(57)【要約】吸着性表面を有する微粒子、このような微粒子を作製する方法、およびその使用が開示される。この微粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物などのポリマーを含み、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、または非イオン性界面活性剤を用いて形成される。代謝可能な油および乳化剤を有する油飛沫エマルジョンのサブミクロンエマルジョンの形態の微粒子がまた、提供される。この微粒子表面は、ポリペプチド（例えば、抗原）、ならびに核酸（例えば、ＥＬＶＩＳベクターおよび生物学的に活性な高分子（例えば、ポリペプチド、抗原およびアジュバント）をコードする異種核酸配列を含む他のベクター構築物）を効率的に吸着する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主動物において免疫応答を生じる方法であって、以下：
第一の抗原をコードする異種核酸配列を含むベクター構築物を、免疫学的応答を誘発するための有効量で該動物に投与する工程であって、ここで、該ベクター構築物は、（ｉ）ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマー、ならびに（ｉｉ）界面活性剤、を含む微粒子に吸着されている、工程；ならびに
続いて、該動物に対して第二の抗原を投与することにより該免疫学的応答を追加する工程であって、ここで、該第一の抗原および該第二の抗原は同一であるか、または異なり得る工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記第一の抗原および前記第二の抗原が同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ベクター構築物がプラスミドＤＮＡおよびＲＮＡベクター構築物より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記プラスミドＤＮＡがＥＬＶＩＳベクターである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記ＥＬＶＩＳベクターがアルファウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス、パラミクソウイルス、および黄熱ウイルスからなる群より選択されるメンバー由来のＲＮＡベクター構築物のｃＤＮＡ相補体を含む、方法。
【請求項６】
前記アルファウイルスが、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、またはロスリバーウイルスからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記プラスミドＤＮＡがＣＭＶプロモーター／エンハンサーを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記第一の抗原および前記第二の抗原が、ＨＩＶ抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗原、およびＡ型インフルエンザウイルス抗原からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第一の抗原および前記第二の抗原が、ＨＩＶ抗原のｇｐ１２０、ｇｐ１４０、ｇｐ１６０、ｐ２４ｇａｇ、ｐ５５ｇａｇからなる群より選択される抗原を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第一の抗原および前記第二の抗原が、ＨＩＶ  ｐ５５ｇｐｇを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第一の抗原および前記第二の抗原が、ＨＩＶ  ｐｇ１４０を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、前記第二の抗原が、（ｉ）ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマー、ならびに（ｉｉ）界面活性剤、を含む微粒子に吸着される、方法。
【請求項１３】
前記第二の抗原がアジュバントと同時投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記アジュバントがＭＦ５９である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法であって、前記ポリマーが、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）およびポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）からなる群より選択されるポリ（α−ヒドロキシ酸）を含み、かつ前記界面活性剤が、ＣＴＡＢ、塩化ベンザルコニウム、ＤＤＡおよびＤＯＴＡＰより選択されるカチオン性界面活性剤を含む、方法。
【請求項１６】
前記ベクター構築物が、前記第二の抗原が投与される前に２回以上投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記第二の抗原がまた、２回以上投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、
前記ベクター構築物が、（ａ）最初の投与時期、（ｂ）最初の投与から１〜８週間の範囲の時期、および（ｃ）最初の投与から４〜３２週間の範囲の時期に投与され、そして
前記第二の抗原が、（ａ）最初の投与から８〜５０週間の範囲の時期、および（ｂ）最初の投与から８〜１００週間の範囲の時期に投与される、方法。
【請求項１９】
前記動物がアカゲザルおよびヒトより選択される哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ベクター構築物および前記第二の抗原が、皮下投与、腹腔内投与、皮内投与、静脈内投与または筋内投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ベクター構築物および前記第二の抗原が、筋内投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ベクター構築物がアジュバントと同時投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記免疫応答がＴｈ１免疫応答を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記免疫応答がＣＴＬ免疫応答を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記免疫応答が、ウイルス感染、細菌感染または寄生虫感染に対して生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
第一の生物学的に活性な高分子が吸着されている吸着性表面を有する微粒子であって、以下：
（ａ）（ｉ）ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマー；ならびに界面活性剤を含む、ポリマー微粒子；および（ｂ）（ｉ）代謝可能な油；および（ｉｉ）１つ以上の乳化剤を含むサブミクロンエマルジョン、からなる群より選択される微粒子；ならびに
ＥＬＶＩＳベクターおよびＲＮＡベクター構築物からなる群より選択される、少なくとも１つのベクター構築物を含む核酸分子である、該第一の生物学的に活性な高分子、
を含む、微粒子。
【請求項２７】
前記サブミクロンエマルジョンが前記微粒子として選択される、請求項２６に記載の微粒子。
【請求項２８】
前記ポリマー微粒子が前記微粒子として選択される、請求項２６に記載の微粒子。
【請求項２９】
請求項２８に記載の微粒子であって、前記ポリマー微粒子が、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）およびポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）からなる群より選択されるポリ（α−ヒドロキシ酸）を含む、微粒子。
【請求項３０】
請求項２８に記載の微粒子であって、前記ポリマーがポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）を含む、微粒子。
【請求項３１】
前記微粒子内に取りこまれた第二の生物学的に活性な高分子をさらに含む請求項２８に記載の微粒子であって、該第二の生物学的に活性な高分子が、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、薬剤、ポリペプチド、ホルモン、酵素、転写メディエーターまたは翻訳メディエーター、代謝経路における中間体、免疫モジュレーター、抗原およびアジュバントからなる群より選択されるメンバーである、微粒子。
【請求項３２】
前記ベクター構築物がＥＬＶＩＳベクターである、請求項２８に記載の微粒子。
【請求項３３】
請求項２８に記載の微粒子であって、前記ベクター構築物が、アルファウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス、パラミクソウイルス、および黄熱ウイルスからなる群より選択されるメンバー由来のＲＮＡベクター構築物のｃＤＮＡ相補体を含む前記ＥＬＶＩＳベクターであり、かつ該ＲＮＡベクター構築物が、選択された異種ヌクレオチド配列をさらに含む、微粒子。
【請求項３４】
請求項３３に記載の微粒子であって、前記ＥＬＶＩＳベクターが、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、またはロスリバーウイルスからなる群より選択されるアルファウイルス由来である、微粒子。
【請求項３５】
請求項２８に記載の微粒子であって、前記ベクター構築物が、アルファウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス、パラミクソウイルス、および黄熱ウイルスからなる群より選択されるメンバー由来のＲＮＡベクター構築物であり、かつ該ＲＮＡベクター構築物が、選択された異種ヌクレオチド配列を含む、微粒子。
【請求項３６】
請求項３５に記載の微粒子であって、前記ＲＮＡベクター構築物が、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、またはロスリバーウイルスからなる群より選択されるアルファウイルスに由来する、微粒子。
【請求項３７】
請求項３２に記載の微粒子であって、前記ベクター構築物が、薬剤、ポリペプチド、ホルモン、酵素、転写メディエーターまたは翻訳メディエーター、代謝経路における中間体、免疫モジュレーター、抗原およびアジュバントからなる群より選択されるメンバーをコードする異種核酸配列を含む、微粒子。
【請求項３８】
前記異種核酸配列が抗原をコードする、請求項３７に記載の微粒子。
【請求項３９】
前記抗原が、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ＨＩＶ  ｇｐ１４０、ＨＩＶ  ｐ２４ｇａｇ、ＨＩＶ  ｐ５５ｇａｇ、およびインフルエンザＡ血球凝集抗原からなる群より選択されるメンバーである、請求項３８に記載の微粒子。
【請求項４０】
前記ベクター構築物が、ＥＬＶＩＳベクターのｐＳＩＮＣＰ−ｇｐ１４０およびｐＳＩＮＣＰ−ｐ５５ｇａｇからなる群から選択されるベクターである、請求項３２に記載の微粒子。
【請求項４１】
請求項２８に記載の微粒子であって、該微粒子が、その表面上に吸着される少なくとも１つの第二の生物学的に活性な高分子をさらに含み、ここで、該第二の生物学的に活性な高分子が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、抗原、薬剤、ホルモン、酵素、転写メディエーターまたは翻訳メディエーター、代謝経路における中間体、免疫モジュレーターおよびアジュバントからなる群より選択される少なくとも１つのメンバーである、微粒子。
【請求項４２】
前記第二の生物学的に活性な高分子が抗原である、請求項４１に記載の微粒子。
【請求項４３】
前記第二の生物学的に活性な高分子が、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ＨＩＶ  ｇｐ１４０、ＨＩＶ  ｐ２４ｇａｇ、ＨＩＶ  ｐ５５ｇａｇ、およびインフルエンザＡ血球凝集抗原からなる群より選択される抗原である、請求項４２に記載の微粒子。
【請求項４４】
前記第二の生物学的に活性な高分子が、ＨＩＶ  ｇｐ１４０をコードするポリヌクレオチドである、請求項４１に記載の微粒子。
【請求項４５】
前記第二の生物学的に活性な高分子が、アジュバントである、請求項４１に記載の微粒子。
【請求項４６】
前記アジュバントがアルミニウム塩である、請求項４５に記載の微粒子。
【請求項４７】
請求項２６に記載の微粒子および薬学的に受容可能な賦形剤を含む、微粒子組成物。
【請求項４８】
アジュバントをさらに含む、請求項４７に記載の微粒子組成物。
【請求項４９】
前記アジュバントが、ＣｐＧオリゴヌクレオチドからなる群より選択されるメンバーである、請求項４８に記載の微粒子組成物。
【請求項５０】
前記アジュバントが、リン酸塩アルミニウムであるアルミニウム塩である、請求項４８に記載の微粒子組成物。
【請求項５１】
選択される核酸配列を発現し得るベクター構築物が吸着されている吸着性表面を有する微粒子を産生する方法であって、該方法が、以下の工程：
（ａ）ポリマー溶液および界面活性剤の混合物を乳化してエマルジョンを形成する工程であって、ここで、該ポリマー溶液が、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマーを含み、該ポリマーが、有機溶媒中に約１％〜約３０％の濃度で存在し、かつ該界面活性剤が、約０．００００１：１〜約０．５：１のポリマーに対する界面活性剤の重量  対  重量の比率で該混合物中に存在する工程；
（ｂ）該微粒子を形成するために、該エマルジョンから該有機溶媒を除去する工程；ならびに
（ｃ）該微粒子の表面に該ベクター構築物を吸着させる工程であって、ここで該ベクター構築物が、ＥＬＶＩＳベクターおよびＲＮＡベクター構築物からなる群より選択される工程、
を包含する、方法。
【請求項５２】
請求項５１に記載の方法であって、前記ベクター構築物がＥＬＶＩＳベクターまたはＲＮＡベクター構築物であり、かつ薬剤、ポリペプチド、ホルモン、酵素、転写メディエーターまたは翻訳メディエーター、代謝経路における中間体、免疫モジュレーター、抗原およびアジュバントからなる群より選択されるメンバーをコードする異種核酸配列を含む、方法。
【請求項５３】
前記異種核酸配列が、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ＨＩＶ  ｇｐ１４０、ＨＩＶ  ｐ２４ｇａｇ、ＨＩＶ  ｐ５５ｇａｇ、およびインフルエンザＡ血球凝集抗原からなる群より選択される抗原をコードする、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記抗原がＨＩＶ  ｇｐ１４０である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
請求項５１に記載の方法に従って作製された微粒子。
【請求項５６】
請求項５５に記載の微粒子および薬学的に受容可能な賦形剤を含む、微粒子組成物。
【請求項５７】
宿主動物において免疫応答を誘導する方法であって、該方法が、請求項４７に記載の微粒子組成物を該動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項５８】
哺乳動物がヒトである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ウイルス感染、細菌感染、または寄生虫感染に対して宿主動物を免疫する方法であって、該方法が、請求項４７に記載の微粒子組成物を該動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項６０】
哺乳動物がヒトである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
宿主動物においてＴｈ１免疫応答を誘導する方法であって、該方法が、請求項４７に記載の微粒子組成物を該動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項６２】
哺乳動物がヒトである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
宿主動物においてＣＴＬ免疫応答を誘導する方法であって、該方法が、請求項４７に記載の微粒子組成物を該動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項６４】
哺乳動物がヒトである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
宿主動物に治療有効量の高分子を送達する方法であって、該方法が、請求項４７に記載の微粒子組成物を、脊椎動物被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項６６】
哺乳動物がヒトである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
ウイルス感染、細菌感染、または寄生虫感染を有する宿主動物を処置する方法であって、該方法が、請求項４７に記載の微粒子組成物を、その感染のレベルを減じるための有効量で該動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項６８】
哺乳動物がヒトである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
疾患治療のための、請求項４７に記載の微粒子組成物の使用。
【請求項７０】
ワクチンのための、請求項４７に記載の微粒子組成物の使用。
【請求項７１】
免疫応答を生じるための、請求項４７に記載の微粒子組成物の使用。
【請求項７２】
請求項３９に記載の微粒子であって、前記異種核酸配列が、ＨＩＶ  ｇａｇポリペプチドをコードし、かつ以下：配列番号６３のヌクレオチド８４４〜９０３、配列番号６４のヌクレオチド８４１〜９００、配列番号６５のヌクレオチド１５１３〜２５４７、配列番号６６のヌクレオチド１２１０〜１３５３、配列番号６７のヌクレオチド１２１３〜１３５３、および配列番号６８のヌクレオチド８２〜１５１２からなる群より選択される配列に、少なくとも９０％同一性を有する配列を含む、微粒子。
【請求項７３】
請求項３９に記載の微粒子であって、前記異種核酸配列が、ＨＩＶ  エンベロープポリペプチドをコードし、かつ以下：配列番号６３のヌクレオチド８４４〜９０３、配列番号６４のヌクレオチド８４１〜９００、配列番号６５のヌクレオチド１５１３〜２５４７、配列番号６６のヌクレオチド１２１０〜１３５３、配列番号６７のヌクレオチド１２１３〜１３５３、および配列番号６８のヌクレオチド８２〜１５１２からなる群より選択される配列に、少なくとも９０％同一性を有する配列を含む、微粒子。
【請求項７４】
請求項５３に記載の方法であって、前記異種核酸配列が、ＨＩＶ  ｇａｇポリペプチドをコードし、かつ以下：配列番号６３のヌクレオチド８４４〜９０３、配列番号６４のヌクレオチド８４１〜９００、配列番号６５のヌクレオチド１５１３〜２５４７、配列番号６６のヌクレオチド１２１０〜１３５３、配列番号６７のヌクレオチド１２１３〜１３５３、および配列番号６８のヌクレオチド８２〜１５１２からなる群より選択される配列に、少なくとも９０％同一性を有する配列を含む、方法。
【請求項７５】
請求項５３に記載の方法であって、前記異種核酸配列が、ＨＩＶ  エンベロープポリペプチドをコードし、かつ以下：配列番号６３のヌクレオチド８４４〜９０３、配列番号６４のヌクレオチド８４１〜９００、配列番号６５のヌクレオチド１５１３〜２５４７、配列番号６６のヌクレオチド１２１０〜１３５３、配列番号６７のヌクレオチド１２１３〜１３５３、および配列番号６８のヌクレオチド８２〜１５１２からなる群より選択される配列に、少なくとも９０％同一性を有する配列を含む、方法。
【請求項７６】
請求項２７に記載の微粒子であって、（ａ）前記油がテルペノイドであり、かつ（ｂ）前記１つ以上の乳化剤が、１つ以上の非イオン性界面活性剤および１つ以上のカチオン性界面活性剤を含む、微粒子。
【請求項７７】
前記油がスクアレンであり、かつ前記１つ以上の乳化剤が、以下：ポリオキシエチエンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、およびＤＯＴＡＰを含む、請求項７６に記載の微粒子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、概して、薬学的組成物に関する。特に、本発明は、生物学的に活性な薬剤、特に核酸（例えば、プラスミドＤＮＡ、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｌａｙｅｒｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＥＬＶＩＳベクター）またはＲＮＡベクター構築物を吸着する吸着性の表面を有するポリマーの微粒子またはサブミクロンのエマルジョン、このような微粒子およびサブミクロンエマルジョンを調製する方法、ならびにその使用（免疫応答の誘導、ワクチン、ならびに真核生物細胞および動物への異種ヌクレオチド配列の送達を含む）に関する。
【０００２】
（背景）
粒子状のキャリアは、治療化合物の制御された非経口送達を達成するために使用されている。このようなキャリアは、延長された期間、送達系において活性剤を維持するよう設計されている。粒子状キャリアの例として、ポリメチルメタクリレートポリマーから誘導されるキャリア、ならびに、ポリ（ラクチド）（例えば、米国特許第３，７７３，９１９号を参照のこと）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧとして知られている）（例えば、米国特許第４，７６７，６２８号を参照のこと）、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧとして知られている）（例えば、米国特許第５，６４８，０９５号を参照のこと）から誘導される微粒子が挙げられる。ポリメチルメタクリレートポリマーは非分解性であるが、ＰＬＧ粒子は、エステル結合の無作為な非酵素的加水分解により分解し、乳酸およびグリコール酸となり、通常の代謝経路に沿って排出される。
【０００３】
例えば、米国特許第５，６４８，０９５号は、カプセル化された薬剤を有するミクロスフィアの、鼻送達、経口送達、肺送達、および経口送達用の薬物送達系としての使用を記載している。種々のポリペプチド成長因子を含む緩効性処方物もまた記載されている。例えば、国際公開番号ＷＯ９４／１２１５８、米国特許第５，１３４，１２２号、および国際公開番号ＷＯ９６／３７２１６を参照のこと。
【０００４】
Ｆａｔｔａｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ５３：１３７−１４３（１９９８）は、吸着したオリゴヌクレオチドを有するポリアルキルシアノアクリレート（ＰＡＣＡ）から調製されたナノ粒子を記載している。
【０００５】
粒子状キャリア（例えば、微粒子）はまた、十分な免疫応答を惹起するために、吸着または捕捉された抗原と共に使用されている。このようなキャリアは、免疫系に複数コピーの選択された抗原を提示し、そして局所的なリンパ節における抗原の捕捉および保持を促進する。この粒子は、マクロファージにより貪食され得、そしてサイトカイン放出を通して抗原提示を増強し得る。例えば、共願の同時係属中の出願０９／０１５，６５２（１９９８年１月２９日出願）は、細胞媒介性免疫応答を刺激するための、抗原吸着微粒子および抗原カプセル化微粒子の使用、ならびにこの微粒子を作製する方法を記載している。
【０００６】
共願の特許出願番号０９／０１５，６５２において、例えば、微粒子を形成する方法が開示されている。この方法は、有機溶媒とポリマーを合わせる工程、次いでエマルジョン安定化剤（例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ））を添加する工程、次いで有機溶媒をエバポレートし、それによって微粒子を形成する工程を包含する。この微粒子の表面は、ポリマーおよび安定化剤を含む。次いで、高分子（例えば、ＥＬＩＶＩＳベクター）、他のヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、ポリペプチド、および抗原は、この表面に吸着され得る。
【０００７】
アジュバントは、抗原に対する免疫応答を増強し得る化合物である。アジュバントは、体液性免疫および細胞性免疫の両方を増強し得る。しかし、特定の病原が細胞性免疫、そして特にＴｈ１細胞を刺激することが好ましい。多くの例において、現在使用されているアジュバントは、Ｔｈ１細胞応答を十分に誘導せず、そして／または有害な副作用を有する。
【０００８】
現在、米国においてヒトへの使用について承認された唯一のアジュバントは、アルミニウム塩（ミョウバン）である。これらのアジュバントは、いくつかのワクチン（Ｂ型肝炎、ジフテリア、ポリオ、狂犬病、およびインフルエンザを含む）について有用であるが、他のワクチンについては有用でないかもしれない。例えば、報告により、ミョウバンは、百日咳ワクチンおよび腸チフスワクチンの効果を改善せず、そしてアデノウイルスワクチンによりわずかな効果が提供されるのみであることが示されている。さらに、注入部位での肉芽腫の誘導およびアルミニウム塩調製物の多くの（ｌｏｔ−ｔｏ−ｌｏｔ）バリエーションのような問題が、起こっている。
【０００９】
生物分解性かつ生物適合性のポリマー（ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）として知られている）から調製された微粒子は、多くの抗原に対して有効な媒体であることが実証された。さらに、ＰＬＧ微粒子は、捕捉された抗原の放出速度を制御し得る。従って、ＰＬＧ微粒子は、単一用量ワクチンの可能性を提供する。さらに、捕捉された抗原を有する生物分解性ポリマーの投与は、動物モデルの範囲で、強力な免疫応答を誘導することが実証された。Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、１９９８、３２、２２５−２４６およびＳｉｎｇｈら、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、１９９８、３４、２８５−３０４。これらの開示は、本明細書中でその全体において参考として援用される。
【００１０】
均一な大きさの微量滴を提供するために微流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅ）された、スクアレン、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５ＴＭ）、およびポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０ＴＭ）を含むエマルジョン（すなわち、ＭＦ５９）はまた、強力な免疫応答を誘導することが示された。ＭＦ５９処方物は、アルミニウム塩アジュバントにより獲得される抗体力価よりも５〜＞１００倍大きい抗体力価を誘導することが示された。ＭＦ５９は、多くの供給源（例えば、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、およびマラリアを含む）由来の抗原に対する免疫応答を増強することが実証された。Ｏｔｔら、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  Ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、１９９５、Ｍ．Ｆ．ＰｏｗｅｌｌおよびＭ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２７７〜２９６頁；Ｓｉｎｇｈら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９８、１６：１８２２−１８２７；Ｏｔｔら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９５、１３、１５５７−１５６２；Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ｍｏｌ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｔｏｄａｙ、１９９７、Ｆｅｂｒｕａｒｙ、６９−７５；ならびにＴｒａｑｕｉｎａら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１９９６、１７４、１１６８−７５、これらの開示は、本明細書中でその全体において、参考として援用される。ＭＦ５９アジュバントは、ミョウバンアジュバントの安全性および耐性プロフィールを維持しつつ、サブユニット抗原の免疫原性を改善する。Ｖａｎ  Ｎｅｓｔら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９２、１９９２、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、５７−６２およびＶａｌｅｎｓｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９４、１５３、４０２９−３９、これらの開示は、本明細書中でその全体において、参考として援用される。ＭＦ５９はさらに、同時係属中の米国出願番号０８／４３４，５１２（１９９５年５月４日出願）（これは、本発明の譲受人に譲渡されている）（この開示は、本明細書中でその全体において、参考として援用される）に記載されている。動物研究において、ＭＦ５９は、遺伝子毒性も、催奇性も見出されておらず、また、これは、感作も引き起さない。ＭＦ５９の作用機構は、強力なＣＤ４＋Ｔ細胞（すなわちＴｈ２細胞）応答の発生に依存するようである。しかし、ＭＦ５９アジュバントは、存在するとしても、ほとんどＴｈ１応答または細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘導しない。
【００１１】
抗原と混合されたＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、強力なＴｈ１免疫応答を誘導することが実証された。Ｒｏｍａｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１９９７、３、８４９−８５４；Ｗｅｉｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９７、９４、１０８３３−１０８３７；Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８、１６０、８７０−８７６；Ｃｈｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９７、１８６、１６２３−１６３１；Ｌｉｐｆｏｒｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７、２７、２３４０−２３４４；およびＭｏｌｄｏｖｅａｎｕら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９８、１６、１２１６−１２２４、これらの開示は、本明細書中でその全体において、参考として援用される。非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドは、細菌ＤＮＡにおいて比較的一般的であるが、脊椎動物ＤＮＡにおいてはそれより少なく見られ、そしてメチル化されている。Ｂｉｒｄ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．、１９８７、３、３４２−３４７。非メチル化ＣｐＧモチーフを含む細菌ＤＮＡまたは合成オリゴヌクレオチドはまた、免疫応答（例えば、Ｂ細胞増殖、インターロイキン−６および免疫グロブリン分泌、ならびにアポトーシス抵抗性）を誘導することが公知である。Ｋｒｉｅｇら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９５、３７４、５４６−５４９；Ｋｌｉｎｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９６、９３、２８７９−２８８３；Ｂａｌｌａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７、１８４０−１８４５；Ｃｏｗｄｅｒｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５６、４５７０−４５７５；Ｈａｌｐｅｒｎら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１６７、７２−７８；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９８８、７９、８６６−８７３；Ｓｔａｃｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７、２１１６−２１２２；Ｍｅｓｓｉｎａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９１、１４７、１７５９−１７６４；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７、４９１８−４９２５；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６、１５７、５３９４−５４０２；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８、１６０、４７５５−４７６１；およびＹｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８、１６０、５８９８−５９０６；ＰＣＴ公開ＷＯ９６／０２５５５；ＰＣＴ公開ＷＯ９８／１６２４７；ＰＣＴ公開ＷＯ９８／１８８１０；ＰＣＴ公開ＷＯ９８／４０１００；ＰＣＴ公開ＷＯ９８／５５４９５；ＰＣＴ公開ＷＯ９８／３７９１９；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９８／５２５８１、これらの開示は、本明細書中でその全体において、参考として援用される。
【００１２】
カチオン性脂質ベースのエマルジョンが遺伝子キャリアとして使用され得ることもまた示されている。例えば、Ｙｉら、Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．、２４：６５３−６５４（１９９７）；Ｋｉｍら、Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．、２５：３４４−３４５（１９９８）；Ｋｉｍら、Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．、２６、＃５４３８（１９９９）を参照のこと。カチオン性サブミクロンエマルジョン（薬学的送達に対するいくつかの最近のアプローチ）は、低分子薬物に対する収容力を有することが初めて示された（Ｅｌｂａｚら  １９９３  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．９６  Ｒ１−Ｒ６）。血清中でオリゴヌクレオチドを安定に結合し、そして保護する荷電した表面の使用は、小オリゴマー（Ｔｅｉｘｅｒａら（１９９９）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  １６  ３０−３６）およびプラスミドＤＮＡ（Ｙｉら（２０００）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  １７３１４−３２０）の両方について実証されている。ＤＯＴＡＰベースのエマルジョンは、インビトロおよびインビボでのトランスフェクションを増強することが示された（Ｋｉｍら、前出）。
【００１３】
従って、予防的処置および治療的処置に使用され得るＴｈ１細胞応答を増加させるアジュバントが望ましい。このような応答は、例えば、ウイルス感染の処置における補助となり、そしてウイルス感染が疑われる個体を免疫するための補助となる。
【００１４】
米国特許第５，８１４，４８２号および同第６，０１５，６８６号は、とりわけ、病原性因子を阻害する方法および真核生物細胞ならびに動物細胞への異種ヌクレオチド配列の送達において、抗原に対する免疫応答を刺激するのに使用するための、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｌａｙｅｒｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＥＬＶＩＳベクター）、特にアルファウイルスゲノム（例えば、ジンドビスウイルス）から獲得および構築されるベクターを開示している。
【００１５】
共願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７３０８および米国特許出願０９／７１５，９０２は、吸着した高分子（例えば、薬剤、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、ホルモン、酵素、転写メディエーターまたは翻訳メディエーター、代謝経路における中間体、免疫モジュレーター、抗原、アジュバント、またはそれらの組み合わせなど）を有する微粒子を作製するための方法を開示している。
【００１６】
共願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／０３３３１は、吸着した高分子（例えば、薬剤、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、ホルモン、酵素、転写メディエーターまたは翻訳メディエーター、代謝経路における中間体、免疫モジュレーター、抗原、アジュバント、またはそれらの組み合わせなど）を有するサブミクロンエマルジョンを作製する方法を開示している。
【００１７】
（発明の要旨）
本発明者らは、核酸、詳細には、核酸配列を発現し得るベクター構築物、そしてより詳細には、抗原をコードする異種核酸配列を含むベクター構築物（例えば、ｐＣＭＶベクター、ＥＬＶＩＳベクター、またはＲＮＡベクター構築物）の種々の用途の有効性が、動物細胞へのベクター構築物の導入およびベクター構築物中に含まれる異種核酸配列の導入を容易にする吸着表面を有するポリマー微粒子またはサブミクロンエマルジョンに、ベクター構築物を吸着させることにより増強されることを発見した。
【００１８】
上記の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７３０８に開示される通り、広範な種々の高分子に吸着し得る吸着表面を有する微粒子を形成する方法を発明した。１つの実施形態において、この微粒子は、ポリマーおよび界面活性剤の両方を含む。本発明の微粒子は、現在利用可能な他の微粒子よりもより効果的にこのような高分子を吸着する。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリシアノアクリレートなどのようなポリマーから誘導され、そしてカチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、または非イオン性界面活性剤のような界面活性剤（これらの界面活性剤は組み合わせて使用され得る）と共に形成される微粒子を使用する。本発明は、これらの微粒子が、ベクター構築物（例えば、ＥＬＶＩＳベクター、ＲＮＡベクター構築物）およびウイルス抗原の改善された吸着を生じ、そしてより優れた免疫応答を提供することを発見した。
【００２０】
上記の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／０３３３１に開示されるように、イオン性界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）を有する油状滴サブミクロンエマルジョンを含む微粒子調製物を発明した。このような組成物は、高分子（例えば、ＤＮＡ、タンパク質、および他の抗原性分子）を容易に吸着する。本発明のいくつかの実施形態は、好ましくは代謝可能な油および乳化剤（好ましくは、実質的に全てが直径１ミクロン未満（好ましくは、２５０ｎｍよりも小さい）油状滴を有するオイルインウォーターエマルジョンの形態で存在する）を含む油状滴エマルジョンから誘導される微粒子を使用する。好ましくは、この組成物は、任意のポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーの非存在下で存在する。この油状物は、好ましくは、動物油、不飽和炭化水素、テルペノイド（例えば、スクアレン）、または植物油である。この組成物は、好ましくは、水性媒質中に０．５〜２０％（容量）の油状物を含む。乳化剤は、好ましくは、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンのモノエステル、ジエステル、もしくはトリエステルまたはソルビタンのモノエーテル、ジエーテル、もしくはトリエーテルを含む。好ましくは、この組成物は、約０．０１〜約５重量％の乳化剤を含む。
【００２１】
従って、いくつかの実施形態において、本発明の組成物の微粒子部分は、吸着表面を有する微粒子である。ここで、この微粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマーを含む。
【００２２】
別の実施形態において、本発明の組成物の微粒子部分は、イオン性界面活性剤と共に処方される油状滴エマルジョンを含むサブミクロンエマルジョンである。
【００２３】
他の実施形態において、この微粒子はさらに、微粒子表面に吸着した、核酸配列を発現し得るベクター構築物（例えば、選択されたＥＬＶＩＳベクターまたはＲＮＡベクター構築物）を含む。このベクター構築物は、ポリペプチド、タンパク質、ホルモン、酵素、転写メディエーターまたは翻訳メディエーター、代謝経路の中間体、免疫モジュレーター、抗原、アジュバント、またはそれらの組み合わせなどをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
【００２４】
他の実施形態において、本発明は、本発明の微粒子に吸着した核酸、好ましくは核酸配列を発現し得るベクター構築物（例えば、選択されたｐＣＭＶベクター、ＥＬＶＩＳベクターまたはＲＮＡベクター構築物）および薬学的に受容可能な賦形剤を含む微粒子組成物に関する。
【００２５】
他の実施形態において、本発明は、吸着した核酸、好ましくは、核酸配列を発現し得るベクター構築物（例えば、ＥＬＶＩＳベクターまたはＲＮＡベクター構築物）を有する微粒子を生成する方法に関する。この方法は、以下：
（ａ）ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマーを含むポリマー溶液（ここで、このポリマーは、有機溶媒中に約１％〜約３０％の濃度で存在する）と、このポリマー溶液に対するアニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、または非イオン性界面活性剤（ここで、この界面活性剤は、界面活性剤：ポリマーが０．００１：１０（ｗ／ｗ）の比で存在する）を合わせてポリマー／界面活性剤混合物を形成する工程；
（ｂ）このポリマー／界面活性剤混合物を分散する工程；
（ｃ）有機溶媒を除去する工程；
（ｄ）微粒子を回収する工程；ならびに
（ｆ）この微粒子の表面に、ＥＬＶＩＳベクターまたはＲＮＡベクター構築物を吸着させる工程（ここで、このＥＬＶＩＳベクターまたはＲＮＡベクター構築物は、ポリペプチド、タンパク質、ホルモン、酵素、転写メディエーターまたは翻訳メディエーター、代謝経路の中間体、免疫モジュレーター、抗原、アジュバント、あるいはその組み合わせなどをコードする異種ヌクレオチド配列を含む）、
の工程を包含する。
【００２６】
好ましくは、このポリマー／界面活性剤混合物は、有機溶媒を除去する前に、エマルジョンを形成するために乳化される。
【００２７】
他の実施形態において、本発明は、上記方法により生成される微粒子に関する。より好ましくは、薬学的に受容可能な賦形剤もまた含む微粒子組成物が生成される。
【００２８】
なお別の実施形態において、本発明は、脊椎動物被験体に異種ヌクレオチド配列を送達する方法に関する。この方法は、上記の任意の組成物を脊椎動物被験体に投与する工程を包含する。
【００２９】
さらなる実施形態において、本発明は、脊椎動物被験体において細胞性免疫応答を惹起する方法に関する。この方法は、本発明の微粒子に吸着された治療有効量の選択された異種ヌクレオチド配列を、脊椎動物被験体に投与する工程を包含する。
【００３０】
他の実施形態において、本発明は、免疫化の方法に関する。この方法は、治療有効量の上記の任意の微粒子組成物を、脊椎動物被験体に投与する工程を包含する。この組成物は、必要に応じて、非結合高分子を含み得、そして、必要に応じて、アジュバント（アルミニウム塩（例えば、リン酸アルミニウム）を含む）または少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドもまた含み得る。
【００３１】
いくつかの好ましい実施形態において、この微粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）；より好ましくは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）；そして最も好ましくは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）から形成される。
【００３２】
非消耗性の先に記載された吸着性微粒子の各々はまた、必要に応じて、その中に捕捉されているか、または捕捉されていない溶液中に高分子を有し得る。従って、本発明は、ある核酸分子が微粒子上に吸着されており、そして他の核酸分子が捕捉または吸着されている種々の組み合わせを包含する。さらに、本発明の微粒子は、この微粒子に吸着した１種以上の核酸およびこの微粒子に吸着した他の抗原性高分子を有し得る。さらに、この微粒子は、この微粒子中に捕捉された、数種の核酸および／または他の抗原性高分子を有し得る。
【００３３】
他の好ましい実施形態において、この微粒子は、上記のようなサブミクロンエマルジョンの形態で調製される。
【００３４】
本発明はまた、核酸（例えば、核酸配列を発現し得るベクター構築物（例えば、選択されたＥＬＶＩＳベクター構築物またはＲＮＡベクター構築物）（ここで、ＥＬＶＩＳベクター構築物またはＲＮＡベクター構築物の異種ヌクレオチド配列部分が抗原をコードし得る））の免疫刺激量、および本明細書中に記載されるアジュバント組成物の免疫刺激量を含有する免疫原性組成物に関する。本発明のいくつかの実施形態において、この免疫原性組成物は、核酸が吸着した微粒子と組み合わせてＣｐＧオリゴヌクレオチドを含有する。この吸着微粒子自体は、好ましくは、抗原性ポリペプチドをコードするＥＬＶＩＳベクター構築物またはＲＮＡベクター構築物である。
【００３５】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、この抗原性ポリペプチドは、例えば以下のようなウイルス由来である：Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、インフルエンザウイルス（ｆｌｕ）、および狂犬病ウイルス。好ましくは、この抗原性ポリペプチドは、以下からなる群より選択される：ＨＳＶ糖タンパク質ｇＤ、ＨＩＶ糖タンパク質ｇｐｌ２０、ＨＩＶ糖タンパク質ｇｐｌ４０、ＨＩＶ  ｐ５５  ｇａｇ、ならびにｐｏｌ領域およびｔａｔ領域由来のポリペプチド。本発明の他の好ましい実施形態において、この抗原性ポリペプチドは、例えば、以下のような細菌に由来する：コレラ、ジフテリア、テタヌス、連鎖球菌（例えば、連鎖球菌Ｂ）、百日咳、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（例えば、Ｂ型髄膜炎）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、およびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ。本発明のなお他の好ましい実施形態において、この抗原性ポリペプチドは、例えば、マラリア寄生虫のような寄生虫に由来する。
【００３６】
アジュバント組成物は、例えば、アルミニム塩を含有し得る。あるいは、アジュバント組成物は、少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを含有し得る。このアジュバント組成物はまた、正に帯電したエマルジョンを生じる任意の成分を含有する。このオリゴヌクレオチドは、好ましくは、少なくとも１つのホスホロチオエート結合またはペプチド核酸結合を含む。本発明の好ましい実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜２８からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。本発明の他の好ましい実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、モチーフのすぐ５’側に２つのプリンが隣接し、そしてモチーフのすぐ３’側に２つのピリミジンが隣接しているＣｐＧモチーフを含む。本発明の他の好ましい実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、配列番号１９〜２８からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。配列番号２８が最も好ましい。本発明のいくつかの好ましい実施形態において、このアジュバント組成物はさらに、好ましくは、ミョウバン、細菌細胞壁成分およびムラミルペプチドからなる群より選択される、別個の免疫刺激因子を含有する。このアジュバント組成物自体は、二次微粒子の形態（ｓｅｃｏｎｄ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）であり得る。この二次微粒子は、種々の核酸および／もしくは抗原性ポリペプチド、または他の抗原性高分子内に吸着され、そして／あるいはその中に包括され得る。さらに、免疫原性組成物は、溶液中で遊離核酸の存在を含み得る。
【００３７】
本発明はまた、宿主動物における免疫応答を刺激する方法に関し、この方法は、この動物に本明細書中に記載される免疫原性組成物を、免疫応答を誘導するのに有効な量で投与する工程を包含する。この宿主動物は、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、アカゲザル、そしてなおより好ましくは、ヒトである。
【００３８】
本発明はまた、ウイルス感染、細菌感染または寄生虫感染に対して宿主動物を免疫化する方法に関し、この方法は、この動物に本明細書中に記載される免疫原性組成物を、防御応答を誘導するのに有効な量で投与する工程を包含する。この宿主動物は、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、アカゲザル、そしてなおより好ましくは、ヒトである。
【００３９】
本発明はまた、宿主動物におけるＴｈ１免疫応答もしくはＣＴＬ応答、もしくはリンパ球増殖（ｌｙｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、もしくはサイトカイン産生を増加させる方法に関し、この方法は、この動物に本明細書中に記載される免疫原性組成物を、Ｔｈ１免疫応答、もしくはＣＴＬ応答、もしくはリホ増殖、もしくはサイトカイン産生を誘導するのに有効な量で投与する工程を包含する。この宿主動物は、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、アカゲザル、そしてなおより好ましくは、ヒトである。
【００４０】
本発明はまた、宿主動物における免疫応答を惹起させる方法に関し、この方法において、一次抗原（例えば、プラスミドＤＮＡ（例えば、ｐＣＭＶベクター構築物もしくはＥＬＶＩＳベクター構築物、またはＲＮＡベクター構築物））をコードする異種核酸配列を含む微粒子に吸着した高分子が、免疫学的応答を誘発するのに有効な量で、この動物に最初に投与される。続いて、二次抗原が、この動物に投与される。
【００４１】
これらの実施形態における、この一次抗原および二次抗原は、同じであっても異なっていてもよく、好ましくは、同じである。好ましい抗原としては、以下が挙げられる：細菌抗原およびウイルス抗原（例えば、ＨＩＶ抗原（例えば、ｇｐｌ２０、ｇｐｌ４０、ｇｐｌ６０、ｐ２４ｇａｇおよびｐ５５ｇａｇ）、Ｃ型肝炎ウイルス抗原、インフルエンザＡ型抗原、Ｂ型髄膜炎細菌抗原、および連鎖球菌Ｂ型細菌抗原）。二次抗原は、好ましくは、本明細書中に記載される高分子に吸着されているか、またはアジュバント（例えば、ＭＦ５９）と共に同時投与される。高分子はまた、所望ならば、アジュバントと共に同時投与される。いくつかの好ましい実施形態において、この高分子は、二次抗体（これもまた、２回以上投与され得る）の前に、２回以上投与される。
【００４２】
１つの特定の局面に従って、（１）（ａ）初期投与と同時に、（ｂ）初期投与から１〜８週間の期間内に、そして（ｃ）初期投与から４〜３２週間の期間内に、高分子が投与され、（２）（ａ）初期投与から８〜５０週間の期間内に、そして（ｂ）初期投与から８〜１００週間の期間内に、二次抗原が投与される。
【００４３】
本発明の微粒子組成物の送達は、直接的な注射（例えば、皮下、腹膜内、静脈内、または筋肉内）を含む任意の公知の方法によって達成され得、そしてこのような送達はまた、エレクトロポレーション（例えば、米国特許出願第０９／４９９，０２３号（この開示は、本明細書中でその全体が参考として援用される）を参照のこと）の使用によって増強され得る。エレクトロポレーションは、細胞膜の透過性を増加させるために細胞に短い電気パルスを印加して、それによって、細胞によるＤＮＡの取り込みを促進することである。近年、電場を組織に印加することで、ＤＮＡの取り込みおよび遺伝子発現がインビボで有意に増加することが見出された（Ｍａｔｈｉｅｓｅｎ，Ｉ．，１９９９，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：５０８）。インビボで標的化される組織の中で、エレクトロポレーションは、皮膚、肝臓、腫瘍、および筋肉である。ＤＮＡワクチンの適用について、Ｗｉｄｅｒａらは、インビボでのエレクトロポレーションがマウス、モルモット、およびウサギにおけるＤＮＡワクチンの能力を実質的に増強させることを示している（Ｗｉｄｅｒａ，Ｇ．ら、２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４６３５）。
【００４４】
上記の実施形態のＥＬＶＩＳベクターは、一般的には、真核細胞、転写産物がＲＮＡベクター構築物（例えば、アルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン）であるｃＤＮＡ配列、および３’末端領域において機能的であるプロモーターを含むＤＮＡ分子である。このＲＮＡベクター構築物は、好ましくは、ピコルナウイルス、トガウイルス科ウイルス（ｔｏｇａｖｉｒｕｓ）、フラビウイルス属、コロナウイルス、パラミクソウイルス、黄熱病ウイルス、またはアルファウイルス属（例えば、Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ、Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ、Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ、またはＲｏｓｓ  Ｒｉｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、そしてより好ましくは、アルファウイルスゲノム由来のＲＮＡゲノムを含み、このゲノムは、１つ以上の構造タンパク質遺伝子を、目的の遺伝子産物をコードする選択された異種核酸配列で置換することによって改変されている。本発明のＲＮＡベクター構築物は、一般的に、インビボでＤＮＡテンプレートから転写することによって得られる。
【００４５】
本発明のこれらおよび他の局面および実施形態は、本明細書中の開示の観点から、当業者によって容易に相到される。
【００４６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、吸着された核酸分子、好ましくは、核酸配列を発現し得るベクター構築物、そしてより好ましくは、抗原をコードする異種核酸配列を含むベクター構築物（例えば、ｐＣＭＶベクター構築物、ＥＬＶＩＳベクター構築物、またはＲＮＡベクター構築物）を有する微粒子が、増強された免疫応答を誘発するという驚くべき発見に基づく。さらに、吸着された核酸分子を有する微粒子（例えば、吸着されたｐＣＭＶベクター、ＥＬＶＩＳベクター、またはＲＮＡベクター構築物を有する微粒子）およびアジュバントの組み合わせは、増強された免疫応答を誘発するために有用である。
【００４７】
本発明はまた、抗原をコードする核酸配列を含む構築物（例えば、ｐＣＭＶベクター構築物、ＥＬＶＩＳベクター構築物、またはＲＮＡベクター構築物）が、その後の抗原の投与に関連して、増強された免疫応答を誘発するという驚くべき発見に基づく。
【００４８】
本発明の実施は、他に指示がなければ、当該分野内の化学、ポリマー化学、生物化学、分子生物学、免疫学、および薬理学の従来方法を使用する。このような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ，編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，編、１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｒｄｉ，Ｋ．Ｓ．，編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７）およびＳｅｙｍｏｕｒ／Ｃａｒｒａｈｅｒ’ｓ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第４版、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，１９９６）を参照のこと。
【００４９】
全ての刊行物、特許および特許出願が、本明細書中で列挙されており、上記または下記のいずれにかかわらず、その全体が本明細書中で参考として援用される。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、他に明確な指示がなければ、複数の言及を含む。従って、例えば、用語「微粒子（単数）」は、１種以上の微粒子などを参照する。
【００５０】
（定義）
本発明を記述する際に、以下の用語が用いられ、以下で示されるように定義されることが意図される。
【００５１】
他に言及されなければ、本明細書中の全ての割合および比率は、重量に基づいて与えられる。
【００５２】
用語「微粒子」とは、本明細書中で使用される場合、約１０ｎｍ〜約１５０μｍの直径、好ましくは、約２００ｎｍ〜約３０μｍの直径、そして最も好ましくは、約５００ｎｍ〜約１０μｍの直径の粒子をいう。好ましくは、微粒子は、ニードルおよびキャピラリーを塞ぐことなく、非経口投与また粘膜投与が可能な直径のものである。微粒子サイズは、当該分野で周知の技術（例えば、光子相関分光法、レーザ回折法、および／または走査電子顕微鏡）によって容易に決定され得る。用語「粒子」はまた、本明細書中で定義されるような微粒子を表すために使用され得る。微粒子は、本明細書中で定義されるようなミクロン以下のエマルジョン組成物に対して、代替的に言及され得る。
本明細書中で使用するためのポリマー微粒子は、滅菌可能であり、無毒性であり、かつ生物分解性である材料から形成される。このような材料としては、限定することなく、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシブチル酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ＰＡＣＡ、およびポリシアノアクリレートが挙げられる。好ましくは、本発明により使用される微粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、特に、ポリ（ラクチド）（「ＰＬＡ」）、あるいはＤ，Ｌ−ラクチドおよびグリコリドもしくはグリコール酸（例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（「ＰＬＧ」または「ＰＬＧＡ」））のコポリマー、またはＤ，Ｌ−ラクチドおよびカプロラクトンのコポリマーから誘導されるポリマー微粒子である。このポリマー微粒子は、種々の分子量を有し、そしてコポリマー（例えば、ＰＬＧ）の場合、種々のラクチド：グリコリド比を有する任意の種々のポリマー出発材料から誘導され得、これらの選択は、選定する際の大きな問題であり、同時投与される高分子に一部依存する。これらのパラメータは、以下により完全に議論される。あるいは、本発明の微粒子は、ミクロン以下のエマルジョンに含まれる。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、句「油状液滴エマルジョン」とは、代謝可能な油状物および乳化剤を含むエマルジョンをいう。用語「ミクロン以下のエマルジョン」とは、本明細書中で使用される場合、約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍのサイズ範囲の液滴を含む、本発明の油状液滴エマルジョンをいう。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、用語「微粒子」とは、本明細書中に記載されるようなポリマー微粒子、または本明細書中に記載されるようなミクロン以下のエマルジョン組成物をいう。
【００５５】
用語「界面活性剤」とは、本明細書中で使用される場合、表面活性剤、分散剤、懸濁剤、およびエマルジョン安定化剤を含む。アニオン性界面活性剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、ＳＬＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）、ＤＳＳ（ジスルホスクシネート（ｄｉｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ））、硫酸化脂肪アルコールなど。カチオン性界面活性剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：セトリミド（セチルトリメチルアンモニウムブロミド、または「ＣＴＡＢ」）、塩化ベンズアルコニウム、ＤＤＡ（ジメチルジオクトデシルアンモニウムブロミド）、ＤＯＴＡＰ（ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン）など。非イオン性界面活性剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＰＶＡ、ポビドン（ポリビニルピロリドン、またはＰＶＰとしてもまた公知）、ソルビタンエステル、ポリソルベート、ポリオキシエチル化グリコールモノエーテル、ポリオキシエチル化アルキル、フェノン、ポルオキサマーなど。
【００５６】
用語「ゼータ位」とは、本明細書中で使用される場合、全ての固体と液体の界面を横切って存在する電位（すなわち、帯電したコロイド状粒子周囲のイオンの拡散層を横切る電位）をいう。ゼータ位は、電気泳動の移動度（すなわち、当該分野で周知の技術を使用して測定される物質と接触して配置された、帯電した電極間をコロイド状粒子が移動する速度）から算出され得る。
【００５７】
用語「高分子」とは、本明細書中で使用される場合、限定することなしに、医薬、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ホルモン、酵素、転写メディエータまたは翻訳メディエータ、代謝経路の中間体、免疫モジュレーター、抗原、アジュバント、あるいはそれらの組み合わせをいう。本発明により使用される特定の高分子が、以下でより詳細に記載される。
【００５８】
用語「医薬」とは、以下でより詳細に議論される、生物学的に活性な化合物（例えば、抗生物質、抗ウイルス剤、成長因子、ホルモンなど）をいう。
【００５９】
用語「アジュバント」とは、医薬の作用を補助または改変する任意の物質をいい、これらとしては、抗原に対する免疫応答を増加または多様化させる免疫学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。
【００６０】
「ポリヌクレオチド」は、核酸ポリマーであり、これは、代表的には、生物学的に活性な（例えば、免疫原性または治療的な）タンパク質またはポリペプチドをコードする。ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの性質に依存して、ポリヌクレオチドは、１０ヌクレオチドほどの少ないヌクレオチドを含み得、例えば、ここでポリヌクレオチドは、抗原をコードする。さらに、「ポリヌクレオチド」は、二本鎖配列および一本鎖配列の両方を含み得、そして限定することなく、ウイルス由来のｃＤＮＡ、原核生物ｍＲＮＡまたは真核生物ｍＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ、およびウイルス由来のＤＮＡ配列（例えば、ＲＮＡおよびＤＮＡのウイルスおよびレトロウイルス）または原核生物ＤＮＡ、ならびに特に、合成ＤＮＡ配列をいう。この用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの、公知の塩基アナログのいずれかを含む配列を捕捉する。この用語はさらに、好ましくは、核酸分子が治療的タンパク質または抗原性タンパク質をコードするように、ネイティブな配列に対する改変（例えば、欠失、付加および置換（一般的に、天然において保存性））を含む。これらの改変は、部位特異的変異誘発のように意図的であり得るか、または抗原を産生する宿主の改変体のように偶発的であり得る。
【００６１】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーをいい、産物の最小長に限定されない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、マルチマーなどは、定義の範囲内に含まれる。全長タンパク質およびそのフラグメントの両方が、この定義に含まれる。この用語はまた、好ましくは、タンパク質が免疫学的応答を誘発するか、またはタンパク質が投与される被験体に対する治療効果を有する能力を維持するように、ネイティブな配列に対する改変（例えば、欠失、付加、および置換（天然において保存的））を含む。
【００６２】
「抗原」により、宿主の免疫系を刺激して、細胞性抗原特異的免疫応答（抗原が本発明に従って存在する場合）、または体液性抗体応答を生じ得る１つ以上のエピトープを含む分子が意味される。抗原は、それ自体で、または別の分子との組み合わせで存在する場合、細胞性応答または体液性応答を誘発し得る。通常、エピトープは、約３〜１５アミノ酸、好ましくは、約５〜１５アミノ酸、そしてより好ましくは、約７〜１５アミノ酸を含む。所定のタンパク質のエピトープは、当該分野で周知の、任意の多数のエピトープマッピング技術を使用して同定され得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第６６巻（Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，編、１９９６）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙを参照のこと。例えば、線状エピトープは、例えば、固体支持体上の多数のペプチド（タンパク質分子の一部に対応するペプチド）を同時に合成し、そしてこのペプチドが依然として支持体に結合している間に、このペプチドを抗体と反応させることによって決定され得る。このような技術は、当該分野で公知であり、そして例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８〜４００２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９〜７１５（全てが、本明細書中で参考として援用される）に記載されている。同様に、コンホメーションエピトープは、アミノ酸の空間的なコンホメーションを決定することによって（例えば、ｘ軸結晶学、および二次元核磁気共鳴によって）、容易に同定され得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，前出を参照のこと。
【００６３】
用語「抗原」とは、本明細書中で使用される場合、サブユニット抗原（すなわち、天然で結合する全生物から分離および離散された抗原）、および屠殺されたか、弱毒化されたか、または不活化された細菌、ウイルス、寄生虫、または他の微生物の両方を示す。抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体、またはそのフラグメント、および合成ペプチドミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ））（これらは、抗原または抗原性決定因子を模倣し得る）はまた、本明細書中で使用されるような定義の下で捉えられる。同様に、治療的タンパク質または免疫原性タンパク質を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、あるいはインビボでの抗原決定因子（例えば、遺伝子療法および核酸免疫化適用）はまた、本明細書中の抗原の定義内に含まれる。
【００６４】
さらに、本発明の目的のために、抗原は、数種の公知のウイルス、細菌、寄生虫および菌類のいずれか、ならびに任意の種々の腫瘍抗原から誘導され得る。さらに、本発明のために、「抗原」は、タンパク質が免疫学的応答を誘発する能力を維持する限り、ネイティブの配列に対する改変（例えば、欠失、付加および置換（一般に、天然において保存的）を含むタンパク質をいう。これらの改変は、部位特異的変異誘発のように意図的であり得るか、または抗原を産生する宿主の改変体のように偶発的であり得る。
【００６５】
抗原または組成物に対する「免疫学的応答」または「免疫応答」は、被験体における、目的の組成物中に存在する分子に対する体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答の発生である。本発明の目的について、「体液性免疫応答」とは、抗体分子によって媒介される免疫応答をいい、「細胞性免疫応答」とは、Ｔリンパ球および／または他の白血球によって媒介される免疫応答である。細胞性免疫の１つの重要な局面は、細胞溶解性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的な応答を含む。ＣＴＬは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によってコードされ、そして細胞の表面上に発現されるタンパク質に関連して提示されるペプチド抗原に対して特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の細胞内破壊、またはこのような微生物によって感染された細胞の溶解を誘導および促進する補助をする。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を含む。ヘルパーＴ細胞は、機能の刺激を補助するように作用し、そしてその表面上にＭＨＣ分子に関連するペプチド抗原を提示する細胞に対する、非特異的エフェクター細胞の活性に集中する。「細胞性免疫応答」はまた、サイトカイン、ケモカイン  ならびに活性化Ｔ細胞および／または他の白血球によって生成される他のこのような分子（ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものを含む）の産生をいう。
【００６６】
細胞性免疫応答を誘発する組成物（例えば、免疫原性組成物）またはワクチンは、細胞表面でのＭＨＣ分子に関連する抗原の提示によって、脊椎動物被験体を感作するために働き得る。細胞媒介性の免疫応答は、表面に抗原を提示する細胞に、またはこの細胞の近傍に指向される。さらに、抗原特異的Ｔリンパ球が生成されて、免疫された宿主のさらなる保護を可能にし得る。
【００６７】
特定の抗原または組成物が細胞媒介性の免疫学的応答を刺激する能力は、多くのアッセイ（例えば、リンパ増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイ）によって、感作された被験体における抗原に対するＴリンパ球特異性をアッセイすることによって、または抗原を用いた再刺激に応答するＴ細胞によるサイトカイン産生の測定によって、決定され得る。このようなアッセイは、当該分野で周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９−４１９９；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９−２３７６；および以下の実施例を参照のこと。
【００６８】
従って、免疫学的応答は、本明細書中で使用される場合、ＣＴＬの増殖および／またはヘルパーＴ細胞の産生もしくは活性化を刺激するものであり得る。目的の抗原はまた、抗体媒介性の免疫応答を誘発し得る。従って、免疫学的応答は、１以上の以下の効果を含み得る：Ｂ細胞による抗体の産生；ならびに／または目的の組成物もしくはワクチン中に存在する抗原に特異的に指向する、サプレッサーＴ細胞および／もしくはγδＴ細胞の活性化。これらの応答は、感染性を中和し、そして／または抗体相補性もしくは抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介して、免疫された宿主に対して保護を提供するように働き得る。このような応答は、当該分野で周知の標準的なイムノアッセイおよび中和アッセイを使用して決定され得る。
【００６９】
微粒子に吸着された選択された抗原を含有する組成物は、微粒子との会合なしに送達される場合に等量の抗原によって誘発される免疫応答よりも大きい免疫応答を誘発する能力を有する場合、「増強された免疫原性」を示す。従って、組成物は、「増強された免疫応答」を示し得る。なぜなら、抗原は、微粒子への吸着によってより強力に免疫原性であるか、またはより低用量の抗原が、これが投与される被験体において免疫応答を達成するために必要だからである。このような増強された免疫原性は、微粒子／抗原組成物および抗原コントロールを動物に投与すること、ならびに標準的なアッセイ（例えば、当該分野で周知のラジオイムノアッセイおよびＥＬＩＳＡ）を使用して、これら２つに対する抗原力価を比較することによって、決定され得る。
【００７０】
用語、所定の組成物の「有効量」または「薬学的有効量」は、本明細書中で提供される場合、非毒性であるが、所望の応答（例えば、免疫学的応答）および対応する治療的効果を提供するに十分な組成物の量をいうか、または治療タンパク質が送達される場合、以下に規定するように、被験体の処置をもたらすために十分な量をいう。以下で指摘されるように、必要な正確な量は、被験体の種、年齢、および全身状態、処置される状態の重篤度、ならびに目的の特定の高分子、投与の様式などに依存して、被験体によって変化する。いずれの個体の場合においても、適切な「有効」量は、従来の実験を使用して、当業者によって決定され得る。
【００７１】
「脊椎動物被験体」とは、脊椎動物（ｃｏｒｄａｔａ）亜門の任意のメンバーを意味し、限定ではなく、以下が挙げられる：哺乳動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマおよびヒト）；家畜動物（例えば、イヌおよびネコ）；ならびに家禽、野生および猟鳥を含む鳥類（例えば、ニワトリ、七面鳥および他のキジ類の鳥のオンドリおよびメンドリ）。この用語は、特定の年齢を示さない。従って、成体および新生仔の動物の両方をカバーすることが意図される。
【００７２】
「薬学的に受容可能」または「薬理学的に受容可能」とは、生物学的にも別の点でも所望される材料を意味する。すなわち、この材料は、個体における所望でない生物学的効果をいずれも引き起こさないか、またはこの材料が含まれる組成物のいかなる成分とも有害な様式で相互作用しないで、微粒子処方物と共に個体に投与され得る。
【００７３】
用語「賦形剤」とは、最終投薬形態内に通常提供される物質をいい、賦形剤としては、以下が挙げられる：ビヒクル、結合剤、崩壊剤、充填剤（希釈剤）、潤滑剤、潤沢剤（流動促進剤）、圧縮補助剤、着色剤、甘味料、保存料、懸濁／分散剤、フィルム形成剤／被覆剤、香料および印刷インク。
【００７４】
「生理学的ｐＨ」または「生理学的範囲のｐＨ」とは、約７．２〜８．０を含む範囲、より代表的には約７．２〜７．６を含む範囲のｐＨを意味する。
【００７５】
本明細書中で使用される場合、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（そのバリエーション、例えば、「処置（「ｔｅａｔ」または「ｔｒｅａｔｅｄ」）」を含む）とは、以下のいずれかをいう：（ｉ）従来のワクチンにおけるような、感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の減少または排除、および（ｉｉｉ）問題の病原または障害の実質的または完全な排除。処置は、予防的に（感染前に）または治療的に（感染後に）もたらされ得る。
【００７６】
本明細書中で使用される場合、句「核酸」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらから形成されるキメラをいう。
【００７７】
本明細書中で使用される場合、句「少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド」とは、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含むポリヌクレオチドをいう。少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、複数のＣｐＧモチーフを含み得る。これらのオリゴヌクレオチドはまた、当該分野で「ＣｐＧオリゴヌクレオチド」としても公知である。本明細書中で使用される場合、句「ＣｐＧモチーフ」とは、シトシンヌクレオチドとその後のグアノシンヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのジヌクレオチド部分をいう。５−メチルシトシンもまた、シトシンの代わりに使用され得る。
【００７８】
本明細書中で使用される場合、「アルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン」、「ＲＮＡベクターレプリコン」、「ＲＮＡベクター構築物」および「レプリコン」とは、標的細胞内でそれ自体の複製またはインビボの自己複製を指向し得るＲＮＡ分子をいう。アルファウイルス由来のＲＮＡベクターレプリコンは、以下の順のエレメントを含む：レプリコンに対してシスで必要な５’ウイルス配列（５’ＣＳＥとも称される）、発現される場合に生物学的に活性であるアルファウイルス非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする配列、レプリコンに対してシスで必要な３’ウイルス配列（３’ＣＳＥとも称される）、およびポリアデニル化区画。アルファウイルス由来のＲＮＡベクターレプリコンはまた、ウイルスサブゲノム「連結領域」プロモーター、１以上の構造タンパク質遺伝子もしくはその部分に由来する配列、生存ウイルスの産生を可能にするに十分な大きさの外来核酸分子、ならびに発現される異種配列を含み得る。
【００７９】
本明細書中で使用される場合、「真核生物多層化ベクター開始系（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｌａｙｅｒｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）」、「ＥＬＶＩＳ」または「ＥＬＶＩＳベクター」とは、目的の配列または遺伝子を指向し得る構築物をいう。真核生物多層化ベクター開始系は、インビボ（すなわち、細胞内）で、ｃＤＮＡからのＲＮＡの合成を開始し得る５’プロモーター、および真核生物細胞において自身の複製を指向し得、そして異種配列もまた発現し得るウイルスベクター配列を含むべきである。好ましい実施形態において、この核酸ベクター配列は、アルファウイルス由来の配列であり、そしてアルファウウイルスＲＮＡの転写を開始し得る５’配列（５’ＣＳＥとも称される）、発現される場合に生物学的に活性であるアルファウイルス非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする配列、およびアルファウイルスポリメラーゼ認識配列（３’ＣＳＥとも称される）から構成される。さらに、このベクター配列は、ウイルスサブゲノム「連結領域」プロモーター、１以上の構造タンパク質遺伝子もしくはその部分に由来する配列、最適な増幅を可能にするに十分な大きさの外来核酸分子、発現される異種配列、異種配列の挿入のための１以上の制限部位ならびにポリアデニル化配列を含み得る。真核生物多層化ベクター開始系はまた、スプライス認識配列、触媒的リボザイムプロセシング配列、核輸送シグナルおよび転写終結配列を含み得る。
【００８０】
「アルファウイルスベクター構築物」とは、目的の配列または遺伝子の発現を指向し得る構築物をいう。このようなベクター構築物は、一般に、アルファウウイルスＲＮＡの転写を開始し得る５’配列（５’ＣＳＥとも称される）、発現される場合に生物学的に活性であるアルファウイルス非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする配列、アルファウイルスポリメラーゼ認識配列（３’ＣＳＥとも称される）およびポリアデニル化区画から構成される。さらに、このベクター構築物は、ウイルスサブゲノム「連結領域」プロモーター、１以上の構造タンパク質遺伝子もしくはその部分に由来する配列、生存ウイルスの産生を可能にするに十分な大きさの外来核酸分子、インビトロもしくはインビボでｃＤＮＡからウイルスＲＮＡの合成を開始し得る５’プロモーター、発現される異種配列、ならびに異種配列の挿入のための１以上の制限部位を含み得る。
【００８１】
本明細書中で使用される場合、句「ベクター構築物」とは、一般に、目的の核酸配列または遺伝子の発現を指向し得る任意の構築物をいう。このベクター構築物は、代表的に、転写プロモーター／エンハンサーまたは遺伝子座規定エレメント、もしくは他の手段（例えば、選択的スプライシング、核ＲＮＡ輸送、メッセンジャーの翻訳後修飾、またはタンパク質の転写後修飾）によって遺伝子の発現を制御する他のエレメントを含む。さらに、このベクター構築物は、代表的に、転写される場合に目的の配列または遺伝子に作動可能に連結され、そして翻訳開始配列として作用する配列を含む。このベクター構築物はまた、必要に応じて、ポリアデニル化、選択マーカー、ならびに１以上の制限部位および転写終結配列を指向するシグナルを含み得る。さらに、このベクター構築物がレトロウイルス中に配置される場合、このベクター構築物は、パッケージングシグナル、長末端反復（ＬＴＲ）、ならびに使用されるレトロウイルスに適切なポジティブおよびネガティブ鎖プライマー結合部位（すでに存在しない場合）を含み得る。ベクター構築物の例としては、ＥＬＶＩＳベクター（ＲＮＡベクター構築物のｃＤＮＡ相補体を含む）、そのＲＮＡベクター構築物、アルファウイルスベクター構築物、ＣＭＶベクター構築物などが挙げられる。
【００８２】
１つの特定の型のベクター構築物は、「プラスミド」であり、これは、環状二重鎖ＤＮＡをいい、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状物である。以下に記載される具体的なプラスミドとしては、ｐＣＭＶおよびｐＳＩＮＣＰが挙げられる。
【００８３】
本発明のいくつかの実施形態に従って、ウイルス、真菌、マイコプスマ、細菌または原生動物感染、および腫瘍に対して宿主動物を処置する（予防的および／または治療的免疫を含む）組成物および方法が提供される。本発明の方法は、哺乳動物、好ましくはヒトに予防的および／または治療的免疫を付与するために有用である。本発明の方法はまた、生物医学的研究設定の哺乳動物を含む、ヒト以外の哺乳動物に対しても実行され得る。
【００８４】
（Ｂ．一般的方法）
（１．高分子に吸着されたポリマー微粒子）
ポリマー微粒子（ＰＬＡおよびＰＬＧ微粒を含む）は、生物学的に活性な高分子を有効に吸着する。さらに、これらの微粒子は、多種の分子（荷電高分子および／またはかさ高い高分子を含む）を吸着する。本発明に関してこのように使用される高分子／微粒子を送達系として使用して、広範な種々の疾患を処置、予防および／または診断するために、生物学的活性を送達し得る。
【００８５】
広範な種々の高分子は、微粒子と関連して送達され得、この微粒子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：例えば、抗体および抗ウイルス剤、非ステロイド抗炎症薬物、鎮痛剤、血管拡張剤、心臓血管薬物、向精神薬、神経弛緩薬、抗うつ剤、抗パーキンソン薬物、βブロッカー、カルシウムチャネルブロッカー、ブラジキニンインヒビター、ＡＣＥインヒビター、血管拡張剤、プロラクチンインヒビター、ステロイド、ホルモンアンタゴニスト、抗ヒスタミン、セロトニンアンタゴニスト、ヘパリン、化学療法剤のような医薬、抗腫瘍剤および増殖因子（例えば、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＩＧＦ−１、およびＩＧＦ−２、ＦＧＦ）、治療的もしくは免疫原性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ワクチンに使用するための免疫原性タンパク質およびそのエピトープ、ペプチドホルモン（例えば、インスリン、プロインスリン、成長ホルモン、ＧＨＲＨ、ＬＨＲＨ、ＥＧＦ、ソマトスタチン、ＳＮＸ−１１１、ＢＮＰ、インスリノトロピン（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｎ）、ＡＮＰ、ＦＳＨ、ＬＨ、ＰＳＨおよびｈＣＧ）、性腺ステロイドホルモン（アンドロゲン、テストロゲンおよびプロゲステロン）、胸腺刺激ホルモン、インヒビン、コレシストキニン、ＡＣＴＨ、ＣＲＦ、ジノルフィン、エンドルフィン、エンドセリン、フィブロネクチンフラグメント、ガラニン、ガストリン、インスリノトロピン、グルカゴン、ＧＴＰ結合タンパク質フラグメント、グアニリン（ｇｕａｎｙｌｉｎ）、ロイコキニン、マゲイニン、マストパラン、ダーマセプチン（ｄｅｒｍａｓｅｐｔｉｎ）、システミン（ｓｙｓｔｅｍｉｎ）、ニューロメディン、ニューロテンシン、パンクレアスタチン、膵臓ポリペプチド、サブスタンスＰ、セクレチン、サイモシンなどを含むホルモン、酵素、転写メディエーターまたは翻訳メディエーター、代謝経路の中間体、免疫モジュレーター（例えば、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４およびγインターフェロンを含む種々のサイトカインのいずれか）、抗原ならびにアジュバント。
【００８６】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、この高分子は、核酸であり、よし好ましくはＥＬＶＩＳベクターのようなベクター構築物またはＲＮＡベクター構築物である。本発明の１つの特定の利点は、ＥＬＶＩＳベクターに吸着された高分子が、脊椎動物宿主において細胞媒介性の免疫応答を生じる能力である。本発明の抗原／微粒子が、選択された抗原に対する細胞媒介性の免疫応答を誘発する能力は、広範な種々の病原による感染に対する強力な道具である。従って、本発明の抗原／微粒子は、ワクチン組成物中に取り込まれ得る。
【００８７】
従って、従来の抗体応答に加えて、本明細書中に記載される系は、例えば、クラスＩ  ＭＨＣ分子と発現される抗原との関連を提供し得、その結果、ＣＴＬの産生を刺激し、抗原のさらなる認識を可能にする、目的の抗原に対するインビボの細胞性免疫応答が高められ得る。さらに、この方法は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を誘発し得る。従って、本発明の方法は、細胞性免疫応答および／または体液性免疫応答が所望される任意の高分子を用いる用途を見出し、好ましくは、ウイルス病原体由来の抗原は、抗体、Ｔ細胞ヘルパーエピトープおよびＴ細胞細胞傷害性エピトープを誘導し得る。このような抗原としては、限定ではなく、ヒトおよび動物のウイルスによってコードされる抗原が挙げられ、構造タンパク質または非構造タンパク質のいずれかに対応し得る。
【００８８】
本発明の微粒子は、通常乏しい免疫応答を誘発する細胞内ウイルスに対する免疫のために特に有用である。例えば、本発明は、ヘルペスウイルスファミリー由来の広範な種々のタンパク質に対する免疫応答を刺激するための用途を見出し、このタンパク質としては、１型および２型の単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）に由来するタンパク質（例えば、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の糖タンパク質である、ｇＢ、ｇＤおよびｇＨ）；水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来の抗原（ＣＭＶ  ｇＢおよびｇＨを含む）；ならびに他のヒトヘルペスウイルス（例えば、ＨＨＶ６およびＨＨＶ７）に由来する抗原が挙げられる（例えば、サイトメガロウイルスのタンパク質コード内容の総論については、Ｃｈｅｅら、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｊ．Ｋ．ＭｃＤｏｕｇａｌｌ、編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  １９９０）１２５−１６９頁；種々のＨＳＶ−１コードタンパク質の考察については、ＭｃＧｅｏｃｈら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６９：１５３１−１５７４；ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のｇＢおよびｇＤタンパク質、ならびにこれらをコードする遺伝子の考察については、米国特許第５，１７１，５６８号；ＥＢＶゲノム中のタンパク質コード配列の特定については、Ｂａｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１０：２０７−２１１；そしてＶＺＶの総論については、ＤａｖｉｓｏｎおよびＳｃｏｔｔ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）６７：１７５９−１８１６を参照のこと）。
【００８９】
ヘルペスファミリーのウイルス（Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）および型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）を含む）由来の抗原はまた、本明細書中に記載される技術において簡便に使用され得る。例として、ＨＣＶのウイルスゲノム配列ならびに配列を得るための方法は公知である。例えば、国際公開番号ＷＯ８９／０４６６９；ＷＯ９０／１１０８９；およびＷＯ９０／１４４３６を参照のこと。ＨＣＶゲノムは、いくつかのウイルスタンパク質をコードし、このタンパク質としては、Ｅ１（Ｅとしても公知）およびＥ２（Ｅ２／ＮＳＩとしても公知）ならびにＮ末端ヌクレオキャプシドタンパク質（「コア」と称される）が挙げられる（例えば、ＨＣＶタンパク質（Ｅ１およびＥ２を含む）の考察については、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）１４：３８１−３８８を参照のこと）。これらのタンパク質の各々ならびにその抗原性フラグメントは、本発明の組成物および方法において用途を見出す。
【００９０】
同様に、ＨＤＶ由来のδ抗原の配列は公知であり（例えば、米国特許第５，３７８，８１４号を参照のこと）、そしてこの抗原は、本発明の組成物および方法において簡便に使用され得る。さらに、ＨＢＶ由来の抗原（例えば、コア抗原、表面抗原、ＳＡｇ）、ならびにプレ表面（ｐｒｅｓｕｒｆａｃｅ）配列（ｐｒｅ−Ｓ１およびｐｒｅ−Ｓ２（以前にはｐｒｅ−Ｓと称された））、ならびに上記の組み合わせ（例えば、ＳＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ１、ＳＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ２、ＳＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ１／ｐｒｅ−Ｓ２およびｐｒｅ−Ｓ１／ｐｒｅ−Ｓ２）が、本明細書中で用途を見出す。例えば、ＨＢＶ構造の考察については、「ＨＢＶ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ−ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｏ  ｌｉｃｅｎｓｅ：ａ  ｃａｓｅ  ｓｔｕｄｙ」、Ｍａｃｋｅｔｔ，Ｍ．およびＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．、Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ、１５９−１７６頁；およびその全体が本明細書中で参考として援用される米国特許第４，７２２，８４０号、同第５，０９８，７０４号、同第５，３２４，５１３号；Ｂｅａｍｅｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９：６８３３−６８３８、Ｂｒｉｎｂａｕｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９０）６４：３３１９−３３３０；およびＺｈｏｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９１）６５：５４５７−５４６４を参照のこと。
【００９１】
他のウイルス由来の抗原（限定ではなく、とりわけ以下のファミリーのメンバーに由来するタンパク質：Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ポリオウイルスなど）；Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、風疹ウイルス、デングウイルスなど）；Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、狂犬病ウイルスなど）；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルスなど）；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、Ａ型、Ｂ型およびＣ型などのインフルエンザウイルス）；Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ；Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｄａｅ（例えば、ＨＴＬＶ−Ｉ；ＨＴＬＶ−ＩＩ；ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶ、ｈＴＬＲなどとしても公知））、単離体ＨＩＶＩＩＩｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＩＶＬＡＶ、ＨＩＶＬＡＩ、ＨＩＶＭＮ由来の抗原が挙げられるが、これらに限定されない）；ＨＩＶ−１ＣＭ２３５、ＨＩＶ−１ＵＳ４；ＨＩＶ−２；サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ））もまた、特許請求された組成物および方法において用途を見出す。さらに、抗原はまた、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）およびダニ媒介脳炎ウイルスに由来し得る。例えば、これらおよび他のウイルスの記載については、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第三版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編、１９８８）；Ｆｕｎｄａｍａｎｔａｌ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第二版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ、編、１９９１）を参照のこと。
【００９２】
より詳細には、上記ＨＩＶ単離体のいずれか由来のｇｐ１２０またはｇｐ１４０エンベロープタンパク質（ＨＩＶの種々の遺伝子サブタイプのメンバーを含む）が公知であり、そして報告されており（種々のＨＩＶ単離体のエンベロープタンパク質の比較については、例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ（１９９２）；Ｍｙｅｒｓら、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｉｄｓ，１９９０，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ：Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ；およびＭｏｄｒｏｗら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８７）６１：５７０−５７８を参照のこと）、そしてこれらの単離体のいずれかに由来する抗原は、本発明の方法において用途を見出す。さらに、本発明は、種々のＨＩＶ単離体のいずれかに由来する他の免疫原性タンパク質（ｇｐ１６０およびｇｐ４１のような種々のエンベロープタンパク質、ｐ２４ｇａｇおよびｐ５５ｇａｇのようなｇａｇ抗原、およびｐｏｌ領域およびｔａｔ領域に由来するタンパク質のいずれかを含む）に等しく適用可能である。これらのタンパク質および抗原のいずれかはまた、本発明における使用のために改変され得る。例えば、図１、２、５、および６は、改変されたｇａｇ抗原をコードするＤＮＡ配列（配列番号６３、６４、６７、および６８）を提供し、そして図３および４は、改変されたエンベロープ抗原をコードするＤＮＡ配列（配列番号６５および６６）を提供する。
【００９３】
インフルエンザウイルスは、本発明が特に有用であるウイルスの別の例である。詳細には、インフルエンザＡのエンベロープ糖タンパク質ＨＡおよびＮＡは、免疫応答を生成するために特に興味深い。インフルエンザＡの多数のＨＡサブタイプが同定されている（Ｋａｗａｏｋａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９０）１７９：７５９−７６７；Ｗｅｂｓｔｅｒら、「Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ａｍｏｎｇ  ｔｙｐｅ  Ａ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ」、１２７−１６８頁、Ｐ．ＰａｌｅｓｅおよびＤ．Ｗ．Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ（編）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。従って、これらの単離体のいずれかに由来するタンパク質はまた、本明細書中に記載される組成物および方法において使用され得る。
【００９４】
本明細書中に記載される組成物および方法は、多数の細菌抗原（例えば、ジフテリア、コレラ、結核、破傷風、百日咳、髄膜炎を引き起こす生物に由来する抗原）、ならびにＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ．Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａＢ型（ＨＩＢ）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、およびこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない他の病原体状態を用いる用途を見出す。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ  Ｂ由来の抗原の例は、以下の共同所有された特許出願において開示される：ＰＣＴ／ＵＳ９９／０９３４６；ＰＣＴ  ＩＢ９８／０１６６５；およびＰＣＴ  ＩＢ９９／００１０３。寄生生物抗原の例としては、マラリアおよびライム病を引き起こす生物に由来する抗原が挙げられる。
【００９５】
本発明を用いる使用のためのさらなる抗原は、以下（直後に列挙される参考文献）を含み、これらのいくつかは、本願のどこかに列挙される：
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ由来のタンパク質抗原（例えば、以下の参考文献１〜７の抗原）。
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂから調製された外膜小胞（ＯＭＶ）（以下の参考文献８、９、１０、１１などにおいて開示されるような外膜小胞）。
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹ由来の多糖抗原（例えば、参考文献１２において開示される血清型Ｃ由来のオリゴ糖）［参考文献１３もまた参照のこと］。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の糖抗原［例えば、参考文献１４、１５、１６］。
−Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の抗原［例えば、参考文献１、２、３］。
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原［例えば、参考文献１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３］。
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原［例えば、参考文献２４］。
−Ａ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、不活化ウイルス）［例えば、参考文献２５、２６］。
−Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、表面抗原および／またはコア抗原）［例えば、参考文献２６、２７］。
−Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば、参考文献２８］。
−必要に応じてまた、ｐｅｒｔａｃｔｉｎならびに／あるいは凝集原２および３と組み合わせてた、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原（例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の百日咳ホロトキシン（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）（ＰＴ）および糸状赤血球凝集素（ＦＨＡ））［例えば、参考文献２９および３０］。
−ジフテリア抗原（例えば、ジフテリアトキソイド［例えば、参考文献３１の第３章］（例えば、ＣＲＭ１９７変異体［例えば、参考文献３２］））
−破傷風抗原（例えば、破傷風トキソイド）［例えば、参考文献３１の第４章］。
−Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ由来のタンパク質抗原（例えば、ＣａｇＡ［例えば、参考文献３３］、ＶａｃＡ［例えば、参考文献３３］、ＮＡＰ［例えば、参考文献３４］、ＨｏｐＸ［例えば、参考文献３５］、ＨｏｐＹ［例えば、参考文献３５］および／またはウレアーゼ）。
−Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ由来の糖抗原［例えば、参考文献１３］。
−Ｐｏｒｐｈｙｒａｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の抗原［例えば、参考文献３６］。
−ポリオ抗原［例えば、参考文献３７、３８］（例えば、ＩＰＶまたはＯＰＶ）。
−ウサギ抗原［例えば、参考文献３９］（例えば、凍結乾燥した不活化ウイルス［例えば、参考文献４０、ＲａｂａｖｅｒｔＴＭ］）。
−麻疹抗原、おたふくかぜ抗原および／または風疹抗原［例えば、参考文献３１の第９、１０および１１章］。
−インフルエンザ抗原［例えば、参考文献３１の第１９章］（例えば、血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質）。
−Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来の抗原［例えば、参考文献４１］。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ由来の抗原（Ｂ群ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）［例えば、参考文献４２、４３］。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の抗原（Ａ群ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）［例えば、参考文献４３、４４、４５］。
−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来の抗原［例えば、参考文献４６］。
−これらの抗原の１つ以上を含む組成物。
【００９６】
多糖抗原または炭水化物抗原が使用される場合、免疫原性を強化するためにキャリアタンパク質に結合体化させることは好ましい［例えば、参考文献４７〜５６］。好ましいキャリアタンパク質は、細菌毒素またはトキソイド（例えば、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイド）である。ＣＲＭ１９７ジフテリアトキソイドは、特に好ましい。他の適切なキャリアタンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質［例えば、参考文献５７］、合成ペプチド［例えば、参考文献５８、５９］、熱ショックタンパク質［例えば、参考文献６０］、百日咳タンパク質［例えば、参考文献６１、６２］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のプロテインＤ［例えば、参考文献６３］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素ＡまたはＢ［例えば、参考文献６４］などが挙げられる。混合物が、血清型ＡおよびＣの両方由来の被膜多糖を含む場合、ＭｅｎＡ多糖：ＭｅｎＣ多糖の比（ｗ／ｗ）は、１より大きい（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１またはこれより大きい）ことが好ましい。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの異なる血清型由来の多糖は、同じまたは異なるキャリアタンパク質に結合体化され得る。
【００９７】
必要な場合、任意の適切なリンカーとの、任意の適切な結合体化反応が使用され得る。
【００９８】
毒性タンパク質抗原は、必要な場合、解毒され得る（例えば、化学的手段による百日咳毒素の解毒）［参考文献３０］。
【００９９】
ジフテリア抗原が、組成物中に含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原を含むこともまた好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原を含むこともまた、好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原を含むこともまた好ましい。
【０１００】
本発明は、広範な種々の高分子を送達するために使用され得、従って、多数の疾患を処置、予防、および／または診断するために使用され得ることが容易に明らかである。いくつかの実施形態において、本発明の高分子／微粒子組成物は、部位特異的標的化送達のために使用され得る。例えば、高分子／微粒子組成物の静脈内投与は、肺、肝臓、脾臓、血液循環、または骨髄を標的化するために使用され得る。
【０１０１】
高分子の吸着剤微粒子の表面（または本発明のミクロン未満のエマルジョン）への吸着は、イオン結合、水素結合、共有結合、ファンデルワールス結合、物理的捕捉、および親水性／疎水性相互作用を介する結合を含むがこれらに限定されない、任意の結合相互作用機構を介して生じる。当業者は、吸着される高分子の型に適した界面活性剤を容易に選択し得る。
【０１０２】
例えば、荷電した界面活性剤（例えば、アニオン性またはカチオン性界面活性剤）の存在下で製造した微粒子は、正味の負電荷または正味の正電荷を有する表面を有する微粒子を生じ得、これは、広範な種々の分子を吸収し得る。例えば、アニオン性界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））を用いて製造された微粒子（すなわち、ＳＤＳ−ＰＬＧ微粒子）は、正に荷電した抗原（例えば、タンパク質）を吸着する。同様に、カチオン性界面活性剤（例えば、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ））を用いて製造された微粒子（すなわち、ＣＴＡＢ−ＰＬＧ微粒子）は、負に荷電した高分子（例えば、ＤＮＡ）を吸着する。吸着される高分子が、正電荷および負電荷の領域を有する場合、カチオン性、アニオン性、非イオン性、または双性イオン性の界面活性剤が適切であり得る。
【０１０３】
本発明と共に使用するための微粒子を製造するための生物分解性ポリマーは、例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、ＧｅｒｍａｎｙおよびＢｉｒｍｉｎｇｈａｍ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ．から市販されている。例えば、本明細書中の微粒子を形成するための有用なポリマーとしては、以下に由来するホモポリマー、コポリマーおよびポリマーブレンドが挙げられる：ポリヒドロキシ酪酸（ポリヒドロキシブチレートとしてもまた公知である）；ポリヒドロキシ吉草酸（ポリヒドロキシバレレートとしてもまた公知である）；ポリグリコール酸（ＰＧＡ）（ポリグリコリドとしてもまた公知である）：ポリ乳酸（ＰＬＡ）（ポリラクチドとしてもまた公知である）；ポリジオキサノン；ポリカプロラクトン；ポリオルトエステル；およびポリ無水物。より好ましいのは、ポリ（α−ヒドロキシ酸）（例えば、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（本明細書中で共に「ＰＬＡ」として公知である））、ポリ（ヒドロキシブチレート）、Ｄ，Ｌ−ラクチドおよびグリコリドのコポリマー（例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド））（本明細書中で「ＰＬＧ」または「ＰＬＧＡ」と命名される）またはＤ，Ｌ−ラクチドおよびカプロラクトンのコポリマーである。本明細書中における使用のための特に好ましいポリマーは、ＰＬＡおよびＰＬＧポリマーである。これらのポリマーは、種々の分子量で利用可能であり、そして所定の使用のための適切な分子量が、当業者によって容易に決定される。従って、例えば、ＰＬＡについて、適切な分子量は、約２０００〜５０００のオーダーである。ＰＬＧについて、適切な分子量は、一般的に、約１０，０００〜約２００，０００の範囲であり、好ましくは、約１５，０００〜１５０，０００の範囲である。
【０１０４】
ＰＬＧのようなコポリマーは、微粒子を形成するために使用される場合、種々のラクチド：グリコリド比が、本明細書中において用途を見出し、そしてこの比は、大部分は、選択でき、同時投与された高分子および所望の分解速度に一部依存する。例えば、５０：５０  ＰＬＧポリマー（５０％  Ｄ，Ｌ−ラクチドおよび５０％グリコリドを含む）は、速く再吸収するコポリマーを提供するが、増加したラクチド成分に起因して、７５：２５  ＰＬＧは、よりゆっくり分解し、そして８５：１５および９０：１０は、さらによりゆっくり分解する。適切な比のラクチド：グリコリドは、例えば、問題の抗原および障害の性質に依存して、当業者によって容易に決定されることは、明らかである。さらに、抗原またはアジュバントが微粒子内に内包される本発明の実施形態において、種々のラクチド：グリコリド比を有する微粒子の混合物は、所定の高分子に所望の放出動力学を達成するため、そして一次免疫反応および二次免疫反応の両方を提供するために本明細書中で用途を見出す。本発明の微粒子の分解速度はまた、ポリマー分子量およびポリマー結晶化度のような因子によって制御され得る。種々のラクチド：グリコリド比および分子量を有するＰＬＧコポリマーは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，ＧｅｒｍａｎｙおよびＢｉｒｍｉｎｇｈａｍ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬを含む多数の供給元から市販されている。これらのポリマーはまた、当業者に周知の技術（例えば、Ｔａｂａｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．（１９８８）２２：８３７−８５８において記載されるような技術）を使用して、乳酸成分の簡単な重縮合によって合成され得る。
【０１０５】
使用される場合、好ましいポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）ポリマーは、３０：７０〜７０：３０、より好ましくは４０：６０〜６０：４０の範囲のラクチド／グリコリドのモル比を有し、かつ１０，０００〜１００，０００ダルトン、より好ましくは３０，０００ダルトン〜７０，０００ダルトンの範囲の分子量を有するポリマーである。
【０１０６】
ポリマー微粒子は、当業者に周知のいくつかの方法のいずれかを使用して調製され得る。例えば、いくつかの実施例において、二重エマルジョン／溶媒エバポレーション技術（例えば、米国特許第３，５２３，９０７号およびＯｇａｗａら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（１９８８）３６：１０９５−１１０３において記載されるような技術）は、微粒子を作製するために本明細書中において使用され得る。これらの技術は、ポリマー溶液の液滴からなる第１のエマルジョンの形成を包含し、これは、引き続き、粒子安定剤／界面活性剤を含む連続的な水相と混合される。
【０１０７】
あるいは、Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９３）１１：９６５−９６９、Ｏ’Ｈａｇａｎらに対するＰＣＴ／ＵＳ９９／１７３０８（ＷＯ  ００／０６１２３）、およびＪｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２によって記載されるように、水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）溶媒エバポレーション系を使用して、微粒子を形成し得る。この技術において、特定のポリマーは、代表的に、有機溶媒（例えば、酢酸エチル、ジメチルクロライド（塩化メチレンおよびジクロロメタンとも呼ばれる）、アセトニトリル、アセトン、クロロホルムなど）と組み合わされる。ポリマーは、有機溶媒中、約１〜３０％、好ましくは約２〜１５％、より好ましくは約３〜１０％、そして最も好ましくは約４〜６％の溶液で提供される。次いでこのポリマー溶液を、水溶液と組み合わせて、乳化してｏ／ｗエマルジョンを形成する。水溶液は、例えば、脱イオン水、通常の生理食塩水、または緩衝液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）またはクエン酸ナトリウム／エチレンジアミン四酢酸（クエン酸ナトリウム／ＥＴＤＡ）緩衝液）であり得る。好ましくは、ポリマー溶液対水溶液の容量比は、約５：１〜２０：１（より好ましくは約１０：１）の範囲である。乳化は、この課題に適切な任意の装置を使用して行われ、そして代表的には、例えば、ホモジナイザーのような高剪断デバイスである。
【０１０８】
次いで、ｏ／ｗエマルジョンの容量を、必要に応じて好ましくは、より大きい容量の水溶液（これは好ましくは、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、または非イオン性界面活性剤を含む）と組み合わせる。水溶液対ｏ／ｗエマルジョンの容量比は、代表的には、約２：１〜１０：１（より代表的には約４：１）の範囲である。本発明の実施に適切なアニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、および非イオン性界面活性剤の例は、上記列挙され、それぞれＳＤＳ、ＣＴＡＢ、およびＰＶＡを含む。特定の高分子は、安定剤および／または界面活性剤の組み合わせ（例えば、ＰＶＡおよびＤＯＴＡＰの組み合わせ）を有する微粒子により容易に吸着し得る。さらに、いくつかの場合において、上記の有機溶媒に界面活性剤を添加することは所望され得る。非イオン性界面活性剤（例えば、ＰＶＡ（エマルジョン安定剤））が使用される場合、これは、約２〜１５％溶液、より代表的には約４〜１０％溶液で提供される。カチオン性またはアニオン性界面活性剤が使用される場合、これは、代表的に約０．０５〜５％溶液、より代表的には約０．２５〜１％溶液で提供される。一般的に、約０．００００１：１〜約０．５：１の範囲の重量対重量の界面活性剤対ポリマー比が使用され、より好ましくは約０．０００１：１〜約０．５：１、より好ましくは約０．００１：１〜約０．５：１、そしてなおより好ましくは約０．００５：１〜約０．５：１の範囲の重量対重量の界面活性剤対ポリマー比が使用される。
【０１０９】
次いで混合物を、ホモジナイズし、安定なｗ／ｏ／ｗ二重エマルジョンを生成する。次いで有機溶媒をエバポレートする。処方物パラメーターを操作し、０．０５μｍ（５０ｎｍ）のオーダーの小さい微粒子から５０μｍ以上の、より大きい微粒子の調製を可能にし得る。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐ．（１９９６）を参照のこと。例えば、減少した撹拌は、内部層容量が増加するにつれて、より大きい微粒子を生じる。小さい粒子は、高濃度のエマルジョン安定剤を用いて低水相容量によって、生成される。
【０１１０】
さらなる情報は、米国出願番号 、代理人書類番号ＰＰ１６５０２．００２、２００１年９月２８日に出願された、発明の名称「Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  Ａｄｓｏｒｂｅｄ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」において見出され得る。
【０１１１】
処方物パラメーターを操作して、０．０５μｍ（５０ｎｍ）のオーダーの小さい微粒子の、５０μｍ以上のより大きい微粒子への調製を可能にし得る。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐ．（１９９６）を参照のこと。例えば、減少した撹拌は、内部相容量が増加するにつれて、より大きい微粒子を生じる。小さい粒子は、高濃度のエマルジョン安定剤を用いて低水相容量によって、生成される。
【０１１２】
微粒子はまた、例えば、Ｔｈｏｍａｓｉｎら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ（１９９６）４１：１３１；米国特許第２，８００，４５７号；Ｍａｓｔｅｒｓ，Ｋ．（１９７６）Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｉｎｇ、第２版、Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋにおいて記載されるような噴霧乾燥およびコアセルベーション；Ｈａｌｌら（１９８０）Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｔｈｅｏｒｙ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａ．Ｆ．Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ編）、第２巻、１３３〜１５４頁、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａの「Ｗｕｒｓｔｅｒ  Ｐｒｏｃｅｓｓ」およびＤｅａｓｙ，Ｐ．Ｂ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．（１９８８）Ｓ（２）：９９−１３９によって記載されるような空気懸濁コーティング技術（例えば、パンコーティングおよびＷｕｒｓｔｅｒコーティング）；ならびに例えば、Ｌｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８０）２１０：９０８−９１０によって記載されるようなイオン性ゲル化を使用して形成され得る。
【０１１３】
粒子サイズは、例えば、ヘリウム−ネオンレーザーを取り込む分光計を使用して、例えば、レーザー光散乱によって決定され得る。一般的に、粒子サイズは、室温で決定され、そして問題のサンプルの複数（例えば、５〜１０回）の分析を含み、粒子直径についての平均値を生じる。粒子サイズはまた、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して容易に決定される。
【０１１４】
本発明の代替的な実施形態は、ミクロン以下のエマルジョンを含む微粒子調製物を利用し、これは、好ましくは、イオン性界面活性剤を含む。例えば、ＭＦ５９などは、ミクロン以下のベースオイル含有エマルジョンとして使用され得るが、イオン性界面活性剤としては、ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＥＰＣ）およびジオレオイル−ホスファチジン酸（ＤＰＡ）が挙げられ得るが、これらに限定されず、これらの各々は、スクアレンに可溶性である。プロトタイプのイオン性エマルジョンは、スクアレン１ｍｌ中４〜５２ｍｇの範囲の濃度で、スクアレン／１０％Ｓｐａｎ  ８５中に各々の界面活性剤を溶解することによって処方され得る。スクアレン／界面活性剤混合物は、５ｍｌスクアレン／１００ｍｌ  Ｈ２Ｏで、０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０／Ｈ２Ｏを用いて乳化され得る。プレエマルジョンは、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎホモジナイザー（５分、５０００ＲＰＭ）を用いる均質化によって形成され得、そして最終エマルジョンは、微小流動化（約１０，０００ｐｓｉ、５回通過、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ  １１０Ｓ）によって作製され得る。ミクロン以下のエマルジョンに関するさらなる考察は、以下に見出され得る。
【０１１５】
調製後、微粒子は、将来の使用のためにそのままかまたは凍結乾燥して貯蔵され得る。代表的に、高分子を微粒子に吸着させるために、微粒子調製物は、目的の高分子と単に混合され、そして得られた処方物は、使用の前に再び凍結乾燥され得る。一般的に、高分子は、微粒子に添加されて、約０．０００１：１〜０．２５：１、好ましくは０．００１：１〜０．１、より好ましくは０．０１〜０．０５の高分子対微粒子の重量対重量比を有する、高分子が吸着された微粒子を生じる。微粒子の高分子含量は、標準的な技術を使用して決定され得る。
【０１１６】
上記のように、本発明と関連する使用のための高分子としては、タンパク質（好ましくは抗原物質）、および核酸（好ましくは核酸配列を発現し得るベクター構築物（例えば、ＣＭＶベースのベクター、ＥＬＶＩＳベクターまたはＲＮＡベクター構築物））が挙げられる。
【０１１７】
本発明のポリマー微粒子の中には高分子が封入されていてもよく、カプセル化されていてもよく、ならびに高分子が表面に吸着されていてもよい。従って、例えば、当業者は、本発明に従って、表面にＥＬＶＩＳベクターが吸着された、アジュバントをカプセル化した微粒子、または表面にＲＮＡベクター構築物が吸着された抗原をカプセル化した微粒子を調製し得る。本発明は、他の核酸ならびに他の抗原性分子と、微粒子上に吸着された核酸高分子および微粒子中に封入された核酸高分子との種々の組み合わせを意図する。いくつかの好ましい実施形態において、本発明の微粒子は、その表面にＥＬＶＩＳベクターまたはＲＮＡベクター構築物が吸着されている。
【０１１８】
さらに、本発明の微粒子の実施形態のいずれもが、エレクトロポレーションと組み合わせて、送達され得る。
【０１１９】
一旦、高分子吸着微粒子および／またはサブミクロンエマルジョン微粒子が生成されると、これらは任意の所望のアジュバントと共に、上記の広範な種々の障害を処置、予防および／または診断するためのワクチンを含有する薬学的組成物に処方される。この組成物は、一般に、１つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤を含む。例えば、ビヒクル（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノールなど）が、使用され得る。他の賦形剤（例えば、湿潤剤または乳化剤、生物学的緩衝物質など）が、このようなビヒクル中に存在し得る。生物学的緩衝液は、薬理学的に受容可能でありかつ所望のｐＨ（すなわち、生理学的範囲のｐＨ）を有する処方物を提供する実質的に任意の溶液であり得る。緩衝溶液の例としては、リン酸緩衝化生理食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水、ハンクス緩衝化生理食塩水などが挙げられる。当該分野で公知の他の賦形剤（例えば、結合剤、崩壊剤、充填剤（希釈剤）、潤滑剤、滑剤（流動向上剤）、圧縮助剤、着色剤、甘味料、保存剤、懸濁／分散剤、フィルム形成剤／コーティング剤、香味剤および印刷インク）もまた、最終的な投薬形態に導入され得る。
【０１２０】
本発明の組成物は、治療有効量の１つ以上の目的の高分子を含む。すなわち、症状を予防、軽減、排除または診断するために、被験体に十分な応答を生じさせる量の高分子／微粒子が、この組成物中に含まれる。正確な必要量は、とりわけ、処置されている被験体；処置される被験体の年齢および一般的な状態；処置されている状態の重篤度；免疫学的応答の場合、抗体を合成する被験体の免疫系の能力；所望される保護の程度および選択される特定の抗原およびその投与様式に依存する。適切な有効量は、当業者によって容易に決定され得る。従って、治療的有効量は、慣用的な試行によって決定され得る比較的広い範囲にある。例えば、本発明の目的のために、高分子がポリヌクレオチドである場合、有効用量は、代表的に、約１ｎｇ〜約１０ｍｇ、より好ましくは約１０ｎｇ〜約１ｍｇ、最も好ましくは約１００μｇ〜約１ｍｇの範囲の送達される高分子／用量であり；この高分子が抗原である場合、有効用量は、代表的に、約１μｇ〜約１ｍｇ、より好ましくは約１０μｇ〜約１ｍｇ、最も好ましくは約５０μｇ〜約１ｍｇの範囲の送達される高分子／用量である。
【０１２１】
一旦、処方されると、本発明の組成物は、例えば、注射によって、非経口投与され得る。この組成物は、皮下、腹腔内、静脈内または筋肉内のいずれかに注射され得る。他の投与形態としては、系鼻投与、粘膜投与、直腸投与、膣投与、経口投与および肺投与、坐剤、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌまたはｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）適用が挙げられる。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数用量スケジュールであり得る。複数用量スケジュールは、投与の一次経過が１〜１０回の別個の用量で行われ、続いて他の用量が、その治療的応答を維持および／または強化するように選択された引き続く時間間隔（例えば、第２の用量について１〜４ヶ月、必要ならば、数ヶ月後に続く用量）で投与される、スケジュールである。
【０１２２】
本発明の特定の実施形態において、ベクター構築物（これは抗原をコードする異種核酸配列を含む）の一連の１回以上の注射は、抗原の一連の１回以上の注射が続く（本明細書中で、「ブースト（追加）」とも呼ばれる）。特定の例として、ベクター構築物は、３回の注射：（ａ）最初の投与の時点で、（ｂ）最初の投与から１〜８週間の範囲の期間で、および（ｃ）最初の投与から４〜３２週の範囲の期間で投与され得、一方、抗原は、２回の注射：（ａ）最初の投与から８〜５０週の範囲の期間で、および（ｂ）最初の投与から８〜１００週の範囲の期間で投与され得る。
【０１２３】
投薬レジメンはまた、少なくとも部分的に、被験体の必要性によって投与され、そして医師の判断に基づく。
【０１２４】
さらに、疾患の予防が所望される場合、吸着ベクター構築物を有する微粒子は、一般に、目的の病原体で一次感染する前に、投与される。疾患の処置（予防以外）（例えば、症状または再発の軽減）が所望される場合、吸着ベクター構築物を有する微粒子は、一般に、一次感染の後に投与される。
【０１２５】
（２．油滴エマルジョン）
本発明の他の実施形態において、代謝可能油および乳化剤を含有する油滴エマルジョン（特に、サブミクロンエマルジョン）が調製される。オリゴヌクレオチドのような、少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含む分子は、油滴エマルジョンと合わせられて、アジュバントを形成し得る。
【０１２６】
油滴エマルジョンは、好ましくは、代謝可能油および乳化剤を含み、ここで個の油および乳化剤は、油滴を有する水中油型エマルジョンの形態で存在し、この油滴の実質的に全ての直径は、１ミクロンよりも小さい。この好ましいサイズ範囲の液滴を含むサブミクロンエマルジョンは、油および乳化剤を含む他のエマルジョン（ここでこの油滴は、本発明により提供される油滴よりもはるかに大きい）を越えて驚くほど優れている。好ましい実施形態において、このエマルジョンは、カチオン性界面活性剤が乳化剤として使用される結果として、正に荷電されるか、あるいは乳化剤に加えて、カチオン性界面活性剤を含む。これにより、ヌクレオチド抗原性分子（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチドまたはベクター構築物）の吸着が可能となる。あるいは、アニオン性界面活性剤の使用によって、タンパク質のような分子の吸着が可能となる。
【０１２７】
本発明のサブミクロンエマルジョン組成物の個々の成分は、一般的に公知であるが、このような組成物は、同じ様式で組み合わされていない。従って、個々の成分は、以下で一般的にかつ好ましい実施形態について幾分詳細に記載されるが、当該分野で周知であり、本明細書中で使用される用語（例えば、代謝可能油、乳化剤、免疫刺激剤、ムラミルペプチドおよび親油性ムラミルペプチド）は、さらなる説明なしで、当業者にこれらの成分を示すのに十分周知である。
【０１２８】
これらの組成物の１成分は、好ましくは約６〜約３０個の炭素原子の代謝可能な非毒性の油であり、アルカン、アルケン、アルキンおよびそれらの対応する酸およびアルコール、それらのエーテルおよびエステル、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。この油は、任意の植物性油、魚油、動物性油または合成的に調製された油であり、これらの油はアジュバントが投与される宿主動物の身体によって代謝され得、そして被験体に対して毒性ではない。宿主動物は、代表的に、哺乳動物、好ましくは、ヒトである。鉱油および類似の毒性蒸留石油は、本発明から明確に排除される。
【０１２９】
本発明の油成分はまた、任意の長鎖のアルカン、アルケンもしくはアルキン、またはそれらの酸誘導体もしくはアルコール誘導体（遊離酸、その塩またはエーテル（例えば、トリグリセリドおよび１，２−プロパンジオールまたは類似のポリヒドロキシアルコールのエステルのようなモノエステルもしくはジエステルもしくはトリエステル）のいずれかとして）であり得る。アルコールは、アミノ官能性酸または多官能性酸（例えば、酢酸、プロパン酸、クエン酸など）を使用してアシル化され得る。油であり本明細書中に記載される他の基準を満たす長鎖アルコールから誘導されるエーテルもまた、使用され得る。
【０１３０】
個々のアルカン、アルケンまたはアルキン部分、およびその酸誘導体またはアルコール誘導体は、一般に、約６〜約３０個の炭素原子を有する。この部分は、直鎖または分枝鎖の鎖構造を有し得る。これは完全に飽和され得るか、または１つ以上の二重結合もしくは三重結合を有し得る。モノエステルもしくはポリエステル、またはモノエーテルもしくはポリエーテルベースの油が用いられる場合、約６〜約３０個の炭素の制限は、全炭素数ではなく、個々の脂肪酸または脂肪アルコール部分に適用される。
【０１３１】
任意の代謝可能油、特に、動物、魚または植物の供給源由来の油が、本明細書中で使用され得る。この油は、これが投与される宿主によって代謝されることが不可欠であり、そうでなければこの油成分は、膿瘍、肉芽腫またはさらに癌を引き起こし得るか、または（獣医診療において使用する場合）この油成分により、ワクチン接種されたトリおよび動物の肉は、消費者に対して代謝されていない油が有し得る有害な影響に起因して、消費者に受け入れられなくなる。
【０１３２】
このようなサブミクロンエマルジョンの詳細な記載については、国際出願番号ＷＯ  ９０／１４８３７、および共有に係る国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／０３３１を参照のこと。
【０１３３】
これらのアジュバントおよび免疫原性組成物の油成分は、約０．５重量％〜約２０重量％、しかし好ましくは約１５容量％を超えない量で存在し、特に約１容量％から約１２容量％の量で存在する。約１容量％〜約４容量％の油を使用することが最も好ましい。
【０１３４】
これらのサブミクロンエマルジョン組成物の水性部分は、好ましくは緩衝化生理食塩水であるか、またはより好ましくは、純水である。これらの組成物は、非経口投与が意図されるため、この組成物と生理学的流体との間の異なるイオン濃度に起因する投与後の膨潤またはこの組成物の迅速な吸収を防止するために、張度、すなわち浸透圧重量モル濃度が、正常な生理学的流体と本質的に同じであるように、免疫原性組成物として使用される最終的な緩衝化溶液を構築することが好ましい。正常な生理学的状態と適合性のｐＨを維持するために、生理食塩水を緩衝化することもまた好ましい。また、特定の場合、グリコペプチドのような特定の組成物成分の安定性を保証するために、特定のレベルにｐＨを維持する必要があり得る。
【０１３５】
任意の生理学的に受容可能な緩衝液が、本明細書中で使用され得るが、リン酸緩衝液が好ましい。他の受容可能な緩衝液（例えば、酢酸緩衝液、トリス緩衝液、銃炭酸緩衝液、炭酸緩衝液など）が、リン酸緩衝液の代用として使用され得る。水性成分のｐＨは、好ましくは、約６．０〜８．０の間である。
【０１３６】
しかし、サブミクロンエマルジョンが最初に調製される場合、純水が、このエマルジョンの水性成分として好ましい。塩濃度の増加により、所望の小さな液滴サイズを達成することがより困難となる。最終的な免疫原性組成物が、アジュバントから調製される場合、抗原性材料は、所望の免疫原性組成物を提供するのに適切な浸透圧重量モル濃度で、緩衝液に添加され得る。
【０１３７】
これらの組成物において用いられる水性成分の量は、この組成物の値を一致させるのに必要な量である。すなわち、この組成物をかさ高くするために、１００％にするのに必要な水性成分の量が、上記の他の成分と混合される。
【０１３８】
かなりの数の乳化剤および懸濁剤が、一般に、薬学において使用される。これには、天然由来の材料（例えば、樹木由来のゴム、植物性タンパク質、糖ベースのポリマー（例えば、アルギネートおよびセルロース）など）が挙げられる。特定のオキシポリマー、またはヒドロキシドもしくは他の親水性置換基を炭素骨格上に有するポリマー（例えば、ポビドン、ポリビニルアルコールおよびグリコールエーテルベースの単官能性化合物および多官能性化合物）は、界面活性を有する。長鎖脂肪酸由来化合物は、本発明で使用され得る、第３のかなりの群の乳化剤および懸濁剤を形成する。上記の界面活性剤のいずれかは、これらが非毒性である限り、有用である。
【０１３９】
本発明に従って使用され得る適切な乳化剤（界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔまたはｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）とも呼ばれる）の具体的な例は、共有に係る国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／０３３１に開示される。界面活性剤は、一般的に、４つの基本的なタイプ：アニオン性、カチオン性、両性イオン性および非イオン性に分けられる。アニオン性界面活性剤の例としては、アルギニン酸、カプリル酸、胆汁酸、１−デカンスルホン酸、デオキシコール酸、１−ドデカンスルホン酸、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸およびタウロコール酸などが挙げられるが、これらに限定されない。カチオン性界面活性剤としては、セトリミド（ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、すなわちＣＴＡＢ）、ベンズアルコニウムクロリド、ジメチルジオクトデシルアンモニウム（ＤＤＡ）ブロミド、ＤＯＴＡＰ、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリド、メチルベンゼトニウムクロリド、および４−ピコリンドデシルスルフェートなどが挙げられるが、これらに限定されない。両性イオン性界面活性剤としては、３−［（３−クロラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（通常、ＣＨＡＰＳと省略される）、３−［（クロラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（一般に、ＤＨＡＰＳＯと省略される）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、およびリゾ−α−ホスファチジルコリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。非イオン性界面活性剤の例としては、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ジエチレングリコールモノペンチルエーテル、ｎ−ドデシルβ−Ｄ−グルコピラノシド、脂肪アルコールのエチレンオキシド縮合体（例えば、Ｌｕｂｒｏｌという商品名で販売されるもの）、脂肪酸（特に、Ｃ１２〜Ｃ２０脂肪酸）のポリオキシエチレンオキシド、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エーテル（例えば、Ｔｗｅｅｎという商品名で販売されるもの）、およびソルビタン脂肪酸エーテル（例えば、Ｓｐａｎという商品名で販売されるもの）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４０】
特に有用な群の界面活性剤は、ソルビタンベースの非イオン性界面活性剤、例えば、市販のＳＰＡＮ（登録商標）またはＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）（これらには、種々のモノエステル置換ソルビタンとジエステル置換ソルビタンとトリエステル置換ソルビタンとを区別する文字または数字の標識が付いている）である。関連の群の界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノエステルおよびポリオキシエチレンソルビタントリエステル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）というマークで市販されている）を含む。このＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤は、エマルジョンの安定性を向上させるために、関連のソルビタンモノエステル界面活性剤またはソルビタントリエステル界面活性剤と組み合わされ得る。
【０１４１】
油滴のサイズは、界面活性剤：油の比を変えることによって（この比が増加するにつれて液滴のサイズは減少する）、作動圧力を変えることによって（この作動圧力が増加するにつれて液滴サイズは減少する）、温度を変えることによって（温度が上昇するにつれて液滴サイズは減少する）、および両親媒性免疫刺激剤を添加することによって（このような薬剤を添加すると液滴サイズは減少する）、変えられ得る。実際の液滴サイズは、特定の界面活性剤、油および免疫刺激剤（存在する場合）、および選択された特定の操作条件と共に変化する。液滴サイズは、サイジング機器（例えば、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより製造される市販のＳｕｂ−Ｍｉｃｒｏｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｏｄｅｌ  Ｎ４ＭＤ））を使用することによって、変えられ得、そしてパラメーターは、実質的に全ての液滴が、１ミクロン未満の直径、好ましくは０．８ミクロンの直径、最も好ましくは０．５ミクロンの直径になるまで、上記のガイドラインを使用して、変えられ得る。実質的に全てとは、少なくとも約８０数％、好ましくは少なくとも約９０数％、より好ましくは少なくとも約９５数％、最も好ましくは少なくとも約９８数％を意味する。粒子サイズ分布は、代表的に、ガウス分布であり、その結果、平均直径は、示された限界値よりも小さい。
【０１４２】
好ましい油滴エマルジョンは、ＭＦ５９である。ＭＦ５９は、例えば、Ｏｔｔら、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ；Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  Ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，１９９５，Ｍ．Ｆ．ＰｏｗｅｌｌおよびＭ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ，編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．２７７−２９６；Ｓｉｎｇｈら、Ｖａｃｃｉｎｅ，１９９８，１６，１８２２−１８２７；Ｏｔｔら、Ｖａｃｃｉｎｅ，１９９５，１３，１５５７−１５６２；およびＶａｌｅｎｓｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４，１５３，４０２９−３９（これらの開示はその全体が本明細書中で参考として援用される）に記載される手順に従って、作製され得る。
【０１４３】
他の油滴エマルジョンとしては、例えば、ＳＡＦ（１０％のＳｑｕａｌａｎｅ，０．４％のＴｗｅｅｎ  ８０、５％のプルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）でブロックされたポリマー  Ｌｌ２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含む）（これはより大きな粒子サイズのエマルジョンを生成するためにサブミクロンエマルジョンに微小流動化されているかまたは渦状にされているかのいずれかである）、およびＲｉｂｉ（登録商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）（２％のＳｑｕａｌｅｎ、０．２％のＴｗｅｅｎ  ８０、ならびにモノホスホリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群から選択される１つ以上の細菌細胞壁成分（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＪ））を含む）が挙げられる（本明細書中で使用するために適切なサブミクロン水中油型エマルジョンのさらなる議論については、共有に係る特許出願番号第０９／０１５，７３６（１９９８年１月２９日出願）を参照のこと）。
【０１４４】
本発明の微粒子を調製した後、ポリマータイプであろうとサブミクロンエマルジョンタイプであろうと、ポリペプチドおよびベクター構築物のような高分子が、上記のようにこの微粒子に吸着され得る。本発明のサブミクロンエマルジョン微粒子はまた、この中に捕捉またはカプセル化された高分子を有し、かつこの上に吸着された高分子を有する。従って、例えば、当業者は、微粒子上に吸着したＥＬＶＩＳベクターを有するカプセル化されたアジュバントを有する微粒子、または微粒子上に吸着したＲＮＡベクター構築物を有するカプセル化された抗原を有する微粒子を、本発明に従って調製し得る。本発明は、微粒子上に吸着され、微粒子内に捕捉された核酸高分子と、他の核酸および他の抗原性分子との種々の組み合わせを意図する。好ましくは、本発明の高分子は、この高分子上に吸着されたＥＬＶＩＳベクターまたはＲＮＡベクター構築物を有する。さらに、本発明の微粒子の実施形態のいずれかは、エレクトロポレーションと組み合わせて送達され得る。
【０１４５】
（３．ＥＬＶＩＳベクター）
ＥＬＶＩＳベクターおよび真核生物層状ベクター開始系（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｌａｙｅｒｅｄ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、一般に、上で引用された米国特許第５，８１４，４８２号および同第６，０１５，６８６号、ならびに国際特許出願ＷＯ９７／３８０８７およびＷＯ９９／１８２２６で記載される。一実施形態において、ＥＬＶＩＳベクターは、アルファウイルス、より好ましくは、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、またはベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＲＲＶ）のゲノム由来である。アルファウイルスは、約１１〜１２ｋｂ長のＲＮＡウイルスであり、５’キャップおよび３’ポリアデニル化テールを含む。成熟感染性ウイルスは、ヌクレオカプシドタンパク質およびエンベロープタンパク質で被覆されたゲノムＲＮＡから構成される。宿主細胞のアルファウイルス感染は、レセプター特異的な事象によって生じ、そして細胞質にゲノムＲＮＡを放出する場合に、最大となる。ウイルス複製の間、ウイルスがコードするエンベロープ糖タンパク質Ｅ１およびＲ２が合成され、そして宿主細胞膜に包埋され、この膜を通って、子孫のビリオンが出芽し、そして宿主の外側に放出される。
【０１４６】
ウイルスゲノムの複製は、相補的な−鎖ＲＮＡの合成のためのテンプレートとして働くゲノムＲＮＡ鎖を用いて、開始される。−鎖ＲＮＡは、次いで、全長ゲノムＲＮＡのため、および内部で開始された＋鎖のサブゲノムＲＮＡのためのテンプレートとして働く。非構造的タンパク質は、ゲノム鎖から翻訳され、一方、構造的タンパク質は、サブゲノム鎖から翻訳される。全てのウイルスゲノムは、ポリタンパク質として発現され、次いで翻訳後にタンパク質分解性切断によって個々のタンパク質にプロセシングされる。
【０１４７】
アルファウイルスベクターレプリコンは、選択された異種核酸配列を有するウイルスゲノム（例えば、構造的タンパク質遺伝子）の特定の部分を置換することによって構築され得る。従って、特定の実施形態において、アルファウイルスレプリコンベクターは、アルファウイルスの転写を開始し得る５’配列、このアルファウイルスの非構造的タンパク質をコードするヌクレオチド配列、アルファウイルス接合領域プロモーター、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識部位および３’ポリアデニル化通路を含み得る。さらに、このアルファウイルスベクターレプリコンは、アルファウイルスベクター構築物内のｃＤＮＡコピーとして含まれ得る。このようなベクター構築物は、代表的に、上流に位置し、ベクターｃＤＮＡと作動可能に連結したｃＤＮＡからのＲＮＡの合成を開始し得る５’プロモーターを含み、その結果、この転写物は、ベクターレプリコンＲＮＡを生成する。このベクター構築物はまた、転写終止を制御する３’配列を含み得る。異種核酸配列は、ウイルス接合領域の上流または下流に存在し得る。
【０１４８】
ＥＬＶＩＳベクターは、二重層アプローチを使用することによって、目的の異種ヌクレオチド配列の送達を達成するＲＮＡウイルスレプリコンの機構（例えば、上記のアルファウイルスベクター構築物に基づく）を利用する。一般に、ＥＬＶＩＳベクターは、目的の遺伝子産物をコードするＲＮＡの量を増幅し得る層状発現系を提供する。なぜなら、第１の層は、第２の層の転写を開始するからである。従って、代表的なＥＬＶＩＳベクターは、ｃＤＮＡからのＲＮＡの合成を開始し得る５’プロモーター、細胞において自律的に複製し得る構築物のｃＤＮＡ相補体であって、この構築物が異種核酸配列を発現し得る、相補体、および転写終止を制御する３’配列を含む。自律的に複製し得、選択された核酸配列を発現し得る構築物は、アルファウイルスベクター構築物であり得る。従って、ＤＮＡ  ＥＬＶＩＳベクターの第１の層は、ＲＮＡアルファウイルスベクター構築物を転写し、このＲＮＡアルファウイルスベクター構築物から、選択された異種核酸配列が達成される。
【０１４９】
アルファウイルスベースのＥＬＶＩＳベクターが、アルファウイルスゲノムと相補的なｃＤＮＡをまず調製することによって、構築され得る。次いで、そのゲノムＲＮＡと対応するｃＤＮＡから、１つ以上のウイルス構造タンパク質をコードする配列が欠失され、次いでその配列を目的の遺伝子産物をコードする異種ＤＮＡで置換され得る。これにより、成熟ウイルスのパッケージングを防ぎかつその異種配列を増幅することが、可能になり得る。次いで、その異種配列を含む改変ｃＤＮＡが、ＥＬＶＩＳベクターの第１層中に挿入される。細胞および核への侵入に際し、このＥＬＶＩＳベクターは転写され、そして生じたｍＲＮＡ分子（自己複製可能なＲＮＡベクターである）は、複製しそしてポリペプチド（目的の異種遺伝子を含む）へと翻訳し始める。
【０１５０】
代表的なシンドビス由来アルファウイルスベクター構築物が好ましいが、本明細書中の教示に従って、他のアルファウイルス種を容易に使用し得る。あるいは、任意のＲＮＡウイルスに由来するベクター（特に、＋鎖ウイルスに由来するベクターが、利用され得る。
【０１５１】
ＥＬＶＩＳベクターの構築は、一般的に、米国特許第５，８１４，４８２号および同第６，０１５，６８６号に記載されている。簡単述べると、ＲＮＡがＲＮＡウイルスから得られ、その後、そのＲＮＡウイルスの特定の遺伝子または部分に適切なプライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、ｃＤＮＡが合成される。このプライマーは、必要な場合は、さらなる制限部位も含み得る。その後、そのｃＤＮＡフラグメントが、プラスミド中にクローニングされ、そして適切な宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）中に形質転換される。陽性コロニーが、プラスミド精製のために増殖され、その後、プラスミドが集合されて、異種ＤＮＡ（例えば、レポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ）または抗原をコードする所望の遺伝子）を有する部分を備える所望のＥＬＶＩＳベクターにされる。下記実施例３は、本発明に従って使用される特に好ましいＥＬＩＶＩＳベクター（ｐＳＩＮＣＰ）を記載する。
【０１５２】
（４．ＲＮＡベクター構築物およびｐＣＭＶベクター構築物）
本発明の他の実施形態において、ＲＮＡベクター構築物またはＲＮＡレプリコンベクターが直接使用されて、細胞中へのＤＮＡの導入および転写が生じる核中への輸送を必要としない。宿主細胞の細胞質中への直接送達のためにＲＮＡベクターが使用されることによって、異種核酸配列の自律複製および翻訳が、効率的に生じる。この実施形態において、そのＲＮＡベクター構築物またはＲＮＡレプリコンベクターは、ＤＮＡベースのベクター構築物からのインビトロ転写によって得られる。好ましくは、このＲＮＡベクター構築物またはＲＮＡレプリコンベクターは、アルファウイルスのゲノムに由来し、より好ましくは、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリスキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、またはロス川ウイルス（ＲＲＶ）に由来する。他の実施形態において、このＲＮＡベクター構築物は、アルファウイルス以外のウイルスに由来する。好ましくは、ＲＮＡベクター構築物の誘導体化のために使用されるそのような他のウイルスは、＋鎖ＲＮＡウイルスであり、より好ましくは、それらは、ピコルナウイルス、フラビウイルス、ルビウイルス、またはコロナウイルスである。アルファウイルスベースのＲＮＡベクターのインビトロ転写のための組成物および方法は、他の場所に詳細に提供されている（米国特許第５，８４２，７２３号およびＰｏｌｏら、１９９９、ＰＮＡＳ  ９６：４５９８〜６０３を参照のこと）。その後、このＲＮＡベクターが、本明細書中に詳述される送達のための本発明の微粒子に吸着される。ＳＩＮ、ＳＦＶ、ＶＥＥまたはＲＲＶ由来の代表的なアルファウイルスＲＮＡベクターが好ましいが、他のアルファウイルス種由来の同様のベクターが、容易に置き換わり得る。
【０１５３】
本発明の他の実施形態において、ｐＣＭＶベクター構築物を使用する。このようなベクター構築物は、当該分野で周知である。特に好ましいｐＣＭＶベクターは、ＣＭＶの極初期エンハンサー／プロモーターと、ウシ成長ホルモンターミネーターとを含む。このことは、Ｃｈａｐｍａｎ，Ｂ．Ｓ．ら、１９９１「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｉｎｔｒｏｎ  Ａ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（Ｔｏｗｎｅ）ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ  ｏｎ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：３９７９〜８６に詳細に記載されている。
【０１５４】
（５．アジュバント）
この薬学的組成物の効果を増強するために、必要に応じてアジュバントが使用され、Ｔｈ１刺激アジュバントが特に好ましい。これらのアジュバントは、本発明の微粒子と同時に、例えば、同じ組成物中で、または別個の組成物中で、投与され得る。あるいは、アジュバントは、本発明の微粒子組成物の前または後に、投与され得る。別の実施形態において、このアジュバント（例えば、免疫学的アジュバント）は、この微粒子中にカプセル化され得る。任意の高分子のようなアジュバントが、当該分野で公知のいくつかの方法のいずれかを使用して、この微粒子中にカプセル化され得る。例えば、米国特許第３，５２３，９０７；Ｏｇａｗａら，Ｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（１９８８）３６：１０９５〜１１０３；Ｏ’Ｈａｇａｎら，Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９３）１１：９６５〜９６９およびＪｅｆｆｅｒｅｙら，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２を参照のこと。あるいは、アジュバントは、任意の高分子について上記されるように、この微粒子上に吸着され得る。あるいは、アジュバントは、本発明の油滴エマルジョンを含み得る。
【０１５５】
免疫学的アジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（１）アルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、水酸化アルミウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）；（２）他の水中油乳濁処方物（他の特定の免疫刺激剤（例えば、ムラミルペプチド（下記を参照のこと）もしくは細菌細胞壁成分）を含むかまたは含まない）（例えば、（ａ）ＭＦ５９（国際公開ＷＯ９０／１４８３７；Ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎ  ａｄｊｕｃａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５の第１０章）（これは、マイクロフリダイザー（例えば、Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）を使用して１ミクロン未満の粒子へと処方された、５％  Ｓｑｕａｌｅｎｅ、０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、および０．５％  Ｓｐａｎ  ８５を含む（必要に応じて、種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（下記を参照のこと）を含むが、必要ではない））、（ｂ）マイクロフルイダイズされて１ミクロン未満のエマルジョンにされたかまたはボルテックスされてより大きな粒径のエマルジョンにされたかのいずれかである、１０％  Ｓｑｕａｌｅｎｅ、０．４％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰ（下記を参照のこと）を含む、ＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％  Ｓｑｕａｒｅｎｅと、０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０と、１つ以上の細菌細胞壁成分（モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群より選択され、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）である）と、を含む、ＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）（本明細書中での用途のために適切な１ミクロン未満の水中油エマルジョンのさらなる説明について、共有に係る特許出願第０９／０１５，７３６号（１９９８年１月２９日提出）を参照のこと））；（３）サポニンアジュバント（例えば、Ｑｕｉｌ  ＡまたはＱＳ２１（例えば、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）））が、使用され得るか、またはそれから生成され得る（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）（このＩＳＣＯＭは、さらなる界面活性剤を欠く（例えば、ＷＯ００／０７６２１））；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（ＷＯ９９／４４６３６）など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など）；（６）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（例えば、ＧＢ−２２２０２２１、ＥＰ−Ａ−０６８９４５４））（これらは、肺炎球菌糖質とともに使用される場合、必要に応じてミョウバンを実質的に伴わない（例えば、ＷＯ００／５６３５８））；（７）３ｄＭＰＬと、例��ば、ＱＳ２１および／または水中油エマルジョンとの組み合わせ（例えば、ＥＰ−Ａ−０８３５３１８、ＥＰ−Ａ−０７３５８９８、ＥＰ−Ａ−０７６１２３１）；（８）ＣｐＧモチーフ含有オリゴヌクレオチド（Ｒｏｍａｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９７，３，８４９〜８５４；Ｗｅｉｎｅｒら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，１９９７，９４，１０８３３〜１０８３７；Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８８，１６０，８７０〜８７６：Ｃｈｕら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９７，１８６，１６２３〜１６３１；Ｌｉｐｆｏｒｄら，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７，２７，２３４０〜２３４４；Ｍｏｌｄｏｖｅａｎｕら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１９８８，１６，１２１６〜１２２４，Ｋｒｉｅｇら，Ｎａｔｕｒｅ，１９９５，３７４，５４６〜５４９；Ｋｌｉｎｍａｎら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，１９９６，９３，２８７９〜２８８３：Ｂａｌｌａｓら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１５７，１８４０〜１８４５；Ｃｏｗｄｅｒｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１５６，４５７０〜４５７５；Ｈａｌｐｅｒｎら，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１６７，７２〜７８；Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９８８，７９，８６６〜８７３；Ｓｔａｃｅｙら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９６，１５７，２１１６〜２１２２；Ｍｅｓｓｉｎａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９１，１４７，１７５９〜１７６４；Ｙｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１５７，４９１８〜４９２５；Ｙｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１５７，５３９４〜５４０２；Ｙｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８，１６０，４７５５〜４７６１；ならびにＹｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８，１６０，５８９８〜５９０６；国際特許出願ＷＯ９６／０２５５５，同ＷＯ９８／１６２４７，同ＷＯ９８／１８８１０，同ＷＯ９８／４０１００，同ＷＯ９８／５５４９５，同ＷＯ９８／３７９１９同およびＷＯ９８／５２５８１）（すなわち、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含み、シトシンの代わりに、５メチルシトシンが、必要に応じて使用される）；（９）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル（例えば、ＷＯ９９／５２５４９）；（１０）オクトオキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１２０７）または少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤（例えば、オクトオキシノール）と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテル（もしくはエステル）界面活性剤（ＷＯ０１／２１１５２）；（１１）サポニンおよび免疫刺激オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）（ＷＯ００／６２８００）；（１２）免疫刺激物質および金属塩粒子（例えば、ＷＯ００／２３１０５）；（１３）サポニンおよび水中油エマルジョン（例えば、ＷＯ９９／１１２４１）；（１４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）（例えば、ＷＯ９８／５７６５９）；（１５）細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素（例えば、コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、またはＥ．ｃｏｌｉ易熱性毒素（ＬＴ））の解毒変��体（特に、ＬＴ−Ｋ６３（６３位の野生型アミノ酸に代わってリジンで置換されている）、ＬＴ−Ｒ７２（７２位の野生型アミノ酸に代わってアルギニンで置換されている）、ＣＴ−Ｓ１０９（１０９位の野生型アミノ酸に代わってセリンで置換されている）、およびＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（９位の野生型アミノ酸に代わってリジンで置換されており、かつ１２９位の野生型アミノ酸に代わってグリシンで置換されている）（例えば、国際公開番号ＷＯ９３／１３２０２およびＷＯ９２／１９２６５を参照のこと））；ならびに（１６）この組成物の有効性を増強するための免疫刺激剤として作用する他の物質。ミョウバン（特に、リン酸アルミニウムおよび／または水酸化アルミニウム）ならびにＭＦ５９が、好ましい。
【０１５６】
ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’，２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５７】
アジュバントのさらなる例について、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５を参照のこと。
【０１５８】
従って、必要に応じた本発明の組成物のさらなる成分は、好ましくは、アジュバント（例えば、アルミニウム塩）であるか、または少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドである。本明細書中で使用される場合、用語「ＣｐＧモチーフ」とは、シトシンヌクレオチドの後にグアノシンヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのジヌクレオチド部分をいう。このようなオリゴヌクレオチドは、当業者に周知の従来のオリゴヌクレオチド合成を使用して、調製され得る。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、改変された骨格（例えば、ホスホロチオエートまたはペプチド核酸）を含んで、そのオリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ抵抗性を付与する。改変された骨格は、当業者に周知である。好ましいペプチド核酸は、米国特許第５，８２１，０６０号，同第５，７８９，５７３号，同第５，７３６，３９２号，および同第５，７２１，１０２号，日本国特許第１０２３１２９０号，欧州特許第８３９，８２８号，ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９８／４２７３５，同ＷＯ  ９８／４２８７６，同ＷＯ  ９８／３６０９８，同ＷＯ  ９８／２７１０５，同ＷＯ  ９８／２０１６２，同ＷＯ  ９８／１６５５０，同ＷＯ  ９８／１５６４８，同ＷＯ  ９８／０４５７１，同ＷＯ  ９７／４１１５０，同  ＷＯ  ９７／３９０２４，および同ＷＯ  ９７／３８０１３に詳細に記載され、これらの開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０１５９】
このオリゴヌクレオチドは、好ましくは、約６と約１００との間のヌクレオチドを含み、より好ましくは、約８と約５０との間のヌクレオチドを含み、最も好ましくは、約１０と約４０との間のヌクレオチドを含む。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、糖部分の置換および窒素性塩基部分の置換を含み得る。好ましいオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｋｒｉｅｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５，１２６３１〜１２６３６，Ｋｌｍｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６，９３，２８７９〜２８８３，Ｗｅｉｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９７，９４，１０８３３〜１０８３７，Ｃｈｕら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９７，１８６，１６２３〜１６３１，Ｂｒａｚｏｌｏｔ−Ｍｉｌｌａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５，１５５５３〜１５５５８，Ｂａｌｌａｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１５７，１８４０〜１８４５，Ｃｏｗｄｅｒｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１５６，４５７０〜４５７５，Ｈａｌｐｅｒｎら，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１６７，７２〜７８，Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９８８，７９，８６６〜８７３，Ｓｔａｃｅｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１５７，２１１６〜２１２２，Ｍｅｓｓｉｎａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９１，１４７，１７５９〜１７６４，Ｙｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１５７，４９１８〜４９２５，Ｙｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１５７，５３９４〜５４０２，Ｙｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８，１６０，４７５５〜４７６１，Ｒｏｍａｎら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９９７，３，８４９〜８５４，Ｄａｖｉｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８，１６０，８７０〜８７６，Ｌｉｐｆｏｒｄら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９７，２７，２３４０〜２３４４，Ｍｏｌｄｏｖｅａｎｕら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１９８８，１６，１２１６〜１２２４，Ｙｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８，１６０，５８９８〜５９０６，ＰＣＴ公開ＷＯ  ９６／０２５５５，ＰＣＴ公開ＷＯ  ９８／１６２４７，ＰＣＴ公開ＷＯ  ９８／１８８１０，ＰＣＴ公開ＷＯ  ９８／４０１００，ＰＣＴ公開ＷＯ  ９８／５５４９５，ＰＣＴ公開ＷＯ  ９８／３７９１９，およびＰＣＴ公開ＷＯ  ９８／５２５８１に開示され、これらの開示は、本明細書中にその全体が参考として援用される。本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むが、複数のＣｐＧモチーフを含み得ることが、理解されるべきである。
【０１６０】
好ましいオリゴヌクレオチドは、例えば、ｔｃｃａｔｇａｃｇｔｔｃｃｔｇａｃｇｔｔ（配列番号１），ａｔａａｔｃｇａｃｇｔｔｃａａｇｃａａｇ（配列番号２），ｇｇｇｇｔｃａａｃｇｔｔｇａｇｇｇｇｇｇ（配列番号３），ｔｃｔｃｃｃａｇｃｇｔｇｃｇｃｃａｔ（配列番号４），ｇａｇａａｃｇｃｔｃｇａｃｃｔｔｃｇａｔ（配列番号５），ｔｃｃａｔｇｔｃｇｔｔｃｃｔｇａｔｇｃｔ（配列番号６），ｔｃｃａｔｇａｃｇｔｔｃｃｔｇａｔｇｃｔ（配列番号７），ｇｃｔａｇａｃｇｔｔａｇｃｇｔ（配列番号８），ａｔｃｇａｃｔｃｔｃｇａｇｃｇｔｔｃｔｃ（配列番号９），ｇａａｃｃｔｔｃｃａｔｇｃｔｇｔｔｃｃｇ（配列番号１０），ｇｃｔａｇａｔｇｔｔａｇｃｇｔ（配列番号１１），ｔｃａａｃｇｔｔ（配列番号１２），ｇｃａａｃｇｔｔ（配列番号１３），ｔｃｇａｃｇｔｃ（配列番号１４），ｔｃａｇｃｇｃｔ（配列番号１５），ｔｃａａｃｇｃｔ（配列番号１６），ｔｃａｔｃｇａｔ（配列番号１７），ｔｃｔｔｃｇａａ（配列番号１８），ｔｇａｃｔｇｔｇａａｃｇｔｔｃｇａｇａｔｇａ（配列番号１９），ｔｇａｃｔｇｔｇａａｃｇｔｔａｇｃｇａｔｇａ（配列番号２０），ｔｇａｃｔｇｔｇａａｃｇｔｔａｇａｇｃｇｇａ（配列番号２１），ｇｔｔｔｇｃｇｃａａｃｇｔｔｇｔｔｇｃｃａｔ（配列番号２２），ａｔｇｇｃａａｃａａｃｇｔｔｇｃｇｃａａａｃ（配列番号２３），ｃａｔｔｇｇａａａａｃｇｔｔｃｔｔｃｇｇｇｇ（配列番号２４），ｃｃｃｃｇａａｇａａｃｇｔｔｔｔｃｃａａｔｇ（配列番号２５），ａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔ（配列番号２６），ｃｔｔｔｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇｇｇｔ（配列番号２７），およびｔｃｃａｔａｃｇｔｔｃｃｔｇａｃｇｔｔ（配列番号２８）のような、ヌクレオチド配列を含む。本発明の好ましい実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧモチーフを含み、このモチーフは、そのモチーフの５’側で２つのプリンに隣接し、かつそのモチーフの３’側で、２つのピリミジンに隣接する。しかし、ＣｐＧモチーフを含む任意のオリゴヌクレオチドが、本明細書中に記載される微粒子組成物と組み合わせた場合にＴｈ１リンパ球刺激の増加をそのオリゴヌクレオチドが誘導する限り、本発明において使用され得ることが、理解されるべきである。
【０１６１】
（６．抗原）
本発明はまた、高分子（好ましくは、抗原をコードするベクター構築物および／または抗原自体）に吸着した上記の微粒子を含む免疫原性組成物に関する。一般に、抗原は、その抗原のレセプターを有するＴリンパ球（好ましくはＴｈ１リンパ球）の増殖を刺激し、そしてそのリンパ球と反応して細胞媒介性免疫と呼ばれる一連の応答を開始し得る。抗原は、このようにＣＴＬ応答および／または体液性応答を誘導し得、そしてサイトカイン産生を誘導し得る。
【０１６２】
エピトープは、この抗原の定義の範囲内にある。エピトープは、抗原分子または抗原複合体の一部であり、その免疫学的特異性を決定する。一般に、エピトープは、天然に存在する抗原におけるペプチドまたは多糖である。人工抗原において、エピトープは、低分子量物質（例えば、アルサニル酸誘導体）であり得る。エピトープは、同種抗体またはＴリンパ球と、インビボまたはインビトロで特異的に反応する。別の用語は、抗原決定基、抗原構造グルーピング（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕａｌ  ｇｒｏｕｐｉｎｇ）およびハプテングルーピング（ｈａｐｔｅｎｉｃ  ｇｒｏｕｐｉｎｇ）である。
【０１６３】
本発明の好ましい実施形態において、その抗原性物質は、ウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、インフルエンザウイルス（ｆｌｕ）、および狂犬病ウイルス）に由来する。好ましくは、その抗原性物質は、ＨＳＶ糖タンパク質ｇＤ、ＨＩＶ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ  ｐ５５  ｇａｇ、ならびに「ｐｏｌおよびｔａｔ領域」由来のポリペプチドからなる群より選択される。本発明の他の好ましい実施形態において、その抗原性物質は、細菌（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，コレラ，ジフテリア，破傷風，Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ，および百日咳菌）に由来する。本発明の他の好ましい実施形態において、その抗原性物質は、寄生生物（例えば、マラリア寄生生物）に由来する。本発明の別の好ましい実施形態において、その抗原は、本発明の微粒子の表面に吸着されている。
【０１６４】
抗原は、当該分野で公知の方法により生成され得るか、または商業的供給源から購入され得る。本発明の範囲内にある抗原としては、不活化ウイルス粒子全体、単離されたウイルスタンパク質および単離されたウイルスタンパク質サブユニット、細胞全体および細菌全体、細胞膜および細胞壁タンパク質などが、挙げられる。いくつかの好ましい抗原が、下記に記載される。
【０１６５】
単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）ｒｇＤ２は、遺伝子操作されたチャイニーズハムスター卵巣細胞において産生される、組換えタンパク質である。このタンパク質は、短縮された正常なアンカー領域を有し、グリコシル化タンパク質が組織培養培地中に分泌されることをもたらす。このｇＤ２は、ＣＨＯ培地において、９０％を超える純度まで精製され得る。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｅｎｖ−２〜３は、遺伝子操作されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて産生される、組換え形態のＨＩＶエンベロープタンパク質である。このタンパク質は、ＨＩＶ  ｇｐ１２０のタンパク質領域全体を示すが、その酵母から精製された場合、グリコシル化されておらずかつ変性されている。ＨＩＶ  ｇｐ１２０は、上記ｇＤ２と類似した様式ＣＨＯ細胞中で産生される、完全にグリコシル化された分泌形態のｇｐ１２０である。免疫原性組成物における使用に適したさらなるＨＩＶ抗原が、ＰＣＲ公開ＷＯ  ８５／０４５８７およびＷＯ  ８８／０２６３４に記載されており、それらの開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される。ｇＢ抗原およびｇＤ抗原の混合物（これらは、そのアンカー領域を欠く、短縮型表面抗原である）が、特に好ましい。
【０１６６】
免疫原性組成物における使用に適切なさらなるＨＩＶ抗原が、米国特許出願第４９０，８５８号（１９９０年３月９日提出）および公開欧州出願第１８１１５０号（１９８６年５月１４日）、ならびに米国特許出願第６０／１６８，４７１号；同第０９／４７５，５１５号；同第０９／４７５，５０４号；および同第０９／６１０，３１３号に記載され、これらの開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０１６７】
免疫原性組成物における使用に適したサイトメガロウイルス抗原が、米国特許第４，６８９，２２５号，米国特許出願第３６７，３６３号（１９８９年６月１６日提出）およびＰＣＴ公開ＷＯ  ８９／０７１４３に記載され、これらの開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０１６８】
免疫原性組成物における使用に適切なＣ型肝炎抗原が、ＰＣＴ／ＵＳ８８／０４１２５，公開欧州出願第３１８２１６号（１９８９年５月３１），公開日本国出願番号１−５００５６５（１９８８年１１月１８日提出），カナダ国出願第５８３，５６１号，およびＥＰＯ  ３８８，２３２に記載され、これらの開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される。ＨＣＶ抗原の異なるセットが、欧州特許出願第９０／３０２８６６．０号（１９９０年３月１６日提出）および米国特許出願第４５６，６３７号（１９８９年１２月２１日提出）およびＰＣＴ／ＵＳ９０／０１３４８に記載され、これらの開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０１６９】
本発明の免疫原性組成物は、鳥類および哺乳動物を疾患および感染に対して免疫するために使用され得、そのような疾患および感染としては、コレラ、ジフテリア、破傷風、百日咳、インフルエンザ、麻疹、髄膜炎、おたふくかぜ、ペスト、ポリオ、狂犬病、ロッキー山紅斑熱、風疹、痘瘡、腸チフス、発疹チフス、ネコ白血病ウイルス、および黄熱病が、挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７０】
本発明の特定の免疫原性組成物は、有効量の抗原を使用する。例えば、アジュバントと組み合わせて、被験体に特異的かつ十分な免疫学的応答を生じて、その後のウイルス、細菌、真菌、マイコプラズマ、または寄生生物への曝露に対する防御をその被験体に付与する量の抗原が、含まれ得る。
【０１７１】
その他の実施形態では、抗原を含む組成物を用いて、（好ましくは抗原をコードする異質核酸配列を含む）先に投与されたベクター構築物の免疫学的応答を追加する。より好ましくは、この抗原は、本明細書に記載の微粒子と会合（例えば吸着）しており、そして／またはこの抗原は、アジュバントと同時投与される。
【０１７２】
本発明で採用され得る各抗原および抗原毎の詳細な指針を提供する、指定され得る単一用量指定はない。抗原の有効量は、その固有の活性および純度の関数であり、そして慣用的な実験により当業者により経験的に決定される。本発明のアジュバント組成物は、細胞全体またはウイルス免疫原性組成物と、および組換えＤＮＡ技法または合成により調製される精製抗原またはタンパク質サブユニットまたはペプチド免疫原性組成物と組み合わせて用いられる得ることが予期される。
【０１７３】
抗原がエマルジョンと組み合わせて提供される場合、本発明アジュバント組成物は安定であるので、代表的には、抗原とエマルジョンとは、単純な振盪により混合され得る。その他の技法、例えば、アジュバントと抗原の溶液または懸濁物の混合物を小さな開口部（例えば、皮下針）を通じて急速に通過させることにより、有用な免疫原性組成物を容易に提供する。
【０１７４】
本発明による免疫原性組成物は、約１ナノグラム〜約１０００マイクログラムの核酸、好ましくは、例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチドのようなＤＮＡを含む。いくつかの好適な実施形態では、この免疫原性組成物は、約１０ナノグラム〜約８００マイクログラムの核酸を含む。いくつかの好適な実施形態では、この免疫原性組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムの核酸を含む。いくつかの好適な実施形態では、この免疫原性組成物は、約１マイクログラム〜約１０ミリグラムの核酸を含む。いくつかの好適な実施形態では、この免疫原性組成物は、約２５０マイクログラム〜約１ミリグラムの核酸を含む。いくつかの好適な実施形態では、この免疫原性組成物は、約５００マイクログラム〜約１ミリグラムの核酸を含む。当業者は、任意の所望の量の核酸を含む免疫原性組成物を容易に処方し得る。本発明による免疫原性組成物は、滅菌され、および発熱物質なしで提供される。この免疫原性組成物は、単位用量形態で便利に投与され得、そして、例えば、その開示が、その全体で参考として本明細書に援用される、Ｒｅｍｉｎｇｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９８０）に記載のような、薬学の技術分野で周知の任意の方法により調製され得る。
【０１７５】
本発明はまた、宿主動物中の免疫応答を刺激する方法に関し、この方法は、動物に、免疫応答を誘導するに有効な量で、１つ以上の上記の免疫原性組成物を投与する工程を包含する。この宿主動物は、好ましくは、哺乳動物、より好ましくはヒトである。投与の好適な経路は、制限されないで、筋肉内経路、腹腔内経路、皮内経路、皮下経路、静脈内経路、動脈内経路、眼内経路および経口経路、ならびに経皮経路または吸入または座薬による経路を含む。投与の最も好適な経路は、筋肉内注射、腹腔内注射、皮内注射および皮下注射を含む。本発明のいくつかの実施形態によれば、免疫原性組成物は、周知であってかつ広く利用可能であるニードルレス注入デバイスを用いて宿主動物に投与される。当業者は，本明細書にある教示に従い、ニードルレス注入デバイスを用いて個体の細胞に免疫原性組成物を送達し得る。さらに、本発明の実施形態は、エレクトロポーレーションとともに送達され得る。
【０１７６】
本発明はまた、宿主動物を、ウイルス感染、細菌感染、または寄生虫感染に対して免疫する方法に関し、この方法は、この動物に、防御応答を誘導するに有効な量の１つ以上の上記免疫原性組成物を投与する工程を包含する。宿主動物は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。投与の好適な経路は上記に記載される。宿主動物の予防処置または治療処置は任意の病原体に関し得るが、好適な病原体は、制限されないで、上記のウイルス病原体、細菌病原体および寄生虫病原体を含む。
【０１７７】
本発明はまた、宿主動物における免疫応答を誘導する方法に関し、この方法は、動物に、免疫応答を誘導するに有効な量の上記の１つ以上の免疫原性組成物を投与する工程を包含する。宿主動物は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。投与の好適な経路は上記に記載される。当業者は、免疫応答およびその測定に容易に精通している。
【０１７８】
本発明は、吸着された高分子を有するポリマー微粒子またはサブミクロンエマルジョン微粒子の使用を意図し、単独または別の高分子と組み合わせて免疫応答を惹起する。すなわち、本発明は、吸着された核酸を有する微粒子、吸着された核酸または免疫刺激分子を有するサブミクロンエマルジョン、および吸着された核酸または免疫刺激分子を有するサブミクロンエマルジョンとの吸着された核酸を有する微粒子の組み合わせを包含する。エレクトロポーレーションもまた、核酸の送達を改善するために用いられ得る。
【０１７９】
以下の実施例により示されるように、本発明の吸着された高分子を有するポリマー微粒子は、強力な免疫応答を惹起する。さらに、本発明のサブミクロンエマルジョン微粒子もまた、強力な免疫応答を惹起する。従って、吸着された高分子を有する本発明の微粒子の組み合わせは、免疫応答を惹起する強力なツールである。
【０１８０】
本明細書に引用されるすべての参考文献は、それらの全体が参考として援用される。
【０１８１】
（Ｃ．実験）
以下は、本発明を実施するための詳細な実施形態の例である。これら実施例は、例示の目的のみに提供され、そしていかなる様式においても本発明の範囲を制限することを意図しない。当業者は、本発明の思想および範囲内にある改変を認識する。
【０１８２】
用いられる数字に関して（例えば、量、温度など）、正確さを確実にする努力をしたが、特定の実験誤差および偏差は勿論許容されるべきである。
【０１８３】
（実施例１）
（吸着された核酸を有するポリマー微粒子の調製）
ＰＬＧ−ＣＡＴＢ微粒子を、改変された溶媒エバポレーションプロセスを用いて調製した。要約すれば、メチレンクロライド中の１０ｍｌの５％ｗ／ｖポリマー溶液を、１ｍｌのＴ．Ｅ．緩衝液と、ＩＫＡホモゲナイザーを用いて高速で乳化することにより、微粒子を調製した。次いで、最初のエマルジョンを、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）（０．５％ｗ／ｖ）を含む５０ｍｌの蒸留水に添加した。これは、ｗ／ｏ／ｗエマルジョンの形成を生じ、これを６０００ｒｐｍで１２時間室温で攪拌し、メチレンクロライドを蒸発させた。得られる微粒子を、１０，０００ｇにおける遠心分離により蒸留水中で２回洗浄し、そして凍結乾燥した。
【０１８４】
１００ｍｇのＤＮＡを吸着させた微粒子の代表的バッチには、１００ｍｇのＰＬＧ−ＣＴＡＢカチオン性微粒子をガラスバイアル中に秤量し、そして５ｍｌ容量のＴ．Ｅ．緩衝液中の２００μｇ／ｍｌＤＮＡ溶液（即ち、ｇｐ１４０またはｐ５５ｇａｇを含むプラスミドｐＣＭＶまたはｐＳＩＮＣＰ）を用いて再懸濁した。この懸濁物を１分間ボルテックスにかけ、ＤＮＡ溶液中に微粒子を均一に分散させた。バイアルを、一晩吸着のために４℃で振盪器（低速度）上にセットした。翌日、微粒子を、Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機上、１０分間８０００ｒｐｍで遠心分離して落とし、そして上清液をＤＮＡ定量のために集めた。ペレットを、１×ＴＥ緩衝液中でペレットを再懸濁することにより１×ＴＥ緩衝液で１回洗浄し、スパチュラを用いて分散し、そして８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。最後のペレットを、最小量の脱イオン水（約２ｍｌ）中に、ペレットをスパチュラで分散することにより再懸濁し、そしてベンチトップ凍結乾燥機（Ｌａｂｃｏｎｃｏ）上で２４時間凍結乾燥した。
【０１８５】
上清液を、ＤＮＡ含量について、２６０ｎｍにおける吸光度を読み取ることによりアッセイした。微粒子上に吸着したＤＮＡの量は、総ＤＮＡインプット（１００ｍｇの微粒子あたり１ｍｇ）から上清液中の量を差し引くことにより算出した。総負荷（ｌｏａｄ）は、０．５Ｍ  ＮａＯＨ／１％ＳＤＳ溶液中に５ｍｇの最終処方物を溶解し、そして加水分解後の透明溶液を２６０ｎｍで読み取ることにより評価した。
【０１８６】
（実施例２）
（吸着された核酸を有するサブミクロンエマルジョン微粒子の調製）
ＭＦ５９およびＤＯＴＡＰから形成されたサブミクロンエマルジョンを、ビーカー中にＤＯＴＡＰ（クロロホルム中）を提供し、そしてそれを２００μｌまで蒸発減量することにより調製した。Ｔｗｅｅｎ（０．５％ｗ／ｗ）、Ｓｑｕａｌｅｎｅ（５．０％ｗ／ｗ）およびＳｐａｎ（０．５％ｗ／ｗ）を添加し、そして１０ｍｍプローブを備えたＯｍｎｉホモジナイザーを用いて、１０Ｋ  回転／分で１分間ホモジナイズし、最終エマルジョン化のために均一フィードストックを提供した。これを、約８００ｐｓｉで、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ  Ｍ１１０Ｓホモジナイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃｏ．、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）中を５回通過させた。正味の表面電荷の尺度である、エマルジョンのζ電位を、ＣｏｕｌｔｅｒからのＤＥＬＳＡ  ４４０  ＳＸ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ上で測定し、そして約＋５５ｍｖであることを見出した。
【０１８７】
ＤＮＡ（ｐＣＭＶまたはｐＳＩＮＣＰ中に存在する、１ｍｇ  ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０  ＤＮＡまたは０．５ｍｇのｐ５５  ｇａｇ  ＤＮＡのいずれか）を、サブミクロンエマルジョンと４℃で一晩のインキュベーションにより吸着させた。
【０１８８】
（実施例３）
（微粒子への吸着のためのＥＬＶＩＳベクターおよびその他のベクター構築物の調製）
アルファウイルスベースのＥＬＶＩＳベクターおよびレプリコンベクターの構築を、シンドビスウイルスを代表例としてを用いて実施した。認識されるように、以下は、当業者によって、任意のアルファウイルスからのベクターの誘導に容易に適用され得る。約１０７個のＢＨＫ−２１細胞を、シンドビスウイルスのＳＩＮＤＣｃｈｉｒｏｎ株（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−２６４３、１９９９年４月１３日）により１ＰＦＵ／細胞のＭＯＩで感染させた。感染後２４時間で、ＣＰＥの進展後、総ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を製造業者の指示書に従って用いて細胞から単離した。精製後、ウイルスＲＮＡをヌレレアーゼフリーの水に溶解し、アリコートとし、そしてｃＤＮＡクローニングにおける次の使用のために−８０℃で貯蔵した。
【０１８９】
ｃＤＮＡの合成は、以下に示すプライマーセットを用いるＰＣＲ増幅により達成した（各プライマーについてシンドビスヌクレオチド番号付けを示す）。
【０１９０】
【化１】
2004518631.tif 000002
プライマー対１〜５は、ウイルス構造タンパク質遺伝子のクローニングのために用い、その一方、対６〜１４は、ウイルス非構造タンパク質遺伝子のたに用いた。対１〜５におけるオリゴヌクレオチドには、シンドビスウイルスのサブゲノムＲＮＡには存在しない、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩのための制限酵素部位を提示する付加配列を含めた。オリゴヌクレオチド６〜１４には、シンドビスウイルスの先に配列決定された株の全ゲノムには存在しないＳａｃＩおよびＸｈｏＩのための部位を含めた（これらの部位には下線を引いた）。
【０１９１】
各逆転写（ＲＴ）反応は、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ酵素（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を製造業者の指示書に従って用い、５０μｌ容量で実施した。反応混合物には、１０６細胞に相当するＲＮＡ量、および以下に示す各プライマーの５０ｐｍｏｌｅを含めた。
混合物１：プライマー１、３および５
混合物２：プライマー２および４
混合物３：プライマー６、９および１２
混合物４：プライマー８、１１および１４。
【０１９２】
ＲＴ反応物を凍結し、そして次にＰＣＲ増幅に用いた。ＰＣＲ反応は、製造業者により推奨されるように、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いて実施した。５０μｌのＰＣＲ反応の各々には、上記のＲＴ混合物の３μｌおよび５０ｐｍｏｌｅのプライマーを含めた。合計１４の反応を実施した（表１）。
【０１９３】
【表１】
2004518631.tif 000003
フラグメント１〜５に対するＰＣＲ反応は、以下の条件を用いて実施した：９５℃３０秒、５６℃３０秒および７４℃９０秒の１２サイクル。フラグメント６〜１４については、サイクルの数を１２から１５に変えた。各反応混合物の小アコートを、アガロースゲル電気泳動により分析し、予想されるサイズのフラグメントの存在を確認した。残りの反応混合物を、フェノール−クロロホルムを用いて抽出し、そしてＤＮＡフラグメントをエタノールを用いて沈殿させた。
【０１９４】
クローニングには、フラグメント１〜５を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そして次に同じ酵素で処理したプラスミドｐＲＳ２（ポリリンカー中に付加的制限部位をもつｐＵＣ）と連結した。フラグメント６〜１４を、ＳａｃＩおよびＸｈｏＩで消化し、そして同じくＳａｃＩおよびＸｈｏＩで処理したｐＲＳ２プラスミドと連結した。すべての組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中に形質転換した。
【０１９５】
さらに、サブゲノムプロモーター領域および３’−末端非翻訳領域を提示するｃＤＮＡクローンもまた、以下のプライマー対を用いて生成した：
【０１９６】
【化２】
2004518631.tif 000004
各形質転換についてのポジティブコロニーを、ＱＩＡＧＥＮキットを製造業者の指示書に従って用い、プラスミド精製のために増殖させた。対応して、ｐ１〜ｐ１４と称するフラグメントを、次いで、適切なベクター構成物中にアセンブルした。
【０１９７】
Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｌａｙｅｒｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＥＬＶＩＳ）、およびレプリコンベクターＲＮＡのインビトロ転写のためのアルファウイルスベクター構築物の構築は、シンドビスウイルスｃＤＮＡクローンｐ１〜ｐ１４と、サブゲノムフラグメントおよび３’末端領域フラグメントとを用い、以下のように達成した。ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターおよびシンドビスウイルスゲノムＲＮＡの開始を含むＡｐａＩ−ＭｓｃＩフラグメントを、ＡｐａＩ−ＸｈｏＩ消化プラスミドｐＲＳ２中のクローン化フラグメント１４のＭｓｃＩ−ＸｈｏＩフラグメントと連結した。得られたプラスミドをｐ１５と名付けた。次に、ｐ８のＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント、ｐ７のＥｃｏＲＩ−ＮｓｉＩフラグメントおよびｐ６のＮｓｉＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、ＳａｃＩ−ＸｈｏＩ消化ｐＲＳ２中に連結した。得られたプラスミドをｐ１６と名付けた。次に、ｐ１２のＳａｃＩ−ＭｕｎＩフラグメント、ｐ１１のＭｕｎＩ−ＮｈｅＩフラグメントおよびｐ１０のＮｈｅＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、ＳａｃＩ−ＸｈｏＩ消化ｐＲＳ２プラスミド中に連結した。得られるプラスミドをｐ１７と名付けた。ｐ１５のＡｐａＩ−ＡｐａＬＩフラグメントおよびｐ１３のＡｐａＩ−ＸｈｏＩフラグメントを次いでＡｐａＩ−ＸｈｏＩ処理ｐＲＳ２中に連結し、ｐ１８と名付けたプラスミドを得た。次いで、ｐ１８のＡｐａＩ−ＮｓｉＩフラグメントおよびｐ１７のＮｓｉＩ−ＸｈｏＩフラグメントを一緒に、ＡｐａＩ−ＸｈｏＩ処理ｐＲＳ２中に連結した。得られたプラスミドをｐ１９と名付けた。最後に、ｐ１９のＡｐａＩ−ＡｖｒＩＩフラグメント、ｐ９のＡｖｒＩＩ−ＳａｌＧＩフラグメントおよびｐ１６のＳａｌＧＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを一緒に、（ＡｐａＩ−ＢａｍＨＩで消化され既存の非構造タンパク質遺伝子が取り除かれた）ＧＦＰレポーターを発現する先に構築されたレプリコンベクター（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８−５１９、１９９６：Ｐｏｌｏら、１９９９、前記；および米国特許第５，８４３，７２３号を参照のこと）中に連結した。ＳＩＮＤＣｃｈｉｒｏｎウイルス株由来の配列を含み、そしてまたＧＦＰレポーターをコードする、得られるシンドビスベクター構築物は、ＳＩＮＣＲ−ＧＦＰであった（ＤＣＳＰ６ＳＩＮｇｆｐとしてまた知られる）。このレポーター構築物からのレプリコンＲＮＡ、および種々のその他の異質配列（例えば、本明細書および以下に記載の抗原）を発現するシンドビスベクター構築物の調製は、ＰｍｅＩを用いるＤＮＡの線状化、次いで、先に記載のような（Ｐｏｌｏら、前記；Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、前記）細菌ファージＳＰ６ポリメラーゼを用いるインビトロ転写により実施した。
【０１９８】
同様に、同じＳｉｎｄｂｉｓ配列を、アルファウイルスに基づく真核生物性階層化ベクター開始系（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｌａｙｅｒｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）（米国特許第５，８１４，４８２号および同第６，０１５，６８６号を参照のこと）へのアセンブリのための使用し、ここで、真核生物プロモーター（例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター）によって、ＥＬＶＩＳプラスミドＤＮＡでトランスフェクトされた真核生物細胞中で、自己増幅ベクターＲＮＡの転写が直接的に生じた。ＥＬＶＩＳプラスミドＤＮＡ（これはまた、ＧＦＰレポーターを発現する）を、上記由来の対応するＳＩＮＣＲ−ＧＦＰ配列用いて既存のＥＬＶＩＳベクター中のＳｉｎｄｂｉｓウイルス由来配列を置換することによって構築した。上述のＥＬＶＩＳベクターｐＳＩＮ１．５（Ｈａｒｉｈａｒａｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７２：９５０−９５８，１９９８）から開始して、このプラスミド骨格を、各プラスミドに見出される２つのＳａｃＩ部位を使用してｐＣＭＶＬｉｎｋ（ｚｕｒ  Ｍｅｇｅｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：２６２８−２６３５，２０００）由来の骨格でこのプラスミド骨格を置換することによって最初に修飾し、ＥＬＶＩＳ１．５ＣＢとして公知の中間体構築物を生成した。次いで、ＥＬＶＩＳ１．５ＣＢの２つのＳａｃＩ部位のうちの１つ（このＳＩＮ  ３’末端に隣接して位置する）を、ＳａｃＩで部分的に消化することによって切断し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを使用して平滑末端化し、次いで、この改変部位、ＰｍｅＩリンカー５’−ＧＴＴＴＡＡＡＣ−３’に連結した。標的化されたＳａｃＩ部位を有さない正確なプラスミドは、設計されたＥＬＶＩＳ１．５ＢｄｌＳａｃであった。次いで、この中間体プラスミドを、ＳａｃＩおよびＸｈｏＩを用いる消化により、新規のＳＩＮ非構造タンパク質遺伝子の挿入について調製した。対応する非構造遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチドプライマー：
【０１９９】
【化３】
2004518631.tif 000005
を使用するＳＩＮＣＲ−ＧＦＰからＰＣＲ増幅によって得、その後、ＳａｃＩおよびＸｈｏＩで消化し、そして連結し、中間体構築物ＳＩＮＣＰ−Ｎｏｔを得た。最後に、この構築物中に存在する２つのＮｏｔＩ部位のうちの１つを、部分的な消化およびクレノウ補完（Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｉｌｌ−ｉｎ）によって除去し、ポリリンカー内の１つのＮｏｔＩ部位のみを残した。この新規の構築されたＥＬＶＩＳベクターは、消化されたＳＩＮＣＰ（またはｐＳＩＮＣＰ）であった。
【０２００】
ＳＩＮＣＲまたはＳＩＮＣＰアルファウイルスベクターへの異種由来配列（例えば、抗原コード遺伝子）の挿入を、主に、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩまたはＸｈｏＩｌＸｂａＩでの消化、その後の、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ末端またはＸｈｏＩ／ＸｂａＩ末端もまた有する所望するＤＮＡフラグメントとの連結によって実施した。あるいは，これらの部位を、平滑末端化し得るか、または他のポリリンカー部位を使用し得（または、他の異種由来配列を置換し得る）、大量の挿入物のクローニングを可能にする。例えば、ＨＩＶ−１  ｐ５５ｇａｇ（ＳＦ２株）およびｇｐｌ４０  ｅｎｖ（ＳＦ１６２株）をコードする遺伝子を、これらのベクターに挿入した。具体的には、コドン最適化ＨＩＶ  ｐ５５ｇａｇｍｏｄ配列（共有に係る米国特許出願０９／４７５，５１５；ｚｕｒ  Ｍｅｇｅｄｅら、前出を参照のこと）を、ＸｈｏＩ／ＸｂａＩを用いてこのベクターを消化し、そしてＳａｌＩ／ＸｂａＩを用いた消化によって得られたｐ５５ｇａｇｍｏｄフラグメント中で連結することによって挿入した。得られたベクターを、ＳＩＮＣＲ−ｐ５５ｇａｇおよびＳＩＮＣＰ−ｐ５５ｇａｇとして示す。同様に、コドン最適化ＨＩＶ  ｇｐｌ４０配列（実施例１０およびＢａｍｅｔｔら、２００１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：５５２６−４０に記載される）を、ＳＩＮＣＲプラスミドおよびＳＩＮＣＰプラスミドの両方に挿入し、構築物ＳＩＮＣＲ−ｇｐｌ４０およびＳＩＮＣＰ−ｇｐｌ４０を生成した。ＥＬＶＩＳプラスミドＤＮＡ（ｐＳＩＮＣＰ）およびＳＩＮＣＲプラスミドからインビトロで転写されるＲＮＡベクターレプリコンの処方は、実施例の他の場所に記載されるように実施される。
【０２０１】
（実施例４）
（微粒子またはサブミクロンエマルジョンを使用した、ｐＣＭＶプラスミドまたはｐＳＩＮＣＰプラスミドを有する、抗原でのＲｈｅｓｕｓ  Ｍａｃａｑｕｅｓの免疫）
ＰＬＧポリマー微粒子およびＭＦ５９サブミクロンエマルジョンを、前述の実施例１および２で上述したように形成した。微粒上にあるかまたはサブミクロンエマルジョン中にある、プラスミドベクター構築物（ｐＣＭＶ−ｇｐｌ４０またはｐＣＭＶ−ｐ５５ｇａｇ（共有に係る米国特許出願０９／４７５，５１５を参照のこと））でｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓを免疫することの異なる効果を分析し、そして上述のように構築されたＥＬＶＩＳプラスミド、ｐＳＩＮＣＰ−ｇｐ１４０またはｐＳＩＮＣＰ−ｐ５５ｇａｇを使用する効果を比較するために、微粒子およびサブミクロンエマルジョンの群を作製した。６群の動物を、以下のように異なる処方物で免疫した：
群１は、微粒子またはサブミクロンエマルジョンを用いることなく、ｐＣＭＶ−ｇｐｌ４０およびｐＣＭＶ−ｐ５５ｇａｇを使用した。
【０２０２】
群２は、ＰＬＧ／ＣＴＡＢ微粒子上に吸着したｐＣＭＶ−ｇｐｌ４０およびｐＣＭＶ−ｐ５５−ｇａｇを使用した。
【０２０３】
群３は、ＭＦ５９−ＤＯＴＡＰサブミクロンエマルジョンに吸着したｐＣＭＶ−ｇｐｌ４０およびｐＣＭＶ−ｐ５５ｇａｇを使用した。
【０２０４】
群４は、微粒子またはサブミクロンエマルジョンを用いずにｐＳＩＮＣＰ−ｇｐｌ４０およびｐＳＩＮＣＰ−ｐ５５ｇａｇを使用した。
【０２０５】
群５は、ＰＬＧ／ＣＴＡＢ微粒子上に吸着したｐＳＩＮＣＰ−ｇｐｌ４０およびｐＳＩＮＣＰ−ｐ５５ｇａｇを使用した。
【０２０６】
群６は、コントロールであり、抗原、微粒子、およびサブミクロンエマルジョンを使用しなかった。
【０２０７】
各郡の動物について、５匹のｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ（群６についてのみ４匹）を、十分な量の物質で免疫し、その結果、（何も含まない）コントロールを除いて、ｇｐ１４０  ＤＮＡを使用するベクターの投薬は、各々１．０ｍｇであって、そしてｐ５５ｇａｇＤＮＡを含有するベクターは、各々０．５ｍｇであった。これらの動物を、初回の免疫後に４週間目に２回目の免疫をし、そして、初回免疫から１４週間目に、３回目の免疫をした。血清を、２（２ｗｐｌ）、６（２ｗｐ２）、１１〜１２週目（７ｗｐ２）、および１６（２ｗｐ３）週目に分析した。免疫の経路は、ＩＭ  ＴＡであった。免疫後に、血漿の抗ｐ５５ｇａｇおよび抗ｇｐｌ４０  ＩｇＧの力価を、測定し、これらの結果を、相乗平均力価として以下の表２および表３に示した。
【０２０８】
（表２）
【０２０９】
【表２】
2004518631.tif 000006
（表３）
【０２１０】
【表３】
2004518631.tif 000007
前述動物について使用したのと同じ群の動物を、ＣＴＬ応答の誘導について分析した。エフェクター  対  標的（Ｅ：Ｔ）の比は、約４：１〜１００：１の範囲であった。ＣＴＬアッセイの結果は、以下の表４および５に示されるようだった。「レスポンダー（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）」は、２以上の連続したＥ：Ｔ比で標的が１０％以上の特異的溶解を示したｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅである。
【０２１１】
（表４）
【０２１２】
【表４】
2004518631.tif 000008
（表５）
【０２１３】
【表５】
2004518631.tif 000009
同じ動物をまた、リンパ増殖について分析した。このアッセイによって、抗原による再刺激に応答するインビトロでの特異的なＴ細胞の増殖が測定される。Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配上の遠心分離によってヘパリン全血から精製した。ＰＢＭＣを、３μｇ／ｍｌの精製した組換えｐ５５ｇａｇタンパク質の存在下または非存在下で、平底マイクロタイタープレート中で１ウェル当たり２×１０５の数で培養した。１条件あたり６つの同型培養（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ）を開始した。培養４日後に、トリチウム化チミジン（［３Ｈ］  ＴｄＲ）（１ウェル当たり１マイクロキュリー）を添加した。培養物を一晩継続し、次の日に収集した。細胞は、ガラスマクロファイバーフィルターシート（ｇｌａｓｓ  ｍｉｃｒｏｆｉｂｅｒ  ｆｉｌｔｅｒ  ｓｈｅｅｔ）に沈澱した。フィルターシートを、シチレーション流体に曝露し、そして流体シチレーションカウンターで計測した。各条件について、［３Ｈ］ＴｄＲの取りこみ（６つの同型に対する１分間あたりの平均の計数（ｍｅａｎ  ｃｏｕｎｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｎ）（ｃｐｍ）として測定される）を、計算した。この結果を以下の表６に示した。相乗平均刺激指数（Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  Ｍｅａｎ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ（ＧＭＳＩ））を、ｐ５５ｇａｇ刺激された細胞の１分間当たりの計数（ｃｐｍ）を非刺激細胞のｃｐｍで除算したものとして計算し、従って、ＧＭＳＩが大きくなるに従い、結果はより陽性となる。
【０２１４】
（表６）
【０２１５】
【表６】
2004518631.tif 000010
同じ動物をまた、細胞内サイトカイン産生の誘導について分析した。このアッセイによって、抗原での短時間の再刺激に応答するインビトロでのＴ細胞によるサイトカインの特異的産生が測定される。Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配上の遠心分離によってヘパリン化全血から精製した。１×１０６ＰＢＭＣのアリコートを、同時刺激抗ＣＤ２８モノクローナル抗体の存在下で、合成オーバーラップペプチド（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）のプールで刺激し、このペプチドは、このｇａｇ（またはｅｎｖ）タンパク質配列に及ぶ。Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａを添加して、細胞中の新たに合成したサイトカインの蓄積を与えた。一晩のインキュベーション後に、ＰＢＭＣを、細胞内インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）の存在について、ならびに細胞表面のＣＤ４およびＣＤ８マーカーについての、市販の蛍光標識したモノクローナル抗体で染色した。染色した細胞サンプルを、フローサイトメトリーに基づいて分析し、データを約５０，０００−１００，０００  ＰＢＭＣについて得た。サイトカイン陽性細胞の頻度を、市販のソフトウェアを使用して各サンプルについて決定した。ｇｐｌ４０およびｐ５５ｇａｇについての結果を表７および８に、それぞれ示した。これらの表によって、応答した動物の数が示され、ここで、このレスポンダーは、細胞内染色によって測定されるＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γを発現する１００，０００個細胞当たり１００個より多くのＣＤ４細胞を記録する動物として定義される。
【０２１６】
（表７）
【０２１７】
【表７】
2004518631.tif 000011
（表８）
【０２１８】
【表８】
2004518631.tif 000012
（実施例５）
（ＲＮＡベクター構築物）
ＲＮＡベクター構築物（例えば、レプリコン）を、動物細胞へ異種由来核酸配列を送達するために微粒子に吸着し得る。このＲＮＡベクター構築物は、一般に、ウイルスＲＮＡを含み得、このウイルスＲＮＡは、選択された異種由来配列で置換されたゲノムＲＮＡ領域（例えば、構造タンパク質遺伝子）を有しており、このゲノムＲＮＡ領域は目的の遺伝子産物のための配列をコードするＤＮＡ由来である。ＲＮＡベクター構築物の代表的な例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：アルファウイルスＲＮＡベクター（例えば、米国特許第５８４３７２３，ＰＣＴ公開ＷＯ  ９９／１８２２６、およびＰｏｌｏら、１９９９，ＰＮＡＳ  ９６：４５９８−４６０３を参照のこと）、ピコルナウイルスＲＮＡベクター（例えば、米国特許第６１５６５３８号、およびＶｉｇｎｕｚｚｉら、２００１，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．８２：１７３７−４７を参照のこと）、フラビウイルスＲＮＡベクター（例えば、Ｖａｒｎａｖｓｋｉら、１９９９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２５５：３６６−７５を参照のこと）、およびルビウイルスＲＮＡベクター（例えば、Ｐｕｇａｃｈｅｖら、２０００，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７４：１０８１１−５を参照のこと）。本発明の用途のためのＲＮＡベクター構築物は、一般に、インビトロ転写（例えば、上記の参考文献を参照のこと）の標準的な手順によって開始物質の供給源としてのプラスミドｃＤＮＡ構築物から得られ得る。次いで、プラスミドＤＮＡと同様にこれらのＲＮＡベクター構築物を、実施例の他の場所に記載されるように本発明の微粒子に吸着し得る。例えば、このＲＮＡベクター構築物を、６時間、４℃にて、１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液中で１００ｍｇのカチオン性微粒子をインキュベートすることにより、この微粒子に吸着させる。次いで、これらの微粒子を、遠心分離によって分離し、このペレットをＴＥ緩衝液で洗浄し、そしてこれらの微粒子を凍結乾燥した。ＰＬＧ処方されたＲＮＡベクター構築物の再構成および送達は、ＤＮＡについて記載されたものに類似しており、例えば、少なくとも１μｇ、１０μｇ、１００μｇ、または１０００μｇの処方されたＲＮＡベクター構築物を送達のために使用する。
【０２１９】
（実施例６）
（マウスにおけるアジュバント）
マウスを用いた実験を実施して、マウス中でのアジュバントアルミニウムホスフェート（ミョウバン）の効果を分析した。ポリマー微粒子を微粒子上に吸着されたｐＣＭＶ−ｐ５５ｇａｇを用いてかまたはこれらを用いずして上記のように調製した。１０μｇのＤＮＡ（裸であるかまたはＰＬＧ微粒子に吸着している）を、ミョウバンを用いずに、またはこれを用いて、０週目と６週目において、６  ＣＢ６  Ｆｌマウスの群に注射した。（抗体の相乗平均力価としての）これらの結果を、以下の表９に示した。
【０２２０】
【表９】
2004518631.tif 000013
（実施例７）
（微粒子およびＥＬＶＩＳベクターおよびＲＮＡベクター構築物を用いたエレクトロポレーション）
上記の核酸のいずれか（例えば、プラスミドＤＮＡ、ＥＬＶＩＳベクター、およびＲＮＡベクター構築物）を用いて作製されたポリマー微粒子またはサブミクロンエマルジョン微粒子とともに、エレクトロポレーションを使用し得る。
【０２２１】
（実施例８）
（初回刺激および追加免疫を用いた、アカゲザルにおける免疫応答の誘導）
ＤＮＡを用いた初回刺激およびＰＬＧ微粒子に吸着されたタンパク質を用いた追加免疫の効果を決定するための実験を行った。特に、ＰＬＧ−ＳＤＳ微粒子を、上記および共有に係る国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７３０８に記載されるように調製し、そして精製された組換え体ｐ５５ｇａｇタンパク質をそのＰＬＧ−ＳＤＳ微粒子に吸着させた。一群の動物を、１ｍｇのｐＣＭＶ−ｐ５５ｇａｇを用いて免疫した。動物を４週目に再び免疫し、次いで、８週目に再び免疫した。動物を、４１週目にＰＬＧ微粒子に吸着されたｐ５５ｇａｇタンパク質を用いて追加免疫した。結果を以下の表１０に示し、これは、応答動物に対する抗体力価、ヘルパーＴ細胞リンパ球増殖の誘導（応答動物の平均刺激指数）、およびＣＴＬの誘導（２以上の継続的Ｅ：Ｔ比における１０％より大きい溶解に基づく、応答動物の数）を示す。結果を、初回刺激カラムについて３回目の初回刺激の１４週後、そして、追加免疫カラムについて２週後に測定した。括弧内の数字は、合計４匹の動物の内の応答動物の数を示す。
【０２２２】
【表１０】
2004518631.tif 000014
（実施例９）
（中和抗体の誘導）
実施例５におけるアカゲザル由来の血清を、ＰＭＢＣ増殖ウイルスストックおよびＣＣＲ５＋／ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞株ベースアッセイを使用して、２つの異なるＨＩＶ−１菌株（ＳＦ２およびＳＦ１６２）の阻害について試験した。血清を１：２０の希釈で使用した。阻害活性を測定し、そして阻害の割合として表現した。免疫の前に、動物の血清の阻害活性を、それぞれの動物についての結果から引いた。それぞれの群の５匹の動物のそれぞれについての結果を、以下の表１１に示す。
【０２２３】
【表１１】
2004518631.tif 000015
（実施例１０）
（プラスミドの調製）
ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって駆動されるＨＩＶ−１  ｐ５５ｇａｇおよびｇｐ１４０ｅｎｖをコードするプラスミドを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５α中で増殖させ、Ｑｉａｇｅｎ  Ｅｎｄｏｆｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｇｉｇａキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．）を使用して精製し、そして０．９％塩化ナトリウム（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃｈｉｃａｇｏ、Ｉｌｌ）に再懸濁させた。使用されるｐＣＭＶベクターは、ＣＭＶの最初期エンハンサー／プロモーターおよびウシ成長ホルモンターミネーターを含み、そして他の場所に詳細に記載される（Ｃｈａｐｍａｎ、Ｂ．Ｓ．ら、１９９１、「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｉｎｔｒｏｎ  Ａ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（Ｔｏｗｎｅ）ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ  ｏｎ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：３９７９−８６）。ＨＩＶｇａｇプラスミドＤＮＡワクチン（ｐＣＭＶｇａｇ）は、以前に記載されたＨＩＶ−１  ＳＦ２菌株から誘導される、哺乳動物利用（ｕｓａｇｅ）を反映したコドンを用いて、合成的に構築されたｐ５５ｇａｇ遺伝子を含む（ｚｕｒ  Ｍｅｇｅｄｅ，Ｊら、２０００．「Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｇａｇ  ｇｅｎｅ」、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７４：２６２８−３５）。ＨＩＶ  ｅｎｖプラスミドＤＮＡワクチン（ｐＣＭＶｇｐ１４０）は、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）シグナル配列およびＨＩＶ−１  ＳＦ１６２菌株由来のｇｐ１４０、哺乳動物細胞における高レベル発現に最適化されたコドンからなった（Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｓ．Ｗ．ら、２００１．「Ｔｈｅ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａｎ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  （ＨＩＶ−１）ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｔｏ  ｅｌｉｃｉｔ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｒｉｍａｒｙ  ＨＩＶ−１  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｉｓ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｐａｒｔｉａｌ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｃｏｎｄ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ．」Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７５：５５２６−４０）。ＨＩＶ−１  ｐ５５ｇａｇまたはｇｐ１４０ｅｎｖのいずれかを有するＳＩＮＣＰプラスミドベクターは、上記実施例３に記載されている。
【０２２４】
（実施例１１）
（タンパク質の調製）
ｇｐ１６０ｅｎｖ．ＳＦ１６２についてのタンパク質配列およびｃＤＮＡ配列は、Ｃｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ，Ｃ．，Ｍ．Ｑｕｉｒｏｇａ，Ｊ．Ｗ．Ｔｕｎｇ，Ｄ．Ｄｉｎａ，ａｎｄ  Ｊ．Ａ．Ｌｅｖｙ．１９９０．「Ｖｉｒａｌ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｏｒ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｔｒｏｐｉｓｍ，ｃｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，ａｎｄ  ＣＤ４  ａｎｔｉｇｅｎ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ」  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６４：４３９０−８に公開されている。これらの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ６５０２４に見出され得る。組換え体ＨＩＶ−１  ｇ１４０．ＳＦ１６２（ｄＶ２）タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣細胞において発現され、そして以前に記載されたように精製された（Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｓ．Ｗ．，ＥＴ．２００１．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７５：５５２６−４０）。組換え体ＨＩＶ−１．ＳＦ２  ｐ５５ｇａｇタンパク質は、酵母において発現され、そしてカチオン交換クロマトグラフィー（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）によって精製される。ＨＩＶ−１のＳＦ２菌株由来のｐ５５ｇａｇ  ｃＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｋ０２００７）を、ユビキチン発現ベクターにクローン化し、野生型配列のＮ末端へのグリシンおよびアルギニンの添加を生じた。組換え体ｐ５５ｇａｇタンパク質は、５０ｍＭホスフェート、６Ｍ尿素、ｐＨ７．９を使用して、酵母細胞ペレットから抽出され、続いて、Ｓ−フラクトゲル（カチオン性）イオン交換クロマトグラフィーを行った。ｐ５５ｇａｇの溶出液を、直線的なＮａＣｌ勾配（０．４ｍ  ＮａＣｌにピーク）を用いて得た。推定される純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって９０％であった。
【０２２５】
（実施例１２）
（ＤＮＡ吸着ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）ＰＬＧ微粒子）
ＰＬＧポリマー（ＲＧ５０５）を、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍから得た。カチオン性微粒子を、改変溶媒蒸発プロセスを使用して調製した。簡単に述べると、微粒子を、ＩＫＡホモジナイザーを使用して、高速で、１ｍｌのリン酸緩化衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて、塩化メチレン中で１０ｍｌの５％（重量／容積）ポリマー溶液を乳化することによって、調製した。次いで、第１のエマルジョンを、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）（０．５％重量／容積）を含む５０ｍｌの蒸留水に添加し、ｗ／ｏ／ｗ（ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）エマルジョンの形成し、これを、６，０００ｒｐｍで１２時間室温で攪拌し、塩化メチレンを蒸発させた。得られた微粒子を、１０，０００ｇの遠心分離によって、２回蒸留水で洗浄し、そして凍結乾燥した。実施例１１からのプラスミドＤＮＡを、１００ｍｇのカチオン性微粒子、ＤＮＡの２００μｇ／ｍｌ溶液（５ｍｌ）を４℃で６時間インキュベートすることによって微粒子上に吸着させた。次いで、微粒子を遠心分離によって分離し、ペレットを、ＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）緩衝液で洗浄し、そして微粒子を凍結乾燥した。
【０２２６】
（実施例１３）
（タンパク質吸着ＰＬＧ微粒子）
ブランクの微粒子を、溶媒蒸発技術によって調製した。簡単に述べると、微粒子を、高速で、１０ｍｍプローブを使用して、ＳＤＳ（１％ｗ／ｖ）を含む４０ｍｌの蒸留水を用いて、塩化メチレン中の６％ｗ／ｖポリマー溶液（１０ｍｌ）を、均質にすることによって調製した。これは、ｏ／ｗエマルジョンを生じ、これを、室温で１２時間１０００ｒｐｍで攪拌し、塩化メチレンを蒸発させた。得られた微粒子を、３８μｍメッシュを通して濾過し、３回蒸留水で洗浄し、そして凍結乾燥した。微粒子のサイズ分布を、粒子サイズアナライザー（Ｍａｓｔｅｒ寸法測定器、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｇｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）を使用して決定した。
【０２２７】
５０ｍｇの凍結乾燥ＳＤＳブランク粒子を、６Ｍ尿素を伴う２５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９）（１０ｍｌ）中の、実施例１２由来のｐ５５ｇａｇタンパク質（０．５ｍｇ）とともにインキュベートした。粒子を、実験室ロッカー（Ａｌｉｑｕｏｔミキサー、Ｍｉｌｅｓ  ｌａｂｓ）に、室温で５時間置いた。微粒子を、遠心分離によりインキュベーション媒体から分離し、そしてＳＤＳペレットを、６Ｍ尿素を伴うホウ酸緩衝液で１回洗浄し、そして凍結乾燥した。
【０２２８】
微粒子に吸着されたタンパク質の充填レベルを、２ｍｌの５％ＳＤＳ−０．２Ｍ水酸化ナトリウム溶液中に、１ｍｇの微粒子を室温で溶解することによって決定した。タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）によって測定した。ブランクおよび吸着微粒子の両方についてのζ電位を、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａアナライザー（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）を使用して、測定した。
【０２２９】
（実施例１４）
（ＭＦ５９アジュバントを伴うタンパク質の調製）
実施例１２由来の組換え体ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０．ＳＦ１６２（ｄＶ２）タンパク質を、以前に記載（Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｓ．Ｗ．ら、２００１．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７５：５５２６−４０）のようにＭＦ５９アジュバントと組み合わせた。
【０２３０】
（実施例１５）
（免疫）
雄性および雌性のアカゲザルを、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）に収容した。
【０２３１】
プラスミドＤＮＡ免疫を、０週目、４週目、および１４週目に行った。アカゲザルに、０．５ｍｇの実施例１１由来のｐＣＭＶｇａｇ（生理食塩水中であるか、または実施例１３に記載されるＰＬＧ／ＣＴＡＢ微粒子を用いて処方されるか、または実施例２に記載されるようにＭＦ５９／ＤＯＴＡＰを用いて処方される）および１．０ｍｇの実施例１１由来のｐｃＭＶ  ｅｎｖ（生理食塩水中であるか、または実施例１３に記載されるＰＬＧ／ＣＴＡＢ微粒子）の筋肉内注射を、動物当たり４つの別々の部位（右上腕および右上脚に０．２５ｍｇのｐＣＭＶｇａｇ；左上腕および左上脚に０．５ｍｇのｐＣＭＶｅｎｖ）に与えた。あるいは、アカゲザルに、０．５ｍｇの実施例１１由来のｐＳＩＮＣＰｇａｇ（生理食塩水中であるか、または実施例１３に記載されるＰＬＧ／ＣＴＡＢ微粒子を用いて処方される）および１．０ｍｇの実施例１１由来のｐＳＩＮＣＰｅｎｖ（生理食塩水中であるか、または実施例１３に記載されるＰＬＧ／ＣＴＡＢ微粒子を用いて処方される）の筋肉内注射を、動物当たり４つの別々の部位に与えた。
【０２３２】
アカゲザルを、０．２ｇの実施例１４由来の組換え体ｐ５５ｇａｇタンパク質／ＰＬＧ微粒子を２９週目に、そして０．１ｍｇの実施例１５由来のｇｐ１４０ｅｎｖ（ｄＶ２）タンパク質／ＭＦ５９アジュバントを３８週目に、筋肉内注射することによって追加免疫した。
【０２３３】
（実施例１６）
（抗体応答）
免疫に続く種々の時点で、ヘパリン処理した血液を、麻酔した動物から収集し、そして血漿を遠心分離によって除去した。抗ＨＩＶ  ＧａｇおよびＥｎｖ抗体を、以下のように、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。マイクロタイタープレートのウェルを、組換え体ＨＩＶ−１．ＳＦ２  ｐ５５ｇａｇタンパク質または組換え体ＨＩＶ−１．ＳＦ１６２  ｇｐ１４０ｅｎｖタンパク質を用いて、ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェルでコーティングし、そして４℃で１晩インキュベートした。プレートを６回洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．３％  Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、そして３７℃で１時間、２００μｌ／ウェルのブロック緩衝液（ＰＢＳ、０．３％  Ｔｗｅｅｎ２０、５％ヤギ血清）を用いてブロックした。試験サンプルを、１：２５に希釈し、次いで、ブロック緩衝液中で３倍に希釈した。ブロック溶液を吸引し、次いで、室温で１時間、７０μｌ／ウェルのそれぞれの血漿希釈液とともに、１時間室温でインキュベートした。６回洗浄した後に、プレートを１時間３７℃、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ＩｇＧ（１：８，０００希釈）とともにインキュベートした。６回の洗浄後、プレートを、ＴＭＢ基質を用いて１５分間発色させた。反応を２Ｎ  ＨＣｌで停止し、そして光学密度（ＯＤ）を、４５０ｎｍの波長で測定した。この力価を、希釈の逆数であるように計算し、このとき、０．５のＯＤ４５０ｎｍを達成した。
【０２３４】
【表１２】
2004518631.tif 000016
（１）０週目、４週目および１４週目になされた、プラスミド免疫に対して
（２）群の相乗平均
（３）対数変換された力価から計算された群の相加平均および標準誤差。ＬＬ＝逆対数（相加平均−標準誤差）。ＵＬ＝逆対数（相加平均＋標準誤差）。
（４）２９週目に投与された、アニオン性ＰＬＧ微粒子に吸着された組換え体ｐ５５ｇａｇタンパク質
【０２３５】
【表１３】
2004518631.tif 000017
（１）０週目、４週目および１４週目になされた、プラスミド免疫に対して
（２）群の相乗平均
（３）対数変換された力価から計算された群の相加平均および標準誤差。ＬＬ＝逆対数（相加平均−標準誤差）。ＵＬ＝逆対数（相加平均＋標準誤差）。
（４）３８週目に投与された、組換え体オリゴマー性ｇｐ１４０ｅｎｖ（ΔＶ２）タンパク質／ＭＦ５９アジュバント
（実施例１７）
（細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答）
２０アミノ酸（ａａ）長の、１０ａａが重なる、ｐ５５  ｇａｇにまたがる５１の合成ペプチドのプール、および２０ａａ長の、１０ａａが重なる、ｇｐ１４０にまたがる６６の合成ペプチドのプールを調製した。Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）勾配での遠心分離によって、ヘパリン化血液から分離した。ＰＢＭＣを、２４ウェルプレート内で、１つのウェルあたり３×１０６で、１０％ウシ胎仔血清を懸濁させた１．５ｍｌのＡＩＭ  Ｖ／ＲＰＭＩ  １６４０（５０：５０）培養培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．）中で、８日間培養した。Ｇａｇ特異的ＣＴＬを、ｇａｇペプチドプールの添加によって刺激し、そしてｅｎｖ特異的ＣＴＬを、ｅｎｖペプチドプールの添加によって刺激した。培養物に、組換えヒトインターロイキン−７（ＩＬ−７；１５ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．）を補充した。ヒト組換えＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍｌ；Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ；Ｃｈｉｒｏｎ）を、１日目、３日目、および６日目に添加した。安定なアカゲザルＢリンパ芽球細胞株（Ｂ−ＬＣＬ）を、ＰＢＭＣをＳ５９４細胞株由来のヒヒヘルペスウイルス含有培養上清（Ｆａｌｋ，Ｌ．ら，１９７６．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｂａｂｏｏｎ  ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１８：７９８−８０７．Ｒａｂｉｎ，Ｈ．ら，１９７６．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｂａｂｏｏｎ（Ｐａｐｉｏ  ｈａｍａｄｒｙａｓ）ｌｙｍｐｈｏｍａ：ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏａｍｙｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｐｒｉｍａｔｏｌ．５：１３−２２．）に、０．５マイクログラム／ｍｌのシクロスポリンＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下で曝露することによって、誘導した。自己由来のＢ−ＬＣＬを、ＨＩＶ−１．ＳＦ２  ｇａｇ−ｐｏｌ（ｒＶＶｇａｇ−ｐｏｌ）またはＨＩＶ−１．ＳＦ１６２  ｇｐ１６０ｅｎｖ（ｒＶＶｇｐ１６０ｅｎｖ）をコードする組換えワクシニアウイルス（ｒＶＶ）（１０のＰＦＵ：細胞の比）に感染させ、そして同時に、１×１０６のＢ−ＬＣＬあたり２５マイクロキュリーのＮａ［５１Ｃｒ］２Ｏ４（ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で標識した。３７℃で一晩の培養の後、ｒＶＶに感染し、５１Ｃｒで標識されたＢ−ＬＣＬを洗浄し、次いで、培養したＰＢＭＣの３倍系列希釈物を含む二連のウェルに添加した（１つの丸底ウェルあたり２，５００個）。次いで、１０５個の、標識されていない、感染していないＢ−ＬＣＬを、ウェルごとに添加して、非特異的な細胞溶解を阻害した。３７℃での４時間のインキュベーション後、５０マイクロリットルの培養上清を採取し、そしてＬｕｍａＰｌａｔｅｓ（Ｐａｃｋａｒｄ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）に添加し、そしてＭｉｃｒｏｂｅｔａ  １４５０液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、放射能を計数した（１分間あたりの計数（ｃｐｍ））。溶解した標的から放出された５１Ｃｒを、以下の式を使用して標準化した：特異的な５１Ｃｒ放出の％＝１００％×（平均実験ｃｐｍ−ＳＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）（ここで、ＳＲは、標的単独からの平均ｃｐｍであり、そしてＭＲは、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に曝露された標的からの平均ｃｐｍである）。ｇａｇペプチドプールで刺激したＰＢＭＣの連続する２つの希釈物において、ｒＶＶｇａｇ−ｐｏｌに感染したＢ−ＬＣＬの溶解が、ｒＶＶｇｐ１６０ｅｎｖに感染したＢ−ＬＣＬの溶解を、少なくとも１０％超え、そして培養されたＰＢＭＣの連続する２つの希釈物において、ｒＶＶｇａｇ−ｐｏｌに感染したＢ−ＬＣＬの、ｇａｇペプチドプールで刺激したＰＢＭＣによる溶解が、ｒＶＶｇａｇ−ｐｏｌに感染したＢ−ＬＣＬの、ｅｎｖペプチドプールで刺激したＢ−ＬＣＬによる溶解を、少なくとも１０％超えた場合、動物を、陽性のｐ５５ｇａｇ特異的応答を有すると決定した。ｅｎｖペプチドプールで刺激したＰＢＭＣの連続する２つの希釈物において、ｒＶＶｇｐ１６０ｅｎｖに感染したＢ−ＬＣＬの溶解が、ｒＶＶｇａｇ−ｐｏｌに感染したＢ−ＬＣＬの溶解を、少なくとも１０％超え、そして培養されたＰＢＭＣの連続する２つの希釈物において、ｒＶＶｇｐ１６０ｅｎｖに感染したＢ−ＬＣＬの、ｅｎｖペプチドプールで刺激したＰＢＭＣによる溶解が、ｒＶＶｇｐ１６０ｅｎｖに感染したＢ−ＬＣＬの、ｇａｇペプチドプールで刺激したＢ−ＬＣＬによる溶解を、少なくとも１０％超えた場合、動物を、陽性のｇｐ１６０特異的応答を有すると決定した。
【０２３６】
【表１４】
2004518631.tif 000018
【０２３７】
【表１５】
2004518631.tif 000019
（実施例１８）
（リンパ増殖アッセイ（ＬＰＡ））
１つのウェルあたり２×１０５個のアカゲザルＰＢＭＣを、組換えｐ５５ｇａｇタンパク質または合成ｅｎｖペプチドのプールの存在下または非存在下で、培養した。６つの反復ウェルを、各培養条件に対して樹立した。インキュベーションの４日後、培養物を、１マイクロキュリー／ウェルの［３Ｈ］ＴｄＲで一晩パルス化した。［３Ｈ］ＴｄＲの、細胞への取込みを、液体シンチレーション計数（ＢｅｔａＰｌａｔｅ，Ｗａｌｌａｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）によって決定した。刺激指数（ＳＩ）を、ＳＩ＝平均ｃｐｍ（ｇａｇ刺激またはｅｎｖ刺激）／平均ｃｐｍ（刺激なし）として計算した。
【０２３８】
【表１６】
2004518631.tif 000020
（ｌ）０週目、４週目および１４週目においてなされたプラスミド免疫に対する
（２）群に対する相乗平均
（３）対数変換された力価から計算した、群の相加平均および標準誤差。ＬＬ＝逆対数（算術的平均標準誤差）。ＵＬ＝逆対数（相加平均＋標準誤差）
（４）２９週目に投与されたアニオン性ＰＬＧ微粒子に吸着された、組換えｐ５５ｇａｇタンパク質
【０２３９】
【表１７】
2004518631.tif 000021
（１）０週目、４週目、および１４週目においてなされたプラスミド免疫に対する
（２）群に対する相乗平均
（３）対数変換された力価から計算した、群の相加平均および標準誤差。ＬＬ＝逆対数（算術的平均−標準誤差）。ＵＬ＝逆対数（相加平均＋標準誤差）
（４）３８週目に投与された、組換えオリゴマーｇｐ１４０ｅｎｖ（ΔＶ２）タンパク質／ＭＦ５９アジュバント
（５）空白値：アッセイを実施しなかった。
【０２４０】
（実施例１９）
（細胞内サイトカイン免疫蛍光およびフローサイトメトリー）
アカゲザルＰＢＭＣ（１ウェルあたり１×１０６個）を、ブレフェルジンＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下で、そしてｇａｇペプチドプールまたはｅｎｖペプチドプールの存在下または非存在下で、一晩培養した。二連のウェルを、各刺激の条件に対して調製した。翌日、細胞をペリジニン（ｐｅｒｉｄｉｎｉｎ）クロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）に結合体化した抗ＣＤ８  ｍＡｂおよびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）に結合体化した抗ＣＤ４  ｍＡｂ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で染色し、固定し、そして透過性にし（Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）そしてフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に結合体化した抗腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）ｍＡｂおよびフィコエリトリン（ＰＥ）に結合体化した抗インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）ｍＡｂ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した。染色した細胞サンプルを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭフローサイトメーターおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔＴＭソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析した。ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αに対して陽性に染色された細胞の画分を、ＣＤ４＋８−Ｔ細胞サブセットおよびＣＤ８＋４−Ｔ細胞サブセットに対して計算した。ｇａｇ特異的細胞またはｅｎｖ特異的細胞の数を、ｇａｇまたはｅｎｖで刺激したウェルにおいて見られる平均ＩＦＮ−γ／ＴＮＦ−α画分からの、刺激されていないコントロールウェルにおいて見られる平均ＩＦＮ−γ／ＴＮＦ−α画分の減算によって、計算した。所定のＴ細胞サブセット（ＣＤ４＋８−またはＣＤ８＋４−）および抗原（ｇａｇまたはｅｎｖ）に対して、抗原特異的細胞の画分が少なくとも０．１％であった場合に、応答を陽性であると割り当てた。
【０２４１】
【表１８】
2004518631.tif 000022
【０２４２】
【表１９】
2004518631.tif 000023
【０２４３】
【表２０】
2004518631.tif 000024
【０２４４】
【表２１】
2004518631.tif 000025
本発明の好ましい実施形態をいくらか詳細に記載したが、明らかな改変が、添付の特許請求の範囲によって規定されるような本発明の意図および範囲から逸脱することなくなされ得ることが、理解される。
【０２４５】
【化４】
2004518631.tif 000026
2004518631.tif 000027
2004518631.tif 000028
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、改変されたＨＩＶ−１  ｐ５５ｇａｇポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号６３）を提供する。
【図２】
図２は、改変されたＨＩＶ−１  ｐ５５ｇａｇポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号６４）を提供する。
【図３】
図３は、改変されたＨＩＶ−１エンベロープポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号６５）を提供する。
【図４】
図４は、改変されたＨＩＶ−１エンベロープポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号６６）を提供する。
【図５】
図５は、改変されたＨＩＶ−１  ｐ５５ｇａｇポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号６７）を提供する。
【図６】
図６は、改変されたＨＩＶ−１  ｐ５５ｇａｇポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号６８）を提供する。
【図１】
2004518631.tif 000029
【図２】
2004518631.tif 000030
【図３】
2004518631.tif 000031
【図４】
2004518631.tif 000032
【図５】
2004518631.tif 000033
【図６】
2004518631.tif 000034
【国際公開パンフレット】
2004518631.tif 000035
2004518631.tif 000036
2004518631.tif 000037
2004518631.tif 000038
2004518631.tif 000039
2004518631.tif 000040
2004518631.tif 000041
2004518631.tif 000042
2004518631.tif 000043
2004518631.tif 000044
2004518631.tif 000045
2004518631.tif 000046
2004518631.tif 000047
2004518631.tif 000048
2004518631.tif 000049
2004518631.tif 000050
2004518631.tif 000051
2004518631.tif 000052
2004518631.tif 000053
2004518631.tif 000054
2004518631.tif 000055
2004518631.tif 000056
2004518631.tif 000057
2004518631.tif 000058
2004518631.tif 000059
2004518631.tif 000060
2004518631.tif 000061
2004518631.tif 000062
2004518631.tif 000063
2004518631.tif 000064
2004518631.tif 000065
2004518631.tif 000066
2004518631.tif 000067
2004518631.tif 000068
2004518631.tif 000069
2004518631.tif 000070
2004518631.tif 000071
2004518631.tif 000072
2004518631.tif 000073
2004518631.tif 000074
2004518631.tif 000075
2004518631.tif 000076
2004518631.tif 000077
2004518631.tif 000078
2004518631.tif 000079
2004518631.tif 000080
2004518631.tif 000081
2004518631.tif 000082
2004518631.tif 000083
2004518631.tif 000084
2004518631.tif 000085
2004518631.tif 000086
2004518631.tif 000087
2004518631.tif 000088
2004518631.tif 000089
2004518631.tif 000090
2004518631.tif 000091
2004518631.tif 000092
2004518631.tif 000093
2004518631.tif 000094
2004518631.tif 000095
2004518631.tif 000096
2004518631.tif 000097
2004518631.tif 000098
2004518631.tif 000099
2004518631.tif 000100
2004518631.tif 000101
2004518631.tif 000102
2004518631.tif 000103
2004518631.tif 000104
2004518631.tif 000105
2004518631.tif 000106
2004518631.tif 000107
2004518631.tif 000108
2004518631.tif 000109
2004518631.tif 000110
2004518631.tif 000111
2004518631.tif 000112
2004518631.tif 000113
2004518631.tif 000114
2004518631.tif 000115
2004518631.tif 000116
2004518631.tif 000117
2004518631.tif 000118
2004518631.tif 000119
2004518631.tif 000120
2004518631.tif 000121
2004518631.tif 000122
2004518631.tif 000123
2004518631.tif 000124
2004518631.tif 000125
2004518631.tif 000126
2004518631.tif 000127
2004518631.tif 000128
2004518631.tif 000129
2004518631.tif 000130
2004518631.tif 000131
2004518631.tif 000132
2004518631.tif 000133
2004518631.tif 000134
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004518631.tif 000135
【国際調査報告】
2004518631.tif 000136
2004518631.tif 000137
2004518631.tif 000138
2004518631.tif 000139