(57)【要約】本発明は、変異アデノウィルスファイバー蛋白質及び該蛋白質を含むアデノウィルス粒子に関する。更に、本発明は、該蛋白質をコードするポリヌクレオチド及び該ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。本発明は又、該アデノウィルス粒子の作成方法及び使用方法に関する。変異ファイバー蛋白質を有するアデノウィルス粒子はもはやそれらの自然な（元の）細胞受容体には結合しない。ウィルスキャプシドへのリガンドの付加によって、特異的な細胞型に対して「標的化（ｔａｒｇｅｔｅｄ）」され、その結果、このウィルスはそのような細胞に結合し感染することが可能となる。元の受容体に対する結合を破壊するような具体的なファイバー変異が挙げられている。野生型ファイバーを有するウィルス粒子と比較して、或るファイバー蛋白質を有するアデノウィルス粒子は、肝細胞への遺伝子移入及びそこでの発現を増強することが判明した。
2004512015.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ，Ｄ若しくはＥ亜群のアデノウィルスの野生型ファイバー蛋白質又はＦ亜群のアデノウィルスの長い野生型ファイバー蛋白質のＣＤループにおける少なくとも一つのアミノ酸が変異を受け、コクサッキーウィルス−アデノウィルス受容体（ＣＡＲ）への該蛋白質の結合能が減少するか又は実質的に消失している、変異アデノウィルスファイバー蛋白質。
【請求項２】
前記ＣＡＲへの前記蛋白質の結合能を実質的に消失させた、請求項１記載の変異アデノウィルスファイバー蛋白質。
【請求項３】
前記ファイバー蛋白質がアデノウィルス血清型５ファイバー蛋白質である、請求項２記載の変異アデノウィルスファイバー蛋白質。
【請求項４】
前記ファイバー蛋白質が、野生型ファイバー蛋白質のアミノ酸位置４４１又は４４２における少なくとも一つの変異を含む、請求項３記載の変異アデノウィルスファイバー蛋白質。
【請求項５】
前記ファイバー蛋白質が更に、野生型ファイバー蛋白質のアミノ酸位置４０８、４０９、４６０、５０９、５１０、５３８及び５３９における一つ又はそれ以上の変異を含む、請求項４記載の変異アデノウィルスファイバー蛋白質。
【請求項６】
前記ファイバー蛋白質が更に、野生型ファイバー蛋白質のアミノ酸位置４０８及び４０９における少なくとも一つの変異を含む、請求項４記載の変異アデノウィルスファイバー蛋白質。
【請求項７】
野生型ファイバー蛋白質のアミノ酸位置４６０、５０９、５１０、５３８及び５３９における一つ又はそれ以上の変異を含み、その変異によってＣＡＲへの該ファイバー蛋白質の結合能が減少するか又は実質的に消失している、変異アデノウィルス血清型５ファイバー蛋白質。
【請求項８】
請求項１記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項３記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項４記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項５記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項７記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１記載のファイバー蛋白質を含むアデノウィルス粒子。
【請求項１４】
請求項３記載のファイバー蛋白質を含むアデノウィルス粒子。
【請求項１５】
請求項４記載のファイバー蛋白質を含むアデノウィルス粒子。
【請求項１６】
請求項５記載のファイバー蛋白質を含むアデノウィルス粒子。
【請求項１７】
請求項７記載のファイバー蛋白質を含むアデノウィルス粒子。
【請求項１８】
更に前記粒子のキャプシド蛋白質内に含有されたターゲティングリガンドを有する、請求項１３記載のアデノウィルス粒子。
【請求項１９】
前記キャプシド蛋白質が変異アデノウィルスファイバー蛋白質である、請求項１８記載のアデノウィルス粒子。
【請求項２０】
更に少なくとも一つの異種ポリヌクレオチドを有する、請求項１９記載のアデノウィルス粒子。
【請求項２１】
更に前記粒子のキャプシド蛋白質内に含有されたターゲティングリガンドを有する、請求項１４−１７のいずれかに記載のアデノウィルス粒子。
【請求項２２】
前記キャプシド蛋白質が変異アデノウィルスファイバー蛋白質である、請求項２１記載のアデノウィルス粒子。
【請求項２３】
更に少なくとも一つの異種ポリヌクレオチドを有する、請求項２２記載のアデノウィルス粒子。
【請求項２４】
請求項８記載のポリヌクレオチドを含むアデノウィルスパッケージング細胞。
【請求項２５】
請求項１３記載のアデノウィルス粒子の作成方法であって、以下のステップ：
該アデノウィルス粒子内にパッケージされるアデノウィルスゲノムを請求項２４記載のパッケージング細胞内に移入させ；
該パッケージング細胞を培養し；及び、
該細胞によって産生されたアデノウィルス粒子を回収する、を含む前記方法。
【請求項２６】
請求項１８記載のアデノウィルス粒子の作成方法であって、以下のステップ：
該アデノウィルス粒子内にパッケージされるアデノウィルスゲノムを、該ゲノムの複製、成熟及びパッケージングに必要な蛋白質を提供するアデノウィルスポリヌクレオチドを有する細胞内に移入させ；
該パッケージング細胞を該粒子の産生を可能にする条件下で培養し；及び、
該細胞によって産生されたアデノウィルス粒子を回収する、を含む前記方法。
【請求項２７】
細胞に請求項２０記載のアデノウィルス粒子を細胞に感染させることを含む、異種ポリヌクレオチドを該細胞で発現させる方法。
【請求項２８】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記哺乳動物細胞が霊長類細胞である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記霊長類細胞がヒト細胞である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
薬学上許容可能なキャリア中に請求項１８記載のアデノウィルス粒子を含む組成物。
【請求項３２】
薬学上許容可能なキャリア中に請求項２０記載のアデノウィルス粒子を含む組成物。
【請求項３３】
野生型ファイバー蛋白質のアミノ酸位置４０８及び４０９における変異を含む、変異アデノウィルス血清型５ファイバー蛋白質。
【請求項３４】
野生型ファイバー蛋白質のアミノ酸位置４０８及び４０９における欠失を含む、請求項３３記載の変異アデノウィルス血清型５ファイバー蛋白質。
【請求項３５】
野生型ファイバー蛋白質のアミノ酸位置４０８及び４０９における置換を含む、請求項３３記載の変異アデノウィルス血清型５ファイバー蛋白質。
【請求項３６】
位置４０８においてグルタミン酸がセリンと置換され、位置４０９においてアラニンがプロリンと置換されている（配列番号４）、請求項３５記載の変異ファイバー蛋白質。
【請求項３７】
請求項３３−３６記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３８】
請求項３３−３６記載のファイバー蛋白質を含むアデノウィルス粒子。
【請求項３９】
更に前記粒子のキャプシド蛋白質内に含有されたターゲティングリガンドを有する、請求項３８に記載のアデノウィルス粒子。
【請求項４０】
更に少なくとも一つの異種ポリヌクレオチドを有する、請求項３９記載のアデノウィルス粒子。
【請求項４１】
前記粒子のペントン蛋白質の少なくとも一つが修飾されＲＧＤ配列を欠失している、請求項３８記載のアデノウィルス粒子。
【請求項４２】
請求項３７記載のポリヌクレオチド含むアデノウィルスパッケージング細胞。
【請求項４３】
請求項３８記載のアデノウィルス粒子の作成方法であって、以下のステップ：
該アデノウィルス粒子内にパッケージされるアデノウィルスゲノムを請求項４２記載のパッケージング細胞内に移入させ；
該パッケージング細胞を培養し；及び、
該細胞によって産生されたアデノウィルス粒子を回収する、を含む前記方法。
【請求項４４】
請求項３８記載のアデノウィルス粒子の作成方法であって、以下のステップ：
該アデノウィルス粒子内にパッケージされるアデノウィルスゲノムを、該ゲノムの複製、成熟及びパッケージングに必要な蛋白質を提供するアデノウィルスポリヌクレオチドを有する細胞内に移入させ；
該パッケージング細胞を該粒子の産生を可能にする条件下で培養し；及び、
該細胞によって産生されたアデノウィルス粒子を回収する、を含む前記方法。
【請求項４５】
細胞に請求項４０記載のアデノウィルス粒子を細胞に感染させることを含む、異種ポリヌクレオチドを該細胞で発現させる方法。
【請求項４６】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞が霊長類細胞である、請求項４５記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞がヒト細胞である、請求項４５記載の方法。
【請求項４９】
薬学上許容可能なキャリア中に請求項４０記載のアデノウィルス粒子を含む組成物。
【請求項５０】
請求項４０記載のアデノウィルス粒子を肝細胞に投与することを含む、アデノウィルス媒介による肝細胞への遺伝子移入及び肝細胞における遺伝子発現の増強方法。
【請求項５１】
アデノウィルス媒介による肝細胞への遺伝子移入及び肝細胞における遺伝子発現の増強方法であって、以下のステップ：
位置４０８においてグルタミン酸がセリンと置換され、位置４０９においてアラニンがプロリンと置換され、更に異種遺伝子を含んでいる、変異アデノウィルス血清型５ファイバー蛋白質を含むアデノウィルス粒子を調製し；及び
肝細胞に該アデノウィルス粒子を感染させる、ことを含む前記方法。
【請求項５２】
請求項２０又は請求項４０記載のアデノウィルス粒子を哺乳動物に投与し、該粒子が該哺乳動物における細胞に形質導入され、該異種ポリヌクレオチドが該細胞内で蛋白質を発現することを含む、哺乳動物内において該蛋白質を発現させる方法。
【請求項５３】
哺乳動物が霊長類である、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
霊長類がヒトである、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
哺乳動物の肝細胞に請求項４０記載のアデノウィルス粒子を形質導入するのに充分な量の該粒子を投与することを含む、哺乳動物の肝細胞内で蛋白質を発現させる方法。
【請求項５６】
前記充分な量が体重キログラム当たり約１粒子から体重キログラム当たり約１０１３粒子を含む、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
前記充分な量が体重キログラム当たり約１０４粒子から体重キログラム当たり約１０１２粒子を含む、請求項５５記載の方法。
【請求項５８】
前記充分な量が体重キログラム当たり約１０８粒子から体重キログラム当たり約１０１１粒子を含む、請求項５５記載の方法。
【請求項５９】
請求項８−１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むアデノウィルスベクター。
【請求項６０】
請求項３７記載のポリヌクレオチドを含むアデノウィルスベクター。
【請求項６１】
アデノウィルス粒子が条件下複製アデノウィルスである、請求項１３、１８、２０、３８、３９、４０又は４１記載のアデノウィルス粒子。
【請求項６２】
アデノウィルスが癌障害性アデノウィルスである、請求項６１記載のアデノウィルス粒子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく以下の米国仮出願：（１）２０００年６月２日出願の仮出願番号０９／５８５，３４４ であって２０００年１２月２１日に提出された仮出願への変更申請の対象とされたもの、及び（２）２００１年２月２２日出願の仮出願番号６０／２７０，５５５ 、の利益を主張するものである。これら出願の開示内容の全体が本明細書内に引用される。
【０００２】
【従来の技術】
アデノウィルスの広範囲な指向性は、それが有する遺伝子運搬ビークルとしての利点の一つである。しかしながら、多くの理由から、標的化したベクターが望まれる。より少ない投与量によって同程度の所望の治療効果が達成されるように、形質導入効率が増大されたアデノウィルスベクターの毒性は低減されていることが望ましい。このような標的化（ｔａｒｇｅｔｅｄ） ベクターの安全性が増大すれば、癌及び心臓血管疾病にような数多くの兆候に適用できるような全身投与等の新たな運搬経路を可能となるであろう。変異ファイバー蛋白質を有するアデノウィルス粒子は標的化アデノウィルスの調製に有用である。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、変異アデノウィルスファイバー蛋白質及び該蛋白質を含むアデノウィルス粒子に関する。更に、本発明は、該蛋白質をコードするポリヌクレオチド及び該ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。本発明は又、該アデノウィルス粒子の作成方法及び使用方法に関する。変異ファイバー蛋白質を有するアデノウィルス粒子はもはやそれらの自然な（元の）細胞受容体には結合しない。ウィルスキャプシドへのリガンドの付加によって、特異的な細胞型に対して「標的化（ｔａｒｇｅｔｅｄ）」され、その結果、このウィルスはそのような細胞に結合し感染することが可能となる。
【０００４】
本明細書において、「アデノウィルス」又は「アデノウィルス粒子」という用語は、全ての群、ずべての亜群、及び全ての血清型を含み、ヒト又は動物に感染する任意のアデノウィルスを包含し、アデノウィルスとして分類される任意の全てのウィルスを含むものとして使用される。好ましくは、ヒト細胞に感染するアデノウィルスである。このようなアデノウィルスは野生型であるか、又は、当業者公知であるか、若しくは本明細書に開示された様々な方法で修飾されたものであり得る。このような修飾には、感染性ウィルスを作成する為に粒子内にパッケージされるアデノウィルスゲノムに対する修飾が含まれる。このような修飾には、Ｅ１，Ｅ２，Ｅ２ｂ，Ｅ３又はＥ４コード領域の一つ又はそれ以上における欠失のような当業者に公知の欠失がある。このような修飾には、更に、アデノウィルスゲノムの全てのコード領域の欠失も含まれる。このようなアデノウィルスは「無力（ｇｕｔｌｅｓｓ）」なアデノウィルスとして知られている。上記の用語には、条件下複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ）アデノウィルス、即ち、或る型の細胞又は組織内では複製するが、その他の型ではしないウィルス、も含まれる。これらは、１９９８年９月１日発行の米国特許第５，８０１，０２９ （ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ）に開示されたウィルスを含む。このようなウィルスはしばしば細胞障害性、又は細胞変性ウィルス（又はベクター）と呼ばれ、それらが新生細胞（新生物）に対して効果を有する場合には、癌障害性（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ）ウィルス（又はベクター）と呼ばれる。
【０００５】
本発明の変異アデノウィルスファイバー蛋白質の一具体例は、Ｃ，Ｄ若しくはＥ亜群のアデノウィルス、又は、Ｆ亜群から選択されたウィルス（特に、長いファイバーを有するもの）の野生型ファイバー蛋白質のＣＤループにおける少なくとも一つのアミノ酸が変異を受け、亜群Ａ及び上記亜群の野生型ファイバーが結合するコクサッキーウィルス−アデノウィルス受容体（ＣＡＲ）として知られている細胞受容体への該蛋白質の結合能が減少するか又は実質的に消失している、ファイバー蛋白質である。これらの亜群は当業者に公知の標準的な分類指標である。亜群Ａにはアデノウィルス血清型１２，１８及び３１が含まれる。亜群Ｃにはアデノウィルス血清型１，２，５及び６が含まれる。亜群Ｄには、アデノウィルス血清型８、９，１０、１３，１５，１７，１９，２０、２２−３０、３２，３３、３６−３９、及び４２−４９が含まれる。亜群Ｅには、アデノウィルス血清型４が含まれる。亜群Ｆには、アデノウィルス血清型４０及び４１が含まれる。これら最後の二つの血清型は長いファイバー蛋白質と短いファイバー蛋白質の双方を有している。このうちの長いファイバー蛋白質のみがＣＡＲに結合する。本発明において好適なアデノウィルス血清型はアデノウィルス血清型５である。
【０００６】
対応する野生型ファイバー蛋白質と比較した、変異アデノウィルスファイバー蛋白質のＣＡＲに結合する能力（結合能）の減少又は消失は、ＣＡＲを有する細胞に対する、変異アデノウィルスファイバー蛋白質を含むアデノウィルス粒子の形質導入効率（マーカー遺伝子の遺伝子移入及び発現）を野生型ファイバー蛋白質を含むアデノウィルス粒子と比較することによって測定される。本明細書中において、「実質的に消失させた（している）」という用語は、実施例１に記載の一過性トランスフェクション／感染系を使用したＨｅｌａ細胞に対する形質導入効率が、野生型ファイバーを有するウィルスの効率に対して約１１％より少ないことを意味する。好ましくは、該効率は約９％より少なく、更に好ましくは、約８％より少ない。本明細書中で、「減少」又は「消失」という用語は、実施例１に記載の一過性トランスフェクション／感染系を使用したＨｅｌａ細胞に対する形質導入効率における変化が、野生型ファイバーを有するウィルスの効率に対して約７５％以下であることを意味する。好ましくは、該効率における変化は。約６５％以下であり、より好ましくは約５５％以下である。
【０００７】
本発明のファイバー蛋白質は当業者に公知の化学的又は生物学的技術によって修飾することが出来る。このような技術によって、野生型ファイバー蛋白質のＣＤループにおける少なくとも一つのアミノ酸が変異を受けており、ＣＡＲへの結合能を変化させる。本明細書中において、「変異」、「変異する」又はこれらと同義の用語は、蛋白質のこの部分における少なくとも一つのアミノ酸の欠失又は変化を意味する。アミノ酸は置換又は該アミノ酸から誘導される方法による修飾によって変化させることが出来る。
【０００８】
上記のように、本発明の好適なファイバー蛋白質は、変異アデノウィルス血清型５ファイバー蛋白質である。野生型ファイバー蛋白質のアミノ酸配列は配列番号２に示されている。野生型アデノウィルス血清型５蛋白質におけるＣＤループはアミノ酸位置４４１から４５３まで伸びている。好適には、野生型ファイバー蛋白質のアミノ酸位置４４１及び／又はアミノ酸位置４４２におけるアミノ酸が変異している。このような変異にはアミノ酸位置４４１及びアミノ酸位置４４２の両方又はいずれかの欠失が含まれる（配列番号６、１０，１２，１３）。別な場合として、これらの両方又はいずれかを置換することも可能である。特に好適な態様においては、野生型ファイバー蛋白質のアミノ酸位置４４１がバリンからアラニンに変化している。もう一つの好適な態様においては、野生型ファイバー蛋白質のアミノ酸位置４４２がリジンからアラニンに変化している。最も好適な態様では、野生型ファイバー蛋白質のアミノ酸位置４４１がバリンからアラニンに変化し、アミノ酸位置４４２がリジンからアラニンに変化している（配列番号１４）。
【０００９】
本発明者は、野生型アデノウィルス血清型５ファイバー蛋白質の他の部分における或る変異によって、該変異ファイバーを有するアデノウィルス粒子のＣＡＲへの結合能を減少又は実質的に消失することを発見した。好適例として、野生型ファイバー蛋白質のアミノ酸位置４０８、４０９、４６０、５０９、５１０、５３８及び５３９における一つ又はそれ以上の変異がある。特に好適な例の一つでは、ファイバー蛋白質はアミノ酸位置４０８及び４０９における変異を含み、好ましくは、位置４０８においてグルタミン酸とセリンが置換され、位置４０９においてアラニンとプロリンが置換されている（配列番号４）。別の好適例では、ファイバー蛋白質はアミノ酸位置４６０における変異を含み、好ましくは、位置４６０においてグルタミン酸とアルギニンが置換されている（配列番号１６）。別の好適例では、ファイバー蛋白質はアミノ酸位置５０９及び５１０における少なくとも一つの変異を含み、好ましくは、これらのアミノ酸が欠失している（配列番号１８）。別の好適例では、ファイバー蛋白質はアミノ酸位置５３８及び５３９における少なくとも一つの変異を含み、好ましくは、これらのアミノ酸が欠失している（配列番号２０）。
【００１０】
これら変異の全て又いずれのものもアデノウィルス５のＣＤループにおける変異に関連する。好適具体例では、本発明の変異ファイバー蛋白質は野生型ファイバー蛋白質のアミノ酸位置４４１及びアミノ酸位置４４２における少なくとも一つのアミノ酸における変異、更には、アミノ酸位置４０８、４０９、４６０、５０９、５１０、５３８及び５３９における一つ又はそれ以上の変異がある（配列番号８）。
【００１１】
別の好適具体例においては、本発明の変異アデノウィルスファイバー蛋白質において、Ｃ，Ｄ若しくはＥ亜群のアデノウィルス、又は、Ｆ亜群から選択されたウィルス（特に、長いファイバーを有するもの）の野生型ファイバー蛋白質のＡＢループにおける少なくとも一つのアミノ酸が変異を受けており、その変異によってＣＡＲへの該ファイバー蛋白質の結合能を減少させるか又は実質的に消失させたものである。この具体例において、好適なファイバー蛋白質は変異アデノウィルス血清型５ファイバー蛋白質である。
【００１２】
より好ましくは、変異アデノウィルス血清型５ファイバー蛋白質は、野生型ファイバー蛋白質のアミノ酸位置４０８及び／又はアミノ酸位置４０９における少なくとも一つのアミノ酸における変異を有する。これらの両方の位置に変異があることが好ましい。上記のように、このような変異は欠失、置換、又は該アミノ酸から誘導される方法による修飾であり得る。それぞれの位置において、同じタイプの変異がなされる必要はない。一好適具体例では、位置４０８においてグルタミン酸とセリンが置換され、別の好適具体例では位置４０９においてアラニンとプロリンが置換されている。最も好適な態様では、野生型ファイバー蛋白質のアミノ酸位置４０８においてグルタミン酸とセリンが置換され、アミノ酸位置４０９においてアラニンとプロリンが置換されている（配列番号４）。
【００１３】
本発明は、本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドも含む。本明細書中で、「ポリヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡのような、ポリヌクレオチドをコードする核酸分子を意味する。この分子は調節配列を含むこと出来る。このようなポリヌクレオチドは本明細書に記載された技術と当業者に公知の技術を組み合わせることによって調製又は得ることが出来る。このようなポリヌクレオチドの例は、配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９に示されている。本発明のポリヌクレオチドには、遺伝子暗号における縮重によって、或る塩基では異なるものの本発明の蛋白質をコードしているポリヌクレオチドも包含される。
【００１４】
本発明には更に、該ポリヌクレオチドを含むベクターも含まれる。このようなベクターとして部分的な又は完全なアデノウィルスゲノム及びプラスミドを挙げることが出来る。このようなベクターは当業者に公知の技術で作成することが出来る。
【００１５】
このようなベクターの主要な用途の一つは、アデノウィルスパッケージング細胞の産生である。本発明のパッケージング細胞とは、アデノウィルス粒子内にパッケージされるアデノウィルスゲノムにおける遺伝子により提供される機能を補う（代償する）機能を提供する細胞である。このような粒子の産生には、複製されるべきゲノム、産生される感染性ウィルスの集合（アセンブリ）に必要な蛋白質が要求される。該粒子は更にウィルス粒子の成熟に必要な蛋白質が要求される。このような蛋白質はパッケージング細胞又はベクターによって供給される。
【００１６】
本発明のパッケージング細胞は変異ファイバー蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含むことが出来る。このようなポリヌクレオチドは、好ましくはプラスミドの一部として細胞内にトランスフェクションされるか、又はウィルスベクターによって細胞に感染される。それは細胞のゲノム内に安定的に取り込まれて、安定したセルラインを与える。又は、ゲノム内には取り込まれないで、一過性の代償性細胞が得られる。
【００１７】
パッケージされるアデノウィルスゲノムは当業者に公知の技術によって代償性細胞に移入される。これらの技術には他のウィルスによるトランスフェクション又は感染を挙げることが出来る。変異ファイバー蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、パッケージング細胞内にある代わりにこのゲノム内にあっても良い。
【００１８】
或る場合には、変異ファイバーをコードするポリヌクレオチドがパッケージされるアデノウィルスゲノム内にあるときに、更に、パッケージング細胞がファイバー蛋白質をコードしていても良い。
【００１９】
パッケージング細胞は所望のウィルス粒子を産生できるような条件下で培養される。ウィルス粒子は標準的に手段で回収される。
【００２０】
本発明のアデノウィルス粒子を作成する好適な方法は以下のとおりである。標準的技術によってアデノウィルスシャトルベクター内で変異ファイバー蛋白質をコードするポリヌクレオチドを作成する。このプラスミドにはウィルスの右端、特にＥ３領域末端から右ＩＴＲまでが含まれている。更に、ｌｏｘ部位のような組換え酵素部位が含まれている。このプラスミドを、Ｅ１領域を除く、及びときには更にＥ２ａ領域を除いて、アデノウィルスゲノムの残りの部分を含むヘルパープラスミドと共に代償性細胞にコトランスフェクションする。Ｃｒｅ等の組換え酵素をコードする遺伝子を含む発現プラスミドである第三のプラスミドも該代償性細胞内にトランスフェクションする。このような代償性細胞としては、好ましくは、アデノウィルスＥ１及びＥ２ａ遺伝子を含む２９３細胞（Ｇｏｒｚｉｇｌｉａ， Ｋａｄａｎ， ｅｔ ａｌ． １９９６） である。最も好ましくは、代償性細胞としては、ＡＥ１−２ａ細胞系から誘導されアデノウィルス血清型５野生型ファイバー蛋白質を安定的に発現する６３３細胞（Ｖｏｎ Ｓｅｇｇｅｒｎ， Ｈｕａｎｇ， ｅｔ ａｌ． ２０００） である。
【００２１】
トランスフェクションされた代償性細胞は標準的な培養条件下で維持される。アデノウィルスプラスミドは組換えられてアデノウィルスゲノムを形成し、これがパッケージされる。該粒子は感染性であるが、そのゲノムは少なくともＥ１遺伝子を欠いているために複製欠損である。この粒子には野生型及び変異ファイバー蛋白質が含まれている。これらは粗ウィルス溶解物から回収され、標準的な方法で精製される。
【００２２】
回収された粒子は、好ましくは２９３又はＡＥ１−２ａ細胞に感染させるために使用する。これによって、キャプシドが所望の変異ファイバーのみを有する粒子を回収することが可能となる。この二段階操作によって本発明のアデノウィルス粒子の高力価バッチを得ることが出来る。
【００２３】
アデノウィルス粒子は複製可能又は複製不能であり得る。本発明の好適具体例においては、該粒子は或る特定の標的組織内では複製するが、その他の細胞又は組織内では複製することが出来ない。本発明の特に好適な具体例では、固形癌及びその他の新生物のような異常増殖性の組織内で複製する。このような条件下複製アデノウィルス粒子及びベクターは、例えば、上記の米国特許第５，９９８，２０５号及び第 ５，８０１，０２９号に開示されているような当業者に公知の方法で作成することが出来る。好適なパッケージング細胞は野生型アデノウィルス粒子を導く可能性がある相同組換えが制限されているように設計された細胞である。このような細胞は、１９９９年１１月３０日発行の米国特許第５，９９４，１２８ 号 （Ｆａｌｌａｕｘ） 及び２０００年３月７日発行の米国特許第６，０３３，９０８ 号 Ｂｏｕｔ， ｅｔ ａｌ）に開示されている。これらに記載のＰＥＲ．Ｃ６として知られているパッケージング細胞は特に好適である。
【００２４】
好ましくは、修飾ファイバーポリヌクレオチドには更にターゲッティングリガンドをコードする配列が含まれている。即ち、このような配列はシャトルプラスミドによって代償性細胞内にトランスフェクションされる。
【００２５】
或いは、ターゲッティングリガンド配列はペントン又はヘキソン蛋白質内に含まれていても良い。このような場合には、それらはヘルパープラスミド内にあることになる。
【００２６】
パッケージされたアデノウィルスゲノムは更に異種ポリヌクレオチドを含むことが出来る。通常、このポリヌクレオチドはヘルパープラスミドの欠失したＥ１領域に含まれる。或いは、このポリヌクレオチドはＥ３領域に含まれていてもよいが、その場合には、シャトルプラスミド内に含まれている。
【００２７】
本発明のアデノウィルス粒子は変異ファイバー蛋白質を含む。このような粒子は本発明の変異ファイバーの異なる型を含むことが出来る。更に、それらに変異ファイバーと共に野生型ファイバーが含まれていても良い。
【００２８】
好ましくは、本発明のアデノウィルス粒子は更に、該粒子のキャプシド蛋白質にターゲッティングリガンドを含む。このリガンドは、ファイバー、ヘキソン、又はペントンのような任意のキャプシド蛋白質内に含まれる。好適には、該リガンドはファイバー蛋白質に含まれ、それは好ましくは本発明の変異ファイバー蛋白質である。最も好ましくは、該リガンドはファイバー蛋白質のＨＩループ内に含まれる。ＨＩループに適合し、且つ、機能性ウィルスを提供できるような任意のリガンドを使用することが出来る。このようなリガンドは８０−９０個のアミノ酸を有するものであり得る。このようなリガンドは、例えば、１９９９年８月１２日公開（ＷＯ９９／３９７３４） のＰＣＴ出願（ＰＣＴ／ＵＳ９９／０２５４９） 、及び２０００年１月１２日出願の米国出願第０９／４８２，６８２ の実施例１２に記載されているような当業者に公知の方法で加えることが出来る。
【００２９】
ターゲッティングリガンドは、アデノウィルス粒子を優先的に所望の細胞型に指向させる、任意の化学構造であり得る。このようなリガンドのカテゴリーとして、例えば、ペプチド、ポリペプチド、単鎖抗体、複合蛋白質（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）がある。特異的なリガンドとして、ＴＮＦ‐α、及びＴＨＦ−βのような腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＬＴ−α、ＬＴ−βのようなリンホトキシン（ＬＴ）、並びにＦａｓ抗原に結合するＦａｓリガンドを含むＴＮＦスーパーファミリー；Ｂリンパ球のＣＤ４０受容体に結合するＣＤ４０リガンド；ホジキンリンパ腫の新生細胞のＣＤ３０受容体に結合するＣＤ３０リガンド；ＣＤ２７リガンド、ＮＧＦリガンド、及びＯＸ−４０リガンド；腫瘍細胞、活性化Ｔ細胞、及び神経組織細胞の上に位置するトランスフェリン受容体に結合するトランスフェリン；肝細胞のＬＤＬ受容体に結合するＡｐｏＢ；肝細胞のＬＲＰ受容体に結合する−２−マクログロブリン；肝臓のアシアロ糖蛋白質に結合するα−１酸糖蛋白質；マクロファージのマンノース受容体に結合するマンノース含有ペプチド；活性化内皮細胞のＥＬＡＭ−１受容体に結合するシアリル−ルイスーＸ抗原含有ぺプチド；造血前駆細胞のＣＤ３４受容体に結合するＣＤ３４リガンド；リンパ球のＬＦＡ−１（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）受容体又はマクロファージのＭａｃ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）受容体に結合するＩＣＡＭ−１；脾臓及び骨髄マクロファージのｃ−ｆｍｓ受容体に結合するＭ−ＣＳＦ；肝細胞のプラスモヂウム・ファルシパラム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ） 受容体に結合するスポロゾイト周辺蛋白質；活性化内皮細胞のＶＣＡＭ−１受容体に結合するＶＬＡ−４；ヘルパーＴ細胞のＣＤ４受容体に結合するＨＩＶｇｐ１２０及びクラスＩＩＭＨＣ抗原；アポリポ蛋白質Ｅ（ＡｐｏＥ）分子の受容体結合領域；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）受容体に結合するＣＳＦ；インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ受容体に夫々結合するＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩのようなインシュリン様増殖因子；夫々インターロイキン１〜１４受容体に結合するインターロイキン１〜１４；免疫グロブリンのＦｖ抗原結合ドメイン；及び、環状ＲＧＤペプチド。環状ＲＧＤペプチドが好適である。本明細書中において、「環状ＲＧＤペプチド又はｃＲＧＤ」という用語は、細胞表面のα―インテグリンに結合し、ＲＧＤ配列（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）を有する任意のアミノ酸を意味する。配列番号４３における配列が特に好ましい。
【００３０】
好適具体例において、アデノウィルスファイバーは三量体（ｔｒｉｍｅｒｉｃ）構造をとっているので、リガンドも三量体構造を有する。より好適な具体例では、リガンドは上記のＴＮＦスーパーファミリーから選択される。このようなリガンドは三量体であり、ファイバーヘッドドメインに類似した大きさを有している。このようなリガンドは、１９９８年５月２６日発行の米国特許第５，７５６，０８６号（ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ）記載の方法を用いてファイバー蛋白質内に取り込むことが出来る。
【００３１】
アデノウィルス粒子は更に少なくとも一つの異種ポリヌクレオチドを含有することが出来る。本明細書において、「異種ポリヌクレオチド」という用語は、アデノウィルス以外の生物学的ソースに由来し、アデノウィルスが細胞に感染した際にポリペプチドをコードするような任意のポリヌクレオチドを意味する。このようなポリヌクレオチドは粒子内のアデノウィルスゲノムに含まれ、当業者に公知の方法で該ゲノムに加えられる。所望の任意の異種ポリヌクレオチドを加えることが出来る。好適なポリヌクレオチドは免疫刺激蛋白質をコードするものであり、例えば、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）である。哺乳動物のＧＭ−ＣＳＦが好ましい。より好適には、霊長類のＧＭ−ＣＳＦであり、最も好ましくはヒトのＧＭ−ＣＳＦである。別の好適なポリヌクレオチドは、１９９７年１１月１９日出願の米国出願（０８／９７４，３９１） （公開ＷＯ９９２５８６０） に記載されたように、安全スイッチとして有用な単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）である。
【００３２】
本発明のアデノウィルス粒子は細胞を遺伝子工学的に操作して、他の場合には発現しないか、又は充分な量では発現しないような蛋白質を発現させる為に使用される。これは、所望の異種ポリヌクレオチドを有するゲノムを含む本発明のアデノウィルス粒子で所望の細胞を感染させることにより達成される。これによって、該異種ポリヌクレオチドが細胞内で発現される。好適には、細胞は哺乳動物細胞であり、より好ましくは霊長類細胞であり、最も好適にはそれはヒト細胞である。このような細胞は動物の体内（インビボ）、又は体外（インビトロ）にある。
【００３３】
好適には、アデノウィルス粒子は上記のようなターゲッティングリガンドを含む。これによって、野生型アデノウィルス粒子が感染する細胞型とは異なる所望の細胞型へ、又は、野生型アデノウィルス粒子が感染する細胞型とは同じ所望の細胞型に対してであるが選択的な方法、即ち、非標的細胞型には感染しない方法で、遺伝子を運搬することが出来る。
【００３４】
従って、本発明のアデノウィルスはインビトロ又は様々な動物モデルにおける細胞形質導入及び遺伝子発現の研究に使用することが出来る。後者には、細胞にインビトロで形質導入された後に動物に投与される生体外（エキソビボ）技術が含まれる。本発明のアデノウィルスは更に、ヒト又は動物の遺伝子治療に使用することが出来る。このような遺伝子治療はエキソビボ又はインビボで行われる。インビボでの遺伝子治療には、薬学上許容可能なキャリア中の本発明のアデノウィルスを、治療用蛋白質をコードする異種遺伝子をヒトの細胞内に導入することによって、ヒトの疾患（病気）又は他の医学的状態を予防、処置、又は改善するために治療上有効な量でヒトに投与（運搬）する。アデノウィルスは体重キログラム当たり約１粒子から体重キログラム当たり約１０１４粒子の投与量で投与される。好ましくは、それらは体重キログラム当たり約１０６粒子から体重キログラム当たり約１０１３粒子の投与量で投与される。最も好ましくは、体重キログラム当たり約１０９粒子から体重キログラム当たり約１０１２粒子の投与量で投与される。
【００３５】
ＡＢループにおける上記のような修飾を有するアデノウィルス粒子、特に、野生型アデノウィルス血清型５ファイバー蛋白質のアミノ酸位置４０８及び４０９における修飾を有するアデノウィルス粒子、最も好適には、位置４０８においてグルタミン酸とセリンが置換され、位置４０９においてアラニンとプロリンが置換されているアデノウィルス粒子（配列番号４）は更に望ましい利点を有している。本発明者は予想外にも、このようなウィルス粒子によって、野生型ファイバー蛋白質を有するアデノウィルスと較べて、動物の肝臓における肝細胞への遺伝子移入及び該細胞での遺伝子発現が増強されることを発見した。従って、本発明は、少なくとも一つのファイバー蛋白質におけるＡＢループ修飾を有するアデノウィルスを肝臓の細胞が形質導入される状態にある動物に投与することから成る、アデノウィルス媒介による肝細胞への遺伝子移入及び肝細胞における遺伝子発現の増強方法を含む。肝細胞が主に形質導入される。好適には、位置４０８においてグルタミン酸とセリンが置換され、位置４０９においてアラニンとプロリンが置換されている変異アデノウィルス血清型５ファイバー蛋白質（配列番号４）を含むアデノウィルス粒子を使用して異種遺伝子を運搬する。
【００３６】
このようなアデノウィルス粒子は患者の肝臓内で異種遺伝子を発現することが望まれる遺伝子治療において特に有用であろう。これは、例えば、糖尿病、血友病、及びアテローム性動脈硬化症のような患者の血中のコレステロール又はトリグリセライドの値が増加することに関連する疾患に使用することが出来る。対象には、患者の肝臓の肝細胞に一つ又はそれ以上の抗血管形成性遺伝子を運搬することを含む抗血管形成治療も含まれる。
【００３７】
遺伝子移入及び遺伝子発現が増強される為に、より少量のウィルス粒子を使用すれば良いことになる。このような型の粒子の投与量は、アデノウィルスは体重キログラム当たり約１粒子から体重キログラム当たり約１０１３粒子の投与量で投与される。好ましくは、それらは体重キログラム当たり約１０５粒子から体重キログラム当たり約１０１２粒子の投与量で投与される。最も好ましくは、体重キログラム当たり約１０８粒子から体重キログラム当たり約１０１１粒子の投与量で投与される。
【００３８】
このような粒子は当業者に公知の投与経路で運搬される。このような経路の一つは静脈内注射である。別の方法として実質細胞内注射がある。肝動脈、門脈、又は胆菅内に注射することによって運搬することも可能である。
【００３９】
ＡＢループ変異を有する本発明の粒子は、該粒子を更に、ペントン蛋白質におけるＲＧＤアミノ酸配列が欠失、修飾又は置換されているように修飾するための基礎として使用することが出来る。このような修飾のための手法は１９９６年９月２４日発行の米国特許第５，５５９，０９９号（Ｗｉｃｋｈａｍ ｅｔ ａｌ） 、１９９８年１月２７日発行の米国特許第５，７１２，１３６号（Ｗｉｃｋｈａｍ ｅｔ ａｌ）、１９９８年３月２４日発行の米国特許第５，７３１，１９０号（Ｗｉｃｋｈａｍ ｅｔ ａｌ）に記載されている。これによって、粒子が細胞表面インテグリンに結合し細胞内に取り込まれることを阻止することが出来る。
【００４０】
【実施例１】
変異ファイバー蛋白質によってシュードタイプ化されたアデノウィルス型５ウィルス粒子はコクサッキーＢ−アデノウィルス受容体担持細胞への感染が減少する
導入
遺伝子運搬プラットフォームとしてのヒトアデノウィルス方５（Ａｄ５）に対する大きな興味（期待）は、一部にはそれが多くの細胞型に効率的に感染することができる能力による。この理由から、Ａｄ５ベクターを特異的に標的とした多くの試みがなされてきた。上記の能力には、その天然な受容体を標的からはずし、同時に或る特定の細胞型に対するウィルス指向性を再標的化することが含まれる。その結果得られたベクターは効率及び安全性の双方の見地からこの遺伝子治療プラットフォームの発展における重要なステップを示すものであろう。望ましくないウィルス−組織を減少させ、所望の相互作用を増大させることによって、使用する投与量を減らすことが出来、それによって、関連する毒性副作用及び宿主における免疫応答を最小化させられる可能性がある。
【００４１】
アデノウィルスベクターの受容体指向性及び結合特異性を変える為の幾つかの戦略が用いられてきた。これらの戦略には、ファイバーノブ（ｋｎｏｂ）ドメインと異なる受容体特異性を有する別のＡｄ血清型由来のノブとの交換（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ， Ｒｏｌｌｅｎｃｅ， ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｋｒａｓｎｙｋｈ， Ｍｉｋｈｅｅｖａ， ｅｔ ａｋ， １９９６； Ｓｔｅｖｅｓｏｎ， Ｒｏｌｌｎｃｅ， ｅｔ ａｌ １９９７）、ファイバーのＣ末端へのペプチドの挿入（Ｗｉｃｋｈａｍ， Ｇｒａｎａｄｏｓ， ｅｔ ａｌ， １９９０； Ｍｉｃｈａｅ， Ｈｏｎｇ， ｅｔ ａｌ． １９９５； Ｗｉｃｈａｍ， Ｔｚｅｎｇ， ｅｔ ａｌ． １９９７）又は露出したＨＩループへのペプチドの挿入（Ｋｒａｓｎｙｋｈ， Ｄｍｉｔｒｉｅｖ， ｅｔ ａｌ．１９９８） 及び二官能性抗体の使用（Ｗｉｃｋｈａｍ， Ｓｅｇａｌ， ｅｔ ａｌ．１９９６） を挙げることが出来る。これらの試みの結果ハ、ウィルス指向性の拡大であり、局所的に運搬されるＡｄベクターの遺伝子移入効率を改良することを目的とする血管遺伝子治療のような幾つかの遺伝子治療には有用であった。しかしながら、全身に運搬するアデノウィルスベクターによってある細胞型に特異的に形質導入する為には、高親和性ターゲッティングリガンドの導入と組み合わせて天然の（元の）受容体指向性を除去する必要がある。
【００４２】
ウィルス粒子における多数のファイバー変異を分析することは、修飾ファイバー遺伝子のアデノウィルスゲノムＤＮＡへの時間のかかる挿入を含む煩雑な作業であった。更に、Ａｄゲノムに変異ファイバー遺伝子を取り込むことによって、Ａｄの効率的な培養及び増殖に影響を及ぼす可能性がある。その結果、変異ファイバータンパク質を含むアデノウィルスベクターを作成及びその評価のために、高力価のウィルスストックを効率的に生産することのできるベクターを生み出す新たな別の方法が必要とされている。
【００４３】
本発明者は、ウィルス粒子の状況における所望の指向性に対する修飾ファイバー蛋白質を容易に分析するための新規なシステムを開発した。このシステムはエピソームプラスミドから一過的に発現されるファイバー蛋白質によってファイバーのないＡｄ５変異体（ミュータント）をシュードタイプ（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅ）化する能力に基づくものである（図１）。ファイバーが欠落したＡｄベクターはＡｄ５．βｇａｌ．△Ｆであり、これはＳＶ４０プロモーターの調節下で細胞質β―ガラクトシダーゼを発現するＥ１−Ｅ３及びファイバー遺伝子を欠いたものである（Ｖｏｎ Ｓｅｇｇｅｒｎ， Ｈｕａｎｇ， ｅｔ ａｌ．１９９９） （図１Ａ）。シュードタイプ化するための修飾ファイバー蛋白質は高レベルのファイバー蛋白質発現用として設計された発現プラスミド構築物によって生産される。このシステムの主な利点の一つは、修飾ファイバー蛋白質を迅速にビリオン内の取り込むことができ、ＣＡＲとの相互作用及びその後の遺伝子移入（浸入）及び発現に対する影響に関して最も関連のある状況又は事情で機能的に分析することが可能なことである。本発明者はこのシステムを使用して、ＣＡＲ発現細胞系であるＨｅｌａ細胞へのアデノウィルス遺伝子移入を媒介する能力に関して一連のファイバー蛋白質を分析した。本発明者は、一過性のトランスフェクション／感染システムが、野生型ビリオンにおいて見られるファイバー蛋白質のレベルと差異のないレベルで、ファイバーが欠落したウィルスキャプシドを効率的にシュードタイプ化することができることを示した。本発明者はこのシステムを使用して、細胞に形質導入し遺伝子移入を達成するアデノウィルスの能力を実質的に減少させる、数多くのファイバー遺伝子変異を同定した。
【００４４】
材料及び方法
プラスミド及びファイバー遺伝子変異
既に、Ｖｏｎ Ｓｅｇｇｅｒｎ， Ｈｕａｎｇ， ｅｔ ａｌ．２０００ に記載されているように、Ａｄ５ファイバーｃＤＮＡはｐｃＤＮＡ３． １にクローン化され、ｐＤＶ６０が得られた。簡潔に述べると、ｐＤＶ６０はＣＭＶプロモーター、Ａｄ５の三つの部分からなるリーダー（ＴＰＬ）のエキソンの第一の部分、天然の第一のイントロン、及び、ＡＤ５ファイバー遺伝子上流の融合した第二及び第三のＴＰＬエキソンを含む。全てのアミノ酸の変更は、ｐＤＶ６０プラスミドを鋳型として使用してファイバーｃＤＮＡ内に取り込まれた。ｐＤＶ６０における個々のアミノ酸残基は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ 部位特異的システム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）を用いて変異させた。それぞれの一つ又は二つのアミノ酸の変更に取り込みに使用したオリゴヌクレオチドプライマーは表１に挙げた。熱サイクラープロトコールは、９５℃で３０秒、９５℃で３０秒を１８サイクル、５５℃で１分間、及び６８℃で２０分間である。
【００４５】
Ａｄ５ファイバーのノブ（ｋｎｏｂ）の全ドメインであるアミノ酸４０４から５８１までを欠落させた。ファイバーのテール及びシャフトの三量体化を回復させるために、ＧＣＮ４ロイシンジッパー（Ｈａｒｂｕｒｙ， Ｚｈａｎｇ， ｅｔ ａｌ．１９９３） 由来の３１個のアミノ酸からなるペプチドをファイバーＴＬＷＴ配列の直後のファイバーシャフト−ヘッドのジャンクションにＰＣＲ遺伝子オーバーラップ伸長（Ｈｏｒｔｏｎ， ｃａｉ， ｅｔ ａｌ．１９９０） を用いて融合させた。この反応によって、Ａｄ５ファイバーのテール及びシャフ領域（アミノ酸１〜４０３）がＧＣＮ４ロイシンジッパーの３１個のアミノ酸と融合してＫＯ１１変異体が形成され、これがｐＶＤ６０ にクローン化されてｐＤＫＯ１１が作成された。全てのファイバー変異に対して、クローン化されたヌクレオチド配列が決定され、各ケースにおいて、期待した配列が選択された。ｐＤＶ５５コントロールプラスミドは、ファイバー遺伝子を欠く点以外はｐＶＤ６０に類似している（Ｖｏｎ Ｓｅｇｇｅｒｎ， Ｈｕａｎｇ， ｅｔ ａｌ．２０００）。
【００４６】
ウィルス
Ａｄ５．βｇａｌ．ｗｔは、Ｅ１領域内のｌａｃＺリポーターカセットを含む、第一世代のＥ１およびＥ３欠失アデノウィルスである（Ｖｏｎ Ｓｅｇｇｅｒｎ， Ｃｈｉｕ， ｅｔ ａｌ．１９９９） 。Ａｄ５．βｇａｌ．△Ｆはファイバー遺伝子が欠けている点以外はＡｄ５．βｇａｌ．ｗｔと同一である（Ｖｏｎ Ｓｅｇｇｅｒｎ， Ｃｈｉｕ， ｅｔ ａｌ．１９９９） 。
【００４７】
細胞
ヒト２９３Ｔ細胞はＡＴＣＣ（ＣＲＬ１１２６８） から入手し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で培養した。２９３Ｔ細胞はＳＶ４０の複製起源からプラスミドの増幅を可能にするＳＶ４０ラージＴ抗原を安定的に発現する。６３３細胞はＡｄ５ファイバー蛋白質を安定的に発現する （Ｖｏｎ Ｓｅｇｇｅｒｎ， Ｃｈｉｕ， ｅｔ ａｌ．２０００）し、Ｅ１ａ及びＥ２ａを欠失したアデノウィルスベクターを代償する細胞ラインであるＡＥ１−２ａから誘導されたものである（Ｇｏｒｚｉｇｌｉａ， Ｋａｎｄａｎ， ｅｔ ａｌ．１９９６）。６３３細胞はリヒターＣＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃Ｃ−２６７１） 及び１０％ＦＢＳで培養した。Ｈｅｌａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）は１０％ＦＢＳ添加ダルベッコ変性イーグル培地で培養した。Ｓ８細胞としても知られるＡＥ１−２ａの調製、及び６３３細胞の調製に関する記述は、更に、２０００年１月１４日出願の米国特許出願０９ ／４８２，６８２の実施例６Ｆ及び実施例６Ｇを参照されたい。
【００４８】
一過性トランスフェクション／感染（インフェクション）
変異ファイバー蛋白質は一過性トランスフェクション／感染（インフェクション）システムを使用してアデノウイルス粒子に取り込んだ。この一過性トランスフェクション／感染（インフェクション）を用いた各アデノウイルスの調製には、７０％集密度（コンフルエント）の２９３Ｔ細胞の４つの１５ｃｍディッシュを使用した。トランスフェクションには、表２に挙げた各ファイバー発現プラスミドＤＮＡ１００μｇ、リポフェクタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）４００μｌ及び３．６ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ１培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）をコニカル２５０ｍｌ滅菌ボトル内で混合した。３０分間室温でインキュベーションした後、６０ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ１培地を添加した。このトランスフェクション混合物の１６ｍｌのアリコートを各プレートに添加し、３７℃、５％ＣＯ２で５時間インキュベートした。トランスフェクション培地を吸引し、２０ｍｌの完全ＤＭＥＭ培地を添加した。ディッシュを３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートしファイバー蛋白質を発現させた。
【００４９】
次にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞にＡｄ５．βｇａｌ．△Ｆ／Ｆ＋ ウィルスを１細胞当たり３５０個の粒子で感染させた。Ａｄ５．βｇａｌ．△Ｆ／Ｆ＋ ウィルスは、キャプシドが野生型Ａｄ５ファイバー蛋白質を含有するようにファイバー代償性細胞ラインである６３３（Ｖｏｎ Ｓｅｇｇｅｒｎ， Ｃｈｉｕ， ｅｔ ａｌ．２０００）内で増殖させたＥ１およびＥ３欠失アデノウィルスである（Ｖｏｎ Ｓｅｇｇｅｒｎ， Ｃｈｉｕ， ｅｔ ａｌ．１９９９）。増殖培地を吸引し、Ａｄ５．βｇａｌ．△Ｆ／Ｆ＋ 含有感染培地（ＤＭＥＭ及び２％ＦＢＳ）２．５ｍｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ２で２時間ゆっくりと揺り動かした。増殖培地（ＤＭＥＭ及び２１０％ＦＢＳ）２０ｍｌを添加し、プレート（ディッシュ）を３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日に培地を交換し、完全な細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察されるまで、典型的は３〜４日間、インキュベーションを続けた。完全な細胞変性の後に、トランスフェクション／感染（インフェクション）された２９３Ｔ細胞を穏やかに遊離させてそれらを収穫し、遠心分離によってピペッティングし、１ｍｌのリン酸生理緩衝液に再懸濁させた。凍結−融解サイクルを５回行って細胞を破壊しウィルスを放出させることによって粗ウィルス溶解物（ＣＶＬ）を調製した。標準的操作によるＣｓＣｌ勾配遠心分離によってウィルスを精製した。ウィルス粒子の力価はＭｉｔｔｅｒｅｄｅｒ Ｍａｒｃｈ， ｅｔ ａｌ． １９９６ に記載のように分光光度法で決定した。修飾ファイバー蛋白質でシュードタイプ化されたＡｄ５．βｇａｌ．△Ｆウィルスの典型的な収率は１０１１から１０１２個の範囲であった。
【００５０】
ウェスタンブロット分析
アデノウィルス粒子での各ファイバー蛋白質の発現及び取り込みは、変性ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）４〜１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウェスタンイムノブロット分析で確認した。各レーン当たり５．０ｘ１０９個の粒子に対応するアデノウィルスベクター調製物のアリコートを分析した。ミニトランスブロット装置（Ｎｏｖｅｘ Ｉｎｃ．） を用いて３０Ｖ、９０分間で蛋白質をニトセルロース膜に転移させた。１５０ｍＭのＮａＣｌ，２ｍＭのＥＤＴＡ，０，０４％Ｔｗｅｅｎ−２０及び５％乾燥ミルクを含有する１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４内で室温、少なくとも１時間、膜をブロックした。ブロックした膜を、第一次のウサギ抗Ａｄ５ファイバーポリクローナル抗血清の１：１０００希釈物で１時間インキュベートした。次に、増感化学発光（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｅ）システム（Ａｍｅｒｃｈａｍ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ） を使用して、第二次のロバ抗ウサギＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体の１：５０００希釈物で膜を発色させた。膜を約１〜２０秒間フィルムに暴露した。そして、ウィルス粒子の等価負荷量を確認するアデノウィルス蛋白質の検出を再度調査する為に膜を使用した。簡潔に述べると、膜を第一次のウサギ抗Ａｄ５ペントンポリクローナル抗血清の１：５０００希釈物で１時間インキュベートした。その後、第二次のヤギ抗ウサギＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体の１：５０００希釈物で、上記のように膜を再度発色させた。
【００５１】
抗Ａｄ５ファイバー及び抗Ａｄ５ペントン特異的抗血清の作成
抗ファイバー及び抗ペントンのウェスタンイムノブロット分析で使用した、ウサギ第一次抗体は、ニュージーランド白ウサギ（Ｌｏｆｔｓｔｒａｎｄ Ｌａｂｓ， Ｌｔｄ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ） の免疫により作成した。Ａｄ５ファイバー及びペントン蛋白質はバキュロウィルス発現システムで発現させた。精製したファイバー蛋白質及び部分精製したペントンベース蛋白質を標準的手法に従い免疫に使用した。得られた抗血清はＡｄ５ファイバー及びペントン蛋白質に対する免疫反応性をウェスタンイムノブロット分析で試験した。
【００５２】
アデノウィルス形質導入
Ｈｅｌａ細胞に変異ファイバー蛋白質を有するアデノウィルスベクターを感染させ、ＣＡＲ相互作用及びその後の遺伝子発現に対するファイバーアミノ酸変異の効果を評価した。１２ウェルディッシュ内のＨｅｌａ細胞の単層に、２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（全量０．３５ｍｌ）中の１細胞当たり１０００個の粒子を３７℃、２時間で感染させた。感染培地を単層から吸引し、１０％ＦＢＳ含有完全ＤＭＥＭを１ウェル当たり１ｍｌ添加した。細胞を更に２４時間インキュベートし、β―ガラクトシダーゼを発現させた。
【００５３】
β−ガラクトシダーゼ発現分析
感染細胞内のアデノウィルスベクターにコードされているβ―ガラクトシダーゼの発現を化学発光（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｅ）レポーターアッセイ及び色素源基質による組織化学染色によって測定した。β―ガラクトシダーゼの相対的レベルはＧａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ 化学発光（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｅ）レポーターアッセイシステム（Ｔｒｏｐｉｘ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）を使用して測定した。簡潔に述べると、細胞の単層をＰＢＳで洗浄し、製造者の指示に従って処理した。細胞ホモジェネートをマイクロフフュージチューブに移して細胞デブリスを除去した。全蛋白質濃度は、ウシ血清アルブミンをアッセイ標準に用いたビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ：ＢＣＡ）蛋白質アッセイ（Ｐｅｉｒｃｅ， Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）で測定した。各試料のアリコートをＴｒｏｐｉｘβ―ガラクトシダーゼ基質と共に９６ウェル内で４５分間インキュベートした。各試料から放射される相対光単位（ＲＬＵ）をルミノメーターを用いて測定し、各試料における全蛋白質量に対して標準化した（ＲＬＵ／μｇ全蛋白質量）。組織化学染色操作に関しては、細胞の単層をＰＢＳ中の０．５％グルタルアルデヒドで固定し、０．５ｍｌＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトサイド（Ｘ−ガル）、５ｍＭカリウムフェロシアナイド、及び２ｍＭのＭｇＣｌ２の混合物でインキュベートした。細胞の単層をＰＢＳで洗浄し、Ｚｅｉｓｓ ＩＤ０３ マイクロスコープを用いた光顕微鏡によって青い細胞を視覚化した。
【００５４】
結果
一過性トランスフェクション／感染（インフェクション）システム
ウイルス粒子の状況におけるＣＡＲ結合ファイバー変異体としての可能性のあるパネルを迅速に評価するため、本発明者は一過性トランスフェクション／感染（インフェクション）システムを開発した。このシステムは、２つの成分からなる変異ファイバー蛋白質を有するファイバー欠落ウィルスのシュードタイピングに基づいている。最初のものは、Ｅ１、Ｅ３及びファイバーが欠失したＡｄ５．βｇａｌ．△Ｆである（Ｖｏｎ Ｓｅｇｇｅｒｎ， Ｃｈｉｕ， ｅｔ ａｌ．１９９９）（図１Ａ） 。このウィルスは、例えば２９３Ｔ細胞のような非ファイバー−代償性細胞ラインで増殖させた場合には、ファイバー蛋白質が欠けたウイルス粒子を産生する。ここでの目的のために、これらの非ファイバービリオンはＡｄ５．βｇａｌ．△Ｆ／Ｆ− と名づける。もしＡｄ５．βｇａｌ．△Ｆを６３３細胞（Ｖｏｎ Ｓｅｇｇｅｒｎ， Ｈｕａｎｇ， ｅｔ ａｌ．２０００）のようなファイバー−代償性細胞ラインで増殖させた場合には、ビリオンは完全な野生型ファイバー蛋白質をその細胞上に有するものとなり、これらはＡｄ５．βｇａｌ．△Ｆ／ Ｆ＋ と呼ばれる。本システムの第二の成分は、トランス（ｔｒａｎｓ）で集合ウィルスにファイバー蛋白質を供給する発現プラスミドである。このプラスミドｐＤＶ６０ は高レベルでファイバー蛋白質を発現するように設計されている（Ｖｏｎ Ｓｅｇｇｅｒｎ， Ｈｕａｎｇ， ｅｔ ａｌ．２０００）。
【００５５】
一過性トランスフェクション／感染（インフェクション）を模式的に図１Ｂに示した。ｐＤＶ６０に基づくファイバー発現プラスミドによる２９３細胞のトランスフェクションによって該細胞において高レベルのファイバー生産が引き起こされた。２４時間後に、６３３細胞における増殖によって野生型ファイバーで予めシュードタイプ化されたＡｄ５．βｇａｌ．△Ｆ／ Ｆ＋で感染させた。約３日後に、感染細胞を回収し、いまやファイバー発現プラスミドによってトランスで供給されたファイバー蛋白質を有するウィルス粒子を精製した。この方法によって、三量体化しウィルス粒子内に取り込むことが出来る、プラスミドにコードされた任意のファイバー蛋白質によってＡｄ５．βｇａｌ．△Ｆが代償される。６３３細胞内における増殖又はファイバー発現プラスミドによる一過性トランスフェクションのいずれかによって代償されたＡｄ５．βｇａｌ．△ＦをＡｄ５．βｇａｌ．△Ｆ／ Ｆ＋ と名づける。ウィルス粒子の状況におけるこれらの修飾ファイバー蛋白質の機能は、ファイバー依存Ａｄ感染及び遺伝子浸入（移入）を媒介する能力に関して試験される。
【００５６】
このシステムによって生成されたＡｄ５．βｇａｌ． △Ｆ／Ｆ＋ウィルス粒子上に取り込まれたファイバー蛋白質のレベルをＡｄ５．βｇａｌ．ｗｔレベルと比較する為に、ウェスタンイムノブロット分析を実施した。Ａｄ５．βｇａｌ．△Ｆ／ Ｆ−、ｐＤＶ６０にコードされたファイバー蛋白質によって予めシュードタイプ化されたＡｄ５．βｇａｌ．△Ｆ／ Ｆ＋及びＡｄ５．βｇａｌ．ｗｔの同じ数の粒子をファイバー及びペントン蛋白質レベルに関して評価した。以前に記載されたように（Ｖｏｎ Ｓｅｇｇｅｒｎ， Ｃｈｉｕ， ｅｔ ａｌ． １９９９）、Ａｄ５．βｇａｌ．△Ｆ／ Ｆ−ビリオンには検出可能なファイバー蛋白質がなく、Ａｄ５．βｇａｌ．ｗｔは予想されるレベルの６２ｋＤａファイバー蛋白質を含んでいた。重要なことは、本発明の一過性トランスフェクション／感染システムを用いてシュードタイプ化されたＡｄ５．βｇａｌ．△Ｆ／ Ｆ＋及ビリオンに取り込まれたｐＤＶ６０にコードされたファイバー蛋白質のレベルはＡｄ５．βｇａｌ．ｗｔ粒子のファイバー蛋白質のレベルに匹敵していたことである。同じ量のウィルス粒子を載せたことは、各ベクターに関して６８ｋＤａのペントンモノマーを検出することによって示された。これらの結果は、発現プラスミドからのトランスによるファイバー蛋白質の発現によってＡｄ５．βｇａｌ．△Ｆが代償され、ゲノム内にファイバーを有するアデノウィルスにおけるファイバー蛋白質と同じレベルのファイバー蛋白質がキャプシド上にもたらしたことを示している。
【００５７】
ファイバー変異分析
次に、一過性トランスフェクション／感染（インフェクション）システムを用いて、ファイバーノブにおける一連の変異がＡｄ５粒子へのＣＡＲ−媒介遺伝子移入に与える影響に関して評価した。１４種類の変異ファイバー蛋白質をコードする発現プラスミド群を作成した（表２）。コントロールとして、野生型ファイバー（ｐＤＶ６０）及び無（ヌル）構築物（ｐＤＶ５５）を使用した（Ｖｏｎ Ｓｅｇｇｅｒｎ， Ｈｕａｎｇ， ｅｔ ａｌ．２０００）。これらのプラスミドは２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、Ａｄ５．βｇａｌ．△Ｆ／ Ｆ＋で感染させた。この操作によって得られたビリオンはプラスミドにコードされたファイバーによりシュードタイプ化された。各ファイバー蛋白質の発現及びアデノウィルスキャプシド内への集合は、ＣｓＣｌ精製ウィルスストックのウェスタンイムノブロット分析により検討された。キャプシド上のファイバー蛋白質の相対的レベルをペントン蛋白質を比較して各レーンに当量のウィルスを載せるように調整した。殆どの変異体にコードされるファイバー蛋白質が充分に発現し、三量体化し、Ａｄ５．βｇａｌ．△Ｆ　ウィルス粒子内に取り込まれた。６２ＫＤａファイバーモノマーをこの分析で検出した。ＫＯ１１変異体の分析によって約４８ＫＤａの予想される蛋白質が示されたが、この切断されたファイバー蛋白質は野生型と同じレベルで取り込まれることがなかった。これらの結果から、これらファイバー遺伝子の導入された変異の多くは、野生型と区別されないレベルで発現し、三量体化し、及ウィルス粒子内に取り込まれる能力を損なわないことが示された。しかしながら、変異体ＫＯ２（配列番号６）、ＫＯ１＋２（配列番号８）、ＫＯ２ａ（配列番号１０）、及びＫＯ１１は取り込まれたファイバー蛋白質量が少なく、ＫＯ１１は完全長野生型Ａｄ５ファイバー蛋白質に対して作られる抗血清に対する免疫反応性が低かった。これら変異体の相対的発現レベル及び三量体化の非変性ポリアクリルアミドゲル上での分析によって、ファイバーモノマー及びトリマー（三量体）のレベルが低いことが示され、これら変異蛋白質の安定状態レベルにおける欠陥が示唆された。全ノブ領域を欠くＫＯ１１を除いて、これら変異体の全ては共通してＶ４４１に変異を有していた。
【００５８】
トランスにおける効率的な発現、及びこれら変異ファイバー蛋白質の殆どがビリオンに取り込まれることが示されたので、次に、これらの変異体がＣＡＲ−結合性に与える影響を評価した。これは、変異ファイバー蛋白質によりシュードタイプ化されたビリオンと野生型ファイバー蛋白質によりシュードタイプ化されたビリオンとのＨｅｌａ細胞に対する形質導入効率を比較することで行った。化学発光レポーターアッセイによりアデノウィルスにコードされるβ―ガラクトシダーゼ活性レベルを測定し、一つの代表的な実験からの値（ＲＬＵ／全細胞蛋白質μｇ）を表２に示した。全部で５〜６回の形質導入が実施され、個々のファイバー変異体を含む各アデノウィルスベクターについて平均β―ガラクトシダーゼ活性（ＲＬＵ／全細胞蛋白質μｇ）を計算した。これらの値を、野生型ファイバーで得られたβ―ガラクトシダーゼ活性化学発光に対して標準化し、野生型ファイバーと比較した各変異体の相対的活性を求めた。Ｆ−、ファイバー無しベクターは、ｗｔ活性の０．１％であって形質導入において最も高い１０００倍の減少を示し、Ｈｅｌａ細胞への充分な形質導入にファイバー蛋白質が必要なことを示した。ＫＯ１変異体は約７０％の減少であり、僅か１．４％ｗｔβ―ガラクトシダーゼ活性を示した。ＫＯ２（配列番号６）変異体は約１６７倍の減少であり０．６％ｗｔ活性であった。ＫＯ２ａ（配列番号１０）、ＫＯ２ｂ（配列番号１２）及びＫＯ２ｃ（配列番号１４）構築物はＣＡＲ相互作用の顕著な減少の原因となるアミノ酸変異を同定すべく設計された。この比較において、ＫＯ２ａ（配列番号１０）においてアミノ酸Ｖ４４１の欠失によりｗｔ活性の１６７倍減少したように、このアミノ酸Ｖ４４１の欠失によってＣＡＲ相互作用が最も減少した。更にＫ４４２が欠失しても何等影響を与えなかった。ＫＯ１＋２（配列番号８）構築物においてＫＯ１（配列番号４）変異とＫＯ２（配列番号６）変異を組み合わせることでｗｔ活性の０．１％であって形質導入において最も高い１０００倍の減少を示されることが判明し、最も重要な変異はこの組み合わせと関連することが判った。更に形質導入効率の劇的な減少が、全ノブ領域を欠くＫＯ１１においてβ―ガラクトシダーゼ活性の１２５倍の減少することで判明した。それほど劇的ではないものの、ＫＯ３（配列番号３）、ＫＯ４（配列番号１８）及びＫＯ５（配列番号２０）においても顕著な減少が認められた。ＫＯ４＋５，ＫＯ８，ＫＯ９及びＫＯ１０では、ファイバー媒介形質導入及び遺伝子発現に殆ど又はまったく影響が認められなかった。各シュードタイプ化されたアデノウィルスベクターの野生型β―ガラクトシダーゼ活性に対する平均％を図にグラフ化した。
【００５９】
我々は更に、ｌａｃＺプロモーター遺伝子に対して陽性である細胞の割合を測定することで、シュードタイプ化されたＡｄ５．βｇａｌ．△Ｆ／ Ｆ＋の形質導入効率を分析した。これは、Ｘ−ｇａｌで形質導入した単層細胞を染色することで行った組織化学的データと化学発光データとは全ての変異体について一致した。細胞当たり１０００粒子で、ｐＤＶ６０でシュードタイプ化されたＡｄ５．βｇａｌ．△Ｆ／ Ｆ＋で感染したＨｅｌａ細胞は青い、即ち、Ｘ−ｇａｌ陽性細胞を示したのに対して、ｐＤＶ５５でシュードタイプ化されたＡｄ５．βｇａｌ．△Ｆ／ Ｆ−で感染した細胞の殆どが青くならなかった。予想された通り、劇的にβ―ガラクトシダーゼ活性が減少した（表２及び図２）、変異体ＫＯ１（配列番号４）、ＫＯ２ａ（配列番号１０）、ＫＯ２（配列番号６）及びＫＯ２ｃ（配列番号１４）は、青い細胞の数も非常に少なかった。ＫＯ４はβ―ガラクトシダーゼ活性及びＸ−ｇａｌ染色陽性細胞数において中程度の減少を示し、ＫＯ１０はどちらの測定においても形質導入効率に関して殆ど影響が認められなかった（図２）。
【００６０】
議論
選択的細胞形質導入への一つのアプローチは、ファイバー蛋白質を操作して、特定の細胞型に対する受容体特異性を再指示することである。このような標的化アデノウィルス遺伝子治療ベクターにとって二つの要請指向がある。その一つは天然の（元の）指向性を破棄することであり、二つ目には所望の標的細胞型に対する新たな指向性を導入することである。我々は、ウィルス粒子の状況下における変異ファイバー蛋白質を分析する新たなシステムを開発した。このシステムを使用して、ウィルス粒子内への取り込まれる能力は維持しながら、ＣＡＲとの相互作用が消滅したことによるファイバー媒介遺伝子移入における減少を示した数多くの変異ファイバー蛋白質を同定した。最も劇的な変異体はＫＯ１１（△４０４−５８１）及びファイバーＡＢループに局在化した変異（ＫＯ１：Ｓ４０８Ｅ；Ｐ４０９Ａ）（配列番号４）及びＣＤループ（ＫＯ２：△Ｖ４４１，Ｋ４４２）（配列番号６）であった。我々は、これらの双方の変異を含むシュードタイプ化したウィルス粒子を作成し、ウィルス形質導入効率における影響を直接示した。更に、Ａｄ５ファイバーのＣＤループにおけるウィルス形質導入に関わる新規な領域を同定した。この領域にアミノ酸変化を有する全ての変異体は、ファイバー媒介遺伝子移入における減少を示した。例えば、ＫＯ１＋２（配列番号８）、ＫＯ２（配列番号６）、ＫＯ２ａ（配列番号１０）、ＫＯ１（配列番号４）、ＫＯ２ｂ（配列番号１２）及びＫＯ２ｃ（配列番号１４）は１０００から１２倍の減少を示した。Ａ：Ｂループにおける２つのアミノ酸置換及びＣ：Ｄループにおける２つのアミノ酸欠失を含むＫＯ１＋２変異体は遺伝子移入において他のどの変異よりも大きな最も強力な減少を示した。これらのデータは、全体構造における単純な障害、又はこれら２つのループ領域の間にＣＡＲ結合における協力的な相互作用があることを示唆する。
【００６１】
ＫＯ２（△Ｖ４４１，Ｋ４４２）（配列番号６）及びＫＯ２ａ（△Ｖ４４１）（配列番号１０）変異体は形質導入効率における１６０倍よりも大きく顕著な減少を示した。この減少の一部は間違いなくウィルスキャプシド上の変異ファイバー蛋白質レベルが低いことによる。しかしながら、ＫＯ２変異と同一の変異がウィルスゲノム内へ遺伝的に導入されたウィルスについても形質導入効率における顕著な減少が示された。このウィルスはキャプシド上の変異バー蛋白質を完全に補うものであるにも拘わらず、試験した全ての細胞型における形質導入率が劇的に減少した。
【００６２】
アミノ酸変異△５０９−５１０（ＫＯ４）（配列番号１８）及び△５３８−５３９（ＫＯ５）（配列番号２０）は、野生型ファイバー蛋白質でシュードタイプ化したウイルス粒子と較べてＨｅｌａ細胞を形質導入する能力が減少した。これは、Ａｄ５ファイバーにおいて、隣接するモノマーにおけるこれらの残基がＣＡＲ結合に関与していることを示唆するものである。
【００６３】
細胞型特異的方法で形質導入するアデノウィルスにとっての第二の要請は、新規な指向性の導入である。最も効率な手段は、ファイバー遺伝子の遺伝的修飾である。Ｋｒａｎｓｎｙｋｈ， Ｄｍｉｔｒｉｅｖ， ｅｔ ａｌ． １９９８ には、ＨＩループが新規な受容体特異を挿入するためのファイバー蛋白質における適当な部位であることが示されている。例えば、ＨＩループに挿入されたｃＲＧＤリガンド（配列番号４３）（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ， Ｋｏｉｖｕｎｅｎ， ｅｔ ａｌ．１９９５） はＡｄの指向性をインビトロ（Ｄｍｉｔｒｉｅｖ， Ｋｒａｎｓｎｙｋｈ， ｅｔ ａｌ． １９９８）及びインビボ（ Ｒｅｙｎｏｌｄｓ， Ｄｍｉｔｒｉｅｖ， ｅｔ ａｌ． １９９９）で拡大することが示されている。本明細書に記載された一過性トランスフェクション／感染システムの一つの利点は、ＣＡＲに結合しないビリオンを増殖させる為にシュード（偽）受容体システムが必要ないことである。ＣＡＲ結合は効率的なウィルス生産に必要である。ファイバーＣＡＲ相互作用が破壊された高力価ベクターストックをそれに代わる細胞結合経路なしで生産することは困難である。一過性トランスフェクション／感染システムにおけるウィルス生産では、イントランスで発現したファイバーでシュードタイプ化したウィルスキャプシドを精製するただ一回の複製を含むのみである。従って、形質導入を媒介する能力に関して、ＣＡＲ結合変異体及びターゲッティングリガンドの組み合わせをより容易に試験することが可能となる。†表１中のアミノ酸残基数はＸｉａ ｅｔ ａｌ １９９４ による。
【００６４】
【表１】
2004512015.tif 000003
【００６５】
【表２】
2004512015.tif 000004
【００６６】
ＲＬＵ：比（相対）光単位。３つのウェルの平均を示す値。
†ファイバーアミノ酸残基数（Ｘｉａ ｅｔ ａｌ． １９９４）。
＊＊％ｗｔ（野生型）は、５−６の別個の形質導入において各ファイバー変異体でシュードタイプ化したＡｄ５．βｇａｌ．△Ｆのβｇａｌ活性＋平均（ＳＤ）を示す。全ての値は野生型（ｐＤＶ６０）を１００％として標準化してある。
＊非対称２テールｔ−テスト分析を用いてｗｔファイバーと有意差、ｐ＜０．００１。
【００６７】
実施例２
ｃＲＧＤターゲティング部分（モイエティ）及び△Ｖ４４１−Ｋ４４２（ＫＯ２）ＣＡＲ−結合変異を有するファイバーを含むＡｖ１ｎＢＧウィルスに関する記載
プラスミド記載
以下の３つのプラスミドを用いて修飾ファイバーを有する感染性アデノウィルスを救済した。ｐ５ＦｌｏｘＰＲＧＤはＡｄゲノム内に修飾ファイバーを取り込ませる為に使用するシャトルベクターである（図３）。それはＡｖ１ゲノムの右端からの最終の６ｋｂから成っている。ｌｏｘ部位がファイバー遺伝子の上流に挿入された。更に、Ａｄ５パーッケージングシグナルが右逆方向末端反復配列（ＲＩＴＲ）近傍に挿入された。ｐＡｖ１ｈｌｐｒは、右ＩＴＲを除いた全Ａｖ１ゲノムから成るヘルパープラスミドである（図４）。これは、Ｅ１領域に挿入された核局在β−ｇａｌ蛋白質をコードするレポーター遺伝子、Ｅ３領域に挿入されたＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子、及びｐ５ＦｌｏｘＰＲＧＤの場合と同じ場所に挿入されたｌｏｘ部位を有する。ＰＣｒｅ はＣｒｅリコンビナーゼ（組換え酵素）を構成的に発現するプラスミドである。それは、発現プラスミドｐｃＤＮＡ１．ｌｚｅｏ＋ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） 内にクローニングされたＣｒｅ遺伝子から成る。これらいずれのプラスミドもそれ自体では感染性Ａｄを生産することは出来ない。しかしながら、これら３種類のプラスミドが代償性細胞系にコトランスフェクションされると、Ｃｒｅ蛋白質がｐ５ＦｌｏｘＰＲＧＤ及びｐ Ａｖ１ｈｌｐｒ におけるｌｏｘ 部位の間で組換えを起こし、その結果、完全長のＡｖｌゲノムが再構成され、感染性ウィルスを産生可能となる。
【００６８】
ＫＯ２ファイバー変異体の生成：
ｐ５ＦｌｏｘＰＲＧＤ アデノウィルスシャトルプラスミドを鋳型として用いて、全てのアミノ酸変化をファイバー遺伝子内に取り込ませた。このシャトルプラスミドは、ＨＩループに挿入されたｃＲＧＤペプチド配列、ＨＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号４３）、を含むファイバーをコードしている。このｃＲＧＤペプチド配列は細胞上のαｖ−インテグリンに結合することが判明している。このファイバー遺伝子のＣＤループ内のアミノ酸残基Ｖ４４１及びＫ４４２をＱｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ部位特異的変異生成システム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）を用いて欠失させた。これら残基の欠失によりアデノウイルス受容体であるＣＡＲを発現するＨｅｌａ細胞系への一過性トランスフェクション／感染における形質導入が劇的に阻害されることが示された。得られたシャトルプラスミドはｐＫＯ２（図５）と命名された。
【００６９】
ＣＤループ変異を有するアデノウィルス生成：
変異ファイバー遺伝子はｃｒｅ−ｌｏｘ 組換えによるアデノウィルスＤＮＡバックボーンに取り込まれた。これを行なうために、ｐＫＯ２シャトルプラスミド及びｐＡｖ１ｈｌｐｒヘルパープラスミドをｐＣｒｅ と共に、野生型ファイバーを発現する細胞系である６３３細胞（Ｖｏｎ Ｓｅｇｇｅｒｎ， Ｈｕａｎｇ， ｅｔ ａｌ．２０００）内にコトランスフェクションした。ｐＣｒｅからのＣｒｅ組換え酵素の発現によりｐＫＯ２及びｐＡｖ１ｈｌｐｒにおけるｌｏｘ 部位の間で組換えが起こり、その結果、β−Ｇａｌ トランスジーンをＥ１領域に含む完全長を有するＡｖｌウィルスＤＮＡが得られた。この６３３代償性細胞系において、ウィルスＤＮＡは野生型及び変異ファイバーの混合物を含む感染性ウィルス粒子内にパッケージされることが可能となる。細胞変性効果を観察した後、ウィルスを標準ＣｓＣｌ遠心操作で精製した。このウィルスはＡｖｌｎＢｇＨＩＲＧＤＫＯ２ （６３３） と命名された。△Ｖ４４１及び△Ｋ４４２変異（配列番号６）を有するアデノウィルス変異ファイバー遺伝子のみを含むウィルス粒子を得る為に、このウィルス調製物を用いて、ファイバーを発現しないＡＥ１−２ａ細胞（Ｇｏｒｚｉｇｌｉａ， Ｋａｄａｎ， ｅｔ ａｌ．１９９６）に感染させた。ウィルス粒子を上記のように精製した。このウィルスをＡｖｌｎＢｇＨＩＲＧＤＫＯ２と命名した。
【００７０】
ＡｖｌｎＢｇＨＩＲＧＤＫＯ２における比較ファイバー取り込み：
ＡｖｌｎＢｇＨＩＲＧＤＫＯ２ウィルス粒子における変異ファイバーのレベルが野生型ファイバーレベルを有するウィルスに対して正常であることを確認するために、ウェスタンブロット分析を実施した。等量のＡｖｌｎＢｇ及びＡｖｌｎＢｇＨＩＲＧＤＫＯ２をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。このゲルを膜に写し、ウサギ抗Ａｄ５ファイバーポリクローナル抗血清及びウサギ抗Ａｄ５ペントンポリクローナル抗血清でインキュベートした。ＡｖｌｎＢｇＨＩＲＧＤＫＯ２ウィルス粒子におけるファイバー／ペントン比はＡｖｌｎＢｇのそれと差異がなく、ウィルスキャプシド上に集合したファイバ蛋白質のレベルにファイバー変異は何等影響を与えないことが示された。
【００７１】
ＡｖｌｎＢｇＨＩＲＧＤＫＯ２の形質導入効率：
実施例１で既に示されたように、ＣＤループにおけるＶ４４１及びＫ４４２の欠失を伴うファイバー蛋白質でシュードタイプ化されたアデノウィルスは、ＣＡＲ発現細胞系Ｈｅｌａにおける遺伝子移入（侵入）を媒介する能力に深刻な影響を受けている。これらの変異体ウィルスによる遺伝子移入が別のリガンド／受容体相互作用に媒介されていることを試験するために、ＡｖｌｎＢｇＨＩＲＧＤＫＯ２ウィルスがＨＤＦ、Ｈｅｌａ，ＰＣ３及びＣＨＯ−Ｋ１細胞系に形質導入する能力に関して試験した（図６）。これら全ての細胞はその細胞表面上にαｖ−インテグリンを発現しており、Ｈｅｌａを除き、ＣＡＲレベルが欠失しているとが知られているか又はそのように予想されているために、形質導入が非常に低いことを示した。
【００７２】
野生型ファイバーであるＡｖｌｎＢｇによる形質導入は、予想されたように、ＨＤＦ，ＰＣ３及びＣＨＯ−ＫＩで特に非効率であった（図６）。ＨＩループにＲＧＤを有するＡｖｌｎＢｇＨＩＲＧＤはかなり高い効率でＨＤＦ，ＰＣ３及びＣＨＯ−ＫＩに形質導入した。しかしながら、ＡｖｌｎＢｇＨＩＲＧＤＫＯ２ウィルスにおけるように、ｃＲＧＤがＶ４４１及びＫ４４２欠失の状況（環境）下におかれると、形質導入効率は不十分なままであった。ＨＤＦ及びＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＡｖｌｎＢｇＨＩＲＧＤＫＯ２形質導入のレベルはＡｖｌｎＢｇに似ており、ＰＣ３細胞においてはより低かった。
【００７３】
αｖ−インテグリンを介して細胞へ形質導入するＡｖｌｎＢｇＨＩＲＧＤＫＯ２形質導入能力が減少したことは、ＲＧＤターゲティング部分における欠陥によるものではない。ＡｖｌｎＢｇＨＩＲＧＤＫＯ２が６３３細胞から精製された場合に得られるウィルスであるＡｖｌｎＢｇＨＩＲＧＤＫＯ２（６３３） は６３３細胞によって発現される野生型ファイバーとアデノウィルスゲノムから発現される変異ファイバーの混合物である。ビリオン表面に両方の型のファイバーを有するこのウィルスはＨＤＦ細胞への形質導入を効率的に媒介することが出来る。このことは、ファイバー内のＲＧＤは、たとえＶ４４１及びＫ４４２欠失の状況（環境）下におかれてもＨＤＦ細胞への形質導入を媒介することが可能であることを示している。
【００７４】
更に、Ｖ４４１及びＫ４４２欠失を含むファイバーのおけるＲＧＤが機能的であることを示すために、競合的実験を実施した（図７）。コンペティター（競合体）であるＡｖｌｎＢｇ、 ＡｖｌｎＢｇＨＩＲＧＤ 又はＡｖｌｎＢｇＨＩＲＧＤＫＯ２ の存在下でＨＤＦ細胞をＡｖｌｎＧＦＰＨＩＲＧＤ で形質導入した。ＧＦＰ陽性細胞の割合を測定した。これら３つ全てのウィルスはＡｖｌｎＧＦＰＨＩＲＧＤ ウィルスが遺伝子移入をする能力を匹敵する程度に阻害することに成功した。
【００７５】
本発明者はこれらの実験から、Ｖ４４１及びＫ４４２欠失を含むファイバーにおけるＲＧＤターゲティングリガンド配列は、（ＡｖｌｎＧＦＰＨＩＲＧＤの形質導入を阻害したことにより）αｖ−インテグリンを介して細胞へ形質導入する能力に関して機能的であり（図４）、（６３３細胞から精製したウィルスによるＨＤＦ細胞への形質導入が可能であることから）ＣＡＲが低い細胞への形質導入の能力に関して機能的であるものと結論する。
【００７６】
まとめると、ＣＤループ変異、△Ｖ４４１，Ｋ４４２（配列番号６）を有するファイバーでシュードタイプ化することにより、遺伝子移入を媒介するウィルスの能力が劇的に減少することに関して記載した。ここに、ファイバー遺伝子にＶ４４１，Ｋ４４２欠失及びＲＧＤ挿入を含むウィルスゲノムが救済されることを示した。このウィルスをＡｖｌｎＢｇＨＩＲＧＤＫＯ２を命名した。変異ファイバー蛋白質は野生型からのレベルと差異のないレベルでウィルス粒子内に取り込まれる。２つの実験が示したように、ＡｖｌｎＢｇＨＩＲＧＤＫＯ２内のＲＧＤターゲティングリガンドは機能的である。第一に、ＡｖｌｎＢｇＨＩＲＧＤＫＯ２はＣＡＲが低くαｖ−インテグリンが高いＨＤＦ細胞へのＡｖｌｎＧＦＰＨＩＲＧＤの形質導入と競合することが出来た。第二に、ＲＧＤターゲティングリガンドを介するＨＤＦ細胞におけるＡｖｌｎＢｇＨＩＲＧＤＫＯ２のリターゲティングを達成することは出来たが、それは野生型ファイバーを発現する細胞内でのウィルスの増殖に依存する（必要とする）ものであった。本発明者は、Ｖ４４１及びＫ４４２の欠失が劇的にＣＡＲ発現細胞への形質導入を媒介する能力を減少させ、これらの欠失及び別のターゲティングリガンドを含むファイバーが機能的であるものと結論する。
【００７７】
実施例３
Ｓ４０８Ｅ、Ｐ４０９Ａ（ＫＯ１）ＣＡＲ結合変異を含み、且つ、ｃＲＧＤターゲティング部分（モイエティ）を有するか又は有さないファイバーを含むアデノウィルスに関する記載
ＫＯ１ファイバー変異とｃＲＧＤターゲティング部分との組み合わせの遺伝的取り込みによるＡｖｌｎＢｇＫＯ１ＲＧＤの作成
実施例２に記載のように、ｐ５ＦｌｏｘＰＲＧＤ アデノウィルスシャトルプラスミドを鋳型として用いて、全てのアミノ酸変化をファイバー遺伝子内に取り込ませた。このシャトルプラスミドは、ＨＩループに挿入されたｃＲＧＤペプチド配列、ＨＣＤＣＲＧＤＣＦＣ、を含むファイバーをコードしている。このｃＲＧＤペプチド配列は細胞上のαｖ−インテグリンに結合することが判明している。このファイバー遺伝子のＡＢループ内のアミノ酸残基４０８及び４０９をＱｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ部位特異的変異生成システム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）を用いて変更した。これら残基の置換によりアデノウイルス受容体であるＣＡＲを発現するＨｅｌａ細胞系への一過性トランスフェクション／感染における形質導入が劇的に阻害されることが示された。得られたシャトルプラスミドはｐＳＫＯ１（図８）と命名された。変異ファイバー遺伝子及びｃＲＧＤターゲティング部分はｃｒｅ−ｌｏｘ 組換えによりアデノウィルスＤＮＡバックボーンに取り込まれた。これを行なうために、実施例２に示したように、ｐＳＫＯ１シャトルプラスミド（図８）及びｐＡｖ１ｈｌｐｒプラスミド（図４）をｐＣｒｅ と共に、野生型ファイバーを発現する細胞系である６３３細胞（Ｖｏｎ Ｓｅｇｇｅｒｎ， Ｈｕａｎｇ， ｅｔ ａｌ．２０００）内にコトランスフェクションした。ｐＣｒｅからのＣｒｅ組換え酵素の発現によりｐＳＫＯ１及びｐＡｖ１ｈｌｐｒにおけるｌｏｘ 部位の間で組換えが起こり、その結果、β−Ｇａｌ トランスジーンをＥ１領域に含む完全長を有するＡｖｌウィルスＤＮＡであるＡｖｌｎＢｇＫＯ１ＲＧＤが得られた。このウィルスのキャプシドは野生型及び変異ファイバー蛋白質の両方を含むものとなる。ＫＯ１変異及びＲＧＤ部分のみを含むウィルス粒子を得るために、ウィルス調製物を用いてファイバーを発現しないＡＥ−１−２ａ細胞（Ｇｏｒｚｉｇｌｉａ， Ｋａｄａｎ， ｅｔ ａｌ．１９９６）に感染させた。
【００７８】
ＫＯ１ファイバー変異のアデノウィルス内への遺伝子取り込み：
ＫＯ１変異のみ遺伝的にアデノウィルスゲノムに取り込みＡｖ３ｎＢｇＦＫＯ１を作成した。ＫＯ１変異は完全長Ａｖ３ アデノウィルス（Ｇｏｒｚｉｇｌｉｚ， Ｋａｎｄａｎ ｅｔ ａｌ． １９９６） を有するプラスミド内にクローニングしてｐＦＬＡｖ３ｎＢｇＦＫＯ１（図９）を作成した。ファイバー代償性細胞系である６３３細胞にトランスフェクションし、ＫＯ１変異を有するウィルスＤＮＡは、野生型ファイバー及び変異ファイバー蛋白質の双方を有する感染性ウィルス粒子内にパッケージングされることが出来る。ＣＰＥ（細胞変性効果）を観察した後、標準的なＣＳＣｌ遠心分離操作によってこれを精製した。Ｓ４０８Ｅ及びＰ４０９Ａを有する変異ＫＯ１ファイバー蛋白質にコードされるアデノウィルスのみを有するウィルス粒子調製物を得るために、ウィルス調製物を用いてファイバーを発現しないＡＥ−１−２ａ細胞（Ｇｏｒｚｉｇｌｉａ， Ｋａｄａｎ， ｅｔ ａｌ．１９９６）に感染させた。ウィルス粒子は上記のように精製した。
【００７９】
ＫＯ１ファイバー変異及びｃＲＧＤターゲティング部分の機能及び特異性を示す研究に幾つかの組換えアデノウィリスベクターを用いた。これらのベクターを以下の表３に示す。
【００８０】
【表３】
2004512015.tif 000005
【００８１】
ＡＢループ変異を有するアデノウィルスベクターの形質導入効率
実施例１で既に示されたように、ＡＢループにおけるＳ４０８Ｅ及びＰ４０９Ａの置換を伴うファイバー蛋白質でシュードタイプ化されたアデノウィルスは、ＣＡＲ発現細胞系Ｈｅｌａにおける遺伝子移入（侵入）を媒介する能力に深刻な影響を受けている。これらのＫＯ１変異の機能及び特異性、並びに、別のリガンド／受容体相互作用により効率的な遺伝子移入が回復されることを示すために、本発明者は、ＫＯ１含有組換えベクターが様々な細胞型に形質導入する能力に関して試験した。表３に挙げた４種類のベクターにつき、Ｈｅｌａ細胞、ヒト２倍体繊維芽細胞（ＨＤＦ）、２種類の異なるヒト肝がん細胞系であるＨｅｐ３Ｂｓ及びＨｅｐＧ２ｓ、並びにマウス肝細胞系であるＦＬ８３ｂに対する形質導入効率に関して比較した。細胞を２４ウェルディッシュに各ウェル当たり１−２ｘ１０５個で接種した。翌日、各細胞型について、代表的なウェルを計数することによって各細胞系の正確なウェル当たり細胞数を測定した。４種類のベクターを使用して、様々な細胞当たりの粒子数（ＰＰＣ）で各細胞に形質導入した。形質導入の２４時間後に細胞をＸ−ｇａｌで染色し、顕微鏡下で細胞を計数してβ―ガラクトシダーゼ発現細胞の割合を測定した。青色細胞を各ウェルにおいて６つの異なる視野にて計測した。各視野当たりの全細胞数はある細胞型についてウェル全体に亘って同一であると仮定して、１つのウェルからの３つの視野における全細胞数を計測して各視野当たりの細胞全数を決定した。その結果、Ａｖ３ｎＢｇＦＫＯ１によるＨｅｌａ細胞、Ｈｅｐ３Ｂｓ、ＨｅｐＧ２ｓ、及びＦＬ８３ｂ細胞への形質導入は、Ａｖ３ｎＢｇと比較して劇的に減少したことが判明した（図１０及び１１）。細胞表面にＣＡＲを殆ど又は全く発現しないＨＤＦはＡｖ３ｎＢｇＦＫＯ１及びＡｖ３ｎＢｇのいずれによっても殆ど形質導入されなかった（図１０Ｂ）。予想されたように、ＨＤＦへの効率的な形質導入がＨＩループにおけるｃＲＧＤリガンドを含む２つのベクター、Ａｖ１５ＦＨＩＲＧＤ及びＡｖｌｎＢｇＫＯ１ＲＧＤを用いることにより観察された。
【００８２】
上記研究において観察された形質導入がファイバー―ＣＡＲ相互作用により媒介されているか否かを決定するために、完全長ファイバー蛋白質又はファイバーノブを蛋白質コンペティター（競合体）として使用し、Ｈｅｌａ細胞を用いた競合的実験を実施した（図１２）。競合は、ベクターで感染させる前に、４０μｇ／ｍｌの完全長ファイバー、又は１６μｇ／ｍｌのファイバーノブを５分間室温で直接細胞に添加することで実施した。得られた結果によれば、完全長ファイバー又はファイバーノブはＡｖ３ｎＢｇによる形質導入を有効に阻害することが出来た。しかしながら、Ａｖ３ｎＢｇＦＫＯ１による細胞への低い形質導入レベルは完全長ファイバー又はファイバーノブにより阻害されなかった。この結果は、低いレベルのＡｖ３ｎＢｇＦＫＯ１による細胞への形質導入はファイバーＣＡＲ相互作用を媒介するものでないことを示すものである。同様な結果が、ヒト肝細胞に関しても得られた。マウス肝細胞におけるＡｖ３ｎＢｇＦＫＯ１のファイバー競合は、競合体非存在下における形質導入が殆ど検出できないために、評価されなかった。
【００８３】
ＫＯ１ファイバー変異を含むアデノウィルスベクターのインビボ分析
アデノウィルスベクターの効率的なインビボターゲティングには、正常な指向性 （ｔｒｏｐｉｓｍ） の破棄と新たな指向性の付加が必要とされる。本発明者はこれら両方の要求が満たされるように設計されたアデノウィルスベクターを作成した。表３参照のこと。正常な指向を破棄するために、アデノウィルス蛋白質を遺伝的に修飾し、ＣＡＲ（コクサッキーアデノウィルス受容体）との相互作用をノックアウトした。異なる受容体にベクターを再度ターゲティングさせるために、ｃＲＧＤターゲティング部分をファイバーノブのＨＩループ内に挿入した。インビトロにおける研究によって、ファイバーノブにＣＡＲとの相互作用をノックアウトする変異を有するアデノウィルスベクターは、標的細胞に感染することが出来ないことが示された。ＫＯ１と呼ばれる一つのファイバーノックアウト変異体はＨｅｌａ細胞への形質導入が野生型ファイバーを有するベクターを用いた場合の形質導入レベルの１．４％まで減少した。更に、インビトロのデータによれば、ｃＲＧＤリガンドをＫＯ１変異体のＨＩループに挿入することによって野生型ベクターに見られるレベルに匹敵するレベルまで形質導入が回復した。次にこれらのベクターをＣ５７ＢＬ／６雄マウスを用いてインビボ分析し、肝臓へのデターゲティングの程度を評価し、尾への静脈注射後のこおようなベクターの組織への分配を測定しｃＲＧＤターゲティングリガンドをＨＩループに挿入したことによって肝臓への形質導入が回復されたか否かを測定した。
【００８４】
インビボ研究の設計
夫々５匹のマウスから成る５つの集団を用いた。核標的化したβ−ガラクトシダーゼ（ｎＢｇ）をコードするアデノウィルスベクターを尾への静脈注射により投与した。投与量は、キログラム当たり１Ｘ１０３粒子であった。ベクター投与の３日後にマウスを殺した。肝臓、心臓、腎臓、及び脾臓を含む組織を回収した。肝臓への形質導入及びベクターバイオ分布、を評価するのに、ヘキソンＰＣＲ分析、β―ｇａｌ免疫組織化学的分析及びβ―ｇａｌトロピックス （Ｔｒｏｐｉｘ） アッセイ等の幾つかのアッセイを使用した。マウスのグループの一つは、アデノウィルスベクターの代わりにハンクス平衡塩緩衝液（ＨＢＳＳ）を投与され陰性（ネガティブ）コントロールとして使用した。第二番目の集団は、野生型ファイバー蛋白質を含むＡｖ３ｎＢｇ を投与され、陽性（ポジティブ）コントロールとして使用した。第三番目のグループにはＡｖ３ｎＢｇＦＫＯ１ 、第四番目のグループにはＡｖｌｎＢｇＫＯ１ＨＩｃＲＧＤ、そして第五番目のグループにはＡｖｌｎＢｇＨＩｃＲＧＤ、が夫々投与された。
【００８５】
ウィルス調製：
各ベクターを滅菌ＨＢＳＳに希釈し、最終濃度を１ｘ１０１２粒子／ｍｌとした。グループ２から６のマウスに１０ｍｌ／ｋｇを投与し、ベクター投与量として１ｘ１０１３粒子／ｋｇ
達成した。ＨＢＳＳコントロールグループには等しい量の投与を実施した。
【００８６】
技術方法：
コントロール及び試験粒子は静脈内ボーラス注射によった。投与量は投与する日の体重から決めた。ベクター投与の約７２時間後に二酸化炭素窒息により殺した。各動物の肝臓、心臓、腎臓、及び脾臓を含む組織を回収した。各組織から２−３ｍｍ厚の切片を中性緩衝ホルマリンに入れ、β−ガラクトシダーゼ免疫組織化学用に試料として保存した。最適組織学のために、各肝葉、肺葉、全腎臓、脾臓の末端断片、及び縦方向に切断した心臓の一片を同じ中性緩衝ホルマリンに入れた。各器官の残りの組織は１ｍｌ凍結バイアルに入れ、ドライアイスで凍結し、ベクター含量を測定するためのヘキソンＰＣＲ分析用に保存した。肝臓の各葉の組織片はドライアイス中で凍結してヘキソンＰＣＲ分析用に保存した。その他の組織片はトロピックス （Ｔｒｏｐｉｘ）バイアル内に入れ、ドライアイス上で凍結した。
【００８７】
β―ガラクトシダーゼ発現の免疫組織化学的染色の結果によれば、Ａｖ３ｎＢｇ 、Ａｖ３ｎＢｇＦＫＯ１ 、Ａｖｌｎ１５ＦＨＩＲＧＤ、及びＡｖｌｎＢｇＫＯ１ＲＧＤの全てが肝細胞への効率的な形質導入を引き起こしたことが示された。Ａｖ３ｎＢｇＦＫＯ１ではβ―ガラクトシダーゼ発現細胞の割合がより高く、Ａｖ３ｎＢｇでの染色よりもその強度が強かった。この結果は、培養における様々な細胞へのＡｖ３ｎＢｇＦＫＯ１による形質導入が劇的に減少したことを考えると、全く予想外のことであった。化学発光アッセイ（図１３）によるマウス肝臓におけるβ―ガラクトシダーゼ発現の評価によってこの免疫組織学的染色の結果が確認された。Ａｖ３ｎＢｇＦＫＯ１を投与されたマウスはＡｖ３ｎＢｇを投与されたマウスよりも高いレベルの発現を示した。肝細胞におけるベクター含量が半定量的ヘキソンＰＣＲアッセイ（図１４）により測定された。得られた結果は上記の免疫組織学化学的染色及び化学発光アッセイの結果と一致した。肝細胞におけるベクター含量は、Ａｖ３ｎＢｇＦＫＯ１を投与されたマウスにおいてＡｖ３ｎＢｇを投与されたマウスよりも約３５％高いものであった。
【００８８】
まとめ
Ａｖ３ｎＢｇＦＫＯ１に含まれるファイバーＡＢ変異はヒト及びマウスＣＡＲとの相互作用をインビトロにおいて破壊する。しかしながら、インビボにおいては、このファイバーＡＢループ変異は全く予期しなかったことに、肝臓及び他の器官に対するアデノウィルス媒介遺伝子移入を劇的に増大させ、ベクター能力を増加させた。このファイバー修飾はインビボ遺伝子治療の戦略に有益であり、全身投与に使用されるアデノウィルスベクターの投与量をより低くすることが出来るであろう。
【００８９】
実施例４
３つの異なるマウス株におけるＡｖ３ｎＢｇＦＫＯ１の使用による肝臓形質導入の増大
以下の実験は、肝細胞におけるベクター含量が観察された肝臓における形質導入がＡｖ３ｎＢｇで観察されたものよりも増大したことが、様々なマウス株で再現されるか否かを確かめるものである。
【００９０】
ＫＯ１ファイバー変異を含むアデノウィルスベクターのインビトロ分析
Ｃ５７ＢＬ／６、バルブ（Ｂａｌｂｃ）、及びＣＤ１雄マウスをＨａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕ Ｄａｗｌｅｙ （Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ） から購入した。マウスが５週令になった時点で、ＨＢＳＳ（ビークルコントロール）、Ａｖ３ｎＢｇ 又はＡｖ３ｎＢｇＦＫＯ１を、マウス１匹当たり約２ｘ１０１１粒子に相当する体重ｋｇ当たり１ｘ１０１３粒子の投与量で尾静脈注射で与えた。５匹から成る集団に各処理を施した。ベクターは注射の直前にハンクス平衡塩緩衝液（ＨＢＳＳ）を用いて１ｘ１０１２粒子／ｍｌに希釈した。ベクター運搬の３日後に、動物を殺し、肝臓、心臓、腎臓、及び脾臓を含む組織を回収した。
【００９１】
ガラクトーライトプラス（商標）化学発光アッセイの技術方法：
上記試料を用いて、ガラクトーライトプラス（商標）化学発光アッセイ（Ｔｒｏｐｉｘ， Ｉｎｃ．， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ） システムによるβ−ガラクトシダーゼ発現を分析した。これら試料を２つのセラミック球（Ｂｉｏ１０１， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）溶解マトリックス試験管に回収し、ドライアイス上で凍結した。組織を融解し、ガラクトーライトプラスキットからの溶解緩衝液（５００μｌ）を各試験管に添加した。ファストプレプシステム（ＦａｓｔＰｒｅｐＳｙｓｔｅｍ）（Ｂｉｏ１０１， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ） を用いて組織を３０秒間ホモゲナイズした。肝臓の試料については更に３０秒間ホモゲナイズした。これら組織溶解物のβ−ガラクトシダーゼ活性は製造者の指示に従ってアッセイした。
【００９２】
結果
得られた結果（図１５）によれば、平均して、Ａｖ３ｎＢｇＦＫＯ１ はＡｖ３ｎＢｇに較べて、３つの全てのマウス株において、肝臓への形質導入レベルが高いことが示された。
【００９３】
β−ガラクトシダーゼ免疫組織化学の技術方法：
更に、各組織から２−３ｍｍ厚の切片を１０％中性緩衝ホルマリンに入れた。固定した後、これらの試料をパラフィンに包埋し、切断し、β−ガラクトシダーゼ発現について免疫組織化学により分析した。１：１２００希釈のウサギ抗β−ガラクトシダーゼ抗体（ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．， Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ， ＣＡ）をＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． （Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ） からのＶｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ キットと共に用いて陽性細胞を視覚化した。
【００９４】
結果
得られた結果によれば、平均して、Ａｖ３ｎＢｇＦＫＯ１ はＡｖ３ｎＢｇに較べて、３つの全てのマウス株において、肝細胞への形質導入レベルが高いことが示された。
【００９５】
実施例５
Ａｖ３ｎＢｇと較べて相対的に低いＡｖ３ｎＢｇＦＫＯ１の培養における初代マウス肝細胞への形質導入
初代マウス肝細胞におけるＡｖ３ｎＢｇ及びＡｖ３ｎＢｇＦＫＯ１の形質導入を評価した。
【００９６】
初代マウス肝細胞の単離及び培養
初代マウス肝細胞を発表されている操作 （Ｓｅｇｌｅｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９７３， １３：２９−８３； Ｌｉｄｄｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｇａｓｔｒｏ Ｈｅｐａｔｏｌ １９９８， １３：８５５−８５８； Ｍａｒｃ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０００， ２６７：９６３−９７０） を変更して、門静脈を介した２段階コラゲナーゼ灌流に従って、成獣の雄ＣＤ−１マウスから単離した。肝臓をその場で肝臓灌流液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）で灌流し、肝臓消化（コラゲナーゼ−ディスパーゼ：Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ） で処理した。肝臓を細かく刻み、細胞を洗浄し、肝細胞洗浄液（濃縮Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓＥ； Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で３回遠心分離した後、肝細胞付着液（１％ペンストレップ（ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ）及び５％ＦＢＳ添加の変性Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓＥ； Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁した。生存率はトリパンブルーエクスクルージョンで評価した。１ウェル当たり約１ｘ１０５個の生存細胞をコラーゲンＩ型で被覆した２４ウェルプレートに蒔き、３７℃、５％ＣＯ２下で２時間付着させた。２時間後に、付着していない細胞及び培地を除去し、細胞を洗浄し、ＨｅｐａｔｐＺＹＭＥＳＦＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。アルブミンの免疫組織化学的染色によってこれらの細胞が肝細胞であることを確認した。
【００９７】
初代マウス肝細胞に対する形質導入効率
上記プレーティングの２４時間後に、アデノウィルスベクターであるＡｖ３ｎＢｇＦＫＯ１及びＡｖ３ｎＢｇを、細胞当たり０〜１２，５００の範囲の様々な粒子数を用いて細胞に形質導入した。培養培地（全量０．２ｍｌ）中で細胞をアデノウィルスベクターと３７℃で１時間インキュベートさせた。次に、細胞単層をＰＢＳで１回洗浄し、適当な培養培地（１ｍｌ）を各ウェルに添加した。これらの細胞を２４時間培養してβ−ガラクトシダーゼを発現させた。細胞単層を固定し、Ｘ−ｇａｌで２４時間染色した。形質導入の割合は、Ｎｉｋｏｎ ＣＬ１ 顕微鏡を用いて、ハイパワー視野における全細胞数に対する形質導入された青い細胞の数を、１ウェル当たり３つの視野を計測することによる光学顕微鏡で測定した。各ベクター投与量で３回行い、ハイパワー視野当たりの形質導入の平均割合（ｎ＝３）を測定した。少なくとも３回の独立した実験から得られた平均％形質導入を求めた。
【００９８】
結果
結果（図１６）によれば、Ａｖ３ｎＢｇと較べてＡｖ３ｎＢｇＦＫＯ１の培養における初代マウス肝細胞への形質導入が劇的に低下することが示された。
【００９９】
参照文献
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【０１００】
本明細書に引用される刊行物及び公開特許明細書は、本発明が関連する技術分野の技術水準を示す為に、参照されることでその全ての開示内容が取り込まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、一過性のトランスフェクション／感染システムを用いて、一過的に発現されるファイバー蛋白質を有するシュードタイプ（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅ）化されたアデノウィルスベクターの作成に用いられた戦略を示す。図１Ａは、ファイバーが欠落したＡｄベクターはＡｄ５．βｇａｌ．△Ｆゲノム構造の模式図である。図１Ｂは一過性のトランスフェクション／感染システムを示す。パネルＡに示したように、ファイバーが欠落したＡｄベクターであるＡｄ５．βｇａｌ．△Ｆは、異なるファイバー蛋白質を一過的又は安定的に発現するパッケージング細胞系において増殖することができ、Ａｄ５．βｇａｌ．△Ｆ／ Ｆ＋ファイバー含有アデノウィルス粒子を生成する。このベクターは、ファイバー発現プラスミドでトランスフェクションさせた２９３Ｔ細胞を感染するために使用される。得られた粒子はファイバー蛋白質上に新たな受容体指向性を有する。
【図２】シュードタイプ化されたアデノウィルスベクターを用いて、Ｈｅｌａ細胞に対する、異なるファイバー蛋白質に依存したアデノルス形質導入特性を示す。Ｈｅｌａ細胞当たり１０００粒子で、夫々シュードタイプ化されたＡｄ５．βｇａｌ．△Ｆ／ Ｆ＋で感染した。２４時間後に、化学発光レポーターアッセイによる細胞のβ−ガラクトシダーゼ活性について分析した。変異ファイバー蛋白質を有するシュードタイプ化された各アデノウィルスベクターの相対的β−ガラクトシダーゼ活性を測定し、野生型ファイバー蛋白質を有するＡｄ５．βｇａｌ．△Ｆ／ ｗｔに対する％で標準化した。全ての値は５〜６回の独立した形質導入から得られたＡｄ５．βｇａｌ．△Ｆ／ ｗｔの平均％＋標準偏差（ｓｄ）である。
【図３】図３は、ｐ５ＦｌｏｘＰＲＧＤ のプラスミド図である。
【図４】図４は、ｐＡｖｌｈｌｐｒ のプラスミド図である。
【図５】図５は、ｃＲＧＤターゲティング部分とファイバー変異を有するｐＳＫＯ２ のプラスミド図である。
【図６Ａ，Ｂ】図６は、リターゲティング（ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ） リガンドとデターゲティング（ｄｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ）ファイバー蛋白質を有するアデノウィルスの形質導入効率を示す。ＨＤＦ（Ｆｉｇ．６Ａ）、Ｈｅｌａ（ＦＩｇ．６Ｂ）、ＣＨＯ−Ｋ１（Ｆｉｇ．６Ｃ）及びＰＣ３（Ｆｉｇ．６Ｄ）細胞を、５倍ごとの投与量増加を伴う細胞当たりの粒子全数２０〜１２５００で夫々示されたファイバー修飾アデノウィルスで感染させた。ＡｖｌｎＢｇは未修飾ファイバー遺伝子を有する親コントロールである。ＡｖｌｎＢｇＨＩＲＧＤはＨＩループにおいてｃＲＧＤを含有するように遺伝的変更を受け、ＡｖｌｎＢｇＨＩＲＧＤＫＯ１はＨＩループにおけるｃＲＧＤ及びファイバーノブにおけるＳ４０８Ｅ，Ｐ４０９Ａ変異を含有するように遺伝的変更を受け、そして、ＡｖｌｎＢｇＨＩＲＧＤＫＯ２はＨＩループにおけるｃＲＧＤ及びファイバーノブにおける△Ｖ４４１，Ｋ４４２変異を含有するように遺伝的変更を受けている。２４時間後、化学発光レポーターアッセイにより各細胞をβ−ガラクトシダーゼレポーラー遺伝子活性について分析した。
【図６Ｃ，Ｄ】同上。
【図７】図７は、ＨＤＦ細胞への形質導入に関して、ＡｖｌｎＢｇＨＩＲＧＤＫＯ２がＡｖｌＧＦＰＨＩＲＧＤと競合することを示す。ｃＲＧＤをＨＩループに含むように遺伝的に変更され、ＧＦＰを発現するアデノウィルスベクターであるＡｖｌＧＦＰＨＩＲＧＤを用いて細胞当たり１０００粒子でＨＤＦ細胞を感染させた。感染をＡｖｌｎＢｇ， ＡｖｌｎＢｇＨＩＲＧＤ， ＡｖｌｎＢｇＨＩＲＧＤＫＯ１， 及びＡｖｌｎＢｇＨＩＲＧＤＫＯ２ を４倍ごとの投与量増加を伴う細胞当たりの粒子全数１０００〜１２８，０００で競合させた。２４時間後、ＦＡＣＳ分析により、ＧＦＰ発現に関して陽性である細胞の分画を測定することにより、ＧＦＰ発現を分析した。データは競合体なしでのＡｖｌＧＦＰＨＩＲＧＤに対する％で標準化した。
【図８】図８は、ｃＲＧＤターゲティング部分とファイバー変異を有するｐＳＫＯ１のプラスミド図である。
【図９】図９は、ＫＯ１ファイバーＡＢループ変異を有する完全長アデノウィルスゲノムを含むｐＦＬＡｖ３ｎＢｇＫＯ１のプラスミド図である。
【図１０】図１０は、ファイバーＡＢループ変異を有するアデノウィルスベクターを用いたＨｅｌａ細胞（Ｆｉｇ．１０Ａ）及びＨＤＦ細胞（Ｆｉｇ．１０Ｂ）への形質導入効率を示す。
【図１１】図１１は、ファイバーＡＢループ変異を有するアデノウィルスベクターを用いたＨｅｐ３Ｂ細胞（Ｆｉｇ．１１Ａ）及びＨｅｐＧ２細胞（Ｆｉｇ．１１Ｂ）及びマウス肝細胞（Ｆｉｇ．１１Ｃ）への形質導入効率を示す。
【図１２】図１２は、競合ウイルス形質導入アッセイを示す。
【図１３】図１３は、マウス肝臓におけるβ−ガラクトシダーゼ活性分析による、インビボでのアデノウィルス媒介によるβ−ガラクトシダーゼの発現を示す。
【図１４】図１４は、マウス肝臓におけるヘキソンＰＣＲ分析による、マウス肝臓のアデノウィルス媒介によるインビボ形質導入示す。
【図１５】図１５は、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｂａｌｂ／Ｃ及びＣＤ−１マウス肝臓における、β−ガラクトシダーゼ活性分析による、インビボでのアデノウィルス媒介によるβ−ガラクトシダーゼの発現を示す。
【図１６】図１６は、単離した初代ＣＤ−１マウス肝細胞へのアデノウィルス媒介によるインビトロでの形質導入示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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