(57)【要約】本発明は微生物学、特にグラム陰性菌の同定と初期菌数計算に用いる栄養混合物と手順に関連する。この混合物により検出すべき細菌の５つの異なるコロニーの色の発現、および３色の蛍光放出の発現、このようなコロニー周囲に不透明な沈殿物を伴う異なる３色のハローと区域の出現が可能になる。これらの因子により、また培地の色の変化により、高感度で高い特異性レベルでの鑑別が可能になる。混合物には、トリプトファンを多く含有するタンパク分画、遊離トリプトファン、有機塩あるいは無機塩、発色または蛍光放出物質、組成中に１つから２つの層を形成するセルロースおよびヘミセルロースおよび他の成分の特異的な関連性が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
前記の混合物に含まれるグラム陰性菌の同定および早期菌数計算に用いる栄養混合物：
−  混合物全体の２２％から４６％（重量／重量）の量の、トリプトファンを多く含有するタンパク分画あるいは遊離トリプトファンの混合物；
−  混合物全体の１５％から２０％（重量／重量）の量の、選択した有機塩および／もしくは無機塩の混合物；
−  混合物全体の０．３％から３７％（重量／重量）の量の、発色するあるいは蛍光を発する混合物；
−  混合物全体の２％から４．５％（重量／重量）の量の、グラム陽性菌の発育阻止物質；および
−  混合物全体の１５％から５０％（重量／重量）の量の、培地に対し固体の構造を示す物質の混合物。
【請求項２】
トリプトファンを多く含有するタンパク分画の混合物中の前記のアミノ酸含有量が前記の混合物の０．２５％から３．８％である請求項１記載の栄養混合物。
【請求項３】
有機塩および／もしくは無機塩の混合物がＮａＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｎａ２ＣＯ３、とピルビン酸ナトリウムおよびこれらの混合物から選択した塩、好ましくは選択したＮａＣｌとＮａ２ＣＯ３を含有する請求項１記載の栄養混合物。
【請求項４】
有機塩および／もしくは無機塩の混合物が混合物全体に対して次の量（重量／重量）を含有する請求項３記載の栄養混合物：
−  ７％から１８％のＮａＣｌ
−  ６％から１１％のＫ２ＨＰＯ４
−  ２％から５％のＫＨ２ＰＯ４
−  １％から４％の（ＮＨ４）２ＳＯ４
−  ０．１％から０．４％のＮａ２ＣＯ３
−  ０．７％から３％のピルビン酸ナトリウム。
【請求項５】
着色するあるいは蛍光を発する物質の混合物がＸ−ＧＡＬ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、ＭＵＧ（４−メチルウンベリフェニル−β−Ｄ−グルクロニド）、ソルビトールおよびニュートラルレッドからなる群から選択した物質、好ましくはＸ−ＧＡＬもしくはＭＵＧを含有する請求項１記載の栄養混合物。
【請求項６】
着色あるいは蛍光を発する物質の混合物が混合物全体に対して次の量（重量／重量）を含有する請求項３記載の栄養混合物：
−  ０．１６％から０．３６％のＸ−ＧＡＬ
−  ０．１６％から０．１８％のＭＵＧ
−  １５％から３６．５％のソルビトール
−  ０．０９％から０．１１％のニュートラルレッド。
【請求項７】
グラム陽性菌の発育阻止物質がデスオキシコール酸ナトリウムおよび胆汁酸塩である請求項１記載の栄養混合物。
【請求項８】
培地に対して固体の構造を形成する物質の混合物が混合物全体に関して次の組み合わせおよび量（重量／重量）から成る請求項１記載の栄養混合物：
−  ０．１％から０．４％の量のニトロセルロースを含有する１９％から４８％の量のアガロースおよびアガロペクチン（ａｇａｒｏｐｅｃｔｉｎａ）；もしくは
−  ０．１％から０．４％の量のニトロセルロースを含有する１．４％から３％の量のセルロースおよびヘミセルロース；もしくは
−  １９％から４８％の量のアガロースおよびアガロペクチンのみ。
【請求項９】
ｐＨが６．６から７．２である請求項１から８記載の栄養混合物。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかの栄養混合物を、固体化させこれらの物質を含有する微生物あるいは検体に接触させた後、３０℃から４５℃の温度で、１２時間から２２時間インキュベートする、３６０ ｎｍから３６６ ｎｍの紫外線下で蛍光検出法を実施する時一目で前記の微生物の同定が可能である、グラム陰性菌の同定と早期菌数計算の手順。
【請求項１１】
異なる５色のコロニー出現、３色の蛍光放出、３色のハロー、培地の色の変化、およびコロニー周囲の沈殿部分の発現、およびこれらの特徴の組み合わせによって微生物の同定が可能である請求項１０記載の手順。
【請求項１２】
検出する微生物の同定を次のように行なう請求項１１記載の手順：
Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ−青色の蛍光を伴う緑色を帯びた青色のコロニーの発現により同定、また培地は橙色である；
Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ−淡いばら色のコロニー、黄色のハローの発現により同定、また培地の色は橙色である；
Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ（Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ， Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ， Ｅ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）−中心が灰色を帯びた緑色で黄色の蛍光を伴う桃色から赤色のコロニーの発現により同定、また培地は赤色である；
ベロ毒素産生株を除くＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ−淡紫色のコロニーと青色の蛍光の発現により同定、また培地は赤色である；
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７−緑色を帯びた青色のコロニーの発現により同定、また培地はオレンジ色である；
Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ−青色のハローを伴う濃紫色のコロニーの発現により同定、また培地は赤色である；
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ−淡紫色のコロニーの発現により同定、また培地は赤色である；
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ−赤色のコロニーの発現により同定、また培地は赤色で不透明の沈殿を伴う；
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ“ｎｏ ｔｙｐｈｉ”−赤色のコロニーの発現により同定、また培地は赤色である；２４時間のインキュベーション後中心部の色は黄色になり、黄色の蛍光を発する；
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ−２４時間のインキュベーションの前に淡いばら色のコロニー、緑色を帯びた蛍光の発現により同定、また培地は橙色である；２４時間のインキュベーション後では緑色を帯びた褐色のコロニーと緑色を帯びた周囲の区域、緑色を帯びた蛍光の発現により同定；
Ｐｒｏｔｅｕｓ， Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ， Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓおよび他のグラム陰性菌−無色あるいは透明なコロニーの発現により同定、培地は橙色。
【請求項１３】
着色するあるいは蛍光を発する混合物の唯一の成分としてＸ−ｇａｌおよびＭＵＧを用いる場合、緑色を帯びた青色のコロニーによって、特にＥ．ｃｏｌｉでは青色の蛍光によって、大腸菌群全体の同定を行なう請求項１０記載の手順。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術部門）
本発明は微生物学、特に同定に用いる栄養混合物と手順の領域、およびグラム陰性菌の鑑別と初期菌数計算の領域に関連する。
【０００２】
例えばＥ．ｃｏｌｉおよび大腸菌群のような標的微生物の検出と菌数計算の種々の方法は様々な製品（水、食料品等）の微生物学的品質管理のために広範囲に用いられる。それにもかかわらず、最も簡単で有効な手順を見出すために研究が続けられている。
【０００３】
通常、生化学的特徴はグラム陰性菌の特定の属にのみ起因するということはほとんどないと考えられており、したがって正確な鑑別を行なうためには種々の適切な試験セットの利用が必要である。
【０００４】
実際に、種々の群のグラム陰性菌を検出し鑑別するための広範囲の培養法が知られている；一部の培養法は定性的な方法であり他の培養法は定量的な方法である。
【０００５】
バイオレットレッド胆汁寒天培地はグラム陰性菌の発育を阻止する胆汁酸とクリスタルバイオレットを組み込んでいる
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この培地は乳糖、およびｐＨ指示薬として、ニュートラルレッドも含有する。大腸菌群は培地上で発育し乳糖を発酵させる。ニュートラルレッドはコロニーおよび培地の周囲を非常に濃い赤色に発色させる。例えば乳糖を添加したＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｇｒｅｅｎ Ｂｒｏｔｈ（ブリリアントグリーン培養液）内での培養あるいはＥｏｓｉｎｅ Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｂｌｕｅ Ａｇａｒ（エオシンメチレンブルー寒天培地）内での画線接種のようなＥ．ｃｏｌｉおよび大腸菌群の確実な鑑別のために別の検証的試験が必要である。
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とはいっても４８時間の検体のインキュベーション後まで試験結果は判明しないが。
【０００６】
他方、この属の少なくとも２つの生化学的特徴を利用し、コロニーと培地が発色するあるいは発色しないことにより鑑別する、一群の固形Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ検出用培地が知られている。それらの例をあげると：デスオキシコール酸クエン酸寒天培地、Ｈｅｋｔｏｅｎ Ｅｎｔｅｒｉｃ寒天培地Ｓ．Ｓ．（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ， Ｓｈｉｇｅｌｌａ）寒天培地、ＸＬＤ（Ｘｙｌｏｓｅ−Ｌｙｓｉｎｅ Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ Ａｇａｒ；キシロースリジンデオキシコール酸）寒天培地、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ寒天培地およびＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｇｒｅｅｎ寒天培地
2004501654.tif 000004
がある。
【０００７】
これらの培地には通常グラム陽性菌および一部のグラム陰性菌の発育阻止物質、例えば胆汁酸塩、クエン酸ナトリウムおよびブリリアントグリーンが含まれる。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ検出はチオ硫酸ナトリウムと鉄塩の存在下で一つ以上の炭水化物を発酵させ硫化水素を発生する能力による。実際にいくつかの種（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ， Ｐ．ｍｉｒａｖｉｌｉｓ， Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）が、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの特徴である、中心部が黒色で無色のコロニーを形成する可能性があるため、これらの培地が非常に特異的であるというわけではない。さらに、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株によるＨ２Ｓ産生は常に起こるするわけではなく、この生化学的反応に影響を与える可能性のある培地のｐＨおよびコロニー周囲における酸素濃度のような種々の因子によって起こる。
【０００８】
１９９３年に、Ａｌａｉｎ Ｒａｍｂａｃｈは、βガラクトシダーゼにより加水分解され、プロピレングリコールの分解が起こる結果、青色に着色する色素産生性の基質の使用が含まれる、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの同定に用いる培地の特許権を得た（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５ １９４ ３７４）。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ検出用のこの培地で行なわれる主要な生化学的試験はプロピレングリコール発酵から成り、ｐＨ指示薬のニュートラルレッドの色調変化により肉眼で検出する。
【０００９】
本製品では、大腸菌群およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｎｏｎ−ｔｙｐｈｉのみをＰｒｏｔｅｕｓおよび他のグラム陰性菌と鑑別できる。さらに、実際には９％のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株がβ−ガラクトシダーゼの活性を示し、およそ３０％がプロピレングリコールを発酵させない可能性がある（Ｋａｌｕｚｅｗｓｋｉ ｙ Ｔｏｍｃｚｕｋ， Ｍｅｄ． Ｄｏｓｗ． Ｍｉｋｒｏｖｉｏｌ．， １９９５， ４７： １５５−１６８）。
【００１０】
Ｒｏｔｈおよび共同研究者は、著者が基質を別の色素産生性群に適用するＥ．ｃｏｌｉおよび大腸菌群の同定と菌数計算に用いる培地と手法を提案したＵ．Ｓ．ＰａｔｅｎｔＮｏ．５３９３ ６６２の承認をうけた。この培地ではＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａおよび他の大腸菌型エンテロバクターの同定および菌数計算はできない。一方、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉはＥ．ｃｏｌｉと同色の特徴をもつコロニーを発育させるため、偽陽性を示す。
【００１１】
１９９５年に、微生物学的解析に用いる手法として、またＳａｌｍｏｎｅｌｌａ 検出に用いる培地として、Ｍｏｎｇｅｔらの特許申請が承認された。この手法はグルクロン酸あるいはその塩を発酵させ、またβガラクトシダーゼを産出しない特別な能力に基づいている。前記の培地には栄養素、さらにβ−ガラクトシダーゼ、グルクロン酸もしくはその塩に対する蛍光を発する基質または色素産出性の基質およびｐＨ指示薬が含まれる。またこの培地には、他のグラム陰性菌を検出する能力を制限し、微生物の計数のための培地を使用不可能にするｎｏｎ−Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属の発育阻止物質が含まれる（ブリリアントグリーンとデスオキシコール酸ナトリウム）この培地には滅菌後の栄養補給剤としてグルコン酸ナトリウムが含まれる。Ｄｅｎｉｓと共同研究者によれば、この培地の特異性は９３．３％で、一方他の旧式のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ検出用培地（Ｈｅｋｔｏｅｎ Ｅｎｔｅｒｉｃ Ａｇａｒ）における特異性は約８５．３％である
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【００１２】
ＲａｍｂａｃｈはＥ．ｃｏｌｉの腸管出血性株の検出に用いる培地およびその手法の特許を申請した（ＷＯ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９７／３９１０３）。本発明はＥ．ｃｏｌｉの、特にＯ−１５７および／もしくはＯ−１１抗原型の鑑別に用いる選択培地から成る。培地にはα−ガラクトシダーゼの色素産出性基質が含まれる。この手法の鑑別能力を高めるために、特に非常に多くの大腸菌群に特徴的なβ−グルコシダーゼと、Ｏ−１５７およびＯ−１１抗原型群を除くＥ．ｃｏｌｉに特徴的なβ−グルクロニダーゼの別の色素産出性基質を追加した。しかしながら、この培地は他のグラム陰性菌の鑑別を可能にしたわけではなく、他方一部のＥ．ｃｏｌｉとＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ株は偽陽性の結果となる可能性がある（ＷａｌｌａｃｅおよびＪｏｎｅｓ， Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １９９６， ８１： ６６３−６６８）。
【００１３】
Ｒｏｔｈおよび共同研究者は、１９９８年３月Ｕ．Ｓ． ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，７２６，０３１の特許の承認をうけた。この特許には試験検体中の生物学的物質の同定と鑑別に用いる試験培地および定量的手法について記載されている。この手法は最初の生物学的物質に特異的で、最初の色を発する色素産出性基質の利用から成る；二番目の生物学的物質に特異的であり、二番目の色と三番目の生物学的物質を産出する他の色素産出性基質がこれらの基質を分解することができる。最初と二番目の生物学的物質は一つの糖を分解することができ、三番目の生物学的物質はこの糖を分解しない。さらに、培地の組成には、糖が分解された場合色素産出性基質により発色するコロニー周囲の培地の色を変化させるｐＨ指示薬が含まれる。
【００１４】
主な成分は６−クロロ−３−インドリルガラクトシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルグルクロニド、ソルビトールおよびフェノールレッドである。他の化合物は胆汁酸塩、ラウリル硫酸ナトリウム、デスオキシコール酸ナトリウム、ポリグリコールエーテル、抗生物質およびアクリフラビン誘導体である。
【００１５】
培地にはその組成中に酵素反応の誘導質、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドが含まれるべきである。
【００１６】
他のゲル化剤の中では、寒天、ペクチン、カラゲエニン、アルギン酸塩、キサンチンおよびペプトンが含まれる。この原型は本発明に最も近いと考えられ、不都合な点について次に示す。
−  この培地はＥ．ｃｏｌｉ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ−１５７：Ｈ７および大腸菌群の同定と計数を可能にするが、Ｐｒｏｔｅｕｓのような、他のグラム陰性菌に対して起こるように白色に発色するため、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの適切な同定を行なうことは困難であり、一部の株では不可能でさえある。共存する別の種では、培地の酸性化によって産出されるため、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに特徴的な、コロニーの周囲に黄色い区域の存在を検出することは、困難である。
−  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉはｎｏｎ−ｔｙｐｈｉと鑑別できない。
−  大腸菌群は培地内で鑑別できず、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａのような非常に重要な病原体のさらなる同定に用いる他の別な鑑別用倍地を適用する必要がある。
−  この培地はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓのような非大腸菌群グラム陰性菌の同定と菌数計算を可能にはしない。
−  用いられた手法は微生物の同定および菌数計算を実施するために２４時間から４８時間必要であり、そのためにこの手法は旧式の培養法と同じくらい時間がかかる。
−  この培地の組成はドデシル硫酸ナトリウム、アクリフラビンおよび／もしくは抗生物質を含有することによってさらに複雑で、高価でまた不安定になった。このことは、これらの物質に熱感受性があり、粉末の脱水された製剤に加えることができないため、主に栄養補助剤として添加される抗生物質の存在によって起こる。
−  発育促進成分は、それ自身の力だけでは、微生物の同定を可能にする反応の初期発現（２４時間前）を可能にするには十分ではない。この培地はＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄ）のようなβ−ガラクトシダーゼ誘導質が必要な場合さえある。
−  この手法は旧式の手法で確立された４４℃よりむしろ４０℃まで反応が起こるようにする。このためには日常的に使用される設備あるいは技術に関して新しいパラメーターを確立することが必要である。
−  日常的に用いられる微生物学的手順では４０℃のインキュベーション温度を想定していないため、公式の手法としてこの手法の包括的認可および承認が必要である。
【００１７】
（発明の開示）
本発明の目的はグラム陰性菌の同定と初期菌数計算に用いる栄養混合物および手順を提供することから成る。
【００１８】
本発明の新案は、グラム陰性菌の同定と早期菌数計算に用いる栄養混合物を供給すること、および前記の混合物を使用する手順から成る。その手順は可視光で少なくとも５つの異なる色の発現を前提とし、コロニー内に３種の蛍光色を発することである；３つの異なる色のハローと前記のコロニー周囲における沈殿物の区域および／もしくはこれらすべての要素と培地における色の変化の組み合わせ。
【００１９】
新しい要素は十分な量のトリプトファンの供給に寄与する。この必須アミノ酸は有意な数の代謝反応に関与し、同定の手順の根拠として役立つ。有機塩および無機塩との関連性、および色および／もしくは蛍光を発する物質との関連性を考慮して、これらの量を決定する。この混合物の目的は明確な反応を初期に出現させることである。いくつかの標的細菌がはっきりしない色を発する場合、あるいは以前には報告されていない色の蛍光を発する場合、あるいははっきりしない色のコロニーの周囲に濃い区域を認める場合、新しい予期しない要素が立証された。例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ（灰色を帯びた緑色のコロニーの中心部分および黄色の蛍光）、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ（青色のハローを伴う濃紫色のコロニー）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｎｏｎ ｔｙｐｈｉ（２４時間後に中心部に黄色の蛍光）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ（透明の沈殿物を伴うコロニー周囲の帯状部分）である。
【００２０】
混合物の成分間の関連性は試験的方法で確立され、また新規の混合物が正当化される要素を構築する。この化合物の関連性は以前には報告されていない。
【００２１】
本発明には次のような利点がある：
−  調製した混合物の存在下でのみ標的細菌の完全な同定および鑑別が可能であり、追加の試験あるいは培地は必要ではない。
−  組成にはグラム陰性菌の発育阻止物質は含まれていないため、その発育を可能にし、またＥ．ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｋｏｍｏｎａｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａのような臨床的および／もしくは衛生的に重要な種の同定とＥ．ｃｏｌｉおよび大腸菌群の菌数計算を可能にする。
−  同定は同時に起こる種々の反応と組合せて実施するため、混合物により種々の細菌の同定が確実に実施できる。これらの反応はこれらの細菌の代謝的特異性に基づいており、混合物の適切な化合物の比率により起こる。これらの反応の一部は初めて報告され、中心部が灰色を帯びた緑色でばら色から赤色のコロニーとして発現するＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ（Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ， Ｅ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ， Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ）、および赤色から黄色の中心部をもつ赤色として発現するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｎｏｎ−ｔｙｐｈｉの場合のように、新しい知見として考慮される可能性がある。この二つの属は黄色の蛍光を発する（２４時間のインキュベーションの後）。これらの特徴により細菌の明確な同定が可能になる。
−  この組成により広範囲のグラム陰性菌の同定および初期菌数計算が可能になる。これはＥ．ｃｏｌｉの同定、Ｓａｌｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉのｎｏｎ−ｔｙｐｈｉとの鑑別、および衛生関連の大腸菌群とＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓのような他の非大腸菌群グラム陰性菌の鑑別を可能にする。これらすべての細菌は同様の一つの手順により同じ培養皿内において最長２２時間で鑑別が可能である。
−  同定は、コロニーの異なる５つの色、異なる３色の蛍光、コロニーの周囲に異なる３色のハロー、およびコロニーの周囲の不透明の沈殿物の区域の発現を組み合わせて視覚化することによって行なう。培地の色の変化はあまり重要ではなく、あるいはＳｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ−１５７：Ｈ７、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのようないくつかの属の同定には全く役に立たない可能性がある。この事実は種々の細菌に汚染された検体中における種々の微生物の同定を誤る危険性を低下させるものである。
−  この組成は調製が非常に簡単で、オートクレーブの必要もなく、検体汚染の危険性を増大させる栄養補助物質の添加の必要もない。
−  オートクレーブ内での滅菌をさけることにより、栄養物および発育因子はより良い条件で保存、この組成のｐＨはさらに安定なまま保たれる。
−  主にトリプトファン含有量の多い、混合物に組み込まれた栄養物および発育因子は、ほとんどの場合２２時間前に、製剤の絶対量が初期に生化学的反応および色素産生性の反応が起こる根拠となりうるという関連性をもっている。
−  混合物層の形を一定のものにする、固体の成分の性質によりコロニー周囲に蛍光放出を集中させることが可能になり、また培養皿の残りの部分に拡散することもなくなる。蛍光が培地の表面に拡散しないため、混合物により蛍光を発する細菌の菌数計算が確実に実施できる。
−  グラム陽性菌発育阻止物質、その絶対量および他の成分との関連性を選択することにより、標的細菌の適切な発育を可能にし、一方グラム陽性菌の全発育阻止（発育なし）が起こる。
−  反応の指示薬あるいは顕色剤を添加した第三層を培養皿の一部分の組成に加えた場合、酵素反応に関わる広範囲の物質、前駆体あるいは基質により他の反応が起こり、また他のグラム陰性菌のさらなる同定が可能になる。
−  混合物の鑑別上の特異性は試験細菌に対して１００％であり、解析感度は透過率の５０％まで標準化した懸濁液から開始して１０−６ＣＦＵ／ｍＬ（ＣＦＵ：ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔコロニー形成単位）に達した。
−  栄養物と発育阻止物質との間のバランスにより、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａのように通常２４時間後の発育した細菌に対してさえも、標的細菌の初期同定および高度発育を可能にする。
−  同定および鑑別が細菌の形態学的特徴に基づいていないことから、専門外の職員によって容易に結果を解析できる。
【００２２】
（発明の詳細な開示）
本発明はグラム陰性菌の同定および初期菌数計算に用いる栄養混合物を提供する。その栄養混合物には次の必須成分が含まれる：
−  混合物全体の２２％から４６％（重量／重量）の量の、トリプトファンを多く含有するタンパク分画あるいは遊離トリプトファンの混合物；
−  混合物全体の１５％から２０％（重量／重量）の量の、選択した有機塩および／もしくは無機塩の混合物；
−  混合物全体の０．３％から３７％（重量／重量）の量の、発色するあるいは蛍光を発する物質の混合物；
−  混合物全体の２％から４．５％（重量／重量）の量の、グラム陽性菌の発育阻止物質；および
−  混合物全体の１５％から５０％（重量／重量）の量の、培地に対し固体の構造を形成する物質の混合物。
【００２３】
個々の混合物の成分の割合は、あらかじめ決定した範囲内で、調製する栄養培地によって変化する。本発明の栄養混合物において、トリプトファンを多く含有するタンパク分画の混合物中のアミノ酸であるトリプトファン含有量は前記の混合物の０．２５％から３．８％である。
【００２４】
本発明の混合物にはまたＮａＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｎａ２ＣＯ３、とピルビン酸ナトリウムおよびこれらの混合物からなる群から選択した、好ましくはＮａＣｌと Ｎａ２ＣＯ３を選択した、有機塩および／もしくは無機塩の混合物が含まれる。
【００２５】
有機塩および／もしくは無機塩の前記の混合物中には混合物全体に対して次の量（重量／重量）を含有する：
−  ７％から１８％のＮａＣｌ
−  ６％から１１％の Ｋ２ＨＰＯ４
−  ２％から５％のＫＨ２ＰＯ４
−  １％から４％の（ＮＨ４）２ＳＯ４
−  ０．１％から０．４％のＮａ２ＣＯ３
−  ０．７％から３％のピルビン酸ナトリウム。
【００２６】
本発明の栄養混合物の他の成分は、Ｘ−ＧＡＬ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、ＭＵＧ（４−メチルウンベリフェニル−β−Ｄ−グルクロニド）、ソルビトールおよびニュートラルレッドからなる群から選択した、好ましくはＸ−ＧＡＬもしくはＭＵＧを選択した、着色するあるいは蛍光を発する物質の混合物である。混合物は、これらの物質を混合物全体に対して次の量（重量／重量）含有する：
−  ０．１６％から０．３６％のＸ−ＧＡＬ
−  ０．１６％から０．１８％のＭＵＧ
−  １５％から３６．５％のソルビトール
−  ０．０９％から０．１１％のニュートラルレッド。
【００２７】
他方、混合物にはグラム陽性菌の発育阻止物質も含まれ、それらのうちデスオキシコール酸ナトリウムおよび胆汁酸塩が利用できる。
【００２８】
最後に、微生物が試験用に発育した場合、本発明の栄養混合物には培地に対して固体の構造を形成する物質の混合物が含まれ、それは混合物全体に対して次の組み合わせおよび量（重量／重量）から成る可能性がある。
−  ０．１％から０．４％の量のニトロセルロースを含有する１９％から４８％の量のアガロースおよびアガロペクチン；もしくは
−  ０．１％から０．４％の量のニトロセルロースを含有する１．４％から３％の量のセルロースおよびヘミセルロース；もしくは
−  １９％から４８％の量のアガロースおよびアガロペクチンのみ。
【００２９】
一度調製した本発明の栄養混合物はｐＨが６．６から７．２である。
【００３０】
本発明の他の特徴はグラム陰性菌の同定および初期菌数計算の手順を提供することである。その場合、固体化させこれらの物質を含有する微生物あるいは検体に接触させた栄養混合物を、３０℃から４５℃の温度で、１２時間から２２時間インキュベートする。それによって３６０ ｎｍから３６６ ｎｍの紫外線下で蛍光検出法を実施する時、一目で前記の微生物の同定が可能である。
【００３１】
本発明の手順は、異なる５色のコロニー出現、３色の蛍光放出、３色のハロー、培地の色の変化、およびコロニー周囲の沈殿区域の発現、およびこれらの特徴の組み合わせによって微生物の同定を可能にする。
【００３２】
本発明の手順を用いて、検出する微生物の同定を次のように行なう：
Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ−青色の蛍光を伴う緑色を帯びた青色のコロニーの発現により同定、また培地は橙色である；
Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ−淡いばら色のコロニー、黄色のハローの発現により同定、また培地の色は橙色である；
Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ（Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ， Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ， Ｅ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）−中心が灰色を帯びた緑色で黄色の蛍光を伴う桃色から赤色のコロニーの発現により同定、また培地は赤色である；
ベロ毒素産生株を除くＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ−淡紫色のコロニーと青色の蛍光の発現により同定、また培地は赤色である；
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７−緑色を帯びた青色のコロニーの発現により同定、また培地はオレンジ色である；
Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ−青色のハローを伴う濃紫色のコロニーの発現により同定、また培地は赤色である；
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ−淡紫色のコロニーの発現により同定、また培地は赤色である；
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ−赤色のコロニーの発現により同定、また培地は赤色で不透明の沈殿を伴う；
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ“ｎｏ ｔｙｐｈｉ”−赤色のコロニーの発現により同定、また培地は赤色である；２４時間のインキュベーション後中心部の色は黄色になり、黄色の蛍光を発する；
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ−２４時間のインキュベーションの前に淡いばら色のコロニー、緑色を帯びた蛍光の発現により同定、また培地は橙色である；２４時間のインキュベーション後では緑色を帯びた褐色のコロニーと緑色を帯びた周囲の区域、緑色を帯びた蛍光の発現により同定；
Ｐｒｏｔｅｕｓ， Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ， Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓおよび他のグラム陰性菌−無色あるいは透明なコロニーの発現により同定、培地は橙色。
【００３３】
本発明の手順における個々の具体例として、着色するあるいは蛍光を発する混合物の唯一の成分としてＸ−ＧＡＬおよびＭＵＧを用いる場合、緑色を帯びた青色のコロニーによって、特にＥ．ｃｏｌｉでは青色の蛍光によって、大腸菌群全体の同定を行なう。
【００３４】
栄養混合物を同じものにするために次の操作を実施する；
２２％から４６％（重量／重量）までの量の、トリプトファンを多く含有するタンパク分画あるいは遊離トリプトファンを供給する物質は、乾燥重量で０．２５％から３，８％のこのアミノ酸を含むべきであることを考慮しながら、三角フラスコ中で重量を測定する。このフラスコにはほんのわずかの栄養混合物が存在するはずである。
【００３５】
続いて有機塩および無機塩の重量を測定し、栄養混合物の乾燥重量で１５％と２０％の間の量で前記の混合物を加えた。有機塩および無機塩のこの群は脱水された栄養混合物の重量で次のように選択する。量：７％から１８％のＮａＣｌ、６％から１１％の Ｋ２ＨＰＯ４、２％から５％のＫＨ２ＰＯ４、１％から４％の（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％から０．４％のＮａ２ＣＯ３および０．７％から３％のピルビン酸ナトリウム。
【００３６】
その後グラム陽性菌の発育阻止物質の重量を測定し、２％から４．５％の量を加える。発育阻止物質のうちデスオキシコール酸ナトリウムと胆汁酸塩を用いることができる。
【００３７】
別に、解析上の計量においては、着色するあるいは蛍光を発する物質の前混合物の重量を０．３％から３７％の量で測定する。
【００３８】
前混合物は、栄養混合物の乾燥重量で、１５％から３６．５％のソルビトール、０．１６％から０．１８％のＭＵＧ、０．１６％から０．３６％のＸ−ＧＡＬおよび０．０９％から０．１１％のニュートラルレッドを含有すべきである。
【００３９】
前記の成分すべては３．５％から６．５％の溶液濃度でｐＨ範囲が６．６から７．２の均一の溶液を得るために蒸留水あるいは脱イオン水を加えて十分に攪拌する。
【００４０】
最後に調製した溶液をアガロースおよびアガロペクチンに加え、および／もしくは種々の形のセルロースとヘミセルロース混合物によって形成された構造の上に注ぐ。
【００４１】
最初の混合物のアガロースおよびアガロペクチンを調製された溶液に加える場合、形成された懸濁液を攪拌し少なくとも１５分間浸す。その後沸騰するまで加熱し、約４５℃まで冷却し最後の試験容器内に分配する。その容器内の混合物は２０−３０分間室温で固体化する。湿気が蓄積する場合、接種に進む前に容器を無菌状態で乾燥すべきである。
【００４２】
セルロースおよびヘミセルロース混合物を用いる場合、最初に滅菌すべきである（１２１℃で１５分間湿った蒸気で、あるいはエチレンオキサイドで、あるいはＸ線照射の方法で）。その後最後の試験容器を配置しあらかじめ調製した２ ｍＬから４ ｍＬの溶液を加える。
【００４３】
両方の場合に、標的細菌のコロニー発現に必要な固体表面を形成するためにあるいは特異的な反応を示すために、ニトロセルロースによってもしくは／およびセルロースアセテートのような他のセルロース誘導体によって形成された他の層を接種の後だけでなく接種中も配置すべきである。
【００４４】
試験検体を別の画線接種あるいは希釈接種法により接種し、Ｅ．ｃｏｌｉの検出の間少なくとも６時間、好ましくは１２時間から２２時間および他のグラム陰性菌の鑑別では１８時間から２２時間、３３℃から４５℃で接種することが可能である。
【００４５】
分離したコロニーと培地の色、コロニー周囲の不透明の沈殿物と着色した区域（ハロー）、蛍光放出の存在と色を観察することにより結果の分析を行ない、またコロニーの形態を観察することも可能である。
【００４６】
種々のグラム陰性菌の分離したコロニーを次の表１のように観察する。
表１．コロニーおよび培地の特徴
【表１】
2004501654.tif 000006
【００４７】
グラム陰性菌の種々の株は、インキュベーション時間によって、５ ｍｍの直径に達するコロニーを発現する。
【００４８】
（例）
例Ｎｏ．１：グラム陰性菌株の鑑別に用いる栄養混合物の組成は次のとおりである（表２）
表２．混合物の組成
【表２】
2004501654.tif 000007
【００４９】
４８ ｇのこの混合物を脱イオン水または蒸留水１Ｌ中に懸濁した。
【００５０】
この検定法ではあらかじめ決定された生化学検査に関してＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａにおける種々の株の性質についての検査を実施した。
【００５１】
得られた結果（表３）
表３．混合物中の発育の結果は次の通りである
【表３】
2004501654.tif 000008
【００５２】
３５±２℃で２４時間インキュベートした後、Ｋｏｖａｃｓ試薬に注入したセルロースの薄層を容器のふたに置いた。インドール産生性微生物を接種した容器内には、セルロース層の色が３０分の間隔でピンク色に変化した。
【００５３】
例Ｎｏ．２
栄養混合物は例１に記載した組成に従って調製したが、トリプトファンの含有量の多いタンパク分画は次の通りであった（表４）
表４．例２に記載した混合物の組成
【表４】
2004501654.tif 000009
【００５４】
ＡＴＣＣコレクションから得られた種々の細菌の接種は分離したコロニーを得るために表面に画線接種する手法によって行なわれた。
【００５５】
この結果の分析は、６、１１、１９および２４時間のインキュベーションにおいて行ない、結果を次に示している（それぞれ表５，６，７及び８）
表５．６時間のインキュベーションにおける発育
【表５】
2004501654.tif 000010
表６．１１時間のインキュベーションにおける発育
【表６】
2004501654.tif 000011
表７：１９時間のインキュベーションにおける発育
【表７】
2004501654.tif 000012
表８：２４時間のインキュベーションにおける発育
【表８】
2004501654.tif 000013
【００５６】
他のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株から得られたこの種の鑑別の際、別の特徴を示す、Ｓ． ｔｙｐｈｉのコロニー周囲の培地に不透明な沈殿物形成が起こるという事実に注目した。
【００５７】
続いて、栄養混合物（ｅｘｐとして次のように確認した）の同様の製剤を、選択した１０−６希釈の試験用細菌懸濁液（５０％の透過率に標定した）に接種した。
【００５８】
微生物は、ＭＵＧを添加したＥＣ Ｂｒｏｔｈ内で、寒天（１３ ｇ／Ｌ）とＸ−Ｇａｌを加えて、同時に検定し、標準混合物（Ｃ）と名づけた。
【００５９】
６、１２、１９、２４および４０時間のインキュベーション後に発育結果の観察を行なった（表９、表１０、表１１）。
表９．６時間のインキュベーションにおける発育
【表９】
2004501654.tif 000014
表１０．１２時間のインキュベーションにおける発育
【表１０】
2004501654.tif 000015
表１１．１９時間のインキュベーションにおける発育。結果は次の通りである。
【表１１】
2004501654.tif 000016
【００６０】
意外なことに、Ｅ． ａｅｒｏｇｅｎｅｓおよび Ｅ． ｃｌｏａｃａｅでは、他の大腸菌群とは異なる形態で、コロニーの中央と境界に鑑別できる色を示した。
【００６１】
（２４時間のインキュベーション後の発育）
コロニーの数は変化せず、コロニーの中心部の青色はさらに濃くなった。
【００６２】
（４０時間のインキュベーション後の発育）
赤色は消失し、青色は大腸菌群に目立ち、赤色のＳａｌｍｏｎｅｌｌａコロニーは黄色に変化した。
【００６３】
（例Ｎｏ．３）
２種の株に関する発育曲線解析により、種々の大腸菌型細菌発育活性化物質、発育阻止物質およびトリプトファンの含有量が多いタンパク分画の種々の組み合わせによる影響についての試験が実施された：
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ １０５３６
Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ ２９２１２
【００６４】
同時にＭＵＧ（Ｄｉｆｃｏ）を添加したＥＣ Ｂｒｏｔｈを接種した。
【００６５】
種々の試験因子として用いた試験製剤（ＭＮ）は表１２に示した。
表１２．例３による組成
【表１２】
2004501654.tif 000017
【００６６】
得られた結果は添付文書の図１と２に示している。
【００６７】
図１に示したように、標準混合物に比較して、ＭＮ３栄養混合物内でのみＥ．ｃｏｌｉの発育速度が小さく、一方ＭＮ２変異株では３時間のインキュベーションで発育がより促進される。６時間のインキュベーションでは、実際にＭＮ混合物を除いて変異株間で発育促進に関して相違はない。
【００６８】
図２では、本発明で提案した全組成において、標準鑑別用培地に比較してＳｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ株ではより阻害作用が強いことを示している。
【００６９】
（例Ｎｏ．４）
この試験では表１３に示した組成を用いた。
表１３．例４による混合物
【表１３】
2004501654.tif 000018
【００７０】
この試験では、接種の際拡散平板培養を用いた。
【００７１】
すべての容器は３５℃で２４時間インキュベートした。
【００７２】
大腸菌群の１０−６希釈懸濁液、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２とＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ １３０４８、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ ２９２１２の１０−１希釈懸濁液を接種した。
【００７３】
寒天（１３．０ ｇ／Ｌ）を加えたＭＵＧ（Ｄｉｆｃｏ）添加ＥＣ Ｂｒｏｔｈを標準培地として用い、「対照」（Ｃ）と名づけた。
【００７４】
次の結果（表１４）が得られた。
表１４．試験混合物および対照混合物における微生物の発育結果
【表１４】
2004501654.tif 000019
【００７５】
試験栄養混合物のコロニーの大きさは軽度に増大しているが、試験変異株とＭＵＧ（Ｄｉｆｃｏ）添加ＥＣ Ｂｒｏｔｈとの間のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２ ＣＦＵの菌数に有意な差（ｐ＜０．０５）は認められない。Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ １３０４８コロニー数は試験変異株でより高いが；それにもかかわらずそれらの間の有意な差は認められない（ｐ≒０．０６）。
【００７６】
意外なことに、Ｅ． ａｅｒｏｇｅｎｅｓはコロニーの中心部と辺縁に異なる着色が認められ、黄色の蛍光により確認が可能であった。
【００７７】
他方、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ ２９２１２はすべての試験変異株で完全に阻害された（微生物は７２時間インキュベートした）。
【００７８】
続いて貯水タンクから採取した１０ ｍＬの飲料水の検体を同様の栄養混合物変異株内に接種した（表１５）
表１５．飲料水の検体中の発育の検出
【表１５】
2004501654.tif 000020
【００７９】
推定による大腸菌群の特徴をもつコロニーの菌数計算のみを実施した。実施した生化学的検査（次に示す）によって分離されたコロニーはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ 属に属することが立証された。
試験                              結果
クエン酸利用                        ＋
リジン脱カルボキシル化              ＋
オルニチン脱カルボキシル化          ＋
アルギニン脱カルボキシル化          −
Ｋｌｉｇｌｅｒ鉄寒天                  Ａ／Ａ ガス＋Ｈ２Ｓ−
ウレアーゼ                          −
固有運動性                          ＋
インドール産生                      −
メチルレッド                        −
フォーゲス・プロスカウエル反応      ＋
【００８０】
初期の培養が進むように、寒天（１３ ｇ／Ｌ）およびＸ−ＧＡＬ（１．０ ｇ／Ｌ）を加えた栄養混合液と標準培地（Ｄｉｆｃｏ）の試験変異株間で、コロニー数の有意な相違は認められない（ｐ＜０．０５）。
【００８１】
例Ｎｏ．５：例Ｎｏ．４と同様の栄養混合液を調製したが、トリプトファン含有量の多いタンパク分画の全量を乾燥重量の４０．４％、３７．７％または３４．８％に確定した（それぞれＶ１、Ｖ２およびＶ３）。
【００８２】
３種の変異株はアガロースおよびアガロペクチン混合物を加えた場合と加えない場合で試験が行なわれた。最初の３種の変異株に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２とＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＡＴＣＣ １４０２８を拡散平板法を用いて接種した。
【００８３】
この試験では次の結果が得られた（表１６）
表１６．試験混合物内における種々の細菌の発育
【表１６】
2004501654.tif 000021
【００８４】
全変異株に対して実施されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ １３０４８とＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＡＴＣＣ １４０２８のコロニー数計算値は類似していた（ｐ＞０．０５）。
【００８５】
同時に、アガロースおよびアガロペクチンの混合物を含まない３種の変異株はグラム陰性菌（正の制御）とグラム陽性菌（負の制御）の発育曲線解析に利用した。使用された標準培地はＤｉｆｃｏから入手したＭＵＧ添加ＥＣ Ｂｒｏｔｈであった。
【００８６】
意外なことに、６時間のインキュベーションでは、３種の試験変異株のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ １３０４８とＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＡＴＣＣ １４０２８株の発育速度（吸収）は標準培地に比較して有意に大きかった（ｐ＜０．０５）。一方、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ ２９２１２株の発育阻止（負の制御）は本発明と同じ変異株で有意に大きかった（図３−６）。
【００８７】
例Ｎｏ．６
ニュートラルレッドおよびＭＵＧの二重直線的濃度により、例Ｎｏ．５のＶ２変異株として栄養混合物を調製した。アガロースおよびアガロペクチン混合物は、標的細菌のコロニー（ｅｘｐ）の発現に対して固体の構造を形成するためにセルロースとヘミセルロースの混合物で代用した。前記のすべての成分は栄養混合物の最初の層を形成する。
【００８８】
微生物を１０−６希釈した懸濁液のうち１ ｍＬを膜透過法を用いて接種した；Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａの個々の属を代表する１０−５希釈のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＡＴＣＣ １３８８３および１０−１希釈のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ２５９２３（負の制御）懸濁液。濾過を行なうために、栄養混合物の別の層として配置したニトロセルロース支持体を用いた。
【００８９】
同時に、バイオレットレッド胆汁酸寒天培地を拡散平板法により接種した（Ｃ）。１８時間のインキュベーションでの試験の結果は表１７に示している。
表１７．例６に記載した混合物における種々の株の発育
【表１７】
2004501654.tif 000022
【００９０】
試験栄養混合物とバイオレットレッド胆汁酸寒天内でのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉおよびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓのコロニー数計算値は有意に相違しなかった（ｐ＜０．０５）。一方Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ−１５７：Ｈ７およびＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉのコロニー数計数値は栄養混合物の中で有意に高かった。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの低倍率希釈（１０−７）懸濁液は完全に発育阻止された（４８時間までインキュベーション）。
【００９１】
栄養混合物の同様の組成およびｍ−Ｅｎｄｏ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）内での種々のグラム陰性菌回収に関する比較試験を実施した。両培地を膜透過法を用いて接種し、次の結果を得た（表１８）。
表１８．Ｅ．ｃｏｌｉおよびＥ．ｃｏｌｉ Ｏ−１５７：Ｈ７の発育
【表１８】
2004501654.tif 000023
【００９２】
大腸菌群の種々の代表例の鑑別は栄養混合物においては明白である。しかしながら、ｍ−Ｅｎｄｏ ｂｒｏｔｈ内ではＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓのコロニーは淡いメタリックの光沢をもつＥ．ｃｏｌｉのコロニーと容易に見間違う可能性がある。
【００９３】
意外にも栄養混合物のこの組成中のＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉのコロニーの周囲に青色のハロー形成（コロニー周囲区域）を検出した。
【００９４】
試験混合物中のＥ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＡＴＣＣ １３８８３およびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｍ ＡＴＣＣ １４０２８のコロニー数計算値は有意に高く（ｐ＜０．０５）、一方両混合物中における他の微生物のコロニー数は類似していた。これらの結果を添付文書の図７に示している。
【００９５】
例Ｎｏ．７
例Ｎｏ．５と同じ組成の変異株Ｖ２を加えた栄養混合液およびＳ．Ｓ．Ａｇａｒを同時に接種した。
【００９６】
この試験の目的は、本発明の試験対象物である栄養混合物、および多菌性の混合物から得られたＳａｌｍｏｎｅｌｌａの検出に用いるＳ．Ｓ．Ａｇａｒの特異性を比較することである。
【００９７】
接種物は次のように調製した：
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＡＴＣＣ １４０２８、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ＡＴＣＣ ８０９０、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ ＡＴＣＣ ８１００、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ ＡＴＣＣ ２３３５５およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ ２７８３５の最初の懸濁液は１０ ｍＬの滅菌生理食塩液中で新たに発育したコロニーから調製した。
【００９８】
個々の懸濁液から十進法希釈（１０−４まで）で調製した。その後９ ｍＬの滅菌生理食塩液を入れた試験管に個々の１０−４希釈の１ ｍＬを加え、ボルテックス・ミキサーで十分攪拌した。
【００９９】
４３℃で２４時間インキュベートしたこの混合液の１ ｍＬを接種した、１０ ｍＬのＳｅｌｅｎｉｔｅ Ｂｒｏｔｈ中で増菌が行なわれた。
【０１００】
Ｓｅｌｅｎｉｔｅ Ｂｒｏｔｈ培地から得られた校正ループを示す検体は、本発明に従って、栄養混合物およびＳ．Ｓ．Ａｇａｒを入れたペトリ皿上に接種した。すべてのプレートを４３℃でインキュベートした。
【０１０１】
発育結果を２４時間インキュベートの後精査した。
【０１０２】
３つの型のコロニーを、栄養混合物を入れたプレート内で観察した；
１．  青色のハローを伴う青色のコロニー（おそらくＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ，）
２．  中心部が黄色の赤色のコロニー（おそらくＳａｌｍｏｎｅｌｌａ）
３．  中心部がばら色で緑色を帯びた蛍光を伴う無色のコロニー（おそらくＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）
【０１０３】
Ｓ．Ｓ．Ａｇａｒ内で４つの型のコロニーを観察した；
１．  中心部が黒色の大きな白色のコロニー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａまたは Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）
２．  中心部が黒色の無色のコロニー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａまたは Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）
３．  大きなばら色のコロニー（大腸菌群）
４．  小さなばら色のコロニー（大腸菌群）。
【０１０４】
生化学検査では次の結果を得た（表１９）。
表１９．生化学的検証試験
【表１９】
2004501654.tif 000024
【０１０５】
本発明の対象栄養混合物中での推定による同定の結果は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ多価抗血清を用いた血清学的試験により確認した。
【０１０６】
Ｓ．Ｓ．Ａｇａｒ中でＳａｌｍｏｎｅｌｌａと同様の無色のコロニーのみを確認した（それらはリジンデカルボキシラーゼ＋）。
【０１０７】
例Ｎｏ．８
栄養混合物は表２０に記載した組成に従って調製した。
表２０：例８の混合物の組成
【表２０】
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【０１０８】
尿の検体中のＥ．ｃｏｌｉおよび大腸菌群の鑑別のために、栄養混合物の機能性を評価した（Ｅ．ｃｏｌｉおよび大腸菌群による感染が泌尿器性敗血症の約９０％である場合）。その後、生化学的検査により泌尿器性敗血症を引き起こした病原体の検証が行なわれた。
【０１０９】
次の表２１では、すべての確認された病原体の発生率を要約している。
表２１．生化学検査によって確認された病原体の発生率
【表２１】
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【０１１０】
鑑別上の感度および特異性を試験混合物中で確認した。評価の際に、同定後の偽陽性は認めず、この事実により鑑別上の特異性は１００％であることを確認できた。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａの一つの株に偽陽性と考えられる蛍光を観察した。この事実により、鑑別上の感度は９８．０４％であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ １０５３６の発育の結果。ＭＮ３栄養混合物内でのみＥ．ｃｏｌｉの発育速度は標準混合物に比較して小さく、一方ＭＮ２変異株は３時間のインキュベーションにおける発育をより促進することを観察した。６時間後、ＭＮ３混合物を除いて、実際に変異株間で発育促進の相違は認めていない。
【図２】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ． Ｔｉの発育は提案した本発明のすべての混合物において、標準鑑別用培地と比較してＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓの発育を阻止した。
【図３】
組成Ｖ１、Ｖ２とＶ３および標準培地内でのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２の発育。
【図４】
混合物Ｖ１、Ｖ２とＶ３および標準培地中のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ １３０４８の発育。
【図５】
混合物Ｖ１、Ｖ２とＶ３および標準培地中のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＡＴＣＣ １４０２８の発育。
【図６】
混合物Ｖ１、Ｖ２とＶ３および標準培地中のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ ２９２１２の発育。
【図７】
試験混合物（ＦＣＥ）および標準組成中における種々の微生物の性質。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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