(57)【要約】酵素の酸化−還元反応におけるNAD(P)+/NAD(P)H補酵素系の代替物としての補助因子として作用する新規物質。還元された又は酸化された生成物への基質の酵素による酸化／還元でのNAD(P)+/NAD(P)H系の作用を模倣する物質。NAD(P)+/NAD(P)H系の代替物として模倣する物質の選択及び製造方法並びにNAD(P)+/NAD(P)H系の代替物としての補助因子を含む装置。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式I
【化１】
2004527509.tif 000013
【化２】
2004527509.tif 000014
（式中、Rは‐CN、‐C(O)NH2、‐C(O)NHCH3、‐C(S)NH2、‐C(O)CH3又は‐C(O)OCH3であり、
R1は、‐(CH2(CH2O)nYR2、リボース‐Y‐R2、又は
【化３】
2004527509.tif 000015
であり、
Yは、−OPOO-、‐OBO2-、‐OSO2-、‐CH3NH、‐(CH2)nNH‐、アデニン又はイミダゾールであり、
R2は、H、‐CH3、‐(OCH2CH2)n、‐(NCH2CH2)n‐又は‐[(N=P(OCH3)2]nであり、Xは、-OCH3、-CF3、-O(CH2CH2O)n又は-OPOOR2であり、
R3は、H、-CH3、-(OCH2CH2)n、-(NCH2CH2)n-又は-[N=P(OCH3)2)]nであり、
nは1-2000である。）の化合物又はその塩化物、臭化物、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩等の塩を、その１，４−還元型と共に含むことを特徴とする、酸化−還元酵素反応におけるNAD(P)+/NAD(P)Hの代替物としての組成物。
【請求項２】
前記化合物は、化合物（6）で表されるβ−ニコチンアミド−５−リボース・メチルホスフェートであり、その還元型は、化合物（7）で表される１，４−ジヒドロニコチンアミド−５−リボース・メチルホスフェートであることを特徴とする、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記化合物は、その１，４−還元型と共に、重合体のマトリックスに固定化されていることを特徴とする、請求項２記載の組成物。
【請求項４】
（ａ）重合体マトリックス、
（ｂ）触媒前駆体、
（ｃ）補助因子、及び
（ｄ）酵素
を含むことを特徴とする、酸化−還元工程におけるNAD(P)+/NAD(P)H系の代替物としての又は再生のための装置。
【請求項５】
前記補助因子は、NAD+、NADP+又は式I若しくは式II
【化４】
2004527509.tif 000016
【化５】
2004527509.tif 000017
（式中、Rは‐CN、‐C(O)NH2、‐C(O)NHCH3、‐C(S)NH2、‐C(O)CH3又は‐C(O)OCH3であり、R1は、‐(CH2(CH2O)nYR2、リボース‐Y‐R2又は
【化６】
2004527509.tif 000018
であり、
Yは、−OPOO-、‐OBO2-、‐OSO2-、‐CH3NH、‐(CH2)nNH‐、アデニン又はイミダゾールであり、
R2は、H、CH3、‐(OCH2CH2)n、‐(NCH2CH2)n‐又は‐[(N=P(OCH3)2)]nであり、
Xは、-OCH3、-CF3、-O(CH2CH2O)n又は-OPOOR2であり、
R3は、H、-CH3、-(OCH2CH2)n、-(NCH2CH2)n-又は-[N=P(OCH3)2]nであり、
nは1-2000である。）
の生物模倣化合物又はその塩であることを特徴する、請求項４記載の装置。
【請求項６】
前記補助因子は、NAD(P)+/NAD(P)H系の代替物として用いる生物模倣剤であることを特徴とする、請求項５記載の装置。
【請求項７】
前記生物模倣剤は、１，４−還元誘導体と組み合わされていることを特徴する、請求項６記載の装置。
【請求項８】
前記触媒前駆体は、複合体を構成するロジウム、亜鉛、ニッケル、コバルト、イリジウム又はルテニウムであることを特徴とする、請求項７記載の装置。
【請求項９】
前記触媒前駆体は、複合体を構成するロジウムであることを特徴とする、請求項８記載の装置。
【請求項１０】
前記触媒前駆体は、[Cp*Rh(bpy)(H2O)]トリフレート塩であることを特徴とする、請求項９記載の装置。
【請求項１１】
還元剤をさらに含むことを特徴とする、請求項８記載の装置。
【請求項１２】
前記還元剤は、ギ酸塩、水素、水素化ホウ素ナトリウム、ヒドロキノン、ナトリウム・ボロハイドレイト（sodium borohydrate）及び電極又は光子であることを特徴とする、請求項１１記載の装置。
【請求項１３】
前記酵素は、酸化酵素または還元酵素であることを特徴とする、請求項１４の装置。
【請求項１４】
NAD(P)+/NAD(P)H補助因子を請求項１記載の生物模倣型組成物に置換する段階を含むことを特徴とする、酸化−還元酵素反応においてNAD(P)+/NAD(P)Hを代替するための方法。
【請求項１５】
酸化酵素または還元酵素の存在下で基質並びに酸化型及び還元型の前記生物模倣剤を含む組成物を反応させる段階を含むことを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
水素化物を提供する触媒前駆体をさらに含むことを特徴とする、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記触媒は、[Cp*Rh(bpy)(H２O)]トリフレート塩であることを特徴とする、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ロジウム、イリジウム、亜鉛、コバルト、ニッケル又はルテニウムを含むことを特徴とする、触媒前駆体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素酸化還元反応におけるNAD(P)+/NAD(P)H補酵素系の代替物としての補助因子として作用する新規物質に関する。特に、本発明は、水溶性又は部分的に水溶性である物質に関し、該物質は、基質を、その還元された又は酸化された生成物へ酵素的に酸化又は還元する反応におけるNAD(P)+/NAD(P)H系の作用を模倣する。さらに、本発明は、NAD(P)+/NAD(P)H系の代替物としての前記模倣物質の選択及び製造方法に関する。最後に、本発明は、NAD(P)+/NAD(P)H系の代替物としての補助因子を含む装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素反応は、その選択性が高いことと環境への影響が低いことから非常に重要である。しかし、既知の全酵素のうち35％以上が、その特有の機能を発揮するのに補酵素又は補助因子を必要としている。特に、生成物への基質の酸化及び／又は還元を触媒する酵素である酸化−還元酵素は、エネルギー送達のためにNAD(P)+とNAD(P)Hの再生を必要とする。しかし、NAD(P)+/NAD(P)H補助因子の細胞内での供給量は限られており、天然資源又は人工的な製造からこれらの補助因子を再生するのには費用がかかるので、NAD(P)+/NAD(P)H酸化−還元系を産業目的で利用することは実用的ではない。また、NAD(P)+/NAD(P)Hの再生工程へのエネルギー送達には酸化還元触媒が必要であり、それ故に、NAD(P)Hを高速で位置特異的に再生することが必要とされる。そのような補助因子の再生は、酵素のキラル合成反応におけるNAD(P)+/1,4-NAD(P)H系の経済的な利用を、特に大量かつエネルギーがさらに強力な工程において制限する段階であった。
【０００３】
ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（NAD+）の還元型である1,4-NADH補酵素を再生する実用的な方法の開発は、生体触媒の分野において引き続き大変重要な事柄であり、酵素による還元反応を、キラル有機化合物の合成に用いている（Appl. Biochem. Biotech., 14:147 (1984)及びJ. Chem. Soc. Perkin Trans., 1:967 (1995)）。
【０００４】
酵素的、化学的、光化学的又は電気化学的な方法によってNAD+を1,4-NADHへ転換することは広く研究されている。
【０００５】
より高速かつより経済的な再生工程を開発するために、様々な遷移金属水素化物が、NAD+及びNAD+のモデルを1,4-NADH誘導体へ位置選択的に還元するための触媒として研究されている（Organometallics, 10:1568 (1991), J. Am. Chem. Soc., 116:2141 (1994)及びNat. Struct. Biol., 3:213 (1996)）。
【０００６】
最も具体的な例としては、Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 29:388 (1990)に、in situで生成した[Cp*Rh(bpy)(H)]+（bpy=2,2’-bipyridyl）を用いて、NAD+を1,4-NADH誘導体へ位置選択的に還元して、酵素のキラル還元反応による前記補助因子の再生工程を実証したことが記載されている。
【０００７】
一方、上記の[Cp*Rh(bpy)(H)]+によるNAD+の還元は、1,4-NADHに対して高い位置特異性があることが当時示されたが、この重要な補助因子の転換機構の詳細は不明であった(Cnem. Ber., 122:1869 (1989)及びOrganometallics (1991), supra)。最近になって、いくつかの見識が、本発明者らによってAngew. Chem. Int. Ed. 38:1429 (1999)に公表した予備的な情報として提供されたのみである。
【０００８】
上記の方法は、非常に高額なNAD+/NADH系の再生のみにしか用いられなかったが、それは大量かつエネルギーがさらに強力な酸化−還元酵素工程に適さなかった。このため、NAD(P)+/NAD(P)H系の工業的な利用が制限されている。
【０００９】
従って、高価なNAD(P)+/NAD(P)H系に代わる新しい方法及び／又は物質が利用できれば、非常に好都合である。NAD(P)+/NAD(P)Hを完全に代替するためのそのような方法及び／又は物質は、酵素による酸化−還元反応の能力を大いに向上して、大量の生産物を処理するだろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明の第１の目的は、酸化／還元酵素反応におけるNAD(P)+/NAD(P)H系の代替物としての補助因子として作用する効果的かつ安価な物質及びその使用方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の１つの態様は、酵素酸化−還元反応におけるNAD(P)+/NAD(P)H系を効果的に代替するために本発明の新規物質を用いる方法である。本発明のもう１つの態様は、酸化−還元反応の補助因子として作用し、NAD(P)+/NAD(P)H系の作用を模倣する水溶性又は部分的に水溶性である新規物質にNAD(P)+/NAD(P)Hを置換することを特徴とする、酵素酸化−還元反応においてNAD(P)+/NAD(P)H系を代替するための方法である。
【００１２】
また、本発明のさらにもう一つの態様は、酸化−還元酵素反応におけるNAD(P)+/NAD(P)H系の代替物としての補助因子として作用し、酸化−還元酵素反応におけるNAD(P)+/NAD(P)H系の作用と非常によく似た作用をする新規物質の一群に関し、前記物質は、式
【化１】
2004527509.tif 000002
（式中、Rは‐CN、‐C(O)NH2、‐C(O)NHCH3、‐C(O)N(C2H5),‐C(S)NH2、‐C(O)CH3又は‐C(O)OCH3であり、
R1は、‐(CH2(CH2O)nYR2、リボース‐Y‐R2、又は
【化２】
2004527509.tif 000003
であり、
Yは、−OPOO-、‐OBO2-、‐OSO2-、‐CH3NH、‐(CH2)nNH‐、アデニン又はイミダゾールであり、
R2は、H、‐CH3、‐(OCH2CH2)n、‐(NCH2CH2)n‐又は‐[(N=P(OCH3)2)]nであり、
Xは、-OCH3、-CF3、-O(CH2CH2O)n又は-OPOOR2であり、
R3は、H、-CH3、-(OCH2CH2)n、-(NCH2CH2)n-又は-[(N=P(OCH3)2)]nであり、
nは1-2000である。）で表される物質又はその塩である。
【００１３】
本発明のさらにもう一つの態様は、還元酵素反応におけるNAD(P)+/NAD(P)H系の代替物に適した水溶性又は部分的に水溶性である新規生物模倣剤に関し、前記還元酵素反応は、Ｎ置換ニコチンアミド化合物及び構造的に関連した化合物、並びにロジウム化合物[Cp*Rh(bipyridyl)H]+又は還元剤である化合物を含む他の金属の反応によって形成される触媒により化学的に還元されたそれらの誘導体によって表され、前記化合物は、NAD(P)+/NAD(P)H系の代替物としての補助因子として機能することを特徴とする。
【００１４】
本発明のさらにもう一つの態様は、還元酵素反応におけるNAD(P)+/NAD(P)H系の代替物に適した水溶性又は部分的に水溶性である新規生物模倣剤に関し、前記還元酵素反応は、β−ニコチンアミド・リボース−５’−メチルホスフェート及び構造的に関連した化合物、並びにロジウム化合物[Cp*Rh(bipyridyl)H]+又は還元剤と一体となった化合物を含む他の金属の反応によって形成される触媒により化学的に還元されたそれらの誘導体によって表され、前記化合物は、NAD(P)+/NAD(P)H系の代替物としての補助因子として機能することを特徴とする。
【００１５】
本発明のさらにもう一つの態様は、電極、光子、化学的な酸化剤又は酵素により酸化されるＮ置換ニコチンアミド化合物による酸化酵素反応におけるNAD(P)+/NAD(P)H系の代替物に適した水溶性又は部分的に水溶性である新規生物模倣剤に関する。
【００１６】
本発明のさらにもう一つの態様は、電極、光子、化学的な酸化剤又は酵素により酸化されるβ−ニコチンアミド・リボース−５’−メチルホスフェートであるニコチンアミド化合物による酸化酵素反応におけるNAD(P)+/NAD(P)H系の代替物に適した水溶性又は部分的に水溶性である新規生物模倣剤に関する。
【００１７】
また、本発明のさらにもう一つの態様は、NAD(P)+/NAD(P)H系の代替物として及び／又はその再生に有用であるバイオセンサー又は化学的な膜のバイオリアクターといった装置である。
【００１８】
（定義）
「物質」、「生物模倣型物質」、「生物模倣型化合物」、「生物模倣剤」又は「補助因子」とは、酸化還元反応の補助因子として作用し、NAD(P)+/NAD(P)H系の作用を効果的に模倣し、その系に取って代わる化合物を意味する。
【００１９】
「NAD+」とは、酸化型のニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドを意味する。
【００２０】
「NAD+モデル」とは、NAD+と類似又は等価の位置選択的、立体選択的及び／又は化学特異的な性質を持つ化合物を意味する。
【００２１】
「NADH」とは、還元型のニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド、すなわち酵素反応における水素化物供与体を意味する。
【００２２】
「NADP+/NADPH」とは、酸化型（NADP+）又は還元型（NADPH）のニコチンアミド・アデニン・ヌクレオチドリン酸を意味する。
【００２３】
「NAD(P)+/NAD(P)H」とは、酸化型のNAD+及びNADP+並びに還元型のNADH及びNADPHの両方ともを意味し、これらを含むものである。
【００２４】
「補助因子」とは、もう１つの分子の作動に不可欠な化学物質、分子又は原子を意味する。補助因子は、特定の効果をもたらす他の分子に合わせて作用する。例えば、補助因子は、化学反応における触媒又はこの場合のように酸化／還元酵素反応を可能にする補助因子が作用できるようにする。該補助因子は、「補酵素」と呼ばれることもある。
【００２５】
「立体選択性」とは、２つ又はそれ以上の考えられうる立体異性の生成物のうち１つのみが優位を占める過程を意味する。
【００２６】
「位置選択性」とは、２つ又はそれ以上の位置選択的な生成物のうち１つのみが優位を占める過程を意味し、例えば、１，４−生成物が１，６−生成物に対して優位を占めるなどがある。
【００２７】
「酸化還元」とは、酸化及び還元を含む化学反応を意味する。
【００２８】
「HLADH」とは、ウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼを意味する。
【００２９】
「酸化還元酵素」とは、酸化−還元反応を触媒する酵素を意味する。
【００３０】
「前触媒」又は「触媒前駆体」とは、例えば、[Cp*Rh(bpy)H２O]といった化合物を意味し、その化合物は３位の水素を除去する際にギ酸ナトリウムによって触媒である[Cp*Rh(bpy)H]+へ転換される。通常、前触媒は、ロジウム、亜鉛、コバルト、ニッケル、ルテニウム、イリジウム等を含む化合物である。
【００３１】
「１−ベンジルニコチンアミド」とは、３−アミドピリジニウムを意味する。
【００３２】
「TOF」とは、位置選択的な還元における代謝回転数、すなわち１時間ごとに完了した酸化／還元サイクルの数を意味する。
【００３３】
「[Cp*Rh(bpy)H]+」とは、前記触媒前駆体より生成されるロジウム水素化物を意味し、「bpy」とは、２，２’ビピリジルを意味する。
【００３４】
「塩」とは、塩化物、臭化物、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、テトラフルオロボレート、トリフレート及びその他の一般に使用される塩を意味する。
【発明の効果】
【００３５】
ここに記載した本発明は、新規な生物模倣型化合物群に関し、該化合物は、酸化還元反応におけるNAD(P)+/NAD(P)H系の機能を模倣して、酸化還元反応の補助因子として機能することにより、内在性のNAD(P)+/NAD(P)H系に取って代わるものである。
【００３６】
さらに、本発明は、NAD(P)+/NAD(P)H系に取って代わる生体触媒の酸化／還元工程におけるこれらの生物模倣剤の使用方法に関する。
【００３７】
さらに、本発明は、これらの生物模倣剤の他にもバイオセンサー又は化学的な膜のバイオリアクター装置を設計し、選択し、製造する方法を提供するものであり、該装置は、本発明の生物模倣型物質を含み、酸化還元系がNAD(P)+/NAD(P)H系でも、新規な生物模倣剤を含む系でも、そのような系の再生のために本発明の生物模倣剤を使用するのを可能にするものである。
【００３８】
本発明の新規な生物模倣剤は、酸化型及び還元型の両方ともが水に可溶である又は部分的に水及び有機溶媒に可溶であり、NAD+、NADP+、1,4-NADH又は1,4-NADPHの化学的及び物理学的性質と類似した性質を多く持つ。前記新規な生物模倣剤は、酸化／還元反応におけるNAD(P)+/NAD(P)H系の効果的かつ安価な代替物としての生物模倣型化合物として有用であり、単独で反応速度を制限するので非経済的かつ非実用的であるNAD(P)+/NAD(P)H系の再生処理においても有用である。
【００３９】
本発明の開発の間に、酵素反応において、新規な生物模倣剤にNAD(P)+/NAD(P)H系を置換すること及び／又は該生物模倣剤を用いてNAD(P)+/NAD(P)H系を再生することを可能にすることだけでなく、酸化／還元酵素系及びその系におけるNAD(P)+/NAD(P)Hの機能も研究した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
I．酵素及びNAD(P)+/NAD(P)H系
酵素は、生体内で生じる多くの化学反応に関与する生物学的な触媒である。酵素は、標準温度及び標準圧力で、標準pHの中性水溶液中の温和な生理学的条件下で様々な反応を触媒する。酵素は、その高い化学的、位置的、立体異性的な選択性のため、有機合成にとって特別な価値がある。酵素は、基質が生成物へ酵素により転換するのを高い特異性で触媒する。通常は、酵素はその活性のために、反応を促進する又は酵素の作用に必要である補酵素とも呼ばれる補助因子の存在を必要とする。
【００４１】
最も重要な酵素系のうちの１つに、酸化−還元酵素による転換がある。そのような酵素による転換には、水素を受容して転移する、いわゆる「補助因子」が必要である。酸化／還元酵素反応の最も重要な補助因子の中には、NAD+又はNADP+（ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド又はそのリン酸塩の酸化型）及び通常は1,4-NADH又は1,4-NAD(P)Hの形で見られるNADH又はNADPH（ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド又はそのリン酸塩の還元型）の２つがある。これらの２つの補助因子は、NAD(P)+/NAD(P)H系を形成しており、前記の系では、各酸化反応中に、NAD(P)+は、還元された生成物より水素を受容し、また還元反応中に、NADPHは、NADHをNAD+へ転換することによって基質へ水素を供与する。NAD(P)+/NAD(P)H系における酸化／還元反応を最も簡単に示すと、次式の通りである。
NAD++H-=NADH
【００４２】
補助因子は、大変重要な酵素反応の構成要素であり、全ての既知の酵素のうち、特に酸化還元反応に関わる酵素の多くはその存在を必要としている。補助因子の量と有効性により、たびたび反応速度は制限される。
【００４３】
II．新規な生物模倣剤によるNAD(P)+/NAD(P)H系の再生又は置換に必要な条件
酸化−還元補助因子の再生又は置換工程の必要条件は大変厳密である。
【００４４】
NAD(P)+/NAD(P)H系の再生又は置換には、特定の水素化物源を再生処理中に供給する必要がある。
【００４５】
例えば、アルコール（基質）をケトン（酸化生成物）へと酸化する間にNAD(P)+補助因子は、水素化物を受容し、酸化酵素によって基質を酸化された生成物へ酸化することを可能にする。この過程の間に、NAD(P)+は水素化物を受容し、この反応の終わりにおいては、NAD(P)+はその還元型であるNADP(H)に転換される。酸化酵素が同じ反応、すなわち新たな酸化反応を繰り返すことを可能とするために、NAD(P)Hを、元のNAD(P)+へ転換しなければならない。この転換は、前記酵素反応が反対の方向へ進む場合、すなわち酸化された基質を還元された生成物へ還元する場合に生じる。そのような場合以外では、酸化の進行は、利用可能なNAD(P)+の量によって必ず制限される。
【００４６】
NADH分子は、３つの部位又は位置的な異性体、すなわち1,4-NADH、1,2-NADH及び1,6-NADH立体異性体として存在するが、1,4-部位異性体のみ酵素活性がある。NAD+及び1,4-NADH補助因子を置換するいかなる化合物も、NAD+又は1,4-NADHと同一又は類似した性質を持たなければならない。
【００４７】
補助因子NAD(P)+/NAD(P)Hを置換するのには、置換する補助因子がNAD(P)+/NAD(P)Hの代替物をして、実質的に同様に機能すること、すなわち往復して水素を転移することができることが必要とされている。
【００４８】
還元及び酸化反応の両方とも、酵素、基質、生成物及び補助因子自身と適合する条件下で行わなければならない。酸−塩基加水分解反応により、酵素触媒だけでなく補助因子も不可逆的に不活性化される可能性があるため、pH条件は、補助因子の失活を避けるために生理学的又は酵素反応性のある条件下で存在する条件と同一あるいは類似していなければならない。
【００４９】
酸化還元反応の条件も維持されなければならない。酵素の酸化還元系には、水素化物が、酵素の酸化還元中心へ転移し、そこから転移するのを容易にする触媒前駆体を必要とする。この点について、ロジウム、イリジウム、亜鉛、コバルト、ルテニウム、ニッケルといった金属複合体、例えば[Cp*Rh(bpy)H2O](OTf)2+複合体が、最も良い反応速度、正確な位置特異性を有することが示されており、媒体と反応することによって不活性化する傾向が最も少ない。
【００５０】
そのような再生又は置換には高い効率も必要とされており、そうでない場合には酵素反応は急速に停止するだろう。再生に用いる任意の反応物質と補助因子との副反応はあるべきではない。補助因子は、基質、生成物又は酵素と反応するべきではない。酸性、塩基性もしくは加水分解性の反応又は水性媒体において、補助因子は反応したり、又は変化したりするべきではない。前記工程は、位置特異的で迅速であり、かつ時間とコストを増す別の工程がないものであるべきであり、酵素系からの生成物の簡単な分離を提供するものであるべきである。
【００５１】
上記より、特にラージスケールでの酸化−還元工程を検討する場合、NAD(P)+/NAD(P)Hの置換に必要な条件を満たすことは容易ではない。
【００５２】
III．NAD(P)+/NAD(P)H系の代替物としての新規な生物模倣剤
上記のNAD(P)+/NAD(P)H補助因子の置換又は再生に成功するために必要な条件を理解した上で、いくつかの群の化合物を、そのようなNAD(P)+/NAD(P)H補助因子の代替物としての又はこれを再生する可能性がある候補として研究した。酵素反応が水性の環境下で好ましく進行することから、それらが水溶性である又は膨潤可能であることに特に重点が置かれた。しかしながら、ラージスケール、大容量での工業用の酸化−還元酵素反応にとって、水性／有機溶媒は差し支えないだけでなく、コストの有効性のために好ましいことが多い。
【００５３】
再生又は置換が可能な補助因子として研究された化合物の第１の群は、ピリジニウム化合物群、特に種々の置換がなされた１−ベンジルニコチンアミドを含み、これらは、単純な有機ロジウム化合物の複合体をその還元のための触媒として用いている。この有機ロジウム化合物複合体は、化学的又は電気化学的のいずれかで生成したヒドリド・イオンをこのピリジニウム化合物へ位置特異的に転移することが可能であり、もっぱら還元型の１−ベンジルピリジニウム塩のみを提供する。この生物模倣剤の群は、あまり水に可溶ではなく、水／有機溶媒中でよく機能する。
【００５４】
研究した化合物の第２の群には、その構造的な特徴が天然のNAD(P)+及びその還元型である１，４−ジヒドロ誘導体1,4-NAD(P)Hとさらに合っているリボース及びリン酸基を含む化合物の群がある。これらの化合物は、β−ニコチンアミド−リボース−５’−メチルホスフェート（6）で表されるが、メチル基を置換する他のアルキル置換基、エチレングリコール鎖又は他の重合体の群からなる化合物もまた含み、分離又は固定化する目的で付加される。これらの化合物は、容易に水に溶け、上記のNAD(P)+/NAD(P)H系との置換に成功するために必要な条件の多くを満たし、さらにバイオセンサー又は本発明の他の装置の製造を可能にする。
【００５５】
生物模倣剤のモデルは、水／有機溶媒の混合物に溶解するものでも、水のみに溶解するものでも本発明の範囲内である。代表的な化合物を実施例１から１１に従って製造し、試験した。
【００５６】
Ａ．酸化−還元酵素反応の生物模倣剤
本発明の新規な生物模倣型化合物は、一般的には式I及びII
【化３】
2004527509.tif 000004
【化４】
2004527509.tif 000005
（式中、Rは‐CN、‐C(O)NH2、‐C(O)NHCH3,‐C(S)NH2、‐C(O)CH3又は‐C(O)OCH3であり、R1は、‐(CH2(CH2O)nYR2、リボース‐Y‐R2、又は
【化５】
2004527509.tif 000006
であり、
Yは、−OPOO-、‐OBO2-、‐OSO2-、CH3NH-、‐(CH2)nNH‐、アデニン又はイミダゾールであり、
R2は、H、CH3、‐(OCH2CH2)n、‐(NCH2CH2)n‐又は‐[(N=P(OCH3)2]nであり、
Xは、-OCH3、-CF3、-O(CH2CH2O)n又は-OPOOR2であり、
R3は、H、-CH3、-(OCH2CH2)n、-(NCH2CH2)n-又は-[(N=P(OCH3)2]nであり、
nは1-2000である。）又はその塩で表される。
【００５７】
Yは、リン酸基、又はプロトン源を供給することによって溶液を緩衝するように作用することが可能であるホウ酸塩もしくは硫酸塩といった別のイオン性の基であってもよい。類似したものとして、アデニン、イミダゾール又はアルキルアミンといった塩基も塩基性の緩衝作用を提供するためのYとして利用してもよい。
【００５８】
ポリエチレン・オキシド鎖を、ポリアミン又はポリホスファゼンといった別の鎖に、用いる溶媒でのその溶解度及び膨潤能力に応じて置換してもよい。前記の鎖の長さは、前記の鎖が、不溶性の重合体の網目、シリカ粒子及びその他同種類のものといった固体の担体に固定化されるかどうか、又は分子が前記溶液に可溶であるかどうかによって決める。不溶性の担体にとって、鎖の長さは、ニコチンアミドの一部分が酵素中心に確実に浸透することができるように十分長ければよく。可溶性の系にとって、前記長さは、前記補助因子がサイズ選択的な膜に確実に浸透しないように十分長いことが必要であり、その結果、生成物の分離及び補助因子の回収の際中に、貴重な補助因子模倣剤の損失が生じないようにする。
【００５９】
前記の固体の担体系を下に図示する。
【化６】
2004527509.tif 000007
【００６０】
上記の図式は、重合体の鎖においてY−置換体を組み込んだもの並びにロジウム触媒及びトリフリック酸等のアニオンを組み込んだものを示す。
【００６１】
上記の図式は、重合可能な基にN置換されたニコチンアミドの共重合によって、生物模倣型の補助因子が、重合体の膜にどのように組み込まれるのかを示す。Y基を含む前記重合体の鎖は緩衝能力を備える。従って、記載した単量体は、例えば、CF2SO8H又はロジウム前触媒といた酸性基を含む単量体と共重合してもよい。そのような重合体は、酸化還元系に必要な酸−塩基および酸化還元化学に適応するための化学種を提供する膨潤可能なマトリックスを形成する。前記重合体の膜又は固定化材は、反応基質及び生成物からの前記補助因子の再生系の分離を容易にし、活性のある再生した種の損失を防ぐ。
【００６２】
Ｂ．１−ベンジルニコチンアミド・トリフレート型生物模倣剤
本発明の開発の最初の段階では、１−ベンジルニコチンアミド型の１−ベンジルピリジンが研究された。
【００６３】
初めに、１−ベンジルニコチンアミド化合物の位置特異性を対象として研究を行った。これらの研究は、その一部がAngew. Chem. Int. Ed., 38（10）: 1429 (1999)に記載されており、NAD+の生物模倣型化合物である１−ベンジルニコチンアミド・トリフレートをNAD+/NADH系の再生に利用するものであった。この化合物は、１−ベンジルピリジニウム・トリフレートの別名でも知られており、ロジウム触媒の前駆体である[Cp*Rh(bpy)H2O](OTf)2及び水素化物源としてギ酸ナトリウムを用いて、その還元された誘導体である１，４−ジヒドロ−１−ベンジルニコチンアミド・トリフレートへ還元された。前記還元では、高い位置特異性が見られた。続いて、１−ベンジルニコチンアミドの種々の３−置換誘導体を実施例２に従って合成し、他の３位のR置換基が位置特異性にどのような影響を与えるかを判断するために研究を行った。その結果を図１に示す。
【００６４】
図１Ａは、図１Ｃに化合物（1a）-（1i）として図示した生物模倣剤（1a‐1i）を含む、１−ベンジルピリジニウムの様々な置換誘導体の合成を示し、化合物1aは、１−ベンジルニコチンアミド・トリフレートに該当する。前記１−ベンジルニコチンアミド化合物は、テトラヒドロフラン溶液中、適切に３位が置換されたピリジニウムを、トリフルオロメタンスルホン酸ナトリウムの存在下でベンジルクロライドと反応させて合成した。ピリジニウムは、３位において図１Ａに示すR置換基（a）-（i）に置換された。次に生じた１−ベンジルピリジニウム・トリフレートの３−置換誘導体である化合物（1a）-（1i）を、化合物（1a）の還元された誘導体である１，４−ジヒドロニコチンアミド（3a）への化合物（1a）の還元を示す図１Ｂに示されているように位置特異的に還元した。
【００６５】
図１Ｂは、水素化物源としてギ酸ナトリウム及び触媒前駆体としてロジウム[Cp*Rh(bpy)H2O](OTf)2である化合物（2）を用いた、NAD+モデルである１−ベンジルニコチンアミド・トリフレート（1a）の位置特異的な還元を示す。水素化物源（HCO2Na）の存在下での化合物（1）及び前記触媒前駆体（2）による比率が1:1であるD2OとTHF-d8の混合溶媒中の1H-NMRスペクトルは、還元型された１−ベンジル−１，４−ジヒドロニコチンアミドである化合物（3a）が優勢な異性体として形成されたことを示した。
【００６６】
前記化合物（1a）-（1i）のうちのいくつかは、部分的にしか水に溶解しなかったので、テトラヒロドフランと水の混合溶液中で研究を行った。そのような部分的な水溶性は、生理学的な条件での酸化−還元反応における効果的なNAD(P)+/NAD(P)Hの再生剤としての有用性に影響を及ぼす可能性がある。しかしながら、そのような限られた水溶性は、大容量、ラージスケールでの酸化−還元工程におけるそれらの工業的利用に利点を与える。
【００６７】
各々の３−置換−１−ベンジルニコチンアミドの相対速度及び代謝回転回数を比較した結果を図１Ｃに示す。図１Ｃに表で示す相対速度は、開始から２時間の間の、内部標準である[(CH3)4N]OTf（テトラメチルアンモニウム・トリフレート）に対するピリジニウムシグナルの消失を観察することによって決定され、１−ベンジルニコチンアミド・トリフレート（1）の相対速度を1.0とした。代謝回転回数を、１時間当たりの触媒（mmol）に対する生成物の生成量（mmol）で算出した。24時間の代謝回転回数の総数は、生成物が得られた全ての基質で９５を越えた。予めシリル化されたJ. Young NMRチューブで反応を行い、引き続き1H-NMRを測定した。図１Ｃで見られるように、化合物（1b）-（1i）のシグナル消失の相対速度は、化合物（1）である１−ベンジルピリジニウム・トリフレートの相対速度を1.0として比較したところ0.9から1.3の範囲内であった。さらに、R置換基がC(O)NH(CH2CH3)2である化合物（1c）といった、３−置換体が立体効果を示す場合、又はR置換基が化合物（1h）の-CH3又は化合物（1i）の-Hなど非結合基を有する場合、触媒による水素化物の転移は環の２位及び６位の位置ではそのような転移が容易に可能であり、より求電子的であるが、その位置でさえも水素化物の転移は観察されなかった。この後者の発見は、CP*Rh金属イオンの中心への生物模倣剤の配位が重大であることを示している。
【００６８】
上記の結果は、NAD+の生物模倣型化合物（1）の還元、すなわち上記の条件下で行われる１，４−ジヒドロベンジルニコチンアミドへの１-ベンジルニコチンアミド・トリフレートの還元はほとんど独占的に1,4-NADH位置特異性をもたらす結果となることを示し、窒素原子上の１−ベンジル置換基は、水素化物の転移に対して重要な電子求引効果を及ぼすことが示され、メチル誘導体と比較して転換速度を２倍増加させた。前記転換の速度式は、THF/水（1：1）溶媒中での触媒前駆体である[Cp*Rh(bpy)H2O]2、基質である１-ベンジルニコチンアミド・トリフレート及び水素化物源であるHCO3Naの濃度によって影響された。水における前記生物模倣剤の濃度は速度に影響を及ぼさなかった。
【００６９】
上記の生物模倣型化合物は中程度しか水溶性がなく、有機溶媒を加えることが還元反応を観察するために必要とされた。すでに上記で述べたように、効果的なNAD(P)+/NAD(P)Hの代替物として、水溶性である化合物が好ましいが、水と溶媒の混合物中で工業用の酵素による酸化−還元反応を行うことにより、たびたびその効率を増加させ、コストを減らす。
【００７０】
Ｃ．水溶性であるβ−ニコチンアミド・リボース−５’−メチルホスフェート型生物模倣剤
本発明の最終的な目標は、NAD+と等価の位置特異的、立体特異的及び化学特異的な性質を有する水溶性又は膨潤可能な生物模倣剤を製造することである。
【００７１】
第１の水溶性生物模倣剤は、NAD+と構造的に類似するように設計され、リボース基及びリン酸基の両方の他にも、炭素数が１から６までである低級アルキル及び／又はポリエチレングリコールを基にした重合体を含む。典型的な化合物であるβ−ニコチンアミド・リボース−５’−メチルホスフェート（6）は、市販されている前駆体であるβ−ニコチンアミド・リボース−５’−ホスフェートである化合物（5）からジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）及びジメチルアミノピリジン（DMAP）の触媒量をメタノール中で用いるメチル化反応により合成された。化合物（6）の製造方法を実施例４に記述する。
【００７２】
β−ニコチンアミド・リボース−５’−メチルホスフェートの構造及びβ−ニコチンアミド・リボース−５’−ホスフェートである化合物（5）からのその合成を図２Ａに示す。図２Ｂは、還元された誘導体である１，４−ジヒドロ−β−ニコチンアミド・リボース−５’−メチルホスフェート（7）へのβ−ニコチンアミド・リボース−５’−メチルホスフェート（6）の位置選択的な還元を示す。化合物（7）への化合物（6）の位置選択的な還元における代謝回転回数は、１時間当たり20であり、化合物（1a）-（1i）のものより約2.5倍代謝回転回数が多かった。天然のNAD+のTOFは、同じ条件下で１時間あたり18であり、これと比較すると、上記水溶性の補助因子のTOFは同じ又はわずかに多く、天然のNAD+と比較可能ないずれの場合でもそうであった。前記の１，４−ジヒドロ類似物質（7）及び前記化合物（6）は、完全に水溶性であった。
【００７３】
新規化合物（6）は、酵素系において活性を示し、ウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼHLADHによって認識されることが示されており、HLADHは、アキラルなケトンからキラルなアルコールを合成するといった、エナンチオ選択性の高い有機化合物の合成を触媒する酵素である。また、下記にさらに詳細に記述するが、還元型での生物模倣剤のHLADHによる認識は、リボース、ピロホスフェート又はアデノシン官能基の存在に依存してキラル生成物を提供するということはない。したがって、これらの研究は、ニコチンアミドの部分といった分子の一部分を含むピリジニウムのみ、基質を生成物へ立体選択的に還元するのに真に必要であることを証明している。
【００７４】
結論として、本発明の生物模倣剤は、例えば、ニコチンアミド、典型的にはさらに１位で置換されているニコチンアミドなど種々の置換がなされたピリジニウムを含む化合物である。
【００７５】
次に、図３で見られる生物模倣型補助因子の第２世代を製造した。これらの生物模倣剤は、重合体のマトリックスへ容易に組み込むことが可能である水性のニコチンアミドであり、NAD(P)+/NAD(P)H系の代替物としての装置を提供する。図３で見られるように、化合物（9）（nは1-500であり、ここで示される例として、１−（８−ヒドロキシ−３，６−ジオキサオクタニル）−３−カルバモイル−ピリジニウム・ブロマイド（n=2））と反応した場合、結果としてニコチンアミド化合物（8）は、生物模倣型の化合物（10）、すなわち１−（８−アクリロイロキシ−３，６−ジオキサオクタノイル）−３−カルバモイルピリジニウム・ブロマイドを形成する。この化合物は、酸化型、還元型共に水と有機溶媒の両方に可溶である。化合物（10）を、重合体の膜または図３に化合物（11）として示される固体の重合体支持系に容易に組み込むことが可能である。
【００７６】
図３は、ニコチンアミド化合物（8）の１位を重合体（9）に置換し、化合物10で示される、重合体の鎖を有する生物模倣剤を得る方法を示す。次に、化合物10に、官能基を付けて、重合して図４に示されるもののような重合体マトリックスを得るのに用いることが可能なアリ−ル化合物（11）を産生する。
【００７７】
重合体支持材は、長さが様々であり、例えばPEG200、PEG400又はPEG600といった分子量が200,000までであるポリエチレングリコール、ポリビニルグリコール、ポリスチレン、ポリアルキルアミン、ポリホスファゼン又はポリエチレンであってもよい。前記重合体鎖の長さは、装置の構造によって短く又は非常に長くすることができる。重合が可能な化合物（10）は、図３に示されている重合体膜に組み込むことが可能である。重合体支持材は、図４で見られるように、電極上の膜、固体の重合体の塊又は容易に再生可能な重合体の形態をとることが可能である。
【００７８】
図４は、前記ロジウム触媒を含むアクリレート・エーテル単量体と共重合した生物模倣型の化合物（11）を示す。この重合体マトリックスは、還元剤、化学物質、光子又は電極と使用するのに適し、酵素反応の生成物から再生系を容易に分離することを可能にする方法で酵素的に活性のある補助因子を得る。図４は、化学物質、光子又は電極からの電子の転移及び酵素の酸化還元中心を含むロジウムへの水素化物の転移も示す。
【００７９】
図４に記述されている系は、正確な位置特異性でNAD(P)+/NAD(P)Hに取って代わることが可能であり、その他の利点も有する。前記生物模倣剤又は系を含む重合体は、補助因子を不活性化する可能性がある酸／塩基反応を受ける可能性がある糖又はリン酸基を含まない。PEGの群といった前記重合体のマトリックスは、補助因子及び触媒前駆体として作用する高価なロジウム化合物を固定化する又は回収する手段を提供する。
【００８０】
従って、はるかに安価であるニコチンアミド生物模倣型化合物は、交換が必要とされる前に、実施される再生のサイクル数が少なくても、NAD(P)+/NAD(P)H系よりはるかに安価な系を提供する。前記系を、生産物の価格がより低く、はるかに大容量である工程に用いることが可能である。
【００８１】
前記の重合体の鎖は、高価な物質を回収し、酵素及び他の反応物質から生成物を分離する手段を提供することに加えて、これらの手段によって反応条件を厳密に調整できるように前記重合体の鎖を調整することが可能である。
【００８２】
Ｄ．触媒前駆体
本発明による位置特異的な還元は、還元反応中に位置特異的な転位を可能にする又はその助けとなる化合物によって触媒される。ここで触媒前駆体（2）と呼ばれるこれらの化合物は、ロジウム、イリジウム、ニッケル、ルテニウム、コバルト又は亜鉛などの金属水素化物複合体であることが好ましい。最も好ましい複合体は、ロジウム化合物である[Cp*Rh(bpy)H2O]トリフレートを含む。従って、触媒前駆体は、還元剤（20）によって還元される化合物であり、補助因子の還元用の水素化物触媒（22）を形成する。
【００８３】
位置特異的な還元を触媒するのに適した１つの触媒前駆体は、[Cp*Rh(bpy)H2O](OTf)2
である。別の方法では、触媒前駆体は、テトラフルオロボレート、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩などといったその他の適したアニオンで製造することが可能である。
【００８４】
前記触媒前駆体[Cp*Rh(bpy)H2O](OTf)2（トリフレート塩として）を、２，２’−ビピリジンと[Cp*Rh(H2O)3](OTf)2の反応を実施例５に従って水中で行うことによって製造した。前記反応により、[Cp*Rh(bpy)H2O](OTf)2、すなわち化合物（2）を、単離した状態で77％の収率で得た。前記トリフレート塩複合体は、これまでに報告されていないので、前記触媒前駆体（2）の構造を、X線結晶解析によって決定した。
【００８５】
表１は、結晶の情報を示す。
【００８６】
【表１】
2004527509.tif 000008
【００８７】
表２は、化合物（2）の典型的なピアノスツール構造から選択された結合の長さ及び角度を示す。
【００８８】
【表２】
2004527509.tif 000009
【００８９】
前記ロジウム触媒前駆体と類似した、亜鉛、ニッケル、コバルト、ルテニウム又はイリジウム等の他の金属イオンは、例えば本生物模倣化合物をその還元された誘導体へ還元するための触媒として利用するのに好都合である可能性がある。
【００９０】
Ｅ．還元剤
本発明で用いられる還元剤は、酵素に適合する条件下で前触媒を触媒へ還元するものである。還元剤の例として、ギ酸塩、水素、水素化ホウ素ナトリウム、ヒドロキノン、ナトリウム、チオスルフェート、電極及び光子があげられる。
【００９１】
Ｆ．生物模倣剤の再生
NAD(P)+/NAD(P)H系の代替物として有用であるために、本発明の生物模倣型化合物は、それ自身再生することができなければならない。前記再生系を酵素による合成に加えて図５に示す。
【００９２】
図５は、生物模倣剤（1）及び（6）によるキラル合成実験を示し、該実験は、相当するアルコール（19）への、アキラルなケトンであるベンジルメチルケトン（12）の転換に対する両方の生物模倣剤の酸化−還元の効果を示す。ウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ（HLADH）の存在下でのそのようなキラル的な転換工程において、生物模倣剤（1）及び（6）は共に、図５で見られるように、類似したキラル合成の結果を与える。前記生物模倣剤は共に、エナンチオマー過剰率は93％ ee（S−エナンチオマー）を越えており、また両方の代謝回転数も１日当たり約30を越え、類似していた。これらの結果は、対照実験としてNAD+で事前に得られた結果と類似していた。
【００９３】
上記の結果は、上記の生物模倣剤群の両方とも、酸化還元反応におけるNAD(P)+/NAD(P)H系の代替物として適していることを確証するだけでなく、そのような機能に必要なものは、１，４−ジヒドロ誘導体へ還元されることが可能であるかぎり、分子中のニコチンアミドの部分のみであることも確証するものであった。
【００９４】
図５で見られるように、生物模倣剤（1）又は（6）の還元は、還元剤（20）、すなわち水素化物源であるHCO-2の存在下で前記ロジウム触媒前駆体（2）の反応から誘発される水素化物の転移を伴い、金属水素化物[Cp*Rh(bpy)H]+（21）及び生物模倣剤（1a）又は（6）の結合に作用する触媒（22）を形成し、触媒（22）は生物模倣剤（1）又は（6）を、相当する還元された誘導体（3）又は（7）へ還元する。アルコール（19）が、ケトン（12）へ酸化される際には、酸化された化合物（1）および（6）は、それらの還元型である（3）及び（7）へ還元される。ケトン（12）をアルコール（19）へHLADH（18）によって還元する際には、前記の反応と反対の反応、すなわち還元型である化合物（3）及び（7）がそれらの非還元型へ転換されるということが起こる。
【００９５】
したがって、図５は、酸化酵素（図５に示していない）又は図５に示されているHLADHといった還元酵素のいずれかの酸化−還元反応の循環及び継続している過程を示す。酸化反応は、反対方向に酸化反応が進行すること以外は、論理的には還元反応と同様に触媒され、酸化された生成物への生物模倣剤の還元を行う。
【００９６】
Ｇ．有機ロジウム複合体による生物模倣剤の位置特異的な還元
本発明の新規な生物模倣剤について、以下の研究で広範囲にわたって試験した。
【００９７】
１．競合位置特異的還元反応
最初の研究では、σ−供与能力及び電子求引置換基の効果を比較した。
【００９８】
１−ベンジルニコチンアミドの３−置換体のσ−供与能力又は電子求引効果が重要なパラメーターであるかどうかを明らかにするために、いくつかの競合的な基質による還元反応実験を行った。
【００９９】
このため、化合物（1a）である１−ベンジルニコチンアミドを、その代替物となる置換誘導体である-C(O)-CH3に置換した化合物（1e）、（-CN）に置換した化合物（1g）、-C(S)NH2に置換した化合物（1d）、又は-C(O)OCH3に置換した化合物（1f）の存在下でロジウム触媒前駆体（2）で還元し、それらの競合的な還元を調べた。
【０１００】
化合物（1a）である１−ベンジルニコチンアミドを、競合率が0.9である化合物（1e）又は競合率が0.8である化合物（1g）のいずれかの存在下で還元した場合、-C(O)NH2基に置換されている化合物（1a）は、-C(O)-CH3又は-CNの類縁物質のいずれよりも反応性である（各々、1.1及び1.3倍速い）ことが判明した。化合物（1）を化合物（1d）又は化合物（1f）の存在下で還元した場合、-C(S)NH2及び-C(O)OCH3誘導体の両方ともがより反応性であることが判明した（各々、1.3及び1.2倍速い）。
【０１０１】
したがって、３−置換基（例えば、化合物（1a）、（1d）及び（1f））のσ−供与能力は、Cp*Rｈへの結合において、還元反応全体で、この３−置換基（例えば、化合物（1e）及び（1g））の初期の電子求引効果よりも重要なパラメーターである。
【０１０２】
これらの発見は、これらの化合物の大半は、１，４位へ水素を転移することが可能であり、従って酵素の酸化還元反応で活性のある補助因子であることを示す。
【０１０３】
２．位置特異的な還元の相対速度又は代謝回転数に対する１-置換ニコチンアミド基質の効果
ニコチンアミドの核の窒素原子に結合した種々の置換基の電子効果も調べた。
【０１０４】
様々な置換がなされたニコチンアミド基質の電子効果を、その相対速度によって決定した。これらの化合物の相対速度は、最初の２時間の間、内部標準である[(CH3)4N]OTfと比較したピリジニウムシグナルの消失を観察することによって決定し、化合物（1a）の相対速度を1.0とした。
【０１０５】
この目的のために、化合物（1a）の１-ベンジル基を１−メチル基に置換し、実施例３に従って１−メチルニコチンアミドを生成した。
【０１０６】
これらの研究で得られた結果は、このように置換基を変えることにより、相対速度が0.5まで減少し、１-メチルニコチンアミドに対する１−ベンジルニコチンアミドの相対速度の比は2.0であった。従って、電子供与基である１-メチル基と比較して、１-ベンジル基は、より良い電子吸引置換基であることが判明した。このことにより、水素化物は４位へ攻撃し易くなった。したがって、４位への水素の転移でのもっともらしい電子の再編成は、ニコチンアミドの核の窒素原子に直通で結合している電子吸引置換基から恩恵を受けている。
【０１０７】
水中のβ−ニコチンアミド・リボース−５−メチルホスフェートを、THFと水の混合溶媒中の１−ベンジルニコチンアミドと比較すると、その代謝回転数（TOF）は、１−ベンジルニコチンアミドのTOFよりも2.5倍多いことが分かった。
【０１０８】
これらの発見は、ピリジニウムにおけるN-置換体（１位）の性質及び使用する溶媒により、水素の転移速度に影響を与え、従って酵素活性に影響を及ぼすことを示す。
【０１０９】
３．ロジウム触媒前駆体による生物模倣化合物（1）及び（6）の位置特異的な還元の反応速度及び活性化のパラメーター。
位置選択的な還元の反応速度論を、２つの生物模倣化合物（1）及び（6）で、紫外可視法を用いてさらに研究し、その結果をNAD+のものと比較した。実験条件を実施例９に記述する。
【０１１０】
１，４−ジヒドロ生成物への低い転換率（〜10％）での初期速度（ri）の効果を基質の前触媒（2）の量とギ酸ナトリウムの濃度を変化させることによって解明した。表３は、化合物（1）の濃度を変化させることによる位置選択的な還元の初期速度への影響を示している。
【０１１１】
【表３】
2004527509.tif 000010
【０１１２】
化合物（3）の形成の初期速度（ri）は、低転換率（〜10％）での時間に対する濃度（354 nm/εにおける吸光度）のプロットより得られた。kcatの値は、温度299°Kで計算した。
【０１１３】
表３は、299°Kで、水とTHFの割合が１：１である混合溶媒中での種々の濃度の１−ベンジルニコチンアミド（1）の位置選択的な還元の初期速度（ri）及びkcatを示している。
【０１１４】
位置選択的な還元の初期速度riは、表３で見られるように、前触媒（2）と共に用いる水素化物源であるギ酸ナトリウムの定常状態の濃度で、（1）、（6）又はNAD+に対して濃度依存的であり、また触媒前駆体[Cp*Rh(bpy)H]+に対しても濃度依存的であった。
【０１１５】
２つのモデル、すなわち水と有機溶媒の溶剤中で行われる化合物（1）と水性条件で行われるNAD+（H2O）を伴う（6）の温度294°Kにおける位置選択的な還元の初期速度及び代謝回転数を比較した結果を表４に示す。
【０１１６】
【表４】
2004527509.tif 000011
【０１１７】
速度は、紫外−可視法によって得られ、２連の平均値で表した。
【０１１８】
表４から分かるように、水性生物模倣型化合物（6）の位置選択的な還元の初期速度は、NAD+に匹敵することが明らかである。水性溶媒中の化合物（6）及びNAD+の両方とも、同等の濃度におけるTHFとH2O（１：１）の混合溶媒中の化合物（1）より3倍を越える初期速度を有する。TOF及びkcatの値においても有意な増加が見られた。
【０１１９】
還元型の生物模倣剤１−ベンジル−１，４−ジヒドロピリジン、１，４−ジヒドロニコチンアミド・リボース−５’メチルホスフェート及びNADH（3）の生成速度に対する溶媒、すなわち水又は有機溶媒であるTHFの効果も研究した。化合物（6）及びNAD+（表４）の水性条件で見られた初期速度の増大を、THFとH2Oの比率が１：１から１：４までである混合溶媒中で行われる化合物（1a）の還元の初期速度と比較した。水性溶媒に対する有機溶媒の比率を減少させることにより、匹敵する濃度が6以上となることで１，４−ジヒドロ誘導体生成の初期速度は増加した。
【０１２０】
結果を表５に示す。表５には、水とTHFの種々の比率、すなわち水：THFが１：１及び４：１で、生物模倣剤（1a）の種々の濃度で、１−ベンジルニコチンアミドのTOFを測定した結果が示されている。
【０１２１】
【表５】
2004527509.tif 000012
【０１２２】
表５で見られるように、生物模倣基質（1a）の濃度及び水と有機溶媒の比率の両方とも、転換の初期速度及び代謝回転数の両方ともに影響を及ぼした。
【０１２３】
表５に示されている位置選択的な還元反応の初期速度の減少は、水溶性の生物模倣剤の重要性を確証している。観察された結果より、THFは、存在する触媒前駆体[Cp*Rh(bpy)H]+の金属イオン中心への化合物（1a）の結合を減少させ、推定される速度の決定段階である基質−触媒結合の平衡に影響を及ぼすことが示唆される。さらに、表５の列３で見られる、水：THFが4:1である混合溶媒中の化合物（1a）の初期速度が増加していることに注目すべきである。これらの速度は、ここでは表４の列１及び２で見られる水中における化合物（6）及びNAD+で得られた値に匹敵している。
【０１２４】
これらの反応速度の研究結果は、簡単な生物模倣化合物は、生物模倣剤及びNAD+を含んでいる、より複雑で高価なリボースと同様に速やかに水素化物を転移することを示す。リボース、糖、リン酸塩及びアデニンの複合体は、そのような転移に必要ではない。
【０１２５】
Ｈ．本発明の生物模倣剤の位置選択性
上記のように、生物模倣化合物１‐ベンジルニコチンアミド・トリフレート（1a）は、水素化物源としてギ酸ナトリウム（20）の存在下、触媒前駆体として[Cp*Rh(bpy)H2O](OTf)2、（2）と反応した場合、独占的にその還元型である１‐ベンジル−１，４−ジヒドロニコチンアミド（3a）へ転換することが可能である。反応を図１Ｂに示す。
【０１２６】
さらに、図２Ａで見られる水性のNAD+モデル、β−ニコチンアミド−５’−リボース・メチルホスフェート（6）も、in situで生成した[Cp*Rh(bpy)H]+により、相当する１，４−ジヒドロニコチンアミド−５’リボース・メチルホスフェート（7）へ同様に位置選択的に還元されることを示した。
【０１２７】
前記生物模倣化合物（6）は、NAD+と、いくつかの構造的に類似した所があり、特にそのモノリボース・ホスフェートの部分がそうであるが、ピロホスフェートも、アデノシン置換基も含まない。前記生物模倣化合物（1a）の構造は、リボース基、ピロホスフェート基及びアデノシン基の代わりに単純な１‐ベンジル基を有する。
【０１２８】
本発明の前記生物模倣剤の高い位置特異性は、前記生物模倣剤の３−置換基のカルボニル基が、環が外れたη3‐Cp*Rh金属イオン中心（配位部位を開く）へ結合することによるものであると思われ、前記金属イオン中心は、ニコチンアミドのC4位への位置特異的な水素化物の転移のための収縮した六員環遷移状態又は中間体を提供する。
【０１２９】
比較研究を行い、そのような構造的な類似は、化合物中にニコチンアミド又はピリジニウム部分が存在する限り、NAD+の代替物としての位置選択性及び適切な機能に必要でない証拠をここに記述した。
【０１３０】
IV．アルコールのキラル合成及びケトンの酵素による還元
本発明の実用について、アルコールのキラル合成の試験をした。THFとH2O（１：４）の混合溶媒中において化合物（1a）を、更にpH6.54の水中において化合物（6）を、in situで生成した[Cp*Rh(bpy)H]+により、それらに相当する１，４−ジヒドロアナログへ位置選択的に還元したところ、初期速度（ri）は両方とも、NAD+のものと非常に類似していた。従って、利用された酵素であるウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ（HLADH）が、単純化された還元型、すなわち還元された化合物（3）及び（7）を認識できなければならないという条件のもとで、キラル還元反応におけるNAD+の生物模倣剤として化合物（1）及び（6）の両方を使用することを、上記の補助因子の再生方法と関連して試みた。
【０１３１】
以前に、HLADH酵素におけるNAD+の結合部位のX線構造は、アデノシンが、酵素の疎水性領域にあることによってこの相互作用を安定化するが、ニコチンアミド基の表面は、親水性及び疎水性部位の両方にあるということを示すことが判明した。その後、１，４−ジヒドロニコチンアミドの核を含む新しい生物模倣剤にまだ存在している最も重要な構造上の特色による、酵素の分子認識及びキラル還元について、本生物模倣剤のリボース基、リン酸基及びアデノシン基を含む１，４−ジヒドロニコチンアミドの核における各々の置換基の役割を研究した。
【０１３２】
キラルなケトンからのアルコールのキラル合成を行うために２つの新規な触媒を試みるにあたって、ピロホスフェート基もアデノシン基も含まない本発明の２つの生物模倣剤、すなわち１−ベンジルニコチンアミド・トリフレート（1a）及びβ−ニコチンアミド−５’−リボースメチルホスフェート（6）による補助因子の再生手段を利用した。それらの１，４−ジヒドロ誘導体は、高いエナンチオ特異的な転換を触媒するウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ（HLADH）酵素によって認識されることが分かった。結果を図６に示す。
【０１３３】
ロジウム触媒前駆体よりin situで生成した触媒[Cp*Rh(bpy)H]+により水素化物源存在下でのNAD+、又は化合物（1）又は（6）の位置選択的な還元を行った結果、還元された生物模倣剤、すなわち１−ベンジル−１，４−ジヒドロニコチンアミド（3）又は１，４−ジヒドロニコチンアミド−５’−リボース・メチルホスフェート（7）が生成し、それらはウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ（HLADH）によって認識され、フェニルメチルケトン及びベンジルメチルケトンなどのケトンをそれらに相当するキラルアルコールへ触媒として還元した（＞93％ee、S−エナンチオマー）。
【０１３４】
驚いたことに、すでに上述した、HLADH（18）による生物模倣剤の認識は、リボース基、ピロリン酸基又はアデノシン基の存在に依存しない。HLADHは、化合物（1a）／（3）及び（6）／（7）をキラル転換の水素化物触媒として認識する。
【０１３５】
図５に示した新規な生物模倣剤（1）及び（6）による直列型補助因子の再生及びキラル合成実験は、比較のためにNAD+を用いたところ、図７で見られるような驚くべき結果を与えた。キラルなケトンである、PhCH2CH2C(O)CH3（12）は、HLADH（18）の存在下で還元され、相当するアルコールPhCH2CH2CH(OH)CH3（19）が93％eeを越えるエナンチオマー過剰率（S−エナンチオマー）で得られた。生物模倣剤（1）及び（6）は、共にNAD+と比較して類似したキラル合成の結果を得た。24時間後、化合物（1）、（6）及びNAD+より、同様の結果が得られた。全てにおいて、エナンチオマー過剰率は93％ee（S−エナンチオマー）を越えて、代謝回転数は〜30 d-1と類似していた。
【０１３６】
HLADHが1,4-NADH生物模倣剤、（3）及び（7）をキラル認識するのに必要なものは、１，４−ジヒドロニコチンアミド部分のみであり、HLADHの疎水性のポケットに結合する際の１−ベンジル及びリボース−５’メチルホスフェートの役割は、ケトン基質への水素化物のキラル転移に影響を及ぼすものではないことは明らかである。
【０１３７】
前記ケトンの構造反応性の研究では、さらに、ベンジルメチルケトン、PhCH2C(O)CH3（13）もまた、それに相当するキラルなアルコールを生成し（＞99％ee、S−エナンチオマー）、一方、アセトフェノン、PhC(O)CH3（14）は、キラル生成物、PhCH(OH)CH3を生成するのが非常に遅く、24時間後、S−エナンチオマーに対するエナンチオマー過剰率がやはり96％eeを越えている生成物を5％しか得られなかった。その結果は、フェニル基及びカルボニル基の間にあるメチレン基の数が減少するにつれて（２から０まで）、キラル還元の速度は次第に遅くなるということを示し、特異的な非共有のπ−π相互作用が、酵素の触媒中心に近接しているフェニルケトンの結合部位において優勢である可能性があることを示している。
【０１３８】
上記の生物模倣剤によるケトンの酵素による還元のための基質を図７に示す。
【０１３９】
図７は、相当するアルコールの生物模倣剤によるキラル合成に用いられるケトン基質12-15の構造を示す。前記基質12-15の相当するアルコールへの転換を、％収率及び１日あたりのTOFで表し、また各転換に対するS−エナンチオマー過剰率（ee）も示す。NAD+で得られた換算値を、括弧内に記載する。前記S−エナンチオマー過剰率（ee）は、修飾したβ−シクロデキストリン・キャピラリーカラムを用いたGLCによって測定した。
【０１４０】
図７に見られるように、アルコールへの前記ケトンのキラル転換効率は、フェニルメチルケトン（12）、ベンジルメチルケトン（13）及びアセトフェノン（14）のNAD+を触媒とした転換効率とほぼ同一である。どういうわけか、化合物（14）及び（15）では、収率（％）が低かった。各化合物のTOFは、同じ反応条件下でこれらのケトンに対して得られたエナンチオマー過剰値と同様に、NAD+のTOF（括弧内）と非常に類似していた。
【０１４１】
これらの結果は、本発明の新規な生物模倣剤は、酸化還元反応におけるNAD(P)+/NAD(P)H系の効果的なNAD(P)+/NAD(P)Hの代替物となる補助因子であることを明らかに示している。
【０１４２】
本発明の生物模倣剤は、さらにアルコールの誘導体化及びノルカンファー（norcamphor）の生物模倣剤による還元に有用である。
【０１４３】
図８は、実施例９に述べるノルカンファー（norcamphor）の生物模倣剤による還元を示す。
【０１４４】
図８に見られるように脂肪族ケトンであるノルカンファー（norcamphor）は、２つのエナンチオマー（16）と（17）の市販用の混合物であり、本発明の生物模倣剤と異なる還元速度で反応し、また、大部分がエンドであるキラルアルコールの種々のジアステレオマー混合物を生成した。図８に見られるように、１つのエナンチオマー（17）では、エキソ及びエンド・アルコールのそれぞれがほぼ等しい量である混合物が生じたが、エナンチオマー（16）では、エンド・アルコールが単独で生じ、エキソ・アルコールは検出されなかった。当量で表されている生物模倣剤の収量は86％であり、同じ条件下で94％のNAD+の収量に相当するものであった。上記の結果は、本発明の生物模倣剤は、NAD+と比較して、ニコチンアミドの核を保持し、かつリボース−５’−リン酸基、１−ベンジル基といった類似した置換基のうちの１つを保持するように又はいずれも保持しないように構造的に改変されており、in situで生成した[Cp*Rh(bpy)H]+によって、その１，４−ジヒドロニコチンアミド誘導体へ転換することが可能であることを初めて示すものである。これらの生物模倣剤は、ケトンのアリル置換されたアルコール転換のキラル合成及び他の酸化−還元反応のデヒドロゲナーゼ又はオキシダーゼなどの酵素によって認識される。
【０１４５】
生物触媒による工程における化合物（1）及び（6）によって例示される本発明の生物模倣剤及びそれらの還元型である（3）及び（7）の利用可能性は、産業的に重要である。特に化合物（1a）は、水と有機溶媒の混合溶媒中でNAD+が加水分解されて損なわれる可能性がある条件下でも安定である点で有用である。
【０１４６】
V．NAD(P)+/NAD(P)H系の代替物としての生物模倣剤を含む装置
本発明の生物模倣剤の有効な用途としては、使用した酵素からの、及び再生触媒系からの生成物の分離がある。自然状態では、そのような分離は細胞膜によって行われる。従って、本発明の一つの態様は、ここに記述するNAD(P)+/NAD(P)H系の代替物としての装置及び／又は酸化−還元触媒の再生装置を提供することである。
【０１４７】
前記装置は、自然状態で見られる装置と同様の原理を利用する。典型的には、装置には好ましくは重合体マトリックスを含む膜系を使用し、再生する生物模倣剤化合物、触媒及び酵素を収容するのみならず、pH、反応条件、大量輸送及びエネルギー送達の調整も行うようにする。触媒前駆体は、好ましくは有機ロジウム触媒前駆体であり、補助因子は、好ましくは本発明の生物模倣化合物であり、酵素は、オキシダーゼ若しくはリダクターゼのいずれか又はその両方とも及び／又はそのいかなる組み合わせで良く、それらを薄いフィルム状の重合体マトリックスに、ロジウム触媒前駆体、生物模倣化合物及び／又は酵素を重合体構造内に収容するように固定化する。
【０１４８】
前記装置は、概ね上述したように、バイオセンサー又は化学的な膜の生物受容体系であってもよく、それらは、溶媒の周囲に設置された少なくとも２つの膜を備えており、前記膜は、補助因子、触媒又は酵素の輸送を制限するが、酸素又は水素イオンの輸送を可能にするものである。
【０１４９】
前記装置の全体の構造を図９に示す。前記装置は、ロジウム触媒、フェロセン、フェノン又は電子又は水素化物を転移することが可能な他の金属複合体などの酸化還元媒体（O/R）、及び例えば１−ベンジルニコチンアミド／１，４−ジヒドロ−ベンジルニコチンアミド又は任意のほかの酸化還元対といった補助因子／生物模倣剤により、酵素に接続した電子源より構成される。前記酵素は、興味の対象である化学反応を担う。
【０１５０】
前記装置は、望ましい酸化還元型での補助因子の再生を可能にし、前記補助因子を不活性化させる酸−塩基反応を防ぎ、下流の処理で補助因子の損失を避けるために適切な分離手段を提供する。
【０１５１】
VI．補助因子の有用性
通常、天然のNAD(P)+/NAD(P)H補助因子の製造は非常にコストがかかる。少なくとも何らかの形で経済的かつ実用的であるためには、補助因子は、何度も循環しなければならない。本発明では、高価な天然の補助因子NAD(P)+/NAD(P)Hを、これと同等又はほぼ同等である効果を有し、約百倍安価である生物模倣化合物に置換することが可能であることを発見した。
【実施例１】
【０１５２】
（方法及び材料）
本実施例では、材料の供給源、化学薬品の処理、使用した計測器及び方法について記述する。
【０１５３】
（材料及び化学薬品）
［Cp*RhCl2］2は、Colonial Metalsより購入し、到着した状態のままで使用した。[Cp*Rh(bpy)(H2O)]OTf2は、Organometallics, 14:2806 (1995)に記載されている方法に従って製造した。
【０１５４】
濃縮したD2O溶媒は、Cambridge Isotope Laboratoryより購入し、商業的に供給されている容器を通じてアルゴンの気泡によって脱気して、使用全般にわたって窒素下で保存した。
【０１５５】
エチルエーテルは、ナトリウム・ベンゾフェノンケチルを介して蒸留し、ジクロロメタンは、使用前に窒素下にて塩化カルシウムを介して蒸留した。
【０１５６】
超乾燥エタノールに対して与えられている方法を用いて、Mg金属で処理することによってメタノールを誘導した。
【０１５７】
使用した他の全ての溶媒は、使用前にアルゴン又は窒素で脱酸素した。
【０１５８】
β−ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（NAD+、ナトリウム塩）、β−１，４−NADH（ジナトリウム塩）、β−ニコチンアミド・モノヌクレオチド及びβ−ニコチンアミド（ジナトリウム塩）の還元型、及びウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ（HLADH）をSigmaより購入し、さらなる精製をせずに使用した。水（HPLC等級）、ノルカンファー（norcamphor、ラセミ体）及びギ酸ナトリウムをAldrichから購入し、精製せずに到着した状態のままで用いた。
【０１５９】
ピリジン（水素化カルシウムを介して）、３−ピコリン（水素化カルシウムを介して）、エチルエーテル（ナトリウム・ベンゾフェノンケチルを介して）、THF（ナトリウム・ベンゾフェノンケチルを介して）、及びジクロロメタン（水素化カルシウムを介して）を、括弧内の適切な乾燥剤と共に還流し、窒素下にて蒸留した。メタノール（化合物（3）及び（7）の合成に用いる）を、超乾燥エタノールに対して与えられている方法を用いて、Mg金属で処理することによって誘導した。塩化ベンジル及び臭化ベンジルを蒸留し、使用した他の全ての溶媒を、使用前にアルゴン又は窒素で脱酸素した。
【０１６０】
［CH3)4N］OTfを、NMRチューブ反応での内部標準として用いた。
【０１６１】
（GCクロマトグラフィー）
別段の指定がない限り、GCクロマトグラムは、FID検出器とβ−シクロデキストリンカラム（Supelco: β-DEX-225, 30m x 0.32mm x 0.25μm, 非結合）を備えたHewlett Packard Instrument, model 8900Aで得た。pH値は、Orion semimicro combination pH electrodeを備えたOrion 601A pHメーターで測定した。全ての反応及び操作は、窒素雰囲気下で、Vacuum Atmospheres gloveboxの中で、又はSchlenk技術を用いて行われた。
【０１６２】
他のカルボニル基質およびGCクロマトグラフィーにおいて内部標準として用いるシクロヘキサノールを、アルゴン下で分留することによって精製し、使用前に脱酸素した。市販されている光学的に純粋なアルコールをFluka又はAldrichより購入し、さらなる精製をせずに使用した。ベンジルアセトンの還元された生成物、PhCH2CH2CH(OH)CH3を、LiAlH4を相当するケトンと反応させることにより得た。フェニルアセトン、PhCH2C(O)CH3を、相当するアルコールを塩化クロム酸ピリジニウム（PCC）で酸化することによって得た。
【０１６３】
[Cp*Rh(bpy)H2O](OTf)2及びNAD+モデルは、文献の方法（Angew. Chem. Inst. Ed. Engl., 29:388 (1990)）に従って製造した。
【０１６４】
（NMR、UV及びIRスペクトルの記録）
別段の指定がない限り、NMRスペクトルは、Bruker AMX-300、AMX-400又はDRX-500 MHzスペクトロメーターで、室温で記録した。
【０１６５】
1H NMRのケミカルシフトは、２，２，３，３−ｄ４−３−トリメチルシリル・プロピオネート（ナトリウム塩）より低磁場のppmで表し、残留溶媒の共鳴（D2Oに関しては1H NMR：4.67）を参照し、ケミカルシフトに続いて、括弧内に多重度、結合定数J値（ヘルツ）、積分値をこの順で記載した。
【０１６６】
δ（dt、J=3.2、7.6、1H）といった複雑なカップリングパターンに関しては、ダブレット（d）はより小さいカップリングを表し、トリプレット（t）はより大きいカップリングを示す。鍵となる部分構造のみ帰属した。31P{1H}NMRのケミカルシフトは、外部標準として85％H3PO4（aq）を参照した。
【０１６７】
紫外−可視スペクトルは、Hewlett-Packard instrument model 8452A diode-array UV-visスペクトロフォトメーターで測定した。
【０１６８】
IRスペクトルは、Nicolet Instrument,model Impact 400 FT-IRスペクトロメーターで得た。別段の指定がなければ、IRサンプルは、固体（KBr粉末）で調整し、吸収を波長（cm-1）で記録した。エレクトロスプレー（Electrospray）/MS及びFAB/MSスペクトルは、それぞれVG Quattroスペクトロメーター及びVG 70スペクトロメーターで得られた。pH値は、Orion semimicro combination pH electrodeを備えたOrion 601A pHメーターで得られ、D2OのpH値をpD（pH＋0.4＝pD）に変換した。元素分析を、カリフォルニア大学化学科（Berkeley, CA.）で行った。
【０１６９】
再密封可能なテフロン（登録商標）のネジ付きキャップを特徴とするJ. Young NMRチューブを、１，１，１，３，３，３−ヘキサメチルジシラザンで予めシリル化し、酸触媒による親水性の反応を防いだ。別段の指定がなければ、全ての反応及び操作を、窒素雰囲気下で、Vacuum Atmospheres glovebox内で、又はSchlenk法を用いて行った。
【０１７０】
［(CH3)4N］OTf及びトリメチルホスフェートを、1H及び31P｛1H｝NMRのNMRチューブの反応における内部標準として用いた。
【実施例２】
【０１７１】
（１−ベンジルニコチンアミド型生物模倣剤の合成）
本実施例では、本発明の生物模倣化合物、すなわち１−ベンジルニコチンアミド基質（1a）-（1i）の合成方法全般について記述する。
【０１７２】
別段の指定がなければ、前記基質（1a）-（1i）の塩化物又は臭化物を、JACS, 77:2261(1955)及びJACS, 114:10134(1992)に記載してある方法によって製造した。THFを反応溶媒として用い、精製工程（収率、41-99％）を簡単にした。陰イオン交換を、AgOTf（1.0当量、MeOH中）又はNaOTf（1.05当量、アセトン中）のいずれかを使用して行った。
【０１７３】
濾液の溶媒を除去した後、粗生成物を（アセトン−CH2Cl2＝１）−Et2Oより再結晶してさらに精製し、-15℃で冷凍した。生じた結晶をグラス−フリット漏斗（glass-fritted funnel）に回収し、次にアセトンとエーテルの混合溶媒（１：４、０℃）で洗浄し、真空下でP2O5により乾燥した。収率は86-97％であった。
【０１７４】
１−ベンジルニコチンアミド化合物の製造に用いた方法全般を、生物模倣型化合物（1d）に関して説明する。他の化合物（1a-1i）を、チオニコチンアミドを適切に置換したニコチンアミドに置換すること以外は同様の方法で製造した。
【０１７５】
（１−ベンジルチオニコチンアミド・トリフレート塩（1d））
100mlの２首のSchlenkフラスコに、冷却器と添加漏斗（addition funnel）を備え付けてあるClaisenヘッドを備え付けた。反応ユニットは、真空下で火炎により乾燥し、窒素（N2）下で室温まで冷却した。窒素の正圧下、チオニコチンアミド（2.82 g，20mmol）を加え、THF（40ml）をシリンジによって加えた。次に、生じた懸濁液を穏やかな還流の下で加熱し、透明で黄色の溶液を得た。次に、20mlのTHF中の塩化ベンジル（2.53g，20mmol）を添加漏斗（addition funnel）に入れて、4時間にわたってN2下で還流しながら反応フラスコに滴下した。添加が完了した際に黄色沈殿が観測された。反応混合物を、さらに4時間、N2下で還流した後、反応フラスコを氷浴で冷却し、さらに反応混合物を元の体積の３分の２の体積まで高真空ラインで濃縮した。沈殿物をグラス−フリット漏斗（glass-fritted funnel）上に回収し、チオールの臭いが感知できなくなるまでアセトンで洗浄した。
【０１７６】
回収した黄色粉末をさらにMeOH−Et2Oより-15℃で３段階の分別再結晶を行って精製した。生じた結晶を、真空下でP2O5より得たアセトンで洗浄し、相当する塩化物を収率32％で得た（1.69g）。NaOTf（1.05当量、アセトン溶液）を用いて陰イオン交換を行った。粗生成物をさらにMeOH−Et2Oより-15℃で２段階の分別再結晶を行って精製し、回収した結晶を、アセトン−Et2O（比率１：４、0℃）で洗浄し、標題の化合物を黄色結晶として収率84％で得た。
【０１７７】
1H NMR (D2O) δ9.31 (s, 1H, H2on Py), 8.88 (d, J=6.4, 1H, H6on Py), 8.71 (d, J=8.4, 1H), 8.00 (dd, J=6.0, 8.1, 1H), 7.41 (app s, 5H), 5.77 (s, 2H, -CH2Ph); Anal. calcd for C14H13F3N2O3S2(378.43): C, 44.43; H, 3.47; N, 7.40. Found: C, 44.36; H, 3.56; N, 7.65.
【０１７８】
（生物模倣剤（1a）-（1i）のスペクトルデータ及び分析データ）
１−ベンジルニコチンアミド、トリフレート塩（ａ）
1H NMR (D2O) δ9.26 (s, 1H, H2on Py), 8.97 (d, J=6.1, 1H, H6on Py), 8.81 (d, J=8.1, 1H), 8.09 (app t, J=7.6, 1H), 7.42 (app s, 5H), 5.81 (s, 2H, -CH2Ph); Anal. Calcd for C14H13F3N2O4S (362.36): C, 46.40; H, 3.62; N, 7.73. Found: C, 46.12; H, 3.65; N, 7.97.
【０１７９】
１−ベンジル−Ｎ−メチルニコチンアミド、トリフレート塩（１ｂ）
1H NMR (D2O) δ9.20 (s, 1H, H2on Py), 8.96 (d, J=5.8, 1H, H6on Py), 8.75 (d, J=8.2, 1H), 8.08 (app t, J=7.2, 1H), 7.43 (app s, 5H), 5.81 (s, 2H, -CH2Ph), 2.88(s, 3H); Anal. Calcd for C15H15F3N2O4S (376.39): C, 47.86; H, 4.03; N, 7.44. Found: C, 47.66; H, 4.35; N, 7.08.
【０１８０】
１−ベンジル−Ｎ，Ｎ−ジエチルニコチンアミド、トリフレート塩（１ｃ）
1H NMR (D2O) δ8.97 (d, J=6.1, 1H, H6on Py), 8.95 (s, 1H, H2on Py), 8.54 (d, J=8.2, 1H), 8.10 (app t, J=6.9, 1H), 7.42 (app s, 5H), 5.79 (s, 2H, -CH2Ph), 2.88 (s, 3H); Anal. Calcd for C18H21F3N2O4S (418.48): C, 51.66; H, 5.07; N, 6.70. Found: C, 51.88; H, 5.43; N, 6.89.
【０１８１】
１−ベンジル−３−アセチルピリジニウム・トリフレート、（１ｅ）：
1H NMR (D2O) δ9.35 (s, 1H, H2on Py), 8.97 (d, J=6.6, 1H, H6on Py), 8.93 (d, J=8.0, 1H), 8.11 (app t, J=7.2, 1H), 7.40 (app s, 5H), 5.81 (s, 2H, -CH2Ph), 2.65 (s, 3H); Anal. Calcd for C15H14F3NO4S (361.37): C, 49.85; H, 3.91; N, 3.88. Found: C, 50.12; H, 3.57; N, 3.89.
【０１８２】
１−ベンジル−３−カルボメトキシピリジニウム・トリフレート、（１ｆ）：
1H NMR (D2O) δ9.42 (s, 1H, H2on Py), 9.03 (d, J=6.1, 1H, H6on Py), 8.97 (d, J=8.1, 1H), 8.13 (dd, J=6.0, 8.1, 1H), 7.43 (app s, 5H), 5.83 (s, 2H, -CH2Ph), 3.96 (s, 3H); Anal. Calcd for C15H14F3NO5S (377.37): C, 47.74; H, 3.75; N, 3.71. Found: C, 48.10; H, 3.87; N, 3.99.
【０１８３】
１−ベンジル−３−シアノピリジニウム・トリフレート、（１ｇ）：
1H NMR (D2O) δ9.42 (s, 1H, H2on Py), 9.17 (d, J=6.0, 1H, H6on Py), 8.90 (d, J=8.5, 1H), 8.22 (app t, J=7.2, 1H), 7.47 (app s, 5H), 5.87 (s, 2H, -CH2Ph); Anal. Calcd for C14H11F3N2O3S (344.34): C, 48.83; H, 3.23; N, 8.14. Found: C, 48.85; H, 3.45; N, 8.56.
【０１８４】
１−ベンジル−３−メチルピリジニウム・トリフレート、（１ｈ）：
1H NMR (D2O) δ8.62 (s, 1H, H2on Py), 8.61 (d, J=5.0, 1H, H6on Py), 8.25 (d, J=7.8, 1H), 7.81 (app t, J=7.2, 1H), 7.37 (app s, 5H), 5.64 (s, 2H, -CH2Ph), 2.40(s, 3H); Anal. Calcd for C14H14F3NO3S (333.36): C, 50.44; H, 4.24; N, 4.20. Found: C, 50.01; H, 4.56; N, 4.64.
【０１８５】
１−ベンジル−ピリジニウム・トリフレート、（1i）：
1H NMR (D2O) δ8.82 (d, J=5.9, 2H), 8.48 (app t, J=7.8, 1H), 7.98 (t, J=6.5, 2H), 7.42 (app s, 5H), 5.73 (s, 2H, -CH2Ph); Anal. Calcd for C13H12F3NO3S (319.33): C, 48.89; H, 3.80; N, 4.39. Found: C, 49.01; H, 3.78; N, 4.55.
【０１８６】
（Ｎ−（２  ヒドロキシエチル）ニコチンアミド臭化物）
Ｎ−（２  ヒドロキシエチル）ニコチンアミド臭化物を、塩化ベンジルを２−クロロエタノールに置換したこと以外はＮ−ベンジルニコチンアミドと同じ方法で製造した。
【実施例３】
【０１８７】
（１−メチルニコチンアミド及び１−（ｐ−メトキシベンジル）ニコチンアミドの製造）
本実施例では、１−メチルニコチンアミド及び１−（ｐ−メトキシベンジル）ニコチンアミドのトリフレート塩の製造について記述する。
【０１８８】
（１−メチルニコチンアミド・トリフレート塩）
１−メチルニコチンアミドのヨウ化物を、相当するニコチンアミド誘導体とCH3Iを反応させて製造した。ニコチンアミド（265.5mg, 2.17mmol）2.17mmolを、攪拌子と冷却器を備えた100mLの２首のSchlenkフラスコに入れ、固体混合物が入っている前記Schlenkフラスコを脱気した。MeOH（6ｍL、簡単に脱酸素した）及びCH3I（3mL、過剰量）を各々N2下で加えた。反応フラスコを45℃の油浴内に置き、反応混合物をN2下で攪拌した。反応をニコチンアミドの消失によって判断されるTLC（EtOAc:CH2Cl2=3:1）で追跡した。通常、反応は6時間以内に終了した。室温まで冷却した後、グラス−フリット漏斗（glass-fritted funnel）上に沈殿物を回収し、アセトン（0℃）で洗浄した。生成物を、真空下でP2O5により乾燥し、タイトルの化合物（494.2mg、86％）を淡黄色の粉末として得た。
【０１８９】
NaOTf（1.0当量、アセトン溶液）を用いて陰イオン交換を行った。粗生成物を、さらにアセトン−Et2Oより、-15℃で再結晶して精製し、タイトルの化合物を、90％を越える収率で得た。
【０１９０】
1H NMR (D2O) δ9.19 (s, 1H, H2on Py), 8.88 (d, J=6.0, 1H, H6on Py), 8.80 (d, J=8.7, 1H), 8.10 (app t, J=7.1, 1H), 4.39 (s, 3H, CH3); Anal. Calcd for C8H9F3N2O4S (286.26): C, 33.56; H, 3.18; N, 9.79. Found: C, 33.80; H, 3.23; N, 10.02.
【０１９１】
１−（ｐ−メトキシベンジル）ニコチンアミド、トリフレート塩
1H NMR (D2O) δ9.21 (s, 1H, H2on Py), 8.93 (d, J=6.0, 1H, H6on Py), 8.78 (d, J=8.1, 1H), 8.07 (app t, J=7.2, 1H), 7.38 (d, J=8.6, 2H), 6.95 (d, J=8.6, 2H), 5.72 (s, 2H, -CH2Ph), 3.73 (s, 3H, -OCH3); Anal. Calcd for C15H15F3N2O5S (392.39): C, 45.91; H, 3.86; N, 7.14. Found: 46.00; H, 3.88; N, 7.34.
【実施例４】
【０１９２】
（β−ニコチンアミド・リボース−５’メチルホスフェートの製造）
本実施例では、新規な置換生物模倣剤β−ニコチンアミド・リボース−５’メチルホスフェート及び化合物（6）の製造について記述する。
【０１９３】
β−ニコチンアミド・モノヌクレオチド（502.9mg、1.44mmol）、ジメチルアミノピリジン（DMAP）（17.6mg、1.44x10-1mmol）及び攪拌子を、火炎で乾燥した250ｍLのSchlenkフラスコに入れた。次にStandard Schlenk技術を行って固体混合物を脱酸素し、カニューレによってメタノール（125ｍL、乾燥状態）を加えてN2下で固体を溶解した。N2の正圧下で、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）の一部（635.0mg、3.08mmol）を加え、室温で攪拌した。反応の進行を、TLC（SiO2, MeOH-CH2Cl2=3, Rf=〜0.3）で追跡した。3時間後、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）（655.8mg、3.18mmol）をさらに加え、反応混合物をさらに24〜30時間攪拌した。
【０１９４】
白色の沈殿物をグラス−フリット漏斗（glass-fritted funnel）で濾過して、CH2Cl2（2x5mL）で洗浄した。回収した濾液を高真空ラインで濃縮し、油状の残留物を得た。次に混合物を水（〜1.5mL、脱酸素した）で回収し、不溶物類をさらに濾過して除き、CH2Cl2（2mL）で洗浄した。濾液の溶媒を揮散させ、少量の溶出溶媒を用いて得られた残留物を溶解した。次に混合物を、SiO2（CH3OH‐CH2CL2=3、脱酸素した）によるカラムクロマトグラフィー（カラムの直径、20mm；カラムの高さ、40cm）によりN2下で精製した。溶離液を高真空ラインで引き出し、粘着性の残留物を得た。得られた残留物を、少量のCH2Cl2を加えることで凝固させることが可能であり、溶媒を高真空ラインで除去し、真空下でP2O5により乾燥して標題の化合物を白色固体（260.8mg、52％）で得るか、又は-15℃下に置いて凝結した。標題の化合物は光に敏感であり、空気にもやや敏感である。生物模倣化合物（6）は、低温で、室内の照明を抑えて使用前まで保管することが大変望ましい。
【０１９５】
1H NMR (D2) δ9.35 (s, 1H, H2on Py), 9.16 (d, J=6.3, 1H, H6on Py), 8.87 (d, J=8.1, 1H), 8.19 (dd, J=6.3, 8.1, 1H), 6.11 (d, J=5.1, 1H, H1), 4.53 (m, 1H), 4.43 (t, J=5.1, 1H), 4.33 (dd, J=2.7, 5.1, 1H), 4.21 (ddd, J=2.5, 4.4, 12.1, 1H), 4.04 (ddd, J=2.3, 5.1, 12.1, 1H), 3.46 (d,3JHP=10.8, 3H, -CH3);31P{1H} NMR (202.3 MHz, （D2O) δ0.31; Anal. Calcd for C12H17N2O8PO.1H2O.0.1CH3OH (353.29): C, 41.13; H, 5.03; N, 7.93. Found: C, 41.14; H, 5.13; N, 7.46.
【０１９６】
その他のβ−ニコチンアミド・リボース−５−メチルリン酸型の生物模倣剤を、メチル化の部分をアルキル化又は重合体を攻撃するのに適切な他の反応に置換したこと以外は同じ方法で製造した。
【実施例５】
【０１９７】
（ロジウム触媒前駆体の製造）
本実施例では、触媒前駆体[Cp*Rh(η2‐(N,N)-2,2'-ビピリジル)(H2O)](OTf)2を含むロジウムの製造について記述する。
【０１９８】
50mlのSchlenkフラスコに攪拌子を備え付けて、これに[Cp*Rh(H2O)3](OTf)2（200.0mg, 338.78x10-3mmol）を入れ、２，２’−ビピリジル（53.1 mg, 339.97x10-3mmol）を加えた後、フラスコに隔膜で蓋をかぶせた。次にStandard Schlenk技術を行い、固体混合物を脱酸素し、水（4ml, 脱酸素した）を、シリンジによって隔膜を通してN2下で加えて懸濁液を得た。反応混合物を、室温で、N2下で攪拌した。
【０１９９】
通常、反応は4時間以内に終了し、ビピリジル・リガンドの消失及び透明な黄橙色の溶液の存在によって判断した。不溶物類を、グラス−フリット漏斗（glass-fritted funnel）で１−インチのセライト（Celite）ベッドを通じてカニューラにより濾過して除いた。濾過ケーキを少量の水（脱酸素した）で、濾過ケーキの色がなくなるまで洗浄し、濾液の溶媒を高真空ラインで除去して黄色粉末を得た。さらに、生じた粉末を、熱水よりN2下で再結晶して精製し、-15℃で冷凍した。結晶を回収して、CH2Cl2−Et2O（定量＝１、0℃）で洗浄し、真空下でNaOHにより乾燥して、化合物2（185.0mg、77％）を黄橙色の固体として得た。標題の複合体は、固体として空気中で安定である。
【０２００】
1H NMR (D2O) δ9.04 (d, J=4.6, 2H, H6on Py), 8.39 (d, J=7.3, 2H), 8.24 (t, J=7.4, 2H), 7.83 (app t, J=6.6, 2H), 1.61(s, 15H); IR 3085, 2914, 1604 (cm-1); Anal. calcd for C22H25F6N2O7RhS2・H2O (728.56): C, 36.27; H, 3.74; N, 3.85. Found: C, 36.30; H, 3.62; N, 4.14.
X線回析による分析に適した単一の結晶を、MeOH−Et2Oより-15℃で再結晶して得た。
【０２０１】
他の触媒前駆体を、ロジウムを亜鉛、コバルト、ニッケル、イリジウム又はルテニウムに置換して、実質的に同じ方法で製造した。
【実施例６】
【０２０２】
（１，４−ジヒドロニコチンアミド誘導体の合成）
本実施例では、生物模倣化合物（1a）-（1i）の還元された誘導体、すなわち１，４−ジヒドロニコチンアミドの製造に有用な手順全般について記述する。
【０２０３】
１，４−ジヒドロニコチンアミド誘導体を、JACS, 114:10134 (1992)に記載してある方法に従って製造した。１，４−ジヒドロニコチンアミド（3）の合成を他の１，４−ジヒドロ還元型誘導体の例として用いる。
【０２０４】
攪拌子を備え付けた25mLのSchlenkフラスコに生物模倣剤（1a）の塩化物（27.7mg、111.37x10-3mmol）及びNa2CO3（38.7mg、365.1x10-3mmol）を入れ、Na2S2O4（71.9mg、342.75x10-3mmol）をN2下で加えた。次に、水（3mL、脱酸素した）を、反応フラスコにシリンジで加えて、反応混合物を45℃の油浴で10分間加熱した後、黄色の油滴を反応フラスコの壁に沈着させた。次に、反応フラスコを氷浴で冷却し、溶媒をN2の正圧下、ピペットで取り除いた。生じた油状の残留物を水（1mlx5、脱酸素した）で洗浄し、洗浄液をN2下でピペットにより取り除いた。得られた油中の残留水を、さらにCH2Cl2（5mlx2）で高真空ラインにより共沸させて取り除き、相当する１，４−ジヒドロピリジン誘導体を淡黄色の固体（収率78％）として得た。  1H NMR (CDCl3) δ 7.38〜7.20 (m, 5H), 7.14 (d, J=1.6, 1H, H2on Py), 5.72 (qd, J=1.6, 8.1, 1H, H6on Py), 5.35 (br s, 2H, -NH2), 4.73 (td, J=3.5, 8.1, 1H, H5on Py), 4.27 (s, 2H, -CH2Ph), 3.15 (dd, J=1.6, 3.5, 2H, H4on Py);1H NMR (D2O-THF-d8) δ 7.60〜7.45 (m, 5H), 7.35 (s, 1H, H2on Py), 6.01 (d, J=8.1, 1H, H6on Py), 4.94 (td, J=3.6, 8.1, 1H, H5on Py), 4.54 (s, 2H, -CH2Ph), 3.28 (br s, 2H, H4on Py).
【０２０５】
多くの場合、１，４−ジヒドロピリジン誘導体は、上述した手順によって純粋な化合物として単離される。しかしながら、生物模倣剤（1c）、（1d）及び（1e）の還元型等のいくつかの場合では、純粋な生成物を得るためには分別再結晶を必要とする。
【実施例７】
【０２０６】
（β−１，４−ジヒドロニコチンアミド・リボース−５’メチルホスフェートの製造）
本実施例では、生物模倣剤（6）の還元された誘導体、すなわちβ−１，４−ジヒドロニコチンアミド・リボース−５’メチルホスフェートの製造について記述する。
【０２０７】
β−ニコチンアミド・モノヌクレオチドの１，４−ジヒドロ型（147mg、371x10-3mmol）、ｐ−ジメチルアミノピリジン（6.1mg、50x10-3mmol）、ピリジニウム・ｐ−トルエンスルホン酸塩（53mg、211x10-3mmol）及び攪拌子を火炎で乾燥した100mLのSchlenkフラスコに入れた。Schlenk技術を行い、固体混合物の酸素を取り除き、次にメタノール（40mL、乾燥状態）をカニューラによって隔膜を通して窒素下で加えた。N2の正圧下、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドの一部（209mg、1013x10-3mmol）を反応混合物に加え、生じた溶液を、室温で、室内照明を抑えて攪拌した。１時間後、ピリジニウム・ｐ−トルエンスルホン酸塩（53mg、211x10-3mmol）と１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（261mg, 1265x10-3mmol）をさらに加えたところ、生じた混合物はわずかに濁った。反応混合物を、さらに7時間攪拌して反応を終了した。最終的な反応混合物のTLC分析を、窒素で満たしたグローブ・ボックス内で行った（セルロースTLC：MeOH、Rf〜0.4、2番目のスポット、線状かつ強い蛍光）。高真空ラインで溶媒を除去した後、残留物を、グローブ・ボックス内で水（2.5ｍL）で回収し、不溶物類をすべて濾過して除き、少量のCH2Cl2（〜2mLx2）で洗浄した。濾液を合わせて溶媒を揮散させ、少量のメタノールを用いて、得られた残留物を溶解した。次に、生じた混合物を、Sephadex LH-20（MeOH、脱酸素した）によるカラムクロマトグラフィー（カラムの直径、20mm；カラムの高さ、35cm）によって、窒素下で精製した。混合物のカラムによる分離を紫外可視検出器によってモニターし、ｐ−トルエンスルホン酸塩と共に溶出している標題の化合物を得た。回収した溶離液の溶媒を高真空ラインで除去し、淡黄色の固体を得た。1H NMRスペクトロスコピー及び元素分析により、真空下でP2O5により乾燥した、得られた淡黄色の固体は、0.33モルの化合物6（C12H18O8N2PNa, 372.28）及び0.67モルのｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム、化合物6’（C7H7O3SNa, 194.20）を含み、収率は75％であった（222.2mg、ニコチンアミドを基準として）。標題の化合物は、光及び空気の両方に敏感である。
【０２０８】
1H NMR (D2O) δ 6.98 (s, 1H, H2on Py), 6.04 (d, J=8.3, 1H, H6on Py), 4.87 (td, J=3.4, 8.2, 1H, H5on Py), 4.77 (d, J=6.8, 1H H1'), 4.16〜4.09 (m, 2H), 3.97(m, 1H), 3.82 (m, 2H, H5'), 3.43 (d,3JHP=10.8, 2H, -CH3), 2.92 (br s, 2H, H4on Py);31P{1H} NMR (161.9 MHz, D2O) δ2.38; Anal. calcd for (0.33 6・0.67 6')・0.4H2O・0.1CH3OH (263.38, appr): C, 39.90; H, 4.54; N, 3.51; S, 8.16. Found: C, 39.56; H, 4.64; N, 3.57; S, 7.82.
【０２０９】
他の還元型化合物を同様の方法で製造した。
【実施例８】
【０２１０】
（新規生物模倣剤の還元における1H NMRスペクトロスコピーによる機構研究）
本実施例では、新規生物模倣剤の1H NMRスペクトロスコピー研究について記述する。
【０２１１】
典型的な反応において、J. Young NMRチューブに生物模倣型基質（1a）-（1i）（1.0mol）、化合物2（1% mol）、及び水素化物源として用いるHCO2Na（1.1mol）を詰めて、Schlenk技術を行い、固体混合物を脱酸素した。希釈した溶媒を、化合物（1a）-（1i）についてのこれらの固体に加えた。なお、前記溶媒はD2O-THF-d8（1=1 0.75mL、脱酸素した）である。前記NMRチューブを液体窒素の槽に置いた。内容物を2連続した凍結−ポンプ−解凍のサイクルでさらに脱気した。反応混合物を解凍した後、前記J. Young NMRチューブを直ちに塩を加えた氷浴中に置き、アルミニウム箔で覆った。次に、迅速に解凍した後、反応を、26℃での1H NMRスペクトロスコピーによって追跡した。
【０２１２】
所与の相対速度及び代謝回転数を、反応の最初の2時間で内部標準(CH3)4N(OTf)と比較して減少した相当するピリジニウム塩の積分値によって決定した。化合物（1a）、（1b）及び（1d）-（1g）の１，４−及び１，６−ジヒドロニコチンアミド誘導体の比率は、共鳴シグナルと基準試料の共鳴シグナルとを比較することによって得られ、診断に用いるシグナルは、1H NMRスペクトルにおいて明らかに同定できる-CH2Phの共鳴である。
【０２１３】
さらに、生物模倣剤（7）又は１，４−NADHのピリジン環のH2及びH6のプロトンのシグナルを異性体の決定に用いた。さらに、生物模倣剤（1）のH4シグナルが、反応時間を延ばした（＞24時間）後に消失し、加えて生物模倣剤（3）のH4プロトンと関連したシグナルも反応時間が24時間を越えた後に消失したことが認められた。これは、１，４−ジヒドロ生成物を与えるすべての生物模倣剤に一般的な現象であることが考えられる。
【実施例９】
【０２１４】
（反応速度的及び熱力学的な研究）
本実施例では、ギ酸イオンの存在下で[Cp*Rh(bpy)H2O][OTf]2である2による位置選択的な還元における、THFとH2Oの比率が１：１の溶液中で行った１−ベンジルニコチンアミド・トリフレート（1a）、pH6.5の水溶液中で行ったβ−ニコチンアミド−５’−リボース・メチルホスフェート（6）及びNAD+の、生成反応速度的及び熱力学的なデータについて記述する。
【０２１５】
反応速度実験は、循環水浴（VWR 1160）に取り付けたHewlett Packard 8452A Diode Array UV-Vis分光光度計で行った。種々の温度で実験を行うために、循環水浴及び紫外−可視機器は、反応速度実験を開始する前に少なくとも１時間ウォーム・アップした。
【０２１６】
１−ベンジルニコチンアミド・トリフレート（1a）、[Cp*Rh(bpy)H2O][OTf]2（2）及び１−ベンジル−１，４−ジヒドロニコチンアミド（3）を実施例２、４及び７に記述した方法によって合成した。NAD+及び1,4-NADH化合物は、Sigmaより購入し、到着した状態のままで使用した。THFをナトリウムより蒸留し、N2ガスで１時間脱酸素した。蒸留水は、Aldrich Chemical Coから購入し、使用前に脱酸素した。THFとH2Oの混合溶液（比率が１：１又は１：４と同様のもの）は、別段の指定がない限り、１−ベンジルニコチンアミド型化合物について行うすべての反応速度実験に使用した。生物模倣剤（1a）（0.018M）、化合物2（6.23x10-3M）及びギ酸ナトリウム（0.25M）のストック溶液を反応速度実験のためにTHFとH2O（1：1）の混合溶液で作製した。
【０２１７】
１−ベンジルニコチンアミド・トリフレート（1a）、（4.29x10-3M）及びギ酸ナトリウム（0.0539）の溶液を、容量フラスコ（10mL）にて、N2下で、THFとH2O（1：1）の混合溶液で作製した。反応速度実験に用いた生物模倣剤（1a）及びギ酸ナトリウムの種々の濃度は、上記に報告してある。
【０２１８】
この溶液の一定分量3mLを恒温紫外−可視セルへ、空気のないシリンジを用いて移し、またN2ガスでパージした。次にサンプルを、30−60分間、紫外−可視分光光度計の恒温セルホルダー内で望ましい温度にした。次に、23μlの6.23x10-3Mの[Cp*Rh(bpy)H2O]2+ストック溶液をN2の正圧下でシリンジを用いて加え、すばやく溶液を混合し、354nmにおける吸光度の上昇をすぐに記録した。実験を2時間行い、生成物である１−ベンジル−１，４−ジヒドロニコチンアミド、（3）の形成を、90秒毎に記録した吸光度の変化で追跡した。いくつかの反応速度実験をすべての開始材料が生成物へ転換するまで行った。誘導された容積の変化を、代謝回転数（TOF）の計算の際に考慮した。
【０２１９】
β−ニコチンアミド−５’−リボース・メチルホスフェート（6）及び天然のNAD+の反応速度実験を、全体として上記と同様の手順で行った。これらの反応速度実験は水中で行い、β−ニコチンアミド−５’−リボース・メチルホスフェート（6）又は天然のNAD+の濃度は1.50x10-3M、ギ酸ナトリウムの濃度は0.0186M及び[Cp*Rh(bpy)H2O]2+（2）の濃度は1.42x10-5Mであった。β−ニコチンアミド−５’−リボース・メチルホスフェート（6）及び天然のNAD+のλmaxは、336nmだった。すべての初期速度のプロットにおいて、時間対濃度のプロットから0秒の時点を除いた。riの標準偏差を2σ値から計算した。
【実施例１０】
【０２２０】
（新規な生物模倣剤で触媒される酵素反応）
本実施例では、本発明の生物模倣剤をNAD+の代替物として用いるカルボニル基質の酵素による還元に用いる手順全般について記述する。
【０２２１】
Ａ．補助因子としてNAD+を用いるカルボニル基質の酵素による還元。
[Cp*Rh(bpy)(H2O)]OTf2（1.9mg、2.61x10-3mmol）、ギ酸ナトリウム（17.8mg、261.69x10-3mmol）、NAD+（8.1mg、11.23x10-3mmol）及びHLADH（10ユニット）を、10mLのSchlenkフラスコに入れ、続いてSchlenk技術を行い、固体混合物を脱酸素した。
【０２２２】
アルゴンの正圧下で、5mLのリン酸カリウムバッファー（100ｍM、pH＝7.02、脱酸素した）及びカルボニル基質（83.58x10-3mmol、脱酸素した）をシリンジによって加えた。反応フラスコを、直ちにグラスストッパーでしっかりと蓋をして、シェイカーで30℃の水浴中で振盪した。反応を、β−シクロデキストリンカラム（Supelco、β−DEX−225）によるガスクロマトグラフィー（gas chromatography、GC）によってモニターし、相当する基準のキラルサンプルと保持時間を比較することによって生成物を同定し、GC-MSで確認した。生成物のエナンチオマー過剰率を、それらのクロマトグラムの相対面積によって直接決定した。反応の進行は、反応溶液の一定分量を内部基準（リン酸バッファー中のシクロヘキサノール）と混合し、クロマトグラムにおける測定した相対面積を相当する反応因子で校正することによって得られた。反応を24時間モニターした。
【０２２３】
Ｂ．生物模倣剤を用いるカルボニル基質の酵素による還元。
NAD+を本発明の生物模倣化合物のうちいずれか１つと置換したこと以外はセクションＡに記述したのと同様の手順に従った。
【０２２４】
Ｃ．ノルカンファー（norcamphor、ラセミ体）の酵素による還元。
セクションＡに記述した手順を、図８で見られるノルカンファー等のラセミ化合物の還元に同様に適用した。前記方法には、以下の変更が必要である。真空状態でノルカンファー（norcamphor）を昇華するために、ノルカンファーをアルゴンの正圧下で加えて、次にシリンジによってリン酸バッファーを加えた。
【実施例１１】
【０２２５】
（２−ペンタノンの生物模倣型還元）
本実施例では、２−ペンタノンの還元に用いた手順について記述する。
【０２２６】
実施例10に記述したのと同様の手順に従った。生成物のエナンチオマー過剰率は、以下の様にして、トルエン中の光学的に純粋なＳ（−）−１−フェニルエチル・イソシアネートでアルコールを140℃で誘導体化して決定し、β−シクロデキストリンカラムで分離した。
【０２２７】
24時間後、反応混合物を、母液中にアルコールがGCで検出できなくなるまでCH2Cl2で抽出した。抽出物を合わせて、Na2SO4で乾燥し、CH2Cl2と共沸させて取り除くことができる残余の水と共に溶媒を油浴においてアルゴン下で蒸留して除いた。生じた残留物をグローブ・ボックスに移し、1.5mLのトルエン（CaH2で乾燥した）を使用して溶液を作製し、それからSchlenk管に移した。次に、過剰量のＳ（−）−１−フェニルエチル・イソシアネートを上記の溶液に加え、Schlenk管を密閉し、グローブ・ボックスの外に出した。反応フラスコを140℃の油浴に12〜20時間置いた。そのようにして生成したジアステレオマーの純度を、クロマトグラムで得られるそれらの相対面積によって決定し、基準の化合物及びGC-MSによって確認した。
【図面の簡単な説明】
【０２２８】
【図１Ａ】図１Ａは、３位で様々なR置換基に置換された１−ベンジルピリジニウム（1）を示す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、１−ベンジルニコチンアミド（1a）の位置選択的な還元を説明する図であり、水素化物源としてギ酸ナトリウムを、触媒前駆体として[Cp*Rh(bpy)(H2O)]](OTf)2を用いて、その１，４−ジヒドロニコチンアミド（3a）としており、ここでRが-CONH2である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、R置換基を一覧表にし、図１Ａに表した１−ベンジルピリジニウム誘導体1a‐1iの位置選択的な還元の相対速度及び代謝回転数を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、天然のNAD(P)+とよく似た構造的な特徴を有する水溶性の生物模倣剤である化合物である、β−ニコチンアミド・リボース−５’−メチルホスフェート（6）の化学合成を示す図であり、市販の前駆体β−ニコチンアミド・リボース−５’−ホスフェート（5）から、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）及び触媒量のｐ−ジメチルアミノピリジン（DMAP）をメタノール中で用いたメチル化反応により合成した。
【図２Ｂ】図２Ｂは、１，４−ジヒドロ誘導体（7）への、β−ニコチンアミド・リボース−５’−メチルホスフェート（6）の還元反応を説明する図である。
【図３】図３は、重合体のマトリックス（11）に組み込まれて、NAD(P)+/NAD(P)H系の代替物として酵素系から容易に分離される生物模倣剤を備える装置を提供する、第２世代の水溶性生物模倣剤の化学構造及び人工的な製造を示す図である。
【図４】図４は、バイオセンサー又は化学的な膜の装置の重合体支持材に新規な生物模倣剤を組み込んだ、NAD(P)+/NAD(P)H系の再生を目的とした新規な生物模倣剤の利用を説明する図であり、また生物模倣剤をその還元誘導体へ還元することによる、水素化物の転移剤といった化学薬品、光子又は電極から酵素酸化還元中心への電子の転移を説明する図である。
【図５】図５は、生物模倣型化合物（1）及び（6）の位置選択的な還元のための触媒のサイクルと、ロジウムを含む触媒前駆体（2）、還元剤（20）、及び触媒（22）により酵素的に活性のある化合物（3a）及び（7）を得て、化合物（3a）及び(7)は、鏡像異性的に純粋なアルコール（19）へケトン（12）をHLADH酵素で還元するための水素を提供する様子を説明する模式図である。
【図６】図６は、ウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ（HLADH）の補助因子として本発明の生物模倣剤を用いた、アルコールへのアキラルなケトンの酵素的還元を説明する図であり、さらに補酵素の生物模倣型の再生、酵素認識及びアルコールのキラル合成を説明する図である。
【図７】図７は、本発明の生物模倣剤による、ケトンがそのキラルなアルコールへ酵素により還元されることを説明する図である。
【図８】図８は、本発明の生物模倣剤を用いた、ノルカンファーの生物模倣還元を示す図である。
【図９】図９は、生物触媒反応又はバイオセンサーの製造に用いることが可能な本発明の生物模倣剤によるNAD(P)+/NAD(P)H系の代替物として又は再生に適した装置の概略図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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