(57)【要約】本発明は、少なくとも１個の酵母、細菌または哺乳類細胞を電気穿孔法にかけること及び放出されたタンパク質を回収することからなる、タンパク質の製造方法に関する。この方法は、インキュベーション段階に先立つ電気穿孔段階を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの酵母、細菌または哺乳類細胞を含む液体培地の流れにエレクトロパルシングを与え、遊離させたタンパク質を回収する、タンパク質の製造方法。
【請求項２】
エレクトロパルシング工程の後にインキュベーション工程が続くことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
細菌、酵母または哺乳類細胞が、エレクトロパルシングを受ける液体培地中で懸濁状態であることを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
液体培地中で懸濁状態である酵母または細菌の濃度が、１０６〜５×１０９細胞／ｍｌの範囲、好ましくは５×１０８〜５×１０９細胞／ｍｌの範囲にあり、哺乳類細胞の濃度が２×１０４〜１０８細胞／ｍｌの範囲、好ましくは１０７〜１０８細胞／ｍｌの範囲にあることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
酵母が、同種及び異種タンパク質を産生し得る種、特にサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）及びハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）から選択されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
遊離させたタンパク質を、ろ過または遠心により酵母、細菌または哺乳類細胞から分離することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
エレクトロパルシングを、少なくとも１ｋＶ／ｃｍの電界強度で実施することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
電界強度が、１〜１０ｋＶ／ｃｍの範囲、好ましくは１〜５ｋＶ／ｃｍの範囲であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
パルス持続時間が約０．０１ｍｓを超えることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
パルス持続時間が１００ｍｓ未満であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
パルス持続時間が０．５〜１５ｍｓの範囲であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
エレクトロパルシング処理の持続時間が、約０．０１〜１００ｓ、好ましくは０．１５〜１５ｓであることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
パルス周波数が０．１Ｈｚ、好ましくは１Ｈｚを超えることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
パルス周波数が１〜５００Ｈｚの範囲である、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
各酵母、細菌または哺乳類細胞の受けるパルス数が、約１〜１００、好ましくは５〜２０の範囲であることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
各酵母、細菌または哺乳類細胞の受けるパルス数が、約１０であることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
インキュベーション用培地が、少なくとも１種の塩、好ましくはリン酸カリウムを含むことを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
抽出用培地が、抽出されたタンパク質の安定性を維持する少なくとも１つの物質を含むことを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
抽出用培地が、少なくとも１つのジチオトレイトール還元剤を含むことを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
酵母及び細菌の場合、エレクトロパルシング用培地が脱イオン水であることを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
電界パルスの形が、方形波、台形波、三角波、正弦波、全波若しくは半波整流正弦波、または指数的に減衰する波、単極、双極、対称若しくは非対称の波であることを特徴とする、請求項１〜２０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
パルス形が、方形波であることを特徴とする、請求項１〜２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項記載の方法により得られるタンパク質。
【請求項２４】
請求項１〜２２のいずれか１項記載の方法により得られる少なくとも１つのタンパク質を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、目的とするタンパク質を製造するための方法に関する。
【０００２】
微生物、すなわち細菌、真菌、植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞、特に酵母は、タンパク質を産生することができるが、ある種の産生物、特にタンパク質などの巨大分子を微生物から回収することが困難であることが証明できる。
【０００３】
目的とするタンパク質、すなわち天然のタンパク質を、化学的または機械的方法を用いて酵母から抽出し得ることが知られている。
【０００４】
圧力下での粉砕及び溶解から構成される通常の機械的方法を用いる場合、酵母の液胞を破壊しないことは不可能であり、液胞内に含有されるプロテアーゼの遊離が、純度の問題の原因となり、したがって最終産生物の精製における問題の原因となる。
【０００５】
さらに、化学的方法も結果として液胞の破壊をもたらし、洗浄剤またはタンパク質分解剤を用いるので、これらが使用される化学的産生物に加わり、媒質を汚染する。これも、その後の精製での問題となる。
【０００６】
さらに、そうした化学作用物質のいくつかは、酵素を不活性化する。
【０００７】
本発明は、流れる細胞の懸濁液にエレクトロパルシング処理を適用し、その後好適な培地中でインキュベートする、新規な方法に関する。細胞は、酵母でもよいし、細菌でもよく、それらの例えば純水中懸濁液にエレクトロパルシングを適用し、その後塩培地中で比較的長時間インキュベートすることが可能で、このとき機械的、化学的または生物学的に修飾することを目的とした細菌培養物の前処理の実施を必要としない。詳細な説明中で明らかになるように、これは哺乳類細胞にも適合させることができる。
【０００８】
本発明は、少なくとも１つの酵母、細菌または哺乳類細胞を含む液体培地の流れにエレクトロパルシングを与え、遊離するタンパク質を回収する、タンパク質の製造方法に関する。以下に明らかになるように、「エレクトロパルシング（ｅｌｅｃｔｒｏｐｕｌｓｉｎｇ）」とは、細胞が一連の電気的インパルスを受ける方法を意味する。
【０００９】
本発明は、上記の問題を解決する。本発明によれば、電気処理は細胞の崩壊を起こさないため、細胞断片が処理後の培地中に現れることがない。細胞の全内容物が放出されるわけではなく、細胞内小器官及び細胞質タンパク質の大部分は細胞壁により保持されている。液胞は影響を受けず、そしてプロテアーゼは放出されない。目的とするタンパク質の精製が簡便化され、そして本発明の方法は、遊離する産生物に関して選択性を増大させる。
【００１０】
固定化床エレクトロパルシング（ｆｉｘｅｄ ｂｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｐｕｌｓｉｎｇ）の研究は行われていたが、Ｖ Ｇａｎｅｖａ、Ｂ ＧａｌｕｔｚｏｖによるＦＥＭＳ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １７４ （１９９９） ２７９−２８４記載の条件では、期待される結果を伴う本発明の方法には至らない。
【００１１】
固定化床法は、処理されたすべての細胞を不可逆的に透過性にするわけではない。本出願人は、固定化床法における特定の実施条件が流れ系のある種の欠点となり得ることを立証してきた。
【００１２】
それは主として、エレクトロパルシング用培地の伝導率についての条件に関係する。最後に、適用したエレクトロパルシング処理は、固定化床中での実施か、流れ系での実施かにより、酵母において異なる効果をもたらし、具体的には、細胞を透過性にすることに対して異なる効果をもたらす。
【００１３】
流れ系では、酵素の不活性化は回避し得るが、これは、細胞懸濁液の実質的加熱が避けられることを意味する。これは、特に収率に関して、極めて有利なことである。というのも、その後の冷却段階及びその段階に要する装置の使用が回避されるからである。
【００１４】
本発明によれば、細胞の高濃度懸濁液を処理すると、培地の加熱を起こさずに至適遊離を得ることができる。
【００１５】
最後に、本発明の方法を大容量に応用して、目的とするタンパク質を大量に、しかも特にプロテアーゼ阻害剤を加えずに簡単な組成の培地を用いて、これまで他の方法では得ることが不可能であった純度で得ることが可能である。
【００１６】
本発明の方法では、細胞に、特に懸濁状態の細胞に高密度の外部電界を印加すると、膜貫通電位に加えて電位が生ずる。臨界レベルに達すると、細胞膜は透過性になる。細胞が動いて（流れて）いる場合には、電極に対して位置を変える。パルスは、標的として表面の様々な領域を有する（パルスの標的となる領域は様々である）。その結果、透過性になった表面が拡がり、静止細胞のもの（バッチ）とは異なる、局所的レベルの構造変化が起こる。パルスの強度、持続時間または回数などの印加電界の規定のパラメータでは、パルスにより惹起される膜の変化が不可逆的になり、細胞内含有物が遊離することになり得る。
【００１７】
細胞壁を有する酵母では、この流出が、細胞壁の孔隙率及び種々の分子に対してその大きさにより異なる透過性により制御される。
【００１８】
本発明者らは、細菌の膜が、酵母に用いられる値に近似する電界に対し透過性になることを観察してきた。
【００１９】
透過性となるのは、電気的なインパルスが印加される数マイクロ秒の間に起こる極めて急速な過程で、電気的処理の後、数分から数時間の間持続する。
【００２０】
酵母に施された処理は、細胞膜周辺腔に局在する酵素であるインベルターゼの放出をおこし得ることが明らかにされている。細胞壁の孔隙率は、細胞膜に対する電界の影響以上に上昇するようである。
【００２１】
本発明の方法は、細胞により分泌され、細胞膜周辺腔に蓄積するタンパク質の流出、したがって遊離及びその後の回収を可能にする。
【００２２】
他の態様では、本発明は、本明細書に記載の方法によって得られるタンパク質及びそれを含む組成物にも関する。
【００２３】
本発明の方法により処理し得る細胞については、異種または同種のタンパク質を産生し得るすべての種を処理することができる。以下の実施例は、発明の外延を限定するものではない。
【００２４】
具体的な酵母として、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｉｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）及びハンセニュラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）を挙げることができる。
【００２５】
列挙可能な細菌には、グラム陰性菌、具体的には大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）などがある。
【００２６】
哺乳類細胞については、線維芽細胞、特にチャイニーズハムスター細胞を挙げることができる。
【００２７】
本発明によれば、細胞を、培養し、次いで洗浄して培地からイオン類を除去し、その後電気処理にかけ、次いでインキュベーション用培地中でインキュベートする。その後細胞を上清から分離する。タンパク質は、通常の方法で精製する。
【００２８】
本発明の方法によれば、エレクトロパルシング段階の前に、培養段階がある。対数期または定常期まで増殖を維持することができる。増殖期まで培養することが望ましいが、好ましい結果は、定常期においても得られる。したがって、培養用培地を選択して同種、異種を問わず所望のタンパク質の発現を最大にすることが可能である。本出願人は、電気抽出効率が培養用培地の組成によって影響されないことを明らかにしている。
【００２９】
懸濁液を遠心した後、培養用培地中の細胞をパルシング用培地に移す。
【００３０】
細胞は、エレクトロパルシングを行う液体培地中に懸濁状態にすることが好ましい。エレクトロパルシング用液体培地中で懸濁状態にある酵母または細菌の濃度は、約１０６〜５×１０９細胞／ｍｌの範囲、好ましくは約５×１０８細胞／ｍｌ〜約２×１０９細胞／ｍｌの範囲にある。哺乳類細胞の濃度は、約５０倍低いことが好ましい。
【００３１】
エレクトロパルシング処理の条件については、少なくとも１ｋＶ／ｃｍ、具体的には１〜１０ｋＶ／ｃｍ、好ましくは１〜５ｋＶ／ｃｍ、そして具体的には２〜４ｋＶ／ｃｍの範囲の電界強度で実施することができる。
【００３２】
パルス持続時間は、０．０１ｍｓ（ミリ秒）を超え、具体的には１ｍｓを超えることが好ましくは選択される。１００ｍｓもの長時間にしてもよい。０．５〜１５ｍｓの範囲、具体的には１〜１５ｍｓの範囲が好ましい。
【００３３】
高密度の電界を印加すると、通常単一のパルスが印加される。連続パルスをかけることも可能で、その連続は数マイクロ秒から数ミリ秒の持続時間を有する。各細胞に適用された処理は、約０．０１〜１００ｓ（秒）、好ましくは０．１５〜１５ｓ持続する。
【００３４】
各酵母、細菌または哺乳類細胞が受けるパルス数は、１〜１００のオーダー、好ましくは５〜２０、さらに好ましくは１２〜２０、例えば１０のオーダーである。
【００３５】
例えば、２Ｈｚならば、パルス持続時間３ｍｓ、電界強度３ｋＶ／ｃｍであり、６Ｈｚならば、持続時間２ｍｓ、強度３．２ｋＶ／ｃｍ、または１ｍｓ、４．３ｋＶ／ｃｍである。
【００３６】
実施例に示すように、一連のパルスは、例えば１パルスが０．１〜４ｍｓ、具体的には２〜４ｍｓの持続時間を有する約１５パルスの連続として印加することができる。
【００３７】
パルスの周波数は、０．１Ｈｚ以上、好ましくは１Ｈｚ以上が好ましい。１００Ｈｚまたは５００Ｈｚさえもあり得る。さらに好ましくは、１〜１００Ｈｚ、具体的には１〜１０Ｈｚの範囲である。さらに、各パルスの持続時間と周波数の積は、１未満でなければならない。
【００３８】
哺乳類細胞に関しては、印加した電界の強度は、細胞質タンパク質を放出させるのに十分なものでなければならない。実施例に例示する電気的パラメータの場合は、外部の培地に細胞質タンパク質を遊離させるために、１ｋＶ／ｃｍを超える電界強度を用いなければならない。より良好な塩析条件下（１．２５ｋＶ／ｃｍ）では５０％の細胞生存率が観察されている。
【００３９】
電界のパルス形については、方形波、台形波、三角波、正弦波、全波若しくは半波整流正弦波（ｓｉｎｇｌｅ ａｎｄ ｈａｌｆ−ｗａｖｅ ｒｅｃｔｉｆｉｅｄ ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ ｗａｖｅｓ）、または指数的に減衰する波、単極波、双極波、対称若しくは非対称波を使用することが可能であり、好ましくは方形波を用いる。
【００４０】
本発明によれば、エレクトロパルシング用培地の伝導率は低く、好ましくは２ｍＳ／ｃｍ未満である。電気パルスに伴うジュール効果を制限するために伝導率を選択する。したがって、単純な塩培地であってもよい。酵母及び細菌については、エレクトロパルシング用培地は脱イオン水であってもよい。
【００４１】
電界処理の後、処理された細胞を含む液体培地をインキュベートして目的とするタンパク質の流出を促す。
【００４２】
インキュベーション用培地は、パルシング用培地と同一でもよいが、変化させてもよい。浸透圧安定化剤を含む緩衝液中にパルス処理された細胞を移すことにより、パルシング用培地からインキュベーション用培地に移行させることができる。
【００４３】
本発明に使用するインキュベーション用培地は、少なくとも１種の塩、例えばリン酸カリウムを含む単純な塩培地でもよい。リン酸カリウムなどの少なくとも１つの緩衝剤を１０ｍＭ〜０．２Ｍ、好ましくは５０〜１５０ｍＭの量で、グリセロールなどの浸透圧安定化剤を０．０５〜１Ｍ、好ましくは０．２〜０．５Ｍの量で含むインキュベーション用培地を使用することも可能であり、同培地は、抽出したタンパク質の安定性を維持するための物質としてジチオトレイトールなどの還元剤を０．０１〜０．２ｍＭで含むこともできるし、メルカプトエタノールまたはメルカプトエチルアミンなどのチオール基（スルフヒドリル基）を含有する他の製品を使用することも可能である。
【００４４】
グリセロールは、浸透圧保護剤として１０〜２０％の濃度でしばしば用いられる。本発明の方法において、グリセロールを用いる目的は、液胞を完全に保つことであり、その濃度ははるかに低く（例えば２．８％）、その結果、遊離させたタンパク質のその後の精製が容易になる。
【００４５】
インキュベーション終了時に、タンパク質を液体培地から分離する公知の方法、例えば固定容量遠心若しくはフロー遠心、ろ過、傾瀉または沈殿、好ましくは遠心またはろ過により、タンパク質を精製することができる。
【００４６】
特に酵母、細菌及び哺乳類細胞を処理する際の培養用培地、インキュベーション用培地及び抽出用培地の選択については、当業者は必要に応じて培地の組成を変えることができる。
【００４７】
酵母及び細菌については、エレクトロパルシングを行う培地を純水とし、培養用培地を塩培地とすることができる。哺乳類細胞については、培養用培地は、好ましくは浸透圧的に平衡化されていなければならず、培養用培地は、エレクトロパルシング用培地に類似であり得る。低イオン含量の培地を使用することが可能であり、例えば、サッカロースは浸透圧ショックから保護する。
【００４８】
本発明の方法を酵母に適用して、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｉｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）の場合、ＤＨＡ（アルコールデヒドロゲナーゼ）、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ＨＫ（ヘキソキナーゼ）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ）、ＧＬＲ（グルタチオンレダクターゼ）、ＳＯＤ（スーパーオキシドジスムターゼ）及びβ−ガラクトシダーゼなどの細胞質酵素を抽出することができる。
【００４９】
本発明によれば、酵母については培養、インキュベーション及び抽出の各段階は、およそ以下の程度の時間で行うことができる。
−対数期までの培養：約１５時間
−定常期までの培養：２４〜４８時間
−培養用培地からの細胞の分離、洗浄、希釈：１時間
−パルシング用チャンバーを横切る各容量の電気処理：数秒
−エレクトロパルシング後のタンパク質遊離を最大量とするためのインキュベーション：３〜８時間
−タンパク質の分離：２０００ｇ、１０分間の遠心
【００５０】
本発明によれば、細菌については、培養、インキュベーション及び抽出の各段階は、およそ以下の程度の時間で行うことができる。
−一晩の前培養
−対数期までの培養：４〜１０時間
−培養用培地からの細胞の分離、洗浄、希釈：１時間
−パルシング用チャンバーを横切る各容量の電気処理：数秒
−エレクトロパルシング後のタンパク質遊離を最大量とするためのインキュベーション：２〜８時間
−タンパク質の分離：２０００ｇ、１０分間の遠心
【００５１】
本発明によれば、哺乳類細胞については、培養、インキュベーション及び抽出の各段階は、以下の順序及び時間で行うことができる。
−対数期までの培養：十分な生物体量を得るために数日
−培養用培地からの細胞の分離、洗浄、希釈：１時間
−パルシング用チャンバーを横切る各容量の電気処理：数秒
−エレクトロパルシング後のタンパク質遊離を最大量とするためのインキュベーション：約３０分
−タンパク質の分離：１００ｇ、１０分間の遠心
【００５２】
この方法を実施するために使用する装置の観点から、エレクトロパルシング用チャンバーをリザーバーに連結し、培養、洗浄及び希釈した後に細胞をそこからチャンバーに吸引し、流れにより細胞をエレクトロパルサーに連結した電極の間を通過させる。チャンバー及びエレクトロパルシング用装置は改変することが可能で、流速の関数である周波数で電気パルスを印加することも可能で、それにより細胞は、強度及び持続時間に関して、例えば２〜５ｋＶ／ｃｍ及び０．１〜１５ｍｓ、例えば１〜１５ｍｓの持続時間で、好適である所定の数のパルスを受ける。
【００５３】
哺乳類細胞には、同じような持続時間で、０．５〜５ｋＶ／ｃｍ、好ましくは１〜４ｋＶ／ｃｍのより低い強度を使用することができる。
【００５４】
フローチャンバーからの流出口において、細胞の流れはインキュベーション用培地中に希釈され、膜を通ってタンパク質放出が起こり得る。その後、遠心またはろ過により酵母、細菌または哺乳類細胞からタンパク質を分離する。次いで、タンパク質を精製する。
【００５５】
微生物からのタンパク質放出は、抽出物中に存在するタンパク質の総量の測定を可能し、可溶性抽出物中の可溶性タンパク質を測定する基準方法であるクーマシーブルー試験により検出することができる。実施例では、膜タンパク質は遠心中に沈殿した。膜タンパク質は、もはや抽出物中には存在しなかった。
【００５６】
その後、公知の方法を用いて酵素を濃縮し、精製した。細胞から遊離させた上清の酵素の分離は、その後の精製に先立つルーチンな段階である。エレクトロパルシングでは、細胞の断片化が起こらないので、酵母及び細菌については１５００〜２０００ｇで遠心すれば十分であり、哺乳類細胞については１００ｇで十分である。工業的な規模では、このような分離は連続遠心またはろ過により実施することができる。
【００５７】
エレクトロパルシング法を、以下に記載の条件下で細胞培養物の連続的な流れについて実施した。
【００５８】
酵母のエレクトロパルシングによるタンパク質製造の実施例
実施例ａ）　サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ： ＦＹ−８６株）を３０℃、２４０ｒｐｍでＹＰＤ培地（１０ｇ／ｌ酵母抽出物、２０ｇ／ｌペプトン、２０ｇ／ｌグルコース）中で培養した。対数期及び定常期に至るまで増殖を維持した。
【００５９】
酵母を培養した後、細胞を、２０００ｇ、５分間遠心することにより培養用培地から分離し、脱イオン水で２回洗浄し、脱イオン水で濃度１０９細胞／ｍｌに希釈した。
【００６０】
パルスのパラメータは、以下のように選択した。一連の１５パルス、各パルスの持続時間は３ｍｓ、周波数４Ｈｚ，流速３ｍｌ／分。
【００６１】
処理直後、懸濁液を抽出用培地中に５倍に希釈した。本例の場合、抽出用培地はインキュベーション用培地でもある。この培地は、０．１Ｍリン酸カリウムバッファ、０．３Ｍグリセロール及び１ｍＭ　ＤＴＴの最終濃度からなった。
【００６２】
抽出用培地中の滞留時間は、約６時間程度であった。抽出を目的としたその後のエレクトロパルシング及びインキュベーションは、周囲温度で実施した。
【００６３】
回収されたタンパク質の活性は、特異的試験を用いて測定した。遊離させたタンパク質の総量は、Ｂｉｏｒａｄ試験を用いて測定した。
【００６４】
サッカロミセス・セレビシアエの場合、リン酸カリウム（０．０８４Ｍ）、グリセロール（０．２４Ｍ）及び０．８ｍＭ　ＤＴＴを含む培地中にグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼなどの細胞質タンパク質の８０％を遊離させるのに４時間を要することが観察された。
【００６５】
実施例ｂ）　類似の試験を上記と同一の条件下で実施したが、増殖は定常期まで維持した。ａ）で得られた結果と類似の結果が得られた。
【００６６】
実施例ｃ）　クルイベルミセス・ラクチス（２２０９株）をＹＰＬ培地（１０ｇ／ｌ酵母抽出物、２０ｇ／ｌペプトン、２０ｇ／ｌラクトース）中で同一の条件下で培養した。
【００６７】
続いて、ａ）に記載のプロトコールと極めてよく似たプロトコールを実施した。
【００６８】
酵母を培養した後、細胞を、２０００ｇ、５分間遠心することにより培養用培地から分離し、脱イオン水で２回洗浄し、脱イオン水で最終濃度１０９細胞／ｍｌに希釈した。
【００６９】
パルスのパラメータは、以下のように選択した。一連の１５パルス、各パルスは３ｍｓ持続、周波数４Ｈｚ、したがって流速３ｍｌ／分であった。流速は、単にパルスチャンバーの幾何学的特性及びエレクトロパルサーの性能を変更するだけで増大させることができた。
【００７０】
処理直後、懸濁液を抽出用培地中に５倍に希釈した。本例の場合も抽出用培地がインキュベーション用培地である。この培地は、リン酸カリウム（０．１Ｍ）、グリセロール（０．３Ｍ）及びＤＴＴ（１ｍＭ）の濃度の初期バッファを含んだ。抽出用培地中の滞留時間は、約８時間程度であった。抽出を目的としたその後のエレクトロパルシング及びインキュベーションは、周囲温度で実施した。
【００７１】
クルイベロミセス・ラクチスでは、培地（リン酸塩（０．０８４Ｍ）、グリセロール（０．２４Ｍ）及び１．６ｍＭ　ＤＴＴ）中に細胞質β−ガラクトシダーゼを遊離させるのに７〜８時間要することを観察した。
【００７２】
インキュベーション後、遠心により遊離させたタンパク質を含有する液体から細胞を分離した。
【００７３】
実施例ｄ）　同じ条件下で、以下のパルスパラメータで実施例ａ）を再現した：１連の１５パルス、各パルスは３ｍｓ持続、周波数５０Ｈｚ、流速６０ｍｌ／分。
【００７４】
実施例ｅ）　実施例ｃ）を繰り返した。ただし、パルスパラメータは、一連の１５パルス、各パルスは３ｍｓ持続、周波数６Ｈｚ、流速７．２ｍｌ／分とした。
【００７５】
これらのデータを従来の酵母溶解物での結果と比較したところ、ａ）ならびにｂ）、ｃ）、ｄ）及びｅ）については、タンパク質分解性の分解はまったく認められなかったが、他の方法では分解が生じた。酵素の５〜１０％未満が不活性化された。この結果は、現在実験室規模で、または工業的方法において使用されている方法と比較して、電気的方法が優れていることを示している。
【００７６】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）後のプロフィールでは、スメアのない明瞭なバンドが得られ、抽出過程でのタンパク質分解性の分解がないことが確認された。
【００７７】
ａ）ならびにｂ）、ｃ）、ｄ）及びｅ）について、以下のような定量的結果が得られた。
−回収されたタンパク質バランスは、全細胞タンパク質（酵素的細胞溶解または機械的な破壊により得られた）の４５％〜５０％を示した。
−遊離させ、分析された酵素のバランスは、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ及びヘキソキナーゼにおいてその細胞含有量の約８０％〜９０％程度であった。
【００７８】
パルスした細胞からの上清中の酵素の比活性は、機械的な粉砕または酵素的細胞溶解により得られたものよりも１．７〜２倍高かった。しかし、インキュベーションの段階で、回収された機能的酵素が精製されていることが明らかになった。
【００７９】
細菌のエレクトロパルシングによるタンパク質製造の実施例
−培養
大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ、ＢＬ２１）の一晩培養物５０ｍｌをＬＢ培地４５０ｍｌに再懸濁した。培養物を３７℃で２時間撹拌しながらインキュベートした。
【００８０】
培養物の光学濃度は、Ｅ６６０＝０．７であった。これを４０００ｒｐｍで１０分間遠心した。残渣をｍｉｌｌｉＱ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）５００ｍｌ中に再懸濁した。周囲温度（２５℃）で３０分間インキュベートした。
【００８１】
これを４０００ｒｐｍで１０分間遠心し、そして残渣をｍｉｌｌｉＱ水４５ｍｌ中に再懸濁した。２回連続洗浄して、細菌が見出されるべき培地からのイオンの大部分を除去した。
【００８２】
−処理条件
パルスチャンバーは、電極（平行な板でステンレス鋼）間の距離が３ｍｍの０．３ｍｌの容量を有した。
【００８３】
流速は、ペリスタポンプを用いて２．４ｍｌ／分に固定した。
【００８４】
各持続時間が２ｍｓで周波数が３Ｈｚのパルスの一連を連続的に印加した。これは細菌１つ当たり２２パルスの印加に相当する。
【００８５】
ジェネレータの電圧は１５００Ｖに固定し、５ｋＶ／ｃｍの電界強度を与えた。
【００８６】
電気処理をした後、電気処理した細菌懸濁液１００マイクロリットルを０．１０５Ｍ　ＰＢＳバッファ（ｐＨ＝７）４００マイクロリットルに再懸濁した。次いで、その検体を３７℃でインキュベートした。
【００８７】
対照細胞は、同じ方法で処理したが、ジェネレータの電圧は０Ｖに固定した。
【００８８】
５時間インキュベートした後、細胞をエッペンドルフ遠心機で３分間（１３０００ｇ）遠心した。上清中のタンパク質の量を測定した。
【００８９】
−タンパク質測定
次いで、上清中のタンパク質の総量を、比色試験を用いて測定した。
【００９０】
上清１００マイクロリットル、ミリＱ水７００マイクロリットル及びＢｒａｄｆｏｒｄ試薬（Ｂｉｏｒａｄ、米国）２００マイクロリットルの混合物の５９５ｎｍにおける光学濃度を測定することにより検体をアッセイした。
【００９１】
ミリＱ水８００マイクロリットル及びＢｒａｄｆｏｒｄ試薬２００マイクロリットルの混合物を分光光度計の基準とした。
【００９２】
タンパク質の標準範囲は、ウシアルブミン（Ｓｉｇｍａ、米国）を用いて作製した。
【００９３】
その結果、試験検体上清の光学濃度は、０．５７０となり、タンパク質１１．４μｇを与えたが、対照の上清光学濃度は０．１０３となり、タンパク質２．４μｇを与えた。これらの測定条件下で、電気処理後５時間インキュベートすることにより評価された細菌検体から、タンパク質９μｇが抽出された。
【００９４】
タンパク質の量（９μｇ）は、検体の容量、すなわち上清０．１ｍｌ、つまり電気処理された細菌懸濁液２５μｌに相当した。
【００９５】
細菌培養物を機械的、化学的または生物学的に変化させることを目的とした細菌培養物の前処理は何ら施さなかった。
【００９６】
哺乳類細胞のエレクトロパルシングによるタンパク質製造の実施例
−培養
チャイニーズハムスター細胞（ＣＨＯ、ＷＴＴクローン）は、部分的に形質転換された細胞である。この細胞を、細胞の支持体への接着を避けるために静かに撹拌しながらガラスのスピナー型フラスコ中で懸濁状態で３７℃で培養した。培養用培地は、８％ウシ胎児血清（Ｓｅｒｏｍｅｄ）、抗生物質（１００単位／ｍｌ　ペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）及びＬ−グルタミン（０．５８ｍｇ／ｍｌ）を補充したＥａｇｌｅ最小培地、ＭＥＭ０１１１（Ｅｕｒｏｂｉｏ）であった。
【００９７】
−エレクトロパルシング
細胞のエレクトロパスシングの間は、培養用培地をパルス用培地に置き換えた。ＣＨＯ細胞では、パルス用培地の構成は、リン酸バッファ（１０ｍＭ、ｐＨ７．２）、サッカロース（２５０ｍＭ）及びＭｇＣｌ２（１ｍＭ）であった（コンダクタンス１４００μＳ／ｃｍ±２００μＳ／ｃｍ；浸透圧約０．３１７ｏｓｍｏｌ／ｋｇ）。低イオン強度を有するこの等浸透圧性培地は、そのコンダクタンスが低いので、電気パルスに伴うジュール効果が制限される。
【００９８】
細胞を１００ｇで５分間遠心した。その上清を除去し、残渣をパルシング用培地に取った。
【００９９】
１ｍｓの１０パルスで、周波数１Ｈｚで印加される、異なる電界でエレクトロパルスを細胞に与えた。流速は１．２ｍ／分であった。チャンバー内で、電極は０．４ｃｍの電極間距離で離れた２枚の平行な板で構成された。パルスチャンバーの容量は０．２ｍｌであり、電界の方向は、平均の流れの方向に対し垂直であった。
【０１００】
エレクトロパルシングの後、細胞を周囲温度にして細胞膜をその天然の状態に回復させた。細胞懸濁液（１×１０６細胞／ｍｌ）１．５ｍｌを各試験用に回収した。細胞を、周囲温度で１０分間インキュベートし、次いで４℃に置いた。その後、細胞を１００ｇで５分間遠心した（８００ｒｐｍ、Ｃ５００遠心機、Ｊｏｕａｎ）。上清（約１ｍｌ）を取り、４℃で保存した。
【０１０１】
−アッセイ
タンパク質はＢｉｏａｒｄキットを使用してパルス用バッファ中でアッセイした。検量線は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、１ｍｇ／ｍｌ）を用いて同時に作製した。ＢＳＡの希釈溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）を用いて、検量線用の様々な希釈物を調製した。検量線の溶液８００μｌ及び種々のアッセイ検体にＢｉｏａｒｄ試薬２００μｌを追加した。分光光度計を用いて５９５ｎｍでの光学濃度を読んだ。抽出されたタンパク質の総評価量を得た。
【０１０２】
−バランス
電界強度Ｅ（ｋＶ／ｃｍ）の関数としての細胞内タンパク質遊離に関する結果から、１．２５ｋＶ／ｃｍの電界強度では、遊離させたタンパク質の濃度が２５μｇ／ｍｌであり、細胞の５０％が生存していることが示された。生存率は、電気処理の２４時間後にクリスタルバイオレット染色法を用いて評価した。生存率を計測するための培養皿への播種を、同数の細胞で行った（約０．７５×１０６細胞／ｍｌ）。電気処理はしないが連続的に流す処理をした細胞について５９５ｎｍで得られたＯＤに関して、１００％生存率を表した。
【国際公開パンフレット】
2004511257.tif 000002
2004511257.tif 000003
2004511257.tif 000004
2004511257.tif 000005
2004511257.tif 000006
2004511257.tif 000007
2004511257.tif 000008
2004511257.tif 000009
2004511257.tif 000010
2004511257.tif 000011
2004511257.tif 000012
2004511257.tif 000013
2004511257.tif 000014
2004511257.tif 000015
2004511257.tif 000016
2004511257.tif 000017
2004511257.tif 000018
2004511257.tif 000019
2004511257.tif 000020
2004511257.tif 000021
2004511257.tif 000022
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004511257.tif 000023
【国際調査報告】
2004511257.tif 000024
2004511257.tif 000025
2004511257.tif 000026
2004511257.tif 000027
2004511257.tif 000028
2004511257.tif 000029
2004511257.tif 000030
2004511257.tif 000031
2004511257.tif 000032
2004511257.tif 000033
2004511257.tif 000034
2004511257.tif 000035