(57)【要約】試料中に標的核酸が存在しているか否かを検出するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体。オリゴヌクレオチド集合体は四つの領域、すなわち標的核酸配列とハイブリッドを形成できる第一領域と第二領域、および第一領域と連結されている第三領域と第二領域に連結されている第四領域を含有する。第三領域と第四領域はお互いにハイブリッドを形成する。かかるハイブリッド構造は制限酵素によって開裂されることができる。かかる開裂はオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと標的とのハイブリッド形成を示すだろう。本発明はこれらのオリゴヌクレオチドを用いる方法をも含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に標的核酸配列が存在しているか否かを検出するのに有用なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体であって、
（ａ）第一領域と第二領域であってそれぞれの少なくとも一部分が各々予め定められたハイブリッド形成条件下、標的核酸配列とハイブリッドを形成できる第一領域と第二領域、および
（ｂ）前記第一領域と第二領域それぞれに連結されている第三領域と第四領域を含有し、そのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体の第一部分と第二部分が前記予め定められたハイブリッド形成条件下、それらの間に第一二重らせん構造を形成することができ、
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体の前記第一、第二、第三および第四の領域は、前記第一領域と第二領域が前記標的核酸配列と前記予め定められたハイブリッド形成条件下でハイブリッドを形成すると、前記第一二重らせん構造が解離して前記第三領域の一部分と前記第四領域の一部分がそれらの間に第二二重らせん構造を形成するように選択され、前記第二二重らせん構造が、前記第一二重らせん構造には存在せずかつ開裂されるとそのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体が標的核酸配列とハイブリッドを形成していることを示ししたがって試料中に標的核酸が存在することを示す核酸開裂剤認識配列を含んでいる、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体。
【請求項２】
前記予め定められたハイブリッド形成条件下、前記第一二重らせん構造を間に形成することができる前記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体の前記第一部分と前記第二部分がそれぞれ、前記第三と第四の領域から誘導される請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体の前記第一、第二、第三および第四の領域が、さらに、前記核酸開裂剤認識配列が開裂した後、前記第一と第二の領域が標的核酸配列から解離して、標的核酸配列をリサイクルすることができるように選択される請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体。
【請求項４】
前記核酸開裂剤認識配列の開裂を検出できるような方式でオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体に連結された少なくとも一つの検出部分をさらに含有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体。
【請求項５】
前記少なくとも一つの検出部分が、少なくとも一つの直接検出できる検出部分および少なくとも一つの間接的に検出できる検出部分からなる群から選択される請求項４に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体。
【請求項６】
前記少なくとも一つの直接検出できる検出部分が蛍光部分と放射性部分からなる群から選択され、そしてさらに、前記少なくとも一つの間接的に検出できる検出部分が、結合する対の少なくとも一つのメンバーおよび化学的に相互に作用する対の少なくとも一つのメンバーからなる群から選択される請求項５に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体。
【請求項７】
前記結合する対の少なくとも一つのメンバーが、抗体、抗原、エピトープ、リガンド、受容体、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、イオンおよびキレーターからなる群から選択され、そしてさらに、前記化学的に相互に作用する対の少なくとも一つのメンバーが酵素、触媒および基質からなる群から選択される請求項６に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体。
【請求項８】
前記少なくとも一つの検出部分が、検出部分の共鳴して相互に作用する対を含み、検出部分の前記共鳴して相互に作用する対が第一検出部分と第二検出部分を含有するが、前記第一検出部分と前記第二検出部分は、前記第一検出部分と前記第二検出部分の少なくとも一方が、他方の検出部分から相互に作用しない距離をおいて位置しているときに検出可能な信号を生成することができるように選択され、その結果、前記核酸認識配列が開裂すると、前記第一検出部分と前記第二検出部分の一方によって信号が生成可能である請求項５に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体。
【請求項９】
前記第一と第二の検出部分が蛍光共鳴エネルギー移動対を形成する請求項８に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体。
【請求項１０】
前記第一検出部分が蛍光体であり、そしてさらに前記第二検出部分が前記蛍光体の消光体である請求項８に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体。
【請求項１１】
前記蛍光体がＥＤＡＮＳであり、そしてさらに前記消光体がＤＡＢＳＹＬである請求項１０に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体。
【請求項１２】
単一のオリゴヌクレオチドを含んでなる請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体。
【請求項１３】
一対のオリゴヌクレオチドを含んでなる請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体。
【請求項１４】
試料中に標的核酸配列が存在しているか否かを検出する方法であって、下記ステップ：
（ａ）試料を予め定められたハイブリッド形成条件下、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体と接触させて反応混合物を形成させ、前記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体が
（ｉ）　第一領域と第二領域であってそれぞれの少なくとも一部分が各々標的核酸配列とハイブリッドを形成できる第一領域と第二領域、および
（ｉｉ）　前記第一領域と前記第二領域にそれぞれに連結されている第三領域と第四領域を含有し、前記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体の第一部分と第二部分が、前記予め定められたハイブリッド形成条件下、それらの間に第一二重らせん構造を形成することができ、
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体の前記第一、第二、第三および第四の領域は、前記第一領域と前記第二領域が前記標的核酸配列と、予め定められたハイブリッド形成条件下でハイブリッドを形成すると、前記第一二重らせん構造が解離して前記第三領域の第二部分と前記第四領域の第二部分がそれらの間に、第二二重らせん構造を形成するように選択され、前記第二二重らせん構造が前記第一二重らせん構造には存在しない核酸開裂剤認識配列を含有し、
（ｂ）核酸開裂剤を前記反応混合物に添加し、その結果、標的核酸配列が試料中に存在しているとき、前記核酸開裂剤認識配列が形成されて、前記開裂剤によって開裂され、次いで、
（ｃ）前記核酸開裂剤による前記核酸開裂剤認識配列の開裂を監視する、
ステップを含んでなり、
前記核酸開裂剤による前記核酸開裂剤認識配列の開裂が、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体が標的核酸配列とハイブリッドを形成していることを示し、したがって試料中に標的核酸が存在することを示す方法。
【請求項１５】
前記予め定められたハイブリッド形成条件下、前記第一二重らせん構造を間に形成できる前記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体の前記第一部分と前記第二部分がそれぞれ前記第三と第四の領域から誘導される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体の前記第一、第二、第三および第四の領域が、さらに、前記核酸開裂剤認識配列が開裂した後、前記第一と第二の領域が標的核酸配列から解離して、標的核酸配列をリサイクルすることができるように選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体が、これに、前記核酸開裂剤認識配列の開裂を検出できるような方式で連結されている少なくとも一つの検出部分を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも一つの検出部分が、少なくとも一つの直接検出することができる部分と少なくとも一つの間接的に検出できる検出部分からなる群から選択される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも一つの直接検出できる検出部分が蛍光部分および放射性部分からなる群から選択され、そしてさらに、前記少なくとも一つの間接的に検出することができる検出部分が、結合する対の少なくとも一つのメンバーおよび化学的に相互に作用する対の少なくとも一つのメンバーからなる群から選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記結合する対の前記少なくとも一つのメンバーが、抗体、抗原、エピトープ、リガンド、受容体、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、イオンおよびキレーターからなる群から選択され、そしてさらに、前記化学的に相互に作用する対の前記少なくとも一つのメンバーが酵素、触媒および基質からなる群から選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも一つの検出部分が、検出部分の共鳴によって相互に作用する対を含み、前記検出部分の共鳴によって相互に作用する対が第一検出部分と第二検出部分を含有するが、前記第一検出部分と前記第二検出部分は、前記第一検出部分と前記第二検出部分の少なくとも一方が、他方の検出部分から相互に作用しない距離をおいて位置しているときに検出可能な信号を生成することができるように選択され、その結果、信号は、前記核酸認識配列が開裂すると、前記第一検出部分と前記第二検出部分の一方によって生成可能である請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記第一と第二の検出部分が蛍光共鳴エネルギー移動対を形成する請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第一検出部分が蛍光体であり、そしてさらに前記第二検出部分が前記蛍光体の消光体である請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記蛍光体がＥＤＡＮＳであり、そしてさらに前記消光体がＤＡＢＳＹＬである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体が単一のオリゴヌクレオチドを含有している請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体が一対のオリゴヌクレオチドを含有している請求項１４に記載の方法。
【請求項２７】
試料中に標的核酸配列が存在しているか否かを検出するのに有用なオリゴヌクレオチド系であって、少なくとも第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドを含有し、前記第一オリゴヌクレオチドおよび前記第二オリゴヌクレオチド各々が、予め定められたハイブリッド形成条件下、標的核酸配列とハイブリッドを形成できる第一領域を含有し、前記第一オリゴヌクレオチドと前記第二オリゴヌクレオチドが各々さらに第二領域を含有し、そして、ハイブリッドを形成すると、前記第一オリゴヌクレオチドと前記第二オリゴヌクレオチドの前記第二領域の少なくとも一部が核酸開裂剤認識配列を含む二重らせん構造を形成し、かつ前記第一オリゴヌクレオチドと前記第二オリゴヌクレオチドの前記第二領域は、前記核酸開裂剤認識配列を認識する核酸開裂剤の存在下、前記第一オリゴヌクレオチドだけが前記核酸開裂剤によって開裂できるように選択されるオリゴヌクレオチド系。
【請求項２８】
前記第一と第二のオリゴヌクレオチドの前記第一と第二の領域が、前記第一オリゴヌクレオチドが開裂すると、前記第一オリゴヌクレオチドの前記第一領域が標的核酸配列から解離するように選択される請求項２７に記載のオリゴヌクレオチド系。
【請求項２９】
前記第二オリゴヌクレオチドの前記第一領域が、前記予め定められたハイブリッド形成条件下、前記第一オリゴヌクレオチドが解離したのち前記第二オリゴヌクレオチドの前記第一領域が標的核酸配列とハイブリッドを形成したままであるように選択され、その結果、標的核酸配列を前記第一オリゴヌクレオチドに対してリサイクルさせる請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド系。
【請求項３０】
前記核酸開裂剤認識配列の一部を形成する前記第二オリゴヌクレオチドの少なくとも一つのヌクレオチドまたはヌクレオチド間結合が、前記第二オリゴヌクレオチドが前記核酸開裂剤によって開裂されるのを防止するように選択された、改変されたかまたは類似のヌクレオチドまたはヌクレオチド間結合である請求項２７に記載のオリゴヌクレオチド系。
【請求項３１】
前記二重らせん構造が、前記第一オリゴヌクレオチドの前記第二領域の一部分の自己アニーリングによって一部分形成される請求項２７に記載のオリゴヌクレオチド系。
【請求項３２】
前記第一と第二のオリゴヌクレオチドの前記第二領域が、前記核酸開裂剤認識配列が前記核酸開裂剤によって開裂可能なヌクレオチド間結合を置換するニックを特徴とするように選択される請求項２７に記載のオリゴヌクレオチド系。
【請求項３３】
前記核酸開裂剤認識配列の開裂を検出できるような方式でオリゴヌクレオチド系に連結された少なくとも一つの検出部分をさらに含有している請求項２７に記載のオリゴヌクレオチド系。
【請求項３４】
前記少なくとも一つの検出部分が、少なくとも一つの直接検出できる検出部分および少なくとも一つの間接的に検出できる検出部分からなる群から選択される請求項３３に記載のオリゴヌクレオチド系。
【請求項３５】
前記少なくとも一つの直接検出できる検出部分が、蛍光部分と放射性部分からなる群から選択され、そしてさらに前記少なくとも一つの間接的に検出できる検出部分が、結合する対の少なくとも一つのメンバーおよび化学的に相互に作用する対の少なくとも一つのメンバーからなる群から選択される請求項３４に記載のオリゴヌクレオチド系。
【請求項３６】
前記結合する対の少なくとも一つのメンバーが、抗体、抗原、エピトープ、リガンド、受容体、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、イオンおよびキレーターからなる群から選択され、そしてさらに前記化学的に相互に作用する対の少なくとも一つのメンバーが酵素、触媒および基質からなる群から選択される請求項３５に記載のオリゴヌクレオチド系。
【請求項３７】
前記少なくとも一つの検出部分が検出部分の共鳴して相互に作用する対を含み、検出部分の前記共鳴して相互に作用する対が第一検出部分および第二検出部分を含むが、前記第一検出部分と前記第二検出部分は、前記第一検出部分と前記第二検出部分の少なくとも一方が他方の検出部分から相互に作用しない距離をおいて位置しているとき検出可能な信号を生成することができるように選択され、その結果、前記核酸認識配列が開裂すると、前記第一検出部分と前記第二検出部分の一方によって信号が生成可能である請求項３４に記載のオリゴヌクレオチド系。
【請求項３８】
前記第一と第二の検出部分が、蛍光共鳴エネルギー移動対を形成する請求項３７に記載のオリゴヌクレオチド系。
【請求項３９】
前記第一検出部分が蛍光体であり、そしてさらに前記第二検出部分が前記蛍光体の消光体である請求項３７に記載のオリゴヌクレオチド系。
【請求項４０】
前記蛍光体がＥＤＡＮＳでありそしてさらに前記消光体がＤＡＢＳＹＬである請求項３９に記載のオリゴヌクレオチド系。
【請求項４１】
試料中に標的核酸配列が存在しているか否かを検出する方法であって、下記ステップ：
（ａ）試料を、ハイブリッド形成条件下、オリゴヌクレオチド系に接触させて反応混合物を形成させ、前記オリゴヌクレオチド系が少なくとも第一オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチドを含有し、前記第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドが各々、予め定められたハイブリッド形成条件下、標的核酸配列とハイブリッドを形成できる第一領域を含有し、前記第一オリゴヌクレオチドおよび前記第二オリゴヌクレオチドが各々、さらに第二領域を含有し、そして前記定められたハイブリッド形成条件下ハイブリッドを形成すると、前記第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの前記第二領域の少なくとも一部分が核酸開裂剤認識配列を含む二重らせん構造を形成し、前記第一オリゴヌクレオチドと前記第二オリゴヌクレオチドの第二領域が、前記核酸開裂剤認識配列を認識する核酸開裂剤の存在下、前記第一オリゴヌクレオチドだけが前記核酸開裂剤によって開裂可能であるように選択され、
（ｂ）前記核酸開裂剤を前記反応混合物に添加し、その結果、標的核酸配列が試料中に存在していると、前記核酸開裂剤認識配列が前記核酸開裂剤によって開裂され、次いで
（ｃ）前記核酸開裂剤認識配列が前記核酸開裂剤によって開裂されるのを監視する、
ステップを含んでなり、
前記核酸開裂剤認識配列が前記核酸開裂剤によって開裂することは、オリゴヌクレオチド系が標的核酸配列とハイブリッドを形成していることを示ししたがって試料中に標的核酸が存在することを示す方法。
【請求項４２】
前記開裂が存在するか否かの検出が、特定の開裂産物が存在するか否かを監視することによって行われる請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記第一と第二のオリゴヌクレオチドの前記第一と第二の領域が、前記第一オリゴヌクレオチドが開裂すると前記第一オリゴヌクレオチドの前記第一領域が標的核酸配列から解離するように選択される請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記第二のオリゴヌクレオチドの前記第一領域が、前記予め定められたハイブリッド形成条件下、前記第一オリゴヌクレオチドが解離した後、前記第二オリゴヌクレオチドの前記第一領域が標的核酸配列とハイブリッドを形成したままであるように選択され、したがって標的核酸配列を前記第一オリゴヌクレオチドに対してリサイクルさせる請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記核酸開裂剤認識配列の一部を形成する前記第二オリゴヌクレオチドの少なくとも一つのヌクレオチドまたはヌクレオチド間結合が、前記第二オリゴヌクレオチドの前記核酸開裂剤による開裂を防止するように選択された、改変されたかまたは類似のヌクレオチドまたはヌクレオチド間結合である請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記二重らせん構造が、前記第一オリゴヌクレオチドの前記第二領域の一部分の自己アニーリングによって一部分形成される請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記第一と第二のオリゴヌクレオチドの前記第二領域が、前記核酸開裂剤認識配列が前記核酸開裂剤によって開裂可能なヌクレオチド間結合を置換するニックを特徴とするように選択される請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記オリゴヌクレオチド配列がさらに、前記核酸開裂剤認識配列の開裂を検出できるような方式でオリゴヌクレオチド系に連結された少なくとも一つの検出部分を含有している請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記少なくとも一つの検出部分が、少なくとも一つの直接検出できる検出部分および少なくとも一つの間接的に検出できる検出部分からなる群から選択される請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記少なくとも一つの直接検出することができる検出部分が蛍光部分および放射性部分からなる群から選択され、そしてさらに、前記少なくとも一つの間接的に検出できる検出部分が、結合する対の少なくとも一つのメンバーおよび化学的に相互に作用する対の少なくとも一つのメンバーからなる群から選択される請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記結合する対の前記少なくとも一つのメンバーが、抗体、抗原、エピトープ、リガンド、受容体、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、イオンおよびキレーターからなる群から選択され、そしてさらに、前記化学的に相互に作用する対の前記少なくとも一つのメンバーが、酵素、触媒および基質からなる群から選択される請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記少なくとも一つの検出部分が検出部分の共鳴して相互に作用する対を含み、検出部分の前記共鳴して相互に作用する対が第一検出部分と第二検出部分を含むが、前記第一検出部分と前記第二検出部分は、前記第一検出部分および前記第二検出部分の少なくとも一方が、他の検出部分から相互に作用しない距離をおいて位置しているとき検出可能な信号を生成することができるように選択され、その結果、前記核酸認識配列が開裂すると前記第一検出部分と前記第二検出部分の一方が信号を生成できる請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記第一と第二の検出部分が、蛍光共鳴エネルギー移動対を形成する請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記第一検出部分が蛍光体であり、そしてさらに前記第二検出部分が前記蛍光体の消光体である請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記蛍光体がＥＤＡＮＳでありそしてさらに前記消光体がＤＡＢＳＹＬである請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
試料中に標的核酸配列が存在しているか否かを検出するのに有用なオリゴヌクレオチド系であって、少なくとも第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドを含有し、前記第一オリゴヌクレオチドと前記第二オリゴヌクレオチドが各々、標的核酸配列に相補的であるかまたは実質的に相補的である第一領域を含有し、前記第一オリゴヌクレオチドと前記第二オリゴヌクレオチドが各々、さらに第二領域を含有し、前記第一と第二のオリゴヌクレオチドの前記第二領域は相補的であるかまたは実質的に相補的であり、かつそれらの間にアニーリングが行われると前記第二領域は核酸開裂剤認識配列を含む二重らせん構造を形成するように選択され、そして、予め定められたハイブリッド形成条件下、前記第一オリゴヌクレオチドの前記第一領域は、前記第二オリゴヌクレオチドの前記第一領域が、前記核酸標的配列と安定してハイブリッドを形成できる場合のみ、前記標的核酸配列と安定してハイブリッドを形成できるオリゴヌクレオチド系。
【請求項５７】
前記予め定められたハイブリッド形成条件下、前記第一と第二のオリゴヌクレオチドの前記第二領域が、それら自体、互いに、実質的にハイブリッドを形成することができない請求項５６に記載のオリゴヌクレオチド系。
【請求項５８】
前記第一オリゴヌクレオチドと前記第二オリゴヌクレオチドの前記第二領域が、前記核酸開裂剤認識配列を認識する核酸開裂剤の存在下、前記第一オリゴヌクレオチドだけが、前記核酸開裂剤によって開裂できるように選択される請求項５６に記載のオリゴヌクレオチド系。
【請求項５９】
前記第一と第二のオリゴヌクレオチドの前記第一と第二の領域が、前記予め定められたハイブリッド形成条件下、前記第一オリゴヌクレオチドが開裂すると、前記第一オリゴヌクレオチドの前記第一領域が標的核酸配列から解離するように選択される請求項５８に記載のオリゴヌクレオチド系。
【請求項６０】
前記核酸開裂剤認識配列の一部を形成する前記第二オリゴヌクレオチドの少なくとも一つのヌクレオチドまたはヌクレオチド間結合が、前記第二オリゴヌクレオチドが前記核酸開裂剤によって開裂されるのを防止するように選択された、改変されたかまたは類似のヌクレオチドまたはヌクレオチド間結合である請求項５８に記載のオリゴヌクレオチド系。
【請求項６１】
前記二重らせん構造が、前記第一オリゴヌクレオチドの前記第二領域の一部分の自己アニーリングによって一部分形成される請求項５８に記載のオリゴヌクレオチド系。
【請求項６２】
前記第一と第二のオリゴヌクレオチドの前記第二領域が、前記核酸開裂剤認識配列が前記核酸開裂剤によって開裂できるヌクレオチド間結合を置換するニックを特徴とするように選択される請求項５８に記載のオリゴヌクレオチド系。
【請求項６３】
前記核酸開裂剤認識配列の開裂を検出できるような方式でオリゴヌクレオチド系に連結された少なくとも一つの検出部分をさらに含有する請求項５６に記載のオリゴヌクレオチド系。
【請求項６４】
前記少なくとも一つの検出部分が、少なくとも一つの直接検出できる検出部分および少なくとも一つの間接的に検出できる検出部分からなる群から選択される請求項６３に記載のオリゴヌクレオチド系。
【請求項６５】
前記少なくとも一つの直接検出できる検出部分が蛍光部分と放射性部分からなる群から選択され、そしてさらに前記少なくとも一つの間接的に検出できる検出部分が結合する対の少なくとも一つのメンバーおよび化学的に相互に作用する対の少なくとも一つのメンバーからなる群から選択される請求項６４に記載のオリゴヌクレオチド系。
【請求項６６】
前記結合する対の前記少なくとも一つのメンバーが抗体、抗原、エピトープ、リガンド、受容体、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、イオンおよびキレーターからなる群から選択され、そしてさらに前記化学的に相互に作用する対の少なくとも一つのメンバーが酵素、触媒および基質からなる群から選択される請求項６５に記載のオリゴヌクレオチド系。
【請求項６７】
前記少なくとも一つの検出部分が検出部分の共鳴して相互に作用する対を含み、検出部分の前記共鳴して相互に作用する対が第一検出部分と第二検出部分を含むが、前記第一検出部分と前記第二検出部分は、前記第一検出部分と前記第二検出部分の少なくとも一方が、他方の検出部分から相互に作用しない距離をおいて位置しているとき検出可能な信号を生成することができるように選択され、その結果、前記核酸認識配列が開裂すると、前記第一検出部分と前記第二検出部分の一方によって信号が生成可能である請求項６４に記載のオリゴヌクレオチド系。
【請求項６８】
前記第一と第二の検出部分が蛍光共鳴エネルギー移動対を形成する請求項６７に記載のオリゴヌクレオチド系。
【請求項６９】
前記第一検出部分が蛍光体であり、そしてさらに前記第二検出部分が前記蛍光体の消光体である請求項６７に記載のオリゴヌクレオチド系。
【請求項７０】
前記蛍光体がＥＤＡＮＳであり、そしてさらに前記消光体がＤＡＢＳＹＬである請求項６８に記載のオリゴヌクレオチド系。
【請求項７１】
試料中に標的核酸配列が存在しているか否かを検出する方法であって、下記ステップ：
（ａ）試料を、オリゴヌクレオチド系に接触させて反応混合物を形成させ、前記オリゴヌクレオチド系が少なくとも第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドを含有し、前記第一オリゴヌクレオチドと前記第二オリゴヌクレオチドが各々標的核酸配列に相補的であるかまたは実質的に相補的である第一領域を含有し、前記第一オリゴヌクレオチドと前記第二オリゴヌクレオチドが各々さらに第二領域を含有し、前記第一と第二のオリゴヌクレオチドの前記第二領域は、相補的であるかまたは実質的に相補的でありかつそれらの間にアニーリングが行われると前記第二領域が核酸開裂剤認識配列を含む二重らせん構造を形成するように選択され、そして前記予め定められたハイブリッド形成条件下、前記第一オリゴヌクレオチドの前記第一領域は、前記第二オリゴヌクレオチドの前記第一領域が前記核酸標的配列と安定してハイブリッドを形成できるときのみ、前記標的核酸配列と安定してハイブリッドを形成することができ、
（ｂ）核酸開裂剤を前記反応混合物に添加し、その結果、標的核酸配列が試料中に存在しているとき、前記核酸開裂剤認識配列が前記核酸開裂剤によって開裂され、次いで
（ｃ）前記核酸開裂剤認識配列の前記核酸開裂剤による開裂を監視する、
ステップを含んでなり、
前記核酸開裂剤認識配列が前記核酸開裂剤によって開裂することは、オリゴヌクレオチド系が標的核酸配列とハイブリッドを形成していることを示し、したがって標的核酸が試料中に存在していることを示す方法。
【請求項７２】
前記開裂が存在するか否かの検出が、特定の開裂産物が存在するか否かを監視することによって行われる請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記第一と第二のオリゴヌクレオチドの前記第一と第二の領域が、前記予め定められたハイブリッド形成条件下、前記第一オリゴヌクレオチドが開裂すると、前記第一オリゴヌクレオチドの前記第一領域が標的核酸配列から解離するように選択される請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記核酸開裂剤認識配列の一部を形成する前記第二オリゴヌクレオチドの少なくとも一つのヌクレオチドまたはヌクレオチド間結合が、前記第二オリゴヌクレオチドが前記核酸開裂剤によって開裂されるのを防止するように選択された、改変されたかまたは類似のヌクレオチドまたはヌクレオチド間結合である請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
前記二重らせん構造が、前記第一オリゴヌクレオチドの前記第二領域の一部分の自己アニーリングによって一部形成される請求項７１に記載の方法。
【請求項７６】
前記第一と第二のオリゴヌクレオチドの前記第二領域が、前記核酸開裂剤認識配列が前記核酸開裂剤によって開裂可能なヌクレオチド間結合を置換するニックを特徴とするように選択される請求項７１に記載の方法。
【請求項７７】
前記オリゴヌクレオチド配列が、前記核酸開裂剤認識配列の開裂を検出できるような方式でオリゴヌクレオチド系に連結された少なくとも一つの検出部分をさらに含有する請求項７１に記載の方法。
【請求項７８】
前記少なくとも一つの検出部分が、少なくとも一つの直接検出できる検出部分と少なくとも一つの間接的に検出できる検出部分からなる群から選択される請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記少なくとも一つの直接検出できる検出部分が蛍光部分と放射性部分からなる群から選択され、そしてさらに前記少なくとも一つの間接的に検出できる検出部分が、結合する対の少なくとも一つのメンバーと化学的に相互に作用する対の少なくとも一つのメンバーからなる群から選択される請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記結合する対の前記少なくとも一つのメンバーが抗体、抗原、エピトープ、リガンド、受容体、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、イオンおよびキレーターからなる群から選択され、そしてさらに前記化学的に相互に作用する対の前記少なくとも一つのメンバーが酵素、触媒および基質からなる群から選択される請求項７９の方法。
【請求項８１】
前記少なくとも一つの検出部分が検出部分の共鳴して相互に作用する対を含み、検出部分の前記共鳴して相互に作用する対が第一検出部分と第二検出部分を含有するが、前記第一検出部分と前記第二検出部分は、前記第一検出部分と前記第二検出部分の少なくとも一方が他方の検出部分から相互に作用しない距離をおいて位置しているときに検出可能な信号を生成することができるように選択され、その結果、前記核酸認識配列が開裂すると、前記第一検出部分と前記第二検出部分の一方によって信号が生成可能である請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
前記第一と第二の検出部分が蛍光共鳴エネルギー移動対を形成する請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記第一検出部分が蛍光体であり、そしてさらに、前記第二検出部分が前記蛍光体の消光体である請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記蛍光体がＥＤＡＮＳであり、そしてさらに前記消光体がＤＡＢＳＹＬである請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
試料中に標的核酸配列が存在しているか否かを検出するのに有用なオリゴヌクレオチド系であって、少なくとも第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドを含有し、前記第一オリゴヌクレオチドと前記第二オリゴヌクレオチドが各々、標的核酸配列に相補的であるかまたは実質的に相補的である第一領域を含有し、前記第一オリゴヌクレオチドと前記第二オリゴヌクレオチドが各々、さらに第二領域を含有し、前記第一と第二のオリゴヌクレオチドの前記第二領域が相補的であるかまたは実質的に相補的であり、そしてそれらの間にアニーリングが行われると、前記第二領域は核酸開裂剤認識配列を含む二重らせん構造を形成するように選択され、そして予め定められたハイブリッド形成条件下、前記第一オリゴヌクレオチドと前記第二オリゴヌクレオチドの前記第一領域は前記標的核酸配列と安定してハイブリッドを形成することができ、かつ、前記第一オリゴヌクレオチドと前記第二オリゴヌクレオチドの前記第二領域は、それらの間に、前記第一オリゴヌクレオチド、前記第二オリゴヌクレオチドおよび前記標的核酸配列が同時にアニールされるときのみ、安定してハイブリッドを形成できるオリゴヌクレオチド系。
【請求項８６】
試料中に標的核酸配列が存在しているか否かを検出する方法であって、下記ステップ：
（ａ）試料を、オリゴヌクレオチド系と接触させて反応混合物を形成させ、前記オリゴヌクレオチド系が少なくとも第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドを含有し、前記第一オリゴヌクレオチドと前記第二オリゴヌクレオチドが各々、標的核酸配列に相補的であるかまたは実質的に相補的である第一領域を含有し、前記第一オリゴヌクレオチドと前記第二オリゴヌクレオチドが各々、さらに第二領域を含有し、前記第一と第二のオリゴヌクレオチドの前記第二領域が相補的であるかまたは実質的に相補的であり、かつそれらの間にアニーリングが行われると前記第二領域が核酸開裂剤認識配列を含む二重らせん構造を形成するように選択され、そして予め定められたハイブリッド形成条件下、前記第一オリゴヌクレオチドと前記第二オリゴヌクレオチドの前記第一領域は前記標的核酸配列と安定してハイブリッドを形成することができかつ前記第一オリゴヌクレオチドと前記第二オリゴヌクレオチドの前記第二領域はそれらの間に、前記第一オリゴヌクレオチド、第二オリゴヌクレオチドおよび前記標的核酸配列が同時にアニールされるときのみ、安定してハイブリッドを形成することができ、
（ｂ）核酸開裂剤を前記反応混合物に添加し、その結果、標的核酸配列が試料中に存在しているとき、前記核酸開裂剤認識配列が前記核酸開裂剤によって開裂され、次いで、
（ｃ）前記核酸開裂剤認識配列の前記核酸開裂剤による開裂を監視する、
ステップを含んでなり、
前記核酸開裂剤認識配列が前記核酸開裂剤によって開裂することは、オリゴヌクレオチド系が標的核酸配列とハイブリッドを形成していることを示し、したがって試料中に標的核酸が存在することを示す方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、試料中の標的核酸配列を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブおよび方法に関する。さらに詳しく述べると、本発明は、標的核酸配列とハイブリッドを形成すると内部開裂可能な（ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙ ｃｌｅａｖａｂｌｅ）オリゴヌクレオチドプローブであって、その開裂によって信号が発生しかつリサイクリングによって増幅が行われるオリゴヌクレオチドプローブに関する。
【０００２】
標的核酸配列を同定することは、生物学の研究および医療診断を行うのに非常に重要である。標的配列の検出を利用して、特定のＤＮＡまたはＲＮＡの分子を同定しおよび／または類別しそして突然変異を明らかにすることができる。
【０００３】
標的配列を検出しおよび／または同定を行うことができる多くの方法と技法が当該技術分野に存在している。例えば、ポリヌクレオチド配列決定法を利用して、標的のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を決定することができる。配列を決定するのに一般に利用される方法としては、サンガーのジデオキシ法（例えば、Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４巻５４６３〜５４６７頁１９７７年参照）またはマクサム・ギルバート法（例えばＭａｘａｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６５巻４９９〜５５９頁１９８０年参照）がある。
【０００４】
試料中に標的配列が存在していることを検出するのに、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）も使用できる。ＰＣＲは、標的配列内の領域に特異的に結合してその標的核酸配列を増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを利用し、増幅産物の生成が標的配列の存在を示す反応である。
【０００５】
標的核酸を同定する別の方法は、オリゴヌクレオチドのプローブを標的核酸配列とハイブリッドを形成させる方法であり、ハイブリッドが形成することは標的核酸配列が存在していることを示す。
【０００６】
オリゴヌクレオチドのプローブは、その塩基と標的核酸の塩基との間に水素結合を形成することによって、標的核酸に結合する。共通Ｂ−ＤＮＡ（ｃｏｍｍｏｎ Ｂ−ＤＮＡ）は、通常のアデニン−チミン（Ａ−Ｔ）およびグアニン−シトシン（Ｇ−Ｃ）のワトソン・クリック塩基対を有し、これら塩基対の塩基はそれぞれ２個および３個の水素結合を形成している。通常のハイブリッド形成法は、配列特異的のＤＮＡもしくはＲＮＡのオリゴヌクレオチドプローブの、ワトソン・クリック水素結合によって相補的標的核酸に結合する性能に基づいている。しかし、別のタイプのヌクレオチド間水素結合パターンが知られており、この場合、第一ヌクレオチドに対するワトソン・クリック塩基対形成に関与していない原子が別のヌクレオチドに対して水素結合を形成することができる。例えば、チミン（Ｔ）が、アデニンに対する水素結合によって、ＡＴワトソン・クリック塩基対に結合して、Ｔ−ＡＴ塩基トリアド（Ｔ−ＡＴ ｂａｓｅ ｔｒｉａｄ）を形成することができる。フーグスティーン（Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ、１２巻８２２頁１９５９年）が、Ｔ−ＡＴ塩基トリアドとＣ−ＧＣ塩基トリアド中に存在する一つおきの水素結合について初めて述べた。さらに最近になって、グアニンが中心のチミンと水素結合できるＧ−ＴＡ塩基トリアドが観察されている（Ｇｒｉｆｆｉｎら、２４５巻９６７〜９７１頁１９８９年）。
【０００７】
ワトソン・クリック水素結合および非ワトソン・クリック水素結合によって標的核酸に結合できるオリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸と極めて安定な複合体を形成するので各種の研究と診断に利用される。
【０００８】
例えば、オリゴヌクレオチドは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ １〜３巻１９８９年、米国ニューヨーク州 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）に記載されているように、フィルターもしくは膜に固定化されているかまたは組織中に存在している標的核酸に対するプローブとして使用できる。しかし、線状オリゴヌクレオチドプローブの用途は、それらの結合の安定性と選択性が劣っているため、用途が限定されることが多い。
【０００９】
別の例としては溶液相検出法がある。時には均一検定法と呼ばれている溶液相検出法がいくつも知られている。用語「均一の」は、当該技術分野で使用する場合、プローブ−標的ハイブリッドからハイブリッドを形成していないオリゴヌクレオチドプローブを分離することなしに実施される方法を意味する。これらの方法は、多くの蛍光標識の蛍光が、オリゴヌクレオチドプローブの立体配座または直接の化学的環境によって影響を受けるということに基づいていることが多い。
【００１０】
Ｌｉｖａｋらの米国特許第５８７６９３０号は、標的の核酸配列の同定方法を開示している。この方法は、蛍光レポーター分子およびそのレポーター分子の蛍光を消光することができる消光分子を含むオリゴヌクレオチドプローブを利用する。この方法のオリゴヌクレオチドプローブは、その消光分子がレポーター分子の蛍光を消光するのに十分にレポーター分子の近くに位置している場合、ハイブリッドを形成していない時に少なくとも一つの一本鎖立体配座中に存在するように構築される。また、そのオリゴヌクレオチドプローブは、その消光分子がレポーター分子の蛍光を消光するのに十分にレポーター分子の近くに位置していない場合、標的核酸とハイブリッドを形成している時に少なくとも一つの一本鎖立体配座中に存在している。このようなハイブリッドを形成する立体配座およびハイブリッドを形成しない立体配座を採用することによって、プローブのレポーター分子と消光分子は、プローブがハイブリッドを形成しているときと形成していない時に、異なる蛍光信号強度を示す。したがって、この方法は、レポーター分子、消光分子またはこれら両者の組合せの蛍光強度の変化に基づいて、特定の標的核酸配列の存在を確認することができる。この方法の限界は、信号を増幅できないために低い標的濃度を検出できないことである。その上、この方法は、本来、バックグランド信号の強いことが特徴である。
【００１１】
Ｔｙａｇｉらの米国特許第５９２５５１７号は、核酸標的配列を検出するために使用する単分子および二分子のハイブリッド形成プローブを開示している。これらのプローブとしては、標的補体配列、標的配列なしで閉鎖した立体配座（ｃｌｏｓｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）中にプローブを保持するアフィニティー対（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐａｉｒ）、およびプローブが閉鎖立体配座中に位置しているとき相互に作用する標識対もしくは特定の単分子プローブの場合の非相互作用標識がある。標的と標的補体の配列がハイブリッドを形成すると、プローブを開放立体配座にシフトする。そのシフトは、標識対の相互作用が低下するためまたは非相互作用標識からの信号を検出することによって検出することができる。特定の単分子プローブは、１ヌクレオチドほどの大きさの差がある標的配列および非標的配列を識別することができる。この方法の限界は、信号を増幅できないので、低い標的濃度を検出できないことである。その上、この方法は、本来、バックグランド信号の強いことが特徴である。
【００１２】
Ｎａｚａｒｅｎｋｏらの米国特許第５８６６３３６号には、標識された核酸増幅オリゴヌクレオチドが記載されており、そのオリゴヌクレオチドは線状もしくはヘアピンのプライマーまたはブロッキングオリゴヌクレオチドである。Ｎａｚａｒｅｎｋｏ の特許に開示されているオリゴヌクレオチドは、分子エネルギー移動対のドナーおよび／またはアクセプターの部分で標識されている。それらの部分は、ドナーが発する蛍光エネルギーがアクセプターによって吸収されるような発蛍光団である。そのアクセプターは、ドナー部分とは異なる波長の蛍光を発する発蛍光団であるか、または消光体である。これらのオリゴヌクレオチドは、ドナー部分とアクセプター部分が増幅産物に取り込まれるように配置形成されている。また、この発明は、増幅産物を、核酸増幅プライマーを利用して直接検出する方法とキットも提供する。標識された線状プライマーを使用すると、エキソヌクレアーゼで処理するとかまたは特定の温度を利用して処理することによって、取りこまれていないプライマーを分離する必要がなくなる。この「閉鎖管（ｃｌｏｓｅｄ−ｔｕｂｅ）」フォーマットは、増幅産物による取りこみ汚染が起こる可能性を大きく低下させて、試料処理量を高め、そして完全に自動化することができる。
【００１３】
Ｄｉａｍｏｎｄらの米国特許第４７６６０６２号には、標識化ポリヌクレオチドに水素結合しているプリン／ピリミジンを通じて結合されたプローブポリヌクレオチドの複合体を含有する診断剤が記載されている。そのプローブは、生物試料の標的配列に結合できる標的結合領域を含有している。米国特許第４７６６０６２号には、さらに、標的のヌクレオチド配列を含有する試料と接触させると、最初に、前記標的と、前記標的結合領域の一本鎖部分との結合を起こさせる方法が記載されている。その後、その標識されたポリヌクレオチドは、前記結合領域中への分岐移動によって、前記複合体から転置される。転置された標識化ポリヌクレオチドを測定すると、試料中の標的ヌクレオチド配列の存在と濃度の関数である値が与えられる。
【００１４】
Ｈｏｇａｎ らの米国特許第５４５１５０３号は、後記「発明の実施の形態」の章でより詳細に考察するが、標的核酸配列とハイブリッドを形成する少なくとも二つの別個の標的特異的領域、および標的核酸とハイブリッドを形成しないが互いにハイブリッドを形成できる相補的領域を有する少なくとも二つの別個のアーム領域を有する少なくとも一つの核酸ストランドを備えた核酸ハイブリッド形成プローブを教示している。これらの領域は次のように設計されている。すなわち、適切なハイブリッド形成条件下で、前記相補的アーム領域は、標的核酸が存在しない場合、互いにハイブリッドを形成しないが、標的核酸が存在している場合、プローブの標的特異的領域が標的核酸とアニーリングを行いかつ相補的アーム領域が互いにアニーリングを行い、その結果、標的核酸配列を検出するのに有用な分岐核酸構造を形成するように設計されている。
【００１５】
上記の方法は、オリゴヌクレオチドのプローブを、フィルターまたは膜に固定化された標的核酸に対して使用するＳａｍｂｒｏｏｋらが述べているような簡単なオリゴヌクレオチドプローブ検出法より実施するのに複雑さが少ないが、いくつかの限界がある。例えば、Ｌｉｖａｋ らが述べているような簡単に実施できる方法は、標的でない配列とのハイブリッド形成も、場合によっては陽性の試験結果を生じるので、擬陽性の試験結果を生じることがある。
【００１６】
一般に、上記の方法は、低い信号と高いバックグランドが特徴である。Ｈｏｇａｎらは、鋳型をリサイクルすることによる信号の増幅およびその特許に採用されるオリゴヌクレオチドのアーム領域の長さを適当に選択することによるバックグランドの減少を教示している。より正確な結果を得ることを目標とする方法は、往々にして実施するのに複雑である。しかし、さらに示しかつ以下に例示するように、信号を増幅し、かつバックグランドを減らす改良方法がいぜんとして要求されている。
【００１７】
したがって、本発明は、標的核酸配列の均一検出法であって、ハイブリッドを形成して、立体配座が変化したオリゴヌクレオチド中に特定の開裂部位が生成することに基づいた方法で利用可能な新規なオリゴヌクレオチドを開示し、したがって、本発明は、高レベルの特異性を保持しながら標的核酸を検出する簡単な方法を提供するものである。
【００１８】
課題を解決するための手段
本発明の一側面によって、試料中に標的核酸配列が存在するか否かを検出するのに有用なオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの集合体（ａｓｓｅｍｂｌｙ）が提供され、そのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの集合体は、（ａ）第一領域と第二領域であってそれぞれの少なくとも一部分が予め定められたハイブリッド形成条件下で標的核酸配列とハイブリッドを形成できる第一領域と第二領域；および（ｂ）第一領域と第二領域それぞれに連結されている第三領域と第四領域を含有し、該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体の第一部分と第二部分は予め定められたハイブリッド形成条件下、それらの間に第一二重らせん構造を形成することができ、該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体の第一、第二、第三および第四の領域は、第一領域と第二領域が標的核酸配列と予め定められたハイブリッド形成条件下でハイブリッドを形成すると、第一二重らせん構造が解離して第三領域の一部と第四領域の一部がその両者の間に第二二重らせん構造を形成するように選択され、その第二二重らせん構造が、第一二重らせん構造には存在せずかつ開裂されると該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体が標的核酸配列とハイブリッドを形成していることを示し、したがって試料中に標的核酸が存在することを示す核酸開裂剤認識配列を含んでいる。
【００１９】
本発明の別の側面で、試料中に標的核酸配列が存在するか否かを検出する方法が提供され、その方法は、（ａ）試料を、予め定められたハイブリッド形成条件下で、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体と接触させて反応混合物を形成させ、そのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体は、（ｉ）第一領域と第二領域であってそれぞれの少なくとも一部分が標的の核酸配列とハイブリッドを形成できる第一領域と第二領域、および（ｉｉ）第一領域と第二領域それぞれに連結されている第三領域と第四領域を含有し、該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体の第一部分と第二部分は予め定められたハイブリッド形成条件下、それらの間に第一二重らせん構造を形成することができ、該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体の第一、第二、第三および第四の領域は、第一領域と第二領域が標的核酸配列と予め定められたハイブリッド形成条件下でハイブリッドを形成すると、第一二重らせん構造が解離して第三領域の第二部分と第四領域の第二部分がそれらの間に第二二重らせん構造を形成するように選択され、その第二二重らせん構造が第一二重らせん構造には存在しない核酸開裂剤認識配列を含有し；（ｂ）核酸開裂剤を前記反応混合物に添加し、その結果、標的核酸配列が試料中に存在しているならば、前記核酸開裂剤認識配列が形成されてその開裂剤によって開裂され；次いで（ｃ）核酸開裂剤認識配列の核酸開裂剤による開裂を監視するステップを含んでなり；核酸開裂剤認識配列の核酸開裂剤による開裂が、該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体が標的核酸配列とハイブリッドを形成していることを示し、したがって試料中に標的核酸が存在することを示す方法である。
【００２０】
下記の本発明の好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、予め定められたハイブリッド形成条件下でそれらの間に第一二重らせん構造を形成することができる前記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体の第一部分と第二部分はそれぞれ、第三領域と第四領域から誘導される。
【００２１】
前記好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体の第一、第二、第三および第四の領域はさらに、核酸開裂剤認識配列が開裂した後、第一領域と第二領域が標的核酸配列から解離して、その標的核酸配列をリサイクルすることができるように選択される。
【００２２】
本発明のさらに別の側面によって、試料中に標的核酸配列が存在するか否かを検出するのに有用なオリゴヌクレオチド系が提供され、そのオリゴヌクレオチド系は少なくとも第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドを含有し、その第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドは各々、予め定められたハイブリッド形成条件下で標的核酸配列とハイブリッドを形成できる第一領域を含有し、その第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドは各々、さらに第二領域を含有し、ハイブリッドを形成すると、第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの第二領域の少なくとも一部が核酸開裂剤認識配列を含む二重らせん構造を形成し、第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの第二領域が、核酸開裂剤認識配列を認識する核酸開裂剤の存在下、第一オリゴヌクレオチドだけが前記核酸開裂剤によって開裂可能であるように選択される。
【００２３】
本発明の追加の側面によって、試料中に標的核酸配列が存在するか否かを検出する方法が提供され、その方法は、（ａ）試料を、ハイブリッド形成条件下、オリゴヌクレオチド系と接触させて反応混合物を生成させ、そのオリゴヌクレオチド系は少なくとも第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドを含有し、その第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドは各々、予め定められたハイブリッド形成条件下、標的核酸配列とハイブリッドを形成することができる第一領域を含有し、第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドは各々さらに第二領域を含有し、そして予め定められたハイブリッド形成条件下ハイブリッドを形成すると、第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの第二領域の少なくとも一部が核酸開裂剤認識配列を含有する二重らせん構造体を形成し、第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの第二領域が、核酸開裂剤認識配列を認識する核酸開裂剤の存在下、第一オリゴヌクレオチドだけが核酸開裂剤によって開裂可能であるように選択され；（ｂ）核酸開裂剤を前記反応混合物に添加し、その結果、標的核酸配列が試料中に存在している場合、核酸開裂剤認識配列が、核酸開裂剤によって開裂され；次いで（ｃ）核酸開裂剤認識配列が核酸開裂剤によって開裂するのを監視するステップを含んでなり；核酸開裂剤認識配列の核酸開裂剤によって開裂することは前記オリゴヌクレオチド系が標的核酸配列とハイブリッドを形成することを示し、したがって試料中に標的核酸が存在することを示す方法である。
【００２４】
下記の本発明の好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、第一と第二のオリゴヌクレオチドの第一領域と第二領域は、第一オリゴヌクレオチドが開裂すると、第一オリゴヌクレオチドの第一領域が標的核酸配列から解離するように選択される。
【００２５】
前記好ましい実施態様のさらなる特徴によって、第二オリゴヌクレオチドの第一領域は、予め定められたハイブリッド形成条件下、第一オリゴヌクレオチドが解離した後、第二オリゴヌクレオチドの第一領域が標的核酸配列とハイブリッドを形成したままであり、その結果、標的核酸配列を第一オリゴヌクレオチドに対しリサイクルできるように選択される。
【００２６】
本発明のさらに追加の側面によって、標的核酸配列が試料中に存在しているか否かを検出するのに有用なオリゴヌクレオチド系が提供され、そのオリゴヌクレオチド系は少なくとも第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドを含有し、その第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドは各々、標的核酸配列と相補的であるかまたは実質的に相補的である第一領域を含有し、その第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドは各々、さらに第二領域を含有し、第一と第二のオリゴヌクレオチドの第二領域は相補的であるかまたは実質的に相補的であり、かつその両第二領域間にアニーリングが行われると、それら第二領域は核酸開裂剤認識配列を含む二重らせん構造を形成するように選択され、そして予め定められたハイブリッド形成条件下、第一オリゴヌクレオチドの第一領域は、第二オリゴヌクレオチドの第一領域が核酸標的配列と安定してハイブリッドを形成できる場合のみ、標的核酸配列と安定してハイブリッドを形成することができる。
【００２７】
本発明のさらに追加の側面で、標的核酸配列が試料中に存在しているか否かを検出する方法が提供され、その方法は、（ａ）試料をオリゴヌクレオチド系と接触させて反応混合物を生成させ、そのオリゴヌクレオチド系は、少なくとも第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドを含有し、その第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドは各々、標的核酸配列と相補的であるかまたは実質的に相補的である第一領域を含有し、さらにその第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドは各々、第二領域を含有し、第一と第二のオリゴヌクレオチドの第二領域は、相補的であるかまたは実質的に相補的であり、かつ両第二領域間にアニーリングを行うと両第二領域が核酸開裂剤認識配列を含む二重らせん構造を生成するように選択され、そして予め定められたハイブリッド形成条件下、第一オリゴヌクレオチドの第一領域は、第二オリゴヌクレオチドの第一領域が核酸標的配列と安定してハイブリッドを形成できる場合のみ標的核酸配列と安定してハイブリッドを形成することができ；（ｂ）核酸開裂剤を前記反応混合物に添加し、その結果、標的核酸配列が試料中に存在している場合、核酸開裂剤認識配列が核酸開裂剤によって開裂され；次いで（ｃ）核酸開裂剤認識配列が核酸開裂剤によって開裂するのを監視する；ステップを含んでなり、核酸開裂剤認識配列が核酸開裂剤によって開裂することは該オリゴヌクレオチド系が標的核酸配列とハイブリッドを形成していることを示ししたがって試料中に標的核酸が存在することを示す。
【００２８】
下記の本発明の好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、予め定められたハイブリッド形成条件下、第一と第二のオリゴヌクレオチドの第二領域は、それ自体互いに、実質的にハイブリッドを形成できない。
【００２９】
前記好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの第二領域は、核酸開裂剤認識配列を認識する核酸開裂剤の存在下、第一オリゴヌクレオチドだけが核酸開裂剤によって開裂可能であるように選択される。
【００３０】
前記好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、第一と第二のオリゴヌクレオチドの第一と第二の領域は、予め定められたハイブリッド形成条件下、第一オリゴヌクレオチドが開裂すると、第一オリゴヌクレオチドの第一領域が標的核酸配列から解離するように選択される。
【００３１】
前記好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、核酸開裂剤認識配列の一部を形成する第二オリゴヌクレオチドの少なくとも一つのヌクレオチドまたはヌクレオチド間結合は、第二オリゴヌクレオチドが核酸開裂剤によって開裂されるのを防止するように選択された、改変されたかまたは類似のヌクレオチドまたはヌクレオチド間結合である。
【００３２】
前記好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、前記二重らせん構造は、第一オリゴヌクレオチドの第二領域の一部分の自己アニーリングによって一部分が形成される。
【００３３】
前記好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、第一と第二のオリゴヌクレオチドの第二領域は、核酸開裂剤認識配列が、核酸開裂剤によって開裂できるヌクレオチド間結合を置換するニックを特徴とするように選択される。
【００３４】
本発明のさらなる側面によって、標的核酸配列が試料中に存在しているか否かを検出するのに有用なオリゴヌクレオチド系が提供され、そのオリゴヌクレオチド系は、少なくとも第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドを含有し、その第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドは各々、標的核酸配列と相補的であるかまたは実質的に相補的である第一領域を含有し、その第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドは各々さらに第二領域を含有し、第一と第二のオリゴヌクレオチドの第二領域は、相補的であるかまたは実質的に相補的であり、かつ両第二領域間のアニーリングを行うと、両第二領域が核酸開裂剤認識配列を含む二重らせんを形成するように選択され、そして予め定められたハイブリッド形成条件下、第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの第一領域は、標的核酸配列と安定してハイブリッドを形成することができ、かつ、第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの第二領域は、第一オリゴヌクレオチド、第二オリゴヌクレオチドおよび標的核酸配列が同時にアニールされるときのみ、両第二領域間のハイブリッドを安定して形成することができる。
【００３５】
本発明のさらなる側面によって、標的核酸配列が試料中に存在しているか否かを検出する方法が提供され、その方法は、（ａ）試料をオリゴヌクレオチド系と接触させて反応混合物を生成させ、そのオリゴヌクレオチド系は少なくとも第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドを含有し、第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドは各々、標的核酸配列と相補的であるかまたは実質的に相補的である第一領域を含有し、さらに、第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドは各々、第二領域を含有し、第一と第二のオリゴヌクレオチドの第二領域は相補的であるかまたは実質的に相補的であり、かつ両者間にアニーリングが行われると両第二領域が核酸開裂剤認識配列を含有する二重らせん構造を形成するように選択され、そして予め定められたハイブリッド形成条件下、第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの第一領域は標的核酸配列と安定してハイブリッドを形成することができ、かつ第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの第二領域は、第一オリゴヌクレオチド、第二オリゴヌクレオチドおよび標的核酸配列が同時にアニールされる場合のみ、両第二領域間に安定してハイブリッドを形成することができ；（ｂ）核酸開裂剤を前記反応混合物に添加し、その結果、標的核酸配列が試料中に存在している場合、核酸開裂剤認識配列が核酸開裂剤によって開裂され；次いで（ｃ）核酸開裂剤認識配列が核酸開裂剤によって開裂されるのを監視する；ステップを含んでなり、核酸開裂剤認識配列が核酸開裂剤によって開裂することは、該オリゴヌクレオチド系が標的核酸配列とハイブリッドを形成していることを示し、したがって試料中に標的核酸が存在することを示す方法である。
【００３６】
本発明は、反応次数またはバックグランド信号の発生を減らしながら標的核酸配列を簡単にかつ効率的に検出できるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体を提供することによって、現在知られている立体配置の欠点をうまく克服する。
【００３７】
図面の簡単な説明
本願では、本発明を、単に実例として添付図面を参照して説明する。ここで詳細に図面を参照すると、図示されている詳細は実例として示されたもので単に本発明の好ましい実施態様を例示考察することを目的とするものであり、そして最も有用であると考えられるものおよび本発明の原理と概念の側面が容易に理解される説明を提供するために提示することを強調するものである。このことについては、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細を示すことはしないが、図面を利用して行った説明によって、当業技術者にとって、いくつもの形態の発明がどのようにして実施できるか明らかになる。
図中：
図１は本発明の好ましい一側面の検出法のステップを示す模式図である。
図２は標的核酸配列とハイブリッドを形成したときの本発明の単一オリゴヌクレオチドおよびヌクレオチド集合体の構造を示す。
図３ａ−ｂは本発明の対合オリゴヌクレオチド（図３ａ）とループ化オリゴヌクレオチド（図３ｂ）のドメイン構造と領域を示す図であり、標的とハイブリッドを形成する領域（第一領域と第二領域）およびステム形成領域（第三領域と第四領域）の融点（Ｔｍ）と遊離エネルギー（△Ｇ）を示す。
図４は２６３ｂｐのＣＭＶ−ＤＮＡ鋳型フラグメント由来の各種ＣＭＶ−ＤＮＡ製剤（１〜８）であって、本発明を実施する際、標的核酸配列として使用したこれら製剤の領域を示す制限地図である。矢印は酵素によって開裂される部位を示す。Ａ＝ＡｆｌＩＩ；Ｄ＝ＤｄｅＩ；Ｆ＝Ｆｎｕ４ＨＩ；Ｈ＝ＨａｅＩＩＩ。
図５ａ−ｅは対合ビオチニル化オリゴヌクレオチドプローブとＣＭＶ−ＤＮＡのハイブリッド形成に対するステムとアームの領域の効果を示す１２．５％未変性ポリアクリルアミドゲルの写真である。ビオチニル化オリゴヌクレオチドを実施例の章に記載されているようにして視覚化した。各レーンの底部の数字は、ハイブリッド形成のインキュベーション温度を示す。星印−ビオチンのタグ。
図６は対合オリゴヌクレオチドプローブによるＣＭＶ−ＤＮＡのリサイクリングに対するアーム領域の長さの効果を示す１２．５％未変性ポリアクリルアミドゲルの写真である。対２と対３を、鋳型ＤＮＡの存在下（＋）または鋳型ＤＮＡなし（−）でインキュベートした。ハイブリッド形成ステップの後、０．１７単位／μｌのＢｓｔＢＩを各試験管に添加して約２ｈｒ、開裂を行わせた。ビオチニル化フラグメントを実施例の章に記載されているようにして視覚化した。星印−ビオチンのタグ。
図７は　鋳型ＤＮＡとプレハイブリダイズされた（＋）かまたはプレハイブリダイズされておらず（−）次いでＴａｑＩ（Ｔ）およびＢｓｔＢＩ（Ｂ）で開裂されたかまたは開裂されていない（Ｈ）単一のループ化オリゴヌクレオチドプローブのクロマトグラフィーによる分離を示す１２．５％未変性ポリアクリルアミドゲルの写真である。
図８ａ−ｂは長い二本鎖標的ＤＮＡ（ｐ．ＣＭＶ−２６３．ｄｓ、表１）（図８ａ）または短い二本鎖標的ＤＮＡ（ｐ．ＣＭＶ−２．ｓｔ、表１）（図８ｂ）と反応させた、ハイブリッドを形成したループ化ビオチニル化オリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成していないループ化ビオチニル化オリゴヌクレオチドのクロマトグラフィーによる分離を示す１２．５％未変性ポリアクリルアミドゲルの写真である。ビオチニル化オリゴヌクレオチドを実施例の章に記載したようにして視覚化した。各レーンの頂部の数字はハイブリッド形成インキュベーションの温度を示す。星印−ビオチンのタグ。
図９ａ−ｂは一本鎖標的ＤＮＡ（アンチセンスＣＭＶ−２．ｓｔ、表１）または同じ長さのｄｓ標的ＤＮＡ（ｓｙｎ．ＣＭＶ−２．ｓｔ、表１）と反応させたループ化したビオチニル化オリゴヌクレオチドのクロマトグラフィーによる分離を示す１２．５％未変性ポリアクリルアミドゲルの写真である。ビオチニル化オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成産物を、実施例の章に記載されているようにして視覚化した。星印−ビオチンのタグ。
図１０ａ−ｃは減少する濃度の一本鎖標的ＤＮＡとハイブリッドを形成させた後に酵素で配列させたループ化オリゴヌクレオチドプローブのクロマトグラフィーによる分離を示す１２．５％ポリアクリルアミドゲルの写真である。その検定は７本ずつの試験管からなる同一の２セットで構成され、各試験管には、減少する量の一本鎖ＣＭＶ標的ＤＮＡ（３５ヌクレオチドの長さ）（アンチセンスＣＭＶ−２．ｓｔ、表１）を添加した。アンチセンスＣＭＶ−２．ｓｔとループ化オリゴヌクレオチドプローブのモル比は１〜６番までの試験管それぞれについて、１：１、１：４、１：１０、１：４０、１：１００、１：４００であった。７番の試験管にはＣＭＶ−ＤＮＡを添加しなかった。図１０ａは、ハイブリッド形成ステップ終了時の試料を示す。図１０ｂはオリゴヌクレオチドを２ｈｒ開裂させ次いで変性条件下で分離して、一本鎖のビオチニル化フラグメントを検出した試料を示す。図１０ｃは図１０ｂと同一の試料であるが未変性のゲルで分離して二本鎖と一本鎖のフラグメントの両者を検出した試料を示す。ビオチニル化フラグメントは、実施例の章で説明したようにして視覚化した。星印−ビオチンのタグ。
図１１ａ−ｃは開裂産物の蓄積に対する長いオリゴヌクレオチドと短いオリゴヌクレオチドのアンカーの効果を示す。開裂させた後の標的とプローブのメンバーの１２．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動物を膜にブロットし（図１１ａ）、それを走査して分析した。図１１ｂ−ｃは、開裂効率（図１１ｂ）および長い方のアンカーメンバーを利用したときのアンプリファイアオリゴヌクレオチドメンバーの開裂の増加を示す（図１１ｃ）。
図１２は標的ＤＮＡ濃度の関数としてアンプリファイアの開裂産物の量を示すグラフであり、増幅率は、各データ点の右に示してある。差し込み図は、０．２ａｍｏｌ、２０ａｍｏｌ、２００ａｍｏｌ、２ｆｍｏｌおよび２０ｆｍｏｌの標的を含有する試料の１５％変性ポリアクリルアミドゲルによる分離を示す。
【００３８】
発明の実施の形態
本発明は、標的核酸配列を検出するのに使用できるオリゴヌクレオチドおよびそのオリゴヌクレオチドの利用方法の発明である。具体的に述べると、本発明は、単一もしくは複数の鋳型配列に対しアニールされると固有の（内因性の）開裂部位を間に形成するオリゴヌクレオチドプローブを利用することによって、特定の標的核酸配列が存在しているか否かを検出するのに利用できる。この開裂部位が次に開裂すると、検出可能な信号が発生し、また単一もしくは複数のオリゴヌクレオチドの一つ以上が標的核酸配列から解離して、鋳型のリサイクリングと信号の増幅を行うことができる。
【００３９】
本発明のオリゴヌクレオチドと方法の原理と作動は、図面と以下の説明によって一層十分に理解することができる。
【００４０】
本発明の少なくとも一つの実施態様を詳細に説明する前に、本発明は、下記説明に記載されかつ諸実施例に例示されている詳細事項に、その用途を限定されないと解すべきである。本発明は、他の実施態様を実施することができるかまたは各種の方式で実施することができる。また、本願に利用される語句と技術用語は、説明することを目的とするものであるから本発明を限定するとみなすべきではないと解すべきである。
【００４１】
用語「オリゴヌクレオチド」と「プローブ」および語句「オリゴヌクレオチドプローブ」は、本願で使用する場合、互いに交換して使用することができ、一つ以上の部分的二本鎖の立体配座を示すことができる一本鎖の核酸分子またはその分子の集合体を意味する。単一もしくは複数のこのような分子は、本願でさらに説明するように、一本鎖のもしくは二本鎖（適当な変性を行った後の）標的核酸配列が存在しているか否かを検出するために、本発明で使用することができる。
【００４２】
本願で使用される場合、用語「鋳型」または語句「標的核酸配列」は、メッセンジャーＲＮＡなどのような自然に一本鎖の形態であるか、またはＤＮＡなどのような一本鎖型に変性されている核酸鋳型を意味する。本発明の標的核酸配列は、粗製形態、部分的に精製された形態または精製された形態でもよく、そしてその起源によって各種の複雑度であってもよい。特異的標的核酸配列は、本願で使用する場合、単一ヌクレオチド、例えば点突然変異または複数のヌクレオチドだけ他の特異的標的核酸配列と異なってもよい。
【００４３】
語句「相補的または実質的に相補的」は、本願で使用する場合、温度とイオン強度の予め定められたハイブリッド形成条件下および／または鋳型の存在下、塩基対をつくることができる配列を意味する。「実質的に相補的」は、少なくとも５０％相補的、好ましくは少なくとも６０％相補的、より好ましくは少なくとも７０％相補的、さらに好ましくは少なくとも８０％相補的であることを意味し、９０％〜１００％相補的であることが有利である。
【００４４】
以下にさらに詳細に述べるように、本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体は、検出できるように、好ましくは、単一もしくは複数の検出部分で標識される。本発明の検出は、このような検出部分を単一もしくは複数のこのようなオリゴヌクレオチドに組みこむことなしに行うことができることは分かるであろうが、以下にさらに詳細に述べる。
【００４５】
以下のパラグラフは、従来技術が教示するオリゴヌクレオチドプローブが、以下にさらに強調してのべる特定の制限つきで本発明の教示にしたがって使用されることを述べているが、その制限は、信号の増幅および／またはバックグランド信号の減少によって標的核酸のはるかに優れた検出をもたらす。
【００４６】
したがって、本発明の一側面によって、標的核酸配列が試料中に存在しているか否かを検出するのに有用なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの集合体が提供される。本発明の一側面のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体は、標的核酸配列とハイブリッドを形成すると、該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体に固有の二重らせん構造を形成することができ、このことは、鋳型ハイブリッド形成の結果として形成された二重らせん構造が、該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体由来の配列だけを含有していることを意味する。
【００４７】
このように形成された二重らせん構造は、核酸開裂剤認識配列（部位）を含有し、その結果、この部位のその後の開裂は、例えば、検出可能な信号の発生によって検出することができる。好ましい条件と溶液および好ましい標的核酸配列／単一もしくは複数のオリゴヌクレオチドの比率などの詳細は、上記基準に一致する各種の特別なオリゴヌクレオチドに関連して次に述べる実施例の章を通じてさらに説明する。
【００４８】
本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体の典型的な立体配置は、第一領域と第二領域を含有している。第一領域の少なくとも一部および第二領域の少なくとも一部が各々、独立して、標的核酸配列の少なくとも一部と相補的である。すなわち、標的核酸配列の一部が、第一領域の少なくとも一部および第二領域の少なくとも一部と同時にハイブリッドを形成することができる。このように、第一領域の少なくとも一部および第二領域の少なくとも一部は、標的核酸配列の異なった一般に隣接するサブ領域とハイブリッドを形成する。
【００４９】
本発明のこの側面のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体は、第一領域と第二領域に、それぞれ直接に連結されているかまたは例えば１〜６個のヌクレオチド塩基のスペーサー領域を通じて、好ましくは共有リン酸ジエステル結合もしくはその類似結合によって連結されている第三領域と第四領域をさらに含有している。
【００５０】
第三領域と第四領域は、第一領域と第二領域が標的核酸配列とハイブリッドを形成すると、第三領域の少なくとも一部と第四領域の少なくとも一部がアニールして、その間に二重らせん構造を形成するように配置構成されている。この二重らせん構造は核酸開裂剤認識配列を含有し、この配列については、以下におよび後記実施例の章でより詳細に説明する。
【００５１】
前記認識配列が適当な核酸開裂剤によって開裂されると、第一領域と第二領域それぞれから、第三領域と第四領域のうちの少なくとも一方の少なくとも一部が分離する。
【００５２】
以下にさらに詳細に述べるように、この開裂と分離は、本発明にしたがって、実質的に該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体が標的核酸配列とハイブリッドを形成する場合にのみまたは好ましくは前記場合に起こるが、その特異的標的核酸配列の存在を検出するのに利用される。
【００５３】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体の第一領域と第二領域は、特異的な鋳型の核酸配列とのハイブリッド形成に関与しているので、これらの領域は、標的核酸配列を認識して、この配列にアニールするように合成されることは分かるであろう。それ故に、本発明の教示にしたがってプローブを合成する場合、第一と第二の領域は、検出すべく標的とされている特定の標的核酸配列にしたがって設計されねばならない。一方、第三と第四の領域は、固有の二重らせんと開裂剤認識配列の形成に関与しているので、これらの領域は一般に普遍的（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）であるから、本発明の多くの特異的オリゴヌクレオチドによって利用できる。しかし、その「普遍的な」第三と第四の領域は、標的特異的の第一と第二の領域とともに使用できない場合がある。例えば、そのような使用がエネルギー的に望ましくない場合、または二重らせん中に含まれている開裂剤認識配列が、標的とハイブリッドを形成するとき、第一領域および／または第二領域にも存在している場合である。かような環境下では、第三と第四の領域は適切に再設計しなければならない。
【００５４】
本発明の一実施態様によれば、そのオリゴヌクレオチド集合体は、二つのオリゴヌクレオチド分子を含有する二分子オリゴヌクレオチドであり、したがって、上記集合体の第一オリゴヌクレオチドは上記の第一と第三の領域を含有し、その結果さらに上記集合体の第二オリゴヌクレオチドは上記の第二と第四の領域を含有している。
【００５５】
本発明の他の実施態様では、単一のオリゴヌクレオチド分子を使用する。この場合、第三と第四の領域は好ましくは共有リン酸ジエステル結合によって連結され、その結果、第三領域の少なくとも一部と第四領域の少なくとも一部がアニールして上記二重らせんを形成するとき、ステムとループの構造が第三領域と第四領域によって形成される。
【００５６】
本発明の他の実施態様では、該オリゴヌクレオチドの第一領域と第二領域の両者は、第三領域と第四領域の少なくとも一部が第一領域および第二領域から分離すると、標的核酸配列から解離する。この場合、第三領域もしくは第四領域またはその両領域が開裂し続いて分離すると、第一領域および／または第二領域が標的核酸配列から解離する。この解離によって、第二の同一のオリゴヌクレオチド分子が、標的核酸配列とハイブリッドを形成して開裂と分離の同じプロセスをたどる。
【００５７】
第三領域と第四両域が結合されていない二分子プローブの場合、これら領域の第一領域と第二領域からの分離とその後の開裂は相互に依存していないことは分かるであろう。
【００５８】
これまでに説明してきた上記オリゴヌクレオチドプローブは、「対合プローブ−第一世代（ｐａｉｒｅｄ ｐｒｏｂｅｓ−Ｆｉｒｓｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」という項目の実施例３および「単一プローブ−第一世代」という項目の実施例６でさらに説明されその使用を例示されるが、構造と機能が、Ｈｏｇａｎらの米国特許第５４５１５０３号に記載されているオリゴヌクレオチドプローブに構造と機能が似ている。
【００５９】
これらオリゴヌクレオチドプローブの立体配置は、標的核酸配列を検出するのに利用できるが、いくつもの固有の制限があるという欠点をもっている。例えば信号発生が低くかつ鋳型と無関係の開裂と信号が発生する。
【００６０】
したがって、本発明の発明者らは、本発明を実施しながら、各種のオリゴヌクレオチドプローブの立体配置を利用して実験し、上記のおよび米国特許第５４５１５０３号に記載のオリゴヌクレオチドプローブに固有の制限を検討した。
【００６１】
下記実施例３−６でさらに説明するように、本発明の発明者らが実施した実験によって、（ｉ）鋳型と無関係の開裂を実質的に減らすことができ；（ｉｉ）反応次数を減らし；および（ｉｉｉ）鋳型のリサイクリングと信号の増幅を可能にする新規なプローブ立体配置が得られた。
【００６２】
したがって、本発明の現在好ましい側面によっておよび下記実施例の章の実施例６に具体的に述べられているように（「ループ化プローブ変異体（Ｌｏｏｐｅｄ ｐｒｏｂｅ ｖａｒｉａｎｔｓ）」および「ブロックされたプローブ（Ｂｌｏｃｋｅｄ ｐｒｏｂｅｓ）」の章、参照）、標的核酸配列とハイブリッドを形成しない場合、核酸開裂剤認識配列を欠いている第一二重らせん構造を形成するように配置構成され、一方ハイブリッド形成に続いて、核酸開裂剤認識配列を含有する第二二重らせん構造を形成する単一オリゴヌクレオチドまたは二分子オリゴヌクレオチドのプローブ（オリゴヌクレオチド系またはオリゴヌクレオチド集合体）が提供される。
【００６３】
本発明のこの側面のこの特徴は、標的配列とハイブリッドを形成した後、第一二重らせん構造が第二二重らせん構造よりエネルギー的に余り好ましくないように、プローブを設計することによって可能である。このことによって、第一二重らせん構造が、標的核酸配列が存在しないときにのみ形成されることが保証される。実施例６でさらに詳細に述べて例示するように、核酸開裂剤認識配列を欠いているこの第一二重らせん構造が生成すると、標的と無関係の二重らせんが発するバックグランド信号および例えば米国特許第５４５１５０３号に記載のプローブを使用するときに生じることがある開裂部位の生成が実質的に減少する。
【００６４】
下記実施例の章の実施例３−４でさらに詳細に述べるように、本発明の好ましい二分子オリゴヌクレオチドプローブは、その二分子プローブの第一オリゴヌクレオチドのメンバーの鋳型ハイブリッド形成が、好ましくはリサイクルされないアンカーもしくは永久アンカーとして働く前記二分子プローブの第二オリゴヌクレオチドのメンバーの先行する鋳型ハイブリッド形成に基づいているように配置構成される。
【００６５】
したがって、本発明の別の現在好ましい側面によって、そのオリゴヌクレオチドのメンバーの一方の標的に相補的な領域が、オリゴヌクレオチドの他方のメンバーが標的とハイブリッドを形成した後しかハイブリッドを形成できないように選択され、その結果、全反応次数が、シングルユニットによってもしくはほぼシングルユニットで低下する。このことについては、標的と安定してハイブリッドを形成するように選択されるオリゴヌクレオチドは標的とともにリサイクルされることが分かるであろう。それのさらなるハイブリッド形成／解離は他方のオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成／解離を維持するのに必要でないので、反応次数は低下し、その特異性は増大しそして発生する信号は増幅される。その上に、このような立体配置は、標的の再結合が原因の一本鎖標的の減損が著しく減少した。
【００６６】
本発明の好ましい実施態様で、前記二分子プローブは、オリゴヌクレオチドの両メンバーのハイブリッド形成がなされた後、二分子のオリゴヌクレオチドプローブの第一オリゴヌクレオチドメンバーだけが開裂剤（実施例３のＳｐｌｔＲＥとＭｏｄＲＥ／ＭｕｔＲＥ参照）によって開裂されるように設計される。この開裂がなされた結果、このオリゴヌクレオチドのメンバーだけが鋳型から解離し、他方の開裂されないオリゴヌクレオチドのメンバーは鋳型に固定されたままであるので、リサイクルされて反応次数が低下する。
【００６７】
好ましくは、この場合、開裂できないオリゴヌクレオチドメンバーの標的と相補的な領域としては、開裂可能なオリゴヌクレオチドのメンバーの標的と相補的な領域より融点が高くて、このメンバーを第一オリゴヌクレオチドのメンバーが解離した後、鋳型とハイブリッドを形成したままにする領域が選択される。
【００６８】
単一メンバーが開裂できるように、本発明の二分子オリゴヌクレオチドの集合体は、前記二重らせん構造の一部分が、標的のハイブリッド形成に参画していない開裂可能なオリゴヌクレオチドのメンバーの一部分の自己アニーリングによって形成されるように配置構成される（図１参照）。形成された二重らせん構造の一部分は、開裂剤認識配列の少なくとも一部分を含有し、そのため、前記自己アニーリングを形成する二分子オリゴヌクレオチド集合体のオリゴヌクレオチドだけを開裂できるが、他のオリゴヌクレオチドは先に記載されたものと類似のアンカーとして働く。この場合、開裂可能な二重らせんは、開裂剤によって開裂可能なヌクレオチド間結合のうち一つを置換するニック（ｎｉｃｋ）を有するように設計される。
【００６９】
あるいは、開裂できないオリゴヌクレオチドの開裂剤認識配列は、少なくとも一つの改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチド間結合を含有して前記二重らせんの所望のストランドの開裂をブロックする。
【００７０】
さらに、代わりに、オリゴヌクレオチドが適当な認識配列を含有している場合、二本鎖ＤＮＡの一本鎖ニッキング活性を特徴とするエンドヌクレアーゼ（完全なダブルニック制限活性と対照して）を利用できる。このようなエンドヌクレアーゼの例としては、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ が販売しているＮ． ＢｓｔＮＢＩ がある。
【００７１】
例えば、以下に列挙するいくつかの改質剤（ｍｏｄｉｆｉｃａｎｔ）はいずれも、オリゴヌクレオチド類の合成中または合成後に利用されて、特異的開裂剤によって認識されるが前記二重らせんの一方のストランドだけが開裂される開裂剤認識配列を構築することができる。エンドヌクレアーゼ開裂剤の場合、開裂できないストランドの認識配列は、その認識配列内に含まれている一つ以上のヌクレオチドのメチル化またはアシル化を行うことができ、その結果、特異的エンドヌクレアーゼが二本鎖認識配列を認識してその配列に結合するが、改変されていないストランドだけを開裂（ニック）する。
【００７２】
本発明の別の実施態様では、二分子オリゴヌクレオチドのプローブの反応次数は維持されるが、そのプローブのオリゴヌクレオチドのメンバーは、それらオリゴヌクレオチドのメンバー間またはそれらメンバーのいずれか一つと標的核酸配列の間の二分子相互作用のレベルを大きく低下させるように選択される。その結果、バックグランドのレベルは有意に低下しそして開裂後の鋳型のリサイクリングも達成されて、検出がはるかに改善されて特異的になる。
【００７３】
以下のパラグラフには本発明のいくつもの側面が述べられているが、特に、それらの側面は各々、（ｉ）反応次数を減らすことによる信号の増幅；（ｉｉ）鋳型のリサイクリングによる信号の増幅；および／または（ｉｉｉ）鋳型に無関係の開裂を阻止することによるバックグランドの減少、を提供する点で、従来技術の米国特許第５４５１５０３号とは明確に異なりかつこの従来技術を超えて明らかに有利である。
【００７４】
したがって、本発明の一側面によって、標的核酸配列が試料中に存在しているか否かを検出するのに有用なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体が提供される。本発明のこの側面のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体は第一領域と第二領域を含有している。第一領域の少なくとも一部分および第二領域の少なくとも一部分は各々、予め定められたハイブリッド形成条件下、標的核酸配列とハイブリッドを形成することができる。本発明のこの側面のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体は、さらに第三領域と第四領域を含有している。その第三領域と第四領域はそれぞれ第一領域と第二領域に連結されている。オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体の第一部分と第二部分としては、予め定められたハイブリッド条件下、それらの間に第一二重らせん構造体を形成できるものが選択される。予め定められた条件下で、それらの間に第一二重らせん構造を形成することができるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体の第一部分と第二部分は、それぞれ、好ましくは第三領域と第四領域から誘導される。いずれにしろ、本発明のこの側面のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体の第一、第二、第三および第四の領域は、予め定められたハイブリッド条件下、第一領域と第二領域が標的核酸配列とハイブリッドを形成すると、前記第一二重らせん構造が解離して、第三領域の一部分と第四領域の一部分がそれらの間に第二二重らせん構造を形成するように選択される。その第二二重らせん構造は、第一二重らせん構造には存在せず、そして開裂すると、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体が標的核酸配列とハイブリッドを形成していることを示し、したがって標的核酸が試料中に存在していることを示す核酸開裂剤認識配列を含有している。その結果、鋳型とは無関係の開裂と関連するバックグランドの信号が大きく低下する。本発明のこの側面の好ましい実施態様で、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体の第一、第二、第三および第四の領域は、さらに、核酸開裂剤認識配列が開裂した後、第一領域と第二領域が標的核酸配列から解離して、標的核酸配列をリサイクルしかつ信号を増幅することができる。
【００７５】
本発明の別の側面によって、標的核酸配列が試料中に存在しているか否かを検出するのに有用なオリゴヌクレオチド系が提供される。本発明のこの側面のオリゴヌクレオチド系は、少なくとも第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドを含有し、それらオリゴヌクレオチドは各々、予め定められたハイブリッド形成条件下、標的核酸配列とハイブリッドを形成することができる第一領域を含有している。第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドは各々、さらに第二領域を含有し、そして、ハイブリッドを形成すると、第一と第二のオリゴヌクレオチドの第二領域の少なくとも一部が、核酸開裂剤認識配列を含有する二重らせん構造を形成するので、第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの第二領域は、核酸開裂剤認識配列を認識する核酸開裂剤の存在下、第一オリゴヌクレオチドだけが核酸開裂剤によって開裂可能であるように選択される。この場合、第一オリゴヌクレオチドが存在しないときに、標的核酸配列とハイブリッドを形成するのに十分な安定性を有する第二オリゴヌクレオチドを選択すると、反応次数が低下して、信号生成の増大に寄与する。したがって、好ましくは、第一と第二のオリゴヌクレオチドの第一と第二の領域は、第一オリゴヌクレオチドが開裂したとき、第一オリゴヌクレオチドの第一領域は標的核酸配列から解離するように選択される。さらに好ましくは、第二オリゴヌクレオチドの第一領域は、予め定められたハイブリッド形成条件下、第一オリゴヌクレオチドが解離した後、第二オリゴヌクレオチドの第一領域が標的核酸配列とハイブリッドを形成したままなので、標的核酸配列を、第一オリゴヌクレオチドに対してリサイクルすることができるように選択される。
【００７６】
本発明のさらに追加の側面によって、標的核酸配列が試料中に存在しているか否かを検出するのに有用なオリゴヌクレオチド系が提供される。そのオリゴヌクレオチド系は少なくとも第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドを含有しており、その第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドは各々、標的核酸配列に相補的であるかまたは実質的に相補的である第一領域を含有し、そしてさらに第二領域を含有し、それら第二領域は、相補的であるかまたは実質的に相補的であり、かつそれらの間にアニーリングが行われると、核酸開裂剤認識配列を含有する二重らせん構造を形成し、そして、予め定められたハイブリッド形成条件下、第一オリゴヌクレオチドの第一領域は、第二オリゴヌクレオチドの第一領域が核酸標的配列と安定してハイブリッドを形成できるときだけ、標的核酸配列と安定してハイブリッドを形成することができ、その結果、反応次数が低下し、バックグランドの信号が減少しそして特異性が増大する。この場合、他のオリゴヌクレオチドを選択して、そのオリゴヌクレオチドを制限した後、鋳型が標的から放出されるようにすることによって、鋳型のリサイクリングを行うことができる。好ましくは、予め定められたハイブリッド形成条件下、第一と第二のオリゴヌクレオチドの第二領域は、さらにバックグランド信号を減らすように、それ自体互いに、実質的にハイブリッドを形成できない。さらに好ましくは、第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの第二領域は、核酸開裂剤認識配列を認識する核酸開裂剤の存在下、第一オリゴヌクレオチドだけがその核酸開裂剤によって開裂可能であるように選択される。第一と第二のオリゴヌクレオチドの第一領域と第二領域は、予め定められたハイブリッド形成条件下、第一オリゴヌクレオチドが開裂すると、第一オリゴヌクレオチドの第一領域が標的核酸配列から解離するように選択されると有利である。核酸開裂剤認識配列の一部を形成する、第二オリゴヌクレオチドの少なくとも一つのヌクレオチドまたはヌクレオチド間結合が、第二オリゴヌクレオチドが核酸開裂剤によって開裂されるのを阻止するため選択された改変されたかまたは類似のヌクレオチドまたはヌクレオチド間結合であることが一層有利である。任意に、前記二重らせん構造は、第一オリゴヌクレオチドの第二領域の一部分を自己アニールすることによって一部形成される。好ましくは、第一と第二のオリゴヌクレオチドの第二領域は、その核酸開裂剤認識配列が、核酸開裂剤によって開裂可能なヌクレオチド間結合を置換するニックを特徴とするように選択される。
【００７７】
本発明のさらに別の側面によって、標的核酸配列が試料中に存在しているか否かを検出するのに有用なオリゴヌクレオチド系が提供される。そのオリゴヌクレオチド系は少なくとも第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドを含有し、そしてそれらオリゴヌクレオチドは各々、標的核酸配列に相補的であるかまたは実質的に相補的である選択された第一領域を含有しかつさらに第二領域を含有し、それら第二領域は相補的であるかまたは実質的に相補的であり、そしてそれらの間にアニーリングが行われると核酸開裂剤認識配列を含有する二重らせん構造を形成するように選択され、その結果、予め定められたハイブリッド形成条件下、第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの第一領域は標的核酸配列と安定してハイブリッド形成することができ、かつ第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの第二領域は、第一オリゴヌクレオチド、第二オリゴヌクレオチドおよび標的核酸配列が同時にアニールされるときだけ、それら第二領域間に安定してハイブリッドを形成することができ、鋳型をリサイクルしかつバックグランド信号を減少させる。
【００７８】
本発明の一つの好ましい側面の標的核酸検出方法の一般原理を図１に例示する。
【００７９】
第一ステップ（Ａと標記してある）において、オリゴヌクレオチド系１２のオリゴヌクレオチド１３と１５を、予め定められたハイブリッド形成条件下、標的核酸配列１４とともにインキュベートする。オリゴヌクレオチド１３は、相互作用を行わない距離を超えて分離されると検出可能な信号を発生する蛍光体−消光体対１７を含有している。
【００８０】
第二ステップ（Ｂと標記してある）で、オリゴヌクレオチド１３と１５および標的１４の間にハイブリッドが形成する。このようなハイブリッド形成は、オリゴヌクレオチド１３と１５の各領域の配列と長さに応じて逐次または同時に行われる。例えば、オリゴヌクレオチド１５の領域１６と１８とオリゴヌクレオチド１３の領域２０と２２は、領域２０と標的１４のハイブリッド形成が、領域１６と標的１４の先行するハイブリッド形成によって決まるように選択することができる。
【００８１】
いずれにしろ、第三ステップ（Ｃで示してある）において、この側面で、オリゴヌクレオチド１３の領域２２の自己アニーリングによって一部分が形成されて一方のストランドにニック（２６で示してある）が形成されている開裂剤認識配列を有する二重らせん構造が開裂剤２４によって開裂される（以下にさらに説明する）。したがって、領域２２だけが開裂剤２４によって開裂され（２８で示してある）、領域２２の部分が放出され、続いて領域２０が標的１４から解離する。
【００８２】
上記開裂の結果、領域２２が領域２０から分離されて、蛍光体と消光体が分離され、検出可能な信号が生成する。
【００８３】
オリゴヌクレオチド１５は、開裂されずかつ標的１４とハイブリッドを形成したままであるから、標的１４とともにリサイクルして、本発明のこの側面の標的核酸検出法の反応次数を減らす。
【００８４】
図１に示すように、本発明の現在好ましい実施態様で、その側面の場合、すべての反応成分は、段階的に添加するのとは異なり予め混合される。いくつかの実施態様で、これを行うには、利用される制限酵素、例えばＢｓｔｂ１またはＴａｑ１の熱安定性が必要である。
【００８５】
したがって、本発明の上記側面は、標的配列を検出するのに有用で、かつ米国特許第５４５１５０３号に記載されているような従来技術のオリゴヌクレオチドプローブに固有の制限がないオリゴヌクレオチドのプローブまたは集合体を提供する。
【００８６】
本発明の一つの好ましい実施態様の開裂剤は化学薬剤である。
【００８７】
本発明の別の好ましい実施態様の開裂剤は、限定されないが、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼを含むヌクレアーゼである。好ましくは、そのヌクレアーゼは、オリゴヌクレアーゼと標的配列のハイブリッド形成のために利用される温度範囲で使用できるように、耐熱性であるものが選択される。
【００８８】
本発明の別の好ましい実施態様のヌクレアーゼは、例えばＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドによって形成される、認識配列を認識し開裂することができるエンドヌクレアーゼである。
【００８９】
上記認識配列は、一般に、少なくとも４塩基対の長さでかつ一般に８塩基対を超えない長さの回文配列である。より長いストレッチのヌクレオチドを認識するエンドヌクレアーゼまたは認識配列から離れて位置している部位を開裂するエンドヌクレアーゼも、本発明は利用することができる。通常、特定のエンドヌクレアーゼが特定の塩基対配列を認識し、その塩基対配列に結合し、そして使用される開裂剤および開裂剤認識配列の各ストランドを形成するヌクレオチドに応じて、二重らせん核酸配列の一方または両方のストランドを開裂する。
【００９０】
しかし、いくつものエンドヌクレアーゼは、利用されるエンドヌクレアーゼの状態または濃度によって変化する開裂特性を示すことは分かるであろう。この特性にはいわゆるエンドヌクレアーゼの「スター」活性が含まれており、最適下限の条件下で、いくつかのエンドヌクレアーゼは、そのエンドヌクレアーゼが一般的に開裂する特定の配列以外の配列を開裂する。したがって、エンドヌクレアーゼは注意深く選択しなければならないが、当業技術者はよく分かっているように、最適下限の／非推薦の条件が、同時に開裂、ハイブリッド形成および解離を起こさせるために時には好ましいことがある。
【００９１】
二重らせん構造を形成して、単一もしくは複数の標的核酸配列とハイブリッドを形成するときだけ開裂剤認識配列を形成するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体を設計するため、いくつものパラメータと検討事項を考慮しなければならないことは分かるであろう。第一に、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば一つのヌクレオチド程度配列が異なっているほぼ同一の標的を識別できるハイブリッド形成条件で、標的核酸配列とハイブリッドを形成できなければならない。したがって、例えば、一点突然変異を有する変異型遺伝子を識別し検出することができる。第二に、ハイブリッドを形成できるように十分に長いが、ステムが開裂したのち標的から解離しそして分子の全体の複雑度と望ましくない二次構造が生成する機会を最小限にするのに十分に短い、標的とハイブリッドを形成する領域を有するオリゴヌクレオチドを少なくともいくつか合成しなければならない。その上、標的特異的アームは開裂剤認識部位を含有していてはならない。第三に、二重らせん構造の形成に関与している領域は、単一のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド集合体中に、その二重らせん構造が、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体が標的核酸配列とハイブリッドを実質的に形成した後だけまたは好ましくはハイブリッドを形成した後に形成されるように設計されねばならない。さもないと、標的とハイブリッドを形成していないオリゴヌクレオチドが開裂されることによる強いバックグランド信号が生成する。さらに、前記開裂認識配列は、好ましい検定条件とステムの長さで選択されねばならない。その上に、ステムは標的特異的アームと相互作用を行ってはならない。これらのおよびその外の考慮は、さらに下記実施例の章で詳細に考察する。
【００９２】
本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体は、標的核酸配列とハイブリッドを形成することができ、かつ少なくとも一つのストランドに、開裂剤によって開裂可能な開裂剤認識配列を形成することができるかぎり、ＤＮＡ、ＲＮＡもしくはＰＮＡまたはそれらのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは修飾体でよい。これらオリゴヌクレオチドは、本発明の教示にしたがって検出オリゴヌクレオチドとして機能できる限り、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格が修飾されてもよくかつ他の付加基または標識を含有していてもよい。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリッドを形成しない部分を、ハイブリッドを形成する部分の間に介在させてもよい。
【００９３】
したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは天然に存在するヌクレオチドとハイブリッドを形成できるヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含有し、さらにハイブリッドを形成しない部分を含んでいることもある。
【００９４】
例えば、これらオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体は、限定されないが例えば以下のような修飾された塩基部分を少なくとも一つ含有していてもよい。すなわち、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５′−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンチルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗおよび２，６−ジアミノプリンである。
【００９５】
本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体中に取りこむことができる修飾糖部分の例としては、限定されないが、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースがある。
【００９６】
本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体中に取りこむことができる修飾リン酸骨格の例としては、限定されないがホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステルおよびホルムアセタールまたはその類似体がある。
【００９７】
本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体は、当該技術分野で知られている標準の方法、例えば、自動ＤＮＡ合成器（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ などが市販している）を使用するポリヌクレオチドのデノボ化学合成法および標準のホスホロアミダイト化学法によって誘導することができる。
【００９８】
オリゴヌクレオチドの好ましい合成法は、当該技術分野で知られている方法で自動ＤＮＡ合成器を使用して実施される。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはＳｔｅｉｎ らの方法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６巻３２０９〜３２２１頁１９８８年）で合成することができ、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは制御された多孔質ガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎ ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５巻７４４８〜７４５１頁１９８８年）などを使用して製造することができる。望ましいオリゴヌクレオチドが合成されたならば、当該技術分野で知られている方法によって、そのオリゴヌクレオチドが合成された固体支持体から開裂され次いで処理されて、存在している保護基が除去される。そのオリゴヌクレオチドは次に、抽出、ゲル精製法およびカラムクロマトグラフィを含む当該技術分野で知られている方法で精製することができる。次いで、合成されたオリゴヌクレオチドの濃度は、当該技術分野で周知の方法で変えることができる。
【００９９】
本発明のオリゴヌクレオチド類は、合成後に固体支持体に連結するかまたはオリゴヌクレオチドを適当な固体支持体に直接合成することによって固体支持体に連結することもできることは分かるであろう。オリゴヌクレオチドは、固体支持体に連結されるとき、好ましくは、連結されたオリゴヌクレオチドまたは連結されたオリゴヌクレオチド集合体が空間的制限を受けることなく上記のように機能できるように、これらオリゴヌクレオチドを、標的核酸配列とハイブリッドを形成して固有の二重らせん構造を形成することに限定できるスペーサを有していることは分かるであろう。
【０１００】
すでに述べたように、本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体は好ましくは、それらの単一もしくは複数の領域が分離するのを検出できる方式で、少なくとも一つの検出部分が連結されている。
【０１０１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドを化学合成中に構成成分で標識してもよく、またはその標識は当該技術分野で公知の方法で合成後に結合させてもよい。
【０１０２】
本発明の好ましい一実施態様の検出部分は、直接検出できる検出部分または間接的に検出できる検出部分である。直接検出することができる検出部分の例としては例えば、放射性イオン例えば３２Ｐ，３５Ｓ，３Ｈなどまたは蛍光体がある（蛍光体の例は以下に列挙する）。この場合、開裂は、例えばカラムクロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィーまたはゲル電気泳動法を含む各種分画法すなわちクロマトグラフィーおよび電気泳動法によって開裂生成物の生成と蓄積を単に監視することによって検出することができる。
【０１０３】
間接的に検出可能な検出部分の例としては、例えば、限定されないが、抗体、抗原、エピトープ、リガンド、受容体、イオン、キレーターなど、結合しおよび／または化学的に相互に作用する対のメンバーがある。これら検出部分のタイプも、クロマトグラフィまたは電気泳動法を使用して検出することができるが、特別の化学反応、例えば酵素反応などが行われるときだけ、検出可能な信号を生成する。このような検出部分は、好ましくは、検出反応の変性ステップとハイブリッド形成ステップに耐えるように熱に安定なものが選択される。例えば、オリゴヌクレオチドは、ハプテン、または標識されたアビジン分子を結合してもよいビオチンなどの分子、または標識された抗ジゴキシゲニン抗体を結合してもよいジゴキシゲニンと共有結合したヌクレオチドを取りこむことによって間接的に標識してもよい。下記実施例の章にさらに例示するように、本発明を実施する際、ビオチンで標識されたオリゴヌクレオチドは、通常のゲル電気泳動法を使用することによって、ストレプトアビジンを接合された酵素によって検出された。
【０１０４】
その上に、間接的に検出可能な部分は、アフィニティーカラムにも使用することができ、そのカラムに捕捉された、ハイブリッドを形成したオリゴヌクレオチド−標的配列だけが開裂によって放出される。このようなオリゴヌクレオチドは、上記のように合成中または合成後に標識される。
【０１０５】
本発明の好ましい実施態様のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体も、少なくとも一対の共鳴して相互に作用する検出部分で標識してもよい。例えば、一対の第一検出部分と第二検出部分は各々、開裂認識配列に隣接するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体に連結してもよく、その結果、認識配列が開裂剤によって開裂されると、これらの部分の分離が起こる。これらの検出部分は、それら部分の少なくとも一方が他方の検出部分から相互に作用しない距離まで隔離されたときに、検出可能な信号を生成できるように選択される。
【０１０６】
本発明を実施する際に使用できる、検出部分の共鳴して相互に作用する対の例としては、限定されないが、蛍光体と消光体および他のタイプの蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対がある（参考のため、例えば「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．」２４６巻１３章３００頁１９９５年のＰａｕｌ Ｒ．Ｓｅｌｖｉｎの論文「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ」；およびＲｉｃｈａｒｄ Ｐ． Ｈａｕｇｌａｎｄ著「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ」第６版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓを参照）。蛍光共鳴エネルギー移動に利用できる分子の具体例は以下に列挙する。
【０１０７】
オリゴヌクレオチドプローブに連結される際の、一対の第一検出部分と第二検出部分の間の最適距離は、第一部分の発光が第二部分によって吸収される距離である。この最適距離は、使用される特定の部分によって変化し、フォルスター半径（Ｆｏｒｓｔｅｒ Ｒａｄｉｕｓ）によって定義される。フォルスター半径（Ｒｏ）は、励起されたドナー分子の５０％を消光体で消光できるドナーとアクセプター間の距離である。Ｒｏは与えられたＦＲＥＴ対について定義することができ、かつＦＲＥＴで標識されたプローブを指摘するガイドラインとして使用できる。
【０１０８】
当業技術者は、当該技術分野で公知の分光測光法を利用して、どの発蛍光団が適切なドナー−アクセプターＦＲＥＴ対をつくるかを容易に決定することができる。例えばＦＡＭ（最大発光波長が５２５ｎｍ）が、ＦＲＥＴ対中で、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸおよびＲ６Ｇ（これらはすべて最大励起波長が５１４ｎｍ）に対して適切なドナーである。使用できる部分の追加の例としては、限定されないが、４−アセトアミド−４′−イソチオシアナトスチルベン−２，２′ジスルホン酸アクリジンおよび誘導体があり、例えばアクリジン、アクリジンイソチオシアネート、５−（２′−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−（３−ビニルスルホニル）フェニル−ナフタルイミド−３，５ジスルホネート（Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ ＶＳ）、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミドとＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ；クマリンと誘導体、例えばクマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマラン１５１）、シアノシン、４′，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、５′，５″−ジブロモピロガロールスルホンフタレイン（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ Ｒｅｄ）、７−ジエチルアミノ−３−（４′−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン、ジエチレントリアミンペンタアセテート、４，４′−ジイソチオシアナトジヒドロースチルベン−２，２′−ジスルホン酸、４，４′−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２′−ジスルホン酸、５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）、４−（４′−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）および４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４′−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体、例えばエオシンとエオシンイソチオシアネート；エリトロシンと誘導体、例えばエリトロシンＢとエリトロシンイソチオシアネートエチジウム；フルオロセインと誘導体、例えば５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２′，７′−ジメトキシ−４′，５′−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）、フルオレセアミン（ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ）、ＩＲ１４４、ＩＲ１４４６、Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎ イソチオシアネート、４−メチルウンベリフェロン、オルトクレゾールフタレイン、ニトロチロシン、パラローザリン、Ｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ、Ｂ−フィコエリトリンおよびｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体、例えばピレン、ピレンブチレート、スクシンイミジル１−ピレンブチレートおよびＲｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ ４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ ＲＴ， Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ ３Ｂ−Ａ）；ローダミンおよび誘導体、例えば６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダ��ン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１、（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リポフラビン、ロゾール酸およびテルビウムキレート誘導体がある。
【０１０９】
オリゴヌクレオチドは好ましくは合成中に修飾されて、修飾されたＴ塩基が、Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６ ｄＴ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を利用して指定の位置に導入され、そして第一級アミノ基が、Ｊｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２巻４３４７〜４３５１頁１９９５年に記載されているように、前記修飾されたＴ塩基に取りこまれる。これらの修飾法は、その後、オリゴヌクレオチドの指定位置に蛍光色素を取りこむのに利用できる。
【０１１０】
開裂によって生成した分離生成物を検出するため、単一の検出部分または一対の検出部分を使用することは本発明にとって好ましいが、このような検出は、かような部分によって標識されていないオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド集合体にも行うことができることは分かるであろう。この場合、生成した開裂生成物は、ＨＰＬＣなどの各種のクロマトグラフィー法または電気泳動法によって特異的に検出することができる。
【０１１１】
したがって、本発明は、核酸標的を検出する方法に有用なオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド集合体を提供するものである。本発明のオリゴヌクレオチドは、検出可能な信号を生成した後、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその一部分が標的核酸から解離する点で、従来技術の設計を超えて特に有利である。この解離によって、追加のオリゴヌクレオチドに、標的とハイブリッドを形成させ次いで追加の検出可能な信号を生成することができる。このように、過剰量のオリゴヌクレオチドが使用されると、標的をリサイクルすることができ、信号が増幅される。
【０１１２】
その上に、上記のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド集合体は、標的とは無関係の開裂に関連するバックグランド信号を実質的に減らす点で従来技術の設計より有利である。
さらに、信号の制限と生成は標的ポリヌクレオチドのタイプおよび配列と無関係であるから、本発明のオリゴヌクレオチドプローブはそれれらを合成しやすくしかつ利用しやすくする普遍的な構造を開裂領域に含めることができる。標的に無関係の開裂のさらなる利点は、本発明のプローブがＤＮＡとＲＮＡの標的配列の両者を検出するのに使用できることである。
【０１１３】
結局、本発明は、等温方式であるから、容易でかつ安価な方式によって標的配列を容易に検出できるようにする。
【０１１４】
本発明の追加の目的、利点および新規な特徴は、本発明を限定するものではない下記実施例を試験すると、当業技術者には明らかになるであろう。さらに、さきに詳述されかつ本願の特許請求の範囲の章に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記諸実施例で実験によって支持されている。
【０１１５】
実施例
上記説明とともに、本発明を限定することなく例示する以下の実施例を、ここで参照する。
【０１１６】
本明細書で使用される用語および本発明で利用される実験室の方法には、一般に、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡの方法が含まれている。このような方法は文献に綿密に説明されている（例えば、以下の諸文献：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ卷 １９９４年；Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ卷 １９９４年；Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ卷 １９９４年；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ 」１９８４年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１９８５年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎおよびＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」１９８４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」１９８６年；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ＣｅｌｌｓおよびＥｎｚｙｍｅｓ」、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８６年；Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．著「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」１９８４年；および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７卷 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ参照）。
【０１１７】
実施例１
材料と一般的方法
オリゴヌクレオチド：
注意深く設計した後、下記オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド集合体を、イスラエルのＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｌｔｄ．またはフランスのＧｅｎｓｅｔから入手した。これらオリゴヌクレオチドの、異なる検定条件下での構造と熱力学的安定性を、Ｇｅｎｅ ｒｕｎｎｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ， ｖｅｒｓｉｏｎ ３．００を利用して予測した。合成しそして本発明を実施して試験したすべてのオリゴヌクレオチドの二次構造と特徴を図２に要約してある。
【０１１８】
ＰＣＲ反応：
ＰＣＲ反応は、Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ ＰＴＣ−１００（商標）（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）を使用して行った。そのＰＣＲ反応で鋳型として利用したＤＮＡは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ、ＡＴＣＣ株ＡＤ１６９）に感染させたヒト胚線維芽（ＨＥＦ）細胞の全細胞溶解物から調製した。
【０１１９】
制限エンドヌクレアーゼとキャリヤーＤＮＡ：
鋳型ＤＮＡとオリゴヌクレオチドプローブの開裂に用いられる制限酵素は米国のＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．から購入した。キャリヤーＤＮＡの製品（ｔＲＮＡ、サケ精子のＤＮＡおよびヒト胎盤ＤＮＡ）はＳｉｇｍａ Ｉｓｒａｅｌ，Ｌｔｄ．から購入した。
ハイブリッド形成と開裂の検定：
４４℃〜６６℃の温度範囲で実施される比較ハイブリッド形成検定は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ／ｇｒａｄｉｅｎｔ ９６ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｃｙｃｌｅｒで実施した。
【０１２０】
５０〜２００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ　トリス−ＨＣｌの存在下、ＣＭＶ−ＤＮＡを一種もしくは複数種のプローブとともにインキュベートした。反応はｐＨ７．８または８．５で、最終容積２５μｌにて実施した。塩類の濃度、一種もしくは複数種のオリゴヌクレオチドプローブ／標的ＤＮＡのモル比および検定温度は、以下にさらに詳細に述べるように各検定の特定の要件にしたがって変えた。
【０１２１】
一種または複数種のプローブのＣＭＶ依存性開裂を確認するために、制限酵素も添加される。制限反応は、ＥＤＴＡを含有するゲル負荷緩衝剤を用いて停止させ、電気泳動を行うまで４℃で保管した。オリゴヌクレオチドプローブのＣＭＶとは無関係の開裂（バックグランド開裂）はＣＭＶ−ＤＮＡなしで実施した。ＣＭＶに無関係の開裂の追加の対照として、オリゴヌクレオチドプローブの酵素消化を、関連のないＰＣＲ産物、ｔＲＮＡ、サケ精子ＤＮＡまたはヒト胎盤ＤＮＡの存在下で試みた。プローブのＤＮＡ依存性開裂は、これらの陰性対照実験では検出されなかった。最大ハイブリッド形成効率の確認を、酵素なしで、非変性ゲル電気泳動法（ｎｏｎ−ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を利用して実施した。ハイブリッド形成のストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）と酵素活性の両者に作用させるため、塩の濃度を変えた。
【０１２２】
４４℃〜６６℃の範囲内で選択した温度で検定を実施した。一般に、対合プローブ（図３ａ）およびループ化プローブ（図３ｂ）について示したように、検定の温度を次のように選択した。（ｉ）標的依存性ステム形成（ｔａｒｇｅｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｔｅｍ−ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）をさせるため、オリゴヌクレオチドステム（二重らせん形成領域）のＴｍより５〜３０℃上の温度であって好ましくは１０〜１５℃上の温度；（ｉｉ）プローブを酵素による開裂によって標的核酸から解離させるため、オリゴヌクレオチドプローブの標的特異的アーム（標的ＤＮＡハイブリッド形成領域）各々のＴｍより１０℃下から２５℃上までの温度、好ましくは個々の標的特異的アームのＴｍより５〜１０℃上の温度；（ｉｉｉ）標的核酸配列の存在下、ハイブリッド形成を促進するため、全長ハイブリッドのＴｍより０〜４０℃下から５℃上までの温度、好ましくは１０〜２０℃低い温度；および（ｉｖ）３０〜１００％の酵素活性を達成するため、制限酵素の最適温度より２５℃下から１０℃上までの温度を選択した。
【０１２３】
検出：
反応生成物を、未変性のポリアクリルアミドゲルおよび尿素を含有する（変性）ポリアクリルアミドゲルのゲル電気泳動法で分析した。ゲル分析は、Ｓｅｒｖａ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ＧｍｂＨから購入したポリアクリルアミド（カタログ番号１０６８０）を使用するＸｃｅｌｌ（商標）Ｍｉｎｉ−ｃｅｌｌ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｐｐａｒａｔｕｓを使用して行った。サザーンブロッティングを、ブロッティングモジュールと使い捨てプラスチック製カセット（Ｎｏｖｅｘ、米国）およびＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋またはＮＸナイロンの膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国）を使用して実施した。
【０１２４】
一本鎖コンファーメーション（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）を確認するため、試料をゲルに負荷する前に沸騰させ、そして７Ｍの尿素を前記ゲルとゲル負荷緩衝液の両方に添加した。ハイブリッドと二次構造を確認するため、未変性の電気泳動条件を利用した。次にゲルをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋またはＮＸナイロン膜上に移し、ＤＮＡを、前記膜に、ＵＶ照射によって固定化した。これらの膜を、ストレプトアビジン接合アルカリホスファターゼとともにインキュベートし、次に、そのビオチニル化反応物を、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質を使用して視覚化した。
【０１２５】
標的核酸配列：
専用のハイブリッド形成可能のプローブを、標的核酸配列を検出させるために本発明の教示にしたがって調製すれば、標的核酸配列を検出できることは分かるであろう。
【０１２６】
ＣＭＶ−ＤＮＡの任意に選ばれた領域のホモログを、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用してＮＣＢＩデータベースで検出した。相同配列を、ヒト、病原体および他の生物体を含む各種生物体内に検出した。その最も長い配列は１７個の塩基対を含有していた。最高度の相同性をＣＭＶ−ＤＮＡと共有しているＣＭＶ−相同配列の融点（Ｔｍ）は５０℃であった。標的核酸と相補的な本発明のオリゴヌクレオチドの領域（すなわちアーム）を、上記ＣＭＶ相同配列に一部分だけ相同の配列を含むように合成した。これによって、オリゴヌクレオチドプローブの各アームは、これらの非ＣＭＶ配列とハイブリッドを形成したとき、Ｔｍが低いことが保証される。さらに、これら二つの標的特異的アームが各々、Ｔｍ値が５０℃を超えるように設計した。反応温度は５０℃を超えているので、標的ポリヌクレオチド配列と安定なハイブリッドを形成できるのは、標的特異的アームだけではない。これら二つのアームをともに使用した場合のＴｍ値は各アームだけのＴｍより高くかつ反応温度より高いので、二本鎖ＣＭＶ　ＤＮＡ配列とハイブリッドを形成するには両方のアームが必要である。したがって、非ＣＭＶ−ＤＮＡの配列に一部分だけ相同のプローブによるその非ＣＭＶ−ＤＮＡの認識は、上記検定条件下、ほとんど起こりそうもない。実際に、ヒト胎盤ＤＮＡまたはサケ精子ＤＮＡを、ＣＭＶ−ＤＮＡの代わりに対照標的ＤＮＡとして使用したとき、プローブと対照ＤＮＡのハイブリッド形成は検出されなかったか（対合プローブ）またはわずかに検出された（ループ化プローブ）が、両方の場合、ＣＭＶ−ＤＮＡとこれらプローブのハイブリッド形成またはＤＮＡ依存性プローブ開裂は実質的に影響を受けなかった。
【０１２７】
実施例２
標的核酸
ＣＭＶ−ＤＮＡの製剤：
ＣＭＶゲノム（ＶＲＬ受託番号Ｘ１７４０３）由来の２６３個塩基対のフラグメント（配列番号：１）を、標的ＤＮＡ配列として使用される各種ＣＭＶ−ＤＮＡ製剤（図４）に用いる鋳型として使用した。これらの各種製剤の主な特徴を表１に列挙し、さらに以下に詳述する。
【０１２８】
ＰＣＲで増幅された二本鎖ＣＭＶ−ＤＮＡ（ｐ．ＣＭＶ−２６３．ｄｓ）：この独特のＣＭＶフラグメントを、ＰＣＲ鋳型としてのＣＭＶ感染ＨＥＦ細胞の全細胞溶解物由来のＤＮＡ製剤とともに、５′−ＡＧＡＣＣＴＴＣＡＴＧＣＡＧＡＴＣＴＣＣ−３′（センスＣＭＶ−ＰＣＲプライマー、配列番号：２）をセンスプライマーとして使用しかつ５′−ＧＧＴＧＣＴＣＡＣＧＣＡＣＡＴＴＧＡＴＣ−３′（アンチセンスＣＭＶ−ＰＣＲプライマー、配列番号：３）をアンチセンスプライマーとして使用して増幅した。このＰＣＲ反応には、９４℃で５分間の第一変性ステップ、これに続く９４℃で１分間；５８℃で３０秒間；７２℃で３０秒間および７２℃で５分間の最終伸長ステップの３０サイクルが含まれていた。
【０１２９】
【表１】
2004512813.tif 000002
【０１３０】
ＰＣＲで増幅された一本鎖アンチセンスＣＭＶ−ＤＮＡ（ｐ．ＣＭＶ−２６３．ｓｓ）：このアンチセンスストランドは、二本鎖ＤＮＡを増幅するのに使用したのと同じＰＣＲプログラム、鋳型およびプライマーを使って増幅した。但し、アンチセンスプライマーはセンスプライマーの２０倍を添加しかつＰＣＲプログラムを４０サイクル実行した。最終のＰＣＲ産物を一本鎖ＣＭＶアンチセンスストランド（２６３ｂｐ）で強化したが、二本鎖ＤＮＡ（２６３ｂｐ）も含有していた。
【０１３１】
開裂されたＰＣＲ増幅二本鎖ＣＭＶ−ＤＮＡ（ｐ．ＣＭＶ−１，２．ｓｔ，２．ｌｇ．ｄｓ）：図４に示すように、ＰＣＲ増幅二本鎖ＣＭＶフラグメント（２６３ｂｐ）を、ＤｄｅＩ（製剤３）、ＨａｅＩＩＩ＋Ｆｎｕ４ＨＩ（製剤４）またはＡｆｌＩＩ＋ＨａｅＩＩＩ（製剤４）を使って消化して、各種オリゴヌクレオチドプローブのアームによってハイブリッドを形成できる的確な配列と適合する制限フラグメントをつくった。これらのＣＭＶ制限フラグメント（５０，３５および６１ｂｐ）は前記２６３ｂｐのＰＣＲ産物よりかなり短いので、これら各種のオリゴヌクレオチドプローブは、ハイブリッドを形成するため、アンチセンスＣＭＶストランドより、未変性のＣＭＶセンスストランドを求めて競合し、その結果、二本鎖ＣＭＶ−ＤＮＡの自己アニーリングが防止された。
【０１３２】
合成された一本鎖ＣＭＶ−ＤＮＡと二本鎖ＣＭＶ−ＤＮＡ（センス／アンチセンスＣＭＶ−２ｓｔ．およびｓｙｎ．ＣＭＶ−２ｓｔ．ｄｓ）：二種類の相補的一本鎖ＣＭＶ−ＤＮＡフラグメントを化学的に合成した。合成のビオチニル化センスストランド（配列番号：８）と合成の相補的なビオチニル化されていないアンチセンスストランド（配列番号：９）を等モル濃度で添加して、合成の二本鎖ＣＭＶフラグメント（配列番号：１０）を得た。このような合成の二本鎖ＤＮＡ配列は、大部分のプローブのアームの大きさに適合するように合成した。これら合成ストランド各々の的確な濃度は分かっているので、反応のための定量測定値を決定することができる。さらに、ビオチニル化されていないアンチセンスストランドは、二本鎖ＣＭＶ−ＤＮＡの二つのストランドの自己アニーリングによって導入される複雑さが原因でないから、プローブ−ＤＮＡのハイブリッド形成を改善するため別個に使用できる。さらに、そのビオチニル化センスストランドによって、二本鎖ＣＭＶ−ＤＮＡの二つのストランドの自己アニーリングによって反応にもたらされる複雑を監視できるようになった。
【０１３３】
酵素で消化したウイルス／ヒトのＤＮＡ混合物（ｇ．ＣＭＶ−１，２．ｓｔ，２ｌｇ）：ＣＭＶに感染したヒト胚線維芽（ＨＥＦ）細胞の全細胞溶解物からのＤＮＡ製剤を、ＤｄｅＩ，ＨａｅＩＩＩ＋Ｆｎｕ４ＨＩまたはＨａｅＩ＋ＡｆｌＩＩによって完全に消化した。
【０１３４】
五種の主要カテゴリーのオリゴヌクレオチドプローブを、本発明を実施中に設計して研究してきたが、それらは対合プローブ、二価プローブ、単一プローブ、ブロックされたプローブおよびＭｏｄＲＥ／ＭｕｔＲｅプローブと呼ぶ。図２に、これらプローブのカテゴリーの主な特徴を要約してある。
【０１３５】
実施例３
二分子対合プローブ
対合プローブ−第一世代：対合オリゴヌクレオチドプローブ（二分子オリゴヌクレオチド集合体）において、その対のオリゴヌクレオチドのメンバーは、標的配列の部分を特異的に認識するように設計されているアームを含有している。しかし各アームは、好ましくは、それ自体に、標的配列と安定なハイブリッドを形成しないよう十分に短く選択される。前記対のオリゴヌクレオチドメンバー両者のアームが標的ＤＮＡと同時にハイブリッドを形成すると、二つのオリゴヌクレオチドのメンバー間に二本鎖ステム（１１−１８ｂｐの長さ）を形成させる。このステムは、両オリゴヌクレオチドメンバーのアームと標的ＤＮＡの間のハイブリッド形成を安定化させるのに不可欠である。さらにこのステムは、ステム構造が生成した結果、形成される開裂可能な制限部位を提供するように設計される。その詳細は以下に詳述する。
【０１３６】
対合プローブのＣＭＶ−ＤＮＡとのハイブリッド形成に対するステムとアームの領域の作用：三つの異なる対合プローブ（図５ｂ、５ｃおよび５ｅ（対１と２およびＳｐｌｔＲＥそれぞれ、表２））の両面バー（その一方がビオチニル化されている）の１ピコモル（ｐｍ）、または異なる対合プローブ［図５ａ（対１と２のビオチニル化オリゴヌクレオチドメンバー、表２）および図５ｄ（ＳｐｌｔＲＥのビオチニル化オリゴヌクレオチドメンバー、表２）］の１ピコモル（ｐｍ）、ならびに５００フェムトモル（ｆｍ）の二本鎖ＣＭＶ−ＤＮＡ（図５ａ−ｃの場合はｐ．ＣＭＶ−１．ｄｓ、図５ｄ−ｅの場合はｐ．ＣＭＶ−２．ｌｇ．、上記表１参照）を９６ウェルのプレートに加えた。ハイブリッド形成検定を、２００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ＝８．５で、最終容積２５μｌにて実施した。反応混合物を鉱油で覆い、次いでＲｏｂｏｃｙｃｌｅｒ／ｇｒａｄｉｅｎｔ ９６ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で、９５℃にて１０分間加熱してストランドを分離させた。次にこれらプレートを温度勾配ブロックに移し、そこでこれらプレートの各カラムを、４４℃で出発し２℃ずつ昇温し６６℃で終わる異なる温度でインキュベートした。１ｈｒインキュベートした後、各試料から１０μｌずつ採取して１２％ポリアクリルアミド未変性ゲルで分析した。ビオチニル化したコンフォーマント（ｃｏｎｆｏｒｍａｎｔ）を、実施例１で述べたのと同様にして視覚化した。その試験結果を図５ａ−ｅに示す。
【０１３７】
図５ａ−ｅに明確に示されているように、各対合プローブとＣＭＶ−ＤＮＡのハイブリッド形成（ゆっくりと移動するバンドによって明白である）は、前記対のオリゴヌクレオチドの両方のメンバーが反応混合物中に存在していることに依存している。その対合オリゴヌクレオチドメンバーが存在しない場合、ビオチニル化オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成は、その標的特異的アームのＴｍが反応温度よりはるかに高くても観察されない（例えば図５ａと５ｄ）。ビオチニル化されていないオリゴヌクレオチドのメンバーを添加すると（図５ｂ，５ｃおよび５ｅ）、ハイブリッド形成が観察される。このことは、ステムの形成が、対合プローブのオリゴヌクレオチドメンバーがＣＭＶ−ＤＮＡとハイブリッドを形成するのに重要であることを示唆している。さらに、標的特異的アームのＴｍは一定に保持されていたが、ステム領域のＴｍは５８℃（図５ｂ）から４２℃（図５ｃ）まで下げたオリゴヌクレオチド対の場合、高温におけるハイブリッド形成の効率がかなり低いことが観察された。さらに、ビオチニル化されていない標的特異的アームのＴｍを６１℃（図５ｂ−ｃ）から８７℃（図５ｅ）まで上げると、低いステムのＴｍを補償して、ステムのＴｍ値が１２℃と低くてもハイブリッドを形成できることが観察された。
【０１３８】
【表２】
2004512813.tif 000003
【０１３９】
異なる温度における各種対合プローブの開裂の効率：表２に列挙した対合プローブ類１〜４の各対合プローブのステムの構造は、二つの制限部位を含むように設計した。一方の部位はＢｓｔＢＩに対する部位であり、他方の部位はＴａｑＩに対する部位である。下記表３に、前記表２に示す対合プローブ１〜４の、異なる温度におけるこれら酵素による開裂の効率を要約して示す。明らかに分かるように、制限酵素ＢｓｔＢ１とＴａｑＩの開裂効率は、ステムが長くなるにつれて増大する。ステム領域が長すぎると、鋳型とは無関係のステムが生成するため特異性が失われる。しかし、反応温度を上げると、ステムの安定化が再び、対合プローブとＣＭＶ−ＤＮＡの鋳型とのハイブリッド形成によって決まり、鋳型に無関係の開裂が減少する。したがって、ステム領域が短いプローブを設計すると、開裂は低温ではＣＭＶ依存性であり、酵素による開裂に対して最適の温度の６５℃まで温度を上げると、これら対合プローブに対するステムの形成が阻害されて、開裂は全く観察されない。表３は、標的特異的アームの長さが重要であることも立証している。対２と対３は同じステムを有しているが、対２は対３よりより効率的に開裂されることが分かるであろう。これについて説明できることは、対２の短い方のアームが開裂の後、ＣＭＶ−ＤＮＡからより容易に解離し、その結果、標的をより良好にリサイクルすることができて、高比率の無傷のプローブがその開裂された形態に変換されるということである。
【０１４０】
【表３】
2004512813.tif 000004
【０１４１】
図６は、標的特異的アームの長さが重要であることを立証している。対合プローブ２，３または両者を、それぞれ１００ｎＭの濃度で、約１００ｎｍの一本鎖強化ＣＭＶ−ＤＮＡ（２６３ｂｐ）あり（＋）またはなし（−）でインキュベートした。最初のハイブリッド形成ステップは、容積３０μｌで、ｐＨ７．８、６０℃にて１５分間実施した。この最初のハイブリッド形成ステップに続いて０．１７単位／μｌのＢｓｔＢＩを各試験管に添加して、開裂を２ｈｒ続けさせた。８μｌの部分を、１５％アクリルアミド−尿素ゲルで分析した。ビオチニル化フラグメントを、前記実施例１で述べたのと同様にして目視可能にした。対２と３のステムとアームの長さ（ｂｐ）とＴｍ（℃）は上記表３に列挙してある。
【０１４２】
図６から分かるように、対２はＣＭＶ−ＤＮＡの存在下で開裂された（レーン２）が、対３の開裂の程度ははるかに小さかった（レーン４）。しかし、対３の存在下、対２の開裂はブロックされた（レーン６）。したがって、対２の鋳型に対する到達性（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）は対３によって阻害されるようである。対３は、そのＣＭＶ特異的アームの配列が長いため、対２と標的ＤＮＡとのハイブリッド形成を阻害する。その上に、対３の開裂がプローブ−ＣＭＶ−ＤＮＡハイブリッド複合体の解離を起こさせなかったので、関連するＤＮＡのリサイクリングは起こらなかった。このハイブリッドは酵素による開裂の後でも無傷のままに保持されたので、対２の前記ＤＮＡに対する到達性は阻害された。したがって、鋳型のリサイクリングおよび信号の増幅も、本発明の教示にしたがって設計された対合プローブによって明確に立証された。
【０１４３】
対合プローブ−第二世代：第二世代の対合プローブの設計は、ステムの形成をステムの解離より優先するように反応を導くことによって、または二本鎖ステムをつくるのに必要な相互作用の数を減らすこと、換言すれば反応次数を減らすことによって、ＣＭＶ依存性開裂の効率を高めることを目的とするものであった。したがって、対合プローブのビオチニル化されていないオリゴヌクレオチドメンバーは、標的ＤＮＡと永久ハイブリッド形成させるために伸長され、そしてこのストランドの制限認識部位は開裂耐性にされた。したがって、対合プローブのビオチニル化されていないオリゴヌクレオチドのメンバーは、それがハイブリッドを形成しているＣＭＶ−ＤＮＡとともにリサイクルされねばならない。二つの方法を試験した。すなわち分断された（ｓｐｌｉｔ）制限部位プローブ（ＳｐｌｔＲＥ）と修飾された制限部位プローブ（「ＭｕｔＲＥまたはＭｏｄＲｅ」）を試験した。両方の場合、その制限部位は、制限酵素が、開裂効率を増大するため、その制限部位とより良好に接触できるように、両側に少なくとも５個の塩基対が隣接された。第二世代の対合プローブの構造は図２に示してある。
【０１４４】
分断された制限部位プローブ（ＳｐｌｔＲＥ）：ＳｐｌｔＲＥ対合プローブのビオチニル化されていないオリゴヌクレオチドメンバーの３′−アームを、伸長して、標的ＤＮＡと永久ハイブリッド形成を行わせた（ｐ．ＣＭＶ−２．ｌｇ、４１塩基の長さ、Ｔｍ＝９０℃）。このオリゴヌクレオチドメンバーの５′末端は、ステムの形成に参画しているが、ＴａｑＩ部位（５′−ＧＡ−３′）を形成している塩基のうち二つだけを提供している。開裂部位自体（５′−Ｔ／Ｃ−３′）を含み、認識部位を形成する残りの二つの塩基は、このストランド中には存在しない。その結果、そのビオチニル化されていないオリゴヌクレオチドのメンバーは、ビオチニル化オリゴヌクレオチドメンバーに対する標的ＤＮＡのアンカーとして働く。分断された制限部位を完成するのに必要な残りのヌクレオチドは、ビオチニル化オリゴヌクレオチドのメンバーに存在している。ビオチニル化オリゴヌクレオチドのメンバーは、長さとＴｍが第一世代の対合プローブ（１９塩基の長さ、Ｔｍ＝６３℃）と類似しているＣＭＶ特異的５′−アームを含有している。したがって、このアームは、酵素による開裂の後、標的ＤＮＡから解離すると考えられる。そのビオチニル化オリゴヌクレオチドメンバーは、その３′末端が折り重なって、ＴａｑＩが部位認識を行うのに必要な二つの塩基（５′−Ｔ／Ｃ−３′）を提供する安定な細胞内ヘアピン構造（６塩基の長さ、Ｔｍ＝８７℃）をつくるように設計される。これらのヌクレオチドは、前記対合プローブのビオチニル化されていないメンバーの５′末端には欠けているヌクレオチドである。第一世代の対合プローブと同様に、酵素は、対合プローブの二つのメンバーがハイブリッドを形成するときだけ、二本鎖立体配置中の完全制限部位（５′−Ｔ／ＣＧＡ−３′）を認識して開裂する。しかし、この場合、対のビオチニル化メンバーだけが開裂されるが、ビオチニル化されていないメンバーは開裂されないままで、標的鋳型とハイブリッドを形成する。したがって、標的ＤＮＡとハイブリッドを形成した伸長オリゴヌクレオチド複合体は、反応混合物中に過剰に存在していると、ビオチニル化オリゴヌクレオチドによってリサイクルされると考えられる。
【０１４５】
修飾された制限部位プローブ（ＭｕｔＲＥ／ＭｏｄＲｅ）：対合プローブのビオチニル化されていない１／２の認識部位を修飾することによって、その修飾ストランドの酵素による開裂を防止することができる。対合プローブのビオチニル化されていないオリゴヌクレオチドメンバー上のＴａｑＩ／ＢｓｔＢＩの認識部位に、５′−Ｔ／ＣＧＡ−３′から５′−Ｔ／ＣＴＡ−３′までおよび５′−Ｔ／ＣＧＡ−３′から５′−Ｔ／ＣＧ（Ｎ６−メチル）Ａまでに収縮が行われて、５種のＭｕｔＲＥプローブ（配列番号：２１〜２５）を得た。ＳｐｌｔＲＥの設計と同様に、ＭｕｔＲＥ対合プローブ法は、インキュベーションを通じて、反応物の濃度が高いことから利益を受けるので、産物生成の効率が高くなるに違いない。
【０１４６】
上記二つの概念（ｓｐｌｔＲＥ／ＭｏｄＲＥと伸長した標的特異的アーム）は別個に試験されたが、両者は同じプローブに同時に適用することができる。プローブの対と標的ＤＮＡのハイブリッド形成および開裂されたビオチニル化アームのＤＮＡからの解離の性質は、対合プローブの修飾／伸長オリゴヌクレオチドメンバーを用いて研究できる。例えば、対合プローブの伸長／修飾オリゴヌクレオチドメンバーは、アームの長さおよびＴｍ値が異なる各種のビオチニル化オリゴヌクレオチドメンバーと結合できる。このようなコンビナトリアル反応において、ハイブリッド形成の効率は、独立して（例えば図５に示すような未変性ゲルを利用して）または開裂の効率とともに（例えば図６に示すような変性ゲルを使用して）研究することができる。
【０１４７】
実施例４
第二世代の対合プローブ−実験結果
対合プローブのビオチニル化されていないオリゴヌクレオチドメンバーを伸長して、標的ＤＮＡ（本願ではアンカープライマーと呼称する）と永久的にハイブリッドを形成させた。このオリゴヌクレオチドメンバーの５′末端は、ステムの形成に参画しているが、ＢｓｔＢＩ認識部位の６個の塩基（５′−ＴＴＣＧＡＡ−３′）から４個の塩基（５′−ＣＧＡＡ−３′）だけを提供する。認識部位を形成する残りの二つの塩基（ＴＴ）は、開裂部位自体（Ｔ／Ｃ）を含めて、このストランドには欠けている。その結果、そのビオチニル化されていないオリゴヌクレオチドメンバーは、開裂できない、標的とハイブリッドを形成したアンカーであり、そのアンカーはビオチニル化オリゴヌクレオチドメンバーと標的ＤＮＡのハイブリッド形成を方向づける（Ｏｒｉｅｎｔ）働きをする。
【０１４８】
認識配列の残りの部分は、ＣＭＶ特異的５′−アームを含有する３′ビオチニル化オリゴヌクレオチドメンバーに存在している。このアームは、開裂に続いて標的ＤＮＡから解離するように設計される。ビオチニル化オリゴヌクレオチドメンバーは、その３′−末端が折り重なって、ＢｓｔＢＩが部位を認識するのに必要な二つの塩基（５′−ＴＴ−３′）を提供する安定な分子内ヘアピン構造（６個の塩基の長さ、Ｔｍ＝８７℃）をつくるように設計される。これらのヌクレオチドは、対合プローブのビオチニル化されていないメンバーの５′−末端からなくなっている二つのヌクレオチドである。
【０１４９】
第一世代の対合プローブと同様に、前記制限エンドヌクレアーゼは、対合プローブの二つのメンバーがハイブリッドを形成して二本鎖の制限部位を形成するときのみ、完全制限部位（５′−ＴＴ／ＣＧＡＡ−３′）を認識して開裂する。しかし、この場合、該対のビオチニル化メンバーだけが開裂されて標的から放出されるが、ビオチニル化されていないメンバーは、開裂されないままでかつ標的ＤＮＡに固定されてその標的ＤＮＡとともにリサイクルされる。
【０１５０】
各種のアンカー（安定してハイブリッドが形成された）およびアンプリファイアプライマーを、開裂されたアンプリファイアの蓄積に対する短いアンカー配列と長いアンカー配列の効果を試験するために（表４〜５）合成した（Ｇｅｎｏｓｙｓ Ｅｎｇｌａｎｄ）。
【０１５１】
【表４】
2004512813.tif 000005
【０１５２】
【表５】
2004512813.tif 000006
【０１５３】
上記増幅反応は、前記実施例１で述べたのと同様にして実施した。簡単に述べると、標的ＤＮＡ５０ｎＭ、短いかまたは長いアンカーオリゴヌクレオチド５０ｎＭおよび各アンプリファイアオリゴヌクレオチド（プライマー１，２または３）２５０ｎＭを、最終容積３０μｌで、反応緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．９）中でともに混合した。鉱油１滴を添加し、温度を５分間で９５℃まで上げて変性を行った。そしてその反応混合物を６５℃で１５分間インキュベートし、ＢｓｔＢＩ制限酵素を最終濃度１単位／μｌまで添加し次いでその反応混合物をさらに１ｈｒ同じ条件に保持した。試料の分析と検出を、実施例１で述べたのと同様にして実施した。開裂産物を、１２．５％ポリアクリルアミドゲルで分離して、膜にブロットし（図１１ａ）、この膜を、Ｋｏｄａｋ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １Ｄソフトウェアを使用して走査分析した。その結果は図１１ｂ−ｃに要約してある。
【０１５４】
長いアンカーを使用すると、３種類のすべてのアンプリファイアとともに開裂産物が多量に蓄積することが観察される（図１１ａ）。これらの試験結果は、アームのＴｍが高い長いアンカー（第一世代の二分子プローブより１９℃高い）を使用すると、有意に高いアンプリファイアの開裂と解離をもたらす（図１１ｂ）ことを示している。図１１ｃから分かるように、長いアンカーを使用すると、使用されるアンプリファイアによっては、開裂が２．３〜６．９倍に増大した。
【０１５５】
したがって、固定された、開裂できないオリゴヌクレオチドメンバーを有する本発明の第二世代二分子プローブは、オリゴヌクレオチドメンバーが一つだけ開裂し解離して、反応次数を減らし、その結果、反応のサイクリング率を劇的に増大し、したがって信号生成が劇的に増大するので、標的配列を同定するのに特に有利である。
【０１５６】
実施例５
第二世代対合プローブのリサイクリング−実験結果
第二世代対合プローブのリサイクリングレベルを、反応混合物中に存在する標的分子の量に対し、蓄積された産物（開裂されたアンプリファイア）分子の量を測定することによって確認した。したがって、リサイクリングのレベルを測定するため、次の配列：５′−ＴＴＧＴＡＴＧＡＴＧＡＣＣＡ−３′（配列番号：４８）を有する標的ＤＮＡを異なる濃度（０，０．５ｐＭ，５ｐＭ，５０ｐＭ，５００ｐＭおよび５０００ｐＭ）で、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ　ＮａＣｌおよび５０ｎＭの長いアンカーのオリゴヌクレオチド（表４と５）を含有する緩衝（トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ、ｐＨ＝７．９）検定溶液に添加した。得られた反応混合物を９５℃で５分間予熱し、次いで６５℃で１０分間インキュベートして、標的ＤＮＡをアンカーオリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成させることによって飽和させた。次にアンプリファイア１オリゴヌクレオチド（表４と５）を最終濃度２５０ｎＭで各反応混合物に添加して、インキュベーションをさらに１５分間続けて、標的−アンカー−アンプリファイアの三分子ハイブリッド形成を完成させた。ＢｓｔＢＩエンドヌクレアーゼを、最終濃度１単位／μｌで反応混合物に添加した。これら試料をさらに１ｈｒインキュベートしてアンプリファイアオリゴヌクレオチドを開裂させた。
【０１５７】
長さと配列がアンプリファイアの開裂産物と同一のビオチニル化オリゴヌクレオチドフラグメント（ビオチン−５′−ＴＴＴＣＡＴＣＡＴＡＡＡＡＧＣＧＴＣＡＣＴＡＧＡＡＴＴ−３′（配列番号：４９））の既知量を含有する試料を、尿素の存在下、１５％変性ポリアクリルアミドゲルによって電気泳動させて、標準曲線を作成するのに利用した。４μｌずつの試料（標的を０．２ａｍｏｌ、２０ａｍｏｌ、２００ａｍｏｌ、２ｆｍｏｌおよび２０ｆｍｏｌ含有する。図１２、差し込み図）を同時に電気泳動させた。そのゲルを、実施例１で述べたのと同様にして、ナイロン膜にブロットしてビオチンを検出した。次いで、そのブロットを、Ｋｏｄａｋ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＩＤソフトウェアを用いて走査して分析した。その試験結果に基づいて、増幅係数（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）を、産物と標的の間のモル比として計算した。標的の各濃度について計算した増幅係数を図１２に示す。約５０ｆｍｏｌの産物が、２０ａｍｏｌという少量の標的ＤＮＡとともに検出されたが、これは約２５００倍の増幅を示す。図１２に示す試験結果は、標的ＤＮＡのリサイクリングが、広範囲の標的濃度で実際に起こることを示している。
【０１５８】
実施例６
単一分子のプローブ
単一プローブ−第一世代：二本鎖ステムを生成するのに必要な相互作用の数を減らすために、単一分子のオリゴヌクレオチドプローブ（表６、図２）を設計した。単一分子プローブにおいて、ステムは分子内相互作用で形成される。第一セットの単一分子プローブは、ＣＭＶ（各アームは１６〜２３塩基の長さ）の３２〜４３ヌクレオチドからなる配列を認識し、１０〜１６ｂｐの長さのステムをもっていた。
【０１５９】
【表６】
2004512813.tif 000007
【０１６０】
各種単一分子プローブのステムまたはアームの領域のＴｍを、これら配列にミスマッチを導入することによって改変して、これら配列を「実質的に相補的」にした。しかし、ステムのＴｍはすべての場合、高すぎたので（Ｔｍ＝６５〜９２℃）、標的ＤＮＡなしの場合、遊離プローブのバックグランド開裂が高くなった。
【０１６１】
第一世代単一分子プローブが認識した標的ＤＮＡ配列をコンピュータで分析した結果は、この特別の配列は、この種の単一分子プローブに対して不適切であることを示唆している。第一に、そのプローブのＣＭＶ特異的アームは二量体を形成しがちである。第二に、選択された標的配列は、ｄｓ標的ＤＮＡの自己アニーリングを促進する高いＴｍ（Ｔｍ＝８２℃）を指令する。結局、その一本鎖標的ＤＮＡの一次構造は、プローブのハイブリッド形成を阻害できる安定な自己折り重なり立体配置をとることができた。
【０１６２】
図７に示すように第一世代単一分子プローブの標的ＤＮＡ鋳型を検出する性能を試験するため、単一分子プローブ１（表６）を、ｐ．ＣＭＶ−１．ｓｓ（一本鎖強化、２６３ｂｐ、上記表１参照）の存在下（＋、レーン１〜３）および存在しない場合（−、レーン４〜６）に、６００ｍＭ　ＮａＣｌ中５５℃でインキュベートした。その反応混合物を１５分間インキュベートした後、最終濃度すなわち１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１００ｎＭプローブおよび４２ｎＭ一本鎖強化ＣＭＶ−ＤＮＡ（２６３）まで希釈した。希釈後、ＴａｑＩ（Ｔ）またはＢｓｔＢＩ（Ｂ）を最終濃度０．１７単位／μｌまで添加し、酵素による制限を６５℃で２ｈｒ行った。その後、変性ゲル分析を行うため、１２μｌずつを採取した。さらに、ハイブリッド形成反応混合物（Ｈ）を５５℃で２ｈｒインキュベートし、そして制限酵素なしの６００ｍＭ　ＮａＣｌを５５℃で２ｈｒインキュベートし、それらの２μｌずつを８％未変性ゲルで分析した。両方の場合、ビオチニル化フラグメントの視覚化を実施例１に記載してあるようにして実施した。
試験結果を図７に示す。明らかにわかるように、プローブのかなりの部分が、ＣＭＶ−ＤＮＡが存在しない場合に開裂された。さらに、標的ＤＮＡが存在しても開裂効率は増大しなかった。これは、安定なステムの形成がこのプローブのタイプに対する標的ＤＮＡのハイブリッド形成と無関係であったことを示唆している。しかし、酵素を添加するとハイブリッドの濃度が低下することは、そのハイブリッドが酵素に対する基質として働くことを示唆している。
【０１６３】
ループ化プローブ：第一世代の単一分子プローブから得た試験結果に基づいて、第二世代の単一分子プローブを設計した。これらのプローブにおける、標的ＤＮＡが存在しない場合の分子内ステムの生成はかなり減少する。図２はハイブリッドを形成した第二世代ループ化プローブの構造を示す。
【０１６４】
第二世代単一分子プローブのステムは、第一世代単一分子プローブのステムと比べて、Ｔｍが低くかつ酵素に対する到達性が高いように設計した。これらのプローブにおいて、ステム領域の４〜６個の塩基対だけが真の二重らせんを形成する。これらの塩基対はＴａｑＩの認識部位（Ｔ／ＣＧＡ）を含有している（６ｂｐの場合、４ｂｐのＲＥ部位には各側に単一塩基対が隣接している）。このステムの真の二重らせん領域には擬似二重らせんが隣接していた（正規の二重らせんの場合のようなＧ−ＣやＡ−Ｔではなくて、Ｃ−ＡまたはＧ−Ｔの塩基対合）。全ステムの長さ（真の二重らせんと擬似二重らせん両者の合計）を、そのプローブがＴａｑＩに対する基質として働くことができるよう十分長いように（１５ｂｐ）計算した。ステムのＴｍは、ステムが形成されるときに形成されるポリ−Ａ−ループの長さを変えることによって操作した。前記六つのループ化プローブの変種は、擬似二重らせんの大きさ、ポリ　Ａ　ループの大きさ（４〜２１個の塩基の長さ）、ステム領域のＴｍ（Ｔｍ＝４４〜５３℃）およびステムの全長（１０〜１５個の塩基の長さ）が異なっている。
【０１６５】
ステム領域の変化に加えて、これら新しいプローブに対する標的配列は、ｐ．ＣＭＶ−１から、ある程度ｐ．ＣＭＶ−１の配列とオーバーラップしたｐ．ＣＭＶ−２まで変化した。ループ化プローブのビオチニル化５′−アームが認識する配列は、第一世代単一分子プローブのビオチニル化されてない３′−アームが認識する配列とオーバーラップしている。ループ化プローブのビオチニル化されていない３′−アームは、このプローブのビオチニル化アームが認識する領域のすぐ下流に位置する配列を認識する。そのループ化プローブの二つのアームは、Ｔｍが同じでかつ六つの全ての変種の場合、同一であった。
【０１６６】
【表７】
2004512813.tif 000008
【０１６７】
ループ化プローブと二本鎖ＣＭＶ−ＤＮＡのハイブリッド形成の効率を試験するため、ＣＭＶ−ＤＮＡの長さが異なるフラグメントを、別個のハイブリッド形成反応に採用した。
【０１６８】
約１ｐｍのループ３（表７）と５００ｆｍの２６３ｂｐの二本鎖ＣＭＶ−ＤＮＡフラグメントを９６ウェルプレートの１２ウェルの行に添加した。１ｐｍのループ３と５００ｆｍの３５ｂｐの二本鎖ＣＭＶ−ＤＮＡフラグメントを、同じプレートの別の１２ウェルの行に添加した。ハイブリッド形成の検定を、１００ｎｇ／μｌのｔＲＮＡをキャリヤーとして添加したことを除いて、さきに記載したのと同様にして実施した。反応混合物を鉱油で覆い、次いでそのプレートを９５℃まで１０分間で加熱してストランドを分離させた。次に、そのプレートを、温度勾配ブロックに移し、前記プレートの各列を、４４℃から６６℃までの範囲で２℃刻みの異なる温度でインキュベートした。温度勾配ブロックでインキュベートした後、各試料１０μｌずつを、１２％未変性ポリアクリルアミドゲルで分析した。ビオチニル化フラグメントを、実施例１に先に記載したようにして視覚化した。試験結果を図８ａ−ｂに示す。
【０１６９】
試験した温度範囲（４４℃〜６６℃）で、２６３ｂｐの二本鎖ＣＭＶフラグメントとのハイブリッド形成は観察されなかったが（図８ｂ）、プローブと３５ｂｐの二本鎖ＣＭＶ−ＤＮＡフラグメントの効率的なハイブリッド形成が５８℃までの温度で観察された（図８ａ）。これらの試験結果は、標的の長さに依存する再アニーリングが、高温におけるプローブのハイブリッド形成効率に影響することを示唆している。標的ＤＮＡの再アニーリングを克服するために、高いプローブ濃度と低い反応温度を採用しなければならない。しかし次の実験で示すように、このような問題は、一本鎖標的ＤＮＡの鋳型を使用すると克服される。
【０１７０】
ループ２プローブ（表７）と、一本鎖ＤＮＡフラグメントまたは二本鎖ＤＮＡフラグメントとのハイブリッド形成の効率も試験した。その試験結果を図９ａ−ｂに示す。
【０１７１】
約１ｐｍのループ化プローブ２と、５００ｆｍの二本鎖（図９ａ）もしくは一本鎖（図９ｂ）の合成ＣＭＶ−ＤＮＡフラグメント（それぞれｓｙｎ．ＣＭＶ−２ｓｔ．ｄｓまたはアンチセンスＣＭＶ−２．ｓｔ）とを、最終容積２５μｌにて２００ｍＭ　ＮａＣｌ中でインキュベートした。上記一本鎖ＣＭＶ−ＤＮＡ製剤（アンチセンスＣＭＶ−２．ｓｔ）は、ループ２プローブの標的特異的アームの大きさに完全に適合する合成のビオチニル化されていないアンチセンスストランドである。二本鎖ＣＭＶ−ＤＮＡ製剤（ｓｙｎ．ＣＭＶ−２ｓｔ．ｄｓ）は、このアンチセンスストランドと、同じＣＭＶ−ＤＮＡ配列（センスＣＭＶ−２．ｓｔ）のビオチニル化センスストランドとの１：１混合物である。以下のハイブリッド形成条件を採用した。すなわち、４４℃で１ｈｒ（レーン１）；４４℃で１ｈｒ続いて９５℃で１０分間（レーン２）；４４℃で１ｈｒ続いて９５℃で１０分間次いで６８℃で１ｈｒ（レーン３）；６８℃で１ｈｒ（レーン４）である。図９ａ−ｂから分かるようにループ化プローブを、アンチセンスＣＭＶ−２．ｓｔストランドだけとともにインキュベートしたとき（図９ｂ）、そのハイブリッドは４４℃と６８℃の両方において安定であったので、９５℃で１０分間加熱した後、６８℃でリフォーム（ｒｅｆｏｒｍ）することができた（レーン３）。標的ＤＮＡの相補的ストランド（センスＣＭＶ−２．ｓｔ、図９ｂ）の存在下、ループのアンチセンスハイブリッドが４４℃で生成し（レーン１）、９５℃で１０分間インキュベートした後、依然として安定であった（レーン２）。しかし、６８℃のインキュベーションで時間を長くしたとき、安定なハイブリッドは形成されなかった（レーン３と４）。これは、プローブが二本鎖標的ＤＮＡの２０倍存在しているにもかかわらず起こったのである。したがって、これらの試験結果から、標的ＤＮＡとプローブの間の与えられた濃度比にて、両ストランドの存在下、ループ化プローブが標的ＤＮＡと効率的にハイブリッドを形成できるようにするには、より低い反応温度が必要であると結論された。
【０１７２】
ループ化プローブと鋳型ＤＮＡのハイブリッド形成の効率をさらに分析するため、プローブのハイブリッド形成と開裂の程度を、一本鎖鋳型ＤＮＡの各種濃度で分析した。試験結果を図１０ａ−ｃに示す。
【０１７３】
この検定は７本の試験管からなる同一の２セットからなり、各試験管には、５００ｆｍのループ５プローブ（表７）および順に量を減らした一本鎖３５ｂｐ　ＣＭＶ−ＤＮＡフラグメント（アンチセンスＣＭＶ−２．ｓｔ）が最終容積２５μｌで入っている。試験管１〜６それぞれの、アンチセンスＣＭＶ−２．ｓｔとプローブのモル比は、１：１、１：４、１：１０、１：４０、１：１００、１：４００であった。７号試験管にはＣＭＶ−ＤＮＡを添加しなかった。キャリヤーとして１００ｎｇ／μｌ　ｔＲＮＡの存在下、ｐＨ８．５および２００ｍＭ　ＮａＣｌで検定を実施した。これら試験管を５３℃でインキュベートして、プローブとＤＮＡのハイブリッドを形成させた。第一組の試験管から各試料を１０μｌずつ採取して、１２％ポリアクリルアミド未変性ゲルによって分析した（図１０ａ）。ハイブリッド形成ステップ終了後、第二組の試験管の各試験管に、ＴａｑＩを、最終濃度０．１５μ／μｌまで添加し、次いでこれら試料を２ｈｒインキュベートした。第二組の試験管の各試料から１０μｌずつを採取して、一本鎖ビオチニル化フラグメントを検出するため、７Ｍの尿素を含有する１５％ポリアクリルアミド変性ゲルで分析した（図１０ｂ）。同じ試料を、二本鎖ストランドのフラグメントと一本鎖ストランドのフラグメントの両者を検出するため、１２％の未変性ゲルで分析した（図１０ｃ）。
【０１７４】
図１０ａ−ｃに示されているように、ＣＭＶに依存するプローブの開裂は、５０ｆｍという少量のＤＮＡで検出することができる。さらに、プローブ開裂の効率は、ハイブリッドの濃度を１／４または１／１０に減らしても低下しなかったが、これはプローブの増幅が存在していることを示唆している。この結論は、さらに、図１０ｃに示すように、同じ反応混合物を未変性の１２％のアクリルアミドゲルに負荷すると、立証される。これらの条件下で、低いゲル移動度を示す開裂産物が検出された。この試験結果は、開裂されたプローブ産物が、ＣＭＶ−ＤＮＡに結合してとどまらせていることを示唆している。しかし、遊離プローブの濃度が高い場合、ＣＭＶ−ＤＮＡとハイブリッドを形成した開裂プローブの産物は無傷のプローブで置換され、これは標的ＤＮＡのリサイクリングが実際に起こっていることを示している。したがって、この実験は、鋳型のリサイクリングと信号の増幅が、本発明の教示によって合成されたループ化プローブを使用して達成できることを立証している。
【０１７５】
ループ化プローブの変種：ループ化プローブの変種は、ＣＭＶ−ＤＮＡに無関係の開裂を減らしかつ利用される制限酵素に、より優れた認識、解離およびステムの開裂をさせるようにステムとループの領域が変化している。ＣＭＶ−ＤＮＡに無関係の開裂を減らすためにいくつもの方法をとることができる。標的ＤＮＡ存在下のループとステムの立体配置を想定して、鋳型ＤＮＡがない場合に、制限部位をブロックするように折り重なるループ領域を生成させることができる。ステム領域は、わずか４ｂｐまで短くすることができるので、鋳型に無関係のステムの形成を減らすことができる。開裂の効率を高めるため、いくつもの方法を実施することができる。擬似二重らせんの塩基部分は、真の二重らせん（２ｂｐの長さ）で、制限部位の下流が閉じられて、長さが１０ｂｐの擬似二重らせん／バルジループをつくることができる。その制限部位は、二つの擬似二重らせん／バルジループ（各々長さが７ｂｐ）の間に配置することができる。制限部位のヌクレオチドは一方のストランドだけを改変することができ、その場合、この改変によって起こる安定性の損失は、ステムの長さを長くすることによって補償することができる。結局、ＣＭＶ−ＤＮＡに依存する開裂は、真の二重らせん（長さが３ｂｐ）を制限部位の各側に付加し、かつポリ　Ａ　ループを擬似二重らせんループで置換することによって高めることができる。
【０１７６】
ブロックされたプローブ：ブロックされたプローブは、そのハイブリッドを形成していないプローブが折り重なって固有の非制限部位を含有する二重らせん構造（配列番号：３６〜３７）を形成できることが特徴である（図２参照）。このブロックされたプローブは、この二重らせん構造の分子内相互作用のＴｍが高いため安定である。このプローブは、このように折りたたまれると、標的分子とハイブリッドを形成できるが、このハイブリッド形成にはそのビオチニル化されていないアームの一部しか利用できないので、このような標的−プローブのハイブリッドは不安定である。したがって、このプローブの立体配置を変化させるための駆動力がそのエネルギー状態で小さいように、安定なハイブリッド状態がエネルギー的に望ましいに違いない。全長のアームが標的ＤＮＡとハイブリッドを形成するのに利用できる場合、非制限部位を含有する二重らせん構造が解離しなければならない。このような解離によってプローブの安定性が一時的に失われるが（例えば、５０℃／６９℃から４１℃／６４℃へのＴｍのシフト）、標的とのハイブリッド形成がこの安定性の損失を補償できるはずである。
【０１７７】
実施例７
二価のプローブ（ＢＩＶ）
図２に示すように、二価のプローブは、二つの標的ＤＮＡ配列を同時に認識するように設計された対合プローブである。その対のオリゴヌクレオチドメンバーは各々、各末端に一つの標的認識アームが隣接しているステム配列を有している。各オリゴヌクレオチドメンバーはその５′末端がビオチニル化されている。このプローブの設計は、ステムの形成をさらに安定化しかつ、ステム形成の標的ＤＮＡの存在に対する依存を高めるのを目的としている。これらＢＩＶプローブは、二つの同一の一本鎖配列（ＢＩＶ１）、与えられた二本鎖配列（ＢＩＶ２）の二つの相補的ストランド、同じポリヌクレオチドの二つの領域または二つの関連のない一本鎖配列（ＢＩＶ３）を検出するのに使用できる。アンチセンス／センスＣＭＶ−２混合物、ＣＭＶ−６（配列番号：３８）またはｐ．ＣＭＶ−２６３．ｄｓ配列を標的とするＢＩＶ３プローブを設計して合成した。そのプローブは、５′−ｂ−ＣＡＧＣＡＴＣＡＣＡＣＴＡＧＴＣＴＣＡＡＴＴＣＧＡＡＧＣＧＧＡＴＧＡＣＣＡＴＧＴＡＣＧＧ−３′（配列番号：３９）と５′−ｂ−ＣＡＣＴＡＧＴＧＡＣＧＣＴＴＧＴＡＴＣＧＣＴＴＣＧＡＡＴＴＣＴＣＴＡＡＧＡＣＡＴＡＧＣＡＧＣＡ−３′（配列番号：４０）を含有している。
【０１７８】
二つの同一一本鎖（ＢＩＶ−１）の同時検出：二つの同一一本鎖を検出するため、二価プローブの各メンバーは、標的配列の３′末端を認識する一つのアームと標的配列の５′末端を認識する一つのアームを含有している。ＢＩＶ１プローブの場合、一つの安定なステムをつくるのに２倍の標的分子が必要であるから、検定の感度が低下する。しかし、その対の両メンバーが標識されているので、各対が開裂すると、二つの標識された開裂産物を生成して、標的分子に対して増大した要求を補償する。
【０１７９】
与えられた二本鎖配列（ＢＩＶ２）の二つの相補的ストランドの同時検出：二本鎖配列の二つの相補的ストランドを検出するため、二価プローブの第一メンバーの５′アームと第二メンバーの３′アームを、標的配列のアンチセンスストランドとハイブリッドを形成するように設計し、一方、両メンバーの残りのアームを、同じ標的ＤＮＡのセンスストランドを認識するように設計する。この設計の、上記対合プローブをしのぐ利点は、ＢＩＶ２プローブが二本鎖標的ＤＮＡの再アニーリング反応と競合することができその結果検定の感度が増大することである。
【０１８０】
二つの無関係の一本鎖（ＢＩＶ３）の同時検出：ＢＩＶ３は二つの独立した一本鎖配列を検出できるので、二つの新しい検出の選択肢を提供する。第一に、同じ標的ＤＮＡの隣接していない二つの配列を同時に検出できるので、検定の特異性を増大しかつＤＮＡ濃度を増大する必要なしに擬陽性を減らすことができる。あるいは、一つのプローブ対を使用して、二つの独立した標的分子を認識することができる。この目的を達成するため、二価プローブの第一メンバーの５′アームと第二メンバーの３′アームを第一標的を認識するように設計し、一方両面バーの残りのアームを第二の独立した標的ＤＮＡを認識するように設計する。
【０１８１】
実施例８
蛍光を検出する戦略
先に詳述したように、プローブおよびその制限産物の検出を、ビオチニル化プローブと比色定量法を利用して行った。この検出法は、ゲル分離法を組み合わせた場合、ハイブリッド形成の各種立体配置を検出するのに適切であるが、ハイブリッドを形成したプローブとハイブリッドを形成していないプローブの両者を検出するので、診断を目的とする場合は適切でない。適切な診断検出を行うために、いくつもの方法を利用することができる。
【０１８２】
例えば同じストランドの制限部位に隣接する蛍光レポーター色素と消光体基を利用できる。その消光体は蛍光基から発せられるエネルギーを捕獲できるので、これら二つの基が互いに十分に接近している限り、その蛍光基が励起されても蛍光は発せられない。標的ＤＮＡの存在下、プローブ内ハイブリッド形成と二本鎖ステム形成を行わせるため、蛍光レポーター色素と消光基を、ステム領域の両末端、単一分子プローブと二分子プローブ両者の第一領域と第三領域の間の配列、および単一分子プローブのループもしくは二分子プローブのステム領域の末端に配置することができる。これらの位置で、前記色素のハイブリッド形成に対する影響は最小になる（図３ａ−ｂ参照）。制限エンドヌクレアーゼによって、ステムの効率的な開裂を行うには、使用される制限酵素に応じて、４〜１８個の塩基からなるスペーサーが蛍光レポーター色素と消光基の間に必要である。酵素で開裂されると、蛍光レポーター色素と消光基は互いに分離して溶液中に分散する。その結果、蛍光基から消光体へのエネルギー移動がないので蛍光を検出することができる。
【０１８３】
蛍光は反応が進行するにつれて検出できるので、増幅をリアルタイムで測定することができる。蛍光増大の強度と速度によって、混合物中に存在する標的分子の数と増幅の速度を推定することができる。その結果、このことは、本発明の教示にしたがって合成されたプローブは、ＰＣＲ検定をリアルタイムで追随するのに用いる相補的薬剤として使用することもできることを意味する。なお、この場合の標的検出は一般に、増幅が完了した後のみに実施される。さらに、これらプローブが発する信号は自己増幅されるから、これらのプローブは、ＰＣＲ検定の感度を増大して、標的を検出するのに必要な熱サイクルの数を減らすことができる。
【０１８４】
多種類の蛍光／消光体の組み合わせを、本発明のプローブは利用することができる。ドナーが、フルオレセイン類を含む色素のキサンテン基由来のドナーであり、かつ消光体が色素（例えば６−ＦＡＭおよびＴＡＭＲＡ）のローダミン基由来の消光体である組み合わせが、当該技術分野で一般に使用される。Ｃｙ５とＲＯＸは使用できる色素の別の一対である。この対を使用すると、標的の存在下、蛍光が２０倍に変化することを経験できる。
【０１８５】
ＤＡＢＳＹＬやＱＳＦ−７などの非蛍光消光体も使用することができ、これらの消光体には、蛍光色素を選択する際に高度の順応性がある。色素対を選択するには、消光体が、両者が近接しているとき蛍光色素のエネルギーを吸収することが必要である。色素の分離（ｄｙｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）による蛍光の増大はできるだけ大きいことが好ましい（蛍光が３〜２０倍に増大することが各種のエネルギー移動系について報告された）。蛍光色素を一種類だけ使用する場合、最高の蛍光強度を有する色素（通常広い発光スペクトルを有する）を選ばねばならない。同じ蛍光／消光基を保持する二つのプローブが、同じ標的の二つの異なる領域を検出するために設計されると、その検定法の感度は増大する。あるいは、蛍光／消光色素の異なる組み合わせを利用すれば、異なる標的を標的とする二種以上のプローブも使用できる。しかし、二種以上の蛍光色素を使用する場合、その検定法の感度は、各種色素の蛍光を識別するため、低下することがある。この検定は、各種の色素の蛍光がオーバーラップしないより狭い発光スペクトルを検出することによって行われる。
【０１８６】
実施例９
標的ＤＮＡの蛍光の検出
ＣＭＶ（ｐ．ＣＭＶ−１）由来の５０ｂｐのセグメントの２５ｆｍまたは２５０ｆｍの試料を標的ＤＮＡ鋳型として使用した。そのＤＮＡ鋳型の配列は、５′−ＴＣＡＧＧＣＴＴＧＧＴＴＡＴＣＡＧＡＧＧＣＣＧＣＴＴＧＧＣＣＡＧＣＡＴＣＡＣＡＣＴＡＧＴＣＴＣＣＴＣ−３′（配列番号：４１）であった。
【０１８７】
対合プローブは、標的配列の３′領域に対応するオリゴヌクレオチドメンバーの５′末端に、６−ＦＡＭ蛍光基の標識を共有結合でつけた。そのＦＡＭ基の１０塩基下流に、ＱＳＹ−７消光基を、対合プローブ２（表２に示す配列）のステムのベースにおけるチミジン残基に共有結合させた。
【０１８８】
この検定は、２００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭトリスｐＨ７．８、および１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２の存在下、６２℃にて、最終容積２５μｌで実施した。
【０１８９】
これら試料を５分間沸騰させてストランドを分離させ、次いで１５分間で６２℃まで冷やして、プローブを、標的ＤＮＡ上のその相補的配列とハイブリッドを形成させた。プローブのハイブリッド形成を行った後、ＴａｑＩエンドヌクレアーゼを、最終濃度０．１７ｕ／μｌで添加してプローブを消化した。２ｈｒインキュベートした後、反応を１０ｍＭ　ＥＤＴＡで停止させた。
【０１９０】
ＦＡＭ蛍光を、キセノンアークランプならびに励起波長と発光波長（それぞれ４９６ｎｍと５１６ｎｍ）を制御するための格子モノクロメーターを備えている蛍光測定器を使用して測定した。酵素を添加する前に採取した試料をブランクとして利用した。ＣＭＶ−ＤＮＡの存在下と存在していない場合の蛍光の差がプローブのＣＭＶに依存する開裂を示したので、ＣＭＶ−ＤＮＡの量も推定できる。
【０１９１】
本発明の特定の特徴は、わかりやすくするため、別個の実施態様と関連して説明されているが、単一の実施態様に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、本発明の各種の特徴は、分かりやすくするため、単一の実施態様と関連して説明されているが、別個にまたは適切なサブコンビネーション（ｓｕｂｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）で提供することもできる。
【０１９２】
本発明は、その特定の実施態様と関連づけて説明してきたが、多くの別法、変型および変更は当業技術者にとって明らかであることは明白である。したがって、本発明は、本願の特許請求の範囲の精神と広い範囲に入るかような別法、変型および変更を全て含むものである。本明細書にあげたすべての刊行物、特許および特許願は、あたかも、個々の各刊行物、特許または特許願が具体的にかつ個々に本願に援用して示されているのと同程度に本明細書に援用するものである。さらに、本願に文献を引用しまたは明記することは、その文献が従来技術として、本発明に利用できるという自白とみなすべきではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明の好ましい一側面の検出法のステップを示す模式図である。
【図２】
標的核酸配列とハイブリッドを形成したときの本発明の単一オリゴヌクレオチドおよびヌクレオチド集合体の構造を示す。
【図３】
本発明の対合オリゴヌクレオチド（図３ａ）とループ化オリゴヌクレオチド（図３ｂ）のドメイン構造と領域を示す図である。
【図４】
２６３ｂｐのＣＭＶ−ＤＮＡ鋳型フラグメント由来の各種ＣＭＶ−ＤＮＡ製剤（１〜８）であって、本発明を実施する際、標的核酸配列として使用したこれら製剤の領域を示す制限地図である。
【図５】
対合ビオチニル化オリゴヌクレオチドプローブとＣＭＶ−ＤＮＡのハイブリッド形成に対するステムとアームの領域の効果を示す１２．５％未変性ポリアクリルアミドゲルの写真である。
【図６】
対合オリゴヌクレオチドプローブによるＣＭＶ−ＤＮＡのリサイクリングに対するアーム領域の長さの効果を示す１２．５％未変性ポリアクリルアミドゲルの写真である。
【図７】
鋳型ＤＮＡとプレハイブリダイズされた（＋）かまたはプレハイブリダイズされておらず（−）次いでＴａｑＩ（Ｔ）およびＢｓｔＢＩ（Ｂ）で開裂されたかまたは開裂されていない（Ｈ）単一のループ化オリゴヌクレオチドプローブのクロマトグラフィーによる分離を示す１２．５％未変性ポリアクリルアミドゲルの写真である。
【図８】
長い二本鎖標的ＤＮＡ（ｐ．ＣＭＶ−２６３．ｄｓ、表１）（図８ａ）または短い二本鎖標的ＤＮＡ（ｐ．ＣＭＶ−２．ｓｔ、表１）（図８ｂ）と反応させた、ハイブリッドを形成したループ化ビオチニル化オリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成していないループ化ビオチニル化オリゴヌクレオチドのクロマトグラフィーによる分離を示す１２．５％未変性ポリアクリルアミドゲルの写真である。
【図９】
一本鎖標的ＤＮＡ（アンチセンスＣＭＶ−２．ｓｔ、表１）または同じ長さのｄｓ標的ＤＮＡ（ｓｙｎ．ＣＭＶ−２．ｓｔ、表１）と反応させたループ化したビオチニル化オリゴヌクレオチドのクロマトグラフィーによる分離を示す１２．５％未変性ポリアクリルアミドゲルの写真である。
【図１０】
減少する濃度の一本鎖標的ＤＮＡとハイブリッドを形成させた後に酵素で配列させたループ化オリゴヌクレオチドプローブのクロマトグラフィーによる分離を示す１２．５％ポリアクリルアミドゲルの写真である。
【図１１】
開裂産物の蓄積に対する長いオリゴヌクレオチドと短いオリゴヌクレオチドのアンカーの効果を示す。
【図１２】
標的ＤＮＡ濃度の関数としてアンプリファイアの開裂産物の量を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成13年9月30日(2001.9.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に標的核酸配列が存在しているか否かを検出するのに有用なオリゴヌクレオチド系であって、オリゴヌクレオチド系はアンカーオリゴヌクレオチドおよびアンプリファイアオリゴヌクレオチドを含有し、前記アンカーおよびアンプリファイアオリゴヌクレオチドが各々、標的核酸配列とハイブリッドを形成できる第一領域を含有し、前記アンカーおよびアンプリファイアオリゴヌクレオチドが各々、さらに第二領域を含有し、前記アンカーおよび前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドの前記第二領域が、前記アンカーおよび前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドの前記第一領域が標的核酸配列とハイブリッドを形成した後、核酸開裂剤認識配列を含む二重らせん構造を形成することができ、前記アンカーおよび前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドは、前記核酸開裂剤認識配列を認識する核酸開裂剤の存在下、標的核酸配列とハイブリッドを形成するとき、前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドだけが前記核酸開裂剤によって開裂されるように選択され、前記アンカーオリゴヌクレオチドが安定したアンカーオリゴヌクレオチド−標的核酸配列とハイブリッドを形成するために標的核酸配列とハイブリッドを形成したまま、前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドの前記開裂が、標的核酸配列からの前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドの解離を誘導し、これによって第二および未開裂のアンプリファイアオリゴヌクレオチドが前記アンカーオリゴヌクレオチド−標的核酸配列のハイブリッドとハイブリッドを形成することができ、したがって前記アンカーオリゴヌクレオチド−標的核酸配列のハイブリッドを前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドに対してリサイクルすることができるオリゴヌクレオチド系。
【請求項２】
予め定められたハイブリッド形成条件下、前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドの前記第一領域が、前記アンカーオリゴヌクレオチドの前記第一領域が前記核酸標的配列と安定にハイブリッドを形成することができるときだけ、前記標的核酸配列と安定にハイブリッドを形成することができる請求項１に記載のオリゴヌクレオチド系。
【請求項３】
前記核酸開裂剤認識配列の一部を形成する前記アンカーオリゴヌクレオチドの少なくとも一つのヌクレオチドまたはヌクレオチド間結合が、前記核酸開裂剤による前記アンカーオリゴヌクレオチドの開裂を防止するように選択される改変を含む請求項１に記載のオリゴヌクレオチド系。
【請求項４】
前記二重らせん構造が、前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドの前記第二領域の一部分の自己アニーリングによって一部分形成される請求項１に記載のオリゴヌクレオチド系。
【請求項５】
試料中に標的核酸配列が存在しているか否かを検出するのに有用なキットであって、キットがアンカーオリゴヌクレオチドとアンプリファイアオリゴヌクレオチドを含有し、前記アンカーおよび前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドが各々、標的核酸配列とハイブリッドを形成できる特有の第一領域を含有し、前記アンカーおよび前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドが各々さらに第二領域を含有し、前記アンカーおよび前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドの前記第二領域が、前記アンカーおよび前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドの前記第一領域と標的核酸配列とのハイブリッド形成後、核酸開裂剤認識配列を含む二重らせん構造を形成することができ、前記アンカーおよび前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドが、前記核酸開裂剤認識配列を認識する核酸開裂剤の存在下、標的核酸配列とハイブリッドを形成するとき、前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドだけが前記核酸開裂剤によって開裂されるように選択され、前記アンカーオリゴヌクレオチドが安定したアンカーオリゴヌクレオチド−標的核酸配列のハイブリッドを形成するために標的核酸配列とハイブリッドを形成したまま、前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドの前記開裂が標的核酸配列からの前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドの解離を誘導し、これによって第二および未開裂のアンプリファイアオリゴヌクレオチドが前記アンカーオリゴヌクレオチド−標的核酸配列のハイブリッドとハイブリッドを形成することができ、したがって前記アンカーオリゴヌクレオチド−標的核酸配列のハイブリッドを前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドに対してリサイクルすることができるキット。
【請求項６】
予め定められたハイブリッド形成条件下、前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドの前記第一領域が、前記アンカーオリゴヌクレオチドの前記第一領域が前記核酸標的配列と安定にハイブリッドを形成することができる場合のみ前記標的核酸配列と安定にハイブリッドを形成することができる請求項５に記載のキット。
【請求項７】
前記キット中の前記アンプリファイアオリゴヌクレオチド量が前記キット中の前記アンカーオリゴヌクレオチド量の少なくとも１０倍である請求項７のキット。
【請求項８】
試料中に標的核酸配列が存在するか否かを検出する方法であって、下記ステップ：
（ａ）ハイブリッド形成条件下オリゴヌクレオチド系と試料を接触させて反応混合物を形成させ、前記オリゴヌクレオチド系がアンカーオリゴヌクレオチドおよびアンプリファイアオリゴヌクレオチドを含有し、前記アンカーおよび前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドが各々、標的核酸配列とハイブリッドを形成することができる第一領域を含有し、前記アンカーおよび前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドが各々、さらに第二領域を含有し、前記アンカーおよび前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドの前記第二領域が、前記アンカーおよび前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドの前記第一領域と標的核酸配列とのハイブリッド形成後、核酸開裂剤認識配列を含む二重らせん構造を形成することができ、前記アンカーおよび前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドが、前記核酸開裂剤認識配列を認識する核酸開裂剤の存在下、標的核酸配列とハイブリッドを形成するとき、前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドだけが前記核酸開裂剤によって開裂できるように選択され、前記アンカーオリゴヌクレオチドが安定したアンカーオリゴヌクレオチド−標的核酸配列のハイブリッドを形成するために標的核酸配列とハイブリッドを形成したまま、前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドの開裂が標的核酸配列からの前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドの解離を誘導し、これによって第二および未開裂アンプリファイアオリゴヌクレオチドが前記アンカーオリゴヌクレオチド−標的核酸配列のハイブリッドとハイブリッドを形成することができ、したがって前記アンカーオリゴヌクレオチド−標的核酸配列のハイブリッドを前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドに対してリサイクルすることができ、
（ｂ）予め定められた反応条件下、前記核酸開裂剤を前記反応混合物に添加し、その結果、標的核酸配列が試料中に存在している場合、前記核酸開裂剤認識配列が前記核酸開裂剤によって開裂され、次いで、
（ｃ）前記核酸開裂剤による前記核酸開裂剤認識配列の開裂を監視する、ステップを含んでなり、前記核酸開裂剤認識配列の前記核酸開裂剤による開裂が、オリゴヌクレオチド系が標的核酸配列とハイブリッドを形成していることを示し、したがって試料中に標的核酸が存在することを示す方法。
【請求項９】
前記ハイブリッド形成条件下、前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドの前記第一領域が、前記アンカーオリゴヌクレオチドの前記第一領域が前記核酸標的配列と安定にハイブリッドを形成できる場合のみ、前記標的核酸配列と安定にハイブリッドを形成することができる請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸開裂剤認識配列の一部分を形成する前記アンカーオリゴヌクレオチドの少なくとも一つのヌクレオチドまたはヌクレオチド間結合が、前記アンカーオリゴヌクレオチドの前記核酸開裂剤による開裂を防止するように選択される改変を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記二重らせん構造が、前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドの前記第二領域の一部分の自己アニーリングによって一部分形成される請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記アンカーオリゴヌクレオチドの前記第一領域の配列は、前記アンカーオリゴヌクレオチドが、前記予め定められた反応条件下、前記標的核酸配列とアニールしたままであるように選択されるが、前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドの前記第一領域の前記配列は、前記核酸開裂剤による前記核酸開裂剤認識配列の開裂後、前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドが、前記予め定められた反応条件下、前記標的核酸配列から解離するように選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記アンカーオリゴヌクレオチドの第一領域のＴｍが、前記アンプリファイアオリゴヌクレオチドの前記第一領域の前記Ｔｍより少なくとも１０℃高い請求項１２に記載の方法。
【国際調査報告】
2004512813.tif 000115
2004512813.tif 000116
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