(57)【要約】本発明は標的へ化合物を輸送するための下記からなる分子輸送媒体を指向している。（ａ）化合物を運ぶための担体、（ｂ）担体に共有結合下アダプター及び（ｃ）認識部分及びターゲティング部分を含むターゲティングタンパク質であって、認識部分はアダプターに結合することができ、ターゲティング部分は標的に結合することができる。本発明はまた上記分子輸送媒体を含む医薬組成物、及び治療用、診断用、または研究用化合物を選択した標的へ分子輸送媒体を使用して輸送する方法を指向している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）該化合物を担う担体、
（ｂ）該担体と共有結合したアダプター、及び
（ｃ）認識部分及びターゲティング部分、該アダプターに結合することができる該認識部分及び該標的に結合できる該ターゲティング部分、
からなる治療用、診断用、または研究用化合物を輸送する分子輸送媒体。
【請求項２】
該標的が天然または人工的表面に接着している請求項１記載の分子輸送媒体。
【請求項３】
該標的が細胞表面受容体または細胞表面抗原である請求項１記載の分子輸送媒体。
【請求項４】
該アダプターが該標的として機能する請求項１記載の分子輸送媒体。
【請求項５】
該担体がポリマーを含む請求項１記載の分子輸送媒体。
【請求項６】
該担体が多糖類、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ジビニル）エーテル−無水マレイン酸共重合体、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（メチルメタアクリル酸）、ポリ酸無水物、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリウレタン、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタアクリルアミド、誘導体化ポリエチレングリコール、コポリマー及び誘導体化コポリマー、リポソーム及び誘導体化リポソーム、デンドリマー及び誘導体化デンドリマー、ウイルス及びバクテリオファージ粒子、ビーズ及びナノパーティクル及びそれらの組合せからなる群から選択されている請求項１記載の分子輸送媒体。
【請求項７】
該治療用、診断用、または研究用化合物が核酸、ペプチド、タンパク質、遺伝子輸送に使用されるウイルス粒子、化学療法剤、常磁性物質、放射性物質、蛍光物質、及びそれらの組合せからなる群から選択されている請求項１記載の分子輸送媒体。
【請求項８】
該アダプターがウシまたはヒトリボヌクレアーゼＡの野生型または変異型Ｓ−タンパク質、セルロース、カルモジュリン、及びストレプトアビジンからなる群から選択されている請求項１記載の分子輸送媒体。
【請求項９】
該ターゲティングタンパク質の該ターゲティング部分がサイトカイン、増殖因子、ペプチドホルモン、抗体、融合タンパク質、及びその組み合わせからなる群から選択されている請求項１記載の分子輸送媒体。
【請求項１０】
該ターゲティングタンパク質の該ターゲティング部分が血管内皮増殖因子１２１である請求項１記載の分子輸送媒体。
【請求項１１】
該ターゲティングタンパク質の該認識部分がウシまたはヒトリボヌクレアーゼＡのＳ−ペプチドフラグメントである請求項１記載の分子輸送媒体。
【請求項１２】
該ターゲティングタンパク質の該認識部分が該ターゲティングタンパク質のＮ−末端に位置する請求項１記載の分子輸送媒体。
【請求項１３】
該標的が血管内皮増殖因子の受容体を発現する細胞からなる群から選択された細胞上に認められる受容体である請求項１記載の分子輸送媒体。
【請求項１４】
該ターゲティングタンパク質が該認識部分及び該ターゲティング部分の間に位置するスペーサーペプチドをさらに含む請求項１記載の分子輸送媒体。
【請求項１５】
（１）医薬的に許容できる担体、及び
（２）（ａ）該化合物を担う担体、
（ｂ）該担体と共有結合したアダプター、及び
（ｃ）認識部分及びターゲティング部分、該アダプターに結合することができる該認識部分及び該標的に結合できる該ターゲティング部分を含むターゲティングタンパク質、を含む、医薬的に有効な量の、治療用、診断用、または研究用化合物を標的に輸送する分子輸送媒体、
からなる医薬組成物。
【請求項１６】
該標的が天然または人工的表面に接着している請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項１７】
該標的が細胞表面受容体または細胞表面抗原である請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項１８】
該アダプターが該標的として機能する請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項１９】
該担体がポリマーを含む請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項２０】
該担体が多糖類、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ジビニル）エーテル−無水マレイン酸共重合体、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（メチルメタアクリル酸）、ポリ酸無水物、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリウレタン、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタアクリルアミド、誘導体化ポリエチレングリコール、コポリマー及び誘導体化コポリマー、リポソーム及び誘導体化リポソーム、デンドリマー及び誘導体化デンドリマー、ウイルス及びバクテリオファージ粒子、ビーズ及びナノパーティクル及びそれらの組合せからなる群から選択されている請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項２１】
該治療用、診断用、または研究用化合物が核酸、ペプチド、タンパク質、遺伝子輸送に使用されるウイルス粒子、化学療法剤、常磁性物質、放射性物質、蛍光物質、及びそれらの組合せからなる群から選択されている請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項２２】
該アダプターがウシまたはヒトリボヌクレアーゼＡの野生型または変異型Ｓ−タンパク質、セルロース、カルモジュリン、及びストレプトアビジンからなる群から選択されている請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項２３】
該ターゲティングタンパク質の該ターゲティング部分がサイトカイン、増殖因子、ペプチドホルモン、抗体、融合タンパク質、及びその組み合わせからなる群から選択されている請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項２４】
該ターゲティングタンパク質の該ターゲティング部分が血管内皮増殖因子１２１である請求項１８記載の医薬組成物。
【請求項２５】
該ターゲティングタンパク質の該認識部分がウシまたはヒトリボヌクレアーゼＡのＳ−ペプチドフラクションである請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項２６】
該ターゲティングタンパク質の該認識部分が該ターゲティングタンパク質のＮ−末端に位置する請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項２７】
該標的が血管内皮増殖因子の受容体を発現する細胞からなる群から選択された細胞上に認められる受容体である請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項２８】
該ターゲティングタンパク質が該認識部分及び該ターゲティング部分の間に位置するスペーサーペプチドをさらに含む請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項２９】
該医薬的に許容できる担体が水、ゼラチン、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物油、ガム、アルコール、ワセリン、平衡食塩液（ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されている請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項３０】
包装資材及び該包装資材の中に含まれる薬剤からなる製品であって、
該薬剤が治療用または診断用化合物の標的誘導輸送により検出または作用することができる細胞による生理的病状を治療するのに有効な治療効果を有し、該包装資材がこの薬剤が治療用または診断用化合物の標的誘導輸送により検出または作用することができる細胞による生理的病状を治療することができることを表示したラベルを含んでおり、
該薬剤が、
（ａ）該化合物を担う担体、
（ｂ）該担体と共有結合したアダプター、及び
（ｃ）認識部分及びターゲティング部分、該アダプターに結合することができる該認識部分及び該標的に結合できる該ターゲティング部分を含むターゲティングタンパク質、
を医薬的に許容できる担体中に含む、医薬的に有効な量の、治療用、診断用、または研究用化合物を標的に輸送する分子輸送媒体を含む、
上記製品。
【請求項３１】
（１）医薬品として受容し得る担体、及び
（２）（ａ）該化合物を担う担体、
（ｂ）該担体と共有結合したアダプター、及び
（ｃ）認識部分及びターゲティング部分、該アダプターに結合することができる該認識部分及び該標的に結合できる該ターゲティング部分を含むターゲティングタンパク質、
からなる医薬組成物を投与する段階を含む、
治療用、診断用、または研究用化合物を標的に輸送する方法。
【請求項３２】
該標的が天然または人工的表面に接着している請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
該標的が細胞表面受容体または細胞表面抗原である請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
該アダプターが標的をとして機能する請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
該担体がポリマーを含む請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
該担体が多糖類、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ジビニル）エーテル−無水マレイン酸共重合体、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（メチルメタアクリル酸）、ポリ酸無水物、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリウレタン、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタアクリルアミド、誘導体化ポリエチレングリコール、コポリマー及び誘導体化コポリマー、リポソーム及び誘導体化リポソーム、デンドリマー及び誘導体化デンドリマー、ウイルス及びバクテリオファージ粒子、ビーズ及びナノパーティクル及びそれらの組合せからなる群から選択されている請求項３１記載の方法。
【請求項３７】
該治療用、診断用、または研究用化合物が核酸、ペプチド、タンパク質、遺伝子輸送に使用されるウイルス粒子、化学療法剤、常磁性物質、放射性物質、蛍光物質、及びそれらの組合せからなる群から選択されている請求項３１記載の方法。
【請求項３８】
該アダプターがウシまたはヒトリボヌクレアーゼＡの野生型または変異型Ｓ−タンパク質、セルロース、カルモジュリン、及びストレプトアビジンからなる群から選択されている請求項３１記載の方法。
【請求項３９】
該ターゲティングタンパク質の該ターゲティング部分がサイトカイン、増殖因子、ペプチドホルモン、抗体、融合タンパク質、及びその組み合わせからなる群から選択されている請求項３１記載の方法。
【請求項４０】
該ターゲティングタンパク質の該ターゲティング部分が血管内皮増殖因子１２１である請求項３１記載の方法。
【請求項４１】
該ターゲティングタンパク質の該認識部分がウシまたはヒトリボヌクレアーゼＡのＳ−ペプチドフラクションである請求項３１記載の方法。
【請求項４２】
該ターゲティングタンパク質の該認識部分が該ターゲティングタンパク質のＮ−末端に位置する請求項３１記載の方法。
【請求項４３】
該標的が血管内皮増殖因子の受容体を発現する細胞からなる群から選択された細胞上に認められる受容体である請求項３１記載の方法。
【請求項４４】
該ターゲティングタンパク質が該認識部分及び該ターゲティング部分の間に位置するスペーサーペプチドをさらに含む請求項３１記載の方法。
【請求項４５】
該医薬品として受容し得る担体が水、ゼラチン、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物油、ガム、アルコール、ワセリン、平衡食塩液、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されている請求項３１記載の方法。
【請求項４６】
（ｉ）Ｓ−ペプチドをコードする第一核酸配列、及び（ｉｉ）ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の全長または変異アイソフォームをコードする第二核酸配列を含み、該単離核酸配列が該第二核酸配列セグメントによりコードされるポリペプチドにより認識される血管内皮増殖因子の受容体に特異的に結合する融合タンパク質をコードする単離核酸配列。
【請求項４７】
請求項４６記載の単離核酸配列によりコードされる単離ポリペプチド。
【請求項４８】
調節配列が作動的に請求項４６記載の核酸配列に結合した発現ベクター。
【請求項４９】
請求項４８記載の発現ベクターを含む形質転換細胞。
【請求項５０】
野生型及び変異型ヒト及びウシＳ−タンパク質をコードする単離核酸配列。
【請求項５１】
請求項５０記載の単離核酸配列によりコードされるポリベプチド。
【請求項５２】
請求項５０記載の核酸配列に作動的に結合した調節配列を含む発現ベクター。
【請求項５３】
請求項５２記載の発現ベクターを含む形質転換細菌細胞。
【請求項５４】
（ｉ）Ｓ−タンパク質をコードする第一核酸配列セグメント、及び（ｉｉ）ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の全長または変異アイソフォームをコードする第二核酸配列を含み、該単離核酸配列が該第二核酸配列セグメントによりコードされるポリペプチドにより認識される血管内皮増殖因子の受容体に特異的に結合する融合タンパク質をコードする単離核酸配列。
【請求項５５】
請求項５４記載の単離核酸配列によりコードされる単離ポリペプチド。
【請求項５６】
請求項５４記載の核酸配列に作動的に結合した調節配列を含む発現ベクター。
【請求項５７】
請求項５６記載の発現ベクターを含む形質転換細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
１．  発明の分野
本発明は一般的に、天然及び／または人工の表面にある種々の標的に治療用、診断用、または研究用の化合物を輸送するための分子輸送媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）、及び選択した化合物を標的に輸送する方法に関するものである。特に、本発明は、（ａ）化合物を運ぶ担体、（ｂ）担体に共有結合したアダプター、（ｃ）認識部分はアダプターと結合することができ、ターゲティング部分は標的と結合することができる認識部分及びターゲティング部分を含むターゲティングタンパク質、からなる治療用、診断用、または研究用の化合物を標的に輸送するための分子輸送媒体に関するものである。本発明はまた分子輸送媒体、並びに核酸及びタンパク質配列、ベクター、及び分子輸送媒体の部分を含む形質転換細胞を含有する医薬組成物に関するものである。
【０００２】
２．  関連技術の説明
治療用、診断用及び研究用の化合物を標的細胞へ選択的に輸送することはその有効性を改善しそして潜在的な副作用を減少させる。人工的な表面に固定化した標的へタンパク質を選択的に輸送することは医療用具及びバイオセンサーに使用することができる。モノクロナール抗体、代謝物、ペプチドホルモン、サイトカイン、成長因子、ウイルス及びバクテリオファージ粒子はターゲティング物質として使用されている。治療用、診断用及び研究用の化合物をターゲティング物質に積込むために主に二つの方法が取られている。第一の方法では、輸送しようとする分子をターゲティング分子に化学的に結合する。蓄積した経験によると１つのターゲティング分子に５−１０より多くの分子を結合することはできない（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ＆  Ｗａｌｋｅｒ，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．８３，６７−１２３及びその中の参考文献に最近概説されている）。二番目の方法では、輸送しようとする分子を積込む能力の高い担体をターゲティング分子に結合するか、あるいはターゲティング分子の中に導入した特殊な基（例えば、ビオチン）と非共有結合で結合する。デキストラン、合成ポリマー、及び種々のリポソームのようないくつかの担体が実用に供されている（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ＆  Ｗａｌｋｅｒ，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．８３，６７−１２３及びその中の参考文献に最近概説されている）。後者の方法は特にこの数年の間に、種々のターゲティング分子及び種々の核酸担体を使用して、標的細胞へ核酸を輸送するために開発された（例えば、Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許６，０５６，９７３、Ｆｅｒｋｏｌ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許５，９７２，９０１、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許５，８７４，２９７、Ｂｏｕｔｉｎに対する米国特許５，８３７，５３３、Ｓｚｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許５，６６１，０２５、Ｋｕｏ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許５，７６６，８９９、及びＢｅｕｇ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許５，７９２，６４５参照）。
【０００３】
上記の両方法は共にターゲティング分子の化学的修飾によるものであり、したがって個別的開発及び個別的に最適化を計らなければならない。最適化の目標は、（１）担体の不活性化を招くこと無くターゲティング分子に積載する分子数を増やすこと、（２）均質な調製を行なうこと、（３）「積荷（ｐａｙｌｏａｄ）」を選択的で有効な放出をすること、である。注目すべきことは、Ｂｅｕｇら（米国特許５，７９２，６４５）は核酸を結合するためのポリ−Ｌ−リジンを含む融合タンパク質としてターゲティング分子を発現する可能性に付いて言及している。しかしながら、そのような分子の構築、発現、精製及び使用の実現可能性に付いては調べられていない。
【０００４】
最近、種々のウイルス及びバクテリオファージ粒子が細胞の中へ核酸を輸送するために使用されている（Ｒｏｂｂｉｎｓ  ＆  Ｇｈｉｖｉｚｚａｎｉ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，８０：３５−４７（１９９８）及びその中の参考文献に最近概説されている）。ウイルスまたはバクテリオファージの表面に融合ターゲティングタンパク質を発現するようにして細胞特異的ターゲティングドメインをウイルスまたはバクテリオファージに融合することをいくつかのグループが報告している（例えば、Ｗｉｃｋｈａｍ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１５７０−１５７３、Ｗｉｃｋｈａｍ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：６８３１−６８３８、Ｋｏｖｅｓｄｉ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：５８３−５８９、Ｅｉｎｆｅｌｄ，Ｄ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９１３０−９１３６、Ｐｏｕｌ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８８：２０３−２１１、Ｃｈａｄｗｉｃｋ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８５：４８５−４９４、Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許５，９９８，１９２及び５，８５８，７４３参照）。既知開示において、ウイルスまたはバクテリオファージ粒子の表面に発現した融合ターゲティングタンパク質あるいは融合表面タンパク質に組込まれた標準抗原決定基を認識する二重特異性抗体のいずれも、新規な標的毎にウイルスまたはバクテリオファージ粒子または二重特異性抗体の開発を成果の不確実な科学的プロジェクトとして、個別的に創られている。
【０００５】
種々の装置も人工的な表面に結合したタンパク質を必要とし、そして現在人工的表面へタンパク質を化学的に結合している。バイオセンサーは加えた分子と相互作用することができる適当な表面に結合したタンパク質（例えば、抗体、酵素）に依存している。医療用具（例えば、ペースメーカー、血管移植、心臓弁、カテーテルなど）は人体組織及び体液の成分と最少あるいは最大の相互作用をするように適切な表面に結合したタンパク質に依存している。特異的なタンパク質と相互作用する化合物のハイスループット（ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ、高処理量）スクリーニングには試験装置の表面に該タンパク質を固定することが必要である。バイオセンサー及び医療用具の人工的表面にタンパク質を化学的に結合する方法がいくつか開発されている（例えば、米国特許５，４９２，８４０、５，８５３，７４４及び６，０３３，７１９参照）。これらの方法はタンパク質の損傷を減らしそして表面の均一性を増すために個別的に開発された。
【０００６】
このように、治療用、診断用、及び研究用の化合物を天然及び人工表面上の標的へ標的の誘導により輸送する分野、及び人工的表面にタンパク質を接着させる分野においては、（１）所与のタンパク質を容易にターゲティングまたは接着タンパク質に変換できる、（２）タンパク質の分解を伴なう化学修飾によらない、（３）治療的、診断的、及び研究的化合物を担う予め調製した化合物を利用する、方法が必要である。本発明はこの目的に応答するものであると考えられる。
【０００７】
（発明の要約）
一態様において、本発明は、（ａ）化合物を運搬するための担体、（ｂ）担体に共有結合したアダプター、及び（ｃ）認識部分はアダプターと結合することができ、ターゲティング部分は標的と結合することができる、認識部分とターゲティング部分を有するターゲティングタンパク質、を含む治療用、診断用、及び研究用化合物を標的へ輸送するための分子輸送媒体を指向している。
【０００８】
その他の態様において、本発明は、
（１）医薬品として受容し得る媒体、及び
（２）（ａ）化合物を運搬するための担体、（ｂ）担体に共有結合したアダプター、及び（ｃ）認識部分はアダプターと結合することができ、ターゲティング部分は標的と結合することができるような認識部分とターゲティング部分を有するターゲティングタンパク質、を含む、医薬的に有効な量の、治療用、診断用、及び研究用化合物を標的へ輸送するための分子輸送媒体、
を含む医薬組成物を指向している。医薬品として受容し得る媒体としては、水、ゼラチン、果糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物油、ガム、アルコール、ワセリンのような硬化油、緩衝食塩液、及びそれらの混合物が含まれる。その他の医薬品として受容し得る媒体は当業者には既知である。
【０００９】
その他の態様では、本発明は、物質の包装及び物質の包装の中に含まれる薬剤からなる製品を指向しており、この薬剤は治療用または診断用化合物が標的誘導輸送により検出しそして作用する細胞のために生じている生理的病状を治療するのに有効であり、また包装された物質には、この薬剤を治療用または診断用化合物が標的誘導輸送により検出しそして作用する細胞のために生じている生理的病状を治療するために使用することができることを示した表示があり、またこの薬剤は、（ａ）化合物を運搬するための担体、（ｂ）担体に共有結合したアダプター、及び（ｃ）認識部分はアダプターと結合することができ、ターゲティング部分は標的と結合することができる、認識部分とターゲティング部分を有するターゲティングタンパク質からなる、医薬的に有効な量の、治療用、診断用、及び研究用化合物を標的へ輸送するための分子輸送媒体を含んでいる。
【００１０】
その他の態様では、本発明は治療用、診断用、及び研究用化合物を標的へ輸送するための下記段階を含む方法を指向している。（１）医薬品として受容し得る担体、及び（２）（ａ）化合物を運搬するための担体、（ｂ）担体に共有結合したアダプター、及び（ｃ）認識部分はアダプターと結合することができ、ターゲティング部分は標的と結合することができる、認識部分とターゲティング部分を有するターゲティングタンパク質、を含む治療用、診断用、及び研究用化合物を標的へ輸送するための分子輸送媒体の薬物療法的に充分な量、からなる医薬組成物を投与すること。
【００１１】
さらに他の態様では、本発明は、融合ターゲティングタンパク質中の認識ペプチドと相互作用する標的として働く該表面アダプター本体上に堆積することからなる望ましい融合タンパク質を持つ人工表面を被う組成物を指向している。
【００１２】
その他の態様では、本発明は、（ｉ）ウシまたはヒトリボヌクレアーゼＡの１から１５アミノ酸残基Ｎ−末端ペプチドフラグメント（Ｓ−ペプチド）をコードする第一核酸配列部分、及び（ｉｉ）ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の全長または変異アイソフォームをコードする第二核酸配列部分を含む単離核酸配列を指向しており、そして第一核酸によりコードされたポリペプチドにより認識されて特異的にアダプタータンパク質と結合し、そして第二核酸配列によりコードされたポリペプチドにより認識される血管内皮増殖因子の受容体と特異的に結合する融合タンパク質を単離核酸配列はコードしている。
【００１３】
その他の態様では、本発明は上記核酸配列に作動的に結合した調節配列を含む発現ベクター、及び上記発現ベクターを含む形質転換細菌細胞を指向している。
【００１４】
本発明はまたアダプタータンパク質と結合することができまた血管内皮増殖因子ＫＤＲ／ｆｌｋ−１細胞表面受容体と結合し、活性化する能力を持つ単離ターゲティングタンパク質となるように、ペプチドスペーサーを介して血管内皮増殖因子のアイソフォームのＮ−末端に融合したウシまたはヒトリボヌクレアーゼＡのＳ−ペプチドフラグメントを含むターゲティングタンパク質を提供する。
【００１５】
その他の態様では、本発明はウシまたはヒトリボヌクレアーゼＡの野生型または変異フラグメント（Ｓ−タンパク質）をコードする単離核酸配列を指向している、そしてこの単離核酸配列は単独または組換えターゲティングタンパク質中においてリボヌクレアーゼのＳ−ペプチドフラグメントに特異的に結合するアダプタータンパク質をコードしている。
【００１６】
その他の態様では、本発明は上記核酸配列に作動的に結合した調節配列を含む発現ベクター、及び上記発現ベクターを含む形質転換細菌細胞を指向している。
【００１７】
本発明はまた単独または組換えターゲティングタンパク質中でＳ−タンパク質と結合する能力を有する単離アダプタータンパク質となるウシまたはヒトリボヌクレアーゼＡのＳ−タンパク質フラグメントを含むアダプタータンパク質を提供する。
【００１８】
その他の態様では、本発明は、（ｉ）ウシまたはヒトリボヌクレアーゼＡのＳ−タンパク質フラグメントをコードする第一核酸配列部分、及び（ｉｉ）ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の全長または変異アイソフォームをコードする第二核酸配列部分を含む単離核酸配列を指向している、そして第一核酸によりコードされたポリペプチドにより認識されて特異的にアダプタータンパク質と結合し、そして第二核酸配列によりコードされたポリペプチドにより認識される血管内皮増殖因子の受容体と特異的に結合する融合タンパク質を単離核酸配列はコードしている。
【００１９】
その他の態様では、本発明は上記核酸配列に作動的に結合した調節配列、及び上記発現ベクターを含む形質転換細菌細胞を含む発現ベクターを指向している。
【００２０】
発明はまた、生成した単離ターゲティングタンパク質が単独または融合タンパク質中においてＳ−ペプチドを結合しそして血管内皮増殖因子ＫＤＲ／ｆｌｋ−１細胞表面受容体に結合して活性化する能力を有するように血管内皮増殖因子のアイソフォームのＮ−末端にペプチドスペーサーを介して融合したウシまたはヒトリボヌクレアーゼＡのＳ−タンパク質フラグメントを含むターゲティングタンパク質を提供する。
【００２１】
本発明はまたリポソームに封入した治療用及び診断用薬剤をＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現する細胞へ輸送するのに使用するための組成物を包含しており、その上記の融合ターゲティングタンパク質を含む組成物はポリエチレングリコールリン脂質と接合したリボヌクレアーゼＡのＳ−タンパク質フラグメントと結合し、そして医薬品として受容し得る希釈剤または担体を含む薬剤を封入したリポソームと会合する。
【００２２】
本発明はまたＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現する細胞へＤＮＡを輸送するのに使用するための組成物を包含しており、この組成物は上記のようにポリエチレンイミンと結合したウシ膵臓リボヌクレアーゼＡのＳ−タンパク質フラグメントと会合した融合ターゲティングタンパク質を含みそして医薬品として受容し得る希釈剤または担体と共に有効量のＤＮＡを含有している。
【００２３】
これらの態様について以下の発明の詳細な説明の中で更に詳しく記述する。
図と共に以下の詳細な説明により本発明がよりよく理解されるであろう。
【００２４】
（発明の詳細な説明）
上に示したように、一態様において、本発明は治療用、診断用、または研究用の化合物を標的へ輸送するための分子輸送媒体である。分子輸送媒体は、（ａ）化合物を運搬するための担体、（ｂ）担体に共有結合したアダプター、及び（ｃ）認識部分はアダプターと結合することができ、ターゲティング部分は標的と結合することができる、認識部分及びターゲティング部分を含むターゲティングタンパク質を含む。標的は水性溶液中に遊離して存在するか、あるいは天然または人工的表面に接着している。
【００２５】
本発明はまた上記分子輸送媒体を輸送する方法、例えば、上記分子輸送媒体を含む医薬組成物を投与する方法を指向している。
【００２６】
本発明はまた医療用具及びバイオセンサーの人工的表面を望ましい融合タンパク質で被う組成物を指向している。使用に際して本発明は目的とする表面上にアダプタータンパク質を堆積することを意図しており、それによりアダプタータンパク質がターゲティングタンパク質中の認識ペプチドと反応する標的として働く。
【００２７】
本発明はまた一般的に標的上の受容体と相互作用するターゲティングタンパク質に融合したリボヌクレアーゼＡの特異的なＳ−ペプチドフラグメントに会合するリボヌクレアーゼＡのＳ−タンパク質フラグメントに接合した担体と会合した治療的、診断的、または研究的化合物を標的（例えば、標的細胞）へ標的誘導輸送をするために有用な方法、化合物及び組成物に関係している。
【００２８】
本発明のその他の目的は、標的上の受容体と相互作用するターゲティングタンパク質に融合したリボヌクレアーゼＡのＳ−ペプチドフラグメントに会合したリボヌクレアーゼＡのＳ−タンパク質フラグメントに接合した担体を含む分子輸送媒体と細胞を接触させることを含む、治療的、診断的、または研究的化合物の標的誘導輸送の方法を提供することである。
【００２９】
本発明のその他の目的は標的上の細胞表面受容体と相互作用するターゲティングタンパク質と融合したリボヌクレアーゼＡのＳ−ペプチドと会合したリボヌクレアーゼＡのＳ−タンパク質に接合した担体を含む複合体を供給することである。
【００３０】
本発明のさらにその他の目的はリボヌクレアーゼＡのＳ−タンパク質フラグメントと治療、診断または研究に使用するのに有用である選択された化合物にとって適切な担体の接合体を含む分子輸送媒体を提供することである。
【００３１】
本発明のさらに他の目的はＤＮＡ配列、組換え発現ベクター、発現宿主、及びリボヌクレアーゼＡのＳ−ペプチドフラグメント及び標的の細胞表面受容体と相互作用するターゲティングタンパク質を含む融合タンパク質を提供することである。
【００３２】
本発明のさらに他の目的はＤＮＡ配列、組換え発現ベクター、発現宿主、及びヒトまたはウシリボヌクレアーゼＡのＳ−ペプチドフラグメントと相互作用するヒトまたはウシリボヌクレアーゼＡのＳ−タンパク質フラグメントの種々の形を含む組換えタンパク質を提供することである。
【００３３】
本発明のさらに他の目的はＤＮＡ配列、組換え発現ベクター、発現宿主、及びリボヌクレアーゼＡのＳ−タンパク質フラグメント及び標的の細胞表面受容体と相互作用するターゲティングタンパク質を含む融合タンパク質を供給することである。
【００３４】
定義
特に定義しない限り、ここに使用された全ての技術的及び科学的用語は該当事項に関して当業者が通常理解しているのと同じ意味を有している。
【００３５】
ここに使用されている、標的への分子輸送媒体の「輸送」とは標的と分子輸送媒体との接触のことである。ある態様においては、分子輸送媒体の細胞内輸送を達成するために受容体仲介エンドサイトーシスを利用するのが有用なことがある。
【００３６】
ここに使用されている、「ターゲティングタンパク質」とは水溶液中、または天然または人工的表面上の標的を認識できる分子のことである。ターゲティングタンパク質のタンパク質としては、サイトカイン、増殖因子、ペプチドホルモン、細胞表面抗原に対する抗体、などがある。タンパク質はタンパク質のターゲティング機能を失うこと無く、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、アミノ酸挿入、アミノ酸付加により修飾されて、融合タンパク質として、使用することができることは理解すべきである。
【００３７】
ここに使用した「天然または人工的表面上の標的」とは特異的分子を結合することができる天然または人工的表面上の成分のことである。標的としては細胞表面受容体、細胞表面抗原、医療用具及びバイオセンサーの表面上のタンパク質などがある。
【００３８】
ここに使用した「治療的、診断的、または研究的化合物」とは天然または人工的表面上の標的に輸送されて有用なものの全てのことである。化合物としては治療用、診断用、または研究用化合物、及び、これに限るものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、化学修飾ＤＮＡ、化学修飾ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、化学修飾タンパク質、化学修飾ペプチド、常磁性物質、放射活性化合物、種々のウイルス、ウイルス及びバクテリオファージ粒子、蛍光物質、種々の組成のリポソーム、及び種々の天然及び合成化合物が含まれる。
【００３９】
ここに使用された「アダプター」とは組換えタンパク質及び天然由来かあるいはコンビナトリアルペプチドライブラリーから選択された特殊なペプチドに結合することができる化学物質を含む天然または人工的物質のことである。有用なアダプターの例としてはリボヌクレアーゼＡのＳ−タンパク質またはＳ−ペプチドフラグメントがある。その他の有用なアダプターとして役立ち得る物質としてはウシ膵臓リボヌクレアーゼＡのＳ−タンパク質フラグメント、セルロース、カルモジュリン、及びストレプトアビジンがある。
【００４０】
ここに使用されている「認識ペプチド」とはアダプターと結合することができそして組換えＤＮＡ技術の方法により融合タンパク質の中に導入することができるコンビナトリアルペプチドライブラリーから選択された天然または合成ペプチドのことである。
【００４１】
ここに使用されている「融合タンパク質」とは適当な宿主中で融合タンパク質として発現できる形で組換えＤＮＡ技術の方法で結合したＤＮＡ配列によりコードされている２以上のポリペプチドフラグメントを含む組換えタンパク質のことである。
【００４２】
ここでは互換的に使用されている「リボヌクレアーゼのＳ−ペプチドフラグメント」、「Ｓ−ペプチド」、または「Ｓ−タグ」とは次のアミノ酸配列を持つウシ膵臓リボヌクレアーゼＡの１５アミノ酸フラグメント：Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１）、または次のアミノ酸配列を持つヒトリボヌクレアーゼＡの１５アミノ酸フラグメント：Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）のことであり、これはリボヌクレアーゼＡのＳ−タンパク質フラグメントと会合してウシタンパク質ではリボヌクレアーゼＳとして知られる会合体を形成する。融合タンパク質中でＳ−ペプチドはＳ−タンパク質フラグメントと結合する能力を失わずにアミノ酸置換、アミノ酸欠失、アミノ酸挿入、アミノ酸付加により修飾して使用し得る。Ｓ−ペプチドのそのような機能的な定義は適当なタンパク質フラグメントに結合し得る他の種のリボヌクレアーゼのペプチドフラグメントを包含している。ウシＳ−タグとの融合タンパク質を発現するためのベクターは市販品を入手することができる。ヒトＳ−タグとの融合タンパク質を発現するベクターは当業者に既知の技術を使用してＬｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の組成を持つヒトＳ−タグをコードするＤＮＡ配列を市販の発現ベクター中に挿入することにより構築する。
【００４３】
ここに互換的に使用されている「リボヌクレアーゼのＳ−タンパク質フラグメント」、または「Ｓ−タンパク質」とはリボヌクレアーゼＡのＳ−ペプチドフラグメントと会合することができるリボヌクレアーゼＡのフラグメントのことである。天然ウシＳ−タンパク質（残基２１−１２４）はウシ膵臓リボヌクレアーゼＡのタンパク質分解酵素サブチリシンによる限定消化により形成される。以下の開示の中で本発明は新規組換えウシ及びヒトＳ−タンパク質を提供する。リボヌクレアーゼのＳ−ペプチドフラグメントと結合するＳ−タンパク質の機能を失はずに、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、アミノ酸挿入、アミノ酸付加による修飾をして、融合タンパク質中で化学修飾及び種々の低および高分子量試薬による誘導体化をして、Ｓ−タンパク質を使用し得ることは理解されるべきである。Ｓ−タンパク質のそのような機能的な定義は適当なペプチドフラグメントに結合し得る他の種のリボヌクレアーゼのタンパク質フラグメントを包含している。天然のウシＳ−タンパク質及びその誘導体は市販品を入手できる。
【００４４】
ここに使用された「標的細胞」とはターゲティング分子と結合することができる細胞表面成分を発現するインビボまたはインビトロの細胞のことである。
【００４５】
ここに使用された、治療用、診断用、または研究用化合物の「担体」とは治療用、診断用、または研究用化合物と共有結合または非共有結合で結合することができる天然または合成分子またはその集合体のことである。そのような担体としては、これに限定されるものでないが、天然または合成ポリマーまたはコポリマー、例えば、デキストランおよびその他の多糖類、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ジビニル）エーテル−無水マレイン酸共重合体、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（メチルメタアクリル酸）、ポリ酸無水物、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリウレタン、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタアクリルアミド、誘導体化ポリマー及びコポリマー、リポソーム、種々のウイルス及びバクテイオファージ粒子、及び種々の合成ビーズ及びナノパーティクル（ｐａｒｔｉｃｌｅ）がある。
【００４６】
ここに使用されている「担体に結合したＳ−タンパク質」とは担体にＳ−タンパク質が共有結合していることである。一部の望ましい態様において、そのような共有結合はＳ−タンパク質及び担体に存在する官能基と共有結合を形成する二重官能基化学試薬を利用することができる。その他の望ましい態様において、二重官能基化学試薬はＳ−タンパク質と担体の共有結合を作るためにＳ−タンパク質及び担体に導入された官能基と結合することができる。一部の望ましい態様において、一つのアダプターは一つの担体に結合することができるが、別の望ましい態様においては、標的への分子輸送媒体の能力を増加させるために、あるいは異なる標的に結合できる手段を構築するために、１以上のアダプターが一つの担体に結合することができる。
【００４７】
ここに使用された「人工表面に結合したＳ−タンパク質」とは表面へのＳ−タンパク質の結合のことである。一部の望ましい態様において、そのような結合はＳ−タンパク質及び表面に存在する官能基と共有結合を形成する二重官能基化学試薬を利用する。その他の望ましい態様において、二重官能基化学試薬はＳ−タンパク質と表面の共有結合を作るためにＳ−タンパク質及び表面に導入された官能基と共有結合を形成することができる。
【００４８】
本発明のターゲティング成分には一般的に他の分子と結合する構造を含む、例えば、標的細胞（例えば、内皮細胞、腫瘍細胞、など）の表面にある受容体または抗原決定基。ターゲティング成分にはアダプターまたは医療用具、バイオセンサーの人工的表面に集積したその他の人工的または生物学的構造、１以上のアダプターと結合し得る種々の担体及び生物学的物質、例えば、その表面にアダプターを発現する細胞、ウイルス、及び細菌が含まれる。アダプターは当業者に既知の物質から選択することができるし、また天然のまたはコンビナトリアルペプチドライブラリーから選択された認識ペプチドと会合することができる。一態様において、アダプター物質がタンパク質であった場合、例えばウイルス及びバクテリオファージの表面タンパク質の中に、あるいは適当な認識ペプチドを担っているその他の物質と相互作用するための適当なターゲティングタンパク質の中に、当業者に既知の組換えＤＮＡ法により取り込むことができる。
【００４９】
本発明の担体成分は当業者に既知の担体から選択することができ、例えば、これに限るものではないが、デキストランおよびその他の多糖類、ポリエチレンイミン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ジビニル）エーテル−無水マレイン酸共重合体、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（メチルメタアクリル酸）、ポリ酸無水物、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリウレタン、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタアクリルアミド、種々のリポソーム及び誘導体化リポソーム、種々のデンドリマー及び誘導体化デンドリマー、種々のウイルス及びバクテイオファージ粒子、及び種々の合成ビーズ及びナノパーティクルがある。
【００５０】
本発明の化合物成分はその機能を明確にすることができる治療用、診断用、または研究用化合物から選択することができ、例えば、これに限るものではないが、核酸、ペプチド、タンパク質、遺伝子輸送に使用されるウイルス、及びバクテリオファージ、化学療法剤、常磁性、放射性または蛍光性薬剤である。
【００５１】
本発明のターゲティングタンパク質は、標的に結合するターゲティングタンパク質の能力を失わないようにタンパク質のＮ−末端またはＣ−末端に融合またはタンパク質本体の中に挿入された認識部分を含んでいる。ターゲティングタンパク質は当業者に既知の方法により融合タンパク質として作ることができそして当業者に既知のタンパク質、これに限るものではないが、サイトカイン、増殖因子、ペプチドホルモン、抗体、から選択することができる。認識部分をタンパク質に加えることにより該認識部分により認識される天然または合成物質と会合できるようになることも理解されるべきである。
【００５２】
認識部分は選択されたアダプター物質へ結合する能力により当業者に既知のペプチドから選択するか、あるいはコンビナトリアルペプチドライブラリーからアダプター物質へ結合する能力により選択することができる。
【００５３】
一つの望ましい態様において、本発明は、標的細胞上の細胞表面受容体と相互作用するターゲティングタンパク質のＮ−末端に融合したリボヌクレアーゼＡのＳ−ペプチドフラグメントと会合しているリボヌクレアーゼＡのＳ−タンパク質フラグメントと接合した担体を含む分子輸送媒体を指向している。
【００５４】
望ましい態様によれば、薬物輸送のための分子手段は薬物を含有するリポソーム担体を含んでおり、そして以下の開示において本発明はリボヌクレアーゼＡのＳ−タンパク質フラグメントとリポソームの会合の方法を提供する。
【００５５】
その他の望ましい態様によれば、薬物輸送の分子手段は核酸の担体としてポリエチレンイミンを含んでおり、そして以下の開示において本発明はポリエチレンイミンとリボヌクレアーゼＡのＳ−タンパク質フラグメントの接合方法を提供する。
【００５６】
特別に望ましい態様によれば、ターゲティングタンパク質はペプチドスペーサーを介して血管内皮増殖因子のＮ−末端と融合したリボヌクレアーゼＡのＳ−ペプチドフラグメントを含み、そして以下の開示において本発明はこのターゲティングタンパク質をコードするＤＮＡ配列、ターゲティングタンパク質を発現するための組換え発現ベクター及び発現宿主を提供する。
【００５７】
その他の望ましい態様によると、アダプターは組換えＳ−タンパク質であり、そして以下の開示において本発明はＤＮＡ配列、発現ベクター、発現宿主、及びヒト及びウシＳ−タンパク質の組換えタンパク質を提供する。
【００５８】
方法
上に示したように、本発明は、天然のまたは人工的表面上の、または水性培地中に遊離している標的へ治療用、診断用、または研究用の化合物を標的細胞へ標的誘導輸送するために有用な方法からなる。本発明はまた、これに限るものではないが、医療用具、バイオセンサー、及びハイスループットスクリーニング用具を含む人工的表面にタンパク質を固定するのに有用な方法からなる。治療用、診断用、または研究用化合物の輸送、または人工表面へのタンパク質の固定について当業者に既知の現行方法はターゲティングタンパク質中の基の化学的修飾に基づいている。化学的修飾としては、これに限定しないが、本体とターゲティング分子との直接共有交差結合、または本体の担体とターゲティング分子との共有交差結合、または本体の担体または当業者に既知の方法により修飾した本体を捕捉することができる基（例えば、ビオチン）の共有交差結合がある。人工表面へのタンパク質の固定について当業者に既知の現行方法はタンパク質中の基の化学的修飾に基づいている。化学的修飾は人工表面に直接交差結合してタンパク質を固定するか、人工表面と相互作用する基または当業者に既知の方法により人工表面に集積するその他の基と交差結合して固定する方法が使用される。
【００５９】
タンパク質の化学的修飾は場合に応じた個別開発にならざるを得ない。さらに、化学的修飾はタンパク質の機能的活性に及ぼす損傷により常に制限されている。最後に、様々なタンパク質の個別的化学的修飾に基づいた方法では、異なるタンパク質を結合することができる治療用、診断用または研究用化合物の標準化された製品の製造、または種々のタンパク質を固定するための標準化された人工表面を製造することができない。
【００６０】
これらの障害を克服するために、本発明は治療用、診断用、または研究用化合物の標的誘導輸送及び人工表面に種々のタンパク質を固定するのに有用な方法を開示する。本方法はタンパク質を、ターゲティングタンパク質のＮ−末端またはＣ−末端にスペーサーペプチドを介して融合したか、またはターゲティングタンパク質本体の中に挿入した認識ペプチドを含む融合タンパク質へ変換することに基づいている。認識ペプチドは表面タンパク質の部分としてウイルスまたはバクテリオファージ粒子の表面に発現することができる、例えば、アデノウイルスのファイバーまたはペントンベース（ｐｅｎｔｏｎ  ｂａｓｅ）コートタンパク質、４０７０Ａ（両性）レトロウイルスエンベロープタンパク質、またはバクテリオファージのタンパク質ＩＩＩ。定義により、そのような融合タンパク質が有用であるためにはその機能活性を保持していなければならない。認識ペプチドはアダプター本体と結合する能力を示さなければならず、また天然ペプチドであるか、またはコンビナトリアルペプチドライブラリーから由来しても良い。認識ペプチドは組換え融合タンパク質の精製のためのタグとして当業者に既知であり、また使用されている。天然ペプチドの例は次のものがある：ウシ膵臓リボヌクレアーゼＡの１５残基Ｓ−ペプチドフラグメント、Ｓ−タグと呼ばれ、ウシ膵臓リボヌクレアーゼＡのＳ−タンパク質フラグメントに結合する（Ｋｉｍ  ＆  Ｒａｉｎｅｓ，１９９３）、セルロースに結合する細菌セルロース由来セルロース結合ドメイン（１０７から１５４ａａ）、カルモジュリンに結合する４ｋＤａカルモジュリン結合ペプチド。コンビナトリアルペプチドライブラリーから選択されたペプチドの例としてはストレプ−タグと呼ばれる内在性ストレプトアビジン結合活性を持つペプチドがある（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＆  Ｓｋｅｒｒａ，１９９３）。
【００６１】
融合タンパク質中の認識ペプチドと結合できるアダプター物質はその天然宿主から精製または組換えＤＮＡ技術の方法または化学合成により作製することができる。アダプター物質は選択された治療用、診断用、または研究用化合物に適する担体と化学的に結合することができ、そして融合ターゲティングタンパク質と会合することができる。アダプター本体は医療用具またはバイオセンサーの人工表面に化学的に結合することができ、そして適当な認識ペプチドを含む融合タンパク質と会合できる。アダプター本体は表面タンパク質の部分としてウイルスまたはバクテリオファージ粒子の表面に発現することができる、例えば、アデノウイルスのファイバーまたはペントンベースコートタンパク質、４０７０Ａ（両性）レトロウイルスエンベロープタンパク質、またはバクテリオファージのタンパク質ＩＩＩに発現することができ、そして融合ターゲティングタンパク質と会合することができる。このように、種々のタンパク質に対する個別の方法を開発する代わりに、本方法はアダプター本体の標準的方法のみに依存している。
【００６２】
種々の担体または医療用具及びバイオセンサーの人工表面とのアダプターの化学的結合、またはアダプタータンパク質またはペプチドのウイルスまたはバクテリオファージ粒子表面への発現のための適当な方法は当業者に既知の多くの方法の中から選択される。アダプターは担体と結合するのに適する特に反応性の高いアミノ酸残基を持つように構築できると理解されている。担体はそのようにしてあるいは既に治療用、診断用、または研究用化合物で修飾されているものを使用すると理解されている。人工的表面はそのようにしてあるいは既知の方法により表面を他の化学基で被って使用すると理解されている。必要があれば、認識ペプチドとアダプター物質の複合体に化学的修飾を行ない、次いで完全な複合体を精製し、次いで既知の方法により複合体から接合体を分離することができる。後者の方法により認識ペプチドに結合する能力を保持した接合体を選択する。定義により、接合体は融合タンパク質中の認識ペプチドと相互作用する能力を保持していなければならない。定義により、ウイルスまたはバクテリオファージ粒子表面に発現したアダプターまたは医療用具またはバイオセンサーの人工表面に接着したアダプターは融合タンパク質中の認識ペプチドと相互作用する能力を保持していなければならない。
【００６３】
接合体はアダプター物質及び認識ペプチド間の相互作用を介して融合タンパク質に結合し、そして生じた輸送複合体は標的誘導輸送に使用される。治療用、診断用または研究用の化合物は接合体を融合タンパク質に結合する前にまたはその後に接合体に積込むことができる。定義により、その複合体を有用にするために天然または人工的表面上の標的に結合する能力を保持していなくてはならない。このように、治療用、診断用、または研究用の化合物を異なるタンパク質に積込む個別的方法の代わりに、本方法は天然または人工表面上の種々の標的を指向することができる様々な融合タンパク質と組合わせることができる接合体の同一の標準的調製に依存している。
【００６４】
治療用、診断用、または研究用の化合物の標的細胞または人工表面への標的誘導輸送に関する提案の方法を図１Ａ及び１Ｂに図示する。
【００６５】
本発明では治療用、診断用、または研究用の化合物の標的誘導輸送に有用な方法の特に望ましい態様を開示する。特に望ましい態様は融合ターゲティングタンパク質に基づいており、それはスペーサーペプチドを介してターゲティングタンパク質に結合したリボヌクレアーゼＡのＳ−ペプチドフラグメントを含んでいる。Ｓ−ペプチドはヒトまたはウシリボヌクレアーゼＡ中のわずか１５アミノ酸残基のみを含み、そしてヒト及びウシタンパク質についてそれぞれわずか１０８及び１０４アミノ酸残基のみを含むＳ−タンパク質と結合する。リボヌクレアーゼＳとして知られる、比較的小さなサイズのＳ−ペプチド／Ｓ−タンパク質複合体はターゲティング融合タンパク質及び天然または人工表面上の標的の間の相互作用に関して立体的制約を生じることが少ないであろう。Ｓ−タンパク質及びＳ−ペプチドのサイズが小さいことは、Ｓ−タンパク質及びＳ−ペプチドがウイルスまたはバクテリオファージの表面タンパク質と融合したときにウイルスまたはバクテリオファージ粒子の構造を乱すことも少ないであろう。さらに、融合ターゲティングタンパク質中のＳ−ペプチドにＳ−タンパク質が結合した後に生じるリボヌクレアーゼＳのリボヌクレアーゼ活性は市販で入手できるキット（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）により容易に定量することができる。
【００６６】
特に望ましい態様は血管内皮増殖因子を含む、ＦＶＥＧＦと呼ばれる、融合ターゲティングタンパク質に基づいている（図２）。血管内皮増殖因子はいくつかの受容体との相互作用を介して内皮細胞の増殖を調節しているが、その受容体のうちのＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体の発現は主として内皮細胞に限定されている。成熟生体では黄体形成を除いて、種々の病的状態の時にのみ内皮細胞の増殖（血管形成）が生じる。したがって、治療用、診断用、または研究用の化合物のＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体誘導輸送は種々の病因の治療に有用であり得る。本発明はＦＶＥＧＦ融合ターゲティングタンパク質が標的細胞の表面上に発現した血管内皮増殖因子受容体ＫＤＲ／ｆｌｋ−１に結合することができることを開示する。
【００６７】
本発明は新規組換えヒト及びウシＳ−タンパク質の作製に関する特に望ましい態様を開示する。これとその他の目的のために、ヒト及びウシＳ−タンパク質を都合よく操作して、アダプターとして使用することができる組換えタンパク質として発現する、この中にはジスルフィド結合に使われずそれゆえ担体と交差結合するのに特に適した追加のシステインを持つアダプターが含まれる（図２Ｃ）。
【００６８】
本発明の特に望ましい態様はＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現する標的細胞に薬物を含有するリポソームを標的誘導輸送をするのに有用な方法である。これとその他の目的のために、アダプタータンパク質として使用されるウシリボヌクレアーゼＡのＳ−タンパク質フラグメントをポリエチレングリコール化リン脂質と化学的に接合して、接合体とリポソームの間の接合と会合がウシリボヌクレアーゼＡのＳ−ペプチドフラグメントへの結合能力を保持するようにしてＳ−タンパク質とリポソームの会合を行なう。薬物含有リポソーム／Ｓ−タンパク質構築（Ｌｉｐ（Ｄｏｘ）−ＳＰと命名）はリボヌクレアーゼＡのＳ−ペプチドフラグメントを含むＦＶＥＧＦ融合ターゲティングタンパク質と会合し、そして生じた複合体はＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体誘導リポソーム輸送に使用する。
【００６９】
本発明はまたＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現する標的細胞へＤＮＡを標的誘導輸送するのに有用な方法の特に望ましい態様を開示する。これとその他の目的のために、接合体がウシ膵臓リボヌクレアーゼＡのＳ−ペプチドフラグメントとの結合能力を保持する様にして、アダプタータンパク質として使用されるウシ膵臓リボヌクレアーゼＡのＳ−タンパク質フラグメントをポリエチレンイミンに化学的に接合する。接合体（ＰＥＩ−ＳＰと命名）はウシ膵臓リボヌクレアーゼＡのＳ−ペプチドフラグメント含むＦＶＥＧＦ融合ターゲティングタンパク質と会合し、そして生じた複合体はＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体誘導ＤＮＡ輸送のためのＤＮＡと会合する。
【００７０】
組成物
１．融合ターゲティングタンパク質。
本発明は治療用、診断用、または研究用の化合物を天然または人工表面へ標的誘導輸送するのに有用な組成を含んでいる。この組成の一つの要素は融合ターゲティングタンパク質であり、これはスペーサーペプチドを介してターゲティングタンパク質のＮ−末端またはＣ−末端に融合しているか、またはその本体の中に挿入されている認識ペプチドを含んでいる。ターゲティングタンパク質は天然または人工表面上の成分を認識することができるタンパク質分子から選択される。また、定義により、認識ペプチドを含む融合タンパク質はどれもアダプタータンパク質を認識することができる。既知のターゲティングタンパク質としては、これに限定しないが、サイトカイン、増殖因子及び細胞表面抗原に対する抗体がある。もしタンパク質を既知の組換えＤＮＡ技術を使用して組換え融合タンパク質を部分として発現することができるならば、そしてもし組換え融合タンパク質が天然または人工表面の標的と結合する能力を保持しているならば、ターゲティングタンパク質を提案する組成の中に使用することができる。ターゲティングタンパク質は治療用、診断用、または研究用の化合物を独占的に、または優先的に天然または人工表面上の指定した標的へ輸送するために選択される。
【００７１】
多くのタンパク質は追加的なペプチドをＮ−末端またはＣ−末端に融合した機能的に活性な融合タンパク質として発現できることは当業者に知られている。市販により入手できるプラスミドを使用して、組換えタンパク質はタンパク質の検出及び精製を容易にするペプチドタグ、例えば、これに限定しないが、ｍｙｃ−タグ、Ｓ−タグ、セルロース結合タグ、カルモジュリン結合タグ、またはストレプ（ｓｔｒｅｐ）−タグ、と共に個別に発現する。一般的に、タグは既知タンパク質の部分であり得るし、またコンビナトリアルペプチドライブラリーから選択することもできる。
【００７２】
本発明は治療用、診断用、または研究用の化合物を標的細胞へ標的誘導輸送をするのに有用な組成の特に望ましい態様を開示する。特に望ましい態様はＦＶＥＧＦと命名される融合ターゲティングタンパク質に基づいており、これはスペーサーペプチドを介して血管内皮増殖因子と結合したリボヌクレアーゼＡのＳ−ペプチドフラグメントを含んでいる（図２）。本発明は、ＦＶＥＧＦ融合タンパク質が標的細胞の表面に発現した血管内皮増殖因子受容体ＫＤＲ／ｆｌｋ−１に結合できることを開示する。
【００７３】
２．担体及びアダプタータンパク質の接合
本発明で開示された組成のもう一つの要素は担体とアダプター物質の接合体である。治療用、診断用、または研究用の化合物を輸送するために使用することができる多くの担体が当業者には既知である。そのような担体は、これに限定しないが、天然または合成ポリマー及びコポリマーであり、例えば、デキストラン及びその他の多糖類、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ジビニル）エーテル‐無水マレイン酸共重合体、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（メチルメタアクリレート）、ポリ無水物、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリウレタン、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタアクリルアミド、誘導体化ポリマー及びコポリマー、リポソーム、種々のウイルス及びバクテリオファージ粒子、及び種々の合成ビーズ及びナノパーティクルである。
【００７４】
アダプター物質は天然宿主から精製することができるし、あるいは組換えＤＮＡ技術の方法または化学合成により作製することができる。もしそれらが結合する認識ペプチドが天然に存在するかまたはコンビナトリアルペプチドライブラリーから選択されるならば、種々のタンパク質がアダプター物質として役立ち得ると理解される。また、認識ペプチドと結合することができる天然または合成ポリマーはアダプター物質になり得る。アダプター物質へ担体を接合する適当な方法は当業者に既知の多くの方法から選択される。この方法としては、これに限定しないが、化学的接合がある。アダプターは担体と接合するのに適した特に反応性の高いアミノ酸残基を持つように構築できると理解される。担体はそのようにしてまたは治療用、診断用、または研究用の化合物で既に修飾されているものとして使用できると理解される。必要があれば、認識ペプチドとアダプター物質の複合体に接合を行ない、次いで完全な複合体を精製し、次いで既知の方法により複合体から接合体を精製することができる。後者の方法により認識ペプチドに結合する能力を保持した接合体を選択する。
【００７５】
本発明は治療用または診断用の薬剤を含有するリポソームの標的細胞への標的誘導輸送に有用な接合体及びＤＮＡ及びその他の核酸及び化学修飾核酸を標的細胞へ標的誘導輸送するのに有用な接合体の特に望ましい態様を開示する。特に望ましい接合体はリボヌクレアーゼＡのＳ−タンパク質フラグメントに接合するリポソーム及びポリエチレンイミンと会合するためにリボヌクレアーゼＡのＳ−タンパク質フラグメントに接合した誘導体化リン脂質を含む。本発明はまた新規アダプター‐担体接合体を開発するために組換えヒト及びウシＳ−タンパク質の特に望ましい態様を開示する。
【００７６】
３．アダプタータンパク質と人工表面との接合
本発明に開示されているその他の要素はアダプター物質と人工表面との接合である。多くの人工表面は使用するためにタンパク質で被わなければならないことが知られている。そのような人工表面は、これに限定しないが、バイオセンサー、医療用具、調節薬剤放出のための埋め込み徐放製剤、及びハイスループットスクリーニング用のタンパク質を固定する表面がある。
【００７７】
アダプター物質は天然宿主から精製するか、または組換えＤＮＡ技術または化学合成により作製することができる。もしそれが結合できる認識ペプチドが天然に存在するかまたはコンビナトリアルペプチドライブラリーから選択されるならば、種々のタンパク質がアダプター物質として役に立つと理解される。また、認識ペプチドに結合することができる天然または合成ポリマーはアダプター物質として役立つ。アダプター物質と人工表面の適当な接合方法は当業者に既知の多くの方法の中から選択する。この方法には、これに限定しないが、アダプター物質と人工表面の化学的接合が含まれる。必要があれば、アダプター物質と認識ペプチドの複合体に接合を行ない次いで当業者に既知の方法により複合体から認識ペプチドを除くことができる。
【００７８】
本発明はアダプター物質の特に望ましい態様を開示する。特に望ましいアダプター物質はリボヌクレアーゼＡのＳ−タンパク質フラグメントを含んでおり、これは容易に、例えば、バイオセンサー、または医療用具、または調節薬剤放出のための埋め込み徐放製剤、及びハイスループットスクリーニング用のタンパク質を固定する表面に接合しそして生物学的に活性なタンパク質を含むＳ−ペプチドに結合する能力を保持している。
【００７９】
４．アダプター物質を含む融合タンパク質
本発明に開示されている組成のその他の要素はアダプター物質として機能するタンパク質またはペプチド部分を含むウイルスまたはバクテリオファージ融合タンパク質である。ウイルス及びバクテリオファージ粒子と核酸輸送に使用できること及び粒子の機能を損なうことなく融合タンパク質としてある表面タンパク質を作り得ることは当業者に知られている。
【００８０】
アダプタータンパク質またはペプチドは当業者に既知の多くの方法の中から選択された組換えＤＮＡ技術の方法によりウイルスまたはバクテリオファージの表面タンパク質中に挿入される。種々のウイルスまたはバクテリオファージ表面タンパク質が挿入に使用される得ると理解される。もしそれが結合できる認識物質が天然に存在するかあるいはコンビナトリアルペプチドライブラリーから選択されるならば、異なるタンパク質またはペプチドはアダプター物質として働くと理解される。
【００８１】
本発明はウイルス及びバクテリオファージ表面タンパク質に挿入するのに有用なアダプター物質の特に望ましい態様を開示する。特に望ましいアダプター物質はリボヌクレアーゼＡのＳ−タンパク質またはＳ−ペプチドを含む。
【００８２】
本発明の分子輸送媒体は治療用または診断用化合物を標的誘導輸送により検出または作用することができる細胞による生理的病状を治療するのに有用である。そのような状態は、これに限定しないが、全ての形の癌、心臓血管疾患、神経学的病気、眼の疾患、傷の治癒などが含まれる。
【００８３】
本発明の分子輸送媒体は医薬組成物の形態で患者に投与することができる。本発明の医薬組成物は体内に、例えば、静脈内に、通常の医薬製剤の形、例えば、腸内または非経口投与する医薬として受容し得る水、ゼラチン、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物油、ガム、アルコール、ワセリンのような石油製品、などのような有機及び／または無機不活性担体を含む賦形剤に入れて、投与されることが望ましい。医薬組成物は通常の固形剤、例えば、錠剤、糖衣錠、坐剤、カプセル、などまたは通常の液剤、例えば、懸濁剤、乳剤、などの形態であり得る。もし望むなら、滅菌し及び／または通常の医薬添加物、例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤、あるいは浸透圧を調節するために使用する塩、を含むこともできる。医薬組成物はその他の薬物活性物質を含むこともできる。
【００８４】
標的誘導輸送用の担体の治療有効用量は求める効果を提供する用量である。一般的に、有効用量は血清ｍｌ当たり０．１ｎｇから１００ｍｇの範囲のターゲティングタンパク質であるはずである。当業者に知られているように、医薬組成物及び投与経路によって、上記範囲は患者の体重ｋｇ当たり一日０．０１から２０００ｍｇ、及び望ましいのは患者の体重ｋｇ当たり一日０．０１から２００ｍｇ、より望ましいのは患者の体重ｋｇ当たり一日０．０１から２０ｍｇの用量の投与により達成し得る。
【００８５】
（例）
以下の例は説明を意図したものであり、本発明の範囲を限定するものではない。特記しない限り全ての比及びパーセントは重量により、全ての温度は℃で示す。
【００８６】
例１．  ペプチドスペーサーを介して血管内皮増殖因子と結合したリボヌクレアーゼのＳ−ペプチドまたはＳ−タンパク質フラグメントを含む融合タンパク質の調製及び組換えＳ−タンパク質の調製
Ａ．  一般的説明
１．細菌株及びプラスミド
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＵＳＡ）から市販品を入手できる。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ１２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ，Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ，Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ株はＮｏｖａｇｅｎ（ＵＳＡ）から市販品を入手できる。平滑末端（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄ）クローニング用のベクターｐＥＴＢｌｕｅ及びＨｉｓ−タグ、Ｓ−タグ及びチオレドキシンを含む末端延長を有する組換えタンパク質の細菌発現用のベクターｐＥＴ３２ａ（＋）はＮｏｖａｇｅｎ（ＵＳＡ）から市販品を入手できる。成人膵臓リボヌクレアーゼＡの１−１２７ａａをコードする合成ＤＮＡフラグメント含むプラスミドｐＥＴ−ＨＰ及び成獣ウシ膵臓リボヌクレアーゼＡの１−１２４ａａをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドｐＴ７−７／リボヌクレアーゼＡはＤｒ．Ｇ．Ｄ’Ａｌｅｓｓｉｏ（Ｎａｐｏｌｉ  Ｆｅｄｅｒｉｃｏ  ＩＩ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｐｌｅｓ，Ｉｔａｌｙ）から入手した。ヒトＶＥＧＦの１２１−、１６５−及び１８９−残基アイソフォームをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドｐＬｅｎ−１２１、ｐＬｅｎ−１６５及びｐＬｅｎ−１８９は、ここにその全体を参考文献として取り入れた、米国特許５，２１９，７３９に記述されており、Ｄｒ．Ｊ．Ａｂｒａｈａｍ（Ｓｃｉｏｓ  Ｎｏｖａ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）から入手した。全長ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体をコードするＤＮＡ配列を含む哺乳動物細胞発現プラスミドｐＢａｌ／Ｐｓｔ／ｐｕｒ−ＫＤＲはＤｒ．Ｔｅｒｍａｎ（Ａ．Ｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＵＳＡ）から入手した。哺乳動物細胞においてルシフェラーゼを発現するためのレポータープラスミドｐＲＬ−ｔｋはＰｒｏｍｅｇａ（ＵＳＡ）から市販品を入手できる。
【００８７】
２．ＤＮＡ操作
ここに使用された制限酵素及び修飾酵素は米国において市販されており、そしてメーカーの使用説明書にしたがって使用した。コンピテント細胞の調製、形質転換、及び細菌培地はＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）にしたがうか、またはメーカーの説明書にしたがった。プラスミドの精製はメーカー説明書にしたがってＷｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓまたは  Ｍａｘｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を使用して行なった。アガロースゲルからのＤＮＡフラグメントの精製はメーカー説明書にしたがってＧｅｎｅｃｌｅａｎ  Ｓｐｉｎ  ｋｉｔ（Ｂｉｏ  １０１，ＵＳＡ）を使用して行なった。
【００８８】
Ｂ．ヒトＶＥＧＦの１２１−、１６５−及び１８９−残基アイソフォームのｐＥＴ３２ａ（＋）発現ベクターへの再クローニング
１．ヒトＶＥＧＦの１２１−、１６５−及び１８９−残基アイソフォームをコードするＤＮＡの増幅用プライマー
ヒトＶＥＧＦ  ＤＮＡ増幅用のプライマーはＧｅｎｅＬｉｎｋ（ＵＳＡ）により合成された。ＶＥＧＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の全アイソフォームの「センス」鎖に対応するプライマーはＶＥＧＦの成熟１２１−，１６５−，及び１８９−残基アイソフォームのアミノ酸−１に対するＤＮＡコドンの直ぐ上流にあるＳｔｕ制限サイトを含んでいた。
【００８９】
ＶＥＧＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３及び４）の全てのアイソフォームの「アンチセンス」鎖に対応するプライマーは成熟ペプチドのカルボキシル末端をコードするＤＮＡのコード配列と相補的であり、成熟ＶＥＧＦをコードする配列の後に翻訳停止コドンを含み、ＶＥＧＦコードＤＮＡ及び停止コドンの下流にＸｈｏ  Ｉ制限サイトが導入されている。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３    ５’−ＴＡＡＧＧＣＣＴＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４    ５’−ＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＴＴＧＴＣＡＣ−３’
【００９０】
２．ヒトＶＥＧＦの１２１−、１６５−及び１８９−残基アイソフォームをコードするＤＮＡ増幅のためのＰＣＲ
ヒトＶＥＧＦ  ｃＤＮＡをヒトＶＥＧＦの１２１−、１６５−及び１８９−残基アイソフォームの配列をそれぞれ含むｐＬｅｎ−１２１、ｐＬｅｎ−１６５及びｐＬｅｎ−１８９プラスミドからＰＣＲにより増幅した。各鋳型ＤＮＡの１０ナノグラムを各オリゴヌクレオチド１０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ  ０．２ｍＭ及びＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ２Ｕ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）のＰｆｕ緩衝溶液を含む標準的ＰＣＲ反応に加えた。インキュベーションはＤＮＡ  ＧｅｎＡｍａｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２４００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ，ＵＳＡ）中で行なった。１サイクルは変性段階（９４℃１分間）、アニーリング段階（６５℃１分間）、及び延長段階（７２℃１分間）を含む。２５サイクルの後、各反応の１０μｌ分液を１％アガロースゲルにかけ増幅生成物が正しいサイズであることを確認した。増幅したＤＮＡフラグメントはＳｔｕ及びＺｈｏ  Ｉで消化してＧｅｎｅｃｌｅａｎ  Ｓｐｉｎ  ｋｉｔ（ＢＩＯ  １０１，ＵＳＡ）で精製した。
【００９１】
３．ｐＥＴ３２−ｔｘＶＥＧＦ１２１、ｐＥＴ３２−ｔｘＶＥＧＦ１６５及びｐＥＴ３２−ｔｘＶＥＧＦ１８９プラスミドの構築
例１．Ｂ．２に記述した増幅ＤＮＡフラグメントをベクターの多重クローニングサイトのＸｈｏ  Ｉサイト及びベクターを次のように処理して、ｐＥＴ３２ａ（＋）ＤＮＡをＮｅｏ  Ｉ制限酵素で直線化し、そして陥凹末端を部分的にＤＮＡポリメラーゼＩラージ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントを使用してシチジンで充たして、構築したＳｔｕ  Ｉサイトを使用してｐＥＴ３２ａ（＋）ベクターに結合した。次いでその構築をＧｅｎｅｃｌｅａｎ  Ｓｐｉｎ  ｋｉｔ（ＢＩＯ  １０１，ＵＳＡ）で精製し、そして１本鎖部分をマング豆ヌクレアーゼで除去した。得られた構築をＸｈｏ  Ｉ制限酵素消化し、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎ  Ｓｐｉｎ  ｋｉｔ（ＢＩＯ  １０１，ＵＳＡ）で精製した。結合はＶＥＧＦの成熟１２１−、１６５−及び１８９−残基アイソフォームの最初のアミノ酸がベクターにより提供されるエンテロキナーゼ切断部位の後の最初のアミノ酸になるようにした。生成したプラスミドはそれぞれｐＥＴ３２−ｔｘＶＥＧＦ１２１、ｐＥＴ３２−ｔｘＶＥＧＦ１６５及びｐＥＴ３２−ｔｘＶＥＧＦ１８９と命名され、そしてＤＨ５αコンピテント細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）にメーカー説明書にしたがって導入した。求めるプラスミドを含む細胞培養は例１．Ａ．２に記述した方法を使用して単離プラスミドを大量に調製するために更に増殖させた。
【００９２】
４．ｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１、ｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１６５及びｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１８９プラスミドの構築
制限酵素Ｎｄｅ  Ｉで精製プラスミドＤＮＡを消化した後Ｔ４リガーゼにより直線化プラスミドＤＮＡの分子内結合を行なって、チオレドキシン（ｔｘ）遺伝子をｐＥＴ３２−ｔｘＶＥＧＦ１２１、ｐＥＴ３２−ｔｘＶＥＧＦ１６５及びｐＥＴ３２−ｔｘＶＥＧＦ１８９プラスミドから除去した。生成したプラスミドはｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１、ｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１６５及び  ｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１８９と命名され、そしてＤＨ５αコンピテント細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）にメーカー説明書にしたがって導入した。求めるプラスミドを含む細胞培養は例１．Ａ．２に記述した方法を使用して単離プラスミドを大量に調製するために更に増殖させた。
【００９３】
Ｃ．ウシ及びヒトＳ−タンパク質をコードするｃＤＮＡフラグメントのｐＥＴＢｌｕｅ−１ベクターへの再クローニング
１．ウシリボヌクレアーゼＡの１６−１２４、１７−１２４、１８−１２４、１９−１２４、２０−１２４、２１−１２４ａａフラグメントをコードするＤＮＡの増幅用プライマー
このプライマーはそれぞれウシリボヌクレアーゼＡのアミノ酸１６、１７、１８、１９、２０及び２１に対するＤＮＡコドンの直ぐ上流にあるＡＵＧコドンを含むウシＳ−タンパク質ｃＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５，６，７，８，９，及び１０）の「センス」鎖に相当する。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５      ５’−ＡＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＴＧＴＡＡＣＣＡＧ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６      ５’−ＡＴＧＡＣＴＴＣＣＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７      ５’−ＡＴＧＴＣＣＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８      ５’−ＡＴＧＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＴＧ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９      ５’−ＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＴＧＴＡＡＣＣ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０     ５’−ＡＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＴＧＴＡＡＣＣＡＧ−３’
【００９４】
ウシＳ−タンパク質ｃＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）の「アンチセンス」鎖に相当するプライマーはＣ−末端ａｌａ１２２−ｓｅｒ１２３−ｖａｌ１２４をコードする配列の後の翻訳停止コドンを含むこのタンパク質のカルボキシル端をコードするＤＮＡのコード配列と相補的であった。ウシ変異Ａ１２２Ｃ  Ｓ−タンパク質ｃＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）の「アンチセンス」鎖に相当するプライマーはＣ−末端ｃｙｓ１２２−ｓｅｒ１２３−ｖａｌ１２４をコードする配列の後の翻訳停止コドンを含むこのタンパク質のカルボキシル端をコードするＤＮＡのコード配列と相補的であった。ウシ変異Ｓ１２３Ｃ、Ｖ１２４Ｓ  Ｓ−タンパク質ｃＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）の「アンチセンス」鎖に相当するプライマーはＣ−末端ａｌａ１２２−ｃｙｓ１２３−ｓｅｒ１２４−ｖａｌ１２５をコードする配列の後の翻訳停止コドンを含むこのタンパク質のカルボキシル端をコードするＤＮＡのコード配列と相補的であった。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１    ５’−ＣＴＡＣＡＣＴＧＡＡＧＣＡＴＣＡＡＡＧＴＧＧＡＣＴＧＧＣ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２    ５’−ＣＴＡＣＡＣＴＧＡＡＣＡＡＴＣＡＡＡＧＴＧＧＡＣＴＧＧＣ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３    ５’−ＣＴＡＣＡＣＴＧＡＧＣＡＡＧＣＡＴＣＡＡＡＧＴＧＧＡＣＴＧＧＣＡＣＧ−３’
【００９５】
２．ヒトリボヌクレアーゼＡの１６−１２７、１９−１２７、２１−１２７ａａフラグメントをコードするＤＮＡの増幅用のプライマー
ヒトリボヌクレアーゼＡ  ｃＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、１５及び１６）の「センス」鎖に相当するプライマーはそれぞれヒトリボヌクレアーゼＡのアミノ酸１６、１９及び２１のＤＮＡコドンの直ぐ上流にあるＡＵＧコドンを含んでいた。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４    ５’−ＡＴＧＧＡＣＴＣＧＡＧＣＣＣＧＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５    ５’−ＡＴＧＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＴＧ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６    ５’−ＡＴＧＴＣＴＴＣＴＴＣＴＡＣＧＴＡＣＴＧＣＡＡＣＣＡＧ−３’
【００９６】
ヒトＳ−タンパク質ｃＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）の「アンチセンス」鎖に相当するプライマーはＣ−末端ｖａｌ１２４−ｇｌｕ１２５−ａｓｐ１２６−ｓｅｒ１２７をコードする配列の後の翻訳停止コドンを含むこのタンパク質のカルボキシル端をコードするＤＮＡのコード配列と相補的であった。ヒト変異Ｖ１２２Ｃ  Ｓ−タンパク質ｃＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）の「アンチセンス」鎖に相当するプライマーはＣ−末端ｃｙｓ１２４−ｇｌｕ１２５−ａｓｐ１２６−ｓｅｒ１２７をコードする配列の後の翻訳停止コドンを含むこのタンパク質のカルボキシル端をコードするＤＮＡのコード配列と相補的であった。ヒト変異、Ｄ１２６Ｃ，Ｓ１２７Ｄ，Ｓ１２８  Ｓ−タンパク質ｃＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）の「アンチセンス」鎖に相当するプライマーはＣ−末端ｖａｌ１２４−ｇｌｕ１２５−ｃｙｓ１２６−ａｓｐ１２７−ｓｅｒ１２８をコードする配列の後の翻訳停止コドンを含むこのタンパク質のカルボキシル端をコードするＤＮＡのコード配列と相補的であった。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７     ５’−ＴＣＡＡＧＡＧＴＣＴＴＣＡＡＣＡＧＡＣＧＣＧＴＣＧ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８     ５’−ＴＣＡＡＧＡＧＴＣＴＴＣＡＣＡＡＧＡＣＧＣＧＴＣＧ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９     ５’−ＴＣＡＡＧＡＧＴＣＧＣＡＴＴＣＡＡＣＡＧＡＣＧＣＧＴＣＧＡＡＡＴＧ−３’
【００９７】
３．１８−１２５ａａ変異ヒトＳ−タンパク質をコードするＤＮＡの増幅用プライマー
ヒト変異Ｐ１９Ａ、Ｓ２０Ａ  Ｓ−タンパク質ｃＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）の「センス」鎖に相当するプライマーはＮ−末端ｓｅｒ１８−ａｌａ１９−ａｌａ２０−ｓｅｒ２１−ｓｅｒ２２−ｓｅｒ２３をコードする配列の直ぐ上流にあるＡＵＧコドンを含んでいた。ヒト変異Ｐ１９Ａ、Ｓ２０Ａ  Ｓ−タンパク質ｃＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）の「センス」鎖に相当するプライマーはＮ−末端ｓｅｒ１８−ａｌａ１９−ａｌａ２０−ｓｅｒ２１−ｓｅｒ２２−ｓｅｒ２３をコードする配列の直ぐ上流にあるＡＵＧコドンを含みまたウシＳ−タンパク質のｓｅｒ１８、ｓｅｒ２１及びｓｅｒ２２をコードするコドンを含んでいた。ヒト変異Ｐ１９Ａ、Ｓ２０Ａ、Ｔ２４Ｄ  Ｓ−タンパク質ｃＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）の「センス」鎖に相当するプライマーはＮ−末端ｓｅｒ１８−ａｌａ１９−ａｌａ２０−ｓｅｒ２１−ｓｅｒ２２−ｓｅｒ２３をコードする配列の直ぐ上流にあるＡＵＧコドンを含みまたウシＳ−タンパク質のｓｅｒ１８、ｓｅｒ２１、ｓｅｒ２２、ｓｅｒ２３及びａｓｐ２４をコードするコドンを含んでいた。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０
５’−ＡＴＧＡＧＣＧＣＴＧＣＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＡＣＧＴＡＣＴＧＣＡＡＣＣＡＧ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１
５’−ＡＴＧＴＣＣＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＣＴＡＣＧＴＡＣＴＧＣＡＡＣＣＡＧＡＴＧ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２
５’−ＡＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＣＡＧＡＴＧＡＴＧＣＧＴＣＧ−３’
【００９８】
ヒトＳ−タンパク質ｃＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）の「アンチセンス」鎖に相当するプライマーはＣ−末端ｓｅｒ１２３−ｖａｌ１２４−ｇｌｕ１２５をコードする配列の後の翻訳停止コドンを含むこのタンパク質のカルボキシル端をコードするＤＮＡのコード配列と相補的であった。ヒト変異Ｓ１２３Ｃ  Ｓ−タンパク質ｃＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）の「アンチセンス」鎖に相当するプライマーはＣ−末端ｃｙｓ１２３−ｖａｌ１２４−ｇｌｕ１２５をコードする配列の後の翻訳停止コドンを含むこのタンパク質のカルボキシル端をコードするＤＮＡのコード配列と相補的であった。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３    ５’−ＴＣＡＴＴＣＡＡＣＡＧＡＣＧＣＧＴＣＧＡＡＡＴＧＡＡＣＣＧＧ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４    ５’−ＣＴＡＴＴＣＡＡＣＡＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＡＡＴＧＡＡＣＣＧＧ−３’
【００９９】
４．  ヒト及びウシＳ−タンパク質を発現するためのプラスミドの構築
ヒト及びウシＳ−タンパク質の野生型及び変異型に対応するｃＤＮＡはそれぞれｐＥＴ−ＨＰ及びｐＴ７−７／ＲＮａｓｅＡプラスミドからＰＣＲにより増幅された。増幅サイクルは次のとおり：１サイクルは９４℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃３０秒を含む。２５サイクルの後、各反応の１０−μｌ分液（ａｌｉｑｕｏｔ）を１％アガロースゲルにかけ増幅生成物の正しいサイズを確認した。増幅したＤＮＡフラグメントを１％アガロースからゲル精製しそしてメーカー説明書にしたがってＰｅｒｆｅｃｔｌｙ  Ｂｌｕｎｔ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）を使用してｐＥＴＢｌｕｅ−１プラスミド中にクローニングした。得られたプラスミドをメーカー説明書にしたがってＮｏｖａＢｌｕｅコピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）に導入した。プラスミドを大量調製するために求めるプラスミドを含む細菌培養を例１．Ａ．２に記述した方法を使用して更に増殖した。
【０１００】
Ｄ．  ウシＳ−タンパク質に相当するｃＤＮＡフラグメントのｐＥＴ／ＶＥＧＦ１２１中ＶＥＧＦのインフレームに再クローニング
１．  ウシＳ−タンパク質／ＶＥＧＦ１２１融合タンパク質を構築するためのウシリボヌクレアーゼＡの１６−１２４ａａをコードするＤＮＡを増幅するためのプライマー
ウシＳ−タンパク質の「センス」鎖に相当するプライマーはこのタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）のｓｅｒ１６のＤＮＡコドンの直ぐ上流にあるＮｄｅＩ制限部位を含んでいた。ウシＳ−タンパク質ｃＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）の「アンチセンス」鎖に相当するプライマーはＣ−末端ｖａｌ１２４の後ろのＫｐｎ  Ｉ制限部位を含むこのタンパク質のカルボキシル末端をコードするＤＮＡのコード配列と相補的であった。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５    ５’−ＡＡＣＡＴＧＣＡＴＡＴＧＡＧＣＡＣＴＴＣＣＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６    ５’−ＴＡＣＧＧＴＡＣＣＣＡＣＴＧＡＡＧＣＡＴＣＡＡＡＧＴＧＧＡＣＴＧＧＣ−３’
【０１０１】
２．  ウシＳ−タンパク質／ＶＥＧＦ１２１融合タンパク質の構築用ウシＳ−タンパク質ＤＮＡを増幅するためのＰＣＲ
ウシリボヌクレアーゼＡの１６−１２１ａａフラグメントに対応するｃＤＮＡをＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５及び２６を使用してｐＴ７−７／リボヌクレアーゼＡプラスミドからＰＣＲにより増幅した。増幅サイクルは次のとおり：１サイクルは９４℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃３０秒を含む。２５サイクルの後、反応の１０μｌ分液を１％アガロースゲルにかけ増幅生成物の正しいサイズを確認した。増幅したＤＮＡフラグメントをＮｄｅ  Ｉ及びＫｐｎ  Ｉで消化しそして１％アガロースからゲル精製した。
【０１０２】
３．  ｐＥＴ／Ｂｏｓ−ＶＥＧＦプラスミドの構築
例１．Ｄ．２に記述した増幅ＤＮＡをｐＥＴ／ＶＥＧＦ１２１ベクター中に結合した。生成したプラスミドをｐＥＴ／Ｂｏｓ−ＶＥＧＦ１２１と命名し、そしてメーカー説明書にしたがってＮｏｖａＢｌｕｅコンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ，  ＵＳＡ）に導入した。プラスミドを大量調製するために求めるプラスミドを含む細菌培養を例１．Ａ．２に記述した方法を使用して更に増殖した。
【０１０３】
Ｅ．  Ｎ−末端ヒトＳ−タグを持つＦＶＥＧＦをコードするｐＥＴ／ｈｕｓ−ＶＥＧＦプラスミドの構築
Ｓ−ペプチドＬｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）をコードするヒトリボヌクレアーゼＡ  ｃＤＮＡの「センス」鎖に相当する１本鎖ＤＮＡフラグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）及び相補的１本鎖ＤＮＡフラグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）を等モル濃度で混合し、そして室温で１０分間アニール（ａｎｎｅａｌ）した。フラグメントはＫ１コドンの上流５’−Ｎｄｅ  Ｉ部位及びＳ１５コドンの下流３’−Ｋｐｎ  Ｉ部位を再構成するようにデザインした。アニールしたＤＮＡフラグメントをＮｄｅ  Ｉ部位及びＫｐｎ  Ｉ部位の間のｐＥＴ／ＶＥＧＦ１２１ベクター中に結合した。生成したプラスミドをｐＥＴ／ｈｕｓ−ＶＥＧＦ１２１と命名し、そしてメーカー説明書にしたがってＮｏｖａＢｌｕｅコンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）に導入した。プラスミドを大量調製するために求めるプラスミドを含む細菌培養を例１．Ａ．２に記述した方法を使用して更に増殖した。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７
５’−ＡＴＧＡＡＡＧＡＡＴＣＴＡＧＡＣＧＴＡＡＡＡＡＡＴＴＴＣＡＡＣＧＴＣＡＡＣＡＣＡＴＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＡＣ−３’
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９
５’−ＣＡＧＡＧＴＣＣＡＴＧＴＧＴＴＧＡＣＧＴＴＧＡＡＡＴＴＴＴＴＴＡＣＧＴＣＴＡＧＡＴＴＣＴＴＴＣＡ−３’
【０１０４】
Ｆ．  組換えＶＥＧＦ融合タンパク質及び組換えＳ−タンパク質の発現及び精製１．  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳにおけるＶＥＧＦ融合タンパク質の発現
ｐＥＴ３２−ｔｘＶＥＧＦ１２１、ｐＥＴ３２−ｔｘＶＥＧＦ１６５、ｐＥＴ３２−ｔｘＶＥＧＦ１８９、ｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１、ｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１６５、ｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１８９、ｐＥＴ／ｈｕｓ−ＶＥＧＦ１２１及びｐＥＴ／ＢｏＳ−ＶＥＧＦを導入したＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを、増殖の対数期に入るかあるいはその中間の吸光度（ＯＤ）までｌａｃリプレッサーによりＶＥＧＦの発現を抑制し、その後ＶＥＧＦをコードするＤＮＡの発現を誘導するためにＩＰＴＧを加える条件の下に増殖させた。
【０１０５】
ｐＥＴ３２−ｔｘＶＥＧＦ１２１、ｐＥＴ３２−ｔｘＶＥＧＦ１６５、ｐＥＴ３２−ｔｘＶＥＧＦ１８９、ｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１２１、ｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１６５、ｐＥＴ３２−ＶＥＧＦ１８９、ｐＥＴ／ｈｕｓ−ＶＥＧＦ１２１及びｐＥＴ／ＢｏＳ−ＶＥＧＦを導入したＥ．ｃｏｌｉ細胞の大容量培養を行なうために、５０ｍｇ／Ｌアンピシリン及び３４ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含有するＬＢ肉汁培地（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ参照）中で形質転換細胞の終夜（約１６時間）培養を行なった。各終夜培養を１：１００に希釈して５０ｍｇ／Ｌアンピシリン及び３４ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含有する１００ｍｌ  ＬＢ肉汁培地の入ったフラスコに入れて、分光光度計（Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ  １０００，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＳＡ）で測定して６００ｎｍにおける吸光度が０．５に達するまで３７℃で振とう培養した。この段階において、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）（Ｇｉｂｃｏ，  ＵＳＡ）を最終濃度１ｍＭになるように添加して各培養においてＶＥＧＦ融合タンパク質の発現を誘導した。誘導を行なった培養はさらに２時間増殖させ、次いで遠心分離（２５分間、５０００ｘｇ）で取出した。
【０１０６】
２．  封入体からＶＥＧＦ融合タンパク質の精製
ＶＥＧＦ融合タンパク質を精製するために例１．Ｃ．１に記述にしたがって得られた対応細胞培養沈殿物を氷冷バッファーＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、２００ｍｇ／Ｌ  ＰＭＳＦ、２５ｍｇ／Ｌアンチトリプシン、５０ｍｇ／Ｌロイペプチン、２５ｍｇ／Ｌアプロチニン）に再懸濁した。凍結及び解凍を５回繰り返した後、細胞懸濁にＤＮＡ分解酵素、５０Ｕ／ｍｌ、を加えた。懸濁を室温で２０分間インキュベーションし；次いで３０分間４℃において５，０００ｘｇで遠心分離した。封入体沈殿を１０ｍｌの８Ｍ尿素で可溶化し、次いで氷冷水音波処理器（ＦＣ  １４，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉ，ＵＳＡ）中で５−１０分音波処理し、タンパク質溶液を１０分間４℃において１４，０００ｘｇで遠心分離して透明にし、そして上清を１６時間４℃で１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌに対して透析した。この記述にしたがって得られたＶＥＧＦ融合タンパク質はクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から判断して７５−９０％の純度であった。チオレドキシンを含むＶＥＧＦ融合タンパク質をｔｘＶＥＧＦ１２１、ｔｘＶＥＧＦ１６５及びｔｘＶＥＧＦ１８９と命名した。チオレドキシンを除いたＶＥＧＦ融合タンパク質をＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５及びＶＥＧＦ１８９と命名した。７ａａリンカーＧＴＤＤＤＤＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）を介してヒトＶＥＧＦ１２１に結合したウシリボヌクレアーゼＡの１６−１２４ａａフラグメントからなる融合タンパク質を１６−ＢｏＳ−ＢＥＧＦ１２１と命名した。７ａａリンカーＧＴＤＤＤＤＫを介してヒトＶＥＧＦ１２１に結合したヒトリボヌクレアーゼＡの１−１５ａａからなる融合タンパク質をｈｕｓ−ＶＥＧＦと命名した。ウシＳ−タグを有するＶＥＧＦ融合タンパク質の濃度は、リボヌクレアーゼのＳ−ペプチドフラグメント（Ｓ−タグ）を持つタンパク質にリボヌクレアーゼのＳ−タンパク質フラグメントを加えた時に回復するリボヌクレアーゼ活性を定量化することに基づく市販Ｓ−タグ迅速アッセイキット（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）により測定した。ｈｕｓ−ＶＥＧＦの濃度はＦＶＥＧＦ１２１を標準としたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した。全てのＶＥＧＦ融合タンパク質の溶液にグリセロールを最終濃度１０％ｖ／ｖになるように添加し、分割して−２０℃で保存した。ペプチドスペーサーを介して対応する血管内皮増殖因子のＮ−末端に結合したＳ−ペプチドまたはＳ−タンパク質からなるＶＥＧＦ融合タンパク質の図による説明を図２に示す。
【０１０７】
３．  ウシリボヌクレアーゼＡのフラグメントを含む組換えタンパク質のＥ．ｃｏｌｉ  Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩにおける発現
例１．Ｃ．４に記述したプラスミドを含有するＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ細菌細胞のクローンを５０ｍｇ／Ｌアンピシリン及び３４ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含有するＬＢ肉汁培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）中で終夜増殖した。各終夜培養を１：５０に希釈して５０ｍｇ／Ｌアンピシリン及び３４ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含有する１００ｍｌ  ＬＢ肉汁培地の入ったフラスコに入れて、分光光度計（Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ  １０００，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＳＡ）で測定して６００ｎｍにおける吸光度が０．５に達するまで３７℃で振とう培養した。この段階において、ＩＰＴＧ（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ）を最終濃度１ｍＭになるように添加して各培養においてＶＥＧＦ融合タンパク質の発現を誘導した。誘導を行なった培養はさらに２時間増殖させ、次いで遠心分離（２５分間、５０００ｘｇ）で取出した。
【０１０８】
４．  ウシリボヌクレアーゼＡのフラグメントを含む組換えタンパク質の封入体からの精製
ウシリボヌクレアーゼＡお１６−１２４ａａ及び１８−１２４ａａフラグメントを含む組換えタンパク質をそれぞれ１６−ＢｏＳ及び１８−ＢｏＳと命名した。Ａ１１２Ｃアミノ酸置換のあるウシリボヌクレアーゼＡの１６−１２４ａａ及び１８−１２４ａａフラグメントを含む組換えタンパク質をそれぞれ１６ＢｏＳ／Ｃ及び１８ＢｏＳ／Ｃと命名した。Ａ１２２及び以前のＳ１２３の間に追加したシステインを有するウシリボヌクレアーゼＡの１６−１２５ａａ及び１８−１２５ａａフラグメントを含む組換えＳ−タンパク質をそれぞれ１６−ＢｏＳ／ａｄ−Ｃ及び１８−ＢｏＳ／ａｄ−Ｃと命名した。７ａａリンカーＧＴＤＤＤＤＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）を介してヒトＶＥＧＦ１２１に結合したウシリボヌクレアーゼＡの１６−１２４ａａフラグメントを含む融合タンパク質を１６−ＢｏＳ−ＶＥＧＦ１２１と命名した。組換えタンパク質は分割して−７０℃で保存した。これらのタンパク質の一部の図による説明を図２に示す。
【０１０９】
組換えタンパク質は封入体中にあるので、封入体をメーカー説明書にしたがってＢｕｇＢｕｓｔｅｒ試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）を使用して細胞培養沈殿から精製した。精製した封入体沈殿を８Ｍ尿素中でＶｉｒＳｏｎｉｃ  ４７５（Ｔｈｅ  Ｖｉｒｔｉｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）の４０％出力で３０秒間音波処理して可溶化し；そして１６時間４℃で１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌに対して透析した。この記述にしたがって得られた組換えタンパク質はクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から判断して７０−８０％の純度であった。
【０１１０】
機能活性を調べるために組換えタンパク質を種々の量のウシＳ−ペプチドＬｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）（ＰｅｐｔｉｄｏＧｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｃｏ，ＵＳＡから購入）と混合した。次いで２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ  ｐｏｌｙ（Ｃ）含む反応緩衝液に加えた。室温５分間のインキュベーションの後反応を５％ＴＣＡにより停止し、５分間氷上でインキュベーションの後酸で沈殿する物質を遠心分離で除去した。ｐｏｌｙ（Ｃ）の酵素加水分解の結果生成する酸可溶性物質が存在する上清の２８０ｎｍにおける吸光度を読んで再構成リボヌクレアーゼ活性を測定した。
【０１１１】
５．  Ｓ（１９，２０）Ａ及びＳ１２３Ｃアミノ酸置換を有するヒトリボヌクレアーゼの変異１８−１２５アミノ酸フラグメントを含む組換えタンパク質ＨｕＳ／Ｃの発現及び精製
ＨｕＳ／Ｃと命名したＨｕＳ／Ｃ組換えタンパク質（図による説明は図２を参照）をコードするプラスミドｐＥＴＢｌｕｅ／ＨｕＳ／ＣをＥ．ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ細胞に導入した。単一選択クローンを５０ｍｇ／Ｌアンピシリン、３４ｍｇ／Ｌクロラムフェニコール、１２．５ｍｇ／Ｌテトラサイクリン、１５ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬＢ肉汁培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）中で終夜増殖した。終夜培養を１：３４に希釈し、５０ｍｇ／Ｌアンピシリン、３４ｍｇ／Ｌクロラムフェニコール、１２．５ｍｇ／Ｌテトラサイクリン、１５ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬＢ肉汁培地２００ｍｌの入ったフラスコに入れ、分光光度計（Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ  １０００，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＳＡ）で測定して６００ｎｍにおける吸光度が０．５に達するまで３７℃で振とう培養した。この段階において、ＩＰＴＧ（Ｇｉｂｃｏ，  ＵＳＡ）を最終濃度１ｍＭになるように添加してＨｕＳ／Ｃの発現を誘導した。誘導を行なった培養はさらに１５−１６時間増殖させ、次いで遠心分離（２５分間、５０００ｘｇ）で取出した。封入体沈殿はメーカー説明書にしたがってＢｕｇＢｕｓｔｅｒ試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）を使用して細胞培養沈殿から得た。精製封入体沈殿を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾールを含む高濃度塩洗浄バッファーで洗い、次いで８Ｍ尿素中でＶｉｒＳｏｎｉｃ  ４７５（Ｔｈｅ  Ｖｉｒｔｉｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）の４０％出力で３０秒間音波処理して可溶化した。溶液を最終濃度２．５ｍＭになるようにＤＴＴと混合し、３７℃１時間インキュベーションし、次いで０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−酢酸  ｐＨ８．６、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍアルギニン、１ｍＭ還元グルタチオン、０．４ｍＭ酸化グルタチオンを含むバッファーに対して２０−２２時間４℃で透析した。ＨｕＳ／Ｃの透析調製品をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、クマシー染色により７０−８０％の純度であった。ＨｕＳ／Ｃ組換えタンパク質は分割して−７０℃で保存した。
【０１１２】
機能活性試験のためにＨｕＳ／Ｃ組換えタンパク質を種々の量のヒトＳ−ペプチドＬｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）（ＰｅｐｔｉｄｏＧｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｃｏ，ＵＳＡから購入）と混合した。そして再構成リオヌクレアーゼの活性は例１．Ｆ．４に記述したように測定した。
【０１１３】
Ｇ．  ＶＥＧＦ融合タンパク質の機能活性
１．  細胞系
形質転換初代ヒト胚性腎細胞系（２９３細胞、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＵＳＡ）を１０％ウシ胎児血清（Ｇｅｍｉｎｉ，ＵＳＡ）、２ｍＭグルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）、及び１：１００希釈ペニシリン‐ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）を添加したＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）中３７℃、５％ＣＯ２で維持した。
【０１１４】
Ｄｒ．Ｂ．Ｔｅｒｍａｎ（Ａ．Ｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＵＳＡ）から入手した、ヒトＩｇＧのＦｃ部分に融合したＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体の可溶性、分泌性細胞外ドメインを過剰発現する２９３細胞の誘導体（２９３／ＫＤＲ−Ｆｃ）は１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１：１００希釈ペニシリン‐ストレプトマイシン及び０．２ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）を添加したＤＭＥＭ中３７℃、５％ＣＯ２で維持した。
【０１１５】
Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓ  ＩＴ−ＬＴ１ポリアミン遺伝子導入試薬（Ｐｎａ  Ｖｅｒａ，ＵＳＡ）をメーカー使用説明書にしたがって使用して、２９３細胞を例１．Ａ．１に記述したｐＢＡｌ／Ｐｓｔ／ｐｕｒ−ＫＤＲ哺乳動物細胞発現プラスミドで形質転換した。形質転換に続いて、細胞を４８時間培養し、１：６に希釈して２４ウエルプレートに分注し、さらに２４時間培養の後、ピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を最終濃度０．３７５μｇ／ｍｌになるように加えた。いくつかのクローンを増殖し、後に記述するようにＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体のＶＥＧＦ１６５−誘発チロシン自己リン酸化を試験した。自己リン酸化試験において強い反応を示したクローンを２９３／ＫＤＲと命名し、そしてその後の実験に使用した。２９３／ＫＤＲ細胞を１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１：１００希釈ペニシリン‐ストレプトマイシン及び０．３７５μｇ／ｍｌピューロマイシンを添加したＤＭＥＭ中３７℃、５％ＣＯ２で維持した。
【０１１６】
ＰＡＥと命名した空のベクターで形質転換したブタ内細胞系、及びＰＡＥ／ＫＤＲと命名したＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を過剰に発現するブタ内皮細胞系はＤｒ．Ｂ．Ｔｅｒｍａｎ（Ａ．Ｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＵＳＡ）から入手した。ＰＡＥ及びＰＡＥ／ＫＤＲ細胞は１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１：１００希釈ペニシリン‐ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ中３７℃、５％ＣＯ２で維持した。
【０１１７】
２．  可溶性及び細胞性ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体に対するＶＥＧＦ融合タンパク質の結合
我々の方法では、融合ターゲティングタンパク質はそのＮ−またはＣ−末端に大きな付加があっても機能活性を保持しなくてはならない。前記のように構築し、発現し、そして精製したｔｘＦＶＥＧＦ１２１、ｔｘＦＶＥＧＦ１６５及びｔｘＦＶＥＧＦ１８９融合タンパク質は１５８アミノ酸のＮ−末端延長を含んでいる。これらのタンパク質の機能活性はＶＥＧＦタンパク質がＮ−末端に大規模な変更を収容できることを示している。ＶＥＧＦ融合タンパク質の機能活性試験の一つはＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体に結合することである。ヒトＩｇＧのＦｃ部分に融合した細胞外ドメインを含む可溶性ＫＤＲ−Ｆｃ受容体は前記のように２９３／ＫＤＲ−Ｆｃ細胞の培養液から精製される。１２５Ｉ−ＶＥＧＦ１６５（Ａｍｅｒｃｈａｍ，ＵＳＡ）タンパク質の可溶性ＫＤＲ−Ｆｃ受容体に対する及び２９３／ＫＤＲ細胞上の細胞性ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体に対する結合を対照として使用し、そして記述（Ｋａｐｌａｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７）にしたがって実施した。ＶＥＧＦ融合タンパク質、ｔｘＦＶＥＧＦ１２１、ｔｘＦＶＥＧＦ１６５及びｔｘＦＶＥＧＦ１８９は可溶性ＫＤＲ−Ｆｃ受容体に対する１２５Ｉ−ＶＥＧＦ１６５の結合を阻害した（図３Ａ）。
【０１１８】
２９３／ＫＤＲ細胞に対する１２５Ｉ−ｔｘＦＶＥＧＦ１２１（ＳｉｂＴｅｃｈ，ＵＳＡ）の結合のスキャッチャード分析によりＫｄ３．５ｎＭを有するＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体が細胞当たり２．５百万個存在することが明確となった（図３Ｂ）。比較として、２９３／ＫＤＲ細胞に対する１２５Ｉ−ＦＶＥＧＦ１２１（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＳＡ）の結合のスキャッチャード分析によりＫｄ０．３ｎＭを有するＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体が細胞当たり２．４百万個存在することが明確となった（図３Ｃ）
【０１１９】
３．  ＶＥＧＦ融合タンパク質による細胞性ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体のチロシンリン酸化の誘導
細胞性ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体のチロシンリン酸化を誘導するＶＥＧＦ融合タンパク質の能力、はＰＡＥ／ＫＤＲ及び２９３／ＫＤＲ細胞を使用して試験した。前記のように、２９３／ＫＤＲ細胞は細胞当たり２．４百万個のＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を発現する。２９３／ＫＤＲ及びＰＡＥ／ＫＤＲ細胞におけるＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体の発現をウエスタンブロット分析したところ、ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞におけるＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体の発現は２９３／ＫＤＲ細胞よりも約１０倍少ない発現であった（図４Ａ）。
【０１２０】
ウエル当たり約５０，０００のＰＡＥ／ＫＤＲ細胞または約１２０，０００の２９３／ＫＤＲ細胞を２４ウエルプレート上で１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１：１００希釈ペニシリン‐ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ  １ｍｌ中に入れそして３７℃、５％ＣＯ２で終夜インキュベートした。翌日、細胞をリン酸バッファー食塩液で一度洗い、そして血清を含まないＤＭＥＭに換えて３７℃、４時間おいた。次いで、培地を０．１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１００ｎｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．２を添加した血清を含まないＤＭＥＭに換えて、細胞を２０分間３７℃でインキュベートし、次いで２０分間４℃でインキュベートした。次いで細胞をＶＥＧＦ融合タンパク質と１時間４℃で次いで８分間３７℃でインキュベートした。次いで細胞を０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８、２．５％ＳＤＳ、７．５％グリセロール、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＤＴＴ、０．０２５％ブロモフェノールブルーを含む氷冷リン酸バッファー食塩液で一度洗い、そしてウエスタンブロッティングで分析した。細胞タンパク質を７．５％ゲル上ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、半乾燥システム２１１７Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ  ＩＩ（ＬＫＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）をメーカーによる説明書にしたがって使用してニトロセルロース（ＢｉｏＲａｄ，ＵＳＡ）に転移した。ウエスタンブロットを処理しそして抗リン酸化チロシンＲＣ２０：ＨＲＰ接合体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂ，ＵＳＡ）をメーカー説明書にしたがって１：２，０００に希釈してプローブした。バンドの検出にはケミルミネッセンスを利用したシステム（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＳＡ）を使用した。
【０１２１】
高濃度のＶＥＧＦ融合タンパク質ｔｘＶＥＧＦ１２１、ｔｘＶＥＧＦ１６５及びｔｘＶＥＧＦ１８９は２９３／ＫＤＲ細胞及びＰＡＥ／ＫＤＲ細胞におけるＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体のチロシンリン酸化をＶＥＧＦ１６５とほぼ同程度有効に誘導した（図４Ｂ、４Ｃ）。例１．Ｇ．２に記述したように、ＶＥＧＦ融合タンパク質はＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体に対して正しいサイズのＶＥＧＦ１６５よりも低い親和性を有していた。２９３／ＫＤＲ細胞及びＰＡＥ／ＫＤＲ細胞におけるＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体のチロシンリン酸化におけるそれらの有効性は細胞上の受容体の数が多いことによるものであろう。さらに、融合ＶＥＧＦタンパク質は血管形成部位の上皮細胞のようにＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を過剰発現する細胞とより有効に相互作用することを示している。
【０１２２】
４．  ＶＥＧＦ融合タンパク質による２９３／ＫＤＲ細胞収縮の誘導
ＶＥＧＦ融合タンパク質の機能活性をさらに新規細胞収縮アッセイで試験した。２９３／ＫＤＲ細胞を６ウエルプレート中で平らなで密に詰まった細胞のコロニーを形成する段階まで増殖し次いで新鮮培地中で３時間３７℃でインキュベートし、次いで正しいサイズのＶＥＧＦ１６５またはｔｘＦＶＥＧＦ１２１、ｔｘＦＶＥＧＦ１６５またはｔｘＦＶＥＧＦ１８９融合タンパク質を最終濃度５０ｎＭになるように加えた。３時間３７℃でタンパク質とインキュベーションした後、細胞をＺｅｉｓｓ  ＩＭ３５顕微鏡に装着したＯｐｔｏｎｉｃｓ  ＤＥＩ  ７５０冷却ＣＣＤカメラで観察した。タンパク質はｔｘＦＶＥＧＦ１２１タンパク質について示すような２９３／ＫＤＲ細胞収縮を誘導した（図５Ｂ）。
【０１２３】
５．  リボヌクレアーゼＡのＳ−タンパク質フラグメントと会合したｔｘＦＶＥＧＦ１２１融合タンパク質の機能活性
Ｓ−タンパク質とｔｘＦＶＥＧＦ１２１融合タンパク質の複合体は２９３／ＫＤＲ細胞のＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体のチロシンリン酸化を誘導する（図６）。この実験のために等モル量のｔｘＦＶＥＧＦ１２１融合タンパク質とＳ−タンパク質を０．１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１００ｎｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．２を添加した血清を含まないＤＭＥＭ中で最終濃度７００ｎＭになるように混合し、氷上で１５−２０分間インキュベートした。この混合物を、最終濃度７ｎＭのｔｘＦＶＥＧＦ１２１／Ｓ−タンパク質複合体を使用して前記（例１．Ｄ．４）のように行なうＫＤＲ／ｆｌｋ−１チロシン自己リン酸化アッセイに使用した。正しいサイズのＶＥＧＦ１６５及び最終濃度７ｎＭのＶＥＧＦ１６５及びＳ−タンパク質の等モル混合物を対照に使用した。３．５ｎＭ濃度の正しいサイズのＶＥＧＦ１６５及び３．５ｎＭ濃度のＶＥＧＦ１６５及び７ｎＭ濃度のＳ−タンパク質の混合物を対照として使用した。
【０１２４】
例２．  リボヌクレアーゼのＳ−タンパク質フラグメントを含有するリポソームの調製
プロトコールはリボヌクレアーゼのＳ−タンパク質フラグメントと化学的に活性なＮＨＳ−ポリエチレングリコール化リン脂質の接合及び脂質誘導体化Ｓ−タンパク質の存在下におけるリポソームの形成を含む。
【０１２５】
１．  Ｓ−タンパク質とポリエチレングリコール化ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミンの接合
ウシリボヌクレアーゼのＳ−タンパク質フラグメント（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）（以降ＳＰと言う）をＮＨＳ−ポリエチレンポリエチレングリコール化ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，ＵＳＡ）とモル比１：０．７５で０．１Ｍ  ＮａＰｉ  ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む接合バッファー中３７℃４時間アルゴン下に混合した。ＤＳＰＥ−ＳＰと呼ぶ生成物を接合バッファーで平衡したデキストラン脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）で精製した。ＳＰ及びＤＳＰＥ−ＳＰ（各４ｎＭ）を種々の量のＳ−タグ付きＶＥＧＦと混合し、そして再構成リボヌクレアーゼ活性をＳ−タグアッセイ（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）を使用して測定した。ＤＳＰＥ−ＳＰはＦＶＥＧＦ１２１融合タンパク質中のＳ−ペプチドと結合する能力を保持していた（図７Ａ）。
【０１２６】
２．  薬物を封入したＳ−タンパク質を含有するリポソームの調製
１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン及びコレステロール（６５：３５）をシクロヘキサンから凍結乾燥し、そして１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．３４ｍＭドキソルビシン（Ｄｏｘ）及び１３μＭ  ＤＳＰＥ−ＳＰを含むＨＮＥバッファー中で水和した。リポソームはメーカー説明書にしたがって微細噴出機（Ａｖａｎｔｉ，ＵＳＡ）を使用して調製した。次いで遊離Ｄｏｘ及びＳＰをＨＮＥバッファーで平衡したセファロースＣＬ−４Ｂカラムでゲル濾過を行なうことにより除去した。Ｌｉｐ（Ｄｏｘ）−ＳＰと命名した精製ドキソルビシン封入リポソームはリン酸塩アッセイ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）による測定で２．５ｍＭ脂質を、４７０ｎｍで励起及び５９０ｎｍで発光する蛍光分光分析により測定して１４．３ｎＭ  Ｄｏｘを、及びミクロＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）により測定して５μＭタンパク質を含有した。Ｓ−タグ付き融合タンパク質中のＳ−ペプチドと相互作用するＬｉｐ（Ｄｏｘ）−ＳＰの能力を試験するために、Ｌｉｐ（Ｄｏｘ）−ＳＰを種々の量のＳ−タグ付きＶＥＧＦと混合しそして再構成リボヌクレアーゼ活性をＳ−タグアッセイキット（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）使用して測定した。Ｌｉｐ（Ｄｏｘ）−ＳＰはＦＶＥＧＦ１２１融合タンパク質中のＳ−ペプチドと結合する能力を保持していた（図７Ｂ）。
【０１２７】
例３．ポリエチレンイミンとリボヌクレアーゼのＳ−タンパク質フラグメントとの接合体の調製
接合プロトコールは、ＰＥＩと呼ぶポリエチレンイミンにＳＨ−基の導入、ＳＰと呼ぶＳ−タンパク質にマレイン酸イミドの導入、及びＳＨ−基及びマレイン酸イミド基間の反応によるＰＥＩ及びＳＰの交差結合を含んでいた。
【０１２８】
１．  ＰＥＩの修飾
ＰＥＩは２−イミノチオラン（Ｔｒｏｕｔの試薬としても知られており、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，ＵＳＡから購入できる）で５０ｍＭトリエタノールアミン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するバッファー中で窒素雰囲気試験管内室温２０分間修飾した。ＰＥＩ及びＴｒｏｕｔの試薬の濃度はそれぞれ５ｍＭであった。ＰＥＩ−ＳＨと呼ぶ生成物は０．１ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する接合バッファーで平衡したデキストラン脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）で精製した。修飾ＰＥＩ−ＳＨの濃度はメーカー説明書にしたがってＥｌｌｍａｎ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）を使用して遊離ＳＨ基に対するＥｌｌｍａｎ反応により測定した。各フラクションのＰＥＩ含量は加えたＳＨに比例する総Ｅｌｌｍａｎ試薬の割合として計算した。
【０１２９】
２．  Ｓ−タンパク質の修飾
ＳＰは、スルホ−ＭＢＳとしても知られる、ｍ−マレインイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルフォコハク酸イミドエステルで０．１ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する接合バッファー中３０分間室温で修飾した。生成物は０．１ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する接合バッファーで平衡したデキストラン脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）で精製した。溶出フラクションは２８０ｎｍにおける吸光度により物質の存在を調べた。各フラクションのＳＰの含量は総２８０ｎｍ吸収物質の割合として計算した。
【０１３０】
種々の量のｍ−マレインイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルフォコハク酸イミドエステル（スルホＭＢＳ）で修飾したＳ−タンパク質とＳ−ペプチドの複合体のリボヌクレアーゼ活性を表１に示す。リボヌクレアーゼ活性はＳ−タグ迅速アッセイキット（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）で測定した。ＳＰを修飾するスルホＭＢＳの量が増加するにしたがって修飾ＳＰのリボヌクレアーゼ活性の再構成能力は徐々に阻害された。他の例に記述されている実験のために、２倍過剰のスルホＭＢＳとＳＰを最終濃度１．３２ｍＭスルホＭＢＳ及び０．６６ｍＭ  ＳＰでインキュベートして修飾ＳＰのフラグメントを調製した。
（表１）ＭＢＳ−修飾Ｓ−タンパク質のリボヌクレアーゼ活性
2004516809.tif 000002
【０１３１】
３．  ＰＥＩ−ＳＨ及び修飾Ｓ−タンパク質の交差結合
前記のようにして得られた修飾Ｓ−タンパク質を１２７μＭ濃度で前記の様にして得られたＰＥＩ−ＳＨの等モル量と４時間室温で接合バッファー中インキュベートした。ＰＥＩ−ＳＰと命名された接合体はリン酸バッファー食塩液で平衡したＧ−１００セパロースカラムで未反応修飾Ｓ−タンパク質から分離した。ＰＥＩ−ＳＰのピークを含むフラクションを集め、分割して−２０℃で保存した。ＰＥＩ−ＳＰはＳ−ペプチド及びＦＶＥＧＦ１２１融合タンパク質中のＳ−ペプチドと結合する能力を保持していた（図７Ａ）。
【０１３２】
４．  Ｓ−タンパク質とその他の治療用、診断用及び研究用化合物の交差結合
その他の治療用、診断用及び研究用化合物及び治療用、診断用及び研究用化合物の担体をＳ−タンパク質に交差結合することは容易にできる。そのような担体としては、これに限定しないが、天然または合成ポリマー及びコポリマーであり、例えば、デキストラン及びその他の多糖類、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ジビニル）エーテル‐無水マレイン酸共重合体、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（メチルメタアクリレート）、ポリ無水物、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリウレタン、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタアクリルアミド、誘導体化ポリマー及びコポリマー、リポソーム、種々のウイルス及びバクテリオファージ粒子、及び種々の合成ビーズ及びナノパーティクル。例えば、種々のリン脂質、ポリエチレングリコールに接合した種々のリン脂質、キレート化合物に接合したリン脂質、ボロン化合物、キレート化合物、などは無作為にあるいは例１に記述したＳ−タンパク質のＣｙｓ−変異体の追加システイン残基のような特異なアミノ酸を介して直接Ｓ−タンパク質にあるいはＳ−タンパク質に導入する二重官能基交差結合試薬に化学的に接合するのに有用な化学的活性基を含む形で市販されている。
【０１３３】
例４．  Ｌｉｐ（ＤＯＸ）−ＳＰとＦＶＥＧＦ１２１の複合体の機能活性
Ｌｉｐ（ＤＯＸ）−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１複合体の２９３／ＫＤＲ細胞におけるＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体のチロシンリン酸化を誘導する能力について試験した。ＶＥＧＦと種々の量のＬｉｐ（ＤＯＸ）−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１を混合して、氷上１５分間インキュベートし、血清を含まない培地中４℃で予備インキュベートした細胞にＶＥＧＦの最終濃度１２．５ｎＭで加えた。Ｌｉｐ（ＤＯＸ）−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１を加えた後、細胞を１時間４℃、次いで１０分間３７℃でインキュベートし、分解しそして例１に記述したようにウエスタンブロット分析により分析した。Ｌｉｐ（ＤＯＸ）−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１複合体はＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体のチロシンリン酸化を誘導した（図８Ａ）。
【０１３４】
例５．  ＰＥＩ−ＳＰ接合体を有するＤＮＡとＦＶＥＧＦ１２１の複合体の調製１．  複合体の組み立て
ＰＥＩ−ＳＰ接合体は血清を含まないＤＭＥＭ中ＦＶＥＧＦ１２１と求める比率で混合し、氷上で２０分間インキュベートした。混合物は血清を含まないＤＭＥＭ中ｐＲＬ−ｔｋプラスミドと求める比率で混合し、氷上で２０分間インキュベートした。複合体をＤＮＡ／ＰＥＩ−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１と命名し、各実験毎に新しく調製した。別の実験においてＤＮＡ／ＰＥＩ−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１複合体を室温で調製したが、氷上で調製したＤＮＡ／ＰＥＩ−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１複合体よりもＤＮＡ輸送効率は低いことが判明した。別の実験において、最初にＰＥＩ−ＳＰをＤＮＡと混合し次いでＶＥＧＦを反応混合物に加えた場合には、ＤＮＡ／ＰＥＩ−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１複合体はＤＮＡ輸送に無効であった。
【０１３５】
２．  ＤＮＡ／ＰＥＩ−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１複合体の機能活性
上記の様にして得たＤＮＡ／ＰＥＩ−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１複合体について２９３／ＫＤＲ細胞のＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体のチロシンリン酸化を誘導する能力を試験した。ＤＮＡ／ＰＥＩ−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１複合体は正しいサイズのＶＥＧＦ１６５と同程度の効果で用量依存的にＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体のチロシンリン酸化を誘導した（図８Ｂ）。
【０１３６】
ＤＮＡ／ＰＥＩ−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１複合体についてはまた２９３／ＫＤＲ細胞のＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体結合に対する１２５Ｉ−ＶＥＧＦ１６５と競合する能力を試験した。２９３／ＫＤＲ細胞を２４ウエルプレートに接種し、２４時間後培地を２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５を添加した血清を含まないＤＭＥＭに換えた。１２５Ｉ−ＶＥＧＦ１６５（４０，０００ｃｐｍ／ウエル）をＦＶＥＧＦ１２１またはＤＮＡ／ＰＥＩ−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１混合して、指定した濃度で細胞に加えた。室温に９０分置いた後培地を除き、細胞を２回、１％ウシ血清アルブミンを含む冷リン酸バッファー食塩液で洗い、そして１回、１％ウシ血清アルブミン及び０．４Ｍ  ＮａＣｌを含む氷冷リン酸バッファー食塩液で洗った。細胞を０．２５ｍｌの１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．２５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで３０分間室温で可溶化し、放射活性をガンマー計数機でカウントした。ＤＮＡ／ＰＥＩ−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１複合体はＦＶＥＧＦ１２１融合タンパク質と同程度の有効性で１２５Ｉ−ＶＥＧＦ１６５と競合することが明らかとなった（図８Ｃ）。
【０１３７】
例６．  ＤＮＡ／ＰＥＩ−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１複合体によるリポソーム輸送  ２９３／ＫＤＲ細胞を２４ウエルプレートに１０５細胞／ウエルで接種し、例１．Ｇ．１に記述した培地中で３７℃及び５％ＣＯ２で維持した。２０時間後新鮮培地中でＬｉｐ（Ｄｏｘ）−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１複合体１：１（図９Ａ）または種々のＬｉｐ（Ｄｏｘ）−ＳＰ：ＦＶＥＧＦ１２１モル比（図９Ｂ）を加えた。対照細胞はＦＶＥＧＦ１２１を除いた同量のＬｉｐ（Ｄｏｘ）−ＳＰで処理した。１６−１８時間後培地を新鮮培地に換えた。４日間インキュベーション後細胞をコールターカウンターでカウントした。
【０１３８】
Ｌｉｐ（Ｄｏｘ）−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１複合体はＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を過剰発現する２９３／ＫＤＲ細胞の増殖をＩＣ５０〜５ｎＭで阻害したが、受容体を持たない２９３細胞の増殖は阻害しなかった（図９Ａ）。Ｌｉｐ（Ｄｏｘ）−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１複合体の阻害活性はこの複合体中にＦＶＥＧＦ１２１の存在が必要であり、また複合体当たり１分子のＦＶＥＧＦ１２１で殆ど１００％の阻害効果を達成するのに充分であった（図９Ｂ）。
【０１３９】
例７．  ＤＮＡ／ＰＥＩ−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１複合体によるＤＮＡ輸送
Ａ．  方法
１．  細胞へのＤＮＡ輸送
２９３及び２９３／ＫＤＲ細胞を２４ウエルプレートに１０５細胞／ウエルで接種し、例１．Ｇ．１に記述した培地中で１６−２０時間３７℃及び５％ＣＯ２で維持した。ＤＮＡ輸送に二つのプロトコールを用いた。第一のプロトコールでは、ＤＮＡ／ＰＥＩ−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１複合体を完全培地中で１６−２０時間維持した細胞に直接加えた。第二のプロトコールでは、完全培地中１６−２０時間３７℃及び５％ＣＯ２で維持した後細胞を２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２を添加した血清を含まないＤＭＥＭ中４時間３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。次いでプレートを４℃にして２０分間インキュベートし、次いでＤＮＡ／ＰＥＩ−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１複合体の氷冷溶液を加えそして更に４０分間４℃でインキュベートした。次いでプレートを３７℃及び５％ＣＯ２に変えそして４時間のインキュベーションの後培地にウシ胎児血清を最終濃度１０％で加えた。
【０１４０】
２９３細胞及び２９３／ＫＤＲ細胞の形質転換性の対照として、核実験において細胞を、ＰＥＩアミノ基の濃度をＮそしてＤＮＡリン酸基の濃度をＰとしてＮ／Ｐ比８のＤＮＡ及びＰＥＩの混合物で形質転換した。
【０１４１】
２．  細胞へのＤＮＡ輸送の測定
哺乳動物細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）中でルシフェラーゼを発現するためのレポータープラスミドｐＲＬ−ｔｋを細胞への輸送に使用した。ルシフェラーゼ活性は輸送の２４時間後に測定した。細胞分解物中のルシフェラーゼ活性は市販のＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｐｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）をメーカー説明書にしたがって使用して定量した。
【０１４２】
３ウエルでの独立した実験でルシフェラーゼ発現レベルの同実験内での変動は２０％以下であることを認めた。それゆえ実験ポイントの大部分は１ウエルを使用した。
【０１４３】
全ての実験を２−３回繰り返した。我々のデータよるとまた他のグループの報告（Ｂｏｕｓｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、Ｂｅｈｒ，１９９５、Ｚａｎｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７、Ｋｉｒｃｈｅｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）と一致して、ルシフェラーゼ発現は、多分ＤＮＡ複合体の性質の微妙な変化（Ｒｏｌａｎｄ，１９９８）を反映して実験間に数倍の変動があった。代表的な成績を示す。
【０１４４】
Ｂ．  ＤＮＡ／ＰＥＩ−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１複合体によるＤＮＡ輸送
１．  ２９３／ＫＤＲ細胞へのＤＮＡ／ＰＥＩ−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１複合体による優先的ＤＮＡ輸送
例４．Ａ．１に記述したプロトコールを使用して、ＤＮＡ／ＰＥＩ−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１複合体を使用してＤＮＡを２９３／ＫＤＲ及び２９３細胞へ輸送した。対照として、同量のＤＮＡ及びＰＥＩ−ＳＰを混合して細胞に加えた。ルシフェラーゼ発現により測定した細胞内ＤＮＡ輸送は受容体を持たない２９３細胞に比較してＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を過剰に発現する２９３／ＫＤＲ細胞において４から５倍高かった（図１０Ａ及び１０Ｂ）。この相違はＤＮＡ／ＰＥＩ−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１複合体の結合を血清を含まない培地中４℃で開始した時及びＤＮＡ／ＰＥＩ−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１複合体を直接完全培地に３７℃で加えたときに認められた。ＰＥＩ−ＳＰ複合体のみによるＤＮＡの輸送は選択したＮ／Ｐ比において無視できる程度であった（図１０Ｂ）。
【０１４５】
２．  ２９３／ＫＤＲ細胞へのＤＮＡ／ＰＥＩ−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１複合体によるＤＮＡ輸送に対するＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体仲介経路の寄与
ヘパリン結合ドメインを欠くＦＶＥＧＦ１２１を使用したので我々はＤＮＡ／ＰＥＩ−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１中のＦＶＥＧＦ１２１基の細胞表面ヘパリン硫酸プロテオグリカンへの結合を期待しなかった。しかし、ポリ−Ｌ−リジンあるいは陽性荷電脂質−ＤＮＡ複合体は陰性荷電細胞表面プロテオグリカンに結合した後細胞内に入り得ることが既に示されていた（Ｍｉｓｌｉｃｋ  ＆  Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｉｅｌｅｒ  １９９６）。ＤＮＡ／ＰＥＩ−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１複合体もＰＥＩ基を介して細胞表面プロテオグリカンに結合し得ると推定するのは合理的である。この仮定を試験するために、ＤＮＡ／ＰＥＩ−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１を２９３及び２９３／ＫＤＲ細胞に４℃で結合し、次いで３７℃でインキュベートする前に０．４Ｍ  ＮａＣｌを含むリン酸バッファー食塩液で洗った。塩洗浄によるルシフェラーゼ発現の減少は２９３／ＫＤＲ細胞においてはわずか〜２０％であったが、２９３細胞における発現は〜７０％減少した（図１１）。これらの成績によりＤＮＡの大部分はＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体仲介経路により２９３／ＫＤＲ細胞に入ることを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】
Ａ及びＢには治療用、診断用、または研究用物質の標的細胞（Ａ）または人工表面（Ｂ）への標的誘導輸送用手段の構造を図示する。
【図２】
ヒトまたはウシＳ−タグ（ＦＶＥＧＦ１２１，ｈｕｓ−ＶＥＧＦ１２１）、ａａ１６からａａ１２４までのウシＳ−タンパク質フラグメント（１６−ＢｏＳ）、Ｓ−タンパク質を含むＶＥＧＦ融合タンパク質（１６−ＢｏＳ−ＶＥＧＦ）を含むＶＥＧＦ融合タンパク質、及びジスルフィド結合に使用されずそのためアダプターとの化学的交差結合に適した追加的システインを含むいくつかの組換え変異ウシ及びヒトＳ−タンパク質（それぞれＢｏＳ及びＨｕＳ）を図示する。
【図３】
リボヌクレアーゼＡのＳ−ペプチドフラグメントを含む１５８アミノ酸Ｎ−末端延長を含むＶＥＧＦ融合タンパク質のＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体との結合能力を示している。これらの実験においてレポーター１２５Ｉ−ＶＥＧＦ１６５タンパク質のＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体との結合は正しいサイズのＶＥＧＦ１６５タンパク質及びｔｘＦＶＥＧＦ１２１、ｔｘＦＶＥＧＦ１６５及びｔｘＦＶＥＧＦ１８９融合タンパク質によって阻害された（パネルＡ）。２９３／ＫＤＲ細胞に対する１２５Ｉ−ｔｘＦＶＥＧＦ１２１の結合（６−ウエルプレート培養）及び対照の１２５Ｉ−ＶＥＧＦ１６５の結合（２４−ウエルプレート培養）のスキャッチャード分析から、これらのタンパク質は細胞当たり同数の結合部位を有するが、ｔｘＦＶＥＧＦ１２１はＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体に対する親和性がＶＥＧＦ１６５よりも約１０倍低いことが明らかとなった（パネルＢ及びＣ）。
【図４】
リボヌクレアーゼＡのＳ−ペプチドフラグメントを含む１５８アミノ酸Ｎ−末端延長を含むＶＥＧＦ融合タンパク質の２９３／ＫＤＲ細胞及びＰＡＥ／ＫＤＲ細胞におけるＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体のチロシン自己リン酸化を誘導する能力を、抗リン酸化チロシン抗体で細胞分解物をウエスタンブロット分析により検出して示している。（矢印はチロシンリン酸化ＫＤＲ／ｆｌｋ−１を示す）。パネルＡは、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体の細胞質ドメインに対して開発したウサギポリクロナール抗血清で細胞分解物をウエスタンブロット分析により検出して、２９３／ＫＤＲ細胞及びＰＡＥ／ＫＤＲ細胞は異なる数のＫＤＲ／ｆｌｋ−１／細胞を発現していることを示している。パネルＢは、示されたＶＥＧＦ融合タンパク質及び正しいサイズの組換えＶＥＧＦ１６５によって用量依存的に誘導された２９３／ＫＤＲ細胞におけるＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体のチロシンリン酸化を示している。パネルＣは、２．５ｎＭの正しいサイズのＶＥＧＦ１６５（１）、並びに１２５ｎＭのｔｘＦＶＥＧＦ１２１（２）、ｔｘＦＶＥＧＦ１６５（３）及びｔｘＦＶＥＧＦ１８９（４）により誘導されたＰＡＥ／ＫＤＲ細胞におけるＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体のチロシン自己リン酸化を示している。
【図５】
リボヌクレアーゼのＳ−ペプチドフラグメントを含む１５８アミノ酸Ｎ−末端延長を含むＶＥＧＦ融合タンパク質の２９３／ＫＤＲ細胞収縮を誘導する能力を示している。細胞を３時間バッファーと（パネルＡ）または５０ｎＭ  ｔｘＦＶＥＧＦ１２１融合タンパク質と（パネルＢ）インキュベートした。
【図６】
Ｓ−タンパク質とリボヌクレアーゼのＳ−ペプチドフラグメントを含む１５８アミノ酸Ｎ−末端延長を含むｔｘＦＶＥＧＦ１２１融合タンパク質との複合体のＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体のチロシン自己リン酸化を誘導する能力を、抗リン酸化チロシン抗体を使用した細胞分解物のウエスタンブロット分析で検出して示している。細胞はバッファー（レーン１）、３．５ｎＭ  ＶＥＧＦ１６５（レーン２）、３．５ｎＭ  ＶＥＧＦ１６５＋７ｎＭ  Ｓ−タンパク質（レーン３）、７ｎＭ  ｔｘＦＶＥＧＦ１２１（レーン４）、７ｎＭ  ｔｘＦＶＥＧＦ１２１融合タンパク質とリボヌクレアーゼのＳ−タンパク質フラグメントの複合体（レーン５）及び７ｎＭ  Ｓ−タンパク質のみ（レーン６）で処理した。
【図７】
Ａ、Ｂ及びＣは、Ｓ−タンパク質／ＰＥＩ接合体（Ａ）、Ｓ−タンパク質／脂質接合体（Ｂ）及びドキソルビシン結合Ｓ−タンパク質含有リポソーム（Ｃ）が反応混合物中のリボヌクレアーゼ活性出現を測定することによりＦＶＥＧＦ１２１融合タンパク質中のＳ−ペプチドに結合する能力を保持していることを示している。反応混合物は種々の量のＦＶＥＧＦ１２１及びＳ−タンパク質（ＳＰ）、Ｓ−タンパク質／脂質接合体（ＤＳＰＥ−ＳＰ）、ドキソルビシン結合Ｓ−タンパク質含有リポソーム（Ｌｉｐ（Ｄｏｘ）−ＳＰ）、またはＳ−タンパク質／ＰＥＩ接合体（ＰＥＩ−ＳＰ）を含む。リボヌクレアーゼ活性はメーカー説明書にしたがってＳ−タグ迅速アッセイキット（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）を使用して測定した。
【図８】
Ｌｉｐ（Ｄｏｘ）−ＳＰ−ＶＥＧＦ及びＤＮＡ／ＰＥＩ−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１複合体の機能活性を示している。パネルＡは、ドキソルビシン結合Ｓ−タンパク質含有リポソームと会合したＦＶＥＧＦ１２１が２９３／ＫＤＲ細胞におけるＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体のチロシンリン酸化を誘導する能力を保持することを示している；パネルＢは、ＤＮＡ−結合ＳＰ−ＰＥＩ接合体と会合したＦＶＥＧＦ１２１が２９３／ＫＤＲ細胞におけるＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体のチロシンリン酸化を誘導する能力を保持することを示している。ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体のチロシンリン酸化はバッファー対照（レーン１）、５０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ１６５（レーン２）、示された濃度のＦＶＥＧＦ１２１におけるＤＮＡ／ＳＰ−ＰＥＩ−ＦＶＥＧＦ１２１複合体（レーン３−５）。パネルＣは、２９３／ＫＤＲ細胞における細胞性ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体への結合に関してＦＶＥＧＦ１２１と同程度有効にＤＮＡ／ＳＰ−ＰＥＩ−ＦＶＥＧＦ１２１複合体が１２５Ｉ−ＶＥＧＦ１６５と競合することを示している。これらの実験において接種２４時間後に２９３／ＫＤＲ細胞を２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５で平衡した血清を含まないＤＭＥＭに換えた。１２５Ｉ−ＶＥＧＦ１６５（４０，０００ｃｐｍ／ウエル）を示した量のＦＶＥＧＦ１２１またはＤＮＡ／ＰＥＩ−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１と混合し、３回リン酸バッファー食塩液で洗った細胞に加えた。室温９０分間インキュベートした後細胞を２回１％ウシ血清アルブミンを含む氷冷リン酸バッファー食塩液で洗いそして１回１％ウシ血清アルブミン及び０．４Ｍ  ＮａＣｌを含む氷冷リン酸バッファー食塩液で洗った。細胞分解物の１２５Ｉ放射活性をガンマー計測器でカウントした。
【図９】
ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を過剰発現する２９３／ＫＤＲ細胞及び対照２９３細胞におけるドキソルビシン結合リポソームのＦＶＥＧＦ１２１仲介輸送の相違を示している。２９３／ＫＤＲ細胞及び２９３親細胞は２４ウエルプレートに、５×１０３細胞／ウエル、接種した。１：１のＬｉｐ（Ｄｏｘ）−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１複合体（パネルＡ）または種々のＬｉｐ（Ｄｏｘ）−ＳＰ／ＦＶＥＧＦ１２１モル比（パネルＢ）を２０時間後に新鮮培地中の細胞に加えた。対照細胞は同量のＶＥＧＦを除いたＬｉｐ（Ｄｏｘ）−ＳＰで処理した。４日間インキュベートした後コールターカウンターでカウントした。
【図１０】
ＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体を過剰発現する２９３／ＫＤＲ細胞及び対照２９３細胞へのＶＥＧＦ仲介ＤＮＡ輸送の相違を示している。パネルＡは血清を含まない培地において行なったＤＮＡ輸送を示す。この実験ではＤＮＡ／ＰＥＩ−ＳＰ及びＤＮＡ／ＰＥＩ−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１複合体は３．７５のＮ／Ｐ比で調製され、そして血清を含まないＤＭＥＭ中最終濃度３０ｎＭ  ＦＶＥＧＦ１２１，６４ｎＭ  ＰＥＩ−ＳＰ接合体、及び２μｇ／ウエルＤＮＡで２９３／ＫＤＲ細胞及び対照２９３細胞に加えた。４℃４０分インキュベーション後、ウシ胎児血清を最終濃度１０％で加えた。２４時間３７℃でインキュベーション後細胞を分解し細胞中のルシフェラーゼ発現を市販のＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を使用して測定した。パネルＢは１０％ウシ胎児血清を含む培地で行なったＤＮＡ輸送を示している。この実験では種々の量のＦＶＥＧＦ１２１（最終濃度２８．５、５７及び１１４ｎＭ）を含むＤＮＡ／ＰＥＩ−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１及び固定量の接合体（最終濃度６４ｎＭ）及びＤＮＡ（２μｇ／ウエル）を１０％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ中に３７℃に維持された細胞に加えた。２４時間３７℃でインキュベーション後細胞を分解し細胞中のルシフェラーゼ発現を市販のＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を使用して測定した。２９３細胞及び２９３／ＫＤＲ細胞の形質転換性は毎実験ごとにＤＮＡ／ＰＥＩ複合体（Ｎ／Ｐ比８）と比較して測定し、同様に〜１５％の実験誤差の範囲内であった。
【図１１】
２９３／ＫＤＲ細胞へのＦＶＥＧＦに基づくＤＮＡ輸送は大部分がＫＤＲ／ｆｌｋ−１受容体仲介経路によることを示している。ＤＮＡ／ＰＥＩ−ＳＰ−ＦＶＥＧＦ１２１複合体を最終濃度５７ｎＭ  ＦＶＥＧＦ１２１，３２ｎＭ  ＰＥＩ−ＳＰ接合体及び０．５μｇ／ウエルＤＮＡ（Ｎ／Ｐ比７．５）で２９３／ＫＤＲ細胞及び２９３細胞に加えた。４℃でインキュベーション後、０．４Ｍ  ＮａＣｌで１回洗った後３７℃でインキュベートした。２４時間３７℃でインキュベーション後細胞を分解し細胞中のルシフェラーゼ発現を市販のＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を使用して測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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