(57)【要約】高親和性モノクロナール抗体を選択するための方法が、このような高親和性抗体を発現するための遺伝子座と共に提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも、抗体軽鎖の可変領域と、連結領域（ｊｏｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）と、重鎖の可変領域と、および選択的に、定常領域とをコードする複数の遺伝子を含む遺伝子座であって、前記コードされる軽鎖領域は、λ軽鎖の配列またはその他の特徴を有する遺伝子座。
【請求項２】
前記遺伝子を発現することができる、請求項１に記載の遺伝子を含む宿主。
【請求項３】
宿主細胞のトランスフェクションのための、請求項１に記載の遺伝子座の使用。
【請求項４】
モノクロナール抗体またはその断片を産生するための方法であって、請求項１に記載の遺伝子を発現することと、選択的に、組換え産物を選択することをも含む方法。
【請求項５】
細胞がモノクロナール抗体またはその断片を産生することができるように細胞を修飾するための方法であって、抗体産生のための宿主の機構を、それが存在する場合には不活性化することと、請求項１に記載の遺伝子を導入することとを含む方法。
【請求項６】
請求項４または請求項５に記載の方法であって、前記モノクローナル抗体またはその断片は、軽鎖および重鎖を含み、また定常領域は、ヒト起源であり、また少なくとも軽鎖の可変領域は、λ軽鎖の配列またはその他の特徴を有する方法。
【請求項７】
前記抗体は、少なくとも１０１０ｌ／ｍｏｌの親和性を有する、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体は、少なくとも１０１３ｌ／ｍｏｌの親和性を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体または断片は、ＦａｂまたはＦｖ断片を含む、請求項４〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
モノクロナール抗体またはその断片のライブラリーであって、少なくとも前記軽鎖は、λ軽鎖の配列またはその他の特徴を有するライブラリー。
【請求項１１】
λ軽鎖である断片を含む、請求項１０に記載のライブラリー。
【請求項１２】
前記抗体は、ヒト化されたか、またはヒトである、請求項１０または請求項１１に記載のライブラリー。
【請求項１３】
前記抗体は、請求項６〜９のいずれか一項に記載の１つまたは複数の特徴を有する、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のライブラリー。
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のライブラリーを示す宿主。
【請求項１５】
高親和性モノクロナール抗体を選択するための方法であって、１つまたは複数のモノクロナール抗体をスクリーニングする工程と、λ軽鎖を有するものを選択する工程とを含む方法。
【請求項１６】
請求項４〜９のいずれか一項に従って産生され、および／または同定されたモノクローナル抗体の医薬における使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高親和性を有するモノクロナール抗体、並びにこのような抗体を同定／産生するための方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】
マウスおよびラットモノクロナール抗体は、広く利用することができるが、ヒト抗体は、外来タンパク質と反応するため、ヒトにおける治療的使用には一般に不適当である。この課題を解決するために、ヒト免疫グロブリンに由来する定常領域と該モノクローナルの可変領域を結合することによるキメラ化齧歯類モノクローナルが提唱されている。このようなモノクローナル抗体を大量に製造するために、キメラ化のための遺伝子またはその他のこのタイプの抗体のための遺伝子を骨髄腫細胞またはその他の宿主細胞株のいずれかにトランスフェクションして発現させることもできる。
【０００３】
齧歯類抗体に関連したもう一つの不都合は、これらの低い親和性である。マウスのモノクローナルの親和定数（Ｋａ）は、典型的には１０１０にすぎない。ヒト化は、しばしばＫａ値を減少するであろうが、材料および実験条件を慎重に選択することにより、もとの値は実質的に保たれるであろう。これは、ヒトにおいて治療に使用することを目的とする高親和性モノクローナルを高生産するための一般的なアプローチであった。
【０００４】
Ｇｒｏｖｅｓ ｅｔ ａｔ， Ｊ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １２６ （１９９０） ２１７−２２２では、マウスのＮＳ１骨髄腫と融合後のプロゲステロンに対する安定な高親和性ヒツジモノクローナルを記載している。ＷＯ−Ａ−９２／１５６９９では、ヒツジモノクロナール抗体を含む高親和性を有する抗体のヒト化について記載する。ＱＷ５７７０４２９は、ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスであって、ヒト重鎖およびヒト軽鎖がマウス細胞ゲノムに安定して組み込まれた導入遺伝子によってコードされるトランスジェニックマウスを開示する。次いで、トランスジェニックマウスは、ヒト免疫グロブリン遺伝子によってコードされる免疫グロブリン鎖を産生することでことができ、ヒト抗原に対する免疫応答を誘発することでことができる。しかし、これらの抗体は、比較的低い親和性を有する。
【０００５】
抗体産生のためには、ＶおよびＪ領域のための遺伝子を含む遺伝子座（または、ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉ−ｌｏｃｕｓ））が、１つの宿主中にクラスタとなって提供されてもよい。発現の際、これらの領域を種々の方法で結合して、多機能な抗体を産生することもできる。
【０００６】
【発明の要旨】
本発明は、高親和性を有するモノクロナール抗体における一般的な特徴を発見したことに基づく。より詳細な結果を以下に示すが、驚くべきことに、モノクロナール抗体の軽鎖を利用することは、これが高親和性で結合するという点において望ましいことが見出された。したがって、軽鎖を有する抗体は既知であるにもかかわらず、このような抗体を選択することは有用なことが今回認められた。このような選択は、種々の方法で達成されるであろう。
【０００７】
本発明の第１の側面にしたがって、少なくとも抗体軽鎖の可変領域と、連結領域（ｊｏｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）と、重鎖の可変領域と、および選択的に、定常領域とをコードする複数の遺伝子を含む遺伝子座であって、前記コードされる軽鎖領域は、λ軽鎖の配列またはその他の特徴を有する遺伝子座が提供される。
【０００８】
本発明の遺伝子座は、適切な宿主中に提供されて、発現されてもよいてもよい。モノクロナール抗体またはその断片を産生するための方法は、上記記載の通りの遺伝子を発現することと、選択的に、組換え産物を選択することをも含む。本発明のさらなる側面にしたがって、細胞がモノクロナール抗体またはその断片を産生することできるように、細胞を修飾するための方法であって、宿主における抗体産生のための機構を、それが存在するならば不活性化することと、上記記載の通りの遺伝子を導入することとを含む方法が提供される。典型的には、モノクロナール抗体またはその断片は、λ軽鎖と、重鎖と、選択的に、ヒト定常領域とを含み、少なくとも軽鎖の可変領域は、λ軽鎖の配列またはその他の特徴を有する。
【０００９】
本発明のさらにもう一つの側面にしたがって、モノクロナール抗体またはその断片のライブラリーであって、軽鎖がλ軽鎖の配列またはその他の特徴を有するライブラリーが提供される。ライブラリーは、ファージまたは別の適切な宿主中に示されてもよい。
【００１０】
本発明は、高親和性抗体を産生するために使用されてもよい。高親和性抗体（たとえば、治療に使用するための）の特段の利点は、：
（ｉ）親和性は、生物反応に関連する。親和性が高くなるにつれ、反応はよりよくなる可能性がある。
【００１１】
（ｉｉ）より高い親和性の抗体は、標的細胞に対する抗体のより迅速な結合、またはより迅速な免疫中和を生じるであろう。これは、抗体または抗体複合体がいっそう局在化するであろうことを意味する。
【００１２】
（ｉｉｉ）より高い親和性とは、用量あたりにより少量の抗体を使用することができ、より経済的に現実的な治療を行うことができることを意味する。これは、重要な点であり、このとき、競合反応が関与する（たとえば、細胞表面または受容体と結合するウイルスまたはリンホカインよりは、ウイルスまたはリンホカインと結合する）。
【００１３】
さらなる側面において、本発明は、高親和性モノクロナール抗体を選択するための方法であって、１つまたは複数のモノクロナール抗体をスクリーニングする工程と、λ軽鎖を有するものを選択する工程とを含む方法を提供する。
【００１４】
もう一つの側面において、本発明は、本発明の方法に従って産生および／または同定されたモノクロナール抗体の医薬における使用を提供する。
【００１５】
【発明の記載】
本発明は、再現的に高親和性を提供するために、κ軽鎖を含む抗体産生を回避することを含む。抗体は、キメラ化してもよく、可変領域のための非ヒトλ軽鎖遺伝子座（すなわち、ＶおよびＪ領域）と、ヒト定常領域（λまたはκのいずれかについて）と、適切な重鎖機構と共に結合してもよい。あるいは、抗体は、可変領域（ＶおよびＪ領域）についてヒトλ軽鎖遺伝子座と、ヒト定常領域（λまたはκのいずれかの）と、適切な重鎖機構とを共に使用して完全にヒトのものであってもよい。
【００１６】
本発明のある側面は、軽鎖可変領域がλである抗体ライブラリーにある。該λ可変領域と、適切な重鎖遺伝子は、たとえば抗体ライブラリ系、ファージまたはリボソーム中に示されてもよい。
【００１７】
典型的には、本発明の抗体は、少なくとも１０１０ｌ／ｍｏｌ、好ましくは少なくとも１０１１ｌ／ｍｏｌ、より好ましくは少なくとも１０１２ｌ／ｍｏｌおよび最も好ましくは１０１３ｌ／ｍｏｌの親和性を有する。親和性は、１０１５ｌ／ｍｏｌと同程度まで高くてもよい。
【００１８】
本発明の好ましい態様において、抗体は、第１に、本発明に従った遺伝子座を組み込んだトランスジェニック動物を作製することによって産生される。
【００１９】
抗体を産生するための適切なトランスジェニック動物は、当業者に既知の技術を使用して発生してもよい。特に、ＵＳ−Ａ−５７７０４２９およびＵＳ−Ａ−５５４５８０７では、動物細胞ゲノムに挿入するための適切な導入遺伝子をデザインする方法を記載する。この技術は、本願明細書において定義された遺伝子座を使用して、導入遺伝子に適応させてもよい。動物に組み込まれた導入遺伝子は、Ｂ細胞発生経路の全体にわたって正確に機能を果たさなければならない。典型的には、導入遺伝子は、少なくとも１つのヒトＩｇ重鎖と、少なくとも一つのヒトＩｇ軽鎖をコードするＤＮＡを含むであろう。ＵＳ−Ａ−５７７０４２９では、多数のＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメント、μＣＨセグメント、少なくとも一つのさらなる重鎖定常領域のための遺伝子セグメントとを、アイソタイプスイッチングに必要とされる全ての必要な配列と共に含む「ミニ遺伝子座」の構築を詳述している。また、これは、λ軽鎖を有する遺伝子座の設計に適応されてもよい。使用可能な状態で連結されて機能的な再編成ができる遺伝子セグメントの多数のコピーを含むことが好ましく、これにより抗体反応における非常に広い多様性を発生することとなる。
【００２０】
適切な抗体を産生するための構築物の作製技術についての実施例がある。これらは、Ｐｏｐｏｖ ＡＶ， Ｚｏｕ Ｘ， Ｘｉａｎ Ｊ， Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ＩＣ， ＢｒＵｇｇｅｍａｎｎ Ｍ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９９ Ｍａｙ １８９：１６１１−２０ ａｎｄ Ｐｏｐｏｖ ＡＶ， Ｂｕｔｚ１ｅｒ Ｃ， Ｆｒｉｐｐｉａｔ ＪＰ， Ｌｅｆｒａｎｃ ＭＰ， Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ Ｍ， Ｇｅｎｅ １９９６ Ｏｃｔ １７７：１９５−２０１を含む。適切な導入遺伝子を調製した後、トランスジェニック動物は、非ヒト動物の生殖系列に適切な導入遺伝子を導入することによって作製することができる。動物の生殖系列（たとえば、初期胚中に）に導入遺伝子を導入するため適切な方法は、当業者に既知であり、たとえば、初期の全能性の胚細胞に導入遺伝子をマイクロインジェクションする。
【００２１】
また、現存するクローン化技術を使用してもよく、これは大きな動物について良い結果が提供されるであろう。これは、受精卵レベルで操作すること、および内因性の免疫グロブリン遺伝子をヒトの同等物と置換するための一段階の方法を使用し、たとえば繊維芽細胞のＤＮＡをクローン化することを含む。これには、いくつかの利点がある；該方法は、迅速であり、しばしば不十分な結果を生じ且つ免疫グロブリンのノックアウト動物を危険にさらす可能性のある繁殖を必要としない。
【００２２】
また、導入遺伝子は、Ｂｒａｄｌｅｙ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９９１； ２：８２３−８２９に記載されたとおりに、相同的組換えによって組み込まれてもよい。
【００２３】
トランスジェニック動物を製造する際に、動物の内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊させて、Ｂ細胞欠損とすることも望ましい。これは、Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９４； ２２（８）： １３ ８９−１３９３によって報告されており、組み込んだ導入遺伝子による抗体産生を改善する。動物における内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊するための方法は、当業者には明らかであろう。１例として、導入遺伝子それ自体が遺伝子座をターゲットして、内因性の産生を破壊することもできる。
【００２４】
トランスジェニック動物は、齧歯類またはより好ましくは、高親和性抗体の産生を補助するでことができる、より大きな動物であってもよい。適切な動物は、ウサギ、ロバ、ヤギ、ウシおよびヒツジである。ヒツジの使用では、機能的なＢ細胞レパートリーを生じさせるために、細胞内メカニズムおよび分子メカニズムの異種間における相違を利用する（Ｗｅｉｌｌ ａｎｄ Ｒｅｙｎａｕｄ， １９９２）。マウスでは、Ｂ細胞前駆体は、骨髄で組換えを受けて、免疫グロブリン遺伝子の組換えを生じる。ヒツジ（反すう動物）では、プライマリーＢ細胞の多様性は、腸関連リンパ系組織における組換えおよび体細胞の過剰変異によって達成される（Ｗｅｉｌｌ ａｎｄ Ｒａｙｎａｕｄ １９９２， Ｄｕｆｏｕｒ ｅｔ ａｌ １９９６）。この相違は、ヒツジによって産生される抗体がより高親和性であることを説明する可能性があり、また、抗原を認識して応答するための免疫系の能力にも重要であろう。マウスおよびヒツジ内へのサンプル複合抗原（たとえば、多数のタンパク質）の接種では、認識されるタンパク質／エピトープに関する種々の免疫グロブリン反応を生じるであろうが、ヒツジでは、より広範なエピトープに応答するであろうことに注目した。この機能は、抗−癌抗体（この場合、研究者は、癌特異的な抗原に対する免疫グロブリン反応を生じるという免疫系の能力に非常に依存している）の分野において商業的に貴重となる。
【００２５】
本発明に従って抗体を産生するために、種々の技術を適用することができる。好ましい態様において、該産物は、（または主に）ヒト起点であり、ヒトで実施される治療方法において、これを満足に使用することができるが、産物中のヒト免疫グロブリンの相対比率は、これを調製する方法に依存するであろう。
【００２６】
総抗体は、重鎖および軽鎖、並びに定常領域および可変領域を含む。可変領域は、抗原結合部位が位置する領域内に、変化しやすいフレームワークおよび高度変異領域を含む。本発明は、その範囲内に抗体断片、たとえばＦ（ａｂ’）２、ＦａｂまたはＦｖ断片を含み、軽鎖がλ軽鎖であるものを提供する。好ましくは、少なくとも軽鎖の部分は、ヒト免疫グロブリン遺伝子に由来する。より好ましくは、本発明の抗体は、ヒトＩｇ遺伝子によってコードされる可変領域および定常領域を含むであろう。
【００２７】
抗体は、本質的に２工程を含む方法によって調製されてもよい。第１に、適切なトランスジェニック動物には、抗原を使用して免疫し、その抗原に対する抗体を分泌するＢ細胞を得る。第２に、高親和性モノクロナール抗体およびこれらをコードする遺伝子を従来のハイブリドーマ技術によって得た後、適切な発現系を含む適切な細胞株中でヒト免疫グロブリンを遺伝子クローニングして発現させる。λ軽鎖を有するこれらの抗体は、本発明に使用される。
【００２８】
ハイブリドーマ技術は、骨髄腫細胞と高親和性ヒト抗体を分泌するＢ細胞を融合することと、反応生成物ハイブリドーマを選択することとを含む。あるいは、適切な生物種に由来するＢ細胞をプレートにまき、選択し、増殖する（たとえば、ＰＣＲ法を使用する）ことができ；選択されたリンパ球からｍＲＮＡを得て、これにより抗体遺伝子を得るために、ファージ回収を使用してもよい。
【００２９】
ハイブリドーマ技術によって高親和性モノクローナルを作製する際に、適切な融合パートナーが選択されるべきである。トランスジェニック動物としてヒツジが使用される場合、もともとＮＳ１細胞株に由来するヒツジ−マウスのへテロ骨髄腫融合パートナーのＳＦＰ１を使用して、ハイブリドーマを調製することもできる。
【００３０】
λまたはκ軽鎖の存在下においてモノクロナール抗体をスクリーニングするための方法は、当業者に周知である。たとえば、抗ラムダ抗体を利用して、ＥＬＩＳＡに基づいた方法を使用することができる。したがって、まず抗原をプレートなどの表面に固定して、スクリーニングされるモノクロナール抗体を添加した後、抗ラムダ抗体を添加する。抗ラムダ抗体は、アルカリホスファターゼなどの酵素に結合されていてもよく、これにより標準的な酵素アッセイを使用した検出を可能にする。あるいは、結合されていない抗ラムダ抗体をさらなる抗体−酵素結合体と共に使用することもできる。適切な試薬の例は、アルカリホスファターゼに結合した抗ヒトのラムダ軽鎖抗体結合体のＳｉｇｍａ Ａ２９０４または抗ヒツジ／ウシのラムダ軽鎖抗体のＶＲＭＤ ＩｎｃのＢＩＧ５Ｏ１Ｅを含む。後者の場合、アルカリホスファターゼなどの酵素に結合した抗マウス抗体を使用する必要があろう。
【００３１】
本発明の抗体は、治療に使用してもよい。癌、炎症、たとえばリュウマチ様の関節炎および臓器移植後の敗血症性ショックの治療に、免疫調節に、ウイルスの治療における受動的免疫療法に、並びに細菌に対する抗体を提供するために、特に価値ある可能性がある。この目的において、抗体は、生理学的に許容できる賦形剤、希釈液またはキャリアと共に適切な組成物中に処方されてもよい。患者にデリバリーするために適切な組成物を処方することは、当業者に明らかであろう。また、抗体のデリバリーは、かなり確立されており、これも当業者には明らかであろう。
【００３２】
本発明の基礎を形成する証拠は、本明細書で記載されているであろう。
【００３３】
ハイブリドーマ融合は、標準的な異種ハイブリドーマ技術を使用して行われ、酸洗浄ＥＬＩＳＡにより、平均的親和性（すなわち、ポリクローナルな集団に関して）より高い値のモノクローナルがスクリーニングされた。軽鎖は、ヒツジλおよびκ軽鎖配列のために設計したプライマを使用し、ＰＣＲクローン化技術によって単離した。
【００３４】
以下の表は、見出された結果を示す。これらは、全ての場合において、高い酸洗浄値（低ｐＨ、高親和性と相関する）がλ軽鎖の存在と関連することを示す。
【００３５】
【表１】
2004516028.tif 000002
【国際公開パンフレット】
2004516028.tif 000003
2004516028.tif 000004
2004516028.tif 000005
2004516028.tif 000006
2004516028.tif 000007
2004516028.tif 000008
2004516028.tif 000009
2004516028.tif 000010
2004516028.tif 000011
2004516028.tif 000012
2004516028.tif 000013
2004516028.tif 000014
2004516028.tif 000015
2004516028.tif 000016
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004516028.tif 000017
【国際調査報告】
2004516028.tif 000018
2004516028.tif 000019
2004516028.tif 000020
2004516028.tif 000021