(57)【要約】シリカテインは珪酸塩産生生物の酵素であり、珪酸塩のスキャフォード構造の合成に使用される。本発明は、高度に発現しかつ高度に活性な組換体シリカテイン、遺伝子誘導後に天然起源から単離したシリカテイン、及びシリカテイン融合タンパク質を、非晶質二酸化珪素（珪酸及び珪酸塩）、シロキサン、及びこれら化合物の改質体の合成への使用、並びにこれらの工業的利用を提供する。
2004516818.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも（ａ）〜（ｅ）の一つを含むことを特徴とする宿主細胞にて組換体シリカテインを生産する方法。
（ａ）シリカテインのＮ末端をコードするＤＮＡ領域に発現される組換体シリカテインを最初のジスルフィド架橋まで延長して切除するステップ、
（ｂ）シリカテインのＣ末端をコードするＤＮＡ領域に発現される組換体シリカテインを最後のジスルフィド架橋まで延長して切除するステップ、
（ｃ）細胞を溶解した後プロテアーゼ阻害混合物を添加するステップ、
（ｄ）リゾチームを添加せずに再生するステップ、及び
（ｅ）ミオトロフィン及び／又は珪酸塩を添加して発現を誘導し、且つ、機能性を有し高度に活性な酵素品を単離するステップ。
【請求項２】
大腸菌、酵母、哺乳動物、又は海綿類や珪藻類等の原始生物の細胞を宿主細胞として使用することを特徴とする請求項１に記載の宿主細胞にて組換体シリカテインを生産する方法。
【請求項３】
Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓの細胞を宿主細胞として使用することを特徴とする請求項１又は２に記載の宿主細胞にて組換体シリカテインを生産する方法。
【請求項４】
組換体シリカテインを（ａ）融合タンパク質（キメラタンパク質）として、又は（ｂ）セパレートタンパク質発現（プロテアーゼ開裂部位）として、又は（ｃ）第二のセパレートタンパク質発現（カセット発現）のいずれかであって、かつ修飾シリカテイン−ｃＤＮＡ配列の形態で発現することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の宿主細胞にて組換体シリカテインを生産する方法。
【請求項５】
ポリクロナール抗体によって、又はヒスチジン−タグによってシリカテインを精製することを含むステップを更に加えることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の宿主細胞にて組換体シリカテインを生産する方法。
【請求項６】
ポリクロナール抗体が固相に結合していることを特徴とする請求項５記載の宿主細胞にて組換体シリカテインを生産する方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の方法に従って生産され、組換えにより生産されたシリカテイン。
【請求項８】
シリカテイン又はその誘導体が、配列表１に記載の配列に従うＳｕｂｅｒｉｔｅｓ ｄｏｍｕｎｃｕｌａ由来であることを特徴とする請求項７に記載の組換えにより生産したシリカテイン。
【請求項９】
請求項７に記載の組換体シリカテインを発現する形質転換宿主細胞が、特に大腸菌、酵母、哺乳動物、又は海綿類、例えばＳｕｂｅｒｉｔｅｓ ｄｏｍｕｎｃｕｌａ、珪藻類、例えばＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ等の原始生物の宿主細胞であること。
【請求項１０】
（ａ）ミオトロフィン及び／又は珪酸塩を添加して発現を誘導するステップ、及び（ｂ）機能性を有し高度に活性な酵素品を単離するステップ、を含むことを特徴とする海綿にてシリカテインを生産する方法。
【請求項１１】
海綿としてＳｕｂｅｒｉｔｅｓ ｄｏｍｕｎｃｕｌａを使用することを特徴とする請求項１０に記載の海綿にてシリカテインを生産する方法。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の方法に従って生産したシリカテイン。
【請求項１３】
ナノテクノジーで使用する、非晶質二酸化珪素（珪酸及び珪酸塩）、シロキサン又は他のシリコン（ＩＶ）−、ガリウム（ＩＶ）−、錫（ＩＶ）−又は鉛（ＩＶ）−化合物から特異的な二次元及び三次元ナノ構造（篩型、網型、籠型又は他の型に成形された構造体）を合成するための請求項７又は１２に記載のシリカテインの使用。
【請求項１４】
基質としてのテトラアルコキシシラン、トリアルコキシシラノール、ジアルコキシシランジオール、モノアルコキシシラントリオール、アルキル−又はアリール−トリアルコキシシラン、アルキル−又はアリール−ジアルコキシシラノール、又はアルキル−又はアリール−モノアルコキシシランジオール、又は、ガリウム（ＩＶ）、錫（ＩＶ）又は鉛（ＩＶ）の対応する（アルキル−又はアリール−置換）アルコキシ化合物を、請求項１〜６、１０又は１１のいずれかに記載の方法に従って生産したシリカテインによって転換することを特徴とする、非晶質二酸化珪素（珪酸及び珪酸塩）、シロキサン又は他のシリコン（ＩＶ）−、又はガリウム（ＩＶ）−、錫（ＩＶ）−又は鉛（ＩＶ）−化合物（いわゆるシラファルマカを含む）又はこれら化合物の混合重合体を生産する方法。
【請求項１５】
表示化合物の規定混合物を使用して、規定組成の混合重合体を生産することを特徴とする、請求項１４記載の非晶質二酸化珪素（珪酸及び珪酸塩）、シロキサン又は他のシリコン（ＩＶ）−、又はガリウム（ＩＶ）−、錫（ＩＶ）−又は鉛（ＩＶ）−化合物（いわゆるシラファルマカを含む）又はこれら化合物の混合重合体を生産する方法。
【請求項１６】
組換体シリカテイン又はシリカテイン融合タンパク質をガラス、金属、金属酸化物、プラスチック、生体ポリマー又は他の材料から成る表面に固定することを特徴とする、請求項１４又は１５に記載の非晶質二酸化珪素（珪酸及び珪酸塩）、シロキサン又は他のシリコン（ＩＶ）−、又はガリウム（ＩＶ）−、錫（ＩＶ）−又は鉛（ＩＶ）−化合物（例えばいわゆるシラファルマカ）又はこれら化合物の混合重合体を生産する方法。
【請求項１７】
精製のために特異的抗体又は特定シリカテイン結合性タンパク質を固相に固定化することを特徴とする、請求項１４〜１６のいずれかに記載の非晶質二酸化珪素（珪酸及び珪酸塩）、シロキサン又は他のシリコン（ＩＶ）−、又はガリウム（ＩＶ）−、錫（ＩＶ）−又は鉛（ＩＶ）−化合物（いわゆるシラファルマカを含む）又はこれら化合物の混合重合体を生産する方法。
【請求項１８】
請求項１４〜１７のいずれかに記載の方法に従って生産した非晶質二酸化珪素（珪酸及び珪酸塩）、シロキサン又は他のシリコン（ＩＶ）−、又はガリウム（ＩＶ）−、錫（ＩＶ）−又は鉛（ＩＶ）−化合物（いわゆるシラファルマカを含む）又はこれら化合物の混合重合体。
【請求項１９】
工業材料及び生体材料の表面を改良することにより、並びに生体分子、医薬物又は他の生理活性化合物をシリカテインで合成した二酸化珪素（ＳｉＯ２）の被膜又はシリカテインで合成したシロキサン又は他のシリコン（ＩＶ）−、ガリウム（ＩＶ）−、錫（ＩＶ）−又は鉛（ＩＶ）−化合物由来の被膜にてカプセル化することにより、これらの生化学的及び薬理学的性質又はこれらの放出（薬物運搬制御）を改良するための、請求項１８に記載の非晶質二酸化珪素（珪酸及び珪酸塩）、シロキサン又は他のシリコン（ＩＶ）−、又はガリウム（ＩＶ）−、錫（ＩＶ）−又は鉛（ＩＶ）−化合物（いわゆるシラファルマカを含む）及びこれら化合物の混合重合体の使用。
【請求項２０】
移植における細胞又は組織をカプセル化するための、請求項１８に記載の非晶質二酸化珪素（珪酸及び珪酸塩）、シロキサン類又は他のシリコン（ＩＶ）−、又はガリウム（ＩＶ）−、錫（ＩＶ）−又は鉛（ＩＶ）−化合物（いわゆるシラファルマカを含む）及びこれら化合物の混合重合体の使用。
【請求項２１】
（シリコン又はゲルマニウム）半導体材料又は（シリコン又はゲルマニウム）バイオセンサーチップの表面（接触領域）の処理のための、請求項１８に記載の非晶質二酸化珪素（珪酸及び珪酸塩）、シロキサン又は他のシリコン（ＩＶ）−、又はガリウム（ＩＶ）−、錫（ＩＶ）−又は鉛（ＩＶ）−化合物（いわゆるシラファルマカを含む）及びこれら化合物の混合重合体の使用。
【請求項２２】
シリコン含有鉱物、宝石、準貴石の合成のための、請求項１８に記載の非晶質二酸化珪素（珪酸及び珪酸塩）、シロキサン又は他のシリコン（ＩＶ）−、ガリウム（ＩＶ）−、錫（ＩＶ）−又は鉛（ＩＶ）−化合物（いわゆるシラファルマカを含む）及びこれら化合物の混合重合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【従来技術】
【０００１】
珪素は地球の地殻で二番目に多い元素（地球の地殻の８０％より多くは珪酸塩から成る）であり、あらゆる形態の異なる化合物として存在している。珪素化合物は鉱物分類での殆どの種類を代表しているばかりでなく、経済的観点からも非常に重要である。これら鉱物は大規模かつ多様な形態で使用される。工業的に重要な材料である、ガラス、磁器、エメリー、粘土、セメント、水ガラスは、珪酸塩から成る。ある種の珪酸ではその触媒性能が合成に利用されている。他の元素、特にアルミニウムが、さもなければ珪素によって占められている格子位置の幾分かを占めるようになれば、珪酸塩の多彩な用途は更に拡大する。例えば長石とゼオライとはアルミノ珪酸塩に属しており、後者は特にその分子篩とイオン交換の性能にその重要性がある。アルミニウムとカルシウムの珪酸塩は、ラッカー、ゴム、プラスチック、紙の産業で充填材料として重要であり、珪酸マグネシウム（滑石）は化粧品、医薬品において吸収及び充填材料として、アルカリアルミニウム珪酸塩は洗剤で燐酸塩の代替として重要となっている。ポルトランドセメントの硬化には珪酸塩が重要な役割を果たしている。或る珪酸塩はその表面に遊離の水酸基（シラノールに類似の）を担っているので、これに反応性の基を結合することができる。この性能は固相技術において固定化に利用されている。
【０００２】
１．１．  二酸化珪素
二酸化珪素（Ｓｉ０２）は融点の高い固体であって、結晶形でも非晶質でも存在する。全ての出現形状において、各珪素原子は四つの酸素原子によって四面体状に包囲されている（配位数４）。結晶化した場合には、二酸化珪素は異なる変形（石英、トリジマイド、クリストバライト等）で存在する。結晶性Ｓｉ０２の最も通常の形態は石英である。非晶質二酸化珪素鉱物は、アカット、オパール、火打ち石の間である。石英を溶融しそれをゆっくり冷却して得られる石英ガラスにはもはや結晶面がない。これは特に石英ランプ（紫外線透過性があるので）及び耐熱装置の製造に使用される。また珪藻類（ダイアトメーン）の殻は非晶質Ｓｉ０２から成る。
【０００３】
１．２．  珪酸及び珪酸塩
珪素の配位数は珪酸及び珪酸塩においても４である。四面体状に造られた［Ｓｉ０２］４イオンはＳｉ０４サブ単位で重合する傾向がある。この場合に、二個の珪素原子が一つの酸素原子によって相互に結合する。
【０００４】
オルト珪酸において水を放出して最初にオルト二珪酸（ピロ珪酸：Ｈ６Ｓｉ２Ｏ７）が生成する（縮合）。更に縮合すると、ポリ珪酸を経てメタ珪酸［（Ｈ２ＳｉＯ３）］ｎになる。Ｓｉ０４単位の数が小さい場合（ｎ＝３、４又は６）には縮合によって環状分子が形成される可能性がある。
【０００５】
ポリ珪酸は非晶質（無秩序）構造である。
【０００６】
オルト二珪酸の塩（オルト−珪酸塩）はＭｅ２Ｓｉ０４構造を有し、単一の［Ｓｉ０４］４−アニオンを含有している。水溶性のアルカリ珪酸塩は、例えば石英をソーダ、食塩水又は炭酸カリウムとともに溶融することにより得られるが、［Ｓｉ０４］４−アニオン以外に［Ｓｉ２０７］６−及び［Ｓｉ３０１０］８−アニオン（及び更に大きなアニオン）も含有している。このような「水ガラス」溶液は、溶解粒子を膜透析により分離することができるので、中でもガラス及び磁器のセメント化、紙の含浸、木材の不燃化剤及び食品の保存に適している。
【０００７】
このようなアルカリ珪酸溶液を酸性化すると、プロトンを取得して［Ｓｉ０４］４− 及び［Ｓｉ２０７］６−基（及び更に大きい基）から酸性分子が形成され、これらが相互に縮合してポリ珪酸（上記参照）を形成し、それによって溶液はゲル状になる。最初に得られる重合体は鎖状又は網状に構成されるが、更に縮合が進行するとＳｉ０２組成に対応する三次元構造が形成される。
【０００８】
以下の分類が得られる：
１．別々のアニオンを有する珪酸塩
ａ）アイランド珪酸塩：これらは［Ｓｉ０４］２−アニオンを有するオルト珪酸塩。例：フェナサイト、かんらん石、ジルコニウム。
ｂ）グループ珪酸塩：複数のＳｉ０４四面体が結合して短鎖単位を形成している。例： ［Ｓｉ２０７］６−アニオンを有するジ珪酸塩及びトリ珪酸塩。
ｃ）リング珪酸塩：複数のＳｉ０４四面体が環状に配列している。例：ベニトイド（３員環）、アキシナイト（４員環）、ベリル（６員環）。
【０００９】
２．チェイン珪酸塩及びリボン珪酸塩。チェイン珪酸塩は相互に結合した鎖状のＳｉ０４四面体から成り、［Ｓｉ０３］２−アニオンの重合体である。数個のＳｉ０４鎖が結合すると、リボン状分子が形成され得る。例：ホーンブレンド、アスベスト。
【００１０】
３．レイヤー珪酸塩（シート珪酸塩）：レイヤー珪酸塩はＳｉ０４四面体から成る平坦なシートを含有している。これらは相互の間に貯留されているカチオンによって一体になっており、［Ｓｉ４０１０］４−アニオンの重合体である。例：タルカム、カオリニット。
【００１１】
４．スキャフォールド珪酸塩：スキャフォールド珪酸塩では、複数の四面体Ｓｉ０４グループが結合して三次元の格子になっている。例：長石のような二酸化珪素のいろいろな変形。
【００１２】
縮合プロセスは、それが進行するとそれぞれポリ珪酸又はポリ珪酸塩になるが、縮合反応に関与しない単結合性のオルガニル残基によって珪酸の水酸基の一部を置換することで制御することができる（種々の珪酸の生産）。
【００１３】
合成珪酸は非晶質で毒性がなく、結晶性Ｓｉ０２変形体とは対照的に、珪肺症（患者）には至らない。
【００１４】
一般文献
Ｈｉｎｚ， Ｓｉｌｉｃａｔ−Ｌｅｘｉｋｏｎ （２ｎｄ Ｖｏｌ．）， Ｂｅｒｌｉｎ； Ａｋａｄｅｍｉｅ Ｖｅｒｌ． １９８５
Ｌｉｅｂａｕ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｓｉｌｉｃａｔｅｓ， Ｂｅｒｌｉｎ； Ｓｐｒｉｎｇｅｒ １９８５
Ｐｅｔｚｏｌｄ， Ｈｉｎｚ， Ｅｉｎｆｕｈｒｕｎｇ ｉｎ ｄｉｅ Ｇｒｕｎｄｌａｇｅｎ ｄｅｒ Ｓｉｌｉｃａｔｃｈｅｍｉｅ， Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ； Ｅｎｋｅ １９７９
ＣＤ Ｒｏｅｍｐｐ Ｃｈｅｍｉｅ Ｌｅｘｉｋｏｎ−Ｖｅｒｓｉｏｎ １．０， Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ １９９５
【００１５】
１．３．  シロキサン、シリコーン
シラノール及びシロキサンを説明するのに用いる従来技術の方法は、有機シリコン誘導体、例えばトリメチルシリシウムクロライド［（ＣＨ３）３ＳｉＣｌ］に水が作用するという点にあり、この場合にはシラノール、例えばトリメチルシラノールが最初に生成する。
（ＣＨ３）３ＳｉＣｌ＋Ｈ２Ｏ → （ＣＨ３）３Ｓｉ−ＯＨ＋ＨＣｌ
【００１６】
次に水を分離して、ヘキサメチルジシロキサン ［（ＣＨ３）３Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３］のようなシロキサンが生成する。
２（ＣＨ３）３Ｓｉ−ＯＨ → （ＣＨ３）３Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３＋Ｈ２Ｏ
【００１７】
更に、環状又は鎖状の構造を有する分子量の高い化合物、あるいは三次元的に架橋しているマクロ分子（「シリコーン」）は、ジメチル又はモノメチルシリコンクロライドと水とを反応させ（中間体ジメチルシランジオール又はメチルシラントリオールをそれぞれ経由して）生産することができる。
（ＣＨ３）２ＳｉＣｌ２＋２Ｈ２Ｏ → （ＣＨ３）２Ｓｉ（ＯＨ）２＋２ＨＣｌ
ｎ（ＣＨ３）２Ｓｉ（ＯＨ）２ → （ＣＨ３）２ＳｉＯｎ＋ｎＨ２Ｏ
【００１８】
出発化合物Ｒ３ＳｉＯＨ（シラノール）、Ｒ２Ｓｉ（ＯＨ）２（シランジオール）、及びＲＳｉ（ＯＨ）３（シラントリオール）は更なるシリコーンの説明に使用するが、これらは通常はそれぞれ対応するハロゲン化合物Ｒ３ＳｉＣｌ２及びＲ２ＳｉＣｌ３（Ｒはエチル基、プロピル基、フェニル基等である）の加水分解によって生産される。
【００１９】
従ってシロキサン（シリコーン）は次のようにグループ分けされる。
（ａ）  タイプＲ３ＳｉＯ［Ｒ２ＳｉＯ］ｎＳｉＲ３の線型ポリシロキサン。
（ｂ）  分枝型のポリシロキサンであって、その分枝部位に三官能性又は四官能性のシロキサン単位を含有するもの。
（ｃ）  環状ポリシロキサンであって、二官能性シロキサン単位から構成されるもの。
（ｄ）架橋型重合体であって、鎖状又は環状を形成する分子が架橋して二次元又は三次元の網目構造になっているもの。
【００２０】
高分子量シリコーン（シリコーンオイル）は、鎖状マクロ分子から成るので、鎖の長さが増大するのに伴い粘度が増加する。シリコーンは工業材料として重要な役割を果たしている。鎖の架橋程度が低い場合にはゴム弾性を示す（シリコーンゴム、用途：シーリング剤等）。高度に架橋した場合のシリコーンは樹脂状になる（シリコーン樹脂）。
【００２１】
シリコーンは、その有機部分に由来する疎水性（撥水性）のために、（繊維、紙等の）含浸目的に使用される。
【００２２】
１．４．  シリカテイン
上記珪素化合物のいくつかは、費用の嵩む方法でのみ生産可能であり、あるいはごく少量でしか存在しない鉱物資源であり、従ってかなりの労力によってのみ単離可能である。珪酸塩の化学合成プロセスでは、高圧高温のような強烈な条件が必要である。
【００２３】
反対に、特定の酵素を援用して生物（特に海綿及び海藻）は自然条件、即ち低温低圧で、珪酸塩のスキャフォールドを生成することができる。この経路の利点は、特異性が高いこと、生成が調整できること、調節可能であること、そしてナノ構造の合成が可能なことである。
【００２４】
珪酸塩生成酵素（シリカテイン）の単離と精製は最近初めて以下の文献で開示された。
Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｋ．，ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６２３４−６２３８（１９９８）。
【００２５】
しかし、結果的にはこれには酵素（シリカテイン）の単離と精製は時間と労力を要しかつ得られる量が比較的に低いという問題がある、
【００２６】
一つの可能なアプローチは、既知のｃＤＮＡ又は遺伝子配列を援用して組換体タンパク質（組換体シリカテイン）を合成することである。これによって酵素的合成による効果的な珪酸塩合成が可能である。
【００２７】
しかし海綿Ｓｕｂｅｒｉｔｅｓ ｄｏｍｕｎｃｕｌａ及び Ｔｅｔｈｙａ ａｕｒａｎｔｉａから組換体シリカテインを生産した場合に問題が起こり、従来技術の方法だけでは達成される収量が非常に低く、かつ組換体タンパク質は低い酵素活性しか示さなかった。しかし、本発明は、発現条件を特別に改良することにより、組換体シリカテインを高収量にてかつ高特異敵活性で生産することが可能であることを記載する。さらに、この改良した組換体酵素は、天然体及び完全長ｃＤＮＡ配列を有する組換体よりもｐＨ及び温度に対する安定性が高い。更に天然体及び完全長ｃＤＮＡ配列を有する組換体は中性域のｐＨ値（ｐＨ７．０）で活性であるのに対し、この改良した組換体タンパク質は広範囲ｐＨ（４．５−１０）にわたって酵素活性を示す。
【００２８】
特異的なポリクロナール抗体を用意し、次にこれを固相に結合することによって、迅速かつ効果的なアフィニティークロマトグラフィーによる酵素の精製が達成可能である。
【００２９】
融合タンパク質を使用、異なる出発基質を利用は、さまざまな変形体と技術的な応用の可能性がある。
【００３０】
２．シリカテインの生産
２．１．  組換体シリカテインの生産
２．１．１．海綿からｃＤＮＡのクローニング
海綿由来のシリカテインタンパク質には特徴的な配列部分を含み、そのいくつかを以下に記述する。セリンが豊富なアミノ酸クラスターの周辺領域（Ｓ．ｄｏｍｕｎｃｕｌａの場合にはアミノ酸２６７−２７７）；触媒三つ組残基の最初のアミノ酸であるシステインの周辺領域（Ｓ．ｄｏｍｕｎｃｕｌａの場合にはアミノ酸１３８）、ただしこれはシリカテインには存在せず、関連する酵素カテプシンに存在する；前駆体ペプチドと成熟体ペプチド間のトランジション 周辺領域（Ｓ．ｄｏｍｕｎｃｕｌａの場合にはアミノ酸１１２／１１３）。
【００３１】
シリカテインの遺伝子は、ポリメラーゼ連鎖反応法によりｃＤＮＡライブラリーから同定することが可能であり、例えばＺａｐＥｘｐｒｅｓｓ 及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’の場合には、適当な縮退プライマー（例えば、逆プライマー  ５’−ＧＡＡ／ＧＣＡＧ／ＣＣＧＩＧＡＩＧＡＡ／ＧＴＣＡ／ＧＴＡＧ／ＣＡＣ−３’と５’ベクターに特異的なプライマー「アミノ酸２６７−２７７周辺領域」の組合せ、又は同じタンパク質断片のフォーワードプライマーと３’ベクターに特異的なプライマーの組合せ）、すなわち対応するベクター特異的プライマーを使用して可能である。この方法で得た合成体を使用してｃＤＮＡライブラリーにおけるスクリーニングを行う。その後、同定した単／複数のクローンをベクター（例えばｐＧｅｍ−Ｔ）中にサブクローン化し、続いて配列決定する。例として、図１はＳｕｂｅｒｉｔｅｓ．ｄｏｍｕｎｃｕｌａのシリカテインに対するｃＤＮＡを示す。
【００３２】
２．１．２．  組換体シリカテインの発現と単離
組換体シリカテインの生産はＥ． ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ中で実施するのが好ましい。しかし、酵母及び哺乳動物の細胞で生産することが可能であり、そして実施して好結果を得た。このために、ｃＤＮＡを、対応するベクター（例えばｐＱＥ−３０）にクローン化する。また、他の発現ベクターも同様に適することが証明されている。Ｅ． ｃｏｌｉを形質転換した後に、シリカテインの発現は、通常、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノサイド）（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．， Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．， Ｋｉｎｇｓｔｏｎ， Ｒ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ， Ｄ．Ｄ．， Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．， Ｓｅｉｄｍａｎｎ， Ｊ．Ｇ． ａｎｄ． Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．， （１９９５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）をもって誘導することにより行われる。シリカテインの発現並びに組換体タンパク質の精製は、例えば組換体タンパク質に存在するヒスチジン−タグを使用して、対応するアフィニティーカラム、例えばＮｉ−ＮＴＡマトリックス（Ｓｋｏｒｏｋｈｏｄ，Ａ．， Ｓｃｈａｅｃｋｅ，Ｈ．， Ｄｉｅｈｌ−Ｓｅｉｆｅｒｔ，Ｂ．，  Ｓｔｅｆｆｅｎ，Ｒ．， Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ Ａ．， ａｎｄ Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｗ．Ｅ．Ｇ． Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４３： ５０９−５１９； １９９７）で行うことができる。
【００３３】
しかし、Ｅ． ｃｏｌｉでのシリカテインの全配列の発現は非常に低い収量でしか達成できなかった。驚くべきことに、発現条件を以下のように改良することにより、該収量は劇的に向上した。
【００３４】
１．  このタンパク質のＮ末端をコードする配列を切除することにより、（完全長ｃＤＮＡを発現した場合と比較して）１００倍より多くの発現効率が達成された。前駆体ペプチドの領域から発現が始まるのが好ましい。しかし、「成熟」タンパク質の領域であって、最初のジスルフィド架橋が生起可能な位置（通常はアミノ酸１３５）の前で切除すると、発現は所望とおりに強力である（図２）。
【００３５】
２．  更に、このタンパク質のＣ末端をコードするｃＤＮＡを切除すると、完全長ｃＤＮＡを発現した場合に比較して２０倍より多くの発現効率が達成された（図２）。最後のジスルフィド架橋が生起可能な位置（通常はアミノ酸３１９）の後の配列領域の３’末端の位置での遺伝子を切除すると、好結果が同様に得られることが証明された。終止コドンをそこに挿入する。
【００３６】
３．  細胞の溶解中にプロテアーゼ阻害剤のカクテル液を添加すると、４０倍より多くの発現効率がＥ． ｃｏｌｉで達成される。以下のプロテアーゼ阻害剤のカクテル液を使用すると有利である。アンチペイン（１０μｇ）、ベスタチン（５μｇ／ｍｌ）、キモスタチン（１０μｇ／ｍｌ）、ロイペプチン（１μｇ／ｍｌ）、ペプスタチン（１μｇ／ｍｌ）、アプロチニン（１μｇ／ｍｌ）。このステップによる発現効率の上昇は特に意外であった。理由は、組換体タンパク質の単離に通常使用するプロトコール、例えばＢｕｇＢｕｓｔｅｒ抽出キット（Ｎｏｖａｇｅｎ）にあるようなプロトコールではこの成果は得られないからである。
【００３７】
４．  Ｅ． ｃｏｌｉ菌を溶解後の溶液は非常に粘性である。組換体タンパク質の効率的な単離は核酸消化用の酵素を添加することで達成される。これには、ヌクレアーゼ「ベンゾナーゼ」が適している。
【００３８】
５．  Ｅ． ｃｏｌｉでシリカテインを発現した場合に、この組換体タンパク質は、通常は「封入体」の形で存在している。そこで、この組換体タンパク質は「天然」形に変換しなければならない。このためには、以下の方法が適していることが証明されている。Ｅ． ｃｏｌｉ菌をＢｕｇＢｕｓｔｅｒ抽出キットの溶液で溶解し、洗浄後「封入体」を遠心分離して回収する。「封入体」を「タンパク質再生キット（Ｎｏｖａｇｅｎ）」のいわゆるＩＢ洗浄用緩衝液で数回洗浄する。例えば「タンパク質再生キット」と共に提供されている指示書を利用して組換体シリカテインを「天然」形に変換する。しかし、この方法及び該方法に匹敵する方法では、組換体シリカテインは分解する。驚くべきことに、この分解プロセスは酵素リゾチームを省略することにより回避することができる。普通、このリゾチームの添加段階は、Ｅ． ｃｏｌｉから組換体タンパク質を抽出するプロトコールでは固定化された段階となっている。この機能は、組換体タンパク質から結合菌膜を除去することである。しかし、Ｎｉ−ＮＴＡマトリックスのようなアフィニティーマトリックスを使用すれば、組換体シリカテインの最終精製は可能である。
【００３９】
このような諸修正を加えた方法を適用すれば、驚く程高い（１００倍より多い）発現がＥ． ｃｏｌｉで達成される。組換体シリカテインの菌培養培地１００ｍｌあたり約１０ｍｇの収量が現在達成されている（図３）。
【００４０】
２．１．３．  他の珪酸塩産生生物からの組換体シリカテインの発現と単離
上記の手順に従えば、さらに二酸化珪素産生生物から、例えば珪藻（例えばＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）から、シリカテインに対するｃＤＮＡの単離、クローニング及び発現が達成される。無菌培地での珪藻抽出は従来技術である（Ｋｒｏｅｇｅｒ，Ｎ． Ｂｅｒｇｓｄｏｒｆ，Ｃ． ａｎｄ Ｓｕｍｐｅｒ Ｍ． Ｅｕｒｏｐ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３９：２５９−２６４； １９９６）。
【００４１】
２．２．  動物及び単細胞生物からのシリカテインの単離と精製
シリカテインは、非晶質珪酸塩を、例えば海綿中で合成する酵素である。従って、シリカテインは当該生物から得ることができる。このためには、例えば海綿Ｓｕｂｅｒｉｔｅｓ ｄｏｍｕｎｃｕｌａ由来の針骨（非晶質珪酸塩から成る）を、Ｃａ＋＋及びＭｇ＋＋の無い海水の中でその組織を解離することにより、得ることができる。沈降分離により針骨を得る。針骨中の非晶質珪酸塩をアルカリ環境下、例えば希釈水酸化ナトリウム中で除去する。針骨の有機繊維にはシリカテインが含まれているので、遠心分離（例えば、２００００×ｇ；１時間；４℃）してこれを得る。高い塩濃度、例えば１ＭのＮａＣｌによって、あるいは「タンパク質再生キット」の方法によっても、タンパク質が溶液中に出現する。
【００４２】
次にシリカテインをアフィニティーマトリックス上で精製する。アフィニティーマトリックスは、シリカテインに特異的な抗体を固相（ＣＮＢｒで活性化したセファローズ又は他の適切な担体）上に固定化して製造し、精製する。抗体として、シリカテインに対するモノクロナール又はポリクロナール抗体を使用するが、これらは標準的な方法（Ｏｓｔｅｒｍａｎ，Ｌ．Ａ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌ．２； Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ［Ｂｅｒｌｉｎ］１９８４）によって生産する。抗体のカラムのマトリックスへの結合は、マトリックスの製造元（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の推奨法により行う。純粋シリカテインの溶出はｐＨのシフト又はイオン強度のシフトにより行う。更に、他のアフィニティーマトリックス、例えばポリマー珪酸塩やポリマー珪酸塩／ゲルマニウム酸塩を使用して好結果が得られている。これらマトリックスからのシリカテインの溶出は、シリカテインの等電点ｐＨ（Ｓ． ｄｏｍｕｎｃｕｌａシリカテインの場合にはｐＨ約６）で行う。
【００４３】
他の二酸化珪素産生生物、例えば珪藻（例、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）からのシリカテインの同様な単離は、上記方法に従って行った。
【００４４】
また、本発明の新規なる点は、培地中の適切な珪酸塩濃度（通常６０μＭ）にてミオトロフィン（１μｇ／ｍｌ）添加によりシリカテイン遺伝子が誘導可能となることである（図４Ａ、Ｂ）。
【００４５】
３．シリカテイン活性の検出と珪素アルコキシ化合物の合成
組換体シリカテインの酵素活性の測定は、通常以下のごとく行う。組換体シリカテインを酵素反応に適した緩衝液、例えば２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８（ｐＨが４．５から１０．５の範囲にある他の緩衝液も適する）で一夜透析する。
【００４６】
通常、組換体シリカテインは、適切な緩衝液、例えば２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）の１ｍｌ、及び通常の１−４．５ｍＭのテトラエトキシシラン溶液の１ｍｌでは、１−６０μｇが溶解している。酵素反応は室温ばかりでなく、５℃と約６５℃の間の温度でも行うことができる。インキュベートの平均時間は６０分である。この時間内に、通常、シリカテイン１００μｇあたり３００ｎモルの非晶質珪酸塩（モリブデン酸塩に反応性の可溶性珪酸塩として）が合成される。珪酸塩生産物の検出には、卓上遠心器で遠心分離（１２０００×ｇ；１５分；＋４℃）し、エタノールで洗浄し、空気乾燥する。次いて、沈殿物を例えば１ＭのＮａＯＨで加水分解する。出現する珪酸塩をモリブデン酸塩がサポートする検出方法、例えばシリコーンアッセイ（Ｍｅｒｃｋ）を使用して溶液中にて定量的に測定する。
【００４７】
驚くべきことに、シリカテインは基質テトラエトキシシラン以外にもシランアルコキサイドを重合させることが判った。
【００４８】
本発明方法の新規なる点は、次の化合物がシリカテイン媒介合成に使用可能なことである。すなわち、テトラアルコキシシラン類、トリアルコキシシラノール類、ジアルコキシシランジオール類、モノアルコキシシラントリオール類、アルキル−又はアリール−トリアルコキシシラン類、アルキル−又はアリール−ジアルコキシシラノール類、又はアルキル−又はアリール−モノアルコキシシランジオール類、又は、それぞれ、ガリウム（ＩＶ）、錫（ＩＶ）又は鉛（ＩＶ）の対応する（アルキル−又はアリール−置換）アルコキシ化合物類である。これら基質の混合物も酵素によって認識され、重合される。従って、混合重合体も生産可能である。
【００４９】
酵素シリカテインの活性を増加させるために、基質、例えばテトラエトキシシランをジメチルスルフォキサイドに溶解して、通常５００ｍＭの保存溶液とし、次に所望の最終濃度に希釈する。
【００５０】
４．シリカテインのｃＤＮＡと他のタンパク質の１以上のｃＤＮＡ（オープンリーディングフレーム）との結合
４．１．  シリカテイン融合タンパク質の生産
シリカテインを有する融合タンパク質は次のようにして得る。適切な発現ベクター（例えばｐＱＥ−３０）を使用する。５’末端に例えばＢａｍＨＩ制限酵素部位及び３’末端に例えばＳａｌＩ制限酵素部位を有するシリカテインｃＤＮＡが生産される。シリカテインｃＤＮＡの終止コドンを除去する。これによって、それぞれ対応する制限酵素部位を有するプライマーを使用してＰＣＲ法により増幅する。次に、第二のタンパク質に対するｃＤＮＡを得るが、このｃＤＮＡでは５’末端にはシリカテインｃＤＮＡの３’末端に存在したと同じ制限酵素部位（この例ではＳａｌＩ）が、また３’末端には他と異なる制限酵素部位（例えばＨｉｎｄＩＩＩ部位）が存在する。内部制限酵素部位がそれぞれのｃＤＮＡ中に存在する場合には別の制限酵素を使用することができる。また両ｃＤＮＡの間にリンカーを使用することができる（図５Ａ）。
【００５１】
二つのｃＤＮＡを連結し、精製し、ｐＱＥ−３０ベクター（Ｑｕｉａｇｅｎ）中に標準の手順に従って連結する。ヒスチジン−タグ（約６個のヒスチジンコドン）の直ぐ後に連結が起こる。融合タンパク質の発現と精製は前記（２．１．２．節）と同様に達成することができる。
【００５２】
４．２．  セパレート発現（ｓｅｐａｒａｔｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）Ｉ
４．１．に説明した方法の別法として、プロテアーゼ開裂部位（例えばエンテロキナーゼ部位）を、シリカテインのｃＤＮＡと生物活性タンパク質のｃＤＮＡの間にクローン化することができる。この場合には生物活性タンパク質遺伝子をコードする領域の前に、新たな開始メチオニンのコドンを挿入することができる。発現し精製すると（融合）タンパク質がタンパク質分解的に開裂する。その結果、両タンパク質が個別に存在する（図５Ｂ）。
【００５３】
４．３．  セパレート発現  ＩＩ（カセット発現）
別法として、両タンパク質を一つの構造体の上に、しかし個別に発現させることができる。これには、発現ベクターの中で、シリカテインの遺伝子をヒスチジン−タグの後ろに続ける。終止コドンをシリカテインｃＤＮＡの末端に挿入する。開始メチオニンのコドンを有するリボソーム結合部位を、シリカテインのｃＤＮＡと生物活性タンパク質のｃＤＮＡの間にクローン化する。更に、別のヒスチジン−タグを生物活性タンパク質のｃＤＮＡに先行させる。この遺伝子に更に終止コドンを具備させる（図５Ｃ）。
【００５４】
タンパク質をそれぞれの宿主細胞での機能性解析用に使用する場合には、ヒスチジン−タグを削除することができる。
【００５５】
４．４．  延長
バクテリア及び真核細胞を４．１から４．３に記載の発現に使用することができる。
【００５６】
４．１から４．３に記載の発現は、３以上のオープンリーディングフレームに使用することができる。
【００５７】
５．  生産したシリカテイン及びシリカテイン融合タンパク質の使用
５．１．  生体材料の表面改質へのシリカテインの使用
（曝露及び／又は移植された）生体材料に対す生物（又は生化学的抽出物／生産物）の生化学的な反応は、それら物質の表面の構造と化学性に大きく支配される。従って、これら生体材料の表面を改質する方法が必要である。生体分子の有利な化学物理的性質を保護することは常に目的（課題）である。これらの生化学的な相互作用が影響を受けないために、最外表面だけを改質する必要がある。
【００５８】
表面を改質（例えば、シリコーン及びシロキサン含有ブロック共重合体による「シラン処理」）した生体材料には、細胞の付着及び成長に影響をあたえることにより、血液適合性を改善し又はタンパク質吸着を制御（コンタクトレンズの吸収削減、ＥＬＩＳＡプレートの前処理）するという用途がある。特に、材料表面の改質のためのシラン化は、水酸基化した又はアミンが豊富な表面（例えばガラス、シリコン、ゲルマニウム、アルミニウム、石英、他の金属酸化物等の水酸基が豊富な材料）の改質に利用できる。文献の所在は、Ｂ．Ｄ．Ｒａｔｎｅｒ ｅｔ．ａｌ．  （ｅｄｉｔｏｒ） Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ−Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９６．である。
【００５９】
しかし、この処理には問題が生じており、これら改質品を生産する過程で適用する条件下では使用する生体材料に有害な（破壊的な）効果がしばしば起きる。
【００６０】
本発明（組換／精製シリカテインの使用）（非晶質ＳｉＯ２−、シロキサン−、又はシロキサンブロック共重合体−含有表面のシリカテイン媒介による酵素的合成）の方法を使用する生体材料の改質は、生化学的な反応にのみ依拠しているので、現行の物理的／化学的方法に比較すると「温和な」方法である。
【００６１】
多くの場合に、材料表面の改質された領域はできるだけ薄くなければならない。理由は、改質表面層が厚過ぎると材料の機械的及び機能的な性質に関係する恐れがあるからである。薄くすることは、シリカテイン媒介酵素反応における反応時間と基質濃度を変更することにより、簡単な方法で達成可能である。
【００６２】
多種の生体材料、実際には重合体、金属、セラミックス、ガラス等の生体材料が、シリカテイン媒介酵素反応を利用することにより利用可能となる。すなわち、それらは生体材料の表面が自然にタンパク質（シリカテイン）結合性となり、あるいは事前の改質によりタンパク質結合能を有するようになる。
【００６３】
シランは二種類の表面構造を形成することができる。微量程度の表面吸着水が存在する場合には、非常に薄い層（単層）となるが、水が多い場合には厚いシラン層となり、この層はＳｉ−Ｏ基が表面に結合しており、かつシラン単位により、三次元のポリメリックネットワークが形成される。例えば水酸基化している表面をｎ−プロピルトリメトキシシランで処理すれば、こうした改質品を製造することができる。
【００６４】
一般文献：Ｐｌｅｕｄｄｅｍａｎｎ， Ｅ．Ｐ．（１９８０） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｓｉｌａｎｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ． Ｉｎ Ｓｉｌｙａｔｅｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ （Ｄ．Ｅ．Ｌｅｙｄｅｎ， ｅｄｉｔｏｒ） Ｇｏｒｄｏｎ ＆ Ｂｒｅａｃｈ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３１−５３）。
【００６５】
更に、シリカテイン媒介酵素反応を利用すれば、複数の生体材料の上に数種の表面構造を形成可能である（温和な条件を使用するので生体材料は障害から防止される）、しかもその合成は酵素により媒介されるので、制御可能である。
【００６６】
特に、シリコン様性質を有する生体材料の表面改質品（例えばシリコン製乳房埋込み物）の製造に、また医療上の埋込み物及びエンドプロセシスに、及びコンタクトレンズに、組換体シリカテイン又は起源の異なる精製シリカテインを使用することは本発明の成果である。
【００６７】
５．２．生体分子のカプセル化へのシリカテインの使用
組換体シリカテイン又は起源の異なる精製シリカテインを使用して、ＳｉＯ２又はシロキサンの被膜を制御的に合成し、これを使用して生体分子（例えばタンパク質と核酸）並びに生体活性分子（例えばホルモン、医薬、サイトカイン）をカプセル化し、これらの生化学的な性質（例えばプロテアーゼ耐性、ヌクレアーゼ耐性、温度安定性）あるいは放出性（制御「薬物運搬」及び局部への薬物運搬の実施可能性）を改善又は向上することは本発明の成果である。
【００６８】
（ａ）タンパク質のプロテアーゼ耐性（及び温度安定性）の増加
方法：タンパク質をＳｉＯ２被膜合成であるシリカテイン被膜（例えば架橋により）で包む。
【００６９】
（ｂ）核酸のヌクレアーゼ耐性（及び温度安定性）の増加
方法：拡散をＳｉＯ２被膜合成であるシリカテイン被膜（例えば架橋により）で包む。
【００７０】
上記の方法により、医薬品（例えばペプチド／プロテオホルモン及びサイトカイン）のデポ型を製造することが可能である。このためには、医薬品（例えばペプチド／プロテオホルモン及びサイトカイン）を最初に（ａ）シリカテインと架橋する、又は（タンパク質の場合は）（ｂ）シリカテインを有する融合タンパク質を生産する。よって、カプセル材質をシリカテイン媒介により合成することでできる。
【００７１】
ＷＯ ９６／１４８３２ Ａ１ １９６６−０５−２３ （ＵＳ ９５１４２６１ １９９５−１１−０６）には、ポリ燐酸塩から合成リポソームを産出し、医薬品の吸収を増加する方法（「薬物運搬」）が開示されている。シリカテインを利用してリポソームを安定化する被膜をデザインすれば、この方法の効率は増大可能である。
【００７２】
更に、これは、組換体又は起源の異なる精製シリカテインを使用して、（組換／精製シリカテインにより生産される）ポリ珪酸塩、シリコン又は混合重合体と（組換体ポリ燐酸塩キナーゼにより生産される）ポリ燐酸塩とを共合成し、新しい生体材料（又は複合材料）、例えば骨又は歯の代替材料の製造をもたらす。
【００７３】
５．３．移植における細胞／組織のカプセル化へのシリカテインの使用
組換体シリカテイン又は起源の異なる精製シリカテインを使用してＳｉＯ２又はシロキサンの被膜を制御的に合成することにより、移植における細胞をカプセル化（生体適合性の向上）することができる。
【００７４】
これは、シリカテインで、又はシリカテイン融合タンパク質を細胞表面上に発現させることを経由して、細胞を被覆することにより行うことができる。
【００７５】
５．４．（シリコン）半導体又はシリコンチップの表面改質（接触面の処理）へのシリカテインの使用、及びこれらの利用
組換体シリカテイン又は起源の異なる精製シリカテインを使用して、（シリコン又はゲルマニウム）半導体又は（シリコン又はゲルマニウム）バイオセンサーチップの表面を改質することもできる。これにより、有機材料を構成する細胞又は他の構造物との接続が達成可能となる。これらの「マトリックス」を使用すれば、細胞の電気的性質を測定することができる。このようなシリカテインで改質された半導体（又はシリコンマイクロチップ）はバイオセンサーとしても使用することができる。
【００７６】
５．５．シリコンを含有する宝石又は準貴石の合成へのシリカテインの使用
組換体又は起源の異なる精製シリカテインは、非晶質ＳｉＯ２を生成することができる。アカット、ジャスピス、オニキス等はそれぞれＳｉＯ２（オパール）の非晶質又は微細結晶質変形体に属する。組換体又は起源の異なる精製シリカテインを援用しで制御条件下で非晶質ＳｉＯ２が合成可能であり、その際に外来の分子／原子を導入可能であり、結果としては、本発明の方法を使用して上記及びその他の宝石／準貴石を製造したことに相当する。
【００７７】
組換体又は起源の異なる精製シリカテインを援用して、薄いＳｉＯとＳｉＯ２の層を（集積回路製造用）半導体担体の上に条件を制御しながら形成することもできる。
【００７８】
５．６．シリコン（ガリウム−、錫−、又は鉛−）化合物（いわゆるシラファルマカを含む）の合成へのシリカテインの使用
シリコンは、結合組織及び骨の形成（ミネラル化）に明らかに必要な微量元素であることが判っている。いわゆるシラファルマカ（ｓｉｌａ−ｐｈａｒｍａｃａ）（これは、ＣをＳｉで置換したファルマカであり、生物への作用モードにおいて相違が顕れる）用の基材としてのシリコン有機化合物の製造は、医療上重要である ［参照：Ｃｈｅｍ．ｕｎｓｅｒｅｒ Ｚｅｉｔ １４， １９７−２０７（１９８０） 及びＢｉｏａｃｔｉｖｅ Ｏｒｇａｎｏ−Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ （Ｔｏｐｉｃｓ Ｃｕｒｒ． Ｃｈｅｍ． ８４）， Ｂｅｒｌｉｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ １９７９］。このような化合物を温和な（酵素的）条件で合成することは、本発明方法により可能である（組換体又は起源の異なる精製シリカテインの使用）。
【００７９】
（組換体又は起源の異なる精製シリカテインを使用し）温和な（酵素的）条件で、本発明方法を援用して合成したシリコン化合物を、更に医薬品及び化粧品に使用（：軟膏の成分又は基剤として、また歯のペーストの部材として合成したシリコン化合物の使用）できる。［化粧品での使用、参照：Ｐａｒｆｕｅｍ．Ｋｏｓｍｅｔ． ６７， ２３２−２３９， ３２６−３３６， ３８４−３８９（１９８６）； ６８， １９５−２０３（１９８７）］。
【００８０】
（組換体又は起源の異なる精製シリカテインを使用し）温和な（酵素的）条件で本発明方法を援用して合成したシリコン化合物は、更に次の目的にも使用できる。潤滑剤（プラスチックの加工用）、グリース（プラスチックギヤー）、消泡剤、金型離形剤（ガラス、セラミックス、繊維、皮革に疎水性を賦与）及び絶縁体（デイエレクトリカ）（例えばトランスフォーメイターにおいて）。
【００８１】
本発明の方法を援用して合成した化合物には、標準技術で使用するシロキサン樹脂、例えば（多少架橋している）ポリメチルシロキサンあるいはポリメチルフェニルシロキサンも含まれる。
【００８２】
シリカテイン媒介の酵素作用が進行している過程で縮合によりシラントリオールＲＳｉ（ＯＨ）３が生成すると、全体組成がＲ２Ｓｉ２Ｏ３となるシート構造様の重合体が合成される。これら重合体の架橋及び延長の程度は、シランジオールとシラノールの混合を制御することにより変更することができる。したがって、シリコン構造を製造するにあたり、特徴的かつ制御可能な性質とを有するように酵素的に誂えることができる。
【００８３】
シロキサンのスキャフォールドは種々の種類の炭化水素残基に結合することができる。これによりその性質は改質される。
【００８４】
シリカテイン媒介の酵素作用によって合成されたシリコン（経験によれば有害ではない）は、耐熱性かつ疎水性であるので、スキンケア化粧品及びプラスチックの外科用品に使用することもできる。
【００８５】
一般文献：Ｂｒｉｎｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ ｉｎ ｄｅｒ Ｌｅｂｅｎｓ− ｕｎｄ Ｇｅｎｕｓｓｍｉｔｔｅｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ， Ｍｕｅｎｃｈｅｎ： Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ １９８１。
【００８６】
５．７．シリカテイン遺伝子／ｃＤＮＡ含有プラスミドでの形質転換による細胞の性質の改変
シリカテイン遺伝子／ｃＤＮＡ含有プラスミドで細胞を形質転換することにより、細胞の性質を改変することができ、結果的にはこれを使用して、（シリカテイン媒介合成したＳｉＯ２とポリ燐酸塩キナーゼｃＤＮＡ含有プラスミドで細胞を形質転換して製造したポリ燐酸塩とを更に共重合して）骨の代替材料を製造する。
【００８７】
５．８．非晶質二酸化珪素由来のナノ構造の合成への組換体シリカテインの使用
組換体シリカテイン、組換体シリカテイン融合タンパク質、又は精製シリカテインを利用すれば、非晶質の二酸化珪素、シロキサン、又は他のシリコン（ＩＶ）−［又は、ガリウム（ＩＶ）−、錫（ＩＶ）−、又は鉛（ＩＶ）−］化合物から、特異的な二次元及び三次元の篩、網、籠等に形成されたナノ規模の構造を合成することができ、この場合にこれら酵素にマクロ分子（合成重合体又は生体機能重合体）を結合させ、これを合成の「案内軌道」として使用する。海の養殖池又はタンクに保存した海綿又は他のシリカテイン産生生物、及び本来は珪酸塩を合成できないが遺伝子技術によって改質した生物を使用してもこの合成は可能である。形成された構造体はナノ技術に（例えばナノ規模での分離工程用「ミニチュアシーブ」として）使用することができる。
【００８８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
以下に添付図面の説明をする。
【図１】Ｓｕｂｅｒｉｔｅｓ ｄｏｍｕｎｃｕｌａシリカテインに対するｃＤＮＡと推定アミノ酸配列。
【図２】海綿Ｓｕｂｅｒｉｔｅｓ ｄｏｍｕｎｃｕｌａ由来のシリカテインのアミノ酸配列。このタンパク質の活性部位を「――」で示してあり、これらはｃＤＮＡにおける切除が行われた後に組換体タンパク質の発現を強力に増加する。また、触媒三つ組残基のアミノ酸を（ＣＴ）にて、同様にジスルフィド架橋の可能性があるシステイン単位を（●）にてマークしてある。
【図３】Ｅ． ｃｏｌｉでの組換体シリカテインタンパク質の産生。記載の方法に従って粗抽出物から純粋シリカテインを得た。レーンａ：非誘導細胞［−ＩＰＴＧ］からのタンパク質抽出物、レーンｂ及びレーンｃ：誘導細胞［＋ＩＰＴＧ］からのタンパク質抽出物で、ＩＰＴＧ添加後２．５時間（レーンｂ）及び８時間（レーンｃ）のもの。レーンｄ：８時間発現後のバクテリア溶解液の可溶性タンパク質抽出物。レーンｅ：封入体のタンパク質抽出物。レーンｆ：Ｎｉ−ＮＴＡマトリックス上でタンパク質を精製後封入体由来の精製シリカテイン。組換体シリカテインの分子量は約３３ｋＤａである。左側に分子量のマーカーを示してある。
【図４】（Ａ）Ｓ． ｄｏｍｕｎｃｕｌａの原形体におけるシリカテイン転写産物の濃度。原形体は、５日の培養後に単細胞から形成されており、外来珪酸塩非存在（珪酸塩マイナス）又は６０μＭの珪酸ナトリウム存在（珪酸塩プラス）にて０（対照：Ｃｏｎ）から５日間インキュベートした。次にＲＮＡを抽出し、５μｇの総ＲＮＡをサイズに従って分離した。ブロット転写の後にＳ． ｄｏｍｕｎｃｕｌａのシリカテインプローブ（ＳＵＢＤＯＳＩＬＩＣＡ）をハイブリッドした。（Ｂ）シリカテイン及び原形体の発現に対する組換体ミオトロフィンの効果。原形体をミオトロフィン非存在（ミオトロフィンマイナス）又は１μｇ／ｍｌのミオトロフィン存在（ミオトロフィンプラス）にて０（対照）から５日間までインキュベートした。次にＳＵＢＤＯＳＩＬＩＣＡプローブを使用してノーザンブロッティングを行い、シリカテインの発現程度を測定した。
【図５】シリカテイン遺伝子と生物活性物質をコードする遺伝子の共発現（スキーム）。Ａ．  シリカテイン−生物活性タンパク質の融合タンパク質の産生。両ｃＤＮＡ｛シリカテイン及び生物活性タンパク質の｝を制限部位（例えばＳａｌＩ）を介して結合し、次にベクターｐＱＥ−３０の制限部位ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの中にクローン化した。ヒスチジン−タグを５’末端に置いた。Ｂ．  セパレートタンパク質発現。両ｃＤＮＡを適当なベクターの中にプロテアーゼ制限部位を介してクローン化した。発現及び精製後、プロテアーゼ消化によって融合タンパク質を個別に得た。Ｃ．  セパレートタンパク質発現（カセット発現）。両ｃＤＮＡを同一の構造体から個別に発現しヒスチジン−タグで精製した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004516818.tif 000048
【国際調査報告】
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