(57)【要約】イオン交換により水性液体から物質を除去する方法であって、液体に存在する該物質を供給すること；少なくとも二つの異なるリガンドを含む吸収マトリックスを供給すること；物質をマトリックスへ吸着させるのに十分な期間および条件下に液体をマトリックスと接触させること；ならびに物質をマトリックスから脱着させる溶離剤を加えることを含む、方法。リガンドのそれぞれ一つは吸着工程の間物質と相互作用し、そして少なくとも一つのリガンドは荷電され、物質とイオン的相互作用をする能力がある。方法は、陽イオン交換もしくは陰イオン交換として操作され得る。物質の脱着は、増加するイオン強度を含む溶離剤を加えることにより実施される。本発明はまた、分離手順で使用されるとき同じ種類の物質と相互作用する少なくとも二つの構造的に異なるリガンドを含む吸着剤を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオン交換により水性液体から物質を除去する方法であって、該方法は：
−  該物質が荷電状態で存在する、液体を提供する；
−  少なくとも一つの弱イオン交換体もしくは少なくとも一つの強イオン交換体を含む、少なくとも二つの構造的に異なるリガンドを含む吸着マトリックスを提供する；
−  物質をマトリックスへ吸着させるのに十分な期間で液体をマトリックスと接触させる；そして
−  物質をマトリックスから脱着させる溶離剤を加える；
工程を含み、
そこではそれぞれのリガンドは吸着工程の間に物質と相互作用し、そして少なくとも一つの該リガンドが荷電されてかつ物質とのイオン相互作用の能力がある、方法。
【請求項２】
一つの荷電リガンドは陰イオン交換体でありそして除去される物質は始めは負に荷電されていて、吸着条件は陰に荷電した物質のｐＨ＞ｐＩによりおよびリガンドの正に荷電した基のｐＨ＜ｐＫａにより規定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
物質についての吸着容量は、本質的にすべての荷電基が第四級アンモニウム基（ｑ−基）である対応する参照イオン交換体における同じ物質の吸着容量の≧２００％のような≧１００％である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
物質の脱着が増加するイオン強度勾配を含む溶離剤を加えることにより実施される、請求項２もしくは３に記載の方法。
【請求項５】
一つの荷電リガンドは陽イオン交換体でありそして除去される物質は始めは正に荷電されていて、吸着条件は正に荷電した物質のｐＨ＜ｐＩによりおよびリガンドに対応する陰性の酸のｐＨ＞ｐＫａにより規定される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
物質についての吸着容量は、本質的にすべての荷電基がスルホプロピル基である対応する参照イオン交換体における同じ物質の吸着容量の≧２００％のような≧１００％である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
物質の脱着が増加するイオン強度を含む溶離剤を加えることにより実施される、請求項５もしくは６に記載の方法。
【請求項８】
吸着が０．１０Ｍ  ＮａＣｌ、好ましくは０．２０Ｍ  ＮａＣｌもしくは０．３０Ｍ  ＮａＣｌの水溶液のイオン強度より高いかまたは同一なイオン強度において実施される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
リガンドが０．２５Ｍ  ＮａＣｌに相当するイオン強度において水性参照液体中で興味のある物質を結合させる能力がある、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも一つのリガンドは疎水性および／もしくは電子供与体−受容体相互作用により物質と相互作用する請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
該リガンドは荷電可能でありそしてマトリックスから物質の脱着はｐＨスイッチにより実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
溶離剤の極性は、物質が除去される水性液体のそれより低い、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも一つのリガンドは、
（ｃ）物質との電荷−電荷引力的相互作用を与える第一のモード部位、および
（ｄ）物質との電荷−電荷引力的相互作用ならびに／または疎水性相互作用および／もしくは電子供与体−受容体相互作用を与える第二のモード部位
を含む混合モードリガンドである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法であって、それは液体から生体高分子構造の除去のためのものであり、その構造は炭水化物構造、ペプチド構造、ペプチド核酸（ＰＮＡ）構造および核酸構造から成る群から選択される、方法。
【請求項１５】
その電荷がｐＨ−依存性である生体高分子の除去のためのものである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
両性物質の除去のためである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法での使用に適する吸着剤であって、それは分離される物質との電子供与体−受容体相互作用に関与する少なくとも一つの官能基を含む第一および第二のリガンドを含み、その官能基は：
（ｉ）以下のような供与体原子／基：
・  ヒドロキシ、エーテル、ニトロ、カルボキシのようなカルボニル、エステル（−Ｏ−および−ＣＯ−Ｏ−）ならびにアミドにあるような、自由電子対を持つ酸素、
・  チオエーテル（−Ｓ−）にあるような、自由電子対を持つ硫黄、
・  アミン、スルホンアミドを含むアミドにあるような、自由電子対を持つ窒素、
・  ハロゲン（フッ素、塩素、臭素およびヨウ素）、ならびに
・  ｓｐ−およびｓｐ２−混成炭素、または
（ｉｉｉ）受容体原子／基、即ち、金属イオン、シアノ、ニトロ中の窒素、例えばＨＯ−（ヒドロキシ、カルボキシ等）、−ＮＨ−（アミド、アミン等）、ＨＳ−（チオール等）等にあるような陰性原子に結合した水素のような、電子不足原子もしくは基
から成る群から選択される、吸着剤。
【請求項１８】
任意の対のセットについて置換度の間の比率は０．０２〜５０以内である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも支持マトリックスの部分において、第一および第二のリガンドが、それらがお互いに関して本質的に無作為に存在するように導入されている、請求項１７もしくは１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、電荷を帯びておりかつ水性液体（Ｉ）中に存在する物質を除去する方法に関する。この方法は、
（ｉ）液体をイオン交換吸着剤（１）と、吸着剤と物質の間に結合をさせる条件下に、接触させ、そして
（ｉｉ）液体（ＩＩ）の使用により該物質を吸着剤から脱着させる
工程を含む。
【０００２】
本発明はまた、新規でかつ革新的な方法に使用され得る新規なイオン交換吸着剤に関する。
本発明の吸着剤は、同じベースマトリックス上で結合される二つもしくはそれ以上の異なるリガンドを含有する。リガンドは機能性および／もしくは構造元素に関して異なる。用語“混合モードリガンド”および“二項リガンド”とは、結合される物質と相互作用する少なくとも二つの異なるが共同的な部位を供給する能力のあるリガンドをいう。これらの部位は機能性および／種類に関して異なる。
【０００３】
典型的に、荷電物質は生物有機性および／もしくは両性である。物質中の荷電基の数に関しては、もし一つ、二つもしくはそれ以上の正に荷電した基および／または一つ、二つもしくはそれ以上の負に荷電した基のように、二つもしくはそれ以上の荷電した基があれば、最大の利点が得られる。物質の分子量に関しては、もし分子量が、５，０００ダルトン以上もしくは１０，０００ダルトン以上のように、１，０００ダルトン以上であれば、最大の利点が得られる。
【０００４】
背景技術
上で規定した方法としては、充てんもしくは流動床の形状で一体構造のまたは粒子の吸着剤を使用するクロマトグラフィー手順および典型的に粒子吸着剤のみを含むバッチ様手順が挙げられる。一体構造の吸着剤としては、多孔性膜、多孔性プラグおよびまた管壁ならびに他の形状の一体型マトリックスが挙げられる。この手順の目的は、電荷を帯びている物質を精製することであろうが、この場合には物質は工程（ｉ）の間に吸着剤に結合されるようになり、そして、必要であれば、吸着剤からの脱着後にさらに精製される。もう一つの目的は、液体（Ｉ）から物質を、それがその中では望ましくない成分であるという理由で、除去することである。後者の場合には、液体を工程（ｉ）の後でさらに処理してもよい。両方の場合において、およびそのように望まれるならば、吸着剤を結合された物質の脱着後に再使用してもよい。
【０００５】
他の使用は、電荷を帯びている物質もしくは液体（Ｉ）に残存する物質のどちらかを測定することを伴うアッセイ手順である。
【０００６】
二種類以上のリガンドで機能化されている吸着剤を記述する、数多くの出版物がある。
・  ＷＯ  ９６００７３５、ＷＯ  ９６０９１１６およびＵＳ  ５，６５２，３４８（Ｂｕｒｔｏｎ等）は、疎水性相互作用に基づく分離方法および基材を開示する。一つの実施態様において、基材はイオン化できるおよびイオン化できないリガンドの両方を含有してもよい。主なアイディアは、装てんを疎水性相互作用を促進する条件下で行い（中性の炭化水素リガンド）そして、吸着されたタンパク質に比較して反対の電荷でリガンドを荷電させるために（反発）、脱着をｐＨスイッチにより行うことである。かくして、ＷＯ  ００／６９８７２はマトリックス上で二つのリガンドを利用し、それらの一つは吸着の間に核酸と相互作用をしていて、そして他の一つは核酸の反発によるその脱着のために利用される。
・  Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ５６（１） （１９９７） ４５−５５は、
（ａ）荷電できるが吸着の間には本質的に変化しない芳香族炭化水素リガンド（第二級アミン／アンモニウム）、もしくは
（ｂ）荷電できない芳香族リガンドプラス未反応のスペーサーに対応する別の陽イオン交換リガンド（−ＣＯＯ−／ＣＯＯＨ）（芳香族リガンドを導入するために使用されている）
を含む吸着剤上でキモシンを精製する試みを記載している。
・  Ｉｓｓａｑ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｌｉｑ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ． １１（１４） （１９８８） ２８５１−２８６１； Ｆｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １５４ （１９８６） ５７０−５７７； ａｎｄ Ｂｕｚｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｌｉｑ． Ｃｈｒｏｍ． ＆ Ｒｅｌ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． ２０（１５） （１９９７） ２３２１−２３２５は、二種類のリガンド（イオン−交換リガンドおよび疎水性（アルキル）相互作用リガンド）で誘導体化したシリカ粒子のクロマトグラフィー的性質を記載している。
・  Ｔｅｉｃｈｂｅｒｇ， Ｊ． Ｃｈｒｏｍｔｏｇ． ５１０ （１９９０） ４９−５７は、正に荷電したリガンドが、加えてまた正に荷電した反発リガンドを保有する吸着剤上で中性のアフィニティーリガンドと相互作用しているアフィニティー反発クロマトグラフィーを記載している。
・  ＷＯ  ９８３９０９４（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）およびＷＯ  ９８３９３６４（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）は、一つの実施態様として、表面層中に一種類の荷電したリガンドがある一方で、ビーズの内部は反対の電荷を持つリガンドで機能化されているビーズを開示している。ビーズは生体分子の吸着用に提案されている。
・  分離マトリックス上にアフィニティーリガンドの導入は、カップリング反応における非能率のために二種類以上の基および／もしくは残渣基をしばしば導入することは公知である。塩化Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルの多糖マトリックスとの反応は、例えば、典型的に（ａ）一つの第三級アンモニウム基のみを含有するリガンドを（ｂ）第三級および第四級アンモニウム基の両方を含有するリガンドと一緒に導入する。我々の知る限りでは、高い塩濃度を含むイオン交換条件における異常に高いブレイクスルー容量は、このタイプの従来のイオン交換体については決して報告されていない。Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ５６（１） （１９９７） ４５−５５と比較されたい。
【０００７】
発明の目的
本発明の目的は：
ａ）比較的高いイオン強度においてイオン交換リガンドを有する吸着剤への、タンパク質のような、荷電物質の吸着／結合を達成すること；
ｂ）標的物質を結合する十分な容量を保持しながら、低減したリガンド含量を有することができるイオン交換基材を提供すること；
ｃ）イオン交換体へ吸着／結合した物質の広範なイオン強度区間内で溶出／脱着を可能にすること、即ち選択性を増加させること；
ｄ）高いブレイクスルー容量（典型的には、＞２ｍｇ／未乾ゲルｍｌ、３００ｃｍ／時間における流動で１０％ブレイクスルー）、タンパク質の良好な回収率（しばしば９５％もしくはそれ以上）等を有するイオン交換体をデザインすること；
ｅ）高い塩濃度においてイオン交換により結合していて、そしてクロマトグラフィー的性質の著しい損失無しに、アルカリ性（ｐＨ≦１３）および／もしくは酸性（ｐＨ≧３）溶液での再生ならびに／または洗浄に耐えることができるイオン交換体をデザインすること；
ｆ）低いイオン強度を必要とするプロセスで用いられるべき比較的高いイオン強度を持つ試料の広範な希釈を不要にすること；
ｇ）簡略化脱塩手順を提供すること；
ｈ）例えば、生産性を改良しおよび／もしくはプロセス装置および投資のコストを低減させるために、イオン交換体を必要とする簡略化プロセスを提供すること；
ｉ）例えば、イオン交換体上で１リットルより多い試料量（＝液体（Ｉ））が添加されて処理される大規模のプロセスにおいて、分取応用に適用されるイオン交換体を提供すること；
ｊ）イオン交換工程後の疎水性相互作用吸着のような、高い塩濃度におけるイオン交換体吸着剤の溶出に基づく分離原理の新規な組合せのための機会を提供すること
である。
【０００８】
一つもしくはそれ以上のこれらの目的は、比較的高い塩濃度でかつ比較的高いイオン強度で吸着するイオン交換体は利点を有することの認識に基づいている。これは、主として脱着を達成するために高い塩濃度および高いイオン強度を利用する、伝統的なイオン交換体に反対である。
【０００９】
本発明の概要
上述の一つもしくはそれ以上の目的は、添付の特許請求の範囲で規定されるよな方法を用いて達成され得る。かくして、本発明はイオン交換により水性液体から物質を除去する方法に関し、該方法は：
−  該物質が荷電状態で存在する、液体を提供する；
−  少なくとも一つの弱イオン交換体もしくは少なくとも一つの強イオン交換体を含む、少なくとも二つの構造的に異なるリガンドを含む吸着マトリックスを提供する；
−  物質をマトリックスへ吸着させるのに十分な期間で液体をマトリックスと接触させる；そして
−  物質をマトリックスから脱着させる溶離剤を加える；
工程を含み、
そこではそれぞれのリガンドは吸着工程の間に物質と相互作用し、そして少なくとも一つの該リガンドが荷電されてかつ物質とのイオン相互作用の能力がある。
【００１０】
したがって、本発明は、二つのリガンドを使用するが一つだけが核酸を吸着するのに有効である、ＷＯ  ００／６９８７２と比較して、吸着の間に興味のある物質と両方が有効に相互作用する二つのリガンドを使用する。
【００１１】
さらに、本発明は主としてイオン相互作用を利用するので、本方法は、疎水性相互作用が利用される、上で議論したＷＯ  ９６／０９１１６とはまた異なる。たとえ該ＷＯ  ９６／０９１１６における実験は同じ条件を用いて幾つかのリガンドを試験するとしても、それぞれのものは単独で、組合せでなく試験され、それ故にただ一つのリガンド吸着剤がそこでは提案されている。さらに、この参照体の溶出は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによる場合が典型的にそうであるように、塩濃度を低下させることにより実施される。反対に、本発明は溶出に塩濃度の増加を利用できて、これは本吸着の主な相互作用はイオンタイプであることを示す。
【００１２】
一つの実施態様において、少なくとも一つの荷電リガンドは陰イオン交換体であり、そして除去される物質は始めは負に荷電されていて、吸着条件は陰に荷電した物質のｐＨ＞ｐＩによりおよびリガンドの正に荷電した基のｐＨ＜ｐＫａにより規定される。本発明による利点は、この吸着効率が予期しないほど高いと示されていることである。かくして、負に荷電した物質についての吸着容量は、本質的にすべての荷電基が第四級アンモニウム基（ｑ−基）である対応する参照イオン交換体における同じ物質の吸着容量の≧１００％、および≧２００％さえと高い。
【００１３】
もう一つの実施態様において、少なくとも一つの荷電リガンドは陽イオン交換体であり、そして除去される物質は始めは正に荷電されていて、吸着条件は正に荷電した物質のｐＨ＜ｐＩによりおよびリガンドに対応する陰性の酸のｐＨ＞ｐＫａにより規定される。ここでは、この物質についての吸着容量は、本質的にすべての荷電基がスルホプロピル基である対応する参照イオン交換体における同じ物質の吸着容量の≧１００％、および≧２００％さえと高い。
【００１４】
本文脈において、吸着容量は、本出願において時々使用されているブレイクスルー容量と同じ変数を指すことを理解すべきである。動的吸着容量は、水性液体が吸着剤を通過するようにされる、クロマトグラフィー手順における容量を指す。同様に、静的吸着容量はバッチ手順の文脈で使用される。
【００１５】
本方法の一つの実施態様において、吸着は、０．１０Ｍ  ＮａＣｌ、好ましくは０．２０Ｍ  ＮａＣｌもしくは０．３０Ｍ  ＮａＣｌの水溶液のイオン強度より高いかまたは同一なイオン強度において実施される。
もう一つの実施態様において、リガンドは、０．２５Ｍ  ＮａＣｌに相当するイオン強度において水性参照液体中で興味のある物質を結合させる能力があることを特徴とすることができる。
【００１６】
特異的な実施態様において、少なくとも一つのリガンドは疎水性および／もしくは電子供与体−受容体相互作用により物質と相互作用する。該リガンドは好ましくは荷電可能であり、そしてマトリックスから物質の脱着はｐＨスイッチにより実施される。
本方法のなおもう一つの実施態様において、溶離剤の極性は、物質が除去される水性液体のそれより低い。
【００１７】
有利な実施態様において、本方法は液体から生体高分子構造の除去のためのものであり、この構造は炭水化物構造、ペプチド構造、ペプチド核酸（ＰＮＡ）構造および核酸構造から成る群から選択される。特異的な実施態様において、この方法は、その電荷がｐＨ−依存性である生体高分子の除去のためのものである。
本方法をまた、両性物質の除去のために使用することができる。
【００１８】
本発明はまた、少なくとも二つのリガンドを含み、そして少なくとも一つのリガンドは混合モードリガンドである、本発明にしたがう方法での使用に好適な吸着剤に関する。そのような混合モードリガンドは、
（ａ）物質との電荷−電荷引力的相互作用を与える第一のモード部位、および
（ｂ）物質との電荷−電荷引力的相互作用ならびに／または疎水性相互作用および／もしくは電子供与体−受容体相互作用を与える第二のモード部位
を含むであろう。
【００１９】
一つの実施態様において、本吸着剤は、分離される物質との電子供与体−受容体相互作用に関与する少なくとも一つの官能基を含む第一および第二のリガンドを含み、その官能基は：
（ｉ）以下のような供与体原子／基：
・  ヒドロキシ、エーテル、ニトロ、カルボキシのようなカルボニル、エステル（−Ｏ−および−ＣＯ−Ｏ−）ならびにアミドにあるような、自由電子対を持つ酸素、
・  チオエーテル（−Ｓ−）にあるような、自由電子対を持つ硫黄、
・  アミン、スルホンアミドを含むアミドにあるような、自由電子対を持つ窒素、
・  ハロゲン（フッ素、塩素、臭素およびヨウ素）、ならびに
・  ｓｐ−およびｓｐ２−混成炭素、または
（ｉｉ）受容体原子／基、即ち、金属イオン、シアノ、ニトロ中の窒素、例えばＨＯ−（ヒドロキシ、カルボキシ等）、−ＮＨ−（アミド、アミン等）、ＨＳ−（チオール等）等にあるような陰性原子に結合した水素のような、電子不足原子もしくは基
から成る群から選択される。
【００２０】
一つの実施態様において、吸着剤において任意の対のセットについて置換度の間の比率は０．０２〜５０以内である。一つの実施態様において、少なくとも支持マトリックスの部分において、第一および第二のリガンドは、それらがお互いに関して本質的に無作為に存在するように導入されている。
【００２１】
本発明の第一の態様
以下に、本発明を、理解を容易にし、さらに種々の実施態様を例示するために、番号を付けた工程を参照してさらに詳しく説明する。かくして、本発明者が発見していることは、もしイオン交換吸着剤（１）が、
（ａ）少なくとも一つのリガンドは液体（Ｉ）により与えられる条件下で物質上に存在する電荷に反対の電荷を有し、
（ｂ）それぞれのリガンドは、液体（Ｉ）により与えられる条件下での結合のために物質と相互作用する能力がある、
少なくとも二つの異なるリガンド（リガンド１、リガンド２）で機能化されているベースマトリックスを含むことを特徴とするイオン交換吸着剤の中で選択されるならば、序言の部で規定されたプロセスにより一つもしくはそれ以上の上記目的を達成することができることである。
相互作用は、他のリガンドのいずれかに関して独立したもしくは共同的な様式のどちらかにある。
【００２２】
本発明の文脈で意図される典型的なリガンドの分子量は、＜７００のような＜１０００ダルトンである。存在し得るハロゲンの分子量の寄与はこれらの範囲に含まれていない。
【００２３】
リガンド１は荷電リガンドである、即ち、工程（ｉ）で与えられる条件下に電荷を帯びている、単一および混合モードリガンドから選択される（第一カテゴリー）。
リガンド２は、リガンド１と比較すると異なる種類の、例えば、
（ａ）電荷−電荷引力的相互作用を伴わないように相互作用する能力がある（第二カテゴリー）、即ち工程（ｉ）で与えられる条件下で荷電されないリガンド、もしくは
（ｂ）電荷−電荷相互作用による相互作用を可能にするがリガンドに比較して異なる種類を持つ電荷を有する、即ち第一カテゴリーから選択される
リガンドである。
（ａ）については、相互作用はファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用および／もしくは電子供与体−受容体相互作用を含んでもよい。
【００２４】
発明の方法で使用されるべきイオン交換吸着剤のもう一つの特徴的な特色は、リガンドの組合せは、吸着剤が：
（Ａ）０．２５Ｍ  ＮａＣｌに相当するイオン強度において水性参照液体中で興味のある物質を結合させる能力がある；そして
（Ｂ）物質が該電荷を有する、ｐＨ区間２〜１２の部分区間において、
（ａ）本質的に全ての荷電リガンドがＱ−リガンドである、対応する陰イオン交換体（吸着剤２ａ）；もしくは
（ｂ）本質的に全ての荷電リガンドがＳＰ−リガンドである、対応する陽イオン交換体（吸着剤２ｂ）
に対する物質のブレイクスルー容量の、≧２００％もしくは≧３００％もしくは≧５００％もしくは≧１０００％のような、≧１００％の物質に対する最高ブレイクスルー容量を可能にする
ように選択されている（置換のタイプおよび度にしたがって）ことである。
【００２５】
用語“ＳＰ基”は、アリル基を亜硫酸水素塩と反応させることにより得ることができるスルホプロピル基を意味する、即ちＳＰ基としては、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−およびそのスルホン酸異性体が挙げられる。
用語“Ｑ基”は、−ＯＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２をハロゲンと反応させた後トリメチルアミンと反応させることにより得ることができる第四級アンモニウム基を意味する、即ちＱ基としては、−ＯＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３および第四級トリメチルアンモニウム基を含有するその異性体が挙げられる。
【００２６】
吸着剤２ａは物質上の電荷が負であるときに、そして吸着剤２ｂは物質上の電荷が正であるときに使用される。水性参照液体は、ＮａＣｌ、緩衝剤および電荷を帯びている興味ある物質を含有する。
【００２７】
上の比較とは、イオン交換体（１）および（２ａ）ならびにイオン交換体（１）および（２ｂ）について本質的に同じ条件下で実施される測定をいう、即ち、ｐＨ、温度、溶媒組成、流速等は（１）および（２ａ）の間でならびに（１）および（２ｂ）の間で同じである。ブレイクスルー容量は、流動において物質の同じ相対濃度で（例えば、ｃ／ｃ０＝３００ｃｍ／時間の流速において１０％、ｃ／ｃ０については実験の部を参照）測定される。
【００２８】
“対応する陰イオン交換体／陽イオン交換体”は、支持マトリックスが同じであることを意味する、即ち、支持材料、ビーズ径、孔径、孔容積、充てん手順等は同じである。イオン交換体１の一つ以上の荷電リガンドについての全置換度は参照イオン交換体（２ａもしくは２ｂ）（それぞれ、塩化物およびナトリウムイオンとして測定される）におけるのと本質的に同じである。対イオンもまた同じであるべきである。スペーサーおよびカップリング化学は異なってもよい。特定の種類のカップリング化学は支持マトリックスの架橋に至り、さらに硬質のマトリックスをもたらすかもしれない。この場合には、比較を行う流れの条件はマトリックスが本質的に非圧縮されているレベルで選択される。
【００２９】
典型的には、物質に対する有用なブレイクスルー容量は、物質が
（ａ）０．１８〜０．２５ｍｍｏｌ／ゲルｍｌの塩化物イオン容量を有する、市販で入手可能な陰イオン交換体であるＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）および／もしくは
（ｂ）０．１８〜０．２５ｍｍｏｌ／ゲルｍｌのナトリウムイオン容量を有する、市販で入手可能な陰イオン交換体であるＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）
の上に有する最高ブレイクスルー容量より高い。
【００３０】
これら二つの参照イオン交換体におけるベースマトリックスはビーズ化形状のエピクロロヒドリン架橋アガロースである。ビーズは４５〜１６５μｍの区間の直径を有する。球状タンパク質についての排除限界は４×１０６である。
【００３１】
実用的見地から、上のことは、問題の物質に対するブレイクスルー容量は、３００ｃｍ／時間の流速でかつ０．２５Ｍ  ＮａＣｌにおいて１０％のブレイクスルーについて、＞４ｍｇ／未乾ゲルｍｌのような＞２ｍｇ／未乾ゲルｍｌであるべきであることを意味する。
ブレイクスルー容量とは、室温、即ち約２５℃で行われる測定を指す。
【００３２】
同じ試薬および条件の使用により、例えば同じ条件を通して並列に、導入されるリガンドは、たとえそれらが構造的に異なっていても、同じ種類であると考えられる。特にこれは、形成されるリガンドが異性体であるときに、当てはまる。
【００３３】
これらの基を最少化するために大過剰の誘導化試薬を使用した後でさえ残存基（未反応基）であるリガンドは非存在と考えられる。典型的には、このタイプの基は、誘導化される基の出発量に比較して５％以下のように１０％以下のモル量で存在する。
典型的には、異なるリガンド間のモル比は０．０１〜１００の区間、しばしば優先して０．０２〜５０の区間、の中にある。
【００３４】
第一カテゴリー：工程（ｉ）で与えられる条件下で電荷を帯びている単一および混合モードリガンド
このカテゴリーのリガンドは、荷電した原子もしくは基および／または最も近接した１〜３原子のような、最も近接した１〜７原子の一つもしくはそれ以上に関して異なり、それらは：
（ａ）正に荷電している種々の窒素；例えば、第一級アンモニウム、第二級アンモニウム、第三級アンモニウム、第四級アンモニウムおよびアミジニウム；
（ｂ）正に荷電している種々の硫黄；例えば、スルホニウム；
（ｃ）負に荷電している種々の酸素；例えば、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、ホスホネートもしくはホスフェート（それぞれ、−ＰＯ３２−、−Ｐ（ＯＨ）Ｏ２−および−ＯＰ（ＯＨ）Ｏ２−、−ＯＰＯ３２−）、スルホネートもしくはスルフェート（それぞれ、−ＳＯ３−および−ＯＳＯ３−）、−アリール−Ｏ−（フェノレート／アリーロレート）等のような基の中の酸素
である。
自由結合（原子価）は、基をベースマトリックスに取り付ける鎖の一部である炭素に直接結合する。
【００３５】
異なる種類の荷電リガンドの概念はまた相違を含み、それらは：
（ｉ）上の（ａ）および／もしくは（ｂ）の荷電原子は線状もしくは環状構造の一部であり、または環状構造は芳香族もしくは非芳香族でありそして／または４−、５−、６−、７−、８−員等の環を含む、
（ｉｉ）上の（ａ）もしくは（ｂ）の荷電原子または上の（ｃ）の荷電基に連結する鎖は、これらの原子／基に隣接して、炭素原子および／もしくはヘテロ原子のタイプに関して異なる１〜３個の原子の一部を有する、
（ｉｉｉ）リガンドは単一もしくは混合モードリガンドである
ことである。
（ｉｉ）で概説した相違は、全てもしくは一部の炭素原子はｓｐ３−、ｓｐ２−およびｓｐ−混成炭素の中で選択されること、またはチオエーテル硫黄、エーテル酸素およびハロゲンから選択されるヘテロ原子は存在してもしなくてもよいことを含む。
【００３６】
リガンドはｐＫａ値に関して異なってもよい。適切な相違は、典型的に、≧１もしくは≧２ｐＨ単位のように、≧０．５ｐＨ単位である。
ｐＨ−依存性の電荷を有するリガンドは酸型および塩基型で存在する。以下のことはｐＨ−依存性の電荷を有するイオン交換リガンドに当てはまる：
ａ）イオン交換リガンドおよびその対応する塩基の両方は、液体（Ｉ）のｐＨが≦ｐＫａ＋２である限り同じ種類のリガンドであると考えられる。
ｂ）イオン交換リガンドおよびその対応する酸の両方は、液体（Ｉ）のｐＨが≧ｐＫａ−２である限り同じ種類のリガンドであると考えられる。
ｐＫａは、（ａ）リガンド（選択肢ａ）もしくはリガンドに相当する酸（選択肢ｂ）のｐＫａを意味する。もし液体（Ｉ）のｐＨがこれらの判定基準に適合しなければ、リガンドの荷電型は非−本質的な量で存在する。
【００３７】
用語“単一モード荷電リガンド”は、荷電原子（上のａもしくはｂ）または荷電基（上のｃ）をベースマトリックスに連結する鎖が、そのような原子もしくは基から７原子の距離以内にあるｓｐ３−混成炭素および単一のエーテル酸素から選択される原子から成ることを意図する。鎖に付いた他の基は主として水素および／もしくはヒドロキシ、ならびにもしかするとまたメチルおよびメトキシである。正の窒素原子は、例えば、水素および／またはメチルもしくはエチルのような低級アルキル（Ｃ１〜５）の中で選択される他の基と結合する。正に荷電した硫黄原子については、これらの追加的な基は、メチルもしくはエチルのような低級アルキル（Ｃ１〜５）の中で主として選択される。
【００３８】
用語“混合モード荷電リガンド”は、荷電原子（上のａもしくはｂ）からまたは荷電基（上のｃ）から７原子の距離以内にあるリガンドが、上で規定したような疎水性相互作用および／もしくは電子供与体−受容体相互作用に関与することができる一つ、二つもしくはそれ以上の原子または基を、これらの原子または基は単一のエーテル酸素、単一のヒドロキシもしくはｓｐ３−炭素でないという条件で、有することを意図する。典型的には、距離は１、２、３，４原子である。
【００３９】
疎水性相互作用としては、リガンドの純粋な炭化水素基と物質の疎水性即ち脂質様基の間の相互作用が挙げられる。適当な純粋な炭化水素基は、２、３、４、５、６もしくはそれ以上の炭素原子（純粋なアルキル、純粋なアリール、純粋なアラルキル、純粋なアルキルアリール、純粋なアルケニル、純粋なアルキイニル等および二つもしくはそれ以上の自由結合（原子価）を含む対応する基）を含む。ファンデルワールス相互作用は、疎水性相互作用の重要な部分であるであろう。
【００４０】
電子供与体−受容体相互作用としては、水素結合、π−π、電荷移動等のような相互作用が挙げられる。電子供与体−受容体相互作用は、自由電子対を持つ陰性原子が供与体として作用して、供与体の電子対に対する受容体として作用する電子不足原子に結合することを意味する。電子供与体−受容体相互作用に関する議論については、Ｋａｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、「分離科学入門」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９７３）４２頁を参照されたい。
【００４１】
供与体原子／基の例示的な例は：
（ａ）ヒドロキシ、エーテル、カルボニルおよびエステル（−Ｏ−および−ＣＯ−Ｏ−）ならびにアミドにあるような、自由電子対を持つ酸素、
（ｂ）チオエーテル（−Ｓ−）にあるような、自由電子対を持つ硫黄、
（ｃ）アミン、スルホンアミド、カルバミド、カルバメート、アミジン等を含むアミド、シアノにあるような、自由電子対を持つ窒素、
（ｄ）ハロゲン（フッ素、塩素、臭素およびヨウ素）、ならびに
（ｅ）ｓｐ−およびｓｐ２−混成炭素
である。
典型的な受容体原子／基は、金属イオン、シアノ、ニトロ中の窒素のような、電子不足原子もしくは基であり、そしてまたヒドロキシおよびカルボキシにあるＨＯ−、アミドおよびアミンにある−ＮＨ−、チオールにあるＨＳ−等のような陰性原子に結合した水素を含む。
【００４２】
供与体および受容体の原子もしくは基は、
・  荷電原子もしくは荷電基をベースマトリックスに連結する鎖、
・  該鎖に結合した分枝、または
・  荷電した原子もしくは基（特に陰イオン交換基／リガンドについて）に直接結合した別の置換基
の中に位置し得る。
電子供与体／受容体の原子もしくは基は、リガンドをベースマトリックスに連結する鎖に結合した分枝中にそして荷電原子もしくは荷電基から７もしくはそれ以上の原子の距離において存在し得る。そのような場合には、完全な分岐は別のリガンドと考えられる。
【００４３】
特に興味深い混合モード荷電リガンドは、荷電した原子もしくは基の上述の距離以内に、チオエーテル（−Ｓ−）および／または、芳香族炭素のような、ｓｐ２−混成炭素を有する。例えば、我々の同時係続国際特許出願のＰＣＴ／ＥＰ００／１１６０５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）およびＰＣＴ／ＥＰ００／１１６０６（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）（両方とも陰イオン交換リガンドに言及する）、ならびに２０００年７月１７日に出願したＳＥ  ０００２６８８−０（陽イオン交換リガンド）およびＷＯ  ９９６５０７（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）（陽イオン交換リガンド）を参照されたい。ＷＯ  ９７２９８２５（ＵＳ  ６，０９０，２８８）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）は、一つもしくはそれ以上のヒドロキシおよび／または、第一級、第二級もしくは第三級アンモニウム窒素から２〜３炭素の位置におけるアミノ／アンモニウム窒素を有する混合モード陰イオン交換リガンドを開示している。本特許の方法で潜在的に有用である混合モードイオン交換リガンドは、ＷＯ  ９８０８６０３（Ｕｐｆｒｏｎｔ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、ＷＯ  ９６００７３５、ＷＯ  ９６０９１１６およびＵＳ  ５，６５２，３４８（Ｂｕｒｔｏｎ等）に記載されている。このパラグラフで参照した全ての出版物は出典明示により本明細書の一部とする。
【００４４】
上で意図したチオエーテル（−Ｓ−）において、自由結合（原子価）のそれぞれは、芳香族もしくは非芳香族であってもなくともよい環状構造の部分でであってもなくともよいｓｐ２−もしくはｓｐ３−混成炭素に結合する。ここで意図したような用語“チオエーテル”はかくしてチオフェンおよび環原子として硫黄を含む他の複素環式芳香族環を含む。
上述の距離以内に３、４、５もしくはそれ以上の炭素原子を含むアルキルタイプの純粋な炭化水素基もまたあり得る。
【００４５】
上で意図した芳香族環構造は、一つもしくはそれ以上の芳香族環、例えば、フェニル、ビフェニルまたはナフチル構造および縮合環または二環式構造を含む他の芳香族環システムを含んでもよい。芳香族環は、複素環式であっても、即ち一つもしくはそれ以上の窒素、酸素または硫黄を含有してもよく、そして置換基を有してもよい。これら他の置換基は、例えば水素結合および／もしくは他の電子供与体−受容体相互作用を可能にする、電子供与体もしくは受容体の原子または基を含有してもよい。例示的な芳香族環構造は、ヒドロキシフェニル（２−、３−および４−）、２−ベンツイマドゾイル、メチルチオキシフェニル（２−、３−および４−）、３−インドリル、２−ヒドロキシ−５−ニトロフェニル、アミノフェニル（２−、３−および４−）、４−（２−アミノエチル）フェニル、３，４−ジヒドロキシフェニル、４−ニトロフェニル、３−トリフルオロメチルフェニル、４−イミダゾリル、４−アミノピリジン、６−アミノピリミジル、２−チエニル、２，４，５−トリアミノフェニル、４−アミノトリアジニル、４−スルホンアミドフェニル等である。
【００４６】
好ましい陰イオン交換リガンドのおよび好ましい陽イオン交換リガンドについて対応する酸のｐＫａは３からおよびそれ以上の区間に見出すことができ、そして、イオン交換リガンドの適切な脱荷電を可能にするために、好ましくは１１以下、好ましくは４〜９の区間にある。
【００４７】
特に興味のある陰イオン交換リガンドはｐＨ依存性電荷を有しそして、≦１０．５のような、≦１２．０であるｐＫａ値を有する。これは、これらのリガンドは、好ましくは第一級もしくは第二級アンモニウム基または第三級アンモニウム基の中で選択される荷電基を含むことを意味する。窒素が芳香族構造の部分である第三級アンモニウム基およびそのα−もしくはβ−位に芳香族炭素を有するアンモニウム基は、８以下のｐＫａ値を有してもよい。通常、陰イオン交換リガンドのｐＫａは≧４のような、≧３である。
【００４８】
特に興味のある負に荷電したリガンドはｐＨ依存性電荷を帯びている。対応する酸についてのｐＫａ値は通常≧４のような、≧３である。かくして、これらの種類のリガンドは、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、ホスホネートもしくはホスフェート（それぞれ、−ＰＯ３２−、−Ｐ（ＯＨ）Ｏ２−および−ＯＰ（ＯＨ）Ｏ２−、−ＯＰＯ３２−）、−アリール−Ｏ−（フェノレート／アリーロレート）ならびに他の弱酸基の中で選択される荷電基を含むべきである。
【００４９】
これは、
・  強酸（ｐＫａ、≦２もしくは≦０のような、≦３）（対応する塩基は陽イオン交換リガンドとして作用する）および
・  弱酸（ｐＫａ、≧１２のような、≧１０、等）もしくはｐＨに依存しない電荷を帯びているリガンド
に対応するイオン交換リガンドはまた、我々の新しくかつ革新的な脱塩方法で使用されるべきイオン交換体中にそれらが組み入れられるときに、利点を有するであろうことを除外しない。他のイオン交換基については、これらの利点は脱塩される特定の物質の性質、例えば、その等電点およびイオン交換体とのその相互作用の強度、に依存する。
リガンドのｐＫａ値は、問題のリガンドの５０％が滴定されるｐＨとして得られる。
【００５０】
第二カテゴリー：工程（ｉ）で与えられる条件下で荷電されないが望ましい荷電物質と相互作用する能力があるリガンド
主として二種類の荷電されないリガンドがある：即ち
（ａ）ｐＨスイッチにより荷電され得るリガンド（クラスＩ）および
（ｂ）ｐＨスイッチにより荷電され得ないリガンド（クラスＩＩ）
である。
【００５１】
クラスＩは、ｐＨ−依存性電荷を有することができる非荷電型リガンドを含む。上記を参照されたい。
クラスＩＩリガンドは、上で議論したように、疎水性相互作用および電子供与体−受容体相互作用を引き起こすことができる一つもしくはそれ以上の構造要素を含有する。典型的なクラスＩＩリガンドにおいては、上で規定したように、二つ、三つ、四つもしくはそれ以上の電子供与体−受容体原子または基がある。それぞれの原子もしくは基は、電子供与体−受容体原子または基から二つ、三つ、四つもしくはそれ以上のお互いに直接連結したｓｐ３−混成炭素だけ離れている。
【００５２】
クラスＩＩのリガンドは、ベースマトリックから突き出ていてかつ先行のパラグラフにおける規定に適合する基の最も外側の部分として規定される。用語“最も外側”は上で規定したようなアルキル基を伴う電子供与体−受容体相互作用にもしくは疎水性相互作用に関与する能力のある最も外側の原子から１〜７原子の距離にある原子を意図する。
【００５３】
かくして、第二のカテゴリーのそれぞれのリガンドは、リガンドが電子供与体−受容体相互作用および／もしくは疎水性相互作用を可能にする一つまたはそれ以上の原子を含むという条件で、イオン交換体においてリガンド２として使用されることができる。存在し得る原子ならびに／または基の例は：フェニル基を含み、置換もしくは未置換であってもよいアリ−ル、純粋なアルキルおよび純粋なアルキレン（Ｃ３およびＣ８以下を優先してそれより多く）、チオエーテル、エーテル、未荷電のアミノ、ヒドキシ、アミド（スルホンアミド、カルバミド、カルバメート等を含むカルボキサミド）、ニトロ、スルホン、未荷電のカルボキシ等、である。この種類のリガンドにおいて、直接一緒に連結された二つもしくはそれ以上のｓｐ３−混成炭素原子はしばしば原子または基をお互いから隔てている。
【００５４】
確率的イオン交換体における種々のリガンドは、支持マトリックスでもしくはその部分でお互いに関して多少とも無作為に存在し得る。導入方法に依存して、リガンドの量の間の比率は変動してもよいが、マトリックスの実質的な部分において少なくとも二つのリガンドについて常に、０．０２〜５０を優先して、０．０１〜１００でなければならない。支持体内で種々のリガンドの不均一なもしくは層状の分布を達成するために、ＷＯ  ９８３９３６４（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）に略述された一般原理を用いることができる。これら二つの特許出版物で主なゴールである鋭い層が導入されないように、反応性、拡散率およびリガンド形成試薬の濃度に関してしかるべき配慮を取らねばならない。ＷＯ  ９８３９３６４は出典明示により本明細書の一部とする。
ｐ１７
【００５５】
特に興味がある確率的イオン交換体は、リガンド１として強イオン交換リガンドをそしてリガンド２としてｐＨでのスイッチにより荷電／脱荷電され得るリガンドを含む。二つの典型的な組合せは：
（ａ）リガンド２として弱陰イオン交換リガンドを組合せたリガンド１として強陽イオン交換リガンド、もしくは
（ｂ）リガンド１として強陰イオン交換リガンドおよびリガンド２として弱陽イオン交換リガンド
である。
この文脈において、強陽イオン交換リガンドはｐＫａ＜３〜４を持つ対応する酸を有する。強陰イオン交換リガンドの例は、第四級アンモニウムリガンドおよび、≧１１もしくは≧１２のようなｐＫａ＞１０を有する陰イオン交換リガンドである。他の種類のイオン交換リガンドは弱と考えられる。
【００５６】
他の興味ある組合せは、例えば、同じベースマトリックス上で同様なｐＫａを持つ二つの異なる弱の陰イオン−もしくは陽イオン−交換リガンド、または同じマトリックスに結合した弱陰イオン−および弱陽イオン−交換リガンドを有する確率的イオン交換体である。ｐＫａにおける差が、２、３もしくは４ｐＨ単位より小、より大リガンドまたはと同一であるように、リガンドを選択することができる。
【００５７】
異なる種類のリガンドを組合せる最大の利点は両性物質の脱塩に関する。典型的に、リガンドは、一つのリガンドは荷電される（リガンド１）一方で、他の一つ（リガンド２）は工程（ｉ）の間は荷電されないで、工程（ｉｉ）の間に放出される物質と同じ電荷で荷電されるようになるような方式で組合される。それは、適切な組合せは脱塩される物質の等電点（ｐＩ）に依存することから起る。さらに下を参照されたい。
【００５８】
支持マトリックス／ベースマトリックス
支持マトリックスはベースマトリックスおよびベースマトリックスにリガンドを取り付ける任意のスペーサーを含む。
ベースマトリックスは有機のおよび／もしくは無機の材料をベースにする。
【００５９】
ベースマトリックスは、好ましくは親水性でそして、水に不溶性でかつ多少膨潤性であるポリマーの形状にある。親水性になるように誘導化されている疎水性ポリマーはこの規定に含まれる。適当なポリマーは、例えば、アガロース、デキストリン、セルロース、でんぷん、プルラン等のような多糖をベースにするポリヒドロキシポリマーならびに、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ（ヒドロキシアルキルビニルエーテル）、ポリ（ヒドロキシアルキルアクリレート）およびポリメタクリレート（例えば、ポリグリシジルメタクリレート）、ポリビニルアルコールならびにスチレンおよびジビニルベンゼンをベースにするポリマー、および上述のポリマーに相当する二つもしくはそれ以上のモノマーが含まれるコポリマーのような、完全に合成的なポリマーである。水に可溶性であるポリマーは、例えば、架橋によりおよび吸着もしくは共有結合により、不溶性になるように誘導化され得る。疎水性ポリマー上に（例えば、モノビニルおよびジビニルベンゼン上に）親水性基を、ＯＨに転換され得る基を示すモノマーの重合により、もしくは、例えば親水性ポリマーのような適当な化合物の吸着による、最終ポリマーの親水性化により、導入することができる。
【００６０】
ベースマトリックに使用される適当な無機材料はシリカ、酸化ジルコニウム、黒鉛、酸化タンタラム等である。
好ましいマトリックスは、シラン、エステル、アミド基およびシリカに存在するそのような基のように、加水分解に対して不安定である基を欠如する。これは特に、使用される液体に直接接触する基に関して当てはまる。
【００６１】
マトリックスは多孔性もしくは非−多孔性であってもよい。これは、マトリックスは、除去される物質（非−多孔性）に十分にもしくは部分的に浸透性である（多孔性）かまたは完全に不浸透性であってもよいことを意味する、即ち、マトリックスは除去される物質について０．４０〜０．９５の区間でＫａｖを有しなければならない。これは、Ｋａｖはさらに低く、例えば０．１０にまでもしくは、例えば増量剤を有する特定のマトリックスについてはなおより低くてもよいことを除外しない。例えば、ＷＯ  ９８３３５７２（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）を参照されたい。
【００６２】
本発明の特に興味深い実施態様において、マトリックスは、１〜１０００μｍ、好ましくは高速の応用には５〜５０μｍで分取目的には５０〜３００μｍの範囲のサイズを持つ不規則なもしくは球状の形状にある。
これに代えて、マトリックスは、管もしくは或る他の種類の容器の壁、多孔性プラグ、多孔性膜またはフィルターのように、一体構造であってもよい。
【００６３】
マトリックスは、工程（ｉ）で使用される液体よりも大きい密度を持つビーズ／粒子の形状にあってもよい。この種類のマトリックスは、流動もしくはエクスパンデッド床クロマトグラフィーの、ならびに種々のバッチ様手順の、例えば攪拌タンク中での、大規模操作において特に応用可能である。流動およびエクスパンデッド床手順はＷＯ  ９２１８２３７（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）およびＷＯ  ９２００７９９（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｋ）に記載されている。
【００６４】
用語“親水性マトリックス”は、マトリックスのアクセス可能な表面が、水性液体はマトリックスに浸透できるという意味で、親水性であることを意味する。典型的には、親水性ベースマトリックス上のアクセス可能な表面は、例えば酸素および／もしくは窒素原子を含む、複数の極性基を露出する。そのような極性基の例は、ヒドキシル、アミノ、カルボキシ、エステル、低級アルキルのエーテル（ｎが整数である、（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）ｎＨのような）である。
【００６５】
スペーサーはベースマトリックスで始まり、上で規定したようなリガンドへ伸びる。
そのようなスペーサーは伝統的なイオン交換体におけるように従来型であり、かくして、上で議論したように、線状の、分岐した、環状飽和の、不飽和および芳香族の炭化水素基（例えば、１〜１０個のような、１〜２０個の炭素原子）を含んでもよい。これらの基は、上で議論したタイプの純粋な炭化水素基、ヒドロキシ基、アルコキシおよびアリールオキシならびに対応するチオ類似体、ならびに／もしくはアミノ基、を含んでもよい。炭化水素基における炭素鎖は、一つもしくはそれ以上の位置においてエーテル酸素およびチオエーテル硫黄により中断されてもよい。また、アミドおよびケトン基におけるようなカルボニル基ならびに加水分解に対して遜色のない安定性を持った基であってもよい。酸素、硫黄および窒素から選択されるせいぜい一つの原子が好ましくは、一つのかつ同じｓｐ３−混成炭素原子に結合される。
【００６６】
スペーサーは、上で議論したように、例えば水素結合に関与することにより、望ましい物質のイオン交換体への結合を強化する、一つもしくはそれ以上の電子供与体もしくは受容体の原子または基を供給し得ることは明らかである。簡単のために、この種類の原子もしくは基はスペーサーの部分と考えられる。また、二つ以上のリガンドを一つで同じスペーサーに取り付けてもよい。上の“分岐”を参照されたい。
【００６７】
リガンドの密度
本発明で使用される吸着剤のイオン交換リガンドのレベルは、０．００５〜０．３ｍｍｏｌ／マトリックスｍｌを優先して、０．００２〜０．５ｍｍｏｌ／マトリックスｍｌのような、０．００１〜４ｍｍｏｌ／マトリックスｍｌの区間で普通選択される。好ましい範囲は、マトリックスの種類、リガンドの種類、吸着される物質によりとりわけ決定される。表現“ｍｍｏｌ／マトリックスｍｌ”は水で飽和された十分に沈渣したマトリックスを指す。リガンド密度の範囲は、十分にプロトン化した／荷電した型のマトリックスがナトリウムイオンおよび／もしくは塩化物イオンのような普通の対イオンを結合させる能力を指し、とりわけ、存在する陰イオンおよび／もしくは陽イオンリガンドに依存する。
【００６８】
最良モード
本発明の最良モードバリアントは興味のある物質により変動する。これまで発見された最良モードは実験の部で提示される。
【００６９】
使用されるイオン交換体の安定性
本発明で使用されるイオン交換体／イオン交換リガンドは、イオン交換吸着を含むプロセスで典型的に適用される条件に耐えなければならない。一般側として、これは、本発明にしたがう吸着剤は水中０．１もしくは１Ｍ  ＮａＯＨに少なくとも１０時間、全イオン結合容量に本質的に減少なしで、耐えることができなければならないことを意味する。“全イオン結合容量に本質的に減少なしで”は、全イオン結合容量は多くとも１０％だけ減少されることを意図する。これは、イオン交換リガンドならびにベースマトリックスは、純粋な炭化水素基（ホモ芳香族および複素環式芳香族構造を含む）、チオエーテルおよびエーテル基（アセタールおよびケタール基を含む）、ヒドロキシ基、スルホン基、カルボキサミド基、スルホンアミド基ならびに同様な加水分解安定性を持つ基の中で選択される構造のみを含有しなければならないことを意味する。
【００７０】
吸着／脱着
吸着および／もしくは脱着工程を、一体構造の形状での陰イオン交換体マトリックスによるクロマトグラフィー手順としてまたは充てんもしくは流動床の形状での粒子として行ってもよい。粒状のマトリックスについては、これらの工程を、液体中で多少とも完全に分散している粒子によるバッチ様モードで行ってもよい。
工程（ｉ）および（ｉｉ）で使用される液体は水性、即ち、できれば水混和性溶媒と共に、水である。
【００７１】
吸着
吸着の間、荷電物質を含有する液体試料は、好ましくはイオン交換により、吸着（結合）をさせる条件下で上に規定したイオン交換体と接触させられる。換言すれば、物質は、吸着工程（ｉ）の間に荷電される最強の傾向を持つリガンドに比較して反対に荷電される少なくとも一つの基もしくは原子を保有する。
【００７２】
好ましくは、物質の実効電荷は工程（ｉ）の間イオン交換体の実効電荷に反対である。水性液体中に存在する両性物質については、陰イオン交換条件は典型的に、ｐＨ≧ｐＩ−０．５、好ましくはｐＨ≧ｐＩ、そして陽イオン交換条件は、ｐＨ≦ｐＩ＋０．５、好ましくはｐＨ≦ｐＩを意味する。
【００７３】
本発明の利点の一つは、従来のイオン交換体（例えば、上で規定したような参照陰イオン交換体）で通常行われてきたものに比較してより高いイオン強度においてもまた吸着／結合を行うことが可能であろうことである。絶対的数字では、これは、本発明にしたがう吸着は１５もしくは２０ｍＳ／ｃｍの上または下のイオン強度で実施され得ることを意味する。イオン強度は３０ｍＳ／ｃｍを越えてもよく、或る場合には４０ｍＳ／ｃｍを越えることさえあり得る。有用なイオン強度はしばしば、≧０．３もしくは≧０．５さえのような、≧０．１のＮａＣｌ濃度（純水）に相当する。使用される伝導率／イオン強度は合計のリガンド、マトリックス上のそれらの密度、結合される物質およびその濃度等に依存するであろう。
【００７４】
脱着
脱着プロセスは少なくとも一つの以下の手順を含まなければならない：
（Ａ）塩濃度（イオン強度）を増加させること；
（Ｂ）望ましい物質とリガンドの間の相互作用を緩和するためにｐＨを変えること；
（Ｃ）水性液体（Ｉ）の極性を減少させるリガンド類似体もしくは試薬（例えば溶媒）を加えること。
項（Ｂ）は、（ａ）望ましい物質へイオン−イオン引力相互作用により結合するリガンドの電荷を消去すること；および（ｂ）反対の電荷を有するリガンドへ結合する望ましい物質上の基の電荷を消去することを含んでもよい。ｐＨの変更は、リガンドおよび物質が工程（ｉｉ）の間同じ電荷を有するであろうように、何度も行うことができる。
【００７５】
（Ａ）〜（Ｃ）で与えられる条件を組合せてもしくは単独で使用してもよい。適切な選択は、
（１）脱着される物質、
（２）イオン交換体（リガンド、マトリックスの種類、スペーサーおよびリガンド密度）、ならびに
（３）水性液体ＩＩの種々の変数（濃度、極性、温度、ｐＨ等）
の特定の組合せに依存するであろう。
かくして、水性液体（Ｉ）（吸着緩衝液）を水性液体（ＩＩ）（脱着緩衝液）と置換することは、温度、ｐＨ、極性、イオン強度、可溶性リガンド類似体等のような変数の少なくとも一つは、脱着が起り得るように他の条件を未変化に保持しながら、変更されねばならないことを意味する。
【００７６】
最も簡単な場合には、これは、水性液体Ｉから水性液体ＩＩへ変更するときに、
（ａ）イオン強度の増加および／もしくは
（ｂ）上で概略したようにｐＨの変更
を意味する。選択肢（ａ）はｐＨの低下、一定化もしくは増加を含む。選択肢（ｂ）はイオン強度の低下、増加もしくは一定化を含む。
【００７７】
クロマトグラフィーおよび／もしくはバッチ手順において、脱着される物質を持つマトリックスはカラムもしくは液体（Ｉ）に接触する適当な容器の中に存在する。次いで、液体により与えられた条件が、望ましい物質がマトリックスから溶出されるまで、上述のように変更される。典型的な脱着プロセスは、イオン強度が吸着の間に使用されたものに比較して増加され、そして多くの場合、もし他の変数のどれも変更されなければ、０．６Ｍ  ＮａＣｌのような、少なくとも０．４Ｍ  ＮａＣｌに相当することを意味する。溶出／脱着についての実際のイオン強度値は、好ましい場合、より低くてもよく、上で議論した種々の要因に依存するであろう。もしもリガンドが適切に選択されるならば、それは、リガンドのおよび／もしくは物質の実効電荷を、それらが反対の種類であるように、変更するためにはｐＨの変更で十分であり得る。これは、塩濃度を使用される緩衝液の濃度と本質的に同じであるように減少させる可能性を意味する。
【００７８】
脱着のために増加したイオン強度を用いる必要条件は、水性液体ＩＩにより与えられる条件に依存してより厳密でなくてもよい。下を参照されたい。
液体（Ｉ）から液体（ＩＩ）への変更は一つもしくはそれ以上の工程で（段階的勾配）もしくは連続的に（連続勾配）達成され得る。マトリックスと接触する液体の種々の変数は、一つずつもしくは組合せて変更され得る。
【００７９】
イオン強度を変更するために使用される典型的な塩は、アルカリ金属もしくはアンモニウムイオンの塩化物、リン酸塩、硫酸塩等の中で選択される。
ｐＨを変更するために使用される緩衝成分は関与するリガンドの種類に依存し、典型的には吸着工程の間は同じである。例えば、もしもイオン交換リガンドが陽イオン性であるならば、緩衝する酸−塩基対は、好ましくは、緩衝成分がリガンドに結合できない酸−塩基対、即ち、ピペラジン、１，３−ジアミノプロパン、エタノールアミン等、の中で選択される。同様に、イオン交換リガンドが陰イオン性である場合における緩衝する酸−塩基対は、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等である。
【００８０】
脱着はまた、液体（ＩＩ）の極性を吸着液体（Ｉ）の極性より低い値に調整することにより補佐され得る。これは、液体ＩＩの中に水混和性のおよび／もしくはより少ない親水性の有機溶媒を含有させることにより達成され得る。
【００８１】
そのような溶媒の例は、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アクリロニトリル等である。水性液体ＩＩの極性の減少（水性液体Ｉに比較して）は恐らく脱着を手助けし、かくしてまたマトリックスから物質の放出に必要なイオン強度を減少させる。
【００８２】
脱着はまた、使用されるリガンドの一つもしくはそれ以上の可溶性構造類似体を含有させることにより補佐され得る。液体（ＩＩ）中の構造類似体の濃度は水性液体（Ｉ）中のその濃度より高くなければならない。“リガンドの構造類似体”もしくは“リガンドの類似体”は、リガンドと構造的類似性を有し、可溶性型でリガンドおよび除去される物質の間の結合を阻害する能力のある物質である。
【００８３】
重要なバリアント
バリアント１：リガンド１はｐＨ−依存性の負電荷を有する陽イオン交換リガンドであり、そしてリガンド２は、荷電され得ないかもしくは相当部分が工程（ｉ）のｐＨでは未荷電である荷電可能な塩基かのどちらかである。リガンド１に相当する酸のｐＫａはリガンド２（荷電可能であれば）に相当する酸のｐＫａより低い。吸着される物質はリガンド２のｐＫａ以上であるｐＩを有する。液体（Ｉ）のｐＨは物質が正の実効電荷を有する、即ちイオン交換体に吸着するであろうように選択される。ｐＨを減少させることにより、物質および恐らくまたリガンド２はプロトン化されて、増加した正電荷を受け取るであろう。これは、中度のｐＨで物質の放出を助成して、液体（ＩＩ）中で低下した塩濃度において脱着をさせるであろう。
【００８４】
バリアント２：リガンド１はｐＨ−依存性の正電荷を有する陰イオン交換リガンドを含み、そしてリガンド２は、完全に荷電され得ないかもしくは相当部分が工程（ｉ）のｐＨでは未荷電である荷電可能な酸型かのどちらかである。リガンド２のｐＫａはリガンド１のｐＫａより高い。吸着される（脱塩される）物質のｐＩはリガンド１のｐＫａおよびリガンド２のｐＫａの両方より低い。液体（Ｉ）（工程（ｉ））のｐＨは、物質は負の実効電荷を有しそしてリガンド１は、リガンド２が本質的に未荷電である一方で、正電荷を有するようにある。かくして、物質は工程（ｉ）で吸着されるであろう。ｐＨを増加させることにより、リガンド２は負に荷電されるようになるであろうが、これは液体（ＩＩ）中でさらに低い塩濃度における物質の脱着を意味する。
【００８５】
回収率
副態様において、本発明方法は吸着された物質の高回収率、例えば８０％以上もしくは９０％以上のような６０％以上の回収率を可能にする。回収率は、吸着／結合工程においてイオン交換体に加えた物質の量に比較して脱着される物質の量である。多くの例において、回収率は、本発明の発明的メリットにしたがい、９５％さえを越える、即ち本質的に定量的であることができる。典型的には、イオン交換体に加える物質の量は、物質に対するイオン交換体の全結合容量の、２０〜６０％のような、１０〜８０％の区間内にある。
【００８６】
液体（Ｉ）から除去される物質
本発明は主として、上で規定したリガンドと相互作用できる幾らかの構造ユニットを有する高分子量物質用である。適切な物質は１０００ダルトン以上である分子量を有し、生物有機であり高分子である。一分子当りの荷電基の数は典型的に一つもしくはそれ以上であり、ｐＨに依存する。分子量および電荷の数に関するさらなるコメントは見出し“技術分野”に呈示されている。物質は両性でもよい。典型的に、物質はペプチド構造（例えば、オリゴ−もしくはポリペプチド構造）、核酸構造、炭水化物構造、脂質構造、ステロイド構造、アミノ酸構造、ヌクレオチド構造および、荷電されているかもしくはｐＨ−スイッチにより荷電され得る任意の他の生物有機構造の中で選択される、構造を含む。
【００８７】
物質は水性基材に溶解され得るかもしくは小さい生物粒子の、例えばコロイドディメンションの、形状にあり得る。生物粒子の例示的な例は、ウイルス、細胞（細菌および他の単細胞生物を含む）ならびに細胞凝集体および細胞小器官を含む細胞の部分である。
本発明は特に、興味のある物質を高濃度の塩と共に含む生物学的流体から得られる水性液体に適用可能であるであろうと信じられている。
【００８８】
上で議論したタイプの種類の生物有機物質を含む、高イオン強度の典型的な液体は、例えば細胞の培養からの発酵ブロス／液、およびそれから得られる液体である。細胞は、哺乳動物のような、脊椎動物、または無脊椎動物（例えば、チョウおよび／もしくはそれらの幼虫からの細胞のような培養昆虫細胞）、または微生物（例えば、培養真菌、細菌、酵母等）から由来してもよい。また含まれるのは、植物細胞および、好ましくは培養された、他の種類の生体細胞である。
【００８９】
液体（Ｉ）がまた望ましくない異物を含有する場合なら、エキスバンデッド床技術を利用することが有益であろう。これは特に、液体（Ｉ）が（ａ）細胞の培養からの発酵ブロス／液、（ｂ）溶菌細胞を含む液体、（ｃ）細胞および／もしくは組織のホモジネートを含む液体、ならびに細胞から得られるペーストから由来するときに当てはまる。
【００９０】
本明細書で説明されるイオン交換体は、塩濃度が高い水性出発組成物に比較してより低い塩濃度を有する生物有機物質を含む水性組成物の製造には特に良く向いている。この種類のプロセスは問題の物質の脱塩を意味する。この出願に並行して出願して、表題「低濃度の塩を含む組成物の製造方法」を有する我々のＳＥ特許出願をさらに参照されたい。
【００９１】
本発明の第二の態様
この態様は、少なくとも一つのリガンドがｐＨ−依存性であってもなくてもよい荷電を有する少なくとも二つの異なるリガンド（リガンド１、リガンド２）で機能化される支持マトリックスを含むことを特徴とするイオン交換吸着剤の中で選択される、イオン交換吸着剤（１）を含む。
【００９２】
リガンド１は荷電されていて、単一もしくは混合モードのイオン交換種類に属し得る。かくして、リガンド１は、リガンドがファンデルワールス相互作用および／もしくは電子供与体−受容体相互作用に関与することを可能にする中性基を含んでも含まなくてもよい。関与する原子および／もしくは基は本発明の第一の態様について上で規定したのと同じである。
【００９３】
リガンド２は中性であっても荷電していてもよい。荷電していると、このリガンドの荷電した原子もしくは基は典型的に、リガンド１の荷電した原子もしくは基に比較して異なる種類に属する。関連する相違については、本発明の第一の態様を参照されたい。荷電したリガンドは、リガンド１と同じ様式で、単一モードもしくは混合モードのリガンドであってもよい。荷電しているか荷電していないことに無関係に、リガンド２は、上でリガンド１についてかつ本発明の第一の態様について議論したように、リガンドが疎水性相互作用および／もしくは電子供与体−受容体相互作用に関与することを可能にする未荷電の基ならびに／または原子を含み得る。
【００９４】
この態様のイオン交換体は、オバルブミン、コナルブミン、ウシ血清アルブミン、β−ラクトアルブミン、α−ラクトアルブミン、リゾチーム、ＩｇＧ、ダイズトリプシンインヒビター（ＳＴＩ）の中で選択され参照物質の少なくとも一つに対するそれが：
（Ａ）０．２５Ｍ  ＮａＣｌに相当するイオン強度を有する水性参照液体中で該少なくとも一つの参照物質を結合させる能力があり；そして
（Ｂ）物質が荷電リガンドに反対の実効電荷を有する、ｐＨ区間２〜１２の部分区間において、
（ａ）物質の実効電荷が負でありそしてイオン交換吸着剤の実効電荷が正であるときに、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（イオン交換体２ａ）、ならびに／または
（ｂ）物質の実効電荷が正でありそしてイオン交換吸着剤の実効電荷が負であるときに、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（イオン交換体２ｂ）
の上で該少なくとも一つの物質のブレイクスルー容量の、≧２００％もしくは≧３００％もしくは≧５００％もしくは≧１０００％のような、≧１００％である該少なくとも一つの参照物質について最高ブレイクスルー容量を有していることをさらに特徴とする。
原理的に、水性参照液体は、ＮａＣｌ、緩衝成分および電荷を帯びている興味のある物質を含有する。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ ＦｌｏｗおよびＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗは本発明の第一の態様の項で呈示されている。
【００９５】
上の比較は、イオン交換体（１）および（２ａ）について、もしくはイオン交換体（１）および（２ｂ）について本質的に同じ条件下で実施される測定を指す、即ち、ｐＨ、温度、溶媒組成、対イオンおよび流速が同じである。ブレイクスルー容量は、流動（例えばｃ／ｃ０＝１０％、ｃ／ｃ０については実験の部を参照）における物質の同じ相対濃度で測定される。
【００９６】
典型的には、本発明のこの態様のイオン交換体に対して少なくとも一つ、二つ、三つもしくはそれ以上の参照物質についてのブレイクスルー容量（３００ｃｍ／時間の流速における流動で１０％）は＞３もしくは４ｍｇ／ゲルｍｌのような＞２ｍｇ／ゲルｍｌである。
【００９７】
種々の実施態様およびそれらの優先性は、本発明の第一の態様について規定されたイオン交換体に対するものと同じである。
本発明を特許実施例で今や例示する。本発明は添付の特許請求の範囲でさらに規定される。
【００９８】
実験の部
１．確率的イオン交換吸着剤の合成
一般事項：
マトリックスの容積は沈降した床の容積を指す。グラムで示すマトリックスの重量は吸引した乾燥重量を指す。大規模の反応では、攪拌をモーター駆動の攪拌機で実施した。小規模反応（ゲル２０ｍｌまで）は振とうテーブル上の密封バイアル中で実施された。イオン交換体のアルキル化、エポキシ化、置換の度の測定は従来の方法で実施された。必要であれば、特に硫黄について元素分析を行った。
合成されたイオン交換吸着剤はベースマトリックスとしてＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （ＡＰＢｉｏｔｅｃｈ ＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）を有した。
【００９９】
１．１．Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ上にアリル基の導入
アリル化をアリルグリシジルエーテルで行った。他の代わりのルート、例えば臭化アリルとの反応、がまたある。
【０１００】
１．１．１．Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （低度置換、フェニル２０μｍｏｌ／ゲルｍｌ）上にアリル基の導入
ａ）低度のアリル置換
水１０ｍｌ中の５０ｇ（固形ゲル５０ｍｌ）のＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（低度置換、フェニル２０μｍｏｌ／ゲルｍｌ）をＮａＯＨ含有（５０％）水溶液２０ｍｌ、ＮａＢＨ４０．２ｇおよびＮａ２ＳＯ４０．５ｇと共に混合した。混合液を５０℃で１時間攪拌した。アリルグリシジルエーテル７ｍｌの添加後、懸濁液を激しい攪拌下に５０℃でさらに１８時間置いた。混合液をろ過後、ゲルを蒸留水５×５０ｍｌ、エタノール５×５０ｍｌ、蒸留水２×５０ｍｌ、０．２Ｍ酢酸２×５０ｍｌおよび蒸留水５×５０ｍｌで順次洗浄した。置換度はアリル０．１３ｍｍｏｌ／ゲルｍｌであった。
ｂ）中度のアリル置換
手順は、アリルグリシジルエーテル２８ｍｌを使用した以外は、１．１．１．ａにおけるのと同じであった。置換度はアリル０．２２ｍｍｏｌ／ゲルｍｌであった。
ｃ）高度のアリル含量
手順は、アリルグリシジルエーテル５０ｍｌを使用した以外は、１．１．１．ａにおけるのと同じであった。置換度はアリル０．４ｍｍｏｌ／ゲルｍｌであった。
【０１０１】
１．１．２．Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（高度置換、フェニル４０μｍｏｌ／ゲルｍｌ）上にアリル基の導入
ａ）低度のアリル含量
水１０ｍｌ中の５０ｇ（固形ゲル５０ｍｌ）のＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（高度置換、フェニル４０μｍｏｌ／ゲルｍｌ）をＮａＯＨ含有（５０％）水溶液２０ｍｌ、ＮａＢＨ４０．２ｇおよびＮａ２ＳＯ４０．５ｇと共に混合した。混合液を５０℃で１時間攪拌した。アリルグリシジルエーテル７ｍｌの添加後、懸濁液を激しい攪拌下に５０℃でさらに１８時間置いた。混合液をろ過後、ゲルを蒸留水５×５０ｍｌ、エタノール５×５０ｍｌ、蒸留水２×５０ｍｌ、０．２Ｍ酢酸２×５０ｍｌおよび蒸留水５×５０ｍｌで順次洗浄した。置換度はアリル０．１７ｍｍｏｌ／ゲルｍｌであった。
ｂ）中度のアリル含量
手順は、アリルグリシジルエーテル２８ｍｌを使用した以外は、１．１．２．ａにおけるのと同じである。置換度はアリル０．２２ｍｍｏｌ／ゲルｍｌであった。
ｃ）高度のアリル含量
手順は、アリルグリシジルエーテル５０ｍｌを使用した以外は、１．１．２．ａにおけるのと同じである。置換度はアリル０．４ｍｍｏｌ／ゲルｍｌであった。
【０１０２】
１．２．スルホプロピルＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの作成
１．２．１．Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（低度置換、フェニル２０μｍｏｌ／ゲルｍｌ）上にスルホプロピルの導入
ａ）１．１．１．ａで作成された中間生成物から。得られた生成物をＣａｔ３と呼ぶ。
二亜硫酸ナトリウム９ｇを水１５ｍｌ中の４５ｇ（固形ゲル４５ｍｌ）のアリル低度置換アリル（アリル０．１３ｍｍｏｌ／ゲルｍｌ）低度置換Ｐｈｅｎｙｌ（フェニル２０μｍｏｌ／ゲルｍｌ） Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗのスラリーに加えた。ＮａＯＨ水溶液（５０％）の添加によりｐＨを６．５に調整した。反応混合液を室温で攪拌下にゆっくり空気を泡立たせながら１８時間保持した。混合液をろ過後、ゲルを蒸留水４×５０ｍｌ、０．５Ｍ  ＨＣｌ２×５０ｍｌおよび１ｍＭ  ＨＣｌ３×５０ｍｌで順次洗浄した。置換度はスルホプロピル０．１２ｍｍｏｌ／ゲルｍｌであった。
ｂ）１．１．１．ｂで作成された中間生成物から。得られた生成物をＣａｔ４と呼ぶ。
手順は、アリルの置換度が０．２２ｍｍｏｌ／ゲルｍｌであり、反応時間が１７時間であった以外は、１．２．１．ａにおけるのと同じである。置換度はスルホプロピル０．１８ｍｍｏｌ／ゲルｍｌであった。
【０１０３】
１．２．２．Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（高度置換、フェニル４０μｍｏｌ／ゲルｍｌ）上にスルホプロピルの導入
ａ）１．１．２．ａで作成された中間生成物から。得られた生成物をＣａｔ１と呼ぶ。
手順は、アリルの含量がアリル０．１７ｍｍｏｌ／ゲルｍｌであり、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（高度置換、フェニル４０μｍｏｌ／ゲルｍｌ）を使用した以外は、１．２．１．ａにおけるのと同じである。置換度はスルホプロピル０．１２ｍｍｏｌ／ゲルｍｌであった。
ｂ）１．１．２．ｂで作成された中間生成物から。得られた生成物をＣａｔ２と呼ぶ。
手順は、アリルの含量がアリル０．２２ｍｍｏｌ／ゲルｍｌであり、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（高度置換、フェニル４０μｍｏｌ／ゲルｍｌ）を使用した以外は、１．２．１．ａにおけるのと同じである。置換度はスルホプロピル０．１５ｍｍｏｌ／ゲルｍｌであった。
【０１０４】
１．３．アリル化Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの活性化
５０ｍｌのアリル化Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アリル０．４ｍｍｏｌ／ゲルｍｌ）、蒸留水５０ｍｌおよび酢酸ナトリウム２ｇの攪拌した懸濁液中に、持続する黄色が得られるまで臭素を加えた。次いで、ギ酸ナトリウムを懸濁液が十分に脱色するまで加えた。反応混合液をろ過し、ゲルを蒸留水２５０ｍｌで洗浄した。次いで、活性化ゲルを反応容器へ移して、適切なリガンド−形成化合物とさらに反応させた。
【０１０５】
１．４．Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗから得られる陰イオン交換体
１．４．１．Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ上に１，３−ジアミノプロパンから得られたアミンリガンドの導入
ａ）１．１．２．ｃで作成された中間生成物から。得られた生成物をＡｎ１と呼ぶ。
５ｍｌの臭素活性化、アリル化Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アリル０．４ｍｍｏｌ／ゲルｍｌ；フェニル４０μｍｏｌ／ゲルｍｌ）を１，３−ジアミノプロパン（７．５ｍｌ、リガンド−形成化合物）を含有する反応バイアルへ移した。反応を攪拌下５５℃で１７時間続けた。反応混合液をろ過後、ゲルを蒸留水３×１０ｍｌ、０．５Ｍ  ＨＣｌ３×１０ｍｌおよび最後に蒸留水３×１０ｍｌで順次洗浄した。置換度はイオン交換リガンド０．１５ｍｍｏｌ／ゲルｍｌであった。
ｂ）１．１．１．ｃで作成された中間生成物から。得られた生成物をＡｎ２と呼ぶ。
手順は、アリル化Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アリル０．４ｍｍｏｌ／ゲルｍｌ；フェニル２０μｍｏｌ／ゲルｍｌ）を使用した以外は、１．４．１．ａにおけるのと同じである。置換度はイオン交換リガンド０．２５ｍｍｏｌ／ゲルｍｌであった。
【０１０６】
１．４．２．Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ上に１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンから得られたアミンリガンドの導入
ａ）１．１．２．ｃで作成された中間生成物から。得られた生成物をＡｎ３と呼ぶ。
手順は、アリル化Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アリル０．４ｍｍｏｌ／ゲルｍｌ；フェニル４０μｍｏｌ／ゲルｍｌ）および、１，３−ジアミノプロパンの代わりに、蒸留水（１．５ｍｌ）中１，３−ジアミノ−２−プロパノール（３ｇ）の溶液を使用した以外は、１．４．１．におけるのと同じである。置換度はイオン交換リガンド０．１６ｍｍｏｌ／ゲルｍｌであった。
ｂ）１．１．１．ｃで作成された中間生成物から。得られた生成物をＡｎ４と呼ぶ。
手順は、アリル化Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アリル０．４ｍｍｏｌ／ゲルｍｌ；フェニル４０μｍｏｌ／ゲルｍｌ）を使用した以外は、１．４．２．ａにおけるのと同じである。置換度はイオン交換リガンド０．１６ｍｍｏｌ／ゲルｍｌであった。
【０１０７】
１．５．Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗから得られる陽イオン交換体
１．５．１．Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ上にメルカプトプロピオン酸から得られたカルボキシリガンドの導入
ａ）１．１．１．ｃで作成された中間生成物から。得られた生成物をＣａｔ５と呼ぶ。
１００ｍｌの臭素活性化、アリル化Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アリル０．４２ｍｍｏｌ／ゲルｍｌ；フェニル４０μｍｏｌ／ゲルｍｌ）を反応容器へ移し、１７．５ｍｌのメルカプトプロピオン酸（アリル基当り６当量）およびＮａＣｌ１２ｇの水溶液（蒸留水５０ｍｌ）と反応させた。添加の前に、ｐＨを５０％ＮａＯＨ水溶液で１１．５に調整した。反応を攪拌下５０℃で１８時間続けた。反応混合液のろ過および蒸留水５００ｍｌでの洗浄により、イオン交換ゲルを得た。置換度はＣＯ２Ｈリガンド０．２７ｍｍｏｌ／ゲルｍｌであった。
ｂ）１．１．１．ｃで作成された中間生成物から。得られた生成物をＣａｔ５と呼ぶ。
手順は、アリル化Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アリル０．４１ｍｍｏｌ／ゲルｍｌ；フェニル２０μｍｏｌ／ゲルｍｌ）を使用し、バッチサイズが５０％であった以外は、１．５．１．ａにおけるのと同じであった。置換度はＣＯ２Ｈリガンド０．２８ｍｍｏｌ／ゲルｍｌであった。
【０１０８】
１．６．Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ上にメルカプトプロピオン酸から得られたカルボキシリガンドおよび２−メルカプトピリジンから得られたピリジルリガンドの導入
１．６．１．アリル化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの作成
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ８０ｇをＮａＢＨ４０．５ｇ、Ｎａ２ＳＯ４１３ｇおよび５０％ＮａＯＨ水溶液５０ｍｌと共に混合した。混合液を５０℃で１時間攪拌した。アリルグリシジルエーテル１００ｍｌの添加後、懸濁液を激しい攪拌下に５０℃でさらに１８時間置いた。混合液をろ過後、ゲルを蒸留水５００ｍｌ、エタノール５００ｍｌ、蒸留水２００ｍｌ、０．２Ｍ酢酸２００ｍｌおよび蒸留水５００ｍｌで順次洗浄した。置換度はアリル０．４１ｍｍｏｌ／ゲルｍｌであった。
【０１０９】
１．６．２．アリル化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの臭素化による活性化
これは、アリル化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを用いた以外は、上の１．３項で説明したように実施された。
【０１１０】
１．６．３．２−メルカプトピリジンから得られたピリジルリガンド（低度置換）およびメルカプトプロピオン酸から得られたカルボキシリガンドで置換されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの合成。生成物をＣａｔＡｎ１と呼ぶ。
反応バイアル中で、０．５Ｍ重炭酸ナトリウム５ｍｌ中の２−メルカプトピリジン０．５ｍｍｏｌの溶液のｐＨを５０％ＮａＯＨ水溶液を加えることによりｐＨ１０．５に調整した。別に、蒸留水１ｍｌ中３−メルカプトプロピオン酸１．２ｇの溶液を調製し、そのｐＨを５０％ＮａＯＨ水溶液を加えることにより１１に調整した。２−メルカプトピリジン溶液を含有するバイアルへ、１０ｍｌの臭素活性化、アリルＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アリル０．４１ｍｍｏｌ／ゲルｍｌ）を加え、反応を攪拌下５０℃で継続した。１．５時間後、３−メルカプトプロピオン酸を含有する溶液を加え、混合液を４５℃で１６時間攪拌した。反応混合液をろ過し、ゲルを蒸留水５×１０ｍｌで洗浄した。微量分析により、ピリジンリガンドについて４３μｍｏｌ／ゲルｍｌおよびプロピオン酸リガンドについて２５１μｍｏｌ／ゲルｍｌの置換度を得た。
【０１１１】
１．６．４．２−メルカプトピリジンから得られたピリジルリガンド（中度置換）およびメルカプトプロピオン酸から得られたカルボキシリガンドで置換されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの合成。生成物をＣａｔＡｎ２と呼ぶ。
手順は、２−メルカプトピリジンの量が二倍増された以外は、１．６．３．におけるのと同じであった。微量分析により、ピリジンリガンドについて８６μｍｏｌ／ゲルｍｌおよびプロピオン酸リガンドについて２１５μｍｏｌ／ゲルｍｌの置換度を得た。
【０１１２】
１．６．５．２−メルカプトピリジンから得られたピリジルリガンド（高度置換）およびメルカプトプロピオン酸から得られたカルボキシリガンドで置換されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの合成。生成物をＣａｔＡｎ３と呼ぶ。
手順は、２−メルカプトピリジンの量が三倍増された以外は、１．６．３．におけるのと同じであった。微量分析により、ピリジンリガンドについて１２７μｍｏｌ／ゲルｍｌおよびプロピオン酸リガンドについて１７１μｍｏｌ／ゲルｍｌの置換度を得た。
【０１１３】
２．クロマトグラフィー
２．１．混合リガンド陽イオン交換基材
三つの精製タンパク質［塩基性（リゾチーム＝Ｌｙｓ）、中性〜弱塩基性（ＩｇＧ）および酸性（ＢＳＡ）タンパク質を代表する］を使用して、新しいシリーズの“高塩”混合リガンド陽イオン交換基材をブレイクスルー容量（Ｑｂ１０％）に関して特性化した。リゾチームの結合および溶出を通常の陽イオン交換操作手順、即ち、中性ｐＨにおける吸着および高濃度の塩（例えば２Ｍ  ＮａＣｌ）を含有する緩衝液での同じｐＨにおける溶出、によって行った。ＩｇＧは、ｐＨ４．５において結合させて、比較的低濃度（０．１Ｍ）の塩を含有する、ｐＨ７．０の緩衝液で溶出させた。ＩｇＧは、相当な多量が種々の基材に高いｐＨにおけるより低いｐＨにおいて吸着され得るので、低いｐＨで結合させた。ＢＳＡは、それが正に荷電される（ＢＳＡのｐＩ＝４．９）、ｐＨ４．０において結合させて、ＩｇＧの場合のように、ｐＨを７．０に上げることにより溶出させた。さらに、三つの塩基性タンパク質（即ち、リボヌクレアーゼ、チトクロームＣおよびリゾチーム）の溶出伝導率をまた全ての混合リガンド陽イオン交換基材について測定した。新しいシリーズの“高塩”混合リガンド陽イオン交換基材についてブレイクスルー容量および溶出伝導率を測定するために使用した手順は下に概略されている。
【０１１４】
２．１．１．“高塩”条件におけるブレイクスルー容量（Ｑｂ１０％）
混合リガンド陽イオン交換基材を“高塩”基材として適格であるとする主な判定基準の一つは、同一の条件下で操作される参照陽イオン交換体のものと比較して比較的高い濃度の塩の存在下におけるタンパク質についてのその結合容量である。ブレイクスルー容量は下で説明される前端分析の方法を用いて測定される。
【０１１５】
２．１．２．実験の部
緩衝液
緩衝液１：２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．３Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ６．８
緩衝液２：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．２５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ４．０
緩衝液３：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．２５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ４．５
緩衝液４：２０ｍＭリン酸ナトリウム、２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ６．８
緩衝液５：１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０
【０１１６】
タンパク質溶液
１．リゾチーム：緩衝液１中４ｍｇ／ｍＬ
２．ＢＳＡ：緩衝液２中４ｍｇ／ｍＬ
３．ＩｇＧ：緩衝液３中４ｍｇ／ｍＬ
全ての緩衝液およびタンパク質溶液を、使用前に、０．４５μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｅｘ ＨＡフィルターを通してろ過した。
【０１１７】
２．１．３．クロマトグラフィーシステム
全ての実験は、Ｕｎｉｃｏｒｎ ３．１ソフトウエア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）を装備したＡｅｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００クロマトグラフィーシステムを用いて室温で実施された。試料を１５０ｍＬスーパーループを経由してカラムに加えた。溶出液を１０ｍｍフローセルを用いて２８０ｎｍにおける吸光度測定により連続的にモニターした。
【０１１８】
前端分析
“高塩”混合リガンド陽イオン交換基材のそれぞれのプロトタイプをＨＲ５／５カラム（充てん床容積＝１ｍＬ）中に充てんし、適切なｐＨおよび塩濃度（緩衝液１、２もしくは３）の緩衝液で平衡化した。適切なタンパク質溶液を１ｍＬ／分（即ち３００ｃｍ／時間）の流速でカラムに供給した。試料の添加を、溶出液のＡ２８０がカラムに加えた試料のＡ２８０の１０％レベルに達するまで、継続した。試料についての最高ＵＶシグナルは、ＵＶ検出器中に試験溶液を直接注入することにより評価された。そのように得られたデータに基づいて（式１参照）、添加タンパク質の濃度の１０％レベルにおける充てんゲルのブレイクスルー容量（Ｑｂ１０％）を計算できる。そのようにして得られた結果は、数多くの“高塩”混合リガンド陽イオン交換基材をスクリーニングするための基礎を形成しており、三つのタンパク質、即ち、リゾチーム、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）、について下に提示する。
【０１１９】
最高吸光度の１０％レベルにおけるブレイクスルー（Ｑｂ１０％）を以下の関係式を用いて計算した。
Ｑｂ１０％＝（ＴＲ１０％−ＴＲＤ）×Ｃ／ＶＣ    （１）
ＴＲ１０％＝最高吸光度の１０％における保持時間（分）
ＴＲＤ＝システムのボイド容積（分）
Ｃ＝供給タンパク質の濃度（４ｍｇ／ｍＬ）
ＶＣ＝カラムの充てん床容積（ｍＬ）
【０１２０】
２．１．５．機能試験
混合リガンド陽イオン交換基材を１．０ｍＬのＨＲ５／５カラムに充てんし、２０カラム容積の緩衝液Ａ（２０ｍＭピペラジン緩衝液、ｐＨ６．０）で平衡化した。５０μｌのタンパク質混合液（６ｍｇ／ｍＬリボヌクレアーゼ、２ｍｇ／ｍＬチトクロームＣおよび２ｍｇ／ｍＬリゾチーム）をカラムに加えて、１００％の緩衝液Ｂ（緩衝液Ａプラス２．０Ｍ  ＮａＣｌ）への直線的勾配（勾配容積＝２０カラム容積）により溶出させた。流速を０．３ｍＬ／分（１００ｃｍ／時間）に保持した。
【０１２１】
２．２．混合リガンド陰イオン交換基材
本発明で提案される基材が参照陰イオン交換体より高いイオン強度においてタンパク質を吸着することを検証するために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のブレイクスルー容量を測定した。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗに付けた陰イオン交換リガンドをベースとする新しい“高塩”混合リガンドをこの試験のＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗと比較した。加えて、ＢＳＡの回収率（脱着され得る、吸着ＢＳＡの量、詳細は下を参照）をまた試験した。さらに、三つのタンパク質、即ち、コナルブミン（Ｃｏｎ  Ａ）、ラクトアルブミン（Ｌａｃｔａｌｂ）およびダイズトリプシンインヒビター（ＳＴＩ）、の溶出伝導率をまた全ての陰イオン交換体について測定した。この機能試験をまた用いて、他のタンパク質について高塩条件における遅延を同様に検証した。
【０１２２】
２．２．１．高塩条件におけるブレイクスルー容量（Ｑｂ１０％）
Ｑｂ１０％−値を、同一の条件下で操作される参照陰イオン交換体Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗと比べて比較的高い塩濃度で評価した。種々の陰イオン交換基材についてのＱｂ１０％−値は下で説明される前端分析の方法を用いて測定された。
【０１２３】
ＢＳＡ（４ｍｇ／ｍＬ）の溶液を０．２５Ｍ  ＮａＣｌを含有する２０ｍＭピペラジン（ｐＨ＝６．０）中で調製した。緩衝液およびタンパク質溶液を、使用前に、０．４５μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｅｘ ＨＡフィルターを通してろ過し、そして実験を２．１．３．で説明したのと同じ装置および機器のセッティングで実施した。
【０１２４】
混合リガンド陰イオン交換基材のそれぞれのプロトタイプをＨＲ５／５カラム（充てん床容積＝１ｍＬ）中に充てんし、ピペラジン緩衝液（２０ｍＭピペラジン、ｐＨ＝６．０、０．２５Ｍ  ＮａＣｌを含有）で平衡化した。ＢＳＡ試料溶液の最高吸光度の１０％レベルにおけるブレイクスルー容量（Ｑｂ１０％ＢＳＡ）を２．１．４．項の手順にしたがって計算した。
【０１２５】
２．２．２．回収率
カラムのタイプ、充てん床容積、緩衝液、タンパク質溶液、流速および器具のタイプは上に概略されている。ピペラジン緩衝液（２０ｍＭピペラジン、ＨＣｌ、ｐＨ＝６．０、０．２５Ｍ  ＮａＣｌ）で平衡化したカラムに、ＢＳＡ溶液を５０ｍＬスーパールーフから、そのブレイクスルー容量の３０％に相当する量が加えられるまで、加えた。次いで、カラムを２床容積の平衡緩衝液で洗浄し、結合したＢＳＡを脱着緩衝液（２０ｍＭピペラジン、ｐＨ＝６．０、２．０Ｍ  ＮａＣｌ）で溶出した。溶出したＢＳＡの量を計算し、ＢＳＡの回収率を以下の関係式を用いて確定した：
溶出したＢＳＡの濃度を式２にしたがい計算した。
ＣＳ＝Ａ／ε・ｂ    （２）
ＣＳ＝溶出したＢＳＡ試料の濃度（ｍｇ／ｍＬ）
Ａ＝２８０ｎｍにおける吸光度
ε＝特定の波長におけるモル吸光率、Ｍ−１ｃｍ−１
ｂ＝通路長、ｃｍ
式３をＢＳＡの回収率を計算するために使用した。
回収率、％＝ＣＳ・ＶＳ／ＣＬ・ＶＬ    （３）
ＶＳ＝溶出したＢＳＡ溶液の容積、ｍＬ
ＣＬ＝添加したＢＳＡ溶液の濃度、ｍｇ／ｍＬ
ＶＬ＝添加したＢＳＡ溶液の容積、ｍＬ
【０１２６】
２．２．３．機能試験
“高塩”混合リガンド陰イオン交換基材をＨＲ５／５カラム（１ｍＬ床容積）に充てんし、２０カラム容積のＡ−緩衝液 （２０ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ６．８）で平衡化した。５０μｌのタンパク質混合液（６ｍｇ／ｍＬＣｏｎ  Ａ、４ｍｇ／ｍＬラクトアルブミンおよび６ｍｇ／ｍＬＳＴＩ）をカラムに加えて、１００％のＢ−緩衝液（Ａ−緩衝液プラス２．０Ｍ  ＮａＣｌ）への直線的勾配（勾配容積＝２０カラム容積）により溶出させた。流速を０．３ｍＬ／分（１００ｃｍ／時間）に保持した。
【０１２７】
２．３．結果
２．３．１．高塩条件における混合リガンド陽イオン交換基材のブレイクスルー容量および通常の陽イオン交換クロマトグラフィー条件における溶出伝導率
一連の代表的な“高塩”混合リガンド陽イオン交換基材（表１参照）についてのブレイクスルー容量について得られた結果を表２にまとめた。表１は、本発明の幾らかの基本概念を例示するために用いた種々の基材の幾らかの特定のリガンド性質を示す。大多数のこれらの新しい混合リガンド陽イオン交換体のリガンド比率は３〜１４の区間にあった。参照陽イオン交換体として、市販で入手可能なＳｕｌｐｈｏｐｒｏｐｙｌ（もしくはＳＰ） Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを使用した。そのリガンド濃度は約０．２２ｍｍｏｌ／充てんゲルｍＬであった。結果（表２）は以下の傾向を示す：
１．一つの例外をもって、新しい陽イオン交換リガンドは、参照陽イオン交換体ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗに比較して、全ての三つのタンパク質についてはるかに高いＱｂ１０％を持つ。
２．ＣａｔＡｎ３はＬｙｓ（５４ｍｇ／ｍＬ）について；Ｃａｔ５およびＣａｔ６はＨＳＡ（４５ｍｇ／ｍＬ）についてならびにＣａｔＡｎ１はＩｇＧ（２６ｍｇ／ｍＬ）について、最高のＱｂ１０％を与えた。これらの値は、参照陽イオン交換体（ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）に比べて上の四つの基材上で、Ｌｙｓ、ＨＳＡおよびＩｇＧについて、それぞれ、１３００％、１５００％および２６００％の増加に相当する。
３．基材Ｃａｔ１、Ｃａｔ２およびＣａｔ３は、ＩｇＧについてよりＢＳＡについてはるかに高いＱｂ１０％を持つ。これらの結果は、これらの基材がＩｇＧ製剤からＢＳＡを除去するのに有用であり得ることを示唆する。
４．三つの基材ＣａｔＡｎ１〜３は、いかにリゾチームおよびＩｇＧのＱｂ１０％−値が二つの混合リガンド（メルカプトプロピオン酸およびメルカプトピリジン）のリガンド比率に関係するかを示す。リガンド比率（メルカプトプロピオン酸のリガンド密度／メルカプトピリジンのリガンド密度）が減少するとき、Ｑｂ１０％Ｌｙｓは増加し、Ｑｂ１０％ＩｇＧは減少する（表１および２）。三つのタンパク質の通常の陽イオン交換クロマトグラフィーにおける溶出伝導率（表２）はまた、基材ＣａｔＡｎ１〜３のリガンド比率により選択性に大きい変動を示す。
【０１２８】
２．３．２．高塩条件における混合リガンド陰イオン交換基材のブレイクスルー容量および通常の陰イオン交換クロマトグラフィーにおける溶出伝導率
一連の代表的な“高塩”混合リガンド陰イオン交換基材（Ａｎ１〜４）についてのブレイクスルー容量について得られた結果を表３にまとめ、そしてリガンドの構造を表１に提示した。参照陰イオン交換体として、市販で入手可能なＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを使用した。結果は以下の傾向を示す：
１．新しい混合−リガンド陰イオン交換基材は、参照陰イオン交換体Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗに比較して、全ての三つのタンパク質についてはるかに高い溶出伝導率（表３）を持つ。
２．新しい陰イオン交換リガンドはまた、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗに比較して、ＢＳＡについてはるかに高いブレイクスルー容量（Ｑｂ１０％ＢＳＡ）を持つ。最高のＱｂ１０％−値を与えた基材は、参照陰イオン交換体に比べて２９００％の増加に相当する。表３に示す基材の中、最低のＱｂ１０％−値を与えた基材は、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗに比べて２２００％の増加を呈示した。
３．回収率のデータは、吸着されたＢＳＡは、７１％より大きい回収率をもって塩工程により溶出され得ることを示す（表３）。
【０１２９】
表１．種々の“高塩”混合リガンドイオン交換基材のタイプおよびリガンド比重比率
【表１】
2004516928.tif 000002
ａこれらの基材は，約４０μｍｏｌ／基材ｍＬのリガンド比重を持つＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（高度置換）をベースにした。
ｂこれらの基材は，約２０μｍｏｌ／基材ｍＬのリガンド比重を持つＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（低度置換）をベースにした。
ｃこれらの基材のリガンド比率は，Ｒ１＞Ｒ２＞Ｒ３の順番で減少する。さらに詳細については、リガンドのカップリングについての項を参照されたい。
【０１３０】
表２．三つのタンパク質についてｐＨ６における溶出伝導率ならびに種々の“高塩”混合リガンド陽イオン交換基材の上のリゾチーム（ｐＨ６．８および０．３Ｍ  ＮａＣｌ）、ＢＳＡならびにＩｇＧ（ｐＨ４．０および０．２５Ｍ  ＮａＣｌ）のブレイクスルー容量
【表２】
2004516928.tif 000003
ａ  ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ
ｎａ＝低いＱｂ１０％−値のために分析せず
【０１３１】
表３．三つのタンパク質（コナルブミン、ラクトアルブミンおよびダイズトリプシンインヒビター）についてｐＨ６における溶出伝導率、ＢＳＡ（ｐＨ６および０．２５Ｍ  ＮａＣｌ）のブレイクスルー容量ならびに種々の“高塩”混合リガンド陰イオン交換基材上のＢＳＡの回収率
【表３】
2004516928.tif 000004
ａ  Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ
ｎａ＝低いＱｂ１０％−値のために分析せず
【国際公開パンフレット】
2004516928.tif 000005
2004516928.tif 000006
2004516928.tif 000007
2004516928.tif 000008
2004516928.tif 000009
2004516928.tif 000010
2004516928.tif 000011
2004516928.tif 000012
2004516928.tif 000013
2004516928.tif 000014
2004516928.tif 000015
2004516928.tif 000016
2004516928.tif 000017
2004516928.tif 000018
2004516928.tif 000019
2004516928.tif 000020
2004516928.tif 000021
2004516928.tif 000022
2004516928.tif 000023
2004516928.tif 000024
2004516928.tif 000025
2004516928.tif 000026
2004516928.tif 000027
2004516928.tif 000028
2004516928.tif 000029
2004516928.tif 000030
2004516928.tif 000031
2004516928.tif 000032
2004516928.tif 000033
2004516928.tif 000034
2004516928.tif 000035
2004516928.tif 000036
2004516928.tif 000037
2004516928.tif 000038
2004516928.tif 000039
2004516928.tif 000040
2004516928.tif 000041
2004516928.tif 000042
2004516928.tif 000043
2004516928.tif 000044
2004516928.tif 000045
2004516928.tif 000046
2004516928.tif 000047
2004516928.tif 000048
2004516928.tif 000049
2004516928.tif 000050
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004516928.tif 000051
【国際調査報告】
2004516928.tif 000052
2004516928.tif 000053
2004516928.tif 000054