(57)【要約】本発明は、ＦＰプロスタノイド受容体とＰＧＦ２α活性を有する化合物との相互作用を阻害する物質をスクリーニングする方法、前記相互作用を阻害する方法、β−カテニンによって媒介されるシグナル伝達を阻害する方法、及び癌を治療する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＰプロスタノイド受容体とＰＧＦ２α活性を有する化合物との相互作用を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
スクリーニングすべき前記物質にＦＰプロスタノイド受容体を発現している細胞を接触させることと、
前記細胞を前記ＰＧＦ２α化合物に接触させることと、
ＦＰプロスタノイド受容体とＰＧＦ２α化合物との相互作用の有無をアッセイすることと、
を備え、ＦＰプロスタノイド受容体とＰＧＦ２α化合物との相互作用が存在しないことが、前記物質が前記相互作用を阻害することを意味する方法。
【請求項２】
前記アッセイが前記細胞の形態を分析することを備え、細胞の球体化、糸状仮足の喪失、及び細胞凝集物の形成からなる群から前記形態が選択され、ＰＧＦ２α化合物に接触されない細胞と比べて細胞形態に変化が存在しないことが前記相互作用の阻害を意味する請求項１の方法。
【請求項３】
前記アッセイが前記細胞中のアポトーシスを測定することを備えた請求項１の方法。
【請求項４】
前記細胞がＦＰプロスタノイド受容体を内在的に発現している請求項１の方法。
【請求項５】
前記アッセイがＴｃｆ／Ｌｅｆ応答性プロモーターの転写活性を測定することを備えた請求項１の方法。
【請求項６】
前記アッセイが、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ルシフェラーゼレポーター遺伝子、β−ｇａｌレポーター遺伝子、及びその他のレポーターからなる群から選択される検出方法を備えた請求項５の方法。
【請求項７】
前記アッセイが前記細胞中のβ−カテニンのリン酸化のレベルを測定することを備え、前記物質と接触されない細胞中のβ−ガラニンと比べてリン酸化のレベルが増加していることが前記相互作用の阻害を意味する請求項１の方法。
【請求項８】
前記物質が抗体である請求項１の方法。
【請求項９】
前記抗体が前記ＦＰプロスタノイド受容体に結合する請求項８の方法。
【請求項１０】
前記抗体がＰＧＦ２α化合物に結合する請求項８の方法。
【請求項１１】
前記ＰＧＦ２α化合物がＰＧＦ２αである請求項１の方法。
【請求項１２】
前記アッセイが、イノシトールリン酸刺激、Ｒｈｏの活性化、張力繊維形成、及びＰ１２５のリン酸化からなる群から選択される少なくとも一つの要素の変化を測定することを備えた請求項１の方法。
【請求項１３】
前記ＦＰプロスタノイド受容体がＦＰＢである請求項１の方法。
【請求項１４】
ＦＰプロスタノイド受容体とＰＧＦ２α活性を有する化合物との相互作用を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
ＦＰプロスタノイド受容体をコードするポリヌクレオチドを導入し発現させることと、
スクリーニングすべき前記物質にＦＰプロスタノイド受容体を発現している前記細胞を接触させることと、
前記細胞を前記ＰＧＦ２α化合物と接触させることと、
ＦＰプロスタノイド受容体とＰＧＦ２α化合物との相互作用の有無をアッセイすることとを備え、
ＦＰプロスタノイド受容体とＰＧＦ２α化合物との間に相互作用が存在しないことが、前記物質が前記相互作用を阻害することを意味する方法。
【請求項１５】
ＦＰプロスタノイド受容体とＰＧＦ２α活性を有する化合物との相互作用を阻害する方法であって、前記相互作用を阻害することができる物質に前記ＦＰＡを接触させることを備えた方法。
【請求項１６】
β−カテニンシグナル伝達を阻害する方法であって、ＦＰプロスタノイド受容体とＰＧＦ２α活性を有する化合物との相互作用を阻害することができる物質にＦＰプロスタノイド受容体を発現している細胞を接触させることを備えた方法。
【請求項１７】
Ｇ１２及びＧ１３によって媒介されるシグナル伝達を阻害する方法であって、ＦＰプロスタノイド受容体とＰＧＦ２α活性を有する化合物との相互作用を阻害することができる物質にＦＰプロスタノイド受容体を発現している細胞を接触させることを備えた方法。
【請求項１８】
癌を治療する方法であって、癌の治療を必要としている患者に、ＦＰプロスタノイド受容体とＰＧＦ２α活性を有する化合物との相互作用を阻害する物質を、前記相互作用を阻害するのに十分な量で投与することを備えた方法。
【請求項１９】
前記癌が直腸結腸癌である請求項１８の方法。
【請求項２０】
β−カテニンシグナル伝達を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
スクリーニングすべき前記物質に、ＦＰプロスタノイド受容体を発現している細胞を接触させることと、
ＰＧＦ２α活性を有する化合物に前記細胞を接触させることと、
β−カテニンのシグナル伝達活性、リン酸化、及び／又は細胞内分布をアッセイすることと、
を備え、シグナル伝達活性、リン酸化、及び／又は細胞内分布のうちの一以上の変化が前記物質と接触されない細胞と比較したシグナル伝達活性、リン酸化、及び／又は細胞内分布より低いことが、前記物質がβ−カテニンシグナル伝達相互作用を阻害することを意味する方法。
【請求項２１】
物質の癌細胞増殖阻害能をスクリーニングする方法であって、
スクリーニングすべき前記物質に、ＦＰプロスタノイド受容体を発現している細胞を接触させることと、
ＰＧＦ２α活性を有する化合物に前記細胞を接触させることと、
細胞増殖の変化をアッセイすることと、
を備え、細胞増殖の減少が癌細胞の増殖の阻害を意味する方法。
【請求項２２】
前記アッセイが前記細胞の形態を分析することを備え、細胞の球体化、糸状仮足の喪失、及び細胞凝集物の形成からなる群から前記形態が選択され、ＰＧＦ２α化合物に接触されない細胞と比べて細胞形態に変化が存在しないことが前記相互作用の阻害を意味する請求項２１の方法。
【請求項２２】
前記アッセイが前記細胞中のアポトーシスを測定することを備えた請求項２１の方法。
【請求項２３】
前記細胞がＦＰプロスタノイド受容体を内在的に発現している請求項２１の方法。
【請求項２４】
前記アッセイがＴｃｆ／Ｌｅｆ応答性プロモーターの転写活性を測定することを備えた請求項２１の方法。
【請求項２５】
前記アッセイが、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ルシフェラーゼレポーター遺伝子、β−ｇａｌレポーター遺伝子、及びその他のレポーターからなる群から選択される検出方法を備えた請求項２４の方法。
【請求項２６】
前記アッセイが前記細胞中のβ−カテニンのリン酸化のレベルを測定することを備え、前記物質と接触されない細胞中のβ−ガテニンと比べてリン酸化のレベルが増加していることが前記相互作用の阻害を意味する請求項２１の方法。
【請求項２７】
前記物質が抗体である請求項２１の方法。
【請求項２８】
前記抗体が前記ＦＰプロスタノイド受容体に結合する請求項２７の方法。
【請求項２９】
前記抗体がＰＧＦ２α化合物に結合する請求項２７の方法。
【請求項３０】
前記ＰＧＦ２α化合物がＰＧＦ２αである請求項２１の方法。
【請求項３１】
前記アッセイが、イノシトールリン酸刺激、Ｒｈｏの活性化、張力繊維形成、及びＰ１２５のリン酸化からなる群から選択される少なくとも一つの要素の変化を測定することを備えた請求項２１の方法。
【請求項３２】
前記ＦＰプロスタノイド受容体がＦＰＢである請求項２１の方法。
【請求項３３】
前記癌細胞増殖の阻害が癌を治療することを備えた請求項２１の方法。
【請求項３４】
前記方法がインビトロ又はインビボで行われる請求項２１の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、ＦＰプロスタノイド受容体とＰＧＦ２α活性を有する化合物との相互作用を阻害する物質をスクリーニングする方法、前記相互作用を阻害する方法、β−カテニンによって媒介されるシグナル伝達を阻害する方法、及び癌を治療する方法を提供する。
【０００２】
背景の考察
ヒツジのＦＰＡプロスタノイド受容体イソフォームとＦＰＢプロスタノイド受容体イソフォームの一次アミノ酸配列は、アミノ末端と七回膜貫通ドメイン全体が同一であるが、ＦＰＢイソフォームは末端切断されており、ＦＰＡイソフォーム中に存在する最後のカルボキシル末端アミノ酸４６個が欠落している（１）。これは、ｍＲＮＡの選択的スプライシングによって、ヒト及びヒト以外の種に様々なイソフォームが生じているＥＰ３（２）及びトロンボキサンＡ２（３）プロスタノイド受容体と極めて似通っている（４）。これらの受容体イソフォームの生理的な重要性は明らかではないが、セカンドメッセンジャーの共役や受容体の脱感作に関して差異が存在することが示されている。本発明者は、ＦＰＡ受容体イソフォームとＦＰＢ受容体イソフォームが類似の薬理特性を有すること、及びこれらのイソフォームを発現している細胞中で、プロスタグランジンＦ２α（ＰＧＦ２α）がホスホイノシチドのターンオーバーを同程度まで刺激することを発見した（１）。さらに、ＦＰＡ又はＦＰＢを発現している細胞をＰＧＦ２αで刺激するとＲｈｏを活性化して、アクチン張力繊維の形成、ｐ１２５局所接着キナーゼのリン酸化、及び細胞の球体化をもたらす（５）。細胞の球体化には、糸状仮足の退縮と、孤立した樹木状の外観から細胞が球体化して玉石様の小さな凝集体を形成した外観への変化とが伴われる（図１Ａ参照）。しかしながら、ＰＧＦ２αを除去すると、ＦＰＡを発現している細胞は元の樹状形態に戻るが、ＦＰＢを発現している細胞は元の形態には戻らず、球状を保つ（６）。本明細書において、ＰＧＦ２でＦＰＢ発現細胞を最初に１時間処理してから１６時間後に、Ｔｃｆ／βカテニン媒介性転写活性化が上昇することを本発明者らは示す。これは、ＦＰＡ発現細胞には観察されないので、ＦＰＢ発現細胞は、Ｔｃｆ／β−カテニンシグナル伝達経路の持続的活性化のために球状を保つことを示唆している。
【０００３】
他者による従来の研究によって、この経路の刺激が結腸直腸その他の癌の発生と強く関連していることが確証されている。非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）によるシクロオキシゲナーゼ酵素の阻害が、直腸結腸癌の治療及び予防に有益であることもよく知られている。この有益な効果は、プロスタノイド代謝産物の生合成の減少に起因するものと推測されているが、何十もの代謝産物が影響を受けるので、この減少が利益をもたらす具体的な機序は不明である。本発明者らのデータは、受容体に立脚した明白な機序であって、直腸結腸癌の予防と治療におけるＮＳＡＩＤの有益な効果を特定のプロスタノイド代謝産物（ＰＧＦ２α）の減少によって説明できる機序を初めて提供するものである。受容体に立脚したこの機序からは、ＦＰプロスタノイド受容体アンタゴニストであれば、ＰＧＦ２αを選択的に減少するという機能的影響を有しているとほぼ確実に予測することができる。このように、直腸結腸癌の治療と予防において（おそらく、その他の癌の治療と予防においても）、ＦＰプロスタノイド受容体アンタゴニストが薬物として有効であることが合理的に予測される。機能スクリーニングで組換えＦＰプロスタノイド受容体を使用することは、このような薬物として使用することができる既存の物質及び新規な物質を発見する効果的な手段であることも明らかである。ＮＳＡＩＤは、全てのプロスタノイド代謝産物の生合成に必要とされキーポイントとなる酵素（シクロオキシゲナーゼ）を遮断するので、ＮＳＡＩＤの使用に立脚する現在の技術は非特異的である。あまりに多くの代謝産物が影響を受けるので、実際、ＮＳＡＩＤが如何にして有益な作用をもたらすかが極めて不明確である。さらに、ＮＳＡＩＤの使用には、プロスタノイド代謝産物の生合成に対するＮＳＡＩＤの多岐にわたる効果に関連して数多くの弊害が伴う。現在のところ、癌の治療と予防に関する限り、特定のプロスタノイド受容体サブタイプ又はイソフォームの薬理的な遮断に基づいた既存の技術は存在しない。さらに、仮にこのようなアプローチを想定したとしても、このようなアプローチを裏付ける既存のデータで、我々が把握しているデータも存在しない。癌の治療及び予防のために、プロスタノイド受容体アンタゴニストを使用することができることを明確に確証しているので、本発明者らの開示は新規なものである。このようなプロスタノイド受容体アンタゴニストは、有害な副作用が少なく、より有効な可能性があると予測されるであろう。さらに、現在まで、ＦＰ受容体が癌の病態生理に関わっているかもしれないと予測することに明白な合理性は存在しなかったので、抗癌剤の候補を発見するために、組換えＦＰ受容体を使用することには類を見ない。直腸結腸抗癌剤の候補を発見するための現在の技術は非常に非特異的であり、該疾病の治療に、かかる受容体に立脚した機序を考慮に入れていないので、組換えＦＰ受容体をこのような用途に使用することには、顕著な利点が存在するであろう。
【０００４】
【発明の概要】
本発明の目的の一つは、ＦＰプロスタノイド受容体とＰＧＦ２α活性を有する化合物との相互作用を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、スクリーニングすべき前記物質にＦＰプロスタノイド受容体を発現している細胞を接触させることと、前記細胞を前記ＰＧＦ２α化合物に接触させることと、ＦＰプロスタノイド受容体と前記ＰＧＦ２α化合物との相互作用の有無をアッセイすることとを含み、ＦＰプロスタノイド受容体と前記ＰＧＦ２α化合物との相互作用が存在しないことが、前記物質が前記相互作用を阻害することを意味する方法である。
【０００５】
好ましい実施態様では、前記ＦＰプロスタノイド受容体はＦＰＢであり、前記ＰＧＦ２α化合物はＰＧＦ２αである。
【０００６】
本発明の別の目的は、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ルシフェラーゼレポーター遺伝子、β−ｇａｌレポーター遺伝子、及びその他のレポーターから選択される検出方法を用いてアッセイすることである。
【０００７】
本発明の別の目的は、前記阻害物質が抗体である。このような抗体は、ＦＰプロスタノイド受容体又は前記ＰＧＦ２α化合物に結合することができる。
【０００８】
本発明の別の目的は、ＦＰプロスタノイド受容体をコードするポリヌクレオチドを導入し発現させることと、前記ＦＰプロスタノイド受容体を発現している細胞をスクリーニングすべき物質と接触させることと、前記細胞を前記ＰＧＦ２α化合物と接触させることと、ＦＰプロスタノイド受容体と前記ＰＧＦ２α化合物との相互作用の有無をアッセイすることによって、ＦＰプロスタノイド受容体とＰＧＦ２α活性を有する化合物との相互作用を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、ＦＰプロスタノイド受容体と前記ＰＧＦ２α化合物との相互作用が存在しないことが、前記物質が前記相互作用を阻害することを意味する方法である。
【０００９】
本発明の別の目的は、ＦＰプロスタノイド受容体とＰＧＦ２α活性を有する化合物との相互作用を阻害する方法であって、前記相互作用を阻害することができる物質に前記ＦＰプロスタノイド受容体を接触させることによって前記相互作用を阻害する方法である。
【００１０】
本発明の別の目的は、ＦＰプロスタノイド受容体とＰＧＦ２α活性を有する化合物との相互作用を阻害することができる物質にＦＰプロスタノイド受容体を発現している細胞を接触させることによって、β−カテニンシグナル伝達を阻害する方法である。
【００１１】
本発明の別の目的は、ＦＰプロスタノイド受容体とＰＧＦ２α活性を有する化合物との相互作用を阻害することができる物質にＦＰプロスタノイド受容体を発現している細胞を接触させることによって、Ｇ１２及びＧ１３を介したシグナル伝達を阻害する方法である。
【００１２】
本発明の別の目的は、ＦＰプロスタノイド受容体とＰＧＦ２α活性を有する化合物との相互作用を阻害する物質を前記相互作用を阻害するのに十分な量で患者に投与することによって癌を治療する方法である。
【００１３】
本発明の別の目的は、ＦＰプロスタノイド受容体を発現している細胞をスクリーニングすべき前記物質と接触させることと、ＰＧＦ２α活性を有する化合物に前記細胞を接触させることと、β−カテニンのシグナル伝達活性、リン酸化、及び／又は細胞内局在をアッセイすることとによってβ−カテニンシグナル伝達を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、一以上のこれらの特性が変化することが、前記物質がβ−カテニンシグナル伝達相互作用を阻害することを意味する方法である。
【００１４】
本発明の別の目的は、ＦＰプロスタノイド受容体を発現している細胞をスクリーニングすべき前記物質と接触させることと、前記細胞をＰＧＦ２αと接触させることと、細胞増殖の変化をアッセイすることとによって、物質の癌細胞増殖阻害能をスクリーニングする方法であって、細胞増殖が減少することが、前記物質が癌の治療に有用であることの指標となる方法である。ある実施態様では、癌細胞増殖の阻害は、癌を治療するのに有用である物質をスクリーニングすることを含む。
【００１５】
添付の図面と合わせて検討すれば、以下の詳細な説明を参照することによって、本発明のより完全な理解及び本発明に伴う数多くの長所が容易に得られるとともに、よりよく理解されるであろう。
【００１６】
【発明の詳細な記述】
特に定義されていなければ、本明細書に使用されている全ての技術用語及び科学用語は、分子生物学の当業者によって一般的に理解されているものと同一の意義を有する。本発明を実施又は試行する際には、本明細書に記載されているものと類似又は均等な方法及び材料を使用することができるが、本明細書には、適切な方法と材料が記載されている。本明細書に言及されている全ての文献、特許出願、特許、及びその他の引用文献は、その全体が参考文献として援用される。抵触する場合には、本明細書（定義を含む）が優先するものとする。さらに、材料、方法、及び例は例示にすぎず、限定を意図したものではない。
【００１７】
本発明に包含される定義、方法、及び基礎技術を実行する手段が収容されている分子生物学の標準的なテキストを参照されたい。例えば、マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．）、「モレキュラークローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク、１９８２年、及びサンブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．）、「モレキュラークローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク、１９８９年、及びその中に引用されている様々な参考文献を参照されたい。
【００１８】
本明細書で使用されるＰＧＦ２αとは、プロスタグランジンＦ２α、ＰＧＦ２αの類縁体、及びＦＰプロスタノイド受容体へのＰＧＦ２αの作用を模倣する物質を意味するものと理解される。ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質共役型受容体を意味するものと理解される。Ｔｃｆは、Ｔ細胞因子を意味するものと理解される。Ｌｅｆは、リンパ系増強因子を意味するものと理解される。ＦＩＴＣは、フルオレッセインイソチオシアネートを意味するものと理解される。ＤＡＰＩは、４’、６−ジアミジノ−２−フェニルインドールを意味するものと理解される。ＲＴは逆転写を意味するものと理解される。ＰＣＲは、ポリメラーゼ連鎖反応を意味するものと理解される。ＧＳＫ−３βは、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３βを意味するものと理解される。ＡＰＣ（ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ ｃｏｌｉ）は、大腸腺腫症ポリポーシスを意味するものと理解される。
【００１９】
本発明は、哺乳動物中の前癌性及び癌性病変の治療及び予防に有用な可能性がある物質を同定する方法を提供する。
【００２０】
本方法の実施に際しては、ＦＰプロスタノイド受容体を内在又は外在的に発現している細胞を使用することができる。細胞がＦＰプロスタノイド受容体を内在的に発現していない場合には、本分野で公知の手法により、ＦＰＡ受容体をコードする遺伝子を担持している適切なベクターを細胞中に導入することができる。前記ベクターは、導入時に、ＦＰプロスタノイド受容体遺伝子の発現を促進するように適切に構築しなければならない。遺伝子は、本分野で公知の方法を用いて、エピソームに保持させてもよいし、細胞の染色体中に組み込ませてもよい。本発明の方法に利用できるＦＰプロスタノイド受容体遺伝子は、哺乳類種、特に、マウス、ラット、ヒト、ヒツジ、ウシなどから単離されたものである。
【００２１】
物質をスクリーニングする方法は、インビトロ又はインビボで実施することができる。
【００２２】
本発明の中で実施されるアッセイのタイプには、細胞の形態を分析すること（前記形態は、細胞の球体化（ｃｅｌｌ ｒｏｕｎｄｉｎｇ）、糸状仮足（ｆｉｌｏｐｏｄｉａ）の喪失、及び細胞凝集物（ｃｅｌｌ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）の形成からなる群から選択され、ＰＧＦ２αに接触されなかった細胞と比べて、細胞の形態に変化が存在しないことが、相互作用を阻害したことを意味する）、前記細胞中のアポトーシスを測定すること、Ｔｃｆ／Ｌｅｆ応答性プロモーターの転写活性を測定することを備えたアッセイを行うこと、又は前記細胞中でのβ−カテニンのリン酸化レベルを測定すること（前記物質に接触されない細胞中のβ−カテニンに比べてリン酸化のレベルが増加していることが、相互作用が阻害されたことを意味する）が含まれる。ある物質がＦＰプロスタノイド受容体とＰＧＦ２αを上手く阻害するかどうかを決定する、本発明の中で実施されるその他の検出方法には、イノシトールリン酸刺激、Ｒｈｏの活性化、張力繊維形成、及びＰ１２５のリン酸化が含まれる（参考文献６を参照）。
【００２３】
本発明の方法のある実施態様では、本分野において公知であるようなレポーター構築物で細胞をトランスフェクトする。このようなレポーター構築物は、典型的には応答性プロモーター（例えば、Ｔｃｆ／Ｌｅｆプロモーター）を導入することによって、カテニンシグナル伝達効力の変化に感受性を有することが好ましい。レポーター構築物から得られる活性のレベルは、例えば、ノーザンブロット、ドットブロット、プライマー伸長、ＲＮアーゼ保護、ＲＴ−ＰＣＲなどを用いて、転写物レベルの変化を測定することによって求めることができる。あるいは、応答性プロモーターをレポーター遺伝子に機能的に連結することによって、レポーター遺伝子の酵素、蛍光、又は比色活性の変化をアッセイすることにより活性のレベルを測定する。このようなレポーター遺伝子は本分野において公知であり、幾つかの例としてβ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質などが含まれる。これら及びその他の方法、遺伝子、及びベクターは、マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．）、「モレキュラークローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク、１９８２年、及びサンブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．）、「モレキュラークローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク、１９８９年、及びその中に引用されている様々な参考文献に記載されている。
【００２４】
本発明のある実施態様では、ＦＰプロスタノイド受容体とＰＧＦ２αとの相互作用の阻害は、Ｇタンパク質であるＧ１２及びＧ１３によって媒介されるシグナル伝達も阻害する。
【００２５】
本発明は、被検物質が、異常増殖、特に前癌性の病変を安全に治療及び予防する能力をスクリーニングする新規方法に関する。特に、本発明は、阻害及びその他の非特異的相互作用に伴う副作用を最小限に抑えつつ、前癌性病変を含む異常増殖を治療及び予防するために使用することができる被検物質を同定する方法を提供する。
【００２６】
本発明の方法は、新生物を治療又は予防するために使用することができる物質であって、従来のＮＳＡＩＤの重篤な副作用を引き起こさない物質を同定するのに有用である。
【００２７】
癌及び前癌は、制御されない細胞増殖を伴う疾病と考えることができる。細胞増殖には、数多くの様々な因子が関与している。一つの因子は細胞増殖速度であり、別の因子は細胞の死滅速度である。細胞は、環境刺激の種類に応じて、壊死又はアポトーシスによって死滅し得る。細胞分化は、腫瘍の増殖速度に影響を与えるさらに別の因子である。細胞増殖の多数の要素のうち何れが被検物質によって影響を受けたかを決定することは、薬剤療法に対する適切な標的を発見する上で重要である。この選択性に基づいたスクリーニングアッセイは、何れの物質が増殖阻害活性を有するかを決定するための検査と組み合わせることができる。
【００２８】
「前癌性病変（ｐｒｅｃａｎｃｅｒｏｕｓ  ｌｅｓｉｏｎ）」には、組織の異常な新生物性（異形成（ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ）を含む）変化によって表される症候が含まれる。例には、大腸、乳房、前立腺、又は肺組織の異形成増殖、又は皮膚の悪性黒色腫の前段階である異形成母斑症候群（ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｎｅｖｕｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）などの症状が含まれる。異形成母斑症候群に加えて、例には、ポリポーシス症候群、大腸ポリープ、子宮頸管（ｃｅｒｖｉｘ）の前癌性病変（すなわち子宮頸部異形成）、食道、肺、前立腺異形成、前立腺内新生物（ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｉｎｔｒａｎｅｏｐｌａｓｉａ）、乳房及び／又は皮膚、並びに関連症状（例えば、紫外線角膜炎）も含まれる（病変が臨床的に同定できるか否かを問わない）。
【００２９】
「癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）」又は「癌（ｃａｎｃｅｒ）」とは、癌性の病変を指す。例には、悪性黒色腫、乳癌、前立腺癌、及び大腸癌が含まれる。本明細書で使用する「異常増殖（ｎｅｏｐｌａｓｉａ）」及び「新生物（ｎｅｏｐｌａｍｓ）」は、癌性病変と前癌性病変の両方を指す。
【００３０】
別の実施態様では、本発明のスクリーニング法は、物質が腫瘍細胞の増殖を低下させるかどうかを決定することをさらに備える。検査すべき組織に応じて、サンプルには、様々な細胞株を使用することができる。例えば、これらの細胞株には、大腸腺癌、肺腺癌癌腫（ｌｕｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳腺癌、黒色腫株、ケラチノサイト、前立腺癌、及び本分野で一般的に使用されるその他の癌のモデル細胞株が含まれる。これらの細胞株を用いて得られた細胞毒性データは、新生物性病変に対する阻害効果の指標となる。これら及びその他の細胞株は十分に性質が特定されており、新規抗癌剤をスクリーニングするために、本分野で一般的に使用されている。
【００３１】
癌の治療用物質を選択するのに有用な物質をスクリーニングする本発明の方法の一実施態様には、腫瘍進行モデルが含まれる。このモデルには、ＴＰＡを与えることによって細胞を癌状態に誘導することが含まれる。被検物質の逐次投与又は同時投与及び腫瘍進行の軽減は、ＦＰプロスタノイド受容体とＰＧＦ２αとの相互作用が首尾よく阻害されたことの指標となるであろう。
【００３２】
さらに、１００μＭ以下の用量で、約５０％を超える腫瘍細胞増殖の顕著な阻害が得られることも、前記物質が新生物性病変を治療するのに有用であることの指標となる。ＩＣ５０値を求め、比較のために使用することが好ましい。この値は、対照に比して、腫瘍細胞増殖を５０％阻害するのに必要とされる薬物の濃度に等しい。好ましくは、新生物性病変の治療に使用する可能性をさらに検討すべき物質の場合、ＩＣ５０値は、１００μＭ未満とすべきである。適切に阻害されたことの指標の一つは、ＦＰプロスタノイド受容体を保有する細胞におけるアポトーシスの有無をアッセイすることである。アポトーシスを検出する方法には、ＴＵＮＥＬアッセイ及びＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。これら及びその他の方法は、トーメイ、Ｌ．Ｄ．（Ｔｏｍｅｉ，Ｌ．Ｄ．）及びコープ、Ｆ．Ｏ．（Ｃｏｐｅ，Ｆ．Ｏ．）、「Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ（１９９１）」、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎ．Ｙ．）；トーメイ、Ｌ．Ｄ．（Ｔｏｍｅｉ，Ｌ．Ｄ．）及びコープ、Ｆ．Ｏ．（Ｃｏｐｅ，Ｆ．Ｏ．）、「Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ＩＩ：Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ Ｄｉｓｅａｓｅ （１９９４）」、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎ．Ｙ．）デュバール（Ｄｕｖａｌｌ）及びワイリー（Ｗｙｌｌｉｅ）、１９８６、Ｉｍｍｕｎ．Ｔｏｄａｙ ７（４）：１１５−１１９、サンブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．）、「モレキュラークローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク、１９８９年に開示されている。
【００３３】
ＦＰプロスタノイド受容体とＰＧＦ２αとの相互作用を阻害することができる有用な物質の例は、ＦＰプロスタノイド又はＰＧＦ２αの何れかに結合する抗体がある。好ましい実施態様では、ＦＰプロスタノイド受容体に結合する抗体は、受容体の細胞外部分に結合する。このような抗体は、従来の抗体単離法及び抗体産生法を用いて、当業者が容易に取得することができる。このような方法は、ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）及びレーン（Ｌａｎｅ）、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、１９９８（参考文献として本明細書に援用する）に記載されている。
【００３４】
ＦＰプロスタノイド受容体とＰＧＦ２αとの相互作用を阻害することができる物質の単離に成功すれば、動物（好ましくはヒト）への投与に適した薬学的組成物にこの物質を処方するのが有用であろう。このような薬学的組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体を含む。本発明に使用することができる薬学的に許容される担体は特に限定されるものではなく、医学分野で使用することができる賦形剤、結合剤、潤滑剤、着色剤、崩壊剤、緩衝剤、等張剤、防腐剤、麻酔剤などが含まれる。
【００３５】
薬学的組成物は、治療の目的に応じて、適切な任意の投与方法によって与えることができ、注射（皮下、皮内、静脈内、腹腔内など）、点眼、点滴注入、経皮投与、経口投与、吸入などから選択することができる。
【００３６】
投与方法に応じて、注射製剤（溶液、懸濁液、エマルジョン、使用時に溶解させる固体など）、錠剤、カプセル、顆粒、粉末、液体、リポソーム封入、軟膏、ゲル、外用粉末（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｐｏｗｄｅｒ）、スプレー、吸入粉末、点眼、眼軟膏剤、座薬、ペッサリーなどのような投薬形態を適切に選択することができ、本発明の阻害物質は適宜に調合することができる。調合一般は、「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第５巻、ハンシュ（Ｈａｎｓｈ）ら編、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ １９９０の２５．２章に記載されている。
【００３７】
本発明の医薬の用量は、投与の目的（予防、現状維持（悪化の予防）、緩和（症状の改善）、又は治癒）、疾病の種類、症状、患者の性別と年齢に応じて、個別的に設定しなければならない。投与法などは、特に限定されるものではない。
【００３８】
本発明を概説したが、具体的な実施例を参照することによって、さらなる理解を得ることができる。実施例は、例示のために、本明細書に記載したものにすぎず、特に明記されていなければ、限定を意図したものではない。
【００３９】
【実施例】
＜実験の手順＞
免疫蛍光顕微鏡  ヒツジのＦＰＡとＦＰＢプロスタノイド受容体イソフォームを安定に発現しているＨＥＫ−２９３細胞（５）を分割し、２２ｍｍラウンドのカバーガラスを含有する６ウェルのプレート中で３−４日間増殖させた。溶媒のみ（炭酸ナトリウム、最終０．００２％）又は１μＭ  ＰＧＦ２αで細胞を処理し、素早く洗浄し、固定し、β−カテニンに対する１０００倍希釈したマウスモノクローナル抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともにインキュベートした。次いで、それらを洗浄し、４０００倍希釈したＦＩＴＣ抱合ヤギ抗マウス二次抗体（Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートした。４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｓｉｇｍａ）で核を染色した。以前に記載したとおり（６）、位相差顕微鏡と落射蛍光顕微鏡によって細胞を可視化した。
【００４０】
免疫沈降とブロッティング  細胞を掻き取り、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド、０．１ｍｇ／ｍＬ  ロイペプチン、及び２ｍＭ  バナジン酸ナトリウムからなる溶解緩衝液中で音波処理した。４℃で１５分間、サンプルを遠心（１６，０００×ｇ）し、上清（細胞質画分）を除去し、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する溶解緩衝液を用いて沈殿（粒子画分）を可溶化した後再度遠心して、不溶性の破砕物を除去した。免疫沈降の場合、β−カテニンに対する抗体とともにサンプルを４℃で２時間回転させた後、プロテインＧ−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加し、さらに一時間回転させた。溶解緩衝液でセファロースを洗浄し、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液で再懸濁し、煮沸した。７．５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上でサンプルを電気泳動し、ニトロセルロース膜に転写し、β−カテニンに対する抗体とともにインキュベートするか、又はホスホセリンに対するマウスモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）とホスホスレオニンに対するマウスモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）の混合物とともにインキュベートした。膜を洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗マウス二次抗体とともにインキュベートし、増強化学発光（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ，Ｐｉｅｒｃｅ）によって可視化した。ウェスティンら（Ｗｅｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）によるディグナム（Ｄｉｇｎａｍ）法の改変法（７）に従って、核抽出物を調製した。
【００４１】
ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とＤＮアーゼＩで前処理したサンプル当り１μｇのＲＮＡとを用いてＲＴを行った。この後、９４℃５分間で最初のインキュベーションを行った後、９４℃、６０℃、及び６８℃（各々２分間）を２０サイクル、６８℃で１０分間の最終インキュベーションを行うＰＣＲを実施した。ヒトβ−カテニンとＧＡＰＤＨプライマー対は、正確にレズヴァニィ（Ｒｅｚｖａｎｉ）とリュウ（Ｌｉｅｗ）の記載どおりであった。産物のサイズは、β―カテニンでは５２１ｂｐ、ＧＡＰＤＨでは７３７ｂｐであり、１．５％のアガロースゲル上での電気泳動によって分離した。β−カテニンとＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの定量的増幅の最適な条件を見出すために、予備実験を行った。
【００４２】
Ｔｃｆ／Ｌｅｆレポーター遺伝子アッセイ  １０ｃｍのシャーレに細胞を分け、翌日、ＦｕＧＥＮＥ−６（Ｒｏｃｈｅ）及び１０μｇ／シャーレの野生型Ｔｃｆ／Ｌｅｆレポータープラスミド、ＴＯＰフラッシュ、又は変異プラスミドＦＯＰフラッシュのうち何れかを用いて細胞を一過性にトランスフェクトした。ＦＯＰフラッシュは、そのＴｃｆ結合部位が突然変異している点がＴＯＰフラッシュとは異なり、Ｔｃｆ／β−カテニンによって媒介されるシグナル伝達をバックグラウンドから識別する役割を果たす（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。細胞を一晩インキュベートし、溶媒のみ又は１μＭ  ＰＧＦ２αを用いて、３７℃で１時間細胞を処理した。次いで、以前に記載したとおり（６）、各回、２ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって、細胞を素早く３回洗浄し、２５０μｇ／ｍＬのジェネティシン、２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシン  Ｂ、及び１００μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有する１０ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中、３７℃で１６時間インキュベートした。細胞を氷上に置き、氷冷したＰＢＳで２回リンスし、Ｌｕｓｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、抽出物を調製した。Ｔｕｒｎｅｒ  ＴＤ−２０／２０ルミノメータを用いて、該抽出物（約５００ｎｇ  タンパク質／サンプル）中のルシフェラーゼ活性を測定し、対応するＴＯＰ−ＦＬＡＳＨの値から、ＦＯＰ−ＦＬＡＳＨの値を差し引くことによって、バックグラウンドに対する補正を行った。
【００４３】
＜結果＞
図１Ａは、溶媒のみ（パネルａとｃ）又は１μＭ  ＰＧＦ２α（パネルｂとｄ）の何れかで処理してから１時間後の、ヒツジＦＰＡプロスタノイド受容体（パネルａとｂ）又はヒツジＦＰＢプロスタノイド受容体（パネルｃとｄ）の何れかを安定に発現しているＨＥＫ細胞の位相差顕微鏡を示している。ＦＰＡとＦＰＢ発現細胞の両者で、ＰＧＦ２αによる処理によって、糸状仮足の喪失と細胞凝集物の形成からなる形態的な変化がもたらされることが理解できる。以前、本発明者らは、これらの形態的変化には、Ｒｈｏの活性化とｐ１２５局所接着キナーゼのリン酸化が関与していることを示した（５）。しかしながら、ＰＧＦ２αを除去すると、ＦＰＡ発現細胞の形態的変化は急速に（１時間以内）元の状態に戻るのに対して、４８時間後でさえ、ＦＰＢ発現細胞は球形のままであった（６）。このプロセスにおいて他の接着タンパク質が果たし得る役割を調べるために、本発明者らは免疫蛍光顕微鏡を使用して、１μＭ  ＰＧＦ２αを処理した後で、ＦＰＡ又はＦＰＢイソフォームの何れかを安定に発現しているＨＥＫ細胞でのＥ−カドヘリン及びβ−カテニンの分布を調べた。Ｅ−カドヘリンの分布に対する効果は明白ではなかったが（データ示さず）、図１Ｂは、ＰＧＦ２α処理によって、ＦＰＢ発現細胞（パネルｃとｄ）中の細胞と細胞が接触している領域にβ−カテニンが顕著に蓄積するが、ＦＰＡ発現細胞では蓄積していない（パネルａとｂ）ことを示している。しかしながら、ＰＧＦ２α処理を行うと、両細胞株ともにアゴニスト依存性の細胞球体化を示したので（図１Ａ）、細胞の球体化工程自体は、ＦＰＢ発現細胞におけるβ−カテニンの連続的な蓄積の増加の原因ではないことを示唆している。
【００４４】
細胞接着における役割に加えて、β−カテニンは、刺激に依存して細胞質から核へと転移し、Ｔｃｆ／Ｌｅｆ媒介性遺伝子転写の制御に関与するシグナル分子であることが広く認知されている（９−１１）。本発明者らは、従って、ＦＰＡ及びＦＰＢ発現細胞をＰＧＦ２αで処理した後のβ−カテニンの発現の変化について粒子画分と細胞質画分の両者を調べるために、イムノブロッティングを使用した。図２Ａは、ＦＰＡ発現細胞と比べて、ＦＰＢ発現細胞から得た粒子画分及び細胞質画分では、β−カテニンの発現が多いことを示している。さらに、ＰＧＦ２αで処理すると、ＦＰＡ及びＦＰＢ発現細胞の両者で、細胞質のβ−カテニンのレベルが増加したが、粒子画分中のβ−カテニンのレベルには殆ど影響がなかった。これらの同じ実験条件下で、β−カテニンのｍＲＮＡレベルに何らかの差が存在するかどうかを測定するために、逆転写（ＲＴ）後に、ポリメラーゼ（ＰＣＲ）を使用した。図２Ｂは、β−カテニンとＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルが両細胞株について同一であり、ＰＧＦ２αにより影響を受けなかったことを示しており、β−カテニンの発現に差が観察されたのは、翻訳及び／又はタンパク質のターンオーバーの変化の結果であると思われる。
【００４５】
グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）によるβ−カテニンのセリン／スレオニンリン酸化は、β−カテニンに分解の印を付け、β−カテニンのシグナル伝達活性の制御における重要な因子である（１２、１３）。このため、多くの条件下で、細胞質のβ−カテニンはリン酸化されて、腫瘍抑制タンパク質、大腸腺腫症ポリポーシス（ＡＰＣ）、及び足場タンパク質アキシンと会合した後に、ユビキチン化とプロテアソーム分解を受ける（１４）。免疫沈降とイムノブロッティングを用いて、本発明者らは、ＦＰＡ又はＦＰＢ発現細胞の何れかをＰＧＦ２αで処理してから、β−カテニンのセリン／スレオニンリン酸化を調べた。図３は、ＦＰＡ発現細胞では、細胞質β−カテニンの溶媒のみの対照レベルは極めて低く、検出可能なリン酸化が存在しないことを示している（レーンａ）。ＰＧＦ２αで処理すると、細胞質β−カテニンのレベルは増加し、リン酸化が顕著に増加する（レーンｂ）。ＦＰＢ発現細胞では、細胞質β―カテニンの溶媒のみの対照レベルが既に上昇しており、リン酸化も同様である（レーンｃ）。このことは、おそらく、内在性のＧＳＫ−３β活性及び細胞質β−カテニンのレベル上昇に対する緊密を共役を反映しているものと思われる。しかしながら、ＦＰＢ発現細胞をＰＧＦ２αで処理すると、細胞質β−カテニンはさらに増加するが、リン酸化は劇的に減少し（レーンｄ）、ＧＳＫ−３β活性の脱共役又は減少を示唆している。従って、ＦＰＡ発現細胞では、核への移行ではなく細胞質β−カテニンの分解が好まれるのに対して、ＦＰＢ発現細胞ではその逆が当てはまると予測されるであろう。このことは、ＦＰＢ発現細胞（レーンｄ）中のβ−カテニンのレベルが、ＦＰＡ発現細胞（レーンｂ）に比べて、ＰＧＦ２α処理後に有意に高くなることを核抽出物のイムノブロッティングが示している図３において確認されるであろう。
【００４６】
β−カテニンは、核に移行した後、Ｔｃｆ／Ｌｅｆファミリーを構成する転写因子と相互作用することが知られており（１５）、多くの事例では、細胞の分化と形質転換のスイッチとして機能する。かかるシグナル伝達能故に、本発明者らは、ＰＧＦ２αを除去しても、ＦＰＢ発現細胞が元の樹状形態に復帰できないことが、β−カテニンによって媒介される遺伝子発現のスイッチングにより誘導される形質転換現象を意味しているかもしれないという可能性に興味を抱いた。これを調べるために、本発明者らは、Ｔｃｆ／Ｌｅｆ応答性レポータープラスミド（１６）でＦＰＡ又はＦＰＢ発現細胞の何れかを一過性にトランスフェクトし、１μＭのＰＧＦ２αで処理した後に、ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性を測定した。ＦＰＡ発現細胞と比べて、ＦＰＢ発現細胞中では、ルシフェラーゼ活性の基底レベルが上昇している（約３倍）こと、及びＰＧＦ２αで１時間処理した直後にレポーター遺伝子活性を測定しても、何れの細胞株におけるルシフェラーゼ活性も刺激しなかった（データは示さず）ことを本発明者らはまず見出した。しかしながら、図４Ａに示されているように、ＦＰＢ発現細胞に対するＰＧＦ２αの形態的影響は、ＰＧＦ２αを除去した後にも、長時間持続する。このため、最初の１時間にＰＧＦ２αで処理してから（処理後に、洗浄と新鮮な培地への交換を行う）１６時間後に細胞を調べると、ＦＰＡ発現細胞は元の樹状形態に戻るのに対して（パネルｂ）、ＦＰＢ発現細胞は球体及び凝集状態のままである（パネルｄ）。それ故、本発明者らは、同じ時点で、Ｔｃｆ／Ｌｅｆレポーター遺伝子活性を調べた。結果は、図４Ｂに示されている。形態的な知見に沿うように、ＦＰＢ発現細胞は、溶媒のみの対照（カラムｃ）又はＰＧＦ２α処理したＦＰＡ細胞（カラムｂ）のいずれよりもほぼ６．５倍高いルシフェラーゼ活性の持続的な活性化を示す（カラムｄ）。本発明者らは、以前に、ＦＰＢ発現細胞が球状の細胞に復帰できなかったのは、ＰＧＦ２α結合のキネティクスや洗浄操作中におけるＰＧＦ２αの除去が変化したことによるものではないことを報告した（６）。
【００４７】
＜考察＞
本発明者らは、ＦＰＢ発現細胞が、Ｔｃｆ／β−カテニンによって媒介されるシグナル伝達を活性化する能力に関して、幾つかの重要な点でＦＰＡ発現細胞と異なることを示した。第一に、ＰＧＦ２αの刺激によって、ＦＰＢ発現細胞は隣接する細胞との境界にβ−カテニンを蓄積するが、これはＦＰＡ発現細胞では明瞭でない。第二に、ＦＰＡ発現細胞とＦＰＢ発現細胞は何れも、ＰＧＦ２αの刺激によって、細胞質β−カテニンの増加を示すが、ＦＰＡ発現細胞では、β−カテニンのリン酸化の増加がこれに伴い、ＦＰＢ発現細胞では、β−カテニンのリン酸化の減少がこれに伴う。第三に、ＦＰＢ発現細胞は、アゴニストを除去してから１６時間後にも、Ｔｃｆ／Ｌｅｆレポーター遺伝子活性の著しい刺激を示すが、ＦＰＡ発現細胞には実質的に存在しない。明らかに、中心となる制御点は、β−カテニンのリン酸化の差である。このため、アゴニストによって刺激されるＦＰＢ細胞の隣接細胞境界へのβ−カテニンの蓄積は、Ｅ−カドヘリンとの接着的相互作用の増強をもたらす可能性がある。続いて、これがＥ−カドヘリンによる細胞外から細胞内へのシグナル伝達を開始させて、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼとＡｋｔキナーゼを順次活性化させる（１７）。ＡｋｔキナーゼによるＧＳＫ−３βのリン酸化は阻害的であり（１８）、アゴニスト処理したＦＰＢ細胞に見出されるβ−カテニンのリン酸化の減少をもたらす可能性があるので、これには大きな意味があるかもしれない。
【００４８】
最近、メイグスら（Ｍｅｉｇｓ ｅｔ ａｌ．）は、Ｇα１２及びＧα１３の構成的に活性な変異体がＥ−カドヘリンの細胞質ドメインと相互作用し、ＡＰＣを欠く変異体細胞株中にβ−カテニンの放出とＴｃｆ／Ｌｅｆレポーター遺伝子活性の刺激をもたらすことを報告した（１９）。ヘテロ三量体のＧタンパク質とＴｃｆ／β−カテニンシグナル伝達経路との関連についての最初の報告なので、これは興味深い発見である。しかしながら、彼らのモデルは変容されているために、その生理的な妥当性には疑問がある。しかし、本知見に照らすと、ＧＰＣＲとヘテロ三量体のＧタンパク質は何れも、この重要なシグナル伝達経路の活性化に関わっている可能性があるものと思われる。本発明者らは、以前に、ＦＰ受容体がＲｈｏを活性化することを示し、これがＧ１２及び／又はＧ１３の活性化を通じて生じるという仮説を立てた（５）。両受容体イソフォームは、この点では効果が等しく、従って、Ｔｃｆ／β−カテニンシグナル伝達の持続的な活性化は、ＦＰＢイソフォームを発現している細胞だけに観察されたので、Ｇ１２及び／又はＧ１３の活性化のみが本知見の原因であるという可能性はなさそうである。
【００４９】
ＦＰＢ受容体を発現している細胞内でのＰＧＦ２αによるＴｃｆ／β−カテニンシグナル伝達の活性化は、形態的には似通っているが、アゴニスト処理したＦＰＡ細胞中で観察された細胞の球体化とは基本的に異なる表現型の変化をもたらすというのが、これに対する一つの可能な機序である。このように、ＦＰＡ発現細胞における形状変化の維持は、ＰＧＦ２αによる連続的な刺激に依存しており、刺激を除去すると、細胞は元の形態に戻る。これに対して、ＦＰＢ発現細胞における形状変化はＰＧＦ２αによって開始されるが、その維持は、ＰＧＦ２αによるさらなる刺激には依存しておらず、最初のアゴニスト刺激の後に、受容体が継続して存在することさえ必要でないかもしれない。このように、ＦＰＢプロスタノイド受容体は、発育又は悪性転換経路における引き金として機能していると予想される。
【００５０】
これは、ＦＰプロスタノイド受容体のシグナル伝達能に対してかなりの重要性を有し、おそらくは他のＧＰＣＲに対してもかなりの重要性を有する。例えば、黄体サイクルの短い期間にすぎないが、ヒツジ及びウシでは、ＰＧＦ２αは黄体の退縮に対する生理的シグナルであることが知られている。このため、妊娠が生じると、黄体が維持されて、ＰＧＦ２αの黄体溶解作用に対する感受性が失われる（２０）。興味深いことに、ＦＰ受容体の発現は、この推移の間に変化しないようであるが、これらの受容体は、ほぼ完全にＦＰＡイソフォームによって占められる（２１）。黄体サイクルの感応期において少数のＦＰＢ受容体が短時間発現されることが、ＰＧＦ２αの黄体溶解作用を説明することができるかもしれない。実際に、主なイソフォームがＦＰＡである中期のヒツジ黄体のｃＤＮＡライブラリーからＦＰＢイソフォームがクローニングされた（１）。
【００５１】
ＦＰＢイソフォーム又は相同体が関与している可能性がある他の症状は、直腸結腸癌である。Ｔｃｆ／β−カテニンシグナル伝達の活性化の異常が、この疾病の発生と強く関連していること（２２−２４）、及び非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）によるシクロオキシゲナーゼの阻害が腫瘍の進行を遅延させ得ること（２５）は十分に確証されている。しかしながら、シクロオキシゲナーゼの阻害によって多数のプロスタノイド代謝物が影響を受けるので、この有益な効果の具体的な機序は不明確である。本出願に記載した開示は、ＮＳＡＩＤによって引き起こされるＰＧＦ２αの減少が、ＦＰＢプロスタノイド受容体によるＴｃｆ／β−カテニンシグナル伝達の減少をもたらすという機序を支持している。ＰＧＦ２αがインドメタシンの抗腫瘍促進活性を覆し、検査したプロスタノイドの中でＰＧＦ２αがホルボールエステルの腫瘍促進活性を増大させた唯一のプロスタノイドであった皮膚発癌動物モデルによって、この結論は裏付けられる（２６）。ヒツジＦＰＢ受容体のヒトにおける相同体は未だ同定されていないが、機能的なＦＰＢイソフォームを生じさせることができる遺伝的機構、さらには翻訳後機構さえ容易に想像できる。ＡＰＣの既知の突然変異とほぼ同様に、対立遺伝子の多様性、体細胞変異、又はタンパク分解性の切断によるヒトＦＰＡ受容体の末端切断によって、Ｔｃｆ／β−カテニンシグナル伝達の持続的な活性化を与え得る受容体を生じる可能性がある。これらの及びその他の生理的過程においてＦＰＢ受容体が果たし得る役割は興味深いものであり、さらなる研究を待っている。
【００５２】
ＦＰＢイソフォーム又は相同体が関与している可能性があるその他の症状には、毛髪の成長の制御がある。このため、緑内障の治療のためにラタノプロスト（ＰＧＦ２αの類縁体）を与えた患者の中に、治療を受けた眼のまつげ及び隣接する毛髪の多毛症が発生したが、治療を受けていない眼には発生しなかった者が存在する（２７−２８）ことが多数文献に報告されている。この興味をそそる副作用の機序は不明であるが、Ｗｎｔシグナル伝達とＴｃｆ／Ｌｅｆ転写複合体の活性化が、毛包の発育と分化にとって重要であることが最近の研究によって示されている（２９−３０）。本出願に記載した開示は、ＦＰＢイソフォーム又は相同体の活性化が毛包中のＴｃｆ／β−カテニンシグナル伝達経路を刺激して、毛髪の成長を増大させるという機序を支持するものである。
【００５３】
上記の教示に照らせば、本発明に対して数多くの改変及び変形を加え得ることが明らかである。従って、本明細書に具体的に記載されていない発明であっても、添付した特許請求の範囲内において実施できることを理解しなければならない。
【００５４】
【参考文献】
2004531223.tif 000002
2004531223.tif 000003
2004531223.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１】（Ａ）：溶媒のみ（パネルａとｃ）又は１μＭのＰＧＦ２α（パネルｂとｄ）により３７℃で１時間処理した後のＦＰＡ及びＦＰＢ発現細胞の位相差顕微鏡（×２２５）。（Ｂ）：同じ処理後のＦＰＡ及びＦＰＢ細胞のβ−カテニンＦＩＴＣ免疫蛍光（緑）及び核ＤＡＰＩ蛍光（青）顕微鏡（×２２５）。実験の手順に記載されているように、細胞を標識し、顕微鏡用に調製した。結果は、４以上の実験のうち代表的なものである。
【図２】（Ａ）：溶媒のみ（レーンａとｃ）又は１μＭのＰＧＦ２α（レーンｂとｄ）により３７℃で１時間処理した後のＦＰＡ及びＦＰＢ発現細胞から調製した粒子画分と細胞質画分中に存在するβ−カテニンのイムノブロット。（Ｂ）：同じ処理を施した後のＦＰＡ及びＦＰＢ発現細胞から得たβ−カテニン及び対照グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ。イムノブロッティング（１０μｇのタンパク質／サンプル）とＲＴ−ＰＣＲは、実験の手順に記載されているとおりに行った。イムノブロッティングとＲＴ−ＰＣＲの結果は何れも、３つの独立した実験のうち代表的なものである。
【図３】溶媒のみ（レーンａとｃ）又は１μＭのＰＧＦ２α（レーンｂとｄ）により３７℃で１時間処理した後のＦＰＡ及びＦＰＢ発現細胞から得た細胞質画分及び核抽出物中に存在するβ−カテニン（β−ｃａｔ）のイムノブロット（ＩＢ）、並びにセリン／スレオニンリン酸化（ＰＳ／ＰＴ）細胞質β−カテニンのイムノブロット。実験の手順に記載されているように細胞質画分を調製し、β−カテニンに対する抗体でサンプル（１００μｇタンパク質）を免疫沈降（ＩＰ）させ、まず、ホスホセリン及びホスホスレオニンに対する抗体でプローブした（上段）後にこれを外し、β−カテニンに対する抗体で再度プローブした（中段）。核抽出物のイムノブロッティング（下段）は、予め免疫沈降せずに、１０μｇタンパク質／サンプルを用いて行った。結果は、独立した３つの実験のうち代表的なものである。
【図４】（Ａ）：位相差顕微鏡（×２２５）、（Ｂ）：溶媒のみ又は１μＭのＰＧＦ２αでＦＰＡ及びＦＰＢ発現細胞を１時間処理し、薬物を含まない溶媒で徹底的に洗浄し、薬物を含まない溶媒中、３７℃でさらに１６時間インキュベートした後のＴｃｆ／Ｌｅｆ応答性ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性の刺激。トランスフェクション条件、薬物の洗浄除去、及びルシフェラーゼアッセイは、実験の手順に記載されている。ルシフェラーゼデータは、溶媒のみで処理したＦＰＡ細胞に対して標準化されており、各々二組で行った独立した３つの実験の平均±標準誤差である。
【図１】
2004531223.tif 000005
【図２】
2004531223.tif 000006
【図３】
2004531223.tif 000007
【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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