(57)【要約】微小規模アフィニティー精製システムは、共通のコンパートメント（１１０，１２０）に始まり、終わる複数の毛管チャンネル（１００）を有する。導入用交差毛管チャンネル（１３０）が上記毛管チャンネル（１００）をその一端の近くで蛇行状（１３６，１３８）に横切って走っており、捕集用チャンネル（１４０）が同様に毛管（１００）と他端の近くで蛇行状（１４８，１５０）に交差している。標的分子を貯槽（１３２）から導入する。それは毛管（１００）内で試料中の所望の強いリガンドに結合する。標的−強いリガンド複合体は毛管（１００）を通って移動し、検出器（１４６）で検出され、捕集用貯槽（１４４）に捕集される。
2004537719.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板；
該基板に形成された長さ方向にのびる複数の毛管チャンネルであって、一端は第一の共通のソースに結合されており、他端は第二の共通のソースに結合されている毛管チャンネル；
該複数の毛管チャンネルに沿って、該第一の共通のソースから該第二の共通のソースへ、または該第二の共通のソースから該第一の共通のソースへ、被検体を移動させる効果をもたらす第一の被検体移動用サブシステム；
該基板に形成され、該第一の共通のソースの近くで該複数の毛管チャンネルを横切ってのびる導入用交差毛管チャンネルであって、該導入用交差毛管チャンネルに全体として蛇行形状を付与するところの該毛管チャンネルの隣接するもの同士を結合する横断部分と該毛管チャンネルの一部と一致する一致部分とからなっている導入用交差毛管チャンネル；
該基板に形成され、該第二の共通のソースの近くで該複数の毛管チャンネルを横切ってのびる捕集用交差毛管チャンネルであって、該捕集用交差毛管チャンネルに全体として蛇行形状を付与するところの該毛管チャンネルの隣接するもの同士を結合する横断部分と該毛管チャンネルの一部と一致する一致部分とからなっている捕集用交差毛管チャンネル；
該導入用交差毛管チャンネルに沿って被検体を移動させる効果をもたらす第二の被検体移動用サブシステム；および
該捕集用交差毛管チャンネルに沿って被検体を移動させる効果をもたらす第三の被検体移動用サブシステム
を具備する微小規模アフィニティー精製システム。
【請求項２】
第一の共通のソースおよび第二の共通のソースが各々、該複数の毛管チャンネルを横切ってのびるソース毛管チャンネルからなる請求項１のシステム。
【請求項３】
該ソース毛管チャンネルの各々がさらに反対側の末端に緩衝液貯槽を具備する請求項２のシステム。
【請求項４】
該第一の被検体移動用サブシステムが、該毛管チャンネルを横切って電位差をもたらす効果のある電気泳動アセンブリーからなる請求項１のシステム。
【請求項５】
該電気泳動アセンブリーが、第一および第二の共通のソースに配置された電極からなる請求項４のシステム。
【請求項６】
該第一の被検体移動用サブシステムが、該複数の毛管チャンネルに真空を付与する効果をもたらす真空ソースからなる請求項１のシステム。
【請求項７】
該第一の被検体移動用サブシステムが、該複数の毛管チャンネルを横切って圧力差を付与する効果をもたらす圧力差ソースからなる請求項１のシステム。
【請求項８】
該第二の被検体移動用サブシステムが、該導入用交差毛管チャンネルを横切って電位差をもたらす効果のある電気泳動アセンブリーからなる請求項１のシステム。
【請求項９】
該電気泳動アセンブリーが、該導入用交差毛管チャンネルの両端に配置された電極を包含する請求項８のシステム。
【請求項１０】
該第二の被検体移動用サブシステムが、該導入用交差毛管チャンネルに真空を付与する効果をもたらす真空ソースからなる請求項１のシステム。
【請求項１１】
該第二の被検体移動用サブシステムが、該導入用交差毛管チャンネルを横切って圧力差を付与する効果をもたらす圧力ソースからなる請求項１のシステム。
【請求項１２】
該導入用交差毛管チャンネルが、一端に第一の貯槽を、他端に第二の貯槽を有する請求項１のシステム。
【請求項１３】
該導入用交差毛管チャンネルの第一および第二の貯槽内に電極が配置されている請求項１２のシステム。
【請求項１４】
該第二の被検体移動用サブシステムが、該捕集用交差毛管チャンネルに沿って標的を移動させる効果をもたらすものである請求項１のシステム。
【請求項１５】
該第三の被検体移動用サブシステムが、該導入用交差毛管チャンネルを横切って電位差をもたらす効果のある電気泳動アセンブリーからなる請求項１のシステム。
【請求項１６】
該電気泳動アセンブリーが、該捕集用交差毛管チャンネルの両端に配置された電極を包含する請求項１５のシステム。
【請求項１７】
該第三の被検体移動用サブシステムが、該捕集用交差毛管チャンネルに真空を付与する効果をもたらす真空ソースからなる請求項１のシステム。
【請求項１８】
該第三の被検体移動用サブシステムが、該捕集用交差毛管チャンネルを横切って圧力差を付与する効果をもたらす圧力ソースからなる請求項１のシステム。
【請求項１９】
該捕集用交差毛管チャンネルが、一端に第一の貯槽を、他端に第二の貯槽を有する請求項１のシステム。
【請求項２０】
捕集用交差毛管チャンネルの該第一および第二の貯槽内に電極が配置されている請求項１のシステム。
【請求項２１】
該第三の被検体移動用サブシステムが、該捕集用交差毛管チャンネルに沿って標的／リガンド複合体を移動させる効果をもたらすものである請求項１のシステム。
【請求項２２】
該基板がさらなる基板によって被覆されている請求項１のシステム。
【請求項２３】
該複数の毛管チャンネル、導入用交差毛管チャンネルおよび捕集用交差毛管チャンネルが、該基板の表面に形成されている請求項１のシステム。
【請求項２４】
該複数の毛管チャンネルが少なくとも２本の毛管チャンネルからなる請求項１のシステム。
【請求項２５】
該複数の毛管チャンネルの各々が、該導入用交差毛管チャンネルと該捕集用交差毛管チャンネルとの間で少なくとも２ｃｍの長さをもつ請求項１のシステム。
【請求項２６】
該電気泳動アセンブリーが、少なくとも０．５ｋＶをもたらす効果のある電源を具備する請求項４、８および１５のシステム。
【請求項２７】
該システムが、捕集用交差毛管チャンネルにおいて、所望の蛋白質／リガンド複合体の存在を検知する効果のある検出要素をさらに具備する請求項１のシステム。
【請求項２８】
該検出要素が、オンラインレーザー誘起蛍光または紫外線検出器からなる請求項２７のシステム。
【請求項２９】
（ａ）請求項１のシステムを準備し；
（ｂ）該第一および第二の共通のソースの一方に天然試料含有緩衝液を加え；
（ｃ）該第一の被検体移動用サブシステムを駆動させて、該複数の毛管チャンネル全体に該緩衝液を充満させ；
（ｄ）該第一の被検体移動用サブシステムの作動を停止し；
（ｅ）該導入用交差毛管チャンネルに標的を添加し；
（ｆ）該第二の被検体移動用サブシステムを駆動させて、該導入用交差毛管チャンネル全体に標的を充満させ；
（ｇ）該第二の被検体移動用サブシステムの作動を停止し；
（ｈ）該第一および第二の共通のソースのいずれかの、（ｂ）で充填されなかった方に、天然試料含有緩衝液を加え；
（ｉ）該第一の被検体移動用サブシステムを駆動させて、該標的を該捕集用交差毛管チャンネルへ向けて移動させ、該標的を該天然試料と結合させ、かかる結合によって標的／リガンド複合体を生ぜしめ；
（ｊ）該標的／リガンド複合体が該捕集用交差毛管チャンネル内に入ったときに該第一の被検体移動用サブシステムの駆動を停止し；
（ｋ）該第三の被検体移動用サブシステムを駆動させて、該標的／リガンド複合体を捕集する、
各工程からなる、天然試料からリガンドを取得する方法。
【請求項３０】
工程（ｄ）がさらに、引続いて該第一および第二の共通のソースの他方に充填することからなる請求項２９の方法。
【請求項３１】
該標的／リガンド複合体を分析する工程をさらに具備する請求項２９の方法。
【請求項３２】
該分析工程が同定を具備する請求項３１の方法。
【請求項３３】
該分析工程が定量を具備する請求項３１の方法。
【請求項３４】
（ａ）請求項１のシステムを準備し；
（ｂ）該第一の被検体移動用サブシステムを駆動させて、該複数の毛管チャンネルに天然試料含有緩衝液を充満させ；
（ｃ）該第二の被検体移動用サブシステムを駆動させて、該導入用交差毛管チャンネルに標的を充満させ；
（ｄ）該第一の被検体移動用サブシステムを駆動させて、該標的を該複数の毛管チャンネルに沿って該捕集用交差毛管チャンネルへ向けて移動させ、該標的を該天然試料と結合させ、かかる結合によって標的／リガンド複合体を生ぜしめ；
（ｅ）該捕集用交差毛管チャンネルにおいて該標的／リガンド複合体の存在を検出し；
（ｆ）該第三の被検体移動用サブシステムを駆動させて、該標的／リガンド複合体を捕集する、
各工程からなる、天然試料からリガンドを取得する方法。
【請求項３５】
基板；
該基板に形成された長さ方向にのびる１本の毛管チャンネルであって、一端は第一の緩衝液ソースに結合されており、他端は第二の緩衝液ソースに結合されている毛管チャンネル；
該毛管チャンネルに沿って、第一の貯槽から第二の貯槽へ、または該第二の貯槽から該第一の貯槽へ、被検体を移動させる効果をもたらす第一の被検体移動用サブシステム；
該基板に形成され、該第一の貯槽の近くで該毛管チャンネルを横切ってのびる導入用交差毛管チャンネルであって、該導入用交差毛管チャンネルの少なくとも一部は該毛管チャンネルの一部と一致する一致部分を包含している導入用交差毛管チャンネル；
該導入用交差毛管チャンネルと被検体を連通させる標的ソース；
該毛管チャンネルと被検体を連通させ、過剰の標的を受容する標的貯槽；
該基板に形成され、該第二の貯槽の近くで該毛管チャンネルを横切ってのびる捕集用交差毛管チャンネルであって、該捕集用交差毛管チャンネルの少なくとも一部は該毛管チャンネルの一部と一致する一致部分からなっている捕集用交差毛管チャンネル；
該捕集用交差毛管チャンネルと被検体を連通させる緩衝液ソース；
該捕集用チャンネルと被検体を連通させ、標的／リガンド複合体を受容する捕集用貯槽；
該導入用交差毛管チャンネルに沿って被検体を移動させる効果のある第二の被検体移動用サブシステム；および
該捕集用交差毛管チャンネルに沿って被検体を移動させる効果のある第三の被検体移動用サブシステム
を具備する微小規模アフィニティー精製システム。
【請求項３６】
該第一、第二および第三の被検体移動用サブシステムが、該毛管チャンネルを通して電位差をもたらす効果のある電気泳動アセンブリーを具備する請求項３５のシステム。
【請求項３７】
該電気泳動アセンブリーが、該毛管チャンネル、導入用交差毛管チャンネルおよび捕集用交差毛管チャンネルのそれぞれの向かい合った両端に配置された電極を具備する請求項３６のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願へのクロスレファレンス］
本出願は、合衆国特許法第１１９条（ｅ）に基づく、２００１年８月３日提出の合衆国仮特許出願第６０／３０９，８１５号、発明の名称「微小規模での流体処理システムにおける天然試料からのリガンドのアフィニティー抽出」の恩恵を受けることを主張するものであり、ここに、その全文を引用して、本明細書に挿入するものである。
【０００２】
［連邦政府により後援を受けた研究または開発に関する陳述］
なし
【０００３】
［発明の背景］
粗製天然抽出物（たとえば、発酵ブロス、植物抽出物、微生物抽出物）から医薬となる可能性のある先導的化合物を単離し、特性を決定することは、複雑で時間のかかる手続きである。このために、医薬品業界の、新規医薬化合物を求めて天然物を追求することへの関心が減少することになっている。一次スクリーニングで可能性のあるヒットないしはリガンドを含有する抽出物が突き止められたならば、さらなる特性決定のための十分なヒット物質の単離という長い、骨の折れる作業が始まる。典型的には、これは、より多くの抽出物のスケールアップ生産（たとえば醗酵または植物生育を通じての）とそれに続くいくつかの煩わしい分画・精製工程を包含することになる。単離プロセスは、液々抽出、固相抽出、向流クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどのいくつかの一連の操作工程を包含しうる。各分画工程で、材料の損失が生じ、かくして、低濃度のヒット化合物は失われてしまうかもしれない。
【０００４】
十分なヒット化合物が最終的に単離され、精製されたのち、それは、典型的には、質量分析（ＭＳ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、紫外（ＵＶ）スペクトル分析などの手法を組合せて用いた構造解析に付される。全体のプロセスには、数週間ないし数か月を要する可能性がある。天然物スクリーニングにおけるさらなる問題は、このプロセスで既知の、興味のない化合物がしばしば再発見されることで、その結果、時間、金銭および資源が途方もなく浪費されることになる。かくして、活性なヒット化合物についてそれをさらに検討する価値があるかどうかを決めるのに十分な情報を迅速に得ることのできる方法をもつことがきわめて望ましい。
【０００５】
微量流体装置および装置の小型化は、生物学的分析手段としてのマイクロチップの使用に呼応して、その開発においてかなりの進展を経験してきた。しかし、微量分析手段は、試験される試料の分析のために異なるタイプの粒子を分離すべく機能するが（すなわち定性的分析作業）、さらなる特性決定のために十分な被検体を抽出・単離するための定量的方法としては機能しない。かくして、ヒット化合物の迅速な単離のための現行の毛管電気泳動およびその他の微小に作られたチップを基本とするシステムの限界の一つは、その後の構造上および分析的検討を実施するのに十分なヒット化合物を取得することにある。
【０００６】
さらなる分析のための十分なヒット化合物を生じさせるだけでなく、医薬品発見の領域における天然物抽出物中のヒット化合物の単離および構造上の特性決定の効率およびプロセスを改善することも有用なことである。
【０００７】
［発明の簡単な要約］
本発明は、その後の特性決定に十分な量のヒット化合物を単離するための微小に作られたアフィニティー精製システムに向けられたものである。本発明の微小規模アフィニティー精製システムは、共通のコンパートメントに始まり、共通のコンパートメントに終り、複合されてアレー（array）をなす複数の毛管チャンネルを包含する。システム内のそれらのチャンネルは、実質的に同じ、最適の断面および長さ寸法をもつ。これらのチャンネルは、一つの共通の検出点に一体化して接続されており、かつ、たとえば毛管電気泳動−質量分析インターフェイスに操作可能に接続されていてもよい一つの共通の捕集チャンネルに接続されている。一面からは、本発明の毛管チャンネルは、一端で、すべてのチャンネルを横切って走る導入用蛇行（serpentine）チャンネルに接続されている。他の一面では、他端において、それらチャンネルは、すべてのチャンネルを横切って走る捕集用蛇行チャンネルにやはり接続されており、捕集用蛇行チャンネルは、一端で緩衝液貯槽に、他端で捕集用貯槽に接続されている。
【０００８】
［発明の詳細な説明］
本発明は、天然試料（ＮＳ）から強いアフィニティーをもつ化合物を抽出するための微小規模アフィニティー精製システムに関するものである。図２を参照すれば、該アフィニティー精製システムは、基板１０２に形成された多数の平行な毛管チャンネル１００を有する（図６および７参照）。基板には、基板の一端、導入端の近くに、導入用交差毛管チャンネル１３０が形成されており、基板の反対側の端部、捕集端の近くには、捕集用交差毛管チャンネル１４０が形成されている。導入用および捕集用交差毛管チャンネルは、以下にさらに述べる蛇行形状をなして、上記多数の平行な毛管チャンネル１００と交差している。
【０００９】
本発明のシステムおよび方法は、天然試料中に存在する強度に結合されるリガンド（ligand）の蛋白質標的によるアフィニティー濃縮の原理を用いる。典型的には、しかし常にそうであるわけではないが、特定の結合強度をもつリガンドは、若干の類似した特性をもっている。「中程度にないしは強く結合する」リガンド（ＭＴＢＬ）および「弱い結合」のリガンドは、「強い結合」のリガンドよりもより速やかな分離速度（ＫＯＦＦ）およびより高い解離定数（ＫＤ）をもち、電気泳動の間に標的帯域に蓄積しない標的／リガンド複合体を形成する。これに対し、強い結合のリガンドは、より低い解離定数およびより遅い分離速度を有し、安定な標的／リガンド複合体を形成し、これらは、電気泳動中、毛管電気泳動の間に検出器を通り過ぎて移動しながら、標的に結合したままであり、標的帯域中に蓄積する。これらのリガンド群の一般的特性を表１にまとめる。
【００１０】
2004537719.tif 000003
【００１１】
複雑な生物材料を含有するあらゆる純粋な、部分的に純粋な、または不純な試料を包含する天然試料が、本発明の方法によって分析されるのに適当な試料であると考えられるが、これらに限定されるものではない。「複雑な生物材料」は、たとえばヒト、他の哺乳動物または農業上のものであれ、生物系において潜在的に有用な化合物を含有しているかもしれない化合物の任意の混合物を包含するものとする。たとえば、可能性としての治療または診断を目的として研究者がきわめて多数の化合物をスクリーニングすることを可能にするべく、コンビナトリアルケミストリーによって大型の化学ライブラリーが頻繁に生み出されている。これらのライブラリーは、本質的には、修飾された生物学的足場物質であってよく、本発明の方法によって有利にスクリーニングすることができる。天然試料の例としてとくに適当なのは、地上および海生植物、ヒトを含む高等動物の細胞、非組換えまたは組換え生物、微生物醗酵ブロス、糸状菌および非糸状菌、原生動物、海藻、古生細菌、ぜん虫、昆虫、海生生物、海綿、珊瑚、甲殻類、ウイルス、ファージ、組織、臓器、血液、土壌、海水、淡水体（たとえば湖、河川）からの水、腐植土、有機堆積物、堆肥、汚泥、および下水の抽出物またはこれらの試料のいずれかについて実施された単離操作に由来する部分的に純粋な画分（たとえばＨＰＬＣ画分）である。
【００１２】
上記天然試料は、環境から採取されたものおよび／または適当な環境条件（生育培地、温度、湿度）下で培養されたものであってもよい。上記採取された試料は、本発明の方法を実施するのに必要な程度にまで単に希釈するだけであることが好ましい。しかし、必要ならば、分析用試料調製のために当業者が使用している標準的操作の任意の組合せによって、上記試料を処理することができる。たとえば、粗製試料を、凍結融解、ホモジナイゼーション、超音波処理、加熱またはマイクロ波抽出による細胞壁破壊などの予備処理に付してもよい。上記試料は、たとえば５０℃で１０分間加熱して、分解性酵素を不活性化することができよう。耐熱性プロテアーゼによる蛋白質性標的の分解を防止するために、非特異的蛋白質を添加してもよい。細胞または培養培地の種々の溶媒、たとえば酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、エタノール、メタノール、エーテルまたは水による抽出を実施し、続いて濾過により粒子状物質および／または高分子量化合物の除去することができる。上記天然試料は、本発明の方法において使用するに先立ち、遠心分離、逐次抽出、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、向流クロマトグラフィーおよび／または他のクロマトグラフィー手法によって分画してもよい。一つの陽性試料の種々の画分を試験して、本発明方法による活性化合物の検出および単離に導く助けとしてもよい。
【００１３】
最後に、上記試料を、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、グッド（Good）の生物緩衝液などの塩類および緩衝液を含有していてもよい運転用緩衝液に加えるのに先立って、水性または非水性溶液中に希釈してもよい。追加の希釈因子が望ましい。
【００１４】
毛管電気泳動（ＣＥ）の高い分解能のため、標的および／またはリガンド／標的複合体が識別可能なＣＥピークを与える限り、標的試料を精製し、または部分的に精製してもよく、精製しなくてさえよい（たとえば、細菌抽出物におけるように）。疾患過程に関係するいかなる分子も、潜在的標的となる。さらに、上記潜在的標的は、特定の状態を診断するのに有用ないかなる分子であってもよい。さらに、他の範疇の標的分子を予想できる。たとえば、農業の領域では、上記標的は、害虫の必須機能を呈する分子であってよいであろう。本発明の方法で使用できる標的分子の例は、蛋白質、核酸、炭水化物、その他の化合物である。治療上の標的分子のいくつかの例を、表２に含めた：
【００１５】
2004537719.tif 000004
【００１６】
適切な分子標的の他の例としては、ＤＮＡまたはＲＮＡ（核酸結合蛋白質、転写因子などの探索に使用）、リボソーム類、細胞膜蛋白質、成長因子類、細胞メッセンジャー類、テロメラーゼ類、エラスチン、毒力因子類、抗体類、レプリカーゼ類、他の蛋白質キナーゼ類、転写因子類、修復酵素類、ストレス蛋白質類、未特定の疾患関連遺伝子類および／またはそれらのＲＮＡおよび蛋白質産物、未特定の疾患関連調節ＤＮＡまたはＲＮＡ配列類、レクチン類、ホルモン類、代謝酵素類、プロテアーゼ類および毒素が挙げられる。この定義は、上に列挙した分子の任意のサブコンポーネント、たとえば蛋白質サブユニット、治療効果のある蛋白質の活性ペプチドドメインおよび小分子の活性領域をも包含する。上記標的分子は、その電気泳動性を改善するために、化学的に、酵素的にまたは組換えによって変性されていてもよく（たとえば、脱グリコシル化）、ＣＥの間のそれの分離および／または検出を容易にするために、蛍光基またはポリイオン付加に付されていてもよい。
【００１７】
上記標的は、毛管電気泳動の間に検出可能であるべきである。たとえば、それは、それの紫外線（ＵＶ）その他の光の吸収性の観測あるいはそれの蛍光性の観測によって検出できればよい。上記標的を、検出可能なタグ（標識）、たとえば蛍光染料または他の染料のタグ、放射性ラベル、化学タグ、その他のマーカーによって標識すればよい。たとえば、蛍光標識された標的は、紫外線吸収検出（典型的にはマイクロモル濃度の検出限界をもつ）により、より好ましくはレーザー誘起蛍光検出（典型的にはピコモルないしはナノモルまでの検出限界をもつ）によって検出できる。蛍光タグの別の利点は、とくに多くのＵＶ吸収性化合物が存在しているかもしれない複雑な試料において付与される選択性である。検出可能なタグの必要性および使用するタイプは、標的分子の本質に依存する。
【００１８】
蛋白質およびペプチド類は、たとえばリシン残基のアミノ標識化またはシステイン残基のスルフヒドリル標識化によって標識すればよい。核酸種およびポリヌクレオチド類は、インビトロ合成反応において標識化ヌクレオチドを挿入することによって標識すればよい。種々の標的の標識化法は、当業界において周知である。
【００１９】
所望により、本発明の方法を実施するに先立ち、修飾した標的、たとえば蛍光標識した標的がその機能的活性を保持していることを確認してもよい。すなわち、標識化した標的が機能的活性部位を保持していることを、機能的活性標的に結果が依存する利用可能な任意の十分に確立された機能アッセイまたは結合アッセイを用いて確認することができる。
【００２０】
本発明の方法において、装置のすべてのチャンネルがまず、捕集すべきヒット化合物とともに選ばれたＮＳを含有する操作用緩衝液によって満たされる。異なる時点での単一チャンネル中におけるプロセスを図示している図１を参照すると、標的試料が、電気泳動または圧力によって毛管チャンネルに導入される。つぎに、該標的は、ＮＳおよび任意の強いヒットを含有する操作用緩衝液中を通して、導入端から捕集端への方向に、電気泳動される。上記標的は、ＮＳ含有操作用緩衝液中を通って移動しながら、任意の強いヒットに結合する。標的試料の近く、蛋白質帯域中では、標的蛋白質の濃度が、ヒット化合物の濃度よりも大きいのが普通である（たとえば、標的蛋白質５μＭ、強いヒット１ｎＭ）。かくして、標的の少しの部分だけが、移動の間の任意の特定の時点で、強いヒットに結合する。標的蛋白質の濃度が過剰であることが、平衡を複合体形成へと押しやる。蛋白質帯域が移動を続けるにつれて、残存する遊離または未結合標的蛋白質が、緩衝液中の強いヒットの新しい部分に暴露される。その結果、電気泳動的移動が進行するにつれて、さらなる蛋白質／強いヒット複合体が生じる。これらの多重事象の結果、前記の標的蛋白質を含有する電気泳動帯域中で強いヒットが濃縮され、かくして、前記標的によってＮＳからアフィニティー抽出される（図１）。捕集端近くでは、捕集用交差毛管チャンネルの近くの適当な検出器によって、標的／ヒット複合体の存在が検出され、ひとたび上記標的が捕集用蛇行交差毛管チャンネル内にくると、上記毛管チャンネルに沿っての電気泳動を停止する。標的／ヒット複合体は、上記捕集用交差毛管チャンネルを介して回収される。
【００２１】
弱いヒットが同じＮＳ中に存在したとしても、それは、電気泳動操作の間に上記標的蛋白質によって濃縮されることがない。いずれの弱いヒット／蛋白質複合体も、該弱いヒットの速やかなキネティックス（離脱速度）のゆえに、解離してしまう。強いヒットの濃縮効果は、容器内での平衡条件下で行われる結合と比較して、弱いヒット存在下での結合についての強いヒットのよりよい競合性を可能ならしめもする。
【００２２】
上記微小規模アフィニティー精製装置の毛管チャンネルは、一つの検出点および一つの捕集点をもつことができ、後者においては、さらなる分析、たとえばオンラインＣＥ−ＭＳまたはオフライン質量分析、アフィニティーＣＥ実験、液体クロマトグラフィー／質量分析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、生物学的アッセイ、生化学的アッセイのために、強いヒット／標的複合体が捕集される。標識検出装置は、毛管チャンネルのうちの任意のものに沿って配置できる。電気泳動を終了したときに蛋白質帯域が上記捕集チャンネル内にあることが確信できるよう、上記検出装置は、本発明の捕集チャンネルの近くにあることが好ましい。多重チャンネルアフィニティー精製システムを用いれば、試料操作の容易さと多数の電気泳動チャンネルからの強いヒットの一つの捕集点への濃縮が可能になる。
【００２３】
上記の操作は、結果として、本発明の微小規模アフィニティー精製システムを用いての天然試料からの強いヒットの単離ということになる。上記強いヒットは、電気泳動帯域内で標的によって濃縮されるよう、上記標的に対して高い親和性（たとえばＫｄ＜１００ｎＭ）をもっていなければならない。
【００２４】
図６−７Ｄを参照すると、上記基板１０２に、上記複数のマイクロチャンネル１００が任意の適当な方法で形成されなければならない。上記基板は、珪素（珪素ウェイファーなど）、ポリシリコン、硼珪酸ガラス、石英、重合体材料（有機または無機）、ポリメチルメチルアクリレート（ＰＭＭＣ）、ポリデメチルシロキサン（ＰＤＭＳ），ポリカーボネートなどの、ただしこれらに限定されるものではない非導電性材料からなるものである。本発明のチャンネルはすべて、微小製作手法、たとえばフォトリソグラフィーおよび湿式化学エッチングあるいは他の微小電気化学系技術（たとえば乾式エッチング、レーザーアブレーション、射出成形、エンボシング、スタンピング）を用いて作成できる。上記チャンネルは、電気浸透流を減少させ、毛管チャンネルおよび交差毛管チャンネルの壁への被検体の吸着を防止するために、親水性重合体によって被覆されていてもよい。
【００２５】
一般的に言って、本発明の微小規模アフィニティー精製システムの構造は、当業者ならばその真価を認めることであろう異なる外形および寸法を有していてよい。たとえば、上記毛管チャンネルは異なる配置、デザインを有していてよい。しかし、その寸法は、過剰な電圧が電気泳動アッセイに悪影響を及ぼさないようなものでなければならない。電気泳動では、たとえば電圧は、約０．５〜３０キロボルトの範囲内にあるべきである。以下は、操作上の構造条件をもたらす寸法の例である。毛管チャンネル基板１０２の厚みは、１〜２ｍｍである。毛管チャンネル１００は、好ましくは平行に配列され、等しい断面積および長さをもつ。上記長さは、１０〜１００ｃｍにわたっていてよく、深さは１０〜１００μｍであってよく、幅は５０〜２００μｍであってよい。一つの好適な具体化例では、上記マイクロチャンネルは、２０ｃｍの長さ、６０μｍの深さおよび１２０μｍの幅をもち、毛管チャンネルの体積として１．４４μＬに適応できる。本発明の微小規模アフィニティー精製システムにおける毛管チャンネル１００の数は、２〜３００チャンネル以上、好ましくは極大で２００チャンネルであってよい。毛管チャンネルの数は、全体としての微小流体装置の寸法に依存する。毛管チャンネル１００は、総体積１００〜２０００μＬに、好ましくは５００μＬに相当する。毛管チャンネル１００間の間隔は、２０〜２００μｍである。
【００２６】
共通の交差毛管チャンネル１１０が、最初の一端に、毛管チャンネル１００と被検体との連通のために設けられ、共通の交差毛管チャンネル１２０が、第二の末端に、毛管チャンネル１００と被検体との連通のために設けられている。本発明に従った被検体は、たとえば天然試料、標的蛋白質、ヒット化合物、またはリガンドを含む任意の分子であってよい。共通交差毛管チャンネル１１０および１２０の両端には、操作用緩衝液の毛管チャンネル１００への充填を容易にするために、かつ可能な電極配置のために、第一および第二の入口貯槽１１２、１１４、１２２および１２４が設けられている。これに代えて、貯槽１１２，１１４、１２２および１２４の任意の一つまたは二つを用いて、すべての毛管チャンネルに充填するようにしてもよい。本発明を実施するためには、たとえば、貯槽１１２、１１４および共通の交差毛管チャンネル１１０を緩衝液で満たす。緩衝液が毛管１００を満たすと、つぎに貯槽１２２、１２４および共通の交差毛管チャンネル１２０が緩衝液で満たされうる。
【００２７】
上記共通の交差毛管チャンネル１１０および１２０は、毛管チャンネル１００を通じて操作用緩衝液を均一に分布する入口を提供する。貯槽中に残留している操作用緩衝液は、所望により、たとえば真空または圧力によって除去してもよい。上記共通の交差毛管チャンネル１１０および１２０およびそれらの対応する貯槽は、総体積で０．５〜２ｍｌ、好ましくは０．５ｍｌを収容する。各々の共通毛管チャンネル１１０および１２０につき、毛管チャンネルの深さは、１０〜１００μｍ、好ましくは６０μｍであってよい；共通交差毛管チャンネル１１０および１２０の幅は０．５〜２ｍｍ、好ましくは１ｍｍであってよい；上記共通の交差毛管チャンネル１１０および１２０の長さは、１０〜４０ｃｍ、好ましくは２０ｃｍであってよいが、これは、所望する毛管チャンネルの数に依存する。
【００２８】
上に言及したように、導入用および捕集用交差毛管チャンネル１３０および１４０は、蛇行形状をもつ。上記交差毛管チャンネル１３０および１４０の隣接毛管チャンネル１００間の部分１３６および１４８は、毛管チャンネル１００を横切ってのびている。上記交差毛管チャンネル１３０および１４０の交互部分１３８および１５０は、上記毛管チャンネル１００の部分と一致する。たとえば図６Ｃ、６Ｄ、７Ｂおよび７Ｃ参照。上記導入用および捕集用交差毛管チャンネル１３０および１４０の一致する部分は、十分な体積または量の標的蛋白質が、導入端および捕集端の両者において、各毛管チャンネル１００へ同時に導入されるのを確実にする。導入用交差毛管チャンネル１３０の一致部分１３８の第一の末端は、共通の交差毛管チャンネル１１０から約０．５〜２ｃｍ離れている。捕集用交差毛管チャンネル１４０の一致部分１５０のもっとも近接した末端は、共通の交差毛管チャンネル１２０から約０．５〜２ｃｍ離れている。導入用交差毛管チャンネル１３０と捕集用交差毛管チャンネル１４０との間の長さは、最適な総体積を収容するのに十分であるべきである。これにより、標的／リガンド複合体の適切な蓄積がもたらされる。たとえば、導入用交差毛管チャンネル１３０から捕集用交差毛管チャンネル１４０までの極小長さは、少なくとも約２ｃｍである。しかし、上記毛管チャンネル１００が線状形状である場合には、導入用交差毛管チャンネル１３０から捕集用交差毛管チャンネル１４０までの距離は、極大長さで、１００ｃｍである。当業者ならば、上記長さが１ｍもの長さとなりうる他の形状を使用してもよいことを了解できるであろう。
【００２９】
導入用交差毛管チャンネル１３０は、両端に貯槽１３２および１３４を有する。貯槽１３２は、標的蛋白質の添加を容易にするために使用する。貯槽１３４は、導入用交差毛管チャンネル１３０全体が上記標的によって満たされたのちの残留標的蛋白質流を捕集するために使用する。捕集用交差毛管チャンネル１４０も、両端に、貯槽１４２および１４４を有する。貯槽１４２は、電気泳動用の緩衝液貯槽を提供する。貯槽１４４は、ヒット（リガンド）のさらなる分析および分離のための標的／強いヒット複合体の捕集用貯槽を提供する。
【００３０】
上記交差毛管チャンネル１３０は、標的（蛋白質）導入用蛇行交差毛管チャンネルであり、深さは１０〜１００μｍ、好ましくは６０μｍであることができ、幅は５０〜２００μｍ、好ましくは１２０μｍであることができる。上記導入用交差毛管チャンネル１３０も、一端に導入用貯槽１３２を有する。
【００３１】
同様に、上記共通の毛管チャンネル１２０から約０．５〜２ｃｍ離れたところに、捕集用の蛇行した交差毛管チャンネル１４０があり、上記交差毛管チャンネルの一端に捕集用貯槽１４４を、他端に緩衝液貯槽１４２をもつ。上記蛇行捕集用交差毛管チャンネル１４０は、１０〜１００μｍの範囲の、好ましくは６０μｍの深さ、および５０〜２００μｍの範囲の、好ましくは１２０μｍの幅をもつことができる。
【００３２】
図６〜６Ｄに詳細に示したように、貯槽１１２および１１４をもつ上記共通の毛管チャンネル１１０は、上記毛管チャンネル１００と共通して描かれている（図６Ｂではより詳細に示されている）。上記導入用交差毛管チャンネル１３０の蛇行形状の拡大図（図６Ｃ）が、捕集用交差毛管チャンネル１４０の蛇行形状のそれ（図６Ｄ）と比較して上記毛管チャンネル１００と一致する水平蛇行距離がより短いことを詳細に示している。上記導入用および捕集用交差毛管チャンネルの一致部分の長さは同じであってもよいが、電気泳動の間の上記標的の拡散のゆえに、捕集用交差毛管チャンネル１４０における一致部分が導入用交差毛管チャンネル１３０における一致部分よりも長いことが好ましい。より長い距離は、拡散された標的／リガンド複合体の捕集のための適切な蓄積を可能にするであろう。
【００３３】
図８および９に示したように、上記毛管チャンネル基板の上方には、被覆またはシーリング基板３００が配置される。この基板は、囲い込まれたマイクロチャンネルをシールする。上記被覆基板３００は、非導電性のシリコーンエラストマーまたは他の透明プラスチック重合体からなっていてよい。しかしながら、本発明の多重毛管装置が基板への穿孔によって製造される場合には、被覆基板は必要ではない。
【００３４】
本発明の微小規模アフィニティー精製システムは、５°〜４５℃の温度範囲で、好ましくは２０℃で使用できる。
【００３５】
上記微小規模アフィニティー精製システムの電気泳動操作のためには、種々の電極を、図４に示したように、しかるべく配置すればよい。当該技術において慣用的に使用されている電極は、たとえば白金線からなっていてよい。貯槽１１２、１１４、１２２および１２４内に配置されている電極を通じて、マイクロチャンネル１００にわたって電位差が加えられる。貯槽１３２および１３４内に配置された電極は、導入用交差毛管チャンネル１３０にわたって電位差を印加する。貯槽１４２および１４４内に配置された電極は、捕集用交差毛管チャンネル１４０にわたって電位差をもたらす。チャンネル（負または陽に荷電された）の表面性状に応じて、流出液の移動が適切な方向をとるように適切な貯槽により大きい電圧を印加しなければならない。マイクロチャンネルの長さおよび所望する移動速度および圧力に応じて、それの操作のために必要な電圧低下は、数十ボルトから数千ボルトまで変化してよい（たとえば０．５ｋＶ／ｃｍ）。
【００３６】
操作に当たっては、貯槽１１２、１１４、１２２および１２４の二つのうちの一方に、緩衝液または溶媒を導入して、すべての毛管チャンネル１００およびチャンネル１１０または１２０のいずれかが天然試料（ＮＳ）含有緩衝液によって満たされるようにすることによって、本発明の微小規模アフィニティー精製システムを作動させる。操作用緩衝液中のＮＳ濃度は、０．０１〜２ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１ｍｇ／ｍｌであってよい。そのとき、上記毛管チャンネル１００は、毛管作用、１〜２分間の真空、または圧力差によって満たされる。
【００３７】
いったん全ＮＳ緩衝液が上記マイクロチャンネル１００に満たされると、貯槽１３２に十分量の標的（蛋白質）が加えられる。蛋白質濃度は、０．１〜５０μＭの範囲内、好ましくは５μＭである。標的の導入用蛇行交差毛管チャンネル１３０から毛管チャンネル１００への望ましくない移行は、共通の毛管チャンネル１１０および１２０からすべての緩衝液を除去するかまたは共通の毛管チャンネル１１０および１２０への電流の流れを阻止するために非導電性物質を添加することによって防止できる。上記標的を貯槽１３２に添加後、導入用交差毛管チャンネル１３０に沿って、電気泳動が開始され、導入用交差毛管チャンネル１３０が上記標的によって満たされるに至る。圧力または真空の適用によって、上記緩衝液および天然試料構成成分は、上記毛管チャンネルの一致部分へと押しやられる。上記標的の電気泳動的導入を用いるとき、上記チャンネル１３０中に緩衝液および無電荷中性物質成分が残留するかもしれない。上記標的の電気泳動的導入を用いるとき、導入用交差毛管チャンネル１３０と捕集用交差毛管チャンネル１４０との間の毛管チャンネル１００に沿っての電場勾配を排除するために、上記捕集用交差毛管チャンネル１４０に沿って電圧を印加する必要があるかもしれない。これにより、いかなる標的をも、上記標的のローディングの間に、導入用交差毛管チャンネル１３０の一致部分１３８から上記毛管チャンネル１００の隣接部分へ移動することを防止することもできる。また、１３０または１４０の機械的分離も、上記被覆基板がＰＤＭＳなどの適当な弾性をもつ材料で作られておれば、それを用いての物理的圧力によって達成できる。
【００３８】
毛管チャンネル１００に沿って電気泳動を適用し、上記標的を上記検出点１４６まで移動させることができる。適用できる検出法の例としては、レーザー誘起蛍光（ＬＩＦ）および紫外（ＵＶ）光検出が挙げられるが、これらに限定されるものではない。検出器１４６を用いて求められるように、標的帯域が捕集用蛇行交差毛管チャンネルに到達すると、毛管チャンネル１００に沿っての電気泳動を停止し、捕集用交差毛管チャンネル１４０に沿っての電気泳動をつぎに開始する。そのとき、上記標的および標的／強いヒット複合体は捕集用貯槽１４４中へ移行する。ここでも、標的注入の場合と同様に、圧力または真空を用いることができる。
【００３９】
さらに図５に示すように、上記標的／強いヒット複合体が捕集用貯槽１４４中へ移行したのち、いくつかの可能な方法、たとえばオンライン毛管電気泳動−質量分析（ＣＥ−ＭＳ）インターフェイス１４８またはオフライン質量分析１５０によって、さらなる分析を実施してもよい。その他のものとしては、アフィニティーＣＥ実験が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらなる分析としては、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）−ＭＳ分析が挙げられ、そこでは、上記の強いヒットが逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムにおいて標的から分離され、質量分析計を用いてオンラインで同定される。Ｃ１８ＨＰＬＣカラムおよび酸性化移動相の使用は、ＨＰＬＣ分離の間の複合体解離を助長するであろう。別法としては、上記標的／強いヒット複合体をマルチチャンネル装置とオンライン接続されたまたはオフライン様式で使用するＣＥ−ＭＳによって分析する。この場合には、標的／強いヒット複合体は、捕集用貯槽１４４に集められた上記天然試料の成分由来のあらゆるバックグラウンドから分離されるであろう。ＣＥ−ＭＳインターフェイスにおいてしばしば使用され、有機溶媒（たとえば５０％メタノール）および有機酸（たとえば１％酢酸）からなる液体シース（鞘）１５２は、複合体解離および質量分析による強いヒットの同定を助けるであろう。
【００４０】
別のアプローチでは、限外濾過装置を使用することができる。上記標的および標的／強いヒット複合体をマルチチャンネル装置で集め、有機溶媒と有機酸とからなる溶液と混合して、複合体の解離を誘起させる。つぎに、反応混合物を、低分子量カットオフフィルター（たとえば３０００Ｄａ）の限外濾過装置の表面に導入する。解離した分子量の小さい強いヒットは当該膜を通過し、高分子量の（たとえば＞３０００Ｄａ）の標的から分離される。精製された強いヒットは、つぎに、分子量同定のための質量分析および抽出された化合物の効力を求めるための他の二次的アッセイに使用する。
【００４１】
適当な一具体化例においては、本発明の微小規模アフィニティー精製システムは、容量が２８８μＬ（毛管チャンネル１本当り１．４４μＬ）で、寸法が６０μｍ（深さ）×１２０μｍ（幅）×２０ｃｍ（長さ）の２００本の毛管チャンネルからなっていてよい。すべての貯槽に操作用緩衝液（ＲＢ）中１ｍｇ／ｍＬの天然試料（ＮＳ）を加える。操作用緩衝液チャンネルを横切って電気泳動を行い、上記緩衝液をすべてのチャンネルに満たすようにする。上記貯槽中に残留緩衝液があれば除去し、電圧はもはや印加しない。５マイクロモル濃度の標的を導入用貯槽に加え、そこへは、導入用交差毛管チャンネルにわたって電圧を印加し、導入用蛇行交差毛管チャンネル１３０を上記標的で満たす。上記アッセイにおけるＮＳは約１ｍｇ／ｍＬであってよく、上記アッセイにおけるヒット化合物（リガンド）は約１０ｎｇ／ｍＬであってよい。各チャンネルに導入される標的の体積は約１０ｎＬであり、これは、本発明のアフィニティー精製システムにおいて約１０−５マイクロモルの標的（３０ｋＤａの標的に基づいて）を含有することができる。この場合、濃縮可能な強いヒット／標的複合体の極大量は１０−５マイクロモルである（化学量論的に１対１の結合を仮定し、標的の全量がヒットに結合したとして）。これは、上記捕集用貯槽１４４において１０μＬの体積で捕集される約５ｎｇのヒット物質（ＭＷ：５００Ｄａと仮定して）に相当する。これは、約０．５μｇ／ｍＬあるいは０．５μＭのヒット濃度という結果となり、これは、質量分析による同定を含めていくつかのタイプの後続試験に十分であろう。
【００４２】
別の具体化態様として、図３に示すように、単一毛管チャンネル装置を説明する。長さ方向にのびた単一の毛管チャンネル２００が、基板２０１に設けられている。第一の緩衝液ソース（source）２０２が、上記チャンネルの一端へ被検体を接続するために設けられている。第二の緩衝液ソース２０４が、上記チャンネルの他端に被検体を接続するために設けられている。上記チャンネルの両端に貯槽２０６および２０８が、それぞれソース２０２および２０４からの緩衝液を受入れるべく設けられている。貯槽２０６および２０８は、たとえば電気泳動のための電極をも含んでいてよい。上記基板に形成され、貯槽２０６の近くの毛管チャンネル２００と交差してのびる導入用交差毛管チャンネル２１４の一端に配置された標的貯槽２１２と被検体との連通のために標的ソース２１０が設けられている。上記導入用交差毛管チャンネル２１４の少なくとも一部は、上記毛管チャンネル２００と一致する一致部分２１６をもつ。上記導入用交差毛管チャンネル２１４の他端には、過剰の標的を受容するための第二の標的貯槽２１８も配置されている。
【００４３】
上記貯槽２０８の近くには、上記毛管チャンネル２００を横切ってのびる捕集用交差毛管チャンネル２２４も上記基板に形成されている。緩衝液ソース２２０が、緩衝液貯槽２２２と被検体との連通のために設けられている。上記緩衝液貯槽２２２は、上記捕集用交差毛管チャンネル２２４の一端に配置されている。上記捕集用交差毛管チャンネルの少なくとも一部は、上記毛管チャンネル２００の一部と一致する一致部分を含んでいる。上記捕集用交差毛管チャンネル２２４の他端には、標的／リガンド複合体を受容するための捕集用貯槽２２８が設けられている。
【００４４】
上記毛管チャンネル２００、導入用交差毛管チャンネル２１４および捕集用交差毛管チャンネル２２４の各々は、上記チャンネルに沿って被検体を移動させるように働く被検体移動システムを包含している。上記被検体移動システムは、それらのチャンネルに沿って電位差をもたらす電気泳動システムであってよい。上記単一チャンネル装置の操作は、多重毛管装置について上で説明したものと実質的に同じである。
【００４５】
本発明を好ましい具体化態様について説明してきたが、当業者ならば、上記の明細書を読んだあとは、本明細書記載の構成および方法について種々の変更、均等物置換およびその他の改変を行うことができるであろう。従って、本発明に対する特許証により付与される保護の範囲は添付の特許請求の範囲に含まれる定義およびその相当語句によってのみ限定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
本発明の他の特徴および利点は、添付の図面を組合せて参照しながらの下記の好ましい実施態様および請求の範囲から明らかになるであろう。図面中、
【図１】標的、ヒットおよび標的／ヒット複合体の電気泳動的移動を示す。
【図２】本発明の微小規模アフィニティー精製システムの概要図を示す。
【図３】本発明の単一チャンネル微小規模アフィニティー精製システムを示す。
【図４】電源からの電極の配置を示す。
【図５】標的／強力ヒット複合体についての分析システムの一例を包含する本発明の微小規模アフィニティー精製システムの概要図を示す。
【図６】微小規模アフィニティー精製システムの上面図である。
【図６Ａ】図６のアフィニティー精製システムの捕集端の細部Ａの部分上面図である。
【図６Ｂ】図６のアフィニティー精製システムの導入端の細部Ｂの部分上面図である。
【図６Ｃ】導入用交差毛管チャンネルの一部の部分上面図である。
【図６Ｄ】捕集用交差毛管チャンネルの一部の部分上面図である。
【図７Ａ】アフィニティー精製システムの等角投影図である。
【図７Ｂ】図７Ａのアフィニティー精製システムの導入用交差毛管チャンネルの細部Ｆの部分等角投影図である。
【図７Ｃ】図７Ａの導入用交差毛管チャンネルの一部Ｅの部分等角投影図である。
【図７Ｄ】図７Ａのアフィニティー精製システムの捕集端の部分等角投影図である。
【図８】本発明の微小規模アフィニティー精製システムの等角投影図であって、カバー基板を示している。
【図９】組立てられた本発明の微小規模アフィニティー精製システムの等角投影図である。
【図１】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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