(57)【要約】ヒトモノクローナル抗体の産生方法において使用するためのヒト骨髄腫細胞系が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数回の連続ｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養により増殖利点に関する選択が行われたヒトモノクローナル抗体産生方法に使用するためのヒト骨髄腫細胞系。
【請求項２】
ａ）ＰＥＧ耐性、
ｂ）ＨＡＴ感受性、および
ｃ）ウワバイン耐性
から成るグループから選択される１つ以上の特性を有するヒトモノクローナル抗体産生方法に使用するためのヒト骨髄腫細胞系。
【請求項３】
特性ａ、ｂおよびｃのいずれをも有する請求項２記載のヒト骨髄腫細胞系。
【請求項４】
染色体数が増加するか、１つ以上の染色体異常を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の骨髄腫細胞系。
【請求項５】
ほぼ四倍体である請求項４記載の骨髄腫細胞系。
【請求項６】
染色体２、１４および２２の１つ以上が二倍体であり、染色体異常が認められない請求項４または５記載の骨髄腫細胞系。
【請求項７】
本明細書に実質的に記載され、寄託番号ＥＣＡＣＣ０００７１１０８に寄託されている試料と同じであるか、またはそれに由来するＫａｒｐａｓ７０７として本明細書において知られている請求項１〜６いずれか１項に記載の骨髄腫細胞系。
【請求項８】
ａ）骨髄腫患者から初代骨髄腫細胞を分離するステップと、　ｂ）初代骨髄腫細胞を凌ぐ増殖利点に関して選択するために、複数回のｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養により細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養し、増殖させるステップと、
ｃ）１つ以上のＨＡＴ感受性細胞についての選択が可能な薬剤に細胞を曝露し、
ｄ）任意選択により、細胞をウワバインに曝露し、ウワバイン耐性を有する１つ以上の細胞を選択するステップと、
ｅ）細胞をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に曝露し、１つ以上のＰＥＧ耐性細胞を選択するステップと
を含み、上記ステップｃ〜ｅは個別に、あるいはあらゆる順序で連続して実施できることを特徴とするヒト骨髄腫細胞系の産生方法。
【請求項９】
ｆ）ＨＡＴ、ウワバイン、ＰＥＧ以外の薬剤に対する感受性または耐性を付与することが可能なマーカーを細胞内に導入するステップを含み、ステップｆ）はステップａ）以後の方法のいずれの時点でも実施できる、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
請求項１から７のいずれか１項に記載のヒト骨髄腫細胞系とヒト白血球の融合ステップを含むヒトハイブリドーマの産生方法。
【請求項１１】
ａ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、不活化センダイウイルスの存在下に、または電気融合条件下に、請求項１から７のいずれか１項に記載のヒト骨髄腫細胞系とヒト白血球とをインキュベーションするステップと、
ｂ）ハイブリッド細胞を選択するステップと
を含む請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ステップｂ）は、
ｉ）ウワバインを含むＨＡＴ存在下で、またはウワバインを含まないＨＡＴ存在下でインキュベーションを持続するステップと、
ｉｉ）ＨＡＴ耐性であり、任意選択によりウワバイン耐性の細胞を選択するステップと、
ｉｉｉ）ＨＡＴ耐性であり、任意選択によりウワバイン耐性の細胞を培養し、個々のハイブリドーマクローンを選択するステップと
を含む請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
白血球が、抗体産生リンパ球、ＥＢＶ不死化リンパ球のようなリンパ芽球、またはリンホカイン産生白血球である請求項１０から１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
白血球がヒト対象から新たに分離される請求項１０から１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
ヒト白血球が、種々の程度の抗原活性化を示すリンパ球集団の一部であり、ヒト骨髄腫細胞系が、この集団の抗原活性化リンパ球と優先的に融合する請求項１０から１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
請求項１０から１５のいずれかに記載の方法により産生されるヒトハイブリドーマ細胞系。
【請求項１７】
多数の粗面小胞体を有する請求項１６記載のヒトハイブリドーマ細胞系。
【請求項１８】
請求項１６または１７記載のハイブリドーマ細胞系により産生されるヒトモノクローナル抗体。
【請求項１９】
疾患の治療方法または予防方法において使用するための請求項１８記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項２０】
ヒト対象への液性免疫付与に使用するための請求項１９記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項２１】
（ｉ）ヒト対象からリンパ球を分離するステップと、
（ｉｉ）請求項１０から１５のいずれか１項に記載の方法においてリンパ球を使用することによりヒトハイブリドーマを産生するステップと、
（ｉｉｉ）ハイブリドーマにより分泌される抗体を分離するステップと
を含む抗体の産生方法。
【請求項２２】
抗体が疾患を治療および／または予防できる請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
リンパ球が腫瘍浸潤リンパ球であり、抗体が癌の治療または予防に有用である請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
（ｉ）請求項２２または２３記載の方法による疾患に特異的な抗体を産生するステップと、
（ｉｉ）その抗体により特異的に認識される抗原を推定するステップと
を含む疾患に特異的な抗原の同定方法。
【請求項２５】
（ｉ）種々の免疫反応段階におけるヒト対象からのリンパ球を分離するステップと、
（ｉｉ）請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法においてリンパ球を使用することによるヒトハイブリドーマを産生するステップと、
（ｉｉｉ）それぞれのハイブリドーマにより分泌される抗体を分離するステップと
を含むヒトにおける免疫反応の監視方法。
【請求項２６】
（ｉ）１つ以上の抗体をコードする遺伝子により請求項１から７のいずれか１項に記載のヒト骨髄腫細胞系をトランスフェクションするステップと、
（ｉｉ）トランスフェクションされた骨髄腫細胞系により抗体を産生させるステップと
を含むヒト抗体産生方法。
【請求項２７】
請求項１から７のいずれか１項に記載の骨髄腫細胞系から得られる細胞と、液性因子を産生できる白血球とを融合するステップを含む液性因子の産生方法。
【請求項２８】
ハイブリッドハイブリドーマを生じる突然変異体を選択する方法における請求項１６記載のヒトハイブリドーマ細胞系の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ヒト骨髄腫細胞系に関する。特に、ヒトモノクローナル抗体を産生できるヒトハイブリドーマ作製方法におけるヒト骨髄腫細胞系に関する。
【０００２】
［背景技術］
マウスモノクローナル抗体の供給技術は、Ｋｏｈｌｅｒ　＆　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１，２）により１９７５年に考案された。この方法において、免疫感作マウスの抗体産生脾臓細胞が、マウス骨髄腫細胞と融合され、ハイブリドーマとして知られるハイブリッド細胞が産生される。融合後、骨髄腫親細胞を死滅させる薬物を使用して細胞が選択されるのに対して、非融合親脾臓細胞は限定された寿命しか持たず、すぐに死滅するので、ハイブリッド細胞だけが生き残る。これらのハイブリドーマは、無限に増殖する能力と、脾臓細胞ドナーの免疫感作に使用された抗原に特異的な抗体を分泌する能力を有する。これらの所望の特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマはクローニングされ、均質な抗体分子集団を産生するハイブリドーマ細胞系（すなわちモノクローナル抗体）を生じる。
【０００３】
この技術を改変して、ヒトモノクローナル抗体を産生するための研究に多大な努力が傾けられてきた。マウス骨髄腫を使用してヒトモノクローナル抗体を得る試みは、異種特異的ハイブリッドが関連するヒト染色体を直ちに喪失するため失敗に終わった。ヒトモノクローナル抗体を産生するために、既知の抗体分泌ヒト骨髄腫細胞系（例えば、Ｕ２６６ヒト骨髄腫細胞系を分泌するＩｇＥ、およびリンパ芽球および形質芽球細胞の異種混合物を含むＲＰＭＩ−８２２６細胞系（３））を使用する試みもなされたが、有望な初期レポートにもかかわらず、全て失敗に終わった。
【０００４】
ヒト抗体を産生するハイブリドーマの入手に失敗したため、種々の代替細胞系が検討された。例えば、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）が、抗体を産生するヒト末梢血Ｂリンパ球の不死化に使用された。しかし、このような細胞系は、マウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマと比較すると、多くの欠点を有する。例えば、これらの細胞系は、増殖に関して不安定な傾向があり、抗体産生能が低く、ＥＢＶは抗体反応に関与するリンパ芽球を優先的に不死化しない（４）。
【０００５】
抗体を産生するヒト細胞系の必要性を回避するヒト形形質を有するモノクローナル抗体を産生するための方法も開発された。例えば、有用なマウスモノクローナル抗体が、齧歯類可変領域とヒト普遍領域を結合することにより、「ヒト化」された（キメラ抗体）（１３）。これは、抗体のヒト抗マウス免疫原性を減少させたが、残りの免疫原性は外来の可変領域フレームワークによって保持される。更に、抗原結合特異性は、本質的にマウスドナーのものである。ＣＤＲの移植とフレームワーク操作（ＥＰ　０２３９４００）により、ヒトにおける治療に利用できるヒト化マウス抗体を産生できる程度まで抗体操作が改善され、正確となった。しかし、それでも抗体特異性は、マウス結合部位ドナーにより決定される。更に、それらの産生は、配列の複雑な操作が必要で、かつ面倒である。
【０００６】
そのＶ遺伝子の回収と、抗体遺伝子内への操作が可能で、その結果モノクローナル抗体が産生されるヒトモノクローナル抗原結合断片のｉｎ　ｖｉｔｒｏ産生のために、ファージディスプレイ技術が開発された（１４）。しかし、この経路によるヒトモノクローナル抗体の産生は複雑な複数段階の手順で、抗体の結合特異性は、無作為に産生される配列の組み合わせの結果としてｉｎ　ｖｉｔｒｏで操作されるため、天然抗体の場合の様にｉｎ　ｖｉｖｏ親和性成熟を受けていない。
【０００７】
マウスの代わりにヒト免疫グロブリン遺伝子を含む形質転換マウス系が作製された（１５）。このマウス系はヒト遺伝子を含み、ヒト抗体を産生するが、作られた多様性は、ヒトにおいてではなくマウス宿主において選択され、また抗体はマウスにおいて親和性成熟を受けるので、抗体は真にヒトではない。
【０００８】
分析の観点から、公知の方法によっても、特異的抗原投与に対するヒトの免疫反応を詳細に分析することはできない。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅後の重鎖と軽鎖の遺伝子の直接分析が、特定の状態の人々により発現される抗体の種類の特徴を明らかにする最良の方法となっている。この方法は、重鎖−軽鎖の対形成の情報が失われるという欠点を有する。
【０００９】
モノクローナル抗体を産生するためのマウスハイブリドーマ法は、（上記のハイブリドーマに基づかない方法を上回る）更なる長所を有する。それは、抗原活性化Ｂ細胞を優先的に不死化できる点で、そのためモノクローナル抗体を長時間供給することができる。
【００１０】
従って、従来のマウスモノクローナル抗体産生方法の利点を全て備えたヒトモノクローナル抗体の産生方法が必要とされている。
【００１１】
［発明の概要］
本発明は、従来のマウスモノクローナル抗体作製方法に使用されるマウス骨髄腫と同様に作用できるヒト骨髄腫細胞系を提供する。従って、本発明により、真のヒトハイブリドーマおよびモノクローナル抗体の信頼性の高い産生が初めて可能となる。
【００１２】
従って、本発明は、ハイブリッド細胞を産生するために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）融合プロトコール、不活化センダイウイルスの利用（２）または電気融合法（１７）等の標準技術を用いて、ヒトリンパ球と融合させることが可能なヒト骨髄腫細胞系に関する。本発明者は、増殖に関して重要な利点（すなわち、骨髄腫患者からの初代プラズマ細胞培養よりも倍加時間がはるかに短い点）を有する骨髄腫細胞系の産生方法も開発した。
【００１３】
本発明のヒト骨髄腫細胞系は、一般の抗体産生細胞として使用できる。例えば、既知の抗体遺伝子を骨髄腫細胞系にトランスフェクションすることにより、以前にその特徴が明らかにされている抗体を産生できる。骨髄腫細胞系は、「生理学的」抗体産生に適している。なぜならば、骨髄腫細胞により産生されるタンパク質の翻訳後修飾が、ヒト抗体産生細胞により産生されるものと同一の可能性が高いからである。
【００１４】
しかし、好ましい実施例において、本発明の骨髄腫細胞系は、ヒトモノクローナル抗体を産生できるヒトハイブリッドの産生方法に使用される。従って、本発明の更なる点は、ヒト骨髄腫細胞系をヒトリンパ球と融合させるステップを含むハイブリドーマ産生方法、そのような方法により産生されるヒトハイブリドーマ細胞系、およびそのようなハイブリドーマにより産生されるヒトモノクローナル抗体に関する。
【００１５】
本発明のハイブリドーマ産生方法を、病的状態の自然の身体反応により誘発されるヒト抗体の不死化に使用できる。これによって、免疫反応を経時的に監視でき、また他の方法により作製される抗体よりも、治療により有用と思われる抗体供給源を供給することもできる。このような抗体の特異性の分析を利用して、ｉｎ　ｖｉｖｏで抗体を誘発した疾患に特異的な抗原に関する情報を提供することができる。この情報は、次にワクチンの改善の様な抗原に基づく治療方法の考案に利用できる。
【００１６】
［発明の詳細な説明］
第一の点において、本発明は、ヒトモノクローナル抗体分泌ハイブリドーマ産生方法における利用に適したヒト骨髄腫細胞系に関する。
【００１７】
骨髄腫細胞系は、骨髄腫患者からの、例えば、骨髄または末梢血からの初代プラズマ細胞培養から作製できる。均質な細胞系を作製するために、患者の細胞はｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養され、増幅される。
【００１８】
新しく作製されたヒト骨髄腫細胞系が、７０時間程度の比較的長い倍加時間を有することは普通である。しかし、本発明者は驚くことに、細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養することにより、はるかに迅速に増殖する細胞系を産生することが可能であることを発見した。例えば、倍加時間を約３５時間以下に短縮することが可能である。
【００１９】
本発明の骨髄腫細胞系の倍加時間を、以前のｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養処理の細胞系の倍加時間の０．７５倍以下、好ましくは０．５倍以下とすることができる。本発明の骨髄腫細胞系は、５０時間以下、好ましくは４０時間以下、より好ましくは３０時間以下である。
【００２０】
標準ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）融合プロトコールを用いるために、本発明の骨髄腫細胞系をＰＥＧ耐性とすることができる。本発明者は、９９％のヒト骨髄腫細胞が、リンパ球融合のためにＰＥＧによる１回目の処理後に死滅したことを見いだした。骨髄腫細胞は、複数回のＰＥＧ処理によりＰＥＧ耐性を付与できる。本発明者は、約２０回の処理により、約２５％の細胞しかＰＥＧ処理により死滅しない細胞系が産生されることを発見した。ＰＥＧ抵抗性骨髄腫細胞の選択により、ヒトリンパ球と融合し、本発明のヒト／ヒトハイブリドーマを産生できる細胞系が産生される。
【００２１】
標準マウスモノクローナル抗体分泌ハイブリドーマ産生方法において、融合細胞は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン（ＨＡＴ）培地を用いて選択される。マウス骨髄腫細胞は、酵素ヒポキサンチン：グアノシンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）を欠失しているのでＨＡＴ感受性であるが、一方ハイブリドーマ細胞は、脾臓細胞融合パートナーによりＨＧＰＲＴ遺伝子が供給されているのでＨＡＴ耐性である。同じ選択方法を用いるために、本発明の骨髄腫細胞系は、ＨＡＴ感受性でなくてはならない。ＨＡＴ感受性は、８−アザグアニンおよび／または６−チオグアニンまたは本技術において公知のその他の選択物質において増殖させることにより選択できる。本明細書に使用されている様に、「ＨＡＴ感受性」とは、ハイブリドーマ融合法において、ＨＡＴ培地で処理することにより、非融合骨髄腫を優先的に死滅させ、その結果ハイブリドーマ細胞が単離される。
【００２２】
細胞系または組織由来の新鮮細胞（例えば、骨髄、扁桃、リンパ節、脾臓、悪性組織）を用いる融合および選択方法を促進するために、ウワバイン耐性を付与することは骨髄腫細胞系にとって好都合である。ウワバイン濃度を漸増させて培養を継続することにより、細胞にウワバイン耐性を付与できる。得られた細胞系はＨＡＴ感受性とウワバイン耐性を有する。
【００２３】
増殖に利点を有する骨髄腫細胞は、倍加時間が長い骨髄腫細胞よりも、染色体数が多い。本発明の骨髄腫細胞は、染色体数が増加しているか（異数性：ａｎｕｐｌｏｉｄ）、またはほぼ４倍体であり、また多くの肉眼的染色体異常を有することがある。しかし、染色体２、１４、２２の１つ以上（好ましくは全て）は、正常および／または２倍体である。Ｇバンディング法の様な標準技術を用いて染色体分析を実施できる。
【００２４】
本発明者は、倍加時間が短く、ＰＥＧ耐性、ウワバイン耐性およびＨＡＴ感受性を有するヒト骨髄腫細胞系を産生し、特徴を明らかにした（具体例参照）。この細胞系は、「Ｋａｒｐａｓ　７０７」として知られ、標本は、寄託番号０００７１１０８として、ＥＣＡＣＣ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＳＰ４　０ＪＧに寄託されている。
【００２５】
本発明の第二の点は、骨髄腫細胞系産生方法に関する。（上記に説明されている）増殖の利点、ＨＡＴ感受性、ウワバイン耐性および／またはＰＥＧ感受性に関する選択ステップに加えて、本方法は、ＨＡＴ、ウワバイン、ＰＥＧ以外の薬剤に対する感受性または耐性を付与できるマーカーを細胞に導入するステップも含めることができる。このようなマーカーは、例えば、本技術において公知の遺伝子工学により細胞内に導入できる。代表的マーカーには、検出可能な産物を産生するβ−ガラクトシダーゼの様な酵素、抗生物質耐性または感受性を付与するタンパク質、ガンシクロビルの存在下に細胞死を引き起こす単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（ＨＡＶＴＫ）の様な、特定の条件でその存在が細胞に対して致死的である遺伝子（「自殺遺伝子」）がある。
【００２６】
本発明は第三の点は、ヒトハイブリドーマ細胞系産生方法に関する。ハイブリドーマは、従来のマウスハイブリドーマ産生方法（７）と類似の方法により産生できる。例えば、本発明の第一の点の骨髄腫細胞系は、例えば、標準ＰＥＧ融合プロトコール、不活化センダイウイルスまたは電気融合法を用いて、ヒトリンパ球と融合できる。
【００２７】
ハイブリッド細胞は、本技術において公知の方法のいずれによっても非融合細胞から選択できる。例えば、ハイブリッド細胞は、細胞ソーティング（例えば、蛍光発色細胞ソーティング（ＦＡＣＳ））、磁気ビーズの利用、あるいは細胞毒性の利用により、選択および／または単離できる。ハイブリッド細胞選択のための従来のマウスの方法は、リンパ球と融合していない骨髄腫細胞を選択的に死滅させる化学薬品（ＨＡＴ）を含む培地で融合後の細胞集団を増殖させることが含まれる。次に、ハイブリッド細胞を任意でクローニングし、均質なハイブリドーマ細胞系を産生することができる。一般的ハイブリドーマ産生方法は本技術において公知である。例えば、以下の手順を使用できる。
【００２８】
免疫感作されたヒト由来のヒトリンパ球の単一細胞懸濁液を、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足した血清を含まないＲＰＭＩ　１６４０（ＲＰＭＩ）の中に形成する。細胞懸濁液を滅菌７０メッシュＮｉｔｅｘ細胞濾過器で濾過し、２００ｇで５分間遠心分離により２回洗浄し、血清を含まないＲＰＭＩにペレットを再懸濁する。
【００２９】
２×１０８個のリンパ球を、４×１０７個の骨髄腫細胞と合わせ（融合前３日間１１％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）補足ＲＰＭＩの中で対数期に維持）、遠心分離し、上清を吸引する。細胞ペレットを取り除き、１分間攪拌しながら、２ｍｌの３７℃ＰＥＧ１５００（７５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ中に５０％、ｐＨ８．０）を加え、１４ｍｌの血清を含まないＲＰＭＩを７分間かけて加えた。更なるＲＰＭＩを加えることができ、２００ｇで１０分間遠心分離する。上清を廃棄後、ペレットを１５％ＦＢＳ、１００ｍＭのヒポキサンチンナトリウム、０．４ｍＭのアミノプテリン、１６ｍＭのチミジン（ＨＡＴ）、２５単位／ｍｌのＩＬ−６、１．５×１０６個／ｍｌのリンパ球を含む２００ｍｌのＲＰＭＩに再懸濁する。懸濁液を１０個の９６ウェル平底組織培養プレートに２００μｌ／ウェルで分配する。各ウェルから１００μｌを１８Ｇ注射針で吸引し、１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−６を含む、または含まない、かつリンパ球を含まない１００μｌ／ウェル平板培養培地を加えることにより、細胞を融合後２、４、６日目にフィーディングする。
【００３０】
細胞増殖が６０〜８０％の密集成長に達したら、培養上清を各ウェルから取り出し、ＥＬＩＳＡにより目的の抗原に対する反応性に関してスクリーニングする。ＥＬＩＳＡは以下の様に実施される。Ｉｍｍｕｌｏｎ４培養皿を、４℃で、ｐＨ９．６の５０ｍＭの炭酸緩衝液に含めた抗原を１００ｎｇ／ウェル、５０μｌ／ウェルで被覆する。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳで洗浄し、０．５％Ｆｉｓｈ　Ｓｋｉｎ　Ｇｅｌａｔｉｎを用いて３７℃で３０分間遮断する。プレートを上記の様に洗浄し、５０μｌの培養上清を加える。３７℃で３０分間インキュベーション後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ｆｃ）［ＰＢＳＴに１：１０，０００で希釈されたもの］を加える。プレートを３７℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳＴで洗浄し、ｐＨ４．５の１００ｍＭクエン酸中の１ｍｇ／ｍｌのＴＭＢと０．１５ｍｌ／ｍｌの３０％Ｈ２Ｏ２から成る１００μｌの基質を加える。５０ｍｌの１５％Ｈ２ＳＯ４を加えて、呈色反応を止める。Ａ４５０をプレートリーダーで読み取る。
【００３１】
リンパ球という言葉は、あらゆる抗体産生細胞を含むことを意図している。例えば、リンパ球は、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞の様なリンパ芽球でもよい。リンパ芽球はｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養細胞でもよい。あるいはリンパ芽球は、ヒト対象からの新鮮分離細胞も可能である。例えば、リンパ球は、扁桃や、リンパ節、脾臓、血液または骨髄等の臓器から入手できる。
【００３２】
ヒト対象は、健常者でも、特に特定抗原により免疫感作されたヒトでも、あるいは特定の疾患に罹患していた（そして、回復した）患者でもよい。あるいは、ヒト対象は特定の疾患患者でもよい。従って、ヒト対象由来のリンパ球は、目的の抗体を産生することが可能である。
【００３３】
本発明の骨髄腫は、非抗体産生リンパ球、あるいはリンホカインを産生するその他の白血球とも融合できる。特に好ましいのは、治療用の抗腫瘍抗体またはリンホカインを産生する腫瘍浸潤細胞である。
【００３４】
本発明のハイブリドーマ産生方法と、従来のマウスモノクローナル抗体分泌ハイブリドーマ産生方法の一利点は、骨髄腫細胞系が抗原により活性化されるリンパ球と優先的に融合する点である。
【００３５】
本発明は、ハイブリドーマ細胞系と、そのような細胞系により産生されるモノクローナル抗体も提供する。
【００３６】
好ましくは、本発明のハイブリドーマは高収量の抗体を産生する。例えば、ハイブリドーマは、１００μｇ／ｍｌ以上の抗体、好ましくは少なくとも２００μｇ／ｍｌの抗体、より好ましくは少なくとも３００μｇ／ｍｌの抗体を分泌できる。
【００３７】
本発明のハイブリドーマは、大量の粗面小胞体（ＲＥＲ）を含むことができる。（検出可能量の粗面小胞体を含む様に見えない）骨髄腫細胞の細胞質と対照的に、本発明者は、本発明のハイブリドーマ細胞の細胞質が、プラズマ細胞と似た平行で同心的なＲＥＲにより取り込まれるのを発見した。本明細書に使用されている「大量の」という言葉は、ハイブリドーマのＲＥＲ量がプラズマ細胞に認められる量に匹敵することを示すために使用されている。
【００３８】
モノクローナル抗体は、全てのアイソタイプが可能で、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＥである。モノクローナル抗体は、軽鎖、重鎖または両者を含むことができる。
【００３９】
好ましくは、抗体は、ある疾患の予防または治療に有用である。例えば、疾患特異性抗体産生細胞をある患者から分離し、細胞を本発明の方法により不死化し、抗体を大量に産生することができる。抗体を受動免疫化プロトコルにより患者に投与し、疾患に対する抵抗性を付与することができる。あるいは、患者に抗体を投与して免疫反応を高め、感染の一掃を補助できる。種々の白血球を用いて得られるハイブリドーマは、一連の液性因子を上昇させることができる。
【００４０】
本発明の方法により産生されるヒトモノクローナル抗体は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏ診断応用、ｉｎ　ｖｉｖｏ分析および試薬への応用等のリガンド−ポリペプチド結合を含むほぼ全てのプロセスに使用できる。例えば、抗体分子は、本技術に精通する者にとって公知の方法により、抗体に基づく分析法、例えば、ＥＬＩＳＡ法に利用できる。
【００４１】
上記に示す様に、本発明により産生される抗体は、診断、予防、治療手順に利用される。例えば、本発明により産生される抗体は、凝集反応、ＥＬＩＳＡ、免疫ペルオキシダーゼ、ウェスタンブロット、標準免疫組織学的方法によるｉｎ　ｓｉｔｕタンパク質検出に利用できる。これらの応用例に使用するために、抗体は本技術において公知の方法により標識される。更に、そのような抗体は、樹脂の様なクロマトグラフィー支持体と複合体を形成し、アフィニティークロマトグラフィー法に予備的に利用できる。この様な技術は全て、本技術において公知である。
【００４２】
本発明により作製された抗体の治療および予防的利用は、レシピエントまたは患者にそれらを投与することが含まれる。
【００４３】
少なくとも９０〜９５％の均質性を有するほぼ純粋な抗体が、患者への投与に好ましく、９８〜９９％以上の均質性が医薬品利用には最も好ましい。部分的または目的の均質性に一旦精製されたなら、選択された抗体を診断または治療に（生体外を含む）、または分析方法、免疫蛍光染色等の開発および実施に利用できる（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｅ　ａｎｄ　Ｐｅｒｎｉｓ，（１９７９および１９８１）　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ　Ｉ　ａｎｄ　ＩＩ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　ＮＹ）。
【００４４】
本発明の抗体は、典型的には炎症状態、アレルギー性過敏症、癌、細菌またはウイルス感染、自己免疫疾患（Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病、重症筋無力症が含まれるが、これらに限定されない。）の予防、抑制または治療に用途を見いだせる。
【００４５】
本明細書において、「予防」とは疾患誘発前の防御組成物の投与を意味する。「抑制」とは、誘発イベント後であるが、疾患の臨床的出現前の組成物の投与を意味する。「治療」とは、病状が顕性となった後の防御組成物の投与を意味する。
【００４６】
疾患の防御または治療における抗体の有効性をスクリーニングするために利用できる動物モデル系は入手可能である。感受性マウスにおける全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の試験方法は、本技術において公知である（Ｋｎｉｇｈｔ　ｅｔ　ａｌ．，（１９７８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１４７：１６５３；Ｒｅｉｎｅｒｓｔｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９７８）Ｎｅｗ　Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２９９：５１５）。重症筋無力症（ＭＧ）は、別の種の可溶性アセチルコリン受容体タンパク質を用いて疾患を誘発することにより、ＳＪＬ／Ｊ雌マウスにおいて試験される（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ　ｅｔ　ａｌ．（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４２：２３３）。関節炎は、ＩＩ型コラーゲンの注入により感受性系マウスにおいて誘発される（Ｓｔｕａｒｔ　ｅｔ　ａｌ．（１９８４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４２：２３３）。アジュバント関節炎が、マイコバクテリア熱ショックタンパク質の注入により感受性ラットにおいて誘発されるモデルが説明されている（Ｖａｎ　Ｅｄｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３１：１７１）。説明されている様に（Ｍａｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５２：１１１５）、甲状腺炎は、サイログロブリン投与により、マウスにおいて誘発される。インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、自然に発症するか、Ｋａｎａｓａｗａ　ｅｔ　ａｌ．（１９８４）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，２７：１１３により説明されている様に特定の系統のマウスにおいて誘発することができる。マウスおよびラットにおける実験的アレルギー性脳脊髄炎は、ヒトにおける多発性硬化症のモデルとなる。このモデルにおいて、ミエリン塩基性タンパク質の投与により脱髄性脳症が誘発される（Ｐａｔｅｒｓｏｎ（１９８６）Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｍｉｓｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，編，Ｇｒｕｎｅ　ａｎｄ　Ｓｔｒａｔｔｏｎ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１７９−２１３；ＭｃＦａｒｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９７３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，１７９：４７８およびＳａｔｏｈ　ｅｔ　ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８：１７９参照）。
【００４７】
本発明の抗体は、その他の抗体、特に疾患の原因であるヒト細胞上のその他のマーカーと反応するヒトモノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）と組み合わせても使用できる。例えば、適切なＴ細胞マーカーには、第１回白血球分化ワークショップ（Ｂｅｒｎｈａｒｄ　ｅｔ　ａｌ．（１９８４）Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｔｙｐｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ）により命名されたいわゆる「分化集団」（Ｃｌｕｓｔｅｒｓｗ　ｏｆ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）に分類されるものを含めることができる。
【００４８】
一般に、本抗体は、薬理学的に適切な担体と共に精製形態で利用される。典型的には、これらの担体には、水溶液またはアルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液、生理食塩水および／または緩衝媒体を含むあらゆるものが含まれる。非経口賦形剤には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液が含まれる。適切な生理学的に許容可能な補助薬は、ポリペプチド複合体を懸濁状態に保つ必要がある場合には、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、アルギネートなどのシックナーから選択される。
【００４９】
静脈内投与用賦形剤には、リンゲルデキストロースに基づく補充液の様な水分および栄養補充液、電解質補充液が含まれる。抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス等の保存剤およびその他の添加剤も含めることができる（Ｍａｃｋ（１９８２）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版）。
【００５０】
本発明の抗体は、単独で投与される組成物としても、または他の薬剤と共に使用することもできる。その他の薬剤には、シクロスポリン、メトトレキセート、アドリアマイシンまたはシスプラチン等の種々の免疫療法薬および免疫毒素が含まれる。医薬組成物には、本発明の選択された抗体、レセプター、またはその結合タンパク質と組み合わせた、更に異なる特異性を有する本発明の選択されたポリペプチドの組み合わせた種々の細胞毒性物質またはその他の物質の「カクテル」が含まれ、それらは投与前プールされていても、されていなくてもよい。
【００５１】
本発明の医薬組成物の投与経路は、本技術において通常の技術を有する者にとって公知の全てが可能である。制限なしの免疫療法を含む治療には、本発明の抗体を標準技術に従って、全ての患者に投与できる。投与は、非経口投与、静脈注射、筋肉注射、腹腔内投与、経皮吸収、肺からの投与経路、または適切であれば、カテーテルによる直接注入等の適切な投与様式が可能である。投与量および投与回数は、年齢、性別、患者の状態、その他の同時服用薬物、禁忌、医師が考慮に入れるべきその他のパラメータによって変わる。
【００５２】
本発明の抗体は、凍結保存可能で、使用前に適切な担体に溶解できる。この技術は、従来の免疫グロブリンに関して有効であることが明らかにされており、本技術において公知の凍結および溶解技術を用いることができる。凍結溶解により、抗体活性が様々な程度に低下する可能性があり（例えば、従来の免疫グロブリン、ＩｇＭ抗体は、ＩｇＧ抗体よりも活性低下が大きい傾向がある）、それを補償するために使用量を増加する様に調整しなくてはならない場合があることは、本技術に精通する者にとって明らかである。
【００５３】
本発明の抗体を含む組成物またはそのカクテルは、予防および／または治療のために投与できる。特定の治療適用例において、選択された細胞集団の少なくとも部分的阻害、抑制、変化、死滅またはその他の測定可能なパラメータを達成する十分量が、「治療有効量」と定義される。この投与量を達成するための必要量は、疾患の重得度および患者自身の免疫システムの一般的状態によって変動するが、体重１ｋｇあたり抗体０．００５から５．０ｍｇの範囲の投与量が一般的で、０．０５から２．０ｍｇ／ｋｇ／用量の投与量がより一般的に使用される。予防適用例においては、本発明の選択されたポリペプチドまたはそのカクテルを含む組成物も、同様の投与量またはやや少ない投与量で投与される。
【００５４】
本発明の抗体を含む組成物は、予防および治療場面で利用でき、哺乳動物における選択標的細胞集団の変更、不活化、死滅または除去を助ける。更に、本明細書に説明されている抗体は、標的細胞集団を体外またはｉｎ　ｖｉｔｒｏで選択的に死滅、減少させるか、あるいは不均質細胞収集物から効率的に除去するために使用できる。哺乳動物の血液を体外で選択された抗体、細胞表面レセプターまたはその結合タンパク質と合わせ、それによって望ましくない細胞を死滅させ、あるいは血液から除去し、標準技術に従って哺乳動物に戻すことができる。
【００５５】
患者の抗体産生細胞から特定の抗体を無制限量産生できる能力は、免疫反応に関する有用な情報を得るためにも利用できる。例えば、患者が病気に罹っている場合、免疫システムが標的とする疾患に特異的な抗原を推定することができる。この情報は、この疾患を治療および／または予防するためのより優れた薬物とワクチンをデザインするために利用できる。
【００５６】
殆ど全ての疾患が抗体を介する免疫反応を引き起こし、従って、免疫応答は抗体を介する治療による予防／治療のための候補機序である。本発明の手法は、病態の自然の防御反応により惹起されるヒト抗体の不死化に非常に重要である。しかし、腫瘍浸潤リンパ球を不死化するための本発明の方法の利用が特に興味深い。これは、有用な抗癌抗体を産生し、腫瘍特異抗原を明らかにすることもできる。このような抗原は次に抗癌ワクチンとして利用できる。
【００５７】
異なる時点で産生された抗体を分析することにより、抗原刺激に対する免疫反応の経過を明らかにすることもできる。コレステロールによって、特定の治療方法またはワクチン接種プロトコールの最適タイミングに関する有用な情報が提供される。
【００５８】
本発明の更なる点において、抗体産生遺伝子を用いて細胞系のトランスフェクションを行う事により抗体を産生するための、本発明の第一の点のヒト骨髄腫細胞系の利用が提供される。ヒト骨髄腫により実施される翻訳後修飾は、ヒト抗体において形成されるものと同じである。従って、生物工学的産生に関して、ヒト骨髄腫細胞系は、ヒトハイブリドーマから得られる抗体だけでなく、既知の抗体遺伝子のトランスフェクションにより得られる抗体の産生にも好ましい。
【００５９】
本発明のヒトハイブリドーマ細胞系は、別のリンパ球と融合後ハイブリッドハイブリドーマ（１６）を産生する様にマウスＡｐ２／０−Ａｇ１４が作製されるのと同じ方法で、ＨＡＴ感受性も有する突然変異体を選択するためにも利用できる。特に、低濃度／検出不能濃度の抗体を産生するが、高濃度のＲＥＲを有する本発明の骨髄腫細胞系を使用して産生されるハイブリドーマは、目的の抗体を産生できる第二のリンパ球と融合させるために選択される。この方法で、所望の抗体を高力価で分泌できるハイブリッドハイブリドーマが作製できる。
【００６０】
以下の具体例は、本発明を説明するためのもので、本発明を制限することを意図するものではない。本発明は特に、これらの具体例に説明されている具体例に関する。
【００６１】
［具体例］
［具体例１−改善されたヒト骨髄腫細胞系の作製］
本発明者は、２０年間にわたり、新しいヒト骨髄腫細胞系の作製を試みてきた。本発明者は、多発性骨髄腫と診断された５３才男性患者の骨髄と末梢血液から作製された骨髄腫細胞系を過去に説明している（５，６）。この細胞系は現在κ軽鎖のみを分泌するので、重鎖も産生する骨髄腫細胞系よりも実用上の利点を有する可能性がある。
【００６２】
＜増殖上の利点を有する骨髄腫細胞の選択＞
分離後のこの骨髄腫細胞系の倍加時間は７０時間以上であるが、何ヶ月以上も連続ｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養後、より迅速に増殖する細胞が出現し、倍加時間は約３０〜４０時間となり、静置培養時にガラスまたはプラスチックの表面に付着する傾向が高くなった。付着細胞は、ハイブリドーマ産生に使用されるマウス骨髄腫細胞と同様に、激しくピペッティングすることにより簡単に剥がすことができる。
【００６３】
＜ＨＡＴ感受性およびウワバイン耐性の選択＞
従来のマウスハイブリドーマ作製方法は、非融合マウス骨髄腫細胞がヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン（ＨＡＴ）に対して感受性を有するという事実に基づいている。（ＨＡＴ）感受性を有するヒト骨髄腫細胞を選択するために、それらを８−アザグアニンの中で増殖させた。３０μｇ／ｍｌの濃度で増殖したアザグアニン耐性細胞を更に３０μｇ／ｍｌの２−アミノ−６−メルカプトプリン（６−チオグアニン）を作用させた。最初に出現した２０個のクローンの、ＨＡＴ培地に対する感受性を検査した。耐性を生じない様に見えた最も迅速に増殖したクローンを更なる研究のために選択した。骨髄腫細胞を抗体産生細胞系とも融合できる様にするために、ウワバイン耐性サブラインに関しても選択することを決定した、ウワバイン濃度を上昇させながら骨髄腫細胞を増殖させることにより、最終的にＨＡＴ感受性ウワバイン耐性サブラインが出現した。
【００６４】
［具体例２−ヒトハイブリドーマの作製］
ハイブリドーマ形成のための条件とスクリーニングを至適化するために、本発明者は、既知の特異性を有する抗体産生ヒトＢリンパ球を（初回融合のために）作製することを決定した。そのため、健康ＨＩＶ−１感染者の末梢血リンパ球をＥＢＶで感染させた。ＥＢＶ不死化Ｂ細胞から、ＨＩＶ−１　ｇｐ４１に対するモノクローナル抗体産生細胞が選択され、クローニングされ、細胞系Ｋａｒｐａｓ１６４と命名された。その時、本発明者は、種々の分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いてＥＢＶ不死化ヒトリンパ球と骨髄腫細胞を融合することを試みたが失敗した。
【００６５】
ハイブリッドの作製に何回も失敗した理由を検討するために、細胞融合に用いたのと同じ手法を用いて、骨髄腫細胞のみをＰＥＧで処理した、その後、ＨＡＴまたはウワバインは含まない増殖培地に細胞を接種し、生存力を検査した。ＰＥＧ処理細胞の検査から、ＰＥＧの毒性が極めて高く、９９％以上の細胞を死滅させることが明らかとなった。
【００６６】
＜ＰＥＧ耐性サブラインの作製＞
上記所見を考慮して、本発明者はＰＥＧ耐性サブラインの作製を試みることを決定した。これは、マウスハイブリドーマ形成に使用されたプロトコールに従って、１０７個の骨髄腫細胞をＰＥＧ（分子量１５００）で処理することにより達成された。結果として生じた少数の生存可能な細胞を再度ＰＥＧで処理した。ＰＥＧ処理により死滅する細胞が約４分の１だけとなる様な骨髄腫のサブラインが出現するまで、約１８ヶ月間にわたり２０回以上この様な処理サイクルを繰り返した。しかし、この過程で、ＨＡＴ耐性細胞が再度出現した。従って、細胞をもう一度８−アザグアニンで処理し、クローニングした。ＨＡＴ培地で増殖させた時に復帰しなかったクローンを分離した。この細胞系は、骨髄腫Ｋａｒｐａｓ７０７細胞系として知られ、その試料は寄託番号ＥＣＡＣＣ０００７１１０８として保存されている。
【００６７】
＜ＥＢＶ不死化リンパ球との融合＞
次に、標準ＰＥＧ融合プロトコール（７）を用いて、ＨＡＴ感受性、ＰＥＧ耐性細胞を、ｇｐ４１に対するモノクローナル抗体を産生するＥＢＶ不死化ヒトＢリンパ球１６４細胞と融合した。細胞懸濁液をマルチウェルプラスチックトレイに接種した。ＨＡＴとウワバインの存在下に増殖後、骨髄腫細胞系に似たクローンが出現した。組織培養液は、抗ウイルス抗体に関するＫａｒｐａｓ　ＡＩＤＳ細胞テスト（８）において、アセトン固定ＨＩＶ−１感染Ｋａｒｐａｓ４５Ｔ細胞の膜の強力な染色を示した。
【００６８】
＜ハイブリドーマにより産生されるヒトモノクローナル抗体の特徴付け＞
ＨＩＶ−１のｇｐ４１の幾つかのポリペプチドを用いる更なる研究により、我々のモノクローナル抗体がペプチドＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧに対して反応するが、ＨＩＶ−１の他の４つのポリペプチドに対しては反応しなかったことを確立することができた（結果は示されていない）。このモノクローナル抗体が認識するエピトープは、ＨＩＶ−１のＡｆｒｉｃａｎ　ＮＤＫ株（９）には存在しない様に見える。なぜならば、抗体がＮＤＫ感染細胞とは反応しないが、ＨＩＶ−１のＣａｍｂｒｉｄｇｅ分離株（１０）だけでなく、初期Ｆｒｅｎｃｈ　ＬＡＶ分離株（１１）とも反応するからである。データベース検索により、ＨＩＶ−１のＦｒｅｎｃｈ（ＬＡＶ）分離株とＢｒｉｔｉｓｈ（ＣＡＭ１）分離株が上記アミノ酸配列を共有しているが、Ａｆｒｉｃａｎ分離株はリジンからアルギニンに突然変異を有することが確認される。
【００６９】
＜新鮮ヒトリンパ球との融合＞
１６４細胞系との融合に成功後、本発明者は、それらの骨髄腫細胞が新鮮ヒトリンパ球とも抗体産生ハイブリドーマを形成するかどうかを確立することを決定した。骨髄腫細胞を、成人の末梢血由来の未分画白血球（ＷＢＣ）と、２人の小児の外科手術により摘出された扁桃から調製された扁桃細胞と融合した。ＰＥＧ融合後に得られた細胞懸濁液を、２４および９６ウェルプラスチック組織培養プレートに接種後、２０％ウシ胎児血清およびＨＡＴを補足したＲＰＭＩ−１６４０培地の中で最初の１２日間増殖させた。その後、増殖培地のみ単独を使用し、骨髄腫細胞が扁桃細胞と融合した約２５％のウェルにおいて、また骨髄腫細胞が血液白血球と融合した約１０％のウェルにおいて、その後の２〜３週間コロニー形成を観察した。活性細胞増殖のあるウェルから収集した組織培養液を、ＩｇＧの存在に関してＥＬＩＳＡにより分析した。この方法において、新たに形成されたハイブリドーマにより産生されたＩｇＧモノクローナル抗体を補足するために、プロテインＡをプラスチックウェルに使用した。１００以上のウェルの培養液がＩｇＧを含んでいた。
【００７０】
本発明者は、現在まで、末梢血リンパ球との融合から２０以上の独立したＩｇ分泌ハイブリッドを、扁桃細胞との融合から１００以上の抗体産生ハイブリドーマを作製した。
【００７１】
［具体例３−ヒト骨髄腫細胞系およびハイブリドーマの特徴付け］
＜ハイブリドーマの形態学的分析＞
出現した多くの細胞の増殖パターンは多様であった。静置培養の場合、骨髄腫細胞は、プラス地区表面を覆う不規則なモザイクを形成する均質パターンの付着細胞に増殖し、細胞は培養液の中に持続的に放出されていた。ローラーフラスコで増殖すると、殆どの細胞が、種々の大きさのクラスターとして懸濁液中に残った。一部のハイブリッドの増殖は、骨髄腫細胞に似ていたが、その他の多くっは異なる形態と増殖形態を獲得した、静置培養では、一部のハイブリッドはプラスチック表面に付着し、多くの厚いが、短い紡錘体、四角形、三角形を呈した。その他は主に単細胞またはクラスターとして懸濁状態で増殖した。
【００７２】
培養骨髄腫の超微細構造検査により、培養１年目に大量の粗面小胞体（ＲＥＲ）を含んでいた細胞と対照的に（５）、長期ｉｎ　ｖｉｔｒｏ増殖後、細胞は殆どのＲＥＲを喪失したことが明らかにされた。しかし、２つのハイブリッド、７０７／１６４および７０７／１０５（血液Ｂ細胞を用いて形成）を検討すると、いずれの場合も、ハイブリッドはプラズマ細胞に似ていた（図４）。細胞質の大部分が、平行で同心的なＲＥＲにより取り込まれ、嚢の拡張度は細胞毎に異なっていた。ＲＥＲの内容物は、微細顆粒物質に見え、これは恐らく免疫グロブリンであろう。多数のミトコンドリアが多くの切片で観察され、ゴルジ部分を通る切片は高度に発達した装置を示していた。ＥＢＶ不死化１６４Ｂ細胞の超微細構造検査では、ＲＥＲの少数の短く薄い鎖しか認められなかったことから、融合リンパ芽球がＩｇ産生のために潜在性骨髄腫ＲＥＲをなぜか活性化すると示唆することは非合理的ではないであろう。
【００７３】
＜骨髄腫細胞系の染色体分析＞
抗体産生細胞が、実際に骨髄腫とヒトリンパ球のハイブリッドであるかことを確認するために、Ｃｚｅｐｕｌｋｏｗｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ．（１２）により説明されているＧバンディング法を用いる染色体分析のために細胞培養を調製した。早くから、培養骨髄腫細胞は（新鮮親細胞の様に）幾つかの染色体異常を含む４５本の染色体を持つ低二倍体であることが発見されている（５）。しかし、選択的増殖の利点（複数回のｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養後）を有し、ＰＥＧ耐性を有する骨髄腫細胞が、多くの並外れて多数の肉眼的染色体異常を含むほぼ四倍体であることが明らかにされた。事実２３本の染色体のうち１３本が異常であった。核型分析により、その全てが普通よりも短くもある染色体１の５つのコピーと、３つの標識染色体が明らかとなった。染色体２、１４、２２（免疫グロブリン遺伝子を含む）が正常で二倍体であることに言及するのは興味深いことである。
【００７４】
ＰＥＧ処理を何回も行ったために、これらの染色体核型異常が引き起こされたどうかを確立するために、ＰＥＧ処理前に凍結された細胞の染色体も分析した。分析結果から、これらの変化は全てＰＥＧ処理前から存在することが明らかとなった。そこで、何ヶ月にもわたる連続ｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養と８−アザグアニン、６−チオグアニン、ＨＡＴ、ウワバインによる処理の間、低二倍体骨髄腫細胞よりも増殖利点を有するほぼ四倍体細胞系が出現した様に思われる。
【００７５】
＜ハイブリッド細胞系の染色体分析＞
１６４細胞によるハイブリドーマの核分析により、細胞が、骨髄腫細胞のほぼ四倍体染色体とリンパ芽球の正常染色体を含む、ほぼ六倍体であることが明らかにされた。
【００７６】
ＨＩＶ−１のｇｐ４１に対するモノクローナル抗体を産生するＥＢＶ形質転換リンパ芽球（Ｋａｒｐａｓ１６４系）の核型分析により、細胞の約１０％が骨髄腫細胞系にも検出されるのと類似の転座、ｔ（１；１６）（ｐ１１；ｑ１０）を示すことが明らかにされている。これは、長期ｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養によるものと思われる。
【００７７】
＜ＩｇＧ産生の分析＞
ＩｇＧ産生量に関して、ＥＢＶ感染リンパ芽球とハイブリッド（７０７／１６４）によるＨＩＶ−１のｇｐ４１に対する抗体分泌量の比較分析により、同じ条件で同数の細胞（１０６／ｍｌ）を培養後、ハイブリドーマがリンパ芽球の少なくとも８倍以上の抗体を産生することが明らかにされた。具体的には、ハイブリッド７０７／１６４は４７０μｇ／ｍｌのＩｇＧを分泌し、１６４細胞は分析検出量未満しか分泌せず、これは培養４日後に７０μｇ／ｍｌであった。どちらの細胞培養も、抗体合成に関する遺伝情報は同じであることから、本発明のハイブリドーマ細胞が、抗体産生に関して遙かに有効であることは明らかである。
【００７８】
免疫グロブリン分泌試験から、骨髄腫細胞が少量の軽鎖のみを産生することが確認されている。扁桃細胞および血液リンパ球との融合物は、ＩｇＧとＩｇＭを分泌するクローンを産生した。扁桃細胞と形成されたハイブリッドの１つは、軽鎖（λ＋κ）のみを産生する。Ｉｇ産生にこの様な多様性があることは、骨髄腫細胞系が、全てでなければ殆どの範囲の抗体産生細胞とハイブリドーマを形成できることを示唆している。事実、本発明者は、本明細書に説明されている骨髄腫細胞系により形成されるハイブリドーマは、マウスハイブリドーマよりも抗体産生に関して遙かに有効であることを見いだした（具体的には、ＨＩＶ−１のｇｐ４１に対する抗体を分泌するハイブリドーマは、４７０μｇ／ｍｌの収量のＩｇＧを産生し、血液リンパ球と融合後に形成されるハイブリドーマは、２１０μｇ／ｍｌと１５０μｇ／ｍｌのＩｇＧを産生した）。これは、マウスハイブリドーマの粗面小胞体がまばらに存在するのに対して、ヒトハイブリドーマに多数の粗面小胞体が存在することと相関していた。
【００７９】
本発明の範囲および意図を逸脱しない本発明の説明されている方法およびシステムに関する種々の改変および変更は、本技術に精通する者にとって明らかである。本発明は、特定の好ましい実施例と関連づけて説明されているが、請求されている本発明はその様な実施例に不当に制限されるものではない。事実、化学または生物または関連分野に精通する者にとって明らかな本発明の実施方式の種々の改変は、本発明により包含されるものである。上記明細書に言及されている全ての出版物は、引用する事により本明細書の一部を成す事とする。
【００８０】
［引用文献］
【表１】
2004502454.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【図１】
２つのハイブリドーマ、７０７／１６４（◯）および７０７／１００（●）によるＩｇＧ分泌量の定量。各ハイブリドーマを、１０％ウシ胎児血清補足ＲＰＭＩ−１６４０増殖培地に３×１０５個／ｍｌの細胞濃度で接種した。試料を表示されている感覚で収集し、免疫固定によるＩｇＧの定量と細胞計数に供した。４日後、７０７／１６４ハイブリドーマの細胞数は８×１０５個／ｍｌに達したが、７０７／１００ハイブリドーマは６×１０５個／ｍｌであった。その後、生存可能な細胞数は減少し、１０日目までには、ほとんど全ての細胞が死滅したが、その時点で培地のＩｇＧ濃度は最高であった。すなわち、両培地共、ＩｇＧ濃度は２１０μｇ／ｍｌであった。
【図２】
骨髄腫Ｋａｒｐａｓ７０７細胞系とハイブリドーマにより分泌される免疫グロブリンの分析。１０％透析ウシ胎児血清と２５０μＣｉ／ｍｌの［３５Ｓ］メチオニンおよびシステインを補足したＬ−メチオニン、Ｌ−シスチン欠乏培地（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）において、２×１０６個／ｍｌの細胞濃度で細胞を増殖させた。ＣＯ２インキュベータの中で３７℃で８時間、細胞培養した。培養後、細胞懸濁液を１０００ｇで５分間遠心分離した。上清を、完全還元後、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。放射標識された分泌されたＩｇＧの同一性が免役固定により確認された。
パネル：
１　骨髄腫細胞により産生される少量のκ軽鎖
２　１６４細胞のハイブリッドにより産生されるｇｐ４１ＨＩＶ−１と反応するＩｇＧ
３，４　骨髄腫細胞を新鮮白血球と融合することにより形成されるＩｇＧ産生ハイブリドーマ
５，８，９，１６　扁桃細胞により形成されるＩｇＧ産生ハイブリドーマ
６，７　κ軽鎖のみを分泌する扁桃細胞による２つのハイブリドーマ
１０〜１２　新鮮扁桃細胞により形成されるハイブリドーマにより分泌されるＩｇＭ。バンド１２は、このハイブリドーマが両方の軽鎖を分泌することを示唆している。
１３　重鎖ＧおよびＭが陰性であったため、このハイブリドーマは２つの軽鎖のみを分泌する様に見える。
１４　骨髄腫と扁桃細胞のハイブリッドにより産生される２つの軽鎖を有するＩｇＧ
１５　高濃度の軽鎖のみを分泌する扁桃細胞のハイブリドーマ
【図３ａ】
ほぼ４倍体であるＫａｒｐａｓ７０７細胞系の染色体の核型。免疫グロブリン遺伝子を含む染色体２、１４、２２が正常と２倍体であることに注意。
【化１】2004502454.tif 000003
【図３ｂ】
染色体Ｎｏ．１の場合明らかな正常の染色体対を含むほぼ６倍体であるハイブリドーマＫａｒｐａｓ７０７／１６４の核型。
【化２】2004502454.tif 000004
【図４】
骨髄腫（ａ）とハイブリドーマ（ｂ）の電子顕微鏡写真。検出可能量の粗面小胞体（ＲＥＲ）を含まない様に見える骨髄腫細胞の細胞質と対照的に、ハイブリドーマの細胞質は、プラズマ細胞に似た平行で同心のＲＥＲにより取り込まれる。これらの形態学的観察結果は、骨髄腫により産生される低濃度のκ軽鎖と、ハイブリドーマにより分泌される高濃度のＩｇＧ濃度と関係づけることができる。細胞を３％グルタルアルデヒドの中で固定し、極薄切片を酢酸ウラニルとクエン酸鉛の中で染色した。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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