(57)【要約】本発明はメバロン酸経路の酵素、例えば、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、またはジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの活性を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供し、これらはフィトエン、リコペン、β-カロテン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、アスタキサンチン、アドニキサンチン、クリプトキサンチン、エキネノン、およびアドニルビンのような、カロテノイドなどのイソプレノイド化合物を組換えにより産生するために有用なポリヌクレオチドである。発現ベクター、培養細胞、およびイソプレノイド化合物産生法もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド：
（a）配列番号：43の残基1〜340位として示されるアミノ酸配列；
（b）配列番号：45の残基1〜349位として示されるアミノ酸配列；
（c）配列番号：47の残基1〜388位として示されるアミノ酸配列；
（d）配列番号：49の残基1〜378位として示されるアミノ酸配列；
（e）配列番号：51の残基1〜305位として示されるアミノ酸配列；
（f）配列番号：53の残基1〜332位として示されるアミノ酸配列；
（g）配列番号：43、45、47、49、51、および53からなる群より選択されるアミノ酸配列の断片であって、少なくとも30の隣接アミノ酸残基を有する断片；
（h）配列番号：43、45、47、49、51、および53からなる群より選択されるポリペプチドの断片のアミノ酸配列であって、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ（HMG-CoAレダクターゼ）、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ（HMG-CoAシンターゼ）、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、またはジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの活性を有する断片；
（i）配列番号：42または配列番号：42の相補体の少なくとも30の連続ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列であって、ポリペプチドが、HMG-CoAレダクターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、HMG-CoAシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、またはジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの活性を有するアミノ酸配列；ならびに
（j）配列番号：43、45、47、49、51または53の保存的に改変された変種。
【請求項２】
下記からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド：
（a）配列番号：159の残基1〜287位として示されるアミノ酸配列；
（b）配列番号：159の少なくとも30の隣接アミノ酸残基；
（c）配列番号：159の断片のアミノ酸配列であって、断片がファルネシル二リン酸シンターゼ（FPPシンターゼ）の活性を有するアミノ酸配列；
（d）配列番号：157の第295〜1158位またはその相補体の少なくとも30の連続ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列であって、ポリペプチドがFPPシンターゼの活性を有するアミノ酸配列；および
（e）配列番号：159の保存的に改変された変種。
【請求項３】
下記からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド：
（a）配列番号：160の残基1〜142位として示されるアミノ酸配列；
（b）配列番号：160の少なくとも30の隣接アミノ酸残基；
（c）配列番号：160の断片のアミノ酸配列であって、断片が1-デオキシキシルロース-5-リン酸シンターゼ（DXPS）の活性を有するアミノ酸配列；
（d）配列番号：157の第1185〜1610位またはその相補体の少なくとも30の連続ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列であって、ポリペプチドがDXPSの活性を有するアミノ酸配列；
（e）配列番号：160の保存的に改変された変種。
【請求項４】
下記からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド：
（a）配列番号：178の残基1〜390位として示されるアミノ酸配列；
（b）配列番号：178の少なくとも30の隣接アミノ酸残基；
（c）配列番号：178のポリペプチド断片のアミノ酸配列であって、断片がアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼの活性を有するアミノ酸配列；
（d）配列番号：177の第1〜1179位またはその相補体の少なくとも30の連続ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列であって、ポリペプチドがアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼの活性を有するアミノ酸配列；および
（e）配列番号：178の保存的に改変された変種。
【請求項５】
下記からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド：
（a）配列番号：179の残基1〜240位として示されるアミノ酸配列；
（b）配列番号：179の少なくとも30の隣接アミノ酸残基；
（c）配列番号：179のポリペプチドの断片のアミノ酸配列であって、断片がアセトアセチル-CoAレダクターゼの活性を有するアミノ酸配列；
（d）配列番号：177の第1258〜1980位またはその相補体の少なくとも30の連続ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列であって、ポリペプチドがアセトアセチル-CoAレダクターゼの活性を有するアミノ酸配列；および
（e）配列番号：179の保存的に改変された変種。
【請求項６】
配列番号：42、パラコッカス属菌種1534株コドン使用表に従って一つまたは複数の置換を含む配列番号：42の変種、配列番号：42の断片（これらはヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ（HMG-CoAレダクターゼ）、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ（HMG-CoAシンターゼ）、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される活性を有するポリペプチドをコードする）、ならびにヌクレオチド配列が配列番号：42、または配列番号：42の相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、HMG-CoAレダクターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、HMG-CoAシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項７】
配列番号：157のヌクレオチド配列、パラコッカス属菌種1534株コドン使用表に従って一つまたは複数の置換を含む配列番号：157の変種、配列番号：157の断片（これらはファルネシル二リン酸（FPP）シンターゼ活性、1-デオキシ-D-キシルロース5-リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドまたはXseBの活性を有するポリペプチドをコードする）、ならびにヌクレオチド配列が配列番号：157、または配列番号：157の相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、FPPシンターゼ活性、1-デオキシ-D-キシルロース5-リン酸シンターゼ活性、およびXseBの活性からなる群より選択される活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項８】
配列番号：177のヌクレオチド配列、パラコッカス属菌種1534株コドン使用表に従って一つまたは複数の置換を含む配列番号：177の変種、配列番号：177の断片（これらはアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼおよびアセトアセチル-CoAレダクターゼからなる群より選択される活性を有するポリペプチドをコードする）、ならびにヌクレオチド配列が配列番号：177、または配列番号：177の相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼおよびアセトアセチル-CoAレダクターゼからなる群より選択される活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項９】
配列番号：42、配列番号：157、配列番号：177、およびその組み合わせからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項１０】
請求項6、7、8、または9のいずれか一項記載のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項１１】
pBBR-K-mev-op16-1、pBBR-K-mev-op16-2、pDS-mvaA、pDS-idi、pDS-hcs、pDS-mvk、pDS-pmk、pDS-mvd、pDS-His-mvaA、pDS-His-idi、pDS-His-hcs、pDS-His-mvk、pDS-His-pmk、pDS-His-mvd、pBBR-K-Zea4、pBBR-K-Zea4-上流、pBBR-K-Zea4-下流、pBBR-K-PcrtE-crtE-3、pBBR-tK-PcrtE-mvaA、pBBR-tK-PcrtE-idi、pBBR-tK-PcrtE-hcs、pBBR-tK-PcrtE-mvk、pBBR-tK-PcrtE-pmk、pBBR-tK-PcrtE-mvd、pBBR-K-PcrtE-mvaA-crtE-3、pDS-His-phaA、pBBR-K-PcrtE-crtW、pBBR-K-PcrtE-crtWZ、pBBR-K-PcrtE-crtZW、およびその組み合わせからなる群より選択される発現ベクター。
【請求項１２】
請求項6、7、8、もしくは9のいずれか一項記載のポリヌクレオチド配列、または請求項10もしくは11記載の発現ベクターを含む培養細胞、または該細胞の子孫であって、ポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを発現する細胞。
【請求項１３】
カロテノイドの産生法であって、請求項12記載の細胞を、ポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養する段階、およびカロテノイドを細胞または細胞の培地から単離する段階を含む方法。
【請求項１４】
カロテノイド産生細胞の作製法であって、
（a）細胞内で発現されるメバロン酸経路の酵素をコードするポリヌクレオチド配列を細胞に導入する段階；および
（b）ポリヌクレオチド配列を導入する前の細胞によって産生されるカロテノイドのレベルの約1.1〜1,000倍のレベルでカロテノイドを産生する、段階（a）のポリヌクレオチド配列を含む細胞を選択する段階を含む方法。
【請求項１５】
イソプレノイド化合物を産生するための細菌の操作法であって、
（a）イソプレノイド化合物の発現を可能にする条件下、培地中で親細菌を培養し、親細菌の約1.1〜1,000倍のイソプレノイド化合物を産生する突然変異菌を培地から選択する段階；
（b）発現制御配列に機能的に連結された配列番号：42で表されるポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを突然変異菌に導入する段階；および
（c）発現ベクターを含み、段階（a）の突然変異体の少なくとも約1.1倍のイソプレノイド化合物を産生する細菌を選択する段階を含む方法。
【請求項１６】
下記の特徴を有するパラコッカス属の微生物：
（i）微生物がパラコッカス属菌種（MBIC3966）ではないとの条件で、
配列番号：12との配列類似性が、GeneCompar v. 2.0ソフトウェアをギャップペナルティ0％で用いた相同性計算から得られた類似性行列を用いて＞97％である；
菌株R-1512、R1534、R114、またはR-1506との相同性が、81.5℃でのDNA：DNAハイブリダイゼーションを用いて＞70％である；
ゲノムDNAのG＋C含有率の、R114、R-1512、R1534、およびR-1506のゲノムDNAのG＋C含有率からの変動が1％未満である；および
平均DNAフィンガープリントが、実施例2のAFLP法を用いて菌株R-1512、R1534、R114、およびR-1506との約58％の類似性に集まる；
（ii）微生物がパラコッカス属菌種（MBIC3966）ではないとの条件で、
18:1w7cが細胞膜の全脂肪酸の少なくとも約75％を構成する；
増殖のための炭素源としてアドニトール、i-エリトリトール、ゲンチオビオース、β-メチルグルコシド、D-ソルビトール、キシリトール、およびキニン酸を用いることができない；ならびに
増殖のための炭素源としてL-アスパラギンおよびL-アスパラギン酸を用いることができる；または
（iii）微生物がパラコッカス属菌種（MBIC3966）ではないとの条件で、
40℃で増殖することができる；
8％NaClを含む培地中で増殖することができる；
pH9.1の培地中で増殖することができる；および
コロニーが黄橙色に着色する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イソプレノイド生合成経路において有用な新規ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列に関する。特に本発明は、改善されたゼアキサンチン産生を示す組換えにより産生された細胞を提供する。またそのような細胞株の作製法および使用法も提供される。
【背景技術】
【０００２】
カロテノイドは、ヒトのための栄養補助剤、医薬品、および食品着色料として、ならびに動物飼料のための色素として用いられる商業的に重要なC-40イソプレノイド化合物である。現在、産業上重要なカロテノイドは、主に化学合成(β-カロテン、カンタキサンチン、およびアスタキサンチン）または天然原料（センジュギクからのルテイン、パプリカからのカプサンチン）からの抽出によって製造されている。しかしながら、微生物を用いたカロテノイドの産生がいくつかの事例において達成されている。例としてβ-カロテンは真菌ブラケスレア  トリスポラ（Blakeslea trispora）による発酵（米国特許第5,328,845号）または耐塩性藻類ドゥナリエラ  サリナ（Dunaliella salina）を用いた沼沢培養（pond culture）［Borowitzka、J. Biotechnol. 70:313-321 (1999)］により産生される。リコペン生産もB.トリスポラで報告されている（国際公開公報第00/77234号）。アスタキサンチンは酵母（パフィア  ロドジマ（Phaffia rhodozyma、最近改名されてキサントフィロミセス  デンドロウス（Xanthophyllomyces dendorous）））を用いた発酵（米国特許第6,015,684号）により、または藻類ハエマトコッカス  プルヴィアリス（Haematococcus pluvialis）を用いた光バイオリアクターもしくは開放沼沢中［LorenzおよびCysewski、Trends Biotechnol. 18:160-167 (1999)；Olaizola、J. Appl. Phycol. 12:499-506 (2000)］により産生される。しかしながら、そのような微生物産生系は、経済的工業的規模の製造に十分な量のカロテノイドを生産しない。
【０００３】
1960年代半ば、Hoffmann-La Rocheの科学者が、家禽の着色およびヒトの加齢性黄斑変性の予防において用途を有する黄色カロテノイドのゼアキサンチンを産生するいくつかの海洋細菌を単離した。有望なレベルのゼアキサンチン産生を示した一つの細菌株がR-1512と命名され、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC、米国ヴァージニア州マナサス）にATCC21588株（米国特許第3,891,504号）として寄託された。当時認められていた分類学的標準（Eidgenoessische Technische Hochschule（チューリッヒ）およびthe National Collection of Industrial Bacteria、Torry Research Station（スコットランド、アバディーン）によって実施された分類）を用いて、ゼアキサンチン産生微生物をフラボバクテリウム属の一員として分類したが、種の名称は割り付けられなかった。
【０００４】
その後、ゼアキサンチン産生能の高いR-1512の突然変異体を単離するために、広範な突然変異誘発およびスクリーニングプログラムを実施した。本発明に記載の研究において、二つのそのような変異体が重要である。これらの変異体は、そのゼアキサンチン産生能の順に挙げると、R1534およびR114である。カロテノイド生合成の生化学的研究のために様々な他の変異体が何年もの間用いられてきた［Goodwin、Biochem. Soc. Symp. 35:233-244 (1972)；McDermottら、Biochem. J. 134:1115-1117 (1973)；Brittonら、Arch. Microbiol. 113:33-37 (1977)；Mohantyら、Helvetica Chimica Acta 83:2036-2053 (2000)］。
【０００５】
R-1512株の古典的に誘導された突然変異体を用いて、ゼアキサンチン産生のための商業的に実行可能な発酵法を開発しようとする初期の試みは成功しなかった。しかしながら、分子生物学の出現により、ゼアキサンチン産生能のより高い株を開発しうる可能性が高まった。この方向の第一段階として、R1534株由来のカロテノイド遺伝子クラスターのクローニングおよび塩基配列決定を行った（米国特許第6,087,152号、この開示は本明細書においてその全体が引用されているかのごとく、参照として本明細書に組み込まれる）。米国特許第6,087,152号は、カロテノイド遺伝子を大腸菌および枯草菌で機能的に発現させ、これらの宿主内でゼアキサンチンが産生されたことを開示している。米国特許第6,087,152号は、カロテノイド遺伝子クラスターを改変することにより、またはアスタキサンチン産生細菌由来の遺伝子を付加することにより、ゼアキサンチン以外のカロテノイドを産生可能であることも開示した（欧州特許第872,554号）。さらに欧州特許第872,554号は、クローニングしたカロテノイド遺伝子クラスターを多コピープラスミド上に導入することにより、R1534株中のカロテノイド産生が高まることを開示した。
【０００６】
イソプレノイド化合物には非常に大きい構造の多様性があるにもかかわらず、すべてが共通のC-5前駆体、イソペンテニルピロリン酸（IPP）から生合成される。1990年代初頭までは、いくつかの実験結果がこの生体スキームに一致していなかったにもかかわらず、IPPは全ての生物でメバロン酸経路を介して合成されると一般に認識されていた［Eisenreichら、Chemistry and Biology 5:R221-R233 (1998)］。
【０００７】
メバロン酸経路：
2004527265.tif 000002
【０００８】
この矛盾はIPP生合成の代替経路であるデオキシキシルロース（DXP）経路の発見によって解消された（注：IPP生合成の代替経路は科学文献において様々な名称で呼ばれている（DXP経路、DOXP経路、MEP経路、GAP/ピルビン酸経路、および非メバロン酸経路）。本明細書において発明者らは単純にするためにDXP経路という名称のみを用いる）。DXP経路の最初の5つの反応が特定されている［Herzら、Proc. Nat. Acad. Sci. 97:2486-2490 (2000)］が、IPPの生成につながるその後の段階はまだ解明されていない。
【０００９】
DXP経路
2004527265.tif 000003
【００１０】
McDermottら（上記）およびBrittonら［J. Chem. Soc. Chem. Comm. p. 27 (1979)］は、元のRoche単離株由来のゼアキサンチン産生突然変異株の粗抽出物が標識メバロン酸塩をゼアキサンチンに取り込むことを明らかにした。メバロン酸経路を介してのIPP生合成に関するこの証拠を疑う理由はないが、この研究はDXP経路の発見前に実施されており、いくつかの細菌（ストレプトミセス属菌）はIPP合成のために両方の経路を有し、これらの経路の発現は時間的に調節されることが報告されている［Setoら、Tetrahedron Lett. 37:7979-7982 (1996)；Dairiら、Mol. Gen. Genet. 262:957-964 (2000)］。加えて、現在のところ、IPP合成のためにメバロン酸経路を有することが判明している真正細菌は少数にすぎない。これらの細菌のいくつかから、メバロン酸経路の酵素をコードする遺伝子がクローニングおよび塩基配列決定されている［Wildingら、J. Bacteriol. 182:4319-4327 (2000)；Takagiら、J. Bacteriol. 182:4153-4157 (2000)］。
【００１１】
微生物におけるカロテノイド産生の改変または改善において、代謝工学の適用が成功した例がいくつかある［Lagardeら、Appl. Env. Microbiol. 66:64-72 (2000)；Wangら、Biotechnol. Bioeng. 62:235-241 (1999)；Wangら、Biotechnol. Prog. 16:922-926 (2000)（およびその中の引用文献）；Sandmannら、Trends Biotechnol. 17:233-237 (2000)；MisawaおよびShimada、J. Biotechnol. 59:169-181 (1998)；MatthewsおよびWurtzel、Appl. Microbiol. Biotechnol. 53:396-400 (2000)；Albrechtら、Nature Biotechnol. 18:843-846 (2000)；Schmidt-Dannertら、Nature Biotechnol. 18:750-753 (2000)：。例えば、非カロテノイド産生細菌である大腸菌を、細菌アグロバクテリウム  アウランティアクム（Agrobacterium aurantiacum）、エルウィニア  ヘルビコラ（Erwinia herbicola）、またはエルウィニア  ウレドヴォラ（Erwinia uredovora）からクローニングしたカロテノイド（crt）遺伝子を導入することにより、カロテノイドを産生するよう操作することができる（MisawaおよびShimada、上記）。HarkerおよびBramley［FEBS Lett. 448:115-119 (1999)］ならびにMatthewsおよびWurtzel（上記）は、そのような操作した大腸菌株におけるカロテノイド産生は、DXP経路の最初の酵素である1-デオキシ-D-キシルロース5-リン酸シンターゼ（DXPS）をコードする遺伝子の過剰発現によって増大しうることを開示した（大腸菌はイソプレノイド生合成のためにDXP経路しか有しておらず、メバロン酸経路は使用しない［Langeら、Proc. Nat. Acad. Sci. 97:13172-13177 (2000)］。HarkerおよびBramley（上記）はDXPSを過剰産生している細胞中の、イソプレノイド化合物であるユビキノン-8の増加もまた開示した。これらの結果は、IPPの利用可能性はDXPSのインビボ活性が不十分であるために制限され、それにより操作した菌株中のカロテノイドおよび他のイソプレノイド化合物の産生が制限されているとの仮説を裏付けていた。同様の大腸菌系を用いて、KimおよびKeasling［Biotechnol. Bioeng. 72:408-415 (2001)］は、DXPSおよびDXP経路の第二の酵素であるDXPレダクトイソメラーゼ（1-デオキシ-D-キシルロース5-リン酸レダクトイソメラーゼ）をコードする遺伝子の組み合わされた過剰発現により、DXPSをコードする遺伝子だけの過剰発現よりも高いカロテノイド産生が得られることを開示した。
【００１２】
これらの試験はすべて、カロテノイドを産生するよう操作された大腸菌で実施された。したがって、これらの試験の一つの欠点は、これらの組換え大腸菌株によって産生されるカロテノイドの量は、カロテノイドの工業的製造に用いられる非組換え微生物によって産生される量と比較しても非常に少ないということであった。さらに、IPP生合成経路の遺伝子工学により改善された細菌中のカロテノイド産生は、IPP生成のためにDXP経路を利用する生物でしか示されていない。メバロン酸経路を介してIPPを産生する細菌について、同様の試験は報告されていない。
【００１３】
イソプレノイド化合物産生を改善するためのメバロン酸経路の代謝工学が酵母で報告されている。例えば、国際公開公報第00/01649は、サッカロミセス  セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）において3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼ（HMG-CoAレダクターゼ）をコードする遺伝子が過剰発現される場合にイソプレノイド化合物産生が増大することを開示した。しかしながら、この戦略が細菌におけるイソプレノイド産生を改善することは示されておらず、特に、細菌中のカロテノイド産生がメバロン酸経路遺伝子の発現を増幅することによって改善されうることは示されていない。真核生物由来［Camposら、Biochem. J. 353:59-67 (2001)］および細菌であるストレプトミセス属菌種（Streptomyces sp.）CL190株由来（Takagiら、上記）のいくつかのメバロン酸経路遺伝子が大腸菌で発現されうることが明らかにされているが、菌株中でのイソプレノイド産生の増加は報告されていない。
【００１４】
IPPを生成する反応（DXPまたはメバロン酸経路を介して）およびファルネシルピロリン酸（FPP）を様々な他のイソプレノイド（例えば、カロテノイド、キノン）に変換する反応に加えて、二つの他の反応がイソプレノイド生合成に関与していることが知られている。IPPイソメラーゼはIPPおよびその異性体であるジメチルアリルピロリン酸（DMAPP）を相互変換する。二つの形のIPPイソメラーゼが存在し、1型酵素は真核生物およびいくつかの細菌で周知であり、新しく同定された2型酵素はFMNおよびNADP(H)依存性である［Kanedaら、Proc. Nat. Acad. Sci. 98:932-937 (2001)］。
【００１５】
いくつかの報告が、カロテノイドを産生するよう操作された大腸菌において、天然または異種の1型IPPイソメラーゼ（idi）遺伝子を増幅すると、カロテノイド産生が刺激されることを開示している［Kajiwaraら、Biochem. J. 324:421-426 (1997)；Verdoesおよびvan Ooyen、Acta Bot. Gallica 146:43-53 (1999)；Wangら、上記］。一つの報告（Wangら、上記）において、FPPシンターゼ（ファルネシル二リン酸シンターゼ）をコードするispA遺伝子の過剰発現は、操作された大腸菌のカロテン産生株においてidiおよびcrtE（GGPPシンターゼ／ゲラニル-ゲラニル二リン酸シンターゼ）遺伝子の過剰発現と組み合わされると、カロテノイド産生を増大させることがさらに開示された。しかしながら、IPP生合成の経路の場合と同様に、IPPイソメラーゼまたはFPPシンターゼをコードする遺伝子の過剰発現が本来のカロテン産生微生物においてカロテン産生を改善するかどうかは明らかにされていない。また、前述の大腸菌株において産生されるカロテノイドのレベルは非常に低く、これらの戦略がカロテノイド産生がすでに高い工業的微生物において役立つかどうかは判明していない。
【００１６】
要約すると、メバロン酸経路の酵素をコードする遺伝子の発現増大が、本来のカロテン産生細菌またはカロテン産生性となるよう操作された本来は非カロテン産生細菌においてカロテノイド産生を改善しうるという証拠はこれまで得られていない。
【発明の開示】
【００１７】
本発明の一つの態様は、下記の群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドである：（a）配列番号：43の残基1〜340位として示されるアミノ酸配列；（b）配列番号：45の残基1〜349位として示されるアミノ酸配列；（c）配列番号：47の残基1〜388位として示されるアミノ酸配列；（d）配列番号：49の残基1〜378位として示されるアミノ酸配列；（e）配列番号：51の残基1〜305位として示されるアミノ酸配列；（f）配列番号：53の残基1〜332位として示されるアミノ酸配列；（g）配列番号：43、45、47、49、51、および53からなる群より選択されるアミノ酸配列の断片であって、少なくとも30の隣接アミノ酸残基を有する断片；（h）配列番号：43、45、47、49、51、および53からなる群より選択されるポリペプチドの断片のアミノ酸配列であって、断片がHMG-CoAレダクターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ（HMG-CoAシンターゼ）、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、またはジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの活性を有するアミノ酸配列；（i）配列番号：42または配列番号：42の相補体の少なくとも30の連続ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列であって、ポリペプチドがHMG-CoAレダクターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、HMG-CoAシンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、またはジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの活性を有するアミノ酸配列；ならびに（j）配列番号：43、45、47、49、51、または53の保存的に改変された変種。
【００１８】
前述のように、本発明はメバロン酸経路の下記の酵素に対応するポリペプチド配列である配列番号：43、45、47、49、51、および53を含む：それぞれヒドロキシメチルグルタリルCoA（HMG-CoA）レダクターゼ、イソペンテニル二リン酸（IPP）イソメラーゼ、HMG-CoAシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。本発明は、同定された各配列の少なくとも30の隣接アミノ酸または生物学的に活性な分子を規定するのに十分な数の隣接アミノ酸も含む。
【００１９】
本発明は、配列番号：43、45、47、49、51、および53から選択されるポリペプチドの断片も含む。断片は少なくとも約30アミノ酸の長さであるべきであるが、同定されたポリペプチドの活性を有していなければならず、例えば、配列番号：43の場合、本発明の範囲内に入るその断片はHMG-CoAレダクターゼの活性を有する。本明細書において用いられるそれぞれの断片の活性の尺度を実施例1に示す。実施例1に示すアッセイ法でバックグラウンドよりも高い活性を有する断片を生物学的に活性で、本発明の範囲内であると考える。
【００２０】
本発明は、配列番号：42（すなわち、メバロン酸オペロン）または配列番号：42の相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブに、前述の定義のストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列も含む。ポリヌクレオチドはメバロン酸経路の酵素の少なくとも一つをコードしなければならない。本発明のために、「ハイブリダイゼーションプローブ」は配列番号：42の約10〜9066ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列である。
【００２１】
本態様において、単離ポリペプチドは配列番号：43、配列番号：45、配列番号：47、配列番号：49、配列番号：51、または配列番号：53のアミノ酸配列を有していてもよい。または、単離ポリペプチドは、異なる種由来の同じ機能を有する酵素と比較した場合に、最も同一性を有さないそれぞれのアミノ酸配列の領域から選択される約30の隣接アミノ酸を含んでいてもよい。したがって、例えば、本発明のポリペプチドは配列番号：43の第68〜97位、配列番号：45の第1〜30位、配列番号：47の第269〜298位、配列番号：49の第109〜138位、配列番号：51の第198〜227位、または配列番号：53の第81〜110位のアミノ酸を含んでいてもよい。
【００２２】
本発明のもう一つの態様は下記から選択されるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドである：（a）配列番号：159の残基1〜287位として示されるアミノ酸配列；（b）配列番号：159の少なくとも30の隣接アミノ酸残基；（c）配列番号：159の断片のアミノ酸配列であって、断片がファルネシル−二リン酸シンターゼ（FPPシンターゼ）の活性を有するアミノ酸配列；（d）ispA遺伝子（すなわち配列番号：157のヌクレオチド295〜1158位）またはその相補体の少なくとも30の連続ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列であって、ポリペプチドがFPPシンターゼの活性を有するアミノ酸配列；ならびに（e）配列番号：159の保存的に改変された変種。
【００２３】
したがって、本態様において、アミノ酸は、FPPシンターゼ（すなわち配列番号：159の残基1〜287位）、その少なくとも30の隣接残基、または実施例1に示すアッセイ法によって測定したFPPシンターゼ活性を有する配列番号：159の断片をコードするオープンリーディングフレーム全体によってコードされてもよい。さらに、本発明の本態様はispA遺伝子（すなわち配列番号：157のヌクレオチド295〜1158位）またはその相補体の少なくとも30の連続ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブに、前述の定義のストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列であって、ポリペプチドが前述の定義のFPPシンターゼ活性を有するアミノ酸配列も含む。
【００２４】
好ましい態様において、ポリペプチドは配列番号：159のアミノ酸配列を有する。
【００２５】
本発明のもう一つの態様は下記の群から選択されるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドである：（a）配列番号：160の残基1〜142位として示されるアミノ酸配列；（b）配列番号：160の少なくとも30の隣接アミノ酸残基；（c）配列番号：160の断片のアミノ酸配列であって、断片が1-デオキシキシルロース-5-リン酸シンターゼ（DXPS）の活性を有するアミノ酸配列；（d）配列番号：157の第1185〜1610位またはその相補体の少なくとも30の連続ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列であって、ポリペプチドがDXPSの活性を有するアミノ酸配列；および（e）配列番号：160の保存的に改変された変種。
【００２６】
したがって、本態様において、アミノ酸は、DXPS（すなわち配列番号：160の残基1〜142位）、その少なくとも30の隣接残基、または実施例1に示すアッセイ法によって測定したDXPS活性を有する配列番号：160の断片をコードするオープンリーディングフレーム全体によってコードされてもよい。さらに、本発明の本態様はDXPS遺伝子（すなわち配列番号：157のヌクレオチド1185〜1610位）またはその相補体の少なくとも30の連続ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブに、前述の定義のストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列であって、ポリペプチドが前述の定義のDXPS活性を有するアミノ酸配列も含む。
【００２７】
好ましい態様において、ポリペプチドは配列番号：160のアミノ酸配列を有する。
【００２８】
本発明のもう一つの態様は下記から選択されるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドである：（a）配列番号：178の残基1〜390位として示されるアミノ酸配列；（b）配列番号：178の少なくとも30の隣接アミノ酸残基；（c）配列番号：178の断片のアミノ酸配列であって、断片がアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼの活性を有するアミノ酸配列；（d）phaA遺伝子（すなわち配列番号：177のヌクレオチド1〜1179位）またはその相補体の少なくとも30の連続ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列であって、ポリペプチドがアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼの活性を有するアミノ酸配列；および（e）配列番号：178の保存的に改変された変種。
【００２９】
したがって、本態様において、アミノ酸は、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ（すなわち配列番号：178の残基1〜143位）、その少なくとも30の隣接残基、または実施例1に示すアッセイ法によって測定したアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ活性を有する配列番号：178の断片をコードするオープンリーディングフレーム全体によってコードされてもよい。さらに、本発明の本態様はphaA遺伝子（すなわち配列番号：177のヌクレオチド1〜1170位）またはその相補体の少なくとも30の連続ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブに、前述の定義のストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列であって、ポリペプチドが前述の定義のアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ活性を有するアミノ酸配列も含む。
【００３０】
好ましい態様において、ポリペプチドは配列番号：178のアミノ酸配列を有する。
【００３１】
本発明のもう一つの態様は下記から選択されるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドである：（a）配列番号：179の残基1〜240位として示されるアミノ酸配列；（b）配列番号：179の少なくとも30の隣接アミノ酸残基；（c）配列番号：179のポリペプチド断片のアミノ酸配列であって、断片がアセトアセチル-CoAレダクターゼの活性を有するアミノ酸配列；（d）phaB遺伝子（すなわち配列番号：177のヌクレオチド1258〜1980位）またはその相補体の少なくとも30の連続ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列であって、ポリペプチドがアセトアセチル-CoAレダクターゼの活性を有するアミノ酸配列；および（e）配列番号：179の保存的に改変された変種。
【００３２】
したがって、本態様において、アミノ酸は、アセトアセチル-CoAレダクターゼ（すなわち配列番号：179の残基1〜240位）、その少なくとも30の隣接残基、または実施例1に示すアッセイ法によって測定したアセトアセチル-CoAレダクターゼ活性を有する配列番号：179の断片をコードするオープンリーディングフレーム全体によってコードされてもよい。さらに、本発明の本態様はphaB遺伝子（すなわち配列番号：177のヌクレオチド1258〜1980位）またはその相補体の少なくとも30の連続ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブに、前述の定義のストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列であって、ポリペプチドが前述の定義のアセトアセチル-CoAレダクターゼ活性を有するアミノ酸配列も含む。
【００３３】
好ましい態様において、ポリペプチドは配列番号：179のアミノ酸配列を有する。
【００３４】
「ポリペプチド」、「ポリペプチド配列」、「アミノ酸」、および「アミノ酸配列」という用語は、本明細書において交換可能に用いられ、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、もしくは蛋白質配列、またはこれらのいずれかの断片、ならびに天然または合成分子を意味する。この場合、「断片」、「免疫原性断片」、または「抗原性断片」とは、少なくとも約30アミノ酸の長さで、問題のポリペプチドの幾分かの生物学的活性または免疫学的活性を保持している、本明細書において定義したポリペプチドのいずれかの断片を意味する。天然の蛋白質分子のアミノ酸配列を指すために、本明細書において「アミノ酸配列」が記載される場合、「アミノ酸配列」および類似の用語はアミノ酸配列を記載の蛋白質分子に関連する完全に天然のアミノ酸配列に限定することを意味するものではない。
【００３５】
ポリペプチドに関して、「単離（された）」という用語は、天然の状態でそれに伴う成分から分離されている蛋白質またはポリペプチドを意味する。単量体蛋白質は、試料の少なくとも約60〜75％が単一のポリペプチド配列を示す場合に単離されている。単離蛋白質は典型的には蛋白質試料の約60〜90重量％を構成し、通常は約95％、好ましくは約99％を越える純度であると考えられる。蛋白質の純度または均一性は、蛋白質試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた後、ゲルを染色して単一のポリペプチドバンドを可視化するなどの、当技術分野において公知のいくつかの手段によって示すことができる。特定の目的のために、HPLCまたは他の当技術分野において公知の手段を用いると、精製のためのより高い分解能を提供することができる。
【００３６】
本明細書において用いられる「生物学的に活性」という用語は、天然分子の構造的、調節的、または生化学的機能を有する蛋白質を意味する。同様に、「免疫学的に活性」とは、天然、組換え、もしくは合成ポリペプチド、またはその任意のオリゴペプチドが、適当な動物または細胞において特異的な免疫応答を誘導し、特定の抗体と結合する能力を意味する。
【００３７】
本発明のもう一つの態様は、メバロン酸オペロン（配列番号：42）、パラコッカス属菌種（Paracoccus sp.）1534株コドン使用表（表14参照）に従って一つまたは複数の置換を含む配列番号：42の変種、または配列番号：42の断片のヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチド配列である。配列番号：42の変種および断片は、下記から選択される活性を有するポリペプチドをコードしなければならない：HMG-CoAレダクターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ（HMG-CoAシンターゼ）、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。本態様は、ヌクレオチド配列が配列番号：42の約10〜約9066のヌクレオチド、好ましくは配列番号：42、またはそのような配列の相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、前述の定義のストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドが下記から選択される活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列も含む：HMG-CoAレダクターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、HMG-CoAシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。
【００３８】
本態様は、配列番号：42の下記の残基にわたる単離ポリヌクレオチド配列も含む：第2622〜3644位、第3641〜4690位、第4687〜5853位、第5834〜6970位、第6970〜7887位、第7880〜8878位。これらの配列の断片も、それらがそれぞれHMG-CoAレダクターゼ活性、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性、HMG-CoAシンターゼ活性、メバロン酸キナーゼ活性、ホスホメバロン酸キナーゼ活性、およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするかぎり、本発明の範囲内である。
【００３９】
本態様は、配列番号：42の下記の残基：第2622〜3644位、第3641〜4690位、第4687〜5853位、第5834〜6970位、第6970〜7887位、第7880〜8878位、またはその相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列から選択されるハイブリダイゼーションプローブに、前述の定義のストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがそれぞれHMG-CoAレダクターゼ活性、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性、HMG-CoAシンターゼ活性、メバロン酸キナーゼ活性、ホスホメバロン酸キナーゼ活性、またはジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド配列も含む。
【００４０】
好ましくは、単離ポリヌクレオチドは配列番号：42のヌクレオチド第2622〜3644位、第3641〜4690位、第4687〜5853位、第5834〜6970位、第6970〜7887位、第7880〜8878位からなる。
【００４１】
本発明のもう一つの態様は、配列番号：157のヌクレオチド配列、パラコッカス属菌種1534株コドン使用表（表14参照）に従って一つまたは複数の置換を含む配列番号：157の変種、または配列番号：157の断片（これらはFPPシンターゼ活性、1-デオキシ-D-キシルロース5-リン酸シンターゼ活性、またはXseBの活性を有するポリペプチドをコードする）を有する単離ポリヌクレオチド配列である。本態様は、ヌクレオチド配列が配列番号：157、または配列番号：157の相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、前述の定義のストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがFPPシンターゼ活性、1-デオキシ-D-キシルロース5-リン酸シンターゼ活性、またはXseBの活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列も含む。
【００４２】
好ましくは、単離ポリヌクレオチドは配列番号：157のヌクレオチド第59〜292位、第295〜1158位、または第1185〜1610位からなる。
【００４３】
下記の群より選択されるヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチド配列も提供される：配列番号：157の第59〜292位にわたるヌクレオチド、パラコッカス属菌種R1534株コドン使用表（表14）に従って一つまたは複数の置換を含む配列番号：157の位置にわたるヌクレオチド配列の変種、配列番号：157の第59〜292位にわたるヌクレオチド配列の断片（これらはXseBの機能を有するポリペプチドをコードする）、およびヌクレオチド配列が配列番号：157の第59〜292位、またはそのような配列の相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがXseBの機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列。
【００４４】
好ましくは、単離ポリヌクレオチドは配列番号：157のヌクレオチド第59〜292位からなる。
【００４５】
下記の群より選択されるヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチド配列も提供される：配列番号：157の第295〜1158位にわたるヌクレオチド、パラコッカス属菌種R1534株コドン使用表（表14）に従って一つまたは複数の置換を含む配列番号：157の第295〜1158位にわたるヌクレオチド配列の変種、配列番号：157の第295〜1158位にわたるヌクレオチド配列の断片（これらはFPPシンターゼ活性をコードする）、およびヌクレオチド配列が配列番号：157の第295〜1158位、またはそのような配列の相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがFPPシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列。
【００４６】
好ましくは、単離ポリヌクレオチド配列はは配列番号：157のヌクレオチド第295〜1158位からなる。
【００４７】
本発明のもう一つの態様は、配列番号：157の第1185〜1610位にわたるヌクレオチド配列、パラコッカス属菌種1534株コドン使用表（表14参照）に従って一つまたは複数の置換を含む配列番号：157の第1185〜1610位にわたるヌクレオチド配列の変種、または配列番号：157の第1185〜1610位にわたるヌクレオチド配列の断片（これらは1-デオキシキシルロース-5-リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする）を有する単離ポリヌクレオチド配列である。本態様は、ヌクレオチド配列が配列番号：157の第1185〜1610位、またはその相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、前述の定義のストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドが1-デオキシキシルロース-5-リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列も含む。
【００４８】
好ましくは、単離ポリヌクレオチドは配列番号：157のヌクレオチド第1185〜1610位からなる。
【００４９】
本発明のもう一つの態様は、配列番号：177のヌクレオチド配列、パラコッカス属菌種1534株コドン使用表（表14参照）に従って一つまたは複数の置換を含む配列番号：177の変種、または配列番号：177の断片（これらはアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼおよびアセトアセチル-CoAレダクターゼから選択される活性を有するポリペプチドをコードする）を有する単離ポリヌクレオチド配列である。本態様は、ヌクレオチド配列が配列番号：177、またはその相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、前述の定義のストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼおよびアセトアセチル-CoAレダクターゼからなる群より選択される活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列も含む。
【００５０】
本態様において、単離ポリヌクレオチド配列は、配列番号：177のヌクレオチド第1〜1170位、パラコッカス属菌種1534株コドン使用表（表14参照）に従って一つまたは複数の置換を含む配列番号：177の変種、または配列番号：177の断片（これらはアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする）を含んでいてもよい。本態様は、ヌクレオチド配列が配列番号：177のヌクレオチド第1〜1170位、またはその相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列も含む。
【００５１】
好ましくは、単離ポリヌクレオチド配列は配列番号：177のヌクレオチド第1〜1170位からなる。
【００５２】
本態様において、単離ポリヌクレオチド配列は、もう一つの選択肢として、配列番号：177のヌクレオチド第1258〜1980位、パラコッカス属菌種1534株コドン使用表（表14参照）に従って一つまたは複数の置換を含む配列番号：177の変種、または配列番号：177の断片（これらはアセトアセチル-CoAレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする）であってもよい。本態様は、ヌクレオチド配列が配列番号：177のヌクレオチド第1258〜1980位、またはその相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがアセトアセチル-CoAレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列も含む。
【００５３】
好ましくは、単離ポリヌクレオチドは配列番号：177のヌクレオチド第1258〜1980位からなる。
【００５４】
本発明のもう一つの態様において、単離ポリヌクレオチド配列は配列番号：42、配列番号：157、配列番号：177、およびその組み合わせから選択されるヌクレオチド配列を有する。本明細書において用いられる「およびその組み合わせ」という句は、ヌクレオチド配列に関して用いられる場合、記載の配列のいかなる組み合わせも単離ポリヌクレオチド配列を生成するために組み合わせることができることを意味する。さらに、本発明において、同じ配列の複数のコピー、すなわちコンカタマーを用いることもできる。同様に、また下記において詳細に示すとおり、同じポリヌクレオチド配列を含むプラスミドの複数のコピーを適当な宿主細胞に導入することもできる。
【００５５】
本明細書において用いられる「単離（された）」ポリヌクレオチド（例えば、RNA、DNA、または混合ポリマー）とは、天然の配列またはポリペプチドに自然に伴う他の細胞成分、例えばリボソーム、ポリメラーゼ、多くの他のゲノム配列、および蛋白質から実質的に分離されているものである。この用語は、それが天然に出現する環境から取り出されているポリヌクレオチドを含み、組換えまたはクローニングされたDNA単離物および化学合成された類似体または異種系によって生合成された類似体も含む。
【００５６】
「核酸配列」という句は、5'末端から3'末端に向かって解読されるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本または二本鎖ポリマーを意味する。この句は染色体DNA、自己複製プラスミド、DNAまたはRNAの感染性ポリマー、および主に構造的役割を果たすDNAまたはRNAを含む。
【００５７】
「発現制御配列」は、機能的に連結された核酸の転写を支配する核酸制御配列のアレイと定義される。そのような発現制御配列の例は「プロモーター」である。プロモーターは転写開始部位付近の必要な核酸配列を含む。プロモーターは、末端のエンハンサーまたはリプレッサー要素も選択的に含み、これらは転写開始部位から数千塩基対も離れて位置することがある。「構成性」プロモーターは、ほとんどの環境および発生条件下で活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境または発生調節下で活性なプロモーターである。「機能的に連結された」という用語は、核酸発現制御配列（例えばプロモーターまたは転写因子結合部位のアレイ）と第二の核酸配列との間の機能的結合であって、発現制御配列が第二の配列に対応する核酸の転写を支配する結合を意味する。
【００５８】
ポリヌクレオチド配列は、それが他の種由来であるか、または同じ種由来で、その元の形から改変されている場合、生物または第二のポリヌクレオチド配列に対して「異種」である。例えば、異種コーディング配列に機能的に連結されたプロモーターとは、プロモーターの由来元とは異なる種由来のコーディング配列、または同じ種由来の場合には、いかなる天然の対立変異体とも異なるコーディング配列を意味する。
【００５９】
導入遺伝子の発現および内在性遺伝子の阻害（例えば、アンチセンス、またはセンス抑制による）の場合はいずれも、当業者であれば挿入されたポリヌクレオチド配列はその由来元の遺伝子配列と同一である必要はないが、「実質的に同一」でありさえすればよいことを理解すると思われる。
【００６０】
挿入されたポリヌクレオチド配列が転写され、翻訳されて、機能的ポリペプチドを生成する場合、当業者であれば、コドン縮重のためいくつかのポリヌクレオチド配列が同じポリペプチドをコードすることを理解すると思われる。これらの変種は明確に本発明の範囲内である。加えて、本発明は互いに実質的に同一（下記に記載のように決定された）であり、野生型ポリペプチドの突然変異体であるか、またはポリペプチドの機能を保持している（例えば、ポリペプチドのアミノ酸の保存的置換により生じる）ポリペプチドをコードする配列を特に含む。加えて、変種は下記のドミナントネガティブな変異体をコードするものであってもよい。
【００６１】
二つの核酸配列またはポリペプチドは、下記のとおり最大対応で整列させた場合に二つの配列内のそれぞれヌクレオチドまたはアミノ酸残基の配列が同じであれば「同一」であるとする。「同一」または「同一性」の割合という用語は、複数の核酸またはポリペプチド配列に関して、下記の配列比較アルゴリズムの一つを用いて、または手動整列および目視試験によって測定し、比較ウィンドウにおいて、最大対応で比較および整列化した場合に同じであるか、または規定の割合の同じアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する複数の配列または部分配列を意味する。配列同一性のパーセンテージが蛋白質またはペプチドに関して用いられる場合、同一でない残基の位置は、アミノ酸残基が類似の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を持つ他のアミノ酸残基で置換され、したがって分子の機能的性質は変化しない、保存的アミノ酸置換によって異なっていることが多いことが理解される。配列が保存的置換で異なる場合、配列同一性パーセントは置換の保存的性質を補正するために上向きに調節することができる。この調節をするための方法は、当業者には公知である。典型的には、この方法は保存的置換を完全ミスマッチではなく部分ミスマッチとしてスコアリングし、それにより配列同一性パーセンテージを高めることを含む。したがって、例えば、同一のアミノ酸にスコア1を与え、非保存的置換にスコアゼロを与える場合、保存的置換にはゼロと1の間のスコアを与える。保存的置換のスコアリングは、例えば、MeyersおよびMiller、Computer Applic. Biol. Sci. 4:11-17 (1988)のアルゴリズムに従い、例えば、プログラムPC/GENE（Intelligenetics、米国カリフォルニア州マウンテンビュー）で実行して計算する。
【００６２】
「実質的に同一」という句は、二つの核酸またはポリペプチドに関して、下記の配列比較アルゴリズムの一つを用いて、または手動整列および目視試験により測定し、比較ウィンドウにおいて、最大対応で整列化させた場合に、少なくとも60％、好ましくは80％、最も好ましくは90〜95％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する配列または部分配列を意味する。この定義は、その配列の相補体が試験配列にハイブリダイズする配列も意味する。
【００６３】
配列比較のために、典型的には一つの配列が基準配列としてはたらき、それに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および基準配列をコンピューターに入力し、必要があれば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。プログラムのデフォルト値を用いてもよく、または代わりのパラメーターを指定することもできる。次いで配列比較アルゴリズムが、プログラムのパラメーターに基づき、基準配列に対する試験配列の配列同一性の割合を計算する。
【００６４】
本明細書において用いられる「比較ウィンドウ」とは、20〜600、通常は約50〜約200、より通常は約100〜約150からなる群より選択される隣接位置の数のいずれか一つの区域を意味し、この中で、二つの配列を最適に整列化させた後に、配列を隣接位置の数が等しい基準配列と比較することができる。比較のための配列整列化の方法は当技術分野において公知である。比較のための、配列の最適整列は、例えば、SmithおよびWaterman、Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所相同性アルゴリズム、NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性整列化アルゴリズム、PearsonおよびLipman、Proc. Nat'1, Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施（Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group、575 Science Dr.、ウィスコンシン州マディソンのGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）または手動整列および目視試験により、実施することができる。
【００６５】
有用なアルゴリズムの一例はPILEUPである。PILEUPは連続性のペアワイズアライメントを用いて関連配列群から多重整列を作製し、関係と配列同一性の割合を示す。PILEUPはアライメントを作製するために用いるクラスター関係を示すツリーまたはデンドグラムもプロットする。PIlEUPはFengおよびDoolittle、J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987)の連続性整列化法の単純化法を用いる。用いる方法は、HigginsおよびSharp、CABIOS 5:151-153 (1989)によって記載された方法に類似である。プログラムはそれぞれ最長5,000ヌクレオチドまたはアミノ酸300配列までを整列化することができる。多重整列法は二つの最も類似している配列のペアワイズアライメントから始め、二つの整列化された配列のクラスターを作製する。次いで、このクラスターを次の最も関係する配列または整列化された配列のクラスターに整列化する。二つの配列クラスターを、二つの個々の配列のペアワイズアライメントの単純な延長により整列化する。最終整列は、一連の連続性ペアワイズアライメントによって達成される。プログラムを、特定の配列および配列比較領域のアミノ酸またはヌクレオチド座標を指定、およびプログラムパラメーターを指定することによって実行する。例えば、下記のパラメーターを用いて基準配列を他の試験配列と比較し、配列同一性の割合の関係を決定することができる：デフォルトギャップウェイト（3.00）。デフォルトギャップ長ウェイト（0.10）、およびウェイトされた末端ギャップ。
【００６６】
配列同一性の割合および配列類似性を求めるのに適したアルゴリズムのもう一つの例はBLASTアルゴリズムである［Altschulら、J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)］。BLAST分析を実施するためのソフトウェアはNational Center for Biotechnology Information（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/）から公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まずクエリー配列における長さWの短いワード（word）を同定することによって高いスコアとなる配列対（high scoring sequence pairs：HSP）を同定することを含み、HSPはデータベース配列中の同じ長さのワードと整列化した場合、ある正の閾値Tとマッチするか、または満たす。Tは近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschulら、上記）。これらの初期近隣ワードヒットはこれらを含むより長いHSPを見いだすための検索を開始するための種としてはたらく。ワードヒットを、累積整列スコアが上昇できるかぎり、それぞれの配列にそって両方向に延長する。各方向のワードヒットの延長は次の場合に停止する：累積整列スコアがその最高値からX低下する；一つまたは複数の負のスコアの残基整列蓄積により、累積スコアがゼロ以下になる；またはいずれかの配列の末端に達する。 BLASTアルゴリズムのパラメーターW、T、およびXは整列化の感度および速度を決定する。BLASTプログラムはデフォルト値として、ワードの長さ（W）11、BLOSUM62スコア行列（HenikoffおよびHenikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)参照）整列（B）50、期待値（E）10、M＝5、N＝-4、および両方の鎖の比較を使用する。
【００６７】
BLASTアルゴリズムは二つの配列の間の類似性について統計学的解析も行う［KarlinおよびAltschul、Proc. Nat'1. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)参照］。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の一つの尺度は最小合計確率（P(N)）で、これは二つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間のマッチが偶然に起こると考えられる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸の基準核酸に対する比較における最小合計確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満であれば、核酸は基準配列に類似であると考えられる。
【００６８】
「保存的に改変された変種」は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変種とは、同一または基本的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、基本的に同一の配列を意味する。遺伝暗号の縮重のため、多数の機能的に同一の核酸コドンが任意の所与の蛋白質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCG、およびGCUはすべてアミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンによってアラニンが特定されるすべての位置で、コドンはコードされるポリペプチドを変更することなく記述された、対応するコドンのいずれにも変更することができる。そのような核酸変動は「沈黙変動」で、保存的に改変された変動の一種である。本明細書におけるポリペプチドをコードするすべての核酸配列は、核酸のすべての可能な沈黙変動も記述する。当業者であれば、核酸中の各コドン（通常はメチオニンの唯一のコドンであるAUGを除く）は機能的に同一の分子を生じるように改変しうることを理解すると思われる。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のそれぞれの沈黙変動はそれぞれの記述された配列において暗黙的である。
【００６９】
アミノ酸配列に関して、当業者であればコードされる配列において単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸（すなわち、15％、10％、5％、4％、3％、2％、または1％などの20％未満）を変更する、核酸に対する個々の置換、欠失、もしくは付加、またはペプチド、ポリペプチド、もしくは蛋白質配列に対する置換は、変更の結果アミノ酸が化学的に類似のアミノ酸と置換されることになる場合、「保存的に改変された変種」であることを理解すると思われる。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は当技術分野において公知である。
【００７０】
下記の6群はそれぞれ互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：
アラニン（A）、セリン（Ｓ）、トレオニン（T）；
アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；
アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；
アルギニン（R）、リシン（K）；
イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；および
フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）。（例えば、Creighton、Proteins (1984)参照）。
【００７１】
二つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるという指標は、第一の核酸によってコードされるポリペプチドが第二の核酸によってコードされるポリペプチドに対して産生される抗体と免疫学的に交差反応性であるということである。したがって、例えば、二つのペプチドが保存的置換でのみ異なる場合、ポリペプチドは典型的には第二のポリペプチドと実質的に同一である。二つの核酸配列が実質的に同一であるというもう一つの指標は、二つの分子またはそれらの相補体が、下に記載されるようなストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするということである。
【００７２】
「特異的にハイブリダイズする」という句は、配列が複雑な混合物（例えば、全細胞の、またはライブラリのDNAまたはRNA）中にあるとき、分子がストリンジェントな条件下特定のヌクレオチド配列にのみ結合、二本鎖形成、またはハイブリダイズすることを意味する。
【００７３】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という句は、プローブが、典型的には核酸配列の複雑な混合物中で、その標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる環境においては異なることになる。より長い配列は特異的により高温でハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての広範な指針はTijssenの、Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of Principles of Hybridization and the Strategy of Nucleic Acid Assays" (1993)に記載されている。一般に、高度にストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびpHで、特異的配列の熱融解温度（Tm）よりも約5〜10℃低くなるように選択される。低ストリンジェントな条件は一般には、Tmよりも約15〜30℃低くなるように選択される。Tmは（規定のイオン強度、pH、および核酸濃度で）標的に対して相補的なプローブの50％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（標的配列が過剰にあれば、Tmでプローブの50％が平衡状態で占有される）温度である。ストリンジェントな条件は、pH7.0〜8.3で塩濃度がナトリウムイオン約1.0M未満、典型的にはナトリウムイオン濃度（または他の塩）約0.01〜1.0Mであり、温度が短いプローブ（例えば、10〜50ヌクレオチド）では少なくとも約30℃、長いプローブ（例えば、50ヌクレオチドよりも長い）では少なくとも約60℃である条件と考えられる。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの脱安定化剤の添加によっても得るることができる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションのために、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも2倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの10倍である。
【００７４】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸でも、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であれば、実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが遺伝暗号によって許容される最大コドン縮重を用いて作られる場合に起こる。そのような場合、核酸は典型的に中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。
【００７５】
本発明において、本発明の核酸を含むゲノムDNAまたはcDNAを、ここで開示される核酸配列を用い、ストリンジェントな条件下、標準的サザンブロットで同定することができる。本開示の目的のために、そのようなハイブリダイゼーションに適したストリンジェントな条件は、40％ホルムアミド、1M NaCl、1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の緩衝液中、37℃でのハイブリダイゼーション、および少なくとも約50℃、通常は約55℃〜約60℃の温度で、0.2×SSC中、20分間の少なくとも1回の洗浄を含む条件、または同等の条件である。陽性のハイブリダイゼーションはバックグラウンドの少なくとも2倍である。当業者であれば、ほぼ同等のストリンジェンシーの条件を提供するために、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の代替条件を用いうることを容易に理解すると思われる。
【００７６】
二つのポリヌクレオチドが実質的に同一であるという他の指標は、オリゴヌクレオチドプライマー対によって増幅された基準配列が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ｃDNAもしくはゲノムライブラリから試験配列を単離するため、または例えばノーザンもしくはサザンブロットにおいて試験配列を同定するためのプローブとして用いうる事ができるかどうかである。
【００７７】
本発明は、前述の定義の発現ベクターも含む。発現ベクターは前述の各ポリヌクレオチド配列の一つまたは複数のコピーを含む。本発明の発現ベクターは、例えば配列番号：42、または配列番号：42の残基2622〜3644位、3641〜4690位、4687〜5853位、5834〜6970位、6970〜7887位、7880〜8878位、配列番号：157の残基59〜292位、295〜1158位、もしくは1185〜1610位、および配列番号：177の残基1〜1170位もしくは1258〜1980位などの、本明細書において定義したポリヌクレオチド配列のいずれをも含んでよい。発現ベクターは、例えば配列番号：42、配列番号：157、および配列番号：177などの本明細書において同定されたポリヌクレオチド配列の組み合わせを含むこともできる。
【００７８】
発現ベクター中のポリヌクレオチド配列は選択的に、上で定義し、実施例に例示している発現制御配列に機能的に連結されていてもよい。
【００７９】
本発明は、例えば下記の発現ベクターも含む：pBBR-K-mev-op16-1、pBBR-K-mev-op16-2、pDS-mvaA、pDS-idi、pDS-hcs、pDS-mvk、pDS-pmk、pDS-mvd、pDS-His-mvaA、pDS-His-idi、pDS-His-hcs、pDS-His-mvk、pDS-His-pmk、pDS-His-mvd、pBBR-K-Zea4、pBBR-K-Zea4-上流、pBBR-K-Zea4-下流、pBBR-K-PcrtE-crtE-3、pBBR-tK-PcrtE-mvaA、pBBR-tK-PcrtE-idi、pBBR-tK-PcrtE-hcs、pBBR-tK-PcrtE-mvk、pBBR-tK-PcrtE-pmk、pBBR-tK-PcrtE-mvd、pBBR-K-PcrtE-mvaA-crtE-3、pDS-His-phaA、pBBR-K-PcrtE-crtW、pBBR-K-PcrtE-crtWZ、pBBR-K-PcrtE-crtZW、およびその組み合わせ。これらの発現ベクターは下記の実施例でさらに詳細に定義される。さらに、本発明は本明細書において定義された配列の一つを含むいかなる発現ベクターも含み、この発現ベクターは適当な宿主細胞においてカロテノイド、好ましくはゼアキサンチンなどのイソプレノイド化合物を発現するために用いる。
【００８０】
本明細書において用いられる「発現ベクター」という句は、本明細書に示すポリヌクレオチド配列をコードするDNA配列を担持し、その発現を仲介することができる、複製可能な媒体である。
【００８１】
本発明の文脈において、「複製可能な」という用語は、ベクターが導入された所与の型の宿主細胞においてベクターが複製可能であることを意味する。目的のポリヌクレオチド配列のすぐ上流に、シグナルペプチドをコードする配列が提供され、これが存在することによりベクターを有する宿主細胞によって発現される、コードされたポリペプチドが確実に分泌される。シグナル配列は、選択されたポリヌクレオチド配列に本来関連するもの、または別の配列由来のものでありうる。
【００８２】
ベクターは組換えDNA法に適宜にかけることができるいかなるベクターであってもよく、ベクターの選択はそれが導入される宿主細胞に依存することが多い。したがって、ベクターは自立複製ベクター、すなわち染色体外の実体として存在し、その複製は染色体複製とは無関係なベクターであってもよく、そのようなベクターの例はプラスミド、ファージ、コスミド、またはミニ染色体である。または、ベクターは、宿主細胞に導入されると宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。適当なベクターの例を実施例に示す。本発明の発現ベクターは、下記に定義する本発明のDNA配列のいずれをも担持してもよく、下記に定義する、本発明の任意のポリペプチドの発現に用いることもできる。
【００８３】
本発明は、本明細書に開示する一つもしくは複数のポリヌクレオチド配列および／または一つもしくは複数の発現ベクターを含む培養細胞も含む。本明細書において用いられる「培養細胞」は、規定の条件下で増殖し、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる一つまたは複数のポリペプチドを発現することができる、いかなる細胞も含む。好ましくは、培養細胞は酵母、真菌、細菌、または藻類である。より好ましくは、培養細胞はパラコッカス、フラボバクテリウム（Flavobacterium）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、アルカリゲネス（Alcaligenes）、エルウィニア、大腸菌、または枯草菌である。さらにより好ましくは、細胞は例えばR-1506、R-1512、R1534、またはR114などのパラコッカスである。本発明は、本明細書に開示するポリペプチドを発現する、本明細書において同定された任意の細胞の子孫も含む。本発明において、細胞のAFLP DNAフィンガープリントが、実施例2に示す条件を用いて推定親細胞のフィンガープリントと識別不可能である場合、その細胞は別の細胞の子孫である。
【００８４】
したがって、本発明の培養細胞は、例えば配列番号：42、または配列番号：42の残基2622〜3644位、3641〜4690位、4687〜5853位、5834〜6970位、6970〜7887位、7880〜8878位、配列番号：157の残基59〜292位、295〜1158位、もしくは1185〜1610位、および配列番号：177の残基1〜1170位もしくは1258〜1980位を含んでいてもよい。これらの配列は細胞に単独で、または発現ベクターの一部として導入することができる。これらの配列は選択的に、発現制御配列に機能的に連結されていてもよい。培養細胞は、例えば配列番号：42、配列番号：157、および配列番号：177などの本明細書において同定されたポリヌクレオチド配列の組み合わせを含むこともできる。
【００８５】
本発明の培養細胞は、カロテノイド生合成経路の一つまたは複数の酵素をコードするポリヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。例えば、本発明の培養細胞は、配列番号：180、182、および184の一つまたは複数のコピーを、単独または本明細書において同定された任意のポリヌクレオチド配列との組み合わせで含むことができる。したがって、本明細書に開示されるポリヌクレオチド配列は、単独または、例えばカロテノイド様ゼアキサンチンまたはアスタキサンチンなどの標的イソプレノイド化合物の産生を促進する別のポリヌクレオチド配列との組み合わせで、培養細胞に導入することができる。これに関して、本発明は、例えば、GGPPシンターゼ、β-カロテン-β4-オキシゲナーゼ（ケトラーゼ）、および／またはβ-カロテンヒドロキシラーゼなどのカロテノイド生合成に関与するポリペプチドをコードするいかなるポリヌクレオチドの使用も含む。加えて、カロテノイド生合成に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの組み合わせを、同じまたは異なる発現ベクター上の本明細書において同定された一つまたは複数のポリヌクレオチドと組み合わせて用いることもできる。そのような構築物を本発明の培養細胞に導入して、目的のイソプレノイドを発現する細胞を提供することができる。
【００８６】
例えば、本発明の培養細胞は一つまたは複数の下記の発現ベクターを含むことができる：pBBR-K-mev-op16-1、pBBR-K-mev-op16-2、pDS-mvaA、pDS-idi、pDS-hcs、pDS-mvk、pDS-pmk、pDS-mvd、pDS-His-mvaA、pDS-His-idi、pDS-His-hcs、pDS-His-mvk、pDS-His-pmk、pDS-His-mvd、pBBR-K-Zea4、pBBR-K-Zea4-上流、pBBR-K-Zea4-下流、pBBR-K-PcrtE-crtE-3、pBBR-tK-PcrtE-mvaA、pBBR-tK-PcrtE-idi、pBBR-tK-PcrtE-hcs、pBBR-tK-PcrtE-mvk、pBBR-tK-PcrtE-pmk、pBBR-tK-PcrtE-mvd、pBBR-K-PcrtE-mvaA-crtE-3、pDS-His-phaA、pBBR-K-PcrtE-crtW、pBBR-K-PcrtE-crtWZ、pBBR-K-PcrtE-crtZW、およびその組み合わせ。
【００８７】
本発明のもう一つの態様は、カロテノイドの産生法である。この方法において、前述の定義の培養細胞を、前述の定義のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養する。ポリペプチドの発現を可能にする培養条件は下記の実施例に示すが、必要があれば、特定の意図される使用に適するように改変することもできる。次いで、カロテノイドを細胞から、または分泌された場合には細胞の培地から単離する。
【００８８】
本発明において、「カロテノイド」には下記の化合物が含まれる：フィトエン、リコペン、β-カロテン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、アスタキサンチン、アドニキサンチン、クリプトキサンチン、エキネノン、アドニルビン、およびその組み合わせ。好ましくは、カロテノイドはゼアキサンチンである。
【００８９】
本発明のもう一つの態様は、カロテノイド産生細胞の作製法である。この方法は（a）細胞内で発現されるメバロン酸経路の酵素をコードするポリヌクレオチド配列を細胞に導入する段階、および（b）ポリヌクレオチド配列導入前の細胞によって産生されるカロテノイドのレベルの約1.1〜1,000倍のレベルでカロテノイドを産生する、段階（a）のポリヌクレオチド配列を含む細胞を選択する段階とを含む。
【００９０】
本明細書において用いられる「メバロン酸経路の酵素」という句は、IPP生合成のためのメバロン酸経路に関与し、atoBまたはphaA、hcs、mvaA、mvk、pmk、およびmvd遺伝子によってコードされる酵素を意味する。本発明の目的のために、酵素は実施例1に示す活性アッセイ法の任意の一つを用いて検出される場合、「細胞内で発現されている」。カロテノイドの産生を検出するためのアッセイ法は当技術分野において公知である。実施例1、11、および12はそれぞれゼアキサンチン、リコペン、およびアスタキサンチンの有無を特定するための典型的なアッセイ法を示す。同様の様式で、他のカロテノイドのアッセイ法を用いて、細胞または培地中の、例えばフィトエン、カンタキサンチン、アドニキサンチン、クリプトキサンチン、エキネノン、およびアドニルビンの有無を検出することもできる。
【００９１】
したがって、この方法は下記の例示的カロテノイドを産生するために用いることができる：フィトエン、リコペン、β-カロテン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、アスタキサンチン、アドニキサンチン、クリプトキサンチン、エキネノン、アドニルビン、およびその組み合わせ。この方法において、ゼアキサンチンが好ましいカロテノイドである。
【００９２】
この方法は、ポリヌクレオチド配列導入前の細胞によって産生されるカロテノイドのレベルの約1.1〜1,000倍、好ましくは約100倍または少なくとも10倍などの約1.5〜500倍のレベルでカロテノイドを産生可能な細胞を作製する段階を含む。
【００９３】
この方法において、細胞は約1mg/L〜約10g/Lのカロテノイドを産生する。細胞は、例えば約500mg/L〜約8g/L、または約1g/L〜約5g/Lなどの、約100mg/L〜約9g/Lのカロテノイドを産生することが好ましい。
【００９４】
この方法において、細胞は酵母、真菌、細菌、および藻類から選択される。好ましくは、細胞はパラコッカス、フラボバクテリウム、アグロバクテリウム、アルカリゲネス、エルウィニア、大腸菌、および枯草菌から選択される細菌である。より好ましくは、細菌はパラコッカスである。
【００９５】
この方法において、細胞は突然変異細胞であってもよい。本明細書において用いられる「突然変異細胞」とは、非天然のポリヌクレオチド配列、またはその天然の形から変更されているポリヌクレオチド配列（例えば、1〜100、好ましくは20〜50、より好ましくは10未満のヌクレオチドの再配列または欠失または置換により）を含む任意の細胞である。そのような非天然配列はランダム突然変異誘発、化学的突然変異誘発、UV照射などによって得ることができる。好ましくは、突然変異の結果、ゼアキサンチンなどのカロテノイドの産生増加を引き起こすメバロン酸経路の一つまたは複数の遺伝子の発現が増加する。そのような突然変異細胞の生成法、スクリーニング法、および同定法は当技術分野において公知であり、下記の実施例に例示している。そのような突然変異体の例はR114またはR1534である。好ましくは、突然変異細胞はR114である。
【００９６】
この方法において、ポリヌクレオチド配列は配列番号：42、または配列番号：42の残基2622〜3644位、3641〜4690位、4687〜5853位、5834〜6970位、6970〜7887位、7880〜8878位、配列番号：157の残基59〜292位、295〜1158位、もしくは1185〜1610位、および配列番号：177の残基1〜1170位もしくは1258〜1980位である。これらの配列はこの方法において単独または発現ベクターの一部として用いることができる。これらの配列は選択的に、発現制御配列に機能的に連結されていてもよい。この方法において、例えば配列番号：42、配列番号：157、および配列番号：177などの本明細書において同定されたポリヌクレオチド配列の組み合わせを用いることもできる。
【００９７】
この方法で用いるために選択しうる発現ベクターの例には、pBBR-K-mev-op16-1、pBBR-K-mev-op16-2、pDS-mvaA、pDS-idi、pDS-hcs、pDS-mvk、pDS-pmk、pDS-mvd、pDS-His-mvaA、pDS-His-idi、pDS-His-hcs、pDS-His-mvk、pDS-His-pmk、pDS-His-mvd、pBBR-K-Zea4、pBBR-K-Zea4-上流、pBBR-K-Zea4-下流、pBBR-K-PcrtE-crtE-3、pBBR-tK-PcrtE-mvaA、pBBR-tK-PcrtE-idi、pBBR-tK-PcrtE-hcs、pBBR-tK-PcrtE-mvk、pBBR-tK-PcrtE-pmk、pBBR-tK-PcrtE-mvd、pBBR-K-PcrtE-mvaA-crtE-3、pDS-His-phaA、pBBR-K-PcrtE-crtW、pBBR-K-PcrtE-crtWZ、pBBR-K-PcrtE-crtZW、およびその組み合わせが含まれる。
【００９８】
この方法において、ポリヌクレオチド配列を任意の従来の手段を用いて細胞に導入する。ポリヌクレオチド配列を細胞に導入するのに適した方法の例には、形質転換、形質導入、形質移入、リポフェクション、電気穿孔法［例えば、ShigekawaおよびDower、Biotechniques 6:742-751 (1988)参照］、接合［例えば、KoehlerおよびThorne、Journal of Bacteriology 169:5771-5278 (1987)参照］、およびバイオリスティクスが含まれる。
【００９９】
ポリヌクレオチド配列を、発現ベクターの形などで受容細菌に導入するための接合の使用は一般に有効で、公知の方法である（例えば、米国特許第5,985,623号）。細菌の菌株に応じて、コンピテント細胞の精製DNAによる形質転換の使用がより一般的であることもある。
【０１００】
公知の電気穿孔法（インビトロおよびインビボの両方）は、処理領域の周囲に置いた電極に短時間の高電圧パルスをかけることによって機能する（例えば、米国特許第6,208,893号）。電極の間に生じた電場によって、細胞膜が一時的に多孔性となり、その後、移植物質の分子が細胞に侵入する。公知の電気穿孔法適用において、この電場は約100μsの期間のおよそ1000V/cmの単一の方形波パルスを含む。そのようなパルスは、例えば、 BTX Division of Genetronics, Inc.製のElectro Square Porator T820の公知の適用において生成することができる。
【０１０１】
バイオリスティクスは、微粒子銃技術を用いてポリヌクレオチドを標的細胞に送達するためのシステムである。加速によってポリヌクレオチドを標的細胞に送達する方法の例示的態様はBiolistics Particle Delivery Systemで、これはDNAまたは細胞でコーティングした粒子を、ステンレススチールまたはNytexスクリーンなどのスクリーンを通して、培養標的細胞で覆われたフィルター表面上に発射するために用いることができる。スクリーンは粒子が大きい凝集塊で標的細胞に送達されないように、粒子を分散する。発射装置と照射する細胞との間に介在するスクリーンは、発射凝集塊のサイズを小さくし、大きすぎる発射物によって受容細胞に与える損傷を低減することにより、より高頻度の形質転換に貢献しうると考えられる。
【０１０２】
粒子銃照射のために、懸濁液中の細胞をフィルターまたは固体培地上で濃縮することが好ましい。または、他の標的細胞を固体培地上に配置することもできる。照射する細胞は、微粒子照射停止板の下の適当な距離に置く。望ましい場合、加速装置と照射する細胞との間に一つまたは複数のスクリーンも配置する。これらの公知の技術を用いることにより、標識遺伝子を一時的に発現する1000以上の細胞巣が得られる。照射後48時間外来性遺伝子産物を発現する巣内の細胞の数は、1〜10個の範囲で、平均1〜3個であることが多い。
【０１０３】
粒子銃による形質転換において、安定な形質転換体の数を最大にするために、照射前培養条件および照射パラメーターを最適化することができる。この技術において、照射の物理的および生物学的パラメーターはいずれも重要である。物理的因子はポリヌクレオチド／発射微粒子沈着物の操作に関するもの、または発射大粒子もしくは微粒子いずれかの飛行および速度に影響をおよぼすものである。生物学的因子は、照射前および照射直後の細胞の操作、照射に伴う損傷の軽減を助けるための標的細胞の浸透圧調節、ならびに直線化DNAまたは無傷のスーパーコイルプラスミドなどの形質転換DNAの性質に関与するすべての段階を含む。
【０１０４】
したがって、条件を完全に最適化するために、小規模試験での様々な照射パラメーターの調節が望まれるであろうことが企図される。間隙距離、飛行距離、組織距離、およびヘリウム圧などの物理的パラメーターの調節が特に望まれると考えられる。また、受容細胞の生理的状態に影響し、したがって形質転換および組込み効率に影響する条件を改変することにより、損傷軽減因子（TRF）を最小にすることができる。例えば、受容細胞の浸透圧状態、組織の水分補給および継代培養の段階または細胞周期を最適な形質転換のために調節することができる。他の通常の調節の実行は、本発明の開示に照らして、当業者には公知であると思われる。
【０１０５】
粒子仲介性の形質転換法は当業者には公知である。例えば、米国特許第5,015,580号（参照として本明細書に特に組み込まれる）は、そのような技術を用いたダイズの形質転換を記載している。
【０１０６】
本発明のもう一つの態様は、イソプレノイド化合物を産生するための細菌の操作法である。そのような細菌は（a）イソプレノイドの発現を可能にする条件下、培地中で親細菌を培養し、親細菌の約1.1〜1,000倍のイソプレノイドを産生する突然変異菌を培地から選択する段階；（b）発現制御配列に機能的に連結された配列番号：42で表されるポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを突然変異菌に導入する段階；および（c）発現ベクターを含み、段階（a）の突然変異体の少なくとも約1.1倍のイソプレノイドを産生する細菌を選択する段階により作製される。
【０１０７】
この態様において、イソプレノイド化合物とは、構造的に下記の式のイソペンテニル二リン酸（IPP）ユニットを基本とする化合物を意味する：
2004527265.tif 000004
【０１０８】
そのような化合物には、ヘミテルペン、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、トリテルペン（例えば、フィトステロール、フィトエストロゲン、フィトエクジソン、エストロゲン、フィトエストロゲン）、テトラテルペン（カロテノイド）、およびポリテルペンが含まれる。好ましくは、イソプレノイドは、例えば上記で特定されたカロテノイドの一つなどのカロテノイド、特にゼアキサンチンである。
【０１０９】
細菌は、本明細書に開示される方法を用いてイソプレノイド化合物を産生することができる、いかなる細菌であってもよい。好ましくは、細菌はパラコッカス、フラボバクテリウム、アグロバクテリウム、アルカリゲネス、エルウィニア、大腸菌、または枯草菌である。さらにより好ましくは、細菌はパラコッカスである。好ましくは、親細菌はR-1506またはR1512で、突然変異菌はR1534またはR114、好ましくはR114である。
【０１１０】
細菌を培地中、イソプレノイド産生のために最適化した条件下で培養する。培地および培養条件の選択は、当技術分野の範囲内である。実施例1、11、および12に記載のアッセイ法は、培地中の特定のカロテノイドの有無を測定するための例示的方法を示している。培養条件を最適化し、標的イソプレノイドの産生について測定することにより、本明細書に記載の特定の産生パラメーターに適合する突然変異体の培養および選択を達成することができる。このように、親細菌の約1.1〜1,000倍のイソプレノイドを産生する突然変異菌を選択することができる。好ましくは、突然変異菌は、例えば親細菌の少なくとも約100倍または少なくとも約10倍のイソプレノイドなどの、親細菌の約1.5〜500倍のイソプレノイドを産生する。次いで、その細菌を培養し、次の段階に用いる。
【０１１１】
所望のレベルのイソプレノイドを産生する突然変異菌を選択した後、前述または実施例に記載の任意の方法を用いて発現ベクターを細菌に導入する。本明細書において定義された任意の発現ベクターを突然変異細胞に導入することができる。好ましくは、発現ベクターは配列番号：42を含む。
【０１１２】
いったん発現ベクターを突然変異菌に導入した後、非形質転換変異体の約5〜約20倍など、少なくとも約1.1倍のイソプレノイドを産生する安定な形質転換体を選択する。選択した形質転換体を次いでイソプレノイド産生に適した条件下で培養し、次いでイソプレノイドを細胞または培地から単離する。
【０１１３】
この方法のさらなる段階は、細菌によるイソプレノイド化合物の産生増加を引き起こす突然変異を変異菌に導入する。突然変異は下記の少なくとも一つから選択することができる：ポリヒドロキシアルカン酸（PHA）経路を不活化する、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼの発現を高める、FPPシンターゼの発現を高める、カロテノイド生合成経路の酵素の発現を高める、およびイソペンテニル二リン酸（IPP）をジメチルアリル二リン酸（DMAPP）に変換する酵素の発現を高める。
【０１１４】
PHA経路の不活化は、phaB（配列番号：177のヌクレオチド第1258〜1980位）によってコードされるポリペプチドを発現しない突然変異菌を選択すること、または配列番号：177もしくはその断片を用いた同種組換えにより野生型phaB遺伝子の発現を妨害することによって達成することができる。
【０１１５】
この方法において、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼの発現を高めることは、発現制御配列に機能的に連結された配列番号：175または配列番号：177のヌクレオチド第1〜1170位で表されるポリヌクレオチド配列を含むベクターを突然変異菌に導入することによって達成することができる。この方法において、FPPシンターゼの発現を高めることは、発現制御配列に機能的に連結された配列番号：157のヌクレオチド第295〜1158位で表されるポリヌクレオチド配列を含むベクターを突然変異菌に導入することによって達成することができる。この方法において、カロテノイド遺伝子の発現を高めることは、例えば発現制御配列に機能的に連結された配列番号：180、182、および184からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列などの、カロテノイド生合成経路における一つまたは複数の酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを突然変異菌に導入することによって達成することができる。
【０１１６】
この方法において、イソプレノイド化合物はイソペンテニル二リン酸（IPP）であることが好ましい。イソプレノイド化合物が、例えばフィトエン、リコペン、β-カロテン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、アスタキサンチン、アドニキサンチン、クリプトキサンチン、エキネノン、アドニルビン、およびその組み合わせなどのカロテノイドであることも好ましい。
【０１１７】
本発明のもう一つの態様は下記の特徴を有するパラコッカス属の微生物である：微生物がパラコッカス属菌種（MBIC3966）ではないとの条件で、（a）配列番号：12との配列類似性が、GeneCompar v. 2.0ソフトウェアをギャップペナルティ0％で用いた相同性計算から得られた類似性行列を用いて＞97％である；（b）R-1512、R1534、R114、またはR-1506との相同性が、81.5℃でのDNA：DNAハイブリダイゼーションを用いて＞70％である；（c）ゲノムDNAのG＋C含有率の、R114、R-1512、R1534、およびR-1506のゲノムDNAのG＋C含有率からの変動が1％未満である；ならびに（d）平均DNAフィンガープリントが、実施例2のAFLP法を用いてR-1512、R1534、R114、およびR-1506株との類似性約58％に集まる。
【０１１８】
これらの各特徴を決定するための方法は実施例2にすべて記載されており、これらの方法を用いれば、前述の基準に合致する微生物は容易に同定可能であることが企図される。本発明の微生物は前述の各特徴（すなわちa〜d）を有することが好ましい。しかしながら、パラコッカス属菌種（MBIC3966）を除いて、R114、R-1512、R1534、およびR-1506と同じ種に属する微生物を分類学上有効に記載するための十分な情報を提供する、特徴a〜dのいかなる組み合わせも本発明の範囲内である。
【０１１９】
本発明のもう一つの態様は下記の特徴を有するパラコッカス属の微生物である：微生物がパラコッカス属菌種（MBIC3966）ではないとの条件で、（a）18:1w7cが細胞膜の全脂肪酸の少なくとも約75％を構成する；（b）増殖のための炭素源としてアドニトール、i-エリトリトール、ゲンチオビオース、β-メチルグルコシド、D-ソルビトール、キシリトール、およびキニン酸を用いることができない；ならびに（c）増殖のための炭素源としてL-アスパラギンおよびL-アスパラギン酸を用いることができる。
【０１２０】
これらの各特徴を決定するための方法も実施例2にすべて記載されており、これらの方法を用いれば、前述の基準に合致する微生物は容易に同定可能であることが企図される。本発明の微生物は前述の各特徴（すなわちa〜c）を有することが好ましい。しかしながら、パラコッカス属菌種（MBIC3966）を除いて、R114、R-1512、R1534、およびR-1506と同じ種に属する微生物を分類学上有効に記載するための十分な情報を提供する、特徴a〜cのいかなる組み合わせも本発明の範囲内である。
【０１２１】
本発明のもう一つの態様は下記の特徴を有するパラコッカス属の微生物である：微生物がパラコッカス属菌種（MBIC3966）ではないとの条件で、（a）40℃で増殖することができる；（b）8％NaClを含む培地中で増殖することができる；（c）pH9.1の培地中で増殖することができる；および（d）コロニーが黄橙色に着色。
【０１２２】
これらの各特徴を決定するための方法も実施例2にすべて記載されており、これらの方法を用いれば、前述の基準に合致する微生物は容易に同定可能であることが企図される。本発明の微生物は前述の各特徴（すなわちa〜d）を有することが好ましい。しかしながら、パラコッカス属菌種（MBIC3966）を除いて、R114、R-1512、R1534、およびR-1506と同じ種に属する微生物を分類学上有効に記載するための十分な情報を提供する、特徴a〜dのいかなる組み合わせも本発明の範囲内である。
【０１２３】
本発明の微生物は、パラコッカス属菌種（MBIC3966）を除いて、R114、R-1512、R1534、およびR-1506と同じ種に属する微生物を分類学上確実に記載するための十分な情報を提供する、前述の11の特徴のいかなる組み合わせを用いても同定することができる。
【０１２４】
前述の記載に従い、本発明は下記を提供する：
（1）下記からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド：
（a）配列番号：43の残基1〜340位として示されるアミノ酸配列、特に配列番号：43の第68〜97位に対応するアミノ酸配列；
（b）配列番号：45の残基1〜349位として示されるアミノ酸配列、特に配列番号：45の第1〜30位に対応するアミノ酸配列；
（c）配列番号：47の残基1〜388位として示されるアミノ酸配列、特に配列番号：47の第269〜298位に対応するアミノ酸配列；
（d）配列番号：49の残基1〜378位として示されるアミノ酸配列、特に配列番号：49の第109〜138位に対応するアミノ酸配列；
（e）配列番号：51の残基1〜305位として示されるアミノ酸配列、特に配列番号：51の第198〜227位に対応するアミノ酸配列；
（f）配列番号：53の残基1〜332位として示されるアミノ酸配列、特に配列番号：53の第81〜110位に対応するアミノ酸配列；
（g）配列番号：43、45、47、49、51、および53からなる群より選択されるアミノ酸配列の断片であって、少なくとも30の隣接アミノ酸残基を有する断片；
（h）配列番号：43、45、47、49、51、および53からなる群より選択されるポリペプチドの断片のアミノ酸配列であって、断片がヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ（HMG-CoAレダクターゼ）、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ（HMG-CoAシンターゼ）、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、またはジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの活性を有するアミノ酸配列；
（i）配列番号：42または配列番号：42の相補体の少なくとも30の連続ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列であって、ポリペプチドがHMG-CoAレダクターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、HMG-CoAシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、またはジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの活性を有するアミノ酸配列；ならびに
（j）配列番号：43、45、47、49、51、または53の保存的に改変された変種。
（2）下記からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド：
（a）配列番号：159の残基1〜287位として示されるアミノ酸配列；
（b）配列番号：159の少なくとも30の隣接アミノ酸残基；
（c）配列番号：159の断片のアミノ酸配列であって、断片がファルネシル二リン酸シンターゼ（FPPシンターゼ）の活性を有するアミノ酸配列；
（d）配列番号：157の第295〜1158位またはその相補体の少なくとも30の連続ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列であって、ポリペプチドがFPPシンターゼの活性を有するアミノ酸配列；および
（e）配列番号：159の保存的に改変された変種。
（3）下記からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド：
（a）配列番号：160の残基1〜142位として示されるアミノ酸配列；
（b）配列番号：160の少なくとも30の隣接アミノ酸残基；
（c）配列番号：160の断片のアミノ酸配列であって、断片が1-デオキシキシルロース-5-リン酸シンターゼ（DXPS）の活性を有するアミノ酸配列；
（d）配列番号：157の第1185〜1610位またはその相補体の少なくとも30の連続ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列であって、ポリペプチドがDXPSの活性を有するアミノ酸配列；
（e）配列番号：160の保存的に改変された変種。
（4）下記からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド：
（a）配列番号：178の残基1〜390位として示されるアミノ酸配列；
（b）配列番号：178の少なくとも30の隣接アミノ酸残基；
（c）配列番号：178のポリペプチドの断片のアミノ酸配列であって、断片がアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼの活性を有するアミノ酸配列；
（d）配列番号：177の第1〜1170位またはその相補体の少なくとも30の連続ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列であって、ポリペプチドがアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼの活性を有するアミノ酸配列；および
（e）配列番号：178の保存的に改変された変種。
（5）下記からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド：
（a）配列番号：179の残基1〜240位として示されるアミノ酸配列；
（b）配列番号：179の少なくとも30の隣接アミノ酸残基；
（c）配列番号：179のポリペプチドの断片のアミノ酸配列であって、断片がアセトアセチル-CoAレダクターゼの活性を有するアミノ酸配列；
（d）配列番号：177の第1258〜1980位またはその相補体の少なくとも30の連続ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列であって、ポリペプチドがアセトアセチル-CoAレダクターゼの活性を有するアミノ酸配列；および
（e）配列番号：179の保存的に改変された変種。
（6）配列番号：42、パラコッカス属菌種R1534株コドン使用表（表14）に従って一つまたは複数の置換を含む配列番号：42の変種、配列番号：42の断片（これらはヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ（HMG-CoAレダクターゼ）、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ（HMG-CoAシンターゼ）、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される活性を有するポリペプチドをコードする）からなる群より選択されるヌクレオチド配列、ならびにヌクレオチド配列が配列番号：42、または配列番号：42の相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリペプチドがHMG-CoAレダクターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、HMG-CoAシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列；特に
（a）配列番号：42のヌクレオチド2622〜3644位、HMG-CoAレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするその断片、およびヌクレオチド配列が配列番号：42の残基2622〜3644位、もしくはその相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがHMG-CoAレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列、特に配列番号：42のヌクレオチド2622〜3644位からなるポリヌクレオチド配列；
（b）配列番号：42のヌクレオチド3641〜4690位、パラコッカス属菌種R1534株コドン使用表（表14）に従って一つもしくは複数の置換を含むその変種、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号：42の断片、およびヌクレオチド配列が配列番号：42の残基3641〜4690位、もしくはその相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列、特に配列番号：42のヌクレオチド3641〜4690位からなるポリヌクレオチド配列；
（c）配列番号：42のヌクレオチド4687〜5853位、パラコッカス属菌種R1534株コドン使用表（表14）に従って一つもしくは複数の置換を含むその変種、HMG-CoAシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号：42の断片、およびヌクレオチド配列が配列番号：42の残基4687〜5853位、もしくはその相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがHMG-CoAシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列、特に配列番号：42のヌクレオチド3641〜4690位からなるポリヌクレオチド配列；
（d）配列番号：42のヌクレオチド5834〜6970位、パラコッカス属菌種R1534株コドン使用表（表14）に従って一つもしくは複数の置換を含むその変種、メバロン酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号：42の断片、およびヌクレオチド配列が配列番号：42の残基5834〜6970位、もしくはその相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがメバロン酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列、特に配列番号：42のヌクレオチド3641〜4690位からなるポリヌクレオチド配列；
（e）配列番号：42のヌクレオチド6970〜7887位、パラコッカス属菌種R1534株コドン使用表（表14）に従って一つもしくは複数の置換を含むその変種、ホスホメバロン酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号：42の断片、およびヌクレオチド配列が配列番号：42の残基6970〜7887位、もしくはその相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがホスホメバロン酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列、特に配列番号：42のヌクレオチド3641〜4690位からなるポリヌクレオチド配列；または
（f）配列番号：42のヌクレオチド7880〜8878位、パラコッカス属菌種R1534株コドン使用表（表14）に従って一つもしくは複数の置換を含むその変種、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号：42の断片、およびヌクレオチド配列が配列番号：42の残基7880〜8878位、もしくはその相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列、特に配列番号：42のヌクレオチド7880〜8878位からなるポリヌクレオチド、特に配列番号：42のヌクレオチド3641〜4690位からなるポリヌクレオチド配列；
（7）配列番号：157のヌクレオチド配列、パラコッカス属菌種R1534株コドン使用表（表14）に従って一つまたは複数の置換を含む配列番号：157の変種、配列番号：157の断片（これらはファルネシル二リン酸（FPP）シンターゼ活性、1-デオキシ-D-キシルロース5-リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、またはXseBの活性を有するポリペプチドをコードする）、ならびにヌクレオチド配列が配列番号：157、または配列番号：157の相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがFPPシンターゼ活性、1-デオキシ-D-キシルロース5-リン酸シンターゼ活性、およびXseBの活性からなる群より選択される活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列、特に
（a）配列番号：157の第59〜292位のヌクレオチド配列、パラコッカス属菌種R1534株コドン使用表（表14）に従って一つまたは複数の置換を含むその変種、XseBの機能を有するポリペプチドをコードする配列番号：157の第59〜292位のヌクレオチド配列の断片、およびヌクレオチド配列が配列番号：157の第59〜292位、またはそのような配列の相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがXseBの機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列、特に配列番号：157のヌクレオチド59〜292位からなる単離ポリヌクレオチド；
（b）配列番号：157の第295〜1158位のヌクレオチド配列、パラコッカス属菌種R1534株コドン使用表（表14）に従って一つまたは複数の置換を含む配列番号：157の第295〜1158位のヌクレオチド配列の変種、FPPシンターゼ活性をコードする配列番号：157の第295〜1158位のヌクレオチド配列の断片、およびヌクレオチド配列が配列番号：157の第295〜1158位、またはそのような配列の相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがFPPシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列、特に配列番号：157のヌクレオチド295〜1158位からなる単離ポリヌクレオチド；
（c）配列番号：157の第1185〜1610位のヌクレオチド配列、パラコッカス属菌種R1534株コドン使用表（表14）に従って一つまたは複数の置換を含む配列番号：157の第1185〜1610位のヌクレオチド配列の変種、1-デオキシキシルロース-5-リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号：157の第1185〜1610位のヌクレオチド配列の断片、およびヌクレオチド配列が配列番号：157の第1185〜1610位、またはそのような配列の相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドが1-デオキシキシルロース-5-リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列、特に配列番号：157のヌクレオチド1185〜1610位からなる単離ポリヌクレオチド；
（8）配列番号：177のヌクレオチド配列、パラコッカス属菌種R1534株コドン使用表（表14）に従って一つまたは複数の置換を含む配列番号：177の変種、配列番号：177の断片（これらはアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼおよびアセトアセチル-CoAレダクターゼからなる群より選択される活性を有するポリペプチドをコードする）、ならびにヌクレオチド配列が配列番号：177、または配列番号：177の相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼおよびアセトアセチル-CoAレダクターゼからなる群より選択される活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列、特に
（a）配列番号：177のヌクレオチド1〜1170位、パラコッカス属菌種R1534株コドン使用表（表14）に従って一つまたは複数の置換を含む配列番号：177の変種、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号：177の断片、およびヌクレオチド配列が配列番号：177の残基1〜1170位、またはその相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列、特に配列番号：177のヌクレオチド1〜1170位からなる単離ポリヌクレオチド配列；
（b）配列番号：177のヌクレオチド1258〜1980位、パラコッカス属菌種R1534株コドン使用表（表14）に従って一つまたは複数の置換を含む配列番号：177の変種、アセトアセチル-CoAレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号：177の断片、およびヌクレオチド配列が配列番号：177の残基1258〜1980位、またはその相補体の少なくとも30の隣接ヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチドがアセトアセチル-CoAレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列、特に配列番号：177のヌクレオチド1258〜1980位からなる単離ポリヌクレオチド配列；
（9）配列番号：42、配列番号：157、配列番号：177、およびその組み合わせからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列；
（10）（6）（a）〜（6）（f）、（7）（a）〜（7）（c）、（8）（a）、（8）（b）、または（9）の任意の一つのポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター、特にポリヌクレオチド配列が発現制御配列に機能的に連結された発現ベクター、例えば、カロテノイド生合成経路の酵素をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む発現ベクター、特にポリヌクレオチド配列が発現制御配列に機能的に連結された配列番号：180、配列番号：182、配列番号：184、およびその組み合わせからなる群より選択される発現ベクター；
（11）pBBR-K-mev-op16-1、pBBR-K-mev-op16-2、pDS-mvaA、pDS-idi、pDS-hcs、pDS-mvk、pDS-pmk、pDS-mvd、pDS-His-mvaA、pDS-His-idi、pDS-His-hcs、pDS-His-mvk、pDS-His-pmk、pDS-His-mvd、pBBR-K-Zea4、pBBR-K-Zea4-上流、pBBR-K-Zea4-下流、pBBR-K-PcrtE-crtE-3、pBBR-tK-PcrtE-mvaA、pBBR-tK-PcrtE-idi、pBBR-tK-PcrtE-hcs、pBBR-tK-PcrtE-mvk、pBBR-tK-PcrtE-pmk、pBBR-tK-PcrtE-mvd、pBBR-K-PcrtE-mvaA-crtE-3、pDS-His-phaA、pBBR-K-PcrtE-crtW、pBBR-K-PcrtE-crtWZ、pBBR-K-PcrtE-crtZW、およびその組み合わせからなる群より選択される発現ベクター、特に
（a）pBBR-K-mev-op16-1およびpBBR-K-mev-opl6-2からなる群より選択される発現ベクター、
（b）pBBR-K-Zea4、pBBR-K-Zea4-上流、およびpBBR-K-Zea4-下流からなる群より選択される発現ベクター；
（c）pBBR-K-PcrtE-crtE-3、pBBR-tK-PcrtE-mvaA、pBBR-tK-PcrtE-idi、pBBR-tK-PcrtE-hcs、pBBR-tK-PcrtE-mvk、pBBR-tK-PcrtE-pmk、pBBR-tK-PcrtE-mvd、およびその組み合わせからなる群より選択される発現ベクター；
（d）pBBR-K-PcrtE-mvaA-crtE-3である発現ベクター；
（e）pDS-His-phaAである発現ベクター；または
（f）pBBR-K-PcrtE-crtW、pBBR-K-PcrtE-crtWZ、およびpBBR-K-PcrtE-crtZWからなる群より選択される発現ベクター；
（12）（6）（a）〜（f）、（7）（a）〜（c）、（8）（a）、（8）（b）もしくは（9）の任意の一つのポリヌクレオチド配列、または（10）もしくは（11）の発現ベクターを含む培養細胞、またはその細胞の子孫であって、ポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを発現する細胞、特に下記から選択される特性によってさらに特徴づけられる細胞：
（a）カロテノイド生合成経路の酵素をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含むこと、特にカロテノイド生合成経路の酵素をコードするポリヌクレオチド配列が配列番号：180、182、および184からなる群より選択される培養細胞、またはその細胞の子孫であって、ポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを発現する細胞、ならびに
（b）酵母、真菌、細菌、および藻類、特にパラコッカス、フラボバクテリウム、アグロバクテリウム、アルカリゲネス、エルウィニア、大腸菌、または枯草菌からなる群より選択される細菌、特にパラコッカス、特にR-1506、R-1512、R1534、およびR114からなる群より選択されるパラコッカスから選択される群のメンバーであること；
（13）カロテノイドの産生法であって、ポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの発現を可能にする条件下で（12）の細胞を培養する段階、および細胞または細胞の培地からカロテノイドを単離する段階とを含む方法；
（14）カロテノイド産生細胞の作製法であって、
（a）細胞内で発現されるメバロン酸経路の酵素をコードするポリヌクレオチド配列を細胞に導入する段階；および
（b）ポリヌクレオチド配列導入前の細胞によって産生されるカロテノイドのレベルの約1.1〜1,000倍のレベルでカロテノイドを産生する、段階（a）のポリヌクレオチド配列を含む細胞を選択する段階を含む方法、
特に下記から選択される特性によって特徴づけられる方法から選択される方法：
（i）選択段階がポリヌクレオチド配列を導入する前の細胞によって産生されるカロテノイドのレベルの約1.5〜500倍、特に約100倍、または少なくとも約10倍のレベルでカロテノイドを産生する、段階（a）のポリヌクレオチド配列を含む細胞を選択することを含むこと；
（ii）細胞が約1mg/L〜約10g/Lのカロテノイドを産生すること；
（iii）細胞が酵母、真菌、細菌、および藻類からなる群より選択され、特にパラコッカス、フラボバクテリウム、アグロバクテリウム、アルカリゲネス、エルウィニア、大腸菌、および枯草菌からなる群より選択され、特にパラコッカスから選択されること；
（iv）段階（a）の細胞が突然変異細胞である、特にR114およびR1534からなる群より選択され、特に突然変異細胞がその非突然変異親細胞と比較して約1.1〜1,000倍、特に1.5〜500倍、特に少なくとも約100倍、または少なくとも約10倍のレベルのカロテノイドを産生すること；
（v）ポリヌクレオチド配列が、（6）（a）〜（f）、（7）（a）〜（c）、（8）（a）、（8）（b）および（9）のポリヌクレオチド配列から選択され、特にポリヌクレオチド配列が発現制御配列に機能的に連結されている；
（vi）ポリヌクレオチド配列が（10）または（11）の発現ベクターであること；
（vii）導入段階が、形質転換、形質導入、形質移入、リポフェクション、電気穿孔法、接合、およびバイオリスティクスからなる群より選択されること；
（viii）カロテノイドがフィトエン、リコペン、β-カロテン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、アスタキサンチン、アドニキサンチン、クリプトキサンチン、エキネノン、アドニルビン、およびその組み合わせからなる群より選択され、特にカロテノイドがゼアキサンチンであること；
（15）イソプレノイド化合物を産生するための細菌の操作法であって、
（a）イソプレノイド化合物の発現を可能にする条件下、培地中で親細菌を培養し、親細菌の約1.1〜1,000倍のイソプレノイド化合物を産生する突然変異菌を培地から選択する段階；
（b）発現制御配列に機能的に連結された配列番号：42で表されるポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを突然変異菌に導入する段階；および
（c）発現ベクターを含み、段階（a）の突然変異体の少なくとも約1.1倍のイソプレノイド化合物を産生する細菌を選択する段階を含む方法、特に
（i）突然変異を突然変異菌に導入する段階をさらに含む方法であって、
特に突然変異が下記の少なくとも一つから選択される効果を引き起こす方法：
ポリヒドロキシアルカン酸（PHA）経路を不活化する、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼの発現を高める、ファルネシル二リン酸（FPP）シンターゼの発現を高める、カロテノイド経路の酵素の発現を高める、イソペンテニル二リン酸（IPP）をジメチルアリル二リン酸（DMAPP）に変換する酵素の発現を高める、
特に、PHA経路の不活化が、phaB（配列番号：177のヌクレオチド第1258〜1980位）によってコードされるポリペプチドを発現しない突然変異菌を選択すること、または配列番号：177もしくはその断片を用いた同種組換えにより野生型phaB遺伝子の発現を妨害することを含む方法、または
アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼの発現を高めることが、発現制御配列に機能的に連結された配列番号：175もしくは配列番号：177のヌクレオチド第1〜1170位で表されるポリヌクレオチド配列を含むベクターを突然変異菌に導入することを含む方法、または
FPPシンターゼの発現を高めることが、発現制御配列に機能的に連結された配列番号：157のヌクレオチド第295〜1158位で表されるポリヌクレオチド配列を含むベクターを突然変異菌に導入することを含む方法、または
カロテノイド経路の酵素の発現を高めることが、発現制御配列に機能的に連結された配列番号：180、182、および184からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含むベクターを突然変異菌に導入することを含む方法；
（b）イソプレノイドがイソペンテニル二リン酸（IPP）である方法；
（c）イソプレノイドがカロテノイドである方法であって、特にカロテノイドがフィトエン、リコペン、β-カロテン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、アスタキサンチン、アドニキサンチン、クリプトキサンチン、エキネノン、アドニルビン、およびその組み合わせからなる群より選択される方法；
（d）親細菌がパラコッカス、特にR-1512もしくはR-1506、またはR1534もしくはR114であり、特に突然変異体がR114である方法；
（16）下記の特徴を有するパラコッカス属の微生物：
（i）微生物がパラコッカス属菌種（MBIC3966）ではないとの条件で、
配列番号：12との配列類似性が、GeneCompar v. 2.0ソフトウェアをギャップペナルティ0％で用いた相同性計算から得られた類似性行列を用いて＞97％である；
菌株R-1512、R1534、R114、またはR-1506との相同性が、81.5℃でのDNA：DNAハイブリダイゼーションを用いて＞70％である；
ゲノムDNAのG＋C含有率の、R114、R-1512、R1534、およびR-1506のゲノムDNAのG＋C含有率からの変動が1％未満である；および
平均DNAフィンガープリントが、実施例2のAFLP法を用いて菌株R-1512、R1534、R114およびR-1506との類似性約58％に集まる；
（ii）微生物がパラコッカス属菌種（MBIC3966）ではないとの条件で、
18:1w7cが細胞膜の全脂肪酸の少なくとも約75％を構成する；
増殖のための炭素源としてアドニトール、i-エリトリトール、ゲンチオビオース、β-メチルグルコシド、D-ソルビトール、キシリトール、およびキニン酸を用いることができない；ならびに
増殖のための炭素源としてL-アスパラギンおよびL-アスパラギン酸を用いることができる；または
（iii）微生物がパラコッカス属菌種（MBIC3966）ではないとの条件で、
40℃で増殖することができる；
8％NaClを含む培地中で増殖することができる；
pH9.1の培地中で増殖することができる；および
コロニーが黄橙色に着色。
【０１２５】
下記の実施例は本発明の特定の局面をさらに例示するために提供するものである。これらの実施例は例示的なものにすぎず、いかなる様式でも本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１２６】
実施例1：分析および生化学的方法
（a）カロテノイドの分析
試料調製
ジメチルスルホキシド（DMSO）およびテトラヒドロフラン（THF）1：1の溶媒混合物をまず調製した。この溶媒混合物を、ブチルヒドロキシトルエン（BHT、溶媒混合物中0.5g/l）を加えることにより安定化した。安定化DMSO/THF混合物4mlを、使い捨ての15mlポリプロピレン遠心管内の細菌培養物0.4mlに加えた（最終希釈率1/11）。チューブに栓をし、ボルテックスミキサーを用いてそれぞれ10秒間混合した。次いで、試料をBrinkmann Vibramix振盪機上に20分間置いた。チューブを室温、4000rpmで4分間遠心分離し、澄明な黄橙色上清の一定分量を褐色ガラスバイアルに移して、高性能液体クロマトグラフィ（HPLC）分析にかけた。
【０１２７】
HPLC
アスタキサンチン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、β-カロテン、およびリコペンの同時定量のために、逆相HPLC法を開発した。この方法はゼアキサンチンの主要なシス異性体を分離することもできた。クロマトグラフィは、サーモスタット付きの自動試料採取器およびダイオードアレイ検出器を備えたAgilent 1100 HPLC装置を用いて実施した。この方法のパラメーターは下記のとおりであった：
カラム：YMCカロテノイドC30カラム、粒径5ミクロン
250*4.6mm（内径）、スチール製
（YMC、部品No.CT99S052546WT）
ガードカラム：Pelliguard LC-18カートリッジ、20mm
（SUPELCO、部品No.59654）
移動相：メタノール（MeOH）/メチルtert-ブチルエーテル（TBME）勾配
2004527265.tif 000005
泳動時間：28分；典型的カラム圧：開始時90bar；流速：1.0ml/分；検出：UV 450nm；注入量：10μl；カラム温度：15℃
【０１２８】
試薬
メタノールおよびTBMEはHPLC等級で、それぞれEM ScienceおよびJ.T. Bakerから入手した。DMSO（Omnisolve）はEM Scienceから購入した。THF（HPLC溶媒）はBurdick and Jacksonから入手した。
【０１２９】
計算
定量分析をは外部標準（Hoffmann-La Roche、スイス、バーゼルより提供）を用いて二段階較正により行った。計算はピーク面積に基づいていた。
【０１３０】
選択性
方法の選択性は、関連するカロテノイド基準化合物の標準溶液を注入することによって検証した。標的化合物（全トランス-カロテノイド）は完全に分離され、干渉は認められなかった。少量のシス異性体が共溶出されることもあるが、これらの干渉の可能性がある異性体はまれで、通常の分析では考慮する必要はない。化合物の保持時間を表1に示す。
【０１３１】
表1.カロテノイドのHPLC保持時間
2004527265.tif 000006
【０１３２】
直線性
全トランス-ゼアキサンチン（25mg）をDMSO/THF混合物（50ml）に溶解した（最終ゼアキサンチン濃度500μg/ml）。一連の希釈液を調製し（最終ゼアキサンチン濃度250、100、50、10、5、1、および0.1μg/ml）、前述のHPLC法で分析した。直線範囲は0.1μg/ml〜250μg/mlと判明した。相関係数は0.9998であった。
【０１３３】
検出限界
この方法によるゼアキサンチンの検出の下限は60μg/lと判定された。注入量を多くし、積分パラメーターを最適化することにより、検出限界を約5μg/lまで下げることができた。
【０１３４】
再現性
全トランス-ゼアキサンチンの保持時間は非常に安定していた（相対標準偏差（RSD）、0.2％）。ピーク面積再現性は、同じ培養試料の10回の反復分析に基づき、RSDは全トランス-ゼアキサンチンでは0.17％、クリプトキサンチンでは1.0％と判定された。
【０１３５】
（b）粗抽出物の調製と酵素アッセイ法
粗抽出物の調製
パラコッカスおよび大腸菌の粗抽出物を、洗浄した細胞ペレットを1mlの抽出緩衝液（緩衝液はアッセイする酵素に応じて用いた−組成は下記の各酵素アッセイ法と共に明記する）に再懸濁することにより調製した。細胞懸濁液を2mlのプラスティック製バイアルに入れ、Mini Bead Beater 8（Biospec Products、米国オクラホマ州バートルズビル）を用いてガラスビーズと共に撹拌することにより破壊した。破壊は中等度撹拌設定を用いて4℃で実施した。破壊調製物を4℃、21,000×gで20分間遠心分離して細胞片を沈降させ、上清を酵素アッセイ法に直接用いた。
【０１３６】
蛋白質定量
粗抽出物中の蛋白質濃度を、Bio-Rad Protein Assay Reagent（Bio-Rad、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いてBradfordの方法［Anal. Biochem. 72:248-254 (1976)］により定量した。標準曲線作成のためにウシ血清アルブミンを基準蛋白質として用いた。
【０１３７】
アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼアッセイ法
粗抽出物を150mM EPPS（N-[2-ヒドロキシエチル]ピペリジン-N'-[3-プロパンスルホン酸]）緩衝液、pH8.0中で調製した。アッセイ法はSlaterら［J. Bacteriol. 180:1979-1987 (1998)］によって記載された方法に従って、チオリシスの方法に実施した。このアッセイ法はアセトアセチル-CoAの消失を304nmで分光光度的に測定する。反応混合物は150mM EPPS緩衝液（pH8.0）、50mM MgCl2、100μM CoA、40μMアセトアセチル-CoA、および粗抽出物を含んでいた。反応を30℃で行い、粗抽出物の添加によって開始した。304nmでのアセトアセチル-CoAの消失をSpectraMAX Plusプレート読み取り器（Molecular Devices Corp.、米国カリフォルニア州サニーベール）および石英マイクロタイタープレートを用いてモニターした（いかなる標準的な分光光度計も用いることができる）。活性（U/mg蛋白質で表す）を、アセトアセチル-CoAで作成した標準曲線を用いて計算した（活性1ユニット＝1分あたりに消費されるアセトアセチル-CoA 1μmol）。アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ活性の検出下限は0.006U/mgであった。
【０１３８】
HMG-CoAシンターゼアッセイ法
HMG-CoAシンターゼをHondaら［Hepatology 27:154-159 (1998)］の方法に従ってアッセイした。このアッセイ法において、アセチル-CoAおよびアセトアセチル-CoAからのHMG-CoAの形成を、反応生成物と基質とをHPLCで分離することにより直接測定した。粗抽出物を50mMトリス-HCl緩衝液（pH8.0）中で調製した。反応混合物（0.1ml）は50mMトリス-HCl緩衝液（pH8.0）、0.1mM EDTA、20mM MgCl2、0.1mMアセトアセチル-CoA、0.8mMアセチル-CoA、および粗抽出物を含んでいた。粗抽出物を加える前に反応物を30℃で2分間予備インキュベートした。30℃で5分間の反応後、0.2mlの200mMリン酸テトラブチルアンモニウム（TBAP、メタノール-水（3：2）に溶解（最終pHは5.5）、内部回収標準として0.2mMプロピオニル-CoAを含む）の添加によって反応を停止した。次いで混合物を4℃、21,000×gで3分間遠心分離した後、逆相イオン対HPLCによって分析するまで氷上に置いた。HMG-CoAおよびプロピオニル-CoAをアセチル-CoAおよびアセトアセチル-CoAからNova-Pak C18カラム（3.9×150mm、Waters Corporation、米国マサチューセッツ州ミロード）を用いて分離した。注入量は20μlで、移動相はメタノール-水（1：1）に溶解した50mM TBAP（最終pHは5.5）、流速は1.0ml/分であった。HMG-CoAおよびプロピオニル-CoAを254nmの吸収により検出した。反応で生成したHMG-CoAを、基準HMG-CoAを用いて作成した標準曲線との比較により定量した。活性はU/mg蛋白質と定義した。活性1ユニット＝1分あたりに生成されるHMG-CoA 1nmol。HMG-CoAシンターゼの検出下限は約1U/mgであった。
【０１３９】
HMG-CoAレダクターゼアッセイ法
粗抽出物を、50mM KC1、1mM EDTA、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma Chemical Co.、米国ミズーリ州セントルイス、カタログ#P-2714）を含む25mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.2）中で調製した。アッセイ法はTakahashiら［J. Bacteriol. 181:1256-1263 (1999)］の方法に従って実施した。このアッセイ法はNADPHのHMG-CoA依存性酸化を340nmで分光光度的に測定する。反応混合物は25mM リン酸カリウム緩衝液（pH7.2）、50mM KC1、1mM EDTA、5mMジチオスレイトール、0.3mM NADPH、0.3mM R,S-HMG-CoA、および粗抽出物を含んでいた。反応は30℃で行い、HMG-CoAの添加により開始した。NADPHのHMG-CoA依存性酸化はSpectraMAX Plusプレート読み取り器（Molecular Devices Corp.、米国カリフォルニア州サニーベール）および石英マイクロタイタープレートを用いて340nmでモニターした（いかなる標準的な分光光度計も用いることができる）。活性（U/mg蛋白質で表す）を、NADPHで作成した標準曲線を用いて計算した（活性1ユニット＝1分あたりに酸化されるNADPH 1μmol）。HMG-CoAレダクターゼ活性の検出下限は0.03U/mgであった。
【０１４０】
メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼおよびメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼアッセイ法
メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、およびメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼの基質調製およびアッセイ法はPopjak［Methods Enzymol. 15:393-425 (1969)］によって詳細に記載されている。すべてのアッセイ法で、酵素活性1ユニットは1分あたりに生成される生成物1μmolと定義されている。これらの分光光度法およびラジオクロマトグラフィによるアッセイ法に加えて、代替法、例えば反応基質と生成物のHPLC分離を用いた方法を用いることもできる。メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、およびメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼの検出下限は典型的には約0.001U/mg蛋白質である。
【０１４１】
IPPイソメラーゼアッセイ法
粗抽出物を50mMトリス-HCl緩衝液（pH7.5）中で調製した。アッセイ法はSpurgeonら［Arch. Biochem. Biophys. 230:445-454 (1984)］の方法を用いて実施した。このアッセイ法はIPPおよびDMAPPの酸不安定性の差に基づいている。反応混合物（最終容量0.1ml）は50mMトリス-HCl緩衝液（pH7.5）、2mMジチオスレイトール、5mM MgCl2、20μM[1-14C]-IPP、および粗抽出物を含んでいた。反応は30℃で15分間行い、濃HCl：メタノール（4：1）の混合物0.3mlを添加し、37℃で20分間さらにインキュベートすることによって停止した。ヘキサン（0.9ml）を加え、チューブを混合した（ボルテックスミキサーを用いて10秒間を4回）。遠心分離（21,000×g、5分間）後、ヘキサン層0.6mlをシンチレーションバイアルに移し、シンチレーション液を加え、放射能を計数した。活性はU/mg蛋白質で表す。活性1ユニット＝1分あたりに酸不安定性の生成物に取り込まれる[1-14C]-IPP 1pmol。IPPイソメラーゼ活性の検出下限は1U/mgであった。
【０１４２】
FPPシンターゼアッセイ法
粗抽出物を50mMトリス-HCl緩衝液（pH8.0）中で調製した。FPPシンターゼアッセイ法は前述のIPPイソメラーゼアッセイ法とほぼ同様で、IPPおよびFPPの酸不安定性の差に基づいていた（Spurgeonら、上記）。反応混合物（最終容量0.1ml）は50mMトリス-HCl緩衝液（pH8.0）、2mMジチオスレイトール、5mM MgCl2、20μM[1-14C]-IPP、25μM GPP（ゲラニルピロリン酸）、および粗抽出物を含んでいた。反応は30℃で15分間行い、濃HCl：メタノール（4：1）の混合物0.3mlを添加し、37℃で20分間さらにインキュベートすることによって停止した。ヘキサン（0.9ml）を加え、チューブを混合した（ボルテックスミキサーを用いて4×10秒間）。遠心分離（21,000×g、5分間）後、ヘキサン層0.6mlをシンチレーションバイアルに移し、シンチレーション液を加え、放射能を計数した。酵素活性ユニットおよび検出下限はIPPイソメラーゼに対する前述の定義と同じであった。高いIPPイソメラーゼ活性がFPPシンターゼ活性の測定を妨害する場合には、粗抽出物を5mMヨードアセトアミド存在下で5分間予備インキュベートして、IPPイソメラーゼ活性を阻害してもよい。
【０１４３】
GGPPシンターゼアッセイ法
粗抽出物を2mMジチオスレイトールを含む50mMトリス-HCl緩衝液（pH8.0）中で調製した。GGPPシンターゼはKuzuguchiら［J. Biol. Chem. 274:5888-5894 (1999)］の方法に従ってアッセイした。このアッセイ法はFPPシンターゼについて前述したものと同じ原理に基づいている。反応混合物（最終容量0.1ml）は50mMトリス-HCl緩衝液（pH8.0）、2mMジチオスレイトール、5mM MgCl2、20μM[1-14C]-IPP、25μM FPP、および粗抽出物を含んでいた。反応条件およびその後のシンチレーション計数のための試料の処理はすべて、FPPシンターゼについて前述したものと同じであった。IPPイソメラーゼ活性を阻害するための抽出物のヨードアセトアミド処理も、前述のとおり用いることができる。酵素活性ユニットおよび検出下限はIPPイソメラーゼに対する前述の定義と同じであった。
【０１４４】
アセトアセチル-CoAレダクターゼアッセイ法
粗抽出物を50mM KClおよび5mMジチオスレイトールを含む50mMトリス-HCl緩衝液（pH7.5）中で調製した。アセトアセチル-CoAレダクターゼはChohanおよびCopeland［Appl. Environ. Microbiol. 64:2859-2863 (1998)］の方法に従ってアッセイした。このアッセイ法はNADPHのアセトアセチル-CoA依存性酸化を340nmで分光光度的に測定する。反応混合物（1ml）は50mMトリス-HCl緩衝液（pH8.5）、15mM MgCl2、250μM NADPH、および100μMアセトアセチル-CoAを含んでいた。反応は石英キュベット内、30℃で行い、アセトアセチル-CoAの添加により開始した。活性（U/mg蛋白質で表す）を、NADPHで作成した標準曲線を用いて計算した（活性1ユニット＝1分あたりに酸化されるNADPH 1μmol）。アセトアセチル-CoAレダクターゼ活性の検出下限は約0.01U/mgであった。
【０１４５】
実施例2：フラボバクテリウム属菌種のパラコッカスとしての分類学的再分類
本実施例は以前にフラボバクテリウム属菌種R-1512株（ATCC21588）と命名されたゼアキサンチン産生菌のパラコッカス属菌種R-1512株（ATCC21588）としての分類学的再分類について記載する。包括的なゲノムおよび生化学／生理学的分析を、Belgian Coordinated Collections of Microorganisms/Laboratorium voor Microbiologie, Universiteit Gent (BCCM（商標）/LMG)により、細菌分類の科学的標準として現在認められている最新の方法を用いて実施した。パラコッカス属菌種R-1512株の他に、パラコッカス属に属するいくつかの他の細菌を試験に含めた（表2にまとめている）。
【０１４６】
表2.  分類学的試験に用いた細菌
2004527265.tif 000007
【０１４７】
R1534およびR114株は、古典的な突然変異誘発および改善されたゼアキサンチン産生のスクリーニングによるR-1512株由来の突然変異体である。一次スクリーニングは、最も高い色強度を生じるコロニーを選択することによって遂行した。二次スクリーニングは、実施例1のHPLC法により液体培地中で遂行した。R-1506株はR-1512株を提供した環境微生物の同じ初期スクリーニングから得た独立の単離株であった。MBIC3024、MBIC3966、MBIC4017、およびMBIC4020株は、それらの16S rDNA遺伝子のヌクレオチド配列によりパラコッカス属の一員であると同定された（DNA配列は公的EMBLデータベースに寄託した。表5参照）。パラコッカス マルクシ（Paracoccus marcusii） DSM 11574Tおよびパラコッカス カロチニファシエンス（Paracoccus carotinifaciens） E-396Tは、カロテノイド産生菌の最近記載された基準菌株である［Harkerら、Int. J. Syst. Bacteriol. 48:543-548 (1998)；Tsubokuraら、Int. J. Syst. Bacteriol. 49:277-282 (1999)］。パラコッカス ソルヴェンティヴォランス（Paracoccus solventivorans） DSM 6637Tは、パラコッカス属の一員であるが、用いた他の細菌との関係が遠く、「対照」菌株として試験に含めた。
【０１４８】
予備的実験の結果、下記の結論を得た。本明細書に示す各方法は、生物間の分類学的関連性または相対的な類似度を決定する、十分に認められた能力を有している。細菌分類群を記述するための方法およびそれらの使用が、Van Dammeら、Microbiological Reviews 60:407-438 (1996)およびJanssenら、Microbiology 142:1881-1893 (1996)によって詳細に記載および比較されている。
（1）R1534およびR114株の細胞膜の脂肪酸分析により、二つの菌株が高度に類似していることが判明し、これらの菌株のパラコッカス デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）およびロドバクタ カプスラトゥス（Rhodobacter capsulatus）に対する分類学的関連性が示された。
（2）細胞蛋白質の一次元ゲル電気泳動により、R1534およびR114の間の高度な類似性（種内レベルの関連性）が示されたが、プロファイルによりこれらの菌株のR. カプスラトゥスまたはP. デニトリフィカンスのいずれかへの割り当ては正当化されなかった。
（3）R1534とR. カプスラトゥス LMG2962TおよびP. デニトリフィカンス LMG4218Tとの間のDNA：DNAハイブリダイゼーションにより、R1534株はR. カプスラトゥスでもP. デニトリフィカンスでもないことが確認された。
（4）R1534およびR114株由来の16S rDNA遺伝子の塩基配列決定により、これらの生物はパラコッカス属に属するが、これらは新しい種であることが判明した。パラコッカス属菌種MBIC3966、MBIC4020、およびMBIC3024株の16S rDNA遺伝子と最も高度の配列類似性が観察された。
（5）Amplified Fragment Length Polymorphism（AFLP（商標））を用いたR1534およびR-1512株のDNAフィンガープリントにより、二つの菌株由来のゲノムDNAの全体にわたる高い類似性が明らかとなり、種内の関連性が示された（すなわち、AFLP（商標）は同じ種の2メンバー間を区別することができる）。
【０１４９】
以下の項では、パラコッカス属菌種R-1512株（およびその突然変異誘導体#1534およびR114）の本包括的分類学的試験の結果と結論を示す。
【０１５０】
16S rDNA塩基配列決定および系統学的試験
表2に示した細菌をLMG培地185（必要に応じて1.5％Difco Bacto寒天を補足した（TSA）BBL 11768）中で培養した。ゲノムDNAをNiemannら［J. Appl. Microbiol. 82:477-484 (1997)］のプロトコルに従って調製した。16S rDNAをコードする遺伝子を、R-1512、R1534、R114、およびR-1506株由来のゲノムDNAから、表3に示すプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅した。
【０１５１】
表3.  パラコッカス属菌種R-1512、R1534、R114、およびR-1506株における16S rDNAをコードするDNAのPCR増幅に用いたプライマー
2004527265.tif 000008
aF、順方向プライマー；R、逆方向プライマー。順方向プライマー16F27（別名：PA）はR1534およびR-1506株に用い、順方向プライマー16F38（別名：ARI C/T）はR-1512およびR114株に用いた。逆方向プライマー16R1522（別名：PH）はすべての菌株に用いた。
b大腸菌16S rDNA遺伝子配列の番号を基準にしたハイブリダイゼーション位置。
【０１５２】
PCR増幅したDNAをQiaquick PCR Purification Kit（Qiagen GmbH, Hilden、ドイツ）を用いて精製した。完全塩基配列決定をApplied Biosystems, Inc. 377 DNA Sequencerおよび製造者（Perkin-Elmer、Applied Biosystems Division、米国カリフォルニア州フォスターシティ）のプロトコルを用い、「商標ABI PRISM商標Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit（登録商標AmpliTaq DNA Polymerase, Fs)」を用いて実施した。DNA塩基配列決定に用いたプライマーを表4に示す。
【０１５３】
表4.  パラコッカス属菌種R-1512、R1534、R114、およびR-1506株における16S rDNAをコードする遺伝子のPCR増幅部分を塩基配列決定するために用いたプライマー
2004527265.tif 000009
aF、順方向プライマー；R、逆方向プライマー。
b大腸菌16S rDNA遺伝子配列の番号を基準にしたハイブリダイゼーション位置。
【０１５４】
配列の部分的重なりが得られるように5つの順方向プライマーおよび三つの逆方向プライマーを用いて、信頼性の高い構築された配列データを確保した。配列構築はプログラムAutoAssembler（Perkin-Elmer、Applied Biosystems Division、米国カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて実施した。系統学的解析は、コンセンサス配列（R-1512、R1534、R114、およびR-1506株由来）を国際ヌクレオチド配列ライブラリEMBLから収集した小さいリボソームサブユニット配列の整列に含めた後、ソフトウェアパッケージGene-Compar（商標）（v. 2.0、Applied Maths B.V.B.A.、ベルギー、コルトレイク）を用いて実施した。この整列化トはオープンギャップペナルティ100％およびユニットギャップペナルティ0％を用いて二つ一組で計算した。類似性行列をギャップペナルティ0％、不明塩基廃棄後の相同性計算によって作成した。得られたツリーを隣接結合（neighbor-joining）法を用いて構築した。
【０１５５】
パラコッカス属菌種R-1512株からの16s rDNA遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号：12として示す。R-1512株とその最も近い類縁体との間の16S rDNA配列類似性のパーセンテージで示した距離行列を表5に示す。R-1512株ならびにその突然変異誘導体R1534およびR114からの配列は同じであった。R-1506からの配列は後者菌株からの配列とヌクレオチド1個のみ異なっていた。これは、R-1512およびR-1506株が系統学的に関連性が高く、同じ種に属するようであることを示していた（DNA：DNAハイブリダイゼーションにより確認、下記参照）。R-1512およびR-1506の配列をEMBLライブラリで公的に入手可能な配列と比較することにより、R-1512およびR-1506はパラコッカス属に位置づけられた。しかしながら、現在分類学的に確実に記載されている全てのパラコッカス属種との間で観察された配列類似性は＜97％で、この値は一般に種レベルでの関連性の可能性の限度として認められている［StackebrandtおよびGoebel、Int. J. Syst. Bacteriol. 44:846-849 (1994)］。これは、R-1512（およびその突然変異誘導体）およびR-1506株が一つまたは二つの新しいパラコッカス属種に属することを示すものであった。97％より高い配列類似性（種レベルでの関連性の可能性として有意）が4つの無名のパラコッカス菌株ならびにR-1512、R1534、R114、およびR-1506の間で観察され、一つまたは複数の無名（MBIC）の菌株が種レベルでR-1512およびR-1506株と関連している可能性が示唆された。クラスタ分析（パラコッカス属菌種R-1512、R1534、R114、R-1506、MBIC3966、およびパラコッカス属の他のメンバーの間の系統学的関連性を示す系統樹）に基づき、種関連性を解析するためのDNA：DNAハイブリダイゼーション実験用にR-1512、R1534、R114、R-1506株、および4つの無名のパラコッカス菌株（MBIC3024、MBIC3966、MBIC4017、およびMBIC4020）が選択された。
【０１５６】
表5.  パラコッカス属菌種R-1512およびその最も近い類縁体の間の16S rDNA配列類似性のパーセンテージで表した距離行列
2004527265.tif 000010
a基準菌株の後ろにはTを付与。
【０１５７】
DNA：DNAハイブリダイゼーションおよびG+C含有率の定量
表5に示した細菌をLMG培地185中で培養した。ゲノムDNAをWilson［Ausabelら（編）、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 2.4.1-2.4.5 (1987)］のプロトコルに従って調製した。DNAのG+C含有率はMesbachら［Int. J. Syst. Bacteriol. 39:159-167 (1989)］に従い、Loganら［Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50:1741-1753 (2000)］の改変のように、HPLCによって定量した。報告値は同じDNA試料でのこれらの測定の平均である。DNA：DNAハイブリダイゼーションはDe Leyら［Eur. J. Biochem. 12:133-142 (1970)］によって記載された初期復元速度法（initial renaturation rate method）を用いて実施した。ハイブリダイゼーション温度は81.5℃であった。この方法では、Vauterinら［Int. J. Syst. Bacteriol. 45:472-489 (1995)］により+/-5.8％の平均偏差が報告されている。細菌DNAのG+C含有率およびDNAハイブリダイゼーション実験の結果を表6にまとめている。
【０１５８】
表6.  パラコッカス属菌種株由来のDNAのG+C含有率（mol％）および菌株間のDNA相同性の割合
2004527265.tif 000011
a未定量
【０１５９】
R-1512、R1534、R114、R-1506、およびMBIC3966株は、70％より高い（一般に認められた種の記述の限度［Wayneら、Int. J. Syst. Bacteriol. 37:463-464 (1987)］のDNA相同性を示し、したがってパラコッカス属内の同じ種に属する。これら5つの菌株のG+C含有率は66.9％〜67.7％まで変動し、したがって十分に限定された種に特徴的な、1％以内にとどまっていた。一方、MBIC3024、MBIC4017、およびMBIC4020株ならびにR-1512、R1534、R114、R-1506、およびMBIC3966株の間の低いDNA相同性は、MBIC3024、MBIC4017、およびMBIC4020がそれぞれパラコッカス属内の異なるゲノム種に属していることを示していた。
【０１６０】
AFLP（商標）を用いたDNAフィンガープリント
AFLP（商標）は、制限断片の選択的増幅および選択的視覚化を介した全ゲノムDNAフィンガープリントのためのPCRに基づいた技術である［Vosら、Nucleic Acids Research 23:4407-4414 (1995)；Janssenら、上記］。この分析において、パラコッカス属菌種R-1512、R1534、R114、R-1506、MBIC3966株、およびパラコッカス マルクシ DSM 11574Tを比較して種内関連性を評価した。これらの細菌をLMG培地185中で培養した。これらの各細菌由来のゲノムDNAをWilson（上記）のプロトコルに従って調製した。精製DNAを二つの制限酵素、4-塩基切断酵素（4-base cutter）および6-塩基切断酵素（6-base cutter）で消化した。この方法で、二つの異なる末端を持ち、効率的なPCRに適したサイズの、限られた数の断片を得た。一つの互換末端（compatible end）を含むアダプター（15〜20bpの小さい二本鎖DNA分子）を制限断片の適当な「粘着」末端に連結した。両方のアダプターは制限酵素に半分の部位特異的で、異なる配列を有している。これらのアダｐターはPCRプライマーの結合部位として役立つ。ここで、用いた制限酵素はApaI（6塩基切断酵素、認識配列GGGCC/C）およびTaqI（4塩基切断酵素、認識配列T/GCA）であった。制限酵素による切断で生じた粘着末端にライゲートしたアダプターの配列を表7に示す（配列番号：13〜22）。PCRを制限断片の選択的増幅に用いた。PCRプライマーは制限断片のアダプター末端に特異的にアニールした。プライマーは3'末端に一つのいわゆる「選択的塩基」を含み、これは制限部位を越えて断片中へ伸長するため、制限部位に隣接する適当な相補的配列を有する制限断片だけが増幅された。用いたPCRプライマーの6つの組み合わせの配列も表7に示す。
【０１６１】
表7.  AFLP（商標）解析に用いたアダプターおよびPCRプライマー
2004527265.tif 000012
【０１６２】
増幅の後、DNAシーケンサー（ABI377）を用い、高分解能ポリアクリルアミドゲル上でPCR生成物をその長さによって分離した。6-bp切断酵素により作製した制限ハーフサイト（restriction halfsite）特異的アダプターを含む断片を、対応するプライマー5'末端の32P標識によるオートラジオグラフィにより視覚化した。電気泳動パターンをスキャンし、Gel-Comparu（商標） 4.2ソフトウェア（Applied Maths, B.V.B.A.、ベルギー、コルトレイク）を用いて数値的に解析し、ピアソン曲線マッチング係数およびウェイトなしペア群平均リンキングを用いてクラスター化した［クラスター化の方法はSneathおよびSokalのNumerical Taxonomy. Freeman & Son、サンフランシスコ(1973)に概説されている］。
【０１６３】
プライマーの6つの組み合わせ（表7、PC A〜H）すべてにおいて、パラコッカス属菌種R-1512、R1534、およびR114株のDNAフィンガープリントは同じではないとしても非常に類似していた。小さい相違が認められた場合、再現性は評価しなかった。R1534およびR114株はR-1512株由来であるため、三つの菌株間の高度な類似性または同一性が予想された。プライマーのすべての組み合わせで、R-1512、R1534、およびR114株は明らかにR-1506およびMBIC3966株とは区別され、後者の二菌株は同じように新しいパラコッカス属種に属していた。しかしながら、フィンガープリントからはR-1512、R1534、およびR114株が、R-1506またはMBIC3966のいずれかに、より関連性が高いとの明確な指標は得られなかった。用いた条件下では、新しい種の5つの菌株は平均約58％の類似性レベルでクラスター化し（この値は6つのAFLP（商標）実験（プライマーの6つの組み合わせ）における新しい種の分岐点の6つの値の平均である）、クラスターは系統学的に関連するカロテノイド産生パラコッカス属種の基準菌株であるパラコッカス マルクシ DSM 11574Tのプロファイルから明らかに区別することができる。パラコッカスMarcusii DSM 11574Tおよび新しい種の6つの分岐点の類似性平均値は約11％であった。
【０１６４】
脂肪酸分析
パラコッカス属菌種R-1512、R1534、R114、R-1506、MBIC3966株の細胞膜の脂肪酸組成を、基準菌株P.マルクシ DSM 11574T、P. カロチニファシエンス E-396T、およびP. ソルヴェンティヴォランス DSM 6637Tと比較した。細菌をLMG培地185中、28℃で24時間培養した。脂肪酸組成を、市販の装置MIDI（Microbial Identification System, Inc.、米国デラウェア州）を用いてガスクロマトグラフィにより定量した。脂肪酸の抽出および分析は、MIDI装置の推奨に従って行った。表8に試験したすべての菌株の結果をまとめている。新しいパラコッカス属種の5つの菌株（R-1512、R1534、R114、R-1506、MBIC3966）について、平均プロファイルを計算した。8つの微生物はすべて同等の細胞膜脂肪酸組成を示し、18:1 w7cが主な化合物であった。脂肪酸組成における小さい相違が、新しいパラコッカス属菌と三つの基準菌株との間に見られたにすぎなかった。
【０１６５】
増殖のための炭素源の利用
炭素源の好気的利用を試験するために、95の基質を含むBIOLOG-SF-N Microplateマイクロタイタープレート（Biolog Inc.、米国カリフォルニア州ヘイワード）を用いたが、例外としてウェルE6の基質は通常のD,L-乳酸ナトリウム塩の代わりにD,L-乳酸メチルエステルであった。表9に同定した各菌株からの細胞をLMG培地12（海洋寒天、Difco 0979）中、28℃で24時間培養した。滅菌蒸留水中で密度が0.5マックファーランド単位（McFarland unit）の細胞懸濁液を調製した。この懸濁液から、18滴をAUX培地21ml（API 20NE、bioMerieux、フランス）に移し、ゆっくり撹拌した。懸濁液0.1mlをBIOLOG MicroPlateの各ウェルに移し、プレートを30℃でインキュベートした。ウェルを48時間後および6日後に増殖について目視検査した。また、6日の時点でBIOLOGプレート読み取り器を用いてマイクロタイタープレートを読み取ることにより、目視評点を確認した。
【０１６６】
BIOLOG解析の結果を表9に示す。増殖（陽性反応）を、基質を含まない基準ウェルと比較した濁度の上昇で判定した。良好な増殖（+）、弱い増殖（±）、および増殖なし（-）の区別をつけた。括弧内の結果は、48時間後に得られた結果と異なる場合の6日後の結果である。クエスチョンマークは6日の時点での不明確な結果を示す。試験した95の炭素源のうち、新しいパラコッカス属種を構成する5つの菌株（R-1512、R1534、R114、R-1506、およびMBIC3966）すべての増殖のために、12を用いることができ、47は用いることができなかった。これらの5菌株は残る36の基質に対して様々な増殖反応を示した。新しいパラコッカス属種は、それらが7つの炭素源（アドニトール、i-エリトリトール、ゲンチオビオース、β-メチルグルコシド、D-ソルビトール、キシリトール、およびキニン酸）を用いることができないことで、二つの他のカロテノイド産生菌（P.マルクシ DSM 11574TおよびP. カロチニファシエンス E-396T）と区別することができた。新しいパラコッカス属種の全5メンバーによって利用される二つの炭素源（L-アスパラギンおよびL-アスパラギン酸）は、P.マルクシ DSM 11574Tによって増殖のために用いられることはなかった。
【０１６７】
表8.  パラコッカス属菌種R-1512、R1534、R114、R-1506、MBIC3966、および他のパラコッカス属種の三つの基準菌株、すなわちP.マルクシ DSM 11574T、P.カロチニファシエンス E-396T、およびP.ソルヴェンティヴォランス DSM 6637Tの細胞膜の脂肪酸組成
2004527265.tif 000013
aND、未検出
【０１６８】
生化学試験
選択した生化学的特徴を、API 20NEストリップ（bioMerieux、フランス）を用いて試験した。表10に同定した各菌株からの細胞をLMG培地12上、28℃で24時間培養した。細胞懸濁液を調製し、ストリップに製造者の指示に従って接種した。ストリップを28℃でインキュベートし、24および48時間後に結果を調べた。結果を表10にまとめている。試験した9の特徴のうち、一つ（ウレアーゼ活性）のみが新しいパラコッカス属種の5菌株で変動性の反応を示した。これら9つの試験では、新しいパラコッカス属種とP.マルクシ DSM 11574TおよびP. カロチニファシエンス E-396Tとの間の区別はされなかった。
【０１６９】
表9.  パラコッカス属菌種株による増殖のための炭素源の利用
2004527265.tif 000014
2004527265.tif 000015
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2004527265.tif 000017
GalNAc：N-アセチル-D-ガラクトサミン；GlucNAc：N-アセチル-D-グルコサミン；β-Methylgluc：β-メチルグルコシド；MMSucc：モノ-メチルスクシネート；GalAlactone：D-ガラクトン酸ラクトン；GalacturonicA: D-ガラクツロン酸；GlucosaminicA：D-グルコサミン酸；GlucuronicA：D-グルクロン酸；AHBA：α-ヒドロキシ酪酸；BHBA：β-ヒドロキシ酪酸；GHBA：γ-ヒドロキシ酪酸；PHPAA：p-ヒドロキシフェニル酢酸；AKBA：α-ケト酪酸；AKGA：α-ケトグルタル酸；AKVA：α-ケト吉草酸；LAME：D,L-乳酸メチルエステル；SaccA：D-糖酸；BromosuccA：ブロモコハク酸；GAA：グリシル-L-アスパラギン酸；GGA：グリシル-L-グルタミン酸；HydPro：ヒドロキシ-L-プロリン；PyroGluA：L-ピログルタミン酸；GABA：γ-アミノ酪酸；PEA：フェニルエチルアミン；GlycP：D,L-α-グリセロリン酸；Gluc-1-P：グルコース-1-リン酸；Gluc-6-P：グルコース-6-リン酸
【０１７０】
表10.  パラコッカス属菌種株：12＝R1512；34＝R1534；14＝R114；06＝R1506；66＝MBIC3966；74＝DSM 11574T、96＝E-396T、37＝DSM 6637Tの生化学的特徴
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a：β-グルコシダーゼ；b：プロテアーゼ；S/+5：遅い+5日
【０１７１】
生理学的試験
いくつかの生理学的および形態学的試験を、新しいパラコッカス属種の5菌株、ならびにパラコッカス マルクシ DSM 11574T、パラコッカス カロチニファシエンス E-396T、およびパラコッカス ソルヴェンティヴォランス DSM 6637Tに対して行った。各試験に用いた方法は下記のとおりであった。
【０１７２】
増殖のための温度範囲
細胞をLMG培地12上、28℃で24時間培養した。密度が1〜2マックファーランド単位の細胞懸濁液を滅菌蒸留水中で調製した。この懸濁液から3滴をLMG培地12の寒天表面上に移した。1滴を画線することにより希釈し、他の2滴は妨害せずにそのまま置いた。プレートを好気的条件下、10℃、25℃、30℃、33℃、37℃、および40℃でインキュベートし、24時間、48時間、および5日後に増殖をチェックした。増殖は、視覚的増殖（液滴中のコンフルエントおよび希釈接種物による画線中のコロニー）として、30℃での増殖（すなわち「対照」）と比較して判定した。判定は次のとおりに行った（対照プレートに対して）；
2004527265.tif 000019
括弧内の結果は、画線中の増殖結果が未妨害の液滴中のコンフルエント増殖と異なる場合には、画線中の結果である。
【０１７３】
塩耐容性
細胞をLMG培地12上、28℃で24時間培養した。密度が1〜2マックファーランド単位の細胞懸濁液を滅菌蒸留水中で調製した。この懸濁液から3滴を、NaClを最終濃度3％、6％、および8％に達するまで補足したLMG培地12の寒天表面上に移した。1滴を画線することにより希釈し、他の2滴は妨害せずにそのまま置いた。プレートを好気的条件下、28℃でインキュベートし、24時間、48時間、および5日後に増殖をチェックした。増殖は、視覚的増殖（液滴中のコンフルエントおよび希釈接種物による画線中のコロニー）として、NaClを添加しない増殖（対照）と比較して判定した。判定は次のとおりに行った（対照プレートに対して）；
2004527265.tif 000020
括弧内の結果は、画線中の増殖結果が未妨害の液滴中のコンフルエント増殖と異なる場合には、画線中の結果である。
【０１７４】
増殖のためのpH範囲
細胞をLMG培地12上、28℃で24時間培養した。密度が1〜2マックファーランド単位の細胞懸濁液を滅菌蒸留水中で調製した。この懸濁液から3滴を、pHを変更し、オートクレーブ後に最終pH値がpH6.1、pH6.3、pH7.0、pH7.7、pH8.1、およびpH9.1とした液体LMG培地12（10ml）を含むチューブに移した。培養液を28℃で好気的に（振盪しながら）インキュベートした。増殖を24時間、48時間、3日、および6日後にチェックした。増殖は濁度の増大（BIOLOG濁度計を用いて透過の割合（％）で測定）として、pH7.0での増殖（対照）と比較して判定した。判定は次のとおりに行った（対照に対して）；
2004527265.tif 000021
【０１７５】
デンプン加水分解
細胞をLMG培地12のプレート上、28℃で24時間培養した。プレートから細胞の白金耳一杯の細胞を採取し、0.2％可溶性デンプンを補足したLMG培地12の寒天表面上に1画線として移した。次いで、プレートを好気的条件下、28℃でインキュベートした。菌株が良好に増殖した時点（48時間後）で、プレートにルゴール溶液（蒸留水中0.5％I2および1％KI）を注いだ。加水分解を増殖に沿った澄明領域（デンプンが加水分解されていない寒天の青色と対比）として判定した。
【０１７６】
脱窒素作用
細胞をLMG培地12のプレート上、28℃で24時間培養した。プレートから細胞の白金耳一杯の細胞を採取し、1％KNO3を補足した半固体（0.1％寒天）LMG培地12を含むチューブに穿刺した。プレートを28℃で5日間インキュベートした。脱窒素作用（硝酸塩からN2）を穿刺部位に沿ったガス生成で判定した。
【０１７７】
電子受容体を加えない嫌気生活下での増殖
細胞をLMG培地12のプレート上、28℃で24時間培養した。プレートから細胞の白金耳一杯の細胞を採取し、LMG培地12の寒天表面上に画線した。寒天プレートを嫌気性条件（約10％CO2＋約90％N2）下、30℃でインキュベートした。24時間後および5日後にプレートを増殖についてチェックした。増殖は目視により判定し、好気性（対照）条件と比較した。判定は次のとおりに行った（対照に対して）；
2004527265.tif 000022
【０１７８】
グルコースを加えての嫌気性条件下での増殖（発酵）
細胞をLMG培地12のプレート上、28℃で24時間培養した。プレートから細胞の白金耳一杯の細胞を採取し、HughおよびLeifsonの塩基性寒天培地［J. Bacteriol. 66:24-26 (1953)］を含むチューブに穿刺した。培地の上面にパラフィン油を加え、チューブを30℃でインキュベートした。48時間後および5日後にチューブを増殖および酸の生成についてチェックした。増殖は目視により判定した。判定は次のとおりに行った；
2004527265.tif 000023
【０１７９】
電子受容体としてKNO3を用いた嫌気性条件下での増殖
細胞をLMG培地12のプレート上、28℃で24時間培養した。プレートから細胞の白金耳一杯の細胞を採取し、0.1％KNO3を補足したLMG培地12の寒天表面上に画線した。プレートを嫌気性条件（約10％CO2＋約90％N2）下、30℃でインキュベートし、3日後に増殖についてチェックした。増殖は好気性（対照）条件と比較した目視による増殖で判定した。判定は次のとおりに行った（対照に対して）；
2004527265.tif 000024
【０１８０】
カタラーゼおよびオキシダーゼ反応
細胞をLMG培地12のプレート上、28℃で24時間培養した。カタラーゼ活性の陽性結果はコロニーを1滴の10％H2O2に懸濁した後の気泡生成であった。オキシダーゼ活性の陽性結果は1％テトラメチルパラフェニレンに浸けたろ紙上にコロニーをこすりつけた後の赤紫色の発色であった。
【０１８１】
コロニー着色
細胞をLMG培地12上、28℃で5日間培養した。コロニーの色を目視観察した。
【０１８２】
細胞の形態および運動性
細胞をLMG培地12上、28℃で24時間培養した。細胞懸濁液を滅菌食塩水中で作製した。細胞の形態および運動性を、位相差光学を備えたOlympus光学顕微鏡（倍率1000×）を用いて顕微鏡で観察した。
【０１８３】
生理学的および形態学的試験の結果を表11にまとめている。新しいパラコッカス属種の5菌株は、実施した生理学的および形態学的試験すべてで基本的に同等に反応した。新しいパラコッカス属種の5菌株すべてについて同等の反応が見られ、これらの生物の、パラコッカス マルクシ DSM 11574Tおよび／またはパラコッカス カロチニファシエンス E-396Tからの区別を可能にする試験は次のとおりであった：40℃で増殖、8％NaClを用いて増殖、pH9.1で増殖、およびコロニー着色。
【０１８４】
R-1512、R1534、R114、およびR-1506株におけるゼアキサンチン産生
R-1512、R1534、R114、およびR-1506株をME培地中で培養した。ME培地は以下を含む（蒸留水1リットルあたり）：グルコース5g、酵母抽出物10g、トリプトン10g、NaCl 30gおよびMgSO4・7H2O 5g。培地のpHを5N NaOHで7.2に調節した後、オートクレーブにより滅菌した。培養物はすべて（プラスティック製のフタが付いた250mlのバッフル付き三角フラスコ中、25mlの量）を200rpmで振盪しながら28℃で培養した。種培養物を凍結グリセロール化保存液から接種し、終夜培養した。一定量を実験フラスコに移して、660nmでの初期光学密度（OD660）0.16とした。次いで、培養物を200rpmで振盪しながら28℃で培養した。増殖を培養中ならびに6、10（またはR114株については15）、および24時間の時点でモニターし、実施例1に記載の方法によるカロテノイドの分析のために培養物の一定量を取り出した。
【０１８５】
これらの条件下でのR-1512、R1534、およびR-1506株の倍加時間は、それぞれ0.85時間、1.15時間、および1.05時間であった。R114株は再現可能に二相性増殖プロファイルを示し、第一相におけるR114株の倍加時間は1.4時間であったが、第二相における倍加時間は3.2時間であった。
【０１８６】
表12に、ME培地中のパラコッカス属菌種株によるゼアキサンチン産生および特異的生成（OD660に正規化したゼアキサンチン産生）を示す。データは4回の独立した実験の平均であり、各実験において各菌株をフラスコ二個ずつで試験した。親菌株R-1512と比較して、古典的に誘導された突然変異菌株R1534およびR114における改善されたゼアキサンチン産生が明らかに示された。R-1506株によるゼアキサンチン産生は、R-1512株とほぼ同じであった。どの培養物からも他のカロテノイドは検出されなかった。
【０１８７】
表11.  パラコッカス属菌種株：12＝R1512；34＝R1534；14＝R114；06＝R1506；66＝MBIC3966；74＝DSM 11574T、96＝E-396T、37＝DSM 6637Tの生理学的特徴
2004527265.tif 000025
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2004527265.tif 000027
Y-O：黄橙色；O-P：橙桃色；PY：淡黄色；SからC：短い桿状から球状；S：短い桿状；C：球状
【０１８８】
表12.  パラコッカス属菌種R-1512、R1534、R114、およびR-1506株によるゼアキサンチン産生
2004527265.tif 000028
【０１８９】
実施例3：ゼアキサンチン産生パラコッカス属菌種R114株におけるメバロン酸経路を介してのIPP生合成
パラコッカス属菌種R114株におけるイソプレノイド前駆体の生合成の起源を（すなわち、メバロン酸またはDXP経路）を決定するために、「逆生合成」アプローチを［EisenreichおよびBacher：Setlow（編）、Genetic Engineering, Principles and Methods, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York 22:121-153 (2000)］を用いた。このデータ解析のための予測的アプローチにより、単一の下流天然生成物の解析から、グルコース異化作用の明確な評価が可能となる。本研究において、これは非標識グルコースおよび特異的な13C-標識グルコースの様々な2成分混合物を含む培地中での細菌増殖、続く産生されたゼアキサンチンの精製およびNMR分光法による標識パターンの解析を含む。用いた方法の詳細および実験結果を下記に示す。
【０１９０】
13C標識実験のためのパラコッカス属菌種R114株の増殖
非標識D-グルコース一水和物はFluka（米国ウィスコンシン州ミルウォーキー）から購入した。[U-13C6]-D-グルコースはIsotec（米国オハイオ州マイアミズバーグ）から購入し、[1-l3C1]D-グルコース、[2-l3C1]D-グルコース、および[6-l3C1]D-グルコースはCambridge Isotope Laboratories（米国マサチューセッツ州アンドーバー）から購入した。酵母抽出物およびペプトン（カゼイン由来、膵臓で消化）はEM Science（米国ニュージャージー州ギブズタウン）から購入した。他の塩および溶媒はすべて分析等級で、標準的化学物質供給元から購入した。
【０１９１】
培養はすべて、凍結細胞懸濁液（細胞密度12 OD660単位、25％グリセロール、-70℃で保存）から開始した。解凍細胞懸濁液1mlを用いて、下記の組成を有する362F/2培地100mlを含む予備培養物（500mlバッフル付き振盪フラスコ）に接種した：30g/l D-グルコース、10g/l酵母抽出物、10g/lペプトン、5g/l NaCl、2.5 g/l MgS04・7H20、0.75g/l (NH4)2HPO4、0.625g/l K2HPO4、187.5mg/l CaCl2・2H2O、0.2g/l (NH4)2Fe(SO4)2・6H2O、15mg/l ZnSO4・7H2O、12.5mg/l FeCl3・6H2O、5mg/l MnSO4・H2O、0.5mg/l NiSO4・6H2O、15mg/l Na-EDTA、および9.375μl/l HCl（37%保存溶液）。培地の初期pHは7.2であった。
【０１９２】
予備培養物を200rpmで振盪しながら28℃で24時間インキュベートした後、OD660は約22吸光度単位であった。主培養物は、下記の組成を含む362F/2培地を含むBioflo 3000バイオリアクター（New Brunswick Scientific、米国ニュージャージー州エジソン）中で培養した：30g/l 全D-グルコース（13C-標識：非標識グルコースの比率については下記参照）、20g/l酵母抽出物、10g/lペプトン、10g/l NaCl、5g/l MgS04・7H20、1.5g/l (NH4)2HPO4、1.25g/l K2HP04、0.4g/l (NH4)2Fe(SO4)2・6H20、375mg/l CaCl2・2H2O、30mg/l ZnS04・7H20、25mg/l FeCl3・6H2O、10mg/l MnS04・H20、1mg/l NiSO4・6H2O、30mg/l Na-EDTA、および18.75μl/l HCl（37%保存溶液）。4つの別々の実験で用いた各13C-標識グルコースの量（培地中の全30g/lグルコースのパーセンテージで表す）は次のとおりであった：条件1  4％[U-13C6]D-グルコース；条件2  50％[1-13C1]D-グルコース；条件3  25％[2-13C1]D-グルコース＋1％[U-13C6]D-グルコース；条件4  25％[6-13C1]D-グルコース＋1％[U-13C6]D-グルコース。非標識グルコースのみを含む対照も含まれた。条件1および2（および非標識対照）については、培養量は2lで、一方、条件3および4の培養量は1lであった。バイオリアクターに予備培養物（初期量1リットルあたり20ml）を接種し、培養を22〜24時間行い、その時点で培地中にグルコースは残っていなかった。培養条件は次のとおりであった：28℃、pH7.2（25％H3PO4および28％NH4OHで制御）、溶存酸素は最低40％に制御（撹拌しながらのカスケード）、撹拌速度および通気速度はそれぞれ300rpm（最小）および1vvm。
【０１９３】
ゼアキサンチンの精製
培養終了時に、培養物を15℃に冷却した。培養物1リットルあたり無水エタノール500mlを加え、100rpmで20分間撹拌を続けた。処理した培養物を5000×gで20分間遠心分離し、上清を廃棄した。次いで、湿ペレットを5倍量のTHFで撹拌しながら20分間抽出した。抽出混合物を遠心分離し、上清は取っておき、得られたペレットを同じ条件下、1倍量のTHFで二回目の抽出を行い、再度遠心分離した。上清（抽出物）を合わせ、ロータリーエバポレーターにより50mlまで濃縮した。ヘキサン5mlを濃縮THF溶液に加えた。混合後、系は乳濁液を形成し、これは遠心分離によって分離することができた。水相を回収し、等量の飽和NaCl溶液で希釈し、ジクロロメタンで再抽出した。ジクロロメタン相を回収し、THF/ヘキサン相と合わせた。有機抽出物の混合物をロータリーエバポレーターで再度濃縮し、ジクロロメタンを除去した。次いで、溶液をシリカゲルカラムにかけ、n-ヘキサンおよびエーテルの混合物（1：1）で溶出した。小さい淡黄色のバンドが最初に溶出し、廃棄した。主要なゼアキサンチン生成物は、カラム内でゆっくり移動する広いバンドで溶出された。主要バンドを完全に溶出するには、約2リットルの溶媒を必要とした。溶出液を丸底フラスコに回収し、溶媒を40℃のロータリーエバポレーターで除去した。残渣を少量のジクロロエタンに40℃で溶解し、次いで溶液をゆっくり冷却した。混合物にヘキサンを濁りが認められるまで滴加した。結晶化は4℃で48時間以内に完了した。結晶をろ紙上で回収し、冷メタノールで洗浄し、減圧下で乾燥した。
【０１９４】
NMR試験
ゼアキサンチンをNMR分光法で解析した。参考のために、ゼアキサンチンの化学構造を以下の式で例示する：
2004527265.tif 000029
1H-NMRおよび13C-NMRスペクトルは、Bruker DRX 500分光計によりそれぞれ500.13MHzおよび125.6MHzで記録した。一次元実験および二次元INADEQUATE実験用の取得および処理パラメーターは標準的なBrukerソフトウェア（XWINNMR）に従った。溶媒は重水素化クロロホルムであった。化学シフトは溶媒シグナルを基準とした。
【０１９５】
同位体標識したゼアキサンチン試料および天然の13C存在度のゼアキサンチン試料の13C NMRスペクトルを同じ実験条件下で記録した。13C NMRシグナルごとに積分を求め、標識化合物の各炭素原子のシグナル積分は天然存在度の材料のものを基準に比較し、したがって標識分子種の各位置について相対13C存在度を得た。次いで、相対存在度を、1H NMRの1.71ppmのH-18シグナルにおける13Cカップリングサテライトから絶対存在度に変換した。多重標識ゼアキサンチン試料の13C NMRスペクトルにおいて、各サテライトを別々に積分した。次いでそれぞれのサテライト対の積分を、所与の炭素原子の全シグナル積分を基準に比較した。ゼアキサンチンは合計8つのイソプレノイド部分を含み（二つのDMAPP単位および6つのIPP単位）、化学シフト縮退により20の13C NMRシグナルしか観察されない。
【０１９６】
[U-l3C6]グルコースおよび非標識グルコース（17：5；w/w）の混合物を用いた実験において、ゼアキサンチンのすべての炭素原子は標識され、13C13Cカップリングによるサテライトが見られた（表13）。4つの炭素原子のシグナルが13C13Cカップリングによる強いサテライトを有している（所与の原子の全体的NMRシグナル強度において61.2±0.6％、表13）。メチルのC-17/C-17'原子のシグナルは、相対強度6％の弱い13Cカップリングしたサテライトを示したにすぎなかった。中央のシグナルは非標識グルコース由来の物質を表す。シグナルから、遠隔カップリングの証拠は見いだせなかった。炭素連結度は13C13Cカップリング定数（表13）および二次元INADEQUATE実験から容易に得られた。
【０１９７】
炭素原子の三つは[6-l3C1]グルコースから標識を得た。他の二つの炭素は[2-13C1]グルコースから標識された。[1-13C1]グルコースによるゼアキサンチンの標識は有意量ではなかった。
【０１９８】
すべての非等時性炭素原子の13C存在度を、非標識ゼアキサンチンのスペクトルとの比較および1H NMRスペクトルの1H13Cカップリングサテライトの評価（表13）により求めた。[U-13C6]グルコースを用いた実験において共に転移された炭素原子対の割合を、カップリングサテライトの積分によって求めた。
【０１９９】
IPP構築ブロックの標識パターンは、再構成されたIPP前駆体について認められる標準偏差によって示されるとおり、正確に再構成することができる。DMAPPおよびIPPの再構成された標識パターンは実験限界内で同じであった。
【０２００】
表13.  13C標識グルコースを供給したパラコッカス属菌種R114株によって産生された13C標識ゼアキサンチンのNMR結果
2004527265.tif 000030
【０２０１】
上で求めた実験的標識パターンを、イソプレノイド生合成についてのメバロン酸経路 対 DXP経路だけでなく、グルコース代謝の異なる経路も考慮に入れて、様々な予測と比較することができる。真正細菌は典型的には主に解糖経路またはエントナードゥドロフ（Entner-Doudoroff）経路を介してグルコースを利用する。解糖によりグルコースから二つのトリオースリン酸分子が生じる。グルコースのC-1およびC-6はいずれも、解糖中に生成するトリオースリン酸の3位に転換される。一方、エントナードゥドロフ経路では、グルコースはグリセルアルデヒド3-リン酸およびピルビン酸塩の混合物に変換される。グルコースのC-1はもっぱらピルビン酸塩のC-1に変換され、グルコースのC-6はもっぱらグリセルアルデヒド3-リン酸のC-3に変換される。
【０２０２】
解糖およびエントナードゥドロフ経路の中間体および生成物は、両方のイソプレノイド生合成経路の出発原料として役立つ。メバロン酸経路に関して、ピルビン酸塩およびトリオースリン酸は前駆体アセチル-CoAに変換されうる。解糖経路を介してのグルコース異化作用は、グルコースのC-1およびC-6からの標識をアセチル-CoAのメチル基に転換する。エントナードゥドロフ経路を介してのグルコース異化作用は、ピルビン酸のアセチル-CoAへの変換中にグルコースからC-1の消失を引き起こす。
【０２０３】
パラコッカス属菌種R114株により産生されたゼアキサンチンの、実験的に観察された濃縮および13C13Cカップリングパターンは、エントナードゥドロフ経路とメバロン酸経路との組み合わせによるゼアキサンチン生合成に必要とされる標識パターンと完全に一致していた。解糖およびエントナードゥドロフ経路の両方が、用いた実験条件下で同時に機能しているのであれば、少なくとも[1-13C1]グルコースからのある程度の標識がゼアキサンチンに与えられているはずである。さらに、メバロン酸経路はせいぜい二つの炭素原子のブロックをテルペノイドに与えることができるが、DXP経路では、三つの炭素ユニットがトリオースリン酸前駆体を介してイソプレノイドに送達されうる。そのような3炭素ブロックはDXP経路に関与する再配列によって分離されることになるが、三つの標識炭素原子のブロックは遠隔カップリングを介してまだ認識することができる。対応する13C-13C遠隔カップリングが、培養植物細胞（Cantharantus roseus）による[2,3,4,5-l3C4]l-デオキシ-D-キシルロースからのカロテノイドのルテイン生合成において観察されている［Arigoniら、Proc. Nat. Acad. Sci. 94:10600-10605 (1997)］。そのような遠隔カップリングは、パラコッカス属菌種R114株により産生されたゼアキサンチンを用いての本実験ではまったく観察されなかった。
【０２０４】
ここで示した結果はパラコッカス属菌種R114株におけるメバロン酸経路を介してのイソプレノイド産生を確認し、用いた培養条件下で解糖を介してのグルコース代謝は、ほとんど、またはまったくないことを示しているが、エントナードゥドロフ経路に加えてペントースリン酸経路を介した、ある程度のグルコース代謝の可能性を除外するものではないことを理解するべきである。後者の二つの経路を介したグルコース代謝の定量は、ピルビン酸塩由来アミノ酸の標識パターンの解析により得ることができた（パラコッカス デニトリフィカンスについて実施［Dunstanら、Biomedical and Environ. Mass Spectrometry 19:369-381 (1990)］。
【０２０５】
実施例4：IPPイソメラーゼおよびパラコッカス属菌種R114株由来のメバロン酸経路の酵素をコードする遺伝子のクローニングおよび塩基配列決定
培養条件
パラコッカス属菌種R114株をF培地（10g/lトリプトン、10g/l 酵母抽出液、30g/l NaCl、10g/l D-グルコース、5g/l MgSO4・7H2O、pH7.0）または上の実施例3に記載の予備培養培地中、28℃で培養した。液体培養物を回転振盪機内、200rpmで培養した。
【０２０６】
ゲノムDNAの単離
パラコッカス属菌種R114株の培養物600mlを4℃、10,000×gで10分間遠心分離し、ペレットを溶解緩衝液（0.1M NaCl、50mM EDTA、10mMトリス-HCl、pH7.5）200mlで1回、および溶解緩衝液100mlで1回洗浄した。最終ペレットを、リゾチーム50mgおよびRNアーゼA（DNアーゼを含まない）1mgを含む溶解緩衝液20ml中に再懸濁した。37℃で15分間のインキュベーション後、20％N-ラウロイル-サルコシン酸ナトリウム1.5mlおよびプロテイナーゼK 2.25mgを加えた。50℃で30〜60分間のインキュベーション後、溶解産物を1倍量の緩衝液飽和フェノール（pH7.5〜7.8）（LifeTechnologies、米国メリーランド州ロックビル）で、ゆっくりであるが完全に混合することにより抽出した。乳濁液を30,000×gで20分間遠心分離し、水相をフェノールで再抽出した。前と同様に相を分離し、水相を1倍量のフェノール：クロロホルム（1：1）で2回抽出した。この段階で、相をうまく分離するために、スイングバケットローター内、3,200×gで20分間の遠心分離で十分であった。1倍量のクロロホルムで最終抽出を行った後、0.1倍量の3M酢酸ナトリウム（pH5.2）を加え、溶液に2倍量の氷冷エタノールをのせた。沈殿したDNAをガラス棒で巻き取り、70％エタノールに5分間浸漬し、クロロホルムで洗浄し、次いで5〜10分間風乾した。DNAをTE（10mMトリス-HCl、pH7.5、1mM EDTA）5mlに終夜再懸濁した。溶液は微量のゼアキサンチンが原因で黄色を呈したため、有機抽出および巻き取りを上のとおりに繰り返し、澄明な調製物を得た。
【０２０７】
λ-DNAの単離
Qiagen Lambda Kit（登録商標）（Qiagen、ドイツ、ヒルデン）を製造者の指示に従って用いた。
【０２０８】
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
オリゴヌクレオチドはLifeTechnologies（米国メリーランド州ロックビル）から購入した。PCRをGeneAmp（登録商標） PCR装置9700（PE Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスターシティ）で、GCを多く含むPCR系（Roche Molecular Biochemicals、ドイツ、マンハイム）を製造者の指示に従って用いて行った。典型的には、用いたMgCl2濃度は1.5mMで、反応溶液（resolution solution）を最終濃度1Mまで加えた。
【０２０９】
DNA標識および検出
DNA標識および検出のために、それぞれPCR DIG Probe Synthesis KitおよびDIG Luminescent Detection Kitを用いた（いずれも、Roche Molecular Biochemicals、ドイツ、マンハイムから入手）。
【０２１０】
DNA塩基配列決定
塩基配列決定反応をBigDye（登録商標）DNA塩基配列決定キット（PE Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスターシティ）を製造者の指示に従って用いて実施した。塩基配列決定反応物をDyeEx（商標）スピンカラム（Qiagen、ドイツ、ヒルデン）上で精製し、断片の分離および検出をABI Prism（商標）310 Genetic Analyzer（PE Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスターシティ）で行った。
【０２１１】
λ-ライブラリ
ラムダFIX（登録商標）II中、Sau3AIで部分消化したパラコッカス属菌種R114株DNAによる受注生産ライブラリをStratagene（米国カリフォルニア州ラホイヤ）から購入した。
【０２１２】
パラコッカス属菌種R114株由来のメバロン酸経路遺伝子クラスターのクローニング、塩基配列決定、および特徴づけ
メバロン酸経路の酵素の一つ、メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼはいくつかのアミノ酸にわたる高度に保存された領域を含む。すべての入手可能な真正細菌のメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼの整列から三つのそのような領域を選択し、パラコッカス属菌種R1534株のカロテノイド遺伝子クラスターにおいて見いだされた好ましいコドン使用（表14）を用いてオリゴヌクレオチドを設計した。
【０２１３】
二つの相同性領域から設計したオリゴヌクレオチドを表15に示す。縮重の程度を下げるために、オリゴヌクレオチドの組を各ペプチドから設計した。例えば、オリゴヌクレオチドmvd-103a〜dは3'末端から3番目のヌクレオチドでのみ異なり、それぞれグリシンに対する一つの可能なコドンに相当する（GGAは、あまり用いられないが、3'末端に非常に近いために含まれた）。別のアミノ酸が、両方の残基に対するオリゴヌクレオチドを設計することにより指定され、例えば、オリゴヌクレオチドmvd-101aおよびmvd-101bはそれぞれ、ペプチド1の二位のロイシンまたはイソロイシンに特異的である（表15）。鋳型としてパラコッカス属菌種114株DNAを用いた、オリゴヌクレオチドmvd-101およびmvd-104またはmvd-106を用いたPCRにより、予想されたサイズの生成物を得た。PCR生成物をベクターpCR（登録商標）2.1-TOPO（Invitrogen、米国カリフォルニア州カールスバッド）中でクローニングし、塩基配列決定した。クローニングした断片をパラコッカス属菌種R114株DNAのサザン分析のためのプローブとして用い、約950bpのBamHI-SalI断片にハイブリダイズすることが判明した。パラコッカス属菌種R114株DNAをBamHIおよびSalIで切断し、断片をアガロースゲル電気泳動で分離した。約950bpの領域を単離し、ベクターpUC19中でクローニングした。次いで、この部分ライブラリをmvd-PCR断片をプローブとして用いてスクリーニングし、陽性クローンの挿入断片を塩基配列決定した。平行して、パラコッカス属菌種R114株DNAから調製したλ-ライブラリをmvd-PCR断片をプローブとして用いてスクリーニングした。二つの陽性λ-クローンからDNAを単離し、BamHIおよびSalIまたはEcoRIおよびSalIで切断した。いくつかの制限断片を単離し、ベクターpUC19中でクローニングした。いくつかの断片がメバロン酸経路の蛋白質をコードする遺伝子に相同の配列を含んでいた。これらの個々の配列を連結しているクローンを、鋳型としてλ-クローンのDNAを用い、クローニングした制限断片の配列由来のプライマーでのPCRによって得た。すべての断片から構築した配列（配列番号：42、44、46、48、50、および52）およびコードされる蛋白質の配列を、配列表に示す（配列番号：43、45、47、49、51、および53）。PatentIn Programの制限に起因して、重複する遺伝子を含むオペロンは単一の配列として示すことができない。したがって、メバロン酸オペロンの各遺伝子に対して、オペロンの全ヌクレオチド配列が各遺伝子について繰り返される。したがって、配列番号：42、44、46、48、50、および52は同一である。本発明の目的のために、発明者らはメバロン酸オペロンのヌクレオチド配列を参照するために配列番号：42を用いた。
【０２１４】
パラコッカス属菌種R114株のメバロン酸経路の遺伝子の配列は、他の細菌の公知のメバロン酸遺伝子クラスターと比較すると独特である。パラコッカス属菌種R114株の他に、ライム病ボレリア（Borrelia burgdorferi）およびストレプトマイセス属菌種（Streptmyces sp.）CL190株（Takagiら、上記）だけが単一のオペロン中にすべてのメバロン酸遺伝子を有している（Wildingら、上記）。溶血連鎖球菌（Streptococcus pyrogenes）において、すべてのメバロン酸遺伝子は単一の遺伝子座にクラスター化しているが、これらは二つのオペロンに分類される。他の種はすべて二つの遺伝子座を有し、二つのキナーゼおよびメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼは一つのオペロンに分類され、HMG-CoAシンターゼおよびHMG-CoAレダクターゼは、オペロンを形成する（肺炎連鎖球菌（Streptcoccus pneumoniae））か、または別々の転写単位として第二の遺伝子座に分類される。スタフィロコッカス（Staphylococcus）のメンバーを除き、すべての種はメバロン酸クラスターに連結する追加の遺伝子を有し、これは最近IPPイソメラーゼと同定された（ストレプトマイセス属菌種CL190株のidi遺伝子）（Kanedaら、上記）。二つの腸球菌種およびブドウ球菌（Staphylococcus haemolyticus）は、HMG-CoAレダクターゼ遺伝子に連結したアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を有している。腸球菌では、後者の二つの遺伝子は融合している。
【０２１５】
表14：パラコッカス属菌種R1534株カロテノイド（crt）遺伝子におけるコドン使用
2004527265.tif 000031
2004527265.tif 000032
【０２１６】
表15：二つの保存細菌Mvdペプチドから設計されたオリゴヌクレオチド
2004527265.tif 000033
a：配列番号：
1パラコッカス属菌種R1534株の好ましいコドンを使用、表1参照
2いくつかの酵素に存在する別のアミノ酸
S＝CまたはG；R＝AまたはG；Y＝CまたはT；B＝CまたはGまたはT；V＝AまたはCまたはG
【０２１７】
パラコッカス属菌種R114株由来のメバロン酸オペロンの遺伝子を、一般のデータベースにおける蛋白質に対する遺伝子産物の相同性によって同定した。パラコッカス属菌種R114株由来のHMG-CoAレダクターゼ（配列番号：43）のアミノ酸整列を、ストレプトマイセス属菌種CL190株（配列番号：54）、S. グリセオスポレウス（S. griseolosporeus）（配列番号：55）、およびストレプトマイセス属菌種KO-3899株（配列番号：56）の細菌クラスI HMF-CoAレダクターゼと実施した。EMBL/GenBank/DDBJデータベースアクセッション番号は、ストレプトマイセス属菌種CL190株はq9z9n4、S. グリセオスポレウスはq9znh1、およびストレプトマイセス属菌種KO-3899株はq9znh0である。HMG-CoAレダクターゼには2クラスある［Bocharら、Mol. Genet. Metab. 66:122-127 (1999)；Boucherら、Mol. Microbiol. 37:703-716 (2000)］。真正細菌HMG-CoAレダクターゼは一般にクラスIIであるが、クラスIの酵素は真核生物および古細菌において見いだされる。これまでに知られているクラスIの真正細菌HMG-CoAレダクターゼは、ストレプトマイセスおよびパラコッカスHMG-CoAレダクターゼ、ならびにコレラ菌（Vibrio cholerae）由来の酵素だけである。
【０２１８】
パラコッカス属菌種R114株由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（IPPイソメラーゼ）（idi）（配列番号：45）のアミノ酸整列を、EMBLデータベースで見いだされる密接な相同体、すなわちエルウィニア  ヘルビコラ（Q01335）（配列番号：57）、ライム病ボレリア（O51627）（配列番号：58）、 シネコシスティス属菌種（Synechocystis sp.）PCC 6803（P74287）（配列番号：59）、ストレプトマイセス属菌種CL190（Q9KWG2）（配列番号：60）、ストレプトマイセス グリセオスポレウス（Q9KWF6）（配列番号：61）、スルホロブス ソルファタリウス（Sulfolobus solfataricus）（P95997）（配列番号：62）、発疹チフスリケッチア（Rickettsia prowazekii）（Q9ZD90）（配列番号：63）、デイノコッカス ラディオドゥランス（Deinococcus radiodurans）（Q9RVE2）（配列番号：64）、アエロピルム ペルニクス（Aeropyrum pernix）（Q9YB30）（配列番号：65）、好塩菌（Halobacterium）属菌種NRC-1（O54623）（配列番号：66）、アルカエオグロブス フルギドゥス（Archaeoglobus fulgidus）（O27997）（配列番号：67）、ピロコッカス アビシ（Pyrococcus abyssi）（Q9UZS9）（配列番号：68）、ピロコッカス ホリコシ（Pyrococcus horikoshii）（O58893）（配列番号：69）、メタノバクレリウム テルモアウトトロフィクム（Methanobacterium thermoautotrophicum）（O26154）（配列番号：70）、メタノコッカス ジャナクシ（Methanococcus jannaschii）（Q58272）（配列番号：71）、テルモプラズマ アシドフィルム（Thermoplasma acidophilum）（CAC11250）（配列番号：72）、およびレーシュマニア メジャー（Leishmania major）（Q9NDJ5）（配列番号：73）を用いて実施した。EMBL/GenBank/DDBJデータベースアクセッション番号を生物名の後ろの括弧内に示している。最初の9つの配列は真正細菌由来で、次の8つの配列は古細菌由来である。興味深いことに、一つの真核生物種である、原虫寄生体のレーシュマニア メジャー（配列番号：73）も、相同性の高い蛋白質を有している。これは、他の真核生物は1型と呼ばれる異なるidiを有する（Kanedaら、上記）ため、予想外である。枯草菌（Bacillus subtilis）由来の保存的な仮説上の蛋白質、YpgAも、実質的な相同性を有するが、2型idiのものよりもかなり小さい。
【０２１９】
パラコッカス属菌種R114株由来の細菌HMG-CoAシンターゼ（配列番号：47）のアミノ酸整列を、EMBLデータベースで見いだされる密接な相同体、すなわち肺炎連鎖球菌（AAG02453）（配列番号：74）、溶血連鎖球菌（AAG02448）（配列番号：75）、エンテロコッカス ファエカリス（Entereococcus faecalis）（AAG02438）（配列番号：76）、エンテロコッカス ファエシウム（Enterococcus faecium）（AAG02443）（配列番号：77）、ブドウ球菌（AAG02427）（配列番号：78）、スタフィロコッカス エピデルミス（Staphylococcus epidermis）（AAG02433）（配列番号：79）、スラフィロコッカス アウレウス（Staphylococcus aureus）（AAG02422）（配列番号：80）、スタフィロコッカス カルノサス（Staphylococcus carnosus）（Q9ZB67）（配列番号：81）、ストレプトマイセス属菌種CL190（Q9KWG1）（配列番号：82）、ストレプトマイセス グリセオスポレウス（Q9KWF5）（配列番号：83）、およびライム病ボレリア（051626）（配列番号：84）と実施した。EMBL/GenBank/DDBJデータベースアクセッション番号を生物名の後ろの括弧内に示している。ストレプトマイセス グリセオスポレウス由来の配列の最初の43アミノ酸は、データベース版では失われている。
【０２２０】
パラコッカス属菌種R114株由来の細菌メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ（配列番号：53）のアミノ酸整列を、他の細菌由来のオルソロガスな蛋白質、すなわち肺炎連鎖球菌（AAG02456）（配列番号：85）、溶血連鎖球菌（AAG02451）（配列番号：86）、エンテロコッカス ファエカリス（AAG02441）（配列番号：87）、エンテロコッカス ファエシウム（AAG02446）（配列番号：88）、ブドウ球菌（AAG02431）（配列番号：89）、スタフィロコッカス エピデルミス（AAG02436）（配列番号：90）、スタフィロコッカス アウレウス（AAG02425）（配列番号：91）、ストレプトマイセス属菌種CL190（Q9KWG4）（配列番号：92）、ストレプトマイセス グリセオスポレウス（Q9KWF8）（配列番号：93）、およびライム病ボレリア（051629）（配列番号：94）を用いて実施した。EMBL/GenBank/DDBJデータベースアクセッション番号を生物名の後ろの括弧内に示している。
【０２２１】
マイクソコッカス クサントゥス（Myxococcus xanthus）由来の二つの蛋白質、TacおよびTaf（データベースアクセッション番号はそれぞれq9xb06およびq9xbO3）ならびに枯草菌由来のポリケチド生合成蛋白質と推定されている蛋白質、PksG（データベースアクセッション番号p40830）はパラコッカス属菌種R114株HMG-CoAシンターゼと実質的な相同性を有する。パラコッカス属菌種R114株HMG-CoAシンターゼと、M.クサントゥスのTacおよびTaf蛋白質との間の相同性は、パラコッカス属菌種R114株および真核生物由来のHMG-CoAシンターゼ間の相同性より大きい。細菌HMG-CoAシンターゼおよび細菌メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼは、それらの真核生物オルソログと実質的な相同性を共有している。古細菌HMG-CoAシンターゼは関係がより遠い酵素群を形成し（Wildingら、上記）、メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼオルソログは古細菌では認められない［SmitおよびMushegian、Genome Res. 10:1468-1484 (2000)］。
【０２２２】
パラコッカス属菌種R114株由来のメバロン酸キナーゼ（Mvk）（配列番号：49）およびホスホメバロン酸キナーゼ（Pmk）（配列番号：51）の整列を、他の細菌由来のオルソロガスな蛋白質、すなわち肺炎連鎖球菌（AAG02455）（配列番号：95）、溶血連鎖球菌（AAG02450）（配列番号：96）、エンテロコッカス ファエカリス（AAG02440）（配列番号：97）、エンテロコッカス ファエシウム（AAG02445）（配列番号：98）、ブドウ球菌（AAG02430）（配列番号：99）、スタフィロコッカス エピデルミス（AAG02435）（配列番号：100）、スタフィロコッカス アウレウス（AAG02424）（配列番号：101）、ストレプトマイセス属菌種CL190（Q9KWG5）（配列番号：102）、ストレプトマイセス グリセオスポレウス（Q9KWF9）（配列番号：103）、およびライム病ボレリア（051631）（配列番号：104）（Mvk）；ならびに肺炎連鎖球菌（AAG02457）（配列番号：105）、溶血連鎖球菌（AAG02452）（配列番号：106）、エンテロコッカス ファエカリス（AAG02442）（配列番号：107）、エンテロコッカス ファエシウム（AAG02447）（配列番号：108）、ブドウ球菌（AAG02432）（配列番号：109）、スタフィロコッカス エピデルミス（AAG02437）（配列番号：110）、スタフィロコッカス アウレウス（AAG02426）（配列番号：111）、ストレプトマイセス属菌種CL190（Q9KWG3）（配列番号：112）、ストレプトマイセス グリセオスポレウス（Q9KWF7）（配列番号：113）、およびライム病ボレリア（051630）（配列番号：114）（Pmk）に対して実施した。EMBL/GenBank/DDBJデータベースアクセッション番号を生物名の後ろの括弧内に示している。
【０２２３】
細菌キナーゼ間では、メバロン酸経路の他の酵素の細菌オルソログ間よりも相同性がはるかに低い。パラコッカス属菌種R114株由来のメバロン酸キナーゼ（配列番号：49）は、アミノ末端領域に37アミノ酸の挿入断片を有するが、これは他のメバロン酸キナーゼには欠けている。細菌Mvkと共に、いくつかの古細菌酵素、例えば、アルカエオグロブス フルギドゥス、メタノバクレリウム テルモアウトトロフィウム、およびピロコッカス アビシ由来の酵素はパラコッカス属菌種R114株由来のMvkに対する最良の相同体に含まれる。細菌ホスホメバロン酸キナーゼ間の相同性は、細菌メバロン酸キナーゼ間の相同性よりもさらに弱い。パラコッカス属菌種R114株由来のPmk（配列番号：51）に対する最良の相同性を有する蛋白質は、古細菌由来のMvk、例えば、アエロピルム ペルニクス、ピロコッカス ホリコシ、M. テルモアウトトロフィウム、P.アビシ、およびA.フルギドゥスである。古細菌ではPmkは認められない（SmitおよびMushegian、上記）ため、これは同一キナーゼが両方のリン酸化を行っている可能性を示唆している。
【０２２４】
実施例5：大腸菌におけるパラコッカス属菌種R114株由来のメバロン酸経路遺伝子およびidi遺伝子の過剰発現
大腸菌におけるメバロン酸オペロンのクローニングと発現
パラコッカス属菌種R114株λライブラリからのクローン16と呼ばれるλクローン（実施例4参照）を、全メバロン酸オペロンのPCR増幅のための鋳型に用いた。プライマーMevop-2020およびMevop-9027（表16）をPCRに用いた。
【０２２５】
表16．  パラコッカス属菌種R114株由来のメバロン酸オペロン増幅のために用いたプライマー
2004527265.tif 000034
【０２２６】
得られたPCR産物をTOPO-XL（Invitrogen、米国カリフォルニア州カールスバッド）中でクローニングし、プラスミドTOPO-XL-mev-op16を得た。メバロン酸オペロンを有する挿入断片をHindIIIおよびSacIで切り出し、HindIII-SacI切断ベクターpBBRIMCS2中でクローニングし［Kovachら、Gene 166:175-176 (1995)］、プラスミドpBBR-K-mev-op16を得た。プラスミドpBBR-K-mev-op16を用いて、電気穿孔適格性大腸菌TG1株を形質転換した［Stratagene、カリフォルニア州ラホイヤ；Sambrookら：Nolan, C.（編）、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（第2版）、p. A.12 (1989)］。二つの代表的陽性形質転換体（大腸菌TG1/pBBR-K-mev-op16-1および大腸菌TG1/pBBR-K-mev-opl6-2）を、50mg/lのカナマイシンを含むLuria Broth（LB、GibcoBRL, Life Technologies）中で培養し、実施例1に記載の方法を用いてHMG-CoAレダクターゼ活性（パラコッカス属菌種R114株mvaA遺伝子によってコードされる）について試験した。大腸菌は酵素HMG-CoAレダクターゼをコードする遺伝子を有しておらず、したがって検出できる活性はない。大腸菌TG1/pBBR-K-mev-opl6の両方の代表的形質転換体の粗抽出物は、容易に測定可能なHMG-CoAレダクターゼ活性を有し、クローニングされたmvaA遺伝子の異種発現を示していた。
【０２２７】
表17.  クローニングされたパラコッカス属菌種R114株由来のメバロン酸遺伝子クラスターを有する大腸菌TG1細胞の粗抽出物におけるHMG-CoAレダクターゼ活性
2004527265.tif 000035
a0.03U/mg未満
【０２２８】
大腸菌におけるパラコッカス属菌種R114株由来のidi遺伝子および個々のメバロン酸経路遺伝子のクローニングと発現
パラコッカス属菌種R114株由来のメバロン酸オペロン遺伝子のコーディング領域を、表18に示したプライマーを用いてPCRにより増幅した。プライマーは、ATG開始コドンがNdeI部位（切断認識部位CATATG）の後半を構成し、BamHI部位（GGATCC）が停止コドンの直後に導入されるように設計した。すべてのPCR産物を登録pCR（商標）2.1-TOPOベクター中でクローニングした。得られたベクターの名称を表19に示す。メバロン酸キナーゼ遺伝子を除いて、すべての遺伝子はBamHI、NdeI、またはEcoRIの制限部位を含んでおり、これらは後のクローニング段階を促進するために除去しなければならなかった。これらの部位はQuikChange（商標）部位指向性突然変異誘発キット（Stratagene、米国カリフォルニア州ラホイヤ）および表20に示したオリゴヌクレオチドを用いて沈黙突然変異を導入することにより除去した。突然変異が誘発されたコーディング領域をTOPO-プラスミドからBamHIおよびNdeIで切り出し、BamHI-NdeI切断発現ベクターpDS-HisおよびpDSと連結した。これらの発現ベクターは、欧州特許第821,063号の実施例2に記載のpDSNdeHisに由来した。プラスミドpDS-Hisは、沈黙クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を有する857bpのNheIおよびXbaI断片を欠失させることにより、pDSNdeHisから構築した。プラスミドpDSは、小さいEcoRI-BamHI断片をアニールしたプライマーS/D-1
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およびS/D-2
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で置換することにより、pDS-Hisから構築した。
【０２２９】
表18：メバロン酸オペロン遺伝子のクローニングのためのオリゴヌクレオチド
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1第二のコドンTCAをAGCに変更した（沈黙突然変異−いずれのコドンもセリンをコードする）。
2最後のコドンGGCをGGAに変更した（沈黙突然変異−いずれのコドンもグリシンをコードする）。
【０２３０】
表19：発現プラスミドおよび構築中間体の名称
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n/a：適用可能；nd：未実施
【０２３１】
表20：部位指向性突然変異誘発のためのオリゴヌクレオチド
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【０２３２】
lacI（lacリプレッサー）含有プラスミドpREP4（EMBL/GenBankアクセッション番号A25856）を有する大腸菌M15株［VillarejoおよびZabin、J. Bacteriol. 120:466-474 (1974)］を連結混合物で形質転換し、組換え細胞を100mg/Lのアンピシリンおよび25mg/Lのカナマイシンを補足したLB-寒天プレートの上で培養することにより選択した。正しいメバロン酸オペロン遺伝子挿入断片を含む陽性クローンをPCRで検証した。
【０２３３】
挿入した遺伝子の発現のために、それぞれの大腸菌株を25mg/Lのカナマイシンおよび100mg/Lのアンピシリンを含むLB培地中、37℃で終夜培養した。次の日、新鮮培地25mlに終夜培養物0.5mlを接種し、新しい培養物を37℃で培養した。培養物のOD600が0.4に達した時点で、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）を最終濃度1mMになるまで加えることによって、クローニングした遺伝子の発現を誘導し、培養物のインキュベーション（振盪しながら）を4時間続け、その後細胞を遠心分離によって回収した。
【０２３４】
粗抽出物調製、HMG-CoAレダクターゼアッセイ法、およびIPPイソメラーゼアッセイ法を実施例1に記載のとおりに実施した。表21および22はそれぞれ、組換え大腸菌株におけるHMG-CoAレダクターゼおよびIPPイソメラーゼ活性を示している。IPTG誘導の際、M15/pDS-mvaAおよびM15/pDS-idi株はそれぞれ高レベルのHMG-CoAレダクターゼおよびIPPイソメラーゼ活性を含んでいた。これは、大腸菌においてパラコッカス属菌種R114株由来のメバロン酸経路遺伝子を過剰発現する（およびそれらの同源遺伝子産物を活性形態で過剰産生する）能力を示している。
【０２３５】
表21.  クローニングされたパラコッカス属菌種R114株由来のmvaA遺伝子を過剰発現する大腸菌株におけるHMG-CoAレダクターゼ活性の誘導
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aM15/pDS-mvdは陰性対照として含めた。
【０２３６】
表22.  クローニングされたパラコッカス属菌種R114株由来のidi遺伝子を過剰発現する大腸菌株におけるIPPイソメラーゼ活性の誘導
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aM15/pDS-mvdは陰性対照として含めた。
b＜1U/mg
【０２３７】
酵素アッセイ法に用いた粗抽出物をドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で分析した。大腸菌M15/pDS-mvaA株および大腸菌M15/pDS-His-mvaA株について、予想された分子質量（36.3kD）の高度に発現された蛋白質の有無は、抽出物中で測定されたHMG-CoAレダクターゼ活性に相関していた（表21）。His標識蛋白質の欠如は、mRNAまたは蛋白質が不安定であるために、転写または翻訳レベルで発現が低下していたことによって説明できた。大腸菌M15/pDS-idiおよび大腸菌M15/pDS-His-idiの粗抽出物はいずれも、予想された分子質量（それぞれ37.3kDおよび39.0kD）の高度に発現された蛋白質を示した。しかしながら、大腸菌M15/pDs-idiからの抽出物だけがIPPイソメラーゼ活性の上昇を示し（表22）、酵素のヒスチジン標識体はこれらの条件下では機能しないことが示された。
【０２３８】
パラコッカス属菌種R114株メバロン酸オペロンの他の4遺伝子（hcs、pmk、mvk、およびmvd、表19参照）を過剰発現する大腸菌株の粗抽出物のSDS-PAGE分析により、酵素の天然体の高度な発現はIPTG誘導の際に検出されなかったが、いくらかの発現は除外できない。一方、4つの蛋白質すべてのHis標識体で高度な発現が観察された。
【０２３９】
実施例6：crtE遺伝子の過剰発現により改善されたパラコッカス属菌種R114株におけるゼアキサンチン産生
pBBR-K-Zea4、pBBR-K-Zea4-上流およびpBBR-K-Zea4-下流の構築、ならびにこれらのプラスミドのパラコッカス属菌種R114株におけるゼアキサンチン産生に対する効果
パラコッカス属菌種R1534株のカロテノイド（crt）遺伝子クラスターを、8.3kbのBamHI-EcoRI断片としてプラスミドpZea-4［Pasamontesら、Gene 185:35-41 (1997)］から切り出した。このcrt遺伝子クラスターを含む断片をBamHIおよびEcoRI切断ベクターpBBR1MCS-2（GenBankアクセッション番号U23751）に連結して、pBBR-K-Zea4を得た。プラスミドpBBR-K-Zea4をパラコッカス属菌種R114株に接合により導入し、改善されたゼアキサンチン産生について試験した。対照R114株、およびR114/pBBR-K-Zea4株の二つの独立した単離株を振盪フラスコ培養におけるゼアキサンチン産生について試験した（362F/2培地を使用、実施例11参照）。表23のデータは、プラスミドpBBR-K-Zea4を有する両方の組換え菌株がR114よりも有意に高いレベルのゼアキサンチンを産生し、より高い特異的生成率（ゼアキサンチンmg/OD660）を有していたことを示している。これは、pBBR-K-Zea4におけるクローニングされた挿入断片内の遺伝子が、パラコッカス属菌種R114株におけるゼアキサンチン産生を制限する一つまたは複数の酵素をコードすることを示唆していた。
【０２４０】
表23.  R114およびR114/pBBR-K-Zea4株によるゼアキサンチン産生
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aゼアキサンチン
b特異的生成（mgZXN/l/OD660）
【０２４１】
陽性効果の位置を確認するために、pBBR-K-Zea4内にあるクローニングされた挿入断片のサブクローニングされた領域を含む二つのプラスミド誘導体を作製した。ORF5ならびに遺伝子atoBおよびcrtE（Pasamontesら、上記）を含む、pBBR-K-Zea4挿入断片の「上流」領域は、制限酵素XbaIおよびArvIIの特有の部位に隣接している。プラスミドpBBR-K-Zea4-下流を、pBBR-K-Zea4をこれら二つの酵素で消化し、「上流」領域を欠失させることによって構築した。同様に、プラスミドpBBR-K-Zea4-上流を、制限酵素EcoRVおよびStuIを用いて、pBBR-K-Zea4中にクローニングされた挿入断片内の「下流」領域を欠失させることにより構築した。二つの新しいプラスミドをパラコッカス属菌種R114株に接合により導入した。ゼアキサンチン産生を菌株R114（宿主対照）、R114/pBBR-K（無ベクター対照）、R114/pBBR-K-Zea4-下流およびR114/pBBR-K-Zea4-上流において比較した（振盪フラスコ培養、上に記載のものと同一の条件）（表24）。データは明らかに、ゼアキサンチン産生における陽性効果はORF5、atoB、およびcrtEを含むクローニングされたセグメントの多コピーにおける存在、すなわちプラスミドpBBR-K-Zea4-上流に存在する挿入断片の結果であることを示していた。一連の欠失プラスミドをpBBR-K-Zea4-上流から構築した。これらの各プラスミドをR114株に導入し、ゼアキサンチン産生について試験することにより、菌株R114/pBBR-K-Zea4およびpBBR-K-Zea4-上流におけるゼアキサンチン産生の改善をもたらすのはcrtE遺伝子の過剰発現であることが明らかとなった。この結果はパラコッカス属菌種R114株におけるゼアキサンチン産生を制限するGGPPシンターゼ（crtEによってコードされる）の活性と一致している。実施例1に記載の方法を用いて、菌株R114/pBBR-K-Zea4-上流の粗抽出物はR114よりも2.6倍高いGGPPシンターゼ活性を有することが判明した。これを直接証明するために、crtE遺伝子のみの過剰発現を可能にする新しいプラスミドを、下記の2項に記載のとおり構築した。
【０２４２】
表24.  プラスミドpBBR-K-Zea4の欠失誘導体を有する菌株によるゼアキサンチン産生
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aゼアキサンチン
b特異的生成（mgZXN/l/OD660）
【０２４３】
発現ベクターpBBR-K-PcrtEおよびpBBR-tK-PcrtEの作製
ベクターpBBR1MCS-2をBstXIおよびBsu36Iで切断し、大きい方の断片をアニールしたオリゴヌクレオチドMCS-2 上流
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およびMCS-2 下流
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に連結し、ベクターpBBR-K-Ndeを得た。リボソーム結合部位およびcrtE開始コドンを含む推定crtEプロモーター（PcrtE）（Pasamontesら、上記）を含む、パラコッカス属菌種R114株由来のカロテノイド遺伝子クラスターにおけるcrtE遺伝子上流の270bp領域を、パラコッカス属菌種R114株DNAから、プライマーcrtE-上流
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およびcrtE-下流
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を用いたPCRによって増幅した。PCR産物をEcoRIおよびNdeIで切断し、pBBR-K-NdeのEcoRI-NdeI切断バックボーンに挿入して、プラスミドpBBR-K-PcrtEを得た。NdeI部位はcrtEのATG開始コドンを含み、プライマーcrtE-下流に含まれていた。したがって、NdeI部位に埋め込まれた開始コドンを有する、導入されたいかなるコーディング領域も、crtEのリボソーム結合部位を用いて発現されると考えられる。プラスミドpBBR-K-PcrtEをBamHIで切断し、アニールしたオリゴヌクレオチドpha-t-上流
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およびpha-t-下流
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を挿入した。挿入を塩基配列決定により検証し、PcrtEプロモーターにより近いBamHI部位を再構成する方向に挿入されたオリゴを有する型のプラスミドをpBBR-tK-PcrtEと命名した。挿入された配列はパラコッカス属菌種R114株phaAとphaB遺伝子との間で見いだされる推定転写終結シグナルを有し（実施例10参照）、したがって、PcrtEプロモーターから開始された転写物の適当な転写終結を確実にする。
【０２４４】
プラスミドpBBR-K-PcrtE-crtE-3の作製
パラコッカス属菌種R114株宿主におけるcrtE遺伝子発現を高めるための多コピープラスミドを構築するために、crtE遺伝子をプラスミドp59-2（Pasamontesら、上記）から、プライマーcrtE-Nde
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およびcrtE-Bam
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を用いたPCRによって増幅した。増幅断片をpCR（登録商標）2.1-TOPOベクター中でクローニングし、プラスミドTOPO-crtEを得た。TOPO-crtEからのNdeI-BamHI断片をNdeI-BamHI消化プラスミドpBBR-K-PcrtE中でサブクローニングし、pBBR-K-PcrtE-crtEを得た。最後に、pBBR-K-PcrtE-crtE-3を、pBBR-K-PcrtE-crtEからの小さい方のBglII断片をpBBR-K-Zea4-上流からの小さい方のBglII断片で置換することにより構築した。プラスミドpBBR-K-PcrtE-crtE-3を電気穿孔によりパラコッカス属菌種R114株に導入した。実施例1に記載の方法を用いて、粗抽出物のGGPPシンターゼ活性はR114/pBBR-K-PcrtE-crtE-3株ではR114株よりも2.9倍高かった。この活性上昇の程度はR114/pBBR-K-Zea4-上流で観察された程度とほぼ同等であった。表25は、R114/pBBR-K-PcrtE-crtE-3株によるゼアキサンチン産生はR114/pBBR-K-Zea4-上流株と基本的に等しかったことを示している。
【０２４５】
表25.  R114/pBBR-K-PcrtE-crtE-3株およびR114/pBBR-K-Zea4-上流株によるゼアキサンチン産生の比較
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aゼアキサンチン
b特異的生成（mgZXN/l/OD660）
【０２４６】
実施例7：天然宿主、パラコッカス属菌種R114株におけるパラコッカス属菌種R114株メバロン酸オペロンの個々の遺伝子の発現
パラコッカス属菌種R114株宿主におけるパラコッカス属菌種R114株メバロン酸オペロンの個々のクローニングされた遺伝子の発現
TOPO-プラスミドにおけるメバロン酸オペロン遺伝子の突然変異が誘発されたコーディング領域（実施例5参照）をBamHIおよびNdeIで切り出し、BamHI-NdeI切断ベクターpBBR-tK-PcrtE（実施例6参照）と連結した。得られたプラスミドpBBR-tK-PcrtE-mvaA、pBBR-tK-PcrtE-idi、pBBR-tK-PcrtE-hcs、pBBR-tK-PcrtE-mvk、pBBR-tK-PcrtE-pmk、およびpBBR-tK-PcrtE-mvdを電気穿孔によりパラコッカス属菌種R114株に導入した。形質転換体を50mg/lのカナマイシンを含む寒天培地上で選択し、PCRで検証した。
【０２４７】
プラスミドに含まれるメバロン酸経路遺伝子が天然宿主パラコッカス属菌種R114株において発現されうることを示すために、HMG-CoAレダクターゼ活性をR114/pBBR-K株（対照）およびR114/pBBR-tK-PcrtE-mvaA株の粗抽出物で比較した（用いた方法は実施例1に示している）。R114/pBBR-K株およびR114/pBBR-tK-PcrtE-mvaA株におけるHMG-CoAレダクターゼの比活性は、それぞれ2.37U/mgおよび6.0U/mgであった。したがって、多コピープラスミド上のmvaA遺伝子が存在（およびPcrtEプロモーターから発現）により、HMG-CoAレダクターゼ活性は空のベクターpBBR-Kを有するR114の基準（すなわち染色体によりコードされた）活性と比較して2.5倍上昇した。
【０２４８】
実施例8：メバロン酸経路のクローニングされた遺伝子の、パラコッカス属菌種R114株crtE遺伝子との同時過剰発現のための「ミニオペロン」の構築
プラスミド構築
実施例6に示したとおり、プラスミドpBBR-K-PcrtE-crtE-3のパラコッカス属菌種R114株への導入により、ゼアキサンチンの産生が増大し、GGPPシンターゼ活性がR114株におけるゼアキサンチン生合成の律速因子であることが示された。実施例7はさらに、メバロン酸経路の酵素をコードする遺伝子が天然宿主パラコッカス属菌種R114株において過剰発現される可能性があり、コードされる酵素の活性上昇を引き起こすことを示した。しかしながら、メバロン酸オペロンのそれぞれ個別の遺伝子を含むプラスミドを担持するパラコッカス属菌種R114株の組換え菌株で、R114株と比較してゼアキサンチン産生の増大を示すものはなかった。パラコッカス属菌種R114株におけるメバロン酸オペロン遺伝子の過剰発現の利点は、ゼアキサンチン経路における下流の「ボトルネック」（GGPPシンターゼ）によって遮蔽されている可能性がある。各メバロン酸経路遺伝子（またはおそらくはこれらの遺伝子の組み合わせ）と、crtEとの同時過剰発現を可能にするプラスミドの作製によって、ゼアキサンチン生合成経路全体のすべての律速因子を軽減することができ、それによってゼアキサンチン産生が改善されると考えられる。次の項では、crtEとメバロン酸経路の5つの酵素をコードする各遺伝子との共同過剰発現を可能にするよう設計された「ミニオペロン」の構築を記載する。
【０２４９】
crtE、mvaA、idi、およびmvk遺伝子をそれぞれのTOPO-プラスミド（実施例5および6に記載）からBamHIおよびNdeIによって切り出し、BamHI-NdeI切断ベクターpOCV-1（実施例12に記載）と連結した。crtE遺伝子はコーディング領域の最後のヌクレオチドとしてアデニンを有しておらず、加えて、TGA停止コドンではなくTAGを有し、停止コドンとBamHI部位との間には不適当な距離がある。したがって、crtEの末端はオペロン構築ベクター（実施例12参照）の要求を満たしておらず、crtEはpOCV-1-crtEで構築されるいかなるオペロンでも最後の遺伝子でなければならない。第二のコドンの最初のヌクレオチドおよび最後のコドンの最後のヌクレオチドがアデニンであるという要求を満たすために、メバロン酸オペロンの三つの遺伝子に突然変異を導入しなければならなかった。Aspをコードするpmkの第二のコドンGATをAsnをコードするAATに変更した。mvdの最後のコドンはTで終わり、pmkおよびhcsの最後のコドンはCで終わる。これらのヌクレオチドをAに変えると、最後のアミノ酸がAspからGluに変わるpmkを除いて、沈黙突然変異が起こる。PCRによって必要な変化を導入するためにオリゴヌクレオチドを設計した。これらのPCR反応に用いたオリゴヌクレオチドおよび鋳型の配列を表26に示す。PCR産物はすべてpCR（登録商標）2.1-TOPOベクター中でクローニングし、プラスミドTOPO-mvdOCV、TOPO-pmkOCV、およびTOPO-hcsOCVを得た。挿入断片をNdeIおよびBamHIで切り出し、pOCV-2のNdeI-BamHI切断バックボーン（実施例12参照）と連結した。それぞれの「ミニオペロン」を構築するための最終クローニング段階は類似しており、pBBR-K-PcrtE-mvaA-crtE-3作製のための代表的スキームで例示する。
【０２５０】
表26：プラスミドTOPO-mvdOCV、TOPO-pmkOCV、およびTOPO-hcsOCV作製におけるPCRのために用いたオリゴヌクレオチドおよび鋳型
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【０２５１】
実施例9：パラコッカス属菌種R114株由来のFPPシンターゼをコードするispA遺伝子のクローニングと塩基配列決定
FPPシンターゼはパラコッカス属菌種R114株におけるゼアキサンチン生合成の中心経路にあるため、ispA遺伝子の量を増加することによってこの酵素の活性を高めることは、ゼアキサンチン産生を改善する可能性がある。このため、パラコッカス属菌種R114株由来のispA遺伝子を下記のとおりにクローニングし、塩基配列決定した。6つの細菌FPPシンターゼのアミノ酸配列を公的データベースから入手した。これらの配列はいくつかの高度に保存された領域を有している。二つのそのような領域、およびPCRのために用いたオリゴヌクレオチドを表27に示す。パラコッカス属菌種R114株DNAを鋳型として用いた、オリゴヌクレオチドGTT-1およびGTT-2によるPCRで、予想されたサイズの生成物を得た。PCR産物をベクターpCR（登録商標）2.1-TOPO中でクローニングし、塩基配列決定した。クローニングした断片をプローブに用いてパラコッカス属菌種R114株DNAのサザン分析を行い、約1.9kbのBamHI-NcoI断片にハイブリダイズすることが明らかとなった。パラコッカス属菌種R114株DNAをBamHIおよびNcoIで切断し、断片をアガロースゲル電気泳動で分離した。1.5から2.1kbの間の領域を単離し、クローニングベクターのBamHIおよびNcoI部位でクローニングした。この部分ライブラリを次いでispA-PCR断片をプローブに用いてスクリーニングし、二つの陽性クローンを単離した。塩基配列決定により両方のクローンのプラスミドがispA遺伝子を含むことが確認された。ispAの上流（配列番号：159）はエキソヌクレアーゼVIIの小さいサブユニット、XseB（配列番号：158）の遺伝子で、下流は1-デオキシキシルロース-5-リン酸シンターゼをコードするdxs遺伝子（配列番号：160）である。これは大腸菌で見られるのと同じ遺伝子の配置である。NcoI-BamHI断片の配列を配列番号：157に示し、XseB、IspA、およびDxsのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：158、配列番号：159、および配列番号：160に示す。ispAの開始コドンはGTGまたはATGであると考えられ、天然IspAのアミノ末端にそれぞれ複数のメチオニン残基を与える。
【０２５２】
実施例5〜7に記載のものと同じ一般的クローニング戦略を用いて、天然宿主パラコッカス属菌種R114株におけるispA遺伝子の過剰発現を可能にするための、新しいプラスミドpBBR-tK-PcrtE-ispA-2を作製した。プラスミドを電気穿孔によってR114株に導入し、形質転換体をPCRで確認した。三つの代表的形質転換体および対照菌株（R114/pBBR-K）を362F/2培地中で培養し（実施例11）、粗抽出物を調製して、実施例1に記載の方法に従ってispA遺伝子産物、FPPシンターゼの活性について分析した。R114/pBBR-Kにおける基準の（染色体によりコードされる）FPPシンターゼ比活性は62.6U/mgであった。三つの形質転換体におけるFPPシンターゼ活性は108.3U/mg（73％の上昇）、98.5U/mg（57％の上昇）、および83.8U/mg（34％の上昇）で、パラコッカス属菌種R114株の活性体におけるispA遺伝子過剰発現、およびその産物、FPPシンターゼの過剰産生が示された。
【０２５３】
表27：二つの保存細菌IspAペプチドから設計されたオリゴヌクレオチド
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Y＝CまたはT
【０２５４】
実施例10：パラコッカス属菌種R114株由来のアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子のクローニングと塩基配列決定
IPP生合成の最初の関係づけられた段階は、HMG-CoAシンターゼによるアセチル-CoAおよびアセトアセチル-CoAのヒドロキシメチルグルタリル-CoA（HMG-CoA）への縮合である。基質アセトアセチル-CoAは酵素アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ（アセトアセチル-CoAチオラーゼまたはβ-ケトチオラーゼとしても知られている）により、アセチル-CoAの二つの分子の縮合によって生成される。この反応は中枢代謝（アセチル-CoAでの）をメバロン酸経路を介してイソプレノイド生合成に連結するため、遺伝子増幅によるアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼの活性増大はカロテノイドおよび他のイソプレノイドへのインビボでの炭素の流れを増大する可能性を有している。パラコッカス属菌種R114株には、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼをコードする少なくとも二つの遺伝子、atoBおよびphaAがある。atoB遺伝子の末端はパラコッカス属菌種R1534株（米国特許第6,087,157）およびR114株（本試験）におけるcrtEの開始の上流にある165ヌクレオチドである。パラコッカス属菌種R1534株由来のatoB遺伝子のヌクレオチド配列およびコードされたアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼの対応するアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：175および配列番号：176に示す。
【０２５５】
実施例5に記載のものと同じ一般的戦略を用いて、atoB遺伝子をプラスミドpDSおよびpDS-His中でクローニングした。新しいプラスミド、pDS-atoBおよびpDS-His-atoBを大腸菌M15株に導入した。得られた菌株M15/pDS-atoBおよびM15/pDS-His-atoBをIPTG誘導を行って、および行わずに培養し（実施例5に記載のとおり）、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼアッセイ法（用いた方法は実施例1に記載）およびSDS-PAGE分析のために粗抽出物を調製した。M15/pDS-atoBおよびM15/pDS-His-atoBの（IPTG誘導を行った）抽出物におけるアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ比活性は、それぞれ0.2U/mgおよび13.52U/mgであった。プラスミドを有していない大腸菌で測定した基準活性は0.006U/mgであった。IPTG誘導の際、atoB遺伝子産物、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼは大腸菌M15において過剰産生される。天然（M15/pDS-atoB）およびHis-標識（M15/pDS/his-atoB）体両方が過剰産生された。過剰産生の程度はM15/pDS-His-atoBではるかに高く、二つの菌株の（誘導された）抽出物で測定したアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ活性と一致していた。
【０２５６】
アセトアセチル-CoAはポリヒドロキシアルカン酸（PHA）生合成における最初の関係づけられた段階の基質でもある。多くの細菌で、PHA生合成に関与する遺伝子はオペロンに分類される［MadisonおよびHuisman、Microbiol. Mol. Biol. Rev., 63:21-53 (1999)］。パラコッカス デニトリフィカンスにおいて、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼおよびアセトアセチル-CoAレダクターゼをそれぞれコードするphaAおよびphaB遺伝子は、オペロン中でクラスター化されるが［Yabutaniら、FEMS Microbiol. Lett. 133:85-90 (1995)］、経路の最後の酵素、ポリ(3-ヒドロキシアルカン酸）シンターゼをコードする遺伝子であるphaCはこのオペロンの一部ではない［Uedaら、J. Bacteriol. 178:774-779 (1995)］。パラコッカス属菌種R1534株由来のphaAおよびパラコッカス属菌種R114株由来のphaCの一部を含むPCR断片を、P. デニトリフィカンス phaAおよびphaC遺伝子配列に基づくプライマーを用いて得た。次いで、PCR断片をプローブに用いてパラコッカス属菌種R114株λ-ライブラリをスクリーニングした（実施例4参照）。phaAまたはphaCプローブにハイブリダイズしているいくつかのλ-クローンを単離し、挿入断片におけるphaAまたはphaC遺伝子の存在を配列分析によって検証した。三つのphaA λ-クローンをサブクローニングおよび塩基配列決定によりさらに分析し、それによりphaBがphaAの下流であることが判明した。したがって、P. デニトリフィカンスの場合と同様、phaAおよびphaB遺伝子はクラスター化されるが、phaC遺伝子はゲノム内の別の所に位置する。パラコッカス属菌種R114株由来のphaABクラスターのヌクレオチド配列およびアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ（PhaA）の導出アミノ酸配列を、それぞれ配列番号：177、ならびに配列番号：178および179に示す。オペロン中のPHA生合成に関与する遺伝子のクラスター化は、少なくともphaAおよびphaBは細胞がポリ(3-ヒドロキシアルカン酸)を産生するときに共に発現されることを示唆している。一方、推定転写停止シグナルがパラコッカス属菌種R114株由来のphaAおよびphaB遺伝子の間に見いだされ、これはP. デニトリフィカンスのphaABオペロンには存在しない（Yabutaniら、上記）。したがって、二つの遺伝子の発現はパラコッカス属菌種R114株内で結合されないと考えられる。
【０２５７】
実施例5に記載のものと同じ一般的戦略を用いて、phaA遺伝子をプラスミドpDS-His中でクローニングした。新しいプラスミド、pDS-His-phaAを大腸菌M15株に導入した。得られた菌株M15/pDS-His-phaAをIPTG誘導を行って、および行わずに培養し（実施例5に記載のとおり）、SDS-PAGE分析のために粗抽出物を調製した。大腸菌M15宿主において、IPTG誘導の際に、クローニングされたHis-標識パラコッカス属菌種R114株PhaA（アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ）が過剰産生される。
【０２５８】
アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼをコードするatoBまたはphaA遺伝子を増幅することの、ゼアキサンチン産生における潜在的な利点が前述されている。加えて、インビボで生成されたいくらかのアセトアセチル-CoAのPHA経路への変換を避けるために、アセトアセチル-CoAレダクターゼ（phaB遺伝子産物）の活性を低下または除去することも、ゼアキサンチン産生にとって有益であると考えられる。phaBの活性を欠くパラコッカス属菌種R114株の突然変異体を、遺伝子置換法（染色体内の野生型phaB遺伝子を遺伝子の不活性体に特異的に置換する）または古典的な突然変異誘発およびスクリーニングによって得ることができた。
【０２５９】
実施例11：パラコッカス属菌種R114株由来の突然変異体を用いたリコペンの工業的生産のためのモデル
リコペンはR-1512株ならびにその突然変異誘導体R1534およびR114によって代表される新しいパラコッカス属種におけるゼアキサンチン生合成の中間体である赤色カロテノイドである。リコペン自体は大きな商業的可能性を有するため、工業的発酵によりリコペンを産生するための新しいパラコッカス属種の可能性を試験することに興味が持たれた。リコペンを蓄積する、ゼアキサンチン生合成において遮断された突然変異体を得るために、パラコッカス属菌種R114株を紫外（UV）線にによる突然変異誘発にかけた後、赤色コロニーをスクリーニングした。UV突然変異誘発は下記のとおりに実施した。R114株の終夜培養物をME培地中で増殖させた（実施例2参照）。その終夜培養物を新鮮ME培地中に継代培養し（初期OD610＝0.1）、28℃で3時間インキュベートした。この培養物の一定量を遠心分離し、ペレットを20mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.2）で洗浄した。二回目の遠心分離後、ペレットを最終OD610が0.1になるまで再懸濁した。細胞懸濁液の一定量（10ml）を滅菌100mlガラスビーカーに入れた。細胞懸濁液の薄層にUV光を1450μW/cm2の束であらかじめ決められた最適な時間照射した。照射中、ビーカー内の紙用クリップおよびマグネチックスターラにより細胞懸濁液を混合した。突然変異を誘発した細胞懸濁液（および非突然変異対照）を362/F2寒天培地上に播種した（表28）。突然変異誘発の前後に、懸濁液の生存プレート数算定を三回ずつ行った（薄暗い室内光で）。プレートを28℃で4〜5日間インキュベートし、コロニーを評価した。いくつかの赤色コロニー（推定リコペン産生細胞）を再度線条培養することにより同定し、精製した。UV7-1と名付けた一つの突然変異体を、リコペン産生についてさらに評価した。
【０２６０】
表29は対照菌株R114およびその突然変異誘導体UV7-1によるゼアキサンチン産生およびリコペン産生を示す。R114株はゼアキサンチンのみを産生した。突然変異体UV7-1は主としてリコペンを産生したが、残余量のゼアキサンチンも産生し、UV7-1（おそらくはcrtY遺伝子内）の突然変異性遮断が完全でないことが示唆された。これらの結果は、パラコッカス属菌種R114株からのリコペン産生菌株の誘導が可能であることを示している。
【０２６１】
表28.  培地362F/2の配合法および調製
2004527265.tif 000056
【０２６２】
表29.  パラコッカス属菌種R114株およびその赤色突然変異誘導体UV7-1によるゼアキサンチンおよびリコペン産生
2004527265.tif 000057
【０２６３】
実施例12：パラコッカス属菌種R114株由来の菌株を用いた発酵によるアスタキサンチンの工業的生産のモデル
アスタキサンチンは主に水産養殖産業において用いられる商業的に重要なカロテノイドである。欧州特許第872,554号は、パラコッカス属菌種R1534株およびパラコッカス カロチニファシエンス E-396T由来のクローニングされたカロテノイド（crt）遺伝子の組み合わせを含むプラスミドを導入することによりアスタキサンチン産生が大腸菌内で達成可能であることを示した。また、クローニングされたcrt遺伝子（crtEBIYZ）およびcrtW（β-カロテンβ-4オキシゲナーゼ）は、ゼアキサンチンを通じてFPPからアスタキサンチンへの全生合成経路をコードした。P. カロチニファシエンス E-396 crtW、パラコッカス属菌種R1534 crtZ、およびパラコッカス属菌種R1534 crtE遺伝子、およびコードされるポリペプチドの配列を（配列番号：180および181（crtW）；182および184（crtZ）；ならびに184および185（crtE））に示す。しかしながら、アスタキサンチン産生がパラコッカス属菌種R114株宿主ファミリーにおいて達成可能であることは示されなかった。R114菌株由来の組換え菌株のアスタキサンチン産生における有用性を示すために、クローニングされたcrtW遺伝子（配列番号：180）を下記のとおりにR114株中に導入した。
【０２６４】
表30.  実施例12に記載の研究に用いられるPCRプライマー
2004527265.tif 000058
【０２６５】
パラコッカス カロチニファシエンス E-396T株のクローニングされたcrtクラスターからcrtW遺伝子を、プライマーcrtW-NdeおよびcrtW-Bam（表30）を用いたPCRにより増幅した（Tsubokuraら、上記；欧州特許第872,554号）。ATG開始コドンがNdeI部位（切断認識部位 CATATG）の後半を構成し、BamHI部位（GGATCC）が停止コドンの直後に導入されるように、プライマーを設計した。PCR産物をpCR（登録商標）2.1-TOPOベクター中でクローニングし、プラスミドTOPO-crtWを得た。crtW遺伝子をNdeIおよびBamHIで切り出し、NdeI-BamHI切断ベクターpBBR-K-PcrtE（実施例6に記載）中でサブクローニングして、プラスミドpBBR-K-PcrtE-crtWを作製した。
【０２６６】
プラスミドpBBR-K-PcrtE-crtWを標準的細菌接合法を用いてパラコッカス属菌種R114株に導入した｛大腸菌S17株［Prieferら、J. Bacteriol. 163:324-330 (1985)］が供与生物であった）。完全に接合した固体を、50mg/lカナマイシンを含む362F/2寒天培地（表28）上で選択し、同じ培地上で再度線条培養することによって精製した。菌株中のプラスミドpBBR-K-PcrtE-crtWの存在をPCRで確認した。菌株R114（宿主対照）、R114/pBBR-K（空ベクター対照）、およびR114/pBBR-K-PcrtE-crtWによるカロテノイド産生を、ME培地の代わりに液体362F/2培地を用いた以外は実施例1および2に記載のように、振盪フラスコ培養物中で測定した。これらの結果を表31に示す。対照菌株R114およびR114/pBBR-Kはゼアキサンチンしか産生しなかった。R114/pBBR-K-PcrtE-crtW株において、ゼアキサンチンはプラスミドがコードするβ-カロテンβ-4オキシゲナーゼによって完全に消費された。しかしながら、アスタキサンチンは産生されたが、他の二つのケトカロテノイド、アドニキサンチンおよびカンタキサンチンがより高いレベルで蓄積された。これは、β-カロテンヒドロキシラーゼ（R114株の染色体crtZ遺伝子によってコードされる）およびクローニングされたβカロテンβ-4オキシゲナーゼ（CrtW）のインビボでの不均衡を示していた。
【０２６７】
この仮説を試験するため、crtZおよびcrtW遺伝子をミニオペロン内に共に含む二つの新しいプラスミドを作製した。遺伝子の順は二つの構築物において異なるようにし（すなわち、crtZ-crtWおよびcrtW-crtZ）、crtZおよびcrtW遺伝子の異なる発現比を試行し、作製した。新しいプラスミドの作製は、下記のような特別なクローニングベクター群の構築を必要とした。一連のオペロン作製ベクター（ベクターpCR（登録商標）2.1-TOPOに基づく）を、遺伝子（この場合、crtZおよびcrtW）のオペロン中への構築を容易にするように設計した。目的の遺伝子はNdeI部位に埋め込まれたATG開始コドン（CATATG）、およびBamHI部位が直後にあるTGA停止コドンを有していなければならない。
【０２６８】
表31.  crtW遺伝子単独およびcrtZ遺伝子との組み合わせで発現するプラスミドを含むパラコッカス属菌種R114株におけるアスタキサンチン産生
2004527265.tif 000059
aZXN、ゼアキサンチン；AND、アドニキサンチン；CXN、カンタキサンチン；AXN、アスタキサンチン。
bmg/l（全カロテノイド）/OD660で表した特異的生成。
【０２６９】
さらに、開始コドンの後の最初のヌクレオチドおよび停止コドンの前の最後のヌクレオチドはアデニンでなければならず、遺伝子は少なくとも一つの酵素BsgI、BseMII、BseRI、およびGsuIの部位を欠いていなければならない。ポリリンカー配列（配列番号：190〜197）の配置が異なる、四つのオペロン作製ベクターを作製した。最初の二つの酵素の切断部位はNdeI部位内である。最後の二つの酵素の切断部位はBamHI部位の前にある。pOCV-1およびpOCV-4におけるBseRI部位は特有ではなく、オペロン作製に用いることはできない。
【０２７０】
オペロン中で構築する遺伝子をまず適当なオペロン作製ベクターのNdeIおよびBamHI部位の間に個別に挿入する。得られた、構想されるオペロンの上流遺伝子を有するプラスミドを、次いでポリリンカー末端の二つの酵素の一つ、およびベクターバックボーン内に特有の部位を有する酵素で切断する。構想されるオペロンの下流遺伝子を含むプラスミドを、ポリリンカーの最初の二つの酵素の一つ、および最初のプラスミド（所望の上流遺伝子を含む）に用いたものと同じ酵素（ベクターバックボーン内に特有の部位を有する）で切断する。遺伝子を有する断片を単離して連結し、NdeIとBamHI部位との間に両方の遺伝子を有するpOCVプラスミドを得る。さらなる遺伝子を同様の様式で加えることができる。構築した遺伝子は、上流遺伝子のTGA停止コドンの最初の二つのヌクレオチドTGが、下流遺伝子のATG開始コドンの最後の二つのヌクレオチドと一致するように重なる。同じ重複が、パラコッカス属菌種R1534株のカロテノイド（crt）オペロン（crtZYIB）におけるすべての遺伝子の間で見いだされる（Pasamontesら、上記）。
【０２７１】
pOCVバックボーンはpCR（登録商標）2.1-TOPO由来である。ColE1開始点の上流の、複製に必要な領域のBseMII部位を、部位をCTCAGからCACAGに変更する部位指向性突然変異誘発によって除去した。残る三つのBseMII部位および一つのGsuI部位を、0.8kbのDdeI-Asp700断片を除去することにより除去した。残るベクターをDdeI陥凹末端の充填後に平滑末端連結した。ポリリンカーをBamHIとXbaI部位との間に、適当な5'オーバーハングを有するアニールされたオリゴヌクレオチドによって挿入した。
【０２７２】
プラスミドpBBR-K-PcrtE-crtZWを、下記のとおりにオペロン作製ベクターpOCV-2を用いて作製した。crtZ遺伝子を、プライマーcrtZ-NdeおよびcrtZ-Bam（表30）を用いたパラコッカス属菌種R114株からPCRにより増幅した。ATG開始コドンがNdeI部位（切断認識部位CATATG）の後半を構成し、BamHI部位（GGATCC）が停止コドンの直後に導入されるように、プライマーを設計した。PCR産物をpCR（登録商標）2.1-TOPOベクター中でクローニングし、プラスミドTOPO-crtZを得た。二つの遺伝子をミニオペロン内で構築するため、両遺伝子crtZおよびcrtWをプラスミドTOPO-crtZおよびTOPO-crtWからNdeIおよびBamHIで切り出し、NdeI-BamHI切断ベクターpOCV-2中でサブクローニングし、プラスミドpOCV-2-crtZおよびpOCV-2-crtWを作製した。プラスミドpOCV-2-crtZをBseMIIおよびPstIで切断し（カナマイシン耐性遺伝子には特有のPstI部位がある）、2.4kbの断片（crtZを含む）をpOCV-2-crtWからのcrtWを含む1876bpのBseRI-PstI断片と連結した。得られたプラスミド、pOCV-2-crtZWをNdeIおよびBamHIで切断し、crtZW断片をpBBR-K-PcrtEのNdeI-BamHIバックボーンと連結して、pBBR-K-PcrtE-crtZWを得た。プラスミドpBBR-K-PcrtE-crtWZを同様の様式で作製した。
【０２７３】
表31のデータは、アドニキサンチン、カンタキサンチン、およびアスタキサンチンの比は、pBBR-K-PcrtE-crtW株と比較してR114/pBBR-K-PcrtE-crtWZ株で明らかな変化はなかったことを示している。しかしながら、pBBR-K-PcrtE-crtZW株では、ケトカロテノイドの産生はアスタキサンチンが多くなるようにシフトした。この結果は、発現のレベルがミニオペロン内の遺伝子の位置に依存することを示しており、β-カロテンヒドロキシラーゼ活性のインビボレベルを高めると、この酵素の活性と、ゼアキサンチンのアスタキサンチンへの完全変換のためにより好ましいβ-カロテンβ-4オキシゲナーゼの活性との間の均衡が得られることを示唆している。
【０２７４】
本実施例に記載の結果は、適当な遺伝子操作を通じて、アスタキサンチンのみならず、商業的に興味が持たれる他のケトカロテノイドをパラコッカス属菌種R114株またはその関連株において産生可能であることも示している。例えば、R114株のcrtZ突然変異体（β-カロテンヒドロキシラーゼ活性を欠いている）においてβ-カロテンβ-4オキシゲナーゼをコードする遺伝子を発現すると、ヒドロキシル化カロテノイドを同時産生することなく、もっぱらケトカロテノイド、例えば、エキネノンまたはカンタキサンチンを産生することになる。本実施例および実施例11に示す結果を共に考慮すると、産業的に重要なカロテノイドを産生するためのパラコッカス属菌種R114株およびその幅広い関連株の有用性を示している。
【０２７５】
実施例13：メバロン酸経路遺伝子を過剰発現するパラコッカス属菌種R114株培養物中のメバロン酸塩の蓄積
パラコッカス属菌種R114株におけるメバロン酸経路の遺伝子の過剰発現は、メバロン酸経路を通じての炭素の流れの増大につながる。プラスミドpBBR-K-mev-op16-2の作製は実施例5に記載した。プラスミドpBBR-K-mev-op-上流-4を下記のとおりに作製した。mvaA遺伝子のほとんどを含むDNA断片ならびに全idiおよびhcs遺伝子を、パラコッカス属菌種R114株メバロン酸オペロンを含むλ-クローンの部分消化後、3.1kbのSmaI-SalI断片上で得た（実施例4参照）。この断片をpUC19中でサブクローニングし、プラスミドpUC19mev-op-上流'を得た。サブクローニングを容易にするために、メバロン酸遺伝子を含むpUC19mev-op-上流'のKpnI-HindIII断片をベクターpBluescriptKS+中で再クローニングし、プラスミドpBluKSp-mev-op-上流'を得た。pUC19mev-op-上流'からの1.7kbのSalI断片を、次にパラコッカス属菌種R114株由来のクローニングされたsalI-EcoRI断片Mを含むpUC19由来プラスミドであるプラスミド2ES2-1のSalI部位でクローニングした（実施例4参照）。これによりプラスミドpUC19mev-op-上流-2を得た。次いでプラスミドpUCmev-op-上流-3を、メバロン酸オペロンの始まり部分を有するpUC19mev-op-上流-2からのBbsI-BsaI断片と、idiおよびhcsを含むpBluKSp-mev-op-上流'からのBbsI-BsaI断片とを結合することによって得た。これとは別に、特有のMluI部位を、ベクターpBBR1MCS-2（実施例5参照）のNsiIとKpnI部位との間にMluI制限部位を含むアニールしたプライマーを挿入することにより導入した。得られた新しいクローニングベクターpBBR-K-MluをMluIおよびKpnIで切断し、メバロン酸オペロンの最初の三つの遺伝子を含むpUCmev-op-上流-3からのMluI-KpnI断片を挿入して、プラスミドpBBR-K-mev-op-上流-3を得た。次いで、プラスミドpBBR-K-mev-op-上流-4を、mvk遺伝子のほとんど、およびpmkの5'末端を含むプラスミド16SB3からのSmaI断片挿入によって作製した（プラスミド16SB3はパラコッカス属菌種R114株SalI-BamHI断片Aを含むpUC19由来プラスミドである；実施例4参照）。プラスミドpBBR-K-mev-op-上流-4の挿入断片は推定メバロン酸オペロンプロモーター領域、メバロン酸オペロンの最初の四つの遺伝子、およびpmkの5'末端を含む。
【０２７６】
プラスミドpBBR-K-mev-op16-2およびpBBR-K-mev-op-上流-4をそれぞれパラコッカス属菌種R114株に電気穿孔により導入した。ゼアキサンチンおよびメバロン酸塩の、その新しい菌株による産生を対照菌株R114と比較した。菌株をバッフル付き振盪フラスコ内の液体培地362F/2（実施例11参照）中で72時間培養した。菌株R114/pBBR-K-mev-op16-2およびR114/pBBR-K-mev-op-上流-4に対して、カナマイシン（50mg/l）も培養物中に加えた。培養温度は28℃、振盪は200rpmで行った。ゼアキサンチンを、実施例1に記載の方法で測定し、培養上清中のメバロン酸塩を下記のとおりに測定した：0.6ml培養試料を13,000×gで4分間遠心分離した。上清400μlをメタノール400μlに加え、ボルテックスにより1分間混合した。混合物を13,000×gで4分間再度遠心分離した。次いで、得られた上清を、Lindemannら［J. Pharm. Biomed. Anal. 9:311-316 (1991)］の方法に下記のようなわずかな改変を加えた方法を用いたガスクロマトグラフィ（GC）により直接分析した。GCはクールオンカラム注入口および水素炎イオン化検出器を備えたHewlett-Packard 6890plus装置（Hewlett-Packard、ペンシルバニア州アボンデール、米国）であった。前述のとおりに調製した試料1μlを、架橋変性ポリエチレングリコール（HP-FFAP、Agilent Technologies、米国）の0.52ミクロンフィルムでコーティングした溶融シリカキャピラリーカラム（長さ15m×内径0.32mm）に注入した。キャリアーガスとしてヘリウムを、入口圧0.6barで用いた。プログラム可能注入口の温度は、30℃/分の比率で82℃から250℃まで勾配をつけた。カラム温度プロファイルは80℃で0.5分の後、15℃/分で250℃までの直線温度勾配、および最後に250℃で5分間維持した。検出器温度は320℃に維持した。
【０２７７】
最初の実験において、ゼアキサンチンおよびメバロン酸塩の産生をR114株およびR114/pBBR-K-mev-op16-2株で測定した（表32）。両方の菌株がほぼ同量のゼアキサンチンを産生したが、R114/pBBR-K-mev-op16-2株は4倍高いレベルのメバロン酸塩を産生した。これらの結果は、パラコッカス属菌種R114株におけるメバロン酸経路の遺伝子の過剰発現は、メバロン酸経路を通じた増大した炭素の流れを引き起こすことを示している。R114/pBBR-K-mev-op16-2株は過剰発現されたcrtE遺伝子を有しておらず、crtE遺伝子産物産生（GGPPシンターゼ）はパラコッカス属菌種R114株におけるゼアキサンチン産生の制限段階であることが知られている（実施例6および8参照）ため、メバロン酸塩の蓄積が予想された。限られた量のGGPPシンターゼを有する細胞は、メバロン酸経路の酵素の過剰産生において、FPPを蓄積すると予想され、FPPはメバロン酸キナーゼの強力な阻害剤であることが知られている［DorseyおよびPorter、J. Biol. Chem. 243:4667-4670 (1968)；GrayおよびKekwick、BBA 279:290-296 (1972)；Hinsonら、J. Lipids Res. 38:2216-2223 (1997)］。したがって、メバロン酸経路の遺伝子過剰発現の結果によるFPPの蓄積は、メバロン酸キナーゼの阻害を引き起こすと考えられ、これは次に培養物中のメバロン酸塩蓄積として現れる。
【０２７８】
表32.  R114株およびR114/pBBR-K-mev-op16-2株におけるゼアキサンチンおよびメバロン酸塩産生
2004527265.tif 000060
【０２７９】
第二の実験において、ゼアキサンチンおよびメバロン酸塩の産生をR114株およびR114/pBBR-K-mev-op-上流-4の二つの独立の単離株で測定した（表33）。これらの結果は再度、メバロン酸経路の遺伝子の過剰発現は、メバロン酸経路を通じた炭素の流れが増大したことを示している。
【０２８０】
表33.  R114株およびR114/pBBR-K-mev-op-上流-4株におけるゼアキサンチンおよびメバロン酸塩産生
2004527265.tif 000061
【０２８１】
下記の生物学的材料を、ブダペスト条約の条項に従い、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）（10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2201, USA）に寄託し、下記のアクセッション番号を割り付けられた：
2004527265.tif 000062
【０２８２】
上で引用した特許、特許出願、および出版物はすべて、本明細書において完全に再度引用されているかのように、それらの全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【０２８３】
本発明は上述のように記載され、本発明は多くの様式で変動しうることが明らかであると思われる。そのような変動は本発明の精神および範囲から逸脱していると考えられることはなく、そのような改変はすべて以下の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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