(57)【要約】本発明は、ヒト血小板凝集並びに大豆リポキシゲナーゼの阻害薬として有用な８−メチル−１３−フェニル−トリデカ−４，６，８，１０，１２−ペンテン−３−オンであって、Aspergillus nigerから得られる式１を有する上記化合物の製造方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板凝集阻害剤および大豆リポキシゲナーゼ阻害剤として有用な８−メチル−１３−フェニル−トリデカ−４，６，８，１０，１２−ペンテン−３−オンの製造方法であって、
i)   ジャガイモデキストロースブロスを含んでなり、pHが５〜５．５である培地を作製し、
ii)   段階(i)の培地に真菌を接種し、培養物を２８〜３７℃で５〜８日間インキュベーションし、
iii)   酢酸エチルを培養物に加えて、これを室温にて１〜３時間インキュベーションし、
iv)   溶媒を醗酵ブロスから濾過によって分離し、
v)   総ての痕跡量の水を培養物から除去し、これを乾燥して粗製抽出物を得て、
vi)   粗製抽出物をカラムクロマトグラフィーにかけて、橙色画分から化合物８−メチル−１３−フェニル−トリデカ−４，６，８，１０，１２−ペンテン−３−オンを赤色結晶生成物として溶離し、
vii)   この化合物を常法によって精製する
段階を含んでなる、上記方法。
【請求項２】
３〜５日経過のジャガイモデキストロース寒天斜面培地からAspergillusの菌糸体または胞子を剥落させることによって発酵用の接種物を作製し、５００〜２０００mlのジャガイモデキストロース寒天斜面培地に移し、５００〜２０００mlのジャガイモデキストロースブロス溶液に移し、１００〜２００rpmで攪拌下にて２８〜３７℃で２４〜４８時間インキュベーションし、それによってブロスを醗酵させことを含んでなる大豆リポキシゲナーゼ阻害を有するヒト血小板凝集阻害剤の製造方法であって、接種物の作製と主醗酵の両方に用いる培地が、培地１００mlに対して皮を剥いて切断したジャガイモを煮沸したもの１５〜２０gとグルコース１〜３gを含んでなるジャガイモデキストロースブロスであって、最終pHが５．１〜５．５であり、培地を１２１℃で１０〜２０分間殺菌し、３０℃まで冷却した後に接種し、接種物０．５〜２リットルを液体培地に移し、１００〜２００rpmにて２８〜３０℃で５〜８日間インキュベーションし、醗酵の終了時に酢酸エチル等の溶媒１〜５リットルを醗酵済の培地に加えて室温にて１〜３時間インキュベーションした後、醗酵済のブロスをワットマン１号濾紙で濾過し、溶媒を分液漏斗を用いて分離し、無水硫酸ナトリウム１０〜５０gを加えて総ての痕跡量の残留水を除去し、溶媒を真空蒸留して粗製抽出物０．５〜２gを得て、これをヘキサン中シリカゲル（１００〜２００メッシュ）１０〜５０gのカラムに装填し、ここでカラムの床容積は２０〜６０mlであり、その後、カラムを最初にヘキサン１〜２容で洗浄した後、阻害剤をヘキサン：クロロホルム（１：１）１〜２容を用いて橙色画分の形態で溶出し、これを真空蒸留して溶媒を留去してこの半精製阻害剤１００〜２００mgを得て、これにヘキサン１〜１０mlを加えて１〜１０℃で少なくとも２〜３日間保管して、ヒト血小板凝集およびリポキシゲナーゼ阻害に対してそれぞれ２３４μmおよび９５．６μmの最終ｉｃ５０活性を有する赤色結晶状の精製した上記阻害剤１〜５mgを得ることを特徴とする、上記方法。
【請求項３】
真菌がAspergillusおよびPenicillium種から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
真菌がAspergillus flavus、Aspergillus japonicus、Aspergillus nigerおよびAspergillus awamoriから選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
段階(i)の培地がジャガイモとグルコースを含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
真菌をジャガイモ、デキストロースおよび寒天を含む培地で１００〜２００rpmで攪拌下にて３〜５日間培養する、請求項２に記載の方法、
【請求項７】
大豆リポキシゲナーゼ阻害を有するヒト血小板凝集阻害剤を産生するための醗酵時間が５〜８日間である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
培地に接種物５〜１５％を接種する、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
醗酵済の培地をクロロホルムおよび酢酸エチル等の水不混和性溶媒で抽出する、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
８−メチル−１３−フェニル−トリデカ−４，６，８，１０，１２−ペンテン−３−オンを極性および無極性溶媒の組合せを用いるカラムクロマトグラフィーによって精製する、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
カラムクロマトグラフィー用溶媒がヘキサンとクロロホルムである、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
８−メチル−１３−フェニル−トリデカ−４，６，８，１０，１２−ペンテン−３−オンの、ヒト血小板凝集阻害剤および大豆リポキシゲナーゼの阻害剤としての使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト血小板凝集並びに大豆リポキシゲナーゼの阻害剤として有用な８−メチル−１３−フェニル−トリデカ−４，６，８，１０，１２−ペンテン−３−オンの製造方法に関する。式１を有する上記化合物は、Aspergillus nigerから得られる。
【化１】
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式１
【背景技術】
【０００２】
日本国特許第０６２５６２７５号公報明細書には、 Streptomyces種由来のウサギ血小板凝集阻害剤の製造方法が記載されている。しかしながら、多数の培地構成成分が阻害剤の製造に用いられていた。
【０００３】
日本国特許第０４１５９２７４号公報明細書には、ウサギ血小板凝集阻害剤としての醗酵によるベンゾキノン誘導体が記載されている。従来技術に記載の活性は極めて低く、すなわち、活性はＩＣ５０が１mmであった。
【０００４】
米国特許第５２０８３６４号公報明細書には、Streptomyces種由来の５−リポキシゲナーゼ阻害剤が記載されている。この従来技術には、ブロス（broth）から阻害剤を精製するのにＨＰＬＣを用いる非実用的方法が記載されている。
【０００５】
リポキシゲナーゼ阻害剤の調製はBetina, V; Prog Ind Microbiol 30 (1994) 121-135に開示されている。この従来技術には、streptoverticillium種および pseudomonas methanica由来のそれぞれ３−メトキシトロポロンおよびkf 8940のようなこれらの阻害剤の製造が記載されている。しかしながら、これらの代謝産物は、複雑な培地成分から製造しなければならないことが報告されている。
【０００６】
効果的な大豆リポキシゲナーゼ阻害を示すＮ−アセチルアミノサリチル酸や５−アミノサリチル酸等のスルファサラジン代謝物についての検討は、Allgayer, H; Eisenburg, J; Paumgartner, G; Eur J Clin Pharmacol. 26 (984) 449-451に開示されている。しかしながら、この従来技術には、大豆リポキシゲナーゼ阻害剤が血小板凝集に対する阻害剤としても作用することは開示も示唆もされていない。
【０００７】
当該技術の状態を記載する上記論文から、ヒト血小板凝集に対する活性を有し且つ大豆リポキシゲナーゼ阻害剤として作用する分子を得るための既知のまたは明らかに単純な醗酵培地も条件もないことが明らかである。更に、上記従来技術のいずれにも、ヒト血小板凝集阻害剤および大豆リポキシゲナーゼ阻害剤として有用な式１の化合物８−メチル−１３−フェニル−トリデカ−４，６，８，１０，１２−ペンテン−３−オンの調製は開示されていない。
【０００８】
発明の概要
本発明の目的は、８−メチル−１３−フェニル−トリデカ−４，６，８，１０，１２−ペンテン−３−オンの製造方法を開発し、ヒト血小板凝集阻害剤および大豆リポキシゲナーゼ阻害剤としてのその使用を開拓することである。上記化合物は、本明細書において以下に示されるように式１を有する。
【化２】
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式１
【０００９】
発明の具体的説明
従って、本発明は、式１を有し且つAspergillus nigerから得られる８−メチル−１３−フェニル−トリデカ−４，６，８，１０，１２−ペンテン−３−オンの製造方法を提供する。上記化合物は、ヒト血小板凝集並びに大豆リポキシゲナーゼの阻害剤として有用である。
【００１０】
８−メチル−１３−フェニル−トリデカ−４，６，８，１０，１２−ペンテン−３−オンの製造方法は、
i)   ジャガイモデキストロースブロスを含んでなりpHが５〜５．５である培地を作製し、
ii)   段階(i)の培地に真菌（fungi）を接種し、培養物を２８〜３７℃で５〜８日間インキュベーションし、
iii)   酢酸エチルを培養物に添加し、これを室温にて１〜３時間インキュベーションし、
iv)   溶媒を醗酵ブロスから濾過によって分離し、
v)   総ての痕跡量の水を培養物から除去し、これを乾燥して粗製抽出物を得て、
vi)   粗製抽出物をカラムクロマトグラフィーにかけて、橙色画分から化合物８−メチル−１３−フェニル−トリデカ−４，６，８，１０，１２−ペンテン−３−オンを赤色結晶生成物として溶離し、
vii)   この化合物を常法によって精製する
段階を含んでなる。
【００１１】
詳細に説明すれば、この方法は、３〜５日経過（old）のジャガイモデキストロース寒天斜面培地からAspergillus nigerの菌糸体または胞子を剥落させることによって発酵用の接種物を作製し、５００〜２０００mlのジャガイモデキストロースブロス溶液に移し、１００〜２００rpmで攪拌下にて２８〜３７℃で２４〜４８時間インキュベーションして醗酵を１０〜１５リットルの容量の醗酵槽で行う段階を含んでなり、ここで、接種物の作製と主醗酵の両方に用いる培地がジャガイモデキストロースである。このブロスは、培地１００mlに対して皮を剥いて切断したジャガイモを煮沸したもの１５〜２０gとグルコース１〜３gを含んでなり、最終pHが５．１〜５．５であり、培地を１２１℃で１０〜２０分間殺菌し、３０℃まで冷却した後に接種を行う。その後、接種物０．５〜２リットルを液体培地に移し、１００〜２００rpmにて２８〜３０℃で５〜８日間インキュベーションする。醗酵工程の終了時に、酢酸エチル等の溶媒１〜５リットルを醗酵済の培地に加えて室温にて１〜３時間インキュベーションした後、醗酵済のブロスをワットマン（whatman）１号濾紙で濾過し、溶媒を分液漏斗を用いて分離する。次の段階は、無水硫酸ナトリウム１０〜５０gを加えて総ての痕跡量の残留水を除去することである。溶媒を真空蒸留して粗製抽出物０．５〜２gを得て、これをヘキサン中シリカゲル（１００〜２００メッシュ）１０〜５０gのカラムに装填し、ここでカラムの床容積は２０〜６０mlである。その後、カラムを最初にヘキサン１〜２容で洗浄した後、阻害剤をヘキサン：クロロホルム（１：１）１〜２容を用いて橙色画分の形態で溶出し、これを真空蒸留して溶媒を留去し、この半精製阻害剤１００〜２００mgを得て、これにヘキサン１〜１０mlを加えて１〜１０℃で少なくとも２〜３日間保管して、ヒト血小板凝集に対して最終ｉｃ５０活性が２３４μmであり、大豆リポキシゲナーゼに対するｉｃ５０活性が９５．６μmである赤色結晶状の精製した上記阻害剤１〜５mgを得る。
【００１２】
本発明の一態様では、aspergillusおよびpenicillin種等の真菌を用いて、阻害剤を産生させることができる。aspergillus種は、A. flavus、A. japonicus、A. niger、A. awamori等の既知の種から選定することができる。これらの菌株は、ATCC 9029、ATCC 11414、ATCC 1015、ATCC 10522、ATCC 26550、NRRL 3、NRRL 556、NRRL 337、NRRL 1042、CBS 102,49、CMI 41876等の菌株と同等である。
【００１３】
本発明のもう一つの態様では、用いる液体培地は、培地１００mlに対してジャガイモ１５〜２０gとグルコース１〜３gからなるポテトデキストロースブロスである。本発明のもう一つの態様では、培養を３〜５日間行うことができ、経過した接種物は１００〜２００rpmで攪拌下にて２４〜４８時間増殖させることができる。本発明の更にもう一つの態様では、醗酵に用いる液体培地を１２１℃で１０〜２０分間殺菌し、５〜１５%の接種物を接種することができる。
【００１４】
本発明の更にもう一つの態様では、ヒト血小板凝集阻害剤の産生のための醗酵時間は５〜８日間とすることができる。
【００１５】
本発明の更にもう一つの態様では、醗酵済の液体培地をクロロホルム、酢酸エチルのような水不混和性溶媒で抽出することができる。
【００１６】
本発明の更にもう一つの態様では、ヒト血小板凝集阻害剤の精製は、極性と無極性溶媒との組合せを用いる通常のカラムクロマトグラフィーによって上記阻害剤を回収することを含んでなる。
【００１７】
従って、本発明は、ヒト血小板凝集阻害剤および大豆リポキシゲナーゼ活性の阻害剤として有用な８−メチル−１３−フェニル−トリデカ−４，６，８，１０，１２−ペンテン−３−オンを提供する。
【００１８】
本発明を、下記の例の記載によって例示するが、制限するものではない。
【実施例】
【００１９】
１５リットル容量の醗酵槽で、新鮮なジャガイモデキストロースブロス１０リットルを、皮を剥いて薄切りにしたジャガイモ２００ｇを２０分間煮沸することによって調製した。室温まで冷却した後、デキストロース２００gを加え、pHを５．１に調節した。次に、フラスコを１２１℃で１５分間オートクレーブ処理を行った。これに、２４時間経過の真菌接種物１リットルを加えた後、３０℃で７日間インキュベーションした。醗酵期間の終了時に、酢酸エチル４リットルを加え、培養物を室温にて２時間インキュベーションした。溶媒をワットマン１号濾紙で濾過した。次いで、溶媒を分液漏斗を用いてブロスから分離し、無水硫酸ナトリウム５０gを溶媒に加えてあらゆる痕跡量の残留水を除去した。溶媒を真空留去して、血小板凝集阻害活性が２２．５%の粗製抽出物１．５を得た。これを、ヘキサン中シリカゲル（１００〜２００メッシュ）５０gのカラムに装填して、床容積４０mlを得た。カラムをヘキサン１００mlで洗浄した後、阻害剤をヘキサン：クロロホルム（１：１）６００mlを用いて溶出した。半精製阻害剤を含む橙色画分を真空蒸留して、溶媒を留去した。この半精製阻害剤１５０mgにヘキサン２mlを加えて、低温にて一晩保管して、赤色結晶状の精製阻害剤３．３mgを得た。阻害剤２３４μmはヒト血小板凝集に対して５０％阻害を生じ、９５．６μmは大豆リポキシゲナーゼに対して５０％阻害を生じた。
【００２０】
化合物の分析データ：８−メチル−１３−フェニル−トリデカ−４，６，８，１０，１２−ペンテン−３−オン
分子式：Ｃ２０Ｈ２２Ｏ
分子量：２７８
阻害剤の色および物理的外観：赤色結晶生成物
溶解度：クロロホルム、ジメチルスルホキシド、アセトニトリルに易溶
３０μg/mlＤＭＳＯでの吸収極大(nm)：２５５，３０４および４０６nm
１Ｈ ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３，δｔｍｓ＝０ppm）：71.4 2H d 9.03Hz; 7.31 2H t 9.00Hz; 7.25 3H m 9.03Hz; 6.92 1H dd 16.1Hz; 6.67 2H dd 18.1Hz; 6.96 1H dd 16.1Hz; 6.39 2H dd 16.1Hz; 6. 21 1H d 18.1Hz; 1.14 3H 5 7.6Hz; 1.97 3H s; 2.6 2H q 7.6Hz.
マススペクトル： m+-CH3 = 263；m+-CH3-CH2 = 249；m+-CH3-CH2-CO+ = 221；m+-91 = 187；187-26 = 161；t 91+ CH=105
精製阻害剤の活性；血小板凝集に対する阻害剤のＩＣ５０：２３４μm.
大豆リポキシゲナーゼに対する阻害剤のＩＣ５０（pH９）：９５．６μm.
【国際公開パンフレット】
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2004531246.tif 000008
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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