(57)【要約】要約書なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非コロイド構造に関して固定化されるための能力をコロイド粒子に与えること；および
非コロイド構造へのコロイド粒子の固定化を測定することを包含する方法。
【請求項２】
コロイド粒子が補助的なシグナル伝達実体を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
補助的なシグナル伝達実体が、染料、色素、電気活性分子、化学ルミネッセンス部分、電気化学ルミネッセンス部分、蛍光部分、アップレギュレートしている蛍光体、またはホースラディッシュペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼを包含する酵素結合シグナル伝達部分を包含する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
シグナル伝達実体がメタロセンを包含する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
シグナル伝達実体がフェロセンまたはフェロセン誘導体を包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
複数のコロイド粒子が非コロイド構造に結合すること、および複数の粒子の非コロイド構造への結合を測定することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
複数のコロイド粒子が補助的なシグナル伝達実体を包含する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
補助的なシグナル伝達実体が、染料、色素、電気活性分子、化学ルミネッセンス部分、電気化学ルミネッセンス部分、蛍光部分、アップレギュレートしている蛍光体、またはホースラディッシュペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼを含む酵素結合シグナル伝達部分を包含する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
非コロイド構造に結合するか、または結合するように適合した生物学的または化学的作用物質、および粒子に結合するか、または結合するように適合した生物学的または化学的作用物質の結合パートナーを提供することをさらに含み、与える工程は作用物質および結合パートナーにより粒子が非コロイド構造に結合することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
非コロイド構造がビーズである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ビーズがポリマー材料、アガロース、テンタゲル、および／または磁性材料を包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ビーズがポリスチレンビーズである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
作用物質を非コロイド構造に結合させ、結合パートナーを粒子に結合させ、および作用物質と結合パートナーをお互いに結合させることを包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
作用物質と結合パートナーがお互いに生物学的に結合させることを包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
生物学的または化学的作用物質が薬物候補であり、そして結合パートナーが薬物候補の標的である、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
非コロイド構造がビーズである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
非コロイド構造が本質的に平面の基質またはチップの表面である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
生物学的または化学的作用物質が核酸配列である、請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
生物学的または化学的作用物質がペプチドであり、そして結合パートナーがペプチドの結合パートナーである、請求項９に記載の方法。
【請求項２０】
生物学的または化学的作用物質がタンパク質であり、そして結合パートナーがタンパク質の結合パートナーである、請求項９に記載の方法。
【請求項２１】
コロイド粒子が固定化リガンドを持ち、そして非コロイド構造がリガンドに対する結合パートナーを持つ、請求項１に記載の方法であって、標的へのリガンド結合の妨害のための候補薬物の存在下で、非コロイド構造に結合する能力をコロイド粒子に与えることを包含する前記方法。
【請求項２２】
非コロイド構造がビーズであり、複数のビーズ、ビーズへの結合に適合した複数の生物学的または化学的作用物質、複数の粒子、および粒子への結合に適合した生物学的または化学的作用物質の複数の結合パートナーを提供することをさらに包含し、ここで少なくともいくつかの作用物質および結合パートナーは互いに結合する能力を有することが推測される、請求項１に記載の方法であって、ここで少なくともビーズのいくつかを少なくとも粒子のいくつかに暴露すること、およびビーズへの粒子の固定化を測定することを包含する前記方法。
【請求項２３】
生物学的または化学的作用物質が薬物候補であり、そして結合パートナーが薬物候補の標的である、請求項２２に記載の方法であって、それぞれが異なる固定化された薬物候補を持つ、２つの異なる位置に少なくとも第１および第２のビーズを提供すること、複数の粒子を少なくとも２つのビーズに暴露すること、そして第１のビーズと第２のビーズへの粒子の結合を区別することを包含する前記方法。
【請求項２４】
少なくとも２つのビーズがマルチウェルプレートの少なくとも２つの異なるウェルに別々に位置する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
生物学的または化学的作用物質が薬物候補であり、そして結合パートナーが薬物候補の標的である、請求項２２に記載の方法であって、２つの異なる位置に薬物候補を持つ少なくとも２つのビーズを用意すること、薬物候補の第１の標的を持つコロイド粒子の第１のセットに第１のビーズを暴露すること、および薬物候補の第２の標的を持つコロイド粒子の第２のセットに第２のビーズを暴露すること、ならびに第１のビーズへの第１のセットの粒子の結合に対して、第２のビーズへの第２のセットの粒子への結合を区別することを包含する前記方法。
【請求項２６】
粒子と相互作用して吸収されるか、または透過する電磁波放射のスペクトルの変化を測定することにより、非コロイド構造における粒子の固定化を測定することを包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項２７】
目視検査により非コロイド構造における粒子の固定化を測定することを包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項２８】
複数のビーズおよびビーズに結合した作用物質、複数の粒子および粒子に結合した結合パートナーを用意すること、ならびにビーズに粒子を暴露すること、およびビーズにおける粒子の固定化を測定することを包含する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
作用物質または結合パートナーの少なくとも一つがそれぞれ、親和性タグ／結合パートナー結合により、非コロイド構造または粒子への結合に適合した、請求項９に記載の方法。
【請求項３０】
作用物質または結合パートナーの少なくとも一つがそれぞれ、金属結合タグ／金属／キレート結合により非コロイド構造または粒子への結合に適合した、請求項９に記載の方法。
【請求項３１】
作用物質または結合パートナーの少なくとも一つがそれに固定化された金属を配位結合させるキレートを持ち、そして作用物質または結合パートナーの少なくとも一つがポリアミノ酸タグにより誘導体化される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
作用物質または結合パートナーの少なくとも一つが、自己組織化単分子層により、それぞれ非コロイド構造または粒子への結合に適合した、請求項９に記載の方法。
【請求項３３】
作用物質または結合パートナーの少なくとも一つが、相補的核酸配列対により、それぞれビーズまたは粒子への結合に適合した、請求項９に記載の方法。
【請求項３４】
結合パートナーがグルタチオン／グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼリガンド相互作用により、粒子への結合に適合した、請求項９に記載の方法。
【請求項３５】
ポリマービーズを包含する少なくとも第１および第２の非コロイド構造ならびに、その第１および第２のビーズにそれぞれ結合した少なくとも第１および第２の作用物質を用意すること；
コロイド粒子に固定化された第１および／または第２の作用物質の推定結合パートナーをそれぞれが持つ複数のコロイド粒子を用意すること；
ビーズを粒子に暴露すること；そして
第１のビーズに対する第２のビーズへの粒子の結合を区別することを包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項３６】
第１および第２のポリマービーズに結合した第１および第２の作用物質が結合パートナーと生物学的または化学的相互作用をすると推測され、そして区別する工程が第１の作用物質と結合パートナーに対して第２の作用物質および結合パートナー間の生物学的相互作用を区別することを包含する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
以下のことを包含する請求項９に記載の方法：
それぞれが固定化された作用物質を持つ複数の、ビーズを包含する、非コロイド構造を用意すること；
コロイド粒子の第１のセットおよび第２のセットを用意することであって、第１のセットがそれに固定された作用物質の第１の推定結合パートナーをそれぞれ持ち、そして第２のセットがそれに固定された作用物質の第２の推定結合パートナーをそれぞれ持つこと；
少なくとも第１のビーズを粒子の第１のセットに、そして少なくとも第２のビーズを粒子の第２のセットに暴露すること；
第１のビーズへの第１の粒子のセットの結合に対して、ビーズへの第２の粒子のセットの結合を区別すること。
【請求項３８】
第１および第２の推定結合パートナーは作用物質と生物学的または化学的相互作用をすると推測され、そして区別する工程が作用物質と第１の推測結合パートナー間に対して、作用物質と第２の推定結合パートナー間の生物学的相互作用を識別することを包含する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
非コロイド構造が細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
粒子への結合に適合した、細胞表面の受容体またはタンパク質に対するリガンドを用意することをさらに含み、与える工程が受容体またはタンパク質と相互作用するリガンドにより粒子を細胞に結合させることを包含する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
リガンドが自己組織化単分子層を介して粒子に結合するように適合した、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
リガンドがペプチド、タンパク質、抗体、酵素、または小分子である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
リガンドが親和性タグ／結合パートナー結合により、粒子に結合するように適合した、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
リガンドが金属結合タグ／金属／キレート結合により、粒子に結合するように適合した、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
リガンドがポリアミノ酸タグを持ち、そして粒子が金属を配位結合させる固定化キレートを持つ、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
キレートがニトリロ三酢酸である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
粒子がニトリロ三酢酸を含む自己組織化単分子層を持つ、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
粒子が固定化キレートを含む自己組織化単分子層を持つ、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
リガンドおよび粒子を細胞に暴露すること、リガンドを粒子に結合させること、および受容体またはタンパク質へのリガンドの結合を測定することを包含する、請求項４０に記載の方法。
【請求項５０】
粒子と相互作用して吸収されるか、または透過する電磁波放射のスペクトルの変化を測定することにより、細胞上の粒子の固定化を測定することを包含する、請求項３９に記載の方法。
【請求項５１】
電子工学的に細胞上の粒子の固定化を測定することを包含する、請求項３９に記載の方法。
【請求項５２】
交流ボルタンメトリーにより、細胞上の粒子の固定化を測定することを包含する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
目視検査により、細胞上の粒子の固定化を測定することを包含する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
以下のことを包含する請求項３９に記載の方法：
その表面に受容体またはタンパク質を提示する細胞を用意すること；
コロイド粒子を用意すること；および
コロイド粒子を受容体またはタンパク質に結合させること。
【請求項５５】
コロイド粒子が補助的なシグナル伝達実体を包含する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
非コロイド構造がその表面に受容体またはタンパク質を露出する細胞であり、粒子への結合に適合した受容体またはタンパク質に対するリガンドを用意すること、およびリガンドと受容体またはタンパク質間の相互作用を妨害するための候補薬物の存在下で細胞にリガンドおよび粒子を暴露すること；ならびに細胞への粒子の結合を測定することをさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５７】
測定工程が、受容体またはタンパク質／標的タンパク質間の相互作用を妨害することにおける候補薬物の有効性を表す、細胞への粒子の結合の阻害を測定することを包含する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
少なくとも第１および第２の細胞を異なる位置に提供すること；
第１の細胞を第１の細胞の細胞受容体またはタンパク質に対するリガンドおよびコロイド粒子、粒子への結合に適合したリガンド、ならびにリガンドと受容体またはタンパク質間の相互作用を妨害するための第１の候補薬物に暴露すること；および
第２の細胞にリガンドおよびコロイド、ならびにリガンドと受容体またはタンパク質間の相互作用を妨害するための第２の候補薬物を添加すること；ならびに
第１の細胞に対して第２の細胞への粒子の結合を区別するすること；
を包含する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
非コロイド構造がその表面に受容体またはタンパク質を露出する細胞である、請求項１に記載の方法であって、さらに：
少なくとも２つの細胞を異なる位置に提供すること；
細胞受容体またはタンパク質に対する異なる標的タンパク質およびそれぞれの標的タンパク質への結合に適合したコロイド粒子にそれぞれの細胞を暴露すること；および
細胞受容体またはタンパク質への異なる標的タンパク質の結合を表す、細胞への粒子の結合を測定すること、を包含する方法。
【請求項６０】
非コロイド構造が磁気ビーズであり、そしてコロイド粒子が補助的なシグナル伝達実体を包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項６１】
シグナル伝達実体がメタロセンである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
シグナル伝達実体がフェロセンまたはフェロセン誘導体である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
作用物質および結合パートナーの存在下、さらに作用物質および結合パートナーを開裂する能力を有する酵素の存在下で粒子をビーズに暴露することを包含する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
はじめに作用物質および結合パートナーを酵素に暴露し、その後粒子およびビーズを作用物質および結合パートナーに暴露することを包含する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
作用物質、結合パートナー、および酵素の存在下、さらに酵素活性を調節するための候補薬物の存在下で粒子をビーズに暴露することを包含する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
結合パートナーが酵素による開裂が可能なタンパク質またはペプチドを包含する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
タンパク質がコロイド粒子への、およびビーズへの結合に適合した、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
タンパク質が金属結合タグおよびビオチンを含み、コロイドまたはビーズの一つが金属を配位結合するキレートを含み、および他のコロイドまたはビーズがストレプトアビジンを包含する、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
タンパク質が金属結合タグおよびビオチンを含み、コロイドが金属を配位結合させるキレートを含み、そしてビーズがストレプトアビジンを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
シグナル伝達実体がメタロセンであり、結合パートナーが酵素による開裂が可能なタンパク質を含む請求項６０に記載の方法であって、作用物質、結合パートナー、および酵素の存在下、さらに酵素活性の調節のための候補薬物の存在下で粒子をビーズに暴露すること、ビーズを電極の近くに磁気的に引き寄せること、および電極を活性化することにより電極へのメタロセンの接近度を測定し、それによって酵素の開裂活性を阻害する薬物候補の有効性を測定することを包含する前記方法。
【請求項７１】
実体を開裂する能力を有する酵素、および酵素活性を調節するための候補薬物の両方の存在下で、コロイド粒子および非コロイド構造の両方への結合に適合した実体にコロイド粒子および非コロイド構造を暴露することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項７２】
非コロイド構造が磁気ビーズであり、コロイド粒子が固定化された電気活性種を持つ、請求項７１に記載の方法であって、ビーズを電極の近くに磁気的に引き寄せること、および電極を活性化することにより電極への電気活性種の接近度を測定し、それによって酵素の開裂活性を阻害する薬物候補の有効性を測定することを包含する、前記方法。
【請求項７３】
非コロイド構造が電極の表面であり、コロイド粒子が固定化された電気活性種を持つ、請求項７１に記載の方法であって、電極をコロイド粒子、コロイド粒子および電極の両方への結合に適合した実体、酵素、および候補薬物に暴露すること、および電極を活性化することにより電極への電気活性種の接近度を測定し、それによって酵素の開裂活性を阻害する薬物候補の有効性を測定することを包含する前記方法。
【請求項７４】
コロイド粒子および非コロイド構造を、非コロイド構造への結合に適合した酵素の基質、粒子への結合に適合した、酵素活性により基質に結合可能な分子種、および基質に対する酵素に暴露することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項７５】
酵素活性を調節するための候補薬物にコロイド粒子および非コロイド構造を暴露することをさらに包含する、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
非コロイド構造が磁気ビーズであり、コロイド粒子が固定化された電気活性実体を持つ、請求項７４に記載の方法であって、ビーズを電極の近くに磁気的に引き寄せること、および電極を活性化することにより電極への電気活性実体の接近度を測定し、それによって酵素の活性を調節する薬物候補の有効性を測定することを包含する前記方法。
【請求項７７】
非コロイド構造が電極の表面であり、コロイド粒子が固定化された電気活性実体を持つ、請求項７４に記載の方法であって、電極表面をコロイド粒子、基質、酵素、および候補薬物に暴露すること、および電極を活性化することにより電極への電気活性実体の接近度を測定し、それによって酵素の活性を調節する薬物候補の有効性を測定することを包含する前記方法。
【請求項７８】
非コロイド構造が磁気ビーズである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７９】
コロイド粒子が補助的なシグナル伝達実体を包含する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
シグナル伝達実体がメタロセンである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
シグナル伝達実体がフェロセンまたはフェロセン誘導体である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
基質および結合パートナーの存在下、さらに酵素活性を調節するための候補薬物の存在下で粒子をビーズに暴露することを包含する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８３】
結合パートナーが金属結合タグ／金属／キレート結合により粒子に結合するように適合し、そして基質がビオチン／ストレプトアバジン結合によりビーズに結合するように適合した、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
シグナル伝達実体がメタロセンである請求項８２に記載の方法であって、ビーズを電極の近くに磁気的に引き寄せること、および電極を活性化することにより電極へのメタロセンの接近度を測定し、それによって酵素活性を調節する薬物候補の有効性を測定することを包含する前記方法。
【請求項８５】
複数のシグナル伝達実体により、第１の生物学的または化学的作用物質の単一の結合を第２の生物学的または化学的作用物質にシグナル伝達することを包含する方法。
【請求項８６】
単一の結合を複数のシグナル伝達実体により同時にシグナル伝達することを包含する、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
複数のシグナル伝達実体を持つ第１の作用物質を提供すること、第１の作用物質を第２の作用物質に結合させること、およびシグナル伝達実体により結合を測定することを包含する、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
シグナル伝達実体が固定化された粒子に第１の作用物質が結合する、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
ポリマーにより第１の作用物質がシグナル伝達実体に結合する、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
第１の作用物質がデンドリマーによりシグナル伝達実体に結合する、請求項８７に記載の方法。
【請求項９１】
第１の作用物質が生物学的または化学的リガンドであり、そして第２の作用物質がその表面に受容体またはタンパク質を提示する細胞である、請求項８７に記載の方法であって、リガンドが受容体またはタンパク質に結合させることを包含する前記方法。
【請求項９２】
複数のシグナル伝達実体が第１の作用物質に結合したポリマーに結合した複数のシグナル伝達実体を包含する、請求項８７に記載の方法。
【請求項９３】
複数のシグナル伝達実体が第１の作用物質に結合したデンドリマーに結合した複数のシグナル伝達実体を包含する、請求項８７に記載の方法。
【請求項９４】
複数の固定化されたシグナル伝達実体を含むコロイド粒子に第１の作用物質を固定した、請求項８７に記載の方法。
【請求項９５】
複数のシグナル伝達実体が複数の電気活性分子を包含する、請求項８５に記載の方法。
【請求項９６】
複数の電気活性分子が複数のメタロセンを包含する、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
複数の電気活性分子が複数のフェロセンまたはフェロセン誘導体を包含する、請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
ポリマーが親和性タグ／結合パートナー結合により第１の作用物質に結合した、請求項９２に記載の方法。
【請求項９９】
ポリマーが結合タグ／金属／キレート結合により第１の作用物質に結合する、請求項９２に記載の方法。
【請求項１００】
第１の作用物質がポリアミノ酸タグを有し、そしてポリマーが金属を配位結合させるキレートを持つ、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
デンドリマーが結合タグ／金属／キレート結合により第１の作用物質に結合する、請求項９２に記載の方法。
【請求項１０２】
第１の作用物質がポリアミノ酸タグを持ち、そしてデンドリマーが金属を配位結合させるキレートを持つ、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
少なくとも補助的なシグナル伝達実体の一つが、染料、色素、電気活性分子、蛍光部分、アップレギュレートしている蛍光体、またはホースラディッシュペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼを含む酵素結合シグナル伝達部分を包含する請求項８５に記載の方法。
【請求項１０４】
タンパク質またはリガンドのいずれも標識せずにＳＰＲの非存在下でタンパク質／リガンド相互作用を測定することを包含する方法。
【請求項１０５】
リガンドと相互作用すると推測されるタンパク質にリガンド、すなわちタンパク質への接近度に依存した電気活性シグナルを有する、電気活性実体と一定の近接関係にあるリガンド、を暴露することを包含する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
電気活性実体が、電気活性実体とタンパク質間の接近度の変化に依存して変わることができる電気活性シグナルを有する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
リガンドと電気活性実体がともに固定化される表面にタンパク質を暴露することを包含する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０８】
表面が電極の表面である、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
リガンドおよび電気活性実体がそれぞれ表面の自己組織化単分子層の部分を形成する、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１０】
自己組織化単分子層が、電子に対する自己組織化単分子層の透過性を促進する種を含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
電子に対する透過性を促進する種が伝導性自己組織化単分子層形成種を包含する、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
電子に対する透過性を促進する種が自己組織化単分子層に欠陥部位を生じさせる種を包含する、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１３】
電気活性実体がメタロセンを包含する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１４】
電気活性実体がフェロセンまたはフェロセン誘導体を包含する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１５】
電気活性実体がフェロセンジカルボン酸を包含する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１６】
リガンドが親和性タグ／結合パートナー結合により自己組織化単分子層形成種に結合する、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１７】
リガンドが金属結合タグ／金属／キレート結合により自己組織化単分子層形成種に結合する、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１８】
以下のことを包含する方法：
ａ）ｉ）コロイド（前記コロイドは細胞表面分子と相互作用することができるリガンドを包含する）を包含する溶液、およびｉｉ）成長細胞を包含する電極を包含する組成物（前記細胞は前記リガンドと相互作用することができる少なくとも１つの細胞表面分子を包含する）を提供すること、
ｂ）少なくとも前記コロイドの部分を前記組成物に添加すること。
【請求項１１９】
さらに以下のことを包含する請求項１１８に記載の方法：
ｃ）前記リガンドと前記細胞表面分子の相互作用の尺度として前記コロイドの凝集を検出すること。
【請求項１２０】
前記コロイドが金コロイドである、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２１】
工程（ａ）の前に、前記金コロイドがチオール基を取り込むように処理される、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
工程（ａ）の前に、前記リガンドが結合パートナーを有する部分により誘導体化される、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２３】
工程（ａ）の前に、前記リガンドが金属キレートに結合することができる部分により誘導体化される、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記部分がヒスチジンタグを包含する、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
以下のことを包含する方法：
ａ）ｉ）コロイド（前記コロイドは細胞表面分子と相互作用することができるリガンドを含む）を包含する溶液、ｉｉ）候補薬物、およびｉｉｉ）成長細胞を包含する電極を包含する組成物（前記細胞は前記リガンドと相互作用することができる少なくとも１つの細胞表面分子を包含する）を提供すること、
ｂ）少なくとも前記コロイドの部分を前記薬物および前記組成物と混合すること。
【請求項１２６】
磁気材料を使用して電子工学的シグナル伝達実体を電極に補充することを包含する方法。
【請求項１２７】
シグナル伝達実体と磁気ビーズ間の固定化に関与するタンパク質／タンパク質結合により部分的に電極にシグナル伝達実体を補充することを包含する、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
タンパク質／タンパク質結合が抗体ではないタンパク質を伴う、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
表面、および表面に関してそれぞれ固定化されたタンパク質および電気活性実体と相互作用すると推測されるリガンドを有するアーティクル。
【請求項１３０】
表面に関して固定化された電子の表面の透過性を促進する種をさらに包含する、請求項１２９に記載のアーティクル。
【請求項１３１】
第２の作用物質への生物学的または化学的結合が可能な、複数のシグナル伝達実体に関して固定化された第１の生物学的または化学的作用物質を包含するアーティクル。
【請求項１３２】
シグナル伝達実体が固定化される粒子に第１の作用物質が結合する、請求項１３１に記載のアーティクル。
【請求項１３３】
第１の作用物質がポリマーによりシグナル伝達実体に関して固定化される、請求項１３１に記載のアーティクル。
【請求項１３４】
第１の作用物質がデンドリマーによりシグナル伝達実体に関して固定化される、請求項１３１に記載のアーティクル。
【請求項１３５】
表面、およびアーティクルの表面に形成された自己組織化単分子層を有するアーティクルであって、単分子層は第１分子種（表面が暴露される流体と表面との電気的連絡を妨げるように、堅く詰まった様式で他の第１分子種とともに表面での自己組織化を促進する分子構造を有する）と第２分子種（第１の種と異なる分子構造を有し、堅く詰まった自己組織化構造の破壊を引き起こして、堅く詰まった構造中に欠陥を生じ、表面が曝露される流体と表面の電気的連絡を可能にする）の混合物を包含する、上記アーティクル。
【請求項１３６】
第１の種が本質的に直線状であり、第２の種が少なくとも１つの非直線部分を包含する、請求項３５に記載のアーティクル。
【請求項１３７】
第１分子が細胞表面受容体またはタンパク質と相互作用することができるリガンドである、前記第１分子および固体支持体に結合した１つまたはそれより多くのシグナル伝達実体を包含する組成物。
【請求項１３８】
前記固体支持体がコロイドである、請求項１３７に記載の組成物。
【請求項１３９】
前記コロイドが金コロイドである、請求項１３８に記載の組成物。
【請求項１４０】
前記リガンドが直接前記コロイドに共有結合する、請求項１３８に記載の組成物。
【請求項１４１】
前記シグナル伝達実体が電気活性分子である、請求項１３８に記載の組成物。
【請求項１４２】
前記電気活性分子がフェロセンまたはフェロセン誘導体を包含する、請求項１４１に記載の組成物。
【請求項１４３】
前記リガンドがペプチドである、請求項１３７に記載の組成物。
【請求項１４４】
前記ペプチドが金属キレートに結合することができる部分とともに誘導体化される、請求項１４３に記載の組成物。
【請求項１４５】
前記部分がヒスチジンタグを包含する、請求項１４４に記載の組成物。
【請求項１４６】
前記固体支持体が金属キレートを含み、そして前記ペプチドが前記金属キレートへの前記部分の結合により前記固体支持体に結合する、請求項１４４に記載の組成物。
【請求項１４７】
固体支持体が第２分子の単分子層を包含する、請求項１３７に記載の組成物。
【請求項１４８】
前記単分子層が自己組織化単分子層である、請求項１４７に記載の組成物。
【請求項１４９】
前記第２分子がチオールである、請求項１４７に記載の組成物。
【請求項１５０】
固体支持体に結合した第１分子、第２分子および第３分子を包含する組成物：ここで前記第１分子は細胞表面受容体またはタンパク質と相互作用可能なリガンドを含み、ここで第２分子は前記固体支持体上で単分子層を形成し、そしてここで前記第３分子は電気活性である。
【請求項１５１】
前記固体支持体がコロイドである、請求項１５０に記載の組成物。
【請求項１５２】
前記コロイドが金コロイドである、請求項１５１に記載の組成物。
【請求項１５３】
前記リガンドが前記コロイドに直接共有結合する、請求項１５１に記載の組成物。
【請求項１５４】
前記電気活性分子がフェロセンまたはフェロセン誘導体を包含する、請求項１５３に記載の組成物。
【請求項１５５】
前記リガンドがペプチドである、請求項１５３に記載の組成物。
【請求項１５６】
前記ペプチドが金属キレートに結合可能な部分とともに誘導体化される、請求項１５５に記載の組成物。
【請求項１５７】
前記部分がヒスチジンタグを包含する、請求項１５６に記載の組成物。
【請求項１５８】
前記固体支持体が金属キレートを含み、そして前記ペプチドが前記金属キレートへの前記部分の結合により前記固体支持体に結合する、請求項１５６に記載の組成物。
【請求項１５９】
前記固体支持体がリポソームである、請求項１３７に記載の組成物。
【請求項１６０】
前記リポソームが反応基を含有する少なくとも１つの脂質を包含する、請求項１４７に記載の組成物。
【請求項１６１】
表面上で細胞の成長を支持するように構築され、配列された金属支持体を包含するアーティクル：前記金属支持体は少なくとも１つのタイプの分子の単分子層を含み、前記単分子層は金属支持体を電極として使用できるように設計される。
【請求項１６２】
金属支持体上で増殖する細胞をさらに包含する、請求項１６１に記載のアーティクル。
【請求項１６３】
以下のものを包含する組成物：
コロイド粒子
コロイド粒子に関して固定化されたシグナル伝達実体；および
コロイド粒子に関して固定化されたタンパク質。
【請求項１６４】
以下のものを包含する組成物：
生物学的または化学的作用物質に結合するように適合した複数のシグナル伝達実体を持つポリマーまたはデンドリマー。
【請求項１６５】
ポリマーまたはデンドリマーが金属結合タグ／金属／キレート結合により化学的または生物学的作用物質に結合するように適合した、請求項１６４に記載の種。
【請求項１６６】
ポリマーまたはデンドリマーが金属を配位結合させることができるキレートを持つ、請求項１６４に記載の種。
【請求項１６７】
ポリマーまたはデンドリマーが複数の電気活性種を持つ、請求項１６４に記載の種。
【請求項１６８】
ポリマーまたはデンドリマーが複数のメタロセンを持つ、請求項１６４に記載の種。
【請求項１６９】
ポリマーまたはデンドリマーが複数のフェロセンまたはフェロセン誘導体を持つ、請求項１６４に記載の種。
【請求項１７０】
グルタチオン誘導体に関して固定化されたコロイド粒子および少なくとも１つのシグナル伝達実体を包含するアーティクル。
【請求項１７１】
グルタチオン誘導体を包含する自己組織化単分子層を表面上に持つコロイド粒子を包含するアーティクル。
【請求項１７２】
非コロイド構造が生物学的試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７３】
生物学的試料がヒトまたは動物から採取される、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７４】
生物学的試料が細胞または組織切片を包含する、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７５】
少なくとも第１および第２生物学的試料を用意すること；
試料により提示される結合パートナーに結合する能力が推測されるまたはそれを有する固定化された種を持つコロイド粒子に、第１および第２試料を暴露すること、
を包含する請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７６】
第１および第２生物学的試料が感染または疾病の異なる状態の試料である、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７７】
異なる試料に対する結合と第１試料へのコロイド粒子の結合の違いを測定することを包含する、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７８】
違いが結合レベルの違いを包含する、請求項１７７に記載の方法。
【請求項１７９】
違いがコロイド固定化パターンの違いである、請求項１７７に記載の方法。
【請求項１８０】
試料のいずれかまたは両方へのコロイド粒子の固定化を測定することをさらに包含する請求項１７５に記載の方法。
【請求項１８１】
試料により発現された、結合パートナーの発現レベルおよび／またはパターンにより測定できる疾患状態の修飾のための候補薬物で生物学的試料またはその供与源が前処理されている、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１８２】
非コロイド構造が表面を有するアーティクル、およびアーティクルの表面で形成される自己組織化単分子層を包含し、単分子層は第１分子種（表面が暴露されている流体と表面との電気的連絡を妨げ、堅く詰まった様式で他の第１分子種とともに表面での自己組織化を促進する、分子構造を有する）と第２分子種（分子ワイヤを包含する）の混合物を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８３】
非コロイド構造が固体支持体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８４】
表面が電極の表面である、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８５】
コロイド粒子の表面での自己組織化単分子層の部分をそれぞれ形成するリガンドおよび電気活性実体をさらに包含する、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８６】
自己組織化単分子層が電子の自己組織化単分子層の透過性を促進する種を含む、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１８７】
電子の透過性を促進する種が伝導性自己組織化単分子層形成種を包含する、請求項１８６に記載の方法。
【請求項１８８】
電子の透過性を促進する種が自己組織化単分子層中に欠陥部位を生じる種を包含する、請求項１８６に記載の方法。
【請求項１８９】
電気活性実体がフェロセンジカルボン酸を包含する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１９０】
金属結合タグ／金属／キレート結合により、リガンドが自己組織化単分子層形成種に結合する、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１９１】
固体支持体が実質的に平面の基質を包含する、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１９２】
アーティクルの表面が自己組織化単分子層を持つ、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１９３】
自己組織化単分子層が伝導性自己組織化単分子層である、請求項１９２に記載の方法。
【請求項１９４】
自己組織化単分子層が親和性タグの結合パートナーを包含する、請求項１９２に記載の方法。
【請求項１９５】
結合パートナーが金属を配位結合させることができるキレートである、請求項１９４に記載の方法。
【請求項１９６】
親和性タグの結合パートナーがグルタチオンまたはビオチンを包含する、請求項１９４に記載の方法。
【請求項１９７】
ＥＤＣ／ＮＨＳカップリング化学により自己組織化単分子層に固定される化学的または生物学的作用物質をさらに包含する、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９８】
自己組織化単分子層に固定され、そして自己組織化単分子層を横切って任意に分配される複数の化学的または生物学的結合パートナーを包含する、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９９】
自己組織化単分子層が、それに固定された唯一の化学的または生物学的結合パートナーをそれぞれさらに包含する隔離された領域を含む、請求項１９３に記載の方法。
【請求項２００】
コロイド構造が結合パートナーであるか、または、アーティクルの表面に固定される化学的または生物学的作用物質の結合パートナーであると推測される、それに固定された化学的または生物学的作用物質を含む、請求項１８２に記載の方法。
【請求項２０１】
コロイド粒子が補助的なシグナル伝達実体を包含する、請求項２００に記載の方法。
【請求項２０２】
コロイド粒子の表面に自己組織化単分子層をさらに包含する、請求項２００に記載の方法。
【請求項２０３】
補助的なシグナル伝達実体が電気活性シグナル伝達実体である、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２０４】
補助的なシグナル伝達実体が可視シグナル伝達実体である、請求項２０１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は一般に化学的および生化学的検出方法、そしてより具体的にはコロイドが電極、ビーズ、または細胞のような非コロイド構造に結合する技術、および複合シグナルが単一結合事象を表す技術に関する。薬物スクリーニングを含む技術が本発明により容易になる。
【０００２】
発明の背景
薬物の発見は、生理的条件下で標的受容体またはタンパク質と相互作用する多数の候補化合物をスクリーニングすることにより促進される。細胞表面受容体またはタンパク質がとりわけ重要である。腫瘍形成を促進する生体分子相互作用の多くは細胞内および細胞間シグナル伝達を共に媒介する細胞表面タンパク質に関連する。“腫瘍マーカー”は、新生物形成状態への形質転換の結果として排他的に発現されるか、または過剰発現される細胞表面上の分子である。これらのマーカーのいくつかは腫瘍の組織に侵入する能力に関連し、転移により特徴付けられる侵略的な成長過程を示す（これらの腫瘍は一般に患者にとって不良予後に繋がる）。たとえば、細胞表面受容体αＶβ３と細胞接着分子ビトロネクチン間の相互作用は血管新生に関連付けられている。Ｊ．Ｖａｒｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，“Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ　ａｎｄ　ｃａｎｃｅｒ、”Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．８：７２４（１９９６）；Ｂ．Ｖａｉｌｈｅ　ｅｔ　ａｌ．，“Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｓ　ｍｏｄｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｆｉｂｒｉｎ　ｇｅｌｓ　ａｎｄ　ｉｓ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ａ　αＶβ３　ｉｎｔｅｇｒｉｎ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ”、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅｖ　Ｂｉｏｌ　Ａｎｉｍ．，３３：７６３（１９９７）；Ｍ．Ｈｏｒｔｏｎ，“Ｔｈｅ　αＶβ３　ｉｎｔｅｇｒｉｎ　‘ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ’，”Ｉｎｔ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，２９：７２１（１９９７）を参照されたい。実際、メラノーマ細胞上のこの受容体の増大した濃度は不良予後と関連付けられている。腫瘍形成および／または血管新生を促進する細胞表面受容体の別の例としては、ＭＵＣ−１抗原がある；この抗原は乳房、前立腺、肺および卵巣癌で過剰発現される。
【０００３】
腫瘍形成に関連する細胞表面受容体に結合し、阻害する薬物の探索は技術的に挑戦され続けてきた、なぜなら、無傷細胞で使用できるアッセイがほとんどないからである。リガンドと生きている無傷細胞の表面の標的受容体間の相互作用を検出する能力が、これらの相互作用を阻害する候補化合物のスクリーニングを可能にするであろう。細胞表面受容体の作用を阻害する薬物の化合物ライブラリーのスクリーニングは、薬物スクリーニング工程の間中、受容体が天然の配座および多量体化状態にあることに非常に依存する。現在の技術では、細胞表面受容体とそれらの天然のリガンドの相互作用を検出することは難しいか、または不可能である。
【０００４】
現在の技術は細胞上のリガンド相互作用をアッセイするそれらの能力が制限される。蛍光励起性セルソーティング（ＦＡＣＳ）は、細胞表面受容体の検出を可能にする少数の技術の中の一つである。細胞表面受容体を阻害する薬物をスクリーニングするためにこの技術を使用することにおける一つの障害は：１）技術が順次的で多数の薬物スクリーニングを促進するために容易に多重化することができないこと；および２）技術が受容体に結合する抗体の検出だけに適しており；抗原抗体反応は一般に薬物が阻害できない、高親和性相互作用であるということである。現在の技術では、細胞表面受容体とそれらの天然のリガンドを検出することは難しいか、または不可能である。細胞表面受容体の作用を阻害する薬物の化合物ライブラリーのスクリーニングは、薬物スクリーニング工程の間中、受容体が天然の配座および多量体化状態にあることに非常に依存する。
【０００５】
細胞表面受容体について調べるために使用することのできる別の技術には、ＥＬＩＳＡアッセイがある。この技術では、細胞を９６−ウェルプラスチックプレートに接着する。コグネイト抗体を関心のある細胞表面受容体に結合させ、非結合抗体は洗い流す。受容体のアベイラビリティはコグネイト抗体の存在を検出することにより推定される。結合抗体の存在は、コグネイト抗体の種に対して活性な、検出可能なレベルに結合した第２抗体を導入することにより検出される。細胞表面タンパク質のアベイラビリティの評価、またはそれらを阻害する薬物のスクリーニングのためのこの技術の有効性を限定するいくつかの固有の問題がある：１）抗体のプラスチックへの非特異的吸着の結果生じる偽陽性により技術が妨害される；２）リガンド−受容体相互作用が多くの洗浄工程によりしばしば阻害される；そして最も重要なことには、３）このアッセイには天然のリガンドよりむしろ抗体を使用しなければならない；これらは典型的には高親和性相互作用をするため、受容体に結合する薬物が容易に阻害することができない；さらに天然のリガンドと異なり、抗体は受容体の正常な機能を阻害しない部位で標的受容体に結合するかもしれない。
【０００６】
必要なものは、化学的または生物学的種間の結合事象をモニターまたは制御するためのアプローチであって、そのアプローチは広範囲の特異的相互作用における万能性を増し、感受性を高めることができる。たとえば、細胞受容体とそれらのリガンドの特異的相互作用（αＶβ３受容体の相互作用を含むが、それらに限定されない）を阻害する薬物のスクリーニングのためのアプローチは好都合であろう。後者の例において、アッセイは順応性を持つべきであり、その結果広範囲の腫瘍型、そしてとりわけ浸潤性腫瘍に対するスクリーニングが可能になる。重要なことは、スクリーニング法により多数の候補薬物の迅速なスクリーニングができることである。
【０００７】
発明の概要
本発明は、薬物スクリーニングに有用な技術を含む、各種新規方法、組成物、および種、ならびに化学的または生物学的種間の相互作用をモニター（検出）するためのアーティクルを提供する。本発明の主な側面としては以下のことが挙げられる。シグナル伝達相互作用のためのタンパク質チップおよび粒子を含む、プロテオミック研究のための手段、および２粒子系のような多粒子系。多粒子系において、１粒子は補充可能な粒子であってもよく、他の粒子は補充可能な粒子によって提示される作用物質の結合パートナーを有していてもよく、そしてシグナル伝達実体であるか、または補助的なシグナル伝達実体を有していてもよい。他の主な部分としては、細胞研究、とりわけリガンドと細胞表面タンパク質および受容体間の相互作用を含む技術が挙げられる。これらの相互作用に影響を与えることができる薬物に関する発見および治療法も、血管新生に関連する薬物療法を特に強調して記載される。具体的に述べると、血管新生を阻害するか、または促進することができる細胞受容体／リガンド相互作用が記載される。他の部分としては、診断のために溶液中または無傷細胞の表面上のいずれかでタンパク質を検出することが挙げられる。
【０００８】
一側面において、本発明は非コロイド構造に固定される能力をコロイド粒子に与える方法を提供し、そしてコロイド粒子が非コロイド構造に固定されているか否かを測定する。この側面はコロイド粒子または、好ましくは各種構造を有する多くのコロイド粒子を含む広範囲の相互作用を扱う。磁気ビーズのようなビーズを含む非コロイド構造は、ビーズに関して固定化された種とコロイド粒子に関して固定化された種との相互作用を測定する補助物としてコロイド粒子と相互作用することができる。コロイド粒子はビーズを“修飾”し、それらを特有の種／種相互作用の目安として肉眼的に同定できるようにすることができる。あるいは、磁気ビーズは表面にコロイド粒子を補充するために使用してもよく、そこでは粒子の同定を電子的もしくは電気化学的、または他の手段などにより行うことができる。電極のような非コロイド構造は、コロイド粒子またはコロイド粒子上に固定された種と共に作動し、具体的なアッセイ結果を示すことができる。細胞のような非コロイド構造は、コロイド構造と相互作用してコロイド粒子が持つ種への細胞の結合を示すことができる。コロイド粒子および非コロイド構造を含むこれらおよび他の技術の利点は、以下の説明からさらにいっそう明らかになるであろう。
【０００９】
別の側面において、本発明は金属結合タグ／金属キレート結合により、ビーズ、コロイド粒子などのようなアーティクルに化学的または生物学的作用物質を結合させるための技術を提供する。このようにして化学的または生物学的種に結合したアーティクルは本発明に包含される。
【００１０】
本発明の別の側面としては以下のことを伴うリガンド／タンパク質相互作用の検出のための技術が挙げられ、それらは電気活性実体との一定の近接関係にあるリガンドを提供すること、および電気活性実体により与えられた電気活性シグナルをモニターすることにより、リガンドとタンパク質との相互作用を測定することであり、そこではシグナルは電気活性実体のタンパク質への接近度に依存する。この技術は、第１の表面に固定化される第１のタンパク質を有し、および、第２の表面に同様に固定化される電気活性実体とともに、粒子であってもよい第２の表面に固定化される当該タンパク質と相互作用すると推定されるリガンドを有する、本発明のアーティクルによって促進されてもよい。本発明のこの側面は、タンパク質またはリガンドのどちらも標識せずに、表面プラズモン共鳴の非存在下でタンパク質／リガンド相互作用を測定する方法である本発明のある別の特色を容易にする。
【００１１】
本発明は、第１の生物学的または化学的作用物質の単一の結合を、多数のシグナル伝達実体を持つ第２の生物学的または化学的作用物質に、シグナル伝達する方法を含む技術および成分も提供する。本発明により提供されるアーティクルはこの技術を容易にし、そしてそれは複数のシグナル伝達実体に結合した第２の作用物質に生物学的または化学的に結合することができる、第１の生物学的または化学的作用物質を有する。複数のシグナル伝達実体は、複数のシグナル伝達実体を持つポリマーまたはデンドリマーとして作用物質に結合してもよく、そして作用物質への結合に適合する。また、技術はコロイド粒子に、たとえば複数のシグナル伝達実体もまた固定化されるコロイド粒子の表面に、作用物質を固定化することにより促進されてもよい。好ましい態様において、３以上のシグナル伝達実体が同時に単一の化学的または生物学的結合事象をシグナル伝達する。より好ましくは、少なくとも１０，さらに好ましくは少なくとも５０，そしてさらに好ましくは少なくとも１０００または１０，０００シグナル伝達実体が本発明のこの側面に従って同時に単一の化学的または生物学的結合事象をシグナル伝達する。
【００１２】
本発明の別の側面は、シグナル伝達実体およびその上に固定化されたタンパク質を共に有するコロイド粒子により説明される。この成分の使用のための技術も本発明に包含される。
【００１３】
本発明は表面で自己組織化単分子層を横切る電子透過性を制御する技術も提供する。かかる技術において、自己組織化単分子層は表面上で形成され、そして少なくとも第１分子種と第２分子種の混合物により説明される。第１分子種は、表面が暴露されている流体と表面との電気的連絡を妨げる、堅く詰まった様式で表面での自己組織化を促進する構造を有する。すなわち、第１の種は、第１の種のみから形成されるＳＡＭ（自己組織化単分子層）については、流体に対して表面を密封する比較的堅く詰まった自己組織化単分子層（ＳＡＭ）を形成する。本発明のこの側面に従ったＳＡＭは第１の種、および、異なる分子構造を有し、ここでその分子構造は堅く詰まった自己組織化構造の破壊を生じる、第２の種から形成され、それによって表面が暴露されている流体が表面と電子的に連絡できるような堅く詰まった構造中の欠陥が明らかになる。このような状況において、流体は、トンネル効果などにより電気的連絡ができる表面に接触するか、または表面に十分に接近することにより、表面と電気的に連絡する。以下の説明から理解されるように、本発明のこの側面は本発明の他の技術と組み合わせると非常に有用になる。
【００１４】
先に述べたように、本発明の一態様は薬物スクリーニングのための一連の成分および技術を提供することである。方法は以下のことを提供する：１）普遍的なシグナル伝達要素への天然のリガンドの結合のためのモジュール系；２）それぞれのリガンドに多数のシグナル伝達要素が結合することによる増大した検出感度；３）より簡単な形式（洗浄工程、酵素的開裂および毒性基質の必要性がない）；４）好都合な電子的出力；および５）多重化の能力。
【００１５】
アッセイの一態様において、本発明は伝導性の固体支持体上に生きた、無傷の成長細胞、または細胞由来分子を固定化することを企図する。表面分子（たとえば、受容体）および細胞内シグナル伝達タンパク質を共に有する、そのような細胞または細胞由来分子は事実上表面または粒子様であってもよい固体支持体に結合する。これらの細胞または細胞由来分子に対するリガンド（または“結合パートナー”）は、既知および未知の両方のリガンドならびに推定薬物候補（他の固体支持体に結合していないか、または表面または粒子様構造に結合する）を含んでいてもよいもので、それらは２つの結合パートナー間の結合が生じ、検出されてもよいような様式で、他の細胞由来分子と相互作用する。結合パートナーまたはその結合支持体の一つは、検出装置により認識、定量が可能な作用物質により付加的に誘導体化されてもよい。次に、この（相互作用を介した）複合体は、結合していない結合パートナーと区別できる、結合した複合体の特性を使用した検出装置に運ばれる。
【００１６】
一態様において、金属支持体の伝導性を維持するように処理（たとえば、細胞増殖と共存できる分子で被覆される）されている金属支持体（たとえば、金）上で細胞の増殖が行われる。一態様において、分子の均質な伝導層は金属表面に付着させ、そこでは分子の絶縁種（たとえば、飽和アルキルチオラート）で均一に被覆された金属より速い速度で電子を伝導させる。別の態様において、先に記載のように表面に暴露された流体が電気的に連絡できる第１および第２の種の混合物を含む異質な分子の層である。別の態様において、異質な伝導性分子層は金属表面に付着させる；異質な層は、伝導性または高伝導性分子（または芝生の“欠陥”）により中断される、低または非‐伝導性の種（たとえば、一つのそのような種または多数のそのような種）の芝生と見ることができる。
【００１７】
異質な伝導性層、または欠陥が流体／表面の電気的連絡を促進させるような、異質な層の好ましい態様において、２つのタイプの分子を金属表面に付着させる：１）芝生を形成するために使用されるアルキルチオールスペーサー分子（非特異的吸着を阻害するためにエチレングリコール単位またはメチル基で停止する）および２）伝導性種または欠陥形成種。伝導性種は以下に記載の実験により容易に同定できる。一態様において、伝導性種は少なくとも１つの環状構造を含む（たとえば、ベンゼン環、ピリミジン環など）。別の態様において、伝導性種は環状構造を全く含まないが、−Ｏ−，−ＯＨ−、−ＮＨ２−およびＳＨから選択される基を含む。
【００１８】
均質な伝導層の一態様において、１つのタイプの分子のみ、すなわち伝導性種だけを金属表面に付着させる。多数の伝導性種を使用する他の態様も企図される。欠陥形成分子の別の説明および、この手順の他の側面は以下に記載される。
【００１９】
先に述べたように、本発明は方法および組成物を共に企図する。一態様において、本発明は固体支持体に接着した第１分子および１以上のシグナル伝達要素（すなわち、分子または分子のクラスターであって、それらは光透過の変化、溶液の色の変化、電荷の変化などによる検出を含むがそれらに限定されないどのような手段によっても検出することができるシグナルを提供する）を含む組成物を企図し、ここで先の第１分子はリガンドであり、そしてタンパク質または細胞表面受容体と相互作用することができる。別の態様において、本発明は固体支持体に付けられた第１分子、第２分子および第３分子を含む組成物を企図し、ここで先の第１分子はタンパク質または細胞表面受容体と相互作用することができるリガンドを包含し、ここで先の第２分子は先の固体支持体上の単分子層を形成し、そしてここで先の第３分子は電気活性である。
【００２０】
本発明は固体支持体の性質により限定されることを意図しない。一態様において、固体支持体はコロイド（たとえば、金コロイド）である。固体支持体へのリガンドの結合の性質により限定されることも意図しない。一態様において、先のリガンドは固体支持体に（直接または別のリガンドを介して、もしくは結合部分により）共有結合的に連結される。別の態様において、リガンドは非共有結合的に、または静電性もしくはイオン性相互作用により連結する。
【００２１】
本発明は、蛍光分子、および呈色基質に作用することができる酵素を含むがそれらに限定されない、各種シグナル伝達要素を企図する。好ましい態様において、本発明は電気活性分子、すなわち適切で慣用の電気的配置の作用電極の近傍で、電子的にまたは電気化学的に測定可能な酸化／還元電位を有する分子、をシグナル伝達要素として企図する。好ましい電気活性分子はメタロセンである。本発明に記載の電気活性シグナル伝達要素として作動することができるメタロセンは既知である。とりわけ好ましい電気活性分子の一例としては、フェロセンまたはフェロセン誘導体基、もしくはフェロセニルチオール（Ｃ３５Ｈ２４ＦｅＳ）のような誘導体を含むものが挙げられる；しかし、他の遷移金属の有機複合体もシグナル伝達要素として企図される。
【００２２】
本発明が化学的または生物学的作用物質の性質により限定されるということは意図しない。たとえば、タンパク質／タンパク質、タンパク質／ペプチド、抗体／抗原、抗体／ハプテン、酵素／基質、酵素／阻害剤、酵素／補因子、結合タンパク質／基質、キャリアタンパク質／基質、レクチン／炭水化物、受容体／ホルモン、受容体／エフェクター、核酸の相補的鎖、タンパク質／核酸、レプレッサー／インデューサー、リガンド／細胞表面受容体、ウイルス／リガンドなどのような、広範な作用物質およびそれらの作用物質の結合パートナーを本発明の結合相互作用のために使用することができる。一態様において、作用物質はリガンド、特にペプチドである。好ましい態様において、ペプチドは金属キレートに結合できる部分（たとえば、ヒスチジンタグ）により誘導体化される。この態様において、固体支持体が金属キレートを含み、そして先のペプチドが先の部分の先の金属キレートへの結合により、先の固体支持体に連結することは好都合である。
【００２３】
ある態様において、細胞表面受容体および細胞内シグナル伝達タンパク質をともに含む細胞由来分子は、事実上表面であるかまたは粒子様のいずれかであってもよい、固体支持体上にあるか、またはそれに連結している。これらの細胞由来タンパク質の結合パートナーは、既知および未知のリガンドの両方、ならびに推定薬物候補を含んでもよいものであるが、それらは表面および／または粒子様構造に連結し、そして２つの結合パートナー間の結合が生じるように、細胞由来タンパク質と相互作用させる。結合パートナーの一つまたはその連結支持体は検出可能な作用物質により付加的に誘導体化されてもよい。相互作用する複合体は、結合していない結合パートナーから結合した複合体を区別する結合複合体の特性を利用して同定される。共通の固体支持体上の結合パートナーの一つと共に固定化されるか、または直接結合パートナーの一つに連結した検出可能部分の存在、またはその変化が検出される。関連する相互作用を阻害する分子は、このシグナルの損失を検出することにより識別できる。相互作用するパートナーは、感知部分に結合パートナーの一つをとどめ、それに他の結合パートナーを補充する、または結合していない結合パートナーから結合した複合体を区別する、結合した複合体の特性を操作する、または結合パートナーの一つもしくはその連結固体支持体に補充可能な要素を連結する、ことによって感知装置に運ばれる。
【００２４】
たとえば、化学的または生物学的結合パートナーを固体支持体の表面に結合してもよく、その支持体は電極、一般的なバイオテクノロジーチップなどのような実質的に平面のアーティクルなどであってもよい。化学的または生物学的作用物質の結合パートナーはコロイドに結合してもよく、そしてアーティクルの表面にコロイドを暴露すると、結合パートナーが結合し、したがって表面にコロイドが固定化される。これは表面、具体的には表面の特定の部分でのコロイドの測定により測定することができる。コロイド粒子は、あるいはこの測定を容易にする補助的なシグナル伝達実体（たとえば、電気活性シグナル伝達実体または蛍光タグのような可視シグナル伝達実体）を含んでいてもよい。
【００２５】
具体的には、タンパク質のような細胞由来分子は、表面およびリガンドに連結し、同様に推定薬物候補は粒子に連結し、そして２つの結合パートナー間の結合が生じるように細胞由来タンパク質と相互作用する。結合パートナーの一つもしくはその連結支持体は検出可能な物質により誘導体化されてもよい。感知部分に結合パートナーの一つをとどめ、それに他の結合パートナーを補充することにより、相互作用するパートナーが感知装置に運ばれる。あるいは、結合パートナーの一つがシグナル伝達実体を表示することができるか、またはできない、補充可能な粒子に連結してもよい。本発明の一側面は、磁気材料を使用して電子的シグナル伝達実体を電極に補充することを伴う。この側面は、本発明の多くのアッセイおよび他の技術に用途を見出すことができる。典型的に、その方法において、シグナル伝達実体に磁気材料（磁気ビーズであってもよい）に関連して固定化される能力が提供される。磁気材料およびシグナル伝達実体は、本明細書に記載される各種化学的および／または物理的結合により、お互いに関連して固定化されてもよい。たとえば、第１の種が磁気材料に関連して固定化、もしくは固定されてもよく、そして第２の種がシグナル伝達実体に関して固定化もしくは固定されてもよく、または第１および第２の種がお互いに結合してもよい。第１および第２の種は本質的に本明細書に記載されているか、または結合のための当技術分野で既知の任意の種であってもよく、一態様においてはタンパク質である。好ましい態様において、タンパク質は抗体ではないが、たとえば、リガンドおよびコグネイト受容体などである。シグナル伝達実体はコロイド粒子のような中間実体に固定されてもよく、結合パートナーとして作用するタンパク質の一つもそれに固定される。また、シグナル伝達実体は磁気材料を使用せずに電極に補充されてもよい。この手順において、シグナル伝達実体は電極に関する種の結合パートナーに関して、固定化されてもよく、結合パートナーはお互いに結合してもよい。本質的に、本明細書に記載、または当技術分野で既知の結合パートナー相互作用はこの技術を促進できる。
【００２６】
本発明の別の側面は、表面上のビオチン含有自己組織化単分子層を提供する。一態様において、表面はコロイド粒子の表面である。
本発明の他の利点、新規態様、および目的は、添付した図面（図式的であって、一定の比率で拡大して表すことを意図していない）に従って判断するとき、本発明の以下の詳細な説明から明らかになるであろう。図において、各種の図で説明されるそれぞれ同一か、またはほとんど同一の成分は、一つの数字で表される。分かり易くするために、当業者が本発明を理解するために説明が必要でない場合、すべての図のすべての成分を表示せず、本発明のそれぞれの態様のすべての成分も示さない。
【００２７】
発明の詳細な説明
“Ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｂｅｒｒａｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ”という表題でＢａｍｄａｄ　ｅｔ　ａｌ．，により０１／２５／００に出願された、国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ００／０１９９７号（ＷＯ／００／４３７９１として０７／２７／００に公開）、“Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｏｌｌｏｉｄ−Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｓｐｅｃｉｅｓ　ｗｉｔｈ　Ｓｐｅｃｉｅｓ　ｏｎ　Ｎｏｎ−Ｃｏｌｌｏｉｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ” という表題でＢａｍｄａｄ　ｅｔ　ａｌ．，により０１／２１／００に出願された、国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ００／０１５０４号（ＷＯ／００／３４７８３として０７／２７／００に公開）、 “Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｏｌｌｏｉｄ−Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｓｐｅｃｉｅｓ　ｗｉｔｈ　Ｓｐｅｃｉｅｓ　ｏｎ　Ｎｏｎ−Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ” という表題でＢａｍｄａｄ　ｅｔ　ａｌ．，により０６／２３／００に出願された、一般的に所有される（ｃｏｍｍｏｎｌｙ−ｏｗｎｅｄ）、同時係属中の米国特許出願番号第０９／６０２，７７８号；および“Ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ” という表題でＢａｍｄａｄ　ｅｔ　ａｌ．，により０８／０３／００に出願された、一般的に所有される（ｃｏｍｍｏｎｌｙ−ｏｗｎｅｄ）、同時係属中の米国特許出願番号第０９／６３１，８１８号はすべて参照として本明細書に援用される。
【００２８】
定義：
本明細書で使用される“小分子”は、５キロダルトン未満、より具体的には１キロダルトン未満の分子を意味する。本明細書で使用される“小分子”は、タンパク質を除外する。
【００２９】
本明細書で使用される用語“候補薬物”はヒト、動物、または植物に使用されるいずれかの医薬品を表す。この定義内には、化合物類似体、天然に存在する物質、合成および組換え医薬品、ホルモン、抗菌剤、神経伝達作用物質などが包含される。これには、神経変性疾患、もしくは異常な凝集が特徴的な他の疾患の治療、またはその予防のための薬物としての使用を評価することになっているいずれかの作用物質または前駆体（天然に存在、合成または組換えのいずれか）が含まれる。本発明のスクリーニングアッセイのようなアッセイ中の活性によって、評価が行われる。
【００３０】
本発明では多様な種類の粒子型が使用される。たとえば、“流体懸濁可能粒子”はそれ自体本発明のために使用される流体（一般に水溶液）中で懸濁液のままでいることができるか、または磁場、電磁場、もしくは撹拌（ｓｔｉｒｒｉｎｇ）、振とう、振動、超音波処理、遠心分離、撹拌（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）のような撹拌（ａｇｉｔａｔｉｏｎ）などの適用により、溶液中に維持できる粒子を意味する。“磁気的に懸濁可能な”粒子は、磁場の適用により流体中で懸濁液として維持できるものである。電磁気的に懸濁可能な粒子は、電磁場の適用により流体中で懸濁液として維持できるものである（たとえば、電荷を持つ粒子、または電荷を持つように修正した粒子）。“自己懸濁可能な粒子”は、たとえば磁場の補助なしに、少なくとも１時間、使用する流体（一般に水溶液）中で懸濁液のままでいる、サイズおよび／または質量が十分に小さいものである。他の自己懸濁可能な粒子は、本発明に従って、補助なしに、５時間、１日、１週間、または１ヶ月間さえも、懸濁液のままでいるであろう。
【００３１】
“タンパク質”および“ペプチド”は当技術分野で既知であり、そしてそれぞれが含むアミノ酸の数に関しては当技術分野で明確には定義されない。本明細書で使用されるこれらの用語は、当該技術分野におけるそれらの通常の意味で与えられる。一般に、ペプチドは１００アミノ酸未満の長さのアミノ酸配列であるが、３００アミノ酸までの配列を含むことができる。タンパク質は一般に少なくとも１００アミノ酸の分子であると考えられる。
【００３２】
本明細書で使用される“金属結合タグ”は、キレートに配位結合した金属に固定されていてもよい分子の群を表す。そのような分子の適切な基は、ヒスチジンおよびシステインを含むが、それらに限定されないアミノ酸配列（ポリアミノ酸タグ）を含む。金属結合タグは以下に定義される、ヒスチジンタグを含む。
【００３３】
本明細書で使用される、“金属を配位結合しているキレート”またはキレートにより配位結合される金属は、キレート剤により配位結合される金属を表し、そのキレート剤は金属上のすべての利用可能な配位結合部位を満たさず、金属結合タグによる結合に利用できるようにいくつかの配位結合部位を残している。
【００３４】
本明細書で使用される、“金属結合タグ／金属／キレート結合”は、第１および第２の種間の結合を定義し、そこでは第１の種は金属結合タグに関して固定化され、そして第２の種はキレートに関して固定化され、ここでキレートは金属を配位結合し、そこに金属結合タグも配位結合する。参照として本明細書に援用されるＢａｍｄａｄ　ｅｔ　ａｌ．，の米国特許第５，６２０，８５０号は例示的な結合を記載する。
【００３５】
“シグナル伝達実体”は、その存在を具体的な試料中または具体的な部位で示すことができる実体を意味する。本発明のシグナル伝達実体は、ヒト裸眼で同定可能なもの、分離すると目に見えなくてもよいが、もし十分な量（たとえば、コロイド粒子）があればヒト裸眼で検出できるもの、可視的に（裸眼または電子顕微鏡などを含む顕微鏡により）、または分光学的に容易に検出できるようなレベル、または波長範囲内で電磁放射を吸収または放射する実体、適切な活性化エネルギーに暴露すると特徴的な酸化／還元パターンを示す酸化還元‐活性分子のような、電子的または電気化学的に検出することができる実体（“電子的シグナル伝達実体”）などであってもよい。例としては、染料、色素、酸化還元‐活性分子のような電気活性分子、蛍光部分（定義上は、燐光性の部分を含む）、アップレギュレートしている蛍光体、化学ルミネセンス実体、電気化学ルミネセンス実体、またはホースラディッシュペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼを含む酵素結合シグナル伝達部分が挙げられる。“シグナル伝達実体の前駆体”は、それ自体はシグナル伝達能力を持たなくてもよいが、他の種と化学的、電気化学的、電気的、磁気的、または物理的相互作用をするときにシグナル伝達実体になる実体である。例としては、他の分子と化学的相互作用をするときのみ、特定の、検出可能な波長内で放射する能力を有する発色団が挙げられる。シグナル伝達実体の前駆体は、本明細書で使用される“シグナル伝達実体”と区別することができるが、その定義内に含まれる。
【００３６】
本明細書で使用される、他の種またはアーティクルの表面に関して種が“固定された、または固定されるように適合した”とは、種が共有結合的連結、特異的な生物学的結合（たとえば、ビオチン／ストレプトアビジン）による連結、キレート／金属結合のような配位結合などにより、化学的にまたは生物学的に結合することを意味する。たとえば、このような状況で“固定された”ものには、ポリスチレンビーズ上で合成されたペプチドのような結合種、ビーズに共有結合的に連結したプロテインＡのようなタンパク質に結合する抗体に特異的に生物学的に結合した結合種、ＧＳＴやＰｈａｇｅのような分子の部分を（遺伝的設計により）形成する結合種であってそれらは同様に表面に共有結合的に固定した結合パートナーに特異的に生物学的に結合するもの（たとえば、ＧＳＴの場合はグルタチオン）など、を含むがそれらに限定されない複数の化学的結合、複数の化学的／生物学的結合などが含まれる。別の例としては、チオールに共有結合する部分は金表面に固定されるように適合する、なぜなら、チオールは金に共有結合するからである。同様に、金属結合タグを持つ種は、表面に共有結合（チオール／金結合）する分子であって金属を配意結合しているキレートをも有する分子を持つ表面に固定されるように適合する。もし、表面が特定のヌクレオチド配列を持ち、そして種が相補的なヌクレオチド配列を含むならば、種は同様に表面に固定されるように適合する。
【００３７】
“共有結合的に固定される”とは、１以上の共有結合により固定されることを意味する。たとえば、同様に金表面に固定されるカルボキシレート‐提示アルキルチオールにＥＤＣ／ＮＨＳ化学により共有結合した種は、その表面に共有結合的に固定される。
【００３８】
本明細書で使用される、他の成分“に関して固定化される”成分は、他の成分に固定されるか、または、たとえば他の成分が同様に固定される第３の成分に固定されることにより、他の成分に間接的に固定されるかのいずれかであるか、またはさもなければ他の成分と翻訳的に（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）関連する。たとえば、シグナル伝達実体が結合種に関して固定される、結合種が固定されるコロイド粒子に固定される、結合種が固定されるデンドリマーまたはポリマーに固定される、などの場合、シグナル伝達実体は結合種に関して固定化される。第１のコロイド粒子の表面に固定された種が実体に結合し、そして第２のコロイド粒子の表面上の種が同じ実体に結合し、ここで実体は単一の実体、複数の種の複合実体、細胞、別の粒子などであってもよい場合は、コロイド粒子は他のコロイド粒子に関して固定化される。本発明の他の実体に固定されるか、または固定されるように適合することが可能なすべての実体もまた、他の実体に固定化されるか、または固定化されるように適合することが可能であり、逆の場合も同じである。
【００３９】
“特異的に固定される”または“特異的に固定されるように適合する”とは、定義“固定される、または固定されるように適合する”の定義に関して先に記載のように、種が別の試料または表面に化学的または生化学的に結合することを意味するが、すべての非特異的結合を除外する。
【００４０】
本明細書で使用される“非特異的結合”は、生化学の分野での通常の意味が与えられる。
本明細書で使用される“コロイド”は、ナノ粒子、すなわち、無機、ポリマー性、および金属粒子を含む、非常に小さく自己懸濁可能な粒子を意味する。典型的には、コロイド粒子は、すべての次元の断面が２５０ｎｍ未満、より典型的にはすべての次元の断面が１００ｎｍ未満、そして好ましくは１０〜３０ｎｍのものであり、そして金属、非金属、結晶質または非晶質であってもよい。本明細書で使用されるように、この用語は生化学の分野で一般に使用される定義を含み、そしてそれは典型的には金コロイド粒子を意味する。
【００４１】
本明細書で使用される、“金属に配位結合することができる部分”は、金属結合タグまたはキレートのような、金属原子上の少なくとも２つの配位結合部位を占有することができるいずれかの分子を意味する。
【００４２】
“多様な生物学的種”は、マウスおよびハムスター、マウスおよびヤギなどを意味する。
用語“試料”は以下のものを含むがそれらに限定されない、好都合には本発明に従って評価することができる、生物学的供給源（“生物学的試料”）またはいずれか他の生物学的もしくは非生物学的媒体由来のいずれかの細胞、組織、もしくは流体を表す：ヒト患者から採取される生物学的試料、動物から採取される試料、ヒトの消費用食物から採取した試料、家畜飼料のような動物の消費用食物を含む試料、ミルク、寄贈された臓器試料、血液供給用の血液の試料、水供給用の試料など。試料の一例として、候補薬物の抗力を測定するために、その薬物を投与されたヒトまたは動物から採取された試料がある。
【００４３】
特定の成分を“含むと推測される試料”は、成分の量が未知である試料を意味する。たとえば、神経変性疾患または非‐神経変性疾患のような疾患を有すると推定されるが、疾患を有することが既知でないヒト由来の流体試料は、神経変性疾患凝集体‐形成種を包含すると推定される試料を定義する。これに関連した“試料”には、ヒトまたは動物由来の生理的試料、食物由来の試料、家畜飼料などの天然に存在する試料が、ならびに“予め構造が決定された試料”は、その化学的または生物学的配列または構造が、神経変性疾患のような具体的な過程と関連するか否かを試験するためのアッセイで使用される試料を意味すると本明細書で定義される。たとえば、“予め構造が決定された試料”にはペプチド配列、ファージディスプレイライブラリー中の任意のペプチド配列などが挙げられる。ヒトまたは他の動物から採取される代表的な試料には、細胞、血液、尿、眼水、唾液、脳脊髄液、または扁桃腺、リンパ節、針生検由来の流体または他の試料などが挙げられる。
【００４４】
本明細書で使用される“金属結合タグ”は、キレートに配位結合した金属に結合することができる１群の分子を表す。そのような分子の適切な群には、典型的には約２から約１０アミノ酸残基までのアミノ酸配列が含まれる。これらには、ヒスチジンおよびシステイン（“ポリアミノ酸タグ”）が含まれるが、それらに限定されない。そのような結合タグは、それらがヒスチジンを含むとき、“ポリ‐ヒスチジントラクト”または“ヒスチジンタグ”もしくは“ＨＩＳ‐タグ”と呼んでもよく、アミノ‐もしくはカルボキシ‐末端のいずれか、またはペプチドもしくはタンパク質または核酸の、任意の露出領域に存在してもよい。６から１０残基までのポリ‐ヒスチジントラクトが本発明の使用には好ましい。また、ポリ‐ヒスチジントラクトは関心のあるタンパク質に添加される多数の連続したヒスチジン残基であるとして機能的に定義され、それらは金属キレートカラム上で得られたタンパク質の親和性精製、または他の分子（たとえば、ＨＩＳ‐タグと反応する抗体）との相互作用によりタンパク質末端の同定をすることができる。
【００４５】
“親和性タグ”は当技術分野で通常の意味が与えられる。親和性タグには、たとえば、金属結合タグ、ＧＳＴ（ＧＳＴ／グルタチオン結合クリップ中にある）、およびストレプトアビジン（ビオチン／ストレプトアビジン結合中にある）が挙げられる。本明細書の各種部分で、結合相互作用と関連して特異的親和性タグについて記載する。親和性タグを使用するいずれかの態様において、本発明は本明細書に記載されたいずれかの親和性タグからの選択をそれぞれ含む、一連の個々の態様を含むということを理解すべきである。
【００４６】
本明細書で使用される“分子ワイヤ”は、ＳＡＭで被覆した電極と接触する流体が電極と電気的に連絡するための能力を高めるワイヤを意味する。これには、伝導性分子、または先に記載し、そして以下でより詳細に例示する、ＳＡＭ中に電極と連絡するための欠陥を生じることができる分子が挙げられる。付加的な分子ワイヤの非限定的なリストには、２−メルカプトピリジン、２−メルカプトベンゾチアゾール、ジチオスレイトール、１，２−ベンゼンジチオール、１，２−ベンゼンジメタンチオール、ベンゼン‐エタンチオール、および２−メルカプトエチルエーテルが挙げられる。また、電極の平面で伝導性を促進する分子の添加により単分子層の伝導性を高めることができる。伝導性ＳＡＭは、以下のものから構成できるが、それらに限定されない：１）硫黄で停止するポリ（エチニルフェニル）鎖；２）ベンゼン環で停止するアルキルチオール；３）ＤＮＡ塩基で停止するアルキルチオール；４）単分子層中に不十分に詰まる、いずれかの硫黄停止種；５）上記の全てに非特異的吸着を阻害するエチレングリコール単位またはメチル基のいずれかで停止するアルキルチオールスペーサー分子を足したものまたは引いたもの。チオールは金に親和性があるためにＳＡＭの容易な形成において記載される。米国特許第５，６２０，８２０号および他の参考文献に基づいて、チオールを当技術分野で既知の他の分子と置換してもよい。分子ワイヤは典型的に、それらのかさおよび他の形状のために、他の点では堅く詰まったＳＡＭ中に欠陥を作り、ＳＡＭが暴露される流体に対して表面がしっかり密閉されるのを妨げる。分子ワイヤは堅く詰まった自己組織化構造の破壊を引き起こし、それによって表面が暴露される流体が表面と電気的に連絡できる欠陥を定義する。これに関連して、流体は表面に接触することにより、またはトンネル効果などにより電気的連絡が起こり得る表面の近傍に十分に接近することにより、表面と電気的に連絡する。
【００４７】
“生物学的結合”という用語はお互いの親和性または結合能力を表す、対応する分子対間の相互作用、典型的には生化学的、物理学的、および／または薬剤的相互作用を含む特異的もしくは非特異的結合または相互作用である。生物学的結合は、タンパク質、核酸、糖タンパク質、炭水化物、ホルモンなどを含む分子対間で起こる相互作用の型を定義する。具体的な例としては、抗体／抗原、抗体／ハプテン、酵素／基質、酵素／阻害剤、酵素／補因子、結合タンパク質／基質、キャリアタンパク質／基質、レクチン／炭水化物、受容体／ホルモン、受容体／エフェクター、核酸の相補的鎖、タンパク質／核酸、レプレッサー／インデューサー、リガンド／細胞表面受容体、ウイルス／リガンドなどが挙げられる。
【００４８】
“結合パートナー”という用語は、特定の分子と結合することができる分子を表す。生物学的結合パートナーは、その例である。たとえば、プロテインＡは生物学的分子ＩｇＧの結合パートナーであり、逆も同様である。
【００４９】
“測定する”という用語は、たとえば、分光法、偏光解析法、圧電測定法、イムノアッセイ、電気化学的測定法などによる、種の定量的、または定性的分析を表す。また、“測定する”は、たとえば２つの種間の結合の検出のように、種間の相互作用を検出または定量することも意味する。
【００５０】
“自己組織化単分子層”（ＳＡＭ）という用語は、自発的に表面に化学吸着される分子の比較的整った集合を表し、そこでは分子はお互いにほぼ平行で、表面にだいたい垂直に配置される。分子のそれぞれは、表面に接着する官能基、および単分子層中で比較的整ったアレイを形成するために隣接する分子と相互作用する部分を含む。Ｌａｉｂｉｎｉｓ，Ｐ．Ｅ．；Ｈｉｃｋｍａｎ，Ｊ．；Ｗｒｉｇｈｔｏｎ，Ｍ．Ｓ．；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４５，８４５（１９８９）、Ｂａｉｎ，Ｃ．；Ｅｖａｌｌ，Ｊ．；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１，７１５５−７１６４（１９８９），Ｂａｉｎ，Ｃ．；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１，７１６４−７１７５（１９８９）を参照されたい、それらはそれぞれ、参照として本明細書に援用される。
【００５１】
“自己組織化混合単分子層”という用語は、不均一の自己組織化単分子層、すなわち、少なくとも２つの異なる分子の比較的整った集合から作られる単分子層を表す。
【００５２】
一側面において、本発明は分析、薬物スクリーニングなどのための化学的または生物学的作用物質間の相互作用を企図する。本発明は無傷細胞（電極上で増殖するか、または溶液中もしくは懸濁液中にある）上のリガンドを含むが、それらに限定されないリガンド相互作用を分析する、および／または阻害することを含むが、それらに限定されない。本発明は、薬物候補、既知または推定リガンド、および小分子薬物ライブラリーの使用を含む各種態様を企図する。
【００５３】
一態様において、細胞は自己組織化単分子層（ＳＡＭｓ）により誘導体化されてもよいか、またはされなくてもよい電極上で増殖する。推定リガンド（たとえば、特定の細胞表面受容体の）は、固体支持体（たとえば、金コロイド）上でシグナル伝達要素（たとえば、電気活性複合体）と一緒に固定化される。これらの誘導体化された固体支持体は、感知電極（たとえば、金属支持体）上に固定化された細胞と共にインキュベートされる。標的受容体と固体支持体上のリガンド（例えば、コロイドに結合したリガンド）間の相互作用は共固定化されたシグナル伝達要素を感知電極近くにつなぎ止める。いずれか具体的な機序に限定されないが、電位が電極に適用されると、近くの酸化還元‐活性金属複合体がそれらの特徴的な酸化電位を受け、電子を放出すると考えられる。振動成分がボルテージランプの上端に添加されるとき、それぞれの金属複合体により多くの電子が放出され、電流出力として検出することができる。この種の電気化学的分析の形状は、交流ボルタンメトリー（ＡＣＶ）と呼ばれる。当業者には知られているように、本明細書で使用される“細胞表面受容体”は、細胞表面タンパク質をも包含する総称的用語である。
【００５４】
本発明のある態様は、コロイド粒子の表面のような表面上の自己組織化単分子層（ＳＡＭｓ）、およびＳＡＭｓで被覆された表面を有するコロイド粒子のようなアーティクルを使用する。好ましい態様の１セットにおいて、完全に合成分子から形成されたＳＡＭｓは、表面または表面の領域を完全に被覆する、たとえばコロイド粒子の表面を完全に被覆する。ここでの“合成分子”は、天然に存在しない分子、どちらかといえば、ヒトの指示、またはヒトにより考案されるか、もしくはヒトにより指示された制御下で合成されたものを意味する。ここでの“完全に被覆する”は、ＳＡＭによる完全で直接的な被覆を妨害する、タンパク質、抗体、または他の種と直接接触する表面の部分または領域がないことを意味する。すなわち好ましい態様において、表面または領域はその全体にわたり、完全に天然に存在しない分子（すなわち合成分子）からなるＳＡＭを含む。ＳＡＭは、表面で堅く詰まったＳＡＭｓを形成するＳＡＭ形成種、または分子ワイヤと組み合わせたこれらの種、もしくはＳＡＭを通して電気的連絡を促進することができる他の種（ＳＡＭに関与可能な欠陥促進種を含む）、もしくはＳＡＭに関与可能な他の種、およびこれらのいずれかの組合せから構成されてもよい。好ましくは、ＳＡＭに関与する種のすべては、金表面に共有結合的に結合するチオールのような、表面に結合する、場合によっては共有結合する官能基を含む。本発明の表面上の自己組織化単分子層は、いずれかの化学的または生物学的官能基を本質的に提示（露出）することができる種（たとえば、金が表面のときのチオール種）の混合物からなっていてよい。たとえば、それらは非特異的吸着を阻害するためのトリ‐エチレングリコール‐停止種（たとえば、トリ‐エチレングリコール停止チオール）、および、たとえばニッケル原子との複合体であるとき、ヒスチジンタグ標識結合種のような金属結合タグ標識種を捕捉するニトリロトリ酢酸のような金属を配位結合することができるキレートで停止するような、親和性タグの結合パートナーで停止する他の種（たとえば、チオール）を含んでいてよい。本発明は、コロイド表面、またはいずれか他の表面上に提示された本質的に任意の化学的または生物学的種の濃度を厳密に管理する方法を提供する。本発明の多くの態様において、自己組織化単分子層は金コロイド表面上に形成される。本発明は、コロイド表面上に提示されたヒスチジンタグ標識ペプチドの濃度を厳密に管理する方法を提供する。それぞれのコロイド表面上のペプチド密度についての厳密な管理をしないと、共固定化されたペプチドはお互いに容易に凝集して微小疎水性領域を形成し、試料中に存在する凝集物形成種の非存在下でコロイド‐コロイド凝集を触媒するであろう。これは既存のコロイド凝集アッセイに優る、本発明の利点である。
【００５５】
本発明に記載の方法は、ＢＳＡによるブロッキングのような、タンパク質ブロッキング工程なしに、非特異的吸着に抵抗するコロイド上の自己組織化単分子層を生成する。また、本発明に記載の方法は、生物学的に適切な流体中で安定であり、および、結合反応を妨害する界面活性剤（安定性のため；コロイドを懸濁液中に維持する）を必要としない誘導体化コロイドを生じる。これにより、溶液中で感度の高い結合アッセイを行うことができる。このことは、既存のコロイド凝集アッセイでは一般的な、吸着表面に接着する結合パートナーを持つ必要性を除外する。以下で説明するように、好都合には界面活性剤はコロイド上でのＳＡＭ形成に使用することができる。この場合、界面活性剤はＳＡＭ形成後に除去してもよく、好ましくは除去し、結合相互作用、もしくはコロイドの他の使用中にコロイド上、ＳＡＭ中、またはどこか他にはもはや存在しない。
【００５６】
本発明は、細胞が金属支持体（たとえば、電極）に直接結合する態様に限定されることを意図しない。態様は、細胞が金属支持体に連結したリガンドの相互作用により、細胞が間接的に結合することを企図する。すなわち、特異的または非特異的相互作用により、直接的または間接的に細胞に結合する分子で表面を被覆することにより、細胞を表面に補充することができる。たとえば、メチル‐停止自己組織化単分子層（ＳＡＭｓ）は非特異的にコラーゲンに結合し、その後非特異的に細胞に結合する。あるいは、アルギニン、グリシン、アスパルテート（ＲＧＤ）モチーフを含むペプチドはビトロネクチンを模倣し、内皮細胞のような特定の細胞型に結合する。同様に、ポリリジン、正荷電、Ｋｒｉｎｇｌｅドメイン、インテグリン、およびペプチド、またはそれらの分子模倣物は細胞を連結するために表面に結合することができる。これらのリガンドは、ＳＡＭｓへの取り込みにより、表面上に表示されてもよい。リガンド自体はＳＡＭに直接取り込まれる必要はない。リガンドに連結した親和性タグの結合パートナーを提示するＳＡＭを使用してもよい。たとえば、ヒスチジンタグにより修飾されたペプチドは、ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）‐ニッケルチオールを含むＳＡＭｓに容易に結合することができる。あるいは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質はグルタチオンまたはその誘導体を取り込むＳＡＭに連結してもよい。金属電極を使用することの１つの利点は、表面にＳＡＭを形成する分子の末端に多くの既知の官能基を提供できることである。
【００５７】
たとえば、溶液中の細胞は、電気泳動により検出電極に連結することができる。具体的には、細胞由来分子は、結合複合体の検出を補助するための、フェロセン誘導体のような電気活性分子も提示するコロイドに連結したリガンドに結合してもよい。しかし、使用される検出要素は、容易に検出可能な、いずれかに荷電した電気活性種もしくは蛍光タグ、またはコロイドそれ自体であってもよい。
【００５８】
シグナル伝達実体は、本発明の各種アッセイおよび手順に使用される。染料、色素、電気活性分子、蛍光部分、アップレギュレートしている蛍光体、ホースラディッシュペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼを含む酵素結合シグナル伝達部分、化学ルミネッセンス部分、電気化学ルミネッセンス部分、などを含む、任意の各種シグナル伝達実体がそれぞれの場合において選択されてよいということを理解すべきである。Ｋｎｉｇｈｔ，“Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，ｖｏｌ．１８，１９９９、ｐｇ．４７；Ｋｎｉｇｈｔ，ｅｔ　ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｔ，ｖｏｌ．１１９，１９９４，ｐａｇｅ　８７９；Ｓｔｕｌｔｓ，ｅｔ　ａｌ．，“Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　Ａｅｑｕｏｒｉｎ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　ａｎｄ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ−Ｂａｓｅｄ　Ａｓｓａｙｓ：Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ａｐｏａｅｑｕｏｒｉｎ　ｆｒｏｍ　ｅｓｃｈｅｒｉａ　ｃｏｌｉ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９２，３１，１４３３；Ｍｅｎｇｅｌｉｎｇ，ｅｔ　ａｌ．，“Ａ　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ−Ｐｈａｓｅ　Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ：Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｋｉｎｅｔｉｃ　Ｃｏｎｓｔａｎｔｓ”，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１９，２８６，（１９９１）を例として参照されたい。所望する場合には、各種シグナル伝達実体はビーズまたはコロイド粒子のような粒子の表面に関して固定化されてもよい。これらのいずれかに提示されたシグナル伝達実体は蛍光分子であってもよい。緑色蛍光タンパク質を含む、蛍光剤が結合した抗体および他の蛍光剤融合タンパク質は生物医学的研究および試験に広く使用される。これらの蛍光タンパク質および分子は、親和性タグ、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学によるか、または本発明に記載のＮＴＡ−ＳＡＭ−被覆コロイド上に提示されたＨｉｓ‐タグ標識プロテインＡまたはＧへの結合によるかのいずれかにより、推定結合パートナーをも提示する金コロイドに容易に連結することができる。また、蛍光部分のようなシグナル伝達実体はビオチン停止リガンドによりコロイド上に共固定化されてもよいか、またはキレート／金属／金属結合タグ結合により固定されてもよい。また、蛍光部分はそれを抗体に練得ｋつし、そして抗体に結合するためのＨｉｓ−プロテインＧとともにキレート／金属／金属結合タグを使用することにより、固定されてもよい。上記部分はその後直接検出することができる。
【００５９】
リガンド誘導体化コロイドは、自己組織化単分子層（ＳＡＭ）により修飾されても、されなくてもよい電極の近くにつなぎ止めてもよく、結合により誘発された電極電流中の摂動により結合細胞を検出することができる。細胞由来タンパク質は、磁気ビーズに連結したリガンドに結合することもできる。あるいは、細胞由来タンパク質は電気活性デンドリマー上のリガンドに結合することもできる。さらに細胞由来タンパク質は、電気活性または酸化還元‐活性複合体も提示するポリマーに連結したリガンドに結合することができる。細胞由来タンパク質は、同様に電気活性または酸化還元‐活性複合体を提示する伝導性ポリマーに連結したリガンドに結合することができる。
【００６０】
代わりとなるスキームにおいて、記載の系は２つの異なるリガンドを使用することができる。構成的に発現された細胞表面受容体に結合する１つのリガンドは、磁気ビーズ上に固定化され、感知電極に細胞を補充するために使用することができる。関心のある細胞表面受容体を認識する２番目のリガンドは、シグナル伝達コロイドに結合する。
【００６１】
別の代わりとなるスキームにおいて、記載の系は異なる電位で酸化する２つのフェロセン誘導体のような、２つの識別可能な電気活性複合体を使用することができる。第１のフェロセン誘導体は関心のある細胞表面受容体のリガンドに直接的または間接的に連結することができる。第２のフェロセン誘導体は、構成的に発現された細胞表面受容体に結合する第２のリガンドに直接的または間接的に連結する。この手段では、２つのシグナルの比は発現の生理学的、環境的、または疾患に関連した変化により誘導される細胞由来分子（たとえば、タンパク質）の誘導のレベルをキャリブレーションするために使用することができる。この発現比の比較は、同じ金属複合体を持つ両リガンドを有するものについても行うことができるが、異なる電極パッド上で試料の異なるアリコートをインキュベートする。
【００６２】
本発明は、粒子様でもよい表面へのリガンド（推定薬物候補を含むが、それらに限定されない）の連結をし、およびそれらを、支持体に連結するか、または細胞上でそのままにしておいてもよいたとえば細胞表面タンパク質などの細胞由来タンパク質を、結合パートナーの同定、それらの存在または非存在の測定、およびそれらのレベルの定量のために、相互作用させることを企図する。具体的には、細胞表面受容体を提示する無傷細胞を第１結合パートナーとして使用することができる。シグナル伝達実体に直接的または間接的に結合した既知、または推定のリガンドは、第２結合パートナーとして作用する。あるいは、細胞由来タンパク質は表面、およびそれらのリガンド、またはコロイドまたは誘導体化コロイドのような、シグナル伝達能力を有する粒子に連結した結合パートナーに結合することができる。薬物候補は相互作用を阻害することで薬物スクリーニングを容易にするために添加することができる。この方法は、診断にも非常に有用である。タンパク質または抗体は表面に固定化されてもよく、そしてこのタンパク質の結合パートナーを含むと推測される試料は、結合を促進するために試料と共にインキュベートしてもよく、そして試料の残りは洗い流すことができる。結合パートナーに対するリガンドをおよびシグナル伝達能力を有する粒子が添加されてもよい。試料が結合パートナーを含有する場合には、その粒子は表面に間接的に結合してシグナルを与えるであろう。表面は補充可能な粒子であってもよい。連結は直接的または間接的であってもよく、すなわち、連結はお互いに固定化される２つの実体に関連していてもよい。粒子は、固定化された抗体、たとえば抗体が結合するヒスチジンタグ標識プロテインＧ、およびその抗体は共通のリガンドを認識してもよいか、またはお互いに認識するタンパク質を含んでいてもよいものを提示してもよい。
【００６３】
本発明の１つの一般的な技術は、結合パートナーによる結合部分（生物学的または化学的作用物質）の捕捉を示す電極の表面に、電子的または電気化学的シグナル伝達実体を補充するための磁気ビーズを使用することを伴う。図２７では、第１の種３０が、メタロセン　フェロセン、３４のようなシグナル伝達能力をも有するコロイド粒子３２に連結される。３０の結合パートナーと推測される第２の種３６は、磁気粒子３８に連結し、３８はシグナル伝達ができないが、電極４０に磁気的に引き寄せられることができる。とりわけ有用な１技術において、種３０および第２の種３６はタンパク質であり、したがって本発明はプロテオミクスの分野に具体的な用途を見出す。上記技術は、コロイド粒子３２に非コロイド構造、磁気ビーズ、３８に固定できるようにすることを伴う、本発明の側面の一例である。コロイド粒子の非コロイド構造への固定の測定は、磁気ビーズを電極に引き寄せ、コロイド粒子も電極の近くにあるか、または連結していないかを測定することにより行われる。具体的には、２つの成分を溶液中で一緒にインキュベートし、得られた複合体を磁気的に電極に引き寄せる。電極は、その後交流ボルタンメトリー（ＡＣＶ）により分析する（Ｌａｖｉｒｏｎ　Ｅ：Ｊ　Ｅｌｅｃｔｒｏ　Ａｎａｌ　Ｃｈｅｍ．，１９７９，１０５：３５）。電流は電位の関数として、リアルタイムでプロットされる。第１成分上の電子的または電気化学的シグナル伝達部分が電極に非常に接近した場合、特徴的な電位において明確な電流ピークが発生するであろう。２つのタンパク質がお互いに相互作用し、磁気粒子が感知電極に引き寄せられる場合、それはシグナル伝達能力を持つコロイド粒子をも持つであろう。第１成分は小さい金コロイドであるため、コロイド粒子上の第１の種と磁気粒子に結合した第２の種間の相互作用により、感知電極に特異的に補充されない限り、懸濁液中に残ったままであろう。シグナル伝達粒子が第１の種と第２の種間の相互作用により磁気ビーズに結合している場合にのみ、電子的または電気化学的シグナルが発生するであろう。この態様において、コロイド粒子はフェロセンに例示されるような、補助的なシグナル伝達実体を含む。以下に記載の他の態様において、コロイド粒子はそれ自体シグナル伝達実体であり、補助的な実体を必要としない。
【００６４】
この研究方法は、アレイフォーマット中のタンパク質‐タンパク質相互作用の迅速なスクリーニングに使用してもよい。潜在的な治療標的を探索する場合、研究者は特定のタンパク質の結合パートナーを同定することをしばしば必要とする。既知のタンパク質は磁気ビーズに結合することができる。これは、化学的官能基を提示する市販の磁気ビーズへの既知のタンパク質の直接的化学的カップリングにより、コグネイト抗体を介してプロテインＡ被覆磁気ビーズへの連結により、またはＮＴＡ‐ＳＡＭにより誘導体化されている金被覆磁気ビーズへヒスチジンタグ標識した既知のタンパク質を連結することにより行うことができる（たとえば、本明細書に参照として援用される米国特許第５，６２０，８５０号を参照されたい）。潜在的な結合パートナーは、ヒスチジンタグ標識タンパク質として発現され、その後フェロセン部分も提示するＮＴＡ‐ＳＡＭ被覆コロイドに別々に結合してもよい。電極アレイに接続したマルチウェルアレイのそれぞれのウェルは、磁気ビーズ上の既知のタンパク質を含むであろう。シグナル伝達コロイドに連結した別個の推定結合パートナーは各ウェルに別々に添加されてもよい。次にどの候補タンパク質が既知のタンパク質に結合したかを調べるために、得られた複合体を電極に磁気的に引き寄せてもよい。既知の種は必ずしもタンパク質である必要はない。結合パートナーが同定されたとき、相互作用を阻害するために薬物候補をアッセイに添加してもよい。
【００６５】
あるいは、生物学的または化学的作用物質３０は薬物候補であり、その結合パートナー（潜在的な結合パートナー）３６は薬物候補の標的であるか、または逆である。具体的には、医学的に適切な標的種に結合する薬物候補を同定するために薬物候補が磁気粒子に連結し、および既知のタンパク質がシグナル伝達コロイドに結合してよい。あるいは、種３０および３６は、それぞれ、標的および標的に対するリガンドであってもよく、そして技術はコロイド３２および磁気ビーズ３８を近づけ、標的へのリガンドの結合を阻害する候補薬物の存在下で３０を３６に結合させることにを伴ってもよい。以下で理解されるように、この技術はコロイドと各種非コロイド構造との相互作用に適用することができる。
【００６６】
ＥＬＩＳＡ、蛍光標識およびＳＰＲのような既存の方法に優るこの技術の利点としては以下のことが挙げられる：この系では、タンパク質標識の必要性がない；タンパク質は標識された成分に結合する。金コロイドは以下の両方により前もって標識することができる：ａ）シグナル伝達部分；およびｂ）タンパク質連結のための官能基。ヒスチジンタグ標識タンパク質を捕捉するためのＮＴＡ／Ｎｉ２＋、および電子的または電気化学的シグナル伝達のためのフェロセン誘導体を共に提示する自己組織化単分子層はコロイド上に形成されてもよい。非修飾タンパク質の化学的カップリング（標準ＥＤＣ／ＮＨＳ化学）のためのカルボン酸基を包含するＳＡＭｓも使用することができる。技術はモジュール方式である。実質的にいずれの生物学的種もシグナル伝達実体を有するコロイド上に共固定化することができる。当該技術は微小電極アレイ上で容易に多重化できるため、費用効率のよい多重化を可能にする。
【００６７】
リポソームも第１の結合パートナー３０を取り込むことができる。上記のように、シグナル伝達自体がリポソームに取り込まれてもよいか、またはリポソーム形成後にＨｉｓタグ標識可溶性受容体を捕捉するために脂質がリポソームに取り込まれてもよい。リポソームは、安定性を増加させるために、リポソーム形成後にＵＶに活性化される交差結合をする、光励起性基を含有することができる。
【００６８】
また、薬物候補の同定は競合的阻害アッセイを使用することにより行うことができる。具体的には、溶液中の遊離薬物候補を別々に組成物と一緒にインキュベートすることができる。受容体またはリガンドに結合した薬物により生じる標的細胞由来タンパク質に対する競合的阻害は、検出シグナルの時間または投与量依存的損失として表すことができる。
【００６９】
これを行うには、シグナル伝達部分を既知のリガンドに直接的に、または間接的に結合する方法を必要とし、そしてその後複合体結合パートナーを感知表面に連結または補充する方法が提供される。前者は先に記載され、後者は以下に記載される。
【００７０】
使用される感知表面は各種の形状であってよい。しかし、説明のために、伝導性ＳＡＭにより修飾される電極を使用する、結合パートナー複合体を補充するための方法が記載される。伝導性ＳＡＭは、金属表面に結合した分子の層であり、その表面は飽和アルキルチオレートのような絶縁種により均一に被覆された金属より速い速度で電子を伝導させる。電子伝導のための好ましい経路は、分子ワイヤ（芳香環化合物のポリマー）が取り込まれている単分子層により提供することができる。本明細書にＭＦ１として表される、ポリ（エチニルフェニルチオール）（すなわち、Ｃ１６Ｈ１０Ｓ）を含むがそれらに限定されない、各種の分子をこの目的に使用することができる：
【００７１】
【化１】
2004512497.tif 000002
【００７２】
本明細書で使用する“分子ワイヤ”は、ＳＡＭで被覆した電極と接触している流体が電極と電気的に連絡する能力を高めるワイヤを意味する。これには、先に記載し、以下でさらに完全に例示する伝導性分子、または流体が電極と接触するようにＳＡＭ中に欠陥を生じることができる分子が含まれる。付加的な分子ワイヤの非限定的なリストには、２−メルカプトピリジン、２−メルカプトベンゾチアゾール、ジチオスレイトール、１，２−ベンゼンジチオール、１，２−ベンゼンジメタンチオール、ベンゼン‐エタンチオール、および２−メルカプトエチルエーテルが挙げられる。また、単分子層の伝導性は電極の平面で伝導性を促進する分子の添加により高めることが可能である。伝導性ＳＡＭは、以下のものからなるが、それらに限定されない：１）硫黄で停止するポリ（エチニルフェニル）鎖；２）ベンゼン環で停止するアルキルチオール；３）ＤＮＡ塩基で停止するアルキルチオール；４）単分子層中に不完全に詰まる、いずれかの硫黄停止種；５）上記の全てに非特異的吸着を阻害するエチレングリコール単位またはメチル基のいずれかで停止するアルキルチオールスペーサー分子を足したものまたは引いたもの。チオールはＳＡＭの即座の形成において、それらの金への親和性のために記載される。米国特許第５，６２０，８２０号および他の参考文献に基づいて、チオールを当技術分野で既知の他の分子と置換してもよい。
【００７３】
シグナル伝達コロイド上の既知のリガンドがそれらのコグネイト細胞由来タンパク質と相互作用するとき、薬物候補を溶液に添加し、異なる作用をモニターしてもよい。細胞に直接的に、または間接的に結合する頭基で停止する分子（たとえば、メチル基、ポリＫ，陽性電荷、ＲＧＤ配列、Ｋｒｉｎｇｌｅモチーフ、インテグリン、およびそれらのペプチド模倣物）も提示する伝導性ＳＡＭにより被覆された電極に細胞が補充されてもよい。あるいは異なる相互作用は、伝導性ＳＡＭ上に提示されたコグネイトリガンドと相互作用している、ＳＡＭに結合した細胞表面タンパク質を有することにより定量することができる。この場合、リガンドが構成的に発現された受容体に結合した後、電子的または電気化学的シグナルが生成される。流動力下では、電子的または電気化学的シグナルはＳＡＭ固定化リガンドと相互作用する細胞表面受容体の数に比例するだろう。流速の関数としての細胞運動性の速度は、表面の細胞接着分子に対する受容体の密度を示す。相互に作用するＳＡＭの下流は、電荷読みとり装置（たとえば、電流計、電荷計数装置）、または光学式読みとり機（たとえば、表面プラズモン共鳴検出器、または蛍光読みとり機）である。さらに、これらの方法は、関与する特異的な受容体‐接着分子相互作用の予備知識なしに、浸潤または転移が特徴であることが既知の細胞表現型を阻害する薬物のスクリーニングに使用することもできる。また、生理学的に適切な相互作用を模倣する薬物のスクリーニングはこの系を使用して以下のいずれかにより行うことができる：溶液中に遊離で薬物候補を添加し、検出シグナルの損失を探索するか、または固体支持体上の薬物候補と共に溶液中で遊離した既知のリガンドを添加し、検出シグナルの出現を探索する。
【００７４】
わずかに陽性のバイアスをＡＣ電位ランプ（ｒａｍｐ）に適用すると細胞は陰性荷電されるという事実から、感知電極に引き寄せられる。リガンドが連結するデンドリマーまたはポリマーに付加的な陰性に荷電した基を添加すると感知電極への補充がさらに促進される。当業者は、デンドリマーまたはポリマーに複数のシグナル伝達実体を容易に固定することができる。あるいは、金属結合タグにより認識リガンドを結合することは、アルキルチオールＮＴＡへのそれらの結合（および結果として関連した細胞の結合）を促進する。金被覆磁気ビーズ上にフェロセンのような金属含有化合物を有するＳＡＭｓは、感知表面電極に複合体を補充するために電磁場、または固定磁石の使用を許容する。また、リガンドを包含する感知電極は、細胞接着分子によるもののような特異的相互作用または非特異的相互作用により、直接的に、またはヒスチジンタグ標識により細胞を引き寄せることができる。
【００７５】
しかし、結合パートナーの一つが分析溶液より比重が大きいため、複合体が重力により沈殿する場合には、検出系への補充も単に重力を用いて行うことができる。早すぎる沈殿を避けるためにインキュベーション段階で機械的混合が行われてもよい。図３２Ａおよび３２Ｂは、表面への結合相互作用を示すシグナル伝達実体および対照、を補充するための重力の使用を示す実験のＡＣＶプロットを示す。ＧＳＴは金属結合タグ／金属／キレート結合（ＮＴＡ‐ＳＡＭ）によりコロイドに結合した。またコロイドは電子的または電気化学的シグナル伝達のためのフェロセン誘導体を提示した。陰性対照としてコロイドを測定電極に溶液中で提示し、図３２Ａのプロットを得た。コロイドの１セットは、グルタチオンで被覆されたポリマービーズ（アガロース）に暴露した。コロイドはグルタチオン／ＧＳＴ結合によりビーズに固定され、ビーズは重力により電極上に固定された。電極に近いフェロセンの電気活性検出を示す図３２ＢのＡＣＶプロットが得られた。
【００７６】
細胞由来タンパク質生成装置として電極を使用する方法において、細胞を溶解させる電位スパイクを発生させるために電極パッド上の点を使用することができる。次に細胞の内容物をシグナル伝達リガンドとインキュベートし、相互作用を検出する。
【００７７】
さらに細胞結合分子は、伝導性分子とともにチャネルを並べ、系の検出能力を高めるために、ＳＡＭを使用してフローチャネルの底に沿って指定のトポロジーの形状にされてもよい。したがって、ＳＡＭは感知能力（光学的または電子的もしくは電気化学的）と細胞結合能力を交互にする形状で、結合部分を提示してもよい。例としては、メチル停止アルキルチオールの縞はＳＡＭ中で伝導性のポリピロール基と交互になる。また、ＳＡＭのトポロジーは細胞を溝中に置き、その結果細胞の側面に沿った受容体を評価できるように操作することができる。交互官能基性ＳＡＭの縞の形成は、共に本明細書に援用される米国特許第５，５１２，１３１号および国際特許公開公報第ＷＯ９６／２９６２９号に記載のように行うことができる。これらの複合体は電子的または電気化学的に検出することができる。１つの検出方法は、交流ボルタンメトリー（ＡＣＶ）と呼ばれる電気化学的技術である。この検出方法は、より高次な調和解析のような付加的な分析技術の使用により補充することができる。これらの複合体は、ＳＰＲのような光学的手段によって検出してもよい。後者の技術を使用すると、感知表面への複合体の補充により、光学的性質の大きなシフトが引き起こされる。
【００７８】
一態様において、以下のように細胞表面タンパク質を検出し、定量することができる：細胞表面タンパク質を認識するヒスチジンタグ標識リガンドをＮＴＡ（Ｈｉｓ‐タグ標識タンパク質を捕捉するため）およびフェロセン部分（電子的または電気化学的シグナル伝達のため）の両方を提示するＳＡＭを持つコロイドに、連結させる。次に、これらの生物特異的、電子的または電気化学的シグナル伝達コロイドを、標的受容体を提示する細胞と共にインキュベートする。細胞はその後、ＳＡＭ被覆電極上に沈殿させ、接着させ、または引き寄せられ、ＡＣＶにより分析される（図３）。シグナル伝達コロイドに固定化されたリガンドが細胞表面上のそれらのコグネイト受容体に結合した場合、フェロセン部分の特徴的な酸化電位で電流ピークが生じるであろう。細胞表面受容体を認識する抗体は、初めにＨｉｓタグ標識プロテインＡまたはＧが結合しているＮＴＡ‐フェロセンを持つコロイドに結合してもよい。あるいは、抗体は金属結合タグ／金属／キレート結合によりコロイドに直接結合してもよく、ここで金属結合タグは抗体に結合さえる。ヒスチジンタグを抗体に結合するための技術は、“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ　Ｆｖ　ｆｒｏｍ　１９６−１４　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｏｗａｒｄ　ｏｖａｒｉａｎ　ｃａｎｃｅｒ−ａｓｓｏｃｏｉａｔｅｄ　ａｎｔｉｇｅｎ　ＣＡ１２５”Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｙ．，Ｔａｎｉｇａｗａ，Ｋ．，Ｎａｋａｓｈｉｍａ，Ｍ．，Ｓｏｎｏｄａ，Ｋ．，Ｕｅｄａ，Ｔ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｔ．，ａｎｄ　Ｉｍｏｔｏ，Ｔ．：１９９９，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，Ｖｏｌ　２２：（１０）１０６８−１０７２．；“Ｈｕｍａｎ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｗｉｔｈ　ｓｕｂｎａｎｏｍｏｌａｒ　ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ａ　ｌａｒｇｅ　ｎｏｎ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ　ｐｈａｇｅ　ｄｉｓｐｌａｙ　ｌｉｂｒａｒｙ”，Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ａ．Ｊ．，Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ，Ｋ．，Ｏｓｂｏｕｒｎ，Ｊ．Ｋ．，Ｐｏｐｅ，Ａ．Ｒ．，Ｅａｒｎｓｈａｗ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ　１４（３）ｐ．２６７．；“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　ａｎｔｉ−ＨＢｘ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｉｎ　Ｅ．ｃｏｌｉ”Ｚｏｕｈ　Ｇ，ｌｕｉ　ＫＤ，Ｓｕｎ　Ｈ．Ｃ．，Ｃｈｅｎ　Ｙ．Ｈ．，Ｔａｎｇ　Ｚ．Ｙ．，ａｎｄ　Ｓｃｈｒｏｄｅｒ　Ｃ．Ｈ．，１９９７，ｖｏｌ　１２３（１１−１２）ｐｇｓ６０９−１３に見出すことができる。
【００７９】
本発明の技術の一例として、図４では、細胞へのコロイド粒子の固定を含む有用な技術の例が記載される。腫瘍マーカー、ＭＵＣ−１は腫瘍細胞上に異常に発現される。ＡＴＣＣから入手できるヒト組織培養乳癌細胞系統ＭＣＦ−７は、ＭＵＣ−１を過剰発現する。Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手できる抗体５０，ＤＦ３またはおよびＤＦ３−ｐは、ヒスチジンタグ標識プロテインＧ　５６により電子的または電気化学的シグナル伝達コロイド５２（ＮＴＡ‐ＳＡＭｓ５４を持つ）に結合する。標的細胞５８は、抗体を持つシグナル伝達コロイド５２と共にインキュベートし、分子ワイヤ含有ＳＡＭ５８で被覆した電極に電気泳動し、ＡＣＶにより分析する。電極４０上のＳＡＭは、より慣用の、堅く詰まったＳＡＭ‐形成種と混合した分子ワイヤ５８を含む。すべての図において説明を簡単にするために、分子ワイヤ５８だけを図式的に示す。抗体を持つシグナル伝達コロイドをＭＵＣ−１を持つ細胞とインキュベートすると、電流ピークが得られる。あるいは、ＭＵＣ−１の推定コグネイトリガンド、Ｉ−ＣＡＭをＨｉｓタグ標識し、ＮＴＡ基をも持つシグナル伝達コロイドに結合してもよい。
【００８０】
別のアッセイを図５に示す。薬物ライブラリーは、ＭＵＣ−１／Ｉ−ＣＡＭ相互作用のような、細胞由来タンパク質との特異的相互作用を阻害するそれらの能力に対してスクリーニングしてもよい。Ｉ−ＣＡＭ　６４は先に記載のようにシグナル伝達コロイド６２に結合し、その後ＭＵＣ−１（６６）を提示する細胞７０および対照細胞と共にインキュベートする。薬物候補６８は、細胞およびコロイドが懸濁している溶液内に添加し、その後細胞は電極に接着し、ＡＣＶにより分析する。シグナルの損失は、薬物候補との相互作用を示す。図６は、使い捨てマイクロウェル７２のアレイを微小電極７４の接続可能なアレイと共に使用することにより、何千もの薬物候補を同時にスクリーニングするためにこのスキームがどのようにして容易に多重化されるかを説明する。それぞれのウェルは、図５に示されるアッセイ、または別のアッセイを含む。
【００８１】
次に図７では、シグナル増加アッセイのために、またはコグネイトリガンドが未知の細胞表面受容体８０に結合する薬物をスクリーニングするために、小分子薬物ライブリーを、電子的または電気化学的シグナル伝達部分３４をも持つコロイドまたは粒子７８上で合成するか、またはそこに共有結合することができる手順が示される。シグナル伝達粒子に結合した薬物候補７６は、関心のある受容体８０を提示する細胞８２、または対照細胞８４とインキュベートすることができる。本アッセイにおける薬物‐標的相互作用により、シグナルが増加する（図７）。
【００８２】
細胞表面受容体、αＶβ３は細胞接着分子ビトロネクチンとの相互作用により血管新生を促進することが示唆されている。αＶβ３細胞表面受容体を提示するヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓから入手できる。αＶβ３の作用を阻害する薬物のスクリーニングのために、ビトロネクチン由来のＲＧＤ‐含有配列を提示するＨｉｓタグ標識ペプチドを、ＮＴＡ基およびフェロセン部分を共に提示するＳＡＭｓを持つコロイドに連結させる。その後、生物特異的シグナル伝達コロイドはＨＵＶＥＣ細胞および薬物候補と共にインキュベートする。ＨＵＶＥＣ細胞は電極上で増殖させることができる。しかし、細胞が溶液または懸濁液中にある場合、それらを電気泳動させるか、または感知電極に磁気的に結合させて、ＡＣＶにより分析することができる。生物特異的コロイドは、対照細胞よりむしろ、ＨＵＶＥＣ細胞と共にインキュベートするとき、電流ピークが生じる。薬物候補がαＶβ３‐ＲＧＤ配列相互作用を妨害する場合、結果としてシグナル損失がおきる。既知の血管新生阻害剤エンドスタチンでαＶβ３‐ＲＧＤ相互作用を阻害することにより、このアッセイの実行可能性が示された。アッセイは、説明したように電子的に、または標準プラスチック皿中で細胞を増殖させてアッセイを行い、細胞を４０倍の倍率で観察することにより、視覚的に行うことができる。
【００８３】
あるいは、薬物候補は、ビーズ、コロイド、または電子的または電気化学的シグナル伝達部分を同様に提示する支持体上で合成されるか、それらに連結してもよい。これらの“粒子”または表面を標的細胞とインキュベートし、感知電極に引き寄せ、ＡＣＶにより分析する。吸引場を逆にし、そしてＲＧＤ配列を含むペプチドを溶液中で滴定する。細胞は再び感知電極に電気泳動され、再分析される。シグナルの損失は、薬物‐細胞相互作用がαＶβ３受容体に特異的であることを示し、ＲＧＤペプチドのＩＣ５０を薬物への結合親和性と関連付けられる。
【００８４】
あるいは、同様にαＶβ３に結合する４９アミノ酸ペプチド、エチスタチンは、先に記載のアッセイにおいてＲＧＤ‐含有ペプチドと交換するためにＨｉｓタグ標識されてもよい。
【００８５】
メタロセンは、以下の理由からシグナル伝達実体としてとりわけ有用である。１００ｍＶから８００ｍＶ間の特有の電位でそれぞれ酸化されるように各種フェロセン誘導体を選択してもよい。それぞれの酸化電位は特有の標識を表し、その結果複数の細胞表面受容体を同時に探索することができる。細胞表面受容体とリガンドを固定化したコロイド間で生物学的に適切な相互作用が起こる場合、細胞は電子的または電気化学的シグナル伝達粒子で修飾され、その結果電流ピークが生じる。電流ピークの大きさは、シグナル伝達コロイドにより認識された細胞表面受容体の数に比例するだろう。
【００８６】
細胞表面分子は懸濁液中、または図８に示すように、組織試料中に埋め込まれた細胞上で検出することができる。凍結組織標本８６は、冷凍で切片にし、ＲＧＤ‐含有ペプチドまたはメチル停止基のような、細胞結合基９０で誘導体化されている柔軟で半透過性の膜支持体８８上に直接置かれる。その後、関心のある細胞表面受容体に対するリガンド９４をも提示する電子的または電気化学的シグナル伝達コロイド９２と共に試料をインキュベートする。非結合コロイドは、インキュベーション時間の後に洗い流される。その後支持体膜を、細胞サイズに匹敵する電極の面積を有する、微小電極アレイ９６と物理的に接触させて、ＡＣＶにより分析する。組織試料のそれぞれの部分は、タンパク質量および発現レベルを分析し、組織病理学的に関連付ける。この能力は単一細胞分析法の妥当性を保証する、なぜなら、その方法により研究者は癌細胞に特に関連したタンパク質の型を同定し、任意の異常なタンパク質発現を排除することができるからである。懸濁液中の細胞は同様に支持体膜に結合することができる。
【００８７】
この技術は、健康な組織または細胞に対して病気を罹ったそれらにおいて異なって発現される受容体またはタンパク質のような、細胞由来分子を同定するために使用することができる。この異なる発現が、健康な組織または細胞に対して病気を罹ったそれらにおける異なる発現のレベル、および／または容易に同定することができる、組織または細胞における発現の異なる型と関連してもよい。この技術が疾患状態の測定のための診断用アッセイを容易にする。たとえば、特定の疾患であると推定される患者に関連して、細胞、具体的には、生検由来の細胞、血液試料などのような疾患の指標に関連する細胞が患者から採取されてもよく、そしてこれらの細胞は、疾患を示す発現レベルまたは型を測定するために健康な細胞に対して分析することができる。また、各種病理学的状態に関与する細胞由来タンパク質のアップレギュレーションを阻害する薬物をスクリーニングするためにこの系を使用することができる。薬物スクリーニングのための２つの技術の例として以下のものが挙げられる：（１）疾患と推定されるか、またはその徴候を示す患者に候補薬物を投与し、そして疾患の治療における薬物の効力を測定するために先に記載の患者の細胞を含む生物学的試料をモニターすること；（２）疾患を有すると推定されるまたは有する患者由来の細胞を含む生物学的試料を採取し、生物学的試料または細胞の成分を候補薬物に暴露し、そして先に記載の技術を使用して、発現レベルおよび／または型をモニターすること。一度結合パートナー（薬物、抗体、または細胞由来タンパク質のタンパク質／ペプチドリガンドを含んでいてもよい）が同定されると、結合パートナーは疾患状態または治療に反応した細胞由来タンパク質の発現レベルを定量するために検出部分に結合させることができる。これは細胞表面および細胞内コンパートメントの両方への細胞由来タンパク質の発現および移動に対する薬物候補の間接的影響を試験する、いずれのアッセイであってもよい。
【００８８】
また本発明は、個々の細胞表面上および／または組織試料中に埋め込まれた細胞上の細胞表面受容体発現の型を視覚的に研究するための能力を提供する。これは、疾患状態に関連付けることができる細胞表面受容体発現の型を示すことができる。また、これらは診断または薬物スクリーニング方法に使用することができる。具体的なアッセイにおいて、細胞表面受容体に結合するリガンドを持つコロイド粒子は個々の細胞または埋め込まれた細胞に暴露され、そして個々の細胞に関するそれらの結合の位置は、視覚的に測定可能で、細胞表面受容体発現の型を示す。たとえば、ＭＵＣ−１は乳癌に関連する細胞表面受容体である。正常にはＭＵＣ−１は、各種細胞型の表面に均一に発現される。各種癌に関連する形質転換細胞において、受容体は過剰発現され、細胞の先端部分に濃縮される。これは、記載された技術を使用して測定することができる。薬物スクリーニングにおいて、形質転換細胞の培養物が提供され、薬物候補により処理されてもよい。先端での型発現の損失が検討される。この態様において、視覚的同定はヒト裸眼、顕微鏡、吸光光度法、電子顕微鏡検査法、蛍光検出などによる観察のような本明細書に記載の任意の技術を含んでいてもよい。
【００８９】
先に記載の電子的または電気化学的検出を含む技術では、発現された種のレベルは、個々の細胞または他の非常に少量のものを含む試料をそれぞれ含む試料間で比較することが可能であり、そして型は組織試料を含むより大きな試料上で測定することができる。先に記載の視覚的検出態様では、発現された種のレベルは、大きな試料および単細胞試料を含む小さい試料の両方に発現された種の型と同様に測定することができる。電子的または電気化学的検出に有用なシグナル伝達実体は、フェロセンのような酸化還元活性分子を含む、電子的または電気化学的検出のために本明細書に記載されたシグナル伝達実体を含む。先に記載の視覚的検出では、コロイドを含む本明細書に記載のいずれかのシグナル伝達実体は単独で、または蛍光もしくは視覚的に同定可能な実体のような補助的なシグナル伝達実体を有しているものとして、使用することができる。複数のシグナル伝達実体が使用されてもよい（すなわち、結合事象ごとに複数のシグナル伝達）。電子的もしくは電気化学的または視覚的シグナル伝達ではともに、異なるアッセイに関して異なるシグナル伝達実体を使用してもよい。たとえば、第１の受容体またはタンパク質を標的にするように選択された第１のリガンドは、第１のシグナル伝達実体に関して固定化されてもよく、一方第２の受容体またはタンパク質を標的にするように選択された第２のリガンドは、第２のシグナル伝達実体に関して固定化されてもよい。電子的または電気化学的シグナル伝達では、異なるシグナル伝達実体が異なる酸化還元電位を含んでいてもよく、それらの間の差は電子的に区別可能であり、そして視覚的同定では、異なるシグナル伝達実体が異なる色の放射性または吸収性実体であってもよい。そのような場合、タンパク質または受容体の発現レベルおよび型が測定されるだけでなく、型は一つの受容体またはタンパク質の発現の位置と他のそれを区別することができる。
【００９０】
また、先に記載の生物特異的コロイドはｉｎ　ｖｉｖｏ画像診断を容易にするために使用することができる。使用されるコロイドは金であり、それは比較的不活性である。腫瘍マーカーに対する抗体または他のリガンドを提示するように誘導体化されている金コロイドは、内部に取り込ませるか、または注入することができる。コグネイト腫瘍マーカーを提示する腫瘍塊はコロイドで覆われ、濃縮装置として作用するであろう。次に腫瘍はＸ線、およびＸ線コンピュータトモグラフィー（ＣＴ）のような画像診断技術により検出することができる、なぜなら、有効な結果は金属中に包まれた腫瘍塊であってもよいからである。溶液中の個々のコロイドは検出に対して見えないであろう。また、生物特異的コロイドでそのように標識されている腫瘍は、ＭＲＩ（磁気共鳴イメージング）により検出することができる。画像診断技術は、常磁性金属および他の対比物質、たとえばＦｅ、Ｇｄ、またはＣｒを取り込むことにより高めることができる。対比物質は、コロイド上に形成されたＳＡＭｓに金属キレートチオールを取り入れることによりコロイドに結合させることができる。あるいは、腫瘍上に発現される標的タンパク質のコグネイトリガンドだけを提示するＳＡＭｓは、対比物質材料からなる粒子上で形成されてもよい。鉄または磁鉄鉱コアを有するコロイドは、金で被覆され、生物特異的ＳＡＭｓで誘導体化されてもよい。あるいは、リポソーム様粒子がキレート基で停止された脂質鎖から形成され、その結果金属対比物質が“コア”を形成し、生物特異的リガンドが溶媒に暴露されてもよい。あるいは、コロイドが生物特異的リガンドに加え、特異的分光分析的特徴を有する部分を持っていてもよく、その部分はＲａｍａｎ分光法を含むエネルギー吸収、または散乱技術により検出することができる。画像診断装置は本体の外側に含まれるか、または観察機械の本体もしくは光ファイバーに導入されてもよい。あるいは、腫瘍塊上で濃縮された場合、高周波を伝える部分を持つコロイドが検出可能なシグナルを生成してもよい。個々のコロイド由来のシグナルは、腫瘍塊に結合したコロイドの集合物から生成されるシグナルに比べ、無視できるか、または検出不可能でなければならない。
【００９１】
図９では、２つのタンパク質がお互いに相互作用するか否かを測定するために、第１のタンパク質１０４をＮＴＡ　５４およびフェロセンリガンド３４を共に提示するコロイド１０６に結合し、第２のタンパク質１００をＮＴＡリガンド５４のみを提示するＳＡＭ‐磁気ビーズ１０２に結合させるであろう。２つの粒子型は一緒に混合され、その後磁石１０８が下にある感知電極４０に磁気的に補充される。磁気ビーズが２つのタンパク質種の相互作用によりシグナル伝達コロイドに結合した場合だけ、電子的または電気化学的シグナルが、生成されるであろう。また、非ヒスチジンタグ標識タンパク質も、シグナル伝達または磁気（補充可能）粒子の上に、それらは荷電され、そしてカップリング化学に関与しない暴露基で停止したチオール（たとえばＮＴＡチオール）とともにカルボキシで停止するチオールをを組み込んだＳＡＭｓを形成することにより、それらに連結できる。次に、第１級アミンを提示するいずれかの分子を結合させるために標準ＥＤＣ／ＮＨＳカップリング化学を使用することができる。電子的または電気化学的標識工程はタンパク質製造工程と分かれているため、一般的な電子的または電気化学的シグナル伝達コロイドおよび磁気粒子を使用して系を効率的に多重化してもよい。これは、研究者が癌の分子的特徴を明確にするのに役立つタンパク質相互作用データベースの構築を容易にする。
【００９２】
相互作用するタンパク質パートナーは、小分子薬物ライブラリーとともにインキュベートすることができ、および薬物リードはシグナルの損失を検出することにより識別した。あるいは、小分子薬物ライブラリーは既知の標的タンパク質に結合する薬物候補を直接スクリーニングするための磁気ビーズ上のものを購入してもよい。
【００９３】
また、本明細書に記載の基礎的な技術は、酵素活性を調節する薬物をスクリーニングするために使用することができる。ある酵素は、進行性疾患に重要なものであると同定されている。ある場合には、分子は活性になるためにその特異的部位で開裂されなければならず、これを行う酵素の活性を阻害する薬物のスクリーニングが望まれるであろう。本明細書に記載の技術を、この目的のために以下で記載のように使用することができる：
以下に記載したものはこの技術の実行に有用である：Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｄｉｓｔｅｆａｎｏは、光励起性交差結合部分で修飾されたファルネシルピロフォスフェート基が、酵母ＦＰＴによりＲＡＳ由来のペプチドモチーフに添加できることを報告している（Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ　Ｒ．ａｎｄ　Ｄｉｓｔｅｆａｎｏ　Ｍ．（１９９７）．Ｐｈｏｔｏａｆｆｉｎｉｔｙ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｏｆ　ｙｅａｓｔ　ｆａｒｎｅｓｙｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ａｎｄ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｓｙｓｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ＲＡＳ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ　ａ　ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖｅ　ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２３５，３７７−３８２）。彼らの目的は、このアッセイを使用して、２つを交差結合することにより、ファルネシル誘導体がＦＰＴにより認識されることを示すことであった。この発見は、酵素活性または特異性を妨害せずにピロフォスフェートから離れた末端で、ファルネシルまたはゲラニル部分をビオチンで修飾することができるという概念と一致する。
【００９４】
図１０では、既知の結合パートナー（ＢＰ１）がある分子１２２に、酵素開裂部位（ＥＣＳ）１１０が１つの末端１１２で連結することができる。他の末端１１４では、それがＳＡＭ（ＨＳ−Ｒ−Ｘ）に取り込まれてもよい分子１１６に連結していてもよく、ここでＳは硫黄であり、ＲはＳＡＭに取り込まれることができる分子種であり、そしてＸはリンカーである。得られた分子は、電子的シグナルを送達できる基１１８（ＨＳ−Ｒ−ＸＭ）（または電極に近くに引き寄せられたとき、電子的または電気化学的シグナルを変換することができる他の基）と共にコロイド１１６上でＳＡＭｓに組み込まれてもよく、ここでＭは酸化還元‐活性金属もしくは遷移金属である。磁気ビーズまたは粒子１２０は、相互標的分子（ＢＰ３）に同時に結合することにより直接的、または間接的のいずれかにより、ＢＰ１　１２２に結合する分子１２４（たとえばストレプトアビジン）（ＢＰ２）を提示するように誘導体化されてもよい。
【００９５】
たとえば、電子的または電気化学的シグナル伝達コロイド１１６は、酵素開裂部位（ＥＣＳ）を持ち、およびビオチンで停止したチオールにより誘導体化されてもよい。磁気ビーズはストレプトアビジンにより誘導体化されてもよい。磁気ビーズおよびシグナル伝達コロイドは関心のある酵素および薬物候補と共にインキュベートしてもよい。薬物候補が酵素作用を調節するか、または阻害する場合、（たとえば、タンパク質またはペプチドの）部位は開裂されず、そしてシグナル伝達コロイドはビオチン／ストレプトアビジン相互作用により磁気ビーズに連結するであろう。複合体が磁気的に感知電極に連結するとき、結果として電流ピークが発生し、アッセイはシグナルの増加検出アッセイになる。すなわち、タンパク質は１つの末端でのＳＡＭ‐形成種、およびビーズ１２０上に固定化された結合パートナー２４に結合可能な結合パートナー１２２を介してコロイド１１６およびビーズ１２０の両方に結合するように適合してもよく、そして開裂またはその調節がモニターされてもよい。タンパク質は記載されたものを含む各種の方法でコロイドおよびビーズに結合してもよいか、または、さらにコロイドが金属を配位結合するキレートを提示してもよく、タンパク質が金属結合タグにより提供されていてもよい。本発明はさらにいっそう一般化され、そこにおいてコロイド粒子１１６およびいずれかの非コロイド構造、たとえばビーズ１２０の両方への結合に適合したいずれかの実体が、実体を開裂する能力を有する酵素、および酵素活性を低下させる候補薬物の両方の存在下で、コロイドおよび非コロイド構造に提示され、そしてそこに結合してもよい。非コロイド構造は図解したようにビーズであってもよく、または電極自体であってもよい。
【００９６】
ＢＰ１はＢＰ２および／またはＢＰ３と同じであってもよい。たとえば、ＥＣＳおよびＢＰ１（ビオチン）を持つチオールは、遊離ストレプトアビジン（ＢＰ３）、次に磁気ビーズ上のビオチン（ＢＰ２）に結合してもよい。あるいは、標的分子に分子の基を添加する酵素を阻害または促進しようとしてもよい、すなわちコロイド粒子および非コロイド構造を、非コロイド構造への結合に適合した酵素の基質、粒子への結合に適合した酵素活性により基質に結合可能な分子種、および基質に対する酵素に暴露してもよい。このことはさらに、酵素の活性調節のための候補薬物の存在下で行ってもよく、非コロイド構造は固定化された電気活性実体を持つコロイド粒子を持つ磁気ビーズであってもよい。あるいは、非コロイド構造は電極表面であってもよい。
【００９７】
具体的には、図１１では、そのような場合、電子的または電気化学的シグナル伝達コロイド１２６は、キレート／金属／金属結合タグ結合によって、基が添加される分子１２８により誘導体化される。添加される小片、添加分子１３０は第１の結合パートナー（ＢＰ１）１３２（ビオチンであってもよい）により停止する。磁気ビーズ１２は、ＢＰ１の結合パートナー（ＢＰ２）１３４（ストレプトアビジンであってもよい）を提示する。コロイド、磁気ビーズ、添加分子、関心のある酵素および薬物候補をインキュベートし、その後分析のために電極に引き寄せる。対照に比較したシグナルの損失は、薬物候補が酵素活性を阻害することを示し、一方シグナルの増加は薬物により亢進した酵素の活性を示す。
【００９８】
本発明に従って、電極、コロイド粒子などのようなアーティクルの表面で結合パートナー、シグナル伝達実体などのような所望する種を提示するために、各種のＳＡＭｓをさまざまな種類の表面上で使用することができる。当業者は、さまざまな種類の表面、官能基、スペーサー部分などの中から選択することができる。例示的な説明は、米国特許第５，６２０，８５０号に見出すことができる。また、この米国特許はニトリロトリ酢酸、２，２′−ビス（サリシリデンアミノ）−６，６′−デメチルジフェニル、および１，８−ビス（ａ−ピリジル）−３，６−ジチアオクタンなどを含む、使用することができる各種金属結合タグについて説明する。
【００９９】
ビーズを含む各種非コロイド構造は先に記載される。ビーズはポリマー材料、アガロース、テンタゲル、および／または磁気材料を含むことができる。ポリスチレンビーズは非常に有用である。本発明のこれらおよび他の態様の効用および利点は、以下の実施例により十分に理解されるであろう。以下の実施例は本発明の利点を説明することを意図するが、本発明の完全な範囲を例証しない。
【０１００】
以下の実施例および実験は、本発明の具体的な態様を説明し、本発明がいずれか特定の態様に限定されると解釈すべきではない。
以下に記載の態様のいくつかにおいて、実施例はＳＡＭ形成、コラーゲン被覆、細胞増殖、コロイド形成、および交流ボルタンメトリー（ＡＣＶ）を含む。ＳＡＭ形成のために、顕微鏡用ガラススライドはＴｉの層、次にＡｕの層で覆った。それぞれの電極はＲＴで０．５時間、１０％メチル停止チオール（ＨＳ−（ＣＨ２）１５ＣＨ３）、４０％トリ−エチレングリコ−ル停止チオール、ＨＳ（ＣＨ２）１１（ＣＨ２ＣＨ２）３ＯＨ、（式）および５０％ＭＦ−１を含有する、３００μｌのＤＭＦ溶液でインキュベートした。その後、チップを含むシンチレーションバイアルに４００μＭ　トリ−エチレングリコ−ル停止チオール２ｍｌを添加し、バイアルは以下の様に水浴中で熱サイクルにかけた：２分間＠５５℃；２分間＠３７℃；１分間＠５５℃；２分間＠３７℃続いてＲＴで１０分間。その後電極はＥｔＯＨに浸し、続いて滅菌ＰＢＳで洗浄した。それらは、生物学的安全性キャビネット中でＬＴＶ殺菌灯下に１時間置き、滅菌を確実にした。
【０１０１】
コラーゲン被覆のために、ＰＢＳ中の０．００５ｍｇ／ｍｌ　コラーゲンの２００μＬ液滴をそれぞれの電極に添加し、４℃で２時間インキュベートした。
細胞増殖のために、電極を細胞増殖フラスコに入れ、培養培地および特定の細胞表面受容体αＶβ３を提示するヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）の溶液を添加した。電極および細胞含有溶液はＣＯ２インキュベータ内で２４時間、３７℃でインキュベートした。１００倍の倍率による肉眼検査は、細胞が電極に接着し、増殖の表現型であるウェブ様の広がりを示したことを示した。
【０１０２】
コロイド製造のために、市販の金コロイド（Ａｕｒｏ　Ｄｙｅ）１．５ｍｌをで微少遠心管中で高速で１０分間遠心分離し、ペレットにした。ペレットは保存用バッファー（クエン酸ナトリウムおよびｔｗｅｅｎ‐２０）１００μＬに再懸濁した。９０μＭ　ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）‐チオール、９０μＭ　フェロセン‐チオール、および５００μＭカルボキシ停止チオールを含有するジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液１００μＬ。そのチオール溶液中で３時間インキュベーション後、コロイドをペレットにし、上清を捨てた。それらをＤＭＦ中の４００μＭ　トリ−エチレングリコ−ル停止チオール１００μＬ中で、２分間、５５℃；２分間、３７℃；１分間、５５℃；２分間、３７℃、続いて室温で１０分間インキュベートした。コロイドはその後ペレットにし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１００μＬを添加した。コロイドは次にコロイド保存用緩衝液中の１８０μＭ　ＮｉＳＯ４で１：１に希釈した。ＰＢＳ中の１００μＭのＨｉｓ‐タグ標識ペプチド　１００μＬを、コロイドを提示するＮＴＡ‐Ｎｉ（ＩＩ）１００μＬに添加し、０．５時間インキュベートした。遊離の非結合ペプチドを取り除くために、その後コロイドをペレットにし、上清を捨てた。コロイドペレットは１００μＬ　ＰＢＳに再懸濁した。コロイドは以下のいずれかに結合した：ａ）αＶβ３受容体に結合するように設計されたペプチド、ＨＨＨＨＨＨ（Ｓ４Ｇ１）３ＧＲＧＤＳＧＲＧＤＳ；またはｂ）不適切なペプチド、ＨＨＨＨＨＨ‐グルタチオンＳ‐トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）。ＲＧＤモチーフを含むペプチドは内皮細胞上のαＶβ３受容体に結合することが示されている。ビトロネクチン（αＶβ３の天然のリガンド）中のＲＧＤモチーフが相互作用に関与すると考えられている。
【０１０３】
ＡＣＶ分析は、ＣＨ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎａｌｙｚｅｒを使用して行われた。３電極系が使用された。銀対塩化銀参照電極を白金補助電極とともに使用した。誘導体化された金被覆チップを作用電極として使用した。２５ｍＶの過電位が１０Ｈｚの周波数で電極に適用された。
【０１０４】
【実施例】
実施例１
この実施例はファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ（ＦＲＴ）およびゲラニルゲラニルタンパク質トランスフェラーゼ（ＧＧＰＴ）の阻害剤のスクリーニングのためのアッセイを記載する。
【０１０５】
本発明者らは以下のことを容易に多重化できるアッセイを考案している：１）初期スクリーニング工程に野生型標的タンパク質および変異体を組み入れる；２）関心のある酵素によるファルネシル／ゲラニル基およびそれらの類似体の標的タンパク質への添加を直接検出し、定量する；および３）酵素活性に対する薬物候補の異なる作用を検出できる。本発明者らの研究方法は以下のとおりである：１）ＮＴＡ／Ｎｉ（ＩＩ）基（ヒスチジンタグ標識タンパク質を捕捉するため）および電子的または電気化学的シグナル伝達のためにフェロセンのような遷移金属の両方を提示するＳＡＭｓを持つコロイドにヒスチジンタグ標識ＲＡＳタンパク質（または各種変異体由来のペプチドモチーフもしくはフラグメント）を結合させる；２）ビオチンでファルネシルピロフォスフェート誘導体を修飾する（図１３）；３）酵素を添加する；４）候補阻害剤を添加する；５）ストレプトアビジンをもつ磁気ビーズを添加する；６）感知電極に磁気的に引き寄せ、電子的に分析する。酵素ＦＰＴは、シグナル伝達コロイド上に固定化されたＲＡＳにビオチン化ファルネシル（またはゲラニル）部分を添加するだろう。ストレプトアビジンをもつ磁気ビーズはビオチンに結合し、その複合体は補充も検出も可能であろう。アッセイは、微小電極アレイと接続したマイクロウェル中で、シグナル伝達コロイド上に固定化されたＲＡＳ変異体および薬物候補を変えて、並行して行われるであろう（図１４および１５）。微小電極アレイの全体は、特定の標的タンパク質のための酵素活性に対する薬物候補の異なる作用を測定するために電子的に分析されるであろう。薬物候補が標的変異体タンパク質にファルネシル基を添加する酵素を妨害する場合、結果として電子的または電気化学的シグナルが減少するであろう。
【０１０６】
この研究方法は酵素の活性をモニターするか、またはその活性を調節する薬物のスクリーニングに使用することができる。また、非ヒスチジンタグ標識タンパク質は標準カップリング化学によりシグナル伝達コロイドに結合することができる。あるいは、ファルネシル誘導体は、磁気ビーズ上に固定化された基の結合パートナーである、ビオチン以外の認識基により修飾されてもよい。
【０１０７】
ＥｄｅｌｓｔｅｉｎおよびＤｉｓｔｅｆａｎｏは、光励起性交差結合部分で修飾されたファルネシルピロフォスフェート基が、酵母ＦＰＴによりＲＡＳ由来のペプチドモチーフに添加できることを報告している（Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ　Ｒ．ａｎｄ　Ｄｉｓｔｅｆａｎｏ　Ｍ．（１９９７）．Ｐｈｏｔｏａｆｆｉｎｉｔｙ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｏｆ　ｙｅａｓｔ　ｆａｒｎｅｓｙｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ａｎｄ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ＲＡＳ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ　ａ　ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖｅ　ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２３５，３７７−３８２）。彼らの目的は、ファルネシル誘導体がＦＰＴと交差結合することにより、ＦＰＴにより認識されることを示すためにこのアッセイを使用することであった。この発見は、酵素活性または特異性を妨害することなしに、ピロフォスフェートから離れた末端でファルネシルまたはゲラニル部分がビオチンで修飾できるという概念と一致する。
【０１０８】
実施例２
この実施例では、細胞をＳＡＭｓにより誘導体化された金被覆電極に連結させた。電極に連結したままの細胞は次に、金コロイドを含む溶液と共にインキュベートし、それらのコロイドは、細胞表面上の受容体に特異的なリガンドおよび電子的または電気化学的シグナルを電極に送達することができる酸化還元‐活性金属を共に提示するように誘導体化されていた。多少のインキュベーション時間の後、電極は交流ボルタンメトリー（ＡＣＶ）により読みとった。コロイド結合リガンドおよび細胞表面受容体間の正の相互作用が、同様にコロイド上にある酸化還元‐活性金属を電極の十分近くに引き寄せ、電子的または電気化学的シグナルを変換するであろう。
【０１０９】
より具体的には、電極への電子の流れを容易にするために、電極は５０％ビス（エチルフェニルチオール）（すなわち、Ｃ１６Ｈ１０Ｓ）のバックグラウンド中で１０％メチル頭基を提示するようにＳＡＭｓにより誘導体化された。４０％トリエチレングリコール停止チオール（ＨＳ（ＣＨ２）１１（ＣＨ２ＣＨ２）３ＯＨ）が単分子層の充填を促進するために包含された。細胞増殖がコラーゲンで被覆されたＨＳＣ１５‐メチル停止ＳＡＭｓ上で維持できることは以前に示されていた。ＨＳＣＨ２Ｃ１５ＣＨ３およびコラーゲンは共に絶縁分子であり、電極への電子の流れを阻害することができる。このため、本実施例では、飽和炭素鎖‐コラーゲン被覆度を低下させ、より伝導性の分子ワイヤに隣接した増殖細胞の島状構造を生じた。細胞表面受容体αＶβ３を提示する、血管新生に重要なヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）は電極上で増殖した。受容体のリガンドおよび電子的または電気化学的シグナル伝達のためのフェロセン部分を持つＳＡＭ‐被覆金コロイドは細胞提示電極としばらくインキュベートし、その後ＡＣＶにより分析した。
【０１１０】
ＡＣＶ分析のために、１ｍｌ容量のシリコンガスケットを細胞提示電極上に固定した。Ｈｉｓタグ標識ＲＧＤモチーフペプチドを前もって結合させたＮＴＡ‐Ｎｉコロイド　１００μｌおよび１００μｌ　ＰＢＳを細胞提示電極と共にインキュベーションするためにガスケットに添加した。１５分後、初めのＡＣＶスキャンが記録された。１５分間隔で２つの連続したスキャンが記録された。電流出力は電圧に対してプロットされた。初めのスキャンはＰＢＳバッファーに特徴的な広幅の電流バルジを生じた。第２および第３のスキャンは、特徴的なフェロセン電位（７８０ｍＶｏｌｔｓ）においてそれぞれ０．５μＡｍｐｓおよび１．６μＡｍｐｓの異なる電流ピークを発生した、図１６を参照されたい。Ｈｉｓタグ標識ＧＳＴが予め結合したＮＴＡ‐Ｎｉ（ＩＩ）コロイド　１００μＬと共に同じ細胞を提示する同一の電極をインキュベートした陰性対照は、ＲＧＤ‐提示コロイドと共にインキュベートした電極に類似した第１のスキャンを生じた。しかし広幅のバルジは、第２および第３のスキャンで減衰し、同一であった（図１７）。陽性対照の１．６μＡｍｐｓのピークと明らかに異なり、陰性対照では鮮明なピークは見られなかった。
【０１１１】
実施例３：伝導性表面上の細胞増殖
この実施例では、コラーゲンで被覆されていない“伝導性”表面上での細胞増殖の電子的検出について記載する。細胞は、いくつかの場合には単分子層に構築されるが、コラーゲンでは被覆されなかった硫黄含有分子で修飾された金電極上で増殖させた。１００％候補薬物と共にインキュベートした電極がトリ‐エチレングリコール停止チオール中で循環加熱されないことを除いて、電極修飾は実施例２の電極製造部分に記載したように行われた。いくつかの電極を同じ細胞増殖フラスコ中に集め、ＨＵＶＥＣ細胞を含む培地を添加した。電極および細胞はＣＯ２インキュベータ中で２４時間インキュベートした。表面は１００倍の倍率を使用して視覚的に分析した。表１は、表面修飾およびその後の細胞接着／増殖の特徴を記載する。表面は低い非特異的結合を示した。しかし、ひとたび細胞が結合すると、細胞増殖は十分であった。ＳＡＭを介して金属を配位結合する金属キレートを提示しタンパク質上の金属結合タグによってＳＡＭにタンパク質を結合し、タンパク質が細胞を引き寄せることにより、細胞をＳＡＭ上に容易に固定化することができる。結果を実証するために写真を撮影した（示していない）。細胞は、フェロセン部分および細胞表面のαＶβ３受容体に特異的な、ペプチド、ＨＨＨＨＨＨ（Ｓ４Ｇ１）３ＧＲＧＤＳＧＲＧＤＳ；または陰性対照としての、不適切なペプチド、ＨＨＨＨＨＨ‐グルタチオンＳ‐トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を提示するコロイド（先に記載）と共にインキュベートした。図１８は、１００％　エチニルフェニルチオール（ＭＦ１）ＳＡＭ‐被覆電極上で増殖した細胞を、αＶβ３受容体に特異的なリガンドを持つコロイドと共にインキュベートしたとき（図１８、実線）だけ電流ピークを生じ、不適切なペプチドＧＳＴにより誘導体化されたコロイドと共にインキュベートしたとき（図１８、点線）は生じなかったということを示す。
【０１１２】
図１９は、絶縁トリ‐エチレングリコール停止チオールのバックグラウンド中で２５％　２−メルカプトエチルエーテルにより誘導体化された電極の電気化学的スキャンを示す。ＲＧＤ配列ペプチドを提示するコロイドで誘導体化された細胞は小ピークを生じ（図１９、実線）、一方ＧＳＴペプチドを提示するコロイドと共にインキュベートした細胞はピークを生じなかった（図１９、点線）。
【０１１３】
【表１】
2004512497.tif 000003
【０１１４】
実施例４：グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン結合を介したコロイド粒子によるポリマービーズの修飾
図２０および２１を参照されたい。以下の実施例は、標的タンパク質の結合パートナーである小分子、薬物候補、ペプチド、タンパク質、核酸、またはそれらの組合せを提示する非コロイド粒子上に、標的タンパク質を提示するコロイドがどのように凝集するかを説明する。多くのコンビナトリアル薬物ライブラリーは非コロイド粒子またはビーズ上で合成され、医学的に適切な標的種を表示するコロイド粒子と混合することができる。標的種の結合パートナーである薬物を表示するビーズは容易に同定することができる、なぜなら、コロイド粒子がそのビーズ上に凝集し、それを赤く着色するからである。
【０１１５】
標的タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）はヒスチジンタグ標識され、そしてＮＴＡ‐Ｎｉ（ヒスチジンタグ標識はＮＴＡ‐Ｎｉに結合する）を提示するＳＡＭ‐被覆コロイド上に固定化された。表面上に４０μＭ　ＮＴＡ‐Ｎｉを提示するコロイド　３０μｌを２１．５μＭ　ＧＳＴ　６５μｌに添加し、溶液中のＧＳＴ最終濃度を１４μＭとした。ＧＳＴを結合する小分子グルタチオンは、アガロースビーズに結合したものをＳｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈから入手できる。グルタチオン被覆ビーズは、ＧＳＴ‐結合コロイドの溶液とともにインキュベートした。数分位内に、ＧＳＴはグルタチオンビーズに結合し、着色コロイドを溶液から除去し、ビーズを赤く修飾した（図２０）。ＧＳＴに結合しない、小分子を表示するビーズは、ＧＳＴ結合コロイドとインキュベートしたとき、無色のままであった（図２１）。第２の陰性対照（その中でグルタチオン被覆ビーズをＧＳＴ非存在下でＮＴＡ‐Ｎｉコロイド　３０μｌとインキュベートした）は、ＮＴＡ‐Ｎｉコロイドがビーズ表面に、またはグルタチオンに非特異的に結合しないことを示した。
【０１１６】
実施例５：ＳＡＭの電子透過性の制御の実例
この実施例は、促進された電子的連絡を含むＳＡＭを形成する能力を示す。ＳＡＭは、第１の堅く詰まる種および、電子的連絡に対するＳＡＭの透過性を高める、異なる分子構造の第２の種の混合物を含んで表面上で形成される。表面が暴露された流体が表面と電気的に連絡できるように、欠陥、または開口部がＳＡＭ中に形成される。具体的には、全体としてＳＡＭに関して破壊的な構造を有する硫黄含有小分子が安定してＳＡＭに取り込まれ、電子に対する透過性亢進が示された。この実施例は、表面を電気的に比較的伝導性にし、およびその後、細胞増殖を支持できることを示す。
【０１１７】
水溶性フェロセン誘導体は電解質溶液：５００μＭ　ＮａＣｌＯ４中のフェロセンジカルボン酸の１００ｍＭ溶液、に溶解した。作用電極は、異なる量の２−単位分子ワイヤ（ＭＦ１）を含むＳＡＭにより誘導体化された金被覆電極であった。特徴的なフェロセン電位でのピークの高さを分子ワイヤ密度の関数としてプロットした。陰性対照として、金被覆電極は１００％　トリ‐エチレングリコール停止チオールからなる絶縁ＳＡＭで誘導体化した。図２２は、ＳＡＭの“伝導性”、または溶液中の電子がＳＡＭに侵入する能力が、ＳＡＭに統合された２−単位分子ワイヤの密度の関数であることを示す。この系は、一連の硫黄含有化合物で修飾された電極の伝導性を試験するために使用された。５０％　候補薬物および５０％　トリ‐エチレングリコール停止チオールにおいて、化合物をＤＭＦ中に溶解した。電極は実施例１に記載のように誘導体化した。表２は、ＡＣＶにより分析したときの、候補薬物および生じた電流ピークの高さを表にする。図２２は、ポリ（エチニルフェニルチオール）による単分子層破壊の関数としての、単分子層の伝導性試験の２つの実験結果を示す。
【０１１８】
ＳＡＭｓは、ＤＭＦ中の５００μＭ　トリエチレングリコール停止チオールおよび５００μＭのメルカプトベンゾチアゾールまたは２−メルカプトエチルエーテルのいずれかから、金チップ上で形成された。チップは平らな表面と１ｍｌ　容量のシリコンガスケット間に固定された。フェロセンジカルボン酸溶液は、５００μＭのＮａＣｌＯ４中に溶解し、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極およびＰｔ補助電極とともにシリコンガスケット中に入れた。金チップは作用電極に結合した。系はＡＣＶにより分析した。溶液中のフェロセンが電極と電気的に連絡することにより得られた電流ピークの大きさは、電極と連絡するＳＡＭ内に欠陥を作製することにより、ＳＡＭの電子流への透過性を高める試験化合物の能力の指標であった。図２３は、単に絶縁種トリ‐エチレングリコール停止（ＣＨ２）１１−ＳＨ（＋＋＋線）および、報告によれば伝導性が亢進した、ポリ‐エチニルフェニルチオール種（ＭＦ１）（実線）を単独で包含するＳＡＭのオーバーレイである。伝導性ポリ‐エチニルフェニルチオール種はより伝導性であると予想される、なぜなら、同一の分子で２つの付加的な反復単位を持つものは伝導性であると報告されているからである（Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９９７　Ｂｕｍｍ　ｅｔ　ａｌ．，）。予測したように、アルキルチオールＳＡＭは、フェロセンジカルボン酸溶液中で電流ピークを生じないが、５０％　ポリ‐エチニルフェニルチオールからなるＳＡＭはそれを生じる。図２４は、２−メルカプトエチルエーテル（実線）およびメルカプトベンゾチアゾール（＋＋＋線）を含む伝導性が亢進したＳＡＭｓに対する図２３のプロット（点はＴＥＧ停止チオール、星印はポリ‐エチニルフェニルチオールである）を示し、ポリ‐エチニルフェニルＳＡＭ由来の電流ピークは、５０％　２−メルカプトエチルエーテルを包含するＳＡＭｓ、または５０％　メルカプトベンゾチアゾールを包含するＳＡＭにより発生するピークより桁違いに小さいことを示し、ＳＡＭに伝導性種を取り込むことによるか、またはＳＡＭに“欠陥”または“開口”分子を挿入することにより、ＳＡＭｓが電子流に透過性になるという概念に一致する。
【０１１９】
表２．電極は、トリ‐エチレングリコール停止チオールバックグラウンド中で以下の化合物により誘導体化された。電極製造は、実施例１に記載のように行われた。表面の“伝導性”または透過性は、電解質溶液（０．５Ｍ　ＮａＣｌＯ４）中のフェロセンジカルボン酸の酸化／還元により生じた電流ピークの大きさを測定することによりアッセイした。非特異的結合に抵抗するそれぞれの化合物の能力は、測定前にＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）にそれぞれの表面を浸すことによりアッセイした。非特異的に吸着されたタンパク質は、単分子層から電極への電子の伝導を妨げるであろう。
【０１２０】
【表２】
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【０１２１】
実施例６：タンパク質‐タンパク質相互作用の検出
この実施例は、固定化されたシグナル伝達実体および固定化されたタンパク質を有するコロイド粒子の有用性を示す（図２７参照）。
【０１２２】
ヒスチジンタグ標識グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ‐Ｈｉｓ）は、４０μＭ　ＮＴＡ‐Ｎｉおよび１００μＭフェロセンチオールを表示する、ＮＴＡ‐ＳＡＭ‐被覆コロイドに連結させた。プロテインＡを提示する市販の磁気ビーズは、抗‐ＧＳＴ抗体により１／１０の結合容量に被覆し、１：５の比でＧＳＴ‐コロイドに添加し、そして磁石の頂部に置いた５０％　ＭＦ‐１　ＳＡＭ被覆電極上で測定した。磁石は電極表面に磁気ビーズを引き寄せ、厚い、可視の沈殿物を形成した。ＧＳＴ‐コロイドは磁気ビーズ上のＧＳＴ抗体と相互作用し、電極表面に引き寄せられ、約２８０ｍＶにおいて電流ピークを生じた。２つの陰性対照、ＧＳＴがコロイド表面に結合しない対照、およびＧＳＴ抗体が磁気ビーズに結合しない他の一つの対照を使用した。いずれの陰性対照も電流ピークを生じなかった。図２５はこの実例の結果をプロットする。実線は、ＧＳＴ‐Ｈｉｓ‐提示コロイドおよび磁気ビーズ上の抗‐ＧＳＴ／Ａｂ間の相互作用を表す。○はＧＳＴを提示しないコロイドとインキュベートした抗体を提示する磁気ビーズを表す。●はＧＳＴを提示するコロイドとインキュベートした抗体を提示しないビーズを表す。
【０１２３】
実施例７：細胞検出
この実施例は、ＳＡＭを横切る電気的連絡を高める分子種を含む混合物を含み、ＳＡＭに欠陥を形成することにより、表面が暴露された流体が表面と電気的に連絡できる表面上のＳＡＭを形成する利点、および固定化されたシグナル伝達実体を持つコロイドのタンパク質への連結の有用性を共に説明する。タンパク質は次にはＳＡＭを提示する電極の表面に連結した細胞に固定化される。この場合の欠陥は、フェニル環を含むＳＡＭに組み込まれた分子のバルクにより生じる。
【０１２４】
ＨＵＶＥＣ細胞は培地に懸濁し、金表面上を被覆したＳＡＭとフラスコに入れた。ＳＡＭは、５０％　直鎖チオール、および５０％　２−単位ポリ（エチニルフェニル）チオール（ＭＦ１）を含んでいた。８．４ｍＭ　ＲＧＤ‐Ｈｉｓペプチド溶液　５μｌを培地に添加し、細胞を一晩３７度でインキュベートして電極表面に接着させた。約１６時間後、ＲＧＤ‐Ｈｉｓペプチドを捕捉するためのＮＴＡおよびシグナル伝達のためのフェロセンを提示するＳＡＭ‐被覆コロイド　１００μｌを細胞に添加し、室温で２０分間インキュベートした。次に電極をバッファーで洗浄し、どのような非結合コロイドも洗い流して、測定した。電流ピークは２００〜２５０ｍＶで記録した。陰性対照は、細胞に結合できない不適切なタンパク質、Ｈｉｓ‐ＧＳＴと共にインキュベートした細胞であった。コロイドを陰性対照に添加し、電極をバッファーで洗浄し、測定を行った。陰性対照ではピークは全く見られなかった。図２６は、フェロセンシグナル伝達実体および細胞表面受容体に対するｈｉｓタグ標識リガンドを提示するコロイドが、細胞／表面相互作用により電極表面に運ばれたときに、発生したピーク（実線）を示す。菱形は陰性対照を表し、コロイドは細胞表面受容体に結合しないように選択された不適切なタンパク質を提示した。
【０１２５】
実施例８：非修飾リガンドに対するリガンド‐受容体相互作用の検出
この実施例は、タンパク質またはリガンドのいずれも標識せずに、ＳＰＲの非存在下で、タンパク質／リガンド相互作用を測定するための能力を示す。具体的には、電極表面上にリガンドおよびフェロセンを含むＳＡＭを形成することにより、リガンドと相互作用すると推定されるタンパク質にリガンドを暴露すること、ここでリガンドは、その電気活性シグナルがタンパク質への接近度に依存する電気活性実体、すなわちフェロセンと一定の接近関係にある。
【０１２６】
本発明者らは、フェロセン誘導体の特徴的な酸化電位はフェロセン誘導体の局所環境の化学的性質に基づいてシフトされてもよいことを見出している。タンパク質はフェロセン誘導体の近くに運ばれるため、変化した電位において第２の電流ピークが現れる。この変化したピークの大きさは系のタンパク質の密度に比例する。
【０１２７】
一連の金‐被覆電極は、トリ‐エチレングリコール停止チオールバックグラウンド中で一定密度の伝導性分子ワイヤチオールおよび可変密度のメチル停止チオールを含む、異種のＳＡＭにより誘導体化された。以下のことは以前に示されている：１）トリ‐エチレングリコール停止ＳＡＭｓはタンパク質の非特異的吸着に抵抗する；および２）メチル停止ＳＡＭｓはタンパク質、特にコラーゲンに結合する。したがって、電極を溶液中のコラーゲンと共にインキュベートする場合、非特異的に吸着するコラーゲンの密度はメチル停止チオールの密度が増大するにつれて増大するであろうと考えた。２％、４％、１０％および１５％メチル停止チオールを含むＳＡＭｓが金被覆電極上に形成された。電極の半分はＰＢＳ中の０．００５ｍｇ／ｍｌ　コラーゲンと共に４℃で２時間インキュベートし、他の半分はＰＢＳのみとインキュベートした。電極は、電解質溶液（０．５Ｍ　ＮａＣｌＯ４）に溶解した水溶性フェロセン誘導体、フェロセンジカルボン酸と共に交流ボルタンメトリー（ＡＣＶ）により分析した。特徴的な電位におけるフェロセンの交互の酸化／還元が電流ピークを生み出す。この電流ピークの大きさおよびそれが発生する電位が記録された。低密度メチル停止チオールでは、電流ピークは約４５０ｍＶで発生した；その大きさおよび位置はタンパク質、コラーゲンの存在により影響されないと考えられた。１０％以上の高密度のメチル停止チオールでは、タンパク質コラーゲンの存在下でのみ、第２の電流ピークが約３００ｍＶで生じる。図２８は、フェロセンジカルボン酸の存在下における高密度メチル停止チオール電極を示す。実線は、メチルチオールに結合したコラーゲンを持つ電極を表す。電極表面上のコラーゲンにより生み出された疎水性の環境は、フェロセンの酸化電位をシフトさせ、２つのピークが見られる。黒丸はコラーゲンに結合していない高密度メチル停止チオール電極を表し、したがってフェロセンの酸化に影響を与えない。
【０１２８】
この研究方法は、非修飾タンパク質、ペプチド、細胞の存在を検出するために以下のように使用することができる：混合ＳＡＭはアルキルチオールに連結したフェロセンジカルボン酸ＳＡＭを電子流について透過性にするチオールおよび標的種の結合パートナー（結合パートナーは、ヒスチジンタグ標識され、ＳＡＭ中のＮＴＡ‐Ｎｉ部分への結合により電極に結合していてもよい）で停止するチオールから形成される。標的種が試料溶液中に存在する場合、それはＳＡＭ上に提示されているその結合パートナーに結合する。ＳＡＭ表面の近くのタンパク質の存在は、フェロセンジカルボン酸のまわりの化学的環境を変化させ、その酸化電位をより低い電位側にシフトさせる。固定化された酸化還元‐活性金属の特徴的な酸化電位のシフトが標的種の存在を示す。
【０１２９】
これらの実験が環上に極性置換基を持たないフェロセン誘導体により行われると、作用は全く観察されなかった。したがって、この研究方法が機能するには、固定化された酸化還元‐活性金属が極性環境中にあり、固定化された結合パートナー（チオールによりＳＡＭに結合された）ができるだけ小さいことが極めて重要である。
【０１３０】
実施例９：ＥＬＩＳＡ
分子または細胞生物学の技術者によく知られた技術は酵素結合免役吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ　２，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１１．２，１９９６，著作権所有者Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ　Ｉｎｃ．１９９４−１９９８）である。ＥＬＩＳＡに伴う重要な問題は感度である。酵素シグナル伝達は１：１の比で起こる；１抗体に結合した酵素は、１抗原の存在をシグナル伝達する。したがって、抗原のマイクログラム量が効果的なＥＬＩＳＡに必要であるが、すべての場合に妥当ではない。このことから、低レベルで発現されるか、または提示される細胞表面上の抗原の検出にはＥＬＩＳＡは適さない。ＥＬＩＳＡに伴う別の問題は、低い抗原濃度では、アッセイに非常に時間がかかることである。酵素加水分解の量は、加水分解の時間に直接比例する。一般にＥＬＩＳＡを行う場合、標的種はプラスチック支持層に直接的にか、または間接的に連結させる。次に固定化された種の存在は、同様にシグナル伝達能力を有する“第２”の抗体がそれに結合することにより検出される；第２の抗体は、典型的にはホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）といった酵素、または添加された基質上で結果として色が変化する反応（分光光度計により検出される）を行うことができる蛍光タグ、もしくは蛍光計により検出できる蛍光標識タグに通常は結合されている（たとえば、“Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｐａｓｓｉｖｅｌｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｈｕｍａｎ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｏ　ｈｅｒｐｅｓ　ｓｉｍｐｌｅｘ　ｖｉｒｕｓ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄ　ｔｏ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｎｅｒｖｅ　ｆｉｂｅｒｓ　ａｎｄ　ｓｅｎｓｏｒｙ　ｎｅｕｒｏｎｓ　ｉｎ　ｖｉｖｏ”，Ｓａｎｎａ　ＰＰ，Ｄｅｅｒｉｎｃｋ　ＴＪ，ａｎｄ　Ｅｌｌｉｓｍａｎ　ＭＨ，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　Ｏｃｔ．Ｖｏｌ　７３（１０８８１７−２３）を参照されたい）。多くの場合、便宜上すべての抗体が酵素に結合する必要がないように、マウス抗体を特異的認識抗体として使用し、その後酵素結合ウサギ‐抗マウス抗体を添加する。
【０１３１】
本明細書に記載の技術を使用して、ＥＬＩＳＡの感度を非常に高め、そしてプローブ分子として天然のリガンド（タンパク質もしくはペプチド）または薬物候補を使用して固定化された標的種の存在を検出することができる。固定化された種の存在は、複数のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）をも提示するコロイドに結合したリガンドをそれに結合することにより検出する。酵素は、酵素に直接連結したヒスチジンタグを含む各種の手段により、またはヒスチジンタグ標識プロテインＧを介してコロイドに結合するヤギ抗体に、マウス‐抗ヤギ酵素結合抗体を結合することにより、コロイドに好都合に結合することができる（Ａｋｅｒｓｔｏｍ，Ｂ．，Ｎｉｅｌｓｏｎ，Ｅ．，Ｂｊｏｒｃｋ，Ｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７　Ｏｃｔ．５　Ｖｏｌ．２６２（２８）；ｐｇｓ．１３３８８−９１　ａｎｄ　Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ，Ｓ．Ｒ．，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｐ．，Ｎａｇｌｅ，Ｊ．ａｎｄ　Ｆｉｌｐｕｌａ，Ｄ．（１９８６）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ．１６７，８７０−８８０）。複数の酵素と共にコロイドに共固定化されたリガンドを第２抗体の代わりに標的種に結合することにより、結合事象に対するシグナル伝達分子の比は桁が増加する。ＥＬＩＳＡプレート上に提示された抗原へのコロイド上の１抗体またはリガンドの結合の結果、間接的に何千または何百万の酵素が結合する。あるいは、既知の種を意図的に９６‐ウェル上プレートのウェルに結合させ、それぞれがシグナル伝達酵素と共に異なる薬物候補を提示することをコロイドにより調べることができる。今のところ、現在のＥＬＩＳＡ技術ではこれを行うことは不可能である。なぜなら、それぞれの薬物候補は酵素に結合することができないからである。あるいは、固定化された標的に対する天然のリガンドが、シグナル伝達酵素と共にコロイド上に提示されてもよく、および薬物候補が相互作用を破壊するためにプレートのそれぞれのウェルに添加されてもよい。非結合コロイド、およびしたがってそれらのシグナルは洗浄工程で失われる。抗体‐またはリガンド提示コロイドの標的は、ＥＬＩＳＡプレートに直接的または間接的に（別の抗体またはリガンドにより）結合した細胞またはタンパク質であってもよい。ＥＬＩＳＡのこの修正の利点は感度だけでなく、効率にもある。数百のシグナル伝達酵素がコロイドにより１抗原に結合したままでいるため、基質加水分解がより速く起き、より少ない時間で適切な解釈が行われるであろう。
【０１３２】
実施例１０：細胞表面受容体とコロイド固定化リガンドの相互作用およびその阻害の視覚的検出
この実施例は、以下のこと除いては実施例３に記載の方法で行われた。細胞は複数ウェルプレート上で増殖させた。相互作用後、肉眼検査は、受容体が発現される細胞上の位置での、コロイドによる細胞の選択的な修飾を示した。図２９Ａでは、全く結合が起きない対照が示される。任意の配列のペプチドが使用された。図２９Ｂは、タンパク質が発現される細胞上の位置におけるコロイドによる選択的な細胞の修飾を示す。
【０１３３】
実施例１１：非特異的に固体支持体に結合した一結合パートナーとコロイドに結合した他のパートナーとの間の結合相互作用の検出
タンパク質、具体的にはストレプトアビジン（Ｐｒｏｍｅｇａ）は、非特異的に固体支持体、具体的にはＱ−セファロースに連結した。その結合パートナー、ビオチンは、コロイド粒子上の自己組織化単分子層に組み込まれたチオールに共有結合的に連結した。コロイド粒子をビーズに暴露すると、ビオチンとストレプトアビジン間の結合により固定化され、ビーズを赤く着色した。図３０Ａは、結合相互作用により修飾されたビーズ（本来、赤色）のコンピュータデジタル化顕微鏡画像の写真複写である。図３０Ｂ（対照）は、修飾されなかったビーズの同様の画像である；同様のビーズ（ストレプトアビジン‐結合）は不適切なタンパク質を提示するコロイドに暴露された。
【０１３４】
また、この実施例は、重要なことには、コロイド粒子上にビオチンを含む自己組織化単分子層について記載する。ビオチンＳＡＭｓは、以下のようにコロイド上に形成された。ＤＭＦ中に５８０μＭ　ＣＯＯＨ停止チオールおよび２０μＭビオチン停止チオールを含む溶液が作製された。チオールはＣ１１であった。コロイド製造は先に記載のように行い、記載された２０μＭビオチンおよび５８０μＭ　ＣＯＯＨチオールのＤＭＦ溶液はコロイドとともにインキュベートした。他の工程は先に記載したものと同様であった。
【０１３５】
実施例１２：単一結合事象の複数のシグナル伝達によるＥＬＩＳＡ
この実施例は以下の例外／詳細を伴って、典型的なＥＬＩＳＡと同様に行われた：洗剤および界面活性剤は洗浄工程から除かれた。ＧＳＴを、マルチウェルプレート上に固定化した。マウス抗‐ＧＳＴ抗体をウェルに添加し、ＧＳＴに結合させた。一般的な洗浄工程後、ウェルの第１セット（実験用）にヒスチジンタグ標識プロテインＧを提示するコロイドを添加し、抗‐ＧＳＴに結合させた。ウェルの第２のセット（対照）にはプロテインＧ固定化コロイドを暴露しなかった。別の一般的な洗浄工程後、すべてのウェルにホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗‐マウス抗体を暴露した。次にすべてにホースラディッシュペルオキシダーゼ基質および硫酸を暴露した。反応は、通常の方法で進行させた。プレートはマルチウェル分光光度計リーダーにより分析した。
【０１３６】
この実施例の結果は、ホースラディッシュペルオキシダーゼがコロイド粒子上の複数のＧ位置に結合するに従い、実験用ウェルが対照ウェルに比べ６桁大きいシグナル伝達をすることを示す。図３１は、この６桁の増大を示す棒グラフである。この実施例は、複数のシグナル伝達実体による、第１の生物学的または化学的作用物質の単一の結合の、第２の生物学的または化学的作用物質へのシグナル伝達を示す。複数の実体のシグナル伝達は、それらがコロイド粒子に結合するのと同時に起こる。
【０１３７】
実施例１３：コロイド表面上に提示された自己組織化単分子層への非修飾化学的または生物学的分子の連結、具体的には、コロイドへのストレプトアビジンの連結
この実施例は、カルボン酸またはその塩を提示することができる表面へのいずれかの本質的にアミンを含有する実体の連結のための技術を提供する。技術は、コロイド表面上に形成された自己組織化単分子層への連結により、コロイドに実体を連結するために使用することができる。自己組織化単分子層に連結される分子は、結合前に親和性タグなどのような、いずれかの特定の化学的官能基を含む必要がない。ただ一つの要件は、多くのアミノ酸に見出されるように、少なくとも一つの第１級アミンを含むということである。したがって技術は、表面にカルボン酸を提示するコロイドに第１級アミノ基を持つタンパク質またはペプチドを共有結合するためにとりわけ適する。
【０１３８】
コロイド上に自己組織化単分子層を形成するための技術は先に記載されている。これらの技術には、以下の具体的な詳細な説明および但し書きが付け加えられた。
【０１３９】
タンパク質はコロイド表面上のカルボキシレート（ＳＡＭによって結合）とペプチドのアミン残基間にアミド結合を形成することにより結合した。アミド結合は、修正されたＥＤＣ／ＮＨＳカップリングプロトコルの適用により形成された。カップリングの成否は、ストレプトアビジンを提示するコロイドとビオチン基を提示するコロイド（ビオチンＳＡＭを介して、先述）を混合することにより試験した。ストレプトアビジンが首尾よく結合した場合、２つの型のコロイドは凝集し、懸濁液が色を変え、最後にコロイドが沈殿して透明な溶液が残るであろう。
【０１４０】
カップリング手順に使用されるコロイドは、他に記載されたように製造し、５４０μＭ（マイクロモラー）ＣＯＯＨ停止チオール、６０μＭ　ＮＴＡ‐停止チオールを含有するチオール溶液中でのインキュベーション、およびその後の４００μＭ　エチレングリコール停止チオール中での循環加熱により形成された。ＰＢＳ中の５０μｌ　コロイドは、水中の５０μｌの１０ｍＭ　ＥＤＣ、４０ｍＭ　ＮＨＳで処理された。７分後、コロイドを遠心分離して沈殿させ、液体を除去し、その後ｐＨ６．４のリン酸バッファー中の０．１ｍｇ／ｍｌ　ストレプトアビジン　５００μｌ（マイクロリットル）に再懸濁した。１．５時間後、コロイドの未反応部位をエタノールアミンを添加することによりブロックし、そしてコロイドを遠心分離して沈殿させ、その後ｐＨ６．４のリン酸バッファー　１００μＬ中に再懸濁し、過剰な、結合しなかったストレプトアビジンを洗い流した。コロイドはその後再び遠心分離して沈殿させ、５０μｌ　ＰＢＳに再懸濁した。２０μＬ　リン酸バッファーおよび１５μｌ　ビオチン提示コロイドの混合物に、先に製造されたストレプトアビジン‐提示コロイド　１５μｌを添加した。この懸濁液を３５μｌ　リン酸バッファーおよび１５μｌ　ビオチン提示コロイドの混合物と比較した。ストレプトアビジン‐提示コロイドの添加は、赤色から青色への速やかな色の変化を引き起こした。〜１０分後、ビオチンコロイドおよびストレプトアビジンコロイドの混合物は透明になり、底に沈殿物が見られた。ビオチンコロイドを含まない混合物は視覚的な変化がなく、赤色のままであった。
【０１４１】
先に記載のプロトコルは、コロイド上の自己組織化単分子層への、アミンを含む本質的にどんな化学的または生物学的分子の結合にも適用できる。結果として凝集を起こす複数のコロイドへの結合よりむしろ、ただ一つのコロイドへの１分子の結合を確実にするために、以下の修正を適宜行ってもよい。望ましく結合した分子の濃度を維持し、そしてＥＤＣ／ＮＨＳ反応物質の濃度を維持する一方で、溶液中のコロイドの濃度を低下させてもよい。各種分子に対して当業者は、他のわずかな修正を行ってもよい。アミン‐含有分子は、当業者により選択されてもよく、そして限定はしないが、タンパク質、合成分子、ペプチド、誘導体化核酸、および他のアミンを含む誘導体化された、または天然に存在する生物学的分子を含んでいてもよい。当業者は、本発明のこの態様に従ってコロイドに連結可能にするために、多様な種がアミンまたはアミン‐含有種とともに合成されるか、またはそれらに連結してもよいことは理解するだろう。
【０１４２】
当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメータは例示的なものであって、実際のパラメータは本発明が使用される方法および装置についての具体的な用途に依存することを容易に理解するであろう。したがって、先の態様は実施例のためだけに提示されること、および添付の請求項およびそれらと同等のものの範囲内で、具体的な記載とは異なって本発明が実行されてもよいということを理解するべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は無傷細胞上のリガンドのコグネイト細胞表面受容体と相互作用するデンドリマーまたはポリマーを介して、フェロセンのような金属含有化合物に連結したリガンドを表す。
【図２】
図２は無傷細胞上のリガンドのコグネイトの受容体と相互作用する粒子に結合したリガンド、フェロセンのような金属含有化合物を表す。
【図３】
図３は、コロイド上の自己組織化単分子層に練得ｋつしたタンパク質を示し、それらは電子的または電気化学的シグナル伝達のための酸化還元‐活性金属も提示する。標的受容体を持つ細胞は、関心のある受容体に対するコグネイトリガンドを持つコロイドとインキュベートし、続いて感知電極に電気泳動的に、または磁気的に引き寄せられる。図は一定の比率に拡大したものではなく、そしてコロイドは２０の金原子から直径数百ナノメーターまでに及ぶ、各種サイズで作られてもよい。
【図４】
図４は、腫瘍マーカーＭＵＣ−１特異的抗体、ＤＦ−３を持つ電子的シグナル伝達コロイドとインキュベートされるＭＵＣ−１を有する細胞を表す。抗体は、コロイド上の自己組織化単分子層に取り込まれたＮＴＡ／Ｎｉ（ＩＩ）基に結合するＨｉｓタグ標識プロテインＧを介して、コロイドに結合する。
【図５】
図５は、薬物ライブラリーの個々のメンバーの細胞表面受容体との相互作用を阻害する能力をスクリーニングするために使用することができる、アッセイの一態様を示す。
【図６】
図６は、マイクロウェル（使い捨てであってもよい）と微小電極アレイおよびロボットをつなぎ合わせることにより、薬物スクリーニングアッセイを容易に多重化できることを示す。電極アレイの分析は、多数の電極の同時分析が可能な、修正した電気化学的アナライザーを使用して行うことができる。電極はマイクロウェルに挿入されるように（矢印を参照されたい）設計することができる。
【図７】
図７は、電気活性シグナル伝達部分をも持つ粒子上で合成されるか、またはそれらに共有結合的に連結することができる薬物候補を示す。シグナル伝達粒子に連結した薬物候補は、関心のある受容体を提示する細胞、および関心のある受容体を発現しない対照細胞と共にインキュベートすることができる。このアッセイにおける薬物−標的相互作用の結果、シグナルが増加するであろう。
【図８】
図８は、ＲＧＤモチーフを含むペプチドとの相互作用により、柔軟な、半透過性支持体に連結するする組織試料を示す。次に、試料は関心のある細胞表面受容体に対するリガンドを持つ、電気活性シグナル伝達コロイドとインキュベートする。試料を洗浄し、次に微小電極アレイにつなげる。電極アレイは電極の面積が細胞の面積に相当するように作製することができる。試料はさらにＡＣＶにより特徴付け、その後組織病理学に関連付けることができる。
【図９】
図９は一般的な補充およびシグナル伝達粒子に基づいた、容易に多重化可能なタンパク質‐タンパク質相互作用アッセイを示す。Ｈｉｓタグ標識タンパク質を選択的に捕捉するＮＴＡ／Ｎｉ（ＩＩ）リガンドを持つ自己組織化単分子層は、シグナル伝達コロイドおよび金被覆磁気ビーズ上に形成される。次に、それぞれの粒子型を、異なるＨｉｓタグ標識タンパク質と手短にインキュベートする。次に磁場が磁気ビーズを感知電極に引き寄せる。第１タンパク質と第２タンパク質間の相互作用を通してコロイド上の電気活性標識（酸化還元活性部分であってもよい）が電極に運ばれるときだけ、シグナルが変換される。非Ｈｉｓタグ標識タンパク質もカルボキシ停止チオールを提示する、自己組織化単分子層を持つ一般的な粒子に結合できることに注意されたい。
【図１０】
図１０は、酵素開裂部位（ＥＣＳ）を持ち、ビオチンで停止したチオールにより誘導体化された電気活性シグナル伝達コロイドを示す。磁気ビーズはストレプトアビジンにより誘導体化し、次に磁気ビーズとシグナル伝達コロイドを関心のある酵素および薬物候補と共にインキュベートする。もし薬物候補が関心のある酵素の作用を阻害すると、その部位は開裂されず、そしてシグナル伝達コロイドはビオチンストレプトアビジン相互作用により磁気ビーズに結合したままであろう。得られた複合体が磁気的に感知電極に結合するとき、電流のピークが得られ、アッセイがシグナル増加検出アッセイになるであろう。
【図１１】
図１１は、酵素活性を調節する薬物のスクリーニングのための研究方法を示す。このスキームにおいて、酵素修飾の標的であるタンパク質は、やはり電気活性部分を持つコロイドに連結する。酵素が標的タンパク質に添加する化学基はビオチンで標識されている。酵素機能が適切であるとき、ビオチン標識化合物はシグナル伝達コロイド上のタンパク質に添加される。このようにして得られた複合体は、さらにストレプトアビジン被覆磁気ビーズに結合する。複合体はさらに感知電極に電磁気的に引き寄せられる。薬物候補はアッセイに添加されてもよい。対照に比較したシグナルの損失は、薬物候補が酵素の活性を阻害したことを示し、一方シグナルの増加は薬物が酵素の活性を高めたことを示すであろう。
【図１２】
図１２は、ファルネシル基、ファルネシルピロフォスフェート、およびゲラニル−ゲラニルピロフォスフェートの化学構造を示す。
【図１３】
図１３は、ビオチンのような認識基によるファルネシル−またはゲラニル−様部分の修飾を示す。
【図１４】
ビオチン部分を持つファルネシルピロフォスフェート誘導体を示す。ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ（ＦＰＴ）酵素は、ＲＡＳタンパク質変異体へのファルネシル誘導体の添加を触媒する。複合体を感知電極に補充するためにストレプトアビジンを持つ磁気ビーズを使用するとき、酵素の活性、または薬物候補が酵素活性を修飾する能力は電流出力を測定することにより定量することができる。
【図１５】
図１５は、薬物候補がそれらの酵素活性を調節できる能力に対して評価されてもよいことを示す。空間的にアドレスできるマイクロウェルはＲＡＳタンパク質（野生型または変異体）、ＦＰＴ酵素、ビオチン修飾付加基（ファルネシル誘導体）、ストレプトアビジンを持つ磁気ビーズ、およびプラスまたはマイナス薬物候補を含む。電極は、さらに交流ボルタンメトリー（ＡＣＶ）を含む、各種電子的および電気化学的技術により分析することができる。
【図１６】
図１６は、ＲＧＤ‐含有リガンドとコラーゲン被覆電極上で増殖する細胞との相互作用のＡＣＶ分析のプロットを示す。
【図１７】
図１７は、（陰性）対照リガンドとコラーゲン被覆電極上で増殖する細胞との相互作用のＡＣＶ分析のプロットを示す。
【図１８】
図１８は、伝導性分子の単一の型のみを含有する金属支持体上で増殖する細胞のＡＣＶ分析のプロットを示す。
【図１９】
図１９は、ＲＧＤ‐含有リガンドと、絶縁および伝導性分子の不均一単分子層を含む金属支持体上で増殖する細胞との相互作用のＡＣＶ分析のプロットを示す。
【図２０】
図２０は、コロイドで修飾されたビーズ、具体的にはタンパク質／タンパク質相互作用によりビーズに結合したコロイドの写真の写真複写である。
【図２１】
図２１は、図２０で示された実験の陰性対照の写真の写真複写である。
【図２２】
図２２は、（絶縁種の芝生中の）伝導性分子の割合の増大に従った単分子層の伝導性増大を表すプロットを示す。
【図２３】
図２３は、フェロセン溶液とともに測定した、非伝導性自己組織化単分子層の陰性対照に対する２単位分子ワイヤ、ポリ（エチニルフェニル）チオール、ＭＦ１を含有する伝導性自己組織化単分子層の単分子層の伝導性のＡＣＶ分析のプロットを示す。
【図２４】
図２４は、フェロセン溶液とともに測定した、より高い伝導性単分子層に対して測定した、図２３の２つの自己組織化単分子層の単分子層の伝導性のＡＣＶ分析のプロットを示す。
【図２５】
磁気ビーズへのコロイドの結合により測定した、タンパク質／タンパク質相互作用のＡＣＶ分析を示す。
【図２６】
図２６は、対照に対する自己組織化単分子層を横切る増大した電子的連絡、および細胞表面へのタンパク質固定化の酸化還元シグナル伝達のＡＣＶ表示を示す。
【図２７】
図２７は、図によるアッセイの説明であり、磁気ビーズへのコロイドの結合により測定したタンパク質／タンパク質相互作用のプロットは、図２５に示す。
【図２８】
図２８は、表面‐結合タンパク質を含む電極、およびフェロセン酸化電位に対するそれらの作用（実線）および陰性対照（点線）のＡＣＶ分析のプロットを示す。
【図２９】
図２９Ａおよび２９Ｂは、受容体が発現される部位で選択的にコロイドにより修飾される細胞（２９Ｂ）および対照（２９Ａ）の顕微鏡写真（倍率４０倍）の写真複写である。
【図３０】
図３０Ａおよび３０Ｂは、自己組織化単分子層上で、タンパク質の結合パートナーを持つコロイド粒子により修飾された非特異的に結合するタンパク質を持つビーズ（３０Ａ）および対照（３０Ｂ）のコンピュータデジタル化顕微鏡画像の写真複写である。
【図３１】
図３１は、複数のシグナル伝達実体により単一結合事象をシグナル伝達することに起因する、６桁改善されたシグナル伝達を示す棒グラフである。
【図３２】
図３２Ａおよび３２Ｂは、表面への結合相互作用を示すシグナル伝達実体を補充するための重力の使用を表示する実験、および対照のＡＣＶプロットを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図３１】
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【図３２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004512497.tif 000147
2004512497.tif 000148
2004512497.tif 000149