(57)【要約】出願人は、二本鎖線状アデノウイルスゲノムを環状化プラスミド形態に変換するために細菌相同的組換え系を利用する方法を特定した（図４参照）。かかる系は、各々５００塩基対未満の、プラスミド上に存在するアデノウイルス末端フラグメントによって機能する。その結果、制限消化、ＰＣＲ、ＤＮＡ塩基配列決定によってより容易に分析される又は一過性トランスフェクション試験において使用されるプラスミドを生じる。生成されるアデノウイルスプラスミドはウイルス形態へと救出されうる。手順全体が、プラーク精製又は希釈クローニング単離手法に必要な数週間ではなく、４日間又はそれ以下しか必要としない。本発明のさらなる利点は、開示する方法が組織培養材料又は設備の使用を必要としないことである。開示する方法は、同時感染する無傷アデノウイルスゲノムの助けなしには増殖することができない変異体の検出を可能にするという点で、ウイルス試料のより広汎で完全な検査を可能にする。プラーク精製の標準的条件下では、これらの変異体ゲノムは検出されない。標準プラーク精製法によって検出されるであろうよりもはるかに多くの変異体ゲノムが迅速な方法を用いて認められるであろうと予測される。
2004511233.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）野生型、突然変異型又は複製欠損型アデノウイルスをコードする第一アデノウイルス核酸配列、及び
（ｂ）線状ベクター、前記線状ベクターは第二および第三アデノウイルス核酸配列ならびに非アデノウイルスセグメントを含み、第二配列は野生型アデノウイルス配列の塩基対５００を過ぎて越えないように野生型アデノウイルス配列の塩基対１−１００に対応する塩基対を含み、第三配列は野生型アデノウイルス配列の塩基対３５，８３５−３５，９３５に対応する塩基対を含み、
を宿主細胞に導入することを含み、
第一アデノウイルス配列が段階（ｂ）のベクター内の第二及び第三アデノウイルス配列と相同的組換えを受けて、段階（ｂ）のベクターの非アデノウイルスセグメントと第一アデノウイルス配列の両方を含むベクターを生じる、
アデノウイルスをコードする核酸配列をベクター骨格に組み込むための方法。
【請求項２】
第二アデノウイルス配列が、野生型アデノウイルス配列の塩基対１−３７５から成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第二アデノウイルス配列が、野生型アデノウイルス配列の塩基対１−１９５から成る、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第三アデノウイルス配列が、野生型アデノウイルス配列の塩基対３５，４５８−３５，９３５から成る、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第二アデノウイルス配列が、野生型アデノウイルス配列の塩基対１−３７５から成り、第三アデノウイルス配列が野生型アデノウイルス配列の塩基対３５，４５８−３５，９３５から成る、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第二アデノウイルス配列が、野生型アデノウイルス配列の塩基対１−１９５から成り、第三アデノウイルス配列が、野生型アデノウイルス配列の塩基対３５，４５８−３５，９３５から成る、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記宿主細胞が、原核生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記宿主細胞が、細菌である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記宿主細胞が、大腸菌ＢＪ５１８３細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸が、ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸が、ｃＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
第一アデノウイルス核酸配列が、Ｅ１欠失アデノウイルスをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
第一アデノウイルス核酸配列が、Ｅ３欠失アデノウイルスをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
第一アデノウイルス核酸配列が、Ｅ１及びＥ３欠失アデノウイルスをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記アデノウイルス核酸配列が、外来遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ベクターが、プラスミドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記プラスミドが、ｐＵＣ１９である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記プラスミドが、プラスミドの即時線状化を可能にする制限酵素認識部位を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記制限酵素認識部位が、段階（ｂ）の第二と第三核酸配列の間に位置する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ベクターが、段階（ｂ）のベクターの非アデノウイルスセグメントと、コードされたアデノウイルスのレスキューを可能にする５’及び３’ＩＴＲの間に制限酵素認識部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ベクターが、複製起点を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ベクターが、選択マーカー遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ベクターが、特定物質に対する耐性を付与する遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ベクターが、アンピシリン耐性遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記アデノウイルスが、サブグループＣのアデノウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記アデノウイルスが、野生型アデノウイルス５型である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２８】
（ａ）相同的組換えの標的となる細胞内にも存在する、アデノウイルスゲノム内の領域に相同なアデノウイルス配列に隣接した所望遺伝子を含むベクターで相補細胞にトランスフェクション導入することにより、相補細胞内に、所望遺伝子を担う組換えアデノウイルスを作製すること、
（ｂ）組換えアデノウイルス核酸を抽出すること、及び
（ｃ）（ｉ）該組換えアデノウイルス配列をコードする第一アデノウイルス核酸配列、及び
（ｉｉ）線状ベクター、前記線状ベクターは第二および第三アデノウイルス核酸配列ならびに非アデノウイルスセグメントを含み、第二配列は野生型アデノウイルス配列の塩基対５００を過ぎて越えないように野生型アデノウイルス配列の塩基対１−１００に対応する塩基対を含み、第三配列は野生型アデノウイルス配列の塩基対３５，８３５−３５，９３５に対応する塩基対を含み、
を宿主細胞に導入することを含み、
第一アデノウイルス配列が段階（ｃ）（ｉｉ）のベクター内の第二及び第三アデノウイルス配列と相同的組換えを受けて、段階（ｃ）（ｉｉ）のベクターの非アデノウイルスセグメントと組換え第一アデノウイルス配列の両方を含むベクターを生じる、
所望遺伝子をベクター骨格内に担う組換えアデノウイルスを調製する方法。
【請求項２９】
第二アデノウイルス配列が、野生型アデノウイルス配列の塩基対１−３７５から成る、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
第二アデノウイルス配列が、野生型アデノウイルス配列の塩基対１−１９５から成る、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
第三アデノウイルス配列が、野生型アデノウイルス配列の塩基対３５，４５８−３５，９３５から成る、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
第二アデノウイルス配列が、野生型アデノウイルス配列の塩基対１−３７５から成り、第三アデノウイルス配列が野生型アデノウイルス配列の塩基対３５，４５８−３５，９３５から成る、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
第二アデノウイルス配列が、野生型アデノウイルス配列の塩基対１−１９５から成り、第三アデノウイルス配列が、野生型アデノウイルス配列の塩基対３５，４５８−３５，９３５から成る、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記相補細胞が、２９３細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞が、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
（ａ）野生型、突然変異型又は複製欠損型アデノウイルスをコードし、相同的組換えの標的となる領域内に制限酵素認識部位を含む、第一アデノウイルス配列を相補細胞に導入すること、
（ｂ）アデノウイルスゲノム内の相同的組換えの標的となる領域に相同なアデノウイルス配列に隣接した前記所望遺伝子を含むベクターで前記細胞にトランスフェクション導入することにより、前記相補細胞内に、前記所望遺伝子を担う組換えアデノウイルスを作製すること、
（ｃ）段階（ａ）の前記制限酵素認識部位を消化することができる制限酵素で生じた細胞産物を消化すること、
（ｄ）前記相補細胞から組換えアデノウイルス核酸を抽出すること、および
（ｅ）細菌細胞内に組換えアデノウイルスとベクターの両方を導入すること、前記ベクターは第二および第三アデノウイルス核酸配列ならびに非アデノウイルスセグメントを含み、第二配列は野生型アデノウイルス配列の５００塩基対を過ぎて越えないように野生型アデノウイルス配列の１−１００に対応する塩基対を含み、第三配列は野生型アデノウイルス配列の塩基対３５，８３５−３５，９３５に対応する塩基対を含み、
を含み、
第一アデノウイルス配列は段階（ｅ）のベクター内の第二及び第三アデノウイルス配列と相同的組換えを受けて、段階（ｅ）のベクターの非アデノウイルスセグメントと組換え第一アデノウイルス配列の両方を含むベクターを生じる、
所望遺伝子をベクター骨格内に担う組換えアデノウイルスを調製する方法。
【請求項３７】
第二アデノウイルス配列が、野生型アデノウイルス配列の塩基対１−３７５から成る、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
第二アデノウイルス配列が、野生型アデノウイルス配列の塩基対１−１９５から成る、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
第三アデノウイルス配列が、野生型アデノウイルス配列の塩基対３５，４５８−３５，９３５から成る、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
第二アデノウイルス配列が、野生型アデノウイルス配列の塩基対１−３７５から成り、第三アデノウイルス配列が野生型アデノウイルス配列の塩基対３５，４５８−３５，９３５から成る、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
第二アデノウイルス配列が、野生型アデノウイルス配列の塩基対１−１９５から成り、第三アデノウイルス配列が野生型アデノウイルス配列の塩基対３５，４５８−３５，９３５から成る、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記制限酵素認識部位が、Ｅ１領域に組み込まれる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
前記制限酵素認識部位が、Ｃｌａ１部位である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
前記相補細胞が、２９３細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞が、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞である、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
組換えアデノウイルスは遺伝子治療の研究において広く使用されている。実際に、アデノウイルスを人での使用のためにより安全にするべく、野生型アデノウイルスの特定成分（例えばＥ１遺伝子）を取り除くために多大の研究が為されてきた。大部分の他の生存ウイルスを使用する場合と同じように、アデノウイルスの使用を取り巻く数多くの懸念が存在する。一例として、組換えアデノウイルスの生産は、複製コンピテントアデノウイルスが存在しないというだけでなく、ウイルス調製の際に存在しうる他の変異種の不在に関しても安全性のガイドラインに適合することを保証することが決定的に重要である。
【０００２】
アデノウイルス（例えばＥ１欠失アデノウイルス）の単離のための標準的な方法は、通常、寒天被覆層での相補細胞（例えば２９３細胞）のプラーク精製によるクローニングを必要とする。この手順は２週間もかかることがある。単離したウイルスのゲノムを検討するためには、さらなる遺伝的変異を導入することができる一連の継代を通してプラークを増幅する必要がある。増幅の規模と精製するウイルスＤＮＡの量に依存して、制限消化産物の放射能標識が必要となりうる。さらに、プラークを形成することができるウイルスゲノムサブセットだけが分析される。もはや近接する無傷ウイルスゲノムの助けなしには増殖することができないように広汎な再配列を受けたウイルスゲノムは、このアプローチでは必ずしも排除されない。この方法は、それ故、試料中に存在する遺伝子異質性の正確な描写をさらに妨げる。
【０００３】
これらの段階の一部を回避してアデノウイルスを単離し、操作する代替的なシステムは確実に好ましい。Ｃｈａｒｔｉｅｒら（米国特許第６，１１０，７３５号）は、例えば、アデノウイルスを含むプラスミド骨格に所望遺伝子を担うセグメントを移入する、原核細胞内での相同的組換えの方法を教示している。このシステムは、同時に細胞に導入されるアデノウイルスゲノムと相同的組換えを受ける、２個の短いアデノウイルスセグメントを担うプラスミドを用いる。これはプラスミド内のアデノウイルス配列に突然変異又は所望遺伝子を移入するための手段をもたらし、これまでのプラーク精製法に固有の野生型バックグラウンドを回避する。この方法はさらに、時間とコストのかかるアデノウイルス単離の性質を改善する。この方法に従った相同的組換えは、５’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ及びキャプシド化領域以外の配列に基づくと考えられる。
【０００４】
ベクター上のアデノウイルス末端配列のより短いセグメント、例えば５００塩基対以下の末端セグメントを利用できること、さらに細胞内に存在するアデノウイルスをベクターに組み込めることは有益であろう。単に突然変異型アデノウイルスの単離という見地から、これはそのような方法の可能な用途の１つにすぎないが、５’及び３’ＩＴＲ領域にしぼったより短い末端セグメントを用いるプロセスは、より大きな頻度で、プラスミド上の使用される末端セグメントの外側の領域、例えばパッケージング領域内で、突然変異を担うアデノウイルスを特定するであろう。
【０００５】
（発明の概要）
相同的組換えによるアデノウイルスの環状化のための方法を提供する。この方法は、アデノウイルスの５’及び３’ＩＴＲとキャプシド化（又はパッケージング）シグナルを含むアデノウイルス末端をベクター（例えばプラスミド）骨格に移入することを含む。アデノウイルス末端と細胞内に存在する野生型、突然変異型又は複製欠損型アデノウイルスの間での相同的組換えは、環状化された、又はベクター骨格に組み込まれた野生型、突然変異型又は複製欠損型アデノウイルスを生じる。この形態のアデノウイルスはより簡単に操作され、スクリーニングも容易であり、プラーク精製又は希釈クローニング手法に必要とされる数週間という時間枠ではなく、この工程はざっと４日間又はそれ以下しかかからない。感染性ウイルスは、さらに、ベクター骨格から容易に救済される。
【０００６】
（定義）
「複製欠損型」又は「第一世代」ベクターは、典型的には欠失又は不活性化したＥ１遺伝子領域を持ち、好ましくは同様に欠失又は不活性化したＥ３遺伝子領域を持つ。
【０００７】
「第一アデノウイルス配列」又は「遊離型アデノウイルス配列」は、野生型アデノウイルス配列の最も右端と最も左端の５００塩基対に対応する領域内の１つのエリアと少なくとも５０塩基対の相同性を持つ領域を有する、野生型、突然変異型又は複製欠損型アデノウイルスを指す。
【０００８】
「突然変異型アデノウイルス」は、配列又はコンフォメーションにおいて野生型アデノウイルスと異なるが、かかる差異が複製には影響を及ぼさないアデノウイルスを指す。
【０００９】
「第二アデノウイルス配列」は、少なくともアデノウイルス５’ＩＴＲを含む本発明のベクター内に存在する５’末端アデノウイルス配列を指す。
【００１０】
プラスミド又はベクター配列に関して、「非アデノウイルスセグメント」又は「非アデノウイルス配列」は、そのプラスミドに天然であるか又は外来性であるかにかかわらず、アデノウイルス配列ではない、プラスミド又はベクター上に存在する核酸配列を指す。
【００１１】
「第三アデノウイルス配列」は、少なくともアデノウイルス３’ＩＴＲを含む本発明のベクター内に存在する３’末端アデノウイルス配列を指す。
【００１２】
（図面の簡単な説明）
図１は、細菌相同的組換え系における完全なアデノウイルスゲノムの回収を例示する。
【００１３】
図２Ａ及び２Ｂは単離したクローンの制限消化分析を示す。図２Ａは、Ｐ１９まで継代した組換えアデノウイルスから細菌相同的組換えによって単離した１８の個別アデノウイルスクローンのＢｓｔ　ＥＩＩ分析を示す。図２Ｂは、Ｐ１７まで継代した組換えアデノウイルスから細菌相同的組換えによって単離した１８の個別アデノウイルスクローンのＰａｃ　Ｉ及びＨｉｎｄ　ＩＩＩ二重消化を示す。
【００１４】
図３Ａ及び３Ｂは、アデノウイルス末端領域の長いセグメントがどのようにしてアデノウイルスゲノム初期領域における突然変異を見落としてしまうかを例示している。図３Ａは、長い末端領域を使用して「レスキュー」プラスミドを作製した場合に起こりうる組換え事象を示す。５’末端の交叉がウイルス混合物に関して存在する変異を乗り超える可能性がある。上のパネルは個体群内でのパッケージング領域の重複の例を示す。５’末端の交叉は野生型（正常）種には影響を及ぼさないが、パッケージング領域の１つ又は２つの重複を含む種は、「レスキュー」プラスミドと変異型ゲノム間の交叉事象が最後のパッケージング領域重複の下流（３’側）で起こる場合には、検出されない可能性がある。図３Ｂは、「レスキュー」プラスミドの末端相同性を制限することにより、交叉事象はパッケージング領域の５’側で起こることが強いられる。このようにして、相同性領域の下流（３’側）のすべての変異体が検出される。
【００１５】
図４は、潜在的出発物質、「レスキュー」プラスミドとウイルスＤＮＡ「プール」からの完全な工程を図式的に示す。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
出願人は、細胞個体群内に存在するアデノウイルス核酸配列をベクター骨格に組み込むための方法を特定し、ここで開示する。この方法は、野生型、突然変異型又は複製欠損型アデノウイルスをコードするアデノウイルス核酸配列（ここでは「第一」アデノウイルス配列と称する）を、その末端にアデノウイルス５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲを含む末端アデノウイルス核酸配列（ここではそれぞれ「第二」及び「第三」アデノウイルス核酸配列と称する）を含む線状ベクターと共に宿主細胞に組み込むことを含む。開示する方法の目標と最終的な結果は、環状化されたプラスミド内への個々のアデノウイルスゲノムの移入と単離である。このプロセスは、細胞内に存在する２つの線状核酸分子間で起こる相同的組換えの作用を利用する。
【００１７】
そのような手順の利益は、個々のクローンのプラーク精製、組織培養でのクローンの増幅、ウイルスのＣｓＣｌ染色法、及び精製したウイルスの透析の必要を排除することである。組織培養の材料あるいは設備を必要とせずに多数の試料を容易に取り扱い、処理することができる。これは重要な時間とコストの利益に相当する。さらに、大腸菌におけるクローニングによって各々のアデノウイルスゲノムを大量に生産しうるので、ウイルスＤＮＡを視覚化するために使用されるより面倒な放射能標識手法ではなく、ゲル電気泳動後の簡単なエチジウムブロマイド染色によって分析が行われる。
【００１８】
全体として、この方法は我々に、プラークを形成することができないものを含めてウイルス試料中に存在する可能性がある変異体を単離し、分析することを可能にする。増殖の間、そのような変異型アデノウイルスは、混合ウイルス個体群内の無傷アデノウイルスによってトランスで供給される必要タンパク質を利用して増殖することができる。このような場合、これらのアデノウイルスは広汎なＰＣＲテクノロジーを使用しない限り検出を免れよう。何らかの試料からのウイルスプール、特に大規模、高い継代数、又は高い感染多重度の増殖のそのような分析は、おそらく常套的プラーク精製手法によってこれまでに特定されたよりもはるかに多くの変異ゲノムを特定するであろう。この手順はまた、その後トランスジーンの発現を分析するための一過性トランスフェクション試験において使用することができるプラスミド試料の作製を可能にする。単離したクローンはまた、これらのゲノムが感染性ビリオンを形成することができるかどうかを同定するためのレスキュー実験においても使用しうる。
【００１９】
Ｃｈａｒｔｉｅｒら（米国特許第６，１１０，７３５号）のようなこれまでの方法に対する本発明の重要な利点は、プラスミド上の使用するアデノウイルス末端部分がこれまでのベクターよりもはるかに短いアデノウイルス末端領域を含むことである。
【００２０】
短縮された末端部分は工程上多くの利点を提供する。移入するプラスミドの運搬上の制約を軽減することに加えて、短い末端はもう１つ予想外の利点を提供する。相同的組換えを通して単離することができる突然変異体の範囲が拡大される。これは特にアデノウイルスの継代の間に創造される突然変異体について認められた。
【００２１】
継代の間に、組換えアデノウイルスのパッケージング領域内で再配列が起こりうることが認められている（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ａｄｖｉｓｏｒｙ　Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ　ｍｅｅｔｉｎｇ、１９９９年１２月）。すべての再配列が同定されうることを保証するためには、「レスキュー」プラスミド（アデノウイルス配列と相同的組換えを受ける２つの末端セグメントを担うプラスミド）の末端相同性の領域を、許容されるレベルのゲノム回収を提供する範囲に限定することが重要である。領域が長すぎると、再配列された領域の下流で相同的組換えの際に交叉事象が起こりうる；図３Ａ及び３Ｂ参照。これが起こった場合、再配置は認められないであろう。出願人は、それぞれ１９５と４７７の左及び右アデノウイルス末端領域を使用することにより、パッケージング領域の突然変異を特定した。
【００２２】
回収するアデノウイルスとほとんどあらゆる長さの末端相同性を含むようにレスキュープラスミドを調製することができるが、効率的な相同的組換えを可能にする長さの相同性を持つことが重要である。アデノウイルスの少なくとも５０ｂｐの左端ＩＴＲと５０ｂｐの右端ＩＴＲセグメントを使用することが好ましい。この説明の領域はほとんどのクローニングベクター、例えばｐＵＣ１９に容易にクローニングすることができる。
【００２３】
「レスキュー」プラスミドは、好ましくは、野生型アデノウイルス配列の塩基対５００を越えないような野生型アデノウイルス配列の塩基対１−５０（好ましくは１−８０、最も好ましくは１−１００）、及び野生型アデノウイルス配列の塩基対３５，８８５−３５，９３５（より好ましくは３５，８３５−３５，９３５）を含む。より好ましくは、アデノウイルス配列の左末端を占める部分は基本的に野生型アデノウイルス配列の塩基対１−３７５、さらに一層好ましくは野生型アデノウイルス配列の塩基対１−１９５から成る。右末端は、最も好ましくは基本的に塩基対３５，４５８−３５，９３５から成る。
【００２４】
本明細書全体を通じて提示する塩基対の数は、野生型アデノウイルス血清型５の配列に基づく。この配列は既知であり、当該技術において記述されている；参照してここに組み込まれる、Ｃｈｒｏｂｏｃｚｅｋら、１９９２　Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１８６：２８０参照。従って、本発明の特定実施形態は、上述した配列がアデノウイルス５型の配列であるベクターである。当業者は、他のアデノウイルス血清型（例えば血清型２、４、６、１２、１６、１７、２４、３１、３３、及び４２）における上記の領域、すなわちアデノウイルス血清型５について示した上記の塩基対位置に対応する塩基対によって規定される領域を容易に同定することができる。それ故、本発明は、野生型アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）核酸配列の、塩基対５００を過ぎて越えないように、塩基対１−５０（好ましくは１−１００）、及び塩基対３５，８８５−３５，９３５（より好ましくは３５，８３５−３５，９３５）に対応するアデノウイルス末端を含むすべてのベクターを包含する。本発明の特に好ましい実施形態は、サブグループＣに分類される、Ａｄ５のようなアデノウイルスから誘導されるもの（例えばＡｄ２）である。
【００２５】
該配列の核酸変異体も本発明における使用のために考慮される。核酸変異体（１個又はそれ以上のヌクレオチドが野生型又は天然に生じるアデノウイルス配列と異なる）は、部位指定突然変異誘発又はプライマーが所望する点突然変異を有するＰＣＲ増幅を用いて産生しうる。化学的突然変異誘発も、当業者に既知である使用可能な代替的方法と同様、使用しうる。目標は、ベクター上の存在するアデノウイルス末端と細胞内に存在する遊離アデノウイルスの間で分子間相同的組換えが起こることを可能にする十分な相同性（おそらく５０塩基対又はそれ以上）を得ることである。
【００２６】
「レスキュー」プラスミドを構築するときは、相同的組換え反応を開始するよう、レスキュープラスミドが２組の配列の間で容易に線状化されるように、ユニーク制限部位が左と右のＩＴＲ配列の間に存在することが重要である。さらに、「レスキュー」プラスミドはまた、ベクター骨格が最終的なアデノベクタープラスミドの全体的アデノウイルスゲノム配列から適切に除去されうるように、ベクターとＩＴＲ配列が出会う接合部にはまれな切断酵素部位（例えばＰａｃ　Ｉ）を持つべきである。上記の例において、Ｐａｃ　Ｉ部位は、必要に応じてこれらの単離アデノベクターをウイルス内に救い出す選択肢を提供する。いずれの場合にも、用いる制限酵素部位が末端領域と第一（又は組換え）アデノウイルス配列の両方においてアデノウイルス配列に存在しないことが勧められる；そうでない場合は、少なくとも比較として少ないことが勧められる。
【００２７】
アデノウイルス末端配列は、当業者が精通する多くの方法で得ることができる。末端フラグメントをＰＣＲによって作製し、既存のベクターから切り出すか、又は代替的に、当該技術において既知の標準的な方法によって合成的に生産することができる。本発明の特定の好ましい実施形態は、例えば、Ｅ１及びＥ３欠失アデノウイルスから回収した末端配列を持つ「レスキュー」プラスミドを用いる。
【００２８】
プラスミドへの末端配列の組み込みも、十分に当業者が有する技術範囲内である。出願人が有用と認めた１つの方法は、先ず、ベクターのマルチクローニングサイト（例えばｐＵＣ１９）内に含まれる制限部位と共通する末端の制限部位を含むように設計したプライマーで末端を増幅することを含む。これは、各々の末端のＰＣＲ増幅した産物の末端を酵素で消化してベクターに連結することを可能にする。選択ベクターへのクローニングのために使用する制限部位の直近に、最終的にベクター骨格からアデノベクターを放出するために使用する適切な制限部位（例えばＰａｃ１）を含むようにプライマーを設計する。最も好ましくは、ユニーク制限部位を創造するためにその一番奥の末端に制限部位を含むようにプライマーを設計する。このユニーク制限部位は、ベクター中へのクローニングの際に、２つの末端ＰＣＲ産物の間に置く。次にこの「レスキュー」プラスミドをこのユニーク制限部位で線状化した後、相同的組換えに供する。
【００２９】
出願人が最も有用と認めた方法を下記で説明する：第一末端フラグメントは、ＥｃｏＲＩ制限部位、ＰａｃＩ制限部位及び野生型アデノウイルスの塩基対１−２０を有する正プライマー、及びＢａｍＨＩ部位、ユニーク部位（ＡｓｃＩ）及び野生型アデノウイルスのヌクレオチド８０−１００を有する逆プライマーで増幅することができる。第二末端フラグメントは、ＢａｍＨＩ及びヌクレオチド３５，８３５−３５，８５５を有する第一プライマーと、ＨｉｎｄＩＩＩ部位、ＰａｃＩ部位及びヌクレオチド３５，９１５−３５，９３５を有する逆プライマーで増幅することができる。次にフラグメントの外側に認められる制限部位（この例では、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩをこの順序で）を有するベクター、例えばＰｕｃ１９を消化して、フラグメントを挿入することができる。ベクターは、ＰａｃＩ制限部位（アデノベクターの除去のため）、５’末端フラグメント、ベクターの線状化のためのＡｓｃＩ部位、３’末端フラグメント及びＰａｃＩ制限部位（アデノベクターの除去のため）をこの順序で有することになる。この例は単に、当業者が等価ステップを実施し、等価最終結果を達成するために理解される、使用可能な多くの方法の非常に特定した実施形態をさらに説明することを意図していることに留意しなければならない。当該技術において慣例的とみなされる多くの手段が、同じ細胞内に存在する遊離型アデノウイルスゲノムと相同的組換えを受けることができるアデノウイルス末端フラグメントを持つベクターを作製するために使用できる。
【００３０】
ベクター核酸はすべて、アデノウイルス配列を除いて、ベクター上の非アデノウイルス配列のセグメントと称される。好ましくは、ベクターは細菌の複製起点を含む。ベクターはまた、抗生物質（例えばアンピシリン）耐性遺伝子のような選択マーカー遺伝子を含みうる。当業者は、様々なベクターのいずれかが、ベクター上に存在するアデノウイルス末端と細胞内の遊離アデノウイルスの間の分子間相同的組換えを生じさせるために使用できることを認識する。特に好ましい発現ベクターは、ｐＵＣ１８とその誘導体、ｐＵＣ１９とその誘導体、ｐＢＲ３２２とその誘導体、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ、ｐＧＥＭシリーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ（商標））、ｐＥＴシリーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ（商標））、及びｐＥＳＰ−１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（商標））を含む。一般に、好ましいベクターは、その増幅のために使用される適切な宿主株において妥当に高いコピー数を有する一般的ベクターである。コスミド、ファージ、ＢＡＣ（細菌人工染色体）及びＹＡＣ（酵母人工染色体）、及び他の代替的なベクターも本発明において有用である。
【００３１】
効率的な相同的組換えを生じさせるために、上述した２つのアデノウイルスセグメント（ここではそれぞれ第二及び第三配列と称する）の間でベクターを線状化する。これらの配列の末端ならびに導入する第一アデノウイルス配列は、平滑末端化されうるか又は５’及び３’突出末端を含みうる。ＢＪ５１８３細菌細胞のような一部の宿主細胞は線状ＤＮＡ分子を再環状化することができないので、フラグメントのホスファターゼ処理に関する絶対必要条件はない。それ故、混入環状プラスミドが存在しない限り、再環状化「レスキュー」プラスミド骨格のバックグラウンドは非常に低い。その結果として、線状「レスキュー」プラスミドとウイルスＤＮＡプール間の１回の同時形質転換は、高いレベルの信頼度で分析のために選択し、増幅することができる数百のコロニーを生成することができる。
【００３２】
好ましい宿主細胞は原核細胞であり、最も好ましくは細菌である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞が特に好ましい。特に有用な細胞及び細胞系統はＥ．ｃｏｌｉＢＪ５１８３から誘導される。この系は、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｒｅｃＢＣのＲｅｃＦ経路、ｓｂｃＢＣ菌株の使用に基づく。
【００３３】
好ましくは、ベクターに組み込むウイルス核酸（ここでは第一アデノウイルス配列と称する）は精製ウイルス核酸である。本明細書全体を通じて言及されるすべてのウイルス核酸（第一、第二及び第三核酸配列）は、ＤＮＡ（例えばＰＣＲ産物、ゲノム又はｃＤＮＡ）、ＲＮＡ又はその類似体であり、好ましくは線状である。精製ウイルス核酸は、精製ウイルスから抽出されるアデノウイルスゲノム混合物全体でありうる。ウイルスは、さらに、非常に高い継代数の増殖から得ることができる。代替的に、例えばＥ１相補細胞系統において組換え型を創造し、それらを細菌細胞（たとえ場ＢＪ５１８３）のベクター骨格内に環状化しようとする場合には、非常に低い継代数の増殖からウイルスを得ることもできる。この場合、野生型アデノウイルスが組換えアデノウイルスと過剰競合しない（連続継代の場合のように）ことを保証するために継代の数を限定することが重要である。
【００３４】
好ましくは、第一アデノウイルス配列はＥ１欠失アデノウイルス、Ｅ３欠失アデノウイルス、又はＥ１及びＥ３欠失アデノウイルスである。
【００３５】
特に好ましい実施形態では、第一アデノウイルス配列は外来遺伝子を含む。治療用途又はワクチンのための遺伝子がここでの使用について特に考慮される。目的とするタンパク質をコードする外来遺伝子は発現カセットの形態で存在しうる。遺伝子発現カセットは好ましくは、（ａ）目的とするタンパク質をコードする核酸、（ｂ）該タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結された異種プロモーター、及び（ｃ）転写ターミネーターを含む。
【００３６】
転写プロモーターは、好ましくは真核生物ＲＮＡポリメラーゼによって認識される。好ましい実施形態では、プロモーターは「強力な」又は「効率的な」プロモーターである。強力なプロモーターの例は、イントロンＡ配列を持つ又は持たない（それぞれＣＭＶ−ｉｎｔＡ及びＣＭＶ（イントロンなし））、前初期ヒトサイトメガロウイルスプロモーターである（参照してここに組み込まれる、Ｃｈａｐｍａｎら、１９９１　Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１９：３９７９−３９８６）。当業者は、強力な免疫グロブリンのような多くの他の既知のプロモーター、あるいはＥＦ１αプロモーター、マウスＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＳＶ４０初期／後期プロモーター及びβ−アクチンプロモーターを含めて、他の真核生物遺伝子プロモーターも使用しうる。
【００３７】
好ましい実施形態では、プラスミドはまた、Ｔｅｔオペレーター配列のような調節可能配列を含みうる。これは、例えば遺伝子産物が所望する以外の結果を生じさせ、抑制が求められる場合に極めて有用であろう。
【００３８】
遺伝子発現カセット内に存在する好ましい転写終結配列は、ウシ成長ホルモンターミネーター／ポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）及び次のように定義される、長さ５０ヌクレオチドの短い合成ポリＡシグナル（ＳＰＡ）：ＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧ（配列番号１）である。
【００３９】
従って、ここで提供するもう１つの方法は、（上述した）ベクター骨格内に、所望する遺伝子を担う組換えアデノウイルスを調製する方法である。この方法は、（ａ）相同的組換えの標的となる細胞内にも存在する、アデノウイルスゲノム内の領域に相同なアデノウイルス配列に隣接した所望遺伝子を含むベクターで相補細胞にトランスフェクション導入することにより、相補細胞内に、所望遺伝子を担う組換えアデノウイルスを作製すること、（ｂ）生成された組換えアデノウイルス核酸を抽出することを含む。次にこの核酸を、上記の説明に従って第二及び第三アデノウイルス配列を含む線状ベクターと共に細菌（又は他の原核生物）細胞に導入する。第一アデノウイルス配列はベクター内の第二及び第三アデノウイルス配列と相同的組換えを受け、ベクターの非アデノウイルスセグメントと組換え第一アデノウイルス配列の両方を含むベクターを生じる。
【００４０】
この工程は、上記に述べたのと同じ方法を利用し、基質、条件等々に関してすべて上記で設定したのと同じガイドラインに従う。出願人がここで提供するのは遊離アデノウイルス核酸のソースであり、それによって、所望遺伝子を含む複製欠損性ベクターを単離するための完全な方法が提供される。
【００４１】
多くの相補細胞のいずれかがこの方法において使用できる。特に好ましい相補細胞は、既知の細胞系統２９３及びＰＥＲ．Ｃ６（商標）を含めて、様々なＥ１相補細胞系統である。これらの細胞系統はいずれもアデノウイルスＥ１遺伝子産物を発現する。ＰＥＲ．Ｃ６（商標）はＷＯ９７／００３２６号（１９９７年１月３日公開）及び許諾された米国特許第６，０３３，９０８号に述べられている。これは、複製欠損性（ＦＧ）アデノウイルスの産生を相補するＥ１遺伝子セグメントを形質導入した一次ヒト網膜芽細胞系統であるが、相同的組換えによる複製コンピテントアデノウイルスの生成を妨げるように設計されている。特に有益な細胞は、４５９−３５１０塩基対（４５９と３５１０を含む）からの、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）のようなＡｄ５Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子をコードするトランスジーンで安定に形質転換されている。２９３細胞はＧｒａｈａｍら、１９７７　Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２に述べられている。
【００４２】
上述した工程を用いて提供されるもう１つの方法は、ベクター骨格内に所望遺伝子を担う組換えアデノウイルスを調製する方法である。これは、（ａ）野生型、突然変異型又は複製欠損型アデノウイルスをコードし、相同的組換えの標的となる領域内に制限酵素認識部位を含む、第一アデノウイルス配列を相補細胞に導入すること、（ｂ）アデノウイルスゲノム内の相同的組換えの標的となる領域に相同なアデノウイルス配列に隣接した所望遺伝子を含むベクターで該細胞にトランスフェクション導入することにより、該相補細胞内に所望遺伝子を担う組換えアデノウイルスを作製すること、（ｃ）段階（ａ）の制限酵素認識部位を特異的に消化することができる制限酵素で生じた細胞産物を消化すること、（ｄ）生じた組換えアデノウイルス核酸を前記相補細胞から抽出すること、および（ｅ）細菌（または原核生物）細胞内に前記核酸を線状ベクターと共に導入すること、前記線状ベクターは第二および第三アデノウイルス核酸配列ならびに非アデノウイルスセグメントを含み、第二配列は野生型アデノウイルス配列の５００塩基対を過ぎて越えないように野生型アデノウイルス配列の１−１００に対応する塩基対を含み、第三配列は野生型アデノウイルス配列の塩基対３５，８３５−３５，９３５に対応する塩基対を含み、を含む。ここで開示する他の方法についても、同じ好ましい実施形態、基質及びガイドラインがすべて適用される。
【００４３】
段階（ａ）において制限酵素認識部位が存在することにより、挿入配列が容易に同定される。制限部位を含む標的領域への遺伝子の挿入は制限部位（例えばＣｌａ１）を除去する。その後制限酵素（例えばＣｌａ１）で消化すると、所望遺伝子を持たない配列（この酵素による消化を受けやすい配列）は、段階（ｅ）のベクター内の第二及び第三アデノウイルス配列の両方との相同的組換えを受けることができなくなり、相同的組換えを受ける配列は所望する挿入を持つものであることが保証される。この方法は、目的とする挿入を担うアデノウイルスベクターの単離を効率化する。
【００４４】
実施例
実施例１
酵素及び試薬
制限酵素ＰａｃＩ、Ｘｂａ　Ｉ、Ａｖｒ　ＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、及びＢｓｔ　ＥＩＩをＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．から購入した。細菌細胞ペレット又はウイルスからのＤＮＡの抽出に使用した緩衝液飽和フェノールはＧｉｂｃｏＢＲＬ、カタログ番号１５５１３−０３９から購入した。ＤＮＡ精製キットＱＩＡＥＸＩＩ（カタログ番号２００２１）、Ｑｉａｇｅｎプラスミド精製カラム（カタログ番号１２１４５）及び試薬Ｐ１（カタログ番号１９０５１）、Ｐ２（カタログ番号１９０５２）及びＰ３（カタログ番号１９０５３）はすべてＱｉａｇｅｎから購入した。
【００４５】
実施例２
ウイルスＤＮＡの抽出
組換えアデノウイルスを継代１７と継代１９の試料から検討した。組換えアデノウイルスは、３５００ｂｐの大きさで、Ｅ１及びＥ３欠失Ａｄ５ベクターのＥ１領域に挿入されたトランスジーンを含んだ。精製ウイルスをプロナーゼ消化し、その後標準的なフェノール抽出とイソプロパノール沈殿で処理して、これらの２つの継代の各々からウイルスＤＮＡを抽出した。精製ウイルスＤＮＡをｄＨ２Ｏ　２０μｌに再懸濁した。Ａ２６０ｎｍでのＯＤ測定によってＤＮＡ濃度を決定した。
【００４６】
実施例３
「レスキュー」プラスミドの構築
Ｅ１及びＥ３欠失アデノベクタープレプラスミド（プラスミド骨格を持つアデノウイルス）をＸｂａ　ＩとＡｖｒ　ＩＩで消化してレスキューベクターを調製した。この二重消化は、１２１７９ｂｐ、７５５３ｂｐ、７１０３ｂｐ、２８８５ｂｐ及び２４８７ｂｐの大きさの５つのフラグメントを生じた。２８８５ｂｐフラグメントを、ＱＩＡＥＸＩＩキット（カタログ番号２００２１）を用いてゲル抽出した。このフラグメントは、複製起点、アンピシリン耐性遺伝子、Ａｄ５ゲノムの最左端の３７５ｂｐ及びＡｄ５ゲノムの最右端の４７７ｂｐを担うベクター骨格を含む。
【００４７】
５’アデノウイルス領域を１９５ｂｐの範囲に制限する、代替的な制限酵素、ＢｓｒＧ１も使用し、これがＸｂａ１制限酵素と同程度に効率的なゲノム回収を提供できることを認めた。
【００４８】
「レスキュー」プラスミドは、所望する長さのアデノウイルス末端相同性を含むように構築することができる。Ａｄ５と１００ｂｐの末端相同性を含む「レスキュー」プラスミドを構築するために、Ａｄ５野生型ゲノムの最も５’側の１００塩基対と野生型Ａｄ５ゲノムの最も３’側の１００塩基対を増幅するようにＰＣＲプライマーを設計することができる。適当な制限部位を含む、適切に設計されたＰＣＲプライマーを使用することにより、ＰＣＲ産物をｐＵＣ１８のような適当なクローニングベクターにクローニングすることができる。左端アデノウイルスＰＣＲ産物の３’末端と右端アデノウイルスＰＣＲ産物の５’末端は同じユニーク制限部位を含むはずなので、２つのフラグメントを一緒にクローニングベクターにクローニングすることは、「レスキュー」プラスミドを線状化するために使用される１個のユニーク制限部位を創造することになる。野生型アデノウイルス５のＤＮＡをＤＮＡ鋳型として使用する従来の方法に従ってＰＣＲ反応を実施する。代替的に、「レスキュー」プラスミドはどのような血清型の左端及び右端末端を含むようにも作製できる。
【００４９】
実施例４
大腸菌ＢＪ５１８３相同的組換え
精製アデノウイルス各々約１００ｎｇとＩＴＲセグメントを含む「レスキュー」プラスミドフラグメント約１００−２００ｎｇを無菌マイクロヒュージ管に加えた。このＤＮＡ混合物の総容量を２−６μｌに制限した。次に、参照してここに組み込まれる、Ｈａｎａｈａｎ　Ｄ．，１９８３　Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１６６：５７７−５８０に述べられているように、各々のＤＮＡ混合物を化学的にコンピテントな大腸菌ＢＪ５１８３細胞１００μｌに形質転換した。その後ＤＮＡと細胞を氷上で２０分間インキュベートした。４２℃の水浴中で４５秒間、細胞に熱ショックを与え、その後直ちに２分間氷上においた。室温で６００μｌ容量のＳＯＣ培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、カタログ番号１５５４４−０４２）を各々の管に加え、３７℃、２２０ｒｐｍで４５分間インキュベートした。インキュベーション後、各々の形質転換培養を、あらかじめ暖めておいた２つのアンピシリン寒天平板（ＢＢＬ（商標）、カタログ番号２９８２７３）上に均一に塗布した。平板を３７℃で放置して乾燥させた後、さかさにして一晩インキュベートした。参照してここに組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓに述べられている手順に従って、コロニーを無作為に選択し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むテリフィック肉汁２ｍｌに接種した。細胞の混濁が認められるまで、培養を３７℃、２２０ｒｐｍで約６時間インキュベートした。細胞を４，２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離してペレット化した。上清を廃棄し、管をハンドタオル上で逆さにして簡単に排水した。
【００５０】
実施例５
大腸菌ＢＪ５１８３形質転換からの全ＤＮＡの抽出
細胞ペレットをＱｉａｇｅｎ溶液Ｐ１（ＲＮアーゼ１を含む）１５０μｌで再懸濁し、無菌マイクロヒュージ管に移した。Ｑｉａｇｅｎ溶液Ｐ２（細胞溶解緩衝液）１５０μｌを加え、各々の管を静かに４−６回さかさにした。５分間以下だけ細胞溶解を進行させ、その後Ｑｉａｇｅｎ溶液Ｐ３（中和溶液）１５０μｌを各々のチューブに加えた。静かに４−６回さかさにすることによって混合を行った。白色沈殿物を認めた。管を含水氷上に１０分間置き、次いでさらに５分間ドライアイス上に置いた。マイクロヒュージ管を１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して沈殿物をペレット化した。上清を新鮮マイクロヒュージ管に移した。フェノール−クロロホルム抽出後、ＤＮＡをイソプロパノールで沈殿させた。ペレットを乾燥するため、管を高熱で５分間凍結乾燥器に入れた。代替的に、ペレットを１５−２０分間空気乾燥した。イソプロパノールのすべての残部を除去した後、ペレットをｄＨ２Ｏ　２０μｌに再懸濁した。
【００５１】
実施例６
大腸菌ＸＬ−１の形質転換
ＢＪ５１８３細胞からの各々の精製ＤＮＡ２μｌを化学的コンピテント大腸菌ＸＬ１　ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２００２４９）５０μｌに加えた。氷上で２０分間インキュベートした後、形質転換混合物に４２℃で４５秒間熱ショックを与え、その後直ちに２分間氷上に置いた。次に室温でＳＯＣ培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、カタログ番号１５５４４−０４２）３００μｌを各々の管に加えた。各々及び／又はの形質転換５０μｌと１５０μｌをあらかじめ暖めておいたＬＢ＋アンピシリン含有平板（ＢＢＬ（商標）、カタログ番号２９８２７３）上に塗布した後、ＳＯＣ中の形質転換混合物を３７℃、２２０ｒｐｍで４５分間インキュベートした。平板を乾燥させた後、さかさにして３７℃で一晩インキュベートした。各々のＢＪ５１８３形質転換から１つのコロニーを選択し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むルリア肉汁（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）５０−１００ｍｌ中で一晩増殖させた。Ｑｉａｇｅｎカラム（カタログ番号１２１４５）を使用してプラスミドＤＮＡのミニプレップを調製した。ＤＮＡをｄＨ２Ｏ　２０μｌに再懸濁した。２６０ｎｍでの溶液の読み取りを用いてＤＮＡ濃度を決定した。
【００５２】
実施例７
診断的制限分析
アデノウイルスゲノムの長さに沿った、ならびにトランスジーン領域内の再配列の同定を可能にする適切な制限酵素を選択した。プラスミドから回収したウイルスゲノムと精製ウイルスＤＮＡの制限パターンを比較するため、プラスミドＤＮＡ試料を最初にＰａｃ　Ｉで消化してベクター骨格を放出させた後、選択した制限酵素で消化した。生じたパターンを、最初に個々のウイルスゲノムを回収するために使用したプールロットからの精製ウイルスＤＮＡと比較した。各試料からのＤＮＡ１μｇを適切な制限酵素で消化し、０．８−１．０％アガロースゲルに充填した。電気泳動後、ゲルをエチジウムブロミドで染色し、ＵＶ透視器で観察した。
【００５３】
実施例８
結果
図２Ａ及び２Ｂは、細菌相同的組換えによって単離した３６の個別ウイルスプラスミドクローンのゲルパターンを示す。図２Ａは、ウイルスの最初のレスキューにおいて使用したプレプラスミドＤＮＡと比較した、１８の個別クローンのＢｓｔ　ＥＩＩ消化後の制限消化パターンを示す。図が示すように、継代１９のこのウイルスから同定された様々な再配列が存在する。対照プレプラスミドレーンと比較して、１８の試料から１つだけ（クローンＮｏ．１３）が対照プレプラスミドと同一のパターンを示す。この分析において同定可能な他の４種類の制限パターンが存在する。１８のうち１１が１つの型のパターンを示し（クローンＮｏ．２、４、５、６、７、９、１０、１１、１４、１５及び１７）、１８のうち４は異なるパターンを示す（クローンＮｏ．１、８、１６及び１８）。クローンＮｏ．３とＮｏ．１２は各々、やはり親プレプラスミドと異なるユニークパターンを示す。
【００５４】
図２Ｂは、同じウイルスのより早い継代（継代１７）から単離した１８クローンの２番目のセットのＰａｃ　Ｉ及びＨｉｎｄ　ＩＩＩ二重消化を示す。Ｐａｃ　Ｉ消化を実施する目的はベクター骨格を除去することであるので、制限パターンは、個々のゲノムの単離のために使用したウイルスＤＮＡ試料と直接比較することができる。このコホートでは、２個のクローン（クローンＮｏ．６及びＮｏ．１８）だけが対照プレプラスミドと同一のパターンを示す。正常パターンを別にして、この分析で同定可能な６種類の制限パターンが存在する。クローンＮｏ．１、３、８及び１５は１セットの消化パターンを示す。レーン２と５からのクローン、レーン９と１４からのクローン、そしてレーン７、１０、１１、１２、１３及び１７からのクローンでは異なる制限パターンが認められる。レーン４と１６からのクローンは各々ユニーク制限パターンを示す。
【００５５】
再配列を含まないことが既知である（放射性制限分析によって分析したとき）ウイルス試料が、この細菌の相同的組換え系を用いて５０のゲノムを単離した後、再配列の所見を生じなかったことから、この試験で同定された再配列が大腸菌自体によって誘導されたのではないことを確認した。
【図面の簡単な説明】
【図１】
細菌相同的組換え系における完全なアデノウイルスゲノムの回収の例示である。
【図２Ａ】
単離したクローンの制限消化分析を示し、Ｐ１９まで継代した組換えアデノウイルスから細菌相同的組換えによって単離した１８の個別アデノウイルスクローンのＢｓｔ　ＥＩＩ消化後の制限消化パターンを示す。
【図２Ｂ】
単離したクローンの制限消化分析を示し、Ｐ１７まで継代した組換えアデノウイルスから細菌相同的組換えによって単離した１８の個別アデノウイルスクローンのＰａｃ　Ｉ及びＨｉｎｄ　ＩＩＩ二重消化後の制限消化パターンを示す。
【図３Ａ】
アデノウイルス末端領域の長いセグメントがどのようにしてアデノウイルスゲノム初期領域における突然変異を見落としてしまうかを例示し、長い末端領域を使用して「レスキュー」プラスミドを作製した場合に起こりうる組換え事象を示す。
【図３Ｂ】
「レスキュー」プラスミドの末端相同性を制限することにより、交叉事象はパッケージング領域の５’側で起こることを強いられることを示す。
【図４】
「レスキュー」プラスミドとウイルスＤＮＡ「プール」からの完全な工程を図式的に示す。
【図１】
2004511233.tif 000003
【図２Ａ】
2004511233.tif 000004
【図２Ｂ】
2004511233.tif 000005
【図３Ａ】
2004511233.tif 000006
【図３Ｂ】
2004511233.tif 000007
【図４】
2004511233.tif 000008
【国際公開パンフレット】
2004511233.tif 000009
2004511233.tif 000010
2004511233.tif 000011
2004511233.tif 000012
2004511233.tif 000013
2004511233.tif 000014
2004511233.tif 000015
2004511233.tif 000016
2004511233.tif 000017
2004511233.tif 000018
2004511233.tif 000019
2004511233.tif 000020
2004511233.tif 000021
2004511233.tif 000022
2004511233.tif 000023
2004511233.tif 000024
2004511233.tif 000025
2004511233.tif 000026
2004511233.tif 000027
2004511233.tif 000028
2004511233.tif 000029
2004511233.tif 000030
2004511233.tif 000031
2004511233.tif 000032
2004511233.tif 000033
2004511233.tif 000034
2004511233.tif 000035
2004511233.tif 000036
2004511233.tif 000037
【国際調査報告】
2004511233.tif 000038