(57)【要約】本発明は細胞の抗酸化能を測定する方法に関する。本発明の細胞の抗酸化能を測定する方法は、下記の工程：抗酸化能を測定しようとする動物組織を摘出し、ホモジナイズすることによって試料を調製する工程；該試料に２’，７’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＤＣＦＨ−ＤＡ）を添加して反応を開始させる工程；該反応混合物にアスコルビン酸及び鉄イオンを添加し、蛍光を測定する工程；及び該蛍光測定値を蛍光対ＤＣＦ濃度の標準曲線を用いて２’，７’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＤＣＦ）濃度に換算して細胞の抗酸化能を測定する工程を含む。本発明の方法は多数の試料の抗酸化能を同時に測定し、比較することができ、そして試料中の全酸化ストレスを容易に測定できる。よって、それは生物レベルでの放射活性に関する研究に実際に用いることができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の抗酸化能を測定する方法であって、下記の工程：
（ｉ）抗酸化能を測定しようとする動物組織を摘出し、ホモジナイズすることによって試料を調製する工程；
（ｉｉ）該試料に２’，７’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＤＣＦＨ−ＤＡ）を添加して反応を開始させる工程；
（ｉｉｉ）該反応混合物にアスコルビン酸及び鉄イオンを添加し、蛍光を測定する工程；及び
（ｉｖ）該蛍光測定値を蛍光対ＤＣＦ濃度の標準曲線を用いて２’，７’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＤＣＦ）濃度に換算して細胞の抗酸化能を測定する工程；
を含む上記方法。
【請求項２】
前記ＤＣＦＨ−ＤＡを最終濃度が３５ないし４５μＭの濃度になるように前記試料に添加する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ｉｉ）の反応を２５ないし３５℃の温度で、１０ないし２０分間行う、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アスコルビン酸を最終濃度が０．０５ないし０．３ｍＭになるように前記反応混合物に添加する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
（技術分野）
本発明は細胞の抗酸化能を測定する方法に関し、さらに詳しくはフリーラジカルがアスコルビン酸と鉄イオンによって生成したとき、２’，７’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＤＣＦＨ−ＤＡ）を用いてフリーラジカルに対する抗酸化能を測定する方法に関する。
【０００２】
（背景技術）
正常な生理学的条件下にある細胞は継続的にフリーラジカルを生成し、疾患、薬物、及び放射線のような種々の要因がフリーラジカルの膨大な増加を引き起こしうる。細胞種によって異なるかもしれないが、全ての細胞はフリーラジカルに対して酵素学的／非酵素学的保護機構を有しているので、細胞内のフリーラジカルの量はプロオキシダント（ｐｒｏｏｘｉｄａｎｔ）及びアンチオキシダント（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ）の機能の合計によって表される。一般に、途方もない大量のフリーラジカルが動物の放射線照射後に生成されるので、組織におけるフリーラジカルの定量は組織の放射線照射に対する感受性の指標として用いられてきた。
【０００３】
一方、高い反応性を有するフリーラジカルの量は経時的に容易に変化する。そのような理由によって、フリーラジカルを測定するために唯一利用できる手段は、これまで電子スピン共鳴分光計（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｓｐｉｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、ＥＳＲ）または電子常磁性共鳴分光計（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、ＥＰＲ）を用いる方法であった。しかしながら、ＥＳＲを用いる該方法は、スーパーオキシド及びヒドロキシラジカルのような高反応性のフリーラジカルを測定することに困難性を示していた。従って、スピントラッピング（ｓｐｉｎ ｔｒａｐｐｉｎｇ）法が当分野で常套的に用いられているが、これは試料中のフリーラジカルを５，５−ジメチルピロリン−Ｎ−オキシド（５，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｉｎｅ−Ｎ−ｏｘｉｄｅ；ＤＭＰＯ）又はα−フェニル−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン（α−ｐｈｅｎｙｌ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｎｉｔｒｏｎｅ；ＰＢＮ）のようなトラッピング剤（ｔｒａｐｐｉｎｇ ａｇｅｎｔ）と反応させることによって生成される比較的安定なフリーラジカルを定量する方法である。該方法は正確で、異なるトラッピング剤を用いることによってフリーラジカルの種類を同定できるけれども、必要な装置が非常に高価でＥＳＲ分光計の専門家しかその結果を分析することができないという意味で満足できるものではないことが証明された。
【０００４】
上記の問題を克服するために、間接的な方法が当分野で使用されてきた。それらの一つはフリーラジカルをサリチル酸のような特異的マーカーと反応させてジヒドロキシ安息香酸のような産物を生成し、ＨＰＬＣで分離してフリーラジカルの量を間接的に定量する方法である。該方法はＥＳＲ法よりも広く用いられているが、ＨＰＬＣを用いる分析に時間がかかり費用もかかる。
【０００５】
もう一つ用いられている間接的な方法では、フリーラジカルの生成過程中に化学発光が生成する。化学発光は、例えば、一重項酸素（ｓｉｎｇｌｅｔ ｏｘｙｇｅｎ）、カルボニル基などの活性三重項酸素（ｔｒｉｐｌｅｔ ｏｘｙｇｅｎ）、ＯＮＯＯ−反応、リポキシゲナ−ゼ反応、Ｆｅｎｔｏｎ反応などで見出されることが報告された。しかし、化学発光の強度は低すぎて直接に測定することができず、適当な化合物との反応によって増幅される。増幅方法の一例は、ラジカルと反応するルミノール（ｌｕｍｉｎｏｌ）またはルシゲニン（ｌｕｃｉｇｅｎｉｎ）を用いるが、その方法はＥＳＲ又はＨＰＬＣ法よりも簡単で容易である。しかしながら、それは低感度であり、ｐＨのような反応環境の影響を受けやすく、高バックグラウンドノイズといったような短所がある。
【０００６】
上記の化学発光の問題を克服するため、非化学発光性の２’，７’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ（ＤＣＦＨ）の化学発光性の２’，７’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ （ＤＣＦ）への転換がフリーラジカルの検出に用いられている。しかしながら、細胞内のフリーラジカル量はプロオキシダントとアンチオキシダントの機能の合計であるので、細胞又は組織内のフリーラジカル量を単に測定できるだけのそのような方法は細胞の抗酸化能を定量するには適切ではない。
【０００７】
かかる状況下、フリーラジカルの量を減少させる細胞の能力を表している、細胞の抗酸化能を測定する方法を探索し開発するための強い動機がある。
【０００８】
（発明の開示）
本発明者らは、細胞の抗酸化能を測定する方法を開発すべく鋭意研究を重ねたところ、アスコルビン酸及び鉄イオンによって種々の組織及び細胞において突然に生成したフリーラジカルを２’，７’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＤＣＦＨ−ＤＡ）を用いることによって測定できること；そして、種々の試料の相対的な抗酸化能をその測定値を比較することによって測定できること見出した。
【０００９】
従って、本発明の主たる目的はアスコルビン酸、鉄イオン及びＤＣＦＨ−ＤＡを用いて細胞の抗酸化能を測定する方法を提供することにある。
【００１０】
本発明の上記及び他の目的及び特徴は添付する図面と併せて与えられる以下の説明からより明確になる。
【００１１】
（発明の実施形態）
本発明による細胞の抗酸化能の測定法は、下記の工程：抗酸化能を測定しようとする動物組織を摘出し、ホモジナイズすることによって試料を調製する工程；該試料に２’，７’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＤＣＦＨ−ＤＡ）を添加して反応を開始させる工程；該反応混合物にアスコルビン酸及び鉄イオンを添加し、蛍光を測定する工程；及び該蛍光測定値を蛍光対ＤＣＦ濃度の標準曲線を用いて２’，７’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＤＣＦ）濃度に換算して細胞の抗酸化能を測定する工程を含む。
【００１２】
本発明による細胞の抗酸化能の測定方法を以下の工程によってさらに説明する。
【００１３】
工程１：試料の調製
抗酸化能を測定しようとする動物組織を摘出しホモジナイズすることによって試料を調製する：該組織として、肝、胃、肺、心臓、脳及び腎臓を使用することができるが、これらに限定はされない。組織の均質化は前もって凍結−固定化した組織をガラスホモジナイザー（ｇｌａｓｓ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）を用いて緩衝液内で実施することが好ましいが、限定はされない。
【００１４】
工程２：ＤＣＦＨ−ＤＡの添加
前記試料にＤＣＦＨ−ＤＡを添加して反応を開始させる：ＤＣＦＨ−ＤＡは最終濃度が３５ないし４５μＭになるよう添加することが好ましく、反応は２５ないし３５℃で１０ないし２０分間行うことが好ましい。
【００１５】
工程３：蛍光の測定
アスコルビン酸及び鉄イオンを前記反応混合物に添加し、生成する蛍光を測定する：アスコルビン酸は最終濃度が０．０５ないし０．３ｍＭになるように添加することが好ましく、限定はされないが、Ｆｅ２＋は最終濃度が３ないし１０μＭになるように添加することが好ましい。限定はされないが、蛍光は１ないし３分の間隔でマイクロプレートフルオロメーター（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）を用いて測定することが好ましい。
【００１６】
工程４：フリーラジカルの検出及び試料間の比較
蛍光測定値を蛍光対ＤＣＦ濃度の標準曲線を用いてＤＣＦ濃度に転換することによって細胞の抗酸化能を測定するが、ここで該標準曲線は０ないし２ｎｍｏｌＤＣＦの範囲内の蛍光を測定することによって作成する。
【００１７】
ＤＣＦＨを細胞に導入するのは難しいので、本発明者らはその酢酸塩である２’，７’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＤＣＦＨ−ＤＡ）を用いた。ＤＣＦＨ−ＤＡは高い細胞透過性を有しており容易に細胞に移行する。細胞内において、ＤＣＦＨ−ＤＡは加水分解されて細胞内に残存する荷電性ＤＣＦＨになる。非蛍光性のＤＣＦＨは酸化されて細胞内で容易に検出できる高蛍光性のＤＣＦになる（励起波長：４８０ｎｍ，発光波長：５３０ｎｍ）。
【００１８】
本発明の測定方法は種々のタイプの試料に適用でき、９６ウェルプレート又はマイクロフルオロメーターを用いることが好ましい。
【００１９】
本発明の原理は以下の通りである：細胞内で測定されたフリーラジカルの量をプロオキシダントとアンチオキシダントの機能の合計によって表す。細胞内では、一定レベルのプロオキシダントが存在するが、細胞の種類と状態によって異なる。細胞の抗酸化能を測定するために、組織又は細胞を等しい酸化ストレス下におき、その後フリーラジカルの量を測定する。ここで、フリーラジカルの測定値は細胞が抗酸化能を発揮後、残存しているフリーラジカルを表し、それは細胞の相対的な抗酸化能の指標とみなされる。即ち、等量のアスコルビン酸と鉄イオンを等量のタンパク質を含む試料に添加後、残存するフリーラジカルを測定する。ここで、残存するフリーラジカルの量が少ないほど細胞が優れた抗酸化能を有していることになる。
【００２０】
本発明をさらに以下の実施例において説明するが、これらは本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。
【００２１】
実施例１：ＤＣＦＨ−ＤＡを用いるフリーラジカルの測定
細胞の抗酸化能の相対的な定量方法の必須成分であるＤＣＦＨ−ＤＡを用いる本発明のフリーラジカル測定方法の妥当性を調べた。
【００２２】
マウス肝組織を２０ｍｇ／μｌの濃度になるように緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中でホモジナイズし、続いて同緩衝液にて４０倍に希釈した。希釈したホモジネートに、ＤＣＦＨ−ＤＡを最終濃度が１２５μＭになるように添加し、その後該混合物を３７℃にて１５分間インキュベートした。該反応混合物を２つの部分に分け、アスコルビン酸とＦｅＳＯ４を最終濃度がそれぞれ０．１ｍＭ及び５μＭになるように一方の部分に添加し、等容量の緩衝液をもう一つの部分に添加した。蛍光を励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）に対しては４８５ｎｍで、発光（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）に対しては５３０ｎｍにてマイクロプレートフルオロメーターを用いて２０分間２分間隔で測定し、直線増加範囲内の直線の傾きを測定した（図１参照）。図１は蛍光の変化を経時的に示したグラフである。ここで、（●）は、アスコルビン酸とＦｅＳＯ４を添加した部分であり、（○）は緩衝液を添加した部分である。図１に示すように、アスコルビン酸とＦｅＳＯ４を添加した部分において蛍光の顕著な増加が観察された。
【００２３】
０ないし２ｎｍｏｌの範囲で蛍光対ＤＣＧの標準曲線を作成した（図２参照）。図１で得られた傾きを図２の標準曲線に適用することによって測定した蛍光をＤＣＦ量に転換し、それよりフリーラジカル量を測定した。試料中のタンパク質量によって割ったフリーラジカル量はｎｍｏｌ（ＤＣＦ）／ｍｇ（タンパク質）／分という単位で表した。
【００２４】
本発明によるフリーラジカル定量法の信頼性のために、肝臓組織の量による蛍光の変化を上記と同様の方法で測定した（図３参照）。図３は、肝臓組織の量による蛍光の変化を示すグラフである。ここで、（●）は、アスコルビン酸とＦｅＳＯ４を添加した部分であり、（○）は緩衝液を添加した部分である。図３に示すように、蛍光は添加した肝臓組織の量に比例して増加した。
【００２５】
以上に明確に説明及び証明したように、本発明は、細胞の抗酸化能を測定する方法を提供する。本発明の細胞の抗酸化能を測定する方法は、抗酸化能を測定しようとする動物組織を摘出し、ホモジナイズすることによって試料を調製する工程；該試料にＤＣＦＨ−ＤＡを添加して反応を開始させる工程；該反応混合物にアスコルビン酸及び鉄イオンを添加し、蛍光を測定する工程；及び該蛍光測定値を蛍光対ＤＣＦ濃度の標準曲線を用いてＤＣＦ濃度に換算して細胞の抗酸化能を測定する工程を含む。本発明の方法は従来技術の方法に比べて利点を有している。即ち、本発明の方法は多数の試料の抗酸化能を同時に測定し、比較することができ、そして試料中の全酸化ストレスを容易に測定できる。よって、それは生物レベルでの放射活性に関する研究に実際に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は肝組織における蛍光の変化を経時的に示すグラフである。
【図２】図２はＤＣＦの標準曲線を示すグラフである。
【図３】図３は肝組織の増加に伴う蛍光の変化の標準曲線を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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