(57)【要約】少なくとも１個のトリプトファン残基を有するペプチドの固相合成方法であって、前記方法は、塩基に不安定な側鎖保護基を有する前記トリプトファン残基のインドール環を一時的に保護することを含み、ここで前記保護基は、固体支持体からの前記ペプチドの開裂中に除去される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2004516330.tif 000004
で示されるペプチドの製造方法であって、式中、
Ａ１は、ｐＧｌｕまたはＮ−Ａｃ−Ｄ−β−Ｎａｌであり；
Ａ２は、Ｈｉｓ、Ｄ−ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ、またはＤ−ｐ−Ｆ−Ｐｈｅであり；
Ａ３は、ＴｒｐまたはＤ−Ｔｒｐであり；
Ａ５は、Ｔｙｒ、ＮｉｃＬｙｓ、ｃＰｚＡＣＡｌａ、またはＰｉｃＬｙｓであり；
Ａ８は、Ａｒｇ、ｈＡｒｇ（Ｅｔ）２、ｈＡｒｇ（Ｂｕ）、ｈＡｒｇ（ＣＨ２ＣＦ３）２、またはＬｙｓ（ｉＰｒ）であり；
Ａ１０は、Ｇｌｙ、Ｄ−Ａｌａ、または、欠失しており；そして、
Ｒ１は、ＮＨ２またはＮＨＥｔであり：
当該方法は：
（ａ）Ａ１０が存在する場合はＢｏｃ−Ａ１０のセシウム塩を、または、Ａ１０が存在しない場合はＢｏｃ−Ｐｒｏを、クロロメチル化ポリスチレン樹脂に付着させ、それぞれＢｏｃ−Ａ１０−樹脂、または、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−樹脂を得ること；
（ｂ）Ｂｏｃ−Ａ１０−樹脂またはＢｏｃ−Ｐｒｏ−樹脂と、Ｂｏｃを脱ブロック化する有機酸の混合物とを混合することによってＢｏｃ−Ａ１０−樹脂またはＢｏｃ−Ｐｒｏ−樹脂を脱ブロック化し、それぞれＨ２Ｎ−Ａ１０−樹脂の有機酸塩、または、Ｈ２Ｎ−Ｐｒｏ−樹脂の有機酸塩を得ること；
（ｃ）Ｈ２Ｎ−Ａ１０−樹脂の有機酸塩、または、Ｈ２Ｎ−Ｐｒｏ−樹脂の有機酸塩を塩基で中和し、それぞれＨ２Ｎ−Ａ１０−樹脂またはＨ２Ｎ−Ｐｒｏ−樹脂を得ること；
（ｄ）Ｂｏｃ−α−アミンで保護されたアミノ酸と、Ｈ２Ｎ−Ａ１０−樹脂またはＨ２Ｎ−Ｐｒｏ−樹脂とをカップリングすること、ここで前記保護されたアミノ酸は、Ｃ末端からＮ末端で示される順番の式（Ｉ）について定義されたアミノ酸に対応しており、工程（ｄ）は：
（ｉ）ペプチドカップリング剤の存在下で、Ｈ２Ｎ−Ａ１０−樹脂またはＨ２Ｎ−Ｐｒｏ−樹脂と、Ｂｏｃ−α−アミンで保護されたアミノ酸とを反応させ、Ｂｏｃでブロック化されたカップリングされた生成物を得ること；
（ｉｉ）Ｂｏｃでブロック化されたカップリングされた生成物と、Ｂｏｃを脱ブロック化する有機酸とを混合することによって、Ｂｏｃでブロック化されたカップリングされた生成物からＢｏｃ基を脱ブロック化し、カップリングした生成物を得ること；
（ｉｉｉ）ペプチドカップリング剤の存在下で、カップリングした生成物と、次のＢｏｃ−α−アミンで保護されたアミノ酸とを反応させ、Ｂｏｃでブロック化されたカップリングされた生成物を得ること；
（ｉｖ）Ｂｏｃでブロック化されたカップリングされた生成物と、Ｂｏｃを脱ブロック化する有機酸とを混合することによって、Ｂｏｃでブロック化されたカップリングされた生成物からＢｏｃ基を脱ブロック化し、次のカップリングした生成物を得ること；
（ｖ）式（Ｉ）で示されるペプチドのＮ末端アミノ酸がカップリングされ、Ｎ末端アミノ酸のＢｏｃ基が脱ブロック化されるまで、工程（ｄ）（ｉｉｉ）および（ｄ）（ｉｖ）を繰り返し、保護された完成ペプチド−樹脂を得ることを含み；
（ｅ）保護された完成ペプチド−樹脂を開裂および脱保護し、式（Ｉ）で示されるペプチドを得ること、ここで前記開裂および脱保護する工程（ｅ）は：
（ｉ）アルコール／不活性な極性非プロトン性溶媒混合物の、保護された完成ペプチド−樹脂溶液を作製すること；
（ｉｉ）約０℃〜約１０℃に該溶液を冷却すること；
（ｉｉｉ）アンモニアガスまたはエチルアミンガスをゆっくりと泡立たせ、該溶液がアンモニアでよく飽和されるまで冷却し続け、飽和溶液を得ること：
（ｉｖ）９５％を超える遊離メチルエステルが、アンモニアガスが用いられた場合、対応するアミドに変換されるまで、または、エチルアミンガスが用いられた場合、対応するエチルアミドに変換されるまで、冷却しないで該飽和溶液を約１５〜３６時間混合することを含み；そして、
（ｆ）前記溶液から前記ペプチドを単離すること、
の各工程を含む、前記式（Ｉ）のペプチドの製造方法。
【請求項２】
Ａ１０がＧｌｙである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
以下のＢｏｃ−α−アミンアミノ酸、すなわちＮ−α−Ｂｏｃ−Ｌ−プロリン、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｌ−アルギニン・ＨＣｌ、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシン、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｄ−トリプトファン（Ｎ’−インドール−ホルミル）、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｌ−チロシン、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｌ−セリン水和物、Ｎ−α−Ｂｏｃ−トリプトファン（Ｎ’−インドール−ホルミル）、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｌ−ヒスチジン（トシル）−シクロヘキシルアミン塩、およびピログルタミン酸を、Ｃ末端からＮ末端まで連続してカップリングする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
アンモニア、第一アミンまたは第二アミン、および、アルコールを含む溶液での処理により、Ｔｒｐ側鎖のホルミル保護基を除去する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記溶液がアンモニアおよびメタノールを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
式（Ｉ）で示される前記ペプチドが、
【化２】
2004516330.tif 000005
である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｄ−トリプトファン（Ｎ’−インドール−ホルミル）、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｌ−チロシン、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｌ−セリン水和物、および、Ｎ−α−Ｂｏｃ−トリプトファン（Ｎ’−インドール−ホルミル）をカップリングする場合、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）も用いられる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
式（ＩＩ）：
【化３】
2004516330.tif 000006
で示されるペプチドの固相合成方法であって、式中、
Ａ１は、ｐＧｌｕまたはＮ−Ａｃ−Ｄ−β−Ｎａｌであり；
Ａ２は、Ｈｉｓ、Ｄ−ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ、またはＤ−ｐ−Ｆ−Ｐｈｅであり；
Ａ３は、Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−β−Ｎａｌ、またはＤ−Ｐａｌであり；
Ａ５は、Ｔｙｒ、ＮｉｃＬｙｓ、ｃＰｚＡＣＡｌａ、またはＰｉｃＬｙｓであり；
Ａ６は、Ｄ−β−Ｎａｌ、Ｄ−ｈＡｒｇ（Ｅｔ）２、Ｄ−Ｌｙｓ（ｉＰｒ）、Ｄ−ｈＡｒｇ（Ｂｕ）、Ｄ−ｈＡｒｇ（ＣＨ２ＣＦ３）２、Ｄ−Ｈｉｓ（Ｂｚｌ）、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｐａｌ、Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−ＮｉｃＬｙｓ、Ｄ−ＰｉｃＬｙｓ、またはＤ−Ｑａｌであり；
Ａ８は、Ａｒｇ、ｈＡｒｇ（Ｅｔ）２、ｈＡｒｇ（Ｂｕ）、ｈＡｒｇ（ＣＨ２ＣＦ３）２、またはＬｙｓ（ｉＰｒ）であり；
Ａ１０は、Ｇｌｙ、ＮＨＮＨＣＯまたはＤ−Ａｌａであるか、または、欠失しており；そして、
Ｒ１は、ＮＨ２またはＮＨＥｔであり；
ここで、Ａ３またはＡ６の少なくとも一つは、ＴｒｐまたはＤ−Ｔｒｐであり、
当該方法は、塩基に不安定な側鎖保護基を用いてトリプトファン残基を一時的に保護することを含み、ここで前記保護基は、固体支持体から式（ＩＩ）で示されるペプチドを開裂させる間、塩基と反応させることによって除去される、前記方法。
【請求項９】
前記ＴｒｐまたはＤ−Ｔｒｐ側鎖保護基がアシル基である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＴｒｐまたはＤ−Ｔｒｐ側鎖保護基が、アンモニア、第一アミンまたは第二アミン、および、アルコールを含む溶液での処理により除去される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記側鎖保護基がホルミルであり、前記塩基がアンモニアを含むメタノール溶液である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
Ａ３がＴｒｐである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ａ１がｐＧｌｕであり、Ａ２がＨｉｓであり、Ａ５がＴｙｒであり、Ａ６がＤ−Ｔｒｐであり、Ａ８がＡｒｇであり、Ａ１０がＧｌｙであり、そしてＲ１がＮＨ２である、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
式：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ２で示されるペプチドの固相合成方法であって、以下の保護されたアミノ酸、すなわち、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ、Ｂｏｃ−Ａｒｇ．ＨＣｌ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ、Ｂｏｃ−Ｄ−Ｔｒｐ（ＰＧ−１）、Ｂｏｃ−Ｔｙｒ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ、Ｂｏｃ−Ｔｒｐ（ＰＧ−１）、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（ＰＧ−２）、およびＢｏｃ−ｐＧｌｕを固体支持体上に連続的にカップリングする工程を含み、ここで、ＰＧ−１は、塩基に不安定な保護基であり、ＰＧ−２は、Ｈｉｓに対する保護基であり、前記方法は、前記ペプチドを前記支持体から開裂させること、および、前記トリプトファン残基から塩基を含む溶液を用いて前記ＰＧ−１を除去することの双方を含む、前記方法。
【請求項１５】
前記ＰＧ−１がアシル基である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記溶液が、アンモニア、第一アミンまたは第二アミンを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＧ−２がトシルである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＰＧ−１がホルミルであり、前記溶液がアンモニアを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
本明細書において実質的に記載され例証された、請求項１で与えられ定義される式（Ｉ）で示されるペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、固相を用いるＴｒｐ残基を有するペプチドの合成方法に関する。
【０００２】
背景技術
黄体形成ホルモン放出ホルモン（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ：ＬＨＲＨ）は、視床下部で生産される神経伝達物質であり、下垂体からの黄体形成ホルモン（ＬＨＲＨ）および卵胞刺激ホルモン（ｆｏｌｌｉｃｌｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ：ＦＳＨ）の分泌を安定化し、テストステロンのようなステロイドホルモンの性腺からの合成を順に刺激する。現在、多くのＬＨＲＨペプチド類似体（例えば、アゴニストおよびアンタゴニスト）が、子宮内膜症、前立腺ガン、早発思春期および他のホルモンが介在する障害の治療用として市販されている。このようなＬＨＲＨ類似体の合成は、難しく、費用がかかる。
【０００３】
液相ペプチド合成に関連した中間体精製の問題の多くを克服するという目的で、１９６３年に固相ペプチド合成が導入された。Ｓｔｅｗａｒｔト等， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， ２ｄ ｅｄ．） １９８４。固相合成の際、アミノ酸が、所望の配列のいずれかのペプチドに組み立てられ（すなわち、カップリングされる）、その一方で、鎖の一方の末端（すなわちＣ末端）が不溶性支持体に固定される。所望の配列が支持体上に共に連結されたら、次いで、ペプチドを支持体から切り離す（すなわち開裂させる）。
【０００４】
米国特許第４，０１０，１２５号（１９７７年）は、［Ｄ−Ｔｒｐ６］−ＬＨＲＨの合成を記載しており、それにおいて、ＬＨＲＨアゴニストの１０個の残基のうち４個の側鎖が保護されている（例えば、Ｌ−ヒスチジル（トシル）、セリル（ベンジル）、チロシル（２，６−ジ−Ｃｌ−Ｂｚｌ）、およびＬ−アルギニル（トシル））。しかしながら、その後、Ｃｏｙ等， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． １４：３５９（１９７９）により多数の他のＬＨＲＨ類似体の合成が報告され、それにおいて、最小限の側鎖保護、例えばアルギニンの塩の保護（すなわち、Ａｒｇ．ＨＣｌ）のみにより、相当する保護された合成より優れた収率が得られた。当業界の傾向がＬＨＲＨ類似体の合成においてアミノ酸側鎖を保護しないというのにもかかわらず、本発明は、固相合成の際にトリプトファン残基を保護することによって、トリプトファン残基を有するＬＨＲＨ類似体（例えば、［Ｄ−Ｔｒｐ６］ＬＨＲＨ）の収率が実際に改善されるという発見に向けられる。
【０００５】
発明の開示
一局面では、本発明は、式（Ｉ）：
【０００６】
【化４】
2004516330.tif 000002
【０００７】
で示されるペプチドの製造方法を提供する。式中、
Ａ１は、ｐＧｌｕまたはＮ−Ａｃ−Ｄ−β−Ｎａｌであり；
Ａ２は、Ｈｉｓ、Ｄ−ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ、またはＤ−ｐ−Ｆ−Ｐｈｅであり；
Ａ３は、ＴｒｐまたはＤ−Ｔｒｐであり；
Ａ５は、Ｔｙｒ、ＮｉｃＬｙｓ、ｃＰｚＡＣＡｌａ、またはＰｉｃＬｙｓであり；
Ａ８は、Ａｒｇ、ｈＡｒｇ（Ｅｔ）２、ｈＡｒｇ（Ｂｕ）、ｈＡｒｇ（ＣＨ２ＣＦ３）２、またはＬｙｓ（ｉＰｒ）であり；
Ａ１０は、Ｇｌｙ、Ｄ−Ａｌａであるか、または、欠失しており；および、
Ｒ１は、ＮＨ２またはＮＨＥｔであり：
当該方法は、以下の：
（ａ）Ａ１０が存在する場合はＢｏｃ−Ａ１０のセシウム塩を、または、Ａ１０が存在しない場合はＢｏｃ−Ｐｒｏを、クロロメチル化ポリスチレン樹脂に付着させ、それぞれＢｏｃ−Ａ１０−樹脂、または、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−樹脂を得ること；
（ｂ）Ｂｏｃ−Ａ１０−樹脂またはＢｏｃ−Ｐｒｏ−樹脂と、Ｂｏｃを脱ブロック化する有機酸の混合物とを混合することによってＢｏｃ−Ａ１０−樹脂またはＢｏｃ−Ｐｒｏ−樹脂を脱ブロック化し、それぞれＨ２Ｎ−Ａ１０−樹脂の有機酸塩、または、Ｈ２Ｎ−Ｐｒｏ−樹脂の有機酸塩を得ること；
（ｃ）Ｈ２Ｎ−Ａ１０−樹脂の有機酸塩、または、Ｈ２Ｎ−Ｐｒｏ−樹脂の有機酸塩を塩基で中和し、それぞれＨ２Ｎ−Ａ１０−樹脂またはＨ２Ｎ−Ｐｒｏ−樹脂を得ること；
（ｄ）Ｂｏｃ−α−アミンで保護されたアミノ酸と、Ｈ２Ｎ−Ａ１０−樹脂またはＨ２Ｎ−Ｐｒｏ−樹脂とをカップリングすること、ここで前記保護されたアミノ酸は、Ｃ末端からＮ末端まで示される順番の式（Ｉ）について定義されるアミノ酸に対応しており、工程（ｄ）は：
（ｉ）ペプチドカップリング剤の存在下で、Ｈ２Ｎ−Ａ１０−樹脂またはＨ２Ｎ−Ｐｒｏ−樹脂と、Ｂｏｃ−α−アミンで保護されたアミノ酸とを反応させ、Ｂｏｃでブロック化されたカップリングされた生成物を得ること；
（ｉｉ）Ｂｏｃでブロック化されたカップリングされた生成物と、Ｂｏｃを脱ブロック化する有機酸とを混合することによって、Ｂｏｃでブロック化されたカップリングされた生成物からＢｏｃ基を脱ブロック化し、カップリングした生成物を得ること；
（ｉｉｉ）ペプチドカップリング剤の存在下で、カップリングした生成物と、次のＢｏｃ−α−アミンで保護されたアミノ酸とを反応させ、Ｂｏｃでブロック化されたカップリングされた生成物を得ること；
（ｉｖ）Ｂｏｃでブロック化されたカップリングされた生成物と、Ｂｏｃを脱ブロック化する有機酸とを混合することによって、Ｂｏｃでブロック化されたカップリングされた生成物からＢｏｃ基を脱ブロック化し、次のカップリングした生成物を得ること；
（ｖ）式（Ｉ）で示されるペプチドのＮ末端アミノ酸がカップリングされ、Ｎ末端アミノ酸のＢｏｃ基が脱ブロック化されるまで、工程（ｄ）（ｉｉｉ）および（ｄ）（ｉｖ）を繰り返し、保護された完成ペプチド−樹脂を得ることを含み；
（ｅ）保護された完成ペプチド−樹脂を開裂および脱保護化し、式（Ｉ）で示されるペプチドを得ること、ここで（ｅ）は：
（ｉ）アルコール／不活性な極性非プロトン性溶媒混合物の、保護された完成ペプチド−樹脂溶液を作製すること；
（ｉｉ）約０℃〜約１０℃に該溶液を冷却すること；
（ｉｉｉ）該溶液中に、アンモニアガスまたはエチルアミンガスをゆっくりと泡立たせ、該溶液がアンモニアでよく飽和されるまで冷却し続け、飽和溶液を得ること；
（ｉｖ）９５％を超える遊離メチルエステルが、アンモニアガスが用いられた場合、対応するアミドに変換されるまで、または、エチルアミンガスが用いられた場合、対応するエチルアミドに変換されるまで、冷却しないで該飽和溶液を約１５〜３６時間混合することを含み；そして、
（ｆ）前記溶液から前記ペプチドを単離すること、
の各工程を含む。
【０００８】
上記方法の好ましい方法は、Ａ１０がＧｌｙの場合である。
【０００９】
直前に記載の方法のなかでも好ましい方法は、以下のＢｏｃ−α−アミンアミノ酸、すなわち、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｌ−プロリン、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｌ−アルギニン・ＨＣｌ、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシン、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｄ−トリプトファン（Ｎ’−インドール−ホルミル）、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｌ−チロシン、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｌ−セリン水和物、Ｎ−α−Ｂｏｃ−トリプトファン（Ｎ’−インドール−ホルミル）、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｌ−ヒスチジン（トシル）−シクロヘキシルアミン塩、およびピログルタミン酸を、Ｃ末端からＮ末端に連続してカップリングする場合である。
【００１０】
直前に記載の方法のなかでも好ましい方法は、Ｔｒｐ側鎖のホルミル保護基が、アンモニア、第一アミンまたは第二アミン、および、アルコールを含む溶液での処理により除去される場合である。
【００１１】
直前に記載の方法のなかでも好ましい方法は、前記溶液がアンモニアおよびメタノールを含む場合である。
【００１２】
直前に記載の方法のなかでも好ましい方法は、前記溶液から前記ペプチドを単離する工程が、
（ｉ）前記溶液をろ過して、ろ液を得ること、；および、
（ｉｉ）前記ろ液を濃縮すること、
を含む場合である。
【００１３】
直前に記載の方法のなかでも好ましい方法は、式（Ｉ）で示される前記ペプチドが、ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ２である場合である。
【００１４】
直前に記載の方法のなかでも好ましい方法は、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｄ−トリプトファン（Ｎ’−インドール−ホルミル）、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｌ−チロシン、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｌ−セリン水和物、および、Ｎ−α−Ｂｏｃ−トリプトファン（Ｎ’−インドール−ホルミル）をカップリングするとき、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）も使用する場合である。
【００１５】
他の局面では、本発明は、式（ＩＩ）：
【００１６】
【化５】
2004516330.tif 000003
【００１７】
で示されるペプチドの固相合成方法を提供する。式中、
Ａ１は、ｐＧｌｕまたはＮ−Ａｃ−Ｄ−β−Ｎａｌであり；
Ａ２は、Ｈｉｓ、Ｄ−ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ、またはＤ−ｐ−Ｆ−Ｐｈｅであり；
Ａ３は、Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−β−Ｎａｌ、またはＤ−Ｐａｌであり；
Ａ５は、Ｔｙｒ、ＮｉｃＬｙｓ、ｃＰｚＡＣＡｌａ、またはＰｉｃＬｙｓであり；
Ａ６は、Ｄ−β−Ｎａｌ、Ｄ−ｈＡｒｇ（Ｅｔ）２、Ｄ−Ｌｙｓ（ｉＰｒ）、Ｄ−ｈＡｒｇ（Ｂｕ）、Ｄ−ｈＡｒｇ（ＣＨ２ＣＦ３）２、Ｄ−Ｈｉｓ（Ｂｚｌ）、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｐａｌ、Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−ＮｉｃＬｙｓ、Ｄ−ＰｉｃＬｙｓ、またはＤ−Ｑａｌであり；
Ａ８は、Ａｒｇ、ｈＡｒｇ（Ｅｔ）２、ｈＡｒｇ（Ｂｕ）、ｈＡｒｇ（ＣＨ２ＣＦ３）２、またはＬｙｓ（ｉＰｒ）であり；
Ａ１０は、Ｇｌｙ、ＮＨＮＨＣＯまたはＤ−Ａｌａであるか、または、欠失しており；および、
Ｒ１は、ＮＨ２またはＮＨＥｔであり；ここで、Ａ３またはＡ６の少なくとも一つは、ＴｒｐまたはＤ−Ｔｒｐである。前記方法は、塩基に不安定な側鎖保護基をもちいてトリプトファン残基を一時的に保護することを含み、ここで前記保護基は、固体支持体から式（ＩＩ）で示されるペプチドを開裂させる間、塩基と反応させることによって除去される。
【００１８】
直前に記載の方法のなかでも好ましい方法は、前記ＴｒｐまたはＤ−Ｔｒｐ側鎖保護基がアシル基の場合である。
【００１９】
直前に記載の方法のなかでも好ましい方法は、前記ＴｒｐまたはＤ−Ｔｒｐ側鎖保護基が、アンモニア、第一アミンまたは第二アミン、および、アルコールを含む溶液で処理することにより除去される場合である。
【００２０】
他の直前に記載の方法のなかでも好ましい方法は、前記側鎖保護基がホルミルであり、前記塩基がアンモニアを含むメタノール溶液の場合である。
【００２１】
直前に記載の方法のなかでも好ましい方法は、Ａ３がＴｒｐの場合である。
【００２２】
直前に記載の方法のなかでも好ましい方法は、Ａ１がｐＧｌｕであり、Ａ２がＨｉｓであり、Ａ５がＴｙｒであり、Ａ６がＤ−Ｔｒｐであり、Ａ８がＡｒｇであり、Ａ１０がＧｌｙであり、そしてＲ１がＮＨ２の場合である。
【００２３】
さらに他の局面では、本発明は、式：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ２で示されるペプチドの固相合成方法に向けられており、当該方法は、以下の保護されたアミノ酸、すなわち、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ、Ｂｏｃ−Ａｒｇ．ＨＣｌ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ、Ｂｏｃ−Ｄ−Ｔｒｐ（ＰＧ−１）、Ｂｏｃ−Ｔｙｒ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ、Ｂｏｃ−Ｔｒｐ（ＰＧ−１）、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（ＰＧ−２）、およびＢｏｃ−ｐＧｌｕを固体支持体上に連続的にカップリングする工程を含み、ここで、ＰＧ−１は、塩基に不安定な保護基であり、ＰＧ−２は、Ｈｉｓに対する保護基であり、前記方法は、前記ペプチドを前記支持体から開裂させること、および、前記トリプトファン残基から、塩基を含む溶液を用いて前記ＰＧ−１を除去することの双方を含む。
【００２４】
直前に記載の方法のなかでも好ましい方法は、前記ＰＧ−１がアシル基の場合である。
【００２５】
直前に記載の方法のなかでも好ましい方法は、前記溶液がアンモニア、第一アミンまたは第二アミンを含む場合である。
【００２６】
直前に記載の方法のなかでも好ましい方法は、前記ＰＧ−２がトシルの場合である。
【００２７】
直前に記載の方法のなかでも好ましい方法は、前記ＰＧ−１がホルミルであり、前記溶液がアンモニアを含む場合である。
【００２８】
本発明の他の特徴および利点は、発明の詳細な説明、および特許請求の範囲から明白である。
【００２９】
略語
ＢＯＣ＝ｔ−ブトキシカルボニル
Ｃｉｔ＝シトルリン
ｃＰｚＡＣＡｌａ＝シス−３−（４−ピラジニルカルボニルアミノシクロヘキシル）アラニン
ｈＡｒｇ（Ｂｕ）＝Ｎ−グアニジノ−（ブチル）−ホモアルギニン
ｈＡｒｇ（Ｅｔ）２＝Ｎ，Ｎ’−グアニジノ−（ジメチル）−ホモアルギニン
ｈＡｒｇ（ＣＨ２ＣＦ３）２＝Ｎ，Ｎ’−ビス−（２，２，２−トリフルオロエチル）−ホモアルギニン
ＨＯＢＴ＝１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
Ｌｙｓ（ｉＰｒ）＝Ｎε−イソプロピルリシン
β−Ｎａｌ＝特に指示がない限り、β−１−ナフチルアラニンまたはβ−２−ナフチルアラニン
ＮｉｃＬｙｓ＝Ｎε−ニコチノイルリシン
Ｐａｌ＝ピリジルアラニン
ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ＝３−（４−クロロフェニル）アラニン
ｐ−Ｆ−Ｐｈｅ＝３−（４−フルオロフェニル）アラニン
ＰｉｃＬｙｓ＝Ｎε−ピコリノイルリシン
Ｑａｌ＝キノリルアラニン。
【００３０】
当業者であれば、本明細書の説明に基づき本発明を最大限利用することができると考えられる。従って、以下の特定の実施形態は、単に例証のためであって、本発明の範囲を制限するものではない、と解釈されるべきである。
【００３１】
特に定義しない限り、本明細書中で用いられた全ての技術的および科学的用語は、当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で示された全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照として本明細書中に含まれる。
【００３２】
式（Ｉ）で示されるペプチドは、メリフィールド樹脂（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ ｒｅｓｉｎ）でのＢｏｃ化学法を用いた固相ペプチド合成によって調製することができ、続いて、アルコール中のアンモニア、第一アミンまたは第二アミンを用いて樹脂からペプチドを開裂させることによって、表題のペプチドを得ることができる。
【００３３】
このような本発明に係る方法の第一工程は、エステル結合を介して、メリフィールド樹脂に、Ｃ末端アミノ酸であるＢｏｃ−Ａ１０のセシウム塩を付着させることである。Ｂｏｃ−Ａ１０のセシウム塩は、メタノールと水との混合物中で、Ｂｏｃ−Ａ１０を炭酸セシウムに添加することによって形成される。Ｂｏｃ−Ａ１０のセシウム塩は、減圧下で乾燥され、続いて、無水極性非プロトン性溶媒、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で、ポリスチレンのクロロメチルベンジル基と反応させる。この反応は、約２４〜４８時間、好ましくは３６時間、約４５℃〜６０℃で、好ましくは５０℃で行われる。次に、反応させた樹脂をろ過し、水、極性非プロトン性溶媒（例えばＤＭＦ）およびアルコール（例えばメタノール）でリンスし、続いて、好ましくは減圧下で、恒量になるまで乾燥させる。乾燥した樹脂を試験し、樹脂の乾燥グラムあたりＡ１０のミリモルとして表されるＢｏｃ−Ａ１０の含有量を決定することができる。計算値を用いて、その後に使用する物質の量のためにアセンブリー反応の大きさと、理論的な収率計算値とを決定する。
【００３４】
式（Ｉ）で示されるペプチドの合成は、底部に焼結ガラスディスクフィルターを備えたガラス製反応器に含まれるＢｏｃ−Ａ１０−樹脂について行うことができる。その反応器を機械式スターラーで撹拌し、不活性ガス圧（例えば窒素圧）を適用し、樹脂を反応器内に保持しながら、下部の焼結ディスクから液体を強制的に引き出すことによって排液する。先ず、Ａ１０−樹脂と、塩素化溶媒中の有機酸混合物、好ましくはジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液中の２５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）とを、初めは約２分間、続いて約２５分間、２回混合し、続いて窒素圧の助けで排液することによって、Ａ１０−樹脂からＢｏｃ−Ａ１０のＢｏｃ基を除去する（例えば、脱ブロック化する）。Ａ１０−樹脂を、ＤＣＭで３回、アルコール（例えばイソプロピルアルコール（ＩＰＡ））で２回リンスし、得られたアミノ−ＴＦＡ塩を、不活性溶媒中の塩基で、好ましくはＤＣＭ中の１０％トリエチルアミン塩基で、２回、それぞれ約５分間中和し、再びＤＣＭで３回リンスする。
【００３５】
次に、その樹脂を、Ｂｏｃ−α−アミノで保護されたアミノ酸の２．５モル等量の混合物（当該保護アミノ酸は、Ｃ末端からＮ末端に進む式（Ｉ）について定義されたアミノ酸に対応する）と、反応媒体として、極性非プロトン性溶媒、好ましくはＤＭＦ／ＤＣＭ混合物中で、ペプチドカップリング剤、好ましくは、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を用いて、カップリングする。各カップリングの後、ＤＭＦとＤＣＭとでリンスする。その樹脂を、各カップリングの完了に関して、アルギニン以外はカイザーのニンヒドリンにより試験でき、アルギニンはイサチンを用いて試験し、残留した未カップリングのプロリンの第二アミンを検出することができる。Ｂｏｃ基を各カップリングされたアミノ酸から除去し、続いて上述の通り試験する。以下の保護されたアミノ酸は、式（Ｉ）で示されるアミノ酸に対応しており、本発明の合成に好ましく用いられる。すなわち、保護されたアミノ酸は、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｌ−プロリン、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｌ−アルギニン・ＨＣｌ、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシン、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｄ−トリプトファン（Ｎ’−インドール−ホルミル）、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｌ−チロシン、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｌ−セリン水和物、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｌ−ヒスチジン（トシル）−シクロヘキシルアミン塩、およびピログルタミン酸である。
【００３６】
また、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、およびＴｒｐの保護誘導体をカップリングする場合、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）も用いることができる（３〜５当量）。最後のアミノ酸カップリングの後、ＤＭＦ中で、ＨＯＢＴで２回、１時間（それぞれ）処理することにより、ヒスチジンのトシル側鎖保護基を除去する。Ｂｏｃ−Ｄ−トリプトファンおよびＢｏｃ−Ｌ−トリプトファンは、インドール環の窒素上のホルミルで保護された側鎖である。当該ホルミルは、後で、塩基を用いてペプチドを樹脂から開裂させる際に除去される。
【００３７】
風袋を測った（ｔａｒｅｄ）焼結ガラス漏斗の中へ、完成したペプチド−樹脂を不活性塩素化溶媒（例えばＤＣＭ）でリンスして入れ、アルコール（例えばメタノール）で２回リンスし、減圧下で乾燥する。乾燥したペプチド−樹脂を、１リットルの三つ口丸底フラスコに移す。メタノール／ＤＭＦが９：１の混合物を、ペプチド樹脂１グラムあたり約１５ミリリットルの割合で、その丸底フラスコに加える。その溶液を約１０℃より低い温度に冷却し、ペプチドのＣ末端アミド形態が望ましい場合、よく飽和されるまで（約１時間の追加）、強く冷却しながらアンモニアガスをゆっくりと泡立たせ、ここで、ペプチドが遊離メチルエステル中間体の形態で樹脂から解放される。その溶液を冷却しないでさらに約１５〜３６時間混合し、この間に、約９５％を超える遊離メチルエステルが対応するアミド生成物に変換される。反応の進行は、例えば高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いてモニターすることができ、所望の程度に反応が完了したところで停止させることができる。溶液中の生成物を焼結ガラス漏斗でろ過し、樹脂をメタノールとＤＭＦとで数回リンスする。全てのリンス液およびろ液を、非常に濃厚な油状物になるまで濃縮する。酢酸エチルを加え、その溶液をつっついて生成物を凝固させ、デカントし、再度酢酸エチルでのつっつきを繰り返す。その粗生成物を、メタノールに溶解し、等量の４Ｎ酢酸を加える。その溶液を濃縮して、全てのメタノールを除去する。その生成物を、４Ｎ酢酸で希釈する。
【００３８】
直前に述べた段落の方法において、アンモニアの代わりにエチルアミンを用いることによってペプチドのＣ末端エチルアミド形態を得ることができ、ここで、エチルアミンでその溶液が飽和する間、その溶液の温度を約１６℃未満の温度、好ましくは約５℃〜約１５℃に維持する。
【００３９】
逆相分取クロマトグラフィーを繰り返し実行し、凍結乾燥することによって、粗物質を精製し、最終生成物を得ることができる。
【００４０】
他の溶媒系も用いられることは当業者に明らかであり、例えば、低分子量アルコール、例えばエタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等、他の極性非プロトン性溶媒、およびその混合物が上げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
本発明を実施する形態
以下の実施例は、本発明の方法を例証する目的で記載されており、いかようにも本発明を制限するものとは解釈してはならない。
【００４２】
実施例
ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（［Ｄ−Ｔｒｐ６］ＬＨＲＨ−ＮＨ２）の合成
メリフィールド樹脂でのＢｏｃ化学法を用いた固相ペプチド合成し、続いて、メタノール性アンモニアを用いて樹脂からペプチドを開裂させることにより、表題のペプチドである［Ｄ−Ｔｒｐ６］ＬＨＲＨ−ＮＨ２を調製して得た。
【００４３】
本方法の第一工程は、エステル結合を介して、Ｃ末端アミノ酸であるＢｏｃ−グリシンのセシウム塩を、メリフィールド樹脂に付着させることである。Ｂｏｃ−グリシンのセシウム塩を、Ｂｏｃ−グリシン（４０．９ｇ）と炭酸セシウム（３７．９ｇ）とを、メタノールおよび水の混合物（８０ｍｌ／４０ｍｌ）中で反応させることによって形成する。Ｂｏｃ−グリシンのセシウム塩を減圧下で乾燥させ、続いて、無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；２００ｍｌ）中のポリスチレンビーズ（メリフィールド樹脂；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ社製、８８．２ｇ）のクロロメチルベンジル基と反応させた。この反応をＢｕｃｈｉ（登録商標）モデルの１１０ロータリーエバポレーターで約５０℃で約３６時間続けた。
【００４４】
次に、反応させた樹脂をろ過し、水、ＤＭＦおよびメタノールでリンスし、続いて、恒量になるまで、３５℃未満の温度で減圧下乾燥させた。次に、乾燥した樹脂を試験し、樹脂の乾燥グラムあたりグリシンのミリモルとして表されるＢｏｃ−グリシン含有量を決定した。０．８７２ミリモル／グラムの計算値が得られ、それを用いて、その後に使用する物質の量のためにアセンブリー反応の正確な規模と、理論的な収率計算値とを決定した。
【００４５】
ペプチドの合成は、反応器の底部および頂部に焼結ガラスディスクフィルターを備えた５００ｍｌのガラス製反応器に含まれるＢｏｃ−グリシン樹脂（１２．５ｇ）について行われた。その反応器を底から満たし、反転させることにより振盪した（３秒で１８０度回転させた）。初めに、をジクロロメタン（ＤＣＭ）中の２５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１７５ｍｌ）で２回（２分および２５分）樹脂を混合することによって、Ｂｏｃ基をグリシン樹脂から除き（例えば、脱ブロック化して）、続いて、窒素圧を用いて排液した。その樹脂を、１２５ｍｌのＤＣＭで３回、１２５ｍｌのイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）で２回、続いて１２５ｍｌのＤＣＭで３回、リンスした。得られたアミノ−ＴＦＡ塩を、ＤＣＭ中の１０％トリエチルアミン塩基（１２５ｍｌ）で２回、それぞれ５分間中和し、再びＤＣＭで３回リンスした。
【００４６】
次に、その樹脂をカップリングし、以下のＢｏｃで保護したアミノ酸と、１６ｍｌのＤＭＦおよび４７ｍｌのＤＣＭ中のジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（４．２ｍｌ）との２．５モル等量の混合物で、脱ブロック化した；ここで、上記Ｂｏｃで保護したアミノ酸は、５．８４ｇのＢｏｃ−Ｌ−プロリン、８．９３ｇのＢｏｃ−Ｌ−アルギニン・ＨＣｌ、６．７７ｇのＢｏｃ−Ｌ−ロイシン、９．０ｇのＢｏｃ−Ｄ−トリプトファン（ホルミル）、７．６４ｇのＢｏｃ−Ｌ−チロシン、９．０ｇのＢｏｃ−Ｌ−トリプトファン（ホルミル）、６．０６ｇのＢｏｃ−Ｌ−セリン水和物、１６ｇのＢｏｃ−Ｌ−ヒスチジン（トシル）シクロヘキシルアミン塩、および１３．５ｇのピログルタミン酸である。Ｄ−Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、およびＴｒｐのカップリングには、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）も用いた（３〜５当量）。Ａｒｇのカップリングには、ＤＭＦおよびＤＣＭの代わりに、７５ｍｌのジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）を用いた。上記樹脂をＤＭＦとＤＣＭとでリンスし、カップリングの完了をカイザーのニンヒドリンにより試験した。上述したようにカップリングされたアミノ酸それぞれからＢｏｃ基を除去した。ヒスチジンは、トシルで保護された側鎖であり、これは、最後のアミノ酸カップリングの後、１０５ｍｌのＤＭＦ中のＨＯＢＴ（４．１６ｇ）で２回、１時間（それぞれ）処理することによって除去された。Ｂｏｃ−Ｄ−トリプトファンおよびＢｏｃ−Ｌ−トリプトファンは、ホルミルで保護された側鎖であり、これは、樹脂からペプチドを開裂させる際に除去された。
【００４７】
風袋を測った焼結ガラス漏斗の中へ、完成したペプチド−樹脂をＤＣＭでリンスして入れ、メタノールで２回リンスし、減圧下で乾燥した。乾燥したペプチド−樹脂を１リットルの三つ口丸底フラスコに移した。９：１のメタノール／ＤＭＦ中、１５ｍｌ／グラムのペプチド樹脂（１０．９ｍＭに対し３８０ｍｌのスケール）を、そのフラスコに加えた。その溶液を約１０℃未満の温度に冷却し、十分飽和されるまで（約１時間の追加）、強く冷却しながらアンモニアガスをゆっくりと泡立たせた。高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）でモニターすることにより決定して、９５％を超える遊離メチルエステルがアミド生成物に変換されるまで、その溶液を冷却しないでさらに約１５〜３６時間混合した。溶液状の生成物を焼結ガラス漏斗でろ過し、樹脂をメタノールおよびＤＭＦで数回リンスした。全てのリンス液およびろ液を、非常に濃厚な油状物になるまで、ロータリーエバポレーターで、４０℃より低い温度で濃縮した。酢酸エチル（０．０８リットル）を加え、その溶液をつっついて生成物を凝固させ、デカントし、０．０８リットルの酢酸エチルで繰り返した。固い、ゴム状の生成物を酢酸エチルに一晩浸し、デカントした。その粗生成物を、メタノール（０．０７リットル）に溶解し、等量の４Ｎ酢酸を加えた。その溶液をロータリーエバポレーターを用いて４０℃より低い温度で濃縮して、全てのメタノールを除去した。その生成物を、４Ｎ酢酸で、約３５グラム生成物／リットルに希釈した。
【００４８】
次に、逆相クロマトグラフィーを繰り返し実施し、凍結乾燥することによって粗物質を精製し、最終生成物（８．４ｇｍ、５９％収率）を、白色固体として、９９％を超える純度で得た。
【００４９】
他の実施態様
上記説明から、当業者であれば、本発明の本質的な特徴を容易に確認することができ、本発明の意図および範囲から逸脱することなく、本発明を多様に変化および改変させて、多様な用途および条件に適合させることができる。従って、他の実施態様もまた、特許請求の範囲内である。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004516330.tif 000036
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