(57)【要約】本発明は、中性エンドペプチダーゼ阻害剤（ＮＥＰｉ）とＮＥＰｉ及びホスホジエステラーゼ５型（ＰＤＥ５）阻害剤の組合せ物の、男性の性機能障害、特にＭＥＤの治療への使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
中性エンドペプチダーゼ阻害剤（ＮＥＰｉ）化合物の、男性の性機能障害を治療する医薬品の製造における使用。
【請求項２】
射精障害、欲望障害、又は男性勃起障害（ＭＥＤ）の治療である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ＭＥＤの治療である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
該医薬品が経口投与される、ＭＥＤの治療である請求項１〜３のいずれか１項に記載のＮＥＰｉ化合物の使用。
【請求項５】
ＮＥＰｉがアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）よりＮＥＰに対して１００倍より高い選択性を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
ＮＥＰｉが式Ｉ：
【化１】
2004502735.tif 000048
［式中：
Ｒ１は、ハロ、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ２−６ヒドロキシアルコキシ、Ｃ１−６アルコキシ（Ｃ１−６アルコキシ）、Ｃ３−７シクロアルキル、Ｃ３−７シクロアルケニル、アリール、アリールオキシ、（Ｃ１−４アルコキシ）アリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、−ＮＲ２Ｒ３、−ＮＲ４ＣＯＲ５、−ＮＲ４ＳＯ２Ｒ５、−ＣＯＮＲ２Ｒ３、−Ｓ（Ｏ）ｐＲ６、−ＣＯＲ７、及び−ＣＯ２（Ｃ１−４アルキル）のリストから選択される、同じであるか又は異なる場合がある、１つ以上の置換基により置換され得るＣ１−６アルキルであるか；又はＲ１は、Ｃ３−７シクロアルキル、アリール、又はヘテロシクリルである（このそれぞれは前記リストからの１つ以上の置換基により置換される場合があり、この置換基は同じであるか又は異なる場合があって、このリストはさらにＣ１−６アルキルを含む）か；
又はＲ１は、Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＲ２Ｒ３、又は−ＮＲ４ＳＯ２Ｒ５であり；
｛ここで、
Ｒ２とＲ３は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、（場合によりヒドロキシ又はＣ１−４アルコキシにより置換される）Ｃ３−７シクロアルキル、アリール、（Ｃ１−４アルキル）アリール、Ｃ１−６アルコキシアリール、又はヘテロシクリルであるか；又はＲ２とＲ３は、それらに付く窒素と一緒に、ピロリジニル、ピペリジノ、モルホリノ、ピペラジニル、又はＮ−（Ｃ１−４アルキル）ピペラジニル基を形成し；
Ｒ４は、Ｈ又はＣ１−４アルキルであり；
Ｒ５は、Ｃ１−４アルキル、ＣＦ３、アリール、（Ｃ１−４アルキル）アリール、（Ｃ１−４アルコキシ）アリール、ヘテロシクリル、Ｃ１−４アルコキシ、又は−ＮＲ２Ｒ３（ここでＲ２とＲ３は、すでに定義された通りである）であり；
Ｒ６は、Ｃ１−４アルキル、アリール、ヘテロシクリル、又は−ＮＲ２Ｒ３（ここでＲ２とＲ３は、すでに定義された通りである）であり；そして、
Ｒ７は、Ｃ１−４アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、アリール、又はヘテロシクリルであり；ｎは０、１、又は２であり；ｐは０、１、２、又は３である｝；
−（ＣＨ２）ｎ−連結は、場合により、Ｃ１−４アルキル、１つ以上のフルオロ基又はフェニルで置換されるＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシ（Ｃ１−３アルキル）、Ｃ３−７シクロアルキル、アリール、又はヘテロシクリルにより置換され；
Ｙは、基：
【化２】
2004502735.tif 000049
｛式中：Ａは、−（ＣＨ２）ｑ−（ここでｑは、１、２、３、又は４である）であり、飽和又は不飽和であり得る３〜７員の炭素環式環を完成させ；Ｒ８は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、−ＣＨ２ＯＨ、フェニル、フェニル（Ｃ１−４アルキル）、又はＣＯＮＲ１１Ｒ１２であり；Ｒ９とＲ１０は、それぞれ独立して、Ｈ、−ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、Ｃ１−６アルキル、（場合によりＣ１−４アルキル、ハロ、又はＣ１−４アルコキシにより置換される）フェニル、又はフェニル（Ｃ１−４アルキル）（ここで該フェニル基は、場合により、Ｃ１−４アルキル、ハロ、又はＣ１−４アルコキシにより置換される）であるか、又はＲ９とＲ１０は、一緒にジオキソランを形成し；同じであるか又は異なる場合があるＲ１１とＲ１２は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、Ｒ１３、又はＳ（Ｏ）ｒＲ１３（ここで、ｒは０、１、又は２であり、Ｒ１３は、場合によりＣ１−４アルキルにより置換されるフェニルであるか又はフェニルＣ１−４アルキルであって、ここで該フェニルは、場合によりＣ１−４アルキルにより置換される）である｝であるか；又は
Ｙは、基：−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２（ここでＲ１１とＲ１２はすでに定義された通りであるが、Ｒ１１とＲ１２がともにＨであることはない）であるか；又は
Ｙは、基：
【化３】
2004502735.tif 000050
｛式中：Ｒ１４は、Ｈ、−ＣＨ２ＯＨ、又はＣＯＮＲ１１Ｒ１２（ここでＲ１１とＲ１２はすでに定義された通りである）であり；存在する場合、Ｒ１５は、他のＲ１５と同じであるか又は異なる場合があり、ＯＨ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ハロ、又はＣＦ３であり；ｔは、０、１、２、３、又は４であり；Ｒ１６とＲ１７は、独立して、Ｈ又はＣ１−４アルキルである｝であるか；又は
Ｙは、基：
【化４】
2004502735.tif 000051
｛式中：Ｂ、Ｄ、Ｅ、又はＦの１又は２つは窒素であり、他は炭素であり；そして、Ｒ１４〜Ｒ１７とｔはすでに定義された通りである｝であるか；又は
Ｙは、場合により置換される５〜７員のヘテロ環式環｛これは、飽和しているか、不飽和であるか、又は芳香族であり得て、窒素、酸素、又はイオウと、場合により、１、２、又は３つのさらなる窒素原子を環中に含有し、場合によりベンゾ縮合され、そして、場合により：
Ｃ１−６アルコキシ；ヒドロキシ；オキソ；アミノ；モノ若しくはジ−（Ｃ１−４アルキル）アミノ；Ｃ１−４アルカノイルアミノ；又は
リスト：Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６ハロアルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、ハロゲン、Ｃ３−７シクロアルキル、ヘテロシクリル、又はフェニルから選択される、同じであるか又は異なる場合がある、１つ以上の置換基により置換され得るＣ１−６アルキル；又は
Ｃ３−７シクロアルキル、アリール、又はヘテロシクリル（このいずれも、リスト：Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６ハロアルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、ハロゲン、Ｃ３−７シクロアルキル、ヘテロシクリル、又はフェニルから選択される、同じであるか又は異なる場合がある、１つ以上の置換基により置換され得る）により置換され得て；
ここで、該ヘテロ環式環にオキソ置換がある場合、その環は１又は２つの窒素原子だけを含有し、該オキソ置換はこの環の窒素原子に隣接している｝であるか；又はＹは、−ＮＲ１８Ｓ（Ｏ）ｕＲ１９（ここでＲ１８は、Ｈ又はＣ１−４アルキルであり；Ｒ１９は、アリール、アリールＣ１−４アルキル、又はヘテロシクリル（好ましくは、ピリジル）であり；そしてｕは、０、１、２、又は３である）である］の化合物（又はその製剤的に許容される塩、溶媒和物、又はプロドラッグ）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
ＮＥＰｉが：
２−［（１−［［（１−ベンジル−６−オキソ−１，６−ジヒドロ−３−ピリジニル）アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）−メチル］−４−メトキシブタン酸；
２−｛［１−（｛［３−（２−オキソ−１−ピロリジニル）プロピル］アミノ｝カルボニル）シクロペンチル］−メチル｝−４−フェニルブタン酸；
（＋）−２−｛［１−（｛［２−（ヒドロキシメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−２−イル］アミノ｝カルボニル）シクロペンチル］メチル｝−４−フェニルブタン酸；
２−［（１−｛［（５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）メチル］−４−フェニルブタン酸；
ｃｉｓ−３−（２−メトキシエトキシ）−２−［（１−［｛（４−｛［（フェニルスルホニル）アミノ］カルボニル｝シクロヘキシル）−アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）メチル］プロパン酸；
（＋）−２−｛［１−（｛［２−（ヒドロキシメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−２−イル］アミノ｝カルボニル）シクロペンチル］メチル｝ペンタン酸；
（２Ｒ）−２−［（１−｛［（５−エチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）メチル］ペンタン酸、又は（−）−２−［（１−｛［（５−エチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）メチル］ペンタン酸；
（２Ｓ）−２−［（１−｛［（５−エチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）メチル］ペンタン酸、又は（＋）−２−［（１−｛［（５−エチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）メチル］ペンタン酸；及び
（Ｓ）−２−｛［１−（｛［２−（ヒドロキシメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−２−イル］アミノ｝カルボニル）シクロペンチル］メチル｝−４−メトキシブタン酸からなる群から選択される、請求項６に記載のＮＥＰｉの使用。
【請求項８】
請求項１〜７に記載のＮＥＰｉと；
１つ以上の天然に存在するか又は合成のプロスタグランジン又はそのエステル；
及び／又は、
１つ以上のα−アドレナリン作動性受容体拮抗化合物；及び／又は、
１つ以上のＮＯ−ドナー（ＮＯ−作動薬）化合物；及び／又は、
１つ以上のカリウムチャネルオープナー若しくはモジュレーター；及び／又は、
１つ以上のドーパミン作用剤；及び／又は、
１つ以上の血管拡張剤；及び／又は、
１つ以上のトロンボキサンＡ２作動薬；及び／又は、
１つ以上の麦角アルカロイド；及び／又は、
ナトリウム利尿因子、特に心房性ナトリウム利尿因子の作用をモジュレートする、１つ以上の化合物；及び／又は、
１つ以上のアンジオテンシン受容体拮抗薬；及び／又は、
ＮＯ−シンターゼの１つ以上の基質；及び／又は、
１つ以上のカルシウムチャネルブロッカー；及び／又は、
１つ以上のエンドセリン受容体拮抗薬とエンドセリン変換酵素阻害剤；及び／又は、
スタチン及びフィブラートのような、１つ以上のコレステロール低下剤；及び／又は、
１つ以上の抗血小板剤及び抗血栓剤；及び／又は、
１つ以上のインスリン増感剤；及び／又は、
１つ以上のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤；及び／又は、
１つ以上のエストロゲン受容体モジュレーター、エストロゲン作動薬、又はエストロゲン拮抗薬；及び／又は、
１つ以上のＰＤＥ阻害剤、より特定するとＰＤＥ２、４、５、７、又は８阻害剤；及び／又は、
１つ以上のＮＰＹ（神経ペプチドＹ）阻害剤、より特定するとＮＰＹ１若しくはＮＰＹ５阻害剤；及び／又は、
１つ以上の血管作動性腸管タンパク質（ＶＩＰ）、ＶＩＰ模擬体、ＶＩＰ類似体、ＶＩＰ受容体作動薬、又はＶＩＰフラグメント、又はＶＩＰと組合せたα−アドレナリン受容体拮抗薬；及び／又は、
１つ以上のメラノコルチン受容体作動薬若しくはモジュレーター、又はメラノコルチンエンハンサー；及び／又は、
１つ以上のセロトニン受容体作動薬、拮抗薬、又はモジュレーター；及び／又は、
１つ以上のテストステロン置換剤、ジヒドロテストステロン、又はテストステロンインプラント；及び／又は、
１つ以上のエストロゲン、エストロゲン及びメドロキシプロゲステロン、又は酢酸メドロキシプロゲステロン（ＭＰＡ）（即ち、組合せ物として）；及び／又は、
ノルアドレナリン、ドーパミン、及び／又はセロトニンの運搬体の１つ以上のモジュレーター；及び／又は、
１つ以上のプリン作動性受容体作動薬及び／又はモジュレーター；及び／又は、１つ以上のニューロキニン（ＮＫ）受容体拮抗薬；及び／又は、
１つ以上のオピオイド受容体作動薬、拮抗薬、又はモジュレーター、好ましくはＯＲＬ−１受容体の作動薬；及び／又は、
１つ以上のオキシトシン／バソプレッシン受容体作動薬若しくはモジュレーター；及び／又は、
１つ以上のカンナビノイド受容体モジュレーターの組合せを含んでなる医薬組合せ物の使用。
【請求項９】
前記組合せ物が男性の性機能障害を治療するためのＮＥＰｉとＰＤＥ５ｉの組合せ物である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
ＭＥＤの治療のためである、請求項９に記載の組合せ物の使用。
【請求項１１】
経口投与のために適用される、請求項８〜１０に記載の組合わせ物の使用。
【請求項１２】
ＰＤＥ５ｉが：
１−［［３−（６，７−ジヒドロ−１−メチル−７−オキソ−３−プロピル−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）−４−エトキシフェニル］スルホニル］−４−メチルピペラジンとしても知られる、５−［２−エトキシ−５−（４−メチル−１−ピペラジニルスルホニル）フェニル］−１−メチル−３−ｎ−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン（シルデナフィル）；
５−（２−エトキシ−５−モルホリノアセチルフェニル）−１−メチル−３−ｎ−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；
３−エチル−５−［５−（４−エチルピペラジン−１−イルスルホニル）−２−ｎ−プロポキシフェニル］−２−（ピリジン−２−イル）メチル−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；
３−エチル−５−［５−（４−エチルピペラジン−１−イルスルホニル）−２−（２−メトキシエトキシ）ピリジン−３−イル］−２−（ピリジン−２−イル）メチル−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；
３−エチル−５−｛５−［４−エチルピペラジン−１−イルスルホニル］−２−（［（１Ｒ）−２−メトキシ−１−メチルエチル］オキシ）ピリジン−３−イル｝−２−メチル−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オンとしても知られる、（＋）−３−エチル−５−［５−（４−エチルピペラジン−１−イルスルホニル）−２−（２−メトキシ−１（Ｒ）−メチルエトキシ）ピリジン−３−イル］−２−メチル−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；
１−｛６−エトキシ−５−［３−エチル−６，７−ジヒドロ−２−（２−メトキシエチル）−７−オキソ−２Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５−イル］−３−ピリジルスルホニル｝−４−エチルピペラジンとしても知られる、５−［２−エトキシ−５−（４−エチルピペラジン−１−イルスルホニル）ピリジン−３−イル］−３−エチル−２−［２−メトキシエチル］−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；
５−［２−ｉｓｏ−ブトキシ−５−（４−エチルピペラジン−１−イルスルホニル）ピリジン−３−イル］−３−エチル−２−（１−メチルピペリジン−４−イル）−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；
５−［２−エトキシ−５−（４−エチルピペラジン−１−イルスルホニル）ピリジン−３−イル］−３−エチル−２−フェニル−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；
５−（５−アセチル−２−プロポキシ−３−ピリジニル）−３−エチル−２−（１−イソプロピル−３−アゼチジニル）−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；
５−（５−アセチル−２−ブトキシ−３−ピリジニル）−３−エチル−２−（１−エチル−３−アゼチジニル）−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；
（６Ｒ，１２ａＲ）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−２−メチル−６−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−ピラジノ［２’，１’：６，１］ピリド［３，４−ｂ］インド−ル−１，４−ジオン（ＩＣ−３５１）；
１−［［３−（３，４−ジヒドロ−５−メチル−４−オキソ−７−プロピルイミダゾ［５，１−ｆ］−ａｓ−トリアジン−２−イル）−４−エトキシフェニル］スルホニル］−４−エチルピペラジンとしても知られる、２−［２−エトキシ−５−（４−エチル−ピペラジン−１−イル−スルホニル）−フェニル］−５−メチル−７−プロピル−３Ｈ−イミダゾ［５，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−４−オン（バルデナフィル）；及び
国際公開特許出願ＷＯ９３／０７１２４（ＥＩＳＡＩ）の実施例１１の化合物からなる群から選択される、請求項９〜１１に記載の使用。
【請求項１３】
ＰＤＥ５ｉがシルデナフィルである、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
ＮＥＰｉ及びＰＤＥ５ｉを含んでなる、ＭＥＤの治療のための医薬組成物。
【請求項１５】
ＭＥＤの治療のために適用される第一成分及び第二成分を含んでなるキットであって、第一成分は請求項１〜７のいずれか１項に記載のＮＥＰｉを含み、第二成分は請求項９〜１３のいずれか１項に記載のＰＤＥ５ｉを含む、前記キット。
【請求項１６】
経口投与のために適用される医薬組合せ物の、男性の性機能障害を治療するための医薬品の製造における使用であって、前記組合せ物は、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）に対する１００ｎＭ未満のＩＣ５０とアンジオテンシン変換酵素よりＮＥＰに対して１００倍より高い選択性を有するＮＥＰ阻害剤と、ホスホジエステラーゼ５型酵素（ＰＤＥ５）に対する１００ｎＭ未満のＩＣ５０とＰＤＥ３よりＰＤＥ５に対して１００倍より高い選択性を有するＰＤＥ５阻害剤を含んでなる、前記使用。
【請求項１７】
有効量の中性エンドペプチダーゼ阻害剤を患者へ投与することを含んでなる、男性の性機能障害を治療する方法。
【請求項１８】
有効量の中性エンドペプチダーゼ阻害剤及びホスホジエステラーゼ５型（ＰＤＥ５）阻害剤を患者へ投与することを含んでなる、男性の性機能障害を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、男性の性機能障害、特に男性勃起障害（ＭＥＤ）の治療に使用する化合物及び医薬組成物に関する。本明細書で言及される男性の性機能には、早漏のような射精障害、（オルガスムを達成し得ない）不感症、性的欲求低下障害（セックスへの関心の不足）のような欲望障害が含まれることを意味する。
【０００２】
本発明は、ＭＥＤの治療の方法にも関する。
本発明は、本発明の医薬組成物の一部を形成し、男性の性機能障害、特にＭＥＤの治療に有用である本発明の化合物を候補選択するためのアッセイにも関する。
【０００３】
便宜上、以下の本文に使用される略号のリストを末尾に提示する。
性機能障害
性機能障害（ＳＤ）は、男性と女性の両方が罹患し得る、重大な臨床問題である。ＳＤの原因には、器質性と心因性の両方があり得る。ＳＤの器質性の側面は、典型的には、高血圧若しくは糖尿病に関連した疾患のような血管系の基礎疾患、処方薬、及び／又はうつ病のような精神系疾患により引き起こされる。心因性の要因には、恐怖、行為への不安、及び個人間の葛藤が含まれる。ＳＤは性行為を妨げ、自尊心を失わせ、人間関係を壊すことによって悩みを招く。臨床では、ＳＤ障害は、女性の性機能障害（ＦＳＤ）と男性の性機能障害（ＭＳＤ）に分けられている（Ｍｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ １９９９）。ＦＳＤの最良の定義は、女性が性的発現において満足を見出すことが困難であるか又はできないことである。男性の性機能障害（ＭＳＤ）は、一般に、男性勃起障害（ＭＥＤ）としても知られている、勃起障害に関連づけられている（Ｂｅｎｅｔ ｅｔ ａｌ １９９４）。
【０００４】
男性勃起障害（ＭＥＤ）
男性勃起障害（ＭＥＤ）に罹患し得る人間がいることが知られている。
男性勃起障害（ＭＥＤ）は、「満足のゆく性行為のために陰茎勃起を達成する、及び／又は維持することができないこと」（性的不能に関するＮＩＨの合意形成パネル、１９９３）と定義されている。
【０００５】
あらゆる程度（軽症、中等症、及び完全な性的不能）の勃起障害（ＥＤ）の罹患率は、４０〜７０歳代の男性で５２％であり、７０歳をすぎた男性でより高率であると推定されている（Ｍｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ １９９９）。この病態は、患者とそのパートナーの生命の質に重大な負の影響を及ぼし、しばしば不安と緊張を高め、それがうつ病や自尊心の低下をもたらす。２０年前、ＭＥＤは主に心因性の障害とみなされていた（Ｂｅｎｅｔ ｅｔ ａｌ １９９４）が、今日では、大多数の患者で器質性の原因が根底にあることが知られている。このため、正常な陰茎勃起の機序とＭＥＤの病態生理を同定することに多大な進歩がなされてきた。
【０００６】
陰茎勃起は、陰茎の海綿体平滑筋及び血管構造の、収縮及び弛緩のバランスに依存する血行力学的な現象である（Ｌｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ １９９３）。陰茎海綿体（ｃｏｒｐｕｓ ｃａｖｅｒｎｏｓａｌ）平滑筋は、本明細書では、海綿体平滑筋、又は複数の意味で、海綿体とも言われる。海綿体平滑筋の弛緩は海綿体の小柱空間への血流増加をもたらし、それが周囲粘膜に対して拡張し、排出静脈を圧迫することを引き起こす。これにより血圧が大いに上昇し、勃起をもたらす（Ｎａｙｌｏｒ， １９９８）。
【０００７】
勃起プロセスの間に起こる変化は複雑で、末梢及び中枢の神経系と内分泌系が関与する、高度に調整されたコントロールが必要とされる。海綿体平滑筋の収縮は、シナプス後α１アドレナリン受容体の活性化を介した交感神経ノルアドレナリン作動性の神経支配により調節される。ＭＥＤは、陰茎海綿体の内因性平滑筋の緊張増加に関連づけられる場合がある。しかしながら、海綿体平滑筋の弛緩プロセスは、非アドレナリン作動性、非コリン作動性（ＮＡＮＣ）の神経伝達により一部仲介される。陰茎中には、ＮＯ以外に、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）や血管作動性腸管タンパク質（ＶＩＰ）のような、他の数多くのＮＡＮＣ神経伝達物質が見出されている。この弛緩を仲介する原因となる主要な弛緩因子は、一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）によりＬ−アルギニンから合成される、酸化窒素（ＮＯ）である（Ｔａｕｂ ｅｔ ａｌ １９９３； Ｃｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ １９９８）。海綿体平滑筋の緊張を低下させると、ＮＯが陰茎海綿体の弛緩を引き起こすことを促進する可能性があると考えられている。男性の性的興奮の間には、ＮＯがニューロン及び内皮から放出され、平滑筋細胞及び内皮中に局在化する可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）へ結合してこれを活性化し、細胞内サイクリックグアノシン３’，５’−一リン酸（ｃＧＭＰ）レベルの上昇をもたらす。このｃＧＭＰの上昇が、プロテインキナーゼＧの活性化が関与すると考えられている未知の機序（おそらくは、Ｃａ２＋ポンプ及びＣａ２＋活性化Ｋ＋チャネルの活性化による；Ｃｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９８）を介した、細胞内カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）の低下により、海面体の弛緩をもたらす。
【０００８】
クエン酸シルデナフィル（Ｖｉａｇｒａ［バイアグラ］ＴＭとしても知られている）は、最近、ファイザー社によりＭＥＤに対する最初の経口治療薬として開発された。シルデナフィルは、ホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）を選択的に阻害することによりｃＧＭＰの５’ＧＭＰへの加水分解を制限することによって、陰茎海綿体におけるｃＧＭＰの分解を阻害し（Ｂｏｏｌｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９６： Ｊｅｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７）、それによりｃＧＭＰの細胞内濃度を高め、海綿体平滑筋の弛緩を促進するように作用する。
【０００９】
現在、市販されている他のＭＥＤ治療薬は、プロスタグランジンをベースとする化合物、即ち、尿道内（Ｖｉｖｕｓ社からＭｕｓｅＴＭとして販売されている）か又は細針注射により（ファルマシア・アンド・アップジョン社からＣａｖｅｒｊｅｃｔＴＭとして販売されている）投与され得るアプロスタジルを用いた治療のように、不便である、及び／又は侵襲性であるかのいずれかである。他の治療には、真空狭窄器具、血管作動薬の注射、又は陰茎プロテーゼの埋込みが含まれる（Ｍｏｎｔａｇｕｅ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。注射可能な血管作動薬は高い効力を示すが、陰茎疼痛、線維症、及び持続勃起のような副作用がよく起こるし、注射療法は経口療法ほど便利ではないので、シルデナフィルが今日の市場で最も好ましい療法となっている。
【００１０】
参考文献
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発明の要約
本発明の独創的な知見は、性機能障害、特にＭＥＤに罹患している男性を中性エンドペプチダーゼ阻害剤（ＮＥＰｉ）の使用で治療し得ることである。驚くべきことに、出願人はまた、中性エンドペプチダーゼ阻害剤（以下、ＮＥＰｉと呼ぶ）を用いたＮＥＰ　ＥＣ３．４．２４．１１の阻害が神経刺激性の勃起プロセスを有意に亢進させることも見出した。
【００１１】
本発明によれば、男性の性機能障害、特にＭＥＤの治療への中性エンドペプチダーゼＥＣ３．４．２４．１１の阻害剤の使用が提供される。
好ましくは、本発明による男性の性機能障害、特にＭＥＤの治療に使用されるＮＥＰ阻害剤は、１００ナノモル／リットル未満、より好ましくは、５０ナノモル／リットル未満のＩＣ５０を有する。
【００１２】
好ましくは、本発明によるＮＥＰ阻害剤は、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）よりＮＥＰに対して１００倍より高い、より好ましくは３００倍より高い選択性を有する。このことにより、ＮＥＰｉが全身的に（例、経口）投与される場合の心臓血管系の事象（例、血圧の低下）の見込みが抑えられる。好ましくは、ＮＥＰｉはまた、エンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）より（ＮＥＰに対して）１００倍より高い選択性を有する。
【００１３】
さらに、ＭＥＤを治療する医薬品の製造におけるＮＥＰｉの使用が提供される。
陰茎又は海綿体におけるＮＥＰ　ＥＣ３．４．２４．１１の発現、又は勃起の機序／プロセスにおけるその機能役割については文書化された証拠がない。
【００１４】
また、陰茎又は海綿体に対する、又は他には、勃起の機序／プロセスにおけるＮＥＰ阻害剤の機能的若しくは生化学的効果についても文書化された証拠がない。
【００１５】
特に、本発明は、ＭＥＤの治療に使用のＮＥＰｉ化合物を提供する。
本発明が有利であるのは、それが正常な性的興奮反応（即ち、陰茎の勃起をもたらす陰茎血流の増加）を回復させる手段を提供するためである。従って、本発明は、正常な性的興奮反応を回復させるか又は高めるための手段を提供する。
【００１６】
いくつかのＮＥＰｉ化合物を「実験の項」（以下参照）に提示される教示に従って製造した。それらは薬剤として試験され、内因性の勃起プロセスを高めるのに有用であり、それにより、ＭＥＤの治療に有用であることが見出された。このＮＥＰｉに関する実験データのいくつかを「実験の項」（以下参照）に提示する。
【００１７】
特定の理論に縛られずに言えば、本明細書では、ＮＥＰ　ＥＣ３．４．２４．１１を阻害することによって、性的興奮の間に放出される、他のニューロン放出性の血管作動剤、最もあり得るのは血管作動性腸管タンパク質（ＶＩＰ）が高められることが提唱される。ＮＥＰｉの使用は、性的刺激の間に放出され、海綿体の血流、従って海綿体圧（ｉｎｔｒａｃａｖｅｒｎｏｓａｌ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を増加させることにより勃起の機序を高める、最もあり得る神経ペプチド（ＶＩＰ）の効果を高めると考えられる。
【００１８】
さらに提唱されるのは、本発明による化合物の使用が、非ＮＯ依存性のＮＡＮＣ経路を亢進させることを介して、ＭＥＤを治療し、陰茎におけるニトロ作動性（ｎｉｔｒｅｇｉｃ）シグナル伝達を高めるか又は促進するように作用することである。
【００１９】
驚くべきことに、出願人はまた、ＮＥＰｉを用いたＮＥＰの阻害が勃起プロセスのＰＤＥ５阻害剤仲介性の亢進を有意に高めることも見出した。
ＮＥＰは身体全体に存在しているので、ＮＥＰｉが全身的に投与され、耐えられない（有害な）副作用を引き起こすことなく男性の性器において治療反応を達成し得ることはきわめて予想外である。このように、以下の ｉｎ ｖｉｖｏ（ウサギ）試験結果では、（特に上記のような選択性を有する）ＮＥＰｉ単独とＮＥＰｉ／ＰＤＥ５の組合せ物を全身投与すると、（骨盤神経刺激により模倣される）性的興奮時に、重大な降圧若しくは昇圧の効果を引き起こすことのような、心臓血管系パラメータに悪影響を及ぼすことなく、性器の血流が増加した（以下の図６を参照のこと）。
【００２０】
従って、本発明の好ましい側面によれば、男性の性機能障害、特にＭＥＤを治療するための医薬品の製造における、全身投与（好ましくは、経口、例えば、嚥下可能な錠剤若しくはカプセル剤、又は舌下若しくは頬内の製剤）によるＮＥＰｉの使用が提供される。
【００２１】
従って、さらなる態様によれば、本発明は、男性の性機能障害、特にＭＥＤの治療への１つ以上のＮＥＰｉと１つ以上のＰＤＥ５ｉの使用を提供する。本発明による他の組合せ物は以下に開示される。
【００２２】
好ましくは、前記組合せ治療は、１つ以上のＮＥＰｉと１つ以上のＰＤＥ５ｉとの組合せ物を含む。より好ましくは、そのような組合せは、ＭＥＤの治療のために１つ以上のＮＥＰｉを１つ以上のＰＤＥ５ｉと併用投与することを提供する。
【００２３】
本明細書できわめて好ましいのは、１つ以上のＮＥＰｉを１つ以上のＰＤＥ５ｉとともに含んでなる医薬組成物のＭＥＤの治療への使用である。
我々の結果は、驚くべきことに、この組合せ物が、血圧をほとんど低下させずに、全身的に（好ましくは、経口、例えば、嚥下可能な錠剤若しくはカプセル剤、又は舌下若しくは頬内の製剤で）投与され得ること、従って、この組合せ物を使用して男性の性機能障害の全身治療が可能であることを示す。
【００２４】
本発明によるＭＥＤの治療への医薬組成物の使用に特に好ましいのは、強力かつ選択的なＮＥＰｉの強力かつ選択的なＰＤＥ５ｉとの組合せである。これらに好ましい数値（ｖａｌｕｅｓ）は、この数値を決定するためのスクリーニング方法とともに以下に示される。
【００２５】
本明細書に好ましい態様では、前記ＮＥＰｉ及びＰＤＥ５ｉの複合（ｃｏｍｂｉｎｅｄ）投与は、併用である。本明細書で定義される併用投与には、ＰＤＥ５ｉ及びＮＥＰｉの同時（分離）投与、同時複合投与、分離投与、複合投与、連続投与、及び共製剤化複合投与が含まれる。
【００２６】
上記に詳述したように、本発明はさらに、ＰＤＥ５ｉ及びＮＥＰｉの併用投与が、ＰＤＥ５だけに関連したＭＥＤ療法により得られるものと比較して、効果の増加をもたらし得ることを提唱する。その例と考察については、「試験結果の項」、実施例４及び５を参照のこと。
【００２７】
本発明のさらなる側面によれば、本明細書では、ＮＥＰｉ及びＰＤＥ５ｉの併用適用がＰＤＥ５ｉ単独により達成可能なものより速い作用の開始を提供し得ることが提唱される。換言すると、本発明は、ＭＥＤの治療への速効性の組成物の使用を追加的に提供する。本明細書で定義され、以下に例示されるような速効性のＭＥＤ組成物とは、この組成物（ＮＥＰｉ及びＰＤＥ５ｉ）の静脈内投与の後で、海綿体圧に対する最大効果への時間がＰＤＥ５ｉ単独の同一用量で得られる同等の時間に対して減少することを意味する。この例と考察については、「試験結果の項」、実施例５を参照のこと。
【００２８】
従って、本発明のさらなる側面は、ＭＥＤの治療に使用されるＮＥＰｉ及びＰＤＥ５ｉを含んでなる速効性の医薬組成物を提供する。
本明細書では、ＮＥＰｉ／ＰＤＥ５ｉ組合せ物の使用がＰＤＥ５ｉの効力を亢進させる可能性があり、それにより特定の効能に必要とされるＰＤＥ５阻害剤の用量の低下を可能にすることがさらに提唱される。本明細書で定義される、ＮＥＰｉと減量されたＰＤＥ５ｉを含んでなる製剤とは、本発明によるＮＥＰｉの有効量と組合せた場合、特有の応答をもたらすのに、ＰＤＥ５ｉ単独の必要量より減量したＰＤＥ５ｉが必要とされることを意味する。ＭＥＤの治療へのそのような減量した組成物は、ＰＤＥ５の潜在的な亜硝酸塩との相互作用を抑制する。さらに、例えば軽症ＭＥＤである男性のような特別な患者群にとって望ましい場合がある。このことは、実施例４及び５に例示されるように、ＰＤＥ５阻害剤（例、シルデナフィル）単独に対して不十分に応答する患者に対しては特に有利であり得る。
【００２９】
患者群
軽症〜中等症ＭＥＤの患者はＮＥＰｉを用いた治療から利益を得るはずであり、重症ＭＥＤの患者も応答する可能性がある。しかしながら、初期の研究は、軽症、中等症、及び重症ＭＥＤの患者の応答率が、ＮＥＰ／ＰＤＥ５阻害剤の組合せ物でより高くなるであろうことを示唆する。軽症、中等症、及び重症ＭＥＤとは当業者に知られている用語であるが、その手引きは Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ １５１， ５４−６１ （１９９４年１月）に見出し得る。
【００３０】
初期の研究は、以下に示されるＭＥＤ患者群がＮＥＰｉ及びＰＤＥ５ｉ（又は以下に説明される他の組合せ）を用いた治療から利益を得ることを示唆する。Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｎｄｒｏｌｏｇｙ ｖｏｌ ２３， ｎｏ． ４， ｐ７７３−７８２ と Ｉ． Ｅａｒｄｌｅｙ 及び Ｋ． Ｓｅｔｈｉａ 著『勃起不全：最新の研究及び管理（Ｅｒｅｃｔｉｌｅ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ−Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ）』（Ｍｏｓｂｙ−Ｗｏｌｆｅ 刊）の第３章により詳しく記載されているこれらの患者群は、以下の通りである：心因性、内分泌性、神経性、動脈因性、薬物起因性の性機能障害（乳腺刺激性）と海綿体の要因、特に静脈性の原因に関連した性機能障害。
【００３１】
ＮＥＰ　ＥＣ３．４．２４．１１
エンケファリナーゼまたはネプリリシンとしても知られているＮＥＰ　ＥＣ３．４．２４．１１は、亜鉛依存性の中性エンドペプチダーゼである。この酵素は、いくつかの生理活性オリゴペプチドの分解に関与し、疎水性アミノ酸残基のアミノ側でペプチド結合を開裂させる（Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７ に概説されている）。ＮＥＰにより代謝される重要な神経放出性の生理活性剤若しくは神経ペプチドには、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）のようなナトリウム利尿ペプチド、並びに脳ナトリウム利尿ペプチドとＣ型ナトリウム利尿ペプチド、ボンベシン、ブラジキニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、エンドセリン、エンケファリン、ニューロテンシン、サブスタンスＰ、及び血管作動性腸管ペプチドが含まれる。これらペプチドのいくつかは、強力な血管拡張及び神経ホルモンの機能、利尿及びナトリウム利尿の活性を有するか、又は行動効果に仲介する。
【００３２】
ＮＥＰに関する背景教示が ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｍ／ｓｅａｒｃｈｏｍｉｍ． ｈｔｍ． で Ｖｉｃｔｏｒ Ａ． ＭｃＫｕｓｉｃｋ ｅｔ ａｌ により提示されている。ＮＥＰに関する以下の情報をその情報源から抜粋する。
【００３３】
「共通急性リンパ球性白血病抗原（ＣＡＬＬＡ）は、ヒト急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）の診断において重要な細胞表面マーカーである。それは、プレＢ表現型の白血病細胞上に存在し、ＡＬＬ症例の８５％に発現する。しかしながら、ＣＡＬＬＡは白血病細胞に限られるのではなく、多種多様な正常組織に見出される。ＣＡＬＬＡは、特に腎臓に豊富な糖タンパク質であり、そこでは、近位尿細管の刷子縁と糸球体上皮に存在している。Ｌｅｔａｒｔｅ ｅｔ ａｌ． （１９８８） は、ＣＡＬＬＡをコード化するｃＤＮＡをクローン化し、このｃＤＮＡ配列から演繹されるアミノ酸配列が、エンケファリナーゼとしても知られているヒト膜結合型中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ；ＥＣ３．４．２４．１１）のそれと同一であることを示した。ＮＥＰは、疎水性残基のアミノ側でペプチドを開裂し、グルカゴン、エンケファリン、サブスタンスＰ、ニューロテンシン、オキシトシン、及びブラジキニンを含むいくつかのペプチドホルモンを不活性化する。ｃＤＮＡトランスフェクション分析により、Ｓｈｉｐｐ ｅｔ ａｌ． （１９８９） は、ＣＡＬＬＡがかつてエンケファリナーゼと呼ばれたタイプの機能性中性エンドペプチダーゼであることを確かめた。Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８９） は、１００ｋＤのＩＩ型膜貫通糖タンパク質をコードするＣＡＬＬＡ遺伝子が４５ｋｂより大きい単一コピーで存在し、細胞表面ＣＡＬＬＡを発現する悪性腫瘍において再配列されないことを示した。この遺伝子は、体細胞ハイブリッドの試験によりヒト第３染色体へ定位され、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションによりその位置が３ｑ２１−ｑ２７へ特定された。Ｔｒａｎ−Ｐａｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８９） はまた、ヒト−げっ歯類の体細胞ハイブリッドに由来するＤＮＡのサザンブロット分析により、この遺伝子を第３染色体へ帰属させた。Ｄ’Ａｄａｍｉｏ ｅｔ ａｌ． （１９８９） は、ＣＡＬＬＡ遺伝子が８０ｋｂより多くを網羅し、２４のエクソンからなることを示した。」
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発明の詳細な説明
１つの側面では、本発明は、男性の性機能障害、特にＭＥＤの治療における使用への（又は、使用されるときの）ＮＥＰｉ化合物と、ＮＥＰｉ化合物を包含する医薬組成物、そしてＮＥＰｉ及びＰＤＥ５ｉを含んでなる医薬組合せ物に関する。前記医薬組成物において、ＮＥＰｉ（及び、存在するならば、ＰＤＥ５ｉ、及び／又は追加の薬剤）は、場合により製剤的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤と混合される。ここで、この組成物は、（本明細書に示される他の組成物と同じように）男性の性機能障害、特にＭＥＤの治療における後続の使用のために包装され得る。
【００３４】
もう１つの側面では、本発明は、男性の性機能障害、特にＭＥＤの治療への（医薬組成物のような）医薬品の製造における薬剤の使用に関する。
さらなる側面では、本発明は、男性の性機能障害、特にＭＥＤに罹患している男性を治療する方法に関し；この方法は、陰茎海綿体における内因性勃起プロセスを亢進させることが可能であるＮＥＰｉを当該男性へデリバリーすることを含んでなり；ここでＮＥＰｉは上記に定義されるような内因性勃起プロセスを亢進させるだけの量で存在し；ここでＮＥＰｉは、場合により、製剤的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤と混合され；そしてここで前記ＮＥＰｉは本明細書に定義される通りである。
【００３５】
さらなる側面では、本発明は、男性の性機能障害、特にＭＥＤを治療するために使用され得る薬剤（以下、ＮＥＰｉと呼ぶ）を同定するためのアッセイ法に関し、このアッセイ法は：試験薬剤が内因性勃起プロセスを直に亢進させ得るかを決定する工程を含んでなり；ここで前記亢進は、本明細書で定義されるような試験薬剤の存在下での海綿体圧（ＩＣＰ）（及び／又は海綿体血流）の増強として定義され；試験薬剤によるそのような増強は、試験薬剤が男性の性機能障害、特にＭＥＤの治療に有用であり得ることを示唆し、そしてここで前記試験薬剤はＮＥＰｉである。
【００３６】
例を挙げると、本発明は、男性の性機能障害、特にＭＥＤを治療するために内因性勃起プロセスを直に亢進させ得る薬剤を同定するアッセイ法に関し、このアッセイ法は：ペプチド（好ましくは、蛍光標識ペプチド）の代謝分解を阻害することが可能な部分を有する試験薬剤を接触させる工程（前記ペプチドは通常ＮＥＰにより代謝される）；及び、一定時間の後で残存するペプチドの活性及び／又はレベルを（例えば、蛍光測定分析により）測定する工程を含んでなり；ここで（例えば）蛍光により測定されるペプチドのレベルの変化は試験薬剤の効力（ＩＣ５０）を示唆し、試験薬剤が男性の性機能障害、特にＭＥＤの治療に有用であり得ることを示唆し；そしてここで前記試験薬剤はＮＥＰｉである。
【００３７】
さらなる側面では、本発明は、（ａ）本発明によるアッセイを実施する工程；（ｂ）内因性勃起プロセスを直に亢進させ得る１つ以上の薬剤を同定する工程；及び（ｃ）その１つ以上の同定された薬剤のある量を製造する工程を含んでなる方法に関し；そしてここで前記薬剤はＮＥＰｉである。
【００３８】
この側面では、工程（ｂ）で同定された薬剤は、例えば活性を最大化するように修飾され、次いで工程（ａ）を繰り返してよい。これらの工程は、所望される活性若しくは薬物動態プロフィールが達成されるまで繰り返してよい。
【００３９】
従って、さらなる側面では、本発明は：（ａ１）本発明によるアッセイを実施する工程；（ｂ１）内因性勃起プロセスを直に亢進させ得る１つ以上の薬剤を同定する工程；（ｂ２）前記同定された薬剤の１つ以上を修飾する工程；（ａ２）場合により、工程（ａ１）を繰り返す工程；及び（ｃ）その１つ以上の同定された薬剤（即ち、修飾されたもの）のある量を製造する工程を含んでなる方法に関し；そしてここで前記薬剤はＮＥＰｉである。
【００４０】
さらなる側面では、本発明は、薬剤を用いたときのＩＣＰ若しくは海綿体血流を測定することにより神経刺激された内因性勃起プロセスを ｉｎ ｖｉｖｏ（ウサギ及び／又はイヌ）で増強することによって、男性の性機能障害、特にＭＥＤを治療する方法に関し；ここでその薬剤は ｉｎ ｖｉｔｒｏ アッセイ法において（上記に述べられたように）蛍光ペプチドの代謝分解を直に阻害することが可能であり；ここでこの ｉｎ ｖｉｔｒｏ アッセイ法は本発明によるアッセイ法であり；そしてここで前記薬剤はＮＥＰｉである。
【００４１】
さらなる側面では、本発明は、男性の性機能障害、特にＭＥＤの治療への医薬組成物の製造における薬剤の使用に関し、ここでこの薬剤は、本発明によるアッセイ法により ｉｎ ｖｉｔｒｏ でアッセイされる場合に蛍光ペプチドの代謝分解を直に阻害することが可能であり；そしてここで前記薬剤はＮＥＰｉである。
【００４２】
さらなる側面では、本発明は、男性の性機能障害（特にＭＥＤ）を治療することが可能な薬剤を同定するために使用される動物モデルに関し、前記モデルは麻酔された雄性動物を含んでなり、その骨盤神経を刺激した後で前記動物の海綿体圧及び／又は海綿体血流の変化を測定する手段が含まれ；そしてここで前記薬剤はＮＥＰｉである。
【００４３】
さらなる側面では、本発明は、ＭＥＤを治療するために、内因性勃起プロセスを直に亢進させ得る薬剤を同定するためのアッセイ法に関し、このアッセイ法は：本発明の動物モデルへ薬剤を投与する工程；及び、内因性勃起プロセスにおける変化を測定する工程を含んでなり；ここで前記変化は定義されるような試験薬剤の存在下での動物モデルにおける海綿体圧（ＩＣＰ）（及び／又は海綿体血流）の増強として定義され；そしてここで前記薬剤はＮＥＰｉである。
【００４４】
さらなる側面では、本発明は診断法に関し；この方法は、男性からサンプルを単離する工程；このサンプルが男性の性機能障害、好ましくはＭＥＤを引き起こすだけの量で存在する実体を含有するかを決定する工程を含んでなり；ここでこの実体は男性の海綿体における内因性勃起プロセスに対する直接効果を有し；ここで前記実体は、薬剤の使用により有益な効果を達成するようにモジュレートされ得て；そしてここで前記薬剤はＮＥＰｉである。
【００４５】
さらなる側面では、本発明は、単離された男性のサンプル中にある実体を検出するための手段を含む診断組成物若しくはキットに関し；ここでこの手段は、そのサンプルが男性の性機能障害、好ましくはＭＥＤを引き起こすだけの量の実体を含有するか、又は性機能障害、好ましくはＭＥＤを引き起こすだけの量で存在するかを決定するために使用され得て；ここで、この実体は内因性勃起プロセスに対する直接効果を有し、ここで前記実体は、薬剤の使用により有益な効果を達成するようにモジュレートされ得て；そしてここで前記薬剤はＮＥＰｉである。
【００４６】
参照しやすくするために、本発明の上記の側面とさらなる側面を、適正な項見出しの下で以下に論じる。しかしながら、各項の教示内容は必ずしもそれぞれの特定項に限定されるわけではない。
【００４７】
好ましい側面
本発明によるＭＥＤの治療に使用への薬剤は、ＮＥＰ　ＥＣ３．４．２４．１１阻害剤である。
【００４８】
１つの態様では、好ましくは、本発明による使用への薬剤は、経口投与により使用され得る。
もう１つの態様では、本発明による使用への薬剤は、陰茎若しくは尿道内投与への局所適用により使用され得る。
【００４９】
ある適用では、好ましくは、本発明による使用への薬剤は、選択的ＮＥＰｉである。
好ましくは、本発明によるＭＥＤの治療における使用への薬剤は阻害剤である、即ち、それは、阻害機能を示すことが可能である。
【００５０】
好ましくは、本発明によるＭＥＤの治療における使用への薬剤は、上記に説明されるような内因性勃起プロセスを直に亢進させることが可能である。
好ましいＮＥＰｉ
本発明によるＮＥＰｉとしての使用に好ましいのは、（同時出願中の出願番号ＧＢ０１０１５８４及びＵＳ６０／２７４９５７、２００１年３月１２日出願に開示されるような）一般式（Ｉ）：
【００５１】
【化５】
2004502735.tif 000002
［式中：
Ｒ１は、ハロ、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ２−６ヒドロキシアルコキシ、Ｃ１−６アルコキシ（Ｃ１−６アルコキシ）、Ｃ３−７シクロアルキル、Ｃ３−７シクロアルケニル、アリール、アリールオキシ、（Ｃ１−４アルコキシ）アリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、−ＮＲ２Ｒ３、−ＮＲ４ＣＯＲ５、−ＮＲ４ＳＯ２Ｒ５、−ＣＯＮＲ２Ｒ３、−Ｓ（Ｏ）ｐＲ６、−ＣＯＲ７、及び−ＣＯ２（Ｃ１−４アルキル）のリストから選択される、同じであるか又は異なる場合がある、１つ以上の置換基により置換され得るＣ１−６アルキルであるか；又はＲ１は、Ｃ３−７シクロアルキル、アリール、又はヘテロシクリルである（このそれぞれは前記リストからの１つ以上の置換基により置換される場合があり、この置換基は同じであるか又は異なる場合があって、このリストはさらにＣ１−６アルキルを含む）か；又はＲ１は、Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＲ２Ｒ３、又は−ＮＲ４ＳＯ２Ｒ５であり；
｛ここで、
Ｒ２とＲ３は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、（場合によりヒドロキシ又はＣ１−４アルコキシにより置換される）Ｃ３−７シクロアルキル、アリール、（Ｃ１−４アルキル）アリール、Ｃ１−６アルコキシアリール、又はヘテロシクリルであるか；又はＲ２とＲ３は、それらに付く窒素と一緒に、ピロリジニル、ピペリジノ、モルホリノ、ピペラジニル、又はＮ−（Ｃ１−４アルキル）ピペラジニル基を形成し；
Ｒ４は、Ｈ又はＣ１−４アルキルであり；
Ｒ５は、Ｃ１−４アルキル、ＣＦ３、アリール、（Ｃ１−４アルキル）アリール、（Ｃ１−４アルコキシ）アリール、ヘテロシクリル、Ｃ１−４アルコキシ、又は−ＮＲ２Ｒ３（ここでＲ２とＲ３は、すでに定義された通りである）であり；
Ｒ６は、Ｃ１−４アルキル、アリール、ヘテロシクリル、又は−ＮＲ２Ｒ３（ここでＲ２とＲ３は、すでに定義された通りである）であり；そして、
Ｒ７は、Ｃ１−４アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、アリール、又はヘテロシクリルであり；ｎは０、１、又は２であり；ｐは０、１、２、又は３である｝；
−（ＣＨ２）ｎ−連結は、場合により、Ｃ１−４アルキル、１つ以上のフルオロ基又はフェニルで置換されるＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシ（Ｃ１−３アルキル）、Ｃ３−７シクロアルキル、アリール、又はヘテロシクリルにより置換され；
Ｙは、基：
【００５２】
【化６】
2004502735.tif 000003
｛式中：Ａは、−（ＣＨ２）ｑ−（ここでｑは、１、２、３、又は４である）であり、飽和又は不飽和であり得る３〜７員の炭素環式環を完成させ；Ｒ８は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、−ＣＨ２ＯＨ、フェニル、フェニル（Ｃ１−４アルキル）、又はＣＯＮＲ１１Ｒ１２であり；Ｒ９とＲ１０は、それぞれ独立して、Ｈ、−ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、Ｃ１−６アルキル、（場合によりＣ１−４アルキル、ハロ、又はＣ１−４アルコキシにより置換される）フェニル、又はフェニル（Ｃ１−４アルキル）（ここで該フェニル基は、場合により、Ｃ１−４アルキル、ハロ、又はＣ１−４アルコキシにより置換される）であるか、又はＲ９とＲ１０は、一緒にジオキソランを形成し；同じであるか又は異なる場合があるＲ１１とＲ１２は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、Ｒ１３、又はＳ（Ｏ）ｒＲ１３（ここで、ｒは０、１、又は２であり、Ｒ１３は、場合によりＣ１−４アルキルにより置換されるフェニルであるか又はフェニルＣ１−４アルキルであり、ここで該フェニルは、場合によりＣ１−４アルキルにより置換される）である｝であるか；又は
Ｙは、基：−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２（ここでＲ１１とＲ１２はすでに定義された通りであるが、Ｒ１１とＲ１２がともにＨであることはない）であるか；又は
Ｙは、基：
【００５３】
【化７】
2004502735.tif 000004
｛式中：Ｒ１４は、Ｈ、−ＣＨ２ＯＨ、又はＣＯＮＲ１１Ｒ１２（ここでＲ１１とＲ１２はすでに定義された通りである）であり；存在する場合、Ｒ１５は、他のＲ１５ト同じであるか又は異なる場合があり、ＯＨ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ハロ、又はＣＦ３であり；ｔは、０、１、２、３、又は４であり；Ｒ１６とＲ１７は、独立して、Ｈ又はＣ１−４アルキルである｝であるか；又は
Ｙは、基：
【００５４】
【化８】
2004502735.tif 000005
｛式中：Ｂ、Ｄ、Ｅ、又はＦの１又は２つは窒素であり、他は炭素であり；そして、Ｒ１４〜Ｒ１７とｔはすでに定義された通りである｝であるか；又は
Ｙは、場合により置換される５〜７員のヘテロ環式環｛これは、飽和しているか、不飽和であるか、又は芳香族であり得て、窒素、酸素、又はイオウと、場合により、１、２、又は３つのさらなる窒素原子を環中に含有し、場合によりベンゾ縮合され、そして、場合により：
Ｃ１−６アルコキシ；ヒドロキシ；オキソ；アミノ；モノ若しくはジ−（Ｃ１−４アルキル）アミノ；Ｃ１−４アルカノイルアミノ；又は
リスト：Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６ハロアルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、ハロゲン、Ｃ３−７シクロアルキル、ヘテロシクリル、又はフェニルから選択される、同じであるか又は異なる場合がある、１つ以上の置換基により置換され得るＣ１−６アルキル；又は
Ｃ３−７シクロアルキル、アリール、又はヘテロシクリル（このいずれも、リスト：Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６ハロアルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、ハロゲン、Ｃ３−７シクロアルキル、ヘテロシクリル、又はフェニルから選択される、同じであるか又は異なる場合がある、１つ以上の置換基により置換され得る）により置換され得て；
ここで、該ヘテロ環式環にオキソ置換がある場合、その環は１又は２つの窒素原子だけを含有し、該オキソ置換はこの環の窒素原子に隣接している｝であるか；又はＹは、−ＮＲ１８Ｓ（Ｏ）ｕＲ１９（ここでＲ１８は、Ｈ又はＣ１−４アルキルであり；Ｒ１９は、アリール、アリールＣ１−４アルキル、又はヘテロシクリル（好ましくは、ピリジル）であり；そしてｕは、０、１、２、又は３である）である］の化合物である。
【００５５】
本発明の特に好ましい化合物は：
２−［（１−［［（１−ベンジル−６−オキソ−１，６−ジヒドロ−３−ピリジニル）アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）−メチル］−４−メトキシブタン酸（実施例６）；
２−｛［１−（｛［３−（２−オキソ−１−ピロリジニル）プロピル］アミノ｝カルボニル）シクロペンチル］−メチル｝−４−フェニルブタン酸（実施例７）；
（＋）−２−｛［１−（｛［２−（ヒドロキシメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−２−イル］アミノ｝カルボニル）シクロペンチル］メチル｝−４−フェニルブタン酸（実施例８）；
２−［（１−｛［（５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）メチル］−４−フェニルブタン酸（実施例１０）；
ｃｉｓ−３−（２−メトキシエトキシ）−２−［（１−［｛（４−｛［（フェニルスルホニル）アミノ］カルボニル｝シクロヘキシル）−アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）メチル］プロパン酸（実施例１１）；
（＋）−２−｛［１−（｛［２−（ヒドロキシメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−２−イル］アミノ｝カルボニル）シクロペンチル］メチル｝ペンタン酸（実施例１２）；
（２Ｒ）−２−［（１−｛［（５−エチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）メチル］ペンタン酸、又は（−）−２−［（１−｛［（５−エチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）メチル］ペンタン酸（実施例１）；
（２Ｓ）−２−［（１−｛［（５−エチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）メチル］ペンタン酸、又は（＋）−２−［（１−｛［（５−エチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）メチル］ペンタン酸（実施例２）；及び
（Ｓ）−２−｛［１−（｛［２−（ヒドロキシメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−２−イル］アミノ｝カルボニル）シクロペンチル］メチル｝−４−メトキシブタン酸（実施例４）である。
【００５６】
一般的な合成ルート
本発明の化合物は、既知のやり方で、多種多様な方法で製造され得る。
本明細書を通して、一般式はローマ数字のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、等により明示される。これら一般式の亜集合は、Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、等、ＩＶａ，ＩＶｂ、ＩＶｃ、等と定義される。
【００５７】
一般式Ｉの化合物は、反応スキーム１に従って、式ＩＩ（ここでＰｒｏｔは好適な保護基である）の化合物を式ＩＩＩの一級アミンと反応させ、式ＩＶの化合物を得ることによって製造され得る。脱保護化により式Ｉの化合物を得る。
【００５８】
この酸／アミンカップリング工程に好ましい反応条件は、活性化剤、場合により触媒、そして過剰の酸アクセプターの存在下、好適な溶媒において、ＩＩをＩＩＩ（又はそのアミン塩）と反応させることを含む。特に好ましい反応条件は、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣＤＩ）若しくはＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（１．１〜１．３当量）、１−ヒドロキシベンゾトラゾール水和物（ＨＯＢＴ）若しくはジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（１．０５〜１．２当量）、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）若しくはトリエチルアミン（２．３〜３当量）の存在下、ジメチルホルムアミド若しくはジクロロメタンにおいて、室温〜９０℃で、１６〜１８時間、ＩＩ（１〜１．５当量）をＩＩＩ（又はその塩、１〜１．５当量）と反応させることを含む。
【００５９】
他のやり方では、この酸／アミンカップリング工程は、過剰の酸アクセプターの存在下、好適な溶媒において、酸クロリドを介して製造され得る。酸クロリドは単離され得るか、又はそれは ｉｎ ｓｉｔｕ で生成され得る。好ましい反応条件は、ＩＩの酸クロリド（１〜１．１当量）、ＩＩＩ（又はその塩、１〜１．５当量）、トリエチルアミン若しくはＮ−メチルモルホリン（１．４〜１０当量）を、ジクロロメタンにおいて、室温で２４時間反応させることを含む。式ＩＩの化合物は、触媒量のジメチルホルムアミドの存在下、室温で２時間、ジクロロメタン中で塩化オキサリルで ｉｎ ｓｉｔｕ 処理することにより酸クロリドへ変換され得る。
【００６０】
酸基の脱保護化の方法は、保護基に依存する。保護化／脱保護化の方法の例については、『有機合成の保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』Ｔ Ｗ Ｇｒｅｅｎｅ と Ｐ Ｇ Ｍ Ｗｕｔｚ を参照のこと。
【００６１】
例えば、Ｐｒｏｔがｔｅｒｔ−ブチルである場合、脱保護化の条件は、室温で２〜１８時間、場合により炭素カチオン捕捉剤、例えばアニソール（１０当量）の存在下で、ＩＶをトリフルオロ酢酸／ジクロロメタン（１：１〜１．５の容量）と反応させることを含む。Ｙがヒドロキシ基を含有する場合、中間体のトリフルオロ酢酸エステルの塩基加水分解が必要となる場合がある。Ｐｒｏｔがｔｅｒｔ−ブチルである場合の他の脱保護化法は、ジクロロメタン中で、室温で３時間、ＩＶを塩酸で処理することを含む。疑念を回避すれば、Ｐｒｏｔは実施例のためにｔｅｒｔ−ブチルとして示されるのであって、ｔｅｒｔ−ブチルに限定されるわけではない。
【００６２】
Ｐｒｏｔがベンジルである場合、脱保護化の条件は、水性エタノール（４０〜９５％）中で、１５〜６０ｐｓｉ、室温で２時間〜３日の間、ＩＶをパラジウム担持木炭（５〜１０％）と反応させることを含む。
【００６３】
スキーム１
【００６４】
【化９】
2004502735.tif 000006
式Ｉａの化合物、即ち、Ｙが−ＮＨＳＯ２Ｒ１９である一般式の化合物は、反応スキーム２に従って製造され得る。はじめに、Ｐｔｏｔ２が好適なアミン保護基である式ＶＩの化合物と式ＩＩの化合物を反応させることによって式Ｖの化合物を製造する。好ましい反応条件は、上記スキーム１について記載された酸／アミンカップリング工程のものに類似している。式Ｖの化合物の選択的アミン脱保護化により、式ＶＩＩの化合物を得る。式ＶＩＩの化合物を、酸アクセプターの存在下、好適な溶媒中でＲ１９ＳＯ２Ｃｌと反応させ、式ＶＩＩＩの化合物を形成させる。スキーム１の脱保護化工程の記載に類似した条件の下で式ＶＩＩＩの化合物を脱保護化し、式Ｉａの化合物を得る。
【００６５】
アミン基の脱保護化の方法は、保護基に依存する。保護化／脱保護化の方法の例については、『有機合成の保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』Ｔ Ｗ Ｇｒｅｅｎｅ と Ｐ Ｇ Ｍ Ｗｕｔｚ を参照のこと。例えば、Ｐｔｏｔ２がベンゾイルオキシカルボニルである場合、脱保護化の条件は、エタノール中で、室温で１８時間、Ｖをパラジウム担持木炭（１０％）と反応させることを含む。
【００６６】
式ＶＩＩＩの化合物の好ましい製法は、トリエチルアミン（１．５〜２．５当量）の存在下、室温で２〜３日の間、ジクロロメタン中でＶＩＩをＲ１９ＳＯ２Ｃｌ（１当量）と反応させることを含む。
【００６７】
スキーム２
【００６８】
【化１０】
2004502735.tif 000007
式Ｉｂの化合物、即ち、ｎが０であり、Ｙが：
【００６９】
【化１１】
2004502735.tif 000008
である式Ｉの化合物は、反応スキーム３に従って製造され得る。式ＩＩの化合物を、スキーム１の酸／アミンカップリング条件と類似の条件の下で式ＩＩＩの化合物と反応させ、式ＩＸの化合物を得る。ここで、Ｐｒｏｔ３は、保護基Ｐｒｏｔの存在下で選択的に除去され得る保護基である。Ｐｒｏｔ３に好ましい保護基は、易塩基性のエステル基である。従って、式ＩＸの化合物を塩基性条件下で処理すると、式Ｘの化合物を得る。スキーム１の酸／アミンカップリング条件と類似の条件の下で、式Ｘの化合物を式ＮＨＲ１１Ｒ１２の化合物と反応させ、式ＸＩの化合物を形成させる。スキーム１の脱保護化工程に類似した条件の下で式ＸＩの化合物を脱保護化し、式Ｉｂの化合物を得る。
【００７０】
保護基Ｐｒｏｔ３のＩＸからの除去に好ましい条件は、室温で２２時間の間、メタノール中の水酸化ナトリウム（１Ｎ）でＩＸを処理することを含む。
スキーム３
【００７１】
【化１２】
2004502735.tif 000009
式ＩＩＩｂの化合物、即ち、ｎが２であり、Ｙが２−オキソピペリジノである一般式ＩＩＩの化合物は、反応スキーム４に従って製造され得る。
【００７２】
スキーム４
【００７３】
【化１３】
2004502735.tif 000010
ｎが１又は２である、式ＩＩＩｃの化合物は、反応スキーム５に従って製造され得る。式ＸＩＩの化合物を、アミン部分において好適な保護基Ｐｒｏｔ４で保護化し、式ＸＩＩＩの化合物を形成させる。好ましい保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルである。式ＸＩＩＩの化合物を典型的な酸／アミンカップリング条件の下でＮＨＲ１１Ｒ１２と反応させて式ＸＩＶの化合物を形成させる。これが脱保護化すると式ＩＩＩｃの化合物を形成する。
【００７４】
ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル保護基を導入するのに典型的な反応条件は、ジオキソランと２Ｎ水酸化ナトリウム中で、室温で１８時間の間、（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）２ＯでＸＩＩを処理することを含む。
【００７５】
典型的な酸／アミンカップリング条件は、ジメチルホルムアミド中で、室温で２時間の間、ＸＩＩＩとＮＨＲ１１Ｒ１２をベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＰＹＢＯＰ）、１−ヒドロキシベンゾトラゾール水和物（ＨＯＢＴ）、Ｈｕｎｉｇｓ塩基、アミン（例、トリエチルアミン）で処理することを含む。他のやり方では、ＸＩＩＩとＮＨＲ１１Ｒ１２が、ジメチルホルムアミド中で、室温で１８時間の間、１−（３−ジクロロメタンイルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩、ＨＯＢＴ、Ｎ−メチルモルホリンで処理され得る。
【００７６】
Ｐｔｏｔ４がｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルである場合の脱保護化に典型的な反応条件は、ジクロロメタン中で、室温で２〜４時間の間、ＸＩＶを塩酸若しくはトリフルオロ酢酸と反応させることを含む。
【００７７】
スキーム５
【００７８】
【化１４】
2004502735.tif 000011
式ＩＩＩｄの化合物は、反応スキーム６に従って製造され得る。保護基は、好ましくはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルであり、これは、すでに記載のように、標準条件の下で除去される。
【００７９】
スキーム６
【００８０】
【化１５】
2004502735.tif 000012
式ＩＩＩｅの化合物は、すでに記載のように、標準的な酸／アミンカップリング反応を使用して、反応スキーム７に従って製造される。保護基は、好ましくはベンジルオキシカルボニルであり、これは、標準条件、典型的にはエタノール中のパラジウム担持木炭（５〜１０％）により、室温、５０ｐｓｉ、４時間で除去され得る。
【００８１】
スキーム７
【００８２】
【化１６】
2004502735.tif 000013
式ＩＩＩｆの化合物は、反応スキーム８に従って製造され得る。
【００８３】
スキーム８
【００８４】
【化１７】
2004502735.tif 000014
式ＩＩＩｇの化合物は、反応スキーム９に従って２工程で製造され得る。第一工程として、反応スキーム１に記載の酸／アミンカップリング条件に類似した標準的な酸／アミンカップリングの方法を使用して、式ＸＶＩの化合物から式ＸＶの化合物を製造する。Ｐｒｏｔ５は、好適な脱離基、好ましくはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルを表す。第二工程は、Ｐｒｏｔ５の除去を含む。Ｐｒｏｔ５がｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルである場合、好ましい反応条件は、ジエチルエーテル／酢酸エチル中で、室温、１８時間の間、塩酸で処理することを含む。
【００８５】
スキーム９
【００８６】
【化１８】
2004502735.tif 000015
式ＩＩＩｈの化合物は、反応スキーム１０に従って３工程で製造され得る。
【００８７】
スキーム１０
【００８８】
【化１９】
2004502735.tif 000016
式ＩＩＩｊの化合物は、反応スキーム１１に従って、ニトロ基の還元により製造され得る。
【００８９】
スキーム１１
【００９０】
【化２０】
2004502735.tif 000017
式ＩＩＩの化合物を製造するためのさらなる方法を以下のスキーム１２に示す（ここで、Ｒａは、Ｃ１−６アルキル若しくはアルコキシである）。
【００９１】
スキーム１２
【００９２】
【化２１】
2004502735.tif 000018
上記の反応と先述の方法で使用される新規出発材料の製法はすべて慣用的である。その実施若しくは製法、並びに所望の生成物を単離する方法に適正な試薬及び反応条件は、参考文献と以下の「実施例」及び「製法」を参照すれば、当業者によく理解されるだろう。
【００９３】
【実施例】
製法の実施例
実施例１
（２Ｒ）−２−［（１−｛［（５−エチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）メチル］ペンタン酸
及び
実施例２
（２Ｓ）−２−［（１−｛［（５−エチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）メチル］ペンタン酸
以下のステージｃ）からの表題化合物を、ＡＤカラムと溶出液としてへキサン：イソプロパノール：トリフルオロ酢酸（８５：１５：０．２）を使用するＨＰＬＣによりさらに精製し、実施例１の表題化合物、４００ｍｇ（約９９．５％）
【００９４】
【化２２】
2004502735.tif 000019
と、実施例２の表題化合物、３８６ｍｇ（約９９％）を得た。
【００９５】
【化２３】
2004502735.tif 000020
出発材料の製法
ａ）１−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−ペンチル］−シクロペンタンカルボン酸
乾燥エタノール（２００ｍｌ）中の１−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−ペンテニル］−シクロペンタンカルボン酸（ＥＰ　２７４２３４）（２３ｇ，８１．５ミリモル）及び１０％パラジウム担持木炭（２ｇ）の混合物を３０ｐｓｉ、室温で１８時間水素化した。この反応混合物をＡｒｂｏｃｅｌ（登録商標）に通して濾過し、濾液を減圧下で蒸発させて黄色のオイルを得た。溶出液として酢酸エチル：ペンタン（４０：６０）を使用するシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、所望の生成物（２１ｇ，９１％）を澄明なオイルとして得た。
【００９６】
【化２４】
2004502735.tif 000021
ｂ）２−［（１−｛［（５−エチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）メチル］ペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチル
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）中の上記ステージａ）由来生成物（１５０ｍｇ，０．５３ミリモル）の溶液へ、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（０．２１ミリモル）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（０．２ミリモル）、Ｎ−メチルモルホリン（０．３１ミリモル）、及び２−アミノ−５−エチル−１，３，４−チアジアゾール（０．２２ミリモル）を加え、この反応物を９０℃で１８時間撹拌した。冷やした溶液を酢酸エチル（９０ｍｌ）で希釈し、水（３ｘ２５ｍｌ）と塩水（２５ｍｌ）で洗浄してから乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、減圧下で蒸発させた。溶出液として酢酸エチル：ペンタン（３０：７０）を使用するシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、表題化合物（９２％）を得た。
【００９７】
【化２５】
2004502735.tif 000022
ｃ）２−［（１−｛［（５−エチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）メチル］ペンタン酸
ジクロロメタン（５ｍｌ）中の上記ステージｂ）由来生成物（０．３１ミリモル）の溶液へ、トリフルオロ酢酸（５ｍｌ）を加え、この溶液を室温で４時間撹拌した。この反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣をトルエン及びジクロロメタンと共沸させて、表題化合物（８１％）を澄明なオイルとして得た。
【００９８】
【化２６】
2004502735.tif 000023
分析値：Ｃ　５６．４６；Ｈ　７．４６；Ｎ　１２．３６。Ｃ１６Ｈ２５Ｎ３Ｏ３Ｓの
理論値：Ｃ　５６．６２；Ｈ　７．４４；Ｎ　１２．３７％。
【００９９】
実施例３
（Ｒ）−２−｛［１−（｛［２−（ヒドロキシメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−２−イル］アミノ｝カルボニル）シクロペンチル］メチル｝−４−メトキシブタン酸
及び
実施例４
（Ｓ）−２−｛［１−（｛［２−（ヒドロキシメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−２−イル］アミノ｝カルボニル）シクロペンチル］メチル｝−４−メトキシブタン酸（実施例４）
実施例５由来のラセミの２−｛［１−（｛［２−（ヒドロキシメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−２−イル］アミノ｝−カルボニル）シクロペンチル］メチル｝−４−メトキシブタン酸を、Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ　ＯＤカラム（２５０ｘ２０ｍｍ）を周囲温度で使用し、０．３％　ＴＦＡ及び０．２％　ＤＥＡを含有する７０％へキサンと０．３％　ＴＦＡ及び０．２％　ＤＥＡを含有する３０％　ＩＰＡの混合液を１０ｍｌ／分の流速で使用するＨＰＬＣにより精製した。実施例３は、６分後、最初に流出したＲエナンチオマー（αＤ：１１．００　ｃ１ｍｇ／ｍｌ／ＥｔＯＨ）である。実施例４は、７分後、二番目に流出したＳエナンチオマー（αＤ：−８．６２　ｃ１．０７ｍｇ／ｍｌ／ＥｔＯＨ）である。
【０１００】
実施例５
２−｛［１−（｛［２−（ヒドロキシメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−２−イル］アミノ｝カルボニル）シクロペンチル］メチル｝−４−メトキシブタン酸
以下のステージｂ）からの表題生成物（０．２５ミリモル）をジオキサン（１０ｍｌ）中の４Ｍ塩化水素溶液に取り、３時間撹拌した。真空で濃縮し、溶出液として５：９５（ＭｅＯＨ：ＤＣＭ）を使用するカラムクロマトグラフィーにより精製し、この酸を無色のフィルムとして得た。
【０１０１】
【化２７】
2004502735.tif 000024
出発材料の製法
ａ）１−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−メトキシブチル］シクロペンタンカルボン酸
ヘキサン（５２ｍｌ）及びテトラヒドロフラン（２００ｍｌ）の混合液中のリチウムジイソプロピルアミド（１３０ｍｌ）の撹拌された溶液へ、乾燥テトラヒドロフラン（１００ｍｌ）中の１−（３−ｔｅｒｔ−ブトキシ−３−オキソプロピル）シクロペンタンカルボン酸（ＥＰ２７４２３４、実施例３５を参照のこと）の溶液を−７８℃、窒素下で加えた。１時間後、温度を−７８℃に維持しながら、テトラヒドロフラン（１００ｍｌ）中の２−ブロモメチルメチルエーテルの溶液を加えた。この反応混合物を一晩で室温まで温めた。この混合物に水（１００ｍｌ）を加えて反応を止め、２Ｍ塩酸でｐＨ１へ酸性化し、酢酸エチル（２ｘ１５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機抽出物を硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空で濃縮して粗製の酸を得て、これをシリカでクロマトグラフ処理した。ジクロロメタン中の割合が高まるメタノール（純粋なジクロロメタン〜１：５０）を用いた溶出により、オイル（７．７ｇ，２５、６ミリモル、５２％）を得た。Ｒｆ＝０．３（メタノール：ジクロロメタン　１：２０）。
【０１０２】
【化２８】
2004502735.tif 000025
ｂ）２−｛［１−（｛［２−（ヒドロキシメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−２−イル］アミノ｝カルボニル）シクロペンチル］メチル｝−４−メトキシブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）中の上記ステージａ）由来生成物（０．５３ミリモル）へ、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（４１ｍｇ，０．２１ミリモル）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（２７ｍｇ，０．２ミリモル）、Ｎ−メチルモルホリン（３５μｌ，０．３１ミリモル）、及び、最後に２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン（ＷＯ９１１０６４４、実施例８）（０．２２ミリモル）を加え、この反応物を９０℃で１８時間撹拌した。冷やした溶液を酢酸エチル（９０ｍｌ）で希釈し、水（３ｘ２５ｍｌ）と塩水（２５ｍｌ）で洗浄してから乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、減圧下で蒸発させた。溶出液として酢酸エチル：ペンタン（３０：７０）を使用するシリカゲルのクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、表題化合物（３８ｍｇ，５７％）を得た。
【０１０３】
【化２９】
2004502735.tif 000026
実施例６
２−［（１−［［（１−ベンジル−６−オキソ−１，６−ジヒドロ−３−ピリジニル）アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）−メチル］−４−メトキシブタン酸
４０％水性エタノール（２１ｍｌ）中の以下のステージａ）由来生成物（８５０ｍｇ，１．６４ミリモル）及び５％パラジウム担持木炭（２５０ｍｇ）の混合物を３０ｐｓｉ、室温で３０分、水素化した。この反応混合物をＨｙｆｌｏ（登録商標）に通して濾過し、濾液を減圧下で蒸発させた。溶出液としてジクロロメタン：メタノール（９７：３）を使用するシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより残渣の泡状物を精製し、表題化合物（５５０ｍｇ，７９％）を白色の泡状物として得た。
【０１０４】
【化３０】
2004502735.tif 000027
分析値：Ｃ　６７．４６；Ｈ　７．１８；Ｎ　６．２４。Ｃ２４Ｈ３０Ｎ２Ｏ５の理論値：Ｃ　６７．５８；Ｈ　７．０９；Ｎ　６．５７％。
【０１０５】
出発材料の製法
ａ）２−［（１−［［（１−ベンジル−６−オキソ−１，６−ジヒドロ−３−ピリジニル）アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）−メチル］−４−メトキシブタン酸ベンジル
ジクロロメタン（２０ｍｌ）中の１−｛２−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−４−メトキシブチル｝シクロペンタンカルボン酸（ＥＰ２７４２３４、実施例１５）（１．０ｇ，３．０ミリモル）及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２滴）の氷冷した溶液へ塩化オキサリル（０．２６ｍｌ，３．０ミリモル）を加え、この反応物を室温で２時間撹拌した。この溶液を減圧下で濃縮し、残渣をジクロロメタン（３ｘ１０ｍｌ）と共沸させた。生成物をジクロロメタン（２０ｍｌ）に溶かしてから、氷浴で冷やした。以下のステージｂ）からの生成物（６００ｍｇ，３ミリモル）とＮ−メチルモルホリン（０．６ｍｌ，５．４５ミリモル）を加え、この反応物を室温で１８時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、水とエーテルの間で分画した。有機層を塩酸（２Ｎ）、重炭酸ナトリウム溶液、次いで水で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、減圧下で蒸発させた。残留した緑色の固形物を、溶出液として酢酸エチル：ヘキサン（９０：１０）を使用するシリカゲルの中速クロマトグラフィーにより精製し、表題化合物（８８０ｍｇ，５７％）を得た。
【０１０６】
【化３１】
2004502735.tif 000028
ｂ）５−アミノ−１−ベンジル−２（１Ｈ）−ピリジノン
濃塩酸（１４ｍｌ）中の１−ベンジル−５−ニトロ−１Ｈ−ピリジン−２−オン（Ｊｕｓｔｕｓ Ｌｉｅｂｉｇｓ Ａｎｎ． Ｃｈｅｍ． ４８４； １９３０； ５２）（１．０ｇ，４．３５ミリモル）及び粒状スズ（３．５ｇ，２９．５ミリモル）の混合物を９０℃で１．５時間加熱した。冷却した溶液を水で希釈し、炭酸ナトリウム溶液を使用して中和し、酢酸エチル（全２５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機抽出物を濾過し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、減圧下で蒸発させ、表題化合物（４４０ｍｇ，５１％）を薄緑色の固形物（時間とともに青くなった）として得た。
【０１０７】
【化３２】
2004502735.tif 000029
実施例７
２−｛［１−（｛［３−（２−オキソ−１−ピロリジニル）プロピル］アミノ｝カルボニル）シクロペンチル］−メチル｝−４−フェニルブタン酸
エタノール：水（９０：１０の容量；３０ｍｌ）中の出発材料（７８０ｍｇ，１．５５ミリモル）及び１０％パラジウム担持木炭（１００ｍｇ）の混合物を、室温、６０ｐｓｉ　Ｈ２圧の下で、１．５時間水素化した。触媒を濾過して除き、濾液を減圧下で蒸発させ、表題化合物（４７３ｍｇ，７４％）を白色の泡状物として得た。
【０１０８】
【化３３】
2004502735.tif 000030
分析値：Ｃ　６４．０５；Ｈ　７．７３；Ｎ　６．２２。Ｃ２４Ｈ３４Ｎ２Ｏ４・０．７５Ｈ２Ｏの理論値：Ｃ　６５．８８；Ｈ　７．８３；Ｎ　６．４０％。
【０１０９】
出発材料の製法
２−｛［１−（｛［３−（２−オキソ−１−ピロリジニル）プロピル］アミノ｝カルボニルシクロペンチル］−メチル｝−４−フェニルブタン酸ベンジル
乾燥ジクロロメタン（１５ｍｌ）中の１−｛２−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−４−フェニルブチル｝シクロペンタンカルボン酸（ＥＰ　２７４２３４，実施例１７）（１．５ｇ，３．９４ミリモル）の冷却溶液へ、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（１．０６ｇ，５．５３ミリモル）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（０．６０ｇ，４．４４ミリモル）、及びＮ−メチルモルホリン（０．５６ｇ，５．５４ミリモル）を室温で連続して加え、次いでＮ−（３−アミノプロピル）−２−ピロリジノン（例えば、アルドリッチ・ケミカル社）（０．５６ｇ，３．９４ミリモル）を加え、この反応物を室温で１８時間撹拌した。この混合物を水、２Ｎ塩酸、飽和重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄してから乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、減圧下で蒸発させた。溶出液として酢酸エチル：ペンタン（５０：５０）を使用するシリカゲルのクロマトグラフィーにより残渣の黄色いオイルを精製し、表題化合物（８００ｍｇ，４０％）を澄明なゴムとして得た。
【０１１０】
【化３４】
2004502735.tif 000031
実施例８
（Ｒ）−２−｛［１−（｛［２−（ヒドロキシメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−２−イル］アミノ｝カルボニル）シクロペンチル］−メチル｝−４−フェニルブタン酸
及び
実施例９
（Ｓ）−２−｛［１−（｛［２−（ヒドロキシメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−２−イル］アミノ｝カルボニル）シクロペンチル］−メチル｝−４−フェニルブタン酸
２−｛［１−（｛［２−（ヒドロキシメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−２−イル］アミノ｝カルボニル）シクロペンチル］メチル｝−４−フェニルブタン酸（ＷＯ９１１０６４４、実施例９）を、ＡＤカラムと溶出液としてへキサン：イソプロパノール：トリフルオロ酢酸（７０：３０：０．２）を使用する標準的なＨＰＬＣ法により精製し、実施例８の表題化合物（約９９．５％）；［α］Ｄ＝＋９．１°（ｃ＝１．７６／エタノール）と、実施例９の表題化合物（約９９．５％）；［α］Ｄ＝−１０．５°（ｃ＝２．２／エタノール）を得た。
【０１１１】
実施例１０
２−［（１−｛［（５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）メチル］−４−フェニルブタン酸
エタノール（２０ｍｌ）中の出発材料（１８７ｍｇ，０．３９ミリモル）及び１０％パラジウム担持木炭（８０ｍｇ）の混合物を、６０ｐｓｉで１８時間水素化した。Ｔｌｃ分析が出発材料の残存していることを示したので、追加の１０％パラジウム担持木炭（１００ｍｇ）を加え、この反応をさらに５時間続けた。Ｔｌｃ分析が出発材料の残存していることを再び示したので、追加の触媒（１００ｍｇ）を加え、水素化を１８時間続けた。この混合物をＡｒｂｏｃｅｌ（登録商標）に通して濾過し、濾液を減圧下で濃縮し、ジクロロメタンと共沸させた。Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）カラムと溶出液としてジクロロメタン：メタノール（９５：５）を使用するシリカゲルのクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、表題化合物（８０ｍｇ，５３％）を澄明なオイルとして得た。
【０１１２】
【化３５】
2004502735.tif 000032
出発材料の製法
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍｌ）中の１−｛２−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−４−フェニルブチル｝シクロペンタンカルボン酸（ＥＰ　２７４２３４，実施例１７）（２０２ｍｇ，０．５３ミリモル）の冷却溶液へ、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（１２２ｍｇ，０．６４ミリモル）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（８６ｍｇ，０．６４ミリモル）、及びＮ−メチルモルホリン（１７３μｌ，１．５９ミリモル）を室温で連続して加え、次いで２−アミノ−５−メチル−１，３，４−チアジアゾール（例えば、ランカスター）（１．０６ミリモル）を加え、この反応物を９０℃で１８時間撹拌した。冷やした溶液を減圧下で濃縮し、水（２０ｍｌ）と酢酸エチル（１００ｍｌ）の間で残渣を分画した。層を分離し、有機相を水（３ｘ３０ｍｌ）、塩水（２５ｍｌ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、減圧下で蒸発させて、澄明なオイルを得た。溶出液としてジクロロメタン：メタノール（９８：２）を使用するシリカゲルのクロマトグラフィーによりこの粗生成物を精製し、表題化合物（７４％）を澄明なゴムとして得た。
【０１１３】
【化３６】
2004502735.tif 000033
実施例１１
ｃｉｓ−３−（２−メトキシエトキシ）−２−［（１−［｛（４−｛［（フェニルスルホニル）アミノ］カルボニル｝シクロヘキシル）アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）メチル］プロパン酸
ジクロロメタン（５ｍｌ）及びトリフルオロ酢酸（５ｍｌ）中の以下のステージｂ）からの出発材料（４４６ｍｇ，０．７５ミリモル）の溶液を室温で１８時間撹拌した。この反応混合物を減圧下で濃縮し、ジクロロメタンに次いでトルエン、最後にエーテルとともに残渣を共沸させて、表題化合物（３８５ｍｇ，９５％）を白色の泡状物として得た。
【０１１４】
【化３７】
2004502735.tif 000034
分析値：Ｃ　５４．８８；Ｈ　６．９０；Ｎ　５．０４。Ｃ２６Ｈ３８Ｎ２Ｏ８Ｓ・１．７Ｈ２Ｏの理論値：Ｃ　５７．９７；Ｈ　７．１１；Ｎ　５．２０％。
【０１１５】
出発材料の製法
ａ）４−｛［（１−｛３−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−［（２−メトキシエトキシ）メチル］−３−オキソプロピル｝シクロペンチル）カルボニル］アミノ｝シクロヘキサンカルボン酸
水（１０ｍｌ）及びエタノール（５０ｍｌ）中の４−｛［（１−｛３−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−［（２−メトキシエトキシ）メチル］−３−オキソプロピル｝シクロペンチル）カルボニル］アミノ｝シクロヘキサンカルボキシル酸ベンジル（ＥＰ２７４２３４、実施例９６）及び１０％パラジウム担持木炭（２５０ｍｇ）の混合物を、５０ｐｓｉ、室温で１８時間水素化した。この反応混合物をＳｏｌｋａｆｌｏｃ（登録商標）に通して濾過し、濾液を減圧下で濃縮し、残渣をトルエン（３ｘ）に次いでジクロロメタン（３ｘ）と共沸させて、表題化合物（２．０ｇ，９６％）を得た。
【０１１６】
【化３８】
2004502735.tif 000035
ｂ）３−（２−メトキシエトキシ）−２−［（１−［｛（４−｛［（フェニルスルホニル）アミノ］カルボニル｝シクロヘキシル）アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）メチル］プロパン酸ｃｉｓ−ｔｅｒｔ−ブチル
ジクロロメタン（１２ｍｌ）及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．５ｍｌ）中の上記ステージａ）由来生成物（４００ｍｇ，０．８７８ミリモル）の氷冷溶液へ、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１９９ｍｇ，０．９７ミリモル）、４−ジメチルアミノピリジン（１１８ｍｇ，０．９７ミリモル）、及びベンゼンスルホンアミド（１５２ｍｇ，０．９７ミリモル）を加え、この反応物を室温で２０時間撹拌した。この混合物を減圧下で濃縮し、残渣を冷酢酸エチルに懸濁させた。生じた不溶性の材料を濾過して除き、濾液を塩酸（１Ｎ）と水で洗浄してから、乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、減圧下で蒸発させた。ジクロロメタン：メタノール（９５：５〜９０：１０）の溶出勾配液を使用するシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、表題化合物（４８０ｍｇ，９２％）を白色の泡状物として得た。
【０１１７】
【化３９】
2004502735.tif 000036
実施例１２
（Ｒ）−２−｛［１−（｛［２−（ヒドロキシメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−２−イル］アミノ｝カルボニル）シクロペンチル］メチル｝ペンタン酸
及び
実施例１３
（Ｓ）−２−｛［１−（｛［２−（ヒドロキシメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−２−イル］アミノ｝カルボニル）シクロペンチル］メチル｝ペンタン酸
２−｛［１−（｛［２−（ヒドロキシメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−２−イル］アミノ｝カルボニル）シクロペンチル］メチル｝ペンタン酸（ＷＯ９１１０６４４、実施例８）を、ＡＤカラムと溶出液としてへキサン：イソプロパノール：トリフルオロ酢酸（９０：１０：０．１）を使用するＨＰＬＣによりさらに精製し、実施例１２の表題化合物（約９９％）；［α］Ｄ＝＋１０．４°（ｃ＝０．０６７、エタノール）と、実施例１３の表題化合物（約９９％）；［α］Ｄ＝−１０．９°（ｃ＝０．０４６、エタノール）を得た。
【０１１８】
ＮＥＰｉ（Ｉ：ＮＥＰ）を同定する、及び／又は試験するのに適したアッセイ系に関する詳細は、以下の「ＮＥＰアッセイ」と題する項に示す。
さらなるＮＥＰ阻害剤の例が以下の概説論文で論じられている：
【０１１９】
【化４０】
2004502735.tif 000037
また、さらなるＮＥＰｉの例が以下の文書に開示されている：
【０１２０】
【化４１】
2004502735.tif 000038
さらなるＩ：ＮＥＰが以下の文書に開示されている：
【０１２１】
【化４２】
2004502735.tif 000039
さらなるＩ：ＮＥＰの例が以下の構造から選択される：
【０１２２】
【表１】
2004502735.tif 000040
【０１２３】
【表２】
2004502735.tif 000041
【０１２４】
【表３】
2004502735.tif 000042
追加のＮＥＰｉが（参照により本明細書に組込まれる文献とともに）以下の構造から選択される：
【０１２５】
【表４】
2004502735.tif 000043
特殊なＮＥＰ阻害剤（又はＰＤＥ５ｉ、又は本発明の組合せ物に使用される他の追加の活性化合物）の適格性は、文献の方法を使用する効力及び選択性の評価に次いで、標準的な創薬のやり方に従った、その毒性、吸収、代謝、薬物動態、等の評価により容易に決定され得る。
【０１２６】
組合せ物
本発明によるＭＥＤの治療に有用なＮＥＰｉと、存在する場合、ＰＤＥ５ｉの化合物は、１つ以上の医薬活性剤と組み合わせても使用され得る。本明細書で定義される追加の医薬活性剤は、「追加薬剤」と呼ばれる場合がある。そのような追加薬剤の１つ以上は、ＰＤＥｉ、もう１つのＮＥＰｉ、又はＮＰＹｉであり得る。薬剤の組合せ物については以下に詳しく論じる。従って、本発明の特に好ましい側面はＰＤＥ５ｉと組合せたＮＥＰｉであるが、ＮＥＰｉと（ＰＤＥ５以外の）活性薬剤の他の組合せ物も本発明の範囲内にある。本発明の中にはまた、ＮＥＰｉと他の追加（活性）薬剤との組合せも含まれる。
【０１２７】
本明細書で種々の薬剤に付いて述べられることは、ＮＥＰｉ若しくはＰＤＥ５ｉの化合物だけでなく、追加薬剤にも適用可能であり得る。
上記に論じられたようなＭＥＤの治療へのＮＥＰｉ化合物の使用によれば、ＮＥＰｉはある標的、好ましくは、特にその標的に作用する。例えば、ＮＥＰｉ及びＰＤＥ５ｉの組合せ物が存在する場合、標的はＮＥＰ及びＰＤＥ５の酵素である。この標的は、「本発明の標的」と呼ばれることがある。しかしながら、本発明の追加薬剤は、１つ以上の他の標的に作用し得る。これら他の標的は「追加標的」と呼ばれる場合がある。同様に、追加薬剤が使用されるならば、その追加薬剤は、本発明の同じ標的、及び／又は追加標的（これは、本発明の薬剤が作用する追加標的と同じでなくともよい）を標的指向し得る。種々の標的が本明細書で記載される。本明細書の標的への一般的な言及が本発明の標的だけでなく追加標的にも適用可能であり得ることを理解されたい。
【０１２８】
本発明は、追加的に、本明細書で概説した男性の性機能障害（より特定すると、男性の勃起障害）の治療へのＮＥＰｉと以下の追加活性薬剤の１つ以上との組合せを含む。
【０１２９】
従って、本発明のさらなる側面は、本発明によるＮＥＰｉと以下の１）〜３５）との（同時、分離、又は連続投与のための）医薬組合せ物を提供する：
１）１つ以上の天然に存在するか又は合成のプロスタグランジン又はそのエステル。本明細書での使用に適したプロスタグランジンには、アプロスタジル、プロスタグランジンＥ１、プロスタグランジンＥ０、１３，１４−ジヒドロプロスタグランジンＥ１、プロスタグランジンＥ２、エプロスチノール、２０００年３月１４日発行のＷＯ−０００３３８２５及び／又はＵＳ６，０３７，３４６（すべて参照により本明細書に組込まれる）に記載のものを含む、天然合成及び半合成のプロスタグランジンとその誘導体、ＰＧＥ０、ＰＧＥ１、ＰＧＡ１、ＰＧＢ１、ＰＧＦ１α、１９−ヒドロキシＰＧＡ１、１９−ヒドロキシ−ＰＧＢ１、ＰＧＥ２、ＰＧＢ２、１９−ヒドロキシＰＧＡ２、１９−ヒドロキシ−ＰＧＢ２、ＰＧＥ３α、カルボプロストトロメタミンジノプロスト、トロメタミン、ジノプロストン、リポプロスト、ゲメプロスト、メテノプロスト、スルプロスツン、チアプロスト、及びモキシシレート；及び／又は
２）α−アドレナリン受容体又はα−受容体又はα−ブロッカーとしても知られている、１つ以上のα−アドレナリン作動性受容体拮抗化合物。本明細書での使用に適した化合物には、ＰＣＴ出願ＷＯ９９／３０６９７（１９９８年６月１４日公開）に記載のα−アドレナリン作動性受容体ブロッカー（α−アドレナリン作動性受容体に関する開示は参照により本明細書に組込まれている）が含まれ、そして、選択的α１−アドレナリン受容体若しくはα２−アドレナリン受容体のブロッカーと非選択的アドレナリン受容体ブロッカーが含まれ、好適なα１−アドレナリン受容体ブロッカーには：フェントラミン、メシル酸フェントラミン、トラゾドン、アルフゾシン、インドラミン、ナフトピジル、タムスロシン、ダピプラゾール、フェノキシベンズアミン、イダゾキサン、エファラキサン、ヨヒンビン、ラウオルフィア・アルカロイド、レコルダティ（Ｒｅｃｏｒｄａｔｉ）１５／２７３９、ＳＮＡＰ１０６９、ＳＮＡＰ５０８９、ＲＳ１７０５３、ＳＬ８９．０５９１、ドキサゾシン、テラゾシン、アバノキル、及びプラゾシン；ＵＳ６，０３７，３４６［２０００年３月１４日］からのα２−ブロッカー遮断剤のジベンアミン、トラゾリン、トリマゾシン、及びジベンアミン；米国特許第４，１８８，３９０；４，０２６，８９４；３，５１１，８３６；４，３１５，００７；３，５２７，７６１；３，９９７，６６６；２，５０３，０５９；４，７０３，０６３；３，３８１，００９；４，２５２，７２１；及び、２，５９９，０００（これらはそれぞれ参照により本明細書に組込まれる）に記載のα−アドレナリン作動性受容体が含まれ；α２−アドレナリン受容体ブロッカーには：クロニジン、パパベリン、塩酸パパベリンが場合によりピルキサミンのような強心剤の存在下で含まれる；及び／又は、
３）１つ以上のＮＯ−ドナー（ＮＯ−作動薬）化合物。本明細書での使用に適したＮＯ−ドナー化合物には、一、二、又は三−硝酸塩のような有機硝酸塩、又は（ニトログリセリンとしても知られる）トリ硝酸グリセリルを含む有機硝酸エステル、５−一硝酸イソソルビド、二硝酸イソソルビド、四硝酸ペンタエリスリトール、四硝酸エリスリチル、ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）、３−モルホリノシドノニミン・モルシドミン、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−グルタチオン（ＳＮＯ−ＧＬＵ）、Ｎ−ヒドロキシ−Ｌ−アルギニン、硝酸アミル、リンシドミン、リンシドミンクロロ水和物、（ＳＩＮ−１）Ｓ−ニトロソ−Ｎ−システイン、ジアゼニウムジオラート、（ＮＯＮＯエート）、１，５−ペンタンジニトレート、Ｌ−アルギニン、ギンセング、ｚｉｚｐｈｉ ｆｒｕｃｔｕｓ、モルシドミン、Ｒｅ−２０４７、公開ＰＣＴ出願ＷＯ００１２０７５に記載されたＮＭＩ−６７８−１１及びＮＭＩ−９３７のようなニトロシレーティド・マキシシライト（ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｅｄ ｍａｘｉｓｙｌｙｔｅ）誘導体が含まれる；及び／又は、
４）１つ以上のカリウムチャネルオープナー若しくはモジュレーター。本明細書での使用に適したカリウムチャネルオープナー／モジュレーターには、ニコランジル、クロモカリム、レブクロマカリム、レマカリム、ピナシジル、クリアゾキシド、ミノキシジル、カリブドトキシン、グリブリド、４−アミノピリジン、ＢａＣｌ２が含まれる；及び／又は、
５）１つ以上のドーパミン作用剤、好ましくは、アポモルヒネ、又は選択的Ｄ２、Ｄ３若しくはＤ２／Ｄ３作動薬、例えば（ＷＯ−００２３０５６に特許請求される）プラミペキソール及びロピリノール、Ｌ−ドーパ若しくはカルビドーパ、（ＷＯ−００４０２２６に特許請求される）ＰＮＵ９５６６６；及び／又は、
６）１つ以上の血管拡張剤。本明細書での使用に適した血管拡張剤には、ニモジピン、ピナシジル、シクランデレート、イソキスプリン、クロルプロマジン、ハロペリドール、Ｒｅｃ１５／２７３９、トラゾドンが含まれる；及び／又は、　７）１つ以上のトロンボキサンＡ２作動薬；及び／又は、
８）１つ以上の麦角アルカロイド。好適な麦角アルカロイドは米国特許第６，０３７，３４６号（２０００年３月１４日発行）に記載され、アセテルガミン、ブラゼルゴリン、ブロメルグリド、シアネルゴリン、デロルゴトリル、ジスレルギン、マレイン酸エルゴノビン、酒石酸エルゴタミン、エチスレルギン、レルゴトリル、リセルギド、メスレルギン、メテルゴリン、メテルゴタミン、ニセルゴリン、ペルゴリド、プロピセルギド、プロテルグリド、テルグリドが含まれる；及び／又は、
９）ナトリウム利尿因子、特に心房性ナトリウム利尿因子（心房性ナトリウム利尿ペプチドとしても知られている）、Ｂ型及びＣ型ナトリウム利尿因子の作用をモジュレートする、１つ以上の化合物；及び／又は、
１０）ロサルタンのような、１つ以上のアンジオテンシン受容体拮抗薬；及び／又は、
１１）Ｌ−アルギニンのような、ＮＯ−シンターゼの１つ以上の基質；及び／又は、
１２）アムロジピンのような、１つ以上のカルシウムチャネルブロッカー；及び／又は、
１３）１つ以上のエンドセリン受容体拮抗薬とエンドセリン変換酵素阻害剤；及び／又は、
１４）スタチン（例、アトルバスタチン／リピトール−（登録商標））及びフィブラートのような、１つ以上のコレステロール低下剤；及び／又は、
１５）１つ以上の抗血小板剤及び抗血栓剤、例えばｔＰＡ、ｕＰＡ、ワルファリン、ヒルジン、及び他のトロンビン阻害剤、ヘパリン、トロンボプラスチン活性化因子阻害剤；及び／又は、
１６）１つ以上の、レズリンのようなインスリン増感剤とグリピジドのような血糖降下剤；及び／又は、
１７）ドネジピルのような１つ以上のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤；及び／又は、
１８）１つ以上のエストロゲン受容体モジュレーター、及び／又はエストロゲン作動薬、及び／又はエストロゲン拮抗薬、好ましくは、ラロキシフェン若しくはラソホキシフェン、（−）−ｃｉｓ−６−フェニル−５−［４−（２−ピロリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル］−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−オール、及びその製剤的に許容される塩（以下の化合物Ａ）、その製法はＷＯ９６／２１６５６に詳しい。
【０１３０】
【化４３】
2004502735.tif 000044
化合物Ａ
２３）１つ以上のＰＤＥ阻害剤、より特定するとＰＤＥ２、４、５、７、又は８阻害剤、好ましくはＰＤＥ２若しくはＰＤＥ５の阻害剤、及び最も好ましくは、ＰＤＥ５阻害剤（以下を参照のこと）、前記阻害剤は、好ましくは、それぞれの酵素に対して１００ｎＭ未満のＩＣ５０を有する；及び／又は、
２４）１つ以上のＮＰＹ（神経ペプチドＹ）阻害剤、より特定するとＮＰＹ１若しくはＮＰＹ５阻害剤、好ましくはＮＰＹ１阻害剤、好ましくは（ＮＰＹ　Ｙ１及びＮＰＹ　Ｙ５を含む）前記ＮＰＹ阻害剤は、１００ｎＭ未満、より好ましくは５０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する；及び／又は、
２５）１つ以上の血管作動性腸管タンパク質（ＶＩＰ）、ＶＩＰ模擬体、より特定すると、１つ以上のＶＩＰ受容体サブタイプ、ＶＰＡＣ１、ＶＰＡＣ、又はＰＡＣＡＰ（下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド）により仲介される、１つ以上のＶＩＰ受容体作動薬若しくはＶＩＰ類似体（例、Ｒｏ−１２５−１５５３）、又はＶＩＰフラグメント、ＶＩＰと組合せた１つ以上のα−アドレナリン受容体拮抗薬（例、インビコープ［Ｉｎｖｉｃｏｒｐ］、アビプタジル［Ａｖｉｐｔａｄｉｌ］）；及び／又は、
２６）１つ以上のメラノコルチン受容体作動薬若しくはモジュレーター、又はメラノコルチンエンハンサー、例えば、メラノタンＩＩ、ＰＴ−１４、ＰＴ−１４１、又はＷＯ−０９９６４００２、ＷＯ−０００７４６７９、ＷＯ−０９９５５６７９、ＷＯ−００１０５４０１、ＷＯ−０００５８３６１、ＷＯ−００１１４８７９、ＷＯ−００１１３１１２、ＷＯ−０９９５４３５８に特許請求される化合物群；及び／又は、
２７）１つ以上のセロトニン受容体作動薬、拮抗薬、又はモジュレーター、より特定すると、ＷＯ−０９９０２１５９、ＷＯ−００００２５５０、及び／又はＷＯ−０００２８９９３に記載されるものを含む、（ＶＭＬ６７０を含む）５ＨＴ１Ａ、５ＨＴ２Ａ、５ＨＴ２Ｃ、５ＨＴ３、及び／又は５ＨＴ６受容体の作動薬、拮抗薬、又はモジュレーター；及び／又は、
２８）１つ以上のテストステロン置換剤（デヒドロアンドロステンジオンを含む）、テストステルノン（Ｔｏｓｔｒｅｌｌｅ）、ジヒドロテストステロン、又はテストステロンインプラント；及び／又は、
２９）１つ以上のエストロゲン、エストロゲン及びメドロキシプロゲステロン、又は酢酸メドロキシプロゲステロン（ＭＰＡ）（即ち、組合せ物として）、又はエストロゲン及びメチルテストステロンホルモン置換療法剤（例、ＨＲＴ、特にプレマリン［Ｐｒｅｍａｒｉｎ］、セネスチン［Ｃｅｎｅｓｔｉｎ］、エストロフェルミナール［Ｏｅｓｔｒｏｆｅｒｍｉｎａｌ］、エクィン［Ｅｑｕｉｎ］、エストレース［Ｅｓｔｒａｃｅ］、エストロフェム［Ｅｓｔｒｏｆｅｍ］、エレステ・ソロ［Ｅｌｌｅｓｔｅ Ｓｏｌｏ］、エストリング［Ｅｓｔｒｉｎｇ］、エストラダームＴＴＳ［Ｅａｓｔｒａｄｅｒｍ ＴＴＳ］、エストラダーム・マトリックス［Ｅａｓｔｒａｄｅｒｍ Ｍａｔｒｉｘ］、ダーメストリル［Ｄｅｒｍｅｓｔｒｉｌ］、プレムフェーズ［Ｐｒｅｍｐｈａｓｅ］、プレエンプロ［Ｐｒｅｅｍｐｒｏ］、プレンパック［Ｐｒｅｍｐａｋ］、プレミク［Ｐｒｅｍｉｑｕｅ］、エストラテスト［Ｅｓｔｒａｔｅｓｔ］、エストラテストＨＳ［Ｅｓｔｒａｔｅｓｔ ＨＳ］、チボロン［Ｔｉｂｏｌｏｎｅ］；及び／又は、
３０）ブプロピオン、ＧＷ−３２０６５９のような、ノルアドレナリン、ドーパミン、及び／又はセロトニンの運搬体の１つ以上のモジュレーター；及び／又は、
３１）１つ以上のプリン作動性（ｐｕｒｉｎｅｒｇｉｃ）受容体作動薬及び／又はモジュレーター；及び／又は、
３２）ＷＯ−０９９６４００８に記載されるものを含む、１つ以上のニューロキニン（ＮＫ）受容体拮抗薬；及び／又は、
３３）１つ以上のオピオイド受容体作動薬、拮抗薬、又はモジュレーター、好ましくはＯＲＬ−１受容体の作動薬；及び／又は、
３４）１つ以上のオキシトシン／バソプレッシン受容体の作動薬若しくはモジュレーター、好ましくは選択的オキシトシン作動薬若しくはモジュレーター；及び／又は、
３５）１つ以上のカンナビノイド受容体モジュレーター。
【０１３１】
追加薬剤のＰＤＥ５阻害剤（Ｉ：ＰＤＥ５）：
ＰＤＥ５阻害剤
本発明による医薬組合せ物における使用に適したＰＤＥ５ｉは、以下に詳述するｃＧＭＰ　ＰＤＥ５ｉである。ここでの使用に特に好ましいのは、強力かつ選択的なｃＧＭＰ　ＰＤＥ５ｉである。
【０１３２】
本発明による使用に適したｃＧＭＰ　ＰＤＥ５阻害剤には、以下が含まれる：ＥＰ−Ａ−０４６３７５６に開示されたピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；公開国際特許出願ＷＯ９３／０６１０４に開示されたピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；公開国際特許出願ＷＯ９３／０７１４９に開示された異性体のピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−７−オン；公開国際特許出願ＷＯ９３／１２０９５に開示されたキナゾリン−４−オン；公開国際特許出願ＷＯ９４／０５６６１に開示されたピリド［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オン；公開国際特許出願ＷＯ９４／００４５３に開示されたプリン−６−オン；公開国際特許出願ＷＯ９８／４９１６６に開示されたピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；公開国際特許出願ＷＯ９９／５４３３３に開示されたピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；ＥＰ−Ａ−０９９５７５１に開示されたピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；公開国際特許出願ＷＯ００／２４７４５に開示されたピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；ＥＰ−Ａ−０９９５７５０に開示されたピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−４−オン；公開国際出願ＷＯ９５／１９９７８に開示された化合物；公開国際出願ＷＯ９９／２４４３３に開示された化合物、及び公開国際出願ＷＯ９３／０７１２４に開示された化合物。
【０１３３】
公開国際出願ＷＯ０１／２７１１２に開示されたピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；公開国際出願ＷＯ０１／２７１１３に開示されたピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；ＥＰ−Ａ−１０９２７１８に開示された化合物、及びＥＰ−Ａ−１０９２７１９に開示された化合物。
【０１３４】
本発明による使用に好ましいＶ型ホスホジエステラーゼ阻害剤には：
１−［［３−（６，７−ジヒドロ−１−メチル−７−オキソ−３−プロピル−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）−４−エトキシフェニル］スルホニル］−４−メチルピペラジンとしても知られる、５−［２−エトキシ−５−（４−メチル−１−ピペラジニルスルホニル）フェニル］−１−メチル−３−ｎ−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン（シルデナフィル）（ＥＰ−Ａ−０４６３７５６を参照のこと）；
５−（２−エトキシ−５−モルホリノアセチルフェニル）−１−メチル−３−ｎ−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン（ＥＰ−Ａ−０５２６００４を参照のこと）；
３−エチル−５−［５−（４−エチルピペラジン−１−イルスルホニル）−２−ｎ−プロポキシフェニル］−２−（ピリジン−２−イル）メチル−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン（ＷＯ９８／４９１６６を参照のこと）；
３−エチル−５−［５−（４−エチルピペラジン−１−イルスルホニル）−２−（２−メトキシエトキシ）ピリジン−３−イル］−２−（ピリジン−２−イル）メチル−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン（ＷＯ９９／５４３３３を参照のこと）；
３−エチル−５−｛５−［４−エチルピペラジン−１−イルスルホニル］−２−（［（１Ｒ）−２−メトキシ−１−メチルエチル］オキシ）ピリジン−３−イル｝−２−メチル−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オンとしても知られる、（＋）−３−エチル−５−［５−（４−エチルピペラジン−１−イルスルホニル）−２−（２−メトキシ−１（Ｒ）−メチルエトキシ）ピリジン−３−イル］−２−メチル−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン（ＷＯ９９／５４３３３を参照のこと）；
１−｛６−エトキシ−５−［３−エチル−６，７−ジヒドロ−２−（２−メトキシエチル）−７−オキソ−２Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５−イル］−３−ピリジルスルホニル｝−４−エチルピペラジンとしても知られる、５−［２−エトキシ−５−（４−エチルピペラジン−１−イルスルホニル）ピリジン−３−イル］−３−エチル−２−［２−メトキシエチル］−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン（ＷＯ０１／２７１１３、実施例８を参照のこと）；
５−［２−ｉｓｏ−ブトキシ−５−（４−エチルピペラジン−１−イルスルホニル）ピリジン−３−イル］−３−エチル−２−（１−メチルピペリジン−４−イル）−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン（ＷＯ０１／２７１１３、実施例１５を参照のこと）；
５−［２−エトキシ−５−（４−エチルピペラジン−１−イルスルホニル）ピリジン−３−イル］−３−エチル−２−フェニル−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン（ＷＯ０１／２７１１３、実施例６６を参照のこと）；
５−（５−アセチル−２−プロポキシ−３−ピリジニル）−３−エチル−２−（１−イソプロピル−３−アゼチジニル）−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン（ＷＯ０１／２７１１２、実施例１２４を参照のこと）；
５−（５−アセチル−２−ブトキシ−３−ピリジニル）−３−エチル−２−（１−エチル−３−アゼチジニル）−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン（ＷＯ０１／２７１１２、実施例１３２を参照のこと）；
（６Ｒ，１２ａＲ）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−２−メチル−６−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−ピラジノ［２’，１’：６，１］ピリド［３，４−ｂ］インド−ル−１，４−ジオン（ＩＣ−３５１）、即ち、公開国際出願ＷＯ９５／１９９７８の実施例７８及び９５の化合物、並びに実施例１、３、７、及び８の化合物；
１−［［３−（３，４−ジヒドロ−５−メチル−４−オキソ−７−プロピルイミダゾ［５，１−ｆ］−ａｓ−トリアジン−２−イル）−４−エトキシフェニル］スルホニル］−４−エチルピペラジンとしても知られる、２−［２−エトキシ−５−（４−エチル−ピペラジン−１−イル−スルホニル）−フェニル］−５−メチル−７−プロピル−３Ｈ−イミダゾ［５，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−４−オン（バルデナフィル）、即ち、公開国際出願ＷＯ９９／２４４３３の実施例２０、１９、３３７、及び３３６の化合物；及び
公開国際出願ＷＯ９３／０７１２４（エーザイ）の実施例１１の化合物；及び、Ｒｏｔｅｌｌａ Ｄ Ｐ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ２０００， ４３， １２５７ からの化合物３及び１４が含まれる。
【０１３５】
本発明に関連して有用なさらに他のｃＧＭＰ　ＰＤＥ５型阻害剤には：４−ブロモ−５−（ピリジルメチルアミノ）−６−［３−（４−クロロフェニル）−プロポキシ］−３（２Ｈ）ピリダジノン；１−［４−［（１，３−ベンゾジオキソル−５−イルメチル）アミノ］−６−クロロ−２−キノゾリニル］−４−ピペリジン−カルボン酸、一ナトリウム塩；（＋）−ｃｉｓ−５，６ａ，７，９，９，９ａ−ヘキサヒドロ−２−［４−（トリフルオロメチル）−フェニルメチル−５−メチル−シクロぺント−４，５］イミダゾ［２，１−ｂ］プリン−４（３Ｈ）オン；フラズロシリン；ｃｉｓ−２−ヘキシル−５−メチル−３，４，５，６ａ，７，８，９，９ａ−オクタヒドロシクロペンタ［４，５］−イミダゾ［２，１−ｂ］プリン−４−オン；３−アセチル−１−（２−クロロベンジル）−２−プロピリンドール−６−カルボキシレート；３−アセチル−１−（２−クロロベンジル）−２−プロピリンドール−６−カルボキシレート；４−ブロモ−５−（３−ピリジルメチルアミノ）−６−（３−（４−クロロフェニル）−プロポキシ）−３（２Ｈ）ピリダジノン；１−メチル−５（５−モルホリノアセチル−２−ｎ−プロポキシフェニル）−３−ｎ−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ（４，３−ｄ）ピリミジン−７−オン；１−［４−［（１，３−ベンゾジオキソル−５−イルメチル）アミノ］−６−クロロ−２−キナゾリニル］−４−ピペリジンカルボン酸、一ナトリウム塩；Ｐｈａｒｍａｐｒｏｊｅｃｔｓ Ｎｏ． ４５１６（グラクソ・ウェルカム）；Ｐｈａｒｍａｐｒｏｊｅｃｔｓ Ｎｏ． ５０５１（バイエル）；Ｐｈａｒｍａｐｒｏｊｅｃｔｓ Ｎｏ． ５０６４（協和発酵；ＷＯ９６／２６９４０を参照のこと）；Ｐｈａｒｍａｐｒｏｊｅｃｔｓ Ｎｏ． ５０６９（シェリング・プラウ）；ＧＦ−１９６９６０（グラクソ・ウェルカム）；Ｅ−８０１０及びＥ−４０１０（エーザイ）；Ｂａｙ−３８−３０４５及び３８−９４５６（バイエル）、及びＳｃｈ−５１８６６が含まれる。
【０１３６】
特殊なｃＧＭＰ　ＰＤＥ５阻害剤の適格性は、文献の方法を使用する効力及び選択性の評価に次いで、標準的な創薬のやり方に従った、その毒性、吸収、代謝、薬物動態、等の評価により容易に決定され得る。
【０１３７】
好ましくは、ｃＧＭＰ　ＰＤＥ５阻害剤は、１００ナノモル／リットル未満、より好ましくは５０ナノモル未満、なおさらに好ましくは１０ナノモル／リットル未満のＩＣ５０を有する。
【０１３８】
ｃＧＭＰ　ＰＤＥ５阻害剤のＩＣ５０値は、以下の「試験方法」項のＰＤＥ５アッセイを使用して決定され得る。
好ましくは、本発明による医薬組合せ物に使用されるｃＧＭＰ　ＰＤＥ５阻害剤は、ＰＤＥ５酵素に選択的である。好ましくは、それらは、ＰＤＥ３よりもＰＤＥ５に対して１００倍を超える、好ましくは３００倍を超える選択性を有する。より好ましくは、このＰＤＥ５は、ＰＤＥ３とＰＤＥ４の両方よりも１００倍を超える、好ましくは３００倍を超える選択性を有する。
【０１３９】
選択性の比率は、当業者により容易に決定され得る。ＰＤＥ３及びＰＤＥ４の酵素に対するＩＣ５０値は、確立された文献の方法を使用して決定され得る。Ｓ Ａ Ｂａｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙ， １９９８， ｖｏｌ． １５９， ２１６４−２１７１ 頁と本明細書の以下の記載を参照のこと。
【０１４０】
上記の公開特許出願と、特にその中の一般式及び例示化合物がそのまま参照により本明細書に組込まれることを了解されたい。
治療
本明細書で治療と言えば、治癒、緩和、及び予防の治療の１つ以上が含まれると理解されたい。
【０１４１】
性的刺激
本発明にはまた、性的刺激の前、及び／又はその間にＮＥＰｉ（及び適用可能な場合は、ＰＤＥ５ｉ）の投与を介した上記に定義される使用が含まれる。ここで「性的刺激」という用語は、「性的興奮」と同義であり得る。本発明のこの側面が有利であるのは、それが全身選択性を提供するからである。この天然のカスケードは生殖器でのみ起こり、他の部位、例えば心臓などでは起こらない。従って、本発明によるＭＥＤ治療を介して生殖器に選択的効果を達成することが可能であろう。
【０１４２】
このように、本明細書によれば、ある段階で性的刺激の工程のあることがきわめて望ましい。我々は、この工程が全身選択性を提供し得ることを見出した。ここで「性的刺激」は、視覚刺激、物理刺激、聴覚刺激、又は思考刺激の１つ以上であり得る。
【０１４３】
活性薬剤
男性の性機能障害、特にＭＥＤの治療に使用される本発明の薬剤は、ＮＥＰｉとして作用し得るのに適した薬剤、そして、適正な場合、ＮＥＰｉとＰＤＥ５ｉ、又は他の追加活性薬剤との組合せであり得る。
【０１４４】
そのような薬剤（即ち、上記に定義されるような薬剤、及び／又は上記に定義されるような追加薬剤）は、アミノ酸配列、又はその化学誘導体であり得る。その物質は、有機化合物、又は他の化学品であってもよい。その薬剤は、ヌクレオチド配列（これは、センス配列若しくはアンチセンス配列であり得る）であってもよい。薬剤は、抗体であってもよい。
【０１４５】
このように、「薬剤」という用語には、限定されないが、天然であってもなくとも、任意の好適な源から入手され得るか又は産生され得る化合物が含まれる。　薬剤は、ペプチド、並びに、リード化合物のような有機低分子といった他の化合物を含み得る化合物のライブラリーから設計され得るか、又は入手され得る。
【０１４６】
例えば、薬剤は、天然物質、生物学的高分子、又は細菌、真菌、又は動物（特に哺乳動物）の細胞若しくは組織のような生物材料からつくられる抽出物、有機若しくは無機分子、合成剤、半合成剤、構造若しくは機能の模擬体、ペプチド、ペプチド模擬体、誘導化剤、完全なタンパク質から切り離されたペプチド、又は（例えば、ペプチド合成機を使用するか、又は組換え技術のいずれか、又はその組合せを使用するように）人工的に合成されたペプチド、組換え薬剤、抗体、天然若しくは非天然の薬剤、融合タンパク質又はその同等物、及びその突然変異体、誘導体、又は組合せ物であり得る。
【０１４７】
本明細書で使用されるように、「薬剤」という用語は、単一の実体であるか、又はそれは薬剤の組合せ物であり得る。
本発明の薬剤（本剤）は、酸付加塩若しくは塩基付加塩、又はそれらの溶媒和物のような製剤的に許容される塩の形態であり得て、それらの水和物も含まれる。好適な塩の概説については、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．， １９７７， ６６， １−１９を参照のこと。
【０１４８】
好適な酸付加塩は、無毒の塩を形成する酸から形成され、その例は、塩酸塩、臭酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、硝酸塩、リン酸塩、リン酸水素酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、コハク酸塩、糖酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、及びパモエート塩である。
【０１４９】
好適な塩基塩は、無毒の塩を形成する塩基から形成され、その例は、ナトリウム、カリウム、アルミニウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、及びジエタノールアミンの塩である。
【０１５０】
上記に定義されるような薬剤の製剤的に許容される塩は、この薬剤と所望される酸若しくは塩基の溶液を適宜一緒に混合することによって容易に調製され得る。この塩は溶液から沈殿して濾過により採取されるか、又は溶媒の蒸発により回収され得る。
【０１５１】
本剤は、多形の形態で存在し得る。
本剤は１つ以上の不斉炭素原子を含有する場合があり、従って、２種又はそれ以上の立体異性形態で存在する。薬剤がアルケニル若しくはアルケニレン基を含有する場合、シス（Ｅ）及びトランス（Ｚ）異性も起こり得る。本発明には、本剤の各立体異性体、さらに、適宜そのそれぞれの互変異性形態、並びにそれらの混合物が含まれる。
【０１５２】
ジアステレオマー又はシス及びトランス異性体の分離は、例えば、本剤又はその好適な塩若しくは誘導体の立体異性混合物の分別結晶化、クロマトグラフィー又はＨ．Ｐ．Ｌ．Ｃ．による従来技術によって達成され得る。薬剤の各エナンチオマーはまた、対応する光学的に純粋な中間体からか、又は好適なキラル支持体を使用する、対応ラセミ化合物のＨ．Ｐ．Ｌ．Ｃ．による分割によるか、又は対応ラセミ化合物の好適な光学活性の酸若しくは塩基との反応により適宜形成されるジアステレオマー塩の分別結晶化によっても製造され得る。
【０１５３】
本発明にはまた、本剤又はその製剤的に許容される塩のすべての好適な同位体変異物も含まれる。本剤又はその製剤的に許容される塩のすべての好適な同位体変異物は、少なくとも１つの原子が同じ原子数であるが通常天然に見出される原子量とは異なる原子量を有する原子により置き換えられているものとして定義される。本剤とその製剤的に許容される塩へ取込まれ得る同位体の例には、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、及び３６Ｃｌのような、それぞれ水素、炭素、窒素、酸素、リン、イオウ、フッ素、及び塩素の同位体が含まれる。本剤とその製剤的に許容される塩のある同位体変異物、例えば、３Ｈ又は１４Ｃのような放射活性同位体が取り込まれたものは、薬物及び／又は基質の組織分布試験において有用である。トリチウム化、即ち３Ｈと、炭素−１４、即ち１４Ｃの同位体は、その調製のし易さと検出可能性のために特に好ましい。さらに、重水素、即ち２Ｈのような同位体での置換は、より高い代謝安定性、例えば ｉｎ ｖｉｖｏ 半減期の増加、又は必要投与量の低減から生じるある種の治療有利性を提供し得るので、ある状況で好ましい場合がある。一般に、本剤とその製剤的に許容される塩の同位体変異物は、好適な試薬の適正な同位体変異物を使用して、慣用法により製造され得る。
【０１５４】
当業者には、本剤がプロドラッグから誘導され得ることが理解されよう。プロドラッグの例には、ある保護基を有し、それ自身では薬理活性を有さない場合があるが、ある場合には、（経口又は非経口のように）投与され、その後体内で代謝されて、薬理学的に活性である本剤を形成し得る実体が含まれる。
【０１５５】
例えば、Ｈ． Ｂｕｎｄｇａａｒｄ， エルセヴィエ、１９８５ による『プロドラッグの設計（Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ）』（この開示内容は参照により本明細書に組込まれる）に記載されるような「プロ部分」として知られる特定の部分が本剤の適正な官能基に配置される場合もあることがさらに理解されよう。そのようなプロドラッグも本発明の範囲内に含まれる。
【０１５６】
ＮＥＰｉ（及び、適宜、ＰＤＥ５ｉ化合物）に関連して本明細書で使用される「阻害剤」という用語は、「拮抗薬」という用語と相互交換可能であるとみなし得る。さらに、「内因性勃起プロセスを亢進させる」というフレーズは、「内因性勃起プロセスのアップレギュレーション」というフレーズと相互交換可能であるとみなし得る。
【０１５７】
（局所適用のような）ある種の適用では、本剤はまた、ＡＣＥ（アンジオテンシン変換酵素）阻害活性を示し得る。ＡＣＥ活性については本明細書の「実験」の項に示される。（特殊なタイプの患者へのような）ある種の適用では、そのような薬剤（即ち、ＡＣＥ阻害活性も示す薬剤）が経口投与に適さない場合がある。
【０１５８】
ある種の適用では、本発明剤はまた、ＥＣＥ（内皮変換酵素）阻害活性を示し得る。ＥＣＥアッセイに当技術分野でよく知られている。
医薬製剤
本発明の活性薬剤（即ち、ＮＥＰｉとその組合せ物）、その製剤的に許容される塩、及びいずれもの実体の製剤的に許容される溶媒和物は単独で投与され得るが、ヒトの治療では、一般に、意図される投与経路と標準的な製剤法に関して選択される好適な医薬賦形剤、希釈剤、又は担体と混合して投与されるものである。
【０１５９】
例えば、本発明の化合物、又はその塩若しくは溶媒和物は、錠剤、カプセル剤（軟ゲルカプセル剤を含む）、丸剤、エリキシル剤、溶液剤、又は懸濁液剤の形態で、経口、頬内、又は舌下で投与され得て、それは芳香剤又は着色剤を含有し得て、即時−、遅延−、改良−、又は持続−、二重−、又はパルス・デリバリーのような、又は制御−放出用であり得る。本発明の化合物はまた、海綿体内注射により投与され得る。本発明の化合物はまた、速分散性若しくは速溶解性の剤形によるか、又は高エネルギー分散物の形態でか、又は被覆された粒子として投与され得る。本発明の化合物に適した医薬製剤は、所望により被覆、又は非被覆の形態であり得る。
【０１６０】
そのような錠剤は、微結晶性セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸二塩基性カルシウム、グリシン、及びデンプン（好ましくは、トウモロコシ、ジャガイモ又はタピオカデンプン）のような賦形剤、グリコール酸ナトリウムデンプン、クロスカルメロースナトリウム、及び特定の複合珪酸塩のような崩壊剤、並びにポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＭＰＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチン及びアカシアのような造粒結合剤を含有し得る。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、及びタルクのような潤滑剤が含まれ得る。
【０１６１】
同様のタイプの固形組成物は、ゼラチンカプセルの充填剤としても利用され得る。この点で好ましい賦形剤には、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖、又は高分子量ポリエチレングリコールが含まれる。水性懸濁液及び／又はエリキシル剤では、本発明の化合物は、様々な甘味剤若しくは芳香剤、着色物質又は色素と、乳化剤及び／又は懸濁剤と、そして水、エタノール、プロピレングリコール及びゼラチン、及びそれらの組み合わせのような希釈剤と複合され得る。
【０１６２】
改良放出及びパルス放出の剤形は、即時放出剤形に付いて述べたような賦形剤と、放出速度調節剤として作用する追加の賦形剤を含有する場合があり、これは、この放出装置の本体上で被覆されているか、又はその中に包含される。放出速度調節剤には、これだけに限定されないが、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロース、酸化ポリエチレン、キサンタンガム、カルボマー（Ｃａｒｂｏｍｅｒ）、アンモニア−メタクリル酸コポリマー、水素化ヒマシ油、カルナウバロウ、パラフィンロウ、酢酸フタル酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メタクリル酸コポリマー、及びこれらの混合物が含まれる。改良放出及びパルス放出の剤形はまた、放出速度調節賦形剤の１つ又は組合せ物を含有し得る。放出速度調節賦形剤は、剤型の内部（即ちマトリックスの内部）、及び／又は剤形の上（即ち表面又はコーティング剤に）の両方に存在し得る。
【０１６３】
速分散性若しくは分解性投与製剤（ＦＤＤＦ）は、以下の成分を含有し得る：アスパルテーム、アセスルフェーム（ａｃｅｓｕｌｆａｍｅ）カリウム、クエン酸、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、二アスコルビン酸、アクリル酸エチル、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、メタクリル酸メチル、芳香ミント、ポリエチレングリコール、発煙シリカ、二酸化ケイ素、グリコール酸ナトリウムデンプン、ステアリルフマル酸ナトリウム、ソルビトール、キシリトール。ＦＤＤＦを記載するために本明細書で使用される「分散性若しくは分解性」という用語は、使用される薬物の溶解性に依存する。即ち、薬物が不溶性である場合は速分散性の剤形が製造され得て、薬物が可溶性である場合は速分解性の剤形が製造され得る。
【０１６４】
本発明の化合物はまた、非経口的に、例えば、海綿体内、静脈内、動脈内、腹腔内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内又は皮下に投与され得るか、又はそれらは注入若しくは注射の技術により投与され得る。そのような非経口投与では、それらは、他の物質、例えば、その溶液を血液と等張にするのに十分な塩若しくはブドウ糖を含有し得る無菌の水溶液の形態で最もよく使用される。この水溶液は、必要ならば、適切に（好ましくは、３〜９のｐＨへ）緩衝化されるべきである。好適な非経口製剤の無菌条件下での製造は、当業者によく知られた標準的な製剤技術により容易に達成される。
【０１６５】
ヒト患者への経口及び非経口投与では、本発明の化合物又はその塩若しくは溶媒和物の１日投与量は、通常、（単回用量若しくは分割用量で）１０〜５００ｍｇであろう。
【０１６６】
従って、例えば、本発明の化合物の錠剤若しくはカプセル剤は、適宜、単回又は２回又はそれより多い回数で投与される活性化合物の５ｍｇ〜２５０ｍｇを含有し得る。医師は、どんな場合でも、個々の患者に最も適している実際の投与量を決定するものであり、それは、特定の患者の年齢、体重、及び応答に応じて変化するものである。上記の投与量は、平均的な症例の例示である。当然ながら、より高いか又はより低い投与量の範囲が利益となる個別の事例があり得て、そのようなものも本発明の範囲内にある。当業者はまた、本発明によるＭＥＤの治療では、ＮＥＰｉ（及び、適正な場合は、ＰＤＥ５ｉ又は追加薬剤）化合物が「要求される」（即ち、必要とされるか又は所望される）ベースで単回用量として服用され得ることも理解されよう。
【０１６７】
錠剤製剤の例
一般に、錠剤製剤は、典型的には化合物（又はその塩）の約０．０１ｍｇ〜５００ｍｇを含有し得て、錠剤の充填重量は５０ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲に及び得る。１０ｍｇ錠の製剤の例を以下に示す：
成分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　％ｗ／ｗ
化合物の遊離酸、遊離塩基、又は塩　　　　１０．０００＊
ラクトース　　　　　　　　　　　　　　　６４．１２５
デンプン　　　　　　　　　　　　　　　　２１．３７５
クロスカルメロースナトリウム　　　　　　　３．００００
ステアリン酸マグネシウム　　　　　　　　　１．５００
＊この量は、典型的には、薬物の活性により調整される。
【０１６８】
錠剤は、標準法、例えば直接圧縮法、又は湿式若しくは乾式造粒法により製造される。錠剤の芯は適正な保護剤（ｏｖｅｒｃｏａｔｓ）で被覆され得る。
本発明の化合物／組成物はまた、鼻腔内又は吸入により投与することが可能であり、好便にも、加圧容器、ポンプ、スプレー又はネブライザーからの乾燥粉末吸入器若しくはエアゾールスプレーの形態において、好適な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ　１３４Ａ［商標］）又は１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ　２２７ＥＡ［商標］）のようなヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素、又は他の好適な気体の使用により、デリバリーされる。加圧エアゾールの場合、投与量単位は、目盛量をデリバリーするための栓を提供することによって決定され得る。加圧容器、ポンプ、スプレー又はネブライザーは、例えば、潤滑剤（例、トリオレイン酸ソルビタン）を追加して含有し得る、エタノール及び噴霧剤の混合物を溶媒として使用して、活性化合物の溶液若しくは懸濁液を含有し得る。吸入器若しくは通気器に使用される（例えば、ゼラチンから製造される）カプセル及びカートリッジは、本発明の化合物とラクトース若しくはデンプンのような好適な粉末基剤の粉末混合物を含有するように製剤化され得る。
【０１６９】
エアゾール若しくは乾燥粉末の製剤は、好ましくは、それぞれの目盛り量若しくは「パフ」が患者へデリバリーされる本発明の化合物の１〜５０ｍｇを含有するように設計される。エアゾールを用いた１日の全用量は１〜５０ｍｇの範囲であり、これは単回用量か、又はより通常は１日を通して分割された用量で投与され得る。
【０１７０】
本化合物はまた、アトマイザーによるデリバリー用に製剤化され得る。アトマイザー装置用の製剤は、可溶化剤、乳化剤、又は懸濁剤のような以下の成分を含有し得る：水、エタノール、グリセロール、ポリエチレングリコール、低分子量ポリエチレングリコール、塩化ナトリウム、フルオロカーボン、ポリエチレングリコールエーテル、トリオレイン酸ソルビタン、オレイン酸。
【０１７１】
他のやり方では、本化合物は、坐剤の形態で投与され得るか、又はそれは、ゲル、ヒドロゲル、ローション、溶液、クリーム、軟膏又は散布剤の形態で局所適用され得る。本発明の化合物、又はその塩若しくは溶媒和物はまた、皮膚投与され得る。本発明の化合物、又はその塩若しくは溶媒和物はまた、例えば皮膚パッチの使用により経皮的に投与され得る。それらはまた、眼、肺、又は直腸の経路により投与され得る。
【０１７２】
眼への使用では、本化合物は、等張で、ｐＨ調整された、無菌の生理食塩水の微細化懸濁液としてか、又は、好ましくは、等張で、ｐＨ調整された、無菌の生理食塩水の溶液として、所望により塩化ベンジルアルコニウムのような保存剤と組み合わせて、製剤化され得る。他のやり方では、それらは、ワセリンのような軟膏において製剤化され得る。
【０１７３】
皮膚への局所適用では、本発明の化合物、又はその塩若しくは溶媒和物は、例えば以下の１つ以上との混合物に懸濁又は溶解した活性化合物を含有する好適な軟膏剤として製剤化され得る：鉱油、流動パラフィン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス、及び水。他のやり方では、それは、例えば以下の１つ以上の混合物に懸濁又は溶解した好適なローション剤若しくはクリーム剤として製剤化され得る：鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリールアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、及び水。
【０１７４】
本化合物はまた、シクロデキストリンと組み合わせて使用され得る。シクロデキストリンは、薬物分子と封入及び非封入の複合体を形成することが知られている。薬物−シクロデキストリン複合体の形成は、薬物分子の溶解度、溶解速度、バイオアベイラビリティ、及び／又は安定特性を変化させる場合がある。薬物−シクロデキストリン複合体は、ほとんどの剤形及び投与経路に概して有用である。薬物との直接的な複合化に代わる手段として、シクロデキストリンは、補助添加剤として、例えば担体、希釈剤、又は可溶化剤として使用される場合がある。α−、β−及びγ−シクロデキストリンが最も一般的に使用され、好適な例がＷＯ−Ａ−９１／１１１７２、ＷＯ−Ａ−９４／０２５１８、及びＷＯ−Ａ−９８／５５１４８号に記載されている。
【０１７５】
一般に、ヒトでは、経口投与が好ましい経路であり、ＭＥＤでは最も簡便であり、海綿体内（ｉ．ｃ．）投与に関連した周知の欠点を回避する。典型的な男性のＭＥＤに好ましい経口投薬処方は、必要とされる場合、約１０ｍｇ〜５００ｍｇの医薬組成物である。この組成物がＮＥＰｉ及びＰＤＥ５ｉの組合せを含む場合、各化合物の２５ｍｇ〜２５０ｍｇが存在し得る。レシピエントが嚥下障害か又は経口投与後の薬物吸収障害に罹患している状況では、薬物は、非経口的、舌下、又は頬内で投与され得る。
【０１７６】
薬物動態、バイオアベイラビリティ
好ましくは、本発明の化合物（及び組合せ物）は、経口で生体利用可能である。経口バイオアベイラビリティは、経口投与された薬物のなかで体循環に到達するものの割合を意味する。薬物の経口バイオアベイラビリティを決定する要因は、溶解性、膜透過性、及び代謝安定性である。典型的には、経口バイオアベイラビリティを決定するには、最初に ｉｎ ｖｉｔｒｏ のスクリーニング・カスケードが、次いで ｉｎ ｖｉｖｏ の技術が使用される。
【０１７７】
可溶化は、胃腸管（ＧＩＴ）の水性内容物による薬物の溶解であり、ＧＩＴを模倣する適正なｐＨで実施される ｉｎ ｖｉｔｒｏ 溶解度の実験から予測され得る。好ましくは、本発明の化合物は、５０ｍｃｇ／ｍｌの最小溶解度を有する。溶解度は、ＡＤｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． ２３， ３−２５ に記載のような当技術分野で知られた標準法により決定され得る。
【０１７８】
膜透過性は、ＧＩＴの細胞を貫通する化合物の通過を意味する。親油性はこれを予測するときの重要な特質であり、有機溶媒と緩衝液を使用する ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｌｏｇ　Ｄ７．４測定により定義される。好ましくは、本発明の化合物は、−２〜＋４、より好ましくは−１〜＋２のＬｏｇ　Ｄ７．４を有する。ｌｏｇ　Ｄは、Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １９９０， ４２： １４４ に記載のような当技術分野で知られた標準法により決定され得る。
【０１７９】
ＣａＣｏ２のような細胞単層アッセイは、ｐ−糖タンパク質のような流出運搬体、いわゆるｃａｃｏ−２フラックスの存在下での好ましい膜透過性の予測に実質的に付け加わる。好ましくは、本発明の化合物は、２ｘ１０−６ｃｍｓ−１より大きい、より好ましくは、５ｘ１０−６ｃｍｓ−１より大きいｃａｃｏ−２フラックスを有する。ｃａｃｏフラックス値は、Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． １９９０， ７９， ５９５−６００ に記載のような当技術分野で知られた標準法により決定され得る。
【０１８０】
代謝安定性は、吸収プロセスの間に化合物を代謝するＧＩＴ若しくは肝臓の能力、つまり初回通過効果に関わる。ミクロソーム、肝細胞、等のようなアッセイ系が代謝感受性を予測する。好ましくは、実施例の化合物は、肝臓抽出物に匹敵するアッセイ系において０．５未満の代謝安定性を示す。アッセイ系及びデータ操作の例が Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ． Ｄｅｖｅｌ．， ２０１， ４， ３６−４４， Ｄｒｕｇ Ｍｅｔ． Ｄｉｓｐ．， ２０００， ２８， １５１８−１５２３ に記載されている。
【０１８１】
上記方法は相互に関連しているので、ある薬物がヒトにおいて経口的に生体利用可能であるというさらなる裏付けを、ｉｎ ｖｉｖｏ の動物実験により得ることができる。これらの試験では、個別にか又は混合物で化合物を経口ルートにより投与することによって、絶対バイオアベイラビリティが決定される。絶対値（吸収率）の決定には、静脈内ルートも利用される。動物における経口バイオアベイラビリティの評価の例は、Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ ７９， ７， ｐ５９５−６００ （１９９０） 及び Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ｖｏｌ １４， ｎｏ． ６ （１９９７） に記載のように、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔ． Ｄｉｓｐ．， ２００１， ２９， ８２−８７； Ｊ． Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ， １９９７， ４０， ８２７−８２９， Ｄｒｕｇ Ｍｅｔ Ｄｉｓｐ．， １９９９， ２７， ２２１−２２６ に見出し得る。
【０１８２】
化学合成法
典型的には、本発明による使用に適したＮＥＰｉ、ＰＤＥ５ｉ、及び他の追加活性化合物は、化学合成技術により製造される。
【０１８３】
本発明の薬剤若しくは標的、又はその変異体、相同体、誘導体、フラグメント又は模擬体は、その薬剤の全体若しくは部分を合成するための化学的な方法を使用して生成し得る。例えば、ペプチドは固相技術により合成され、樹脂から切り離され、調製用高速液体クロマトグラフィーにより精製することができる（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ （１９８３）『タンパク質の構造と分子の原理（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ）』ＷＨフリーマン社、ニューヨーク、ＮＹ）。合成ペプチドの組成はアミノ酸の分析若しくは配列決定により確定され得る（例えば、エドマン分解法；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， 同上）。
【０１８４】
本剤、又はその変異体、相同体、誘導体、フラグメント又は模擬体の直接合成は、様々な固相技術（Ｒｏｂｅｒｇｅ ＪＹ ｅｔ ａｌ （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９： ２０２−２０４）を使用して実施することが可能であり、例えば、ＡＢＩ　４３　１Ａペプチド合成機（パーキンエルマー）を使用して、製造業者により提供される指示書に従って、自動合成を達成し得る。さらに、本剤又はその一部を含んでなるアミノ酸配列は、直接合成の間に変更し得るか、及び／又は化学法を使用して、他のサブユニット又はその一部からの配列と結合させ、例えば、変異体ＮＥＰのような、変異体の薬剤若しくは標的を生成し得る。
【０１８５】
本発明の別の態様では、本剤の標的、又はその変異体、相同体、誘導体、フラグメント又は模擬体のコーディング配列が、当技術分野でよく知られている化学法（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ＭＨ ｅｔ ａｌ （１９８０） Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ ２１５−２３， Ｈｏｒｎ Ｔ ｅｔ ａｌ （１９８０） Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ ２２５−２３２ を参照のこと）を使用して、全体的若しくは部分的に合成され得る。
【０１８６】
模擬体
本明細書で使用されるように、「模擬体」という用語は任意の化学品に関連し、限定されないが、標的に対し基準薬剤と同じ定性的な活性若しくは効果を有するペプチド、ポリペプチド、抗体、又は他の有機化学品が含まれる。
【０１８７】
化学修飾
本発明の１つの態様では、本剤は、化学修飾された薬剤であり得る。
薬剤の化学修飾は、薬剤と標的間の水素結合相互作用、電荷相互作用、疎水性相互作用、ファン・デル・ワールス相互作用、又は双極子相互作用を増強するか又は減弱させる場合がある。
【０１８８】
１つの側面では、同定された薬剤が他の化合物の開発についてのモデル（例えば、鋳型）として作用し得る。
組換え法
典型的には、本発明のアッセイに使用の標的は、組換えＤＮＡ技術により製造され得る。
【０１８９】
アミノ酸配列
本明細書で使用されるように、「アミノ酸配列」という用語は、「ポリペプチド」という用語及び／又は「タンパク質」という用語と同義である。ある例では、「アミノ酸配列」という用語は、「ペプチド」という用語と同義である。ある例では、「アミノ酸配列」という用語は、「タンパク質」という用語と同義である。
【０１９０】
アミノ酸配列は、好適な供給源から単離されて調製され得るか、又はそれは合成的に創出され得るか、又はそれは組換えＤＮＡ技術の使用により調製され得る。
【０１９１】
ヌクレオチド配列
本明細書で使用されるように、「ヌクレオチド配列」という用語は、「ポリヌクレオチド」という用語と同義である。
【０１９２】
ヌクレオチド配列は、ゲノム又は合成、又は組換え起源のＤＮＡ若しくはＲＮＡであり得る。ヌクレオチド配列は二本鎖若しくは一本鎖であり得て、センス若しくはアンチセンス鎖、又はその組み合わせを表す。
【０１９３】
ある適用では、好ましくは、ヌクレオチド配列はＤＮＡである。
ある適用では、好ましくは、ヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技術（例えば、組換えＤＮＡ）の使用により製造される。
【０１９４】
ある適用では、好ましくは、ヌクレオチド配列はｃＤＮＡである。
ある適用では、好ましくは、ヌクレオチド配列は、この側面について天然に存在する形態と同一であり得る。
【０１９５】
当業者には、数多くの異なるヌクレオチド配列が遺伝コードの縮重性の結果として標的をコード化し得ることが理解されよう。
さらに、定常的な技術を使用して、本発明のヌクレオチド配列によりコード化される活性に実質的には影響を及ぼさないヌクレオチド置換に、標的が発現される特定宿主のコドン使用を反映させ得ることが理解されるべきである。従って、付帯の配列リストに示されるヌクレオチド配列に関連した「変異体」、「相同体」、又は「誘導体」という用語には、当該配列から１つ（以上）の核酸の置換、変異、修飾、置き換え、欠失、又はそれへの付加が含まれ、それにより生じたヌクレオチド配列は、本発明による機能標的（又は、前記薬剤がヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列を含む場合、本発明による薬剤さえ）をコード化する。
【０１９６】
上記に示されるように、配列相同性に関して言えば、本明細書に参照されるＮＥＰ配列に対して、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性が存在する。より好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の相同性が存在する。ヌクレオチド相同性の比較は、上記に記載のように実施され得る。好ましい配列比較プログラムは、上記のＧＣＧウィスコンシン・ベストフィットプログラムである。デフォルト・スコアリング・マトリックスは、それぞれ同一のヌクレオチドについては１０、それぞれのミスマッチについては−９の適合値を有する。デフォルト・ギャップ創出ペナルティは−５０であり、デフォルト・ギャップ伸張ペナルティは各ヌクレオチドにつき−３である。
【０１９７】
本発明にはまた、本明細書に示される配列、又はその変異体、フラグメント、又は誘導体、又は上記のいずれの相補体に対して選択的にハイブリダイズすることが可能であるヌクレオチド配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドの長さ、より好ましくは、少なくとも２０、３０、４０、又は５０ヌクレオチドの長さである。これらの配列は、診断キットにおけるように、プローブとして使用され得る。
【０１９８】
変異体／相同体／誘導体
本明細書で述べた特定のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列に加えて、本発明にはまた、その変異体、相同体及び誘導体の使用も含まれる。ここで、「相同性」という用語は、「同一性」と同等であり得る。
【０１９９】
本発明の文脈では、相同配列は、少なくとも７５、８５又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であり得るアミノ酸配列を包含すると考えられる。特に、相同性は、典型的には、ある活性について必須であることが知られている配列の領域に関して考慮されるべきである。相同性は類似性（即ち、類似した化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）に関しても考慮し得るが、本発明の文脈では、配列同一性に関して相同性を表現することが好ましい。
【０２００】
相同性比較は視察によるか、又はより通常は、容易に利用し得る配列比較プログラムを利用して実施され得る。これらの市販コンピュータ・プログラムは、２つ以上の配列間の相同性比率（％）を算出し得る。
【０２０１】
相同性比率（％）は、連続配列で算出され得る。即ち、一方の配列を他方の配列と並置し、一方の配列内の各アミノ酸を他方の配列内の対応アミノ酸と、１回１残基で直接比較する。これは「非ギャップ」並置と呼ばれる。典型的には、そのような非ギャップ並置は、比較的短い数の残基でのみ実施される。
【０２０２】
これはごく単純で首尾一貫した方法であるが、例えば、他の点では同一な配列の対でも、１個の挿入若しくは欠失により、後続のアミノ酸残基が並置から外れ、それにより、全体並置が実施されるときに相同性比率（％）が大きく減少する可能性があることを考慮していない。従って、ほとんどの配列比較法は、全体の相同性スコアを不当に不利にすることなく、可能な挿入及び欠失を考慮する最適な並置を生じるように設計されている。このことは、配列並置に「ギャップ」を挿入して局所の相同性の最大化を試みることによって達成される。
【０２０３】
しかしながら、これらのより複雑な方法では、並置で生じる各ギャップにつき「ギャップペナルティ」を割当てる。それで、同数の同一アミノ酸では、可能な限り少ないギャップを有する配列並置（２つの比較配列間のより高い関連性を反映する）のほうが、多くのギャップのある配列並置より高いスコアを達成することになる。「アフィンギャップコスト」は、典型的には、ギャップの存在に対して比較的高いコストを科し、ギャップ内の各後続残基にはより小さいペナルティを科すように使用される。これは、最も使用されるギャップスコアリング系である。当然ながら、高いギャップペナルティを科せば、より少ないギャップを有する最適並置を生じる。ほとんどの並置プログラムはギャップペナルティが改良されることを可能にする。しかしながら、そのような配列比較のソフトウェアを使用するときには、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧウィスコンシン・ベストフィット・パッケージを使用する場合、アミノ酸配列についてのデフォルトギャップペナルティは、１つのギャップにつき−１２であり、それぞれの伸張について−４である。
【０２０４】
故に、最大相同性比率（％）の算出には、ギャップペナルティを考慮した、最適並置を生み出すことが必要とされる。そのような並置を行うのに適したコンピュータ・プログラムは、ＧＣＧウィスコンシン・ベストフィット・パッケージ（ウィスコンシン大学、アメリカ；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２： ３８７）である。配列比較を実施し得る他のソフトウェアの例には、限定されないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９９ 同上−１８章を参照のこと）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４０３−４１０）及び、比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳセットが含まれる。ＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡはいずれもオフラインとオンライン検索で利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９９ 同上， ７−５８〜７−６０頁を参照のこと）。しかしながら、ＧＣＧベストフィット・プログラムを使用することが好ましい。「ＢＬＡＳＴ２配列」と呼ばれる新たなツールもまた、タンパク質及び核酸の配列を比較するのに利用し得る（ＦＥＭＳ ＭＩｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １９９９ １７４ （２）： ２４７−２５０； ＦＥＭＳ ＭＩｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １９９９ １７７ （１）： １８７−８、及び ｔａｔｉａｎａ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ を参照のこと）。
【０２０５】
最終相同性比率（％）は同一性により測定され得るが、並置法そのものは、典型的には、全か無かの対比較には基づかない。むしろ、化学的類似性又は進化距離に基づいたそれぞれの対合比較へスコアを割り当てる定率類似性スコアマトリックス（ｓｃａｌｅｄ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ）が一般に使用される。一般に使用されるそのようなマトリックスの例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（ＢＬＡＳＴプログラムセットのデフォルトマトリックス）である。ＧＣＧウィスコンシンプログラムは、一般に、公表デフォルト値か、もしあれば一般記号比較表のいずれかを使用する（詳しくは、使用者手引きを参照のこと）。ＧＣＧパッケージに対しては公表デフォルト値を使用し、他のソフトウェアの場合は、ＢＬＯＳＵＭ６２のようなデフォルトマトリックスを使用することが好ましい。
【０２０６】
ソフトウェアが最適並置を生み出したならば、相同性（％）、好ましくは配列同一性（％）を算出することが可能である。典型的には、ソフトウェアは、配列比較の一部としてこれを実行し、数的結果を作成する。
【０２０７】
配列はまた、サイレント変化をもたらし、機能上は同一の物質をもたらす、アミノ酸の欠失、挿入又は置換を有する場合がある。物質の二次結合活性が保たれる限りは、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性における類似に基づいて、意図的なアミノ酸の置換がなされ得る。例えば、負電荷のアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸；陽電荷のアミノ酸にはリジン及びアルギニンが含まれ、そして、同様の親水性の数値を有する、電荷のない極性ヘッドをもったアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンが含まれる。
【０２０８】
保守的な置換は、例えば、以下の表によりなし得る。第二カラムの同一ブロックにあるアミノ酸、そして好ましくは、第三カラムの同一ラインにあるアミノ酸は、互いに置換され得る：
【０２０９】
【表５】
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本発明にはまた、相同置換が起こり得ることが含まれる（本明細書では、置換及び置き換えは、ある既存アミノ酸の他の残基との相互交換を意味するために使用される）。即ち、塩基性には塩基性、酸性には酸性、極性には極性、等のような類似物同士の置換である。非相同置換も起こり得る。即ち、ある群の残基から別の群の残基への置換、又は他のやり方では、オルニチン（以下、Ｚと呼ぶ）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下、Ｂと呼ぶ）、ノルロイシンオルニチン（以下、Ｏと呼ぶ）、ピリニルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン及びフェニルグリシンのような非天然アミノ酸の包含も伴う。
【０２１０】
置換はまた非天然アミノ酸によってもなし得るが、それには、α＊−及びα−二置換＊アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸＊、乳酸＊、トリフルオロチロシン＊、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｉ−フェニルアラニン＊のような天然アミノ酸のハロゲン化誘導体、Ｌ−アリル−グリシン＊、β−アラニン＊、Ｌ−α−アミノ酪酸＊、Ｌ−γ−アミノ酪酸＊、Ｌ−α−アミノイソ酪酸＊、Ｌ−ε−アミノカプロン酸＃、７−アミノヘプタン酸＊、Ｌ−メチオニンスルホン＃＊、Ｌ−ノルロイシン＊、Ｌ−ノルバリン＊、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン＊、Ｌ−ヒドロキシプロリン＃、Ｌ−チオプロリン＊、４−メチル−Ｐｈｅ＊、ペンタメチル−Ｐｈｅ＊、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）＃、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）＊、Ｌ−Ｐｈｅ（４−イソプロピル）＊、Ｌ−Ｔｉｃ（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸）＊、Ｌ−ジアミノプロピオン酸＃及びＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）＊のようなフェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体が含まれる。＊の表記は誘導体の疎水性を示すために（相同若しくは非相同置換に関連して）上記の目的で利用した。これにに対し、＃は誘導体の親水性を示すために利用した。＃＊は、両親媒性の特性を示す。
【０２１１】
変異体のアミノ酸配列には、配列の２つのアミノ酸残基間に挿入され得る好適なスペーサー基が含まれる場合があるが、それには、メチル、エチル、又はプロピル基のようなアルキル基、さらに、グリシン又はβ−アラニン残基のようなアミノ酸のスペーサーが含まれる。さらなる変異の形態は、当業者によく理解されているように、ペプトイド形態である１つ以上のアミノ酸残基の存在を伴う。疑念を回避すれば、「ペプトイド（ｐｅｐｔｏｉｄ）形態」は、α−炭素の置換基がα−炭素ではなく残基の窒素原子上に存在する、変異アミノ酸残基を意味するために使用される。ペプトイド形態のペプチドを製造する方法は当技術分野で知られている。例えば、Ｓｉｍｏｎ ＲＪ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ （１９９２） ８９ （２０）， ９３６７−９３７１ 及び Ｈｏｒｗｅｌｌ ＤＣ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （１９９５） １３ （４）， １３２−１３４。
【０２１２】
ハイブリダイゼーション
本発明にはまた、本明細書に提示される標的へ、本剤がアンチセンス配列であるかのようにハイブリダイズし得る配列の使用も含まれる。
【０２１３】
本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション」という用語には、「核酸の鎖が塩基対合を介して相補的な鎖と結合する方法」、並びにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術において実行されるような増幅の方法が含まれる。
【０２１４】
本明細書に提示されるヌクレオチド配列、又はその相補体へ選択的にハイブリダイズし得る本発明のヌクレオチド配列は、一般に、本明細書に提示される対応する相補ヌクレオチド配列に対し、少なくとも２０、好ましくは少なくとも２５若しくは３０、例えば少なくとも４０、６０、又は１００以上の連続したヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５若しくは９０％、及び、より好ましくは少なくとも９５％若しくは９８％相同である。
【０２１５】
「選択的にハイブリダイズし得る」という用語は、ヌクレオチド配列が、プローブとして使用される場合、標的ヌクレオチド配列がバックグラウンドより有意に高いレベルでそのプローブへハイブリダイズすることが見出される条件の下で使用されることを意味する。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、例えば、スクリーニングを受けるｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡの中に存在する他のヌクレオチド配列のために起こり得る。この事象では、バックグラウンドは、プローブとライブラリーの非特異ＤＮＡメンバーとの間の相互作用により産生される、標的ＤＮＡについて観察される特異的相互作用の１／１０未満、好ましくは１／１００未満の強さのシグナルレベルを含意する。相互作用の強度は、例えば、プローブを３２Ｐで放射標識することによって、測定され得る。
【０２１６】
ハイブリダイゼーション条件は、Ｂｅｒｇｅｒ と Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７，『分子クローニング技術の手引き（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）』Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ １５２， アカデミック・プレス、サンディエゴ、ＣＡ）に教示されるように、核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づき、以下に説明されるように、定義された「ストリンジェンシー」を与える。
【０２１７】
典型的には、最大ストリンジェンシーは約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５度低い）で生じ；高ストリンジェンシーはＴｍより約５℃〜１０℃低いところで；中間ストリジェンシーはＴｍより約１０℃〜２０℃低いところで；低ストリンジェンシーはＴｍより約２０℃〜２５℃低いところで生じる。当業者に理解されるように、同一のヌクレオチド配列を同定するか又は検出するには最大ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションが使用され得るのに対し、類似又は関連のポリヌクレオチド配列を同定するか又は検出するには中間（又は低）ストリンジェンシーハイブリダイゼーションが使用され得る。
【０２１８】
好ましい側面では、本発明は、本発明のヌクレオチド配列へストリンジェント条件（例えば、６５℃及び０．１ｘＳＳＣ｛１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，０．０１５Ｍ　クエン酸Ｎａ３，ｐＨ７．０｝）の下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を包含する。本発明のヌクレオチド配列が二本鎖である場合、二本鎖の両鎖が、個別であるか又は組合せて、本発明により含まれる。ヌクレオチド配列が一本鎖である場合、そのヌクレオチド配列の相補配列も本発明の範囲内に含まれると理解されるべきである。
【０２１９】
本発明の配列に対し１００％相同ではないが本発明の範囲に含まれるヌクレオチド配列は数多くのやり方で入手され得る。本明細書に記載される配列の他の変異体は、例えば、ある範囲の供給源からつくられるＤＮＡライブラリーをプローブすることによって得ることが可能である。さらに、哺乳動物の細胞（例えば、ラット、マウス、ウシ、及び霊長類の細胞）に見出される、他のウイルス／細菌、又は細胞の相同体、特に細胞の相同体を得ることが可能であり、そのような相同体とそのフラグメントは、一般に、本明細書にリストされる配列の中に示される配列へ選択的にハイブリダイズすることが可能であろう。そのような配列は、中位〜高ストリンジェンシーの条件下で、他の動物種由来のゲノムＤＮＡライブラリーからつくられるｃＤＮＡライブラリーをプローブすること、及び、本明細書に示されるヌクレオチド配列の全部もしくは一部を含んでなるプローブでそのようなライブラリーをプローブすることによって得られる場合がある。本発明のアミノ酸及び／又はヌクレオチド配列の種相同体及び対立遺伝子変異体を得るにも同様の考察が適用される。
【０２２０】
変異体と系統／種相同体は、本発明の配列内の配列を標的指向するために設計されたプライマーを使用する縮重ＰＣＲを使用しても入手され得る。例えば、いくつかの変異体／相同体由来のアミノ酸配列を並置することによって、保存配列を予測し得る。配列並置は当業者に知られたコンピュータ・ソフトウェアを使用して実施され得る。例えば、ＧＣＧウィスコンシン・パイルアップ（ＰｉｌｅＵｐ）プログラムが広く使用されている。縮重ＰＣＲに使用されるプライマーは１つ以上の縮重位置を含有し、単一配列プライマーのある配列を既知配列に対してクローン化するのに使用されるものより低いストリンジェンシー条件で使用される。
【０２２１】
他のやり方では、本発明の配列リストの配列番号２に示されるヌクレオチド配列のような、特性決定された配列の部位突然変異誘発により入手され得る。これは、ヌクレオチド配列が発現される特有の宿主細胞へのコドン選好性を最適化するためにサイレントコドン変化が配列へ必要とされる場合に有用であり得る。制限酵素認識部位を導入するか、又はヌクレオチド配列によりコード化されるタンパク質の活性を変化させるには、他の配列変化が所望され得る。
【０２２２】
本発明のヌクレオチド配列は、プライマー（例、ＰＣＲプライマー）、他の増幅反応用のプライマー、プローブ（例えば、放射標識若しくは非放射標識ラベルを使用する慣用法により明示ラベルで標識化された）を産生するために使用され得るか、又はヌクレオチド配列はベクターへクローン化され得る。そのようなプライマー、プローブ、及び他のヌクレオチド配列は、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、例えば少なくとも２５、３０、又は４０ヌクレオチドの長さであり、本明細書に使用されるような本発明のヌクレオチド配列にも含まれる。
【０２２３】
本発明によるＤＮＡポリヌクレオチド及びプローブのようなヌクレオチド配列は、組換え的、合成的、又は当業者に利用可能な任意の手段により生成され得る。それらはまた標準技術によりクローン化され得る。
【０２２４】
一般に、プライマーは、所望の核酸配列を１回に１ヌクレオチドを段階的に製造する合成手段により生成され得る。自動化技術を使用してこれを達成する技術は当技術分野で容易に利用可能である。
【０２２５】
一般に、より長いヌクレオチド配列は、組換え手段、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を使用して生成され得る。これには、クローン化することが所望される標的配列の領域に隣接する（例えば、約１５〜３０ヌクレオチドの）プライマーの対をつくる工程、動物若しくはヒトの細胞から得られるｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡにこのプライマーを接触させる工程、所望の領域の増幅をもたらす条件の下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施する工程、増幅されたフラグメントを（例えば、反応混合物をアガロースゲルで精製することによって）単離する工程、及び増幅されたＤＮＡを回収する工程が伴う。このプライマーは、増幅されたＤＮＡが好適なベクターへクローン化され得るように好適な制限酵素認識部位を含有するように設計され得る。
【０２２６】
遺伝コードに内在する縮重性により、同じであるか又は機能的に同等なアミノ酸配列を実質的にコード化する他のＤＮＡ配列を使用して標的配列をクローン化し、発現させることが可能である。当業者に理解されるように、ある種の発現系では、天然に存在しないコドンを有する標的配列を生成することが有利である場合がある。例えば、標的発現の速度を高めたり、天然に存在する配列から産生される転写物より長い半減期のような望ましい特性を有する組換えＲＮＡ転写物を産生するために、特有の原核若しくは真核宿主により選好されるコドン（Ｍｕｒｒａｙ Ｅ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １７： ４７７−５０６）が選択され得る。
【０２２７】
発現ベクター
標的として使用されるか又は標的を発現させるためのヌクレオチド配列は、複製可能な組換えベクターへ取込まれ得る。このベクターは、適合する宿主細胞において複製し、それからヌクレオチド配列を発現するために使用され得る。発現は、プロモーター／エンハンサー及び他の発現調節シグナルを包含するコントロール配列を使用して制御され得る。原核プロモーターと真核細胞で機能的なプロモーターが使用され得る。組織特異的又は刺激特異的なプロモーターを使用し得る。上記に記載した２つ以上の異なるプロモーター由来の配列要素を含んでなるキメラプロモーターも使用され得る。
【０２２８】
ヌクレオチド配列の発現により宿主の組換え細胞によって産生されるタンパク質は、その配列及び／又は使用されるベクターに依存して、分泌されるか又は細胞内に閉じ込められる場合がある。特定の原核若しくは真核の細胞膜を通した、配列をコード化する物質の分泌を指令するシグナル配列の付いたコーディング配列を設計し得る。
【０２２９】
融合タンパク質
標的アミノ酸配列は、例えば抽出及び精製を促進するために、融合タンパク質として産生される場合がある。融合タンパクパートナーの例には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合及び／又は転写活性化ドメイン）及びβ−ガラクトシダーゼが含まれる。また、融合タンパク配列の除去を可能にするために、融合タンパクパートナーと注目のタンパク配列との間にタンパク分解部位を包含することも好便であり得る。好ましくは、融合タンパク質は、標的の活性を妨害しない。
【０２３０】
融合タンパク質は、本発明の物質へ融合する抗原若しくは抗原決定基を含む場合がある。この態様では、融合タンパク質は、免疫系の全般的な刺激を提供するという意味でアジュバントとして作用し得る物質を含んでなる、天然に存在しない融合タンパク質であり得る。抗原又は抗原決定基は、物質のアミノ若しくはカルボキシ末端のいずれか一方へ付着され得る。
【０２３１】
本発明のもう１つの態様では、融合タンパク質をコード化するために、アミノ酸配列が異種の配列へ連結され得る。例えば、物質の活性に影響を及ぼし得る薬剤についてのペプチドライブラリーのスクリーニングでは、市販の抗体により認識される異種エピトープを発現するキメラ物質をコード化することが有用であり得る。
【０２３２】
抗体
本発明の１つの態様では、本剤が抗体であり得る。さらに、又は別のやり方では、標的が抗体であり得る。さらに、又は別のやり方では、標的を検出する手段が抗体であり得る。
【０２３３】
抗体は、本発明の物質を用いた免疫化か又はファージ・ディスプレイ・ライブラリーを使用することのような、標準技術により産生され得る。
本発明の目的では、「抗体」という用語には、反対に特定されなければ、限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生されるフラグメント、並びにそれらの模擬体が含まれる。そのようなフラグメントには、標的物質への結合活性を保持する、完全抗体のフラグメント、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）２フラグメント、並びに単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、融合タンパク質、及び抗体の抗原結合部位を含む他の合成タンパク質が含まれる。さらに、抗体とそのフラグメントは、ヒト化抗体であり得る。中和抗体、即ち、ポリペプチド物質の生物学的活性を阻害する抗体は、診断薬及び治療薬に特に好ましい。
【０２３４】
ポリクローナル抗体が所望される場合、選択される哺乳動物（例、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、など）を、本発明の同定される薬剤及び／又は物質から得られるエピトープを担う免疫原性ポリペプチドで免疫化する。宿主の種に応じて、免疫学的な応答を増加させるために、様々なアジュバントが使用され得る。そのようなアジュバントには、限定されないが、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのような鉱質ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、アオガイヘモシアニン、及びジニトロフェノールのような界面活性物質が含まれる。ＢＣＧ（カルメット−ゲラン菌）とコリネバクテリウム・パルブムは潜在的に有用なヒトのアジュバントであり、免疫低下した個体へ精製ポリペプチド物質が投与される場合に、全身の防御を刺激する目的で利用され得る。
【０２３５】
既知の方法により、免疫化した動物の血清を採取し、処理する。本発明の同定される薬剤及び／又は物質から得られるエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する血清が他の抗原への抗体を含有するならば、このポリクローナル抗体は免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製し得る。ポリクローナル抗血清を産生させ、処理するための技術は当技術分野で知られている。そのような抗体が創製されるように、本発明はまた、動物若しくはヒトにおける免疫原として使用するための、本発明のポリペプチド、又は別のポリペプチドへハプテン化したそのフラグメントを提供する。
【０２３６】
本発明の同定される薬剤及び／又は物質から得られるエピトープに対して指向されるモノクローナル抗体もまた、当業者により容易に産生され得る。よく知られているのは、ハイブリドーマによりモノクローナル抗体を産生する一般法である。不死の抗体産生細胞系は、細胞融合、及び腫瘍化ＤＮＡを用いたＢリンパ球の直接的な形質転換、又はエプシュタイン−バー・ウイルスを用いたトランスフェクションのような他の技術によっても創出され得る。軌道（ｏｒｂｉｔ）エピトープに対して産生されるモノクローナル抗体のパネルは、様々な特性、即ちアイソタイプやエピトープ親和性について候補選択され得る。
【０２３７】
本発明の物質、及び／又は同定された薬剤へのモノクローナル抗体は、連続細胞系による培養での抗体分子の産生をもたらす任意の技術を使用して調製され得る。これには、限定されないが、はじめに Ｋｏｅｈｌｅｒ と ＭＩｌｓｔｅｉｎ （１９７５ Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５−４９７） により記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒ ｅｔ ａｌ （１９８３） Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４： ７２； Ｃｏｔｅ ｅｔ ａｌ （１９８３） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８０： ２０２６−２０３０）、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｔｅ ｅｔ ａｌ （１９８５）『モノクローナル抗体と癌治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）』アラン・Ｒ．リス社、ｐｐ ７７−９６）が含まれる。さらに、「キメラ抗体」の産生、適正な抗原特異性と生物学的活性を有する分子を得るためにマウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子へスプライスすることのために開発された技術を使用し得る（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ （１９８４） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１： ６８５１−６８５５； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１２： ６０４−６０８； Ｔａｋａｄａ ｅｔ ａｌ （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１４： ４５２−４５４）。他のやり方では、単鎖抗体の産生について記載された技術（米国特許第４，９４６，７７９号）が特定の単鎖抗体の物質を産生するために採用され得る。
【０２３８】
同定される薬剤及び／又は物質から得られるエピトープに対して向けられた、モノクローナルとポリクローナルの両方の抗体は、診断において特に有用であり、中和抗体は、受動免疫療法に有用である。特にモノクローナル抗体は、抗イディオタイプ抗体を高めるために使用され得る。抗イディオタイプ抗体は、保護が所望される物質及び／又は薬剤の「内部イメージ」を担う免疫グロブリンである。抗イディオタイプ抗体を高める技術は当技術分野で知られている。これら抗イディオタイプ抗体は治療にも有用であり得る。
【０２３９】
抗体はまた、Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ （１９８９， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８６： ３８３３−３８３７）、及び、Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ 及び Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ （１９９１； Ｎａｔｕｒｅ ３４９： ２９３−２９９） に開示されるように、リンパ球の集団において ｉｎ ｖｉｖｏ 産生を誘導するか、又はきわめて特異的な結合試薬の組換え免疫グロブリンライブラリー若しくはパネルを候補選択することによっても産生され得る。
【０２４０】
当該物質に対して特定の結合部位を含有する抗体フラグメントも産生され得る。例えば、そのようなフラグメントには、限定されないが、抗体分子のペプシン消化により産生され得るＦ（ａｂ’）２フラグメントと、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって産生され得るＦａｂフラグメントが含まれる。他のやり方では、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にするＦａｂ発現ライブラリーが構築され得る（Ｈｕｓｅ ＷＤ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６： １２７５−１２８１）。
【０２４１】
レポーター
本発明のアッセイ法（並びに候補選択）では多種多様なレポーターが使用される場合があり、好ましいレポーターは、好便にも（例えば、分光法により）検出可能なシグナルを提供する。例を挙げると、レポーター遺伝子は、光吸収特性を変化させる反応を触媒する酵素をコード化し得る。
【０２４２】
レポーター分子の例には、限定されないが、β−ガラクトシダーゼ、インベルターゼ、グリーン蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール、アセチルトランスフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、エクソグルカナーゼ、及びグルコアミラーゼが含まれる。他のやり方では、放射標識又は蛍光タグ標識されたヌクレオチドを新生転写物へ取り込むことが可能であり、次いで、これはオリゴヌクレオチドプローブへ結合したときに同定される。
【０２４３】
１つの好ましい態様では、レポーター分子の産生がβ−ガラクトシダーゼのようなレポーター遺伝子産物の酵素活性により測定される。
標的の発現を、そのタンパク質に特異的なポリクローナル若しくはモノクローナル抗体のいずれかを使用するようにして、検出及び測定するための多種多様なプロトコールが当技術分野で知られている。その例には、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が含まれる。ポリペプチド上の２つの非干渉性エピトープへ反応するモノクローナル抗体を利用する２部位モノクローナル抗体ベース免疫アッセイが好ましいが、競合結合アッセイも利用され得る。こういった他のアッセイについては、特に、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒ ｅｔ ａｌ （１９９０，『血清学の方法、実験マニュアル（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）』ＡＰＳプレス、セントポール、ＭＮ）と Ｍａｄｄｏｘ ＤＥ ｅｔ ａｌ （１９８３， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １５ ８： １２１ １）に記載されている。
【０２４４】
多種多様な標識とコンジュゲーション技術が当業者に知られていて、様々な核酸及びアミノ酸のアッセイに使用され得る。標的ポリヌクレオチド配列を検出するために標識ハイブリダイゼーション又はＰＣＲプローブを産生する手段には、標識ヌクレオチドを使用する、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、又はＰＣＲ増幅が含まれる。他のやり方では、コーディング配列又はその一部がｍＲＮＡプローブを産生するためのベクターへクローン化され得る。そのようなベクターは当技術分野で知られ、市販されていて、Ｔ７、Ｔ３、又はＳＰ６のような適正なポリメラーゼと標識オリゴヌクレオチドの追加によりｉｎ ｖｉｔｒｏ でＲＮＡプローブを合成するために使用され得る。
【０２４５】
ファルマシアバイオテク（ピスカタウェイ、ＮＪ）、プロメガ（マジソン、ＷＩ）及びＵＳバイオケミカル社（クリーブランド、ＯＨ）のような数多くの企業がこれらの方法の市販キット及びプロトコールを供給する。好適なレポーター分子若しくは標識には、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、又は発色剤、並びに基質、補因子、阻害剤、磁気粒子、等が含まれる。そのような標識の使用を教示する特許には、ＵＳ−Ａ−３８１７８３７；ＵＳ−Ａ−３８５０７５２；ＵＳ−Ａ−３９３９３５０；ＵＳ−Ａ−３９９６３４５；ＵＳ−Ａ−４２７７４３７；ＵＳ−Ａ−４２７５１４９、及びＵＳ−Ａ−４３６６２４１が含まれる。また、組換え免疫グロブリンはＵＳ−Ａ−４８１６５６７に示されるように産生され得る。
【０２４６】
特定分子の発現を定量する追加の方法には、ヌクレオチドの放射標識化（Ｍｅｌｂｙ ＰＣ ｅｔ ａｌ １９８３ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １５９： ２３５−４４）若しくはビオチニル化（Ｄｕｐｌａａ Ｃ ｅｔ ａｌ １９９３ Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２２９−３６）、コントロール核酸の同時増幅、及び、実験結果が内挿される標準曲線が含まれる。多数のサンプルの定量は、注目のオリゴマーが様々な希釈で提示され、分光測定若しくは熱量測定の応答が迅速な定量化を与えるＥＬＩＳＡフォーマットでアッセイを実行することによって加速化され得る。
【０２４７】
マーカー遺伝子発現の存在／不在は、注目の遺伝子が存在していることも示唆するが、その存在と発現を確かめるべきである。例えば、ヌクレオチド配列がマーカー遺伝子配列の内部に挿入された場合、それを含有する組換え細胞は、マーカー遺伝子機能の不在により同定され得る。他のやり方では、マーカー遺伝子が、標的コーディング配列とタンデムに、単一プロモーターの制御下に配置され得る。誘導若しくは選択に反応してマーカー遺伝子が発現されると、通常、標的遺伝子も同様に発現される。
【０２４８】
他のやり方では、標的のコーディング配列を含有し、その標的コーディング領域を発現する宿主細胞が当業者に知られた多種多様な方法により同定され得る。これらの方法には、限定されないが、ＤＮＡ−ＤＮＡ若しくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションとタンパク質のバイオアッセイ若しくはイムノアッセイ技術が含まれ、それには核酸若しくはタンパク質を検出、及び／又は定量するための膜ベース、溶液ベース、又はチップベースの技術が含まれる。
【０２４９】
診断薬
本発明はまた、診断組成物、又はＭＥＤへの素因の検出キットを提供する。この点で、組成物又はキットは、１つ以上の標的の試験サンプルにおける存在、又は不在でさえも示すことが可能である実体を含む。好ましくは、試験サンプルは、陰茎から得られる。
【０２５０】
例を挙げると、診断組成物は、本明細書に示されるヌクレオチド配列、又はその変異体、相同体、フラグメント、又は誘導体のいずれか１つ、又はこのヌクレオチド配列のいずれか１つの全部若しくは一部へハイブリダイズすることが可能な配列を含み得る。
【０２５１】
疾患の診断の基礎を提供するには、標的からの正常値若しくは標準値が確定されるべきである。このことは、動物又はヒトのいずれかの正常被検者から採取した体液若しくは細胞抽出物を、当技術分野でよく知られている複合体形成に適した条件の下で、標的への抗体と組み合わせることによって達成され得る。標準的な複合体形成の量は、既知量の抗体が既知濃度の精製された標的と組み合わされる陽性対照の希釈系列とそれを比較することによって定量され得る。従って、正常サンプルから得られる標準値が、潜在的にＭＥＤに罹患する可能性がある被検者由来のサンプルから得られる数値と比較され得る。標準値と被検者の数値のずれにより病態の存在が確かめられる。
【０２５２】
標的そのもの、又はその一部が診断及び／又は治療化合物の基礎となり得る。診断の目的には、ＭＥＤが疑われる病態、障害、又は疾患における遺伝子の発現を検出して定量するために標的ポリヌクレオチド配列が使用され得る。
【０２５３】
標的の発現から生じるＭＥＤの診断にはポリヌクレオチド配列をコード化する標的が使用され得る。例えば、標的発現の異常を検出するためには、生検又は剖検又は体液由来の組織のハイブリダイゼーション若しくはＰＣＲアッセイにおいて、標的をコード化するポリヌクレオチド配列が使用され得る。そのような定性若しくは定量法の形態には、サザン若しくはノーザン分析、ドットブロット、又は他の膜ベース技術；ＰＣＲ技術；ディップスティック、ピン若しくはチップ技術；及び、ＥＬＩＳＡ又は他の複数サンプル形式技術が含まれる。これらの技術はいずれも当技術分野でよく知られていて、事実、多くの市販診断キットの基礎となっている。
【０２５４】
そのようなアッセイは、特有の治療方式の効力を評価するために特別設計され得て、動物試験、臨床治験、又は個別患者の治療のモニタリングに使用され得る。疾患の診断の基礎を提供するには、標的発現の正常若しくは標準プロフィールが確立されるべきである。このことは、動物又はヒトのいずれかの正常被検者から採取した体液若しくは細胞抽出物を、ハイブリダイゼーション若しくは増幅に適した条件の下で、標的又はその一部と組み合わせることによって達成される。標準的なハイブリダイゼーションは、正常被検者から得られる数値を、既知量の精製された標的が使用されるのと同一の実験で実施される陽性対照の希釈系列と比較することによって定量され得る。正常サンプルから得られる標準値を、標的コーディング配列の発現に関連した障害若しくは疾患に潜在的に罹患する可能性がある被検者由来のサンプルから得られる数値と比較し得る。標準値と被検者の数値のずれにより病態の存在を確かめる。疾患が確かめられれば、既存の治療薬剤を投与し、治療のプロフィール又は種々の数値が作成され得る。最後に、このアッセイを定期的なベースで繰り返し、その数値が正常若しくは標準パターンの方へ進展するか又は復帰するかを評価し得る。数日又は数ヶ月の期間に及ぶ治療の効果を示すには、連続治療プロフィールが使用され得る。
【０２５５】
このように、１つの側面では、本発明は、例えばＭＥＤにおける標的レベルを検出して定量するための診断薬として使用され得る、標的ポリペプチド、又はその変異体、相同体、フラグメント、又は誘導体の使用に関する。
【０２５６】
本発明は、さらに、陽性対照として使用され得る精製標的と抗標的抗体を含んでなる、細胞及び組織中の標的を検出するための診断アッセイ及びキットを提供する。そのような抗体は、標的タンパク質の発現、又はその欠失、又は変異体、相同体、フラグメント、又は誘導体の発現に関連した病的状態若しくは病態を検出するための溶液ベース、膜ベース、又は組織ベースの技術に使用され得る。
【０２５７】
アッセイ法
診断用の組成物及び／又は方法及び／又はキットが以下の技術において使用され得て、限定されないが、それには競合及び非競合アッセイ、ラジオイムノアッセイ、サンドイッチアッセイ、免疫放射測定アッセイ、ドットブロット、ＥＬＩＳＡを含む酵素結合アッセイ、マイクロタイタープレート、尿若しくは血液の迅速モニタリングに用いる抗体コートの紙片若しくはディップスティック、免疫組織化学、及び免疫細胞化学が含まれる。
【０２５８】
例を挙げると、免疫組織化学キットは、ＮＥＰ活性の性器組織における定位にも使用され得る。この免疫組織化学キットは、研究と臨床の両方の目的に使用され得る、光学顕微鏡と電子顕微鏡の両方を使用して組織切片及び培養細胞においてＮＥＰを定位することを可能にする。そのような情報は、ＭＥＤの検出、及び／又は予防、及び／又は治療において、診断と可能ならば治療の目的に有用であろう。それぞれのキットについて、アッセイの範囲、感度、正確性、信頼性、特異性、及び再現性を確定する。アッセイ内及びアッセイ間の偏差を、置換若しくは活性の標準曲線上の２０％、５０％、及び８０％の点で確定する。
【０２５９】
プローブ
本発明のもう１つの側面は、標的コーディング領域か又は対立遺伝子のような緊密に関連した分子をコード化するゲノム配列を含むポリヌクレオチド配列を検出することが可能である、核酸ハイブリダイゼーション若しくはＰＣＲプローブ（特に、選択的に選択することが可能であるプローブ）の提供である。このプローブの特異性（即ち、それが高度保存、保存、非保存の領域若しくはドメインのいずれから誘導されるかということ）と、ハイブリダイゼーション若しくは増幅のストリンジェンシー（高い、中位、又は低い）により、天然に存在する標的コーディング配列、又は関連配列だけがこのプローブにより同定されるのかが決定される。関連核酸配列を検出するためのプローブは、標的ファミリーメンバーの保存若しくは高度保存ヌクレオチド領域から選択され、そのようなプローブは縮重プローブのプールにおいて使用され得る。同一の核酸配列を検出するためか、又は最大の特異性が所望される場合、核酸プローブは、標的ポリヌクレオチドの非保存ヌクレオチド領域若しくはユニーク領域から選択される。本明細書で使用されるように、「非保存ヌクレオチド領域」という用語は、本明細書に開示される標的コーディング配列にユニークであって、関連するファミリーメンバーでは生じないヌクレオチド領域を意味する。
【０２６０】
ＵＳ−Ａ−４６８３１９５、ＵＳ−Ａ−４８００１９５、及びＵＳ−Ａ−４９６５１８８号に記載のようなＰＣＲは、標的配列に基づいたオリゴヌクレオチドの追加の使用を提供する。そのようなオリゴマーは概して化学的に合成されるが、それらは酵素的に産生され得るか、又は組換えの供給源からも生成され得る。一般に、オリゴマーは２つのヌクレオチド配列を含み、一方はセンスの配向（５’→３’）で他方はアンチセンスの配向（３’←５’）であり、特定の遺伝子若しくは条件の同定に最適の条件の下で利用される。緊密に関連したＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列の検出及び／又は定量には、よりストリンジェントでない条件の下で、同一の２つのオリゴマー、ネスティッド・オリゴマーのセット、又は縮重オリゴマーのプールでさえ利用され得る。
【０２６１】
標的の核酸配列は、内因性ゲノム配列をマップするための、すでに記載のようなハイブリダイゼーションプローブを産生するためにも使用され得る。この配列は、既知の技術を使用して、特有の染色体、又は染色体の特定領域へマップされ得る。これには、染色体スプレッドへの ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ （１９８８）『ヒト染色体：基本技術マニュアル（Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）』ペルガモンプレス、ニューヨーク市）、流動層別（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体調製、又はＹＡＣ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、細菌ＰＩ構築物、又は単一染色体ｃＤＮＡライブラリーのような人工染色体構築物が含まれる。
【０２６２】
染色体調製物の ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションと確立された染色体マーカーを使用する連鎖分析のような物理マッピング技術は、遺伝子地図を拡張するのに貴重である。遺伝子地図の例は、Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９５； ２７０： ４１０ｆ と １９９４； ２６５： １９８１ｆ） に見出し得る。しばしば、別の哺乳動物種の染色体上にある遺伝子の配置にょり、たとえ特有のヒト染色体の数若しくはアームが知られていなくても、関連マーカーが明らかになる場合がある。新たな配列は、物理マッピングにより、染色体のアーム、又はその部分へ帰属され得る。これは、位置クローニングや他の遺伝子探索技術を使用して疾患遺伝子を探している研究者にとって貴重な情報を提供する。ある疾患若しくは症候群が、遺伝子連鎖により特有のゲノム領域へおおまかに定位されると、その領域へマップされる配列は、さらなる検討のための関連若しくは調節遺伝子を表す場合がある。本発明のヌクレオチド配列はまた、正常、キャリア、又は罹患個体間での転座、反転などによる染色体位置の違いを検出するためにも使用され得る。
【０２６３】
生物
本発明に関連した「生物」という用語には、本発明の標的及び／又はそれらから得られる産物を含み得る、任意の生物が含まれる。生物の例には、真菌、酵母又は、植物が含まれる場合がある。
【０２６４】
本発明に関連した「トランスジェニック生物」という用語には、本発明の標的及び／又は得られる産物を含む、任意の生物が含まれる。
宿主細胞／宿主生物の形質転換
先に示したように、宿主生物は、原核又は真核の生物であり得る。好適な原核宿主の例には、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）と枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が含まれる。原核宿主の形質転換についての教示は当技術分野で十分に文書化されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（『分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版』、１９８９，コールドスプリングハーバーラボラトリープレス）と Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，『分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）』（１９９５）ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社、を参照のこと。
【０２６５】
原核宿主を使用する場合、ヌクレオチド配列は、形質転換の前に、イントロンの除去によるように、適切に修飾しておく必要がある。
もう１つの態様では、トランスジェニック生物は酵母であり得る。この点に関して言えば、酵母はまた異種遺伝子発現の運搬体として広く使用されてきた。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）種には、異種遺伝子の発現へのその使用を含む、工業使用の長い歴史がある。サッカロミセス・セレビシエにおける異種遺伝子の発現は、Ｇｏｏｄｅｙ ｅｔ ａｌ （１９８７，『酵母のバイオテクノロジー（Ｙｅａｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）』、Ｄ Ｒ Ｂｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ， 編、４０１−４２９ 頁、アレン・アンド・アンウィン、ロンドン）と Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ （１９８９，『酵母の分子／細胞生物学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｙｅａｓｔｓ）』、Ｅ Ｆ Ｗａｌｔｏｎ と Ｇ Ｔ Ｙａｒｒｏｎｔｏｎ 編、１０７−１３３ 頁、ブラッキー、グラスゴー）により概説されている。
【０２６６】
サッカロミセス・セレビシエが異種遺伝子の発現によく適しているのはいくつかの理由からである。第一に、それは人間に対して非病原性であり、特定の内毒素を産生することができない。第二に、それは、数世紀に及ぶ様々な目的の商業開発の後で、安全使用の長い歴史を有する。このことにより広く大衆に受け入れられている。第三に、この生物へ注力された広範な商業用の使用及び研究によって、サッカロミセス・セレビシエの遺伝学及び生理学、並びに大量スケール発酵の特徴について豊富な知識がもたらされた。
【０２６７】
サッカロミセス・セレビシエにおける異種遺伝子発現と遺伝子産物の分泌の諸原理に関する概説が、Ｅ Ｈｉｎｃｈｃｌｉｆｆｅ Ｅ Ｋｅｎｎｙ（１９９３，『異種遺伝子発現の運搬体としての酵母（Ｙｅａｓｔ ａｓ ａ ｖｅｈｉｃｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅｓ）』、酵母、第５巻、Ａｎｔｈｏｎｙ Ｈ Ｒｏｓｅ と Ｊ Ｓｔｕａｒｔ Ｈａｒｒｉｓｏｎ 編、第２版、アカデミックプレス社）に述べられている。
【０２６８】
いくつかのタイプの酵母ベクターが利用可能であり、その維持に宿主ゲノムとの組換えを必要とする組込みベクター、及び自己複製プラスミドベクターが含まれる。
【０２６９】
トランスジェニック・サッカロミセスを調製するには、酵母における発現のために設計された構築体へ本発明のヌクレオチド配列を挿入することによって、発現構築体を調製する。異種発現のために使用される数タイプの構築体が開発されてきた。この構築体は、本発明のヌクレオチド配列へ融合した酵母において活性なプロモーター、通常は、ＧＡＬ１　プロモーターのような酵母起源のプロモーターを含有する。通常、ＳＵＣ２シグナルペプチドをコード化する配列のような、酵母起源のシグナル配列が使用される。酵母において活性なターミネーターがこの発現系を終了させる。
【０２７０】
酵母の形質転換については、いくつかの形質転換プロモーターが開発されてきた。例えば、本発明によるトランスジェニック・サッカロミセスは、Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ （１９７８， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＵＳＡ ７５， １９２９）； Ｂｅｇｇｓ， Ｊ Ｄ （１９７８， Ｎａｔｕｒｅ， Ｌｏｎｄｏｎ， ２７５， １０４）； 及び Ｉｔｏ， Ｈ ｅｔ ａｌ （１９８３， Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １５３， １６３−１６８） の教示に従うことによって調製され得る。
【０２７１】
形質転換された酵母細胞は、様々な選択マーカーを使用して選択される。形質転換に使用されるマーカーには、ＬＥＵ２、ＨＩＳ４、及びＴＲＰ１のような数多くの栄養要求性マーカー、及びアミノグリコシド抗生物質マーカー、例えばＧ４１８のような優性抗生物質耐性マーカーがある。
【０２７２】
もう１つの宿主生物は植物である。遺伝子修飾される植物の構築における基本原理は、遺伝情報を植物ゲノムに挿入し、挿入された遺伝物質の安定な維持を得ることである。遺伝情報を挿入するにはいくつかの技術が存在し、その２つの主要原理は、遺伝情報の直接的な導入と、ベクター系の使用による遺伝情報の導入である。一般的な技術の概説は、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ （Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ［１９９１］ ４２： ２０５−２２５） 及び Ｃｈｒｉｓｔｏｕ （Ａｇｒｏ−Ｆｏｏｄ−Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｈｉ−Ｔｅｃｈ Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ １９９４ １７−２７） による論文に見出し得る。植物の形質転換に関するさらなる教示はＥＰ−Ａ−０４４９３７５号に見出し得る。
【０２７３】
このように、本発明はまた、標的であるか又は標的を発現することが可能であるヌクレオチド配列で宿主細胞を形質転換する方法を提供する。このヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、コード化されるタンパク質の発現とその細胞培養からの回収に適した条件の下で培養され得る。組換え細胞により産生されるタンパク質は、使用される配列、及び／又はベクターに依存して、分泌され得るか、又は細胞内に閉じ込められる場合がある。当業者により理解されるように、コーディング配列を含有する発現ベクターは、特定の原核若しくは真核細胞膜を介したコーディング配列の分泌を指令するシグナル配列を有するように設計され得る。他の組換え構築物により、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコード化するヌクレオチド配列へコーディング配列を結合し得る（Ｋｒｏｌｌ Ｄ Ｊ ｅｔ ａｌ （１９９３） ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２： ４４１−５３）。
【０２７４】
ＮＥＰｉ−動物試験モデル
動物モデル
麻酔ウサギの方法
雄のニュージーランドウサギ（約２．５ｋｇ）に、メデトミジン（Ｄｏｍｉｔｏｒ（登録商標））０．５ｍｌ／ｋｇ，ｉ．ｍ．及びケタミン（Ｖｅｔａｌａｒ（登録商標））０．２５ｍｌ／ｋｇ，ｉ．ｍ．の組合せ物を予め投薬し、酸素取込みをフェースマスクにより維持した。このウサギを、ベンチレータへ接続したＰｏｒｔｅｘＴＭ袖なし（ｕｎｃｕｆｆｅｄ）気管内チューブ、３ＩＤ．を使用して気管切開し、３０〜４０呼吸／分の換気率、約１８〜２０ｍｌの１回換気量、１０ｃｍ　Ｈ２Ｏの最大空気圧に維持した。次いで、麻酔をイソフルラン（Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）へ変更し、２ｌ／分のＯ２で換気を続けた。２３Ｇ若しくは２４Ｇのカテーテルを使用して、右耳縁静脈へカニューレ挿入し、乳酸リンゲル溶液を０．５ｍｌ／分で灌流した。ウサギは侵襲手術の間は３％イソフルランに維持し、維持麻酔の間は２％へ落とした。左頚静脈を曝露し、単離してから、薬物及び化合物の注入用にＰＶＣカテーテル（１７Ｇ）をカニューレ挿入した。
【０２７５】
ウサギの左鼡径部の毛を剃り、股に沿って約５ｃｍの長さで垂直の切開を入れた。大腿静脈及び動脈を曝露し、単離してから、薬物及び化合物の注入用にＰＶＣカテーテル（１７Ｇ）をカニューレ挿入した。大腿動脈についてはカニューレ挿入を繰り返し、カテーテルを１０ｃｍの深さまで挿入し、カテーテルが腹部大動脈に達することを確保した。この動脈カテーテルを、血圧を記録するグールド計へ連結させた。血液ガス分析用のサンプルも動脈カテーテルから採取した。収縮期圧と拡張期圧を測定してから、式：（拡張期圧ｘ２＋収縮期圧）÷３を使用して、平均動脈圧を計算した。パルス酸素メーターとＰｏ−ｎｅ−ｍａｈデータ獲得ソフトウェアシステム（Ｐｏｎｅｍａｈ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　Ｐｌａｔｆｏｒｍ，グールド機器システム社）により心拍数を測定した。
【０２７６】
腹腔へ腹部中線切開を入れた。この切開は恥骨のすぐ上で約５ｃｍの長さであった。脂肪と筋肉をおおまかに切除し、体腔の下を通る下腹神経を明らかにした。恥骨の上に存在する大腿静脈及び動脈を傷つけないようにするには、恥骨壁の側曲線に接近することが不可欠であった。坐骨神経と骨盤神経はより深いところに存在するので、ウサギの背側にさらに切除した後で定位した。坐骨神経が同定されたなら、骨盤神経は容易に定位された。「骨盤神経（ｐｅｌｖｉｃ ｎｅｒｖｅ）」という用語は、不正確に適用される：この主題に関する解剖学の本は、この神経を十分に詳しく確定しているわけではない。しかしながら、この神経の刺激は、海綿体圧及び海綿体血流と、骨盤領域の神経支配の増加を引き起こす。骨盤神経を周囲組織から解放し、その神経の周りにハーバード双極子刺激電極を置いた。この神経を少し持ち上げてやや緊張を与えてから、電極の位置を固定した。この神経と電極の周りに約１ｍｌの軽パラフィン油を入れた。これは、神経への保護潤滑剤として機能し、電極を血液汚染から防ぐ。電極をＧｒａｓｓ　Ｓ８８刺激器へつないだ。骨盤神経を以下のパラメータを使用して刺激した：−５Ｖ、パルス幅０．５ｍｓ、１６Ｈｚの振動数で２０秒間の刺激。この神経を１５〜２０分ごとに刺激すると、再現性のある応答が得られた。上記パラメータを使用する数回の刺激を実施して、平均の対照応答を確定した。連続１５分の刺激サイクルを可能にするハーバード２２注入ポンプを使用して、試験すべき化合物を頚静脈より注入した。陰茎周囲の皮膚及び結合組織を除去し、陰茎を露出させた。カテーテルセット（Ｉｎｓｙｔｅ−Ｗ，ベクトン−ディキンソン２０ゲージ、１．１ｘ４８ｍｍ）を白膜（ｌｕｎｉｃａ ａｌｂｉｃａ）を通して左海綿体スペースへ挿入し、注射針を除き、弾性カテーテルを残した。このカテーテルを圧変換器（Ｏｈｍｅｄａ　５２９９−０４）を介してグールドシステムへ連結し、海綿体圧を記録した。海綿体圧を確定したらすぐに、Ｖｅｔｂｏｎｄ（組織癒着性、３Ｍ）を使用して、カテーテルをその場で密封した。パルス酸素メーターとＰｏ−ｎｅ−ｍａｈデータ獲得ソフトウェアシステム（Ｐｏｎｅｍａｈ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　Ｐｌａｔｆｏｒｍ，グールド機器システム社）により心拍数を測定した。
【０２７７】
海綿体血流は、Ｐｏ−ｎｅ−ｍａｈデータ獲得ソフトウェアシステム（Ｐｏｎｅｍａｈ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　Ｐｌａｔｆｏｒｍ，グールド機器システム社）を使用する流量計からの直接の数字としてか、又はグールドチャートレコーダーの追跡からの間接的な数字として記録した。実験のはじめに較正を設定した（０〜１２５ｍｌ／分／１００ｇ組織）。ＮＥＰ（中性エンドペプチダーゼ５型ＥＣ３．４．２４．１１）阻害剤は生理食塩水＋１０％　１Ｍ　ＮａＯＨ中で調製し、ホスホジエステラーゼ５型（ＰＤＥ５）阻害剤は生理食塩水＋５％１ＭＨＣｌで調製した。阻害剤と担体対照を０．１ｍｌ／秒の割合で注入した。骨盤神経刺激に先立って、ＮＥＰ阻害剤とＰＤＥｃＡＭＰ阻害剤を１５分放置した。
【０２７８】
すべてのデータを平均±ｓ．ｅ．ｍ．として報告する。スチューデントのｔ−検定を使用して有意な変化を同定した。
麻酔犬の方法
体重１２〜１５ｋｇの範囲の雄ビーグルを一晩絶食させた。ペントバルビトン（３０〜４５ｍｇ／ｋｇ　ｉ．ｖ．）で麻酔し、１〜１．４ｍｌ／時間の割合でペントバルビトン（６０ｍｇ／ｍｌ）を連続注入することにより麻酔状態を維持した。血圧の測定のために左大腿静脈にカニューレを挿入し、第ＩＩ誘導Ｅ．Ｃ．Ｇ．を記録し、心拍数を導いた。化合物の投与のために左大腿静脈へカニューレを導入した。膀胱における尿蓄積を防ぐために中線腹部切開を介して両尿管へカニューレを挿入し、膀胱を完全に空にした。左内陰部動脈を慎重に切除して周囲組織から放し、動脈血流測定用のＴｒａｎｓｏｎｉｃフロー探針の配置を可能にした。両骨盤神経の空洞枝を切除して解放し、双極子刺激電極へ入れた。陰茎周囲の皮膚を開き、陰茎海綿体を曝露した。弾性カテーテルにより圧変換器へ付いた２１ｇ注射針を、両方のｉ．ｃ．（海綿体）圧測定とＳＮＰの注射のために海綿体（通常、左）へ挿入した。このシステムをヘパリン添加生理食塩水（１５〜２０Ｕ／ｍｌ）で満たした。この犬では海綿体が完全に分離しているので、必要ならば、片側又は両側を使用することが可能であった。
【０２７９】
血液ガスをｐＯ２　９５〜１１５ｍｍＨｇ；ｐＣＯ２　２５〜４０ｍｍＨｇの範囲に維持するように調整したＵｇｏ　Ｂａｓｉｌｅ　５０２５イヌ用ベンチレータでこの犬を呼吸させた。呼気をＤａｔｅｘ　Ｎｏｒｍｏｃａｐ　２００により連続的にモニターして呼吸コントロールに役立てた。体温は、電気毛布を使用して、３６〜３８℃の範囲内に維持した。種々のパラメータをグールドＴＡ４０００ポリグラフに記録し、Ｐｏ−Ｎｅ−Ｍａｈシステムを使用して、すべてのデータの獲得と誘導パラメータの計算をオンラインで行った。骨盤神経の空洞枝を、１０ボルト、２ｍｓ間隔で、１分未満の間Ｇｒａｓｓ　Ｓ８８スティミュレータで刺激した。平衡化の時間の後で、骨盤神経を１６Ｈｚで刺激し、ｉ．ｃ．圧の上昇が変換器により迅速かつ完全に登録され、血流の変化が検出されるかどうかを評価した。１又は２Ｈｚの神経刺激に対する対照応答を得た。回復したらすぐに最初の振動数の２倍で第二の刺激を実施した。何匹かの犬では第三の振動数を使用した。この刺激サイクルを３０分後に繰り返した。ＮＥＰ阻害剤をアルカリ性の生理食塩水に溶かし、ローディング注入液と３０分間の維持注入液からはじめる２階層の系列注入液として与えてから、注入液の第二セットを開始した。３０分ごとの間隔か、又はｉ．ｃ．圧がベースラインへ復帰したときに、後続の注入を開始した。すべての注入液を１ｍｌ／分の割合で投与した。各注入の１５分後に刺激サイクルを開始した。
【０２８０】
さらに、投薬前、各注入から１５、及び３０分後に、血圧カニューレを介して、腹部大動脈から動脈血サンプルを採取し、「薬物代謝」による未結合化合物の濃度を後で分析することに供した。
【０２８１】
ＮＥＰｉの試験結果及び考察
陰茎勃起、即ち、陰茎血流と海綿体圧の増加の生理を模倣する、勃起の麻酔動物モデルが数多く存在する。性的興奮の効果は、陰茎を神経支配する骨盤神経を刺激することで模倣される。これは、勃起の機序を研究し、ＭＥＤの治療の潜在的な治療薬を評価するためのメカニズムである。
【０２８２】
シルデナフィルのような選択的ＰＤＥ５阻害剤が動物モデルにおいて海綿体圧（ＩＣＰ）の神経刺激増加を亢進させること、そしてこの神経刺激がヒトに観察される勃起プロセスを模倣することが今日確立されている（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｔｒａｉｓｈ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｏｍｏｔｅ １９９９， Ｗａｌｌｉｓ １９９９）。このＰＤＥ５阻害剤誘発性ＩＣＰ亢進はＰＤＥ５阻害剤の作用機序を特徴づけ、シルデナフィルのような薬剤がＭＥＤ若しくは性的不能に関連した弛緩の不足をいかに克服するかを説明する。これら先の研究に一致して、以下の実施例は、静脈内投与された選択的ＰＤＥ阻害剤が、麻酔されたウサギ及びイヌにおいて神経刺激性のＩＣＰ増加を高めることを明示した（実施例２、４、５）。
【０２８３】
本明細書の以下の実施例は、選択的ＮＥＰ阻害剤を用いたＮＥＰ　ＥＣ３．４．２４．１１の阻害が、麻酔犬において海綿体圧の神経刺激性の増加を用量依存的に高めることを明示する（実施例１、２、及び３）。本試験で使用される用量では、ＰＤＥ５阻害剤で観察されるのと同様の勃起プロセスの亢進がＮＥＰｉについて観察された（実施例２）。海綿体圧（ＩＣＰ）と海綿体血流の同時記録は、選択的ＮＥＰ阻害剤がＩＣＰと海綿体血流の両方を亢進させることを示した（実施例３）。これら実施例は、勃起プロセスを亢進させるＮＥＰ阻害剤療法の、ＭＥＤの治療における潜在的な臨床応用の基礎となる。
【０２８４】
実施例４及び５は、ＮＥＰ　ＥＣ３．４．２４．１１及びＰＤＥ５の同時阻害により、同じＰＤＥ５阻害剤単独の同一量で達成され得るより顕著なＩＣＰ若しくは勃起プロセスの亢進を生じたことを明示する。ウサギの勃起モデルを使用して、ＰＤＥ５の阻害により誘導されるＩＣＰの亢進をＮＥＰ　ＥＣ３．４．２４．１１阻害剤の同時投与（ＮＥＰｉ，１ｍｇ／ｋｇの静脈内投与による；実施例４）によりさらに高め得ることが明示された。ＰＤＥ５阻害剤の１ｍｇ／ｋｇ（ｉｖ）用量でＩＣＰの最大上昇を観察するが、この知見により、この仲介されるＰＤＥ５阻害剤の最大量を超えたところでＩＣＰをさらに高め得ることはほとんど期待できない。このデータは、ＰＤＥ５阻害剤及びＮＥＰ阻害剤の同時投与には、ＰＤＥ５阻害剤単独の療法に優る臨床上の多くの利益があることを例示する。これには、効力の増加と、ＰＤＥ５阻害剤療法に反応しないＭＥＤ亜集団を治療する機会が含まれる。
【０２８５】
本発明の好ましい側面は、ＭＥＤの治療に使用されるＮＥＰｉ及びＰＤＥ５ｉを含んでなる医薬組成物を提供し、ここでこの特定の組合せは相乗的な利益を提供する。
【０２８６】
さらに、ＰＤＥ５阻害剤の作用の開始、即ち、最大効果に至るのに要する時間は、ＮＥＰ　ＥＣ３．４．２４．１１阻害剤の存在下で大いに短縮される（実施例５）。臨床的に言えば、このことはより速やかな開始時間を表す。
【０２８７】
さらに、ＮＥＰｉ及びＰＤＥ５ｉの同時投与によりＰＤＥ５ｉの作用の開始が短縮される。従って、薬剤投与と臨床エンドポイント間の時間が迅速化される。　ＮＥＰ　ＥＣ３．４．２４．１１及びＰＤＥ５の阻害剤、又はこの２つの組合せは、非刺激性ＩＣＰには有意な効果を及ぼさない。即ち、それらは、性的推進／興奮の不在下ではＩＣＰの増加を直接的には誘導しない。作用するのに性的刺激を必要とする、ＭＥＤへの市販された治療法がシルデナフィルしかない状況では、このことはきわめて有利であり、従って、本発明は、シルデナフィルと他のあらゆるＰＤＥ５単独ベースの薬物に代わり得る実効的な経口療法を提供する。
【０２８８】
ＮＥＰｉ−動物モデルの実施例
実施例１〜６で使用された化合物：
ＮＥＰｉ：（２Ｒ）−２−［（１−｛［（５−エチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）メチル］ペンタン酸（本明細書で製造）を参照のこと；ヒトネーティブＮＥＰに対するＩＣ５０＝１８．８ｎＭ、ＡＣＥ（ネーティブ、ヒト）に対するＮＥＰ（ヒト）への選択性は５００を超え、ＥＣＥ（組換え）に対するＮＥＰ選択性は３００を超える。
【０２８９】
ＰＤＥ５ｉ：３−エチル−５−［５−（４−エチルピペラジン−１−イルスルホニル）−２−ｎ−プロポキシフレニル］−２−（ピリジン−２−イル）メチル−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オンとしても知られる、３−エチル−５−｛５−［４−エチルピペリジノ］スルホニル−２−ｎ−プロポキシフェニル｝−２−（２−ピリジルメチル）−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン（ＷＯ９８／４９１０６６を参照のこと）。ヒトネーティブＰＤＥ５に対するＩＣ５０＝１．１ｎＭ、ＰＤＥ３（ネーティブ、ヒト）に対するＮＥＰ（ネーティブ、ヒト）への選択性は９０，０００を超え、ＰＤＥ４に対する選択性は１８５４５である。
【０２９０】
引用されるすべての効力及び選択性の数値は、ヒトネーティブ酵素に関するものである（本明細書のアッセイを参照のこと）。
【０２９１】
【実施例】
実施例１．ＮＥＰ　ＥＣ３．４．２４．１１の阻害は、麻酔犬勃起モデルにおいて、神経刺激性の海綿体圧増加を用量依存的に高める：
神経刺激により誘導される海綿体圧（ＩＣＰ）の準最高増加が、増加用量の選択的ＮＥＰ　ＥＣ３．４．２４．１１阻害剤（定常濃度までｉｖ注入）の存在下で有意に増加した。ネーティブＮＥＰに対して得られるＩＣ５０値の約１０倍で最大の増強（約７０％）が観察された。データは、対照刺激増加に比較した増加の比率（％）として、平均血圧（ＭＢＰ）で割り、１００倍したＩＣＰで表す。数値は平均±ｓ．ｅ．平均として表す。＊Ｐ＜０．０１，対照増加に比較したスチューデント非対ｔ−検定。
【０２９２】
ＮＥＰ阻害の基底／非刺激性海綿体圧に及ぼす主たる効果はなかった。
図１は、麻酔犬勃起モデルにおいて、ＮＥＰの阻害が神経刺激性の勃起を用量依存的に高めることを示す。
【０２９３】
実施例２．ＰＤＥ５若しくはＮＥＰ　ＥＣ３．４．２４．１１の阻害は、麻酔犬勃起モデルにおいて、神経刺激性の海綿体圧増加を高める：
神経刺激により誘導される海綿体圧（ＩＣＰ）の準最高増加は、選択的ＰＤＥ５阻害剤（１０μｇ／ｋｇ；ｉｖ，ボーラス）とＮＥＰ　ＥＣ３．４．２４．１１阻害剤（１００μｇ／ｋｇ；ｉｖ，ボーラス）の存在下で有意に増加した。両剤についての最大増強は、使用した用量で約６５％であった。データは、平均血圧（ＭＢＰ）で割り、１００倍したＩＣＰとして表す。数値は平均±ｓ．ｅ．平均として表す。＊Ｐ＜０．０１，対照増加に比較したスチューデント非対ｔ−検定。
【０２９４】
ＮＥＰ若しくはＰＤＥ５阻害の基底／非刺激性海綿体圧に及ぼす主たる効果はなかった。
図２は、麻酔犬勃起モデルにおいて、ＮＥＰ若しくはＰＤＥ５の阻害が神経刺激性の勃起を高めることを示す。
【０２９５】
実施例３．ＮＥＰの阻害は、麻酔犬勃起モデルにおいて、神経刺激性の海綿体圧及び海綿体血流増加を用量依存的に高める：
神経刺激により誘導される海綿体圧（ＩＣＰ）の準最高増加と海綿体血流の増加が、増加用量の選択的ＮＥＰ　ＥＣ３．４．２４．１１阻害剤（定常濃度までｉｖ注入）の存在下で増加した。ＩＣＰが約１８８％増加したのに対し、血流は約２２８％増加した。ＩＣＰ及び血流についてのデータは、いずれも曲線下面積（ＡＵＣ）として表し、単一の動物から同時に記録した。
【０２９６】
図３は、ＮＥＰの阻害が神経刺激性の海綿体圧及び海綿体血流の増加を用量依存的に高めることを示す。
実施例４．ＮＥＰの阻害は、麻酔ウサギ勃起モデルにおいて、陰茎勃起を亢進させるＰＤＥ５阻害剤の効力を有意に増加させる：
選択的ＰＤＥ５阻害剤の静脈内投与（１ｍｇ／ｋｇ）は、神経刺激性のＩＣＰ増加を対照増加に比較して１３３±２２％だけ有意に亢進した。ＰＤＥ５ｉ仲介性の増加がひとたび維持されると、選択的ＮＥＰ　ＥＣ３．４．２４．１１阻害剤の同時投与により、神経刺激性のＩＣＰ増加がさらに亢進された。このことは、ＮＥＰ阻害が、ＰＤＥ５阻害剤で観察される増加に比較して７９％の増強（Ｐ＜０．０１，対ｔ−検定）を誘導したことを表す。データは、対照増加に対するＩＣＰの増加率として表す。数値は平均±ｓ．ｅ．平均として表す。＊Ｐ＜０．０１，対照増加に比較したスチューデント非対ｔ−検定。
【０２９７】
ＰＤＥ阻害、又は組合せたＰＤＥ５／ＮＥＰの阻害の基底／非刺激性海綿体圧に及ぼす効果はなかった。
図４は、ＮＥＰ及びＰＤＥ５の同時阻害がＰＤＥ５仲介性の神経刺激性勃起亢進を有意に高めることを示す。
【０２９８】
実施例５．ＮＥＰの阻害は、麻酔ウサギ勃起モデルにおいて、ＰＤＥ５阻害剤の勃起効果を高め、ＰＤＥ５阻害剤の作用の開始を速める：
ＮＥＰ　ＥＣ３．４．２４．１１及びＰＤＥ５の同時阻害は、神経刺激性海綿体圧（ＩＣＰ）増加のＰＤＥ５仲介性の亢進を有意に高める。ＩＣＰの準最高増加は、選択的ＰＤＥ５阻害剤（１ｍｇ／ｋｇ；ｉｖ，ボーラス）の存在下で有意に（対照増加に比較して約９０％）高められる。ＮＥＰ阻害剤（１ｍｇ／ｋｇ；ｉｖ，ボーラス）の存在下で同量のＰＤＥ５阻害剤を与えると、ＩＣＰのさらなる亢進（対照増加に比較して約１８７％）が観察される。このことは、仲介するＮＥＰ阻害剤がＰＤＥ５阻害剤仲介性の効果を約１００％亢進させることを表す。
【０２９９】
ＮＥＰｉ及びＰＤＥ５ｉの同時適用で観察されるＩＣＰの増加した亢進に加えて、ＰＤＥ５阻害剤がその最大効果を発揮するのに要する時間（即ち、作用の開始）は、ＮＥＰ阻害剤の存在下で短縮される（ＮＥＰ阻害剤の不在下では６７．５分であるのに対し、その存在下では２２．５分）。
【０３００】
ＮＥＰ阻害、又は組合せたＰＤＥ５／ＮＥＰの阻害の基底／非刺激性海綿体圧に及ぼす主たる効果はなかった。
データは、対照増加に対するＩＣＰの増加率として表す。数値は平均±ｓ．ｅ．平均として表す。＊Ｐ＜０．０１，ＰＤＥ５阻害剤仲介性の増加に比較したスチューデント非対ｔ−検定。
【０３０１】
図５は、ＮＥＰ及びＰＤＥ５の同時阻害がＰＤＥ５仲介性の神経刺激性勃起亢進を有意に高めることを示す。
実施例６．麻酔ウサギにおいて、海綿体圧を亢進させる薬剤が平均動脈圧に及ぼす効果：
ＭＥＤのような男性の性機能障害を治療する新規療法への探索では、血圧や心拍数に対する影響のような、関連する心臓血管系への有害効果のないことが望ましい。我々の試験では、ＶＩＰの注入が平均動脈圧を有意に低下させ（図６を参照のこと）、心拍数を有意に増加させることを見出した。しかしながら、ＰＤＥ阻害剤（１ｍｇ／ｋｇ）とＮＥＰ阻害剤（１ｍｇ／ｋｇ）、又はＮＥＰ阻害剤及びＰＤＥ５阻害剤（いずれも１ｍｇ／ｋｇ）の同時適用は、血圧にも心拍数にも実質的な影響を及ぼさなかった。
【０３０２】
図６−ＮＥＰｉ、ＰＤＥ５ｉの静脈内投与、又はＮＥＰｉのＰＤＥ５ｉとの同時適用は、麻酔ウサギの陰茎勃起モデルにおいて、平均動脈圧に実質的な影響を及ぼさなかった。このグラフは、ＶＩＰ、血管作動性薬剤、ＮＥＰ阻害剤（１ｍｇ／ｋｇ）、又はＮＥＰ阻害剤及びＰＤＥ５阻害剤（いずれも１ｍｇ／ｋｇ）の同時適用の、麻酔ウサギの平均動脈圧に対する典型的な効果を図示する。これらの観察された効果は試験したすべての動物に見られる傾向を代表している。ＶＩＰが平均動脈圧の有意な低下（約６ｍｍＨｇ）を引き起こしたのに対し、ＨｅｐｓａｌｉｎｅやＰＤＥ５若しくはＮＥＰの阻害剤の対照注入は血圧に影響を及ぼさない。ＶＩＰ注入に関連した血圧の低下には心拍数の大きな増加も関連していることに注目すること。
【０３０３】
スクリーン（候補選択）
アミノ酸配列、及び／又はヌクレオチド配列のような、１つ以上の適正な標的が多種多様な薬物スクリーニング技術においてＮＥＰｉを同定するために使用され得る。そのような試験で利用される標的は、溶液中でフリーであるか、固形支持体に固定されているか、細胞表面上に存在するか、又は細胞内に局在化している。標的は動物モデルの体内にさえ存在し得るが、ここで前記標的は外来性の標的、又は導入された標的であり得る。動物モデルは非ヒト動物モデルであろう。標的活性の消失、又は標的及び試験薬剤の間での複合体の形成が測定され得る。
【０３０４】
薬物スクリーニングの技術は、１９８４年９月１３日に公開された、Ｇｅｙｓｅｎ，ヨーロッパ特許出願８４／０３５６４に記載の方法に基づく場合がある。要約すると、多数の異なる低ペプチド試験化合物が、プラスチックピンや他の表面のような固体基質上で合成される。このペプチド試験化合物を好適な標的又はそのフラグメントと反応させ、洗浄する。次いで、当技術分野で知られている方法を適正に採用することにより、結合した実体を検出する。精製した標的も薬物スクリーニング技術での使用のために直接プレート上で被覆され得る。他のやり方では、非中和抗体を使用して、ペプチドを捕捉し、それを固形支持体上に固定化することができる。
【０３０５】
本発明はまた、標的へ結合することが可能な中和抗体が標的への結合について試験化合物と特異的に競合する、競合薬物スクリーニングアッセイの使用も考慮する。
【０３０６】
もう１つのスクリーニング技術は、標的物質への好適な結合親和性を有する薬剤のハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）を必要とし、ＷＯ８４／０３５６４に詳しく記載された方法に基づく。
【０３０７】
本発明のアッセイ法は、試験化合物の小規模及び大規模スクリーニングの両方、並びに定量アッセイに適していると期待される。
好ましい側面では，本発明のスクリーンは、少なくとも以下の工程を含む（これと同じ順序である必要はない）：（ａ）候補薬剤が（イヌ腎臓由来のＮＥＰのようなＮＥＰのモジュレーションのような）関連した活性を有するかどうかを決定するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ スクリーンを実施する工程；（ｂ）前記候補薬剤の選択性を決定する（例えば、前記薬剤がＡＣＥ阻害剤でもあるかを、本明細書に示すアッセイプロトコールを使用することによって確かめる）ために、１つ以上の選択性スクリーンを実施する工程；（ｃ）（例えば、機能動物モデルを使用して）前記候補薬剤について ｉｎ ｖｉｖｏ スクリーンを実施する工程。典型的には、前記候補薬剤がスクリーン（ａ）とスクリーニング（ｂ）を通過したならば、スクリーン（ｃ）を実施する。
【０３０８】
ＮＥＰ酵素アッセイ
本明細書に示されるＮＥＰｉ効力の数値を以下のアッセイにより決定する。
「イヌ、ラット、ウサギ、及びヒトの腎皮質由来可溶性（ＮＥＰ）中性エンドペプチダーゼの調製及びアッセイ」
可溶性ＮＥＰを腎皮質から得て、ＮＥＰ基質のＡｂｚ−Ｄ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−ＥＤＤｎｐを開裂させてその蛍光生成物、Ａｂｚ−Ｄ−Ａｒｇ−Ａｒｇを産生する比率を測定することによって活性をアッセイする。
【０３０９】
実験方法：
１．材料
水はすべて２回脱イオン化する。
１．１　組織
ヒト腎臓　　ＩＩＡＭ（ペンシルヴェニア、アメリカ）
ラット腎臓
ウサギ腎臓
イヌ腎臓
１．２　ホモジェナイゼーション媒体
１００ｍＭマンニトールと２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ａ）ｐＨ７．１
２．４２ｇのＴｒｉｓ（フィッシャー　Ｔ／Ｐ６３０／６０）を１リットルの水に希釈し、室温で６Ｍ　ＨＣｌを使用して、ｐＨを７．１へ調整する。これへ１８．２２ｇのマンニトール（シグマ　Ｍ−９５４６）を加える。
１．３　Ｔｒｉｓ緩衝液（ＮＥＰ緩衝液）
５０ｍｌの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）（シグマ　Ｔ２６６３）を９５０ｍｌの水に希釈する。
１．４　基質（Ａｂｚ−Ｄ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−ＥＤＤｎｐ）
ＳＮＰＥからの注文生産品を粉末として−２０℃に保存する。この基質をＴｒｉｓ緩衝液中で穏やかに再懸濁することにより２ｍＭストックを調製するが、振盪したり音波処理してはならない。この２ｍＭストックの６００μｌアリコートを−２０℃で１ヶ月まで保存する（Ｍｅｄｅｉｒｏｓ， Ｍ． Ａ． Ｓ．， Ｆｒａｎｃａ， Ｍ． Ｓ． Ｆ． ｅｔ ａｌ．， （１９９７）， Ｂｒａｚｉｌｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ３０， １１５７−１１６２）。
１．５　全産物
１００％の基質から変換産物に対応するサンプルをプレート上に含め、基質回転率（％）が決定され得るようにする。この全産物は、１ｍｌの２ｍＭ基質を２０μｌの酵素ストックとともに３７℃で２４時間インキュベートすることによって産生される。
１．６　停止溶液
ホスホロアミドン（Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ）の３００μＭストックをＮＥＰ緩衝液で調製し、５０μｌのアリコートにして−２０℃で保存する。
１．７　ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）。
１．８　塩化マグネシウム：ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（フィッシャー　Ｍ０６００／５３）。
１．９　ブラック９６穴平底アッセイプレート（コスター　３９１５）。
１．１０　トップシール（Ｔｏｐｓｅａｌ）Ａ（パッカード　６００５１８５）。
１．１１　遠心分離管。
【０３１０】
２．特定の機器
２．１　Ｓｏｒｖａｌｌ　ＲＣ−５Ｂ遠心分離機（ＳＳ３４　ＧＳＡローター、４℃へ予冷却）。
２．２　Ｂｒａｕｎミニプライマー（ｍｉｎｉｐｒｉｍｅｒ）ミキサー。
２．３　ベックマン　ＣＳ−６Ｒ遠心分離機。
２．４　Ｆｌｕｏｓｔａｒ　ｇａｌａｘｙ．
２．５　Ｗｅｓｂａｒｔ　１５８９　振盪インキュベーター
３．方法
３．１　「組織調製」
３．２　Ｂｏｏｔｈ， Ａ． Ｇ． ＆ Ｋｅｎｎｙ， Ａ． Ｊ． （１９７４） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １４２， ５７５−５８１ から採用した方法を使用して、イヌ，ラット、ウサギ、及びヒトのＮＥＰを腎皮質から入手する。
３．３　凍結腎臓を室温で融かし、その髄質から皮質を切除する。
３．４　この皮質を細かく刻み、Ｂｒａｕｎミニプライマー（２．２）を使用して、約１０倍量のホモジェナイゼーション緩衝液（１．２）中でホモジェナイズする。
３．５　塩化マグネシウム（１．８）（２０．３ｍｇ／ｇｍ組織）をこのホモジェネートへ加え、氷水浴で１５分撹拌する。
３．６　このホモジェネートをベックマン遠心分離機（２．３）において１，５００ｇ（３，８２０ｒｐｍ）で１２分間遠心分離させてから、上澄液を新鮮な遠心分離管へ移し、ペレットを捨てる。
３．７　この上澄液をＳｏｖａｌｌ遠心分離機（２．１）において１５，０００ｇ（１２，１００ｒｐｍ）で１２分間遠心分離させて、上澄液を捨てる。
３．８　残存するペレットの上部にある薄桃色の層を除去し、塩化マグネシウムを含有するホモジェナイゼーション緩衝液（９ｍｇ　ＭｇＣｌ２／５ｍｌ緩衝液／１ｇ組織）に再懸濁させる。
３．９　この懸濁液をベックマン遠心分離機（２．３）において２，２００ｇ（４，６３０ｒｐｍ）で１２分間遠心分離させてから、ペレットを捨てる。
３．１０　この上澄液をＳｏｖａｌｌ遠心分離機（２．１）において１５，０００ｇ（１２，１００ｒｐｍ）で１２分間遠心分離させて、上澄液を捨てる。
３．１１　この最終ペレットを、塩化マグネシウムを含有するホモジェナイゼーション緩衝液（０．９ｍｇ　ＭｇＣｌ２／０．５ｍｌ緩衝液／１ｇ組織）に再懸濁させる。Ｂｒａｕｎミニプライマー（２．２）を使用して、均質な懸濁液を得る。次いで、これをＮＥＰ活性についてアッセイするために１００μｌのアリコートで凍結する。
【０３１１】
４．０　ＮＥＰ活性の決定
先にアリコートにしたＮＥＰの活性を、ＮＥＰ特異ペプチド基質を開裂するその能力により測定する。
４．１　４％　ＤＭＳＯ／ＮＥＰ緩衝溶液を調製する（９６ｍｌのＮＥＰ緩衝液中４ｍｌのＤＭＳＯ）。
４．２　基質、全産物、酵素、及びホスホロアミドンのストックを氷上で融かす。
４．３　５０μｌの４％　ＤＭＳＯ／ＮＥＰ緩衝溶液を各ウェルへ加える。
４．４　２ｍＭの基質ストックを４０倍希釈して、５０μＭの溶液を調製する。５０μＭ基質の１００μｌを各ウェルへ加える（最終濃度：２５μＭ）。
４．５　ある範囲の酵素希釈液（通常、１：１００、１：２００、１：４００、１：８００、１：１６００、及び１：３２００を使用する）の５０μｌを加えて反応を開始する。ブランクのウェルへ５０μｌのＮＥＰ緩衝液を加える。
４．６　２ｍＭの全産物を８０倍希釈して２５μＭ溶液を調製する。２００μｌの２５μＭ産物を新たなプレートのはじめの４ウェルへ加える。
４．７　振盪インキュベーター中、３７℃で６０分間、プレートをインキュベートする。
４．８　３００μＭのホスホロアミドンストックを１０００倍希釈して３００ｎＭとする。３００ｎＭホスホロアミドンの１００μｌの追加によりこの反応を止め、振盪インキュベーター中、３７℃で２０分間インキュベートしてから、Ｆｌｕｏｓｔａｒ（ｅｘ３２０／ｅｍ４２０）で読み取る。
【０３１２】
５．ＮＥＰ阻害アッセイ
５．１　基質、全産物、酵素、及びホスホロアミドンのストックを氷上で融かす。
５．２　化合物のストックを１００％　ＤＭＳＯで調製し、ＮＥＰ緩衝液で２５倍希釈して４％　ＤＭＳＯ溶液を得る。以降の希釈はすべて４％　ＤＭＳＯ溶液（４ｍｌ　ＤＭＳＯ／９６ｍｌ　ＮＥＰ緩衝液）中で行う。
５．３　５０μｌの化合物を同一２検体で９６穴プレートへ加え、４％　ＤＭＳＯ／ＮＥＰ緩衝液の５０μｌを対照及びブランクのウェルへ加える。
５．４　２ｍＭの基質ストックをＮＥＰ緩衝液で４０倍希釈し、５０μＭ溶液を調製する（プレート１枚につき、２ｍＭの基質２７５μｌに対し１０．７３ｍｌの緩衝液で十分である）。
５．５　酵素ストックをＮＥＰ緩衝液で希釈する（活性のチェックから決定される）。
５．６　２ｍＭの全産物ストックをＮＥＰ緩衝液で８０倍希釈し、２５μＭ溶液とする。別プレートのはじめの４ウェルへ２００μｌを加える。
５．７　３００μＭのホスホロアミドンストックを１０００倍希釈して３００ｎＭストックとする（１０．９９ｍｌのＮＥＰ緩衝液に対して１１μｌのホスホロアミドン）。
５．８　この９６穴プレートの各ウェルへ以下を加える：
９６穴プレートへ加える試薬の表：
【０３１３】
【表６】
2004502735.tif 000046
５．９　ＮＥＰ酵素の追加により反応を開始させてから、振盪インキュベーター中、３７℃で１時間インキュベートする。
５．１０　３００ｎＭホスホロアミドンの１００μｌの追加によりこの反応を止め、振盪インキュベーター中、３７℃で２０分間インキュベートしてから、Ｆｌｕｏｓｔａｒ（ｅｘ３２０／ｅｍ４２０）で読み取る。
【０３１４】
６．計算
化合物の存在及び不在下でＮＥＰ酵素の活性を決定し、比率として表す。
対照活性（酵素の代謝回転）（％）：
（対照の平均ＦＵ−ブランクの平均ＦＵ）ｘ１００／（全産物の平均ＦＵ−ブランクの平均ＦＵ）
阻害剤ありの活性（％）：
（化合物の平均ＦＵ−ブランクの平均ＦＵ）ｘ１００／（全産物の平均ＦＵ−ブランクの平均ＦＵ）
対照への比率として表される活性：
阻害剤ありの活性（％）ｘ１００／対照活性（％）
Ｓ字状の用量反応曲線を、化合物濃度に対する活性（％）（対照の％）へ適合させ、エクセル（Ｅｘｃｅｌ）中のＬａｂＳｔａｔｓ適合曲線を使用してＩＣ５０を計算する。
【０３１５】
ＡＣＥアッセイ
ＮＥＰ阻害剤のＡＣＥ効力値、又はＡＣＥに対する選択性の数値を以下のアッセイにより決定する。
【０３１６】
「ブタ及びヒトの腎皮質由来可溶性アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の調製及びアッセイ」
可溶性ＡＣＥ活性を腎皮質から得て、ＡＣＥ基質のＡｂｚ−Ｇｌｙ−ｐ−ニトロ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−ＯＨを開裂させてその蛍光生成物、Ａｂｚ−Ｇｌｙを産生する率を測定することによってアッセイする。
１．材料
水はすべて２回脱イオン化する。
１．１　ヒト腎臓　　ＩＩＡＭ（ペンシルヴェニア、アメリカ）又はＵＫヒト組織バンク（ＵＫ　ＨＴＢ）
１．２　ブタ腎臓ＡＣＥ　　シグマ（Ａ２５８０）
１．３　ホモジェナイゼーション緩衝液−１
１００ｍＭマンニトールと２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ａ）ｐＨ７．１
２．４２ｇのＴｒｉｓ（フィッシャー　Ｔ／Ｐ６３０／６０）を１リットルの水に希釈し、室温で６Ｍ　ＨＣｌを使用して、ｐＨを７．１へ調整する。これへ１８．２２ｇのマンニトール（シグマ　Ｍ−９５４６）を加える。
１．４　ホモジェナイゼーション緩衝液−２
１００ｍＭマンニトール、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ａ）ｐＨ７．１、及び１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（フィッシャー　Ｍ０６００／５３）。５００ｍｌのホモジェナイゼーション緩衝液−１（１．３）へ１．０１７ｇのＭｇＣｌ２を加える。
１．５　Ｔｒｉｓ緩衝液（ＡＣＥ緩衝液）
５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ及び３００ｍＭ　ＮａＣｌ（ａ）ｐＨ７．４
５０ｍｌの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）（シグマ　Ｔ２６６３）と１７．５２ｇのＮａＣｌ（フィッシャー　Ｓ／３１６０／６０）を水に溶かして１０００ｍｌとする。
１．６　基質（Ａｂｚ−Ｄ−Ｇｌｙ−ｐ−ニトロ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−ＯＨ）（Ｂａｃｈｅｍ　Ｍ−１１００）
ＡＣＥ基質を粉末として−２０℃に保存する。この基質をＡＣＥ緩衝液中で穏やかに再懸濁することにより２ｍＭストックを調製するが、振盪したり音波処理してはならない。この２ｍＭストックの４００μｌアリコートを−２０℃で１ヶ月まで保存する。
１．７　全産物
１００％の基質から変換産物に対応するサンプルをプレート上に含め、基質回転率（％）が決定され得るようにする（計算を参照のこと）。この全産物は、１ｍｌの２ｍＭ基質を２０μｌの酵素ストックとともに３７℃で２４時間インキュベートすることによって産生される。
１．８　停止溶液
０．５Ｍ　ＥＤＴＡ（プロメガ　ＣＡＳ［６０８１／９２／６］）をＡＣＥ緩衝液で２５０倍希釈し、２ｍＭ溶液を調製する。
１．９　ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）。
１．１０　塩化マグネシウム：ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（フィッシャー　Ｍ０６００／５３）。
１．１１　ブラック９６穴平底アッセイプレート（コスター　３９１５、又はパッカード）。
１．１２　トップシールＡ（パッカード　６００５１８５）。
１．１３　遠心分離管。
【０３１７】
２．特定の機器
２．１　Ｓｏｒｖａｌｌ　ＲＣ−５Ｂ遠心分離機（ＳＳ３４　ＧＳＡローター、４℃へ予冷却）。
２．２　Ｂｒａｕｎミニプライマーミキサー。
２．３　ベックマン　ＣＳ−６Ｒ遠心分離機。
２．４　ＢＭＧ　Ｆｌｕｏｓｔａｒ　Ｇａｌａｘｙ．
２．５　Ｗｅｓｂａｒｔ　１５８９　振盪インキュベーター
３．方法
３．１　「組織調製」
３．２　Ｂｏｏｔｈ， Ａ． Ｇ． ＆ Ｋｅｎｎｙ， Ａ． Ｊ． （１９７４） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １４２， ５７５−５８１ から採用した方法を使用して、ヒトＡＣＥを腎皮質から入手する。
３．３　凍結腎臓を室温で融かし、その髄質から皮質を切除する。
３．４　この皮質を細かく刻み、Ｂｒａｕｎミニプライマー（２．２）を使用して、約１０倍量のホモジェナイゼーション緩衝液−１（１．４）中でホモジェナイズする。
３．５　塩化マグネシウム（１．１１）（２０．３ｍｇ／ｇｍ組織）をこのホモジェネートへ加え、氷水浴で１５分撹拌する。
３．６　このホモジェネートをベックマン遠心分離機（２．３）において１，５００ｇ（３，８２０ｒｐｍ）で１２分間遠心分離させてから、上澄液を新鮮な遠心分離管へ移し、ペレットを捨てる。
３．７　この上澄液をＳｏｖａｌｌ遠心分離機（２．１）において１５，０００ｇ（１２，１００ｒｐｍ）で１２分間遠心分離させて、上澄液を捨てる。
３．８　残存するペレットの上部にある薄桃色の層を除去し、ホモジェナイゼーション緩衝液−２（１．５）（５ｍｌ緩衝液／１ｇ組織）に再懸濁させる。
３．９　この懸濁液をベックマン遠心分離機において２，２００ｇ（４，６３０ｒｐｍ）で１２分間遠心分離させてから、ペレットを捨てる。
３．１０　この上澄液を、Ｓｏｖａｌｌ遠心分離機を使用して１５，０００ｇ（１２，１００ｒｐｍ）で１２分間遠心分離させて、上澄液を捨てる。
３．１１　この最終ペレットを、ホモジェナイゼーション緩衝液−２（０．５ｍｌ緩衝液／１ｇ組織）に再懸濁させる。Ｂｒａｕｎミニプライマーを使用して、均質な懸濁液を得る。次いで、これをＮＥＰ活性についてアッセイするために１００μｌのアリコートで凍結する。
【０３１８】
４．０　ＡＣＥ活性の決定
先にアリコートにしたＡＣＥの活性を、ＡＣＥ特異ペプチド基質を開裂するその能力により測定する。
ブタＡＣＥ（１．２）を解凍し、０．００４Ｕ／μｌでＡＣＥ緩衝液（１．６）に再懸濁させ、これを５０μｌのアリコートで凍結する。
４．１　４％　ＤＭＳＯ／ＡＣＥ緩衝溶液を調製する（９６ｍｌのＡＣＥ緩衝液中４ｍｌのＤＭＳＯ）。
４．２　基質（１．７）、全産物（１．８）、及び酵素（１．１、１．２、１．３）を氷上で融かす。
４．３　５０μｌの４％　ＤＭＳＯ／ＡＣＥ緩衝溶液を各ウェルへ加える。
４．４　２ｍＭの基質ストックを１００倍希釈して、２０μＭの溶液を調製する。２０μＭ基質の１００μｌを各ウェルへ加える（アッセイでの最終濃度：１０μＭ）。
４．５　ある範囲の酵素希釈液（通常、１：１００、１：２００、１：４００、１：８００、１：１６００、及び１：３２００を使用する）の５０μｌを加えて反応を開始する。ブランクのウェルへ５０μｌのＡＣＥ緩衝液を加える。
４．６　２ｍＭの全産物を２００倍希釈して１０μＭ溶液を調製する。２００μｌの１０μＭ産物を新たなプレートのはじめの４ウェルへ加える。
４．７　振盪インキュベーター中、３７℃で６０分間、プレートをインキュベートする。
４．８　ＡＣＥ緩衝液中２ｍＭ　ＥＤＴＡの１００μｌの追加によりこの酵素反応を止め、振盪インキュベーター中、３７℃で２０分間インキュベートしてから、ＢＭＧ　Ｆｌｕｏｓｔａｒ　Ｇａｌａｘｙ（ｅｘ３２０／ｅｍ４２０）で読み取る。
【０３１９】
５．ＡＣＥ阻害アッセイ
５．１　基質、全産物、及び酵素のストックを氷上で融かす。
５．２　化合物のストックを１００％　ＤＭＳＯで調製し、ＡＣＥ緩衝液で２５倍希釈して４％　ＤＭＳＯ溶液を得る。以降の希釈はすべて４％　ＤＭＳＯ／ＡＣＥ緩衝溶液（４ｍｌ　ＤＭＳＯ／９６ｍｌ　ＡＣＥ緩衝液）中で行う。
５．３　５０μｌの化合物を同一２検体で９６穴プレートへ加え、４％　ＤＭＳＯ／ＡＣＥ緩衝液の５０μｌを対照及びブランクのウェルへ加える。
５．４　工程５．２及び５．３は、手動か又はパッカード・マルチプローブ・ロボットを使用するかのいずれかで行うことができる。
５．５　２ｍＭの基質ストックをＡＣＥ緩衝液で１００倍希釈し、２０μＭ溶液を調製する（アッセイでは１０μＭの最終濃度）（プレート１枚につき、２ｍＭの基質１１０μｌに対し１０．８９ｍｌの緩衝液で十分である）。
５．６　活性のチェック（４．０）から決定されるように、酵素ストックをＡＣＥ緩衝液で希釈する。
５．７　２ｍＭの全産物ストックをＡＣＥ緩衝液で２００倍希釈し、１０μＭ溶液とする。別プレートのはじめの４ウェルへ２００μｌを加える。
５．８　０．５ｍＭ　ＥＤＴＡストックを２５０倍希釈して２ｍＭストックを調製する（１０．９６ｍｌのＡＣＥ緩衝液に対して４４μｌのＥＤＴＡ）。
５．９　この９６穴プレートの各ウェルへ以下の試薬を加える：
表１．９６穴プレートへ加える試薬：
【０３２０】
【表７】
2004502735.tif 000047
５．１０　このアッセイで使用される各化合物の最高濃度の５０μｌを全産物（５．７）と同じ９６穴プレートへ同一２検体で加える。１５０μｌのＡＣＥ緩衝液を加えて化合物の蛍光を決定する。
５．１１　ＡＣＥ酵素の追加により反応を開始させてから、振盪インキュベーター中、３７℃で１時間インキュベートする。
５．１２　２ｍＭ　ＥＤＴＡの１００μｌの追加によりこの反応を止め、振盪インキュベーター中、３７℃で２０分間インキュベートしてから、ＢＭＧ　Ｆｌｕｏｓｔａｒ　Ｇａｌａｘｙ（ｅｘ３２０／ｅｍ４２０）で読み取る。
【０３２１】
６．計算
化合物の存在及び不在下でＡＣＥ酵素の活性を決定し、比率として表す。
ＦＵ＝蛍光単位
（ｉ）対照活性（酵素の代謝回転）（％）：
（対照の平均ＦＵ−ブランクの平均ＦＵ）ｘ１００／（全産物の平均ＦＵ−ブランクの平均ＦＵ）
（ｉｉ）阻害剤ありの活性（％）：
（化合物の平均ＦＵ−ブランクの平均ＦＵ）ｘ１００／（全産物の平均ＦＵ−ブランクの平均ＦＵ）
（ｉｉｉ）対照への比率として表される活性：
阻害剤ありの活性（％）ｘ１００／対照活性（％）
又は、（化合物の平均ＦＵ−ブランクの平均ＦＵ）ｘ１００／（対照の平均ＦＵ−ブランクの平均ＦＵ）
（ｉｖ）阻害率（％）＝１００−対照（％）
（ｖ）蛍光化合物では、使用される化合物の平均ＦＵ値から化合物（５．１０）を含有するブランクの平均ＦＵを差引いて活性（％）を計算する。
【０３２２】
Ｓ字状の用量反応曲線を、化合物濃度に対する活性（％）（対照の％）へ適合させ、エクセル中のＬａｂＳｔａｔｓ適合曲線を使用してＩＣ５０値を計算する。
本明細書に示されるＰＤＥ作用の効力値を以下のアッセイにより決定する：
ＰＤＥ５阻害剤−試験方法
ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害活性
本発明による使用に適した好ましいＰＤＥ化合物は、強力かつ選択的なｃＧＭＰ　ＰＤＥ５阻害剤である。サイクリックグアノシン３’，５’−一リン酸（ｃＧＭＰ）及びサイクリックアデノシン３’，５’−一リン酸（ｃＡＭＰ）ホスホジエステラーゼに対する ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＤＥ阻害活性は、そのＩＣ５０値（酵素活性の５０％阻害に必要とされる化合物の濃度）の測定により決定され得る。
【０３２３】
必要とされるＰＤＥ酵素は、ヒト陰茎海綿体、ヒト及びウサギの血小板、ヒト心室、ヒト骨格筋、及びウシ網膜を含む、多種多様な供給源から、Ｗ． Ｊ． Ｔｈｏｍｐｓｏｎ と Ｍ． Ｍ． Ａｐｐｌｅｍａｎ （Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １９７１， １０， ３１１） の方法により単離され得る。特に、ｃＧＭＰ特異的ＰＤＥ（ＰＤＥ５）とｃＧＭＰ阻害性ｃＡＭＰ　ＰＤＥ（ＰＤＥ３）は、ヒト陰茎海綿体組織、ヒト血小板、又はウサギ血小板から入手され得るが、ｃＧＭＰ刺激性ＰＤＥ（ＰＤＥ２）はヒト陰茎海綿体から得られ、カルシウム／カルモジュリン（Ｃａ／ＣＡＭ）依存性ＰＤＥ（ＰＤＥ１）はヒト心室から、ｃＡＭＰ特異的ＰＤＥ（ＰＤＥ４）はヒト骨格筋から、光受容体ＰＤＥ（ＰＤＥ６）はウシ網膜から得られた。ホスホジエステラーゼ７〜１１は、ＳＦ９細胞へトランスフェクトされた完全長のヒト組換えクローンから産生され得る。
【０３２４】
アッセイは、Ｗ． Ｊ． Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １９７９， １８， ５２２８） の「バッチ」法の変法を使用するか、又は製品コードＴＲＫＱ７０９０／７１００の下でアマーシャムｐｌｃにより記載のプロトコールの変法を使用するＡＭＰ／ＧＭＰの直接検出用シンチレーション近似アッセイを使用して実施され得る。要約すると、ＰＤＥ阻害剤の効果を、ＩＣ５０＝Ｋｉとなるような、様々な阻害剤濃度と低濃度の基質（ｃＧＭＰ若しくはｃＡＭＰ、約１／３Ｋｍの濃度、未標識：［３Ｈ］標識が３：１の比率）の存在下で一定量の酵素をアッセイすることによって検討した。最終アッセイ量をアッセイ緩衝液［２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１ｍｇ／ｍｌ　ウシ血清アルブミン］で１００μｌへ調製した。酵素を加えて反応を開始させ、３０℃で３０〜６０分インキュベートし、３０％未満の基質回転を得てから、（ＰＤＥ９及び１１のそれぞれに対する未標識サイクリックヌクレオチドの３ｍＭを含有する）５０μｌの珪酸イットリウムＳＰＡビーズで停止させた。プレートを再シールして２０分間振り混ぜてから、暗所でビーズを静置させ、次いでＴｏｐＣｏｕｎｔプレートリーダー（パッカード、メリデン、ＣＴ）で計数した。放射活性単位を非阻害対照（１００％）の活性（％）へ変換し、阻害剤濃度に対してプロットし、「適合曲線」のマイクロソフトエクセル拡張を使用して阻害剤のＩＣ５０値を得た。
【０３２５】
機能アッセイ
これは、Ｓ． Ａ． Ｂａｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ． （Ｂｒｉｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １９９６， １１８ （補遺）、抄録 １５３Ｐ）により記載されるように、予め収縮したウサギ海綿体組織切片のニトロプルシドナトリウム誘発性弛緩を亢進させる本発明の化合物の能力を決定することによって ｉｎ ｖｉｔｒｏ で評価され得る。
【０３２６】
ｉｎ ｖｉｖｏ 活性
Ｔｒｉｇｏ−Ｒｏｃｈａ ｅｔ ａｌ． （Ｎｅｕｒｏｕｒｏｌ． ａｎｄ Ｕｒｏｄｙｎ．， １９９４， １３， ７１） の記載に基づく方法を使用して、化合物を麻酔犬においてスクリーニングにかけ、ｉ．ｖ．投与後に、ニトロプルシドナトリウムの海綿体内注射により誘発される陰茎海綿体における圧上昇を亢進させる能力を決定した。
【０３２７】
ＮＰＹアッセイ：
ＮＰＹ阻害剤を同定するアッセイは、ＷＯ−Ａ−９８／５２８９０（９６頁、２〜２８行を参照のこと）に提示されている。
【０３２８】
本明細書の上記に示された公表物はすべて参照により本明細書に組込まれる。本発明に記載の方法及びシステムを、本発明の範囲及び精神から逸脱せずに、様々に改良及び変更することは、当業者に明らかであろう。本発明は特定の好ましい態様に関連して記載されているが、特許請求される本発明はそのような特定の態様に不当にも制限されないと解釈されるべきである。実際、本発明を実行するための記載の形式を様々に変更することは、生化学及びバイオテクノロジーや他の関連分野の技術者には明らかであり、以下の特許請求項の範囲内にあるとみなされる。
【０３２９】
本発明により使用され得る、本明細書で相互参照される種々の特許に含まれる化合物は、特許請求項（特に請求項１）と特定の実施例（これらはすべて参照により本明細書に組込まれている）において定義されるような治療活性化合物を意味する。
【０３３０】
略号
ｃＡＭＰ＝サイクリックアデノシン−３’，５’−一リン酸
ｃＧＭＰ＝サイクリックグアノシン−３’，５’−一リン酸
ＰｃＧＭＰ＝ｃＧＭＰ増強剤
ＮＥＰ＝中性エンドペプチダーゼ
ＮＥＰｉ＝ＮＥＰ阻害剤（Ｉ：ＮＥＰとしても知られる）
ＶＩＰ＝血管作動性腸管ペプチド
ＰＤＥ＝ホスホジエステラーゼ
ＰＤＥｎ＝ＰＤＥファミリー（例、ＰＤＥ１、ＰＤＥ２、等）
ＰＤＥｃＧＭＰ＝ｃＧＭＰ加水分解ＰＤＥ
ＰＤＥｉ＝ＰＤＥ阻害剤（Ｉ：ＰＤＥとしても知られる）
ＮＰＹ＝神経ペプチドＹ
Ｉ：ＮＰＹ＝ＮＰＹ阻害剤
ｋＤａ＝キロダルトン
ｂｐ＝塩基対
ｋｂ＝キロベース対
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、麻酔犬勃起モデルにおいて、ＮＥＰの阻害が神経刺激性の勃起を用量依存的に高めることを示す。
【図２】図２は、麻酔犬勃起モデルにおいて、ＮＥＰ若しくはＰＤＥ５の阻害が神経刺激性の勃起を高めることを示す。
【図３】図３は、ＮＥＰの阻害が神経刺激性の海綿体圧及び海綿体血流の増加を用量依存的に高めることを示す。
【図４】図４は、ＮＥＰ及びＰＤＥ５の同時阻害がＰＤＥ５仲介性の神経刺激性勃起亢進を有意に高めることを示す。
【図５】図５は、ＮＥＰ及びＰＤＥ５の同時阻害がＰＤＥ５仲介性の神経刺激性勃起亢進を有意に高めることを示す。
【図６】図６は、ｉｎ ｖｉｖｏ（ウサギ）試験結果において、ＮＥＰｉ単独とＮＥＰｉ／ＰＤＥ５の組合せ物を全身投与すると、（骨盤神経刺激により模倣される）性的興奮時に、重大な降圧若しくは昇圧の効果を引き起こすことのような、心臓血管系パラメータに悪影響を及ぼすことなく、性器の血流が増加したことを示す。
【図１】
2004502735.tif 000052
【図２】
2004502735.tif 000053
【図３】
2004502735.tif 000054
【図４】
2004502735.tif 000055
【図５】
2004502735.tif 000056
【図６】
2004502735.tif 000057
【国際公開パンフレット】
2004502735.tif 000058
2004502735.tif 000059
2004502735.tif 000060
2004502735.tif 000061
2004502735.tif 000062
2004502735.tif 000063
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004502735.tif 000182
【手続補正書】
【提出日】平成14年10月17日(2002.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
射精障害、性的欲求低下障害、又は男性勃起障害（ＭＥＤ）を治療する医薬品の製造における中性エンドペプチダーゼ阻害剤（ＮＥＰｉ）の使用であって、該ＮＥＰｉがアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）よりＮＥＰに対して１００倍より高い選択性を有し、かつエンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）よりＮＥＰに対して１００倍より高い選択性を有するものである、前記使用。
【請求項２】
男性勃起障害（ＭＥＤ）の治療である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
該医薬品が経口投与される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
ＮＥＰｉが式Ｉ：
【化１】
2004502735.tif 000183
［式中：
Ｒ１は、ハロ、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ２−６ヒドロキシアルコキシ、Ｃ１−６アルコキシ（Ｃ１−６アルコキシ）、Ｃ３−７シクロアルキル、Ｃ３−７シクロアルケニル、アリール、アリールオキシ、（Ｃ１−４アルコキシ）アリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、−ＮＲ２Ｒ３、−ＮＲ４ＣＯＲ５、−ＮＲ４ＳＯ２Ｒ５、−ＣＯＮＲ２Ｒ３、−Ｓ（Ｏ）ｐＲ６、−ＣＯＲ７、及び−ＣＯ２（Ｃ１−４アルキル）のリストから選択される、同じであるか又は異なる場合がある、１つ以上の置換基により置換され得るＣ１−６アルキルであるか；又はＲ１は、Ｃ３−７シクロアルキル、アリール、又はヘテロシクリルである（このそれぞれは前記リストからの１つ以上の置換基により置換される場合があり、この置換基は同じであるか又は異なる場合があって、このリストはさらにＣ１−６アルキルを含む）か；又はＲ１は、Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＲ２Ｒ３、又は−ＮＲ４ＳＯ２Ｒ５であり；
｛ここで、
Ｒ２とＲ３は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、（場合によりヒドロキシ又はＣ１−４アルコキシにより置換される）Ｃ３−７シクロアルキル、アリール、（Ｃ１−４アルキル）アリール、Ｃ１−６アルコキシアリール、又はヘテロシクリルであるか；又はＲ２とＲ３は、それらに付く窒素と一緒に、ピロリジニル、ピペリジノ、モルホリノ、ピペラジニル、又はＮ−（Ｃ１−４アルキル）ピペラジニル基を形成し；
Ｒ４は、Ｈ又はＣ１−４アルキルであり；
Ｒ５は、Ｃ１−４アルキル、ＣＦ３、アリール、（Ｃ１−４アルキル）アリール、（Ｃ１−４アルコキシ）アリール、ヘテロシクリル、Ｃ１−４アルコキシ、又は−ＮＲ２Ｒ３（ここでＲ２とＲ３は、すでに定義された通りである）であり；
Ｒ６は、Ｃ１−４アルキル、アリール、ヘテロシクリル、又は−ＮＲ２Ｒ３（ここでＲ２とＲ３は、すでに定義された通りである）であり；そして、
Ｒ７は、Ｃ１−４アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、アリール、又はヘテロシクリルであり；ｎは０、１、又は２であり；ｐは０、１、２、又は３である｝；
−（ＣＨ２）ｎ−連結は、場合により、Ｃ１−４アルキル、１つ以上のフルオロ基又はフェニルで置換されるＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシ（Ｃ１−３アルキル）、Ｃ３−７シクロアルキル、アリール、又はヘテロシクリルにより置換され；
Ｙは、基：
【化２】
2004502735.tif 000184
｛式中：Ａは、−（ＣＨ２）ｑ−（ここでｑは、１、２、３、又は４である）であり、飽和又は不飽和であり得る３〜７員の炭素環式環を完成させ；Ｒ８は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、−ＣＨ２ＯＨ、フェニル、フェニル（Ｃ１−４アルキル）、又はＣＯＮＲ１１Ｒ１２であり；Ｒ９とＲ１０は、それぞれ独立して、Ｈ、−ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、Ｃ１−６アルキル、（場合によりＣ１−４アルキル、ハロ、又はＣ１−４アルコキシにより置換される）フェニル、又はフェニル（Ｃ１−４アルキル）（ここで該フェニル基は、場合により、Ｃ１−４アルキル、ハロ、又はＣ１−４アルコキシにより置換される）であるか、又はＲ９とＲ１０は、一緒にジオキソランを形成し；同じであるか又は異なる場合があるＲ１１とＲ１２は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、Ｒ１３、又はＳ（Ｏ）ｒＲ１３（ここで、ｒは０、１、又は２であり、Ｒ１３は、場合によりＣ１−４アルキルにより置換されるフェニルであるか又はフェニルＣ１−４アルキルであって、ここで該フェニルは、場合によりＣ１−４アルキルにより置換される）である｝であるか；又は
Ｙは、基：−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２（ここでＲ１１とＲ１２はすでに定義された通りであるが、Ｒ１１とＲ１２がともにＨであることはない）であるか；又は
Ｙは、基：
【化３】
2004502735.tif 000185
｛式中：Ｒ１４は、Ｈ、−ＣＨ２ＯＨ、又はＣＯＮＲ１１Ｒ１２（ここでＲ１１とＲ１２はすでに定義された通りである）であり；存在する場合、Ｒ１５は、他のＲ１５と同じであるか又は異なる場合があり、ＯＨ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ハロ、又はＣＦ３であり；ｔは、０、１、２、３、又は４であり；Ｒ１６とＲ１７は、独立して、Ｈ又はＣ１−４アルキルである｝であるか；又は
Ｙは、基：
【化４】
2004502735.tif 000186
｛式中：Ｂ、Ｄ、Ｅ、又はＦの１又は２つは窒素であり、他は炭素であり；そして、Ｒ１４〜Ｒ１７とｔはすでに定義された通りである｝であるか；又は
Ｙは、場合により置換される５〜７員のヘテロ環式環｛これは、飽和しているか、不飽和であるか、又は芳香族であり得て、窒素、酸素、又はイオウと、場合により、１、２、又は３つのさらなる窒素原子を環中に含有し、場合によりベンゾ縮合され、そして、場合により：
Ｃ１−６アルコキシ；ヒドロキシ；オキソ；アミノ；モノ若しくはジ−（Ｃ１−４アルキル）アミノ；Ｃ１−４アルカノイルアミノ；又は
リスト：Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６ハロアルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、ハロゲン、Ｃ３−７シクロアルキル、ヘテロシクリル、又はフェニルから選択される、同じであるか又は異なる場合がある、１つ以上の置換基により置換され得るＣ１−６アルキル；又は
Ｃ３−７シクロアルキル、アリール、又はヘテロシクリル（このいずれも、リスト：Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６ハロアルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、ハロゲン、Ｃ３−７シクロアルキル、ヘテロシクリル、又はフェニルから選択される、同じであるか又は異なる場合がある、１つ以上の置換基により置換され得る）により置換され得て；
ここで、該ヘテロ環式環にオキソ置換がある場合、その環は１又は２つの窒素原子だけを含有し、該オキソ置換はこの環の窒素原子に隣接している｝であるか；又はＹは、−ＮＲ１８Ｓ（Ｏ）ｕＲ１９（ここでＲ１８は、Ｈ又はＣ１−４アルキルであり；Ｒ１９は、アリール、アリールＣ１−４アルキル、又はヘテロシクリル（好ましくは、ピリジル）であり；そしてｕは、０、１、２、又は３である）である］の化合物（又はその製剤的に許容される塩、溶媒和物、又はプロドラッグ）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
ＮＥＰｉが：
２−［（１−［［（１−ベンジル−６−オキソ−１，６−ジヒドロ−３−ピリジニル）アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）−メチル］−４−メトキシブタン酸；
２−｛［１−（｛［３−（２−オキソ−１−ピロリジニル）プロピル］アミノ｝カルボニル）シクロペンチル］−メチル｝−４−フェニルブタン酸；
（＋）−２−｛［１−（｛［２−（ヒドロキシメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−２−イル］アミノ｝カルボニル）シクロペンチル］メチル｝−４−フェニルブタン酸；
２−［（１−｛［（５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）メチル］−４−フェニルブタン酸；
ｃｉｓ−３−（２−メトキシエトキシ）−２−［（１−［｛（４−｛［（フェニルスルホニル）アミノ］カルボニル｝シクロヘキシル）−アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）メチル］プロパン酸；
（＋）−２−｛［１−（｛［２−（ヒドロキシメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−２−イル］アミノ｝カルボニル）シクロペンチル］メチル｝ペンタン酸；
（２Ｒ）−２−［（１−｛［（５−エチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）メチル］ペンタン酸、又は（−）−２−［（１−｛［（５−エチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）メチル］ペンタン酸；
（２Ｓ）−２−［（１−｛［（５−エチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）メチル］ペンタン酸、又は（＋）−２−［（１−｛［（５−エチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル｝シクロペンチル）メチル］ペンタン酸；及び
（Ｓ）−２−｛［１−（｛［２−（ヒドロキシメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−２−イル］アミノ｝カルボニル）シクロペンチル］メチル｝−４−メトキシブタン酸からなる群から選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
請求項１〜５に記載のＮＥＰｉと；
１つ以上の天然に存在するか又は合成のプロスタグランジン又はそのエステル；及び／又は、
１つ以上のα−アドレナリン作動性受容体拮抗化合物；及び／又は、
１つ以上のＮＯ−ドナー（ＮＯ−作動薬）化合物；及び／又は、
１つ以上のカリウムチャネルオープナー若しくはモジュレーター；及び／又は、
１つ以上のドーパミン作用剤；及び／又は、
１つ以上の血管拡張剤；及び／又は、
１つ以上のトロンボキサンＡ２作動薬；及び／又は、
１つ以上の麦角アルカロイド；及び／又は、
ナトリウム利尿因子、特に心房性ナトリウム利尿因子の作用をモジュレートする、１つ以上の化合物；及び／又は、
１つ以上のアンジオテンシン受容体拮抗薬；及び／又は、
ＮＯ−シンターゼの１つ以上の基質；及び／又は、
１つ以上のカルシウムチャネルブロッカー；及び／又は、
１つ以上のエンドセリン受容体拮抗薬とエンドセリン変換酵素阻害剤；及び／又は、
スタチン及びフィブラートのような、１つ以上のコレステロール低下剤；及び／又は、
１つ以上の抗血小板剤及び抗血栓剤；及び／又は、
１つ以上のインスリン増感剤；及び／又は、
１つ以上のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤；及び／又は、
１つ以上のエストロゲン受容体モジュレーター、エストロゲン作動薬、又はエストロゲン拮抗薬；及び／又は、
１つ以上のＰＤＥ阻害剤、より特定するとＰＤＥ２、４、５、７、又は８阻害剤；及び／又は、
１つ以上のＮＰＹ（神経ペプチドＹ）阻害剤、より特定するとＮＰＹ１若しくはＮＰＹ５阻害剤；及び／又は、
１つ以上の血管作動性腸管タンパク質（ＶＩＰ）、ＶＩＰ模擬体、ＶＩＰ類似体、ＶＩＰ受容体作動薬、又はＶＩＰフラグメント、又はＶＩＰと組合せたα−アドレナリン受容体拮抗薬；及び／又は、
１つ以上のメラノコルチン受容体作動薬若しくはモジュレーター、又はメラノコルチンエンハンサー；及び／又は、
１つ以上のセロトニン受容体作動薬、拮抗薬、又はモジュレーター；及び／又は、
１つ以上のテストステロン置換剤、ジヒドロテストステロン、又はテストステロンインプラント；及び／又は、
１つ以上のエストロゲン、エストロゲン及びメドロキシプロゲステロン、又は酢酸メドロキシプロゲステロン（ＭＰＡ）（即ち、組合せ物として）；及び／又は、
ノルアドレナリン、ドーパミン、及び／又はセロトニンの運搬体の１つ以上のモジュレーター；及び／又は、
１つ以上のプリン作動性受容体作動薬及び／又はモジュレーター；及び／又は、１つ以上のニューロキニン（ＮＫ）受容体拮抗薬；及び／又は、
１つ以上のオピオイド受容体作動薬、拮抗薬、又はモジュレーター、好ましくはＯＲＬ−１受容体の作動薬；及び／又は、
１つ以上のオキシトシン／バソプレッシン受容体作動薬若しくはモジュレーター；及び／又は、
１つ以上のカンナビノイド受容体モジュレーターの組合せを含んでなる医薬組合せ物の、射精障害、性的欲求低下障害、又は男性勃起障害（ＭＥＤ）を治療する医薬品の製造における使用。
【請求項７】
前記組合せ物が請求項１〜６記載のＮＥＰｉとＰＤＥ５阻害剤（ＰＤＥ５ｉ）の組合せ物である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
ＭＥＤの治療のためである、請求項６または７に記載の使用。
【請求項９】
経口投与として適用される、請求項６〜８のいずれか１項記載の組合わせ物の使用。
【請求項１０】
ＰＤＥ５ｉが：
１−［［３−（６，７−ジヒドロ−１−メチル−７−オキソ−３−プロピル−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）−４−エトキシフェニル］スルホニル］−４−メチルピペラジンとしても知られる、５−［２−エトキシ−５−（４−メチル−１−ピペラジニルスルホニル）フェニル］−１−メチル−３−ｎ−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン（シルデナフィル）；
５−（２−エトキシ−５−モルホリノアセチルフェニル）−１−メチル−３−ｎ−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；
３−エチル−５−［５−（４−エチルピペラジン−１−イルスルホニル）−２−ｎ−プロポキシフェニル］−２−（ピリジン−２−イル）メチル−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；
３−エチル−５−［５−（４−エチルピペラジン−１−イルスルホニル）−２−（２−メトキシエトキシ）ピリジン−３−イル］−２−（ピリジン−２−イル）メチル−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；
３−エチル−５−｛５−［４−エチルピペラジン−１−イルスルホニル］−２−（［（１Ｒ）−２−メトキシ−１−メチルエチル］オキシ）ピリジン−３−イル｝−２−メチル−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オンとしても知られる、（＋）−３−エチル−５−［５−（４−エチルピペラジン−１−イルスルホニル）−２−（２−メトキシ−１（Ｒ）−メチルエトキシ）ピリジン−３−イル］−２−メチル−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；
１−｛６−エトキシ−５−［３−エチル−６，７−ジヒドロ−２−（２−メトキシエチル）−７−オキソ−２Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５−イル］−３−ピリジルスルホニル｝−４−エチルピペラジンとしても知られる、５−［２−エトキシ−５−（４−エチルピペラジン−１−イルスルホニル）ピリジン−３−イル］−３−エチル−２−［２−メトキシエチル］−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；
５−［２−ｉｓｏ−ブトキシ−５−（４−エチルピペラジン−１−イルスルホニル）ピリジン−３−イル］−３−エチル−２−（１−メチルピペリジン−４−イル）−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；
５−［２−エトキシ−５−（４−エチルピペラジン−１−イルスルホニル）ピリジン−３−イル］−３−エチル−２−フェニル−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；
５−（５−アセチル−２−プロポキシ−３−ピリジニル）−３−エチル−２−（１−イソプロピル−３−アゼチジニル）−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；
５−（５−アセチル−２−ブトキシ−３−ピリジニル）−３−エチル−２−（１−エチル−３−アゼチジニル）−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；
（６Ｒ，１２ａＲ）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−２−メチル−６−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−ピラジノ［２’，１’：６，１］ピリド［３，４−ｂ］インド−ル−１，４−ジオン（ＩＣ−３５１）；
１−［［３−（３，４−ジヒドロ−５−メチル−４−オキソ−７−プロピルイミダゾ［５，１−ｆ］−ａｓ−トリアジン−２−イル）−４−エトキシフェニル］スルホニル］−４−エチルピペラジンとしても知られる、２−［２−エトキシ−５−（４−エチル−ピペラジン−１−イル−スルホニル）−フェニル］−５−メチル−７−プロピル−３Ｈ−イミダゾ［５，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−４−オン（バルデナフィル）；及び
国際公開特許出願ＷＯ９３／０７１２４（エーザイ）の実施例１１の化合物からなる群から選択される、請求項６〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
ＰＤＥ５ｉがシルデナフィルである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
射精障害、性的欲求低下障害、又は男性勃起障害（ＭＥＤ）の治療のための、ＮＥＰｉ及びＰＤＥ５ｉを含んでなる医薬組成物であって、該ＮＥＰｉ化合物がアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）よりＮＥＰに対して１００倍より高い選択性を有し、かつエンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）よりＮＥＰに対して１００倍より高い選択性を有するものである、前記医薬組成物。
【請求項１３】
ＭＥＤの治療のための、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
射精障害、性的欲求低下障害、又は男性勃起障害（ＭＥＤ）の治療に適用される第一成分及び第二成分を含んでなるキットであって、第一成分は請求項１〜５のいずれか１項に記載のＮＥＰｉを含み、第二成分は請求項９〜１１のいずれか１項に記載のＰＤＥ５ｉを含む、前記キット。
【請求項１５】
ＭＥＤの治療に適用される、請求項１４記載のキット。
【請求項１６】
射精障害、性的欲求低下障害、又は男性勃起障害（ＭＥＤ）の治療のための医薬品の製造における、経口投与として適用される医薬組合せ物の使用であって、該組合せ物がＮＥＰに対する１００ｎＭ未満のＩＣ５０とアンジオテンシン変換酵素よりＮＥＰに対して１００倍より高い選択性およびエンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）よりＮＥＰに対して１００倍より高い選択性を有するＮＥＰｉと、ＰＤＥ５に対する１００ｎＭ未満のＩＣ５０とＰＤＥ３よりＰＤＥ５に対して１００倍より高い選択性を有するＰＤＥ５ｉを含むものである、前記使用。
【請求項１７】
ＭＥＤの治療のための、請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
有効量のＮＥＰｉを患者へ投与することを含む、射精障害、性的欲求低下障害、又は男性勃起障害（ＭＥＤ）の治療方法であって、該ＮＥＰｉがアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）よりＮＥＰに対して１００倍より高い選択性を有し、かつエンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）よりＮＥＰに対して１００倍より高い選択性を有するものである、前記方法。
【請求項１９】
有効量のＮＥＰｉおよびＰＤＥ５ｉを患者へ投与することを含む、射精障害、性的欲求低下障害、又は男性勃起障害（ＭＥＤ）の治療方法であって、該ＮＥＰｉがアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）よりＮＥＰに対して１００倍より高い選択性を有し、かつエンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）よりＮＥＰに対して１００倍より高い選択性を有するものである、前記方法。
【請求項２０】
ＭＥＤの治療のための、請求項１８または１９記載の方法。
【国際調査報告】
2004502735.tif 000187
2004502735.tif 000188
2004502735.tif 000189
2004502735.tif 000190