(57)【要約】本発明は、HERGイオンチャネルと種々の化合物との極めて正確な相互作用を測定する方法を開示する。本発明の方法は、アフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞中の異種インビボ発現を組合せた、ナンセンスコドン抑制法を利用する。
2006509495.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非天然のアミノ酸をHERGイオンチャネルに取り込む方法であって、以下のステップ：
a)アンタゴニストまたはアゴニスト候補とHERGイオンチャネルとの相互作用部位を決定すること；及び、
b)ナンセンスコドン抑制法を使用して、(a)で決定された部位に非天然のアミノ酸を取り込むこと、を含む、前記方法。
【請求項２】
前記非天然のアミノ酸が以下の式(I)：
【化１】
2006509495.tif 000008
｛式中、
Xは以下の：
【化２】
2006509495.tif 000009
からなる群から選ばれる。｝
により表される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非天然のアミノ酸が以下の式(II)：
【化３】
2006509495.tif 000010
｛式中、
YはCH2、(CH)n、N、O、又はSであり、nは1又は2である。｝
により表される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記非天然のアミノ酸が以下の：
【化４】
2006509495.tif 000011
からなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記HERGイオンチャネルがアフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞中で発現される、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
化合物のHERGとの相互作用の性質を測定する方法であって、以下のステップ：
a)非天然のアミノ酸をHERGの結合部位および制御部位に取り込み、改変HERGを得ること；
b)改変HERGに結合する上記化合物の能力を測定すること；および
c)ステップ(b)の結果を、同じ化合物の非改変HERGに結合する能力と比較することを含む、前記方法。
【請求項７】
心臓毒性を引き起こす化合物のスクリーニング方法であって、以下のステップ：
a)ECG読み値のQT間隔を延長させる化合物を探索することを可能にするスクリーニングアッセイシステムを開発すること；
b)前記スクリーニングアッセイシステムを使用して、前記化合物のHERG結合の性質と位置の詳細を測定すること；および
c)前記化合物が如何にかつどこでHERGに結合するかを評価することにより、前記毒性を引き起こす化合物を予測すること、を含む前記方法。
【請求項８】
未変性のアミノ酸を非天然のアミノ酸で置換するように修飾されているHERGイオンチャネルを含むHERGスクリーニングアッセイシステムであって、ここで、上記イオンチャネルはインビボで発現され、化合物がHERG結合親和性についてスクリーニングされる、前記システム。
【請求項９】
置換される未変性のアミノ酸が、G648、Y652、F656、T623およびV625よりなる群から選ばれる、請求項8に記載のスクリーニングアッセイシステム。
【請求項１０】
前記非天然のアミノ酸が以下の式(I)：
【化５】
2006509495.tif 000012
｛式中、
Xは以下の：
【化６】
2006509495.tif 000013
から成る群から選ばれる。｝
により表される、請求項8に記載のスクリーニングアッセイシステム。
【請求項１１】
前記非天然のアミノ酸が以下の式(II)：
【化７】
2006509495.tif 000014
｛式中、
Yは、CH2、(CH)n、N、O、又はSであり、nは1又は2である。｝
により表される、請求項8に記載のスクリーニングアッセイシステム。
【請求項１２】
前記非天然のアミノ酸が以下の式：
【化８】
2006509495.tif 000015
により表される化合物からなる群から選ばれる、請求項8に記載のスクリーニングアッセイシステム。
【請求項１３】
HERG結合親和性についてスクリーニングされる前記化合物が、ドフェチリドおよびドフェチリド類似体である、請求項8に記載のスクリーニングアッセイシステム。
【請求項１４】
上記ドフェチリド類似体が以下の式：
【化９】
2006509495.tif 000016
により表される化合物からなる群から選ばれる、請求項13に記載のスクリーニングアッセイシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野と産業上の利用可能性
本発明は一般に、膜タンパク質イオンチャネルHERGについての極めて正確な構造および機能情報を得るための方法に関する。さらに詳しくは本発明は、ナンセンスコドン抑制とインビボの異種発現を使用する方法に関し、これは、極めて高い特異性で化合物によるHERG結合を測定することを可能にする。予測できないHERG活性、すなわち非特異的調節作用は、多くの薬剤の効力を制限し、悪い副作用を与えることもある。本発明はまた、予測できないHERG活性の無い、より安全でより選択的な化合物の発見と設計のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
電位依存性カリウムチャネルは、正常な細胞活性の主要な決定要因であるが、疾患に影響を与えることが有り、従って治療標的候補としての認識が増大している。カリウムチャネルおよび発現されるタイプの性質の変化は、いくつかの心臓疾患および神経疾患に関連付けられている。Nerbonne (1998) J. Nerurobiol. 37:37-59。
【０００３】
ヒトether-a-go-go関連遺伝子（以後、HERG）K+ チャネルは、心臓活動電位の生成を担う無数のイオンチャネルの1つである。HERGは、心臓活動電位の再分極において重要な役割を果たし内向き整流性カリウムチャネルをコードする。HERGチャネルの内向き整流は、急速な電圧依存性不活性化ゲーティングが、非常にゆっくりした活性化ゲーティングと組合わさって生じる。
【０００４】
HERGは、元々Warmkeら、(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3438-3442によりヒトの海馬からクローン化され、心臓で強く発現されている。HERGタンパク質のハイドロパシープロットは、このチャネルがシェーカー（Shaker）カリウムチャネルに似ており、両方とも、高度に荷電した4番目の膜貫通セグメントを有する6つの膜貫通領域サブユニット構造を有することを、示唆している。この類似性にもかかわらず、HERGチャネルはシェーカーチャネルとは非常に異なった挙動をする：HERGは、外向き整流器ではなく内向き整流器として作用する。Sanguinettiら、(1995) Cell 81:299-307。この異常挙動は、HERGゲーティングの異常な動力学（ゆっくりした活性化ゲーティングと急速な不活性化ゲーティング）が原因である。脱分極中、HERGチャネルはゆっくり活性化し、次に急速に不活性化して、外向き電流はほとんど無くなり；以後の過分極中、チャネルは不活性化から急速に回復するが、ゆっくり非活性化し、大きな内向き電流が生じる。
【０００５】
QT延長症候群（LQT）は心筋再分極の異常であり、これがある人は心室性不整脈になりやすく、これは心室細動になり突然死を引き起こすことがある。HERGイオンチャネルはQT間隔延長と突然死に関連付けられている。HERGチャネル遺伝子の変異は、遺伝性の長いQTを引き起こす。しかしQT間隔の延長はまた、非遺伝性または外因性の原因によっても引き起こされる。近年いくつかの処方薬がこのQT間隔延長に関与していて、従ってHERG活性に関連していると推測されている。セルダン（Seldan）、プロプルシド（Propulsid）、ヒスマナール（Hismanal）などの薬は、その心臓への副作用の可能性とHERG活性が疑われるため、市場から取り除かれている。さらに臨床治験中の多くの有望な薬剤や無数の前臨床の化合物が、HERGイオンチャネルにおける活性のために、開発課程から取り除かれている。このため、文字通り数十億ドルの収入が失われ、開発コストが無駄になっている。
【０００６】
予測できないHERG活性は、遺伝によるものであっても遺伝によらないものであっても、製薬業界では不満が増大している分野である。FDAは、ECG読み値でQT間隔を延長させる可能性のある有害な化合物をスクリーニングするための、詳細なインビトロとインビボの前臨床試験を製薬会社が行なうことを推奨している（「ヒトの薬剤についての安全性薬理学試験に関するICHガイドライン（ICH Guideline on Safety Pharmacology Studies for Human Pharmaceuticals）」（ICH S7A）、2002年2月7日）。
【０００７】
従って、この予測できない活性の測定方法は製薬業界では極めて望ましいものである。他のチャネルの受容体結合部位の構造−機能相関を調べるために、ナンセンスコドン抑制方法が使用されている。Nowakら (1995) Science 268:439。部位特異的突然変異誘発と異種発現とを組合せたこの方法は、ニコチン性受容体とそのアゴニストおよびアンタゴニストとの機能的関連を解明するのに有用であった。同上。これらの方法をHERGシステムに応用すると、QT間隔の延長を引き起こす予測できない活性を解明およびおそらく調節することを助けるかも知れない。
【０００８】
現在のHERGスクリーニングは、HERG結合の存在と強度についての情報を明らかにするが、結合の性質と位置についての正確な詳細や、およびHERG活性を避けるために如何に化合物に小さな修飾をすることができるかについての指示を与えない。本発明は、化合物がHERGに結合するかどうかだけでなく、結合の方法と特異的位置の詳細な情報をも提供する。高精度な化合物修飾により、本発明は、HERG活性が原因で排除されるようなクラスの薬剤の同定と開発継続を可能にし、化合物がアジュバントとして、他の化合物のHERG活性を阻止および低下させることを可能にするであろう。
【発明の開示】
【０００９】
発明の要約
HERGイオンチャネルとの正確な化合物相互作用を測定する方法が開示される。さらに詳しくは、完全な細胞で発現されるHERGイオンチャネルに非天然のアミノ酸を取り込む方法が提供され、その結果構造−機能相関を調べることができる。さらにHERG相互作用の高精度測定法が、本明細書で開示される。
【００１０】
本発明の目的は、非天然のアミノ酸をHERGイオンチャネルに取り込む方法であって、以下のステップ：a)アンタゴニストまたはアゴニスト候補とHERGイオンチャネルとの相互作用部位を決定すること；b)ナンセンスコドン抑制法を使用して、ステップ(a)で決定された部位に非天然のアミノ酸を取り込むこと；およびc)目的の化合物とHERGイオンチャネルとの結合相互作用を測定すること、を含む方法を提供することである。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、化合物のHERGとの相互作用の性質を測定するための体系的方法であって、以下のステップ：a)非天然のアミノ酸をHERGの結合部位および制御部位に取り込み、改変HERGを得ること；b)改変HERGに結合する上記化合物の能力を測定すること；およびc)ステップ(b)の結果を、非改変HERGに結合する同じ化合物の能力と比較すること、を含む方法を提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、アッセイシステムを開発することを含む、心臓毒性を引き起こす化合物の体系的スクリーニング法を提供することであって、該システムは、a)ECG読み値のQT間隔を延長させる化合物を探索すること、次にb)該システムを使用して、該化合物のHERG結合の性質と位置の詳細を測定すること；および最後にc)該化合物が如何にかつどこでHERGに結合するかを評価することにより、該毒性を引き起こす化合物を決定すること、を可能にする。
【００１３】
本発明の別の目的は、HERGチャネル結合部位の化合物接触点の3次元像を提供するレセプトフォア（receptophore）モデルを提供することである。
【００１４】
また本発明の目的は、HERGと相互作用しないように化合物を改変する方法であって、以下のステップ：a)化合物のHERGとの相互作用の性質を測定すること；b)化合物が如何にかつどこでHERGと相互作用するかを分析すること、及びc)；工程(b)の分析に基づいて、化合物を化学修飾してHERG相互作用を避けること、を含む方法を提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、好ましくないHERG相互作用から他の化合物を阻害、妨害、または阻止する化合物を設計する方法を提供することである。これは、HERG活性を有する化合物の弱毒化を可能にすることがある。
【００１６】
本発明の別の目的は、未変性のアミノ酸を非天然のアミノ酸で置換するように修飾されているHERGチャネルを含むHERGスクリーニングアッセイシステムを提供することであり、ここでチャネルはインビボでアフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞中で発現される。
【００１７】
本発明の好適な実施態様の詳細な説明
本発明は、イオンチャネルの膜貫通ドメイン内の重要な部位での非天然のアミノ酸の取り込みを利用して、リガンドまたは薬剤とHERGイオンチャネルとの極めて正確な結合および相互作用情報を得る方法を記載する。これらの新規実験から解明される情報は、好ましくないHERG活性に寄与するかもしくは引き起こす結合分子もしくは薬剤、ならびにそのような活性を緩和する物質の、予測的同定を可能にするであろう。
【００１８】
本明細書において用語「HERG」とは、6つの膜貫通鎖を有するヒトether-a-go-go関連カリウムイオンチャネルを意味する。このHERGポリペプチドは、イオンチャネルのS4-含有スーパーファミリーのメンバーと構造的類似性を示し、その挙動は典型的なゲート特性（例えば活性化のシグモイド的経時変化とC-型不活性化）により説明される。
【００１９】
本明細書において、電位依存性イオンチャネル（VGIC）は、細胞膜チャネルタンパク質の群をあらわす。VGICファミリーのこれらのタンパク質は、広範囲の細菌、原核生物、および真核生物に存在するイオン選択性チャネルタンパク質である。機能的に特徴付けられるメンバーは、K+、Na+、またはCa2+に特異的である。K+チャネルは通常、それぞれのサブユニットが6つの膜貫通スパナー（transmembrane spanner）（TMS）を有するホモ4量体構造からなる。多くの電位感受性K+チャネルが、K+チャネルゲーティングを修飾するサブユニットとともに機能する。これらの付属サブユニットのいくつか（しかしHERGチャネルのものではない）は、小胞体中で4量体サブユニットと同時集合し、サブユニット4量体に強く接着している酸化還元酵素である。いくつかのカリウムチャネル（しかしHERGチャネルのものではない）の高分解能構造が利用できる（例えば、Jiangら、Nature (2002) May 30;417(6888):515-22）。ベータサブユニットの高分解能構造が利用できる（Gulbisら、Cell (1999) Jun 25:97(7):943-52）。
【００２０】
真核生物では、各VGICファミリーチャネルタイプは、薬理的および電気生理学的データに基づきいくつかのサブタイプを有する。すなわち5つのタイプのCa2+チャネル（L、N、P、QおよびT）がある。少なくとも以下の10個のタイプのK+チャネルがあり、それぞれが異なる刺激に対して異なる応答をする：電位感受性［Ka、Kv、Kvr、KvsおよびKsr]、Ca2+感受性[BKCa、IKCaおよびSKCa]、受容体結合[KMとKACh]。少なくとも6つのタイプのNa+チャネルがある（I、II、III、μ1、H1およびPN3）。各サブユニットが6つではなく2つのTMSを有し、これらの2つのTMSは、電位感受性チャネルタンパク質中に存在する6つのTMS単位のうちのTMS5と6に相同的である、原核生物と真核生物由来の4量体チャネルが知られている。エス・リビダンス（S. lividans）のKcsAは、そのような2つのTMSチャネルタンパク質の例である。これらのチャネルは、KNa（Na+−活性化）およびKVol（細胞容量−感受性）K+チャネル、ならびに関連の小さいチャネル（例えば、酵母のTok1 K+チャネル）を含む。TWIK-1と-2、TREK-1、TRAAK、およびTASK-1と-2 K+チャネルはすべて、2重の2 TMS単位を示し、従ってホモダイマーチャネルを形成することができる。これらの4つのTMSを有するタンパク質の約50が、シー・エレガンス（C. elegans）ゲノムにコードされている。VGICファミリーのタンパク質との配列類似性が不充分なため、Pドメインと2つのフランキングTMSとを有する内向き整流性K+ IRKチャネル（ATPにより制御される、またはGタンパク質により活性化される）は、離れたファミリー（TC#1.A.2）に置かれる。しかしPドメイン中の実質的な配列類似性は、これらが相同であることを示唆する。VGICファミリーメンバーのサブユニットは、存在するなら、チャネル活性化／脱活性化においてしばしば制御的役割を果たす。
【００２１】
本明細書において、HERGアッセイは、非天然のアミノ酸で修飾され、目的の化学物質と相互作用するとアフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞中で発現される、修飾HERGイオンチャネルを測定する。
【００２２】
本明細書においてレセプトフォアモデルは、特異的リガンドとの最適超分子相互作用を確実にし、かつ標的の生物学的機能を開始（または阻止）するのに必要な生物学的標的の、立体的かつ電子的特徴の集合である。
【００２３】
本明細書においてQT間隔は、心電図で測定された心臓再分極に必要な時間である。この間隔の延長は、トルサード・ド・ポアント（torsades de point）として知られている命にかかわる心室性不整脈を引き起こすことがある。Ben-Daviesら (1993) Lancet 341:1578。同様に、QT延長症候群は心筋再分極の異常であり、これを受けた人は心室性不整脈になりやすく、これが心室細動になり突然死を引き起こすことがある。
【００２４】
本明細書において心電図（以後「ECG」）は、詳細な心臓律動、波形および拍動を測定するための一般的な検査である。
【００２５】
本明細書において「非天然のアミノ酸」は、Creighton, Proteins、（W.H. Freeman and Co.  1984）、pp. 2-53に記載の20個の認識されている天然のアミノ酸以外の任意のアミノ酸である。
【００２６】
HERGの構造と機能
HERGイオンチャネルは、脱分極−活性化カリウムチャネルファミリーのメンバーであり、これは6つの推定膜貫通架橋（spanning）ドメインを有する。このイオンチャネルは内向き整流性カリウムチャネルのような整流性を示すが、これらは2つの膜貫通ドメインしか持たないため、このイオンチャネルは異常である。Smithら (1996) Nature 379:833は、哺乳動物細胞で発現されるHERGチャネルを試験し、この内向き整流は、陽性電圧でのコンダクタンスを低下させる迅速な電位依存性不活性化プロセスにより生じることを見いだした。HERGの不活性化ゲーティング機構は、しばしば他のカリウムチャネルの「遅い」不活性化機構であると見なされるC型不活性化に似ている。このゲーティングの特徴は、不整脈の正常な抑制におけるこのチャネルの特異的役割を示唆した。余分な拍動を抑制するHERGの役割は、HERG電流が欠如した患者における心臓突然死の頻度の増加を説明する助けになるかも知れない。というのは、かれらは遺伝的欠陥を有するため、または例えばかれらはHERGチャネルを阻止するクラスIII抗不整脈薬で治療されているためである。したがって、任意の薬剤またはこのタイプの化合物とHERGチャネルとの結合相互作用の測定は、この相互作用を如何に避けるかについての情報を提供するであろう。
【００２７】
結晶化は、3次元構造及びそれらと薬剤化合物との相互作用を研究するための1つの慣用法である。しかし結晶構造の解明は非常に時間がかかり、結果は必ずしもすべての可能な相互作用を測定できるほど正確ではない。膜タンパク質（すなわち、HERGイオンチャネル）の場合、結合部位相互作用を研究する試みにおいて、タンパク質を種々の既知のチャネルブロッカーと同時結晶化することに多くの試みが失敗している。さらにHERGチャネルは動的性質を有するため、静的な結晶像は正しい機能的状態ではないかも知れない。最後に、試験されるタンパク質のコンフォメーションは、結晶の充填力のために変化しているかも知れない。本明細書に記載の方法は、結晶学的分析無しで非常に正確な相互作用と結合データを提供する。結晶学分析により提供されるような膜タンパク質についての原子スケールの構造データが無い場合、これらの技術は詳細な構造情報を提供することができる。
【００２８】
本発明の方法を使用してHERGイオンチャネル上のどの部位を修飾するかを決定するためには、HERGイオンチャネルを用いた以前の研究を見ることが有用であろう。例えば、HERGイオンチャネルの慣用の突然変異誘発試験は、膜貫通ドメイン内の可能な結合部位についての情報を提供することができる。Mitchesonら (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 97:12329-12333を参照されたい。配列解析とKcsA相同性モデルとの比較に基づき、HERGチャネルの内腔は、他の電位依存性カリウムチャネルよりはるかに大きいかも知れない。また、他の電位依存性カリウムチャネルと異なり、HERGチャネルのS6ドメインは、内腔を向いている2つの芳香族残基を有する。特にこれらの残基は薬剤に結合し、予測できないHERG活性を引き起こすことがある。従来、HERGの結合部位は、S6膜貫通ドメイン（G648、Y652およびF656）とポアーヘリックス（T623とV625）に位置するアミノ酸からなると報告されている。Mitchesonらを参照されたい。したがって、これらの部位は、非天然のアミノ酸の取り込みのために好ましい。
【００２９】
レセプトフォアモデルの作成
正確なレセプトフォアモデルは、リガンド結合部位に関与するアミノ酸の同定及び関与する分子力の探索により構築される。まず、ナンセンス抑制法を使用して、非天然のアミノ酸がHERGイオンチャネル中に取り込まれる。改変イオンチャネルが、アフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞膜上で異種性に発現される。改変チャネルに対する結合効率について、化合物がスクリーニングされる。電気生理学的または生化学的アッセイを使用して、リガンド結合に及ぼす非天然のアミノ酸置換の影響（もしあれば）を測定する。野生型に関する結合データ対改変チャネルに関する結合データを比較して、リガンド結合に関与する分子力を定義する。
【００３０】
Zhongら (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95:12088-12093に記載されるニコチンアゴニストの相互作用についてのレセプトフォアモデルを開発するために、最近アセチルコリンとニコチン性アセチルコリン受容体との相互作用が研究されている。非天然のアミノ酸取り込みについてのインビボナンセンス抑制法を使用した標的結合部位の体系的マッピングにより、複数のアゴニスト接触点が同定された後に、ニコチン性受容体ファミリーの明確なアゴニストレセプトフォアモデルが現れるであろう。アゴニスト結合部位に寄与するものとして多くの芳香族アミノ酸が同定されており、陽イオン-p相互作用が、アゴニストであるアセチルコリンの四級アンモニウム基への結合に関与する可能性を示唆する。(i)陽イオン-p結合能力の最初から（ab initio）の量子力学的予測と、(ii)非天然のアミノ酸の取り込みについてインビボのナンセンス抑制法を使用して、受容体に取り込まれた一連のトリプトファン誘導体の受容体でのアセチルコリンのEC50値との、明らかな相関が証明されている。そのような相関は、芳香族残基の1カ所、唯1カ所で見られる：サブユニットのトリプトファン−149。この知見は、この受容体について今日まで最も正確な構造情報を提供し、アセチルコリンの陽イオン性四級アンモニウム基は、結合するとトリプトファン−149のインドール側鎖とファンデアワールス接触を形成することを示唆している。
アセチルコリン結合部位における他の可能な立体的および電子的相互作用の同様の体系的探索により、ニコチン受容体でのアゴニストの結合および生理学的活性についてレセプトフォアモデルが構築されるであろう。この一般的方法を使用して、広範囲の受容体やイオンチャネルとの、他のアゴニスト、アンタゴニストの、またはアロステリック相互作用のレセプトフォアモデルを構築することができるであろう。同上。
【００３１】
非天然のアミノ酸は、ナンセンスコドン抑制の使用を介して、HERGイオンチャネル結合部位中に取り込まれる。Norenら (1989) Science 244:182；Nowakら (1998) Methods in Enzymol. 293:515。図1を参照されたい。ナンセンス抑制法では、線状化プラスミドからのインビトロ合成のような標準的方法を使用して2つのRNA種が調製される。最初のものは、HERGチャネルをコードするが、非天然のアミノ酸の取り込みが望ましい位置でアンバー（amber）停止コドン（UAG）を含有するように設計されたmRNAである。第2のものは、対応するアンチコドン（CUA）を含有する、使用される発現系［例えばアフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞についてのテトラヒメナ・サーモフィラ（Tetrahymena thermophila）tRNAGlnG73または大腸菌（E. coli）発現系］に適合性のあるサプレッサーtRNAである。tRNAは次に、例えばKearneyら (1996) Mol. Pharmacol. 50:1401-1412に記載されたような当該分野で公知の方法を使用して、所望の非天然のアミノ酸を用いて3'末端で化学的にアシル化される。
【００３２】
非天然のアミノ酸の合成は所望の構造に依存する。非天然のアミノ酸は、例えば天然のアミノ酸の修飾により調製される。また多くの非天然のアミノ酸は市販もされている。NRCバイオテクノロジー研究所ペプチド／タンパク質化学グループ（NRC Biotechnology Research Institute Peptide/Protein Chemistry Group）は、http://aminoacid.bri.nrc.ca.に市販のアミノ酸の優れたリストを保持している。
【００３３】
本発明の方法を使用して哺乳動物細胞へ取り込むのに好適な非天然のアミノ酸の例には、特に限定されないが、以下の式(I)：
【化１】
2006509495.tif 000003
｛式中、
Xは以下の式：
【化２】
2006509495.tif 000004
からなる群から選ばれる。｝
により表される。
【００３４】
別の好適な実施態様において、哺乳動物細胞へ取り込むための非天然のアミノ酸の例には、特に限定されないが、以下の式(II)：
【化３】
2006509495.tif 000005
｛式中、
Yは、CH2、(CH)n、N、O、またはSであり、nは1または2である。｝
により表されるものがある。そのような化合物の例には、特に限定されないが、以下の化合物がある：
【化４】
2006509495.tif 000006
D-アミノ酸は取り込まれずL-アミノ酸のみが取り込まれるため、ラセミ体アミノ酸を使用することができることにも注意されたい。Cornishら (1995) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34:621-633。
【００３５】
好適な実施態様において、関連するmRNAとアシル化tRNAの合成後に、これらは当該分野で公知の標準的方法を使用して、Nowakら (1998) Methods in Enzymol. 293:515に記載のように、完全なアフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞中に同時注入される。翻訳の間リボゾームは、作成された停止コドンの位置の新生中のペプチド中に非天然のアミノ酸を取り込み、卵母細胞膜上で改変HERGチャネルが発現される。
【００３６】
改変イオンチャネルまたは受容体のリガンド結合能力を評価するのに、電気生理学的方法として電流クランプまたは好ましくは電圧クランプが使用される。電流クランプアッセイは、細胞膜を横切るイオン伝導に関係する卵母細胞膜電位の変化を検出することにより、受容体またはイオンチャネルへのリガンド結合を測定する。電圧クランプは、細胞膜を横切るイオン伝導に関係する電圧クランプ電流を測定する。これらの電流は、時間とともに、アゴニストおよびアンタゴニストの濃度とともに、および膜電位とともに変化し、これらの変動は、任意の時間でのオープンチャネルの数を測定する。そのような電気生理学的方法は、当該分野で周知（Hille, 2001; Methods in Enzymology, Vol 152）であり、アフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞発現系中のイオンチャネルの研究に広く使用されている。
【００３７】
膜電位の変化が関与しないリガンド結合イベントを測定するために、他のリガンド結合アッセイを開発することができる。当業者は、特定の発現系で使用するための生化学的アッセイ、および特定の研究に関与する非天然のアミノ酸、イオンチャネル、リガンドおよび調節物質を選択することができるが、我々はここでいくつかのリガンド結合アッセイの例を説明する。本発明は、使用される特定の結合アッセイに限定されない。
【００３８】
ある実施態様において、結合または非結合リガンドの存在を物理的に検出するために標識リガンドが使用される。種々の種類の標識物（特に限定されないが、放射性、蛍光、および酵素標識物を含む）が、結合研究で使用され当該分野で周知である。標識リガンドは市販されているか、または当該分野で公知の方法を使用して調製することができる。放射能標識リガンドを使用する結合アッセイは以下の工程を含む：(1)精製したイオンチャネルまたはイオンチャネルを発現する卵母細胞を、標識リガンドとともにインキュベートする、(2)リガンド結合のために適切な時間放置する、(3)シンチレーションカウンターを使用して結合リガンドの数を数える、および(4)改変および非改変チャネルの放射能カウントの相違を比較する。
【００３９】
イオンチャネル／リガンド結合データを編集して、リガンド結合イベントのモデルを作成する。リガンド結合への特定のアミノ酸側鎖の寄与は、天然のアミノ酸の性質を置換された非天然のアミノ酸の性質と比較することにより推定される。したがって、意味のあるデータの作成は、適切な置換基の選択に部分的に依存するであろう。当業者は、推定チャネル／リガンド相互作用を研究するために非天然のアミノ酸置換を選択することができるが、我々は、これらの実験から、如何に関連する情報が外挿されるかのいくつかの例を提供する。
【００４０】
(1)天然のアミノ酸の代わりのフルオロ−、シアノ−、およびブロモ−アミノ酸誘導体がリガンド結合を無くすなら、陽イオン-p相互作用が重要である。芳香族アミノ酸中に取り込まれると、これらの置換基は芳香環から電子密度を引き出し、リガンド上の陽性に荷電した基と芳香族部分との推定の静電的相互作用を弱める。フッ素は強い電子吸引基であり、立体的変動は無視できることが多いため、フルオロ−誘導体が好ましいことが多い。
【００４１】
(2)側鎖の立体構造を大きく変化させることなく疎水性を上昇させる置換によりリガンド結合が影響を受けるなら、疎水性相互作用が好ましく、こうして人工的な立体構造的束縛がない状態で、疎水性相互作用の重要性の研究が可能になる。そのような操作の1つの例は、極性酸素から非極性CH2基への変換（例えば、O-メチル-スレオニンからイソロイシンへ）である。疎水性を上昇させる他の方法（例えば、バリンからアロ−イソロイシンへの置換のように側鎖の長さを長くするか、またはイソロイシンからノルバリンへの置換のようにβ−分岐を付加、イソロイシンからｔ−ブチルアラニンへの置換のようにγ−分岐を付加）は、疎水性相互作用の重要性を支持する結果を与える。
【００４２】
(3)α−ヒドロキシ酸置換がリガンド結合に影響を与えるなら、局所的α−らせんまたはβ−シート構造が重要である。ペプチド骨格にα−ヒドロキシ酸を取り込むと、アミド結合の代わりにエステル結合が生成する。局所的α−らせんとβ−シートの安定化のためにアミド水素結合が重要であるため、α−ヒドロキシ酸置換はこれらの構造を破壊する。
【００４３】
(4) 研究者は、あるアミノ酸のリン酸化またはグリコシル化類似体をイオンチャネル中に取り込むことにより、推定された修飾の存在下または非存在下でリガンド結合を比較することができる。
【００４４】
(5)光反応性の非天然のアミノ酸を使用して、特異的側鎖またはタンパク質修飾の重要性を研究することができる。例えばアミノ酸の側鎖に光除去可能なニトロベンジル基を付加すると、リガンドとの相互作用を防止するか、または側鎖修飾（例えばリン酸化及びメチル化）を阻止することができる。UV照射はニトロベンジル基を除去し、それによってアミノ酸をその本来の形に戻す。したがって、UV照射の前後に取ったリガンド結合測定値は、リガンド結合への側鎖の寄与を明らかにする。同様に、非天然のアミノ酸（2-ニトロフェニル）グリシン（Npg）を取り込むことにより、ループのような局所的タンパク質構造の重要性を研究することができる。Npg-修飾アミノ酸の照射は、タンパク質チャネル骨格のタンパク質分解を開始する。UV照射がNpg-修飾チャネルへのリガンド結合を破壊するなら、取り込まれる非天然のアミノ酸の近くの構造が重要である可能性がある。
【００４５】
(6)ニトロベンゾキサジアゾール（NBD）蛍光物質のような蛍光レポーター基またはニトロキシルのようなスピンラベルを、これらの標識物を含有する非天然のアミノ酸を使用してイオンチャネル中に取り込むことができる。例えばチャネルへのNBD-アミノ酸の取り込み後に、蛍光標識リガンドとNBD-アミノ酸の間の蛍光共鳴エネルギー移動が、アミノ酸残基とリガンド結合部位との距離のような情報を与えることができる。
【００４６】
修飾HERGチャネルへの結合親和性についてスクリーニングされる目的の化合物には、特に限定されないが抗不整脈剤がある。構造的に多様な多くの化合物がHERGチャネルを阻止することが知られており、したがって、これらの化合物のうちのいずれかが、本発明のシステムによるスクリーニングの候補である。特に好適な化合物には、MK-449、テルフェナジン（terfenadin）、シサプリド（cisapride）、およびドフェチリド（dofetilide）がある。
【００４７】
以下の例は、例示のためであって、決して本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００４８】
材料：
Expedite DNA合成機（パーセプティブ・バイオシステムズ（Perseptive Biosystems）、フラミンガム、マサチューセッツ州）で、DNAオリゴヌクレオチドを合成した。制限エンドヌクレアーゼとT4リガーゼは、ニューイングランドバイオラボズ（New England Biolabs）（ビバリー（Beverly）、マサチューセッツ州）から購入した。T4 ポリヌクレオチドキナーゼ、T4 DNAリガーゼ、およびRnaseインヒビターは、ベーリンガーマンハイムバイオケミカルズ（Boehringer Mannheim Biochemicals）（インディアポリス、インディアナ州）から購入した。35S-メチオニンと14C-標識タンパク質分子量マーカーは、アマシャム（Amersham）（アーリントンハイツ、イリノイ州）から購入した。無機ピロホスファターゼはシグマ（Sigma）（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。Stains-allはアルドリッチ（Aldrich）（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）から購入した。T7 RNAポリメラーゼはGrodbergとDunn (1988) J. Bact. 170:1245の方法を使用して、プラスミドpAR1219を有する過剰産生性大腸菌（E. coli）BL21株から精製するか、またはアンビオン（Ambion）（オースチン、テキサス州）から購入した。記載のすべての緩衝液について、特に明記しない場合は、最後のpH調整は不要であった。
【００４９】
非天然のアミノ酸：
ほとんどの非天然のアミノ酸は市販品を購入したが、他の非天然のアミノ酸は公知の方法により合成することができる。トリプトファン類似体は、Gilchristら (1979) J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1089-90 の方法を使用して調製した。テトラフルオロインドールは、Rajhら (1979) Int. J. Pept. Protein Res. 14:68-79 の方法により調製した。5,7-ジフルオロインドールと5,6,7-トリフルオロインドールは、CuI／ジメチルホルムアミドを類似の6-トリメチルシリルアセチレニルアニリンと反応させて調製した。
【００５０】
典型的にはアミノ基は、o-ニトロベラトリルオキシカルボニル（NVOC）基として保護され、これは次に、当該分野で公知の方法により光化学的に除去される。しかし、光反応性側鎖を有するアミノ酸については、4-ペンテノイル（4PO）基（Fraser-Reidにより最初に記載された保護基）のような別のものを使用しなければならない。Madsenら (1995) J. Org. Chem. 60, 7920-7926; Lodderら (1997) J. Org. Chem. 62, 778-779。我々はここに、Englandら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA （印刷中）が記載した非天然のアミノ酸 (2-ニトロフェニル)グリシン（Npg）に基づく代表的方法を記載する。
【００５１】
N-4PO-D,L-(2-ニトロフェニル)グリシン。非天然のアミノ酸 D,L-(2-ニトロフェニルグリシン)塩酸塩を、Davisら (1973) J. Med. Chem. 16:1043-1045; Muralidharanら (1995) J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 27:123-137に従って調製した。このアミンを4-ペンテノイル（4PO）誘導体として以下のように保護した。H2O：ジオキサン（0.75ml：0.5ml）中の(2-ニトロフェニル)グリシン塩酸塩（82mg, 0.35mmol）の室温溶液に、Na2CO3 （111mg、1.05mmol）を加え、次にジオキサン（0.25ml）中の4-ペンテノイックアンヒドリド（70.8mg、0.39mmol）の溶液を加えた。3時間後、混合物を飽和NaHSO4に注ぎ、CH2Cl2で抽出した。有機相を無水Na2SO4で乾燥し、真空下で濃縮した。残存油状物をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、標題化合物（73.2mg、75.2％）を白色の固体として得た。1H NMR（300MHz、CD3OD）δ8.06 (dd, J=1.2, 8.1 Hz, 1H), 7.70 (ddd, J=1.2, 7.5, 7.5 Hz, 1H), 7.62-7.53 (m, 2H), 6.21 (s, 1H), 5.80 (m, 1H), 5.04-4.97 (m, 2H), 2.42-2.28 (m, 4H)。C13H14N2O5について計算したHRMS  279.0981、実測値279.0992。
【００５２】
N-4PO-D,L-(2-ニトロフェニル)グリシネートシアノメチルエステル。酸をシアノメチルエステルとして、本分野で公知の方法を使用して活性化した。（Robertsonら (1989) Nucleic Acids Res. 17:9649-9660；Ellmanら (1991) Meth. Enzym. 202:301-336。無水DMF（1ml）中の酸（63.2mg、0.23mmol）の室温溶液に、NEt3（95μl、0.68mmol）を、次にClCH2CN（1ml）を加えた。16時間後、混合物をEt2Oで希釈し、H2Oに対して抽出した。有機相を飽和NaClで洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、真空下で濃縮した。残存油状物をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、標題化合物（62.6mg、85.8％）を黄色の固体として得た。1H NMR（300MHz、CDCl3）δ8.18 (dd, J=1.2, 8.1 Hz, 1H), 7.74-7.65 (m, 2H), 7.58 (ddd, J=1.8, 7.2, 8.4 Hz, 1H), 6.84 (d, J=7.8 Hz, 1H), 6.17 (d, J=6.2 Hz, 1H), 5.76 (m, 1H), 5.00 (dd, J=1.5, 15.6 Hz, 1H), 4.96 (dd, J=1.5, 9.9 Hz, 1H), 4.79 (d, J=15.6 Hz, 1H), 4.72 (d, J=15.6 Hz, 1H), 2.45-2.25 (m, 4H)。C16H17N3O5について計算したHRMS  317.1012、実測値317.1004。
【００５３】
N-4PO-(2-ニトロフェニル)グリシン-dCA。ジヌクレオチドdCAを、Schultz（同上）が報告したように、Kearneyら (1996) Mol. Pharmacol. 50:1401-1412が記載した修飾を加えて調製した。次にシアノメチルエステルを以下のようにdCAに結合させた。アルゴン下で無水DMF（400μl）中のdCA（テトラブチルアンモニウム塩、20mg、16.6μmol）の室温溶液に、N-4PO-D,L-(2-ニトロフェニル)グリシネートシアノメチルエステル（16.3mg、51.4μmol）を加えた。溶液を1時間攪拌し、次に25mM NH4OAc（pH4.5）（20μl）で停止させた。粗生成物を逆相半分取用HPLC（Whatman Partisil 10 ODS-3カラム、9.4mm×50cm）で、25mM NH4OAc（pH4.5）〜CH3CNの勾配を使用して精製した。適切な画分を合わせ凍結乾燥した。生じた固体を10mM HOAc/CH3CNに再溶解し、凍結乾燥して4PO-Npg-dCA（3.9mg、8.8％）を淡黄色の固体として得た。ESI-MS M- 896(31)、[M-H]- 895(100)、C32H36N10O17P2についての計算値896。この物質をUV吸収（ε260  ほぼ37,000M-1cm-1）により定量した。
【００５４】
サプレッサーtRNA設計と合成：
所望の非天然のアミノ酸をコードするサプレッサーtRNAを、例えばNowakら (1998)とPeterssonら (2002) RNA 8(4):542-7が教示する方法により作成した。サプレッサーtRNA THG73について続いて以下の方法を使用した。上流T7プロモーターと下流FokI制限部位が両側に位置し、75位と76位のCAが欠如するティー・サーモフィラ（T. thermophila） tRNAGlnCUA G73の遺伝子を、以下の8つの重複DNAオリゴヌクレオチド（配列番号1〜8）から構築し、pUC19ベクター中にクローン化した。
配列番号1  5'-AATTCGTAATACGACTCACTATAGGTTCTATAG-3'
配列番号2  3'-  GCATTATGCTGAGTGATATCCAAGA  -5'
配列番号3  5'-  TATAGCGGTTAGTACTGGGGACTCTAAA -3'
配列番号4  3'-TATCATATCGCCAATCATGACCCCTGAG  -5'
配列番号5  5'-  TCCCTTGACCTGGGTTCG   -3'
配列番号6  3'-ATTTAGGGAACTGGACCC        -5'
配列番号7  5'- AATCCCAGTAGGACCGCCATGAGACCCATCCG  -3'
配列番号8  3'-AGCTTAGGGTCATCCTGGCGGTACTCTGGGTAGGCCTAG-5'
【００５５】
得られたプラスミド（pTHG73）をFokIで消化して、75位と76位にCAの無い、tRNA転写体に対応する線状化DNA鋳型が得られた。FokIで線状化したpTHG73のインビトロでの転写を、Sampsonら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:1033が記載したように行った。74ヌクレオチドのtRNA転写体であるtRNA-THG73（CAが無い）を、変性ポリアクリルアミド電気泳動により単一のヌクレオチドまで精製し、次にUV吸収により定量した。
【００５６】
tRNAの化学的アシル化と保護基の除去：
T4 RNAリガーゼを使用して、a-NH2-保護dCA-アミノ酸またはdCAを酵素的にTHG73 FokIランオフ転写体に結合させて、完全長の化学的に荷電されたa-NH2-保護アミノアシル-THG73または完全長であるがアシル化されていないTHG73-dCAを形成した。
【００５７】
連結の前に、10μlのTHG73（水中1μg/μl）を5μlの10mMヘペス、pH7.5と混合した。このtRNA/ヘペスプレミックスを95℃で3分間加熱し、37℃までゆっくり冷却させた。
【００５８】
37℃で2時間インキュベーション後、DEPC-H2O（52μl）と3M 酢酸ナトリウム、pH5.0（8μl）を加え、反応混合物を等量のフェノール（300mMの酢酸ナトリウムで飽和、pH5.0）：CHCl3：イソアミルアルコール（25：24：1）で一回抽出し、等量のCHCl3：イソアミルアルコール（24：1）で一回抽出し、次に-20℃の2.5倍量の冷エタノールで沈降させた。混合物を14,000rpmで4℃で15分間遠心分離し、ペレットを冷70％（v/v)エタノールで洗浄し、真空下で乾燥し、7μlの1mM酢酸ナトリウム、pH5.0に再懸濁した。A260を測定してa-NH2-保護アミノアシル-THG73の量を定量し、1mM酢酸ナトリウム、pH5.0を用いて濃度を1μg/μlに調整した。
【００５９】
連結効率を分析PAGEにより測定した。典型的なゲル条件下では部分的に加水分解して複数のバンドを生じるa-NH2-保護dCA-アミノアシル-tRNAは、連結したtRNAを脱保護してからのせた。そのような脱保護tRNAは、のせると直ちに加水分解される。典型的には、10μlのBPB/XC緩衡液中の1μgの連結したtRNAをゲルにのせ、サイズ標準物質として1μgの非連結tRNAを流した。連結効率は、連結tRNA（76塩基）と非連結tRNA（74塩基）に対応するバンドの相対的強度から測定した。
【００６０】
mRNAの作成：
目的のアミノ酸の位置に停止コドンTAGを含有する変異した相補的cDNAクローンから、インビトロでmRNAを合成した。ナンセンスコドン抑制方法のために、注入の1〜2日後に卵母細胞中の機能的応答が観察されるように、目的の遺伝子を高発現プラスミド中に有することが好ましい。特に、これはサプレッサーtRNAの再アシル化の可能性を小さくする。当業者には多くの高発現卵母細胞プラスミドが利用できるが、我々はここに、pBluescript SK+の複数のクローニング領域を修飾することにより作成した高発現プラスミドpAMV-PAを記載する。Nowakら (1998) Methods in Enzymol. 293:515。
【００６１】
5'末端にアルファルファモザイクウイルス（AMV）配列を挿入し、3'末端にポリ(A)テイルを付加して、プラスミドpAMV-PAを得た。AMV領域を含有するmRNA転写体は、高親和性でリボゾーム複合体に結合し、タンパク質合成が30倍上昇する。3'ポリ(A)テイルを含有させるとmRNA半減期が上昇することが証明され、したがって合成されるタンパク質量が増加する。目的の遺伝子をpAMV-PAにサブクローン化し、AMV領域が遺伝子のATG開始コドンの直ぐ5'に位置するようにした（すなわち、遺伝子の5'非翻訳領域は完全に除去された）。プラスミドpAMV-PAを、CaltechのC. Labaracaから入手できた。
【００６２】
非天然のアミノ酸取り込みが望ましい位置に、部位特異的突然変異誘発によりTAG停止コドンを作成した。望ましい位置に停止コドンを作成するのに使用される適当な部位特異的突然変異誘発法には、Transformerキット（クロンテク（Clontech）、パロアルト（Palo Alto）、カリフォルニア州）、Altered Sitesキット（ストラタジーン（Stratagene）、ラホヤ（La Jolla）、カリフォルニア州）、および標準的ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）カセット突然変異誘発法がある。最初の2つの方法では、変異プラスミド（400〜600塩基対）の小さな領域を、もとのプラスミドにサブクローン化した。すべての方法で、挿入されたDNA領域を、連結部位にわたって自動配列決定によりチェックした。pAMV-PAプラスミド構築体をNotIで線状化し、mMessage mMachine T7 RNA ポリメラーゼキット（アンビオン（Ambion）、オースチン、テキサス州）を使用してmRNA転写体を作成した。
【００６３】
卵母細胞−調製と注入：
卵母細胞は、当該分野で公知の技術を使用してゼノプス・ラエビス（Xenopus laevis）から取り出した。Quick, M., Lester, H.A. (1994)。アフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞中の興奮性タンパク質の発現方法。Ion Channels of Excitable Cells. （Narahashi, T.編）、pp. 261-279、アカデミックプレス（Academic Press）、サンジエゴ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国、中。卵母細胞を、ピルビン酸ナトリウム（2.5mM）、ゲンタマイシン（50μg/ml）、テオフィリン（0.6mM）およびウマ血清（5％）を補足した、96mM NaCl、2mM KCl、1mM MgCl2、1.8mM CaCl2、および5mMヘペス（pH7.5）からなるND96溶液中で18℃で維持した。注入の前に、1mM NaOAc（pH5.0）中のNVOC−アミノアシル−tRNA（1μg/μl）を、WG-335とUG-11フィルター（ショット（Schott））を取り付けた600Wで作動する1000Wキセノンアークランプ（オリエル（Oriel））を用いて、5分間照射して脱保護した。脱保護したアミノアシル−tRNAを、所望のtRNAの水溶液と1：1で混合した。卵母細胞に、25〜50ngアミノアシル−tRNAと12.5〜18ngの総イオンチャネルmRNA（α：β：γ：δサブユニットについて20：1：1：1の比）を含有する50nlの混合物を注入した。
【００６４】
電気生理学：
アクソン（Axon）のpCLAMP6またはCLAMPEXソフトウェアを動かすPCを接続したGeneClamp500回路とDigidata1200デジタイザー（アクソンインスツルメンツ社（Axon Instruments, Inc.）（フォスターシティ、カリフォルニア州））を使用して、注入の24〜36時間後に、2電極電圧クランプ記録を行った。記録溶液は、96mM NaCl、2mM MgCl2、および5mMヘペス（pH7.4）を含有した。記載の保持電位（典型的には-60mV）で種々のリガンド濃度に対する全細胞電流応答を、Hill式 I/Imax＝1/{1+(EC50/[A])n}に適合させた（ここで、Ｉは[A]でのアゴニストにより誘導された電流であり、Imaxは最大電流であり、EC50は、最大応答の半分を誘導する濃度であり、nはHill係数である）。
【００６５】
レセプトフォアモデルの開発：
非改変受容体（WT）とα-Trp149での非天然アミノ酸置換について、用量応答曲線をHill式に適合させた。置換は、5-F-Trp、5,7-F2-Trp、5,6,7-F3-Trp、および4,5,6,7-F4-Trpを含む。各置換と非改変受容体についてlog[EC50/EC50(WT)]を、各フッ素化trp誘導体の陽イオン−π結合能力に対してプロットした。trpとフッ素化誘導体について陽イオン−π結合能力を、最初からの（ab initio）量子力学計算を使用して予測した。Mecozziら (1996) J. Am. Chem. Soc. 118:2307-2308；Mecozziら (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10566-10571。データは、直線y＝3.2-0.096xに適合し、相関係数 r＝0.99である。図2を参照。各置換のEC50値は、置換による予測された結合エネルギーの喪失によく一致するため、これらのデータは、α-Trp149と結合位置のアセチルコリンの四級アンモニウムとの間の陽イオン−π結合に一致する。アセチルコリンとニコチン性アセチルコリン受容体との接触のさらに体系的なマッピング後に、この相互作用に関与する完全な立体的および電子的特徴を説明するレセプトフォアモデルを作成することができる。
【００６６】
ドフェチリド（dofetilide）を使用するY652とF656での陽イオン−π相互作用部位の特徴付け
この実験は、この部位での結合の詳細な状況を作成するために、ドフェチリド及びいくつかのその類似体と、HERGチャネル及びいくつかのその変異体（Y652とF656に非天然のアミノ酸変異を含有する）との結合と電気生理学を解析する。ドフェチリド類似体は、HERGチャネルへの結合親和性の範囲を示すために選択された。この実験は、HERGチャネルへのドフェチリド結合のファルマコホア（Pharmacophore）の定義を可能にする相互作用の範囲を提供する。非天然のHERGチャネル変異体は結合相互作用の詳細を明らかにし、これは結合部位でのドフェチリドとその類似体の配向を示す。この実験で使用されるドフェチリドとドフェチリド類似体（下記）は、当該分野で公知であり、例えば米国特許第4,959,366号およびEP649,838号に記載されている。
【化５】
2006509495.tif 000007
【００６７】
HERGチャネルの連結（concatenated）遺伝子の構築
化合物が結合するチャネルの面の説明を可能にするHERGチャネルの連結遺伝子が構築される。HERGチャネルには4つの同じ面があり、連結遺伝子は、チャネルのどの具体的な面が相互作用点を含有するかを決定することを可能にする。当業者は、例えばSilvermanら（J. Biol. Chem. 1996 Nov 29;271(48):30524-8）とPessiaら（EMBO J 1996 Jun 17;15(12):2980-7）による論文に沿って進めるであろう。
【００６８】
本明細書に記載のすべての文献は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６９】
本発明をその実施例とともに説明したが、前記説明は例示と説明のためであり、かつ本発明とその好適な実施態様を例示することが目的である。日常的な実験により当業者は、本発明の精神から逸脱することなく明らかな修飾と変更態様を認識するであろう。すなわち、本発明は上記説明によって規定されるものではなく、特許請求の範囲とその相当物によって定義されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、非天然のアミノ酸を、アフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞中で発現されるタンパク質中に取り込むためのスキームである。
【図２】図２は、野生型trpとフッ素化trp誘導体である5-F-Trp、5,7-F2-Trp、5,6,7-F3-Trp、および4,5,6,7-F4-Trpの、ニコチン性アセチルコリン受容体のα-Trp149でのlog[EC50/EC50(WT)]対陽イオン−π結合能力のプロットである。
【図１】
2006509495.tif 000017
【図２】
2006509495.tif 000018