(57)【要約】【課題】本発明は、プロスタグランジン・エンドペルオキシドＨ２（ＰＧＨ２）を用いる又は生成する酵素の活性を測定するアッセイ、該アッセイを用いて、このような酵素の可能なモジュレーターをスクリーニングする方法、及び該アッセイを行なうためのキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＧＨ２を用いるが、マロンジアルデヒドを生成しない酵素の活性の測定方法であって、
（ａ）サンプルを、ＰＧＨ２をマロンジアルデヒドに実質的に転化させるために適した条件下で還元剤と接触させて、それによって反応済みサンプルを得る工程；
（ｂ）該反応済みサンプルを、マロンジアルデヒドを検出可能な化合物に実質的に転化させるために適した条件下でマロンジアルデヒド検出試薬と接触させる工程；及び
（ｃ）検出可能な化合物量を測定する工程
を含み、この場合、サンプル中の酵素活性が検出可能な化合物量に逆比例する方法。
【請求項２】
酵素がプロスタグランジン・シンターゼ及びプロスタサイクリン・シンターゼから成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
還元剤が塩化第１鉄である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
検出試薬が２−チオバルビツル酸（ＴＢＡ）又は２−チオバルビツル酸誘導体である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
検出可能な化合物が蛍光化合物である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ＰＧＨ２を生成するが、マロンジアルデヒドを生成しない酵素の活性の測定方法であって、
（ａ）サンプルを、ＰＧＨ２をマロンジアルデヒドに実質的に転化させるために適した条件下で還元剤と接触させて、それによって反応済みサンプルを得る工程；
（ｂ）該反応済みサンプルを、マロンジアルデヒドを検出可能な化合物に実質的に転化させるために適した条件下でマロンジアルデヒド検出試薬と接触させる工程；及び
（ｃ）検出可能な化合物量を測定する工程
を含み、この場合、サンプル中の酵素活性が検出可能な化合物量に比例する方法。
【請求項７】
前記酵素がＰＧＨ２シンターゼである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
還元剤が塩化第１鉄である、請求項６記載の方法。
【請求項９】
検出試薬が２−チオバルビツル酸（ＴＢＡ）又は２−チオバルビツル酸誘導体である、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
ＰＧＨ２を用いる若しくは生成するが、マロンジアルデヒドを生成しない酵素のモジュレーターの同定方法であって、
（ａ）酵素を含有するサンプルを試験化合物と接触させる工程；
（ｂ）該サンプルを、ＰＧＨ２をマロンジアルデヒドに転化させるために適した条件下で還元剤と接触させて、それによって反応済みサンプルを得る工程；
（ｃ）該反応済みサンプルを、マロンジアルデヒドを検出可能な化合物に転化させるために適した条件下でマロンジアルデヒド検出試薬と接触させる工程；及び
（ｄ）検出可能な化合物量を測定する工程
を含み、この場合、該検出可能な化合物量を用いて、試験化合物が酵素活性をモジュレートするか否かを決定する方法。
【請求項１１】
前記酵素を単離、精製又は部分的に精製する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該試験化合物が小分子である、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
サンプル中の検出可能な化合物量を複数の時点において測定して、一定時間にわたる検出可能な化合物量の変化が、試験化合物が酵素活性をモジュレートすることを実証する、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
試験化合物と接触したサンプル中の検出可能な化合物量を測定して、酵素を含有するが、該酵素が試験化合物と接触していない対照サンプル中で測定された検出可能な化合物量と比較する、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
ＰＧＨ２を用いる又は生成するが、生成物としてマロンジアルデヒドを生成しない酵素の活性を測定するためのキットであって、還元剤及びマロンジアルデヒド検出試薬を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、例えばプロスタグランジンＥシンターゼ（ＰＧＥＳ）のような、プロスタグランジン・エンドペルオキシドＨ２（ＰＧＨ２）を用いる又は生成する酵素の活性を測定する方法に関する。本発明はまた、ＰＧＨ２を用いる又は生成する酵素のモジュレーターを同定する及び試験する方法、並びに同方法を実施するためのキットをも提供する。
【０００２】
本発明の背景
プロスタグランジン類（ＰＧＨ２、ＰＧＥ２、ＰＧＤ２、ＰＧＦ２α、ＰＧＩ２及び他の関連化合物を包含する）は、脂肪酸の代謝に由来するオートクリン及びパラクリン・ホルモンの多様なグループを表す。これらは、細胞中にそれ自体では貯蔵されないが、アラキドン酸、細胞膜リン脂質の分解に由来する２０炭素脂肪酸からの要求に応じて生合成される自然発生エイコサノイドのファミリー（プロスタグランジン、トロンボキサン及びロイコトリエン）に属する。通常の状況下で、エイコサノイドは低レベルで生成して、細胞の種類の相違でかなり異なる可能性がある、多くの多様な細胞機能の重要な仲介体として役立つ。プロスタグランジンはまた、病態生理学においても重要な役割を果たす。特に、炎症は、少なくとも一部は、損傷した細胞におけるプロスタグランジンの過剰生成によって開始され、かつ維持される。炎症においてプロスタグランジンが果たす主要な役割は、多くの病的な炎症状態の治療に非常に効果的であるような、アスピリン様非ステロイド系抗炎症薬が全て、プロスタグランジン合成の阻害によって作用するという事実によって強調される。
【０００３】
プロスタグランジン・エンドペルオキシドＨ２（ＰＧＨ２）は、アラキドン酸からシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−１又は−２の作用によって形成される。ＣＯＸ−１は多くの細胞及び組織において構成的に発現されるが、ＣＯＸ−２タンパク質は炎症部位において例えばインターロイキン−１βのような炎症前サイトカインによって誘導されうる。シクロオキシゲナーゼの下流では、生成物ＰＧＨ２が多様な酵素によってさらに代謝されて、種々な生理的に重要なエイコサノイド、例えば、ＰＧＦ２α、ＰＧＥ２、ＰＧＤ２、ＰＧＩ２（プロスタサイクリン）及びトロンボキサン（ＴＸ）Ａ２（Smith,W.L.,Am.J.Physiol.,263,F181,1992）になる。プロスタグランジンＥシンターゼは、環状エンドペルオキシド基質から該基質の９−ケト，１１αヒドロキシ形への転化を触媒する酵素である。ＰＧＥＳは、例えば前駆体分子のＰＧＥ２及びその類似体、例えば合成類似体への転化を触媒する。例えば、ＰＧＥＳは、ＰＧＨ２の、ＰＧＥ２への転化を触媒する。
【０００４】
発明の概要
本発明は、一部では、ＰＧＨ２を用いる又は生成するが、マロンジアルデヒドを生成しない酵素の活性を測定するための方法を提供する。第１態様では、サンプル中で、ＰＧＨ２を用いる酵素の活性を測定する方法は：（ａ）サンプルを、ＰＧＨ２をマロンジアルデヒドに実質的に転化させるために適した条件下で還元剤と接触させて、それによって反応済みサンプル(reacted sample)を得る工程；（ｂ）該反応済みサンプルを、マロンジアルデヒドを検出可能な化合物に実質的に転化させるために適した条件下でマロンジアルデヒド検出試薬と接触させる工程；及び（ｃ）検出可能な化合物量を測定する工程を含むことができ、この場合、サンプル中の酵素活性が検出可能な化合物量に逆比例する。第１態様の１実施態様では、酵素はプロスタグランジン・シンターゼ及びプロスタサイクリン・シンターゼから成る群から選択することができ、このような１実施態様では、酵素はプロスタグランジン・シンターゼである。１実施態様では、プロスタグランジン・シンターゼはプロスタグランジンＥシンターゼ（ＰＧＥＳ）である。本発明の１実施態様では、還元剤は塩化第１鉄である。本発明の他の実施態様では、検出試薬は２−チオバルビツル酸（ＴＢＡ）又は２−チオバルビツル酸誘導体であることができる。本発明の１実施態様では、検出可能な化合物は蛍光化合物である。
【０００５】
第２態様では、サンプル中で、ＰＧＨ２を生成する酵素の活性の測定方法は：（ａ）サンプルを、ＰＧＨ２をマロンジアルデヒドに実質的に転化させるために適した条件下で還元剤と接触させて、それによって反応済みサンプルを得る工程；（ｂ）該反応済みサンプルを、マロンジアルデヒドを検出可能な化合物に実質的に転化させるために適した条件下でマロンジアルデヒド検出試薬と接触させる工程；及び（ｃ）検出可能な化合物量を測定する工程を含むことができ、この場合、サンプル中の酵素活性は検出可能な化合物量に比例する。このような１実施態様では、該酵素はＰＧＨ２シンターゼである。
【０００６】
本発明はまた、ＰＧＨ２を用いる若しくは生成するが、マロンジアルデヒドを生成しない酵素のモジュレーターを同定し、試験する方法を提供する。１態様では、プロスタグランジンを用いる又は生成する酵素のモジュレーターを同定し、試験する方法は：（ａ）酵素を含有するサンプルを試験化合物と接触させる工程；（ｂ）サンプルを、ＰＧＨ２をマロンジアルデヒドに転化させるために適した条件下で還元剤と接触させて、それによって反応済みサンプルを得る工程；（ｃ）該反応済みサンプルを、マロンジアルデヒドを検出可能な化合物に転化させるために適した条件下でマロンジアルデヒド検出試薬と接触させる工程；及び（ｄ）検出可能な化合物量を測定する工程を含むことができ、この方法では、該検出可能な化合物量を用いて、試験化合物が酵素活性をモジュレートするか否かを決定する。幾つかの実施態様では、サンプル中の検出可能な化合物量を複数の時点において測定する、この場合、一定時間にわたる検出可能な化合物量の変化が、試験化合物が酵素活性をモジュレートすることを実証する。他の実施態様では、試験化合物と接触したサンプル中の検出可能な化合物量を測定して、酵素を含有するが、該酵素が試験化合物と接触していないサンプル中で測定された検出可能な化合物量と比較する。幾つかの実施態様では、酵素を精製する又は単離することができる。１実施態様では、酵素を部分的に精製することができる。幾つかの実施態様では、試験化合物は小分子であることができる。
【０００７】
本発明はさらに、ＰＧＨ２を用いる又は生成するが、生成物としてマロンジアルデヒドを生成しない酵素の活性を測定するためのキットであって、還元剤及び／又はマロンジアルデヒド検出試薬、及び任意に、これらのキットの使用説明書を含むキットを提供する。
【０００８】
本発明の他の特徴及び利点は、下記の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
発明の詳細な説明
Ａ．概要
プロスタグランジンを用いる又は生成するが、副生成物としてマロンジアルデヒドを生成しない酵素の活性を測定するためのアッセイが開発されている。一般に、還元剤を最初に用いて、未反応プロスタグランジンをマロンジアルデヒドに転化させる。次に、該マロンジアルデヒドをマロンジアルデヒド検出試薬と反応させて、検出可能なアダクツを製造する。ヒトプロスタグランジンＥ２シンターゼは、ＰＧＨ２からＰＧＥ２への転化を仲介する。未反応ＰＧＨ２をマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）及び１２−ヒドロキシヘプタデカトリエン酸（１２ＨＨＴ）に転化させるために、塩化第１鉄が用いられている。次に、マロンジアルデヒドをチオバルビツル酸と反応させて、蛍光アダクツを形成し、これを蛍光光度法によって、直接定量した。蛍光アダクツの生産量は、サンプル中に存在するＰＧＨ２量に相関するので、ＰＧＥＳ酵素によるＰＧＨ２の転化をモニターするために用いることができる。
【０００９】
Ｂ．定義
便宜上、本発明をさらに説明する前に、明細書、実施例及び特許請求の範囲で用いる、ある一定の用語をここに集める。当業者は、これらの定義を、全体の開示を考慮して、読み、理解すべきである。
【００１０】
単数形の表現（「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」）は、前後関係が明確に別に指示しない限り、複数の意味も包含する。
相互交換的に用いられる「生物学的活性」又は「生物活性(bioactivity)」又は「活性」又は「生物学的機能」は、本明細書のために、ＰＧＨ２を用いる又は生成する酵素、例えば、ＰＧＨ２からのＰＧＥ２の形成を触媒する能力を有する酵素によって果たされる機能を意味する。
【００１１】
「含む(comprise)」及び「含むこと(comprising)」は、包括的な、開かれた意味で用いられ、付加的要素が包含されうることを意味する。
「コンビナトリアル・ライブラリー」又は「ライブラリー」は、「メンバー(members)」と呼ぶことができ、ライブラリー内の各反応において、１種類以上の出発物質から同じ又は異なる反応物若しくは反応条件を用いて合成又は他のやり方で製造することができる化合物群(a plurality of compounds)である。一般に、いずれのライブラリーのメンバーも、少なくとも幾つかの構造多様性を示し、この構造多様性がしばしば化学的多様性を生じる。ライブラリーはいずれかに２つの異なるメンバーから約１０８メンバー以上までを有することができる。ある一定の実施態様では、本発明のライブラリーは約１２、５０及び９０を超えるメンバーを有する。本発明のある一定の実施態様では、出発物質とある一定の反応物とは同じであり、このようなライブラリーにおける化学的多様性は、ライブラリーの製造中に反応物又は反応条件の少なくとも１つを変えることによって達成される。本発明のコンビナトリアル・ライブラリーは溶液中で又は固相上に製造することができる。
【００１２】
「ＰＧＨ２を用いるが、マロンジアルデヒドを生成しない酵素」とは、ＰＧＨ２が基質である酵素であって、ＰＧＨ２と酵素との反応が、反応の生成物であるマロンジアルデヒドを生じないような、いずれの酵素をも意味する。このような酵素は、例えば、ＰＧＨ２を他の構造に転位させるイソメラーゼ、ＰＧＨ２を還元して、別の分子を形成するリダクターゼ、又はＰＧＨ２を新しい分子に転化させるシンターゼであることができる。ＰＧＨ２を用いる酵素の非限定的例は、プロスタグランジン・シンターゼとプロスタサイクリン・シンターゼを包含する。ＰＧＨ２から他のプロスタグランジンへの転化を触媒するプロスタグランジン・シンターゼの例は、非限定的に、プロスタグランジンＥシンターゼ（ＰＧＥＳ）、プロスタグランジンＤシンターゼ（ＰＧＤＳ）、及びプロスタグランジンＦシンターゼ（ＰＧＦＳ）を包含する。その触媒作用においてＰＧＨ２のインターコンバージョン(interconversion)を触媒する又は他のやり方でＰＧＨ２を用いるプロスタサイクリン・シンターゼの例は、非限定的に、プロスタグランジンＩ２シンターゼ（ＰＧＩＳ）を包含する。
【００１３】
「ＰＧＨ２を生成するが、マロンジアルデヒドを生成しない酵素」とは、ＰＧＨ２を合成する酵素であって、ＰＧＨ２を形成する該酵素の反応が、反応の生成物としてマロンジアルデヒドを生成しない任意の酵素を意味する。ＰＧＨ２を生成する酵素の非限定的例は、ＰＧＨ２シンターゼを包含する。
【００１４】
基準ポリペプチドに関連して用いられる場合の「断片(fragment)」は、基準ポリペプチド自体と比べたときにアミノ酸残基が欠失しているが、残りのアミノ酸配列が通常は基準ポリペプチドの配列と同じであるポリペプチドを意味する。このような欠失は基準ポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端で、或いは両方で起こりうる。断片は典型的に、少なくとも約５、６、８若しくは１０アミノ酸長さ、少なくとも約１４アミノ酸長さ、少なくとも約２０、３０、４０若しくは５０アミノ酸長さ、少なくとも約７５アミノ酸長さ、又は少なくとも約１００、１５０、２００、３００、５００若しくはそれ以上のアミノ酸長さである。断片は、基準ポリペプチドの生物学的活性の１つ以上を保持することができる。種々な実施態様において、断片は、基準ポリペプチドの酵素活性及び／又は相互作用部位を含むことができる。他の実施態様では、断片は、免疫原性を有することができる。
【００１５】
「包含する」は、本明細書では、「非限定的に包含する」を意味するために用いられる。「包含する」及び「非限定的に包含する」は相互交換的に用いられる。
「相互作用する」とは、例えばハイブリダイゼーション・アッセイを用いて検出されることができるような、分子間の検出可能な相互作用を包含する意味である。相互作用するはまた、分子間の「結合」相互作用を包含する。相互作用は、例えば、本質的に、タンパク質−タンパク質、タンパク質−核酸、タンパク質−小分子又は小分子−核酸であることができる。
「単離ポリペプチド」は、組み換えＤＮＡ若しくはＲＮＡから製造することができるポリペプチド、又は合成由来でありうるポリペプチドを意味し、これらのある組み合わせ(some combination thereof)は、ミクロソーム調製からの画分であることができる、或いは、自然発生ポリペプチドでありうるポリペプチドを意味し、単離ポリペプチドは、（１）通常、本来結合するタンパク質と結合していない、（２）それが通常発生する細胞から単離されたものであり、（３）同じ細胞ソースからの他のタンパク質を本質的に含まない、（４）異なる種からの細胞によって発現される、又は（５）自然状態では(in nature)発生しない。
【００１６】
「標識」又は「標識した」は、例えばマロンジアルデヒド検出試薬のような、検出可能なマーカーを分子に、共有的に又は非共有的に、組み込む又は付着させることを意味する。分子を標識する任意の適当な方法を本発明に用いることができる。標識の例は、非限定的に、放射性同位体、蛍光標識、重原子、化学発光基及び／又はビオチニル基を包含する。
【００１７】
「マロンジアルデヒド検出試薬」は、サンプル中のマロンジアルデヒドの存在を検出するために用いることができる、如何なる分子又は化合物をも意味する。このような分子又は化合物はマロンジアルデヒドと共に、分光法によって又は他の方法で検出可能な共有アダクツを形成することができ、溶液からマロンジアルデヒドを沈殿させることができる、及び／又はマロンジアルデヒドを別の分子に転化させることができる。
【００１８】
「モジュレーション」は、機能性又は生物学的活性若しくはプロセス（例えば、酵素活性又は受容体結合）に関連して用いる場合に、このような性質、活性又はプロセスの質をアップレギュレートする（例えば、活性化する若しくは刺激する）、ダウンレギュレートする（例えば、阻害する若しくは抑制する）又は他の形式で変化させるのいずれかの可能性(capacity)を意味する。ある一定の場合に、このようなレギュレーションは、例えば、シグナル伝達経路の活性化のようなイベントの発生を条件としうる、及び／又は特定の細胞種においてのみ出現しうる。
【００１９】
「モジュレーター」は、モジュレーションを惹起することができる、ポリペプチド、核酸、マクロ分子、錯体、分子、例えば分子量１０００ダルトン未満の小分子、化合物、種等（自然発生若しくは非自然発生）、又は分子量１０００ダルトンを超える大分子、或いは例えば細菌、植物、真菌類又は動物細胞若しくは組織のような生物学的物質から製造される抽出物を意味する。モジュレーターは、アッセイに組み込むことによって、機能性、生物学的活性若しくはプロセス、又はこれらの組み合わせの阻害剤又は活性剤（直接的又は間接的）（例えば、アゴニスト、部分アンタゴニスト、部分アゴニスト、インバース・アゴニスト、アンタゴニスト、抗菌剤、微生物感染若しくは増殖の阻害剤等）としての可能な活性に関して評価することができる。このようなアッセイでは、個別のモジュレーター又はモジュレーターの任意の適当な組み合わせをスクリーニングすることができる。所定のモジュレーターの活性は既知であることも、未知であることも、一部既知であることもできる。モジュレーターは薬剤としての使用に適合性でありうる。
【００２０】
「ＰＧＥＳ」又は「ＰＧＥシンターゼ」は、プロスタグランジンＥシンターゼ、環状エンドペルオキシド基質から該基質の９−ケト，１１αヒドロキシ形への転化を触媒する酵素である。ＰＧＥＳは、例えば、前駆体分子からＰＧＥ２及びその類似体（例えば合成類似体）への転化を触媒する。例えば、ＰＧＥＳは、ＰＧＨ２からＰＧＥ２への転化を触媒する。
【００２１】
「ＰＧＨ２」はプロスタグランジン・エンドペルオキシドＨ２である。
「精製した(purified)」は、存在する主要な種である（即ち、モル基準で、組成物中の如何なる他の個別の種よりも豊富に存在する）対象種(object species)を意味する。「部分的に精製した」組成物中では、対象種は、存在する全ての種の少なくとも約５０％（モル基準で）を占める。溶液又は分散系中の種の純度を測定する場合に、種が溶解している又は分散している溶媒又はマトリックスをこのような測定に含める必要はない；その代わりに、溶解又は分散している種（問題の種を含む）のみを考慮する。一般に、「精製した」組成物は、組成物中に存在する全ての種の約８５％より多く、存在する全ての種の約８５％を超えて、９０％、９５％、９９％又はそれ以上を占める１つの種を有する。対象種は、組成物が本質的に単独種から成るような、本質的な同種性(homogeneity)（慣用的な検出方法によって組成物中に汚染種を検出することができない）にまで精製することができる。タンパク質の精製は、本明細書の教示を考慮して、タンパク質精製の標準方法を用いて達成することができる。ポリペプチドの純度は、例えば、アミノ末端アミノ酸配列分析、ゲル電気泳動及び質量分光法分析を含めた、当業者に知られた、多くの方法によって測定することができる。
【００２２】
「組み換えタンパク質」、「異種タンパク質」及び「外因性タンパク質」は、組み換えＤＮＡ手法によって作製されるポリペプチドを意味するために相互交換的に用いられる、組み換えＤＮＡ手法では、一般に、ポリペプチドをコードするＤＮＡを適当な発現ベクター中に挿入し、該発現ベクターは次に、宿主細胞を形質転換して、異種タンパク質を作製するために用いられる。即ち、該ポリペプチドは異種核酸から発現される。このような組み換えポリペプチドは、例えば全細胞溶解物又はミクロソーム調製物を含むことができ、場合によっては、これらから精製することもできる。さらに、このような組み換えポリペプチドは、ミクロソーム調製物に由来する安定化ポリペプチド調製物を含むことができる。
【００２３】
「還元剤」は、化学反応において電子（単数又は複数）を供与して、他の物質が還元されるときに酸化された状態になる、如何なる分子又は化合物をも意味する。
「サンプル」は、対象から得られた物質を包含する。例えば、ヒト若しくは動物対象、植物、細胞培養物又は、例えば水若しくは空気サンプルのような、環境ロケーション(environmental location)から得ることができる。サンプルはまた、加工されている又は他の物質と混合されている物質をも包含する。例えば、血液サンプルを加工して、血清、赤血球等を得ることができ、これらの各々はサンプルと見なすことができる。
【００２４】
「小分子」は、約１０００ダルトン未満の分子量を有する組成物(composition)を意味する。小分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメチック、炭水化物、脂質又は他の有機（炭素含有）若しくは無機分子であることができる。当業者が本明細書に基づいて理解するように、化学及び／又は生物学的混合物、真菌、細菌若しくは藻抽出物の化学及び／又は生物学的イクステンシブ・ライブラリー(extensive libraries)のライブラリーを本発明のアッセイのいずれかによってスクリーニングして、モジュレーターである化合物を同定することができる。
【００２５】
「試験化合物」は、ＰＧＨ２を用いる又は生成する酵素の推定モジュレーターとして１つ以上のスクリーニング方法によって試験される分子を意味する。試験化合物は通常、問題のターゲットに結合することを知られていない。「対照試験化合物」なる用語は、ターゲット（例えば、既知アゴニスト、アンタゴニスト、部分アゴニスト又はインバース・アゴニスト）に結合することを知られている化合物を意味する。「試験化合物」なる用語は、ターゲットの機能を変化させて、アッセイにおけるシグナル特異性を決定するために、対照条件として加えられる化学物質を含まない。このような対照化学物質若しくは条件は、（１）非特異的若しくは実質的に、タンパク質構造を破壊する（例えば、変性剤（例えば、尿素若しくはグアニジニウム）、カオトロピック剤、スルフヒドリル試薬（例えば、ジチオトレイトール及びβ−メルカプトエタノール）、及びプロテアーゼ）、（２）一般に、細胞代謝を阻害する（例えば、ミトコンドリア脱共役剤）及び（３）非特異的にタンパク質の静電的若しくは疎水性相互作用を破壊する（例えば、高い塩濃度、若しくは疎水性相互作用を非特異的に破壊するために充分な濃度の界面活性剤(detergent)）化学物質を包含する。試験化合物の例は、非限定的に、ペプチド、核酸、炭水化物、生物学的に不活性な物質及び小分子を包含する。「新規な試験化合物」なる用語は、本出願の出願日の時点で存在していない試験化合物を意味する。新規な試験化合物を用いた、ある一定のアッセイでは、該新規な試験化合物は、該アッセイに又は該アッセイの任意の特定のトライアルに用いた試験化合物の少なくとも約５０％、７５％、８５％、９０％、９５％以上を占める。
【００２６】
ポリペプチドＸの「変形(variant)」は、１つ以上のアミノ酸残基において変化している、ペプチドＸのアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。該変形は、置換アミノ酸が同様な構造的又は化学的性質を有する「保存性(conservative)」変化（例えば、イソロイシンによるロイシンの置換）を有することができる。変形は、置換アミノ酸が異なる構造的又は化学的性質を有する「非保存性(nonconservative)」変化（例えば、トリプトファンによるグリシンの置換）を有することができる。類似している重要でない変化は、アミノ酸欠失又は挿入又は両方を含むこともできる。生物学的又は免疫学的活性を破壊することなく、いずれのアミノ酸残基を置換、挿入又は欠失することができるかを評価する場合のガイダンスが、当該技術分野で周知のコンピューター・プログラム、例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて見出すことができることを、当業者は理解するであろう。
【００２７】
Ｃ．検出可能な酵素活性
反応によってＰＧＨ２を用いる又は生成する、如何なる酵素の活性も本発明のアッセイを用いて評価することができる。ＰＧＨ２を生成する酵素は、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−１若しくは−２のようなＰＧＨ２シンターゼを包含する。ＰＧＨ２の特異的インターコンバージョン(interconversion)を用いる又は触媒する酵素は、プロスタグランジン・シンターゼ、プロスタサイクリン・シンターゼ及びトロンボキサン・シンターゼを包含する。マロンジアルデヒド副生成物を生成しない、プロスタグランジン・シンターゼ、プロスタサイクリン・シンターゼ及び、ＰＧＨ２を用いる又は生成する、如何なる、他の酵素の活性も、本発明のアッセイを用いて検出することができる。ＰＧＨ２から他のプロスタグランジンへの転化を触媒するプロスタグランジン・シンターゼの例は、非限定的に、プロスタグランジンＥシンターゼ（ＰＧＥＳ）、プロスタグランジンＤシンターゼ（ＰＧＤＳ）、プロスタグランジンＦシンターゼ（ＰＧＦＳ）等を包含する。その触媒作用においてＰＧＨ２のインターコンバージョン(interconversion)を触媒する又は他のやり方でＰＧＨ２を用いるプロスタサイクリン・シンターゼの例は、非限定的に、プロスタグランジンＩ２シンターゼ（ＰＧＩＳ）等を包含する。
【００２８】
幾つかの実施態様では、酵素はＰＧＥＳである。ＰＧＥＳ及びその変形の精製した調製物が製造されており、これらは、同時係属出願「プロスタグランジンＥシンターゼの製造方法」、ＵＳＳＮ１０／２２７，６１７（２００２年８月２３日出願）の主題である。単離ＰＧＥシンターゼ及びＰＧＥシンターゼ活性のモジュレーターのアッセイは、米国特許６，３９５，５０２Ｂ１に開示されている。ＵＳＳＮ１０／２２７，６１７と米国特許６，３９５，５０２Ｂ１の両方は、それらの全体で、本明細書に援用される。本出願に教示した通りに調製された、酵素と、その変形及び類似体は、本発明の方法を用いて分析することができる。
【００２９】
上記酵素のいずれの断片も、酵素の類似体及び変形と同様に、本発明のアッセイによって用いることができる。本発明のアッセイによって用いるための酵素は、例えばネイティブ・ソース(native source)から精製した、自然発生のものであることも、組み換え体であることもできる。
【００３０】
Ｄ．アッセイ
ＰＧＨ２を用いる又は生成する酵素の活性の測定方法は：（ａ）サンプルを、ＰＧＨ２をマロンジアルデヒドに転化させるために適した条件下で還元剤と接触させて、それによって反応済みサンプルを得る工程；（ｂ）該反応済みサンプルを、マロンジアルデヒドを検出可能な化合物に転化させるために適した条件下でマロンジアルデヒド検出試薬と接触させる工程；及び（ｃ）検出可能な化合物量を測定する工程を含むことができる。
【００３１】
Ｄ．１．還元剤
本発明のアッセイにおいてＰＧＨ２をマロンジアルデヒドに転化させるために用いる還元剤は、当該技術分野で認められた比較的緩和な還元剤のいずれからか選択することができる。一般に、還元は、ＰＧＨ２のモル当り２〜２０当量の如何なる量の還元剤をも用いて中性ｐＨ及び室温において水性条件下で行なうことができる。１つの好ましい実施態様では、アッセイに用いる還元剤は塩化第１鉄（ＦｅＣｌ２）である。
【００３２】
Ｄ．２．マロンジアルデヒド検出試薬
サンプル中のマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の存在を検出する又は検出可能にすることができる如何なる分子又は化合物も、本発明のアッセイに用いることができる。このような検出試薬は、標識されたアダクツ、可視的生成物、蛍光生成物又は同位体標識された生成物を生成することができる。ある一定の実施態様では、例えば、検出すべきＰＧＨ２レベルが比色又は蛍光アッセイの限界未満である場合には、上記検出試薬は、例えば３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、３３Ｐ、３２Ｐ等によって同位体標識することができる。
【００３３】
１つの好ましい実施態様では、マロンジアルデヒド検出試薬は、２−チオバルビツル酸（ＴＢＡ）である。マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）と２−チオバルビツル酸（ＴＢＡ）との反応は、約１：２アダクツを生じる、これは有色性かつ蛍光性である。真下に示すスキーム１を参照のこと。
【００３４】
【化１】
2006515763.tif 000002
【００３５】
スキーム１．酸触媒求核性付加機構による、ＭＤＡとＴＢＡとの間の蛍光赤色１：２アダクツ形成
当業者が理解するように、１：２アダクツの蛍光によるＭＤＡの検出は、ＴＢＡとその誘導体のアダクツに限定する必要はない。ＭＤＡが第１級アミンと１：２アダクツを形成する場合には、検出可能な蛍光化合物が得られる。真下に記載するスキーム２を参照のこと。
【００３６】
【化２】
2006515763.tif 000003
【００３７】
スキーム２．それぞれ、１：１非蛍光及び１：２蛍光ＭＤＡ：アミン・アダクツ（後者は共役シッフ塩基である）を形成するための、ＭＤＡと第１級アミンＲ１−ＮＨ２及びＲ２−ＮＨ２との反応
Ｒ１とＲ２とは、独立的に、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、又はアルカリル(alkaryl)基を非限定的に含む、シッフ塩基の形成に一般に用いられる任意の有機基であることができる。シッフ塩基の形成は１当量の水を生じるので、該反応を右方向に駆動するために、反応から水を除去する手段が一般に用いられる。２つの一般的な水除去方法は、加熱及び乾燥剤の使用を含む。
【００３８】
該反応は、窒素が例えばアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル又はアルカリル基によって置換されている、ＴＢＡの誘導体によって行なうこともできる。２つの一般的な非限定的例は、下記に示す、１，３−ジエチル−２−チオバルビツル酸及び１，３−ジフェニルバルビツル酸を包含する。
【００３９】
【化３】
2006515763.tif 000004
【００４０】
しかし、マロンジアルデヒド検出試薬は、ＴＢＡ及びＴＢＡ誘導体に限定されない。むしろ、上述したように、マロンジアルデヒドの存在を検出する又は検出可能にすることができる、任意の分子又は化合物を用いることができる。他の実施態様では、マロンジアルデヒドに対する抗体を、特異的抗体を誘出する(eliciting)ために当該技術分野で周知の方法を用いて生成して、本発明のアッセイに検出剤として用いることができる。１実施態様では、マロンジアルデヒドをサンプルから免疫沈降させることができる。別の実施態様では、抗ＭＤＡモノクローナル抗体を検出可能な標識にコンジュゲートさせて、ＭＤＡを含有する可能性があるサンプルと反応させることができる。このような実施態様では、ＭＤＡを酵素免疫測定法(enzyme-linked immunosorbent assay)（ＥＬＩＳＡ）フォーマットによって検出することができる。他の実施態様では、例えばＡＭＣＡヒドラジド(Molecular Probes,Eugene,OR)又は任意の他の蛍光標識された若しくは他のやり方で標識されたヒドラジン誘導体（セミカルバジド及びカルボヒドラジドを包含する）のようなアルデヒド反応性プローブを用いて、サンプル中のＭＤＡを検出することができる。
【００４１】
Ｅ．本発明のアルデヒドの使用方法
本発明は、ＰＧＨ２を用いる又は生成する酵素の活性を検出するための上記アッセイの使用方法を提供する。１実施態様では、サンプル中の、ＰＧＨ２を用いる酵素の活性を測定する方法は：（ａ）サンプルを、ＰＧＨ２をマロンジアルデヒドに実質的に転化させるために適した条件下で還元剤と接触させて、それによって反応済みサンプルを得る工程；（ｂ）該反応済みサンプルを、マロンジアルデヒドを検出可能な化合物に実質的に転化させるために適した条件下でマロンジアルデヒド検出試薬と接触させる工程；及び（ｃ）検出可能な化合物量を測定する工程を含むことができ、この方法では、サンプル中の酵素活性は検出可能な化合物量に逆比例する。１実施態様では、酵素は、プロスタグランジン・シンターゼ及びプロスタサイクリン・シンターゼから成る群から選択することができ、１実施態様では、プロスタグランジン・シンターゼである。１実施態様では、該プロスタグランジン・シンターゼは、プロスタグランジンＥシンターゼ（ＰＧＥＳ）である。本発明の１実施態様では、還元剤は塩化第１鉄である。本発明の他の実施態様では、検出剤は２−チオバルビツル酸（ＴＢＡ）又は２−チオバルビツル酸誘導体であることができる。本発明の１実施態様では、検出可能な化合物は蛍光化合物である。
【００４２】
他の実施態様では、サンプル中の、ＰＧＨ２を生成する酵素の活性を測定する方法は：（ａ）サンプルを、ＰＧＨ２をマロンジアルデヒドに実質的に転化させるために適した条件下で還元剤と接触させて、それによって反応済みサンプルを得る工程；（ｂ）該反応済みサンプルを、マロンジアルデヒドを検出可能な化合物に実質的に転化させるために適した条件下でマロンジアルデヒド検出試薬と接触させる工程；及び（ｃ）検出可能な化合物量を測定する工程を含むことができ、この方法では、サンプル中の酵素活性は検出可能な化合物量に比例する。１実施態様では、酵素はＰＧＨ２シンターゼである。
【００４３】
このような方法は、ＰＧＨ２を用いる又は生成する酵素を含む、例えば、薬剤、コスメチック、試薬又は他のこのような商業的製剤の活性の測定に用いることができる。このような方法はまた、精製プロトコール中の、ＰＧＨ２を用いる又は生成する酵素の活性を評価するために、又は例えば精製タンパク質のサンプル、対象から採取したサンプル等中の、このような酵素の活性レベルを測定するためにも用いることができる。このような方法はまた、このような酵素の断片、類似体又は変形が生物学的活性を保持するか否かを判定するためにも用いることができる。
【００４４】
さらに他の実施態様では、該アッセイを、対象における又は該対象から採取したサンプル中の酵素活性レベルを測定するために用いることができる。該アッセイを行なう前に、必要に応じて、サンプルを少なくとも部分的に又は完全に精製することができる。
【００４５】
生物学的活性の分析は、反応物質の含有に適した、任意の容器内で達成することができる。例は、マイクロタイター・プレート、試験管及び微小遠心分離管を包含する。このようなアッセイは無細胞であることができる。ある一定の実施態様では、酵素を精製するか、又は部分的に精製する。
【００４６】
本発明はさらに、ＰＧＨ２を用いる又は生成する酵素の活性のモジュレーターをスクリーニングする方法を提供する。１実施態様では、プロスタグランジンを用いる又は生成する酵素のモジュレーターを同定し、試験する方法は：（ａ）酵素を含有するサンプルを試験化合物と接触させる工程；（ｂ）該サンプルを、ＰＧＨ２をマロンジアルデヒドに転化させるために適した条件下で還元剤と接触させて、それによって反応済みサンプルを得る工程；（ｃ）該反応済みサンプルを、マロンジアルデヒドを検出可能な化合物に転化させるために適した条件下でマロンジアルデヒド検出試薬と接触させる工程；及び（ｄ）検出可能な化合物量を測定する工程を含むことができ、この方法では、該検出可能な化合物量を用いて、試験化合物が酵素活性をモジュレートするか否かを判定する。幾つかの実施態様では、サンプル中の検出可能な化合物量を複数の時点において測定する、この場合、一定時間にわたる(over time)検出可能な化合物量の変化が、試験化合物が酵素活性をモジュレートすることを実証する。他の実施態様では、試験化合物と接触したサンプル中の検出可能な化合物量を測定して、酵素を含有するが、該酵素が試験化合物と接触していないサンプル中で測定された検出可能な化合物量と比較する。幾つかの実施態様では、酵素を精製又は単離することができる。１実施態様では、酵素を部分的に精製することができる。幾つかの実施態様では、試験化合物は小分子であることができる。
【００４７】
幾つかの実施態様では、「プロスタグランジンＥシンターゼの製造方法」、ＵＳＳＮ１０／２２７，６１７（２００２年８月２３日出願）に記載されているような、ＰＧＥＳ活性を検出する、ＰＧＥＳモジュレーターの同定方法に、本発明の活性アッセイを組み入れることができる。
【００４８】
１実施態様では、このようなモジュレーターを同定するための分析物は、本質的に、ポリペプチド（例えば、場合によっては、異種ポリペプチドに縮合した、ＰＧＨ２を用いる又は生成する酵素又はその類似体若しくは断片）及び試験化合物又は試験化合物ライブラリーを含有する反応混合物にある。このような試験化合物ライブラリー、例えば、複数種類の試験化合物はコンビナトリアル合成方法を用いて形成するか、又は販売者から購入することができる。
【００４９】
当業者が決定することができるような、化合物の任意の適当な接触を本発明の方法に用いることができる。本発明の１つの典型的なアッセイは、酵素又はその機能性断片(functional fragment)を試験化合物又は試験化合物ライブラリーと接触させて、複合体の形成を検出することを含む。試験化合物の効力は、試験化合物の種々な濃度を用いて得たデータからの用量反応曲線を形成することによって評価することができる。さらに、比較の基準を与えるために、対照アッセイを行なうこともできる。対照アッセイでは、試験化合物の不存在下であること以外は、同じアッセイ条件を用いて酵素活性を定量する。
【００５０】
試験化合物の存在下及び不存在下での生物学的活性の分析は、反応物質の含有に適した任意の容器内で達成することができる。このようなアッセイは、キット形式でパッケージングすることができる。例は、マイクロタイタープレート、試験管及び微小遠心分離管を包含する。化合物ライブラリー及び天然抽出物を試験する、多くの薬物スクリーニング・プログラムでは、一定時間内に検査する化合物数を最大化するために、高いスループットのアッセイが望ましい。例えば精製タンパク質若しくは半精製タンパク質によって又は細胞溶解物(lysates)によって得られるような、無細胞系において行なわれる本発明のアッセイは、試験化合物によって仲介される、分子ターゲットの変化の迅速な発生及び比較的容易な検出を可能にするように、それらを形成することができる点で、「プライマリー(primary)」スクリーンとしてしばしば好まれる。さらに、試験化合物の細胞傷害性(cellular toxicity)及び／又はバイオアベイラビリティ(bioavailability)の影響は、in vitro系では一般に無視することができ、その代わりに、該アッセイは、分子ターゲットの、他のタンパク質との結合アフィニティの変化又は酵素的特性(enzymatic properties)の変化に現れうるような、分子ターゲットに対する薬物影響に主として集中する。したがって、細胞溶解物における問題の機能相互作用の構成によって形成した無細胞系で、可能なモジュレーターを検出することができる。代替フォーマットでは、再構成タンパク質混合物としてアッセイを導出することができ、これは、以下に述べるように、細胞溶解物に基づくアッセイを凌駕して多くの利点を提供する。
【００５１】
本発明のアッセイの、幾つかのin vitro実施態様では、サンプルは少なくとも半精製したタンパク質の再構成タンパク質混合物を含む。半精製した(semi-purified)とは、再構成混合物に用いたタンパク質が他の細胞タンパク質又はウイルスタンパク質から予め分離されていることを意味する。例えば、細胞溶解物とは対照的に、タンパク質−基質、タンパク質−タンパク質又は核酸−タンパク質相互作用に関与するタンパク質は、混合物中の、全ての他のタンパク質を基準にして少なくとも５０％純度まで、混合物中に存在し、より好ましくは、９０〜９５％純度で存在する。本発明の方法のある一定の実施態様では、再構成タンパク質混合物が、ある一定のタンパク質−基質、タンパク質−タンパク質相互作用、又は核酸−タンパク質相互作用から生じる活性を測定する能力を妨害する又は他のやり方で変化させることができる他のタンパク質（例えば、細胞若しくはウイルス由来のような）を実質的に含まないように、高度に精製されたタンパク質の混合によって、再構成タンパク質混合物を得る。
【００５２】
Ｆ．キット
本発明は、上記方法の実施に用いるためのキットを提供する。キットは、酵素活性のレベルを測定するための適当な試薬と、任意にそれらの使用説明書を含むことができる。キットはさらに、基準(standards)、例えば、活性が知られている酵素を含むことができる。キット構成要素は、上記方法の手動での実施又は部分的若しくは完全自動化実施のためにパッケージングすることができる。キットに関与する他の実施態様では、本発明は、本発明の組成物と、任意にそれらの使用説明書を含むキットを提供する。このようなキットは、例えば薬物スクリーニングを含めた、多様な用途を有することができる。
【００５３】
本発明を一般的に説明してきたが、下記実施例を参照することによって、本発明はさらに容易に理解することができる、下記実施例は本発明のある一定の態様及び実施態様を説明するためにのみ含まれるのであり、如何なる意味でも本発明を限定するようには意図されない。
【００５４】
実施例
ＰＧＥＳ活性検出アッセイ
これらのアッセイは、ＰＧＨ２基質の消費をモニターすることによって、ＰＧＥＳの活性を検出する。一般には、ＰＧＥＳとＰＧＨ２をそれらの反応を促進させる条件下でインキュベートする。このインキュベーションを、塩化第１鉄（ＦｅＣｌ２、Sigma F-2130）とクエン酸（Sigma C-1909）を用いて、クエンチする、このときに残留する基質は反応性種と不活性副生成物に転化する。該反応性種を次に、ＴＢＡ誘導体化試薬と反応させて、５３０ｎｍに励起最大及び５５０ｎｍに発光最大（ｅｍ）を有する蛍光生成物を形成する。図１は、アッセイの主要な３工程において生じる化学反応を要約する。
【００５５】
図２は、アッセイの典型的な実施態様を用いたＰＧＨ２の滴定を説明する、図２では未加工の蛍光読み取り値をＰＧＨ２の濃度に対してプロットする。種々な濃度のＰＧＨ２をＰＧＥＳ酵素と共に１００μｌ中で４℃においてインキュベートした。インキュベーションを、５０μｌの２５ｍＭ  ＦｅＣｌ２、５０ｍＭクエン酸、ｐＨ２．５によって室温で３０分間クエンチした。チオバルビツル酸（ＴＢＡ、０．５３％、１５０μｌ）を加えて、プレートを７０℃で９０分間展開させた(developed)。次に、プレートを室温に冷却し、蛍光計で５３０ｎｍ  ｅｘｃ／５５０ｎｍ  ｅｍを用いて読み取った。
【００５６】
図３は、アッセイの典型的な実施態様によって測定した、一定時間にわたるＰＧＥＳによるＰＧＨ２の転化％を示す。ＰＧＥＳ（２５μｇ／ｍｌ）を１００μｌ中で１０μＭ  ＰＧＨ２と共に４℃で種々な時間にわたってインキュベートした。インキュベーションを、５０μｌの２５ｍＭ  ＦｅＣｌ２、５０ｍＭクエン酸、ｐＨ２．５によって室温で３０分間クエンチした。ＴＢＡ（０．５３％、１５０μｌ）を加えて、プレートを７０℃で９０分間展開させた。次に、プレートをＲＴに冷却し、５３０ｎｍ  ｅｘｃ／５５０ｎｍ  ｅｍを用いて読み取った。転化％は下記式によって算出した：
％Ｐ形成＝（［Ｐ］Ｔ／［Ｓ］０）ｘ１００＝（ＰＴ／（ＳＴ＋ＰＴ））ｘ１００
式中、ｔ＝時間、０＝時間０、Ｐ＝生成物、Ｓ＝基質
図４は、アッセイの典型的な実施態様によって測定した、種々なＰＧＥＳ濃度によるＰＧＨ２の転化％を示す。種々な濃度のＰＧＥＳを１００μｌ中で１０μＭ  ＰＧＨ２と共に４℃で２分間にわたってインキュベートした。インキュベーションを、５０μｌの２５ｍＭ  ＦｅＣｌ２、５０ｍＭクエン酸、ｐＨ２．５によって室温で３０分間クエンチした。ＴＢＡ（０．５３％、１５０μｌ）を加えて、プレートを７０℃で９０分間展開させた。次に、プレートをＲＴに冷却し、５３０ｎｍ  ｅｘｃ／５５０ｎｍ  ｅｍを用いて読み取った。
【００５７】
ＰＧＥＳ活性モジュレーション・アッセイ
このアッセイを用いて、ＰＧＥＳ活性をモジュレートする化合物を発見し、同定することができる。下記プロトコールでは、量は反応当りである。０．０１Ｍリン酸カリウムｐＨ７．４のアッセイ緩衝液を調製して、ＰＧＥＳ酵素（Dr.Per-Johan Jakobsson, Karolinska Institute,Swedenによって提供されるクローン）を希釈するために用いた。ＰＧＨ２基質（Dr.Mats Hamburg, Karolinska Institute,Swedenから購入）を氷冷アセトン中で希釈した。９６穴平底プレートの各穴に、マルチドロップ・ピペッターを用いて冷アッセイ緩衝液８５μｌを加えた。試験化合物（７倍に圧縮）５μｌをプレートに加えた。続いて、氷冷酵素（１：１００希釈）溶液１０μｌを加えて、プレートを化学フード(chemical hood)中に移した。氷冷ＰＧＨ２基質（１０μＭ最終）５μｌを該プレートに分配した。該プレートを４℃で３分間インキュベートした。インキュベーションを、５０μｌの２５ｍＭ  ＦｅＣｌ２、５０ｍＭクエン酸、ｐＨ２．５によって室温で３０分間クエンチした、このときに残留する基質は反応性種と不活性副生成物に転化する。この反応性種を次に、加えた誘導体化溶液（ＴＢＡ、０．５３％）１５０μｌと反応させて、該プレートを６０〜７０℃で９０分間インキュベートした、このときに蛍光生成物が形成された。該プレートをMolecular Devices Gemini蛍光計で励起５３０ｎｍ及び発光５５０ｎｍによって読み取った。
【００５８】
上記アッセイを用いて、ＣＡＳ１１８４１４−８２−７（１Ｈ−インドール−２−プロパン酸、１−［（４−クロロフェニル）メチル］−３−［（１，１−ジメチルエチル）チオ］−α，α−ジメチル−５−（１−メチルエチル）−（９Ｃｌ））、商業的に入手可能な阻害剤（Cayman Chemical）の能力を測定した。図５は、ＣＡＳ１１８４１４−８２−７の構造と、アッセイの結果を示す。約５．３μＭのＩＣ５０が観察され、これは報告された値と一致する。
【００５９】
同等物
本発明は、一部では、ＰＧＨ２を用いる又は生成する酵素の活性を測定するための新規なアッセイを提供する。本発明の特定の実施態様を考察してきたが、上記明細書は例示であり、非限定的である。本明細書を検討するならば、本発明の多くの変化が当業者に明らかになるであろう。特許請求の範囲は、このような実施態様及び変化の全てを特許請求するようには意図されていない、本発明の全範囲は、請求項をそれらの同等物の全範囲と共に、及び本明細書をこのような変化と共に参照することによって、決定すべきである。
【００６０】
本明細書に挙げた、刊行物及び特許の全ては、以下に列挙したものを含めて、あたかも各個々の刊行物又は特許が具体的にかつ個別に援用されるように示されているかのごとく、それらの全体で本明細書に援用される。抵触の場合には、本出願は、本明細書中の如何なる定義をも含めて、制御されることになる。
【００６１】
追加の参考文献
Janero,D.R.,(1990)Free Radical Biol.Med.9:515-540;
Ledergerber,D.and Hartmann,R.W.(1995)J.Enzyme Inhib.9:253-261;
Hamberg,M.and Samuelson,B.(1974)Proc.Natl.Acad.U.S.A.71:3400-3404;
Konturek,S.J.,and Pawlik,W.(1986)Digestive Diseases and Sciences 31:65-195;及び
Hammarstrom,S.(1982)Arch.Biochem.Biophys.214:431-445.
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１Ａは、アッセイの典型的な１実施態様の３工程で生じる化学反応を示す。図１Ｂは、アッセイの典型的な１実施態様の３工程で生じる化学反応を示す。図１Ｃは、アッセイの典型的な１実施態様の３工程で生じる化学反応を示す。
【図２】図２は、アッセイの典型的な実施態様を用いたＰＧＨ２の滴定を説明する、図２では未加工の蛍光読み取り値をＰＧＨ２の濃度に対してプロットする。
【図３】図３は、アッセイの典型的な実施態様によって測定した、一定時間にわたるＰＧＥＳによるＰＧＨ２の転化％を示す。
【図４】図４は、アッセイの典型的な実施態様によって測定した、種々なＰＧＥＳ濃度によるＰＧＨ２の転化％を示す。
【図５】図５は、左に、ＰＧＥＳの商業的に入手可能な阻害剤であるＭＫ８８６の構造を示す。右には、ＰＧＥＳを阻害するＭＫ８８６の能力を測定するために、該アッセイの１実施態様を用いた結果を示す。本発明のアッセイによって測定した、ＭＫ８８６のＩＣ５０は図の最上部に示す。
【図１】
2006515763.tif 000005
【図２】
2006515763.tif 000006
【図３】
2006515763.tif 000007
【図４】
2006515763.tif 000008
【図５】
2006515763.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月22日(2004.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＧＨ２を用いるが、マロンジアルデヒドを生成しない酵素の活性の測定方法であって、
（ａ）ＰＧＨ２を含有するサンプルを、ＰＧＨ２をマロンジアルデヒドに実質的に転化させるために適した条件下で還元剤と接触させて、それによって反応済みサンプルを得る工程；
（ｂ）該反応済みサンプルを、マロンジアルデヒドを検出可能な化合物に実質的に転化させるために適した条件下でマロンジアルデヒド検出試薬と接触させる工程；及び
（ｃ）検出可能な化合物量を測定する工程
を含み、この場合、サンプル中の酵素活性が検出可能な化合物量に逆比例する方法。
【請求項２】
酵素がプロスタグランジン・シンターゼ及びプロスタサイクリン・シンターゼから成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
還元剤が塩化第１鉄である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
検出試薬が２−チオバルビツル酸（ＴＢＡ）又は２−チオバルビツル酸誘導体である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
検出可能な化合物が蛍光化合物である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ＰＧＨ２を生成するが、マロンジアルデヒドを生成しない酵素の活性の測定方法であって、
（ａ）ＰＧＨ２を含有するサンプルを、ＰＧＨ２をマロンジアルデヒドに実質的に転化させるために適した条件下で還元剤と接触させて、それによって反応済みサンプルを得る工程；
（ｂ）該反応済みサンプルを、マロンジアルデヒドを検出可能な化合物に実質的に転化させるために適した条件下でマロンジアルデヒド検出試薬と接触させる工程；及び
（ｃ）検出可能な化合物量を測定する工程
を含み、この場合、サンプル中の酵素活性が検出可能な化合物量に比例する方法。
【請求項７】
前記酵素がＰＧＨ２シンターゼである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
還元剤が塩化第１鉄である、請求項６記載の方法。
【請求項９】
検出試薬が２−チオバルビツル酸（ＴＢＡ）又は２−チオバルビツル酸誘導体である、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
ＰＧＨ２を用いる若しくは生成するが、マロンジアルデヒドを生成しない酵素のモジュレーターの同定方法であって、
（ａ）酵素を含有するサンプルを試験化合物と接触させる工程；
（ｂ）工程（ａ）から生成した又は残留するＰＧＨ２を含む、工程（ａ）のサンプルを、ＰＧＨ２をマロンジアルデヒドに転化させるために適した条件下で還元剤と接触させて、それによって反応済みサンプルを得る工程；
（ｃ）該反応済みサンプルを、マロンジアルデヒドを検出可能な化合物に転化させるために適した条件下でマロンジアルデヒド検出試薬と接触させる工程；及び
（ｄ）検出可能な化合物量を測定する工程
を含み、この場合、該検出可能な化合物量を用いて、試験化合物が酵素活性をモジュレートするか否かを決定する方法。
【請求項１１】
前記酵素を単離、精製又は部分的に精製する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該試験化合物が小分子である、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
サンプル中の検出可能な化合物量を複数の時点において測定して、一定時間にわたる検出可能な化合物量の変化が、試験化合物が酵素活性をモジュレートすることを実証する、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
試験化合物と接触したサンプル中の検出可能な化合物量を測定して、酵素を含有するが、該酵素が試験化合物と接触していない対照サンプル中で測定された検出可能な化合物量と比較する、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
ＰＧＨ２を用いる又は生成するが、生成物としてマロンジアルデヒドを生成しない酵素の活性を測定するためのキットであって、還元剤及びマロンジアルデヒド検出試薬を含むキット。
【国際調査報告】
2006515763.tif 000010
2006515763.tif 000011
2006515763.tif 000012