(57)【要約】本発明は、アポミクシスとも称される、植物の栄養繁殖に関する。特に本発明は、(a)第一の親株の胚嚢近傍において、体細胞胚増殖受容体型キナーゼをコードしているまたはこれと相互作用している遺伝子をトランスジェニック的に発現する工程、(b)工程(a)の第一の親株を、第二の遺伝的に多型性の親株と交雑し、かつ交雑した植物に、開花前にオーキシンを施用する工程、(c)オーキシン処理した植物から得た種子から、F1後代植物を生育する工程、(d)工程(c)から得たF1後代植物を自殖し、F2後代植物を得る工程、および(e)工程(d)において自殖されたF1後代植物の核ゲノムのマーカープロファイルと同じマーカープロファイルを伴う核ゲノムを有するF2後代植物を選択する工程を含む、種子の作出法を説明する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚嚢の近傍に、体細胞胚増殖受容体型キナーゼをコードするまたはこれと相互作用する遺伝子をトランスジェニック的に発現している植物世代におけるアポミクシスの確率を増大にする工程段階であり、ここでオーキシンが、開花前に植物に施用される、工程段階。
【請求項２】
種子の作出法であり：
(a)第一の親株の胚嚢近傍において、体細胞胚増殖受容体型キナーゼをコードするまたはこれと相互作用する遺伝子をトランスジェニック的に発現する工程、
(b)工程(a)の第一の親株を、第二の遺伝的に多型性の親株と交雑させ、そして交雑させた植物に、開花前にオーキシンを施用する工程、
(c)オーキシン処理した植物から得た種子から、F1後代植物を生育する工程、
(d)工程(c)から得たF1後代植物を自殖し、F2後代植物を得る工程、
(e)工程(d)において自殖されたF1後代植物の核ゲノムのマーカープロファイルと同じマーカープロファイルを伴う核ゲノムを有するF2後代植物を選択する工程、および
(f)任意に、該F2後代植物を、1ラウンドよりも多い自殖において、繁殖する工程を含む、方法。
【請求項３】
オーキシンが、開花前に1〜2日の期間少なくとも1回、好ましくは2回施用される、請求項１記載の工程段階。
【請求項４】
オーキシンが、2,4D；NAAおよびIAAからなる群より選択される、請求項１記載の工程段階または請求項２記載の方法。
【請求項５】
オーキシンが、2,4Dである、請求項４記載の工程段階または方法。
【請求項６】
トランスジェニック的に発現された遺伝子が、国際公開公報第97/43427号の配列3および21ならびに国際公開公報第00/24914号の配列2、4、6、8、10、12、14および16からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしている、請求項１記載の工程段階または請求項２記載の方法。
【請求項７】
遺伝子の発現が、誘導可能なまたは発生的に調節されたプロモーターの制御下にある、請求項１記載の工程段階または請求項２記載の方法。
【請求項８】
遺伝子が、極性核と雄性配偶子核の融合前に発現される、請求項７記載の工程段階または方法。
【請求項９】
遺伝子が、胚嚢、子房壁、核、または珠皮の体細胞において発現される、請求項７記載の工程段階または方法。
【請求項１０】
遺伝子の発現が、ニンジンキチナーゼDcEP3-1遺伝子プロモーター、Arabidopsis AtChitIV遺伝子プロモーター、Arabidopsis LTP-1遺伝子プロモーター、Arabidopsis bel-1遺伝子プロモーター、ペチュニアfbp-7遺伝子プロモーター、Arabidopsis ANT遺伝子プロモーターまたはPhalaenopsisの0126遺伝子のプロモーター、またはSERK遺伝子プロモーターの制御下にある、請求項７記載の工程段階または方法。
【請求項１２】
F2後代植物のマーカープロファイルが、工程段階(b)において使用された母株のマーカープロファイルと同じである、請求項２記載の方法。
【請求項１３】
工程段階(d)において自殖されたF1後代植物の核ゲノムのマーカープロファイルと同じマーカープロファイルを伴う核ゲノムを有するF2後代植物を、F2後代植物のゲノム指紋の、工程段階(d)において自殖したF1後代植物のゲノム指紋との比較後同定する、請求項２記載の方法。
【請求項１４】
分子マーカーのセット使用し、DNAフィンガープリント決定およびゲノムの比較を行う、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
同じマーカープロファイルを伴う核ゲノムを有する種子の作出法であり、請求項２において得られた植物または得られた後代植物の自殖または交雑の反復サイクルを含む、方法。
【請求項１６】
有性後代植物からのアポミクシス系を識別する方法であり、後代および親株において少なくとも5種の分子マーカーのマーカープロファイルを特徴決定すること、ならびに母株のマーカープロファイルと同じマーカープロファイルを有する後代植物を同定することを含み、ここでこれらのマーカーが親株について多型性である、方法。
【請求項１７】
分子マーカーが、制限断片長多型、無作為増殖多型DNA、一塩基多型、単純配列長多型、切断増幅多型または増幅断片長多型からなる群より選択される、請求項１６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポミクシスとも称される、植物の栄養繁殖に関する。特に本発明は、植物世代において形成されたアポミクシス系種子の割合、すなわち種子を通じて栄養繁殖の可能性を増大する工程段階を説明する。
【０００２】
アポミクシスは、母株と遺伝上本質的に同じ子孫植物を生じる多倍数体の非栽培植物種の一部において認められた、植物の遺伝的に制御された生殖機構である。胚嚢の近傍におけるトランスジェニック発現時にアポミクシス系種子の割合を増大する遺伝子は、国際公開公報第97/43427号および国際公開公報第00/24914号に開示されている。これらは、体細胞胚形成受容体型キナーゼ(Somatic Embryogenesis Receptor Kinase)(SERK)またはそれらと相互作用するタンパク質のいずれかをコードしている。
【０００３】
配偶体型アポミクシスおよび非配偶体型アポミクシスの2種類のアポミクシスが区別されている。配偶体型アポミクシスにおいて、典型的には反足細胞核を欠いている複数の胚嚢が形成されるか、または胚嚢内に他の大胞子形成が生じる。不定胚とも称される非配偶体型アポミクシスにおいて、体細胞胚は、胚嚢、子房壁または珠皮の細胞から直接発生する。周辺細胞からの体細胞胚は、有性子房(sexual ovary)に侵入し、かつ体細胞胚のひとつを、他の体細胞胚および生殖胚と大きく競合し、かつ作成された胚乳を利用する。
【０００４】
アポミクシスは、真の育種のために、種子繁殖したハイブリッドをもたらす。従って、栽培された植物種へのアポミクシスの遺伝子工学的操作は、望ましい遺伝子組合せを安定させるための自殖および後代検定は省略することができるので、これは育種過程を短縮しかつ簡便化するであろう。アポミクシス系遺伝子型はヘテロ接合性とは真にかかわりなく育種されるので、独自の遺伝子組合せを伴う遺伝子型は、栽培品種として使用することができるであろう。従って、遺伝子または遺伝子群は、「ピラミッド状とされ」かつ望ましい遺伝子型に「固定」されるであろう。有性(sexual)-アポミクシス性交雑からの優れたアポミクシス系遺伝子型毎に、栽培品種となる可能性があるであろう。栽培品種化された植物へと遺伝子工学的に操作されたアポミクシスは、植物育種家が、高さ、種子および茎葉品質および成熟度などの特性に関して特異的に安定した形質を伴う栽培品種を開発することを可能にするであろう。育種家は、(i)雄性不稔母株を作出するための細胞質-核相互作用、または(ii)花粉媒介者の能力を回復する受精率により、それらのハイブリッドの商業的生産を制限されることはないであろう。ほとんど全ての交雑和合性の生殖質は、アポミクシス系ハイブリッドを作成するための可能性のある親株であろう。
【０００５】
アポミクシスは更に、商業用ハイブリッド種子生産を単純化するであろう。特に、(I)商業用ハイブリッド生産圃場の物理的隔離の必要がないこと；(ii)花粉媒介者と雄性不稔株の間で空間を分ける代わりに、全ての利用可能な土地を、ハイブリッド種子増大に使用することができること；および、(iii)親株種子ストックの維持の必要がないことである。
【０００６】
本発明は、体細胞胚増殖受容体型キナーゼをコードしているまたはこれと相互作用している遺伝子を胚嚢近傍にトランスジェニック的に発現している植物世代において、形成されまたは発生されたアポミクシス系種子の割合を増大する種子作成の工程段階を明らかにしている。本発明において、オーキシンが、開花が始まる前に、該植物に施用される。実現された増大したアポミクシス系繁殖は、誘導可能なアポミクシス系繁殖として見ることができ、これは、オーキシンを除去した後、ほとんど正常な有性繁殖に復帰する。
【発明の開示】
【０００７】
本発明に従い種子を作成する方法は、
(a)第一の親株の胚嚢近傍において、体細胞胚増殖受容体型キナーゼをコードするまたはそれと相互作用する遺伝子をトランスジェニック的に発現する工程、
(b)工程(a)の第一の親株を、第二の遺伝的に多型性の親株と交雑し、そして交雑した植物に、開花前にオーキシンを施用する工程、
(c)オーキシン処理した植物から得た種子から、F1後代植物を生育する工程、
(d)工程(c)から得たF1後代植物を自殖し、F2後代植物を得る工程、
(e)工程(d)において自殖されたF1後代植物の核ゲノムのマーカープロファイルと同じマーカープロファイルを伴う核ゲノムを有するF2後代植物を選択する工程、および
(f)任意に、該F2後代植物を、1ラウンドよりも多い自殖において、繁殖する工程を含む。
【０００８】
同じマーカープロファイルを伴う核ゲノムを有する十分量の種子を作成するために、前述の方法で得られたアポミクシス系植物は、自殖または交雑の反復サイクルにおいて繁殖することができる。後代検定の目的のために、工程段階(b)の近交系を使用することは、都合がよい。しかし本方法は、近交弱勢が存在する状況においても適用することができる。
【０００９】
胚嚢近傍においてトランスジェニック的に発現される遺伝子の例は、Daucus carote SERK遺伝子(GENBANK寄託番号U93048)、Arabidopsis thaliana SERK遺伝子(GENBANK寄託番号A67827)に加え、GENBANK寄託番号AX024556、AX024558、AX024560、AX024562、AX024564、AX024566、AX024568およびAX024570により記載のArabidopsis thaliana遺伝子のような、SERK遺伝子産物と物理的に相互作用するタンパク質をコードしている遺伝子である。これらは、国際公開公報第97/43427号の配列番号:3および21、ならびに国際公開公報第00/24914号の配列番号:2、4、6、8、10、12、14および16からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしている。同様の機能であり他の植物種から入手可能な構造的に関連した遺伝子も、使用することができる。胚嚢近傍で導入遺伝子の発現を達成するために、この遺伝子は、適当な誘導可能なまたは発生的に調節されたプロモーターに機能的に連結されなければならない。好ましくはこの遺伝子は、極性核が雄性配偶子核に融合する前に、雌性配偶体において発現されている。特に興味深いのは、胚嚢、子房壁、核または珠皮の体細胞における遺伝子の発現である。適当なプロモーターの具体例は、ニンジンキチナーゼDcEP3-1遺伝子プロモーター、Arabidopsis AtChitIV遺伝子プロモーター、Arabidopsis LTP-1遺伝子プロモーター、Arabidopsis bel-1遺伝子プロモーター、ペチュニアfbp-7遺伝子プロモーター、Arabidopsis ANT遺伝子プロモーター、Arabidopsis AtDMC1プロモーター、PhalaenopsisのO126遺伝子のプロモーターまたはSERK遺伝子プロモーターである。
【００１０】
アポミクシス系種子を同定するために、初回交雑の親株のゲノムは、互いに十分に多型性でなければならない。遺伝的に類似した植物が初回交雑に使用される場合は、アポミクシス系種子も作成されるにもかかわらず、このような交雑から得られるアポミクシス系種子の同定はほとんど不可能である。親株の遺伝的多型は、代わりに、DNA指紋により後代植物を容易に特徴決定することを可能にし、その結果アポミクシス性繁殖から得られた種子の同定を可能にする。親株が、少なくとも5〜10個、好ましくは20個を上回り、さらにより好ましくは50〜60個またはそれ以上の個別に隔離されている遺伝子座を含み、これは、少なくともひとつの親株においてまたは親株間のいずれかにおいて遺伝的変動を示す場合に、これらは十分に多型性であるとみなすことができる。
【００１１】
親株の初回交雑の後、オーキシンが、開花の1〜10日前の期間、好ましくは開花の1〜2日前に、少なくとも1回施用される。開花前の期間における2、3、4または5回のような、オーキシンの反復施用も好ましい。オーキシンは、2,4D(2,4-ジクロロフェノキシ酢酸)；NAA(ナフタレン酢酸)およびIAA(インドール酢酸)からなる群より選択することができる。特に適当なオーキシンは、2,4Dである。
【００１２】
アポミクシス性繁殖は、初回交雑の母株と遺伝的に同じである植物を生じることができる。従って、本発明の状況において、F2後代植物の核ゲノムは、初回交雑、すなわち、前述の方法の工程段階(b)において使用される母株の核ゲノムと本質的に同じであると考えられる。
【００１３】
本発明は、双子葉植物および単子葉植物に適用することができる。双子葉植物の中で、Arabidopsis、大豆、綿花、サトウキビ、甘藷、油料種子ナタネ、タバコおよびヒマワリが好ましい。特に好ましいのは、ダイズ、綿花、タバコ、サトウキビおよび油料種子ナタネである。単子葉植物の中では、トウモロコシ、スイートコーン、小麦、大麦、サトウモロコシ、ライ麦、オート麦、芝および飼草、キビおよび米が好ましい。特に好ましいのは、トウモロコシ、小麦、サトウモロコシ、および米である。
【００１４】
初回交雑のために十分に多型性の植物を用いることは、アポミクシス性繁殖から生じたものを同定するための様々な後代植物の識別のための、DNA指紋技法を利用する。先に概説した方法の具体的態様において、先の工程段階(d)において自殖したF1後代植物の核ゲノムと本質的に同じである核ゲノムを有するF2後代植物は、F2後代植物のゲノム指紋を、工程段階(d)においてF2後代植物を作出するために自殖されたF1後代植物のゲノム指紋と比較することにより同定される。これらのゲノムの指紋決定および比較は、都合の良いことに、制限断片長多型(RFLP)、無作為増殖多型DNA(RAPD)、一塩基多型(SNP)、単純配列長多型(SSLP)、切断増幅多型(CAP)または増幅断片長多型(AFLP)のような分子マーカーのセットを用いて行うことができる。いくつかの特異的Arabidopsis SSLPの一覧は、例えばArabidopsis Genome Center(URL http://genome.salk.edu/)からアクセスすることができる。Arabidopsis SSLPおよび対応するオリゴヌクレオチドの一覧は、URL (http://genome.salk.edu/SSLP_info/SSLPsordered.html)で見ることができる。
【００１５】
従って本発明は更に、後代および親株において、少なくとも5〜10個、好ましくは20個より多い、更により好ましくは50〜60個またはそれよりも多い独立して隔離されている分子マーカー遺伝子座のマーカープロファイルを特徴決定する工程、およびマーカーが親株について多型であるような、母株のマーカープロファイルと同じマーカープロファイルを有する後代植物を同定する工程を含む、有性後代植物からアポミクシス系のものを識別する方法を含む。
【００１６】
実施例
実施例1：AtLTP::AtSERK1発現ベクターの構築
2.1kbのAtSERK1完全長cDNAを、SacI-KpnI断片として、CaM V35Sプロモーターを含む、pRT105ベクター(Topferら、Nucleic Acids Res.、15:5890 (1987))にクローニングする。その後CaM V35Sプロモーターを、HincII-SmaI消化によりpRT105から取り除き、AtLTP1(Thomaら、Plant Physiol.、105:35 (1994))プロモーター断片と置換えた。このAtLTP1::AtSERK1カセットは、フランキングしているpRT105プラスミドDNAに特異的でありかつSmaI制限部位を含む、下記プライマーを用いる、PCRにより増幅する：
pRTフォワード：5'-TCCCCCGGGGGAAGCTTGCATGCCTG-3' (配列番号:1)、および
pRTリバース：5'-TCCCCCGGGGGACTGGATTTTGGTT-3' (配列番号:2)。
その後このPCR断片は、SmaI消化後、植物の形質転換のために、バイナリーベクターpMOG800(Mogen社)へと移される。この構築体は、AtSERK1特異的プライマーSERK1 Rev:5' -TAAGTTTGTCAGATTTCCAAGATTACTAGG-3' (配列番号:3)を使用し、配列決定により証明され、かつAgrobacterium tumefaciens株AGL1において電気穿孔される(Lazoら、Biotechnology、5:963 (1991))。
【００１７】
実施例2：Arabidopsis thaliana植物のAtLTP::AtSERK1発現ベクターによる形質転換
Arabidopsis thaliana生態型WS植物を、Bechtoldらの論文(C.R. Acad.Sci. Paris, Sciences de la vie、316:1194 (1993))に説明されたような真空浸潤(vacuum infiltration)により形質転換する。T1種子は、10％ショ糖および50mg/lカナマイシンを補充した1/2 MS-塩培地(MurashigeおよびSkoog、Duchefa Biochemie BV)において、10日間かけて選択する。カナマイシン耐性種子系統は、土壌に移し、かつ種子の増殖に使用する。
【００１８】
実施例3：アポミクシス系種子の作成
a.材料および方法
AtLTP1::AtSERK1構築体とホモ接合性である、トランスジェニックT3 Arabidopsis thaliana生態型WS植物、すなわち、形質転換後の第3世代のトランスジェニック植物を、雄性ドナーとして使用し、Arabidopsis thaliana生態型Landsberg erecta (Ler)植物に受粉した。Vivian-Smithらの論文(Plant Physiol.、121:437 (1999))に説明されたように、開花のほぼ1〜2日前のステージ11から12(Smythら、The Plant Cell、2: 755 (1990))で、F1植物の花芽を、界面活性剤として0.04％(v/v)Triton X-100を補充した2μM 2,4-Dを含有する水溶液に浸漬する。この処理を2日間間隔で2回繰り返し、かつ植物をF2種子にセットしたままとする(left to set)。平行して、野生型Ler雌性植物と野生型WS雄性植物の間の対照交雑を行い、F1植物を得た。これらのF1植物は、野生型F1植物と称し、かつこれらは、オーキシン処理をしないこと以外は、トランスジェニックF1植物と同じ方法で分析する。
【００１９】
Ponceらの論文(Mol. Gen. Genet.、261:408 (1999))に説明されたように、F2種子を、生育し実生とし、各植物から得た数枚のそう生葉を用い、DNA抽出する。Ponceらの論文(前掲)により説明されたような、蛍光標識したプライマーによる反復PCRを使用する、11種のSSLPマーカー(表1参照)の同時増幅により、単純配列長多型(SSLP)解析を行う。使用した全てのSSLPマーカーは、WSおよびLer生態型について多型性であり、ゲノム内に均等に分布されており、F2後代においてメンデルの分離をもたらすために連関されていない。各々のフォワードプライマーを、3種の異なる蛍光色素のなかのひとつで標識し、かつPCR産物を、GS 36C-2400モジュールで試行するABI PRISM(商標)377 DNAシークエンサー上で分離する。その後DNA断片解析を、GeneScan(登録商標)3.1およびGenotyper(登録商標)ソフトウェア(Applied Biosystems社)を用いて行う。
【００２０】
【表１】
2004531255.tif 000002
【００２１】
b. 結果／解釈／考察
本発明者らは、AtSERK1過剰発現している植物の後代におけるアポミクシスのスクリーニングのために、遺伝子を基にした方法を用いた。この方法は、単純配列長多型(SSLP)マーカーの使用を基にしている。SSLPは、縦列反復した2〜5塩基対DNAコア配列である。これらの反復単位にフランキングしているDNA配列は、一般に、介在SSLPを増幅するであろうPCRプライマーの選択ができるように、保存されている。縦列反復単位の数の変動は、PCR産物の長さの差異を生じる。Arabidopsis 50において、SSLPマーカーが説明されており、かつこれらは連関および遺伝子型分析のための共優性遺伝子マーカーとして慣習的に使用されている。SSLPは、高レベルのアレル変動を検出し、かつこれらはPCRにより容易に評価可能である(19)。
【００２２】
全てのトランスジェニックおよび対照F1植物のSSLPプロファイルは、同じであり、常に22 PCR産物を増幅する。これらは、Lerにおいて11種のSSLPアレルに、および全てのヘテロ接合性F1植物において存在するWS生態型において11種のSSLPアレルに相当している。各トランスジェニック実験からのF2植物および野生型対照実験からのF2植物は、先に説明されたように、同じ11種のSSLPマーカーの遺伝子型である。各F2植物のSSLPプロファイルを、対応するF1母本植物のSSLPプロファイルと比較する。結果を、表2および3に示す。
【００２３】
【表２】
2004531255.tif 000003
【００２４】
【表３】
2004531255.tif 000004
【００２５】
本発明者らは、各トランスジェニック実験および野生型対照において、11種のSSLPマーカーについてヘテロ接合性であるF2植物の数をスコア化した。有性集団において、11種のSSLPマーカーについてヘテロ接合性である植物の予想された数は、0.00048であり、これは2048植物の集団につき1植物を意味する。本発明者らの実験(459植物)においてスコア化した野生型植物の数について、予想値は0.2である。この集団において11種のSSLPマーカーについてヘテロ接合性の植物は検出されなかった。これは、χ2値0.2を生じ、このことは、予想値からの偏差は459のF2植物の集団について有意ではないことを示している。これらのデータは、野生型Arabidopsis植物は有性繁殖することを明らかにしている。トランスジェニック交雑No.15の結果は、使用したAtLTPI::AtSERK1を過剰-発現している植物について、χ2値は、高度に有意であることを示している(χ2=37)。175植物のF2集団において、本発明者らは、11種のSSLPマーカーについてホモ接合性である2植物を同定した。これが偶然生じる確率は、低く(p＜0.0001)、本発明者らは、これら2種の植物は母本起源であることおよびこれらはアポミクシス系後代であることを結論付けた。交雑No.15で使用したトランスジェニック株と比較し、低レベルのSERK1タンパク質を発現している(ウェスタンブロット分析により検出)トランスジェニック株との、別のトランスジェニック交雑(交雑No.14)においては、選択されたマーカー11種のSSLP全てについてヘテロ接合性の植物は検出されなかった。
【００２６】
分析したトランスジェニック植物において減数しない(non-reduced)配偶子が存在しないことを基に、本発明者らは、アポミクシスの配偶体型は生じないと結論した。このことは、アポミクシス性胚形成の可能性のある様式として、中心細胞の受精(偽受精生殖)または不定胚形成が存在する場合には、単為生殖、それに続く二ゲノム性半数体形成(dihaploidisation)を残している。子孫は試験した全てのマーカーについて完全にヘテロ接合性であるので、偽受精生殖は除外することができる。これは、アポミクシスの最も可能性のあるモデルとして生じる、受精前に通常開始される不定胚形成を残す。
【国際公開パンフレット】
2004531255.tif 000005
2004531255.tif 000006
2004531255.tif 000007
2004531255.tif 000008
2004531255.tif 000009
2004531255.tif 000010
2004531255.tif 000011
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2004531255.tif 000013
2004531255.tif 000014
2004531255.tif 000015
2004531255.tif 000016
2004531255.tif 000017
2004531255.tif 000018
2004531255.tif 000019
2004531255.tif 000020
2004531255.tif 000021
2004531255.tif 000022
2004531255.tif 000023
2004531255.tif 000024
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004531255.tif 000025
【国際調査報告】
2004531255.tif 000026
2004531255.tif 000027
2004531255.tif 000028
2004531255.tif 000029