(57)【要約】本発明は、破壊されたＦＨＩＴ遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック動物を提供する。本発明は、Ｆｈｉｔ対立遺伝子の一方または両方が不活化されたトランスジェニックマウスをさらに提供する。Ｆｈｉｔ欠損マウスは、ミュア−トール家族性癌症候群に類似した、内臓および脂腺の両方の起源の複数種の腫瘍を発生することが好ましい。本発明はさらに、これらのトランスジェニックマウスの作製、および癌（好ましくは、ミュア−トール症候群がその一部に含まれる胃腸癌）の新生物細胞のクローン性増殖の促進における発癌性因子の影響を研究するためのそれらのモデル系としての使用に関する。本発明はさらに、癌（好ましくは、胃腸癌）の予防および治療における効力について治療剤をテストすることに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＨＩＴ遺伝子座の破壊を有する胚幹細胞であって、該破壊がエキソン５コード領域中に終止コドンを含むものである、前記胚幹細胞。
【請求項２】
ＦＨＩＴ遺伝子座の破壊を有する細胞を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、該破壊がエキソン５コード領域中に終止コドンを含むものである、前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
ＦＨＩＴ遺伝子座の破壊に関してキメラである、請求項２に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項４】
マウスである、請求項２に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項５】
ＦＨＩＴ遺伝子座の破壊を有する細胞が生殖系列細胞および体細胞の両方である、請求項４に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項６】
ＦＨＩＴ遺伝子座の破壊がホモ接合性である、請求項４に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項７】
ＦＨＩＴ遺伝子座の破壊がヘテロ接合性である、請求項４に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項８】
ある範囲の内臓腫瘍および皮膚腫瘍を発生しやすい素因を持つという特徴を有する、請求項６または７に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項９】
ＮＭＢＡに対して高感受性であるという特徴を有する、請求項６または７に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１０】
ＭＳＨ２遺伝子における破壊をさらに含む、請求項６または７に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１１】
請求項６に記載のトランスジェニックマウス由来の細胞を用いて調製された細胞培養物。
【請求項１２】
請求項７に記載のトランスジェニックマウス由来の細胞を用いて調製された細胞培養物。
【請求項１３】
分子の発癌性をテストする方法であって、
（ａ）該分子を請求項５に記載のトランスジェニックマウスに投与する工程；および
（ｂ）該トランスジェニックマウスにおける腫瘍形成率を、該分子が投与されていない同じ遺伝子型の対照マウスと比較する工程
を含み、かつ、テストする該分子の投与後の腫瘍形成率が増加することにより該分子が発癌物質であることが示される、前記方法。
【請求項１４】
分子の発癌性をテストする方法であって、
（ａ）請求項１１または１２に記載の細胞培養物を該分子と接触させる工程；および
（ｂ）該細胞培養物の増殖速度を未処理細胞培養物と比較する工程
を含み、かつ、テストする該分子への曝露後の増殖速度が増加することにより該分子が発癌物質であることが示される、前記方法。
【請求項１５】
癌を治療または予防する際の分子の治療的効力をテストする方法であって、
（ａ）該分子を請求項５に記載のトランスジェニックマウスに投与する工程；および
（ｂ）該トランスジェニックマウスにおける腫瘍形成率を、該分子が投与されていない同じ遺伝子型の対照マウスと比較する工程
を含み、かつ、テストする該分子の投与後の腫瘍形成率が低下することにより該分子が癌に対して治療的価値を有することが示される、前記方法。
【請求項１６】
癌を治療または予防する際の分子の治療的効力をテストする方法であって、
（ａ）請求項１１または１２に記載の細胞培養物を該分子と接触させる工程；および
（ｂ）該細胞培養物の増殖速度を未処理細胞培養物と比較する工程
を含み、かつ、テストする該分子への曝露後の細胞増殖速度が低下することにより該分子が癌に対して治療的価値を有することが示される、前記方法。
【請求項１７】
癌が胃腸癌である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
癌が胃腸癌である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
癌がミュア−トール症候群関連癌である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
癌がミュア−トール症候群関連癌である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
癌が遺伝性非ポリポーシス大腸癌である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
癌が遺伝性非ポリポーシス大腸癌である、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、国立癌研究所、ＵＳＰＨＳにより与えられる助成金番号ＣＡ２１１２４および同ＣＡ５６３３６号；米国癌研究財団からの助成金番号９７Ｂ１１５−ＲＥＶ、ならびにペンシルヴァニア保健局からの助成金番号ＭＥ９９−１０５の下で、部分的に政府の援助を受けて為された。本発明に関して政府は一定の権利を有する。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、癌生物学の分野に関し、特に、複数種の腫瘍を発生しやすく、ミュア−トール家族性癌症候群のモデルとして有用なトランスジェニック動物に関する。
【０００３】
２．発明の背景
ヒト染色体脆弱部位が、新形成において転座または欠失により非ランダムに変化した染色体バンドにマッピングされることが最初に認められたことから、染色体脆弱部位の（おそらく環境中の発癌物質により増強される）組換え生成性（ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）が、脆弱部位の癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子の発現を変化させ得ることが提案されてきた（ＹｕｎｉｓおよびＳｏｒｅｎｇ， １９８４， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６：１１９９−１２０４）。この提唱の当然の帰結として、脆弱部位に存在する遺伝子の発現における変化は、新生物細胞のクローン性増殖の一因となることとなる。ＦＨＩＴは、現時点で、構成的脆弱領域の遺伝子の唯一の例であり、腫瘍抑制遺伝子に顕著な特徴の多くを示す（Ｏｈｔａら， １９９６， Ｃｅｌｌ ８４：５８７−５９７）。
【０００４】
ＦＨＩＴ遺伝子は、多種類の癌（肺癌、子宮頸癌、胃癌および膵臓癌を含む）のかなりの割合において欠失または転座により変化する（Ｏｈｔａら， １９９６， Ｃｅｌｌ ８４：５８７−５９７；Ｓｏｚｚｉら， １９９６， Ｃｅｌｌ ８５：１７−２６；Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓら， １９９７， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７：２１１２−２１１５；Ｇｒｅｅｎｓｐａｎら， １９９７， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７：４６９２−４６９８；Ｂａｆｆａら， １９９８， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８：４７０８−４７１４；Ｓｉｍｏｎら， １９９８ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８：１５３８−１５８７；Ｓｏｒｉｏら， １９９９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９：１３０８−１３１４）。ＦＨＩＴタンパク質は、これらの癌の大部分において、また他種類の癌のかなりの割合において（Ｈａｄａｃｚｅｋら， １９９８， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８：２９４６−２９５；Ｉｎｇｖａｒｓｓｏｎら， １９９９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９：２６８２−２６８９；ｖａｎ Ｈｅｅｒｄｅｎら， １９９９， Ｊ． Ｏｒａｌ Ｐａｔｈ． Ｍｅｄ ２８：４３３−４３７）、および肺における前新生物病変（Ｓｏｚｚｉら， １９９８， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８：５０３２−５０３７）において、欠損または減少する。それにもかかわらず、ＦＨＩＴは腫瘍サプレッサーとして一般的なものではなく（Ｌｅ Ｂｅａｕら， １９９８， Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ２１：２８１−２８９）、一部の報告は、遺伝子座の脆弱性だけで、癌におけるＦＨＩＴでのクローン性またはオリゴクローン性遺伝子変化が生じる原因となり得ることを示唆している。癌発生におけるＦＨＩＴタンパク質の役割を明らかにするために、Ｆｈｉｔ欠損マウス系統を確立した。驚くべきことに、これらのマウスは、脂腺腫瘍および内臓腫瘍を組合せて発生しやすいという特徴を有するミュア−トール症候群（ＭＴＳ）を患うヒトにおいて認められる症状に似た症状を発症する。本発明のＦｈｉｔ欠損マウスは、非ヒト動物においてミュア−トール症候群を研究するための機会を提供する。
【０００５】
本明細書における参考文献の引用または言及は、それらが本発明に対する先行技術であることを認めるものではない。
【０００６】
３．発明の要旨
本発明は、ＦＨＩＴ遺伝子座の破壊を有する胚幹細胞であって、該破壊がエキソン５コード領域中に終止コドンを含むものである、前記胚幹細胞を提供する。本発明はさらに、ＦＨＩＴ遺伝子座の破壊を有する細胞を含むトランスジェニック哺乳動物であって、該破壊がエキソン５コード領域中に終止コドンを含むものである、前記トランスジェニック哺乳動物を提供する。ＦＨＩＴ破壊は、ホモ接合性であってもヘテロ接合性であってもよい。好適な実施形態では、トランスジェニック哺乳動物はマウスである。一実施形態では、マウスは、ＦＨＩＴ遺伝子座の破壊に関してキメラである。別の実施形態では、マウスの生殖系列細胞および体細胞は、ＦＨＩＴ遺伝子座の破壊を有する。ＦＨＩＴ破壊を含むマウスは、ある範囲の内臓腫瘍および皮膚腫瘍を発生しやすい素因を持つという特徴、および／またはＮＭＢＡに対して高感受性であるという特徴を有することが好ましい。特定の実施形態では、ＦＨＩＴ破壊を含むマウスは、さらにＭＳＨ２遺伝子における破壊を含む。
【０００７】
本発明はさらに、ＦＨＩＴ破壊についてホモ接合性またはヘテロ接合性であるトランスジェニックマウスの細胞から調製された細胞培養物を提供する。
【０００８】
本発明はさらに、分子の発癌性をテストする方法であって、該分子をＦｈｉｔが破壊されたトランスジェニックマウスに投与すること、および該トランスジェニックマウスにおける腫瘍形成率を該分子が投与されていない同じ遺伝子型の対照マウスと比較することを含み、かつ、該分子の投与後の腫瘍形成率が増加することにより該分子が発癌物質であることが示される、前記方法を提供する。
【０００９】
あるいはまた、本発明は、分子の発癌性をテストする方法であって、Ｆｈｉｔ破壊についてホモ接合性またはヘテロ接合性であるマウスから作製した細胞培養物を該分子と接触させること、および該細胞培養物の増殖速度を未処理細胞培養物と比較することを含み、かつ、該分子への曝露後の増殖速度が増加することにより該分子が発癌物質であることが示される、前記方法を提供する。
【００１０】
本発明はさらに、癌を治療または予防する際の分子の治療的効力をテストする方法であって、該分子をＦｈｉｔが破壊されたトランスジェニックマウスに投与すること、および該トランスジェニックマウスにおける腫瘍形成率を該分子が投与されていない同じ遺伝子型の対照マウスと比較することを含み、該分子の投与後の腫瘍形成率が低下することにより該分子が癌に対して治療的価値を有することが示される、前記方法を提供する。
【００１１】
あるいはまた、本発明は、癌を治療または予防する際の分子の治療的効力をテストする方法であって、Ｆｈｉｔ破壊についてホモ接合性またはヘテロ接合性であるマウスから作製した細胞培養物を該分子と接触させること、および該細胞培養物の増殖速度を未処理細胞培養物と比較することを含み、かつ、該分子への曝露後の細胞増殖速度が低下することにより該分子が癌に対して治療的価値を有することが示される、前記方法を提供する。
【００１２】
３．１  略語
ＮＭＢＡ：Ｎ，ニトロソメチルベンジルアミン
Ｈ ＆ Ｅ：ヘマトキシリン−エオシン
ＭＴＳ：ミュア−トール症候群
ＭＳＩ：マイクロサテライト不安定性
４．図面の説明
図１：マウスゲノム上のＦＨＩＴ遺伝子座、ターゲティングおよびスクリーニング戦略。一番上の行は、エキソン５を囲むゲノム上のＦＨＩＴ遺伝子座を表す。中央の行は、６．６ ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）−Ｐｓｔ１（Ｐ）断片を有し、終始コドンがエキソン５に挿入されたターゲティングベクターを示す。相同組換え後のターゲティングされた遺伝子座を、ＢａｍＨＩ（Ｂ）切断後のＥＳコロニーおよび子孫ＤＮＡのサザンブロットスクリーニングのために使用されるプローブと共に一番下の行に示す。野生型（Ｆ，Ｒ）および標的（Ｎ，Ｒ）対立遺伝子を同定するための子孫ＤＮＡのＰＣＲ増幅に使用されるプライマーの位置を示す。制限酵素部位を、ＥｃｏＲＶ（ＥＶ）、ＥｃｏＲＩ（Ｅｌ）、Ｓｐｈ１（Ｓｐ）、Ｓａｃ１（Ｓ）、Ｎｏｔ１（Ｎ）、Ｎｃｏ１（Ｎｃ）、Ｐｍｅ１（Ｐｍ）について示す。３つのプライマーＦ、ＲおよびＮの５’−（Ｒ）３’配列はそれぞれ以下のとおりである：ＣＴＴＧＡＡＴＣＴＡＧＧＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＣＧＡＧ（配列番号１）、ＧＡＴＴＣＣＴＴＧＣＴＴＡＣＣＴＴＴＴＧＧＧＧＡＴＧＧ（配列番号２）、およびＴＧＧＧＣＴＣＴＡＴＧＧＣＴＴＣＴＧＡＧＧＣ（配列番号３）。第１の反応産物はエキソン５を含む約４５０ｂｐの野生型断片であり；第２の産物はＮｅｏ選択遺伝子からイントロン５にわたる約２８０ｂｐの変異型断片である。ＰＣＲ条件は以下の通りである：変性９４℃、３０秒間；アニーリング６２℃、３０秒間；伸長７２℃、３０秒間；３５サイクル。
【００１３】
図２：Ｆｈｉｔ−／−マウスにおけるＦＨＩＴタンパク質の不在。Ｆｈｉｔ−／−マウスの組織由来の溶解産物を、マウス組織溶解産物のイムノブロット分析によりＦＨＩＴの発現についてテストした：レーン１、ＦＨＩＴ＋／＋肺；レーン２、＋／＋肝臓；レーン３、＋／＋腎臓；レーン４、Ｆｈｉｔ−／−肝臓；レーン５、−／−腎臓。
【００１４】
図３：ＦＨＩＴ発現の免疫組織化学検出。Ａ、ＮＭＢＡの１０週間後のＦＨＩＴ＋／＋マウス２３の正常食道上皮（２００×）におけるＦＨＩＴ発現（茶色の色素はＦＨＩＴタンパク質を表す）；Ｂ、ＮＭＢＡの１０週間後のＦｈｉｔ＋／−マウス３３の噴門洞の扁平乳頭腫（２００×）におけるＦＨＩＴ発現の欠如；Ｃ、ＮＭＢＡの１０週間後のＦＨＩＴ＋／＋マウス２５の接合部の扁平乳頭腫（２００×）におけるＦＨＩＴ発現の不在；Ｄ、ＮＭＢＡの１０週間後のＦｈｉｔ＋／−マウス３１の噴門洞の侵襲性扁平上皮癌（１００×）におけるＦＨＩＴ発現の欠如；Ｅ、ＮＭＢＡの１０週間後のＦｈｉｔ＋／−マウス２７の脂腺腫瘍（１００×）におけるＦＨＩＴ発現の欠如；Ｆ、ＮＭＢＡの１０週間後のＦｈｉｔ＋／−マウス２１の脂腺腫瘍（１００×）におけるＦＨＩＴタンパク質の不在。
【００１５】
図４：ＭＴＳ腫瘍におけるヒトＦＨＩＴの免疫組織化学検出。Ａ、正常毛包（２００×）におけるＦＨＩＴ発現；密度の高いケラチン角（ｈｏｒｎ）は非特異的染色を示す点に注意；Ｂ、正常皮脂腺（２００×）におけるＦＨＩＴ発現；Ｃ、ミュア−トール症候群ケース１脂腺腫瘍のヘマトキシリン−エオシン（Ｈ ＆ Ｅ）染色；Ｄ、ケース１脂腺腫瘍のほとんどの細胞におけるＦＨＩＴ発現の欠如。
【００１６】
図５：マウス腫瘍におけるＦＨＩＴ遺伝子座の完全性。尾部および脂腺腫瘍由来のＤＮＡをＸｂａＩで切断し、電気泳動にかけ、膜に移し、３２Ｐ標識完全長ＦＨＩＴ ｃＤＮＡプローブにハイブリダイズさせた。ＦＨＩＴエキソンを左側に示す；＊は、不活化Ｆｈｉｔエキソン５を示す。レーン１、３および４は、Ｆｈｉｔ＋／−マウス２１、２７および３１の脂腺腫瘍由来のＤＮＡを含んでいた；レーン２はＦＨＩＴ＋／＋マウス２５の尾部由来のＤＮＡを含んでいた；レーン５は多形により様々な大きさであるエキソン３（別の断片によりはっきりとしない）を示すスイスマウス３Ｔ３細胞系由来のＤＮＡを含んでいた。ＦＨＩＴ＋／＋および＋／−マウスは、エキソン８の２つの異なる対立遺伝子を示すＢ６１２９Ｆ１である。右側のパネルは、膜へ消化ＤＮＡをブロッティングする前のアガロースゲルを示す；このゲルは、約１μｇ（レーン４）〜約１０μｇ（レーン２）にわたる個々のレーンに充填されたＤＮＡの量を明らかにする。
【００１７】
図６：腫瘍におけるＭＳＩの評価。マウスおよびヒト腫瘍および対照由来のＤＮＡ鋳型を、マイクロサテライト対立遺伝子に隣接するプライマーを用いて増幅した。標識増幅産物をＰＡＧＥゲルにかけ、乾燥させ、曝露した。Ｄ６Ｍｉｔ５９、Ｄ１９Ｍｉｔ３６およびＤ１７Ｍｉｔ１２３パネルは、Ｆｈｉｔ＋／−マウス２７噴門洞腫瘍（レーン１）、ＦＨＩＴ＋／＋マウス２５噴門洞腫瘍（レーン２）、ＦＨＩＴ＋／＋マウス２５尾部（レーン３）、Ｆｈｉｔ＋／−マウス２１脂腺腫瘍（レーン４）、Ｆｈｉｔ＋／−マウス２７脂腺腫瘍（レーン５）、Ｆｈｉｔ＋／−マウス２７第２脂腺腫瘍（レーン６）、Ｆｈｉｔ＋／−マウス３１脂腺腫瘍（レーン７）、Ｋ１７３５マウス黒色腫細胞系（レーン８）、ＮＰ３マウス細胞系（レーン９）、陰性対照（ＤＮＡ無し）（レーン１０）から増幅されたマウス対立遺伝子を示す。マウス腫瘍において表記の３つのマーカーについてＭＳＩは観察されなかった。Ｄ１８５３５およびＤ３５１２９５パネルは、ヒトＭＴＳケース由来の生殖細胞系列および腫瘍ＤＮＡを示す；末梢血液リンパ球由来のＤＮＡ（レーン１）、同じ個体の脂腺腫瘍１８５由来のＤＮＡ（レーン２）、リンパ球ＤＮＡ（レーン３）、ならびに同じ個体由来の脂腺腫瘍１８５（レーン４）および９０２９（レーン５）由来のＤＮＡ。これらの脂腺腫瘍は、増幅が成功した各対立遺伝子においてＭＳＩを示した。
【００１８】
図７：酵母および細菌人工染色体（それぞれＹＡＣおよびＢＡＣ）に対するエキソン配列の相対的位置付けを示すマウスゲノム上のＦＨＩＴ遺伝子座のマップ。ＧｅｎＢａｎｋに登録された配列を有するマウスゲノムＦＨＩＴ遺伝子座の領域は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号によりマップ上に示す。
【００１９】
５．発明の説明
マウスＦＨＩＴ遺伝子座（図７；Ｐｅｋａｒｓｋｙら， １９９８， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８：３４０１−３４０８；Ｇｌｏｖｅｒら， １９９８， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８：３４０９−３４１４）は、そのヒト相同体（米国特許第５，９２８，８８４号）と類似しており、共通の脆弱部位を含み、マウス癌細胞系において変化している。癌発生におけるＦＨＩＴタンパク質の役割を明らかにするために、Ｆｈｉｔ＋／−マウス系統を確立した。ＦＨＩＴ＋／＋および＋／−マウスにおける発癌物質誘導腫瘍形成の頻度を、確立したＮ−ニトロソメチルベンジルアミン（ＮＭＢＡ）食道癌／胃癌モデルを用いて比較した（ＦｏｎｇおよびＭａｇｅｅ， １９９９， Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ １４３：６３−６９）。
【００２０】
生物活性化の際に、ＮＭＢＡは、ベンズアルデヒドおよび求電子性メチル化剤を生成するが（ＬａｂｕｃおよびＡｒｃｈｅｒ， １９８２， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４２：３１８１−３１８６）、これはＤＮＡをメチル化して前変異原性付加物０６−メチルグアニン（Ｏ６−ｍｅＧ）の形成を生じる（Ｆｏｎｇら， １９７９， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ２３：６７９−６８２）。ＮＭＢＡは、胃管栄養法によりまたは飲み水に入れて投与した場合に、食道腫瘍および噴門洞腫瘍の両方を誘導することが報告された（ＦｏｎｇおよびＭａｇｅｅ， １９９９， Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ １４３：６３−６９；Ｓａｎｄｅｒら， １９７３， １９：１５７−１６１）。Ｆｏｎｇおよび共同研究者らは、ラットおよびマウスにおけるＮＭＢＡによる食道腫瘍誘導についての一連の研究に基づいて、低用量のＮＭＢＡを必要とするモデル系を開発した（ＦｏｎｇおよびＭａｇｅｅ， １９９９， Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ １４３：６３−６９；Ｆｏｎｇら， １９８４， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ７２：４１９−４２５；Ｆｏｎｇら， １９９７， Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １８：１４７７−１４８４）。このモデル系を、Ｆｈｉｔ＋／−マウスに対するＮＭＢＡ投与の影響をテストするために使用した。ＮＭＢＡ曝露の１０週間後には、全てのＦｈｉｔ＋／−マウスが、ヒト癌症候群であるミュア−トール症候群（ＭＴＳ）、すなわちミスマッチ修復遺伝子の欠陥により生じる疾患、において観察されるものと類似したある範囲の内臓癌および皮膚癌を引き起こした。
【００２１】
従って、本発明は、Ｆｈｉｔ欠損細胞およびＦｈｉｔ欠損非ヒト動物の作製に関する。本発明はさらに、ミュア−トール症候群の研究用、ならびに潜在的な発癌物質および治療剤をテストするための実験モデルとしてのＦｈｉｔ欠損非ヒト動物の使用に関する。
【００２２】
本発明が包含する非ヒトトランスジェニック動物は、概して、ＦＨＩＴ遺伝子またはその相同体がコードされているあらゆる脊椎動物、好ましくは哺乳動物を含む。このような非ヒトトランスジェニック動物としては、例えば、トランスジェニックブタ、トランスジェニックラット、トランスジェニックウサギ、トランスジェニックウシ、トランスジェニックヤギ、および当該分野で公知の他のトランスジェニック動物種、特に哺乳動物種が挙げられる。さらに、げっ歯類の仲間の他のメンバー（例えば、ラットおよびモルモット）、ならびに非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー）を本発明を実施するために使用してもよい。本発明を実施するために最も好ましい動物はマウスである。
【００２３】
ＦＨＩＴ遺伝子に関して、本明細書において使用する「機能的破壊」または「機能的に破壊された」という用語は、ＦＨＩＴ遺伝子座が少なくとも１つの突然変異または構造的変化を含んでおり、それによって機能的に破壊された遺伝子が、機能的遺伝子産物の有効な発現を実質的に指令できなくなることを意味する。一例であり限定するものではないが、機能的ＦＨＩＴタンパク質をコードできずコードエキソン（例えば、第５エキソン）に組み込まれた、終止コドン（任意にｎｅｏまたは他のマーカー遺伝子カセットが後続する）が導入された内因性ＦＨＩＴ遺伝子は、従って、機能的に破壊されたＦＨＩＴ遺伝子座である。機能的破壊は、別の遺伝子（例えば、βガラクトシダーゼなどのリポーター遺伝子）によるＦＨＩＴ遺伝子の完全な置換を含み、これは例えば、その結果として、マウスＦＨＩＴオープンリーディングフレーム全体をβガラクトシダーゼオープンリーディングフレームに置き換えるターゲティング導入遺伝子が、内因性マウスβガラクトシダーゼ遺伝子座に置き換わることによりそれを機能的に破壊したものとされる。必須転写調節エレメント、ポリアデニル化シグナル、スプライシング部位配列の欠失または中断もまた、機能的に破壊された遺伝子を生ずる。ＦＨＩＴ遺伝子の機能的破壊は、他の方法（例えば、アンチセンスポリヌクレオチド遺伝子抑制）によっても生じ得る。また、ＦＨＩＴ遺伝子に関して、「構造的に破壊された」という用語は、少なくとも１つの構造（すなわちエキソン）配列が相同遺伝子ターゲティングにより（例えば、挿入、欠失、点突然変異、および／または再配置により）改変されている標的ＦＨＩＴ遺伝子を指す。典型的に、ＦＨＩＴ遺伝子は、コード配列の破壊の結果として機能的に破壊される。しかし、ＦＨＩＴ遺伝子はまた、構造的な破壊を伴わなくても、すなわちプロモーターの除去などの非コード配列のターゲティングされた改変により、機能的に破壊され得る。対立遺伝子由来の機能的遺伝子産物の有効な発現を妨害するターゲティングされた改変を含む対立遺伝子は、当該分野において「ヌル対立遺伝子」と称される。
【００２４】
ＦＨＩＴ核酸に関して、本明細書で使用する「対応する」という用語は、ポリヌクレオチド配列が、参照ポリヌクレオチド配列の全体または一部に相同（すなわち、厳密に進化学的に関連するということではないが、同一）であること、またはポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列と同一であることを意味する。対照的に、「相補的」という用語は、ＦＨＩＴ遺伝子に関して、相補配列が参照ＦＨＩＴポリヌクレオチド配列の全体または一部と相同であるという意味で本明細書において使用する。
【００２５】
「実質的に対応する」、「実質的に相同」、または「実質的に同一」という用語は、ＦＨＩＴ核酸配列との関連で使用する場合は、参照配列と比べて核酸配列が少なくとも約７０％の配列同一性、通常は少なくとも約８５％の配列同一性、そして好ましくは参照配列と比べて少なくとも約９５％の配列同一性を有するという該核酸配列の特徴を示す。配列同一性のパーセンテージは、参照配列の合計２５％未満の小さい欠失または付加を含まないで計算する。参照配列は、遺伝子もしくは隣接配列の一部、または染色体の反復部分など、より大きい配列の一部であってもよい。しかし、参照配列は、少なくとも１８ヌクレオチドの長さ、通常は約３０ヌクレオチドの長さ、そして好ましくは少なくとも約５０〜１００ヌクレオチドの長さを有している。本明細書で使用する「実質的に相補的」とは、参照配列に実質的に対応する配列に相補的な配列を指す。一般的に、ターゲティング効率は、標的ＤＮＡ中に存在する参照配列（すなわち、交差標的配列）に実質的に相補的なターゲティング導入遺伝子部分（すなわち相同領域）の長さと共に増加する。一般的に、ターゲティング効率は、同質遺伝子ＤＮＡ相同クランプの使用により最適化されるが、各種リコンビナーゼの存在により、効率的な組換えのために必要な配列同一性が低下し得ることが認められている。
【００２６】
ＦＨＩＴ核酸に関連して本明細書で使用する「非相同配列」という用語は、概して、指定されたＦＨＩＴ核酸配列と実質的に同一でない配列を示す。
【００２７】
ＦＨＩＴ核酸配列に関する「特異的ハイブリダイゼーション」とは、本明細書において、ＦＨＩＴターゲティング導入遺伝子配列（例えば、置換、欠失、および／または付加を含み得るＦＨＩＴポリヌクレオチド）と、特異的な標的ＤＮＡ配列（例えば、ＦＨＩＴ遺伝子配列）との間のハイブリッド形成として定義する。特異的なハイブリダイゼーションは、標識ＦＨＩＴターゲティング導入遺伝子配列を用いて試験して、ＦＨＩＴ標的に優先的にハイブリダイズするか否か（例えば、該標識ターゲティングＦＨＩＴ導入遺伝子配列をプローブとして用いる、細胞から調製したＤＮＡのサザンブロットにおいて、ゲノムＦＨＩＴ遺伝子の制限断片に対応する単一バンドが同定できるか否か）を決定できる。最適ハイブリダイゼーション条件は、ＦＨＩＴターゲティング導入遺伝子と内因性標的とのＦＨＩＴ配列組成および長さ、ならびに実施者により選択される実験法に応じて異なることが明らかである。適切なハイブリダイゼーション条件を選択するために様々なガイドラインが使用できる（Ｍａｎｉａｔｉｓら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， １９８９， 第二版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．、ならびにＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ １５２． Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １９８７， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．を参照）。
【００２８】
一般的にそして本明細書で使用する「天然型」という用語は、目的物に適用される場合に、該目的物が自然界で認められ得るという事実を指す。例えば、自然界の供給源から単離でき、実験室において意図的に改変されていない生物（ウイルスを含む）に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は天然型である。本明細書で使用する場合、古典的遺伝学により選択的に育種され得るげっ歯類の実験室系統は、天然型動物とする。
【００２９】
「ターゲティング構築物」という用語は、ＦＨＩＴ核酸に関して本明細書で使用する場合、概して以下：（１）宿主細胞の内因性ＦＨＩＴ遺伝子座に存在する配列と実質的に同一または実質的に相補的な配列を有する少なくとも１つのＦＨＩＴ相同領域、および（２）ターゲティング構築物相同領域と内因性ＦＨＩＴ遺伝子座配列との間の相同組換えにより、該宿主細胞の内因性ＦＨＩＴ遺伝子座に組み込まれるターゲティング領域、を含むポリヌクレオチドを指す。ターゲティング構築物が「ヒット・アンド・ラン（ｈｉｔ−ａｎｄ−ｒｕｎ）」型または「イン・アンド・アウト（ｉｎ−ａｎｄ−ｏｕｔ）」型の構築物である場合（ＶａｌａｎｃｉｕｓおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ， １９９１， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１：１４０２；Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒら， １９９２， Ｎａｔｕｒｅ ３５６：２１５；Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒら， １９９１， Ｊ． ＮＩＨ Ｒｅｓ． ３：５９）、ＦＨＩＴターゲティング領域は、内因性ＦＨＩＴ遺伝子座に一時的に組み込まれるだけであり、選択により宿主ゲノムから排除される。ＦＨＩＴターゲティング領域は、内因性ＦＨＩＴ遺伝子配列に実質的に相同な配列を含み得るか、および／または選択マーカー（例えば、ｎｅｏ、ｔｋ、ｇｐｔ）などの非相同配列を含み得る。「ターゲティング構築物」という用語は、ポリヌクレオチドが、宿主ゲノムに組み込まれる遺伝子を含むことを必ずしも示すものではないし、ポリヌクレオチドが完全な構造遺伝子配列を含むことを必ずしも示すものでもない。当該分野で使用される「ターゲティング領域」という用語は、本明細書で使用する「ターゲティング導入遺伝子」という用語と同意語である。
【００３０】
ＦＨＩＴ核酸に関して本明細書で使用する「相同領域」および「相同クランプ」という用語は、ＦＨＩＴ遺伝子に隣接する配列を含み得る所定の内因性ＦＨＩＴ遺伝子配列と実質的に対応するか、または実質的に相補的な配列を有するＦＨＩＴターゲティング構築物のセグメント（すなわち部分）を指す。相同領域は、一般的に、少なくとも約１００ヌクレオチドの長さ、好ましくは少なくとも約２５０〜５００ヌクレオチドの長さ、通常は少なくとも約１０００ヌクレオチドの長さまたはそれ以上の長さである。相同組換えを仲介するための相同クランプの理論上の最短の長さは実証されていないが、一般的に相同組換え効率は、相同クランプの長さと共に増加すると考えられている。同様に、組換え効率は、ターゲティング構築物相同領域と内因性標的配列との間の配列相同性の程度と共に増加し、最適組換え効率は相同クランプが内因性標的配列と同質遺伝子である場合に生じる。「相同クランプ」および「相同領域」という用語は、本明細書において互換的に使用され得る。相同クランプは、内因性配列との塩基対合ハイブリッド構造の形成を必ずしも意味するわけではない。導入遺伝子相同領域に実質的に対応するか、または実質的に相補的な内因性ＦＨＩＴ遺伝子配列を、本明細書において「交差標的配列」または「内因性標的配列」と呼ぶ。
【００３１】
本明細書において使用する「正確にターゲティングされた構築物」という用語は、ＦＨＩＴ構築物に関して使用する場合、内因性交差ＦＨＩＴ標的配列（内因性ＦＨＩＴ遺伝子座の部分など）中に組み込まれるかまたはそれに隣接するターゲティング構築物の部分を指す。一例であり限定するものではないが、ｎｅｏをコードし、第１エキソンに隣接する内因性ＦＨＩＴ遺伝子配列と実質的な同一性を有する相同領域に隣接するＦＨＩＴターゲティング導入遺伝子の部分は、該導入遺伝子部分が染色体上の位置に組み込まれて、例えば内因性ＦＨＩＴ遺伝子の第１エキソンを置き換える場合に、正確にターゲティングされていると言う。その一方で同じく一例として、ターゲティング導入遺伝子またはその部分が、非相同領域および／またはＦＨＩＴ遺伝子配列の約５０ ｋｂ以内ではない領域中に組み込まれる場合、得られる生成物は不正確にターゲティングされたＦＨＩＴ導入遺伝子である。正確にターゲティングされたＦＨＩＴ導入遺伝子および不正確にターゲティングされたＦＨＩＴ導入遺伝子の両方を有する細胞を作製することが可能である。正確にターゲティングされたＦＨＩＴ導入遺伝子および／または不正確にターゲティングされたＦＨＩＴ導入遺伝子を有する細胞および動物は、ゲノムＤＮＡのＰＣＲおよび／またはサザンブロット分析により同定および明らかにされ得る。
【００３２】
本明細書で使用する「ターゲティング領域」という用語は、ＦＨＩＴターゲティング領域に関して使用する場合、相同クランプと内因性ＦＨＩＴ遺伝子配列との間の相同組換え後に内因性ＦＨＩＴ染色体位置に組み込まれるＦＨＩＴターゲティング構築物の部分を指す。典型的には、ＦＨＩＴターゲティング領域は、その両側がＦＨＩＴ相同クランプに隣接していて、その結果、各相同クランプとその対応する内因性ＦＨＩＴ遺伝子配列との間の二重交差組換えにより、内因性ＦＨＩＴ遺伝子座の部分がターゲティング領域に置き換えられる。このような二重交差遺伝子置換用ターゲティング構築物においては、ターゲティング領域は「ＦＨＩＴ置換領域」と呼ぶことができる。しかし、ターゲティング構築物の中には、単一のＦＨＩＴ相同クランプのみを持つものがあってもよい（例えば、一部の「ヒット・アンド・ラン」型のベクター、Ｂｒａｄｌｅｙら， １９９２， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：５３４を参照）。
【００３３】
本明細書で使用する「置換領域」という用語は、ＦＨＩＴ導入遺伝子との関連で使用される場合、ＦＨＩＴ相同領域に隣接するＦＨＩＴターゲティング構築物の部分を指す。隣接する相同領域とそれらの対応する内因性ＦＨＩＴ遺伝子交差標的配列との間の二重交差相同組換えの際に、置換領域は、内因性交差ＦＨＩＴ標的配列の間で宿主細胞染色体に組み込まれる。置換領域は、相同（例えば、内因性ＦＨＩＴ遺伝子配列に類似しているが、点突然変異またはミスセンス突然変異を有する配列を有する）、非相同（例えば、ｎｅｏ遺伝子発現カセット）、または相同および非相同領域の組合せであり得る。
【００３４】
本明細書で使用する「ミニジーン」という用語は、ＦＨＩＴミニジーンに関して使用する場合、天然型ＦＨＩＴ遺伝子に関してＦＨＩＴ遺伝子の１つ以上の非必須セグメントが欠失した異種遺伝子構築物を指す。通常は、欠失するセグメントは、少なくとも約５００塩基対から数キロベースのイントロン配列であり、数十キロベース以上にまで及ぶものでもよい。大きな（すなわち約３０〜１００キロベースを上回る）ターゲティング構築物の単離および操作はしばしば困難で、ターゲティング構築物が宿主細胞に導入される効率が低下することがあり得る。従って、ＦＨＩＴ遺伝子の１以上の非必須部分を欠失することにより、ターゲティング構築物の大きさを小さくすることが望ましいことが多い。通常は、必須調節エレメントを含まないイントロン配列を欠失させればよい。例えば、ＦＨＩＴミニジーンは、ヒトＦＨＩＴ遺伝子の第５エキソンと第６エキソンとの間のイントロンセグメントの欠失を含み得る。多くの場合、都合のよい制限部位が、クローン化ＦＨＩＴ遺伝子配列の非必須イントロン配列に結合されていれば、イントロン配列の欠失は以下の方法により行い得る：すなわち、（１）クローン化ＤＮＡを適切な制限酵素で消化する、（２）制限断片を（例えば、電気泳動により）分離する、（３）必須エキソンおよび調節エレメントを含む制限断片を単離する、ならびに（４）単離された制限断片を連結して、エキソンが天然型ＦＨＩＴ遺伝子の生殖細胞系列コピーに存在するときと同じ直線的順序になっているミニジーンを形成する。ミニジーンを作製するための代替的な方法は、当業者に明らかである（例えば、必須エキソンを含むが、イントロン配列の部分を欠く部分的ゲノムクローンのライゲーション）。最も典型的には、ミニジーンを含む遺伝子セグメントは、生殖細胞系列ＦＨＩＴ遺伝子に存在するのと同じ直線的順序で配置されるが、常にそうであるとは限らない。一部の所望の調節エレメント（例えば、エンハンサー、サイレンサー）は比較的位置に左右されにくいため、対応する生殖細胞系列遺伝子と比べてミニジーンにおいて異なる位置にあっても調節エレメントは正確に機能し得る。例えば、エンハンサーは、プロモーターから様々な距離で、異なる向きで、および／または異なる直線的順序で位置していてよい。例えば、生殖細胞系列構成においてプロモーターの３’側に位置するエンハンサーは、ミニジーンにおいてはプロモーターの５’側に位置していてもよい。同様に、一部のＦＨＩＴ遺伝子は、ＲＮＡレベルにおいて選択的スプライシングされるエキソンを有し、従ってミニジーンはより少ないエキソンおよび／または対応する生殖細胞系列ＦＨＩＴ遺伝子とは異なる直線的順序のエキソンを有して、それでもなお機能的遺伝子産物をコードし得る。ＦＨＩＴ遺伝子産物をコードするｃＤＮＡも、ミニジーンを構築するために使用し得る。
【００３５】
本明細書で使用するＦｈｉｔ欠損とは、２つの野生型ＦＨＩＴ染色体対立遺伝子の少なくとも１つが突然変異されて、野生型レベルよりも低いＦＨＩＴ活性が生成されることを意味する。「Ｆｈｉｔ欠損」という用語は、ホモ接合ＦＨＩＴ変異体細胞および動物の両方、ならびにＦＨＩＴ変異体遺伝子型についてヘテロ接合性である細胞を含む。
【００３６】
一般的に、本明細書において使用する専門用語、以下に記載する細胞培養、分子遺伝学、核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける実験手順は、当該分野において周知であり、一般的に採用されるものである。標準的な技術を、組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、細胞培養、および導入遺伝子組込み（例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション）において使用する。一般的に、酵素反応、オリゴヌクレオチド合成、および精製ステップは、製造元の説明書に従って行う。技術および手順は、一般的に、当該分野の従来方法、および本明細書を通して提示する様々な一般参考文献に従って行う。
【００３７】
本発明の好適な実施形態は、ＦＨＩＴ対立遺伝子の少なくとも１つが突然変異を含んで該細胞が野生型レベルよりも低いＦＨＩＴ活性を生成するようなＦＨＩＴ遺伝子の２つの染色体対立遺伝子を含む二倍体マウス細胞、マウス胚、およびマウスを包含する。このようなＦＨＩＴ欠損動物および細胞は、とりわけ、治療剤、ならびに変異原性刺激（放射線および化学的突然変異原など）の影響を分析およびテストするための、疾患モデルとして有用であるとみなされる。好適な実施形態では、ＦＨＩＴ突然変異は、エキソン５のオープンリーディングフレームにおいて終止コドンを生じる置換突然変異である。
【００３８】
ミスマッチ修復は、腫瘍形成に対する抑制としておそらく機能する、細胞には一般的なプロセスである。もしＦＨＩＴ欠損動物が、ミュア−トール症候群に認められるのと同様に複数種の腫瘍を発生しやすければ、本明細書に記載する細胞および動物は、ミュア−トール症候群、およびそれを治療するための薬剤の研究のためにも有用であると考えられる。
【００３９】
特に、ＦＨＩＴ欠損細胞または生物の増殖性異常を救う条件をスクリーニングするための方法が意図される。このような条件の例としては、外因的に加えられたタンパク質もしくは化学因子の存在、トランスフェクトされた遺伝子もしくは内因性遺伝子の過剰発現、またはトランスフェクトされた遺伝子もしくは内因性遺伝子の異所的発現、または遺伝子の突然変異誘発などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４０】
ＦＨＩＴ遺伝子における突然変異またはターゲティングされる破壊は、当該分野で周知のよく確立された多数ある突然変異のいずれかを用いて操作され得る。突然変異は、好ましくは置換突然変異であり、最も好ましくはＦＨＩＴオープンリーディングフレームの終止コドンを生じる置換突然変異であるが、欠失突然変異および／または挿入突然変異も本発明の範囲に含まれる。Ｈａｓｔｙら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５０：２４３−２４６に記載されるように、ＦＨＩＴ遺伝子の５’端の近くに終止コドンまたは他の突然変異を導入して、ＦＨＩＴタンパク質生成の失敗、またはＦＨＩＴ活性を欠く変異体タンパク質の生成を生じさせる部位特異的突然変異誘発により、置換突然変異を行うことができる。同様に、挿入突然変異は、ＦＨＩＴ遺伝子中の都合のよい制限部位（ＦＨＩＴ遺伝子のエキソン配列決定および制限マッピング、ならびに（Ｈａｓｔｙら， １９９１， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１：４５０９−４５１７；Ｊｏｙｎｅｒら， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３３８：１５３−１５６）に記載される技術により容易に同定されるエキソン制限部位または他の部位のいずれかなど）を利用して、ＦＨＩＴ遺伝子中に導入できる。挿入または他の突然変異を導入する別の方法は、ｖｏｎ Ｍｅｌｃｈｎｅｒら， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ６：９１９−９２７に記載されるように、ＦＨＩＴ遺伝子座に組み込まれるレトロウイルスに感染させて、変異型Ｆｈｉｔ対立遺伝子を作製することからなる。他の実施形態では、本発明の変異体は、ＦＨＩＴタンパク質をコードするＤＮＡ配列の一部を欠いており（すなわち欠失変異体）、おそらく欠損ＦＨＩＴ対立遺伝子が作製されることが好ましい。欠失変異体の追加的な特徴は、ｖｏｎ Ｍｅｌｃｈｎｅｒに教示される挿入変異体に関して、非変異型対立遺伝子への復帰の可能性が劇的に低くなることである。欠失変異体は、ＦＨＩＴ遺伝子のコード領域からＤＮＡ断片を除去して、ＦＨＩＴタンパク質の正しい折り畳みまたは基質結合を妨げることにより作製される。欠失の大きさは異なり得るが、一般的に、小さい欠失よりも大きい欠失が好ましい。なぜなら、大きい欠失はＦＨＩＴ活性の欠陥をより生じ易いからである。典型的に、欠失突然変異は、所与の遺伝子（非コード隣接領域を含む）の１塩基〜基本的には全塩基、の切除を伴う。あるいはまた、コード領域から、単一の塩基対、２つの塩基対、または３で割り切れない任意の数の塩基対を欠失させることにより、機能的ＦＨＩＴタンパク質を作製する上で悪影響を及ぼすであろうフレームシフト突然変異を生じる。後者の場合、ポリペプチド合成が、フレームシフト誘導終止コドンにより中断されるため、末端切断ポリペプチドが生成され得る。突然変異誘発および突然変異の全般的なレビューについては、”Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ”， 第４版， １９８９ （Ｄ． Ｓｕｚｕｋｉ， Ａ． Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ， Ｊ． ＭｉｌｌｅｒおよびＲ．Ｌｅｗｏｎｔｉｎ編）， Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｎ．Ｙ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。
【００４１】
ＦＨＩＴ遺伝子のコード領域中の単一の塩基対（または複数の塩基対）の変化はまた、アミノ酸変化を生じるものであれば、ＦＨＩＴタンパク質の正確な折り畳みを変化させて、Ｆｈｉｔ欠損を生じ得る突然変異を生じ得る。このようにして生成された単一アミノ酸変化はまた、ＦＨＩＴタンパク質の活性も変化させ得る。別の代替例は、ＦＨＩＴメッセンジャーＲＮＡの正しいスプライシングに影響するＦＨＩＴ遺伝子の非コード領域において欠失または他の突然変異を生成することである。このような突然変異は、野生型ＦＨＩＴメッセージと比べてエキソン全体またはいくつかのエキソンを欠く変異型ＦＨＩＴ転写産物を効果的に作製できる。別の代替例は、非コード調節領域を欠失させて、ＦＨＩＴ遺伝子の発現を低下させることである。欠失の好ましい大きさは、遺伝子の５’端付近にある約数百ヌクレオチドである。このような欠失は、３で割り切れない数のヌクレオチドをコード領域から除去して、同様にフレームシフト突然変異を生じることが好ましい。あるいはまた、プロモーター配列を、ＦＨＩＴ遺伝子の転写を減少させるように欠失または変化させてもよい。
【００４２】
遺伝子におけるコドン使用を変化させて、所与の遺伝子の発現を変化させることも可能である。このような変化は、その遺伝子産物のアミノ酸配列を保存しつつ、発現のレベルを上げるか、または下げるかする。
【００４３】
特定の遺伝子の発現を部分的または完全にノックアウトするために、アンチセンスポリヌクレオチドを含むアンチセンス導入遺伝子も採用され得る（ＨｅｌｅｎｅおよびＴｏｕｌｍｅ， １９９０， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｏｓｈｙｓ． Ａｃｔａ １０４９：９９；Ｐｅｐｉｎら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：７２５；ＳｔｏｕｔおよびＣａｓｋｅｙ， １９９０， Ｓｏｍａｔ． Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． １６：３６９；ならびにＭｕｎｉｒら， １９９０， Ｓｏｍａｔ． Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． １６：３８３）。
【００４４】
「アンチセンスポリヌクレオチド」とは、以下のようなポリヌクレオチドである：すなわち（１）参照標的配列（ＦＨＩＴ遺伝子の配列など）の全体または一部に相補的で、かつ、相補的標的配列（染色体遺伝子座ｍＲＮＡなど）に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。このような相補的アンチセンスポリヌクレオチドは、関連する標的配列への特異的ハイブリダイゼーションがポリヌクレオチドの機能的特性として保持される限り、ヌクレオチド置換、付加、欠失、または転位を含み得る。相補的アンチセンスポリヌクレオチドは、個々のｍＲＮＡ種に特異的にハイブリダイズし、ｍＲＮＡ種の転写および／もしくはＲＮＡプロセシング、ならびに／またはコード化ポリペプチドの翻訳を妨害または回避できるアンチセンスＲＮＡを含む（Ｃｈｉｎｇら， １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：１０００６−１００１０；Ｂｒｏｄｅｒら， Ａｎｎ． Ｉｎｔ． Ｍｅｄ １１３：６０４−６１８；Ｌｏｒｅａｕら， １９９０， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２７４：５３−５６；Ｈｏｌｃｅｎｂｅｒｇら， ＷＯ９１／１１５３５；ＷＯ９１／０９８６５；ＷＯ９１／０４７５３；ＷＯ９０／１３６４１；およびＥＰ ３８６５６３）。アンチセンス配列は、細胞中の１または複数の標的遺伝子配列と実質的に相補的な、少なくとも約１５の連続するヌクレオチドの長さ、通常は少なくとも２０〜３０ヌクレオチドの長さ、好ましくは約３０ヌクレオチドを上回る長さのポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、アンチセンス配列は、相補的標的配列と比べて、置換、付加または欠失を有し得るが、特異的なハイブリダイゼーションが保持される限り、ポリヌクレオチドは概ね遺伝子発現のアンチセンスインヒビターとして機能する。
【００４５】
本発明の目的のために、アンチセンス配列は、内因性ＦＨＩＴ標的遺伝子配列に相補的なものである。場合によっては、ＦＨＩＴ標的領域配列に対応するセンス配列は、特に転写を妨害することにより、発現を抑制するように機能し得る。あるいはまた、アンチセンスポリヌクレオチドは、一般に、転写後レベルでＦＨＩＴ発現を抑制する。
【００４６】
アンチセンスポリヌクレオチドが細胞中のポリペプチドの生成を阻害する場合、非ヒトトランスジェニック動物のＦＨＩＴタンパク質生成能力もさらに変化し得る。
【００４７】
アンチセンスポリヌクレオチドは、トランスジェニック多能性胚幹細胞に挿入された異種発現カセットから生成させることができ、これはその後、本明細書に記載するＦｈｉｔ欠損動物を作製するために使用され得る。
【００４８】
５．１  ＦＨＩＴ遺伝子配列
本発明は、相同組換えターゲティング構築物を用いた遺伝子ターゲティングにより不活化された少なくとも１つのＦＨＩＴ遺伝子座を有する非ヒト動物（例えば、非霊長類哺乳動物）を作製する方法を包含する。ターゲティング構築物中の相同クランプとして使用できるポリヌクレオチド配列が（例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベース、文献刊行物から、または日常的なクローニングおよび配列決定などにより）得ることができるという前提のもと、あらゆるＦＨＩＴ遺伝子を本発明の方法により機能的に破壊できる。典型的に、ＦＨＩＴ遺伝子配列は、ターゲティング構築物中の相同クランプとして使用されうる領域に隣接するＰＣＲプライマーを産生するための基礎として使用される。次いで、ＰＣＲプライマーは、高忠実度ＰＣＲ増幅（Ｍａｔｔｉｌａら， １９９１， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：４９６７；ＥｃｋｅｒｔおよびＫｕｎｋｅｌ， １９９１， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １：１７；米国特許第４，６８３，２０２号）により、好ましくはターゲティング構築物によりターゲティングされる非ヒト動物系統に由来する、ゲノムクローンライブラリー、またはゲノムＤＮＡの調製物からゲノム配列を増幅するために使用される。次いで、増幅されたＤＮＡを相同クランプおよび／またはターゲティング領域として使用する。従って、本質的にあらゆるＦＨＩＴ遺伝子をターゲティングするための相同クランプを、当技術分野および／または日常的なクローニングにより入手可能なヌクレオチド配列情報に基づいて容易に作製できる。ターゲティング構築物の構築および選択方法に関する全般的な原理は、Ｂｒａｄｌｅｙら， １９９２， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：５３４で概説されている。
【００４９】
５．２  ターゲティング構築物のためのＦｈｉｔ突然変異
ターゲティング構築物は、多能性幹細胞（マウス胚幹細胞など）に導入され得る。この場合、ターゲティング構築物は内因性ＦＨＩＴ遺伝子座の一部と相同的に組換えられ、突然変異（すなわち、挿入、欠失、再配置、配列置換、および／または点突然変異）を生じて、内因性ＦＨＩＴ遺伝子の機能的発現を妨げる。本発明の好ましい方法は、ターゲティングされた相同組換えにより、内因性ＦＨＩＴ遺伝子の必須構造的エレメントを欠失させることである。例えば、ターゲティング構築物は、内因性ＦＨＩＴ遺伝子と相同的に組換えられ、１つ以上のエキソンの実質的に全てにわたる部分を欠失させ、典型的には対応するエキソンを欠く置換領域を挿入することによりエキソン欠乏（ｅｘｏｎ−ｄｅｐｌｅｔｅｄ）対立遺伝子を生成することができる。（例えば、互いにヘテロ接合体の交配により）エキソン欠乏対立遺伝子についてホモ接合性となったトランスジェニック動物は、機能的内因性ＦＨＩＴ分子を本質的に発現できない。同様に、所望であれば、相同遺伝子ターゲティングを使用して、内因性ＦＨＩＴ遺伝子のエキソンの部分のみを欠失させることによりＦＨＩＴ遺伝子を機能的に破壊できる。またターゲティング構築物は、ＦＨＩＴ構造遺伝子の上流または下流に生じるが、ＦＨＩＴ遺伝子発現に関与する配列を含むＦＨＩＴ遺伝子の必須調節エレメント（プロモーター、エンハンサー、スプライス部位、ポリアデニル化部位、および他の調節配列など）を欠失するためにも使用できる。調節エレメントの欠失は、典型的に、相同二重交差組換えにより、対応する調節エレメントを欠く置換領域を挿入することにより達成される。
【００５０】
本発明の好ましい代替方法は、ポリヌクレオチド配列のターゲティングされた挿入により、内因性ＦＨＩＴ遺伝子の必須構造および／または調節エレメントを中断して、内因性ＦＨＩＴ遺伝子を機能的に破壊することである。例えば、ターゲティング構築物は、内因性ＦＨＩＴ遺伝子と相同的に組換えられ、非相同配列（ｎｅｏ発現カセットなど）を構造エレメント（例えばエキソン）および／または調節エレメント（例えば、エンハンサー、プロモーター、スプライス部位、ポリアデニル化部位など）に挿入して、挿入により中断されたターゲティングＦＨＩＴ対立遺伝子を作製できる。挿入された配列は、長い非相同置換領域を有するターゲティング構築物との相同遺伝子ターゲティングの効率に応じて制限され、約１ヌクレオチド（例えば、エキソン配列においてフレームシフトを生じさせる）〜数キロベース以上の大きさにわたり得る。
【００５１】
また本発明のターゲティング構築物は、内因性ＦＨＩＴ遺伝子の部分を外因性配列（すなわち、ターゲティング導入遺伝子の部分）で置換するためにも使用され得る；例えば、ＦＨＩＴ遺伝子の第５エキソンは、ナンセンスまたはミスセンス突然変異を含む実質的に同一の部分で置換され得る。
【００５２】
ＦＨＩＴ遺伝子座の不活化は、マウス胚幹細胞中の相同組換えによる遺伝子のターゲティングされた破壊により達成される。不活化のためには、標的ＦＨＩＴ遺伝子座において、該遺伝子座の機能的遺伝子産物の有効な発現を回避するような遺伝子変化を生じるあらゆるターゲティング構築物が採用され得る。調節エレメントのみがターゲティングされる場合、ターゲティングされた遺伝子のいくらかの低レベル発現が生じ得る（すなわちターゲティングされた対立遺伝子は「漏出性」である）が、発現レベルは漏出性のターゲティングされた対立遺伝子が機能的に破壊されているのに十分な程度に低くあり得る。
【００５３】
５．３  遺伝子ターゲティング
哺乳動物ゲノムを改変するために相同組換えを使用する方法である遺伝子ターゲティングを使用して、培養細胞に変化を導入することができる。胚幹（ＥＳ）細胞中の目的の遺伝子をターゲティングすることにより、これらの変化を実験動物の生殖細胞系列に導入して、他の使用の中でも特に生物全体に対する改変の影響を研究することができる。遺伝子ターゲティング手順は、組織培養細胞に、標的遺伝子座に相同的であり、意図する配列改変（例えば、挿入、欠失、点突然変異）を含むセグメントを有するＤＮＡターゲティング構築物を導入することにより達成される。次いで、処理された細胞は、正確なターゲティングについてスクリーニングされて、正確にターゲティングされたものを同定および単離する。ＥＳ細胞中での遺伝子ターゲティングによって遺伝子機能を破壊するための全般的なスキームは、ＥＳ細胞ゲノム中の染色体対応部分と相同組換えを生じるように設計されたターゲティング構築物を構築することである。ターゲティング構築物は、典型的には、追加の配列（陽性選択マーカーなど）を標的遺伝子のコードエレメントに挿入して、それを機能的に破壊するように配置される。通常、ターゲティング構築物は挿入型（「ノック・イン」）または置換型構築物（「ノックアウト」；Ｈａｓｔｙら， １９９１， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１：４５０９）である。
【００５４】
本発明のＦｈｉｔ欠損動物および細胞は、当技術分野でよく確立されているいくつかある技術のいずれによっても調製でき、これは上記引用したものなどが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉに発行された米国特許第５，４６４，７６４号に教示されるものと同様の技術を使用してもよい。一般的に、Ｆｈｉｔ欠損細胞は、以下のステップを使用して操作され得る：
（１）  クローニングベクター、および動物のＦＨＩＴ遺伝子の２つの領域または互いに同じ５’−３’配向にあるゲノム遺伝子座に隣接された少なくとも１つの陽性選択可能マーカー遺伝子（陽性選択マーカー）を含むＤＮＡ断片を含むターゲティングベクターを構築すること；
（２）  ターゲティングベクターには、相同領域の１つに隣接して陰性選択マーカー遺伝子（陰性選択マーカー）が含まれる。この陰性選択マーカーは、所望の相同組換え事象（ＦＨＩＴ遺伝子の一部を欠失させること）を回収する可能性を高め得るが、必要ではない；
（３）  ＦＨＩＴ＋／＋動物細胞を、ステップ（２）のターゲティングベクターでトランスフェクトすること；
（４）  ステップ（３）で得たトランスフェクトされた細胞を、ベクター上のマーカーについて選択すること；ならびに
（５）  ステップ（４）の細胞から、陽性選択マーカーを含むかまたは発現するが、陰性選択マーカーは発現しないことが見出されるＦｈｉｔ欠損動物細胞についてスクリーニングすること。
【００５５】
５．４  ターゲティング構築物
ステップ（１）のターゲティングベクターにおいて存在しなければならない厳密なＦＨＩＴ遺伝子または遺伝子座配列は、ＦＨＩＴ遺伝子座の改変のために選択される配列、および（２）突然変異体の操作において採用される制限ヌクレアーゼに依存するだろう。
【００５６】
ステップ（１）で必要となる相同性の特異的領域は、ターゲティングベクター中の欠失の特性に依存する。一般的に、ターゲティングベクター中で使用される相同領域は、好ましくは少なくとも約１００ ｂｐ、より好ましくは少なくとも約２５０〜５００ ｂｐ、より好ましくは少なくとも１０００ ｂｐ、そして最も好ましくは少なくとも約１．５ ｋｂ以上を含むことで、高い度合いのターゲティング効率を保証するだろう。
【００５７】
生成するＦｈｉｔ突然変異が欠失突然変異の場合、欠失の大きさも、ターゲティングベクターで使用する相同領域によって異なり、依存するだろう。非連続相同領域が欠失ターゲティングベクターにおいて使用されるため、相同領域の間に位置する野生型対立遺伝子における該領域は、ターゲティングベクターでの相同組換え後に欠失される領域を構成する。一般的に、ＦＨＩＴ遺伝子のエキソンの少なくとも一部、または全エキソンを欠失させることが好ましく、これにより対応して突然変異されたＦＨＩＴメッセンジャーＲＮＡが生じる。
【００５８】
本発明において採用される特定の陽性および陰性選択マーカーは、本発明の実施に当たって重要ではない。陽性選択可能マーカーは相同領域の間に位置し、陰性マーカーは、使用される場合には、相同領域の外側にある。相同領域は、一般的に、互いに対して同じ５’−３’配向でベクター中に存在する。逆に、陽性および陰性選択マーカーの相対的な配向は重要ではない。陰性選択マーカーを含むことは必要ではないが、陰性マーカーの存在により、ターゲティングされたクローンの選択が改善し得る。
【００５９】
陽性選択マーカーは、遺伝子改変のためにターゲティングされる細胞において発現されることが好ましい。陽性および／または陰性選択マーカーは、選択マーカーをコードするＤＮＡ配列が陽性または陰性表現型選択特徴のいずれかを、配列を発現する細胞に寄与することができる場合に、トランスフェクトされた細胞において機能的であると見なされる。一般的に、マーカーは、マーカーの発現を介在する調製配列に機能的に連結されるだろう。核酸マーカーは、別の核酸配列と機能的な関係に配置されている場合に「機能的に連結」されている。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響をもたらす場合にコード配列に機能的に連結されている。転写調節配列に関して、機能的に連結されているとは、連結されるＤＮＡ配列が連続することを意味する。
【００６０】
さらに、陽性選択マーカー遺伝子を機能的にする手段は、本発明にとって重要ではない。陽性選択は、細胞を、組み込まれた陽性選択マーカーを含まないかまたは発現しない細胞を殺すかまたは選択する適切な薬剤に曝露することにより達成される。陽性選択マーカー遺伝子は、その発現を駆動するプロモーターを有し得るか、または標的遺伝子座において陽性選択マーカーと転写エレメントが並置することにより駆動され得る。後者の遺伝子構成は、転写エレメントがトランスフェクトされた細胞において活性であることを必要とする。
【００６１】
陽性選択マーカーに加えて、ターゲティングベクター中に遺伝子操作される突然変異は、ＦＨＩＴ遺伝子相同領域の間に、欠失ＦＨＩＴ ＤＮＡの代わりにＤＮＡ配列（例えば、オリゴヌクレオチドリンカー）を含み得る。オリゴヌクレオチドリンカーは、通常、約８〜１０ヌクレオチドの長さであるが、より長くても（例えば約５０ヌクレオチド）、またはより短くても（例えば、４、５または７ヌクレオチド）よい。オリゴヌクレオチドリンカーの好ましい長さは、約２０〜４０ヌクレオチドの長さである。オリゴヌクレオチドリンカーのＤＮＡ配列は重要ではない。
【００６２】
ターゲティングベクターＤＮＡ中の相同領域の間にオリゴヌクレオチドを挿入する方法は、使用するオリゴヌクレオチドリンカーの種類に依存するだろう。オリゴヌクレオチド配列において１以上の制限ヌクレアーゼ部位を含むパリンドローム二本鎖リンカー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）は、周知の手順により挿入され得る（Ｍａｎｉａｔｉｓら， １９８２， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．）。
【００６３】
オリゴヌクレオチドリンカーを、末端トランスフェラーゼを用いて相補的ホモポリマーと端部を連結（ｔａｉｌｉｎｇ）させることによりプラスミドＤＮＡ中の欠失に挿入してもよいし（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前掲）、または切断プラスミドの３’側窪み（ｒｅｃｅｓｓｅｄ）付着末端および３’側突出付着末端に相補的な端部を含むオリゴヌクレオチドをアニーリングした後、オリゴヌクレオチド配列に相補的なギャップをＤＮＡポリメラーゼ（クレノウ断片）で埋めてつなぐことにより、一本鎖オリゴヌクレオチドリンカーをプラスミド中の欠失に挿入してもよい。その後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結させた後、閉環ＤＮＡ分子を再生させることができる。
【００６４】
あるいは、部位特異的突然変異誘発を使用し、一本鎖オリゴヌクレオチドを用いて、標的遺伝子の所望の領域を「ループ・アウト（ｌｏｏｐ−ｏｕｔ）」することにより、特異的な欠失を構築するのと同時に、リンカー配列を挿入してもよい（ＫｒｏｇｓｔａｄおよびＣｈａｍｐｏｕｘ， １９９０， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６４（６）：２７９６−２８０１）。
【００６５】
オリゴヌクレオチドリンカーの長さおよび配列を慎重に選択することにより欠失領域がエキソンを中断するようにターゲティングベクターが設計される場合、ＦＨＩＴ遺伝子内の欠失に加えて、フレームシフト突然変異および／または終止コドンをＦＨＩＴ遺伝子において生じさせることができる。
【００６６】
ターゲティングベクター中で操作される突然変異は、陽性選択マーカーに加えて、ＦＨＩＴ遺伝子相同領域の間にＤＮＡ配列（例えばスプライス受容配列）を含み得る。このような配列は、異常つまり非機能的なｍＲＮＡを生じることが示されている。
【００６７】
相同領域に使用されるＤＮＡ配列は、一般的に、ＦＨＩＴ遺伝子配列、ＦＨＩＴ遺伝子座に隣接する配列、またはそれらの組合せから誘導される。Ｆｈｉｔ欠損マウスが所望である場合、ＦＨＩＴ ＤＮＡを誘導するマウス系統は重要ではないが、遺伝子は遺伝子導入のためにターゲティングされる細胞と同じマウス系統から得られることが好ましい。標的細胞と同質遺伝子的なＤＮＡを（相同領域で）使用することにより、全般的に、遺伝子ターゲティングの効率が増強されるだろう。相同領域は、様々なクローニングベクター（λファージベクター、コスミドベクター、プラスミドベクター、ｐ１ファージベクター、酵母人工染色体ベクターなど）にクローニングされ得るマウスＤＮＡのゲノムライブラリーから誘導され得る。またターゲティングベクターに組み込まれる相同領域は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてゲノムＤＮＡからも誘導され得る。このようにして誘導された相同領域は、ターゲティングベクターに直接サブクローニングされ得る。あるいは、相同領域は、適切なｃＤＮＡライブラリーから誘導され得る。
【００６８】
５．４．１  ターゲティングベクター
幅広い種類のクローニングベクターのいずれかを使用して、本発明のＦＨＩＴターゲティングベクターを構築してよい。このようなクローニングベクターの例としては、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２２に基づくベクター（Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ， １９８３， Ｇｅｎｅ ２１：２６７）、ｐＭＢ９、ｐＢＲ３２５、ｐＫＨ４７（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ｐＢＲ３２８、ｐＨＣ７９、ファージシャロン（Ｃｈａｒｏｎ）２８（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ｐＫＢ１１、ｐＫＳＶ−１０（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、およびオリゴヌクレオチド（ｄｇ）付加（ｔａｉｌｅｄ）ｐＢＲ３２２（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔまたは類似のプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＫ１９または関連プラスミド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｐＵＣシリーズのプラスミド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｐＧＥＭシリーズのプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６９】
上記考察したように、ターゲティングベクターは、一般的に、陽性選択マーカーにより離れた２つのＦＨＩＴ相同領域、および任意に隣接する陰性選択マーカー（クローニングベクターが選択可能な特徴（例えば、薬剤耐性）を発現する遺伝子を含む限り重要ではない）を含むだろう。またターゲティングベクターは、λファージベクター、コスミドベクター、プラスミドベクター、ｐ１ファージベクター、酵母人工染色体ベクターなど他のクローニングベクターにもクローニングされ得る。
【００７０】
別の選択は、ターゲティングベクターの構成要素をＰＣＲにより合成的に調製し、陽性選択マーカーが相同領域の間に位置し、相同領域が互いに対して正確な配向で位置されるように、それぞれの構成要素を単純に連結させることである。
【００７１】
ＦＨＩＴ遺伝子を含む断片を産生するために、種々の制限ヌクレアーゼのいずれかを採用してもよい。従って、ＦＨＩＴ遺伝子制限マップは、本発明を都合よく実施するために幅広い種類のクローニングベクターが使用できるという指針を提供することができる。実際、制限エンドヌクレアーゼの多くの組合せが、ＦＨＩＴターゲティングベクターを作製して、ＦＨＩＴ遺伝子を突然変異させるために使用できる。例えば、マウスＦＨＩＴ遺伝子における適切な制限部位はＢａｍＨ１である。
【００７２】
本発明のターゲティングベクターを増殖させるために使用する具体的な宿主は重要ではないが、宿主は機能的ｈｓｄ改変系を有することが好ましいだろう。このような宿主の例としては、大腸菌Ｋ１２ ＲＲ１（Ｂｏｌｉｖａｒら， １９７７， Ｇｅｎｅ ２：９５）；大腸菌Ｋ１２ ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ３３６９４）；大腸菌ＭＭ２１（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ３３６７８０）；および大腸菌ＤＨ１（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ３３８４９）が挙げられる。本発明において好ましい宿主は、大腸菌株ＤＨ５α（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。同様に、大腸菌もしくはサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、または両方において増殖するターゲティングベクター、または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｕｓ）において増殖するプラスミドベクターなどの代替的なベクター／クローニング系を採用してもよい（Ｕｒｅら， １９８３， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」， ｖｏｌ． １０１， Ｐａｒｔ Ｃ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．）。
【００７３】
５．５  ＦＨＩＴの誘導可能で、かつ組織および発達段階特異的なターゲティング
本発明の特定の実施形態では、ＦＨＩＴトランスジェニック動物におけるＦｈｉｔ欠損は、特定の発達段階または特定の組織に限定される。別の実施形態では、ＦＨＩＴトランスジェニック動物またはＦＨＩＴトランスジェニック動物由来の細胞におけるＦｈｉｔ欠損が誘導可能である。
【００７４】
Ｆｈｉｔ欠損が一時的にまたは発達的に調節されることが望ましい場合、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ系を採用してもよい。Ｃｒｅ−Ｌｏｘ系は、ＦＨＩＴ遺伝子を特定の発達段階または特定の組織で活性化または不活化するために使用され得る。一般的に、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ技術を利用する方法は、ＴｏｒｒｅｓおよびＫｕｈｎ， １９９７，「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ」， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓに記載されるように実施される。Ｃｒｅ−Ｌｏｘ系について記載されているものと同様の方法論が、ＦＬＰ−ＦＲＴ系を用いて採用できる。
【００７５】
特定の発達段階または特定の組織におけるＦＨＩＴ遺伝子発現の不活化のために、本明細書に記載する方法に従って、ＦＨＩＴコード領域を、ＬｏｘＰ部位が隣接するコード領域を含むカセットで置き換える。ＬｏｘＰ部位は、Ｃｒｅリコンビナーゼの標的である。得られるトランスジェニック動物は、空間的および／または時間的に調節されたプロモーターの制御下でＣｒｅリコンビナーゼを発現している別のトランスジェニック動物と交配（ｃｒｏｓｓ）させる。Ｃｒｅ発現が活性化された場合、ＬｏｘＰ部位は、組換えを生じて、ＦＨＩＴコード領域を切除して、Ｆｈｉｔ欠損組織をもたらす。
【００７６】
選択された組織および特定の発達段階におけるＦＨＩＴ発現の活性化のために、ターゲティング構築物における相同領域は、ＬｏｘＰ部位が隣接する全てのリーディングフレームにおいて複数の終止コドンを含む挿入断片を含むプロモーター配列である。このターゲティング構築物をＦＨＩＴプロモーターに挿入する際に、ＦＨＩＴタンパク質は産生されない。得られるトランスジェニック動物を、空間的および／または時間的に調節されたプロモーターの制御下でＣｒｅリコンビナーゼを発現している別のトランスジェニック動物と交配させる。Ｃｒｅ発現が活性化された場合、ＬｏｘＰ部位は、組換えを生じて、終止コドンを切除し、ＦＨＩＴ遺伝子を未破壊状態に戻す。
【００７７】
誘導可能なＦＨＩＴ活性化または不活化のために、Ｔｅｔオペレーターを天然型ＦＨＩＴ調節エレメントと置き換えるかまたは挿入して、ＦＨＩＴ遺伝子が、テトラサイクリン制御可能トランスアクチベーター（ｔＴＡ）およびテトラサイクリン制御可能リプレッサー（ＴｅｔＲ）（それぞれ、テトラサイクリンの存在下のみで転写を活性化または抑制できる）の制御下に置かれるようにできる。次いで、ＦＨＩＴ遺伝子においてＴｅｔプロモーターを含むトランスジェニック動物は、例えばｒＴＡまたはＴｅｔＲを構成的に発現する動物と交配され、テトラサイクリンを動物に投与することでＦＨＩＴ発現を誘導または抑制する。あるいは、トランスジェニック動物由来の培養細胞を産生して、細胞をｒＴＡまたはＴｅｔＲ発現構築物でトランスフェクトし、培養物をテトラサイクリンと接触させて、ＦＨＩＴ発現を誘導または阻害できる。さらなる詳細については、米国特許第５，９２２，９２７号を参照のこと。
【００７８】
５．６  前駆体細胞
本発明において突然変異される具体的な非ヒト動物細胞は重要ではない；しかし、前駆体細胞または少なくとも多能性細胞であることが好ましい。前駆体という用語は、多能性細胞が、本発明の所望のトランスフェクトされた多能性細胞の前駆体であることを意味する。確立された技術を用いて、多能性細胞をｉｎ ｖｉｖｏで培養して、突然変異型動物を形成してもよい（Ｅｖａｎｓら， １９８１， Ｎａｔｕｒｅ ２９２：２９２−１５６）。
【００７９】
突然変異される細胞がマウス細胞である場合、本発明において採用できるマウス細胞の例としては、ＲＷ４、ＡＢ１（ｈｐｒｔ−細胞系）、またはＡＢ２．１（ＡＢ １、ｈｐｒｔ＋細胞系）などの胚幹（ＥＳ）細胞（好ましくはＥＳ細胞の一次単離物）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８０】
本質的にＥＫ．ＣＣＥ細胞系またはＥＳ細胞について一般的に記載されているように、ＥＳ細胞の一次単離物は、胚から直接得てもよい。本発明において採用する具体的な胚幹細胞は重要ではない。
【００８１】
ＥＳ細胞は、「Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ」， Ｅ．Ｊ． Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（Ｏｘｆｏｒｄ： ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）， ｐｐ． ７１−１１２に掲載のＲｏｂｅｒｔｓｏｎ， １９８７に記載されるように、間質細胞（例えば、ＳＴＯ細胞および／または一次胚繊維芽細胞）上で培養されることが好ましい。間質（および／または繊維芽）細胞は、異常なＥＳ細胞のクローン生成（ｃｌｏｎａｌ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）の減少に役立つ。
【００８２】
突然変異型ＦＨＩＴ遺伝子（インフレーム終止コドンを生じる置換突然変異を含むＦＨＩＴ遺伝子など）を有するＥＳ細胞は、いくつかの方法により選択できる。まず、選択マーカー（例えば、ｎｅｏ、ｇｐｔ、ｔｋ）を、ターゲティング構築物において（例えば、イントロンまたは隣接配列中の）異種ＦＨＩＴ遺伝子に連結して、置換対立遺伝子を有する細胞について選択し得るようにしてもよい。ほとんどの場合、ＦＨＩＴ遺伝子ターゲティング構築物は、陽性選択発現カセットおよび陰性選択発現カセットの両方を含んで、陽性−陰性選択スキームにより相同的にターゲティングされた細胞について選択できるようにし得る。（Ｍａｎｓｏｕｒら， １９８８， Ｎａｔｕｒｅ ３３６： ３４８）。一般的に、陽性選択発現カセットは異種ＦＨＩＴ遺伝子置換領域のイントロン領域に位置し、一方、陰性選択発現カセットは相同クランプから離れて位置することで、二重交差相同組換えにより陽性選択カセットの組込みおよび陰性選択カセットの損失を生じさせるだろう。
【００８３】
他の実施形態では、ターゲティング構築物の導入は、前核注射により達成される。前核注射のために好ましい前駆体細胞型は受精した卵母細胞である。
【００８４】
５．７  ターゲティング構築物
いくつかの遺伝子ターゲティング技術が記載されており、以下のものが挙げられるがこれらに限定されない：同時エレクトロポレーション、「ヒット・アンド・ラン（ｈｉｔ−ａｎｄ−ｒｕｎ）」、一重交差組込み、および二重交差組換え（Ｂｒａｄｌｅｙら， １９９２， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：５３４）。本発明は、本質的に当技術分野で公知のあらゆる適用可能な相同遺伝子ターゲティングストラテジーを用いて実施できる。ターゲティング構築物の構成は、選択される具体的なターゲティング技術に依存する。例えば、一重交差組込みまたは「ヒット・アンド・ラン」型ターゲティングのためのターゲティング構築物は、単一の相同クランプのみがターゲティング領域に連結されることを必要とするが、二重交差置換型ターゲティング構築物は、２つの相同クランプ（それぞれ置換領域の片側に隣接する）を必要とする。
【００８５】
限定しない例として、好適な実施形態は、以下のものをこの順番で含むターゲティング構築物である：（１）内因性ＦＨＩＴ遺伝子のエキソンの上流（すなわち、ＦＨＩＴ遺伝子エキソンの翻訳リーディングフレームと逆方向に）約３キロベース以内にある配列と実質的に同一の配列を有する第１の相同クランプ、（２）ｎｅｏ遺伝子の転写を駆動するｐｇｋプロモーターを有する陽性選択カセットを含む置換領域、（３）前記内因性ＦＨＩＴ遺伝子の前記エキソンの下流約３キロベース以内にある配列と実質的に同一の配列を有する第２の相同クランプ、および（４）ＨＳＶ ｔｋ遺伝子の転写を駆動するＨＳＶ ｔｋプロモーターを含む陰性選択カセット。このようなターゲティング構築物は、前記エキソンにわたる内因性ＦＨＩＴ遺伝子座の部分を欠失させ、陽性選択カセットを有する置換領域で置き換える二重交差置換組換えに適している。欠失されたエキソンが、機能的ＦＨＩＴ遺伝子産物の発現のために必須であれば、得られるエキソン欠乏対立遺伝子は機能的に破壊されており、ヌル対立遺伝子と称される。
【００８６】
本発明のターゲティング構築物は、ポリヌクレオチド連結（すなわちホスホジエステル結合）を介してターゲティング領域に連結した少なくとも１つの相同クランプを含む。相同クランプは、非ヒト宿主動物の予め決められた内因性ＦＨＩＴ遺伝子配列に実質的に対応するか、または実質的に相補的な配列を有し、予め決められたＦＨＩＴ遺伝子に隣接する配列を含み得る。
【００８７】
遺伝子ターゲティングのための組換え生成性（ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃ）相同クランプについては大きさの下限も上限も当技術分野で決定的に決められていないが、相同クランプの最良な様式としては約５０塩基対〜数十キロベースであると考えられている。それゆえ、ターゲティング構築物は、通常、少なくとも約５０〜１００ヌクレオチドの長さ、好ましくは少なくとも約２５０〜５００ヌクレオチドの長さ、より好ましくは少なくとも約１０００〜２０００ヌクレオチドの長さ、またはそれ以上の長さである。構築物相同領域（相同クランプ）は、通常少なくとも約５０〜１００塩基の長さ、好ましくは少なくとも約１００〜５００塩基の長さ、より好ましくは少なくとも約７５０〜２０００塩基の長さである。約７〜８キロベースの長さの相同領域が好ましいと考えられており、好ましい一実施形態では、約７キロベースの第１の相同領域が置換領域の一方の側に隣接し、約１キロベースの第２の相同領域が該置換領域の他方の側に隣接する。相同領域の相同性（実質的な同一性）の長さは、予め決められた内因性ＦＨＩＴ遺伝子標的配列の配列組成および複雑性、ならびに当技術分野で提供されているガイダンス（Ｈａｓｔｙら， １９９１， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１：５５８６；Ｓｈｕｌｍａｎら， １９９０， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０：４４６６）に基づき実施者の裁量により選択し得る。ターゲティング構築物は、ＦＨＩＴ遺伝子配列などの予め決められた内因性ＦＨＩＴ遺伝子配列（例えば、エキソン配列、エンハンサー、プロモーター、イントロン配列、またはＦＨＩＴ遺伝子の約３〜２０ ｋｂ以内にある隣接配列）に実質的に対応するか、または実質的に相補的な配列を有する少なくとも１つの相同領域を有する。このようなターゲティング導入遺伝子相同領域は、実質的に同一の内因性ＦＨＩＴ遺伝子配列との相同的な対合および組換えのための鋳型として機能する。ターゲティング構築物においては、このような相同領域は、典型的に、ターゲティングされた内因性ＦＨＩＴ遺伝子配列と置き換わるターゲティング構築物の領域である置換領域に隣接する（Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎら， １９９２， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １２：３６０、参照により本明細書に組み入れる）。従って、相同領域に隣接するターゲティング構築物のセグメントは、二重交差相同組換えにより内因性ＦＨＩＴ遺伝子配列のセグメントに置き換わることができる。相同領域およびターゲティング領域は、従来の線状ポリヌクレオチド連結（５’−３’ホスホジエステル骨格）により共に連結している。ターゲティング構築物は、通常二本鎖ＤＮＡ分子であり、殆どの場合線状である。
【００８８】
相同組換えまたは遺伝子変換のいずれの特定の理論に縛られることを望むものではないが、このような二重交差置換組換えにおいては、第１のターゲティング構築物相同領域と第１の内因性ＦＨＩＴ遺伝子配列との間の第１の相同組換え（例えば、鎖交換、鎖対合、鎖切断、鎖連結）は、第２のターゲティング構築物相同領域と第２の内因性ＦＨＩＴ遺伝子配列との間の第２の相同組換えを伴って、第１および第２の内因性ＦＨＩＴ遺伝子配列の間に位置した内因性ＦＨＩＴ遺伝子の部分に置き換わり２つの相同領域の間に位置したターゲティング構築物の部分を生じると考えられている。このために、相同領域は、通常、同じ配向（すなわち、再配置を回避するために導入遺伝子のそれぞれの相同領域について上流方向が同じ）で使用される。従って、二重交差置換組換えを使用して、内因性ＦＨＩＴ遺伝子の部分を欠失させ、同時に非相同部分（例えば、ｎｅｏ遺伝子発現カセット）を対応する染色体位置に導入できる。また二重交差組換えを使用して、内因性染色体部分を欠失させずに非相同部分を内因性ＦＨＩＴ遺伝子に付加することもできる。しかし、また二重交差組換えは、非相同部分を内因性ＦＨＩＴ遺伝子に導入することなく、単純に内因性遺伝子配列の部分を欠失するためにも採用できる（Ｊａｓｉｎら， １９８８， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌ． ２：１３５３を参照）。非相同部分の上流および／または下流には、二重交差相同組換えが生じたか否かの識別を提供する遺伝子が存在してもよい；このような遺伝子は典型的に、陰性選択に使用され得るＨＳＶ ｔｋ遺伝子である。
【００８９】
典型的に、本発明のターゲティング構築物は、内因性ＦＨＩＴ遺伝子を機能的に破壊するために使用され、ｎｅｏなどの選択マーカーをコードする発現カセットを含む非相同配列により分離した少なくとも２つの相同領域を含む（ＳｍｉｔｈおよびＢｅｒｇ， １９８４， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ４９： １７１；ＳｅｄｉｖｙおよびＳｈａｒｐ， １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８６：２２７；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ， １９８７， ｃｅｌｌ ５１：５０３、これらは参照により本明細書に組み入れる）。しかし、本発明のいくつかのターゲティング導入遺伝子は、非相同配列の片側のみに隣接する相同領域を有し得る。本発明のターゲティング導入遺伝子はまた、当技術分野でいう「ヒット・アンド・ラン」または「イン・アンド・アウト（ｉｎ−ａｎｄ−ｏｕｔ）」型導入遺伝子という種類のものであり得る（ＶａｌａｎｃｉｕｓおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ， １９９１， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１：１４０２；Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒら （１９９２） Ｎａｔｕｒｅ ３５６：２１５； （１９９１） Ｊ． ＮＩＨ Ｒｅｓ． ３：５９；これらは参照により本明細書に組み入れる）。
【００９０】
陽性選択発現カセットは、陽性選択発現カセットにわたるターゲティング導入遺伝子配列を組み込んだ細胞を選択する手段を提供する選択可能マーカーをコードする。陰性選択発現カセットは、陰性選択発現カセットの組込みコピーを持たない細胞を選択する手段を提供する選択マーカーをコードする。従って、組合せ陽性−陰性選択プロトコールによれば、陽性マーカーの存在および陰性マーカーの不在について選択することで、相同置換組換えを経て相同領域の間の導入遺伝子の部分（すなわち置換領域）が染色体位置に組み込まれた細胞を選択できる。また選択可能マーカーは、典型的に、ヒット・アンド・ラン型ターゲティング構築物および選択スキームのためにも使用される（ＶａｌａｎｃｉｕｓおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ， １９９１， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１：１４０２）。
【００９１】
発現カセットは、典型的に、ターゲティングされた宿主細胞（例えば、ＥＳ細胞）において、ターゲティングされた宿主細胞上に選択可能表現型を与えるタンパク質またはポリペプチドをコードする構造配列に機能的に連結したプロモーター、およびポリアデニル化シグナルを含む。発現カセットに含まれるプロモーターは、構成的、細胞型特異的、段階特異的、および／または（例えば、グルココルチコイドなどのホルモンにより（ＭＭＴＶプロモーター））モジュレート可能であるが、選択の前および／または間に発現される。発現カセットは、典型的にプロモーターの上流で約３〜１０キロベース以内に連結した１つ以上のエンハンサーを任意に含むことができる。しかし、ターゲティングされた内因性部位における相同組換えが非相同配列を機能的内因性プロモーターの下流に配置した場合、ターゲティング構築物置換領域は選択マーカーをコードする構造配列のみを含んで、内因性プロモーターが転写を駆動するのに依存し得る（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８５：８５８３）。同様に、エンハンサーのない導入遺伝子構築物における導入遺伝子配列の転写を増強するために、ターゲティングされた内因性部位付近に位置する内因性エンハンサーに依存し得る。本発明の好ましい発現カセットは、薬剤耐性選択マーカーおよび／またはＨＳＶチミジンキナーゼ酵素をコードしおよび発現する。適切な薬剤耐性遺伝子としては、例えば以下のものが挙げられる：ミコフェノール酸で選択できるｇｐｔ（キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）；Ｇ４１８またはハイグロマイシンで選択できるｎｅｏ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）；およびメトトレキセートで選択できるＤＦＨＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ （１９８１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ７８：２０７２；ＳｏｕｔｈｅｒｎおよびＢｅｒｇ （１９８２） Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． １：３２７；これらは参照により本明細書に組み入れる）。
【００９２】
正確にターゲティングされた組換え体についての選択は、通常非相同発現カセットが内因的に組み込まれた発現カセットを有するターゲティングされた細胞に選択可能な表現型を与える機能的タンパク質（例えば、ｎｅｏまたはｇｐｔ）をコードしおよび発現する陽性選択を少なくとも採用し、選択剤（例えば、Ｇ４１８またはミコフェノール酸）の添加により、このようなターゲティングされた細胞が組み込み発現カセットを持たない細胞に比べて増殖的または生存的な利点をもつようにする。
【００９３】
正確にターゲティングされた相同組換え体についての選択は陰性選択も採用して、導入遺伝子の非相同組込みのみを担持する細胞に対して選択することが好ましい。典型的に、このような陰性選択は、導入遺伝子に位置して非相同組換えのみにより組込みを行う単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ ｔｋ）をコードする発現カセットを採用する。このような位置付けは、通常、ＨＳＶ ｔｋ発現カセット（または他の陰性選択カセット）を組換え生成性相同領域から離して連結し、相同領域の二重交差置換組換えにより陽性選択発現カセットは染色体位置に導入されるが、ＨＳＶ ｔｋ遺伝子（または他の陰性選択カセット）は染色体位置に導入されないようにすることにより達成される。ＨＳＶ ｔｋを発現する細胞に対して優先的に毒性なヌクレオシド類似体であるガンシクロビル（ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）は、組込みＨＳＶ ｔｋ発現カセットを持たない細胞について選択するため、陰性選択剤として使用できる。ＦＩＡＵも、ＨＳＶ ｔｋを欠く細胞について選択するための選択剤として使用できる。
【００９４】
不正確に組み込まれたターゲティング構築物配列を有する細胞のバックグラウンドを低下させるために、組合せ陽性−陰性選択スキームを使用できる（Ｍａｎｓｏｕｒら， １９８８， Ｎａｔｕｒｅ ３６６：３４８）。陽性−陰性選択は、２つの活性な選択カセットの使用を含む：（１）ランダム組込みまたは相同ターゲティングのいずれかの後に安定して発現することができる陽性のもの（例えばｎｅｏ遺伝子）、および（２）ランダム組込みの後にのみ安定して発現し、正確にターゲティングされた二重交差相同組換え後には発現することができない陰性のもの（例えば、ＨＳＶ ｔｋ遺伝子）。陽性および陰性選択ステップの両方を組み合わせることにより、導入遺伝子と内因性ＦＨＩＴ遺伝子との間の正確にターゲティングされた相同組換えを有する宿主細胞を得ることができる。
【００９５】
一般的に、本発明のターゲティング構築物は以下のものを含むことが好ましい：（１）宿主細胞内因性ＦＨＩＴ遺伝子配列と実質的に同一である２つの相同領域に隣接された陽性選択発現カセット、および（２）遠位陰性選択発現カセット。しかし、陽性選択発現カセットのみを含むターゲティング構築物も使用できる。典型的に、ターゲティング構築物は、ＨＳＶ ｔｋプロモーターまたはｐｇｋプロモーターなどのプロモーターの下流に（すなわち、翻訳リーディングフレーム配向でコードされるポリペプチドのカルボキシ末端に向かって）連結したｎｅｏ遺伝子を含む陽性選択発現カセットを含むだろう。より典型的には、またターゲティング導入遺伝子は、ＨＳＶ ｔｋプロモーターの下流に連結したＨＳＶ ｔｋ遺伝子を含む陰性選択発現カセットも含むだろう。例えば、本発明を限定するものではないが、本発明の典型的な陽性−陰性ＦＨＩＴターゲティング構築物の模式的な説明を図４に示す。
【００９６】
本発明のターゲティング構築物は、予め決められた標的内因性ＤＮＡ配列に対して高度に相同的、好ましくは同質遺伝子的（すなわち同一配列）である相同領域を有することが好ましい。同質遺伝子的またはほぼ同質遺伝子的である配列は、遺伝子ターゲティング手順で使用するＥＳ細胞の供給源である非ヒト動物系統由来のゲノムＤＮＡのゲノムクローニングまたは高忠実度ＰＣＲ増幅により得てもよい。典型的に、本発明のターゲティングポリヌクレオチドは、少なくとも約５０ヌクレオチドの長さの相同領域を少なくとも１つ有し、該相同領域は好ましくは少なくとも約７５〜１００ヌクレオチドの長さ、より好ましくは少なくとも約２００〜２０００ヌクレオチドの長さであるが、相同領域とターゲティングされた配列との間の配列相同性の程度、およびターゲティングされた配列の塩基組成により最適かつ最小限の相同領域の長さが決まるだろう（例えば、ＧＣ富化配列は、典型的に熱力学的により安定しており、通常より短い相同領域の長さを必要とするだろう）。従って、相同領域の長さおよび配列相同性の程度の両方は特定の予め決められた配列を参照してのみ決定できるが、相同領域は、通常、少なくとも約５０ヌクレオチドの長さで、かつまた予め決められた内因性標的配列に実質的に対応または実質的に相補的でなければならない。相同領域は、少なくとも約１００ヌクレオチドの長さであり、ＦＨＩＴ遺伝子中にあるか、ＦＨＩＴ遺伝子に隣接する予め決められた標的配列と同一または相補的であることが好ましい。正確にターゲティングされた相同組換え体が高効率で生成されることが所望である場合、少なくとも１つの相同領域が同質遺伝子的であること（すなわち、内因性ＦＨＩＴ遺伝子の交差標的配列と厳密な配列同一性を有すること）が好ましく、ターゲティングされた内因性ＦＨＩＴ配列に置き換わる外因性ターゲティング構築物配列と同質遺伝子的である相同領域が隣接することがより好ましい。
【００９７】
一般的に、所定の内因性ＦＨＩＴ遺伝子配列を有する哺乳動物細胞中の、該所定の内因性ＦＨＩＴ遺伝子座配列に実質的に対応するか、または実質的に相補的である少なくとも１つの相同領域を有するターゲティング導入遺伝子を用いた相同組換え（遺伝子変換を含む）により、任意の所定の内因性ＦＨＩＴ遺伝子座を改変できる。典型的に、ターゲティング導入遺伝子は、単一ミスマッチヌクレオチドの小ささであっても、または約数キロベース以上の非相同配列にわたってもよい、予め選択された内因性標的ＦＨＩＴ配列に存在しない配列を有する部分（すなわち、非相同部分）を含む。一般的に、このような非相同部分は、両側が相同領域に隣接しているが、（例えば、挿入導入遺伝子において）単一の隣接相同領域を使用してもよい。非相同部分は、所定の内因性標的ＦＨＩＴ遺伝子配列において挿入、欠失、および／もしくは置換を生じるように、ならびに／または所定の内因性標的ＤＮＡ配列において１個もしくは複数のヌクレオチド置換を生じるように使用し、得られる組換え配列（すなわち、機能的に破壊された内因性ＦＨＩＴ遺伝子）がターゲティング構築物の非相同部分の配列情報を取り込むようにする。置換、付加および欠失は、１ヌクレオチドの小ささであってもよいし、または約２〜１０キロベース以上にわたっていてもよい。ターゲティング導入遺伝子の好ましい非相同部分は、染色体位置に導入され、安定して複製され、選択剤（例えば、Ｇ４１８）により選択され得る薬剤耐性選択マーカー（例えば、ｎｅｏ遺伝子）である。ターゲティング導入遺伝子は、細胞（マウスＥＳ細胞など）中の１つ以上のＦＨＩＴ遺伝子を不活化するために使用することができ、このような不活化遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物を作製し得る。
【００９８】
改変されるべき特定のＦＨＩＴ遺伝子を選択した後、それらの配列に関し可能性のある破壊部位（例えば、第２および第３エキソンにわたるマウスＦＨＩＴ遺伝子のセグメント）について調べた。プラスミドは、目的のＦＨＩＴ遺伝子に欠失または挿入を有する適切な大きさの構築置換配列、および内因性標的ＤＮＡ配列に実質的に対応するかまたは実質的に相補的な少なくとも１つの隣接相同領域を含むように操作する。典型的に、２つの隣接相同領域を、置換領域配列の各側にそれぞれ使用する。例えば、本発明を限定するものではないが、１つの相同領域は、上流にある（すなわち、マウスＦＨＩＴ第２エキソンの転写開始部位に向かう方向の）配列に実質的に同一であり得、第２の相同領域は、マウスＦＨＩＴ第３エキソンの下流にある配列に実質的に同一であり得る。本発明の好適な方法は、宿主胚盤胞への注射後にトランスジェニック非ヒト動物を作製するのに使用できる多能性幹細胞系に、ターゲティング導入遺伝子を導入することである。本発明の特に好適な実施形態は、陽性（例えば、ｎｅｏ）、および任意に陰性（例えば、ＨＳＶ ｔｋ）選択発現カセットの両方を含む、ＦＨＩＴ遺伝子ターゲティング構築物である。ＦＨＩＴターゲティング導入遺伝子は、エレクトロポレートされたＥＳ細胞を継続して生存させるために、適切な条件下で（例えばエレクトロポレーションにより）マウスＥＳ細胞に導入する。エレクトロポレートされたＥＳ細胞は、陽性選択のための選択的条件下（例えば、Ｇ４１８の選択的濃度）で培養し、任意に陰性選択のための選択的条件下（ガンシクロビルまたはＦＩＡＵの選択的濃度）で、同時にまたは順番に培養する。次いで、標準的ＰＣＲによるＰＣＲ分析または当該分野で公知のサザンブロッティング法（米国特許第４，６８３，２０２号；Ｅｒｌｉｃｈら， １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２： １６４３）により、正確にターゲティングされた導入遺伝子組換えを有するか否かについて、選択された細胞を検証する。次いで、正確にターゲティングされたＥＳ細胞を、適切な胚盤胞宿主に導入して、当該分野で公知の方法に従ってキメラトランスジェニック動物を作製する（Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｍ．， １９８９， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ５： ７０）。
【００９９】
簡単に言うと、本発明は、生殖細胞組織に分化可能な多能性細胞系における相同組換えによる、ＦＨＩＴ遺伝子（ほとんどの場合ＦＨＩＴ遺伝子）の不活化を含む。改変されたマウスＦＨＩＴ遺伝子のコピー（例えばＦＨＩＴ遺伝子）を含むＤＮＡ構築物を、胚幹細胞の核に導入する。細胞の一部分において、導入されたＤＮＡはマウス遺伝子の内因性コピーと組換えられ、改変コピーと置き換わる。その新たに操作された遺伝子損傷（ｌｅｓｉｏｎ）を含む細胞を宿主マウス胚に注射し、これをレシピエントのメスに再移植する。これらの胚の一部は、変異型細胞系に由来する生殖細胞を有するキメラマウスに発達する。従って、キメラマウスを育成することにより、導入された遺伝子損傷を含む新しいマウス系統を得ることができる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｍ．， １９８９， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ５：７０により検討されている）。
【０１００】
マウスＦＨＩＴ遺伝子を破壊するために、マウスβ２−ミクログロブリン遺伝子を首尾よく破壊するためのＪａｅｎｉｓｃｈおよび共同研究者ら（Ｚｊｉｌｓｔｒａら， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８）の設計に基づくターゲティング構築物を使用できる。プラスミドｐＭＣＩＮＥＯから得たネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）を、標的ＦＨＩＴ遺伝子のコード領域に挿入する。ｐＭＣＩｎｅｏ挿入物にはハイブリッドウイルスプロモーター／エンハンサー配列を使用し、ｎｅｏ発現を駆動する。このプロモーターは、胚幹細胞において活性である。従って、ｎｅｏを、ターゲティング構築物の組込み用の選択マーカーとして使用できる。ＨＳＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を、ランダムな挿入事象に対する陰性選択マーカーとして、構築物の端部に付加する（Ｚｊｉｌｓｔｒａら， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４２： ４３５−４３８）。
【０１０１】
ターゲティング構築物を含むベクターは、典型的に、大腸菌において成長させてから、標準的分子生物学的方法を用いて単離するか、またはオリゴヌクレオチドとして合成することができる。原核生物または真核生物ベクターを必要としない直接標的不活化も行い得る。ターゲティング導入遺伝子は、任意の適切な技術（とりわけ、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、パーティクルガン（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）、リン酸カルシウム沈降、およびウイルス利用ベクターが挙げられる）により、宿主細胞に導入できる。哺乳動物細胞を形質転換させる他の方法としては、ポリブレン、プロトプラスト融合法などの使用が挙げられる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， １９８９， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．を全般的に参照のこと）。
【０１０２】
改変された標的遺伝子配列のみを含むがベクター配列は含まない線状化導入遺伝子を用いるトランスフェクション技術を使用することが好ましい。改変された遺伝子部位は、注意深く選択されたプライマーおよびＰＣＲまたはサザンブロット分析を使用し、次いで、所望の標的事象に特異的なＰＣＲ産物またはサザンブロットバンドが存在するか否かを分析することにより、外因性ターゲティング構築物と内因性ＤＮＡ標的配列との相同組換えが識別できるようなものである（Ｅｒｌｉｃｈら， １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２： １６４３）。例えば、以下の６．２節および図１に記載するように、マウスＦＨＩＴ遺伝子座のターゲティングされた破壊により、５ ｋｂ野生型対応部分に対して８．７ ｋｂ ＢａｍＨ１断片が生じる。ＢａｍＨ１で消化されたゲノムＤＮＡのサザンブロット分析により、違いを同定できる。さらに、図１に示すように、ターゲティングされた遺伝子座は、所与のＰＣＲ産物の大きさの変化（例えば、プライマーＦおよびＲでのゲノムＤＮＡの増幅は、標的細胞および非標的細胞において異なる長さの断片を生成する）、または非標的細胞では増幅不可能な標的細胞のゲノムからのＰＣＲ産物の生成（例えば、プライマーＮおよびＲを用いたゲノムＤＮＡの増幅）により同定できる。
【０１０３】
いくつかの研究では、既にＰＣＲを用いて、所望のトランスフェクトされた細胞系を上手く同定している（ＺｉｍｍｅｒおよびＧｒｕｓｓ， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３３８： １５０；Ｍｏｕｅｌｌｉｃら， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８７： ４７１２；Ｓｈｅｓｅｌｙら， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：４２９４）。このアプローチは、外因性ターゲティング導入遺伝子を受ける細胞の数が多く（すなわち、エレクトロポレーションまたはリポソームで）、処置される細胞集合が拡大可能である場合に非常に有効である（Ｃａｐｅｃｃｈｉ， １９８９， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ５：７０）。
【０１０４】
トランスジェニック非ヒト動物（相同的にターゲティングされた非ヒト動物を含む）を作製するには、胚幹細胞（ＥＳ細胞）が好ましい。胚幹細胞は、公開されている手順に従って操作される（Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．， １９８７；Ｚｊｉｌｓｔｒａら， Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８， １９８９；およびＳｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇら， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：７９９−８０３）。
【０１０５】
トランスジェニック非ヒト動物がマウスである場合、分裂的に不活性なＳＮＬ７６／７細胞支持細胞層上で成長したＡＢ−１系統などのマウスＥＳ細胞を使用する（ＭｃＭａｈｏｎおよびＢｒａｄｌｅｙ， １９９０， Ｃｅｌｌ ６２：１０７３−１０８５）。他の適切なＥＳ系統としては、Ｅ１４系統（Ｈｏｏｐｅｒら， １９８７， Ｎａｔｕｒｅ ３２６：２９２−２９５）、Ｄ３系統（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら， １９８５， Ｊ． Ｅｍｂｒｙｏｌ． Ｅｘｐ． Ｍｏｒｐｈ． ８７：２７−４５）、ならびにＣＣＥ系統（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら， １９８６， Ｎａｔｕｒｅ ３２３：４４５−４４８）が挙げられるがこれらに限定されない。好適な実施形態では、ＥＳ細胞系はＲＷ４（Ｇｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）である。
【０１０６】
特定のターゲティングされた突然変異を担持するＥＳ細胞からのマウス系統の作製の成功は、ＥＳ細胞の多能性（すなわち、宿主胚盤胞に注射された後に、胚形成に関与し、生じた動物の生殖細胞に寄与する能力）に左右される。注射されたＥＳ細胞を含む胚盤胞は、偽妊娠非ヒトのメスの子宮において発達し、キメラマウスとして産まれる。得られるトランスジェニックマウスは、不活化内因性ＦＨＩＴ遺伝子座を有する細胞に関してキメラであり、戻し交雑され、子孫の尾部生検ＤＮＡに対するＰＣＲまたはサザンブロット分析により正確にターゲティングされた導入遺伝子の存在についてスクリーニングされて、１つまたは複数の不活化ＦＨＩＴ遺伝子座についてヘテロ接合性であるトランスジェニックマウスを同定する。適切な交配を行うことにより、破壊されたＦＨＩＴ遺伝子座についてホモ接合性であるトランスジェニック非ヒト動物を作製できる。Ｆｈｉｔ欠損動物はまた、Ｍｓｈ２欠損マウス（米国特許第５，９０７，０７９号）など他の突然変異を担持するマウスと交配してもよい。
【０１０７】
５．８  Ｆｈｉｔ欠損マウスの作製
ほとんどの場合、ターゲティング構築物は、エレクトロポーレーションまたはマイクロインジェクションにより、マウスＲＷ４、ＡＢ−１またはＣＣＥ系統などの全能胚幹（ＥＳ）細胞系へ導入する。ターゲティング構築物は、ＦＨＩＴ遺伝子座の中にあるか隣接する内因性配列と相同的に組換えを行い、ＦＨＩＴ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子を機能的に破壊する。典型的に、ターゲティング構築物と内因性ＦＨＩＴ遺伝子座配列との相同組換えは、通常陽性選択カセットの形態でｎｅｏなどの選択可能マーカーをコードし、発現する非相同配列の組込みをもたらす（以下記載）。機能的に破壊された対立遺伝子は、ＦＨＩＴ ヌル対立遺伝子と称される。選択可能マーカーを発現する細胞の優先的な増殖を可能にする培地において細胞を増殖することにより、少なくとも１つのＦＨＩＴ ヌル対立遺伝子を有するＥＳ細胞を選択する。選択されたＥＳ細胞を、ＰＣＲ分析および／またはサザンブロット分析により検査して、正確にターゲティングされたＦＨＩＴ対立遺伝子の存在を検証する。
【０１０８】
本発明のＦＨＩＴ欠損マウスを得るために、”Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ”， Ｅ． Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（Ｏｘｆｏｒｄ： ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）， ｐｐ． １１３−１５１に掲載のＢｒａｄｌｅｙ， １９８７に記載されるように、変異型胚幹細胞をマウス胚盤胞に注射する。本発明で使用した特定のマウス胚盤胞は重要ではない。このような胚盤胞の例としては、Ｃ５７ＢＬ６マウス、Ｃ５７ＢＬ６アルビノ、Ｓｗｉｓｓ異系交配体、ＣＦＬＰ、ＭＦＩなどから誘導されたものがが挙げられる。キメラ標的マウスは、Ｈｏｇａｎら， Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８８；およびＴｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”， Ｅ． Ｊ． Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．，１９８７に従って得る。
【０１０９】
ヌル対立遺伝子に関しヘテロ接合性である非ヒト動物の交配を行って、該ヌル対立遺伝子に関してホモ接合性である非ヒト動物（いわゆる「ノックアウト」動物）を作製し得る（Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒら， １９９２， Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ２１５；Ｔｒａｖｉｓ， １９９２， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６： １３９２）。あるいはまた、選択マーカーを組み込まれたヌル対立遺伝子に関してホモ接合性のＥＳ細胞を、高濃度の選択剤（例えば、Ｇ４１８またはハイグロマイシン）を含む培地中で選択することにより、培養生成できる。正確にターゲティングされたヌル対立遺伝子に関するヘテロ接合性および／またはホモ接合性は、選択されたＥＳ細胞クローンのアリコートおよび／または尾部生検材料から単離されたＤＮＡのＰＣＲ分析および／またはサザンブロット分析により検証できる。
【０１１０】
別の実施形態では、他の方法により（例えば、単細胞胚の前核への組換え遺伝子の前核注射、人工酵母染色体の胚幹細胞への取込み、遺伝子ターゲティング法、胚幹細胞方法論により）、ターゲティング構築物を非ヒト動物の生殖細胞系列に導入する。例えば、米国特許第４，７３６，８６６号；同第４，８７３，１９１号；同第４，８７３，３１６号；同第５，０８２，７７９号；同第５，３０４，４８９号；同第５，１７４，９８６号；同第５，１７５，３８４号；同第５，１７５，３８５号；同第５，２２１，７７８号；Ｇｏｒｄｏｎら， １９８０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７７：７３８０−７３８４；Ｐａｌｍｉｔｅｒら， １９８５， Ｃｅｌｌ ４１：３４３−３４５ （１９８５）；Ｐａｌｍｉｔｅｒら， １９８６， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ， ２０：４６５−４９９；Ａｓｋｅｗら， １９９３， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏ．， １３：４１１５−４１２４；Ｇａｍｅｓら， １９９５， Ｎａｔｕｒｅ， ３７３：５２３−５２７；ＶａｌａｎｃｉｕｓおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ， １９９１， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏ．， １１：１４０２−１４０８；Ｓｔａｃｅｙら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏ．， １９９４， １４：１００９−１０１６；Ｈａｓｔｙら， １９９５， Ｎａｔｕｒｅ， ３５０：２４３−２４６；Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎら， １９９３， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， ２１：２６１３−２６１７を参照のこと。
【０１１１】
本発明の変異型マウスを異種交配（ｉｎｔｅｒｃｒｏｓｓ）させてＦＨＩＴ遺伝子における突然変異に関してホモ接合性の胚を得るか、および／または他のマウス株と交配させて、Ｆｈｉｔ突然変異をこれらの他の株に導入してもよい。一実施形態では、Ｆｈｉｔ変異型マウスをＭＳＨ２変異型マウスと交配させる。
【０１１２】
５．９  Ｆｈｉｔ欠損マウスにおけるＦＨＩＴ発現または活性をアッセイする
Ｆｈｉｔ欠損の程度は、標準的な分子生物学的方法を用いて簡単に測定できる。例えば、逆転写酵素仲介型ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いてＦＨＩＴメッセンジャーＲＮＡレベルで欠損について測定できる。
【０１１３】
別の実施形態では、様々な方法によりタンパク質レベルまたは活性を測定することで、本発明のＦｈｉｔ欠損動物におけるＦｈｉｔ欠損の程度をアッセイすることができる。例えば、一実施形態では、Ｆｈｉｔ欠損細胞および組織から得たタンパク質抽出物を、当該分野で公知の様々なイムノアッセイに対する能力により、それらのＦＨＩＴタンパク質のレベルについてアッセイする。このようなイムノアッセイとしては、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着アッセイ）、「サンドウィッチ」型イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、ｉｎ ｓｉｔｕイムノアッセイ（例えば、金コロイド、酵素もしくは放射性同位体を使用）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどの技術を用いた競合アッセイ系および非競合アッセイ系が挙げられるがこれらに限定されない。一態様の実施形態では、抗体結合は、一次抗体上の標識を検出することにより検出される。別態様の実施形態では、一次抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することにより一次抗体を検出する。任意に、二次抗体を標識化してもよい。イムノアッセイにおける結合を検出するために当該分野において多くの手段が公知であり、それらは本発明の範囲内にある。
【０１１４】
本発明の目的のために、ＦＨＩＴ欠損を有するように遺伝子操作された細胞または動物は、概して、対応する野生型細胞または動物よりも少なくとも約２０％低いＦＨＩＴを発現し、好ましくは対応する野生型細胞または動物よりも少なくとも約５０％低いＦＨＩＴを発現する。別の実施形態では、ＦＨＩＴ欠損を有する細胞または動物は、対応する野生型細胞または動物よりも少なくとも約９０％低いＦＨＩＴを発現し、より好ましくは野生型細胞または動物で認められるＦＨＩＴタンパク質の１．０％未満であり、特定の好適な実施形態では、Ｆｈｉｔ欠損細胞または動物は、検出不可能なレベルの完全長（野生型）ＦＨＩＴ転写産物を生成する。
【０１１５】
５．１０  薬剤スクリーニングアッセイ
以下の第６節に示すように、Ｆｈｉｔ欠損動物は、細胞過剰増幅が関与する疾患または障害（例えば、悪性腫瘍）を発生しやすい。特に、Ｆｈｉｔ欠損マウスでは、ミュア−トール症候群を患うヒトにおいて認められるものを連想させる脂腺腫瘍および内臓腫瘍が発生した。該マウスは、ミュア−トール症候群の動物モデルとして、例えば過剰増殖（例えば、腫瘍形成）を阻害する能力について分子（例えば、潜在的な抗癌治療薬）をスクリーニングまたはテストするために用いられ、従ってこのような疾患または障害を治療または予防するために有用である。特に関心が高いのは、ヒト細胞に対して低い毒性を有する薬剤についてのスクリーニングアッセイである。
【０１１６】
この目的のために、以下に記載するものを含む様々な種類のアッセイが使用できる。具体的なアッセイに応じて、動物全体を使用してもよいし、そこから誘導された細胞を使用してもよい。細胞は動物から新たに単離されてもよいし、培養にて不死化させてもよい。特に関心のある細胞としては、本発明のトランスジェニック動物の脂腺組織および内臓組織、ならびにそこから誘導される培養物である。
【０１１７】
本明細書で使用する「薬剤」という用語は、ＦＨＩＴ活性の生物学的作用の任意の特徴に作用することができるあらゆる分子（例えば、タンパク質または非タンパク質有機製剤）を表す。一般的に、複数のアッセイ混合物を、異なる薬剤濃度で平同時にかけて、様々な濃度に対する異なる応答を得る。典型的に、これらの濃度のうちの１つは陰性対照（すなわち、ゼロ濃度または検出レベル未満）として作用する。
【０１１８】
候補薬剤は膨大な化学クラス（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｌａｓｓ）を含むが、典型的には有機分子、好ましくは５０ダルトンより大きく約２，５００ダルトン未満の分子量を有する小さい有機化合物である。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用（特に水素結合）に必要な官能基を含み、典型的に、少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を含み、好ましくは少なくとも２つの該官能化学基を含む。候補薬剤は、複素環式構造および／または芳香族もしくはポリ芳香族構造上の環状（ｃｙｃｌｉｃａｌ）炭素が、上記官能基の１つ以上により置換されることが多い。候補薬剤は、生物分子（ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造的類似体、または組合せが挙げられるがこれらに限定されない）においても認められる。
【０１１９】
候補薬剤は、合成または天然の化合物のライブラリーを含む様々な由来源から得る。例えば、様々な有機化合物および生物分子のランダムな合成および特異的（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）合成のために多数の手段（ランダム化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む）がある。あるいはまた、細菌、菌類、植物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが入手可能であるか、または容易に作製できる。さらに、天然または合成的に作製されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的手段により容易に改変され、それを用いてコンビナトリアルライブラリーを作製してもよい。公知の薬剤は、特異的またはランダム化学修飾（例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）など）に供して、構造的類似体を作製してもよい。新しい潜在的な治療剤を、合理的な薬剤設計またはコンピュータモデリングなどの方法を用いて作ってもよい。
【０１２０】
スクリーニングは、公知の薬理学的に活性な化合物およびそれらの化学的類似体、または合理的な薬剤設計を通じて作られたものなど未知の特性を有する新規薬剤に向けられてもよい。腫瘍成長を阻止および／または無効にする候補薬剤を使用してもよい。
【０１２１】
スクリーニングアッセイが結合アッセイである場合、１つ以上の分子を、検出可能なシグナルを直接的または間接的に提供し得る標識に結合してもよい。様々な標識としては、放射性同位体、蛍光剤、化学発光剤、酵素、特異的結合分子、粒子（例えば、磁性粒子）などが挙げられる。特異的結合分子としては、ビオチンおよびストレプトアビジン、ジゴキシンおよび抗ジゴキシンなどの組み合わせが挙げられる。特異的結合メンバーについては、相補的メンバーが、通常、公知の手順により、検出を可能にする分子で標識されている。
【０１２２】
その他の様々な試薬もスクリーニングアッセイに含まれていてもよい。これらとしては、最適タンパク質−タンパク質結合を容易にするか、および／または非特異的もしくはバックグラウンド相互作用を減少させるために用いられる塩、中性タンパク質（例えば、アルブミン）、界面活性剤などの試薬が挙げられる。プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤などのアッセイの効率を改善する試薬を使用してもよい。成分の混合物は、必須な結合をもたらす任意の順番で添加する。任意の適切な温度（典型的に、４〜４０℃）にてインキュベーションを行う。インキュベーション時間は、最適な活性のために選択するが、高速スループットスクリーニングを円滑にするために最適化され得る。典型的に、０．１〜１時間が十分である。
【０１２３】
不溶性担体は、可溶性物質から分離し易く、その他の点では全般的な方法に適合する、ポリペプチドが結合できる任意の組成物であり得る。このような担体の表面は固体でも多孔性であってもよく、任意の都合のよい形状をとっていてもよい。受容体が結合する適切な不溶性担体の例としては、ビーズ（例えば、磁性ビーズ）、膜、およびマイクロタイタープレートが挙げられる。これらは、典型的に、ガラス、プラスチック（例えば、ポリスチレン）、多糖類、ナイロン、またはニトロセルロースから作られる。マイクロタイタープレートは、少量の試薬およびサンプルを用いて多数のアッセイを同時に行うことができるので特に都合がよい。
【０１２４】
当該分野において、癌細胞に対するテスト分子の作用を確かめるための多数のアッセイが公知である。このようなアッセイは、癌細胞系（Ｆｈｉｔ変異型マウス由来の細胞系）の細胞を使用してもよい。このような生存および／または成長を評価するために、当該分野で周知の多くのアッセイが使用できる；例えば、細胞増殖は、（３Ｈ）−チミジン取り込みを測定すること、直接細胞の数を数えること、または原癌遺伝子（例えば、ｆｏｓ、ｍｙｃ）もしくは細胞サイクルマーカー（Ｒｂ、ｃｄｃ２、サイクリンＡ、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｅなど）などの公知の遺伝子の転写、翻訳もしくは活性の変化を検出することによりアッセイできる。このようなタンパク質およびｍＲＮＡのレベル、ならびに活性は、当該分野で周知の任意の方法により決定できる。例えば、タンパク質は、市販の抗体（例えば、多くの細胞サイクルマーカー抗体がＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｉｎｃ．から出ている）を用いたウェスタンブロッティングまたは免疫沈降などの公知の免疫診断法により定量できる。ｍＲＮＡは、当該分野において周知かつ常套である方法（例えば、ノーザン分析、ＲＮａｓｅ保護、逆転写に関するポリメラーゼ連鎖反応など）により定量できる。細胞生存性は、トリパンブルー染色、または当該分野で公知の他の細胞死もしくは細胞生存マーカーを用いて評価できる。分化は、形態の変化などに基づいて可視的に評価できる。
【０１２５】
本発明は、以下の細胞増殖測定方法を含む（ただし、これらに限定されない）当該分野で公知の様々な技術により増殖性Ｆｈｉｔ変異型細胞のインヒビターについてスクリーニングする方法を提供する。
【０１２６】
一例として、ブロモデオキシウリジン（ＢＲＤＵ）取り込みを、増殖細胞を同定するアッセイとして使用してもよい。ＢＲＤＵアッセイは、新しく合成されたＤＮＡへのＢＲＤＵの取り込みによりＤＮＡ合成を受ける細胞集合を同定する。次いで、新しく合成されたＤＮＡを、抗ＢＲＤＵ抗体を用いて検出してもよい（Ｈｏｓｈｉｎｏら， １９８６， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ３８， ３６９；Ｃａｍｐａｎａら， １９８８， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． １０７， ７９を参照）。
【０１２７】
細胞増殖は、（３Ｈ）−チミジン取り込みを用いても検査できる（例えば、Ｃｈｅｎ， Ｊ．，１９９６， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １３：１３９５−４０３；Ｊｅｏｕｎｇ， Ｊ．， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：１８３６７−７３を参照）。このアッセイは、Ｓ期ＤＮＡ合成の定量的特徴決定を可能にする。このアッセイでは、ＤＮＡを合成する細胞が、新しく合成されたＤＮＡへ（３Ｈ）−チミジンを取り込む。次いで、シンチレーションカウンター（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ ＬＳ ３８００液体シンチレーションカウンター）において放射性同位体を数えるなどの当該分野における標準的技術により取り込みを測定してもよい。
【０１２８】
増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）の検出も、細胞増殖を測定するために使用してもよい。ＰＣＮＡは、増殖細胞、特に細胞サイクルの初期Ｇ１およびＳ期において発現が高まる３６キロダルトンのタンパク質であり、従って、増殖細胞のマーカーとして機能し得る。陽性細胞は、抗ＰＣＮＡ抗体を用いた免疫染色により同定される（Ｌｉら， １９９６， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ６：１８９−１９９；Ｖａｓｓｉｌｅｖら， １９９５， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １０８：１２０５−１５を参照）。
【０１２９】
細胞増殖は、経時的に細胞集合のサンプルを数えること（例えば、毎日の細胞計数）により測定してもよい。細胞は、血球計および光学顕微鏡（例えば、ＨｙＬｉｔｅ血球計、Ｈａｕｓｓｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて数えられ得る。細胞数を時間に対してプロットし、目的の集合についての成長曲線を得てもよい。好適な実施形態では、この方法により数えられた細胞をまず染料トリパンブルー（Ｓｉｇｍａ）と混合し、生存細胞が染料を排除し、集合の生存メンバーとして計数されるようにする。
【０１３０】
例えば、細胞のＤＮＡ倍数値（ｐｌｏｉｄｙ ｖａｌｕｅ）に基づいて、細胞のＤＮＡ含量および／または分裂指数を測定してもよい。例えば、細胞サイクルのＧ１期の細胞は、通常、２Ｎ ＤＮＡ倍数値を有する。ＤＮＡが複製されたが分裂まで進展していない細胞（例えば、Ｓ期にある細胞）は、２Ｎを上回る倍数値および４ＮまでのＤＮＡ含量を示す。倍数値および細胞サイクル反応速度論は、ヨウ化プロピジウムアッセイを用いてさらに測定できる（例えば、Ｔｕｒｎｅｒ， Ｔ．ら， １９９８， Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３４：１７５−８１を参照）。あるいはまた、ＤＮＡ倍数性は、コンピュータ化マイクロデンシトメトリー染色システム上でのＤＮＡフォイルゲン染色（化学量論的にＤＮＡに結合する）の定量により決定されてもよい（例えば、Ｂａｃｕｓ， Ｓ．， １９８９， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １３５：７８３−９２を参照）。別の実施形態では、染色体スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）の調製によりＤＮＡ含量を分析してもよい（Ｚａｂａｌｏｕ， Ｓ．， １９９４， Ｈｅｒｅｄｉｔａｓ． １２０：１２７−４０；Ｐａｒｄｕｅ， １９９４， Ｍｅｔｈ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ４４：３３３−３５１）。
【０１３１】
細胞サイクルタンパク質（例えば、ＣｙｃＡ、ＣｙｃＢ、ＣｙｃＥ、ＣｙｃＤ、ｃｄｃ２、Ｃｄｋ４／６、Ｒｂ、ｐ２１、ｐ２７など）の発現により、細胞または細胞集合の増殖状態に関係する重大な情報が得られる。例えば、抗増殖シグナリング経路における同定は、ｐ２１ｃｉｐ１の誘導により示され得る。細胞における高いレベルのｐ２１発現は、細胞サイクルのＧ１の開始を遅延させる（Ｈａｒｐｅｒら， １９９３， Ｃｅｌｌ ７５：８０５−８１６；Ｌｉら， １９９６， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ６：１８９−１９９）。ｐ２１誘導は、市販されている（例えば、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）特異的な抗ｐ２１抗体を用いた免疫染色により同定され得る。同様に、市販の抗体を用いたウェスタンブロット分析により細胞サイクルタンパク質を検査してもよい。別の実施形態では、細胞集合は、細胞サイクルタンパク質の検出の前に同期化させる。細胞サイクルタンパク質は、目的のタンパク質に対する抗体を用いたＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分取装置）分析によっても検出され得る。
【０１３２】
細胞サイクルの長さまたは細胞サイクルの速度における変化の検出も、テスト分子によるＦｈｉｔ変異型細胞増殖の阻害を測定するために使用できる。一実施形態では、細胞サイクルの長さは、細胞集合の倍加時間により（例えば、１つ以上のテスト化合物に接触した細胞または接触していない細胞を用いて）決定される。別の実施形態では、ＦＡＣＳ分析を使用して、細胞サイクル進展の期間を分析するか、またはＧ１、ＳおよびＧ２／Ｍ画分を精製する（例えば、Ｄｅｌｉａ， Ｄ．ら， １９９７， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １４：２１３７−４７を参照）。
【０１３３】
細胞サイクルチェックポイントの経過、および／または細胞サイクルチェックポイントの誘導は、本明細書に記載する方法または当該分野で公知の任意の方法により検査できる。限定するものではないが、細胞サイクルチェックポイントは、特定の細胞事象が特定の順番で生じることを確実にするメカニズムである。チェックポイント遺伝子は、前期事象が先に終了することなく後期事象が生じさせ得るような突然変異により特徴づけられる（Ｗｅｉｎｅｒｔ， Ｔ．およびＨａｒｔｗｅｌｌ， Ｌ．， １９９３， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １３４：６３−８０）。細胞サイクルチェックポイント遺伝子の誘導または阻害は、例えば、ウェスタンブロット分析または免疫染色などによりアッセイされ得る。細胞サイクルチェックポイントの経過はさらに、特定の事象が先に発生することのないチェックポイントを通過する細胞の進行（例えば、ゲノムＤＮＡが完全に複製すること無しに分裂に進行すること）により評価され得る。
【０１３４】
特定の細胞サイクルタンパク質の発現の作用に加えて、細胞サイクルに関与するタンパク質の活性および翻訳後修飾は、細胞の調節および増殖状態において不可欠な役割を果たし得る。本発明は、当該分野で公知の任意の方法による翻訳後修飾（例えば、リン酸化）を検出するアッセイを提供する。例えば、リン酸化チロシン残基を検出する抗体は市販されており、ウェスタンブロット分析において使用してこのような修飾を有するタンパク質を検出し得る。別の例では、ミリスチン化などの修飾は、薄膜クロマトグラフィーまたは逆相高速液体クロマトグラフィー上で検出され得る（例えば、Ｇｌｏｖｅｒ， Ｃ．， １９８８， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２５０：４８５−９１；Ｐａｉｇｅ， Ｌ．， １９８８， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．； ２５０：４８５−９１を参照）。
【０１３５】
シグナリングおよび細胞サイクルタンパク質ならびに／またはタンパク質複合体の活性は、キナーゼ活性により仲介されることが多い。本発明は、ヒストンＨ１アッセイなどのアッセイによるキナーゼ活性の分析を提供する（例えば、Ｄｅｌｉａ， Ｄ．ら， １９９７， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １４：２１３７−４７を参照）。
【０１３６】
Ｆｈｉｔ欠損細胞における腫瘍発達を阻害するテスト化合物の能力をテストするために、該化合物が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞形質転換（または悪性表現型への進行）を阻害することを実証することもできる。本実施形態では、形質転換された細胞表現型を有するＦｈｉｔ欠損細胞を、１以上のテスト化合物と接触させ、形質転換された表現型に関連する特徴（ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍形成能に関連するｉｎ ｖｉｔｒｏ特徴の組み合わせ）、例えば、軟寒天中のコロニー形成、より丸い（ｒｏｕｎｄｅｄ）細胞形態、よりゆるい基板付着、接触阻害の損失、固定依存性の損失、プラスミノゲンアクチベーターなどのプロテアーゼの放出、高い糖輸送、低い血清所要量、または胎児抗原の発現など（ただしこれらに限定されない）の変化について検査する（Ｌｕｒｉａら， １９７８， Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， 第３版， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ４３６−４４６を参照）。
【０１３７】
侵襲性の低下または増加した接着性も、Ｆｈｉｔ欠損細胞に対するテスト化合物の抗癌作用を実証するために使用できる。例えば、転移性癌の形成の重要な特徴は、前癌細胞または癌細胞が疾患の原発性部位から離れ、新しい成長コロニーを二次的部位に樹立する能力である。細胞が周辺部位を侵襲する能力は、癌状態の可能性を反映する。侵襲性の低下は、当該分野で公知の様々な技術により測定してもよく、例えば、Ｅ−カドヘリン仲介型細胞−細胞接着が挙げられる。このようなＥ−カドヘリン仲介型接着は、表現型復帰および侵襲性の低下を生じ得る（Ｈｏｒｄｉｊｋら， １９９７， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：１４６４−６６）。
【０１３８】
侵襲性の低下は、細胞移動の阻害によりさらに検査され得る。様々な二次元および三次元細胞マトリックスが市販されている（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）。マトリックスを横切る、またはマトリックスへの細胞移動は、顕微鏡検査、経時的写真撮影法、もしくは映像法、または細胞移動の測定が可能な当該分野の任意の方法により検査され得る。関連する実施形態では、侵襲性の低下は、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）に対する応答により検査される。ＨＧＦ誘導型細胞散乱は、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞などの細胞の侵襲性に相関し、他の新形成細胞型の侵襲性をテストするために使用され得る。このアッセイは、ＨＧＦに応答して細胞散乱活性を失った細胞集合を同定する（Ｈｏｒｄｉｊｋら， １９９７， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：１４６４−６６）。
【０１３９】
あるいはまた、侵襲性の低下は、化学走性チャンバ（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ／Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ． Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ， ＢＣ）を介した細胞移動により測定され得る。このようなアッセイでは、化学誘引物質を一方のチャンバ（例えば、下部チャンバ）でインキュベートし、反対側（例えば、上部チャンバ）とを隔てるフィルタ上に細胞をプレート化する。細胞が、上部チャンバから下部チャンバに通り抜けるためには、細胞はフィルタ中の小さい孔を通過し能動的に移動しなければならない。移動した細胞数のチェッカー盤分析は、侵襲性と相関させることができる（例えば、Ｏｈｎｉｓｈｉ， Ｔ．， １９９３， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １９３：５１８−２５を参照）。
【０１４０】
例えば、本明細書に記載するｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング法により同定されたリード化合物を、Ｆｈｉｔ欠損またはヌルマウスに投与し、その後、リード化合物を投与されていない対照と比較した内臓および／または脂腺腫瘍形成の発生の低下についてマウスを検査してもよい。あるいはまた、リード化合物を、腫瘍が発生したＦｈｉｔ欠損またはヌルマウスに投与して、その後、リード化合物を投与されていない対照と比較した腫瘍後退についてマウスの腫瘍を検査してもよい
このように、リード化合物は、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍形成を阻害することが実証され得る。
【０１４１】
スクリーンは、対照値（例えば、テスト動物における腫瘍の発生数、またはテスト化合物の不在下におけるテスト動物由来の培養および癌細胞の増殖率）を含むことが好ましい。陽性である（ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍成長を阻害するか、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞増殖を阻害する）と見なされるテスト物質は、ミュア−トール関連癌の治療に有益であると思われ、薬剤開発のための有用なリード候補であると考えられる。
【０１４２】
５．１１  発癌性テスト
本発明のトランスジェニック動物およびそこから培養された細胞は、当該分野で公知の標準的方法に従ってテスト剤の発癌性をアッセイするために使用できる。このような方法としては、以下の第６．１節、ならびにＤｉＰａｏｌｏら， １９６９， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ４２：８６７；Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆら， １９７３， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ３３：３２３１；Ｋａｋｕｎａｇａ， １９７３， Ｉｎｔｌ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， １２：４６３；米国特許第４，７５３，８７４号；米国特許第５，２７３，８８０号；米国特許第４，８８５，２３８号；米国特許第４，３０２，５３５号；米国特許第５，５０６，１３１号；米国特許第５，４２９，９４８；および米国特許第５，１８０，６６６号に記載されるものが挙げられるがこれらに限定されない。発癌物質であると疑われる作用物質は、例えば化学発癌物質などの分子、電離性放射線、または電磁界であり得る。発癌物質は、フリーラジカル形成を誘導可能でもあり得る。
【０１４３】
特定の実施形態では、テスト分子の発癌性のアッセイは、米国特許第６，０２０，１４６号の方法に従って行う。該特許は、細胞サンプルを約７日間にわたる期間の間テスト分子に曝露する工程、細胞サンプルを凝集させる工程、ハロゲン化デオキシウリジン類似体（発癌物質により形質転換された細胞には取り込まれ、非形質転換球状細胞には取り込まれない）およびチミジル酸シンターゼインヒビターを凝集した細胞サンプルに投与する工程、および凝集細胞サンプルを培養容器の成長表面上に分散させる工程を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法を開示している。次いで、細胞サンプルを、ハロゲン化デオキシウリジンと特異的に結合する抗体と接触させ、標準的なイムノアッセイにより抗体結合の量を検出および定量する。ハロゲン化デオキシウリジンの量が、テスト分子と接触させていない細胞と比べてテスト分子と接触した細胞において少なくとも２倍である場合、テスト化合物は発癌物質であると言える。
【０１４４】
別の特定の実施形態では、テスト分子の発癌性は、米国特許第５，９５５，２８９号の方法に従い、ｐ３４ｃｄｃ２などのチロシルリン酸化（ｔｙｒｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ）サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）のレベルと相関する。
【０１４５】
さらに別の特定の実施形態では、テスト化合物の組織特異的発癌性（例えば、肝組織と対比した脂腺組織に対する発癌性）を、例えば米国特許第５，９２５，５２４号に記載されたように測定する。
【０１４６】
場合によっては、肝臓により化学的に変化されているかもしれない分子をテストするために、テスト分子はＦｈｉｔ欠損動物または細胞に曝露される前に肝臓抽出物とインキュベートする（Ａｍｅｓら， １９７５， Ｍｕｔ． Ｒｅｓ． ３１：３４７−３６４）。
【０１４７】
全動物テストのために、発癌活性を有すると疑われるテスト化合物を、任意の適切な方法（注射、摂取または局所的投与が挙げられるがこれらに限定されない）により動物に導入する。
【０１４８】
本発明の方法を実施するため、ならびに細胞および動物を作製するための代替的な実施形態は当業者には明らかであり、請求の範囲内に包含されることを意図する。以下の実験例は、例示のために提示するものであり、限定するものではない。
【０１４９】
６．  実施例
６．１  材料および方法
マウスＦｈｉｔタンパク質のイムノブロット分析
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子融合マウスＦＨＩＴ ｃＤＮＡ組換え体を、細菌発現ベクターにクローニングした。得られた構築物ｐＧＥＸ４Ｔ１−ｍＦｈｉｔでは、マウスＦｈｉｔタンパク質コード配列をＧＳＴ遺伝子の下流に置いた。ＧＳＴ−ｍＦｈｉｔ融合タンパク質を、ＢＬ２１細菌株（Ｄｒｕｃｋら， １９７７， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７：５０４−５１２）中で生成し、精製後、ＧＳＴ−ｍＦｈｉｔをトロンビンプロテアーゼで切断した。精製されたマウスＦｈｉｔタンパク質に対するポリクローナル抗血清を調達し（Ｃｏｃａｌｉｃｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ， Ｒｅａｍｓｔｏｗｎ， ＰＡ）、イムノブロットにおいて１：８０００希釈、および免疫組織化学実験において１：４０００で使用した。内因性または外因性Ｆｈｉｔタンパク質発現を伴うかまたは伴わないマウス細胞および組織由来のタンパク質溶解物上で特異性をテストした。
【０１５０】
免疫組織化学
抗原回収の後、内因性ペルオキシダーゼを３％過酸化水素で阻害し、非特異的結合部位を正常ヤギ血清でブロックした（Ｆｏｎｇら， １９９７， Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １８：１４７７−１４８４）。スライドを、一次ウサギ抗マウスＦｈｉｔとインキュベートし（１：４０００希釈、一晩）、その後ビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体とインキュベートした。次いで、スライドを、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｄａｋｏ、１：１０００希釈）とインキュベートした。３，３’−四塩酸ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、Ｓｉｇｍａ）との最終インキュベーションによりＦｈｉｔタンパク質の分布を決定した。スライドを、ヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、カバーグラスで覆った。
【０１５１】
発癌性調査
Ｆｈｉｔ＋／＋または＋／−の（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ Ｘ １２９／ＳｖＪ）Ｆ１マウス（Ｂ６１２９Ｆ１ｓ）を作製した。１８匹のＦｈｉｔ＋／＋および２２匹のＦｈｉｔ＋／−マウス（３０〜４６週）に、８回のＮＭＢＡ（Ａｓｈ Ｓｔｅｖｅｎｓ， Ｄｅｔｒｏｉｔ， ＭＩ）の胃内投与を、３週間にわたり、２ ｍｇ／ｋｇ体重で行った。マウスの約半分を最終ＮＭＢＡ投与の６週間後に屠殺し、残りのマウスを１０週間目に屠殺した。腫瘍発生の違いを、両側検定フィッシャー直接確率テスト（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ｅｘａｃｔ ｔｅｓｔ）により分析した（ＡｒｍｉｔａｇｅおよびＢｅｒｒｙ， １９８７， Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， 第２版， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｏｘｆｏｒｄ）。比較のために、４匹の未処置Ｆｈｉｔ＋／−マウス（５４〜５９週齢）および１匹の未処置Ｆｈｉｔ＋／＋マウス（５９週齢）を同様に解剖した。解剖の際に、全食道および胃を除去し、縦に開いた。明らかな腫瘍を有する他の組織も検査した。食道、噴門洞、腺胃（ｇｌａｎｄｕｌａｒ ｓｔｏｍａｃｈ）（ＳＣＪ）との扁平円柱上皮接合部、および他の組織に腫瘍を担持する動物の数をスコア付けした。組織を、緩衝化ホルマリン中で固定化し、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ ＆ Ｅ）染色後に、角質増殖、錯角化、形成異常、乳頭腫、腺腫、および癌の存在について組織学的に検査した。
【０１５２】
ＭＴＳケース
２つのケースのＭＴＳについての記録用パラフィンブロックは、Ｔｈｏｍａｓ Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ケース１）およびＣｈｒｉｓｔｉａｎａ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ケース２）の外科的病理学アーカイブから入手可能であった。ケース１については２つの脂腺腫瘍のためのパラフィンブロックが入手可能であり、ケース２については１つの脂腺腫瘍ブロックが入手可能であった。正常および腫瘍細胞を、パラフィンブロックから顕微解剖切除し、ＤＮＡを調製した。組織切片を、記載される免疫組織化学によりＦｈｉｔ発現について分析した（Ｈａｄａｃｚｅｋら， １９９８， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８：２９４６−２９５１）。ＭＴＳ患者の末梢血液リンパ球から生殖細胞系列ＤＮＡを調製した。
【０１５３】
マイクロサテライト不安定性分析（ＭＳＩ）
大きい脂腺腫瘍の部分を、０．６％ ＳＤＳおよび５０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫおよび標準的フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈降により調製した腫瘍ＤＮＡを含む緩衝液に溶解した。Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＧｅｎｅｔｉｃｓまたはＴｈｏｍａｓ Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＫｉｍｍｅｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｆａｃｉｌｉｔｙから購入したマウス対立遺伝子のためのプライマーＤ１Ｍｉｔ４、Ｄ２Ｍｉｔ１３、Ｄ３Ｍｉｔ１、Ｄ３Ｍｉｔ２０３、Ｄ６Ｍｉｔ５９、Ｄ８Ｍｉｔ１４、Ｄ１０Ｍｉｔ２、Ｄ１４Ｎｄｓ１、Ｄ１７Ｍｉｔ１２３およびＤ１９Ｍｉｔ３６（Ｒｅｉｔｍａｉｒら， １９９６， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６：３８４２−３８４９）、ならびにヒト対立遺伝子のためのプライマーＤ２Ｓ１２３、Ｄ３Ｓ１２９８、Ｄ１８Ｓ３５、ＢＡＴ２５およびＢＡＴ２６（Ｋｒｕｓｅら， １９９８， Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ６３：６３−７０；Ｂｏｃｋｅｒら， １９９７， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７：４７３９−４７４３）を用いたＰＣＲ増幅によりＭＳＩをアッセイした。５０ ｎｇ鋳型ＤＮＡ、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．３）、５０ ｍＭ ＫＣｌ、０．１ ｍｇ／ｍｌゼラチン、１．５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、それぞれ１２．５ μＭのｄＮＴＰ、０．５ユニットのＴａｑポリメラーゼ、２０ ｎｇプライマーおよび１μＣｉ［３２Ｐ］ｄＣＴＰを含む反応混合液中、９４℃にて３０秒間、５７℃にて３０秒間、および７２℃にて３０秒間を３０サイクルで、サンプルを増幅した。ＰＣＲ産物（１ ｍｌ）を９ ｍｌ配列決定停止緩衝液（９５％ホルムアミド、０．０５％ブロムフェノールブルー、０．０５％キシレンシアノールＦＦ、および１０ ｍＭ ＮａＯＨ）と混合し、９４℃にて８分間変性させた。この混合物を７μｌ、６％アクリルアミド：ビス（１９：１）、８ Ｍ尿素ゲルに入れ、８０ワットにて電気泳動を２〜３時間行った。ゲルを乾燥させ、Ｘ線フィルムに一晩曝露した。
【０１５４】
Ｆｈｉｔ配列分析
ヒトＦＨＩＴエキソンのそれぞれに隣接するプライマー対（Ｄｒｕｃｋら， １９７７， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７：５０４−５１２）、およびマウスＦＨＩＴコードエキソンを、ＭＴＳケースまたはマウス腫瘍から得たＤＮＡのＰＣＲ増幅にそれぞれ使用した。マウスＦＨＩＴエキソンを囲むプライマー対は、エキソン５および６については既に公開されており（Ｐｅｋａｒｓｋｙら， １９９８， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８：３４０１−３４０８）、エキソン４（ｍｆｉｅｘ４Ｆ：ＧＴＧＴＴＣＴＴＣＡＣＡＧＴＴＡＣＧ（配列番号４）；ｍｆｉｅｘ４Ｒ：ＣＡＡＴＴＣＴＡＴＡＣＡＴＴＣＴＴＴＧＣ（配列番号５））、エキソン７（ｍｆｉｅｘ７Ｆ：ＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＴＡＡＴＴＣＡＴＡ（配列番号６）；ｍｆｉｅｘ７Ｒ：ＡＧＡＴＡＡＣＡＴＡＡＴＧＡＡＡＧＡＧＣ（配列番号７））、エキソン８（ｍｆｉｅｘ８Ｆ：ＣＡＣＴＧＴＣＡＡＧＴＣＡＡＡＡＴＡＴＡＧ（配列番号８）；ｍｆｉｅｘ８Ｒ（２）：ＧＧＣＣＴＴＧＴＧＡＣＴＡＡＡＴＡＡＴＡＡ（配列番号９））、およびエキソン９（ｍｆｉｅｘ９Ｆ：ＣＴＣＴＣＴＣＣＴＣＣＡＡＴＧＴＴＡＴ（配列番号１０）；ｍｆｉｅｘ９Ｒ：ＡＡＧＧＴＴＡＧＣＡＧＡＡＡＧＡＧＧ（配列番号１１））については新規に設計した。産物を、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した後に、Ｔａｑ ＤｙｅＤｅｏｘｙターミネーターサイクル配列決定キット（ＡＢＩ）を用いて配列決定した。配列決定反応産物を、電気泳動させ、３７７ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ）上に記録した。
【０１５５】
サザンブロット分析
腫瘍におけるマウスＦｈｉｔ対立遺伝子の完全性を検査するために、いくつかの脂腺腫瘍から得たＤＮＡを、制限酵素ＸｂａＩで消化し、０．８％アガロースゲル上で電気泳動させ、ナイロン膜に移動させた。乾燥後、膜結合ＤＮＡを、３２Ｐ標識完全長マウスＦｈｉｔｃＤＮＡまたはエキソン１〜４、４〜１０もしくは７〜９とハイブリダイズさせて、Ｆｈｉｔ対立遺伝子の部分が欠失されているか否かを決定した。サザンブロットオートラジオグラフの特定のレーンのデンシトメトリー分析を行った。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｉｎｃ． Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）を用いて、シグナルの定量を行った。
【０１５６】
６．２  結果
Ｆｈｉｔｔｍ２ＫＣＣマウスの作製
Ｆｈｉｔエキソン５を含む１２９／ＳｖＪマウスゲノム断片を、クローニングし、エキソン５コード領域に終止コドンを導入した。エキソン５は、最初のタンパク質コード領域であるため、終止コドンはタンパク質の翻訳を防ぐ。安定タンパク質の翻訳を開始できるＭｅｔコドンは下流にはない（Ｈｕｅｂｎｅｒら， １９９８， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ３２：７−３１）。この改変されたゲノムクローンを、Ｍｃ１−ＴＫベクターの誘導体に、ＰＧＫ Ｎｅｏ ｂｐａ遺伝子と共に挿入した（図１）。ＲＷ４ ＥＳ細胞（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、このＦｈｉｔ標的化ベクターでトランスフェクトし、相同組換えを介して内因性Ｆｈｉｔ対立遺伝子に組み込まれたベクターを有するＥＳ細胞クローンを選択した（図１）。標的化ＥＳ細胞クローンを、３．５日胚盤胞に導入して、キメラを生成した。仔アグーチ由来の尾部ＤＮＡのサザンブロット分析により決定したところ、それぞれのキメラは、欠損Ｆｈｉｔ対立遺伝子を子へ伝達した。１つのキメラの子孫（＋／Ｆｈｉｔｔｍ２ＫＣＣ 、Ｆｈｉｔ＋／−マウスと称される）を異種交配させ、そして遺伝子型決定により３つの遺伝子型全てが予想メンデル分布に近似した比率で示された。
【０１５７】
ノックアウトマウスにおけるＦｈｉｔ遺伝子座の破壊を、図１に例示するようにＰＣＲ分析によりさらに検証した。サザンおよびＰＣＲ分析の結果から、Ｆｈｉｔ−／−マウスが野生型Ｆｈｉｔ遺伝子座を担持しないことを確認した。異種交配で得た仔の常套的な型決定（ｔｙｐｉｎｇ）においてＰＣＲ分析を使用した。
【０１５８】
Ｆｈｉｔ−／−マウスにおける機能的Ｆｈｉｔ遺伝子の不在を確認するために、離乳マウスを屠殺し、器官を取り出し、イムノブロット分析および免疫組織化学によりＦｈｉｔタンパク質発現を評価した。イムノブロット分析は、Ｆｈｉｔ−／−マウス組織が、Ｆｈｉｔタンパク質について完全に陰性であることを示した（図２）；Ｆｈｉｔ＋／＋、＋／−および−／−腎臓切片におけるＦｈｉｔタンパク質の免疫組織化学検出は、Ｆｈｉｔ−／−切片におけるＦｈｉｔタンパク質の不在、およびＦｈｉｔ＋／−切片における発現の低下を示した。
【０１５９】
腫瘍のＮＭＢＡ誘導
最終ＮＭＢＡ投与の６週間後、Ｆｈｉｔ＋／＋と＋／−マウスとで目に見える違いはなかった。最終投与から１０週間後、Ｆｈｉｔ＋／−マウスのうちの３匹が、腹部の皮下組織において腫瘍を示した。１０週目の解剖において、５０％を上回るＦｈｉｔ＋／−マウスが、腹部、乳房または身体中心部領域においてこれらの腫瘍を１つ以上示し、場合によっては筋肉組織に侵入していた；腫瘍の色は黄色から白色まで様々であった。腫瘍を固定化するために除去した後に、食道／噴門洞を検査した。Ｆｈｉｔ＋／＋マウスにおいて胃外（ｅｘｔｒａｇａｓｔｒｉｃ）腫瘍は認められなかった。
【０１６０】
処置の６週間後における食道および胃組織全体の検分の際に、１０匹のＦｈｉｔ＋／−マウスのうち７匹が１つ以上の小さい腫瘍を示し、１０匹のＦｈｉｔ＋／＋マウスのうちの２匹は非常に小さい食道または噴門洞の腫瘍を示した。１０週目において、１２匹のＦｈｉｔ＋／−マウスのうちの１１匹が、噴門洞、後胃との扁平円柱上皮接合部、および／または他の組織において明らかな腫瘍（たいてい複数）を示した（表１）；８匹のＦｈｉｔ＋／＋マウスのうちの２匹が腫瘍を示した。
【０１６１】
未処置Ｆｈｉｔ＋／＋マウス（５９週）は、皮膚、食道、噴門洞、または接合部の異常を示さなかった。他の内臓は正常と思われた。４匹の未処置Ｆｈｉｔ＋／−マウス（５４〜５９週）のうちの３匹が、小さい腹部腫瘍を皮膚において示し、１匹のＦｈｉｔ＋／−マウスは僅かに拡大した脾臓を示した。その他、４匹の＋／−および１匹の＋／＋未処置動物は正常かつ健康であった。
【０１６２】
組織学的および免疫組織化学的分析
食道腫瘍は解剖において認められなかったが、組織学的検査により、ＮＭＢＡの６週間後の１／１０Ｆｈｉｔ＋／＋マウス、ならびにＮＭＢＡの１０週間後のＦｈｉｔ＋／−マウス３３および３６において食道扁平乳頭腫（ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｐａｐｉｌｌｏｍａ）が明らかになった（表１）。ＮＭＢＡ処置の６週間後、Ｆｈｉｔ＋／−マウスは、Ｆｈｉｔ＋／＋マウスよりも多くの腫瘍を有していた（７０％対２０％；表２にまとめた）。ＮＭＢＡ処置の１０週間後、＋／＋マウス（２５％）と比べた、Ｆｈｉｔ＋／−マウス（１００％）の腫瘍負担は、非常に顕著であった（表１および２）。ほとんどの腫瘍は、先にＢ６マウスにおいて認められたように（ＦｏｎｇおよびＭａｇｅｅ， １９９９， Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ １４３：６３−６９）、噴門洞および腺胃との扁平円柱上皮接合部に存在した。Ｆｈｉｔ＋／−マウスの腹部腫瘍の組織学的検査は、それらが脂腺から誘導され（表１、図３）、ミュア−トール症候群（ＭＴＳ）（すなわち遺伝性非ポリポーシス大腸癌（ＨＮＰＣＣ）症候群の変種）の顕著な特徴である脂腺腫瘍と同一であったことを示した。小さい脂腺腫瘍が、４匹の未処置Ｆｈｉｔ＋／＋マウスのうちの３匹に認められ、ＮＭＢＡ処置マウス中の脂腺腫瘍の頻度と同様の頻度で、非常に小さい脂腺腫瘍が自発的に生じることを含意した。食道、噴門洞、および腺胃との扁平円柱上皮接合部を含む未処置マウスの他の組織は正常であった。
【０１６３】
固定化された組織から得た切片を、Ｆｈｉｔタンパク質発現の免疫組織化学検出により分析して、残ったＦｈｉｔ対立遺伝子が腫瘍において不活化されたか否かを決定した。食道、噴門洞、および腺胃との接合部の内側を覆う上皮細胞は、Ｆｈｉｔ発現について陽性であった。食道において、上皮基底細胞は、上にある扁平上皮細胞よりも弱く染色される（図３Ａを参照）。全ての扁平乳頭腫および他の腫瘍は、図３のＢ〜Ｆに示す例に示すようにＦｈｉｔ陰性であった。特に、図３のＥおよびＦに示す脂腺腫瘍におけるＦｈｉｔ発現の欠如に留意されたい。
【０１６４】
マウス脂腺腫瘍を、ミュア−トール症候群ケース由来の脂腺腫瘍と比べるために、２つのミュア−トール症候群ケースから得た脂腺腫瘍切片をヒトＦｈｉｔの発現について分析した。Ｆｈｉｔタンパク質を、ミュア−トール症候群腫瘍切片から得た正常ヒト毛包および脂腺において検出した（図４ＡおよびＢ）。Ｆｈｉｔタンパク質は、ケース１から得た２つのヒト脂腺腫瘍において発現されなかったが（例として、図４Ｄを参照）、ケース２から得た脂腺腫瘍においては発現された。
【０１６５】
６．３  遺伝子型分析
マウス組織
尾部生検ならびにＦｈｉｔ＋／＋および＋／−マウスの大きい腫瘍の部分からＤＮＡを調製し、腫瘍におけるＦｈｉｔ遺伝子座の完全性を検査した。腫瘍において野生型Ｆｈｉｔ対立遺伝子が欠失または再配置されたか否かを決定するために、ＰＣＲ増幅により野生型またはターゲティングされたＦｈｉｔ対立遺伝子の存在についてＤＮＡを型決定し、両方のエキソン５対立遺伝子を検出した。尾部および腫瘍ＤＮＡはまた、制限酵素で消化し、サザンブロットにより野生型または改変型Ｆｈｉｔ対立遺伝子の存在について型決定した。図５に示す結果は、腫瘍２１、２７および３１における野生型およびターゲティングされたＦｈｉｔエキソン５の両方の存在を示す（図５、レーン１、３、４）。他の全てのＦｈｉｔエキソンの少なくとも１コピーが腫瘍に保持される（レーン１および２を比較）。マウスエキソン１〜４、７〜９および４〜１０に対するプローブにハイブリダイズしたＢａｍＨＩまたはＸｂａＩ消化腫瘍ＤＮＡのさらなる分析は、Ｆｈｉｔ遺伝子座の再配置またはホモ接合欠失を示さなかったが、ヘミ接合欠失の可能性は考慮から外せなかった。例えば、図５のレーン１、２および３における特定のＦｈｉｔエキソンについてのバンドの強度を比較するためのデンシトメトリー分析は、レーン１（マウス２１由来の腫瘍）におけるエキソン１についてのシグナルが、他のエキソンに比べてレーン２および３におけるエキソン１についてのシグナルの半分の強度であることを示した。レーン１および３（マウス２１および２７由来の腫瘍）におけるエキソン５についてのシグナルは、一方はレーンの上部付近および他方は下部にある２つのバンドに分離し、それぞれ野生型および変異型エキソン５を表す。
【０１６６】
マウス不安定部位における野生型Ｆｈｉｔ対立遺伝子の改変により、全てのＮＭＢＡ誘導型腫瘍においてＦｈｉｔタンパク質が不活化される。ＮＭＢＡが野生型Ｆｈｉｔ対立遺伝子において突然変異を誘発したか否かを決定するために、マウス２１、２７および３１から得た脂腺腫瘍由来のＤＮＡ、ならびにマウス２５および２７における扁平乳頭腫由来のＤＮＡも、Ｆｈｉｔエキソン４〜９における突然変異について検査した。エキソンに隣接するプライマーを使用して、これらの腫瘍におけるエキソン４〜９を増幅および配列決定した。突然変異は検出されなかった。
【０１６７】
ヒトＭＴＳ症候群は、常にではないが、通常ミスマッチ修復遺伝子の不活化により生じ、ミュア−トール症候群腫瘍は通常マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を示す。尾部および腫瘍ＤＮＡを、１０のマイクロサテライト遺伝子座のＰＣＲ増幅における鋳型として使用し、マイクロサテライト不安定性を検索した。これらの遺伝子座のうちの３つについての結果を図６に示す。テストしたいずれのマウス遺伝子座のにおいてもマイクロサテライト不安定性は認められず、マウスＭＴＳ様疾患が内在的なミスマッチ修復欠陥を持たないことを実証した。
【０１６８】
ヒト組織
全てのミュア−トール症候群ケースがＭＳＨ２またはＭＬＨ１の生殖細胞系列突然変異を示すこと、またミュア−トール症候群腫瘍がマイクロサテライト不安定性（ミスマッチ修復欠陥の顕著な特徴）を示すことが認められたわけではない。Ｆｈｉｔ陰性腫瘍を有する一部のミュア−トール症候群ケースは、ＦＨＩＴ遺伝子における生殖細胞系列突然変異により生じるという可能性もある。この調査において使用したミュア−トール症候群ケースを、野生型生殖細胞系列ＦＨＩＴ対立遺伝子の存在について分析した。２つのミュア−トール症候群から得た生殖細胞系列ＤＮＡの制限酵素消化から、ＦＨＩＴ遺伝子座の改変は明らかにならなかった。各ＦＨＩＴエキソンを２つのミュア−トール症候群ケースから増幅し、産物を配列決定した。両方のケースから得た全ての生殖細胞系列ＦＨＩＴエキソンが野生型配列を示した。
【０１６９】
ミュア−トール症候群ケースの大部分が、ミスマッチ修復遺伝子ＭＳＨ２の生殖細胞系列突然変異によるものであった。従って、ミュア−トール症候群腫瘍は、マイクロサテライト不安定性を示すことが予想される。ミュア−トール症候群ケース１の２つのＦｈｉｔ陰性脂腺腫瘍およびケース２のＦｈｉｔ陽性腫瘍から得たＤＮＡは、テストした５つのマーカーのいくつかにおいてマイクロサテライト不安定性を確かに示した（例として図６の下部パネルを参照）。
【０１７０】
【表１】
2004516002.tif 000002
【０１７１】
【表２】
2004516002.tif 000003
【０１７２】
６．４  ディスカッション
Ｆｈｉｔ＋／−表現型
本発明は、マウスにおける一方のＦｈｉｔ対立遺伝子の不活化に関する。一方のＦｈｉｔ対立遺伝子の不活化は腫瘍表現を生じる；この腫瘍表現型は発癌物質処置によりさらに影響を受ける。１歳の４匹の未処置Ｆｈｉｔ＋／−マウスのうちの３匹における脂腺腫瘍の観察から、マウスにおける一方のＦｈｉｔ対立遺伝子の不活化により腫瘍表現型が生じることが明らかになったが、Ｆｈｉｔ＋／−およびＦｈｉｔ−／−マウスにおいて自発的に発生する腫瘍の完全な範囲はまだ未知である。処置したＦｈｉｔ＋／＋マウスの２５％に対して、ＮＭＢＡで処置されたＦｈｉｔ＋／−マウスの１００％が腫瘍を示すという非常に顕著な違いを示し、＋／＋マウスのいずれも脂腺腫瘍が発達しなかった。つまり、一方のＦｈｉｔ対立遺伝子の不在は、脂腺腫瘍に対する感受性および胃腫瘍の発癌物質誘導を生じた。表１に示すように、１２匹のＦｈｉｔ＋／−マウスのうちの５匹（１歳未満）が、大きい（＞５×５ ｍｍ）脂腺腫瘍を示し、そのうちの３匹は解剖前に目立っていた。未処置マウスにおいては解剖以外では脂腺腫瘍は認められなかった。この解剖では、１歳を超える４匹のマウスのうちの３匹において小さい皮下腫瘍（＜２×２ ｍｍ）が明らかになった。
【０１７３】
両方のマウス株における腫瘍がＦｈｉｔタンパク質を発現しない。ＮＭＢＡ処置は、Ｆｈｉｔ＋／＋マウスにおける両方の不安定Ｆｈｉｔ対立遺伝子の不活化を生じた。＋／−マウスにおける一方のＦｈｉｔ対立遺伝子のみを不活化して、腫瘍発達の頻度を高める（ヒト散発性癌対家族性癌に必要な２ヒット（ｈｉｔ）対１ヒットに類似する）必要があった。Ｆｈｉｔ＋／＋と＋／−マウスとの唯一の遺伝的な違いは、＋／−マウスにおける標的Ｆｈｉｔ対立遺伝子であるため、第２のＦｈｉｔ対立遺伝子は、腫瘍発達におけるゲートキーパー（ｇａｔｅｋｅｅｐｅｒ）として作用する。しかし、発癌物質は、両方のマウス株の腫瘍における他の抑制遺伝子の突然変異を確かに生じた。Ｆｈｉｔ＋／−および−／−マウスは、繁殖力があり、長寿であり、かつ発癌物質に対する感受性を有するため、様々な器官の腫瘍の発癌物質誘導についての有用なモデルとして作用する。
【０１７４】
ＮＭＢＡの役割
発癌物質処置はＦｈｉｔ＋／−マウスにおける腫瘍の発生の頻度を高めるが、自発的な腫瘍も確かに生じる。発癌物質ＮＭＢＡは、Ｆｈｉｔハプロ不全マウスにおいて、ヒトにおけるミュア−トール症候群に似た疾患を生じる。発癌物質は、ヒトミュア−トール症候群ケースにおけるミスマッチ修復欠陥の役割に似た役割を果たす（発癌物質およびミスマッチ修復欠陥の両方とも不安定Ｆｈｉｔ遺伝子座の改変の頻度を高めて、Ｆｈｉｔ陰性腫瘍を選択的に成長させる）。Ｏ６−ｍｅＧミス対合の存在下において、Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６複合体は、既に遅れているＦｈｉｔ遺伝子座の複製を遅らせて、Ｇ２／Ｍにおいて複製がいまだ不完全であるようにして、不安定Ｆｈｉｔ遺伝子座における欠失を導く。
【０１７５】
ＮＭＢＡの器官特異性は、発癌物質を生物学的に活性化する食道シトクロムＰ４５０酵素の存在によるものである（ＬａｂｕｃおよびＡｒｃｈｅｒ， １９８２， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４２：３１８１−３１８６）。ＤＮＡにおけるグアニンのＮ−７位は、アルキル化の主要部位であるが、０−６位におけるメチル化は生物学的活性により関連する（Ｆｏｎｇら， １９７９， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ２３：６７９−６８２）。なぜなら、０−６−メチルグアニン付加物は、塩基ミス対合および突然変異に関連するからである。上記議論したように、Ｆｈｉｔ＋／−マウスは脂腺腫瘍が自発的に発達するが、ＮＭＢＡ処置Ｆｈｉｔ＋／−マウスにおける脂腺腫瘍はより大きく数が多かった。脂腺腫瘍の発達または進行に対するＮＭＢＡ処置の影響はさらなる研究を必要とする。
【０１７６】
ミュア−トール症候群
ミュアは、１つ以上の内臓癌を伴う１つ以上の脂腺腫瘍の共存を記載した；それ以降、１５０を超えるケースが報告されている（Ｋｒｕｓｅら， １９９８， Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ６３：６３−７０）。ミュア−トール症候群は家族性であり（Ｌｙｎｃｈら， １９８１， Ａｒｃｈ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ． １４１：６０７−６１１）、遺伝性非ポリポーシス大腸癌（ＨＮＰＣＣ）を患う家族において認められている（Ｌｙｎｃｈら， １９９３， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １０４：１５３５−１５４９）。最もよく認められる内部新生物は大腸癌である；従って、この症候群は、遺伝性非ポリポーシス大腸癌と臨床的および病理学的特徴を共有する。ミュア−トール症候群ケースの大きいサブグループは、ＭＳＨ２またはＭＬＨ１遺伝子においてマイクロサテライト不安定性および生殖細胞系列突然変異を示す（Ｋｒｕｓｅら， １９９８， Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ６３：６３−７０）。Ｆｈｉｔ欠損マウス腫瘍は、マイクロサテライト不安定性を示さず、Ｆｈｉｔ発現の損失はＭＴＳ様疾患において役割を果たす；従って、マウス症候群がミスマッチ修復欠陥を伴うことはあり得ない。
【０１７７】
マウス腫瘍においては、１つ以上のエキソンの欠失により、第２のＦｈｉｔ対立遺伝子が不活化された。このＦｈｉｔタンパク質の損失は、ゲートキーパーの役割の損失をもたらし、腫瘍形成を生じた。ヒトＦＨＩＴ遺伝子座の研究から、１０〜５０ ｋｂ対の間隔をあけられたプライマー対を用いたＰＣＲ増幅により約１．５ Ｍｂ遺伝子座を走査することにより、２対立遺伝子（ｂｉａｌｌｅｌｉｃ）欠失が観察および特徴決定されることが知られている。マウス腫瘍の場合、変異型対立遺伝子は不活性であるため野生型対立遺伝子のみの部分的欠失が必要である。この種の欠失は、非癌性細胞が混合した小さい腫瘍から得たＤＮＡにおいては観察しにくい。
【０１７８】
Ｆｈｉｔ＋／−マウス２１から得た脂腺腫瘍については、サザンブロットにおいてエキソン１シグナルが半分消失し、野生型対立遺伝子由来の１つのＦｈｉｔエキソン１の不在を含意した。これは、マウスＦｈｉｔ不安定性の中心点が、ヒトＦＲＡ３Ｂのようにエキソン３と６との間に集中する（Ｈｕｅｂｎｅｒら， １９９８， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ３２：７−３１）のではなく、遺伝子の５’側へシフトすることと合致する（Ｇｌｏｖｅｒら， １９９８， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８：３４０９−３４１４）。
【０１７９】
ヒトおよびマウスミュア−トール症候群ケースが同様のメカニズムにより生じる場合、ＦＨＩＴ遺伝子は、ミスマッチ修復欠陥腫瘍の一部（特にＭＳＨ２欠陥を有するもの）における損傷の標的であって、Ｆｈｉｔタンパク質損失およびＦｈｉｔ陰性細胞のクローン性増殖をもたらし得る。Ｆｈｉｔ不活化がミスマッチ修復欠陥のよくある結果、およびミュア−トール症候群へのよくある経路である場合、Ｆｈｉｔ＋／−マウスはミュア−トール症候群に罹患しやすくなる。ヒトミスマッチ修復欠陥症候群におけるＦＨＩＴ遺伝子の不活化の頻度は、Ｆｈｉｔタンパク質発現におけるマイクロサテライト不安定性を有する結腸および他の腫瘍の検査により決定され得る。興味深いことに、Ｍｓｈ２（Ｒｅｉｔｍａｉｒら， １９９６， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６：３８４２−３８４９）およびＭｓｈ６（Ｅｄｅｌｍａｎｎら， １９９７， Ｃｅｌｌ ９１：４６７−４７７）ヌルマウスは、低い頻度で脂腺腫瘍を示し、このことは、Ｆｈｉｔ欠損マウスをＭｓｈ２欠陥マウスと交差させると、どちらかの親マウス株の自発的腫瘍頻度と比べて脂腺腫瘍および他の腫瘍の頻度が高まることを意味する。
【０１８０】
Ｍｓｈ２は、Ｍｓｈ３またはＭｓｈ６と複合体を形成することが示された。これらの複合体は、異なるミス対合認識特異性を有する。Ｍｓｈ２−Ｍｓｈ６複合体は、単一塩基ミス対合および小さい挿入／欠失ミス対合の修復において機能する。Ｄｅ Ｗｉｎｄら（１９９５）は、Ｍｓｈ２が、ＮＭＢＡなどのメチル化剤の毒性を仲介し、僅かに分岐進化した（ｄｉｖｅｒｇｅｄ）ＤＮＡ配列の相同組換えを抑制するために必要であることを報告している。癌細胞のヒトＦＨＩＴ遺伝子座において認められる種類の染色体再配置は、ほとんどの場合に僅かに分岐進化した配列の相同組換えを伴う（Ｉｎｏｕｅら， １９９７；Ｍｉｍｏｒｉら， １９９９）。従って、腫瘍におけるＭｓｈ２の不在は、ＦＲＡ３Ｂ／ＦＨＩＴ不安定遺伝子座における染色体再配置の増加をもたらし、Ｆｈｉｔタンパク質の損失を生じる。実際、高いマイクロサテライト不安定性を有する３つのヒト膵臓癌細胞系のうちの２つが、ＦＨＩＴにおいてホモ接合欠失を有することが既に認められている（ＨｉｌｇｅｒｓおよびＫｅｒｎ， １９９９， Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍ． Ｃａｎｃｅｒ ２６：１−１２）。
【０１８１】
ミュア−トール症候群についてのモデルとしてのトランスジェニックマウス
トランスジェニック動物の開発により、生物学者および医学者に、疾患の研究における有用なモデルが提供されてきた。これらの動物は、疾患を治療するための用途について製薬剤をテストする際、および疾患の発達を生じるか促進し得る化合物をテストするのに有用である。さらに、トランスジェニック動物は、特定の疾患の原因を研究するのに有用な組織培養のための腫瘍細胞または非腫瘍細胞の両方の細胞の由来源である。
【０１８２】
本発明は、本明細書に記載する特定の実施形態によりその範囲を限定されない。実際に、当業者には、本明細書に記載する改変に加えて本発明の様々な改変が上記記載および添付の図面から明らかになるであろう。このような改変は請求の範囲内にあると意図する。
【０１８３】
特許および科学論文を含む様々な文献を本明細書で引用しているが、これらの開示はあらゆる意味においてその全体が参照により援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
マウスＦＨＩＴゲノム遺伝子座、ターゲティングおよびスクリーニング戦略を示す概略図である。
【図２】
Ｆｈｉｔ−／−マウスにおけるＦＨＩＴタンパク質の不在を示すイムノブロット分析の図である。
【図３】
ＦＨＩＴ発現の免疫組織化学検出を示す図である。
【図４】
ＭＴＳ腫瘍におけるヒトＦＨＩＴの免疫組織化学検出を示す図である。
【図５】
マウス腫瘍におけるＦＨＩＴ遺伝子座の完全性を示すハイブリダイゼーションの図である。
【図６】
腫瘍におけるＭＳＩの評価を示すＰＡＧＥの結果図である。
【図７】
酵母および細菌人工染色体（それぞれＹＡＣおよびＢＡＣ）に対するエキソン配列の相対的位置付けを示すマウスゲノムＦＨＩＴ遺伝子座のマップを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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