(57)【要約】本発明は、真核のヒストンＨ１プロテインを含んで成る抗微生物の薬学的組成物、及び病原菌バクテリアを含むがこれに限定されない微生物を殺し又はその成長を阻害する真核のヒストンＨ１プロテインを使用する方法である。本発明は更に、真核のヒストンＨ１を含有する動物用食物及び動物へ食物を与えることにより動物の成長を改良する方法を含む。本発明は更に、抗生物質の薬学的組成物を含む真核のヒストンＨ１、及び前記組成物の使用法を記載した指示用資料を含んで成るキットを含む。更に本発明は真核のヒストンＨ１プロテインを含んで成るワクチン及びワクチンを使用して動物に接種する方法を含む。
2004501056.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物の成長を阻害し及び／又は死滅を誘発するための真核ヒストンＨ１プロテイン。
【請求項２】
請求項１の実質的に精製された真核ヒストンＨ１プロテインを含んで成る抗微生物組成物。
【請求項３】
前記真核ヒストンＨ１プロテインが化学的に修飾されている請求項２に記載の抗微生物組成物。
【請求項４】
前記化学的に修飾された真核ヒストンＨ１プロテインがポリエチレングリコール誘導の真核ヒストンＨ１プロテインである請求項３に記載の抗微生物組成物。
【請求項５】
ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４及びＨ５、ペニシリン、ストレプトマイシン、バンコマイシン、バシトラシン、ポリミキシン、ネオマイシン、クロラムフェニコール、クロルテトラサイクリン、シプロフロキサシン、トブラマイシン、エリスロマイシン、ゲンタミシン、グラミシジン、オキシテトラサイクリン、ノルフロキサシン、抗生物質の塩及び抗生物質のエステルから成る群から選択されるサプリメントの抗生物質を更に含んで成る請求項２から４までのいずれかに記載の抗微生物組成物。
【請求項６】
リゾチームを含んで成る請求項２から５までのいずれかに記載の抗微生物組成物。
【請求項７】
請求項２から６までのいずれかに記載の抗微生物組成物と薬学的に許容できるキャリアを含んで成る薬学的組成物。
【請求項８】
請求項２から７までのいずれかに記載の微生物の成長を阻害し及び／又は死滅を誘発するための組成物の使用方法であって、前記微生物が真核のヒストンＨ１と接触するようにした前記組成物の使用方法。
【請求項９】
少なくとも１種類の抗体に対して耐性を有する微生物の成長を阻害し及び／又は死滅を誘発するための請求項２から８までのいずれかに記載の組成物の使用方法。
【請求項１０】
前記微生物がヒト又は動物の病原体である請求項８又は９に記載の組成物の使用方法。
【請求項１１】
前記病原体がバクテリアである請求項１０記載の組成物の使用方法。
【請求項１２】
前記バクテリアが、エシェリキア・コーリ、クケブシーラ・ニューモニエ、シゲラ株、セラチア・マルセセンス、 バシルス・セレウス、　バシルス・スブチリス、プソイドモナス・エルギノサ、プロテウス・モルガニ、スタフィロコクス・アルブス、サルモネラ・チフィムリウム、サルモネラ・エンテリチディス及びバシルス・メガテリウムから成る群から選択される請求項１１に記載の組成物の使用方法。
【請求項１３】
前記薬学的組成物がヒト又は動物又は植物に投与される該ヒト又は動物又は植物中の微生物の感染を処理するための請求項７から１２までのいずれかに記載の薬学的組成物の使用方法。
【請求項１４】
前記薬学的組成物がヒト又は動物の組織中に注射や点滴をするために適した懸濁の形態である請求項７から１３までのいずれかに記載の薬学的組成物の使用方法。
【請求項１５】
前記組織が血液である請求項１４に記載の薬学的組成物の使用方法。
【請求項１６】
前記薬学的組成物が傷手当て用品の形態である請求項７から１３までのいずれかに記載の薬学的組成物の使用方法。
【請求項１７】
前記傷手当て用品が、クリーム、ジェル、吸収剤及び生理学的に分解できる物質から成る群から選択される請求項１６に記載の傷手当て用品。
【請求項１８】
請求項７から１５までのいずれかに記載の薬学的組成物及び／又は請求項１６又は１７に記載の傷手当て用品、及び微生物を殺すための薬学的組成物及び／又は傷手当て用品の使用法を記した指示用資料及び微生物の成長を阻止するための抗微生物組成物及び／又は傷手当て用品の使用法を記した指示用資料から成る群から選択される指示用資料を含んで成るキット。
【請求項１９】
微生物に対するワクチン調製のための請求項１の真核のヒストンＨ１プロテインの使用方法であって、真核のヒストンＨ１プロテインが少なくとも１種類の微生物株からの微生物を含んで成る微生物の調合剤に添加され、これにより前記微生物が衰え又は殺され、更に前記ワクチンが前記真核のヒストンＨ１プロテインと前記衰え又は殺された微生物を含んで成るヒストンＨ１プロテインの使用方法。
【請求項２０】
請求項１９のワクチンをヒト又は動物に投与することを含んで成る前記ヒト又は動物へのワクチンの使用方法。
【請求項２１】
へパリンを含んで成る真核のヒストンＨ１プロテインに対する解毒組成物。
【請求項２２】
真核のヒストンＨ１プロテインを含んで成る薬学的組成物の使用としてヒト又は動物に投与される真核のヒストンＨ１プロテインの部分的又は全体的な不活性化のために使用され、該ヒストンＨ１の部分的又は全体的な不活性化のための予め定められた量のへパリンが前記ヒト又は動物へ投与される請求項２１記載の解毒組成物の使用方法。
【請求項２３】
真核のヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ２Ａ：Ｈ２Ｂダイマー、Ｈ３及び／又はＨ４及びＨ５の、そして好ましくは真核のヒストンＨ１の予め定められた量を、ヘパリンの部分的又は全体的な不活性化のためにヒト又は動物に投与する、該ヒト又は動物の体内のヘパリンの部分的又は全体的な不活性化のための、真核のヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ２Ａ：Ｈ２Ｂダイマー、Ｈ３及び／又はＨ４及びＨ５の使用方法。
【請求項２４】
牛、豚、鶏肉、魚類及び家庭内の動物を含んで成りこれに限定されない動物の飼育中の微生物感染を防止し又は処理するための請求項２から２０までのいずれかに記載の抗微生物組成物の使用方法。
【請求項２５】
その組成物でサプリメントされた動物用食物を含んで成る、該サプリメントされた動物用食物中で使用される請求項２から１３までのいずれかに記載の微生物的及び／又は薬学的組成物の使用方法。
【請求項２６】
前記組成物でサプリメントされた前記動物用食物を、前記動物に与えることを含んで成るヒトでない動物の成長を改良するための請求項第２５項に記載のサプリメントされた動物用食物の使用方法。
【請求項２７】
肉、魚、ミルク、チーズ、パン、作物、ビール、ワイン及びこれらから調製される任意のものを含んで成りこれらに限定されない固体食物及び／又は飲料を含んで成る食材の製造中のバクテリアの成長を阻害するためであって、前記抗微生物組成物が前記食材へ追加される請求項２から６までのいずれかに記載の抗微生物組成物の使用方法。
【請求項２８】
肉、魚、ミルク、チーズ、パン、作物、ビール、ワイン及びこれらから調製される任意のものを含んで成りこれらに限定されない固体食物及び／又は飲料を含んで成る食材の保存のためであって、前記抗微生物組成物が前記食材へ追加される請求項２から６まで及び２７のいずれかに記載の抗微生物組成物の使用方法。
【請求項２９】
クリーム、ローション、防臭剤、口紅、ペースト、歯磨き粉、歯科用綿、うがい薬、衛生ナプキン又は膣用タンポンを含む化粧品、及び靴の内底の任意のタイプを含んで成り、当抗微生物組成物が個人用ケア用品に添加される個人用ケア用品中で使用される請求項２から１８までのいずれかに記載の抗微生物及び／又は薬学的組成物の使用方法。
【請求項３０】
不要なバクテリアの感染処理に使用される治療用インプラント；及び静脈ライン、静脈ポンプ及び尿のカテーテルを含んで成りこれらに限定されないカテーテル；バンドエイド、傷手当て用品、プラスター、衛生ナプキン又は膣用タンポン中に、真核のヒストンＨ１プロテインが組み入れられ及び／又はその被覆で使用される請求項１から１３までのいずれかに記載の真核のヒストンＨ１プロテインの使用方法。
【請求項３１】
負に帯電したグループを含むようにチタンのインプラントの表面の少なくとも一部の予め決められた部分を化学的に修飾する第１のステップと、前記インプラントを真核のヒストンＨ１と接触させる第２のステップ　を含んで成る請求項３０に記載の真核のヒストンＨ１プロテインを有するチタンインプラントを組み入れられ及び／又は被覆するための方法。
【請求項３２】
不要なバクテリアの感染処理に使用される治療用インプラント；及び静脈ライン、静脈ポンプ及び尿のカテーテルを含んで成りこれらに限定されないカテーテル；バンドエイド、傷手当て用品、プラスター、衛生ナプキン又は膣用タンポンの表面の少なくとも一部の予め決められた部分に、カップリンググループを共有結合させ、該カップリンググループを共有結合的又は静電的相互作用でヒストンに結合する第１のステップと、前記不要なバクテリアの感染処理に使用される治療用インプラント；及び静脈ライン、静脈ポンプ及び尿のカテーテルを含んで成りこれらに限定されないカテーテル；バンドエイド、傷手当て用品、プラスター、衛生ナプキン又は膣用タンポンをヒストンＨ１と接触する第２のステップを含んで成る請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３３】
前記不要なバクテリアの感染処理に使用される治療用インプラント；及び静脈ライン、静脈ポンプ及び尿のカテーテルを含んで成りこれらに限定されないカテーテル；バンドエイド、傷手当て用品、プラスター、衛生ナプキン又は膣用タンポンの少なくとも１つの予め決められた表面の部分を、ヒストンＨ１；及び少なくとも１種類の合成ポリマー及び／又は生物学的な巨大分子を含む少なくとも１種類のポリマーを含んで成る表面層と接触させるようにした 請求項３０から３２までのいずれかに記載の真核のヒストンＨ１プロテインの使用方法。
【請求項３４】
真核のヒストンＨ１プロテインが、少なくとも１種類の合成ポリマー及び／又は生物学的な巨大分子を含む少なくとも１種類のポリマーを含んで成る腐りやすい食物の被覆及び保存のための包装に組み入れられ及び／又はその被覆として使用される請求項１から１３までのいずれかに記載の真核のヒストンＨ１プロテインの使用方法。
【請求項３５】
カップリンググループが、少なくとも１種類の合成ポリマー及び／又は生物学的な巨大分子を含む少なくとも１種類のポリマーを含んで成る腐りやすい食物の被覆及び保存のための包装の表面の少なくとも一部の予め決められた部分に共有結合し、前記カップリンググループが共有結合的又は静電的相互作用でヒストンに結合する第１のステップと、包装をヒストンＨ１と接触させる第２のステップを含んで成る請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記包装の少なくとも一部の表面の少なくとも一部の予め定められた部分を、ヒストンＨ１を含んで成る表面層、及び少なくとも１種類の合成ポリマー及び／又は生物学的な巨大分子を含む少なくとも１種類のポリマーを含んで成る表面層で被覆するようにした請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
表面層が、拡散及び／又は該表面層の生物学的分解により、連続的にヒストンＨ１を放出する請求項３３又は３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明の分野は、抗微生物組成物、キット及びその使用方法である。
背景技術
多数の抗生物質組成物が公知になっており、その中のいくつかは広い範囲の微生物に対する抗生物質としての活性を示し、他のものはグラム陽性菌のような１種類又は数種類の狭い範囲の有機体のみへの抗微生物としての活性を示す。全ての公知の抗生物質に関連する欠点は、微生物特にバクテリアがある条件下でそれらが以前に受け入れた抗生物質に対する耐性を有することができるようになることである。ヒト病原体は、抗生物質耐性を増加させられる微生物に属する。従ってある種の抗生物質が広い範囲の微生物に対して高度に効き目があるとしても、連続して新しい抗生物質組成物を開発し、抗微生物作用の固有の特性に起因して、抗生物質に耐性のある微生物に先んじておくか或いは耐性のある株を発生させないような抗生物質を開発することが必要になる。更に新規な抗生物質の特定を連続して行っておくと、大部分又は全ての公知の抗生物質に耐性を有する微生物の株が現れる可能性を減少させる。
抗生物質に対するバクテリアの耐性は、アメリカ合衆国及び海外の両者において、潜在的にその割合が広がっている重要な問題である。ある調査では、患者から得られたストレプトコクス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の１７，０００のバクテリア単離物の３１％を越えるものがペニシリンに対して耐性を有すると同定された。更に１９９７年に、ニュージャージー州のカムデンで３種の処理できないバンコマイシン耐性のにケースが報告された（ムーレイ、１９９７年、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ． １０２：２８４−２９３）。
多薬剤耐性バクテリアの感染の発生に起因して、過去数年間で抗微生物製品の需要が増大している。米国疾病管理及び防止センターは、抗生物質が米国及び全世界の両者で、最も広く使用されている薬剤の１つであると評価している。可能性のある抗生物質の候補組成物を特定するための強力な研究のための努力は道半ばである。本発明は新規な抗生物質組成物用の継続的な必要性を満足させる。
発明の開示
本発明は微生物の死滅を誘発する方法に関する。該方法は、実質的に精製された真核ヒストンＨ１プロテインを含んで成る組成物に微生物を接触させることを含んで成るものである。これにより微生物の死滅が誘発される。ある態様では、微生物は、エシェリキア・コーリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クケブシーラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、 シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）株、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、 バシルス・セレウス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、　バシルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、プソイドモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、プロテウス・モルガニ（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｏｒｇａｎｉ）、スタフィロコクス・アルブス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・エンテリチディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）及びバシルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）から成る群から選択されるバクテリアのようなヒト病原体である。他の態様では、真核ヒストンＨ１プロテインは、ポリエチレングリコール誘導の真核ヒストンＨ１プロテインのように化学的に修飾されている。
本発明は更に微生物の成長を阻害する方法に関する。この方法は、実質的に精製された真核ヒストンＨ１プロテインを含んで成る組成物に微生物を接触させることを含んで成るものである。
本発明は更に、実質的に精製された真核ヒストンＨ１プロテイン及び薬学的に許容できるキャリアを含んで成る抗微生物の薬学的組成物に関する。この組成物は例えば血のような動物の組織内への注射や点滴用に適した懸濁液の形態であっても良い。更にこの組成物は、例えば傷手当て用品の形態であっても良い。この傷手当て用品は、クリーム、ジェル、吸収剤及び生理学的に分解できる物質から成る群から選択されても良い。ある態様では、前記組成物は、更にヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４及びＨ５、ペニシリン、ストレプトマイシン、バンコマイシン、バシトラシン、ポリミキシン、ネオマイシン、クロラムフェニコール、クロルテトラサイクリン、シプロフロキサシン、トブラマイシン、エリスロマイシン、ゲンタミシン、グラミシジン、オキシテトラサイクリン、ノルフロキサシン、抗生物質の塩及び抗生物質のエステルから成る群から選択されるようなサプリメントの抗微生物を含んで成っても良い。
本発明は更に、本発明の組成物と、微生物を殺すための抗微生物組成物の使用法を記した指示用資料及び微生物の成長を阻止するための抗微生物組成物の使用法を記した指示用資料から成る群から選択される指示用資料を含んで成るキットに関する。例えば前記組成物は、ユニット投薬の形態であっても良い。他の態様では、前記キットはへパリンのようなヒストンＨ１解毒剤を更に含んで成っていても良い。
本発明は更に、動物中での微生物の感染の処理方法に関する。この方法は、実質的に精製された真核のヒストンＨ１プロテインを含んで成る抗微生物組成物を動物に投与することを含んで成る。この動物はヒトのような哺乳類でも良い。更にこの組成物は例えば、経口、イントラペリトニールの経路、静脈の経路及び局所の経路で投与できる。
本発明は更に、あるサイトでの微生物の成長を阻害する方法に関する。この方法は前記サイトに、真核のヒストンＨ１プロテインを含んで成る抗微生物の組成物を供給することを含んで成る。該組成物は例えば、そのサイトへ前記組成物を該サイトへ組み入れることにより供給しても良い。多様な態様において、前記サイトは、食料品の表面又はその中、又は動物の組織の表面又はその中に位置する。他の態様では、前記組成物は、動物の組織へ外科的な手法を通して、又は該組成物をサイトに接触する表面に供給することにより前記サイトに供給する。例えば前記表面は、動物の傷の表面、及び外科的な器具の表面から成る群から選択される。他の態様では、前記サイトは動物の内部であり、この場合は、前記組成物を含んで成る生物的に分解できるインプラントを前記サイトに供給する。
本発明は更に、実質的に精製された真核のヒストンＨ１プロテインを含んで成る抗微生物組成物で補われた動物への食物を含んで成るサプリメントされた動物への食物に関する。
更に本発明はヒトでない動物の成長を改良する方法に関する。この方法は、本発明のサプリメントされた動物への食物を動物に与えることを含んで成る。このヒトでない動物は例えば農場の動物である。
本発明は更に動物のワクチンを調製する方法に関する。この方法は微生物の調製物に、真核のヒストンＨ１プロテインを追加することを含んで成る。これにより微生物が殺され、殺された微生物の調合剤がワクチンになる。
本発明は更に動物にワクチンを与える方法に関し、この方法は本発明のワクチンを動物に投与することえを含んで成る。
本発明は更に、動物にワクチンを与える他の方法に関する。この方法は、衰えた又は殺された微生物及び実質的に精製された真核のヒストンＨ１プロテインを含んで成る組成物を動物に投与することを含んで成る。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、真核のヒストンＨ１プロテインが抗体活性を示すという発見に基づくものである。従って本発明は、真核のヒストンＨ１プロテインを含んで成る抗体組成物に関する。本発明は更に、微生物を殺し、及び／又は微生物の成長を防止し又は減少させる方法にも関し、該方法は微生物を真核のヒストンＨ１プロテインに接触させることを含んで成る。
本明細書で使用される「抗体」とは、抗体活性を示す化学物質である。
本明細書で使用される化学物質は、微生物が接触すると当該物質が微生物を死滅に導くか微生物の成長を禁止するか阻害する場合に、「抗体活性」を示す。
本明細書で使用される化学物質は、該物質が微生物の細胞数又はそのサイズの増加の速度をを減少させ、微生物の増殖速度を減少させ、又は微生物の成長を防止すると、「抗体活性」を示すことになる。
本明細書で使用される「微生物」は、単細胞及び多細胞有機体の両者を含む微視的ディメンジョンの有機体を意味する。一般的に言って微生物はその長手方向のディメンジョンに沿って約２５０μｍより長いが、いくつかの微生物は、非常に大きいディメンジョンを有する広がった多細胞複合体として存在することを理解すべきである。微生物の多細胞複合体は特殊化された細胞のタイプを含まず、従ってこのような複合体は微生物ではなく特殊化された細胞のタイプを有する組織を含んで成る同様のサイズの有機体から区別できる。従って微生物は、原生動物、喪類、菌類、糸状菌、バクテリア及びアーカエ（ａｒｃｈａｅａ）を含むがこれらに限定されない。
真核のヒストンＨ１の毒性濃度は処理している細胞のタイプに依存する。多くの非癌細胞真核細胞のヒストンＨ１の毒性濃度は、約２００又は２５０マイクログラム／ミリリットルを超える。真核癌細胞用のヒストンＨ１の毒性濃度は、約１５０から２００マイクログラム／ミリリットルである。バクテリア細胞用のヒストンＨ１の毒性濃度は、約８０マイクログラム／ミリリットル未満である。
本明細書で使用される「殺菌剤」は、それが接触するとバクテリアを死滅に導く化学物質である。
本明細書で使用される「静的殺菌剤」は、それが接触するとバクテリアの成長を阻害する化学物質である。
本明細書では、天然に存在する形態の微生物に対して抗体活性を示す化学物質が微生物に対して有効でない場合に、微生物が「抗体活性」を示すものとして使用される。
真核のヒストンＨ１を含んで成る組成物
ヒストンＨ１は真核有機体の中で高度に保存されたサイズとアミノ酸シーケンスを有するプロテインである。例えばヒトを含むいくつかの真核有機体は、高度の同族関係を有するヒストンＨ１の複数のサブタイプを含んで成る。ヒストンＨ１は組成物の種とサブタイプに依存して、約２１０個のアミノ酸を含んで成り、約２１キロダルトンの分子質量を有している。ヒストンＨ１のアミノ酸シーケンス及び他の物理的及び化学的な情報はアイセンベルクにより記載されている（１９７９、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４８：１５９−１９１）。
本発明はヒストンＨ１の同族体も提供する。同族体は、天然に存在するプロテインやペプチドから、保存されたアミノ酸シーケンスの差異又はシーケンスに影響を与えない修飾により区別できる。
例えば、プロテインやペプチドの当初のシーケンスとは異なるが、その機能は通常変化していない保存されたアミノ酸を変化させたものは作ることができる。保存されたアミノ酸置換体は、次のグループの置換体を含む。グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、リシン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン。
初期シーケンスを通常は変えない修飾は、インビボ又はインビトロのポリペプチドの化学的誘導、例えばアセチル化やカルボキシル化を含む。更に含まれるのは、合成や加工のプロセスの間又はそれに続く加工プロセス、例えばグリコシル化に影響を与える酵素、例えば哺乳動物のグリコシル化又は脱グリコシル化酵素、にポリペプチドを露出させて、ポリペプチドのグリコシル化のパターンを修飾して得られるようなグリコシル化による修飾である。更に含まれるのは、例えばホスホチロシン、ホスホセリン又はホスホスレオニンのようなホスホリル化されたアミノ酸残基のシーケンスである。
更に含まれるのは、通常の分子生物学的技術を使用して修飾されることにより、プロテイン分解に対する耐性が改良され、又は溶解特性が最適化され、又は治療薬としてより溶解性を高くしたポリペプチドである。このようなポリペプチドの同族体は、天然に存在するＬ−アミノ酸以外、例えばＤ−アミノ酸や天然に存在しない合成アミノ酸のような残基を含むものである。本発明のペプチドは、ここに挙げた特定の例示プロセスの製品に限定されない。
Ｈ１はヒト又は他の真核生物に本来存在するプロテインである。ヒストンＨ１はＤＮＡ超構造と連携すると知られている。ヒト又は動物中で現在使用されている多くの抗体は、菌により生産された物質又はそれに由来するもので、従ってヒトに関しては外来性物質である。他の抗体と比較してヒストンＨ１を使用する利点は、ヒストンＨ１は組織両立性があり、ヒストンＨ１は極端に低い免疫性を示すことである。任意の特定の理論に縛られることなく、ヒストンＨ１がヒト及び動物の免疫システムにより「自己」プロテインと認識されているため、ヒストンＨ１は極端に低い免疫性を示すと信じられている。更に高度のシーケンス同一性と種々の真核生物のヒストンＨ１プロテイン間の関連性は、動物から得られるヒストンＨ１プロテインが他の動物に投与されたときに「自己」プロテインとして認識される可能性を高くしている。
「ヒストンＨ１」という用語が本開示で使用される場合、該用語は任意の真核生物で示されるヒストンＨ１プロテインの任意のサブタイプまで広げられる。好ましくはヒストンＨ１はヒトヒストンＨ１、サブタイプゼロであり、ここでは「ヒストンＨ１」とする。それにもかかわらず、本発明の組成物、キット及び方法は、任意の真核のヒストンＨ１の使用まで広げられる。
ヒストンＨ１は多細胞真核生物の多くの組織から抽出でき、排除／親和クロマトグラフィ及び／又はＨＰＬＣのような標準的な生化学的操作を使用して、９９重量％を超える純度に単離できる（ペーソンら、１９８１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２０：２２９８−２３０１）。米国特許第５，１８２，２５７号明細書に記載されているように、ヒストンＨ１プロテインは例えば抽出により、牛の胸腺から調製できる。ヒストンＨ１は、Ｅ．ｃｏｌｉやイーストを使用する発現システムのような組替え発現システムを使用して発現することもできる（リンダーら、１９９４，　Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２８２２−２８３５；ゲーチマンら、１９９４，Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆ．５：２４２−２５１）。本発明の組成物、キット及び方法中で使用されるヒストンＨ１プロテインは実質的に精製されたヒストンＨ１プロテインの形態であることが好ましい。
本明細書で使用される「実質的精製された」ヒストンＨ１プロテインは、それに天然に同伴する成分から分離されたものである。典型的には、試料全量中の少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７０−８０％、更により好ましくは９０％、更に最も好ましくは９９％（湿潤又は乾燥重量あるいはモル分率のいずれかで評価した場合）がヒストンＨ１であれば、ヒストンＨ１は実質的に純粋である。純度は、ポリペプチドの場合、カラムクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、又はＨＰＬＣ分析のような任意の適切な方法で測定できる。実質的に純粋なヒストンＨ１プロテインは、細胞中に通常同伴するプロテインの好ましくは９０重量％を超える純度で、より好ましくは９９重量％を超える純度で分離される。
本発明は、ヒトの中の病原性の株や、ペニシリン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン及びバンコマイシンのような既知の抗体に耐性を示す株を含みこれらに限定されない多数のバクテリア株に対してヒストンＨ１が強力な抗体活性を示すという発見を含んでいる。比較的純粋でないこのプロテインの調合剤（つまり７０〜８０重量％のヒストンＨ１）が抗体効果を示す。本明細書に記載した実験は、高度に精製した（ＨＰＬＣで確認した純度＞９９重量％）ヒストンＨ１又はＥ．ｃｏｌｉで発現した高度に精製した組替えヒストンＨ１を使用して行った。当業者は個々で述べた抗体効果がヒストンＨ１に帰するものと理解するであろう。
本発明の組成物、キット及び方法で有用な真核のヒストンＨ１プロテインは、化学的に修飾されたヒストンＨ１である。ヒストンＨ１は修飾して血清のハーフタイムを増加させたり、潜在的な抗原性を減少させる。例示すると、プロテインはポリエチレングリコール誘導の真核ヒストンＨ１プロテインである。例示すると、ヒストンＨ１は既知の方法を使ってポリエチレングリコールと共有結合で複合体化できる。これらの方法は、口語的に「ＰＥＧ化」として参照される。更に約２０までのアミノ酸残基は、プロテインにより示される抗体活性に重要な影響を与えることなく、アミノ又はカルボキシ末端のいづれか又は両者から除去できる。これらの修飾は従来技術として記載されている（アイセンベルクらの上記文献）。
本明細書で使用される「化学的に修飾された」ヒストンＨ１プロテインは、プロテインの天然任意存在する形態と比較して、ヒトの患者の血管にそれを投与したときの抗原性又は免疫性を減少させる化学的な置換基を少なくとも１つ含んで成るように処理されたものである。ヒストンＨ１プロテインの抗原性減少処理の例は、ヒストンＨ１プロテインに共有結合的にポリエチレングリコールを付加することである。
ヒストンＨ１に特定して結合しているモノクロナール抗体が公衆に対して提供され、血清や他の組織又は液体中でヒストンＨ１の濃度追跡のために使用できる。このような抗体は、例えばカリフォルニア州サンロモンのバイオジェネックス社から入手できる。
本発明は、本明細書で述べたように、実質的に精製された真核のヒストンＨ１プロテイン及び薬学的に受け入れられるキャリアを含んで成る抗微生物薬学的組成物基を含む。該組成物は、血のような動物組織中に注射し注入するためにてきしたものであること、又は傷手当て用品の形態中の組成物と共に、局部への適用に適したものであることが好ましい。例えばこのような傷手当て用品は、クリーム、ジェル、吸収剤及び生理学的に分解できる物質から成る群から選択される。
抗微生物活性がアルギニン富化ヒストンに関し記述されているが、ヒストンＨ１のようなリシン富化ヒストンが抗微生物活性を示さないという報告があった（ヒルシュ、１９５８， Ｊ． Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １０８：９２５−９４４）。本発明の抗微生物薬学的組成物は、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４及びＨ５から成る群から選択されるようなサプリメント抗体を更に含んで成っても良い。その替わりに、本発明の抗微生物薬学的組成物は、バシトラシン、ポリミキシン、ネオマイシン、クロラムフェニコール、クロルテトラサイクリン、シプロフロキサシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、バンコマイシン、トブラマイシン、エリスロマイシン、ゲンタミシン、グラミシジン、オキシテトラサイクリン、ノルフロキサシン及びこれらの抗生物質の塩及びエステルから成る群から選択されるようなサプリメントの抗生物質を更に含んでいても良い。
本発明は、活性成分として真核のヒストンＨ１プロテインを含んで成る薬学的組成物の調製及び使用まで広がる。このような薬学的組成物は、対象への投与に適した形態のヒストンＨ１プロテイン単独から成っても良い。その替わりに、前記薬学的組成物は、ヒストンＨ１プロテイン、１又は２以上の化学的に受け入れられるキャリア、１又は２以上の付加的な成分、又はこれらの組み合わせを含んで成っても良い。これらの薬学的組成物のうちの１つ組成物の対象への投与は、本明細書の他の開示で述べたように、微生物を殺すか微生物の成長を阻害する。ヒストンＨ１プロテインは、周知の通り、生理学的に受け入れられるカチオンやアニオンとの組み合わせのような生理学的に受け入れられるエステル又は塩の形態の薬学的組成物中に存在しても良い。
本発明は核酸解読ヒストンＨ１を含んで成る核酸ベクターの使用まで広がる。核酸ベクターも既知の促進剤、抑制剤、作動遺伝子、及び他の調整シーケンスから成っても良く、これにより患者に核酸ベクターを与えた後に、ヒストンＨ１の発現を制御できる。本発明は、ヒストンＨ１を解読する核酸ベクターを含んで成りかつ存在のベクターからヒストンＨ１を発現する細胞まで広がる。
本明細書で使用される「薬学的に受け入れられるキャリア」は、ヒストンＨ１プロテインが組み合わされ、組み合わせ後にヒストンＨ１プロテインを対象に投与できる化学的組成物を意味する。
本明細書で使用される「生理学的に受け入れられる」エステルや塩は、薬学的組成物の他の成分と両立しかつ組成物が投与される対象に有害でないヒストンＨ１プロテインのエステル又は塩の形態を意味する。
本明細書で述べた薬学的組成物の配合剤は、薬学の技術で既知の又はその後に開発される任意の方法で調製できる。このような調製方法は一般に、ヒストンＨ１プロテインをキャリア又は１又は２以上の他のアクセサリー成分と接触させるステップを含み、次いで必要又は望ましいのであれば、製品を望ましい単一又は多数回投薬ユニットを成形し又は包装する。
本明細書の薬学的組成物の記載は、ヒトへの倫理的な投与に適した薬学的組成物を原理的に指向しているが、このような組成物は一般的に全て種類の動物への投与に適していることを当業者は理解すべきである。前記組成物を、種々の動物への投与のために適したものにするための、ヒトへの投与に適した薬学的組成物の修飾は良好に理解され、当業者である獣医である薬学者は、必要ならば簡単な通常実験でこのような修飾を設計し実行するであろう。本発明の薬学的組成物が投与される対象は、ヒト及び他の霊長類、及び牛、豚、馬、羊、猫及び犬、更にニワトリ、アヒル、ガチョウ及び七面鳥のような鳥、農場で飼育される魚及びアクアリウムの魚、及び農場で育った貝のような甲殻類を含む魚を含み、これらに限定されない。
本発明方法で有用な薬学的組成物は、口、直腸、パレンテラル、局所、肺、鼻、頬、眼又は他の投与ルートに適した配合剤として、調製し、包装し、販売できる。他の予定する配合剤は、企画されたナノ粒子、リポゾームの調製物、ヒストンＨ１プロテインを含む再シールしたエリスロサイト、及び免疫的ベースの配合剤を含む。
本発明の薬学的組成物は、単一回のユニット投薬量として、又は単一回のユニット投薬量の複数回分として、バルクとして調製され、包装され、販売される。本明細書で使用される「ユニット投薬量」は、予め定められた量のヒストンＨ１プロテインを含んで成る薬学的組成物のばらばらな量である。ヒストンＨ１プロテインの量は、一般に対象へ投与されるヒストンＨ１プロテインの投薬量、又はこのような投薬量の例えば２分の１又は３分の１といったこのような投薬量の良便なフラクションである。
本発明の薬学的組成物中のヒストンＨ１プロテイン、薬学的に受け入れられるキャリア及び任意の追加成分の相対量は、処理する対象の同一性、サイズ及び条件に依存し、更に前記組成物が投与されるべき経路に依存する。 例えば前記組成物は０．１％と１００％（重量／重量）の間のヒストンＨ１プロテインを含んで成る。本発明の薬学的組成物のユニット投薬量は、一般にヒストンＨ１プロテインの約１ｍｇから約１００ｍｇであり、好ましくはヒストンＨ１プロテインの約１ｍｇから約１０ｍｇである。
ヒストンＨ１プロテインに加えて、本発明の薬学的組成物は、１又は２以上の付加的な薬学的に活性な薬剤を含んでいても良い。特別に意図される追加薬剤はヒストンＨ１以外の抗生物質である。そのような抗生物質は、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４及びＨ５、バシトラシン、ポリミキシン、ネオマイシン、クロラムフェニコール、クロルテトラサイクリン、シプロフロキサシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、バンコマイシン、トブラマイシン、エリスロマイシン、ゲンタミシン、グラミシジン、オキシテトラサイクリン、ノルフロキサシン及び抗生物質の塩及びエステルを含むがこれらに限定されない。
本発明の薬学的組成物の制御された又は保持された放出配合剤は従来技術を使用して調製できる。
経口投与に適した本発明の薬学的組成物の配合剤は、それぞれが予め定められた量のヒストンＨ１プロテインを含むタブレット、硬質又は軟質カプセル、オブラート、トローチ又は菱形錠剤を含むがこれらに限定されないばらばらで固体の投薬ユニットの形態で調製され、包装され、又は販売されても良い。経口投与に適した他の配合剤は、粉末化又は粒化した配合剤、水性又は油状懸濁液、水性又は油状溶液、又は乳化物を含むがこれらに限定されない。
本明細書で使用される「油状」液体は炭素含有液体分子を含んで成り、水より極性の小さい特性を示す。
ヒストンＨ１プロテインを含んで成るタブレットは、任意的に１又は２以上の追加成分と共に、例えばヒストンＨ１プロテインを圧縮し又は成型することにより調製できる。圧縮されたタブレットは、任意的にバインダー、潤滑剤、エクスシピーント、界面活性剤及び分散剤のうちの１又は２以上を混合した、粉末又は粒状の調製物のような自由に流動できる形態にあるヒストンＨ１プロテインを適切な器具中で圧縮することにより調製される。成型されたタブレットは、ヒストンＨ１プロテイン、薬学的に受け入れられるキャリア及び当該混合物に湿気を与えるために少なくとも必要な液体の混合物を適切な器具中で成型することにより調製される。タブレット製造で使用される薬学的に受け入れられるエクスシピーントは、不活性な希釈剤、粒化及び分散剤、結合剤、潤滑剤を含むがこれらに限定されない。既知の分散剤は、ジャガイモの澱粉やナトリウム澱粉グルコレートを含むがこれらに限定されない。既知の界面活性剤はナトリウムラウリルサルフェ−トを含むがこれらに限定されない。既知の希釈剤は炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクト−ス、微結晶セルロース、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム及びリン酸ナトリウムを含むがこれらに限定されない。既知の粒化及び分散剤はトウモロコシの澱粉及びアルギニン酸を含むがこれらに限定されない。既知の結合剤はゼラチン、アカシア、予備ゼラチン化したトウモロコシの澱粉、ポリビニルピロリドン及びヒドロキシプロピルメチルセルロースを含むがこれらに限定されない。既知の潤滑剤はステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリカ及び雲母を含むがこれらに限定されない。
タブレットは被覆しなくても、又対象の胃腸の広がりの中の分散の遅れを達成するために既知の方法を使用して被覆をしても良く、これによりヒストンＨ１プロテインの放出の維持及び吸収を提供する。例えば、グリセリルモノステアレート又はグリセリルジステアレートのような物質をタブレットの被覆に使用できる。更に、例えばタブレットは米国特許第４，２５６，１０８、４，１６０，４５２及び４，２６５，８７４号に記載された方法を使用して被覆しても良く、これにより浸透により制御された放出タブレットが形成される。タブレットは、更に甘味料、香味剤、着色剤、保存剤、又はこれらの組み合わせを含んで成っても良く、これにより薬学的に的確で美味な調製物が提供される。
ヒストンＨ１プロテインを含んで成る硬質のカプセルはゼラチンのような生理学的に分解する組成物を使用して調製できる。このような硬質カプセルは、ヒストンＨ１プロテインを含んで成り、更に例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム又はカオリンのような不活性な固体希釈剤を含んでも良い。
ヒストンＨ１プロテインを含んで成る軟質のカプセルはゼラチンのような生理学的に分解する組成物を使用して調製できる。このような硬質カプセルは、ヒストンＨ１プロテインを含んで成り、これは水、又はピーナッツ油、液体パラフィン又はオリーブ油のような油性媒体と混合しても良い。
経口投与に適した本発明の薬学的組成物の液体配合剤は、液体の形態、又は使用前に水や他の適切な溶剤で再構成することを意図する乾燥製品の形態のいずれかで調製され、包装され、販売され提供も良い。
液体懸濁液質は水性又は油状の溶媒中でヒストンＨ１プロテインを懸濁させるための従来法を使用して調製できる。水性溶媒は例えば水及び等浸透圧の塩水を含む。油状の溶媒は例えばアーモンド油、油状エステル、エチルアルコール、アラキス、オリーブ、ゴマ又はココナツ油のような野菜油、分留した野菜油及び液体パラフィンのようなミネラル油を含む。液体懸濁液は、更に懸濁剤、分散又は湿潤剤、乳化剤、鎮痛剤、保存剤、緩衝液、塩、香味剤、着色剤及び甘味料を含むがこれらに限定されない１又は２以上の追加成分を含んで成っても良い。油状懸濁液は更に濃厚化剤を含んで成っても良い。既知の懸濁剤は、ソルビトールシロップ、水素化された食用油、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、ゴム・トラガカンス、ゴム・アカシア、及びナトリウム・カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース誘導体を含むがこれらに限定されない。既知の分散又は湿潤剤は、レクチンのような天然に存在するホスファチド；酸化アルキレンと、脂肪酸又は長鎖脂肪族アルコール又は脂肪酸とへキシトールから誘導される部分エステル又は脂肪酸とへキシトール無水物から誘導される部分エステルとの縮合物（例えばそれぞれポリオキシエチレンステアレート、ヘプタデカエチレンルオキシセタノール、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレアート及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）を含むがこれらに限定されない。既知の乳化剤はレクチン及びアカシアを含むがこれらに限定されない。既知の保存剤は、メチル−、エチル−又はｎ−プロピル−パラ−ヒドロキシベンゾエート類、アスコルビン酸及びソルビン酸を含むがこれらに限定されない。既知の甘味料は、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、サクロ−ス及びサッカリンを含むがこれらに限定されない。油状懸濁液のための既知の濃厚化剤は例えば、蜂蜜、硬質パラフィン及びセチルアルコールを含む。
水性又は油状溶媒中のヒストンＨ１プロテインの液状溶液は、液体懸濁液と実質的に同じ手法で調製でき、主要な差異は溶媒中に懸濁するのではなく、ヒストンＨ１プロテインを溶解させることである。本発明の薬学的組成物の液体溶液は、液体懸濁液に関して述べた成分の各々を含むことができ、懸濁剤はヒストンＨ１プロテインを溶媒中に溶解させる助けには必ずしもならないことを理解すべきである。水性溶媒は例えば水及び等浸透圧の塩水を含む。油状の溶媒は例えばアーモンド油、油状エステル、エチルアルコール；アラキス、オリーブ、ゴマ又はココナツ油のような野菜油、分留した野菜油及び液体パラフィンのようなミネラル油を含む。
本発明の薬学的調製物の粉末化及び粒化した配合剤は既知の方法を使用して調製できる。このような配合剤は、例えばタブレットを形成して、カプセルを充填して、又は水性又は油状の溶媒をそれに加えることで水性又は油状の懸濁液又は溶液を調製することで、直接対象の投与できる。これらの配合剤の各々は、分散又は湿潤剤、懸濁剤及び保存剤の１又は２以上を含んでいても良い。充填剤及び甘味剤、香味剤及び着色剤のような追加のエクスシピーントをこれらの配合剤中に含んでいても良い。
本発明の薬学的組成物は、水中に油が乳化している液、又は油中に水が乳化している液の形態で、調製し、包装し、販売しても良い。油相は、オリーブ又はアラキス油のような野菜油、又は液体パラフィンのようなミネラル油、又はこれらの組み合わせである。このような組成物は、更にゴム・アカシア又はゴム・トラガカンスのような天然に存在するゴム；大豆やレクチンホスファチドのような天然に存在するホスファチド；ソルビタンモノオレアートのような脂肪酸とヘキシトール無水物の組み合わせから誘導されるエステル又は部分エステル；及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートのような前記部分エステルと酸化エチレンの縮合生成物のうちの１又は２以上の乳化剤を含んで成っていても良い。これらの乳化剤は、例えば甘味剤や香味剤を含む追加成分も含んでいても良い。
本発明の薬学的組成物は、直腸投与に適した形態で調製し、包装し、販売しても良い。このような組成物は、例えば 座薬、保持浣腸調製剤、及び直腸又は結腸洗浄の形態としても良い。
座薬配合剤は、ヒストンＨ１プロテインを、通常の室温（つまり約２０℃）では固体で、対象の直腸温度（つまり健康な人間では約３７℃）では液体の非洗浄の薬学的に受け入れられるエクスシピーントと組み合わせることにより調製できる。適切な薬学的に受け入れられるエクスシピーントは、ココアバター、ポリエチレングリコール及び種々のグリセリド類の含むがこれらに限定されない。座薬配合剤は更に酸化防止剤及び保存剤を含むがこれらに限定されない種々の追加成分を含んで成っても良い。
直腸又は結腸洗浄用の保持浣腸調製剤又は溶液は、ヒストンＨ１プロテインを薬学的に受け入れられる液体キャリアと結合することにより調製できる。周知なように、浣腸調製剤は対象の解剖に適用できる排出器具を使用しそしてその中に包装して使用できる。浣腸調製剤は、更に酸化防止剤及び保存剤を含むがこれらに限定されない種々の追加成分を含んで成っても良い。
本発明の薬学的組成物は、膣への投与に適した形態で調製し、包装し、販売しても良い。このような組成物は、例えば座薬、タンポンのような染み込ませ又は被覆した膣に挿入可能な物質、注水調製剤、又は膣洗浄用溶液の形態にすることができる。
化学的組成物を物質に染み込ませ又は被覆する方法は、化学的組成物を表面に付着又は結合させる方法、物質（つまり生理学的に分解する物質のように）の合成の間に物質の構造中に化学的組成物を組み入れる方法、及び引き続く乾燥を行い又は行わず、吸収物質中に水性又は油状の溶液又は懸濁液を吸収させる方法を含むがこれらに限定されない。
膣洗浄用の注水調製剤又は溶液は、ヒストンＨ１プロテインを薬学的受け入れられるキャリアと結合することにより調製できる。周知なように、注水調製剤は対象の膣構造に適用できる排出器具を使用しそしてその中に包装して使用できる。注水調製剤は、更に酸化防止剤、抗生物質、抗菌剤及び保存剤を含むがこれらに限定されない種々の追加成分を含んで成っても良い。
本明細書で使用される薬学的組成物の「パレンテラルな投与」は、対象の組織の物理的な孔により特徴付けられる投与、及び組織の孔を通しての薬学的組成物の投与の任意の経路を含む。従ってパレンテラルな投与は、組成物の注入により、治療上の切開部を通しての組成物の適用により、組織を通過する治療上ではない傷を通しての組成物の適用等による薬学的組成物の投与を含むがこれらに限定されない。特にパレンテラルな投与は、皮下、内腹膜、静脈注射、内動脈、内筋肉又は内胸骨注射、及び静脈、内動脈又は腎臓透析の点滴技術を含むよう意図するがこれらに限定されない。
パレンテラル投与に適した薬学的組成物の配合剤は、ヒストンＨ１プロテイン及びこれに結合した薬学的受け入れられるキャリア、例えば無菌水又は無菌の等浸透圧の塩水を含んで成る。このような配合剤は、丸薬投与又は連続投与に適した形態で調製し、包装し、販売できる。注射可能な配合剤は、アンプル中、又は保存剤を含む多投薬コンテナ中のようなユニット投薬形態で、調製し、包装し、販売できる。パレンテラルな投与のための配合剤は、懸濁液、溶液、水性又は油状溶媒中の乳化剤、ペースト及びインプラントできる維持された放出又は生物的に分解できる配合剤を含むがこれらに限定されない。このような配合剤は、懸濁、安定又は分散剤を含むがこれらに限定されない１又は２以上の追加成分を更に含んで成っても良い。パレンテラルな投与用の配合剤のある態様では、ヒストンＨ１プロテインは、再構成組成物のパレンテラルな投与前に、適切な溶媒（例えば無菌の発熱源のない水）で再構築するために乾燥（つまり粉末又は粒状）の形態で提供される。
薬学的組成物は、無菌の注射できる水性又は油状の懸濁液又は溶液及び形態で調製し、包装し、販売できる。この懸濁液又は溶液は、既知方法に従って配合でき、ヒストンＨ１プロテインに加えて、本明細書で述べた分散剤、湿潤剤、又は懸濁剤のような追加成分を含んで成っても良い。このような無菌の注射できる配合剤は、例えば水や１，３−ブタンジオールのような毒のないパレンテラルな受け入れられる希釈剤又は溶媒を使用して調製できる。他の受け入れられる希釈剤及び溶媒は、リンガーの溶液、等浸透圧の塩化ナトリウム溶液；及び合成モノー又はジ−グリセリドのような固定された油を含むがこれらに限定されない。有用な他のパレンテラルに投与できる配合剤は、ヒストンＨ１プロテインを、微結晶の形態で、リボソームの調製剤の形態で、又は生物学的に分解するポリマーシステムの成分を含んで成る。維持している放出又はインプラント用の組成物は、乳化剤、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー又は難溶性塩を、薬学的に受け入れられるポリマー状又は疎水性物質を含んで成る。
薬学的組成物は、局所投与に適した形態で、調製し、包装し、販売される。局所投与に適した配合剤は、塗擦剤、ローション、クリーム、軟膏やペーストのようなオイル−イン−ウォーター又はウォーター−イン−オイルの乳化剤、及び溶液又は懸濁液を含むがこれらに限定されない。局所投与可能な配合剤は例えば、約１％から約１０％（重量／重量）のヒストンＨ１プロテインを含んで成ることができるが、ヒストンＨ１プロテインの濃度は溶媒中のヒストンＨ１プロテインの溶解限度まで高くても良い。局所投与用配合剤は、本明細書で述べた１又は２以上の追加成分を更に含んで成っていても良い。局所投与配合剤は、外的な（つまり皮膚の）使用を意図する物、ヒストンＨ１プロテインの皮膚間の移送を意図する物、及びヒストンＨ１プロテインのトランスムコサルな移送を意図する物を含むがこれらに限定されない。
本発明の薬学的組成物は、口腔内空間を通して肺へ投与するために適した配合剤としえ調製し、包装し、販売されても良い。このような配合剤は、ヒストンＨ１プロテインを含んで成り、粒径が約０．５から約７ナノメートル、好ましくは約１から約６ナノメートルである乾燥粒子を含んで成る。このような組成物は、好都合なことに投与用の乾燥粉末の形態であり、この投与は、粉末を分散させるための推進剤の流れが向かう乾燥粉末貯留槽を含んで成る器具を使用し、又はシールされた容器中の低沸点中に溶解又は懸濁にされたヒストンＨ１プロテインを含んで成る器具のような自己推進溶媒／粉末分散容器を使用する。このような粉末は、粒子の少なくとも９８重量％が０．５ナノメートルを超える粒径を有し、そして少なくとも９５％（数による）の粒子が７ナノメートル未満の粒径を有している。より好ましくは、少なくとも９５重量％の粒子が１ナノメートルを超える粒径を有し、そして少なくとも９０％（数による）の粒子が６ナノメートル未満の粒径を有している。乾燥粉末組成物は、砂糖のような固体の微粉末希釈剤を好ましくは含み、ユニット投薬の形態として都合よく提供される。
一般に低沸点推進剤は大気圧で６５°Ｆ未満の沸点を有する液体推進剤を含む。推進剤は一般に組成物の５０から９９．９％（重量／重量）を構成し、ヒストンＨ１プロテインは０．１から２０％（重量／重量）を構成する。推進剤は更に液体の非イオン性又は固体のアニオン性界面活性剤又は固体の希釈剤のような追加成分（好ましくはヒストンＨ１プロテインを含んで成る粒子と同じオーダーの粒径を有する）を含んで成っても良い。
肺への供給のために配合された本発明の薬学的組成物も溶液の雫又は懸濁の形態でヒストンＨ１プロテインを提供することができる。このような配合剤は、無菌であることを選択しても良いヒストンＨ１プロテインを含んで成る水性又は希釈したアルコール溶液又は懸濁液として調製し、包装し、販売されても良く、ネブリゼーション又は噴霧化用器具を使用して都合良く投与できる。このような配合剤は、サッカリンナトリウムのような甘味剤、揮発油、緩衝剤、界面活性剤、又はメチルヒドロキシベンゾエートのような保存剤を含むがこれらに限定されない１又は２以上の追加成分を更に含んで成っていても良い。この投与経路で提供される雫は好ましくは約０．１から約２００ナノメートルの範囲の平均径を有する。
肺への供給用として有用として本明細書で説明した配合剤は、本発明の薬学的組成物の鼻内部への供給用としても有用である。
鼻内部への投与用として適した他の配合剤は、ヒストンＨ１プロテインを含んで成り平均粒径が約０．２から約５００ナノメートルの粗い粉末である。このような配合剤は、鼻近くに保持された粉末のコンテナから鼻の経路を通して吸引つまり迅速な吸入を行う手法で投与する
鼻からの投与に適した配合剤は、例えばヒストンＨ１プロテインに対して約０．１％（重量／重量）の低い所から１００％（重量／重量）の高い所まで含んで成ることができ、更に本明細書で説明した１又は２以上の追加成分を含んで成っていても良い。
本発明の薬学的組成物は、口からの投与に適した形態で調製し、包装し、販売されても良い。このような配合剤は、例えば従来法を使用して調製したタブレット又は菱形の錠剤の形態とすることができ、例えば０．１から２０％（重量／重量）のヒストンＨ１プロテインと残部の口内で溶解できる又は分散できる組成物を含み、更に本明細書で説明した１又は２以上の追加成分を含むよう選択しても良い。その替わりに、口からの投与に適した配合剤はヒストンＨ１プロテインを含んで成る粉末又はエアロゾル又は噴霧化した溶液又は懸濁液を含んで成っていても良い。このような粉末化され、エアロゾル化された配合剤は、分散されたときに、好ましくは約０．１から約２００ナノメートルの範囲の平均粒径又は雫サイズを有し、更に本明細書で説明した１又は２以上の追加成分を含んで成っていても良い。
本発明の薬学的組成物は、眼からの投与に適した形態で調製し、包装し、販売されても良い。このような配合剤は、例えば水性又は油状キャリア中で、０．１から１．０％（重量／容量）のヒストンＨ１プロテインの溶液又は懸濁液を含む目薬の形態としても良い。このような目薬は更に緩衝剤、塩、又は本明細書で説明した１又は２以上の追加成分を含んでいても良い。他の眼から投与できる有用な配合剤は、微結晶の形態で又はリポゾームの調製物としてヒストンＨ１プロテインを含んでいても良い。
本明細書で使用される「追加成分」は１又は２以上の次のエクスシピーントを含むがこれらに限定されない。界面活性剤、分散剤、不活性な希釈剤、粒化及び分散剤、結合剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、着色剤、保存剤、ゼラチンのような生理学的に分解できる組成物、水性の溶剤及び溶媒、油状の溶剤及び溶媒、懸濁剤、分散又は湿潤剤、乳化剤、鎮痛剤、緩衝剤、塩、濃厚化剤、充填剤、乳化剤、酸化防止剤、抗生物質、抗菌剤、安定化剤及び薬学的に受け入れられる重合性又は疎水性物質。本発明の薬学的組成物中に含まれる他の「追加成分」は、例えば本明細書中に参照文献として組み入れられるペンシルベニア州イーストンのマーク・パブリッシング・カンパニーの１９８５年ジェナロ版のレミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシーズ中に記載され知られている。
本発明の薬学的組成物は、１ｎｇ／ｋｇ／日及び１００ｍｇ／ｋｇ／日間の投薬量で、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ／日及び１０ｍｇ／ｋｇ／日間の投薬量で対象に供給し投与できる。
熟練した医者や獣医は対象中の微生物を殺し又は成長を阻害する混合物の有効量を容易に決定し処方すると理解する。このような処置では、例えば医者又は獣医は当初は比較的少ない投薬量を処方し、次いで好適な応答が得られるまで投薬量を増加させる。しかし、特別の対象のための特定の投薬レベルは、使用する特定の混合物の活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、対象の食事、投与時間、投与の経路、排出速度、薬剤との組み合わせ、微生物感染又は処理している寄生の厳格性を含む種々の因子に依存することを理解すべきである。
ヒストンＨ１を使用する微生物死滅の誘導
ヒストンＨ１は、幅広い細胞毒性及び細胞活動抑制効果を有し、この効果は対象細胞のタイプとヒストン濃度に依存する。特定の細胞タイプへの細胞毒性及び細胞活動抑制のために有用なヒストンＨ１の濃度は、当業者が過大な実験を行うことなく決定できる。例えばヒストンの細胞毒性及び細胞活動抑制の濃度は、細胞の培養を、適切な媒体中でヒストンＨ１の選択された種々の濃度で行い又は行わないことで決定できる。細胞数に対するヒストンＨ１濃度の効果を観察することにより、細胞毒性及び細胞活動抑制の濃度が当業者には明かになる。
ヒストンＨ１は幅広い細胞毒性及び細胞活動抑制効果を示すので、他の抗生物質に反応しない微生物を殺し又はその成長を阻害するために使用できる。例えば抗生物質耐性のバクテリアは人間の健康の分野で重要性が増大している問題である。病原菌に感染した人間の患者へ１又は２以上の抗生物質を投与しても生き長らえるヒトの病原菌の能力は、感染の長さ及び重大性を増加させる。種々の既知の抗生物質剤に耐性のあるヒトの病原菌は単離されている。本明細書で説明したように、少なくともある種のこれら抗生物質耐性の病原菌は、ヒストンＨ１の抗生物質効果に反応する。例えば本明細書で説明したように、ワイルドタイプのエシェリキア・コーリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が殺されるのとほぼ同じ濃度のヒストン存在下で、ペニシリン耐性のＥ．ｃｏｌｉが殺される。更にヒストンＨ１は、モルベースで、ペニシリンやカナマイシンのような既知の抗生物質剤より大きな抗生物質としての効果を有する。
微生物の死滅を誘起する方法も本発明に含まれる。この方法は、微生物を、実質的に精製されたヒストンＨ１プロテインを含んで成る組成物と接触させることを含んで成る。微生物はヒトの病原菌であることが好ましい。例えば細胞は、ペニシリンやカナマイシンのような既知の抗生物質剤に耐性を有するバクテリアの株であっても良い。前記微生物は、例えば治療器具やインプラントの表面のような無菌状態であることが望ましいサイトに存在する微生物でも良い。前記微生物は例えば、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）のようなヒト細胞中の微生物であっても良い。
この方法によると、微生物が該微生物を殺すために十分な量のヒストンＨ１プロテインと接触する。選択された微生物を殺すために十分なヒストンＨ１プロテインの正確な量は、微生物の特性、ヒストンＨ１プロテインが保存された状態、微生物の細胞濃度、及び本明細書の開示から当業者に明かになるように、微生物が位置する環境の物理的及び化学的な特性を含む他の因子に依存する。約０．２マイクロモルからヒストンＨ１プロテインの溶解限度までの範囲のヒストンＨ１プロテイン濃度が、前記死滅誘起法で有用であると考えられる。本明細書で説明したように、約０．２マイクロモルの低濃度から約４マイクロモルの高濃度のヒストンＨ１プロテイン濃度が、少なくともある種のタイプのバクテリアの死滅を誘起するために有効である。当業者は過大な実験を行うことなく、本明細書で開示したガイダンスに従うことにより、任意の特定の微生物用のヒストンＨ１プロテイン濃度の範囲を決定できる。
非常に高いヒストンＨ１濃度（つまり１０〜１００マイクロモルのオーダー）は動物細胞の死滅を誘起することがあることを認識すべきである。従ってヒトのような動物にヒストンＨ１プロテインを抗生物質として使用する場合は、動物にヒストンＨ１プロテインを投与する経路と投薬量を選択して、ヒストンＨ１のインビボ濃度を動物細胞に対する細胞毒性が生じるより低い濃度に維持することが重要である。動物中でヒストンＨ１がもたらす細胞毒性を最小にするような、標準的な薬学的なテスト法、投与経路及びヒストンＨ１プロテインの投与レベルの使用が決定できる。本明細書で説明したように、バクテリア細胞の死滅が比較的低いヒストンＨ１濃度（例えば０．２〜４μＭ）で誘起されるので、当業者は、バクテリア細胞で感染した動物中に臨床的に重大な細胞毒性を誘起させることなく、動物中でバクテリア細胞の死滅を誘起するために有効なヒストンＨ１のインビボ濃度を理解するであろう。
微生物の成長の阻害
本発明は微生物の成長を阻害する方法も含む。この方法は、微生物を、実質的に精製された真核のヒストンＨ１プロテインを含んで成る組成物に接触させることを含んで成る。バクテリアの多薬剤耐性株を含む、ヒトの病原菌バクテリアの成長を阻害する方法の使用を意図している。本発明方法によると、本明細書で説明した細胞死滅を誘起する方法中で使用するよう説明した同じ組成物が、前記方法で使用したのと実質的に同じ手法で使用され、ヒストンＨ１は多くの微生物に対して細胞毒性活性を、他の微生物に対して細胞活性抑制効果を示すと理解できる。しかし、ヒトの病原菌のような微生物の成長阻害は、感染の重大性が増加する速度を減少させかつ、ヒストンＨ１により誘起される成長阻害がない場合より、強い反応を感染部にもたらす感染した動物の免疫システムの設置が可能になる。
本発明は更に、ヒトのような動物中での微生物感染を処理する方法も含む。この方法は、実質的に精製された真核のヒストンＨ１プロテインを含んで成る抗微生物組成物を動物に投与することを含んで成る。前記組成物は、口、直腸、膣、パレンテラル、局所、肺、鼻内部、頬、眼、及び他の投与経路により、動物に投与する。これらの経路による投与に適した薬学的組成物は本明細書で説明した通りである。
本発明は更に、例えばヒトのような動物体の上又はその中のサイト、非生物の上又はその中のサイト、微生物成長が疑われ又は存在することが知られているサイトである選択されたサイトで微生物成長を阻害する方法に関する。この方法は、真核のヒストンＨ１プロテインを含んで成る抗微生物組成物を前記サイトに供給することを含んで成る。この方法の一態様では、前記組成物を含んで成る物質を使用して物体を合成することのようにして、前記組成物を前記サイトに組み入れることにより、前記組成物を前記サイトに供給できる。例えば組成物中に真核のヒストンＨ１プロテインを含む注射可能な薬学的組成物中で微生物成長を阻害できる。更に、例えば前記サイトは食品の上又は内部のサイトである。サイトが動物体の上又は内部にある場合、治療時又はその前に組成物をサイトに供給し、これによりサイトにおける微生物成長を阻害することにより、感染を防止し又は阻害する。
本方法の他の態様では、サイトに接触している表面に組成物を供給することにより、前記組成物をサイトに与える。この表面は、傷ついた動物の傷の表面のような動物表面であるか、又は調製された食品表面又は治療器具の表面のような非生物表面であっても良い。更に前記表面は、ヒトのような動物体内にインプラントされた組成物を含んで成る生物的に分解できるインプラントの表面であっても良い。
１又は２以上の抗生物質を有するサプリメント用の動物の食品は、食物を摂取する牛や他の農場の動物のような動物の成長を改善する。従って本発明は、実質的に精製された真核のヒストンＨ１プロテインを含んで成る抗微生物組成物でサプリメントされた動物の食物を含んで成るサプリメント用動物の食物である。本発明は更に、ヒトでない動物の成長を改善する方法を含み、この方法はヒストンＨ１でサプリメントされた動物食物を動物に供給することを含んで成る。
本発明は更に、動物に、微生物に対する予防接種を行う方法を含む。この方法は、衰えたか殺された形態の微生物及び実質的に精製された真核のヒストンＨ１プロテインを含んで成る組成物を動物に投与することを含んで成る。米国特許第５，１８２，２５７号に記載されているように、ヒストンＨ１を含むヒストン類は免疫増強効果を示し、これはヒストンを動物に投与したときに免疫システムの成分の活性が増加することを意味する。ヒストンＨ１も抗微生物活性を示すので、微生物を殺すために混合物中のヒストンＨ１に微生物を接触させることによりワクチンを調製し、次いで前記混合物を動物に投与して微生物に対して動物を免疫する。このように調製されたワクチンは、抗原を含んで成る殺された微生物と、好ましくはヒストンＨ１である免疫増強したヒストンの両者を含んでいる。従って本発明は、ワクチンの調製方法、該方法により調製されたワクチン、及び開示された方法で調製されたワクチンを動物に投与することを含んで成る動物の免疫方法を含む。
本発明のキット
本発明は、本発明の抗微生物薬学的組成物と、微生物を殺すための抗微生物組成物の使用を記載した指示用試料及び微生物の成長を阻害する抗微生物組成物の使用を記載した指示用試料から成る群から選択される指示用試料を含んで成るキットを追加して含む。好ましくは前記組成物はユニット投薬の形態になっている。
本発明のキットの一態様では、該キットはヘパリンのようなヒストンＨ１解毒剤を含んで成る第２の組成物を含んで成る。他の態様では、キットは更に、動物へヒストンＨ１解毒剤の投与を記載した指示用試料を含んで成り、この指示用試料はヒストンＨ１を動物へ投与する逆の反応が示されている。
本明細書で使用される「指示用試料」は、対象中の微生物を殺し成長を阻害する本発明の薬学的組成物の有用性を伝達するために使用される表現を有する刊行物、記録、図表、又は他の媒体を含む。この指示用試料は、例えば本発明の薬学的組成物の好適な投薬量も記載している。本発明のキットの指示用試料は、例えば本発明の薬学的組成物を含む容器に貼ったり、又は前記薬学的組成物を含む容器と共に出荷することができる。その替わりに、前記指示用試料と薬学的組成物が受け手により協調的に使用されるという意図の下に、前記指示用試料を容器とは別に出荷するようにしても良い。
本発明は更に、本発明の薬学的組成物と、該組成物を対象に供給するための供給器具を含んで成るキットを含む。例えば供給器具は押出し可能なスプレーボトル、投薬量を計測できるスプレーボトル、アエロゾルスプレー器具、噴霧器、乾燥粉末供給器具、自己推進型溶媒／粉末分配器具、シリンジ、針、タンポン又は投薬量測定容器であっても良い。前記器具は本明細書で説明したような指示用試料を含んでいても良い。
本発明を引き続く実施例に従って説明する。これらの実施例は例示のみの目的で提示されるもので、本発明はどのような形でもこれらの実施例に限定されると解釈されるべきでなく、むしろ本教示の結果として明かになるような任意で全ての変形まで広がると解釈されるべきである。
実施例１
精製された牛ヒストンの調製
ペルソンら（１９８１、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２０：２２９８−２３０１）の報文に従ってヒストン類を精製した。
実施例２
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中の組替えヒトヒストンＨ１の調製
本明細書で引用した文献に記載されているように、組替えヒトヒストンＨ１をＥ．ｃｏｌｉ中で調製することができる。
実施例３
イースト中の組替えヒトヒストンＨ１の調製
本明細書で引用した文献に記載されているように、組替えヒトヒストンＨ１をイースト中で調製することができる。
実施例４
ヒストンＨ１の細胞毒性の濃度依存性
精製したウシヒストンＨ１を実施例１に記載したように調製した。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＢ１１５７（ＡＴＣＣから入手）をＮＹＥＴ媒体（４ｇ／リットルの栄養液、７．５ｇ／リットルのイースト抽出物、及び４ｇ／リットルのトリプトン）中３７℃で成長させた。ほぼ指数的な成長相でのＥ．ｃｏｌｉ細胞を、選択濃度のヒストンＨ１存在下で２０分間ソーレンセンの緩衝液（４１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２５．７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４）で培養した。ヒストンＨ１に接触しなかった細胞に対する、ヒストンＨ１に接触した細胞の生存割合を、自動コロニー計数器（３Ｍモデル６２０）を使用してコロニー数を計数することにより決定した。１．５％（重量／重量）のバクト・アガー（Ｂａｃｔｏ　Ａｇａｒ）を含む５７℃の媒体の１０ミリリットルを添加することにより、Ｈ１を含むバクテリアの懸濁物約２００マイクロリットルがペトリ皿中に付着した。ヒストンＨ１を熱で不活性化し、この操作により５０倍に希釈したところ、Ｈ１の濃度は最早生物学的に活性ではなかった。
第１図及び第１図Ａに示すように、ヒストンＨ１濃度が１マイクロモル未満のヒストンＨ１濃度を有する懸濁液と細胞が接触した後では、９８％を超えるＥ．ｃｏｌｉが死滅した。０．２４マイクロモルまで低いＨ１濃度で大きな細胞毒性が観察された。１．９マイクロモルのＨ１を含んで成る組成物を使用して３７℃で細胞を１０分未満だけ培養したが、最大の細胞毒性効果を達成するには十分であった。第２図に示すように、培養時間を延ばしても高い死滅率は得られなかった。
ヒストンＨ１の細胞毒性の有効性を、同じ濃度のペニシリン及びカナマイシンと比較した。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＢ１１５７を、１．９マイクロモルのヒストンＨ１、１．９マイクロモルのペニシリン及び１．９マイクロモルのカナマイシンのうちの１種を有するソーレンセンの緩衝液中で１０分間３７℃で培養した。ヒストンＨ１の存在下に細胞の培養を行ったことによる細胞毒性は、ペニシリンの存在下に細胞の培養を行ったことにより得られた細胞毒性の１００倍を超えた。カナマイシンの存在下の細胞の培養では、測定できる細胞毒性は得られなかった。
この実施例で提示した実験は、ヒストンＨ１は同じ濃度のペニシリン又はカナマイシンのいずれよりも速くかつ効率良くバクテリアを殺すことを示している。実施例５
ヒストンＨ１の抗生物質効果の温度依存性
精製したウシヒストンＨ１を実施例１で記載したように調製した。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＢ１１５７の細胞を、１．９マイクロモルのヒストンＨ１の存在下で、選択された時間、選択された温度で、ソーレンセンの緩衝液中で培養した。ヒストンＨ１に接触した細胞の、ヒストンＨ１に接触しなかった細胞に対する、生存割合を実施例４と同様にして決定した。ヒストンＨ１の殺菌効果は４℃又は３０℃のいずれよりも３７℃の方が顕著に大きいことが観察された。通常の人体の温度は約３７℃である。
この実施例で提示された実験の結果は、ヒストンＨ１は低温よりも通常の人体の体温でより大きい殺菌効果を示すことを示している。従って通常の人体の体温より低い温度の情況では高濃度のヒストンＨ１を使用して等価の殺菌効果を達成することが必要である。従って、例えばヒトの皮膚の傷に消毒用として使用する局所の抗生物質調製剤は、人体内に静脈注射を意図している場合より、高濃度のヒストンＨ１を含むようにする。
実施例６
ペニシリン耐性バクテリアに対するヒストンＨ１の殺菌効果
精製したウシヒストンＨ１を実施例１で記載したように調製した。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＢ１１５７の細胞、又はＡＢ１１５７から誘導したペニシリン耐性Ｅ．ｃｏｌｉ株の細胞を（別個に）、１．９マイクロモルのヒストンＨ１の存在下で、選択された時間、３７℃で、ソーレンセンの緩衝液中で培養した。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＢ１１５７の細胞は、ペニシリンを含有する成長媒体中で数日間培養することにより、ペニシリン耐性を有するようになった。生成した集団は完全にペニシリン耐性を有していた。ヒストンに接触していない細胞に対するＨ１ヒストンＨ１に接触した細胞の生存割合は実施例４と同じようにして決定した。
第３図に示すように、ヒストンＨ１は、それがワイルドタイプの細胞を殺すのとほぼ同等の効率で、ペニシリン耐性細胞を殺した。これらの結果は、ヒストンＨ１が、薬剤耐性バクテリアを包含する感染の処理に使用できることを示している。 ヒストンＨ１の殺菌効果はバクテリアにペニシリン耐性を付与するバクテリアの機構により影響されなかった。
実施例７
ヒストンＨ１の抗生物質活性のターシャリ構造依存性
精製したウシヒストンＨ１を実施例１で記載したように調製した。トリプシンを０．０５％（重量／容量）含むソーレンセンの緩衝液中で室温（つまり約２０℃）で３０分、精製したヒストンＨ１を培養することにより、プロテイン分解で消化されたヒストンＨ１を調製した。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＢ１１５７の細胞を、１．９マイクロモルのヒストンＨ１又は１．９マイクロモルのトリプシン化ヒストンＨ１のいずれかを存在させた３７℃のソーレンセンの緩衝液中で２０分間培養した。ヒストンＨ１に接触した細胞の、ヒストンＨ１に接触しなかった細胞に対する、生存割合を実施例４と同様にして決定した。
トリプシン化ヒストンＨ１は抗生物質活性を示さなかったが、トリプシン化していないヒストンＨ１は示した。トリプシン自体はバクテリアの生存に影響を与えない。これらの結果は、ヒストンＨ１の抗生物質効果が、対象細胞の特定の生物学的な分子に対するヒストンの結合に起因し、更にヒストンＨ１の抗生物質活性が単にヒストンの成分の物理的特性（例えばヒストンＨ１のアミノ酸側鎖の単なる存在又は本質的な性質）に起因するものでないことを示している。更にこれらの結果は、ヒストンＨ１の抗生物質活性が、ヒストンと対象細胞のプロテイン間の特定のプロテイン−プロテイン相互作用であることを示唆している。
実施例８
ヒストンＨ１の熱安定性
精製したウシヒストンＨ１を実施例１で記載したように調製した。第１の実験で、精製したヒストンＨ１を−８０℃で３６時間以上貯蔵した。ヒストンＨ１の抗生物質活性はこの貯蔵法ではさほど減少しなかった。
第２の実験では、精製したヒストンＨ１を複数に振り分けたアリクオットを別個に−８０℃、４℃及び３７℃で２０時間貯蔵した。前記３種のアリクオットのいずれかから得られた４０μｇ／ｍｌのヒストンＨ１の存在下、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＢ１１５７の細胞を、３７℃のソーレンセンの緩衝液中で１０分間培養した。ヒストンＨ１に接触した細胞の、ヒストンＨ１に接触しなかった細胞に対する、生存割合を実施例４と同様にして決定した。−８０℃で貯蔵したヒストンＨ１で培養した細胞の生存割合は約０．１％であった。４℃で貯蔵したヒストンＨ１で培養した細胞の生存割合は約１％であった。３７℃で貯蔵したヒストンＨ１で培養した細胞の生存割合は約６％であった。
この実施例で記載した実験の結果は、その酵素を−２０℃以下で好ましくは−８０℃以下で貯蔵することにより、ヒストンＨ１の抗生物質活性が保存されることを示している。ヒストンＨ１は解凍から６時間以内に使用すべきである。これらの結果は更に、ヒストンＨ１は活性ロスなしに少なくとも３６ヶ月間、−８０℃で貯蔵でき、そして使用前に約２４ヵ月を超えて貯蔵しない方が良いことを示している。
実施例９
ヒストンＨ１の抗生物質活性の範囲
精製したウシヒストンＨ１を実施例１で記載したように調製した。種々のテストバクテリアの培養体を適切に選択された媒体中で作製し、標準的な操作を使用して、培養体が初期記録フェーズの成長を示すと評価されるまで細胞の培養を行った。ソーレンセンの緩衝液に懸濁させたヒストンＨ１を、個々のバクテリア培養体のアリクオットに添加し、最終濃度が１．９マイクロモル又は３．８マイクロモルのいずれかになるようにした。個々のコントロール培養体アリクオットにはヒストンＨ１を添加しなかった。その後アリクオットを３７℃で、１０分間又は４５分間のいずれかの時間、培養し、該アリクオットを適切な固体又は半固体の媒体に付着させた。次の日に、付着したアリクオット中のコロニー数を列挙し、表１に示すように、コロニー形成の％減少を、付着ヒストンＨ１で処理したアリクオットを付着したコントロールアリクオット中に形成したコロニーと比較することにより決定した。
【表１】
2004501056.tif 000003
表１のデータは、ヒストンＨ１が、エシェリキア・コーリ株ＡＢ１１５７、プソイドモナス・エルギノサ、バシルス・スブチリス、バシルス・メガテリウム、バシルス・セレウス及びセラチア・マルセセンスに関して抗生物質活性を示したことを示している。
第９図に示したように、ヒストンＨ１は、尿管感染から単離された種々のＥ．ｃｏｌｉ株に関して抗生物質活性を示した。３０分後、全ての株は３％未満の生存割合を示した。
ヒストンＨ１は表２に列挙したバクテリアに関しては少なくとも抗生物質活性を示すと予想できる。
【表２】
2004501056.tif 000004
実施例１０
ヒストンＨ１の抗生物質活性の血清独立性
精製したウシヒストンＨ１を実施例１で記載したように調製した。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＢ１１５７の細胞を、選択された濃度のヒストンＨ１の存在下、選択された温度で選択された時間、ソーレンセンの緩衝液中で培養した。選択された分析体において、媒体は０から約１０％（容量／容量）の間のヒト又はウシの血清を含んでいた。ヒストンＨ１に接触した細胞の、ヒストンＨ１に接触しなかった細胞に対する、生存割合を実施例４と同様にして決定した。
ヒトＡＢ血清又はウシ胎児血清のいずれかを使用して、少なくとも血清濃度が高だか１０％（容量／容量）である場合には、Ｈ１の抗生物質活性が血清濃度に依存しないことが決定された。これらの観察に基づいて、当業者は、ヒトの血流のような血清を含有する環境でもヒストンＨ１は抗生物質活性を示すことを理解するであろう。
実施例１１
ヒストンＨ１の抗生物質活性の抑制剤
精製したウシヒストンＨ１を実施例１で記載したように調製した。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＢ１１５７の細胞を、４μｇ／ｍｌのヒストンＨ１の存在下、３７℃で１０分間ソーレンセンの緩衝液中で培養した。選択された分析体において、培養媒体は０から約２５０ユニット／ｍｌの範囲の選択された濃度のヘパリンを含んでいた。ヒストンＨ１に接触した細胞の、ヒストンＨ１に接触しなかった細胞に対する、生存割合を実施例４と同様にして決定した。
第４図に示すように、ヘパリンは６．２ユニット／ｍｌの低濃度ではヒストンＨ１の抗生物質活性を減少させた。約１５０ユニット／ｍｌを超えるヘパリン濃度では、ヒストンＨ１は実質的に抗生物質活性を示さなかった。これらの結果は、ヒストンＨ１の抗生物質活性が、ヘパリンをヒストンＨ１含有媒体中に添加することにより阻害できることを示している。これらの結果は更に、ヒトのような対象に投与する際にヒストンＨ１が潜在的に示す悪い細胞毒性効果を、対象のヒストンＨ１含有サイトにヘパリンを投与することにより、遮断できる。例えばヒストンＨ１の静脈への投与後に、ヒストンＨ１に反応するヒト患者で観察される血液の活性は、ヘパリンを患者に静脈投与することにより阻害し又は除去できる。
実施例１２
ヒストンＨ１の抗生物質活性に対するバクテリア耐性の発展
精製したウシヒストンＨ１を実施例１で記載したように調製した。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＢ１１５７の細胞を、種々のセットされた濃度のヒストンＨ１を含むソーレンセンの緩衝液のアリクオット中で培養する。その中で細胞が増殖する（例えば緩衝液の濁度で示される） 最高のヒストンＨ１濃度を有するアリクオットが、より高いヒストンＨ１濃度を有する培養体に養分を与えるために使用される。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に対して通常毒性を有するヒストンＨ１の濃度で成長する細胞が単離されるまで、前記プロセスが繰り返される。
実施例６で述べたように、ヒストンＨ１は比較的迅速にバクテリアを殺す（つまり約１０分以内）。薬剤を使用して迅速にバクテリア殺すことにより、薬剤に対するバクテリア耐性の成長のための選択圧力が減少することが知られている（デスノッテス、１９９８、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ １２：６）。これらのデータに基づいて、当業者は、ヒストンＨ１耐性バクテリアの増殖が最早起こらず、起こっても僅かで、既知の抗生物質に対する耐性を有するバクテリアの増殖より小さいことを理解するであろう。
実施例１３
ヒストンＨ１のバクテリアへの結合
精製したウシヒストンＨ１を実施例１で記載したように調製した。実施例４と同じようにＥ．ｃｏｌｉ株ＡＢ１１５７の細胞のアリクオットをヒストンＨ１と共に培養した。４５分間の培養の後、細胞を遠心分離とデカンテーションで除去した。デカンテーションされた媒体は新鮮なＥ．ｃｏｌｉ細胞で接種され、これらの細胞の生存割合を実施例４と同様にして決定し、新鮮に調製したヒストンＨ１で培養した細胞のサンプルと比較した。この実験の結果は第５図に示した。
Ｈ１を含有する培養媒体は、Ｅ．ｃｏｌｉで媒体を培養することにより、抗生物質として活性なＨ１が明かにクリアされる。本実施例で記載した実験の結果は、ヒストンＨ１が不可逆的にバクテリアに特異的に結合することを示している。これらの結果は、Ｈ１の抗生物質活性が、反応を受けやすいバクテリア上のＨ１リガンドの存在に依存する、対象に特異的な、選択的な機構であることを示している。
実施例１４
ヒストンＨ１のバクテリア膜の完全性への影響
精製したウシヒストンＨ１を実施例１で記載したように調製した。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＢ１１５７の細胞を、種々の濃度のヒストンＨ１の存在下、３７℃でソーレンセンの緩衝液中で培養した。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の膜の損傷をシトックス・グリーンという染料と流量計を使用して種々のタイムインターバルで決定した（ロスら、１９９７、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６３：２４２１−２４３１）。
第７図に提示されたデータにより示されるように、膜損傷を示す細胞の割合は媒体中に存在するヒストンＨ１の濃度に依存した。
本実施例で提示される実験の結果は、膜の完全性が損なわれることがＨ１の抗生物質活性に関連することを示し、これがＨ１の膜を損傷させる効果がヒストンＨ１の殺菌効果であることを示唆している。
実施例１５
ヒストンＨ１の殺菌促進効果
精製したウシヒストンＨ１を実施例１で記載したように調製した。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＢ１１５７の細胞を、ヒストンＨ１又はリゾチーム又はヒストンＨ１とリゾチームの組み合わせのいずれかと共に、ソーレンセンの緩衝液中で１０分間３７℃で培養した。これらの細胞の生存割合を実施例４と同様にして決定した。
第８図で示されているように、ヒストンＨ１なしで培養したリゾチームは実質的に抗生物質活性を示さなかった。ヒストンＨ１と共に培養すると、リゾチームに起因する抗生物質活性が増加した。これらの結果は、ヒストンＨ１は共に培養されるか共に投与される混合物の殺菌効果を向上させることを示している。
ヒストンＨ１に対する耐性
従来の抗生物質は、バクテリアの代謝の幾つかの本質的な生化学的経路を直接妨げることにより微生物の成長を阻害したり微生物の死滅を起こさせたりしている。多くの既知の抗生物質は、生化学的経路の個々のステップ高度の特異性で妨げ、そして細胞の巨大分子の前駆体分子の合成（例えばペプチドグリカン合成、膜脂質の合成、アミノ酸生合成、転写、翻訳及びＤＮＡ複製）に含まれる中央の代謝にその多くが起こる特定の欠点に導く。非常に多数の抗生物質の作用の機構が分子レベルまで従来技術で決定されている。これらの研究では、自然耐性の現象が大きな利点であった。従って抗生物質に対する耐性は代謝経路の個々の酵素中の単一の突然変異の結果であるとしばしば観察された。多くのケースではこのように、与えられた抗生物質により特別に阻害された生化学的経路の個々の酵素を示し、更に抗生物質に対して耐性を与えるために、酵素のどの部分が突然変異により構造的に変化しなければならないかを示すことが可能になった。
従来の抗生物質は高度の特異性でバクテリアの代謝の個々の酵素の活性を妨げ、従って耐性の共通の理由は抗生物質により特異的に阻害される対象酵素の構造的変化である。抗生物質に対するバクテリア耐性の他の共通機構は、反応しやすい対象酵素の増加する細胞濃度であり、そして多数の機構による細胞からの減少するアップテイクと増加するエフラックスである。従来技術の抗生物質に対する前述の全てのバクテリア耐性の機構は、共通の原理に基づき、つまり与えられた抗生物質の対象細胞との高度に特異的な相互作用による干渉である。従って例えば上記特定の耐性機構による従来技術の抗生物質への耐性は、抗生物質とその対象細胞との間の特定の相互作用で幾分か干渉することで、バクテリアにより容易に獲得できる。上述したように、バクテリアは、単一遺伝子中の自然の突然変異により、従来技術の高度に特異的な抗生物質に対する簡単であるが効果的な種々の耐性機構を獲得できる。
ヒストンＨ１の抗生物質作用の機構は、Ｈ１がバクテリア膜と相互作用を行う点で、従来技術の抗生物質の作用の機構と異なり、固有の膜構造を変化させ又は崩壊させ、これにより細胞の分解とバクテリアの死滅が生じる。従ってヒストンＨ１の抗生物質活性は、生物的膜と相互作用を行いかつそれらの初期構造を破壊するヒストンＨ１の能力の結果である。ヒストンＨ１の相互作用を行いかつ細胞膜を破壊する能力は、バクテリア膜に特異的でなく、真核及びアーカエル膜でも観察でき、ヒト腫瘍の治療中などで使用できる。しかし本明細書で説明したように、菌やヒト細胞の細胞膜のような真核膜と比較して、バクテリア膜にはヒストンＨ１に対する顕著に増加する感度がある。これは人体内で抗生物質としてヒストンＨ１の使用を許容することを意味する。
ヒストンＨ１は単一の特定の細胞プロテインとよりむしろバクテリア膜と相互作用を行うため、バクテリアは容易にヒストンＨ１に対する抵抗を得られない。従って単一遺伝子中の突然変異はヒストンＨ１に対してバクテリア耐性を導くことができない。ヒストンＨ１の一般的な膜損傷性能に対して耐性を有するようになるため、バクテリアは膜の構造を大きく変化させなければならない。従ってヒストンＨ１に対する耐性は、従来技術の抗生物質によるものと同じくらい迅速にはバクテリアによって獲得されることはできず、それは起こり難い。ヒストンＨ１に対する耐性を付与するバクテリア膜の全体構造の変化は、異なった遺伝子中の種々の突然変異を必要とし、これに対し従来技術の抗生物質に対する耐性は単一の突然変異から生じる。更に細胞膜の全体構造の変化はバクテリア膜の機能の重要なもののいくつかの妨げに非常になりやすく、全体の細胞の成長又は生存に有害になりやすい。
ヒストンＨ１の抗生物質作用に対する耐性は、従来技術の抗生物質に対する耐性より、バクテリアにとって得難くなっている。従ってヒストンＨ１は、多耐性のバクテリア株での感染処理用に使用できる。更に動物の飼育中、食料の生産又は保存中、個人のケア製品中などのような耐性バクテリア株の増殖を避けるために、抗生物質を使用できないような情況でも、ヒストンＨ１は使用できる。
本明細書で説明したように、その作用の固有の機構のため、ヒストンＨ１は更に他のバクテリア性混合物と組み合わせて使用できる。大きな利点として、ヒストンＨ１は、グラム陽性バクテリアのペプチドグリカン層を破壊し、又ヒストンＨ１に近づけるバクテリア膜を作り出すリゾチームのような殺菌剤と組み合わせて使用できる。
ヒストンＨ１のヘパリンとの相互作用
上述した通り、ヒストンＨ１は結合する大きな能力を有し、生物学的な膜の構造を破壊する。しかし本明細書で説明したように、バクテリア細胞は、例えば菌やヒトの細胞のような真核細胞と、ヒストンＨ１に対する反応性の面で大きく異なっている。バクテリアに対するヒストンＨ１の毒性濃度は本明細書に開示され、それは菌に対するものよりかなり低く、ヒト細胞に対するものより特別に低い。従ってヒストンＨ１は、患者への危険がない状態で、例えばバクテリア感染の処理用に患者に投与できる。しかし感受性の高い患者や困難な情況の場合のために、本発明は、ヒストンＨ１に対する解毒を提供し、これは患者に対して容易に投与してヒストンＨ１に特異的に結合させ、これによりヒストンＨ１を不活性化する。
本発明の他の態様では、ヘパリンはヒストンＨ１に対する解毒剤として提供される。ヘパリンは、例えば治療の間又はその後に、血液凝固を防止するために、長い間使用されてきた薬学的な化合物である。ヘパリンをヒストンＨ１に対する解毒剤として使用するのはヘパリンの発明性のある新規な適用である。このヘパリンの発明性のある新規な適用の危険を生じさせることなく、患者に投与できる薬学的組成物は、従来技術から取出すことができる。特に、ヘパリンをインフセートへ安全に組み入れること、及び患者へ投与できるヘパリンの毒性のない投与量は公知である。
ヘパリンは特異的にヒストンＨ１に結合しこれを不活性化する。これは、少なくとも部分的には、ヘパリンがポリアニオンで従って多くの正の電荷を有するヒストンＨ１と容易に相互作用を行うといった事実に起因する。従ってヒストンＨ１に対する本発明の他の解毒剤は、ヒストンＨ１に結合する任意の可溶性のポリアニオンであり、危険なく患者に投与でき、そして特に点滴用溶液中に組み入れられる可溶性のポリアニオンを含む。
本発明の他の態様によると、ヒストンＨ１をヘパリンに対する解毒剤として使用できる。ヘパリンは血液凝固を防止するために、治療の間又は後に頻繁に使用される。特に心臓治療の間に患者は大量のヘパリンを注入されて血液凝固が防止される。治療後にヘパリンは多くの場合に、プロタミンの注入によりルーチン的に除去される。プロタミンは、正に帯電した塩基性のアミノ酸を高い含有量で含むため、ヒストンＨ１に類似する。プロタミンとヒストンＨ１の生理学的機能は異なっているが、不要なヘパリンを除去するためにプロタミンの替わりに、ヒストンＨ１を治療用として使用できる。従って本発明は、ヘパリンに対する解毒剤としてヒストンＨ１を提供し、これらに限定されないが、治療処理後、特に心臓の治療後に、不要なヘパリンの結合及び不活性化に使用される。
無菌物質中へのヒストンＨ１の組込み
本発明の他の態様では、ヒストンＨ１が無菌物質中へ組込まれる。これらの態様では、ヒストンＨ１は無菌製品の表面に結合され、又は無菌製品（例えば、手術用インプラント、長期間カテーテル、バンドエイド、及び腐り易い食品用の合成ポリマーのラップ）から連続して放出される。
例えばヒップ置換手術のような手術用移植では、移植サイトで再発感染の長期間の危険がある。移植サイトでのバクテリア感染は、成功した移植の後の数年間に起こることが観察された。これらの場合、バクテリアは移植サイトへ、インプラントと共に又はインプラントの表面に付着して導入されると一般に信じられている。未知の理由で、バクテリアが不活性状態に残り、又は先天的な免疫防御のコントロール下で数年間残ることがある。しかし後の段階で、残されたバクテリアを活性化し増殖を始め、移植サイトでの感染を生じさせる。
上述の移植サイトの局所感染の場合、病原菌バクテリアが、適切に無菌化されていないインプラントの表面の移植サイトへ導入されるか、周囲からの汚染により手術の間に傷に進入する。従って、前記感染を回避するために、インプラントの無菌化に加えて、移植サイトにおける追加のバクテリア作用が必要になる。本発明の一態様によると、ヒストンＨ１がインプラントの表面に結合され、又はインプラントに含まれ又は放出される。従ってヒストンＨ１は移植サイトに存在し、手術の間及び後に移植サイトでのバクテリアの成長を阻害する。本発明によると、インプラントの表面に結合され、又はインプラントに含まれ又は放出されるヒストンＨ１が、不必要に移植サイトに導入されたバクテリアの生存、活性化及び繁殖に対抗して長期の保護を意図する。
本発明によると、ヒストンＨ１が手術しているインプラントに組み込まれ、従ってインプラントの表面に存在するか、手術の間及び／又はその後にインプラントから放出される。このようにヒストンＨ１は移植サイトの不必要なバクテリアの繁殖に対して抗微生物保護を与える。インプラント中にヒストンＨ１を殺菌剤として組み入れる重要な利点は、前記に加えてヒストンＨ１が弱い免疫性で移植サイトで不必要な免疫応答を行わないことである。
無菌物質中にヒストンＨ１を組み入れる本発明の第１の態様において、チタンインプラントの表面がヒストンＨ１で被覆される。そのチタンインプラントの表面は正に帯電したヒストンＨ１で容易に被覆できる。その酸化電位のため、チタン表面は常に薄く緻密な酸化チタンの付着層で被覆されている。第１のステップで、酸化物層が従来技術の化学操作で処理され、これにより正に帯電したヒストンＨ１に静電的な相互作用で容易に結合するヒドロキシルグループ又はアニオン性酸素グループが含まれるようになる。第２のステップで、その表面に負の帯電を含むチタンインプラントを、正に帯電しかつチタンインプラントの表面に静電的相互作用で容易に密着しているヒストンＨ１に接触させる。
第１の好ましい態様では、第１のステップで、チタンインプラントを従来技術の操作に含まれるがこれに限定されない群から選択される操作で化学的に処理して、チタンインプラントの負に帯電した表面を得る。第２のステップで、例えば熱に露出するような従来技術の方法で、インプラントを無菌化し、第３のステップで、前記インプラントを、例えば無菌化した粉末又は無菌化した溶液のような無菌化の形態にあるヒストンＨ１と接触させ、チタンインプラントの負に帯電した表面と正に帯電したヒストンＨ１間に静電的相互作用を起こさせる。ヒストンＨ１の無菌化した粉末を使用すると、チタンインプラントのヒストンＨ１による被覆、及びインプラントの包装を無菌状態下で単一ステップで行うことができる。ヒストンＨ１の無菌化溶液を使用する場合は、無菌状態下でヒストンＨ１被覆チタンインプラントの乾燥と包装を行う追加ステップが必要になる。包装されたヒストンＨ１被覆インプラントは再度酸化エチレン、γ−照射のようなイオン化照射を含む他の任意の無菌化方法（但しヒストンＨ１の天然の生物学的に活性なコンフォメーションを変性させない熱を除く）で無菌化しても良い。
第２の好ましい態様では、第１のステップで、チタンインプラントを従来技術の操作に含まれるがこれに限定されない群から選択される操作で化学的に処理して、インプラントの負に帯電した表面を得る。第２のステップで、前記チタンインプラントを、例えばヒストンＨ１の溶液又はヒストンＨ１を含む粉末のようなヒストンＨ１と接触させ、チタンインプラントの負に帯電した表面と正に帯電したヒストンＨ１間に静電的相互作用を起こさせる。第３のステップで、必要ならばヒストンＨ１で被覆したチタンインプラントを乾燥し、次いで包装する。第４のステップで、包装されたヒストンＨ１被覆インプラントを、酸化エチレン、γ−照射のようなイオン化照射を含む他の任意の無菌化方法（但しヒストンＨ１の天然の生物学的に活性なコンフォメーションを変性させない熱を除く）で無菌化しても良い。
本発明の更に他の態様によると、ヒストンＨ１を、チタンインプラント、又は例えば歯科手術での炭素インプラントのような手術用インプラント用に使用される他の任意の物質のインプラントにある一定の方法により密着され、前記ある一定の方法が、ヒストンＨ１をインプラント表面に結合する選択されたカップリンググループを固定することを含み、前記結合が例えば静電的又は共有結合で行われ、更に前記カップリンググループがヒストンＨ１を結合できる従来技術のカップリンググループを含まれるがこれに限定されない群から選択される第１のステップと；ヒストンＨ１がインプラントに結合され、該ヒストンＨ１はインプラントの表面のカップリンググループに結合される第２のステップと；ヒストンＨ１被覆インプラントを包装する第３のステップを含む。第４のステップでは、包装されたインプラントを、酸化エチレン、γ−照射のようなイオン化照射を含む他の任意の無菌化方法（但しヒストンＨ１の天然の生物学的に活性なコンフォメーションを変性させない熱を除く）で無菌化する。
本発明の更に他の態様では、上述の第１のステップでその表面にカップリンググループが固定されたインプラントを選択された方法で無菌化する。前記選択された方法は、インプラント上のカップリンググループを不活性化せずかつ引き続く前記カップリンググループにヒストンＨ１を結合する工程を阻害しない方法である。次のステップでは、前記インプラントを、例えば無菌化した粉末又は無菌化した溶液のような無菌化の形態にあるヒストンＨ１と接触させ、チタンインプラントの負に帯電した表面と正に帯電したヒストンＨ１間に静電的相互作用を起こさせ、ヒストンＨ１をインプラント表面上のカップリンググループに、例えば静電的又は共有結合で結合させる。ヒストンＨ１の無菌化した粉末を使用すると、チタンインプラントのヒストンＨ１による被覆、及びインプラントの包装を無菌状態下で単一ステップで行うことができる。ヒストンＨ１の無菌化溶液を使用する場合は、無菌状態下でヒストンＨ１被覆チタンインプラントの乾燥と包装を行う追加ステップが必要になる。包装されたヒストンＨ１被覆インプラントは再度酸化エチレン、γ−照射のようなイオン化照射を含む他の任意の無菌化方法（但しヒストンＨ１の天然の生物学的に活性なコンフォメーションを変性させない熱を除く）で無菌化しても良い。
好ましい態様によると、ヒストンＨ１でインプラント表面を被覆する上述した方法は、インプラントの表面の選択された少なくとも一部のみに被覆するよう修正しても良い。
本発明の他の態様によると、インプラントの表面又は表面の少なくとも選択された部分を、ヒストンＨ１含有層で被覆し、このヒストンＨ１含有層は選択された長さの時間に渡って連続的な形態で移植サイト内にヒストンＨ１を放出する。ヒストンＨ１含有表面層からのヒストンＨ１の連続的な放出は、延長された時間に渡って不要なバクテリア成長に対して連続的な保護を与える。更に与えられた時間内に放出されるヒストンＨ１の量、従ってインプラント表面における遊離のヒストンＨ１の濃度は本発明に従って選択できる。
好ましい態様では、インプラント表面上のヒストンＨ１含有層が、ヒストンＨ１を含むポリマーマトリクスとして形成され、ここで前記ポリマーマトリクスは水を吸うか及び／又は生物学的に分解できる。ヒストンＨ１は、ポリマーマトリクスからの拡散及び／又はポリマーマトリクスの分解によりヒストンＨ１含有層から放出される。本発明のインプラントのヒストンＨ１含有層のポリマーマトリクスは、生物的な互換性があり毒性はない。ポリマーマトリクスはピロージェンフリーで、移植サイトの組織を刺激したり炎症を起こさせたりしない。更にポリマーマトリクスは免疫学的に不活性で、つまりそれは特定の又は不特定の活性化及び／又は免疫システムの応答を生じさせない。
本発明のインプラントのヒストンＨ１含有層のポリマーマトリクスは、体内の薬学的化合物の連続的な放出のため、特にインプラントされた貯蔵器具から薬学的化合物の長期放出のためのジェレニクス又は薬学の分野で既知又は連続的に開発されている生物的に互換性で及び生物的に分解でき及び／又は水和できるポリマーを含むがこれに限定されないグループから選択される。このような貯蔵器具は、避妊用、糖尿病処理用、又は他の臨床疾患用の形態として又はそれら用として連続的に開発されている。好ましい態様では、本発明のインプラントのヒストンＨ１含有層のポリマーマトリクスは、正に帯電された分子、特に例えばヒストンＨ１のような正に帯電されたプロテインを含むように及び／又は放出するように適用されたポリマーから選択される。
本発明の好ましい他の態様では、ヒストンＨ１の殺菌作用によるバクテリア感染に対抗する保護を意図する長期用カテーテルが提供される。例えばバイパス手術、ライン、ポンプ又は尿のカテーテル用に使用されるような長期用カテーテルが、局所感染のため、患者からしばしば除去されなければならない。カテーテルの表面に沿って体内に侵入し、又はカテーテルの表面に沿って導入されるバクテリアや菌による感染は、長期用カテーテルと共に起こり、そして組織の局所的な刺激、損傷又は破壊に導く重大な問題であり、長期用カテーテルを有する患者に連続的な被害を生じさせ、更にシステム的な感染に導くことがある。従来技術では、尿や血液に関する上記した衛生的な問題点は解決されていない。
本発明では、任意の形態の及び各用途用のカテーテルが提供され、これはその表面にヒストンＨ１を含みあるいは選択された時間に渡って連続的にヒストンＨ１を放出し、これによりバクテリア感染に対して保護を与える。本発明のカテーテルは、例えばバイパス手術、ライン、ポンプに使用されるような血液カテーテル及び尿カテーテルを含むがこれに限定されない群から選択される。
第１の態様では、本発明のカテーテルは従来技術のカテーテル用材料で製造され少なくともその外表面がヒストンＨ１で被覆されている。ヒストンＨ１を使用するカテーテルの被覆は、予備形成されたカテーテルを溶液又は粉末の形態のヒストンＨ１と接触させることにより行われ、ここではヒストンＨ１が自動的にカテーテルの変化していない表面に吸着される。被覆されたカテーテルは包装され、ヒストンＨ１の生物的に活性なコンフォメーションを逆に崩壊させることのない無菌法で無菌化する。
好ましい態様によると、カテーテルの被覆は、カテーテルの表面に負の帯電を与えるカテーテルの化学的、物理化学的、電気的又は照射処理により促進される。他の好ましい態様によると、ヒストンＨ１用のカップリンググループが本発明のカテーテルの少なくとも外表面に固定され、かつヒストンＨ１が静電的又は共有結合的な相互作用でカテーテルの少なくとも外表面に結合される。他の好ましい態様によると、カテーテルはヒストンＨ１に高い親和性で結合された選択された物質の少なくとも１種で形成され、あるいはこれを含む。該物質は負に帯電されたポリマー及びヒストンＨ１に静電的又は共有結合的に相互作用を行うカップリンググループを有するポリマーを含むがこれに限定されないグループから選択される。本発明によると、ヒストンＨ１は被覆されたカテーテルから放出されあるいは被覆されたカテーテルの表面に固定されたまま残る。
更に他の好ましい態様によると、本発明のカテーテルは、ヒストンＨ１を含むポリマーマトリクスの表面層を含み、ここではポリマーマトリクスは水を吸うか及び／又は生物学的に分解できる。ヒストンＨ１は、ポリマーマトリクスからの拡散及び／又はポリマーマトリクスの分解によりヒストンＨ１含有層から放出される。本発明のカテーテルのヒストンＨ１含有層のポリマーマトリクスは、生物的な互換性があり毒性はなく、ピロージェンフリーで、カテーテルと接触する組織を刺激したり炎症を起こさせたりしない。更にポリマーマトリクスは免疫学的に不活性で、つまりそれは特定の又は不特定の活性化及び／又は免疫システムの応答を生じさせない。
本発明のカテーテルのヒストンＨ１含有層のポリマーマトリクスは、体内の薬学的化合物の連続的な放出のため、特にインプラントされた貯蔵器具から薬学的化合物の長期放出のためのジェレニクス又は薬学の分野で既知又は連続的に開発されている生物的に互換性で及び生物的に分解でき及び／又は水和できるポリマーを含むがこれに限定されないグループから選択される。このような貯蔵器具は、避妊用、糖尿病処理用、又は他の臨床疾患用の形態として又はそれら用として連続的に開発されている。好ましい態様では、本発明のカテーテルのヒストンＨ１含有層のポリマーマトリクスは、正に帯電された分子、特に例えばヒストンＨ１のような正に帯電されたプロテインを含むように及び／又は放出するように適用されたポリマーから選択される。
本発明の他の態様によると、ヒストンＨ１を含み、不要なバクテリアによる感染を処理するためのバンドエイド、傷手当て用品、プラスター、衛生ナプキン及び膣用タンポンが提供される。この態様では、ヒストンＨ１は粉末の形態、又はヒストンＨ１を含む任意の形態の含浸品で適用できるという利点がある。
本発明の更に他の形態によると、食物の被覆及び保存用に合成ポリマーのラップが提供され、これはヒストンＨ１を含み、微生物の成長を阻害する。本発明の合成ポリマーのラップは、例えばチーズ、肉及び魚のような腐りやすい食品の安全な貯蔵用という利点と共に使用できる。
第１の形態によると、ヒストンＨ１が静電的相互作用により本発明の合成ポリマーのラップに結合されている。この場合、前記合成ポリマーは負の帯電を含み又は含むように処理され、従って正に帯電したヒストンＨ１に結合する。第２の態様によると、本発明のラップに含まれ又はそれを形成する少なくとも１個の合成ポリマーのアンカーグループに、ヒストンＨ１が共有結合的に結合している。本発明によると、ヒストンＨ１は、合成ポリマーの特許性のあるラップの表面のいずれか一方又は両者に結合できる。本発明のラップは、ヒストンＨ１を結合させ又は結合させるようにすることのできる任意の合成ポリマーで形成する。他の態様では、本発明の合成ポリマーのラップは両面上又はいずれかの面上に、ヒストンＨ１を有する少なくとも１層のポリマーマトリクスを含む。更に他の態様では、ヒストンＨ１は合成ポリマーのラップから及び／又は合成ポリマーの前記ラップの表面の層から連続的に放出される。
本明細書で引用した特許、特許出願、及び刊行物のそれぞれの開示はそれらの全部が参照することにより本明細書に含まれる。
本発明を特定の態様を参照して行ったが、本発明の他の態様及び変形が、本発明の真の精神及び範囲を離れることなく特許庁により考案されるであろう。添付した特許請求の範囲はこのような全ての態様と等価の変形を含むものと解釈されることを意図している。
【図面の簡単な説明】
第１図は、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＢ１１５７に関してヒストンＨ１により示される抗体活性の濃度依存性を示すグラフである。
第２図は、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＢ１１５７に関してヒストンＨ１により示される抗体活性の露出時間依存性を示すグラフである。
第３図は、ペニシリンに反応するＥ．ｃｏｌｉ株ＡＢ１１５７のヒストンＨ１により示される抗体活性と、ヒストンＨ１の種々の濃度における、本明細書の実施例６で記載したＡＢ１１５７株から誘導されたＥ．ｃｏｌｉのペニシリン耐性株に関する抗体活性を比較する棒グラフである。ペニシリンに反応するＥ．ｃｏｌｉ細胞の生存は色の薄い方のストライプの棒により示されている。ペニシリン耐性Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の生存は色の濃い方のストライプの棒により示されている。
第４図は、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＢ１１５７に関してヒストンにより示される抗体活性の、ヒストンと細胞が接触する媒体中のヘパリン濃度に対する依存性を示すグラフである。
第５図は、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＢ１１５７に関するヒストンＨ１調合剤により示される抗体活性と、前もってＥ．ｃｏｌｉ細胞と接触させたヒストンＨ１の水性調合剤により示される抗体活性とを比較するグラフである。前もって吸収されていないヒストンＨ１の調合剤はグラフ上で丸い点でマークされた線で示されている。前もって接触されたヒストンＨ１の調合剤はグラフ上で四角でマークされた線で示されている。
第６図は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞がヒストンＨ１の抗生物質活性への耐性を増加させられることを示すグラフである。
第７図は、膜の完全性の崩壊がヒストンＨ１の殺菌効果に依るものであることを示すグラフである。このグラフは、膜が損傷した細胞のパーセントをヒストンＨ１の種々の濃度の培養時間と比較するものである。黒丸の点は１．９μＭのヒストンＨ１を示すラインで、三角の点は０．４μＭのヒストンＨ１を示すラインで、黒い四角の点は０．９５μＭのヒストンＨ１を示すラインである。
第８図は、ヒストンＨ１、リゾチーム及びリゾチームと共に培養したヒストンＨ１調製物により示される抗生物質活性を比較するグラフである。リゾチームのみの抗生物質調製物は斜めのハッチングを付した棒で示している。０．４８μＭのヒストンの調製物は濃いストライプの棒を有する棒で示している。０．４８μＭのヒストンとリゾチームの調製物はより薄いストライプの棒で示している。
第９図は、尿道感染から誘導した種々のＥ．ｃｏｌｉ株に関してヒストンＨ１により示される抗生物質活性の露出時間依存性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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