(57)【要約】本発明は、β−エストラジオールにより可逆的に活性化可能であるインターフェロン調節因子−１／ヒトエストロゲン受容体融合タンパク質に、ならびに癌を治療するための、特に肝細胞癌を治療するためのその使用に関する。
2004529888.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子構築物またはポリヌクレオチドの使用であって、それによりＩＲＦファミリーのメンバーである該遺伝子構築物またはポリヌクレオチドの遺伝子産物の活性が、腫瘍性、感染性および／または免疫疾患に対する治療、予防、防御的治療および／または予防免疫接種のために活性化される使用。
【請求項２】
遺伝子産物としてのＩＲＦファミリーの前記メンバーは、野生型ＩＲＦ−１，合成ＩＲＦ−１、免疫学的活性ＩＲＦ−１変異体、ＩＲＦ−１以外のＩＲＦファミリーの野生型メンバー、ＩＲＦ−１以外のＩＲＦファミリーの合成メンバー、ＩＲＦ−１以外のＩＲＦファミリーのメンバーの免疫学的活性変異体、およびそれらの融合タンパク質から成る群から選択される請求項１記載の使用。
【請求項３】
哺乳類、特にヒトの治療のための請求項１および／または２記載の使用。
【請求項４】
前記遺伝子構築物は、融合タンパク質のドメインの１つとしての前記ＩＲＦファミリーのメンバーおよび該融合タンパク質の別のドメインとしての外来タンパク質を含む融合タンパク質としての前記ＩＲＦファミリーのメンバーをコードし、前記融合タンパク質の活性は、化学的または物理的手段によりスイッチを切り換えられ得る１つまたは複数の先行の請求項で特定された使用。
【請求項５】
前記遺伝子構築物は、ＩＲＦ−１／ｈＥＲ融合タンパク質の前記発現をコードし、該融合タンパク質の活性は、エストロゲンまたは抗エストロゲン活性を有する化合物により制御され得る１つまたは複数の先行の請求項で特定された使用。
【請求項６】
前記遺伝子構築物または前記ポリヌクレオチドは、哺乳類細胞中への移入のための生成物として、特にウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクターとして提供される１つまたは複数の先行の請求項で特定された使用。
【請求項７】
前記発現は、化学的または物理的活性化によりスイッチを入れられ得る１つまたは複数の先行の請求項で特定された使用。
【請求項８】
前記発現は、加熱によりまたは放射線照射によりスイッチを入れられ得る請求項７記載の使用。
【請求項９】
前記発現は、調節可能プロモーターによりスイッチを入れられ得る請求項７および／または８記載の使用。
【請求項１０】
前記発現は、外的刺激により、特にテトラサイクリンによりスイッチを切り換えられ得る請求項９記載の使用。
【請求項１１】
１つまたは複数の先行の請求項で特定された遺伝子構築物またはポリヌクレオチドを、ウイルス、細菌、真菌および寄生生物起源、あるいは腫瘍細胞由来の１つまたは複数の抗原コード遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の抗原と一緒に含むワクチン。
【請求項１２】
前記遺伝子構築物またはポリヌクレオチドおよび前記抗原コード配列(単数または複数)は、複数の別個のベクター、すべての構成成分を提供するベクター、またはポリシストロン発現ユニットを用いて提供される請求項１１記載のワクチン。
【請求項１３】
前記遺伝子構築物またはポリヌクレオチドおよび前記抗原コード配列(単数または複数)は、ウイルスまたは細菌担体として提供される請求項１１および／または１２記載のワクチン。
【請求項１４】
腫瘍性、感染性および／または免疫疾患の治療、予防、防御的治療および／または予防免疫接種のための調製物の製造のための１つまたは複数の先行の請求項で特定された使用。
【請求項１５】
腫瘍性、感染性および／または免疫疾患の治療、予防、防御的治療および／または予防免疫接種のための、ＩＲＦファミリーのメンバーあるいは融合タンパク質の構成成分の１つとしての前記メンバーおよび該融合タンパク質の別の構成成分としての治療的に許容可能なタンパク質を有するかまたはそれらから成る融合タンパク質。
【請求項１６】
ＩＲＦ−１が前記融合タンパク質の構成成分の１つであり、および／またはｈＥＲが前記融合タンパク質の他の構成成分である請求項１５記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
腫瘍性、感染性および／または免疫疾患の治療、予防、防御的治療および／または予防免疫接種のための、ＩＲＦファミリーのメンバーあるいは融合タンパク質の構成成分の１つとしての前記メンバーおよび該融合タンパク質の別の構成成分としての治療的に許容可能なタンパク質を有するかまたはそれらからなる融合タンパク質からなるかあるいは含む予防的および／または治療的組成物。
【請求項１８】
ＩＲＦ−１が融合タンパク質の構成成分の１つであり、および／またはｈＥＲが前記構成成分の他の構成成分である請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＩＲＦファミリーのメンバーの発現のための請求項１ないし１０のうちの１つまたは複数に規定される遺伝子構築物またはポリヌクレオチドがｅｘ  ｖｉｖｏでチャージされたヒト細胞。
【請求項２０】
遺伝子移入、物理的形質導入、特に電気穿孔、化学的形質導入またはウイルス形質導入によりチャージされた請求項１９記載のヒト細胞。
【請求項２１】
自系または同種異系細胞である請求項１９および／または２０記載のヒト細胞。
【請求項２２】
腫瘍細胞、特に癌細胞、好ましくは肝細胞癌細胞、肉腫細胞または造血系由来の腫瘍である請求項１９ないし２１のうちの１つまたは複数に記載のヒト細胞。
【請求項２３】
腫瘍性、感染性および／または免疫疾患に対する治療、予防、防御的治療および／または予防免疫接種のための請求項１９ないし２２のうちの１つまたは複数に記載のヒト細胞。
【請求項２４】
請求項１１ないし１３のうちの１つまたは複数に記載の遺伝子を用いて請求項２０記載の遺伝子移入を施されたヒト抗原提示細胞(ＡＰＣ)。
【請求項２５】
ＩＲＦファミリーの前記メンバーの活性レベルは、インターフェロン−βにより誘起されるＩＲＦ−１のレベルより高い請求項１９ないし２４のうちの１つまたは複数に記載のヒト細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍を治療する方法の開発に関する。本方法は、ＩＲＦ−１、特にβ−エストラジオールにより不可逆的に活性化可能であるＩＲＦ−１／ヒトエストロゲン受容体融合タンパク質の活性化に基づいている。
【０００２】
本明細書中で用いられる略語：
ＡＦＰ＝αフェトプロテイン
ｃ−Ｈａ−ｒａｓ＝ｒａｓ癌遺伝子
ｃ−ｍｙｃ＝ｍｙｃ癌遺伝子
ＣＴＬ＝細胞傷害性Ｔリンパ球
Ｅ２＝β−エストラジオール
ＦＣＳ＝ウシ胎児血清
ｆｏｓＢ＝転写因子ｆｏｓＢ
ＨＣＣ＝肝細胞癌細胞
ＨＥＲ１＝ＥＧＦ受容体
ＩＣＥ＝カスパーゼ
ＩＬ−１５＝インターロイキン−１５
ｉＮＯＳ＝誘導ＮＯシンターゼ
ＩＳＧ＝インターフェロン刺激遺伝子
ＩＳＧＦ３＝ＩＲＦ−１関連サブユニット
ＩＳＲＥ＝インターフェロン刺激応答要素
ＬＭＰ２＝タンパク質プロセシング因子
ｍＡＦＰ＝ネズミαフェトプロテイン
ＭＥＣＬ１＝多触媒性エンドペプチダーゼ複合体１
ＭＨＣ＝主要組織適合性複合体
ＮＫ細胞＝ナチュラルキラー細胞
ＯＡＳＥ＝２’，５’−オリゴ(Ａ)シンテターゼ
ＰＫＲ＝プロテインキナーゼＲ
ｒａｓ誘導＝ｒａｓタンパク質の誘導
ＴＡＰ−１＝タンパク質プロセシング因子
ＴＨ１＝１型Ｔヘルパー細胞
【０００３】
詳細な書誌情報を有する引用参考文献の完全一覧を、本明細書の末尾に示す。
【０００４】
肝細胞癌(ＨＣＣ)は、世界中の全ての悪性疾患の中で第五位の発生頻度であって、１９９０年の新症例数は４３７，０００と概算されている（１）。種々の非外科的治療法が開発され、外科技法は大いに改良されてきたが、これらの療法の中で、ＨＣＣ患者の非常に不十分な予後を有意に改善したものはない。全体的な５年生存率は全世界で２％に過ぎず（２）、したがってＨＣＣのための新規の遺伝子および免疫療法戦略が開発されつつある。当該発明者等は、腫瘍の治療のための腫瘍サプレッサーおよび免疫モジュレーターとしてのインターフェロン調節因子−１(ＩＲＦ−１)の広範な役割を用いようと試みた（３）。本発明者等は、マウスにおける免疫応答性同系ＨＣＣ腫瘍モデルおよび免疫不全マウスにおける試験のための別の腫瘍細胞系を用いた。
【０００５】
ＩＲＦ−１発現は多数のインターフェロン刺激遺伝子(ＩＳＧ)の誘導をもたらし(４〜６)、それにより組織適合性抗原（７）および抗ウイルス状態（５、８）の誘導を含めた通常のＩＦＮ−機能を誘導する。ＩＲＦ−１遺伝子はそれ自体、ＩＦＮにより誘導可能であるため、それはＩＦＮ媒介性細胞応答に関与され得ることが示唆された（５、９、１０）。しかしながら機能的ＩＲＦ−１遺伝子を欠くマウスおよび細胞では、典型的ＩＳＧ（例えば９〜２７、１〜８、ＰＫＲ）のＩＦＮ誘導性誘導は影響を受けない（８、１１〜１３）。したがってＩＲＦ−１は、ＩＳＧ−プロモーターをＩＲＦ−１関連サブユニットＩＳＧＦ３で結合するＩＳＧＦ−３によりＩＳＧのＩＦＮ特異的誘導を刺激すると思われる（１４）。これらのマウスにおける特異的変更は、ＩＦＮ−βに対する応答においてｉＮＯＳ(誘導可能ＮＯシンターゼ)誘導を欠くことである（１５）。
【０００６】
ＩＲＦ−１は、ＤＮＡ結合およびトランス活性化により抗増殖作用を発揮する（４）。成長抑制作用を発揮する複数の遺伝子を誘導することが既知である。それらの例としては、リシルオキシダーゼ（１６）、ＰＫＲ（１７）、２’−５’ＯＡＳＥ（１８）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（１９）およびＩＩ型アンギオテンシン受容体（２０）がある。繊維芽細胞および上皮起源の確立された細胞系では、ＩＲＦ−１はアポトーシスの兆候を伴わずに細胞増殖停止をもたらす（２１）。しかしながらｒａｓ誘導性アポトーシスに必要とされる腫瘍サプレッサーｐ５３の活性（２２、２３）と同様に、ＩＲＦ−１は癌遺伝子依存性アポトーシスを発揮し得る。当該発明者等は、ＩＲＦ−１により成長抑制される３Ｔ３細胞が条件付ＨＥＲ１癌遺伝子活性化後にアポトーシスを受けることを示した（２４）。実際、ＩＣＥのようなある種のカスパーゼ遺伝子のプロモーター領域はＩＳＲＥ様配列を含有する（２５）。これらの遺伝子は、ＩＲＦ−１の標的であり得る（２６）。
【０００７】
ＩＲＦ−１は、腫瘍サプレッサーとして確認された（４、１７、２４、２７）。ヒトにおけるＩＲＦ−１遺伝子座の染色体欠失は、脊髄形成異常および））ある種の白血病に関連する（２８）。ＩＲＦ−遺伝子における突然変異を有さない一次胚繊維芽細胞は、単一癌遺伝子(ｃ−Ｈａ−ｒａｓ)の発現による形質転換を受け易い。これらのＩＲＦ−１−／−細胞は、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ癌遺伝子発現および血清飢餓時にアポトーシスを受けないが、一方、ＩＲＦ−１遺伝子を保有する野生型細胞はプログラムされた細胞死を受ける（２１）。ＩＲＦ−１発現はまた、ｃ−ｍｙｃおよびｆｏｓＢ癌遺伝子により発揮される腫瘍原性表現型を復帰させる（２９）。ｃ−Ｈａ−ｒａｓおよびＩＲＦ−１を欠くマウスはより高率の腫瘍原性を示すことをさらなるデータは示した（３０）。
【０００８】
腫瘍サプレッサーとしてのＩＲＦ−１のｉｎ  ｖｉｖｏでの作用は、複雑である。細胞の種類によって、ＩＲＦ−１は成長阻害、アポトーシスを誘導し、細胞外マトリクスならびに免疫調節機能に影響を及ぼす。ＩＲＦ−１は、多数の免疫調節作用、例えばＭＨＣクラスＩ（３１、３２）、ｉＮＯＳ（１５）、ＩＦＮ−β（１１）転写を誘導し、ＩＬ−１５の適切な発現にも必要である（３３）。ＩＲＦ−１の一過性発現は、ＩＦＮ−β遺伝子の活性化をもたらす（９、３４、３５）。ＩＲＦ−１ノックアウト細胞を用いた試験は、ＩＲＦ−１がＮＫ細胞の分化および機能に関与し（３３、３６）、ＴＨ１型のＴヘルパー細胞の生成、ならびにＤＮＡ損傷に関与することを実証する（２６、３７）。ＩＲＦ−１はさらに、ＬＭＰ２、ＴＡＰ−１およびＭＥＣＬ１の転写的誘導（３８、３９）ならびにＭＨＣクラスＩＩの誘導（７、４０）による抗原提示の上向き調節に関与する。これらの事実は、ＩＲＦ−１が抗原の提示のための補刺激因子として作用し得ることを示唆する。
【発明の開示】
【０００９】
本発明の目的は、腫瘍に対する療法的アプローチに関するＩＲＦ−１の効能を実証することであった。本報告は、β−エストラジオール(Ｅ２)の存在下で活性になるＩＲＦ−１／ヒトエストロゲン受容体融合タンパク質をコードするプラスミドおよびネズミ細胞系の構築（４）、およびこれらの細胞系のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの表現型の詳細な特徴付けを詳述する。さらに本発明者等は、免疫応答性および非応答性マウスを用いたｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖に対するこの活性化可能ＩＲＦ−１系の防御的および治療的能力を記載し、腫瘍に対するＴ細胞応答を特徴付け、かつ、ＨＣＣ特異的自己分化抗原マウスα−フェトプロテイン(ＡＦＰ)に対する免疫学的耐性（４１）がこのアプローチにより破壊され得ることを実証する。最後に、本発明者等の結果は、ＩＲＦ−１が、直接的抗腫瘍成長作用および腫瘍の免疫細胞認識強化の両方によりその抗腫瘍作用を媒介することを実証する。
【００１０】
本発明の問題は、腫瘍性、感染性および／または免疫疾患に対する治療、予防、防御的治療および／または予防免疫接種のための、遺伝子構築物またはポリヌクレオチドの使用であり、それによりＩＲＦファミリーのメンバーであるその遺伝子産物の活性が活性化されるようになり得る使用によって解決される。本発明の特徴的な実施形態は、上述した使用であって、遺伝子産物としてのＩＲＦファミリーのメンバーは、野生型ＩＲＦ−１，合成ＩＲＦ−１、免疫学的活性ＩＲＦ−１変異体、ＩＲＦ−１以外のＩＲＦファミリーの野生型メンバー、ＩＲＦ−１以外のＩＲＦファミリーの合成メンバー、ＩＲＦ−１以外のＩＲＦファミリーのメンバーの免疫学的活性変異体、およびそれらの融合タンパク質から成る群から選択される使用を含む。本発明は、哺乳類、特にヒトの治療のための上述した使用に関する。
【００１１】
さらなる実施形態は、上述した使用であって、遺伝子構築物は、融合タンパク質のドメインの１つとしてのメンバーおよび融合タンパク質の別のドメインとしての外来タンパク質を含む融合タンパク質としてのＩＲＦファミリーのメンバーをコードし、融合タンパク質の活性は、化学的または物理的手段によりスイッチを切り換えられ得、特に、遺伝子構築物は、ＩＲＦ−１／ｈＥＲ融合タンパク質の発現をコードし、その活性がエストロゲンまたは抗エストロゲン活性を有する化合物により制御され得る使用を含む。
【００１２】
さらなる実施形態は、上述した使用であって、遺伝子構築物またはポリヌクレオチドは、哺乳類細胞中への移入のための生成物として、特にウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクターとして提供される使用を含む。
【００１３】
本発明の特徴的な態様は、化学的または物理的活性化により、例えば、加熱または放射線照射により、スイッチを入れられ得る上述したタンパク質の発現より成る。さらなる特徴的な態様は、上記タンパク質の発現であって、発現は、調節可能プロモーターにより、例えば、外的刺激、特にテトラサイクリンにより、スイッチを切り替えられ得る発現により成る。
【００１４】
本発明の有利な実施形態は、先行の請求項のうちの１つまたは複数に記載される遺伝子構築物またはポリヌクレオチドを、ウイルス、細菌、真菌および寄生生物起源、あるいは腫瘍細胞由来の１つまたは複数の抗原コード遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の抗原と一緒に含むワクチンから成る。本実施形態の利点は、腫瘍細胞の使用を避けることにから成る。ワクチン接種は、遺伝子構築物またはポリヌクレオチドを単に施すことによって実行することができ、抗原コード配列(単数または複数)は別個のベクターを用いて提供され、またワクチン接種は、すべての構成成分を提供するベクターを施すことにより、またはポリシストロン発現ユニットを施すことにより実行することができる。さらなる有利な実施形態は、上述したワクチンであって、遺伝子構築物またはポリヌクレオチドおよび抗原コード配列(単数または複数)がウイルスまたは細菌担体として提供されるワクチンを含む。
【００１５】
本発明の他の実施形態は、腫瘍性、感染性および／または免疫疾患の治療、予防、防御的治療および／または予防免疫接種のための調製物の製造のための上述した使用から成る。
【００１６】
さらに、他の実施形態は、腫瘍性、感染性および／または免疫疾患の治療、予防、防御的治療および／または予防免疫接種のためのＩＲＦファミリーのメンバーあるいは融合タンパク質の構成成分の１つとしての上記メンバーおよび融合タンパク質の別の構成成分としての治療的に許容可能なタンパク質を有するかまたはそれらから成る融合タンパク質であって、特に、ＩＲＦ−１がその構成成分の１つであり、および／またはｈＥＲが融合タンパク質の他の構成成分である融合タンパク質に関する。
【００１７】
本発明は、腫瘍性、感染性および／または免疫疾患の治療、予防、防御的治療および／または予防免疫接種のためのＩＲＦファミリーのメンバーあるいは融合タンパク質の構成成分の１つとしての上記メンバーおよび融合タンパク質の別の構成成分としての治療的に許容可能なタンパク質を有するかまたはそれらからなる融合タンパク質からなるかまたは含む予防的および／または治療的組成物であって、特に、ＩＲＦ−１が融合タンパク質の構成成分の１つであり、および／またはｈＥＲがその構成成分のその他の構成成分である、予防的および／または治療的組成物をさらに含む。
【００１８】
さらに、本発明は、ＩＲＦファミリーのメンバーの発現のための上述した遺伝子構築物またはポリヌクレオチドがｅｘ  ｖｉｖｏでチャージ（charge）されたヒト細胞、好ましくは、遺伝子移入、物理的形質導入、より好ましくは電気穿孔、化学的形質導入またはウイルス形質導入によりチャージされたヒト細胞に関する。上述したヒト細胞は、自系または同種異系細胞であり得る。さらに、上述したヒト細胞は、腫瘍細胞、特に癌細胞、より好ましくは肝細胞癌細胞、肉腫細胞または造血系由来の腫瘍であり得る。付加的に、上述したヒト細胞は、腫瘍性、感染性および／または免疫疾患に対する治療、予防、防御的治療および／または予防免疫接種に適する。
【００１９】
本発明の好ましい有益な実施形態は、予防接種の実施形態に記述された１つまたは複数の遺伝子を用いて、遺伝子移入、物理的形質導入、特に電気穿孔、化学的形質導入またはウイルス形質導入を施されたヒト抗原提示細胞(ＡＰＣ)に関する。
【００２０】
最後に本発明は、ＩＲＦファミリーのメンバーの活性レベルがインターフェロン−βにより誘導されるＩＲＦ−１のレベルより高い上記のようなヒト細胞の実施形態を含有する。
【００２１】
本発明の目的、その種々の特徴ならびに本発明それ自体は、添付の図／図面を参照しながら読むと、以下の説明からさらに十分に理解され得る。
【００２２】
以下において、実施例および図面を参照しながら本発明をより詳細に開示する。しかしながら記載される特定の形態または好ましい実施形態は、すべての点で、本発明を説明するためであって、本発明を制限するものではなく、本発明の範囲は以下の説明ではなく添付の特許請求の範囲により指示され、したがって特許請求の範囲と均等の意味および範囲内であるすべての変更がその中に包含されるよう意図される。
【００２３】
材料および方法
ベクター構築：
ｐＢＴＴＡＨｉｓ：ヒスチジジノール遺伝子を含有するＢｂｒＰＩ／ＮｏｔＩ断片をｐＤＡＦ２ＨＩＳから単離し（Spitzer et al., 1998）、対応する制限プラスミドｐＲＢＴｔＴＡ中に挿入した（Unsinger et al., 2001）。その結果生じたプラスミドをｐＢＴＴＡＨｉｓと呼ぶ。Ｈｅｐａ１〜６細胞の安定的トランスフェクションのために、発現構築物ＩＲＦ−１−ｈＥＲ（４）（ｐＭＴ７ＲＦ−１−ｈＥＲ）およびプロマイシン耐性付与プラスミド（４２）を本発明者等は用いた。ｐＨＢＴＭＲＳ：三シストロン発現カセットとしてｃ−ｍｙｃ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓおよびＳＥＡＰ遺伝子を含有するＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ断片を、ｐＲＢＴからの二方向性テトラサイクリン応答可能プロモーターの３’末端上に挿入した（Unsinger et al., 2001）。ヒロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼをＰＣＲ増幅し、ｐＲＢＴＭＲＳ中の二方向性テトラサイクリン応答可能プロモーターからのＰｍｅＩ  ５’を介して挿入し、ｐＨＢＴＭＲＳを生じた（Kroger, 1999）。
【００２４】
ｐＣＭＶＩＨＥＧ：ＩＲＦ−１ｈＥＲ融合タンパク質遺伝子およびポリオＩＲＥＳ配列を含有するＳｐｅＩ／ＥｃｏＲＩ断片をＣＭＶプロモーターおよびｅＧＦＰ遺伝子間に挿入して、二シストロンｍＲＮＡ上のＩＲＦ−１ｈＥＲおよびｅＧＥＰを発現するプラスミドを生じた。ｐＣＭＶＩＨ：ポリオＩＲＥＳおよびｅＧＦＰをコードする配列を、ＰｍａＣＩ／ＨｐａＩを用いたｐＣＭＶＩＨＥＧの消化および再連結により排除した。ｐＬＴＲ−ＴＢＴＩＨＥＧ：ＩＲＦ−１−ｈＥＲおよびｅＧＦＰに関する二シストロン発現カセットを含有するＰｍｅＩ／ＮｏｔＩ断片を、対応して制限されたＬＴＲ−ＴＨＴＧ中に挿入し（Unsinger et al., 2002）、ｐＬＴＲ−ＴＢＴＩＨＥＧを生じた。
【００２５】
アデノウイルスコスミドの調製：
Ａｄ−ＩＨ、Ａｄ−ＩＨＥＧ、Ａｄ−ＩＨＥＧｉｎｖ、Ａｄ−ＬＴＲ−ＴＢＴＩＨＥＧ、Ａｄ−ＬＴＲ−ＴＢＴＩＨＥＧｉｎｖ：組換えアデノウイルスを、大腸菌（E. coli）中でのクローニングにより組換えアデノウイルスゲノムの直接アセンブリーを可能にするコスミドクローニング手順を用いて構築した。コスミドベクターｐＡｄｃｏｓ４５（Unsinger et al., 2002）をＥ１領域の単一クローニング部位でＸｂａＩを用いて消化し、充填した。以下のカセットをこの部位に挿入した：ＰｍｅＩ／ＳｗａＩ断片としてのｐＣＭＶＩＨＥＧのＣＭＶＩＨＥＧカセット、ＢｓｒＢＩ／ＦｓｐＩ断片としてのｐＬＴＲ−ＴＢＴＩＨＥＧのＬＴＲ−ＴＢＴＩＨＥＧおよびＰｍｅ／ＳｗａＩ断片としてのｐＣＭＶＩＨからのＣＭＶＩＨカセット。ＤＮＡを連結し、パッケージング抽出物を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏでパッケージングした。大腸菌ＤＨ５α中への形質導入後に、アンピシリン耐性クローンを単離した。大腸菌中でのｉｎ  ｖｉｔｒｏパッケージングおよび増殖後に、Ａｄ−ＩＨ、Ａｄ−ＩＨＥＧ、Ａｄ−ＩＨＥＧｉｎｖ、Ａｄ−ＬＴＲ−ＴＢＴＩＨＥＧ、Ａｄ−ＬＴＲ−ＴＢＴＩＨＥＧｉｎｖのためのコスミド調製物を得た。制限分析は、予測された構造を確証した。
【００２６】
細胞培養および遺伝子形質導入：
ネズミ繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞(ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８)をダルベッコの変法イーグル培地(ＤＭＥＭ)中に保持し、Ｈｅｐａ１〜６細胞(ネズミＨ−２ｂ−制限ＨＣＣ細胞系；９２１１０３０５；動物細胞培養の欧州コレクション（European Collection of Animal Cell Cultures)）をＲＰＭＩ１６４０培地中で成長させ、２９３細胞（低継代でのヒト胚腎細胞；ミクロビックス（Microbix）ＰＤ−０２−０１）を最少必須培地(ＭＥＭ)中で培養した。培地に、１０％エストロゲン無含有熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミンペニシリン(１０Ｕ／ｍｌ)およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補充した。トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞を１２８Ｕ／ｍｌのハイグロマイシンＢ、８００μｇ／ｍｌのヒスチジノールまたは８００μｇ／ｍｌのＧ４１８を用いて選択した。Ｈｅｐａ１〜６細胞の選択のためには、１μｇ／ｍｌプロマイシンを用いた。
【００２７】
ｐＢＴＴＡＨｉｓ、ｐＨＢＴＭＲＳ、ｐＭＴ７ＩＲＨ−１−ｈＥＲおよびネオマイシン耐性付与プラスミドｐＡＧ６０を用いて、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を安定的に同時トランスフェクトした（Colbere et al., 1981）。Ｈｅｐａ１〜６細胞は、ＩＲＦ−１−ｈＥＲをコードする発現構築物（４）およびプロマイシン耐性付与プラスミド（４２）を用いて安定的に同時トランスフェクトした。トランスフェクタントを選択し、単一クローンを採取し展開させた。その後、ウエスタンブロットによりタンパク質発現に関してクローンをスクリーニングした。
【００２８】
組換えアデノウイルスの産生
組換えアデノウイルスの産生のために、リン酸カルシウム共沈殿を用いて、環状アデノウイルスコスミドＤＮＡ２０μｇを２９３ヘルパー細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクション後１０〜１４日目に、この時点でアデノウイルスプラークの形成が明白になった。ウイルスを収集し、２９３細胞を再感染させた。細胞変性作用が観察された後、ウイルス粒子を収集し、２９３細胞の感染により力価を確定した。ＤＮＡ（Graham et al., 1991）は、予期された構造を確認するものであった。すなわち、コスミドＤＮＡからのウイルス配列の精確な切除を制限分析により制御した。アデノウイルス感染のために、細胞をＭＥＭ培地中に播種した。翌日、１００(Ｈｅｐａ１〜６細胞)または２（２９３細胞）のＭＯＩを用いて、細胞を感染させた。２％ＦＣＳを補充したＰＢＳ  １ｍｌ中で組換えアデノウイルスを希釈した。アデノウイルス感染の１時間後に、５％ＦＣＳを補充した培地中で細胞をさらに培養した。
【００２９】
ＩＲＦ−１−ｈＥＲ融合タンパク質中のＩＲＦ−１の活性化のために、最終濃度が１μＭに達するまでＥ２（SERVA, Frankfurt, Germany）を細胞培地に添加した。
【００３０】
ウエスタンブロッティング。  全細胞抽出物から得られるイムノブロットを、ヒトエストロゲン受容体（ＨＣ−３０、Santa Crutz Biotechnology, USA）のホルモン結合ドメインに対して誘導される抗体を用いてプローブし、メーカーの使用説明書に従ってＥＣＬ（Amersham, Arlington Heights, IL, USA）により可視化した。
【００３１】
ＩＦＮ試験。  マウスＬ９２９細胞（４３）を用いた抗ウイルスアッセイにより、細胞培養上清中のインターフェロン濃度を確定した。抗ウイルス活性の特異性を確証するために、試験細胞への添加前に、マウスＩＦＮ−βに対して向けられる中和モノクローナル抗体を上清に添加した。
【００３２】
細胞成長の測定。  細胞増殖の確定のために、２×１０３細胞／ウェルをマイクロタイタープレート中に播種して、段階希釈（１：１）を実施し、数個の別々の測定点を可能にした。細胞を指示濃度のβ−エストラジオールで処置した。メーカーの指示に従ってＷＳＴキット（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）を用いて、細胞成長を測定した。１０％未満の偏差を生じる三重反復試験の平均値をプロットした。
【００３３】
足場非依存性成長に関するアッセイ。  軟寒天中に懸濁した細胞のコロニー形成効率を評価することにより、足場非依存性増殖能力を確定した。０．６％下張り寒天（underlay agar）５０μｌで被覆したマイクロタイタープレート中の０．３％上塗り寒天（overlay agar）５０μｌ中に、１×１０３細胞を播種した。誘導培地を上部に添加した（５０μｌ／ウェル）。平板培養後３週間目に、コロニーを計数した。
【００３４】
マウス。  雄Ｃ５７Ｌ／Ｊ(Ｈ−２ｂ)マウスをフライブルク大学病院（University Hospital Freiburg）の動物施設で飼育して、１０〜２５週齢で使用した。
【００３５】
ヌードマウス実験
雄６〜８週齢ＮＭＲＩヌードマウス（Harlan Winkelmann, Borchen, Germany）を、ドイツバイオテクノロジー研究センター（German Research Centre for Biotechnology）の動物施設のＳＰＦユニットで飼育した。マウスを各群５匹の２つの実験群に分けた。０．２ｍｌのＰＢＳ  ＮＩＨ３Ｔ３ＴＡ／ＭＲ／ＩＨ細胞中の１×１０６細胞をマウスの側腹部に皮下注射した。群を以下のように処置した：群１：未処置(ｎ＝５)；群２：１．５ｍｇのＥ２を２日毎にｉ．ｐ．(ｎ＝４)。腫瘍容積を、カリパスを用いて週３回測定し、記録した。データは腫瘍容積の平均値として示す。
【００３６】
腫瘍モデル。  同系ホスト中で確実な成長を示すので、Ｃ５７Ｌ／ＪマウスにおけるＨｅｐａ１〜６腫瘍モデル（４４）を選択した。Ｈｅｐａ１〜６細胞は、Ｃ５７Ｌマウスに生じたＢＷ７７５６マウス肝癌の派生物である。ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ発現は、Ｃ５７ＬおよびＣ５７Ｌ／Ｊマウス間で同一であり、Ｈｅｐａ１〜６ＨＣＣはＡＦＰ発現により特徴付けられる。マウスの右側腹部に１００μｌの血清無含有ＭＥＭ培地中で注射される１×１０７または５×１０６個のＨｅｐａ１〜６細胞を用いて、１００％のマウスにおけるＨｅｐａ１〜６ネズミＨＣＣ細胞の確実な腫瘍成長が達成されることが実証され得た。６日後、腫瘍が可視的になり、平均で１８日後に約２０００mm３のサイズに達した。この腫瘍サイズを本発明における終点として用いて、その後、マウスを屠殺した。腫瘍発生率および容積を、カリパスを用いて２日毎に評価した。データは、平均容積＋／−ＳＥとして示す。
【００３７】
フローサイトメトリー。  抗マウスＨ−２Ｋｂ／Ｈ−２Ｄｂおよび抗マウスＣＤ８０特異的抗体（それぞれクローン２８−８−６および０１９４０Ｂ）を、およびその後のＦＩＴＣ−標識抗マウス（クローン０２０１４Ｄ）またはＦＩＴＣ−標識抗ラット（クローン１００９４Ｄ）抗体それぞれを用いたＦＡＣＳ分析により、Ｈｅｐａ１〜６およびＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ細胞中でのＭＨＣクラスＩおよびＣＤ８０発現を調べた。さらに、ＰＥ−またはＦＩＴＣ−標識抗体(抗体はすべて、PharMingen, San Diego, CA, USAから得られた)により、ＣＤ５４（クローン０１５４４Ｄ）、Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ（クローン０６３５５Ａ）およびＣＤ８６（クローン０９２７４）の発現を確定した。
【００３８】
組換えワクシニアウイルスの生成。  ＣＴＬ応答を試験するために、ＡＦＰ発現およびｐＳｃ１１（空ベクター陰性対照）組換えワクシニアウイルスを前に記載された（４４）ように生成した。
【００３９】
細胞傷害性アッセイ。  腫瘍攻撃または対照マウスから得られた脾臓細胞を懸濁し、２４ウェルプレート中でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激の６日後に、細胞傷害活性に関して脾臓細胞を分析した。１×１０７の野生型Ｈｅｐａ１〜６細胞を用いて、または特異性に関する陰性対照として、同系ルイス肺癌細胞（３ＬＬ）を用いて(ともに８０００ｒａｄで照射)、４×１０７の腫瘍で初回抗原刺激した脾臓細胞をインキュベートすることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激を実施した。ＡＦＰ特異的免疫応答を評価するために、未処置同系ドナーマウスの脾臓細胞を用いて、腫瘍攻撃または対照マウス由来の脾臓細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激した。未処置同系ドナーマウスの脾臓細胞は、感染多重度（ＭＯＩ）５で、ＵＶ−不活性化(３００ｍＪ)ｒＶＶ−ＡＦＰにより、または特異性に関する陰性対照として、ｒＶＶ−ｐＳＣ１１を感染させ、次に２０Ｇｙ(２０００ｒａｄ)で照射して刺激細胞の増殖を防止した。その後、６時間５１Ｃｒ放出アッセイを実施した。標的細胞として、ＡＦＰ発現同系Ｈｅｐａ１〜６細胞およびＡＦＰ陰性同系ルイス肺癌細胞を用いた。結果は、次式により表した：溶解％＝(実験的放出−自発性放出)／(最大放出−自発性放出)。実験的放出は、エフェクター細胞の存在下で標的細胞により放出される平均数／分を表す。総放出は、５％トリトンＸ−１００による標的細胞の全体的溶解後に放出された放射能を表す。自発性放出は、標的細胞のみに由来する培地中に存在する放射能を表す。Ｈｅｐａ１〜６腫瘍またはｍＡＦＰ特異的溶解は、Ｈｅｐａ１〜６標的に対する溶解値から３ＬＬに対する溶解値を差し引くことにより示された。
【００４０】
ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ。  多重スクリーン−ＨＡ９６ウェルフィルタープレートを、４℃で一晩、４μｇ／ｍｌのラット抗マウスＩＦＮ−γまたはラット抗マウスＩＬ−４抗体（PharMingen, San Diego, CA, USA。それぞれクローンＲ４６Ａ２または１８１９１Ａ）で被覆した。腫瘍攻撃または非攻撃マウス由来の脾臓細胞(１×１０５／ウェル)を、２００μｌの培地中の１×１０４照射刺激細胞(Ｈｅｐａ１〜６、３ＬＬまたはｒＶＶ−ＡＦＰ感染脾臓細胞)／ウェルを用いて２０時間、三重反復試験で培養した。培養後、細胞を洗浄し、２μｇ／ｍｌのビオチン化ラット抗マウスＩＦＮ−γまたはＩＬ−４抗体（PharMingen, San Diego, CA, USA。それぞれクローンＸＭＧ１．２または１８０４２Ｄ）を添加し、プレートを室温で３時間インキュベートした。プレートを再び洗浄し、ストレプタビジン−アルカリホスファターゼポリマー（Mabtech, Koln, Germany）の１：１０００希釈液を用いて室温で３０分間インキュベートし、次に、ＡＬＰ接合基質溶液（BCIP/NBT, BioRad, Richmond, USA）で展開した。各ウェル中のスポットを顕微鏡下で計数し、その値を、培養開始時に各ウェルに添加された脾臓細胞数と比較したスポット形成細胞の数として表される。特異性に関する対照として、腫瘍攻撃マウスの脾臓細胞および異なる照射刺激細胞を単独で培養した。
【００４１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍実験の実験計画
腫瘍防御試験。  Ｃ５７Ｌ／Ｊマウスの右側腹部に１×１０７Ｈｅｐａ１〜６（群１および２）またはＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ（群３および４）細胞を接種した。群５にはいかなる腫瘍も接種しなかった。それぞれの群を以下のように処置した：
【００４２】
【表１】
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【００４３】
再攻撃に対する防御。  ナイーブＣ５７Ｌ／ＪマウスまたはＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ腫瘍成長に対して防御されたことのあるＥ２処置動物を、Ｅ２処置停止後１１日目(初期腫瘍接種後２８日目)に、１×１０７個の野生型Ｈｅｐａ１〜６(ｎ＝３)またはＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ(ｎ＝３)腫瘍細胞を用いて再攻撃した。これらのマウスが任意のさらなるＥ２処置を受けなかったことは重要である。
【００４４】
腫瘍療法。  Ｃ５７Ｌ／Ｊマウスの右側腹部に１×１０７個のＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ（群１および２）細胞を接種した。両群とも、いかなるＥ２処置も受けなかった。１９日目に、腫瘍は両群において約２０００ｍｍ３のサイズに達した。１９日目に開始して、群２(ｎ＝６)には、２日毎に２８日目まで、１．５ｍｇのβ−エストラジオールをｉ．ｐ．注射した。その後、Ｅ２処置を２匹のマウスにおいては再び中止したが、一方、残りの４匹はＥ２療法を維持した。群１(ｎ＝３)のマウスはＥ２処置を受けなかったが、その後、腫瘍が１０，０００ｍｍ３に達した場合に屠殺した。
【００４５】
ｉｎ  ｖｉｖｏモノクローナル抗体除去。  精製ハイブリドーマ上清のｉ．ｐ．注射により、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞亜集団を枯渇させた。総量１ｍｇ／マウス／注射の抗ＣＤ８（クローンＹＴＳ１６９）または抗ＣＤ４（クローンＹＴＳ１９１．１）（４５、４６）を、ＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ腫瘍接種の５日前、３日前および１日前、ならびにその後５日毎に注射した。種々の群を以下のように処置した：
【００４６】
【表２】
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【００４７】
統計学的分析。  データはすべて、ウィルコクソンの符号付順位検定により分析した。０．０５未満の両面ｐ値は、統計学的に有意であると考えられた。腫瘍出現および２５００ｍｍ３への成長をカプラン−マイアー法により算定し、各群に関する平均の標準偏差として示して、免疫接種マウスと対照マウス間の差異をマンテル−ヘンツェル検定により算定した。
【００４８】
結果
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析
ＩＲＦ−１はＨＣＣ細胞系Ｈｅｐａ１〜６の細胞成長を阻害する
ＩＲＦ−１の構成的発現は、いくつかの細胞系に強力な細胞増殖阻害を強いる（４、２４、４０）。これは、異種ＩＲＦ−１の非常に低い、しばしば不安定な発現に関して選択される安定トランスフェクタントを生じる。ＨＣＣ細胞系Ｈｅｐａ１〜６の成長阻害剤としてのＩＲＦ−１の活性を確定するために、本発明者等は、したがって、条件付活性ＩＲＦ−１ｈＥＲ融合タンパク質を用いた。ホルモン刺激の非存在下で、構成的発現キメラタンパク質は不活性であるが、タンパク質のｈＥＲ部分とのＥ２の結合時に、活性配座に変わり得ることが実証された。ＩＲＦ−１−ｈＥＲは、Ｈｅｐａ１〜６細胞中で安定的にトランスフェクトされた。異なるレベルのＩＲＦ−１ｈＥＲ発現がトランスフェクタントで観察され(図１Ａ、上パネル)、アクチン発現（図１Ａ、下パネル）に正規化された。異なる強度のＩＲＦ−１ｈＥＲ発現を有する３つの細胞クローンを選択した(ｃ４、ｃ９、ｃ２２)。これらのクローンの細胞成長を、ＩＲＦ−１活性化後７日目に確定した。図１Ｂに示したように、３つの細胞クローン由来の細胞は、増殖阻害に関してＩＲＦ−１活性に感受性であった。増殖阻害の程度は、異なる細胞クローン間で４０〜８０％変化し、異なる発現量のＩＲＦ−１と相関した。ＩＲＦ−１−ｈＥＲを発現しない野生型Ｈｅｐａ１〜６細胞を、対照として用いた。非トランスフェクト細胞系は細胞成長の変更を伴ってβ−エストラジオールに対して応答しなかった。これは、３つの細胞クローンすべてが活性化可能ＩＲＦ−１を発現し、ＩＲＦ−１表現型の典型的成長阻害特性に応答したことを示す。しかしながらＨｅｐａ１〜６細胞の増殖阻害は、他の細胞系と比較した場合、非常に強力であるというわけではない（２４）ことに留意すべきである。細胞増殖の低減にもかかわらず、細胞はこの状態でかなりの時間培養され得た。さらにこれらの細胞は、β−エストラジオールによるＩＲＦ−１活性化時にアポトーシスのいかなる兆候も示さなかった。これは、亜二倍体ＤＮＡ（（４７）、データは示されていない）およびアネキシン染色(（４８）、データは示されていない)の実験により確証された。
【００４９】
活性化ＩＲＦ−１はＩＦＮ分泌を誘導する
ＩＦＮ−βの誘導は、ＩＲＦ−１活性化後に観察される典型的特性である。分泌ＩＦＮ−βの量は、ＩＲＦ−１活性の測定値とみなされ得る（１７）。ＩＦＮは免疫調節に関連があるため、抗ウイルスアッセイによりＩＦＮ−βの分泌を確定した(表１)。ＩＲＦ−１は、３つの細胞クローンすべてにおいて、β−エストラジオールにより活性化されることが示された。最高ＩＦＮ分泌は、クローン２２により示されたが、これは、ＩＲＦ−１発現の強度(図１Ａ)および増殖阻害(図１Ｂ)と一致する。ＩＦＮ−βに対して誘導される中和抗体を用いて、分泌抗ウイルス活性が専らＩＦＮ−βであることを本発明者等は確認するものであった。ＩＦＮは、細胞増殖を阻害することが既知である。しかしながらＨｅｐａ１〜６細胞クローンにより分泌されるＩＦＮ−βの量は、匹敵する量の組換えネズミＩＦＮ−βによる対照細胞の処置により確定されるように細胞成長に及ぼす観察された作用を媒介するのに十分でない(データは示されていない)。
【００５０】
ＩＲＦ−１活性化中の足場非依存性成長の低減
腫瘍原性細胞を非腫瘍原性細胞と区別する最も決定的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ特徴は、足場非依存性成長である。ＩＲＦ−１がｉｎ  ｖｉｔｒｏでのこのＨＣＣ細胞系の形質転換表現型を逆転するか否かを確定するために、不活性または活性ＩＲＦ−１の存在下で足場非依存性コロニーを形成するその能力を、本発明者等は試験した(図２)。非トランスフェクト腫瘍細胞クローンは、軟寒天中で良好に増殖した。ＩＲＦ−１ｈＥＲを発現しない形質転換野生型Ｈｅｐａ１〜６細胞系のコロニー形成は、β−エストラジオールにより影響されなかった。対照的に、軟寒天成長の能力は、異なる細胞クローン中では、活性化ＩＲＦ−１により有意に低減された。非トランスフェクト細胞と対照的に、ＩＲＦ−１ｈＥＲ保有細胞はより少ないが、しかしやや大きいコロニーを形成した。Ｅ２の存在下では、クローン２２は軟寒天中で最低量のコロニーを形成したが、これはＩＲＦ−１ｈＥＲ発現の強度と逆相関する。クローン９は、Ｅ２処置細胞を上回る最高比率の、非処置細胞からの軟寒天コロニー形成を示した。したがってクローンｃ９（以下で簡単にＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲと示す）を、さらなるｉｎ  ｖｉｔｒｏ特性化のために、かつｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍モデルのために用いた。
【００５１】
活性化ＩＲＦ−１ｈＥＲは免疫学的に関連がある細胞表面タンパク質発現を調整する
ＩＲＦ−１発現は、ＭＨＣ遺伝子の発現を増大することが既に示されている（７、３１）。ＦＡＣＳ分析により、−エストラジオールによるＩＲＦ−１活性化の前後の細胞表面におけるＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ５４、ＣＤ８０、およびＣＤ８６発現のレベルを、本発明者等は調べた。野生型Ｈｅｐａ１〜６およびＥ２未処置ＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０、およびＣＤ８６発現の欠如により特性化された。ＭＨＣクラスＩ(Ｈ−２Ｋｂ／Ｈ−２Ｄｂ)は低レベルで、ＣＤ５４は高レベルで発現された。ＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ細胞のＥ２処置はＨ−２Ｋｂ／Ｈ−２Ｄｂの強力な上向き調節を生じ、ＣＤ５４発現は依然として変化せず、ＭＨＣクラスＩＩ発現は弱く上向き調節された(図３)。ＣＤ８０およびＣＤ８６発現は、陰性のままであった(データは示されていない)。
【００５２】
ＩＲＦ−１のアデノウイルス媒介性発現はＨＣＣ細胞の強力なＩＦＮ−β分泌をもたらす
広範囲の細胞中にＩＲＦ−１を移入するために、かつｉｎ  ｖｉｖｏ形質導入のための送達系として、ＩＲＦ−１−ｈＥＲ融合タンパク質のためのｐＡｄｃｏｓ４５含有発現カセットに基づいたアデノウイルスベクターを構築した。ＩＲＦ−１−ｈＥＲのｃＤＮＡをアデノウイルスベクターｐＡｄｃｏｓ４５中に導入し、ウイルスを調製した。
【００５３】
Ｈｅｐａ１〜６細胞をｐＡｄ−１Ｈ、ｐＡｄ−ＩＨＥＧ、ｐＡｄ−ＬＴＲ−ＴＢＴＩＨＥＧおよびｐＡｄ−ＬＴＲ−ＴＢＴＩＨＥＧｉｎｖウイルスで感染させた(図４Ａ)。感染の４８時間後に、ウエスタンブロット分析によりＩＲＦ−１−ｈＥＲ発現を分析した。これらのアデノウイルスに感染した細胞中で、高レベルのＩＲＦ−１ｈＥＲ発現が見出された(図４Ｂ)。感染細胞のＥ２処置または偽処置後に、ＩＦＮ分泌を測定した。Ｅ２処置後にＩＲＦ−１  ｈＥＲ遺伝子を含有するアデノウイルスで感染させた細胞の培養上清中にＩＦＮを検出したが、これは、ＩＲＦ−１活性化のみがＩＦＮ分泌を誘導するが、感染自体では誘導しないことを示す（表２）。アデノウイルス性形質導入細胞における分泌ＩＦＮの量は、ＩＲＦ−１ｈＥＲ融合タンパク質を安定的に発現するトランスフェクタントより３．５〜６倍多かった。
【００５４】
ＩＲＦ−１は癌遺伝子性形質転換ＮＩＨ３Ｔ３細胞中で作用する
癌遺伝子性形質転換ＮＩＨ３Ｔ３細胞中のＩＲＦ−１の作用を調べた。癌遺伝子ｃ−ｍｙｃおよびｃ−Ｈａ−ｒａｓを条件付で発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いた。両癌遺伝子は、テトラサイクリン調節可能プロモーターの制御下で二シストロン的に発現された（Kroger, Dissertation, Universitat Braunschweig, 1999）。細胞は、ＩＲＦ−１−ｈＥＲ融合タンパク質コード構築物で安定的にトランスフェクトされた。この細胞系は、非形質転換ＮＩＨ３Ｔ３細胞中（ドキシサイクリンの存在下）での、ならびに細胞の形質転換状態（ドキシサイクリンの非存在下）でのＩＲＦ−１作用の研究を可能にする。ＩＲＦ−１のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗腫瘍活性を調べた：増殖に及ぼす影響、軟寒天成長、ならびにＥ２処置によるＩＲＦ−１ｈＥＲ活性化を伴うおよび伴わないＩＦＮ誘導を測定した。これは、非形質転換状態ならびに形質転換状態で行われた。Ｅ２およびドキシサイクリンを５日間添加した。Ｅ２の非存在下での形質転換細胞は細胞成長の強化を示すという事実にもかかわらず、活性化ＩＲＦ−１−ｈＥＲは、非形質転換細胞および形質転換細胞の両方で、細胞成長の顕著な低減を同程度にもたらした(表３)。
【００５５】
ＩＲＦ−１が細胞の形質転換表現型を逆転するか否かを確定するために、軟寒天中のコロニーの形成をアッセイした。非形質転換状態の細胞は、軟寒天中で成長しなかった。対照的に、ドキシサイクリン(形質転換状態)の非存在下では、細胞は良好に成長し、軟寒天クローンを形成した。軟寒天増殖の能力は、Ｅ２贈与によるＩＲＦ−１の活性化により完全に撤廃された(表３)。抗ウイルスアッセイにより確定した場合のＩＦＮ分泌は、ＩＲＦ−１活性の測定値とみなされた。Ｅ２処置によるＩＲＦ−１活性化は、非形質転換細胞および形質転換細胞において等価であると実証された(表３)。
【００５６】
ＩＲＦ−１活性化はヌードマウスにおける形質転換細胞の腫瘍成長を低減する
ＩＲＦ−１は癌遺伝子性形質転換ＮＩＨ３Ｔ３細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞形質転換を阻害したので、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍原性に及ぼすその作用を評価した。ＩＲＦ−１の考え得る抗腫瘍活性を立証するために、細胞をヌードマウスの側腹部に皮下注射した。腫瘍形成をアッセイした。形質転換細胞の注射は４週間以内に腫瘍形成をもたらし、移植された動物の１００％が６週間以内に腫瘍を発症した(図５)。マウスに形質転換細胞を接種し、Ｅ２で処置した場合、腫瘍成長の動態は劇的に変化した。１５００ｍｍ３までの腫瘍サイズに達したのは未処置動物の場合より４週間遅く、Ｅ２処置マウスの４０％が腫瘍を発症しなかった。これらの結果は、ＩＲＦ−１ｈＥＲ融合タンパク質の活性化が、ＴおよびＢ細胞を欠く動物の形質転換細胞における腫瘍原性の動態を延長するのに十分であることを実証する。
【００５７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ分析
ＩＲＦ−１活性化はＨＣＣ成長を阻害する
Ｃ５７Ｌ／Ｊマウスにおいて皮下で成長するネズミＨｅｐａ１〜６ＨＣＣに対するＩＲＦ−１ｈＥＲ発現の抗腫瘍効力を確定するために、異なる処置群を無作為に計画した。同系Ｃ５７Ｌ／Ｊマウスにおける腫瘍モデルのために用いられたＨｅｐａ１〜６ＨＣＣ細胞系は、中等度に速い腫瘍成長により特徴付けられ、移植された動物の１００％が腫瘍を発症した。野生型Ｈｅｐａ１〜６およびＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ細胞はともに、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓ．ｃ．注射後にほぼ同一の腫瘍原性を示したが、これは、Ｅ２非処置ＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ細胞中の不活性ＩＲＦ−１ｈＥＲ融合タンパク質の存在を示唆する(図６Ａ、ｐ＞０．５)。１７日以内に、大型腫瘍が発症し、平均サイズは１５００ｍｍ３であった。野生型Ｈｅｐａ１〜６細胞を接種したマウスをＥ２で処置した場合、Ｅ２処置を伴わずにＨｅｐａ１〜６またはＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ細胞で攻撃されたマウスと比較して、腫瘍発症に及ぼす作用はまったく観察されなかった。これらの結果は、Ｅ２処置それ自体が腫瘍成長および動物の健康に及ぼす負の作用を有さないことを実証する。しかしながらＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲを接種されたＣ５７Ｌ／Ｊマウスが腫瘍接種の時点で開始するＥ２による２日毎のｉ．ｐ．注射を受けた場合、腫瘍成長はかなり抑制された。８匹の動物のうちの６匹の動物が腫瘍成長に対して完全に防御され、２匹の動物が遅い増殖速度により特徴付けられる非常に小さい腫瘍のみを発症したことは重要な知見であった(図６Ａ)。４０日後、腫瘍サイズは４５０ｍｍ３に過ぎず、４２日目にＥ２処置を中止しても、腫瘍の増殖速度が速まることはなかった。
【００５８】
腫瘍細胞におけるＩＲＦ−１活性化は、Ｔ細胞記憶を誘導する
ＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲによる攻撃に対して防御されたＥ２処置マウスにおける腫瘍特異的記憶Ｔ細胞の存在を調べることに、本発明者等は興味を持った。したがって、腫瘍攻撃後２８日目およびＥ２処置中止後１１日目に、腫瘍無含有マウスに１×１０７個の野生型Ｈｅｐａ１〜６(ｎ＝３)またはＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ細胞(ｎ＝３)を接種した。これらのマウスが任意のさらなるＥ２処置を受けなかったことは重要である。図６Ｂに示したように、両群のマウスはすべて腫瘍成長に対して防御されたが、しかしＣＤ８＋Ｔ細胞ｉｎ  ｖｉｖｏ枯渇後は防御されなかった(ｎ＝２、データは示されていない)。対照的に、Ｅ２処置を伴わないナイーブＣ５７Ｌ／Ｊマウスは、迅速なＨｅｐａ１〜６およびＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ腫瘍成長により特徴付けられた。これらの結果は、活性ＩＲＦ−１ｈＥＲの発現による腫瘍特異的免疫性の初回抗原刺激後の腫瘍特異的Ｔ細胞記憶の存在を示唆する。
【００５９】
ＩＲＦ−１活性化腫瘍細胞によるＣＴＬ活性の誘導
実際、照射Ｈｅｐａ１〜６細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激後のＨｅｐａ１〜６標的細胞に対する強力なＣＴＬ活性は、ＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ細胞を用いて攻撃され、かつＥ２で処置されたマウスにおいて観察された(図７Ａ)。腫瘍攻撃されなかったマウスから、あるいはＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ細胞で攻撃され、３ＬＬ細胞でｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激されたＥ２処置マウス由来の脾臓細胞がＨｅｐａ１〜６標的に対する弱いバックグラウンド殺害活性のみを示したため、このＣＴＬ活性はＨｅｐａ１〜６腫瘍細胞に対して特異的であった（図７Ａ）。Ｉｎ  ｖｉｖｏでサイトカイン産生細胞をモニタリングすることにより、一次Ｔ細胞応答を評価した。照射Ｈｅｐａ１〜６細胞による刺激時のＩＦＮ−γ（５，０００のうち１）およびＩＬ−４（１０，０００のうち１）を分泌する脾臓細胞の数の有意の増大(図７Ｂ)は、Ｅ２非処置／ＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ、Ｅ２非処置／Ｈｅｐａ１〜６、またはＥ２処置／Ｈｅｐａ１〜６攻撃マウスと比較して、ＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ腫瘍を接種されたＥ２処置マウスにおいて観察された(２０，０００ＩＦＮ−γのうち１および４０，０００ＩＬ−４分泌Ｔ細胞のうち１、ｐ＝０．０１)が、このことは、ＴＨ１およびＴＨ２腫瘍免疫性の両方の有意の発症を示唆する。エリスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）分析により得られたｉｎ  ｖｉｖｏ結果とは対照的に、５１Ｃｒ放出アッセイ（図７Ａ）におけるＣＴＬ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ殺害活性の差は、異なる群間で統計学的に有意でなかった。これは、エリスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）技法と比較した場合の、腫瘍特異的Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ展開、ならびに５１Ｃｒ放出アッセイのより低い感受性の結果であり得る。
【００６０】
ＩＲＦ−１活性化は腫瘍特異的自己抗原無視を打破する
より詳細にＨＣＣに対する免疫応答を確定し、活性化ＩＲＦ−１の発現が腫瘍特異的抗原に対する免疫応答を初回抗原刺激し得たか否かを見出すために、標的としてＨＣＣ細胞中で高レベルでしばしば発現されるＨＣＣ特異的自己抗原ＡＦＰを本発明者等は選択する。高レベルでＡＦＰを内因的に発現するＨｅｐａ１〜６ＨＣＣに対する中間体ＣＴＬ活性は、Ｅ２処置／ＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ攻撃マウスで観察された(図８Ａ)。他の群（１，０００，０００のうち１）と比較した場合、これらのマウスにおいては、ＣＴＬ活性は有意に強く（ｐ＝０．０２）、ＡＦＰ特異的ＩＦＮ−γ（図８Ｂ）産生脾臓細胞（１１，０００のうち１）の数はより多かった(ｐ＝０．００１)。腫瘍を伴わない対照動物においては、特異的ＣＴＬ活性またはＨｅｐａ１〜６または３ＬＬ標的細胞に対するバックグラウンド溶解強化は観察されなかった。さらに、これらの標的細胞の溶解の増大は、ＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ細胞で攻撃されたＥ２処置マウス由来のｒＶＶ−ｐＳＣ１１によるエフェクター細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激後に認められず、これは、ＡＦＰに対するＣＴＬ活性の特異性を示唆する(図８Ａ)。エフェクターを伴わないｒＶＶ−ＡＦＰ感染脾臓細胞単独を用いた、あるいはエフェクターのみを用いたエリスポットの実施はバックグラウンドスポット形成の増加を生じなかったが、これはさらに、ＡＦＰ特異性を示唆する(データは示されていない)。これらのデータは、ＨＣＣ腫瘍成長制御におそらくは関与するメカニズムである自己抗原ＡＦＰに対する耐性が活性化ＩＲＦ−１の腫瘍内発現により破壊され得ることを実証する。
【００６１】
ホスト免疫応答ではない他の因子はＩＲＦ−１活性化腫瘍細胞の拒絶に関与する
ホスト抗腫瘍免疫応答が腫瘍拒絶に関与する唯一のパラメーターであるか否かを確定するために、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴ細胞枯渇実験をＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ腫瘍を用いて攻撃されたＥ２処置マウスで実施した(図９Ａ)。非枯渇マウスは、腫瘍成長に対して再び防御された。ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞枯渇はともに、すべてのマウスにおいて腫瘍成長を生じたが、しかしながらこれはＥ２処置を受けなかった非枯渇マウスと比較して、有意に遅延されていた。この知見は、ホスト免疫応答が腫瘍防御における重要な因子であるということを暗に意味するが、腫瘍成長の初期制御においては部分的なものに過ぎないと思われる。
【００６２】
ＩＲＦ−１活性化は活発に成長する腫瘍の増大を停止する
Ｅ２非処置Ｃ５７Ｌ／Ｊマウスにおいて皮下で成長中のＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ  ＨＣＣに対するＩＲＦ−１ｈＥＲ活性化の治療的効力を評価するために、腫瘍攻撃後１９日目にＥ２処置を開始した。この時点で、腫瘍は約２０００ｍｍ３の平均サイズに達していた。図９Ｂに示したように、腫瘍成長はＥ２処置の開始後４日目という早期に恒久的に停止されたが、これは、ＨＣＣに対するＩＲＦ−１活性化の有意の治療的な可能性を実証する。対照的に、ＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ腫瘍はＥ２非処置マウスにおいて急速に増殖した。９日間のＥ２処置は、長期腫瘍成長制御を誘導するのに十分であった。これは、Ｅ２処置が２８日目に再び中止された６匹のＥ２処置マウスのうちの２匹において容易に実証された。これらのマウスにおける腫瘍成長は、二日毎のＥ２注射を受け続けたマウスと比較して、異ならなかった。
【００６３】
一側腹部における腫瘍のＩＲＦ−１活性化は両側腹部の腫瘍成長に影響を及ぼす
腫瘍に対する治療的ワクチンとしてのＩＲＦ−１活性化の効力を調べた。マウスの右側腹部にＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ細胞を皮下注射し、野生型Ｈｅｐａ１〜６細胞を左側腹部に注射した。動物を１．５ｍｇのＥ２で２日毎に処置するか、または非処置のままにした。ＩＲＦ−１−ｈＥＲの活性化は、マウスの右側腹部のＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ細胞の腫瘍成長を撤廃した。さらに、左側腹部に野生型Ｈｅｐａ１〜６の腫瘍成長も、１日目に開始されたＨｅｐａ１〜６腫瘍成長と比較して低減されたが、それが非処置動物において起きたようなさらなる展開は抑制された。
【００６４】
考察
ＨＣＣは、予後は不十分で、治療的意見も少なく非常に悪性の腫瘍である。ＩＲＦ−１の活性化を意図する新規の免疫療法的アプローチを検討した。β−エストラジオールの存在下で活性になるＩＲＦ−１／ヒトエストロゲン受容体融合タンパク質をコードするネズミＨＣＣ細胞系（ＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ）を構築した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ表現型、細胞成長、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの足場非依存性成長、ｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫原性、およびＩＲＦ−１の治療的な可能性をすべて調べた．安定的構成的ＩＲＦ−１発現は、低発現クローンを選択するという欠点を有する。このような細胞系における実際的導入遺伝子発現は、内因性ＩＲＦ−１発現の多くを無効にするというわけではない。さらに構成的発現は、長期に亘ってＩＲＦ−１応答性の損失に対する選択を誘導する（４、４０）。対照的に、本発明に用いられる活性化可能ＩＲＦ−１ｈＥＲ系は、ＩＲＦ−１活性の厳密な調節を可能にし、腫瘍細胞中でかなり高レベルのＩＲＦ−１を発現させる。Ｅ２(Ｅ２＝β−エストラジオール)活性化可能系は広範に研究されており、野生型ＩＲＦ−１遺伝子のテトラサイクリン調節性転写活性化とも比較されてきた。差異は見出されなかった（Kirchhoff et al., 1995; Koster et al., 1995）。突然変異体エストラジオール受容体遺伝子（４９）の使用のために、融合タンパク質は、低エストラジオール濃度に対して無反応性であり、したがって内因性エストロゲンレベルにより活性化されることなくマウスにおいて用いられ得る。しかしながらＩＲＦ−１ｈＥＲのそれぞれのタモキシフェン特異的突然変異体（５０）は、ＩＲＦ−１活性の厳密な調節を示さなかった（A. Kroger、未発表）。したがってβ−エストラジオール誘導系を用いて、ＩＲＦ−１の抗腫瘍作用をより詳細に本発明者等は取り扱い、かつその異なる抗腫瘍性エフェクターアームの活性化を分析し得た。
【００６５】
Ｈｅｐａ１〜６細胞の成長および形質転換の阻害をｉｎ  ｖｉｔｒｏで実証し、ＩＲＦ−１の先天免疫活性に帰すべき特性を確証した。異所性ＩＲＦ−１発現は、ｍｙｃ、ｆｏｓＢ（２９）、ＩＲＦ−２（５１、５２）、ＥＧＦＲおよびＥｌａ／ｂ（２４）のような異なる癌遺伝子により誘導される細胞形質転換特性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで抑制する。野生型細胞中のｃ−Ｈａ−ｒａｓ癌遺伝子の発現が成長制限条件下で細胞にアポトーシスを被らせるがＩＲＦ−１−／−細胞中ではそうではないＩＲＦ−１−／−マウスからの胚性繊維芽細胞を用いて早期に得られた結果（Tanaka et al., 1994）の通りに、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＥＧＦＲおよびＩＲＦ−１の組合せ活性は、アポトーシスによる有意の細胞死を誘導することが示された（２４）。しかしながらこの報告に提示されたデータは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの癌遺伝子依存性腫瘍抑制がアポトーシスにより媒介される必要がないことを示す。したがって形質転換阻害のその他のメカニズムが働くことが予測される。ＩＲＦ−１は、形質転換阻害に寄与し得る多数の遺伝子のＤＮＡ結合およびトランス活性化によりその作用を発揮する。それらの例としては、リシルオキシダーゼ（１６）、ＰＫＲ（１７、５３）、２’−５’ＯＡＳＥ（１８）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（１９）、およびＩＩ型アンギオテンシン受容体（２０）がある。この状況でのＩＦＮ−β分泌の役割は明らかでないが、これらの遺伝子のフィードバックエンハンサーとして作用し得る。
【００６６】
ＩＲＦ−１は、いくつかのその他の関連するｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を有する。これらは、ＩＲＦ−１の免疫調節作用、例えばヘルパーＴおよびＮＫ細胞の刺激（５４、５５）、ＭＨＣ遺伝子（４、３１、５６、５７）の、ならびに抗原提示に関与する遺伝子（３８、５８）の転写の強化によるものである。したがってＩＲＦ−１の発現または活性を強化するほとんどの事象または薬剤が、形質転換細胞の特異的殺害を誘導することにより癌療法に有用であり得る。実際、マウスにおける実験が記載され、攻撃的非免疫原性肉腫細胞におけるＩＲＦ−１の発現が悪性表現型を抑制することが実証されている（４０）。
【００６７】
高腫瘍原性ＨＣＣ細胞系のｉｎ  ｖｉｖｏでの抑制および制御は、ＩＲＦ−１の最も重要な活性であった。Ｅ２処置は、ＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ腫瘍を用いた攻撃に対して７５％のマウスを防御し、腫瘍を発症するマウスは、Ｅ２非処置動物と比較して、腫瘍成長の有意の抑制および生存強化により特徴付けられた。同様の結果は、肉腫細胞系中でのＩＲＦ−１の構成的発現が部分的な腫瘍制御を生じた近年の研究において観察された（４０）。Ｔ細胞枯渇実験により、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞が腫瘍成長の制御に重要な役割を果たすということが実証されたが、これは、ＴＨ１分化の誘導におけるＩＲＦ−１の既知の重要性を確証する（５５）。さらに、腫瘍成長に対して相乗的に作用し得る腫瘍特異的ＴＨ２細胞の有意の活性化を、本発明者等は観察した（５９、６０）。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方の枯渇実験の作用は、ＩＲＦ−１媒介性腫瘍成長制御の全体的作用を説明することができない。ＩＦＮ−βはＮＫ細胞を活性化し得ることが示された。したがってＮＫ細胞は腫瘍制御に寄与することができる。
【００６８】
ＩＲＦ−１の腫瘍内発現が、ＨＣＣ特異的自己抗原ＡＦＰのような腫瘍関連抗原に対する有意のＴ細胞応答を誘導することがはじめて実証されたことはさらに重要であり、これは、ＡＦＰに対する耐性がこのアプローチにより破壊され得ることを示唆する。ＡＦＰ特異的ＣＴＬ活性は、高免疫原性ウイルス抗原、例えばＨＢＶまたはＨＣＶ構造タンパク質と比較して、低かった（６１、６２）。これは、低ＣＴＬ前駆体頻度および／または低親和性ＴＣＲの結果であり得る。しかしながら近年の研究は、ＤＮＡまたは樹状細胞ベースの免疫接種後のＡＦＰ特異的Ｔ細胞がＡＦＰ発現ネズミＨＣＣに対してｉｎ  ｖｉｖｏで機能的であることを実証した（４４、６３）が、これは、ＡＦＰ特異的Ｔ細胞が、本発明に提示されたような抗腫瘍作用に寄与したことを示唆する。細胞性イムニティーのみは、ｉｎ  ｖｉｖｏ枯渇実験により実証されるように腫瘍成長を完全に制御し得なかったが、腫瘍に対する有意のＴ細胞記憶が誘導され、これは、さらなるＥ２処置を用いずにＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲを用いた再攻撃、野生型Ｈｅｐａ１〜６細胞を用いてさえの再攻撃に対してマウスを防御した。ＨＣＣ診断後の臨床状態を反映するＩＲＦ−１発現の考え得る治療的効力が示されたことはさらに重要である。Ｅ２を用いた大型ＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ腫瘍を保有するマウスの処置は、４日以内に腫瘍の成長停止を生じた。９日間に亘るＥ２処置は、任意のさらなるＥ２処置を伴わずに長期間腫瘍成長を制御するのに十分であった。上記の腫瘍防御試験によれば、この長期腫瘍制御は主として免疫媒介され得る。
【００６９】
ＩＲＦ−１を発現するＨＣＣ腫瘍の免疫原性強化は、上記のようにＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子の上向き調節により媒介され得るが、ＭＨＣクラスＩＩ誘導はＨＣＣ細胞中では低かった。共刺激性分子ＣＤ８０およびＣＤ８６は検出することができなかったが、このことは、抗腫瘍性免疫応答の初回抗原刺激が、プロ抗原提示細胞により排液リンパ節で起きたに違いないことを示唆する。ＩＲＦ−１媒介性腫瘍成長制御に関与する付加的因子は、プロテアソームによる免疫系への提示のための次世代のＭＨＣクラスＩ制限抗原性ペプチドであり得る（３８、３９、５８）。
【００７０】
Yim等（４０）が予知したように、異所性ＩＲＦ−１発現は有意の治療的抗腫瘍性免疫応答を誘導し、組織特異的自己腫瘍抗原、例えばＡＦＰに対する免疫を初回抗原刺激することが初めて示された。したがって本発明者等の結果は、ＨＣＣの局所的およびＡＦＰベースの免疫療法との関連を有し得る。
【００７１】
要約すると、肝細胞癌(ＨＣＣ)は、予後は不十分で、治療的意見も少ない非常に悪性の腫瘍である。
【００７２】
ＨＣＣは、他の腫瘍存在物の一例とみなされる。ＩＲＦ−１は他の腫瘍種において同一の全身性作用を有するという良好な証拠がある。以下の例は、この仮説を支持する：
１．  Yim等（1997；４０）は、肉腫細胞系は、ＩＲＦ−１を発現する場合、拒絶および免疫性を部分的に誘導すると報告した。ＩＲＦ−１は十分に発現されなかったため、作用は完全でなかった。
２．  癌遺伝子性形質転換３Ｔ３細胞を用いた例は、活性ＩＲＦ−１が発現された場合、ヌードマウスにおいてさえ、腫瘍成長が有意に低減されるという見解を支持する。ヌードマウスにおける腫瘍成長の遅延は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータから予測されたものより非常に高く、これは、この動物における免疫系の残りの部分が関与したことを示す。
３．  多数の異なる癌遺伝子性形質転換細胞系を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏデータは、ＩＲＦ−１が軟寒天成長を有意にまたは完全に抑制し、インターフェロン分泌を誘導し、ＭＨＣ上向き調節を活性化することを示す（Kirchhoff et al., 1999およびKroger et al.、未発表データ）。
【００７３】
マウスにおける腫瘍防衛の詳細な分子機能は既知でないが、提示されたデータは、免疫細胞(ＣＴＬ、ＴＨ１およびＴＨ２細胞)が関与することを示す。ヌードマウス実験は、ＮＫ細胞も関与することを示唆する。ＩＦＮ−βはＮＫ細胞活性の強力な活性剤であることが既知である。さらにＩＦＮ−βは、適応免疫系における多様な活性化機能に関しても既知である。最後に、ＩＲＦ−１のアポトーシスならびに成長阻害作用は、ＩＲＦ−１を過剰発現する細胞中で観察される腫瘍阻害作用に寄与し得る。免疫学的作用はＭＨＣ上向き調節およびインターフェロン分泌により媒介されると考えられるが、ＩＲＦ−１により誘導されるその他の、今のところ未知の活性が抗腫瘍作用に寄与し得る。
【００７４】
ＩＲＦ−１活性化時に分泌されるインターフェロンは、全身的に、ならびに局所的に作用し得る。したがって、抗原提示細胞(例えばＩＲＦ−１を過剰発現するもの)の周囲におけるＩＦＮの産生は、抗腫瘍活性の高度の刺激をもたらすと考えられる。
【００７５】
本発明の研究において、ＩＲＦ−１は抗腫瘍活性を誘導することが実証された。ＩＲＦ−１と比較した場合、他のＩＲＦが類似の結合特性を有することはよく知られている。例えばＩＲＦ−３は、ＩＲＦ−１により活性化されるのと同一のまたは類似の組の遺伝子を活性化し得ると思われる。したがって構成的に活性である恒久的活性化ＩＲＦ−３またはＩＲＦ−３変異体は、ここに示されたのと同一の抗腫瘍活性を有し得る。
【００７６】
動物腫瘍モデルにおいて観察された作用はどのようにヒト療法に転換され得るであろうか。シナリオはすべて、ＩＲＦ−１または関連転写因子の強力な活性に基づいている(上記参照)。
【００７７】
１．  細胞療法：
ウイルス感染またはその他の遺伝子移入方法により、患者の腫瘍細胞または同一腫瘍実態を有する他の患者からの腫瘍細胞(同種異系細胞)に遺伝子をチャージすることができた。これらの遺伝子が一時的に発現されるかまたは長期間発現されるかは重要でない。あるいは、標的腫瘍に関連する腫瘍抗原を提示し得るかまたは提示させ得る非特異的細胞またはプロフェッショナル抗原提示細胞が、ＩＲＦ構築物によりチャージされる。これらの細胞は、患者由来か、または同種異系であり得る。これらの細胞中でのＩＲＦ遺伝子の活性化は、患者への贈与の直前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化され得る。あるいは、それらはそれぞれの活性剤（β−エストラジオールまたはテトラサイクリン)の贈与により患者内で活性化され得る。ヒトにおいては、細胞療法は、通常は他の細胞を不活性化することにより、ＵＶまたはγ線照射のような方法により実行される。
【００７８】
２．  ウイルス移入法による遺伝子療法
例えば上記のようなＩＲＦは、上記のアデノウイルスベクターのようなウイルスベクターにより形質導入され得る。好ましくはこれは腫瘍中または腫瘍付近の組織中へのウイルスの感染により行われる。ある場合には、それは、全身的適用によっても行われ得る。これは典型的には、血流中へのアデノウイルスの適用による肝臓腫瘍の場合に行われる。アデノウイルスは主に肝臓で捕捉され、したがって遺伝子移入は極端に肝臓特異的であることがよく知られている。ウイルスベクターにより保有されるＩＲＦの活性化または低減は、それぞれの作用物質により患者においてｉｎ  ｖｉｖｏで活性化される。非腫瘍細胞中でのＩＲＦ−１活性化が可逆的増殖阻害を引き起こすが、阻止作用をもたらさないということを初期の研究は示したことに言及する必要がある。
【００７９】
３．  非ウイルス法による遺伝子療法
遺伝子がヒト組織中に移入され得る多数の方法が既知である。それらの例としては、リポフェクション、遺伝子銃、電気穿孔等がある。ＩＲＦは、これらの方法によりそれぞれの腫瘍組織中にトランスフェクトされ得る。
【００８０】
４．  患者の腫瘍中のまたは抗原提示細胞中の内因性ＩＲＦ−１の活性化または誘導は、サイトカインおよびその他の生物学的応答修飾剤のような多数の化合物から活性化または誘導され得る。それらがＩＲＦ−１の転写および産生を活性化することは既知である。強力な誘導物質またはこのような組合せを用いて、ＩＲＦ−１を誘導し、かつ観察された抗腫瘍作用を誘導し得る。内因性ＩＲＦ−１を活性化する、ハイスループットスクリーニングにより典型的に見出されるその他の化合物も、同一方法で用い得る。
【００８１】
【表３】
2004529888.tif 000005
【００８２】
【表４】
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【００８３】
【表５】
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【００８４】
【表６】
2004529888.tif 000008
【００８５】
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【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】ＩＲＦ−１はＨｅｐａ１〜６細胞における細胞成長阻害を媒介する。Ａ：ＩＲＦ−１ｈＥＲでトランスフェクトされたＨｅｐａ１〜６細胞におけるＩＲＦ−１ｈＥＲ融合タンパク質のウエスタンブロット分析。これらの細胞クローンから得られた溶解物(タンパク質５０μｇ)をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付して、抗ＥＲ抗体を用いて分析した(上パネル)。膜を剥いで、抗アクチン抗体で再プローブして、試料のタンパク質チャージを制御した(下パネル)。Ｂ：細胞成長の確定のために、同一クローン由来の細胞をマイクロタイタープレートのウェル中に播種して、β−エストラジオール１μＭを用いて(黒棒)または用いずに(白棒)成長させた。処置の７日後に、培養の代謝活性を測定した。個々のＨｅｐａ１〜６細胞クローンの成長特性はわずかに異なるため、未処置細胞の代謝活性を１００％と設定した。
【図２】ＩＲＦ−１の活性化は、Ｈｅｐａ１〜６細胞の腫瘍原性表現型を復帰させる。Ａ：軟寒天中のＩＲＦ−１トランスフェクト細胞クローンの足場非依存性成長。Ｂ：β−エストラジオール１μＭを用いずに(黒棒)または用いて(白棒)３週間培養後、指示細胞クローンのコロニー数を測定した。
【図３】ＩＲＦ−１の活性化は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ発現の増大をもたらす。ＩＲＦ−１−ｈＥＲを発現するＨｅｐａ１〜６細胞の表面タンパク質のＦＡＣＳ分析(クローン９)を、Ｈ２Ｋｂ／Ｄｂ（Ａ）、Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｂ（Ｂ）およびＣＤ５４（Ｃ）に対して誘導される抗体を用いて行った。エストロゲン無含有培地中でまたは１ｍＭのβ−エストラジオールの１：１，０００希釈物を含有する培地中で、ＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ細胞を３〜４日間培養した。その後、適切なＦＩＴＣ標識またはＰＥ標識抗体を用いて細胞を染色した。特異性に関する対照として、ＦＩＴＣ標識またはＰＥ標識非特異的アイソタイプ対照で細胞を染色した。データは、３つの個々の実験から得られる。
【図４】ＩＲＦ−１−ＨＥＲのアデノウイルス形質導入はＩＲＦ−１媒介性表現型をもたらす  Ａ  材料と方法の節に記載されたような異なるアデノウイルスベクターの模式図。矢印：サイトメガロウイルスプロモーター(ＣＭＶ)；二方向矢印：二方向ｔＴＡ−プロモーター(ｂｉｔＴＡ)；黒丸：ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル；黒長方形：ポリオウイルス由来内部リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)；ｅＧＦＰ：強化グリーン蛍光タンパク質；ＬＴＲ：レトロウイルス末端反復配列；ｔＴＡ：トランス活性化因子。Ｂ  指示アデノウイルスに感染されたＨｅｐａ１〜６細胞におけるＩＲＦ−１−ｈＥＲ融合タンパク質のウエスタンブロット分析。感染後４８時間目の細胞由来の溶解物(タンパク質５０μｇ)をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付して、ヒトエストロゲン受容体に対して誘導される抗体を用いて分析した。
【図５】ＩＲＦ−１の活性化はヌードマウスにおける腫瘍成長を遅延し、部分的に阻害する。  ＮＭＲＩヌードマウスの右側腹部に１０６細胞／マウスを皮下注射した。１．５ｍｇのＥ２の２日毎のｉ．ｐ．でマウスを処置するかまたは未処置のままにした。データは、５匹の動物の平均値を示す。Ａ  腫瘍容積により腫瘍成長を測定した。Ｂ  腫瘍無含有ヌードマウス生存率を示すカプラン−マイアープロット。
【図６】同系免疫応答性Ｃ５７Ｌ／ＪマウスにおけるＥ２処置および腫瘍再攻撃に対する防御に依存するＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲおよびＨｅｐａ１〜６細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ特性。Ａ：マウスの右側腹部に１×１０７Ｈｅｐａ１〜６またはＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ細胞を接種し、2日毎の１．５ｍｇβ−エストラジオールｉ．ｐ．でマウスを処置するか、または未処置のままにした。８匹のＥ２処置動物のうちの６匹はＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ腫瘍成長に対して完全に防御され、２匹は、Ｅ２処置停止後でさえ非常に遅い成長速度を特徴とする小腫瘍を発症しただけであることに留意されたい。Ｂ：ナイーブＣ５７Ｌ／ＪマウスまたはＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ腫瘍成長に対して防御されたＥ２処置動物を、Ｅ２処置停止後１１日目(最初の腫瘍接種後２８日目)に、１×１０７野生型Ｈｅｐａ１〜６(ｎ＝３)またはＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ(ｎ＝３)腫瘍細胞を用いて再攻撃させた。これらのマウスが任意のさらなるＥ２処置を受けなかったことは重要である。
【図７】Ｈｅｐａ１〜６腫瘍に対するＣＴＬ活性ならびにＴ細胞前駆体頻度。Ａ：腫瘍攻撃処置または対照マウス(各群ｎ＝５)由来の脾臓細胞を、放射線照射Ｈｅｐａ１〜６細胞を用いて再刺激し、その後、指示されたＥ：Ｔ比で、同系Ｈｅｐａ１〜６およびルイス肺癌細胞に対する細胞傷害性活性に関して分析した。特異性の対照のために、ＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ細胞を用いて攻撃されたＥ２処置マウスを３ＬＬ細胞でｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激して、その後、同系Ｈｅｐａ１〜６および３ＬＬ癌細胞に対する細胞傷害性活性に関して分析した。Ｈｅｐａ１〜６腫瘍特異的溶解物は、Ｈｅｐａ１〜６標的に対する溶解値から３ＬＬに対する溶解値を差し引くことにより提示された。値は、３重反復試験確定値の平均を表す。Ｂ：腫瘍攻撃または非攻撃処置マウス(各群ｎ＝５)由来の脾臓細胞を、Ｈｅｐａ１〜６または３ＬＬ細胞を用いて２０時間刺激した。その後、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４エリスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを実施した。各ウェル中のスポットを顕微鏡下で計数し、その値を、培養の開始時に各ウェルに添加された脾臓細胞数に対するスポット形成細胞の数として表す。
【図８】ＡＦＰ特異的ＣＴＬ応答およびＣＴＬ−ｐ頻度。Ａ：腫瘍攻撃処置または対照マウス(各群ｎ＝５)由来の脾臓細胞を、ＵＶ不活性化ｒＶＶ−ｍＡＦＰに感染させた放射線照射自系脾臓細胞を用いて再刺激し、その後、指示されたＥ：Ｔ比で、同系Ｈｅｐａ１〜６およびルイス肺癌細胞に対する細胞傷害性活性に関して分析した。特異性の対照のために、ＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ細胞を用いて攻撃されたＥ２処置マウスをｒＶＶ−ｐＳＣ１１に感染させた脾臓細胞でｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激して、その後、同系Ｈｅｐａ１〜６およびルイス肺癌細胞に対する細胞傷害性活性に関して分析した。ＡＦＰ特異的溶解物は、Ｈｅｐａ１〜６標的に対する溶解値から３ＬＬに対する溶解値を差し引くことにより示された。値は、３重反復試験測定の平均を表す。Ｂ：腫瘍攻撃または非攻撃処置マウス(各群ｎ＝５)由来の脾臓細胞を、ＵＶ不活性化ｒＶＶ−ＡＦＰまたはｒＶＶ−ｐＳＣ１１感染同系放射線照射脾臓細胞を用いて２０時間刺激した。その後、ＩＦＮ−γエリスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを実施した。
【図９】ｉｎ  ｖｉｖｏおよびＩＲＦ−１媒介性ＨＣＣ療法における抗腫瘍免疫反応性の同定。Ａ：抗腫瘍免疫は部分的に、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の関与を要した。材料と方法において記載されたような精製ハイブリドーマ上清のｉ．ｐ．注射により、ＨｅｐａＩＲＦ−ｈＥＲ細胞を接種されたＥ２処置または未処置マウスのＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞亜集団を枯渇させた。各群は、マウス２匹を含有した。Ｂ：Ｃ５７Ｌ／Ｊマウスの右側腹部に１×１０７ＨｅｐａＩＲＦ−１ｈＥＲ(群１および２)細胞を接種した。両群は、いかなるＥ２処置も受けなかった。１９日目に、腫瘍は両群で約２０００ｍｍ３のサイズに達した。１９日目に開始して、２８日目まで２日毎に、群２(ｎ＝６)に１．５ｍｇのＥ２をｉ．ｐ．注射した。その後、Ｅ２処置は２匹のマウスで再度中止されたが、一方、残りの４匹のマウスはＥ２療法を維持された。腫瘍成長における差異は観察されなかった。群１(ｎ＝３)のマウスにはＥ２処置を施さず、その後、腫瘍が１０，０００ｍｍ３に達した場合に屠殺した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年5月22日(2003.5.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ｉ)遺伝子構築物またはポリヌクレオチドであって、それによりＩＲＦファミリーのメンバーである該遺伝子構築物またはポリヌクレオチドの遺伝子産物の活性を腫瘍性、感染性および／または免疫疾患に対する治療、予防、防御的治療および／または予防免疫接種のために活性化される遺伝子構築物またはポリヌクレオチドと、(ｉｉ)ウイルス、細菌、真菌および寄生生物起源、あるいは腫瘍細胞由来の１つまたは複数の抗原コード遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の抗原とを一緒に含有してなるワクチン。
【請求項２】
遺伝子産物としてのＩＲＦファミリーの前記メンバーは、野生型ＩＲＦ−１、合成ＩＲＦ−１、免疫学的活性ＩＲＦ−１変異体、ＩＲＦ−１以外のＩＲＦファミリーの野生型メンバー、ＩＲＦ−１以外のＩＲＦファミリーの合成メンバー、ＩＲＦ−１以外のＩＲＦファミリーのメンバーの免疫学的活性変異体およびそれらの融合タンパク質から成る群から選択される請求項１記載のワクチン。
【請求項３】
哺乳類、特にヒトの治療のための請求項１および／または２記載のワクチン。
【請求項４】
前記遺伝子構築物は、融合タンパク質のドメインの１つとしての前記ＩＲＦフェミリーのメンバーおよび該融合タンパク質の別のドメインとしての外来タンパク質を含む融合タンパク質としての前記ＩＲＦファミリーのメンバーをコードし、前記融合タンパク質の活性は、化学的または物理的手段によりスイッチを切り換えられ得る１つまたは複数の先行の請求項で特定されたワクチン。
【請求項５】
前記遺伝子構築物は、ＩＲＦ−１／ｈＥＲ融合タンパク質の前記発現をコードし、該融合タンパク質の活性は、エストロゲンまたは抗エストロゲン活性を有する化合物により制御され得る１つまたは複数の先行の請求項で特定されたワクチン。
【請求項６】
前記遺伝子構築物または前記ポリヌクレオチドは、哺乳類細胞中への移入のための生成物として、特にウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクターとして提供される１つまたは複数の先行の請求項で特定されたワクチン。
【請求項７】
前記発現は、化学的または物理的活性化によりスイッチを入れられ得る１つまたは複数の先行の請求項で特定されたワクチン。
【請求項８】
前記発現は、加熱によりまたは放射線照射によりスイッチを入れられ得る請求項７記載のワクチン。
【請求項９】
前記発現は、調節可能プロモーターによりスイッチを入れられ得る請求項７および／または８記載のワクチン。
【請求項１０】
前記発現は、外的刺激により、特にテトラサイクリンによりスイッチを切り換えられ得る請求項９記載のワクチン。
【請求項１１】
前記遺伝子構築物またはポリヌクレオチドおよび前記抗原コード配列(単数または複数)は、複数の別個のベクター、すべての構成成分を提供するベクター、またはポリシストロン発現ユニットを用いて提供される１つまたは複数の先行の請求項で特定されたワクチン。
【請求項１２】
前記遺伝子構築物またはポリヌクレオチドおよび前記抗原コード配列(単数または複数)は、ウイルスまたは細菌担体として提供される請求項１１および／または１２記載のワクチン。
【請求項１３】
請求項１(特徴(ｉ))ないし１０のうちの１つまたは複数に記載される遺伝子構築物またはポリヌクレオチドを用いてｅｘ  ｖｉｖｏで、ならびに請求項１（特徴(ｉｉ)）および請求項１１ないし１２のうちの１つまたは複数に記載の遺伝子を用いて遺伝子移入を施されたヒト抗原提示細胞(ＡＰＣ)。
【請求項１４】
物理的形質導入、特に電気穿孔、化学的形質導入またはウイルス形質導入によりチャージされた請求項１３記載のヒト細胞。
【請求項１５】
自系または同種異系細胞である請求項１３および／または１４記載のヒト細胞。
【請求項１６】
腫瘍細胞、特に癌細胞、好ましくは肝細胞癌細胞、肉腫細胞または造血系由来の腫瘍である請求項１３ないし１５のうちの１つまたは複数に記載のヒト細胞。
【請求項１７】
腫瘍性、感染性および／または免疫疾患に対する治療、予防、防御的治療および／または予防免疫接種のための請求項１３ないし１６のうちの１つまたは複数に記載のヒト細胞。
【請求項１８】
ＩＲＦファミリーの前記メンバーの活性レベルは、インターフェロン−γにより誘起されるＩＲＦ−１のレベルより高い請求項１３ないし１７のうちの１つまたは複数に記載のヒト細胞。
【国際調査報告】
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