(57)【要約】本発明は、Ｎ−アルキルグリシントリマー（Ｉ）［式中、Ｒ１は、２−（２，４−ジクロロフェニル）エチル、３−メチル−ブチル、２−（メチルカルボニルアミン）エチル、２−（Ｎ−イミダゾリル）エチルまたは３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン）プロピル；Ｒ２は、２−（２，４−ジクロロフェニル）エチル、２−（４−メトキシフェニル）エチル、３，３−ジフェニルプロピルまたは３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン）プロピル；そしてＲ３は、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピル、３，３−ジフェニルプロピルまたは２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチルである］に関する。該トリマーは、外因性の化学物質により、熱刺激によりまたは炎症メディエーター、例えば侵害受容器ＶＲ１およびグルタミン酸イオンチャネル型受容体、により活性化されるイオンチャネルを遮断することが可能であり、これら受容体の活性が介在する障害の処置に有用である。2004511491.tif 000009（Ｉ）
2004511491.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外因性の化学物質の適用により、または熱刺激により、または炎症を起こした組織による化学物質の内因的な遊離により誘発された疼痛感に関与する一次感覚ニューロンの神経活性の減弱のための医薬の製造における、一般式（Ｉ）
【化１】
2004511491.tif 000004
（Ｉ）
［式中、
Ｒ１は、２−（２，４−ジクロロフェニル）エチル、３−メチル−ブチル、２−（メチルカルボニルアミン）エチル、２−（Ｎ−イミダゾリル）エチルおよび３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン）プロピルから選択され；
Ｒ２は、２−（２，４−ジクロロフェニル）エチル、２−（４−メトキシフェニル）エチル、３，３−ジフェニルプロピルおよび３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン）プロピルから選択され；そして
Ｒ３は、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピル、３，３−ジフェニルプロピルおよび２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチルから選択される］
で示されるＮ−アルキルグリシントリマー、その立体異性体およびそれらのラセミまたは非ラセミ混合物並びにそれらの製薬的に許容し得る塩の使用。
【請求項２】
疼痛感につながる、外因性の化学物質により、熱刺激により、または炎症メディエーターにより活性化されたイオンチャネルを阻害する医薬の製造における、一般式（Ｉ）
【化２】
2004511491.tif 000005
（Ｉ）
［式中、
Ｒ１は、２−（２，４−ジクロロフェニル）エチル、３−メチル−ブチル、２−（メチルカルボニルアミン）エチル、２−（Ｎ−イミダゾリル）エチルおよび３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン）プロピルから選択され；
Ｒ２は、２−（２，４−ジクロロフェニル）エチル、２−（４−メトキシフェニル）エチル、３，３−ジフェニルプロピルおよび３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン）プロピルから選択され；そして
Ｒ３は、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピル、３，３−ジフェニルプロピルおよび２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチルから選択される］
で示されるＮ−アルキルグリシントリマー、その立体異性体およびそれらのラセミまたは非ラセミ混合物並びにそれらの製薬的に許容し得る塩の使用。
【請求項３】
ＶＲ１侵害受容器イオンチャネルおよびＬ−グルタミン酸イオンチャネル型受容体、好ましくはＮＭＤＡ型、の活性が介在する病気および障害、例えば有害な刺激に応答する疼痛感、の処置のための医薬の製造における、一般式（Ｉ）
【化３】
2004511491.tif 000006
（Ｉ）
［式中、
Ｒ１は、２−（２，４−ジクロロフェニル）エチル、３−メチル−ブチル、２−（メチルカルボニルアミン）エチル、２−（Ｎ−イミダゾリル）エチルおよび３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン）プロピルから選択され；
Ｒ２は、２−（２，４−ジクロロフェニル）エチル、２−（４−メトキシフェニル）エチル、３，３−ジフェニルプロピルおよび３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン）プロピルから選択され；そして
Ｒ３は、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピル、３，３−ジフェニルプロピルおよび２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチルから選択される］
で示されるＮ−アルキルグリシントリマー、その立体異性体およびそれらのラセミまたは非ラセミ混合物並びにそれらの製薬的に許容し得る塩の使用。
【請求項４】
疼痛の処置のための医薬の製造のための、請求項３に記載のＮ−アルキルグリシントリマーの使用。
【請求項５】
熱性痛覚過敏または熱感の処置のための医薬の製造のための、請求項３に記載のＮ−アルキルグリシントリマーの使用。
【請求項６】
神経障害性疼痛および神経障害性炎症の処置のための医薬の製造のための、請求項３に記載のＮ−アルキルグリシントリマーの使用。
【請求項７】
治療上有効な量の上記請求項のいずれかに記載のＮ−アルキルグリシントリマーの少なくとも１つ、および少なくとも１つの製薬的に許容し得る賦形剤を含有する医薬組成物。
【請求項８】
美容上有効な量の少なくとも１つの一般式（Ｉ）
【化４】
2004511491.tif 000007
（Ｉ）
［式中、
Ｒ１は、２−（２，４−ジクロロフェニル）エチル、３−メチル−ブチル、２−（メチルカルボニルアミン）エチル、２−（Ｎ−イミダゾリル）エチルおよび３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン）プロピルから選択され；
Ｒ２は、２−（２，４−ジクロロフェニル）エチル、２−（４−メトキシフェニル）エチル、３，３−ジフェニルプロピルおよび３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン）プロピルから選択され；そして
Ｒ３は、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピル、３，３−ジフェニルプロピルおよび２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチルから選択される］
で示されるＮ−アルキルグリシントリマー、その立体異性体およびそれらのラセミまたは非ラセミ混合物並びにそれらの製薬的に許容し得る塩と、少なくとも１つの美容的に許容し得る賦形剤とを含有する、請求項１、２および５に記載の皮膚用美容組成物。
【請求項９】
アフター・サン・プロダクト、アフター・シェーブ・プロダクトおよび脱毛後製品から選択される、皮膚のトリートメントおよびスキンケアのための請求項８に記載の皮膚用美容組成物。
【請求項１０】
熱的、機械的または化学的な刺激または熱性知覚過敏によって生じる皮膚の痛みまたは炎症を、沈静化、減少、減弱または軽減するのに有用な皮膚用美容組成物の製造における、請求項１、２および５に記載の、一般式（Ｉ）
【化５】
2004511491.tif 000008
（Ｉ）
［式中、
Ｒ１は、２−（２，４−ジクロロフェニル）エチル、３−メチル−ブチル、２−（メチルカルボニルアミン）エチル、２−（Ｎ−イミダゾリル）エチルおよび３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン）プロピルから選択され；
Ｒ２は、２−（２，４−ジクロロフェニル）エチル、２−（４−メトキシフェニル）エチル、３，３−ジフェニルプロピルおよび３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン）プロピルから選択され；そして
Ｒ３は、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピル、３，３−ジフェニルプロピルおよび２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチルから選択される］
で示されるＮ−アルキルグリシントリマー、その立体異性体およびそれらのラセミまたは非ラセミ混合物並びにそれらの製薬的に許容し得る塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の範囲
本発明は、化学物質または熱刺激またはニューロン受容体炎症メディエーター、例えばＶＲ１侵害受容器 および／またはイオンチャンネル型Ｌ−グルタミン酸 レセプターに対する応答を遮断することが可能なＮ−アルキルグリシントリマー、それを含有する組成物および該レセプターの活性が介在する病気または障害の処置におけるそれらの利用に関する。
【０００２】
発明の背景
痛みは、深刻な社会的および経済的問題となっている。計算では、１日に２００万人を超える人々が、一時的または慢性的な痛みを感じることにより活動能力が奪われている。端的な例としては、癌、片頭痛、関節炎、火傷を患っている人、および事故に遭った人や外科手術を受けた人が経験する痛みが挙げられる。問題の深刻さにもかかわらず、その症状や進行と戦う、阻止するおよび／または減少させる薬理学的手段は、ある程度は、それが作用する具体的な治療標的が欠けているために意外にも限られている。
【０００３】
痛みの感覚は、侵害受容器ニューロンとして知られる、感覚ニューロン群の末梢の末端が、化学的、機械的または熱的な性質の有害な刺激によって活性化されたときに始まる （１，２） ［ＢＩＢＬＩＯＧＲＡＰＨＹの項を参照］。侵害受容器ニューロンは、組織の損傷に関して、脊髄および脳における疼痛感覚を処理する中枢へ情報を伝達する。生物学的な疼痛伝達のメカニズムは詳細には明らかになっていないが、最近、カプサイシンで活性化された膜受容体 （このことから「ＶＲ１ 侵害受容器」と表示される）のクローニングおよびキャラクタリゼーションについて記載され、この受容体が疼痛経路に直接関与していた （３−５）。ＶＲ１侵害受容器は感覚ニューロンにおいて特異的に発現し、化学的および熱的性質の有害な刺激に対する応答を媒介する（３、４、６）。この侵害受容器は、リガンドで活性化されたイオンチャンネルであり、高いカルシウム透過性を有する点で特徴づけられる（５，７）。ＶＲ１侵害受容器の高いカルシウム透過性は、例えば、慢性的な疼痛状態において、侵害受容器 ニューロンの持続的な活性化によって観察される神経変性と矛盾しない （１、５、６）。したがって、 末梢の疼痛の伝達および知覚を減少させるための手段は、特異的で強力なアンタゴニストを開発することにより、侵害受容器の化学的応答に関与するイオンチャネルを抑制することである。
【０００４】
ＶＲ１侵害受容器に加えて、疼痛伝達におけるＬ−グルタミン酸興奮性神経伝達物質の関与に関して記載もされている（８−１０）。グルタミン酸は、イオンチャネル活性を有する膜受容体（イオンチャンネル型レセプター）またはＧタンパク質を会してシグナルを伝達する膜受容体（代謝共役型受容体）を活性化する （１１）。イオンチャンネル型グルタミン酸レセプターは、Ｃａ２＋イオン透過性のためにグルタミン酸作動性侵害受容に関与していた（１０、１１）。提唱された分子のメカニズムは、高くて慢性のグルタミン酸レベルが、イオンチャンネル型レセプターの持続的な活性化 （過剰活性化） を引き起こし、これが大規模な活性化と過剰な細胞内カスケードの引きがねとなり、疼痛伝達につながることを示している （２、８）。実際、これら受容体のアンタゴニストは、痛覚消失をもたらすことが可能である（１２−１７）。詳述されたことから、痛覚を阻止または減少させるための手段は、特に、侵害受容器ニューロンに存在するようなグルタミン酸イオンチャンネル型レセプターの機能的な活性を抑制することであると推測できる。
【０００５】
したがって、ＶＲ１侵害受容器およびＬ−グルタミン酸 イオンチャンネル型レセプターは、末梢の疼痛を効果的に抑制するのに重要な治療標的であると考えられる。
【０００６】
過去２、３年に進歩があったにもかかわらず、強力で、選択的で毒性のないニューロン受容体インヒビターまだ開発されていない。これまで、中枢神経系のオピオイド受容体を認識するオピオイドの開発ににかなりの努力が強いられてきた（１、２）。これらの分子は、強力な鎮痛剤であるが、例えば、耐性（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）認識異常などの重大な二次的作用を示し、その臨床的使用が制限される（１７、１８）。また、グルタミン酸および／またはグリシン競争的および非競争的アンタゴニストの開発にも重要な努力がなされてきた ［ＮＭＤＡ型のグルタミン酸 （Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸）の活性化に関与する共アゴニスト］。これらのインヒビターは、効果的で強力で疼痛感覚を緩和することが分かっているが、先ほど記載したように、二次的作用を示すために臨床的使用が制限される（１０）。競争的および非競争的アンタゴニストを使用することの主な欠点は、これらの分子がその受容体と相互作用して神経伝達を非選択的に阻害し、グルタミン酸の病理学的活性とその生理学的活性の両方に影響を及ぼすということである（１３）。この治療上の障害を克服するための方策は、アゴニスト−受容体複合体に優先的に参加する非競争的および／または反競争的（ａｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）アンタゴニストを使用することであろう。このタイプのアンタゴニストを用いることの最も重要な利点は、これらの作用物質が、主に、過剰に活性化された受容体（病的な受容体）に対して作用し、急速な興奮性神経伝達過程において機能する受容体（生理学的受容体）に対しては最低限の相互作用を示すということである（１０）。「病的な」受容体に対する、この好ましい活性は、これらのタイプのアンタゴニストを疼痛の伝達を阻止するための有望な治療物質として価値あるものにする （１０−１６）。フェンサイクリジン（ｐｈｅｎｃｙｃｌｉｄｉｎｅ）およびジゾルシピン（ｄｉｚｏｌｃｉｐｉｎｅ）等の分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで有効な神経保護物質として作用するＮＭＤＡ受容体の強力な反競争的アンタゴニストである（１０、１４−１６）。しかしながら、それらの臨床的使用は、心理的模擬（ｐｓｙｃｏｔｏｍｉｍｅｔｉｃ）効果により疑問である（１０）。
【０００７】
発明の要旨
本発明は、上記に示された欠点を全面的にまたは部分的に克服する、末梢の疼痛を減少または処置することが可能な、新しい神経保護化合物を探索するという問題を解決するものである。
【０００８】
本発明によって提供される解決手段は、外因的な化学物質、熱刺激または炎症メディエーター、例えばＶＲ１侵害受容器およびＬ−グルタミン酸イオンチャネル型受容体、により活性化されたイオンチャネルを遮断することが可能で、該受容体の活性が介在する障害を処置するのに有用である、Ｎ−アルキルグリシントリマーの開発に基づくものである。
【０００９】
ＶＲ１侵害受容器およびＮＭＤＡ型Ｌ−グルタミン酸イオン共役型受容体を遮断するこのＮ−アルキルグリシントリマーの能力は、実施例１．２に記載された試験によって明らかとなり、それらの鎮痛活性は実施例１．３に記載された試験によって証明された。
【００１０】
従って、本発明の目的は、化学物質、熱刺激または侵害受容器およびＬ−グルタミン酸イオン共役型受容体炎症メディエーターに対する応答を遮断することが可能で、該受容体のイオンチャネルを遮断することが可能なＮ−アルキルグリシントリマーによって構成される。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、少なくとも１つの該Ｎ−アルキルグリシントリマーを含有する組成物、例えば医薬組成物または美容組成物によって構成される。
【００１２】
該受容体の活性が介在する障害の処置のための医薬の製造における該Ｎ−アルキルグリシントリマーの利用は、本発明のさらに別の目的を構成する。
【００１３】
本発明の詳細な記載
本発明は、一般式（Ｉ）
【化６】
2004511491.tif 000003
（Ｉ）
［式中、
Ｒ１は、２−（２，４−ジクロロフェニル）エチル、３−メチル−ブチル、２−（メチルカルボニルアミン）エチル、２−（Ｎ−イミダゾリル）エチルおよび３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン）プロピルから選択され；
Ｒ２は、２−（２，４−ジクロロフェニル）エチル、２−（４−メトキシフェニル）エチル、３，３−ジフェニルプロピルおよび３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン）プロピルから選択され；そして
Ｒ３は、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピル、３，３−ジフェニルプロピルおよび２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチルから選択される］
で示されるＮ−アルキルグリシントリマー、その立体異性体およびそれらのラセミまたは非ラセミ混合物並びにそれらの製薬的に許容し得る塩を提供する。
【００１４】
式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーには、１またはそれ以上のキラル中心を有するものが存在する。従って、前記の式（Ｉ）の化合物は、それらの立体異性体（エナンチオマーまたはジアステレオマ異性体）のいずれかで、またはそのラセミまたは非ラセミ体の混合物として存在し得、それらはすべて本発明の範囲内に含まれる。キラル中心を含む式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーの具体例としては、２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル［（Ｒ，Ｓ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル、（Ｒ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチルまたは（Ｓ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］を含むものが挙げられる。
【００１５】
さらに別の具体的な態様において、本発明は、該化合物のバイオアベイラビリティーの増大および血液脳関門（ｈｅｍａｔｏｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ ｂａｒｒｉｅｒ）および上皮組織通過の容易性を目的とした可逆的な修飾をさらに含むＮ−アルキルグリシントリマーを提供する。
【００１６】
本発明により提供される、式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーの実例は、表１にまとめられる（実施例１．１）。
【００１７】
本発明の範囲内には、本発明により提供される式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーの製薬的に許容し得る塩が含まれる。用語「製薬的に許容し得る塩」には、金属塩の形成に通常用いられる塩、または付加的な酸との塩が含まれる。塩の性質は、その塩が製薬的に許容し得る限り重要ではない。式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーの製薬的に許容し得る塩は、有機または無機の酸から得ることができる。この塩は、適当な酸を式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーと反応させて当業者に周知の慣用的な方法により得ることができる。
【００１８】
式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーは、例えば、該トリマーの構成要素を構築するグリシン誘導体の間での縮合およびアミド化反応などの、慣用的な技術により得ることができる。同様に、グリシン誘導体は慣用的なアミノ酸修飾法により得ることができる。式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーは、対応するエナンチオマーまたは原料となる産物のラセミまたは非ラセミ混合物から合成することができる。エナンチオマー混合物から分離する場合、得られる立体異性体は、慣用的な立体異性体分割法（エナンチオマーおよびジアステレオマー）、例えば、分画結晶化、クロマトグラフィーまたは塩形成など、によって分離することができる。
【００１９】
様々な試験によって、式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーはＶＲ１侵害受容器およびＬ−グルタミン酸 イオンチャンネル型レセプター、ＮＭＤＡ型受容体の特徴的なイオンチャネル活性を遮断することが可能であることが明らかに証明された。さらに、試験した式 （Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーは、カプサイシンリガンドの競争的アンタゴニストとして振舞うことが確認された。
【００２０】
Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ 卵細胞において発現したＶＲ１侵害受容器イオンチャネルを遮断する、並びに、Ｘ． ｌａｅｖｉｓにおいて発現したＬ−グルタミン酸 イオンチャンネル型レセプター，特にＮＭＤＡ型受容体のイオンチャネルを遮断する式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーの能力は、このニューロン受容体を発現するＸ． ｌａｅｖｉｓ 卵細胞においてアゴニストによって活性化されたイオン電流を遮断する該Ｎ−アルキルグリシントリマーの効率（ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）および効力（ｐｏｗｅｒ）を評価する試験によって測定することができる（実施例１．２参照）。これら生物学的試験は、機能的に活性な受容体におけるアンタゴニストの探索が可能であり、そのｉｎ ｖｉｖｏでの使用の効力が増大する点で有利である。
【００２１】
鎮痛の有効性を評価する式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーの能力は、Ｂｅｌｍｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ． （６）に詳細に記載されているような、麻酔したネコの角膜を刺激する侵害受容器感覚ニューロン線維の電子生理学的応答に対するこのＮ−アルキルグリシントリマーの効果を測定することからなる試験によって実証することができる。簡潔に言えば、１つの単一の求心性線維の単位が電気刺激によって局在化および同定されるまで細かい神経の切片で角膜を刺激する毛様体神経の解剖から構成される。単離した線維を、受容体領域の部位および拡大部分の測定、伝導速度の測定、カプサイシンに対する化学的感受性、熱感受性および機械的感受性の閾値の調査を含む電気生理学的実験に付す。これらすべてのパラメータを決定し、求心性神経の感覚線維を電気生理学的に特徴付けたら、ＶＲ１侵害受容器の種々のアンタゴニストによるそれらの調節を試験する（実施例１．３参照）。
【００２２】
疼痛経路の統合におけるＶＲ１侵害受容器の中心的役割を考えると、式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーの作用による該受容体の遮断活性の結果、新しい鎮痛剤のファミリーの開発が可能である。さらに、得られた結果は、式 （Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーが、それらの結果が明らかにしたＶＲ１侵害受容器の遮断効力から、新世代の鎮痛剤を構成する確固たる候補であることを示していると考えられる。
【００２３】
式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーは、ＶＲ１ 侵害受容器イオンチャネルおよびＬ−グルタミン酸 イオンチャンネル型レセプター自体の遮断薬として有用であり、それゆえに該Ｎ−アルキルグリシントリマーがＶＲ１侵害受容器イオンチャネルおよび／またはＬ−グルタミン酸 イオンチャンネル型レセプター、特にＮＭＤＡ型受容体の活性または機能が介在する病気または病理学的障害、例えば有害な刺激（機械的、化学的および熱的な）に応答する疼痛感覚、の処置に適している。
【００２４】
式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーは、哺乳動物、好ましくはヒト、の体に適用するための様々な種類の組成物の一部を構成することができる。この意味において、本発明は、少なくとも１つの式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーを含有する組成物を提供する。具体的な態様では、この組成物は医薬組成物であり、さらに別の具体的な態様では該組成物は美容組成物である。
【００２５】
本発明により提供される医薬組成物は、治療上有効量の少なくとも１つの式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーを、少なくとも１つの製薬的に許容し得る賦形剤とともに含有する。
【００２６】
式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーは、該Ｎ−アルキルグリシントリマーと哺乳動物、好ましくはヒト、の体における作用部位との接触を誘導する任意の手段によって投与することができる。
【００２７】
投与しなければならない式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーの治療上有効な量、並びに式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーまたは本発明の医薬組成物により病理学的状態を処置するためのその用量は、年齢、患者の状態、病気または障害の重篤度、投与の経路および頻度、および使用される具体的な式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーを含む、多くの要因に依存する。
【００２８】
本発明によって提供される医薬組成物は、任意の投与形態、例えば、固体、液体であってよく、任意の適当な方法、例えば、経口、非経口、直腸または局所的に投与することができ、そのために所望の投与形態の製剤化に必要な製薬的に許容し得る賦形剤を含む。医薬の投与のための種々の剤型の変更および、その剤型の入手のために必要な賦形剤の変更は、例えば、“Ｔｒｅａｔｙ ｏｆ Ｇａｌｅｎｉｃ Ｐｈａｒｍａｃｙ”、Ｃ．Ｆａｕｌｉ ｉ Ｔｒｉｌｌｏ、１９９３、Ｌｕｚａｎ ５、Ｓ．Ａ． Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓ、Ｍａｄｒｉｄに記載されている。
【００２９】
従って、本発明の更なる目的は、外因性の化学物質の適用により、または熱刺激により、または炎症を起こした組織による化学物質の内因的な遊離により誘発された疼痛感に関与する一次感覚ニューロンの神経活性の減弱のための医薬の製造、または疼痛感につながる外因性の化学物質により、または熱刺激により、または炎症メディエーターにより活性化されたイオンチャネルを阻害する医薬の製造において、式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーを利用することによって構成される。
【００３０】
より具体的には、ＶＲ１侵害受容器イオンチャネルおよびＬ−グルタミン酸イオンチャネル型受容体、好ましくはＮＭＤＡ型、の活性が介在する病気および障害、例えば有害な刺激に応答する疼痛感、の処置のための医薬の製造における、式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーの使用に関する。
【００３１】
本発明は、さらに、侵害受容器イオンチャネルの活性が介在する病理学的な病気および障害、例えば機械的、化学的および熱的な様々な有害刺激に応答してＶＲ１侵害受容器およびＬ−グルタミン酸イオンチャネル型受容体により媒介される疼痛感を有する患者の処置のための方法であって、該病理学的病気または障害を患っている患者に治療上有効な量の式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーを、好ましくはその化合物を含有する医薬組成物の形態で投与することを含む、方法を提供する。
【００３２】
本発明によって提供される美容組成物は、美容上有効な量の、少なくとも１つの式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーを、少なくとも１つの美容上許容し得る賦形剤または助剤と共に含有する。
【００３３】
式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーは、例えば日光にさらされた後の、熱刺激；機械的な刺激、例えば脱毛、剃毛；または若干侵襲的な化学物質によってもたらされる皮膚の痛みまたは炎症を、沈静化、減少、減弱または軽減するために美容組成物において投与することができる。本発明の美容組成物は、Ｎ−アルキルグリシントリマーとその化合物が適用される哺乳動物の体におけるその化合物の作用部位との接触を可能する任意の形態で提供され得る。
【００３４】
投与する式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーの量は、熱的、機械的または化学的な刺激によってもたらされる疼痛または炎症の程度および使用するＮ−アルキルグリシントリマーなどの多くの要因に依存する。
【００３５】
本発明によって提供される美容組成物は、任意の投与剤型、例えば，固体または液体など、で提供され、任意の投与経路、好ましくは局所、で投与してもよく、そのための美容組成物の提示の形態に適当な美容上許容し得る賦形剤または助剤を含有してもよい。具体的な態様では、本発明によって提供される美容組成物は、日光にさらされることによる日焼けによって生じる症状の沈静化、減少、減弱または軽減に適当なアフター・サン・プロダクト（ａｆｔｅｒ−ｓｕｎ ｐｒｏｄｕｃｔ）、例えばクリーム、軟膏、エマルションまたは「アフター・サン」ローションである。別の具体的な態様では、本発明によって提供される美容組成物は、機械的な刺激（剃毛）によって生じる皮膚の疼痛の沈静化、減少、減弱または軽減に適当なアフター・シェーブ・プロダクト、 例えば，クリーム、アフター・シェーブ・バルサム、エマルションまたはローションである。別の具体的な態様では、本発明によって提供される美容組成物は、脱毛によって生じる皮膚の疼痛または炎症の沈静化、減少、減弱または軽減に適当な脱毛後製品である。美容組成物の提示の様々な形態の変更およびそれらの獲得に必要な賦形剤および助剤は、例えば“Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ−ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｃｏｓｍｅｔｏｌｏｇｙ”、Ｐｒｏｆ． Ａ． Ｄｅｌ Ｐｏｚｏ、ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｔｈｅＧｅｎｅｒａｌ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｂｏａｒｄ、３ｒｄ Ｉｓｓｕｅ、１９８５に記載されている。
【００３６】
結果として、本発明の更なる目的は、熱的な、機械的な、または化学的な刺激によって生じる皮膚の疼痛または炎症の沈静化、減少、減弱または軽減に適当な美容組成物の製造における、式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーの使用によって構成される。
【００３７】
本発明はさらに、哺乳動物、好ましくはヒトにおける、熱的な、機械的な、または化学的な刺激によって生じる皮膚の疼痛または炎症を沈静化、減少、減弱または軽減するのための美容方法であって、該哺乳動物に有効量の式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーを、好ましくはそれを含有する美容組成物の形態で投与することを含む美容方法に関する。
【００３８】
一方、生物活性分子の同定に必須の要件は、治療標的に対する生物学的活性の測定が可能な試験を実施するということである。本発明者によって、ＶＲ１侵害受容器およびＬ−グルタミン酸イオンチャネル型受容体などのニューロン受容体を発現するＸ．ｌａｅｖｉｓｏ 卵細胞において、アゴニストにより活性化されたイオン電流を遮断する分子の効力を評価することが可能な生物学的試験が開発された（１９，２０）。この生物学的試験の重要な利点は、機能的に活性な受容体におけるアンタゴニストの探索が可能であり、ｉｎ ｖｉｖｏでのその使用の効力が増大するということである。
【００３９】
受容体ヘテロローガス発現法は、Ｆｅｒｒｅｒ−Ｍｏｎｔｉｅｌ ａｎｄ Ｍｏｎｔａｌ（１９）に詳細に記載されている。
【００４０】
したがって、本発明はさらに、単離された分子と同様、様々な、化学的に多様な化学物質ライブラリーをスクリーニングするための高性能スクリーニングとして適当なＶＲ１侵害受容器およびグルタミン酸作動性受容体のアンタゴニストを同定するための試験を提供する。
【００４１】
本試験は、ＶＲ１侵害受容器またはグルタミン酸作動性レセプターを発現するＸ． ｌａｅｖｉｓ 卵細胞と、該ＶＲ１ 侵害受容器に対するアゴニスト （リガンド）、例えば、カプサイシンまたはＬ−グルタミン酸、との、試験化合物の存在下または非存在下での接触を含んでなり、膜間電圧を−８０ｍＶに維持し、アゴニストにより活性化されたイオン電流を試験化合物の存在下および非存在下で測定することにより該化合物の阻害活性を検出する。試験化合物の阻害活性の効力および効率は、用量応答曲線を入手することにより決定することができる。このため、試験化合物の増大する濃度の存在下で、受容体を発現するＸ． ｌａｅｖｉｓ卵細胞アゴニストによって活性化されたイオン電流遮断の程度を試験する。該化合物の存在下および非存在下でのイオン電流の強さの比率によって用量応答曲線の入手が可能である（１９，２０）。これらのグラフは、最大遮断（効力）と最大遮断の半分を生じるアンタゴニスト濃度（ＩＣ５０効率）を決定するための対数関数を満たしている。
【００４２】
以下の実施例は本発明の本質を説明するものであり、限定的に解釈されるべきではない。実施例１．１は、式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーのいくつかの合成を記載し、実施例１．２および実施例１．３は、これら化合物の生物学的活性および鎮痛活性を説明するものである。
【００４３】
実施例１
Ｎ−アルキルグリシントリマー
１．１ Ｎ−アルキルグリシントリマーの合成
表１に示されるＮ−アルキルグリシントリマーは、固相ペプチド合成の慣用的方法によって合成した（２１）。トリマーは、高分解能液体クロマトグラフィーによって精製した。
表１
式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマー
［１］：［Ｎ−［（Ｒ，Ｓ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−（４−メトキシフェネチル）グリシル］−Ｎ−（３−メチルブチル）グリシンアミド；
［１ａ］：［Ｎ−［（Ｒ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−（４−メトキシフェネチル）グリシル］−Ｎ−（３−メチルブチル）グリシンアミド；
［１ｂ］：［Ｎ−［（Ｓ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−（４−メトキシフェネチル）グリシル］−Ｎ−（３−メチルブチル）グリシンアミド
［２］：［Ｎ−［（Ｒ，Ｓ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−（４−メトキシフェネチル）グリシル］−Ｎ−（２，４−ジクロロフェネチル）グリシンアミド；
［２ａ］：［Ｎ−［（Ｒ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−（４−メトキシフェネチル）グリシル］−Ｎ−（２，４−ジクロロフェネチル）グリシンアミド
［２ｂ］：［Ｎ−［（Ｓ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−（４−メトキシフェネチル）グリシル］−Ｎ−（２，４−ジクロロフェネチル）グリシンアミド
［３］：［Ｎ−［（Ｒ，Ｓ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−（２，４−ジクロロフェネチル）グリシル］−Ｎ−（３−メチルブチル）グリシンアミド；
［３ａ］：［Ｎ−［（Ｒ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−（２，４−ジクロロフェネチル）グリシル］−Ｎ−（３−メチルブチル）グリシンアミド；
［３ｂ］：［Ｎ−［（Ｓ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−（２，４−ジクロロフェネチル）グリシル］−Ｎ−（３−メチルブチル）グリシンアミド；
［４］：［Ｎ−［（Ｒ，Ｓ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−（２，４−ジクロロフェネチル）グリシル］−Ｎ−（２，４−ジクロロフェネチル）グリシンアミド．
［４ａ］：［Ｎ−［（Ｒ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−（２，４−ジクロロフェネチル）グリシル］−Ｎ−（２，４−ジクロロフェネチル）グリシンアミド；
［４ｂ］：［Ｎ−［（Ｓ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−（２，４−ジクロロフェネチル）グリシル］−Ｎ−（２，４−ジクロロフェネチル）グリシンアミド；
［５］：［Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン）プロピル］グリシル］−［Ｎ−（４−メトキシフェネチル）グリシル］−Ｎ−（３−メチルブチル）グリシンアミド；
［６］：［Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン）プロピル］グリシル］−［Ｎ−（４−メトキシフェネチル）グリシル］−Ｎ−（２，４−ジクロロフェネチル）グリシンアミド；
［７］：［Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン）プロピル］グリシル］−［Ｎ−（２，４−ジクロロフェネチル）グリシル］−Ｎ−（３−メチルブチル）グリシンアミド；
［８］：［Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン）プロピル］グリシル］−［Ｎ−（２，４−ジクロロフェネチル）グリシル］−Ｎ−（２，４−ジクロロフェネチル）グリシンアミド；
［９］：［Ｎ−［３，３−ジフェニルプロピル）グリシル］−｀Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン）プロピル］グリシル］−［Ｎ−（２−メチルカルボニルアミン）エチル］−Ｎ−（２，４−ジクロロフェネチル）グリシンアミド；
［１０］：［Ｎ−（３，３−ジフェニルプロピル）グリシル］−［Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン）プロピル］グリシル］−［Ｎ−［２−（２−ピリジル）エチル］グリシンアミド；
［１１］：［Ｎ−（３，３−ジフェニルプロピル）グリシル］−［Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン）プロピル］グリシル］−［Ｎ−［２−（Ｎ−イミダゾリル）エチル］グリシンアミド；
［１２］［Ｎ−（３，３−ジフェニルプロピル）グリシル］−［Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン）プロピル］グリシル］−［Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン）プロピル］グリシンアミド；
［１３］：［Ｎ−（３，３−ジフェニルプロピル）グリシル］−［Ｎ−（３，３−ジフェニルプロピル）グリシル］−Ｎ−［２−（メチルカルボニルアミン）エチル］グリシンアミド；
［１４］：［Ｎ−（３，３−ジフェニルプロピル）グリシル］−［Ｎ−［３，３−ジフェニルプロピル）グリシル］−Ｎ−［２−（２−ピリジル）エチル］グリシンアミド；
［１５］：［Ｎ−（３，３−ジフェニルプロピル）グリシル］−［Ｎ−［３，３−ジフェニルプロピル）グリシル］−Ｎ−［２−（Ｎ−イミダゾリル）エチル］グリシンアミド；
［１６］：［Ｎ−（３，３−ジフェニルプロピル）グリシル］−［Ｎ−［３，３−ジフェニルプロピル）グリシル］−Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン）プロピル］グリシンアミド；
［１７］：［Ｎ−［（Ｒ，Ｓ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン）プロピル］グリシル］−Ｎ−［２−（メチルカルボニルアミン）エチル］グリシンアミド；
［１７ａ］：　［Ｎ−［（Ｒ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン）プロピル］グリシル］−Ｎ−［２−（メチルカルボニルアミン）エチル］グリシンアミド；
［１７ｂ］：　［Ｎ−［（Ｓ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン）プロピル］グリシル］−Ｎ−［２−（メチルカルボニルアミン）エチル］グリシンアミド；
［１８］：［Ｎ−［（Ｒ，Ｓ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン）プロピル］グリシル］−Ｎ−［２−（２−ピリジル）エチル］グリシンアミド；
［１８ａ］：　［Ｎ−［（Ｒ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン）プロピル］グリシル］−Ｎ−［２−（２−ピリジル）エチル］グリシンアミド；
［１８ｂ］：　［Ｎ−［（Ｓ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン）プロピル］グリシル］−Ｎ−［２−（２−ピリジル）エチル］グリシンアミド；
［１９］：［Ｎ−［（Ｒ，Ｓ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン）プロピル］グリシル］−Ｎ−［２−（Ｎ−イミダゾリル）エチル］グリシンアミド；
［１９ａ］：　［Ｎ−［（Ｒ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン）プロピル］グリシル］−Ｎ−［２−（Ｎ−イミダゾリル）エチル］グリシンアミド；
［１９ｂ］：　［Ｎ−［（Ｓ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン）プロピル］グリシル］−Ｎ−［２−（Ｎ−イミダゾリル）エチル］グリシンアミド；
［２０］：［Ｎ−［（Ｒ，Ｓ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン）プロピル］グリシル］−Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン）プロピル］グリシンアミド；
［２０ａ］：　［Ｎ−［（Ｒ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン）プロピル］グリシル］−Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン）プロピル］グリシンアミド；
［２０ｂ］：　［Ｎ−［（Ｓ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン）プロピル］グリシル］−Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン）プロピル］グリシンアミド；
［２１］：［Ｎ−［（Ｒ，Ｓ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−（３，３−ジフェニルプロピル）グリシル］−Ｎ−［２−（メチルカルボニルアミン）エチル］グリシルアミド；
［２１ａ］：　［Ｎ−［（Ｒ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−（３，３−ジフェニルプロピル）グリシル］−Ｎ−［２−（メチルカルボニルアミン）エチル］グリシルアミド；
［２１ｂ］：　［Ｎ−［（Ｓ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−（３，３−ジフェニルプロピル）グリシル］−Ｎ−［２−（メチルカルボニルアミン）エチル］グリシルアミド；
［２２］：［Ｎ−［（Ｒ，Ｓ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−（３，３−ジフェニルプロピル）グリシル］−Ｎ−［２−（２−ピリジル）エチル］グリシンアミド；
［２２ａ］：　［Ｎ−［（Ｒ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−（３，３−ジフェニルプロピル）グリシル］−Ｎ−［２−（２−ピリジル）エチル］グリシンアミド；
［２２ｂ］：　［Ｎ−［（Ｓ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−（３，３−ジフェニルプロピル）グリシル］−Ｎ−［２−（２−ピリジル）エチル］グリシンアミド；
［２３］：［Ｎ−［（Ｒ，Ｓ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−（３，３−ジフェニルプロピル）グリシル］−Ｎ−［２−（Ｎ−イミダゾリル）エチル］グリシンアミド；
［２３ａ］：　［Ｎ−［（Ｒ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−（３，３−ジフェニルプロピル）グリシル］−Ｎ−［２−（Ｎ−イミダゾリル）エチル］グリシンアミド；
［２３ｂ］：　［Ｎ−［（Ｓ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−（３，３−ジフェニルプロピル）グリシル］−Ｎ−［２−（Ｎ−イミダゾリル）エチル］グリシンアミド；
［２４］：［Ｎ−［（Ｒ，Ｓ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−（３，３−ジフェニルプロピル）グリシル］−Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン）プロピル）グリシンアミド；
［２４ａ］：　［Ｎ−［（Ｒ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−（３，３−ジフェニルプロピル）グリシル］−Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン）プロピル）グリシンアミド；
［２４ｂ］：　［Ｎ−［（Ｓ）−２−［２−（Ｎ−メチル）ピロリジニル］エチル］グリシル］−［Ｎ−（３，３−ジフェニルプロピル）グリシル］−Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン）プロピル）グリシンアミド；
【００４４】
１．２ 生物学的活性の評価
１．２．１．ＶＲ１侵害受容器の遮断
実施例１で得られたＮ−アルキルグリシントリマーのＶＲ１侵害受容器に対する生物学的活性を評価するために、ＶＲ１侵害受容器を発現したＸ． ｌａｅｖｉｓ 卵細胞においてアゴニストによって活性化されたイオン電流を遮断する該化合物の効率および効力を評価する試験を開発した。
【００４５】
Ｘ．ｌａｅｖｉｓ ｏｖｏｃｉｔｅｓにおける受容体のヘテロローガスな発現は、Ｆｅｒｒｅｒ−Ｍｏｎｔｉｅｌ ａｎｄ Ｍｏｎｔａｌ（１９）に記載の手順にしたがって行うことができる。簡潔には、成体のカエルＸ．ｌａｅｖｉｓ ｏｖｏｃｉｔｅｓを集め、操作してＶＲ１侵害受容器をコードするｃＤＮＡを注入する。カプサイシンアゴニストにより活性化されたイオン電流を、２個の微小電極を用いた定電圧法により記録する（二微小電極電圧固定法）（１９，２０）。ＶＲ１侵害受容器を発現した卵細胞を記録チャンバーに移し、８アウトプット潅流システムを用いて潅流する。カプサイシンを、試験するＮ−アルキルグリシントリマーの非存在下および存在下の両方で、１００μＭのフルフェナム酸を添加したＲｉｎｇｅｒ緩衝液（Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ、ｐＨ７，４、ＮａＣｌ １００ｍＭ、ＢａＣｌ２２，０ｍＭ、ＫＣｌ ３，０ｍＭ）中に溶解する（１９、２０）。この緩衝溶液を用いて、ＶＲ１侵害受容器のイオン電流に対するカルシウムにより活性化された内因性のクロリドイオンチャネルの寄与を最小限にする（１９，２０）。膜間電圧を−８０ｍＶに保ち、イオン電流を、試験するＮ−アルキルグリシントリマーの増大する濃度の存在下または非存在下で、カプサイシン溶液（２０μＭ）のパルスを適用することにより活性化する。阻害活性を、Ｎ−アルキルグリシントリマーの存在下および非存在下でアゴニストにより活性化されたイオン電流を測定することにより検出する。
【００４６】
Ｎ−アルキルグリシントリマーの阻害活性の効力および効率は、用量応答曲線を入手することにより決定する。このため、増大するＮ−アルキルグリシントリマー濃度の存在下で、ＶＲ１侵害受容器を発現する卵細胞においてカプサイシンによって活性化されたイオン電流遮断の程度を試験する。該Ｎ−アルキルグリシントリマーの存在下および非存在下でのイオン電流の強さの比率を用いて、用量応答曲線を入手する（１９，２０）。これらのグラフは、最大遮断（効力）と最大遮断の半分を生じるアンタゴニスト濃度（ＩＣ５０効率）を決定するための対数関数を満たしている。
【００４７】
得られた結果は、試験したＮ−アルキルグリシントリマーのすべてが、Ｘ．ｌａｅｖｉｓカエル卵細胞において発現したＶＲ１侵害受容器に特徴的なイオンチャネル活性を遮断することを示した。２０μＭの濃度のカプサイシンによって活性化されたＶＲ１侵害受容器を半分阻害するＮ−アルキルグリシントリマー濃度（ＩＣ５０）は、化合物［４］として同定されるＮ−アルキルグリシントリマーについては約１μＭであり、化合物［８］として同定されるＮ−アルキルグリシントリマーについては約２μＭであり、化合物［７］として同定されるＮ−アルキルグリシントリマーについては約３０μＭであった。
【００４８】
一方、式（Ｉ）のＮ−アルキルグリシントリマーには、立体異性体として存在するものがあるという事実により、ラセミ混合物のＶＲ１侵害受容器の遮断活性が、その異性体の１つに優先的に対応している可能性について調べた。このため、［４ａ］および［４ｂ］（表１参照）として示されるエナンチオマーのＶＲ１侵害受容器の遮断活性を以前に記載されたプロトコルにしたがって評価し、該エナンチオマーの該ラセミ混合物の遮断活性と比較した。得られた結果は、いずれの場合でも同じであり、両エナンチオマーが、同等なＶＲ１侵害受容器の遮断活性を示すことが示された。
【００４９】
疼痛経路の統合における侵害受容器の役割を考えれば、これらのＮ−アルキルグリシントリマーの遮断活性の結果によりそれらが鎮痛剤として使用されることになる。
【００５０】
１．２．２ ＮＭＤＡ型グルタミン酸作動性 レセプターの遮断
実施例１．１で得られたＮ−アルキルグリシントリマーの、ＮＭＤＡ型グルタミン酸作動性 レセプターに対する生物学的活性を評価するために、ＮＭＤＡ型レセプター、ＶＲ１侵害受容器を発現するＸ． ｌａｅｖｉｓ卵細胞においてアゴニストにより活性化されたイオン電流を遮断する該化合物の効率および効力を評価する試験を行った。
【００５１】
Ｘ． ｌａｅｖｉｓ 卵細胞における受容体のヘテロローガスな発現は、Ｆｅｒｒｅｒ−Ｍｏｎｔｉｅｌ ａｎｄ Ｍｏｎｔａｌ （１９）に記載された手順にしたがって行うことができる。簡潔に言えば、成体のカエルＸ．ｌａｅｖｉｓ ｏｖｏｃｉｔｅｓを集め、操作してＮＭＤＡ受容体のＮＲ１およびＮＲ２ＡサブユニットをコードするｃＲＮＡを注入する（５，２０）。グリシン共アゴニストの存在下でＬ−グルタミン酸アゴニストにより活性化されたイオン電流を、２個の微小電極を用いた定電圧法により記録する（二微小電極電圧固定法）（１９，２０）。受容体を発現した卵細胞を記録チャンバーに移し、８アウトプット潅流システムを用いて潅流する。アゴニストおよび共アゴニストを、試験するＮ−アルキルグリシントリマーの非存在下および存在下の両方で、１００μＭのフルフェナム酸を添加したＲｉｎｇｅｒ緩衝液（Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ、ｐＨ７，４、ＮａＣｌ １００ｍＭ、ＢａＣｌ２２，０ｍＭ、ＫＣｌ ３，０ｍＭ）中に溶解する（２０）。この緩衝溶液を用いて、グルタミン酸作動性受容体イオン電流に対するカルシウムにより活性化されたクロリド内因性イオンチャネルの寄与を最小限にする（１９，２０）。膜間電圧を−８０ｍＶに維持し、イオン電流を、試験するＮ−アルキルグリシントリマーの増大する濃度の存在下または非存在下で、Ｌ−グルタミン酸／グリシン溶液（１００μＭ／２０μＭ）のパルスを適用することにより活性化する。阻害活性を、Ｎ−アルキルグリシントリマーの存在下および非存在下でアゴニストにより活性化されたイオン電流を測定することにより検出する。
【００５２】
Ｎ−アルキルグリシントリマーの阻害活性の効力および効率は、用量応答曲線を入手することにより決定する。このため、Ｎ−アルキルグリシントリマーの増大する濃度の存在下で、ＮＭＤＡ受容体を発現する卵細胞においてＬ−グルタミン酸／グリシンによって活性化されたイオン電流遮断の程度を試験する。該Ｎ−アルキルグリシントリマーの存在下および非存在下でのイオン電流の強さの比率を用いて、用量応答曲線を入手する（１９，２０）。これらのグラフは、最大遮断（効力）と最大遮断の半分を生じるアンタゴニスト濃度（ＩＣ５０効率）を決定するための対数関数を満たしている。
【００５３】
得られた結果は、試験したＮ−アルキルグリシントリマーのすべてが、Ｘ．ｌａｅｖｉｓカエル卵細胞において発現したＮＭＤＡ受容体に特徴的なイオンチャネル活性を遮断することを示した。１００μＭ／２０μＭの濃度のＬ−グルタミン酸／グリシンによって活性化されたＮＭＤＡ受容体応答を半分阻害するＮ−アルキルグリシントリマー濃度（ＩＣ５０）は、試験した種々のＮ−アルキルグリシントリマー（表１）について０．１μＭと１００μＭの間に分布した。このように、例えば、化合物［９］として同定されるＮ−アルキルグリシントリマーのＩＣ５０は、１．０μＭであり、化合物［１０］として同定されるＮ−アルキルグリシントリマーについては、約２μＭであり、化合物［１１］として同定されるＮ−アルキルグリシントリマーについては、約１０μＭであった。
【００５４】
１．３ 鎮痛活性の評価
動物の眼、眼の疼痛モデル （２２）、におけるカプサイシンの局所的適用によって生じた炎症に対する、表１に示したＮ−アルキルグリシントリマーの減弱に対する評価を行った。実験の枠組みには、Ｎ−アルキルグリシントリマーの非存在下および存在下での、マウスの眼に対する０．０１％でのカプサイシンの局所的投与後の引っ掻き回数が含まれる。カプサイシンの投与後、処置した眼をマウスが１分間に引っ掻いた回数を計測する。次に、その引っ掻いた眼を食塩水で十分にすすぎ、適用１５分後に試験化合物を投与する。５分間インキュベーションした後、試験化合物を含有する０．１％ カプサイシン溶液を投与する。１分間にマウスがその眼を引っ掻く回数を直後に計測する。鎮痛能力はカプサイシンの最初の適用後の引っ掻き回数（試験化合物なし）と、刺激物質の２回目の投与後の引っ掻き回数（試験化合物の存在下）とを比較することにより得る。カプサイシンの２回目の適用後の引っ掻き回数の減少は、試験したＮ−アルキルグリシントリマーの鎮痛活性を示す。
【００５５】
化合物 ［４］および［８］として同定されるＮ−アルキルグリシントリマーによって得られた結果は、化合物 ［４］が、カプサイシンによって生じた眼の炎症を約４０％減弱し、化合物 ［８］が約２０％減弱したことを示し、これらの化合物が動物の疼痛モデルにおいて試験した鎮痛活性を有することを確認することが可能である。
【００５６】
参考文献一覧
１． Ｆｉｅｌｄｓ， Ｈ．Ｌ． （１９８７） Ｐａｉｎ （ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ）， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．
２． Ｂａｒａｎａｕｓｋａｓ， Ｇ． ａｎｄ Ｎｉｓｔｒｉ， Ａ． （１９９８） Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｉｎ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ　ｔｈｅ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ： ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ． Ｐｒｏｇ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ５４， ３４９−３６５．
３． Ｌｉｕ， Ｌ． ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ， Ｓ．Ａ． （１９９４） Ａ ｒａｐｉｄ ｃａｐｓａｉｃｉｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｕｒｒｅｎｔ ｉｎ ｒａｔ ｔｒｉｇｅｍｉｎａｌ ｇａｎｇｌｉｏｎ ｎｅｕｒｏｎｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１， ７３８−７４１
４． Ｓｚａｌｌａｓｉ， Ａ． ＆ Ｂｌｕｍｂｅｒｇ， Ｐ．Ｍ． （１９９６） Ｖａｎｉｌｌｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ： ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｅｎｈａｎｃｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ． Ｐａｉｎ ６８， １９５−２０８．
５． Ｃａｔｅｒｉｎａ， Ｍ．Ｊ． Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ， Ｍ．Ａ．， Ｔｏｍｉｎａｇａ， Ｍ．， Ｒｏｓｓｅｎ， Ｔ．Ａ．， Ｌｅｖｉｎｅ， Ｊ．Ｄ． ａｎｄ Ｊｕｌｉｕｓ， Ｄ． （１９９７） Ｔｈｅ ｃａｐｓａｉｃｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ： ａ ｈｅａｔ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｉｎ ｐａｔｈｗａｙ． Ｎａｔｕｒｅ ３８９， ８１６−８２４．
６． Ｂｅｌｍｏｎｔｅ， Ｃ．， Ｇａｌｌａｒ， Ｊ．， Ｐｏｚｏ， Ｍ．Ａ． ａｎｄ Ｒｅｂｏｌｌｏ， Ｉ． （１９９１） Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｂｙ ｉｒｒｉｔａｎｔ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｏｆ ｓｅｎｓｏｒｙ ａｆｆｅｒｅｎｔ ｕｎｉｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｔ’ｓ ｃｏｒｎｅａ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． （Ｌｏｎｄ） ４３７， ７０９−７２５．
７． Ｇａｒｃｉａ−Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄ， Ｊ．， Ｌｏｐｅｚ−Ｂｒｉｏｎｅｓ， Ｌ．Ｇ．，Ｂｅｌｍｏｎｔｅ， Ｃ． ａｎｄ Ｖａｌｄｅｏｌｍｉｌｌｏｓ， Ｍ． （１９９４） Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｒｅｅ ｃａｌｃｉｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｐｒｏｔｏｎｓ ａｎｄ ｃａｐｓａｉｃｉｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｔｒｉｇｅｍｉｎａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ６７， ２３５−２４３．
８． Ｓａｋｕｒａｄａ， Ｔ．， Ｗａｋｏ， Ｋ．， Ｓｕｇｉｙａｍａ， Ａ．， Ｓａｋｕｒａｄａ， Ｃ．， Ｔａｎ−Ｎｏ， Ｋ． ａｎｄ Ｋｉｓａｒａ， Ｋ． （１９９８） Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｐｉｎａｌ ＮＭＤＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｃａｐｓａｉｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｏｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｅｈａｖ． ５９， ３３９−３４５．
９． Ｏｍｏｔｅ， Ｋ．， Ｋａｗａｍａｔａ， Ｔ．， Ｋａｗａｍａｔａ， Ｍ． ａｎｄ Ｎａｍｉｋｉ， Ａ． （１９９８） Ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｋｉｎ ｏｆ ｒａｔ ｈｉｎｄｐａｗ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ７８７， １６１−１６４．
１０． Ｌｉｐｔｏｎ， Ｓ．Ａ． ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ， Ｐ．Ａ． （１９９４）． Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｓ ａ ｆｉｎａｌ ｃｏｍｍｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ． Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３０， ６１３−６２２．
１１． Ｎａｋａｎｉｓｈｉ， Ｓ． ａｎｄ Ｍａｓｕ， Ｍ． （１９９４） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ （１９９４） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｔｒｕｃ． ２３， ３１９−３４８．
１２． Ｚａｈｎ， Ｐ．Ｋ， Ｕｍａｌｉ， Ｅ． ａｎｄ Ｂｒｅａｎｎａｎ， Ｔ．Ｊ． （１９９８） Ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ ｎｏｎ−ＮＭＤＡ ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｉｎｈｉｂｉｔ ｐａｉｎ ｂｅｈａｖｉｏｕｒｓ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｐａｉｎ． Ｐａｉｎ ７４， ２１３−２２３．
１３． Ｎｉｃｏｌｏｄｉ， Ｍ．， Ｄｅｌ Ｂｉａｎｃｏ， Ｐ．Ｌ． ａｎｄ Ｓｉｃｕｔｅｒｉ， Ｆ． （１９９７） Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｐａｔｈｗａｙ： ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｃｈｒｏｎｉｃ ｄａｉｌｙ ｈｅａｄａｃｈｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎａｌｇｅｓｉｃ ｄｒｕｇ ａｂｕｓｅ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｓ． １７， ９７−１００．
１４． Ｗｉｅｓｅｎｆｅｌｄ−Ｈａｌｌｉｎ， Ｚ． （１９９８） Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｏｐｉｏｉｄ−ＮＭＤＡ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ． Ｗｈａｔ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｄｏ ｔｈｅｙ ｏｆｆｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐａｉｎ ｓｙｍｄｒｏｍｅｓ？ Ｄｒｕｇｓ ５５， １−４．
１５． Ｄａｖｉｄｓｏｎ， Ｅ．Ｍ． ａｎｄ Ｃａｒｌｔｏｎ， Ｓ．Ｍ． （１９９８） Ｉｎｔｅｒｐｌａｎａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｘｔｒｏｒｐｈａｎ， ｋｅｔａｍｉｎｅ ｏｒ ｍｅｍａｎｔｉｎｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｅｈａｖｉｏｕｒｓ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ７８５． １３６−１４２．
１６． Ｅｉｓｅｎｂｅｒｆ， Ｅ． ａｎｄ Ｐｕｄ， Ｄ． （１９９８） Ｃａｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ｐａｉｎ ｂｅ ｃｕｒｅｄ ｂｙ ａｃｕｔｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＮＭＤＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ａｍａｎｔａｄｉｎｅ？． Ｐａｉｎ ７４， ３３７−３３９．
１７． Ｋａｒｌｓｔｅｎ， Ｒ． ａｎｄ Ｇｏｒｄｈ， Ｔ． （１９９７） Ｈｏｗ ｄｏ ｄｒｕｇｓ ｒｅｌｉｅｖｅ ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ｐａｉｎ？ Ｄｒｕｇｓ Ａｇｉｎｇ １１， ３９８−４１２．
１８． Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ｐ．， Ｃａｂｅｌｌｏ， Ｐ．， Ｇｅｒｍａｎｙ， Ａ．， Ｎｏｒｒｉｓ， Ｂ． ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ， Ｅ． （１９９７） Ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ， ａｎｄ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｎ ｍｏｒｐｈｉｎｅ ｂｙ， ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３３２， ２５７−２６２．
１９． Ｆｅｒｒｅｒ−Ｍｏｎｔｉｅｌ， Ａ．Ｖ． ａｎｄ Ｍｏｎｔａｌ， Ｍ． （１９９４）． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｌｉｇａｎｄ−ｇａｔｅｄ ｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌｓ： Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｉｎ ｌｉｐｉｄ ｂｉｌａｙｅｒｓ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｘｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ： ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６， ６０−６９．
２０． Ｆｅｒｒｅｒ−Ｍｏｎｔｉｅｌ， Ａ．Ｖ．， Ｓｕｎ， Ｗ． ａｎｄ Ｍｏｎｔａｌ， Ｍ． （１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｔｈｅ ＮＭＤＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｆｏｒ ＰＣＰ ａｎｄ ＭＫ−８０１． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９２， ８０２１−８０２５．
２１． Ｆｉｇｌｉｏｚｚｉ， Ｇ．Ｍ．ｍ， Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ， Ｒ．， Ｎｇ．， Ｓ．Ｃ．， Ｂａｎｖｉｌｌｅ， Ｓ．Ｃ．， Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ， Ｒ．Ｎ． （１９９６） Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｇｌｙｃｉｎｅ ｐｅｐｔｏｉｄ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ． Ｍｅｔｈｏｄ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６７， ４３７−４４７．
２２． Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ｇ．Ｇ．， Ｇａｒｃｉａ ｄｅ ｌａ Ｒｕｂｉａ， Ｐ．， Ｇａｌｌａｒ， Ｊ． ａｎｄ Ｂｅｌｍｏｎｔｅ， Ｃ． （１９９３） Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｐｓａｉｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｃｕｌａｒ ｐａｉｎ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｂｙ ｃａｌｃｉｕｍ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ． Ｉｎｖｅｓｔｉｇ． Ｏｐｈｔａｌｍｏｌ． Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉ． ３４， ３３２９−３３３５．
【国際公開パンフレット】
2004511491.tif 000010
2004511491.tif 000011
2004511491.tif 000012
2004511491.tif 000013
2004511491.tif 000014
2004511491.tif 000015
2004511491.tif 000016
2004511491.tif 000017
2004511491.tif 000018
2004511491.tif 000019
2004511491.tif 000020
2004511491.tif 000021
2004511491.tif 000022
2004511491.tif 000023
2004511491.tif 000024
2004511491.tif 000025
2004511491.tif 000026
2004511491.tif 000027
2004511491.tif 000028
2004511491.tif 000029
2004511491.tif 000030
2004511491.tif 000031
2004511491.tif 000032
2004511491.tif 000033
2004511491.tif 000034
2004511491.tif 000035
2004511491.tif 000036
2004511491.tif 000037
2004511491.tif 000038
2004511491.tif 000039
2004511491.tif 000040
2004511491.tif 000041
2004511491.tif 000042
【国際調査報告】
2004511491.tif 000043
2004511491.tif 000044
2004511491.tif 000045
2004511491.tif 000046
2004511491.tif 000047
2004511491.tif 000048