(57)【要約】本発明は、そのＰ５０が３７℃で約６〜７ｍｍＨｇでありＮＯ及び／又はＳＮＯ基に結合することができる遊離システインを含有する、重合グロビン鎖を含む、約３００万〜約４００万ダルトンの高分子量細胞外ヘモグロビンの血液代替物としての使用に関する。
2004501118.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
約３００万〜約４００万ダルトンの分子量を有し、重合グロビン鎖を含み、ＮＯ及び／又はＳＮＯ基に結合することができる遊離システインを含有し、３７℃で約６〜約７ｍｍＨｇのＰ５０を有する細胞外ヘモグロビンの、血液代替物としての、使用。
【請求項２】
約３００万〜約４００万ダルトンの分子量を有し、重合グロビン鎖を含み、ＮＯ及び／又はＳＮＯ基に結合することができる遊離システインを含有し、３７℃で約６〜約７ｍｍＨｇのＰ５０を有する細胞外ヘモグロビンを含む、血液代替物、特にヒト血液代替物。
【請求項３】
ヘモグロビン協同性係数が、２〜３（ｎ５０）である、請求項２記載の血液代替物。
【請求項４】
細胞外ヘモグロビンのグロビン鎖が、共有結合、特に分子間ジスルフィド架橋によってそれら自身の間で安定化されており、グロビン鎖が、分子内ジスルフィド架橋によって自己安定化されている、請求項２又は３記載の血液代替物。
【請求項５】
細胞外ヘモグロビンが、ヘモグロビンに六面構造を付与する構造鎖を含む、請求項２〜４のいずれか１項記載の血液代替物。
【請求項６】
細胞外ヘモグロビンが、硫化水素のような毒性化合物を中和することができる、請求項２〜５のいずれか１項記載の血液代替物。
【請求項７】
細胞外ヘモグロビンが、ヘモグロビン上に場合により固定されているいかなる酸素を放出するためにいかなるコファクターをも必要としない、請求項２〜６のいずれか１項記載の血液代替物。
【請求項８】
請求項２〜７のいずれか１項記載の血液代替物であって、細胞外ヘモグロビンが以下：
−非毒性である、
−病原因子を含まない、
−酸化しないで４℃で少なくとも６週間もつ、
−すべての血液型に対して輸血可能である、
−それが輸血される生物の天然ヘモグロビンへの再生を確実にするのに充分に長い滞留時間を有する、
−副作用なしにそれが輸血される生物によって排出される
の特性を有する、血液代替物。
【請求項９】
細胞外ヘモグロビンが、環形動物由来である、請求項２〜８のいずれか１項記載の血液代替物。
【請求項１０】
細胞外ヘモグロビンが、アレニコラ  マリナ（Ａｒｅｎｉｃｏｌａ ｍａｒｉｎａ）由来である、請求項９記載の血液代替物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、高分子量細胞外ヘモグロビンの血液代替物としての使用に関する。
本発明は、高分子量細胞外ヘモグロビンを含有する、新規な血液代替物にも関する。
【０００２】
血液は複雑な液体であり、その主要な機能は、酸素及び二酸化炭素を輸送し、呼吸プロセスを確実にすることである。この機能は、赤血球に見出されるヘモグロビン分子によって行われる。
【０００３】
哺乳類においては、ヘモグロビン分子は、対になった４つの同様の機能的ポリペプチド鎖（２つのα型グロビン鎖及び２つのβ型グロビン鎖）から作られている。これらのポリペプチド鎖の各々は、ミオグロビン分子の同じ四次構造を有する（１１）。
【０００４】
ヘモグロビンの活性部位であるヘムは、テトラピロールプロトポルフィリン環であり、その中心に単一の鉄原子を含有する。この鉄原子は酸素を固定するものであり、６個の配位結合：４個はポルフィリン中の窒素原子と、１個はＦ８プロキシマルヒスチジンと、そして１個はグロビンの酸素化の間に酸素分子を請け負う。
【０００５】
現在、供血者の数が汚染の恐れのために減少しているため、血液の供給に関して問題がある。したがって、最近２、３年は、血液代替物の研究の加速が見られた。感染性疾患の伝播の危険を排除することができる、そして、血液グループ適合性の問題からの解放をももたらすであろう、人工血液代替物を設計する試みが行われている。
【０００６】
現在まで、研究は、主に、一方では化学物質の合成（２３）に、他方では生物学的製品の合成（２４，２５）に関するものであった。
【０００７】
研究の第一の領域に関しては、パーフルオロカーボン（ＰＦＣｓ）が利用されてきた。ＰＦＣは、酸素を輸送することができる化学物質であり、酸素及び二酸化炭素のような大量の気体を溶解することができる。
より効率的に血液中に分散し得るこれらの製品のエマルジョンを製造する努力が現在為されている（２９〜３１）。
【０００８】
ＰＦＣの利点は、肺の中の酸素の量に正比例するオキシフォリック（ｏｘｙｐｈｏｒｉｃ）容量にある。更に、横断すべき膜がないという事実によって、ＰＦＣは、より迅速に組織に酸素を輸送することができる。しかし、生物におけるこれらの製品の保持の長期間の影響は未知である。１９６０年代にこれらの製品がマウスにおいて血液代替物として最初に使用された時（２３、２８、３２）、その副作用は非常に重いものであった。ＰＦＣは、満足できる程度には循環から除去されず、生物の組織中に蓄積し、浮腫を引き起こした。
【０００９】
１９８０年代に、新規なバージョンのＰＦＣが臨床フェーズで試験された。しかし、保存、経済的コスト、かなりの副作用及びこの化合物の効率の低さにより、そのマーケティングの拡張が妨害された（３３、３４、３５）。
【００１０】
最近、新世代のＰＦＣが開発された（ＰＦＢＯ；パーフルオロオクチルブロミド）。新製品（２９）が米国において臨床試験されているが、既に、血液中の酸素量の増大が組織における酸素の蓄積を引き起こし得、それが生物にとって危険であること（スーパーオキシド型のラジカル酸素の形成）が見出されている。
したがって、達成された進歩にもかかわらず、これらの化合物の副作用は、未だ重大すぎて大規模なマーケティングが可能になっていない。
【００１１】
研究の第二の領域に関しては、天然ヘモグロビンの構造を改変することによる血液代替物の開発に関する作業が行われてきた（２４，３６）。改変されたヘモグロビン型の血液代替物を得るためには、遺伝的に改変された微生物由来の、又はヒトもしくは動物起源の、ヘモグロビン、特にウシヘモグロビン分子が利用されている。ウシヘモグロビンは、免疫学に関してヒトヘモグロビンとやや異なるが、より容易に組織に酸素を運搬する。それにもかかわらず、ウイルス又は海綿状脳症型の汚染のリスクは、なおかなり存在するままである。
【００１２】
機能的であるためには、ヘモグロビンは、アロステリックエフェクターである２，３−ジホスホグリセレート（２，３−ＤＰＧ）と接触しなければならず、これは赤血球の内部のみに存在する（３８）。更に、赤血球中に存在する２，３−ＤＰＧ、及びメトヘモグロビンレダクターゼのような他の要素なしで、ヘモグロビンは自己酸化過程を行い、酸素又は二酸化炭素を輸送するその能力を失う。
【００１３】
これらのプロセスは、ヘモグロビンの構造を改変することによって、より正確には２つのα及びβダイマー間のテトラマー分子の弱い結合を安定化させることによって、排除することができる（３９）。多数の改変が試験された：２つのα鎖間、２つのβ鎖間、及びα及びβの間の、共有結合（４０，４１）。
【００１４】
テトラマー分子を重合する、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）として知られるポリマーとそれらとをコンジュゲート化する試みも為されてきた（４２）。これらの改変は、分子の安定化及びサイズの増大をもたらし、腎臓による排出を防止する。
【００１５】
環形動物は、その細胞外ヘモグロビンについて広く研究されてきた（１０，４４）。これらの細胞外ヘモグロビン分子は、環形動物の３つのクラス、ｐｏｌｙｃｈａｅｔｅｓ（多毛類），ｏｌｉｇｏｃｈａｅｔｅｓ（貧毛類）及びａｃｈａｅｔｅｓ（無毛類）に、そしてｖｅｓｔｉｍｅｎｔｉｆｅｒｓにも、存在する。これらは巨大なバイオポリマーであり、６又は７つの異なるタイプに属する約２００のポリペプチド鎖から構成されており、それらは一般に２つのカテゴリーにグループ化されている。第一のカテゴリーは、１４４〜１９２個の要素からなり、活性部位を有し、可逆的に酸素を結合することができる「機能的」ポリペプチド鎖をグループ化する；これらは１５〜１８ｋＤａの質量のグロビンタイプの鎖であり、脊椎動物のα及びβタイプの鎖と非常に類似している。第二のカテゴリーは、３６〜４２個の要素からなり、活性部位を全く又はほとんど持たないが「１２分の１分子（ｔｗｅｌｆｔｈｓ）」の会合を可能にする「構造的」ポリペプチド鎖をグループ化する。
【００１６】
Ａｒｅｎｉｃｏｌａの細胞外ヘモグロビンの最初に得られたイメージ（４５，４６）は、六面体の要素を解明した。各ヘモグロビン分子は、六面体二重層と呼ばれる２つの重なった六面体から構成されており（４７，４８）、各六面体は、それ自体、中空球形構造（５１，５４）又は「１２分の１分子」と呼ばれる水滴の形態の６個の要素から構成されている（４９，５０）。ネイティブな分子は、分子量約２５０ｋＤａのこれらのサブユニット１２個から形成されている。
【００１７】
潮間生態系の多毛類の環形動物であるＡｒｅｎｉｃｏｌａ ｍａｒｉｎａには特別の興味がある。更に、その細胞外ヘモグロビンの構造は、既に公知である（６０）。
【００１８】
血液代替物としてのオオミミズ（Ｌｕｍｂｒｉｃｕｓ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）の細胞外ヘモグロビンの使用の研究が行われてきた（２）。しかし、このヘモグロビンは、第一に、遊離システイン残基の欠如のために血管収縮及び／又は血管拡張をおそらく妨害するため（７０）、第二に、このヘモグロビンは酸素に対して弱すぎる親和性、すなわち高いＰ５０を示すため、好適ではないであろう。
現在まで、利用可能な血液代替物のいずれもが、副作用はないとしても、汚染の問題及び血液型適合性の回避を可能にするものではない。
【００１９】
本発明は、これらの不利益を修復することを可能にする。
本発明の目的は、供血者の欠如の問題を排除することを可能にする新規な血液代替物を提案することである。
本発明の対象は、また、献血の間の感染性疾患の伝播の問題を回避することを可能にする新規な血液代替物を提案することである。
本発明はまた、移植中に器官を保存することを可能にする新規な血液代替物にも関する。
本発明はまた、特に輸血中の、血液型適合性の問題から解放されることを可能にする新規な血液代替物にも関する。
【００２０】
本発明は、血液代替物としての、約３００万〜約４００万ダルトンの分子量を有し、重合したグロビンの鎖を含み、ＮＯ及び／又はＳＮＯ基に結合することができる遊離システインを含有し、３７℃で約６〜約７ｍｍＨｇのＰ５０を有する、細胞外ヘモグロビンの使用に関する。
【００２１】
本発明はまた、約３００万〜約４００万ダルトンの分子量を有し、重合したグロビンの鎖を含み、ＮＯ及び／又はＳＮＯ基に結合することができる遊離システインを含有し、３７℃で約６〜約７ｍｍＨｇのＰ５０を有する細胞外ヘモグロビンを含む、血液代替物、特にヒト血液代替物にも関する。
【００２２】
「血液代替物」という用語は、赤血球中に存在するヘモグロビンを置き換えることができ、気体（酸素及び二酸化炭素）の輸送者としてのその機能を行うことができる生物学的製品を定義する。この血液代替物はまた、組織に酸素を供給し、組織でＣＯ２をチャージされ、この気体を交換表面（肺）で放出しなければならない。
【００２３】
「細胞外ヘモグロビン」という用語は、細胞に含有されておらず、血液中に溶解しているヘモグロビンを指す。
【００２４】
「重合（した）グロビンの鎖」という用語は、グロビン鎖の共有結合による会合物を定義する。
【００２５】
ＮＯ及び／又はＳＮＯ基に結合することができる遊離システインの数は、約１２０〜約１５０、特に約１２０〜約１３０にわたることができる。
ＮＯ基への結合を決定することを可能にする試験の一例は、Ｊｉａら（７１）によって使用されているものである。
ＳＮＯ基への結合を決定することを可能にする試験の一例は、Ｊｉａら（７１）によって使用されているものである。
【００２６】
Ｐ５０は、酸素に対する呼吸色素の親和性を測定するのに使用されるパラメーターであり、呼吸色素の結合部位の５０％酸素飽和に相当する。
これはヘムに固定する酸素の効率に相当する。
Ｐ５０は、ヘモックス技術（１）を用いて測定することができる。
【００２７】
有利な態様によれば、本発明の血液代替物においては、細胞外ヘモグロビン協同性係数（ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｉｔｙ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）（ｎ５０）は２〜３である。
ヘモグロビン協同性係数（ｎ５０）は、グロビン鎖の異なる活性部位の酸素結合能力を概算するために用いられるパラメーターであるとして定義される。
ｎ５０は、ヘモックス技術を用いて得られる呼吸色素の酸素飽和曲線上で測定することができる。
【００２８】
有利な態様によれば、本発明の血液代替物においては、細胞外ヘモグロビンのグロビン鎖は、共有結合、特に分子間ジスルフィド架橋によって、それら自身の間で安定化されており、グロビン鎖は、分子内ジスルフィド架橋によって自己安定化されている。
「細胞外ヘモグロビンのグロビン鎖は共有結合によってそれら自身の間で安定化される」という表現は、２以上のグロビン鎖間の鎖間ジスルフィド結合の存在を指す。
「グロビン鎖は自己安定化される」という表現は、各グロビン鎖上の鎖内ジスルフィド結合の存在を指す。
【００２９】
有利な態様によれば、本発明の血液代替物において、細胞外ヘモグロビンは、ヘモグロビンに六辺形の構造を付与する構造鎖を含む。
「構造鎖」という用語は、ヘムを全く又はほとんど有さない、分子の六面体構造を維持するポリペプチド鎖を示す。
【００３０】
有利な態様によれば、本発明の血液代替物においては、細胞外ヘモグロビンは、硫化水素のような毒性化合物を中和することができる。
「細胞外ヘモグロビンは毒性化合物を中和することができる」という表現は、遊離システイン残基上の硫化水素の固定が、生物の内部環境からこの化合物を低減又は除去することを可能にすることを指す。いったん固定されると、硫化水素は非毒性となる。
「毒性化合物」という用語は、例えば、生物において生理学的障害又は病理学的不全を生じうる化学的又は生物学的要素を定義する。
【００３１】
毒性化合物の中和を確認するための試験の一例は、２つの刊行物において使用されているもの（５９，７４）であり、気相でのクロマトグラフィによる用量決定を含む試験である。
【００３２】
有利な態様によれば、本発明の血液代替物においては、細胞外ヘモグロビンは、おそらくヘモグロビン上に固定されているあらゆる酸素を放出させるために、いかなるコファクターも必要としない。
「細胞外ヘモグロビンはいかなるコファクターも必要としない」という表現は、ヘモグロビンが血液中に溶解しており、例えば２，３−ＤＰＧが関与する細胞内ヘモグロビンの場合のように、別の分子の関与なしに酸素を放出し得ることを指す。
【００３３】
脊椎動物のヘモグロビンは、無核細胞又は赤血球に含有されている。これらの細胞の内側で、見出されている主要なコファクターは、固定された酸素が放出されるのを可能にする２，３−ＤＰＧである。
２，３−ＤＰＧが細胞外ヘモグロビンの存在下で見出された場合、これは、この色素による酸素の放出に対していかなる影響も及ぼさないであろう。
【００３４】
有利な態様によれば、本発明の血液代替物においては、細胞外ヘモグロビンは以下の特性を有する：
−それは非毒性である
−それは病原因子を有さない
−それは酸化なしに４℃で少なくとも６週間もつ
−それはすべての血液型に対して輸血可能である
−それはそれが輸血される生物の天然ヘモグロビンへの再生を確実にするのに充分に長い滞留時間を有する
−それは副作用なしにそれが輸血される生物によって排除される
「非毒性」という表現は、血液代替物が、免疫反応、アレルギー又は腎毒性タイプのいかなる病理学的不全も引き起こさないことを意味する。
「病原因子を有さない」という表現は、同定された微生物又はウイルスの不存在を指す。
病理学的不全の不存在は、間接的に病原体の不存在を意味する。
「酸化なしに４℃で少なくとも６週間維持する」という表現は、酸素の結合に関与する、活性部位、特にヘムに存在する鉄が、Ｆｅ２＋形態（機能的状態）にとどまることを意味する。活性部位の酸化は、酸素の結合の可能性を包含するＦｅ２＋からＦｅ３＋への通過による。
「すべての血液型に対して輸血可能な」という表現は、血液タイピング（ＡＢＯ又はＲｈ系）の欠如を指す。このヘモグロビンは、普遍的ドナータイプのヘモグロビンとして考えることができる。
「それが輸血される生物の天然ヘモグロビンへの再生を確実にするのに充分に長い滞留時間を有する」という表現は、輸血前の少なくとも４８時間の後に血液系にこのヘモグロビンが存在することを指す。この時間は、生物がそれ自身の赤血球を再合成するのを可能にするのに充分に長い。
説明の方法として、ヒトの輸血のフレームワーク内で、この時間は、有利には４８時間のオーダーのものでなければならない。
「副作用なしにそれが輸血される生物によって排出される」という表現は、この細胞外ヘモグロビンが、特に病理学的不全を何ら生じずに、天然の手段によって排出されるように見えることを意味する。
【００３５】
脊椎動物においては、赤血球の寿命は約１２０日である。その後、赤血球は食細胞により処理される（生理学的溶血）。次に、ヘモグロビンはビリベルジン及びビリルビンに変換され、それらは胆汁によって排出される。
【００３６】
従来技術の製品について遭遇する可能性が高い副作用のいずれも、特に浮腫、免疫原性及び腎毒性の問題が、本発明のフレームワーク内には存在しない。
【００３７】
有利な態様によれば、本発明の血液代替物においては、細胞外ヘモグロビンは環形動物由来である。
環形動物という用語を用いる場合に参照される分類は、Ｍｅｇｌｉｔｓｃｈ， Ｐ．Ａ．（１９７２）によって記載されたものである（７５）。
【００３８】
有利な態様によれば、本発明の血液代替物においては、細胞外ヘモグロビンはＡｒｅｎｉｃｏｌａ ｍａｒｉｎａ由来である。
Ａｒｅｎｉｃｏｌａ ｍａｒｉｎａの細胞外ヘモグロビンにおいては、ＮＯ及び／又はＳＮＯ基に結合することができる遊離システインの数は１２４に等しい。
【００３９】
更に、各グロビン鎖上に１つの鎖内結合（ジスルフィド結合）があり、この分子が１５６個のグロビンタイプの鎖から構成されているので、全部で１５６の鎖内ジスルフィド架橋がグロビン鎖に存在する（６０）。
【００４０】
分子間結合に関しては、この分子の各々の１２分の１は、以下のものと関連する１２のグロビンタイプの鎖から構成されている：３個の共有結合トリマー及び３個のモノマー。したがって、グロビン鎖間には５２の分子間結合が存在する。
【００４１】
【実施例】
ヘモグロビン試料の採取
Ａｒｅｎｉｃｏｌａ類は、フランスのＳａｉｎｔ−Ｐｏｌ ｄｅ Ｌｅｏｎ， Ｎｏｒｔｈ Ｆｉｎｉｓｔｅｒｒｅに近い波打ち際で干潮時に収穫した。氷のベッド上で解剖した後、腹部血管からその血液を採取した。試料を、Ｔｏｕｌｍｏｎｄによって開発された口吸引システムにつなげられたガラスマイクロピペット（１９７５）又は２５Ｇ×５／８″針を装備した１ｍｌ皮下シリンジを用いて採取する。試料を氷上で集める。組織破砕物を除去するための冷却遠心（１５０００ｇで１５分間、４℃）の後、上清を、−２０℃で又は液体窒素中で凍結するか、又は直ちに精製する。
【００４２】
ヘモグロビンの精製
精製の前に、融解した試料を５０００ｇで５分間、４℃で遠心する。遠心後、一般に少量の残存物が存在する。これを除去する。
上清の１００μｌのアリコートの低圧ろ過（ＦＰＬＣ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６Ｃカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、分離範囲５×１０３〜５×１０６Ｄａ）を用いて又は２．５×１００ｃｍ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−５００  ＨＲカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、分離範囲４０〜２００００ｋＤａ）を用いる簡便クロマトグラフィによって行う。試料を、Ａｒｐら（１９８７）及びＦｉｓｈｅｒら（１９８８）によって開発されたＲｉｆｔｉａ塩類化緩衝液を用いて溶出する。この改変された緩衝液の組成は、以下のとおりである：１リットルについて、２３．３８ｇ  ＮａＣｌ（４００ｍＭ）；０．２２ｇＫＣｌ（２．９５ｍＭ）；７．８８ｇ  ＭｇＳＯ４，７Ｈ２Ｏ（３１．９７ｍＭ）；１．６２ｇ  ＣａＣｌ２，２Ｈ２Ｏ（１１．０２ｍＭ）及びＨＥＰＥＳ（５０ｍＭ）。ＨＣｌを添加することによってｐＨをｐＨ＝７．０に調整する。使用した速度は、一般に０．４〜０．５ｍｌ／分である。溶出液の吸光度を、２つの波長で追跡する：２８０ｎｍ（タンパク質吸光度ピーク）及び４１４ｎｍ（ヘモグロビン吸光度ピーク）。ヘムを含有するフラクションを、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１００（１５ｍｌ）チューブを用いて又は１００００Ｄａ以上の分子量の分子を保持する撹拌セルを用いて濃縮する。同じプロトコールにしたがう２回の精製プロセスが純粋なフラクションを得るために必要である。
【００４３】
マウスへのＡｒＨｂの輸血
この実験の目的は、脊椎動物モデルにおいて血液代替物としてＡｒｅｎｉｃｏｌａ ｍａｒｉｎａの細胞外ヘモグロビン（ＡｒＨｂ）を用いることの可能性を調べることであった。
この目的のために、３０匹の成体の繁殖性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを用い、それらの体重は２５〜４０ｇの間であった。４匹のマウスを対照として用いた。このタイプのマウスの血液量は一般に１．５〜２ｍｌである。
【００４４】
最初に、マウスを、体重測定し、明らかに同定した後にクロロホルムで麻酔した。
次に、２００〜８００μｌの血液を後眼窩脈叢から採取し、各マウスの血液を低速で遠心して血漿（上清）を回収した。これを、同じマウスに後でＡｒＨｂとともに再注入するために注意深く保持した。予め精製したＡｒＨｂを１．５ｇ％の濃度で血漿に溶解させる。
このようにして調製した混合物を、次に尾静脈中に注入した。対照マウスの場合には、ある容量の血液を採取した後、同じ容量の、それぞれの血漿を含有する等張塩類溶液を注入した。
最後に、５匹のマウスの場合には、輸血前の１０μｌ及び輸血後の１０μｌのマウス血液を保持して、機能的特性を調べた。別の５匹のマウスの場合には、機能的特性を分析し、おそらくメトヘモグロビンの同定を可能にする分光光度研究を行うために、血液の３０〜４０μｌ試料を２及び４８時間後に眼窩脈叢から採取した。
これらのマウスを３ヶ月モニタリングし、より詳細にそれらの一般的な行動及び体重増加を観察した。
ＡｒＨｂを輸血されたマウスは死亡せず、それらの行動が対照マウスの行動と同様であったことが見出された。
【００４５】
血液試料の分析により以下の要素が示された：ｉ）ＡｒＨｂは輸血に先立つ４８時間後になお存在した；ｉｉ）輸血されたマウスの血液の機能的特性に変更がない；ｉｉｉ）メトヘモグロビンの存在の兆候がない。
【００４６】
免疫反応性
ＡｒＨｂでの最初の輸血の２ヶ月後に、血管系（２匹のマウス）及び腹腔内（２匹のマウス）への新たな注入を行った。これらの８００μｌの注入物は、ＡｒＨｂが溶解された（１〜２ｇ／％）等張塩類溶液を含んでいた。
麻酔から回復した後、障害は全く観察されず、これらの動物は今日もまだ生存している。
この免疫反応の欠如は、免疫系の活性化を可能にしないこのタンパク質のサイズ、又は２，３日後にマクロファージがこれらの外来タンパク質を全体的に排除してしまったという事実のいずれかに関連している可能性がある。
【００４７】
機能的特性
Ｐ５０
Ｐ５０は、ヘモックス技術（１）を用いて測定した。
ｎ５０
ｎ５０は、ヘモックス技術を用いて得られた呼吸色素の酸素飽和曲線上で測定した。
【００４８】
以下の表は、相当するヒトヘモグロビンの値と比較した、Ａｒｅｎｉｃｏｌａ ｍａｒｉｎａについてのＰ５０（親和性）及びｎ５０（協同性）の測定値を示す。これらの測定値は、ヒトヘモグロビン及びＡｒｅｎｉｃｏｌａ ｍａｒｉｎａのヘモグロビンについて同じ条件下でインビトロで得られた。
【００４９】
【表１】
2004501118.tif 000003
【００５０】
Ａｒｅｎｉｃｏｌａ ｍａｒｉｎａについては、示されている値は３つの測定値の平均である。
これらの結果は、Ａｒｅｎｉｃｏｌａ ｍａｒｉｎａのヘモグロビン及びヒトヘモグロビン（ＨｂＡ）が予め何ら改変をせずに同様の機能的特性を有することを示す。
【００５１】
ＮＯ／ＳＮＯに関する細胞外ヘモグロビン
一酸化窒素（ＮＯ）
血管を、外側が平滑筋で、次に血液と接触する内皮細胞の層から構成される円柱で模式的に示すことができる。この内皮細胞の層は、ＮＯ放出プロセスに関与するため、重要な役割を果たす。ＮＯは、血管の緊張を制御する主要な因子である。血液中のＮＯの濃度が低減すると、血管は血管収縮の状態にあり、逆に、ＮＯの増大は血管の血管拡張をもたらすことになる（６８）。一酸化窒素は、神経伝達物質として知られている（６９）。それは、他の代謝制御メカニズムにも関与している（７０）。内皮細胞間のジャンクションは、テトラマー状ヘモグロビンがこの細胞層を横断し、循環から除去されるのを可能にする。結果として、ヘモグロビンは、一酸化窒素を固定することができるので、血管を去るに際し、ＮＯのためのウェルとして作用し、そのことは、血管収縮現象だけでなく、多数の神経学的問題をも生じる。現在では、すべての改変された（架橋、重合又はコンジュゲート化）ヘモグロビン溶液は、内皮細胞層を横断する少量の正常テトラマー状ヘモグロビンを含有する。この問題は、天然に重合されており、大きすぎて血管壁を横断できないＡｒｅｎｉｃｏｌａ ｍａｒｉｎａ由来ヘモグロビンのような高分子量細胞外ヘモグロビンを用いることによって解決される。
【００５２】
チオニトロシル基（ＳＮＯ）
酸素の輸送者としての役割に加えて、脊椎動物のヘモグロビンは、ＮＯ及びＳＮＯの輸送においても重要な役割を果たす（７１）。基本的には、オキシヘモグロビンはデオキシヘモグロビンよりも大きい親和性をＳＮＯについて有すること、デオキシヘモグロビンはオキシヘモグロビンよりも大きい親和性をＮＯに対して有すること、及びＳＮＯは特に肺で産生されること及びそれが血管収縮及び血管拡張の制御において主要な役割を有することが示されている。ここで、Ａｒｅｎｉｃｏｌａ ｍａｒｉｎａの細胞外ヘモグロビンに関して、硫化水素が豊富な環境に生息する海洋性蠕虫に属するヘモグロビンのみがこの機能を行うのに必要な部位（グロビンタイプ鎖上の遊離システインの存在）を有することを注記することは興味深い（５８）。この特性は、Ｊｉａら（７１）の技術を用いて研究された。
【００５３】
細胞外ヘモグロビン及びＳＯＤ活性
赤血球は、カタラーゼ及びスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）のような多数の酵素を含有し、それらは非常に毒性の化合物であるラジカル酸素の不活性化においてかけがえのない役割を有する。しかし、存在する血液代替物は、赤血球の外側に位置するので、これらの活性を有していない。出血性ショック又は虚血によって引き起こされる、生物における酸素化欠損は、ヒポキサンチンの産生を刺激し、キサンチンオキシダーゼを活性化する。この生物が次に酸素下に置かれると、キサンチンオキシダーゼはヒポキサンチンを過酸化物に変換し、それがラジカル酸素を生じることになる。酵素スーパーオキシドジスムターゼは、次に、ラジカル酸素を、それ自身カタラーゼによって水に変換される過酸化水素に変換する役割を果たす。第一世代の血液代替物はこれらの酵素を欠いており、多数の副作用を生じた。新世代の製品は、これらの問題を克服しようと試みてはいるが、まだ解決されておらず、そのことはＡｒｅｎｉｃｏｌａ ｍａｒｉｎａ由来の細胞外ヘモグロビンの使用に対して更なる利点を与える。これは、これらの分子が構造鎖の存在と連関していることができる内在性ＳＯＤ活性を有するためである（７２，７３）。
【００５４】
ＡｒＨｂのＳＯＤ（スーパーオキシドジスムターゼ）活性を測定し、１０Ｕ／ｍｇタンパク質のオーダーの値を見出した。
このＳＯＤ活性を発光を用いて研究した。この定量は、スーパーオキシドアニオンについてのＳＯＤとイミダゾロピラジン（ｉｍｉｄａｚｏｌｏｐｙｒａｄｉｎｅ）との間の競合に基づいている。このアニオンは、酸素の存在下でのヒポキサンチンに対するキサンチンオキシダーゼの作用によって生じ、イミダゾロピラジンと反応して光を生じることができる。ＳＯＤの存在下では、スーパーオキシドアニオンの一部が消費され、その他はイミダゾロピラジン（反応媒体中に過剰量で存在する）を酸化し、測定される光を放出する。したがって、試料中のＳＯＤが低いほど、測定される発光が高くなる。
【００５５】
ＨＰＸ（ヒポキサンチン）＋ＸＯＤ（キサンチンオキシダーゼ）＋Ｏ２→尿酸＋Ｏ２−（スーパーオキシドイオン）
２Ｏ２−＋ＳＯＤ→Ｈ２Ｏ２＋Ｏ２
ＣＬ９（コエレンテラジン）＋Ｏ２−→酸化型ＣＬ９＋ｈｖ
【００５６】
マウスへのＡｒｅｎｉｃｏｌａのヘモグロビンの輸血
約５０％の容量の血液を抽出し、１〜２ｇ／％のＡｒｅｎｉｃｏｌａ ｍａｒｉｎａのヘモグロビンで置き換えた。環形動物のヘモグロビンは、注入前に動物の血漿中又は緩衝液中に溶解されている。注入された置換物の容量は、マウスから採取された最初の容量と基本的に同じである。最も驚くべき観察は、Ａｒｅｎｉｃｏｌａ ｍａｒｉｎａのヘモグロビンを部分的に輸血されたこれらのマウス（ｎ＝３０）において、１４ヵ月後でさえも、行動上又は生理病理学的影響が全くなかったことである（図４）。
【００５７】
免疫反応性
最初の輸血の９週間後にＡｒｅｎｉｃｏｌａ ｍａｒｉｎａのヘモグロビンを再輸血されたマウスは、全くアレルギー反応を示さず、全く死亡していない。これらのすべての実験において、２００μｇのヘモグロビンが尾静脈を介して２匹のマウスに輸血された。麻酔から回復した後、これらのマウスは正常に行動する。この輸血から２週間後（すなわち最初の輸血の１２週間後）、これらのマウスに、腹腔内注射によってＡｒｅｎｉｃｏｌａ ｍａｒｉｎａヘモグロビンの溶液を再輸血し、ここでも、アレルギー又は病理学的応答は全く観察されなかった（図４）。したがって、抗体の形成からもたらされる抗原による認識のメカニズムは、このサイズのタンパク質によっては活性化されないか、又はマクロファージがこの大きなタンパク質を見かけ上何ら問題なく排除した、と結論することができる。
【００５８】
これらの新規な結果は、これらの分子のサイズが、Ａｒｅｎｉｃｏｌａ ｍａｒｉｎａヘモグロビンが脊椎動物において非毒性的に機能することを可能にすることにおいて決定因子であり得るという結論をもたらす。
【００５９】
【表２】
2004501118.tif 000004
2004501118.tif 000005
2004501118.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ヘモグロビン分子の構造を示す。
哺乳類ヘモグロビン分子は、対になった４つの類似の機能的ポリペプチド鎖（２つのα型グロビン鎖及び２つのβ型グロビン鎖）から構成されており、各々ミオグロビン分子の四次構造を有する（１１）。
【図２Ａ】
図２Ａ及び図２Ｂは、Ａｒｅｎｉｃｏｌａ ｍａｒｉｎａの六面体二重層（ＨＢＬ）ヘモグロビンのモデルを示す。
図２Ａ：正面図。Ｔｎはグロビンタイプ鎖ｂ、ｃ及びｄから構成される異なるトリマーに相当する。
【図２Ｂ】
図２Ａ及び図２Ｂは、Ａｒｅｎｉｃｏｌａ ｍａｒｉｎａの六面体二重層（ＨＢＬ）ヘモグロビンのモデルを示す。
図２Ｂ：１２分の１分子の詳細。
【図３Ａ】
図３Ａ，３Ｂ及び３Ｃは、透過型電子顕微鏡で観察されたＡｒｅｎｉｃｏｌａ ｍａｒｉｎａのヘモグロビンを示す。
図３Ａ：Ａｒｅｎｉｃｏｌａ ｍａｒｉｎａの細胞外ヘモグロビンを含有する溶液の全体図。
【図３Ｂ】
図３Ａ，３Ｂ及び３Ｃは、透過型電子顕微鏡で観察されたＡｒｅｎｉｃｏｌａ ｍａｒｉｎａのヘモグロビンを示す。
図３Ｂ：分子の正面図。
【図３Ｃ】
図３Ａ，３Ｂ及び３Ｃは、透過型電子顕微鏡で観察されたＡｒｅｎｉｃｏｌａ ｍａｒｉｎａのヘモグロビンを示す。
図３Ｃ：プロフィール図。
【図４】
以下の実施例に記載されたように、Ａｒｅｎｉｃｏｌａの１〜２ｇ／％のヘモグロビンを輸血された５匹のマウスの群の体重の、１７週間を超えるモニタリング。
ｘ軸は週数に相当し、ｙ軸は体重に相当する。白丸のついた曲線は対照マウスに、黒丸のついたものはマウス番号１に、白三角のついたものはマウス番号２に、黒三角のついたものはマウス番号３に、そして白四角のついたものはマウス番号４に相当する。
血液の交換後であっても、マウスは成長を続け、対照マウスはこれらの動物が良好な状態にあることを証明している。
９週間後、２匹のマウスにＡｒｅｎｉｃｏｌａ ｍａｒｉｎａ由来のヘモグロビンを再輸血する。ここでも、障害は全く観察されず、免疫原性又はアレルギー反応の欠如が証明される。
【図４】
2004501118.tif 000007
【国際公開パンフレット】
2004501118.tif 000008
2004501118.tif 000009
2004501118.tif 000010
2004501118.tif 000011
2004501118.tif 000012
2004501118.tif 000013
2004501118.tif 000014
2004501118.tif 000015
2004501118.tif 000016
2004501118.tif 000017
2004501118.tif 000018
2004501118.tif 000019
2004501118.tif 000020
2004501118.tif 000021
2004501118.tif 000022
2004501118.tif 000023
2004501118.tif 000024
2004501118.tif 000025
2004501118.tif 000026
2004501118.tif 000027
2004501118.tif 000028
2004501118.tif 000029
2004501118.tif 000030
2004501118.tif 000031
2004501118.tif 000032
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004501118.tif 000033
2004501118.tif 000034
【国際調査報告】
2004501118.tif 000035
2004501118.tif 000036
2004501118.tif 000037
2004501118.tif 000038
2004501118.tif 000039
2004501118.tif 000040