(57)【要約】本発明は、単一分子検出を用いて核酸を配列決定するための化合物と、方法と、システムとを提供する。電荷スイッチング挙動を示す標識ＮＰｓを使用して、マイクロチャネル選別システムにおいて単一分子ＤＮＡ配列決定が実現される。操作中、連続する検出可能部分が検出チャネルを通過する場合リアルタイム配列決定を可能にし、配列決定中の産物が検出される。荷電分子を電気的に選別することによって、切断された産物分子は、組み込まれていないＮＰｓから妨害されることなく、およびポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体を照射することなく単独で検出される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光団部分が結合した末端リン酸を有し、第１の分子電荷が結合した無傷のＮＰプローブを含み、末端リン酸がリン酸蛍光団部分として切断されると、リン酸蛍光団部分が第２の分子電荷を保有し、第１の分子電荷と第２の分子電荷の差が少なくとも０．５である電荷スイッチリン酸ヌクレオチド（ＮＰ）プローブ。
【請求項２】
無傷のＮＰプローブが正の分子電荷を有するか、または末端リン酸蛍光団部分が切断されると、該末端リン酸蛍光団部分が該無傷のＮＰプローブに対して正の分子電荷を保有する、請求項１記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項３】
電荷スイッチＮＰプローブがヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）であり、末端リン酸が、蛍光団部分が結合したピロリン酸である、請求項１記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項４】
無傷のＮＴＰプローブが正の電荷を有する、請求項３記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項５】
末端リン酸がピロリン酸蛍光団部分として切断されると、ピロリン酸蛍光団部分が、無傷のＮＴＰプローブに対して正の電荷を保有する、請求項３記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項６】
ＮＴＰプローブが、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）およびヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）からなる群より選択されるメンバーである、請求項３記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項７】
ＮＴＰプローブがデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）である、請求項６記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項８】
デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）が、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシシトシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシチミジン三リン酸およびデオキシウリジン三リン酸からなる群より選択されるメンバーである、請求項７記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項９】
ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）が、アデノシン三リン酸、シトシン三リン酸、グアノシン三リン酸およびウリジン三リン酸からなる群より選択されるメンバーである、請求項６記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項１０】
蛍光団部分が、フルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、ローダミン、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、アントラニルアミド、クマリン、テルビウムキレート誘導体、リアクティブレッド（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ）４、ボディピー色素およびシアニン色素からなる群より選択されるメンバーである、請求項１記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項１１】
蛍光団部分が、リンカーを介して末端リン酸に結合されている、請求項３記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項１２】
蛍光団リンカーが、炭素数約５〜約１２個のアルキレン基である、請求項１１記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項１３】
リンカーが少なくとも１つの正の電荷を保有する、請求項１１記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項１４】
リンカーが少なくとも２つの正の電荷を保有する、請求項１１記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項１５】
リン酸ヌクレオチドプローブのリン酸部分の少なくとも１つは、対陽イオンが結合したイオン化酸素原子を有する、請求項１記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項１６】
対陽イオンが金属イオンである、請求項１５記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項１７】
金属イオンが、Ｍｇ＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｋ＋およびＮａ＋からなる群より選択される、請求項１６記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項１８】
蛍光団部分がボディピー ＴＲである、請求項１１記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項１９】
第１の分子電荷と第２の分子電荷との差が、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９および４．０からなる群より選択される、請求項１記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項２０】
第１の分子電荷と第２の分子電荷との差が、ｐＨ ７．０における純水において算出される、請求項１記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項２１】
電荷スイッチプローブが、図６Ａ〜Ｄの化合物５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９および６０からなる群より選択される、請求項１記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項２２】
検出可能な部分を有する標識リン酸ヌクレオチドを、試料流動体中に放出された荷電した検出可能な部分を分離するための方法であって、
ａ）単一分子構成の固相支持体に、核酸ポリメラーゼまたは標的核酸を含む複合体を固定する段階と、
ｂ）複合体に、ポリメラーゼが固定されている場合には標的核酸または標的核酸が固定されている場合にはポリメラーゼ、該標的核酸の一領域と相補的であるプライマー核酸および検出可能な部分を有する標識リン酸ヌクレオチドを含む試料流動体を接触させる段階であって、ＮＰがプライマー核酸に組み込まれると検出可能な部分が荷電した検出可能な部分として放出される段階と、
ｃ）試料流動体にエネルギー場を適用し、それによって荷電した検出可能な部分から標識ＮＰを分離する段階と
を含む方法。
【請求項２３】
標識リン酸ヌクレオチド（ＮＰ）が標識ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
検出可能な部分を有する標識ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）が、検出可能な部分が結合したγ−リン酸を有するＮＴＰである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
荷電した検出可能な部分が放出された場合、蛍光団部分が結合したピロリン酸を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
標識ＮＴＰが、ポリメラーゼを使用して標的核酸にハイブリダイゼーションした核酸プライマーに組み込まれ、それによって検出可能な部分が結合したγ−リン酸を放出する、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
標的核酸が、プライマーを形成する自己相補領域を含む、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
放出後の検出可能な部分の電荷が、検出可能な部分が結合した標識リン酸ヌクレオチド（ＮＰ）とは異なる、請求項２２記載の方法。
【請求項２９】
検出可能な部分の電荷が組み込まれていない標識ＮＰより正である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
結合した検出可能な部分の電荷が、組み込まれていない蛍光標識ＮＰと比較して符号が反対である、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
ｄ）測定装置を用いて検出可能な部分を測定する段階を
さらに含む、請求項２２記載の方法。
【請求項３２】
測定装置が、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ、フォトダイオード、ビデオチップ、電流メータ、電圧メータおよび光ファイバセンサの色素含浸ポリマーコーティングからなる群より選択される、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
検出がＣＣＤカメラによる、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
検出がフォトダイオードによる、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
リン酸の検出可能部分から無傷のＮＰプローブを分離するための分析方法であって、
ａ）検出可能な部分が結合した無傷のＮＰプローブを含む試料を提供する段階であって、無傷のＮＰプローブが酵素的に切断されると、無傷のＮＰプローブの分子電荷とは異なる分子電荷を保有するリン酸の検出可能な部分を形成する段階と、
ｂ）試料にエネルギー場を提供し、それによって該無傷のＮＰプローブからリン酸の検出可能な部分を分離する段階と
を含む方法。
【請求項３６】
検出可能な部分を有するＮＰプローブが標識ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）である、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
ポリメラーゼを用いて標的核酸を配列決定する方法であって、
ａ）単一分子構成の固相支持体に、核酸ポリメラーゼまたは標的核酸を含む複合体を固定する段階と、
ｂ）複合体に、ポリメラーゼが固定されている場合には標的核酸または標的核酸が固定されている場合にはポリメラーゼ、配列決定対象の領域の該標的核酸の一領域と相補的であるプライマー核酸および検出可能な部分を有する標識リン酸ヌクレオチドを含む試料流動体を接触させる段階であって、ＮＰがプライマー核酸に組み込まれると検出可能な部分が荷電した検出可能な部分として放出され、固相支持体が、流入部と流出部を有するフローセルに接続されている段階と、
ｃ）試料流動体にエネルギー場を適用する段階と
ｄ）荷電した検出可能な部分を検出し、それによって該標的核酸を配列決定する段階と
を含む方法。
【請求項４０】
検出可能なリン酸ヌクレオチドが、検出可能な部分が結合したγ−リン酸を有する標識ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）である、請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
ＮＰが、ポリメラーゼを使用して標的核酸にハイブリダイゼーションしたプライマー鎖に組み込まれ、それによって検出可能な部分が結合したγ−リン酸を放出する、請求項３７記載の方法。
【請求項４２】
エネルギー場が電場である、請求項３７記載の方法。
【請求項４３】
電場が横方向に適用される第１の電場であり、第２の電場が軸方向に適用される、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
蛍光団部分が結合したγ−リン酸の電荷が、組み込まれていない蛍光標識ＮＴＰより大きい、請求項３７記載の方法。
【請求項４５】
蛍光団部分が結合したγ−リン酸の電荷が、組み込まれていない蛍光標識ＮＴＰより小さい、請求項３７記載の方法。
【請求項４６】
蛍光団部分が結合したγ−リン酸の電荷が、組み込まれていない蛍光標識ＮＴＰと比較して符号が反対である、請求項３７記載の方法。
【請求項４７】
検出が電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラによる、請求項３７記載の方法。
【請求項４８】
検出が、光ファイバセンサの色素含浸ポリマーコーティングによる、請求項３７記載の方法。
【請求項４９】
検出が遮断電流による、請求項３７記載の方法。
【請求項５０】
検出がフォトダイオードによる、請求項３７記載の方法。
【請求項５１】
リン酸の検出可能な部分から無傷のＮＰプローブを分離する方法であって、
ａ）検出可能な部分が結合した無傷のＮＰプローブを含む試料を提供する段階であって、無傷のＮＰプローブが酵素的に切断されると、該無傷のＮＰプローブの分子電荷とは異なる分子電荷を保有するリン酸の検出可能な部分を形成する段階と、
ｂ）試料にエネルギー場を適用し、それによって該無傷のＮＰプローブからリン酸の検出可能な部分を分離する段階と
を含む方法。
【請求項５２】
無傷のＮＰプローブが、末端のリン酸に検出可能な部分を有する電荷スイッチリン酸ヌクレオチドプローブである、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
無傷の電荷スイッチリン酸ヌクレオチド（ＮＰ）プローブを同定するための方法であって、
ａ）無傷の電荷スイッチＮＰプローブを含む試料に酵素を接触させて、リン酸の検出可能な部分を形成する段階と、
ｂ）試料に電場を適用する段階であって、リン酸の検出可能な部分は、該無傷の電荷スイッチＮＰプローブと異なる電極に移動する段階と
を含む方法。
【請求項５４】
酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ホスホジエステラーゼおよびホスファターゼからなる群より選択される、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
無傷の電荷スイッチリン酸ヌクレオチド（ＮＰ）プローブが酵素的に切断されると、リン酸の検出可能な部分を形成し、リン酸の検出可能な部分が一方の電極に移動し、無傷の電荷スイッチＮＰプローブが他方の電極に移動する、無傷の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項５６】
無傷のＮＰプローブが正の分子電荷を有するか、またはリン酸の検出可能な部分が切断されると、該リン酸の検出可能な部分が該無傷のＮＰプローブに対して正の分子電荷を保有する、請求項５５記載の無傷の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項５７】
電荷スイッチＮＰプローブがヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）であり、リン酸の検出可能な部分が、蛍光団部分が結合したピロリン酸である、請求項５５記載の無傷の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項５８】
無傷のＮＴＰプローブが正の電荷を有する、請求項５５記載の無傷の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項５９】
リン酸の検出可能な部分がピロリン酸蛍光団部分として切断されると、ピロリン酸蛍光団部分が、無傷のＮＴＰプローブに対して正の電荷を保有する、請求項５７記載の無傷の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項６０】
ＮＴＰプローブが、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）およびヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）からなる群より選択されるメンバーである、請求項５５記載の無傷の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項６１】
ＮＴＰプローブがデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）である、請求項６０記載の無傷の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項６２】
デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）が、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシシトシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシチミジン三リン酸およびデオキシウリジン三リン酸からなる群より選択されるメンバーである、請求項６１記載の無傷の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項６３】
ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）が、アデノシン三リン酸、シトシン三リン酸、グアノシン三リン酸およびウリジン三リン酸からなる群より選択されるメンバーである、請求項６０記載の無傷の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項６４】
蛍光団部分が、リンカーを介して末端リン酸に結合している、請求項５７記載の無傷の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項６５】
蛍光団リンカーが、炭素数約５〜約１２個のアルキレン基である、請求項６４記載の無傷の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項６６】
核酸を配列決定するための方法であって、
標的核酸、プライマー鎖、ポリメラーゼおよび複数のＮＰプローブを提供する段階と、
複数のＮＰプローブの標的依存的重合を可能にする条件下において標的核酸、配列プライマー、ポリメラーゼ、複数のＮＰプローブをフローセル中で混合して、それによって重合産物を提供する段階と、
エネルギー場によってフローセル中の重合産物を分離して、該標的核酸の配列を提供する段階と
を含む方法。
【請求項６７】
複数のＮＰプローブの重合が複数のリン酸の検出可能な部分を形成する、請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
複数のＮＰプローブが、ポリメラーゼを使用して標的核酸にハイブリダイゼーションしたプライマー鎖に組み込まれ、それによって検出可能な部分が結合したγ−リン酸を放出する、請求項６６記載の方法。
【請求項６９】
エネルギー場が電場である、請求項６６記載の方法。
【請求項７０】
電場が横方向に適用される第１の電場であり、第２の電場が軸方向に適用される、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
核酸を配列決定するための方法であって、
標的核酸、ポリメラーゼプライミング部分、ポリメラーゼおよび複数の無傷のＮＰプローブを提供する段階と、
複数のＮＰプローブの標的依存的重合を可能にし、複数のリン酸の検出可能な部分の時間配列を提供することができる条件下において標的核酸、ポリメラーゼプライミング部分、ポリメラーゼおよび複数のＮＰプローブを混合する段階と、
電荷によって、複数のリン酸の検出可能な部分を該複数の無傷のＮＰプローブから分離する段階と、
該複数のリン酸の検出可能な部分を経時的に検出して、該標的核酸の配列を提供する段階と
を含む方法。
【請求項７２】
プライマー部分がヘアピンループである、請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
複数のリン酸の検出可能な部分が、ＰＰｉ色素、末端リン酸の蛍光団部分、検出可能な部分、荷電基、電気的に活性な基、レポーター基およびそれらの組み合わせからなる群より独立に選択される、請求項７１記載の方法。
【請求項７４】
リン酸の蛍光団部分が、１色配列決定、２色配列決定、３色配列決定、４色配列決定およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるメンバーに使用される、請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
ポリメラーゼが単一の分子構成で固定されている、請求項７１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、共に全体の内容が全ての目的のために参照として本明細書に組み入れられている、２０００年６月７日出願の米国特許仮出願第６０／２０９，８９６号および２００１年４月２４日出願の米国特許仮出願第６０／２８６，２３８号の優先権を主張する。本願は、さらに、弁護士名簿番号０２００３１−０００８１０ＵＳおよび０２００３１−０００８２０ＵＳを有し、共に全体の内容が全ての目的のために参照として本明細書に組み入れられている、２００１年６月６日出願の米国特許出願第０９／８７６，３７４号および第０９／８７６，３７５号の優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
核酸の一次配列は、遺伝子の機能および制御を理解するのに重要であり、また分子生物学の基礎技術の多くを適用するのに重要である。実際、ヒトの全ゲノムを解明する目標が達成されると、迅速なＤＮＡ配列決定がより中心的な役割となっている。ＤＮＡ配列決定は、ゲノム分析だけでなく、遺伝的同定、法医学的分析、遺伝相談、医学的診断等などの他の用途の重要なツールである。医学的診断用の配列決定分野に関しては、疾患、疾患素因および疾病状態の予後は、１つまたはそれ以上の遺伝子座に特定のＤＮＡ配列が存在することまたはＤＮＡ配列の変化（または突然変異）の程度に関連することがある。このような現象の例には、ヒト白血病抗原（ＨＬＡ）タイピング、嚢胞性線維素症、腫瘍進行および異質性、ｐ５３癌原遺伝子突然変異およびｒａｓ癌原遺伝子突然変異が挙げられる（Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎら、「ＰＣＲ法と応用（ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」 １： ９１−９８（１９９１）； Ｓａｎｔａｍａｒｉａらに付与された米国特許第５，５７８，４４３号およびＴｓｕｉらに付与された米国特許第５，７７６，６７７号参照）。
【０００３】
種々のＤＮＡ配列決定方法が存在する。ジデオキシ鎖終端法は、現在使用可能な自動ＤＮＡ配列決定装置全ての基礎となっている（Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、７４： ５４６３−５４６７（１９７７）； Ｃｈｕｒｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０： １８５−１８８（１９８８）およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４： ５９−６７（１９９１）参照）。他の方法には、化学分解方法（Ｍａｘａｍら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、７４： ５６０−５６４（１９７７）参照）、全ゲノム方法（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６９、４９６（１９９５）参照）、発現配列タグ配列決定（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０、（１９９５）参照）、ハイブリダイゼーションによる配列決定に基づいたアレイ方法（Ｋｏｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４、１１２３（１９９６）参照）および単一分子配列決定（ＳＭＳ）（Ｊｅｔｔら、Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｄｙｎ． ７、３０１（１９８９）およびＳｃｈｅｃｋｅｒら、Ｐｒｏｃ． ＳＰＩＥ−Ｉｎｔ． Ｓｏｃ． Ｏｐｔ． Ｅｎｇ． ２３８６、４（１９９５）参照）が挙げられる。
【０００４】
１９９９年１２月１３日に出願され、参照として本明細書に組み入れられているＰＣＴ出願米国特許第９９／２９５８５号は、固相支持体における単一分子による配列決定法を開示している。固相支持体は、選択的に、固定されたポリメラーゼを通過して流動する反応物の再生を可能にする流入部および流出部を有する流動チャンバに収容される。流動チャンバはプラスチック製またはガラス製であってもよいが、顕微鏡または光学式読取装置が観測する面が開いているかまたは透明でなければならない。電気浸透流には、固相支持体の固定電荷と、固相支持体の両端に配置された２つの電極間を通過する電圧傾度（電流）が必要である。流動チャンバは、別個に配列決定するための多数のチャネルに分割してもよい。
【０００５】
さらに最近では、２０００年５月１８日に出願されたＰＣＴ出願米国特許第００／１３６７７号は、複数の塩基を有する標的核酸分子を配列決定する方法を開示している。重合反応中の塩基付加の暫定的な順序は核酸分子について測定される。その後、核酸重合酵素の鋳型核酸分子に対する活性がやがて生じる。塩基付加配列の各段階における重合酵素による標的核酸の成長中の相補鎖にどの塩基が組み込まれるかを同定することによって配列が推定される。標識ヌクレオチド類似体を提供する段階と、成長中の核酸鎖を重合する段階と、付加されたヌクレオチド類似体を同定する段階を、核酸鎖がさらに伸長され、次いで配列決定されるように反復する。
【０００６】
さらに、米国特許第４，９７９，８２４号は、単一分子検出は、流動中の試料が、小容量を規定するために使用される空間フィルタを有する集束レーザーを通過するフローサイトメトリーを使用して実施することができることを記載している。さらに、米国特許第４，７９３，７０５号は、フローセル中の粒子の流動列において個々の分子を同定するための検出システムを記載している。この特許は、さらに、異なる蛍光の核酸塩基特異的標識を検出するための複数のレーザー、フィルタおよび検出器を配列する方法を記載している。
【０００７】
固相支持体における単一分子検出はイシカワ（Ｉｓｈｉｋａｗａ）らＪａｎ． Ｊ． Ａｐｐｌｅ． Ｐｈｙｓ． ３３： １５７１−１５７６（１９９４）によって記載されている。そこに記載されているように、単一分子検出は、蛍光顕微鏡に接続した光子計数カメラシステムを含む位置感受性光子計数装置を用いたレーザー励起蛍光技術によって実施される。石英毛細管中の単一分子を検出するための毛細管中の単一分子のレーザー励起蛍光検出も記載されている。レーザーの選択は標識および必要な光線の質に依存する。ダイオード、ヘリウムネオン、アルゴンイオン、アルゴン−クリプトン混合イオンおよびＮｄ： ＹＡＧレーザーが本発明に有用である（Ｌｅｅら、（１９９４） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．、６６： ４１４２−４１４９参照）。
【０００８】
特に、単一分子によるＤＮＡ配列決定に関する場合、単一分子検出のためのより効果的で、効率的のよい化合物、方法およびシステムの必要性が現在存在する。これらの必要性およびさらに別の必要性は本発明によって提供される。
【０００９】
発明の概要
本発明は、核酸の配列を決定し、解明するための化合物と、方法と、システムとに関する。有利なことに、本発明の化合物、方法およびシステムは、迅速且つ増幅またはクローニングの必要なく核酸を配列決定するために使用することができる。
【００１０】
一態様において、本発明は、蛍光団部分が結合した末端のリン酸を有し、第１の分子電荷が結合した無傷のＮＰプローブを含み、末端のリン酸がリン酸蛍光団部分として切断されると、リン酸蛍光団部分が第２の分子電荷を保有し、該第１の分子電荷と該第２の分子電荷の差が少なくとも０．５である電荷スイッチ（ｃｈａｒｇｅ−ｓｗｉｔｃｈ）リン酸ヌクレオチド（ＮＰ）プローブを提供する。好ましくは、第１の分子電荷と第２の分子電荷の差が、ｐＨ ７．０の純水中で算出した場合、少なくとも０．５である。好ましい局面において、電荷の差は約１〜約４およびその間の任意の小数である。ある好ましい態様において、ＮＰプローブは正電荷を有するか、または末端のリン酸がリン酸蛍光団部分として切断されると、リン酸蛍光団部分は、ＮＰプローブに対して正の電荷を保有する。
【００１１】
好ましい局面において、ＮＰプローブはヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）であり、末端リン酸は、蛍光団部分が結合したγ−リン酸である。ある局面において、ＮＰプローブは、標的核酸に相補的である成長中の核酸鎖に組み込まれ、その結果、蛍光団部分が結合したγ−リン酸が検出可能なピロリン酸部分として放出される。
【００１２】
一態様において、本発明は、無傷の電荷スイッチＮＰプローブが酵素的に切断されると、リン酸の検出可能な部分を形成し、リン酸の検出可能な部分が一方の電極に移動し、無傷の電荷スイッチＮＰプローブが他方の電極に移動する無傷の電荷スイッチリン酸ヌクレオチド（ＮＰ）プローブを提供する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、検出可能な部分を有する標識リン酸ヌクレオチドを試料流動体中に放出された荷電した検出可能な部分から分離するための方法であって、ａ）単一分子構成の固相支持体に、核酸ポリメラーゼまたは標的核酸を含む複合体を固定する段階と、ｂ）複合体に、ポリメラーゼが固定されている場合には標的核酸または標的核酸が固定されている場合にはポリメラーゼ、標的核酸の一領域と相補的であるプライマー核酸および検出可能な部分を有する標識リン酸ヌクレオチドを含む試料流動体を接触させる段階であって、ＮＰがプライマー核酸に組み込まれると検出可能な部分が荷電した検出可能な部分として放出される段階と、ｃ）試料流動体にエネルギー場を適用し、それによって荷電した検出可能な部分から標識ＮＰを分離する段階とを含む方法を提供する。
【００１４】
ある局面において、ＮＰは、検出可能な部分を有する標識ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）であり、検出可能な部分は、蛍光団部分が結合したγ−リン酸である。好ましい局面において、放出後の検出可能な部分の電荷は、検出可能な部分が結合した標識リン酸ヌクレオチド（ＮＰ）とは異なる。
【００１５】
別の態様において、本発明は、標的核酸を配列決定するための方法であって、ａ）単一分子構成の固相支持体に、核酸ポリメラーゼまたは標的核酸を含む複合体を固定する段階と、ｂ）複合体に、ポリメラーゼが固定されている場合には標的核酸または標的核酸が固定されている場合にはポリメラーゼ、配列決定対象の領域の標的核酸の一領域と相補的であるプライマー核酸および検出可能な部分を有する標識リン酸ヌクレオチド（ＮＰ）を含む試料流動体を接触させる段階であって、ＮＰがプライマー核酸に組み込まれると検出可能な部分が荷電した検出可能な部分として放出され、固相支持体が、流入部と流出部を有するフローセルに配置されている段階と、ｃ）試料流動体にエネルギー場を適用する段階と、ｄ）荷電した検出可能な部分を検出し、それによって標的核酸を配列決定する段階とを含む方法を提供する。好ましい局面において、エネルギー場は横方向に適用される電場などの第１のエネルギー場および軸方向に適用される圧力場などの第２のエネルギー場である。リン酸ヌクレオチドは、好ましくは、ヌクレオチド三リン酸である。
【００１６】
好適な核酸塩基には、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、デアザアデニンおよびデアザグアノシンが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい態様において、ＮＰｓは電荷スイッチγ−リン酸標識ｄＮＴＰである。一局面において、ポリメラーゼが固定され、試料流動体が標的核酸を含有する。別の局面において、標的核酸が固定され、試料流動体がポリメラーゼを含有する。別の局面において、本発明の方法は、試薬と産物を選別するために、試料流動体に横方向の電場を適用する段階を含む。
【００１７】
さらに別の局面において、本発明は、蛍光標識ヌクレオチドとポリメラーゼとの接触を促進し、その後光学的視野からそれらを除去する（と同時にシグナルを発する）のに使用することができる。システムは、検出を促進する単一分子による配列決定スキームに特に有用である。従って、本発明は、ａ）検出可能な分析物を有する試料流動体が流動する流入部と流出部を有するフローセルと、ｂ）試料流動体に適用されるエネルギー場供給源と、ｃ）分析物を検出するための検出器を備える、単一分子検出のための微小製造されたフローセルシステムを提供する。
【００１８】
ある局面において、このシステムは、一方のエネルギー場は試料流動体に軸方向に、他方のエネルギー場は横方向に適用される２つのエネルギー場を含む。好ましくは、適用されるエネルギー場は電場、圧力場およびそれらの組み合わせである。この場は可変であるので、ヌクレオチドおよび（組み込み後の）リン酸の検出可能な部分（例えば、蛍光標識されたリン酸）の動きを制御することができる。
【００１９】
ある態様において、フローセルは、検出可能な分析物を有する試料流動体が流動する多数の流入部と多数の流出部を有する。第１のエネルギー場および第２のエネルギー場以外に、ある局面において、本発明のフローセルは、フローセル配列全体に配置される一連のエネルギー場並びに一連の固定されたポリメラーゼ、標的核酸およびそれらの組み合わせを単一分子構成で含む。この配列は、単一のフローセル装置において複数の核酸を分析するために使用することができる。
【００２０】
従来の化合物、方法およびシステムを上回る数多くの利益および利点が本発明によって達成される。例えば、電荷スイッチリン酸ヌクレオチドにより、切断された末端リン酸（例えば、ピロリン酸）を無傷のリン酸ヌクレオチドプローブ試薬から分離することができる。この特徴は、エネルギー場を用いたマイクロチャネル選別システムにおける単一分子によるＤＮＡ配列決定に有用である。各々が独自の色素で標識された４つの異なるＮＴＰｓを使用して、異なる標識を有する放出されたピロリン酸を検出することによってリアルタイムＤＮＡ配列決定が可能になる。このように電荷が異なる分子を電気的に選別することによって、組み込まれていないＮＴＰｓから妨害されることなく、またポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体を照射することなく、切断されたＰＰｉ色素分子が単独で検出される。
【００２１】
フローセルに関しては、エネルギー場は、シグナル検出の確率を増加するために、分子の電荷により変えてもよい。さらに、本発明のシステムのフローセルは、検出可能な部分のシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を増加する。Ｓ／Ｎを増加することによって、検出限界を低くすることができる。
【００２２】
これらおよび他の目的および利点は、以下の添付の詳細な説明および図面を読むと、より明らかになる。
【００２３】
本発明の詳細な説明および好ましい態様
Ｉ．  定義
本明細書において使用する「電荷スイッチヌクレオチド」という用語は、リン酸の検出可能な部分（例えば、ＰＰｉ色素）が放出または切断されると、無傷のリン酸ヌクレオチドプローブ（例えば、γ−ＮＰ色素）と比較して、異なる正味電荷が切断産物に結合している標識リン酸ヌクレオチド（例えば、γ−ＮＰ色素）をいう。ある好ましい局面において、色素のＰＰｉへの結合は、酸素に代わって窒素を介する。好ましくは、無傷のγ−ＮＰ色素とＰＰｉ色素との電荷の差は少なくとも０．５であり、より好ましくは約１〜約４である（例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９および４．０）
【００２４】
「ＰＰｉ色素」または「ＰＰ−Ｆ」等の用語は、無傷の電荷スイッチヌクレオチド（ＮＴＰ）からのピロリン酸切断産物をいう。ヌクレオチド二リン酸を使用する場合には、切断産物は「Ｐ色素」または「Ｐ−Ｆ」である。
【００２５】
「リン酸の検出可能な部分」という用語は、本発明のＮＰプローブからの検出可能な切断産物をいう。例として、ＰＰｉ色素、ＰＰ−Ｆ、Ｐ色素、リン酸の蛍光団部分、末端リン酸の蛍光団部分、検出可能な部分、荷電基、電気的に活性な基、検出可能な基、レポーター基、それらの組み合わせ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
本明細書において使用する「不均質」アッセイ法という用語は、アッセイ混合物の反応物の少なくとも１つが、固相支持体などの固相に結合されているアッセイ方法をいう。
【００２７】
本明細書において使用する「オリゴヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド等を含むヌクレオチドまたはそれらの類似体の直鎖状オリゴマーを含む。通常、オリゴヌクレオチドは、３〜４のような数個のモノマー単位から数百のモノマー単位までサイズがある。オリゴヌクレオチドが「ＡＴＧＣＣＴＧ」などの文字の配列によって表される場合はいつも、特に明記しない限り、ヌクレオチドは左から右に５’−３’の順であり、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」はチミジンを示す。
【００２８】
本明細書において使用する「ヌクレオシド」という用語は、例えば、コーンバーグ（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ）およびベイカー（Ｂａｋｅｒ）、「ＤＮＡ複製（ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」、第２版（Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ、１９９２）に記載されている、２’−デオキシ型および２’−ヒドロキシル型を含む、ペントースの１’位に結合したプリン、デアザプリンまたはピリミジンヌクレオシド塩基、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシン等からなる化合物をいう。
【００２９】
本明細書において使用する「ヌクレオチド」という用語は、エステル化の最も一般的な部位がペントースのＣ５位に結合した水酸基である、ヌクレオシドのリン酸エステル、例えば、モノリン酸エステル、ジリン酸エステルおよびトリリン酸エステルをいう。ヌクレオシドには、例えば、シュート（Ｓｃｈｅｉｔ）、「ヌクレオチド類似体（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ）」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ、Ｎ．Ｙ．、１９８０）に大体において記載されている、修飾塩基部分および／または修飾糖部分を有する合成ヌクレオシドも挙げられるが、これらに限定されない。好適なＮＴＰｓには、天然型および合成ヌクレオチド三リン酸が挙げられるが、ＡＴＰ、ｄＡＴＰ、ＣＴＰ、ｄＣＴＰ、ＧＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ、ｄＴＴＰ、ＵＴＰおよびｄＵＴＰに限定されない。好ましくは、本発明の方法に使用されるヌクレオチド三リン酸は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰおよびそれらの混合物から選択される。
【００３０】
「プライマー」という用語は、独自のポリヌクレオチド配列に特異的にアニーリングし、ポリヌクレオチド配列の相補鎖の合成を可能にする直鎖状のオリゴヌクレオチドをいう。ある態様において、プライマーはヘアピンのような鋳型に共有結合する。
【００３１】
ポリヌクレオチドに言及する際の「配列決定」または「ヌクレオチド配列を決定する」という句は、ポリヌクレオチドの一部および全部の配列情報を決定することを含む。すなわち、この用語は標的ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドについての配列の比較、フィンガープリンティングおよび同レベルの情報並びに標的ポリヌクレオチドにおけるヌクレオシド、通常各ヌクレオシドの発現同定および順番づけを含む。この用語はまた、標的ポリヌクレオチド内の４種のヌクレオチドの１つ、２つまたは３つの同定、順番および位置の決定を含む。
【００３２】
「固相支持体」という用語は、不均質反応により液相の試薬と相互作用する固相の物質をいう。固相支持体は、１つまたはそれ以上の結合部位を介する共有または非共有結合によって、酵素、ペプチド、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドなどのタンパク質で誘導体化され、それによってタンパク質または核酸を固相支持体に「固定」してもよい。
【００３３】
「標的核酸」または「標的ポリヌクレオチド」という句は、配列の同一性またはヌクレオシドの順番もしくは位置が本明細書に記載されている方法を使用して決定することができる核酸またはポリヌクレオチドをいう。
【００３４】
「末端リン酸の酸素」という句は、ヌクレオチドリン酸プローブの末端のリン酸の原子に結合した二次電離酸素原子（ｐＫ〜６．５）をいう。
【００３５】
「内部リン酸の酸素」という句は、ヌクレオチドリン酸プローブの一次電離酸素原子（ｐＫ〜２）をいう。ＮＴＰは３つの内部リン酸の酸素（α、βおよびγ−リン酸に各１つ）プラス１つの末端リン酸の酸素（γ−リン酸）を有する。
【００３６】
「単一分子構成」という用語は、本発明の化合物、方法およびシステムが、一連の分子のメンバーが規定の位置に配置された個々の分子として存在する固相支持体上の一連の分子などの単一分子事象を測定できることをいう。メンバーは同じであっても、異なってもよい。
【００３７】
ＩＩ．  化合物
一態様において、本発明は、電荷スイッチリン酸ヌクレオチド（ＮＰ）プローブを提供する。ＮＰプローブは、蛍光団部分が結合した末端リン酸を有する。ＮＰプローブはヌクレオチド二リン酸であっても、ヌクレオチド三リン酸であってもよい。好ましくは、電荷スイッチＮＰプローブはヌクレオチド三リン酸である。ある好ましい局面において、ヌクレオシド部分は、正または負の電荷を与える付加物で修飾される。以下に詳細に説明されるように、修飾は塩基、糖、リン酸基、リンカーおよびそれらの組み合わせに生じてもよい。有利なことに、無傷の電荷スイッチヌクレオチドを切断されたＰＰｉ色素から分離するなどによって、互いに対して異なる電荷を有する分子を電気的に選別することによって、切断されたＰＰｉ色素（ＰＰｉ−Ｆ）分子は組み込まれていないＮＰプローブ（例えば、γ−ＮＰ色素）から妨害されることなく、単独で検出される。
【００３８】
ある態様において、核酸の成長中の相補鎖にＮＰプローブが組み込まれることにより、リン酸の検出可能な部分が放出される。好ましい態様において、検出可能な部分は、ポリメラーゼによりγ−標識ｄＮＴＰｓから切断されるγ−リン酸標識である。特に好ましい態様において、陽イオンγ−標識を有するγ−標識−ｄＮＴＰｓは、無傷の三リン酸（γ−ＮＴＰ色素）の電荷が負で、放出されるＰＰｉ色素が正である電荷スイッチング挙動を示す。従って、ＰＰｉ色素の放出により、ＰＰｉ−蛍光団部分に切断依存的な電荷の変化が生じる。ある局面において、ヌクレオシドからのピロリン酸の切断は、ヌクレオシドに関連する電荷を差し引く。これらの電荷の変化は正であっても、負であってもよい。ある局面において、ＰＰｉ色素の切断は、末端のリン酸−酸素が対イオンとして１価または２価陽イオン（例えば、Ｍｇ＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｋ＋、Ｎａ＋等）に結合するので、末端のリン酸の酸素を形成することによって、内部リン酸−酸素より良好にＰＰｉ色素部分に正の電荷を付加する。
【００３９】
ある局面において、本発明の電荷スイッチＮＰプローブは総正電荷を有する。例えば、塩基にはアミンが結合してもよく、このアミンはプロトン化することができる。塩基−陽イオンが切断されると、ＰＰｉ色素はさらに負になる。逆に、負塩基ＮＰ（例えば、カルボン酸塩、硫酸塩等が結合している塩基）が切断されると、ＰＰｉ色素はさらに正に荷電される。中性塩基ＮＴＰ（天然の構造）が切断されても、末端のリン酸酸素が形成される以外にＰＰｉ色素に何の貢献もしない。
【００４０】
Ａ．  荷電状態
ＮＰプローブおよび放出された末端リン酸（例えば、ピロリン酸）の荷電状態は本発明の化合物のパラメーターである。当業者は、γ−ＮＰ色素および末端リン酸色素（例えば、ＰＰｉ色素部分）の電荷を形成または電荷に貢献する種々のパラメーターを考慮している。ある局面において、電荷スイッチリン酸ヌクレオチド（ＮＰ）プローブは、蛍光団部分が結合した末端リン酸を有する無傷のＮＰプローブを含む。無傷のＮＰプローブは第１の分子電荷が結合しており、ピロリン酸蛍光団部分の切断などの末端リン酸が切断されると、ピロリン酸蛍光団部分が第２の分子電荷を保有する。約ｐＨ ７の純水中で得られるイオン条件下で算出する場合、第１の分子電荷は第２の分子電荷より少なくとも０．４異なる（図２参照）。無傷のＮＰプローブとの電荷の差は、さらに好ましくは、約１〜約４および整数１、２および３の任意の小数である。
【００４１】
γＮＰ色素もしくは末端のリン酸色素（例えば、ＰＰｉ色素）のどちらかまたは両方の荷電状態は、ｉ）塩基の電荷、ｉｉ）蛍光団またはリンカーの電荷およびｉｉｉ）緩衝液の陽イオン組成および濃度を算出することによって任意のイオン条件について測定することができる（実施例Ｉ参照）。
【００４２】
一般に、ｄＮＴＰなどのリン酸ヌクレオチドの正味電荷は、塩基の環窒素および３つのリン酸によって支配される。約６．５〜約８．５のｐＨでは、塩基はほとんどが未荷電である（窒素のｐＫは３〜４および９．５〜１０）。各リン酸のイオン化可能な各酸素原子の一次電離（ｐＫ〜２）は、完全な１つの負電荷を生じる。リン酸酸素に特異的な二次電離（ｐＫ〜６．５）はｐＨ ７．５では時間平均電荷−０．９を生じるので、ｄＮＴＰの総電荷は−３．９である。
【００４３】
図１は、本発明の代表的な化合物を例示し、無傷のγ−ＮＰ色素および検出可能な部分を有する放出されたピロリン酸を示す。図１に示すように、ある局面において、核酸塩基は陽イオン付加物を保有し、末端酸素はγ−ｄＮＴＰでは窒素および標識部分で置換され、従って、二次電離がなくなり、ｐＨ ７（Ｈ２Ｏ）では、γ−ｄＮＴＰの電荷は−２．０（中性のγ−標識）である。ヌクレオチドからの切断後では、ＰＰｉ色素の荷電は−２．７４である。その理由は、核酸塩基の正電荷（＋１）を失ったが、末端のリン酸酸素との水素イオン平衡により部分的な正電荷（＋０．２６）を再び得たからである（置換二リン酸の二次電離はｐＫ ６．４）。
【００４４】
図２は、理想的な条件下（結合する対イオンまたは緩衝液が存在せず、荷電付加物は完全に荷電している）または純水（最後のカラムのみ）における核酸塩基および色素並びにそれらのそれぞれの正味電荷に関連する種々の態様および電荷を示す参照用の表である。エントリー３２は先の実施例を例示する。図２に表で示されるように、理想的な条件では、核酸塩基は電荷が１であり、色素は電荷が０であるので、正味電荷−２がγ−ＮＰ色素に関連し、電荷−３がＰＰｉ色素であり、電荷の差が−１となる。しかし、ＰＰｉ−Ｆの末端リン酸酸素は水素イオンとより容易に結合するので、ｐＨ ７の純水中では電荷の差はわずかに少ない（−０．７４、最後のカラム）。表に示すように、核酸塩基および色素の種々の電荷は、成長中の核酸に核酸塩基が組み込まれると、色素に異なる影響を与える。核酸塩基がＤＮＡに組み込まれる場合、核酸塩基が色素から分離されるので、理想的な条件下における電荷の差は、核酸塩基部分および末端のリン酸色素部分の電荷の反対の合計に等しい。純水（最後のカラム）中の電荷の差は水素イオン平衡による結合を考慮している。
【００４５】
ある他の態様において、本発明の電荷スイッチＮＰプローブには、それらに関連する種々の対イオンを有する（例えば、Ｍｇ＋＋または他の陽イオン）。例えば、Ｍｇ＋＋は、１０３〜１０５ｓｅｃ−１で迅速に平衡化する種々の配位異性体のリン酸基と結合する。タンパク質と同じように、Ｍｇ＋＋イオンも「内部」リン酸より末端リン酸によりしっかりと結合する。これは、ＰＰｉ色素部分は、γ−ｄＮＴＰ色素と比較して多くの正電荷を対イオンから獲得することを意味している。操作の際には、本発明の化合物、方法およびシステムを使用して、例えば、マイクロチャネルシステムにおいて、この差を使用して、放出されたＰＰｉ色素を無傷のγ−ＮＴＰ色素から選別または分離する。
【００４６】
以下にさらに詳細に説明するように、正または負に荷電した基をヌクレオシドに結合することによって（通常は、ｐＨ ７．５の中性）、電荷スイッチの大きさを増大することができる。ＮＰプローブおよびＰＰｉ−Ｆの両方が負に荷電するか、または両方が正に荷電するか、または一方が負に荷電し、他方が正に荷電するように、蛍光団および／またはリンカーのγ−リン酸標識に荷電基を結合することによって電荷スイッチの範囲を設定することができる。このような組み合わせおよび変形は全て本発明に含まれる。従って、塩基がＤＮＡに組み込まれると、荷電基がＰＰｉ−Ｆから分離されて、「天然」の対イオン（例えば、Ｍｇ＋＋）依存的電荷効果を増強する。
【００４７】
選別のために使用することができる電荷スイッチモードには１０種類ある（負−弱い負、負−強い負、負−０、負−正、０−負、０−正、正−負、正−０、弱い正−強い正および強い正−弱い正）。２つの「二極」様式、すなわち、負−正、正−負は電気的選別に好ましいが、他の様式も適当な微小流動条件下において使用することができる。図２の他の好ましい化合物を表１に記載する。
【表１】
2004516810.tif 000003
【００４８】
二極モードを得るために、電荷スイッチが中性を「通過する」ように、γ−ｄＮＴＰを荷電に関して「平衡化」する。図３（Ａ〜Ｆ）は、対イオン濃度（例えば、Ｍｇ＋＋イオン）が一般的なγ−ヌクレオチド（Ｎ−ＰＰＰ−Ｆ）および切断産物（ＰＰ−Ｆ）の電荷にどのように影響するかを例示する。６つの異なる電荷構成「Ｎ（ｂ）Ｆ（ｇ）」を示す（Ａ〜Ｆ）（式中、ｂおよびｇは、それぞれ、ヌクレオシドγ−標識の電荷である）。（異なるｐＫ’ｓを有する）荷電基は、例えば、正電荷（＋）を付加する１級もしくは４級アミンまたは負電荷（−）を付加するカルボン酸等であってもよい。付加基がない場合にはＮ（０）Ｆ（０）（パネルＡ）、ｐＨ ８における最大の電荷スイッチ（ｃｈａｒｇｅ ｓｗｉｔｃｈ）（Δｑ＝＋１）は約２ ｍＭのＭｇ＋＋で生じ、変化は負の範囲（−２．５〜−１．５）である。γ−標識に（＋２）の電荷を付加することによって（パネルＢ）、シフトが、γ−ｄＮＴＰ−ＦおよびＰＰｉ−Ｆが反対に荷電する（−０．５−＋０．５）に二極モードであることを除いて、同じ電荷スイッチが得られる（Δｑ＝＋１）。図３の他の構成（Ｃ〜Ｆ）は、核酸塩基および／またはγ−標識に種々の電荷を付加することによって、（電気的選別を容易にするために）電荷スイッチの大きさをさらに増すことができることを示す。図３から明らかなように、電荷の差（Δｑ）は負の範囲、正の範囲、負から正の範囲または正から負の範囲において生じてもよい。
【００４９】
図４に例示するように、無傷のＮＰプローブと検出可能な部分との電荷の差は、γ−標識に固定された荷電部分を介して導入することができるので、γ−ＮＴＰ色素は正味負であり、ＰＰｉ色素は正味正である。図４に示すように、＋２の電荷を有するリンカーを使用して、電気的に中性の色素ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ） ＴＲ（登録商標）をｄＴＴＰに結合する。このヌクレオチドをポリメラーゼによりＤＮＡに組み込むことができ、リン酸が放出されるので、ＰＰｉ−Ｌｉｎｋｅｒ色素部分は、γ−ＮＴＰ色素より大きい正電荷を獲得する。
【００５０】
以下の実施例Ｉに記載されている等式を使用し、図５を参照すると、金属対イオンが存在する場合または存在しない場合におけるγ−ＮＰ色素および放出された末端リン酸（例えば、ＰＰｉ色素）の正味電荷を算出することができる。ある例において、本発明の化合物に対する陽イオンの平衡結合は、陽イオンの組成、濃度およびｐＨに応じてΔｑに約１の正電荷を加える（図３参照）。
【００５１】
各部分の電荷の決定は、以下の実施例Ｉおよび図５に例示する平衡算出式を使用して実施することができる。平衡等式を使用して、実施例Ｉは、図４の化合物の電荷の測定値を記載している。
【００５２】
図６（Ａ〜Ｄ）は、本発明の種々の電荷スイッチヌクレオチドを例示する。これらの化合物は例示にすぎず、本明細書の特許請求の範囲を限定するべきではない。当業者は、他の変更、改良および代替を認識している。
【００５３】
ある局面において、本発明は、電荷スイッチリン酸ヌクレオチド（ＮＰ）プローブを提供する。ＮＰプローブは蛍光団部分が結合した末端リン酸を有し、無傷のＮＰプローブには第１の分子電荷が結合しており、リン酸またはピロリン酸基が付加した蛍光団部分が切断されると、Ｐ−ＦまたはＰＰｉ−Ｆは第２の電荷を有する。第１の電荷および第２の電荷は異なる。式Ｉは、
【化１】
2004516810.tif 000004
本発明の電荷スイッチリン酸ヌクレオチドプローブを提供する。
【００５４】
式Ｉにおいて、Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、５−メチルシトシン、ハイポキサンチンまたは２−アミノアデニンを含むが、これらに限定されない天然型または合成プリンまたはピリミジン複素環塩基を含むが、これらに限定されない核酸塩基である。他のこのような複素環塩基には、２−メチルプリン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン、２，６−ジメルカプトプリン、２−アミノ−６−メルカプトプリン、５−メチルシトシン、４−アミノ−２−メルカプトピリミジン、２，４−ジメルカプトピリミジンおよび５−フルオロシトシンが挙げられる。代表的な複素環塩基は、参照として本明細書に組み入れられている、米国特許第３，６８７，８０８号（Ｍｅｒｉｇａｎら）に開示されている。
【００５５】
ある好ましい局面において、Ｂは荷電部分を含む。これらの荷電塩基部分は正に荷電していても、負に荷電していてもよい。荷電塩基部分を使用して、塩基または無傷のγ−ＮＴＰ−Ｆに追加の電荷を付与することができる。好適な荷電塩基結合基はカルボン酸基、スルホン酸基等を付加することができる。
【００５６】
式ＩのＲ１は、水素、水酸基または荷電基、例えば、Ｌ−ＳＯ３−、Ｌ−ＮＨ３＋、Ｌ−ＣＯ２−等（式中、Ｌはリンカーである）である。
【００５７】
式ＩのＲ２は、水素または荷電基、例えば、Ｌ−ＳＯ３−、Ｌ−ＮＨ３＋、Ｌ−ＣＯ２−等（式中、Ｌはリンカーである）である。
【００５８】
式Ｉにおいて、Ｘは、窒素、酸素および硫黄などのヘテロ原子である。好ましくは、Ｘは窒素である。本発明のＮＰプローブは四リン酸、三リン酸または二リン酸であってもよいので、式Ｉの指数「ｙ」は０、１または３であってもよい。
【００５９】
式Ｉにおいて、Ｆは蛍光団または色素である。ある好ましい局面において、Ｆは荷電標識リンカー基を含む。荷電標識結合基を使用して、蛍光団部分（すなわち、切断されたＰＰｉ−ＦまたはＰ−Ｆ）に追加の電荷を付与することができる。好適な荷電標識結合基は四級窒素等を付加することができる。式Ｉの化合物には、対イオンが結合してもよい。これらの対イオンには、Ｍｇ＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｋ＋およびＮａ＋を含むが、これらに限定されない１価および２価金属イオンが含まれる。当業者は、本発明に使用するのに好適な別の対イオンを周知している。図６（Ａ〜Ｄ）は本発明の好ましい化合物を記載している。
【００６０】
Ｂ．  標識
多数の色素または標識が本発明の電荷スイッチリン酸ヌクレオチドに好適である。実際、蛍光および発色分子並びに関連する光学的特性の膨大なリストを提供する文献から大量の実用的な手引きが入手できる（例えば、Ｂｅｒｌｍａｎ、「芳香族分子の蛍光スペクトルハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」、第２版（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７１）、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、「有機分子の色と構成（Ｃｏｌｏｕｒ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７６）、Ｂｉｓｈｏｐ編、インジケータ（Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ）（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９７２）、Ｈａｕｇｌａｎｄ、「蛍光プローブおよび研究用化合物ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、１９９２） Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ、「蛍光とリン光（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）」（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９４９）等を参照）。さらに、以下の参照文献、米国特許第３，９９６，３４５号、カーナ（Ｋｈａｎｎａ）ら、および米国特許第４，３５１，７６０号によって例示されるように、ヌクレオチドに付加することができる共通の反応性基を介して共有結合する蛍光分子を誘導体化する広範な手引きが文献で見られる。
【００６１】
ある好ましい局面において、好適な色素には、クマリン色素、キサンテン色素、レゾルフィン、シアニン色素、ジフルオロボラジアザインダセン色素（ボディピー）、アレキサ（ＡＬＥＸＡ）色素、インドール、ビマン、イソインドール、ダンシル色素、ナフタルイミド、フタルイミド、キサンテン、ランタニド色素、ローダミンおよびフルオロレセインが挙げられるが、これらに限定されない。ある態様において、ある可視色素および近赤外線色素が、単一分子として検出されるのに十分な蛍光を示し、光安定性であることが知られている。この局面において、可視色素、ボディピー Ｒ６Ｇ（５２５／５４５）および大型色素、ＬＩ−ＣＯＲの近赤外線色素、ＩＲＤ−３８（７８０／８１０）が単一分子感度で検出することができ、本発明を実施するのに使用することができる。
【００６２】
ある好ましい局面において、好適な色素には、フルオロレセイン、５−カルボキシフルオロレセイン（ＦＡＭ）、ローダミン、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、アントラニルアミド、クマリン、 テルビウムキレート誘導体、リアクティブレッド（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ）４、ボディピー色素およびシアニン色素が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
ある局面において、リン酸の検出可能な部分は荷電基である。以下に説明するように、図６Ｅのスキーム１〜６は、γ−リン酸結合のための脂肪族リンカーを記載している。ある態様において、スキーム１〜６のリンカーは、蛍光団などの標識をさらに結合しないで使用することができる。リンカー自体をリン酸の検出可能な部分として使用することができる。
【００６４】
Ｃ．  標識のリンカー
以下の参照文献によって例示されるように、ヌクレオチドに蛍光団部分を結合する多数の結合部分および方法が存在する：エクスタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）編、「オリゴヌクレオチドおよび類似体：実用方法（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード、１９９１）、ザッカーマン（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５： ５３０５−５３２１（１９８７）（オリゴヌクレオチドの３’チオール基）、シャーマ（Ｓｈａｒｍａ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９：３０１９（１９９１（３’スルフヒドリル）、ギルスティ（Ｇｉｕｓｔｉ）ら、「ＰＣＲ法と応用（ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、２： ２２３−２２７（１９９３）およびファング（Ｆｕｎｇ）ら、米国特許第４，７５７，１４１号（カリフォルニア州フォスターシティーのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のアミノリンク（Ａｍｉｎｏｌｉｎｋ）（商標） ＩＩを介する５’ホスホアミノ基）、スタビンスキー（Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ）、米国特許第４，７３９，０４４号（３’アミノアルキルホスホリル基）、ＡＰ３標識技術（Ｅ． Ｉ． ＤｕＰｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ＆Ｃｏに付与された米国特許第５，０４７，５１９号および同第５，１５１，５０７号）、アグラワル（Ａｇｒａｗａｌ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、３１： １５４３−１５４６（１９９０）（ホスホラミデート結合を介する結合）、Ｓｐｒｏａｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５： ４８３７（１９８７）（５’メルカプト基）、Ｎｅｌｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１７： ７１８７−７１９４（１９８９）（３’アミノ基）等。
【００６５】
ある局面において、蛍光団部分は、直接またはリンカーを介してγ−リン酸に結合するために誘導体化した蛍光有機色素である。一般に、ヌクレオチド標識は、既知の結合、結合基および関連する相補的な官能基を使用した数多くの既知のヌクレオチド標識技術のいずれかを使用して実施することができる。蛍光団をリン酸に結合する結合基は関連するポリメラーゼと相溶性でなければならない。
【００６６】
一態様において、リンカーは、メチレンまたはエチレン基などのアルキレン基である。この態様において、蛍光団リンカーは、選択的に、ヘテロ原子が挿入されている、炭素原子数約１〜約５０個、好ましくは炭素原子数約１０〜３０個、さらに好ましくは炭素原子数約１５〜約２５個のアルキレン基である。ある局面において、リンカーには、少なくとも１の正または負電荷が結合されている。
【００６７】
ある他の態様において、種々の荷電リンカーを使用することもできる。図６Ｅのスキーム１〜６はγ−リン酸結合の脂肪族リンカーを記載している。
【００６８】
図６Ｅに示すように、スキーム１は、フタルアミド保護基を使用して形成されるＭＯＳ（＋）（１四級塩）を記載している。ＭＱＳは、その後、スキーム３および４において試薬として使用する。スキーム２は、ＢＱＳ（＋＋）（２二級塩）リンカーを記載している。スキーム３は、適当な化学量論を使用して、ＭＱＳ単位１とＢＱＳ単位１を組み合わせることによって製造される、ＴＱＳ（＋＋＋）（３四級塩）リンカーを記載している。フタルアミド保護基は、適宜、１Ｍ ＮａＯＨにおいて２時間反応させて除去される。さらに、スキーム４は、示すように、ＭＱＳ単位２とＢＱＳ単位１を組み合わせることによって製造されるＴｅｔＱＳ（＋＋＋＋）（４四級塩）を記載している。スキーム５は、ＡＡ−ｄＵＴＰのアミノアリルアミノ基の保護を記載しており、スキーム６はＢＱＳリンカーをｄＴＴＰに結合する化学物質を記載している。生成物はＨＰＬＣで精製され、ボディピーＴＲのスクシンイミドエステルと反応させる。
【００６９】
さらに他の態様において、図６Ｆは、末端のリン酸に蛍光団を結合するためのペプチド部分を記載している。好ましくは、ペプチドはアミノ酸鎖が２〜１５である。スキーム７は、ε−アミンを介して３つのリジン（ＫＫＫ）がカップリングし、各残基がリンカーに７原子を提供することを示している。３つのリジンは一体として、ＢＱＳリンカーとほぼ同じサイズである、原子長２１の大型の脂肪族リンカーを形成する。ペプチドのＣ末端およびＮ末端はアミド化またはアシル化によってブロックされる。可逆的な保護基は定方向カップリングを実施するのに必要である。配列ＲＰＴＬ（Ｃ−Ｎ方向）を有する保護基を使用して、アルギニンのＣ末端側のペプチドリンカーをトロンビンによって非常に特異的に切断することができる（Ｈａｒｒｉｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ、９７： ７７５４−７７５９（２０００））。さらに、スキーム８は、ｄＮＴＰｓのγ−Ｐに定方向的にカップリングさせるスキーム７のペプチドを示す。本発明に使用するのに好適な別のリンカーは当業者に明らかである。
【００７０】
Ｄ．  塩基の荷電部分
ある局面において、塩基には、分子電荷を増加または減少するために荷電部分が付加されている。一般に、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの荷電部分を結合することは、既知の結合、結合基および関連の相補的な官能基を使用した膨大な数の既知のヌクレオチド標識技術のいずれかを使用して実施することができる。好ましくは、荷電部分およびヌクレオチドを結合する結合は関連のポリメラーゼと相溶性でなければならない。
【００７１】
好ましくは、荷電部分は、ピリミジン塩基の５−炭素および７−デアザプリン塩基の７−炭素に共有結合される。例えば、その各々が参照として本明細書に組み入れられている、ギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５： ６４５５−６４６７（１９８７）、ゲビュー（Ｇｅｂｅｙｅｈｕ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５： ４５１３−４５３５（１９８７）、ハラムビディス（Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５： ４８５６−４８７６（１９８７）、ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、５（３）２３３−２４１（１９８６）、バーグストローム（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ）ら、ＪＡＣＳ、１１１、３７４−３７５（１９８９）、米国特許第４，８５５，２２５号および同第５，４４９，７６７号のように、本発明に使用することができるいくつかの好適な塩基標識手法が報告されている。好ましくは、結合はアセチレンアミドまたはアルケンアミド結合であり、荷電部分とヌクレオチド塩基との間の結合は、荷電部分の活性化されたＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルとヌクレオチドのアルキニルアミノ誘導化塩基またはアルケニエルアミノ誘導化塩基を反応させることによって形成される。
【００７２】
アルキニルアミノ誘導化ヌクレオチドの合成は、参照として本明細書に組み入れられている、欧州特許出願第８７３０５８４４．０号、Ｅ． Ｉ． ＤｕＰｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ＆Ｃｏに付与された米国特許第５，０４７，５１９号および同第５，１５１，５０７号のホッブズ（Ｈｏｂｂｓ）ら、並びにホッブズ（Ｈｏｂｂｓ）ら、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．、５４： ３４２０（１９８９）によって教示されている。そこに教示されているように、アルキニルアミノ誘導化ヌクレオチドは、適当なハロデオキシヌクレオチド（通常は、５−ヨードピリミジンおよび７−ヨード−７−デアザプリンデオキシヌクレオチド）およびＣｕ（Ｉ）をフラスコに入れ、アルゴンを通気して空気を除去し、乾燥ＤＭＦを添加し、次にアルキニルアミン、トリエチル−アミンおよびＰｄ（０）を添加することによって製造される。反応混合物は数時間または薄層クロマトグラフィーがハロデオキシヌクレオチドが消費されたことを示すまで撹拌することができる。
【００７３】
１９９１年９月１０日にホッブズ（Ｈｏｂｂｓ）ら、に付与された米国特許第５，０４７，５１９号に教示されているように、アルキニルアミノリンカーは、構造、
【化２】
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（式中、Ｒ１は原子数１〜２０の置換または非置換ジラジカル部分である）を有する。Ｎｕｃはプリンまたはピリミジン塩基である。Ｒ１は、選択的に、二重結合、三重結合、アリール基またはＮ、ＯもしくはＳなどのヘテロ原子を鎖に含有する直鎖状アルキレン、Ｃ１−Ｃ２０であってもよい。好ましくは、Ｒ１は直鎖状アルキレンＣ１−Ｃ２０であり、最も好ましくはＲ１はＣＨ２である。Ｒ１の置換基はＣ１−Ｃ６アルキル基、アリール基、エステル基、エーテル基、アミン基、アミド基またはクロロ基を含んでもよい。Ｒ２およびＲ３は、独立に、Ｈ、アルキル、Ｃ１−Ｃ４またはアシルなどの保護基、アルコキシカルボニル、荷電部分またはスルホニルである。好ましくは、Ｒ２はＨであり、Ｒ３は荷電部分である。アルキニルアミノリンカーは、好ましくは、ピリミジンヌクレオチドの５位およびプリンヌクレオチドの７位に結合する。
【００７４】
さらに他の態様において、図６Ｆは、無水コハク酸（−１）または１，２，４−ベンゼントリカルボン酸無水物（−２）を使用してＡＡ−ｄＵＴＰのアミノアリル基をカルボキシル化するための方法を記載している。これにより、高い値の電荷スイッチ構造物を試験するための負電荷塩基が提供される。さらに、スキーム１０は、ペプチドリンカーがスキーム９に記載されているカルボキシル化γ−ｄＵＴＰｓを合成するために使用されることを示している。
【００７５】
さらに別の局面において、荷電基は糖に結合される。好適な荷電基およびそれらの合成は、米国特許第６，１９１，２６６号（参照として本明細書に組み入れられている）に開示されている。荷電基はＣ２もしくはＣ３またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００７６】
Ｅ．  電荷を評価するアッセイ法
当業者は、無傷のリン酸ヌクレオチドおよび標識を保有する切断されたピロリン酸の電荷を評価するために種々のアッセイ法が容易に実施されることを容易に認識する。以下のアッセイ法は、γ−ＮＰ色素および放出されたＰＰｉ−ＦまたはＰ−Ｆ部分の正味電荷を算出および評価するために使用可能な多数のアッセイ法の１つである。
【００７７】
ある例において、実施例ＶＩＩに記載されているアッセイ法は、ヌクレオチドの末端リン酸に結合している色素に関連する電荷の変化を試験するために使用される。一態様において、電荷スイッチは、ヌクレオチドに色素を結合するホスホジエステル結合の切断によって生じる。一例において、切断はヘビ毒ホスホジエステラーゼによって触媒される。本明細書に掲載されているＤＮＡポリメラーゼなどの他の酵素も、電荷スイッチングを証明するために使用することができることが理解されている。
【００７８】
従って、別の態様において、本発明は、無傷の電荷スイッチリン酸ヌクレオチド（ＮＰ）プローブを同定するための方法であって、ａ）無傷の電荷スイッチＮＰプローブを含む試料に酵素を接触させて、リン酸の検出可能な部分を形成する段階と、ｂ）試料に電場を適用する段階であって、リン酸の検出可能な部分は、無傷の電荷スイッチＮＰプローブと異なる電極に移動する段階とを含む方法を提供する。
【００７９】
ＩＩＩ．  方法
本発明の電荷スイッチリン酸ヌクレオチドプローブは、核酸を配列決定するための方法およびシステムなどの種々の方法およびシステムに使用することができる。上記のように、ある局面において、γ−標識は、種々のポリメラーゼによってγ−ｄＮＴＰｓから切断される。この反応では、組み込まれたヌクレオチドのαおよびβリン酸間のリン酸エステルはＤＮＡポリメラーゼによって切断され、β−γ−二リン酸（ピロリン酸）が溶液に放出される。本明細書において使用される、ピロリン酸という用語はまた、ピロリン酸基の酸素原子のいずれかを窒素もしくは硫黄原子またはそれらの組み合わせで置換して、チオピロリン酸、ジチオピロリン酸等を生成することも含む。組み込まれていないγ−ＮＰ色素が、放出されたＰＰｉ色素と異なる正味電荷を有する場合には、組み込まれていないγ−ＮＰ色素ｓのＰＰｉ色素からの分離が促進される。例えば、陽イオンＰＰｉ色素および負の無傷のγ−ＮＰ色素（例えば、三リン酸）は電荷スイッチング（ｃｈａｒｇｅ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）を示す。例えば、ポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体がチャネル交点のすぐ上流に固定されている場合には、この特徴はマイクロチャネル選別システムにおける単一分子ＤＮＡ配列決定に有用である。
【００８０】
Ａ．  分離、選別および配列決定
図７は、製造された本発明のフローセルシステム７０の略図である。このダイアグラムは、例示にすぎず、本明細書の特許請求の範囲を限定すべきものではない。当業者は、他の変更、改良および代替を認識していると思われる。
【００８１】
交点の電場７１Ａおよび７１Ｂは、第１のマイクロチャネル中の無傷のγ−ｄＮＴＰ色素ｓを陽極７１Ａ方向に動かすが、ＰＰｉ色素分子は第２のチャネル中を陰極７１Ｂ方向に動かされ、そこで検出器７４で検出される。操作の際には、４つのｄＮＴＰｓは各々異なる色素で標識され、検出チャネル７５を通過する連続したＰＰｉ−γ色素分子の流動としてリアルタイム配列決定を可能にする。このように電荷が異なる分子を電気的に選別することによって、切断されたＰＰｉ色素分子７６は、組み込まれていないγ−ｄＮＴＰ色素ｓ７７から妨害を受けることなく、またポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体７９を照射することなく、単独で検出される。
【００８２】
ある局面において、電荷の符号の変化（例えば、γ−ｄＮＴＰ色素ｓの−１からＰＰｉ色素の＋１への変化）を使用して、γ−ｄＮＴＰ色素をＰＰｉ色素から分離する。ある局面において、γ−ｄＮＴＰ色素は、横方向のチャネルのすぐ上流に配置されたポリメラーゼを超えて流動する。γ−ｄＮＴＰ色素はポリメラーゼによって加水分解され、遊離したＰＰｉ色素は媒体に拡散し、横方向のチャネル方向に移動する。横方向の電場はＰＰｉ色素を陰極７１Ｂに誘導するが、無傷のγ−ｄＮＴＰ色素分子は陽極７１Ａ方向に移動する。従って、ＰＰｉ色素分子は横方向のチャネルで検出される。有利なことに、この態様は、無傷のγ−ｄＮＴＰ色素分子由来のバックグラウンドが低いか、またはないので、ポリメラーゼ反応を起こさせるために高いγ−ｄＮＴＰ色素濃度を使用することができる。
【００８３】
従って、本発明は、検出可能な部分を有する標識リン酸ヌクレオチドを、試料流動体中に放出された荷電した検出可能な部分から分離するための方法であって、ａ）単一分子構成の固相支持体に、核酸複合体を固定する段階と、ｂ）複合体に、ポリメラーゼおよび複数のリン酸ヌクレオチドを接触させる段階であって、複数のリン酸ヌクレオチドの少なくとも１つが検出可能な部分を有し、ＮＰがプライマー核酸に組み込まれると荷電した検出可能な部分が放出される段階と、ｃ）試料流動体にエネルギー場を適用し、それによって荷電した検出可能な部分から標識ＮＰを分離する段階とを含む方法を提供する。
【００８４】
別の態様において、本発明は、標的核酸を配列決定するための方法であって、ａ）単一分子構成の固相支持体に、核酸ポリメラーゼを固定する段階と、ｂ）固相支持体に、標的核酸、プライマー核酸および検出可能なリン酸ヌクレオチドを含む試料流動対を接触させる段階であって、試料流動体がフローセルを通過して流動する段階と、ｃ）試料流動体にエネルギー場を適用する段階と、ｄ）検出可能なリン酸ヌクレオチドを検出し、それによって標的核酸を配列決定する段階とを含む方法を提供する。
【００８５】
好適な核酸塩基には、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、デアザアデニンおよびデアザグアノシンが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい態様において、ＮＰプローブは、電荷スイッチ特性を有するｄＮＴＰプローブである。他の局面において、核酸塩基は固相支持体に固定され、試料流動体はポリメラーゼを含有する。
【００８６】
ある好ましい態様において、無傷のＮＰプローブには、第１の分子電荷が結合しており、末端のリン酸が末端のリン酸蛍光団部分として切断されると、リン酸蛍光団部分は第２の分子電荷を有し、第１の分子電荷と第２の分子電荷の差は、好ましくは、１〜４である。電荷スイッチ特性は、末端のリン酸またはピロリン酸基が酵素的に切断されると、提供される。
【００８７】
ある局面において、少なくとも２つのエネルギー場が使用される。少なくとも２つのエネルギー場を使用することによって、シグナル分子対ノイズ分子の予測される電荷を併用して設計されると、シグナル／ノイズ識別が増強されうる。すなわち、シグナル分子（蛍光リン酸）は、その電荷の大きさがノイズ分子（例えば、蛍光標識されていて組み込まれていないヌクレオチド）の電荷の大きさより大きい場合には、特定の場により強く応答し、またはその電荷の大きさがノイズ分子の電荷の大きさより小さい場合には、強く応答しない。
【００８８】
ポリメラーゼによって組み込まれると、ｄＮＴＰは通常通り加水分解され、遊離したピロリン酸−色素部分は周囲の媒体に拡散する。遊離の色素分子は蛍光であり、その出現は、顕微鏡下においてビデオレートで画像化される。流動中の試料流動体は、親のＤＮＡ分子から色素を除去する。ポリメラーゼがＤＮＡと共に移動し続ける場合、ヌクレオチド配列は、放出される色素の順によって読み取られる。配列決定は、ポリメラーゼがＤＮＡ鋳型と共に進行する速さと同じ速さで迅速に進行する。
【００８９】
別の態様において、本発明は、リン酸の検出可能な部分から無傷のＮＰプローブを分離する方法であって、ａ）検出可能な部分が結合した無傷のＮＰプローブを含む試料を提供する段階であって、無傷のＮＰプローブが酵素的に切断されると、無傷のＮＰプローブの分子電荷とは異なる分子電荷を保有するリン酸の検出可能な部分を形成する段階と、ｂ）試料にエネルギー場を提供し、それによって無傷のＮＰプローブからリン酸の検出可能な部分を分離する段階とを含む方法を提供する。
【００９０】
よりさらに別の態様において、本発明は、核酸を配列決定するための方法であって、標的核酸、プライマー鎖、ポリメラーゼおよび複数のＮＰプローブを提供する段階と、複数のＮＰプローブの標的依存的重合を可能にする条件下において標的核酸、プライマー鎖、ポリメラーゼ、複数のＮＰプローブをフローセル中で混合して、それによって重合産物を提供する段階と、エネルギー場によってフローセル中の重合産物を分離して、標的核酸の配列を提供する段階とを含む方法を提供する。
【００９１】
さらに別の態様において、本発明は、核酸を配列決定するための方法であって、標的核酸、ポリメラーゼプライミング部分、ポリメラーゼおよび標識ＮＰｓを提供する段階と、ＮＰｓの標的依存的重合を可能にし、標識ピロリン酸産物の時間配列を提供することができる条件下において標的核酸、ポリメラーゼプライミング部分、ポリメラーゼおよび標識ＮＰｓを混合する段階と、電荷によって、リン酸の検出可能な部分の産物を重合しなかった標識ＮＰｓから分離する段階と、リン酸の検出可能な部分を経時的に検出して、標的核酸の配列を提供する段階とを含む方法を提供する。ある局面において、本方法は、多分子ＤＮＡ配列決定と、４つの異なるＮＰ’ｓ（全て同じ色で標識されている）が逐次的に反応部位に導入される単色（多分子または単一分子）配列決定とに関する。他の局面において、２色、３色または４色配列決定を使用することができる。
【００９２】
Ｂ． ピロリン酸の検出
ある他の態様において、本発明は、ピロリン酸を検出するための不均質アッセイ法を提供する。ピロリン酸の検出は、数多くの生物反応において有利である。例えば、ポリメラーゼが溶液から単一ＤＮＡ分子を選択し、その後プライマー鎖の３’末端にヌクレオチドを組み込むＤＮＡポリメラーゼ反応では、このような組み込みの自然の結果としてピロリン酸が放出される。アッセイ溶液が、各々γ−リン酸に結合した異なる色の蛍光色素で標識した４種のデオキシヌクレオチド三リン酸を含む場合には、標的ＤＮＡに作用するポリメラーゼの活性を逐次的に記録することができる。その後、放出されたピロリン酸結合色素の順番によって標的ＤＮＡのヌクレオチド配列を直接読み取ることができる。
【００９３】
他の態様において、本発明は、ｄＮＴＰ分子などの個々の蛍光形成ＮＰ分子をポリメラーゼが単一核酸分子に組み込む場合、それらを検出し、同定する方法を提供する。ある局面において、蛍光色素はγ−リン酸に結合される。上記のように、ポリメラーゼによる加水分解の結果と、色素に関連する電荷の変化を調節するために、荷電部分が核酸塩基に結合される。
【００９４】
従って、本発明は、ピロリン酸切断を検出するための方法であって、アッセイの成分は電荷スイッチＮＴＰ、標的核酸、プライマー核酸およびポリメラーゼを含み、（ａ）蛍光団部分が結合したγ−リン酸を有する標識電荷スイッチリン酸ヌクレオチド（ＮＰ）を、ポリメラーゼおよび標的核酸からなる群より選択される固定成分を通過して流動させる段階と、（ｂ）酵素を使用して標的核酸にハイブリダイゼーションしたプライマー鎖にＮＰを組み込み、蛍光団部分が結合したγ−リン酸を放出する段階と、（ｃ）蛍光部分を検出し、それによってピロリン酸切断を検出する段階とを含む方法を提供する。本発明の方法において、ポリメラーゼまたは標的核酸のどちらかが固相支持体などの固相に結合される。好ましくは、本発明の方法において、核酸が固相支持体に固定される。
【００９５】
本明細書の態様の多くにおいて、本発明の方法は、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩまたはＩＩＩなどのＤＮＡポリメラーゼを使用する。他の局面において、好適なポリメラーゼには、ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼおよびＨＩＶ逆転写酵素などの逆転写酵素が挙げられるが、これらに限定されない。特異的な例には、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Φ２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ４ ＤＮＡ ポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、本発明に使用するのに好適な酵素またはポリメラーゼを周知している。ある局面において、標的核酸は、ポリメラーゼ、オリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイゼーションした未標識の１本鎖ＤＮＡ断片およびＮＴＰｓの混合物を含む流動中の溶液に浸す。選択的に、プライマーは固定された標的核酸に結合してもよい。
【００９６】
ある局面において、リン酸の検出可能な部分（例えば、ＰＰｉ色素）の検出は、酵素結合アッセイ法を使用して実施される。ＰＰｉは多数の異なる方法によって測定することができ、数多くの酵素的方法は文献に記載されている（Ｒｅｅｖｅｓら、（１９６９）、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２８、２８２−２８７、Ｇｕｉｌｏｒｙら、（１９７１）、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３９、１７０−１８０、Ｊｏｈｎｓｏｎら、（１９６８）、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５、２７３、Ｃｏｏｋら、（１９７８）、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ９１、５５７−５６５；およびＤｒａｋｅら、（１９７９）、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ９４、１１７−１２０）。当業者は、本発明に使用するのに好適な他の酵素結合アッセイ法を周知していると思われる。
【００９７】
一態様において、ホスファターゼを使用すると、ＰＰｉ−Ｆを脱リン酸することによって電荷スイッチの大きさが増加される。ある他の局面において、形成される光線量は、放出されるピロリン酸の量と実質的に比例し、組み込まれる塩基の量と直接比例するので、ピロリン酸の放出を同定するために、ルシフェラーゼおよびルシフェリンを併用使用することが好ましい。光線量は、ルミノメータなどの好適な光線感受性装置によって容易に推定することができる。
【００９８】
ＰＰｉの放出を検出するルシフェリン−ルシフェラーゼ反応は当技術上周知である。特に、酵素ＡＴＰスルフリラーゼおよびルシフェラーゼに基づいたＰＰｉ放出を連続的にモニターする方法はニレン（Ｎｙｒｅｎ）およびランディン（Ｌｕｎｄｉｎ）（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５１、５０４−５０９、１９８５）によって開発され、ＥＬＩＤＡ（酵素発光測定無機ピロリン酸検出アッセイ法（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ））と名づけた。上記の方法は、例えば、熱安定性ルシフェラーゼを使用することによって改良することができる（Ｋａｌｉｙａｍａら、１９９４、Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５８、１１７０−１１７１）。ＰＰｉ検出反応に関与する好ましい検出酵素は、従って、ＡＴＰスルフリラーゼおよびルシフェラーゼである。
【００９９】
図８に示すように、蛍光団がγ−リン酸に結合した本発明の好ましい化合物では、蛍光団は、ピロリン酸基とともにヌクレオチドから放出される。例えば、単一分子検出を使用すると、蛍光シグナルが、観察対象の個々の分子の位置に出現する。ある局面において、組み込まれた核酸塩基を放出される蛍光団によって逐次的に同定することができるように、各々の種類のヌクレオチドを異なる蛍光団で標識する。好ましくは、本発明のヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）には、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシシトシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシチミジン三リン酸、デオキシウリジン三リン酸またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されず、各々γ−リン酸に独自の蛍光団が結合されている。
【０１００】
ある態様において、プライマーがハイブリダイゼーションされている未標識で、１本鎖の標的核酸をガラススライドなどの固相支持体の表面に結合する。別の局面において、ニックを有する２本鎖核酸を結合する。ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素および蛍光形成ｄＮＴＰｓを含む水溶液が表面を流動する。または、別の態様において、個々のポリメラーゼ分子をガラススライドに固定し、１）オリゴヌクレオチドプライマー（または、共有結合したヘアピン）にハイブリダイゼーションした未標識の１本鎖ＤＮＡ断片および２）各々、γ−リン酸に結合した異なる色の蛍光色素で独自に標識されているデオキシヌクレオチド三リン酸の混合物を含む流動中の溶液にポリメラーゼを入れる。
【０１０１】
ある態様において、一過性の明視野は、ガラス−水溶液界面のレーザービームの全反射（ＴＩＲ）によって設定される。ある局面において、ＴＩＲ照明野は、インテンシファイド電荷結合素子カメラ（ＩＣＣＤ）を備えたビデオレートで連続的に画像化する。
【０１０２】
Ｃ．  固相
本明細書のある態様において、本発明は、固相の物質が液層の試薬と相互作用する方法に関する。ある局面において、核酸は固相に結合される。核酸は、種々の周知の共有結合または非共有相互作用のいずれか１つにより固相支持体に固定されるなど固相状態であってもよい。ある局面において、支持体は、細孔性ガラス、ガラス板またはスライド、ポリスチレン、アクリルアミドゲルおよび活性化デキストランなどの不溶性物質からなる。他の局面において、支持体は剛性または半剛性で、ビーズ状のような球形、四角形、不規則粒子、ゲル、マイクロスフェアまたは実質的に平坦な支持体のような任意の形状であってもよい。ある態様では、例えば、ウェル、隆起部、くぼみ、ピン、溝、棒、ピン、円柱の内壁または外壁等を有する支持体上に物理的に分離した一連の配列領域を形成することが望ましいことがある。他の好適な支持体材料には、アガロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアミド、ポリエチレン、ポリエチレンオキシまたはこれらのコポリマーおよびグラフト重合体が挙げられるが、これらに限定されない。固相支持体の他の態様には、小粒子、無孔表面、アドレス指定可能な配列、ベクター、プラスミドまたはポリヌクレオチド固定媒体が挙げられる。
【０１０３】
本発明の方法に使用されるように、核酸は、固相支持体の化学的に反応性の官能基との共有結合または他の親和性相互作用によって固相支持体に結合することができる。核酸は、固相支持体の３’，５’，糖または核酸塩基部位に結合することができる。ある態様では、安定または選択的に切断可能なリンカーに使用できる選択肢が多いことにより、リンカーを介して支持体に結合するための３’部位が好ましい。固定は、好ましくは、支持体と核酸との間の共有結合によって実施される。結合単位すなわちリンカーは、安定で、固定されている核酸が配列相補鎖に容易に接近できるように設計される。または、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジンなどの非共有結合が有用である。他の官能基リンカーの例として、エステル、アミド、カルバメート、尿素、スルホネート、エーテルおよびチオエステルが挙げられる。５’ビオチン化ヌクレオチドまたは３’ビオチン化ヌクレオチドを、ガラスなどの支持体に結合したアビジンまたはストレプトアビジンに固定することができる。
【０１０４】
本発明の方法の他の局面において、ポリメラーゼが固相支持体に固定される。好適な固相支持体には、細孔性ガラス、ガラス板またはスライド、ポリスチレン、および活性化デキストランが挙げられるが、これらに限定されない。他の局面において、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレートおよびポリスチレンなどの合成有機ポリマーも例示的な支持体表面である。さらに、セルロースおよびデキストランなどの多糖もさらに別の例示的な例の支持体表面である。繊維などの他の支持体表面も操作可能である。
【０１０５】
他の局面において、ポリメラーゼの固定は、樹脂と酵素との共有結合を可能にする官能基を含むように修飾または活性化されている固相のクロマトグラフィー樹脂を使用して実施される。典型的には、脂肪族リンカーアームを使用する。本発明の酵素は、例えば、イオンまたは疎水性機序によって固相支持体表面に非共有結合されてもよい。
【０１０６】
好ましい態様において、タンパク質または核酸のガラス表面または金属酸化物表面への共有結合は、先ず、表面をアミノシランで活性化することによって実施することができる。次いで、アミン反応性官能基で誘導体化したＤＮＡまたはタンパク質を表面に結合することができる（Ｋ． Ｎａｒａｓｉｍｈａｎら、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． ７、２８３（１９８５）； Ｍ． Ｊ． Ｈｅｌｌｅｒら、米国特許第５，６０５，６６２号およびＡ． Ｎ． Ａｓａｎｏｖら、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７０、１１５６（１９９８）参照）。
【０１０７】
当業者は、核酸およびタンパク質を支持体表面に結合するための数多くの他のスキームを周知している。さらに、支持体表面の選択および酵素を固定する方法は、主に、便利さの問題であり、種々の支持体表面に対する実施者の馴染みやすさおよび好み並びに種々の固定スキームの好みおよび基質の知識に依存する。
【０１０８】
操作の際には、ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素を固定する場合には、酵素は溶液から単一ＤＮＡ分子を選択する。ポリメラーゼは、第１のヌクレオチドをプライマー鎖の３’側末端に組み込む。次いで、ポリメラーゼは標的ＤＮＡの次の位置に移動し、相補的ヌクレオチドを組み込み、それぞれのＰＰｉ色素を放出する。放出された色素は、固定されている酵素から流動中の試料溶液に移動する。次いで、例えば、単一蛍光団分子を検出することができるＣＣＤカメラを使用したビデオレート画像形成によってこの事象を逐次的に記録することができる。得られた映像は、ＤＮＡの単一分子上で機能する単一ポリメラーゼ分子の活性を示す。ＤＮＡ標的のヌクレオチド配列は、放出される色素の順序によって直接読み取られる。第１の核酸分子が配列決定されたら、ポリメラーゼはそれを放出し、溶液から別の鋳型を選択する。多数のＤＮＡ分子が、単一のポリメラーゼによって配列決定される。この過程は酵素の寿命のあるかぎり継続する。
【０１０９】
Ｄ．  標的核酸の製造
標的核酸は種々の従来方法によって製造することができる。例えば、標的核酸は、従来のＤＮＡ配列決定に使用されるものを含む、従来のクローニングベクターのいずれかの挿入物として製造することができる。適当なクローニングベクターを選択し、使用するための広範な手引きはサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク、１９８９）および同様の参照文献に見られる。サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らおよびイニス（Ｉｎｎｉｓ）ら編、「ＰＣＲプロトコール（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９０）も標的ポリヌクレオチドを製造するためにポリメラーゼ連鎖反応を使用する手引きを提供している。固相支持体に結合できるクローニングまたはＰＣＲ−増幅された標的核酸が製造される。
【０１１０】
好ましい態様において、対象生物、好ましくはヒト由来の剪断ＤＮＡ断片を、平滑末端となるように処理し、次いで２つのオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮｓ）にライゲーションする。第１のＯＤＮはビオチンで誘導体化し、第２は配列決定プライマーに相補的である。ライゲーションしたＤＮＡを変性させ、ストレプトアビジン活性化スライドに接触させると、ビオチンを介してスライドに結合する。配列決定前に、プライマーを結合した断片にハイブリダイゼーションする。各種類のＯＤＮを有するＤＮＡ断片だけが結合し、配列決定され、２つのプライマーＯＤＮｓを有する断片は結合せず、２つの結合ＯＤＮｓを有するものは伸長がプライミングしない。ＤＮＡ結合はまた、ＤＮＡチップに実施される直接的な共有結合によっても実施することができる（米国特許第５，６０５，６６２号参照）。大量のプローブを必要とするＤＮＡチップとは異なり、好ましくは、小数のＤＮＡ分子が表面積あたり結合する。ＤＮＡ試料に担体を添加することによって、結合密度は容易に制御される（例えば、ビオチン化ＤＮＡ試料への遊離のビオチンの添加）。
【０１１１】
プライマー（ＤＮＡポリメラーゼ）またはプロモーター（ＲＮＡポリメラーゼ）は、従来の核酸合成技術を使用して合成により製造される。プローブの相補鎖は、例えば、以下の参照文献に開示されている、ホスホラミデート化学物質などの標準的な化学物質を使用した、Ａｐｐｌｉｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．（カリフォルニア州フォスターシティー）社製のモデル３９２ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）または３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機のような自動ＤＮＡ合成装置で都合良く合成される：ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）およびアイヤー（Ｉｙｅｒ）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４８： ２２２３−２３１１（１９９２）、モルコ（Ｍｏｌｋｏ）ら、米国特許第４，９８０，４６０、コスター（Ｋｏｓｔｅｒ）ら、米国特許第４，７２５，６７７号、カラザー（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）ら、米国特許第４，４１５，７３２号、同第４，４５８，０６６号および同第４，９７３，６７９号等。得られるオリゴヌクレオチドがポリメラーゼと適合すれば、ホスホロチオエート、ホスホラミデート等などの非天然型骨格基を生じるような別の化学物質を使用することもできる。それらは、特注のオリゴヌクレオチドを専門とする種々の会社から市販されているものを注文することができる。
【０１１２】
オリゴヌクレオチドの精製は、必要がある場合に、典型的には、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびレグニア（Ｒｅｇｎｉｅｒ）（１９８３） Ｊ． Ｃｈｒｏｍ． ２５５： １３７−１４９に記載されている未変性のアクリルアミドゲル電気泳動または陰イオン交換ＨＰＬＣによって実施される。合成オリゴヌクレオチドの配列は、グロスマン（Ｇｒｏｓｓｍａｎ）およびモルダイブ（Ｍｏｌｄａｖｅ）（編）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、「酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」６５： ４９９−５６０のマキサム（Ｍａｘａｍ）とギルバーアト（Ｇｉｌｂｅｒｔ）（１９８０）の化学的分解方法を使用して証明することができる。
【０１１３】
プライマーは数多くの配列のいずれかにハイブリダイゼーションすることができるが、最適なプライマーの選択は、典型的には、使用可能な配列のコンピュータ支援による考慮を使用し、望ましいハイブリダイゼーション特性を持たない可能性のあるプライマーを排除し、および／または選択したハイブリダイゼーション特性を満足する可能性のあるプライマーを含めることによって実施される。これは、既知の配列に基づいて選択したハイブリダイゼーション特性（例えば、選択した鎖長を有するもの、Ｇ：Ｃ比、所定の配列における独自性等）を有する全ての可能な核酸プライマーまたは全ての可能なプライマーのサブセットを測定することによって実施される。プライマーのハイブリダイゼーション特性の選択は、プライマーの望ましいハイブリダイゼーションおよび識別特性に依存する。
【０１１４】
当業者は、核酸ハイブリダイゼーションおよびプライマー選択の理論および実施を周知している。ガイト（Ｇａｉｔ）編、「オリゴヌクレオチド合成：実用的方法（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード（１９８４）、Ｗ． Ｈ． Ａ． Ｋｕｉｊｐｅｒｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８（１７）、５１９７（１９９４）、デュホーム（Ｋ． Ｌ． Ｄｕｅｈｏｌｍ）Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ５９、５７６７−５７７３（１９９４）、アグラワル（Ｓ． Ａｇｒａｗａｌ）（編）「分子生物学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、２０巻およびティジャセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）（１９９３）「生化学および分子生物学の実験技術−核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅｓ）」、例えば、パートＩ第２章「ハイブリダイゼーションの原理と核酸プローブアッセイ方法の概要（Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ）」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ニューヨークは、核酸ハイブリダイゼーションの基礎的なガイドを提供している。イニス（Ｉｎｎｉｓ）上記は、プライマー選択の概要を提供している。
【０１１５】
プライマーをポリメラーゼと組み合わせて使用して標的ＤＮＡを配列決定する。プライマー鎖長は、相補的な鋳型ＤＮＡとハイブリダイゼーションするように選択される。プライマーは、一般に、鎖長が少なくとも１０ ｂｐであり、通常鎖長が１５〜３０ｂｐである。プライマーは、対象の標的ＤＮＡの既知の内側部位にハイブリダイゼーションするように設計される。または、プライマーは、リガーゼによって標的ＤＮＡの末端に結合した合成オリゴヌクレオチドアダプタに結合することができる。同様に、プロモーターを使用する場合には、それらは標的ＤＮＡの内側であっても、末端のアダプタとしてライゲーションされてもよい。
【０１１６】
配列決定用の反応混合物は、特定のポリメラーゼに対して最適である緩衝水溶液を含む。一般に、緩衝液は、１価イオン源、２価陽イオン源および緩衝剤を含む。ＫＣｌ、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、グルタミン酸カリウム、ＮＨ４Ｃｌ、硫酸アンモニウム等などの１価イオンの任意の便利な供給源を使用することができ、この場合には、緩衝液に存在する１価イオン源の量は、約５００〜２０，０００マイクロオーム、通常約１０００〜１０，０００マイクロオーム、さらに通常約３，０００〜６，０００マイクロオームの伝導率を提供するのに十分な量が存在する。
【０１１７】
２価陽イオンはマグネシウム、マンガン、亜鉛等であってもよく、この場合には、陽イオンは、典型的には、マグネシウムである。ＭｇＣｌ２、酢酸マグネシウム等を含む任意の便利なマグネシウム陽イオン源を使用することができる。緩衝液に存在するＭｇイオンの量は０．５〜２０ ｍＭの範囲であってもよいが、好ましくは約１〜１２ ｍＭの範囲であり、さらに好ましくは２〜１０ ｍＭの範囲であり、理想的には約５ｍＭである。
【０１１８】
緩衝液中に存在してもよい代表的な緩衝剤または塩には、トリス、トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ等が挙げられ、緩衝剤の量は、典型的には、約５〜１５０ｍＭの範囲であり、通常は約１０〜１００ ｍＭの範囲であり、さらに通常は、約２０〜５０ ｍＭの範囲であり、ある好ましい態様において、緩衝剤は約６．０〜９．５の範囲のｐＨを提供するのに十分な量が存在し、２５℃においてｐＨ７．６が最も好ましい。緩衝媒体に存在してもよい他の薬剤には、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ等などのキレート剤が挙げられる。
【０１１９】
Ｅ．  検出
ある態様において、単一分子検出を使用して、酵素反応がモニターされる。本発明の単一分子蛍光検出は、近接場顕微鏡、遠視野共焦点（ｆａｒ−ｆｉｅｌｄ ｃｏｎｆｏｃａｌ）顕微鏡、広視野落射照明および全反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡を含む光学的装置使用して実施することができる。好適な光子検出器には、フォトダイオードおよびインテンシファイドＣＣＤカメラが挙げられるが、これらに限定されない。他の態様において、ＣＭＯＳなどのビデオチップを使用することができる。好ましい態様において、インテンシファイドＣＣＤ（ＩＣＣＤ）カメラが使用される。ガラススライドの表面付近の流動中の個々の蛍光色素分子を画像化するためにＩＣＣＤカメラを使用することは、いくつかの理由により有利である。ＩＣＣＤ光学的装置の場合には、蛍光団の経時的な画像配列（映像）を得ることができる。ある局面において、本発明のＮＴＰｓの各々には独自の蛍光団が結合しているので、４つのカメラおよび４つ以下の励起レーザーまたはそれらの任意の組み合わせを有する４色装置を有することができる。従って、ＤＮＡを配列決定するためにこの光学的装置を使用することができる。さらに、多数の異なるＤＮＡ分子を同時に画像形成し、配列決定することができる。さらに、画像分析アルゴリズムを使用する場合には、単一色素の通過を追跡し、それらを一定のバックグラウンド蛍光から識別することができる。
【０１２０】
ある局面において、単一分子のＩＣＣＤ検出のための好ましい幾何学的配置は、全反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡である。ＴＩＲＦでは、レーザービームは、ガラス−水界面で全体が反射する。場は反射面で急に終わらないが、強度は距離と共に指数的に低下する。界面における薄い「一過的」な光学場はバックグラウンドが低く、可視波長においてシグナル対ノイズ比が約６：１、好ましくは約８：１、さらに好ましくは約１２：１の単一分子検出を可能にする（Ｍ． Ｔｏｋｕｎａｇａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ２３５、４７（１９９７）および Ｐ．Ａｍｂｒｏｓｅ、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、３６、２４４（１９９９）参照）。ある局面において、ＴＩＲ照明場は、インテンシファイドＣＣＤ（ＩＣＣＤ）カメラを備えたビデオレートで連続的に画像形成される。従って、ピロリン酸が酵素によって加水分解される場合、ピロリン酸を画像形成することができる。
【０１２１】
場のガラスを超える透過は、波長およびレーザービームの入射角に依存する。より深い透過は長い波長および臨界角の範囲内の垂直面に対してより小さい角で得られる。典型的なアッセイ法では、蛍光団は、表面から約２００ｎｍ以内で検出され、これは約６００塩基対のＤＮＡの外形長さに相当する。単一分子画像形成用であるプリズム型または対物型ＴＩＲＥ幾何学的配置が使用される（Ｘ−Ｈ．Ｎ．Ｘｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１、１６５０（１９９８）およびＴｏｋｕｎａｇａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍ．、２３５、４７（１９９９）参照）。
【０１２２】
ＤＮＡ、タンパク質および脂質は全て、標識プローブを使用して単一分子感度で、複雑な試料中で検出された（Ｌ．Ｅｄｍａｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９３、６７１０（１９９６）、Ｍ． Ｋｉｎｊｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２３、１７９５（１９９５）、Ａ．ＣａｓｔｒｏおよびＪ．Ｇ．Ｋ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６９、３９１５（１９９７）、Ｓ． Ｎｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６６、１０１８（１９９４）、Ｓ．Ｎｉｅら、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．６７、２８４９（１９９５）およびＴ． Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ、９、２９２６（１９９６）参照）。単一蛍光団は、簡単な検出であること以外にも、蛍光寿命、スペクトルシフトおよび回転配向で特徴づけられる。本発明の好ましい局面において、ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素および識別可能な蛍光形成ｄＮＴＰｓ、すなわち、各核酸塩基の特徴的な色素を含む水溶液が表面を流動する。ガラス−水溶液界面におけるレーザービームの全反射（ＴＩＲ）によって一過的な光照射場が設定される。ある局面において、ＴＩＲ照明場は、インテンシファイドＣＣＤ（ＩＣＣＤ）カメラを備えたビデオレートで連続的に画像形成される。従って、ピロリン酸が酵素によって加水分解される場合、ピロリン酸を画像形成することができる。
【０１２３】
ポリメラーゼによって組み込まれると、ｄＮＴＰは通常通り加水分解され、遊離した末端リン酸（例えば、ピロリン酸−色素）部分は周囲の媒体に拡散する。遊離の色素分子は顕微鏡下においてビデオレートで画像化される。流動中の試料流動体は、親のＤＮＡ分子から色素を除去する。ポリメラーゼがＤＮＡと共に移動し続ける場合、ヌクレオチド配列は、放出される色素の順によって読み取られる。配列決定は、ポリメラーゼがＤＮＡ鋳型と共に進行する速さと同じ速さで進行する。
【０１２４】
別の態様において、本発明は、１９９８年９月２９日にウォルト（Ｗａｌｔ）ら、に付与された米国特許第５，８１４，５２４号に開示されているセンサーを含む。関心対象の１つまたはそれ以上の分析物またはリガンドを単独または混合状態で検出し、評価するための光学的センサ、光学的感知装置および方法を含む光学的検出および同定システムが該特許に開示されている。このシステムは、支持部材と、感知受容体装置として機能し、スペクトル認識パターンを使用して種々の異なる分析物およびリガンドを検出することができる不均質半選択性ポリマーフィルムから製造されているアレイとを含む。このシステムを使用すると、画像形成繊維の化学的センサを用いた観察と化学的感知を組み合わせることができる。
【０１２５】
さらに別の態様において、検出は、チャーチ（Ｃｈｕｒｃｈ）ら、に付与され、全ての目的のために全体の内容が参照として本明細書に組み入れられている、米国特許第５，７９５，７８２号に記載されている遮断電流を使用して実施される。該特許に開示されているように、使用する２種類のプールの媒体は、分析物の十分な移動を可能にして、界面相互作用を生じる任意の流体であってもよい。典型的には、プールは液体であり、通常、水溶液または分析物を分布させることができる他の液体もしくは溶液である。プール間の界面は、１度に分析物分子１つと逐次的に相互作用するように設計される。界面の有用な部分は不透過性障壁におけるまたは該障壁を通る通路であってもよく、または非混和性液体間の界面であってもよい。不透過性障壁では１つの通路だけが存在または機能していることが好ましい。界面依存的測定は、分析物−界面相互作用によって変わる、例えば、物理的または電気的な任意の測定であってもよい。例えば、分析物が界面と逐次的に相互作用する場合に生じる物理的変化を測定することができる。分析物が界面のイオン流動と干渉することによって生じる電流の変化を測定することができる。測定値は、分析物の界面との逐次的な相互作用を反映することができ、配列依存的な特性の等式を作成することができる。
【０１２６】
一態様において、プールは、組成が同じであっても、異なってもよい、電気伝導性の媒体を含む。伝導性媒体のプールは、イオン透過性通路を含む不透過性障壁によって分離され、界面特性の測定は、イオン電流がイオン透過性通路を流れることができるように、２つのプール間に電位差を確立することを含む。分析物がイオン透過性通路の界面と逐次的に相互作用すると、通路のイオン伝導性は、各分析物が相互作用するのにつれて変化する（例えば、低下または増加する）。
【０１２７】
使用する伝導性媒体は任意の媒体であってもよく、好ましくは溶液であり、さらに好ましくは電流を通すことができる水溶液である。このような溶液は、一般に、電流伝導性物質として、ナトリウム、カリウム、塩化物、カルシウム、セシウム、バリウム、硫酸塩およびリン酸のようなイオンを含有する。孔またはチャネルのコンダクタンス（ｇ）は、伝導性媒体を介して孔またはチャネルを流れる電流を測定することによって測定される。電圧差は、プールの少なくとも一方に電流を投入または加えて電位差を確立する電圧源によるような従来の手段によってプール間の障壁を挟んで与えることができる。または、各プールのイオンを異なるものにするか、またはプールの溶液もしくは媒体中のイオンの少なくとも１つの濃度を変えることによって、２つのプールのイオン組成に差をつけることによって電気化学的勾配を確立することができる。本発明のこの態様では、コンダクタンスの変化が測定され、分析物依存的な特性を示す。
【０１２８】
Ｆ．  高スループットスクリーニング
本発明はまた、ＤＮＡ配列決定およびピロリン酸検出の高スループットスクリーニングのための統合システムを提供する。本システムは、典型的には、流体を供給源から目的地に送達するロボットアーマチュア、ロボットアーマチュアを制御するコントローラ、ＩＣＣＤカメラ、検出を記録するデータ記憶装置および一定の反応物を含むマイクロタイター皿または基質などのアッセイ成分を含む。数多くのロボット式流体送達システムが使用可能であり、また既存の構成要素から容易に製造することができる。例えば、マイクロラボ（Ｍｉｃｒｏｌａｂ）２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ネバダ州レノ）ピペッティングステーションを使用したザイメート（Ｚｙｍａｔｅ） ＸＰ（Ｚｙｍａｒｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ホプキントン）自動式ロボットは、平行試料を送達して、平行ポリメラーゼ反応をいくつが同時に開始するために使用することができる。
【０１２９】
カメラまたは他の記録装置（例えば、フォトダイオードおよびデータ記憶装置）によって観察される（選択的に、記録される）光学的画像は、本明細書の態様のいずれかにおいて、選択的に、例えば、画像をデジタル化し、選別し、コンピュータで画像を分析することによって、さらに処理される。デジタル化、選別およびデジタル化したビデオまたはデジタル化した光学的画像を分析するために種々の市販の周辺機器が使用可能である。ある局面において、本発明の統合システムは、一連の画素（ピクセル）を含む光線を標本野からＣＣＤカメラまで送達する。標本からの光線はＣＣＤカメラに画像形成される。標本の領域に対応する特定のピクセル（例えば、ガラス表面の個々のポリメラーゼ部位）がサンプリングされて、各位置の光線強度の読み値が得られる。速度を上げるために、多数のピクセルを平行して処理する。本発明の装置および方法は、例えば、蛍光または暗視野顕微鏡技術によって任意の試料を観察するために容易に使用される。
【０１３０】
ＩＶ．  システム
図９は微小製造された本発明のフローセルシステム９０の略図である。このダイアグラムは例示にすぎず、本明細書の特許請求の範囲を限定するべきではない。当業者は他の変更、改良および代替を認識している。
【０１３１】
図９に示すように、本発明は、検出可能な分析物を有する試料流動体が流動する流入部９１と流出部９２を有する微小製造されたフローセル９０を提供する。ある局面において、本システムは、試料流動体に対して横方向のエネルギー場を有する第１のエネルギー場供給源９３を少なくとも１つ含む。ある態様では、本発明のシステムは、試料流動体に対して軸方向の第２のエネルギー場を有する第２のエネルギー場供給源９４を含む。横方向のエネルギー場は１対の電極９５ａ、９５ｂを有し、選択的に、軸方向のエネルギー場は液圧差９６ａ、９６ｂを有する。本発明のシステムは、マイクロチャネル帯９８の分析物を検出するための検出器９９も備える。好適なエネルギー場には、電場、温熱場、磁場、電磁場、光電場、光線場、力学場、圧力場またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、電場および圧力場を使用する。
【０１３２】
ある態様において、本発明のフローセルは、当業者に既知の微小製造方法によって製造される。例えば、精密射出成形プラスチックまたは成形エラストマーも製造に使用することができる。流動チャンバはプラスチック製またはガラス製であってもよいが、検出器、顕微鏡または光学式読取装置が観測する面が開いているかまたは透明でなければならない。
【０１３３】
一態様において、フローセルは長さが約０．１ ｍｍ〜約１００ ｃｍであり、好ましくは長さが約１ ｍｍ〜約１０ ｃｍである。ある局面において、フローセルは、寸法が異なってもよく、典型的には、長さが約０．５〜１０ ｃｍで、深さが０．５〜１００ｕｍであることができる試料流動体のためのチャネルを有する。チャネルの寸法は、同一フローセル内の場所によって異なってもよい。チャネルの形状は異なってもよく、四角形、卵形、円形、三角形、台形またはそれら以外であってもよい。ある局面において、種々のチャネル形状が存在する。チャネルの幅は、典型的には、約１ μｍ〜約１００μｍである。
【０１３４】
ある態様において、本発明のシステムは、基質粒子、ヌクレオチド、酵素等を含有する液体担体を備える流入部９１に導入された分析物の流動体を含んでもよい。ある態様において、分析物はビーズなどの固相支持体に固定され、ビーズはマイクロチャネルの特徴構造に捕獲されてもよい。液体担体は、供給流動から粒子を受け取ることができ、インジケータ基質を含有することができる任意の流体であってもよい。好ましい試料流動体は、水および当業者に既知の緩衝溶液を含有する塩の水溶液などの溶液を含む。または、アセトン、イソプロピルアルコール、エタノールまたは検出を妨害しない都合のよい任意の他の液体などの種々の有機溶媒が好適である。
【０１３５】
国際公開公報００／３６１５２号に開示されており、参照として本明細書に組み入れられているように、好ましい態様において、各ヌクレオチドは独自の蛍光団が結合しているので、４つのカメラおよび４つの励起レーザー、または画像スプリッター装置を有する１つのカメラ、または４つの異なる色素を励起するのに十分な３つ以下の励起レーザーを有する４色装置を使用することができる。さらに、マイクロチャネルに固定した多数の異なるＤＮＡ分子を同時に画像形成し、配列決定することができる。さらに、画像分析アルゴリズムを使用する場合には、単一色素の通過を追跡し、それらを一定のバックグラウンド蛍光から識別することができる。
【０１３６】
別の態様において、２００１年３月１５日に刊行されウィリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）に付与され、全ての目的のために全体の内容が参照として本明細書に組み入れられている、米国特許第６，２３２，０７５号に開示されているヌクレオチドを使用することができる。該特許に開示されているように、蛍光標識が結合したヌクレオチドプローブが開示されている。
【０１３７】
ある他の態様において、検出および分析は、光学分光学などの光学的手段およびラマン分光または蛍光などの他の手段を含む当技術上周知の種々の方法によって、分析物に暴露された場合色または他の特性を変化させる化学的インジケータによって、免疫学的手段によって、例えば装置に挿入した電極のような電気的手段によって、電気化学的手段によって、遮断電流手段によって、放射能手段によってまたはイオン、分子、ポリマー、ウィルス、核酸配列、抗原、微生物等などの分析物の存在を検出するための当技術上既知の実質的に任意の微小分析技術によって実施される。好ましくは、光学的または蛍光手段を使用し、抗体、ヌクレオチド等が蛍光マーカーに結合される。
【０１３８】
ある他の態様において、本発明のフローセルシステムは、さらに選択的に、電圧プローブ、導電性電極（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ）、ｐＨセル、導電性メータ、ｐＨメータ、電流計、電圧計、流速モニタ、データ獲得装置およびマイクロコンピュータを備える。当業者は有用な追加のセンサおよびプローブを認識していると思われる。
【０１３９】
図１０は、複数のフローセル（一連のフローセル）を有する微小製造された本発明のフローセルシステムの略図である。このダイアグラムは例示にすぎず、本明細書の特許請求の範囲を限定するべきものではない。当業者は、他の変更、改良および代替を認識していると思われる。
【０１４０】
この態様では、本発明のフローセル１０００は、複数の構成要素を有する一連のフローセル１０７２ａ、１０７２ｂに延在している。本明細書において使用する一連は少なくとも２つのフローセルである。例えば、多数の固定部位、流入および流出部、検出器等を有することができる。
【０１４１】
Ｖ．  実施例
以下の実施例は例示するために提供されているが、本発明を限定するものではない。
【０１４２】
実施例  Ｉ
この実施例は、無傷のヌクレオチドプローブおよび切断産物の電荷を算出し、水素イオンおよび２価金属陽イオンの寄与を考慮するアルゴリズムを示す。特定の平衡定数はその瞬間の化学的環境によって影響されること、および平衡定数は計算結果に影響を与えることが当業者によって理解されている。この実施例で説明するアルゴリズムはコンピュータプログラムで実行されて、計算を実施し、その一部の結果を図３に例示する。
【０１４３】
以下の段階１〜３では、示した平衡定数Ｋ（□中）の定義は図５を参照。平衡定数の値は、フレイ（Ｆｒｅｙ）およびスター（Ｓｔｕｈｒ）（１９７２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、９４： ８８９８の類似の化合物から考慮する。計算段階では、これらの定義を適用する：Ｎ−ＰＰＰ−Ｆ＝「Ｌ」（リガンド）、Ｈ＋＝「Ｈ」（水素イオン）およびＭｇ＋＋＝「Ｍ」（対イオン金属）。
【０１４４】
2004516810.tif 000006
【０１４５】
2004516810.tif 000007
【０１４６】
2004516810.tif 000008
【０１４７】
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【０１４８】
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【０１４９】
2004516810.tif 000011
【０１５０】
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【０１５１】
2004516810.tif 000013
【０１５２】
上記と同様に、ＰＰ−Ｆについて平衡計算を実施することができる。ＰＰ−Ｆに適当な異なる平衡定数（以下の□中に示した値）を使用することを除いて、Ｎ−ＰＰＰ−Ｆと同じ論理を適用する。以下の段階１〜３では、示した平衡定数Ｋ（□中に示す）の定義は図５を参照。平衡定数の値は、フレイ（Ｆｒｅｙ）およびスター（Ｓｔｕｈｒ）（１９７２）ＪＡＣＳ、９４： ８８９８の類似の化合物から考慮する。以下の定義を適用する：ＰＰ−Ｆ＝「Ｌ」（リガンド）、Ｈ＋＝「Ｈ」（水素イオン）およびＭｇ＋＋＝「Ｍ」対イオン（または金属）。
【０１５３】
2004516810.tif 000014
【０１５４】
2004516810.tif 000015
【０１５５】
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【０１５６】
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【０１５７】
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【０１５８】
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【０１５９】
2004516810.tif 000020
【０１６０】
実施例  ＩＩ
材料と方法
本発明のシステムを使用したヌクレオチド配列決定のモデリングを実施した。シミュレーションは、ＭＡＴＬＡＢ（Ｔｈｅ ＭａｔｈＷｏｒｋｓ， Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ナティック）バージョンＲ１１．１を用いて実施し、インテルペンティウム（Ｉｎｔｅｌ Ｐｅｎｔｉｕｍ）ＩＩＩ搭載機で操作した。動作システムはウィンドウズ（Ｗｉｎｄｏｗｓ）９８（第２版）である。ヌクレオチドの動きは、以下の方法により算出した。各時間段階は、
１．  両方向の平面のこの時点の電圧を所定の波形から測定する。
２．  電圧による軸方向および横方向の電場を計算する。
ベクトル式に全ての電場を加算する。
３．  分子の物理的パラメータを考慮して、得られた速度を計算する。
なお、消光剤−核酸塩基−色素部分の電荷および核酸係数は、放出されたピロリン酸−色素部分とは異なる
４．  時間段階を指定して、速度から得られる動きを計算する。
５．  拡散によるガウシアン分散運動を計算する。
６．  拡散による動きと電場による動きをベクトル式に加算する。
７．  分子を移動する。
【０１６１】
Ａ．  この実施例は、ＤＣ場が軸方向に適用される電気泳動の場合に類似している。
【０１６２】
この実施例では、横方向の面に場を適用せず、軸方向に一定の場を適用する。色素−核酸塩基−消光剤構造の電荷は−４であり、ピロリン酸−色素構造の電荷は−２である。軸方向の場の強度は３×１０５Ｖ／ｍであり、例えば、１ｃｍに３０００ Ｖ適用されている結果であると思われる。
【０１６３】
この実施例では、組み込まれていない構造と放出された色素との電荷の比は２であり、平均では、組み込まれていない構造は放出された色素の２倍早く移動することを意味している。
【０１６４】
Ｂ．  この実施例は、軸方向に適用されるＤＣ場と横方向に適用されるＡＣ場を例示する。
【０１６５】
この実施例では、横方向の場を正弦波式に調節する。電荷の比は２である。軸方向の場の強度は実施例１と同じであり、横方向の場はピーク間振幅が５０ Ｖである。振動の周波数は２００ Ｈｚである。バックグラウンド分子は広い領域に光子を拡散または「投げる」。その理由は、空間周波数（通路のピーク間長さ）はＥ場に強く応答することにより大きいからである。これは、バックグラウンドを軽減する影響を有し、シグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）を大きくする。好ましい設定は、放出されるリン酸に小さいけれども識別可能な通路振幅（ｐａｔｈ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）を持たせるべきである（振幅が大きすぎると、光子を多数のＣＣＤピクセルに散乱しすぎると思われる）。
【０１６６】
実施例  ＩＩＩ
この実施例は、軸方向に適用されたＡＣ場および横方向に適用されたＡＣ場を例示する。
【０１６７】
関心対象の別の場合は、ＡＣ成分だけを横方向および軸方向の場に適用することである。両方の場の強度が、振幅および周波数が一致した正弦波である場合には、拡散に関連して得られる通路は、組み込み事象が生じる場合、画像に明るいスポットを描く。この方法は酵素を通過する連続した「洗浄」を可能にして、組み込みを促進するが、全体の横幅を制限し、光子を１箇所に濃縮させる。さらに、「停電」時にシグナルが離散しないように、ＣＣＤカメラが読み取り、シャッターが閉じられる場合には、本発明の方法を使用することは有利である（画像は記録されない）。軸方向の場のピーク強度は、先の２つのＤＣの実施例と同じであるが、横方向のピーク電圧は５０Ｖである。両方の波形は２００ Ｈｚ周期である。
【０１６８】
実施例 ＩＶ
この実施例は、軸方向に適用されるＡＣおよびＤＣ場並びに横方向に適用されるＡＣを例示する。
【０１６９】
軸方向の面にＡＣおよびＤＣ場の両方を適用すると、より短くて太い縞が生じる。その理由は、分子はフローセルの下方でらせんパターンを取るからである。ＤＣ成分は、全ての分子を洗い流す。横方向のＡＣ場は、光子をより広い領域に投げるように組み込まれていない分子を促進し、先のように、バックグラウンドを均等化する傾向がある。
【０１７０】
実施例 Ｖ
この実施例は、Ｍｇ＋＋は、ｄＴＴＰおよびｄＴＤＰ（未標識）の電気泳動の移動を大きい負から小さい負に変化することができることを例示している。ｄＴＴＰ−（＋＋）−ボディピーＴＲの電気泳動の移動は、Ｍｇ＋＋濃度が増加すると、負から正に変化されうることも示している。
【０１７１】
５．１  キャピラリー電気泳動によるｄＴＴＰおよびｄＴＤＰの分析
ｄＴＴＰおよびｄＴＤＰの電気泳動の移動に対するＭｇ＋＋の影響を、キャピラリー電気泳動によって測定した。電気泳動の緩衝液は、５０ ｍＭのトリス−酢酸塩ｐＨ８．０、６０ ｍＭのＫＣｌおよび種々の濃度のＭｇＣｌ２（３ ｍＭ、４ ｍＭ、６ ｍＭ、１０ ｍＭ、１５ ｍＭ、２５ ｍＭおよび４０ ｍＭ）を含有した。試料は、０．５ ｍＭのヌクレオチド（ｄＴＴＰまたはｄＴＤＰ、Ｓｉｇｍａ）および０．８ ｍＭのメシチルオキシド（電気的中性マーカー、Ｓｉｇｍａ）を含有した。未コーティング融解石英キャピラリー（注入端部から検出帯まで４０ ｃｍ）を使用したキャピラリー電気泳動（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）によって試料を分析した。電圧は８．５ｋＶであり、ピークは２６０ ｎｍにおける吸光度でモニターした。各試料ピークの動電学速度は、距離（４０ｃｍ）を溶出時間で割ることによって計算した。バルク緩衝液の電気浸透流動（ＥＯＦ）はメシチルオキシドマーカーの速度と考える。ヌクレオチドの電気泳動速度はヌクレオチド動電学速度−ＥＯＦである。ヌクレオチドの電気泳動速度を、Ｍｇ＋＋濃度の関数としてプロットする（図１１Ａ）。ｄＴＴＰは、予想通り、電気泳動移動がｄＴＤＰよりも大きい負である。その理由は、ｄＴＴＰは追加のリン酸基を有するからである。（「負の移動」は、分子が、負に荷電している分子のように、正電極の方向に移動することを意味する）Ｍｇ＋＋は、両方のヌクレオチドの電気泳動の移動を大きい負から小さい負に変化させた。
【０１７２】
５．２  ゲル電気泳動によるｄＴＴＰ−ＢＱＳ（＋＋）−ボディピーＴＲの分析
γ−リン酸に結合したリンカーに２つの四級アミン基を付加することによってｄＴＴＰの正味電荷を正方向に調節し、電気的中性の色素マーカーもリンカーに結合して、化合物ｄＴＴＰ−ＢＱＳ（＋＋）−ボディピーＴＲを得た（図４）。このヌクレオチドの電気泳動の移動に対するＭｇ＋＋の影響は、アガロースゲル電気泳動によって測定した。電気泳動の緩衝液は、５０ ｍＭのトリス−酢酸塩ｐＨ８．０、６０ ｍＭのＫＣｌおよび種々の濃度のＭｇＣｌ２（０ ｍＭ、１ ｍＭ、１．５ ｍＭ、２ ｍＭ、３ ｍＭ、４ ｍＭ、６ ｍＭ、１０ ｍＭ、１５ ｍＭ、２５ ｍＭおよび４０ ｍＭ）を含有した。スラブゲル（４％アガロース）を各電気泳動緩衝液中で成形し、各ゲルを、それぞれの電気泳動緩衝液を含有するスラブゲル装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に入れた。試料のウェルに２０μＭのｄＴＴＰ−ＢＱＳ（＋＋）−ボディピーＴＲ５μＬを添加し、１ｃｍあたり６Ｖで１０分間電気泳動を実施した。ゲルをＵＶトランスイルミネーターで撮影し、別個の画像を１つの図に集成した（図１１Ｂ）。未標識のｄＴＴＰでわかるように（図１１Ａ）、Ｍｇ＋＋はヌクレオチドに正電荷を付加した。しかし、２つの四級アミンは、未標識のヌクレオチドと比較して、標識ヌクレオチドを小さい負にするので、Ｍｇ＋＋の影響はヌクレオチドの移動を正味の負から正味の正に変化することである。
【０１７３】
実施例ＶＩ
この実施例は、本発明の電荷スイッチヌクレオチドの合成を例示する。
【０１７４】
６．１ 化合物１’の調製
図１２ＡおよびＢにおいて、１１．２ｇのｔ−ＢＯＣ無水物（Ａｌｄｒｉｃｈ、２１８ｇ／ｍｏｌ、５２．４ ｍｍｏｌｅ）を１００ｍＬの試薬等級のメタノール（Ｆｉｓｈｅｒ）に溶解する。１０ ｍＬのＮ，Ｎジメチルプロピルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ、１０２．１ｇ／ｍｏｌ、４８．９ ｍｍｏｌｅ）を反応混合物に徐々に添加する。反応混合物を室温において１６時間撹拌する。反応は、ＴＬＣ（Ｃ１８、１：１ アセトニトリル／メタノール、Ｉ２で可視化）により完全であると思われる。溶媒を真空下で蒸発する。次いで、化合物１’（図１５）をカラムクロマトグラフィー（１：１塩化メチレンおよびメタノール）で精製する。純粋な化合物を含有する画分を合わせて、真空下で蒸発して、１７．７ｇの精製産物を得た。
【０１７５】
６．２  化合物２’の調製
２．１６ｇの化合物１（２０２ｇ／ｍｏｌ、１０．７ｍｍｏｌｅ）を乾燥した試薬等級のブチロニトリル（ｂｕｔｙｒｏｎｉｔｒｉｌｅ）（Ｆｉｓｈｅｒ）１０ｍＬに溶解する。１．５１グラムの１，４−ジヨードブタンを添加し、混合物を１３５℃において２４時間還流する。反応はＴＬＣ（Ｃ１８、４０％メタノール水溶液、Ｉ２で可視化）でチェックし、完全であると判定する。反応混合物をジエチルエーテルで沈殿させ、回収する。メタノールに溶解後、産物を再度ジエチルエーテルで沈殿させる。得られる粘性の黄色の残渣をメタノールに溶解し、溶媒を真空下除去する。この物質は、さらに精製することなく、化合物３を生成するために使用する。
【０１７６】
６．３  化合物３’の調製
乾燥すると、化合物は綿毛状の黄色の固体となる。この物質を５Ｎ ＨＣｌ（濃ＨＣｌから調製、Ｆｉｓｈｅｒ）の２０ｍＬに溶解し、室温において５時間撹拌する。反応の完全性は、ＴＬＣ（Ｃ１８、１：１アセトニトリル／メタノール、ニンヒドリンおよびＵＶ可視化）によってチェックする。酸溶液を濃縮し、関心対象の産物をジエチルエーテルで沈殿させる。この固形物をメタノールに溶解し、再度ジエチルエーテルで沈殿させる。固形物を回収し、真空下乾燥する。この産物は、さらに精製することなく、または収率を計算することなく使用する。
【０１７７】
６．４  化合物４’の調製
１．１ ｍｇのｄＴＴＰ（Ｓｉｇｍａ、４９２．７ｇ／ｍｏｌ、２．２μｍｏｌｅ）を０．１Ｍ ＭＥＳ ｐＨ５．７の１００μＬに溶解する。分離バイアルにおいて、１９．７ｍｇのＥＤＣ（Ａｌｄｒｉｃｈ、１９１．７ｇ／ｍｏｌ、１００μｍｏｌｅ）を０．１Ｍ ＭＥＳ ｐＨ５．７の１００μＬに溶解する。これらの２つの溶液を合わせて、室温において１０分間インキュベーションさせる。
【０１７８】
１１．６ｍｇの化合物３をＭＥＳ緩衝液４００μｌに溶解する。この溶液のｐＨをｐＨ紙でチェックすると、５．８であることがわかる。この溶液を活性化ヌクレオチドに添加し、反応を室温において１１０分間放置する。反応は、逆相ＨＰＬＣでモニターする。関心対象の産物を逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８、０．１ Ｍ ＴＥＡＡに溶解した４〜８０％ アセトニトリルをに加える、２０分間）で単離する。精製した化合物＃４から真空下において溶媒を除去する。ｄＴＴＰからの収率は１２．７％である。
【０１７９】
６．５ 化合物５６の調製
化合物４’（０．１５μｍｏｌｅ、９７５ ｇ／ｍｏｌ）を、ｐＨ８．３の５０ｍＭ 炭酸緩衝液１００μｌに溶解する。ｐＨをカラーｐＨａｓｔ（ｃｏｌｏｒｐＨａｓｔ）ｐＨストリップで調べ、８．３であることが判明する。２２ｍＭ ＴＡＭＲＡ−Ｘ−ＳＥ ６’ ９．４μＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、６４０．５９ｇ／ｍｏｌ、０．２３μｍｏｌ）を添加し、反応混合液を暗所で１８時間室温で放置させる。すべての活性型色素エステルの加水分解後、反応の完了を判定する。関心対象の生成物５６を逆層ＨＰＬＣ（Ｃ１８、０．１Ｍ ＴＥＡＡ中の４−１８％ アセトニトリル、２０分間）で単離する。生成物から溶媒を暗所で真空下において除去する。化合物４からの収率は３０％である。
【０１８０】
実施例  ＶＩＩ
この実施例は、本発明の化合物の電荷スイッチング活性を証明するためのアッセイ系を例示する。
【０１８１】
このアッセイ法は、ヌクレオチドのリン酸に結合した色素に関連する電荷の変化を試験するために使用される。色素の電荷スイッチ（ｃｈａｒｇｅ−ｓｗｉｔｃｈ）は、色素をヌクレオチドに結合するホスホジエステル結合が切断されることによって生じる。この実施例では、切断は、ヘビ毒ホスホジエステラーゼによって触媒される。
【０１８２】
ホスホジエステラーゼＩ（ガラガラヘビ属（Ｃｒｏｔａｌｕｓ）ａｄａｍａｎｔｅｕｓ ｖｅｎｕｍ；ＵＳＢ Ｃｏｒｐ．）は、１１０ ｍＭのＮａＣｌ、１５ ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する１１０ ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．９）に溶解し、最終酵素濃度を４０ｕｎｉｔｓ／ｍＬとした。反応試料（５０μＬ）はホスホジエステラーゼＩ（３．６ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（４０ｍＭ）およびｄＴＴＰ−ＢＱＳ−ＢＴＲ（３８μＭ）を含有した。対照試料は、酵素が含有されないことを除いて、反応試料と同じであった。反応試料および対照試料を３７℃において１時間インキュベーションし、５０ ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、６０ ｍＭ ＫＣｌ、２ ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むランニング緩衝液を使用して５％アガロースにおける電気泳動によって分析した。反応試料中のＢＴＲ色素は負電極（−）に移動したが、対照試料中の色素は正の電極（＋）に移動した。
【０１８３】
実施例  ＶＩＩＩ
この実施例は、本発明の化合物の電荷スイッチング活性を証明する。
【０１８４】
材料
マイクロチャネルは、ケイ素マスターに対してポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）をレプリカモデリングよって製造した。チャネルは幅１０ミクロンで、深さ１０ミクロンである。互いに垂直に２つの交差するチャネルを十文字状に形成した。各チャネルの遠位端は、直径４ｍｍで、深さ５ｍｍの別個の円形のウェルにつながる。
【０１８５】
図９を参照すると、白金電極が、垂直チャネル９５ａ、９５ｂのウェルに配置された。（図９には明白には示していないが、各チャネルの遠位端は別個の円形のウェル、すなわち、９５ａ、９５ｂおよび９６ａ、９６ｂにつながる。この態様では、命名９５ａ、９５ｂおよび９６ａ、９６ｂは、チャネルのウェルおよび電極および圧力をそれぞれ示すために使用され、交換可能である）。電圧をこれらの電極に適用して、垂直なチャネルの下方に電場を導入する。同時に、圧力を９６ａ、９６ｂに適用した。ウェル９６ａに適用した圧力は色素を交点方向に移動させるが、ウェル９６ｂに適用した圧力は、色素がウェル９６ｂ方向に移動を続けるのを妨害する（色素ウェル９５ａ、９５ｂのどちらかの方向に垂直チャネルを移動する）。
【０１８６】
５３０．９ラインの同調可能なアルゴン−クリプトンレーザーを使用して、フローセルチャネルを直接照射した。クリーンアップフィルター（中心波長５３０ ｎｍ、バンド幅１０ｎｍ）を、レーザーの出力部とフローセルの間に挿入した。放射される蛍光は、空中目標（１０×、ＮＡ０．２５）を使用して倒立顕微鏡を用いて観察した。対物レンズの後方では、ホログラフィーノッチフィルター（中心波長５３０．９ｎｍ、バンド幅３ｎｍ）およびバンドパス放射フィルター（中心波長５７５ｎｍ、バンド幅５０ｎｍ）がレイリーおよびラマン散乱を除去した。得られたシグナルはＣＣＤカメラで画像形成し、フレームグラバハードウェアおよびソフトウェアを備えるＰＣで捕獲した。
【０１８７】
緩衝液は、２０ ｍＭのトリス−ＯＡｃ ｐＨ ８、３％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、２ｍＭＭｇＣｌ２および０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０からなった。緩衝液＋色素溶液は、ｇｌｙ−ＴＡＭＲＡ（電荷−１）またはＢＱＳ−ＴＡＭＲＡ（電荷＋１）色素を、色素濃度が１μＭであるように同じ緩衝液構成物に添加することによって作製した。
【０１８８】
ＰＤＭＳ型およびボロシリケートカバースライドは、酸素プラズマチャンバで１分間処理した。処理後、接触させると、ＰＤＭＳとガラスは非可逆的に結合すると思われる。プラズマはまたフローセルおよびガラス表面を親水性にし、毛細管作用によってチャネルに容易に充填できる。
【０１８９】
Ｉ．  この実験の目的は、負に荷電した色素は、電場を適用することによって角を曲がって移動させることができるが、電気浸透流動（ＥＯＦ）を抑制できることを示すことであった。
【０１９０】
垂直チャネル９５ａ、９５ｂの末端のウェルおよび水平チャネル９６ｂの末端のウェルに４０μＬの緩衝溶液を充填すると同時に、拡大画像を示すモニターで交点を観察する。チャネルが濡れた後、ウェル９６ａには４０μＬの緩衝液＋色素溶液が満たされた。０．２８ｐｓｉの圧力をウェル９６ａに適用すると同時に、０．４３ｐｓｉをウェル９６ｂに適用した。８２０Ｖ／ｃｍの電場をウェル９５ａからウェル９５ｂに適用した（ウェル９５ａは正の電極を含有する）。
【０１９１】
電場は、負に荷電した色素をウェル９５ａ（正の電極）方向に向かわせる。色素は正の電極から離れる方向には移動しないので、ＥＯＦは抑制されることが知られている（負に荷電した壁から生じるＥＯＦは正の電極からのバルク流動を生じる）。
【０１９２】
次いで、極性がスイッチし、大きさは等しいが、方向が反対の電場が垂直チャネルの末端部のウェルに適用された。色素は方向をスイッチし、その結果、再度正の電極方向に移動した。
【０１９３】
ＩＩ  この実験の目的は、正に荷電した色素も、電場を適用することによって角を曲がって移動可能であることを示すことであった。
【０１９４】
ウェル９５ｂ、９５ａおよび９６ｂに４０μＬの緩衝溶液を充填すると同時に、モニターで交点を観察した。チャネルが濡れた後、ウェル９６ａには４０μＬの緩衝液＋色素溶液が満たされた。０．８８ｐｓｉの圧力をウェル９６ａに適用すると同時に、１．０９ｐｓｉをウェル９６ｂに適用した。４５５Ｖ／ｃｍの電場をウェル９５ａからウェル９５ｂに適用した。
【０１９５】
電場は、正に荷電した色素をウェル９６ｂ（負の電極）方向に移動させる。その後極性がスイッチし、色素がウェル９５ａの方向に向きを変えたことを確認した。
【０１９６】
本明細書に記載されている実施例および態様は例示的な目的のためだけであること、およびそれに関する種々の改良または変更が当業者に示唆されており、本願および添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれるべきであることが理解される。本明細書に引用されている全ての文献、特許および特許出願は、全ての目的のために全体の内容が参照として本明細書に組み入れられている。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のモデル化合物を例示する。
【図２】本発明による電荷スイッチ（ｃｈａｒｇｅ−ｓｗｉｔｃｈ）ヌクレオチドの種々の電荷を表にしたものを示す。理想的な条件では、核酸塩基、糖または標識「Ｆ」に結合した荷電した基は完全に荷電した形態であると考えられる。純水条件では、リン酸基の正味電荷に対する水素イオンの影響は、フレイ（Ｆｒｅｙ）およびスター（Ｓｔｕｈｒ）（１９７２）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、９４： ８８１８によって与えられる平衡定数を使用して算出される。ＰＰｉ−Ｆ基にだけ存在する二次電離リン酸酸素の存在により、ＮＰプローブと比較した場合、水素イオンは、主に、ＰＰｉ−Ｆ基に時間平均された部分正電荷を与える。
【図３】「リガンド」Ｎ−ＰＰＰ−ＦおよびＰＰ−Ｆ（Ｎ＝ヌクレオチド、ＰＰＰ＝三リン酸、ＰＰ＝ピロリン酸、Ｆ＝γ−標識）の時間平均電荷に対するＭｇ＋＋の影響を示す平衡算出式を略図で例示する。イオンＨ＋およびＭｇ＋＋への結合を考慮する。イオンに結合するリガンドの画分は、ｆｒａｃＢｏｕｎｄ＝［イオン］／（［イオン］＋Ｋ）（式中、ＫがｆｒａｃＢｏｕｎｄ＝５０％を与えるイオン濃度である（すなわち、結合定数または解離定数））として与えられる。プロトン化形態のＮ−ＰＰＰ−ＦおよびＰＰ−Ｆの画分は上記等式により算出された。次いで、Ｍｇ＋＋に結合した画分は、Ｎ−ＰＰＰ−ＦおよびＰＰ−Ｆのプロトン化形態および非プロトン化形態について算出した。次いで、各形態の画分にそれぞれの電荷を乗じ、分子の形態の全てを加算することによって、平均電荷を算出した。結果は、Ｍｇ＋＋濃度（０〜２５ｍＭ）の関数としてプロットする。ＮおよびＦの電荷は、ｐＨ−非依存的四級塩（＋）またはカルボン酸塩（−）としてモデル化した。パネル Ａ Ｎ（０）Ｆ（０）、パネル Ｂ Ｎ（０）Ｆ（２）、パネル Ｃ Ｎ１０）Ｆ（０）、パネル Ｄ Ｎ（２）Ｆ（０）、パネル Ｅ Ｎ（−１）Ｆ（２）、パネル Ｅ Ｎ（−２）Ｆ（３）。
【図４】本発明の化合物（ｄＴＴＰ−ＢＱＳ−ＢＴＲ）を例示する。
【図５】本発明の平衡算出式の略図を示す（実施例Ｉ参照）。
【図６】パネルＡは本発明の化合物であり、パネルＢは本発明の化合物であり、パネルＣは本発明の化合物であり、パネルＤは本発明の化合物であり、パネルＥは本発明の化合物に使用する種々のリンカーの態様であり、パネルＦは本発明の化合物に使用する種々のリンカーの態様である。
【図７】本発明の微小製造されたフローセルの一態様の略図を例示する。
【図８】本発明の一方法の態様の略図を例示する。
【図９】本発明の微小製造されたフローセルの一態様の略図を例示する。
【図１０】本発明の微小製造されたフローセルの一態様の略図を例示する。
【図１１】パネルＡは、ヌクレオチドの電気泳動速度をＭｇ＋＋濃度の関数としてプロットしたものであり、パネルＢは、示した量のＭｇ＋＋を含有するアガロースゲルにおける図４の化合物の電気泳動の移動に対するＭｇ＋＋の影響を示す。
【図１２】本発明の態様の合成略図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年8月14日(2002.8.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光団部分が結合した末端リン酸を有し、第１の分子電荷が結合した無傷のＮＰプローブを含み、末端リン酸がリン酸蛍光団部分として切断されると、リン酸蛍光団部分が第２の分子電荷を保有し、第１の分子電荷と第２の分子電荷の差が少なくとも０．５である電荷スイッチリン酸ヌクレオチド（ＮＰ）プローブ。
【請求項２】
無傷のＮＰプローブが正の分子電荷を有するか、または末端リン酸蛍光団部分が切断されると、該末端リン酸蛍光団部分が該無傷のＮＰプローブに対して正の分子電荷を保有する、請求項１記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項３】
電荷スイッチＮＰプローブがヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）であり、末端リン酸が、蛍光団部分が結合したピロリン酸である、請求項１記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項４】
無傷のＮＴＰプローブが正の電荷を有する、請求項３記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項５】
末端リン酸がピロリン酸蛍光団部分として切断されると、ピロリン酸蛍光団部分が、無傷のＮＴＰプローブに対して正の電荷を保有する、請求項３記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項６】
ＮＴＰプローブが、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）およびヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）からなる群より選択されるメンバーである、請求項３記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項７】
ＮＴＰプローブがデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）である、請求項６記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項８】
デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）が、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシシトシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシチミジン三リン酸およびデオキシウリジン三リン酸からなる群より選択されるメンバーである、請求項７記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項９】
ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）が、アデノシン三リン酸、シトシン三リン酸、グアノシン三リン酸およびウリジン三リン酸からなる群より選択されるメンバーである、請求項６記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項１０】
蛍光団部分が、フルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、ローダミン、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、アントラニルアミド、クマリン、テルビウムキレート誘導体、リアクティブレッド（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ）４、ボディピー色素およびシアニン色素からなる群より選択されるメンバーである、請求項１記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項１１】
蛍光団部分が、リンカーを介して末端リン酸に結合されている、請求項３記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項１２】
蛍光団リンカーが、炭素数約５〜約１２個のアルキレン基である、請求項１１記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項１３】
リンカーが少なくとも１つの正の電荷を保有する、請求項１１記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項１４】
リンカーが少なくとも２つの正の電荷を保有する、請求項１１記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項１５】
リン酸ヌクレオチドプローブのリン酸部分の少なくとも１つは、対陽イオンが結合したイオン化酸素原子を有する、請求項１記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項１６】
対陽イオンが金属イオンである、請求項１５記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項１７】
金属イオンが、Ｍｇ＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｋ＋およびＮａ＋からなる群より選択される、請求項１６記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項１８】
蛍光団部分がボディピー ＴＲである、請求項１１記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項１９】
第１の分子電荷と第２の分子電荷との差が、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９および４．０からなる群より選択される、請求項１記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項２０】
第１の分子電荷と第２の分子電荷との差が、ｐＨ ７．０における純水において算出される、請求項１記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項２１】
電荷スイッチプローブが、図６Ａ〜Ｄの化合物５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９および６０からなる群より選択される、請求項１記載の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項２２】
検出可能な部分を有する標識リン酸ヌクレオチドを、試料流動体中に放出された荷電した検出可能な部分を分離するための方法であって、
ａ）単一分子構成の固相支持体に、核酸ポリメラーゼまたは標的核酸を含む複合体を固定する段階と、
ｂ）複合体に、ポリメラーゼが固定されている場合には標的核酸または標的核酸が固定されている場合にはポリメラーゼ、該標的核酸の一領域と相補的であるプライマー核酸および検出可能な部分を有する電荷スイッチリン酸ヌクレオチド（ＮＰ）プローブを含む試料流動体を接触させる段階であって、電荷スイッチリン酸ヌクレオチド（ＮＰ）がプライマー核酸に組み込まれると検出可能な部分が荷電した検出可能な部分として放出される段階と、
ｃ）試料流動体にエネルギー場を適用し、それによって荷電した検出可能な部分から標識ＮＰを分離する段階と
を含む方法。
【請求項２３】
電荷スイッチリン酸ヌクレオチド（ＮＰ）が標識ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
検出可能な部分を有する標識ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）が、検出可能な部分が結合したγ−リン酸を有するＮＴＰである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
荷電した検出可能な部分が放出された場合、蛍光団部分が結合したピロリン酸を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
標識ＮＴＰが、ポリメラーゼを使用して標的核酸にハイブリダイゼーションした核酸プライマーに組み込まれ、それによって検出可能な部分が結合したγ−リン酸を放出する、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
標的核酸が、プライマーを形成する自己相補領域を含む、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
放出後の検出可能な部分の電荷が、検出可能な部分が結合した標識リン酸ヌクレオチド（ＮＰ）とは異なる、請求項２２記載の方法。
【請求項２９】
検出可能な部分の電荷が組み込まれていない標識ＮＰより正である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
結合した検出可能な部分の電荷が、組み込まれていない蛍光標識ＮＰと比較して符号が反対である、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
ｄ）測定装置を用いて検出可能な部分を測定する段階を
さらに含む、請求項２２記載の方法。
【請求項３２】
測定装置が、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ、フォトダイオード、ビデオチップ、電流メータ、電圧メータおよび光ファイバセンサの色素含浸ポリマーコーティングからなる群より選択される、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
検出がＣＣＤカメラによる、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
検出がフォトダイオードによる、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
リン酸の検出可能部分から無傷のＮＰプローブを分離するための分析方法であって、
ａ）検出可能な部分が結合した無傷のＮＰプローブを含む試料を提供する段階であって、無傷のＮＰプローブが酵素的に切断されると、無傷のＮＰプローブの分子電荷とは異なる分子電荷を保有するリン酸の検出可能な部分を形成する段階と、
ｂ）試料にエネルギー場を提供し、それによって該無傷のＮＰプローブからリン酸の検出可能な部分を分離する段階と
を含む方法。
【請求項３６】
検出可能な部分を有するＮＰプローブが標識ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）である、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
ポリメラーゼを用いて標的核酸を配列決定する方法であって、
ａ）単一分子構成の固相支持体に、核酸ポリメラーゼまたは標的核酸を含む複合体を固定する段階と、
ｂ）複合体に、ポリメラーゼが固定されている場合には標的核酸または標的核酸が固定されている場合にはポリメラーゼ、配列決定対象の領域の該標的核酸の一領域と相補的であるプライマー核酸および検出可能な部分を有する標識リン酸ヌクレオチドを含む試料流動体を接触させる段階であって、ＮＰがプライマー核酸に組み込まれると検出可能な部分が荷電した検出可能な部分として放出され、固相支持体が、流入部と流出部を有するフローセルに接続されている段階と、
ｃ）試料流動体にエネルギー場を適用する段階と
ｄ）荷電した検出可能な部分を検出し、それによって該標的核酸を配列決定する段階と
を含む方法。
【請求項３８】
検出可能なリン酸ヌクレオチドが、検出可能な部分が結合したγ−リン酸を有する標識ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）である、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
ＮＰが、ポリメラーゼを使用して標的核酸にハイブリダイゼーションしたプライマー鎖に組み込まれ、それによって検出可能な部分が結合したγ−リン酸を放出する、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
エネルギー場が電場である、請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
電場が横方向に適用される第１の電場であり、第２の電場が軸方向に適用される、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
蛍光団部分が結合したγ−リン酸の電荷が、組み込まれていない蛍光標識ＮＴＰより大きい、請求項３７記載の方法。
【請求項４３】
蛍光団部分が結合したγ−リン酸の電荷が、組み込まれていない蛍光標識ＮＴＰより小さい、請求項３７記載の方法。
【請求項４４】
蛍光団部分が結合したγ−リン酸の電荷が、組み込まれていない蛍光標識ＮＴＰと比較して符号が反対である、請求項３７記載の方法。
【請求項４５】
検出が電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラによる、請求項３７記載の方法。
【請求項４６】
検出が、光ファイバセンサの色素含浸ポリマーコーティングによる、請求項３７記載の方法。
【請求項４７】
検出が遮断電流による、請求項３７記載の方法。
【請求項４８】
検出がフォトダイオードによる、請求項３７記載の方法。
【請求項４９】
リン酸の検出可能な部分から無傷のＮＰプローブを分離する方法であって、
ａ）検出可能な部分が結合した無傷のＮＰプローブを含む試料を提供する段階であって、無傷のＮＰプローブが酵素的に切断されると、該無傷のＮＰプローブの分子電荷とは異なる分子電荷を保有するリン酸の検出可能な部分を形成する段階と、
ｂ）試料にエネルギー場を適用し、それによって該無傷のＮＰプローブからリン酸の検出可能な部分を分離する段階と
を含む方法。
【請求項５０】
無傷のＮＰプローブが、末端のリン酸に検出可能な部分を有する電荷スイッチリン酸ヌクレオチドプローブである、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
無傷の電荷スイッチリン酸ヌクレオチド（ＮＰ）プローブを同定するための方法であって、
ａ）無傷の電荷スイッチＮＰプローブを含む試料に酵素を接触させて、リン酸の検出可能な部分を形成する段階と、
ｂ）試料に電場を適用する段階であって、リン酸の検出可能な部分は、該無傷の電荷スイッチＮＰプローブと異なる電極に移動する段階と
を含む方法。
【請求項５２】
酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ホスホジエステラーゼおよびホスファターゼからなる群より選択される、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
無傷の電荷スイッチリン酸ヌクレオチド（ＮＰ）プローブが酵素的に切断されると、リン酸の検出可能な部分を形成し、リン酸の検出可能な部分が一方の電極に移動し、無傷の電荷スイッチＮＰプローブが他方の電極に移動する、無傷の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項５４】
無傷のＮＰプローブが正の分子電荷を有するか、またはリン酸の検出可能な部分が切断されると、該リン酸の検出可能な部分が該無傷のＮＰプローブに対して正の分子電荷を保有する、請求項５３記載の無傷の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項５５】
電荷スイッチＮＰプローブがヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）であり、リン酸の検出可能な部分が、蛍光団部分が結合したピロリン酸である、請求項５３記載の無傷の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項５６】
無傷のＮＴＰプローブが正の電荷を有する、請求項５３記載の無傷の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項５７】
リン酸の検出可能な部分がピロリン酸蛍光団部分として切断されると、ピロリン酸蛍光団部分が、無傷のＮＴＰプローブに対して正の電荷を保有する、請求項５５記載の無傷の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項５８】
ＮＴＰプローブが、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）およびヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）からなる群より選択されるメンバーである、請求項５３記載の無傷の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項５９】
ＮＴＰプローブがデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）である、請求項５８記載の無傷の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項６０】
デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）が、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシシトシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシチミジン三リン酸およびデオキシウリジン三リン酸からなる群より選択されるメンバーである、請求項５９記載の無傷の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項６１】
ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）が、アデノシン三リン酸、シトシン三リン酸、グアノシン三リン酸およびウリジン三リン酸からなる群より選択されるメンバーである、請求項５８記載の無傷の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項６２】
蛍光団部分が、リンカーを介して末端リン酸に結合している、請求項５５記載の無傷の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項６３】
蛍光団リンカーが、炭素数約５〜約１２個のアルキレン基である、請求項６２記載の無傷の電荷スイッチＮＰプローブ。
【請求項６４】
核酸を配列決定するための方法であって、
標的核酸、プライマー鎖、ポリメラーゼおよび複数のＮＰプローブを提供する段階と、
複数のＮＰプローブの標的依存的重合を可能にする条件下において標的核酸、配列プライマー、ポリメラーゼ、複数のＮＰプローブをフローセル中で混合して、それによって重合産物を提供する段階と、
エネルギー場によってフローセル中の重合産物を分離して、該標的核酸の配列を提供する段階と
を含む方法。
【請求項６５】
複数のＮＰプローブの重合が複数のリン酸の検出可能な部分を形成する、請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
複数のＮＰプローブが、ポリメラーゼを使用して標的核酸にハイブリダイゼーションしたプライマー鎖に組み込まれ、それによって検出可能な部分が結合したγ−リン酸を放出する、請求項６４記載の方法。
【請求項６７】
エネルギー場が電場である、請求項６４記載の方法。
【請求項６８】
電場が横方向に適用される第１の電場であり、第２の電場が軸方向に適用される、請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
核酸を配列決定するための方法であって、
標的核酸、ポリメラーゼプライミング部分、ポリメラーゼおよび複数の無傷のＮＰプローブを提供する段階と、
複数のＮＰプローブの標的依存的重合を可能にし、複数のリン酸の検出可能な部分の時間配列を提供することができる条件下において標的核酸、ポリメラーゼプライミング部分、ポリメラーゼおよび複数のＮＰプローブを混合する段階と、
電荷によって、複数のリン酸の検出可能な部分を該複数の無傷のＮＰプローブから分離する段階と、
該複数のリン酸の検出可能な部分を経時的に検出して、該標的核酸の配列を提供する段階と
を含む方法。
【請求項７０】
プライマー部分がヘアピンループである、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
複数のリン酸の検出可能な部分が、ＰＰｉ−Ｄｙｅ、末端リン酸の蛍光団部分、検出可能な部分、荷電基、電気的に活性な基、レポーター基およびそれらの組み合わせからなる群より独立に選択される、請求項６９記載の方法。
【請求項７２】
リン酸の蛍光団部分が、１色配列決定、２色配列決定、３色配列決定、４色配列決定およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるメンバーに使用される、請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
ポリメラーゼが単一の分子構成で固定されている、請求項６９記載の方法。
【国際調査報告】
2004516810.tif 000117
2004516810.tif 000118
2004516810.tif 000119