(57)【要約】作物害虫又は動物寄生虫の防除方法が、１２，０００ダルトン以下の分子量をもつペプチドであって、作物害虫のニューロン内に又はシナプス間隙に入った後にその効果を発揮することができ且つ感覚器から出発して逆行性神経輸送を介して取り込ませることができるペプチドと、作物害虫又は動物寄生虫とを接触させることによって提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１２，０００ダルトン以下の分子量をもつペプチドであって、作物害虫のニューロン内か又はシナプス間隙に入った後にその効果を発揮でき且つ感覚器から出発して逆行性神経輸送を介して取り込ませることができるペプチドと、作物害虫又は動物寄生虫とを接触させることによる作物害虫又は動物寄生虫の防除方法。
【請求項２】
作物害虫又は動物寄生虫が無脊椎動物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
作物害虫又は動物寄生虫が線虫である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
作物害虫がマイマイ亜綱腹足類軟体動物である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
作物害虫が貧毛類環形動物である請求項２に記載の方法。
【請求項６】
作物害虫が節足動物である請求項２に記載の方法。
【請求項７】
作物害虫が昆虫である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
作物害虫がダニである請求項６に記載の方法。
【請求項９】
動物寄生虫が蠕虫である請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチドがアセチルコリンの結合性ミメティックであって、この神経伝達物質の正常機能、アセチルコリンとその受容体の相互作用、及びアセチルコリンエステラーゼによるアセチルコリンの分解を妨害する結合性ミメティックであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドがアセチルコリンエステラーゼの阻害剤であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドがアミノ酸配列 ＳＶＳＶＧＭＫＰＳＰＲＰ 又はコンストレインドアミノ酸配列 ＣＳＩＮＷＲＨＨＣ を含有するものであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ペプチドがアミノ酸配列 ＳＩＮＷＲＨＨ を含有するものであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ペプチドが駆虫剤レバミゾールの結合性ミメティックであって、アセチルコリン受容体の正常機能又はレバミゾールが結合する別の部位の正常機能を妨害する結合性ミメティックであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ペプチドがアミノ酸配列 ＣＴＴＭＨＰＲＬＣ 又は ＴＴＭＨＰＲＬ を含有するものであることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
植物が、前記のペプチドをコードする核酸を用いて形質転換されているものであることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記の形質転換植物が宿主動物の食物作物である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペプチドが、宿主動物の食物サプリメントとして使用し得る形質転換微生物によって発現されるものであることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
１２，０００ダルトン以下の分子量を有し、アミノ酸配列ＳＩＮＷＲＨＨ、ＳＶＳＶＧＭＫＰＳＰＲＰ 又は ＴＴＭＨＰＲＬを含有するペプチド。
【請求項２０】
アミノ酸配列 ＣＳＩＮＷＲＨＨＣ 又はＣＴＴＭＨＰＲＬＣを含有する請求項１９に記載のペプチド。
【請求項２１】
請求項１９又は２０に記載のペプチドの１つ又はそれ以上の反復をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項２１に記載のポリヌクレオチドを含有し、転写開始領域に操作して結合された発現用組立て体。
【請求項２３】
請求項２２に記載の発現用組立て体を含有するベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載のベクターを含有する微生物。
【請求項２５】
請求項２２に記載の発現用組立て体又は請求項２３に記載のベクターを用いて形質転換された生物。
【請求項２６】
細菌、酵母、真菌、昆虫、植物、又は細胞培養によって得られる細胞であることを特徴とする請求項２５に記載の生物。
【請求項２７】
植物であることを特徴とする請求項２６に記載の生物。
【請求項２８】
ジャガイモ植物であることを特徴とする請求項２７に記載の生物。
【請求項２９】
作物害虫又は動物寄生虫に対して活性なペプチドであり、前記の害虫又は寄生虫の感覚器から出発して逆行性神経輸送を介して取り込ませることができ且つ前記の害虫又は寄生虫のニューロン内に入った後にその効果を発揮させることができるペプチドの同定方法であって、
ａ） 前記の害虫又は寄生虫から標的化合物の単離懸濁物を取得し（但し、前記化合物は殺虫剤の標的であることが知られているものであるか又は該化合物は阻害されるならば前記の害虫又は寄生虫の神経機能を阻害するものである）；
ｂ） 前記標的化合物に対するファージペプチド又はタンパク質ライブラリーからファージ類をバイオパニングし；
ｃ） 前記標的化合物に結合するファージ類を単離し；
ｄ） 得られたファージからペプチドインサートを単離し；
ｅ） 前記ペプチドインサートを配列決定し；
ｆ） この配列に従ってある一定量のペプチドを合成し；
ｇ） 前記の量を挙動バイオアッセイで試験し；且つ
ｈ） 前記の量が化学受容に悪影響を及ぼす場合に、前記ペプチドを同定する
工程からなる作物害虫又は動物寄生虫に対して活性なペプチドの同定方法。
【請求項３０】
標的化合物がアセチルコリンエステラーゼである請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
標的化合物がニコチン性アセチルコリン受容体である請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
標的化合物が、感覚子受容体分子、順行又は逆行輸送モーター、キネシン、ダイニン、ダイナクチン、及び作物害虫又は動物寄生虫特異的ハウスキーピング化合物からなる群から選択されるものである請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の方法によって同定されたペプチド。
【請求項３４】
請求項１９、２０又は３３のいずれか１項に記載のペプチドを含有してなる医薬組成物。
【請求項３５】
宿主動物に対する経口、非経口又は局所投与に適した組成物であって、請求項１９、２０又は３３のいずれか１項に記載のペプチドと、製薬学的に許容し得る賦形剤とを含有してなる組成物。
【請求項３６】
請求項２７に記載の植物の宿主動物用食物作物としての使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、神経伝達プロセスに影響を及ぼし且つ感覚ニューロンの神経終末を介して取り込ませることができる化合物を害虫に施用することによる害虫の効果的な防除に関する。本発明の一つの態様においては、前記害虫は、作物害虫、特に植物寄生線虫、節足動物、クモ類、昆虫、軟体動物などであり、これらの害虫はそのニューロンを介してタンパク質又はペプチドを取り込むことができる。本発明の別の態様においては、前記と同じニューロンのタンパク質又はペプチド取り込みは、動物又は人間の寄生虫である害虫、特に線虫、扁形動物、昆虫などによるものであり、これらの害虫はそのニューロンを介してタンパク質又はペプチドを取り込むことができる。特に、本発明は、作物害虫の神経伝達を阻害することができる、特に 線虫の化学受容を阻害することができるタンパク質又はペプチドを産生する形質転換植物すなわちトランスジェニック植物に関する。かかる阻害（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）は、例えば植物作物害虫がトランスジェニック植物の内部又は外部寄生虫になる場合に生じる。宿主の消化管に生息する動物寄生虫については、かかる阻害は、タンパク質又はペプチドを発現するトランスジェニック植物あるいはかかる植物から誘導される産生物を宿主が摂取する場合に生じる。動物及び人間の寄生虫の全てについて、かかる阻害は、医薬が前記のタンパク質又はペプチドを発現するトランスジェニック植物又は微生物から該タンパク質又はペプチドを抽出することによって調製されるものである場合に生じる。この場合、かかる医薬は、食品添加物として使用できるし、又はかかる化合物が現在使用されている種々の方法のいずれかの方法で提供される抗寄生虫性タンパク質又はペプチド薬物として使用できる。
【０００２】
背景技術
本発明は、オックスフォードコンサイス辞典に“迷惑な又は有害な動物”として定義されている害虫を防除するための新規な原理（ｂａｓｉｓ）を提供する。特に、本発明は、作物に被害を与える有害動物（作物害虫）の防除、あるいは人間又は動物、特に家畜及び伴侶動物（コンパニオンアニマル）に寄生する有害動物の防除に関する。作物害虫の襲撃又は感染から作物植物を保護する方法の大部分は、殺虫剤（ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ）の施用を取り扱っている。ほとんどの場合に、殺虫剤は有機化学分子であり、保護すべき必要がある生物を害虫が襲撃する場所で局所施用する必要がある。植物の場合には、このことは、前記の化学物質を作物に噴霧すること、植物の散水中に施用すること又は土壌中に取り込ませることを意味する。このようにして施用される殺虫剤は、風、雨及び土壌地下水への漏出による分散並びに生物学的プロセスによる分解に暴露されることから、規則正しい間隔で施用しなければならないことが多い。殺虫剤の単回施用及び反復施用は、種々の有毒性の及び環境上の脅威を構成する。農業労働者は、前記化合物を取り扱い、施用する場合に、慢性的な影響又は場合によっては中毒作用による危険さえも覚悟している。環境上の危険は、噴霧液ドリフト、非対象領域への分散又は非対象生物への無用な毒性に起因して生じる。前記化合物は土壌中に残存するかもしれないし、あるいは水道水又は地下水に接近するかもしれない。この最後の対象は、Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ， Ｄ．Ｉ．， １９９３（Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ ｉｎ ｄｒｉｎｋｉｎｇ ｗａｔｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ： Ｖａｎ Ｎｏｓｔｒａｎｄ Ｒｅｉｎｈｏｌｄ）によって詳細に取り上げられている。
【０００３】
好ましい方法は、植物が生物農薬すなわちバイオ農薬（ｂｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅ）〔すなわち、インプランタ農薬（ａ ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ ｉｎ ｐｌａｎｔａ）〕を作ることである。この点で、タンパク性農薬が都合がよい。その理由は、タンパク性農薬は、特異的酵素又は基質を必要とせずに組換えＤＮＡ技術によって植物中で発現させることができ、しかも環境中での寿命が短く、従って環境に与える害がより少ないからである。
【０００４】
しかし、知られているタンパク質性又はペプチド作用性の農薬はほんの数種だけである。前記農薬のうちのあるものは毒素であり、その中で破傷風毒素及びバシラス・スリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）由来の毒素が最もよく知られ、施用されている群を形成している。多数のシステインに富む殺菌性及び抗菌性ペプチドが、植物から、特に種子から単離されている〔Ｇａｒｃｉａ−Ｏｌｍｅｄｏ， Ｆ．， Ｍｏｌｉｎａ， Ａ．， Ａｌａｍｉｌｌｏ， Ｊ．Ｍ．， Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｐａｌｅｎｚｕｅｌａ， Ｐ． （１９９８） Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ４７， ４７９−４９１； Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ， Ｗ．Ｆ．， Ｃａｍｍｕｅ， Ｂ．Ｐ．Ａ．， ＤｅＢｏｌｌｅ， Ｍ．Ｆ．Ｃ．， Ｔｈｅｖｉｓｓｅｎ， Ｋ．， ＤｅＳａｍｂｌａｎｘ， Ｇ．Ｗ．， Ｏｓｂｏｒｎ， Ｒ．Ｗ． （１９９７） Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ， Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６， ２９７−３２３〕。これらのペプチドは、相同性に基づいてチオニン類、脂質輸送タンパク質類及び植物デフェンシン類を含めて８種類に分類される。これらのペプチドは全て、ジスルフィド架橋によって安定化されたコンパクトな構造であり、２〜９ｋＤａの大きさの範囲に入る。これらのペプチドは、永久的な病原体防御物及び誘導性病原体防御物の一部分である。
【０００５】
これらのペプチドの例として、ソラマメ由来のファバチン類（アミノ酸４７個の長さをもち、細菌に対して活性である）〔Ｚｈａｎｇ， Ｙ． ａｎｄ Ｌｅｗｉｓ， Ｋ． （１９９７） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １４９， ５９−６４〕、大根由来のデフェンシンと呼ばれる小さな（５ｋＤａ）、システインに富む抗菌性タンパク質〔Ｔｅｒｒａｓ， Ｆ．Ｒ．Ｇ．， Ｅｇｇｅｒｍｏｎｔ， Ｋ．， Ｋｏｖａｌｅｖａ， Ｖ．， Ｒａｉｋｈｅｌ， Ｎ．Ｖ．， Ｏｓｂｏｒｎ， Ｒ．Ｗ．， Ｋｅｓｔｅｒ， Ａ．， Ｒｅｅｓ， Ｓ．Ｂ．， Ｔｏｒｒｅｋｅｎｓ， Ｓ．， Ｖａｎｌｅｕｖｅｎ， Ｆ．， Ｖａｎｄｅｒｌｅｙｄｅｎ， Ｊ．， Ｃａｍｍｕｅ， Ｂ．Ｐ．Ａ．， Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ， Ｗ．Ｆ． （１９９５） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ７， ５７３−５８８〕、オオムギ及びトウモロコシ由来の、細菌性植物病原体及び真菌性植物病原体の両方に活性をもつ脂質輸送タンパク質〔Ｍｏｌｉｎａ， Ａ．， Ｓｅｇｕｒａ， Ａ．， Ｇａｒｃｉａ−Ｏｌｍｅｄｏ， Ｆ． （１９９３） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３１６， １１９−１２２〕が挙げられる。
【０００６】
これまでに単離された最も小さい植物由来の抗菌性ペプチドは、ホウセンカ（Ｉｍｐａｔｉｅｎｓ ｂａｌｓａｍｉｎａ）の種子由来のものである〔Ｔａｉｌｏｒ， Ｒ．Ｈ．， Ａｃｌａｎｄ， Ｄ．Ｐ．， Ａｔｔｅｎｂｏｒｏｕｇｈ， Ｓ．， Ｃａｍｍｕｅ， Ｂ．Ｐ．Ａ．， Ｅｖａｎｓ， Ｉ．Ｊ．， Ｏｓｂｏｒｎ， Ｒ．Ｗ．， Ｒａｙ， Ｊ．Ａ．， Ｒｅｅｓ， Ｓ．Ｂ．， Ｂｒｏｅｋｅａｒｔ， Ｗ．Ｆ． （１９９７） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７２， ２４４８０−２４４８７〕。４種類の密接に関連したペプチドそれぞれは、アミノ酸２０個からなり、一連の真菌類及び細菌類に対して阻害性である。それぞれのペプチドはジスルフィド結合を２個有し、しかも４種類のペプチド全部が、前駆体タンパク質を生成する単一の転写物によってコードされ、後に操作されて個々のペプチドを放出する。
【０００７】
また、非植物源由来の抗菌性ペプチドもトランスジェニック植物中で発現されている。カブトガニから単離された２．３ｋＤａペプチドであるタキプレシンは、ジャガイモ中で発現され、軟腐病に対する抵抗性の増大をもたらしている〔Ａｌｌｅｆｓ， Ｓ．Ｊ．Ｈ．Ｍ．， ＤｅＪｏｎｇ， Ｅ．Ｒ．， Ｆｌｏｒａｃｋ， Ｄ．Ｅ．Ａ．， Ｈｏｏｇｅｎｄｏｏｒｎ， Ｃ．， Ｓｔｉｅｋｅｍａ， Ｗ．Ｊ． （１９９６） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ２， ９７−１０５〕。
【０００８】
アフリカツメガエル由来の抗菌性ペプチドであるマゲイニンＩＩを発現するジャガイモ系統が生産されており〔Ｂａｒｒｅｌｌ， Ｐ．Ｊ．， Ｃｏｎｎｅｒ， Ａ．Ｊ， Ｈｉｃｋｆｏｒｄ， Ｊ．Ｇ．Ｈ． （１９９９） ＭＰＭＩ ９ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ １８．１６〕、また３８アミノ酸溶菌ペプチドであるセクロピンＢは、トランスジェニックタバコの細菌性立枯れ病に対して高められた抵抗性を付与する〔Ｊａｙｎｅｓ， Ｊ．Ｍ．， Ｎａｇｐａｌａ， Ｐ．， ＤｅＳｔｅｆａｎｏ−Ｂｅｌｔｒａｎ， Ｌ．， Ｈｕａｎｇ， Ｊ．Ｈ．， Ｋｉｍ， Ｊ．Ｈ．， Ｄｅｎｎｙ， Ｔ． Ｃｅｔｉｎｅｒ， Ｓ． （１９９３） Ｐｌａｎｔ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ８９， ４３−５３〕。
【０００９】
また、ある種の植物病原体又は害虫のキチン質外皮を破壊できるキチナーゼのような酵素が頻繁に施用されている。しかし、多くの場合、これらの公知のタンパク質は、病原体又は害虫の襲撃を防止及び／又は停止させるほど十分に強力ではない。
【００１０】
特に、前記のタンパク質又はペプチドは、作物害虫である植物寄生線虫に対して活性であるべきである。これらの害虫は、植物の内部寄生虫、外部寄生虫及び外部−内部寄生虫に細分できる。害虫のあるものは定住性であり、またあるものはエサを食べるのにつれて移動し続ける。害虫は全て、植物細胞壁に穴をあけるのに吻針（ｓｔｙｌｅｔ）を使用し、植物細胞変化（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の前後に植物細胞の内容物を取り出すことによってエサを食べる〔Ｓｙｍｏｎｓ， Ｐ．Ｃ． Ａｔｋｉｎｓｏｎ， Ｈ．Ｊ． ａｎｄ Ｗｙｓｓ， Ｕ． ［１９９４］ Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３２， ２３５−２５９〕。具体的な重要な害虫の属及び種の詳細、その宿主の範囲及び経済的重要性は、標準的な教科書に定義されている〔Ｌｕｃ ｅｔ ａｌ ［１９９０］ Ｐｌａｎｔ ｐａｒａｓｉｔｉｃ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ ｉｎ ｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ ａｎｄ ｔｒｏｐｉｃａｌ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ： Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ Ｃ．Ａ．Ｂ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ； Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ ［１９９３］ Ｐｌａｎｔ ｐａｒａｓｉｔｉｃ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ ｉｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｅ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ：ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ〕。ヘテロデラ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ）属及びグロボデラ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ）属のシストセンチュウが重要な作物害虫である。これらの線虫としては、ダイズシストセンチュウ（Ｈ． ｇｌｙｃｉｎｅｓ）、テンサイシストセンチュウ（Ｈ． ｓｃｈａｃｈｔｉｉ）、ムギシストセンチュウ（Ｈ． ａｖｅｎａｅ） 及びジャガイモシストセンチュウ（Ｇ． ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ） 及び シロシストセンチュウ（Ｇ． ｐａｌｌｉｄａ）が挙げられる。ネコブセンチュウ、特にキタネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）属は、広範な作物に被害を及ぼす。その例は、ジャワネコブセンチュウ（Ｍ． ｊａｖａｎｉｃａ）、キタネコブセンチュウ（Ｍ． ｈａｐｌａ）、アレナリアネコブセンチュウ（Ｍ． ａｒｅｎａｒｉａ）及びサツマイモネコブセンチュウ（Ｍ． ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）である。その他に多数の経済的に重要な線虫が存在する。前記の群は両方共に、その他の経済上の属、例えば
Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ、Ｎａｃｏｂｂｕｓ及びＴｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓのように、増大した定住性の雌を産生する。その他の経済上の線虫は雌性成虫のように移動性であり、これらの多くは種々様々な作物に被害を与える。例としては、クキセンチュウ（Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ）、Ｒａｄｏｐｈｏｌｏｕｓ、ネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）、Ｈｅｌｉｃｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ及び
Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎｉｅｌｌａ種が挙げられる。その他の種は必ずしも植物内に入り込まないが、外部寄生虫として植物からエサを取る。その例としては、ハガレセンチュウ（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ）科、アングイナ（Ａｎｇｕｉｎａ）科、クリコネマ（Ｃｒｉｃｏｎｅｍｏｉｄｅｓ）科、Ｃｒｉｃｏｎｅｍａ Ｈｅｍｉｃｙｃｌｉｐｈｏｒａ、Ｈｅｍｉｃｒｉｃｏｎｅｍｏｉｄｅｓ、パラティレンクス（Ｐａｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）及びＢｅｌｏｎｏｌａｉｍｕｓが挙げられる。外部寄生虫の中から、
Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ、Ｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ、Ｐａｒａｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ及びＰａｒａｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ属は特有の重要性を有する。これらは、作物を食することによって被害を及ぼすが、作物害虫としてのその経済的立場は、ＮＥＰＯ及びＴＯＢＲＡ植物ウイルスのベクターとしての役割によることが多い。
【００１１】
他の種々様々な無脊椎動物もまた作物害虫である。これらの作物害虫としては、種々様々な昆虫、特に直翅目、半翅目、双翅目、鞘翅目及び鱗翅目並びに幾つかの小数の目、例えば総翅目及びトビムシ目が挙げられる。また、数種は、動物の寄生虫、特に管クラゲ目、シラミ目及び幾つかの双翅目である。クモ形類動物もまた重要な害虫である。特に、この例として、作物害虫及び動物の外部寄生虫であるダニ類並びに動物の外部寄生虫であるマダニ類が挙げられる。全ての節足動物は、よく定義された化学受容器を持つ場合が多く、しかも感覚化学物質がこれらの節足動物にとって食物及び仲間を確認するのに重要である。本発明が関連する全ての多細胞無脊椎動物と同様に、その化学受容器はニューロンを有する〔Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈ Ｖ．Ｂ． ［２０００］ Ｉｎｓｅｃｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ９ｔｈ ｅｄ． Ｌｏｎｄｏｎ Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ〕。害虫である種々様々な昆虫及びその他の節足動物は標準的な教科書に定義されている〔Ｈｉｌｌ Ｄ．Ｓ． ［１９８３］ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｉｎｓｅｃｔ ｐｅｓｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒｏｐｉｃｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ２ｎｄ ｅｄ． Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ． Ｊｏｎｅｓ， Ｆ．Ｇ．Ｗ． ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ， Ｍ．Ｇ． ［１９８４］ Ｐｅｓｔｓ ｏｆ Ｆｉｅｌｄ Ｃｒｏｐｓ， ３ｒｄ ｅｄ． Ｌｏｎｄｏｎ Ｅｄｗａｒｄ Ａｒｎｏｌｄ． Ｈｉｌｌ Ｄ．Ｓ． ［１９８７］ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｉｎｓｅｃｔ ｐｅｓｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．〕。軟体動物の大部分は海洋に生息するが、多くの腹足類軟体動物は陸上に存在し、通常、ナメクジ及びカタツムリと呼ばれる。これらの多くは、かなり経済的に重要な作物害虫であり、これらは化学受容のよく発達した感覚を有する〔Ｇｏｄａｎ， Ｄ． ［１９８３］ Ｐｅｓｔ Ｓｌｕｇｓ ａｎｄ Ｓｎａｉｌｓ， ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ， ４４５ｐｐ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｅｒｌｉｎ， Ｓｏｕｔｈ， Ａ． ［１９９２］ Ｔｅｒｒｅｓｔｒｉａｌ ｓｌｕｇｓ， ｂｉｏｌｏｇｙ， ｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ， ４２８ｐｐ， Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ， Ｌｏｎｄｏｎ〕。ミミズなどの多くの貧毛類軟体動物は、有益な無脊椎動物であるが、数種（例えば、ｅｎｃｈａｅｔｒｉｄ ｗｏｒｍｓ）は根を食べ、作物害虫であり得る。環形動物もまた化学受容器をもっている。
【００１２】
節足動物、特に昆虫の場合、一般的に施用される殺虫剤の幾つかは、線虫と昆虫の両方に対して活性である。本発明に特に関連する殺虫剤について、オキシムカルバメート系のアルジカルブは低濃度で線虫及び昆虫の両方に対して有効であり、両方のタイプの作物害虫を防除するのに商業的に使用されている。
【００１３】
線虫は、神経系の多数の特徴（ａｓｐｅｃｔ）を含めて保存された組織を共有する〔Ａｓｈｔｏｎ， Ｆ．Ｔ． Ｌｉ， Ｊ． ａｎｄ Ｓｃｈａｄ， Ｇ．Ａ． （１９９９） Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ， ８４， ２９７−３１６〕。これらの線虫及びその他の寄生虫の寿命及び病原性の詳細は、標準的な教科書に示されている。その例は： Ｓｃｈｍｉｄｔ， Ｇ．Ｍ． ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｌ．Ｓ． （１９８９） Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ， Ｔｉｍｅｓ Ｍｉｒｒｏｒ／Ｍｏｓｂｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， Ｕ．Ｓ．Ａ． 及び Ｕｒｑｕｈａｒｔ， Ｇ．Ｍ． ｅｔ ａｌ （１９８７） Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ， Ｌｏｎｇｍａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｕ．Ｋ．である。
【００１４】
人間及び動物の線虫寄生虫は、線虫の数種の群において見出される。これらの線虫寄生虫として、回虫目、例えば豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ ｓｕｕｍ）、回虫（Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、鶏回虫（Ａｓｃａｒｉｄｉａ ｇａｌｌｉ）、アニサキス種（Ａｎｉｓａｋｉｓ ｓｐｐ）、馬回虫（Ｐａｒａｓｃａｒｉｓ ｅｑｕｏｒｕｍ）、犬回虫（Ｔｏｘｏｃａｒａ ｃａｎｉｓ）、猫回虫（Ｔ． ｃａｔｉ）、牛回虫 （Ｔ． ｖｉｔｕｌｏｒｕｍ）及び犬小回虫（Ｔｏｘａｓｃａｒｉｓ ｌｅｏｎｉｎｅ）が挙げられる。別の重要な群は毛様線虫属（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）である。その例は、ネマトディルス・バツス（Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ ｂａｔｔｕｓ）、ネマトディルス・スパティガー（Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ ｓｐａｔｈｉｇｅｒ）、細頸毛円虫（Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ ｆｉｌｉｃｏｌｌｉｓ）、捻転胃虫（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）、蛇状毛様線虫（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ）、トリコストロンギルス・テヌイス（Ｔ． ｔｅｎｕｉｓ）、トリコストロンギルス・カプリコラ（Ｔ． ｃａｐｒｉｃｏｌａ）、トリコストロンギルス・ファルカツス（Ｔ． ｆａｌｃａｔｕｓ）、トリコストロンギルス・ルガツス（Ｔ． ｒｕｇａｔｕｓ）、トリコストロンギルス・アクセイ（Ｔ． ａｘｅｉ）、オステルタギア・オステルタギ（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ ｏｓｔｅｒｔａｇｉ）、オステルタギア胃虫（Ｏ． ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）、オステルタギア・トリフルカータ（Ｏ． ｔｒｉｆｕｒｃａｔａ）、牛腸結節虫（Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍ ｒａｄｉａｔｕｍ）及びクーペリア・クチセイ（Ｃｏｏｐｅｒｉａ ｃｕｔｉｃｅｉ）である。さらに、別の群は、糞線虫属、例えば糞線虫（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ）、豚糞線虫（Ｓ． ｒａｎｓｏｍｉ） 及び乳頭糞線虫（Ｓ． ｐａｐｉｌｌｏｓｕｓ）である。鉤虫、例えばアメリカ鉤虫（Ｎｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｉｓ）、ズビニ鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）、セイロン鉤虫（Ａ． ｃｅｙｌａｉｔｉｃｕｍ）、ブラジル鉤虫（Ａ． ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｅ）、犬鉤虫（Ａ． ｃａｎｉｎｕｍ） 及び牛鉤虫種（Ｂｕｎｏｓｔｏｍｕｍ ｓｐｐ）もまた動物寄生線虫である。さらに２つの群、鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒａｔａ）目、例えば鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ ｔｒｉｃｈｕｒｉａ）、豚鞭虫（Ｔ． ｓｕｉｓ）、羊鞭虫（Ｔ． ｏｖｉｓ）、肝毛頭虫（Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ ｈｅｐａｔｉｃａ）、有環毛細線虫（Ｃ． ａｎｎｕｌａｔａ）及び有環毛細線虫（Ｃ． ｃａｕｄｉｎｆｌａｔａ） 並びに蟯虫目、例えば鶏盲腸虫（Ｈｅｔｅｒａｋｉｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、馬蟯虫（Ｏｘｙｕｒｉｓ ｅｑｕｉ）、蟯虫（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ） 及びエンテロビウス・グレゴリイ（Ｅ． ｇｒｅｇｏｒｉｉ）に入る。
【００１５】
現在、寄生虫病の防除は、薬物の使用、中間宿主の防除及び生活環境、特に衛生の改善に大きく依存している。現在使用されている駆虫薬としては、下記のもの：すなわち、（１）ベンズイミダゾール類（これらはβ−チューブリンを選択的に結合し、微小管産生、グルコース摂取及び酵素分泌を阻害する）；（２）レバミゾール（これはアセチルコリン作動薬であり、フマル酸レダクターゼである）；（３）ピペラジン（これはＧＡＢＡ作動薬である）；（４）大環状ラクトン（例えば、イベルメクチン及びミルベマイシン）が挙げられる。これらは、グルタミン酸型塩素イオンチャンネルの開口を促進する。
【００１６】
医薬として経口投与されるか抗寄生虫性タンパク質薬物又は寄生された動物用の食物として使用される植物において発現される抗寄生虫性タンパク質薬物が、寄生虫に対する治療を提供できることが明らかにされている（Ａｔｋｉｎｓｏｎらの米国特許第５，８６３，７７５号明細書）。また、プロテイナーゼ阻害剤などのある種のタンパク質が、マラリアを引き起こす生物であるマラリア原虫に対して、その宿主の血流中に注射の後に有効であることが明らかにされている〔Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ， Ｐ．Ｊ． Ｌｅｅ， Ｇ．Ｋ． Ｓｍｉｔｈ， Ｒ．Ｅ． ［１９９３］ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｎｃｋｅｉ ｃｙｓｔｅｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｃｕｒｅｓ ｍｕｒｉｎｅ ｍａｌａｒｉａ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ， ９１， １０５２−１０５６〕。
【００１７】
薬物治療は、一般に高価であり、その目的が予防であろうと、治療であろうと頻繁に反復される必要があり得る。第三世界では、診断専門知識及び適切な薬剤の入手可能性について物流上の（ｌｏｇｉｓｔｉｃａｌ）問題がある場合が多く、ある種の薬物については医療監視が必要である。さらなる問題は、幾つかの薬剤耐性の例である。前記の理由の全てについて、寄生虫防除を提供する医薬用の新規で且つ改良されたな基剤（ｂａｓｅ）に対する絶え間ない探索が続いている。
【００１８】
従って、作物植物に対する新規な殺虫剤並びに動物及び人間の寄生虫に対して有効な新規分子に対する要求がさらに存在している。
【００１９】
発明の概要
本発明者らは、今般、作物害虫及び線虫などの寄生虫を低濃度のペプチドに暴露させると、これらの作物害虫及び寄生虫の化学受容に影響を及ぼすことができることを意外にも見出した。化学受容を阻害するある種の殺虫剤（例えば、アルジカルブ）又は抗寄生虫剤（例えば、レバミゾール）の結合性ミメティック（ｍｉｍｅｔｉｃ）であるペプチドが特に有用である。この化学受容の阻害は、化学受容器に関連するある種のニューロンによる１２ｋ Ｄａ以下の分子の取り込みに関連する。この化学受容の阻害は、これらの害虫及び寄生虫を防除する新規な手段並びに新規な殺虫剤又は抗寄生虫剤の発見に対する新規な関心の的を提供する。この化学受容の阻害は、ニューロンの機能を妨害するための新規な標的の同定を支持する取り込みの方法を明らかにする。適当な大きさの抗寄生虫性ペプチド又はタンパク質は、この取り込み経路によって送達させ得る。このアプローチは、かかるペプチド又はタンパク質を発現するトランスジェニック植物を保護するのに使用できる。また、本発明は、動物寄生虫の防除も提供できる。ペプチド又はタンパク質を発現するトランスジェニック植物は食品添加剤として使用できる。また、前記のタンパク質又はペプチドは、かかる植物中で又は微生物中で調製し得るし、医薬として使用できるし又は抗寄生虫剤を投与する別の種々の方法で使用できる。
【００２０】
また、農薬の結合性ミメティックとして、特にアルジカルブ及びレバミゾールの結合性ミメティックとして作用する新規なペプチドが提供される。本発明の別の部分は、前記の新規ペプチドを発現するベクターであり且つこれらのベクターを用いて形質転換させた植物である。また、作物害虫抵抗性を付与するためのペプチドの使用も、本発明の一部である。さらにまた、前記ペプチドは、医薬組成物に使用できるし、あるいは動物又は人間において寄生虫防除を提供するための食品又は食料に使用できる。
【００２１】
図面の簡単な説明
図１：蛍光色素ＦＩＴＣで“満たされた”２匹のダイズシストセンチュウ（Ｈ． ｇｌｙｃｉｎｅｓ）（Ａ及びＢ）の感覚樹状突起（Ｄ）及び細胞本体（ＣＢ）を表す。前記色素は頭部感覚子（アンフィド）（Ａｍ）から細胞体（ＣＢ）までニューロンを下方に伸び、次いで交連（ＣＳ）を経由して伸びる。軸索は神経環（ＮＲ）に入る。線虫Ｂでは、標識された細胞体（ＣＢ）及び交連（ＣＳ）が、神経環に対する直接連結を有することを認めることができる。この連結は線虫Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓのＡＤＬニューロンに類似している。この図は左側面であり、スケールバーは１０μｍである。ジメチルホルムアミドに５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解したＦＩＴＣのアリコート５０μＬをＭ９緩衝液２００μｌに加え、線虫を暗中で室温で１〜１６時間インキュベートした。インキュベーションを、０．４５μｍミニフィルターチューブ中で行い、染色液の除去を促進し、次いで洗浄した。線虫をスライドガラス上に乗せ、顕微鏡下でエピルミネーション（ｅｐｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）とＦＩＴＣ蛍光用フィルター（４００×、Ｌｅｉｔｚ ＤＭＲ Ｂ）とを使用して観察した。画像は、ＰＣ走査Ｌｅｉｃａ ＱＷｉｎ 画像分析ソフトウエアに接続したＣＣＤカメラ（Ｃｏｈｕ）を使用して取り込んだ。
【００２２】
図２：１ｍｇ／ｍｌのビスベンズアミド中、暗中で室温で１６時間インキュベートした後のダイズシストセンチュウ（Ｈ． ｇｌｙｃｉｎｅｓ）の感染段階を表す。化学感覚神経細胞体（ＣＢ）が染色され、明確に肉眼で見ることができる。吻針（ｓｔｙｌｅｔ）（Ｓ）が自家蛍光により肉眼で見ることができる。ＦＩＴＣフィルターをＵＶフィルターに代えた以外は図１に記載のようにして顕微鏡でセンチュウを見た。スケールバーは１０μｍである。
【００２３】
図３：Ｍｒ １２ｋＤａのＦＩＴＣ／デキストラン複合物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）（Ｓｉｇｍａ社製）で満たされたセンチュウの感覚樹状突起（Ｄ）を表す。前記色素が上記樹状突起内に明確に肉眼で見ることができ、頭部感覚子（Ａｍ）から細胞体（ＣＢ）までの前記化合物の輸送を反映している。この色素はまた、センチュウによって飲み込まれることによって、咽頭の細胞内腔（Ｌ）においても肉眼で見ることができる。スケールバーは２０μｍである。センチュウ（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）を種々のサイズのＦＩＴＣ／デキストラン中でインキュベートして、感覚ニューロンの除外限界を確認した。デキストランをＰＢＳに１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、センチュウを、０．４５μｍミニフィルターチューブ中で、暗中で、室温で１６時間インキュベートした。センチュウを図１に記載のようにして観察した。
【００２４】
図４：種々の濃度のアルジカルブ（●）、アルジカルブのコンストレインド（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ペプチドミメティック（○）及び線状ペプチドミメティック（□）中でインキュベートした後のダイズシストセンチュウ（Ｈ． ｇｌｙｃｉｎｅｓ）の誘引物質ディスク（ａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｄｉｓｃ）に対する応答を表す。曲線は、プロビット分析により適合され、バーはＳＥＭ値である。
【００２５】
図５：対照に対する、ダイズシストセンチュウ（Ｈ． ｇｌｙｃｉｎｅｓ）感染性幼虫の誘引物質含有ディスク下に集合する能力に対するレバミゾール中での予備インキュベーションの影響（詳細については実施例３参照）を表す。点線（比率１）は、誘引がないことを表す。
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明は、寄生虫、病原体又は害虫であり且つそのニューロンを介してタンパク質又はペプチドを取り込むことができる無脊椎動物の全ての種類に適用することができる。これらの病原体として、線虫、条虫、扁形動物、節足動物、昆虫、クモ類、軟体動物、環形動物などが挙げられる。
【００２７】
全ての植物寄生線虫は、その宿主及び仲間を確認するために化学受容を使用していると思われ、こうした時及び食餌の場所に移動する間には、阻害に対して特に感受性で有り得る〔Ｐｅｒｒｙ Ｒ．Ｎ． ［１９９６］ Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ３４， １８１−１８９〕。昆虫もまた、食物の場所の確認、摂食及び仲間の位置の確認などの活動において化学受容に依存することが知られている〔Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈ Ｖ．Ｂ． ［２０００］ Ｉｎｓｅｃｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ９ｔｈ ｅｄ． Ｌｏｎｄｏｎ Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ〕。化学受容器は、本発明が適用される無脊椎動物の全ての群に重要である。例えば、化学受容は、動物寄生線虫の寿命全体を通じて必須の要件である。その動物寄生線虫のあるものは、適当な宿主を特定し、それに侵入しなければならないし、また動物寄生線虫は全てその宿主内の場所にいるのに気付き、そして自分自身を養うことを必要とする。また、多くは寿命を全うするために宿主内で複雑な移動をとる。宿主の場所で寄生虫として最適な位置を維持する必要がある。成熟した成虫は、化学受容を使用して交尾で互いの位置を確認する。また、多くの線虫は、化学感覚信号に応答して脱皮する。化学受容に影響を及ぼすと、寿命の途絶を可能にする。従って、本発明の幾つかの態様は、動物寄生虫の防除のために実用性を有する。
【００２８】
本発明の化合物は、合成後に多くの方法で使用できる。本発明の化合物は、駆虫薬又は殺虫剤として、局所投与できるし、あるいは寄生虫又は植物の害虫の場所、例えば植物を取り囲む土壌及び他の環境で投与することができる。また、本発明の化合物は、医薬又は薬剤として局所に、動物又は人間に注射又は経口投与することによって使用することもできる。本発明の化合物は、寄生虫又は作物害虫に関して予防又は治療処置を提供できる。また、本発明の化合物は、精製可能な物質又は前記の用途の抽出物を得るためにトランスジェニック生物によって産生されることができる。また、本発明の化合物は、トランスジェニック植物をその病原体、寄生虫又は害虫から保護するための生物農薬（バイオ農薬）としてインプランタ（ｉｎ ｐｌａｎｔａ）で製造することができる。これは生物農薬の構成性又は組織特異的発現を伴うことができる。発現は、病原体、寄生虫又は害虫の襲撃に応じることもでき、おそらくは感染の部位に限定され得るであろう。好ましい態様においては、線虫の感染防除用の新規な殺虫剤が提供される。植物寄生線虫は重要な植物害虫であり、地球上で、毎年少なくとも１０００億ドルの作物損失を引き起こしている〔Ｊ．Ｎ． Ｓａｓｓｅｒ， Ｗ．Ｎ． Ｆｒｅｃｋｍａｎ， ｉｎ： Ｖｉｓｔａｓ ｏｎ Ｎｅｍａｔｏｌｏｇｙ， Ｊ．Ａ． Ｖｅｅｃｈ， Ｄ．Ｗ． Ｄｉｃｋｓｏｎ， Ｅｄｓ．， Ｓｏｃ． Ｎｅｍａｔｏｌ．， Ｈｙａｔｔｓｖｉｌｌｅ， ＭＤ， １９８７， ｐｐ．７−１４〕。化学的殺線虫剤は、環境及び毒性上の危険に対して高まりつつある関心の的である。従って、政府による規制の変化の結果として、使用を積極的に中止する新しい歴史がある。今般、ペプチド類が線虫のニューロンによって取り込まれ得ることが知見された。線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）に関しては、Ｂａｒｇｍａｎｎ とＭｏｒｉ によって前部感覚器（頭部感覚子又は感覚毛）に関連した化学受容性ニューロンの機能が明らかにされている〔Ｂａｒｇｍａｎｎ， Ｃ．Ｉ． ａｎｄ Ｍｏｒｉ， Ｌ．， ｉｎ： Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ ＩＩ， Ｄ．Ｌ． Ｒｉｄｄｌｅ， Ｔ． Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ， Ｂ．Ｊ． Ｍｅｙｅｒ， Ｊ．Ｒ． Ｐｒｉｅｓｓ， Ｅｄｓ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ．７１７−７３８， １９９７〕。これらのニューロンは、動物寄生線虫のおそらくは相同性のニューロンのように、色素フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）を“満たす（ｆｉｌｌ）”ことが明らかにされている〔Ｈｅｄｇｅｃｏｃｋ， Ｅ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １１， １５８， １９８５； Ａｓｈｔｏｎ， Ｆ．Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｖｅｔ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．， ８４， ２９７， １９９９〕。今般、線虫（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）の化学受容性ニューロンもまた４４００ダルトン、少なくとも１２０００ダルトンの分子量をもつ ＦＩＴＣ／デキストラン複合体を取り込むことが確証される。このニューロン取り込みは、環境中の種々の分子の化学受容中のニューロン機能の結果である。これらの観察から見ると、化学受容性ニューロンもまた、１９．５ｋＤ未満、好ましくは１２ｋＤ未満の分子量をもつペプチド、タンパク質及び他の分子を��り込むことができるということになり、このことは実験の部に示したデータからも明らかである。
【００２９】
作物害虫又は寄生虫のニューロンに、その機能を低下させるような方法で影響を及ぼすペプチド又はタンパク質が本発明に有用であることが理解されるであろう。特に有用なものは、神経機能のある局面（ａｓｐｅｃｔ）を妨害する抗寄生虫薬（駆虫剤、殺ダニ剤、殺虫剤など）又は殺虫剤（殺線虫剤、殺虫剤、殺ダニ剤、殺軟体動物剤など）の結合性ミメティックであるペプチドである。特に、本発明は、アセチルコリンによって及びさらには線虫の他の部位でニコチン性受容体に結合するレバミゾールのミメティックによって促進される神経伝達に関する。
【００３０】
この意味において、本発明のペプチドが妨害し得る４種類の標的分子が存在する。第一の標的分子は、感覚子の受容体分子である。これらの標的分子のブロック又は阻害は線虫の機能を強力に低下させ、それによってその感染性を防止又は妨害することが意図される。
【００３１】
第二の標的は、化学受容性ニューロンの機能に不可欠なハウスキーパー機能物又はその他の遺伝子であり得る。特異的な標的の例は、順行性又は逆行性輸送モーターである。線虫（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）においては、Ｏｓｍ−３（これはキネシン様タンパク質である）に欠陥のある変異体が非走化性であり、しかもｄａｕｅｒ形成を示すことが明らかにされている。また、ダイニン及びその受容体ダイナクチンはキネシン分子であり、これらは標的として選択し得るであろう。殺菌剤ベノミルは、線虫（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）内のキネシンと相互作用することが知られている。
【００３２】
第三の標的は、全神経細胞生存性（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を標的とすることである。ここで標的は本質的なハウスキーピング化合物であり得る。最もよい選択は、環境に支障をきたさないように、作物害虫に特異的な前記ハウスキーピング化合物であることが強調される。
【００３３】
第四の標的は神経伝達である。シナプス内で又はその域を越えてそのペプチド効果を発揮することによって神経伝達を妨害することができるペプチドが特に有用である。この場合、ＧＡＢＡ作動性伝達が標的である。その理由は、殺虫剤ピペラジンがＧＡＢＡ作動性ニューロンにおいて作動薬として作用することが立証されているからである。イベルメクチンはグルタミン酸型塩素チャネル及びリアノジン受容体に影響を及ぼす。さらに重要な標的はニューロンであり、ニューロン内ではその神経伝達が神経伝達物質アセチルコリン（ＡＣｈ）によって促進される。コリン作動性神経伝達との相互作用は、前シナプス性及び後シナプス性であり得、しかもニコチン性又はムスカリン性であり得る。
【００３４】
本発明の一つの態様は、ペプチド ＳＶＳＶＧＭＫＰＳＰＲＰ（線状ペプチド）又はＣＳＩＮＷＲＨＨＣ （コンストレインドペプチド）からなる。前記のペプチド ＳＶＳＶＧＭＫＰＳＰＲＰ がアグロバクテリウム・フェーカリス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆａｅｃａｅｌｉｓ）由来のアルコールデヒドロゲナーゼ酵素に適したリガンドであると認められることが知見されている（国際出願公開第ＷＯ９８／１９１６２号明細書）。しかし、この国際出願公開明細書には、作物害虫又は寄生虫に対する前記ペプチドの効果あるいは神経活動に対する前記ペプチドの効果は記載されていない。本発明の別の態様は、活性部位としてアミノ酸配列ＳＩＮＷＲＨＨ を含有するペプチドからなる。
【００３５】
本発明の別の態様は、レバミゾールを模したものであり且つアミノ酸配列 ＣＴＴＭＨＰＲＬＣ を有するペプチドである。データベースによる調査では、先に報告されているペプチドは明らかにされていないし、レバミゾールの結合性ミメティックを特徴とするペプチド配列 ＴＴＭＨＰＲＬ を有するタンパク質も明らかにされていない。類似のペプチドが報告されているが、この関連性は現時点では明らかではない。前記の配列 ＴＩＭＨＰＲＬ はイノシシ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）由来の推定される嗅覚受容体において生じるし（寄託番号ＡＡＣ２６７４４及びＣＡＢ １０６９３）、配列 ＴＴＭＨＰＳＬ は、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）の仮想（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ）タンパク質ＺＣ５１３．３（寄託番号ＡＡＣ４８２６５及びＴ２８９９８） において生じる。この従来の研究は、前記の配列ＴＴＭＨＰＲＬ が本発明において報告されたレバミゾール結合性ミメティックであることを明らかにしていない。
【００３６】
公知又は新規な線虫標的（タンパク質）に結合するペプチドは、ファージペプチドライブラリーのバイオパニングによって富化することができ、その方法において、ペプチドは標的に対する結合の連続回数で富化され、結合されなかったファージを洗浄し、結合されたファージ粒子を増幅し、次いでクローン化し、配列決定し且つ 標的タンパク質の結合及び機能破壊（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）を確認する。
【００３７】
線虫防除用の新規な可能な標的を、予測される機能と、生物の生存に不可欠であるか又はその病原性の重要な様相に不可欠であることが知られているモデル生物由来の遺伝子に対する相同性とに基づいて、比較ゲノミックスアプローチを使用してインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）で同定し得る〔Ｌａｖｏｒｇｎａ， Ｇ．， Ｂｏｎｃｉｎｅｌｌｉ， Ｅ．， Ｗａｇｎｅｒ， Ａ．， ａｎｄ Ｗｅｒｎｅｒ， Ｔ． （１９９８） Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ？ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４（９）， ３７５−３７６〕。次いで、かかる標的は、ＲＮＡ阻害（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を使用する機能阻害によって又は標的遺伝子のノックアウト変異体を研究することによって確証することができる〔国際特許出願公開第ＷＯ ００／０１８４６号公報； Ｂｏｓｈｅｒ， Ｊ．Ｍ． ａｎｄ Ｌａｂｏｕｅｓｓｅ， Ｍ． （２０００） ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ： ｇｅｎｅｔｉｃ ｗａｎｄ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｗａｔｃｈｄｏｇ． Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２（２）， Ｅ３１−Ｅ３６； Ｂｉｒｄ， Ｄ．Ｍ．， Ｏｐｐｅｒｍａｎ， Ｃ．Ｈ．， Ｊｏｎｅｓ， Ｓ．Ｊ．Ｍ．， ａｎｄ Ｂａｉｌｌｉｅ， Ｄ．Ｌ． （１９９９） Ｔｈｅ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ｇｅｎｏｍｅ： Ａ ｇｕｉｄｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｏｓｔ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｇｅ． Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３７， ２４７−２６５〕。
【００３８】
本発明の別の要旨によれば、前記のペプチド類のいずれかをコードするＤＮＡ配列を用いて形質転換されている植物が提供される。かかるＤＮＡ配列は、デノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成によって又は該配列を天然源から単離することによって得ることができる。適切に発現させるためには、前記ＤＮＡ配列はプロモーターに操作して結合しなければならない。プロモーターの選択は、所望の発現部位、並びに所望の発現の程度及びプロモーター制御下の遺伝子調節の所望の方法に左右される。これは通常の技術の範囲内に全て入る。プロモーター特異性が特に好ましいものでない限りは、植物全体を通じて機能し、発育パターンに関する可能な制限ができるだけ少ない強力な構成性プロモーターを使用することができる。高レベル発現用の構成性プロモーターの一例は、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターである。高レベル、光誘導性プロモーターの別の例は、その中の、リブロースビスリン酸カルボキシラーゼの小さいサブユニット（ｒｂｃＳＳＵ）プロモーター、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（Ｃａｂ）プロモーター、キメラフェレドキシン／ＲｏｌＤプロモーター（国際特許出願公開第ＷＯ９９／３１２５８号明細書）などである。
【００３９】
線虫のような根特異的病原体を防除するには、根特異的プロモーターが好ましい。かかるプロモーターの例は：ＲｏｌＤプロモーター、ＲＰＬ１６Ａ． Ｔｕｂ−１、ＡＲＳＫ１、ＰｓＭＴａ（国際特許出願公開第Ｗ０９７／２００５７号明細書）及びＡｔａｏ１（Ｍｏｌｌｅｒ， Ｓ．Ｇ． ａｎｄ ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｍ．Ｊ．， １９９８， Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ， Ｊ．， １３， ７８１−７９１）である。
【００４０】
一般に、最適なＤＮＡ組立て体の一つ又は複数は、少なくともプロモーターと転写ターミネーターとを含有してなる発現用カセットに含まれる。かかる要素を適切に機能させるためにどのように連結すべきであるかは周知であり、これは発明の技術を実施することなく決定することができる。本発明の小さなペプチドの発現レベルを高めるのに特異的な方法であって、転写後にｍＲＮＡ又はプレタンパク質を本発明のペプチドの数個の反復が生じるような方法で操作する方法は、一つの遺伝子組立て体（いわゆる、ポリタンパク質）にこれらペプチドの多数のコード配列を含有させるべきである。
【００４１】
植物種の形質転換は、現在では、多数の植物種、例えば双子葉植物及び単子葉植物について常用されている。基本的には、任意の形質転換法を使用して本発明のキメラＤＮＡを適当な祖先細胞に導入してもよい。方法は、プロトプラスト用のカルシウム／ポリエチレングリコール法（Ｋｒｅｎｓ， Ｆ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｎａｔｕｒｅ ２９６， ７２−７４； Ｎｅｇｒｕｔｉｕ Ｉ． ｅｔ ａｌ， Ｊｕｎｅ １９８７， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ８， ３６３−３７３）、プロトプラストのエレクトロポレーション法 （Ｓｈｉｌｌｉｔｏ Ｒ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．， １９８５ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ． ３， １０９９−１１０２）、植物材料中への微小注入法（Ｃｒｏｓｓｗａｙ Ａ． ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ， ２０２， １７９−１８５）、種々の植物材料の（ＤＮＡ又はＲＮＡ被覆）パーティクルボンバードメント法 （Ｋｌｅｉｎ Ｔ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｎａｔｕｒｅ ３２７， ７０）、（非組み込み）ウイルスを用いた感染法、成熟植物の浸潤（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）あるいは成熟花粉又は小胞子の形質転換によるｉｎ ｐｌａｎｔａ アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）媒介遺伝子伝達法（欧州特許第０ ３０１ ３１６号明細書）などの中から選択されることが適当であり得る。本発明の好ましい方法は、アグロバクテリウム媒介ＤＮＡ伝達法からなる。特に好ましい方法は、欧州特許第１２０ ５１６号明細書及び米国特許第４，９４０，８３８号明細書に記載されているような、いわゆるバイナリーベクター技法の使用である。
【００４２】
トマトの形質転換は、本質的にＶａｎ Ｒｏｅｌｃｅｌらによって報告されているようにして行うことが好ましい〔Ｖａｎ Ｒｏｅｌｃｅｌ， Ｊ．Ｓ．Ｃ．， Ｄａｍｍ， Ｂ．， Ｍｅｌｃｈｅｒｓ， Ｌ．Ｓ．， Ｈｏｅｋｅｍａ， Ａ． （１９９３）． Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｔｏｍａｔｏ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｉｎ）． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ， １２， ６４４−６４７〕。ジャガイモの形質転換は、本質的にＨｏｅｋｅｍａらによって報告されているようにして行うことが好ましい〔Ｈｏｅｋｅｍａ， Ａ．， Ｈｕｉｓｍａｎ， Ｍ．Ｊ．， Ｍｏｌｅｎｄｉｊｋ， Ｌ．， ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｌｚｅｎ， Ｐ．Ｊ．Ｍ．， ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ， Ｂ．Ｊ．Ｃ． （１９８９）． Ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｗｏ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｐｏｔａｔｏ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ ｆｏｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｘ． Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７， ２７３−２７８〕。
【００４３】
遺伝子形質転換に対しては幾分扱いにくいと考えられるが、単子葉植物は形質転換を受けることができ、繁殖力のあるトランスジェニック植物は形質転換細胞又は胚、あるいは他の植物から再生できる。現在、単子葉植物の形質転換に好ましい方法は、胚、外植片又は懸濁細胞のミクロプロジェクタイル（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）ボンバードメント法、及び直接ＤＮＡ取り込み法又は（組織）エレクトロポレーション法（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ， ｅｔ ａｌ， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３３８， ２７４−２７６）である。
【００４４】
形質転換トウモロコシ植物は、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ） ｂａｒ−遺伝子〔これはホスフィノスリシン・アセチルトランスフェラーゼ（除草剤ホスフィノスリシンを不活性化する酵素）をコードする〕を、トウモロコシ懸濁培養物の胚形成細胞に、マイクロプロジェクタイルボンバードメント法によって導入することによって得られている（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ， １９９０， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ２， ６０３−６１８）。コムギ及びオオムギなどの他の単子葉植物作物のアリューロン・プロトプラストへの遺伝子材料の導入が報告されている（Ｌｅｅ， １９８９， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １３， ２１−３０）。コムギ植物は、胚形成懸濁培養物を確立するために胚形成カルスを選択することによって、胚形成懸濁培養物から再生されている（Ｖａｓｉｌ， １９９０ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．， ８， ４２９−４３４）。これらの作物について複数の形質転換系との組み合わせにより、単子葉植物に対する本発明の適用が可能になる。
【００４５】
単子葉植物、例えば稲、小麦及びトウモロコシのような商業的に重要な作物もまた、アグロバクテリウム株によるＤＮＡ伝達を受け易い（国際特許出願公開第ＷＯ９４／００９７７号明細書；欧州特許第０ １５９ ４１８ Ｂｌ号明細書；欧州特許第０ ８５６ ０６０号明細書；Ｇｏｕｌｄ Ｊ， Ｍｉｃｈａｅｌ Ｄ， Ｈａｓｅｇａｗａ Ｏ， Ｕｌｉａｎ ＥＣ， Ｐｅｔｅｒｓｏｎ Ｇ， Ｓｍｉｔｈ ＲＨ， （１９９１） Ｐｌａｎｔ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ９５， ４２６−４３４ 参照）。
【００４６】
実施例１
ダイズシストセンチュウの化学感覚系による蛍光色素の取り込み
ダイズシストセンチュウ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ）のシストを、先の研究（Ａｔｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ９８， ４７９−４８７） で報告されているようにして産生させた。この線虫のシストは、ダイズ植物の生育に使用された土壌から、該土壌を分級篩に通すことによって単離した。シストを、マラカイトグリーン中で３０分間、部分表面滅菌し、次いで水道水で数時間洗浄した。このシストを、ｄＨ２Ｏを入れた皿の３５μｍナイロンメッシュ上に置くことによって第二期幼虫を得、２６℃で孵化させた。幼虫を収集し（最大で孵化後７２時間目）、次いで０．４５μｍ微量遠心分離フィルターチューブ中で、ｄＨ２Ｏを用いて遠心洗浄した（微量遠心分離装置中、低速、＜３００ｇ）。得られた線虫懸濁液を、最小残留液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）まで遠心分離し、次いで適当な色素溶液２００μｌを加え、線虫を暗室で室温でインキュベートした。適切な染色が１〜２時間で達成されたが、動物はその移動性又は生存性に悪影響を及ぼすことなく一夜放置することができる。
【００４７】
色素溶液：
ａ）　ジメチルホルムアミドに溶解した２０ｍｇ／ｍｌ濃度のフルオレセインイソチオシアネート異性体Ｉ（Ｓｉｇｍａ社Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｆ４７２４） ５０μｌをＭ９緩衝液２００μｌに加えた。
【００４８】
ｂ）　緩衝塩溶液１ｍｌ当たりＦＩＴＣ異性体Ｉ１ｍｇ
ｃ）　ビスベンズアミド（Ｓｉｇｍａ社Ｃａｔ． Ｎｏ．Ｂ１７８２）：ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ
生体染色時間に続いて、線虫を０．４５μｍ微量遠心分離フィルターチューブ中で過剰量のｄＨ２Ｏを用いて低速で数回（最小５回）遠心洗浄して、色素濃度をバックグランド蛍光を与えない水準まで下げた。溶液は最大で約２００μｌに調製した。線虫懸濁液の幾つかのアリコートをガラス製顕微鏡用スライド上に置き、カバースリップで覆い、蒸発を抑えるために両端をアセテートペイントでシールした。スライドを６０℃の加熱ブロック上に１５〜２０秒間置くことによって、線虫をリラックスさせた。生存している間の動物の色素取り込みを確実にするために、生存動物について幾つかの観察を行った。
【００４９】
線虫を、黒白カメラ（Ｃｏｈｕ社製）又はカラーカメラ（Ｋａｐｐａ社製）を取り付けたライカ（Ｌｅｉｃａ）製ＤＭＲ光学顕微鏡を使用して肉眼で見た。画像を、Ｌｅｉｃａ製ＱＷｉｎ画像分析装置及びソフトウエアを使用して取り込んだ。ＦＩＴＣの取り込みを、樹状突起に沿って頭部感覚子から細胞体まで且つ細胞体を通り越して交連を経由して神経環内に感覚神経系にエピルミネッセンスを使用して視覚化し、エピルミネッセンスをに通した（図１）。
【００５０】
ビスベンズアミドは、ＤＮＡとキレートを形成した場合に蛍光を発する。１〜２時間インキュベートした後に、植物寄生線虫において唯一明確に目に見える核は、ある頭部感覚子ニューロンの神経細胞体であった。幼虫の外皮が損傷している場合には、あらゆる細胞核が視覚的に染色されてしまう。色素が感覚樹状突起に沿ってその神経細胞体まで輸送されるので正常に限定された染色が生じる。多数のニューロンの核を含めて他の核が視覚化されなかったことから、アクセスは表皮を介して生じたとは思われない。得られた結果は、ＦＩＴＣに関して視覚化されたような取り込みと一致した。ビスベンズアミドは、ニューロンに沿って通過する間は蛍光を発しなかった。蛍光は、ニューロンの核内でＤＮＡに結合する際に生じる（図２）。
【００５１】
実施例２
自由生活線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）の化学感覚系による、ＦＩＴＣ及びＦＩＴＣ標識化合物の取り込み
線虫 （Ｎ２系） をＢｒｅｎｎｅｒの方法（１９７４ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７７， ７１−９４）により養った。ＦＩＴＣによる感覚ニューロンの染色を、Ｈｅｄｇｅｃｏｃｋらの方法（１９８５ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１１， １５８−１７０）により行った。
ニューロンに沿って輸送された分子の大きさに関する制限の可能性を調べた。
ＦＩＴＣ （Ｓｉｇｍａ社から供給された、それぞれＣａｔ Ｎｏｓ．ＦＤ４、ＦＤ１０ 及び ＦＤ４０）に複合した種々の大きさ（４．４ｋＤａ、１２ｋＤａ 及び１９．５ｋＤａ） の３種類のデキストランを、Ｍ９緩衝液に溶解して５ｍｇ／ｍｌの量で使用した。 樹状突起及び細胞体の染色は、４．４ｋＤａ又は１２ｋＤａのＦＩＴＣ−デキストランを用いて染色した線虫において肉眼で見ることができた（図３）。これにより、少なくとも１２ｋＤａのある種の物質が感覚性ニューロンに入ることができ、しかも樹状突起に沿って神経環の後の細胞体に輸送されたことが確認された。
【００５２】
実施例３
ダイズシストセンチュウ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ）及びシロシストセンチュウ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｐａｌｌｉｄａ）の宿主の根浸出液の方向に向くことができる能力に対する殺線虫剤及びその他の物質の影響を確認するための挙動バイオアッセイ
このアッセイは、Ｇｒｕｎｄｌｅｒらが使用した方法（Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ １０３， １４９−１５５； １９９１）を部分的に改変したものであった。ダイズ植物を、熱帯温室内で、パーライトを入れた鉢で根系が十分に確立されるまで育てた。植物を水道水で注意深く洗浄してパーライトを除き、次いで数本の苗を、根を光から遠ざけるためにアルミ箔で覆ったコニカルフラスコ内のｄＨ２Ｏ ２００ｃｍ３に入れ、次いでＳａｎｙｏ植物生育室中で４８時間（太陽光中で２４℃で１６時間、暗中で２０℃で８時間）インキュベートした。根浸出液を採取し、０．４５μｍシリンジフィルターを通してフィルター滅菌した。
【００５３】
ｄＨ２Ｏ又は根浸出液のいずれかで覆ったアガロースディスクを、次の通りに調製した。アガロース（３ｍｌ、ｄＨ２Ｏで調製した１．５％溶液）を６ｃｍペトリ皿に注ぎ、次いでその表面を乾燥させた。このペトリ皿の上に根浸出液又はｄＨ２Ｏ １ｍｌをピペットで加え、ペトリ皿を回転させることによって表面を被覆し、次いで放置して完全に蒸発させた。このペトリ皿から６ｍｍのディスクをコルクボーラーを使用して切り出した。
【００５４】
オキシムカルバメート系殺線虫剤アルジカルブは、テミク（Ｔｅｍｉｋ）（１０Ｇ、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ社製）１ｇをクロロホルム１０ｍｌに入れて該オキシムカルバメートをその不活性担体から分離することによって得た。１時間後に、粒状物質を遠心分離によって除去した。クロロホルム／アルジカルブ溶液のアリコート１００μｌ、１０μｌ又は１μｌをピペットで１．５ｍｌマイクロチューブに採り、ドラフトチャンバー中に放置して蒸発させた。これによって、それぞれのチューブ中にアルジカルブ１ｍｇ、０．１ｍｇ及び０．０１ｍｇそれぞれが残った。これらのチューブにｄＨ２Ｏ １ｍｌを加えて、それぞれ５．２５μＭ、０．５２５μＭ及び０．０５２５μＭの溶液が得られた。
【００５５】
ダイズシストセンチュウ（Ｈ． ｇｌｙｃｉｎｅｓ）の幼虫のアリコートを、一連の濃度のアルジカルブ中で、又はアルジカルブと同じアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）標的を認識する生成ペプチド（実施例ＩＶ参照）中で、１６時間インキュベートした。化学受容に対する種々のアルジカルブ又はペプチドの影響を測定した。対照の線虫は、水又はペプチド実験用のＰＢＳのいずれかでインキュベートした。
【００５６】
少量の（典型的には２０μｌ）ｄＨ２Ｏ中で処理した線虫の幼虫（約３００匹）を、１．５％アガロース１．５ｍｌを入れた直径３．５ｃｍのペトリ皿の中心に置いた。水を蒸発させた後に、線虫を１時間放置してペトリ皿全体に無作為に分布させた。根の浸出液と、水アガロース試験ディスクとを、ペトリ皿に中心から等間隔（５ｍｍ）で置き、このペトリ皿を暗中に室温で１時間放置した。この実験は、検定されるアルジカルブ又はペプチドの濃度当たりにつき８〜１０個の複製を作成して行った。線虫を化学物質又はペプチドミメティックで処理しなかった対照もまた、それぞれの実験日について使用して１００％の誘引率を得た。これにより、どんな条件でも供試化合物によって仲介された化学誘引の程度について測定が可能になった。
【００５７】
それぞれのディスクの下での線虫の個体数を、解剖顕微鏡を使用して数えた。対照実験においては、水対照ディスクの下で数えた線虫よりも典型的に２〜４倍ほど多い線虫個体数が数えられた。対照ディスクの下で数えた線虫個体数を差し引いた対応試験の線虫個体数を使用して応答を算出した。ペトリ皿上の〜３００匹の線虫については、その差は約４０〜８０であった。誘引剤ディスク下の個体数と対照ディスク下の個体数との間の差を使用して実験の日について最大応答を定義した。ＡＣｈＥ認識ペプチドとアルジカルブの両方は、麻痺を引き起こす濃度よりも低い濃度で化学感覚誘引を完全に阻害する（ｄｉｓｒｕｐｔ）ことができた。
【００５８】
これらの種々の濃度の化合物を、部分改変バイオアッセイを用いて試験した。供試化合物の数種の濃度それぞれの多数の複製用の手段を含む多数のデータを図４に示す。このデータのそれぞれの組を、パーソナルコンピューターにインストールした標準の統計分析パッケージ（ＳＰＳＳ）内のプロビット解析を使用して分析した。１．１±３．０６ｐＭアルジカルブ、２．１６±６．５４ｎＭコンストレインド７量体ペプチド又は３．６８±３３．６μＭ線状１２量体ペプチドのいずれかにおいて１６時間インキュベートした後に、誘引物質に対するダイズシストセンチュウ（Ｈ． ｇｌｙｃｉｎｅｓ）の誘引に５０％の減少があった。２μＭ（ＡＣｈＥコンストレインドペプチドを用いて５０％阻害に必要な濃度よりも１０３濃厚である）での対照ペプチド中でのダイズシストセンチュウ（Ｈ． ｇｌｙｃｉｎｅｓ）のインキュベーションは、化学受容の喪失を招いた。アルジカルブ並びに二つのＡＣｈＥ結合性ペプチドのさらに高い濃度であっても、化学受容を阻害するのに必要とされるよりも運動を阻害するのに必要であった。
【００５９】
５０ｍＭ ＣａＣｌ２を誘引剤としてアガロースディスクと共に使用した。これらのアッセイは２７℃で行った。これにより、室温でダイズシストセンチュウ（Ｈ． ｇｌｙｃｉｎｅｓ）を用いた植物根浸出液と同様の結果が示された。これにより、２種以上の誘引剤に対する指向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）の中断をこれらの阻害剤を使用して達成できることが確認される。また、前記ペプチドを、ジャガイモシストセンチュウ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｐａｌｌｉｄａ）に対し、ダイズシストセンチュウ（Ｈ． ｇｌｙｃｉｎｅｓ）について記載した方法と同じ方法を使用して試験した。ジャガイモシストセンチュウ（Ｇ． ｐａｌｌｉｄａ）を、ペプチドを１．２４２×ｌ０−８ Ｍ含有する溶液中で、室温で１６時間インキュベートした。前記線虫を、２０℃で記載したバイオアッセイと、誘引剤として５０ｍＭ ＺｎＣｌ２とを使用して試験した。誘引剤を使用しない場合よりもむしろ誘引剤を使用したディスク下での線虫の平均値（ｒａｔｉｏ）は、１．６４±０．１９であった。これに対して、ペプチドで前処理したジャガイモシストセンチュウ（Ｇ． ｐａｌｌｉｄａ）は、対応する値０．７７±０．０８を示した。これらの値は、著しく異なる（Ｐ＜０．００１；ｔ検定）。＞１の値は化学受容応答を示すことから、得られたデータは、この濃度のペプチドを用いて前処理した後に化学受容が完全に喪失したことを立証している。化学受容機能は、バイオアッセイの開始後３時間目に未だ阻害されていた。未処理及びペプチド処理のジャガイモシストセンチュウ（Ｇ． ｐａｌｌｉｄａ）それぞれの値（ｒａｔｉｏ）は著しく異なる。その平均値は、それぞれ１．６８±０．２４及び０．７８±０．０６であり、著しく異なっていた（Ｐ ＜ ０．０１；ｔ検定）。このことは、ペプチドの効果が 線虫を処理から取り除いた後３時間持続することを示している。
【００６０】
実施例４
アセチルコリンエステラーゼを阻害するペプチドを見出すためのファージライブラリーのバイオパニング
アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ社製、Ｃａｔ． Ｎｏ．Ｃ２５１１）に固定されたシビレエイ（Ｔｏｒｐｅｄｏ）のアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）の懸濁液２００μｌを使用して、２種類のファージペプチドライブラリー（一方は線状１２量体であり、他方はコンストレインド７量体である）からペプチド配列を単離した。これらのライブラリーは、市販されている（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから）。ファージ（約１０１１粒子）を上記ライブラリー（約１０９個の種々の配列）から採取し、マイクロチューブに入れたＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液１ｍｌ中で上記のコリンエステラーゼ結合アガロースから回転装置を用いて１時間バイオパニングした。緩衝液に溶解した遠心洗浄液を数回使用して未結合ファージを除去した。次いで、得られたアガロースビーズを５．２５μＭアルジカルブ１ｍｌ中で１時間インキュベートした。これにより、アセチルコリンエステラーゼ／アガロース複合体に特異的に結合されたファージが溶出された。これらの溶出されたファージを、宿主大腸菌培地２０ｍｌ中で一夜増幅し、得られたファージ粒子を濃縮し、力価測定した。選択的に溶出され、増幅されたファージをさらに３〜４回のバイオパンニングに使用し、ｔｗｅｅｎ−２０の濃度を段階的に上げて、それぞれの場合について結合の高められたストリンジェンシーを選択した。
【００６１】
バイオパニングを完了した後に、増幅されたファージ個体群を、クローンの選別を可能にする一連の希釈液を用いて寒天平板上で力価測定した。プラーク＜２００の平板については、滅菌木製ピックを使用してクローンを選別し、それぞれのクローンを、１ウエル当たり大腸菌２００μｌを入れてある滅菌９６ウエルプレートのそれぞれのウエルに移植した。このプレートを３７℃振盪インキュベーターで４．５時間インキュベートした。次いで、このプレートを、プレート遠心分離装置中で４℃で遠心分離して、懸濁液から細胞を除去した。上清を新しい滅菌プレートに移し、その後にグリセロールを加えてクローンを凍結した。
【００６２】
単離クローンのＡｃｈＥ結合能を検定した。酵素結合免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）を展開した。シビレエイＡＣｈＥ （Ｓｉｇｍａ社製、Ｃａｔ． Ｎｏ．Ｃ３３８９）を、９６ウエルプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ製）に炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ８．６）中５μｇ／ｍｌで４℃で一夜固定した。単離クローン上清のアリコート（３０μｌをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ７０μ１に加えた）を、結合について選別するために２重に試験した（プレート２枚）。プールした増幅最終バイオパン（ｂｉｏｐａｎ）を陽性結合対照（ＴＢＳ Ｔｗｅｅｎ ９８μｌに２μｌ溶解）として使用した。このプレートを、プレート振盪装置を用いて室温で１時間インキュベートし、次いでＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で５分間の洗浄を３回行って未結合ファージを除去した。抗Ｍ１３ペルオキシダーゼ複合抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）１００μｌをＴＢＳに溶解した１：４０００の希釈液で使用して、特異的に結合されたファージを検出した。プレートを、振盪装置上で室温でさらに１時間インキュベートし、次いでＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液中で５分間の洗浄を３回以上行った。前記複合抗体を、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩溶液（Ｓｉｇｍａ社製、Ｃａｔ． Ｎｏ．Ｐ９１８７） １５０μｌを使用して検出した。色が発現したら直ちに、全部のウエルに２Ｍ Ｈ２Ｓ０４ ３０μｌを加えることによって反応を停止させた。
【００６３】
ＢｉｏＲａｄプレートリーダー（型式３３５０） を使用して、４９２ｎｍフィルターを用いてプレートを読み取った。陰性対照（ペプチドインサートをもたないＭ１３ヘルパーファージ）の結合レベルよりも２倍以上高い結合レベルを示したクローンを増幅させた。このクローン由来のＤＮＡを沈殿させ、ＤＮＡ ５００ｎｇを、ペプチドをコードするインサートに隣接した特異的プライマーを有するチューブに、色素ターミネーター化学配列決定混合物と一緒に加えた。リニアＰＣＲを行い、フェノール／クロロホルムを使用してＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡ沈殿物を緩衝液に再懸濁し、配列決定ゲル上でＤＮＡ配列決定装置ＡＢＩ ３７３Ａを使用して走査した。
【００６４】
得られた配列は、線状及びコンストレインドペプチドライブラリーそれぞれについて異なっていたが、特異的ライブラリー中でＡＣｈＥを結合したクローンは全て同じペプチド配列を含んでいた。これらの２つのペプチド ＳＶＳＶＧＭＫＰＳＰＲＰ （線状ライブラリーから）及び ＣＳＩＮＷＲＨＨＣ （コンストレインドライブラリーから）、並びに７量体配列（ＳＩＮＷＲＨＨ）のランダム化により作成された対照コンストレインドペプチド（ＣＨＮＳＨＩＲＷＣ） を、市販の試薬によって合成した。
【００６５】
実施例５：
線虫ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）を用いたレバミゾールのペプチドミメティックのバイオパンニング
線虫（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）（Ｎ２野生型）を、９ｃｍ寒天平板上で線虫増殖培地及び大腸菌（ＯＰ５０）を使用して育てた。十分に生息させた後に、線虫を寒天平板から氷冷ＭＡＮ緩衝液〔１０ｍＭ ３−（Ｎ−モルフィリノ）プロパンスルホン酸、ｐＨ６．８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＮ３〕２ｍｌを使用して洗い落とし、１５ｍｌ試験管に採取し且つ５分間放置して沈降させた。得られた線虫ペレットを、氷冷ＭＡＮ緩衝液２ｍｌを入れた新しい試験管に移し、放置して沈降させ、この方法を再度繰り返した。
【００６６】
膜懸濁液を調製するために、前記線虫ペレットを氷の上で１０秒間５回の破砕で全出力で超音波分解し、氷冷ＭＡＮ緩衝液で１：１希釈した。得られたホモジネートを液体Ｎ２中で５回凍結融解した。次いで、ホモジネートをＤｏｕｎｃｅホモジナイザーに移し、氷上でホモジナイザーに５×３０回通した。その３０回それぞれの時間間隔は５分であった。氷冷ＭＡＮ緩衝液中で容量を１．５ｍｌに調製し、３３，０００ｇで４℃で３０分間遠心分離した。得られたペレットを氷冷ＭＡＮ緩衝液１ｍｌに再懸濁し、１００μｌずつの試料に小分けし、液体Ｎ２中で簡易凍結し、必要になるまで−８０℃で保存した。
【００６７】
膜画分のアリコート１００μｌを、ＴＢＳ ９００μｌに０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて希釈した。これに、もとのコンストレインドファージライブラリー１０μｌを加え、回転装置上で１時間インキュベートした。未結合ファージを除去するために、膜画分を微量遠心分離装置中で、１３，０００ｇで、４℃で５分間遠心分離することによってペッレット化し、上清を除去し、次いで得られたペレットを新しいＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ １ｍｌに再懸濁した。これを５回反復し、次いでＴｗｅｅｎを含有していないＴＢＳで最終洗浄した。
【００６８】
ｎＡＣｈＲに特異的に結合したファージを、ＴＢＳに溶解した１０ｍｇ／ｍｌ濃度のレバミゾールを用いて溶出した。得られた膜画分を遠心分離することによりペレット化し、上清を保持し、次いで前記のようにして宿主大腸菌中で、３７℃で４．５時間増幅させた。この増殖第一画分を力価測定し、線虫膜画分に対するバイオパンを、初期値１×１０１１ ｐｆｕのファージを有する新しい抽出液を使用して反復した。
【００６９】
２回目のバイオパニングの後に、１０分間の緩衝液洗浄物を保持して、緩衝液溶出液及びレバミゾー溶出液の両方を力価測定することによって特異的溶出液のレベルを調べた。
緩衝液　１０μｌ中１．６×１０４ ｐｆｕ
レバミゾール １０μｌ中２．９×１０５ ｐｆｕ
２回目のバイオパン溶出液を増幅させずに再度選別して、ＯＰ５０由来の野生型Ｍ１３による膜画分への混入に関する生じ得る問題を解決した。野生型Ｍ１３は、遺伝子の３種類のタンパク質への変化により、ペプチド発現ファージよりも効率的に大腸菌に感染する。最終溶出液を力価測定し、これは再び緩衝液線状液よりもレバミゾールを用いてさらに高い特異的溶出を再び示した。ブループラークをタイタープレートから取り出し、配列決定した。ＣＴＴＭＢＲＬＣの共通配列が得られた。
【００７０】
実施例６
動物寄生線虫駆虫剤レバミゾールを用いた植物寄生線虫の化学受容の阻害
新たに孵化したダイズシストセンチュウ（Ｈ． ｇｌｙｃｉｎｅｓ）を種々の濃度のレバミゾールの中で、室温で１６時間、インキュベートした。これらダイズシストセンチュウを、実施例３に記載のバイオアッセイを用いて、試験した。
結果
この線虫は麻痺状態の兆候を示さなかった。得られた結果を図５に示した。得られた結果は、神経筋接合部分に影響を及ぼすだけであると考えられる動物寄生線虫に対する動物薬が、低濃度で提供された場合に用量に依存した方法で化学受容を阻害できることを示している。
【００７１】
実施例７
動物寄生線虫駆虫剤レバミゾールの結合性ミメティックを使用した植物寄生線虫の化学受容の阻害
ダイズシストセンチュウ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ）及びシロシストセンチュウ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｐａｌｌｉｄａ）を１×１０−６Ｍの濃度のレバミゾールのコンストレインドペプチド結合性ミメティック（ＣＴＴＭＨＰＲＬＣ）を含有する溶液中で１６時間インキュベートした。次いで、これらの線虫を実施例３にそれぞれの種について記載しているようにバイオアッセイを用いて試験した。二つの種は同様の結果を示した。そのデータをプールした。処理した動物は、この誘引剤に応答しなかった。誘引剤を用いていないというよりも誘引剤を用いたディスクの下での線虫の平均値は、２．４１±０．４８であった。これに対して、ペプチド ＣＴＴＭＨＰＲＬＣを用いて、前処理した線虫は１．０３±０．１１の対応する値（ｒａｔｉｏ）を示した。これらの値は著しく異なる（Ｐ ＜ ０．０５；ｔ検定）が、後者は１の値に近かった。＞１の値は化学受容応答を示すことから、このデータは１×１０−６Ｍのペプチドを用いて前処理した後には、化学受容が全くないことを証明している。化学受容の機能はバイオアッセイの開始後 ３時間目にさらに阻害された。未処理及びペプチド処理のダイズシストセンチュウ（Ｈ． ｇｌｙｃｉｎｅｓ）それぞれについての値は、それぞれ１．９３±０．０７及び１．２４±０．１１（Ｐ ＜ ０．０１ ； ｔ検定）であり、著しく異なっていた。これは、ペプチドの効果が線虫を前記の処理から取り除いた後には３時間持続していることを示している。
【００７２】
実施例８
線虫ＧＡＢＡ受容体を使用したピペリジンのペプチドミメティックのバイオパニング
線虫（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）（Ｎ２野生型）を、９ｃｍ寒天平板上で線虫増殖培地及び大腸菌（ＯＰ５０）を使用して育てた。十分に生息させた後に、線虫を寒天平板から氷冷ＭＡＮ緩衝液〔１０ｍＭ ３−（Ｎ−モルフィリノ）プロパンスルホン酸、ｐＨ６．８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＮ３〕２ｍｌを使用して洗い落とし、１５ｍｌ試験管に採取し且つ５分間放置して沈降させた。得られた線虫ペレットを、氷冷ＭＡＮ緩衝液２ｍｌを入れた新しい試験管に移し、放置して沈降させ、この方法を再度繰り返した。
【００７３】
膜懸濁液を調製するために、前記線虫ペレットを氷の上で１０秒間５回の破砕で全出力で超音波分解し、氷冷ＭＡＮ緩衝液で１：１希釈した。得られたホモジネートを液体Ｎ２中で５回凍結融解した。次いで、ホモジネートをＤｏｕｎｃｅホモジナイザーに移し、氷上でホモジナイザーに５×３０回通した。その３０回それぞれの時間間隔は５分であった。氷冷ＭＡＮ緩衝液中で容量を１．５ｍｌに調製し、３３，０００ｇで４℃で３０分間遠心分離した。ペレットを氷冷ＭＡＮ緩衝液１ｍｌに再懸濁し、１００μｌずつの試料に小分けし、液体Ｎ２中で簡易凍結して、必要になるまで−８０℃で保存した。
【００７４】
膜画分のアリコート１００μｌを、ＴＢＳ ９００μｌに０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて希釈した。これに、もとのコンストレインドファージライブラリー１０μｌを加え、回転装置上で１時間インキュベートした。未結合ファージを除去するために、膜画分を微量遠心分離装置中で、１３，０００ｇで、４℃で５分間遠心分離することによってペッレット化し、上清を除去し、次いで得られたペレットを新しいＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ １ｍｌに再懸濁した。これを５回反復し、次いでＴｗｅｅｎを含有していないＴＢＳで最終洗浄した。
【００７５】
ＧＡＢＡに特異的に結合したファージを、ＴＢＳに溶解した１０ｍｇ／ｍｌ濃度のピペラジンを用いて溶出した。得られた膜画分を遠心分離することによりペレット化し、上清を保持し、次いで前記のようにして宿主大腸菌中で３７℃で４．５時間増幅した。この増殖第一画分を力価測定し、線虫膜画分に対するバイオパンを、初期値１×１０１１ ｐｆｕのファージを有する新しい抽出液を使用して反復した。
【００７６】
２回目のバイオパニングの後に、１０分間の緩衝液洗浄物を保持して、緩衝液溶出液及びレバミゾー溶出液の両方を力価測定することによって特異的溶出液のレベルを調べた。
緩衝液　１０μｌ中５．９×１０４ ｐｆｕ
ピペラジン １０μｌ中３．０×１０５ ｐｆｕ
【００７７】
この実施例は、実施例５に記載の方法の可能性を例証し、線虫由来のＧＡＢＡ受容体に対するペプチドの特異的結合を得た。この方法を使用して、全く新規なペプチドを特異的標的及びその得られた配列に対して生じさせることができる。実施例６及び７の方法に従って、これらの別の興味ある標的及びペプチドをさらに調べることができる。
【００７８】
【配列表】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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