(57)【要約】本発明は、サンプル物質を検体に分離するフリーフロー電気泳動方法に関する。本方法は、いくつかのステップ、すなわちサンプル物質を粗分別する第１のステップと、粗分別されたサンプル物質を精密に分別する少なくとも１つの第２ステップとから成る。これらのステップは、並列同時法、直列法、又はこれら２つの組み合わせで実行することができる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル物質を検体に分離するキャリアレス電気泳動方法であって、第１段階で、前記サンプル物質の粗分別を行い、少なくとも１つの第２段階で、前記粗分別されたサンプル物質の精密分別を行うことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記第１段階で、大きな線流速及び分離対象となる前記検体の短い移動経路を用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１段階では、前記第２段階よりも少ない数の分別サイトを用いることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
全段階を並列して同時に実行することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
段階の並列同時処理による実行と、少なくとも１つの段階の直列実行とを組み合わせることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
分離チャンバと、電極と、分別部と、サンプル投入部とを備え、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法を実行する電気泳動装置であって、前記分離チャンバが、独立した電極と独立した分別部と独立したサンプル投入部とをそれぞれ有する多数の独立した分離空間に分割されていることを特徴とする装置。
【請求項７】
隣接する分離空間が共通の電極を備えることを特徴とする請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記独立した分別部が異なる数の分別サイトを有することを特徴とする請求項６又は７に記載の装置。
【請求項９】
媒体を同じ体積だけ導入し且つ放出するために、定量ポンプの２つの独立した移送チャンネルが、前記分離空間の、電極近くの分別出口の領域に接続されていることを特徴とする請求項６〜８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１０】
前記分離チャンバは、それぞれ複数の独立した構造チャンバ要素から成る前部及び後部で構成されることを特徴とする請求項６〜９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１１】
前記後部が固体金属ブロックから成ることを特徴とする請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記金属ブロックが冷却パイプを備えることを特徴とする請求項１１に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、サンプル物質を検体に分離するキャリアレス電気泳動方法及びこの方法を実行する電気泳動装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
既知のキャリアレスＦＦＥ電気泳動方法は、独立した電極空間をただ２つ、及びこの電極空間の間に分離空間をただ１つ備えた分離チャンバを有する電気泳動装置で行われるのが普通である。
【０００３】
ところで、ＦＦＥをプロテオミクス研究の分野に用いる場合は、数多くの異なるサンプル物質を短時間で分離して、最大の分離量及びできるだけ高いサンプル物質のスループット率をあげる必要がある。
【０００４】
しかし、大部分の分離処理におけるように、ＦＦＥの場合、電気泳動装置を分離性能とサンプルスループットとについて同時に最適化することは非常に狭い範囲でしか可能ではない。これは、サンプル物質の量が増加すると分離性能が低下するからである。
【０００５】
また、分離性能を最適化するには、できるだけ狭くて精密な分離チャンバギャップを有する分離空間と、特定の分離境界条件、例えば比較的小さい線流速、できるだけ長い分離時間、並びに分離空間の全幅及び／又は分離空間の当該サンプル物質を分別する領域に渡るできるだけ多くの分別サイトなどが必要となる。しかし、線流速を自由に下げることは出来ないため、分離時間を延長するには電極の長さを相応に長くする必要がある。そしてこのことは、分離チャンバの外形寸法を同時に大きくする必要があることを意味するため、分離チャンバギャップを所望の精度で製造することが難しくなる。
【０００６】
ドイツ特許出願公開公報第２２１５７６１Ａ１号公報から、電気濾過処理によって作動する電気泳動装置が知られている。この既知の電気泳動装置は、分離チャンバと、分離チャンバの両側に配置された電極と、分別サイトと、サンプル投入サイトとを備える。分離チャンバ内には、分離チャンバを互いに接続された多数の分離空間に分割するいくつかのメンブレンが設けられる。メンブレンはフィルタとして機能し、いずれも分離対象となる種に対して透過性を有する。
【０００７】
欧州特許出願公開公報第０２０３７１３Ａ２号公報から、このような電気泳動装置において、メンブレンで区切られた分離空間の各々に対して、独立した１対の電極を設けることも知られている。
【０００８】
【特許文献１】
ドイツ特許出願公開公報第２２１５７６１Ａ１号公報
【特許文献２】
欧州特許出願公開公報第０２０３７１３Ａ２号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
このため、本発明の目的は、分離性能を向上し、分離時間を短縮し、高スループットを達成することが可能なキャリアレス電気泳動方法及びこの方法を実行する電気泳動装置を作成することにある。
【課題を解決するための手段】
この目的は、本発明によれば、請求項１に詳述のキャリアレス電気泳動方法によって達成される。
本発明に係る方法の特に好適な発展及び実施形態が、請求項２〜５の主題である。
本発明に係る電気泳動装置が、請求項６の主題である。
本発明に係る電気泳動装置の特に好適な発展及び実施形態が、請求項７〜１２の主題である。
【００１０】
本発明によれば、１段階の分離処理でなく２段階の分離処理が用いられるため、分離性能とサンプルスループットが同時に最適化される。この処理では、できるだけ高いサンプルスループットを達成するために極めて高速な予備分離もしくは粗分別を行い、次いで少なくとも第２段階で、粗分別されたサンプル物質の部分流に対して所期の精密分別を行う。
【００１１】
第１段階の粗分別におけるサンプルスループットの増大は、特に、線流速を大きくすると同時に分離対象となる検体の移動経路を短くしてＦＦＥによる分離処理を行うことで達成される。このため、粗分別用の分別サイトの数をかなり少なくすることが可能であり、１つのフラクションだけに注目するなら分別サイトを１つ設けるだけでもよい。この２段階処理を並列同時多重処理として実行することで、サンプルスループット率を更に上げることができる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の好適な実施例を、対応する図面を用いて更に詳細に説明する。
図１、図２及び図３に、本発明に係る分離チャンバの３つの例を、電気泳動装置の別々の実施例として図示する。分離チャンバが分離チャンバギャップを所要の精度で製造可能な外形寸法を有するように、いくつかの独立した分離空間を分離チャンバ内に設ける。図１では、４つの独立した分離空間に、４つの独立した媒体源と、それぞれｎ個（ｎは１５よりも小さい）の分別サイトを有する４つの独立した分別部とを設ける。図２は、２つの独立した分離空間と、それぞれｎ個（ｎは５０よりも大きい）の分別サイトを有する２つの独立した分別部への２つの独立した媒体入口とを有する分離チャンバを示す。最後に、図３は、３つの独立した分離空間と、３つの独立した媒体入口と、ｎ１個及びｎ３個（ｎ１は１５よりも小さく、ｎ３は５０よりも大きい）の分別サイトを有する２つの独立した分別部と、更に、ｎ２個（ｎ２は１５よりも大きい）の分別サイトを有する独立した分別部を備えた分離チャンバを示す。
【００１３】
図１〜図３に示す分離空間は、設計によって、独立した電極を備えるか、又は隣接する電極空間で同一の媒体を用いることが出来る場合には当該分離空間に共通の電極を備える。
【００１４】
図１〜図３に示す分離チャンバによると、キャリアレスＦＦＥ電気泳動を行って、少なくとも２段階処理の形でサンプル物質を検体へ分離することができる。第１段階では、サンプル物質の粗分別が行われ、少なくとも１つの第２段階では、粗分別されたサンプル物質の精密分別が行われる。
【００１５】
この処理は、並列同時処理として又は連続処理で行うことができる。並列同時処理においては、図１及び図２に示す分離空間を、粗分別ための分離空間（図１）及び精密分別のための分離空間（図２）として使用できる。図３は、３段階処理の形での連続処理用の分離空間を示す。ここでは、粗分別が、２段階の精密分別と直列に組み合わされている。
【００１６】
並列処理法の場合、１つのサンプル物質をいくつかの分離空間に同時に計量投入することが可能であり、異なるサンプル物質を独立した分離空間に適用することも可能である。並列同時処理でサンプル物質を分離することで、サンプル物質のスループット率またはサンプル物質数を増やすことができる。
【００１７】
独立した分離空間の幅を小さくすることで、検体の移動経路を短くすることができ、分離媒体及びサンプル物質の流速が大きい状態で分離処理を行うことができる。分離空間の数が増えるのに伴い、分離空間の幅は十分に小さくなるが、その結果として、サンプルスループットははるかに高くなるものの粗分別は１度しか可能ではなくなる。
【００１８】
分離空間を完全に独立した電極空間と直列に接続すると、１つの分離空間での分離で得られたフラクションが後続の分離空間において同じ分離条件で更に分別されるため、分離量を大きくすることができる。なお、直列接続された分離空間では、分離手法、分離媒体及び／又は使用する電気泳動分離パラメータ全体に関して別々の条件で分離操作を行うことも可能である。
【００１９】
分離空間及び個々の分離空間の技術設計は、上述の構造を用いて後述するようにほぼ自由に組み合わせることができる。
【００２０】
図４及び図５に示すように、分離チャンバは、２つのサブアセンブリ、すなわち分離チャンバの前部と分離チャンバの後部とから成るのが普通である。しかし、本発明に係る設計の場合、個々のサブアセンブリは、図４及び図５に図示するいくつかの独立した構造要素から成る。
【００２１】
詳しくは、図４に示す場合、硬質合成樹脂シート２と軟質合成樹脂シート３とを有する合成樹脂ブロック１から成る分離チャンバ前部と、ガラスシート１０と軟質合成樹脂シート１１とを有する金属ブロック８から成る分離チャンバ後部とが、スペーサ５を介して互いに隣接して配置される。合成樹脂ブロック１は、いくつかの（図示の実施例では、４つの）電極空間４を備える。金属ブロック８は、冷却パイプ９を備える。更に、媒体入口７と多数の分別サイト６が設けられている。図５に、分別済みサンプルの移動１２を示す。
【００２２】
図４の分離チャンバの前部のサブアセンブリは、結果として、基本構成ブロックすなわちプレキシグラス１の固体ブロックから成り、最大８つの電極空間４と、媒体フィーダ及び分別部の特定のメソッドモジュール用の開口とを収容している。この基本構成ブロック１に、硬質合成樹脂素材の薄いシート２が貼付される。後者は、当該用途に必要とされる合成樹脂ブロック１の電極空間領域のフローを搬送するための穴を有し、合成樹脂ブロック１の所要の電極空間を開口している。硬質合成樹脂シート２の、媒体フィーダ７及び分別部６の領域における設計についても同様である。分離空間に面する硬質合成樹脂シート２の表面は、直接化学的に変性しても良いし、図示のように合成樹脂シート３で覆っても良い。分離空間の直接の界面を形成する合成樹脂シート３の表面は、サンプル種の電気浸透及び吸着の影響が最小化される程度まで化学的に変性されている。
【００２３】
先述のように基本構成ブロック、すなわち合成樹脂ブロック１を、特定の用途に合わせて変性された２つの合成樹脂シート２、３と組み合わせることにより、必要な分離段数、分離空間の幾何学的配置、及び特殊な電気泳動境界条件に関する上述の全ての要件が、当該分離処理の段階で達成される。
【００２４】
図６及び図７に、分離チャンバの前部及び分離チャンバの後部の構造を詳細に示す。図７に示すように、分離チャンバの後部は、いくつかの層、すなわち金属ブロック８と、ガラスシート１０と、軟質合成樹脂シート１１とから成る。これらの層は、分離装置を当該用途に応じて最適化するために、様々に組み合わせることができる。
【００２５】
従って、分離チャンバの後部の基本構成ブロックである固体金属ブロック８は、外部冷却と組み合わせることで、電気泳動分離中に発生する熱を効果的に取り除くことができる。分離空間に面する金属ブロック８の表面は、ガラス製の薄い電気絶縁シート１０又はセラミックシートで覆われる。この電気絶縁シートを覆う合成樹脂シート１１の表面（分離空間との界面を直接形成する）は、分離処理を最適化するよう化学的に変性されている。一般に、分離空間に面する合成樹脂シート、すなわちシート３及び１１は、材料及び化学変性の種類が同一か又は類似していて良いが、特定の処理の組み合わせの場合には異なっていても良い。
【００２６】
図８、図９及び図１０に、本発明に係る方法に用いることができる様々な分別モジュールを示す。標準的な設計では、図８に示す分別モジュールは、分別用の３つの出口を有する。特殊な用途においては、それぞれ図９及び図１０に示すように、５つ又は７つの分別出口を設ける。これらの図では、分離媒体の流れの方向を矢印１３で表すとともに、クロスフロー用の供給サイト１４と、サンプル物質用のｎ個の分別サイト１５と、残りの媒体用のｎ＋１個の出口１６を示す。
【００２７】
動作中、定量ポンプの移送速度が等しい２つの独立した移送チャンネルが、分離空間の、電極近くの分別出口の領域にそれぞれ接続される。移送ポンプの回転の方向によって、一方の接続部を介して媒体が電極近くの分離空間に導入されるとともに、第２の接続部を介して媒体が分離空間から同じ体積速度で放出される。電極近くの分離空間において媒体を同時に導入し放出することにより、サンプルの分別サイトの領域におけるフロープロファイルが、図１１、図１２及び図１３に示すように変化する。
【００２８】
図１１は、２つの検体１７及び１８、クロスフロー用ポンプ２１、クロスフロー用フィーダライン２０、及びフロープロファイル用マスク１９を示す。図１１に、クロスフロー無しのフロープロファイルを示す。図１２は、クロスフローを開始した後のフロープロファイルを示す。図１３は、ポンプ２１の回転方向を逆にしてクロスフローを開始した場合のフロープロファイルを示す。
【００２９】
以下に、予備長期試験、すなわち２つの典型的な応用例におけるフラクションモジュールの動作を説明する。
【００３０】
所望の分離物質の予備分離中、２チャンネルポンプの移送速度を選択して、分離対象となる物質がこの目的のために設けられたサンプル出口を介して収集されるようにする。２チャンネルポンプの移送速度は、予備分離の時間中、変化しない。サンプル分別ライン内に放出された検体を僅かな時間遅れで量的に検出できる場合、分離処理を制御する検出信号を用いて、検体が最適な収率及び純度で分離できるようにすることが可能である。
【００３１】
一方、ポンプの移送速度が電気泳動分離処理中に連続的に変更される場合、次々と分離された物質がサンプル分別サイトを介して収集される。２チャンネルポンプの移送速度を変えることにより、また回転方向を変えることにより、全ての分離種を分別サイトを介して連続的に溶出し、続いて収集容器を時間制御またはピーク制御切替えしながら検出システムとフラクション収集装置とに引き渡すことができる。
【００３２】
サンプル分別サイトに向かって２０ｍｍを超えてサンプル帯を局所移動したい場合は、サンプル分別出口の数を増やすと良い。この数を自由に増やして分離空間の幅を大きくし、サンプルの最適な溶離性を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例における分離チャンバの設計の概略図である。
【図２】本発明の一実施例における分離チャンバの設計の概略図である。
【図３】本発明の一実施例における分離チャンバの設計の概略図である。
【図４】本発明の一実施例における分離チャンバの概略断面図である。
【図５】本発明の一実施例における分離チャンバの概略断面図である。
【図６】分離チャンバの前部の、媒体源の領域における構造を示す。
【図７】分離チャンバの後部の、分別部の領域における構造を示す。
【図８】異なる分別サイト及びクロスフローフィーダラインの相対的な空間配置を示す。
【図９】異なる分別サイト及びクロスフローフィーダラインの相対的な空間配置を示す。
【図１０】異なる分別サイト及びクロスフローフィーダラインの相対的な空間配置を示す。
【図１１】クロスフローによるフロープロファイルへの影響を示す。
【図１２】クロスフローによるフロープロファイルへの影響を示す。
【図１３】クロスフローによるフロープロファイルへの影響を示す。
【符号の説明】
１：合成樹脂ブロック
２：硬質合成樹脂シート
３：軟質合成樹脂シート
４：電極空間
５：スペーサ
６：分別サイト
７：媒体入口
８：金属ブロック
９：冷却パイプ
１０：ガラスシート
１１：軟質合成樹脂シート
１２：分別済みサンプルの移動
１３：分離媒体の流れ
１４：クロスフロー用供給サイト
１５：サンプル物質用分別サイト
１６：媒体用出口
１７：検体
１８：検体
１９：フロープロファイル用マスク
２０：クロスフロー用フィーダライン
２１：ポンプ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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2004516472.tif 000018
2004516472.tif 000019
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2004516472.tif 000029
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004516472.tif 000034
【国際調査報告】
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