(57)【要約】本発明は、好熱性細菌、特に好熱菌種の新規シトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ、これと同等のものをコードするヌクレオチド配列、モノオキシゲナーゼの組換え体による生産、有機化合物の微生物的酸化へのこれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の配列のアミノ酸残基Ｐｒｏ３２８からＧｌｕ３４５までの部分配列を含むアミノ酸配列を有するシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ。
【請求項２】
配列番号２の配列のアミノ酸残基Ｖａｌ２１６からＡｌａ２２７までの部分配列をさらに含む、請求項１記載のシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ。
【請求項３】
配列番号２の配列のアミノ酸残基Ｍｅｔ１からＰｈｅ３２７までおよびＧｌｙ３４６からＡｌａ３８９までの配列の領域に由来する連続した少なくとも１０アミノ酸からなる部分配列から選択されるさらなる少なくとも１つの部分配列をさらに含む、請求項１または２記載のシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ。
【請求項４】
配列番号２の配列に実質的に相当するアミノ酸配列を呈する、請求項１〜３のいずれか１項記載のシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ。
【請求項５】
好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属細菌由来の請求項１〜４のいずれか１項記載のシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ。
【請求項６】
高度好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｏｌｕｓ）種の細菌由来の請求項５記載のシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載のシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードする核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号１の配列の連続する少なくとも４５ヌクレオチド残基を含むヌクレオチド配列の領域に実質的に相補的である核酸配列を含む、請求項７記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
請求項７または８記載のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、シトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項記載のシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードするポリヌクレオチド、およびこれに相補的なポリヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号１の配列の核酸配列を有する請求項１０記載のポリヌクレオチド、およびこれに相補的な核酸配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドに少なくとも１つの制御核酸配列が機能し得る形で連結されている発現カセット。
【請求項１３】
請求項９〜１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１２記載の発現カセットを有する組換えベクター。
【請求項１４】
請求項１３記載の少なくとも１つの組換えベクターを含む微生物。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか１項記載のシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼを生産する方法であって、シトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼを産生する微生物を培養して、該モノオキシゲナーゼを培養物から単離することを含む方法。
【請求項１６】
有機化合物の微生物的酸化方法であって、請求項１〜６のいずれか１項記載の少なくとも１種のシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼで該化合物を転換することを含む方法。
【請求項１７】
請求項１６記載の方法であって、
ａ１）モノオキシゲナーゼの基質である、外来の有機化合物または中間体として生成される有機化合物の存在する培地中で、請求項１４記載の組換え微生物を培養すること；または
ａ２）基質を含む反応培地を、請求項１〜６のいずれか１項に記載のシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼとインキュベートすること；および
ｂ）生成した酸化産物またはそれから続いて生成される産物を培地から単離すること；
を含む方法。
【請求項１８】
外来の基質または中間体として生成される基質が、以下のａ〜ｅよりなる群から選択される、請求項１７記載の方法：
ａ）場合によっては置換されている、Ｎ−、Ｏ−またはＳ−複素環式単環、二環または多環芳香族化合物；
ｂ）場合によっては置換されている、単環または多環の芳香族；
ｃ）直鎖または分枝アルカンおよびアルケン；
ｄ）場合によっては置換されている、シクロアルカンおよびシクロアルケン；ならびに
ｅ）脂肪族（末端は飽和している）カルボン酸。
【請求項１９】
最低でも約２０℃の培養温度で、約６〜９のｐＨで酸素の存在下で微生物を培養することにより酸化が達成される、請求項１７または１８記載の方法。
【請求項２０】
上記ａ〜ｅからなる群より選択された少なくとも１つの化合物を外来の基質として培地に添加し、最低でも約２０℃の培養温度で、約６〜９のｐＨで酸素の存在下で、酵素的転換によって酸化が達成され、この際、基質含有培地が、基質に基づく還元等価物を約１０〜１００倍のモル濃度でさらに含むこととする、請求項１７または１８記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の酵素または請求項１４記載の組換え微生物を固定化した形態で含有するバイオリアクター。
【請求項２２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ、請求項１３記載のベクター、または請求項１４記載の組換え微生物の、以下のａ〜ｅの微生物的酸化における使用：
ａ）場合によっては置換されている、Ｎ−、Ｏ−またはＳ−複素環式単環、二環または多環芳香族化合物；
ｂ）場合によっては置換されている、単環または多環の芳香族
ｃ）直鎖または分枝アルカンおよびアルケン；
ｄ）場合によっては置換されている、シクロアルカンおよびシクロアルケン；ならびに／または
ｅ）脂肪族カルボン酸。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、好熱性細菌、特に好熱菌種由来の新規シトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ、これをコードするヌクレオチド配列、これらのモノオキシゲナーゼの組換え体の調製、および有機化合物の微生物的酸化におけるこれらの使用に関する。
【０００２】
シトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼは産業上有用である酸化反応を触媒する能力を有するため、これまでにかなり研究されてきている。そして、例えば、シトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼＢＭ−３はバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）から単離され、組換え法によって得られている（例えば、ＤＥ−Ａ−１９９ ３５ １１５参照）。
【０００３】
このシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼは、通常、長鎖飽和酸ならびにこれに相当するアミドおよびアルコールの末端付近の水酸化反応、または不飽和長鎖脂肪酸もしくは飽和長鎖脂肪酸を触媒する。飽和脂肪酸の最適鎖長は、炭素数１４〜１６である。
【０００４】
Ｐ４５０ ＢＭ−３のヘムドメインの構造は、Ｘ線構造解析によって決定されている。基質結合部位は、分子の表面から鉄分子に至るまでの長いトンネル状の穴の形をしており、実質的に疎水性アミノ酸残基のみによって確定されている。ヘムドメインの表面で荷電している残基は、残基Ａｒｇ４７およびＴｙｒ５１のみである。後者は水素結合を形成することにより基質のカルボキシル基の結合に関与すると考えられる。このことから、この酵素の基質範囲は、標的化した点突然変異の導入によって拡大させることに成功した。したがって、より短いまたはより長い鎖を有するカルボン酸、アルカン、アルケン、シクロアルカン、シクロアルケンおよび広範な芳香族類の、該酵素による酸化が可能となった（ＤＥ−Ａ−１９９ ３５ １１５、１９９ ５５ ６０５、１００ １１ ７２３および１００ １４ ０８５参照）。
【０００５】
この類の酵素の産業上利用性をさらに拡大させるためには、工業生産条件により適した（例えば、熱安定性の向上等）新規シトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼを見出すことが望ましい。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、工業的生産条件により適したシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼを提供することである。
【０００７】
配列番号２の配列のアミノ酸残基Ｐｒｏ３２８〜Ｇｌｕ３４５までの部分配列を含み、かつ好ましくは配列番号２の配列のアミノ酸残基Ｖａｌ２１６〜Ａｌａ２２７までの部分配列をも含むアミノ酸配列からなるシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼを提供することにより上記目的を達成した。
【０００８】
本発明に好ましいシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼは、配列番号２の配列のアミノ酸残基Ｍｅｔ１〜Ｐｈｅ３２およびＧｌｙ３４６〜Ａｌａ３８９に規定される領域の配列に由来する連続した少なくとも１０アミノ酸残基からなる部分配列から選択される少なくとも１つの部分配列をさらに含むアミノ酸配列を有する。
【０００９】
特に好ましいシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼは、配列番号２の配列に実質的に相当するアミノ酸配列を有している。
【００１０】
本発明のシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼは、特に好熱性細菌から、より好ましくは好熱菌属の細菌（例えば、高度好熱菌種ＨＢ２７株（ＤＳＭ受託番号ＤＳＭ７０３９）から単離されたものであり得る。本発明によると、「好熱性」細菌は、Ｈ．Ｇ．Ｓｃｈｌｅｇｅｌ著、「一般微生物学（Ａｌｌｇｅｍｅｉｎｅ Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ）」（Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ， 第５版， ｐａｇｅ １７３， 高度好熱菌および超高度好熱菌の欄）に記載の熱耐性の基準（すなわち、最適増殖温度が４０℃以上）に合致するものとする。
【００１１】
本発明のモノオキシゲナーゼは、好ましくは、熱安定性の向上を特徴とする。バチルスマガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｇａｔｅｒｉｕｍ）Ｐ４５０ ＢＭ−３に比べて高温（例えば、３０〜６０℃、ｐＨ７．５、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ）での失活が少ない形態を有している。
【００１２】
好ましい実施形態では、シトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼは、高度好熱細菌Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから本発明によって提供される。このタンパク質は、約４４ｋＤａの分子量を有し（ＳＤＳゲル電気泳動で決定）、可溶性であり、還元状態、酸化状態で吸光スペクトルを有しており、他のＰ４５０酵素のカルボニル付加に類似するカルボニル付加を有している。高度好熱細菌由来の本発明の該酵素と、既知のＰ４５０酵素である、Ｐ４５０ ＢＭ３との配列をアラインさせて得られた同一性は３２％であり、ＣＹＰ１１９ Ｐ４５０ ＢＭ３との配列をアラインさせて得られた同一性は２９％であり、Ｐ４５０ｅｒｙＦとの配列をアラインさせて得られた同一性は３１％である。本発明の酵素は、極めて熱安定性であり、融解温度（ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｏｉｎｔ）は約８５℃であり、この値はＰ４５０ｃａｍの値を３０℃上回っている。
【００１３】
本発明の対象はさらに、本発明のシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードする核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。
【００１４】
特に、本発明の対象は、配列番号１の配列中の連続する少なくとも３０〜４５残基を含むヌクレオチド配列領域に実質的に相補的な核酸配列を含むオリゴヌクレオチドも包含する。
【００１５】
さらなる本発明の対象は、上記のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、シトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ、特に他の微生物由来の、例えば好熱菌属の微生物由来のシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００１６】
特に、上記のシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードするポリヌクレオチド、およびこれに相補的なポリヌクレオチドもまた本発明の対象である。
【００１７】
実質的に配列番号１の核酸配列、およびこれに相補的な核酸配列を有するポリヌクレオチド、ならびにこれらから誘導されるポリヌクレオチドが好ましい。
【００１８】
本発明のさらなる対象は、本発明のモノオキシゲナーゼの組換え生産のための、上述のポリヌクレオチドの少なくとも１つに少なくとも１つの制御核酸配列が機能し得る形で連結されている発現カセットに関する。
【００１９】
本発明のさらなる対象は、上述の少なくとも１つのポリヌクレオチドまたは少なくとも１つの発現カセットを有する組換えベクター、少なくとも１つのそのような組換えベクターを含む微生物、および本発明のシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼを調製する方法であって、シトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼを産生する微生物を培養して該培養物から該モノオキシゲナーゼを単離する方法に関する。
【００２０】
本発明の酵素およびこれから誘導される突然変異体は、産業上重要な有機化合物の種々の生化学的酸化反応の生触媒として有用である。同様に、本発明の組換え微生物もまたかかる酸化反応を実施するために用いることができる。
【００２１】
したがって、本発明のさらなる対象は、本発明のシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼと反応する有機化合物の微生物による微生物的酸化方法に関する。
【００２２】
該方法は好ましくは、
ａ１）モノオキシゲナーゼの基質である、外来の（外部から供給した）有機化合物または中間体として生成される有機化合物の存在する培地中で、好ましくは、酸素の存在下で、場合によっては電子供与体の存在下で、上記の組換え微生物を培養すること；または
ａ２）基質を含む反応培地を、本発明のシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼと、好ましくは、酸素および電子供与体の存在下でインキュベートすること；および
ｂ）生成した酸化物またはそれから続いて生成される産物を培地から単離するという方法で達成される。
【００２３】
上記外来の基質または中間体として生成される基質は、以下のａ〜ｅよりなる群から選択される：
ａ）場合によっては置換されている、Ｎ−、Ｏ−またはＳ−複素環式単環、二環または多環芳香族化合物；
ｂ）場合によっては置換されている、単環または多環の芳香族
ｃ）直鎖または分枝アルカンおよびアルケン；
ｄ）場合によっては置換されている、シクロアルカンおよびシクロアルケン；ならびに
ｅ）脂肪族（末端は飽和している）カルボン酸。
【００２４】
本発明の方法の好ましい一つの変法では、培養温度が最低でも約２０℃で、ｐＨが約６〜９で酸素の存在下で微生物を培養することにより酸化が達成される。
【００２５】
本発明の方法の好ましい第２の変法では、上記ａ〜ｅからなる群より選択された少なくとも１つの化合物を外来の基質として培地に添加し、培養温度が最低でも約２０℃で、ｐＨが約６〜９で酸素の存在下で、酵素的転換によって酸化が達成され、この際、基質含有培地が、約１０〜１００倍のモル濃度の基質に基づく還元等価物（電子供与体）をさらに含む。
【００２６】
上記方法は好ましくは、バイオリアクター内で実施される。したがって、かかるバイオリアクターであって、本発明の少なくとも１つのモノオキシゲナーゼまたは少なくとも１つの組換え微生物を（場合によっては、適宜固定化された形態で）含むものも本発明の対象である。
【００２７】
最後に、本発明は、シトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ、本発明のベクターまたは微生物の、上記化合物類の微生物的酸化における使用に関する。
【００２８】
本発明は、添付の図面にさらに詳細に示している。
【００２９】
図１は、バチルス・メガテリウムＰ４５０ ＢＭ３のヘムドメインを有する、Ｐ４５０高度好熱菌を示す。ヘム結合部位は、２重下線で示している（Ｐ４５０ ＢＭ３のＣｙｓ４００は、補欠分子団の鉄原子と協調するシステイン残基である）。脂肪酸鎖のω−末端と接触する領域は、１重下線で示している。これらの一致の程度は、異なるマークで示す（★は同一残基、：および・は類似残基）。
【００３０】
図２は、Ｐ４５０ ＢＭ３および好熱菌種のＰ４５０の熱安定性を判定する試験の比較結果である。鉄含量に対する４００〜５００ｎｍの波長の吸収スペクトルにより熱安定性を決定した。
【００３１】
特定して開示される新規Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの「機能的等価物」は本発明に包含される。
【００３２】
本発明の目的のための、特定して開示される新規Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの「機能的等価物」または類似体は、上記新規Ｐ４５０モノオキシゲナーゼとは異なるが、上記ａ〜ｅの酸化の少なくとも１つを含む望ましい基質特異性を維持し、かつ／または例えば、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ中で３０〜６０℃の範囲内の温度、適切であればより高い温度で３０分間処理した後の熱安定性がＰ４５０ ＢＭ３と比較すると向上している酵素である。
【００３３】
本発明に関する「機能的等価物」という用語は、上述の配列中少なくとも１つの位置に存在するアミノ酸がそれ以外のアミノ酸に置換されているが、上述の酸化反応のうちの１つを触媒する特定の変異体を意味するものと解されたい。「機能的等価物」という用語は、１以上、例えば１〜３０または１〜２０または１〜１０個のアミノ酸の付加、置換、欠失および／または挿入によって得られる変異体も含む。本発明の範囲にある性質を有する突然変異をもたらす限り、配列中のどの位置でこのような改変が起こっていてもよい。機能的等価物とは、特に、変異体と変異していない酵素との間での反応性パターンが質的に一致する場合、すなわち異なる反応速度で同一の基質を転換する場合をいう。
【００３４】
本発明に包含される「機能的等価物」は、少なくとも１つの位で配列番号２とは異なるが、該配列の改変はモノオキシゲナーゼ活性を好ましくはわずかにしか変化させないものであり、すなわち、約９０％以上、特に５０％または３０％以上異なることはない、アミノ酸配列を有している。この変化は、標準基質、例えば、標準的条件下（例えば、０．１〜０．５Ｍの基質、ｐＨ６〜８、特にｐＨ７、温度６０〜７０℃、特に６５℃）でβ−イオノンを用いて決定することができる。
【００３５】
本発明に包含される「機能的等価物」は明細書に開示されたタンパク質の類似体である。これらは、明細書中に示す配列の１つと、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、特に好ましくは少なくとも８５％、例えば、９０％、９５％または９９％などの相同性を有する。該相同性は、Ｐｅａｒｓｏｎ およびＬｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ８５ （８）， １９８８， ２４４４−２４４８のアルゴリズムによって計算される。
【００３６】
本発明のタンパク質またはポリペプチドの相同体は、タンパク質の点突然変異または末端切断などの突然変異によって作製することができる。
【００３７】
本発明のタンパク質の相同体は、突然変異体（例えば、末端切断型変異体など）のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。例えば、タンパク質変異体の多様化（ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ）ライブラリーを、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素的連結によって、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発により作製することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列に由来する潜在的な相同体のライブラリーを作製するために用いることができる方法は、多種の方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成はＤＮＡ合成機によって可能であり、合成遺伝子を適切な発現ベクターに連結させることができる。遺伝子の縮重セットの使用により、潜在的にタンパク質配列の望ましいセットをコードする全ての配列が混合物として提供される。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は当業者に公知であり（例えば、Ｎａｒａｎｇ， Ｓ．Ａ．（１９８３）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３； Ｉｔａｋｕｒａ ら、（１９８４） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５３：３２３； Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８４） Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６； Ｉｋｅら、（１９８３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １１：４４７）。
【００３８】
「機能的等価物」とは、他の生物、例えば、本明細書中に特に記載する細菌とは異なる細菌から得ることができるＰ４５０モノオキシゲナーゼおよび天然に存在する変異体を含む。例えば、相同配列領域の部分は配列アラインメントによって同定でき、等価物は本発明の特定の対象に対して決定することができる。
【００３９】
本発明によって酸化可能である上記（ａ）グループの基質は、場合によっては置換されている、複素環式単環、二環、または多環芳香族化合物；特に、酸化またはヒドロキシル化が可能なＮ−、Ｏ−またはＳ−複素環式単環、二環、または多環芳香族化合物である。例えば、２、３、または４〜７員の、特に６または５員の縮合環であって、少なくともそのうちの１つ、好ましくはすべての環が芳香族性であり、かつ該芳香環が環に結合した１〜３個の、好ましくは１個のＮ−、Ｏ−、またはＳ−複素原子を有している。場合によっては、環構造全体が、さらに１または２個の同一または異なる複素原子を有していてもよい。さらに、芳香族化合物は、環員炭素原子または複素原子に結合した１〜５個の置換基を有していてもよい。適切な置換基の例としては、メチル、エチル、ｎ−もしくはｉ−プロピルまたはｎ−、ｉ−もしくはｔ−ブチルなどのＣ１〜Ｃ４アルキル、あるいはエテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニルまたは３−ブテニルなどのＣ２〜Ｃ４アルケニル、ヒドロキシルおよびフッ素、塩素および臭素などのハロゲンが挙げられる。場合によっては、上述のアルキルまたはアルケニル置換基は、ケトまたはアルデヒド基を有していてもよく、例えば、プロパン−２−オン−３−イル、ブタン−２−オン−４−イル、３−ブテン−２−オン−４−イルなどが挙げられる。適切な複素環式基質の非限定的な例としては、特に、インドール、Ｎ−メチルインドールなどの二環複素環、ならびに１〜３個の置換基によって炭素原子が置換されたこれらの類似体、例えば、５−クロロインドール、５−ブロモインドール、ならびにまた、キノリンおよび、例えば、８−メチルキノリン、６−メチルキノリンおよびキノリジンなどのキノリン誘導体、ならびにベンゾチオフェンおよび１〜３個の置換基によって炭素原子が置換されているこれらの類似体が挙げられる。その他には、アクリジンなどの三環複素芳香族、および１〜３個の置換基によって炭素原子が置換されているこれらの類似体が挙げられる。
【００４０】
本発明によって酸化可能である上記（ｂ）グループの基質は、場合によっては置換されている、単環または多環の、特に単環または二環の芳香族化合物、例えばベンゼンおよびナフタリンがある。場合によっては、芳香族化合物は、１または複数の置換を有していてもよく、例えば、１〜５個の置換基が環員炭素原子に結合していてもよい。適切な置換基の例としては、メチル、エチル、ｎ−もしくはｉ−プロピルまたはｎ−、ｉ−もしくはｔ−ブチルなどのＣ１〜Ｃ４アルキル、あるいはエテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニルまたは３−ブテニルなどのＣ２〜Ｃ４アルケニル、ヒドロキシルおよびフッ素、塩素および臭素などのハロゲンが上げられる。場合によっては、上述のアルキルまたはアルケニル置換基は、ケトまたはアルデヒド基を有していてもよく、例えば、プロパン−２−オン−３−イル、ブタン−２−オン−４−イル、３−ブテン−２−オン−４−イルなどが挙げられる。場合によっては、芳香環が４〜７員の非芳香環に縮合していてもよい。場合によっては、この非芳香環は、１または２個のＣ−Ｃ二重結合を有し、上記置換基によって１または複数の置換を有していてもよく、場合によっては、１または２個の環員複素原子に結合していてもよい。特に有用な芳香族化合物の例としては、クメンなどの単環芳香族化合物、インデンおよびナフタレンなどの二環基質、ならびに１〜３個の置換基によって炭素原子が置換されているこれらの類似体がある。
【００４１】
本発明によって酸化可能である上記（ｃ）グループの基質は、４〜１５個、好ましくは６〜１２個の炭素原子を有する直鎖または分枝アルカンおよびアルケンである。例を挙げるとすれば、ｎ−ペンタン、ｎ−へキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン、ｎ−ノナン、ｎ−デカン、ｎ−ウンデカンおよびｎ−ドデカンおよび１以上の分枝を有するこれらの類似体、例えば、１〜３メチル側鎖を有する類似体化合物、または上記アルカンの一不飽和または多価不飽和、好ましくは一不飽和類似体である。
【００４２】
本発明によって酸化可能である上記（ｄ）グループの基質は、場合によっては置換されている、シクロアルカンおよびシクロアルケンである。シクロペンタン、シクロペンテン、シクロへキサン、シクロヘキセン、シクロへプタンおよびシクロヘプテンなどがある。本明細書中に用いる場合、１または複数の置換を有していてもよく、例えば上記（ａ）および（ｂ）のグループの化合物について記載したのと同様の１〜５個の置換基が結合したものでもよい。非限定的な例として、イオノン、例えばα−、β−およびγ−イオノン、ならびに対応するメチルイオノンおよびイソメチルイオノンがある。
【００４３】
本発明によって酸化可能である上記（ｅ）グループの基質は、直鎖または分枝の、飽和または一不飽和または多価不飽和のＣ８〜Ｃ３０カルボン酸であり、特にモノカルボン酸またはこれらのカルボン酸誘導体、例えばエステルおよびアミドである。例を挙げるならば、飽和モノカルボン酸があり、これは末端または末端付近（ω−１−、ω−２−またはω−３位）が水酸化していてもよい。
【００４４】
本発明の対象はまた、上述のモノオキシゲナーゼのうちの１つをコードする核酸配列（一本鎖および二本鎖ＤＮＡならびにＲＮＡ配列）、およびこれらの機能的等価物である。さらに、本発明の核酸配列は、配列番号１に示す配列に由来する、１以上のヌクレオチドの付加、置換、挿入または欠失により配列番号１とは異なるものであって、その性質が所望の範囲内にあるモノオキシゲナーゼをコードするものである。
【００４５】
本発明はまた、本明細書中に特定する配列と比較した場合に、サイレント変異として知られている核酸配列、または由来とする特定の生物のコドン使用頻度により変更されている核酸配列をも含む。天然に存在する変異体、例えば、スプライシング変異体なども含む。また、保存的ヌクレオチド置換により（すなわち、対象とするアミノ酸を、電荷、大きさ、極性および／または可溶性の類似したアミノ酸で置換することにより）得られる配列もまた対象である。
【００４６】
さらに、本発明は、上述のコード配列とハイブリダイズするかまたはこれに相補的である核酸配列を含む。これらのポリヌクレオチドは、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、適当なプライマーを用いてＰＣＲによってそれを増幅させて、例えば適当なプローブを用いるなどして単離することにより見つけることができる。本発明のポリヌクレオチドまたはベクターで適切な微生物を形質転換し、微生物を増殖させてポリヌクレオチドを増幅させ、そして単離することももう一つの可能性である。さらには、本発明のポリヌクレオチドは化学合成することも可能である。
【００４７】
ポリヌクレオチドに「ハイブリダイズ」が可能であるという性質は、非相補的なパートナー同士では非特異的結合が起こらないようなストリンジェントな条件下で、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが実質的に相補的な配列に結合できるということであると理解されたい。ここで、配列は、７０〜１００％、好ましくは９０〜１００％の相補性を有しているべきである。互いに特異的に結合し得る相補配列の性質は、ノーザンもしくはサザンブロット法またはＰＣＲもしくはＲＴ−ＰＣＲにおけるプライマーの結合のために開発された。３０塩基対以上の長さを有するオリゴヌクレオチドが通常この目的に用いられる。ストリンジェントな条件とは、例えば、ノーザンブロット法、のためには、５０〜７０℃、好ましくは６０〜６５℃で例えば０．１％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣバッファー（２０×ＳＳＣは、３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）の洗浄液を、非特異的にハイブリダイズしたｃＤＮＡプローブまたはオリゴヌクレオチドを溶出するために使用することである。上述のとおり、相補性の高い核酸のみが、この工程では互いに結合したまま残っている。
【００４８】
本発明のさらなる対象は、遺伝子制御または支配核酸配列の下流に本発明の変異体をコードする核酸配列を含有する発現構築物、および少なくとも１つのかかる発現構築物を含むベクターである。本発明のかかる構築物は、対象のコード配列の５’上流にプロモーターおよび３’下流にターミネータ配列を含み、また場合によっては、通常の制御エレメントをさらに含み、それぞれがコード配列に対して機能し得る形で連結されていることが好ましい。「機能し得る形で連結」とは、プロモーター、コード配列、ターミネーターおよび、場合によっては、さらなる制御エレメントを、それぞれの制御エレメントが、コード配列の発現のために十分に機能し得るように連続的に配置されていることを意味すると解される。機能し得る形で連結する配列の例としては、標的とする配列、ならびに翻訳および他のエンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどである。さらなる制御エレメントは、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などである。
【００４９】
人工の制御配列に加えて、天然の制御配列は、現実の構造遺伝子の前に存在していてもよい。場合によっては、遺伝子改変を用いてこの天然の制御を遮断することも可能であり、遺伝子の発現を増加または減少させることもできる。しかし、遺伝子構築物がより単純な構造を有するようにしてもよく、すなわち構造遺伝子の前に制御シグナルを添加することなく、その制御をする天然のプロモーターを除去しないままでもよい。代わりに、天然の制御配列は、それが制御しなくなりかつ遺伝子発現が増大または減少するように変異させてもよい。核酸配列の１以上のコピーが遺伝子構築物中に存在し得る。
【００５０】
有用なプロモーターの例としては、ｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃＩｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ＳＰ６、１−ＰＲまたは１−ＰＬプロモーター（は全てグラム陰性菌への利用に有利である）、またグラム陽性菌のプロモーターａｍｙおよびＳＰＯ２、酵母プロモーターＡＤＣ１、ＭＦａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、または植物プロモーターＣａＭＶ／３５Ｓ、ＳＳＵ、ＯＣＳ、ｌｉｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ｎｏｔ、またはユビキチンもしくはファゼオリンプロモーターが挙げられる。光誘導性プロモーター、および特に温度誘導性プロモーター（ＰｒＰ１プロモーターなど）などの誘導性プロモーターの使用は、特に好ましい。
【００５１】
特に、制御配列と共に全ての天然プロモーターを使用することができる。さらに、合成プロモーターも使用に有利である。
【００５２】
上記制御配列は、核酸配列およびタンパク質発現の標的化発現を可能にすることを意図するものである。宿主細胞によって、例えば、誘導後においてのみ遺伝子が発現または過剰発現される、または即時に発現および／または過剰発現されるということを意味する。
【００５３】
制御配列または因子は、発現に対して積極的な効果を有し得そしてそれを増加または減少させるものであることが好ましい。したがって、制御エレメントは、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどの転写シグナルを利用して転写レベルを有利に増大させることができる。さらに、例えばｍＲＮＡの安定性を増大させることなどにより、翻訳を増加させることも可能である。
【００５４】
発現カセットを、適切なモノオキシゲナーゼヌクレオチド配列およびターミネータまたはポリアデニル化シグナルに適切なプロモーターを融合させることによって調製することができる。通常の組換えおよびクローニング技法（例えば、Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｅ． Ｆ．　ＦｒｉｔｓｃｈおよびＪ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８９）、ならびにＴ． Ｊ． Ｓｉｌｈａｖｙ， Ｍ．Ｌ ＢｅｒｍａｎおよびＬ． Ｗ． Ｅｎｑｕｉｓｔ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８４）、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． およびＷｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ （１９８７）などに記載のもの）をこの目的に用いることができる。
【００５５】
適切な宿主生物で発現させるためには、宿主での遺伝子の最適な発現を可能とする組換え核酸構築物または遺伝子構築物を宿主特異的ベクターに挿入することが有利である。ベクターは当業者に公知であるが、例えば、「クローニングベクター（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ）」（Ｐｏｕｗｅｌｓ Ｐ．Ｈ．ら編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ， １９８５）などに記載されている。プラスミドに加えて、当業者に公知の、例えば、ファージ、ウイルス（ＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルスおよびアデノウイルスなど）、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファージミド、コスミド、および直鎖状または環状ＤＮＡなどの他の全てのものを意味すると解されたい。これらのベクターは、宿主生物で自律的または染色体複製により複製され得る。
【００５６】
組換え微生物、例えば少なくとも１つの本発明のベクターで形質転換されたもの、および突然変異体の作製のために用いることができるものは、本発明のベクターによって作製することができる。有利には、上述の本発明の組換え構築物を、適切な宿主系に導入し、発現させるためには、当業者が慣用しているようなクローニングおよびトランスフェクション技法（例えば、共沈法、プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション法、レトロウイルストランスフェクション法など）を使用して対象とする発現系に上記核酸を発現させることが好ましい。適切な系は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ． Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９７）に記載されている。
【００５７】
宿主生物として適切なものは、主に、本発明の核酸、対立遺伝子変異体、その機能的等価物または誘導物の発現を可能とする全ての生物である。宿主生物は、例えば、細菌、真菌、酵母、植物または動物細胞を意味するものと理解される。好ましい生物は、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなど）、ストレプトミセス、バチルスまたはシュードモナス、真核微生物（酵母、アスペルギルス）、高等真核細胞（動物または植物由来の細胞、例えば、Ｓｆ９もしくはＣＨＯ細胞）などが挙げられる。
【００５８】
形質転換を達成した生物は、ベクターまたは発現カセット中に存在するマーカー遺伝子によって選択可能である。かかるマーカーの例としては、抗生物質に耐性の遺伝子および形質転換細胞を染める色素反応を触媒する酵素の遺伝子などである。後者は、その後自動セルソーターによって選択することも可能である。ベクターでの形質転換が達成され、抗生物質（例えば、Ｇ４１８またはハイグロマイシンなど）に耐性な関連遺伝子を担持する微生物は、抗生物質を含有する適切な液体または固体培地で選択可能である。細胞表面に呈示されるマーカータンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーでの選択に利用することができる。
【００５９】
宿主生物と生物に適合するベクター（プラスミド、ウイルスまたはファージ）の組み合わせは、例えばＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系を有するプラスミド、λファージもしくはμファージまたは他のテンペレントファージ（ｔｅｍｐｅｒｅｎｔ ｐｈａｇｅ）あるいはトランスポゾンおよび／またはさらなる有利な制御配列を有するプラスミドにより発現系が形成される。例えば、「発現系」という用語は、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞とｐｃＤＨＡ３ｎｅｏベクターなどの哺乳動物細胞に適切なベクターとの組み合わせをいう。
【００６０】
所望であれば、遺伝子産物をトランスジェニック動物（特に、マウス、ヒツジ）またはトランスジェニック植物などのトランスジェニック生物内で発現させることができる。
【００６１】
本発明の対象さらなる対象は、本発明のモノオキシゲナーゼの組換え産生方法である。モノオキシゲナーゼを産生する微生物を増殖させ、場合によってはモノオキシゲナーゼの発現を誘導し、そして培養物からモノオキシゲナーゼを単離する。したがって、モノオキシゲナーゼは所望の通りの工業的レベルで産生することができる。
【００６２】
組換え微生物は、公知の方法で増殖および醗酵させることができる。例えば、ＴＢまたはＬＢ培地中で２０〜４０℃の温度にてｐＨ６〜ｐＨ９で細菌を増殖させることができる。特定の適切な培養条件は、例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８９）に記載されている。
【００６３】
モノオキシゲナーゼが培地中に分泌されないのであれば、細胞を破砕して酵素を細胞溶解物から公知のタンパク質単離方法によって得る。細胞は、高頻度超音波、例えばフレンチプレス（Ｆｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓ）などの高圧、浸透圧による溶解、界面活性剤の作用、溶解性酵素または有機溶媒、ホモジナイザーまたはこれらのうちの１つ以上のものの組み合わせから選択される方法で、破砕できる。
【００６４】
モノオキシゲナーゼの精製は、Ｑ−セファロースクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性クロマトグラフィーなどの分子ふるい（ゲルろ過）によるクロマトグラフィー、ならびに、限外ろ過、結晶化、塩析、透析および非変性電気泳動などの他のクロマトグラフィー法などの公知のクロマトグラフィー法によって達成されうる。適切な方法は、例えば、Ｃｏｏｐｅｒ， Ｆ．Ｇ．，「生化学技法（Ｂｅｉｏｃｈｅｍｉｓｃｈ Ａｒｂｅｉｔｓｒｏｃｅｓｓｅｎ）」（Ｖｅｒｌａｇ Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ， Ｂｅｒｌｉｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、またはＳｃｏｐｅｓ， Ｒｌ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｂｅｒｌｉｎ）に開示されている。
【００６５】
組換えタンパク質を単離するために、特定のヌクレオチド配列でｃＤＮＡを伸長させて改変ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするベクター系またはオリゴヌクレオチドを使用することが特に有利である。かかる適切な修飾は、例えば、アンカーとしての機能を有する「タグ」として知られているもの（例えば、ヘキサヒスチジンアンカーとして知られているもの）の修飾物、または抗原として抗体に認識されるエピトープなどが挙げられる（例えば、Ｈｅｒｌｏｗ， Ｅ． およびｌａｎｅ， Ｄ．， １９８８， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ （Ｎ．Ｙ．）Ｐｒｅｓｓ）。これらのアンカーは固相支持体（例えば、ポリマーマトリックスなど）にタンパク質を接着させる働きをし、例えば、予め充填したクロマトグラフィーカラムまたは、マイクロタイタープレートその他に使用できる。
【００６６】
これらのアンカーを同時に用いてタンパク質を識別することができる。その他、タンパク質の識別に用いることができるものとしては、蛍光染色色素、基質との反応後に検出可能な反応産物を形成する酵素標識、放射性標識などの通常の標識があり、これらを単独で、またはタンパク質を誘導するためのアンカーと組合わせて用いることができる。
【００６７】
本発明はさらに、既述のタイプの有機化合物の微生物的酸化方法に関する。
【００６８】
転換を組換え微生物で実施する場合、微生物は、酸素の存在下でかつＴＢまたはＬＢ培地などの複合適培地中で、培養温度が約２０℃以上でｐＨが約６〜９で、十分な細胞密度が得られるまで増殖させる。より良好な酸化反応を得るためには、誘導性プロモーターの使用が好ましい。モノオキシゲナーゼ産生の誘導後、酸素の存在下で１２時間から３日間培養を続ける。
【００６９】
これとは異なり、本発明の転換を精製酵素または濃縮酵素で行う場合、本発明の酵素を外来基質（０．０１〜１０ｍＭまたは０．０５〜５ｍＭ）含む培地に溶解し、約１０℃以上でｐＨが約６〜９（例えば、１００〜２００ｍＭのリン酸バッファーまたはＴｒｉｓバッファーで調製するなど）で、好ましくは酸素の存在下で、かつ還元剤の存在下でさらに約１０〜１００倍の過剰なモル濃度で酸化されるべき基質に基づく還元等価物を含む基質含有培地中で転換を実施する。還元剤はＮＡＤＰＨが好ましい。
【００７０】
本発明の基質酸化方法において、反応培地中に存在するかまたは添加された酸素は、酵素的還元切断に供される。所望の還元等価物は、還元剤（電子供与体）を添加することによって提供される。
【００７１】
生成する酸化産物は、例えば抽出またはクロマトグラフィーなどの通常の方法で培地から分離および精製される。
【００７２】
以下に示す実施例は、非限定的なものであるが、特定の実施態様を説明する。
【００７３】
実施例
一般的実験データ
ａ）　一般的クローニング技法
例えば、制限酵素切断、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡ断片の精製、ニトロセルロースおよびナイロン膜への核酸のトランスファー、ＤＮＡ断片の連結、大腸菌細胞の形質転換、細菌の増殖、ファージの増殖および組換えＤＮＡの配列分析はＳａｍｂｒｏｏｋら（上述）によって記載されている通りに実施した。
【００７４】
ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ＰＣＲは以下の反応混合液を用いて標準的な方法で実施した。
【００７５】
ｄＮＴＰ混合液（２００μＭ）：８μｌ、ＭｇＣｌ２不含Ｔａｑポリメラーゼバッファー（１０×）：１０μｌ、ＭｇＣｌ２（２５μＭ）：８μｌ、各プライマー（０．１μＭ）：１μｌ、増幅させるＤＮＡ：１μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ， Ｖｉｌｎｉｕｓ， Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）：２．５Ｕ、脱イオン水で１００μｌにする。
【００７６】
ｃ）大腸菌の培養
組換え大腸菌ＤＨ５α株をＬＢ−Ａｍｐ培地（Ｔｒｉｐｔｏｎ：１０．０ｇ、ＮａＣｌ：５．０ｇ、酵母抽出液：５．０ｇ、アンピシリン：１００ｇ／ｍｌ、水で１０００ｍｌとする）で、３７℃にて培養した。このために、それぞれ、寒天プレートからコロニーを５ｍｌのＬＢ−Ａｍｐ培地にループを用いて移した。約１８時間２２０ｒｐｍで振盪培養後、２ｌのフラスコ内の４００ｍｌの培地中に培養物４ｍｌを接種した。大腸菌におけるＰ４５０の発現は、ＯＤ５７８の値が、０．８〜１．０の範囲内になった後、４２℃で熱ショック誘導により誘導して３〜４時間培養した。
【００７７】
ｄ）細胞破砕
新鮮な生物体重量で１５ｇまでの大腸菌ＤＨ５αの細胞ペレットを水中で溶かして、２５ｍｌのリン酸バッファー（５０ｍＭ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ）またはＴｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した。大腸菌の懸濁液を氷上で冷却しながら、３分間、出力８０Ｗ、操作間隔２０％で超音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ Ｗ２５０ （ＤＩｅｔｚｅｎｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ））した。タンパク質の精製に先立って、細胞懸濁液を２０分間、３２，５００×ｇで遠心し、０．２２ｍｍ Ｓｔｅｒｉｖｅｘ−ＧＰフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過し、粗抽出液を得た。
【００７８】
実施例１：高度好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） ＨＢ２７のＰ４５０およびそのｈｉｓタグ誘導体のクローニングと発現
１：高度好熱菌ＨＢ２７からのＰ４５０のクローニング
Ｐ４５０コード配列（平滑末端）を、プラスミドｐＴＺ１９Ｒ（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）のＨｉｎｃＩＩ切断部位に挿入してクローニングした。該Ｐ４５０コード配列を、得られたプラスミドＴＴＨＢ６６からＰＣＲにより増幅させた。この際、以下のプライマーを用いた：
ａ）　Ｐ４５０のＡＴＧ開始コドン部分にＮｄｅＩ切断部位（小文字）を含む３０ｍｅｒセンス鎖オリゴヌクレオチド：
５’−ＣＧＡＡＧＣＴｃａｔａｔｇＡＡＧＣＧＣＣＴＴＴＣＣＣＴＧＡＧ　（配列番号７）
ｂ）　Ｐ４５０のＴＧＡ終止コドン部分にＥｃｏＲＩ切断部位（小文字）を含む３０ｍｅｒアンチセンス鎖オリゴヌクレオチド：
５’−ＧＣｇａａｔｔｃＡＣＧＣＣＣＧＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＣＴＡＧＧ　（配列番号８）。
【００７９】
得られた断片をベクターｐＣＹＴＥＸＰ１（λバクテリオファージの熱誘導性ＰＲＰＬプロモーター系を有するプラスミド）のＮｄｅＩ切断部位にクローニングして、大腸菌ＤＨ−５α（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｈｅｉｄｌｂｅｒｇ）に形質転換した。
【００８０】
対象とするプラスミドを含む大腸菌ＤＨ−５αを、アンピシリン含有ＬＢ培地に接種して、３７℃で一晩インキュベートした。サンプルのうちの数個を新しいＬＢ培地（アンピシリン含有）に接種し、得られた培養物を３７℃でＯＤが０．９になるまで増殖させた。温度を４２℃に上げて２４時間以上誘導をかけた。ＣＯ差スペクトルを測定することにより発現中のＰ４５０含量の変化を決定した。
【表１】
2004511255.tif 000002
【００８１】
２：Ｎ末端にＨｉｓタグを有する高度好熱菌ＨＢ２７由来Ｐ４５０のクローニング
Ｐ４５０コード配列を、得られたプラスミドＴＴＨＢ６６からＰＣＲにより増幅させた。この際、以下のプライマーを用いた：
（ａ）　Ｐ４５０のＡＴＧ開始コドン部分にＮｄｅＩ切断部位（小文字）とタグコードコドン（下線）を含む５０ｍｅｒセンス鎖オリゴヌクレオチド：
５’−ＣＧＡＡＧＣＴｃａｔａｔｇＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＡＡＧＣＧＣＣＴＴＴＣＣＣＴＧＡＧ　（配列番号９）
ｂ）　Ｐ４５０のＴＧＡ終止コドン部分にＥｃｏＲＩ切断部位（小文字）を含む３０ｍｅｒアンチセンス鎖オリゴヌクレオチド：
５’−ＧＣｇａａｔｔｃＡＣＧＣＣＣＧＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＣＴＡＧＧ　（配列番号８）。
【００８２】
得られた断片をベクターｐＣＹＴＥＸＰ１のＮｄｅＩ切断部位とＥｃｏＲＩ切断部位にクローニングして、大腸菌ＤＨ−５α（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｈｅｉｄｌｂｅｒｇ）に形質転換した。
【００８３】
対象とするプラスミドを含む大腸菌ＤＨ−５αを、アンピシリン含有ＬＢ培地に接種して、３７℃で一晩インキュベートした。サンプルのうちの数個を新しいＬＢ培地（アンピシリン含有）に接種し、得られた培養物を３７℃でＯＤが０．９になるまで増殖させた。温度を４２℃に上げて２４時間以上誘導をかけた。差スペクトルを測定することにより発現中のＰ４５０含量の変化を決定した。
【表２】
2004511255.tif 000003
【００８４】
３：Ｃ末端にＨｉｓタグを有する高度好熱菌ＨＢ２７由来Ｐ４５０のクローニング
Ｐ４５０コード配列を、得られたプラスミドＴＴＨＢ６６からＰＣＲにより増幅させた。この際、以下のプライマーを用いた：
ａ）　Ｐ４５０のＡＴＧ開始コドン部分にＮｄｅＩ切断部位（小文字）を含む３０ｍｅｒセンス鎖オリゴヌクレオチド：
５’−ＣＧＡＡＧＣＴｃａｔａｔｇＡＡＧＣＧＣＣＴＴＴＣＣＣＴＧＡＧ　（配列番号７）
ｂ）　Ｐ４５０のＴＧＡ終止コドン部分にＥｃｏＲＩ切断部位（小文字）とタグコードコドン（下線）を含む４７ｍｅｒアンチセンス鎖オリゴヌクレオチド：
５’−ＧＣｇａａｔｔｃＡＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＣＧＣＣＣＧＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＣＴＡＧＧ　（配列番号１０）。
【００８５】
得られた断片をベクターｐＣＹＴＥＸＰ１のＮｄｅＩ切断部位とＥｃｏＲＩ切断部位ににクローニングして、大腸菌ＤＨ−５α（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｈｅｉｄｌｂｅｒｇ）に形質転換した。
【００８６】
対象とするプラスミドを含む大腸菌ＤＨ−５αを、アンピシリン含有ＬＢ培地に接種して、３７℃で一晩インキュベートした。サンプルのうちの数個を新しいＬＢ培地（アンピシリン含有）に接種し、得られた培養物を３７℃でＯＤが０．９になるまで増殖させた。温度を４２℃に上げて２４時間以上誘導をかけた。差スペクトルを測定することにより発現中のＰ４５０含量の変化を決定した。
【表３】
2004511255.tif 000004
【００８７】
実施例２：Ｐ４５０ ＢＭ３と比較した高度好熱菌Ｐ４５０の熱安定性の測定
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５、２５ｍＭ）にて異なる温度で３０分間、２種の酵素をインキュベートした。反応混合液を冷やし、Ｐ４５０の濃度を分光光度計により測定した。結果を下記表に示し、グラフを図２に示している。
【表４】
2004511255.tif 000005
【００８８】
試験結果から、本発明の酵素は、各温度で３０分間インキュベートした後の熱安定性は、有意に高かった。
【００８９】
実施例３：バイオ形質転換実験
本発明の高度好熱菌シトクロームＰ４５０に対する内因性酸化還元パートナーを明確に同定することは今まで不可能であった。しかし、例えば、β−および／またはα−イオノンの水酸化において酵素活性を観察した。基質としてβ−イオノンを用いると、主生成物への転換が観察され、α−イオノンは生成混合物へと転換された。合成標準液と比較することにより、β−イオノンの転換主生成物は４−ヒドロキシ−β−イオノンであることが分かった。
【００９０】
寒天プレート培養から接種して高度好熱菌の前培養（５ｍｌ Ｔｔ培地中（酵母抽出液：２ｇ、トリプトン：１ｇ、ＮａＣｌ：１ｇ、脱イオン水で５００ｍｌにする））を振盪（１５０ｒｐｍ）しながら６５℃で２４時間インキュベートして行った。続いて、１００ｍｌのＴｔ培地に前培養液を加えて、振盪しながら６５℃でインキュベートした。
【００９１】
２４時間後、β−イオノンを加えた（培養物中に１０７μｌ／ｍｌ）。培養を７８時間続けた後、遠心により細胞を除去して、上清をジエチルエーテルで抽出した。抽出液をＧＣおよびＴＬＣで分析した。基質を加えていない対照の培養物を同様の条件で調製し、分析した。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、バチルス・メガテリウムＰ４５０ ＢＭ３のヘムドメインを有する、Ｐ４５０高度好熱菌を示す。ヘム結合部位は、２重下線で示している（Ｐ４５０ ＢＭ３のＣｙｓ４００は、補欠分子団の鉄原子と協調するシステイン残基である）。脂肪酸鎖のω−末端と接触する領域は、１重下線で示している。これらの一致の程度は、異なるマークで示す（★は同一残基、：および・は類似残基）。
【図２】
図２は、Ｐ４５０ ＢＭ３および好熱菌種のＰ４５０の熱安定性を判定する試験の比較結果である。鉄含量に対する４００〜５００ｎｍの波長の吸収スペクトルにより熱安定性を決定した。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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