔｈｅｒａｂｕｒｇ、ＭＤ、およびＣｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）。ＮＧＰＣＲは７ＴＭファミリーの受容体の膜貫通タンパク質である。他のＧＰＣＲと同様に、リガンドが受容体に結合したときに信号伝達が開始される。天然リガンドの結合を妨害し、またはリガンドを中和もしくは除去し、またはＮＧＰＣＲへのリガンドの結合を妨害すると、ＮＧＰＣＲ仲介による信号伝達が影響を受ける。７ＴＭ、特にＧＰＣＲタンパクは生物学的に重要であるので、集中的な科学的および商業的探索の対象となってきた（たとえばＵＳＰ５，９４２，４１６および５，８９１，７２０参照；両方をＮＧＰＣＲを伴う適用、使用、および分析のために全体として本明細書に援用する）。７ＴＭタンパクに加えて、前記ＮＧＰＣＲは、とりわけ精巣上体６（ＨＥ６）、セクレチン、およびラトロトキシン受容体ファミリーのＧＰＣＲと顕著な相同性を共有する。
【００１２】
本発明は、疾病の診断および処置において、記載するＮＧＰＣＲヌクレオチド、ＮＧＰＣＲタンパク、およびペプチド、並びにＮＧＰＣＲに対する抗体、好ましくは人化モノクローナル抗体、または結合断片、ドメインもしくはそれらの融合タンパク（たとえばＮＧＰＣＲのアゴニストまたはアンタゴニストとしても作用することができる）、受容体活性もしくは発現を阻害するアンタゴニスト、またはＮＧＰＣＲ受容体活性を高めもしくはＮＧＰＣＲ発現を増大させるアゴニストとしての使用を包含する。
【００１３】
特に、以下の各サブセクションに記載する本発明は、下記のものを包含する：ＮＧＰＣＲの機能性ドメイン（たとえばＥＣＤ、ＴＭまたはＣＤ）に対応するＮＧＰＣＲポリペプチドまたはペプチド；変異、トランケートまたは欠失ＮＧＰＣＲ（たとえば１以上の機能性ドメインまたはその一部を失ったＮＧＰＣＲ、たとえば△ＥＣＤ、△ＴＭおよび／または△ＣＤ）、ＮＧＰＣＲ融合タンパク質（たとえば、ＮＧＰＣＲまたはＮＧＰＣＲ機能性ドメインが、関連のないタンパク質またはペプチド、たとえば免疫グロブリン定常部、すなわちＩｇＦｃに融合したもの）、それらの生成物をコードするヌクレオチド配列、ならびにそれらのＮＧＰＣＲ生成物を産生できる宿主細胞発現系。
【００１４】
本発明は下記のものをも包含する：抗体および抗イディオタイプ抗体（Ｆａｂフラグメントを含む）、ＮＧＰＣＲのアンタゴニストおよびアゴニスト、並びにＮＧＰＣＲ配列の発現を阻害する化合物もしくはヌクレオチド構築体（転写因子阻害薬、アンチセンス分子およびリボザイム分子、または遺伝子もしくは調節配列置換構築体）、またはＮＧＰＣＲの発現を促進する化合物もしくはヌクレオチド構築体（たとえばＮＧＰＣＲコード配列が機能可能な状態でプロモーター、プロモーター／エンハンサーなどの発現制御要素と結合した発現構築体）。本発明は、ヒトＮＧＰＣＲ（またはその変異体）を発現するか、あるいは動物の内因性ＮＧＰＣＲ遺伝子の発現を阻害または”ノックアウト”するように遺伝子工学的に処理した宿主細胞および動物にも関する。
【００１５】
ＮＧＰＣＲタンパク質またはペプチド、ＮＧＰＣＲ融合タンパク質、ＮＧＰＣＲヌクレオチド配列、抗体、アンタゴニストおよびアゴニストは、疾病の診断のために変異ＮＧＰＣＲまたは不適正発現したＮＧＰＣＲを検出するのに有用となりうる。ＮＧＰＣＲタンパク質またはペプチド、ＮＧＰＣＲ融合タンパク質、ＮＧＰＣＲヌクレオチド配列、宿主細胞発現系、抗体、アンタゴニスト、アゴニスト、ならびに遺伝子工学的に処理した細胞および動物は、体内における正常なＮＧＰＣＲ機能の撹乱の症候性発現または表現型発現を処置するのに有効な候補を同定する薬物スクリーニング（またはコンビナトリアルライブラリーのハイスループットスクリーニング）にも使用できる。遺伝子工学的に処理した宿主細胞および／または動物の使用は、それらの系によりＮＧＰＣＲのＥＣＤに結合する化合物を同定できるだけでなく、活性ＮＧＰＣＲによる信号伝達に影響を与える化合物をも同定できるという点で、有利である。
【００１６】
最後に、ＮＧＰＣＲ生成物（特に可溶性誘導体、たとえばＮＧＰＣＲ  ＥＣＤに対応するペプチドまたは１以上のＴＭドメインを欠如するトランケート型ポリペプチド）、ならびに融合タンパク質生成物（特にＮＧＰＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質、すなわちＩｇＦｃへのＮＧＰＣＲまたはＮＧＰＣＲドメイン、たとえばＥＣＤ、△ＴＭの融合体）、抗体および抗イディオタイプ抗体（Ｆａｂフラグメントが含まれる）、アンタゴニストまたはアゴニスト（信号伝達を調節する化合物が含まれめる；これらはＮＧＰＣＲ仲介による信号伝達経路における下流ターゲットに作用する可能性がある）を用いて、そのような疾病を処置することができる。たとえば、有効量の可溶性ＮＧＰＣＲ  ＥＣＤ、△ＴＭ、またはＮＧＰＣＲ  ＥＣＤを模倣したＥＣＤ−ＩｇＦｃ融合タンパク質もしくは抗イディオタイプ抗体（またはそのＦａｂ）の投与により、内因性ＮＧＰＣＲリガンドが”掃討”または中和され、結合および受容体活性化が阻止され、または低下するであろう。そのようなＮＧＰＣＲ生成物をコードするヌクレオチド構築体を用いて、そのような生成物をインビボで発現するように宿主細胞を遺伝子工学的に処理することができる；遺伝子工学的に処理したこれらの細胞は体内で”バイオリアクター”として作用し、ＮＧＰＣＲ、ＮＧＰＣＲペプチド、可溶性ＥＣＤもしくは△ＴＭまたはＮＧＰＣＲ融合タンパク質を身体に連続的に供給し、これらがＮＧＰＣＲリガンドを”掃討”または中和する。機能性ＮＧＰＣＲ、変異ＮＧＰＣＲ、ならびにアンチセンス分子およびリボザイム分子をコードするヌクレオチド構築体は、ＮＧＰＣＲ発現を調節する”遺伝子療法”方式にも使用できる。したがって本発明は、生物学的障害を処置するための医薬配合物および方法をも包含する。
【００１７】
本発明の多様な態様について、以下の各サブセクションにさらに詳細に記載する。
【００１８】
５．１  ＮＧＰＣＲポリヌクレオチド
前記ヒトＮＧＰＣＲのｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を配列表に示す。前記ＮＧＰＣＲは、上述のように様々なヒト組織において発現され、明らかにヒトＸ染色体上にコードされている。
【００１９】
ＮＧＰＣＲの配列解析過程で、いくつかの多型が同定され、それにはたとえば配列番号１のヌクレオチド位として３６０１位でのＴ／Ｃ多型（それは配列番号２の相当するアミノ酸１２０１位で、同じアミノ酸トレオニンとなる）、および配列番号３のヌクレオチド位として２１７３位でのＴ／Ｃ多型（それは配列番号４の相当するアミノ酸７２５位で、同じアミノ酸トレオニンとなる）が含まれる。
【００２０】
本発明のＮＧＰＣＲには下記のものが含まれる：配列表に示したヒトＤＮＡ配列（およびそれを含むベクター）；さらに、配列表に示したＤＮＡ配列の相補配列に高ストリンジェントな条件下で［たとえば０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、６５℃でフィルター結合ＤＮＡにハイブリダイゼーション、そして０．１×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中、６８℃で洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．編，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社，およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社，ニューヨーク，ｐ．２．１０．３）］ハイブリダイズする連続した機能性ＮＧＰＣＲオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をもち、機能的に均等な遺伝子生成物をコードする、いかなるヌクレオチド配列も考慮される。さらに、配列表に示したアミノ酸をコードおよび発現するＤＮＡ配列の相補配列に中等度ストリンジェントな条件下で［たとえば０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中、４２℃で洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，前掲］ハイブリダイズし、なおかつ機能的に均等なＮＧＰＣＲ遺伝子生成物をコードする、いかなるヌクレオチド配列も考慮される。ＮＧＰＣＲの機能均等物には、他の種に存在する天然ＮＧＰＣＲ、および天然の、または（部位特異的変異、遺伝子シャフリング、定方向進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）（たとえばＵＳＰ５，８３７，４５８および５，７２３，３２３（両特許をここに参照として援用する）に記載されている）によって）遺伝子工学的に作成した変異ＮＧＰＣＲが含まれる。本発明には、開示したＮＧＰＣＲポリヌクレオチド配列の縮重核酸変異体も含まれる。
【００２１】
更に考慮されるのは、ＮＧＰＣＲ  ＯＲＦｓをコードするポリヌクレオチド、もしくは配列表のポリヌクレオチド配列の相当領域と約９９％、９５％、９０％もしくは約８５％の相同性もしくは同一な（例えば、本明細書に記載したＧＣＧ配列解析パッケージをデフォルトパラメーターを使用して、ＢＬＡＳＴ配列比較解析により測定する）ポリヌクレオチドによってコードされるそれらの機能均等物である。
【００２２】
本発明には、前記ＮＧＰＣＲヌクレオチド配列にハイブリダイズする、したがってその相補配列にハイブリダイズする核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子も含まれる。そのようなハイブリダイゼーション条件は、本明細書記載のように高ストリンジェントであってもよく、またはストリンジェント度がより低くてもよい。核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド（”ＤＮＡオリゴ体”）である場合、それらの分子は本発明の配列表に初めて開示したヌクレオチド配列の連続領域を含む、約１６〜約１００塩基、約２０〜約８０塩基、または約３４〜約４５塩基の長さのもの、またはそこに示すサイズの任意の変更または組合わせであり、それらをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と組み合わせて用いて、ライブラリーのスクリーニング、クローンの単離、ならびにクローニング鋳型および配列決定用鋳型の調製などを行うことができる。
【００２３】
あるいは、そのようなＮＧＰＣＲオリゴヌクレオチドは、ライブラリーのスクリーニングのため、または遺伝子発現パターン評価のためのハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる（特に、マイクロアレイあるいは高処理能力“チップ”フォーマットを使用して）。さらに、一連の記載したＮＧＰＣＲオリゴヌクレオチド配列あるいはその相補体は、記載したＮＧＰＣＲ配列のすべてあるいは一部を代表するものとして使用することができる。配列番号１−９の配列の１つまたはそれ以上の少なくとも一部に開示されている新規オリゴヌクレオチドあるいはポリヌクレオチド配列を、固相支持体マトリックス／基板（樹脂、ビーズ、膜、プラスチック、ポリマー、金属あるいは金属化した基板、結晶性あるいは多結晶性の基板など）に結合させてハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。特に注目すべきは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、あるいは相当するオリゴペプチドおよびポリペプチドの、空間的にアクセス可能な（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）アレイ（即ち、遺伝子チップ、マイクロタイタープレートなど）である。ここで該空間的にアクセス可能なアレイに存在するバイオポリマーの少なくとも一つは、配列番号１−９の配列の少なくとも一つに開示されている新規オリゴヌクレオチドあるいはポリヌクレオチド配列、あるいはそれらによってコードされるアミノ酸配列からなる。バイオポリマーを固体支持マトリックスに接着する方法、あるいは固体支持マトリックス上でバイオポリマーを合成する方法、およびそれらにより結合試験を実施する方法は、特に米国特許第５，７００，６３７、５，５５６，７５２、５，７４４，３０５、４，６３１，２１１、５，４４５，９３４、５，２５２，７４３、４，７１３，３２６、５，４２４，１８６、および４，６８９，４０５に記載されており、それらの全体をここに参照として援用する。
【００２４】
配列番号１−９に開示されている新規配列を含むアクセス可能なアレイは、遺伝子の時および組織特異的発現を同定および特徴づけするのに使用することができる。それらの空間的にアクセス可能な（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）アレイは、要求される特異性を満たすために十分な長さのオリゴヌクレオチド配列を含むが、依然その生産技術による制限がある。それらのプローブの長さは、約８から約２０００ヌクレオチドの間の範囲である。好ましくは、該プローブは、配列番号１−９に開示されている新規配列中の６０ヌクレオチドからなり、より好ましくは２５ヌクレオチドからなる。
【００２５】
例えば、一連の記載した配列あるいはそれらの相補配列を、記載したＮＧＰＣＲの全てあるいは一部を表す（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ）ためにチップ形式で使用することができる。オリゴヌクレオチド、典型的には約１６から約４０ヌクレオチド長の間のオリゴヌクレオチド（あるいはこの範囲内のいずれかの整数長）は、互いに部分的に重なり合うことができ、および／またはＮＧＰＣＲ配列は、重なり合わないオリゴヌクレオチドを使用して表すことができる。従って、記載したポリヌクレオチド配列は、典型的には配列表に記載したそれぞれの新規配列中の少なくとも約１８ヌクレオチド長の少なくとも約２もしくは３つの別個のオリゴヌクレオチド配列を含む。そのようなオリゴヌクレオチド配列は配列表の配列内に存在するいずれのヌクレオチドから開始することができ、そして記載した配列に向かった方向であるセンス方向（５’から３’方向）あるいはアンチセンス方向（３’から５’方向）のいずれにも進めることができる。
【００２６】
マイクロアレイ解析により、幅広い遺伝子活性のパターンが明らかとなり、遺伝子機能の新たな知見を提供し、また転写過程および生物メカニズムに関する新しくかつ予期しない見識に導くことが可能になる。配列番号１−９に開示されている新規配列を含むアクセス可能なアレイの使用は、ある特定の経路に関与する転写の変化に関する詳細な情報を提供し、新しい表現型であると証明する新しい成分または遺伝子機能の同定に導き得る。
【００２７】
配列番号１−９に開示されている新規配列からなるプローブも、薬剤開発の新しい分子ターゲットの同定、選別、および確認に使用することができる。それらのユニークな配列の使用は、薬剤ターゲットの直接的な確認、および薬剤の意図したターゲットとは異なる経路により調節される遺伝子発現の薬剤依存的変化の認識を可能にする。それゆえ、それらのユニークな配列は、薬剤作用および毒性の両方を明らかにする、およびモニターするのに有用である。
【００２８】
有用性の例として、配列番号１−９に開示されている新規配列は、ある特定の病的状態の患者から得た遺伝子材料の蓄積物を検査するために、マイクロアレイまたは他のアッセイフォーマットに使用することができる。それらの調査は、配列番号１−９に開示されている新規配列を使用してインシリコにて、以前に収集された遺伝子データベースと開示した配列を当業者に知られたコンピューターソフトウェアを使用して行うことができる。
【００２９】
このように、配列番号１−９に開示されている新規配列は、特定の疾患に関係した変異を同定するために使用することができ、および診断または予後の分析に使用することができる。
【００３０】
記載した配列はヌクレオチド配列を使用して特定的に記載されているが、配列のそれぞれは広範囲な付加的な構造属性のいずれかを使用して特徴的に記載することができることは理解できるであろう。例えば、ある既定の配列は、配列番号１−９にはじめて開示された一つもしくはそれ以上の特定のオリゴヌクレオチド配列の存在の連結として、該配列の既定の領域内に存在するヌクレオチドの正味の組成物として記載することができる。あるいは、制限エンドヌクレアーゼ切断部位の相対的位置を特定する制限地図、または様々なパリンドロームあるいは他の特定のオリゴヌクレオチド配列は、ある特定の配列を構造的に記載するのに使用することができる。そのような制限地図は、典型的に広く利用されているコンピュータープログラム（例えば、Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＧＣＧ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｐａｃｋａｇｅ，  ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ  ３．０，  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐ．，  Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，  ＭＩ，  等）により作ることができ、選択的に配列中に存在する一つあるいはそれ以上の別個のヌクレオチド配列の連結として使用することができ、開示配列中に存在する一つあるいはそれ以上の付加的な配列、あるいは一つもしくはそれ以上の切断部位との相対的な配列位置によって記載することができる。
【００３１】
オリゴヌクレオチドプローブに関して、高ストリンジェントな条件とは、たとえば６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム中、３７℃（１４塩基オリゴ体について）、４８℃（１７塩基オリゴ体について）、５５℃（２０塩基オリゴ体について）、および６０℃（２３塩基オリゴ体について）での洗浄を表す。
【００３２】
記載するオリゴヌクレオチドは、たとえばＮＧＰＣＲ遺伝子調節（および／またはＮＧＰＣＲ遺伝子核酸配列の増幅反応におけるアンチセンスプライマーとして）に有用なＮＧＰＣＲアンチセンス分子をコードし、またはそれらの分子として作用することができる。ＮＧＰＣＲ遺伝子調節に関しては、それらの方法を用いて生物学的機能を調節することができる。さらに、そのような配列を、同様にＮＧＰＣＲ遺伝子調節に有用なリボザイムおよび／または三重らせん配列の一部として使用できる。
【００３３】
さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、下記を含めた群（これらに限定されない）から選択される少なくとも１個の修飾塩基部分を含むことができる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。
【００３４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースを含めた（これらに限定されない）群から選択される少なくとも１個の修飾糖部分を含むこともできる。
【００３５】
さらに他の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステルおよびホルムアセタール、またはその類似体よりなる群から選択される少なくとも１個の修飾リン酸主鎖を含む。
【００３６】
さらに他の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはα−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、通常のβ−単位と異なり、鎖が互いに平行に走行する特異的な二本鎖ハイブリッドを相補的ＲＮＡと形成する（Ｇａｕｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５：６６２５−６６４１）。このオリゴヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５：６１３１−６１４８）、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）である。あるいは、２本鎖ＲＮＡは、標的ＮＧＰＣＲの発現を抑制し、および機能を失わせるのに使用することができる。
【００３７】
本発明のオリゴヌクレオチドは、当技術分野で既知の標準法により、たとえば自動ＤＮＡ合成装置（たとえばＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販されているもの）を用いて合成できる。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは合成でき（Ｓｔｅｉｎら、１９８８，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：３２０９）、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは制御ポアガラスポリマー支持体を用いて製造できる（Ｓａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：７４４８−７４５１）など。
【００３８】
低ストリンジェントな条件は当業者に周知であり、ライブラリーおよび標識配列が由来する個々の生物に応じて異なるが、推定可能であろう。そのような条件に関する手引きについては、たとえば下記を参照されたい：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（およびその定期的改訂版）；およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，上述（およびその定期的改訂版）。
【００３９】
あるいは、適切なストリンジェント条件を採用し、またはＰＣＲにより、適切に標識したＮＧＰＣＲヌクレオチドプローブを用いてヒトゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。ヒトゲノムクローンの同定および解明は、多型性（制限的ではないが、ヌクレオチドリピート、マイクロサテライト対立遺伝子、シングルヌクレオチド多型、あるいはコードシングルヌクレオチド多型を含む）の確認、特定の遺伝子座／対立遺伝子のゲノム構造の決定、および診断試験の設計に有用である。たとえばヒト遺伝子のイントロン／エキソン境界に隣接する領域に由来する配列を用いて、エキソン、イントロン、スプライス部位（たとえばスプライスアクセプターおよび／またはドナー部位）内などの変異を検出するための増幅アッセイに用いるプライマーを設計し、これらを診断および薬理遺伝学に使用できる。
【００４０】
たとえば、本発明の配列は、制限酵素断片長多型（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ（ＲＦＬＰ））解析において特定のものを同定するために使用することができる。この技術では、個々のゲノムＤＮＡが一つもしくはそれ以上の制限酵素で切断され、そしてサザンプロットで精査され、同定のためのユニークなバンドが得られる（米国特許番号５，２７２，０５７に一般的に記載されており、ここに参照として援用する）。さらに、本発明の配列は、ポリヌクレオチド試薬、たとえばヒトゲノムの特定位置にターゲットされたＰＣＲプライマーで、たとえば他の“同定マーカー”（すなわち、特定の個人に対してユニークな他のＤＮＡ配列）を提供することによってＤＮＡに基づいた法的同定の信頼性を高めることができるＰＣＲプライマー、を提供するために使用することができる。実際の塩基配列情報は、制限酵素によって生じた断片により形成された正確なパターンとして、同定のために使用することができる。
【００４１】
さらに、本明細書に記載するＮＧＰＣＲ生成物内のアミノ酸配列に基づいて設計した２つの縮重オリゴヌクレオチドプライマープールを用いてＰＣＲを行うことにより、目的生物の核酸からＮＧＰＣＲ遺伝子相同配列を単離できる。反応の鋳型は、ＮＧＰＣＲ遺伝子対立遺伝子を発現することが分かっているかまたは推測される、たとえばヒトまたは非ヒト細胞系または組織から調製したｍＲＮＡの逆転写により得られる全ＲＮＡ、ｍＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡであってよい。
【００４２】
増幅配列が目的ＮＧＰＣＲ遺伝子の配列であることを確認するために、ＰＣＲ生成物をサブクローニングして配列決定することができる。次いでそのＰＣＲフラグメントを用いて多様な方法で全長ｃＤＮＡクローンを単離できる。たとえば増幅フラグメントを標識し、ｃＤＮＡライブラリー、たとえばバクテリオファージｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用できる。あるいは、標識フラグメントを用いて、ゲノムライブラリーのスクリーニングによりゲノムクローンを単離することができる。
【００４３】
ＰＣＲ法を利用して、全長ＮＧＰＣＲｃＤＮＡ配列を単離することもできる。たとえば標準法により、適切な細胞源または組織源（すなわち、ＮＧＰＣＲ遺伝子を発現することが分かっているかまたは推測されるもの）からＲＮＡを単離できる。最も５’末端の増幅フラグメントに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを第１鎖合成のプライミングに用いて、ＲＮＡについて逆転写（ＲＴ）反応を行うことができる。次いで得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを標準的なターミナルトランスフェラーゼ反応により”テイル形成”し、このハイブリッドをＲＮａｓｅ  Ｈで消化し、次いで相補プライマーにより第２鎖合成をプライミングすることができる。こうして、増幅フラグメントの上流のｃＤＮＡ配列を容易に単離できる。使用できるクローニング方式の概説については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９（前掲）を参照されたい。
【００４４】
変異ＮＧＰＣＲ遺伝子のｃＤＮＡは、たとえばＰＣＲを用いて単離できる。この場合、第１ｃＤＮＡ鎖は、変異ＮＧＰＣＲ対立遺伝子を保有すると推定される個体において変異ＮＧＰＣＲ対立遺伝子を発現することが分かっているかまたは推測される組織から単離したｍＲＮＡに、オリゴ−ｄＴオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、この新たな鎖を逆転写酵素で延長することにより合成できる。次いで正常遺伝子の５’末端に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いて、第２鎖を合成する。次いでこれら２プライマーを用いて、生成物をＰＣＲにより増幅させ、所望により適切なベクター中へクローニングし、当業者に周知の方法でＤＮＡ配列分析を行う。変異ＮＧＰＣＲ対立遺伝子のＤＮＡ配列を正常なＮＧＰＣＲ対立遺伝子のものと比較することにより、変異ＮＧＰＣＲ遺伝子生成物の機能の喪失または変化に関与する変異（１以上）を確認できる。
【００４５】
あるいは、変異ＮＧＰＣＲ対立遺伝子を保有することが推測されるかもしくは分かっている個体から得たＤＮＡを用いてゲノムライブラリーを構築することができ、または変異ＮＧＰＣＲ対立遺伝子を発現することが分かっているかもしくは推測される組織からのＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを構築することができる。次いで、正常なＮＧＰＣＲ遺伝子、またはそのいずれか適切なフラグメントを標識してプローブとして用い、そのようなライブラリー中の対応する変異ＮＧＰＣＲ対立遺伝子を同定することができる。次いで、当業者に周知の方法で変異ＮＧＰＣＲ遺伝子配列を含むクローンを精製し、配列分析することができる。
【００４６】
さらに、たとえば変異ＮＧＰＣＲ対立遺伝子を保有することが推測されるかまたは分かっている個体の、そのような変異対立遺伝子を発現することが分かっているかまたは推測される組織より単離したＲＮＡから合成したｃＤＮＡを利用して、発現ライブラリーを構築できる。この方法で、後記セクション５．３に記載するように、推定変異組織が形成した遺伝子生成物を発現させ、正常ＮＧＰＣＲ生成物に対して産生された抗体と組み合わせた標準抗体スクリーニング法を用いてスクリーニングすることができる（スクリーニング法については、たとえばＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ編，１９８８，”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，コールド・スプリング・ハーバー参照、本明細書にその全体を援用する）。
【００４７】
さらに、標識ＮＧＰＣＲ融合タンパク質、たとえばアルカリ性ホスファターゼ−ＮＧＰＣＲまたはＮＧＰＣＲ−アルカリ性ホスファターゼ融合タンパク質を用いてスクリーニングを行うことができる。ＮＧＰＣＲ変異により機能の変化した遺伝子生成物が発現する場合（たとえばミスセンス変異またはフレームシフト変異の結果）、ＮＧＰＣＲに対するポリクローナル抗体セットがこの変異ＮＧＰＣＲ遺伝子生成物と交差反応する可能性がある。それらとそのような標識抗体との反応により検出されるライブラリークローンを当業者に周知の方法で精製し、配列分析することができる。
【００４８】
本発明は、変異ＮＧＰＣＲ、ＮＧＰＣＲのペプチドフラグメント、トランケートしたＮＧＰＣＲ、およびＮＧＰＣＲ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列をも包含する。これらには、後に記載する変異ＮＧＰＣＲをコードするヌクレオチド配列；ＮＧＰＣＲの１以上のＥＣＤ、ＴＭおよび／またはＣＤドメイン、あるいはこれらのドメインの一部に対応するポリペプチドまたはペプチド；１または２つのドメインが欠失したトランケートＮＧＰＣＲ、たとえばＴＭ領域またはＴＭとＣＤの両領域を欠如する可溶性ＮＧＰＣＲ、あるいはＣＤ領域の全部または一部を欠如するトランケートした非機能性ＮＧＰＣＲが含まれるが、これらに限定されない。融合タンパク質をコードするヌクレオチドには、全長ＮＧＰＣＲ配列、トランケートしたＮＧＰＣＲ、またはＮＧＰＣＲのペプチドフラグメントが下記のような関連のないタンパク質もしくはペプチドに融合したものをコードするヌクレオチドを含めることができるが、これらに限定されない：ＮＧＰＣＲ  ＥＣＤを細胞に結合させる膜貫通配列；得られる融合タンパク質（たとえばＮＧＰＣＲ−Ｉｇ）の血流中での安定性および半減期を高めるＩｇＦｃドメイン；またはマーカーとして使用できる酵素、蛍光タンパク質もしくは発光タンパク質。
【００４９】
本発明は下記のものをも包含する：（ａ）前記ＮＧＰＣＲコード配列および／またはその相補配列（すなわちアンチセンス）のいずれかを含むＤＮＡベクター；（ｂ）コード配列の発現を指令する少なくとも第一調節要素に機能可能な状態で結合した前記ＮＧＰＣＲコード配列のいずれかを含むＤＮＡ発現ベクター（たとえば、ＵＳＰ５，８６９，３３６に記載されたバキュロウイルスベクター、該特許を参照としてここに援用する）；（ｃ）宿主細胞におけるコード配列の発現を指令する少なくとも第一調節要素に機能可能な状態で結合した前記ＮＧＰＣＲコード配列のいずれかを含む、遺伝子工学的に処理した宿主細胞；ならびに（ｄ）外因導入調節要素のコントロール下（すなわち遺伝子活性化）での内因性ＮＧＰＣＲ配列を発現する遺伝子操作宿主細胞。本明細書中で用いる調節要素には、誘導性および非誘導性のプロモーター、エンハンサー、オペレーター、ならびに発現を誘発および調節することが当業者に知られている他の要素が含まれるが、これらに限定されない。それらの調節要素には、下記のものが含まれるが、これらに限定されない：サイトメガロウイルスｈＣＭＶ極初期遺伝子、ＳＶ４０あるいはアデノウイルスの調節可能なウイルス初期または後期プロモーター（特にレトロウイルスＬＴＲプロモーター）、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔｅｔ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ファージラムダの主オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、ならびに酵母α−接合因子のプロモーター。
【００５０】
前記ＮＧＰＣＲヌクレオチド配列の更なる利用は、例えばポリヌクレオチドシャッフリングあるいは関連した方法論を使用した、前記新規配列により少なくとも部分的にコードされるタンパク質の分子変異／進化におけるそれらの使用である。それらの試みは、米国特許５，８３０，７２１、５，７２３，３２３および５，８３７，４５８に記載されており、それらの全体をここに参照として援用する。
【００５１】
記載した配列の更に考慮される使用には、米国特許出願番号６０／１１０，９０６、６０／１０６，３００、６０／０９４，８７９、および６０／１２１，８５１に記載されている方法および応用を使用した、細胞アッセイおよび遺伝子操作動物における使用のための、構成的に“ＯＮ”である変異体の作成が含まれる。それらの特許出願の全体を参照として本明細書に援用する。
【００５２】
ＮＧＰＣＲ遺伝子生成物をトランスジェニック動物において発現させることもできる。蟯虫、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ミニブタ、鳥類、ヤギおよび非ヒト霊長類、たとえばヒヒ、サルおよびチンパンジーなどを含めた（これらに限定されない）任意の種の動物を用いて、ＮＧＰＣＲトランスジェニック動物を作成することができる。
【００５３】
ＮＧＰＣＲトランスジーンを動物に導入してトランスジェニック動物の創始系を作成するための、当技術分野で既知の任意の方法を使用できる。そのような方法には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：前核マイクロインジェクション（ＨｏｐｐｅおよびＷａｇｎｅｒ，１９８９，ＵＳＰ４，８７３，１９１）；レトロウイルス仲介による生殖系細胞への遺伝子伝達（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：６１４８−６１５２）；胚性幹細胞における遺伝子ターゲティング（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｅｌｌ，５６：３１３−３２１）；胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ，１９８３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３：１８０３−１８１４）；および精子仲介遺伝子伝達（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｅｌｌ，５７：７１７−７２３）など。そのような方法の概説については、Ｇｏｒｄｏｎ，１９８９，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．，１１５：１７１−２２９参照；この全体を参考として本明細書に援用する。
【００５４】
本発明は、それらのすべての細胞にＮＧＰＣＲトランスジーンを保有するトランスジェニック動物、およびそれらのすべての細胞ではなく一部の細胞にこのトランスジーンを保有する動物、すなわちモザイク動物または体細胞トランスジェニック動物を提供する。トランスジーンは単一トランスジーンとして、またはコンカテマー中に、たとえば頭−頭縦列または頭−尾縦列で組み込まれてもよい。トランスジーンは、たとえばＬａｓｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：６２３２−６２３６の教示に従って、特定の細胞タイプに選択的に導入され、活性化されてもよい。そのような細胞タイプ特異的活性化に必要な調節配列は、目的とするその細胞タイプに依存し、当業者に自明であろう。
【００５５】
ＮＧＰＣＲトランスジーンを染色体の内因性ＮＧＰＣＲ遺伝子部位に組み込みたい場合、遺伝子ターゲティングが好ましい。要約すると、そのような方法を用いたい場合、内因性ＮＧＰＣＲ遺伝子のヌクレオチド配列に染色体配列との相同組換えにより組み込ませ、その機能を撹乱するために（すなわちノックアウト動物）、内因性ＮＧＰＣＲ遺伝子に相同な若干のヌクレオチド配列を含むベクターを設計する。
【００５６】
トランスジーンを特定の細胞タイプに選択的に導入し、これによりその細胞タイプにおいてのみ内因性ＮＧＰＣＲ遺伝子を不活性化することもできる：たとえばＧｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５：１０３−１０６の教示による。そのような細胞タイプ特異的不活性化に必要な調節配列は、目的とするその細胞タイプに依存し、当業者に自明であろう。
【００５７】
トランスジェニック動物が作成されると、標準法により組換えＮＧＰＣＲ遺伝子の発現を評価することができる。サザンブロット分析またはＰＣＲ法により初期スクリーニングを行って動物組織を分析し、トランスジーンの組込みが行われたかどうかをアッセイすることができる。トランスジェニック動物の組織におけるトランスジーンのｍＲＮＡ発現レベルも、その動物から得た組織試料のノーザンブロット分析、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析、およびＲＴ−ＰＣＲを含めた方法（これらに限定されない）を用いて評価することができる。ＮＧＰＣＲ遺伝子発現組織の試料を、そのＮＧＰＣＲトランスジーン生成物に特異的な抗体を用いて免疫細胞化学的に評価することもできる。
【００５８】
５．２  ＮＧＰＣＲタンパク質及びポリペプチド
ＮＧＰＣＲタンパク、ポリペプチド、およびペプチドフラグメント、変異、トランケートもしくは欠失形のＮＧＰＣＲ、および／またはＮＧＰＣＲ融合タンパク質を、多様な用途のために調製することができる。これらの使用には、タンパク治療、抗体産生、診断アッセイにおける試薬として、ＮＧＰＣＲに関連した他の細胞遺伝子生成物の同定、精神的、生物学的または医学的な障害（すなわち、腎臓疾患、消化疾患、不妊、血圧異常、体重障害など）および疾病の療法処置に有用な医薬として使用できる化合物のスクリーニングのためのアッセイにおける試薬としての用途が含まれるが、これらに限定されない。前記ＮＧＰＣＲは、制限的ではないが、ラトロトキシン受容体およびラトロフィリンを含む化合物と構造上の類似性を有する。類似性に関する情報と発現データに基づき、前記ＮＧＰＣＲは、疾患の治療または治療剤の効果を治療的に増強するための（薬剤、オリゴ、抗体などによる）ターゲットとされる。
【００５９】
配列表に、前記ＮＧＰＣＲヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を開示する。前記ＮＧＰＣＲは、翻訳開始部位に一致するＤＮＡ配列コンテクストにイニシエーターメチオニンをもち、これに膜結合あるいは分泌タンパクに典型的な疎水性のシグナル配列が続く。本明細書に示す配列データは、ＮＧＰＣＲの選択的スプライシングによるものが存在することを示している。
【００６０】
本発明のＮＧＰＣＲアミノ酸配列には、配列表に示したアミノ酸配列、ならびにその類似体および誘導体が含まれる。さらに、他の種に由来する対応するＮＧＰＣＲ相同配列も本発明に包含される。事実、前記ＮＧＰＣＲヌクレオチドがコードするいかなるＮＧＰＣＲタンパク質も本発明の範囲に含まれ、配列表に示したアミノ酸配列の全部またはいずれかの新規部分をコードする新規ポリヌクレオチド配列も同様に本発明に含まれる。遺伝子コードの縮重性は周知であり、したがって配列表に示した各アミノ酸はそのアミノ酸をコードしうる周知の核酸”トリプレット”コドン（または多くの場合コドン類）の一般的代表例である。したがって、本明細書で意図するように、配列表に示したアミノ酸配列は、遺伝子コード（たとえば”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，１９８６，Ｄａｒｎｅｌｌら編，ｐ．１０９，表４−１参照，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，ニューヨーク州ニューヨーク；本明細書に参考として援用）を合わせて考慮すると、そのようなアミノ酸配列をコードしうる核酸配列の種々の変形および組合わせすべてのうちの一般的代表例である。
【００６１】
本発明は、多数の基準のいずれかにより判定して、記載したヌクレオチド配列がコードするＮＧＰＣＲに機能的に均等なタンパク質をも包含する。これらの基準には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：ＮＧＰＣＲのリガンドを結合する能力；適切な細胞タイプにＮＧＰＣＲ均等物が存在する場合に、均等もしくは相補的な信号伝達経路、細胞代謝の変化（たとえばイオンフラックス、チロシンリン酸化など）、または表現型における変化（たとえば生化学的、生物物理学的または顕示表現型の軽減、阻止または遅延）。そのような機能的に均等なＮＧＰＣＲタンパク質には、記載したＮＧＰＣＲヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列内のアミノ酸残基の付加体または置換体であって、ただしサイレント変化を生じ、したがって機能的に均等な遺伝子生成物を産生するものが含まれるが、これらに限定されない。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水度、親水度および／または両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。たとえば非極性（疎水性）アミノ酸残基にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれ；極性中性アミノ酸にはグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれ；正に荷電した（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リシンおよびヒスチジンが含まれ；負に荷電した（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
【００６２】
ＮＧＰＣＲ  ＤＮＡにランダム変異を行わせ（当業者に周知のランダム変異誘発法を用いて）、得られた変異ＮＧＰＣＲの活性を調べることができるが、ＮＧＰＣＲコード配列の部位特異的変異を工学的に形成して（当業者に周知の部位特異的変異誘発法を用いて）、機能の向上した（たとえばターゲットリガンドに対する結合アフィニティーがより高い、および／または信号伝達能がより高い）、または機能の低下した（ターゲットリガンドに対する結合アフィニティーがより弱い、および／または信号伝達能がより低い）、変異ＮＧＰＣＲを形成することができる。そのような分析の出発点のひとつは、例えば異種間で保存されているアミノ酸配列モチーフを同定するために、開示したヒト配列と他の哺乳動物由来の対応する遺伝子／タンパク質配列とをアラインさせることによる。種々の位置で非保存変化を工学的に行って、機能、信号伝達能、または両方を変更することができる。あるいは、機能の変更が望まれる場合、保存領域（すなわち同一アミノ酸）の欠失または非保存変更、たとえば種々の保存された膜貫通ドメインの欠失または非保存変更（置換または挿入）を工学的に行うことができる。
【００６３】
選択した宿主細胞における発現、スケールアップなどに、より適したＮＧＰＣＲを形成するために、ＮＧＰＣＲコード配列に他の変異を行うことができる。たとえばジスルフィド橋を排除するためにシステイン残基を欠失させるか、または他のアミノ酸と置換することができ、そしてたとえばＮ−結合部位を過剰グリコシル化することが知られている酵母宿主からより容易に採集および精製される均質な生成物を発現させるために、Ｎ−結合グリコシル化部位を変更または排除することができる。この目的で、ＥＣＤ中にあるいずれか１以上のグリコシル化認識配列（Ｎ−Ｘ−ＳまたはＮ−Ｘ−Ｔ）の第１もしくは第３アミノ酸の一方または両方の位置における多様なアミノ酸置換、および／またはＥＣＤ中のいずれか１以上のそのような認識配列の第２位置におけるアミノ酸欠失は、この修飾されたトリペプチド配列におけるＮＧＰＣＲのグリコシル化を阻止するであろう（たとえばＭｉｙａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，ＥＭＢＯ  Ｊ．，５：１１９３−１１９７）。
【００６４】
ＮＧＰＣＲの１以上のドメインに対応するペプチド（たとえばＥＣＤ、ＴＭ、ＣＤなど）、トランケートまたは欠失ＮＧＰＣＲ（たとえばＥＣＤ、ＴＭ、ＣＤを欠失したＮＧＰＣＲ）、および融合タンパク質（全長ＮＧＰＣＲ、ＮＧＰＣＲペプチドまたはトランケートＮＧＰＣＲが、関連のないタンパク質に融合したもの）も本発明の範囲に含まれ、本明細書に開示するＮＧＰＣＲ遺伝子ヌクレオチドおよびＮＧＰＣＲアミノ酸配列に基づいて設計することができる。そのような融合タンパク質には、ＮＧＰＣＲタンパク質もしくはペプチドを安定化してインビボでの半減期を延長するＩｇＦｃ融合体；または融合タンパク質を細胞膜に固定してＥＣＤを細胞表面に提示するいずれかのアミノ酸配列に対する融合体；またはマーカー機能を与える酵素、蛍光タンパク質もしくは発光タンパク質への融合体が含まれるが、それらに限定されない。
【００６５】
ＮＧＰＣＲポリペプチドおよびペプチドを化学的に合成できる（たとえばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，ニューヨーク，参照）が、ＮＧＰＣＲ由来の大型ポリペプチド、全長ＮＧＰＣＲは、ＮＧＰＣＲ遺伝子配列および／またはコード配列を含む核酸の発現に関して当技術分野で周知の方法を用いる組換えＤＮＡ法で有利に製造することができる。そのような方法を用いて、一つあるいはそれ以上の記載したＮＧＰＣＲヌクレオチド配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築できる。これらの方法には、たとえばインビトロ組換えＤＮＡ法、合成法およびインビボ遺伝子組換え法が含まれる。たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９（前掲）およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９（前掲）に記載の方法を参照。あるいは、ＮＧＰＣＲヌクレオチド配列がコードする転写体の全部または一部に対応するＲＮＡを、たとえば合成装置で化学的に合成することができる。たとえば”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，１９８４，Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，オックスフォード，に記載の方法を参照；その全体を参考として本明細書に援用する。
【００６６】
多様な宿主発現ベクター系を利用して、本発明のＮＧＰＣＲヌクレオチド配列を発現させることができる。ＮＧＰＣＲペプチドまたはポリペプチドが可溶性誘導体（たとえばＥＣＤに対応するＮＧＰＣＲペプチド；ＴＭおよび／またはＣＤを欠失したトランケートまたは欠失ＮＧＰＣＲ）であれば、ペプチドまたはポリペプチドを培養物から、すなわちＮＧＰＣＲペプチドまたはポリペプチドが宿主細胞により分泌されない場合は宿主細胞から、ＮＧＰＣＲペプチドまたはポリペプチドが分泌される場合は培地から、採集することができる。しかしそのような発現系には、ＮＧＰＣＲまたはその機能均等物をｉｎ  ｓｉｔｕで、すなわち細胞膜に固定した状態で発現する、工学的に処理した宿主細胞も包含される。そのような発現系からのＮＧＰＣＲの精製または富化は、適切な界面活性剤および脂質ミセル、ならびに当業者に周知の方法を用いて行うことができる。しかし、ＮＧＰＣＲの構造特性および機能特性を維持するだけでなく、たとえば薬物スクリーニングアッセイにおいて生物学的活性を評価することが重要である場合、そのような工学的に処理した宿主細胞自体を使用できる。
【００６７】
本発明の目的に使用できる発現系には下記のものが含まれるが、それらに限定されない：ＮＧＰＣＲヌクレオチド配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した微生物、たとえば細菌（たとえば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））；ＮＧＰＣＲヌクレオチド配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母（たとえばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ））；ＮＧＰＣＲヌクレオチド配列を含む組換えウイルス発現ベクター（たとえばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ＮＧＰＣＲヌクレオチド配列を含む組換えウイルス発現ベクター（たとえばカリフラワーモザイクウイルス，ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス，ＴＭＶ）を感染させた、もしくは組換えプラスミド発現ベクター（たとえばＴｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系；またはＮＧＰＣＲヌクレオチド配列および哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（たとえばメタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（たとえばアデノウイルス後期プロモーターあるいはワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築体を宿した哺乳動物細胞系（たとえばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２３９、３Ｔ３）。
【００６８】
細菌系では、発現するＮＧＰＣＲ生成物について意図する用途に応じて、多数の発現ベクターを有利に選択できる。たとえばＮＧＰＣＲタンパク質の医薬組成物を調製において、あるいはＮＧＰＣＲタンパク質に対する抗体を産生させるために、そのようなタンパク質を大量に製造したい場合、容易に精製される融合タンパク質生成物の高レベル発現を指令するベクターが望ましいことがある。そのようなベクターには下記のものが含まれるが、それらに限定されない：大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２：１７９１）、この場合、ＮＧＰＣＲコード配列を個々に、融合タンパク質が産生されるようにｌａｃＺコード領域と読み枠を一致させて、ベクターにライゲートさせることができる；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ，１９８５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：３１０１−３１０９；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：５５０３−５５０９）など。ｐＧＥＸベクターを用いて、ＮＧＰＣＲタンパク、ポリペプチドあるいはペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させることもできる。一般にそのような融合タンパク質は可溶性であり、溶解細胞からグルタチオン−アガロースビーズへの吸着、次いで遊離グルタチオンの存在下での溶離によって、容易に精製できる。ＰＧＥＸベクターがトロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ開裂部位を含むように設計し、これにより、ＮＧＰＣＲタンパク、ポリペプチドあるいはペプチドをＧＳＴ部分から放出させることができる。
【００６９】
典型的昆虫系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核ポリヒドローシスウイルス（ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ）をＮＧＰＣＲヌクレオチド配列発現のためのベクターとして用いる。このウイルスをＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞内で増殖させる。ＮＧＰＣＲ遺伝子コード配列を個々にウイルスの非必須領域（たとえばポリヘドリン遺伝子）内へクローン化し、ＡｃＮＰＶプロモーター（たとえばポリヘドリンプロモーター）の制御下におく。ＮＧＰＣＲ遺伝子コード配列の挿入に成功すると、ポリヘドリン遺伝子が不活性化され、ノンオクルーデッド（ｎｏｎ−ｏｃｃｌｕｄｅｄ）組換えウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子がコードするタンパク質性コートをもたないウイルス）が産生されるであろう。次いでこれらの組換えウイルスをＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞の感染に用い、ここで挿入遺伝子を発現させる（たとえばＳｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６：５８４；Ｓｍｉｔｈ，ＵＳＰ４，２１５，０５１参照）。
【００７０】
哺乳動物宿主細胞の場合、多数のウイルス性発現系を利用できる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、目的とするＮＧＰＣＲ遺伝子ヌクレオチド配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、たとえば後期プロモーターおよび三部分（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列にライゲートさせることができる。次いでこのキメラ配列をインビトロまたはインビボ組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入する。ウイルスゲノムの非必須領域（たとえば領域Ｅ１またはＥ３）に挿入すると、感染宿主においてＮＧＰＣＲ遺伝子生成物を発現しうる生存可能な組換えウイルスが得られる（たとえばＬｏｇａｎ  ＆  Ｓｈｅｎｋ，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３６５５−３６５９参照）。挿入したＮＧＰＣＲヌクレオチド配列の効率的翻訳には、特異的開始シグナルが必要な可能性もある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。それ自身の開始コドンおよび隣接配列を含む全ＮＧＰＣＲ遺伝子またはｃＤＮＡを適切な発現ベクターに挿入する場合、追加の翻訳制御シグナルは必要ないかもしれない。しかしＮＧＰＣＲコード配列の一部のみを挿入する場合、外因性翻訳制御シグナル（おそらく、ＡＴＧ開始コドンを含む）を供給することができる。さらに、挿入配列全体を確実に翻訳するためには、開始コドンが目的ＮＧＰＣＲコード配列の読み枠と一致しなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成のいずれでも、多様な由来のものであってよい。適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを取り込ませることにより、発現効率を高めることができる（Ｂｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：５１６−５４４）。
【００７１】
さらに、挿入配列の発現を調節し、または発現生成物を目的とする特定の様式で修飾およびプロセシングする、宿主細胞系統を選ぶことができる。タンパク質生成物のそのような修飾（たとえばグリコシル化）およびプロセシング（たとえば開裂）は、タンパク質の機能にとって重要である。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子あるいは発現生成物の翻訳後プロセシングおよび修飾に特徴的かつ特異的な機序をもつ。発現した外来タンパク質の適正な修飾およびプロセシングを確実にするために、適切な細胞系または宿主系を選ぶことができる。このために、一次転写体の適正なプロセシング、遺伝子生成物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構をもつ真核宿主細胞を使用できる。そのような哺乳動物宿主細胞にはＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３およびＷＩ３８細胞系が含まれるが、これらに限定されない。
【００７２】
組換えタンパク質の長期高収率産生のためには、安定な発現が好ましい。たとえば前記ＮＧＰＣＲ配列を安定に発現する細胞系を工学的に作成することができる。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを用いるのではなく、適切な発現制御要素（たとえばプロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により制御されるＤＮＡ、および選択性マーカーで宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、工学的に処理した細胞を富化培地で１〜２日間増殖させ、次いで選択培地に切り替える。組換えプラスミド内の選択性マーカーが選択に対する耐性を与え、細胞はそのプラスミドを細胞の染色体に安定に組み込むことができ、増殖してフォーカスを形成する。次いでこれをクローン化し、細胞系に拡張することができる。この方法は、目的ＮＧＰＣＲ生成物を発現する細胞系を工学的に作成するのに有利に使用できる。このような工学的に作成した細胞系は、ＮＧＰＣＲ遺伝子生成物の内因活性に影響を与える化合物のスクリーニングおよび評価に特に有用である。
【００７３】
多数の選択系を使用でき、これには下記のものが含まれるが、これらに限定されない：単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９７７，Ｃｅｌｌ，１１：２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，１９６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４８：２０２６）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ，２２：８１７）遺伝子を、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞に使用できる。代謝拮抗物質耐性を下記の遺伝子の選択の基礎として用いることもできる：ｄｈｆｒ、これはメトトレキセートに対する耐性を与える（Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：３５６７；Ｏ’Ｈａｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：１５２７）；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸に対する耐性を与える（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：２０７２）；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与える（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１）；およびｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンに対する耐性を与える（Ｓａｎｔｅｒｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｇｅｎｅ，３０：１４７）。
【００７４】
あるいは、発現する融合タンパク質に特異的な抗体を利用することにより、いかなる融合タンパク質も容易に精製できる。たとえばそのような１つの系は、ヒト細胞系において発現した非変性融合タンパク質を容易に精製できる（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８９７２−８９７６）。この系では、目的遺伝子をそのオープンリーディングフレームが翻訳可能な状態で６ヒスチジン残基からなるアミノ末端タグに融合するように、ワクシニア組換えプラスミド内へサブクローニングする。組換えワクシニアウイルスを感染させた細胞からの抽出物をＮｉ２＋・ニトリロ酢酸−アガロースカラムに装填し、ヒスチジンタグ付きタンパク質をイミダゾール含有緩衝液で選択的に溶離する。
【００７５】
本発明には、ＮＧＰＣＲをターゲット臓器へ向かわせ、および／または膜を透過して細胞質ゾル内への輸送を促進する融合タンパク質が含まれる。抗体分子またはそのＦａｂフラグメントへのＮＧＰＣＲの結合は、特定のエピトープを保有する細胞をターゲティングするのに利用できる。適切なシグナル配列をＮＧＰＣＲに結合させると、ＮＧＰＣＲを細胞内の目的位置へ輸送することもできる。あるいは、ＮＧＰＣＲまたはそれらの核酸配列のターゲティングは、リポソームまたは脂質複合体をベースとする送達系を用いて達成することもできる。そのような技術は、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｎｅｗ  ＲＲＣ編、オックスフォード大学出版社、ニューヨーク、およびＵＳＰ４，５９４，５９５、５，４５９，１２７、５，９４８，７６７および６，１１０，４９０に記載されており、それらの各開示内容全体を本明細書に援用する。更に本発明には、新規なタンパク質構築体であって、ＮＧＰＣＲが細胞膜および／または核を透過し、その機能を発揮するターゲット部位あるいは目的臓器へのＮＧＰＣＲの輸送を容易にするように作成したものも包含される。この目標は、ＮＧＰＣＲのターゲティング特異性を与えるサイトカインあるいは他のリガンドとのカップリングによって、および／または細胞膜透過容易にするためにタンパク形質導入ドメイン（そのような形質導入配列の例として米国特許出願６０／１１１，７０１および６０／０５６，７１３を参照。これらを参照として本明細書に援用する。）とＮＧＰＣＲをカップリングすることにより達成され、および／または選択的に一つ又はそれ以上の核局在化シグナルを含むように作成することができる。
【００７６】
５．３  ＮＧＰＣＲタンパク質に対する抗体
１以上のＮＧＰＣＲのエピトープ、またはＮＧＰＣＲの保存変異体のエピトープ、またはＮＧＰＣＲのペプチドフラグメントを特異的に認識する抗体も、本発明に包含される。そのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、および前記のいずれかのエピトープ結合性フラグメントが含まれるが、それらに限定されない。
【００７７】
本発明の抗体は、たとえば生物試料中のＮＧＰＣＲの検出に使用でき、したがって患者を一つ又はそれ以上のＮＧＰＣＲの異常な量について調べる診断法または予後判定法の一部として使用できる。そのような抗体を、たとえば化合物スクリーニング法（下記参照）と組み合わせて、ＮＧＰＣＲ発現または遺伝子生成物の発現および／または活性に対する被験化合物の作用を評価するのにも利用できる。さらに、そのような抗体を遺伝子療法と組み合わせて用い、たとえば正常な、および／または工学的に処理したＮＧＰＣＲ発現細胞を患者に導入する前に評価することができる。そのような抗体をさらに、異常ＮＧＰＣＲ活性の阻害のために使用できる。したがって、そのような抗体を様々な治療処方、たとえば腎臓疾患、消化疾患、不妊、血圧異常、および／または体重障害の治療処方の一部として利用できる。
【００７８】
抗体産生のためには、ＮＧＰＣＲ、一つ又はそれ以上のＮＧＰＣＲペプチド（たとえばこの受容体の機能性ドメイン、ＥＣＤ、ＴＭまたはＣＤに対応するもの）、トランケートＮＧＰＣＲポリペプチド（１以上のドメイン、たとえばＴＭまたはＣＤが欠失したＮＧＰＣＲ）、ＮＧＰＣＲの機能均等物、またはＮＧＰＣＲの変異配列を注射することにより、種々の宿主動物を免疫化することができる。数例を挙げると、そのような宿主動物にはウサギ、マウスおよびラットが含まれるが、これらに限定されない。宿主の種に応じて、免疫応答を高めるために種々のアジュバントを使用でき、これにはフロイントアジュバント（完全および不完全）、鉱物塩、たとえば水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム、、キトサン、界面活性物質、たとえばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルション、ならびに潜在的に有用なヒトアジュバント、たとえばＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、キーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、破傷風毒素、ジフテリア毒素、卵アルブミン、コレラ毒素、またはそのフラグメントなどの分子との組合わせおよび／または結合により免疫応答を高めることができる。ポリクローナル抗体は免疫化動物の血清から得られる不均一な抗体分子集団である。
【００７９】
特定の抗原に対する均一な抗体集団であるモノクローナル抗体は、連続した培養細胞系により抗体分子を産生するいかなる方法によっても得ることができる。これらには下記の方法が含まれるが、これらに限定されない：ハイブリドーマ法（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７；およびＵＳＰ４，３７６，１１０）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｓｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４：７２；Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２０２６−２０３０）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ社，ｐｐ．７７−９６）。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそのいずれかのサブクラスを含めた、いかなる免疫グロブリンクラスであってもよい。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマをインビトロまたはインビボで培養することができる。インビボで高力価のｍＡｂを産生できるので、これは現在好ましい産生方法である。
【００８０】
さらに、”キメラ抗体”（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：４５２−４５４）の産生のために開発された、適切な抗原特異性をもつマウス抗体分子からの遺伝子を適切な生物学的活性をもつヒト抗体分子からの遺伝子とスプライシングすることによる方法を使用できる。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子、たとえばネズミｍＡｂ由来の可変部とヒト免疫グロブリン定常部をもつものである。その技術は、米国特許第６，０７５，１８１および５，８７７，３９７に記載されており、それらの全体を本明細書に参照として援用する。同様に好ましいのは、米国特許６，１５０，５８４に記載されている完全人化モノクローナル抗体の使用であり、相当する開示の全体を参照として本明細書に援用する。
【００８１】
あるいは、一本鎖抗体の産生のために記載された方法（ＵＳＰ４，９４６，７７８；Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３；およびＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４−５４６）を、ＮＧＰＣＲペプチド、ポリペプチドおよび／またはタンパクに対する一本鎖抗体の産生に適合させることができる。一本鎖抗体は、Ｆｖ部のＨ鎖およびＬ鎖フラグメントをアミノ酸橋により結合させ、一本鎖ポリペプチドにすることにより形成される。
【００８２】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、既知の方法で形成できる。たとえばそのようなフラグメントには、抗体分子のペプシン消化により調製できるＦ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド橋を還元することにより調製できるＦａｂフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して（Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１）、目的とする特異性をもつモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速かつ容易に同定することができる。
【００８３】
次いでＮＧＰＣＲに対する抗体を、当業者に周知の方法を用いて、与えられたＮＧＰＣＲを”模倣”した抗イディオタイプ抗体を産生させるために使用することができる（たとえばＧｒｅｅｎｓｐａｎ  ＆  ａｎｄ  Ｂｏｎａ，１９９３，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７：４３７−４４４；およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：２４２９−２４３８参照）。たとえば、ＮＧＰＣＲ  ＥＣＤに結合してＮＧＰＣＲのリガンドが結合するのを競合阻害する抗体を用いて、ＮＧＰＣＲ  ＥＣＤを”模倣”する、したがってリガンドに結合して中和する抗イディオタイプ抗体を産生させることができる。そのような中和性の抗イディオタイプ抗体またはそのような抗イディオタイプ抗体のＦａｂフラグメントは、ＮＧＰＣＲシグナリング経路を伴う療法に使用できる。
【００８４】
さらに与えられた哺乳動物ＮＧＰＣＲの高い関連性により、前記（特定のＮＧＰＣＲを有しておらず、該ＮＧＰＣＲに対して寛容でない）ノックアウトマウスはユニークな有用性を有し、該ノックアウトマウスは前記哺乳動物ＮＧＰＣＲに対する抗体生成に有益に適用することができる（すなわち、ＮＧＰＣＲはＮＧＰＣＲノックアウト動物において免疫原となる）。
【００８５】
５．４  ＮＧＰＣＲに関連する異常性の診断
ＮＧＰＣＲ機能関連障害の診断および予後評価、ならびにそのような障害の素因をもつ対象の確認のために、多様な方法を採用できる。
【００８６】
そのような方法は、たとえばセクション５．１に記載したＮＧＰＣＲヌクレオチド配列、および／またはセクション５．３に記載したＮＧＰＣＲ抗体などの試薬を利用できる。具体的には、そのような試薬を、たとえば下記のために使用できる：（１）ＮＧＰＣＲ遺伝子変異の存在の検出、または特定の（すなわち、通常の）表現型に関するＮＧＰＣＲ  ｍＲＮＡの発現過剰もしくは発現不足の検出；（２）特定の（すなわち、通常の）表現型に関するＮＧＰＣＲ遺伝子生成物の過剰もしくは不足の検出；および（３）ＮＧＰＣＲが仲介する信号伝達経路における撹乱または異常の検出。
【００８７】
本明細書に記載する方法は、たとえば本明細書に記載する少なくとも１つの特異的ＮＧＰＣＲヌクレオチド配列および／またはＮＧＰＣＲ抗体試薬を含むプレパッケージ診断用キットを用いて行うことができ、これをたとえば臨床下で、腎臓疾患、消化疾患、不妊、血圧異常、および／または体重異常障害などの医療的障害または異常を示している患者の診断に簡便に使用できる。
【００８８】
ＮＧＰＣＲ変異を検出するために、ゲノム核酸の出発源として任意の成核細胞を使用できる。ＮＧＰＣＲ遺伝子発現またはＮＧＰＣＲ遺伝子生成物を検出するためには、ＮＧＰＣＲ遺伝子が発現する任意の細胞タイプまたは組織を使用できる。
【００８９】
核酸ベースの検出法およびペプチド検出法を詳細に以下に記載する。
【００９０】
５．４．１ＮＧＰＣＲ遺伝子および転写体の検出
ＮＧＰＣＲ遺伝子またはヌクレオチド配列内の変異は、多数の方法で検出できる。任意の成核細胞に由来する核酸をそのようなアッセイ法の出発点として使用でき、当業者に周知の標準核酸調製法に従って単離できる。
【００９１】
点変異、挿入、欠失および染色体再配列を含めたＮＧＰＣＲ遺伝子構造に関する異常を検出するために、生物試料のハイブリダイゼーションアッセイまたは増幅アッセイにＤＮＡを使用できる。そのようなアッセイ法には、サザン分析、一本鎖コンホメーション多型分析（ＳＳＣＰ）、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ、ＵＳＰ５，２７２，０５７に一般的に記載されている。該特許を本明細書に参照として援用する。）、一塩基多型（ｃｏｄｉｎｇ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）およびＰＣＲ分析が含まれるが、これらに限定されない。
【００９２】
ＮＧＰＣＲ遺伝子特異性変異を検出するためのそのような診断法はたとえば、患者試料または他の適切な細胞源に由来する試料から得た、組換えＤＮＡ分子、クローン化遺伝子、またはその縮重変異体を含めた核酸を、セクション５．１に記載した組換えＤＮＡ分子、クローン化遺伝子、またはその縮重変異体を含めた１以上の標識核酸試薬と、これらの試薬がＮＧＰＣＲ遺伝子または配列内のそれらの相補配列に特異的にアニールするのに好ましい条件下で、たとえば接触およびインキュベートすることを伴う。好ましくは、これらの核酸試薬の長さは少なくとも１５〜３０ヌクレオチドである。インキュベーション後、核酸：ＮＧＰＣＲ分子ハイブリッドから、アニールしていない核酸をすべて除去する。次いでハイブリダイズした核酸の存在（そのような分子が存在する場合）を検出する。このような検出方式を用いて、目的とする細胞タイプまたは組織に由来する核酸を、たとえば膜またはプラスチック表面（マイクロタイタープレートまたはポリスチレンビーズの表面など）などの固体支持体に固定化することができる。そのような場合、インキュベーション後、セクション５．１に記載したタイプのアニールしていない標識核酸試薬は容易に除去される。残りのアニールした標識ＮＧＰＣＲ核酸試薬の検出は、当業者に周知の標準法によって容易に行われる。ＮＧＰＣＲ変異の有無を判定するために、核酸試薬がアニールしたＮＧＰＣＲ配列を、正常なＮＧＰＣＲ配列から予想されるアニーリングパターンと比較することができる。
【００９３】
患者試料または他の適切な細胞源中のＮＧＰＣＲ遺伝子特異的核酸分子を検出するための別の診断法は、それらをたとえばＰＣＲにより増幅させ（実験様式はＵＳＰ４，６８３，１９５、４，６８３，２０２および４，８００，１５９に述べられている。それらの全体を本明細書に援用する。）、次いで増幅分子を当業者に周知の方法で検出することを伴う。ＮＧＰＣＲ遺伝子変異の有無を判定するために、得られた増幅配列を、増幅核酸が正常なＮＧＰＣＲ遺伝子コピーのみを含有していた場合に予想されるものと比較することができる。
【００９４】
さらに、周知の遺伝子型判定法を実施して、ＮＧＰＣＲ遺伝子変異をもつ個体を確認できる。そのような方法には、たとえば制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）の採用が含まれる。これは、用いる特異的制限酵素に対する認識部位の１つにおける配列の相違を伴うものである。
【００９５】
さらに、ＮＧＰＣＲ遺伝子変異の確認に利用できる改良されたＤＮＡ多型分析法の記載があり、これは制限酵素部位間にある、個数の変動する短鎖縦列反復ＤＮＡ配列の存在を利用する。たとえばＷｅｂｅｒ（ＵＳＰ５，０７５，２１７、その全体を参考として本明細書に援用する）は、（ｄＣ−ｄＡ）ｎ（ｄＧ−ｄＴ）ｎ短鎖縦列反復配列ブロック中の断片長多型に基づくＤＮＡマーカーを記載している。（ｄＣ−ｄＡ）ｎ（ｄＧ−ｄＴ）ｎブロックの平均距離は３０，０００〜６０，０００ｂｐであると推定される。このように近接したマーカーは高頻度の同時遺伝（ｃｏ−ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ）を示し、遺伝子変異、たとえばＮＧＰＣＲ遺伝子内の変異の確認、ならびにＮＧＰＣＲ変異に関連する疾病および障害の診断にきわめて有用である。
【００９６】
Ｃａｓｋｅｙら（ＵＳＰ５，３６４，７５９、その全体を参考として本明細書に援用する）も、短い３および４ヌクレオチド反復配列を検出するためのＤＮＡプロファイリングアッセイを記載している。この方法は、目的とするＤＮＡ、たとえばＮＧＰＣＲ遺伝子を抽出し、抽出したＤＮＡを増幅させ、反復配列を標識してその個体のＤＮＡの遺伝子型地図を作成することを含む。
【００９７】
ＮＧＰＣＲ遺伝子発現レベルも、ＮＧＰＣＲ転写の検出および測定によりアッセイできる。たとえばＮＧＰＣＲ遺伝子を発現することが分かっているかまたは推測される細胞タイプまたは組織からＲＮＡを単離し、本明細書記載のようなハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法により検査することができる。単離細胞は細胞培養物または患者に由来するものであってよい。培養物から採取した細胞の分析は、細胞ベースの遺伝子療法の一部として用いる細胞を評価するのに、または化合物がＮＧＰＣＲ遺伝子の発現に与える影響を調べるために、必要な工程であろう。そのような分析により、ＮＧＰＣＲ遺伝子の発現パターンの量的および質的観点（ＮＧＰＣＲ遺伝子発現の活性化または不活性化を含む）を共に明らかにすることができる。
【００９８】
そのようなＮＧＰＣＲ検出方式の１態様においては、目的とするＲＮＡからｃＤＮＡを合成する（たとえばＲＮＡ分子からｃＤＮＡへの逆転写による）。次いでｃＤＮＡ内の配列を核酸増幅反応、たとえばＰＣＲ増幅反応などの鋳型として用いる。この方法の逆転写工程および核酸増幅工程に合成開始試薬として用いる核酸試薬（たとえばプライマー）は、セクション５．１に記載したＮＧＰＣＲ核酸試薬から選ばれる。このような核酸試薬の好ましい長さは、少なくとも約９〜３０ヌクレオチドである。増幅生成物の検出のために、放射性または非放射性標識ヌクレオチドを用いて核酸増幅を行うことができる。あるいは、標準的な臭化エチジウム染色法、または他のいずれかの適切な核酸染色法、または配列決定法により、生成物を視覚化できるのに十分な増幅生成物を調製することができる。
【００９９】
さらに、そのようなＮＧＰＣＲ遺伝子発現アッセイを”ｉｎ  ｓｉｔｕ”で、すなわち生検または切除により得た患者組織の組織切片（固定および／または凍結したもの）について直接に行うことができ、したがって核酸精製は必要ない。上に記載したような核酸試薬を、そのようなｉｎ  ｓｉｔｕ法のプローブおよび／またはプライマーとして使用できる（たとえばＮｕｏｖｏ，Ｇ．Ｊ．，１９９２，”ＰＣＲ  Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，参照）。
【０１００】
あるいは、十分な量の適切な細胞を得ることができれば、標準ノーザン分析を行って、ＮＧＰＣＲのｍＲＮＡ発現レベルを測定できる。
【０１０１】
さらに、ＮＧＰＣＲオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列は、固体支持マトリックス／基板（たとえば樹脂、ビーズ、膜、プラスチック、ポリマー、金属または金属基板、遺伝子チップ、および結晶おるいは多結晶基板など）に結合させ、ハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。
【０１０２】
５．４．２  ＮＧＰＣＲ生成物の検出
上記で考察した、野生型もしくは変異ＮＧＰＣＲ生成物に対して、またはその保存変異体もしくはペプチドフラグメントに対して形成された抗体も、本明細書に記載するように診断および予後判定に使用できる。そのような診断法は、ＮＧＰＣＲ遺伝子発現レベルの異常、あるいはＮＧＰＣＲの構造の異常、および／または時間的、組織、細胞もしくは細胞下でのＮＧＰＣＲの存在位置の異常を検出するのに使用でき、たとえば生検組織についてインビボまたはインビトロで実施できる。
【０１０３】
たとえばＮＧＰＣＲ  ＥＣＤのエピトープに対する抗体をインビボで用いて、体内でのＮＧＰＣＲ発現のパターンおよびレベルを検出できる。体内で発現したＮＧＰＣＲへの結合をＸ線、ＣＡＴ−走査またはＭＲＩなどの方法で視覚化するために、そのような抗体を、たとえば放射線不透過性化合物その他の適切な化合物で標識し、被験者に注射することができる。抗原結合領域の最小部分を含む標識抗体フラグメント、たとえばＦａｂまたは一本鎖抗体が、この目的で、血液−脳関門の通過を促進し、脳で発現したＮＧＰＣＲの標識を可能にするために好ましい。
【０１０４】
さらに、その存在を検出できるＮＧＰＣＲ融合タンパク質またはＮＧＰＣＲ結合タンパク質を投与してもよい。たとえば放射線不透過性化合物その他の適切な化合物で標識したＮＧＰＣＲ融合タンパク質またはＮＧＰＣＲ結合タンパク質を投与し、標識抗体について前記に述べたようにインビボで視覚化することができる。さらに、そのようなＮＧＰＣＲ融合タンパク質（たとえばアルカリホスファターゼ−ＮＧＰＣＲまたはＮＧＰＣＲ−アルカリホスファターゼ融合タンパク質）をインビトロ診断法に利用できる。
【０１０５】
あるいは、前記の免疫アッセイまたは融合タンパク質検出アッセイをインビトロで生検試料および切除試料に利用して、ＮＧＰＣＲ発現パターンを評価することができる。そのようなアッセイ法はＮＧＰＣＲ  ＥＣＤを規定する抗体の使用に限定されず、ＮＧＰＣＲの任意のドメイン、たとえばＥＣＤ、ＴＭおよび／またはＣＤのエピトープに対する抗体の使用も含めることができる。これらの標識抗体それぞれ、または全部を用いることにより、ＮＧＰＣＲの翻訳および細胞表面への細胞内輸送に関する有用な情報が得られ、プロセシングの欠陥を確認することができる。
【０１０６】
分析する組織または細胞タイプには、一般にＮＧＰＣＲ遺伝子を発現することが分かっているかまたは推定されるものが含まれる。本発明に用いるタンパク質単離法は、すでに文献に記載されたもの、たとえば（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８，上述）であってもよい。単離細胞は細胞培養物または患者に由来するものであってよい。培養物から採取した細胞の分析は、細胞ベースの遺伝子療法の一部として使用できる細胞を評価するのに、あるいは化合物がＮＧＰＣＲ遺伝子の発現に与える作用を調べるために、必要な工程であろう。
【０１０７】
たとえば、セクション５．３に記載した本発明に有用な抗体または抗体フラグメントを用いて、ＮＧＰＣＲ生成物またはその保存変異体もしくはペプチドフラグメントの存在を定量的および定性的に検出することができる。これはたとえば、光学顕微鏡、フローサイトメトリーまたは蛍光測定検出と連結した、蛍光標識抗体を用いる免疫蛍光法（このセクションの後記参照）により行うことができる。このような方法は、そのようなＮＧＰＣＲ遺伝子生成物が少なくとも一時的に細胞表面に発現する場合、特に好ましい。
【０１０８】
本発明に有用な抗体（またはそのフラグメント）またはＮＧＰＣＲ融合もしくは結合タンパク質はさらに、組織学的に、免疫蛍光、免疫電子顕微鏡または非免疫アッセイ法において、ＮＧＰＣＲ遺伝子生成物またはその保存変異体もしくはペプチドフラグメントのｉｎ  ｓｉｔｕ検出に、あるいはＮＧＰＣＲ結合のアッセイに（標識ＮＧＰＣＲ−リガンド融合タンパク質の場合）使用できる。
【０１０９】
ｉｎ  ｓｉｔｕ検出は、患者から組織検体を摘出し、それに本発明の標識抗体または融合タンパク質を付与することにより行うことができる。抗体（またはフラグメント）または融合タンパク質は、生物試料に標識抗体（またはフラグメント）を積層することにより付与するのが好ましい。このような方法を用いることにより、ＮＧＰＣＲ生成物または保存変異体もしくはペプチドフラグメントの存在、あるいはＮＧＰＣＲの結合だけでなく、被験組織におけるＮＧＰＣＲの分布をも測定することができる。本発明を用いて多様な組織学的方法（たとえば染色法）をこのようなｉｎ  ｓｉｔｕ検出の達成のために改変しうることは、当業者に自明であろう。
【０１１０】
ＮＧＰＣＲ遺伝子生成物またはその保存変異体もしくはペプチドフラグメントの免疫アッセイ法および非免疫アッセイ法は、一般に試料、たとえば生物学的流体、組織抽出物、採取したばかりの細胞、または細胞溶解物（細胞培養においてインキュベートしたもの）を、ＮＧＰＣＲ遺伝子生成物またはその保存変異体もしくはペプチドフラグメントを同定しうる検出可能な標識抗体の存在下でインキュベートし、結合した抗体を当技術分野で周知の多数の方法のいずれかで検出することを含む。
【０１１１】
細胞、細胞粒子または可溶性タンパク質を固定化しうる固相支持体またはキャリヤー、たとえばニトロセルロースまたは他の固体支持体に、生物試料を接触させて固定化してもよい。次いで支持体を適切な緩衝液で洗浄した後、検出可能な状態に標識したＮＧＰＣＲ抗体またはＮＧＰＣＲリガンド融合タンパク質で処理する。次いで固相支持体を緩衝液で再度洗浄して、結合していない抗体または融合タンパク質を除去する。次いで固体支持体に残存する結合した標識の量を、常法により検出することができる。
【０１１２】
”固相支持体またはキャリヤー”とは、抗原または抗体に結合しうるいかなる支持体をも表すものとする。周知の支持体またはキャリヤーには、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑れい岩（ｇａｂｂｒｏ）および磁鉄鉱が含まれるがそれらに限定されない。本発明の目的には、キャリヤーの性質はある程度可溶性であるか、あるいは不溶性であってよい。支持体材料は、結合分子が抗原または抗体に結合しうる限り、実質的に任意の可能な構造形状をもつことができる。たとえば支持体の形状は、ビーズのような球状、または試験管の内面もしくは棒の外面のような円筒形であってもよい。あるいは、表面がシート、試験片などのように平坦であってもよい。好ましい支持体には、ポリスチレンビーズが含まれる。当業者には抗体または抗原を結合させるのに適した他の多数のキャリヤーが知られており、またはルーティン実験によりこれらを確認することができる。
【０１１３】
あるロットのＮＧＰＣＲ抗体またはＮＧＰＣＲリガンド融合タンパク質の結合活性は、周知の方法で測定できる。当業者は、ルーティン実験を用いて各測定に有効かつ最適なアッセイ条件を判定できるであろう。
【０１１４】
抗体に関して、ＮＧＰＣＲ抗体を検出可能な状態に標識できる方法の１つは、これを酵素に結合させ、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）に用いるものである（Ｖｏｌｌｅｒ，１９７８，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ，２：１−７，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，メリーランド州ウォーカースビル；Ｖｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，３１：５０７−５２０；Ｂｕｔｌｅｒ，１９８１，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３：４８２−５２３；Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（編），１９８０，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，フロリダ州Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ；およびＩｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（編），１９８１，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，化学書院，東京）。抗体に結合した酵素を、分光測光法、蛍光測定法または視覚的手段で検出できる部分を生じるように、適切な基質、好ましくは色素原基質と反応させる。抗体を検出可能な状態に標識するために使用できる酵素には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：マレイン酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ。検出は、酵素に対する色素原基質を用いる比色法により行うことができる。検出は、基質の酵素反応の程度を同様に調製した標準品と対比する視覚的比較により行うこともできる。
【０１１５】
検出は、他の多様な免疫アッセイ法のいずれかを用いて行うこともできる。たとえば抗体または抗体フラグメントを放射性標識することにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いてＮＧＰＣＲを検出できる（たとえばＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９８６年３月，参照，これを参考として本明細書に援用する）。放射性同位体は、ガンマ計数器、シンチレーション計数器の使用またはオートラジオグラフィーなどの手段で検出できる。
【０１１６】
抗体を蛍光化合物で標識することもできる。蛍光標識抗体を適正な波長の光で照射すると、蛍光によりその存在を検出できる。最も一般的に用いられる蛍光標識用化合物には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレサミンがある。
【０１１７】
抗体を、蛍光発光金属、たとえば１５２Ｅｕまたはランタニド系列の他の金属で、検出可能な状態に標識することもできる。これらの金属を、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート化基で抗体に結合させることができる。
【０１１８】
抗体を、化学発光化合物に結合させることにより、検出可能な状態に標識することもできる。次いで化学反応中に生じる発光の存在を検出することにより、化学発光−タグ付き抗体の存在を判定する。特に有用な化学発光標識用化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマチック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。
【０１１９】
同様に生物発光化合物を用いて本発明の抗体（またはそれらのフラグメント）を標識することができる。生物発光は生物系にみられるタイプの化学発光であり、この場合は触媒タンパク質が化学発光反応の効率を高める。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することにより判定できる。標識のために重要な生物発光化合物はルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリン（グリーン蛍光タンパクおよびそれらの変異体：ＵＳＰ５，４９１，０８４、５，６２５，０４８、５，７７７，０７９、５，７９５，７３７、５，８０４，３８７、５，８７４，３０４、５，９６８，７５０、５，９７６，７９６、６，０２０，１９２、６，０２７，８８１、６，０５４，３２１、６，０９６，８６５、６，１４６，８２６、６，１７２，１８８および６，２６５，５４８に記載されており、それらを参照として本明細書に援用する。）である。
【０１２０】
５．５  ＮＧＰＣＲの発現または活性を調節する化合物のスクリーニングアッセイ
以下のアッセイ法は、ＮＧＰＣＲ（ＮＧＰＣＲのＥＣＤまたはＣＤが含まれるが、これらに限定されない）と相互作用する（たとえば結合する）化合物、ＮＧＰＣＲ（ＮＧＰＣＲのＥＣＤまたはＣＤが含まれが、これらに限定されない）と相互作用するタンパク質、ＮＧＰＣＲ仲介による信号伝達に関与する膜貫通または細胞内タンパク質とＮＧＰＣＲの相互作用を妨害する化合物、およびＮＧＰＣＲ遺伝子の活性を調節する（すなわちＮＧＰＣＲ遺伝子発現レベルを調節する）か、またはＮＧＰＣＲのレベルを調節する化合物の同定のために設計されたものである。さらに、ＮＧＰＣＲ遺伝子調節配列（たとえばプロモーター配列）に結合してＮＧＰＣＲ遺伝子発現を調節する化合物を同定するアッセイ法も使用できる（たとえばＰｌａｔｔ，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：２８５５８−２８５６２参照；その全体を本明細書に援用する）。
【０１２１】
本発明によりスクリーニングできる化合物には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：ペプチド、抗体およびそのフラグメント、ならびに他の有機化合物（たとえばペプチド模倣体）であって、ＮＧＰＣＲのＥＣＤに結合して天然リガンドが開始させる活性を模倣するもの（すなわちアゴニスト）または天然リガンドが開始させる活性を阻害するもの（すなわちアンタゴニスト）；ＮＧＰＣＲのＥＣＤ（またはその一部）を模倣し、天然リガンドに結合して”中和”する、ペプチド、抗体およびそのフラグメント、ならびに他の有機化合物。
【０１２２】
そのような化合物には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：ペプチド、たとえば可溶性ペプチド、これには下記のものが含まれるが、これらに限定されない：ランダムペプチドライブラリー（たとえばＬａｍ，ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２−８４；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８４−８６参照）；以下のものからなるコンビナトリアルケミストリー由来の分子ライブラリー：Ｄ−および／またはＬ−立体配置のアミノ酸、ホスホペプチド（ランダムまたは部分変性同義（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）、指向性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ホスホペプチドライブラリーが含まれるが、これらに限定されない；たとえばＳｏｎｇｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｃｅｌｌ，７２：７６７−７７８参照）、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラまたは一本鎖抗体、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂＮ）２およびＦａｂ発現ライブラリーのフラグメント、ならびにそのエピトープ結合性フラグメントが含まれるが、これらに限定されない）、および小型の有機または無機分子。
【０１２３】
本発明によりスクリーニングできる他の化合物には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：血液−脳関門を通過して適切な細胞（たとえば小脳、視床下部など）に侵入し、ＮＧＰＣＲ遺伝子もしくはＮＧＰＣＲ信号伝達経路に関与する他のいずれかの遺伝子の発現に影響を与える（たとえば遺伝子発現に関与する調節領域または転写因子との相互作用により）ことができる小型の有機分子；またはＮＧＰＣＲの活性に影響を与える（たとえばＣＤの酵素活性を阻害または増強することにより）か、もしくはＮＧＰＣＲ信号伝達経路に関与する他のいずれかの細胞内因子の活性に影響を与える化合物。
【０１２４】
コンピューターによるモデリングおよび探索法により、ＮＧＰＣＲの発現または活性を調節しうる化合物の同定、または既に同定されている化合物の改良を行うことができる。そのような化合物または組成物が同定されると、活性部位または領域が同定される。そのような活性部位は一般にリガンド結合部位である可能性がある。活性部位は当技術分野で既知の方法により、たとえばペプチドのアミノ酸配列から、核酸のヌクレオチド配列から、または関連化合物もしくは組成物とそのリガンドとの複合体の研究から同定できる。後者の場合、化学的方法またはＸ線結晶学的方法を用いてその因子上の複合体形成リガンドがある位置を見いだすことにより、活性部位を見いだすことができる。
【０１２５】
次いで活性部位の三次元幾何学的構造を決定する。これは完全分子構造を決定できる既知の方法で行うことができ、これにはＸ線結晶学的方法が含まれる。他方、固相または液相ＮＭＲを用いて、特定の分子内距離を決定できる。構造決定のための他の任意の実験法を用いて、部分的または完全な幾何学的構造を求めることができる。幾何学的構造は複合体形成した天然または合成リガンドを用いて判定することもでき、これは判定した活性部位構造の精度を高める。
【０１２６】
判定した構造の精度が不完全または不十分である場合、その構造を完成させ、またはその精度を高めるために、コンピューターベースの数値モデリング法を採用できる。認識されている任意のモデリング法を採用でき、これには特定の生体ポリマー（タンパク質または核酸など）に特異的なパラメター化モデル、分子運動のコンピューター処理に基づく分子動態モデル、サーマルアンサンブルに基づく統計学的機構モデル、または混合モデルが含まれる。大部分のタイプのモデルについて構成原子間および基間の力を表す標準分子力場が必要であり、これは物理化学において既知の力場から選択できる。実験で得た不完全なまたは精度の低い構造は、そのようなモデリング法によるコンピューター処理で得た、より完全かつ正確な構造に対する拘束となる可能性がある。
【０１２７】
活性部位の構造を実験、モデリングまたはそれらの組合わせにより決定した後、化合物を含むデータベースをそれらの分子構造についての情報と合わせて検索することにより、候補となる調節化合物を同定できる。このような検索により、決定した活性部位構造と調和し、かつ活性部位を規定する基と相互作用する構造をもつ化合物を求める。このような検索は手動で行うこともできるが、好ましくはコンピューター支援による。そのような検索で見いだした化合物は潜在ＮＭＲ調節化合物である。
【０１２８】
あるいはこれらの方法を用いて、既知の調節化合物またはリガンドから改良された調節化合物を同定できる。新規組成に適用した前記の実験的方法およびコンピューターモデリング法を用いて既知化合物の組成を修飾し、修飾の構造効果を判定できる。次いで変更した構造を化合物の活性部位構造と比較して、調和または相互作用が改良されたかどうかを判定する。この方法でたとえば側鎖基の変更による系統的な組成変化を迅速に評価して、改良された特異性または活性をもつ修飾された調節化合物を得ることができる。
【０１２９】
さらに、ＮＧＰＣＲならびに関連のトランスダクション因子および転写因子の活性部位の同定に基づく、調節化合物の同定に有用な他の実験的方法およびコンピューターモデリング法は、当業者に自明であろう。
【０１３０】
分子モデリングシステムの例は、ＣＨＡＲＭＭおよびＱＵＡＮＴＡプログラム（Ｐｏｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチュセッツ州ウォルサム）である。ＣＨＡＲＭＭはエネルギー最小化および分子動態の機能をもち、一方、ＱＵＡＮＴＡは分子構造の構築、グラフモデリングおよび分析を行う。ＱＵＡＮＴＡは、分子相互の行動の相互構築、修飾、視覚化および分析を行うことができる。
【０１３１】
多数の報文に特定のタンパク質と相互作用する薬物のコンピューターモデリングについて概説されている：たとえばＲｏｔｉｖｉｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｅｎｎｉｃａ，９７：１５９−１６６；Ｒｉｐｋａ，Ｎｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，５４−５７（１９８８年６月１６日）；ＭｃＫｉｎａｌｙ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｍａｎｎ，１９８９，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｉｏｌ．，２９：１１１−１２２；Ｐｅｒｒｙ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｅｓ，ＯＳＡＲ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｒａｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，ｐｐ．１８９−１９３（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ社，１９８９）；Ｌｅｗｉｓ  ａｎｄ  Ｄｅａｎ，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．，２３６：１２５−１４０および１４１−１６２；ならびに核酸成分に対するモデル受容体に関してはＡｓｋｅｗ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１１：１０８２−１０９０。化学物質をスクリーニングしてグラフ表示する他のコンピュータープログラムを、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ社（カリフォルニア州パサデナ）、Ａｌｌｅｌｉｘ社（カナダ国オンタリオ州ミシソーガ）およびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ社（オンタリオ州ケンブリッジ）などの会社から入手できる。これらは主に特定のタンパク質に特異的な薬物に適用するために設計されているが、領域が同定されればＮＧＰＣＲあるいはＮＧＰＣＲのＤＮＡまたはＲＮＡの領域に特異的な薬物の設計にも適用できる。
【０１３２】
結合を変化させる化合物の設計および生成に関して前記に述べたが、既知化合物のライブラリーをスクリーニングすることもできる。これには、天然または合成の化学物質、およびタンパク質などの生物活性物質をスクリーニングして、阻害薬または活性化薬を求めることが含まれる。
【０１３３】
ＮＧＰＣＲに結合する化合物を同定し、生細胞内でそのような結合に伴って変化する活性を評価するために、細胞ベースの系も使用できる。そのようなアッセイに特に有用な道具の１つは緑色蛍光タンパク質であり、これはたとえば特にＵＳＰ５，６２５，０４８に記載されており、これを本明細書に援用する。そのような細胞アッセイに使用できる細胞には白血球、または白血球由来の細胞系、リンパ球、幹細胞（胚性幹細胞を含む）などが含まれるが、これらに限定されない。さらに、目的の機能性ＮＧＰＣＲを発現して被験リガンドまたは天然リガンドによる活性化に応答するように（化学的変化もしくは表現型の変化により測定）または他の宿主細胞遺伝子の誘導に応答するように遺伝子工学的に処理した発現宿主細胞（たとえばＢ９５細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＯＭＫ細胞、線維芽細胞、Ｓｆ９細胞）を、アッセイの最終点として使用できる。
【０１３４】
５．５．１  ＮＧＰＣＲに結合する化合物のインビトロスクリーニングアッセイ
ＮＧＰＣＲ（ＮＧＰＣＲのＥＣＤまたはＣＤを含むが、これらに限定されない）と相互作用する（たとえば結合する）ことができる化合物を同定するためにインビトロ系を設計できる。同定した化合物は、たとえば野生型および／または変異ＮＧＰＣＲ遺伝子生成物の調節に有用であり；あるいはＮＧＰＣＲの生物学的機能を誘導するのに有用であり；正常なＮＧＰＣＲ相互作用を撹乱する化合物の同定に利用でき；あるいはそれ自体がそのような相互作用を撹乱する。
【０１３５】
ＮＧＰＣＲに結合する化合物の同定に用いるアッセイ法の原理は、ＮＧＰＣＲと被験化合物の反応混合物を調製し、これら２成分が相互作用するのに十分な条件下でそれに十分な時間、結合させるものであり、こうして形成された複合体を分離し、および／または反応混合物中で検出できる。用いるＮＧＰＣＲ種は、スクリーニングアッセイの目標に応じて異なる。たとえば天然リガンドのアゴニストを目的とする場合、全長ＮＧＰＣＲ、または可溶性トランケートＮＧＰＣＲ、たとえばＴＭおよび／またはＣＤを分子から欠失させたもの、ＥＣＤに対応するペプチド、または１以上のＮＧＰＣＲ  ＥＣＤが、アッセイ系に利点をもたらすタンパク質もしくはポリペプチド（たとえば標識、生成複合体の単離など）に融合したものを含む融合タンパク質を使用できる。細胞質ドメインと相互作用する化合物を目的とする場合、ＮＧＰＣＲ  ＣＤに対応するペプチド、またはＮＧＰＣＲ  ＣＤを含む融合タンパク質を使用できる。
【０１３６】
スクリーニングアッセイは多様な方法で実施できる。たとえばそのようなアッセイを実施するための１方法は、ＮＧＰＣＲタンパク質、ポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質、または被験物質を固相に固定し、反応終了時に固相に固定されているＮＧＰＣＲ／被験化合物複合体を検出する。そのような方法の１態様においては、ＮＧＰＣＲ反応体を固相表面に固定し、固定しない被験化合物を直接または間接的に標識する。分子を固定化するのに利用可能な技術のいくつかの例は、Ｃａｓｓ  ｅｄ．“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ中で議論されている。
【０１３７】
実施に際しては、固相としてマイクロタイタープレートを用いるのが好都合である。固定される成分を共有結合または非共有結合のいずれにより固定化してもよい。非共有結合は、固相表面をタンパク質でコーティングし、乾燥させるだけで達成できる。あるいはタンパク質を固体表面に固定するために、固定化すべきタンパク質に特異的な固定化抗体、好ましくはモノクローナル抗体を使用できる。この表面は予め調製して保存しておくことができる。
【０１３８】
アッセイを実施するためには、固定した成分を含有するコーティング面に、固定化されていない成分を添加する。反応終了後、形成された複合体が固体表面に固定化された状態を維持する条件下で、未反応成分を除去（たとえば洗浄による）する。固体表面に固定された複合体の検出は多数の方法で実施できる。先に固定化しない成分を予め標識した場合、表面に固定化された標識が検出されると複合体が形成されたことを示す。先に固定化しない成分を予め標識していなければ、表面に固定された複合体を検出するために間接標識を使用できる。たとえば先に固定化されない成分に特異的な標識抗体を使用する（この抗体を標識抗−Ｉｇ抗体で直接または間接的に標識できる）。
【０１３９】
あるいは反応を液相で実施し、反応生成物を未反応成分から分離し、複合体を検出することができる。検出には、たとえばＮＧＰＣＲタンパク質、ペプチドもしくは融合タンパク質または被験化合物に特異的な、溶液中に形成された複合体を結合させるための固定化抗体、および固定化された複合体を検出するための、可能性のある複合体の他方の成分に特異的な抗体を用いる。
【０１４０】
あるいは細胞ベースのアッセイを用いて、ＮＧＰＣＲと相互作用する化合物を同定することができる。このためには、ＮＧＰＣＲを発現する細胞系、またはＮＧＰＣＲを発現するように遺伝子工学的に処理された（たとえばＮＧＰＣＲ  ＤＮＡの形質転換またはトランスダクションによる）細胞系（たとえばＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、線維芽細胞など）を使用できる。被験化合物と、たとえば宿主細胞が発現したＮＧＰＣＲのＥＣＤとの相互作用を、天然リガンドとの比較または競合により測定できる。
【０１４１】
５．５．２  ＮＧＰＣＲと相互作用する細胞内タンパク質のアッセイ
ＮＧＰＣＲと相互作用する膜貫通タンパク質または細胞内タンパク質の同定のためには、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するのに適した任意の方法を使用できる。使用できる従来法には、細胞溶解物または細胞溶解物およびＮＧＰＣＲから得たタンパク質を免疫共沈法、架橋法、および勾配またはクロマトグラフィーカラムにより同時精製して、ＮＧＰＣＲと相互作用する、細胞溶解物中のタンパク質を同定する方法がある。これらのアッセイに用いるＮＧＰＣＲ成分は、全長ＮＧＰＣＲ、膜固定領域を欠如する可溶性誘導体（たとえばトランケートＮＧＰＣＲ：ＴＭを欠失した結果、ＥＣＤがＣＤに融合したものを含むトランケート分子が生成）、ＮＧＰＣＲのＣＤに対応するペプチドまたはＣＤを含有する融合タンパク質であってよい。細胞内タンパク質が単離されると、これを同定し、次いでそれが相互作用するタンパク質を同定するための標準法と組見合わせて使用できる。たとえば、ＮＧＰＣＲと相互作用する細胞内タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部を、当業者に周知の方法、たとえばエドマン分解法により確認できる（たとえばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，”Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ”，ｐｐ．３４−４９参照，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，ニューヨーク）。得られたアミノ酸配列は、そのような細胞内タンパク質をコードするヌクレオチド配列のスクリーニングに使用できるオリゴヌクレオチド混合物を作製するための指針として採用できる。スクリーニングは、たとえば標準ハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法により実施できる。オリゴヌクレオチド混合物の作製法およびスクリーニング法は周知である（たとえばＡｕｓｕｂｅｌ，前掲；およびＩｎｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．編，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社，ニューヨーク，参照）。
【０１４２】
さらに、ＮＧＰＣＲと相互作用する膜貫通タンパク質または細胞内タンパク質をコードする遺伝子を同時同定する方法を採用できる。これらの方法には、たとえばλｇｔ１１ライブラリーの抗体検査のための周知の方法と同様にして、標識ＮＧＰＣＲタンパク質、あるいはＮＧＰＣＲポリペプチド、ペプチド、または融合タンパク質、たとえばマーカー（たとえば酵素、蛍光タンパク質、発光タンパク質、または色素）もしくはＩｇ−Ｆｃドメインに融合したＮＧＰＣＲポリペプチドもしくはＮＧＰＣＲドメインを用いて、発現ライブラリーを検査する方法が含まれる。
【０１４３】
インビボでタンパク質相互作用を検出する１方法である２ハイブリッドシステム（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ）について詳述するが、これは説明のためのものにすぎず、限定ではない。このシステムの１形式は、酵母細胞を利用し（Ｃｈｉｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：９５７８−９５８２）、他のものは哺乳動物細胞を使用する（Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２２：３５０−３５２）。酵母細胞と哺乳動物細胞の２ハイブリッドシステムはＣｌｏｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州パロ・アルト）から市販されており、さらにＵＳＰ５，２８３，１７３；５，４６８，６１４および５，６６７，９７３に記載されており、それらの全体を本明細書に援用する。
【０１４４】
要約すると、そのようなシステムを用いてハイブリッドタンパク質をコードする２種類のプラスミドを構築する：一方のプラスミドは、転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合性ドメインをコードするヌクレオチドが、ＮＧＰＣＲタンパク、ポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質をコードするＮＧＰＣＲヌクレオチド配列に融合したものからなり；他方のプラスミドは、ＮＧＰＣＲとの相互作用を試験される未知タンパク質をコードするｃＤＮＡに融合した転写活性化タンパク質の活性化ドメインをコードするヌクレオチドが、このプラスミドにｃＤＮＡライブラリーの一部として再結合したものからなる。このＤＮＡ結合性ドメイン融合プラスミドおよびｃＤＮＡライブラリーを、その調節領域に転写活性化タンパク質の結合部位を含むレポーター遺伝子（たとえばＨＢＳ、ｌａｃＺ、ＣＡＴまたは必須アミノ酸をコードする遺伝子）を含む酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）あるいは哺乳動物細胞（たとえばＳａｏｓ−２、ＣＨＯ、ＣＶ１、ＪｕｒｋａｔまたはＨｅＬａ）株に形質転換する。いずれか一方のハイブリッドタンパク質だけでレポーター遺伝子の転写を活性化することはできない：ＤＮＡ結合性ドメインハイブリッドが活性化できない理由は、それが活性化機能をもたないためであり、活性化ドメインハイブリッドが活性化できない理由は、それが活性化タンパク質結合部位に局在できないためである。これら２つのハイブリッドタンパク質の相互作用により機能性活性化タンパク質が再構成され、レポーター遺伝子が発現する。これをレポーター遺伝子生成物のアッセイにより検出する。
【０１４５】
この２ハイブリッドシステムまたは関連方法を用いて活性化ドメインライブラリーをスクリーニングし、”おとり（ｂａｉｔ）”遺伝子生成物と相互作用するタンパク質を求めることができる。限定ではないが、たとえばＮＧＰＣＲをおとり遺伝子生成物として使用できる。活性化ドメインをコードするＤＮＡに、全ゲノまたはｃＤＮＡ配列を融合させる。このライブラリー、およびＤＮＡ結合性ドメインに融合したおとりＮＧＰＣＲ遺伝子生成物のハイブリッドをコードするプラスミドを、レポーター株に同時形質転換し、得られた形質転換体をスクリーニングして、レポーター遺伝子を発現しているものを求める。限定ではないが、たとえばおとりＮＧＰＣＲ遺伝子配列、たとえばＮＧＰＣＲのオープンリーディングフレーム（またはＮＧＰＣＲの１ドメイン）をベクター中へ、ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合性ドメインをコードするＤＮＡに翻訳時融合するようにクローニングすることができる。これらのコロニーを精製し、レポーター遺伝子発現に関与するライブラリープラスミドを単離する。次いでＤＮＡ配列決定法を用いて、ライブラリープラスミドがコードするタンパク質を同定できる。
【０１４６】
おとりＮＧＰＣＲ遺伝子生成物と相互作用するタンパク質をそれから検出する細胞系のｃＤＮＡライブラリーは、当技術分野でルーティンに実施されている方法で調製できる。ある特定のシステムによれば、たとえばｃＤＮＡフラグメントをベクター中へ、ＧＡＬ４の転写活性化ドメインに翻訳時融合するように挿入することができる。このライブラリーを、おとりＮＧＰＣＲ遺伝子−ＧＡＬ４融合プラスミドと共に酵母株中へ同時形質転換することができ、それはａ）添加ヒスチジン無しには生育できず、ｂ）ＧＡＬ４活性化配列含有プロモーターにより誘発されるＨＩＳ３遺伝子を含む。ｃＤＮＡによりコードされ、ＧＡＬ４転写活性化ドメインに融合し、おとりＭＡＲＫ３遺伝子生成物と相互作用するタンパク質が活性ＧＡＬ４タンパク質を再構成し、これによりＨＩＳ３遺伝子の発現を誘発する。ＨＩＳ３を発現したコロニーは、ヒスチジンを欠如する半固体寒天培地を入れたペトリ皿上で増殖することにより検出できる。次いでこれらの株から当技術分野でルーティンに実施されている方法でｃＤＮＡを精製し、おとりＮＧＰＣＲ遺伝子と相互作用するタンパク質の製造および単離に使用できる。
【０１４７】
５．５．３  ＮＧＰＣＲ／細胞内高分子またはＮＧＰＣＲ／膜貫通高分子の相互作用を妨害する化合物のアッセイ
この考察のために、ＮＧＰＣＲと相互作用する高分子を”結合パートナー”と呼ぶ。これらの結合パートナーは、ＮＧＰＣＲ信号伝達経路に関与すると思われる。したがってＮＧＰＣＲとそのような結合パートナーの相互作用を妨害または撹乱する化合物を同定することが望ましい。これらの化合物は、ＮＧＰＣＲ活性を調節してＮＧＰＣＲ活性に関連する障害を抑制するのに有用であろう。例えば、それらの発現パターンを考慮すると、記載したＮＧＰＣＲは、高あるいは低血圧（および関連した症状）、腎臓疾患、体重コントロール障害、代謝異常、および癌の治療的処置に有効な化合物を同定する方法に特に有効であると考えられる。
【０１４８】
ＮＧＰＣＲとその結合パートナーまたはパートナー類との相互作用を妨害する化合物の同定に用いるアッセイ系の基本原理は、セクション５．５．１およびセクション５．５．２に記載のようにＮＧＰＣＲタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質、および結合パートナーを含有する反応混合物を調製し、両者が相互作用して結合するのに十分な条件下でそれに十分な時間反応させて、複合体を形成させるものである。化合物の阻害活性を試験するために、被験化合物が存在する反応混合物と存在しないものを調製する。被験化合物は最初から反応混合物に含有させてもよく、ＮＧＰＣＲ部分およびその結合パートナーの添加後に添加してもよい。対照反応混合物は、被験化合物なしで、またはプラシーボと共にインキュベートされる。次いでＮＧＰＣＲ部分と結合パートナーの複合体の形成を検出する。対照反応において複合体が形成され、被験化合物を含有する反応混合物においては形成されない場合、その化合物はＮＧＰＣＲと相互作用性結合パートナーの相互作用を妨害することを示す。さらに、被験化合物および正常ＮＧＰＣＲタンパク質を含有する反応混合物における複合体形成を、被験化合物および変異ＮＧＰＣＲを含有する反応混合物における複合体形成と比較することもできる。この比較は、変異ＮＧＰＣＲまたは変異させたＮＧＰＣＲとの相互作用を特異的に撹乱しかつ正常ＮＧＰＣＲとの相互作用を撹乱しない化合物を同定したい場合に重要である。
【０１４９】
前記ＮＧＰＣＲと結合パートナーの相互作用を妨害する化合物のアッセイは、不均質方式または均質方式で実施できる。不均質アッセイは、ＮＧＰＣＲ部分または結合パートナーを固体に固定し、反応終了時に固相に固定された複合体を検出することを伴う。均質アッセイにおいては、反応全体を液相で実施する。いずれの方法でも、被験化合物について異なる情報を得るために反応体の添加順序を変更できる。たとえば、競合により相互作用を妨害する被験化合物は、被験化合物の存在下で反応を実施することにより同定できる：すなわちＮＧＰＣＲ部分および相互作用性結合パートナーの前またはそれらと同時に、被験物質を反応混合物に添加する。あるいは既に形成された複合体を撹乱する被験化合物、たとえばより高い結合定数をもち複合体から成分の１つを排除する化合物は、複合体が形成された後の反応混合物に被験化合物を添加することにより試験できる。各種の方式について以下に簡単に記載する。
【０１５０】
不均質アッセイ系においては、ＮＧＰＣＲ部分または相互作用性結合パートナーのいずれかを固体表面に固定し、固定しない種を直接または間接的に標識する。実施に際しては、マイクロタイタープレートを用いるのが好都合である。固定する種を共有結合または非共有結合のいずれによって固定化してもよい。非共有結合は、固相表面をＮＧＰＣＲ遺伝子生成物または結合パートナーでコーティングし、乾燥させるだけで達成できる。あるいはその種を固体表面に固定するために、固定化すべき種に特異的な固定化抗体を使用できる。この表面は予め調製して保存しておくことができる。
【０１５１】
アッセイを実施するためには、コーティング面に、被験化合物の存在下または不存在下で、固定化された種のパートナーを接触させる。反応終了後、未反応成分を除去（たとえば洗浄による）すると、形成された複合体が固体表面に固定化されたまま残る。固体表面に固定された複合体の検出は多数の方法で実施できる。固定化されない種を予め標識した場合、表面に固定化された標識が検出されると複合体が形成されたことを示す。固定化されない成分を予め標識していなければ、表面に固定された複合体を検出するために間接標識を使用できる。たとえば最初に固定化されない種に特異的な標識抗体を使用する（この抗体を標識抗−Ｉｇ抗体で直接または間接的に標識できる）。反応成分の添加順序に応じて、複合体形成を阻害する被験化合物または既に形成された複合体を撹乱する被験化合物を検出できる。
【０１５２】
あるいは反応を液相で、被験化合物の存在下または不存在下に実施し、反応生成物を未反応成分から分離し、複合体を検出することができる。検出には、たとえば結合成分の一方に特異的な、溶液中に形成された複合体を固定するための固定化抗体、および固定化された複合体を検出するための、可能性のある複合体の他方のパートナーに特異的な標識抗体を用いる。この場合も、液相への反応成分の添加順序に応じて、複合体形成を阻害する化合物または既に形成された複合体を撹乱する化合物を検出できる。
【０１５３】
本発明の他の態様においては、均質アッセイを用いる。この方法では、ＮＧＰＣＲ部分と相互作用性結合パートナーの予め形成した複合体を調製する。その際、ＮＧＰＣＲまたはその結合パートナーのいずれか一方を標識するが、標識が発する信号は複合体形成により消失する（たとえばＵＳＰ４，１０９，４９６参照；この方法を免疫アッセイに用いている）。既に形成された複合体から一方の種を排除する競合性の被験物質を添加すると、バックグラウンドより高い信号が発生する。こうして、ＮＧＰＣＲ／相互作用性結合パートナーの相互作用を撹乱する物質を同定できる。
【０１５４】
具体的態様においては、ＮＧＰＣＲ融合タンパクを固定化のために調製できる。たとえばＮＧＰＣＲまたはペプチドフラグメント（たとえばＣＤに対応するフラグメント）をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子に、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１などの融合ベクターにより、得られる融合タンパク質においてその結合活性が維持されるように融合させる。相互作用性結合パートナーを精製し、前記セクション５．３に記載したルーティンに実施される方法でモノクローナル抗体を産生させる。この抗体を、たとえば当技術分野でルーティンに実施されている方法により放射性同位体１２５Ｉで標識する。不均質アッセイにおいては、たとえばＧＳＴ−ＮＧＰＣＲ融合タンパク質をグルタチオン−アガロースビーズに固定する。次いで、相互作用性結合パートナーを被験化合物の存在下または不存在下に、相互作用および結合が起きる条件下で添加する。反応期間の終了時に結合していない物質を洗い去り、標識モノクローナル抗体をこの系に添加し、複合体形成した成分に結合させる。グルタチオン−アガロースビーズに結合したままの放射能の量を測定することにより、ＮＧＰＣＲ遺伝子生成物と相互作用性結合パートナーの相互作用を検出できる。被験化合物により相互作用が効果的に阻害されると、測定放射能が低下するであろう。
【０１５５】
あるいは、ＧＳＴ−ＮＧＰＣＲタンパク質と相互作用性結合パートナーを液体中、固体グルタチオン−アガロースビーズの不存在下で混合することができる。被験化合物は、これらの種を相互作用させる途中または相互作用の後のいずれに添加してもよい。次いでこの混合物をグルタチオン−アガロースビーズに添加し、結合していない物質を洗い去る。この場合も、標識抗体を添加し、ビーズに結合した放射能を測定することにより、ＮＧＰＣＲ／結合パートナー相互作用の阻害度を検出できる。
【０１５６】
本発明の他の態様においては、ＮＧＰＣＲの結合性ドメインおよび／または相互作用もしくは結合パートナーに対応するペプチドフラグメントを、一方または両方の全長タンパク質の代わりに用いて、これらと同じ方法を採用できる（結合パートナーがタンパク質である場合）。当技術分野でルーティンに実施されている多数の方法のいずれかを用いて、結合性部位を同定および単離できる。これらの方法には、一方のタンパク質をコードする遺伝子の変異誘発、および同時免疫沈降アッセイにおける結合撹乱のスクリーニングが含まれるが、これらに限定されない。次いで、複合体中の第２種をコードする配列における代償変異を選択する。各タンパク質をコードする遺伝子の配列分析により、相互作用性結合に関与するタンパク質領域に対応する変異が明かになる。あるいは一方のタンパク質を前記方法で固体表面に固定し、それの標識された結合パートナーと相互作用させて結合させる。この結合パートナーは、タンパク質分解酵素、たとえばトリプシンで予め処理されている。洗浄後、結合ドメインを含む比較的短い標識ペプチドが固体材料と結合したまま残り、これを単離してアミノ酸配列決定法により同定できる。同様に、細胞内結合パートナーをコードする遺伝子が得られれば、そのタンパク質のペプチドフラグメントを発現するように短い遺伝子セグメントを遺伝子工学的に処理し、次いでこれらの結合活性を試験し、精製または合成することができる。
【０１５７】
限定ではないが、たとえば前記に従ってＧＳＴ−ＮＧＰＣＲ融合タンパク質を形成し、これをグルタチオン−アガロースビーズに結合させることにより、ＮＧＰＣＲ遺伝子生成物を固体材料に固定することができる。相互作用性結合パートナーを放射能同位体、たとえば３５Ｓで標識し、タンパク質分解酵素、たとえばトリプシンで開裂させる。次いで開裂生成物を固定ＧＳＴ−ＮＧＰＣＲ融合タンパク質に添加し、結合させる。結合していないペプチドを洗い去った後、標識されている結合物質（細胞内結合パートナー結合ドメインである）を周知の方法で溶離、精製し、アミノ酸配列を分析する。こうして同定したペプチドを合成により製造し、または組換えＤＮＡ法を用いて適切な促進性タンパク質に融合させることができる。
【０１５８】
５．６医薬組成物
本明細書に記載したアッセイ法などにより同定された化合物は、たとえばＮＧＰＣＲ遺伝子生成物の生物学的機能を高めるのに有用である。そのような化合物を、多様な生理的障害または精神障害の処置のために療法有効量で患者に投与できる。療法有効量とは、発症の遅延、生物学的症状または顕性症状の軽減、阻止、抑制または変化を生じるのに十分な化合物量を表す。
【０１５９】
５．６．１  有効量
そのような化合物の毒性および療法有効性は、細胞培養または実験動物において医薬標準法、たとえばＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な量）およびＥＤ５０（集団の５０％において療法上有効な量）により判定できる。毒性と療法有効性の用量比が治療指数であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物の方が好ましい。有害な副作用を示す化合物もある態様では使用できるが、罹患していない細胞に与える損傷の可能性を最小限に抑えることにより副作用を少なくするために、それらの化合物が罹患組織をターゲティングする送達システムを設計するように配慮すべきである。
【０１６０】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータを、ヒトに使用するための用量範囲の設定に利用できる。それらの化合物の用量は、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度範囲内にあることが好ましい。用量は、この範囲内で、用いる剤形および採用する投与経路に応じて変更できる。本発明方法に用いるいずれの化合物についても、まず細胞培養アッセイにより療法有効量を推定できる。動物モデルにおいて、細胞培養において測定したＩＣ５０（すなわち最大の症状阻害の半分を達成する被験化合物濃度）含む循環血漿濃度を達成するように設定する。そのような情報を利用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定できる。血漿濃度は、たとえば高速液体クロマトグラフィーにより測定できる。
【０１６１】
疾病の治療を熟考する場合、試験動物に対するキログラム重量あたりでの活性製剤の最大許容量（すなわちＭＴＤ）を決定する動物試験により、適切な用量を決定することもできる。一般に、試験される少なくとも１つの動物類は哺乳動物である。当業者は通常、ヒトを含む他の種に対する有用な用量および毒性回避のための用量を推定する。効能に関するヒトでの試験の前において、正常被検体でのフェーズＩ臨床試験は、安全な用量決定の助けとなる。
【０１６２】
さらに、活性薬剤は、例えば、該活性薬剤の安定性を高めるか、あるいはその薬剤的特性（例えば、生体内での半減期を長くする、毒性を低下させるなど）を高める、様々なすでに確立している化合物あるいは構造物と複合させることができる。
【０１６３】
治療剤は、当業者に既知の方法のいずれかにより投与されるが、それには制限的でない例として、吸入、皮下投与（ｓｕｂ−ｑ）、静脈投与（Ｉ．Ｖ．）、腹腔投与（Ｉ．Ｐ．）、筋肉投与（Ｉ．Ｍ．）、鞘内投与、または局所投与（経皮、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、クリーム、軟膏（ｓａｌｖｅ）、点眼薬など）を含む。
【０１６４】
５．６．２  医薬組成物および使用
本発明に従って使用する医薬組成物は、常法により１以上の医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤を用いて配合できる。たとえば本発明化合物およびそれらの生理学的に許容できる塩類および溶媒和物を、吸入もしくは吹入れ（口または鼻から）、または経口、口腔、非経口、頭蓋内、局所、くも膜下または直腸投与により投与できる。
【０１６５】
経口投与のためには、医薬組成物は常法により、たとえば下記の医薬的に許容できる賦形剤を用いて、たとえば錠剤またはカプセル剤の形をとることができる：結合剤（たとえばプレゲル化したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（たとえば乳糖、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（たとえばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（たとえばバレイショデンプンまたはグリコール酸デンプンナトリウム）；または湿潤剤（たとえばラウリル硫酸ナトリウム）。錠剤を当技術分野で周知の方法によりコーティングできる。経口投与用の液体製剤はたとえば液剤、シロップ剤または懸濁液剤の形をとるか、あるいは使用前に水または他の適切なビヒクルで調製するための乾燥製剤として供給することができる。そのような液体製剤は常法により、たとえば下記の医薬的に許容できる添加剤を用いて調製できる：沈殿防止剤（たとえばソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂肪）；乳化剤（たとえばレシチンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（たとえばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画した植物油）；および保存剤（たとえばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル、またはソルビン酸）。製剤は緩衝塩類、着香剤、着色剤および甘味剤を適宜含有してもよい。
【０１６６】
経口投与用製剤は、有効化合物の制御放出に適するように配合することもできる。
【０１６７】
口腔投与のためには、組成物は常法により配合した錠剤またはカプセル剤の形をとることができる。
【０１６８】
吸入による投与のためには、本発明により使用する化合物をエアゾルスプレー製剤の形で加圧パックまたは噴霧器から、適切な噴射剤、たとえばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスを用いて送達するのが好都合である。加圧エアゾル剤の場合、計量された量を送達する弁を設けることにより投与単位を決定できる。化合物および適切な粉末基剤（たとえば乳糖またはデンプン）の粉末ミックスを収容した、吸入器または吹入れ器に使用するための、たとえばゼラチン製のカプセルまたはカートリッジを調製できる。
【０１６９】
本発明化合物を注射、たとえばボーラス注射、または連続注入による非経口投与用に配合できる。注射用配合物は単位投与剤形で、たとえばアンプルまたは多数回分の容器に入れ、保存剤を添加して供給することができる。組成物は油性または水性ビヒクル中の懸濁液剤、液剤または乳剤の形をとることができ、配合用剤、たとえば沈殿防止剤、安定剤および／または分散剤を含有してもよい。あるいは有効成分は適切なビヒクル、たとえば発熱物質を含有しない無菌水で使用前に調製するための粉末状であってもよい。
【０１７０】
本発明化合物を直腸用組成物、たとえば坐剤または貯留浣腸剤、たとえば一般的な坐剤基坐剤（たとえばカカオ脂または他のグリセリド）を含有するものとしても配合できる。
【０１７１】
上記配合物のほか、本発明化合物はデポー製剤としても配合できる。そのような長時間作用型配合物は埋込み（たとえば皮下または筋肉内）または筋肉注射により投与できる。たとえば本発明化合物を適切なポリマーまたは疎水性材料と共に（たとえば許容できる油中の乳剤として）、もしくはイオン交換樹脂と共に、または貧溶性誘導体、たとえば貧溶性塩として配合することができる。
【０１７２】
本発明組成物は、有効成分を含有する１以上の単位剤形を入れたパックまたはディスペンサー器具として提供することもできる。パックはたとえば金属箔またはプラスチック箔を含むブリスターパックなどを含む。パックまたはディスペンサー器具には投与指示書を添付することができる。
【０１７３】
本発明の範囲は本明細書に記載した具体的態様により限定されない。これらの態様は本発明の個々の態様を説明するために示したにすぎず、機能的に均等な方法および成分は本発明の範囲に含まれる。実際に、本明細書に例示および記載したもののほか本発明の種々の変更が、以上の記載から当業者に明らかになるであろう。そのような変更も本発明の範囲に含まれる。本明細書に引用したすべての参考文献、特許および特許出願の全体を参考として援用する。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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