(57)【要約】ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）に富んだ糖タンパク質（ＨＲＧＰ）、反復性のプロリンに富んだタンパク質（ＲＰＲＰ）およびアラビノガラクタンタンパク質（ＡＧＰ）の生産に対して新たな解決法を提示する、植物ゴムの分野における新たなアプローチを説明する。植物宿主細胞を含む宿主細胞における、アラビアゴム糖タンパク質（ＧＡＧＰ）のペプチド配列を含む、このような糖タンパク質の反復性ペプチド配列から設計した、合成遺伝子の発現を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列
2004516003.tif 000074
（ここでＡはＳｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＢはＨｙｐ、Ｐｒｏ、ＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＣはＰｒｏおよびＨｙｐから選択され；ＤはＨｙｐ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＥはＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＦはＳｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＧはＳｅｒ、Ｌｅｕ、Ｈｙｐ、Ｔｈｒ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；ＨはＨｙｐ、Ｐｒｏ、ＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＩはＴｈｒ、ＡｌａおよびＳｅｒから選択され；ＪはＴｈｒ、ＳｅｒおよびＡｌａから選択され；ＫはＴｈｒ、Ｌｅｕ、Ｈｙｐ、Ｓｅｒ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；ＬはＧｌｙ、Ｌｅｕ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；かつＭはＨｉｓおよびＰｒｏから選択される）
の少なくとも一部分を含み、該部分が該アミノ酸配列の１２個の連続したアミノ酸より長い、実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項２】
部分がポリペプチド中に反復配列として存在する、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
反復配列が１回から６４回繰り返す、請求項２記載のポリペプチド。
【請求項４】
ＡがＳｅｒであり；ＢがＨｙｐおよびＬｅｕから選択され；ＤがＨｙｐ、ＳｅｒおよびＴｈｒから選択され；ＥがＬｅｕであり；ＦがＳｅｒであり；ＧがＳｅｒ、ＬｅｕおよびＨｙｐから選択され；ＨがＨｙｐ、ＰｒｏおよびＬｅｕから選択され；ＩがＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＪがＴｈｒであり；ＫがＴｈｒ、ＬｅｕおよびＨｙｐから選択され；ＬがＧｌｙおよびＬｅｕから選択され；かつＭがＨｉｓおよびＰｒｏから選択される、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項５】
アミノ酸配列が、
2004516003.tif 000075
2004516003.tif 000076
2004516003.tif 000077
（ここでＡはＨｙｐ、ＴｈｒおよびＳｅｒから選択され、かつＢはＨｙｐおよびＬｙｓから選択される）、配列番号：１３１ならびに配列番号：１３３から選択される、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項６】
部分が（Ｘａａ−Ｈｙｐ）ｘ（配列番号：１８２）およびＸａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ（配列番号：１８３）（ここでＸａａはヒドロキシプロリン以外の任意のアミノ酸であり、ｘは２から１０００である）から選択されるモチーフを含む、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項７】
部分が配列Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ−Ｈｙｐ（配列番号：９）を含み、ＸａａはＳｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択される、請求項６記載のポリペプチド。
【請求項８】
部分が、Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐｎ（配列番号：２０９）およびＸａａ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐｎ（配列番号：２１０）（ここでｎは１から１００であり、Ｘａａはヒドロキシプロリン以外の任意のアミノ酸である）から選択されるモチーフを含む、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項９】
部分が、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ２（配列番号：２１１）、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ３（配列番号：２１２）、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ４（配列番号：３）、Ｔｈｒ−Ｈｙｐ２（配列番号：２１３）およびＴｈｒ−Ｈｙｐ３（配列番号：２１４）から選択されるペプチド配列を含む、請求項８記載のポリペプチド。
【請求項１０】
部分が、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ２−Ｐｒｏ（配列番号：２１５）およびＳｅｒ−Ｈｙｐ２−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ（配列番号：２１６）から選択されるペプチド配列を含む、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項１１】
（Ｘａａ−Ｈｙｐ）ｘ（配列番号：１８２）およびＸａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ（配列番号：１８３）（ここでＸａａはヒドロキシプロリン以外の任意のアミノ酸であり、ｘは２から１０００である）から選択される第１のモチーフを含む、実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項１２】
配列がＸａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ−Ｈｙｐ（配列番号：９）であり、かつＸａａはＳｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択される、請求項１１記載のポリペプチド。
【請求項１３】
Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐｎ（配列番号：２０９）およびＸａａ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐｎ（配列番号：２１０）（ここでｎは１から１００であり、Ｘａａはヒドロキシプロリン以外の任意のアミノ酸である）から選択される第２のモチーフをさらに含む、請求項１１記載のポリペプチド。
【請求項１４】
第１および第２のモチーフがポリペプチド中に交互に存在する、請求項１３記載のポリペプチド。
【請求項１５】
交互に存在する第１および第２のモチーフが、１回から５００回繰り返す、請求項１４記載のポリペプチド。
【請求項１６】
Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐｎ（配列番号：２０９）およびＸａａ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐｎ（配列番号：２１０）（ここでｎは１から１００であり、Ｘａａはヒドロキシプロリン以外の任意のアミノ酸である）から選択されるモチーフを含む、実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項１７】
部分が、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ２（配列番号：２１１）、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ３（配列番号：２１２）、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ４（配列番号：３）、Ｔｈｒ−Ｈｙｐ２（配列番号：２１３）およびＴｈｒ−Ｈｙｐ３（配列番号：２１４）から選択されるペプチド配列を含む、請求項１６記載のポリペプチド。
【請求項１８】
以下から選択されるアミノ酸配列の少なくとも一部分に機能的に結合した、非アラビアゴムタンパク質配列および非アラビアゴム糖タンパク質配列から選択される第１の配列を含む融合タンパク質：（ａ）Ａ−Ｈｙｐ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ−Ｈｙｐ−Ｇ−Ｈ−Ｉ−Ｈｙｐ−Ｊ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐ−Ｋ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｍ（配列番号：１３６）（ここでＡはＳｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＢはＨｙｐ、Ｐｒｏ、ＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＣはＰｒｏおよびＨｙｐから選択され；ＤはＨｙｐ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＥはＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＦはＳｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＧはＳｅｒ、Ｌｅｕ、Ｈｙｐ、Ｔｈｒ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；ＨはＨｙｐ、Ｐｒｏ、ＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＩはＴｈｒ、ＡｌａおよびＳｅｒから選択され；ＪはＴｈｒ、ＳｅｒおよびＡｌａから選択され；ＫはＴｈｒ、Ｌｅｕ、Ｈｙｐ、Ｓｅｒ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；ＬはＧｌｙ、Ｌｅｕ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；かつＭはＨｉｓおよびＰｒｏから選択され、さらに該部分は該アミノ酸配列の１２個の連続したアミノ酸より長い）、（ｂ）（Ｘａａ−Ｈｙｐ）ｘ（配列番号：１８２）およびＸａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ（配列番号：１８３）（ここでｘは２から１０００である）から選択される、第１のモチーフを含むポリペプチド、（ｃ）Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐｎ（配列番号：２０９）およびＸａａ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐｎ（配列番号：２１０）（ここでｎは１から５００である）から選択される第２のモチーフを含むポリペプチド、ならびに（ｄ）該第１のモチーフおよび該第２のモチーフを含むポリペプチド（ここでＸａａはヒドロキシプロリン以外の任意のアミノ酸である）。
【請求項１９】
第１の配列が緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列である、請求項１８記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
以下から選択されるアミノ酸配列の少なくとも一部分をコードする、単離されたポリヌクレオチド配列：
2004516003.tif 000078
（ここでＡはＳｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＢはＨｙｐ、Ｐｒｏ、ＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＣはＰｒｏおよびＨｙｐから選択され；ＤはＨｙｐ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＥはＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＦはＳｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＧはＳｅｒ、Ｌｅｕ、Ｈｙｐ、Ｔｈｒ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；ＨはＨｙｐ、Ｐｒｏ、ＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＩはＴｈｒ、ＡｌａおよびＳｅｒから選択され；ＪはＴｈｒ、ＳｅｒおよびＡｌａから選択され；ＫはＴｈｒ、Ｌｅｕ、Ｈｙｐ、Ｓｅｒ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；ＬはＧｌｙ、Ｌｅｕ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；かつＭはＨｉｓおよびＰｒｏから選択され、さらに該部分は、該アミノ酸配列の１２個の連続したアミノ酸より長い）、（ｂ）（Ｘａａ−Ｈｙｐ）ｘ（配列番号：１８２）およびＸａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ（配列番号：１８３）（ここでｘは２から１０００である）から選択される、第１のモチーフを含むポリペプチド、（ｃ）Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐｎ（配列番号：２０９）およびＸａａ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐｎ（配列番号：２１０）（ここでｎは１から５００である）から選択される、第２のモチーフを含むポリペプチド、ならびに（ｄ）該第１のモチーフおよび該第２のモチーフを含むポリペプチド（ここでＸａａはヒドロキシプロリン以外の任意のアミノ酸である）。
【請求項２１】
以下から選択されるアミノ酸配列の一部分をコードするポリヌクレオチド配列を含む、組換え発現ベクター：
2004516003.tif 000079
（ここでＡはＳｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＢはＨｙｐ、Ｐｒｏ、ＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＣはＰｒｏおよびＨｙｐから選択され；ＤはＨｙｐ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＥはＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＦはＳｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＧはＳｅｒ、Ｌｅｕ、Ｈｙｐ、Ｔｈｒ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；ＨはＨｙｐ、Ｐｒｏ、ＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＩはＴｈｒ、ＡｌａおよびＳｅｒから選択され；ＪはＴｈｒ、ＳｅｒおよびＡｌａから選択され；ＫはＴｈｒ、Ｌｅｕ、Ｈｙｐ、Ｓｅｒ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；ＬはＧｌｙ、Ｌｅｕ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；かつＭはＨｉｓおよびＰｒｏから選択され、さらに該部分は、該アミノ酸配列の１２個の連続したアミノ酸より長い）、（ｂ）（Ｘａａ−Ｈｙｐ）ｘ（配列番号：１８２）およびＸａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ（配列番号：１８３）（ここでｘは２から１０００である）から選択される、第１のモチーフを含むポリペプチド、（ｃ）Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐｎ（配列番号：２０９）およびＸａａ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐｎ（配列番号：２１０）（ここでｎは１から５００である）から選択される、第２のモチーフを含むポリペプチド、ならびに（ｄ）該第１のモチーフおよび該第２のモチーフを含むポリペプチド（ここでＸａａはヒドロキシプロリン以外の任意のアミノ酸である）。
【請求項２２】
ポリヌクレオチド配列に機能的に結合したプロモーターをさらに含む、請求項２１記載の発現ベクター。
【請求項２３】
プロモーターがウイルスプロモーターである、請求項２２記載の発現ベクター。
【請求項２４】
ウイルスプロモーターが、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓおよび１９Ｓ ＲＮＡプロモーターからなる群より選択される、請求項２３記載の発現ベクター。
【請求項２５】
エクステンシンシグナル配列（配列番号：１４）、およびトマトのアラビノガラクタンタンパク質シグナル配列（配列番号：２１５）から選択されるシグナル配列をさらに含む、請求項２２記載の発現ベクター。
【請求項２６】
レポーター遺伝子をさらに含む、請求項２５記載の発現ベクター。
【請求項２７】
レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質遺伝子である、請求項２６記載の発現ベクター。
【請求項２８】
ベクターが宿主細胞の内部に含まれる、請求項２１記載の発現ベクター。
【請求項２９】
宿主細胞が植物細胞である、請求項２８記載の発現ベクター。
【請求項３０】
植物細胞が部分を含む糖タンパク質を発現する、請求項２９記載の発現ベクター。
【請求項３１】
以下の段階を含む、糖タンパク質の少なくとも一部分を産生するための方法：
ａ）ｉ）以下から選択されるアミノ酸配列の少なくとも一部分をコードする、ポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター：
2004516003.tif 000080
（ここでＡはＳｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＢはＨｙｐ、Ｐｒｏ、ＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＣはＰｒｏおよびＨｙｐから選択され；ＤはＨｙｐ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＥはＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＦはＳｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＧはＳｅｒ、Ｌｅｕ、Ｈｙｐ、Ｔｈｒ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；ＨはＨｙｐ、Ｐｒｏ、ＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＩはＴｈｒ、ＡｌａおよびＳｅｒから選択され；ＪはＴｈｒ、ＳｅｒおよびＡｌａから選択され；ＫはＴｈｒ、Ｌｅｕ、Ｈｙｐ、Ｓｅｒ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；ＬはＧｌｙ、Ｌｅｕ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；かつＭはＨｉｓおよびＰｒｏから選択され、さらに該部分は、該アミノ酸配列の１２個の連続するアミノ酸より長い）、（ｂ）（Ｘａａ−Ｈｙｐ）ｘ（配列番号：１８２）およびＸａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ（配列番号：１８３）（ここでｘは２から１０００である）から選択される、第１のモチーフを含むポリペプチド、（ｃ）Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐｎ（配列番号：２０９）およびＸａａ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐｎ（配列番号：２１０）（ここでｎは１から５００である）から選択される、第２のモチーフを含むポリペプチド、ならびに（ｄ）該第１のモチーフおよび該第２のモチーフを含むポリペプチド（ここでＸａａはヒドロキシプロリン以外の任意のアミノ酸である）；ならびに
ｉｉ）宿主細胞
を提供する段階；ならびに
ｂ）該部分が発現されるような条件下で、該ベクターを該宿主細胞に導入する段階。
【請求項３２】
宿主細胞が培養で増殖している、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
ｃ）宿主細胞の培養物から部分を回収する段階
をさらに含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
宿主細胞が植物細胞である、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
植物細胞がマメ科から選択される植物に由来する、請求項３４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般に、植物ゴムおよび他のヒドロキシプロリンに富んだ糖タンパク質の分野に関し、特に、反復性ペプチド配列から設計した合成遺伝子の発現に関する。
【０００２】
背景
ゴム腫は、樹皮の亀裂部にゴム性密封物質の滲出が起こる一般的な創傷反応である。スティーブン（Ａ．Ｍ． Ｓｔｅｐｈｅｎ）ら、「滲出性ゴム（Ｅｘｕｄａｔｅ Ｇｕｍｓ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）。この滲出物は一般に、ガラクタン［Ｇ．Ｏ． Ａｓｐｉｎａｌｌ、「植物ゴム（Ｐｌａｎｔ Ｇｕｍｓ）」、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ２Ｂ：５２２５３６（１９７０）］およびヒドロキシプロリンに富んだ糖タンパク質［ＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＭｃＤｏｕｇａｌｌ、「フィロディニア系に属する８種のオーストラリア・アカシア種由来のゴム性滲出物の化学的特徴の決定（Ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｕｍ ｅｘｕｄａｔｅｓ ｆｒｏｍ ｅｉｇｈｔ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ａｃａｃｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｐｈｙｌｌｏｄｉｎｅａｅ）」、Ｆｏｏｄ Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ、２：３２９（１９８８）］などの、細胞壁成分に構造的にかかわる多糖類と糖タンパク質との複合物である。
【０００３】
アラビアゴムは、これらの滲出物の中でも特徴が最も明らかにされたものと思われる（しかし、その化学分析は依然として非常に困難である）。これはさまざまなアカシア属の樹木から分泌される天然の植物滲出物である。アカシア・セネガル（Ａｃａｃｉａ ｓｅｎｅｇａｌ）はアラビアゴムの生産量の約８０％を占め、アカシア・セヤル（Ａｃａｃｉａ ｓｅｙａｌ）、アカシア・レイタ（Ａｃａｃｉａ ｌａｅｔａ）、アカシア・カンプリラカンタ（Ａｃａｃｉａ ｃａｍｐｌｙｌａｃａｎｔｈａ）およびアカシア・ドレパノロビウム（Ａｃａｃｉａ ｄｒｅｐａｎｏｌｏｂｉｕｍ）が残りの２０％を占める。ゴムはアフリカで手作業で収穫されている。これは、樹皮に穴を開けたり樹皮を剥いだりした後に、機械的創傷に反応して形成された涙滴状の乾燥した球状物質を時間をおいて回収するという、時間のかかる面倒な作業である。
【０００４】
アラビアゴムの厳密な化学的性質は解明されていない。これはミクロ不均一性（ｍｉｃｒｏｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）のグルクロノアラビノラムノガラクタンポリサッカライドおよび高分子量のヒドロキシプロリンに富んだ糖タンパク質という２種類の主成分からなると考えられている。オスマン（Ｏｓｍａｎ）ら「陰イオン交換クロマトグラフィーによって入手したアラビアゴム画分の特徴決定（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｕｍ Ａｒａｂｉｃ Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ Ｏｂｔａｉｎｅｄ Ｂｙ Ａｎｉｏｎ−Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）」Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：４０９（１９８４）およびチー（Ｑｉ）ら「アラビアゴム糖タンパク質は撚糸状の細線維である（Ｇｕｍ Ａｒａｂｉｃ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｓ Ａ Ｔｗｉｓｔｅｄ Ｈａｉｒｙ Ｒｏｐｅ）」、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９６：８４８（１９９１）。タンパク質部分のアミノ酸組成は分析されているが、正確なアミノ酸配列はほとんどわかっていない。
【０００５】
アラビアゴムの厳密な化学的性質はまだ不明であるが、このゴムは他のゴムに比べて溶解性が高く粘性が低いため、特に有用である。ＦＤＡはこのゴムがＧＲＡＳ承認を受けた食品添加物であることを公表している。このため、これは食品産業で増粘剤、乳化剤、安定剤、界面活性剤、保護コロイドおよび風味固定剤（ｆｌａｖｏｒ ｆｉｘａｔｉｖｅ）または保存料として広く用いられている。ジーザック（Ｉ． Ｄｚｉｅｚａｋ）、「ゴムに関する焦点（Ａ Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｕｍｓ）」、Ｆｏｏｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９１年３月）。また、これは化粧品産業でも広い範囲に用いられている。
【０００６】
通常、アラビアゴムの世界での生産量は毎年１００，０００トンより多い。しかし、この生産はゴムを生産する地域の環境的および政治的な安定性に依存している。例えば、１９７０年初頭には深刻な干ばつのためにゴムの生産量は３０，００トンまで落ち込んだ。１９８５年にも干ばつのためにゴムが不足し、価格が６００％も上昇した。
【０００７】
アラビアゴムの供給が幾分不安定であるという問題に対処するために、３種類のアプローチがとられている。第１に、地球上の他の地域にある他のゴムが探索されている。第２に、質の劣るアラビアゴムに補充するための添加物が検討されている。第３に、培養細胞による産生が検討されている。
【０００８】
地球上の他の地域にある他のゴムを探そうという取り組みは、ある程度の成果を上げている。しかし、アカシアから採ったアラビアゴムの溶解性は、湯にも冷水にも溶けるという点で他のゴムよりも優れている。さらに、他の滲出物は粘性が過剰なために５％溶液までに限られるが、アラビアゴムは溶けやすいために５５％溶液も作ることができる。
【０００９】
アラビアゴムに補充するための添加物はいくつか同定されている。例えば、乳清タンパク質を用いてアラビアゴムの機能を高めることができる。プラカシュ（Ａ． Ｐｒａｋａｓｈ）ら、「清涼飲料乳濁系におけるアラビアゴムの機能に対するタンパク質添加の効果（Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｄｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ ｏｆ ｇｕｍ ａｒａｂｉｃ ｉｎ ｓｏｆｔ ｄｒｉｎｋ ｅｍｕｌｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ）」、Ｆｏｏｄ Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ ４：１７７（１９９０）。しかし、このアプローチには限界がある。最終的な食品に異臭を生じさせないためには、このような添加物の使用は低濃度に限られる。
【００１０】
アカシア・セネガル（Ａｃａｃｉａ ｓｅｎｅｇａｌ）の培養細胞にアラビアゴムを産生させようとする取り組みも行われている。残念ながら、培養下でアラビアゴムを発現させる条件は見いだされていない。モラード（Ａ． Ｍｏｌｌａｒｄ）およびジョセルー（Ｊ−Ｐ． Ｊｏｓｅｌｅａｕ）、「懸濁培養したアカシア・セネガル細胞はヒドロキシプロリンを欠くアラビノガラクタンタンパク質を分泌する（Ａｃａｃｉａ ｓｅｎｅｇａｌ ｃｅｌｌｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｓｅｃｒｅｔｅ ａ ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ａｒａｂｉｎｏｇａｌａｃｔａｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ）」、Ｐｌａｎｔ Ｐｌｉｙｓｉｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３２：７０３（１９９４）。
【００１１】
明らかに、アラビアゴムの生産を改良するための新たなアプローチが必要である。このようなアプローチは環境因子または政治的要因に依存しないことが必要である。理想的には、このようなアプローチは生産を容易にし、比較的費用のかからないものであるべきである。
【００１２】
発明の概要
本発明は、植物ゴムの分野における新たなアプローチを含むものであり、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）に富んだ糖タンパク質（ＨＲＧＰ）、反復性プロリンに富んだタンパク質（ＲＰＲＰ）、およびアラビノガラクタンタンパク質（ＡＧＰ）の生産に対して、新たな解決法を提示する。本発明は、アラビアゴム糖タンパク質（ＧＡＧＰ）のペプチド配列を含む、このような糖タンパク質の反復性ペプチド配列から設計した合成遺伝子の発現を意図する。
【００１３】
ＧＡＧＰに関して、本発明は、アミノ酸配列
2004516003.tif 000002
（配列番号：１および配列番号：２）またはその変異型の少なくとも一部分を含む、実質的に精製されたポリペプチドを意図する。「変異型」とは、その配列が必ずしも正確な配列を含まないでもよく、最大５つのアミノ酸置換を意図することを意味する。例えば、ＬｅｕまたはＨｙｐでＧｌｙを置換してもよく、ＬｅｕでＳｅｒおよび１つまたは複数のＨｙｐを置換してもよい。また、「変異型」とは、配列が必ずしも１９アミノ酸の全部でなくともよいことも意味する。変異型の例は表３に示されている。１つの好ましい態様において、変異型は以下の３つのモチーフのうち１つまたは複数を含む：Ｓｅｒ−Ｈｙｐ４、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ３−ＴｈｒおよびＸａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ−Ｈｙｐ、ここでＸａａはヒドロキシプロリン以外の任意のアミノ酸である。
【００１４】
実際には、本発明は精製されたポリペプチドの厳密な長さによっては限定されないものとする。１つの態様において、本ペプチドは、配列の１９個のアミノ酸のうち１２個より多いアミノ酸を含む。もう１つの態様では、１９個のアミノ酸（配列番号：１および配列番号：２を参照）の一部を反復配列として用いる。さらにもう１つの態様では、１９個のアミノ酸（配列番号：１および配列番号：２を参照、アミノ酸置換を伴うもの、または伴わないもの）のすべてを反復配列として用いる。
【００１５】
本発明は厳密な反復回数によっては限定されないものとする。本配列（すなわち、配列番号：１および配列番号：２）またはその変異型は、１回から最大５０回までの間、より好ましくは１０回から最大３０回までの間、最も好ましくは約２０回の反復配列として用いうる。本配列（すなわち、配列番号：１および配列番号：２）またはその変異型は、連続した反復として用いてもよく、非連続的な反復（他のアミノ酸またはアミノ酸類似体が反復配列の間に位置する）として用いてもよい。
【００１６】
本発明は特に、非アラビアゴムタンパク質または糖タンパク質配列、およびアラビアゴム糖タンパク質配列（配列番号：１および配列番号：２）の一部を含む、融合タンパク質を意図する。本発明は、非アラビアゴム糖タンパク質配列の性質によっては限定されないものとする。１つの態様において、非アラビアゴム糖タンパク質配列は緑色蛍光タンパク質である。
【００１７】
上記の通り、本発明は、このようなペプチドをコードする合成遺伝子を意図する。「合成遺伝子」とは、その核酸配列が、関心対象のペプチド配列の使用（ｃＤＮＡからの核酸配列の使用ではなく）に由来することを意味する。１つの態様において、本発明は、配列番号：１および配列番号：２のポリペプチドまたはそれらの変異型の少なくとも一部分を含む、ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列を意図する。本発明は特に、配列番号：１および配列番号：２またはそれらの変異型の１つまたは複数の反復を含む、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を意図する。重要なこととして、本発明は関心対象のポリペプチドをコードする厳密な核酸配列には限定されないものとする。
【００１８】
本発明は、コードされるペプチドが高度に保存された１つまたは複数のＳｅｒ−Ｈｙｐ４（配列番号：３）モチーフを含む、ＨＲＧＰの部分をコードする合成遺伝子を意図する。本発明は、コードされるペプチドが１つまたは複数のペンタペプチドモチーフ：Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（配列番号：４）ならびにこの配列の変異型、例えばＸ−Ｈｙｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（配列番号：５）およびＰｒｏ−Ｈｙｐ−Ｖａｌ−Ｘ−Ｌｙｓ（配列番号：６）およびＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｔｙｒ−ＬｙｓおよびＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｔｙｒ−Ｘ（配列番号：８）（ここで「Ｘ」にはＴｈｒ、Ｇｌｕ、Ｈｙｐ、Ｐｒｏ、ＨｉｓおよびＩｌｅが可能）などを含むような、ＲＰＲＰの部分をコードする合成遺伝子も意図する。本発明はまた、コードされるペプチドが１つまたは複数のＸａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ−Ｈｙｐ（配列番号：９）の反復を含むような、ＡＧＰの部分をコードする合成遺伝子も意図する。このようなペプチドは、融合タンパク質を非制限的に含む、さまざまな形態として発現させることができる。
【００１９】
ＨＲＧＰのモチーフに関して、本発明は、配列：
2004516003.tif 000003
を含む、ポリヌクレオチド配列を意図する。ＡＧＰのモチーフに関して、本発明は、配列：
2004516003.tif 000004
を含むポリヌクレオチド配列を意図する。当然ながら、本発明は特定の配列によっては限定されないものとする。実際には、本発明は特に、配列番号：１０および１１の配列と同一ではないものの相同な配列を意図する。本発明は、配列番号：１０および１１の配列に対して相補的な（部分的に相補的であるに過ぎない配列を含む）配列も意図する。このような相補配列には、配列番号：１０および１１の配列と低ストリンジェンシー条件下ならびに高ストリンジェンシー条件下（以下の定義の項を参照）でハイブリダイズすると考えられる配列が含まれる。
【００２０】
本発明は、野生型配列には認められない、モチーフ（すなわち、モジュール）の混合も意図する。例えば、ＧＡＧＰモジュールをエクステンシンに付加してもよく、ＲＰＲＰ架橋モジュールをＡＧＰ様分子に付加してもよい。
【００２１】
本発明は、ポリペプチドのインビトロおよびインビボでの発現のために、本発明のポリヌクレオチドを用いることを意図する。このため、本発明は、組換え発現ベクターに含まれるポリヌクレオチド配列である、配列番号：１および配列番号：２の配列またはそれらの変異型の、２つまたはそれ以上の反復をコードするポリヌクレオチド配列を意図する。また、このようなベクターを、真核細胞および原核細胞の両方を含む種々の宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌）に導入することも意図する。
【００２２】
１つの態様において、ベクターはさらにプロモーターを含む。本発明は特定のプロモーターには限定されないものとする。植物ゴムポリペプチド（または上記の関心対象のその他のヒドロキシプロリンに富んだポリペプチド）の一部をコードする、機能的に結合した核酸配列の発現を指示しうる任意のプロモーター配列が本発明の範囲に含まれると考えられる。プロモーターには、細菌、ウイルスおよび植物由来のプロモーター配列が非制限的に含まれる。細菌由来のプロモーターには、オクトピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、および天然のＴｉプラスミドに由来する他のプロモーターが非制限的に含まれる。ウイルスプロモーターには、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓおよび１９Ｓ ＲＮＡプロモーター、ならびにアグロバクテリウム由来のＴ−ＤＮＡプロモーターが非制限的に含まれる。植物プロモーターには、リブロース−１，３−二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットプロモーター、トウモロコシユビキチンプロモーター、ファゼオリンプロモーター、Ｅ８プロモーターおよびＴｏｂ７プロモーターが非制限的に含まれる。
【００２３】
本発明は、関心対象の核酸配列の発現を制御するために用いるプロモーターの数には限定されない。関心対象の核酸配列の発現が望ましい様式で制御される限り、任意の数のプロモーターを用いてよい。さらに、プロモーターの選択は、植物全体にわたる発現と、植物の選択的な組織、例えば、根、葉、果実などに限局した発現のいずれが望ましいかによっても左右されうる。例えば、花において活性のあるプロモーターが公知である（Ｂｅｎｆｙら（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：８４９〜８５６）。
【００２４】
宿主細胞における核酸配列のプロモーター活性は、当技術分野で公知の、本明細書に例示する方法を用いて決定（すなわち、測定または評価）することができる。例えば、プロモーター配列の候補の試験は、それをレポーター遺伝子配列とインフレームに連結してレポーター構築物を作製し、本明細書に記載の方法を用いてレポーター構築物を宿主細胞（例えば、トマト細胞またはジャガイモ細胞）に導入した上で、レポーター遺伝子の発現を検出する（例えば、コードされるｍＲＮＡもしくはコードされるタンパク質の存在、またはレポーター遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を検出する）ことによって行いうる。レポーター遺伝子は抗生物質耐性または除草剤耐性を付与するものでもよい。レポーター遺伝子の例には、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ［Ｗｉｇｌｅｒ Ｍら（１９８０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ７７：３５６７〜７０］；アミノ配糖体のネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｐｔ［Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ Ｆら（１９８１）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１〜１４］、ならびにそれぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与するａｌｓまたはｐａｔが、非制限的に含まれる。最近では、可視マーカーを発現するレポーター遺伝子システムの使用が一般化しており、β−グルクロニダーゼおよびその基質（Ｘ−Ｇｌｕｃ）、ルシフェラーゼおよびその基質（ルシフェリン）、ならびにβ−ガラクトシダーゼおよびその基質（Ｘ−Ｇａｌ）などのマーカーは、形質転換体の同定のためだけでなく、特定のベクター系に起因する一時的または安定的なタンパク質発現の量を定量化するためにも広く用いられている［Ｒｈｏｄｅｓ ＣＡら（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ５５：１２１〜１３１］。
【００２５】
発現構築物は、プロモーター配列に加えて、終結が効果的になされるように関心対象の核酸配列の下流に転写終結配列を含むことが好ましい。１つの態様において、終結配列はノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）配列である。もう１つの態様において、終結領域はサトウキビのリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ルビスコ）小サブユニット（ｓｃｒｂｃｓ）遺伝子の種々の断片を含む。発現構築物の終結配列は本発明にとって特に重要ではない。終結配列はプロモーター配列と同じ遺伝子から入手してもよく、異なる遺伝子から入手してもよい。
【００２６】
関心対象の核酸配列によってコードされるｍＲＮＡを効率良く転写させようとする場合には、ポリアデニル化配列も発現構築物に加えることが一般的である。ポリアデニル化配列の例には、アグロバクテリウムのオクトピンシンターゼシグナルまたはノパリンシンターゼシグナルが非制限的に含まれる。
【００２７】
本発明は、単一の関心対象の核酸配列を発現する構築物には限定されない。同じプロモーター配列の転写制御下にある複数の（すなわち、２つまたはそれ以上の）核酸配列を含む構築物は、本発明の範囲に含まれるものと明確に考えられる。同じく、異なるプロモーターの転写制御下にある同じまたは異なる核酸配列も、本発明の範囲に含まれる。このような構築物は例えば、選択した植物組織を、同じまたは異なる関心対象の核酸配列の発現の標的とするために望ましい可能性がある。
【００２８】
上記の通り、本発明は、植物ゴムポリペプチドの一部のインビトロおよびインビボでの発現のために、本発明のポリヌクレオチドを用いることを意図する。発現がインビボで起こる場合、本発明はトランスジェニック植物を意図する。本発明のトランスジェニック植物は、各細胞および全細胞が関心対象の核酸配列を発現する植物には限定されない。関心対象の核酸配列を発現する少なくとも１つの細胞を含む任意の植物（例えば、タバコ、トマト、トウモロコシ、藻類など）が、本発明の範囲に含まれる。必ずしもというわけではないが、トランスジェニック植物は関心対象の核酸配列を複数の細胞において、より好ましくは１つまたは複数の組織において発現することが好ましい。宿主細胞が機能的な（例えば、食品産業または化粧品産業における使用に関して）植物ゴムポリペプチドを産生するように、発現の後に植物ゴムポリペプチド断片またはその変異型が適切にグリコシル化されることが特に好ましい。
【００２９】
関心対象の核酸配列によって植物細胞の形質転換が行われたという事実は、当技術分野で公知のさまざまな方法を用いて判定することができる。このような方法には、ゲノムＤＮＡの制限地図の作成、ＰＣＲ分析、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびＤＮＡ配列解析が非制限的に含まれる。
【００３０】
発現されたポリペプチド（またはその断片）は、種々の供給源（例えば、藻類、植物、動物、微生物）からのＨＲＧＰ結合性分子の単離に用いるために、固体支持体または樹脂上に（共有的または非共有的に）固定することができる。このようなポリペプチドを抗体の作製に用いることもできる。
【００３１】
本発明はさらに、アラビアゴムのコンセンサス配列の少なくとも一部分を含む、実質的に精製されたポリペプチドを提供する。特に本発明は、アミノ酸配列
2004516003.tif 000005
（ここでＡはＳｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＢはＨｙｐ、Ｐｒｏ、ＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＣはＰｒｏおよびＨｙｐから選択され；ＤはＨｙｐ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＥはＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＦはＳｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＧはＳｅｒ、Ｌｅｕ、Ｈｙｐ、Ｔｈｒ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；ＨはＨｙｐ、Ｐｒｏ、ＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＩはＴｈｒ、ＡｌａおよびＳｅｒから選択され；ＪはＴｈｒ、ＳｅｒおよびＡｌａから選択され；ＫはＴｈｒ、Ｌｅｕ、Ｈｙｐ、Ｓｅｒ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；ＬはＧｌｙ、Ｌｅｕ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；ＭはＨｉｓおよびＰｒｏから選択される）の少なくとも一部分を含み、その部分がこのアミノ酸配列の１２個の連続したアミノ酸より長い、実質的に精製されたポリペプチドを提供する。１つの好ましい態様において、この部分はポリペプチド中に反復配列として存在する。１つのさらに好ましい態様において、反復配列は１回〜６４回繰り返す。１つの代替的な好ましい態様において、ＡはＳｅｒであり；ＢはＨｙｐおよびＬｅｕから選択され；ＤはＨｙｐ、ＳｅｒおよびＴｈｒから選択され；ＥはＬｅｕであり；ＦはＳｅｒであり；ＧはＳｅｒ、ＬｅｕおよびＨｙｐから選択され；ＨはＨｙｐ、ＰｒｏおよびＬｅｕから選択され；ＩはＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＪはＴｈｒであり；ＫはＴｈｒ、ＬｅｕおよびＨｙｐから選択され；ＬはＧｌｙおよびＬｅｕから選択され；かつＭはＨｉｓおよびＰｒｏから選択される。もう１つの代替的な態様において、アミノ酸配列は、
2004516003.tif 000006
2004516003.tif 000007
2004516003.tif 000008
（ここでＡはＨｙｐ、ＴｈｒおよびＳｅｒから選択され、ＢはＨｙｐおよびＬｙｓから選択される）、配列番号：１３１ならびに配列番号：１３３から選択される。さらにもう１つの代替的な態様において、この部分は（Ｘａａ−Ｈｙｐ）ｘ（配列番号：１８２）およびＸａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ（配列番号：１８３）（ここでＸａａはヒドロキシプロリン以外の任意のアミノ酸であり、ｘは２〜１０００である）から選択されるモチーフを含む。１つの好ましい態様において、この部分は配列Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ−Ｈｙｐ（配列番号：９）を含み、ここでＸａａはＳｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択される。さらにもう１つの代替的な態様において、この部分はＸａａ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐｎ（配列番号：２０９）およびＸａａ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐｎ（配列番号：２１０）（ここでｎは１〜１００であり、Ｘａａはヒドロキシプロリン以外の任意のアミノ酸である）から選択されるモチーフを含む。１つの好ましい態様において、この部分はＳｅｒ−Ｈｙｐ２（配列番号：２１１）、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ３（配列番号：２１２）、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ４（配列番号：３）、Ｔｈｒ−Ｈｙｐ２（配列番号：２１３）およびＴｈｒ−Ｈｙｐ３（配列番号：２１４）から選択される、ペプチド配列を含む。さらにもう１つの代替的な態様において、この部分はＳｅｒ−Ｈｙｐ２−Ｐｒｏ（配列番号：２１５）およびＳｅｒ−Ｈｙｐ２−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ（配列番号：２１６）から選択されるペプチド配列を含む。
【００３２】
本発明はさらに、非連続的なヒドロキシプロリンモチーフを含む、実質的に精製されたポリペプチドを提供する。特に本発明は、（Ｘａａ−Ｈｙｐ）ｘ（配列番号：１８２）およびＸａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ（配列番号：１８３）（ここでＸａａはヒドロキシプロリン以外の任意のアミノ酸であり、ｘは２〜１０００である）から選択される第１のモチーフを含む、実質的に精製されたポリペプチドを提供する。１つの態様において、配列はＸａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ−Ｈｙｐ（配列番号：９）（ここでＸａａはＳｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択される）である。１つの代替的な態様において、本ポリペプチドはさらに、Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐｎ（配列番号：２０９）およびＸａａ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐｎ（配列番号：２１０）（ここでｎは１〜１００であり、Ｘａａはヒドロキシプロリン以外の任意のアミノ酸である）から選択される連続的なヒドロキシプロリンモチーフ（すなわち、第２のモチーフ）を含む。１つの好ましい態様において、第１および第２のモチーフはポリペプチド中に交互に存在する。より好ましい１つの態様において、交互に存在する第１および第２のモチーフは１回〜５００回繰り返す。
【００３３】
Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐｎ（配列番号：２０９）およびＸａａ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐｎ（配列番号：２１０）（ここでｎは１〜１００であり、Ｘａａはヒドロキシプロリン以外の任意のアミノ酸である）から選択されるモチーフを含む、実質的に精製されたポリペプチドも本明細書で提供する。１つの態様において、この部分はＳｅｒ−Ｈｙｐ２（配列番号：２１１）、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ３（配列番号：２１２）、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ４（配列番号：３）、Ｔｈｒ−Ｈｙｐ２（配列番号：２１３）およびＴｈｒ−Ｈｙｐ３（配列番号：２１４）から選択されるペプチド配列を含む。
【００３４】
本発明はまた、以下から選択されるアミノ酸配列の少なくとも一部分と機能的に結合した、非アラビアゴムタンパク質配列および非アラビアゴム糖タンパク質配列から選択される第１の配列を含む、融合タンパク質を提供する：
2004516003.tif 000009
（ここでＡはＳｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＢはＨｙｐ、Ｐｒｏ、ＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＣはＰｒｏおよびＨｙｐから選択され；ＤはＨｙｐ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒおよび−ａから選択され；ＥはＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＦはＳｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＧはＳｅｒ、Ｌｅｕ、Ｈｙｐ、Ｔｈｒ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；ＨはＨｙｐ、Ｐｒｏ、ＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＩはＴｈｒ、ＡｌａおよびＳｅｒから選択され；ＪはＴｈｒ、ＳｅｒおよびＡｌａから選択され；ＫはＴｈｒ、Ｌｅｕ、Ｈｙｐ、Ｓｅｒ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；ＬはＧｌｙ、Ｌｅｕ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；かつＭはＨｉｓおよびＰｒｏから選択され、さらに該部分はこのアミノ酸配列の１２個の連続したアミノ酸より長い）、（ｂ）（Ｘａａ−Ｈｙｐ）ｘ（配列番号：１８２）およびＸａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ（配列番号：１８３）（ここでｘは２〜１０００である）から選択される、第１のモチーフを含むポリペプチド、（ｃ）Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐｎ（配列番号：２０９）およびＸａａ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐｎ（配列番号：２１０）（ここでｎは１〜５００である）から選択される、第２のモチーフを含むポリペプチド、ならびに（ｄ）第１のモチーフおよび第２のモチーフを含むポリペプチド（ここでＸａａはヒドロキシプロリン以外の任意のアミノ酸である）。１つの態様において、第１の配列は緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列である。
【００３５】
以下から選択されるアミノ酸配列の少なくとも一部分をコードする、単離されたポリヌクレオチド配列も本発明によって提供される：
2004516003.tif 000010
（ここでＡはＳｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＢはＨｙｐ、Ｐｒｏ、ＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＣはＰｒｏおよびＨｙｐから選択され；ＤはＨｙｐ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＥはＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＦはＳｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＧはＳｅｒ、Ｌｅｕ、Ｈｙｐ、Ｔｈｒ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；ＨはＨｙｐ、Ｐｒｏ、ＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＩはＴｈｒ、ＡｌａおよびＳｅｒから選択され；ＪはＴｈｒ、ＳｅｒおよびＡｌａから選択され；ＫはＴｈｒ、Ｌｅｕ、Ｈｙｐ、Ｓｅｒ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；ＬはＧｌｙ、Ｌｅｕ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；かつＭはＨｉｓおよびＰｒｏから選択され、さらに該部分はこのアミノ酸配列の１２個の連続したアミノ酸より長い）、（ｂ）（Ｘａａ−Ｈｙｐ）ｘ（配列番号：１８２）およびＸａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ（配列番号：１８３）（ここでｘは２〜１０００である）から選択される、第１のモチーフを含むポリペプチド、（ｃ）Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐｎ（配列番号：２０９）およびＸａａ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐｎ（配列番号：２１０）（ここでｎは１〜５００である）から選択される、第２のモチーフを含むポリペプチド、ならびに（ｄ）第１のモチーフおよび第２のモチーフを含むポリペプチド（ここでＸａａはヒドロキシプロリン以外の任意のアミノ酸である）。
【００３６】
本発明はさらに、以下から選択されるアミノ酸配列の一部分をコードするポリヌクレオチド配列を含む、組換え発現ベクターを提供する：
2004516003.tif 000011
（ここでＡはＳｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＢはＨｙｐ、Ｐｒｏ、ＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＣはＰｒｏおよびＨｙｐから選択され；ＤはＨｙｐ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＥはＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＦはＳｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＧはＳｅｒ、Ｌｅｕ、Ｈｙｐ、Ｔｈｒ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；ＨはＨｙｐ、Ｐｒｏ、ＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＩはＴｈｒ、ＡｌａおよびＳｅｒから選択され；ＪはＴｈｒ、ＳｅｒおよびＡｌａから選択され；ＫはＴｈｒ、Ｌｅｕ、Ｈｙｐ、Ｓｅｒ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；ＬはＧｌｙ、Ｌｅｕ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；かつＭはＨｉｓおよびＰｒｏから選択され、さらに該部分はこのアミノ酸配列の１２個の連続したアミノ酸より長い）、（ｂ）（Ｘａａ−Ｈｙｐ）ｘ（配列番号：１８２）およびＸａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ（配列番号：１８３）（ここでｘは２〜１０００である）から選択される、第１のモチーフを含むポリペプチド、（ｃ）Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐｎ（配列番号：２０９）およびＸａａ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐｎ（配列番号：２１０）（ここでｎは１〜５００である）から選択される、第２のモチーフを含むポリペプチド、ならびに（ｄ）第１のモチーフおよび第２のモチーフを含むポリペプチド（ここでＸａａはヒドロキシプロリン以外の任意のアミノ酸である）。１つの態様において、発現ベクターはさらに、ポリヌクレオチド配列と機能的に結合したプロモーターを含む。１つの好ましい態様において、プロモーターはウイルスプロモーターである。より好ましい１つの態様において、ウイルスプロモーターは、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓおよび１９Ｓ ＲＮＡプロモーターからなる群より選択される。１つの代替的な好ましい態様において、発現ベクターはさらに、エクステンシンシグナル配列（配列番号：１４）およびトマトのアラビノガラクタンタンパク質シグナル配列（配列番号：２１５）より選択される、シグナル配列を含む。より好ましい１つの態様において、発現ベクターはさらにレポーター遺伝子を含む。さらにもう１つのより好ましい態様において、レポーター遺伝子は緑色蛍光タンパク質遺伝子である。もう１つの態様において、ベクターは宿主細胞の内部に含まれる。１つの好ましい態様において、宿主細胞は植物細胞である。より好ましい１つの態様において、植物細胞はこの部分を含む糖タンパク質を発現する。
【００３７】
以下の段階を含む、糖タンパク質の少なくとも一部分を生産するための方法も、提供される：
ａ）以下を提供する段階：
ｉ）以下から選択されるアミノ酸配列の、少なくとも一部分をコードするポリヌクレオチド配列を含む、組換え発現ベクター：
2004516003.tif 000012
（ここでＡはＳｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＢはＨｙｐ、Ｐｒｏ、ＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＣはＰｒｏおよびＨｙｐから選択され；ＤはＨｙｐ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＥはＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＦはＳｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＧはＳｅｒ、Ｌｅｕ、Ｈｙｐ、Ｔｈｒ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；ＨはＨｙｐ、Ｐｒｏ、ＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＩはＴｈｒ、ＡｌａおよびＳｅｒから選択され；ＪはＴｈｒ、ＳｅｒおよびＡｌａから選択され；ＫはＴｈｒ、Ｌｅｕ、Ｈｙｐ、Ｓｅｒ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；ＬはＧｌｙ、Ｌｅｕ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；かつＭはＨｉｓおよびＰｒｏから選択され、さらに該部分はこのアミノ酸配列の１２個の連続したアミノ酸より長い）、
（ｂ）（Ｘａａ−Ｈｙｐ）ｘ（配列番号：１８２）およびＸａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ（配列番号：１８３）（ここでｘは２〜１０００である）から選択される、第１のモチーフを含むポリペプチド、
（ｃ）Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐｎ（配列番号：２０９）およびＸａａ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐｎ（配列番号：２１０）（ここでｎは１〜５００である）から選択される、第２のモチーフを含むポリペプチド、ならびに
（ｄ）第１のモチーフおよび第２のモチーフを含むポリペプチド（ここでＸａａはヒドロキシプロリン以外の任意のアミノ酸である）；ならびに
ｉｉ）宿主細胞を提供する段階；ならびに
ｂ）該部分が発現されるような条件下で、ベクターを宿主細胞に導入する段階。１つの態様において、宿主細胞は培養下で増殖している。１つの好ましい態様において、本方法はさらに、ｃ）宿主細胞の培養物からこの部分を回収する段階を含む。１つの代替的な態様において、宿主細胞は植物細胞である。より好ましい１つの態様において、植物細胞はマメ科から選択される植物に由来する。
【００３８】
定義
「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたはその前駆体の産生に必要な制御配列およびコード配列を含む、ＤＮＡ配列を指す。ポリペプチドは完全長コード配列によってコードされることも、コード配列の任意の部分によってコードされることも可能である。
【００３９】
「関心対象の核酸配列」という用語は、当業者が何らかの理由で（例えば、品質の向上）、その操作が望ましいと考える、任意の核酸配列を指す。
【００４０】
「野生型」という用語は、遺伝子に言及して用いる場合、天然に存在する供給源から単離された、遺伝子の特徴を有する遺伝子を指す。「野生型」という用語は、遺伝子産物に言及して用いる場合、天然に存在する供給源から単離された遺伝子産物の特徴を有する遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は集団内で最も高い頻度で観察されるものであり、このため任意に「正常」型または「野生型」の遺伝子と呼ばれる。これに対して、「改変された」または「変異体」という用語は、遺伝子または遺伝子産物に言及して用いる場合、それぞれ、野生型遺伝子または遺伝子産物と比べた場合に、配列および／または機能特性の変化（すなわち、特徴の変化）を示す遺伝子または遺伝子産物を指す。天然にみられる変異体を単離しうることにも注意を要する；これらは野生型の遺伝子または遺伝子産物と比べた場合に、特徴が変化しているという事実によって同定される。
【００４１】
「組換え」という用語は、ＤＮＡ分子に言及して用いる場合、分子生物学の技法によって連結された、複数のＤＮＡセグメントを含むＤＮＡ分子を指す。「組換え」という用語は、タンパク質またはポリペプチドに言及して用いる場合、組換えＤＮＡ分子を用いて発現されるタンパク質分子を指す。
【００４２】
本明細書で用いる「ベクター」および「媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）」という用語は、ＤＮＡセグメントを１つの細胞から別の細胞に移行させる核酸分子を指して、互換的に用いられる。
【００４３】
本明細書で用いる「発現ベクター」または「発現カセット」という用語は、望ましいコード配列、および機能的に結合したコード配列の特定の宿主生物における発現のために必要な、適切な核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子を指す。原核生物における発現のために必要な核酸配列には、通常、プロモーター、オペレーター（選択的）およびリボソーム結合部位がしばしば他の配列とともに含まれる。真核細胞はプロモーター、エンハンサーならびに終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルを用いることが公知である。
【００４４】
「ターゲティングベクター」または「ターゲティング構築物」という用語は、隣接する認識配列の間に位置するＤＮＡ配列の相同組換えを行いうる認識配列が両側に隣接した、関心対象の遺伝子を含むオリゴヌクレオチド配列を指す。
【００４５】
本明細書で用いる「機能的な組み合わせである」「機能的な順序で」および「機能的に結合した」という用語は、所与の遺伝子の発現および／または望ましいタンパク質分子の合成を指示しうる核酸分子が生じるような様式での核酸分子の結合を指す。この用語は、機能的タンパク質が生じるような様式での、アミノ酸配列の結合も指す。
【００４６】
本明細書で用いる「形質転換」という用語は、外来性ＤＮＡの細胞への導入を指す。植物細胞の形質転換は、以下を含む、当技術分野で公知のさまざまな手段によって行える：粒子を介した遺伝子導入（例えば、米国特許第５，５８４，８０７号を参照。これは参照として本明細書に組み入れられる）；外来性ＤＮＡの植物細胞ゲノムへの無作為な組み込み（米国特許第４，９４０，８３８号を参照。これは参照として本明細書に組み入れられる）または標的指向性（ｔａｒｇｅｔｅｄ）組み込み（米国特許第５，５０１，９６７号を参照。これは参照として本明細書に組み入れられる）のための外来性ＤＮＡを含むアグロバクテリウム菌株による感染；エレクトロインジェクション（Ｎａｎら（１９９５）、「農業および林業におけるバイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ）」、バジャジ（Ｙ．Ｐ．Ｓ． Ｂａｊａｊ）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｖｏｌ ３４：１４５〜１５５；Ｇｒｉｅｓｂａｃｈ（１９９２）ＨｏｒｔＳｃｉｅｎｃｅ ２７：６２０）；リポソーム、リソソーム、細胞、ミニ細胞または融合性脂質が表面にある他の物質との融合（Ｆｒａｌｅｙら（１９８２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：１８５９〜１８６３；ポリエチレングリコール（Ｋｒｅｎｓら（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９６：７２〜７４）；遊離ＤＮＡの取り込みを増加させる化学物質；ウイルスを用いる形質転換など。
【００４７】
ウイルスに「感染させること」およびウイルスの「感染」という用語は、標的生物試料（例えば、細胞、組織など）を細菌と、細菌の内部に含まれる核酸配列が標的生物試料の１つまたは複数の細胞に導入されるような条件下でインキュベートすることを指す。
【００４８】
「アグロバクテリウム」という用語は、クラウンゴール（ｃｒｏｗｎ ｇａｌｌ）の原因となる、植物病原性の土壌性グラム陰性桿菌を指す。「アグロバクテリウム」という用語には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（これは主に感染植物におけるクラウンゴールの原因となる）およびアグロバクテリウムリゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｓ）（これは感染宿主植物における毛根病の原因となる）が非制限的に含まれる。植物細胞がアグロバクテリウムに感染すると一般に、感染細胞によるオパイン（例えば、ノパリン、アグロピン、オクトピンなど）の産生が引き起こされる。このため、ノパリンの産生を引き起こすアグロバクテリウムの菌株（例えば、ＬＢＡ４３０１株、Ｃ５８株、Ａ２０８株）は「ノパリン型」アグロバクテリウムと呼ばれ、オクトピンの産生を引き起こすアグロバクテリウムの菌株（例えば、ＬＢＡ４４０４株、Ａｃｈ５株、Ｂ６株）は「オクトピン型」アグロバクテリウムと呼ばれ、アグロピンの産生を引き起こすアグロバクテリウムの菌株（例えば、ＥＨＡ１０５株、ＥＨＡ１０１株、Ａ２８１株）は「アグロピン型」アグロバクテリウムと呼ばれる。
【００４９】
「打ち込むこと（ｂｏｍｂａｒｄｉｎｇ）」、「打ち込み（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）」、および「微粒子銃による打ち込み（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）」という用語は、標的生物試料中の細胞の細胞膜を損傷し、および／または粒子の標的生物試料への進入をもたらすために、粒子を標的生物試料（例えば、細胞、組織など）に向かって加速させるプロセスを指す。微粒子銃による打ち込みのための方法は当技術分野で知られており（例えば、米国特許第５，５８４，８０７号を参照。その内容は参照として本明細書に組み入れられる）、市販もされている（例えば、ヘリウムガス駆動式の微粒子加速装置（ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ）（ＢｉｏＲａｄ）。
【００５０】
「微小損傷の作成（ｍｉｃｒｏｗｏｕｎｄｉｎｇ）」という用語は、植物組織に言及して用いる場合、その組織に微小損傷を導入することを指す。微小損傷の作成は、例えば、粒子または微粒子銃による打ち込みによって行える。
【００５１】
「トランスジェニック」という用語は、植物細胞に言及して用いる場合、導入遺伝子を含む、または導入遺伝子の導入によってゲノムが改変された、植物細胞を指す。「トランスジェニック」という用語は、植物に言及して用いる場合、導入遺伝子を含む、または導入遺伝子の導入によってゲノムが改変された、１つまたは複数の細胞を含む植物を指す。これらのトランスジェニック細胞およびトランスジェニック植物は、本明細書に記載の方法などによる人為的な介入による、核酸（通常はＤＮＡ）を含む「導入遺伝子」の標的細胞への導入または標的細胞の染色体への組み込みを含む、いくつかの方法によって作製しうる。
【００５２】
本明細書で用いる「導入遺伝子」という用語は、実験操作によって植物細胞のゲノムに導入される任意の核酸配列を指す。導入遺伝子は「内因性ＤＮＡ配列」でも「異種ＤＮＡ配列」（すなわち「外来性ＤＮＡ」）でもよい。「内因性ＤＮＡ配列」という用語は、天然の配列と比べて何らかの改変（例えば、点変異、選択マーカー遺伝子の存在など）を含まないという条件付きで、それを導入しようとする細胞に必然的に見出されるヌクレオチド配列を指す。「異種ＤＮＡ配列」という用語は、天然では連結されていない、または天然では異なる部位で連結されている核酸配列に、連結した、または連結するように操作された、ヌクレオチド配列を指す。異種ＤＮＡはそれが導入される細胞にとって内因性ではなく、別の細胞から得られたものである。異種ＤＮＡには、何らかの改変を含む内因性ＤＮＡ配列も含まれる。必然的ではないものの、異種ＤＮＡは一般に、それを発現させようとする細胞によって通常は産生されないＲＮＡおよびタンパク質をコードする。異種ＤＮＡの例には、変異した野生型遺伝子（すなわち、野生型遺伝子ではないように改変された野生型遺伝子）、レポーター遺伝子、転写調節配列および翻訳調節配列、選択マーカータンパク質（例えば、薬剤耐性を付与するタンパク質）などが含まれる。
【００５３】
本明細書で用いる「プローブ」という用語は、オリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）に対して用いる場合、精製された制限消化物中に天然のものとして存在するか、または合成、組換えもしくはＰＣＲ増幅によって生産されたかを問わず、関心対象の別のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドを指す。プローブは一本鎖でも二本鎖でもよい。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定および単離に有用である。プローブを検出系を用いて検出できるように、オリゴヌクレオチドプローブを「レポーター分子」で標識してもよい。検出系には酵素、蛍光、放射能および発光による系が非制限的に含まれる。
【００５４】
本明細書で用いる「選択マーカー」という用語は、選択マーカーが発現される細胞に、抗生物質または薬剤に対する耐性を付与する活性がある酵素をコードする遺伝子を指す。選択マーカーは「陽性」でも「陰性」でもよい。陽性選択マーカーの例には、Ｇ４１８およびカナマイシンに対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、ならびに抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を付与する細菌ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｙｇ）が含まれる。陰性選択マーカーは、適切な選択培地中で増殖させた場合にその発現が細胞にとって細胞傷害性であるような酵素活性をコードする。例えば、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が選択マーカーとしてよく用いられる。ガンシクロビルまたはアシクロビルの存在下で増殖した細胞におけるＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の発現は、細胞傷害性であり、このためガンシクロビルまたはアシクロビルを含む選択培地中での細胞の増殖により、機能的なＨＳＶ ＴＫ酵素を発現しうる細胞が選択される。
【００５５】
本明細書で用いる「プロモーターエレメント」「プロモーター」または「プロモーター配列」という用語は、ＤＮＡポリマーのタンパク質コード領域の５’末端（すなわち、前方）に位置するＤＮＡ配列を指す。自然界で公知のほとんどのプロモーターの位置は、転写される領域の前方にある。プロモーターはスイッチとして働き、遺伝子の発現を活性化する。遺伝子が活性化されれば、それは転写される、または転写に関与するといわれる。転写は遺伝子からのｍＲＮＡの合成を伴う。このため、プロモーターは転写調節エレメントとして働くとともに、遺伝子のｍＲＮＡへの転写を開始するための部位ともなる。
【００５６】
「増幅」という用語は、核酸配列の追加的なコピーの産生と定義され、一般には当技術分野で公知のポリメラーゼ連鎖反応の技術を用いて行われる［Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ＣＷおよびＧＳ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（１９９５）、「ＰＣＲプライマー、実験マニュアル（ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ］．本明細書で用いる「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）という用語は、クローニングまたは精製を行わずに、ゲノムＤＮＡ混合物中の標的配列のセグメントの濃度を高めるための方法を記載した、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号および第４，９６５，１８８号（これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）に記載された方法を指す。標的配列を増幅するためのこの過程は、望ましい標的配列を含むＤＮＡ混合物に大過剰量の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを導入した後に、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で厳密な一連の熱サイクルを加えることからなる。２つのプライマーは二本鎖標的配列のそれぞれの鎖に対して相補的である。増幅を行うためには、混合物を変性させ、続いてプライマーを標的分子内部の相補配列とアニーリングさせる。アニーリングに続いて、新たな相補鎖の対が形成されるようにプライマーをポリメラーゼによって伸長させる。変性、プライマーのアニーリングおよびポリメラーゼ伸長の段階を何回も反復すること（すなわち、変性、アニーリングおよび伸長が１つの「サイクル」を構成する；数多くの「サイクル」が可能である）により、望ましい標的配列の増幅セグメントを高濃度に得ることができる。望ましい標的配列の増幅セグメントの長さはプライマー同士の互いの相対的な位置によって決まるため、この長さは調節可能なパラメーターである。この過程の反復的な側面から、本方法は「ポリメラーゼ連鎖反応」（以下、「ＰＣＲ」）と呼ばれる。標的配列の望ましい増幅セグメントが混合物中で最も主要な配列（濃度の点で）となるため、それらは「ＰＣＲで増幅された」といわれる。
【００５７】
ＰＣＲの最新の方法によれば、ゲノムＤＮＡ中にある特定の標的配列の単一コピーを、いくつかの異なる方法（例えば、標識プローブとのハイブリダイゼーション；ビオチン化プライマーを組み入れた後にアビジン−酵素結合物を検出すること；および／または、３２Ｐ標識したｄＣＴＰまたはｄＡＴＰなどのデオキシリボヌクレオチド三リン酸を増幅セグメントに組み入れること）により、検出可能なレベルへと増幅することが可能である。ゲノムＤＮＡのほかにも、任意のオリゴヌクレオチド配列を適切なプライマー分子の組によって増幅することができる。特に、ＰＣＲ過程自体によって生成された増幅セグメントは、それ自体が、その後のＰＣＲ増幅に有効なテンプレートとなる。増幅された標的配列を用いて、ターゲティングベクター、導入遺伝子などを構築するためのＤＮＡセグメント（例えば、遺伝子）を入手することもできる。
【００５８】
本発明は、ＰＣＲなどの増幅法を用いて、植物ゴムおよび他のヒドロキシプロリンに富んだポリペプチドをコードする植物遺伝子の、ｃＤＮＡ（またはその部分）を入手することを意図する。１つの態様では、本明細書に記載の合成遺伝子配列（例えば、特定のモチーフをコードする配列を含むもの）を用いてプライマーを設計し、低ストリンジェンシー条件下でＰＣＲを行う（ゴム滲出物を産生しうる任意の植物に由来するゲノムＤＮＡまたは他の核酸源を用いる）。もう１つの態様では、高ストリンジェンシー条件下でＰＣＲを行う。増幅産物をゲル上で泳動させ、ゲルから単離することができる。
【００５９】
本明細書で用いる「ハイブリダイゼーション」という用語は、核酸鎖を塩基対合によって相補鎖と結合させる、任意の過程を指す［Ｃｏｏｍｂｓ Ｊ（１９９４）、「バイオテクノロジー辞典（Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ］。
【００６０】
本明細書で用いる「相補的」または「相補性」という用語は、ポリヌクレオチドに言及して用いる場合、塩基対合則によって関連づけられるポリヌクレオチドを指す。例えば、配列５’−ＡＧＴ−３’は配列５’−ＡＣＴ−３’に対して相補的である。相補性は、核酸塩基の一部のみが塩基対合則に従って対応するというように「部分的」でもよい。または、核酸の間に「完全」または「全体的」な相補性があってもよい。核酸鎖の間の相補性の程度は、核酸鎖の間のハイブリダイゼーションの効率および強度に大きな影響を及ぼす。これは特に、核酸間の結合に依存する増幅反応ならびに検出方法において重要である。
【００６１】
「相同性」という用語は、核酸に言及して用いる場合、相補性の程度を指す。これは部分的な相同性でも完全な相同性（すなわち、同一性）でもよい。部分的に相補的な配列とは、完全に相補的な配列が標的核酸とハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害するものであり、これは「実質的に相同な」という機能的な用語を用いて呼ばれる。完全に相補的な配列と標的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロット法またはノーザンブロット法、溶液ハイブリダイゼーションなど）を低ストリンジェンシー条件下で用いることによって検査しうる。実質的に相同な配列またはプローブは、低ストリンジェンシー条件下で、完全に相同な配列の標的との結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）と競合し、それを阻害すると考えられる。低ストリンジェンシー条件は非特異的な結合が許容される条件というわけではなく、低ストリンジェンシー条件でも２つの配列の互いの結合が特異的（すなわち選択的）な相互作用であることが必要である。非特異的な結合が存在しないことは、部分的な程度の相補性も存在しない（例えば、同一性が約３０％未満の）第２の標的を用いて検査しうる；非特異的な結合が存在しなければプローブは第２の非相補的な標的とハイブリダイズしないと考えられる。
【００６２】
低ストリンジェンシー条件は、核酸ハイブリダイゼーションに言及して用いる場合、約１００〜約１０００ヌクレオチド長のＤＮＡプローブを用いる場合で、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏおよび１．８５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ、ｐＨをＮａＯＨで７．４に調整）、１％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬［５０×デンハルト試薬は５００ｍｌ当たり以下を含む：５ｇフィコール（タイプ４００、ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、５ｇ ＢＳＡ（第Ｖ画分；シグマ社）］および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、６８℃での結合またはハイブリダイゼーションに続いて、０．２×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中、室温で洗浄することと等価な条件を含む。
【００６３】
高ストリンジェンシー条件は、核酸ハイブリダイゼーションに言及して用いる場合、約１００〜約１０００ヌクレオチド長のプローブを用いる場合で、５×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、６８℃での結合またはハイブリダイゼーションに続いて、０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中、６８℃で洗浄することと等価な条件を含む。
【００６４】
「等価な」という用語は、関心対象のハイブリダイゼーション条件に関係するハイブリダイゼーション条件に言及して用いる場合、ハイブリダイゼーション条件および関心対象のハイブリダイゼーション条件が、同じ範囲の相同性パーセント（％）を有する、核酸配列のハイブリダイゼーションを引き起こすことを意味する。例えば、関心対象のハイブリダイゼーション条件が、第１の核酸配列および第１の核酸配列に対して５０％〜７０％の相同性を有する他の核酸配列のハイブリダイゼーションを引き起こす場合、もう１つのハイブリダイゼーション条件は、この別のハイブリダイゼーション条件も第１の核酸配列および第１の核酸配列に対して５０％〜７０％の相同性を有する他の核酸配列とのハイブリダイゼーションを引き起こす場合、関心対象のハイブリダイゼーション条件と等価であるという。
【００６５】
核酸ハイブリダイゼーションに言及して用いる場合、当技術分野では、さまざまな等価な条件を用いて低ストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシーのいずれの条件も構成しうることが公知である；プローブの長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）、標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物、溶液中に存在する、または固定されているなど）、ならびに塩および他の成分の濃度（例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコールの有無）などの要因が考慮されるほか、上に挙げた条件とは異なるものの、等価な低ストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が生じるように、ハイブリダイゼーション溶液を変更してもよい。
【００６６】
「ストリンジェンシー」は、核酸ハイブリダイゼーションに言及して用いる場合、一般的にはほぼＴｍ−５℃（プローブのＴｍよりも５℃低い）からＴｍよりも約２０℃〜２５℃低い範囲で生じる。当業者は理解していると考えられるが、ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、同一なポリヌクレオチド配列の同定もしくは検出のため、または類似もしくは関連したポリヌクレオチド配列の検出のために用いることができる。「ストリンジェントな条件」の下では、関心対象の核酸配列はその厳密な相補体または関連性の高い配列とハイブリダイズすると考えられる。
【００６７】
本明細書で用いる「融合タンパク質」という用語は、関心対象のタンパク質（すなわち、ＧＡＧＰおよびその断片）が、外因性タンパク質の断片（非ＧＡＧＰ配列からなる融合パートナー）と連結されたものを含む、キメラタンパク質を指す。融合パートナーは検出可能な部分を提供してもよく、宿主細胞からの組換え融合タンパク質の精製を可能とする親和性タグを提供してもよく、またはその両方でもよい。必要に応じて、当技術分野で公知のさまざまな酵素的または化学的な手段により、融合タンパク質を関心対象のタンパク質（すなわち、ＧＡＧＰタンパク質またはその断片）から分離してもよい。１つの代替的な態様において、本発明の融合タンパク質を植物グリコシルトランスフェラーゼの基質として用いてもよい。例えば、脱グリコシル化の後に、一例として（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）３２−ＥＧＦＰ（実施例２３参照）をガラクトース付加のためのアクセプターとして用い、ガラクトシルトランスフェラーゼによって触媒されるＵＤＰ−ガラクトースを補基質として用いてもよい。融合パートナーのＥＧＦＰにより、新たにガラクトシル化されたポリペプチドを容易に単離することが可能となる。本発明の配列を含む融合タンパク質は、ゲル濾過（実施例２２）、疎水性相互作用クロマトグラフ（ＨＩＣ）、逆相クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーなどの、当技術分野で公知の方法を用いて単離しうる。
【００６８】
本明細書で用いる「非アラビアゴム糖タンパク質」または「非アラビアゴム糖タンパク質配列」という用語は、アラビアゴム糖タンパク質に由来しないタンパク質またはタンパク質配列を含む、融合タンパク質の部分を指す。
【００６９】
本明細書で用いる「関心対象のタンパク質」という用語は、融合タンパク質の内部での発現が望まれるタンパク質を指す。融合タンパク質において、関心対象のタンパク質（例えば、ＧＡＧＰ）は、関心対象のタンパク質の安定性および／または融合タンパク質の精製の容易さを向上させるために、別のタンパク質またはタンパク質ドメイン（例えば、ＧＦＰ）である融合パートナーと連結または融合されると考えられる。
【００７０】
本明細書で用いる「精製された」または「精製すること」という用語は、混入物を試料から除去することを指す。例えば、ＨＲＧＰ−ＧＦＰ融合タンパク質を含む組換えＨＲＧＰポリペプチドは、核酸、リポ多糖（例えば、内毒素）などの宿主成分の成分を除去することによって精製される。「実質的に精製された」分子は、それに天然に付随する他の成分を除いた部分が少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％である。
【００７１】
本明細書で用いる「組換えＤＮＡ分子」という用語は、分子生物学の技法によって互いに連結された、複数のＤＮＡセグメントを含むＤＮＡ分子を指す。
【００７２】
本明細書で用いる「組換えタンパク質」または「組換えポリペプチド」という用語は、組換えＤＮＡ分子から発現されるタンパク質分子を指す。
【００７３】
本明細書で用いる「部分」という用語は、タンパク質に言及している場合（「所定のタンパク質の一部分」のように）、そのタンパク質の断片を指す。断片のサイズは、４アミノ酸残基から、全アミノ酸配列から１アミノ酸を差し引いたものまでの範囲をとりうる。したがって、３０ヌクレオチド長のアミノ酸配列の一部分とは、その配列の４個〜２９個の連続したアミノ酸の範囲にわたる、その配列の任意の断片を指す。アミノ酸配列の「少なくとも一部分」を含むポリペプチドには、アミノ酸配列の４つの連続したアミノ酸残基から全アミノ酸配列までが含まれる。核酸配列に言及して用いる場合、「部分」という用語は、そのサイズが１２個の核酸から、全核酸配列から１つの核酸を差し引いたものまでの範囲にわたる断片を意味する。したがって、ヌクレオチド配列の「少なくとも一部分」を含む核酸配列には、ヌクレオチド配列の１２個の連続したヌクレオチド残基から全ヌクレオチド配列までが含まれる。
【００７４】
「単離された」という用語は、「単離された核酸配列」というように核酸に関して用いる場合、その天然の供給源において通常付随している、少なくとも１つの混入核酸から識別され、分離された核酸配列を指す。
【００７５】
「モチーフ」および「モジュール」という用語は、アミノ酸配列に言及して用いる場合は等価な用語であり、その配列における特定の種類、数および配置のアミノ酸を指す。
【００７６】
「糖モジュール（ｇｌｙｃｏｍｏｄｕｌｅ）」という用語は、糖質部分がアミノ酸配列モチーフと共有結合している糖ペプチドを指す。
【００７７】
「反復配列」という用語は、ポリペプチド配列に含まれるペプチド配列に言及して用いる場合、ペプチド配列がポリペプチド配列において１回〜１０回、より好ましくは１回〜１００回、最も好ましくは１回〜１０００回繰り返されることを意味する。ペプチド配列の反復は非連続的でも連続的でもよい。「非連続的な反復」という用語は、反復性ペプチド配列に言及して用いる場合、反復配列の間に少なくとも１つのアミノ酸（またはアミノ酸類似体）が位置することを意味する。「連続的な反復」という用語は、反復性ペプチド配列に言及して用いる場合、反復配列の間に介在アミノ酸（またはアミノ酸類似体）が存在しないことを意味する。
【００７８】
発明の一般的な説明
本発明は一般に、植物ゴムおよび他のヒドロキシプロリンに富んだ糖タンパク質の分野に関し、特に、反復性ペプチド配列から設計した合成遺伝子の発現に関する。ヒドロキシプロリンに富んだ糖タンパク質（ＨＲＧＰ）スーパーファミリーは、植物界の全体を通じて、一次細胞壁または細胞外マトリックスに偏在している。ファミリーのメンバーは構造的に多様であり、植物の成長および発生のあらゆる面に関与する。これには、病気の発生および機械的損傷によって加わるストレスに対する植物の応答が含まれる。
【００７９】
植物ＨＲＧＰには動物における既知の相同体が存在しない。さらに、ヒドロキシプロリン残基は植物の糖タンパク質ではＯ−グリコシル化されるが、これは動物では全くみられない。これらの特有の植物糖タンパク質の機能は分子レベルでは未だにあまり解明されていない。
【００８０】
ＨＲＧＰは、その程度に差はあるものの、長い反復性のモジュールタンパク質である。モジュールは小型で（一般に４〜６アミノ酸残基のモチーフ）、通常はグリコシル化されており、ほとんどのＨＲＧＰは複数の型の反復性モジュールから構成されている。本発明の合成遺伝子を構築するためには、グリコシル化ポリペプチドのモジュールを単にペプチドまたはオリゴサッカライドとしてではなく、小型の機能的モチーフとして見ることが有用である。
【００８１】
本発明の説明には、Ａ）関心対象のポリペプチドの設計、Ｂ）関心対象のポリペプチドをコードする合成遺伝子の作製、Ｃ）発現ベクターの構築、Ｄ）宿主細胞の選択、Ｅ）特定の細胞への発現構築物の導入（インビトロまたはインビボで）、Ｆ）好ましいコンセンサス配列およびその部分、ならびにＧ）Ｏ−グリコシル化コードが含まれる。
【００８２】
Ａ．関心対象のポリペプチドの設計
本発明は、ヒドロキシプロリンに富んだ糖タンパク質（ＨＲＧＰ）、反復性プロリンに富んだタンパク質（ＲＰＲＰ）およびアラビノガラクタンタンパク質（ＡＧＰ）の断片である、ポリペプチドを意図する。本発明は、高度に保存されたＳｅｒ−Ｈｙｐ４（配列番号：３）モチーフを１つまたは複数含む、ＨＲＧＰの部分を意図する。本発明は、ペンタペプチドモチーフ：Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（配列番号：４）を１つまたは複数含む、ＲＰＲＰの部分も意図する。本発明はまた、１つまたは複数のＸａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ−Ｈｙｐ（配列番号：９）反復を含む、ＡＧＰの部分も意図する。
【００８３】
グリコシル化の天然の機構を理解することが、本発明を首尾良く実施するために必要なわけではないが、ＧＡＧＰおよび他のＨＲＧＰでは、反復性Ｘａａ−ＨｙｐモチーフがＨｙｐ−グリコシル化コードを形成し、連続モチーフ（Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐ）として存在するＨｙｐ、および非連続的なＨｙｐ反復として存在するＨｙｐが、それぞれアラビノシルトランスフェラーゼおよびガラクトシルトランスフェラーゼという異なる酵素によって認識されると考えられている。
【００８４】
ＲＰＲＰ（およびいくつかのノジュリン）は、最小量の連続Ｈｙｐを含む短い反復性モチーフからなる（例えば、ダイズＲＰＲＰ１：［ＰＯＶＹＫ］ｎ、ここでＯ＝Ｈｙｐ）。それらは、比較的少数のＨｙｐ残基がアラビノシル化され、アラビノガラクタンポリサッカライドは存在しないという、グリコシル化の範囲のうち最も低い側の例でもある。例えば、ダイズＲＰＲＰ１ではＬ−アラビノフラノースが分子内の単一のＨｙｐ残基のみに結合するものと思われる。
【００８５】
エクステンシンはグリコシル化の過程における中間的な位置を占めており、糖質を約５０％含むが、これは主としてＨｙｐ−アラビノシド（１個〜４個のＡｒａ残基）として存在し、Ｈｙｐ−アラビノガラクタンポリサッカライドとしては存在しない。エクステンシンは、その診断に役立つ、高度にアラビノシル化された反復性のＳｅｒ−Ｈｙｐ４（配列番号：３）糖ペプチドモジュールを含む。このモジュールの正確な機能はわかっていないが、以前の研究により、これらのアラビノシル化Ｈｙｐのモチーフが、エクステンシンの長いポリプロリン−ＩＩヘリックスの安定化に役立つことが示されている。モノガラクトースもＳｅｒ残基上に存在する。
【００８６】
古典的なＳｅｒ−Ｈｙｐ４（配列番号：３）糖ペプチドモジュールには特に関心がもたれる。このモチーフの各々のＨｙｐ残基にテトラ−Ｌ−アラビノフラノシルオリゴサッカライドが結合する。３つの特有にｂ結合した（ｂ−ｌｉｎｋｅｄ）アラビノフラノシル残基、および１つのａ結合した（ａ−ｌｉｎｋｅｄ）非還元末端が、テトラアラビノオリゴサッカライドを構成する。グリコシル化の天然の機構を理解することが本発明を首尾良く実施するために必要なわけではないが、アラビノシル化Ｈｙｐ残基が単一のガラクトシル−セリン残基とともに、それ自体を含む、壁の他の構成要素と相互作用し、それらによって認識される特有の分子表面形態を形成すると考えられている。Ｈｙｐのより短いモチーフ、すなわちＨｙｐ３およびＨｙｐ２には第４の（ａ結合した）アラビノース残基がなく、このことからもＨｙｐ４モチーフに特有な第４のＡｒａに特別な役割があり、これが認識または切断のために存在する可能性が示唆される。
【００８７】
テトラ−アラビノースおよびトリ−アラビノースは既知のテトラ−Ｈｙｐモチーフと結合している。天然のエクステンシンから単離されたこのようなＳｅｒ−Ｈｙｐ４では、すべてのＨｙｐ残基がアラビノシル化されている。しかし、本明細書に開示するＥＧＦＰとの融合したＳｅｒ−Ｈｙｐ４反復では、いくつかのＨｙｐ残基がグリコシル化されておらず、いくつかはモノ−およびジ−アラビノシル化されていることが示された。Ｈｙｐ残基は主としてトリ−アラビノシル化およびテトラ−アラビノシル化されていた。例えば、Ｈｙｐ−Ａｒａ４は全Ｈｙｐの３１％であり、Ｈｙｐ−Ａｒａ３は全Ｈｙｐの５２％であり、Ｈｙｐ−Ａｒａ２は全Ｈｙｐの８％であり、Ｈｙｐ−Ａｒａは全Ｈｙｐの２％であった。全Ｈｙｐのうち７％はグリコシル化されていなかった。ＥＧＦＰとの融合した本発明の例示的なＳｅｒ−Ｈｙｐ４反復におけるセリン残基のほとんどは、ガラクトシル化されていなかった。これは、Ｓｅｒがしばしばモノ−ガラクトシル化されている天然のＳｅｒ−Ｈｙｐ４とは対照的である。重要なことに、ＥＧＦＰとの融合したＳｅｒ−Ｈｙｐ４反復において、Ｈｙｐ−ポリサッカライドは全く検出されなかった。
【００８８】
グリコシル化の範囲のうち最も高い側（ほぼ９０％が糖）では、アラビノガラクタンタンパク質（ＡＧＰ）および構造の類似したアラビアゴム糖タンパク質（ＧＡＧＰ）は、アラビノガラクタンポリサッカライドによる特有のグリコシル化を受ける。ＧＡＧＰ、およびＨｙｐ−グリコシドプロフィールにより、これまでに特徴付けられたすべてのＡＧＰは、Ｈｙｐ隣接仮説（Ｈｙｐ ｃｏｎｔｉｇｕｉｔｙ ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ）によって連続Ｈｙｐ残基に指定される、Ｈｙｐと結合したアラビノシドを含む。しかし、これらの糖タンパク質は特有のＸａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ−Ｈｙｐ（配列番号：９）反復も含む。これらの反復は多糖結合部位と推定されている。
【００８９】
本発明は特に、アラビアゴム糖タンパク質（ＧＡＧＰ）の断片を意図する。上記の通り、ＧＡＧＰの化学分析はかなり困難であった。本発明者らが本明細書に開示する配列を発見する前には、アラビアゴムから得られ、配列が決定された最大のペプチドは、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ−Ｓｅｒ−Ｈｙｐ−Ｔｈｒ−Ｈｙｐ−Ｔｈｒ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号：１３）の配列を有する、１２アミノ酸のペプチドであった。デロネー（Ｃ． Ｌ． Ｄｅｌｏｎｎａｙ）、「アラビアゴムのタンパク質成分の決定（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ Ｏｆ Ｇｕｍ Ａｒａｂｉｃ）」、科学修士論文（Ｍａｓｔｅｒ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｈｅｓｉｓ）（１９９３）。本発明は、合成遺伝子の設計のために、このデロネー配列、ならびにＧＡＧＰの（これまで記載されていない）より長いペプチド断片（およびその変異型）を用いることを意図する。この方式により、「デザイナー（ｄｅｓｉｇｎｅｒ）植物ゴム」を生産することができる（「デザイナーエクステンシン」も意図する）。
【００９０】
１つの態様において、本発明は、アミノ酸コンセンサス配列
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またはその変異型の少なくとも一部分を含む、実質的に精製されたポリペプチドを意図する。グリコシル化の天然の機構を理解することが、本発明を首尾良く実施するために必要なわけではないが、天然のＧＡＧＰでは、このＧＡＧＰの１９アミノ酸コンセンサス反復配列（連続的なＨｙｐ反復および非連続的なＨｙｐ反復の両方を含む）がグリコシル化されており、Ｈｙｐ−アラビノシドおよびＨｙｐ−ポリサッカライドの両方が一定のモル比で存在すると考えられている。さらに、アラビアゴムの高分子量タンパク質成分（すなわち、ＧＡＧＰ）は、食品産業および清涼飲料産業によって利用されている、顕著な（および有益な）乳化活性および安定化活性の原因であると考えられている。
【００９１】
本発明の配列を、ヒドロキシプロリンに富んだ糖タンパク質と結合する分子の単離に用いてもよい。例えば、種々の供給源（例えば、藻類、植物、動物、微生物）由来のＨＲＧＰ結合分子の単離に用いるために、本発明のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを、固体支持体または樹脂上に（共有的または非共有的に）固定することができる。市販のキットを用いてポリペプチドを固定するための一般的な方法は当技術分野で公知である。例えば、所望のポリペプチド配列を、固定された免疫グロブリン上への融合タンパク質の固定を可能とする、異種タンパク質Ａとの融合タンパク質として発現させてもよい。さらに、ｐＧＥＸベクター（プロメガ社、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて、所望のポリペプチドをグルタチオン−アガロースビーズに吸着されるグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させてもよい。
【００９２】
本発明の配列を、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の作製に用いることもできる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製するための一般的な方法は、当技術分野で公知である。例えば、モノクローナル抗体は、ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）（１９７６）Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：５１１〜５１９（物件Ｂ）、ならびにゴディング（Ｊ． Ｇｏｄｉｎｇ）（１９８６）、「モノクローナル抗体：原理および実践（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ｐｐ ５９〜１０３の方法を用いて作製しうる。
【００９３】
Ｂ．合成遺伝子の作製
本発明は、カルスおよび懸濁培養物を非制限的に含む細胞における反復性糖ペプチドモジュールの発現を目的として作製された、合成遺伝子の使用を意図する。本発明は厳密な反復回数によっては限定されないものとする。
【００９４】
１つの態様において、本発明は、２回から最大５０回までの間、より好ましくは１０回から最大３０回までの間、最も好ましくは約２０回の反復配列として用いうる、ＧＡＧＰのコンセンサス配列（すなわち、配列番号：１および配列番号：２）またはその変異型をコードする核酸配列を意図する。コンセンサス配列（すなわち、配列番号：１および配列番号：２）またはその変異型をコードする核酸は、連続した反復として用いてもよく、非連続的な反復として用いてもよい。
【００９５】
何らかのＨＲＧＰ遺伝子カセットを設計する際には以下の指針を用いる：
【００９６】
１）コード配列の反復性を最小限に抑えながら、宿主植物のＨＲＧＰコドンバイアスも考慮する（例えば、トマトが宿主植物である場合には、Ｐｒｏ残基に対してＣＣＡおよびＣＣＴが優先され［ＣＣＧではなく］、Ｓｅｒ残基に対してＴＣＡおよびＴＣＣが優先されるトマトのコドン使用頻度バイアスを用いる）。おそらくは他のイネ科の単子葉植物（例えば、イネ、オオムギ、コムギおよびすべてのイネ科植物）もそうであるが、トウモロコシ（コーンなど）では、プロリンに対してＣＣＧおよびＣＣＣが優先され、バリンに対してＧＴＣおよびＣＴＴが優先され、リジンに対してＡＡＧが優先される。双子葉植物（マメ科植物を含む）ではプロリンに対してＣＣＡおよびＣＣＴが優先され、セリンに対してＴＣＡおよびＴＣＴが優先される。
【００９７】
２）厳密な配列周期性を最小限に抑える。
【００９８】
３）適切な「頭部から尾部への」重合が確実に起こるように、モノマーおよび末端リンカーには非パリンドローム性末端を用いる。
【００９９】
４）構築物は、これらの配列を発現ベクターに挿入するため、またはこのようなベクターを後に操作する際に用いる、制限酵素用の内部制限酵素認識部位を含まない。５’リンカーは一般に、クローニングベクター（例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）へのクローニングに用いられるＢａｍＨＩ部位の下流に、ＸｍａＩ部位を含む。このＸｍａＩ部位はＨＲＧＰ遺伝子カセットを発現ベクター（例えば、ｐＢＩ１２１−Ｓｉｇ−ＥＧＦＰ）に挿入するために用いられる。３’リンカーは一般に、クローニングベクター（例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）へのクローニングに用いられるＥｃｏＲＩ部位の上流に、ＡｇｅＩ部位を含む。このＡｇｅＩ部位はＨＲＧＰ遺伝子カセットを発現ベクターに挿入するために用いられる［融合タンパク質のためのＧＦＰを含まないプラスミドｐＢＩ１２１−Ｓｉｇの場合は、同じシグナル配列（ＳＳ）を用いるが、３’リンカーはシグナル配列の後方かつＮＯＳターミネーターの前方にＸｍａＩ／ＳｓｔＩ断片として挿入するための、ＳｓｔＩ制限部位を含む］。
【０１００】
５）用いるオリゴヌクレオチドは高品質のものとし（例えば、ＧｉｂｃｏＢＲＬ社のオペロン）、望ましくない合成産物を除去して精製しておく。
【０１０１】
６）正しく整列したオリゴマーのＴｍは、可能性のある二量体、ヘアピンまたは架橋二量体（ｃｒｏｓｓｄｉｍｅｒ）のＴｍよりも高い。
【０１０２】
当業者は、本発明の配列中のヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）残基が、遺伝子によってコードされるポリペプチド中のプロリン（Ｐｒｏ）残基の翻訳後修飾の結果として生じることを認識している。このため、本発明の配列中にヒドロキシプロリン残基が存在することが望ましい場合には、プロリンをコードするように対応するコドンが選択されると考えられる。以下の実施例２３に述べるように、どのＰｒｏ残基がヒドロキシル化されてＨｙｐとなったかを特定するために、エドマン分解を用いてもよい。
【０１０３】
Ｃ．発現ベクターの構築
本発明は発現ベクターの性質によっては限定されないものとする。種々のベクターを意図する。１つの態様では、いずれもｐＢＩ１２１（クロンテック社）に由来する２つの植物形質転換ベクターを調製する。これは両方とも、構築物がＥＲ／ゴルジを通って輸送されて翻訳後修飾を受けるための、エクステンシンシグナル配列（ＳＳ）を含む。第１のプラスミド構築物はＧＵＳの代わりにレポータータンパク質として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むものとした。第２のプラスミドはＧＦＰを含まない。
【０１０４】
ｐＢＩ１２１はジェファーソン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ）によるベクターであり、ＢａｍＨＩ部位およびＳｓｔＩ部位を用いて、３５Ｓ ＣａＭＶプロモーターとアグロバクテリウムＴｉプラスミドのノパリンシンターゼ遺伝子由来の終結／ポリアデニル化シグナル（ＮＯＳ−ｔｅｒ）との間に、外来性ＤＮＡを挿入することができる；これはＲＫ２複製起点、カナマイシン耐性遺伝子およびＧＵＳレポーター遺伝子も含む。
【０１０５】
シグナル配列
上記の通り、ＧＵＳ配列は、ニコチアナ・プルムバギニフォリア（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｐｌｕｍｂａｇｉｎｆｏｌｉａ）およびタバコ（Ｎ． ｔａｂａｃｕｍ）のエクステンシンシグナル配列に基づくペプチドシグナル配列、
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をコードする合成ＤＮＡ配列によって、置換される（ＢａｍＨＩ／ＳｓｔＩを介して）。このＤＮＡ配列は、１５ｂｐの５’非翻訳領域のほか、ＧＵＳの代わりにｐＢＩ１２１中に挿入するためのＢａｍＨＩ用の制限部位を５’端に、ＳｓｔＩ部位を３’末端の最先端に含む。ＸｍａＩ制限部位はＳｓｔＩ部位の１６ｂｐ上流に存在し、これによって後にＥＧＦＰをプラスミド中にＸｍａＩ／ＳｓｔＩ断片として挿入することが可能となる。
【０１０６】
上記の箇所で下線を施した配列は、Ｎ．プルムバギニフォリア・エクステンシン融合タンパク質が、ＥＲおよびゴルジを通って翻訳後修飾を受けるようにさせ、最終的には壁に向かわせる。提示したシグナル配列は、同じ科（ナス科）の植物におけるエクステンシンおよびエクステンシンモジュールの輸送にも関与する。または、トマトＰ１エクステンシン自体に由来するシグナル配列を用いることもできる。
【０１０７】
【表１】
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【０１０８】
さらにもう１つの選択肢として、トマトのアラビノガラクタンタンパク質（Ｌｅ−ＡＧＰ−１）のシグナル配列を用いてもよい。この配列は以前にクローニングされており［Ｌｉ（１９９６）「トマトアラビノガラクタンタンパク質をコードする遺伝子および相補ＤＮＡの単離および特徴付け（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｔｏｍａｔｏ ａｒａｂｉｏｇａｌａｃｔａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）、博士論文、オハイオ大学、Ａｔｈｅｎｓ、Ｏｈｉｏ］、タンパク質配列
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をコードする。この配列は本発明者らにより、本発明の配列の発現をタバコ細胞培養物の細胞外媒体に指向させるために首尾良く用いられているほか、（Ａｌａ−Ｐｒｏ）ｎ−ＥＧＦＰおよび（Ｔｈｒ−Ｐｒｏ）ｎ−ＥＧＦＰをタバコ細胞培養物の細胞外マトリックスに向かわせるためにも用いられている。
【０１０９】
ＧＦＰの付加
反復性ＨＲＧＰモジュールをＧＵＳ融合体ではなくＧＦＰ融合産物として発現させることもでき、ＧＦＰを伴わないモジュールとして発現させることもできる。ＥＧＦＰ（植物に対して推奨されるＳ６５Ｔ変異型、クロンテック社による）または他の適した変異体（上の表１参照）のような、植物での使用に適するように赤方偏移した緑色蛍光タンパク質のレポーター遺伝子との融合により、細胞表面にある７００個未満のＧＦＰ分子を検出することが可能となる。ＧＦＰは蛍光団の酸化的形成のために好気的条件を必要とする。これは植物細胞培養に用いられる比較的低い温度で十分に働く上、通常はタンパク質の機能に悪影響を及ぼすこともないが、植物の再生が可能なのはＥＲを標的とした場合のみと考えられる。
【０１１０】
プロモーター
上記の通り、本発明は発現構築物に用いるプロモーターの性質によっては限定されないものとする。ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターが好ましいが、これは完全に構成性ではなく、発現は「中等度」である。いくつかの態様においては、ＨＲＧＰモジュールの収量を高めるために、構築物のより高度の発現が望ましい；このような場合には「二重の（ｄｏｕｂｌｅ）」ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを有するプラスミドを用いる。
【０１１１】
Ｄ．宿主細胞の選択
種々の宿主細胞を意図する（真核細胞および原核細胞のいずれも）。本発明は、本発明の合成遺伝子の発現のために用いる宿主細胞によっては限定されないものとする。マメ科植物（例えば、ダイズ）およびナス科植物（例えば、タバコ、トマトなど）を非制限的に含む、植物宿主細胞が好ましい。本発明の範囲に含まれると考えられるその他の細胞には、緑色藻類［例えば、クラミドモナス、ボルテックスおよびウキクサ（Ｌｅｍｎａ）］がある。
【０１１２】
本発明は植物細胞の性質によっては限定されない。あらゆる由来の植物組織を意図する。１つの態様において、本発明の配列を発現しうるベクターによる形質転換の標的として選択される植物組織は、植物を再生させることができる。本明細書で用いる「再生」という用語は、１つの植物細胞、植物細胞の一群、植物の一部または植物の小片（例えば、種子、プロトプラスト、カルス、プロトコーム様小体または組織の部分）から全植物体を生長させることを意味する。このような組織には種子が非制限的に含まれる。顕花植物の種子は胚、種皮および貯蔵食糧からなる。完全に形成された胚は基本的には、胚軸−根軸を有する１つまたは２つの子葉、ならびに茎頂および根端にある頂端分裂組織からなる。ほとんどの双子葉植物の子葉は多肉質であり、種子の貯蔵食糧を含む。他の双子葉植物およびほとんどの単子葉植物では、食糧は内乳に貯蔵され、子葉は食糧の消化によって生じた比較的単純な化合物を吸収する働きをする。
【０１１３】
以下の例の植物属に由来する種は、形質転換プロトプラストから再生すると思われる：ヘビイチゴ属（Ｆｒａｇａｒｉａ）、ミヤコグサ属（Ｌｏｔｕｓ）、ウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、オノブリキス属（Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ）、シャジクソウ属（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ）、トリゴネラ属（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ）、ササゲ属（Ｖｉｇｎａ）、ミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ）、アマ属（Ｌｉｎｕｍ）、フウロソウ属（Ｇｅｒａｎｉｕｍ）、イモノキ属（Ｍａｎｉｈｏｔ）、ニンジン属（Ｄａｕｃｕｓ）、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ダイコン属（Ｒａｐｈａｎｕｓ）、シロガラシ属（Ｓｉｎａｐｉｓ）、ロウトウ属（Ａｔｒｏｐａ）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、ヒヨス属（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）、トマト属（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）、ジギタリス属（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ）、マヨラナ属（Ｍａｊｏｒａｎａ）、チオホリウム属（Ｃｉｏｈｏｒｉｕｍ）、ヒマワリ属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）、アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）、スズメノチャヒ属（Ｂｒｏｍｕｓ）、アスパラガス属（Ａｓｐａｒａｇｕｓ）、キンギョソウ属（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ）、ヘレロカリス属（Ｈｅｒｅｒｏｃａｌｌｉｓ）、ネメシア属（Ｎｅｍｅｓｉａ）、テンジクアオイ属（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）、チカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）、キンポウゲ属（Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ）、キオン属（Ｓｅｎｅｃｉｏ）、サルメンバナ属（Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ）、キュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）、ブロワーリア属（Ｂｒｏｗａａｌｉａ）、ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）、トウモロコシ属（Ｚｅａ）、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）およびチョウセンアサガオ属（Ｄａｔｕｒａ）。
【０１１４】
トランスジェニック性プロトプラストからのトランスジェニック植物の再生のためには、形質転換されたプロトプラストの懸濁液、または形質転換されたエクスプラントを含むペトリ皿をまず用意する。カルス組織を形成させ、さらにカルスから苗条を誘導し、その後に根付かせてもよい。または、カルス組織における体細胞胚の形成を誘導してもよい。これらの体細胞胚は天然の胚として出芽し、植物体を形成する。培養基は一般に、種々のアミノ酸、ならびにオーキシンおよびサイトカイニンなどの植物ホルモンを含む。また、特にトウモロコシおよびアルファルファなどの種に対しては、培養基にグルタミン酸およびプロリンを添加することも有益である。再生効率は培養基、遺伝子型および培養物に依存すると考えられる。これらの３つの変数を経験的に調節することにより、再現性のある再生が得られる可能性がある。
【０１１５】
植物を培養細胞または培養組織から再生させることもできる。形質転換された個々の細胞から再生して、トランスジェニック全植物体が得られることが示されている双子葉植物には、例えば、リンゴ（Ｍａｌｕｓ ｐｕｍｉｌａ）、クロイチゴ（キイチゴ属）、クロイチゴ／ラズベリー雑種（キイチゴ属）、赤ラズベリー（キイチゴ属）、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、カリフラワー（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）、セロリ（Ａｐｉｕｍ ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、野生ツルマメ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）、イチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ ｘ ａｎａｎａｓｓａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、クルミ（Ｊｕｇｌａｎｓ ｒｅｇｉａ）、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）およびマンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ）が含まれる。形質転換された個々の細胞から再生して、トランスジェニック全植物体が得られることが示されている単子葉植物には、例えば、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）およびトウモロコシが含まれる。
【０１１６】
さらに、以下では細胞（必ずしも形質転換されたものではない）からの全植物体の再生も観察されている：アンズ（Ｐｒｕｎｕｓ ａｒｍｅｎｉａｃａ）、アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、バナナ（バショウ属交配種）、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サクランボ（サクラ属交配種）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ）、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）、オクラ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）、タマネギ（ネギ属交配種）、オレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、パパイヤ（Ｃａｒｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）、モモ（Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ）、プラム（Ｐｒｕｎｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、セイヨウナシ（Ｐｙｒｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）、スイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）およびコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）。
【０１１７】
再生した植物は標準的な土壌条件に移し、通常の様式で栽培する。発現ベクターが再生したトランスジェニック植物に安定的に取り込まれた後には、それを栄養繁殖または性的交配によって他の植物に移行させることができる。例えば、栄養繁殖を行わせる農作物では、成熟したトランスジェニック植物を挿し穂の採取または組織培養法によって繁殖させて、多数の同一な植物を得ることができる。種子繁殖を行わせる農作物では、成熟したトランスジェニック植物を自己交配させて、子孫に導入遺伝子をメンデル遺伝によって伝達しうる、ホモ接合性の同系交配植物を得ることができる。同系交配植物は、関心対象の核酸配列を含む種子を生産する。これらの種子を生長させて、所望のポリペプチドを産生すると考えられる植物を得ることができる。同系交配植物は、同系交配植物を別の同系交配植物と交配させて交配種を作出することにより、新たな交配種を開発するために用いることもできる。
【０１１８】
本発明は特定の種類の細胞のみには限定されないものとする。単子葉植物および双子葉植物の両方を意図する。単子葉植物には、イネ科植物、ユリ科植物、アヤメ属植物、ラン、ガマ、ヤシ、トウモロコシ（コーンなど）、イネ、オオムギ、コムギおよびすべての草が含まれる。双子葉植物には、公知の高木および低木のほぼすべて（針葉樹を除く）ならびに草本植物（木質でない植物）の多くが含まれる。
【０１１９】
トマト培養物は、反復性ＨＲＧＰモジュールのヒドロキシル化およびグリコシル化を行うための、理想的な受容体である：トマトは容易に形質転換される。この培養物は、無傷細胞の細胞表面から容易に溶出する細胞表面ＨＲＧＰを高収量で産生するほか、これらは植物に特有な必須の翻訳後修飾酵素、すなわちＨＲＧＰプロリルヒドロキシラーゼ、ヒドロキシプロリンＯ−グリコシルトランスフェラーゼ、および複雑な多糖側鎖を構築するための他の特異的なグリコシルトランスフェラーゼを有する。さらに、トマトの遺伝学およびトマトのリーフディスク形質転換／小植物体再生は十分に確立されている。
【０１２０】
本発明の配列に関するその他の好ましい受容体には、タバコの培養細胞および植物体が含まれる。
【０１２１】
Ｅ．核酸の導入
本発明の発現構築物は当技術分野で公知の方法を用いて、宿主細胞（例えば、植物細胞）に導入しうる。１つの態様では、粒子を介した遺伝子導入によって発現構築物を植物細胞に導入する。粒子を介した遺伝子導入法は当技術分野で知られ、市販されており、これにはマッケイブ（ＭｃＣａｂｅ）、米国特許第５，５８４，８０７号（その内容はすべて参照として本明細書に組み入れられる）に記載された、気体駆動式遺伝子送達装置が非制限的に含まれる。この方法は、関心対象の核酸配列を重金属粒子にコーティングし、コーティングした粒子を標的組織への送達のために圧縮ガスの圧力下で加速させる段階を含む。
【０１２２】
その他の粒子打ち込み法も異種核酸配列の植物細胞への導入に用いうる。一般に、これらの方法は、金、白金またはタングステンなどの材料の小さな稠密粒子の表面に、関心対象の核酸配列を付着させる段階を含む。コーティングした粒子を次に、金属板などの硬質面またはマイラーなどの脆い材料でできた担体シートにコーティングする。続いて、コーティングされたシートを標的生物組織に向けて加速して当てる。平坦シートの使用により、均一な条件下で粒子を受け取る細胞の数が最大となるような加速粒子の均一な広がりが生じ、核酸試料の標的組織への導入がもたらされる。
【０１２３】
または、関心対象の核酸配列によってあらかじめ形質転換された、アグロバクテリウム菌株を非制限的に含む細菌を感染させることにより、発現構築物を植物細胞のゲノムに挿入してもよい。一般には、当技術分野で周知の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．ら（１９８９）前記）を用いて関心対象の核酸配列を含むように構築された、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの組換えＴｉプラスミドまたはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）のＲｉプラスミド（米国特許第４，９４０，８３８号に記載されたものなど、その内容はすべて参照として本明細書に組み入れられる）により、無毒化したアグロバクテリウム細胞の形質転換を行う。続いて、形質転換されたアグロバクテリウム株を感染させることにより、関心対象の核酸配列を植物ゲノム中に安定的に組み込ませる。例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスおよびアグロバクテリウム・リゾゲネスの天然のＤＮＡ伝達系を用いて、異種核酸配列が植物組織に導入されている（総説については、Ｋｌｅｅら（１９８７）Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ． ３８：４６７〜４８６を参照）。
【０１２４】
当業者は、当技術分野で公知のさまざまな方法を用いて、アグロバクテリウムによる形質転換の効率を高めうることを認識している。例えば、アセトシリンゴン（ＡＳ）などの天然の損傷応答分子をアグロバクテリウム培養物に含めることにより、アグロバクテリウム・ツメファシエンスによる形質転換効率が高まることが示されている［Ｓｈａｈｌａら（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ８：２９１〜２９８］。または、形質転換を行う標的組織に損傷を加えることによって、形質転換効率を高めることもできる。例えば、孔開け、冷浸、微粒子銃による打ち込みなどにより、植物組織に損傷を加えることができる［例えば、Ｂｉｄｎｅｙら（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． １８：３０１〜３１３を参照］。
【０１２５】
関心対象の核酸配列に、植物ゲノムの特定の遺伝子座を標的とさせるのが望ましい場合も考えられる。関心対象の核酸配列の植物細胞ゲノムへの位置特異的組み込みは、例えば、アグロバクテリウム由来の配列を用いる相同組換えによって行える。一般には、以前に記載されたように（Ｏｆｆｒｉｎｇａら（１９９６）、米国特許第５，５０１，９６７号、その内容はすべて参照として本明細書に組み入れられる）、植物細胞を、標的遺伝子座の内部のＤＮＡ配列と相同な配列に隣接して、アグロバクテリウムの転移ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）配列が存在するターゲティングベクターを含むアグロバクテリウム菌株とともに、インキュベートする。当業者は、標的遺伝子の調節エレメントまたは遺伝子のコード領域のいずれに属するかを問わず、植物遺伝子の任意の部分と相同な配列を含むターゲティングベクターを用いて、相同組換えを行えることを認識している。標的とする部位に隣接する領域の核酸配列が公知である限り、相同組換えは植物遺伝子の任意の領域で行うことができる。
【０１２６】
相同組換えが望ましい場合、用いるターゲティングベクターは置換型のものでも挿入型のものでもよい（Ｏｆｆｒｉｎｇａら（１９９６）、前記）。置換型ベクターは一般に、標的ゲノム配列と相同であって、異種核酸配列、例えば選択マーカーの遺伝子配列と隣接した、２つの領域を含む。置換型ベクターは選択マーカー遺伝子の挿入をもたらし、それによって標的遺伝子を破壊する。挿入型ベクターは標的遺伝子と相同な単一の領域を含み、ターゲティングベクター全体の標的遺伝子への挿入をもたらす。
【０１２７】
植物組織への発現構築物の導入に、他の方法、例えば、エレクトロインジェクション（Ｎａｎら（１９９５）「農業および林業におけるバイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ）」、Ｙ．Ｐ．Ｓ． Ｂａｊａｊ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、第３４巻：１４５〜１５５；Ｇｒｉｅｓｂａｃｈ（１９９２）ＨｏｒｔＳｃｉｅｎｃｅ ２７：６２０）；リソソーム、細胞、ミニ細胞、または融合性脂質が表面にある他の物質との融合（Ｆｒａｌｅｙら（１９８２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：１８５９〜１８６３；ポリエチレングリコール（Ｋｒｅｎｓら（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９６：７２〜７４）；遊離ＤＮＡの取り込みを増加させる化学物質；ウイルスを用いる形質転換などを用いることもできる。
【０１２８】
１つの態様において、本発明は、リーフディスク形質転換法によって核酸を導入することを意図する。ホーシュ（Ｈｏｒｓｃｈ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：１２２９〜１２３１（１９８５）。簡潔に述べると、滅菌した葉の表面からディスクに孔を開け、２８℃のルリア培地（ＬＢ）中で一晩増殖させたＡ．ツメファシエンスの培養物中に、ゆっくりと振盪しながら浸漬する。続いてディスクを吸取紙で乾かし、保護培養プレート上に裏返しに置いて苗条の再生を誘導する。２〜３日後にリーフディスクを、同じ培地を含むがフィーダー細胞および濾紙は含まず、さらに抗生物質耐性に関する選択のためにカルベニシリン（５００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（３００μｇ／ｍｌ）が入ったペトリ皿に移す。発育した苗条を２〜４週後にカルスから採取し、適切な抗生物質を加えた毛根誘発性培地に入れる。根が形成された後にこれらの苗条をさらに土壌に移植する。
【０１２９】
関心対象の異種核酸配列によって形質転換された細胞および組織は、ゲノムＤＮＡの制限地図の作成、ＰＣＲ分析、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション、ＤＮＡ配列解析などを非制限的に含む、当技術分野で公知の方法を用いて容易に検出される。
【０１３０】
さらに、選択マーカー遺伝子を用いて形質転換細胞の選択を行うこともできる。必ずしもというわけではないが、形質転換された植物細胞の選択には選択マーカー遺伝子を用いることが好ましい。選択マーカー遺伝子は陽性選択を付与するものでも陰性選択を付与するものでもよい。
【０１３１】
陽性選択マーカー遺伝子を、無作為な組み込み、および位置特異的（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）組み込みのために、構築物中に用いてもよい。陽性選択マーカー遺伝子には抗生物質耐性遺伝子および除草剤耐性遺伝子などが含まれる。１つの態様において、陽性選択マーカー遺伝子は、ジェネティシン（Ｇ４１８）またはカナマイシンに対する耐性を付与するＮＰＴＩＩ遺伝子である。もう１つの態様において、陽性選択マーカー遺伝子は、ハイグロマイシンに対する耐性を付与するＨＰＴ遺伝子である。陽性選択マーカー遺伝子の選択は、それが機能的なポリペプチド産物をコードする限り、本発明にとって特に重要ではない。当技術分野で公知の陽性選択遺伝子には、ＡＬＳ遺伝子（クロルスルフロン耐性）およびＤＨＦＲ遺伝子（メトトレキサート耐性）が非制限的に含まれる。
【０１３２】
また、陰性選択マーカー遺伝子を構築物中に含めてもよい。相同組換えに用いるための構築物には、１つまたは複数の陰性選択マーカー遺伝子を１つの陽性選択マーカー遺伝子と組み合わせて用いることが好ましい。陰性選択マーカー遺伝子は一般に、相同組換え事象に関与する領域の外側に位置する。陰性選択マーカー遺伝子は、これらの遺伝子がゲノム中に発現可能な様式で組み込まれた細胞に対して、不利益（好ましくは致死性）を与える働きをする。相同組換え用のターゲティングベクターがゲノム中に無作為に組み込まれた細胞は、陰性選択マーカー遺伝子が存在するために、傷害または細胞死を被ると考えられる。陽性選択マーカー遺伝子が構築物中に含まれる場合には、陽性選択マーカー遺伝子がゲノム中に組み込まれた細胞のみが、生存すると考えられる。
【０１３３】
陰性選択マーカー遺伝子の選択は、それが形質転換植物細胞において機能的なポリペプチドをコードする限り、本発明にとって特に重要ではない。陰性選択遺伝子は例えば、アグロバクテリウムのＴｉプラスミド由来のａｕｘ−２遺伝子、ＳＶ４０由来のｔｋ遺伝子、ストレプトマイセス・グリセウス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）由来のシトクロムＰ４５０、トウモロコシまたはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）などのＡｄｈ遺伝子などから選択しうる。植物細胞にとって通常は無害な物質を、植物細胞にとって有害な物質に変換しうる酵素をコードする遺伝子を用いてもよい。
【０１３４】
本発明の配列またはこれらの配列を含む発現構築物によって形質転換される宿主細胞は、何らかの特定の表現型を呈する細胞には限定されないものとする。必要とされるのは、形質転換細胞が本発明の配列によってコードされるポリペプチドを発現することのみである。このような宿主細胞を、発現されたポリペプチドを後に用いる目的（例えば、食品産業または化粧品産業において、ＨＲＧＰ結合分子の単離のため、および抗体の作製のため）で精製するために用いてもよい。
【０１３５】
また、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を特定のレベル、細胞のライフサイクルの特定の時期、または形質転換植物の特定の部位で発現する形質転換細胞にも限定されないものとする。逆に、本発明は、所望のタンパク質を比較的低いレベルおよび比較的高いレベルで発現する細胞を、このような発現が形質転換植物の一部またはすべての部分で起こるか、およびそれが細胞の成長もしくは植物の発育に伴って変化するかまたは変化しないかにかかわらず、明確に意図する。
【０１３６】
Ｆ．好ましいコンセンサス配列およびその部分
本発明は、ＧＡＧＰ配列、特に配列番号：１３４のコンセンサス配列を提供する。アラビアゴム糖タンパク質（ＧＡＧＰ）は、アラビアゴムの成分である高分子量のヒドロキシプロリンに富んだアラビノガラクタンタンパク質（ＡＧＰ）の一つである。ＧＡＧＰはかなり偏りのある単純なアミノ酸組成を有しており、これは反復性ポリペプチド骨格の存在を意味する。反復性ポリペプチド骨格は、それぞれが３つのＨｙｐ−アラビノシド結合部位および１つのＨｙｐ−アラビノガラクタンポリサッカライド結合部位を有する、小型（約１０個のアミノ酸残基）の反復性ペプチドモチーフを含むことが示唆されている［Ｑｉら（１９９１）前記］。本発明者らは、ＧＡＧＰのペプチドの作製および配列決定を行い、単離したＨｙｐ−ポリサッカライドのグリコシル分析および結合分析を行うことにより、この仮説を検証した。驚くべきことに、本発明者らは、チー（Ｑｉ）ら（１９９１）が以前に仮定したサイズの概ね２倍である、１９アミノ酸のコンセンサス配列を見いだした。反復モチーフのサイズの違いに加えて、本発明者らは驚くべきことに、本発明の１９アミノ酸のコンセンサス配列のペプチドには、チー（Ｑｉ）ら［Ｑｉら（１９９１）前記］によって示唆された、反復性モチーフに関するチー（Ｑｉ）らの実験式［すなわち、
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］に存在するアミノ酸のいくつか、特にＨｉｓ（表６、ペプチドＰＨ３Ｇ２）が存在しないことも見いだした。本発明者らは驚くべきことに、本発明の１９アミノ酸のＧＡＧＰコンセンサスモチーフが約９個のＨｙｐ残基を含み、ポリサッカライド結合部位は１つしかないことも見いだした。ＧＡＧＰのＨｙｐ−グリコシドプロフィールから判断して、本発明のコンセンサスモチーフは、チー（Ｑｉ）らによる３つではなく６つのＨｙｐ−アラビノシドを含み、チー（Ｑｉ）らによる１つではなく２つのＨｙｐ−ポリサッカライドを含んでいた。
【０１３７】
本発明は、コンセンサス配列（配列番号：１３６）：
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（ここでＡはＳｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＢはＨｙｐ、Ｐｒｏ、ＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＣはＰｒｏおよびＨｙｐから選択され；ＤはＨｙｐ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＥはＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＦはＳｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＧはＳｅｒ、Ｌｅｕ、Ｈｙｐ、Ｔｈｒ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；ＨはＨｙｐ、Ｐｒｏ、ＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＩはＴｈｒ、ＡｌａおよびＳｅｒから選択され；ＪはＴｈｒ、ＳｅｒおよびＡｌａから選択され；ＫはＴｈｒ、Ｌｅｕ、Ｈｙｐ、Ｓｅｒ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；ＬはＧｌｙ、Ｌｅｕ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；かつＭはＨｉｓおよびＰｒｏから選択される）を提供する（実施例１８、例えば、表３および表６）。また、本コンセンサス配列の４個〜１９個の連続したアミノ酸残基を有する、コンセンサス配列の部分も本発明に含まれる。
【０１３８】
１つの好ましい態様において、本発明のＧＡＧＰコンセンサス配列は１９個のアミノ酸を含み、このうち約９個はＨｙｐ残基である。ＧＡＧＰのＨｙｐ−グリコシドプロフィール（表７）から判断して、５つのＨｙｐ残基のうち約１つはポリサッカライド置換を受けている。したがって、１つの好ましい態様において、本コンセンサス配列およびその部分には約２個のＨｙｐ−ポリサッカライド部位がある。本発明を何らかの機序に限定するわけではないが、本発明者らは、連続したＨｙｐ残基のアラビノシル化、および、ＡＧＰに多くみられるＸ−Ｈｙｐ−Ｘ−Ｈｙｐモジュール［Ｎｏｔｈｎａｇｅｌ（１９９７）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ １７４：１９５］などの、クラスター化した非連続的なＨｙｐ残基に対するアラビノガラクタン−ポリサッカライド付加を予想している。同じく本発明を特定の理論に限定するわけではないが、本発明者らは、本発明の１９アミノ酸のコンセンサスモチーフが、好ましくは、クラスター化した非連続的なＨｙｐモチーフ［Ｆ−Ｈｙｐ−Ｇ−Ｈ−Ｉ−Ｈｙｐ（配列番号：１３７）（ここでＦはＳｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＧはＳｅｒ、Ｌｅｕ、Ｈｙｐ、Ｔｈｒ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；ＨはＨｙｐ、Ｐｒｏ、ＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；かつＩはＴｈｒ、ＡｌａおよびＳｅｒから選択される）、例えばＳｅｒ−Ｈｙｐ−Ｓｅｒ−Ｈｙｐ−Ｔｈｒ−Ｈｙｐ（配列番号：１３８）］内に約２つのポリサッカライド結合部位を含み、これに隣接してアラビノシル化された連続したＨｙｐ残基、例えばＡ−Ｈｙｐ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ（配列番号：１３９）（ここでＡはＳｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；ＢはＨｙｐ、ＬｅｕおよびＩｌｅから選択され；ＣはＰｒｏおよびＨｙｐから選択され；ＤはＨｙｐ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され；かつＥはＬｅｕおよびＩｌｅから選択される）；より好ましくは
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、ならびに例えばＪ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐ−Ｋ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｍ（配列番号：１４１）（ここでＪはＴｈｒ、ＳｅｒおよびＡｌａから選択され；ＫはＴｈｒ、Ｌｅｕ、Ｈｙｐ、Ｓｅｒ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；ＬはＧｌｙ、Ｌｅｕ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；かつＭはＨｉｓおよびＰｒｏから選択される）；より好ましくは
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が存在すると意図する（図９）。以下の表２に、４個〜１９個のアミノ酸を有し、本発明の配列番号：１３６に含まれる、４５種の例示的な配列を示す。
【０１３９】
【表２】
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＊ 遺伝子の設計のためには、最後の３つのアミノ酸配列（例えば、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘａａ）をＤＮＡ配列の末尾から前端に移動させることが好ましい。植物で発現されると、ほとんどのＰｒｏ残基は翻訳後修飾を受けてＨｙｐとなり、グリコシル化されると考えられる−Ｈｙｐグリコシル化は機能的に極めて重要である。この表は本コンセンサス配列から導き出せるすべての変形物を挙げたものではない。
【０１４０】
１つの好ましい態様において、コンセンサス配列およびその部分は、
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（配列番号：１７９）（ここでＡはＨｙｐ、ＴｈｒおよびＳｅｒから選択され、ＢはＨｙｐおよびＬｅｕから選択される）から選択される（表６）。注目されることに、この配列の１５個のアミノ酸残基は「準パリンドローム性（ｑｕａｓｉ−ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ）」であり、Ｎ末端またはＣ末端のどちらから読んでも、側鎖配列がほぼ同じである。本発明を特定の理論または機序に限定するわけではないが、本発明者らは、エクステンシンおよびＡＧＰに高い頻度でみられるこのようなペプチド対称性が、分子の充填、認識および自己集合性を高める可能性があると考えている。実際に、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐ−（Ｈｙｐ）およびＴｈｒ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐ−（Ｈｙｐ）というモチーフ内の、連続Ｈｙｐモチーフによる厳密なパリンドローム的対称性は、ＧＡＧＰおよび他のＨＲＧＰに自己秩序化の特性を付与している可能性がある。このため、本発明者らは、ＧＡＧＰの特性がポリサッカライド置換基と関係すると考えている。特に、中央に２つのポリサッカライドがあり、Ｈｙｐアラビノシドが隣接しているという反復性糖ペプチドの対称性は、著しく低い粘性［Ｃｈｕｒｍｓら（１９８３）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２３：２６７］、風味乳化剤および安定剤として作用する能力、ならびに可塑的密封物質の成分としてのＧＡＧＰの生物学的役割を含む、アラビアゴムの優れた特性を向上させている可能性がある。
【０１４１】
１つの態様においては、本発明の配列およびその部分を反復として用いることができる。反復は好ましくは１回〜５００回、より好ましくは１回〜１００回、最も好ましくは１回〜１０回の範囲である。本明細書に開示するデータは、アラビアゴムモチーフの８回、１６回、２０回、３２回および６４回の反復の生産を示す（実施例１９）。
【０１４２】
反復は連続的でも非連続的でもよい。連続的な反復とは、反復配列の間に介在アミノ酸またはアミノ酸類似体が存在しないものである。反復は、コンセンサス配列（配列番号：１３６）およびその部分によって記載される、２つまたはそれ以上の配列を含みうる。この２つまたはそれ以上の配列は同じでも異なっていてもよい。２つの１９アミノ酸の配列が異なる、１回の反復の例は、以下の実施例１９に述べるモチーフ１−モチーフ２
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のものである。２つの１９アミノ酸の配列が異なる、１回の反復のもう１つの例は、表２のモチーフ７−モチーフ１３のものであり、これは配列（配列番号：１８０）：
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を有し、下線を付したモチーフ１３にモチーフ７が隣接している。２つの１９アミノ酸の配列が異なる、１回の反復のさらにもう１つの例は、表２のモチーフ１０−モチーフ１２のものであり、これは配列（配列番号：１８１）：
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を有し、下線を付したモチーフ１０にモチーフ１２が隣接している。２つの１９アミノ酸の配列が同じである、１回の反復の例は、（モチーフ１−モチーフ１）、（モチーフ２−モチーフ２）、（モチーフ３−モチーフ３）などである。
【０１４３】
１つの代替的な態様では、本発明の配列およびその部分を非連続な反復、すなわち反復配列の間に１個〜１０００個、より好ましくは１個〜１００個、さらにより好ましくは１個〜１０個の介在アミノ酸またはアミノ酸類似体が位置するものとして用いる。「アミノ酸類似体」という用語は、化学修飾されたアミノ酸であるアミノ酸を指す。このような修飾の例には、アルキル基、アシル基もしくはアミノ基による水素の置換、またはビオチン基もしくは蛍光基との共有付加物が考えられる。アミノ酸には、生体アミノ酸のほかに非生体アミノ酸が含まれる。「生体アミノ酸」という用語は、細胞がｍＲＮＡから翻訳してポリペプチドを導くことができる、既知の２０種のコード化されたアミノ酸のいずれか１つを指す。「非生体アミノ酸」という用語は、生体アミノ酸ではないアミノ酸を指す。非生体アミノ酸は例えば、それらの立体化学的または化学的な特性の点で有用である。例えば、非生体アミノ酸であるノルロイシンは、メチオニンのものと形状が類似した側鎖を有する。しかし、ノルロイシンには側鎖に硫黄原子がないため、メチオニンよりも酸化を受けにくい。非生体アミノ酸のその他の例にはアミノ酪酸、ノルバリンおよびアロイソロイシンが含まれ、これらは生体アミノ酸とは立体特性が異なる疎水性側鎖を含む。「誘導体」という用語は、アミノ酸配列に言及する場合、アミノ酸配列が少なくとも１つのアミノ酸類似体を含むことを意味する。
【０１４４】
反復配列は、当技術分野で公知の方法［例えば、Ｌｅｗｉｓら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＆ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ７：４００〜４０６］、および本明細書に記載の方法（実施例１９）を用いて作製することができる。
【０１４５】
１つの好ましい態様において、コンセンサス配列およびその部分は、少なくとも１つの非連続的なヒドロキシプロリン配列および／または少なくとも１つの連続的なヒドロキシプロリン配列を含む。より好ましい１つの態様において、コンセンサス配列およびその部分は、少なくとも１つの非連続的なヒドロキシプロリン配列および少なくとも１つの連続的なヒドロキシプロリン配列を含む。
【０１４６】
「非連続的なヒドロキシプロリン配列」という用語は、（Ｘａａ−Ｈｙｐ）ｘおよびＸａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ（ここでＸａａはヒドロキシプロリン以外の任意のアミノ酸であり、ｘは２〜１０００、より好ましくは２〜１００、および最も好ましくは２〜５０である）から選択される配列を指す。１つの好ましい態様において、非連続的なヒドロキシプロリン配列はＸａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ−Ｈｙｐ（配列番号：９）（ここでＸａａはＳｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択される）である。
【０１４７】
「連続的なヒドロキシプロリン配列」という用語は、Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐｎ（配列番号：２０９）およびＸａａ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐｎ（配列番号：２１０）（ここでｎは１〜１００であり、Ｘａａはヒドロキシプロリン以外の任意のアミノ酸である）から選択される配列を指す。１つの好ましい態様において、連続的なヒドロキシプロリン配列は、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ２（配列番号：２１１）、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ３（配列番号：２１２）、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ４（配列番号：３）、Ｔｈｒ−Ｈｙｐ２（配列番号：２１３）およびＴｈｒ−Ｈｙｐ３（配列番号：２１４）から選択される。
【０１４８】
本明細書に提示するデータにより、非連続的なヒドロキシプロリン配列［例えば（Ｘａａ−Ｈｙｐ）ｘ、ここでｘは少なくとも２であることが好ましい］が、Ｈｙｐへのアラビノガラクタンポリサッカライドの限定的な付加を導く機能的糖モジュールであり、連続的なヒドロキシプロリン配列はアラビノシル化を導く機能的糖モジュールであることが示されている（実施例２３）。「機能的」という用語は、非連続的なヒドロキシプロリン配列または非連続的なヒドロキシプロリン配列を含む配列に言及して用いる場合、配列がその配列内のＨｙｐ残基へのアラビノガラクタンポリサッカライドの限定的な付加を導くことを意味する。Ｈｙｐ残基へのアラビノガラクタンポリサッカライドの付加は、本明細書に記載の方法（実施例２３）を用いて判定しうる。「機能的」という用語は、連続的なヒドロキシプロリン配列または連続的なヒドロキシプロリン配列を含む配列に言及して用いる場合、配列が、本明細書に開示する方法（実施例２３）によって判定される、その配列内のＨｙｐ残基のアラビノシル化を導くことを意味する。
【０１４９】
本発明は、配列番号：１３６およびその部分に対して相補的な配列および部分的に相補的な配列、例えば、これらの配列と低ストリンジェンシー条件下および高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするものなどを意図する。
【０１５０】
上記の通り、本発明の配列を、ヒドロキシプロリンに富んだ糖タンパク質と結合する分子を単離するため、およびポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製するために用いることもできる。さらに、本発明の配列を乳化剤として、および／または乳濁液を安定化するために用いてもよいが、これはいずれも食品業界がＧＡＧＰを高く評価する理由となっている特性である。本発明のタンパク質、糖タンパク質およびその部分の、乳化活性および乳濁液安定化活性は、市販の試薬を用いる当技術分野で公知の一般的な方法［ＫｅｖｉｎおよびＪｏｈｎ（１９７８）Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ ２６（３）：７１６〜７２３；ＪａｍｅｓおよびＰａｔｅｌ、「タンパク質用の標準的な水中油型乳化試験の開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ ｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、Ｌｅａｔｈｅｒｈｅａｄ Ｆｏｏｄ ＲＡ Ｒｅｓ． Ｒｅｐ． Ｎｏ． ６３１］を用いて評価することができる。
【０１５１】
例えば、オレンジ油（シグマ社）を本質的には製造者の指示に従って用いて、以下のアッセイ法を行うことができる。凍結乾燥した糖タンパク質を０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ ６．５）中に０．５％（ｍ／ｖ）の濃度に溶解する。水溶液とオレンジ油を６０：４０（ｖ／ｖ）の比率で混ぜ合わせる。マイクロチップ（Ｍｉｃｒｏｔｉｐ）プローブを装着したソニックディスメンブレーター（Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（フィッシャー・サイエンティフィック））を用いて、０℃でガラス管内に１ｍｌの乳濁液を調製する。増幅値を４に設定し、混合時間を１分間に設定する。乳化能力（ＥＡ）を測定するには、０．１Ｍ ＮａＣｌおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液で乳濁液を連続希釈し、最終希釈倍率を１／１５００とする。続いて、希釈した乳濁液を光路長１ｃｍのキュベットに入れて５０ｎｍで光学濃度を測定し、これをＥＡとして定義する。乳濁液を入れたガラス管を立てて室温で３時間置いた後、保存試料の下方の相を１：１５００に希釈して光学濃度を測定する。乳化安定性（ＥＳ）は２時間置いた後に保たれている、光学濃度の比率として定義される。ＢＳＡを陽性対照として用いる。実施例２４に述べるように、本アッセイ法は本発明の範囲内に含まれる配列の活性を測定するために用いている。
【０１５２】
Ｇ．Ｏ−グリコシル化コード
本発明はさらに、Ｏ−グリコシル化のシグナルとなる配列を提供する。Ｏ−グリコシル化配列は、非連続的なヒドロキシプロリン配列（Ｘａａ−Ｈｙｐ）ｘ（配列番号：１８２）およびＸａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ（配列番号：１８３）である（ここでＸａａはヒドロキシプロリン以外の任意のアミノ酸であり、ｘは１〜１０００、より好ましくは２〜１００、さらにより好ましくは２〜５０の数字である）。より好ましい１つの態様において、本配列はＸａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ−Ｈｙｐ（配列番号：９）である（ここでＸａａはＳｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａから選択される）。
【０１５３】
本発明者らによるこれらの配列の発見は、クラスター化した非連続的なＨｙｐ残基が、アラビノガラクタンポリサッカライドの結合部位であるという仮説に基づくものであった。特に本発明者らは、ＡＧＰのＸａａ−Ｈｙｐ−Ｘａａ−Ｈｙｐ反復のような、クラスター化した非連続的なＨｙｐ残基のＨｙｐガラクトシル化が、アラビノースおよび他の糖の側鎖を伴うガラクタンコアの付加をもたらし、これによって特徴的なＨｙｐ−アラビノガラクタンポリサッカライドが生じると予想した。ＡＧＰがプロテアーゼで分解されず、部分的なアルカリ加水分解による分解では、精製が困難なアラビノガラクタン−糖ペプチドが得られることから、このようなアラビノガラクタンポリサッカライドの結合部位は、これまでほとんど明らかにされてこなかった。
【０１５４】
本発明者らによるＯ−グリコシル化配列の発見は、本明細書に開示する、ＨＲＧＰグリコシル化部位のマッピングのための、新たなアプローチに依拠するものであった。非連続的なＨｙｐ残基がアラビノガラクタンポリサッカライドの結合部位であるという仮説を検証するために、本発明者らは３種類の合成遺伝子を設計した。Ｓｉｇ−（Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）３２−ＥＧＦＰと命名した第１の合成遺伝子は、Ｎ末端のシグナル配列（Ｓｉｇ）に続いて、本発明者らの予想ではポリサッカライド付加部位をコードすると考えられる、クラスター化した非連続的なＨｙｐ残基のみをコードする反復性Ｓｅｒ−Ｈｙｐモチーフ［すなわち、（Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）３２］をコードする。（Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）３２に続いてＣ末端にＥＧＦＰがある（図１１）。本発明者らは、非連続的なＨｙｐに対するポリサッカライド付加により、Ｈｙｐ−ポリサッカライドを限定的に含む発現産物が得られるべきであると予想した。Ｓｉｇ−（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰと命名した第２の合成遺伝子は、わずかに修飾された１９アミノ酸残基のＧＡＧＰコンセンサス配列（図１４）の３回の反復をコードし、本発明者らはこれを、Ｈｙｐ−ポリサッカライドに加えてＨｙｐアラビノシドも含む発現産物が得られるか否かを明らかにするために用いた。第３の合成遺伝子は、シグナル配列およびＥＧＦＰのみをコードする対照構築物（Ｓｉｇ−ＥＧＦＰ）であった。この発現産物は、Ｈｙｐグリコシル化が、ＡＧＰの糖モジュールと推定されるものをコードするＥＧＦＰ修飾物に起因するか否かを検討するための対照とした。本明細書に提示するデータにより、この２つの実験的な配列モジュールは、発現させて分泌のためのターゲティングを行わせた場合、ＨＲＧＰグリコシルトランスフェラーゼの単純な内因性基質として機能することが示されている。非連続的なＨｙｐを発現する第１の構築物では、すべてのＨｙｐ残基にポリサッカライドがＯ−結合するという、限定的なポリサッカライドの付加が認められた。これに対して、非連続的なＨｙｐに加えて連続的なＨｙｐも含む第２の構築物では、ポリサッカライドおよびアラビノオリゴサッカライドの両方が認められた。このデータから、本発明者らは本発明のＯ−グリコシル化配列に到達した。
【０１５５】
本発明の配列は、Ｏ−Ｈｙｐアラビノシルトランスフェラーゼおよびガラクトシルトランスフェラーゼの基質として有用である。これらの基質は、これらの酵素を単離して明確に同定するため、さらには酵素の基質選好性を明らかにするために用いうる。
【０１５６】
本発明の配列のさらにもう１つの用途は、ＨＲＧＰにおけるオリゴアラビノシド付加部位と考えられるものを同定することにあり、これはそのゲノム配列から推測しうる。さらに、これらの配列により、ＧＡＧＰなどの滲出性ゴム糖タンパク質［Ｂｒｅｔｏｎら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１２３、１０００〜１００９；Ｉｓｌａｍら（１９９７）Ｆｏｏｄ Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ １１、４９３〜５０５］のように有用な産物を、アカシアのようなトゲの多い砂漠性低木から、他の望ましい作物に移行させることが可能になると考えられる。
【０１５７】
本発明の配列のさらにもう１つの用途は、それらにより、新たなＨＲＧＰの新規設計および望ましい特性を向上させるための操作が容易になることである。例えば、前記ならびに実施例２４に述べるように、本発明のＯ−グリコシル化配列を含む糖タンパク質を乳化剤として、および／または乳濁液を安定化するために用いることもできる。
【０１５８】
実施例
以下の実施例は、本発明のいくつかの好ましい態様および局面を例示するためのものであり、その範囲を制限するものとみなされるべきではない。
【０１５９】
以下の実験の開示においては、以下の略語を用いる：ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル）；μＭ（マイクロモル）；ｎｍ（ナノメートル）；Ｌ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μｌ（マイクロリットル）；℃（摂氏温度）；ｍ（メートル）；ｓｅｃ．（秒）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ｍＲＮＡ（メッセンジャーリボ核酸）；Ｘｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）；ＬＢ（ルリア培地）、ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）；ＮＡＡ（α−ナフタレン酢酸）；ＢＡＰ（６−ベンジルアミノプリン）；Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン）；ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）；２×ＳＳＣ（０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸三ナトリウム、ｐＨ ７．０）；アグリバイオ社（Ａｇｒｉ−Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）（Ｎｏｒｔｈ Ｍｉａｍｉ、ＦＬ）；アナリティカル・サイエンティフィック・インスツルメンツ社（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）（Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）；バイオラド社（ＢｉｏＲａｄ）（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）；クロンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）；デルモンテ・フレッシュ・プロデュース社（Ｄｅｌｍｏｎｔｅ Ｆｒｅｓｈ Ｐｒｏｄｕｃｅ）（Ｋｕｎｉａ、ハワイ）；ディフコラボラトリーズ社（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）；ドール・フレッシュ・フルーツ社（Ｄｏｌｅ Ｆｒｅｓｈ Ｆｒｕｉｔ）（Ｗａｈｉａｗａ、ハワイ）；ダイナテック・ラボラトリーズ社（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｃ．）（Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ ＶＡ）；ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＩＤ）；ゴールドバイオテクノロジー社（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．）（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；ＧＴＥ社（ＧＴＥ Ｃｏｒｐ．）（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）；ＭＳＩ社（ＭＳＩ Ｃｏｒｐ．）（Ｍｉｃｒｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔｂｏｒｏ、ＭＡ）；オペロン社（Ｏｐｅｒｏｎ）（Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｉｅｓ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）；パイオニア・ハイブレッド・インターナショナル社（Ｐｉｏｎｅｅｒ Ｈｉ−Ｂｒｅｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．）（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、ＩＡ）；５プライム３プライム社（５ Ｐｒｉｍｅ ３ Ｐｒｉｍｅ）（Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）；シグマ社（Ｓｉｇｍａ）（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）；ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）；ＵＳＢ社（ＵＳＢ）（Ｕ．Ｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）。
【０１６０】
実施例１
アカシア（Ａｃａｃｉａ）アラビアゴム糖タンパク質のペプチド配列の決定
本実施例では、ＧＡＧＰ（配列番号：１５）を単離し、（キモトリプシンを用いることにより）脱グリコシル化したポリペプチド骨格を調製した。ＧＡＧＰは通常のキモトリプシン切断部位を含まないが、ロイシル残基およびヒスチジル残基は含んでおり、これらは時折切断される。キモトリプシンはこれらの「時折切断される」部位を十分に切断し、その結果、密接に関連したペプチドのペプチドマップが作成された。
【０１６１】
ＧＡＧＰ（配列番号：１５）の精製および脱グリコシル化
ＧＡＧＰを調製用スーパーロース−６（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ−６）ゲル濾過によって単離した。無水フッ化水素によってこれを脱グリコシル化し（２０ｍｇ粉末／ｍＬ ＨＦ、４℃、完全な脱グリコシル化が確実に起こるように手順を２回繰り返した）、スーパーロース−６による再クロマトグラフィーの後に、単一の対称性ピークを示すｄＧＡＧＰを得た（データは示していない）。逆相クロマトグラフィーによってｄＧＡＧＰをさらに精製した場合も単一の主要ピークが得られ、ピークの範囲にわたって採取した複数の画分中のアミノ酸組成が、大きく偏っているものの一定であることが示された。これらのデータから、ｄＧＡＧＰが、配列解析を行える程度に十分に純粋な単一のポリペプチド成分であることが示された。
【０１６２】
配列解析
プロナーゼ不完全消化物から大きなペプチドＰＲＰ３が得られ、推測したｄＧＡＧＰ反復モチーフ中に存在するすべてのアミノ酸を含む部分配列（表３）をこれから得た。プロナーゼの限界を考慮し、ペプチドマッピングをさらに行い、より明確な配列情報を入手するために、ｄＧＡＧＰをキモトリプシンで消化し、その後に二段階ＨＰＬＣ分画を行った。ポリスルホエチルＡ（ＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ Ａ）（商標）（ＰＳＡ指定、ＰｏｌｙＬＣ， Ｉｎｃ． ＥｌｌｉｃｏｔＩ Ｃｉｔｙ、ＭＤ）陽イオン交換カラムによるキモトリプシン分解ペプチド（ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｔｉｄｅ）の初回分離により、３つの主要画分が得られた：このうちＳ１およびＳ２は消化時間が長いほど増加したが、Ｓ３はこれに伴って減少した。ＰＲＰ−１によるクロマトグラフィーをさらに行い、ＰＳＡ画分Ｓ１およびＳ２をいくつかのペプチドに分離した。
【０１６３】
【表３】
2004516003.tif 000028
【０１６４】
エドマン分解により、これらのキモトリプシン分解ペプチドが、相互に、主要なプロナーゼ分解ペプチドの部分配列（表３）、およびデロネー（Ｄｅｌｏｎｎａｙ）によって以前に単離されたＧＡＧＰの主要なプロナーゼ分解ペプチド（上記参照）に、密接に関連することが示された。実際に、同じ位置にわずかな違いはあるが、これらはすべて単一の１９アミノ酸残基のコンセンサス配列と関連づけることができる（表３）。これらのペプチドは全体的なアミノ酸組成も反映しており、このため、反復性モチーフにわずかな違い（これにはＨｙｐおよびＳｅｒのＬｅｕによる時折の置換が含まれる）を伴う、高反復性ポリペプチド骨格が存在する証拠となる。注目されることに、この配列の１５個のアミノ酸残基は「準パリンドローム性」であり、Ｎ末端またはＣ末端のどちらから読んでも側鎖配列がほぼ同じである。
【０１６５】
実施例２
合成ＨＲＧＰ遺伝子カセットの構築
連続的および非連続的なＨｙｐモジュールをコードする合成遺伝子カセットは、いずれも相補的な「付着」末端を有する「内部反復配列（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）の対」および「外部３’−リンカーおよび５’−リンカーの対」それぞれの、オリゴヌクレオチド対からなる部分的に重複した組を用いて構築される。反復性ＨＲＧＰモジュールの設計戦略には、大腸菌における、新規反復性ポリペプチド重合体の産生（ＭｃＧｒａｔｈら［１９９０］Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． ６：１８８）、ムラサキガイ（Ｍｙｔｉｌｕｓ ｅｄｕｌｉｓ）の生体接着性前駆体タンパク質の反復性合成類似体の産生、クモの糸の反復性タンパク質の産生（Ｌｅｗｉｓら［１９９６］Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ． Ｐｕｒｉｆ． ７：４００）、およびタバコにおける高反復性エラスチン様重合体の産生［Ｚｈａｎｇ， Ｘ．、Ｕｒｒｙ， Ｄ．Ｗ．およびＤａｎｉｅｌｌ， Ｈ．「トランスジェニックタバコ植物における、環境に優しい合成タンパク質を基礎とする、重合体遺伝子の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｌｙ ｆｒｉｅｎｄｌｙ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂａｓｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ）」、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ、１６：１７４（１９９６）］に関して以前に記載された、実証済みのアプローチを組み合わせる。
【０１６６】
合成ＨＲＧＰ遺伝子カセットに関する基本的な設計戦略について、以下の例示的な構築物を例として説明する。
【０１６７】
ａ）Ｓｅｒ−Ｈｙｐ４（配列番号：３）遺伝子カセット
エクステンシン様Ｓｅｒ−Ｈｙｐ４（配列番号：３）モジュールをコードする合成遺伝子は、以下の部分的に重複したオリゴヌクレオチド対の組を用いて構築される。
2004516003.tif 000029
【０１６８】
「内部」遺伝子カセットならびに５’および３’「外部」遺伝子カセットの、長い二重鎖ＤＮＡへの変換は以下の段階を用いて行う：
【０１６９】
１．相補的オリゴヌクレオチド対のそれぞれを９０℃に加熱した後、徐々に６０℃まで冷却することによってアニーリングを行わせ、それによって短い二重鎖の内部ＤＮＡおよび外部ＤＮＡを形成させる。
【０１７０】
２．５’外部リンカーの二重鎖と内部反復配列の二重鎖を約１：２０のモル比で混ぜ合わせ、さらに冷却することにより、５’リンカーのキャップを有する長い二重鎖ＤＮＡを得る。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いた連結により、５’リンカーを内部反復配列の二重鎖と共有結合させる（好ましくは最大５０回、より好ましくは最大３０回の内部反復配列の二重鎖の繰り返しを用いることができる）。
【０１７１】
３．モル過剰量の３’外部リンカー二重鎖を上記の５’リンカー−内部反復配列二重鎖と混ぜ合わせ、上記の通りにアニーリングおよび連結を行う。
【０１７２】
４．５’リンカー−内部反復配列−３’リンカー二重鎖を、ＢａｍＨＩ（５’−リンカー内部で切断）およびＥｃｏＲＩ（３’−リンカー内部で切断）で消化切断する。
【０１７３】
５．セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ゲル浸透クロマトグラフィーを用いて反応生成物のサイズ分画を行い、９０ｂｐより長い構築物を選択する。
【０１７４】
６．サイズを選別し、消化した合成遺伝子カセットを、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位を含むポリリンカーを有するプラスミド（例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋またはＫＳ＋［ストラタジーン社］）中に挿入する。
【０１７５】
７．合成遺伝子構築物を連結したプラスミドにより、大腸菌細胞の形質転換を行う（例えば、エレクトロポレーションによる、またはコンピテント細胞の使用による）。
【０１７６】
８．大腸菌の形質転換の後に、内部反復配列オリゴヌクレオチドを用いて、合成遺伝子構築物を有する、アンピシリン耐性コロニーのスクリーニングおよび同定を行う。
【０１７７】
９．アンピシリン耐性コロニー内のプラスミドに含まれる挿入物の配列決定を行い、合成遺伝子構築物の正確さを確かめる。
【０１７８】
ｂ）ＧＡＧＰ（配列番号：１５）コンセンサス配列カセット
ＧＡＧＰコンセンサス配列をコードする合成遺伝子カセットは、以下の５’リンカー、内部反復配列、および３’リンカーの二重鎖を用いて、上記の通りに作製する。
2004516003.tif 000030
【０１７９】
「内部」ＡＧＰ様モチーフならびに５’および３’「外部」遺伝子カセットの長い二重鎖ＤＮＡへの変換は、上記のａ）節に述べた段階を用いて行う。最大５０回反復した内部反復配列の二重鎖が望ましい（より好ましくは最大３０回の反復、およびより好ましくは約２０回の反復）（すなわち、野生型タンパク質はこれらの反復を２０回含む）。
【０１８０】
上記のＧＡＧＰ内部反復配列はコンセンサス配列であるため、コンセンサス配列とは異なる反復配列を含む反復があることも望ましい（上記の表３参照）。この点に関して、変異型配列ではグリコシル化の様式が幾分異なる可能性が高く、このために異なる特性がもたらされる可能性がある（例えば、溶解性が高い、など）。その他の構築物を、他の例示的なモジュールに関して表４に示す。
【０１８１】
実施例３
トマトＰ１エクステンシンｃＤＮＡクローンの単離
トマトＰ１エクステンシンのシグナル配列（すなわち、シグナルペプチド）を入手するために、Ｐ１に特有のタンパク質配列（配列番号：５１）：Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｈｙｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓに基づいて設計したオリゴヌクレオチドを用いて、Ｐ１エクステンシンｃＤＮＡクローンを単離した。タンパク質配列のＮ末端に存在すると、Ｐ１エクステンシンシグナル配列は新生ペプチド鎖をＥＲに向かわせる。
【０１８２】
実施例４
発現ベクターの１つの態様の構築
ｐＢＩ１２１は、植物細胞（例えば、トマト、タバコ、ナス科植物、マメ科植物、イネ科でない単子葉植物）における挿入遺伝子の、高レベルの発現および分泌を可能とする発現ベクターである。ｐＢＩ１２１は、３５Ｓ ＶａＭＶプロモーター、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｐｌｕｎｚｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）エクステンシンシグナル配列、ＥＧＦＰ遺伝子、ノパリンシンテターゼ遺伝子由来の終結／ポリアデニル化シグナル（ＮＯＳ−ｔｅｒ）、カナマイシン耐性遺伝子（ｎｐｔＩＩ）、ならびにアグロバクテリウムを介した形質転換による、植物への導入を可能とするＴ−ＤＮＡの右端および左端を含む。
【０１８３】
【表４】
2004516003.tif 000031
2004516003.tif 000032
2004516003.tif 000033
2004516003.tif 000034
【０１８４】
ＢＩ１２１発現ベクター中に挿入された遺伝子によってコードされるタンパク質（例えば、合成遺伝子構築物によってコードされるＨＲＧＰ）のＮ末端に、エクステンシンシグナル配列が存在する。タバコのシグナル配列は、エクステンシン融合タンパク質がＥＲおよびゴルジを通って翻訳後修飾を受けるようにさせ、最終的には壁に向かわせることが示された。組換えＨＲＧＰの標的指向的発現は、タバコのエクステンシンシグナル配列の使用に依存しない。同じ科（マメ科）の植物における、エクステンシンおよびエクステンシンモジュールの輸送に関与する、シグナル配列を用いてもよい；または、トマトＰ１エクステンシンのシグナル配列を用いてもよい。
【０１８５】
ＥＧＦＰ遺伝子は、植物での使用に適するように赤方偏移した緑色蛍光タンパク質をコードする（ＥＧＦＰ遺伝子は、植物における使用に最適化されたＳ６５Ｔ変異型をコードし、これはクロンテック社から入手しうる）。他の適した変異体を用いてもよい（上の表１参照）。これらの改変ＧＦＰにより、細胞表面にある７００個未満のＧＦＰ分子を検出することが可能となる。ＧＦＰ遺伝子を用いることでレポーター遺伝子が得られ、反復性ＨＲＧＰモジュールを含む融合タンパク質の形成が可能となる。ＧＦＰは蛍光団の酸化的形成のために好気的条件を必要とする。これは植物細胞培養に用いられる比較的低い温度で十分に働き、通常はタンパク質の機能に悪影響を及ぼさない。
【０１８６】
プラスミドｐＢＩ１２１−ＳｉｇおよびｐＢＩ１２１−Ｓｉｇ−ＥＧＦＰは、以下のように構築する。いずれのプラスミドの場合も、ＢａｍＨＩおよびＳｓｔＩで消化することによって、ｐＢＩ１２１（クロンテック社）に存在するＧＵＳ遺伝子を除去し、タバコのエクステンシンシグナル配列をコードする部分的に相補的なオリゴヌクレオチドの対を、ＢａｍＨＩおよびＳｓｔＩ末端にアニーリングさせる。２１アミノ酸のエクステンシンシグナル配列をコードするオリゴヌクレオチドは、以下の配列を有する：
2004516003.tif 000035
このオリゴヌクレオチド対は、エクステンシンシグナル配列をコードすることに加えて、消化処理したｐＢＩ１２１ベクター中に挿入した場合に、ＢａｍＨＩ部位（５’末端）ならびにＸｍａＩ部位およびＳｓｔＩ部位（３’末端）を提供する。ＸｍａＩ部位およびＳｓｔＩ部位により、ＧＦＰ遺伝子の挿入が可能となる。ＧＵＳ遺伝子が欠失し、合成エクステンシンシグナル配列を含むこの改変ｐＢＩ１２１ベクターを、ｐＢＩ１２１−Ｓｉｇと命名する。ｐＢＩ１２１が正しく構築されたことを、ＤＮＡ配列決定によって確認する。
【０１８７】
以下の通りにＧＦＰ遺伝子（例えば、ＥＧＦＰ遺伝子）をｐＢＩ１２１−Ｓｉｇに挿入し、ｐＢＩ１２１−Ｓｉｇ−ＥＧＦＰを作製する。ＥＧＦＰ遺伝子を１．４８ｋｂのＸｍａＩ／ＮｏｔＩ断片（ｐＥＧＦＰの塩基対２７０〜１０１０）としてｐＥＧＦＰ（クロンテック社）から切り出す。続いて、この１．４８ｋｂのＸｍａＩ／ＮｏｔＩ断片を合成３’リンカーとアニーリングさせて連結する（上記参照）。このＥＧＦＰ−３’リンカーをＳｓｔＩで消化してＸｍａＩ／ＳｓｔＩ ＥＧＦＰ断片を作製し、これをｐＢＩ１２１−ＳｉｇのＸｍａＩ／ＳｓｔＩ部位に挿入してｐＢＩ１２１−Ｓｉｇ−ＥＧＦＰを作製する。ＡｇｅＩ（以下に考察）、ＸｍａＩおよびＳｓｔＩ部位により、特有の制限酵素部位が得られる。プラスミドが正しく構築されたことをＤＮＡ配列決定によって確認する。
【０１８８】
ｐＢＩ１２１−Ｓｉｇ−ＥＧＦＰ中のＥＧＦＰ配列は、ＥＧＦＰの翻訳開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）の直前にＡｇｅＩ部位を１つ含む。合成ＨＲＧＰ遺伝子カセットを、プラスミド中のシグナル配列とＥＧＦＰ遺伝子配列との間に、ＸｍａＩ／ＡｇｅＩ断片として挿入する；実施例２に述べたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ構築物から、ＨＲＧＰ遺伝子カセットをＸｍａＩ／ＡｇｅＩ断片として切り出す。ＨＲＧＰを含む発現ベクターが正しく構築されたことを、ＤＮＡ配列決定および／または制限酵素消化によって確認する。
【０１８９】
合成ＨＲＧＰ遺伝子カセットの発現はｐＢＩ１２１−ＳｉｇおよびｐＢＩ１２１−Ｓｉｇ−ＥＧＦＰ遺伝子カセットの使用に依存しない。植物細胞において機能する他のプロモーターエレメントを含む類似の発現ベクターを用いてもよい（例えば、ＣａＭＶ領域ＩＶプロモーター、リブロース−１，６−二リン酸（ＲＵＢＰ）カルボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓｕ）プロモーター、ノパリンプロモーター、オクトピンプロモーター、マンノピンプロモーター、β−コングリシニンプロモーター、ＡＤＨプロモーター、熱ショックプロモーター、組織特異的プロモーター、例えば、果実熟成に関係するプロモーター、種子熟成時に調節されるプロモーター（例えば、ナピン、ファゼオリンおよびグリシニンの遺伝子のプロモーター）。例えば、植物の種子（例えば、コーン、コムギ、イネ、トマト、ジャガイモ、ヤマノイモ、コショウ、カボチャ、キュウリ、インゲンマメ、エンドウマメ、リンゴ、サクランボ、モモ、ハリエンジュ、マツおよびカエデを非制限的に含む、果実、豆類および穀類）における、挿入遺伝子配列の高レベル発現を指令するプロモーターを含む、発現ベクターを用いてもよい。緑藻類における発現を行ってもよい。
【０１９０】
さらに、ＧＦＰ遺伝子の代わりに代替的なレポーター遺伝子を用いてもよい。適したレポーター遺伝子には、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）が含まれる。好ましいレポーター遺伝子はＨｙｐ残基を欠いたものである。さらに、合成ＨＲＧＰ遺伝子によってコードされるタンパク質を、必ずしも融合タンパク質として発現させなくともよい。これはｐＢＩ１２１−Ｓｉｇベクターを用いて容易に行うことができる。
【０１９１】
実施例５
トマト細胞懸濁培養物における組換えＨＲＧＰの発現
本発明は、トマト細胞懸濁培養物物において発現される、合成ＨＲＧＰ遺伝子モジュールを含む発現ベクターによってコードされる、組換えＨＲＧＰを意図する。トマト細胞懸濁培養物における組換えＨＲＧＰの発現について、組換えＧＡＧＰの発現に関する以下の考察を例として説明する。
【０１９２】
ａ）組換えＧＡＧＰの発現
合成ＧＡＧＰ遺伝子カセット（ＧＦＰとの融合体、またはＧＦＰ配列を伴わないものとして発現されうる）を含む発現ベクターを、トマト細胞懸濁培養物に導入する。当技術分野では、アグロバクテリウムを介した導入および微粒子銃による形質転換を含む、トマト細胞懸濁培養物へのＤＮＡの導入のためのさまざまな手段が公知である。
【０１９３】
アグロバクテリウムを介した形質転換：
本発明は、上記のプラスミド構築物（および他のもの）を、三親交配によって大腸菌からアグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＬＢＡ４４０４に移行させることにより、懸濁培養細胞（ボニーベスト（Ｂｏｎｎｉｅ Ｂｅｓｔ）培養物）およびトマトリーフディスクの双方の形質転換を行うことを意図する。陽性コロニーをトマト（Ｌｙｓｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の培養物またはリーフディスクの感染に用いる。形質転換された細胞／植物体を、５００ｍｇ／ｍＬカルベニシリンおよび１００ｍｇ／ｍＬカナマイシンを含むＭＳＯ培地上で選別する。ＧＦＰ融合産物の発現は、高Ｑ ＦＩＴＣ（ｈｉｇｈ Ｑ ＦＩＴＣ）フィルターセット（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．）を用いて蛍光顕微鏡により首尾良く観測しうる。精製した組換えＧＦＰとともに、ＦＩＴＣ結合物（例えば、ＦＩＴＣ−ＢＳＡ）を顕微鏡機器に関する対照として用いることができる。培養トマト細胞は非常に弱い自己蛍光しか示さない。このため、ＧＦＰ−Ｈｙｐモジュール融合産物の空間的・時間的な発現を容易に検証しうる。
【０１９４】
トランスジェニック細胞／植物体は、内部反復配列オリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、導入遺伝子のコピー数および構築物の正確さに関してはゲノムサザンブロット法により、ＨＲＧＰ構築物のｍＲＮＡに関してはノーザンブロット法により、検討することができる。対照には、形質転換を行っていない組織／植物のほか、ｐＢＩ１２１のみ、ＧＦＰのみを含むｐＢＩ１２１、ならびにシグナル配列およびＧＦＰを含むがＨＲＧＰ合成遺伝子は含まないｐＢＩ１２１による形質転換を行ったものが含まれる。
【０１９５】
微粒子銃による打ち込み：
１．６Ｍの金粒子を、トマト懸濁培養物／カルスまたは他の組織の形質転換を目的とする、微粒子銃による粒子送達システムに用いるのに適した、各プラスミドＤＮＡ構築物によってコーティングする。対照には以下が含まれる：ＤＮＡを含まない粒子、ｐＢＩ１２１のみを含む粒子、ならびにｐＢＩ１２１およびＧＦＰを含む粒子。
【０１９６】
ｂ）その他の関心対象のＨＲＧＰの発現
上記の通り、本発明は種々のＨＲＧＰ、断片および変異型を発現させることを意図する。このようなＨＲＧＰには、ＲＰＲＰ、エクステンシン、ＡＧＰおよび他の植物ゴム（例えば、カラヤゴム、トラガカントゴム、インドゴムなど）が非制限的に含まれる。ＨＲＧＰキメラには、ナス科レクチンを含むＨＲＧＰ植物レクチン、植物キチナーゼ、および（ヒマワリのように）ＨＲＧＰ部分がスペーサーとして作用するタンパク質が、非制限的に含まれる。本発明は特に、複数の非ＨＲＧＰタンパク質（例えば、酵素） を結合するためのスペーサーとして、ＨＲＧＰモジュール（上記）を用いることを意図する。
【０１９７】
実施例６
ＧＡＧＰ構築物を組み入れた合成ＨＲＧＰ遺伝子カセットの構築
連続的および非連続的なＨｙｐモジュールをコードする合成遺伝子カセットを、いずれも相補的な「付着」末端を有する、「内部反復配列の対」および「外部３’−リンカーおよび５’−リンカーの対」それぞれの、オリゴヌクレオチド対からなる部分的に重複した組を用いて構築した。以下の５’−リンカー二重鎖、内部反復配列二重鎖および３’−リンカー二重鎖を用いた：
2004516003.tif 000036
2004516003.tif 000037
上記の構築物を用いて、タバコおよびトマトの細胞培養物ならびにタバコ植物体において、以下の合成遺伝子（配列番号：１０６）が最終的に発現された：
2004516003.tif 000038
【０１９８】
本実施例には以下が含まれる：（Ａ）オリゴヌクレオチド対の調製；（Ｂ）オリゴヌクレオチドの重合；（Ｃ）構築物の沈殿；（Ｄ）３’−リンカーおよび５’−リンカーによってキャップを形成した（ｃａｐｐｅｄ）遺伝子末端の制限消化；（Ｅ）サイズ分画および酵素混入物の除去；（Ｆ）ＳＫプラスミドベクターへの遺伝子挿入。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製したオリゴヌクレオチドはすべてギブコ社が合成した。
【０１９９】
（Ａ）オリゴヌクレオチド対の調製
別々のエッペンドルフチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｔｕｂｅ）内に以下を混ぜ合わせた：
チューブ１）５．５μｌのＧＡＧＰ内部反復配列センスオリゴヌクレオチド（０．５ｎｍｏｌ／μｌ）、５．５μｌのＧＡＧＰ内部反復配列アンチセンスオリゴヌクレオチド（０．５ｎｍｏｌ／μｌ）、１１μｌのＴ４リガーゼ１０倍連結緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；
チューブ２）２μｌの５’−センスリンカー（０．０５ｎｍｏｌ／μｌ）、２μｌの５’−アンチセンスリンカー（０．０５ｎｍｏｌ／μｌ）、１μｌ Ｈ２Ｏ、５μｌのＴ４リガーゼ１０倍連結緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；
チューブ３）２μｌの３’−センスリンカー（１ｎｍｏｌ／μｌ）、２μｌの３’−アンチセンスリンカー（１ｎｍｏｌ／μｌ）、１μｌの水、５μｌのＴ４リガーゼ１０倍連結緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。
すべてのチューブを９０℃〜９５℃で５分間加熱した後、３時間かけて徐々に４５℃まで冷却した。続いてチューブを４５℃で２時間インキュベートした。
【０２００】
（Ｂ）オリゴヌクレオチドの重合
チューブ１（内部反復配列の対）の溶液１０μｌをチューブ２（５’リンカーの対）の溶液１０μｌと混合し、１７℃で３時間インキュベートした。この混合物に水８０μｌおよび２μｌ（４０００Ｕ）のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加し、１２℃〜１５℃でさらに３６時間インキュベートした。重合の程度は２．２％アガロースゲル（Ｆｉｓｈｅｒ）で確認した。
【０２０１】
続いて、上記の連結したＧＡＧＰ ５’−リンカー混合物５０μｌをチューブ３（３’−リンカー）の溶液５μｌに添加し、３０℃に加熱した上で１７℃で３時間インキュベートすることにより、重合体の３’末端にキャップを形成した。次に水２０μｌおよび２μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加し、溶液を１２℃〜１５℃で３６時間インキュベートした。最後に溶液を６５℃で１０分間加熱してリガーゼを変性させた。
【０２０２】
（Ｃ）構築物の沈殿
上記の（Ｂ）のＧＡＧＰ構築物１０μｌを水２５μｌおよび５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと混ぜ合わせた。次に１５０μｌのＥｔＯＨを添加し、溶液を４℃で３０分間インキュベートした。次にこの溶液を１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。この結果得られたペレットを７０％ＥｔＯＨで洗浄して乾燥させた。
【０２０３】
（Ｄ）３’−リンカーおよび５’−リンカーによってキャップを形成した遺伝子末端の制限消化
上記の（Ｃ）のペレットを１４μｌの水に溶解した。続いて、２μｌの１０倍ＥｃｏＲＩ制限緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、２μｌのＥｃｏＲＩ １０Ｕ／μｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）および２μｌのＢａｍＨＩ ２０Ｕ／μｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加し、混合物を３７℃で一晩インキュベートした。
【０２０４】
（Ｅ）サイズ分画および酵素混入物の除去
上記の段階（Ｄ）で制限消化を行った遺伝子２０μｌに水１０μｌを添加した。この混合物をセファクリルＳ−４００（ファルマシア社 Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ（商標））ミニカラムにかけ、遠心分離処理を行って小さな（９０ｂｐ未満の）オリゴヌクレオチド断片を除去した。カラムからの最初の溶出液（すなわち、分子量の大きい物質）を回収した。最後にキアクイック（Ｑｉａｑｕｉｃｋ）ヌクレオチド除去キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて酵素を除去した。混合物の最終容積は約５０μｌであった。
【０２０５】
（Ｆ）ＳＫプラスミドベクターへの遺伝子挿入
ＳＫプラスミドベクター（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで制限処理し、制限消化された大きなプラスミド断片をアガロースゲルから単離した。制限消化を行った２〜３μｇのＳＫプラスミド（水１０μｌ中）に対して、段階（Ｅ）で制限消化を行ったＧＡＧＰ遺伝子構築物６μｌ、２μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）および１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加した。この溶液を８℃に一晩保って連結を行わせた。 続いて、３μｌの連結混合物により、１００μｌのコンピテントＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（ストラタジーン社）の形質転換を行った。クローンの選択は、プロメガ社の「プロトコールおよび利用の手引き（Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｃｉａｔｉｏｎｓ Ｇｕｉｄｅ）」第２版（１９９１）の記載の通りに青／白（Ｂｌｕｅ／Ｗｈｉｔｅ）アッセイ法（プロメガ社）を行うことにより、３２Ｐ標識したアンチセンス内部オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより、さらに制限地図の作成によって行った。
【０２０６】
実施例７
ＳＰ構築物を組み入れた合成ＨＲＧＰ遺伝子カセットの構築
連続的および非連続的なＨｙｐモジュールをコードする合成遺伝子カセットを、いずれも相補的な「付着」末端を有する「内部反復配列の対」および「外部３’−リンカーおよび５’−リンカーの対」それぞれの、オリゴヌクレオチド対からなる部分的に重複した組を用いて構築した。以下の５’−リンカー、内部反復配列および３’−リンカーの二重鎖を用いた：
2004516003.tif 000039
上記の構築物を用いて、タバコおよびトマトの細胞培養物ならびにタバコ植物体において、以下の合成遺伝子（配列番号：１１０）が最終的に発現された：
2004516003.tif 000040
【０２０７】
本実施例には以下が含まれる：（Ａ）オリゴヌクレオチド対の調製；（Ｂ）オリゴヌクレオチドの重合；（Ｃ）構築物の沈殿；（Ｄ）３’−リンカーおよび５’−リンカーによってキャップを形成した遺伝子末端の制限消化；（Ｅ）サイズ分画および酵素混入物の除去；（Ｆ）ＳＫプラスミドベクターへの遺伝子挿入。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製したオリゴヌクレオチドはすべてギブコ社が合成した。
【０２０８】
（Ａ）オリゴヌクレオチド対の調製
別々のエッペンドルフチューブ内に以下を混ぜ合わせた：
チューブ１）５．５μｌのＳＰ内部反復配列センスオリゴヌクレオチド（０．５ｎｍｏｌ／μｌ）、５．５μｌのＳＰ内部反復配列アンチセンスオリゴヌクレオチド（０．５ｎｍｏｌ／μｌ）、１１μｌのＴ４リガーゼ１０倍連結緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；
チューブ２）２μｌの５’−センスリンカー（０．０５ｎｍｏｌ／μｌ）、２μｌの５’−アンチセンスリンカー（０．０５ｎｍｏｌ／μｌ）、１μｌのＨ２Ｏ、５μｌのＴ４リガーゼ１０倍連結緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；
チューブ３）２μｌの３’−センスリンカー（１ｎｍｏｌ／μｌ）、２μｌの３’−アンチセンスリンカー（１ｎｍｏｌ／μｌ）、１μｌの水、５μｌのＴ４リガーゼ１０倍連結緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。
すべてのチューブを９０℃〜９５℃で５分間加熱した後、３時間かけて徐々に４５℃まで冷却した。続いてチューブを４５℃で２時間インキュベートした。
【０２０９】
（Ｂ）オリゴヌクレオチドの重合
チューブ１（内部反復配列の対）の溶液１０μｌをチューブ２（５’リンカーの対）の溶液１０μｌと合わせ、１７℃で３時間インキュベートした。この混合物に水８０μｌおよび２μｌ（４０００Ｕ）のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加し、１２℃〜１５℃でさらに３６時間インキュベートした。重合の程度は２．２％アガロースゲル（Ｆｉｓｈｅｒ）で確認した。
【０２１０】
続いて、上記の連結したＳＰ ５’−リンカー混合物５０μｌをチューブ３（３’−リンカー）の溶液５μｌに添加し、３０℃に加熱した上で１７℃で３時間インキュベートすることにより、重合体の３’末端にキャップを形成した。次に水２０μｌおよび２μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加し、溶液を１２℃〜１５℃で３６時間インキュベートした。最後に溶液を６５℃で１０分間加熱してリガーゼを変性させた。
【０２１１】
（Ｃ）構築物の沈殿
上記の（Ｂ）のＳＰ構築物１０μｌを水２５μｌおよび５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと混ぜ合わせた。次に１５０μｌのＥｔＯＨを添加し、溶液を４℃で３０分間インキュベートした。次にこの溶液を１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。この結果得られたペレットを７０％ＥｔＯＨで洗浄して乾燥させた。
【０２１２】
（Ｄ）３’−リンカーおよび５’−リンカーによってキャップを形成した遺伝子末端の制限消化
上記の（Ｃ）のペレットを１４μｌの水に溶解した。続いて、２μｌの１０倍ＥｃｏＲＩ制限緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、２μｌのＥｃｏＲＩ １０Ｕ／μｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）および２μｌのＢａｍＨＩ ２０Ｕ／μｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加し、混合物を３７℃で一晩インキュベートした。
【０２１３】
（Ｅ）サイズ分画および酵素混入物の除去
上記の段階（Ｄ）で制限消化を行った遺伝子２０μｌに水１０μｌを添加した。この混合物をセファクリルＳ−４００（ファルマシア社 Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ（商標））ミニカラムにかけ、遠心分離処理を行って、小さな（９０ｂｐ未満の）オリゴヌクレオチド断片を除去した。カラムからの最初の溶出液（すなわち、分子量の大きい物質）を回収した。最後にキアクイック（Ｑｉａｑｕｉｃｋ）ヌクレオチド除去キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて酵素を除去した。混合物の最終容積は約５０μｌであった。
【０２１４】
（Ｆ）ＳＫプラスミドベクターへの遺伝子挿入
ＳＫプラスミドベクター（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで制限処理し、制限消化された大きなプラスミド断片をアガロースゲルから単離した。制限消化を行った２〜３μｇのＳＫプラスミド（水１０μｌ中）に対して、段階（Ｅ）で制限消化を行ったＳＰ遺伝子構築物６μｌ、２μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、および１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加した。この溶液を８℃に一晩保って連結を行わせた。 続いて、３μｌの連結混合物により、１００μｌのコンピテントＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（ストラタジーン社）の形質転換を行った。クローンの選択は、プロメガ社の「プロトコールおよび利用の手引き（Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｃｉａｔｉｏｎｓ Ｇｕｉｄｅ）」第２版（１９９１）の記載の通りに、青／白アッセイ法（プロメガ社）を介して、３２Ｐ標識したアンチセンス内部オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより、さらに制限地図の作成によって行った。
【０２１５】
実施例８
ｐＥＧＰ、ｐＫＳ、ｐＵＣ１８およびｐＢＩ１２１への遺伝子サブクローニング、ならびにシグナル配列の合成
以下の例の方法を用いて、実施例６および７の合成遺伝子をｐＢＩ１２１プラスミドに組み入れた。制限消化、連結、サブクローニングおよび大腸菌の形質転換は一般に、アウスユーベル（Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ）編、「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（１９９５）、第３章：「ＤＮＡの酵素的操作およびＤＮＡ制限地図の作成；ＤＮＡ断片のサブクローニング（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｍａｐｐｉｎｇ；Ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）」。用いた制限消化物は、１μｇ〜２μｇのプラスミドＤＮＡ、５Ｕ〜１０Ｕの制限酵素、および推奨される１倍制限緩衝液（企業により供給される１０倍緩衝液から出発したもの）とした。試料をＴＢＥ緩衝液中の１％〜２．２％アガロースゲルに流した。プラスミドおよびＤＮＡ断片をＱＩＡＥＸ ＩＩゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲルから単離した。用いたＤＮＡリガーゼは４００Ｕ Ｔ４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）であった。用いたベクター：断片の比は１：２〜１：６であり、連結液の容積は２０μｌであった。
【０２１６】
大腸菌の形質転換はＸＬ−Ｂｌｕｅコンピテント細胞（ストラタジーン社）を含む、５μｌ〜１０μｌの連結反応液中で行った。細胞を５０μｇ／ｍｌアンピシリンまたは３０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢプレートに播いた。
【０２１７】
プラスミドの単離は、形質転換されたＸＬ−Ｂｌｕｅ細胞を３ｍＬのＬＢ−アンピシリンまたはＬＢ−カナマイシン培地中で増殖させることによって行った。次にウィザードプラスミニプレップ（Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ） ＤＮＡ精製システム（プロメガ社）を用いて、プラスミドを単離した。
【０２１８】
本実施例には以下を伴う：（Ａ）合成遺伝子のｐＥＧＦＰへの挿入；（Ｂ）ＧＡＧＰ−ＥＧＦＰ断片またはＳＰ−ＥＧＦＰ断片のｐＫＳへの挿入；（Ｃ）シグナル配列の構築物およびｐＵＣ１８へのクローニング；（Ｄ）ＧＡＧＰ−ＥＧＦＰ構築物またはＳＰ−ＥＧＦＰ構築物のｐＵＣ１８への挿入；（Ｅ）ＳＳ−ＧＡＧＰ−ＥＧＦＰ遺伝子またはＳＳ−ＳＰ−ＥＧＦＰ遺伝子のｐＢＩ１２１への挿入。
【０２１９】
（Ａ）ＧＡＧＰまたはＳＰに関する合成遺伝子のｐＥＧＦＰへの挿入
この段階は、ＥＧＦＰの５’末端に遺伝子の方向性クローニング（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｃｌｏｎｉｎｇ）を行うために行った。まず、ＧＡＧＰ遺伝子またはＳＰ遺伝子をｐＳＫ［実施例６（Ｆ）および７（Ｆ）によるもの］からＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）断片およびＡｇｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）断片として単離した。次にｐＥＧＦＰ（クロンテック社）をＢａｍＩＨＩおよびＡｇｅＩで制限消化した。最後にＢａｍＨＩ／ＡｇｅＩで制限消化された遺伝子を、ＢａｍＨＩ／ＡｇｅＩで制限消化したｐＥＧＦＰとアニーリングさせて連結し、ＥＧＦＰの５’末端に挿入された形で合成遺伝子を含むｐＥＧＦＰを得た。
【０２２０】
（Ｂ）ＧＡＧＰ−ＥＧＦＰ断片またはＳＰ−ＥＧＦＰ断片のｐＫＳへの挿入
この段階は、ＥＧＦＰの３’末端にＳｓｔＩ部位を１つ得るために行った。上記の（Ａ）のＧＡＧＰ−ＥＧＦＰ構築物またはＳＰ−ＥＧＦＰ構築物を、ＸｍａＩ／ＮｏｔＩ断片としてｐＥＧＦＰから単離した。次にｐＫＳ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）をＸｍａＩおよびＮｏｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で制限消化した。最後にＧＡＧＰ−ＥＧＦＰ構築物またはＳＰ−ＥＧＦＰ構築物を、切断したｐＫＳとアニーリングさせて連結し、ＧＡＧＰ−ＥＧＦＰまたはＳＰ−ＥＧＦＰを含むｐＫＳを得た。
【０２２１】
（Ｃ）シグナル配列の構築物およびｐＵＣ１８へのクローニング
エクステンシンシグナル配列をコードする部分的に重複したセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドをアニーリングさせるため、２μｌのシグナル配列センスオリゴヌクレオチド（０．１ｎｍｏｌ／μｌ）、２μｌのシグナル配列アンチセンスオリゴヌクレオチド（０．１ｎｍｏｌ／μｌ）、２μｌの１０倍ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）および１４μｌのＨ２Ｏを混合し、８５℃で５分間加熱した。続いて混合物を１時間かけて４０℃まで徐々に冷却した。
【０２２２】
次に、アニーリングしたオリゴヌクレオチドをプライマー伸長によって伸長させた。上記の混合物に２μｌのｄＮＴＰ ２．５ｍＭ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）および１μｌのＤＮＡポリメラーゼ５Ｕ／μｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加し、この混合物を３７℃で１０分間インキュベートした。次にポリメラーゼを７０℃で１０分間加熱することによって変性させた。続いて８μｌの緩衝液４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、６６μｌのＨ２Ｏ、２μｌのＢａｍＨＩ ２０Ｕ／μｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）および２μｌのＳｓｔＩ １４Ｕ／μｌ（シグマ社）を添加し、混合物を３７℃で一晩インキュベートした。その後、７０℃で１０分間加熱することによって制限酵素を変性させた。
【０２２３】
続いて、この混合物をＥｔＯＨ／酢酸ナトリウム（６μｌ酢酸ナトリウム／３００μｌ ＥｔＯＨ）で沈殿させ、遠心分離を行ってペレット化した。ペレットを７０％ＥｔＯＨで洗浄して乾燥させた。このペレットを２０μｌのＨ２Ｏ中に溶解し、４μｌをＢａｍＩＨＩ／ＳｓｔＩ断片として２μｇのｐＳＫ（ストラタジーン社）への連結に用いた。最後にシグナル配列をＢａｍＨＩ／ＳｓｔＩ断片としてｐＵＣ１８中にサブクローニングした。
【０２２４】
（Ｄ）ＧＡＧＰ−ＥＧＦＰ構築物またはＳＰ−ＥＧＦＰ構築物のｐＵＣ１８への挿入
この段階は、ＧＡＧＰ−ＥＧＦＰ構築物またはＳＰ−ＥＧＦＰ構築物を、シグナル配列の後に挿入する目的で行った。上記の（Ｂ）によるＧＡＧＰ−ＥＧＦＰ構築物またはＳＰ−ＥＧＦＰ構築物を、ＸｍａＩ／ＳｓｔＩ断片としてｐＫＳから取り出した。シグナル配列を含むｐＵＣ１８（ＳＳ−ｐＵＣ１８）をＸｍａＩ／Ｓｓｔで制限消化した。続いて、ＧＡＧＰ−ＥＧＦＰ断片またはＳＰ−ＥＧＦＰ断片を、切断したＳＳ−ｐＵＣ１８とアニーリングさせて連結した。次に、ｐＵＣ１８の１７残基の配列決定用プライマー（ストラタジーン社）を用いるＤＮＡ配列決定により、ＳＳ−ＧＡＧＰ−ＥＧＦＰまたはＳＳ−ＳＰ−ＥＧＦＰの遺伝子配列を確認した。
【０２２５】
（Ｅ）ＳＳ−ＧＡＧＰ−ＥＧＦＰ遺伝子またはＳＳ−ＳＰ−ＥＧＦＰ遺伝子のｐＢＩ１２１への挿入
上記の（Ｄ）によるＳＳ−ＧＡＧＰ−ＥＧＦＰ遺伝子またはＳＳ−ＳＰ−ＥＧＦＰ遺伝子を、ＢａｍＨＩ／ＳｓｔＩ断片としてｐＵＣ１８から取り出した。ｐＢＩ１２１（クロンテック社）をＢａｍＨＩおよびＳｓｔＩで制限消化し、大きい方のプラスミド断片を回収した。ＧＵＳレポーター遺伝子を含む小さい方の断片は廃棄した。ＳＳ−ＧＡＧＰ−ＥＧＦＰ断片またはＳＳ−ＳＰ−ＥＧＦＰ断片を、制限消化したｐＢＩ１２１断片とアニーリングさせて連結した。
【０２２６】
実施例９
ｐＢＩ１２１由来のプラスミドによるアグロバクテリウムの形質転換
アン（Ａｎ）ら、「植物分子生物学マニュアル（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ）」Ａ３：１〜１９（１９８８）に従い、上記の実施例８によるＳＳ−ＧＡＧＰ−ＥＧＦＰまたはＳＳ−ＳＰ−ＥＧＦＰを含む２μｇのｐＢＩ１２１を用いて、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（ＬＢ４４０４株、米国ノースカロライナ州立大学のロン・シェデロフ博士（Ｄｒ． Ｒｏｎ Ｓｅｄｅｒｏｆｆ）による）の形質転換を行った。
【０２２７】
実施例１０
ｐＢＩ１２１由来のプラスミドによるタバコ培養細胞の形質転換
すべての段階を滅菌条件下で行った。１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＮＴ−１培地（ｐＨ ５．２、１リットル当たり：ＭＳ塩 １Ｌパケット（シグマ社 ＃Ｓ５５２４）、スクロース３０ｇ、６％ＫＨ２ＰＯ４ ３ｍｌ、ミオイノシトール１００ｍｇ、塩酸チアミン１ｍＬ（１ｍｇ／ｍｌ保存液）、２，４−Ｄ ２０μｌ（１０ｍｇ／ｍｌ保存液））中で、タバコ細胞を５日〜７日増殖させた。細胞を５００ｍＬの培地を含む１Ｌフラスコ内で、回転振盪器（９４ｒｐｍ、２７℃）により、細胞容積が１５％〜４０％となるまで増殖させた。ｐＢＩ１２１由来のプラスミド（実施例９）によって形質転換したアグロバクテリウム細胞を、３０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むルリア培地中で一晩増殖させた。アグロバクテリウム細胞培養液を６０００ｒｐｍ、１分間の遠心分離処理によってペレット化し、ペレットを２００μｌのＮＴ−１培地中に再懸濁した。
【０２２８】
培養液の粘稠性がアップルソース程度になるように、余分な培地をタバコ細胞培養液から除去した。タバコ細胞をペトリ皿に入れ、２００μｌのアグロバクテリウム調製液を添加した。この混合物を暗所にて室温で４８時間インキュベートした。
【０２２９】
続いて、アグロバクテリウム細胞を除去するために、混合物を２０ｍｌのＮＴ−１で４回洗い、４００μｇ／ｍｌチメンチンおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＮＴ−１プレート上で、植物細胞をプレート洗浄した。抗生物質培地上で増殖した細胞を選別し、励起波長４８８ｎｍ（実施例１６参照）で、蛍光顕微鏡により緑色蛍光を確認した。
【０２３０】
実施例１１
ｐＢＩ１２１由来のプラスミドによるトマト培養細胞の形質転換
すべての段階を滅菌条件下で行った。２００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むシェンク−ヒルデブラント培地（ｐＨ ５．８、１リットル当たり：Ｓ−Ｈ基本塩 １Ｌパケット（シグマ社 ＃Ｓ６７６５）、スクロース３４ｇ、シェンク−ヒルデブラントビタミン粉末１ｇ（シグマ社 ＃Ｓ３７６６）、カイネチン１ｍｇ／ｍｌ保存液１００μｌ（シグマ社 ＃Ｋ３２５３２）、２，４−Ｄ １０ｍｇ／ｍｌ保存液４４μｌ、ｐ−クロロフェノキシ酢酸１ｍｇ／ｍｌ保存液２．１ｍｌ（シグマ社））中で、トマト細胞を５日〜７日増殖させた。細胞を５００ｍＬの培地を含む１Ｌフラスコ内で、回転振盪器（９４ｒｐｍ、２７℃）により、細胞容積が１５％〜４０％となるまで増殖させた。ｐＢＩ１２１由来のプラスミド（実施例９）によって形質転換したアグロバクテリウム細胞を、３０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むルリア培地中で一晩増殖させた。アグロバクテリウム細胞培養液を６０００ｒｐｍ、１分間の遠心分離処理によってペレット化し、ペレットを２００μｌのＮＴ−１培地中に再懸濁した。
【０２３１】
培養液の粘稠性がアップルソース程度になるように、余分な培地をトマト細胞培養液から除去した。トマト細胞をペトリ皿に入れ、２００μｌのアグロバクテリウム調製液を添加した。この混合物を暗所にて室温で４８時間インキュベートした。
【０２３２】
続いて、アグロバクテリウム細胞を除去するために混合物を２０ｍｌのＮＴ−１で４回洗い、４００μｇ／ｍｌチメンチンおよび２００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＮＴ−１プレート上で、植物細胞をプレート洗浄した。抗生物質培地上で増殖した細胞を選別し、励起波長４８８ｎｍで、蛍光顕微鏡により緑色蛍光を確認した。
【０２３３】
実施例１２
タバコ細胞懸濁培養液からのＧＡＧＰ−ＥＧＦＰの単離
形質転換されたタバコ細胞を、上記の実施例１１の記載の通りに回転振盪器で増殖させた。焼結ガラス漏斗（目の粗いもの）で濾過することによって培養液を細胞から分離し、培養液を凍結乾燥した。次に培養液を水（凍結乾燥前の最初の溶液５００ｍＬにつき約５０ｍｌ）中に再懸濁し、冷水に対して４８時間透析した（水は６回交換した）。沈殿したペクチン混入物を遠心分離処理によって除去し、ペレットを廃棄して上清を凍結乾燥した。乾燥した上清をスーパーロース緩衝液２０ｍｇ／ｍｌ（２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ７、０．０５％アジ化ナトリウムを含む）中に溶解し、遠心管に入れて遠心分離処理を行い、不溶物をペレット化した。この調製物１．５ｍｌ（１８ｍｇ〜３０ｍｇ）を準調製用スーパーロース−１２ゲル濾過カラム（ファルマシア社）に注入し、スーパーロース緩衝液で平衡化して、１ｍｌ／分で溶出させた。ＵＶ吸光度を２２０ｎｍでモニターした。ＧＡＧＰ−ＥＧＦＰが５９分〜７０分の間（約２．５倍容量）に溶出されると予想した上で、２ｍｌずつの画分を全体を通して回収した。ＧＡＧＰ−ＥＧＦＰは実際には６５分で溶出した（図３参照、ピークの分析に用いた方法については実施例１５参照）。
【０２３４】
ＧＡＧＰ−ＥＧＦＰを含むスーパーロースのピークを冷水に対して２４時間透析し（水は４回交換）、凍結乾燥した。乾燥したＧＡＧＰ−ＥＧＦＰピークを２５０μｌの０．１％ＴＦＡ水溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）中に溶解し、緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ水溶液）で平衡化したＰＲＰ−１カラム（重合による逆相、ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ））にかけた。続いてカラムを緩衝液Ｂ（０．１％ＴＦＡ／８０％アセトニトリル水溶液；勾配は０％〜７０％Ｂ／１００分）により、０．５ｍＬ／分で溶出させ、ＵＶ吸光度を２２０ｎｍでモニターしたところ、ＧＡＧＰ−ＥＧＦＰは６３分で溶出した（図４参照、ピークの分析に用いた方法については実施例１５参照）。最後にＮ２（気体）送気によってＴＦＡ／アセトニトリルを除去した。
【０２３５】
実施例１３
中性糖分析によるＧＡＧＰ−ＥＧＦＰの特徴づけ
タバコ細胞から単離した１００μｇのＧＡＧＰ−ＥＧＦＰを、１ｍｌのガラス製マイクロバイアルに分注し、Ｎ２（気体）中で乾燥させた。２００μｌの２Ｎ ＴＦＡを添加してバイアルに蓋をした。バイアルを１２１℃で１時間加熱した後、５０℃のＮ２を送気して試料から酸を除去した。２５μｌの水素化ホウ素ナトリウム溶液（２０ｍｇ／ｍｌ、３Ｍ水酸化アンモニウム中）を添加し、混合物を室温に１時間保った。濃酢酸を発泡しなくなるまで１〜３滴添加し、混合物に４０℃のＮ２を送気した。１００μｌのＭｅＯＨを添加して混合物をボルテックス処理し、４０℃のＮ２を送気した後、この段階を繰り返した。１００μｌのＭｅＯＨおよび１００μｌのＨ２Ｏの混合物を添加してボルテックス処理を行い、４０℃のＮ２を送気した後に、１００μｌのＭｅＯＨの添加し、ボルテックス処理およびＮ２処理を３回繰り返した。得られた混合物を真空下で一晩乾燥させた。
【０２３６】
５０μｌの試薬級無水酢酸を添加し、混合物を１２１℃で０．５時間加熱した。次に試料をキリチェフスキー（Ｋｉｅｌｉｓｚｅｗｓｋｉ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９８：９１９（１９９２）の記載の通りに、ガスクロマトグラフィーによって分析した。この試料はヒドロキシプロリンおよび糖を含み、乾燥重量にして融合産物の約５０％を占めることが示された。ガラクトース、アラビノースおよびラムノースは３：３：１のモル比で存在し、これは天然ＧＡＧＰのモル比である３．５：４：１と類似していた。これは、発現された構築物中に、Ｈｙｐ−アラビノシドおよびＨｙｐ−アラビノガラクタンポリサッカライドが両方とも存在する可能性がの高いことと一致する。ＧＡＧＰ−ＥＧＦＰ融合糖タンパク質におけるＡｒａの割合が少ないことは、ＰｒｏがＡｌａに置換され、ペプチド中のアラビノシル化部位が１つ減ることと一致する（実施例６参照）。
【０２３７】
実施例１４
ヒドロキシプロリンアッセイ法によるＧＡＧＰ−ＥＧＦＰの特徴づけ
１００μｇの精製ＧＡＧＰ−ＥＧＦＰの加水分解を、６Ｎ ＨＣｌ（Ｐｉｅｒｃｅ）により１１０℃で１８時間行った。続いて余分な酸をＮ２送気によって除去した。続いて、キビリッコ（Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ）およびイルスマ（Ｉｌｅｓｍａ）、Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ． １１：１２８（１９５９）に従ってヒドロキシプロリンを測定した。
【０２３８】
実施例１５
タバコおよびトマトの発現産物の酵素結合免疫吸着アッセイ法による特徴づけ
キリチェフスキー（Ｋｉｅｌｉｓｚｅｗｓｋｉ）およびランポート（Ｌａｍｐｏｒｔ）、「ＥＬＩＳＡ法により測定した、伸長前駆体に対するポリクローナル抗体の交差反応性（Ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｖｉａ ＥＬＩＳＡ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｙ ２５：６７３〜６７７（１９８６）の方法を用いた、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）により、トマトおよびタバコの細胞培養液ならびにカラムピーク（実施例１２参照）から、ＧＡＧＰ−ＥＧＦＰ産物およびＳＰ−ＥＧＦＰ産物が検出された。抗ＥＧＦＰ抗体を用いたＧＡＧＰ−ＥＧＦＰ産物のアッセイも行った。抗ＥＧＦＰ抗体（クロンテック社）を一次抗体とし、製造者による推奨に従って１０００倍に希釈した。二次抗体は、５０００倍に希釈したペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩＧＧ抗体（シグマ社）とした。組換えＥＧＦＰ（クロンテック社）を対照として用いた。上記の実施例１２の図３および図４は本アッセイ法を用いて作成した。
【０２３９】
実施例１６
タバコおよびトマトの発現産物の蛍光による特徴づけ
ＧＡＧＰ−ＥＧＦＰ遺伝子およびＳＰ−ＥＧＦＰ遺伝子による形質転換を行った、タバコ細胞およびトマト細胞の培地を採取した。ＥＧＦＰタグはＵＶ光を照射すると蛍光を発する；ここで用いた励起波長は４８８ｎｍとした。これらの培地を、シグナル配列の後方で発現されて培地中に分泌されたＥＧＦＰを含む培地、非改変型ｐＢＩ１２１による形質転換を行った細胞、および非形質転換細胞の培地と比較した。はっきりとした明るい緑色蛍光（データは示していない）により、ＥＲ／ゴルジ膜系を通って輸送中の標的産物を観察することができた。アグロバクテリウムにはＨＲＧＰを生じる翻訳後修飾機構がないため、蛍光タンパク質は必然的に植物由来のものである。
【０２４０】
実施例１７
タバコのリーフディスク形質転換
滅菌したタバコ葉を刻んで小片にし、針で傷を付けた。ホルモンを含まない４ｍｌのＮＴ−１培地（実施例１０のＮＴ−１培地から２−４Ｄを除いたもの）および一晩培養したアグロバクテリウムの濃縮液１５０μｌ（実施例９参照）を葉に添加し、このリーフディスクを暗所で４８時間インキュベートした。その後、ホルモンを含まないＮＴ−１培地でリーフディスクを洗った。次にディスクをＮＴ−１固形培地プレート（実施例１０のＮＴ−１培地＋７．５ｇバクトアガー（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））、４００μｌ／ｍｌチメンチンおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシンの上に置いた。
【０２４１】
３週後に、苗条をホルモンを含まないＮＴ−Ｂ固形培地［実施例１０のＮＴ−１培地から２−４Ｄを除き、ＤＭＳＯ（Ｎ−ベンジル−９−（テトラヒドロピラニル）アデニン（シグマ社）中に構成した２ｍｇ／ｍｌ保存液から調製した３００μｌ／Ｌのベンジルアデニンを加えたもの］から根に移した。実施例１６の蛍光アッセイ法による評価で、形質転換植物はＳＰ−ＥＧＦＰおよびＧＡＧＰ−ＥＧＦＰを葉細胞および根細胞で発現した（データは示していない）。
【０２４２】
実施例１８
ＧＡＧＰの配列解析およびコンセンサス配列の決定
本実施例では、配列番号：１３６の範囲に含まれる配列（好ましいコンセンサス配列を含む）が得られた、アミノ酸配列決定、グリコシルおよび結合分析について述べる。
【０２４３】
１．実験
本発明の配列の好ましい態様に到るまでには、以下の実験プロトコールを用いた。
【０２４４】
Ａ．サイズ分画
以下の通りに、チー（Ｑｉ）ら［Ｑｉら（１９９１）前記］の方法を用いて、調整用スーパーロース−６ゲル濾過によってＧＡＧＰを単離した。アラビアゴム（Ｋｏｒｄｏｆａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ、Ｓｕｄａｎ）の塊は、ＡＥＰコロイズ社（ＡＥＰ Ｃｏｌｌｏｉｄｓ）（Ｂａｌｌｓｔｏｎ Ｓｐａ、ＮＹ）のゲーリー・ワイン（Ｇａｒｙ Ｗｉｎｅ）氏から寄贈されたものである。テクマー（Ｔｅｋｍａｒ）Ａ−１０型粉砕器で塊を粉砕して細粉（約２ｍｍ）にした。アラビアゴムの試料（１００ｍｇ／ｍｌ）を水に溶かし、０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７）中に希釈して５０ｍｇ／ｍｌとした。試料を遠心分離処理して不溶性物質をペレット化し、１ｍｌのアリコートを準調整用スーパーロース−６ゲル濾過カラム（内径１．６ｃｍ×５０ｃｍ、ファルマシア社）にかけ、以前の記載の通り［Ｑｉら（１９９１）前記］にイソクラティック溶出を行った。ＧＡＧＰに対応するタンパク質ピークを、塩を除去するために水に対して透析した後、凍結乾燥した。
【０２４５】
Ｂ．ＨＦ−脱グリコシル化
キモトリプシン分解ペプチドマッピングのために、ＧＡＧＰを以下のようにしてＨＦ−脱グリコシル化した。スーパーロース−６で分画したＧＡＧＰ（ｄＧＡＧＰと命名）を、以前の記載の通り［Ｑｉら（１９９１）前記］に無水フッ化水素（ＨＦ）（２０ｍｇ粉末／ｍｌ ＨＦ、４℃で１時間）中で脱グリコシル化し、完全な脱グリコシル化が確実に行われるようにこの手順を２回繰り返した。
【０２４６】
Ｃ．サイズ分画したＧＡＧＰおよびｄＧＡＧＰの逆相ＨＰＬＣによる精製
スーパーロースで分画したＧＡＧＰを、グリコシド分析のために精製するか、またはｄＧＡＧＰ試料を用いて、緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ、水性）で平衡化し、緩衝液Ｂ（０．１％ＴＦＡ、８０％アセトニトリル、水性）で勾配溶出（０〜１００％Ｂ／８０分；流速０．５ｍＬ／分）によって溶出させることによる、ハミルトンＰＲＰ−１準調整用カラム（１０ｍｍ、２５０×４．１ｍｍ）上でのペプチドマッピングを行った。溶出液を２２０ｎｍでモニターした。回収したピークをＮ２（気体）送気によって乾燥させ、ｄｄＨ２Ｏ中に再び溶解した上で凍結乾燥を行った。
【０２４７】
Ｄ．脱グリコシル化ＧＡＧＰの、キモトリプシンまたはプロナーゼによるタンパク質分解
ｄＧＡＧＰの試料２ｍｇ〜９ｍｇを、以前の記載の通り［Ｋｉｅｌｉｓｚｅｗｓｋｉら（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ９９：５３８］にプロナーゼまたはキモトリプシンによって消化処理した。続いて消化物を凍結乾燥した。
【０２４８】
Ｅ．ｄＧＡＧＰキモトリプシン分解ペプチドの陽イオン交換ＨＰＬＣによる分画
ｄＧＡＧＰキモトリプシン分解ペプチド（４００ｍｇ／１注入）を、ポリスルホエチルＡ（ＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ Ａ）（商標）陽イオン交換カラム（内径９．４ｍｍ×２００ｍｍ；ＰｏｌｙＬＣ、Ｅｌｌｉｃｏｔ Ｃｉｔｙ、ＭＤ）を緩衝液Ａ（５ｍＭリン酸ナトリウム／リン酸緩衝液、ｐＨ ３、２５％ｖ／ｖのアセトニトリルを含む）で平衡化し、緩衝液Ｂ（１Ｍ ＫＣｌを含む緩衝液Ａ）でプログラム化した勾配溶出を用いて溶出させることによって分画した。溶出勾配は０％〜４％緩衝液Ｂ／４５分、４％〜８％緩衝液Ｂ／４５分〜５０分、８％〜３０％緩衝液Ｂ／５０分〜６５分とした。流速は０．４ｍＬ／分とし、２２０ｎｍで吸光度をモニターした。回収したピークをプールしてＮ２（気体）を送気し、ｄｄＨ２Ｏ中に再び溶解した上で凍結乾燥した。
【０２４９】
Ｆ．逆相ＨＰＬＣによるペプチド単離
ｄＧＡＧＰのプロナーゼ部分消化物、ならびにポリスルホエチルアスパルトアミド（ＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ Ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ）カラムの主要ピークＳ１およびＳ２を緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ、水性）に溶解し、ハミルトンＰＲＰ−１分析用逆相カラム（内径４．１ｍｍ×１５０ｍｍ）に注入した上で、０〜５０％／１００分の緩衝液Ｂ（０．１％ＴＦＡおよび８０％ｖ／ｖアセトニトリル）勾配により０．５ｍＬ／分で溶出させた。溶出液を２２０ｎｍでモニターし、回収したピークにＮ２（気体）を送気し、ｄｄＨ２Ｏ中に再び溶解して凍結乾燥を行った後に配列決定を行った。プロナーゼ分解ペプチドＰ３（図６）の分解能を高めるために、Ｐ３をＰＲＰ−１カラムに再度通し、０〜３０％の緩衝液Ｂ勾配によって溶出させた。
【０２５０】
Ｇ．ｄＧＡＧＰキモトリプシン分解ペプチドの自動エドマン分解
ｄＧＡＧＰペプチドの配列決定は、ミシガン州立大学の高分子施設で、アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）の４７７Ａ気相シークエンサーを用いて行った。
【０２５１】
Ｈ．アミノ酸分析
アミノ酸組成は、アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートによるアミノ酸のプレカラム誘導体化を行った後に、ウォーターズ社（Ｗａｔｅｒｓ）のＡｃｃＱ−Ｔａｇ化学パッケージ（ＡｃｃＱ−Ｔａｇ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｐａｃｋａｇｅ）およびコラーゲン加水分解物の分析に関してウォーターズ社が推奨している勾配［ＣｒｉｍｍｉｎｓおよびＣｈｅｒｉａｎ（１９９７）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４４：４０７；ｖａｎ ＷａｎｄｅｌｅｎおよびＣｏｈｅｎ（１９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ ７６３：１１］を用いる逆相ＨＰＬＣ（Ｎｏｖａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ１８カラム）によって決定した。
【０２５２】
ヒドロキシプロリングリコシドプロフィール
ＧＡＧＰのヒドロキシプロリングリコシドの分布は、以前の記載の通り［ＬａｍｐｏｒｔおよびＭｉｌｌｅｒ（１９７１）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ４８：４５４］に、アルカリ加水分解（１０５℃、１８時間、０．２２Ｎ Ｂａ（ＯＨ）２）および中和の後に、７５×０．６ｃｍのテクニコンクロモビーズ（Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ Ｃｈｒｏｍｏｂｅａｄｓ）Ｃ２陽イオン交換樹脂によるクロマトグラフィーを行って決定した。
【０２５３】
Ｉ．Ｈｙｐ−ポリサッカライドの単離
スーパーロース−６のアルカリ加水分解産物（上記参照）およびＰＲＰ−１精製したＧＡＧＰをＧ−５０セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル浸透カラムにかけ、１００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ ６．８によるイソクラティック溶出を流速０．３ｍｌ／分で行った。１ｍｌの画分を回収し、以前の記載の通り［ＫｉｖｉｒｉｋｋｏおよびＩｌｅｓｍａａ（１９５９）Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ １１：１２８；Ｋｉｅｌｉｓｚｅｗｓｋｉら（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ９２：３１６］に、各画分の４０ｍｌのアリコートをＨｙｐに関してアッセイした。画分を凍結乾燥した後に秤量し、画分中のＨｙｐおよび糖の量を回収重量、Ｈｙｐアッセイおよび単糖組成分析によって算出した。
【０２５４】
Ｊ．ＧＡＧＰのアルカリ部分加水分解
以前の記載の通り［ＡｋｉｙａｍａおよびＫａｔｏ（１９８４）Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４８：２３５］に、スーパーロースで分画したＧＡＧＰ（１０ｍｇ／ｍｌ）を０．２Ｎ ＮａＯＨ／ＮａＢＨ４中に溶解し、５０℃に加熱した。２００ｍｌのアリコートをその直後（ゼロ時間対照）および６時間の間、１時間ごとに採取し、氷上で冷却した上で２０ｍｌ氷酢酸を添加した（最終ｐＨ＝５．８）。以前の記載の通り［ＫｉｖｉｒｉｋｋｏおよびＩｌｅｓｍａａ（１９５９）Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ １１：１２８；Ｋｉｅｌｉｓｚｅｗｓｋｉら（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ９２：３１６］に、各試料をＨｙｐに関してアッセイした。
【０２５５】
Ｋ．糖組成および結合分析
単糖組成の決定および結合分析は、ジョージア大学複合糖質研究センター（Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｏｒｇｉａ）で、ヨーク（Ｙｏｒｋ）ら［Ｙｏｒｋら（１９８５）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１８：３］ならびにメークル（Ｍｅｒｋｌｅ）およびポップ（Ｐｏｐｐｅ）の方法［ＭｅｒｋｌｅおよびＰｏｐｐｅ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２３０：１］に従って行った。
【０２５６】
２．代表的なコンセンサス配列の決定
本発明者らは、チー（Ｑｉ）らの方法［Ｑｉら（１９９１）前記］を用いて、調整用スーパーロース−６ゲル濾過によってＧＡＧＰを単離した。キモトリプシン分解ペプチドマッピングにはＨＦ−脱グリコシル化したＧＡＧＰを用いた。これにより、図５に示すように、逆相クロマトグラフィーによってさらに分画した際に対称的なピークが示された（ｄＧＡＧＰと命名）。図５は、ハミルトンＰＲＰ−１カラム上での逆相クロマトグラフィーおよび勾配溶出による分画によるｄＧＡＧＰの溶出プロフィールである。３５分にみられた成分はＨｙｐに乏しい混入物であった。
【０２５７】
アミノ酸分析により、ｄＧＡＧＰが、ピークの全体を通じて採取した複数の画分において大きく偏っているものの一定なアミノ酸組成を有することが示され（表５）、ｄＧＡＧＰが配列解析を行える程度に十分に純粋な単一のポリペプチド成分であることが示された。
【０２５８】
【表５】
2004516003.tif 000041
＊ ピークの均一性を確かめるために、ｄＧＡＧＰピークにまたがるこれらの３つの連続画分（上昇部、中心部、下降部と命名）を分析した。
＋ モル百分率として表した。
＋＋  測定せず。
【０２５９】
これは、組成が相互に類似し、親ＧＡＧＰ（表５）とも類似したペプチドの単離（表６）によって確認された。
【０２６０】
【表６】
2004516003.tif 000042
＊ Ｏはペプチド配列中のヒドロキシプロリンを表し、Ｘはブランクサイクルを表す。
＋ デロネー（Ｄｅｌｏｎｎａｙ）ら（１９９３）による
＋＋ 主要ペプチドＰ１、Ｐ３、Ｓ１Ｐ３、Ｓ１Ｐ５、Ｓ２Ｐ１、Ｓ２Ｐ３およびＰＨ３Ｇ２に由来する。
【０２６１】
天然のＧＡＧＰはプロナーゼで十分に消化されず［ＡｋｉｙａｍａおよびＫａｔｏ（１９８４）Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４８：２３５；Ｃｈｉｋａｍａｉら（１９９６）Ｆｏｏｄ Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ １０：３０９］、約２００ｋＤａの大きい断片が生じるのみであるが［Ｃｏｎｎｏｌｌｙら（１９８８）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ８：２３］、ランポート（Ｌａｍｐｏｒｔ）の研究室における予備的な研究で、ｄＧＡＧＰはプロナーゼによる徹底的な消化によって小さなペプチドにうまく分解されることが示されている［Ｄｅｌｏｎｎａｙ（１９９３）修士論文、ミシガン州立大学、ＭＩＴ］。しかし、これらのペプチドには、チー（Ｑｉ）ら［Ｑｉら（１９９１）前記］によって示唆された、反復性モチーフに関するチー（Ｑｉ）らの実験式：Ｈｙｐ４ Ｓｅｒ２ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｈｉｓ（配列番号：１９９）に存在するアミノ酸のいくつか、特にＨｉｓ（表６、ペプチドＰＨ３Ｇ２）が存在しなかった。このため、プロナーゼ消化ｏｆ ｄＧＡＧＰのプロナーゼ部分消化を行った。これにより、部分配列（表６）が実験式中のアミノ酸のすべてを含む、図６に示した２つの大きな主要ペプチドＰ１およびＰ３が得られた。
【０２６２】
ロイシル結合およびヒスチジル結合を緩徐に切断するキモトリプシンによるｄＧＡＧＰの消化も行い、これに続いて二段階ＨＰＬＣ分画を行った。ポリスルホエチルＡ（ＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ Ａ）（商標）（ＰｏｌｙＬＣ， Ｉｎｃ． ＥｌｌｉｃｏｔＩ Ｃｉｔｙ、ＭＤ）陽イオン交換カラムによるキモトリプシン分解ペプチドの初回分離により、Ｓ１およびＳ２と命名した２つの主要画分が得られた（図７）。逆相カラムクロマトグラフィーによる分画をさらに行うために、この主なキモトリプシン分解画分、Ｓ１およびＳ２を回収した。ハミルトンＰＲＰ−１逆相カラムによるクロマトグラフィーをさらに行ったところ、画分Ｓ１はＳ１Ｐ１〜Ｓ１Ｐ５と命名した５つの主要ペプチドに分離され、Ｓ２分画はＳ２Ｐ１〜Ｓ２Ｐ４と命名した４つの主要ペプチドに分離され、これらの配列を決定した（図８ａおよびｂ）。エドマン分解により、これらのキモトリプシン分解ペプチドの相互同士およびプロナーゼ分解ペプチドとの関連性が高いことが示された。これらのペプチドはＧＡＧＰの全体的なアミノ酸組成を反映しており、表６に示した１９アミノ酸残基のコンセンサス配列（配列番号：１７９）と関連づけることができる。
【０２６３】
以上のデータから、本発明者らはＧＡＧＰが、配列にわずかなばらつきはあるものの、高反復性ポリペプチドを有すると結論した。ＧＡＧＰが１５０ｎｍの線状分子であることに基づき［Ｑｉら（１９９１）前記］、さらにエクステンシンおよびＡＧＰに存在する長いポリプロリンＩＩヘリックスの存在を仮定することにより［ＫｉｅｌｉｓｚｅｗｓｋｉおよびＬａｍｐｏｒｔ（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ５：１５７；Ｎｏｔｈｎａｇｅｌ（１９９７）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ １７４：１９５］、本発明者らはＧＡＧＰが部分反復を時に伴う約２０ペプチドの反復配列を含むと推定している。コンセンサス配列の部分反復は、天然のＧＡＧＰにおけるセリン含有量がコンセンサス配列のものよりも幾分多い理由である可能性がある。
【０２６４】
表６の代表的な１９アミノ酸残基からなるＧＡＧＰコンセンサス配列は約９個のＨｙｐ残基を含み、これは単一のポリサッカライド結合部位のみを含むと以前に仮定されたサイズの概ね２倍である［Ｑｉら（１９９１）前記］。ＧＡＧＰのＨｙｐ−グリコシドプロフィール（表７）［Ｑｉら（１９９１）前記］から判断すると、５つのＨｙｐ残基につき約１つはポリサッカライド置換を受けている。
【０２６５】
【表７】
2004516003.tif 000043
【０２６６】
したがって、本発明の代表的なコンセンサス配列中には約２個のＨｙｐ−ポリサッカライド部位が存在する。本発明を何らかの特定の理論に限定するわけではないが、どのＨｙｐ残基がポリサッカライド結合に関与するかを明らかにするために、本発明者らは、連続したＨｙｐ残基のアラビノシル化、および、ＡＧＰに多くみられるＸ−Ｈｙｐ−Ｘ−Ｈｙｐモジュール［Ｎｏｔｈｎａｇｅｌ（１９９７）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ １７４：１９５］などの、クラスター化した非連続的なＨｙｐ残基に対するアラビノガラクタン−ポリサッカライド付加を予想している。この予想に基づき、本発明者らは、図９に示すように、表６の代表的なコンセンサス配列がクラスター化した非連続的なＨｙｐモチーフ：Ｓｅｒ−Ｈｙｐ−Ｓｅｒ−Ｈｙｐ−Ｔｈｒ−Ｈｙｐ内に約２つのポリサッカライド結合部位を含み、これに隣接してアラビノシル化された連続したＨｙｐ残基が存在すると考えている。図９では、アミノ酸についてはＨｙｐに関して［Ｄｕら（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ６：１６４３］による表記を用いたことを例外として標準的な一文字記号を用い、糖についてはグルクロン酸をＧｌｃＡと表記したことを除いて標準的な三文字記号を用いている。このモデルは、アラビノシドおよびポリサッカライド置換基が対称的に分布し、それがペプチド骨格内のＨｙｐ残基のパリンドローム様配置によって導かれることを示す：Ｓｅｒ−０はパリンドロームの中心である。しかし、縮重変形物も存在する（表６）。本発明者らはこの構造の根拠を、単離したＨｙｐ−ポリサッカライド画分に関する組成分析および結合分析（表７および８）［Ｑｉら（１９９１）前記］、ならびにデフェイ（Ｄｅｆａｙｅ）およびウォン（Ｗｏｎｇ）［ＤｅｆａｙｅおよびＷｏｎｇ（１９８６）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５０：２２１］により、粗アラビアゴムに関して解明された五糖側鎖構造（表９のＲｈａｔ、Ａｒａｔ、３−Ａｒａ、４−ＧｌｃＡおよび２，３，６−Ｇａｌに対応する）に置いている。
【０２６７】
ヒドロキシプロリン−Ｏ−グリコシド結合は塩基中で安定であり［Ｌａｍｐｏｒｔ（１９６７）Ｎａｔｕｒｅ ２１６：１３２２；Ｍｉｌｌｅｒら（１９７２）Ｓｃｉｅｎｃｅ １７６：９１８；Ｐｏｐｅ（１９７７）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ５９：８９４］、β−脱離を生じるセリンおよびトレオニンなどの他のＯ−グリコシル化ヒドロキシアミノ酸とは対照的である［Ｌａｍｐｏｒｔら（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ １３３：１２５］。このため、ＧＡＧＰからのＨｙｐ−アラビノガラクタンポリサッカライドの単離および特徴づけには、以前に示した通り［Ｑｉら（１９９１）前記］、アルカリ加水分解を用いた。
【０２６８】
アルカリ加水分解産物のセファデックスＧ−５０上での分画によってＧＡＧＰから単離された、小型のＨｙｐ−ポリサッカライドの組成分析により（図１０；表８）、糖の含有量が５１５８ｎＭであることが示された。
【０２６９】
【表８】
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【０２７０】
図１０では、回収した全画分にわたるＨｙｐのアッセイにより、Ｈｙｐ−ポリサッカライドのサイズが広範囲にわたることが示された（画分１７〜３２）。画分２７〜３０を結合分析および組成分析のために回収した。Ｈｙｐアラビノシドおよび非グリコシル化Ｈｙｐは画分３３〜４２に溶出した。対応する定量的Ｈｙｐアッセイにより、単離および分析を行ったピーク内のＨｙｐが計２２０ｎｍであることが示された（図１０）。２２０ｎｍ Ｈｙｐ：５１５６ｎｍ糖というモル比から、この画分中には約２３残基のラムノグルクロノアラビノガラクタンＨｙｐ−ポリサッカライド置換基が存在することが示された。ポリサッカライドのメチル化分析（表９）からは、図９に特徴を示したモデルに一致する結合が示されたが、含まれる糖残基は、図９に特徴を示した２３残基ではなく２１〜２２糖残基であった。
【０２７１】
【表９】
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＊ 残基／ポリサッカライドの推定数。
【０２７２】
以上のデータに基づき、本発明者らは、各々の小ポリサッカライドが、約７残基の（１−３）β−Ｄ−ガラクタン骨格ヘリックスに沿って配置された、２つの五糖側鎖（Ｇａｌ、Ａｒａ２、ＧｌｃＡ、Ｒｈａ）を含み、同じくＡｒａおよびＧａｌの単糖側鎖も含むと結論した。
【０２７３】
本明細書に提示したデータは、Ｈｙｐ−ポリサッカライドおよびＧＡＧＰの結合分析の結果がいずれも類似することを示しており（表９）、ＧＡＧＰとアラビアゴムポリサッカライドとの間に類似性があるという証拠を提供するものである。これらの結果は、より大きいＨｙｐ−ポリサッカライド（図１０）が、約１２個のガラクトース残基／反復を含む反復単位を含む可能性を示唆する。したがって、本発明を何らかの特定の理論または機序に限定するわけではないが、本発明者らは、Ｇ−５０セファデックスカラムから、画分１８〜２６中に溶出したより大きなアラビノガラクタン部分には、５つ程度の側鎖（約４０個の糖）が存在すると推定している（図１０）。本発明者らはさらに、ＧＡＧＰおよび他のＡＧＰのアルカリ分解に対する感受性には、グリコシド結合ではなくペプチド結合がかかわっていると考えている。
【０２７４】
実施例１９
アラビアゴムモチーフの８回、１６回、２０回、３２回および６４回の反復配列の構築、ならびに植物細胞における発現
本実施例は、本発明のコンセンサス配列に基づくアラビアゴム糖タンパク質反復配列の発現のための、合成遺伝子を開示する。本遺伝子は、それぞれが本発明のコンセンサス配列に含まれる２つのモチーフ
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の８個、２０個、３２個または６４個の連続単位を有する。６４個の連続単位［すなわち、（モチーフ１−モチーフ２）３２］は、ＤＮＡ反復回数が厳密に制御された、極めて大きなサイズの挿入物の構築を可能とする、互換的ではあるが再生不能な制限部位を用いる、以前に記載された［Ｌｅｗｉｓら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＆ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ７：４００〜４０６］手法の変法を用いて構築した。
【０２７５】
１．Ａｍｐｒ遺伝子からＢｓｒＦＩ制限部位を除去するための位置特異的変異誘発
プラスミドｐＵＣ１８はＡｍｐｒ遺伝子中に内因性ＢｓｒＦＩ部位を有する。ＸｍａＩ−ＢｓｒＦＩ合成遺伝子断片のサブクローニングに適用しうるプラスミドを作製するために、ＰＣＲコアシステムＩキット（プロメガ社）を用いて、この部位を変異によって除去した。ＰＣＲプライマー１：（上流プライマー）は配列（配列番号：２０４）
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を有する；このプライマーはｐＵＣ１８のヌクレオチド１７５６〜１７８５から設計したが、１７８０位に置換が１つ（Ｇの代わりにＡ）（太字の下線部）ある点が異なる。このために１つのＡｌａコドン（ＧＣＣ）が別のもの（ＧＣＴ）に変化し、Ａｍｐｒアミノ酸配列は保たれるがＢｓｒＦＩ部位は変異する。ＰＣＲプライマー２：（下流プライマー）は配列（配列番号：２０５）
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を有し、ｐＵＣ１８の２２２０〜２１９８ヌクレオチドから設計した。ＰＣＲ反応条件は９５℃で２分間、９５℃で３０秒間、４８℃で１分間、７２℃で１分間（３０サイクル）、７２℃で５分間とした。ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで分離した。ＱＩＡＥＸ ＩＩゲル抽出キットを用いて、４６４ｂｐのＰＣＲ断片をゲルから切り出した。単離した断片を制限消化し、ｐＵＣ１８中にＳｃａＩ−ＢｐｍＩ断片としてサブクローニングした。ＭｐＵＣ１８と命名したこの新たなプラスミドは、活動性Ａｍｐｒ遺伝子を含むがＢｓｒＦＩ部位は含まない。
【０２７６】
２．相互プライミング性オリゴヌクレオチドを用いたアラビアゴム糖タンパク質（ＧＡＧＰ）反復配列の合成
アラビアゴム糖タンパク質のモチーフ１がモチーフと結合した連続単位をコードするＤＮＡを、以前に記載された方法［分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、８．２．８節〜８．２．１０節］を用いて構築した。２つのＧＡＧＰモチーフをコードするＤＮＡ断片を、以下の２つの部分的に重複する合成オリゴヌクレオチドのプライマー伸長によって合成した：第１のオリゴヌクレオチド（配列番号：２０６）：
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；第２のオリゴヌクレオチド（配列番号：２０７）：
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このオリゴヌクレオチド（各０．０５ｎｍ）を９５℃で５分間加熱し、４８℃で５分間アニーリングさせた後、ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片（プロメガ社）によって３７℃で３０分間伸長させた。７５℃で１０分間加熱することによって反応を停止させ、緩衝液をセファクリルＳ−２００カラム（ファルマシア社 Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ（商標））によって交換した。次にプラスミドをＭｐＵＣ１８中にＨｉｎｄＩ−ＸｍａＩ断片としてサブクローニングした。プラスミドの配列はｐＵＣ／Ｍ１３順方向プライマー（１７ｍｅｒ）を用いて決定した。
【０２７７】
３．再生不能な制限部位を用いたＧＡＧＰ内部反復配列の倍増化
規定数のＧＡＧＰ反復配列を含む合成遺伝子を以下のように、図１５に示した通りに合成した。上記のＰＣＲ産物（図１６Ａに示した２つのＧＡＧＰモチーフ）を含むＭｐＵＣ１８（ＭｐＵＣ ｇｕｍ−２と命名）を２本のチューブに分割した。チューブ１内のＭｐＵＣ ｇｕｍ−２はＳｃａＩおよびＢｓｒＦＩで制限消化し、チューブ２内のＭｐＵＣ ｇｕｍ−２はＳｃａＩおよびＸｍａＩで制限消化した。消化物を１％アガロースゲルで分離した。チューブ１（ＳｃａＩ／ＢｓｒＦＩ消化物）からの１８８４ｋｂのバンド、およびチューブ２（ＳｃａＩ／ＸｍａＩ消化物）からの１０４４ｋｂのバンドをゲルから切り出し、合わせた上で互いに連結した。この結果得られたプラスミド（ＭｐＵＣ ｇｕｍ−４）は４つのＧＡＧＰ内部反復配列［すなわち（モチーフ１−モチーフ２）２］を含んでいた（図１６Ｂ）。この手法を用いて、ＧＡＧＰの８回、１６回、２０回、３２回および６４回の内部反復配列を含むプラスミドを構築することに成功した。
【０２７８】
４．合成ｇｕｍ反復配列のｐＵＣ ｓｓ−ＥＧＦＰプラスミド中へのサブクローニング
ｇｕｍ遺伝子（ｇｕｍ−８、ｇｕｍ−２０およびｇｕｍ−３２）をＭｐＵＣ１８プラスミドからＢｓｐＥＩ／ＳａｃＩ断片として取り出し、ｐＵＣ ｓｓ−ＥＧＦＰプラスミド中のシグナル配列の後ろにサブクローニングした。このサブクローニング中にＥＧＦＰをｐＵＣ ｓｓ−ＥＧＦＰからＸｍａＩ／ＳａｃＩ断片として取り出した。ＸｍａＩおよびＢｓｐＥＩ制限部位は互換的であるが、再生不能である。
【０２７９】
ＥＧＦＰ遺伝子をｇｕｍ配列の後ろにインフレームに配置するために、次のサブクローニングを行った。ｐＵＣ ｓｓ−ＥＧＦＰプラスミドをＸｍａＩで切断し、マングビーンエンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理した。フェノール／クロロホルム抽出に続いてエタノール沈殿を行うことによって酵素を失活させた。続いてプラスミドをＳａｃＩで切断した。ＥＧＦＰ断片を制限消化した後に、ＳｍａＩ／ＳａｃＩ制限酵素で切断したｐＵＣ ｓｓ−ｇｕｍプラスミド中にサブクローニングした。シグナル配列−合成遺伝子−ＥＧＦＰ断片をＭｐＵＣ１８プラスミドからＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ断片として取り出し、β−グルクロニダーゼレポーター遺伝子との置換によりｐＢＩ１２１中にサブクローニングした。ＭｐＵＣ ｓｓ−ｇｕｍ２０−ＥＧＦＰおよびＭｐＵＣ ｓｓ−ｇｕｍ３２−ＥＧＦＰプラスミドの配列決定を、ｐＵＣ／Ｍ１３順方向（１７ｍｅｒ）プライマー、およびｐＥＧＦＰのヌクレオチド５６６〜ヌクレオチド５８８に由来するＧＦＰプライマー
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を用いて行った。
【０２８０】
５．タバコ培養細胞、タバコリーフディスクおよびトマト培養細胞の形質転換、ならびに多数のＧＡＧＰ内部反復配列の発現
発現ベクターには、構築物を翻訳後修飾のためにＥＲ／ゴルジに輸送させるためのエクステンシンシグナル配列またはトマトシグナル配列のほか、下記のようにレポータータンパク質として緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）も含めた。
【０２８１】
Ａ．エクステンシンシグナル配列
形質転換ベクターはｐＢＩ１２１（クロンテック社）を由来とした。これらのベクターにはエクステンシンシグナル配列（ＳＳ）のほか、レポータータンパク質として緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含めた。ＧＡＧＰの８個、２０個、３２個および６４個の内部反復配列をシグナル配列とＧＦＰとの間に挿入し、それぞれプラスミドＳＳ−ＧＡＧＰ８−ＥＧＦＰ、ＳＳ−ＧＡＧＰ２０−ＥＧＦＰ、ＳＳ−ＧＡＧＰ３２−ＥＧＦＰおよびＳＳ−ＧＡＧＰ６４−ＥＧＦＰを得た。６４個のＧＡＧＰ反復配列をコードする遺伝子はｐＢＩ１２１では不安定なことが予備的なデータで示されているため、前記のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（実施例９）の形質転換にはプラスミドＳＳ−ＧＡＧＰ８−ＥＧＦＰ、ＳＳ−ＧＡＧＰ２０−ＥＧＦＰおよびＳＳ−ＧＡＧＰ３２−ＥＧＦＰを用いた。
【０２８２】
Ｂ．トマトＬｅＡＧＰ−１シグナル配列
エクステンシンシグナル配列の代わりとして、トマトＬｅＡＧＰ−１シグナル配列を用いた。ＬｅＡＧＰ−１シグナル配列のクローニングは、センスプライマー
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（Ｔｍ：６８℃）（矢印はＢａｍＨＩ制限部位を示す）およびアンチセンスプライマー
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（Ｔｍ：８０℃）（矢印はＸｍａＩ制限部位を示す）を用いて以下の通りに行った。
【０２８３】
ＰＣＲは５２．８ｐｍｏｌのセンスプライマーおよび４７ｐｍｏｌのアンチセンスプライマーを用いて行った。ＬｅＡＧＰ−１シグナル配列のテンプレート（０．０１μｇ）をＰＣＲ混合物とともに添加した。反応溶液を油で覆い、インキュベーションを９５℃で５分間（サイクル１）；９５℃で４５秒間、５８℃で１分間、７４℃で１分間（サイクル２〜３０）；７４℃で５分間として行った。計５０μｌのＰＣＲ溶液のうち２０μｌを取り出し、２％アガロースゲルを用いて精製した。このＰＣＲ産物のサイズは１２７ｂｐであり、ＱＩＡＥＸＩＩキットを用いて単離した。この断片を以下の通りに３７℃で一晩消化した：
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【０２８４】
消化した試料をアガロースゲルにかけた。ベクターおよび断片をゲルから切り出し、ＱＩＡＥＸＩＩを用いて単離した。連結反応液［ｐＵＣ−ＳＳＴｏｂＧＦＰ（ＢＸ）１００ｎｇ、ＰＣＲ断片（ＢＸ）２０ｎｇ、リガーゼ緩衝液（１０倍）１μｌ、リガーゼ１μｌ］を１０℃で一晩インキュベートした。
【０２８５】
形質転換を行い、アンピシリンを含むＬＢ培地中で３つのクローンを別々に培養した。プラスミドを形質転換細胞から単離し、ＢａｍＨＩおよびＸｍａＩで消化して、断片が９９ｂｐ長であることを確認した。トマトシグナル配列を含むこのプラスミドをＰＵＣ−ＳＳｔｏｍ−ＧＦＰと命名した。
【０２８６】
トマトシグナル配列を反復性ＧＡＧＰ配列およびレポーター遺伝子としてのＥＧＦＰと直列に含むプラスミドを、前記のアグロバクテリウム・ツメファシエンスの形質転換に用いる（実施例９）。
【０２８７】
形質転換されたアグロバクテリウム細胞を、上記のようにタバコ培養細胞の形質転換に用いた（実施例１０）。形質転換細胞は、ＧＦＰを発現する蛍光細胞の検出によって選別した。
【０２８８】
形質転換されたアグロバクテリウム細胞は、上記のトマト培養細胞およびタバコディスクの形質転換に用いられると考えられる（実施例１１および１７、前記）。形質転換細胞はＧＦＰを発現する蛍光細胞の検出によって選別されると考えられる。タバコ培養細胞、タバコリーフディスクおよびトマト培養細胞における８回、２０回および３２回のＧＡＧＰ内部反復配列の発現の成功は、以上の実施例の項に述べた方法を用いて確認しうる。
【０２８９】
実施例２０
連続的および非連続的なヒドロキシプロリン糖モジュール（ＳＰ）３２、（ＧＡＧＰ）３、（ＳＰＰ）２４、（ＳＰＰＰ）１６および（ＳＰＰＰＰ）１８を含む、遺伝子およびベクターの構築
本実施例では、タバコシグナル配列およびＥＧＦＰをそれぞれコードする３種のプラスミドの構築、ならびに（ＳＰ）３２、（ＧＡＧＰ）３、ＥＧＦＰ、（ＳＰＰ）２４、（ＳＰＰＰ）１６、（ＳＰＰＰＰ）１８のサブクローニングについて述べる。ここに述べる３種のプラスミドには、産物がＥＲおよびゴルジを通過した後に細胞外マトリックスに向かうようにシグナル配列を用いた［Ｇｏｏｄｅｎｏｕｇｈら（１９８６）Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０３、４０３；ＧａｒｄｉｎｅｒおよびＣｈｒｉｓｐｅｅｌｓ（１９７５）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５５、５３６〜５４１］。プラスミドのうち２つは、６個の（Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）内部反復配列単位（配列番号：１１７）または３個の（ＧＡＧＰ）内部反復配列単位（配列番号：１２２）（図１１）を、シグナル配列と遺伝子改良型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）との間に挟まれた形でコードする合成遺伝子（配列番号：１１２、１１３、１１５、１１６）も含む。図１１では、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ反復配列またはＧＡＧＰ配列をコードする内部反復配列オリゴヌクレオチドの組を、５’−リンカーの組［配列番号：１２２をコードする、配列番号：１２０および１２１］の存在下で頭部から尾部へと重合させた。連結後に３’−リンカー［配列番号：１２５をコードする配列番号：１２３および１２４］を添加し、続いて遺伝子をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで制限消化してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ中に挿入した。シグナル配列（配列番号：１１８および１１９）は、ここに特徴を示した重複性オリゴヌクレオチドのプライマー伸長によって構築した。重複部には下線を施している。
【０２９０】
保存的な（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）ｎモチーフを選択した理由は、これが緑色藻類（クラミドモナス）および高等植物のＡＧＰの両方に存在するためである。この非連続的なＨｙｐモチーフは、オリゴアラビノシド付加部位およびポリサッカライド付加部位の両方を含むＧＡＧＰのコンセンサス配列中にも連続的なＨｙｐモチーフとともに存在する点から特に興味深い。
【０２９１】
シグナル配列（図１１）は、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｐｌｕｍｎｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）由来のエクステンシンシグナル配列に倣ってモデル化した；相互プライミング性オリゴヌクレオチドをＴ７ ＤＮＡポリメラーゼによって伸長させ、この二重鎖をｐＵＣ１８中にＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片として配置した。部分的に重複する相補的な相補オリゴヌクレオチド対の、３つの組の重合に用いる所定の合成遺伝子の構築は、以前の記載の通りに行った（図１１）。シグナル配列−合成遺伝子−改良型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）単位の植物形質転換ベクターｐＢＩ１２１（クロンテック社）への導入を容易にする、ＤＮＡ断片／制限部位を作製するためには、以下のサブクローニングが必要であった：合成遺伝子をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（ストラタジーン社）中にＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片として配置した後、この遺伝子をｐＥＧＦＰ（クロンテック社）中のＥＧＦＰ遺伝子の前にＢａｍＨＩ−ＡｇｅＩ断片としてサブクローニングした（Ｔｓｉｅｎ、Ｒ．Ｙ．（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６７，５０９〜５４４；Ｈａｓｅｌｏｆｆ、Ｊ．、Ｓｉｅｍｅｒｉｎｇ、Ｋ．Ｒ．、Ｐｒａｓｈｅｒ、Ｄ．Ｃ．およびＨｏｄｇｅ、５．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ９４、２１２２〜２１２７．２２）。続いて合成遺伝子−ＥＧＦＰ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（ストラタジーン社）中にＸｍａＩ／ＮｏｔＩ断片としてサブクローニングし、ＸｍａＩ−Ｓｓｔｌ断片として取り出した上でｐＵＣ１８中のシグナル配列の後ろにサブクローニングした。ＤＮＡ配列を配列解析によって確認した後に、ｐＢＩ１２１中にｂ−グルクロニダーゼレポーター遺伝子との置換によりＢａｍＨＩ／ＳｓｔＩ断片として挿入した。構築物はすべて３５Ｓカリフラワーモザイクウイルスプロモーターの制御下に置いた。オリゴヌクレオチドはライフサイエンシズ（Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）によって合成した。アラビアゴム糖タンパク質（ＧＡＧＰ）内部反復配列モジュール（配列番号：２０８）
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の残基８における、Ｐｒｏ／ＨｙｐのＡｌａへの置換は、合成時にセンス鎖にＣのＧへの塩基置換が生じたために偶発的に導入された。
【０２９２】
以下は（ＳＰ）３２、（ＧＡＧＰ）３、ＥＧＦＰ、（ＳＰＰ）２４、（ＳＰＰＰ）１６、（ＳＰＰＰＰ）１８のサブクローニングに用いたプロトコールのより詳細な説明である。簡潔に述べると、すべてのものをまず構築し、ｐＵＣ１８に挿入して配列決定を行った後に、１つのブロック（すなわち、シグナル配列−合成遺伝子−ＥＧＦＰ）としてｐＢＩ１２１に導入した。ｐＢＩ１２１中の構築物の配列決定は行わなかった。ｐＢＩ１２１プラスミドを用いてアグロバクテリウムの形質転換を行い、形質転換されたアグロバクテリウムを以下の実施例２１に述べるように植物細胞の形質転換に用いた。
【０２９３】
１．シグナル配列の合成
シグナル配列の構築は、相互プライミング性オリゴヌクレオチド［分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（１９９５）ページ８．２．８〜８．２．１０］を用いることによって行った。オリゴヌクレオチド（０．２ｎｍｏｌ、０．２ｎｍｏｌ）をアニーリングさせ（７０℃で５分間、続いて４０℃で５分間）、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー）ラージフラグメント（プロメガ社）によって伸長させた（３７℃で３０分間）。７５℃で１０分間加熱することによって反応を停止させた。この結果得られたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＳｓｔＩ酵素で切断し、ｐＵＣ１８プラスミド中に配置した。プラスミドの配列決定はｐＵＣ／Ｍ１３順方向（１７ｍｅｒ）プライマーを用いて行った。
【０２９４】
２．合成遺伝子の合成およびサブクローニング
オリゴヌクレオチドの合成およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ精製はギブコ社またはインテグレーテッドＤＮＡテクノロジーズ社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）が行った。それらを水中に適切な濃度に溶解した。
【０２９５】
Ａ．（ＳＰ）３２および（ＧＡＧＰ）３の合成およびサブクローニング
ｉ）アニーリング反応
オリゴヌクレオチド対を以下の通りにエッペンドルフチューブ内で混ぜ合わせた：
ａ）５．５μｌ 内部反復配列センスオリゴヌクレオチド（０．５ｎｍｏｌ／μｌ）
５．５μｌ 内部反復配列アンチセンスオリゴヌクレオチド（０．５ｎｍｏｌ／μｌ）
１１μｌ Ｔ４リガーゼ１０倍連結緩衝液
ｂ）２μｌ ５’末端センスリンカー（０．０５ｎｍｏｌ／μｌ）
２μｌ ５’末端アンチセンスリンカー（０．０５ｎｍｏｌ／μｌ）
１μｌ 水
５μｌ Ｔ４リガーゼ１０倍連結緩衝液
ｃ）２μｌ ３’末端センスリンカー（１ｎｍｏｌ／μｌ）
２μｌ ３’末端アンチセンスリンカー（１ｎｍｏｌ／μｌ）
１μｌ 水
５μｌ Ｔ４リガーゼ１０倍連結緩衝液
すべてのチューブを９０〜９５℃で５分間加熱した。次にそれらを３時間かけて４５℃まで冷却し、４５℃にさらに２時間保った。
【０２９６】
ｉｉ．オリゴヌクレオチドの重合
１０μｌの内部反復配列の対を１０μｌの５’末端リンカー対と混ぜ合わせた（１５：１モル比）。この混合物を１７℃でインキュベートした。続いて水８０μｌ（１倍濃度の連結緩衝液を得るため）および２μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（４，０００Ｕ）を添加した。連結反応液を１２℃〜１５℃で３６時間インキュベートした。重合の程度は２．２％アガロースゲルで確認した。
【０２９７】
５’末端リンカー−内部反復配列重合体に、３’末端リンカーによりキャップを形成した。５μｌの３’末端リンカーを上記の段階による５０μｌの連結反応液に添加した。混合物を３０℃に加熱し（非特異的なハイブリダイゼーションを破壊するため）、１７℃で３時間インキュベートした。水２０μｌおよび２μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（４，０００Ｕ）を添加し、連結反応液を１２℃〜１５℃で３６時間インキュベートした。６５℃で１０分間加熱することによって反応を停止させた。
【０２９８】
構築物をエタノール沈殿させ、７０％エタノールで洗浄した後に風乾させた。ペレットを８０μｌの水に溶解した。その１０μｌをＥｃｏＲＩ（１０単位）およびＢａｍＨＩ（２０単位）による制限処理に用いた。セファクリルＳ−４００カラム（ファルマシア社 Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ（商標））を用いて、塩および小さなオリゴヌクレオチド断片を除去した。キアクイック（Ｑｉａｑｕｉｃｋ）ヌクレオチド除去キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて酵素を除去した。この結果得られた断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫプラスミド（ストラタジーン社）中に挿入した。クローンの選別は青／白アッセイ法によって行った。合成遺伝子の構造はｐＵＣ／Ｍ１３順方向（１７ｍｅｒ）プライマーを用いる配列決定によって確認した。
【０２９９】
ｉｉｉ．サブクローニング
合成遺伝子をｐＥｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）からＢａｍＨＩ／ＡｇｅＩ断片としてまず取り出し、ｐＥＧＦＰ（クロンテック社）中にサブクローニングした（この段階によって方向性クローニングが可能となる）。合成遺伝子−ＥＧＦＰ断片をｐＥＧＦＰからＸｍａＩ／ＮｏｔＩ断片として取り出し、ＫＳ（ストラタジーン社）中にサブクローニングした（この段階はＥＧＦＰの末端にＳｓｔＩ部位を得る目的で行った）。合成遺伝子−ＥＧＦＰ断片をＫＳからＸｍａＩ／ＳｓｔＩ断片として取り出し、ｐＵＣ−シグナル配列プラスミド中にシグナル配列の後ろにサブクローニングした。合成遺伝子の構造はｐＵＣ／Ｍ１３順方向（１７ｍｅｒ）プライマーを用いる配列決定によって確認した。シグナル配列−合成遺伝子−ＥＧＦＰ断片をｐＵＣ１８プラスミドからＢａｍＨＩ／ＳｓｔＩ断片として取り出し、ｐＢＩ１２１（クロンテック社）中にサブクローニングした。
【０３００】
ｉｖ．ＥＧＦＰのサブクローニング
ＥＧＦＰ断片をｐＥＧＦＰからＸｍａＩ／ＮｏｔＩ断片として取り出し、ＫＳ中にサブクローニングした（この段階は ＥＧＦＰの末端にＳｓｔＩ部位を得る目的で行った）。ＥＧＦＰ断片をＫＳからＸｍａＩ／ＳｓｔＩ断片として取り出し、ｐＵＣシグナル配列プラスミド中にシグナル配列の後ろにサブクローニングした。シグナル配列−ＥＧＦＰ断片をｐＵＣ１８プラスミドからＢａｍＨＩ／ＳｓｔＩ断片として取り出し、ｐＢＩ１２１中にサブクローニングした。
【０３０１】
Ｂ．（ＳＰＰ）２４、（ＳＰＰＰ）１６、（ＳＰＰＰＰ）１８パリンドローム反復配列の合成およびサブクローニング
ｉ．アニーリング反応
オリゴヌクレオチド対を以下の通りにエッペンドルフチューブ内に混ぜ合わせた：
ａ）２μｌ 内部反復配列センスオリゴヌクレオチド（０．２５ｎｍｏｌ／μｌ）
２μｌ 内部反復配列アンチセンスオリゴヌクレオチド（０．２５ｎｍｏｌ／μｌ）
３μｌ Ｔ４リガーゼ１０倍連結緩衝液
２３μｌ 水
ｂ）１μｌ ５’末端センスリンカー（０．５ｎｍｏｌ／μｌ）
１μｌ ５’末端アンチセンスリンカー（０．５ｎｍｏｌ／μｌ）
４μｌ Ｔ４リガーゼ１０倍連結緩衝液
３４μｌ 水
ｃ）２μｌ ３’末端センスリンカー（０．２５ｎｍｏｌ／μｌ）
２μｌ ３’末端アンチセンスリンカー（０．２５ｎｍｏｌ／μｌ）
３μｌ Ｔ４リガーゼ１０倍連結緩衝液
２３μｌ 水
すべてのチューブを９０℃〜９５℃で５分間加熱した。次にそれらを３０分かけてアニーリング温度（）まで冷却し、その温度にさらに１時間保った。
【０３０２】
ｉｉ．オリゴヌクレオチドの重合
２５μｌの内部反復配列の対を２０μｌの５’末端リンカー対と混ぜ合わせた（１．５：１モル比）。内部反復配列の対によって生じた環状構造を破壊するために混合物を３５℃に加熱した。２０℃に冷却した後に０．５μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（１．５Ｕ）を添加した。連結反応液を２０℃で３時間インキュベートした。３μｌの連結混合物を用いて重合の程度を２％アガロースゲルで確認した。
【０３０３】
５’末端リンカー−内部反復配列重合体に、３’末端リンカーによりキャップを形成した。１５μｌの３’末端リンカーを、上記の段階による４０μｌの連結反応液および０．５μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（１．５Ｕ）に添加した。連結反応液を２０℃で３時間インキュベートした。６５℃で１０分間加熱することによって反応を停止させた。３μｌの連結混合物を用いて重合の程度を２％アガロースゲルで確認した。セファクリルＳ−２００カラム（ファルマシア社 Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ（商標））を用いて塩を除去した。４μｌ〜６μｌの溶液をＥｃｏＲＩ（１０単位）およびＢａｍＨＩ（２０単位）による制限処理に用いた。制限処理の後に、１５０ｂｐ〜５００ｂｐの断片を２％アガロースゲルから切り出した。ＱＩＡＥＸ ＩＩゲル抽出キットを用いてゲルから断片を単離した。
【０３０４】
この結果得られた断片をｐＵＣ１８プラスミド中に挿入した。クローンの選別は青／白アッセイ法によって行った。合成遺伝子の構造はｐＵＣ／Ｍ１３順方向（１７ｍｅｒ）プライマーを用いる配列決定によって確認した。
【０３０５】
ｉｉｉ．サブクローニング
合成遺伝子をｐＵＣ１８からＸｍａＩ／ＮｃｏＩ断片として取り出し、ｐＵＣ−シグナル配列ＥＧＦＰプラスミド中のシグナル配列の後方かつＥＧＦＰの前方にサブクローニングした。シグナル配列−合成遺伝子−ＥＧＦＰ断片をｐＵＣ１８プラスミドからＢａｍＨＩ／ＳｓｔＩ断片として取り出し、ｐＢＩ１２１中にサブクローニングした。
【０３０６】
以上のプロトコールにより、（ＳＰ）３２、（ＧＡＧＰ）３、ＥＧＦＰ、（ＳＰＰ）２４、（ＳＰＰＰ）１６、（ＳＰＰＰＰ）１８パリンドローム反復配列のそれぞれをコードする遺伝子がシグナル配列およびＥＧＦＰをコードする配列と連結されているｐＢＩ１２１発現構築物を得た。
【０３０７】
実施例２１
タバコ細胞の形質転換および形質転換細胞系の選択
本実施例では、実施例２０の発現ベクターによる懸濁培養タバコ細胞の形質転換、および緑色蛍光タンパク質を発現する形質転換体の選択について述べる。
【０３０８】
ｐＢＩ１２１由来の植物形質転換ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株により、懸濁培養したタバコ細胞（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ、ＢＹ２）の形質転換を行った。形質転換された細胞系の選別を、１００ｍｇ／ｍＬカナマイシンを含むムラシゲ−スクーグ固形培地（シグマ社 ＃ ５５２４）にて行った。最初はアグロバクテリウムを死滅させるために４００ｍｇ／ｍＬのチメンチンを含めた。その後、細胞を５００ｍＬのシェンク−ヒルデブラント培地（シグマ社 ＃ ６７６５）および１００ｍｇ／ｍＬカナマイシンを含む１Ｌフラスコ内に入れ、回転振盪器による１００ｒｐｍ振盪下で増殖させた。
【０３０９】
Ｓｉｇ−（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰ、Ｓｉｇ−（Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）３２−ＥＧＦＰまたはＳｉｇ−ＥＧＦＰ（実施例２０に記載）のいずれかを備えた、植物形質転換プラスミドｐＢＩ１２１を保有するアグロバクテリウムによるタバコ細胞の形質転換を行った後に、固形培地上での選別および液体培養での増殖を行うことにより、緑色蛍光を発する培養液中にある細胞が得られた。これらの培養細胞は液胞が多くを占め、光顕切片による判断では蛍光は核の周囲にみられ、その内部には認められなかった（図示していない）。顕微鏡はモレキュラーダイナミクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）社のサラストロ（Ｓａｒａｓｔｒｏ）２０００共焦点レーザー操作顕微鏡であり、４８８ｎｍレーザー波長フィルタ、５１０ｎｍ一次ビームスプリッタおよび５１０ｎｍバリアフィルタを装着して用いた。
【０３１０】
本実施例は、ＥＧＦＰレポータータンパク質を含めることにより、形質転換細胞の選別、およびその後の単離時の発現産物の検出が容易になることを示す（図１３および１４）。増殖培地におけるＥＧＦＰ蛍光は、Ｓｉｇに分泌を導く効果があることを視覚的に示したものでもある。培養物に明らかな細胞溶解がみられず、グリコシル化発現産物の産物収量が優れていることから、緑色蛍光が真の分泌産物であることが確認された。興味深いことに、糖モジュールを含まないＥＧＦＰの分泌レベルは極めて低かったが、これは溶解性が低いためと考えられる。
【０３１１】
実施例２２
形質転換細胞からの（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）３２−ＥＧＦＰ、（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰ、（ＳＰＰ）２４−ＥＧＦＰ、（ＳＰＰＰ）１６−ＥＧＦＰおよび（ＳＰＰＰＰ）１８−ＥＧＦＰの単離
本実施例では、連続的および非連続的なＨｙｐ残基を含む配列を、これらのポリペプチドを発現する発現ベクターによる形質転換を行ったタバコ細胞の増殖培地から単離することについて述べる。
【０３１２】
以下のように、上記の実施例２１に述べた細胞の培養液を継代培養から７日〜２１日後に回収し、ゲル浸透クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー（図１３および１４）によって遺伝子産物を精製した。培養液をロータリー蒸発装置によって１０倍に濃縮した後に、２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ７で平衡化したスーパーロース−１２ゲル濾過カラム（ファルマシア社）に注ぎ、流速１ｍＬ／分で溶出させた。ＥＧＦＰ蛍光をヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）１１００シリーズ流通型蛍光光度計でモニターした（励起＝４８８ｎｍ；発光＝５２０ｎｍ）。スーパーロース−１２カラムは分子量標準物質（ＢＳＡ、インスリン、カタラーゼおよびアジ化ナトリウム）によって較正した。蛍光スーパーロース−１２画分をハミルトンＰＲＰ−１逆相カラムに直接注ぎ入れ、流速０．５ｍＬ／分で勾配溶出を行った。開始緩衝液は０．１％ＴＦＡ（水性）からなり、溶出緩衝液は０．１％ＴＦＡ／８０％アセトニトリル（水性）とした。試料を３５分間かけてカラムに繰り返し注ぎ（０．５ｍＬ／分）、その後に溶出緩衝液の勾配（０〜７０％／１３５分間）によって溶出させた。天然のＧＡＧＰはチー（Ｑｉ）らによる記載の通りにアラビアゴムの塊から単離した。内因性タバコＡＧＰはＰＲＰ−１逆相カラムによって単離したが、その結果は図１３に示されている。図１３は（Ａ）（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）３２−ＥＧＦＰ、（Ｂ）（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰおよび（Ｃ）非形質転換タバコ細胞の培養液中の糖タンパク質を含む、スーパーロース−１２ピークのＰＲＰ−１逆相分画を示す。内因性タバコＡＧＰは４７分〜６３分の間に溶出し、エクステンシンは約６７分に溶出した。（Ｃ）非形質転換タバコ細胞から採取した対照培養液をまずスーパーロース−１２で分画し、４７分〜６３分の間に溶出した画分を回収した上で、内因性ＡＧＰ／ＨＲＧＰが（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）３２−ＥＧＦＰまたは（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰとともにクロマトグラフィーで分離されたか否かを明らかにするためにＰＲＰ−１でさらに分離した。
【０３１３】
検討した６種の細胞系［（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）３２−ＥＧＦＰおよび（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰに対してそれぞれ３つ］は同等のサイズの蛍光性糖タンパク質を合成したが、産物の収量には細胞系によって１０倍もの差があった。産物の特徴づけを行うために、単離後に２３ｍｇ／Ｌの（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）３２−ＥＧＦＰおよび８ｍｇ／Ｌの（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰが一般に産生された、高収量の細胞系を選択した。
【０３１４】
図１２は、（Ａ）（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）３２−ＥＧＦＰを含む培養液、（Ｂ）４倍に濃縮した（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰ培養液、（Ｃ）細胞外マトリックスを標的とするＥＧＦＰ培養液（１０倍に濃縮）、および（Ｄ）クロンテック社の１０ｍｇの標準ＥＧＦＰの蛍光検出を用いた、スーパーロース−１２ゲル浸透クロマトグラフィーを示す。上記の結果に一致して蛍光ピークが認められなかった非形質転換タバコ細胞の培養液の分画については示していない。２つの融合糖タンパク質のスーパーロース−１２分画（図１２）と分子量標準物質（図示していない）との比較により、分子量の範囲が（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）３２−ＥＧＦＰは約９５〜１１５ｋＤ、（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰは約７０ｋＤ〜１００ｋＤであることが示された。以上のデータは、これらの配列を発現しうるベクターによって形質転換された細胞からのＧＡＧＰ配列の単離が、成功したことを示す。
【０３１５】
本実施例における（ＳＰ）３２−ＥＧＦＰおよび（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰに関する前記の形質転換細胞から、組換え（ＳＰＰ）２４−ＥＧＦＰ、（ＳＰＰＰ）１６−ＥＧＦＰおよび（ＳＰＰＰＰ）１８−ＥＧＦＰが単離された。
【０３１６】
実施例２３
形質転換細胞から単離した糖タンパク質の特徴づけ
実施例２２に記載の形質転換タバコ細胞から単離した糖タンパク質の特徴づけを以下のように行った結果、新たなアラビノガラクタンタンパク質（ＡＧＰ）であることが示された。
【０３１７】
１．ヤリーブ（Ｙａｒｉｖ）試薬との共沈殿
（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）３２−ＥＧＦＰ、（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰ、タバコＡＧＰおよび天然ＧＡＧＰは、以前に記載されたヤリーブ試薬と共沈殿した。（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）３２−ＥＧＦＰおよび（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰはいずれもヤリーブ試薬と共沈殿したが（表１０）、これはｂ−１，３結合アラビノガラクタンタンパク質に固有の特徴である。
【０３１８】
【表１０】
2004516003.tif 000056
【０３１９】
２．ヒドロキシプロリングリコシドプロフィール
Ｈｙｐ−グリコシドプロフィールをランポート（Ｌａｍｐｏｒｔ）およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）の記載の通りに決定した。５．８ｍｇ〜１２．２ｍｇの（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）３２−ＥＧＦＰまたは（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰを０．４４Ｎ ＮａＯＨ中で加水分解し、加水分解産物を０．３Ｍ ＨＣｌで中和した後にＣ２陽イオン交換カラムに注いだ。（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）３２−ＥＧＦＰにおける各Ｈｙｐ残基は、アラビノガラクタン−ポリサッカライド置換基を含んでいた；（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰのＨｙｐ残基はアラビノガラクタン−ポリサッカライドに加えて、アラビノオリゴサッカライド置換基も含んでいた（表１１）。
【０３２０】
【表１１】
2004516003.tif 000057
【０３２１】
（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）３２−ＥＧＦＰのＨｙｐ−グリコシドプロフィールからは、Ｈｙｐ−ポリサッカライドに対応するＨｙｐの単一のピークが得られた。意義深いことに、Ｈｙｐ−アラビノシドおよび非グリコシル化Ｈｙｐに対応するピークはなかった。重要なことに、このことは糖モジュール内のすべてのＨｙｐ残基がポリサッカライドと結合していたことを示す。
【０３２２】
これに対して、（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰからはＨｙｐ−アラビノシド、非グリコシル化ＨｙｐおよびＨｙｐ−ポリサッカライドに対応する複数のピークが得られた。しかし、（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰ（図１１および１５）は、天然のＧＡＧＰのコンセンサス配列よりも連続的なＨｙｐ残基が少ないように設計したものであり、その結果、連続的なＨｙｐアラビノシル化部位の少なさに一致してＨｙｐアラビノシドも少なくなっている［ＫｉｅｌｉｓｚｅｗｓｋｉおよびＬａｍｐｏｒｔ（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｊ． ５、１５７〜１７２；Ｋｉｅｌｉｓｚｅｗｓｋｉら（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９８、９１９〜９２６．；Ｋｉｅｌｉｓｚｅｗｓｋｉら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７０、２５４１〜２５４９］。さらに、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏモチーフの中央のプロリン残基のヒドロキシル化は時に不完全で（図１４Ｂ）で、連続的なＨｙｐ（アラビノシル化部位と推定される）が非連続的なＨｙｐ（ポリサッカライド付加部位）に変化している。細胞外マトリックスを標的とする対照ＥＧＦＰはＨｙｐを含まず、このため、手作業によるＨｙｐアッセイによる判断ではグリコシル化Ｈｙｐは存在しなかった。
【０３２３】
以下には、遺伝子および発現されたタンパク質の配列、さらには表４に記したＳＰＰおよびＳＰＰＰモジュールならびにＳＰＰＰＰモジュールを用いて得たＨｙｐ−グリコシド糖タンパク質プロフィールについて述べる。
【０３２４】
Ａ．Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ遺伝子
表４の２．ａ項に記した［ＳＰＰ］ｎモジュールを、以下の配列を用いて発現させた：
2004516003.tif 000058
【０３２５】
Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ遺伝子はタンパク質配列［Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｓｅｒ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐ−Ｓｅｒ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐ−Ｓｅｒ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐ−Ｓｅｒ］６（配列番号：２３１）を発現し、そのＨｙｐ−グリコシドプロフィールは以下の通りであった：Ｈｙｐ（全Ｈｙｐの５１％）、Ｈｙｐ−Ａｒａ（全Ｈｙｐの０％）、Ｈｙｐ−Ａｒａ２（全Ｈｙｐの０％）、Ｈｙｐ−Ａｒａ３（全Ｈｙｐの４９％）、Ｈｙｐ−Ａｒａ４（全Ｈｙｐの０％）、Ｈｙｐ−ポリサッカライド（全Ｈｙｐの０％）。
【０３２６】
Ｂ．Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ遺伝子
表４のｂ項に記した［ＳＰＰＰ］ｎモジュールを、以下の配列を用いて発現させた：
2004516003.tif 000059
【０３２７】
発現されたタンパク質配列のＨｙｐ−グリコシドプロフィールは以下の通りであった：Ｈｙｐ（全Ｈｙｐの０％）、Ｈｙｐ−Ａｒａ（全Ｈｙｐの０％）、Ｈｙｐ−Ａｒａ２（全Ｈｙｐの２１％）、Ｈｙｐ−Ａｒａ３（全Ｈｙｐの３９％）、Ｈｙｐ−Ａｒａ４（全Ｈｙｐの３％）、Ｈｙｐ−ポリサッカライド（全Ｈｙｐの３７％）。
【０３２８】
Ｃ．Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ遺伝子
［ＳＰＰＰＰ］ｎモジュールは以下の配列を用いて発現させた：
2004516003.tif 000060
【０３２９】
発現されたタンパク質配列のＨｙｐ−グリコシドプロフィールは以下の通りであった：Ｈｙｐ（全Ｈｙｐの７％）、Ｈｙｐ−Ａｒａ（全Ｈｙｐの２％）、Ｈｙｐ−Ａｒａ２（全Ｈｙｐの８％）、Ｈｙｐ−Ａｒａ３（全Ｈｙｐの５２％）、Ｈｙｐ−Ａｒａ４（全Ｈｙｐの３１％）、Ｈｙｐ−ポリサッカライド（全Ｈｙｐの０％）。
【０３３０】
３．単糖分析およびグリコシル結合分析
単糖組成の決定および結合分析は、以前の記載の通り、ジョージア大学複合糖質研究センター（Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｏｒｇｉａ）で行った。その結果を表１２に示す。
【０３３１】
【表１２】
2004516003.tif 000061
ａ 少量のグルコース混入に関して値を補正した。
【０３３２】
いずれの融合タンパク質においてもＧａｌおよびＡｒａが糖質の多くを占め、ＲｈａおよびＧｌｃＵＡは少量であった（表１２）；糖質は（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）３２−ＥＧＦＰの５８％（乾燥重量）、（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰの４８％（乾燥重量）を占めた。メチル化分析により、３−および３，６−結合型のガラクトース種が（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）３２−ＥＧＦＰにおける糖の５０モル％、（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰにおける糖の４６モル％を占めた；２−結合アラビノフラノース（Ａｒａ（ｆ））ははそれぞれ１．６および３．１モル％であった；末端型Ａｒａ（ｆ）はそれぞれ２０および２１モル％であった；４−アラビノピラノースまたは５−Ａｒａ（ｆ）はそれぞれ６および８％であった；ラムノースはすべて末端型であった；ＧｌｃＵＡはすべて４−結合型であった。
【０３３３】
表１２の糖分析データは、２つの融合糖タンパク質がいずれも、ガラクトースアラビノースのモル比が約２：１であり、グルクロン酸およびラムノースがそれよりも少量であるというＡＧＰに典型的な糖組成を有していたことを示す。メチル化分析によって３−および３，６−結合ガラクトースならびに末端アラビノフラノースが主であったことは、アラビノース、グルクロン酸およびラムノースの側鎖を有する（−１，３−結合ガラクタン骨格に一致する［Ｎｏｔｈｎａｇｅｌ、Ｅ．Ａ．（１９９７）Ｊｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ． １７４、１９５〜２９１］。（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）３２−ＥＧＦＰにおける１，２−結合アラビノースが極めて少量であったことはＨｙｐアラビノシドが存在しないことと一致し、（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰにおける１，２−結合アラビノースの存在は、ＨｙｐグリコシドプロフィールにＨｙｐアラビノシドが存在し、その多くが１，２−結合型であることが公知であることと一致する［Ｓｔｉｃｈｅｒら（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０１、１２３９〜１２４７；Ａｋｉｙａｍａら（１９８０）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ４４、２４８７〜２４８９］。このように（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰは、それぞれがアラビノシル化部位およびポリサッカライド付加部位と推定される連続的および非連続的なＨｙｐを有するポリペプチドの存在に一致する、両方のタイプのＨｙｐグリコシル化を含んでいた。。
【０３３４】
結合したポリサッカライドのサイズに関しては、Ｈｙｐグリコシドプロフィールにより、各融合糖タンパク質におけるＨｙｐ−ポリサッカライドのモル比が示されている（表１１）。これはそれぞれの糖タンパク質分子における（ポリサッカライド）−Ｈｙｐ残基の数を示す（例えば、Ｈｙｐ−ポリサッカライドは（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）３２におけるＨｙｐグリコシドの１００％を占め、３１個〜３２個のＨｙｐ−ポリサッカライドがある）。脱グリコシル化前後の糖タンパク質のサイズから、結合したポリサッカライドの大まかなサイズが示される。脱グリコシル化の前および後の融合タンパク質のサイズは、（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）３２−ＥＧＦＰに関してはそれぞれ約９５ｋＤａ〜１１５ｋＤａおよび３４ｋＤａ（糖質は約７１ｋＤａ）、（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰに関してはそれぞれ約７０ｋＤａ〜１００ｋＤａおよび３４ｋＤａ（糖質は約５１ｋＤａ）であった。遺伝子配列（図示せず）および図１４から判断して、（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）３２−ＥＧＦＰはすべてが非連続的な約３１個〜３２個のＨｙｐ残基を含み、ポリサッカライドの平均サイズは７１ｋＤａ／３１＝２．２ｋＤａ〜２．３ｋＤａであったが、これは１４個〜１５個の糖残基に対応し（表１２の糖組成から算出した糖残基の平均分子重量は１５５である）、表１２の組成データに基づく実験式Ｇａｌ６ Ａｒａ３ ＧｌｃＡ２ Ｒｈａとも一致する。同様に（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰは２３個〜２５個のＨｙｐ残基を含み、このうち６２％（表１１）すなわち約１５個にポリサッカライドが結合している。ポリサッカライドは約５１ｋＤａ／１５＝３．４ｋＤａで約２２個の糖残基に対応するが、これはＨｙｐアラビノオリゴサッカライドからのアラビノースを含むことを考えれば幾分過剰な評価である。
【０３３５】
これらの融合糖タンパク質の天然ＧＡＧＰとの類似性（表１２）により、ラムノース、アラビノースおよびグルクロン酸を含む小さな側鎖を有するガラクタンコアのＨｙｐ−ポリサッカライドのモデルが、一般的なアラビノガラクタン構造に基づいて推定される［Ａｋｉｙａｍａら（１９８０）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ４４、２４８７〜２４８９；ＡｓｐｉｎａｌｌおよびＫｎｅｂｉ（１９８６）Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ． １５７、２５７〜２６０；ＤｅｆａｙｅおよびＷｏｎｇ（１９８６）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ． １５０、２２１〜２３１］。上記の実験式によって表される約１２残基の小さなモチーフの反復付加により、より大きなアラビノガラクタンポリサッカライドを構築することも可能と考えられる［Ｃｌａｒｋｅら（１９７９）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ． １８、５２１〜５４０；Ｂａｃｉｃら（１９８７）Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ． １６２、８５〜９３］。
【０３３６】
４．分泌されたＥＧＦＰのヒドロキシプロリンアッセイ
Ｓｉｇ−ＥＧＦＰ遺伝子の産物である分泌されたＥＧＦＰをスーパーロース−１２分画によって単離した。プロナーゼ消化（１％炭酸アンモニウム、５ｍＭ ＣａＣｌ２；２７℃、１：１００の酵素：基質比）を一晩行うことによって融合糖タンパク質からＥＧＦＰを分離させ、続いて上記の通りにゲル浸透クロマトグラフィーによってＥＧＦＰを単離した。透析および凍結乾燥の後に、０．５ｍｇのＥＧＦＰを以前の記載の通りにＨｙｐに関してアッセイした。分泌されたＥＧＦＰ、プロナーゼにより融合糖タンパク質から分離したＥＧＦＰのいずれにもＨｙｐは存在しなかった。
【０３３７】
５．無水フッ化水素（ＨＦ）による脱グリコシル化
それぞれ４．５ｍｇの（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）３２−ＥＧＦＰおよび（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰを、１０％無水メタノールを含む０℃の無水ＨＦ中に１時間置いた後に、反応をｄｄＨ２Ｏ中で停止させることによって脱グリコシル化した。各４．５ｍｇの融合糖タンパク質を脱グリコシル化した後、１ｍｇの脱グリコシル化（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）３２−ＥＧＦＰ（すなわち、重量回収率は約２３％）および２．２ｍｇの脱グリコシル化（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰ（すなわち、回収率は約５０％）が回収された。
【０３３８】
６．タンパク質配列およびＤＮＡ配列の解析
タンパク質配列の解析は、ミシガン州立大学の高分子施設で、アプライドバイオシステムズ社の４７７Ａ気相シークエンサーを用いて行った。ＤＮＡ配列決定は、ゲルフ大学、オンタリオ、カナダのゲルフ分子スーパーセンター（Ｇｕｅｌｐｈ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｕｐｒｅｃｅｎｔｒｅ）で行った。エドマン分解によって遺伝子配列を確認し、どのＰｒｏ残基がＨｙｐにヒドロキシル化されたかを同定した。特に、（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）３２−ＥＧＦＰおよび（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰの両方のＮ末端配列決定（図１４）によって合成遺伝子配列を確認し、ヒドロキシプロリン残基を同定した。プロリンの不完全なヒドロキシル化がいたるところに観察されたが［ｄｅ Ｂｌａｎｋら（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２２、１１６７〜１１７１］、このことはプロリルヒドロキシラーゼの信頼性が１００％に満たないことを単に示すものと思われる。
【０３３９】
以上のデータは、反復性Ｓｅｒ−Ｈｙｐモチーフが（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）３２−ＥＧＦＰ内のＨｙｐへのアラビノガラクタンポリサッカライドの限定的な付加を導き、一方、Ｈｙｐアラビノシル化は（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰ内の連続的なＨｙｐモチーフの存在と相関していることを示す。このため、植物のＯ−Ｈｙｐグリコシルトランスフェラーゼは、その多様性ならびに一次配列および部位クラスター化に基づく識別能力の点で、動物のＯ−ＳｅｒおよびＯ−Ｔｈｒグリコシルトランスフェラーゼと類似しているように思われる［Ｂａｃｉｃら（１９８７）前記；Ｇｅｒｋｅｎら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７２、９７０９〜９７１９］。
【０３４０】
実施例２４
ＧＡＧＰの乳化活性および乳化安定化活性のアッセイ法
本実施例では、上記の形質転換タバコ細胞培養物（実施例２３）の培養液中に発現された、組換え（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰの乳化活性（ＥＡ）および乳化安定化活性（ＥＳ）を分析する。これらの活性を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、アカシア・セネガル（Ａｃａｃｉａ ｓｅｎｅｇａｌ）から単離した粗アラビアゴム糖タンパク質（粗ＧＡＧＰ）、透析したアラビアゴム糖タンパク質、および少なくとも４種の異なるアラビノガラクタンタンパク質の混合物を含むタバコアラビノガラクタンタンパク質（ＡＧＰ）のものと比較した。さらに本実施例では、スーパーロース−６および逆相カラムで分画した（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰタンパク質画分（実施例２３）の乳化活性および乳化安定化活性、さらには乳化活性および乳化安定化活性に対する（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰのサイズおよびグリコシル化の影響についても述べる。以下の表１４〜１７中の用いたＧＡＧＰ乳濁液はすべて、０．５％（ｗ／ｖ）の濃度で調製した。
【０３４１】
乳化活性および乳化安定化活性は、オレンジ油（シグマ社）を本質的には製造者の指示に従って用いて評価した。凍結乾燥した糖タンパク質を０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ ６．５）中に０．５％（ｍ／ｖ）の濃度で溶解した。この水溶液をオレンジ油と６０：４０（ｖ／ｖ）の比で混ぜ合わせた。マイクロチッププローブを装着したソニックディスメンブレーター（Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ）（フィッシャー・サイエンティフィック）を用いて、０℃でガラス管内に１ｍｌの乳濁液を調製した。増幅値は４に設定し、混合時間は１分間に設定した。
【０３４２】
乳化能力（ＥＡ）を測定するために、０．１Ｍ ＮａＣｌおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液で乳濁液を連続希釈し、最終希釈倍率を１／１５００とした。続いて、希釈した乳濁液を光路長１ｃｍのキュベットに入れて５０ｎｍで光学濃度を測定し、これを乳化活性（ＥＡ）として定義した。ＢＳＡを陽性対照として用いた。ＢＳＡ対照の乳化活性の少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７５％の乳化活性を示した被験試料を、「乳化活性を有することを特徴とする」という。
【０３４３】
乳化安定性に関しては、乳濁液を入れたガラス管を立てて室温で３時間置いた後、保存試料の下方の相を１：１５００に希釈して光学濃度を測定した。乳化安定性（ＥＳ）は２時間置いた後に保たれている光学濃度の比率として定義した。ＢＳＡを陽性対照として用いた。ＢＳＡ対照の乳化安定化活性の少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７５％の乳化安定化活性を示した被験試料を、「乳化安定化活性」を有することを特徴とする」という。
【０３４４】
（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰが乳化活性および／または乳化安定化活性を有するか否かを明らかにするために、本糖タンパク質を上記の通りにアッセイし、その活性をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、粗アラビアゴム、透析したアラビアゴムおよびタバコＡＧＰのものと比較した。その結果を表１３に示したが、これは天然アラビアゴムの乳化特性をＢＳＡ、合成ＧＡＧＰ３−ＥＧＦＰおよび天然タバコＡＧＰと比較して示す。
【０３４５】
【表１３】
2004516003.tif 000062
ａ 括弧内の値は濃度（重量％）である。
ｂ 合成ＧＡＧＰ（すなわち、ＧＡＧＰ３−ＥＧＦＰ）は組換えタバコ細胞培養物から単離した。融合したＧＦＰは乳化特性の測定前にプロナーゼ消化によって除去した。
【０３４６】
さらに、スーパーロース−６カラム分画によって得られた種々の（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰ画分のアッセイも行い、その結果を表１４に示したが、これは天然のＧＡＧＰを含む画分Ｆ−２が検討した全画分の中で最も高い乳化活性および乳化安定化活性を示したことを示す。これらの結果は、ＧＡＧＰがアラビアゴムの乳化成分であることを立証するものである。
【０３４７】
【表１４】
2004516003.tif 000063
【０３４８】
Ｆ−２画分を疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）でさらに分離した。Ｆ−２画分を４．２Ｍ ＮａＣｌ中に溶解し、ＨＩＣカラムに注いだ。４．２Ｍ ＮａＣｌから開始し、続いて３．０Ｍ ＮａＣｌ、２．０Ｍ ＮａＣｌ、１．０Ｍ ＮａＣｌおよび蒸留水により、カラムを溶出させた。この結果得られた画分を調べてその結果を表１５に示したが、これはＦ−２が乳化活性および乳化安定化活性を有することを特徴とするＧＡＧＰを含むことを示す。表１５は、Ｆ−２が疎水性の異なる４つの成分に分離され、２．０Ｍおよび１．０Ｍ ＮａＣｌによる加水分解産物が優れた乳化剤であることも示す。
【０３４９】
【表１５】
2004516003.tif 000064
【０３５０】
乳濁液活性および乳化安定化活性に対するＧＡＧＰのサイズの影響を明らかにするために、天然のＧＡＧＰを含むＦ−２画分を０．２Ｎ ＮａＯＨ中にて５０℃で０．５時間、１．０時間、２．０時間、４．０時間および８．０時間にわたってインキュベートし、各試料の乳化特性を表１６に示した通りに決定した。
【０３５１】
【表１６】
2004516003.tif 000065
【０３５２】
表１６の結果は、ＧＡＧＰの乳化活性および乳化安定化活性がいずれもＧＡＧＰサイズの低下に伴って低下することを示す。
【０３５３】
ＧＡＧＰの糖質部分がその乳濁液活性および乳化安定化活性に影響するか否かを明らかにするために、Ｆ−２画分を上記の通りに無水フッ化水素（ＨＦ）によって部分的に脱グリコシル化し、脱グリコシル化された試料の乳化特性を調べた。脱グリコシル化されたＦ−２画分のＥＡは０．２６９であり、ＥＳは４６．５％であった。これらの結果はＦ−２画分中のＧＡＧＰがその乳化能のほとんどを失っていることを示し、このことはＧＡＧＰの糖質部分が乳化に重要であることを意味する。
【０３５４】
実施例２５
組換え（Ａｌａ−Ｐｒｏ）ｎ、（Ｔｈｒ−Ｐｒｏ）ｎおよび（Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ）ｎ配列におけるＨｙｐ−Ｏ−グリコシル化
以上のデータは、モジュールＳｅｒ−Ｈｙｐ４に由来する（Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）ｎ、（Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）ｎ、（Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）ｎ、（Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）ｎなどの反復性モジュールが首尾良く発現されたことを示す。本実施例では、（Ａｌａ−Ｐｒｏ）ｎ、（Ｔｈｒ−Ｐｒｏ）ｎおよび（Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ）ｎをコードする遺伝子を、それらのＨｙｐ−Ｏ−グリコシル化の特異性を検討するために構築した。さらに、これらの遺伝子に対応するタンパク質ならびにアラビアゴム糖タンパク質の高次構造もモニターした。
【０３５５】
１．合成遺伝子カセットの設計
反復性ポリペプチドの作製には頭−尾重合法を用いた。これは、互いに部分的に相補的で、そのために重合が可能となる付着末端が生じるようなオリゴヌクレオチドの３つの対を設計することを含む。
【０３５６】
このうち最も重要な対は、糖モジュールをコードするオリゴヌクレオチドである。Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ反復に関して、これらを以下の通りに設計した：
2004516003.tif 000066
【０３５７】
上記のオリゴヌクレオチドのアニーリング後に生じる２つの異なる付着末端により、これらのオリゴヌクレオチド単量体が互いにアニーリングして長い反復配列（（ＡＰ）５）ｎ多量体を生じることが可能となる。
【０３５８】
５’および３’−リンカーと命名した残る２つのオリゴヌクレオチド対は、ＡＰ重合体に隣接し、形質転換用の制限部位をもたらすように設計した：
2004516003.tif 000067
【０３５９】
Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ用に用いたオリゴヌクレオチドを以下に示す：
2004516003.tif 000068
【０３６０】
Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ構築物用のオリゴヌクレオチドは以下の通りである：
2004516003.tif 000069
【０３６１】
内部オリゴヌクレオチド単量体の重合は、線状および環状の多量体が形成され、このうち環状多量体には制限部位がなく、そのためにクローニングを行えないように設計した。環状化を防ぐため、またはできるだけ少なくするために、５’−リンカー（または３’−リンカー）の低モル比（リンカー１に対して内部反復配列オリゴヌクレオチドが１０の比率）での存在下において、「キャップ形成反応」と同時に重合反応を行った。その後、多量体のもう一方の端に３’−リンカー（または５’−リンカー）でキャップを形成した。
【０３６２】
続いてＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩという２つのエンドヌクレアーゼの存在下で制限消化反応を行った。小さな断片を除去するために、反応混合物をセファクリルゲルクロマトグラフィーによって分離した。処理した多量体をｐＵＣ１９プラスミド中にクローニングした。ＢａｍＨＩ制限部位とＥｃｏＲＩ制限部位との間のＤＮＡサイズを確認することにより、形質転換クローンのスクリーニングおよび選別を行った。より長い糖ペプチドを発現するように本発明者らが設計した比較的大きいサイズの遺伝子を有するクローンを選択し、配列決定を行った。
【０３６３】
２．形質転換ベクターの構築
以下の一連の形質転換実験に用いるために、ｐＵＣベクターおよびｐＢＩ１２１ベクターをまず改変した。ＸｍａＩ、ＮｃｏＩおよびＳａｃＩ用の制限部位をｐＵＣ１９に導入し、これらを元のｐＵＣ１９がすでに有しているＢａｍＨＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位に隣接するようにした。タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）エクステンシン遺伝子に由来するエクステンシンシグナル配列をＢａｍＨＩ部位およびＸｍａＩ部位と連結した。ＮｃｏＩ部位とＳａｃＩ部位との間の断片を、４８８ｎｍのＵＶ下で強い可視的な緑色蛍光を発しうる強力なレポーターである緑色蛍光タンパク質をコードするＥＧＦＰ遺伝子によって置換した。この特性により、以下のインビボおよびインビトロの両方の実験における融合タンパク質の位置決定、ならびに形質転換された植物細胞系の選別が容易になる。ＥＧＦＰのもう１つの重要な特徴は、それが融合タンパク質の糖ペプチドドメインのヒドロキシル化およびグリコシル化に影響を及ぼさないと考えられることである。
【０３６４】
タバコおよびトマトの双方におけるＡＰおよび他の構築物の発現を観測するために、トマトＡＧＰシグナル配列を、タバコのシグナル配列の代わりにＢａｍＨＩおよびＸｍａＩ部位中にクローニングした。トマトの主なＡＧＰであるＬｅＡＧＰのシグナル配列をＰＣＲによって増幅し、タバコエクステンシンシグナル配列との置換によって改変ｐＵＣプラスミド中に連結した。これらのシグナル配列は、融合タンパク質を、翻訳後修飾のためにＥＲおよびゴルジを通過させた上で最終的な位置に向かわせるために用いた。構築物の概略図を図１７に示す。
【０３６５】
プラスミドを大腸菌細胞の培養によって増幅した。ＢａｍＨＩとＳａｃＩとの間の遺伝子を切り出してｐＢＩ１２１（クロンテック社）中に連結した。このため、ＥＧＦＰは植物細胞の形質転換に通常用いられるβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）の代わりのマーカーとして作用する。
【０３６６】
３．植物細胞培養物の形質転換
改変ｐＢＩ１２１プラスミドを形質転換によってアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株に導入した。陽性コロニーをタバコ細胞およびトマト細胞の感染に用いた。現在まで、タバコ細胞は首尾良く形質転換されている。形質転換細胞を、カナマイシン耐性遺伝子を有するｐＢＩ１２１プラスミドによって付与されるカナマイシン耐性（１００（培地１ｍｌ当たりのグラム数））によって選別した。植物形質転換の成功は、ＦＩＴＣフィルターセットを装着した蛍光顕微鏡を用いてＥＧＦＰ発現を検出することによって確認される。
【０３６７】
４．糖モジュールの精製および特徴づけ
シグナル配列によって融合タンパク質に植物細胞の外側を標的とさせたため、融合タンパク質は懸濁培養細胞の培養液から入手しうると思われる。融合タンパク質は天然のＨＲＧＰよりもはるかに小さいため、これは他のＨＲＧＰから分離しうると思われる：すなわち、ＧＦＰは２７ｋＤａに過ぎず、組換え糖ペプチドはさらに小さい。単離は、疎水性に基づくフェニルセファロースカラム（ファルマシア社）での疎水性相互作用クロマトグラフィーによって行った。緑色画分を、ＥＧＦＰによってもたらされる疎水性の増加に基づくＰＲＰ−１カラムでの逆相クロマトグラフィーによってさらに精製した。さらに、ＥＧＦＰの蛍光特性によって、融合タンパク質を含む画分の決定が容易になった。
【０３６８】
糖タンパク質モジュールの構造を決定するために、アミノ酸組成、ヒドロキシプロリン−グリコシドプロフィール、糖の数および結合、ならびに二次構造および三次構造を、ＣＤおよびＮＭＲによって分析した。
【０３６９】
単離した融合タンパク質の糖部分をＨＦを用いて除去した後に、ペプチド骨格をエドマン分解にかける。２Ｎ ＴＦＡ加水分解産物の酢酸誘導体化の後にガスクロマトグラフィーを用いて糖組成を決定する。穏和なアルカリ加水分解およびイオン交換分離により、グリコシル化ヒドロキシプロリン残基の種類、および結合した各々のアラビノオリゴサッカライドまたはポリサッカライドのサイズを調べることができる。メチル化分析およびＮＭＲにより、糖アノマーの高次構造に関する情報が得られると考えられる。
【０３７０】
５．糖モジュールの機能の分析
Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏおよび他のモジュールの発現産物の構造は、Ｈｙｐ隣接仮説に対する重要な検証になると考えられる。その結果は、Ｈｙｐに隣接するアミノ酸が糖置換基の性質に影響を及ぼすか否かを解明するために用いうると思われる。また、植物の表現型に対するこれらのモジュールの影響を観測することも考えられる。
【０３７１】
６．トマト形質転換用のベクターの構築
トマトＬｅＡＧＰシグナル配列のＰＣＲ増幅を、ｃＤＮＡ ＬｅＡＧＰ−１ ｃ、ならびにそれぞれＢａｍＨＩ制限部位およびＸｍａＩ制限部位を含む２つのプライマー（センスプライマー（配列番号：２３７）：
2004516003.tif 000070
アンチセンスプライマー（配列番号：２３８）：
2004516003.tif 000071
）を用いて行った。この配列を、タバコエクステンシンシグナル配列との置換によってｐＵＣ−ＳＳＴｏｂ−ＳＰ−ＥＧＦＰ中にクローニングした。配列決定により、シグナル配列は上記の２つの制限部位が隣接した９３ヌクレオチド長の領域であることが確認された。
【０３７２】
７．反復性モジュールの構築および形質転換
ＢａｍＨＩ制限部位とＥｃｏＲＩ制限部位との間に約３７０ｂｐ、６００ｂｐおよび３６０ｂｐのサイズを有する反復配列断片を用いて、ｐＵＣ−ＡＰ、ｐＵＣ−ＴＰおよびｐＵＣ−ＡＴＰプラスミドを首尾良く構築した。Ｍ１３順方向プライマーを用いたプラスミドの配列決定により、１０個のＡＰ内部単量体単位（１００アミノ酸残基をコードする）、２０個のＴＰ内部単量体単位（２００アミノ酸残基をコードする）および１０個のＡＴＰ内部単量体単位（１２０アミノ酸残基をコードする）が、ＸｍａＩ制限部位とＮｃｏＩ制限部位との間に並んでいることが示された。このため、これらのプラスミドをそれぞれｐＵＣ−（ＡＰ）５０、ｐＵＣ−（ＴＰ）１００およびｐＵＣ−（ＡＴＰ）４０と命名した。
【０３７３】
ＸｍａＩおよびＮｃｏＩ制限部位を用いることにより、これらのプラスミドをさらに、シグナル配列（トマト細胞およびタバコ細胞の両方）およびＥＧＦＰ遺伝子を含むベクター（図１７）に導入した。これらの形質転換プラスミドをｐＵＣ−ＳＳＴｏｍ−ＡＰ−ＥＧＦＰ、ｐＵＣ−ＳＳＴｏｍ−ＴＰ−ＥＧＦＰおよびｐＵＣ−ＳＳＴｏｍ−ＡＴＰ−ＥＧＦＰまたはｐＵＣ−ＳＳＴｏｂ−ＡＰ−ＥＧＦＰ、ｐＵＣ−ＳＳＴｏｂ−ＴＰ−ＥＧＦＰおよびｐＵＣ−ＳＳＴｏｂ−ＡＴＰ−ＥＧＦＰと命名した。自動配列決定により、リーディングフレームに変異がないことが確認された。それらの配列を図１８〜２０に示す。
【０３７４】
シグナル配列を含むプラスミドをそれぞれ、ＢａｍＨＩ部位およびＳａｃＩ部位に基づいてｐＢＩ１２１プラスミドに導入し、続いてアグロバクテリウムへの形質転換を行った。プラスミドのサイズをゲル上で確認した後、陽性クローンをタバコ細胞の感染に用いた。
【０３７５】
８．融合タンパク質の単離
形質転換タバコ細胞をＳＨ培地（１００ｍｌ）中に継代し、１０日間培養した。続いて細胞を、５００ｍｌのＳＨ培地を含むフラスコに移し、さらに約２０日間培養した。細胞を濾過することによって懸濁培養培地を回収し、ロータリー蒸発装置により２５（Ｃで１／１０の容積にした。濃縮した培地を１０５００ｒｐｍで遠心分離し、ｄｄＨ２Ｏに対して透析した。
【０３７６】
透析した培地を、２Ｍ ＮａＣｌ溶液で飽和させ、１Ｍ ＮａＣｌ溶液で洗浄したＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）カラムにかけた。純水によって緑色画分がカラムから溶出した。この精製したタンパク質を、０％ＣＨ３ＣＮ、０．１％ＴＦＡ中（水性）から８０％ＣＨ３ＣＮ、０．１％ＴＦＡ中（水性）までの勾配を用いるＰＲＰ−１カラムでのＨＰＬＣによってさらに分離した。融合タンパク質は約５０％のＣＨ３ＣＮで溶出した。対応する融合タンパク質を含む画分を凍結乾燥した。
【０３７７】
各構築物の２つの細胞系から融合タンパク質を単離した。融合タンパク質の回収量は、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ構築物に関しては３０ｍｇ／ｌ（培地）であり、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ構築物に関しては１０ｍｇ／ ｌ、Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ構築物に関しては２５ｍｇ／ｌであった。
【０３７８】
９．融合タンパク質の特徴づけ
Ａ． Ｈｙｐプロフィール：
本アッセイは、翻訳後修飾によって生じたｈｙｐのグリコシル化パターン、および全ｈｙｐに占めるそれらの比率を決定する目的で行った。約１００μｇのｈｙｐを含む十分量の融合タンパク質を、１０５（Ｃの０．４４Ｎ ＮａＯＨ中で１８時間かけて加水分解した（ｈｙｐのヒドロキシル基は（位にあり、（−脱離はこの塩基濃度では生じないため、ｈｙｐに結合した糖は加水分解されない）。続いて、加水分解産物を氷上で１Ｎ ＨＣｌによって中和した。この溶液を凍結乾燥し、１ｍｌのｄｄＨ２Ｏ中に再び溶解した後、ｈｙｐ−サッカライド鎖をサイズに従って分離しうるＣ−２陽イオン交換カラムにかけた。カラムを０〜０．７Ｎ ＨＣｌの勾配によって溶出させた。本発明者らは画分の溶出の順序をｈｙｐ−ポリサッカライド、ｈｙｐ−ａｒａ４、ｈｙｐ−ａｒａ３、ｈｙｐ−ａｒａ２、ｈｙｐ−ａｒａｌおよびｈｙｐと予想した。各構築物の２つの細胞系によって再現性が立証された。
【０３７９】
【表１７】
2004516003.tif 000072
【０３８０】
Ｈｙｐ隣接仮説に一致して、ＡＰは限定的にＨｙｐ−ポリサッカライドを含んでいた。しかし、ＴＰは主にＨｙｐポリサッカライドを含むが、Ｈｙｐ−アラビノシドおよびグリコシル化されていないものも含んでおり、このことはトレオニン側鎖がＨｙｐ−グリコシル化にある程度影響することを示す。
【０３８１】
Ｂ．糖組成分析：
これらのアッセイは、それぞれの融合タンパク質における糖の組成、さらにそれらの相対的な比を分析することを目的として行った。
【０３８２】
ｉ．中性糖のＧＣ分析：
融合タンパク質を１２１（Ｃの２Ｎ ＴＦＡ中で１時間かけて加水分解した。加水分解産物を送気によって乾燥させ、１２１（Ｃの無水酢酸中に１時間おいて酢酸化した。糖組成分析および定量した糖標準物質との比較による定量的検出のために、処理した試料１μｌをＧＣにかけた。
【０３８３】
ｉｉ．ウロン酸アッセイ：
本アッセイは、融合タンパク質における酸性糖の量を観測することが可能である。融合タンパク質を硫酸／四ホウ酸試薬、続いてヒドロキシジフェニル試薬によって処理した。グルクロン酸標準物質を用いて５２０ｎｍで定量した。
【０３８４】
【表１８】
2004516003.tif 000073
【０３８５】
Ｃ．タンパク質骨格の特徴づけ
ｉ．モジュールタンパク質の単離：
各構築物のタンパク質骨格をさらに確認する目的でアミノ酸組成をさらに分析するために、融合タンパク質をプロナーゼで処理してＥＧＦＰ尾部を切除した。
【０３８６】
２０ｍｇのＡＰ−ＥＧＦＰタンパク質を２％炭酸アンモニウム（５ｍＭ ＣａＣｌ２中、水性）中のプロナーゼＥによって消化した。ＴＰ−ＥＧＦＰ融合タンパク質に関しては、それぞれの２０ｍｇをプロナーゼの場合と同じ条件でトリプシン（大量または微量の非グリコシル化ｈｙｐを含む）によって消化した。消化後に、未消化のタンパク質を除去するために各試料をスーパーロース−１２カラムで精製した。モジュール画分をＰＲＰ−１カラムでのＨＰＬＣによって分離した。モジュールタンパク質は約１５％のＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＥＡ中、水性）によって溶出した。
【０３８７】
ｉｉ．アミノ酸組成分析：
ＡＰモジュールタンパク質はＡｌａおよびＨｙｐのみを１：１のモル比で含んでいた。ＴＰモジュールタンパク質はＴｈｒ（４７モル％）、Ｈｙｐ（３７モル％）およびＰｒｏ（１６モル％）を含んでいた。
【０３８８】
以上から、本発明が植物ゴムの生産に関する問題に対して、新たなアプローチおよび解決を提供することは明らかであると考えられる。本アプローチは環境要因に依存せず、種々の天然ゴム、ならびにデザイナーゴムの生産を非常に容易にする。
【図面の説明】
【図１】本発明の合成遺伝子の１つの態様の核酸配列（配列番号：１２）を示す。
【図２】発現ベクターの１つの態様における合成遺伝子の１つの態様を示す。
【図３】形質転換タバコ細胞からの発現タンパク質のサイズ分画を示したグラフである。
【図４】逆相クロマトグラフィーによるＧＡ−ＥＧＦＰの単離を示したグラフである。
【図５】ハミルトンＰＲＰ−１カラム上での逆相クロマトグラフィーおよび勾配溶出による分画による、ｄＧＡＧＰの溶出プロフィールである。
【図６】ｄＧＡＧＰのプロナーゼ不完全消化物の逆相クロマトグラフィーによる溶出プロフィールである。ｄＧＡＧＰの不完全消化物をハミルトンＰＲＰ−１逆相カラムで分画し、Ｐ１およびＰ３と命名した２つの主要な画分を得た。
【図７】ポリスルホエチルアスパルトアミド（Ｐｏｌｙｓｕｌｆｏｅｔｈｙｌ ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ）陽イオン交換カラムで分画した、ｄＧＡＧＰのキモトリプシン消化物の溶出プロフィールである。
【図８】ａ）Ｓ１およびｂ）Ｓ２の逆相カラムクロマトグラフィーによる、ｄＧＡＧＰキモトリプシン分解ペプチドの溶出プロフィールである。
【図９】典型的なコンセンサス配列を含む、代表的な糖ペプチドの提唱モデルである。
【図１０】セファデックスＧ−５０ゲル浸透クロマトグラフィーによる、ＧＡＧＰを主体とする加水分解産物の溶出プロフィールである。
【図１１】Ｓｅｔ−Ｐｒｏ内部反復性ポリペプチド（配列番号：１１４）、ＧＡＧＰ内部反復性ポリペプチド（配列番号：１１７）、５’−リンカー（配列番号：１２２）および３’−リンカー（配列番号：１２５）をコードする合成遺伝子の構築に用いた、オリゴヌクレオチド配列（配列番号：１１２、１１３、１１５、１１６、１１８〜１２１、１２３および１２４）の組を示す。
【図１２】（Ａ）（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）３２−ＥＧＦＰを含む培養液、（Ｂ）４倍に濃縮した（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰ培養液、（Ｃ）細胞外マトリックスを標的とするＥＧＦＰ培養液（１０倍に濃縮）および（Ｄ）クロンテック社の１０ｍｇの標準ＥＧＦＰの蛍光検出を用いた、スーパーロース−１２ゲル浸透クロマトグラフィーを示す。
【図１３】（Ａ）（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）３２−ＥＧＦＰ、（Ｂ）（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰおよび（Ｃ）非形質転換タバコ細胞の培養液中の糖タンパク質を含む、スーパーロース−１２ピークのＰＲＰ−１逆相分画を示す。
【図１４】脱グリコシル化の前および後の（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）３２−ＥＧＦＰおよび（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰのポリペプチド配列を示す。（Ａ）糖タンパク質、（Ｓｅｒ−Ｈｙｐ）３２−ＥＧＦＰのＮ末端アミノ酸配列を、糖タンパク質（上の配列）（配列番号：１２６）および脱グリコシル化後のポリペプチド（下の配列）（配列番号：１２７）の２つの部分配列とともに示した。Ｘはグリコシル化されたＨｙｐに対応するブランクサイクル（ｂｌａｎｋ ｃｙｃｌｅ）を表す；糖化アミノ酸はアラビノシルＨｙｐを除き、エドマン分解によってブランクサイクルを生じる傾向がある。（Ｂ）グリコシル化された（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰ（上の配列）（配列番号：１２８）および脱グリコシル化された（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰ（下の配列）（配列番号：１２９）のポリペプチド配列。星印（＊）を付した残基は、モル収量の少ないＨｙｐ、およびグリコシル化された（ＧＡＧＰ）３−ＥＧＦＰにおいて、アラビノガラクタンポリサッカライドの結合する可能性の高い部位を表す。例えば、収量は第１のサイクルでは４８０ｐＭ Ａｓｐであり、第２のサイクルでは３３１ｐＭ Ｓｅｒ、第３のサイクルでは１９４ｐＭ Ｈｙｐ、第４のサイクルでは５０８ｐＭ Ｓｅｒであった。
【図１５】ＧＡＧＰ配列の反復を作製するためのクローニング手法に関する図解である。
【図１６】（Ａ）２回のＧＡＧＰ反復があるヌクレオチド配列（配列番号：１３０）およびアミノ酸配列（配列番号：１３１）、ならびに（Ｂ）４回のＧＡＧＰ反復（配列番号：１３３）があるヌクレオチド配列（配列番号：１３２）およびアミノ酸配列（配列番号：１３３）の例を示す。
【図１７】プラスミドｐＵＣ−ＳＳ−ＡＰ／ＴＰ／ＡＴＰ−ＥＧＦＰの概略図である。
【図１８】Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ構築物のヌクレオチド配列（配列番号：２３９）およびコードされるアミノ酸配列（配列番号：２４０）を示す。
【図１９】Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ構築物のヌクレオチド配列（配列番号：２４１）およびコードされるアミノ酸配列（配列番号：２４２）を示す。
【図２０】Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ構築物のヌクレオチド配列（配列番号：２４３）およびコードされるアミノ酸配列（配列番号：２４４）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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