(57)【要約】ヒト中和抗体（完全抗体または機能的フラグメント）は、炭疽菌、ボツリヌス、痘瘡、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウィルス（ＶＥＥＶ）、西ナイルウィルス（ＷＮＶ）などの感染性作用物質に対する抗毒素または抗感染症剤として有用である。ファージディスプレイ技術と、ワクチンを接種した人または回復期の人のリンパ細胞から誘導したメッセンジャーＲＮＡとを使用し、本明細書に記載の方法にしたがって、感染性作用物質からの抗原に結合する抗体フラグメント（Ｆａｂ）のパネルを速やかに決定することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭疽菌に感染した動物を処置する方法であって、炭疽菌の保護抗原に対する少なくとも１×１０−８Ｍの結合親和性、ならびに該保護抗原と、細胞受容体、浮腫因子および致死因子からなる群の１つ以上のメンバーとの結合をブロックする能力を有する抗体または抗体フラグメントを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
炭疽菌に感染した動物を処置する方法であって、炭疽菌感染に関係する分子に対する少なくとも１×１０−８Ｍの結合親和性、ならびに炭疽菌感染に関係する該分子と、細胞受容体、ＰＡ６３、ＰＡ６３ヘプタマー、ＰＡ８３、浮腫因子および致死因子からなる群の１つ以上のメンバーとの結合をブロックする能力を有する抗体または抗体フラグメントを投与する工程を包含する、方法。
【請求項３】
炭疽菌に感染した動物を処置する方法であって、ＥＦおよび／またはＬＦがＰＡ６３ヘプタマーに結合することを阻止する能力を有する抗体または抗体フラグメントを投与する工程を包含する、方法。
【請求項４】
前記抗体または抗体フラグメントがＰＡ６３のヘプタマー形成を阻止する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体または抗体フラグメントがＰＡ６３とＥＦまたはＬＦとの結合を阻止する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体または抗体フラグメントがＥＦおよび／またはＬＦとＰＡ６３ヘプタマーとの結合を阻止する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体または抗体フラグメントが配列番号１〜１８からなる群から選択される配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体または抗体フラグメントが配列番号１９〜２６からなる群から選択される配列を有する軽鎖κ領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体または抗体フラグメントが配列番号２７〜３８からなる群から選択される配列を有する軽鎖λ領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体または抗体フラグメントが配列番号３９〜６１からなる群から選択される配列を有する軽鎖κ領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体または抗体フラグメントが配列番号６２〜７７からなる群から選択される配列を有する軽鎖λ領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体または抗体フラグメントが配列番号７８〜１１２からなる群から選択される配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
炭疽菌汚染を判断する方法であって、
被験体から体液または組織の試験サンプルを得る工程、および
前記試験サンプル中の、細胞受容体、ＰＡ６３、ＰＡ６３ヘプタマー、ＰＡ８３、浮腫因子および致死因子からなる群の１つ以上の分子の存在を、該分子に結合親和性を有する抗体または抗体フラグメントでアッセイする工程を包含し、
該サンプル中における高レベルの該抗体または抗体フラグメントの存在が炭疽菌関連性疾患の存在と相互に関連する、
方法。
【請求項１４】
前記抗体または抗体フラグメントが配列番号１〜１８からなる群から選択される配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体または抗体フラグメントが配列番号１９〜２６からなる群から選択される配列を有する軽鎖κ領域を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体または抗体フラグメントが配列番号２７〜３８からなる群から選択される配列を有する軽鎖λ領域を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体または抗体フラグメントが配列番号３９〜６１からなる群から選択される配列を有する軽鎖κ領域を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体または抗体フラグメントが配列番号６２〜７７からなる群から選択される配列を有する軽鎖λ領域を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体または抗体フラグメントが配列番号７８〜１１２からなる群から選択される配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
ベネズエラウマ脳脊髄炎汚染を判断する方法であって、
被験体から体液または組織の試験サンプルを得る工程、および
該試験サンプル中のベネズエラウマ脳脊髄炎による感染に関係する１つ以上の分子の存在を、該分子に結合親和性を有する抗体または抗体フラグメントでアッセイする工程を包含し、
該サンプル中の高レベルの該抗体または抗体フラグメントの存在がベネズエラウマ脳脊髄炎関連性疾患の存在と相互に関連する、
方法。
【請求項２１】
前記抗体または抗体フラグメントが配列番号１１３〜１１５からなる群から選択される可変軽鎖領域を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体または抗体フラグメントが配列番号１１６〜１１８からなる群から選択される可変重鎖領域を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
炭疽菌汚染を判断する方法であって、
被験体から体液または組織の試験サンプルを得る工程、および
該試験サンプル中の細胞受容体、ＰＡ６３、ＰＡ６３ヘプタマー、ＰＡ８３、浮腫因子および致死因子からなる群の１つ以上の分子に対する抗体の存在を、該抗体に結合親和性を有する二次抗体または抗体フラグメントでアッセイする工程を包含し、
該サンプル中の高レベルの該二次抗体または抗体フラグメントの存在が該被験体における炭疽菌の存在と相互に関連する、
方法。
【請求項２４】
前記試験サンプル中の抗体または抗体フラグメントのレベルを、配列番号１〜１８からなる群から選択される配列を有する重鎖可変領域を含むコントロール抗体または抗体フラグメントと関連づける工程をさらに包含する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記試験サンプル中の抗体または抗体フラグメントのレベルを、配列番号１９〜２６からなる群から選択される配列を有する軽鎖κ領域を含むコントロール抗体または抗体フラグメントと関連づける工程をさらに包含する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記試験サンプル中の抗体または抗体フラグメントのレベルを、配列番号２７〜３８からなる群から選択される配列を有する軽鎖λ領域を含むコントロール抗体または抗体フラグメントと関連づける工程をさらに包含する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記試験サンプル中の抗体または抗体フラグメントのレベルを、配列番号３９〜６１からなる群から選択される配列を有する軽鎖κ領域を含むコントロール抗体または抗体フラグメントと関連づける工程をさらに包含する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記試験サンプル中の抗体または抗体フラグメントのレベルを、配列番号６２〜７７からなる群から選択される配列を有する軽鎖λ領域を含むコントロール抗体または抗体フラグメントと関連づける工程をさらに包含する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
試験サンプル中の抗体または抗体フラグメントのレベルを、配列番号７８〜１１２からなる群から選択される配列を有する重鎖可変領域を含むコントロール抗体または抗体フラグメントと関連づける工程をさらに包含する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
ベネズエラウマ脳脊髄炎汚染を判断する方法であって、
被験体から体液または組織の試験サンプルを得る工程、および
該試験サンプル中の抗ベネズエラウマ脳脊髄炎ウィルス抗体の存在を、該抗体に結合親和性を有する二次抗体または抗体フラグメントでアッセイする工程を包含し、
高レベルの該二次抗体または抗体フラグメントの存在が該被験体のベネズエラウマ脳脊髄炎の存在と相互に関連する、
方法。
【請求項３１】
前記抗体または抗体フラグメントが配列番号１１３〜１１５からなる群から選択される可変軽鎖領域を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗体または抗体フラグメントが配列番号１１６〜１１８からなる群から選択される可変重鎖領域を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
炭疽菌汚染を判断するための診断キットであって、該キットは、細胞受容体、ＰＡ６３、ＰＡ６３ヘプタマー、ＰＡ８３、浮腫因子および致死因子からなる群の、炭疽菌感染に関係する１つ以上の分子と特異的に反応する抗体を含む、キット。
【請求項３４】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項３３に記載の診断キット。
【請求項３５】
前記抗体または抗体フラグメントが配列番号１〜１８からなる群から選択される配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項３３に記載の診断キット。
【請求項３６】
前記抗体または抗体フラグメントが配列番号１９〜２６からなる群から選択される配列を有する軽鎖κ領域を含む、請求項３３に記載の診断キット。
【請求項３７】
前記抗体または抗体フラグメントが配列番号２７〜３８からなる群から選択される配列を有する軽鎖λ領域を含む、請求項３３に記載の診断キット。
【請求項３８】
前記抗体または抗体フラグメントが配列番号３９〜６１からなる群から選択される配列を有する軽鎖κ領域を含む、請求項３３に記載の診断キット。
【請求項３９】
前記抗体または抗体フラグメントが配列番号６２〜７７からなる群から選択される配列を有する軽鎖λ領域を含む、請求項３３に記載の診断キット。
【請求項４０】
前記抗体または抗体フラグメントが配列番号７８〜１１２からなる群から選択される配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項３３に記載の診断キット。
【請求項４１】
ベネズエラウマ脳脊髄炎による感染に関係する１つ以上の分子と特異的に反応する抗体を含む、ベネズエラウマ脳脊髄炎汚染を検出するための診断キット。
【請求項４２】
前記抗体が配列番号１１３〜１１５からなる群から選択される可変軽鎖領域を含む、請求項４１に記載の診断キット。
【請求項４３】
前記抗体が配列番号１１６〜１１８からなる群から選択される重鎖可変領域を含む、請求項４１に記載のキット。
【請求項４４】
薬物学的に受容可能な担体中に、ＰＡ６３のマルチマーを含む組成物を被験体に投与する工程を包含する、予防的処置法。
【請求項４５】
前記ＰＡ６３のマルチマーが７つまでのＰＡ６３ユニットを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＰＡ６３のマルチマーがＰＡ６３ヘプタマーを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
薬物学的に受容可能な担体中にＰＡ６３のマルチマーを含む、ワクチン。
【請求項４８】
前記ＰＡ６３のマルチマーがＰＡ６３ユニットを７つまで含む、請求項４７に記載のワクチン。
【請求項４９】
前記ＰＡ６３のマルチマーがＰＡ６３のヘプタマーを含む、請求項４７に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、同時継続の米国特許出願番号第１０／３６４，７４３号（２００３年２月１１日出願）の部分継続であり、同様に、米国仮出願番号第６０／３５６，０８６号、同第６０／３７６，４０８号および同第６０／４２８，８０７号（それぞれ２００２年２月１１日、２００２年４月２９日および２００２年１１月２５日に出願）に優先権を主張する。
【０００２】
（発明の背景）
（技術的分野）
本開示は炭疽菌、ボツリヌス、痘瘡、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウィルス（ＶＥＥＶ）、西ナイルウィルス（ＷＮＶ）などの感染性作用物質に対する抗毒素または抗感染症剤として有用なヒト中和抗体（完全抗体または機能的フラグメント）に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
（関連技術の背景）
米国における最近のテロ行為後、我々の炭疽菌感染防止および処置能力に関する懸念が高まった。炭疽菌ワクチンは存在するとはいえ、それは間隔を置いた６回の接種からなり、毎年ブースターを必要とし、ワクチン接種を受けた人々の大部分に不快な副作用を起こす。それはこのワクチン接種の普及を妨げ、依然として一般大衆に接種する際の主な欠点の一つである。現在使用される炭疽菌ワクチンはビオポート社（Ｂｉｏｐｏｒｔ）（ランシング、ミシガン州）によって、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｏｒａｃｉｓの溶解物から保護抗原を精製する工程を含む製法によって作られる。これは今のところスターン（Ｓｔｅｒｎｅ）生ワクチン菌種であるようにみえる；ただしこのワクチンを生成するために使用できる、ＬＦおよびＥＦに欠けるその他の菌種並びに収率の高い組換えＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓが使用できるかも知れない。このような付加的ワクチンの試験および比較は困難で、市場も小さいため、実際的な試験、認可および生産が妨げられていると推測される。現在のワクチンの副作用、多くの人が抱いている湾岸戦争症候群との関連性、およびテロリストの脅威に直面して大規模ワクチン接種が必要とされる可能性は、現在のワクチンの改良を推めるべきであることを示唆する。合理的ワクチンが存在しない限り、汚染に対する処置がテロ行為に対する主な対応策である。
【０００４】
アメリカ合衆国において汚染した手紙から発生した炭疽菌汚染は全て、抗生物質に感受性のある炭疽菌の菌種に関係していたが、痛ましいことに多くの人が診断の遅れから死亡した。このため疾病および死を阻止でき、抗生物質治療および／または適切な免疫の追加時期を効果的にすることができる炭疽菌汚染対策を講ずることが有用である。
【０００５】
炭疽菌による主な死亡原因は、この細菌によって生産される２種類の関連毒素に対する体の反応である。これらは両方とも、ＰＡ８３として細胞受容体に結合し、その後ＰＡ６３にプロセッシングされるＰＡ６３と呼ばれるプロセスドタンパク質を含む。ヒト細胞における炭疽菌毒素に対する受容体であるＡＴＲ（炭疽菌毒素受容体）が最近確認された。Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ  ４１４，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ８，２００１を参照されたい。その後ＰＡ６３は、ＥＦタンパク質（浮腫因子）またはＬＦタンパク質（致死因子）のいずれかと結合できるハプタマーを形成する。ハプタマー化ＰＡ６３および、結合ＥＦおよび／またはＬＦのエンドソーマル・インターナリゼーションによりＥＦおよびＬＦ毒素の細胞内への導入が容易になる。エンドソーム小胞の酸性化によりＰＡハプタマーは孔を形成し、その孔を通ってＥＦおよび／またはＬＦが細胞質に侵入し、それらの毒性作用をあらわす。ＥＦ、ＬＦまたはＰＡという３成分のいずれも、それだけでは病気を起こすことはできない。
【０００６】
ＰＡの受容体への結合を阻止できる、またはＥＦおよびＬＦとＰＡとの相互作用を遮断できることを示すいくつかの証拠がある。ワクチンそれ自体は、精製されたＰＡ部分だけを用いて防御的抗体を作り出す。Ｌｉｔｔｌｅら（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：５１７１−５１７５（１９９７））はモルモットにＰＡ抗体を受動投与した。それはその後の炭疽菌感染に対する防御を示した−ポリクローナル抗体では７０％防御し、そしてあるモノクローナでは死を２日間遅らせた。ＰＡの受容体への結合を阻止するために短鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖｓ）も使用される。Ｃｉｒｉｎｏら（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：２９５７−２９６３（１９９９））はナイーブ・ヒト・ライブラリーからＰＡ８３に結合する多数のｓｃＦｖｓを同定した。彼らは細胞をベースとするアッセイにこれらを使用した。このアッセイにおいてＰＡ６３の短縮型であるＰＡ３２はＥＧＦＰと融合し、ＰＡ６３と同様な仕方で細胞に取り込まれた。ＥＧＦＰの蛍光を利用して、細胞内取り込みにおけるＰＡ３２−ＥＧＦＰに対するこれらｓｃＦｖｓの効果をモニターすることができた。細胞によるＰＡ３２−ＥＧＦＰの取り込みを阻止できる一つのｓｃＦｖｓが同定された。Ｍｏｕｒｅｚら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃ．１９：９５８−９６１（２００１））は、炭疽菌毒素に対する多価ペプチドインヒビタを作出した。それはＥＦ／ＬＦ部位で、またはその近くでＰＡ６３ハプタマーに結合する。彼らは細胞をベースとするアッセイを使用して、このインヒビタがＰＡ／ＬＦ毒性から細胞を防御できることを証明した。ラットにＰＡおよびＬＦの最小致死量を１０回投与した場合、その攻撃の３−４分後に上記インヒビタを投与するとラットは防御されることも彼らは示した。
【０００７】
これらのデータは全て、炭疽菌感染の診断が遅れた患者における抗生物質との組み合わせ治療のための治療用ヒト組合わせ抗体が開発できることを示唆するものである。
【０００８】
ベネズエラウマ脳脊髄炎ウィルス（ＶＥＥＶ）は、ウマおよびヒトホスト両方に伝染し得る、蚊によって媒介されるアルファウィルスである。ウマおよびロバ集団の感染は高い死亡率に至ることがあり、その一方で自然のヒト感染は発熱、悪寒、倦怠感およびひどい頭痛からなり、１−４％の人では重症脳炎にまで悪化する。しかしＶＥＥＶは、その低いヒト感染量、容易な増殖およびエーロゾル化のため、ＣＤＣによって“カテゴリーＢ”の危険な生物作用物質として分類されている。エーロゾル化ＶＥＥＶは効果的生物兵器として使用できる。その際強い感染力をもつことが知られており、嗅索から容易に中枢神経系に直接近づくことができるタイプのＶＥＥＶが使用される。このウィルスの複製がＣＮＳで始まると脳炎が深刻なリスクとなる。残念なことに、ＶＥＥＶ感染症の処置は支持療法に限られる。
【０００９】
ＶＥＥＶに対して使用できる研究段階のワクチンがあるが、それらの使用はリスクのある研究者や戦闘隊員に限られている。弱毒化生ワクチンであるＴＣ−８３（ＦＤＡ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ＃１４２）（Ｐｉｔｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １４，ｐｐ３３７−３４３（１９９６））がこれらの両集団に使用されてきた。このワクチンは猛毒のトリニダードロバウィルスを連続継代組織培養することによって確立された。ＴＣ−８３ウィルスは大部分のヒトおよびウマにおいてＶＥＥＶに特異的な中和抗体を誘導する。（Ｋｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０，１９−３０（１９８９））。実験動物において、このワクチンは猛毒ＶＥＥＶ菌種の皮下投与または空気感染に対して免疫を生ずることができた（Ｐｈｉｌｌｐｏｔｔｓ，Ｖａｃｃｉｎｅ  １７，ｐｐ２４２９−２４３５（１９９９））。しかし、ワクチンを投与されるヒトの１８％までは最初のワクチン接種で防御を得ることができない。さらに、このワクチンは比較的高率の反応原性を有する（２５％）。最近の一報告は、ＴＣ−８３はもはやヒトに使用できないと述べている（Ｐｈｉｌｌｐｏｔｔｓ，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０，ｐ１４９７−１５０４（２００２））。ＴＣ−８３に関する懸念が不活性化ワクチン、Ｃ−８４の開発を促進した。しかしＣ−８４は動物モデルにおいてこのウィルスの猛毒株による空気感染を防御することができなかった（Ｐｉｔｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １４，ｐｐ３３７−３４３（１９９６））。その結果、Ｃ−８４は研究者用の一次イムノゲンとしては使用されず、むしろＴＣ−８３に反応しない人のための追加的ワクチンとして、またはブースターとして（この際それはリコール抗原として作用する）有用である。このため、強力な中和抗ＶＥＥＶ抗体のような抗ＶＥＥＶ療法が必要に迫られている。
【００１０】
ＶＥＥＶはエンベロープに包まれたウィルスであり、エンベロープとカプシド構造とは脂質二重層によって分離され、Ｅ２糖タンパク質の膜貫通型尾部を介して相互作用すると考えられている。シンドビスウィルスと同様に、ＶＥＥＶはＥ１／Ｅ２ヘテロダイマーのトリマーとして構成されたビリオンタンパク質スパイクを有する（Ｐａｒｅｄｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５，ｐｐｐ９５３２−９５３７（２００１）；Ｐｈｉｎｎｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４，ｐｐ５６６７−５６７８（２０００））。厳密な中和部位に関係するかも知れないＥ１（ｇｐ５０）およびＥ２（ｇｐ５６）上のエピトープがモノクローナル抗体を使用して研究された（Ｍａｔｈｅｗｓ  ａｎｄ  Ｒｏｅｈｒｉｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｐｐ２７６３−２７６７（１９８２））。部位Ｅ２ｃはＥ２スパイクの先端に存在し、中和（Ｎ）エピトープであると考えられる。その他のエピトープも中和活性を示し、Ｅ２ｃ部位と密接な構造的関係を有するらしい。
【００１１】
ＶＥＥＶ感染のマウスモデルはヒトに似た病原論的機序を辿ると考えられている。ウィルス攻撃前の中和抗体の受動的移入はこれら正常マウスの死を効果的に予防した（Ｒｏｅｈｒｉｇ  ａｎｄ  Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８５）１４２，ｐｐ３４７−３５６；Ｐｈｉｌｌｐｏｔｔｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００２）２０，１４９７−１５０４などを参照されたい）。非中和抗体もマウスを腹腔内または静脈内ウィルス攻撃から防御することを示した（Ｈｕｎｔ  ａｎｄ  Ｒｏｅｈｒｉｇ，Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９５）１３，ｐｐ２８１−２８８；Ｈｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）１８５，２８１−２９０）。非中和抗体がウィルス攻撃を防御する作用機序は不明であるが、それらがウィルス複製を遅らせ、そうすることによってホスト免疫系の反応時間をウィルス感染に対応させて、ウィルス感染を抑制するという仕方で作用すると推測される（Ｈｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）１８５，２８１−２９０）。ＶＥＥＶ空気感染に対するヒトの有効治療は、例えば汚染時またはその直後にウィルスを直接中和するというような、より迅速な動作を必要とする。特に重要な問題は、中和抗体がＶＥＥＶの脳への広がりを阻止する能力である。これに関連して、空気感染によるウィルス攻撃後２４時間までにマウスに中和抗体を投与すると防御効果が示されたことは重要である（Ｐｈｉｌｌｐｏｔｔｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０，１４９７−１５０４（２００２））。
【００１２】
これらの研究および同様な研究に記載されたネズミ抗体はヒトにおけるＶＥＥＶ感染の予防および処置に使用できるかも知れ〜かし齧歯類の抗体はヒトでは高度に免疫原性であり、したがってそれらの臨床的応用は限られる。特に治療において反復投与が必要とされる場合にこれが言える。抗体ヒト化と呼ばれるプロセスを用いて、元の抗原特異性を維持するように努めながら齧歯類抗体の大部分をヒト抗体領域で置換することによって、齧歯類抗体の免疫原性を弱めることができる。しかしこの企ては通常、時間もお金もかかり、ヒト化Ａｂに対する免疫原性反応の可能性は排除されない。ＶＥＥＶ上の完全にヒトの標的中和エピトープである抗体が最も好ましい治療的候補である、なぜならばそれらはウィルス感染を効果的にブロックする最良の機会を提示し、免疫原となるリスクが最も小さいからである。
【００１３】
ボツリナム神経毒は知られている限り最も強力な細菌性毒素であり、ヒトにおけるＬＤ５０は１ｎｇ／ｋｇである。この毒素は細菌Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍによって、そして数種のその他のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ菌種によって生産され、毒素のセロタイプが７種類（ＡからＧまで）確認されている。分子レベルでは、この毒素は１５０ｋＤａタンパク質として産生される。このタンパク質はプロテアーゼに曝されると分解し、結合したままの２本の鎖：約５０ｋＤａの軽鎖および１００ｋＤａの重鎖を生成する。重鎖は神経細胞への結合をおこすドメインを含み、その一方で軽鎖は神経細胞質に侵入する亜鉛依存性エンドプロテアーゼドメインを含む。内部に入ると、このエンドプロテアーゼは、例えばシナプトブレビン、シンタキシンおよびＳＮＡＰ−２５などのシナプスタンパク質のタンパク質分解的切断によってその毒性作用をあらわす。これらタンパク質の破壊は神経伝達を阻害し、進行性マヒや死をもたらす。
【００１４】
ボツリナム神経毒素に対する抗体が防御的であることは受動および能動免疫モデルにおいて示されている。セロタイプＡからＥまでからなるＰＢＴワクチンが現在、ボツリナム神経毒汚染リスクのある人々に、デパートメント・オブ・ディフェンス（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｅｆｅｎｓｅ）およびセンター・フォア・ディジーズ・コントロール（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）から提供されている。セロタイプＦは一般的であるが、セロタイプＤおよびＧは自然のヒト感染症ではまれに見られるに過ぎず、ＰＢＴワクチンはない。セロタイプＤおよびＧが生物テロ攻撃に使用される可能性は見逃すべきでない。自然感染では次のような幾つかのポリクローナル抗体製剤が免疫治療剤として上首尾に使用されているが、毒素の神経細胞への侵入を最小にするためにはこれらを感染初期に与えなければならない。次のようないくつかのポリクローナル免疫グロブリン製剤が免疫療法剤として使用できる：ウマ三価（Ａ、Ｂ、およびＥ）製剤、免疫グロブリンのＦｃ部分をプロテイナーゼ切断によって除去したウマ六価製剤、およびＰＢＴワクチンを接種したドナーから得られるヒト免疫グロブリン製剤（ｈＢＩＧ）。ウマ製剤は両方とも、処置される人々に過敏反応を起こすという欠点を有する。上記ヒト製剤は耐容性が良く、有効であるが、供給量が足りず、７セロタイプのうち５セロタイプに対して有用であるに過ぎない。自然感染用としても、ボツリヌス神経毒の全てのセロタイプに対する完全ヒト中和抗体の供給を準備することが有用である。２００１年の意図的炭疽菌放出後、生物テロに対して我々が無防備であることが知られるようになった結果、このような免疫療法剤の開発がさらに緊急のものとなった。
【００１５】
１９８０年５月の痘瘡根絶宣言（Ｆｅｒｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）および予防接種プログラムの中止以降、予防接種を受けた人々の間では免疫が弱まっており、１９８０年以降に生まれた人々は予防接種を受けていない。免疫の世界的低下は、生物兵器としてのバリオラウィルス（痘瘡の原因物質である）の意図的放出の脅威を劇的に高めた。このウィルスは生物戦争に特に適するという特徴を有する。このウィルスは呼吸器経路を介してまたは直接接触によって人から人に広がる。このウィルスはエアロゾルの形ではかなり安定であり、その感染量は非常に小さいから、このウィルスのエアロゾル放出は広く伝播する可能性がある（Ｗｈｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９７０）。この病気に特異的な処置法はない。大量の感染性ウィルスが紛失する脅威もある。ソビエト連邦公民生物兵器プログラム（Ｓｏｖｉｅｔ  Ｕｎｉｏｎ’ｃｉｖｉｌｌｉａｎ  ｂｉｏｗｅｐｏｎｓ  ｐｒｏｇｒａｍ）の前副ディレクターであるＡｌｉｂｅｃ（Ａｌｉｂｅｋ，１９９９）は、１９８０年にソビエト政府は生物兵器プログラムを開始し、爆弾や弾道ミサイルで運搬するための年間何トンものバリオラウィルスを生産する方法を開発したと報告した。１９９２年のソビエト国民生物戦争プログラムのための経済的援助の減少およびこのプログラムの中止によって、熟練せる科学者、機器、および材料は他の国々に移されたらしい。報告されたアジアにおける流行病は死亡率３０％以上であった（Ｆｅｒｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。今日人々は病気にかかりやすくなっており、移動も多いため、ウィルスは国全体および世界中に非常に速く広まる可能性がある。
【００１６】
バリオラウィルスはＤＮＡウィルスであり、それはワクシニア（完全痘疱）、サル痘ウィルス、および血清学的に交差反応するその他数種の動物痘瘡ウィルスを含むポックスウィルス科、およびオルトポックスウィルス属の一メンバーである（Ｆｅｒｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。バリオラウィルスだけが人から人へ容易に伝播される（Ｂｒｅｍａｎ  ａｎｄａ  Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，２００２）。ＤＮＡ配列分析の結果、バリオラウィルスとワクシニアウィルスとは密接に関連することが明らかにされた（Ｍａｓｓｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。バリオラウィルスの感染量は非常に低く、数ビリオンに過ぎないと考えられている（Ｗｈｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９７０）。それは転写し、そのゲノムを複製し、子孫ビリオンを完全に感染細胞の細胞質内に構成する（Ｍｏｓｓ，１９９６）。４種類の感染型、すなわち細胞内成熟ウィルス（ＩＭＶ）、細胞内エンベロープドウィルス（ＩＥＶ）、細胞関連性エンベロープドウィルス（ＣＥＶ）、および細胞外エンベロープドウィルス（ＥＥＶ）が産生する（Ｍｏｓｓ  １９９６）。ＩＭＶは細胞質に残る主要な型である、ＥＥＶは感染粒子の小部分であるが、ウィルスのインビトロおよびインビボにおける長期にわたる伝播および広がりに関して生物学的に重要な型である（Ｐａｙｎｅ，１９８０；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｖａｎｄｅｒｐｌａｓｓｃｈｅｎ，１９９８；Ｌａｗ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，２００１）。オルトポックスウィルス感染の防御にはＥＥＶに対する免疫反応が必要だが、ＩＭＶに対する免疫反応は必要ないことが示されている（Ａｐｐｌｅｙａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９７１；Ｂｏｕｌｔｅｒ，１９６９；Ｂｏｕｌｔｅｒ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｅｙａｒｄ，１９７３；Ｂｏｕｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７１；Ｉｃｈｉｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９７１；Ｍｏｒｇａｎ，１９７６；Ｐａｙｎｅ，１９８０；Ｐａｙｎｅ  ａｎｄ  Ｋｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ，１９８５；Ｔｕｒｎｅｒ  ｎｄ  Ｓｑｕｉｒｅｓ，１９７１）。ＥＥＶの外部エンベロープのための１０種類のタンパク質をコードする６遺伝子が報告されている（Ｐａｙｎｅ，１９７８；Ｐａｙｎｅ，１９７９）。それらはＡ３３Ｒ（ｇｐ２２−２８）（Ｒｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、Ａ３４Ｒ（ｇｐ２２−２４）（Ｄｕｎｃａｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９９２）、Ａ３６Ｒ（ｐ４５−５０）（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９９４）、Ａ５６Ｒ（ｇｐ８６、重度にグリコシル化されたヘマグルチニン）（Ｐａｙｎｅ  ａｎｄ  Ｎｏｒｒｂｙ，１９７６；Ｓｈｉｄａ，１９８６）、Ｂ５Ｒ（ｇｐ４２）（Ｉｓａａｃｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｅｎｇｌｅｓｔａｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、およびＦ１２ＬまたはＦ１３Ｌ（ｐ３７）（Ｈｉｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｂｌａｓｃｏ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ，１９９１）である。Ａ３６Ｒタンパク質はＣＥＶおよびＥＥＶ粒子には存在しないことが最近判明した（ｖａｎ  Ｅｉｊｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ＩＭＶのエンベロープタンパク質はＡ２７Ｌ（ｐ１４）（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｅｓｔｅｂａｎ，１９８５）、Ｄ８Ｌ（ｐ３２）（Ｍａａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｎｉｌｅｓ  ａｎｄ  Ｓｅｔｏ，１９８８）、Ａ��７Ｌ（ｐ２１）（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、およびＬ１Ｒ（Ｍ２５、ミリスチル化ビリオンタンパク質）（Ｆｒａｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）である。Ａ２７Ｌ、Ａ１７ＬおよびＬ１ＲはＩＭＶの融合および透過に関連する（Ｉｃｈｉｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｏｉｅ，１９９６）。
【００１７】
ワクシニアウィルスから製造された痘瘡ワクチンは、それまでに製造された最初のワクチンである。現在の貯蔵量は子ウシの皮膚に増殖させた生ワクシニアウィルスからなる。アメリカ合衆国では貯蔵供給量は限られている；６〜７百万人に接種するのに丁度間に合う。その他の国で、突然の流行が起きた際に全国民に行きわたる十分量を有する国はない。痘瘡ワクチン接種はその他のいかなる型のワクチン接種よりひどい副作用も有する。それが、根絶後にワクチン接種を中止した理由の一つである（Ｏｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。現在、それは疑いのある症例だけに使用し、集団予防接種としては使用しないことが世界保険機構および米国防疫センターによって推められている（Ｓｍａｌｌｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ワクシニアウィルスのワクチン接種は少なくとも５年間は痘瘡を効果的に予防し、より長期間感染を防止または緩和するらしいが、これは人によって著しい差がある。
【００１８】
中和抗体が、オルトポックスウィルスに対する免疫において、特に感染症の悪化および伝染の阻止に重要な役割を演ずることは一般的に意見が一致している。感染を阻止しまたはワクシニア免疫による副作用をコントロールするワクシニア免疫グロブリン（ＶＩＧ）の利点が明らかにされた（Ｋｅｍｐｅ，１９６０，Ｋｅｍｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９６１，Ｈｏｂｄａｙ，１９６２）。組換えＢ５Ｒタンパク質に対するポリクローナル抗血清はＥＥＶ感染を阻止した（Ｇａｌｍｉｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。Ｂ５Ｒタンパク質を接種したマウスはワクシニアウィルスによる致死的攻撃を防御した。これは中和抗体によって仲介されると考えられる。タンパク質Ａ３３Ｒも能動および受動免疫において防御した（ただしＡ３４ＲおよびＡ３６Ｒは防御しない）が、その防御は抗体値とは関連せず、抗Ａ３３Ｒ抗体はインビトロでＥＥＶを中和しなかった。著者らは、その防御は単純な抗体結合とは異なる作用機序を含むと考えられると述べている（Ｇａｌｍｉｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９、Ｓｃｈｍａｌｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ＩＭＶの膜に存在するワクシニアウィルスのトリマー１４ｋＤａタンパク質（Ａ２７Ｌ，ｐ１４）に対するマウス中和抗体を予防的並びに治療的に投与すると、マウスにおけるそのウィルスの複製は効果的に抑制された（Ｒａｍｉｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。Ｌ１ＲおよびＡ３３Ｒ遺伝子を有するＤＮＡワクチン接種により、マウスはＬ１ＲおよびＡ３３Ｒに対する中和抗体で致死的ウィルス攻撃から防御された（Ｈｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【００１９】
エマージング・インフェクシャス・ディジーゼズ（Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）の最近版（Ｃａｓａｄｅｖａｌ，２００２）に記述されているように、生物学的作用物質に対する即時免疫を提供し得る唯一適用できる対策は抗体による受動免疫である。ワクチンは防御免疫を誘起するために時間がかかり、ホストの免疫反応生成能力に左右される。その一方で受動免疫はホストの免疫状態には無関係に合理的に防御することができる。受動免疫の長所のなかで、低細胞毒性および高度に特異的な活性は、汚染後処置のその他の手段にまさる。
【００２０】
十分な血清中和活性を有する免疫ドナーの確定およびこのようなドナーの骨髄からの組合わせ抗体ライブラリーの作成が、ウィルス感染に対する高度に特異的な中和抗体の大きいパネルを分離するための合理的アプローチである（Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｂｕｒｉｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。中和エピトープを含む組換えエンベロープタンパク質類に関するライブラリーの選択は簡単な仕事である。マウス抗体とは異なり、ヒト抗体は非免疫原性であり、感染しやすい動物でそれらの効果が十分に特徴づけられた際には、それらは安全に患者に投与できる。
【００２１】
生物戦争に使用され得る種類の感染性物質を中和する抗体を同定することが好ましい。これらの生物防御抗体が単一の抗体ライブラリーから誘導できることも好ましい。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
（概要）
ファージディスプレイ技術と、ワクチンを接種した人または回復期の人のリンパ細胞から誘導したメッセンジャーＲＮＡとを使用し、本明細書に記載の方法にしたがって、感染性作用物質からの抗原に結合する抗体フラグメント（Ｆａｂ）のパネルを速やかに決定することができる。これらのＦａｂと抗原との相互作用の強さは表面プラズモン共鳴を使用してそれらの結合運動を試験するというやり方で決定できる。これらのヒトＦａｂは、残りの定常領域ドメインを含む適切な哺乳動物発現ベクターにサブクローニングすることによって完全ＩｇＧに容易に変えることができる。その後小さい動物モデルにおけるインビトロおよびインビボウィルスまたは毒素阻害研究においてこれらのパネルからのＦａｂまたは抗体類を試験することにより、臨床前試験および臨床試験に適切につながる中和抗体のサブセットを同定することができる。これらの抗体はその後上記の作用物質のいずれかに感染した、またはさらされた人々の処置の際に免疫療法剤として使用でき、または汚染リスクが予測される人々に予防的に使用できる。
【００２３】
一局面において、感染性作用物質による感染を中和または阻止するための抗体類またはその機能的フラグメントが抗体ライブラリーから同定され、単離され、大量に生産されるという上記抗体ライブラリーが記載される。
【００２４】
また別の局面において、炭疽菌感染を効果的に処置するヘテロダイマー抗体類が記載される。上記ヘテロダイマー抗体は抗体ライブラリーから選択される。このライブラリーは免疫されたヒト・ソースから作るのが好ましい。上記ヘテロダイマー抗体は炭疽菌感染に関係する分子、例えば炭疽菌保護抗原またはＥＦまたはＬＦタンパク質などに結合し、その活性を無力にし、それによって毒素の細胞内侵入に関係するプログラムを妨害することによって毒素活性を抑制する。これらのプログラムは非制限的に下記を含む：受容体へのＰＡ８３結合、ＰＡ８３をプロセッシングしてＰＡ６３にする、ＰＡ６３の相互作用によりプレポア複合体を形成する、ＥＦまたはＬＦと上記プレポアとの結合、ＥＦまたはＬＦの膜転座を可能にするプレポアのコンフォーメショナル変化、または上記ポア（孔）を通過するＥＦまたはＬＦ転座。この干渉は、体内細胞によるこれらタンパク質の取り込みに関連する毒性作用が弱まるかまたは排除されるように起こる。特に有用な実施形態において、ヘテロダイマー抗体は炭疽菌感染症に含まれる１分子に対して最低１×１０−８Ｍの親和性を有する。また別の実施形態においては、これらの抗体を診断用試薬として用いることができる。もう一つの局面において、ボツリナムを中和する抗体または抗体の機能的フラグメントが記載される。
【００２５】
また別の局面において、バリオラウィルス（痘瘡）／ワクシニアウィルスを中和する抗体または抗体の機能的フラグメントが記載される。
【００２６】
また別の局面において、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウィルス（ＶＥＥＶ）、を中和する抗体また抗体の機能的フラグメントが記載される。
【００２７】
もう一つの局面において、西ナイルウィルス（ＷＮＶ）を中和する抗体また抗体の機能的フラグメントが記載される。
【００２８】
また別の局面において、デング熱を中和する抗体また抗体の機能的フラグメントが記載される。
【００２９】
また別の局面において、感染性作用物質による感染を防止するために抗体または抗体の機能的フラグメントを予防的に投与する方法が記載される。
【００３０】
また別の局面において、感染性作用物質による感染を処置するために抗体また抗体の機能的フラグメントを投与する方法が記載される。
【００３１】
また別の局面において、感染性作用物質を化学量以下の量で中和するＦａｂ構成成分を有する抗体が記載される。
【００３２】
また別の局面において、ＰＡ６３のマルチマーを含むワクチン並びにそのようなワクチンの使用法が記載される。
【００３３】
また別の局面において、感染性作用物質の存在を検出する（直接または感染性作用物質によって放出される毒素の検出による）アッセイにおいて本開示による感染性作用物質に対する結合親和性を有する抗体または抗体フラグメントを使用し、上記感染性作用物質に関連する疾患の存在を診断する。
【００３４】
また別の局面において、感染性作用物質の汚染に反応した抗体類の存在を検出するアッセイにおいて、本開示による感染性作用物質に対する抗体に対する結合親和性を有する抗体または抗体フラグメントがコントロール抗体として使用される。このようなアッセイは感染性作用物質汚染を検出し、上記感染性作用物質に関連する疾患を診断するために有用である。
【００３５】
また別の局面において、感染性作用物質に関連する疾患を診断するためのキットが記載される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本開示によるヒト抗体は全抗体でも抗体フラグメントでもよい。これらの抗体はヘテロダイマーまたは一本鎖抗体でもよい。用語“ヘテロダイマー”とは、自然に生成する抗体のように、抗体または抗体フラグメントの軽鎖および重鎖がジスルフィド結合を介して互いに結合していることを意味する。一本鎖抗体はリンカー配列によって結合する抗体軽鎖および重鎖可変部を有する。
【００３７】
本発明のヒト抗体は抗体ライブラリーのスクリーニングによって同定される。抗体ライブラリーを作成およびスクリーニングする技術は当業者の範囲内である。Ｒａｄｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ，Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０００）、Ｌｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第６，２９１，１６１号および同時係属出願ＷＯ０３／０２５２０２および米国仮特許出願第６０／３２３，４００号を参照されたい。これらの開示は参考としてそのまま本明細書に組み込まれる。
【００３８】
一般に、本開示によって抗体ライブラリーを作成する最初の工程は、１種類以上の感染性作用物質に対するまたは感染性作用物質から生ずる抗原類に対する抗体を産生している個体から細胞を集めることを含む。通常そのような個体は、感染性作用物質および／または感染性作用物質からの抗原にさらされたことがある。特に有用な実施形態において、個体は、生物戦争に関して戦略上重要な複数の感染性作用物質または感染性作用物質から生ずる抗原類にさらされる。このような物質は、炭疽菌、炭疽菌からの抗原類、ボツリナム、ボツリナムからの抗原類、痘瘡、痘瘡からの抗原類、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウィルス（ＶＥＥＶ）、ＶＥＥＶからの抗原類、デング熱、デング熱からの抗原類、チフス菌、チフス菌からの抗原類、黄熱、黄熱からの抗原類、肝炎、肝炎からの抗原類、西ナイルウィルス（ＷＮＶ）、ＷＮＶからの抗原類および重症急性呼吸症候群（ＳＡＲＳ）を起こすウィルスからなる群から選択される作用物質を含む。図１は本開示の好ましい実施形態による抗体ライブラリーの作成に適切に使用できる人々の汚染履歴をまとめた表である。抗体類を産生するまたは含む組織から得た細胞で感染または免疫した後約７日目の人々から集める。適切な組織としては血液および骨髄が含まれる。
【００３９】
細胞を集め、当業者に公知の方法を用いてそれらからＲＮＡを分離し、組合わせ抗体ライブラリーを作成する。組合わせ抗体ライブラリーを作る方法は、抗体類またはそれらの部分、例えば軽鎖および／または重鎖をコードする標的配列を、ある抗体の単離ＲＮＡを用いて増幅することを含むのが一般的である。例えば本来多様である抗体ｍＲＮＡのサンプルで開始し、第一ストランドｃＤＮＡを作り、テンプレートを用意する。その後一般的ＰＣＲまたはその他の増幅技術を使用してライブラリーを作成する。
【００４０】
抗体ライブラリーのスクリーニングは例えば所望のウィルス抗原に対してパンニングするなど、公知の方法を用いて実現できる。Ｒａｄｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ，Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０００）を参照されたい。幾つかの抗原はクローン化されており、組換えによって作られ、免疫原として使用される。中和能力は、ウィルスと細胞受容体との結合をブロックする抗体の能力を測定する細胞アッセイで評価できる。インビトロで中和能力を有する抗体が同定されたならば、動物モデルでそれらのインビボ試験をおこなうことができる。
【００４１】
この方法で同定された抗体類は、有益なことに感染性作用物質による感染症を効果的に処置することができる。本発明の抗体類は完全にヒト抗体であるため、それらの耐容性は安全かつ容易である。その上、多数回投与しても抗イディオタイプ反応が急速に起きることはない。完全抗体を使用する場合、比較的高い親和性と比較的大きいサイズ（一本鎖抗体に比較して）が好ましい；というのは、それらは患者の系内に比較的長時間留まるからである。
【００４２】
本開示による抗体ライブラリーを作成し、本開示による抗体類を同定して特徴づける特に有用な方法を以下に述べる。
【００４３】
（ライブラリー）
種々の感染性作用物質に対して免疫された現役軍人ドナーの２つの骨髄サンプル（９５１および１０３７、および１つの血液サンプル（ＭＤ３）、図１参照）の各々から、λまたはκ軽鎖およびＩｇＧ重鎖フラグメント（Ｆｄ）のいずれかを含む３つのＦａｂライブラリーを誘導した。
【００４４】
ライブラリーは、炭疽菌、ベネズエラウマ脳脊髄炎およびボツリナム、西ナイルウィルス、ワクシニアウィルス、およびデング熱など種々の感染性作用物質に対して選択およびスクリーニングを受けることができる。
【００４５】
（ライブラリーの作成）
総ＲＮＡは、トリ−リアジェント（Ｔｒｉ−ｒｅａｇｅｎｔ）ＢＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を使用し、このメーカーの使用説明書にしたがって骨髄および血液サンプルから得られる。メッセンジャーＲＮＡはオリゴテックス（キアゲン社）スピンカラムを用い、メーカーの使用説明書にしたがって得られる。抗体Ｆａｂフラグメント（ＩｇＧ重鎖フラグメント（Ｆｄ）に複合体化したκまたはλ軽鎖）を発現するファージライブラリーが、米国特許出願第１０／２５１，０８５に記載される方法によってプラスミドベクターに構成される（この開示は参考として本明細書にそのまま組み込まれる）。各ドナーごとに２つのＦａｂライブラリーが作成され、１つはκ軽鎖を、１つはλ軽鎖を発現し、全てがガンマ重鎖を利用する。
【００４６】
（ライブラリーの選択）
使用した全てのライブラリーから得られるＦａｂ担持ファージは選択されたウィルス抗原および毒素に対して１〜４ラウンドの富化によるパンニングを受ける。パンニングは、先ず最初に、数個のイムロン２ＨＢミクロタイターウェル中で溶液Ａ  ５０μｌ中、十分量の組換え抗原（通常１−２μｇ）を４℃で一晩インキュベートすることによって行われる。溶液Ａは０．０８％煮沸カゼイン溶液（ＢＣ）を含む燐酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４、である。ＢＣは０．５％カゼイン、０．０１％チメロサル、および０．００５％フェノールレッドを含むＰＢＳである。抗原溶液を除去後、ウェルを１％ツイーン２０を含むＢＣ  ２５０μｌで、３７℃で１時間ブロックする。ファージストックを、０．０２５％ツイーン２０を含むＢＣからなる溶液Ｄに希釈し、５０μｌを各ウェルに加え、３７℃で２時間インキュベートした。ウェルを、０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳで１０回洗い、その後徐々に酸性を強めた下記のような一連の緩衝液（Ｄ’Ｍｅｌｌｏ  ｅｔａ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈ  ２４７：１９１−２０３（２００１））でそれぞれ１回２分間ずつ洗った：ｐＨ５．０、４．０および３．０のトリス緩衝食塩液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）。最終的溶出は０．１Ｍグリセリン−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ２．２、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で行った。溶出液を２Ｍトリス塩基で中和し、指数的増殖期のＥＲ２７３８細胞に加える。感染細菌にヘルパーファージ（ＶＣＳＭ１３株）を添加することによってファージを作る。感染しやすい細菌にファージストックを感染させ、培養することによって個々のコロニーを生成する。
【００４７】
スクリーニングは、ファージ遺伝子ＩＩＩの一部との融合タンパク質としてＦａｂを含む上澄液で行われる。スクリーニング後、陽性候補を配列決定し、サブクローニングして、Ｆａｂ生成前に遺伝子ＩＩＩを除去し、試験する。或いはパンニングした各ライブラリーからＤＮＡをサブクローニングして遺伝子ＩＩＩ融合領域を除去し、インフルエンザヘマグルチニン・エピトープタグ（ＨＡ）（Ｃｈｅｎ  ｅｔａ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：６５０８−１２（１９９３））および６ヒスチジンアミノ酸（Ｈｉｓタグ）からなる組み合わせエピトープタグを導入し、その後の抗−ＨＡおよびＮｉ−ＮＴＡによる検出および精製のために使用することができる。
【００４８】
（ライブラリーのスクリーニング）
スクリーニングのために、選んだ抗原に反応するＦａｂ構成物をＥＬＩＳＡアッセイにおいてそれらの結合能力によって確認する。溶液Ａ中、１００−２５０ｎｇ／ウェルの組換え抗原をイムロン・ミクロタイター・ディッシュ中で一晩インキュベートし、上記のようにブロックした。スクリーニングは、Ｑ−ピックス機器を使用して１１５０コロニーを取り上げ、テカン（Ｔｅｃａｎ）ロボットを使用してＥＬＩＳＡを行うことによって高処理量で行われる。個々のコロニーをディープウェル・ミクロタイター・ディッシュに入れ、Ｈｉ−Ｇｒｏ高速インキュベータ撹拌器中で一晩増殖させる。部分をとり、１５％グリセロールまたは１０％ＤＭＳＯと共にストックとして保存する。ディープウェル・ディッシュの遠心分離後、これらのストックからのＦａｂを含む上澄液を、特異抗原を塗布したウェル中でインキュベートし、別にカゼインまたは卵アルブミンなどのコントロール抗原を塗布したウェル中でインキュベートする。アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２抗体（ピアース社）を使用して抗原に結合したＦａｂを検出する。陽性候補からのミニプレプＤＮＡ（キアゲン社）について、９６ウェル形式の自動色素ターミネータ・シーケンシング（レトロゲン、サンジエゴ）によって、これらのベクターに対するストックプライマーを用いて軽鎖および重鎖の配列決定を行う。ＤＮＡｓｔａｒソフトウエアを用いて配列を分析し、特異的候補を同定し、分類する。これらのデータから、使用した各組換え抗原に対する特殊な異なる結合物のパネルが確認され、密接に関連する配列群に分類される。
【００４９】
（パネルからのＦａｂの生成および精製）
（Ｆａｂの精製）
溶解性Ｆａｂの発現および精製のために、遺伝子ＩＩＩ領域をサブクローニングによって特異的陽性候補から除去する。この時点に、インフルエンザウィルスヘマグルチニン（ＨＡ）タグ（Ｃｈｅｎ  ｅｔａ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：６５０８−１２（１９９３））および６ヒスチジン残基（Ｈｉｓタグ）からなる組合わせエピトープタグをコードするオリゴヌクレオチドを挿入し、抗−ＨＡおよび／またはＮｉ−ＮＴＡによって検出および精製することもできる。
【００５０】
ＥＬＩＳＡをベースとするアッセイおよび高処理量形式のインビトロ中和試験のために十分なＦａｂを精製するために、ニッケル−ＮＴＡカラムクロマトグラフィー（キアゲン社）を用いる。この場合、Ｈｉｓタグを含むように（スクリーニング前か後に）サブクローニングしたＦａｂをＳＢ  １リットル中で、ＯＤ６００が０．８になるまで増殖させ、３０℃で１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で３−４時間誘導し、最適量のＦａｂを生成する。ペリプラズム腔からＦａｂを分離するために、細胞ペレットをコンプリート・ミニ（ロッシュ）・プロテアーゼインヒビタを加えた冷１×ＰＢＳに再懸濁し、ソニックス・ビブラ・セルＶＣ７５０を使用して超音波処理する。細胞くずをペレットにし、上澄液をキアゲンＮｉ−ＮＴＡカラムに入れる。これらカラムを１６本使用して、最初の試験で候補あたり７５μｇのＦａｂを得た。単純な９６−ウェルフォーマットでＦａｂあたり１２本のカラム列を使用することによって、８Ｆａｂを生成することができ、最初のＰＲＮＴおよびＥＬＩＳＡアッセイのために十分な材料が得られた。エピトープ特異性試験はタグをつけないＦａｂも必要とする。これらのＦａｂは上に記載したようにプロテインＧまたはプロテインＡ（ファルマシア）に結合したヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２（ピアース社）からなるカラムで、９６ウェルフォーマットで精製する。多量の任意の所望Ｆａｂが高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）（ファルマシア）によって、抗ヒトＦ（ａｂ’）２カラムでもニッケルカラムでも精製できる。この方法は一般に約１５０−１０００μｇ／リットルの精製Ｆａｂを与える；ただしこれはＦａｂによって異なる。
【００５１】
（精製Ｆａｂの特徴づけ）
（抗原上での滴定）
精製ＦａｂをＥＬＩＳＡアッセイで抗原に対して滴定し、配列決定によって確定した関連群内のＦａｂの抗原結合特性を比較する。
【００５２】
（エピトープ特異性の測定試験）
エピトープの特異性はＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイまたは拮抗アッセイによって測定できる。遺伝子ＩＩＩに融合したＦａｂ（ファージが付加したまたは付加しない融合Ｆａｂ）またはタグに融合したＦａｂと、遺伝子ＩＩＩまたはタグのない精製Ｆａｂとが拮抗し、エピトープ特異性を測定することができる。ＰＢＳ中４μｇ／ｍｌの抗原５０μｌをミクロタイターウェル中で、４℃で一晩インキュベートする。ＰＢＳで洗浄後、ウェルをＰＢＳ中１％ツイーン２０を含むＢＣで、室温で３０分間ブロックする。ある精製Ｆａｂの希釈液を含むＰＢＳ  ５０μｌを加えてウェルをブロックし、３７℃で１時間インキュベートする。これに第二のＦａｂを融合物として含む上澄液５０μｌを加え、インキュベーションを３７℃でさらに１時間行う。第二のＦａｂはホースラディッシュペルオキシダーゼ−結合抗Ｍ１３抗体（ファルマシア）で検出される。燐酸クエン酸緩衝液、ｐＨ５．０中、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）を使用し、シグマ社のＨＲＰ基質緩衝液でウェルを展開する。ＨＡ／Ｈｉｓタグを担持するＦａｂをこのアッセイに使用するために、上記の検出に用いる抗Ｍ１３抗体はＰＮＰＰアッセイで検出されるアルカリホスファターゼ標識抗ＨＡまたは標識抗−Ｈｉｓ抗体のいずれかで置換される。
【００５３】
（中和することが確認されたＦａｂからのＩｇＧの生産および精製）
Ｆａｂの個々の疾患の中和能力を当業者に公知の方法によって試験する。
【００５４】
（Ｆａｂから完全ＩｇＧへの変換および安定細胞系の生成）
Ｆａｂを二段階法で、完全ＩｇＧ１重鎖を作り出す哺乳動物発現ベクターにサブクローニングする。このベクターは選択マーカーとしてグルタミン合成遺伝子を利用し、無グルタミン培地中でトランスフェクテド細胞を増殖させる（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：６９−７５。１９９２）。一般的方法を用いるエレクトロポレーション法によってベクターをＮＳＯマウス骨髄腫細胞系にトランスフェクトする。安定細胞系を無グルタミン培地において選択し、制限希釈によって分離する。ＮＳＯまたはＣＨＯ−Ｋ１細胞においてこのベクターでプールド・トランスフェクションも行うことができ、安定細胞系を選択する前に少量のＩｇＧを試験することができる。各クローン系から調製されたＤＮＡを制限消化によって分析し、ベクター免疫グロブリンの挿入成功が確認される。各クローン系からの培地のウエスタンブロット分析を使用して完全ＩｇＧの生成を評価し、適切な抗体で軽鎖を捕獲し、重鎖を検出することによって定量的ＥＬＩＳＡアセンブリーアッセイを行う。
【００５５】
ＩｇＧを精製するために、ＩｇＧ候補を発現する一過性感染細胞または安定細胞系をミニパーム生物反応器（ビバサイエンス社）または中空繊維性生物反応器中で増殖させる。上澄液はタンパク質Ｇまたはタンパク質Ａカラムを用いるＦＰＬＣによって精製される。疎水性相互作用カラムを用いて追加的精製を行うことができる。
【００５６】
（ＩｇＧのインビトロおよびインビボ試験）
Ｆａｂから誘導されるＩｇＧを、下記のような個々の疾患に特異的なアッセイにおいてインビトロおよびインビボ試験することができる。
【００５７】
上記の方法は炭疽菌およびＶＥＥＶの場合は上首尾に用いられる。その他のヒトドナーから作成された同一ライブラリーおよび／または複数のライブラリーがデング熱ウィルス、ＷＮＶ、およびワクシニアウィルスに対してパンニングされる。同じ方法を用いてＦａｂから全ＩｇＧに変化させ、ＩｇＧ精製をおこなうことができる。
【００５８】
本発明の抗体または抗体フラグメントはヒトまたはヒト化モノクローナル抗体などその他の抗体（またはそれらの部分）と組み合わせて、またはそれに加えて使用してもよい。これらその他の抗体とは触媒抗体であり、および／またはそれらの抗体を使う疾患に特徴的なその他のマーカー（エピトープ）と反応できるものでもよいし、異なる特異性を有するものでもよい。これらの抗体（またはその部分）は別個に投与される組成物や、２作用物質が一般的化学物質によってまたは分子生物学的方法によって結合している単一組成物などの抗体類（またはそれらの部分）と共に投与できる。さらに、これら抗体の診断的および治療的価値は、これら抗体を検出可能シグナルを（インビトロまたはインビボで）生成する標識または治療的特性を有する標識で標識化することによって増大する。
【００５９】
本開示による抗体類および／またはそれらのフラグメントを種々のインビトロおよびインビボイムノアッセイに使用して被験体における感染性作用物質の存在を検出し、または感染性作用物質汚染に反応して人に生ずる抗体類の存在を検出することができる。適切なイムノアッセイとしては例えばラジオイムノアッセイ（固相および液相）、蛍光結合アッセイ、酵素結合イムノソルベントアッセイまたは蛍光共鳴エネルギー転移法（ＦＲＥＴ）などがある。
【００６０】
一実施形態において、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて患者の体液の毒素に対するヒト抗体の存在を検出することができる。典型的アッセイ法において、抗原ＰＡ８３（リスト・ラボラトリーズ（Ｌｉｓｔ  Ｌａｂｏｒａｔｐｒｉｅｓ））のような感染性作用物質と関係する抗原を溶液中に置き、イムロン２ＨＢプレート（ＶＷＲ）に結合させ、好ましくは約４℃で一晩インキュベートする。その後ウェルを洗い、適切なＰＢＡ由来溶液とツイーン２０との混合物で約１時間インキュベートすることによってブロックする。ウェルを洗い、患者サンプル（例えば血液、血清、複数の洗浄液）そのものまたは患者サンプルの希釈系列と共に約３７℃で約１時間〜約２時間インキュベートする。陽性コントロールとして、また定量のために、幾つかのウェルを本開示にしたがって生成した感染性作用物質に対する抗体と共にインキュベートする。ウェルを洗い、その後二次抗体（アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２でよい）と共に３７℃で約１〜２時間インキュベートする。ウェルを再び洗い、市販の手段およびＥＬＩＳＡリーダーを使用して検出する。
【００６１】
このアッセイの変法は、感染性作用物質と関連する抗原、例えばＰＡ８３抗原などをその他の固体支持体、例えば計量棒やビーズなどに結合させる；ヤギ抗ヒトＩｇＧなどその他の二次抗体を用いて同定する；およびターボ（Ｔｕｒｂｏ）ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡキット（ピアース社）で検出されるホースラディッシュペルオキシダーゼなどの別の標識を使用して検出するなどである。
【００６２】
また別の実施形態において、感染性作用物質と関連する抗原、例えばＰＡ８３など、に対する２種類の抗体を使用してサンプル中の抗原を検出し、定量する。第一の抗体は固体基質（ミクロタイター、プレート、ビーズ、または計量棒など）に結合する。例えば本開示によって作成される抗体を溶液中に入れ、ミクロタイターウェル中で、約４℃で一晩インキュベートする。ウェルをその後洗い、適切なＰＢＳ由来溶液とツイーン２０との混合物と共に１時間インキュベートすることによってブロックする。ウェルを洗い、患者サンプル（血液、血清、複数の洗浄液など）そのもの、または希釈液とした患者サンプルと共に３７℃で約１〜約２時間インキュベートする。希釈系列の抗原を使用して作成される標準曲線も含まれる。ウェルをその後洗い、上記抗原上の非拮抗エピトープに結合する第二の抗炭疽菌抗体と共に約３７℃で約１〜約２時間インキュベートする。ウェルを洗い、その後市販の手段およびＥＬＩＳＡリーダーを使用して検出する。
【００６３】
このアッセイの変法は、第一の抗体をその他の固体支持体に結合させる；異なる抗体濃度および結合条件、および商業上のアッセイに使用するための固体／抗体結合の安定化法を利用する；別の溶液類でブロックまたは洗浄する；第二抗体上に異なる標識を用いるか別の検出系を使用する；または非標識第二抗体を用い、その後その第二抗体を検出する第三の標識抗体を使用する；などである。第一または第二抗体だけがヒト抗体で、その他は別の実在物または別の動物ソースからの抗体であるという変法も含まれる。
【００６４】
もう一つの実施形態において、イムノアッセイは少なくとも１種類の抗感染性作用物質モノクローナル抗体および少なくとも１種類の標識化被検体（標識化抗体か標識化ペプチドでよい）を使用する。サンドイッチイムノアッセイでは抗感染性作用物質抗体の使用がより好ましく、ポリクローナル抗体の使用が最も好ましい。サンドイッチイムノアッセイは：
ａ）固相に抗感染性作用物質モノクローナル抗体をコーティングする、
ｂ）試験サンプルを、コーティングされた固相に加え、これら２つをインキュベートする、
ｃ）上記固相を洗う、
ｄ）標識化抗感染性作用物質抗体を加え、それらをインキュベートする、
ｅ）上記固相を洗う、
ｆ）標識活性を検出して感染性作用物質の存在を確認する
諸工程を含む。
【００６５】
上記標識化抗体は固相上の抗体または上記感染性作用物質に結合特異性を有する。洗浄溶液は概して緩衝溶液であるが、水でもよく、またはその他の成分を含むことができる。
【００６６】
試験サンプルは動物の体から得られる体液または組織であり、血漿がより好ましいが、血清、全血、尿、脳脊髄液、滑液などその他の体液も使用できる。標識は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−燐酸脱水素酵素、ルシフェラーゼおよびベータ−ガラクトシダーゼなど、当業者に公知の酵素でよい。非酵素標識の例としてはフルオロイソチオシアネート、ローダミンまたはフルオレッセインなどの蛍光標識、ラジオイムノアッセイ用の放射性同位体、および粒子類がある。
【００６７】
また別の実施形態において、イムノアッセイは蛍光共鳴エネルギー転移法（ＦＲＥＴ）を利用して行われる。この一例として、感染性作用物質の抗原に対する抗体をあるクロモフォアで標識し、同じ抗原のもう一つのエピトープに対する第二抗体を別のクロモフォアで標識する。これらの抗体のいずれかまたは両方が本開示によって生成できる。これらのクロモフォアは、例えば同じ抗原への結合などによって極めて近くにあると、蛍光シグナルを発生するように相互作用する。したがってこれら２種類の抗体を患者サンプルに加えて希釈すると、感染性作用物質の適切な抗原の存在下では検出可能の蛍光シグナルを発生する。
【００６８】
感染性作用物質のインビトロ検出のためのその他の方法の非制限的例としては、拮抗阻害アッセイ、単一工程アッセイおよび凝集反応アッセイがある。
【００６９】
サンプル中の高レベルの抗体または抗体フラグメントの存在は、被験体における感染性作用物質の存在およびそれによって誘起された疾患の存在と関連する。アッセイが上記感染性作用物質に対する抗体に関するものである場合、感染性作用物質に対する抗体に対する二次抗体または抗体フラグメントの高レベルは被験体における感染性作用物質の存在およびそれによって引き起こされる疾患の存在と関連づけられる。
【００７０】
本開示はサンプル中の感染性作用物質または抗体類のアッセイに使用される少なくとも１種類の抗感染性作用物質モノクローナル抗体を含む診断試験キットを含む。診断キットはその他に、緩衝溶液、標識ポリクローナルまたはモノクローナル抗感染性作用物質抗体、抗原またはペプチド、およびキットの使用に必要な任意の付属物を含むことができる。
【００７１】
また別の局面において、本開示は炭疽菌ウィルスによる感染症を予防的に処置するためのワクチンを提供する。これらのワクチンは薬物学的に受容可能な担体中のＰＡ６３マルチマーを含む。ＰＡ６３マルチマーは１２ユニットまでのＰＡ６３を含むことができる。したがって上記マルチマーはダイマー、トリマー、クォドリマー、ペンタマー、ヘキサマー、ヘプタマー、オクタマーなどでよい。特に有用な実施形態において、ＰＡ６３マルチマーは７ユニットまでのＰＡ６３を含み、ＰＡ６３ヘプタマーがより好ましい。上記ワクチンは、炭疽菌ウィルス汚染に先立って被験体に予防的に投与できる。
【００７２】
本発明の抗体または抗体フラグメントは医薬的担体を含む組成物として患者に投与されるのが一般的である。上記医薬的担体はモノクローナル抗体を患者に適切に送達する任意の耐容性、無毒性物質でよい。上記担体としては滅菌水、アルコール、脂肪、ワックス、不活性固体がある。薬物学的に受容可能なアジュバント（緩衝剤、分散剤）も上記医薬組成物に組み入れることができる。組成物は全抗体および抗体フラグメントの両方を含むことができるのは当然である。
【００７３】
抗体および／またはフラグメント組成物は種々の方法で患者に投与される。上記医薬組成物は患者に例えば皮下、筋肉内、硬膜外または静脈内投与されるのが好ましい。このため非経口投与するための組成物は、容認される担体、好ましくは水性担体に溶解した抗体、抗体フラグメント、またはそれらのカクテルの溶液を含む。水、緩衝水、０．４％食塩液、０．３％グリセリンなど、種々の水性担体を使用できる。これらの溶液は無菌で、一般的には粒状物質を含まない。これらの組成物は生理的条件を適切にするために必要な、ｐＨ調節および緩衝剤、毒性調節剤などのような薬物学的に受容可能な補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸カルシウムなどを含むことができる。これら処方中の抗体または抗体フラグメントの濃度は例えば約０．５重量％未満から、普通、約１重量％または最低約１重量％から１５または２０重量％までに広く変動し、選択される特定の投与法に応じて主として体液量、粘度などに基づいて選択される。
【００７４】
非経口投与できる組成物の実際的製法および被験体に投与するために必要な調節は、当業者には公知であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１７ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ（１９８５）に、より詳細に記載されている。これは参考として本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００７５】
（実施例１−炭疽菌）
炭疽菌に対するワクチンを接種された現役勤務軍人ドナーの血液および骨髄から分離したメッセンジャーＲＮＡからファージライブラリーを作成した。軍医のボランティアから血液サンプルを集めた。彼らは集めるまえにＡＶＡ炭疽菌ワクチンのブーストを１週間に１回受けた。さらに商業的ソースから、コーデド骨髄が現役軍人の適合血清および免疫記録と共に提供された。骨髄ドナーの何人か、および血液ドナーの全ては炭疽菌抗原ＰＡ８３に対するタイターを有した（図２）。ＰＡ８３（９５１）に対する最良のタイターを有する骨髄ドナーは血液採取の３週間前に炭疽菌に対する免疫を受けていた。
【００７６】
総ＲＮＡは、メーカーの使用説明書によって、トリ−リアジェントＢＤ（モレキュラー・リサーチ・センター）を使用して骨髄サンプル９５１および１０３７および血液サンプルＭＤ３から得た。メッセンジャーＲＮＡはメーカーの使用説明書により、オリゴテックス（キアゲン）スピンカラムを使用して得た。抗体Ｆａｂフラグメント（可変部と結合するκまたはλ軽鎖および重鎖の第一定常部）を表すファージライブラリーが、米国仮特許出願第６０／２８７，３５５および第６０／３２３，４５５に記載の特許登録された方法によってプラスミドｐＡＸ２４３ｈベクターに構成された。上記の開示は参考としてそのまま本明細書に組み込まれる。２つのＦａｂライブラリーが各ドナーについて作成され、一つはκ軽鎖を発現し、一つはλ軽鎖を発現し、全てがガンマ重鎖を利用する。６ライブラリーからのＦａｂを担うファージをＰＡ８３に対して４ラウンドの集積（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）によってパンニングした。９５１ライブラリーも、Ｍｉｌｌｅｒらが記載した方法でＰＡ８３から作られる精製ＰＡ６３に対して４ラウンドの集積によって別個にパンニングした（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ＰＡ８３と共にＰＡ６３部位にも結合したファージを除去するために、可溶性ＰＡ８３を最初にそのファージに２０μｇ／ｍｌ濃度で３７℃で１時間結合させ、その後その混合物をミクロタイタープレート・ウェルに結合したＰＡ６３と共にインキュベートした。
【００７７】
組換えＰＡ８３抗原をフォート・デトリック（Ｆｏｒｔ  Ｄｅｔｒｉｃｋ）のＵＳＡＭＲＩＩＤから入手し、ＥＬＩＳＡアッセイに用い、ＰＡ８３抗原に対して最も高いタイターを有する炭疽菌接種軍人を確認した。これら軍人の骨髄または血液からＲＮＡを分離し、制限酵素消化／重複オリゴヌクレオチド伸長反応／単一プライマー増幅（ＲＥＤ／ＮＯＥＲ／ＳＰＡ）を行って、このＲＮＡから組み合わせＦａｂライブラリーを得た。図２を参照されたい。
【００７８】
最高のタイターを示す３名からのＲＮＡを使用してＲＥＤ／ＮＯＥＲ／ＳＰＡ増幅法を用いてライブラリーを作成した。２つのライブラリー、９５１および１０３７、はポイエティックス社（Ｐｏｉｅｔｉｃｓ）（メンロパーク（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ）、カリホルニア）から入手した。第三のライブラリー、ＭＤ３、はワクチン接種したボランティアの血液からのものであった。ライブラリー結合の効率を以下の表１に示す：
【００７９】
【表１】
2006526639.tif 000002
全てのライブラリーをＰＡ８３に対してパンニングし、９５１ライブラリーをＰＡ６３に対してパンニングした。ＰＡ８３では、抗原はウェルに結合し、提示されたＦａｂフラグメントを担うファージを添加する前にブロックされた。ＰＡ６３では、ディスプレイファージを先ず最初にＰＡ８３と混合してから、ウェルに結合したＰＡ６３抗原と反応させ、ＰＡ８３とＰＡ６３に共有される抗原に反応したファージの回収を減らした。Ｍｉｌｌｅｒら（１９９９）によって記載された方法によってＰＡ６３を生成し、ＰＡ８３から精製した。２つの上記ライブラリーのパンニングおよびＰＡ６３に対する上記パンニングの結果を下表に示す。
【００８０】
パンニングは最初にＰＡ８３に対して９５１およびＭＤ３ライブラリーで、ＰＡ６３に対して９５１ライブラリーで行われた。最初のＸＬ１−ブルーへのライブラリー変換は別として、ＥＲ２７３８細胞が使用された。両パンニングラウンドに関するインプット、アウトプットおよび幾つかの初期ＥＬＩＳＡの結果を下表に示す。
【００８１】
【表２】
2006526639.tif 000003
全てのＰＡ８３パンニング−ライブラリーにおいて集積が明らかである。ＰＡ６３に対してパンニングしたライブラリーはＰＡ８３に対する非常に弱い反応性を有する幾つかの候補を示した。これらの候補はＰＡ６３に対して試験した際には陽性であった。陽性反応体のＶＨおよびＶＫまたはＶＬ領域の配列分析の結果を図３−５に示す。二、三の配列が優勢であるとはいえ、多様性が明らかになる。ＰＡ８３をあらかじめ吸収してから、ＰＡ６３に対してパンニングしたＦａｂは、ＰＡ８３に対してパンニングしたものとは有意に異なる配列群を含むようにみえる。
【００８２】
パンニング後、４つのＰＡ８３−パンニング−ライブラリー全てで、異なるパンニングラウンドの個々の候補のＰＡ８３に対する反応性をＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。ＰＡ６３結合Ｆａｂフラグメントを同定するために、ＰＡ６３に対するパンニングを受けた９５１κおよびλライブラリーファージを先ず最初にＰＡ８３結合に関してスクリーニングし、ＰＡ８３結合物をスクリーニングから排除した。しかしＰＡ８３に十分結合する候補は見つからなかった。これはファージを先ず最初に可溶性ＰＡ８３と共にインキュベートすることによっておこなわれた拮抗が有効であったことを示すものである。両方の抗ＰＡ６３ライブラリーの第四ラウンドライブラリーにおけるクローンのわずかのパーセントが、基質中における数時間のインキュベーション後、非常に弱いＥＬＩＳＡ反応性を示した。これらのクローンをＰＡ６３に対してスクリーニングすると、遥かに強いシグナルが生成した。ＰＡ８３に対する弱い反応性はＰＡ８３との交差反応性によるものかも知れず、またはＰＡ８３プレパレーション中の少量のＰＡ６３を反映するものかも知れない。後者は精製または保存中に起きるＰＡ８３のフリンプロテアーゼ感受性部位のプロテアーゼ切断（Ｋｌｉｍｐｅｌ  ｅｔａｌ．，１９９２）に起因するものらしい。
【００８３】
６つの異なるパンニングライブラリーから選択した、強いＰＡ８３またはＰＡ６３結合活性を有する１４４の個々の候補について配列決定し、全ての変異体候補のパネルを決定した。これは３１の特異的ＰＡ８３結合物および６個の特異的ＰＡ６３結合物を含んでいた。２５の特異的ＰＡ８３結合物は全て可変重鎖（ＶＨ）座  ３−３０／３−３０．５から誘導された。ＰＡ６３結合物の重鎖のなかで、２つの関連配列が目立っていた；これらはＰＡ８３配列には似ていなかった。１つの突然変異が抗体の親和性を劇的に変え得るから、候補が他の候補に比較して重鎖または軽鎖に一つのアミノ酸差を有するならば、それらは特異的であると考えた。
【００８４】
炭疽菌タンパク質ＰＡ８３およびＰＡ６３に対するその他の抗体配列を図６−８Ｃに示す。図６に示されるヒトκ軽鎖可変配列では、クローニングにおいてＳ（セリン）およびＲ（ａｒｇｅｎｔｉｎｅ）がＸｂａｌ（ＴＣＴＡＧＡ）部位から誘導される。図のアミノ酸ナンバー３はＫａｂａｔナンバリング系（免疫学的に見たタンパク質の配列、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）におけるヒトκ軽鎖のアミノ酸ナンバー１に対応する。大部分の配列で示される最後の４アミノ酸（ＲＴＶＡ）はヒトκ軽鎖定常領域の最初の４アミノ酸（Ｋａｂａｔナンバリング系では１０８−１１１と数えられる）に対応する。示された２配列は定常領域の始まりの部分にまでは伸長しない。可変領域は長さの多様性を含むから、各配列のアミノ酸の実際的数は１１３（最初の２アミノ酸プラス１１１）より大きいか小さい可能性がある。図７に示すヒトλ軽鎖可変配列では、最初の２アミノ酸、ＳおよびＲ（ａｒｇｅｎｔｉｎｅ）はクローニングに用いたＸｂａｌ（ＴＣＴＡＧＡ）から誘導される。図のアミノ酸ナンバー３はＫａｂａｔナンバリング系のヒトλ軽鎖のアミノ酸ナンバー１に対応する。各配列で記載される最後のアミノ酸はＫａｂａｔナンバリング系ではヒトλ軽鎖定常領域のアミノ酸１５５に対応する。可変領域は長さの多様性を含むから、各配列のアミノ酸の実際数は１５７より大きいか小さい可能性がある。図８Ａ−Ｃに示されるヒトガンマ重鎖可変部配列では、最初の２つのアミノ酸、Ｌ（ロイシン）およびＥ（グルタメート）はクローニングに用いたＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）部位から誘導される。図のアミノ酸ナンバー３はＫａｂａｔナンバリング系におけるヒトガンマ重鎖のアミノ酸ナンバー１に対応する。各配列で示される最後のアミノ酸はＫａｂａｔナンバリング系のヒトガンマ重鎖定常領域のアミノ酸１１８に相当する。可変領域は長さの多様性を含むから、各配列のアミノ酸の実際数は１２０より大きいかも知れない。
【００８５】
軍関係者を免疫するために使用されるＡＶＡワクチンにも少量存在するＥＦおよびＬＦに対するパンニングがこれらのライブラリーで行われる。ＰＡ６３に対する追加的パンニングはその他のライブラリーで行うことができる。異なる抗体類の親和性を評価するためにビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）アッセイが行われる。同じエピトープ結合特性を共有する抗体類の群を同定するために拮抗実験が行われる。候補について、ＰＡと、受容体、ＥＦまたはＬＦいずれかとの結合をブロックするそれらの能力を細胞アッセイで測定する。その後最良の候補について、ＰＡ、ＥＦおよびＬＦか、または実際の炭疽菌感染症のいずれかを使用して、動物モデルでインビボ毒性をブロックする能力を試験する。１つ以上のこれらの試験において、候補は任意に完全ヒト抗体に変更される。
【００８６】
その他の試験に用いる精製抗体を作るために、このパネルからの候補をサブクローニング工程にかけ、Ｆａｂフラグメントの重鎖部分から遺伝子ＩＩＩを除去する。その後Ｆａｂを、２〜４リットルの培地からヤギ抗ヒトＦａｂカラムを用いる高性能液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によって精製した。精製Ｆａｂを使用する中和アッセイは、リットルの方法（Ｌｉｔｔｌｅ  ｅｔａｌ．，１９９０）にしたがって、マウスマクロファージ細胞系、Ｊ７７４Ａ．１、を使用して行われた。毒性作用に反応した細胞死によって放出される乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を測定するための条件を、Ｃｙｔｏｔｏｘ９６検出キット（プロメガ社）を用いて決定した。Ｊ７７４Ａ．１細胞を９６ウェル皿上で１４，０００細胞／ウェルで一晩培養した。各点において４−８ウェルを測定した。Ｆａｂは５０ｎＭで使用した。毒素は次のようにして発生させた：４００ｎｇ／ｍｌ（４．６ｎＭ）のＰＡ８３を４０ｎＭ／ｍｌのＬＦと共に加えた。３７℃で４時間インキュベーション後、ウェルを顕微鏡で検査し、その後培地を除去し、遠心分離して未付着の細胞をペレット化した。
【００８７】
多数の中和アッセイの結果を図９にまとめる。これらのＦａｂはＦ９Ｌ６Ｒ２（本明細書では９５１Ｌ６Ｒ２および８３Ｌ６Ｒとも言う）、ＦＭＬ５Ｂ（本明細書では８３Ｌ５Ｂとも言う）、ＦＭＫ９Ｃ（本明細書では８３Ｋ９Ｃとも言う）、Ｆ９Ｋ３Ｃ（本明細書では８３Ｋ３Ｃとも言う）、Ｆ９Ｋ２Ａ（本明細書では８３Ｋ２Ａとも言う）、ＦＭＬ８Ｅ（本明細書では８３Ｌ８Ｅとも言う）、ＦＭＬ８Ｆ（本明細書では８３Ｌ８Ｆとも言う）、ＦＭＬ３Ｂ（本明細書では８３Ｌ３Ｂとも言う）、ＦＭＬ２Ｄ（本明細書では８３Ｌ２Ｄとも言う）、ＦＭＬ７Ｄ（本明細書では８３Ｌ７Ｄとも言う）、Ｆ９Ｋ３Ｈ（本明細書では８３Ｋ３Ｈとも言う）、ＦＭＬ４Ｅ（本明細書では８３Ｌ４Ｅとも言う）、ＦＭＬ２Ｅ（本明細書では８３Ｌ２Ｅとも言う）、Ｆ９Ｋ２Ｈ（本明細書では８３Ｋ２Ｈとも言う）、Ｆ９Ｋ７Ｈ（本明細書では８３Ｋ７Ｈとも言う）、ＦＭＫ７Ｃ（本明細書では８３Ｋ７Ｃとも言う）、および９５１Ｌ６３１Ｄ（本明細書では６３Ｌ１Ｄとも言う）を含む。図からわかるように、試験した１７の抗−ＰＡ  Ｆａｂ（サンプルｅ−ｕ）のうち１４は８０％以上の有効性で炭疽菌毒素の効果を中和できる。５つのＦａｂはこの濃度でこの時間内に完全に中和する。サンプル（ａ）および（ｂ）は毒素を添加しない２つのＦａｂである；これらから、この時間内には精製サンプルのエンドトキシンによって細胞死は誘起されないことがわかる。サンプル（ｃ）は毒素単独の効果を示す。サンプル（ｄ）は、細胞を炭疽菌毒素作用から有意には防御しない不適切なＦａｂを含む。
【００８８】
選択されたＦａｂを滴定し、インビトロ  ５０％防御値を決定した（図１０）。Ｆａｂを逓減希釈し、部分を毒素含有培地に加えた。これらの実験において、ＰＡの最終濃度は４００ｎｇ／ｍｌで、ＬＦの最終濃度は８０ｎｇ／ｍｌであった。これらの部分を四重に細胞に加え、３７℃で４時間インキュベートした。細胞毒性を目で見て評価し、既述のようにＣｙｔｏｔｏｘ９６アッセイで定量測定した。ここに示す抗−ＰＡ８３  Ｆａｂは全て、このアッセイに使用したＰＡ８３濃度と等モル量に近い５０％中和値を有する。しかし抗−ＰＡ６３Ｆａｂ  ９５１Ｌ６３１Ｄはこれらより低い、約５−７分の１の５０％中和値を有する；言い換えれば、９５１Ｌ６３１Ｄの１分子はＰＡ８３の多数の分子を中和する。この実験においてＰＡ８３はＪ７７４Ａ．１細胞によって切断され、ヘプタマーポアに変えられる。ＰＡ８３の化学量以下の量を中和する９５１Ｌ６３１Ｄの能力の最も妥当な説明は、それがヘプタマーポアのレベルで作用しており、一度に７つまでのＰＡ８３分子を効果的に中和する、というものである。
【００８９】
９５１Ｌ６３１ＤおよびＭＫ７Ｃのインビボ試験が最近行われた。総容量２００μｌのＰＢＳ中ＰＡ８３  ４０μｇおよびＬＦ  ８μｇを投与した２匹のラットは６０分および７１分で死んだ。同じ量の毒素および３１０μｇの９５１Ｌ６３１Ｄを投与した２匹のラットは、２５時間は生きており、この時点で殺された。約３−５時間目にこれらのラットは嗜眠および軽い浅速呼吸などの疾患症状を示したが、１６時間目には１匹のラットではこれは消失し、他の１匹では嗜眠が残ったが呼吸は正常であった。２５時間目までに両ラット共、ＰＢＳ注射コントロールラットに比較して正常であるように見えた。したがって９５１Ｌ６３１Ｄはラットをインビボ  炭疽菌中毒から防ぐことができるようにみえる。１匹のラットでＭＫ７Ｃ  ３００μｇを毒素と共に試験した。そのラットは症状を何ら示すことなく生存した。
【００９０】
９Ｋ２Ｈ（本明細書では８３Ｋ２Ｈとも言われる）、９Ｌ６Ｒ２（本明細書では９５１Ｌ６Ｒ２および８３Ｌ６Ｒとも言われる）、ＭＫ７Ｃ（本明細書では８３Ｋ７Ｃとも言われる）、９Ｋ７Ｈ（本明細書では８３Ｋ７Ｈとも言われる）、ＭＬ８Ｅ（本明細書では８３Ｌ８Ｅとも言われる）、および９５１Ｌ６３１Ｄ（本明細書では６３Ｌ１Ｄとも言われる）から生成するＦａｂについて、それらが線状エピトープと反応する能力を試験した。ＰＡ８３およびＰＡ６３を変性（だが非還元）条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で処理し、ウエスタンブロット法によってニトロセルロースフィルタに移した。ＰＡ６３かＰＡ８３を含むブロットから切り取ったストリップを同じ濃度でこれら精製抗体の各々にハイブリッド化した。結合抗体をアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２（ピアース社）と反応させた。結果を図１１に示す。Ｆａｂ  ６３Ｌ１ＤはモノマーＰＡ６３またはＰＡ８３に結合しなかった。このデータは、Ｆａｂ  ６３Ｌ１Ｄは配座エピトープに結合することを示す。使用した抗−ＰＡ８３Ｆａｂの全てはこれらの条件下でＰＡ８３によく結合し、線状エピトープか、またはウエスタン移動条件下で変形されるかも知れないエピトープに結合することを示した。８３Ｋ７Ｃは前に見られたようにＰＡ８３およびＰＡ６３に等しくよく結合した。８３Ｌ８Ｅおよび８３Ｌ６Ｒはウエスタン法においてＰＡ６３に若干結合した。これは、使用したＦａｂおよび抗原の量が多かったためか、またはＰＡ６３がウエスタン上ではモノマーであるが、図１４のＥＬＩＳＡでは大部分がヘプタマーであるような条件だったためかも知れない。
【００９１】
試験した５つの抗−ＰＡ８３  Ｆａｂの全てはＰＡ８３の線状エピトープに結合するように見える（図１２）。それに対して抗−ＰＡ６３抗体は変性ＰＡ６３には結合せず、ＰＡ８３へのかすかな非特異的結合と考えられるようなものを示す。９Ｋ２Ｈおよび９Ｋ７Ｈは変性ＰＡ６３には結合を示さず、ＭＫ７ＣおよびＭＬ８Ｅは強く結合する。９Ｌ６Ｒ２は弱い結合を示す。
【００９２】
これらのＦａｂの幾つかについて、ＰＡ８３およびＰＡ６３への結合能力をＥＬＩＳＡ法で抗原に対するＦａｂ滴定を実施することによって定量的に分析した。ＰＡ８３およびＰＡ６３はリスト・ラボラトリーズから購入し、使用説明書によって水または５０％グリセロールにそれぞれ再懸濁した。以下のグラフはＰＡ８３またはＰＡ６３に対する４Ｆａｂフラグメントの滴定を示す。黒い記号はＰＡ８３に対する反応性を示し、白い記号はＰＡ６３に対する反応性を示す。この結果から、Ｆａｂ  ６３Ｌ１ＤはＰＡ６３に結合するがＰＡ８３には結合しないことがわかる。これは、それがＰＡ８３のＰＡ６３への変換後に限って使用できるエピトープに結合することを示唆する。Ｆａｂ  ８３Ｋ７ＣはＥＬＩＳＡ法においてＰＡ６３にもＰＡ８３にも結合し、その一方で、もともとＰＡ８３で選択された２つのその他のＦａｂでは、ＰＡ６３への結合はＰＡ８３に比較して有意に低下する。ＰＡ６３に対してＦａｂ  ６３Ｌ１Ｄが到達した飽和値はＦａｂ  ８３Ｋ７Ｃのそれの約４分の１であったことに注目されたい。これらの考察は、ＰＡ６３のヘプタマー化によって形成される配座エピトープにＦａｂ  ６３Ｌ１Ｄが結合することを証明する。ＥＬＩＳＡ法における低い結合はヘプタマー上の結合できる部位の数がより限られているためであった。それは、正しくヘプタマー化され、結合に使用できるＰＡ６３が少ないことを反映している。ＰＡ８３は等しくよく結合するので、使用できるＰＡの絶対量は、理論上は同等であった。ＬＦはヘプタマーによって形成される配座エピトープに結合することが知られている（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｍｏｇｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）；７カ所に存在するとはいえ、結合ＬＦの立体障害のためにＬＦは３カ所だけに結合できる。
【００９３】
図１３において、Ｆａｂ  ＦＭＬ８Ｅのｈｉｓタグ付き変形体を作り、それをその他の無タグＦａｂと拮抗させてエピトープ特異性を評価した。Ｆａｂ  Ｆ９Ｋ２Ｈ、Ｆ９Ｋ７ＨおよびＦＭＬ８Ｆは全て、ＦＭＬ８Ｅとの自己競合と同様に拮抗し、これらのＦａｂが同じエピトープを、またはＦＭＬ８Ｅによって見られるものに非常に近いエピトープを識別することを示唆する。Ｆ９５１Ｌ６Ｒ２は同様にではないが拮抗し、このエピトープが競合を起こすほど十分近くにあるとはいえ、同じではないことを示唆する。ＦＭＫ７Ｃは競合に関しては非常に無力であり、多分離れた部位に結合することを示唆する。興味深いことに、ＰＡ６３に分解すると、上のウエスタンブロット法で示されるように、Ｆ９Ｋ２ＨおよびＦ９Ｋ７Ｈによる結合はなくなり、その一方、ウエスタンにおける結合はＦＭＬ８ＥおよびＦ９５１Ｌ６Ｒ２ではまだ明らかで、高濃度では上記のＥＬＩＳＡ滴定において若干の反応性もみられる。これはＦ９Ｋ２Ｈ／Ｆ９Ｋ７Ｈと結合するエピトープがＦＭＬ８Ｅ／ＦＭＬ８Ｆ、Ｆ９５１Ｌ６Ｒ２、またはＦＭＫ７Ｃのためのエピトープとは同じでないことを示唆する。上記のＦａｂを１：４に逓減希釈し、２００ｎｇのＰＡ８３で一晩コーティングしたミクロタイターウェルに３７℃で１時間結合させた。その後洗わずにｈｉｓタグ付きＦＭＬ８Ｅを５μｇ／ｍｌ加え、２時間反応させた。その後プレートを洗い、アルカリホスファターゼ結合抗−Ｈｉｓと反応させＰＮＰＰアッセイを行う。ＦＭＬ８ＥおよびＦＭＬ８Ｆは同様な重鎖を有するが、異なる軽鎖を有することは注目される。Ｆ９Ｋ２ＨおよびＦ９Ｋ７Ｈは互いに関連があり、ＦＭＬ８Ｅと同じく重鎖ジャームライン座を使用するが、ＭＬ８Ｅとは全く異なるＣＤＲ領域を有する。Ｆ９５１Ｌ６３１ＤおよびＦＭＫ７Ｃは異なる重鎖ジャームライン座からのものである。
【００９４】
ＥＬＩＳＡ法においてその他の抗−ＰＡ８３  ＦａｂがＰＡ６３と結合する能力を、１μｇ／ｍｌ濃度で２００ｎｇ／ウェルのＰＡ６３またはＰＡ８３に対して評価した。１μｇ／ｍｌの濃度を使用したのは、図１２に決められた濃度であったためである。この濃度では８３Ｌ８Ｅおよび８３Ｌ６Ｒの結合がなくなるか或いは減少するのが認められた。図１４に見られるように、ＰＡ６３に結合した唯一の抗−ＰＡ８３  Ｆａｂは明らかに８３Ｋ７Ｃであった。
【００９５】
Ｆａｂ  ６３Ｌ１ＤがＬＦと同様の仕方で結合するように見えるため、ＰＡ６３との結合に関してＦａｂ  ６３Ｌ１ＤがＬＦと拮抗するかどうかをＥＬＩＳＡにおいて決定する実験を行った。このアッセイのために、ＰＡ６３をミクロタイターウェル皿に２００ｎｇ／ウェルで結合させた。ウェルを洗い、ブロックし、ＬＦを既述のように逓減希釈し、３７℃で２時間、四重にインキュベートした。Ｆａｂ  ６３Ｌ１Ｄおよび８３Ｋ７Ｃは最終濃度１μｇ／ｍｌで使用した。これは各ＦａｂについてＰＡ６３に対してＥＬＩＳＡ滴定で測定された５０％最大結合濃度より幾らか高い濃度である。Ｆａｂをウェルに加え、１５分および２時間競合させた。結合Ｆａｂをアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＦａｂおよびＰＮＰＰアッセイで検出した。
【００９６】
この実験の結果を図１５に示す。８３Ｋ７ＣはＬＦの全ての濃度で等しくよく結合することが判明した。これは、８３Ｋ７ＣがＰＡ６３への結合に関してＬＦと拮抗しなかったことを示唆する。１５分間の６３Ｌ１Ｄ結合は、より高濃度のＬＦにおいては減少を示し、ＰＡ６３への結合に関してＬＦと拮抗することを示唆する。競合を２時間続けた場合は、最高濃度のＬＦが存在していても、比較的多くの６３Ｌ１Ｄが結合できた。このデータはＦａｂ  ６３Ｌ１ＤがＬＦと拮抗し得ることを示すものである。
【００９７】
競合的ＥＬＩＳＡ検定を行った。その際マウスモノクローナル抗体（１４Ｂ７）を種々濃度のＦａｂ  ８３Ｋ７Ｃまたは８３Ｌ８Ｅと混合し、その後ミクロタイタープレート上に固定したＰＡ８３に結合させた。マウスモノクローナル抗体１４Ｂ７をステファン・レプラ（Ｓｔｅｐｈａｎ  Ｌｅｐｐｌａ）（Ｌｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）から入手した。このモノクローナル抗体はＰＡ８３に結合し、ＰＡ８３のその細胞受容体への結合をブロックすることが証明されている（Ｌｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。結合した１４Ｂ７はアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃを使用して検出された。図１６は、８３Ｋ７Ｃが結合に関して１４Ｂ７と競合する（だが８３Ｌ８Ｅは競合しない）ことを示す。例えばＦａｂ  ８３Ｋ７Ｃは同様なまたは折り重なったエピトープに結合し、受容体結合をブロックすることによって作用する。
【００９８】
ビアコア（バイオセンサー・ツールズ（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  Ｔｏｏｌｓ）、ソルトレークシティー、ユタ州）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いる動態学的分析を行い、Ｆａｂ／毒素相互作用に関する動態および結合パラメーターを測定した。会合（ｋａ）および解離（ｋｄ）速度定数をビアコアによって測定した；ＫＤは（ｋｄ／ｋａ）として計算された。括弧内の数字は最後のディジットの標準誤差をあらわす。残差標準偏差は概して各データポイントがモデルからどのくらい乖離しているのかをＲＵの数値で表している。下の表３に示される結果は、６３Ｌ１Ｄおよび８３Ｋ７Ｃが固定ＰＡ６３にナノメータ以下の親和性で結合することを示す。
【００９９】
【表３】
2006526639.tif 000004
Ｆａｂ  ６３Ｌ１ＤはＰＡ８３に結合しなかったため、数値は測定されなかった。これは、ＦａｂがＰＡ６３ヘプタマー、またはＰＡ８３切断後に露出したエピトープに結合することを示すＥＬＩＳＡデータと一致する。興味深いことに、８３Ｋ７ＣはＰＡ８３に比較してＰＡ６３の方によりしっかりと結合した。その主な理由として離れる割合が低いことが挙げられる。
【０１００】
この開示は、インビトロで高親和性を有し、強力に中和するヒト抗炭疽菌毒素抗体がＡＶＡ免疫ドナーから分離できることを先ず最初に明らかにする。Ｌｉｔｔｌｅら（１９９０）は炭疽菌毒素致死因子に対するネズミモノクローナル抗体の１群を同定した。  インビトロ対インビボ防御を評価すると、稀な例を除いてインビトロ防御度がインビボ防御と相互に関係することを示唆する。試験した１９の中和抗体のうち１５の中和抗体が同定された。そのうち幾つかは低濃度で完全に中和する。そこで、これら抗体の幾つかはインビボで防御することが期待される。データはさらに、ＡＶＡワクチンがヒトを炭疽菌汚染から効果的に防御することを示唆する。
【０１０１】
抗ＰＡ８３および抗ＰＡ６３両方の活性を組合わせると、インビボ治療を目的にできる可能性が生まれる。抗ＰＡ８３は細胞受容体へのＰＡ８３分子の結合数を制限する。破壊されず、ヘプタマーポアを形成したＰＡ８３分子はその後抗ＰＡ６３活性によって中和され、炭疽菌感染の致死効果を強力に防御する。２抗体の組み合わせは、感染症の始まりまたはその過程における新しい機能的ポア構造の形成を直ちに防ぐことができる。
【０１０２】
これら２抗体の使用は、予想される炭疽菌放出にさらされる可能性のあるワクチン接種を受けた、または受けていない人々に追加的受動防御を提供することができる。疾患を防御し得る治療剤があれば、炭疽菌に関する一般大衆の不安の解消に役立つかも知れない。その上、そのような治療薬は炭疽菌の意図的放出を生物テロ行為として成功し難くし、したがってそのような攻撃の可能性を減らすかも知れない。
【０１０３】
（インビトロ実験）
Ｃｙｔｏｔｏｘ９６検出キット（プロメガ社）を使用して、毒素作用に反応した細胞死によって遊離される乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を測定するために諸条件を決定した。マウスマクロファージ細胞系Ｊ７７４Ａ．１（Ｌｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａ．，１９９０）を９６ウェル皿に１４，０００細胞／ウェルで一晩培養した。各時点に４−８ウェルを測定した。Ｆａｂは図に示すように使用された。毒素を次のように生成した：ＰＡ８３  ４００ｎｇ／ｍｌ（４．６ｎＭ）を８０ｎｇ／ｍｌのＬＦと共に加えた。３７℃で４時間培養後、ウェルを顕微鏡検査し、その後培地を取り、遠心分離して未付着細胞をペレットにした。培地のＣｙｔｏｔｏｘ９６（プロメガ社）アッセイをメーカーの使用説明書によって行った。
【０１０４】
選択されたＦａｂのインビトロ中和活性を、逓減希釈法を用いて測定した。中和曲線を図１０に示す。８３Ｋ７Ｃを含む図１０に示される抗ＰＡ８３Ｆａｂは全て、このアッセイに使用したＰＡ８３の濃度（４．６ｎＭ）と等モル量に近い５０％中和値を有した。しかし抗ＰＡ６３Ｆａｂ  ６３Ｌ１ＤはＰＡ８３で得られる数値の約３．５〜６分の１の５０％中和値を有した。この数値はＰＡ８３に関して化学量以下であった。これはヘプタマー上に見いだされる配座エピトープへのＦａｂ  ６３Ｌ１Ｄの結合と一致し、したがって１つより多いＰＡ分子を効果的に一度に中和することができる。６３Ｌ１Ｄも８３Ｋ７Ｃも両方とも比較的高濃度で細胞を細胞死から完全に防御し、再現性のある結果をもたらす。
【０１０５】
Ｆａｂ  ６３Ｌ１Ｄおよび８３Ｋ７Ｃの結合をさらに特徴づけるために追加的実験を行い、選択されたＦａｂが、ＰＡが細胞に結合した後でも毒素の効果を中和できるかどうかを調べた。ヘプタマーとＬＦとの結合前に作用するものは、活性をブロックすることが期待されない。よって、ＰＡ８３を４００ｎｇ／ｍｌ濃度で細胞に加え、４℃で２時間インキュベートし、その後細胞を洗い、８０ｎｇ／ｍｌのＬＦと５０ｎＭのＦａｂを加えた。このアッセイの結果を図１７に示す。図からわかるように、Ｆａｂ  ６３Ｌ１Ｄは細胞死を防いだ。これは、この抗体が、ＬＦ結合を阻止できる部位でヘプタマーに結合するという結論と一致する。
【０１０６】
（薬理学的動物実験）
動物操作は、実験が行われるペリー・サイエンティフィック社のインスティテューショナル・ケア・アンド・ユース委員会によって承認された。フィッシャー３４４ラットに、ラット２５０ｇにつきＰＡ４０μｇおよびＬＦ８μｇをＥｚｚｅｌｌらの方法（１９８４）によって注射した；ただし今回は尾静脈を使用した。陽性コントロールには毒素だけを使用した；他の群に対しては記載のように毒素を種々の量のＦａｂと共に使用した。１または２匹のラットで行った最初のトライアルにより、Ｆａｂ  ８３Ｋ７Ｃおよび６３Ｌ１Ｄが防御効果を有することが判明した後、これら２種類のＦａｂで用量反応試験が行われた。１群あたり４匹のラットを使用した。陰性コントロールには溶媒として使用された、Ｆａｂ透析からのＰＢＳを注射した。生存しているラットを７日後に殺した。
【０１０７】
組換え毒素攻撃に対するＦａｂ  ８３Ｋ７Ｃおよび６３Ｌ１Ｄのインビボ試験結果を図１８に示す。図からわかるように、８３Ｋ７Ｃおよび６３Ｌ１Ｄは異なる防御パターンを有する。８３Ｋ７Ｃは２および６ｎｍｏｌ（それぞれ〜１００または３００μｇ／ラット、）の両方で完全に防御し、０．６ｎｍｏｌで症状および死をわずかだが統計的に有意に遅らせた（両側スチュデントｔ−検定において、それぞれｐ＝０．０００５およびｐ＝０．０３８）。６３Ｌ１Ｄは６ｎｍｏｌで完全に防御した。２ｎｍｏｌでは、６３Ｌ１Ｄは死から防御はしたが、注射後約２時間１５分後に動物は炭疽菌中毒の症状を示し始めた。症状は１または２時間はわずかだが残り、結局は治まり、動物は生き延びた。０．６ｎｍｏｌ（〜３０μｇ／ラット）では６３Ｌ１Ｄは症状および死を実質的に遅らせた。これら２Ｆａｂの効果の差は、それらの作用モードに関係している。ＥＬＩＳＡ法において８３Ｋ７ＣはＰＡ８３およびＰＡ６３に等しくよく結合し、毒素の細胞への結合を阻止するようにはたらく。上述のように、６３Ｌ１Ｄは細胞表面に形成されたヘプタマーに結合する。２ｎｍｏｌの６３Ｌ１Ｄは炭疽菌毒素の存在のもとで２時間ラットを十分に防御するようにみえるとはいえ、ＦａｂはＬＦより速くその動物からなくなる。そこで、残っているＬＦが細胞のあらかじめ結合したＰＡに入るにつれて症状が起きるが、発生する中和されていない毒素の量は肺浮腫や死につながる二次的ショックを起こすには不十分である。Ｆａｂのクリアランスはある場合には症状の出現の一因となるので、６３Ｌ１Ｄの完全ＩｇＧ変形体の使用によって、この濃度またはこれより低い濃度で完全に防御できる。０．６ｎｍｏｌでは、症状および死の遅れは８３Ｋ７Ｃより６３Ｌ１Ｄの方が大きかった。この結果はインビトロ結果に平行する。インビトロ結果では６３Ｌ１Ｄが抗ＰＡ８３抗体フラグメントより強力であり、化学量以下で防御できる。
【０１０８】
（実施例２−ベネズエラウマ脳脊髄炎ウィルス）
（ヒト抗−ＶＥＥＶ抗体）
実施例１に関して上に述べたドナー血清を、標準ＥＬＩＳＡアッセイを使用してＴＣ−８３抗体に対して試験した（図１９）。ドナー１０３７、８１１および９５１はＴＣ−８３に対する顕著な血清反応性を示した。これは、抗−ＶＥＥＶ  Ｆａｂが、対応するドナー骨髄から作成された抗体ライブラリーから得られる可能性が高いことを示唆した。１０３７および９５１の両方のためのＩｇＧ−κおよびＩｇＧ−λライブラリー（全部で４ライブラリー）が、炭疽菌の例で記したように、前に作られている。これらのファージ−ディスプレー抗体ライブラリーをＴＣ−８３抗原上で４ラウンド、パンニングした。この実験結果を以下に示す：
最初のライブラリーの大きさ：
９５１Ｋ                ５．７×１０９
９５１Ｌ                ２．６×１０９
１０３７Ｋ              ３．１×１０９
１０３７Ｌ              ４．５×１０９
ラウンド１パンニング：
インプット          アウトプット
９５１Ｋ                ５．６×１０１１    ６．０×１０４
９５１Ｌ                ２．６×１０１１    １．８×１０５
１０３７Ｋ              ４．８×１０１１    ４．０×１０４
１０３７Ｌ              ３．２×１０１１    １．０×１０５
ラウンド２パンニング
インプット          アウトプット
９５１Ｋ                １．２×１０１３    １．２×１０７
９５１Ｌ                ３．０×１０１３    １．０×１０６
１０３７Ｋ              ３．８×１０１３    ４．４×１０７
１０３７Ｌ              ２．２×１０１３    ４．８×１０６
ラウンド３パンニング
インプット          アウトプット
９５１Ｋ                ５．０×１０１３    ３．１×１０８
９５１Ｌ                ７．８×１０１３    ４．０×１０７
１０３７Ｋ              ８．０×１０１３    ６．１×１０８
１０３７Ｌ              ８．８×１０１３    ２．１×１０８
ラウンド４パンニング
インプット          アウトプット
９５１Ｋ              １．０×１０１４    ８．０×１０９
９５１Ｌ              ４．４×１０１３    ２．０×１０９
１０３７Ｋ            １．５×１０１４    １．０×１０１０
１０３７Ｌ            ３．８×１０１３    ４．０×１０９。
【０１０９】
４ライブラリー全て（９５１Ｋ、９５１Ｌ、１０３７Ｋおよび１０３７Ｌ）のラウンド３および４のパンニングから得たＦａｂクローンのパネルを、高処理量フォーマットのテカン・ロボティック・プラットフォームを使用して、ＥＬＩＳＡ法による固定ＴＣ−８３への結合に関してスクリーニングした。図２０Ａ−Ｄに見られるように、ＴＣ−８３に顕著に結合するＦａｂ（アルカリホスファターゼ結合抗−ヒトＦａｂを使用して検出される）が４ライブラリー全てで得られた。Ｆａｂクローンを、陽性コントロールＨｙ４−２６Ａ（３Ｂ４Ｃ−４のヒト化変異体）および陰性コントロール抗−テタヌストキソイドＦａｂ（これらは図２０の各グラフのそれぞれ最後の前のサンプルおよび最後のサンプルである）に比較してスクリーニングした。上記４ライブラリーの各々から最高のＥＬＩＳＡシグナルを有する３Ｆａｂを選び、その後の分析を行った。各クローンでＤＮＡを作り、配列決定分析にかけた。配列決定結果から、３つの９５１Ｋクローンが同定されることがわかった。さらに、１２クローンのうち１０が同じ可変重鎖領域（ＶＨ）を有したが、これらＦａｂの大部分は異なる軽鎖配列を有した。つまり、３つの別個の重鎖（ＨＣ）グループに１０の特異的クローンがある。
【０１１０】
４つのヒトＦａｂクローンを選び、その後分析を行った。選択されたＦａｂは同定された明らかに異なる３つのＨＣクラス全てを示した。
【０１１１】
クローン            ＶＨ分類（一般化されたグループ）        ＬＣ
Ｐ３Ｆ２                ＃１                                κ
Ｐ３Ｆ５                ＃２                                κ
Ｐ３Ｈ６                ＃３                                κ
Ｐ３Ｇ１                ＃１                                λ
抗ヒトＦ（ａｂ’）２カラムを使用するＦＰＬＣによって、Ｆａｂの全てを細菌性ペリプラズム標本から精製した。Ｐ３Ｈ６  Ｆａｂは非常に低い収量であったため、その後の分析は行わなかった。
【０１１２】
図２１は、ＴＣ−８３に対する滴定ＥＬＩＳＡアッセイにおける３種類のヒト抗−ＶＥＥＶ  Ｆａｂの結合活性を示す。精製した抗−ＶＥＥＶ  Ｆａｂを、競合的ＥＬＩＳＡ実験においても試験した。競合物としてｍＨｙ４Ｆａｂを使用した。この実験結果は図２２に示され、３種類のＶＥＥＶ  Ｆａｂが同じエピトープ（Ｅ２ｃ）に対して、ｍＨｙ４  Ｆａｂのようには拮抗しないことが判明する。
【０１１３】
ヒトＦａｂはＥ２ｃエピトープでは拮抗しないが、それらはＶＥＥＶ上のその他の中和エピトープに結合するかも知れない。これを試験するために、各精製ＶＥＥＶ  Ｆａｂの一部をＣＤＣの共同研究者に送り、彼らはこれを使用して細胞をベースとするＶＥＥＶ中和アッセイを行った。別々の２実験からの結果は、Ｐ３Ｆ５が陽性コントロール３Ｂ４Ｃ−４でみられるものと同様な非常によい中和能力を有することを示した。Ｐ３Ｇ１も顕著な中和を示したが、Ｐ３Ｆ２  Ｆａｂは中和試験において明らかな効果を示さなかった。
【０１１４】
【表４】
2006526639.tif 000005
表４はＶＥＥＶに対するインビトロ中和アッセイの結果を記す。ベロ細胞のＶＥＥウィルス斑を７０％減少させるのに必要なＡｂまたはＦａｂのタイターが報告されている。ネズミＡｂ  ３Ｂ４Ｃ−４（全ＩｇＧとして）を陽性コントロールとして使用した。以前、二価抗体がウィルスをより効果的に中和することが明らかにされたので、抗−Ｆａｂ交差結合Ａｂを幾つかのウェルに加えた（非最適化濃度）。非結合陰性コントロールＦａｂはいかなる試験濃度でも中和を示さなかった。サンプルＰ３Ｆ５はネズミ３Ｂ４Ｃ−４のそれに近い活性を示した。
【０１１５】
これらの予備的結果は、完全なヒト中和抗−ＶＥＥＶ抗体が単離されたことを示すものである。図２３Ａおよび図２３Ｂはこの開示にしたがって生産された、ＶＥＥＶを中和する完全ヒトＦａｂの配列を示す。これらの現存のヒト抗−ＶＥＥＶ  Ｆａｂを上記のように全ＩｇＧに変え、精製し、その後に特徴づけることができる。
【０１１６】
ＶＥＥＶに対する抗体のエピトープ特異性の試験（Ｒｏｅｈｒｉｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８２）１１８，ｐｐ２６９−２７８；Ｒｏｅｈｒｉｇ  ａｎｄ  Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８５）１４２，ｐｐ３４７−３５６）。
【０１１７】
ＴＣ−８３ウィルスタンパク質のいずれが上記のＦａｂによって識別されるのかを調べるためにウエスタンブロット法を行う。線状エピトープよりむしろ配座エピトープが識別されるので、ウエスタンブロットによって反応しないＦａｂでは、ネイティブＥ１およびＥ２エンベロープ糖タンパク質をウィルス溶解物から精製し、既述のようにＥＬＩＳＡまたは放射標識免疫沈殿アッセイを行う。
【０１１８】
ウィルスタンパク質上の反応性エピトープの同定は、下の表５に列挙するように、各結合基に対する代表的モノクローナル抗体で競合的ＥＬＩＳＡ法を用いてマッピングする。全ウィルスを塗布したミクロタイターウェルを最大約８０％の結合を与える量の代表的Ａｂと共にインキュベートする。ウェルは漸増量の試験Ｆａｂも含む。代表的Ａｂのウィルスへの結合を抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ特異的−アルカリホスファターゼ結合物を使用してモニターする。結合の喪失は試験ヒトＦａｂによる拮抗結合として説明され、エピトープの特異性または間隙配置を示唆する。
【０１１９】
【表５−１】
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【０１２０】
【表５−２】
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代表的Ａｂ（Ｊｏｈｎ  Ｒｏｅｒｉｇ  ａｔ  ＣＤＣ，Ｆｔ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，コロラド）は５０％硫酸アンモニウム沈殿およびタンパク質Ｇカラム上クロマトグラフィー後の腹水液から得ることができる。或いは抗体類を、無Ｉｇ−培地で増殖させたそれらのハイブリドーマ細胞系の条件培地から精製することができる。
【０１２１】
試験ウィルス菌種の交差反応性（Ｒｏｅｈｒｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７）  ３５，ｐｐ１８８７−１８９０：Ｒｏｅｈｒｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８２）１１８，ｐｐ２６９−２７８）
ＶＥＥＶは６サブタイプからなり、サブタイプ１は５変異体（１ＡＢ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅおよび１Ｆ）を含む。各サブタイプのウィルス菌種を既述のようにＥＬＩＳＡまたは間接的蛍光抗体アッセイ（ＩＦＡ）によって各候補Ｆａｂとの反応性について試験する。これらの分析に有用なプロトタイプウィルスを下の表６に列挙する。
【０１２２】
【表６】
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センター・フォア・ディジーズ・コントロール（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）、ベクター担持ウィルス疾患部（フォートコリンズ、コロラド）に貯蔵されているストックからのウィルス類をＢＨＫ２１細胞において増殖させることができる。
【０１２３】
（全ＩｇＧによるインビトロ中和試験の実施）
中和試験はベロ細胞において５０−１００ＰＦＵ／試験を用いて行われ、既述のように７０％終点を記録する（Ｒｏｅｈｒｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２）。
【０１２４】
（マウスをウィルス攻撃から防御する抗体類の能力の試験）
ＰＢＳで希釈した精製ＩｇＧの既知量を、例えば齢３週間のＮＩＨスイスマウスのような若いマウスに尾静脈から静脈内接種した。２４時間後、マウスに細胞培養培地で希釈したＶＥＥＶを腹腔内投与した。コントロールにはＰＢＳの静脈内投与とウィルスかウィルス希釈物投与をおこなった。また別のコントロール群は防御することが以前に証明されたネズミＡｂ  １Ａ４Ａ−１または３Ｂ４Ｃ−４を受けた。マウスを２週間観察する。接種されたマウスからのヘパリン化血漿試料は、眼球後静脈叢からの出血によって得た。
【０１２５】
（追加的抗−ＶＥＥＶ  Ｆａｂの単離）
ＴＣ−８３抗原に対するヒトＦａｂの広域パネルを作成する。既にＴＣ−８３上でパンニングされた、１０３７および９５１ライブラリーからの＞１０００の個々のＦａｂクローンを追加的ＥＬＩＳＡスクリーニングにかける。これは、それらのパンニングされたライブラリーからの１９０Ｆａｂクローンのオリジナルスクリーンを補うものである。さらに、ＴＣ−８３に対するタイターを有することが前に示されたあるドナー（８１１）のＲＮＡから新しいファージディスプレイ抗体ライブラリーが作成される。新しく作成された８１１ライブラリーを固定ＴＣ−８３に対してパンニングする。特異的Ｆａｂについて、インビトロ中和、および致死的ウィルス攻撃に対する動物モデルの防御をもたらすそれらの能力を既述のように特徴づける。
【０１２６】
（実施例３−ボツリナム）
前述のライブラリー作成およびパンニング技術を適用することによって、多くの異なるボツリナム毒素セロタイプに結合する抗体類を単離し、大量に生産する。炭疽菌およびＶＥＥＶについて上に記載した中和抗体のように、ボツリナム神経毒素に対するこれらの完全ヒト抗体は免疫予防のためにまたは免疫療法剤として適する。
【０１２７】
（実施例４−デング熱ウィルス）
ヒト完全中和抗体は理論的なおよび天然の抗毒素または抗感染症剤として特に有用である、というのは、それらがその他の治療的目的に対しても安全で耐容性がよいことが既に証明されているからである。動物にワクチン接種して得られるものであろうと、種々の動物ホストに受動的に投与されるものであろうと、中和抗体はデング熱を防御することが幾つかの例で証明された。しかし、ヒトにおけるデング熱感染はワクチン接種によって増強されることが示唆され、また特殊のデング熱抗原に対する抗体はそれ自体、凝固タンパク質およびインテグリン／付着タンパク質上の一般的エピトープ類との交差反応によって出血を起こすことが報告されている（Ｆａｌｃｏｎａｒ，１９９７）。
【０１２８】
デング熱ウィルスの種々のセロタイプに感染したか、またはそれをワクチン接種した８名のヒトドナーの血液または骨髄サンプルから１６の抗体ライブラリーを作成した。２ライブラリーが各ドナーから作成され、１つはκ軽鎖を使用し、その他はλ軽鎖を使用する。８名のドナーはデング熱の４セロタイプの各々で一回感染した、またはワクチン接種された４名のドナーを含み、デング熱セロタイプで複数回感染した人からの２ライブラリー、および四価デング熱ワクチンを受けた人からの２ライブラリーを含む。１６の抗体ライブラリーを使用して、生存細胞、生存ウィルスおよびウィルス溶解物、並びに４デング熱セロタイプからのエンベロープおよびＮＡ１タンパク質を含む組換えデング熱セロタイプに対して選択する。
【０１２９】
同定されたＦａｂ抗体を精製し、特異性、親和性、およびその他のＦａｂおよび抗体類との拮抗を特徴づけるために使用する。
【０１３０】
中和することが確認された重要なデング熱抗体フラグメントは、コーディング領域を家畜である哺乳動物の発現ベクターにサブクローニングすることによって、全ヒトＩｇＧ１に変換される。全ＩｇＧコーディング配列を含むプラスミドを哺乳動物細胞にトランスフェクトすると、特徴づけのための、および受動免疫療法に使用するための大量のＩｇＧを生産することができる。
【０１３１】
（実施例５−西ナイルウィルス）
前述のライブラリー作成およびパンニング技術を適用することによって、多くの異なる西ナイルウィルス菌種に結合する抗体類が単離され、大量に生産される。炭疽菌およびＶＥＥＶで上に記載した中和抗体のように、西ナイルウィルスに対するこれらの完全ヒト抗体は免疫防御のためにまたは免疫療法剤として適している。
【０１３２】
（実施例６−痘瘡／ワクシニアウィルス）
ワクシニアの中和に関係することが知られている、既述の個々の抗原に対する免疫ヒトライブラリーのスクリーニングによって、その抗原に結合する抗体類の同様なパネルが得られ、インビトロおよびインビボでウィルスの侵入および伝播を中和できる抗体類が同定される。さらに本明細書に記載の技術によって、同様な重鎖／軽鎖対の多くの変異体が同定され、これら変異体は試験および開発のために最も好ましい特徴を有する候補を選択できるある範囲の親和性を提供する。選択される抗原類、例えば感染細胞、溶解物、またはビリオンなどの混合物の使用ももう一つのアプローチと考えられる。これによって引き出される高親和性候補は、別のあるアプローチでは必要とされる親和性の成熟を必要とせずに、免疫予防のために単独で使用できる。或いは必要ならば特異的抗原に対する抗体類のカクテルを使用することができる。例えばＨｏｏｐｅｒら（２０００）は、ワクシニアの遺伝子Ｌ１ＲおよびＡ３３Ｒを使用するＤＮＡワクチン接種が、それらを単独で使用するよりも効果が大きく、両方に対して生成した抗体がどちらか１つに対する抗体よりもよい防御を与えることを示唆する。Ｎｏｗａｋｏｗｓｋｉら（２００２）は、ファージディスプレイによって誘導される非重複エピトープに対する３抗体の混合物がポツリナム神経毒を強力に中和することを見いだした。この際、各抗体は単独ではほとんど無効であった。
【０１３３】
（実施例７−患者体液における、毒素に対するヒト抗体の存在を検出するＥＬＩＳＡアッセイ）
このアッセイにおいて、溶液Ａ（ＰＢＳ＋０．０８％ＢＣ溶液）中、抗原ＰＡ８３（リスト・ラボラトリーズ）４ｎｇ／ｍｌ溶液の５０μｌをイムロン２ＨＢプレート（ＶＷＲ）に結合させ、４℃で一晩インキュベートさせる。ＢＣ溶液は０．５％カゼイン（シグマ社）、０．０１％チメロサル（シグマ社）、０．００５％フェノールレッド、および０．０１Ｎ  ＮａＯＨを含むＰＢＳである。ウェルをその後ＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０で３回洗い、溶液Ｃ（ＢＣ溶液＋１％ツイーン２０）と共に１時間インキュベートすることによってブロックする。ウェルを再びＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０で３回洗い、患者サンプル（例えば血液、血清、胸膜洗浄液など）５０μｌ（そのまま、または希釈系列として）と共に３７℃で１〜２時間インキュベートする。希釈は溶液Ｄ（ＢＣ＋０．０２５％ツイーン２０）で行われる。陽性コントロールとして、幾つかのウェルを、このアッセイのために決められた濃度にまで溶液Ｄで希釈した実施例１に記載の抗炭疽菌抗体と共にインキュベートする。ウェルをＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０で３回洗い、溶液Ｄ中の二次抗体、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２と共に３７℃で１〜２時間インキュベートする。ウェルをＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０で３回洗い、それから１０ｍＭジエタノールアミン、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．５、中ホスファターゼ基質（シグマ社）を用いて検出した。陽性サンプルはＥＬＩＳＡリーダーを使用してＡ４０５で検出、定量される。
【０１３４】
（実施例８−患者体液中のＰＡ８３を検出および定量するためのアッセイ）
このアッセイでは炭疽菌ＰＡ８３に対する２つの抗体を使用する。第一の抗体は固体基質（例えばミクロタイタープレート、ビーズまたはディップスティック）に結合する。例えば、溶液Ａ（ＰＢＳ＋０．０８％ＢＣ溶液）中実施例１からの抗体４ｎｇ／ｍｌの溶液５０μｌをミクロタイターウェル中で、４℃で一晩インキュベートする。ウェルをＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０で３回洗い、溶液Ｃと共に１時間インキュベートすることによってブロックする。ウェルを再びＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０で３回洗い、患者サンプル（例えば血液、血清、胸膜洗浄液）５０μｌ（そのまま、または希釈系列として）と共に３７℃で１〜２時間インキュベートする。ＰＡ８３の希釈系列を使用した標準曲線も含まれる。希釈は溶液Ｄ（ＢＣ＋０．０２５％ツイーン２０）で行われる。ウェルをＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０で３回洗い、ＰＡ８３上の非競合エピトープに結合する第二の抗炭疽菌抗体と共に３７℃で１〜２時間インキュベートする。この二次抗体はアルカリホスファターゼで標識されている。ウェルをＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０で３回洗い、その後１０ｍＭジエタノールアミン、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．５、中ホスファターゼ基質（シグマ社）を使用して検出する。陽性サンプルはＥＬＩＳＡリーダーを用いてＡ４０５で検出される。
【０１３５】
下記の参考文献は参考としてそのまま本明細書に援用される：
【０１３６】
【表７−１】
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【０１３７】
【表７−２】
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【０１３８】
【表７−３】
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本明細書に開示された実施形態には種々の変更をおこなうことができることは理解される。例えば本明細書に記載される特異的配列は、抗体または抗体フラグメントの機能に必ずしも悪影響を与えることなく若干変更できることは当業者の当然とするところである。例えば、抗体またはフラグメントの機能を破壊せずに抗体配列の単一または複数のアミノ酸を置換することはよくある。そこで、本明細書に記載される特異的抗体に７０％以上の相同性を有する抗体類は本開示の範囲内である。特に有用な実施形態において、本明細書に記載される特異抗体に約８０％より大きい相同性を有する抗体類が考慮される。その他の有用な実施形態において、本明細書に記載される特異抗体に約９０％より大きい相同性を有する抗体類が考慮される。したがって前述したところは制限するためのものではなく、単に好ましい実施形態の例示であるに過ぎない。当業者はこの開示の範囲および精神を逸脱することなくその他の変更を構想することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】図１は、本開示の好ましい実施形態によるライブラリー作成のための組織ソースとして適切な人々の汚染履歴をまとめた表である。
【図２】図２は、炭疽菌のＰＡ８３抗原に対する骨髄および血液ドナーの滴定値を示す。
【図３】図３は、ＰＡ６３およびＰＡ８３に対するＶＨ陽性反応性の配列分析を示す。
【図４】図４は、ＰＡ６３およびＰＡ８３に対するＶＫ陽性反応性の配列分析を示す。
【図５】図５は、ＰＡ６３およびＰＡ８３に対するＶＬ陽性反応性の配列分析を示す。
【図６】図６は、炭疽菌タンパク質ＰＡ８３およびＰＡ６３に対する抗体類の変異ヒトκ軽鎖の配列を示す。
【図７】図７は、炭疽菌タンパク質ＰＡ８３およびＰＡ６３に対する抗体類の変異ヒトλ軽鎖の配列を示す。
【図８Ａ】図８Ａ−８Ｃは、炭疽菌タンパク質ＰＡ８３およびＰＡ６３に対する抗体類の変異ヒト重鎖のアミノ酸配列を示す。
【図８Ｂ】図８Ａ−８Ｃは、炭疽菌タンパク質ＰＡ８３およびＰＡ６３に対する抗体類の変異ヒト重鎖のアミノ酸配列を示す。
【図８Ｃ】図８Ａ−８Ｃは、炭疽菌タンパク質ＰＡ８３およびＰＡ６３に対する抗体類の変異ヒト重鎖のアミノ酸配列を示す。
【図９】図９は、精製Ｆａｂによる炭疽菌毒素活性の中和を示す。
【図１０】図１０は、７種類の逓減希釈Ｆａｂの防御パーセント（毒素だけの場合に比較）を示す。
【図１１】図１１は、本明細書に記載の方法によって作製されたＦａｂの、ＰＡ６３および／またはＰＡ８３上の線状エピトープと反応する能力を示すウエスタンブロットを示す。試験した５種類の抗ＰＡ８３Ｆａｂの全てはＰＡ８３上の線状エピトープに結合するようにみえるが、これに対して抗ＰＡ６３抗体は変性ＰＡ６３には結合せず、かすかな、多分ＰＡ８３への非特異的結合であると思われるものを示す。
【図１２】図１２はＰＡ８３およびＰＡ６３上の選択されたＦａｂのＥＬＩＳＡ滴定を示す。ＰＡ６３への切断はＦＭＬ８ＥおよびＦ９Ｌ６Ｒ２の結合を劇的に変えるが、ＦＭＫ７Ｃは両方の型に同様によく結合する。Ｆ９５１Ｌ６３１ＤはＰＡ６３だけに結合する。最大結合はＦＭＫ７Ｃのそれの４分の１であり、ＰＡ６３物質の一部だけがＦ９５１Ｌ６３１Ｄと相互作用し得る型であることを示唆する。
【図１３】図１３は、Ｆａｂ  ＦＭＬ８Ｅのｈｉｓ−タグ付き変種をその他のタグなしＦａｂと比較して用いてエピトープ特異性を試験した結果を示す。
【図１４】図１４は、２００ｎｇ／ウェルのＰＡ６３およびＰＡ８３に対する選択されたＦａｂ  １μｇ／ｍｌのＥＬＩＳＡ滴定を示す。
【図１５】図１５は、ＰＡ６３に対する結合に関して、２種類のＦａｂ  ６３Ｌ１Ｄおよび８３Ｋ７ＣとＬＦとの拮抗を示す。
【図１６】図１６は、２種類の抗ＰＡ８３Ｆａｂ、８３Ｋ７Ｃおよび８３Ｌ８Ｅの、マウスモノクローナル抗体１４Ｂ７との拮抗を示す。
【図１７】図１７は、ＰＡが細胞に結合した後、選択されたＦａｂが毒素の効果を中和できるかどうかを決定するアッセイの結果を示す。
【図１８】図１８は、組換え毒素攻撃に対抗するＦａｂ８３Ｋ７Ｃおよび６３Ｌ１Ｄのインビボ試験結果を示す。
【図１９】図１９は、ＶＥＥＶの固定ＴＣ−８３抗原に関する血清反応性を示す。
【図２０Ａ】図２０Ａ−２０Ｄは、ＶＥＥＶの固定ＴＣ−８３抗原に結合するＦａｂクローンを、４ライブラリー（９５１Ｋ、９５１Ｌ、１０３７Ｋ、１０３７Ｌ）からスクリーニングした結果を示す。
【図２０Ｂ】図２０Ａ−２０Ｄは、ＶＥＥＶの固定ＴＣ−８３抗原に結合するＦａｂクローンを、４ライブラリー（９５１Ｋ、９５１Ｌ、１０３７Ｋ、１０３７Ｌ）からスクリーニングした結果を示す。
【図２０Ｃ】図２０Ａ−２０Ｄは、ＶＥＥＶの固定ＴＣ−８３抗原に結合するＦａｂクローンを、４ライブラリー（９５１Ｋ、９５１Ｌ、１０３７Ｋ、１０３７Ｌ）からスクリーニングした結果を示す。
【図２０Ｄ】図２０Ａ−２０Ｄは、ＶＥＥＶの固定ＴＣ−８３抗原に結合するＦａｂクローンを、４ライブラリー（９５１Ｋ、９５１Ｌ、１０３７Ｋ、１０３７Ｌ）からスクリーニングした結果を示す。
【図２１】図２１は、ＶＥＥＶの固定ＴＣ−８３抗原上の精製ヒトＦａｂの直接滴定値を示す。
【図２２】図２２は、ＶＥＥＶまたはＢＳＡの固定ＴＣ−８３抗原に対する結合に関してヒトＦａｂｓとネズミＦａｂ  ｍＨｙ４（３Ｂ４Ｃ−４）とが拮抗することを示す。
【図２３】図２３Ａおよび２３Ｂは、ＶＥＥＶを中和する本開示にしたがって作られる完全ヒトＦａｂの配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
2006526639.tif 000020
【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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