(57)【要約】本発明は、コードモノヌクレオチドミクロサテライト（ｃＭＮＲ）またはジヌクレオチドミクロサテライト（ｃＤＮＲ）を含む遺伝子に関する。前記遺伝子は、ｃＭＮＲまたはｃＤＮＲにおける変異により非ＭＳＩ＋（腫瘍）細胞由来の対応する遺伝子とは異なり、ネオペプチドを含む遺伝子産物をコードする。本発明はまた、ＭＳＩ＋腫瘍の予防、診断および／または治療のための前記遺伝子およびそれらの遺伝子産物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コードモノヌクレオチドミクロサテライト（ｃＭＮＲ）またはコードジヌクレオチドミクロサテライト（ｃＤＮＲ）を有する遺伝子であって、ＭＳＩ＋腫瘍細胞から単離され得、ｃＭＮＲまたはｃＤＮＲにおける変異により非ＭＳＩ＋（腫瘍）細胞由来の対応する遺伝子とは異なり、かつネオペプチドを含む遺伝子産物をコードする遺伝子。
【請求項２】
非ＭＳＩ＋（腫瘍）細胞からの対応する遺伝子が図１のものである、請求項１記載の遺伝子。
【請求項３】
図２に示される変異を有する、 ＭＳＩ＋ 腫瘍細胞から単離されうる請求項１または２記載の遺伝子。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか記載のＭＳＩ＋腫瘍細胞から単離されうる遺伝子によりコードされる遺伝子産物。
【請求項５】
請求項４記載の遺伝子産物に対する抗体。
【請求項６】
請求項１〜３いずれか記載のｃＭＮＲまたはｃＤＮＲを有するＭＳＩ＋腫瘍細胞から単離されうる遺伝子を同定する方法であって、ここで非ＭＳＩ （腫瘍）細胞のデータベースがｃＭＮＲ− またはｃＤＮＲ− 含有遺伝子配列について検索され、それらの配列はＭＳＩ＋腫瘍細胞における等しい遺伝子を検出するために使用され、それらの等しい遺伝子は、それらが非ＭＳＩ＋（腫瘍）細胞に由来する遺伝子配列と比較してｃＭＮＲまたはｃＤＮＲにおいて変異を有し、かつネオペプチドを含む遺伝子産物をコードするような様式で選択される、方法。
【請求項７】
ＭＳＩ＋腫瘍細胞内の同一遺伝子を検出するために、ＰＣＲ 反応がｃＭＮＲまたはｃＤＮＲ含有遺伝子配列から開発されたプライマーを用いて行われる請求項６記載の方法。
【請求項８】
プライマーが表１記載のものである請求項６または７記載の方法。
【請求項９】
１％〜１００ ％の頻度で等しい型の種々のＭＳＩ＋腫瘍のＭＳＩ＋腫瘍細胞に存在するＭＳＩ＋腫瘍細胞由来の遺伝子について選択が行われる請求項６〜８いずれか記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜３いずれか記載の遺伝子、請求項４記載の遺伝子産物、請求項５記載の抗体、および／または表１記載のプライマー対の１つまたはいくつかの代表物を含有してなるキット。
【請求項１１】
ＭＳＩ＋腫瘍およびそれらの予備段階の分子研究ならびにその診断のための請求項１〜３いずれか記載の遺伝子、請求項４記載の遺伝子産物、請求項５記載の抗体、または請求項１０記載のキットの使用。
【請求項１２】
ＭＳＩ＋腫瘍およびその予備段階に対して個体を免疫するための請求項１〜３いずれか記載の発現可能形態の遺伝子または請求項４記載の遺伝子産物の使用。
【請求項１３】
免疫がＭＳＩ＋腫瘍の予防および／または治療処置を基礎として行われる請求項１２記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＭＳＩ＋腫瘍に関連する遺伝子およびその遺伝子産物に関する。本発明はまた、かかる遺伝子の同定方法ならびにＭＳＩ＋腫瘍の予防、診断および／または治療のための遺伝子および／またはその遺伝子産物の使用に関する。
【０００２】
腫瘍細胞は、正常な増殖および標準的な分化を維持するのに必須な遺伝子内に不安定性（変異）を蓄積する。２種類の遺伝的不安定性をヒト腫瘍において同定した：染色体不安定性（ＣＩＮ ）およびミクロサテライト（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ）不安定性（ＭＳＩ ）、後者は、二倍体腫瘍細胞における繰り返しＤＮＡ 配列の長さの変化によって特徴づけられる。変異遺伝子の型および種類に関してＣＩＮ とＭＳＩ＋腫瘍との間に広範な差異がある。これは、種々の経路の癌形成をいう。しかし、これらは互いに排他的ではない。ＭＳＩ は、約９０％の遺伝性の非ポリープ状の結腸直腸の腫瘍（ＨＮＰＣＣ ）および約１５％の大腸の散発性腫瘍およびさらなる器官において起こり、種々のＤＮＡ ミスマッチ修復遺伝子の変異誘導性不活化により引き起こされる。ＭＳＩ＋腫瘍は、特別な組織病理学的な特徴を有する。ＭＳＩ＋腫瘍はまた、非コード領域またはイントロン配列におけるルール（ｒｕｌｅ）ミクロサテライトとして用いて分類される。しかし、ミクロサテライトがまた、コード遺伝子領域において不安定性に曝されるという情報がある。これは、ＭＳＩ＋腫瘍の腫瘍形成に非常に有意であるかもしれない。
【０００３】
従って、本発明は、分子レベルでＭＳＩ＋腫瘍を研究するために貢献し、ＭＳＩ＋腫瘍の診断および／または治療に適切である産物を提供する技術課題に基づく。
【０００４】
本発明に従って、この技術課題は、特許請求の範囲に規定される主題によって解決される。
【０００５】
本発明は、ＭＳＩ＋腫瘍コードモノヌクレオチドミクロサテライト（ｃＭＮＲ）に含まれる遺伝子がそれらのｃＭＮＲにおいて不安定性（変異）をしばしば有するという出願人の見識に基づく。この目的のために、彼は、コンピューターアルゴリズム補助データベース解析によりｎ≧６またはｎ≧４の繰り返しユニットを含む、約１７，０００個のコードモノヌクレオチドミクロサテライト（ｃＭＮＲ）および約２，０００ 個のコードジヌクレオチドミクロサテライト（ｃＤＮＲ）を同定した。１５個のｃＭＮＲ（ｎ≧９）および４つのｃＤＮＲ（ｎ≧５）の遺伝的不安定性ならびに対応する遺伝子の発現を１６個のＭＳＩ＋および２０個の非ＭＳＩ＋腫瘍および細胞株において調査し、これらの解析は長い繰り返しユニットに焦点を当てた。ｃＭＮＲおよび／またはｃＤＮＲは、ＭＳＩ＋腫瘍細胞において１〜１００ ％を網羅する不安定性（変異）頻度を示した；しかし、ｃＭＮＲおよび／またはｃＤＮＲは、非ＭＳＩ＋（腫瘍）細胞において安定であった。ほとんどのｃＭＮＲ含有遺伝子（１５の内の１０＝６６％）は、ＭＳＩ＋および非ＭＳＩ＋（腫瘍）細胞の全てにおいて高度に発現され、発現レベルと変異頻度との間に有意な相関は観察されなかった。さらに、彼は、不安定なｃＭＮＲおよび／またはｃＤＮＲ保有遺伝子がネオペプチド含有遺伝子産物をコードし、これらの遺伝子産物がＭＳＩ＋腫瘍および／またはその予備段階に対する個体の免疫に適切であることを見出した。図１〜３、表１〜３および下記の実施例を参照のこと。
【０００６】
本発明の主題は、従って、コードモノヌクレオチドミクロサテライト（ｃＭＮＲ）またはコードジヌクレオチドミクロサテライト（ｃＤＮＲ）を有する遺伝子に関する。ここで、前記遺伝子は、ＭＳＩ＋腫瘍細胞から単離され得、非ＭＳＩ＋（腫瘍）細胞に由来する対応する遺伝子とはｃＭＮＲまたはｃＤＮＲにおける変異により異なり得、ネオペプチドを含む遺伝子産物をコードしうる。
【０００７】
表現「コードモノヌクレオチドミクロサテライト」は、少なくとも３つの等しいモノヌクレオチドＡ、Ｔ、ＧまたはＣ（ｎ≧３）の繰り返しユニットを含み、繰り返しユニットはコード遺伝子領域中に存在する。
【０００８】
用語「コードジヌクレオチドミクロサテライト」は、少なくとも３つの等しいジヌクレオチド（ＡＣ、ＡＧ、ＡＴ、ＣＡ、ＣＧ、ＣＴ、ＧＡ、ＧＣ、ＧＴ、ＴＡ、ＴＣ、ＴＧ、ｎ≧３）、好ましくは少なくとも６つ（ｎ≧６）、より好ましくは少なくとも９つ（ｎ≧９）の繰り返しユニットを含み、繰り返しユニットはコード遺伝子領域内に位置する。
【０００９】
表現「変異したｃＭＮＲまたはｃＤＮＲを有する遺伝子」（ＭＳＩ＋腫瘍細胞から単離されうる）は、ネオペプチドをコードする配列を含む全長のかかる遺伝子ならびにその変異および一部を含む。
【００１０】
表現「ＭＳＩ＋腫瘍細胞」は、ミクロサテライト不安定性を有する任意の腫瘍細胞を含む。かかる腫瘍細胞は、任意の形態、例えば、細胞凝集物、特に腫瘍で利用可能であり得、またはそういうものとして培養物中に保存されうる。好ましいＭＳＩ＋腫瘍細胞は、細胞株ＬｏＶｏ、ＫＭ１２、ＨＣＴ１１６、ＬＳ１７４ およびＳＷ４８を含む。
【００１１】
表現「非ＭＳＩ＋（腫瘍）細胞」は、ミクロサテライト不安定性を有さない任意の細胞を含む。かかる細胞は、任意の種類および起源であり得、例えば細胞は健康な個体または腫瘍に由来し得、および／または腫瘍細胞株でありうる。
【００１２】
用語「変異」および「ネオペプチド含有遺伝子産物」は、ＭＳＩ＋腫瘍細胞から単離されうる遺伝子のコードミクロサテライト（ｃＭＮＲまたはｃＤＮＲ）中に、非ＭＳＩ＋（腫瘍）細胞由来の対応する遺伝子のｃＭＮＲまたはｃＤＮＲと比べて、変異が存在し、前記変異は前記遺伝子がネオペプチド含有遺伝子産物をコードするような変異であることを示す。例えば、変異は、１つまたは幾つかのモノヌクレオチドおよび／またはジヌクレオチドの挿入および／または欠失である。変異は、遺伝子産物がネオペプチド、すなわち新規に産生されたペプチドを含む遺伝子産物の形態で存在するようなリーディングフレームシフトを生じる。
【００１３】
好ましい態様では、本発明の遺伝子は、ｃＭＮＲまたはｃＤＮＲにおける変異により図１に示される非ＭＳＩ＋（腫瘍）細胞の遺伝子とは異なり、かつネオペプチド含有遺伝子産物をコードするものである。詳細には、本発明の遺伝子は、ｃＭＮＲまたはｃＤＮＲ中に図２に示される変異を有し、示されるネオペプチド含有遺伝子産物をコードする。
【００１４】
本発明の遺伝子は、種々の方法により同定され、提供されうる。非ＭＳＩ＋（腫瘍）細胞のデータベースがコードモノヌクレオチドミクロサテライト（ｃＭＮＲ）またはコードジヌクレオチドミクロサテライト（ｃＤＮＲ）を含む遺伝子配列について検索される方法を使用することが好ましく、これらはＭＳＩ＋腫瘍細胞内の等しい遺伝子を検出するために使用され、それらの等しい遺伝子は、それらが非ＭＳＴ＋（腫瘍）細胞由来の遺伝子配列と比べてｃＭＮＲまたはｃＤＮＲ内に変異を有し、かつネオペプチド含有遺伝子産物をコードするように選択される。ＭＳＩ＋腫瘍細胞内の遺伝子を検出するために、ｃＭＮＲまたはｃＤＮＲ含有遺伝子配列から開発されたプライマーとのＰＣＲ 反応に曝されることがそのＤＮＡ にとって有利である。プライマーは、好ましくは、表１に示される配列を含む。また、ＭＳＩ＋腫瘍細胞に由来する遺伝子の選択に関して、約１％〜１００ ％の頻度の同一の型の異なるＭＳＩ＋腫瘍のＭＳＩ＋腫瘍細胞に存在するものについて選択を行うことが有利である。また、ＭＳＩ＋腫瘍細胞から遺伝子を単離するために、適切なプライマーの調製のためにデータベースからの対応する遺伝子配列を使用し、ＭＳＩ＋腫瘍細胞においてそれらを用いて遺伝子を増幅することが有利である。次いで、増幅遺伝子のクローニングおよびその発現は、一般的な方法により行われうる。例えば、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＵＣ 誘導体、ｐＧＥＸ−２Ｔ 、ｐＥＴ３ｂ およびｐＱＥ−８ は、大腸菌における発現のためのベクターとして言及されるべきである。動物細胞における発現のために、例えば、ｐＫＣＲ、ｐＥＦＢＯＳ、ｃＤＭ８およびｐＣＥＶ４ が言及されるべきであり、バキュロウイルス発現ベクターｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａは、昆虫細胞における発現のための例示として示される。当業者は、発現ベクター内に存在する遺伝子を発現するための適切な細胞に精通している。かかる細胞の例としては、大腸菌株ＨＢ１０１ 、ＤＨ １、ｘ１７７６ 、ＪＭ１０１ 、ＪＭ１０９ 、ＢＬ２１およびＳＧ１３００９ 、酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび動物細胞Ｌ、ＮＩＨ ３Ｔ３ 、ＦＭ３Ａ、ＣＨＯ 、Ｃ０５ 、ＶｅｒｏおよびＨｅｌａならびに昆虫細胞ｓｆ９ が挙げられる。当業者はまた、形質転換細胞および／またはトランスフェクト細胞を培養し、発現した遺伝子産物を単離および精製する条件に精通している。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８９）を参照のこと。
【００１５】
本発明のさらなる主題は、上記遺伝子によりコードされる遺伝子産物に関する。本発明の遺伝子に関して、上記の情報を参照のこと。この情報は、本発明の遺伝子産物に対応して適用する。特に、遺伝子産物は、ｃＭＮＲまたはｃＤＮＲによりコードされ、領域内の変異により図１に示される遺伝子の遺伝子産物とは異なり、かつネオペプチドを含むものである。特に、遺伝子産物は、図２に示されるｃＭＮＲまたはｃＤＮＲにより引き起こされる変異を含み、示されるネオペプチドを有する。一般的な方法が上記遺伝子産物を提供するために使用されうる。上記の情報を参照のこと。また、特にペプチド合成によりネオペプチドを提供することが有利でありうる。補足のためにＳａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと。
【００１６】
本発明のさらなる主題は、上記遺伝子産物に対する抗体に関する。遺伝子産物に関して上記の情報を参照のこと。この情報は、本発明の抗体に対応して適用する。これらの抗体は、好ましくは、モノクローナル、ポリクローナル、もしくは合成抗体またはそのフラグメントである。これに関して、用語「フラグメント」は、完全な抗体と同じエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体の全ての部分（例えば、Ｆａｂ 、Ｆｖまたは一本鎖Ｆｖフラグメント）をいう。当業者は、かかるフラグメントの産生に精通している。本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。本発明の抗体は、標準的な方法に従って調製され得、上記遺伝子産物は、免疫原として好適に働く。モノクローナル抗体を得る方法は、当業者に公知である。
【００１７】
本発明のさらなる主題はまた、分子レベル上のＭＳＩ＋腫瘍の研究およびその診断に適切であるキットに関する。キットはまた、ＭＳＩ＋腫瘍に関する遺伝子を同定するために使用されうる。かかるキットは、本発明の遺伝子、遺伝子産物、抗体および／またはプライマー対の１つまたは数個の代表物を含む。本発明の遺伝子、遺伝子産物および抗体に関しては、上記情報が参照されうる。キットはまた、逆転写酵素、ＤＮＡ ポリメラーゼ、リガーゼ、バッファーおよび試薬（例えば、標識、ｄＮＴＰ）などのさらなる物質を含んでもよい。さらに、本発明の遺伝子、遺伝子産物、抗体および／またはプライマー対は標識されうる。それらはまた、自由に入手され得るか、または固体キャリア（例えば、試験管、マイクロ滴定プレート、試験ロッドなど）への接着により固定されうる。キットはまた、標識の検出のためまたは陽性対照および陰性対照を標識するための適切な試薬、洗浄溶液、希釈バッファーなどを含みうる。
【００１８】
本発明のさらなる主題は、個体に発現可能な形態で上記遺伝子またはそれによりコードされた遺伝子産物を与える、ＭＳＩ＋腫瘍およびその予備状態の個体を免疫する方法に関する。本発明の遺伝子および遺伝子産物の上記情報が参照される。
【００１９】
上記遺伝子の投与のために、それは、ＲＮＡ またはＤＮＡ として、好ましくはＤＮＡ として入手されうる。それはまた、それ自体で、すなわちその発現に適切なエレメントと共に、またはベクターと組み合わせて存在しうる。かかるエレメントの例は、ＣＭＶ 、ＳＶ４０、ＲＳＶ 、金属結合性タンパク質Ｉおよびポリヘドリン（Ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）プロモーターおよび／またはＣＭＶ およびＳＶ４０エンハンサーなどのプロモーターおよびエンハンサーである。さらに、発現に適切な配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ ：遺伝子発現技術：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ（１９９０）に従う。さらに、ベクターとして、哺乳動物細胞における発現に適切な任意のベクターを用いることが可能である。例えば、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＳＸ、ｐＫＣＲ、ｐＥＦＢＯＳ、ｃＤＭ８およびｐＣＥＶ４ 、ならびにｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ 、ｐＳＶ２ｇｐｔ 、ｐＳＶ２ｎｅｏ 、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ 、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ 、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７ 、ｐｋｏ−ｎｅｏ およびｐＨｙｇに由来するベクターがある。組換えウイルス、例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルスまたはアデノ随伴ウイルスがまた、ベクターとして使用されうる。
【００２０】
上記遺伝子産物の投与に対して、これは、それ自体で、またはキャリアと組み合わせて存在しうる。個体において、免疫原効果を持たないキャリアが好ましい。かかるキャリアは、個体自身のものまたは外来タンパク質および／またはそのフラグメントでありうる。血清アルブミン、フィブリノゲンもしくはトランスフェリンまたはそのフラグメントなどのキャリアが好ましい。
【００２１】
ＭＳＩ＋腫瘍を伴う疾患にかかるかもしれない個体、またはすでにその疾患にある個体が、発現可能な形態で上記遺伝子またはそれによりコードされた遺伝子産物を用いて免疫されうる。かかる個体の例は、ヒトおよび動物ならびにそれらの細胞である。免疫化が、一般の条件下で行われ得、投与される遺伝子またはそれによりコードされる遺伝子産物の量が容易に決定可能である。それは、とりわけ、個体の免疫化が、遺伝子産物に対する抗体の導入または遺伝子産物に対する細胞障害性Ｔ細胞（例えば ＣＤ８＋ Ｔ細胞）の刺激のどちらに焦点を当てるかにむしろ依存する。免疫化の両方の可能性が、本発明により達成されうる。その上、この量は、免疫化が予防的処理または治療的処理のどちらを意図するかに依存する。さらに、個体の年齢、性別、体重ならびにさらなる臨床パラメーター（例えば、腎臓／肝臓の機能）は、量を決定するための役割を果たす。上記遺伝子産物の１００ μｇ 〜１ｇまたは上記発現可能な遺伝子を含む組換えウイルスの感染粒子の１０６ 〜１０１２を注射することにより、個体に与えることが好ましい。注射は、筋内、皮下、皮内または数箇所の個体の部位への任意の他の適用形態で与えられうる。１つまたは複数のほぼ等量を有するブースター注射を行なうのもまた好ましいであろう。
【００２２】
本発明は、したがって、診断によるＭＳＩ＋腫瘍の検出を可能にする。これらの腫瘍はまた、予防および治療により攻撃されうる。
【００２３】
以下の実施例は、本発明を説明する。
【００２４】
実施例１：一般法
（Ａ）データベース解析
ＥＭＢＬデータベース公開（ＥＭＢＬ Ｒｅｌ． ６２， ２０００年 ５月）を、ヒトコード配列におけるモノヌクレオチドおよびジヌクレオチドリピートに対する検索のために基礎として用いた。多数のコマンドルーチンおよび／またはプログラム、いわゆる「Ｐｅｒｌ ｓｃｒｉｐｔｓ」（Ｗａｌｌら、Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｐｅｒｌ． Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ＆ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．，（１９９６））が書かれており、コード配列の存在に関して全ヒト１０９２８９−ＥＭＢＬ エントリーをチェックした。少なくとも６塩基（モノヌクレオチドリピートの場合）および８塩基（ジヌクレオチドリピートの場合）を有するモノヌクレオチドおよびジヌクレオチドのリピートの存在に関してこれらのコード配列をチェックした。データベースエントリー候補において、各ヌクレオチド型の最も長いリピートのみをモノヌクレオチドリピートとして記録した。ジヌクレオチドリピートに関しては、１２個の異なる種類のジヌクレオチドリピートの全てを考慮に入れた。ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ に対するエントリーを別々に扱った；遺伝子に対して両方のＤＮＡ 型が入手されうる場合、ゲノム配列を優先させた。さらに、種々のフィルターを用いた。例えば、偽遺伝子であると示されたエントリーを排除した。なぜなら、偽遺伝子は通常転写されないからである。したがって、かかるリピートは、非コードミクロサテライトである。同定された候補配列の全てを、関連するデータベースにさらなる解析のために保存した。
【００２５】
（Ｂ）ｃＭＮＲおよびｃＤＮＲ候補リストの解析
不適切な候補配列の解析を避けるために、偽遺伝子または免疫グロブリンファミリーのメンバーであることが知られている全候補配列を排除した。さらに、既知の配列の最も外側の５’または３’末端でリピートを有する全候補ならびに一次データの綿密な解析においてシークエンシング人工物のクローニングとして同定されうる全ｃＭＮＲおよびｃＤＮＲを排除した。９個のＡ およびＴ リピートより多くならびに９個のリピート単位を有する全Ｃ またはＧ リピートを有する全ｃＭＮＲを選択した。なぜなら、ミューテーター表現型を有する腫瘍におけるミクロサテライトの不安定性の確率がリピート単位の数で増加するからである（Ｓｔｒａｕｓｓ ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１９９７），８０６−８１３ ）。２つの独立したＢＬＡＳＴ 解析を、次に行った（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ． Ａｃ． Ｒｅｓ． ２５（１９９７），３３８９−３４０２）。次に、選択されたｃＤＮＡのエキソン／イントロン遷移を同定しうるように相同性配列およびゲノム配列を同定することを試みた。それは、ｃＤＮＡにおけるリピート領域は、スプライシングプロセスのために形成しなかったという事実に対する確認であった。ある場合において、ｃＤＮＡのリピート配列と他の公開配列のものとの間の差異が、まさしくリピート領域で得られた。したがって、ゲノムＤＮＡ は、配列情報を検証するために各リピート領域において配列決定をしなければならなかった。候補ｃＤＮＡおよび相同ゲノムＤＮＡ 配列のＭＡＬＩＧＮ解析（ＨＵＳＡＲ ソフトウエアプログラムパッケージ）によりエキソン／イントロン遷移を同定した。
【００２６】
（ｃ）細胞株および腫瘍サンプル
１４個のヒト大腸癌細胞株を、上記遺伝子のそれぞれにおいてミクロサテライト変化に関して研究した。１４個の大腸癌細胞株のうち ５個をＭＳＩ＋（ＬｏＶｏ、ＫＭ１２Ｌ４、ＨＣＴ１１６、ＬＳ１７４ＴおよびＳＷ４８）として分類し、９ 個の細胞株を、ＭＳＩ−低下またはＭＳＩ−陰性（ＣＸＦ９４ 、ＳＷ９４８ 、ＬＳ１８０ 、ＳＷ７０７ 、ＣａＣｏ−２、ＨＴ２９、Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ 、ＳＷ４８０ およびＣＸ−２）として分類した。細胞株ＳＷ４８およびＨＣＴ１１６をＥＣＡＣＣ ［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｍｒ．ｏｒｇ．ｕｋ／ｆｒａｍｅ．ｈｔｍ］から得た。株ＨＴ２９、ＳＷ７０７ 、ＳＷ９４８ 、ＣａＣｏ２ 、ＣＸ−２、ＣＸＦ９４ 、ＳＷ４８０ 、ＣＯＬＯ３２０ＤＭ 、ＬｏＶｏ、ＬＳ１７４ＴおよびＬＳ１８０ をＤｅｕｔｓｈｅｓ Ｋｒｅｂｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ の腫瘍バンクから得た。ＫＭ１２Ｌ４細胞は、Ｄｒ．Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ， ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｈｏｕｓｔｏｎ， Ｕ．Ｓ．Ａ． により提供された。１０個のＭＳＩ＋ ＣＲＣ腫瘍、ＭＳＩ＋卵巣腫瘍（Ｂ１９０ ＴＵ） および２ 個のＭＳＩ−低下またはＭＳＩ−陰性のＣＲＣ 腫瘍（Ｂ２１５ ＴＵおよびＢ２４５ ＴＵ２） もまた解析した。パラフィン包埋腫瘍は、Ｃｈｉｒｕｒｇｉｓｃｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔｓｋｌｉｎｉｋ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ の保管材料から取り出すかまたはＩｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｅｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ Ｍａｎｎｈｅｉｍ により提供された。標準法を用いる顕微解剖により得られた腫瘍サンプルおよび対応する粘膜サンプルのゲノムＤＮＡ は、Ｃｈ． Ｓｕｔｔｅｒにより提供された（Ｓｕｔｔｅｒら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ， １３（１９９９）， １５７−１６５ ）。「ＮＣＩ ＩＣＧ−ＨＮＰＣＣ 」−ミクロサテライトマーカーパネル（Ｂｏｌａｎｄ ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８（１９９８）， ５２４８−５２５７）により、およびさらにさらなるミクロサテライトマーカーＢＡＴ４０ 、ＡＣＴＣ、Ｄ１３Ｓ１５３ 、Ｄ５Ｓ１０７およびＤ５Ｓ４０６の増幅によりＭＳＩ 状態を決定した。
【００２７】
（Ｄ）ゲノムＭＳＩ 解析
「ＨＵＳＡＲ 」プログラムパッケージに含まれる「ＰＲＩＭＥＲ」プログラムによりプライマーを設計し、「ＦＡＳＴＡ 」解析［ＨＵＳＡＲ プログラムパッケージ］により他のヒト配列に関してさらに結合部位（配列相同）をチェックした。約１００ｂｐ の長さを有する短いアンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）を得るようにリピート領域のできるだけ近くにあるようなプライマー位を選択した。これは、パラフィンに包埋された組織サンプルから得られるＤＮＡ の正確なフラグメント解析に対する最適の結果を示した。これらはまた、未知のゲノム構造を有する候補を解析するために必要なものを証明した。使用したプライマーの全てを、以下の表１に示す。
【００２８】
全容量２５μｌ（５０ｎｇのゲノムＤＮＡ 、２．５ μｌ の１０×反応バッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ−Ｌｅｏｐｏｌｄｓｈａｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、１．５ｍＭ のＭｇＣｌ２ 、２００ μＭ のｄＮＴＰ、０．２５μＭ の各プライマーおよび０．５Ｕの Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））中でＰＣＲ 反応を行なった。１つのプライマーをその５’末端でフルオレセインで標識した。９４℃（４分） での初期変性段階の後、９４℃の変性温度で３０秒間、５７〜６３℃のプライマーシステムに依存する異なる付着温度で４５秒間および７２℃の拡張温度で３０秒間で３５サイクルを行なって、７２℃で（６分） 最終伸長段階を続けた。２ ％アガロースゲル上でＰＣＲ 産物を解析した。フラグメント解析前に、増幅産物を１：２ 〜１：１０に希釈し、希釈産物の１ μｌ を５ μｌ の適用バッファー（０．６％「ブルーデキストラン」、１００ ％ホルムアミド） と混合した。サンプルを９０℃で３ 分間変性させ、次にフラグメントを６．６ ％ポリアクリルアミド／７Ｍ 尿素ゲルを用いる「ＡＬＦ 」ＤＮＡ シークエンシングデバイス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｆｒｅｉｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ） 上の電気泳動により分離した。ミクロサテライトピークのサイズ、高さおよびプロフィールを「ＡｌｌｅｌｅＬｉｎｋｓ 」ソフトウエアにより、解析した（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。
【００２９】
【表１】
2004512021.tif 000002
【００３０】
（Ｅ）配列の確定
全てのコードミクロサテライトを「熱サイクル（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅ ）」配列決定によって確定した。ＰＣＲ 反応を上記のように実施した。ＰＣＲ 産物を「ＱＩＡｑｕｉｃｋ」ＰＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ ）を用いて精製し、「Ｂｉｇ Ｄｙｅ ターミネーターサイクル配列決定キット（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｄａｒｍｓｔａｄｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して対応するプライマーで配列決定した。
【００３１】
（Ｆ）発現解析およびｃＤＮＡ−ＭＳＩ解析
１４個の大腸癌細胞株のポリ（Ａ ）ＲＮＡ を、オリゴ（ｄＴ）セルロース法（Ｖｅｎｎｓｔｒｏｍ およびＢｉｓｈｏｐ， Ｃｅｌｌ ２８ （１９８２）， １３５−１４３ ）を用いて抽出した。ＲＮＡ 調製物および逆転写物の品質を、ＧＡＰＤＨ 増幅（Ｈｓｕ ら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ５５： ３９７−４０１， １９９３ ）を用いてチェックした。ｃＤＮＡと混入物として含まれる可能性のあるゲノムＤＮＡ アンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）との間のサイズによる区別を可能にするプライマー対は、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによる発現解析に適切であると考えられた。未知のエクソン構造の場合、ｃＤＮＡに局在化するプライマーを設計し、ゲノムＰＣＲ が、ＲＴ−ＰＣＲの増幅産物と同じか、より長いか、またはまったく異なっているかのいずれの増幅産物を生じるかをチェックした。使用した全てのプライマーを、表１に列挙する。１００ｎｇ のポリ（Ａ＋）ＲＮＡ を、２００ 単位のＨ−ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ （ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する２０μｌ の最終容量中の０．５ μｇ のオリゴ（ｄＴ）１２−１８ を用いて、１時間、３７℃にて、逆転写に供した。ＲＮＡ 完全性および第１のｃＤＮＡ鎖の合成をチェックするために、コントロールＰＣＲ 反応を、ＧＡＰＤＨ 特異的プライマー（Ｈｓｕ ら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ５５（１９９３） ３９７−４０１ ）を用いて実施した。ＰＣＲ 反応を、ゲノムＤＮＡ の増幅について上記した増幅プロトコールを用いて５０μｌ （１μｌ のｃＤＮＡ、５μｌ の１０倍反応緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ）、１．５ｍＭ のＭｇＣｌ２ 、２００ μＭ のｄＮＴＰ、０．２５μＭ の各プライマーおよび０．５ 単位のＴａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ））の総体積で、実施した。ＰＣＲ 産物を、２％アガロースゲル上で分離して、エチジウムブロマイド染色で可視とした。
【００３２】
ｃＤＮＡ−ＭＳＩ解析用のＰＣＲ 反応を、発現解析について記載したように（５’末端でフルオレセインを用いて標識したプライマーを使用することを除く）実施した。フラグメント解析を、ゲノム解析について記載したように実施した。
【００３３】
実施例２：コンピューターアシスト解析
コンピューターデータベース配列解析は、９ 塩基の最小長を有するモノヌクレオチド繰り返し（合計：６ 塩基以上記の長さを有する１７６５４ 個のモノヌクレオチド繰り返し）に対して３６５ 個の候補を生じた。さらに、８ 塩基の最小長を有する２０２８個のジヌクレオチド繰り返しを、見出した。最も長いモノヌクレオチド領域は、３２塩基を含み、そして最も長いジヌクレオチド領域は、４２塩基、すなわち２１の繰り返し単位を含む。
【００３４】
実施例３：ｃＭＮＲの同定
１０個以上記の繰り返し単位を有する全てのｃＭＮＲおよび９ 個以上記の繰り返し単位を有する全てのＣまたはＧ繰り返し領域を、この目的のために解析した。なぜなら、変異率は、相対的に長い繰り返し領域において増加することが想定されるからである。さらに、さらなる排除基準を満たす全ての候補配列を、解析から除外した。従って、総計で４３個のｃＭＮＲ候補配列が得られ、この配列は、１２個の複製を含み、その結果、３１個の異なる候補配列を選択した。
【００３５】
これらの候補配列を、コード領域におけるミクロサテライトとして実験的に実証しなければならなかった。従って、繰り返し領域に隣接するプライマーを、各候補配列に対して設計しなければならなかった。ゲノム構造についての全情報は、ゲノム配列についてのデータベースを用いるｃＤＮＡの配列比較によって得られ得る。系統的な配列比較は、３１個の候補配列のうちの９個についてのエクソン／イントロントランシジョンおよびコード領域についての情報を供給する。
【００３６】
従って、ｃＤＮＡ配列に基づくプライマー対を、他の２２個のｃＤＮＡ配列に対して設計しなければならなかった。ｃＤＮＡおよび対応するゲノムＤＮＡ の両方における繰り返し領域の増幅は、２２個の候補のうちさらに９ 個において同一のＰＣＲ 産物を生じた。これは、これらの９ 個の配列が、コード領域においてモノヌクレオチド領域を含むことを示す。ゲノムＤＮＡ 配列のＰＣＲ 反応は、１３個のモノヌクレオチド領域において陰性であったか、または対応するｃＤＮＡの増幅によって得られたアンプリマーよりも長いアンプリマーを生じた。従って、対応する遺伝子のゲノム構造の別の解析は、これらの候補配列のそれぞれのために必要であった。合計１８個のモノヌクレオチド領域を、配列解析に供した。
【００３７】
１８ケースのうち１７ケースにおいて配列解析によって繰り返し領域を確認することができた。１つの候補のみが、期待されたＡ１４ 繰り返しを示さなかった。２つの候補配列において、繰り返し領域は、ゲノムＤＮＡ 配列の予測されたコード配列内に位置していたが、ＲＴ−ＰＣＲ解析による発現を示すことは不可能であった。さらに、繰り返し領域に対するＥＳＴ または部分的コード配列ホモログに関して情報は同定され得なかった。これらの研究を、「ＥＳＴ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇソフトウェア」（Ｈｕｓａｒ プログラムパッケージ）を用いて実施した。従って、配列解析および確認実験は、１５個のｃＭＮＲの同一性の基礎を形成した（図１参照）。
【００３８】
実施例４：ｃＤＮＲの検出
配列解析および配列データの実験的実証に使用したのと同じストラテジーを、ｃＤＮＲ（最も長いｃＤＮＲ候補を用いて始められる）に適用した。４ 個のｃＤＮＲ候補のｃＤＮＡ配列を同定したことによって、ＭＳＩ＋ ＭＳＩ大腸癌細胞株およびＭＳＩ＋腫瘍におけるＭＳＩ 状態を、解析した。これらの候補の１つ（（ＡＣ）７ ）は、ＭＳＩ＋腫瘍において変異を示したが、非ＭＳＩ＋（腫瘍）細胞において変異を示さなかった（図２参照）。変異率が９より上記の繰り返し数を有するｃＤＮＲの場合に増加していることが考えられる。
【００３９】
実施例５：ｃＭＮＲの変異率に関する研究
特に、４０〜８０％ の範囲の種々の変異率を、３ 個のＣ９−ｃＭＮＲ において観察し、１０〜１００％の範囲の率を、Ａ１０−ｃＭＮＲにおいて検出した。一方、Ｔ１０ およびＮ≧１１−ｃＭＮＲ は、７５と１００％の間のより高い変異率を常に示した。３ 個のｃＭＮＲマーカー（（ＳＹＣＰ１（Ａ１０）、ＡＴＲ（Ａ１０）、およびＭＢＤ４（Ａ１０） ）において、小さな変異頻度のみを、ＭＳＩ＋細胞株および腫瘍サンプルにおいて同定し得た。しかし、ＭＳＩ＋細胞株およびＭＳＩ＋腫瘍において、高い変異率を、２ 個のｃＭＮＲマーカー（ＨＰＤＭＰＫ（Ｔ１４） およびＵ７９２６０（Ｔ１４） ）について検出した：５ 個のＭＳＩ＋細胞株全ておよび１１個のうち１０個のＭＳＩ＋腫瘍は、ＨＰＤＭＰＫに関する配列において変化を示した。類似の結果を、５ 個のＭＳＩ＋細胞株全ておよび１１個のうち９ 個のＭＳＩ＋腫瘍において突然変異したＵ７９２６０遺伝子のモノｃＭＮＲについて見出した（下の表２参照）。
【００４０】
【表２】
2004512021.tif 000003
【００４１】
実施例６：ｃＭＮＲの発現解析
上記の１５個のｃＭＮＲ含有遺伝子の発現レベルは、１４個の試験された大腸癌細胞株の全てにおいて大いに異なり、そして検出不可能発現と絶えず強力な転写活性との間で変わった。ＳＹＣＰ１ 遺伝子は、減数分裂に関し、そして造血成長因子ＦＬＴ３ＬＧをコードする遺伝子は、大腸癌細胞株において発現されなかった。遺伝子ＨＰＤＭＰＫは、筋緊張性ジストロフィ（Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉａ ｍｙｏｔｏｎｉｃａ）に関連し、かつ仮定タンパク質をコードする２ 個の遺伝子に対する遺伝子座の下流に位置し、そしてＥＲ膜タンパク質ＳＥＣ６３ をコードする遺伝子は、全ての細胞株においてそれほど高く発現されなかったが、常に発現された。ａＣ１−ｍＲＮＡおよびＰＴＨｒＰ 遺伝子のスプライシング改変体３ （ＰＴＨＬ３ ）は、異なる程度まで大腸癌細胞株において発現された。両方の遺伝子は、約５０％ の研究細胞株において発現された。三機能性リボヌクレオチドシンセターゼをコードするＧＡＲＴ遺伝子、ＤＮＡ 依存性タンパク質キナーゼをコードするＰＲＫＤＣ および細胞周期に関連するＡＴＲ 遺伝子は、大腸細胞株において高く発現された。ＭＡＣ３０Ｘはまた、大腸癌細胞株において高く発現された（図３参照）。まとめると、対応する遺伝子の発現レベルは、影響を及ぼす細胞株のＭＳＩ 状態に相関しないことを示し得る。
【００４２】
実施例７：ｃＤＮＡのＭＳＩ 解析
上記の１４個の大腸癌細胞株のｃＭＮＲの増幅されたｃＤＮＡのフラグメント解析を、実施した：３ 個のｃＭＮＲが、影響を受ける細胞株（ＧＡＲＴ）またはもっとも影響を受ける細胞株（ＳＥＣ６３ ）において野生型ｃＤＮＡを示した。７ 個のｃＭＲＮにおいて、ゲノム配列と転写配列との間に対応が存在した（ＭＡＣ３０Ｘ、ＨＰＤＭＰＫ、Ｕ７９２６０、ＭＢＤ４およびＡＴＲ ）。
【００４３】
実施例８：上記の遺伝子産物に対するＣＤ８ ＋ Ｔ 細胞の刺激およびこの遺伝子産物を発現するＭＳＩ＋腫瘍細胞の溶解
（ａ）本発明のネオペプチドに対するＣＤ８ ＊ Ｔ 細胞の刺激
ＨＬＡ−Ａ０２０１ 陽性の健康な発端者由来の末梢血リンパ球（ＰＢＬ ）を、Ｆｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ（登録商標）勾配で密度遠心分離によって精製した。Ｔ リンパ球を、抗体連結磁性ビーズ（ＣＤ１１、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、およびＣＤ５６）（Ｐａｎ Ｔ 細胞単離キット（登録商標）、Ｍｉｌｔｅｎｙ 、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｎｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ ）を使用してＢ リンパ球および／または単球を分離することによって得た。約２ ×１０７ 個のＴ 細胞を、３０ｍｌの血液から得た。それらのうちの約２ ×１０６ 個のＴ 細胞を、自己細胞（下の表３（図２も参照）のＨＬＡ−Ａ０２０１ 制限ネオペプチドのうちの１つで負荷した、すなわち２４ウェルプレートで同時培養したＣＤ４０上で活性化されたＢ 細胞（約５ ×１０５ 個））で刺激した。この刺激を、５ 〜６ 週間の期間弱く繰り返した。
【００４４】
【表３】
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【００４５】
既知のＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔａｎａｌｙｓｉｓによって、ネオペプチドに対する反応性を、０ 日で開始して、弱く測定した。２８日目、１７６０個の特異的細胞／ペプチド番号１６　（ＳＬＹＫＦＳＰＦＰＬ）に対する１，０００，０００ 個の細胞の反応性を観察し、３５日目に、１１２３個の特異的細胞／ペプチド番号１５（ＦＬＳＡＳＨＦＬＬ ）に対する１，０００，０００ 個の細胞のうちの１つおよび７３３ 個の特異的細胞／ペプチド番号２１（ＴＬＳＰＧＷＳＡＶ ）に対する１，０００，０００ 個の細胞のうちの１つを見出した。従って反応の強度は、ウイルス性抗原によって通常達成されるのみの範囲内であり、ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ ペプチド（インフルエンザウイルスのマトリクスタンパク質由来）に対する値は、１１７０個の特異的細胞／３５日目の１，０００，０００ 個の細胞であった。このため、本発明に従うネオペプチドに対して活性化ＣＤ８ ＋ Ｔ 細胞を刺激することができることが明らかになる。
【００４６】
（ｂ）本発明のネオペプチドで負荷された細胞の溶解
別の再刺激後、活性化ＣＤ８ ＋ Ｔ 細胞の細胞傷害性の可能性を、ネオペプチド負荷ＨＬＡ−Ａ２．１＋ 結腸癌細胞株ＳＷ４８０ およびＨＣＴ１１６ならびにＴ２細胞について試験した。未負荷細胞はコントロールとして利用した。１ ×１６６ 細胞それぞれを、５１Ｃｒ（１００ μＣｉ）を用いて１時間３７℃にて放射性標識し、そして活性化ＣＤ８ ＋ Ｔ 細胞の量を増加しながら４ 時間同時培養した。個々の細胞株の特異的溶解を、上清に放出された放射能を測定することによって決定した。ＨＬＡ−Ａ０２０１ 発現細胞株はネオペプチドを負荷される場合に溶解され、未負荷の細胞は溶解され得ないことがわかった。
【００４７】
さらに、競合実験を実施した。どのような方法でも放射能標識されないネオペプチド負荷Ｔ２細胞の反応バッチ（放射能標識されたネオペプチド負荷Ｔ２細胞および活性化ＣＤ８ ＋ Ｔ 細胞を含有する）への過剰添加（１個の「放射性（ｈｏｔ） 」ネオペプチド負荷細胞に対して５０個の「非放射性（ｃｏｌｄ）」ネオペプチド負荷細胞）によって、放射能の放出とＴ 細胞の特異的細胞傷害性活性を競合することは可能であった。従って、ネオペプチドに対するＣＤ８ ＋ Ｔ 細胞が特異的にネオペプチド発現腫瘍細胞を検出し、溶解する証拠となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、非−ＭＳＩ＋（腫瘍）細胞由来のｃＭＮＲまたはｃＤＮＲを有する遺伝子を示す。
【図２】
図２は、ＭＳＩ＋腫瘍に由来するｃＭＮＲまたはｃＤＮＲにおける変異およびそれから得られる新生ペプチドを示す。非−ＭＳＩ＋（腫瘍）細胞由来の遺伝子に対応する比較もまた示す。
【図３】
図３は、大腸癌細胞株におけるｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲを用いた研究を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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