(57)【要約】本発明は、精神病のような疾患または障害のリスクのあるまたはそれに罹患した対象を診断する方法を特徴とする。また、特定の対象または対象群について好ましい療法を選択する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において精神病を診断する方法であり、この方法が：
（ａ）該対象から得た試料中のメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）核酸を解析する段階；および
（ｂ）該対象における少なくとも１種のヘテロ接合型ＭＴＨＦＲ変異対立遺伝子の存在を決定する段階を含み、ここで該変異対立遺伝子の存在が、該精神病を有する該対象の指標である、方法。
【請求項２】
精神病が精神分裂症である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
変異対立遺伝子が、低下した活性または低下した熱安定性を伴うＭＴＨＦＲタンパク質をコードしている、請求項１記載の方法。
【請求項４】
変異対立遺伝子が、１６７位のＧ／Ａ変異、４８２位のＧ／Ａ変異、５５９位のＣ／Ｔ変異、６７７位のＣ／Ｔ変異、６９２位のＣ／Ｔ変異、７６４位のＣ／Ｔ変異、７９２＋１位のＧ／Ａ変異、９８５位のＣ／Ｔ変異、１０１５位のＣ／Ｔ変異、１０８１位のＣ／Ｔ変異、１２９８位のＡ／Ｃ変異、または１３１７位のＴ／Ｃ変異を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
変異対立遺伝子が、６７７位のＣ／Ｔ変異および１２９８位のＡ／Ｃ変異を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
対象における精神病のリスクまたはその性向を決定する方法であり、この方法が：
（ａ）該対象から得た試料中のＭＴＨＦＲ核酸を解析する段階；および
（ｂ）該対象中の少なくとも１種のヘテロ接合型ＭＴＨＦＲ変異対立遺伝子の存在を決定する段階を含み、ここで該変異対立遺伝子の存在が、該対象における精神病のリスクまたはその性向の指標である、方法。
【請求項７】
精神病が精神分裂症である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
変異対立遺伝子が、低下した活性または低下した熱安定性を伴うＭＴＨＦＲタンパク質をコードしている、請求項６記載の方法。
【請求項９】
変異対立遺伝子が、１６７位のＧ／Ａ変異、４８２位のＧ／Ａ変異、５５９位のＣ／Ｔ変異、６７７位のＣ／Ｔ変異、６９２位のＣ／Ｔ変異、７６４位のＣ／Ｔ変異、７９２＋１位のＧ／Ａ変異、９８５位のＣ／Ｔ変異、１０１５位のＣ／Ｔ変異、１０８１位のＣ／Ｔ変異、１２９８位のＡ／Ｃ変異、または１３１７位のＴ／Ｃ変異を含む、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
変異対立遺伝子が、６７７位のＣ／Ｔ変異または１２９８位のＡ／Ｃ変異を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
対象における精神病の診断法であり、この方法が：
（ａ）該対象から得た試料中のＭＴＨＦＲ核酸を解析する段階；および
（ｂ）６７７位のヘテロ接合型ＭＴＨＦＲ変異の存在および少なくとも１種の６７７位以外の位置での他のＭＴＨＦＲ変異の存在を決定する段階を含み、ここで該変異の存在が、該精神病を有する該対象の指標である、方法。
【請求項１２】
精神病が精神分裂症である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
変異ＭＴＨＦＲ核酸が、低下した活性または低下した熱安定性を伴うタンパク質をコードしている、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
変異ＭＴＨＦＲ核酸が、１６７位のＧ／Ａ変異、４８２位のＧ／Ａ変異、５５９位のＣ／Ｔ変異、６７７位のＣ／Ｔ変異、６９２位のＣ／Ｔ変異、７６４位のＣ／Ｔ変異、７９２＋１位のＧ／Ａ変異、９８５位のＣ／Ｔ変異、１０１５位のＣ／Ｔ変異、１０８１位のＣ／Ｔ変異、１２９８位のＡ／Ｃ変異、または１３１７位のＴ／Ｃ変異を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
変異ＭＴＨＦＲ核酸が、６７７位のＣ／Ｔ変異または１２９８位のＡ／Ｃ変異を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
対象における精神病のリスクまたはその性向を診断する方法であり、この方法が：
（ａ）該対象から得た試料中のＭＴＨＦＲ核酸を解析する段階；および
（ｂ）６７７位のヘテロ接合型ＭＴＨＦＲ変異の存在および少なくとも１種の６７７位以外の位置での他のＭＴＨＦＲ変異の存在を決定する段階を含み、ここで該変異の存在が、該対象における精神病のリスクまたはその性向の指標である、方法。
【請求項１７】
精神病が精神分裂症である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
変異ＭＴＨＦＲ核酸が、低下した活性または低下した熱安定性を伴うタンパク質をコードしている、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
変異ＭＴＨＦＲ核酸が、１６７位のＧ／Ａ変異、４８２位のＧ／Ａ変異、５５９位のＣ／Ｔ変異、６７７位のＣ／Ｔ変異、６９２位のＣ／Ｔ変異、７６４位のＣ／Ｔ変異、７９２＋１位のＧ／Ａ変異、９８５位のＣ／Ｔ変異、１０１５位のＣ／Ｔ変異、１０８１位のＣ／Ｔ変異、１２９８位のＡ／Ｃ変異、または１３１７位のＴ／Ｃ変異を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
変異ＭＴＨＦＲ核酸が、６７７位のＣ／Ｔ変異または１２９８位のＡ／Ｃ変異を含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
抗精神病療法の臨床試験に参加した対象の層化の方法であり、この方法が、該対象から得た試料中のＭＴＨＦＲ核酸を解析する段階、および該臨床試験の前、途中および後に、該対象における少なくとも１種のＭＴＨＦＲ変異対立遺伝子の存在を決定する段階を含み、ここで該対象中の該変異対立遺伝子の存在により、該対象が該臨床試験のサブグループに組入れられる、方法。
【請求項２２】
抗精神病療法が、精神分裂症の療法である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
変異対立遺伝子が、低下した活性または低下した熱安定性を伴うＭＴＨＦＲタンパク質をコードしている、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
変異対立遺伝子が、１６７位のＧ／Ａ変異、４８２位のＧ／Ａ変異、５５９位のＣ／Ｔ変異、６７７位のＣ／Ｔ変異、６９２位のＣ／Ｔ変異、７６４位のＣ／Ｔ変異、７９２＋１位のＧ／Ａ変異、９８５位のＣ／Ｔ変異、１０１５位のＣ／Ｔ変異、１０８１位のＣ／Ｔ変異、１２９８位のＡ／Ｃ変異、または１３１７位のＴ／Ｃ変異を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
変異対立遺伝子が、６７７位のＣ／Ｔ変異または１２９８位のＡ／Ｃ変異を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
対象が、少なくとも２種のＭＴＨＦＲ変異対立遺伝子を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２７】
変異対立遺伝子が、１６７位のＧ／Ａ変異、４８２位のＧ／Ａ変異、５５９位のＣ／Ｔ変異、６７７位のＣ／Ｔ変異、６９２位のＣ／Ｔ変異、７６４位のＣ／Ｔ変異、７９２＋１位のＧ／Ａ変異、９８５位のＣ／Ｔ変異、１０１５位のＣ／Ｔ変異、１０８１位のＣ／Ｔ変異、１２９８位のＡ／Ｃ変異、または１３１７位のＴ／Ｃ変異の少なくとも１種を含む、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
変異対立遺伝子が、６７７位のＣ／Ｔ変異または１２９８位のＡ／Ｃ変異の少なくとも一方を含む、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
精神病に罹患した対象に関して療法を選択する方法であり、該方法が：
（ａ）該対象から得た試料中のＭＴＨＦＲ核酸を解析する段階；および
（ｂ）該対象中の少なくとも１種のＭＴＨＦＲ変異対立遺伝子の存在を決定する段階を含み、ここで該変異対立遺伝子の存在が、該治療の安全性または有効性の指標である、方法。
【請求項３０】
精神病が精神分裂症である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
変異対立遺伝子が、低下した活性または低下した熱安定性を伴うＭＴＨＦＲタンパク質をコードしている、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
変異対立遺伝子が、１６７位のＧ／Ａ変異、４８２位のＧ／Ａ変異、５５９位のＣ／Ｔ変異、６７７位のＣ／Ｔ変異、６９２位のＣ／Ｔ変異、７６４位のＣ／Ｔ変異、７９２＋１位のＧ／Ａ変異、９８５位のＣ／Ｔ変異、１０１５位のＣ／Ｔ変異、１０８１位のＣ／Ｔ変異、１２９８位のＡ／Ｃ変異、または１３１７位のＴ／Ｃ変異を含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
変異対立遺伝子が、６７７位のＣ／Ｔ変異または１２９８位のＡ／Ｃ変異を含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
対象が、少なくとも２種のＭＴＨＦＲ変異対立遺伝子を含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３５】
変異対立遺伝子が、１６７位のＧ／Ａ変異、４８２位のＧ／Ａ変異、５５９位のＣ／Ｔ変異、６７７位のＣ／Ｔ変異、６９２位のＣ／Ｔ変異、７６４位のＣ／Ｔ変異、７９２＋１位のＧ／Ａ変異、９８５位のＣ／Ｔ変異、１０１５位のＣ／Ｔ変異、１０８１位のＣ／Ｔ変異、１２９８位のＡ／Ｃ変異、または１３１７位のＴ／Ｃ変異の少なくとも１種を含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
変異対立遺伝子が、６７７位のＣ／Ｔ変異または１２９８位のＡ／Ｃ変異の少なくとも一方を含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
変異体ＭＴＨＦＲ対立遺伝子が、精神病の療法に対する反応の指標であるかどうかを決定する方法であり、該方法が：
（ａ）該精神病のリスクが増大しているかまたは該精神病と診断された第一の対象または対象の組の反応が、該精神病のリスクが増大しているかまたは該精神病と診断された第二の対象または対象の組の反応と異なるかどうかを決定する段階；
（ｂ）該第一の対象または対象の組および該第二の対象または対象の組から得た試料中のＭＴＨＦＲ核酸を解析する段階；および
（ｃ）少なくとも１種のＭＴＨＦＲ変異対立遺伝子が、該第一の対象または対象の組と該第二の対象または対象の組との間で異なるかどうかを決定する段階を含み、ここで該変異対立遺伝子の存在は該反応と相関しており、これにより該変異対立遺伝子が、該療法の安全性または有効性の指標であるかどうかが決定される、方法。
【請求項３８】
精神病が精神分裂症である、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
変異対立遺伝子が、低下した活性または低下した熱安定性を伴うＭＴＨＦＲタンパク質をコードしている、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
変異対立遺伝子が、１６７位のＧ／Ａ変異、４８２位のＧ／Ａ変異、５５９位のＣ／Ｔ変異、６７７位のＣ／Ｔ変異、６９２位のＣ／Ｔ変異、７６４位のＣ／Ｔ変異、７９２＋１位のＧ／Ａ変異、９８５位のＣ／Ｔ変異、１０１５位のＣ／Ｔ変異、１０８１位のＣ／Ｔ変異、１２９８位のＡ／Ｃ変異、または１３１７位のＴ／Ｃ変異を含む、請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
変異対立遺伝子が、６７７位のＣ／Ｔ変異または１２９８位のＡ／Ｃ変異を含む、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
対象が、少なくとも２種のＭＴＨＦＲ変異対立遺伝子を含む、請求項３７記載の方法。
【請求項４３】
変異対立遺伝子が、１６７位のＧ／Ａ変異、４８２位のＧ／Ａ変異、５５９位のＣ／Ｔ変異、６７７位のＣ／Ｔ変異、６９２位のＣ／Ｔ変異、７６４位のＣ／Ｔ変異、７９２＋１位のＧ／Ａ変異、９８５位のＣ／Ｔ変異、１０１５位のＣ／Ｔ変異、１０８１位のＣ／Ｔ変異、１２９８位のＡ／Ｃ変異、または１３１７位のＴ／Ｃ変異の少なくとも１種を含む、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
変異対立遺伝子が、６７７位のＣ／Ｔ変異または１２９８位のＡ／Ｃ変異の少なくとも一方を含む、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
対象における精神病を予防、遅延または治療する方法であり、該方法が：
（ａ）前述の対象から得られた試料中のＭＴＨＦＲ核酸を解析する段階；
（ｂ）該対象中の少なくとも１種のＭＴＨＦＲ変異対立遺伝子の存在を決定し、ここで該変異対立遺伝子の存在により、少なくとも１種の抗精神病療法の安全性または有効性が予測される、段階；
（ｃ）対象について好ましい療法を決定する段階；および
（ｄ）好ましい療法を該対象に投与する段階
を含む、方法。
【請求項４６】
精神病が精神分裂症である、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
変異対立遺伝子が、低下した活性または低下した熱安定性を伴うＭＴＨＦＲタンパク質をコードしている、請求項４５記載の方法。
【請求項４８】
変異対立遺伝子が、１６７位のＧ／Ａ変異、４８２位のＧ／Ａ変異、５５９位のＣ／Ｔ変異、６７７位のＣ／Ｔ変異、６９２位のＣ／Ｔ変異、７６４位のＣ／Ｔ変異、７９２＋１位のＧ／Ａ変異、９８５位のＣ／Ｔ変異、１０１５位のＣ／Ｔ変異、１０８１位のＣ／Ｔ変異、１２９８位のＡ／Ｃ変異、または１３１７位のＴ／Ｃ変異を含む、請求項４５記載の方法。
【請求項４９】
変異対立遺伝子が、６７７位のＣ／Ｔ変異または１２９８位のＡ／Ｃ変異を含む、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
対象が、少なくとも２種のＭＴＨＦＲ変異対立遺伝子を含む、請求項４５記載の方法。
【請求項５１】
変異対立遺伝子が、１６７位のＧ／Ａ変異、４８２位のＧ／Ａ変異、５５９位のＣ／Ｔ変異、６７７位のＣ／Ｔ変異、６９２位のＣ／Ｔ変異、７６４位のＣ／Ｔ変異、７９２＋１位のＧ／Ａ変異、９８５位のＣ／Ｔ変異、１０１５位のＣ／Ｔ変異、１０８１位のＣ／Ｔ変異、１２９８位のＡ／Ｃ変異、または１３１７位のＴ／Ｃ変異の少なくとも１種を含む、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
変異対立遺伝子が、６７７位のＣ／Ｔ変異または１２９８位のＡ／Ｃ変異の少なくとも一方を含む、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
特定のＭＴＨＦＲ対立遺伝子の少なくとも１種のコピーを有する対象において鑑別作用を有する化合物；および
薬学的に許容できる担体または賦形剤または希釈剤を含有する薬学的組成物であり、
ここで該組成物が、該ＭＴＨＦＲ対立遺伝子を有する対象を治療するのに優先的に効果がある、薬学的組成物。
【請求項５４】
組成物が、単位剤形、追加の活性成分の存在、該化合物の安定化成分との複合、または該化合物の送達を増強もしくは排泄を遅延する成分の封入に基づいて優先的に効果があるように適合される、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
化合物が、少なくとも１種の該ＭＴＨＦＲ対立遺伝子を有する対象に対しまたは少なくとも１種の該ＭＴＨＦＲ対立遺伝子を有さない対象において有害であるが、両者においてそうではない、請求項５３記載の組成物。
【請求項５６】
対象が、筋萎縮性側索硬化症、不安症、痴呆、鬱病、癲癇、ハンチントン病、片頭痛、脱髄疾患、多発性硬化症、疼痛、パーキンソン病、精神分裂症、精神病および脳卒中からなる群より選択される疾患または状態に罹患している、請求項５３記載の組成物。
【請求項５７】
組成物が、少なくとも１種の該ＭＴＨＦＲ対立遺伝子の存在または非存在を決定する診断試験の使用について規制当局の制限または推奨の下にある、請求項５３記載の薬学的組成物。
【請求項５８】
薬学的組成物が、少なくとも１種の該ＭＴＨＦＲ対立遺伝子を有する対象に対する該薬学的組成物の使用の制限または制限の推奨について規制当局の制限または推奨の下にある、請求項５３記載の薬学的組成物。
【請求項５９】
薬学的組成物が、少なくとも１種の該ＭＴＨＦＲ対立遺伝子を有する対象においては該薬学的組成物を使用しないことを指示するような規制当局の制限または推奨の下にある、請求項５３記載の薬学的組成物。
【請求項６０】
薬学的組成物が、包装され、かつ該包装が少なくとも１種の該ＭＴＨＦＲ対立遺伝子を有する対象への該薬学的組成物の使用を制限するまたは制限を推奨するラベルまたは添付文書を含む、請求項５３記載の薬学的組成物。
【請求項６１】
薬学的組成物が、包装され、かつ該包装が対象における少なくとも１種の該ＭＴＨＦＲ対立遺伝子の存在または非存在を決定する試験の使用を要求または推奨するラベルまたは添付文書を含む、請求項５３記載の薬学的組成物。
【請求項６２】
化合物が抗精神病療法である、請求項５３記載の薬学的組成物。
【請求項６３】
化合物が精神分裂症療法である、請求項６２記載の薬学的組成物。
【請求項６４】
ＭＴＨＦＲ対立遺伝子が、低下した活性または低下した熱安定性を伴うＭＴＨＦＲタンパク質をコードしている、請求項５３記載の薬学的組成物。
【請求項６５】
ＭＴＨＦＲ対立遺伝子が、１６７位のＧ／Ａ変異、４８２位のＧ／Ａ変異、５５９位のＣ／Ｔ変異、６７７位のＣ／Ｔ変異、６９２位のＣ／Ｔ変異、７６４位のＣ／Ｔ変異、７９２＋１位のＧ／Ａ変異、９８５位のＣ／Ｔ変異、１０１５位のＣ／Ｔ変異、１０８１位のＣ／Ｔ変異、１２９８位のＡ／Ｃ変異、または１３１７位のＴ／Ｃ変異を含む、請求項５３記載の薬学的組成物。
【請求項６６】
ＭＴＨＦＲ対立遺伝子が、６７７位のＣ／Ｔ変異または１２９８位のＡ／Ｃ変異を含む、請求項５３記載の薬学的組成物。
【請求項６７】
対象が、少なくとも２種のＭＴＨＦＲ変異対立遺伝子を含む、請求項５３記載の薬学的組成物。
【請求項６８】
変異対立遺伝子が、１６７位のＧ／Ａ変異、４８２位のＧ／Ａ変異、５５９位のＣ／Ｔ変異、６７７位のＣ／Ｔ変異、６９２位のＣ／Ｔ変異、７６４位のＣ／Ｔ変異、７９２＋１位のＧ／Ａ変異、９８５位のＣ／Ｔ変異、１０１５位のＣ／Ｔ変異、１０８１位のＣ／Ｔ変異、１２９８位のＡ／Ｃ変異、または１３１７位のＴ／Ｃ変異の少なくとも１種を含む、請求項６７記載の薬学的組成物。
【請求項６９】
変異ＭＴＨＦＲ対立遺伝子が、６７７位のＣ／Ｔ変異または１２９８位のＡ／Ｃ変異の少なくとも一方を含む、請求項６７記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
（ａ） 発明の分野
本発明は、ヒトメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）のｃＤＮＡプローブ及びその使用に関する。
【０００２】
（ｂ） 先行技術の説明
葉酸誘導体は、プリン、チミジル酸及びメチオニンの生合成反応を含む、いくつかの重要な単一炭素転位反応のための補酵素である。メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ； ＥＣ １．５．１．２０）は、ホモシステインのメチオニンへのメチル化のための補助基質である５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸塩の５−メチルテトラヒドロ葉酸塩へのＮＡＤＰＨ結合型還元を触媒する。ブタ肝臓酵素であるフラビンタンパク質を、均質になるまで精製する；フラビンタンパク質は、７７ ｋＤａの複数のサブユニットからなるホモダイマーである。ブタのペプチドの部分的タンパク質分解は、２つの空間的に異なるドメインを示す：４０ ｋＤａのＮ末端ドメイン及び３７ｋＤａのＣ末端ドメイン。後者のドメインは、アロステリック調節因子Ｓ−アデノシルメチオニンの結合ドメインを含む。
【０００３】
常染色体の劣性異常であるＭＴＨＦＲの遺伝的欠損は、最も一般的な葉酸代謝の先天的欠陥である。メチルテトラヒドロ葉酸塩の生産単位は、メチオニンの正常レベルに比べ低いホモシステインを上昇させる。重度のＭＴＨＦＲ欠損患者（繊維芽細胞において０〜２０％の活性）は、不定の表現型を示すことができる。発達遅延、精神遅滞、運動歩行異常、末梢神経障害、発作及び精神障害は、この群において報告されているが、少なくとも１人の重度のＭＴＨＦＲ欠損患者は無症候性である。重度の形態における病理学的変化は、ホモシステインが上昇し、並びに中枢神経系における神経伝達物質及びメチオニンレベルが減少する他の病気においても見出される管の変化を含む。ＭＴＨＦＲのより軽度の欠損（３５〜５０％の活性）を、冠動脈疾病（下を参照のこと）の患者において記述している。遺伝的異種は、細胞における多様な臨床的特徴、変動する酵素活性レベル、及び還元酵素の特異的熱不活性化プロファイルをおそらく考慮する。
【０００４】
冠動脈性心疾患（ＣＡＤ）は、カナダ人の死因の２５％を占める。心血管の危険因子（男性、家族の病歴、喫煙、高血圧、異常リポタンパク質血症及び糖尿病）は、ＣＡＤ患者と健康な対象とを識別する能力のほぼ６０〜７０％を占める。上昇した血漿ホモシステインは、心血管疾患についての他に依存しない危険因子であることも示される。
【０００５】
ホモシステインは、メチオニンの脱メチル化によって形成されたメルカプト基含有アミノ酸である。それは、通常システイン（転位硫化）に代謝され、またはメチオニンに再メチル化される。ホモシスチン尿症のために血漿中のホモシステインを最大に上昇させる代謝の先天性異常（重度のＭＴＨＦＲ欠損における場合）は、未熟な管疾患及び全身に広がっている動脈と静脈の血栓症に関連している。血漿のホモシステインのより程度の軽い上昇（軽度のＭＴＨＦＲ欠損における場合）は、末梢性管疾患、脳血管疾患、及び未熟ＣＡＤに関連する。
【０００６】
ホモシステインのメチオニンへの再メチル化は、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）の作用によって、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸塩から生成された、葉酸中間体の５−メチルテトラヒドロ葉酸を必要とする。ＭＴＨＦＲ欠損は、ホモシステインをメチオニンに代謝できなくなり；上昇した血漿ホモシステインと減少したメチオニンは代謝ブロックの結果である。上記の重度のＭＴＨＦＲ欠損（対照活性の２０％より少ない）は、神経病学的徴候（精神遅滞、末梢神経障害、発作など）及びアテローム性動脈硬化症の変遷と血栓塞栓症に関連する。酵素が熱不安定型のＭＴＨＦＲのより軽度の欠損（対照活性の３５〜５０％）は、明らかな神経病学的異常のない心血管疾患の患者に見られる。
【０００７】
検査された冠静脈疾患を有する２１２人の患者の調査において、ＭＴＨＦＲの熱不安定型は、ＣＡＤ群の１７％と対照の５％において見出された。冠状欠陥造影を受けた３３９人の対照についてのこの後の報告において、熱不安定性ＭＴＨＦＲと冠動脈狭窄症の程度との相関関係が見出された。さらに、在来の危険因子（年齢、性別、喫煙、高血圧など）が、熱不安定性ＭＴＨＦＲにはっきりとは関連しない。酵素の熱不安定性を測定するために熱処理する前と後の活性測定に関する、リンパ球におけるＭＴＨＦＲの酵素学的アッセイ法によって、ＭＴＨＦＲに関するあらゆる研究のすべてが行われた。
【０００８】
ＭＴＨＦＲ反応の生成物である５−メチルテトラヒドロ葉酸塩は循環型葉酸塩の初期の形態であるため、ＭＴＨＦＲの欠損は他種の異常を導く。例えば、女性への近概念の葉酸投与は、彼女らの子孫において神経管欠損の発生と再発を減らす。神経管欠損は、神経管閉塞という機能不全のために生じる発達形成異常（髄膜脊髄ヘルニア、無能症、及び脳ヘルニア）の１つの群である。血漿ホモシステインの上昇したレベルは、神経管欠損のある子供の母親に関して報告されている。上昇した血漿ホモシステインは、心血管疾患に関する上記のように、ＭＴＨＦＲ欠損が原因となりうる。
【０００９】
神経芽腫は、神経冠細胞由来の腫瘍である。これらの腫瘍には、ＭＴＨＦＲがマッピングされたゲノム領域であるヒト染色体領域１ｐ３６に欠失があると報告されているものが多い。ＭＴＨＦＲ欠損／変異はこの種の腫瘍の形成の原因、または一因となる可能性がある。高レベルの食事性葉酸は、結腸直腸癌の危険性と逆に関連することが示されるため、ＭＴＨＦＲ異常は、結腸直腸腫瘍のような他の種類の腫瘍の形成の一因にもなる。
【００１０】
ＭＴＨＦＲ活性は、メチオニンへのホモシステインのメチル化に必要とされる。メチオニンは、ＤＮＡ、タンパク質、脂質、神経伝達物質などのメチル化のための最初のメチル基のドナーであるＳ−アデノシルメチオニンの形成に必要である。ＭＴＨＦＲ異常は、メチオニンとＳ−アデノシルメチオニンのレベルをより低くし、並びにホモシステインを上昇させる可能性がある。メチル化過程の崩壊は、新生組織形成、発達異常、神経病障害などの幅広い様々な病気の原因となる。
【００１１】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） のＭＴＨＦＲ遺伝子（ｍｅｔＦ）は、単離、配列決定されているが、高等生物における酵素の分子レベルでの研究は、真核生物のｃＤＮＡの有用性がない場合には制限されている。
【００１２】
ヒトのメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）のためのｃＤＮＡプローブを提供されることが非常に望ましいと考えられる。このプローブは、心血管疾患患者と神経病学的徴候または腫瘍を有する患者を含む、重度のまたは軽度のＭＴＨＦＲ欠損を有する個体における配列異常の同定のために使用されると考えられる。プローブは、遺伝子治療、遺伝子の単離、及びＭＴＨＦＲタンパク質を生成するための発現研究においても用いられる。プローブはまた、ヒトＭＴＨＦＲタンパク質のアミノ酸配列を提供し、このタンパク質は、生化学的または薬理学的アプローチによってＭＴＨＦＲ欠損の治療に有用であると考えられる。
【００１３】
メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素欠損変異の分子レベルでの説明を提供されることが非常に望まれると考えられる。
【００１４】
ＭＴＨＦＲにおいて配列異常を持つ患者は、様々な薬剤に対する様々な反応する可能性があるが、葉酸代謝に作用する薬剤に限定されないと考えられる。これにより、これらの変異が適当な治療を決定する前に示される場合には、それは、知るために有用であると考えられる。これが関連する薬剤／疾病は、癌の化学療法薬剤、抗生物質、抗癲癇性薬物療法、抗関節炎薬物療法などを含む。
【００１５】
発明の概要
本発明の目的の１つは、ヒトメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）のｃＤＮＡプローブを提供することである。
【００１６】
本発明のもう１つの目的は、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素欠損変異の分子レベルでの説明を提供することである。
【００１７】
本発明の別の目的は、ヒトメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素の核酸配列とアミノ酸配列を提供することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素欠損を持つ個体に対する可能性のある治療を提供することである。
【００１９】
本発明の別の目的は、インビトロにおいてＭＴＨＦＲタンパク質合成系を提供することである。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、ＭＴＨＦＲ遺伝子の配列変化の同定のための技術／プロトコールを提供することである。
【００２１】
本発明の１つの局面に従って、配列番号：１に示される塩基配列によってコードされる、または配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有する、ヒトメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）遺伝子のためのｃＤＮＡプローブが提供される。プローブは、ＭＴＨＦＲ塩基配列にハイブリダイズする塩基配列、またはＭＴＨＦＲアミノ酸配列にハイブリダイズするアミノ酸配列を含む。
【００２２】
本発明の別の局面に従って、ＭＴＨＦＲ欠損患者におけるメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）欠損の診断方法が提供される。方法は、患者から得られたＤＮＡ試料を増幅するか、または患者から得られたＲＮＡ試料を逆転写する段階、および増幅したＤＮＡを解析し、配列番号：１に示される塩基配列によってコードされるか、または配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するヒトＭＴＨＦＲに関するＭＴＨＦＲ欠損を示す少なくとも１つの配列異常を決定する段階を含む。
【００２３】
配列異常は、１６７Ｇ／Ａ、４８２Ｇ／Ａ、５５９Ｃ／Ｔ、６７７Ｃ／Ｔ、６９２Ｃ／Ｔ、７６４Ｃ／Ｔ、７９２＋１Ｇ／Ａ、９８５Ｃ／Ｔ、１０１５Ｃ／Ｔ、１０８１Ｃ／Ｔ、１２９８Ａ／Ｃ、及び１３１７Ｔ／Ｃからなる群より選択される変異を含む可能性がある。
【００２４】
選択される変異は６７７Ｃ／Ｔを含んでもよい。
【００２５】
ＭＴＨＦＲ欠損は、心血管障害、癌、骨粗鬆症、患者の子孫における神経管欠損が発生する危険性の増加、 神経病学的な障害、葉酸代謝によって影響を受ける障害、代謝性または内分泌疾患、先天性代謝異常、炎症、免疫障害、精神病、腫瘍性疾患及び他の関連疾患、ならびに腎疾患からなる群より選択される疾患、障害、または機能不全に関連されうる。
【００２６】
癌は、神経芽腫と結腸直腸癌腫からなる群より選択されうる。
【００２７】
障害は、骨粗鬆症を含んでもよい。
【００２８】
本発明のさらに別の局面に従って、 患者のメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）欠損の遺伝子治療法が提供される。本方法は、適当なプロモーターの制御下で、配列番号：１に示される塩基配列によってコードされる、または配列番号：２に示されるアミノ酸配列を持つＭＴＨＦＲの発現用組換えベクターを作製する段階、及びＭＴＨＦＲの発現用ベクターを患者にトランスフェクトする段階を含む。
【００２９】
本発明のさらに別の局面に従って、配列番号：１に示される塩基配列によってコードされる、または配列番号：２に示されるアミノ酸配列を持つヒトメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）タンパク質が提供される。
【００３０】
本発明のさらに別の局面に従って、配列番号：１に示される塩基配列によってコードされる、または配列番号：２に示されるアミノ酸配列を持つ組換えヒトメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）タンパク質が提供される。
【００３１】
本発明のさらに別の局面に従って、そのようなＭＴＨＦＲタンパク質の投与を含む患者のＭＴＨＦＲ欠損治療方法が提供される。
【００３２】
ＭＴＨＦＲ欠損は、癌に関連されうる。
【００３３】
癌は、神経芽腫と結腸直腸癌腫からなる群より選択されうる。
【００３４】
本発明のさらに別の局面に従って、患者の子孫における神経管欠損発生の予防方法が提供される。本方法は、そのようなＭＴＨＦＲタンパク質を患者に投与することを含む。
【００３５】
本発明のさらに別の局面に従って、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）欠損患者の薬物感受性、薬物反応または薬物毒性の測定方法が提供される。本方法は、患者から得られるＤＮＡ試料を増幅するか、または患者から得られるＲＮＡ試料を逆転写し、該ＤＮＡを増幅する段階、増幅したＤＮＡを解析し、配列番号：１に示される塩基配列によってコードされる、または配列番号：２に示されるアミノ酸配列を持つＭＴＨＦＲ配列における配列異常を決定する段階、及び患者に薬物を投与して、患者の薬物に対する感受性、反応、または毒性に関連する配列異常を決定する段階を含む。更に、ヒトの治療的方法において、薬物動態学および薬力学の両方が、葉酸代謝により影響を受け得る。薬物動態学は、吸収、分布、代謝および排泄などの要因を含むが、これらに限定されるものではない。別の考察は、安全性および毒性である。治療毒性の例は、血液悪液質、皮膚毒性、全身毒性、ＣＮＳ毒性、肝毒性、心臓血管系毒性、肺毒性、および腎毒性を含むが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
配列異常は、１６７Ｇ／Ａ、４８２Ｇ／Ａ、５５９Ｃ／Ｔ、６７７Ｃ／Ｔ、６９２Ｃ／Ｔ、７６４Ｃ／Ｔ、７９２＋１Ｇ／Ａ、９８５Ｃ／Ｔ、１０１５Ｃ／Ｔ、１０８１Ｃ／Ｔ、１２９８Ａ／Ｃ、及び１３１７Ｔ／Ｃからなる群より選択される変異を含んでいてもよく、薬物は癌の化学療法薬、抗生物質、抗癇癪薬、抗関節炎薬、及び抗炎症薬からなる群より選択されてもよい。化学療法剤の例は、アルキル化剤（ナイトロジェンマスタード、エチレンイミンおよびメチルメラミン、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、トリアゼン）、代謝阻害剤（葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体および関連阻害剤）、および天然の産物（ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、抗生物質、酵素、生体反応修飾剤）を含む。抗炎症薬の例は、非ステロイド性抗炎症薬、ステロイド、抗ヒスタミン性作用薬、５−ＬＯ阻害剤、サイトカインアゴニスト、およびサイトカインアンタゴニストを含む。この薬物は、更にホルモンアゴニストおよびアンタゴニスト、細胞内反応修飾剤、および分泌促進物質のような、代謝性または内分泌疾患の療法を含む。他の可能性のある薬物は、抗貧血薬、抗狭心症薬、抗不整脈薬、抗高血圧薬、陽性変力薬、および抗血栓薬のような、心臓血管系疾患または障害の療法を含む。薬物は、例えば免疫変調薬、免疫抑制薬、および免疫賦活薬のような、免疫障害に対する療法も含むことができる。加えて、代謝疾患、先天性代謝異常、精神障害、腫瘍性疾患および他の関連疾患、ならびに腎疾患の治療のためのいずれか他の薬物が、本発明に関連している。
【００３７】
ＭＴＨＦＲ欠損は、心血管障害、冠動脈障害、神経病障害、子孫における神経管欠損発生の危険性の増加、癌、骨粗鬆症、及び葉酸代謝によって影響を受ける他の障害からなる群より選択される障害に関連する可能性がある。
【００３８】
本発明のさらに別の局面に従って、ＭＴＨＦＲタンパク質またはその遺伝子から作製されたｍＲＮＡの遺伝子発現を阻害する段階を含む癌患者の治療方法が提供される。
【００３９】
本発明のさらに別の局面に従って、ＭＴＨＦＲタンパク質を阻害する段階を含む癌患者の治療方法が提供される。
【００４０】
診断、治療、予後診断および薬理遺伝学のマーカーとしてのＭＴＨＦＲ対立遺伝子の使用は、精神病のような神経障害ならびに抗精神病治療薬で治療することができる他の疾患および障害にも適用することができる。特定のＭＴＨＦＲ対立遺伝子の存在を使用し、特定の療法の安全性および有効性を予測し、かつこれらの対象にとって好ましい療法を選択することができる。
【００４１】
従ってひとつの局面において、本発明は、対象の精神病の診断法を提供する。この方法は、対象から得た試料中のＭＴＨＦＲ核酸の解析、および精神病を有する対象の指標である対象における少なくとも１種のヘテロ接合型ＭＴＨＦＲ変異対立遺伝子の存在の決定に関連する。
【００４２】
関連した局面において、本発明は、対象の精神病のリスクまたは精神病の性向を決定する方法を特徴としている。この方法は、該対象から得た試料中のＭＴＨＦＲ核酸を解析する段階、および対象の精神病のリスクまたは精神病の性向の指標である対象における少なくとも１種のヘテロ接合型ＭＴＨＦＲ変異対立遺伝子の存在を決定する段階を含む。
【００４３】
別の局面において、本発明は、対象における精神病診断の方法を提供する。この方法は、対象から得た試料中のＭＴＨＦＲ核酸を解析し、ならびに６７７位のヘテロ接合型ＭＴＨＦＲ変異の存在および／または少なくとも１種の６７７位以外の位置での他のＭＴＨＦＲ変異の存在を決定することに関する。これらの変異は、精神病を有する対象の指標である。
【００４４】
本発明は更に、対象の精神病のリスクまたは精神病の性向の診断に関連した方法を提供する。この方法は、対象から得た試料中のＭＴＨＦＲ核酸を解析し、かつ６７７位のヘテロ接合型ＭＴＨＦＲ変異の存在および少なくとも１種の６７７位以外の位置での他のＭＴＨＦＲ変異の存在を決定する段階を含む。これらの変異は、対象における精神病のリスクまたは精神病の性向の指標である。
【００４５】
これらの精神病または増大した精神病のリスクの診断における使用に加え、ＭＴＨＦＲ対立遺伝子における１種または複数の変異の決定を使用し、対象を抗精神病療法の臨床試験のサブグループに分類し、対象にとって好ましい抗精神病療法を決定し、かつＭＴＨＦＲ変異が抗精神病療法に対する反応の指標であるかどうかを決定することもできる。
【００４６】
従って本発明は、抗精神病療法の臨床試験に参加した対象を層化する方法を提供する。この方法は、対象から得た試料中のＭＴＨＦＲ核酸を解析し、および臨床試験前、途中または後の、対象を臨床試験のサブグループに組入れる対象において少なくとも１種のＭＴＨＦＲ変異対立遺伝子の存在を決定することに関連している。ある好ましい態様において、抗精神病療法は、精神分裂症療法である。
【００４７】
別の局面において、本発明は、精神病に罹患した対象の療法の選択法を提供する。この方法は、対象から得た試料中のＭＴＨＦＲ核酸を解析し、およびその療法の安全性または有効性の指標となる対象における少なくとも１種のＭＴＨＦＲ変異対立遺伝子の存在を決定する段階を含む。
【００４８】
更に別の局面において、本発明は、変異体ＭＴＨＦＲ対立遺伝子が、精神病療法に対する反応の指標であるかどうかを決定する方法を特徴としている。この方法は、（ａ）精神病のリスクが増大しているかまたは精神病と診断された第一の対象または対象の組の反応が、精神病のリスクが増大しているかまたは精神病と診断された第二の対象または対象の組の反応と異なるかどうかを決定する段階；（ｂ）第一および第二の対象または対象の組から得た試料中のＭＴＨＦＲ核酸を解析する段階；ならびに、（ｃ）少なくとも１種のＭＴＨＦＲ変異対立遺伝子が、第一の対象または対象の組と第二の対象または対象の組との間で異なるかどうかを決定する段階を含む。このＭＴＨＦＲ変異対立遺伝子が、療法に対する反応と相関しているならば、この変異対立遺伝子は、療法の安全性または有効性の指標である。
【００４９】
本発明は更に、対象において精神病を予防、遅延または治療する方法を提供する。この方法は、（ａ）対象から得た試料中のＭＴＨＦＲ核酸を解析する段階；（ｂ）少なくとも１種の抗精神病療法の安全性または有効性を予測する対象中の少なくとも１種のＭＴＨＦＲ変異対立遺伝子の存在を決定する段階；（ｃ）対象について好ましい療法を決定する段階；ならびに、（ｄ）好ましい療法をその対象に投与する段階を含む。
【００５０】
別の局面において、本発明は、特定のＭＴＨＦＲ対立遺伝子の少なくとも１種のコピーを有する対象において鑑別作用を有する化合物、および薬学的に許容できる担体、賦形剤または希釈剤を含有する薬学的組成物を提供する。この化合物は、特定のＭＴＨＦＲ対立遺伝子を有する対象を治療するのに優先的に効果がある。好ましい態様において、この組成物は、単位剤形、追加の活性成分の存在、化合物の安定化成分との複合、または該化合物の送達を増強または排泄を遅延する成分の封入に基づいて優先的に効果があるように適合される。別の好ましい態様において、化合物は、少なくとも１種の特定のＭＴＨＦＲ対立遺伝子を有する対象に対して、または少なくとも１種の特定のＭＴＨＦＲ対立遺伝子のコピーを有さない対象において有害であるが、両者においてそうではない。更に別の好ましい態様において、この対象は、筋萎縮性側索硬化症、不安症、痴呆、鬱病、癲癇、ハンチントン病、片頭痛、脱髄疾患、多発性硬化症、疼痛、パーキンソン病、精神分裂症、精神病および脳卒中からなる群より選択される疾患または状態に罹患している。別の更に好ましい態様において、この薬学的組成物は、少なくとも１種の特定のＭＴＨＦＲ対立遺伝子の存在または非存在を決定する診断試験の使用について規制当局の制限または推奨の下にある。別の好ましい態様において、この薬学的組成物は、少なくとも１種の特定のＭＴＨＦＲ対立遺伝子を有する対象に対する該薬学的組成物の使用の制限または制限の推奨について規制当局の制限または推奨の下にある。更に別の好ましい態様において、この薬学的組成物が、少なくとも１種の特定のＭＴＨＦＲ対立遺伝子を有する対象においてはこの薬学的組成物を使用しないことを指示するような規制当局の制限または推奨の下にある。
【００５１】
更に別の好ましい態様において、この薬学的組成物は包装され、かつこの包装は、少なくとも１種の特定のＭＴＨＦＲ対立遺伝子を有する対象への薬学的組成物の使用を制限するまたは制限を推奨するラベルまたは添付文書を含んでいる。更に別の態様において、この薬学的組成物は包装され、かつこの包装は、対象における少なくとも１種の特定のＭＴＨＦＲ対立遺伝子の存在または非存在を決定する試験の使用を要求するまたは推奨するラベルまたは添付文書を含んでいる。好ましくは、この化合物は、精神分裂症療法であるような抗精神病療法である。
【００５２】
本発明の各々の局面の好ましい態様において、変異体ＭＴＨＦＲ対立遺伝子は、低下した活性または低下した熱安定性を伴うＭＴＨＦＲタンパク質をコードしている。更に、ＭＴＨＦＲタンパク質は、減少した半減期を有し得ることが考えられている。好ましくは、ＭＴＨＦＲ変異は、ミスセンス変異である。好ましいＭＴＨＦＲ変異は、１６７位のＧ／Ａ変異、４８２位のＧ／Ａ変異、５５９位のＣ／Ｔ変異、６７７位のＣ／Ｔ変異、６９２位のＣ／Ｔ変異、７６４位のＣ／Ｔ変異、７９２＋１位のＧ／Ａ変異、９８５位のＣ／Ｔ変異、１０１５位のＣ／Ｔ変異、１０８１位のＣ／Ｔ変異、１２９８位のＡ／Ｃ変異、および１３１７位のＴ／Ｃ変異を含む。更にこれらの位置での変異は、他のヌクレオチドへの変化を含むことも考えられている。別の好ましい態様において、対象は、少なくとも２種のＭＴＨＦＲ変異対立遺伝子を含む。好ましくは、２種またはそれ以上の変異体ＭＴＨＦＲ対立遺伝子は、以下の少なくとも１種を含む：１６７位のＧ／Ａ変異、４８２位のＧ／Ａ変異、５５９位のＣ／Ｔ変異、６７７位のＣ／Ｔ変異、６９２位のＣ／Ｔ変異、７６４位のＣ／Ｔ変異、７９２＋１位のＧ／Ａ変異、９８５位のＣ／Ｔ変異、１０１５位のＣ／Ｔ変異、１０８１位のＣ／Ｔ変異、１２９８位のＡ／Ｃ変異、または１３１７位のＴ／Ｃ変異。更に別の好ましい態様において、ＭＴＨＦＲ変異は、コードタンパク質の２２６位のアミノ酸において、野生型ＭＴＨＦＲで見られるアラニンから、バリンまたはバリン以外の残基を含むいずれか他のアミノ酸への変化を生じる。更に別の好ましい態様において、この変異は、コードタンパク質の４３３位のアミノ酸において、グルタミン酸から、アラニンまたはアラニン以外の残基を含むいずれか他のアミノ酸への変化を生じる。２種の変異が異なるヌクレオチド位置に存在する場合、これらの変異は、同じまたは異なるＭＴＨＦＲ対立遺伝子であることができる。ＭＴＨＦＲ変異は、挿入、欠失またはフレームシフト変異であることができるが、これらに限定されるものではない。
【００５３】
診断または治療される精神病は、精神分裂症であることが好ましい。精神病は、躁鬱病、精神病的特徴を伴う鬱病、器質性精神病障害、アルコールまたは薬物中毒による精神病、感染症後精神病、産褥後精神病、老人性精神病、外傷性精神病、躁鬱病性精神病、毒物による精神病、および急性特発性精神疾患のようないずれか他の精神病であることもできる。
【００５４】
診断、治療、予後判定および薬理遺伝学のマーカーとしてのＭＴＨＦＲ対立遺伝子の使用は、他の神経障害に適用することもできる。神経障害の例は、気分障害、神経変性疾患、認知障害、癲癇のような発作障害、片頭痛のような頭痛、中枢神経系に関連した疼痛、脱髄疾患、痙直、神経管欠損、神経線維腫症、および血栓性および出血性脳卒中のような虚血性脳血管疾患を含むが、これらに限定されるものではない。気分障害は、単極性鬱病、双極性鬱病および不安症のような状態を含むが、これ以外を除外しない。神経変性疾患の例は、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、後天性または症候性パーキンソン症候群、ハンチントン病、および遺伝性変性疾患がある。認知障害の例は、痴呆、アルツハイマー型痴呆、血管性痴呆、多発脳梗塞性痴呆および外傷後痴呆がある。脱髄疾患は、下記のような疾患からなる：多発性硬化症（ＭＳ）、ＭＳのマールブルグおよびバーロ型、視神経脊髄炎、脳炎の既応、急性播種性脳脊髄炎、および急性壊死性（ｎｅｃｏｔｉｚｉｎｇ）出血性脳炎。
【００５５】
本発明の方法は、抗精神病薬が使用される非精神医学的状態に適用することもできる。これらの状態の例は、悪心、吐気、ハンチントン病およびトゥーレット症候群のような神経変性疾患に関連した運動障害、掻痒、および慢性しゃっくりである。心臓血管系障害、癌、腫瘍性疾患および他の関連疾患、骨粗鬆症、神経管欠損、神経系障害、葉酸代謝により影響された障害、代謝性または内分泌疾患、先天性代謝異常、炎症、免疫疾患、精神医学的疾患、および腎疾患も、これらの方法に関連している。
【００５６】
本発明の方法は、いずれか他の疾患または障害に適応することができることも理解されるべきである。他の疾患または障害の例には、ＭＴＨＦＲ活性、ホモシステインレベル、メチオニンレベル、Ｓ−アデノシルメチオニン活性、またはメチル化の増加または減少により間接的または直接的に影響されたものが含まれる。
【００５７】
本発明の方法に関連した療法は、前述の疾患および障害のために臨床的に使用される療法および前臨床または臨床で開発された療法の全てを含む。好ましい療法は、データベース、例えばＬｉｆｅ Ｃｙｃｌｅ、Ｒ＆Ｄ Ｆｏｃｕｓ、ＩＭＳ Ｗｏｒｌｄ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｌｏｎｄｏｎ ＵＫ、または開発中および／もしくはＦＤＡ認可されたいずれか他の療法データベースに列記された療法を含む。好ましい抗精神病療法は、従来型の神経遮断薬、例えばフェノチアジン（例えばクロロプロマジン）、チオキサンテン（例えばチオチキセン）、ブチロフェノン（例えばハロペリドール、最も有用な従来型の抗精神病薬のひとつ）、ジベンズオキサゼピン、ジベンゾジアゼピン、ジフェニルブチルピペリジン、および他のヘテロ環式化合物を含む。好ましい非定型神経遮断薬は、クロザリル、リスペリドン、オランザピン、クエチアピン、ジプラシドン、アミスルプリド、セルチンドール、およびイロペリドンなどの化合物を含む。加えて例えばロキサピンなどの抗精神病療法は、従来型神経遮断薬と非定型神経遮断薬の間に薬学的中間体を有することがある。好ましい態様において、神経疾患の治療または予防は、ドパミン、ヒスタミン、ムスカリン様コリン作用性、α−アドレナリン作用性、またはセロトニンの受容体などに結合する１種または複数の治療活性のある化合物の投与を含む。
【００５８】
他の抗精神病薬として使用することができる薬学的に活性のある化合物の例は、合成の有機分子、天然の有機分子、核酸分子、生合成タンパク質またはペプチド、天然のペプチドまたはタンパク質、および修飾された天然のペプチドまたはタンパク質を含む。好ましい態様において、好ましい療法は、他の臨床的に使用される用法と、または治療薬の併用投与と比較して、変更された用法からなる。更に好ましい療法は、外科的手技、電気ショック療法、または心理療法などの他の医学的処置からなることも考えられている。心理療法の例は、動的心理療法、認知−行動療法、対人療法、行動療法、集団心理療法、および家族療法を含む。対象への治療的活性のある化合物の投与について、あらゆる投与様式または用法を使用することができる。いずれか特定の対象について、具体的用法を個人の必要性および本組成物投与について投与するかまたは指図する専門家の判断に従い時間をかけて調整されなければならないことは理解されるべきである。
【００５９】
臨床的に使用された療法の説明（例えば精神病について）およびそれらの使用の指針は、「医師用卓上参考書（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）（ＰＤＲ）」などの一般的参考文献において容易に入手できる。加えて治療薬は、「グッドマンギルマン薬理書（Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」（ＨａｒｄｍａｎおよびＬｉｍｂｉｒｄ（編）、第９版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、ニューヨーク、１９９６）などの医学、薬剤学、および薬理学の雑誌および教科書に説明されかつ列記されている。特定の適応、疾患または障害に関する臨床試験においてＦＤＡが認可した治療薬および療法に関する追加情報は、定期購読により入手できる電子データベースおよび製薬会社の情報において容易に見つけることができる。
【００６０】
「好ましい療法」とは、有効、安全であり、および／もしくは疾患または障害の別の療法に比べ低下した毒性を有する、疾患、障害、または機能不全の療法を意味する。１種または複数のＭＴＨＦＲ対立遺伝子における１種または複数の変異に基づいて選択された好ましい療法は、ＭＴＨＦＲ変異を有する対象の少なくとも２０、３０、５０、７０、または９０％において効果があることが好ましい。「効果がある」とは、疾患、障害もしくは機能不全に罹患した対象における症状の除去、軽減もしくは安定化が、疾患、障害もしくは機能不全のリスクのある対象における症状の発症を予防すること、または対応する同じＭＴＨＦＲ変異を持つ未処置の対象の平均発症年齢と比較し、この対象における症状が結果としてより遅い年齢で発症されることを意味する。精神病治療のための療法の効果は、常法を用い、臨床全般改善度（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｌｏｂａｌ Ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＣＧＩ）、遺伝研究のための精神科診断面接（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｖｉｅｗ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｕｄｉｅｓ）（ＤＩＧＳ）、社会評価スコア（Ｇｌｏｂａｌ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｓｃｏｒｅ）（ＧＡＳ）、または簡易精神症状評価尺度（Ｂｒｉｅｆ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ｒａｔｉｎｇ Ｓｃａｌｅ）（ＢＰＲＳ）に基づいて評価される。合計ＢＰＲＳスコアは、好ましくは５、より好ましくは１０、および最も好ましくは１５ポイント低い。「低下した毒性」とは、有害な薬理学的または生理学的作用が低レベルであることを意味する。好ましくは、この療法は、ＭＴＨＦＲ変異を有する対象において、１種または複数のＭＴＨＬＦＲ変異を有さない対象よりも、５、１０、２０、３０、または５０％少ない臨床的に許容できない副作用を生じる。
【００６１】
「多型」とは、一般的な集団の１％またはそれ以上の対立遺伝子について存在する変異または対立遺伝子の変動を意味するものである。多型は、疾患を持つ患者において存在するが、一般的な集団において存在しない場合、病気の原因となる。しかし、疾患を持つ患者と一般的な集団のどちらにおいても存在する多型は、必ずしも良性ではない。良性の多型と異なる場合の病因となる置換の定義は、以下の３つの因子に基づく：（１）少なくとも５０個の独立した対照染色体において変化がないこと；（２）進化的意義を証明する細菌の酵素のアミノ酸が存在すること及び（３）保存されていないアミノ酸の変化。置換したものの発現には、それらが良性ではないということを正式に証明することが必要とされるが、上記の特徴により、本明細書に記載の変化が活性に影響を与える可能性がある。
【００６２】
発明の詳細な説明
ブタＭＴＨＦＲ由来のペプチドの配列決定
均質な天然のブタＭＴＨＦＲはトリプシンで分解され、４０ｋＤａのＮ末断片と３１ｋＤａのＣ末断片を生じ、３１ｋＤａの断片は３７ｋＤａの断片のタンパク質分解産物である。断片は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離、電解溶出され、かつ変性した断片はリシルエンドペプチダーゼ（ＬｙｓＣ）で分解された。生じたペプチドは逆相ＨＰＬＣによって分離され、エドマン分解によって配列解析された（詳細は、Ｇｏｙｅｔｔｅ Ｐら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９４、７：１９５−２００に含まれる）。
【００６３】
ｃＤＮＡの単離と配列決定
２つの変性オリゴヌクレオチドは、３０アミノ酸のブタＭＴＨＦＲペプチドの配列（図２の最初の下線のペプチド）に基づいて合成された。これらは９０ｂｐのＰＣＲ産物を作製するために使用されたが、これらは、予測ペプチドをコードし、５００ｎｇのブタ肝臓ポリＡ＋ＲＮＡの逆転写ＰＣＲ反応由来のものである。その後、ブタ特異的（非変性、アンチセンス）ＰＣＲプライマーをこの短いｃＤＮＡ配列から合成した。このプライマーとファージのアームのためのプライマーを用いて、ヒト肝臓λｇｔ１０ ｃＤＮＡ ライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）をＰＣＲによってスクリーニングした。この技術には、５分間煮沸され、その後これらの２つのプライマーを用いたＰＣＲ反応において直接使用されたファージの溶解物ストック（５０，０００ ｐｆｕ）の作製が含まれた。次に、ＰＣＲ断片は直接配列決定され（Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎｇ（登録商標）キット、ＧＩＢＣＯ社）、および陽性クローンは、推定アミノ酸配列とブタペプチドの配列との比較によって同定された（種間変化を考慮して）。それから、陽性ストックをより低い濃度で再び培養し、かつ完全に単離されたプラークが同定するまで、プラークハイブリダイゼーションによって放射同位元素標識された陽性ＰＣＲ産物を用いてスクリーニングした。ファージＤＮＡは精製され、その後、挿入断片をｐＢＳ＋（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）へサブクローニングし、両鎖を配列決定した（Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（登録商標）キット、ＧＩＢＣＯ社とＳｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）。ヒトｃＤＮＡの推定アミノ酸配列を、ブタペプチド配列、大腸菌（ｅｃｏｍｅｔｆ、アクセッション番号ＶＯ１５０２）及びネズミチフス菌（Ｓ． Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（ｓｔｙｍｅｔＦ、アクセッション番号ＸＯ７６８９）由来のｍｅｔＦ遺伝子に対してアライメントし、かつ除去修復遺伝子であるｙｓＲＡＤ１（アクセッション番号ＫＯ２０７０）について異なって転写され、以前は未同定であったサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のオープンリーディングフレームに対して整列化した。ＧＣＧコンピューターパッケージにおいてＢｅｓｔＦｉｔ（登録商標）を用いて最初にアライメントし、これらのアライメントを手作業で調整し、相同性を最大にした。
【００６４】
要約すると、変性オリゴヌクレオチドプライマーを、酵素のＮ末端領域のブタペプチドの３０アミノ酸部分に対応する配列を増幅するために設計した（図２の最初のブタのペプチド）。９０ｂｐのブタｃＤＮＡ断片は、ブタ肝臓ＲＮＡの逆転写／ＰＣＲから得られた。ＰＣＲ断片の配列決定は、予測アミノ酸配列とブタペプチド配列との比較によりその同一性を確認した。非変性オリゴヌクレオチドプライマーは、ブタｃＤＮＡの中の配列に基づき、これらのプライマーをファージのアーム用のプライマーとともに用いて、ＰＣＲ によってヒト肝臓 λｇｔ１０ ｃＤＮＡ ライブラリーをスクリーニングした。陽性クローンの挿入断片を単離し、配列決定した。配列は、連続したオープンリーディングフレームを含む１２６６ｂｐからなる。
【００６５】
他種におけるＭＴＨＦＲについての相同性
ヒトｃＤＮＡの予測アミノ酸配列を、大腸菌およびネズミチフス菌のｍｅｔＦ遺伝子、並びに以前は未同定であったサッカロマイセス・セレビシエの除去修復後の遺伝子であるｙｓＲＡＤ１についての互いに異なって転写されるＯＲＦとアライメントした（図２）。５つのブタのペプチドに相同な配列に、図２において下線を引いた。３つの区分（６１〜９４番目の残基、２１９〜２４０番目の残基、及び３３７〜３５１番目の残基）は、ブタ肝臓酵素のＮ末端の４０ｋＤａのドメイン内のペプチド配列に相応する。３７４〜３９３番目の残基は、酵素を（３Ｈ−メチル）ＡｄｏＭｅｔ存在下でＵＶ光で照射した場合、標識されるブタ肝臓酵素のＣ末端ドメインのＬｙｓＣペプチドの上流部分に相応し；ＡｄｏｍＭｅｔ標識検査から予測した場合、このペプチドは３７ｋＤａのドメインの一端（Ｎ末端）に位置する。５番目の相同領域（３５９〜３７２番目の残基）もまた同定されたが、天然のタンパク質内のブタペプチドの局在は、これまで決定されていなかった。
【００６６】
メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）は、アミノ酸代謝関連酵素で、十分なメチオニンプールを維持するために、並びにホモシステイン濃度が毒性のあるレベルに到達していないことを確認するために重要である。大腸菌からホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）までの高い配列保存性は、これらの種においてＭＴＨＦＲの重要性を証明する。大腸菌酵素（ｍｅｔＦ遺伝子座によってコードされる）は、還元型ＦＡＤに結合する３３ｋＤＡのペプチドであり、メチレンテトラヒドロ葉酸塩からメチルテトラヒドロ葉酸塩への還元を触媒する。ｍｅｔＦ酵素は、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨがそれを還元できず、その活性がＳ−アデノシルメチオニンによってアロステリックに調節されないという点で、哺乳類の酵素とは異なる。天然のブタ酵素は、Ｎ末端の４０ｋＤａドメインとＣ末端の３７ｋＤａドメイン間でトリプシン切断されやすく、この切断でアデノシルメチオニンによるアロステリックに調節されなくなるが、触媒活性がなくなることはない。細菌と哺乳類の酵素は、Ｎ末端ドメイン内において相同性があるので、この領域は、葉酸基質に結合し、その還元を触媒するために必要なフラビン結合部位と残基を含む必要がある。ヒト酵素のドメイン構造は解明されていないが、ヒト酵素は、１５０ ｋＤａの分子量を持っていると報告されており、７７ｋＤａのホモダイマーであると考えられる。
【００６７】
２つのドメイン間の予測切断部位は、ヒト配列の３５１番目の残基と３７４番目の残基の間にあり、ブタ酵素の単離されたドメインから得られたペプチドの局在に基づく。この領域は、高い電荷のＫＲＲＥＥＤ配列を含み、予測ヒト配列における任意の領域の親和性であり、かつ表面にある可能性が最も高いと予測された。
【００６８】
ブタタンパク質のＮ末端を配列決定し、タンパク質のこの部分をコードする領域はヒトｃＤＮＡから欠失している。推定切断部位（ＫＲＲＥＥＤ）の上流の予測配列の推定分子量は４０ ｋＤａであり、ブタのＮ末端ドメインの測定分子量もまた４０ ｋＤａであるので、このｃＤＮＡがＮ末端にある数残基だけが欠失していると推測されている。細菌、酵母及びヒトの配列をアライメントする場合、予測ヒト配列は、Ｎ末端の４０アミノ酸の付加部分を含み；この付加部分にはＮＡＤＰＨ結合決定因子が含まれると考えられる。多くのピリジンヌクレオチド依存性酸化還元酵素は、タンパク質のＮ末端にこのような決定因子を含む。
【００６９】
ヒト配列のＣ末端は、タンパク質がトリチウム化されたＡｄｏＭｅｔ存在下で紫外線光で照射される場合に標識されるペプチドを含む。本明細書で報告されるｃＤＮＡ配列は、このドメインの３７ ｋＤａの推定分子量のうち約７ ｋＤａのみを含み、このｃＤＮＡが同様に３’末端においても先端が切断されていることを示す。Ｃ末端のブタドメインからの多くのペプチドもまた検出されている。予測されうるように、原核生物の酵素がＡｄｏＭｅｔによってアロステリックに調節されることが明白ではないことが示されたので、このｃＤＮＡにおけるＣ末端領域と原核生物のｍｅｔＦ配列間の有意な相同性はない。図２に示されるアライメントは、相同性配列がヒト酵素の推定切断部位の直前で終わっていることを示す。
【００７０】
染色体上の割り当て
ヒト染色体の有糸分裂中期のインサイチューハイブリダイゼーションは、ヒト遺伝子の局在化のために使用された。２００個の銀粒子の分布解析により、１ｐ３６．３の上方に観察される、大部分の粒子である２５グレーンを持つ第１染色体（ｐ＜０．０００１）のｐ３６．３からｐ３６．２までの領域において、４０グレーンの粒子の重要なクラスターが明らかになった。
【００７１】
ヒトｃＤＮＡの単離により、本発明者らは染色体の１ｐ３６．３に対して遺伝子を局在化させることができる。バックグラウンドがほとんどないその染色体上の１つの強いシグナルの観察は、偽遺伝子ではないだた１つの遺伝子座を強く示唆する。このｃＤＮＡはコード配列のおよそ半分をコードしているので、ヒトＤＮＡのサザンブロットは、およそ１０ ｋｂの断片が示され、遺伝子の平均の大きさが推定された。
【００７２】
発現解析用の付加的なｃＤＮＡ配列および構築物
ヒト結腸癌腫のｃＤＮＡライブラリー（Ｎｉｃｏｌｅ Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎ博士、ＭａｃＧｉｌｌ大学より贈与）は、付加的なコード配列を得るために元々の１．３ｋｂのｃＤＮＡを用いたプラークハイブリダイゼーションによってスクリーニングされた。２．２ｋｂのｃＤＮＡが単離され、これは、元々のｃＤＮＡに重複する１．３ｋｂの配列と３’端において付加的な９００ｂｐを含んでいた（図６）。アミノ酸配列は、元々のｃＤＮＡにおいてはＧＬＹコドンであった、１７７番目のコドン（ＡＳＰ）を除いた重複するセグメント（１〜４１５番目のコドン） についての元々のｃＤＮＡのアミノ酸配列と同一である。５０個の対照染色体の解析は、この位置においてＡＳＰコドンを示した。ｃＤＮＡは、１９８０ｂｐのオープンリーディングフレーム、１００ｂｐの３’ ＵＴＲ、及びポリＡ尾部を含む。
【００７３】
配列決定は、全ｃＤＮＡについての両鎖において行われた。追加的な５’配列（８００ｂｐ）は、ヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）から得られたが、これらの配列は追加的なコード配列を含まず、その後、ＰＣＲを元にした突然変異生成のため（下記のような）だけに用いられ、発現解析用には用いられなかった。２つのｃＤＮＡｓ（２．２ ｋｂと８００ ｂｐ）は、１９９番目の塩基対にあるＥｃｏＲＩ部位を用いて連結され、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に挿入された。２．２ ｋｂのｃＤＮＡは、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）とｐＴｒｃ９９Ａの両ベクターのポリリンカー領域における１１番目の塩基対にあるＮｃｏＩ部位とＸｂａＩ部位を用いて発現ベクター ｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）へサブクローニングした。クローニングサイトにわたって配列決定を行い、野生型構築物を確認した。
【００７４】
変異同定における発明の使用
Ｉ．重度のＭＴＨＦＲ欠損における最初の２つの変異の同定
ＭＴＨＦＲ欠損患者由来の皮膚の繊維芽細胞の全ＲＮＡを、一本鎖構造多型（ＳＳＣＰ）法（Ｏｒｉｔａ、Ｍ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１９８９、５：８８７４−８８７９）による解析のために逆転写し、ＰＣＲで増幅した。プライマーは、２５０〜３００ ｂｐの断片を生じ、両端において各々の断片に関する重複する小さな領域内に、有用なｃＤＮＡ配列を含有するように設計された。ＳＳＣＰによって同定された最初の変異は、患者１５５４において５５９番目の塩基対においてＣからＴへの置換であり；この置換により、アルギニンコドンが終結コドンへ変換した（図３Ａ）。変異によりＦｏｋＩ部位が完全に無くなったため、制限酵素分解は、この変異について変化の確認と追加的な患者のスクリーニングのために用いられ、二人目の患者（１６２７）がこのように同定された（図３Ｂ）。患者１５５４についてのＳＳＣＰパターンと両患者の制限酵素分解パターンはホモ接合型変異の状態または任意の検出可能なＲＮＡを生成しない二つ目の変異についてのナンセンス変異（無（ｎｕｌｌ）対立遺伝子）からなる遺伝的複合体と一致した。両親における調査は確認のために必要である。
【００７５】
二番目の置換（図４Ａ）は、患者１８３４において４８２番目の塩基対でのＧがＡへの変換で、アルギニン残基をグルタミン残基へ変換した。置換はＰｓｔＩ部位を作出し、この部位は置換を実証し、この変化を有する二人目の患者（１８６３）を同定するために用いられた（図４Ｂ）。ＳＳＣＰ解析と制限酵素分解パターンは両患者のヘテロ接合型の状態に一致した。図２に示されるような、この変化によって影響を受けるアルギニンコドンは、進化的に保存された残基である。コドン変化が保存的ではないということに関連して、この観察は良性の多型というよりむしろ病気を伴う変化であるということを激しく議論させる。さらに、３５人の対照（発端者と同じ人種的背景の）をＰｓｔＩ分解ＤＮＡのサザンブロットによってこの置換について試験し、全ての個体が陰性であった。
【００７６】
患者１８３４の家族を検査した。症候性の兄弟と発端者の母親はすべてこの置換を保有していることを示したが、その一方、父親は変化については陰性であった（図４Ｂ）。１８６３の家族においては、発端者の母は保有者であることが示されたが、その一方、父親と変化を受けていない兄弟は陰性であった。
【００７７】
細胞系
細胞系 １５５４は、ホピ族の男性で、生後３ヶ月でホモシステイン尿症、発病、脱水症、角膜混濁、低血圧及びカンジダ・セプシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｅｐｓｉｓ）について認められた。培養した繊維芽細胞における葉酸分布が、ペディオコッカス・セリビッシエ／ラクトバチルス・キャセイ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｒｉｖｉｓｉａｅ／Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）（ＰＣ／ＬＣ）比が０．５２であることを示した（対照 ０．１４）。測定可能なメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）活性はなかった（対照値＝９．７ ｎｍｏｌ／時間／ｍｇタンパク質と１５．１ ｎｍｏｌ／時間／ｍｇタンパク質；対照抽出物を５５℃、２０分間処理した後の残存活性＝２８％と３１％）。
【００７８】
細胞系 １６２７は、チョクトー族の男性で、生後５週間で、不十分な摂食、無呼吸、生育不十分、脱水症及びホモシステイン尿症を示した。彼は、その後上矢状洞の血栓症と水頭症であることが判明した。ＰＣ／ＬＣ比は、０．６１でＭＴＨＦＲの比活性は０．１ ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ タンパク質であった。母方の祖母と父方の祖母は「遠縁の親戚」であると考えられる。
【００７９】
細胞系 １７７９は、ホモシステイン尿症のフランス系カナダ人の男性由来で、この男性は１５歳の時に、四肢が弱くなり、筋肉運動の不協調、感覚異常及び憶え違いがあった。彼の兄弟（細胞系 １８３４）もまた、ホモシステイン尿症であるが、３７歳で無症候性である。１７７９と１８３４についてＭＴＨＦＲの比活性は、それぞれ０．７ ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ タンパク質と０．９ ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ タンパク質であり；１７７９と１８３４についての５５℃の熱処理後の残存活性は、それぞれ０．９％と０％であった。
【００８０】
細胞系 １８６３は、白人の男性由来で、この男性は進行性歩行障害、痙攣麻痺、大脳白脳変性及びホモシステイン尿症のために、２１歳の時に診断された。彼には、神経変性疾患で２１歳の時に死亡した兄弟がいた。繊維芽細胞抽出物におけるＭＴＨＦＲの比活性は、１．７６ ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ タンパク質であり、５５℃の熱処理後の残存活性は３．６％であった。
【００８１】
変異解析
プライマーを、各々の端において５０〜７５ ｂｐを重複する２５０〜３００ ｂｐの断片を作製するためにｃＤＮＡ配列から設計した。一対のプライマーを、５μｇの患者の全繊維芽細胞ＲＮＡについての逆転写ＰＣＲにおいて使用した。ＰＣＲ産物を、一本鎖検出のための直接的銀染色法を用いる非同位元素迅速ＳＳＣＰプロトコールによって解析した（ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ（登録商標）Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）。ＳＳＣＰゲルにおいてシフトしている患者由来の任意のＰＣＲ産物を、ＮｕＳｉｅｖｅ（ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社）で精製し、変化を同定するために直接配列を決定した（Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（登録商標）キット、ＧＩＢＣＯ社）。変化が制限酵素部位に影響を及ぼした場合には、その後ＰＣＲ産物は適当な制限エンドヌクレアーゼで分解され、ポリアクリルアミドゲルで解析された。対照におけるＡｒｇからＧｌｎへの変異についてスクリーニングするために、５ μｇのＰｓｔＩ分解ＤＮＡを０．８％ アガロースゲルで泳動し、一般的な手法によって放射性同位元素標識したｃＤＮＡを用いたサザンブロッティングによって解析した。
【００８２】
ＩＩ． 遺伝子型に関するメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）遺伝子座においてのの７つの付加的変異：重度のＭＴＨＦＲ欠損における表現型の相関関係
この遺伝子座における７つの付加的変異の特徴を下文に報告する：６つのミスセンス変異及びコード配列における潜在的スプライス部位を活性化する５’スプライス部位。この遺伝子座においてこれまでに同定された９つすべての変異に関する遺伝子型と表現型の関係の予備的解析もまた報告する。ホモ接合体の状態における１つのナンセンス変異と２つのミスセンス変異（プロリンからロイシンへ、及びスレオニンからメチオニンへ）は、極めて低い活性（０〜３％）と最初の一年以内の徴候の始まりに関連する。別のミスセンス変異（アルギニンからシステインへ、及びアルギニンからグルタミンへ）は、より高い酵素活性と徴候のより遅い始まりに関連する。
【００８３】
ＭＴＨＦＲ遺伝子座においての７つの付加的変異を記述し、重度のＭＴＨＦＲ欠損における遺伝子型、酵素活性及び臨床的表現型間の関連を調べた。
【００８４】
患者の説明
患者の臨床的及び実験的所見を公開された文献において報告されている。ＭＴＨＦＲの残存活性を合流において培養された繊維芽細胞中であらかじめ測定された。
【００８５】
患者 ３５４であるアフリカ系アメリカ人の少女は、１３歳の時に軽度の精神遅延であると診断された。彼女の姉妹である患者 ３５５は、１５歳の時に無食欲、震顫、幻覚及び進行性の引きこもりであると診断された。患者 ３５４については、ＭＴＨＦＲ残存活性が１９％で、彼女の姉妹である３５５については、それが対照値の１４％であった。熱処理後の残存活性は、対照酵素と同等の熱安定性を持っていた。
【００８６】
患者 １８０７である日本人の少女は、両親がいとこであり、２歳になるまでに歩行遅滞と言語遅滞があり、６歳で発病し、かつ１６歳で末梢神経障害のための歩行障害になった。ＭＴＨＦＲの残存活性は３％で、酵素は熱不安定性であった。
【００８７】
患者 ７３５であるアフリカン系インド人の少女は、生後７ヶ月で小頭症、進行性精神発達低下、無呼吸及び無感覚であると診断された。ＭＴＨＦＲの残存活性は、対照レベルの２％であった。熱特性は測定されなかった。
【００８８】
患者 １０８４であるカフカス人の男性は、生後３ヶ月で乳児繊維肉腫と診断された。彼は、筋肉が低緊張であることが判明し、無呼吸になった。彼は４ヶ月で死亡した。ＭＴＨＦＲの残存活性は検出できなかった。熱特性は測定されなかった。
【００８９】
患者 ３５６であるＭＴＨＦＲ欠損について報告された最初の患者は、イタリア系アメリカ人男性で、１６歳の時に筋肉が弱くなり、異常歩行と上肢の振り回し動作を示した。ＭＴＨＦＲの残存活性は、対照値の２０％であり、活性は５５℃で急速にかつ指数関数的に不活性化した。
【００９０】
患者 ４５８であるカフカス人の男性は、１２歳で運動失調症と最小限のスクールパフォーマンス（ｍａｒｇｉｎａｌ ｓｃｈｏｏｌ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）と診断された。ＭＴＨＦＲの残存活性はほぼ１０％で、活性は熱不安定性であった。
【００９１】
患者 １３９６であるカフカス人女性は、幼少期に不器用で全体的な学習障害をもっていると説明された。１４歳の時に、彼女は運動失調症、尖足及び歩行不能になった。彼女は、重度の静脈血栓症と両肺の塞栓になった。ＭＴＨＦＲの残存活性は１４％で、酵素は熱不安定性であった。
【００９２】
ゲノム構造とイントロンプライマー
エキソンの名称は、ゴエット（Ｇｏｙｅｔｔｅ）ら、（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９４、７：１９５−２００）において入手可能なｃＤＮＡ配列に基づいている。 第１エキソンは、１番目の塩基対から第１イントロンまでの領域として任意に設計されている。イントロンの同定は、ｃＤＮＡプライマー配列を用いたゲノムＤＮＡの増幅によって行われた。ＰＣＲ産物は、予測されたｃＤＮＡの大きさよりサイズは大きく、この産物は直接配列決定された。
【００９３】
変異検出
特定のエキソン（プライマー配列については表１を参照のこと）をゲノムＤＮＡからのＰＣＲによって増幅し、ＳＳＣＰプロトコールによって解析した。ＳＳＣＰは、以前記述されたように（Ｇｏｙｅｔｔｅ Ｐ ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９４、７：１９５−２００）Ｐｈｓｔｇｅｌ（登録商標）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、非同位体元素迅速ＳＳＣＰプロトコールを用いて、または室温において、６％アクリルアミド：１０％グリセロールゲルで泳動した３５Ｓで標識したＰＣＲ産物を用いて行われた（６ワット、一晩）。ＳＳＣＰ解析の前にＰＣＲ産物を切断するための制限エンドヌクレアーゼの使用がバンドシフトの検出を高める場合もあった。移動度が変化したＰＣＲ断片を直接配列決定した（ＧＩＢＣＯ社、Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（登録商標）キット）。配列の変化が制限エンドヌクレアーゼ部位に影響を与える場合には、その後ＰＣＲ産物を適当な酵素を用いて分解し、ＰＡＧＥによって解析した。別の方法では、対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ハイブリダイゼーションをＰＣＲで増幅したエキソンのドットブロットによって行った。
【００９４】
【表１】ＤＮＡ増幅のためのＰＣＲプライマーおよびＭＴＨＦＲの変異解析
2004502469.tif 000002
【００９５】
【表２】ＭＴＨＦＲ欠損患者の遺伝子型、酵素活性、発病年齢、および背景の概要
2004502469.tif 000003
ａ　患者 １５５４、１６２７、１７７９、１８３４及び１８６３は、ゴエット（Ｇｏｙｅｔｔｅ）ら、（１９９４）によって以前報告された。
ｂ ？＝未同定変異
ｃ 患者 １７７９及び１８３４は血縁関係がある。
ｄ 患者 ３５４と３５５は血縁関係がある。
【００９６】
（１）　５’スプライス部位変異
逆転写された全繊維芽細胞ＲＮＡ由来の６５３番目から９３９番目までの塩基対のｃＤＮＡの増幅は、姉妹である３５４と３５５において２つのバンドを示した：正常な２８７ ｂｐの対立遺伝子に加えて、小さい方のＰＣＲ断片（２３０ｂｐ） （図８Ａ）。 図８Ａは、逆転写されたＲＮＡ由来のｃＤＮＡの６５３番目から９３９番目までの塩基対の増幅産物についてのＰＡＧＥ解析である。対照は、予測された２８７ ｂｐの断片を持つが、その一方で患者 ３５４と３５５は付加的な２３０ ｂｐの断片を持つ。小さい方の断片の塩基配列決定により、１９アミノ酸を除去すると考えられる５７ｂｐのインフレームの欠失を同定した（図８Ｂ）。図８Ｂは、患者 ３５４由来のＰＣＲ産物の直接塩基配列決定したものである。５７ ｂｐの欠失は、ｃＤＮＡの７３６番目から７９２番目までの塩基対まで及んでいる。ほぼ完全な５’スプライス部位（囲んだ部分）は、５’欠失限界点において見られる。欠失していない断片中の５’欠失限界点においての配列解析は、ほぼ完全な５’スプライス部位保存配列（ＡＧ／ｇｃａｔｇｃ）を示した。この観察は、欠失した対立遺伝子を生じるための、この潜在的部位を活性化しうる本来の５’スプライス部位におけるスプライシング変異の存在を示唆した。変異体対立遺伝子における欠失限界点が後に続く配列は、次のエキソン配列に正確に一致していた。逆転写されたＲＮＡのために用いた場合と同じ増幅用プライマーを用いたゲノムＤＮＡの増幅は、イントロンの存在を示す１．２ ｋｂのＰＣＲ産物を生じた。患者 ３５４におけるこのＰＣＲ断片の直接塩基配列決定は、５’スプライス部位におけるイントロンの保存されたＧＴジヌクレオチドのヘテロ接合Ｇ→Ａ置換を同定した（図８Ｃ）。図８Ｃは、対照と患者 ３５４における５’スプライス部位の塩基配列決定したものである。患者は、５’スプライス部位（囲んだ部分）におけるヘテロ接合体のＧ→Ａ置換を保有している。イントロン配列は小文字である。この置換は、２人の姉妹における変異を確認するために用いられたＨｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を欠失した（図８Ｄ）。図８Ｄは、患者 ３５４と３５５、及び３人の対照（ｃ）の第４エキソンについてのＤＮＡのＰＣＲ産物におけるＨｐｈＩ 制限エンドヌクレアーゼ解析である。１９８ｂｐのＰＣＲ産物は２つのＨｐｈＩ 部位を持つ。対照の対立遺伝子の分解産物は、１５１ｂｐ、２４ｂｐ及び２３ｂｐである。ＨｐｈＩ 部位が欠失したために、変異対立遺伝子の分解産物は、１７５ ｂｐと２３ ｂｐである。２４ ｂｐと２３ ｂｐの断片は、ゲルから流出する。
【００９７】
（２）　ホモ接合コーディング置換を有する患者
患者 １８０７についての第４エキソンのＳＳＣＰ解析は、異常な移動をする断片を示し、この断片は直接塩基配列決定され、プロリン残基からロイシン残基へ変換するホモ接合Ｃ→Ｔ置換（７６４番目の塩基対）を示した。この変化は、ＭｎｌＩ 制限エンドヌクレアーゼ部位を作出し、この部位は、変異のホモ接合の状態を確認するために用いられた（図９Ａ）。図９Ａは、患者 １８０７と３人の対照（Ｃ）について第４エキソンのＰＣＲ産物のＭｎｌＩ制限酵素解析である。予測される断片：対照対立遺伝子、９０ｂｐ、４６ｂｐ、４４ｂｐ、１８ｂｐ；変異対立遺伝子、７３ｂｐ、４６ｂｐ、４４ｂｐ、１８ｂｐ、１７ｂｐ。ゲルの底部の付加的なバンドがプライマーである。５０個の別々の対照カフカス人の染色体と１２個の対照日本人の染色体は、制限酵素解析によって試験され、すべてがこの変異については陰性であった。この患者におけるホモ接合性は両親の血族関係によると考えられる。
【００９８】
患者 ７３５と１０８４は、ホモ接合の状態で第４エキソンにおける同様の変異を持っていた：進化上保存されたスレオニン残基からメチオニン残基に変換し、かつＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を完全に破壊するＣ→Ｔ置換（６９２番目の塩基対）。 増幅された第４エキソンに対する対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（図１０Ａ及び図１０Ｂ）は、これらの２人の患者における変異を確認し、かつ６０個の別々の染色体をスクリーニングするために用いられ、これら全てが陰性であることが判明した。図１０Ａは、患者 ７３５、１０８４、及び３０人の対照由来の第４エキソンのＰＣＲ産物に対する変異オリゴヌクレオチド（６９２Ｔ）のハイブリダイゼーションである。患者 ７３５、１０８４からのＤＮＡだけが、このプローブにハイブリダイズした。図１０Ｂは、Ａからのストリップ型ドットブロットに対する正常なオリゴヌクレオチド（６９２Ｃ）のハイブリダイゼーションである。全ての対照ＤＮＡはこのプローブにハイブリダイズした。
【００９９】
患者　３５６は、第５エキソンのＳＳＣＰ解析においてシフトを示した。ダイレクト塩基配列決定は、進化上保存されたアルギニン残基からシステイン残基へ変換したホモ接合Ｃ→Ｔ置換（９８５番目の塩基対）を明らかにし、置換はＡｃｉＩ 制限エンドヌクレアーゼ部位を完全に破壊した。これは、患者 ３５６における変異のホモ接合体の状態と両親のヘテロ接合の状態におけるその存在を確認するために用いられた（図９Ｂ）。５０個の別々の対照染色体は、同様に試験され、この変異については陰性であった。図９Ｂは、患者３５６、彼の父親（Ｆ）、彼の母親（Ｍ）、及び３人の対照（ｃ）についての第５エキソンのＰＣＲ産物のＡｃｉＩ制限酵素解析である。予測断片：対照対立遺伝子、１２９ｂｐ、１０５ｂｐ、９０ｂｐ、６８ｂｐ；変異対立遺伝子、１９５ｂｐ、１２９ｂｐ、６８ｂｐ。
【０１００】
（３）　遺伝的混成である患者
患者 ４５８は、第５エキソンにおける変異と第１エキソンにおける変異の複合ヘテロ接合体である。第５エキソンの置換（１０１５番目の塩基対においてのＣ→Ｔ置換）は、アルギニン残基からシステイン残基への置換を生じ、これが患者 ４５８においてＨｈａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を完全に破壊し、これを使用し、患者 ４５８における変異を確認し、５０個の対照染色体が陰性であると示した（図９Ｃ）。 図９Ｃは、患者 ４５８と４人の対照（ｃ）の第５エキソンのＨｈａＩ制限酵素解析である。予測断片：対照対立遺伝子、３１７ｂｐ及び７５ｂｐ；変異対立遺伝子、３９２ｂｐ。７５ ｂｐの断片は、図９Ｃに示していない。二番目の変異は、アルギニン残基をグルタミン残基に変換するヘテロ接合Ｇ→Ａ置換（１６７番目の塩基対）であった。増幅された第１エキソンに対する対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、患者 ４５８におけるこの変異についてのヘテロ接合の状態を確認し、ヘテロ接合の状態においてもこの変異を保有する二番目の患者（１３９６）を同定した（図１０Ｃと１０Ｄ）。図１０Ｃは、患者 ４５８、１３９６及び３１人の対照からの第１エキソンのＰＣＲ産物に対する変異オリゴヌクレオチド（１６７Ａ）のハイブリダイゼーションである。図１０Ｄは、Ｃからのストリップ型ドットブロットに対する正常なオリゴヌクレオチド（１６７Ｇ）のハイブリダイゼーションである。６２個の対照染色体にはこの変異を持つものはなかった。
【０１０１】
患者 １３９６における２番目の変異は、第６エキソンにおいて同定された：アルギニン残基からシステイン残基へ変換し、かつＨｈａＩ 制限エンドヌクレアーゼ部位を完全に破壊するヘテロ接合Ｃ→Ｔ置換（１０８１番目の塩基対）。制限酵素解析は、１３９６におけるヘテロ接合体の置換を確認し（図９Ｄ）、かつ５０個の対照染色体が陰性であることを示した。虫歯は、唾液がｐＨ ５．０以上の患者においては生じない。図９Ｄは、患者 １３９６と２人の対照（ｃ）についての第６エキソンのＰＣＲ産物のＨｈａＩ制限酵素解析である。予測断片：対照対立遺伝子、１５２ｂｐ、８６ｂｐ、１３ｂｐ；変異対立遺伝子 １６５ｂｐ、８６ｂｐ。１３ｂｐの断片は、ゲルから抜け出る。
【０１０２】
（４）　付加的な配列変化
上記の第６エキソンのＨｈａＩ解析は、ＤＮＡ多型を示した。この変化は、１０６８番目の塩基対におけるＴ→Ｃ置換であり、この置換はアミノ酸（セリン）を変えないが、ＨｈａＩ認識部位を作出する。１０６８番目の塩基対のＴは、試験された染色体の９％において見出された。配列解析は、公開されたｃＤＮＡ配列に関して２つの不一致が同定された：グリシンをアスパラギン酸のコドンに変換する５４２番目の塩基対におけるＧ→Ａ置換、及びアミノ酸（スレオニン）を変えない１０３２番目の塩基対におけるＣ→Ｔ変化。試験された全てのＤＮＡ（５０個より多い染色体）は５４２番目のＡと１０３２番目のＴを持っていたので、元のｃＤＮＡ配列がいくつかのクローニングの人工産物を含んでいたと考えられる。
【０１０３】
遺伝子型：表現型の相関関係
表２は、重度のＭＴＨＦＲ欠損において変異の現状をまとめている。８人の患者において、両変異は同定されており；５人の患者（３家族）において、１つの変異のみが同定されている。遺伝型、酵素活性、及び表現型の間の全ての相関関係は一致する。生後一年以内に症状が出始める５人の患者は、対照活性の３％以下であった。これらの患者のうち３人が、ホモ接合の状態でミスセンス変異を持っていた：スレオニンからメチオニンへ置換している２人の患者（Ｃ６９２Ｔ）とプロリンからロイシンへ置換している１人の患者（Ｃ７６４Ｔ）。患者１５５４と１６２７においてのホモ接合体の状態でのナンセンス変異（Ｃ５５９Ｔ）（Ｇｏｙｅｔｔｅ Ｐら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９４年、７：１９５−２００において以前報告された）はまた、予測されたように新生児の重度のタイプに関連する。
【０１０４】
表２における他の患者は、対照活性の６％以上であり、生後２０年以内または２０年後に症状が出始め、唯一の例外は、以前報告された患者 １８３４である（Ｇｏｙｅｔｔｅ Ｐら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９４年、７：１９５−２００）。ミスセンス変異を持つ３人の患者（３５６、４５８及び１３９６）は、アルギニンがグルタミンへ置換し、２つ目の未同定の変異を持つ以前報告された患者（１７７９、１８３４、および１８６３）と同様である（Ｇｏｙｅｔｔｅ Ｐら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９４年、７：１９５−２００）。５’スプライス変異と未同定の２つめの変異を持つ姉妹はまた、同じ値域における活性レベルを持ち、２０歳になると症状が出はじめたが、活性は、２つ目の未同定の対立遺伝子によると考えられる。
【０１０５】
考察
患者は、多種の民族背景の個体である。患者 １５５４と１６２７の二個体とも、原住民アメリカ人であるが、変異は様々なハプロタイプで見出され、これは子孫による同一変異よりむしろ繰り返される変異を示唆する。置換が変異についての「ホットスポット」であるＣｐＧジヌクレオチドにおいて見出されるので、繰り返される変異は妥当な仮説である。いくつかの変異には集団特異的であるかどうか評価することは、総数が現今ではかなり少ないので難しい。
【０１０６】
ＭＴＨＦＲ欠損は、葉酸代謝の最も一般的な先天性の欠陥であり、遺伝的ホモシステイン尿症の主な原因である。ＭＴＨＦＲについてのｃＤＮＡが最近単離されたことで、酵素についての重要なドメインを定義し、ＭＴＨＦＲ欠損患者における遺伝子型と表現型の相関関係を明らかにするためのこの遺伝子座においての突然変異解析が可能となっている。
【０１０７】
本明細書で記述される７つの変異（６つの単一アミノ酸の置換と５’スプライス部位変異）は、合計で重度のＭＴＨＦＲ欠損においてこれまで同定された９つの変異をもたらし、８人の患者についての突然変異解析を終了する。１つまたは２つの家族における各々の変異の同定は、この遺伝子座においての遺伝的異種の程度が著しいことを示している。９つの変異のうち７つは、ＣｐＧジヌクレオチドの中に位置され、突然変異を発生しやすい。
【０１０８】
５’スプライス部位変異
患者 ３５４と３５５において５’スプライス部位のＧＴジヌクレオチドにおけるＧ→Ａ置換は、コード配列の５７ｂｐのインフレームの欠失を生じ、これがタンパク質の１９アミノ酸を欠失すると考えられる。潜在的な５’スプライス部位（ＡＧ／ｇｃ）の活性化の結果、この潜在的な部位が完全な５’スプライス部位共通配列（ＡＧ／ｇｔ）持たないが、この欠失が生じる。しかし、イントロンの最初の２ヌクレオチドの（ＧＴの代わりの）ＧＣ は、ヒトプロトロンビンとヒトアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼの遺伝子における場合のいくつかの天然のスプライス部位において報告されており、かつマウスＲＮＡポリメラーゼＩＩの最も大きいサブユニットの遺伝子内ではその２倍報告されている。その予測される変化を持つ（Ａ６０Ｇ７９／ｇ１００ｔ１００ａ５９ａ７１ｇ８２ｔ５０）潜在的な部位の残りのヌクレオチドは、通常のスプライス部位共通配列に一致する。異所でスプライシングされたｍＲＮＡから生じる欠失酵素は、任意の活性を持つと考えられ；１９個の欠失アミノ酸のうち８個は、大腸菌酵素において保存されている。２人の患者は対象の２０％の範囲で残存酵素活性を示すが、活性はこれらの患者における未同定の２番目の対立遺伝子におそらく係るものであるという可能性はない。
【０１０９】
６つのミスセンス変異
患者 １３９６におけるＡｒｇ→Ｃｙｓ置換（Ｃ１０８１Ｔ）は、ＭＴＨＦＲにおける触媒ドメインと調節ドメイン間のリンカー領域であると以前仮定された親水性の配列内にある（Ｇｏｙｅｔｔｅ Ｐら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９４、７：１９５−２００）。これらの２つのドメインは、ブタ酵素の緩和なトリプシン処理によってすぐに分離できる。リンカードメインで高電荷の領域は、タンパク質の外側の面上に位置し、そのためによりタンパク質分解されやすいと可能性が高い。Ａｒｇ→Ｃｙｓ置換は、荷電した親水性残基を荷電してない極性残基へ変換するので、それは保存的変化とみなすことはできず、酵素の安定性に影響を及ぼすと考えられる。
【０１１０】
患者 ３５６と４５８において同定された２つのＡｒｇ→Ｃｙｓ置換（それぞれＣ９８５ＴとＣ１０１５Ｔ）は、ＦＡＤ補因子の結合に関わっていると可能性がある。文献中の以前の研究は、ＦＡＤ補因子非存在以下で５５℃で繊維芽細胞の加熱処理はＭＴＨＦＲを完全に不活性化することを示した。熱不活性化の前に反応混合液にＦＡＤを添加すると、対照抽出物と何人かの患者からの抽出物にある酵素活性を戻すが、その一方で、患者 ３５６と４５８の抽出物は影響を受けなかった。これらの観察に基づいて、これらの２人の患者がＦＡＤの結合に関わるタンパク質の領域に影響を及ぼす変異を持つことが示唆された。２つの変異は、１１アミノ酸内で互いにかなり近接して見出された。患者 ３５６において、Ａｒｇ残基は、大腸菌で進化上保存され、保存された９アミノ酸の一続きの部分において見出され、これがこの残基についての潜在的な役割を示唆し；患者 ４５８において変化したＡｒｇ残基は進化上保存されていない。フラビンタンパク質である中間鎖アクリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＭＣＡＤ）の結晶構造解析は、ＦＡＤの結合に関わる定義された重要な残基を明らかにしている。ＭＣＡＤタンパク質の２つの連続した残基であるＭｅｔ１６５とＴｒｐ１６６は、ＦＡＤとの相互作用に関わり、ＭＴＨＦＲにおいて患者 ４５８において変化したＡｒｇ残基から各々３アミノ酸と４アミノ酸下流で同定されることもできる。
【０１１１】
Ｔｈｒ→Ｍｅｔ置換（Ｃ６９２Ｔ）は、大腸菌酵素について高く保存された領域において、かつヒトデヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）とかなり相同性のある領域において見出される（図１１）。図１１において、＝は同一であり；・は相同；及び＄はウシ亜科ＤＨＦＲ酵素と同一である。アステリスク（＊）は、Ｔｒｙ→Ｍｅｔ置換の位置を示す。患者の初期の病気の始まりの表現型を考慮すると、スレオニン残基が活性に重要であること、またはそれがタンパク質の重要なドメインの一因となることを仮定できる。ＤＨＦＲにおける相同性のあるこの領域は、葉酸結合に関わると報告されているＴｈｒ１３６の残基を含む。ＤＨＦＲにおけるこのＴｈｒ残基は、同様の生化学的性質を持つアミノ酸である、ＭＴＨＦＲにおけるＳｅｒ残基とアライメントされる。Ｔｈｒ→Ｍｅｔ置換は、ＤＨＦＲこのＳｅｒコドンから６アミノ酸下流に位置する。Ｔｈｒ→Ｍｅｔ置換は、２つの酵素間の相同領域の真ん中のこのＳｅｒコドンから８アミノ酸下流に位置する。それによって、Ｔｈｒ→Ｍｅｔ置換が葉酸基質の結合を改変する可能性があると仮定される。
【０１１２】
Ｇ１６７Ａ（Ａｒｇ→Ｇｌｎ）とＣ７６４Ｔ（Ｐｒｏ→Ｌｅｕ）の両置換は非保存性アミノ酸に影響を及ぼす。ＭＴＨＦＲ欠損の発生においてのそれらの意義を、現在のところ決定することができない。これまで同定されたすべての変異は、コード配列の５’末端で、ＭＴＨＦＲの触媒ドメインをコードすると考えられる領域に位置する。突然変異解析は、構造についての取りかかりに有用である：酵素の機能特性並びに重度のＭＴＨＦＲ欠損における多様な表現型を理解すること。
【０１１３】
ＩＩＩ．　Ａ→Ｖ変異の同定
ＳＳＣＰ解析とＰＣＲ断片の直接的塩基配列決定は、６７７番目の塩基対においてのアラニン残基からバリン残基へ変換する、ＣからＴへの置換を同定するために用いられた（図５Ａ）。Ａ→Ｖ変化の解析用プライマーは：
2004502469.tif 000004
であり；これらのプライマーは、１９８ｂｐの断片を作成する。図５Ａは、アラニン残基についてのホモ接合体とバリン残基についてのヘテロ接合体である２個体の配列を示す。アンチセンス鎖を示す。この改変は、ＨｉｆＩ部位を作製し（図５Ｂ）、この部位を１１４個の任意抽出のフランス系カナダ人の染色体をスクリーニングするために用い；対立遺伝子の置換頻度は、．３８であった。置換は、ＨｉｎｆＩ認識配列を作出し、１９８ｂｐの断片を１７５ｂｐと２３ｂｐの断片に分解し、後者の断片はゲルから抜け出す。図５Ｂは、３つの生じうる遺伝子型を示す。３つの遺伝子型の頻度は、以下である：−／−、３７％；＋／−、５１％；及び ＋／＋、１２％（（＋）は ＨｉｎｆＩ 制限酵素部位とバリン残基の存在を示す）。
【０１１４】
アラニン残基は、ブタＭＴＨＦＲにおいて、並びに大腸菌およびネズミチフス菌のｍｅｔＦ遺伝子とｓｔｙｍｅｔＦ遺伝子において保存されている。この残基のかなり高い保存性と微生物酵素と高い相同性のある領域内のその位置は、酵素の構造と作用におけるその重要性をそれとなく言及している。さらに、（＋／＋）遺伝子型の頻度は、管疾患に関連する熱不安定性ＭＴＨＦＲ異型の頻度と一致した。
【０１１５】
臨床材料
Ａ→Ｖ変異の頻度を測定するために、ケベック出身の５７個体のヒトからのＤＮＡをＰＣＲと制限酵素分解によって解析した。あらゆるフランス系カナダ人の個体を臨床的にまたは生化学的に検査した。
【０１１６】
表３の解析された４０人は、イングバーセン（Ｅｎｇｂｅｒｓｅｎ）ら（Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．、１９９５、５６：１４２−１５０）において以前に記述されている。 １３個体の心血管患者のうち８個体は脳血管動脈硬化を持ち、５個体は末梢性動脈硬化を持っていた。５個体は熱不安定性ＭＴＨＦＲを持っていたが、その一方で８個体は熱安定性ＭＴＨＦＲを持っていた（加熱後は３３％より高い残存活性）。対照と患者は、すべて２０〜６０歳の間のドイツ系カフカス人であった。これらの個体のうちホモシステインレベルを改変できるビタミンを使用した個体はいなかった。酵素アッセイ法とホモシステイン測定はまた、イングバーセン（Ｅｎｇｂｅｒｓｅｎ）らによって報告されている（Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．、１９９５、５６：１４２−１５０）。
【０１１７】
【表３】ＭＴＨＦＲ遺伝子型と酵素活性間、熱不安定性と血漿ホモシステインレベル間の相関関係
2004502469.tif 000005
ａ 一方向分散分析 ｐ＜．０１
ｂ すべての組み合わせについての対のｔ検定　ｐ＜．０１
ｃ 対のｔ検定 ＋／＋群対＋／−群または−／−群についてのｐ＜．０５；＋／−群対−／−群についてｐ＞．０５
ｄ　このパラメーターのためのｎ＝１８
ｅ　このパラメーターのためのｎ＝１１
【０１１８】
酵素活性と血漿ホモシステインを以前報告したように測定した。それぞれの値を平均±標準誤差で表した。範囲は、平均の下のかっこ内に示す。
【０１１９】
Ａ→Ｖ変異と改変ＭＴＨＦＲ作用の相関関係
遺伝子型解析が行われ、酵素活性と熱不安定性を早期管疾患患者と対照由来の４０個のリンパ球粒の総計において測定した。１３人の管患者は以前の研究（Ｅｎｇｂｅｒｓｅｎら、Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．、１９９５、５６：１４２−１５０）から選抜され、そのうち５人は熱不安定性ＭＴＨＦＲを持つと考えられた。８９人の対照からなる大きい参照群から、熱不安定性ＭＴＨＦＲを持つ７人全ての個体を調べ、正常なＭＴＨＦＲを持つ追加の２０人の対照を同じ参照群から選抜した。表３は、遺伝子型と酵素比活性間、熱不安定性と血漿ホモシステインレベル間の関係を詳細に示している。置換がホモ接合である（＋／＋）個体についての平均のＭＴＨＦＲ活性は、アラニン残基がホモ接合である（−／−）個体についての平均活性のほぼ３０％であった。ヘテロ接合体は、（−／−）個体の活性の６５％の平均ＭＴＨＦＲ活性を持ち；この値は（−／−）個体と（＋／＋）個体についての値の中間である。活性の範囲は、ヘテロ接合体と（−／−）遺伝子型についていくらか重複を示したが、ホモ接合（＋／＋）個体は前者の群について実質上は重複を示さなかった。分散の一方向分析では、Ｐ値＜．０００１が得られ；一対のボンフェロニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）ｔ検定は、３つすべての遺伝子型が３つの起こりうる組み合わせについてのｐ＜０．０１が有意に異なることを示した。
【０１２０】
３つの遺伝子型は、すべて酵素熱不安定性に関して有意に異なっていた（ｐ＜．０１）。４６℃、５分間の熱処理後の平均残存活性は、（−／−）、（＋／−）及び（＋／＋）の遺伝型について、それぞれ６７％、５６％及び２２％であった。熱不安定性の程度が（−／−）とヘテロ接合体の個体についていくらか重複しているが、２つの変異対立遺伝子を持つ個体は明らかにより低い範囲であった。（＋／＋）遺伝子型を持つ全ての個体は、（−／−）遺伝子型についての加熱後の３５％より低いの残存活性、及び５０％より低いの比活性を持っていた。
【０１２１】
断食後とメチオニン投与後６時間の血漿中のホモシステイン濃度を蛍光検出を用いた高速液体クロマトグラフィーによって測定した。（＋／＋）の個体における断食ホモシステインレベルは（＋／−）個体と（−／−）個体についての値の約二倍であった。ホモシステインがメチオニン投与６時間後に測定された場合は、血漿ホモシステインについての遺伝子型間での違いは維持されていた。一方向分散分析で、断食とメチオニン投与後のホモシステインレベルについてｐ＜．０１が得られた。１対のボンフェロニｔ検定は、ホモ接合変異の個体だけがホモシステインレベルが有意に上昇していることを示した（ｐ＜．０５）
【０１２２】
インビトロにおけるＡ→Ｖ変異の発現のためのＰＣＲを基本とする突然変異誘発
ｃＤＮＡ含有Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ベクターを鋳型として用いたＰＣＲを基本とする突然変異誘発は、ＡからＶへの変異を作成するするために用いられた。Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ（ＮＥＢ社）はＰＣＲエラーを減らすために用いられた。以下のプライマーを用いた：プライマー１、−２００上流から−１７８までの塩基対であるセンス；プライマー２、６６７番目から６８７番目までの塩基対であり、６７７番目の塩基対にミスマッチであるＡを含むアンチセンス；プライマー ３、６６７番目から６８７番目までの塩基対であり、６７７番目の塩基対においてミスマッチであるＴを含むセンス；プライマー ４、１０９２番目から１１１４番目までの塩基対であるアンチセンス。プライマー１と２を用いてＰＣＲを行い、８８７ ｂｐの産物を作製し、かつプライマー ３と４を用いて４４７ｂｐの産物を作製した。２つのＰＣＲ断片をＧｅｎｅｃｌｅａｎ（登録商標）（ＢＩＯ １０１）によって１．２％ アガロースゲルから単離した。鋳型としてプライマー１と４、及び最初の２つのＰＣＲ断片を用いた最終的なＰＣＲ反応を行い、変異を含む１．３ ｋｂのバンドを作出した。１．３ ｋｂの断片を、ＮｃｏＩとＭｓｃＩで分解し、１１番目の塩基対のＮｃｏＩ部位と９４３番目の塩基対のＭｓｃＩ部位間の配列を置き換えることによって、野生型ｃＤＮＡ含有発現ベクターに挿入した。置き換えた全断片とクローニング部位をＰＣＲによって付加的な変化が導入されていないことを立証するために配列決定した。
【０１２３】
野生型ｃＤＮＡ及び突然変異誘発ｃＤＮＡの発現解析
ベクターのみ、ベクター ＋ 野生型 ＭＴＨＦＲ ｃＤＮＡ、またはベクター ＋ 変異誘発 ｃＤＮＡを含有するＪＭ１０５（登録商標）の一晩の培養物を、３７℃で、．０５ ｍｇ／ｍｌ アンピシリンを添加した２ ｘ ＹＴ培地中で増殖させた。それぞれの新鮮な１０ｍｌ培養物を、開始Ｏ．Ｄ．を０．０５にするために、約５０μｌの一晩培養した培養物を植菌し、かつ４２０ ｎＭにおけるＯ．Ｄ．が１になるまで、３７℃で増殖させた。その後、培養物を１ ｍＭ ＩＰＴＧで２時間誘導し、沈殿させた。細胞を２ μｇ／ｍｌ アプロチニンと２ μｇ／ｍｌ ロイペプチン（３．５ ｘ 細胞の湿重量）を含むＴＥバッファーで再懸濁した。細胞懸濁液は、３ ｘ １５秒間で超音波をあてて分解し、むきだしの細胞膜を破壊し、その後、４℃で３０分間遠心分離し、細胞残渣と非溶解細胞を沈殿させた。上清をＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）タンパク質アッセイ法を用いてタンパク質濃度をアッセイした。ウェスタン解析を、精製ブタ肝臓ＭＴＨＦＲに対して作製した抗血清を使用し、業者の説明書に係るＡｍｅｒｓｈａｍ社 ＥＣＬ（登録商標）キットを用いて行った。酵素アッセイ法を確立した手順で行い；活性測定の前に４６℃、５分間であらかじめ処理した抽出物を、熱不安定性を評価した。比活性（ｎｍｏｌ ホルムアルデヒド／時間／ｍｇタンパク質）をベクターだけについて得られた値を引いた（バックグラウンドである大腸菌ＭＴＨＦＲ活性を引くために）後で２つのｃＤＮＡ含有構築物について計算した。
【０１２４】
ＭＴＨＦＲ ｃＤＮＡ（２．２ ｋｂ）（図６）は１９８０ ｂｐのオープンリーディングフレームを含み、７４．６ ｋＤａのタンパク質が推定される。精製ブタ肝臓酵素は、７７ ｋＤａのサブユニットを持つことが示されている。いくつかのヒト組織とブタ肝臓についてのウェスタン解析（図７Ａ）は、すべての研究された組織における７７ ｋＤａのポリペプチド、ならびにヒト胎児肝臓とブタ肝臓におけるほぼ７０ ｋＤａの付加的なポリペプチドにおいてを示し、アイソザイムの存在を示唆した。２μｇの細菌抽出タンパク質をレーン１〜３において用いた。組織（レーン４〜８）を、プロテアーゼ阻害剤（アプロチニンとロイペプチン各々２μｇ／ｍｌ）を含む．２５Ｍ スクロースでホモジナイズすることによって調製し、その後氷上で超音波処理（３ ｘ １５秒）した。抽出物を微量遠心機において１４，０００ ｇで１５分間回転させ、１００μｇの上清タンパク質をウェスタン解析用に用いた。ｈ＝ヒト；ｐ＝ブタ。
【０１２５】
野生型ｃＤＮＡとＡ→Ｖ置換を含む突然変異誘発ｃＤＮＡを、大腸菌において発現させ、約７０ ｋＤａのタンパク質を産生し（図７Ａ）、このタンパク質は上記のより小さいポリペプチドとともに拡散している。抽出物を４６℃、５分間処理することにより、置換を含む酵素が野生型酵素より有意に熱不安定性であることが示された（ｐ＜．００１；図７Ｂ）。２つの別々の実験（各々の実験用の各々の構築物のための３〜４回の複製についての）を野生型ＭＴＨＦＲと突然変異誘発された複数のＭＴＨＦＲ Ａ→Ｖ ｃＤＮＡの熱不安定性活性を測定するために行った。示された値は、各々の実験について平均±標準誤差を加熱後の残存活性の％で表した。加熱前の比活性の平均（ｎｍｏｌ ホルムアミド／時間／ｍｇ． タンパク質として表された）は以下であった：実験 １、ＭＴＨＦＲとＭＴＨＦＲ Ａ→Ｖについては各々３．８と５．３；実験 ２、ＭＴＨＦＲとＭＴＨＦＲ Ａ→Ｖについては各々６．２と７．５。発現効率における変動が解釈の難しさの原因となりうるので、発現実験を加熱までの比活性における差を測定するために計画した。しかしながら、好奇心をそそることに、両実験における変異体構築物についての比活性はより高かった。変異体タンパク質が大腸菌において安定して増加する、または抽出物における封入体が適当に組み立てられた酵素の回収における差の一因となったという可能性がある。
【０１２６】
これらの研究は、インビトロとインビボにおいて熱不安定性になるＭＨＦＲ遺伝子の共通の置換を同定した。ヘテロ接合またはホモ接合の状態での変異は、リンパ球抽出物における減少した酵素活性と増加した熱不安定性に相関がある。血漿ホモシステインの有意な上昇が変異がホモ接合体となっている個体において観察された。ホモシステインレベルに関する統計学的有意差がヘテロ接合の個体及び（−／−）の個体との間で観察され；血漿ホモシステインが葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ６、及びメチオニンを含むいくつかの環境因子によって、並びにシスタチオニン−β−合成酵素遺伝子のような他の遺伝子座における遺伝子変化によって影響を及ぼされうるので、この観察は、驚くべきことではない。
【０１２７】
酵素活性と重度の高ホモシステイン血症において顕著な減少と関連する、以前に報告されたＭＴＨＦＲにおけるアルギニンからグルタミンへの変化のような非保存的変化とは対照的に、アラニンのバリンへの置換は、アミノ酸残基の疎水性を維持し、活性のわずかな変化に関連している。アラニン残基は、細菌のｍｅｔＦ遺伝子との相同領域中に位置する。アラニン残基自体が保存されていないが、同じ相同領域はまた、ヒトジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子においても観察され（図１１）；ＤＨＦＲの１３０〜１４９番目までのこのアミノ酸領域は、組換えヒトＤＨＦＲの結晶構造解析において葉酸結合に関連しているＴ１３６を含む。ＭＴＨＦＲのこの領域が葉酸結合にも関連し、酵素が葉酸存在下で安定化する可能性があることを推測させる気にさせる。この仮説は、かなり詳細に文献に記載されたホモシステインレベルへの葉酸の影響と早期管疾患患者と熱不安定性ＭＴＨＦＲを持つ患者における報告された葉酸による軽度の高ホモシステイン血症の矯正に合致する。
【０１２８】
ｃＤＮＡは、大きい方のＭＴＨＦＲポリペプチドをコードするための十分な長さがないが、小さい方のアイソザイムの合成を指向することができる。このポリペプチドのＡＴＧ開始コドンは、翻訳開始のための十分な共通配列中に存在する。アイソザイムが肝臓に限定されるかどうか、及びこの組織中でのその役割が何であるが決定されるべきことが残っている。
【０１２９】
これらのデータは、熱不安定性になるＭＴＨＦＲにおける共通の遺伝子変化を同定し；これらの実験がこの変化と肝疾患の間の関係を直接的には提示しない。それにもかかわらず、この多型は、高ホモシステイン血症におけるＭＴＨＦＲ熱不安定性の評価についての診断試験に相当する。大きい症例の調節研究は、閉塞動脈疾患の様々な形におけるこの遺伝子変化の頻度を評価し、遺伝子マーカーと食事要因間の相互作用を調べるために必要とされる。有限のデータはこれまで集団特異的な対立遺伝子が頻出する可能性を示唆するので、かなり明確な集団を調べる必要がある。しかしながら、より重要なことに、肝疾患の遺伝的候補危険因子の同定は、栄養素の取り込みによって影響を受ける可能性があり、ホモシステイン型の動脈硬化のための適当な治療計画において重要な段階になる。
【０１３０】
ＭＴＨＦＲのｃＤＮＡとその潜在的有用性
ｃＤＮＡ配列は、心血管疾患及び神経病の危険にさらされている個体を同定すると考えられるＭＴＨＦＲ配列異常、並びに葉酸代謝によって影響を受ける他の障害の検出のための必要な出発点である。ＤＮＡ解析による診断試験は、酵素／生化学的アッセイ法による試験よりも効率がよく、かつ正確である。より少量の血液が必要とされ、結果はより短期間で求められる。試験は、酵素を基本にした試験に必要とされる特殊な試薬／専門技術なしで、分子遺伝子診断を行う任意の研究室において日常的な操作として行われる。
【０１３１】
ｃＤＮＡの二番目の主要な有用性は、ＭＴＨＦＲ欠損の矯正のための治療プロトコールの計画においてである。遺伝子発現を改変できる遺伝子治療の試みにおいて、または試薬を使用する場合に、これらのプロトコールは遺伝子を直接必要である。または、酵素活性を改変すると考えられる試薬を用いた場合に、治療はアミノ酸配列情報（ｃＤＮＡ配列由来の）を必要とする可能性がある。ＦＡＤ結合部位または葉酸結合部位のようなｃＤＮＡまたはタンパク質のある特定の領域における配列の同定及び／または配列変化の同定は、先の栄養素を含む治療プロトコールを作製する際に有用である。
【０１３２】
臨床的及び診断的検討における発明の有用性
モントリオールの冠動脈疾患患者（ｎ＝１５３）を調査し、アラニンからバリンへ置換頻度を調べた。患者の１４％がこの変異についてホモ接合体であった。対照の７０個体（冠動脈疾患を持たない）についての解析は、これらの個体の７％だけがアラニンからバリンへの変異についてホモ接合体であることを示した。
【０１３３】
上の患者の群の１２３人の男性におけるホモシステインレベルの解析は、変異対立遺伝子がホモ接合体の正常な男性においては１０．２μｍｏｌ／Ｌから１１．５μｍｏｌ／Ｌまでホモシステインレベルが有意に上昇し、ヘテロ接合変異及びホモ接合変異において各々１１．５μモル／Ｌと１２．７μモル／Ｌに上昇することを示した。
【０１３４】
神経管欠損である二分脊椎を持つ子供の家族はアラニンからバリンへの変異の存在について検査された。二分脊椎を持つ子供の母親の約１６％はこの変異についてホモ接合体であったが、一方、対照の個体のうち５％だけがホモ接合体であった。二分脊椎を持つ子供の父親もまた、病気に冒された子供達自身（１３％）のようにホモ接合の変異遺伝型の罹患率が増加していた（１０％）。
【０１３５】
表４は、アラニンからバリンへ変化したホモ接合変異と葉酸の相互作用の結果を示す。フレーミングハム、マサチューセッツ及びユタ出身の家族の調査において、ホモ接合変異であるが、葉酸レベルが５ ｎｇ／ｍｌより高い個体は、正常な遺伝子型またはヘテロ接合の遺伝子型を持つ個体と比較して、ホモシステインレベルが増加してはいなかった。しかしながら、ホモ接合変異であるが、５ｎｇ／ｍｌより低い葉酸レベルを持つ個体は、他の遺伝子型よりホモシステインレベルが有意に高かった。
【０１３６】
【表４】様々なＭＴＨＦＲ遺伝子型についての断食とＰＭＬの平均ホモシステインレベル
2004502469.tif 000006
＊ 葉酸レベルと遺伝子型間の有意な相互作用（ｐ＝０．０３）
【０１３７】
表４は、アラニンからバリンへの変化についてホモ接合である個体に対する葉酸補給によって治療的介入のための予備的なデータを供給する。データは、より高い血漿葉酸レベルが変異を持つ個体におけるホモシステインレベルを標準化させ、冠動脈疾患、神経管欠損、及び生じうる他の障害のような高いホモシステインレベルに関連した障害の発生を予防する可能性があることを示唆する。変異を持つ個体のための葉酸補給はまた、メチオニンとＳ−アデノシルメチオニンレベルを正常値まで回復することができる。これは、新生組織形成、発達以上、神経病などのようなメチル化によって影響をうける異常を明らかにすると考えられる。
【０１３８】
活性の減少に関連するメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）における遺伝的多型
共通の変異（Ｃ６７７Ｔ）により、比活性が減少した熱不安定性酵素になる（ホモ接合変異を持つ個体において対照値のほぼ３５％）。ホモ接合変異体を持つ個体（北アメリカ人の約１０％）は、葉酸塩の状態が低い場合、軽度の高ホモシステイン血症になりやすい。この遺伝的−栄養素相互作用効果が、神経管欠損（ＮＴＤ）と管疾患の危険性を増加すると考えられる。Ｃ６７７Ｔに関してホモ接合変異の遺伝型を持つ子供における二分脊椎の危険性が増加していると報告されている。本発明に関して、ＭＴＨＦＲにおける２つめの共通の異型（Ａ１２９８Ｃ）のＥからＡへの置換を特徴としている。ホモ接合性がカナダ人の個体のほぼ１０％において観察される。この多型は、酵素活性の減少に関連しており、ホモ接合体はリンパ球において対照活性の約６０％であった。
【０１３９】
配列の変化（Ｃ１２９８Ａ）が同定されている。個体のほぼ１５％である、Ｃ６７７ＴとＡ１２９８Ｃの両変異についてヘテロ接合体は、Ｃ６７７Ｔ異型について１つのヘテロ接合体において見出される値よりも低い値であり、対照活性の５０〜６０％の活性を持っていた。両変異がホモ接合である個体は存在しなかった。無症状の遺伝的異型Ｔ１３１７Ｃは、同じエキソンにおいて同定された。それは、調査群において比較的まれである（対立遺伝子頻度 ＝ ５％）が、アフリカの個体の少ない試料においても共通であった（対立遺伝子頻度 ＝ ３９％）。
【０１４０】
さらに、葉酸依存的ホモシステイン代謝におけるＭＴＨＦＲの役割によって、Ｃ６７７Ｔ変異は、低い葉酸塩の状態の存在下の管疾患の危険因子である軽度の高ホモシステイン血症になりやすい。本発明によって、Ａ１２９８Ｃ異型の頻度が測定され、酵素作用に対する可能性がある影響を評価する。
【０１４１】
二分脊椎を有する患者と患者の母親は、機関検査委員会から認可されたモントリオール子供病院の二分脊椎診療所から採用された。対照の子供と対照の母親は同じ機関から採用された。血液試料を末梢性リンパ球からＤＮＡを調製するために用い、リンパ球抽出物中のＭＴＨＦＲの活性をアッセイし、かつ全血漿ホモシステイン（ｔＨｃｙ）を測定した。（ＡからＶへの）Ｃ６７７Ｔ変異の存在を、ＰＣＲとＨｉｎｆＩ分解によって評価した（２）。Ａ１２９８Ｃ変異をＰＣＲとＭｂｏＩＩ分解によって最初に検査した（５）。無症状の変異のＴ１３１７Ｃは、重度のＭＴＨＦＲ欠損患者とホモシステイン尿症患者におけるＳＳＣＰと配列解析によって同定された。この親であるアフリカ系アメリカ人の女性は、以前記述されたスプライス変異を保有している（患者 ３５４（８））。この変異により、ＭｂｏＩＩ部位を作成し、Ａ１２９８Ｃ 変異と同一の分解パターンになるので、明らかな人工的に作成された制限酵素部位がこれらの２つの変異を区別するために用いられた。１３８ｂｐのＰＣＲ断片がＣ対立遺伝子存在下でＦｎｕ４ＨＩによって、１１９ｂｐと１９ｂｐの断片に分解されるように、Ａ１２９８Ｃ 多型の検出は、センスプライマー
2004502469.tif 000007
とアンチセンスプライマー
2004502469.tif 000008
を用いておこなった。アンチセンスプライマー
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は、ＴａｑＩ部位を導入し、Ｔ１３１７Ｃ多型の Ｃ 対立遺伝子を同定するために、同様に設計された。センスプライマー
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とともに、２２７ｂｐの断片は２０２ｂｐと２５ｂｐの断片に分解される。
【０１４２】
【表５】母親と子供についての遺伝子型の分布、ＭＴＨＦＲ活性（ｎｍｏｌ／ホルムアルデヒド／ｍｇタンパク質／時間）、及び全血漿ホモシステイン（ｔＨｃｙ；μＭ）
2004502469.tif 000011
３つのＡ１２９８Ｃ 遺伝子型と３つのＣ６７７Ｔ 遺伝子型はアミノ酸コードによって命名される；それぞれＥＥ、ＥＡ、ＡＡ、及びＡＡ、ＡＶ、ＶＶ。統計学的有意性は、ＥＥＡＡ値と比較したスチューデントｔ検定によって評価される。＊（ｐ＜０．０５）；／＊＊（ｐ≦０．０７）。標準偏差を示し、四角括弧をＭＴＨＦＲ活性とホモシステインレベルを求めた人数を示す。
【０１４３】
Ａ１２９８Ｃ変異についての３つの遺伝子型（ＥＥ、ＥＡ及びＡＡ）の頻度は、患者と対照の母親間、または患者と対照の子供の間に違いはなかった（データ示さず）。結果として、すべての母親とすべての子供を解析のために一緒に一群にした（表５）。母親の９％が、ホモ接合のＡＡ遺伝子型を持ち、その一方、３７％がヘテロ接合体であった。この頻度は、Ｃ６７７Ｔ多型についてホモ接合変異遺伝型（ＶＶ）の頻度と全く同様であった。上記のＭＴＨＲヒトｃＤＮＡ配列において、ｃＤＮＡはＣ１２９８Ａ置換として１２９８番目の塩基対のＣヌクレオチド変化を含んでいた。Ａヌクレオチドは、明らかにこの位置においてより頻出する塩基であり、Ａ１２９８Ｃという名称が選択された。
【０１４４】
Ｃ６７７Ｔ変異（ＡからＴへの）が、ＭＴＨＦＲ活性を減少し、ホモシステインレベルを増加するので、Ａ１２９８Ｃ（ＥからＡへの）変異についての３つの遺伝子型の群を、さらにＡからＶへの変異についての遺伝子型によって等級別に分類し、後者の多型のＭＴＨＦＲ活性とホモシステインレベルに及ぼす混同した影響を避けた。各々の遺伝子型に対してのＭＴＨＦＲ活性とホモシステインレベルについて９つの遺伝子型の度数を表５に示す。いずれの変異も持たない母親と子供、すなわちＥＥ／ＡＡが参考（対照）群として用いられる場合には、Ａ１２９８Ｃ変異についてホモ接合体（ＡＡＡＡ）である母親と子供は、各々は対照ＭＴＨＦＲ活性のほぼ６５％と５７％である。Ｃ６７７Ｔ変化についてヘテロ接合体（ＥＥＡＶ）が他の調査で報告されるように対照活性のほぼ７０％であるが、一方、母親の１８％と子供の１１％である二重のホモ接合体（ＥＡＡＶ）は、活性が追加的に低下する（それぞれ対照値のほぼ６２％と５０％）。
【０１４５】
ホモシステインレベルは、Ａ１２９８Ｃ変異によって有意に増加されないが、ホモシステインはＣ６７７Ｔ変化についてホモ接合体であった母親と子供において上昇していた（境界有意性について、ｐ≦０．０７）。Ａ１２９８Ｃ変異についてホモ接合であった少数の個体（ｎ＝１３）は、統計学的解析の検出力に影響を与え、Ｃ６７７Ｔ変異を持つ個体において見出されるように、軽度の高ホモシステイン血症に至る遺伝的−栄養素の相互作用の調査を阻む可能性がある。
【０１４６】
スプライシング欠陥を現時点では防げないが、Ｔ１３１７Ｃ置換はアミノ酸（フェニルアラニン）を改変せず、おそらく良性の変化である。この調査からの３８人の対照の母親の評価において、２個体がヘテロ接合体であることが判明し、１個体がホモ接合体として同定され、その結果対立遺伝子の頻度が５％となった（４／７６）。この置換はアフリカ系アメリカ人の女性において同定されたので、対照のアフリカ人個体もまた検査された（ｎ＝９）。これらのうち７個体が、ヘテロ接合で、その結果、対立遺伝子の頻度が３９％となった（７／１８）。
【０１４７】
Ｃ６７７Ｔ変異よりも低い程度ではあったが、Ａ１２９８Ｃ変異はＭＴＨＦＲ活性を減少した。結果的に、個体が両変異を保有する、及び／または不十分な栄養状態である個体の場合、ホモシステインレベルへのその影響を少なくもし、実際に有意であり得るだけである。しかしながら、二重のヘテロ接合体が集団のほぼ１５％を示すと見積もられるので、この異型は高ホモシステイン血症についての調査におけるＣ６７７Ｔ異型と関連して検査されるべきである。
【０１４８】
Ａ１２９８Ｃ変異は、カナダ人における明確な多型であり、他の集団において検査されるべきである。元のヒトＭＴＨＦＲｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０９８０６）はＣヌクレオチドを保有するが、Ａヌクレオチドはより共通の対立遺伝子となるので、おそらかう祖先配列である。この多型は、頻度においてＣ６７７Ｔ多型と同様である。両置換（Ｃ１２９８／Ｔ６７７またはＡ／Ｖ）についてのハプロタイプは極めてまれであるので、２つの置換はＡ１２９８／Ｃ６７７またはＥ／Ａハプロタイプにおいて別々に生じると考えられる。そのような１つのハプロタイプはＥＡＶＶ遺伝子型を持つ子供において見出され、組換え染色体を示唆した。
【０１４９】
二重ホモ接合の個体（ＡＡＶＶ）は、この調査では観察されなかった。シス位における二重変異はまれであるため、十分な対立遺伝子が調査されていない可能性がある。他の集団におけるより大規模な調査は、これらの個体の同定できる可能性がある。ＭＴＨＦＲ活性はよりいっそう低いと考えられ、ホモシステインレベルはこれまで観察されたレベルより高い可能性がある。
【０１５０】
第４エキソンにおけるＣ６７７Ｔの多型は、酵素のＮ末端触媒ドメイン内に存在するが、第７エキソンにおけるＡ１２９８Ｃ多型はＣ末端の調節ドメイン内に存在する。最初の多型に関する酵素活性に対するより劇的な影響は、触媒領域内のその位置の結果でありうる。２つめの多型は、おそらくＣ末端領域において結合すると知られているＭＴＨＦＲのアロステリック阻害剤であるＳ−アデノシルメチオニンによって、酵素の調節に影響を及ぼしうる。
【０１５１】
多くの調査はＭＴＨＦＲ酵素活性とホモシステインレベルに対するＣ６７７Ｔ多型の影響を調べた。この置換の存在と減少した酵素活性／増加したホモシステインレベル間の相関関係は、かなり密接であるが、結果における、特に、ヘテロ接合体の個体の変異性は、集団における２つ目の共通の異型の存在をもたらす可能性がある。
【０１５２】
３つ目の異型のＴ１３１７Ｃは、カナダ人の個体の対立遺伝子の５％において存在していたが、アフリカ人が祖先という個体において極めて共通していることが明白である。最初に述べたようにＡ１２９８Ｃ変化の解析のためのＭｂｏＩＩ制限酵素部位の使用が２つの多型を区別するとは考えられないので、本明細書で概略を述べている方法を、他の集団におけるＡ１２９８ＣとＴ１３１７Ｃの頻度を評価するために用いるべきである。
【０１５３】
Ｃ６７７Ｔ変異は、高ホモシステイン血症の危険因子であり、神経管欠損と管疾患の両方に関連している。
【０１５４】
ヒトとマウスのメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）の遺伝子構造
長さが２．２ｋｂのヒトＭＴＨＦＲのｃＤＮＡは、発現され、結果としてほぼ７０ｋＤａの触媒活性酵素を生じることが示されている。１５個の変異はＭＴＨＦＲ遺伝子において同定されている：重度の酵素欠損に関連する１４個のまれな変異とより軽度の欠失に関連する１つの共通の異型。共通の多型は、３つの多因子性疾患に関連する：閉塞管疾患、神経管欠損及び結腸癌。ヒト遺伝子は、染色体領域１ｐ３６．３にマッピングされているが、マウス遺伝子は第４染色体の末端に位置される。ヒトとマウスのＭＴＨＦＲ遺伝子の単離と特徴を本明細書において記載する。ヒトゲノムクローン（１７ｂｋ）は、２．２ｋｂの全ｃＤＮＡ配列を含むことが見出され；大きさが１０２ｂｐから４３２ｂｐまでの間の１１エキソンが存在した。イントロンの大きさは、４．２ｋｂの１つの例外を除いて２５０ｂｐから１．５ｋｂまでの間である。マウスのゲノムクローン（１９ｋｂ）は、５’からエキソン１までの７ｋｂに始まり、コード配列の末端まで及ぶ。マウスアミノ酸配列は、それに相応するヒト配列とほぼ９０％ 同一である。エキソンの大きさ、イントロンの境界位置、及びイントロンの大きさもまた、２つの種間で全く同様である。ヒトゲノムクローンの有用性は、エキソンの増幅及び変異検出のためのプライマーを設計する際に有用である。マウスゲノムクローンを、遺伝子ターゲッティングとＭＴＨＦＲ欠損用のマウスモデル作製のための構築物を作製するために用いてもよい。
【０１５５】
アラニンコドンからバリンへ変換する共通の多型であるＣ６７７Ｔは、同定された（Ｆｒｏｓｓｒら、１９９５年）。北アメリカ人の集団においてほぼ３５％の対立遺伝子において存在するこの共通の多型は、熱不安定性異型をコードし、葉酸塩の状態が低い場合に軽度の高ホモシステイン血症になりやすくする（Ｆｒｏｓｓｔら、１９９５年；Ｊａｃｑｕｅｓら、１９９６；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、１９９７年）。この遺伝的−栄養素の相互作用効果は、動脈硬化症と神経管欠損の危険因子であると考えられている（Ｆｒｏｓｓｔら、１９９５年）。反対に、変異体ホモ接合遺伝子型は、結腸癌の危険性を減少する可能性がある。
【０１５６】
ヒトＭＴＨＦＲのゲノム構造の特徴を本明細書において報告している。これらの２種における全遺伝子構成とアミノ酸配列を比較したマウス遺伝子の対応解析もまた示す。
【０１５７】
ゲノムライブラリーのスクリーニング
ゲノムライブラリーをプラークハイブリダイゼーションという一般的な方法を用いてスクリーニングした。２．２ｋｂのヒトｃＤＮＡを放射同位体標識し、ヒトとマウスの両ゲノムライブラリーをスクリーニングする際にプローブとして用いた。ヒト遺伝子のスクリーニングは全ゲノムＤＮＡ由来の部分的ＥｃｏＲＩ分解断片のファージライブラリー（ＡＴＣＣ ＃ ３７３８５）と第１染色体特異的な完全ＥｃｏＲＩ分解断片のファージライブラリー（ＡＴＣＣ＃ ５７７３８）に対して行われた。マウス遺伝子のスクリーニングは、マウス１２９ＳＶ株の全ゲノムＤＮＡからの部分的Ｓａｕ３Ａ分解断片のλＤＡＳＨライブラリーに対して行われた（Ｄｒ． Ｊ． Ｒｏｓｓａｎｔ、Ｔｏｒｏｎｔｏ大学から入手した）。陽性クローンを、スクリーニングと単離を連続的に繰り返すことによって精製し、かつファージＤＮＡをファージＤＮＡ単離用カラム（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて単離した。ヒトクローンをＥｃｏＲＩで分解し、挿入断片を切り離し、その後ＸｂａＩで分解し、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）へのクローニングを容易にした。マウスクローンをＳａｌＩまたはＥｃｏＲＩを用いて分解し、挿入断片をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔへサブクローニングした。
【０１５８】
マウスｃＤＮＡ配列の特徴づけ
マウスゲノムクローンを入手可能な２．２ｋｂのｃＤＮＡのほとんどに及ぶヒトｃＤＮＡプライマーを用いて配列決定した（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ キット、Ａｍｅｒｓｈａｍ社）。その後、これらの配列を用いて、マウス特異的ｃＤＮＡプライマーを作製した。マウス特異的プライマーを逆転写マウス肝臓ＲＮＡ由来の重複しているｃＤＮＡ断片のＰＣＲによる増幅に用いられた。ＰＣＲ産物をＰＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングし、配列決定した。マウスの２つの異なる種（Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ及びｃｔ）を用い、ＲＴ−ＰＣＲによるＭＴＨＦＲ配列を作製し、ＰＣＲプロトコールが配列ミスを生じていないことを確認した。
【０１５９】
イントロンの境界と大きさの特徴づけ、及びヒトとマウスの遺伝子の制限酵素解析
ヒトとマウスのｃＤＮＡ配列由来のプライマーが、各々のゲノムクローンを配列決定するために用いられた。イントロンの境界を、ｃＤＮＡ配列とゲノムクローン配列間の相違領域から、及びスプライスの受容部位と供与部位の同定によって決定した。イントロン配列は連結部から４０〜５０ ｂｐの間に得られ、図１２Ａから１２Ｂ（ヒト）と図１３Ａから１３Ｂ（マウス）において示される。同じｃＤＮＡプライマーを全ゲノムＤＮＡとゲノムクローンのＰＣＲ増幅に使用し、ヒトとマウスの遺伝子におけるイントロンのおおよその大きさを決定した。表６は、２つの種のイントロンの位置とおおよその大きさを列挙する。ＰＣＲ産物を制限酵素分解によって解析し、遺伝子の予備的な制限酵素マップを作製した。その後、この制限マップをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中のゲノムクローンの制限酵素解析によって確認した。
【０１６０】
図１２Ａから図１２Ｂを言及する場合には、かっこ内のｃＤＮＡ内のエキソンの塩基対の位置は公開されたヒトｃＤＮＡ配列に基づいている（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０９８０６）。１番目の塩基対は、元のｃＤＮＡにおけるＡＴＧの１２ ｂｐ上流であり；アステリスクは本明細書において同等の塩基対を示す。第１エキソンはＡＴＧ開始部位（下線）を含み、第１１エキソンは終結コドン（下線）を含む。大文字はエキソンの配列を示し、かつ小文字はイントロンの配列を示す。共通スプライス連結配列に下線を引いている。第１１エキソンの３’境界はポリＡ尾部の位置によって示される。
【０１６１】
図１３Ａから図１３Ｂを言及する場合には、かっこ内のｃＤＮＡ内のエキソンの塩基対の位置は、図１２Ａから図１２Ｂにおけるヒト配列の１番目の同等の塩基対に基づいている（１番目の塩基対はアステリスクによって示される）。第１エキソンは、ＡＴＧ開始部位（下線）を含み、かつ第１１エキソンは終結コドン（二重下線）を含む。大文字はエキソンの配列を示し、かつ小文字はイントロンの配列である。共通スプライス連結配列に下線を引いている。ポリアデニル化部位は未知であるため、第１１エキソンの３’境界は終結コドンとして示される。また第１１エキソンにおいて５２ ｂｐの繰返しエレメントの最初の繰返しにも下線を引いている。
【０１６２】
図１４を言及する場合には、ヒトとマウスのエキソンの大きさは、それぞれ図１２Ａから図１２Ｂ及び図１３Ａから１３Ｂにおいて報告される。エキソンを影をつけたボックスで示す。遺伝子の特徴づけされていない領域は細い線で示し、かつエキソンのナンバリングは図１２Ａから図１２Ｂ及び図１３Ａから図１３Ｂに一致する。Ｅ＝ＥｃｏＲＩ；Ｘ＝ＸｂａＩ；Ａｎ＝ポリアデニル化部位。マウス遺伝子の５’末端におけるＥｃｏＲＩ制限部位は、ファージポリリンカー配列の一部である。
【０１６３】
図１５を言及する場合には、ヒトＭＴＨＦＲ配列と同一である残基を空の箱で示し、かつアミノ酸相同性におけるギャップはダッシュで表される。
【０１６４】
ヒトゲノムクローン
ヒトライブラリーから単離されたゲノムクローンは１６ ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を含んでおり、これは第１エキソンと第２エキソンから第１１エキソンまでの一部、および第１エキソンのほとんどを含む１ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を含む。第１エキソンは以前に公開されたｃＤＮＡ配列由来の大部分の５’エキソンとして定義されており、細菌抽出物においてヒトｃＤＮＡを発現するために用いられたＡＴＧ開始部位を含む（Ｆｒｏｓｓｔら、１９９５年）。ヒト遺伝子の説明図とその制限マップを図３に表す。各々のエキソン配列と５０ｂｐの隣接するイントロン配列を図１２Ａから図１２Ｂにおいて示す。エキソンは大きさが１０２ ｂｐから４３２ ｂｐまでの間であり、５’と３’のスプライス部位の共通配列中の重要なジヌクレオチド（各々ＧＴ及びＡＧ）に下線を引いている。第１１エキソンの３’境界は、ｃＤＮＡのポリアデニル化部位によって定義され；実行可能なポリアデニル化シグナル（ＡＡＣＣＴＡ）は、ポリアデニル化部位の１５ ｂｐ上流に存在するが、それは共通配列と異なる。表６はＰＣＲ増幅によって決定される場合のイントロンの位置とおおよその大きさを列挙しており；イントロンは大きさがおおよそ２５０ ｂｐから４．２ ｋｂまでの間である。
【０１６５】
マウスゲノムクローン
マウスライブラリーから単離されたゲノムクローンは、サブクローニングと特徴づけのためにＥｃｏＲＩを用いて分解された。エキソンの名称は、相当するヒト遺伝子配列に基づいている。図１３Ａから図１３Ｂは、４０ｂｐから５０ｂｐまでの隣接するイントロン配列を持つすべての既知のエキソンとそれらの大きさを列挙している。図１４はヒト遺伝子とアライメントされたマウスゲノム構造の図示する。第１１エキソンの領域の配列はゲノムクローンから直接決定されたので、そのエキソンの大きさは未測定である。終結コドンは遺伝子において３回繰り返される５２ ｂｐの領域内に位置する。これについての意義があるとしても、現時点では不明である。スプライス連結部のジヌクレオチド（図１３Ａから図１３Ｂにおいて下線が引かれている）は、共通配列と一致する。表６はＰＣＲによって決定されるようなイントロンのおおよその大きさ、及びｃＤＮＡ中のそれらの塩基対の位置を列挙している。イントロンは、大きさがおおよそ２５０ ｂｐから４．２ ｋｂまでの間である。
【０１６６】
ヒト遺伝子とマウス遺伝子の比較
ヒト遺伝子とマウス遺伝子は大きさと構造においてかなり類似している（図１４）。イントロンは、大きさが類似しており、コード配列内の位置に関しては同一である。しかしながら、マウスｃＤＮＡの番号を付けた塩基対においてシフトの原因となる第１エキソンにおいて、マウスｃＤＮＡは、１アミノ酸短い（表６、図１３Ａから図１３Ｂ）。第１エキソンは、翻訳開始コドンの存在を元にして元々の公開されたヒトｃＤＮＡから範囲を限定された。ヒトとマウスの両遺伝子において、第１エキソンの５’境界はこの連結部からのオルタネイティブスプライシングにより作製される、いくつかの非コードｃＤＮＡ付加部分の単離後に割り当てられる。これらの５’ ｃＤＮＡ付加部分の特徴づけは、進行中である。ヒトとマウスの遺伝子の塩基配列は、コード領域内ではかなり相同であるが、相同性は３’ ＵＴＲ領域において、及びイントロン内では劇的に減少している。
【０１６７】
ヒトとマウスの一次アミノ酸配列の相同性
ヒトとマウスの一次アミノ酸配列を互いに比較し、細菌由来のＭｅｔＦ（ＭＴＨＦＲ）酵素の配列とアライメントした（図１５）。ヒトとマウスのアミノ酸配列はほぼ９０％が同一である。以前観察されたように、哺乳類の配列の５’側の半分だけがを微生物酵素とアライメントし；細菌のＭＴＨＦＲは、哺乳類の酵素と同様の酵素活性を持つが、Ｃ末端ドメインにおける調節領域が欠失している。ネズミアミノ酸配列は、ヒト配列より２アミノ酸短い：第１エキソンにおいては１アミノ酸少なく、第１１エキソンにおいては１アミノ酸少ない。
【０１６８】
ヒトＭＴＨＦＲ遺伝子の単離と遺伝子構造の解析は、継続中のホモシステイン尿症及び多因子性疾患におけるＭＴＨＦＲ欠陥を調査しようとしている努力の一部である。遺伝子構造情報とイントロン配列の有用性が、ＭＴＨＦＲ欠損に罹患した患者の突然変異解析と５’ 調節領域の特徴づけにおいて有効である。
【０１６９】
細菌発現システムにおける２．２ｋｂのｃＤＮＡの発現解析は、そのｃＤＮＡが触媒活性のある７０ｋＤａのタンパク質になると帰着する（Ｆｒｏｓｓｔら、１９９５年）。この大きさのＭＴＨＦＲポリペプチドは、ウェスタンブロットでヒトの組織において観察されるものもあるが、ブタポリペプチドの推測された大きさに相当するより大きいアイソザイム（７７ｋＤａ）は、全ての検査組織において観察された。これらのデータは、組織特異的でありうるＭＴＨＦＲについてのタンパク質のアイソフォームの存在を示唆した（Ｆｒｏｓｓｔら、１９９５年）。Ｎ末端のブタアミノ酸配列に相同なヒトまたはマウスの配列は同定されていないため、より大きいアイソフォームをコードするために必要とされる欠失配列は、５’から入手可能なｃＤＮＡ配列までであることが推測された。ヒトＭＴＨＦＲについての２つのｍＲＮＡ（ほぼ７．５ｋｂと８．５ｋｂ）が、ノーザンブロットにおいてすべての組織に見出され（データ示さず）、かなり大きいＵＴＲを示唆する。５’コード配列の単離は、第１エキソン中にスプライシングされるいくつかのオルタネイティブスプライシングされた５’非コード性付加部の存在によって複雑にされる。第１エキソン中のオルタネイティブスプライシングは、ヒトＭＴＨＦＲとマウスのＭＴＨＦＲに両方おいて観察される。長いＵＴＲとオルタネイティブスプライシングの結果は、この重要な遺伝子の制御がかなり複雑である可能性を示唆する。
【０１７０】
それにもかかわらず、有用な情報はＭＴＨＦＲ欠損についての様々な型を有する患者における変異の同定に重要である。第１エキソンと第２エキソンにおけるマウスの配列は、マウス胚培養物中のＭＴＨＦＲを首尾よく阻害し、神経管の発達を妨害するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計する際に有用である（Ｌａｎｏｕｅら、１９９７年）。マウスのゲノムクローンの単離と特徴づけは、ＭＴＨＦＲ欠損のためのモデルマウスを作出するためのターゲティングベクターの構築に必要不可欠である。
【０１７１】
【表６】ヒトとマウスのＭＴＨＦＲ ｃＤＮＡにおけるイントロンのおおよその大きさ、及びそれらの位置
2004502469.tif 000012
１ 図１から図２までのイントロンに隣接する塩基対。ｃＤＮＡ配列についての最初の報告のように、１番目の塩基対は、ＡＴＧから１２ ｂｐ上流にある（Ｇｏｙｅｔｔｅら、１９９４年）。
【０１７２】
様々な投与量のメトトレキサート（癌と関節炎、ことによると他の疾患の治療に用いられる薬剤）は、培養中に結腸癌系統に添加される。この変異を保有しない系統と比較して、かなり低い投与量のメトトレキサートは、ＭＴＨＦＲにおける６７７Ｃ／Ｔ変異を保有する系統を殺すために必要とされる。ＩＣ５０（細胞の半分を殺すために必要とされる濃度）は、変異を持つ系統についてはほぼ２０ｎＭ、及び変異を持たない系統についてはほぼ１５０ｎＭである。ヒトの病状に対して推定する場合には、このＭＴＨＦＲ変異を有する患者は、治療のためにより低量なメトトレキサートを必要とする可能性があるか、または高投与量でメトトレキサート毒性にさらされる可能性がある。
【０１７３】
【表７】ＢＭＤ解析の概要
2004502469.tif 000013
表７は、ＭＴＨＦＲのＣ６７７Ｔ 変異について検査された個体の１群における骨の無機質密度についての値を示す。
遺伝子型 １／１＝正常 Ｃ／Ｃ
遺伝子型 １／２＝保有者 Ｃ／Ｔ
遺伝子型 ２／２＝ホモ接合体変異 Ｔ／Ｔ
【０１７４】
表７において見られるように、スコアが低ければ低い程、骨無機質密度が低く、そのために、骨粗鬆症の危険性がより高くなる。結果は、ホモ接合体変異遺伝子型（２／２）はより低い骨無機質濃度に関連し、それによって骨粗鬆症の危険性がより高くなる。
【０１７５】
精神病の診断および治療の転帰
ＭＴＨＦＲ対立遺伝子は、精神病のような神経系障害ならびに抗精神病治療薬により治療することができるその他の疾患および障害の診断、治療、予後判定および薬理遺伝学的のマーカーとしても有用である。
【０１７６】
精神病は、現実との接触の喪失により特徴付けられる重篤な衰弱性精神的疾患であり、かつ下記の症状のいずれかをまた含みうる：妄想、幻覚、思考障害、異常な行動もしくは情動、または社会との接触からの離脱。精神病の未治療の期間は、患者の予後の不良に相関している。
【０１７７】
精神分裂症は、最も一般的な精神病であり、これにおよそ２００万人のアメリカ人が冒されている。遺伝的要因が精神分裂症の病理発生において役割を果たすことはわかっているが、感受性のある遺伝子の同定は困難である。この困難さは、症状の重症度、投薬に対する反応、および長期転帰の変動を含む、精神分裂症表現型の変動性に一部起因している。実際精神分裂症の対象の１／３から１／４が、神経遮断薬とも称される抗精神病治療薬の単独または併用による複数の試験にもかかわらず、重度の症状であり続ける。この変動性は、遺伝的不均質性または修飾遺伝子の存在のような要因を反映しているであろう。神経遮断薬の無反応者と比べ、反応者の群は、高い女対男比、より良い長期転帰、およびドパミン神経伝達の高頻度で傷害された指標を特徴としている。
【０１７８】
現在の神経遮断薬療法は、かなりの数の精神分裂症患者の症状を低下させることができないことに加え、様々な重篤な副作用を引き起すこともある。従来型の神経遮断薬の有害作用の例は、患者の死、発作、不随反復運動（晩発性ジスキネジー）、認知の鈍化、鎮静、体重増加、性的または生殖機能不全、血液悪液質、黄疸、じんま疹および皮膚炎のような皮膚反応、ならびに錐体外路系作用を引き起すことがある心伝導異常を含む。錐体外路系の副作用は、異常な表情、情動不安または一定の運動、ならびに休止時の硬直および振戦（パーキンソン症候群）の状態を含む。従来型の神経遮断薬のこれらの副作用の重症度および低い治療対毒性指標のために、非定型神経遮断薬と称される他の神経遮断薬が最近開発されている。非定型神経遮断薬は、錐体外路系症状および晩発性ジスキネジーの出現率がより低い；しかし、これらは依然、従来型の神経遮断薬において認められるように、体重増加に関連し、かつ血圧および肝機能に作用する。
【０１７９】
精神分裂症の重症度および不均質性のために、精神分裂症のリスクのあるまたはそれに罹患した人々を診断する改善された方法が必要である。改善された方法は更に、特定の診断された個人または個人の群にとって好ましい療法を決定するために望ましい。特定の対象についての好ましい療法の選択は対象が、その対象には無効である療法によるおそらく不可逆性の副作用に耐えることを防止することができる。好ましい療法の他の療法と比べて低下した副作用により、患者の服薬遵守がより大きくもたらされ、更にその療法に関する治療的恩恵の可能性が増大する。
【０１８０】
本発明者らは、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）のＣ６７７Ｔ変異のヘテロ接合型が、健常対照集団と比べ、精神分裂症と診断された患者においてより共通であり、従ってこの疾患のリスク要因であることを発見した。加えて、この変異のヘテロ接合型およびホモ接合型は両方とも、神経遮断薬治療に対する改善された反応および長期転帰に関連している。
【０１８１】
Ｃ６７７Ｔ変異は、低下したＭＴＨＦＲ活性および増加した酵素の熱不安定性を生じるので、同様の特性を有する他のＭＴＨＦＲ遺伝子型またはハプロタイプを、精神分裂症および神経遮断薬に対する改善された反応に関連づけることができる。例えば、別のヒトＭＴＨＦＲの変異である、グルタミン酸をアラニンに転換するＡ１２９８Ｃも、コードされたタンパク質の活性低下を生じ、ならびにＣ６７７ＴおよびＡ１２９８Ｃ変異の両方についてヘテロ接合型である個人は、更に低いＭＴＨＦＲ活性を有し、かつ単独のＣ６７７Ｔ変異を有する個人において観察されたものに比べより高いホモシステインレベルを有する。他の同様の変異は、Ｇ１６７Ａ、Ｇ４８２Ａ、Ｃ５５９Ｔ、Ｃ６９２Ｔ、Ｃ７６４Ｔ、Ｇ／Ａ Ｇ７９２＋１Ａ、Ｃ９８５Ｔ、Ｃ１０１５Ｔ、Ｃ１Ｏ８１Ｔ、Ｔ１３１７Ｃ、およびこれらのＭＴＨＦＲ変異の組合せを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１８２】
本試験において、精神分裂症患者の２群を、長期転帰および神経遮断薬に対する反応の先験的に定義された判定基準に基づいて選択し（優れた反応者および非常に不良の反応者、表８）、ならびに健常志願者の対照群と、「Ｖ対立遺伝子」と称されるＭＴＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド６７７位におけるＣからＴへの置換に関して比較した。
【０１８３】
【表８】患者および対照の個体群統計学的および臨床学的特徴
2004502469.tif 000014
１Ｃにおける年齢＝最初に精神病療養施設に来院した年齢、Ｕ＝未分化、Ｐ＝パラノイア、Ｄ＝分裂、Ｃ＝緊張症、ＢＰＲＳ＝簡易精神症状評価尺度
【０１８４】
ヘテロ接合性およびホモ接合性のＣ６７７Ｔ変異は、精神分裂症患者において対照対象よりも高頻度に認められた（表９）。
【０１８５】
【表９】ＭＴＨＦＲ遺伝子における６６７Ｃ→Ｔ多型の遺伝子型および対立遺伝子関係の解析
2004502469.tif 000015
Ｄ＝優性モデル、Ｒ＝劣性モデル、Ｃ＝対照、Ｒ＝ＮＬＰ反応患者、ＮＲ＝ＮＬＰ非反応患者、Ｐ値は、複数回の試験について補正した。
【０１８６】
加えて、精神分裂症とＭＴＨＦＲ遺伝子の少なくとも１種のＣ６７７Ｔ対立遺伝子の存在の間には、有意な関係があった（χ２＝５．４４、自由度（ｄｆ）＝１、ｐ＝０．０１９）。この関係は、神経遮断薬反応患者において対照と比べ対立遺伝子Ｖの過剰な提示（ｏｖｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）に起因し（χ２＝１６．７７、ｄｆ＝１、ｐ＝０．００００４）；無反応患者は、対照と差がなかった。加えて神経遮断薬反応患者群における少なくとも１種のＶ対立遺伝子保持の寄与割合は７５％であり、これは精神分裂症症例の７５％がこの変異に起因していることを意味している。反応患者とＣ６７７Ｔ変異との間の関係は、男性において女性よりも統計学的により強力であった。
【０１８７】
Ｃ６７７Ｔ変異と精神分裂症との間の関係は、この変異の伝達について劣性モデル（ＶＶ対ＡＶ＋ＡＡ）に加え優性モデル（ＶＶ＋ＡＶ対ＡＡ）の両方において認められた；しかし、後者は、一貫して反応患者と対照とを識別するより大きい検出力を示した（表９））。
【０１８８】
これらの結果は、神経遮断薬投薬に対する良好な反応および良好な長期転帰は、ＭＴＨＦＲ遺伝子の対立遺伝子Ｖに関連した精神分裂症表現型の特徴であることを示している。Ｖ対立遺伝子との関係が神経遮断薬無反応患者の群において認められなかったという事実は、先に示唆したように、これらの２群の患者が病理発生の観点から少なくとも部分的には異なることを示している。対立遺伝子Ｖの発症年齢、神経遮断薬への反応性とは無関係の疾患重症度のマーカーに対する用量作用は、この関係が精神分裂症サブタイプにより媒介される可能性があることを示唆している。従って、Ｃ６７７Ｔ変異の存在または非存在による精神分裂症患者の分類は、精神分裂症の治療または生物学の試験の不均質性を低下させるために有効な戦略であろう。加えて対立遺伝子Ｖの、精神病症状を逆転させる神経遮断薬治療の能力および恐らく未治療の精神病に関連した増悪との関係は、精神分裂症サブタイプとは無関係である神経遮断薬に反応する能力と対立遺伝子Ｖの関係に起因するであろう。
【０１８９】
本発明を特定の理論に結びつけることを意図するものではないが、ＭＴＨＦＲは、普遍的メチル供与体であるＳ−アデノシルメチオニン生成のための炭素基を提供するので、Ｖ対立遺伝子を、ＭＴＨＦＲにより調節された一炭素サイクル代謝（ｏｎｅ−ｃａｒｂｏｎ ｃｙｃｌｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）の障害に関連づけることも可能である。一炭素サイクル代謝の障害は、解毒、ＤＮＡメチル化および生体アミン代謝の調節を含む、多くの経路に必要とされるメチル化反応の欠損を生じ得る。別の可能性は、このＶ対立遺伝子変種が、ホモシステインの血漿濃度を増大させることにより、精神分裂症の重症度のモデレーター（ｍｏｄｅｒａｔｏｒ）として作用することがあることである。実際、ホモシステイン負荷は精神分裂症患者において精神病症状の増悪を生じることが報告されている。
【０１９０】
他のＭＴＨＦＲ対立遺伝子の、精神分裂症もしくは他の疾患、または特定の療法に対する反応との関係は、常法により決定することができる（例えば、国際公開公報第００／０４１９４号；Ｕｅｄａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、９８：２１４８−２１５３（１９９８）；Ｔａｎら、Ｌａｎｃｅｔ、３５０：９９５−９９９（１９９７）；Ｐｏｉｒｉｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９２：１２２６０−１２２６４（１９９５）；Ｓｐｉｒｅ−Ｖａｙｒｏｎ ｄｅ ｌａ Ｍｏｕｒｅｙｒｅら、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ． ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１２５：８７９−８８７（１９９８）；Ｄｒａｚｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２２：１６８−１７０（１９９９）；Ｓｍｅｒａｌｄｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、３：５０８−５１１（１９９８）；Ｋｕｉｖｅｎｈｏｖｅｎら、Ｎｅｗ Ｅｎｇ． Ｊ． ｏｆ Ｍｅｄ．、３３８（２）：８６−９３（１９９８）；Ａａｒｒａｎｚら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、３：６１−６６（１９９８）に記載の方法を参照のこと）。ハプロタイプ決定も、特定の変異または変異の組合せと特定の疾患または特定の療法に対する反応との間の関係を決定するために使用することができる。
【０１９１】
抗精神病療法に関する臨床試験は、以下に説明したようにまたはいずれか他の適当な方法を用いて行うことができる。試験の対象は、関連する多型部位でのそれらのＭＴＨＦＲ遺伝子型に基づいて層化される。この層化は、療法の有効性または安全性についてＭＴＨＦＲ遺伝子型またはハロタイプを補正するために使用することができ、かつ臨床試験の前、途中または後に行うことができる。特定のＭＴＨＦＲ変異またはＭＴＨＦＲ変異の組合せを伴う対象における療法の安全性および有効性の相関は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の認可過程において考慮され、かつ対象の異なるＭＴＨＦＲ亜群の好ましい療法の決定に使用されるであろう。
【０１９２】
簡単に述べると、臨床試験は一般に４つの相からなる：第Ｉ相は、一般に健常志願者が参加している安全性試験である；第ＩＩ相は、病態と診断された対象が参加している用量−範囲設定有効性試験であり；および第ＩＩＩ相は、より大規模な安全性および有効性試験である。第ＩＩＩ相試験から得た有効性のデータが統計学的に有意である場合は、この療法はＦＤＡにより認可される。第ＩＶ相は、認可された適応集団を更に詳細にするために使用されるか、またはひとつの療法を別のものと比較するための医薬品市販後調査である。当業者は、このヒトにおいて療法を試験する過程は、療法の具体的薬物動態もしくは薬力学特性または病態と診断された対象の利用可能度に応じて変更することもできる。例えば、癌の化学療法のような細胞毒性療法は、健常対照対象においては試験されず、かつ一般に第ＩＩ相試験から始まる。
【０１９３】
臨床試験は、標準のプロトコールに従い行うことができる（例えば、Ｓｐｉｌｋｅｒ、「臨床試験指針（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ）」、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、１９９１；Ｔｙｇｓｔｒｕｐ編、「無作為化臨床試験および治療薬決定（Ｔｈｅ Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｅｃｉｓｉｏｎｓ）」Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ；Ｔｈａｌｌ編、「最新臨床試験計画および解析の進歩（Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ）」Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃｔａｒ ７５， Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ， １９９５；および、Ｐｉａｎｔａｄｏｓｉ、「臨床試験：方法論的展望（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ： Ａ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ）」、Ｗｉｌｅｙ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、１９９７を参照のこと）。可能性のある臨床試験プロトコールの例は、プラセボ対照試験、単盲検試験、二重盲検試験、クロスオーバー試験およびその他の試験である。
【０１９４】
療法に対する患者反応の変動に対するＭＴＨＦＲ変異またはＭＴＨＦＲ変異の組合せの寄与を試験するための臨床試験計画に関して、当業者は、特定の臨床試験に適したパラメータを決定するために容易に利用可能な方法を使用することができる。このような因子の例は、試験される遺伝的仮説、統計学的に有意な作用を認めるために必要な対象数（検出力解析）、適当な用量範囲、試験期間、および療法に対する反応を測定するのに適当なエンドポイントを含む。遺伝的仮説試験、検出力解析、および臨床試験各相に対する患者の反応の統計解析を適用することについては、先に説明されている。加えて、ハプロタイプ決定を用い、どの位置でどのＭＴＨＦＲ遺伝子型が特定の療法に対する特定の反応と相関しているかを決定することができる。
【０１９５】
抗精神病療法の臨床試験のエンドポイントは、状態に関連した要因を含むことができる。可能性のあるエンドポイントの例は、試験担当者により与えられた半主観的（ｓｅｍｉ−ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）等級化スケールである。いくつかの標準等級化スケールが開発されかつ臨床試験における療法の有効性の評価の道具として受け入れられており、これは、認知評価、疼痛、心理学、行動および全般の臨床的印象のスケールを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１９６】
精神科疾患の範疇における化合物の臨床試験計画に関する更なる考察は、試験期間に関する。これは、対象が臨床試験前に受けている療法について「ウォシュアウト」（すなわち、療法の除去時点への用量減量）を達成するまでに、数週間から数ヶ月間を要するであろう。加えて多くの抗精神病薬は、用量依存的効能を示し、経験的に臨床での全体の印象および半−主観的等級化スケール解析が治療的用量に到達したことを示すまでに２〜３週間を要することが多い。治療的用量達成のための「ならし（ｒｕｎ−ｉｎ）」期間および臨床試験後の療法からの離脱のための引き続きの用量減量の「枯渇（ｒｕｎ−ｏｕｔ）」期間は両方とも管理された状況下で行われなければならない。
【０１９７】
本発明は、多くの利点を提供する。例えば本明細書に説明された方法は、精神病を予防または遅延するための予防的療法の時宜を得た投与のために、精神病のリスクのある対象を決定することを可能にする。従って精神病のリスク増加の決定は、さもなければ確定診断が必要となるような衰弱性症状が存在する以前に行うことができる。本発明の方法は更に、精神病と変異との関連に関して、ホモ接合性変異を必要とする代わりに、１つのＭＴＨＦＲ対立遺伝子において１つの変異の存在のみを必要とする利点も有し；これは、先にホモ接合性の患者の遺伝子型と優先的に相関された精神分裂症の診断において特に利点である。加えて、ＭＴＨＦＲ対立遺伝子における変異の存在は、標準技術を用い、容易かつ迅速に決定することができる。更に精神病のリスクのあるまたは精神病と診断された対象への好ましい療法の投与は、他の療法の投与と比べ、改善された患者の転帰、改善された薬効、または低下された薬物毒性を生じることができる。これらの結果は、必要な医師の診察または入院の回数を減らすことにより、医療費を削減することができる。
【０１９８】
下記実施例は、本発明を例証するために示している。これはいかなる意味においても本発明を限定するものではない。
【０１９９】
Ｃ６７７Ｔ ＭＴＨＦＲ変異の精神分裂症、療法への反応および長期転帰との関係
患者の選択
無反応性精神分裂症患者（ＮＲ、ｎ＝４３）を、従来型の神経遮断薬に対し治療抵抗性があるので、非定型神経遮断薬で治療するまたは治療した候補として確定された精神分裂症患者リストから選択した。３施設がこれらのＮＲ患者を提供した：ダグラス病院（Ｄｏｕｇｌａｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）、Ｌ． Ｈ． ラフォンテーヌ病院の青少年成人診療所（Ｃｌｉｎｉｑｕｅ Ｊｅｕｎｅｓ Ａｄｕｌｔｅｓ ｏｆ Ｌ．Ｈ． Ｌａｆｏｎｔａｉｎｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）、およびロイヤルオタワ病院の精神分裂症診療所（ｔｈｅ Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ Ｃｌｉｎｉｃ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｏｔｔａｗａ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）。モントリオール市内の地区のわずかにふたつの大学と提携した精神科病院であるダグラス病院とＬ． Ｈ． ラフォンテーヌ病院に付属の外来患者診療所に従事している担当の医師および／または看護師により従来型の神経遮断薬に対し非常に良好な反応者とみなされた全患者のリストから反応性患者（Ｒ、ｎ＝６２）を選択した。
【０２００】
従来型の神経遮断薬に対する反応または抵抗性に関する下記の判定基準を、ＮＲ精神分裂症患者の選択に使用した。ＮＲ患者で、過去２年間に精神病症状の寛解を経験した者はなかった。先の５年間において、ＮＲ患者全員が、少なくとも２種の個別の薬物ファミリー中の従来型の神経遮断薬による、単剤療法については７５０ｍｇクロロプロマジン（ＣＰＺ）同等物もしくはそれより多い、または、神経遮断薬との併用療法については１０００ｍｇ ＣＰＺと等しいかもしくはそれよりも多い用量での、少なくとも３期間の治療を受けていた。少なくとも６週間連続して維持される治療は、症状の有意な低下を生じなかった。最終的に患者全員が、全て、またはほぼ全ての社会的領域および職業活動において監督なしでは職務を果たすことができず、かつ過去１２ヶ月以内に４０より大きい社会評価スコア（ＧＡＳ）を有した（Ｅｎｄｉｃｏｔｔら、Ａｒｃｈ． Ｇｅｎ． Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、３３：７６６−７７１（１９７６））。無反応の決定は、下記の点に特に注意し、医療記録の検討時に調査担当精神科医により行った：（ｉ）思考内容の異常、（ｉｉ）幻覚、（ｉｉｉ）概念の解体、（ｉｖ）運動減退、および（ｖ）情動鈍麻（簡易精神症状評価尺度（ＢＰＲＳ）の第３、４、１２、１３および１５項目）（Ｗｏｅｒｎｅｒら、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｂｕｌｌ．、２４：１１２−１１７（１９８８））。登録時に、ＢＰＲＳ ５項目（３、４、１２、１３、１５）中少なくとも３項目について最低スコアが４（中等度から重度）、合計ＢＰＲＳスコアが少なくとも４５および／またはＣＧＩ（臨床全般改善度）スコアが少なくとも５（顕著な疾患）が必要であった。治療抵抗性に関するこれらの判定基準は、Ｋａｎｅらのものに由来した（Ａｒｃｈ． Ｇｅｎ． Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、４５（９）：７８９−９６（１９８８））。
【０２０１】
選択されたＲ患者の中で、全ての患者が、急性の精神病エピソードのために、少なくとも１回は医療機関の精神科に入院していた。各々の入院期間に、患者は、６〜８週間以内の連続治療で従来型の神経遮断薬による治療に対する反応において完全または部分寛解を経験していた。全ての患者は、社会的領域および職業活動の全て、またはほぼ全てにおいて時折の監督により自発的に職務を果たすことができた。Ｒ患者で、連続神経遮断薬治療下にある時に精神病の増悪のために病院に入院した者は無かった。Ｒ患者は全員、神経遮断薬の投薬を減量または中止した場合に、少なくとも１種の精神病が再発した。寛解は、治療担当精神科医の臨床評価および病院の記録を基に、精神分裂症症状の完全、または限定された症状の残余を伴う準完全な消滅と定義した。登録時に、合計ＢＰＲＳスコアは３０未満であり、１項目より多くの項目でスコア４でありおよび／またはＣＧＩスコアは３未満（境界精神疾患）であった。
【０２０２】
ＮＲおよびＲ患者は両方共、遺伝研究のための精神科診断面接（ＤＩＧＳ）（Ｎｕｒｎｂｅｒｇｅｒら、Ａｒｃｈ． Ｇｅｎ． Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、５１：８４９−８５９（１９９４））を用い直接問診し、かつそれらの医療記録を、調査担当精神科医が包括的に検証した。治療担当精神科医および看護師からの変化に関する包括的情報も入手した。試験時の臨床症状の重症度は、ＢＰＲＳにより評価し、かつＮＲまたはＲ患者の判定基準に合致した診断を、全ての利用可能なデータのベースとした。
【０２０３】
対照患者９０名（Ｃ）は、ＤＩＧＳを基にＤＳＭ−ＩＶ第Ｉ軸の精神障害を有さなかった。
全ての対象は、主にフランス系カナダ人である（５２％）カフカス人であった。本プロジェクトは、各参加機関の治験倫理審査委員会（ＲＥＢ）の承認を受けた。
【０２０４】
遺伝的解析
ゲノムＤＮＡは、常法を用い末梢リンパ球から単離した。標的配列を、Ｆｒｏｓｓｔらの論文（Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、１０（１）：１１１−１１３（１９９５））に公表された手法を用い、ＰＣＲ増幅した。Ｃ６７７Ｔ変異はＨｉｎｆＩ認識配列を作出するので、ＰＣＲ産物をＨｉｎｆＩで切断した。Ｃ６７７Ｔ変異が存在する場合は、１９８ｂｐのＰＣＲ産物は、１７５ｂｐおよび２３ｂｐの断片に消化されたが、野生型（アラニン）対立遺伝子は消化されずに残った（１９８ｂｐ）。消化されたＰＣＲ産物は、９％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、写真撮影した。遺伝子タイピングおよびスコア化を、診断に対して盲検化された者が行った。
【０２０５】
統計解析
精神分裂症の対象群および対照群における対立遺伝子頻度を、自由度１のχ２検定を用い比較した。対立遺伝子Ｖの頻度について患者と対照の間に統計学的有意差が認められたので、引き続き対照の３群（Ｒ、ＮＲおよびＣ）間で対のある比較を行った。試験した対象の集団バイアスを検定するために、両親がフランス系カナダ人である患者および少なくとも一方の親がフランス系カナダ人祖先でない患者についてのＲ、ＮＲおよびＣ患者間の解析も行った。
【０２０６】
Ｃ６７７Ｔ ＭＴＨＦＲ対立遺伝子の頻度を基にした反応群、無反応群、および対照群の比較
ＲおよびＮＲ精神分裂症患者は、年齢および性別の分布に関しては有意に異ならなかった。対照は、ＲおよびＮＲ群と比べ、有意に年齢が高く、かつより多くの女性を含んでいた。試験計画を維持することにおいて、これら２群の精神分裂症患者は、精神病の重症度、医療機関の精神科への初回受診から入院患者となるまでに費やした時間の割合、および精神病療養施設の初回受診時のそれらの年齢において、有意に異なっていた（表８）。
【０２０７】
対立遺伝子Ｖは、精神分裂症患者において、神経遮断薬に対するそれらの反応の質および長期転帰とは無関係に、対照と比べ有意に高頻度であった（χ２＝５．４４、ｄｆ＝１、ｐ＝０．０１９）。しかし最も衝撃的な知見は、患者がそれらの従来型神経遮断薬に対する反応の質および長期転帰に従い層化された場合に認められた。Ｒ患者群は、対立遺伝子Ｖの頻度において、より高い有意な増加を示し（χ２＝１６．７７、ｄｆ＝１、ｐ＝０．００００４）、これはＮＲ群患者とは対照的であった（χ２＝０．０５３、ｄｆ＝１、ｐ＝０．８１）。反応患者の群における少なくとも１種の対立遺伝子Ｖの保持に関するオッズ比は６．８０であり、９５％信頼区間は５．２２から８．８７であった。
【０２０８】
両親がフランス系カナダ人親の対象（χ２＝８．９１、ｄｆ＝１、ｐ＝０．００２）、少なくとも一方が非フランス系カナダ人親の対象（χ２＝６．７１、ｄｆ＝１、ｐ＝０．００９）と個別に比較した場合に、反応者と対照との間の差異に同じパターンが認められた。試験したカフカス人集団全体と比較して両亜集団内で認められた同様の結果では、このデータにおける集団統計学的バイアスの尤度が低下した。性別に従うデータの統計では、男性における有意差（χ２＝１２．６３、ｄｆ＝１、ｐ＝０．０００３）および女性における傾向（χ２＝２．５８、ｄｆ＝１、ｐ＝０．１０）が生じた。
【０２０９】
Ｃ６７７Ｔ変異の伝達の優性モデル（ＶＶ±ＡＶ、対、ＡＡ）および劣性モデル（ＶＶ、対、ＡＶ±ＡＡ）の両方を試験した。両方のモデルについて、神経遮断薬反応患者と対照との間の差異は、全患者群についても親の背景因子について層化した群についても有意であった（表９）。最後に、遺伝子型が群化変数（ｇｒｏｕｐｉｎｇ ｖａｒｉａｂｌｅ）でありおよび発症年齢は結果変数であるＡＮＯＶＡ解析を行った。発症年齢について対立遺伝子Ｖの用量作用の傾向が認められた（Ｆ＝２．４８、ｄｆ＝（２．９４）；ｐ＝０．０８８）。発症時の平均年齢±（ＳＤ）は、遺伝子型ＡＡ、ＡＶおよびＶＶの患者について、各々、１９．１６（４．４９）、２０．９１（５．４２）および２２．５２（５．５３）であった。
【０２１０】
その他の態様
本発明は、特定の態様とともにそれについて記述されているが、一方では、さらに改変でき、この出願が、一般的に、発明の原理に追随し、本発明が属する技術分野内で既知のまたは通例の実施の範囲内で生じ、かつ開示された本明細書の上文の本質的な特徴に適用されてもよく、添付の特許請求の範囲内で理解されるような本発明の開示からのこのような逸脱を含む、本発明の任意の変形、使用、または適用に及ぶことを意図するものであると理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａから１Ｆ】メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）についての最初のｃＤＮＡコード配列（配列番号：１及び配列番号：２）を図示する。
【図２】ヒトメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）、大腸菌（ＥＣＯＭＥＴＦ）及びネズミチフス菌（ＳＴＹＭＥＴＦ）由来のｍｅｔＦ遺伝子、並びに除去修復遺伝子（ｙｓＲＡＤ１）から異なって転写されるサッカロマイセス・セレビシエの未同定のオープンリーディングフレームについてのアミノ酸のアライメントである。
【図３Ａおよび３Ｂ】ＡｒｇからＴｅｒへの置換についての配列決定と制限酵素解析を図示する。
【図４Ａおよび４Ｂ】ＡｒｇからＧｌｎへの置換についての配列決定と制限酵素解析を図示する。
【図５Ａおよび５Ｂ】アラニンからバリンへの置換についての配列変化と制限酵素解析を図示する。
【図６Ａから６Ｃ】ヒトＭＴＨＦＲ ｃＤＮＡの入手可能な全配列（配列番号：３と配列番号：４）を図示する。
【図７Ａおよび７Ｂ】大腸菌ＭＴＨＦＲ ｃＤＮＡの発現解析、各々（図７Ａ）細菌の抽出物と組織についてのウェスタンブロット、及び（図７Ｂ）細菌抽出物の熱不安定性アッセイ法を図示する。
【図８Ａから８Ｄ】ｃＤＮＡについて５７ｂｐのインフレームを欠失させる５’スプライス部位変異の同定を図示する。
【図９Ａから９Ｄ】４変異の診断的制限エンドヌクレアーゼ解析を図示する。
【図１０Ａから１０Ｄ】２変異のＡＳＯハイブリダイゼーション解析を図示する。
【図１１】ヒトメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）とヒトジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）間の相同領域を図示する。
【図１２Ａおよび１２Ｂ】ヒトＭＴＨＦＲ遺伝子の隣接するイントロン配列とエキソン配列を図示する。
【図１３Ａおよび１３Ｂ】マウスＭＴＨＦＲ遺伝子の隣接するイントロン配列とエキソン配列を図示する。
【図１４】ヒトとマウスの両遺伝子のイントロンの大きさと位置を図示する。
【図１５】ヒトＭＴＨＦＲ（ｈＭＴＨＦＲ）、マウスＭＴＨＦＲ（ｍＭＴＨＦＲ）及び細菌ＭｅｔＦ遺伝子（ｂＭＴＨＦＲ）についてのＭＴＨＦＲアミノ酸配列のアライメントを図示する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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