(57)【要約】生細胞でのタンパク質相互作用をアッセイする方法を記載する。方法は、対象となる成分と第二成分との相互作用の有無を示す検出成分の細胞分布の測定を用いる。方法は、ある成分が、細胞内の所定位置に再分布するよう刺激できるとの知識を用いている。誘導性再分布系は、成分間で特異的な相互作用が生じる場合に測定することができる。再分布刺激が、再分布が誘導される成分以外の細胞の他の系にアッセイ中に影響しない、再分布刺激が本質的に「無効」であることが証明されている誘導系を記載する。また、細胞内成分の細胞内分布に影響する薬剤のハイスループットスクリーニングに有用な抽出緩衝液を記載する。抽出緩衝液は、細胞固定剤と細胞透過剤からなる。抽出緩衝液の組成の最適化及びその種々の細胞種への適用を記載する。
2004502434.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）　 第一の異種接合体が、検出基に接合される第一対象タンパク質からなり、
第二の異種接合体が、細胞内の内部構造に特異的に結合できるアンカータンパク質に接合される第二対象タンパク質からなる、
２つの異種接合体を含む細胞を準備し、
（ｂ）　２つの対象タンパク質間の結合を示すアンカー−タンパク質の細胞内分布を模倣する検出基の細胞内分布を検出し、
（ｃ）　化合物を用いて、また用いないで工程（ｂ）を繰り返す工程からなり、
化合物を用いる、又は用いない検出基の細胞内分布の変化が、タンパク質相互作用調節化合物を示す、
化合物が細胞内タンパク質相互作用を調節するかどうかを検出する方法。
【請求項２】
細胞内の内部構造物への特異的結合が、アンカー刺激の添加によって解消される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
特異的結合がフォルスコリンの添加によって解消され、アンカータンパク質がＰＫＡである前記請求項に記載の方法。
【請求項４】
アンカータンパク質がＰＫＡｃａｔαである前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
特異的結合がロリプラムの添加によって解消され、アンカータンパク質がＰＤＥ４Ａ１である前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
特異的結合がＡＴＰの添加で解消され、アンカータンパク質がＰＬＣ−デルタである前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
特異的結合がトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）の添加で解消され、アンカータンパク質がヒストンデアセチラーゼ５（ＨＤＡＣ５）である前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
細胞内の内部構造物への特異的結合が、独力で対象の細胞内のシグナル化活性を刺激又は阻害する見込みがほとんどないアンカー刺激によって誘導される前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
特異的結合がロリプラムの添加で誘導され、アンカータンパク質がＰＤＥ４Ａ４である前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
アンカータンパク質がＣｙｓ１ドメインである前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
検出基がＧＦＰである前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）　細胞成分に結合した発光団を含む細胞を、影響と、また影響なしに接触させ；
（ｂ）　細胞固定剤及び細胞透過剤からなる抽出緩衝液を工程（ａ）の細胞に加え；かつ
（ｃ）　工程（ｂ）の細胞由来の発光団から発せられる光を測定することからなり、
影響の存在、また不在で細胞から発せられる光強度の相違が、影響によって引き起こされる細胞成分の可動性の相違を示す、影響によって引き起こされる細胞成分の可動性変化の測定方法。
【請求項１３】
可動性の変化が、可溶性の細胞質状態〜結合性の細胞質状態、又はその逆の変化である、前記請求項のいずれかに記載の細胞成分の可動性変化の測定方法。
【請求項１４】
可動性変化が、可溶性の細胞質状態〜成分が細胞膜に結合した状態、又はその逆の変化である、前記請求項のいずれかに記載の細胞成分の可動性変化の測定方法。
【請求項１５】
可動性変化が、可溶性の細胞質状態〜成分が核に結合しているか、又は導入されている状態、又はその逆の変化である、前記請求項のいずれかに記載の細胞成分の可動性変化の測定方法。
【請求項１６】
可動性変化が、結合性の細胞質状態〜成分が核に結合しているか、もしくは導入されている状態、又はその逆の変化である、前記請求項のいずれかに記載の細胞成分の可動性変化の測定方法。
【請求項１７】
影響が、化学物質である前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
発光団が、細胞に収容されるヌクレオチド配列によってエンコードされ、またこれから発現されるポリペプチドである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
発光団が、一方が発光性ポリペプチドからなり、他方が細胞成分からなる２つのポリペプチドそれぞれの少なくとも一部の融合体からなるハイブリッドポリペプチドである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
発光ポリペプチドが緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
ＧＦＰが、Ｆ６４Ｌ突然変異を有するＧＦＰである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
ＧＦＰが、Ｆ６４Ｌ−ＧＦＰ、Ｆ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰ、Ｆ６４Ｌ−Ｓ６５Ｔ−ＧＦＰ、Ｆ６４Ｌ−Ｅ２２２Ｄ−ＧＦＰ及びＥＧＦＰからなる群から選択されるＧＦＰ変異体である前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
抽出緩衝液が、細胞固定剤としてホルマリンを含む前記請求項のいずれかに記載の細胞内再分布の測定方法。
【請求項２４】
抽出緩衝液が、細胞透過剤としてトリトンＸ−１００からなる、前記請求項のいずれかに記載の細胞内再分布の測定方法。
【請求項２５】
（ａ）　 物質の影響に関連して再分布しうる、及び／又は物質の影響に関連して再分布しうる成分と結合し得る発光団を含む機械的に無傷な生細胞又は機械的に無傷な生細胞群を基準化合物と接触又はインキュベートし；
（ｂ）　（ａ）の細胞に似た細胞を基準化合物なしに接触又はインキュベートし；
（ｃ）　細胞固定剤及び細胞透過剤からなる抽出緩衝液を、（ａ）及び（ｂ）の細胞に加え；
（ｄ）　発光団から発せられる光を測定し；
（ｅ）　細胞固定剤と細胞透過剤を種々の濃度で有する抽出緩衝液を用いて工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返し；
（ｆ） 工程（ｅ）で試験される各抽出緩衝液について、（刺激細胞中の蛍光−非刺激細胞中の蛍光）／ 非刺激細胞中の蛍光×１００％としてシグナル／ノイズ（ｓ／ｎ）割合を算出する工程からなり、
最適化された抽出緩衝液は、最も高いシグナル／ノイズ割合を伴う緩衝液である、抽出緩衝液の最適化方法。
【請求項２６】
細胞固定剤と細胞透過剤からなる抽出緩衝液。
【請求項２７】
抽出緩衝液が細胞固定剤としてホルマリンを含む前記請求項のいずれかに記載の抽出緩衝液。
【請求項２８】
抽出緩衝液が、細胞透過剤としてトリトン−Ｘを含む前記請求項のいずれかに記載の抽出緩衝液。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
分　野
この発明は、細胞に存在し、いずれもがほぼ通常は組成物中で全体に又は主としてタンパク様である２つの成分間の相互作用（つまり、相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用又はタンパク質−タンパク質結合事象である）の測定に関する。これは、現在、「相互作用タンパク質のＧＦＰ補助出力（ＧＦＰ ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｒｅａｄｏｕｔ ｏｆ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（ＧＲＩＰ）」」として言及されている。
また、この発明は、細胞内成分の細胞内分布に影響を及ぼす薬剤に対しハイスループットスクリーニングで使用される抽出緩衝液に関する。抽出緩衝液は、細胞固定剤及び細胞透過剤からなる。
【０００２】
背　景
相互の、及び他の細胞成分とのタンパク質の相互作用は、ほぼ全ての細胞過程に固有な部分であり、これは、特に細胞内シグナル化システムに当てはまる。情報は、このような一連の相互作用によるシグナル化系をとおして、またシグナル化系間でやりとりされる。タンパク質の機能を研究するために、実際的なストラテジは、最初にタンパク質が相互作用する成分を同定することである。これらの多くは他のタンパク質、時には同種のタンパク質であるが、最も頻繁には、極めて異なるタイプで、非常に異なる機能特性を有する。
【０００３】
新規な相互作用の同定は、細胞生物学及びシグナル変換において極めて急速に拡大している研究分野である。この分野での最近の発見に関して注目に値する性質は、細胞表面に見られるリガンド−レセプター相互作用に一般に認められる特異性の程度に匹敵するか、又はそれを超える、パートナーが相互作用する特異性である。相互作用する種の同定は、細胞シグナル化に関与するタンパク質の機能特性において非常に補助し得る新規なシグナル化相互作用を同定する機会をもたらす。さらに、その方法は、相互作用におけるパートナーを混乱させるか、又は束縛し得る新規な薬剤の開発に適用することができるであろう。この作用機序を有する化合物は、シグナル化経路を介して情報の流出を調節することができ、そうすることにおいて、ヒト及び動物の健康管理に関する非常に多くの分野での適用が見出されるであろう。そのような化合物は本質的に極めて選択的で、触媒活性の全体的な阻害に対する必要性なしにその作用を有するので、それらの使用に基づく治療は、多くの従来の活性部位阻害剤に一般的に伴われた、特異性の乏しさと、ダメージを与える副作用という問題を伴わないことが期待される。
【０００４】
相互作用種の同定のための既存の方法は、２つの群に分けることができる：第一は、インビトロで一緒にした多少の精製成分を用いてのみ作用し得る方法、例えば対象の成分が細胞環境から単離されるという共通の性質を持つ、表面プラスモン共鳴（微細な波長の方法）、タンパク質質量分析、蛍光相関分光及び異方性手段である。第二の群には、生細胞内で作用することを目的とする全ての方法が含まれる。これらのうち、多くは酵母細胞で作用するように開発されている（酵母２ハイブリッド（ｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄ）、リバース酵母２ハイブリッド及びその変異体）が、哺乳動物細胞系での使用に適合しているものもある。タンパク質の相互作用についての細胞の検出方法は、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ， Ａ．Ｒ．， Ｂｒｅｎｔ， Ｒ． （１９９９） （Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４（５４２２）：１９４８）によって十分に検証されている。これらの方法の多くは、従来の２−ハイブリッド法から派生している。その方法では、転写活性が、結合した「おとり（ｂａｉｔ）」及び「餌食（ｐｒｅｙ）」成分の相互作用を介して２分した転写因子を一緒にすることで開始されるが、他の方法は、インビボでの生化学的な機能の再構築に依っている。この結果、Ｒｏｓｓｉら（２０００） （Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：１１９−１２２）は、出力が転写ではなく、変異されたβ−ガラクトシダーゼ酵素の再構築である、哺乳動物細胞−ベースのタンパク質−タンパク質相互作用アッセイを開発した。テトラマー酵素の再構築によって、酵素活性をモニターすることができる。さらに、タンパク質−タンパク質の相互作用をモニターする方法は、光学的な出力、つまり蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、又は合致分析（蛍光相関分光の変形）、又は蛍光存在変化に基づいている。最後の３種は単純化されたインビトロ条件下でかなり一般的に適用されるが、生細胞のより複雑な環境に条件を移すための試みもなされている。
【０００５】
近年、Ｔｏｂｉａｓ Ｍｅｙｅｒは、２つの異種接合体を細胞に導入する方法を報告した （ＷＯ００／１７２２１）。第一の異種接合体は、検出基（例えばＧＦＰ）に接合した第一の対象タンパク質からなる。第二の異種接合体は、ホルボールエステルでの刺激により細胞内の内部構造に特異的に結合するタンパク質に接合した第二の対象タンパク質からなる。第二タンパク質が、既知の分布で細胞内の内部構造に結合している場合、２つの対象タンパク質間の結合は、検出基が細胞内の内部構造に結合して局在しているので、視覚化することができる。
【０００６】
細胞内器官又は区画に「固定」されていないが、サイトゾルで多少可動性のタンパク質（−ＧＦＰ）は、課される透過度によって主に決定される速度で、細胞透過により周囲の媒体に拡散する。洗剤は、膜を崩壊するのみならず、時間中、細胞内成分を崩壊する傾向があるため、透過によっては細胞内容物の放出を制御しがたい。これに加えて、膜にダメージを与えると、幾つかの非制御プロテアーゼ活性が開始され、同一の意図しない結果を伴う。この現象は、非洗剤性の透過（例えばジギトニン）を用いてもみられる。
【０００７】
固定剤は、顕微鏡用生物材料の調製に必要な処理中、細胞において構造上の完全性を保持するために一般に用いられる。細胞内のタンパク質構造の保持又は安定化を目的とする固定剤は、２つの群に分けられる； 有機酸又はアルコール（例えば酢酸、エタノール）のようなタンパク質を凝固する剤及びアルデヒド（例えばホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒド）のような架橋タンパク質が不溶性網になる剤である。このような剤による固定速度は、剤が達成し得る化学的な架橋又は凝固の速度と共に、細胞への浸透速度によって決定される。細胞固定の処理と方法は、完全に研究され、化学文献に記載されている（例えば、Ｆｉｘａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｂｙ Ｍ．Ａ． Ｈａｙａｔ， １９８１， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。
【０００８】
移動は、通常、成分と固定（又は実際上非可動性の）成分間の相互作用変化による、又は成分の位置もしくは区画の変化、例えば核外細胞質から核自体への移動による、細胞内の少なくともひとつのタンパク質の事実上の可動変化を伴う。相互作用又は区画の変化は、移動を構成する。再分布（Ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ（登録商標））は、測定可能な事象を移動させる技術である（ＷＯ９８／４５７０４）。移動は、対象成分が結合している成分、例えば対象成分を保持するモータータンパク質の可動性又は区画の変化を伴う可能性がある。幾つかの移動は、やや顕微鏡的な広がり、例えば細胞質中の可溶性シグナル化タンパク質と隣合うアクチンフィラメント又は細胞内膜との相互作用を伴う。あらかじめ可溶性成分の可動性は、そのような移動で大きく変化されるが、空間的な位置での変化は、顕微鏡的手段では解像できない可能性がある。この場合、再分布シグナルを顕在化するには、対象タンパク質の不動性形態から可動性形態を分離することが望ましい
【０００９】
通常、再分布（登録商標）は「画像化」によって測定され、非常に時間がかかり、ＨＴ型での薬剤スクリーニングに不都合である。
再分布（登録商標）アッセイは、しばしば特定の対象タンパク質（最も頻繁には、対象タンパク質とＧＦＰのような発光タンパク質との設計された融合タンパク質であるタンパク質）を安定的に発現する細胞系からなる。そのような細胞では、対象成分が、相互作用すべき細胞中の他の成分に対してある程度まで過剰発現される場合がある。これは、細胞で利用可能な限られた数のパートナー成分と物理的に相互作用できない過剰量の対象タンパク質によって、移動事象の遮蔽をもたらすことができる。そのような場合、過剰な対象成分の除去は、生じた移動の非遮蔽に十分であり得る。
透過前の細胞の固定は、そのような場合にいまだ成功していない。というのは、タンパク質全てが、固定剤の影響下でほぼ同程度まで事実上固定化され、その結果、細胞から特異的に除いたり、又は洗い出すことができないためである。
【００１０】
発明の要約
ＳｏｓとＧｒｂ２の相互作用は、種々の方法で測定することができる。実施例７に示すように、ＰＤＥ４Ａ４−ＳｏｓＡ接合体とＧｒｂ２−ＥＧＦＰ接合体で同時にトランスフェクトした細胞は、ＳｏｓＡとＧｒｂ２との結合を示している。実施例８では、接合体は、 ＰＫＡｃａｔ−ｈＧｒｂ２ 及びＥＧＦＰ−Ｓｏｓ−Ｃｔｅｒｍである。ＰＫＡｃａｔ接合体の利点は、ＰＫＡが優勢的にその制御サブユニットに結合するように細胞内のｃＡＭＰレベルが十分に低いままである限り、相互作用を視覚化するための特別な処理が不要であることである。実施例９では、接合体はＣｙｓ１−Ｇｒｂ２ 及びＥＧＦＰ−Ｓｏｓ−Ｃｔｅｒｍである。Ｃｙｓ１接合体の潜在的な利点は、接合体が、ＰＭＡ又は幾つかの他の活性化刺激での処理時に原形質膜に対して一対の成分を採用することである。この特別な位置は、研究される成分の相互作用を活性化するために必要である可能性がある。
【００１１】
実施例３は、各々が異種接合体を発現する２つのプラスミドの同時トランスフェクションによる細胞系の作製に一般的な方法を記載している。この実施例で例示されるように、アンカー−タンパク質としてＰＤＥ４Ａ４ベースのアンカープローブを用いることにより、２つの密集した集合物の平均がロリプラムでの処理によって形成される。これらの集合物は、ＰＤＥ４ＡのユニークなＣ−末端ペプチド配列に対する抗体を用いて直接検出することができる。密集した集合物（スポット）は、ロリプラムが除かれるか、又は特定のＰＤＥ４阻害剤群のひとつ（例えばＲＰ７３４０１）に対して競合した際に消失するであろう。ロリプラムでの処理が細胞における ｃＡＭＰレベルに影響を及ぼさないことに留意することが重要である（実施例１４）。
【００１２】
実施例４は、アンカー−タンパク質としてＰＫＡｃａｔαベースのアンカープローブを用いて、細胞質ｃＡＭＰ濃度が低い際に集合物が細胞質に形成されることを記載している。これらの集合物は、ＰＫＡｃ又はＰＫＡ制御サブユニットに対する抗体を用いて直接検出することができる。これらの集合物は、ｃＡＭＰ濃度が上昇すると、細胞質に分散する。
実施例５は、アンカー−タンパク質としてＰＤＥ４Ａ１ベースのアンカープローブを用いて、他の点では未処理の細胞の細胞質中に小さな核周囲スポットが形成されることを記載している。ＰＤＥ４Ａ１スポットは、ＰＤＥ４ＡのユニークなＣ−末端ペプチド配列に対する抗体を用いて直接検出することができる。これらのスポットは、ロリプラムが細胞に加えられると、細胞質に分散する。
【００１３】
実施例６は、アンカー−タンパク質としてＣｙｓ１ドメインベースのアンカープローブが、例えばＰＭＡでの処理により活性化されると、原形質膜へ再分布することを記載している。Ｃｙｓ１ドメインの局在化は、（ｍｙｃ又はｆｌａｇ配列が細胞をトランスフェクトするのに用いられる遺伝構築物に含まれる際には） ｍｙｃ又はｆｌａｇ抗原に対する抗体を用いて確認することができる。
【００１４】
この文書に記載されるように、固定剤の適用と透過は同時に、可動形態又は非固着形態を自由に細胞から放出させながら、対象タンパク質の固着物、拡散して限定される物又は大部分が不動性形態の物の局所濃度を保持することを目的とする。特に洗剤による細胞透過処理は、適当な時期に比較的不動性のタンパク質、固着タンパク質又は区画化タンパク質を細胞から除くと予測され、その結果、洗剤によって生じる透過と可溶化の速度と、架橋又は固定が生じる速度との均衡を図る必要がある。この均衡は、固定剤と透過剤の相対濃度を制御しながら、これらを注意深く選択することにより、また剤が作用する物理的かつ化学的条件（ｐＨ、浸透度又はイオン強度、温度）を制御することによって達成してもよい。
細胞内の器官及び区画を崩壊せずに「浮遊（ｆｌｏａｔｉｎｇ）」タンパク質を細胞から出すレベルまで透過を制御するため、細胞は透過処理中わずかに化学的に固定される。その目的は、まさに「非結合」タンパク質を細胞から出し、次いで残りを化学的に固定させることである。
【００１５】
この出願は、細胞内の複雑な細胞内挙動を容易に測定できる方法を開示する。実施例１０では、１４−３−３タンパク質とＢＡＤとの結合で生じるＢＡＤの可動性変化は、ＰＤＥ４Ａ４−１４−３−３ 及びＥＧＦＰ−ＢＡＤ 融合体を用いて測定される。ＰＤＥ４Ａ４−１４−３−３ タンパク質は、ロリプラムでの先立った処理によって細胞内のスポットに固着する。細胞透過剤及び細胞固定剤の組合せからなる緩衝液を用いてＧＦＰに融合した可溶性（又は可動性）ＢＡＤを抽出することによって、不動性ＧＦＰのみが細胞に残り、１４−３−３タンパク質への結合によって生じるＢＡＤの可動性変化は、蛍光強度変化として読み取ることができる。実施例１１は、ＮＦｋＢの刺激によってサイトゾルから核へのＮＦｋＢ（ｐ６５）の再分布（登録商標）に適用される同一の原理を示している。
細胞固定剤と細胞透過剤との最適比を同定するための抽出緩衝液の最適化を、実施例１２に例示する。
【００１６】
詳細な説明
この出願の対象である再分布−トラップ法は、ＰＤＥ４からの位置情報、ある観点では細胞中のＧＦＰ−標識蛍光プローブの分布を利用し、特定の成分間の相互作用の有無を示す点で上記の方法と異なる。上記のことは細胞の複雑な環境でのことであり、自然系で生じるのと同様に相互作用を調節し得る因子が影響する見込みがあるので、方法に重要な生理学的関連性を付加している。方法は、細胞が生きており、モニターされながら活性であることを意味する非−破壊性の蛍光画像化に基づくので、また例えばロリプラムでの非−妨害処理に基づいているので、再分布−トラップ法によっても過渡的又は暫定的な相互作用をモニターすることができる。過渡的又は暫定的な相互作用は、成分がホスホリル化されているか、又はさもなければ操作サイクル中に修飾されている（例えばシグナル伝達）際に生じてもよく、そのような修飾は、細胞内シグナル化経路の成分に共通である。方法が共有的な相互作用に依存しておらず、必要な成分が相互作用によって特異的な方向を有してもいないので、方法は、極めて高感度であり、低いアフィニティ相互作用さえ測定することができる。
【００１７】
したがって、ひとつの観点は、
（ａ）　 第一の異種接合体が、検出基に接合される第一対象タンパク質からなり、第二の異種接合体が、細胞内の内部構造に特異的に結合できるアンカータンパク質に接合される第二対象タンパク質からなる、
２つの異種接合体を含む細胞を準備し、
（ｂ）　２つの対象タンパク質間の結合を示すアンカー−タンパク質の細胞内分布を模倣する検出基の細胞内分布を検出し、
（ｃ）　化合物を用いて、また用いないで工程（ｂ）を繰り返す工程からなり、
化合物を用いての、又は用いないでの検出基の細胞内分布の変化が、タンパク質相互作用調節化合物を示す、
化合物が細胞内タンパク質相互作用を調節するかどうかを検出する方法に関する。
【００１８】
この発明による再分布−トラップ法は、多くのシグナル化成分が特異的な刺激又は処理によって細胞内で特異的な位置に再分布するとの事実を利用している。成分が何らかの方法で標識され、細胞中で視覚化されると、その位置は、多くの画像化に基づく技術によってモニターし、測定することができる。画像化技術は非破壊性であるので、生細胞で測定を行うことができ、この結果、活性過程は、過渡的な事象をモニターする必要があるような、必要な場合に、時間中追跡することができる。この出願は、細胞内成分間の相互作用を研究する系を作製するために、特定の成分がある刺激（「アンカー」刺激）を受けて再分布する知見をどのように利用できるかを詳述している。成分がある刺激によって既知の細胞位置に分布することが知られている場合、別の成分（「おとり」）を第一の物（「アンカー」）に共有的に結合させてもよく、適当なアンカー刺激を与えると、それが結合しているアンカー成分と同一の分布を細胞内で呈することが予測されるであろう。おとり成分と相互作用することが予想される別の成分（「餌食」）は、同一細胞に導入される。餌食成分は、細胞中で視覚化させる何らかの方法で標識される。相互作用が（おそらくは別の「相互作用刺激」を要して）おとりと餌食の間で生じるならば、餌食成分は、アンカー−おとり成分と同一の分布を細胞内で踏襲するが、それも適当なアンカー刺激が適用される場合のみである。したがって、この系を用いて、特定のおとり餌食相互作用と検出可能なおとり成分の分布に影響を及ぼす他の条件とを識別することができる。
【００１９】
したがって、再分布−トラップ法は、単離物中の成分が機能サイクルの一部として好ましい再分布を通常示していなくとも、細胞内の成分を相互作用することによって全体的な再分布を課すことができる。アンカー系は、相互作用している成分が、成分間の相互作用を通常は調節することが求められる影響を受けている細胞内の区画又は位置へ再分布するよう設計することができる。一例として、幾つかの成分は、原形質膜の平面に隔離された酵素によって通常はホスホリル化又は脱ホスホリル化される必要がある。そのような成分に対しては、アンカー刺激が原形質膜にアンカープローブを再分布するように選択し、相互作用している成分を適当に修飾できるアンカー系が適当である。そのようなアンカー系の例は、ＰＫＣγのＣｙｓ１ドメインベースの系であろう。
【００２０】
また、その方法は、局所特異的な状態が相互作用を生じるのに必要かどうかを研究する目的で細胞内の異なる位置に相互作用を標的化することができる。ひとつの具体例では、ひとつ又は双方の相互作用成分が核区画に標的化される。別の具体例では、ひとつ又は双方の相互作用成分は、ミトコンドリアの内外膜に標的化される。別の具体例では、ひとつ又は双方の相互作用成分は、ゴルジ体の異なる領域に標的化される。別の具体例では、ひとつ又は双方の相互作用成分は、限局性の接着複合体に標的化される。別の具体例では、ひとつ又は双方の相互作用成分が、Ｆ−アクチン鎖又は微小管束のような細胞骨格構造に標的化される。別の好ましい具体例では、ひとつ又は双方の相互作用成分は、原形質膜に標的化される。別の好ましい具体例では、ひとつ又は双方の相互作用成分は、ロリプラムの存在下でＰＤＥ４Ａ４によって形成されるような細胞質顆粒又は集合物に標的化される。
【００２１】
つまり、この発明の詳細な具体例は、細胞内の内部構造への特異的結合が、独力で対象細胞内のシグナル化活性を刺激又は阻害する見込みがほとんどないアンカー刺激によって誘導される方法に関する。
ロリプラム及びＲＳ２５３４４のような他の特異的なＰＤＥ４阻害剤に対するＰＤＥ４Ａ４の強力なアンカー反応のため、ＰＤＥ４Ａ４はアンカー種としてもっとも好ましい。さらに、アンカー部位に対するＰＤＥ４Ａ４の結合は、ＰＤＥ４Ａ４分子のＣ−末端に結合する追加部分の存在によって影響されないと思われ、これらの結合は非常に多様な大きさであってもよい（１０ｋＤａ未満から、少なくとも１５０ｋＤａまで）。したがって、この発明の詳細な具体例は、特異的な結合がアンカー刺激ロリプラムの付加によって誘導され、アンカータンパク質がＰＤＥ４Ａ４である上記方法に関する。
【００２２】
刺激−誘導性分布、例えばＰＤＥ４Ａ４アンカー又はＰＫＣαＣｙｓ１ドメインベースの分布の特別な有用性は、ある同じ細胞において、それ以前にはなかった特徴的な分布に切り替えることができることである。これは、あらかじめ、特徴的な分布が、純粋に、固着された検出可能な成分間の特異的な相互作用の結果であることを保証するだけでなく（刺激に応じたアンカー成分は、検出可能な成分によって修飾されない限り「不可視」である）、この相互作用が、アンカー成分の特異的かつ予想される分布を検出するように形成されるアッセイ機器によって測定できるシグナルを生じることも保証する。事実上、この後者の点は、測定機器又はアッセイ方法を再形成する必要なしに、多くの異なる相互作用を測定でき、アッセイできることを意味している。また、誘導刺激は、スクリーニングアッセイでの基準化合物を生じ、それにより、アッセイに対する最大及び最少の予想シグナルを測定することができる。
【００２３】
多くのシグナル化成分は、細胞内で特異的な位置を有し、特定の刺激又は処理によって再分布する。それらの成分が何らかの方法で標識され、細胞中で視覚化されると、幾つかの画像化に基づく技術によってその位置をモニターし、測定することができる。画像化技術は非破壊性であるので、生細胞で測定することができ、この結果、活性過程は、過渡的な事象をモニターする必要がある場合のような必要な際に、時間中追跡することができる。この出願は、細胞内成分間の相互作用を研究する系を作製するために、特定の成分がある刺激（「アンカー」刺激）を受けて再分布する知見をどのように利用できるかを詳述している。成分が本質的に特徴的な細胞分布を有することが知られていれば、別の成分（「おとり」）を第一の物（「アンカー」）に共有的に結合させてもよく、アンカー刺激がなければ、それが結合しているアンカー成分と同一の分布を細胞内で呈することが予測されるであろう。おとり成分と相互作用することが予想される別の成分（「餌食」）は、同一細胞に導入される。餌食成分は、細胞中で視覚化させる何らかの方法で標識される。相互作用がおとりと餌食の間で（おそらくは別の「相互作用刺激」を要して）生じるならば、餌食成分は、最初の環境での特異的な位置によってアンカー刺激が付加されなくても、アンカー−おとり成分と同一の分布を細胞内でも踏襲する。さらに、アンカー成分の本質的に特徴的な分布がアンカー刺激の適用によって解消されれば、そのような系は、特異的なおとり餌食の相互作用と、検出可能な餌食成分の分布に影響する他の条件とを識別するのに有用である。
【００２４】
したがって、再分布−トラップ法は、単離物中の成分が機能サイクルの一部として好ましい再分布を通常示さないとしても、細胞内の成分の相互作用によって全体的な再分布を課すことができる。アンカー系は、相互作用成分が成分間の相互作用を通常調節する必要のある影響を受けている細胞内の区画又は位置への再分布を達成するよう設計することができる。一例として、ＰＫＡのスポット様細胞質分布は、フォルスコリンの添加で解消することができる；ＰＤＥ４Ａ１のスポット様細胞質分布は、ロリプラムの添加で解消することができる；ヒストンデアセチラーゼ５ （ＨＤＡＣ５）のスポット様核分布は、トリコスタチンＡ （ＴＳＡ）によって解消され； 又はアンカータンパク質の細胞膜に対する特異的結合はＰＬＣ−デルタであり、ＡＴＰの添加で解消され、細胞質内に分布される。
【００２５】
特徴的な分布が特異的な刺激（アンカー刺激）、例えばＰＤＥ４Ａ１、ＰＫＡｃａｔ、ＰＬＣデルタ又はＨＤＡＣ５ベースの刺激によって分散又は解消されるこれらの系について、刺激は、特徴的な分布が、固着され、かつ検出可能な成分間の相互作用の結果であるか、又は細胞内の特徴的な分布を呈する検出可能な成分の幾らか本来的な傾向による結果であるかを確認する手段を提供している。このことは、相互作用についてのアッセイが測定されるある同一の細胞で確認することができる。刺激−誘導性分布を伴うので、アンカー成分について最初の特徴的な分布を有する系は、ある装置及びアッセイプロトコルの構成を用いて多くの異なる相互作用をアッセイできる利点を共有する。各場合のアンカー刺激は、スクリーニングアッセイの基準化合物を再提供し、それにより、アッセイについて最大及び最少の予想シグナルを測定することができる。アンカー刺激が分布を分散しているそれらの系の特に追加できる利点は、分布刺激での細胞の前処理又は同時処理が、アンカー刺激が試験される相互作用を直接又は間接に干渉し得るあらゆる可能性をアッセイ中に除外する必要のないことである。
【００２６】
用語「化合物」は、細胞系において生物学的機能を有するか、又は生物学的作用を発揮する何らかの試料を意味することを意図する。試料は生物物質の試料、例えば血液、血漿、唾液、乳、尿を含む体液、又は微生物もしくは植物の抽出物の試料、重金属又は毒素を含む汚染物質含有環境試料であってもよく、又は有機合成もしくは遺伝技術によって調製される化合物又は混合化合物を含む試料であってもよい。化合物は、タンパク質及びペプチドを含む、小さな有機化合物又は生体ポリマーであってもよい。
試験される化合物は、特別な相互作用刺激とみなすことができる。
【００２７】
多くの細胞系が、トランスフェクション用に存在する。少数の例が、クセノプスの卵母細胞又は昆虫細胞、例えばｓｆ９細胞系、又は健康な動物もしくは疾患動物から採取される組織あるいは器官から直接単離される哺乳動物細胞（原始細胞）、又は細胞培養条件下で無期限に複製し得る形質転換哺乳動物細胞（細胞系）である。しかし、使用する細胞は哺乳動物細胞であることが好ましい。これは、各細胞型に特異的な複雑な生化学的相互作用に起因している。用語「哺乳動物細胞」は、哺乳動物起源の何らかの生細胞を示すことを意図する。細胞は確立された細胞系であってもよく、その多くはＴｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ， ＵＳＡ）又は同様の細胞培養コレクションから入手可能である。細胞は、トランスジェニック動物由来組織を含む、哺乳動物組織由来の寿命が限られた原始細胞、又はトランスジェニック組織を含む哺乳動物組織由来の新たに確立された不死細胞系、又は哺乳動物起源の異なる細胞型を融合して得られるハイブリッド細胞もしくは細胞系、例えばハイブリドーマ細胞系であってもよい。細胞は、蛍光プローブの前に、又はそれに加えて、１以上の非天然遺伝子産物、例えばレセプター、酵素、酵素基質を任意に発現してもよい。好ましい細胞系には、繊維芽細胞由来の系、例えばＢＨＫ、ＣＨＯ、ＢＡＬＢ、ＮＩＨ−３Ｔ３、又は上皮細胞由来の系、例えばＨＵＶＥＣ、ＢＡＥ （ウシ動脈内皮）、ＣＰＡＥ （ウシ肺動脈内皮）、ＨＬＭＶＥＣ （ヒト肺微小管内皮細胞）、又は気道上皮起源の系、例えばＢＥＡＳ−２Ｂ、又は膵臓由来の系、例えばＲＩＮ、ＩＮＳ−１、ＭＩＮ６、ｂＴＣ３、ａＴＣ６、ｂＴＣ６、ＨＩＴ又は造血器官起源の系、例えば一次単離ヒト単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球走化因子及びリンパ球群、ＡＭＬ−１４、ＡＭＬ−１９３、ＨＬ−６０、ＲＢＬ−１、Ｕ９３７、ＲＡＷ、ＪＡＷＳ又は脂肪細胞起源の系、例えば３Ｔ３−Ｌ１、ヒト前−脂肪細胞、又は神経性内分泌起源の系、例えばＡｔＴ２０、ＰＣ１２、ＧＨ３、筋起源の系、例えばＳＫＭＣ、Ａ１０、Ｃ２Ｃ１２、腎臓起源の系、例えばＨＥＫ ２９３、ＬＬＣ−ＰＫ１、又はニューロン起源の系、例えばＳＫ−Ｎ−ＤＺ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）、ＨＣＮ−１Ａ、ＮＴ２／Ｄ１が含まれるが、これに限定されない。
【００２８】
この発明の実施例は、ＣＨＯ細胞に基づいている。したがって、繊維芽細胞由来細胞系、例えばＢＡＬＢ、ＮＩＨ−３Ｔ３及びＢＨＫ細胞が好ましい。
２つの異種接合体は、トランスフェクト細胞が第一及び第二の異種接合体の双方を同時に発現し、組み込むように、プラスミド、例えばＦｕｇｅｎｅのような適当なトランスフェクション剤での細胞への適用によって混合される２つの個々のプラスミドとして細胞に導入されることが好ましい（実施例３、実施例４、実施例５及び実施例６参照）。ひとつ又は双方の接合体の導入のための多くの他の手段は、一様に実行可能な手段、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、マイクロインジェクション、アデノウイルス及びレトロウイルス法、両接合体をエンコードする２シストロン性（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）プラスミドなどである。
【００２９】
この発明をとおして、用語「タンパク質」は一般的な意味を有するべきである。それには、翻訳産物のみならず、化学的な合成タンパク質が含まれる。細胞内で翻訳されるタンパク質については、天然の、又は誘導される、翻訳後修飾、例えばグリコシル化及び脂質化が起こることが予想され、それらのタンパク質は依然として考慮されるタンパク質である。
細胞内タンパク質相互作用の用語は、同一細胞内の上記のような２タンパク質間の相互作用の一般的な意味を有する。相互作用は、もっとも通常は、その物理−化学的性質が、多少特異的に認識し、その後、関与する２タンパク質成分間の相互作用を可能にする、各タンパク質の１以上の領域又はドメイン間のタンパク質成分間の非共有力に起因している。好ましい具体例では、細胞内相互作用は、タンパク質−タンパク質結合である。
【００３０】
発光団は、光を発することによって、成分の空間分布を視覚化及び／又は記録することができる。この発明の好ましい観点では、発光団は、成分と実質的に同様にして再分布することができる。さらに別の発明の具体例では、発光団は、経路の調節によって分布される成分との空間的な結合によって消光することができ、消光は、発光の強度又は寿命の変化として測定される。
好ましい観点では、発光団は蛍光団である。この発明の好ましい具体例では、発光団は、細胞又は細胞類に収容されるヌクレオチド配列によってエンコードされ、発現されるポリペプチドである。例えば、発光団は、一方が発光ポリペプチドからなり、他方が成分からなる２つのポリペプチドの少なくとも各部分の融合体からなるハイブリッドポリペプチドの一部である。実施例がＧＦＰを用いて行われるように、ＧＦＰが特に好ましい。
【００３１】
この明細書で、用語「緑蛍光タンパク質」（ＧＦＰ）は、（例えばＣｈａｌｆｉｅ， Ｍ．ら、（１９９４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３， ８０２−８０５によって記載されるように）細胞での発現時に正確な励起波長光への暴露によって蛍光を発するタンパク質を示すことを意図する。１以上のアミノ酸が置換、挿入又は欠失されているような蛍光タンパク質も、「ＧＦＰ」と称する。ここで使用される「ＧＦＰ」には、クラゲＡｅｑｕｏｒｅａ Ｖｉｃｔｏｒｉａ又は腔腸動物類の他のメンバーから得られる野生型ＧＦＰ、例えばＤｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ．の赤色蛍光タンパク質（Ｍａｔｚ， Ｍ．Ｖ．ら． １９９９， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７： ９６９−９７３）、又は他の動物、菌類もしくは植物由来の蛍光タンパク質、及びＨｅｉｍら（Ｈｅｉｍ， Ｒ．ら、１９９４， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ９１：２６， ｐｐ １２５０１−１２５０４）によって開示されたＧＦＰの青色蛍光変異体のようなＧＦＰ修飾型、及びＧＦＰ蛍光のスペクトル特性を変える他の修飾型、あるいは１９９７年３月２７日にＷＯ ９７／１１０９４として公開され、ここに引用により導入されたＰＣＴ／ＤＫ９６／０００５１に記載の約３０℃より高温での細胞での発現時に増大した蛍光を示す修飾型が含まれ、それは、発光団から１つ上流位置にあるアミノ酸が突然変異され、この発明の蛍光タンパク質を細胞で発現する際に蛍光強度を増すＡｅｑｕｏｒｅａの緑蛍光タンパク質由来の蛍光タンパク質又はその機能類似体からなる。好ましいＧＦＰ変異型は、Ｆ６４Ｌ−ＧＦＰ、Ｆ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰ、Ｆ６４Ｌ−Ｓ６５Ｔ−ＧＦＰ、Ｆ６４Ｌ−Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰである。この発明の全ての観点での使用に特に好ましいＧＦＰ変異型は、ＥＧＦＰである（哺乳動物細胞での発現に最適化されたコドンを有するＦ６４Ｌ−Ｓ６５Ｔ 変異型である、ＥＧＦＰをエンコードするＤＮＡは、ＥＧＦＰ ＤＮＡ配列を含むＣｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏのプラスミドから入手可能である（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｕ５５７６２、 Ｕ５５７６３参照））。別の特に好ましいＧＦＰ変異型は、Ｆ６４Ｌ−Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰである。実施例で用いられるように、検出基は好ましくは緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。ＧＦＰは、好ましくはここで定義されるＦ６４Ｌ突然変異を有するＧＦＰ、例えばＦ６４Ｌ−ＧＦＰ、Ｆ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰ、Ｆ６４Ｌ−Ｓ６５Ｔ−ＧＦＰ、ＥＧＦＰ及びＦ６４Ｌ−Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰからなる群から選択される。ＧＦＰは、任意にペプチドリンカーを介して、生物学的に活性なポリペプチド又はその一部又はそのサブユニットにＮ− 又はＣ−末端タッグされる。
【００３２】
代替的な具体例では、検出基は、インサイトゥで又はマイクロインジェクションによって化学蛍光団で標識されるか、さもなければ細胞に導入される。さらに別の具体例では、検出基は、蛍光団でタッグされているか、又はビオチン−ストレプトアビジン標識法もしくは蛍光団で標識した二次抗体によって検出し得るために、他の方法で検出可能な抗体に対するエピトープを含む。そのようなエピトープの例は、蛍光団でタッグされているか、又はビオチン−ストレプトアビジン標識法もしくは蛍光団で標識した二次抗体によって検出し得るために、他の方法で検出可能な抗体で検出され得るｍｙｃ又はｆｌａｇ抗原のような検出性ｔａｇを含む。
ここで使用されるような内部構造物は、細胞内に含まれる異なる個別の同一とみなし得る成分を意味する。そのような内部構造物は、一般に、それらを含む細胞の解剖学的構造物である。内部構造物の例には、サイトゾル又は核外の細胞質に局在する構造物（細胞質構造物とも称する）及び核内に局在する構造物（核構造物）の双方が含まれる。核膜を含む核自体は、内部構造物である。
【００３３】
検出基の記録は、選択される検出基に伴って変化するであろう。例えば、ＧＦＰが検出基として使用される際には、発せられた光は、当業者に公知の種々の装置を用いて測定することができる。一般に、そのような装置は、以下の部分からなる： （ａ）光源、（ｂ） 発光団の発光を励起させる光源からの光の波長の選択方法、（ｃ）励起光を迅速にブロックするか、又は残りの系に通すことのできる装置、（ｄ）励起光を試験片に運搬し、発せられた蛍光を空間的な解像様式で集め、この蛍光発光（又は検出及び測定方法に関連する別タイプの強度マップ）から画像を形成する一連の光学素子、（ｅ）一連の光学素子に対し所定のジオメトリーで測定される細胞容器を収容するベンチ又はスタンド、（ｆ）好ましくは画像形態で光強度を記録するための検出器、（ｇ）コンピューター又は電子系及び記録された情報及び／又は画像を獲得して蓄積し、記録画像から再分布の程度を計算するための関連ソフトウエア。
【００３４】
この発明の好ましい具体例では、装置系は自動化される。ひとつの具体例では、上記ｄ及びｅ部分は蛍光顕微鏡からなる。ひとつの具体例では、上記ｆ部分はＣＣＤカメラである。ひとつの具体例では、上記ｆ部分は光電子増倍管／装置のアレイである。
この発明のひとつの具体例では、実際の蛍光は、マイクロタイタープレート用の標準型蛍光光度計（蛍光プレートリーダー）で測定される。
ひとつの具体例では、光学走査系は、発光又は蛍光における変化の時間−解像記録が全空間制限から同時に成し得るように、マイクロタイター型プレートの底を照らすために用いられる。
【００３５】
ひとつの具体例では、画像は、光学走査系によって形成され、記録される。好ましい具体例では、実際の発光又は蛍光測定は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｉｎｃ．から市販されているＦＬＩＰＲ（登録商標）機器でなされる。
細胞内経路に対する影響又は影響の結果に応じた細胞応答の程度を示す定量情報は、関連する特異的な影響の既知の程度に対して、同様に記録される、応答又は結果に基づく所定の較正による記録又は記録類から抽出される。この結果、影響によって引き起こされる再分布の程度は、同程度の細胞応答を引き起こす関連する特異的な影響の用量として示される。未知の影響、例えば細胞成分の再分布に対する影響が知られていない新たな化学物質又は化学品を試験することによって、再分布に影響を有する薬剤のスクリーニングアッセイが達成される。
【００３６】
これらの科学的かつ知的な知見に基づけば、この発明は、
分子間レベルの細胞成分間の相互作用をモニターするための細胞アッセイをつくり、細胞成分間の過渡的な相互作用をモニターするための細胞アッセイをつくり、
細胞成分間の暫定的な相互作用をモニターするための細胞アッセイをつくり、
互いに対して親和性の低い成分間の相互作用をモニターするための細胞アッセイをつくり、
特定の分子成分、例えばシグナル化分子種の可動性が条件付きで制限（監禁）され、その種の活性について機能的なノックアウトを達成し得る細胞試験系をつくり、
特定の分子成分、例えばシグナル化分子種の可動性が条件付で放出（分散）され、その種の活性について機能的なノックイン（ｋｎｏｃｋ−ｉｎ）を達成し得る細胞試験系をつくり、
特定成分間の相互作用事象が特定の位置に制限される細胞系をつくる
ために特に有用である。
【００３７】
使用例は、
相互作用の阻害剤を見出すための細胞アッセイ、
相互作用の活性因子を見出すための細胞アッセイ、
ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって、いずれかの特異的な細胞成分に対する新規な結合パートナーを同定するための細胞アッセイ、
生物学的利用能の可能性を示すために、細胞膜の浸透能について活性化合物を自動的にスクリーンするための細胞アッセイ、
アッセイ中に化合物の細胞代謝及び排出を示すために、細胞環境での安定性について化合物を自動的にスクリーンするための細胞アッセイ、
特定の細胞成分の機能を研究するための細胞試験系、
オーファンレセプター及び／又はオーファンリガンドによって使用されるシグナル化経路を同定するための細胞アッセイ、
相互作用モジュレーターについてのハイスループットスクリーニングにおける細胞アッセイ
である。
【００３８】
この発明の幾つかの特徴：
哺乳動物細胞アッセイにより相互作用について生理学的に関連する状況を提供し、因子の影響が天然系、例えば完全なヒト系の細胞で、相互作用を調節し得ることを可能にする、
再分布−トラップ構想が、生細胞又は化学的に固定された細胞を用いる、多様な蛍光画像化法に適合している、
再分布−トラップ構想に基づくアッセイの何らかの反応を、経時的な応答を作成するために、時間中、逐次的な測定として連続的に、又は１点測定（ｓｉｎｇｌｅ ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）によりモニターすることができる（経時測定は終始、生細胞を要する。１点測定は生細胞又は化学的に固定した細胞で成すことができる）、
方法が、ロー（ｌｏｗ）スループットならびにハイスループット測定に対応できる、方法が、哺乳動物細胞に有用である（哺乳動物細胞は、植物又は酵母細胞のような菌由来の細胞と異なって細胞壁を有しない。細胞壁は、化合物が細胞に入るのを妨げることができる）。
【００３９】
上記のタンパク質相互作用の測定は、そのような相互作用を調節する化合物の同定／スクリーニングに理想的である。そのようなアッセイ及びハイスループットでの他のアッセイを実施するために、この発明のひとつの観点は、影響によって引き起こされる細胞成分の可動性変化を測定する方法に関する。その方法は、
（ａ）　細胞成分に結合した発光団からなる細胞を、影響と、また影響なしに接触させるか、又はインキュベートし；
（ｂ）　細胞固定剤及び細胞透過剤からなる抽出緩衝液を工程（ａ）の細胞に加え；かつ
（ｃ）　工程（ｂ）の細胞由来の発光団から発せられる光を測定することからなり、
影響の存在又は不在で細胞から発せられる光の相違が、影響によって引き起こされる細胞成分の可動性の相違を示す。原則は、刺激によって移動しているか、又は移動していない発光団−成分結合を除くことである。
【００４０】
この発明のひとつの主要な利点は、可動性変化が光強度の変化として測定できることである。後述されるように、また実施例に記載されるように、この技術により蛍光強度変化として再分布（登録商標）を検出することができる。
多様な機器が、光強度を測定するために存在する。発光団がＧＦＰである、この発明の好ましい観点では、発光団から発せられる光の測定機器はＦＬＩＰＲ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）である。代替的な具体例では、発光団から発せられる光はプレートリーダーで測定される。この技術は、４時間／プレート（画像化）のスクリーン時間から約３０秒／プレート（つまり４８０倍早い）まで、ＮＦｋＢアッセイ（実施例１１）のような改良された再分布（登録商標）アッセイ及びＰＤＥ４Ａ４−トラップ（実施例１０及び実施例１２）のようなＴＲＡＰアッセイを有している。
【００４１】
この出願をとおして、可動性変化は、成分が影響との接触又はインキュベーション前後のいずれかで実質的に固定していることで特徴付けられる。実質的な固定とは、抽出工程中に成分が検出域外に移動しないものとして定義される。細胞を抽出後に洗浄すると、検出域は、本質において細胞（又は浸透して化学的に固定されている際に、細胞から出されたものすべて）であろう。一般的な概要では、成分の可動性変化は、細胞成分と結合しているか、又はそれに付着している成分によって引き起こされる。例えば、不活性型ＰＫＡｃａｔ−ＧＦＰの多くは細胞質でスポットして凝集する。ＰＫＡｃａｔスポットは、活性化によって、個々のＰＫＡｃａｔ 分子がより可動性であるサイトゾルに解散する。
【００４２】
この発明のひとつの観点で、固定は、細胞内分布が未知の結合パートナーへの成分の結合によって引き起こされる。この発明の具体例では、結合パートナーは、実質的に不動性の細胞内分布が知られているタンパク質と融合され、成分は依然として発光団に結合される。この結果、成分と結合パートナーとの結合は、成分を実質的に固定するであろう。
ひとつの観点において、可動性変化は、可溶性細胞質状態〜結合性細胞質状態の変化である。つまり、細胞器官への結合、例えばＩＲへの結合である。別の観点では、可動性変化は、結合性細胞質状態〜可溶性細胞質状態の変化である。
【００４３】
ひとつの観点では、可動性変化は、可溶性細胞質状態〜成分が細胞膜に結合している状態の変化である。別の観点では、可動性変化は、成分が細胞膜に結合している状態〜成分が細胞質で可溶性の状態の変化である。ひとつの観点では、可動性変化は、可溶性細胞質状態〜成分が核に結合又は導入されている状態の変化である。別の観点では、可動性変化は、成分が核に結合又は導入されている状態〜可溶性細胞質状態の変化である。
ひとつの観点では、可動性変化は、結合性細胞質状態〜成分が核に結合又は導入されている状態の変化である。別の観点では、可動性変化は、成分が核に結合又は導入されている状態〜結合性細胞質状態の変化である。
細胞での結合は、内部構造物、例えば細胞器官、膜、細胞骨格又は分子構造物によって媒介されるものと予想される。
【００４４】
キナーゼ、プロテインキナーゼ及びホスファターゼを含む細胞内リン酸化及び脱リン酸化過程に関与する酵素のみならず、細胞内シグナル形質導入で重要な役割を果たす細胞骨格を構成するタンパク質のように、細胞成分が細胞内シグナル化経路に寄与することが好ましい。より好ましい具体例では、細胞成分は、プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ又は転写因子である。
この発明の好ましい具体例では、影響は、機械的に無傷な生細胞又は機械的に無傷な生細胞群と化学物質との接触及び／又は機械的に無傷な生細胞又は機械的に無傷な生細胞群と化学物質とのインキュベーションである。
ひとつの具体例では、この発明は、化合物ライブラリーのような未知の影響の作用を標準条件下の既知の基準化合物の影響と比較できるスクリーニングプログラムに基づいて使用される。
【００４５】
抽出緩衝液は、細胞固定剤及び細胞透過剤からなる。
この発明のひとつの観点では、細胞固定剤は、タンパク質凝固剤もしくはタンパク質架橋剤、例えばエタノール、酢酸、アクロレイン、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、過マンガン酸カリウム、タンニン酸、パラホルムアルデヒドのひとつ又は混合物である。もっとも好ましい固定剤は、ホルマリンである。
この発明の別の観点では、細胞透過剤は、細胞の原形質膜を穿孔し得る剤、例えばストレプトリジンＯ、又はアニオン性、ノニオン性、双性イオンもしくはカチオン性界面活性剤又は界面活性剤緩衝液、例えばラウリル硫酸塩、デオキシコール酸、ジギトニン、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ） Ｆ６８、サポニン、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ノニデット（ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０、ＣＨＡＰＳ、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド又は塩もしくはジギトキシンのような浸透ショック誘導剤のひとつもしくは混合物である。もっとも好ましい透過剤は、トリトンＸ−１００である。
【００４６】
実験に適当な細胞型を支持するいずれの塩基性緩衝液も使用することができる。ひとつの好ましい塩基性緩衝液は、通常ＰＢＳである。最終的な洗浄緩衝液は、ＧＦＰから最大蛍光を得るのに適当なｐＨ、例えばｐＨ７．５〜９．０、もっとも好ましくはｐＨ８．５で注意深く緩衝されるべきである。緩衝能は、洗浄後に細胞中又はその周囲に残存し得るホルマリン及びヘキスト染色の残量の作用を妨げるのに十分であるべきである。
固定剤と透過剤の割合は、本質的に重要である。一方では、細胞は細胞から可動性の成分を拡散させるように透過される必要があり、他方では、細胞は、全細胞画分の拡散を妨げるよう化学的に固定される必要がある。実施例１０〜１２に示すように、最適比は細胞種、より重要なことには（先に論じたように）不動性の成分及び種類によるので、各場合に割合を最適化することが最も重要である。０．１％ホルムアルデヒド及び０．１％トリトンＸ−１００からなる抽出緩衝液は、我々の手法では、これらの濃度が最適ではなくても常にアッセイを向上するので、良好な開始点であることが分かっている。
【００４７】
固定剤と透過剤の割合を最適化するためには、以下の工程が行われる：
（ａ）　発光団を含む細胞を基準化合物と接触させ；
（ｂ）　（ａ）の細胞に似た細胞を基準化合物なしに接触又はインキュベートし；
（ｃ）　細胞固定剤及び細胞透過剤からなる抽出緩衝液を、（ａ）及び（ｂ）の細胞に加え；
（ｄ）　発光団から発せられる光を測定し；
（ｅ）　細胞固定剤と細胞透過剤を種々の濃度で有する抽出緩衝液を用いて工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返し；
（ｆ） 工程（ｅ）で試験される各抽出緩衝液について、（刺激細胞中の蛍光−非刺激細胞中の蛍光）／ 非刺激細胞中の蛍光×１００％としてシグナル／ノイズ（ｓ／ｎ）割合を算出し、
最適化された抽出緩衝液は、最も高いシグナル／ノイズ割合を伴う緩衝液である。
基準化合物は、成分について高度な可動性変化を引き起こすことが知られた化合物である。
【００４８】
細胞内再分布の測定時にバックグラウンドの蛍光を低下させる方法は、
（ａ）　物質の影響に関連して再分布しうる、及び／又は物質の影響に関連して再分布しうる成分と結合し得る発光団を含む機械的に無傷な生細胞又は機械的に無傷な生細胞群を物質と接触又はインキュベートし；
（ｂ）　細胞固定剤及び細胞透過剤からなる抽出緩衝液を細胞に加え； かつ
（ｃ）　空間分布光の分布を測定する
工程からなる。
【００４９】
実施例
実施例１： プローブ及び融合体の構築：
ＰＳ４６２は、ＣＭＶプロモーターの制御下でＰＤＥ４Ａ４とＥＧＦＰの融合体を含み、選択マーカーとしてＧ４１８耐性を有する。ＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ融合体を構築するために、全ＰＤＥ４Ａイソ型に共通のＨＳＰＤＥ４Ａ４の約１．９ ｋｂのＣ−末端部分（ＧｅｎＢａｎｋ アクセス番号 Ｌ２０９６５）を、後述のプライマー４Ａ−Ｃｔ−トップ及び４Ａ −ボトムでのＰＣＲを用いて増幅する。トッププライマーの配列はサイレント突然変異を含み、これにより、共有される４Ａ領域の最初に正確にＤｒａ１部位を導入する。ボトムプライマーは、停止コドン、ＢａｍＨ１ クローニング部位、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１へのクローン時にリーディングフレームを保存するための２つの余分なヌクレオチドのない共通のＣ−末端配列を含む。ＨＳＰＤＥ４Ａ４のユニークな約０．８ ｋｂのＮ−末端部分は、後述の４Ａ４−トップ及び４Ａ４Ｎ−ボトムのプライマーで５％ ＤＭＳＯ の存在下ＰＣＲを用いて増幅される。トッププライマーは、ＡＴＧに続く特定のＨＳＰＤＥ４Ａ４配列、コザック（Ｋｏｚａｋ）配列及びＨｉｎｄ３クローニング部位を含む。ボトムプライマーは、ユニークな４Ａ４ Ｎ−末端部分と共通の４Ａ Ｃ−末端部分の接合点にわたっており、共有される４Ａ 領域の最初に正確にＤｒａ１部位を導入するサイレント突然変異変異を含む。ＰＣＲ産物を適当な制限酵素で消化し（ユニークなＮ−末端部分についてはＨｉｎｄ３ 及びＤｒａ１ならびに共通のＣ−末端部分についてはＤｒａ１及びＢａｍＨ１）、Ｈｉｎｄ３とＢａｍＨ１で消化したｐＥＧＦＰ−Ｎ１ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ； ＧｅｎＢａｎｋ アクセス番号Ｕ５５７６２）に共に連結する。これにより、ＣＭＶプロモーターの制御下でＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ融合体を生じる。得られたプラスミドをＰＳ４６２ （Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ （ＤＳＭＺ） に２０００年４月１７日に ＤＳＭ １３４５０でブダペスト条約の下で寄託）と称する。
【００５０】
４Ａ−Ｃｔ−トップ： ５’−ＧＴＴＴＡＡＡＡＧＧＡＴＧＴＴＧＡＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＣ−３’
４Ａ−ボトム： ５’−ＧＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＧＴＡＧＧＧＴＣＴＣＣＡＣＣＴＧＡ−３’
４Ａ４−トップ： ５’−ＧＴＡＡＧＣＴＴＧＣＧＣＣＡＴＧＧＡＡＣＣＣＣＣＧＡＣＣ−３’
４Ａ４Ｎ−ボトム： ５’−ＧＧＴＴＴＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＣＧＡＧＧＣＣＡＴＣＴＣＧＣＴＧＡＣ−３’
【００５１】
プラスミドＰＳ６４２はＣＭＶプロモーターの制御下でＰＤＥ４Ａ４とＳＯＳ１の融合体を含み、選択マーカーとしてゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）耐性を有する。ＰＳ６４２は、ＰＳ４６２由来のＰＳ６１４から誘導される。
ＰＳ４６２は、上記のように構築される。ＰＳ４６２でのネオマイシン耐性マーカーは、ネオマイシンを切出すＡｖｒ２でＰＳ４６２を消化し、ゼオシン耐性をエンコードする約 ０．５ ｋｂのＡｖｒ２ フラグメントとベクターフラグメントを連結することにより、ゼオシン耐性マーカーと置換される。このフラグメントは、鋳型としてｐＺｅｏＳＶ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに後述のプライマー９６５５及び９６５８を用いるＰＣＲにより単離される。プライマーは、いずれもＡｖｒ２クローニング部位を含み、その大腸菌プロモーターを含むゼオシン耐性遺伝子をフランクしている。トッププライマー９６５８はゼオシンの最初のＡｓｅ１部位にわたっており、それを用いて、哺乳動物細胞に耐性を駆動するＳＶ４０プロモーターに対してＡｖｒ２インサートを方向づけることができる。得られたプラスミドをＰＳ６１４と称する。
【００５２】
９６５８−トップ： ＴＣＣＴＡＧＧＣＴＧＣＡＧＣＡＣＧＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧ−３’
９６５５−ボトム： ＴＣＣＴＡＧＧＴＣＡＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＣＧＧＣＣＡＣＧＡＡＧＴＧＣＡＣ−３’
【００５３】
ヒトＳＯＳ１のコード配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿００５６３３）は、例えば後述のプライマー００９９ 及び０１００を用いるＰＣＲによってヒトの胎児又は脳のｃＤＮＡライブラリーから単離される。トッププライマーは、ＡＴＧに続く特定のＳＯＳ１配列及びＢａｍＨ１クローニング部位を含む。ボトムプライマーは、停止コドン及びＮｏｔ１クローニング部位を含む特定のＳＯＳ１配列を含む。ＰＣＲ産物は制限酵素ＢａｍＨ１及びＮｏｔ１で消化され、ＢａｍＨ１とＮｏｔ１で消化したＰＳ６１４ベクターＤＮＡに連結される。これは、ＣＭＶプロモーターの制御下でＰＤＥ４Ａ４とＳＯＳ１との融合体を生じる。得られたプラスミドを、ＰＳ６４２と称する。
【００５４】
００９９−トップ： ５’−ＧＴＴＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＣＡＧＣＡＧＧＣＧＣＣＧＣＡＧＣＣＴＴＡＣ −３’
０１００−ボトム： ５’− ＧＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＧＧＧＧＡＧＴＴＴＣＴＧＣＡＴＴＴＴＣ −３’
【００５５】
プラスミドＰＳ５８７は、ＣＭＶプロモーターの制御下でＧＲＢ２とＥＧＦＰの融合体を含み、選択マーカーとしてネオマイシン耐性を有する。ヒトＧＲＢ２のコード配列（ＧｅｎＢａｎｋ アクセス番号ＮＭ＿００２０８６）は、例えば後述のプライマー００７３及び００７４を用いるＰＣＲにより、ヒトの胎児又は脳又は胎盤のｃＤＮＡライブラリーから単離される。トッププライマーは、ＡＴＧに続く特定のＧＲＢ２配列及びＨｉｎｄ３ クローニング部位を含む。ボトムプライマーは、停止コドン及びＥｃｏＲ１クローニング部位を含む特定のＧＲＢ２配列を含む。ＰＣＲ産物は制限酵素Ｈｉｎｄ３ 及びＥｃｏＲ１で消化し、 Ｈｉｎｄ３ 及びＥｃｏＲ１で消化したｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターＤＮＡ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＧｅｎＢａｎｋ アクセス番号Ｕ５５６７２）に連結する。これにより、ＣＭＶプロモーターの制御下でＧＲＢ２とＥＧＦＰとの融合体が生じる。ベクターは、ＥＧＦＰのすぐ上流に（インビトロの転写に使用できる）Ｔ７プロモーターを含むように、任意に最初に修飾されてもよい。これは、ＥＧＦＰのすぐ上流を切断する制限酵素Ｎｈｅ１及びＢｇｌ２でｐＥＧＦＰ−Ｎ１を消化し、ベクターフラグメントをアニール化オリゴ９９４９ 及び９９５０と連結して達成することができる。得られたプラスミドを、ＰＳ５８７と称する。
【００５６】
００７３−トップ： ５’−ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＴＣＡＧＡＡＴＧＧＡＡＧＣＣＡＴＣＧ −３’
００７４−ボトム： ５’−ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＣＧＴＴＣＣＧＧＴＴＣＡＣＧ −３’
９９４９： ５’−ＣＴＡＧＣＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡ−３’
９９５０： ５’−ＧＡＴＣＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＴＧ−３’
【００５７】
プラスミドＰＳ６３９は、ＣＭＶプロモーターの制御下でＰＫＡの触媒サブユニット（ＰＫＡｃａｔ）及びＧＲＢ２の融合体を含み、選択マーカーとしてゼオシン耐性を有する。
ＰＳ６３９は、ＰＳ４５７由来のＰＳ６１０から由来する。
プラスミドＰＳ４５７ は、ＣＭＶプロモーター制御下でＰＫＡｃａｔとＥＧＦＰの融合体を含み、選択マーカーとしてネオマイシン耐性を有する。１７個のＮ−末端アミノ酸を除くヒトＰＫＡｃａｔ （ＧｅｎＢａｎｋ アクセス番号Ｘ０７７６７）のコード配列は、例えば後述のプライマー９９５２ と９９２２ を用いるＰＣＲによりヒトの肝臓又は脾臓のｃＤＮＡライブラリーから単離される。トッププライマーは、コード配列のＮ−末端近くの ＥｃｏＲ１部位にわたる特定のＰＫＡｃａｔ配列を含む。ボトムプライマーは、停止コドンとＢａｍＨ１クローニング部位のない特定のＰＫＡｃａｔ配列を含む。ＰＣＲ産物は制限酵素ＥｃｏＲ１及び ＢａｍＨ１で消化し、ＥｃｏＲ１と ＢａｍＨ１で消化したｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターＤＮＡ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｕ５５６７２）に連結する。この中間体を Ｈｉｎｄ３及びＥｃｏＲ１で消化し、アニール化オリゴ９９５５及び９９５６と連結し、残りのＮ−末端アミノ酸をＰＫＡｃａｔに付加し、こうしてＣＭＶプロモーターの制御下で ＰＫＡｃａｔとＥＧＦＰとの融合体を生じる。この構築物をＰＳ４５７と称する。
【００５８】
９９５２−トップ： ５’−ＧＡＧＣＧＴＧＡＡＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＣＣＡＡＡＧ−３’
９９２２−ボトム： ５’−ＧＴＧＧＡＴＣＣＣＡＡＡＡＣＴＣＡＧＡＡＡＡＣＴＣＣＴＴＧ−３’
９９５５：
５’−ＡＧＣＴＴＣＣＧＣＧＡＴＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＧＧＧＣＡＧＣＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＣ
ＧＴＧＡＡＡＧ−３’
９９５６：
５’−ＡＡＴＴＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＧＣＴＧＣＣＣＴＴＣＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＴＴＧＣＣＣＡＴＣ
ＧＣＧＧＡ−３’
【００５９】
ＰＳ６１０は、ＰＳ４５７のネオマイシン耐性を上記のゼオシン耐性に変えることによって構築される。
ヒト ＧＲＢ２のコード配列は、後述のプライマー０１４３ 及び０１４２を用いるＰＣＲによって上記のＰＳ５８７から単離される。トッププライマーは、ＡＴＧ に続く特定の ＧＲＢ２ 配列及びＢａｍＨ１クローニング部位を含む。ボトムプライマーは、停止コドン及びＸｂａ１クローニング部位を含む特定のＧＲＢ２配列を含む。ＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨ１及びＸｂａ１で消化し、ＢａｍＨ１とＸｂａ１で消化したＰＳ６１０ ベクターＤＮＡ （ダム（ｄａｍ）−マイナス大腸菌から単離）に連結する。これにより、ＣＭＶプロモーターの制御下でＰＫＡｃａｔとＧＲＢ２との融合体を生じる。得られたプラスミドをＰＳ６３９と称する。
【００６０】
０１４３−トップ： ５’−ＧＴＴＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＡＡＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＡＡＴＡＴＧ−３’
０１４２−ボトム： ５’−ＧＴＴＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＡＣＧＴＴＣＣＧＧＴＴＣＡＣＧＧ−３’
【００６１】
プラスミドＰＳ６０２は、ＣＭＶプロモーターの制御下でＥＧＦＰとＳＯＳ１の ２６５個のＣ−末端アミノ酸との融合体とネオマイシン耐性マーカーを含む。ヒトＳＯＳ１のコード配列のＣ−末端部分（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿００５６３３）は、例えば後述のプライマー０１２２ と０１２３を用いるＰＣＲによってヒトの胎児又は脳のｃＤＮＡから単離される。トッププライマーは、ＡＴＧ及びＸｈｏ１クローニング部位の付加したアミノ酸番号１０６７の後に特定のＳＯＳ１配列を含む。ボトムプライマーは、停止コドンとＢａｍＨ１クローニング部位を含む特定のＳＯＳ１配列を含む。ＰＣＲ産物を制限酵素Ｘｈｏ１ と ＢａｍＨ１で消化し、Ｘｈｏ１ と ＢａｍＨ１で消化したｐＥＧＦＰ−Ｃ１ ベクターＤＮＡ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｕ５５６７３）に連結する。これにより、ＣＭＶプロモーター制御下でＥＧＦＰとＳＯＳ１のＣ−末端部分との融合体を生じる。ベクターは、上記のＥＧＦＰのすぐ上流に（インビトロの転写に使用できる）Ｔ７プロモーターを含むように任意に最初に修飾されていてもよい。得られたプラスミドをＰＳ６０２と称する。
【００６２】
０１２２： ５’−ＧＴＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＧＡＧＣＴＴＴＡＧＴＣＧＧＡＴＴＧＣＴＧ−３’
０１２３： ５’−ＧＴＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＧＧＧＧＡＧＴＴＴＣＴＧＣＡＴＴＴＴＣ−３’
【００６３】
プラスミドＰＳ６２８は、ＣＭＶプロモーターの制御下でＰＫＣガンマ のＣｙｓ１ドメインとＧＲＢ２の融合体を含み、選択マーカーとしてゼオシン耐性を有する。ＰＳ６２８は、ＰＳ４４３由来のＰＳ６１３に由来する。
プラスミドＰＳ４４３は、ＣＭＶプロモーターの制御下でヒトＰＫＣガンマ の９０ Ｎ−末端アミノ酸（Ｃｙｓ１ドメイン）及びＥＧＦＰの融合体を含み、選択マーカーとしてネオマイシン耐性を有する。ヒトＰＫＣガンマのＣｙｓ１ドメイン（ＧｅｎＢａｎｋ アクセス番号 Ｍ１３９７７及びＺ１５１１４）は、例えば後述のプライマー９９１６及び９９３５ を用いるＰＣＲによってヒトの脳のｃＤＮＡライブラリーから単離される。トッププライマーは、ＡＴＧ 及びＥｃｏＲ１クローニング部位にわたる特定のＰＫＣガンマ配列を含む。ボトムプライマーは、アミノ酸番号９０及びＡｃｃ６５クローニング部位の周囲に特定のＰＫＣガンマ配列を含む。ＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲ１及びＡｃｃ６５で消化し、ＥｃｏＲ１及びＡｃｃ６５で消化したｐＥＧＦＰ−Ｎ１ ベクターＤＮＡ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｕ５５６７２）に連結する。これにより、ＣＭＶプロモーターの制御下でＰＫＣガンマ−Ｃｙｓ１及びＥＧＦＰの融合体を生じる。この構築物を、ＰＳ４４３と称する。
【００６４】
９９１６： ５’−ＧＴＧＡＡＴＴＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＣ−３’
９９３５： ５’−ＧＴＧＧＴＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＧＣＣＴＧＧＡＣＡＣＴＣ−３’
【００６５】
ＰＳ６１３は、上記のようにゼオシン耐性でＰＳ４４３のネオマイシン耐性を置換することによって構築される。
ヒトＧＲＢ２のコード配列は、後述のプライマー０１４３ 及び０１４２を用いるＰＣＲによって上記のＰＳ５８７から単離される。トッププライマーは、ＡＴＧに続く特定のＧＲＢ２配列及び ＢａｍＨ１クローニング部位を含む。ボトムプライマーは、停止コドンと Ｘｂａ１クローニング部位を含む特定のＧＲＢ２配列を含む。ＰＣＲ産物は、制限酵素ＢａｍＨ１ 及びＸｂａ１で消化し、ＢａｍＨ１とＸｂａ１で消化したＰＳ６１０ ベクターＤＮＡ （ダム−マイナス大腸菌から単離）に連結する。これにより、ＣＭＶプロモーターの制御下でＣｙｓ１とＧＲＢ２の融合体が生じる。得られたプラスミドをＰＳ６２８と称する。
【００６６】
０１４３−トップ： ５’−ＧＴＴＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＡＡＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＡＡＴＡＴＧ−３’
０１４２−ボトム： ５’−ＧＴＴＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＡＣＧＴＴＣＣＧＧＴＴＣＡＣＧＧ−３’
【００６７】
ＨＳＰＤＥ４Ａ１−ＥＧＦＰ融合体を構築するために、ＨＳＰＤＥ４Ａ１ の約１．９５ ｋｂのコード領域（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｕ９７５８４）を、ＰＣＲ及び後述のプライマー４Ａ１−トップ及び ４Ａ−ボトムを用いて増幅する。トッププライマーは、ＡＴＧに続く特定の ＨＳＰＤＥ４Ａ１配列、コザック配列及びＨｉｎｄ３クローニング部位を含む。ボトムプライマーは、停止コドン、ＢａｍＨ１クローニング部位及びｐＥＧＦＰ−Ｎ１への挿入時にリーディングフレームを保存するための２つの余分なヌクレオチドのない共通のＰＤＥ４Ａ Ｃ−末端配列を含む。ＰＣＲ産物を制限酵素Ｈｉｎｄ３とＢａｍＨ１で消化し、Ｈｉｎｄ３とＢａｍＨ１で切断したｐＥＧＦＰ−Ｎ１ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ； ＧｅｎＢａｎｋ アクセス番号Ｕ５５７６２）にクローンする。これにより、ＣＭＶプロモーターの制御下でＨＳＰＤＥ４Ａ１−ＥＧＦＰ融合体が生じる。得られたプラスミドをＰＳ４６１と称し、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ （ＤＳＭＺ）に２０００年４月１７日にＤＳＭ １３４４９でブダペスト条約の下で寄託した。
【００６８】
４Ａ１−トップ： ５’−ＧＴＡＡＧＣＴＴＡＡＧＡＴＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＴＴＴＣＴＴＣ−３’、ＰＤＥ４Ａ１に特異的、
４Ａ−ボトム： ５’−ＧＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＧＴＡＧＧＧＴＣＴＣＣＡＣＣＴＧＡ−３’
【００６９】
【表１】
2004502434.tif 000003
１開始コドンから３’−末端のＢａｍＨ１ クローニング部位までＰＳ４６２にみ
られるようなＰＤＥ４Ａ４のＤＮＡ配列
２ＰＳ４６２にみられるようなＰＤＥ４Ａ４のタンパク質配列
３開始コドンから３’−末端のＢａｍＨ１ クローニング部位までＰＳ４６１にみ
られるようなＰＤＥ４Ａ１のＤＮＡ配列
４ＰＳ４６１にみられるようなＰＤＥ４Ａ１のタンパク質配列
５開始コドンから停止コドンまでＰＳ６４２にみられるようなＳＯＳ１のＤＮＡ
配列
【００７０】
実施例２： プロトコル及び方法
この実施例は、実施例１に記載のプローブのインビボ発現に用いるプロトコル及び方法、ならびに単一で、もしくはＣＨＯ細胞でのアンカープローブとの同時トランスフェクションとしてトランスフェクトされたＥＧＦＰ融合プローブによる変化の視覚化及び測定を記載する。
【００７１】
トランスフェクション及び細胞培養：
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）を、１種のプラスミド又は供給者によって推奨される方法にしたがってトランスフェクション剤ＦｕＧＥＮＥ（登録商標） ６ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ， ＵＳＡ）を用いて同時にトランスフェクションされた一対のプラスミドを用いて、上記実施例１に記載のプラスミドでトランスフェクトする。単一のＧＦＰプローブの安定なトランスフェクタントを、適当な選択剤、通常は、増殖培地（グルタマクス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）−１、１０ ％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００μｇ ペニシリン−ストレプトマイシン混合物 ｍｌ−１ （ＧｉｂｃｏＢＲＬ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｄｅｎｍａｒｋより供給）とのＨＡＭ’ｓ Ｆ１２ 栄養ミックス）中０．５ ｍｇ／ｍｌのＧ４１８ 硫酸塩（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いて選択する。同時にトランスフェクトした細胞を、使用されるプラスミドに適当な２つの選択剤、通常は０．５ ｍｇ／ｍｌのＧ４１８ 硫酸塩及び１ ｍｇ／ｍｌゼオシンを添加する以外は同一の培地で培養する。細胞を３７℃で１００％湿度及び５％ ＣＯ２を追加した通常の雰囲気ガス条件で培養する。
【００７２】
特定の性質を有するクローン細胞系を、個々の細胞を単離し、選択されるプラスミドに適当なように、０．５ ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８硫酸塩又は０．５ ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８ 硫酸塩 ＋ １ ｍｇ／ｍｌ ゼオシンを有する新鮮な培養培地を含む滅菌培養フラスコに細胞を除くことにより、安定なトランスフェクト細胞の混合群から半培養（ｓｕｂ ｃｕｌｔｕｒｅｄ）する。
蛍光顕微鏡検査用に、細胞を少なくとも２４時間Ｌａｂ−Ｔｅｋチャンバーカバーガラス（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ ＵＳＡ）に接着させ、次いで約８０％に集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）するまで培養する。画像化目的用にプラスチックの９６−ウェルのプレート（Ｐｏｌｙｆｉｌｔｒｏｎｉｃｓ Ｐａｃｋａｒｄ ９６−Ｖｉｅｗ Ｐｌａｔｅ 又は Ｃｏｓｔａｒ Ｂｌａｃｋ Ｐｌａｔｅ、透明底； いずれのタイプも組織培養を処理した）で細胞を成長させることができる。実験前に、グルタマクス、１００ μｇ ペニシリン−ストレプトマイシン混合物 ｍｌ−１ 及び１０ ％ ＦＢＳを有するＨＡＭ Ｆ−１２培地中で選択剤なしに一晩細胞を培養する。この培地は、インキュベーターから直接的な細胞の蛍光顕微鏡検査を可能にする低自動蛍光を有する。特に特定の細胞成長因子の存在に関して所定の組成の培地を要する試験用には、３．６ ＫＣｌ、１４０ ＮａＣｌ、２ ＮａＨＣＯ３、０．５ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５ ＭｇＳＯ４、１．５ ＣａＣｌ２、１０ Ｈｅｐｅｓ、５ グルコース、ｐＨ７．４を（ｍＭで）含む緩衝生理食塩溶液（ＫＲＷ緩衝液）でＨＡＭ培養培地を画像化前に置換する。
【００７３】
共焦画像化：
共焦画像を、４８８ ｎｍで励起光を発するアルゴンイオンレーザーを備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ４１０顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ， Ｊｅｎａ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて回収する。光路には、ＦＴ５１０ 二色性ビーム分割機及び５１５ ｎｍの長−路（ｌｏｎｇ−ｐａｔｈ）フィルター又は５１０〜５２５ ｎｍ の帯域放射フィルターがある。画像を一般にＦｌｕａｒ ４０Ｘ， ＮＡ： １．３ 油浸対物レンズを用いて回収し、顕微鏡の共焦開口を（このレンズに最適な）１０単位値にセットする。
【００７４】
経時的なシークエンス及び分析：
時間中（経時的（Ｔｉｍｅ ｌａｐｓｅ）、例えば図５、６、１１、１２）の生細胞の画像シークエンスを、Ｆｌｕａｒ ４０Ｘ， ＮＡ： １．３油浸対物レンズを備え、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ ＣＨ２５０電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ， Ｔｕｃｓｏｎ， ＡＺ ＵＳＡ）に連結したＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ １３５Ｍ 蛍光顕微鏡を用いて集める。細胞を１００ Ｗ のＨＢＯ アーク灯で照らす。光路には、４７０±２０ ｎｍの励起フィルター、５１０ ｎｍのダイクロイックミラー及び最少の画像バックグラウンド用の５１５±１５ ｎｍ 励起フィルターがある。細胞を、誂えた段階ヒーターで３７℃に維持する。
シークエンス中の各連続画像に同一の座標又は画素にわたって明確に定めた対象領域（ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ （ＲＯＩ））を用いる画像シークエンスから、経時的な反応プロフィルを抽出する：画素値を合計し、各画像で ＲＯＩに対して平均し、得られた値を画像数にプロットして、所定のシークエンス領域に対する経時的な反応プロフィルを得る。ＲＯＩには、多くの細胞、単細胞又は単細胞内の領域を含めることができる。
【００７５】
自動画像化及び分析：
細胞群におけるトランスフェクトプローブの蛍光スポット及び他の蓄積物の量は、スポットの平均数／細胞を測定するような自動化法で画像化し、定量することができる。この目的のため、細胞をほぼ８０％〜９０％の集密までカバーガラスチャンバー又はプラスチックの９６−ウェルプレートで培養し、関連処理を行い、反応させる。反応段階の最後に、３０分〜２時間４％ ホルムアルデヒド緩衝液（Ｌｉｌｌｉｅｓ 固定緩衝液、ｐＨ７．０： Ｂｉｅ ａｎｄ Ｂｅｒｎｔｓｅｎ Ａ／Ｓ， Ｄｅｎｍａｒｋ）で細胞を化学的に固定し、次いでリン酸緩衝液（ＰＢＳ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｄｅｎｍａｒｋ）で３回洗浄する。細胞質から非局在（つまり可動性）ＧＦＰプローブを除くのに有用な、代替的な同時固定＋透過法は、０．２〜１％のトリトンＸ−１００を加えた０．４〜２％のホルムアルデヒド緩衝液（１０〜５０％強度のＬｉｌｌｉｅｓ 固定剤）を導入する１回の固定法を伴う。使用する実際の濃度を、使用する細胞種に最適化する必要がある；ＣＨＯ細胞については、２％ホルムアルデヒド＋１％トリトンＸ−１００が優れた結果を生じる。固定剤＋洗剤の組み合わせは、室温で１０〜２０分細胞に適用される。次いで、リン酸緩衝生理食塩水で細胞を３回洗浄する。核ＤＮＡを２５℃で１０分ＰＢＳ中１０μＭのヘキスト３３２５８ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， Ｏｒｅｇｏｎ， ＵＳＡ）で染色し、次いでＰＢＳで２回洗浄する。自動画像を、Ｎｉｋｏｎ Ｐｌａｎ Ｆｌｕｏｒ ２０Ｘ／０．５ＮＡ 対物レンズを用いてＮｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ ３００ （Ｎｉｋｏｎ， Ｊａｐａｎ）で回収する。基本顕微鏡は、電動の試験片足場と電動の焦点制御（Ｐｒｉｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｆｕｌｂｏｕｒｎ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＵＫ）、励起フィルターホイール（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｎｏｖａｔｏ ＣＡ ＵＳＡ）及びＫＡＦ１４００ ＣＣＤ チップを有するＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ ＰＸＬシリーズカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ， Ｔｕｃｓｏｎ， ＡＺ ＵＳＡ）（これらの品目は、それぞれＭａｃｉｎｔｏｓｈ ７２００／９０コンピューター（Ａｐｐｌｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ， Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ， ＣＡ ＵＳＡ）の制御下にある）を備える。足場位置、焦点、励起フィルター選択及び画像捕捉の自動化は、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ用のＩＰＬａｂ スペクトル（Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ， Ｆａｉｒｆａｘ， ＶＡ ＵＳＡ）下で作動する、内部に書き込まれたマクロス（ｍａｃｒｏｓ）を用いて行う。１００ Ｗ のＨＢＯ ランプから、蛍光照明を生じる。最初に３４０／１０ ｎｍ 励起フィルターを用いて、次に４７５ＲＤＦ４０ 励起フィルター（Ｃｈｒｏｍａ， Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ， Ｖｅｒｍｏｎｔ）を用いて、画像を対で回収する。双方の画像を、ＥＧＦＰ用途（ＸＦ１００ フィルターセット， Ｏｍｅｇａ Ｏｐｔｉｃａｌ， Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ， Ｖｅｒｍｏｎｔ）用に最適化した同じダイクロイック放出フィルターを介して回収する。核染色（ヘキスト３３２５８）画像化用のフィルターの選択が色素のスペクトル特性に十分に合わず、画像強度が低下するが、同じダイクロイック放出フィルターを用いて双方の画像を回収できること���よって、方法のスループットが大きく改善される。これにより、２つの異なるフィルターセットを用いることに起因し、捕捉方法にさらに数段階を要し、克服するのに広範囲な画像化処理を要する画像の登録問題及び焦点シフトが排除される。
【００７６】
必要な画像を以下のとおり回収する： ４個の８−ウェルのカバーガラスチャンバーを含むホルダー又は１つの９６−ウェルプレートを顕微鏡に載せる。プログラムを開始し、第１ウェルの細胞を位置に動かし、技師により手動で粗く焦点を合わす。３４０／１０ 励起を用いる自動焦点の機械的操作で、微細に画像の焦点を合わす。画像を捕捉し、この励起波長で蓄積し（核の画像）、次いで第二画像を捕捉し、長い波長励起で蓄積する（ＧＦＰ画像）。足場を自動的に再度位置付け、顕微鏡の焦点を再度自動的に合わせ、同一ウェル内で第二画像対を捕捉する。この方法を、第一ウェルについて数回（一般に４〜８回）繰り返す。次に、足場を画像位置の隣のウェルに進め、数セットの画像対が各細胞ウェルから捕捉されるまで、方法を繰り返す。
【００７７】
ＩＰＬａｂ スペクトルソフトウェアで作動する一組のマクロスを用いて、以下のようにして画像対を自動的に分析する： 最初に、核の画像対をデジタルフィルターでフィルターにかけ、同時に縁をシャープにし、核の強度の相違を抑制する。フィルターの選択及びフィルターの定数（ｆｉｌｔｅｒ ｃｏｎｓｔａｎｔ）は、種々のデータセットを用いて実験中に達せられた。次に、フィルターにかけた画像を、この閾値未満の画素が核領域内にないように、またこの閾値より大きい画素が核領域内にあるように、所定の強度値でセグメントに分ける。次に、核と核ではない他の対象物とを十分に正確に識別するように予め決定した領域より大きいか、又はある（異なる）領域より小さい隣接領域を除いた後、閾値より大きい隣接領域を計測する。最終的な総数は、その範囲で見積もられる核数である。各対のＧＦＰ画像を、次いで実験的に選択したフィルターでデジタルフィルターにかけ、このバックグランドに関して明ポイント（ｂｒｉｇｈｔ ｐｏｉｎｔ）−様対象物の強度を減じながら、ＧＦＰの一般的な非局在化分布による強度変化を抑制する。次いで、このフィルターにかけた画像を実験的に決定した閾値でセグメントに分け、スポットにある可能性の高い（閾値より大きい）画素及びスポットにはない可能性の高い（閾値未満の）画素に画像を分ける。スポットに特有であることが予め決定された、ある形態学的特性を持たない領域を除いた後、閾値より大きい画素の隣接領域を計測する。各対について核の計測に対するスポットの計測の割合は、画像対における細胞当たりの平均スポット数の予測を示す。画像対全てをこうして処理し、最終的な値表を用いて、所定の処理に対する細胞の反応を確立する。図３は、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ発現ＣＨＯ細胞におけるスポット密度による化合物の作用が、自動画像化及び画像解析法を用いてどのように測定できるかについての一例である。
【００７８】
細胞群におけるトランスフェクトプローブの蛍光スポット及び他の蓄積物の量は、ＴＥＣＡＮ Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ （Ｔｅｃａｎ Ｕ．Ｓ． Ｉｎｃ．， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ， ＮＣ ２７７０９， ＵＳＡ） のような蛍光プレートリーダー又は蛍光画像化プレートリーダー（ＦＬＩＰＲ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ ９４０８９， ＵＳＡ）を用いて定量することもできる。固定剤＋透過法を組合わせた使用は、特に蛍光プレートリーダーで測定される際に、細胞中のスポット及び他の蓄積物の測定用のバックグラウンドに対するシグナルを大きく改善する。図４は、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ発現ＣＨＯ細胞におけるスポット密度による化合物の作用を測定するためのＦＬＩＰＲの使用例である。細胞を同時に固定及び透過プロトコルで処理し、これらのデータを得た。
【００７９】
細胞質から原形質膜への蛍光プローブの再分布は、細胞質ＲＯＩの蛍光強度の変化の簡単な画像分析を用いて標準的な画像化法によって定量してもよい。同様の再分布は、ＦＲＩＰＲで、また標準的な蛍光プレートリーダー、特にマイクロタイタープレートで接着細胞からのシグナルを測定するよう形成したプレートリーダーにおいてでも測定できる。
ＰＫＣ−様再分布（ＥＧＦＰ−Ｃｙｓ１（ＰＫＣγ）がその一例である）、またＰＫＡｃ−様再分布を測定するためのＦＬＩＰＲの使用は、実際には先の特許「細胞反応に対する影響に関する量的情報を抽出するための改良方法」（ＷＯ ００／２３６１５）に詳述されている。図７は、Ｃｙｓ１γ−ＥＧＦＰの再分布に対する化合物の作用がＦＬＩＰＲを用いてどのように定量できるかを示している。
【００８０】
実施例３： ＰＤＥ４Ａ４ アンカータンパク質でのタンパク質Ｘ及びＹのプローブ
この実施例及び実施例４、実施例５ならびに実施例６は、２つのパートナー成分Ｘ及びＹ間の特異的な相互作用に対する標的化合物をスクリーニングするのに適当な細胞系を作製する一般的な方法を記載している。これらの実施例で、細胞は、一方がアンカー分子（アンカープローブ）のＣ又はＮ末端に結合するＸ又はＹとの融合プローブをコードし、第二のものがＧＦＰ（検出基）のＣ又はＮ末端に結合した他のパートナーＹ又はＸとの融合プローブをコードしている、２つのプラスミドで同時にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に由来する。したがって、相互作用対Ｘ−Ｙ及び８個の有用な組合わせを同時にトランスフェクトし得る、４個の潜在的なアンカープローブと４個の潜在的な検出プローブがある。アンカー及び検出プローブは、異なる選択マーカーを用いて、選択中の細胞に両プラスミドを確実に維持させる；例えばアンカーは、ネオマイシンに対して検出性である、ゼオシン耐性を付与し得る。連続的な選択中（最低限２週間）に両プローブを維持する細胞を「安定」と称する。
【００８１】
この実施例では、アンカープローブはＨＳＰＤＥ４Ａ４Ｂ （ヒトのホスホジエステラーゼ　タイプ４、イソ型Ａ、スプライス変異体４Ｂ： 以降、ＰＤＥ４Ａ４と称する）に基づいており、これはＰＤＥ４阻害剤のロリプラムでの処理時に、各細胞の細胞質中に稠密な幾つかの集合物を形成する（ＥＣ５０ ０．２〜０．３ μＭ）。これらのロリプラム−誘導性集合物は、図１０に示されるように、ＨＳＰＤＥ４Ａ のユニークなＣ−末端ペプチド配列に対する抗体で検出されてもよい。ＰＤＥ４Ａ４のＣ−末端に融合したＧＦＰを有する融合タンパク質をコードするプラスミドで成功裏にトランスフェクトされた細胞では、蛍光は細胞質内で包括的かつ全く均一に分布するが（図１）、ロリプラムで処理すると集合物が生じ、これらは細胞中の明るい緑蛍光のスポットとしてはっきり見える（図２）。核の側方の正反対に位置する、そのような集合物は、ロリプラム−処理細胞当たり平均２個ある。１０μＭのロリプラムに１０〜１６時間暴露した後、これらの集合物は、直径約２〜４μｍに成長する。
【００８２】
ロリプラムの除去は、６０分以内にこれらの集合物を分散させる。同様のスポットは、ＰＤＥ４ 阻害剤ＲＳ２５３４４ （ＥＣ５０ ０．０２ μＭ， Ｓｙｎｔｅｘ） 及びＲｏ ２０−１７２４ （ＥＣ５０ ４ μＭ， Ｒｏｃｈｅ）で処理すると、ＰＤＥ４Ａ４−トランスフェクト細胞ではっきりと見られる。ＥＧＦＰ−Ｙ検出プローブを加えたＰＤＥ４Ａ４−アンカープローブ−Ｘで同時にトランスフェクトした細胞では、ＧＦＰ−明スポット（ｂｒｉｇｈｔ ｓｐｏｔ）は、ＸとＹが相互作用し、互いを誘因するならば、ロリプラムでの処理後の細胞でのみはっきりと見られるであろう（図８）。ロリプラムを除くか、又は別の有力なＰＤＥ４阻害剤であるＲＰ７３４０１ （Ｐｉｃｌａｍｉｌａｓｔ， Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ）と競合させると（ＩＣ５０ 対 ３ μＭ ロリプラム　約２０ ｎＭ、図３及び４）、スポットは消失するであろう（図９）。
【００８３】
ＰＤＥ４Ａ４ アンカー系のプロトコル：
１）　ＰＤＥ４Ａ４ アンカー−検出対のＣＨＯへの同時トランスフェクト、
２）　ＧＦＰ−明スポットがないことのチェックと開始。スポットがあるか、又は存在するＧＦＰについて別の明確な分布があれば、（３）で細胞を試験する価値が依然としてある可能性がある： 分布変化は、このトランスフェクションが有用であれば、工程（３）で見られなければならない、
３）　１０ μＭ ロリプラムと（個別に）１μＭ ＲＳ２５３４４での一晩の過渡物（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）の試験、
ａ．　スポットの出現： 過渡物から細胞をクローン、及び（４にあるような）二重選択下で操作。安定時にスクリーニングするための細胞の準備、
ｂ．　スポットなし： 二重選択下の細胞からの安定な細胞系形成を待機（４参照）、
【００８４】
４）　二重選択（例えば１ ｍｇ／ｍｌゼオシン＋０．５ ｍｇ／ｍｌネオマイシン／Ｇ４１８） を用いる安定な細胞系の作製。１０ μＭのロリプラム及び１ μＭ ＲＳ２５３４４での個別の試験、
ａ．　スポットの出現： スクリーニング用途のため二重選択下の安定物（ｓｔａｂｌｅ）から細胞をクローン、
ｂ．　スポットなし： 抗−４Ａ 抗体で固定と染色（ロリプラム又はＲＳ２５３４４−処理細胞）、
ｉ．　　　抗体でスポット染色： （５）に進む
ｉｉ．　　 スポットなし： アンカー系が存在しないか又は作用していない −同時トランスフェクションを反復、又は別のアンカー系もしくは方向付けを試験、
５）　暫定的な結合を試験（以下のＡ及びＢ参照）、
６）　結合状態が見られない場合、アンカー／検出対の別の組合わせを選択し、再度開始する。
【００８５】
適当な相互作用刺激：Ａ及びＢでの暫定的結合についての試験を、同時に行うことができる。「可溶性段階」でのみ生じる潜在的な状態又は結合についてのＢ試験。
Ａ　　　ｉ） １０Ｍのロリプラムと別々の１Ｍ ＲＳ２５３４４で一晩、安定物をインキュベート、
ｉｉ）　相互作用刺激、つまり対を一緒にするような処理で試験、ＮＢこれは、過渡物を捕捉するため時間経過を要し得る：
ａ．　　　 スポットの出現： 安定物から細胞をクローン、
ｂ．　　　 スポットなし： （Ｂ）を行う、
【００８６】
Ｂ　　　ｉ） １０ μＭ のロリプラムと別々の１ μＭ ＲＳ２５３４４で一晩、安定物をインキュベート、
ｉｉ） ロリプラム又はＲＳの洗い出し、６０分インキュベート（ＰＤＥ４Ａ４アンカーをその結合から解放する）、
ｉｉｉ） １０ μＭロリプラム又は１ μＭ ＲＳ２５３４４とともに（又はそれによって迅速に続けて）相互作用刺激、つまり対を一緒にするような適当な処理で試験、
ａ． スポットの出現： 安定物から細胞をクローン、
ｂ． スポットなし： （６）を参照のこと。
【００８７】
実施例４：ＰＫＡｃａｔαアンカータンパク質でのタンパク質Ｘ及びＹのプローブ
この実施例で、アンカープローブはＨＳＰＫＡｃａｔα（ヒトサイクリックＡＭＰ−依存プロテインキナーゼの触媒サブユニット、イソ型α：以降、ＰＫＡｃとして言及）に基づいており、これは、細胞へのトランスフェクト時に低濃度の細胞質ｃＡＭＰ条件下で細胞質に集合物を形成する。これらの集合物は、ＰＫＡｃに対する抗体、またＰＫＡ制御サブユニット１α型（Ｒ１α）に対する抗体を用いて検出され得る。ＰＫＡｃのＣ末端に融合されるＧＦＰを有する融合タンパク質をコードするプラスミドで成功裏にトランスフェクトされた細胞では、そのような集合物は、細胞で明るい緑色の蛍光スポットとして見られる（図５）。これらの集合物は、ｃＡＭＰが細胞で上昇する場合、例えば細胞を５００μＭイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を加えた２５μＭのフォルスコリンで処理する場合、細胞質に分散する。検出可能なＥＧＦＰ（一方がＸ、他方がＹ）を加えたＰＫＡｃアンカープローブで同時にトランスフェクトした細胞では、ＧＦＰ−明スポットは、ＸとＹが相互作用して互いに引き寄せるならば、細胞でのみ見られるであろう（図１１ａ）。スポットは、ｃＡＭＰが細胞で上昇する場合に消失するであろう（図１１ｂ）。
【００８８】
ＰＫＡｃアンカー系のプロトコル：
１）　アンカー−検出対のＣＨＯへの同時トランスフェクト、
２）　過渡物の分布のチェック
ａ）　スポットあり： 過渡物から細胞をクローン、及び（３にあるような）二重選択下で操作。安定時にスクリーニングするための細胞の準備、
ｂ）　スポットなし： 安定物３）を待機、
ｃ）　他の分布が存在し、正常なＰＫＡスポットとは異なれば、５０μＭフォルスコリン＋５００μＭ ＩＢＭＸで試験し、
ｉ）　分布が変化すれば、（３）に記載する二重選択下でのスクリーニングで用いる細胞を準備し、
ｉｉ） 変化なし： （３）の安定物に続行する価値が依然としてあり得る、
【００８９】
３）　二重選択（例えばゼオシン１ｍｇ／ｍｌ＋０．５ｍｇ／ｍｌネオマイシン／Ｇ４１８）を用いて安定な細胞系を作製、
ａ）　スポットの出現：５０μＭ フォルスコリン ＋ ５００ μＭ ＩＢＭＸで試験；分布が変化すれば、スクリーニングで用いるための細胞を二重選択下でクローン、
ｂ）　スポットなし： 抗−ＰＫＡｃａｔ抗体で固定し、染色
ｉ）　　ＰＫＡｃａｔ抗体で染色： （４）に進む
ｉｉ）　 スポットなし：アンカー系が存在していないか、作用していない、又はｃＡＭＰが極めて高い
・　ＰＫＡ制御サブユニット１α型（Ｒ１α）に対する抗体で染色 − これは、触媒サブユニットが分離していても（高ｃＡＭＰ）ＰＫＡ「スポット」を示すであろう： スポットが見られなければ、再トランスフェクトする、
４）　暫定的結合を試験（以下のＡ及びＢ参照）、
５）　結合状態が見られなければ、アンカー／検出対の別の組み合わせを選択肢、再度開始する。
【００９０】
適当な相互作用刺激：Ａ及びＢでの暫定的結合についての試験を、同時に行うことができる。「可溶性段階」でのみ生じる潜在的な状態又は結合についてのＢ試験。
Ａ　　　ｉ）　相互作用刺激、つまり対を一緒にするような処理で試験、ＮＢこれは、過渡物を捕捉するため時間経過を要し得る：
ａ．　　　 スポットの出現： スクリーニングで用いるための細胞をクローン、
ｂ．　　　 スポットなし： （Ｂ）を行う、
【００９１】
Ｂ　　　ｉ） ５０ μＭ のフォルスコリン＋５００μＭのＩＢＭＸで３０分安定物をインキュベート（ＰＫＡアンカーを解放する）、
ｉｉ） フォルスコリン＋ＩＢＭＸの洗い出し、相互作用刺激、つまり対を一緒にするような処理で試験、３０〜６０分インキュベート、
ａ． スポットの出現： スクリーニングで用いるための細胞をクローン、
ｂ． スポットなし： （５）を参照のこと。
【００９２】
実施例５：ＰＤＥ４Ａ１ドメインアンカータンパク質でのタンパク質Ｘ及びＹのプローブ
この実施例で、アンカープローブはＰＤＥ４Ａ１ドメインに基づいている。ＰＤＥ４Ａ１は、他の点では未処理の細胞で小さな核周辺スポットとして蓄積する。これらのスポットは、ＰＤＥ４ＡのユニークなＣ末端部分に対する抗体で容易に検出される。ロリプラムでの処理は、これらのスポットを細胞質へ分散させる（図１３）。その後、ロリプラムを除くと、核周辺スポットが迅速に再現される。
【００９３】
図１３ａで、ＨＳＰＤＥ４Ａ１−ＧＦＰを安定的に発現するＣＨＯ細胞は、１０％ＦＢＳを有するＨＡＭ’ｓＦ１２培地でのみ生育する；ＧＦＰ蛍光は、各細胞の核周辺の細胞質内の明るい顆粒状のスポットに限定される。スポットは、ゴルジ膜の周囲、内部又は膜上に密集していてもよい。図１３ｂで、１３ａで見られたのと同様の細胞を、２μＭのロリプラムで２時間処理した。大部分のＧＦＰ−明スポットはロリプラム処理下の全細胞で消失し、細胞質が一般に明るくなる。大きなスポットは、幾つかの細胞では完全には分散しない可能性がある。ロリプラムを洗い出すと、スポットは、１．７５時間以内に再形成する。
さらに、ＰＤＥ４Ａ１の分布及びそのあらゆる変化は、自動画像化によって容易に測定できる。
【００９４】
図１４は、ロリプラムに対するスポットの分散についての用量反応曲線を示す。各濃度のロリプラムについて、細胞当たりのスポット数は４回の測定±ｓｅｍの平均であり、各測定はそれ自体１００個以上の細胞から得た平均である。様々な濃度のロリプラムと１０％ＦＢＳを加えたＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で細胞を７時間生育させる。そして、細胞を４％のホルマリン緩衝液（ｐＨ７．５）で１５分間化学的に固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ 中１０μＭのヘキスト３３２５８で２５℃で１０分間染色し、そしてＰＢＳで２回洗浄する。実施例２に記載のように、自動画像を収集し、細胞当たりのスポット数を分析する。
【００９５】
ＰＤＥ４Ａ１アンカー系のプロトコル：
１）　アンカー−検出対のＣＨＯへの同時トランスフェクト、
２）　過渡物の分布のチェック
ａ）　スポットあり： 過渡物から細胞をクローン、及び（３にあるような）二重選択下で操作。安定時にスクリーニングするための細胞の準備、
ｂ）　スポットなし： 安定物３）を待機、
ｃ）　他の分布が存在し、正常なＰＤＥ４Ａ１スポットとは異なれば、１０μＭロリプラムで試験し、
ｉ）　分布が変化すれば、（３）に記載する二重選択下でのスクリーニングで用いる細胞を準備し、
ｉｉ） 変化なし： （３）の安定物に続行する価値が依然としてあり得る、
【００９６】
３）　二重選択（例えばゼオシン１ｍｇ／ｍｌ＋０．５ｍｇ／ｍｌネオマイシン／Ｇ４１８）を用いて安定な細胞系を作製、
ａ）　スポットの出現：１０μＭ ロリプラムで試験；分布が変化すれば、スクリーニングで用いるための細胞を二重選択下でクローン、
ｂ）　スポットなし： 抗− ＰＤＥ４Ａ抗体で固定し、染色
ｉ）　　ＰＤＥ４Ａ抗体で染色： （４）に進む
ｉｉ）　　　スポットなし：アンカー系が存在していないか、作用していない、再トランスフェクト、
４）　暫定的結合を試験（以下のＡ及びＢ参照）、
５）　結合状態が見られなければ、アンカー／検出対の別の組み合わせを選択肢、再度開始する。
【００９７】
適当な相互作用刺激：Ａ及びＢでの暫定的結合についての試験を、同時に行うことができる。「可溶性段階」でのみ生じる潜在的な状態又は結合についてのＢ試験。
Ａ　　　ｉｉ）　相互作用刺激、つまり対を一緒にするような処理で試験、ＮＢこれは、過渡物を捕捉するため時間経過を要し得る：
ａ．　　　 スポットの出現： スクリーニングで用いるための細胞をクローン、
ｂ．　　　 スポットなし： （Ｂ）を行う、
【００９８】
Ｂ　　　ｉ） １０ μＭ のロリプラムで７時間安定物をインキュベート（ＰＤＥ４Ａ１アンカーを解放する）、
ｉｉ） ロリプラムの洗い出し、相互作用刺激、つまり対を一緒にするような処理で試験、２〜４時間インキュベート、
ａ． スポットの出現： スクリーニングで用いるための細胞をクローン、
ｂ． スポットなし： （５）を参照のこと。
【００９９】
実施例６：Ｃｙｓ１ドメインアンカータンパク質でのタンパク質Ｘ及びＹのプローブ
この実施例で、アンカープローブは、ｍｙｃ 又は ｆｌａｇ抗原のコード配列が任意に含まれる ＰＫＣγのＣｙｓ１ドメイン（プロテインキナーゼＣイソ型γのＣｙｓ１ドメイン）に基づいており、これは、細胞へのトランスフェクト時に、ＰＭＡ（ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート）での処理時に原形質膜に再分布する一般的な細胞質分布を有する。これらがＣｙｓ１構築物内に設計されるならば、細胞質から原形質膜への再分布は、ＰＫＣγのＣｙｓ１ドメインに対する抗体、又はｍｙｃもしくはｆｌａｇ抗原に対する抗体を用いて検出され得る。ＰＫＣγのＣｙｓ１ドメインのＣ末端にＧＦＰが融合した融合タンパク質をコードするプラスミドで成功裏にトランスフェクトされた細胞では、ｍｙｃ又はｆｌａｇ抗原配列を用いて、あるいは用いないで、ＰＭＡ−誘導性再分布を、原形質膜でのＧＦＰ蛍光の随伴する増加に伴う細胞質中のＧＦＰ蛍光の低下として検出することができる（図６）。ＥＧＦＰ検出プローブ（一方がＸ、他方がＹ）を加えたＰＫＣγアンカープローブのＣｙｓ１ドメインで同時にトランスフェクトした細胞では、ＧＦＰ蛍光は、Ｘ及びＹが相互作用して互いを引き寄せる場合に、ＰＭＡ処理によって原形質膜に再分布するにすぎないであろう（図１２）。
【０１００】
Ｃｙｓ１アンカー
１）　新たなアンカー−検出対のＣＨＯへの同時トランスフェクト、
２）　過渡物で分布が細胞質であることをチェック。スポット又は他の明確な分布が存在すれば、（３）の試験をする価値が依然としてある可能性がある、しかし、分布変化が測定可能な場合のみである、
３）　過渡物を３０分１００ｎＭ ＰＭＡで試験、
ａ）　原形質膜へのプローブの分布：（４）にあるような二重選択下で過渡物から細胞をクローン、
ｂ）　再分布なし：安定物を待機（４参照）、
【０１０１】
４）　二重選択（例えばゼオシン１ｍｇ／ｍｌ＋０．５ｍｇ／ｍｌネオマイシン／Ｇ４１８）を用いて安定な細胞系を作製。ＰＭＡで試験、
ａ）　原形質膜へのプローブの分布：二重選択下、クリーニングで用いるための備、
ｂ）　再分布なし：抗−ｍｙｃ抗原で固定し、染色、
ｉ）　　抗体でＰＭ染色： （５）に進む
ｉｉ）　 ＰＭ染色なし：アンカー系が存在していないか、作用していない−再トランスフェクト、
５）　暫定的結合を試験（以下のＡ及びＢ参照）、
６）　結合状態が見られなければ、アンカー／検出対の別の組み合わせを選択肢、再度開始する。
【０１０２】
適当な相互作用刺激：Ａ及びＢでの暫定的結合についての試験を、同時に行うことができる。ＰＭへの標的化を課す前に、「可溶性段階」でのみ生じる潜在的な状態又は結合についてのＢ試験。
Ａ　　　ｉ）　１００ｎＭ ＰＭＡで安定物を３０分インキュベート、
ｉｉ）　相互作用刺激、つまり対を一緒にするような処理で試験、ＮＢこれは、過渡物を捕捉するため時間経過を要し得る：
（ａ）　ＰＭに対して再分布：安定物などから細胞をクローン、
（ｂ）　再分布なし：（Ｂ）を試験、
【０１０３】
Ｂ　　　ｉ）　１００ｎＭ ＰＭＡで安定物を３０分インキュベート、
ｉｉ）　相互作用刺激、つまり１００ｎＭ ＰＭＡとともに（又はそれにより迅速に続けて）対を一緒にするような処理で試験、
（ａ）　ＰＭに対して再分布：（４）のような二重選択下で安定物から細胞をクローン、
（ｂ）　再分布なし：（６）参照。
【０１０４】
実施例７：ＰＤＥ４Ａ４でのＳｏｓとＧｒｂ２の相互作用の評価
この実施例は、ＳｏｓとＧｒｂ２との相互作用に対する化合物、哺乳動物細胞の原形質膜に局在するあるチロシンキナーゼレセプターからすぐ下流のシグナル経路に関与する成分、例えばインスリン及び上皮細胞成長因子レセプターをスクリーニングするのに適した細胞系を作成する再分布トラップ法の使用を説明する。ＳｏｓはＲａｓ−様ＧＴＰａｓｅの活性化をもたらすグアニンヌクレオチド変換因子であり、Ｇｒｂ２は活性レセプターへのＳｏｓの補充をもたらすアダプター成分である。この実施例で、アンカープローブはＨＳＰＤＥ４Ａ４に基づいている。ＣＨＯ細胞を、実施例２及び３に記載のように、アンカープローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＳｏｓＡ及び「検出性」プローブｈＧｒｂ２−ＥＧＦＰを用いて安定的に同時トランスフェクトさせる。ゼオシンを用いてアンカープローブを選択し、ネオマイシン（Ｇ４１８）を用いて検出性プローブを選択する。図８ａは、１０％ＦＢＳを有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で成長する、そのような細胞の共焦画像であり、図８ｂは、１０μＭのロリプラムでの処理後の同様の細胞を示す。トランスフェクト細胞は、混合された非−クローン群である。ＧＦＰ−標識した検出プローブ（ＧＦＰ蛍光）は、核中わずかに高い濃度で、ロリプラム処理前の細胞一面に分布している。ロリプラム処理（２０時間）後、幾つかの細胞は、クローン群で明瞭な明スポットを生じる（図８ｂ）。スポットの出現とロリプラムの必要性は、ＰＤＥ４Ａ４に予測されるように、これらの細胞でアンカープローブがロリプラムに反応すること（図２）、及び、ＧＦＰ−標識した検出プローブがそれと結合しているに違いなことを示している。スポットがアンカープローブに対するロリプラム誘導性作用の結果であることを確認するため、ＰＤＥ４特異的阻害剤ＲＰ７３４０１をロリプラムの存在下で適用する（図９）。ＲＰ７３４０１はロリプラムと競合し、そしてＰＤＥ４Ａ４スポットを分散させる（図３及び４）。図９に見られるように、スポットはＲＰ７３４０１処理で消失し、それが、検出プローブのまばらな分布をもたらすアンカープローブであること、またアンカーと検出対が相互作用していることを立証している。ＨＳＰＤＥ４Ａ４及びＥＧＦＰは同時トランスフェクト及びロリプラム処理時に相互作用しない（示していない、しかしＥＧＦＰ分布は、そのような細胞中の核及び細胞質の双方で常に総−細胞性であり、その分布はロリプラムによって影響されない）ので、相互作用は、ＳｏｓとＧｒｂ２の天然の相互作用によって媒介される必要がある。
【０１０５】
クローン時、Ｓｏｓ−Ｇｒｂ２相互作用に対する化合物をスクリーニングするために同時トランスフェクト細胞を使用してもよい。これらの同時トランスフェクト細胞でロリプラム−誘導性スポットをつくり、消失するが、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブのみを安定的に発現する細胞ではロリプラム−誘導性スポットに影響しない化合物は、ＳｏｓとＧｒｂ２との相互作用を特に崩壊させる化合物である。
【０１０６】
実施例８：ＰＫＡｃａｔαでのＳｏｓとＧｒｂ２の相互作用の評価
この実施例は、Ｇｒｂ２とＳｏｓのＣ末端配列（Ｓｏｓの１０６７〜１３３２アミノ酸）との相互作用に対する化合物をスクリーニングするのに適した細胞系の作成を記載している。これは、アンカープローブがｃＡＭＰ−依存プロテインキナーゼイソ型αの触媒サブユニット（ＨＳＰＫＡｃａｔ−ｈＧｒｂ２）に基づく以外は、実施例７に記載の相互作用対に類似しており、それゆえ、それらが引き寄せ合えば、検出プローブ（ＥＧＦＰ−Ｓｏｓ−Ｃｔｅｒｍ）がＧＦＰ−鮮やかとなる集合物として非刺激細胞に局在する。このアンカー系のひとつの潜在的な利点は、事前のアンカー刺激が、相互作用を評価するには必要でないが、相互作用を同定した後に確認試験として使用されることである。したがって、この系を用いる相互作用調節物のスクリーニング工程は、試験中の相互作用を干渉し得る他の細胞シグナル系路の活性を変える見込みを伴わない。
【０１０７】
フォルスコリン±ＩＢＭＸ（イソブチルメチルキサンチン、非特異的ＰＤＥ阻害剤）での処理は、あらゆるＧＦＰ−鮮やかな集合物がこの系でのアンカーと検出プローブとの特異的相互作用の結果であることを確認するために、ＰＫＡｃａｔ系で用いられる。というのは、ＰＫＡｃａｔの集合物は、この処理下の細胞質に分解するためである。
実施例２及び実施例４に記載のように、アンカープローブＨＳＰＫＡｃａｔ−ｈＧｒｂ２及びＧＦＰ−標識した検出プローブＥＧＦＰ−Ｓｏｓ−Ｃｔｅｒｍを用いてＣＨＯ細胞を安定的に同時トランスフェクトさせる。ゼオシンを用いてアンカープローブを選択し、そしてネオマイシン（Ｇ４１８）を用いて検出プローブを選択する。アンカープローブＨＳＰＫＡｃａｔ−ｈＧｒｂ２及びＧＦＰ−標識した検出プローブＥＧＦＰ−Ｓｏｓ−Ｃｔｅｒｍの双方を安定的に発現するＣＨＯ細胞を、５０μＭのフォルスコリン＋５００μＭのＩＢＭＸでの処理前（図１１ａ）及び処理から１０分後（図１１ｂ）の図１１に示す。非刺激細胞（図５、ｔ＝０分）で見られるＰＫＡｃａｔ−ＥＧＦＰの分布に典型的なＧＦＰ−鮮やかな集合物を有する３個の細胞を、（図１１ａ）に明らかにする。フォルスコリン＋ＩＢＭＸによるこれらのスポットの分散、細胞中のｃＡＭＰを増加させる処理は、ＧＦＰ−標識した検出プローブが同時トランスフェクト細胞中のアンカープローブと相互作用するに違いないことを示している。というのは、アンカープローブのみがこうして増加したｃＡＭＰに反応できるためである（図５）。
【０１０８】
スポットを示す細胞は、クローニングに適しており、Ｇｒｂ２とＳｏｓ−Ｃｔｅｒｍとの相互作用に対する化合物のスクリーニングに使用してもよい。ＧＦＰ−鮮やかな集合物をこれらの同時トランスフェクト細胞で消失させるが、ＰＫＡｃａｔ−ＥＧＦＰプローブのみで安定的にトランスフェクトされた細胞では集合物に影響しない化合物は、Ｓｏｓ−ＣｔｅｒｍとＧｒｂ２との相互作用を特に崩壊させる化合物である。
【０１０９】
実施例９：Ｃｙｓ１ドメインでのＳｏｓとＧｒｂ２の相互作用の評価
この実施例は、Ｇｒｂ２とＳｏｓのＣ末端配列（Ｓｏｓの１０６７〜１３３２アミノ酸）との相互作用に対する化合物のスクリーニングに適した別の細胞系の作成を記載している。これは、アンカープローブがプロテインキナーゼＣイソ型ガンマのＣｙｓ１ドメインに基づく以外は、実施例６に記載されるものと同一の相互作用対であり、このため、非刺激細胞で細胞質及び核一面に局在する。これらの細胞を１００ｎＭのＰＭＡで処理すると、アンカープローブが原形質膜に再分布し、相互作用がアンカーと検出プローブとの間で発生すれば、ＧＦＰ蛍光が原形質膜に再分布することも認められるであろう。このアンカー系の利点は、ＰＭＡでの刺激時に、アンカープローブが、アンカーに結合する成分とＥＧＦＰ分子との相互作用を調節する上で重要な可能性がある他の成分と極めて接近するような原形質膜に取り込まれることである。Ｇｒｂ２及びＳｏｓ−Ｃｔｅｒｍの場合、原形質膜への接近は、それらの相互作用の開始には不要と思われるが、ある成分対は、この条件に合致しなければ、相互作用しない可能性がある。ＰＭＡでの処理は、２つのプローブの相互作用が最初に起これば、原形質膜への蛍光の再分布のみが生じるので、アンカーと検出プローブとの相互作用がこの系で生じることを確認するために用いられる。これは、ＰＭＡが蛍光の分布に影響しないＥＧＦＰ−Ｓｏｓ−ＣｔｅｒｍのみでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞でチェックすることができる。
【０１１０】
実施例２及び実施例６に記載のように、アンカープローブＣｙｓ１−ｈＧｒｂ２及びＧＦＰ−標識した検出プローブＥＧＦＰ−Ｓｏｓ−Ｃｔｅｒｍを用いてＣＨＯ細胞を安定的に同時トランスフェクトする。アンカープローブをゼオシンで選択し、検出プローブをネオマイシン（Ｇ４１８）で選択する。図１２は、１００ｎＭのＰＭＡでの処理前（図１２ａ）及び処理から５分後（図１２ｂ）のアンカープローブＣｙｓ１−ｈＧｒｂ２及びＧＦＰ−標識した検出プローブＥＧＦＰ−Ｓｏｓ−Ｃｔｅｒｍの双方を安定的に発現するＣＨＯ細胞を示す。ＰＭＡ処理前の細胞の大多数は、かなり一般的な細胞質様及び核様の蛍光分布を有する。ＰＭＡでの処理は、原形質膜に対し測定可能な蛍光のシフトを引き起こし、同様に、Ｃｙｓ１−ＥＧＦＰがＰＭＡに応じて再分布するであろう（図６）。この結果は、アンカープローブのみがこうしてＰＭＡに反応できるため、ＧＦＰ−標識した検出プローブがアンカープローブと相互作用しているに違いないことを示している。
【０１１１】
この様相を示す細胞は、クローニングに適しており、Ｇｒｂ２とＳｏｓ−Ｃｔｅｒｍとの相互作用に対する化合物のスクリーニングに使用してもよい。これらの同時トランスフェクト細胞でＥＧＦＰ蛍光のＰＭＡ−誘導性再分布を妨げるが、Ｃｙｓ１−ＥＧＦＰプローブのみで安定的にトランスフェクトされた細胞で蛍光再分布に影響しない化合物は、Ｓｏｓ−ＣｔｅｒｍとＧｒｂ２との相互作用を特異的に崩壊させる化合物である。
【０１１２】
実施例１０：トラップアッセイのアッセイ方法
選択的なＰＤＥ４阻害剤のロリプラムは、大部分の細胞で一般的なＰＤＥ４Ａ４の細胞質分布が、細胞質内の幾つかの明瞭なスポットに局在するＰＤＥ４Ａ４の濃度からなる分布に徐々に変化するように、ＰＤＥ４Ａ４の物理特性及び挙動に影響を及ぼす（実施例３参照）。
この実施例は、１４−３−３タンパク質とＢＡＤとの結合が、ＰＤＥ４Ａ４−１４−３β及びｅＧＦＰ−ＢＡＤ融合体を用いてどのようにして可視化できるかを示している。それは、可溶性の細胞質状態から、ｅＧＦＰ−ＢＡＤ融合体が結合されているか、又は細胞質中で実際に凝集している状態への可動性変化の一例である。
【０１１３】
使用される化学製品：
グルタマクス−１を有するＮＵＴ．ＭＩＸ Ｆ−１２（ＨＡＭ）．Ｇｉｂｃｏ Ｂｒｉ ３１７６５−０２７。
「ＦＣＳ」、仔ウシ血清、Ｇｉｂｃｏ Ｂｒｉ １００８４−１６８。
Ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（１００ｕ／ｍｌ／１００μｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ ｃａｔ Ｂｒｉ １５１４０−１２２。
４％のホルムアルデヒド、Ｂｉｅ＆Ｂｅｒｎｔｓｅｎ Ｌａｂ ００２２０。
トリトン−Ｘ １００、Ｓｉｇｍａ
ヘキスト３３２５８（貯蔵液：１０ｍＭ）
ロリプラム、ＲＢＩ
ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ Ｄ−５８７９。
【０１１４】
器具：
Ｆｌｕｏｓｃａｎ ＡＳＣＥＮＴ ＣＦプレートリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）
フィルター： ４８５／５２７（ＧＦＰ）及び３５５／４６０（ヘキスト）、全てＬａｂｓｙｓｔｅｍｓのもの
緩衝液：
抽出緩衝液：ＰＢＳで１：４０（＝０．１％）に希釈したホルムアルデヒド４％＋トリトン−Ｘ １００ １％＋ヘキスト３３２５８ １０μＭ
ＰＢＳ ダルベッコ：ＧＩＢＣＯ １４１９０−０９４
【０１１５】
細胞：
細胞型：ＰＤＥ４Ａ４とヒト１４−３−３βとのインフレームの融合タンパク質を発現するプラスミドと、ＥＧＦＰとヒトＢＡＤとのインフレームの融合タンパク質を発現する別のプラスミドでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞（このようなプローブの構築についての詳細は、実施例１及び３に見出すことができる）。
密度：９６ウェル−マイクロタイタープレート（ＶｉｅｗＰｌａｔｅ９６、黒色；Ｐａｃｋａｒｄ）中、１．０×１０Ｅ５／ウェル（接種日）
【０１１６】
方法：
細胞を、スクリーニングの２０〜２４時間前に、２００μｌのＨＡＭ Ｆ−１２ｗ．１０％ＦＣＳ及び５％ ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ中の１．０×１０Ｅ５／ウェルにプレートする。刺激細胞に、さらに１０μＭのロリプラムを加える。
１４−３−３とＢＡＤとの相互作用を阻害し得る薬剤を試験するため、試験化合物を２００μｌのＨＡＭ Ｆ−１２生育培地の上部に加え、ＣＯ２インキュベーターで２時間培養する。
試験化合物を有するＨＡＭ Ｆ−１２をマイクロタイタープレートの全ウェルから出し、細胞を２００μｌの抽出緩衝液で５分間抽出する。
細胞に２００μｌの抽出緩衝液の上部で１００μｌのホルムアルデヒド４％緩衝液を加え、５分インキュベートする。
抽出緩衝液を除き、細胞を１００μｌ のＰＢＳで２回洗浄する。細胞に２００μｌのＰＢＳ緩衝液を加える。
【０１１７】
予めプログラム化した方法及びＧＦＰならびにヘキスト３３２５８蛍光団に適したフィルター設定を用いて、ＡＳＣＥＮＴプレートリーダーで蛍光を読み取る。ヘキストの読み取りを用いて、細胞数を予測でき、それによって、同数の細胞の含んでいない可能性のあるウェルからＧＦＰシグナルの標準化に有用なシグナルを供する。結果を図１５に示す。
【０１１８】
実施例１１：再分布（登録商標）アッセイのアッセイ法
ＮＦｋＢ（ｐ６５）がＩＩ−１とのＮＦｋＢの刺激でサイトソルから核へ移動することは、十分に立証されている。このことは、ＮＦｋＢ（ｐ６５）−ＧＦＰ融合体を用いて視覚化できる。サイトゾルのＮＦｋＢ（ｐ６５）−ＧＦＰの移動後に測定される総ＧＦＰ濃度は、核への移動度、つまりＮＦｋＢの活性化度を示す。これは、可溶性細胞質ＮＦｋＢから核中に結合された成分への変化としての可動性変化の一例である。
抽出法を適用することで、非刺激細胞及び刺激細胞との相違を蛍光の強度によって読み取ることができる（図１６参照）。
【０１１９】
実施例１２：抽出最適化
細胞を既知の濃度で接種し、２４時間生育させる。トリトン−ｘ １００とホルマリンを様々に組み合わせて刺激細胞と非刺激細胞（完全な「運的」範囲を示す）を抽出し、シグナルをプレートリーダーで読み取る。本目的は、ノイズに対する最適なシグナル（ｓ／ｎ）割合を示すホルマリンとトリトン−ｘとの割合を同定することである。ｓ／ｎは、（刺激細胞中の蛍光−非刺激細胞中の蛍光）／非刺激細胞での蛍光×１００％として算出される。
【０１２０】
【数１】
2004502434.tif 000004
【０１２１】
１４−３−３タンパク質とＢＡＤとの結合用抽出緩衝液の最適化
最適化を図１７で例示する。
【０１２２】
実施例１３：抽出物を用いるフォルスコリン誘導性ＰＫＡｃａｔ移動の定量
ＰＫＡｃａｔ−ＧＦＰは、不活性な四量体形態の明瞭なスポットを形成する。細胞ｃＡＭＰの増加（例えばフォルスコリンによるアデニレートシクラーゼ活性の刺激による）によって、ＰＫＡｃａｔがその制御サブユニットから分離し、スポットをサイトゾルに「分解」する。抽出方法をとおしてサイトソルＰＫＡｃａｔ−ＧＦＰを除いた後に測定される総ＧＦＰ強度は、不活性化、非−分離ＰＫＡｃａｔのレベルを示している。
この実施例では、抽出法を用いて、ＰＫＡｃａｔ−ＧＦＰアッセイでのフォルスコリン用量反応を定量している。
細胞を、種々の濃度のフォルスコリンで１５分間処理する（スポットの除去）。細胞を抽出する（０．２％のホルマリン／ ０．２％のトリトン−ｘ）。シグナルをＦＬＩＰＲで読み取る。結果を図１８に示す。約３μＭで測定されたＥＤ５０は、文献の基準と一致している。
【０１２３】
実施例１４：正常なＣＨＯ細胞とＨＳＰＤＥ４Ａ４Ｂ−ＧＦＰ融合タンパク質を安定的に発現するＣＨＯ細胞におけるロリプラム処理の作用の比較
ＰＤＥ４阻害剤のロリプラムは、実施例３に記載のＰＤＥ４Ａ４に対する融合体でトランスフェクトした細胞の細胞質中で、稠密なＰＤＥ４Ａ４集合物の生成を刺激するために用いられる。そのような刺激を用いることに関して有り得る懸念は、ＰＤＥ４酵素の基質である二次メッセンジャー分子ｃＡＭＰのレベルが、ロリプラム処理細胞で望ましくないｃＡＭＰ−依存性工程も活性化され得るような程度に、それらの細胞で増加する可能性があることである。ｃＡＭＰ−依存性エフェクタータンパク質の例には、ＰＫＡファミリーのキナーゼ、幾つかのイオンチャンネル及びｃＡＭＰ−ＧＥＦ１ならびに２のような、あるグアニンヌクレオチド変換因子が含まれる。この実施例は、ロリプラムでの処理が、融合タンパク質はホスホジエステラーゼ活性を有するが、ＨＳＰＤＥ４Ａ４Ｂ−ＧＦＰを発現するＣＨＯ細胞では細胞ｃＡＭＰレベルを独力で増さないことを立証している。したがって、これらの細胞での望ましくないｃＡＭＰ−依存性工程の活性化は、ロリプラムが、これらの細胞でＰＤＥ４Ａ４の稠密な集合物の生成を刺激する際には、極めて見込みがない。
【０１２４】
ＨＳＰＤＥ４Ａ４Ｂ−ＧＦＰを安定的に発現するＣＨＯ細胞（実施例２参照）及び非トランスフェクトＣＨＯ細胞を、１．２×１０５細胞／ウェルの密度で９６−ウェルマイクロタイタープレートの個々のウェルに接種し、グルタマクス、１００μｇのペニシリン−ストレプトマイシン混合物ｍｌ−１及び種々の濃度のロリプラムを加えた１０％ＦＢＳを有するＨＡＭ Ｆ−１２培地で１６〜１８時間培養する。インキュベート後、Ａｍａｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈの市販キット、キット♯ＲＰＡ５３８を用い、製造元の指示にしたがってｃＡＭＰ含量を測定する。
【０１２５】
アッセイキットの製造元が推奨するように、ｃＡＭＰ／ウェルの量を、ｃＡＭＰ標準曲線から回帰分析を用いて算出した。この実験の結果を図１９に示す。正常な非トランスフェクトＣＨＯ細胞（◆）及びＨＳＰＤＥ４Ａ４Ｂ−ＧＦＰを安定的に発現する細胞（■）の曲線は、いずれも０．０３μＭ〜３μＭのロリプラム処理の範囲に対し細胞ｃＡＭＰ濃度の際立った増加を示さない。１０μＭのロリプラムでの正常なＣＨＯ細胞の僅かなｃＡＭＰ増加は、この濃度が公知のＰＤＥ４イソ型のロリプラムによる阻害について報告されているあらゆるＩＣ５０値よりも３０〜３００倍高いため、おそらく有意ではないであろう。
【０１２６】
別の実験で、非トランスフェクトＣＨＯ細胞及び安定的にＨＳＰＤＥ４Ａ４Ｂ−ＧＦＰを発現するＣＨＯ細胞を、図１９に記載のようにロリプラムを加えずに、但し種々の濃度のフォルスコリンを添加し、ｃＡＭＰレベルの測定前に６０分培養した。この実験の結果を図２０に示す。正常な非トランスフェクトＣＨＯ細胞（◆）の曲線は、アデニレートシクラーゼ活性体に応じて予想される細胞ｃＡＭＰの用量−依存増加を示す。ＨＳＰＤＥ４Ａ４Ｂ−ＧＦＰを安定的に発現する細胞（■）は、０．３μＭ〜１００μＭのフォルスコリン処理の範囲に対し細胞ｃＡＭＰ濃度の際立った増加を示さない。この結果は、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＧＦＰ融合タンパク質が活性なホスホジエステラーゼ酵素であること、及び、その大きく増した発現は、試験範囲にわたるフォルスコリンによるアデニレートシクラーゼ活性化にも関わらず、これらの細胞でのあらゆるｃＡＭＰ増加を効果的に妨げることを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】
１０％ＦＢＳを有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で成育する、プローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ−Ｎ１で安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を示す共焦蛍光画像。トランスフェクト細胞は、非−クローン混合群由来のクローンである。ＧＦＰ蛍光は、ほぼ均等に非−核細胞質に分布しており、この範囲内の暗領域は、おそらく、見かけ上プローブが除かれたミトコンドリアであろう。
【図２】
１０％ＦＢＳ及び２μＭロリプラムを有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で成育する、プローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ−Ｎ１で安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を示す共焦蛍光画像。トランスフェクト細胞は、非−クローン群から単離した単細胞に由来する。細胞を６．７時間ロリプラムで処理した。ＧＦＰ蛍光は、９５％以上の細胞の明スポットに集中している。
【図３】
ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰを発現するクローン細胞での３μＭロリプラムに対するＲＰ７３４０１の用量反応。細胞を９６−ウェルのＰａｃｋａｒｄ ＶｉｅｗＰｌａｔｅに接種し、約８０％の集密まで３μＭロリプラムと１０％ＦＢＳを加えたＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で生育させる。ロリプラム処理は、計１６時間であった。種々の濃度のＲＰ７３４０１をロリプラム−含有ウェルに加え、さらに４時間インキュベートした。次いで、細胞を化学的に固定し、洗浄し、ヘキスト ３３２５８で染色し、自動画像化を用いて各処理ウェルについて細胞当たりの平均スポットを計測した（全て実施例２に記載のとおり）。各ポイントは、同濃度のＲＰ７３４０１ で５個の処理ウェルから測定される細胞当たりの平均スポットの平均である。結果を４−パラメータのヒルプロット（Ｈｉｌｌ ｐｌｏｔ）に適合させ、３μＭロリプラムによるスポット形成のＲＰ７３４０１での競合阻害に対する２０ｎＭのＩＣ５０数を出す。
【図４】
ＦＩＰＲで測定される、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰを発現するクローン細胞での１μＭロリプラムに対するＲＰ７３４０１の用量反応。細胞を９６−ウェルＰａｃｋａｒｄ ＶｉｅｗＰｌａｔｅに接種し、約８０％の集密まで１μＭロリプラムと１０％ＦＢＳを加えたＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で生育させる。ロリプラム処理は、計１６時間であった。様々な濃度のＲＰ７３４０１をロリプラム−含有ウェルに加え、さらに４時間インキュベートした。次いで、細胞を同時にかつ化学的に固定し、浸透させ、洗浄し、そしてスポット形成をＦＬＩＰＲ装置で測定した（全て実施例２に記載のとおり）。スポット形成の程度（縦座標値）を、バックグラウンドシグナル（ロリプラム未処理細胞からの値）±標準偏差を含む未修正値として得る。
結果を４−パラメータのヒルプロットに適合させ、１μＭロリプラムによるスポット形成のＲＰ７３４０１での競合阻害に対する約５０ｎＭのＩＣ５０数を出す。
【図５】
フォルスコリン処理した、ヒトｃＡＭＰ−依存プロテインキナーゼ触媒サブユニットイソ型αのＣ末端へのＥＧＦＰの融合体である、ＨＳＰＫＡｃａｔ−ＥＧＦＰを発現するＣＨＯ細胞の経時的画像。細胞は、１０％ＦＢＳを加えたＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で生育するクローン細胞系で、これにｔ＝０時で１μＭフォルスコリンを加えた。連続画像は、ｃＡＭＰレベルがフォルスコリン処理の結果として細胞内で増すにつれて、蛍光タッグされたＰＫＡの触媒サブユニットが、数分のあいだに鮮やかな集合物から細胞質にどのようにして再分布するかを示している。スケールバー＝１０μ。
【図６】
１００ｎＭＰＭＡでの処理前（ａ）及び処理から５分後の、ヒトプロテインキナーゼＣイソ型ガンマ由来ｃｙｓ１ドメインのＣ末端へのＥＧＦＰの融合体であるＣｙｓ１−ＥＧＦＰを発現するＣＨＯ細胞の経時的画像。細胞は、１０％ＦＢＳを加えたＨＡＭ’ｓ　Ｆ１２培地で生育するクローン細胞系である。１００ｎＭ ＰＭＡでの処理から５分後（ｂ）、蛍光タッグされたＰＫＣガンマのＣｙｓ１ドメインは、細胞質及び核から原形質膜に再分布する。
【図７】
Ｃ−末端をＧＦＰでタッグしたＰＫＣガンマのヒトイソ型のＣｙｓ１ドメインを安定的に発現するＣＨＯクローン細胞系を、９６−ウェルのマイクロタイタープレート（Ｐａｃｋａｒｄ Ｖｉｅｗ−Ｐｌａｔｅ）で培養した。ＫＲＷ（実験緩衝液、ＮａＣｌ １４０、ＫＣｌ ３．６、ＮａＨ２ＰＯ４ ０．５、ＭｇＳＯ４ ０．５、ＮａＨＣＯ３ ２．０、ＣａＣｌ２ １．５及びＨＥＰＥＳ １０、Ｄ−グルコース ５（ｐＨ ７．４、１Ｍ ＮａＯＨで滴定）を（ｍＭで）含む改質クレブス−リンゲル緩衝液）中で２０分、事前にインキュベートした後、細胞プレートをＦＩＰＲに置く。続いて、１：３工程で１０μＭ〜０．５ｎＭの用量で得たホルボールエステルＰＭＡを用いて細胞をＦＩＰＲ装置上で刺激した。これは、ＰＫＣガンマ−Ｃｙｓ１が最初の１〜５分の刺激中にサイトゾル及び核の画分から原形質膜に移動するので、蛍光強度の縮小として定量できるタイプの再分布反応をこれらの細胞で生じる。図は、ＰＭＡでの刺激の最初の３分間に蓄積される蛍光変化（ｎ＝８）の平均（＋ＳＤ）として用量反応を示す。８個のバックグラウンドトレースに基づくバックグラウンドトレースの控除によって全データをバックグラウンドに対して補正し、ＰＭＡの添加時を０に設定した。
【図８】
１０％ＦＢＳを有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で生育する、アンカープローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＳｏｓＡ及び検出プローブｈＧｒｂ２−ＥＧＦＰで安定的に同時トランスフェクトされたＣＨＯ細胞（ａ）、及び１０μＭロリプラム処理後の同様の細胞（ｂ）を示す共焦蛍光画像。トランスフェクト細胞は、非−クローン混合群である。ＧＦＰ−標識した検出プローブ（ＧＦＰ蛍光）は、ロリプラム処理前（ａ）、核で僅かに高い濃度を有しながら、細胞一面に分布している。ロリプラム処理後（２０時間；ｂ）、クローン群中、幾つかの細胞は明瞭な明スポットを生じる。スポットの出現とロリプラムの必要性は、ＰＤＥ４Ａ４に予想されるように、これらの細胞でアンカープローブがロリプラムに反応すること（図２）、及び、ＧＦＰ−標識した検出プローブがそれと結合しているに違いなことを示している。
【図９】
１０μＭのロリプラムで２０時間処理した図８ｂ と同一の細胞群（ａ）を、室温で７５分１０μＭ ＲＰ７３４０１を用いてさらに処理する（ｂ）。この処理は、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰのロリプラム−誘導性スポットを分解し（図３及び４）、これらの細胞でＧＦＰ−明スポットに同一の作用を有する。これは、これらのスポットが、アンカープローブとＧＦＰ−標識した検出プローブとの相互作用の結果であることを立証している。
【図１０】
ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰを発現するＣＨＯ細胞を、１０μＭロリプラムで２０時間処理し、次いで化学的に固定し、ＨＳＰＤＥ４Ａ４酵素のユニークなＣ末端配列の一部と同一のペプチドに対して宿主のヒツジで生じる抗体を用いて免疫染色した。抗体は、Ａｌｅｘａ ５４９接合性ロバ抗ヒツジ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ、Ｏｒｅｇｏｎ、ＵＳＡ）を用いて検出される。この共焦顕微鏡写真対は、Ａｌｅｘａ５４９蛍光で得られる画像（ｂ）と比較した細胞中のＥＧＦＰ蛍光の画像（ａ）を示している。ＧＦＰとＡｌｅｘａ ５９４の画像とに有意なブリード−スルー（ｂｌｅｅｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）蛍光が確実にないように、放射フィルター（ａ：５１５〜５２５ｎｍ帯域、ｂ：５９０ｎｍ長−路）を選択する。これらの画像は、ロリプラム処理した同時トランスフェクト細胞で未標識ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ベースのアンカープローブの存在を確認するのに有用な、ＥＧＦＰタグを個々に要するＨＳＰＤＥ４Ａ４の集合物をＰＤＥ４Ａ４抗体を用いてどのようにして検出できるかを立証している。
【図１１】
５０μＭフォルスコリン＋５００μＭ ＩＢＭＸでの処理前（ａ）ならびに処理から１０分後（ｂ）のアンカープローブＨＳＰＫＡｃａｔ−ｈＧｒｂ２及びＧＦＰ−標識した検出プローブＥＧＦＰ−Ｓｏｓ−Ｃｔｅｒｍの双方を安定的に発現するＣＨＯ細胞。非刺激細胞で見られるＰＫＡｃａｔ−ＥＧＦＰの分布に典型的なＧＦＰ−鮮やかな集合物を有する３個の細胞が、（ａ）で明らかである（図５、ｔ＝０分）。フォルスコリン＋ＩＢＭＸによるこれらのスポットの分散、細胞でｃＡＭＰを増す処理は、アンカープローブのみがこうして増加したｃＡＭＰに反応できるため、ＧＦＰ−標識した検出プローブが同時トランスフェクト細胞でアンカープローブと相互作用するに違いないことを示している（図５）。
【図１２】
１００ｎＭ ＰＭＡでの処理前（ａ）及び処理から５分後（ｂ）のアンカープローブＣｙｓ１−ｈＧｒｂ２とＧＦＰ−標識した検出プローブＥＧＦＰ−Ｓｏｓ−Ｃｔｅｒｍの双方を安定的に発現するＣＨＯ細胞。（ａ）の細胞の大多数は、かなり一般的な細胞質及び核の蛍光分布を有する。ＰＭＡでの処理で、原形質膜への蛍光の測定可能なシフトが引き起こされ、同様にしてＣｙｓ１−ＥＧＦＰがＰＭＡに応じて再分布する（図６）。この結果は、アンカープローブのみがこうしてＰＭＡに反応できるため、ＧＦＰ−標識した検出プローブがアンカープローブと相互作用するに違いないことを示している。
【図１３】
プローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰで安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を示す共焦蛍光画像。画像を、強度を直接比較するため、同一の顕微鏡設定で記録する。トランスフェクト細胞は、単一親細胞由来のクローン群である。図１３ａでは、細胞は１０％ＦＢＳを有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地のみで生育する；ＧＦＰ蛍光は、各細胞の核周辺細胞質内の鮮やかな顆粒様スポットに限定される。図１３ｂでは、図１３ａで見られるのと同様の細胞を２μＭロリプラムで２時間処理した。ＧＦＰ−明スポットの大多数はロリプラム処理中の全細胞で消失し、細胞質は一般に明るくなる。大きなスポットは、幾つかの細胞では消失しない。ロリプラムを洗い流すと、スポットは１．７５時間以内に再形成する。
【図１４】
図１４は、ロリプラムに対するＰＤＥ４Ａ１スポット分散の用量反応曲線を示す。種々の阻害剤の各濃度に対する細胞当たりのスポット数は４回の測定±ｓｅｍの平均であり、各測定はそれ自体１００個以上の細胞から得た平均である。細胞を、様々な濃度のロリプラムと１０％ＦＢＳを加えたＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で７時間生育させる。次いで、細胞を４％のホルマリン緩衝液（ｐＨ ７）で１５分間化学的に固定し、ＰＢＳで洗い、ＰＢＳ中１０μＭのヘキスト３３２５８で２５℃で１０分間染色し、そしてＰＢＳで２回洗浄する。実施例２に記載のように自動画像を収集し、細胞当たりのスポット数を分析する。
【図１５】
ＰＤＥ４Ａ４とヒト１４−３−３βとのインフレーム融合タンパク質及びＥＧＦＰとヒトＢＡＤとのインフレーム融合タンパク質を発現するＣＨＯ細胞の刺激作用。著しいスポットの出現が、ロリプラムで刺激した細胞で観察される（左パネル）。抽出細胞は、スポット及び集合物に局在する蛍光を大部分保持するが、細胞質により一般的に分布している蛍光を失う。この非−アンカー蛍光は恐らく可動性で、それゆえ、その浸透により細胞から迅速に洗い流される。
【図１６】
１ｎｇ／ｍｌのＩＩ−１でのＮＦｋＢ（ｐ６５）−ＥＧＦＰ融合体を発現するＣＨＯ細胞の刺激作用。サイトソルから核への著しい再分布が観察される（左パネル）。抽出細胞は、核由来の蛍光の大部分を保持するが、サイトソル由来の蛍光は失われる（右パネル）。
【図１７】
トラップアッセイ（スポット）：４Ａ４−１４−３−３ｂ＋ｅＧＦＰ−ＢＡＤ
Ａ：測定される完全な蛍光
Ｂ：図Ａのデータに基づくシグナル／ノイズ割合。見られるように、最適なシグナル／ノイズ割合は、この場合、ホルマリン０．８％＋トリトン−ｘ １００ ２％を用いて得られる。
【図１８】
ＰＫＡ移動を刺激するフォルスコリンの作用に対する用量反応。算出されるＥＣ５０＝３．２８ｕＭフォルスコリン。
【図１９】
ＨＳＰＤＥ４Ａ４Ｂ−ＧＦＰを安定的に発現するＣＨＯ細胞（実施例２参照）及び非トランスフェクトＣＨＯ細胞を、９６−ウェルのマイクロタイタープレートの個々のウェルに１．２×１０５細胞／ウェルの密度で接種し、グルタマクス、１００μｇのペニシリン−ストレプトマイシン混合物ｍｌ−１及び様々な濃度のロリプラムを加えた１０％ＦＢＳを有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で１６〜１８時間培養する。インキュベート後、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈの市販キット、ｋｉｔ♯ＲＰＡ５３８を用い、製造元の指示に従ってｃＡＭＰ含量を測定する。
アッセイキットの製造元によって推奨されるようにして、ｃＡＭＰ標準曲線から回帰分析を用いてｃＡＭＰ／ウェルの量を算出した。正常な非トランスフェクトＣＨＯ細胞（◆）及びＨＳＰＤＥ４Ａ４Ｂ−ＧＦＰを安定的に発現する細胞（■）の曲線は、いずれも０．０３μＭ〜３μＭのロリプラム処理の範囲に対し細胞ｃＡＭＰ濃度の際立った増加を示さない。１０μＭのロリプラムでの正常なＣＨＯ細胞の僅かなｃＡＭＰ増加は、おそらく有意ではない。
【図２０】
ＨＳＰＤＥ４Ａ４Ｂ−ＧＦＰを安定的に発現するＣＨＯ細胞（実施例２参照）及び非トランスフェクトＣＨＯ細胞を、９６−ウェルのマイクロタイタープレートの個々のウェルに１．２×１０５細胞／ウェルの密度で接種し、グルタマクス、１００μｇのペニシリン−ストレプトマイシン混合物ｍｌ−１及び１０％ＦＢＳを有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で１６〜１８時間培養する。１６〜１８時間培養後、細胞を様々な濃度のフォルスコリンを用いて６０分処理する。
処理後、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈの市販キット、ｋｉｔ♯ＲＰＡ５３８を用い、製造元の指示に従ってｃＡＭＰ含量を測定する。
ｃＡＭＰ／ウェルの量を、アッセイキットの製造元が推奨しているように、ｃＡＭＰ標準曲線から回帰分析を用いて算出した。
正常な非トランスフェクトＣＨＯ細胞（◆）の曲線は、このアデニレートシクラーゼ活性体に応じて予想される細胞ｃＡＭＰの用量−依存増加を示す。ＨＳＰＤＥ４Ａ４Ｂ−ＧＦＰを安定的に発現する細胞（■）は、０．３μＭ〜１００μＭのフォルスコリン処理の範囲に対し細胞ｃＡＭＰ濃度の際立った増加を示さない。
【０１２７】
【表Ａ】2004502434.tif 000005
【０１２８】
【表Ｂ】2004502434.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際公開パンフレット】
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2004502434.tif 000107
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004502434.tif 000108
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004502434.tif 000109
【国際調査報告】
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