(57)【要約】光学的薄膜アレイを分析するためのイメージ分析ワークステーションが開示されている。開示されている一実施態様は、それぞれが目的とする分析物のための固定化された捕捉試薬を包含する複数の個別的にアドレス可能な位置を提供する単一の光学的薄膜テスト表面を含む個別のアレイに関連する。ここでは、これらを『アレイ状の光学的薄膜テスト表面』と呼ぶ。好ましくは、個別のアレイ状の光学的薄膜が少なくとも４、より好ましくは少なくとも１６、さらに好ましくは少なくとも３２、それよりも好ましくは少なくとも６４、もっとも好ましくは１２８個もしくはそれを超える数の個別的にアドレス可能な位置を包含する。個別的にアドレス可能な位置の１ないしは複数は、コントロール信号（たとえば、正規化信号用、および／または正および／または負のコントロールとして作用する信号）または基準信号（すなわち、デバイス内におけるアレイ状の光学的薄膜テスト表面の相対的なアラインメントを決定するために使用される情報）を提供することができる。
2006526151.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
テスト表面上のアレイの位置を識別する方法であって：
（ａ）前記テスト表面の電子イメージを取り込むこと；
（ｂ）前記イメージを方形化してピクセルの列および行を、それぞれ実質的に垂直および水平の構成に適応させること；
（ｃ）前記イメージの前記列および行のグリッドの位置を決定すること；および、
（ｄ）信号強度の閾値を使用して前記イメージを二値化し、前記グリッド上のスポットの位置を識別すること；
を包含する方法。
【請求項２】
前記方形化するステップは：
前記イメージのエッジを検出すること；および、
前記イメージを回転すること；
を包含する、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
前記エッジを検出するステップは：
前記イメージ内のピクセルの列のセットについてピクセル和の第１のベクトルを生成すること；
前記イメージ内のピクセルの行のセットについてピクセル和の第２のベクトルを生成すること；
前記第１および第２のベクトルの二乗した一次導関数を生成すること；および、
前記二乗した一次導関数におけるピークを検出すること；
を包含する、特許請求の範囲第２項に記載の方法。
【請求項４】
前記グリッドの位置を決定するステップは：
前記グリッドの行および列に対応する信号のピークのグリッドを検出すること；
を包含する、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項５】
前記信号のピークのグリッドを検出するステップは：
反転したピクセル和の二次導関数を生成すること；および、
前記二次導関数の最小値の位置を決定すること；
を包含する、特許請求の範囲第４項に記載の方法。
【請求項６】
前記二値化するステップは、適応閾値を使用する、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項７】
前記適応閾値は、平均適応閾値である、特許請求の範囲第６項に記載の方法。
【請求項８】
前記適応閾値は、中央値適応閾値である、特許請求の範囲第６項に記載の方法。
【請求項９】
さらに：
（ｅ）前記グリッドをデフォルトのグリッドに相関させ、ここで前記グリッドは前記アレイに対応すること；
を包含する、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記相関させることは：
（ｆ）ステップ（ｅ）において位置決定された前記スポットのそれぞれの中心を、前記デフォルトのグリッド内のスポットに相関させること；
を包含する、特許請求の範囲第９項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ステップ（ｆ）は：
前記デフォルトのグリッド内の前記スポットにおける信号が、ステップ（ｄ）において位置決定された前記スポットの１つの前記中心に対応しているか否かを決定すること；および、
前記決定が否定的決定を提供するとき、前記デフォルトのグリッドに対して前記スポットの再センタリングを行うこと；
を包含する、特許請求の範囲第１０項に記載の方法。
【請求項１２】
さらに：
（ｄ）ステップ（ｄ）において位置決定された前記スポットにハフ変換を適用し、前記アレイについて予測されるスポットに対する前記スポットの相関を評価すること；
を包含する、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項１３】
テスト表面上のアレイの位置を識別する方法であって：
（ａ）イメージに関する勾配を、２つの実質的に直交する方向において生成すること；
（ｂ）前記生成した勾配に対応する二乗後の勾配の大きさを生成すること；
（ｃ）前記勾配の大きさを、前記二乗後の勾配の大きさの閾値を用いて二値化すること；
（ｄ）前記勾配に基づいて変換イメージを生成すること；
（ｅ）ステップ（ｄ）の変換についての最大票カウントの閾値を使用して前記変換イメージを二値化し、閾値適用済み変換イメージを生成すること；
（ｆ）前記閾値適用済み変換イメージ内においてピクセルの連続するグループを検出すること；
（ｇ）前記アレイのレイアウトに対応するグリッドを構築すること；
（ｈ）前記グリッドのスポット位置において信号強度を測定すること；および、
（ｉ）スポット・ポジションおよび信号の表を生成すること、およびそれにおいて前記スポット・ポジションはスポットの中心を表すこと；
を包含する方法。
【請求項１４】
さらに：
ステップ（ａ）に先行して、前記テスト表面のエッジを検出すること；および、
前記検出したエッジに対して前記イメージのクロッピングを行うこと；
を包含する、特許請求の範囲第１３項に記載の方法。
【請求項１５】
マシン可読プログラム・コードを包含するプログラム・プロダクトであって、マシンに：
（ａ）前記テスト表面を方形化してピクセルの列および行を、それぞれ実質的に垂直および水平の構成に適応させる方法ステップ；
（ｂ）前記イメージの前記列および行のグリッドの位置を決定する方法ステップ；および、
（ｃ）信号強度の閾値を使用して前記イメージを二値化し、前記グリッド上のスポットの位置を識別する方法ステップ；
を実行させるためのマシン可読プログラム・コードを包含するプログラム・プロダクト。
【請求項１６】
前記方形化するステップは、マシンに：
前記イメージのエッジを検出するステップ；および、
前記イメージを回転する方法ステップ；
を実行させるためのプログラム・コードを包含する、特許請求の範囲第１５項に記載のプログラム・プロダクト。
【請求項１７】
前記エッジを検出するステップは、マシンに：
前記イメージ内のピクセルの列のセットについてピクセル和の第１のベクトルを生成する方法ステップ；
前記イメージ内のピクセルの行のセットについてピクセル和の第２のベクトルを生成する方法ステップ；
前記第１および第２のベクトルの二乗した一次導関数を生成する方法ステップ；および、
前記二乗した一次導関数におけるピークを検出する方法ステップ；
を実行させるためのプログラム・コードを包含する、特許請求の範囲第１６項に記載のプログラム・プロダクト。
【請求項１８】
前記グリッドの位置を決定するステップは、マシンに：
前記グリッドの行および列に対応する信号のピークのグリッドを検出する方法ステップ；
を実行させるためのプログラム・コードを包含する、特許請求の範囲第１５項に記載のプログラム・プロダクト。
【請求項１９】
前記信号のピークのグリッドを検出するステップは、マシンに：
反転したピクセル和の二次導関数を生成する方法ステップ；および、
前記二次導関数の最小値の位置を決定する方法ステップ；
を実行させるためのプログラム・コードを包含する、特許請求の範囲第１８項に記載のプログラム・プロダクト。
【請求項２０】
前記二値化するステップは、適応閾値を使用する、特許請求の範囲第１５項に記載のプログラム・プロダクト。
【請求項２１】
前記適応閾値は、平均適応閾値である、特許請求の範囲第２０項に記載のプログラム・プロダクト。
【請求項２２】
前記適応閾値は、中央値適応閾値である、特許請求の範囲第２０項に記載のプログラム・プロダクト。
【請求項２３】
さらに：
（ｄ）前記グリッドをデフォルトのグリッドに相関させる方法ステップであって、それにおいては前記グリッドが前記アレイに対応する方法ステップ；
をマシンに実行させるためのプログラム・コードを包含する、特許請求の範囲第１５項に記載のプログラム・プロダクト。
【請求項２４】
前記相関させることは、：
（ｅ）ステップ（ｃ）において位置決定された前記スポットのそれぞれの中心を、前記デフォルトのグリッド内のスポットに相関させる方法ステップ；
をマシンに実行させるためのプログラム・コードを包含する、特許請求の範囲第２３項に記載のプログラム・プロダクト。
【請求項２５】
前記ステップ（ｅ）は：
前記デフォルトのグリッド内の前記スポットにおける信号が、ステップ（ｃ）において位置決定された前記スポットの１つの前記中心に対応しているか否かを決定する方法ステップ；および、
前記決定が否定的決定を提供するとき、前記デフォルトのグリッドに対して前記スポットの再センタリングを行う方法ステップ；
をマシンに実行させるためのプログラム・コードを包含する、特許請求の範囲第２４項に記載のプログラム・プロダクト。
【請求項２６】
さらに：
（ｄ）ステップ（ｃ）において位置決定された前記スポットにハフ変換を適用し、前記アレイについて予測されるスポットに対する前記スポットの相関を評価する方法ステップ；
をマシンに実行させるためのプログラム・コードを包含する、特許請求の範囲第１５項に記載のプログラム・プロダクト。
【請求項２７】
マシン可読プログラム・コードを包含するプログラム・プロダクトであって、マシンに：
（ａ）イメージに関する勾配を、２つの実質的に直交する方向において生成する方法ステップ；
（ｂ）前記生成した勾配に対応する二乗後の勾配の大きさを生成する方法ステップ；
（ｃ）前記勾配の大きさを、前記二乗後の勾配の大きさの閾値を用いて二値化する方法ステップ；
（ｄ）前記勾配に基づいて変換イメージを生成する方法ステップ；
（ｅ）ステップ（ｄ）の変換についての最大票カウントの閾値を使用して前記変換イメージを二値化し、閾値適用済み変換イメージを生成する方法ステップ；
（ｆ）前記閾値適用済み変換イメージ内においてピクセルの連続するグループを検出する方法ステップ；
（ｇ）前記アレイのレイアウトに対応するグリッドを構築する方法ステップ；
（ｈ）前記グリッドのスポット位置において信号強度を測定する方法ステップ；および、
（ｉ）スポット・ポジションおよび信号の表を生成する方法ステップであって、それにおいては前記スポット・ポジションがスポットの中心を表す方法ステップ；
を実行させるためのマシン可読プログラム・コードを包含するプログラム・プロダクト。
【請求項２８】
さらに：
ステップ（ａ）に先行して、前記テスト表面のエッジを検出する方法ステップ；および、
前記検出したエッジに対して前記イメージのクロッピングを行う方法ステップ；
をマシンに実行させるためのプログラム・コードを包含する、特許請求の範囲第２７項に記載のプログラム・プロダクト。
【請求項２９】
複数の凹部であって、それぞれが個別的なアレイ状の光学的薄膜テスト表面を保持し、前記凹部内において前記テスト表面の上側に液体を保持するための体積を提供するべく構成されており、イメージ分析プロセスにおける干渉を排除するべく構成された深さを有する複数の凹部；および、
前記凹部のそれぞれの中に配置されるアレイ状の光学的薄膜テスト表面であって、捕捉試薬および１ないしは複数の基準位置を包含する複数の個別的なテスト位置を包含するアレイ状の光学的薄膜テスト表面；
を包含するテスト表面キャリア。
【請求項３０】
イメージ分析応用において使用するためのつや消し表面であって、テスト表面キャリアからの擬似反射を低減するつや消し表面；
を包含するテスト表面キャリア。
【請求項３１】
複数のテスト表面を受け入れる複数の凹部；および、
各凹部の１ないしは複数のパターン認識ターゲットであって、前記凹部内における１ないしは複数のテスト表面の配置を改善するパターン認識ターゲット；
を包含するテスト表面キャリア。
【請求項３２】
前記パターン認識ターゲットは、自動化された製造プロセスにおいて前記テスト表面を配置するために使用される、特許請求の範囲第３１項に記載のテスト表面キャリア。
【請求項３３】
前記パターン認識ターゲットは、滑らかであり、光沢がある、特許請求の範囲第３１項に記載のテスト表面キャリア。
【請求項３４】
前記パターン認識ターゲットは、幾何学的形状である、特許請求の範囲第３１項に記載のテスト表面キャリア。
【請求項３５】
前記幾何学的形状は円である、特許請求の範囲第３４項に記載のテスト表面キャリア。
【請求項３６】
前記パターン認識ターゲットは、イメージ分析プロセスにおいて、前記凹部の識別、位置決定、間隔の確認、およびアライメントに使用される、特許請求の範囲第３１項に記載のテスト表面キャリア。
【請求項３７】
複数のテスト表面を受け入れる複数の凹部；および、
前記凹部内のアライメント・リブであって、前記テスト表面を支持するべく作用するアライメント・リブ；
を包含し、それにおいて前記アライメント・リブは、前記テスト表面キャリアの製造の間に前記凹部内における前記テスト表面の向きもしくはスキューをコントロールする、テスト表面キャリア。
【請求項３８】
複数のテスト表面を受け入れる複数の凹部；および、
前記凹部内の拡張ウインドウ・フレーム機能であって、前記テスト表面を支持するべく作用する拡張ウインドウ・フレーム機能；
を包含し、それにおいて前記拡張ウインドウ・フレーム機能は、接着剤を含むポケットを作り、接着レベルが、前記テスト表面キャリアの製造の間に前記凹部内の前記拡張ウインドウのポジションに対するマシンの視覚プロセスによってコントロールされる、テスト表面キャリア。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エレメントのアレイの光学検出、解像、および識別、好ましくは光学的薄膜表面の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
次に述べる本発明の背景の説明は、単に本発明の理解の補助として提供されており、本発明に対する従来技術を記述し、あるいはそれを構成することを認めたものではない。
【０００３】
半導体分野においては、一般に半導体製造プロセスの種々の段階で真空蒸着法、気相成長法、スピン・コーティング法、またはディップ・コーティング法が使用される。薄膜の実際の厚さおよび物理的特性のコントロールならびに監視は、この技術を使用して作成されるデバイスの機能にとって絶対的に必要不可欠である。これらの特性は、製造間およびその後にわたり頻繁に監視されなければならない。『光学的薄膜の決定』は、基板表面上に形成される１ないしは複数の薄層の厚さを決定するための方法を言う。この種の『薄膜』は、約１ｎｍから約１００μｍの厚さの範囲にわたる。
【０００４】
通常、光学的薄膜測定は、『光学的薄膜テスト表面』を構成する基板から反射される光の１ないしは複数の特性における変化をよりどころとする。これは、その表面が入射光を反射し、表面上の質量もしくは厚さにおける変化に直接起因する信号を生成するために、屈折率（ｎ）および吸収係数（ｋ）を選択することによって構成され、アレンジされるということが含意されている。この信号は、光を用いて表面を照明することによって獲得される；光は、表面から反射されるか、あるいは表面を通過し、その表面上に薄膜があればそれによって、反射され、あるいは透過された光の色、楕円率、および／または１ないしは複数の波長の強度が、干渉効果に起因して変化することになる。この変化の大きさ、したがって獲得される信号の大きさは、表面の膜（１ないしは複数）の質量もしくは厚さに依存する。
【０００５】
薄膜の光学的測定のためのデバイスは、概して、次の２つの計器クラスに分けられる：すなわち、反射率計および楕円偏光計である。反射率法は、光学的薄膜テスト表面から反射される光の強度および／または色における変化の測定に基づいており；楕円偏光法は、光学的薄膜テスト表面から反射される光の偏光における変化の測定に基づいている。これらの方法は、この分野に周知である。たとえば、トンプキンス（Ｔｏｍｐｋｉｎｓ）およびマクガハン（ＭｃＧａｈａｎ）著「スペクトロスコーピック・エリプソメトリ・アンド・レフレクトメトリ：ア・ユーザズ・ガイド（Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  Ｅｌｌｉｐｓｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｒｅｆｌｅｃｔｏｍｅｔｒｙ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ」（ジョン・ワイリ・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）、１９９９年）には、材料の光学定数の性質、反射率計、楕円偏光スペクトル、および単一波長楕円偏光計の計器アスペクトをはじめ、楕円偏光法ならびに反射率法のデータの収集ならびに分析に関する分析的アプローチについて論じられている。
【０００６】
これらの方法ならびにデバイスの、分子寸法において膜厚内の変化を敏感に検出できるという能力から、生物学的システムに対する光学的薄膜測定の応用が定着した。たとえば、結合反応の直接検出のためのデバイスならびに方法（たとえば、免疫学的検定法、核酸ハイブリダイゼーション等）が記述されている。米国特許第６，４８３，５８５号；第６，３５５，４２９号；第６，２８７，７８３号；第６，０６０，２３７号；第５，９５５，３７７号；第５，６３９，６７１号；第５，６３１，１７１号；第５，６２９，２４１号；第５，５５２，２７２号；第５，５５０，０６３号；第５，４９４，８２９号を参照されたい。これらの方法は、信号の生成について信号発現エレメント（たとえば、蛍光分析、ルミネセンス、または比色分析成分）の存在に依存しないが、結合反応の検出を強化するために追加の質量または光学的な厚さを提供する増幅方法（たとえば、ラテックス、金等の粒子の析出物または結合の触媒生成）を採用してもよい。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ハイスループットの薄膜光学アッセイ・デバイスのデバイス、構成、および当該デバイスの製造ならび使用ための方法に関する。以下のセクションは、ゲノミクス、プロテオミクス、アレルギ・パネル、薬剤発見、ハイスループットのスクリーニング、ファーマコゲノミクス、トキシコゲノミクス、ＡＤＭＥスクリーニング、感染症パネル、特定の疾病または状態等のためのＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）分析等の医療もしくはリサーチ応用における使用のための光学的薄膜テスト表面アレイの分析に求められるハードウエアならびにソフトウエア要件を述べている。
【０００８】
第１の側面において、本発明は、それぞれが目的とする分析物のための固定化された捕捉試薬を包含する複数の個別的にアドレス可能な位置を提供する単一の光学的薄膜テスト表面を包含する個別のアレイに関する。これらをここでは『アレイ状の光学的薄膜テスト表面』と呼ぶ。好ましくは、個々のアレイ状の光学的薄膜テスト表面は、少なくとも４、より好ましくは少なくとも１６、さらに好ましくは少なくとも３２、それよりも好ましくは少なくとも６４、もっとも好ましくは１２８もしくはそれを超える数の個別的にアドレス可能な位置を包含する。個別的にアドレス可能な位置の１ないしは複数は、コントロール信号（たとえば、正規化信号用、および／または正および／または負のコントロールとして作用する）または基準信号（すなわち、デバイス内におけるアレイ状の光学的薄膜テスト表面の相対的なアライメントを決定するために使用される情報）を提供することができる。
【０００９】
関連する側面において、アレイ状の光学的薄膜テスト表面は、単一ハウジング内において『アレイのアレイ』を提供する、より大きな『テスト表面キャリア』内に包含され、それによりさらにスループットが向上する。好ましくは個別のテスト表面キャリアが、少なくとも１つ、より好ましくは少なくとも２、さらに好ましくは少なくとも５、それよりも好ましくは少なくとも１０、それよりもなお好ましくは少なくとも２０、さらにそれよりも好ましくは少なくとも５０、もっとも好ましくは９０もしくはそれを超える数の個別的なアレイ状の光学的薄膜テスト表面を、単一のハウジング内に包含する。アレイと同様に、テスト表面キャリアもまた、そのテスト表面キャリア内の光学的薄膜テスト表面の相対的なアライメントを決定するために使用される情報を提供する基準位置を備えることができる。
【００１０】
ここで個別のアレイに関して使用されている『個別的』という表現は、不連続な表面を有する２もしくはそれを超える数のアレイを言う。また、ここで単一アレイ上の個々の位置に関して使用されている『個別的にアドレス可能』という表現は、特異的な信号を獲得することができる表面の個別的な領域を言う。
【００１１】
アレイ状の光学的薄膜テスト表面上の個別的にアドレス可能な位置から、ターゲット分子の、アレイ内のポジションにある捕捉試薬との特異的な反応の結果として、膜の厚さもしくは質量の変化によって信号が生成される。膜の厚さもしくは質量が変化するとき、表面から反射される光は、偏光状態、位相、または干渉色において変化を受ける。捕捉試薬は、小分子、ポリペプチド、タンパク質、環状ポリペプチド、ペプチド模倣体、アプタマー、抗体、ｓｃＦｖ、多糖類、レセプタ、ポリヌクレオチド、および／またはポリヌクレオチド類似体であることができる；同様に、ターゲット分子についても、小分子、ポリペプチド、タンパク質、環状ポリペプチド、ペプチド模倣体、アプタマー、抗体、ｓｃＦｖｓ、多糖類、レセプタ、ポリヌクレオチド、および／またはポリヌクレオチド類似体であることができる。本発明においては、互いに特異的な結合特性を伴う物質の任意の組み合わせを、捕捉試薬／分析物ペアとして使用することができる。
【００１２】
ここで使用されている『小分子』という表現は、３０００ダルトンより小さい、好ましくは２０００もしくは１５００ダルトンより小さい、さらに好ましくは１０００ダルトンより小さい、もっとも好ましくは６００ダルトンより小分子質量を有する化合物を言う。好ましくは、必須ではないが、小分子はオリゴペプチドではない。
【００１３】
ここで使用されている『ポリペプチド』という表現は、アミド結合によって隣接アミノ酸単位に連結された少なくとも２つのモノマー・アミノ酸単位を包含する共有結合形アセンブリを言う。『オリゴペプチド』は、短いアミノ酸配列（すなわち、２を超え、数百までのアミノ酸）を含むポリペプチドである。オリゴペプチドは、概して化学合成によって、あるいはより大きなポリペプチドのフラグメント化によって製造される。ポリペプチド薬剤の例としては、限定する意図ではないが、治療抗生物質、インシュリン、副甲状腺ホルモン、ポリペプチド・ワクチン、およびバンコマイシン等の抗生物質が挙げられる。新しいポリペプチド薬剤は、たとえばファージディスプレイ法によって同定することができる。
【００１４】
ここで使用されている『抗体』という表現は、免疫抗原性反応のインビトロまたはインビボ生成によって獲得される免疫グロブリン分子を言い、ポリクローン性、単一特異性のモノクローン性抗体、およびそれらの抗原結合フラグメント（たとえばＦａｂフラグメント）をともに含む。『免疫原性応答』は、適切な細胞がその種の抗原と接触した後に１ないしは複数の抗原に向けられた抗体の生成をもたらす反応である。
【００１５】
ここで使用されている『単鎖可変領域フラグメント』または『ｓｃＦｖ』という表現は、軽鎖および重鎖部分の抗原結合サイトの形成を可能にするに充分な長さを有する共有結合によって互いに連結された単一の抗体軽鎖および抗体重鎖の可変抗原結合決定領域を言う。この種のリンカーは、短いときは共有結合に等しくてもよく；好ましいリンカーは、２ないし５０のアミノ酸であるが、より好ましくは５ないし２５のアミノ酸である。
【００１６】
ここで使用されている『ポリヌクレオチド』という表現は、通常、隣接リボースまたはデオキシリボース単位の３’および５’ヒドロキシルを介してホスホジエステル結合によって連結されるヌクレオチドの共有結合形アセンブリを含む分子を言う。『オリゴヌクレオチド』は、短い塩基配列を含むポリヌクレオチド（すなわち、２を超え、数百までのヌクレオチドであり、２５ないし５０のヌクレオチド・オリゴマーが一般的である）である。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡおよびＤＮＡをともに含み、ハンマーヘッド、ダンベル等の３次元形状が仮定でき、また一本鎖であっても二本鎖であってもよい。ポリヌクレオチド薬剤には、リボザイムＲＮＡｉ構造物、およびポリヌクレオチド・ワクチンを含めることができる。またポリヌクレオチドは、１ないしは複数の置換、たとえば２’および／または３’位において−アルキル（たとえば、−Ｏ−メチル、−Ｏ−エチル、−Ｏ−プロピル）、−メトキシエトキシ、−アリル、−アミノ、または−フルオロによって置換されたリボースまたはデオキシリボースを包含することもできる。
【００１７】
ここで使用されている『ポリヌクレオチド類似体』という表現は、ポリヌクレオチドの構造ならびに機能を模倣するが、ホスホジエステル結合によって連結されたヌクレオチドの共有結合形アセンブリではない分子を言う。Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン単位の骨格結合を介して連結されるプリン塩基およびピリミジン塩基を含むペプチド核酸は、オリゴヌクレオチド類似体の一例である。
【００１８】
ここで使用されている『多糖類』という表現は、２もしくはそれを超える数の共有結合的に連結された糖単位を言う。『オリゴ糖類』は、短い糖配列を含む多糖類である（すなわち、２を超え、数百までの糖単位）。
【００１９】
ここで使用されている『環状ポリペプチド』という表現は、モノマー・アミノ酸単位の共有結合形アセンブリを含む分子を言い、そのそれぞれは、アミド結合によって少なくとも２つの隣接アミノ酸単位に連結されて大環状を形成する。
【００２０】
ここで使用されている『ペプチド模倣体』という表現は、ポリペプチドの構造ならびに機能を模倣するが、アミド結合によって連結されるアミノ酸の共有結合形アセンブリではない分子を言う。Ｎ−置換グリシン単位のポリマーであるペプトイドは、ペプチド模倣体の一例である。
【００２１】
ここで使用されている『アプタマー』という表現は、非ポリヌクレオチド・ターゲット分子に結合するポリヌクレオチドを言う（たとえば、ポリペプチドまたは小分子）。
【００２２】
好ましいアレイ状の光学的薄膜テスト表面は、光学的薄膜テスト表面を支持する基板からなる。好ましい基板材料としては、実質的に剛体のガラス、硬質プラスチック、金属、シリコン等が挙げられる。特に好ましい基板材料について次に述べる。基板は、本質的に、測定されるべき薄膜効果の生成に関与する反射表面を有するか、その種の反射表面を提供するべく、たとえば金属層の気相成長によって改変することができる。あるいは、種々の実施態様においては、透明基板が好ましいこともある。以下に述べる種々の実施態様においては、アレイ状の光学的薄膜テスト表面が、さらに反射表面の上に配置される以下のような１ないし複数の追加の層を包含することができる：すなわち、反射防止層；および共有結合形もしくは非共有結合形の結合を提供して捕捉試薬を固定化する付着層である。ここで記述しているとおり、反射防止層が本発明のすべての態様において必要であるということはなく、捕捉試薬は、表面上のサイトに対して直接固定化できることから、これらの層のそれぞれはオプションである。
【００２３】
好ましいフォーマットは、個別のアレイ状の光学的薄膜テスト表面を、マニュアルもしくは既製のロボットを使用した試薬の供給およびアッセイ操作に対して容易に適合させることのできるデバイス内に配置するものである。したがって、種々の実施態様においては、市販の９６ウェル・プレートに類似した、個別のアレイの位置の離隔を提供する９６ポジション・プレートを使用して、ここで述べている方法ならびに装置において使用するための複数の個別のアレイを収容する。ここで理解される必要があるが、追加のプレート構成も本発明の範囲内であり、それには複数の９６ウエル（たとえば、３８４および１５３６ウエル）も含まれ、それらは、市販の液体取り扱いロボットを用いて都合よく使用される。
【００２４】
追加の側面において、本発明は、アレイ状の光学的薄膜テスト表面およびテスト表面キャリアを構成するための方法に関する。以下に述べるとおり、本発明のテスト表面キャリアは、光学的薄膜方法を超えて広い範囲の検出技術のための利点を提供する。
【００２５】
ここで説明している方法およびデバイスは、特に、標本内における複数の分析物の存在もしくは量のマルチプレックス検出に有用である。ここで使用されている『分析物』または『ターゲット』という表現は、アッセイによって検出される任意の分子を言う。分析物（またはターゲット）は、通常、アレイ状の光学的薄膜テスト表面上のテスト位置に固定化された１ないしは複数の結合パートナー（ここで言う『捕捉試薬』）によって検出される。この結合パートナーは、ここで述べている方法による検出のために分析物を固定化する。
【００２６】
好ましいものは生物学的標本である。『生物学的標本』という表現は、生物体から獲得された標本を言う。その種の標本は、臨床設定におけるヒトの診断、予後、または評価を目的として獲得することができる。特定の実施態様においては、その種の標本は、進行中の状態の結果、もしくはある条件での治療計画の効果を決定する目的で獲得してもよい。好ましい生物学的標本としては、血液標本、組織標本、糞便標本、唾液標本、血清標本、血漿標本、脳脊髄液標本、尿標本、およびそのほかの、患者、生物、もしくは標本から得られた液体が挙げられる。
【００２７】
別の側面において、本発明は、アレイもしくはアレイのアレイから獲得されたイメージの、マニュアルから完全自動までの取り込みおよび処理を行うための方法、ソフトウエアおよび関連ハードウエアに関する。ここでは、アレイ状の光学的薄膜テスト表面の分析に関して述べられているが、当業者であれば理解されるとおり、これらの方法、ソフトウエア、およびハードウエアは、概して、組織のアレイ（たとえば、ザイメッド（Ｘｙｍｅｄ）から市販されているマックスアレイ（ＭＡＸＡＲＲＡＹTM）；核酸のアレイおよびマイクロアレイ（たとえば、アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）から市販されているジェネチップ（ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）））；タンパク質／核酸のアレイおよびマイクロアレイ（たとえば、パノミクス（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）から市販されているもの）；抗体のアレイおよびマイクロアレイ（たとえば、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から市販されているもの）；およびタンパク質のアレイおよびマイクロアレイ（たとえば、サイファジェン（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ）から市販されているもの）などのアレイの分析に適用できる。
【００２８】
好ましい実施態様においては、統合された『イメージ分析ステーション』が提供され、これは以下の要素のうちの１ないしは複数、好ましくはすべてを包含する：すなわち、ここで述べている複数のアレイを包含するテスト表面キャリア；複数の個別的にアドレス可能な位置から信号を生成するためにアレイ（１ないしは複数）を照明するための光学コンポーネント；この拡散性光源を包含する光学コンポーネント；１ないしは複数のアレイのイメージを記録するためのディジタル・カメラ；ディジタル・カメラの焦点および／またはフレームをコントロールするための光学コンポーネント；ディジタル・カメラの視野と相対的にテスト表面キャリアを移動させるためのステージ；ステージ移動メカニズム；ステージ移動メカニズムのためのマニュアル・コントロール；ディジタル・カメラのためのマニュアル・コントロール；ステージ移動メカニズムおよび／またはディジタル・カメラと統合されたコンピュータ・プロセッサ；あらかじめ決定されたステージ移動および／またはカメラ・コントロールのための指示を提供するソフトウエア；イメージおよび結果を記録するためのディジタル・ストレージ・メディア；および／またはコマンドを入力するため、および／またはイメージおよび／または結果を観察するためのユーザ・インターフェースである。好ましい実施態様においては、ユーザの介入を伴うことなくテスト表面キャリア内のすべての反応済みアレイについてイメージ分析が自動的に行われる。
【００２９】
ここで使用している『イメージ分析』および『イメージ処理』という表現は、１ないしは複数のディジタル・イメージをアレイから取り込むこと、および収集されたイメージ（１ないしは複数）を使用して、そのアレイの個別的にアドレス可能な位置の１つ、または好ましくは複数の位置における、１ないしは複数の分析物の存在もしくは量を決定することを言う。
【００３０】
ここで使用している『アレイを照明するための光学コンポーネント』という表現は、所望の入射光をアレイ上に提供するための光源ならびに関連光学エレメントを言う。アッセイのフォーマットに応じて、アレイを照明するための光学コンポーネントは、単純に白色光またはコヒーレント光源であってもよく；あるいは希望しない光の波長を除去するために光源とアレイの間に含めるフィルタ（たとえば、ロー・パス、ハイ・パス、バンド・パス・フィルタ）；光の偏光状態を変更するために光源とアレイの間に含める偏光器；および／または当業者によって反射率計および／または楕円偏光計に広く使用されているそのほかのコンポーネントを含めることができる。楕円偏光法は、コヒーレント、および／または単色光源の使用を必要とすることがある。
【００３１】
ここで使用している『拡散性光源』という表現は、実質的に一様な照明をディジタル・カメラの視野全体にわたって提供する光源を言う。
【００３２】
ここで使用している『ディジタル・カメラ』という表現は、カメラによって獲得されたイメージに対応するディジタル出力信号を提供するカメラを言う。ＣＭＯＳ（相補形金属酸化膜半導体）、ＡＰＳ（能動ピクセル・センサ）、ＣＣＤ、および非ＣＣＤカメラを含め、適切なカメラがこの分野に周知である。好ましいタイプのＣＣＤカメラは、リニア、行間書き込み、フルフレーム、およびフレーム転送タイプである。リニアＣＣＤは、単一行のピクセルからなる；イメージを画定するためには、リニアＣＣＤがイメージの面にわたってスキャンされなければならず、行ごとにピクチャが組み立てられる。行間書き込み、フルフレーム、およびフレーム転送設計は、矩形もしくは方形のエリアを形成する複数の行および列からなるためエリア・アレイＣＣＤと見なされる。行間書き込みＣＣＤにおいては、それぞれのピクセルが光学検出器および電荷ストレージ・エリアを両方とも有する。ストレージ・エリアは、光からピクセルを遮光またはマスキングする部分からによって形成され、電荷転送プロセスのためだけにそれが使用される。フルフレームＣＣＤは、全体のピクセルがイメージ取り込みに当てられる。したがって、電荷転送が生じたとき、ピクセルがビジーになり、光子の取り込みを続けることができない。それらが電荷転送に関係しているとき追加の光の読み取りを続けること（イメージ上の光のスメアを導く可能性がある）を防止するために、しばしばカメラ・レンズの間もしくは背後に機械的シャッタが採用される。最後のフレーム転送ＣＣＤは、フルフレームに似ているが、アレイの半分をマスク・アウトして、『ストレージ・アレイ』と呼ばれる電荷のための一時的なストレージを提供する。アナログ・ディジタル・コンバータと結合されたアナログ・カメラは、コンピュータ・プロセッサによるその先の処理のために必要なイメージのディジタル出力を提供することから、この種のカメラもまた本発明の範囲内である。
【００３３】
イメージがコンピュータ・プロセッサによる処理のために取り込まれるとき、カメラによってイメージが『記録される』と言う。ここで述べているとおり、イメージは、その全体もしくはその部分を、カメラのエレクトロニクスの中にストアし（一時的に、もしくは恒久的に）、あるいは取り付けられたストレージ・デバイスに転送し、またはストレージなしにコンピュータ・プロセッサに対して直接転送することができる。特定のデバイスの要件および／またはスループット要件に応じて、イメージを、一度に単一のテスト表面として取り込むこと、あるいは単一イメージ内の複数のテスト表面として、静的イメージもしくはリアルタイム・イメージとして、または連続またはスキャニング・モード・イメージとして取り込むことができる。
【００３４】
ここで使用されている『焦点をコントロールするための光学コンポーネント』という表現は、目的とするエリアをディジタル・カメラによる記録のための焦点の中に持ち込むために採用される光学系および関連する機械的ハードウエアを言う。同様に『フレームをコントロールするための光学コンポーネント』は、ズームおよびパン・コントロールをディジタル・カメラに提供するために採用される光学系および関連する機械的ハードウエアを言う。
【００３５】
ここで使用されている『ステージ』という表現は、テスト表面キャリアの１ないしは複数の軸に沿った移動を支持し、それを提供するために必要な機械的ハードウエアを言う。好ましくは、ステージが恣意的にＸおよびＹとラベル付けする直交軸に沿った移動を提供し；かつ特定の実施態様においては、Ｚ軸（Ｘ／Ｙ平面に垂直な軸）に沿った移動を含む。
【００３６】
ここで使用されている『ステージ移動メカニズム』という表現は、ステージに移動を提供するコンポーネント（たとえば、ステップ・モータ、ギア、ラック・アンド・ピニオン・エレメント、ベアリング等）を言う。
【００３７】
マニュアル・コントロールまたはコンピュータ・プロセッサからデバイスのエレメントに指示が中継される場合には、マニュアル・コントロールまたはコンピュータ・プロセッサにそのエレメントが『統合』されて、そのエレメントによるその後に続くアクションを提供する。好ましくは、この統合は、デバイスからマニュアル・コントロールまたはコンピュータ・プロセッサに対するフィードバックも提供する。たとえば、コンピュータ・プロセッサが組み込まれたディジタル・カメラは、プロセッサからイメージを記録する指示を受け取ることができ、および／またはイメージ・データ全体または部分がカメラからプロセッサへ転送されることができる。統合は、有線態様（たとえば、ハード配線、シリアル・ポート（標準のＲＳ−２３２ポート等）、ＵＳＢポート、『ファイヤワイヤ』ポート等を経由）あるいは無線態様（たとえば、赤外線接続、無線周波数接続、ブルートゥース（Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標））接続等を経由）で提供することができる。
【００３８】
ここで使用されている『ソフトウエア』という表現は、コンピュータ・プロセッサによる実行のために揮発性もしくは不揮発性ディジタル・メディア内にストアされた指示、プログラム、および／またはプロシージャのセットを言う。この種のソフトウエアは、ハードディスクまたはフロッピー（登録商標）ディスク上、揮発性もしくは不揮発性メモリ内、光学メディア上等にストアすることができる。本発明においては、ソフトウエアが、以下に述べるとおり、たとえばロボット・システムによるアッセイの実行のため；ディジタル・イメージの記録のため；および／またはディジタル・イメージの分析のための指示を提供することができる。
【００３９】
『コンピュータ・プロセッサ』は、コンピュータのプログラムの論理オペレーションを実行するためのディジタル・デバイスを言い、しばしば『ＣＰＵ』と呼ばれる。通常、コンピュータ・プロセッサは、演算／論理オペレーションを実行する演算論理ユニット（ＡＬＵ）を有するデータパス、メモリ・アドレスを提供するアドレス生成ユニット、およびデータパスの種々のデバイスが所望のオペレーション（１ないしは複数）を実行するための適切なコントロール信号を提供するコントロール・ユニットを包含する。コンピュータは、通常、プロセッサ、メイン・メモリ、２次ストレージ・デバイス、およびプロセッサ、メイン・メモリおよび周辺デバイスを接続するためのバスを有する。ディジタル・カメラは、このバスを経由して、あるいはパラレル・ポートもしくはシリアル・ポートを経由してコンピュータに接続することができる。ここで述べているデバイスには、カリフォルニア州サンタクララのインテル・コーポレーション（Ｉｎｔｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から提供されるプロセッサ等、多数ある周知のコンピュータ・プロセッサのいずれを使用してもよい。
【００４０】
ここで使用されている『ディジタル・ストレージ・メディア』という表現は、情報がディジタル形式でストアされる任意のメディアを言う。それには、ハードディスクおよびフロッピー（登録商標）ディスク、光学ディスク、ランダム・アクセス・メモリ、および読み出し専用メモリ等が含まれる。
【００４１】
ここで使用されている『ユーザ・インターフェース』という表現は、ユーザに本発明のデバイスとのインタラクションを可能にするエレメントを言い、次のうちの１ないしは複数を含む：すなわち、キーボード、マウス、ジョイスティック、キーパッド、タッチスクリーン、モニタ等である。
【００４２】
特に示さない限り、ここで使用されている『約』という表現は、与えられた任意の測定値の＋／−１０％を言う。
【００４３】
ここで述べているイメージ分析ステーションのハードウエアは、薄膜の変化の検出に関して述べられているが、当業者であれば理解されるとおり、特にソフトウエアを含めた種々のコンポーネントは、信号生成の方法とは無関係に任意のイメージ分析方法とともに使用することができる。イメージには、背景を対比させ、アレイ中のエレメントのいくらかの空間分解能を有する、適切なプロセッシング・フォーマットでストアが可能な信号を提供することが必要となるに過ぎない。したがってソフトウエアは、蛍光、化学ルミネセンス、およびそのほかの発色団と互換性がある。このように、１つの側面において本発明は、アレイ上の個別的にアドレス可能な位置の１つにおいて、好ましくは複数において、１ないしは複数の分析物の存在もしくは量を決定する自動化されたイメージ分析のための、ソフトウエアを含む方法およびデバイスに関する。
【００４４】
ここで述べているとおり、本発明のイメージ分析機器は、好ましくは、限られたユーザ入力の下に、ユーザによるアレイの位置決定を伴うことなく多数のアレイの分析を行い、もっとも好ましくは完全に自動化された態様でこれを行う。しかしながら、必要な場合、もしくは望ましい場合には、マニュアル・シーケンスを実行することも可能である。イメージ分析ステーションは、光と表面の上に生成された薄膜との相互作用から反射光内に信号を生成する高反射率のテスト表面を読み取るべく選択されている。この表面の薄膜特性は、反応の恒久的記録であり、必要な回数だけ分析することができる。生成される信号は、光漂白または光減衰を受けにくく、したがって分析プロシージャを通じて安定している。薄膜の効果がデバイスの層に固有であることから、蛍光もしくはそのほかの発光団の測定時に観察されるような、反応済みゾーン間のクロス−トークが存在しない。
【００４５】
使用容易性を促進するために、イメージ分析ステーションは、マイクロタイター・ウェル等の凹部の底にマウントされる表面を分析するべく設計される。これは、標本ならびに試薬を操作し、供給するための容易なメカニズムを提供するが、イメージ分析ステーションが再現性をもって各ウェルを位置決定し、その後、ウェル内に焦点を当てて、ウェル内の壁からの干渉を伴うことなくイメージの取り込みが可能であることを必要とする。同一の光学的構成を使用して、単純なスライド・フォーマットまたは個別のテスト表面等の広範な他の供給フォーマットで与えられる表面を分析することができる。ステージは、好適に各タイプのフォーマットを保持し、デバイス内の各アレイをイメージングするべくテスト表面を適切に移動するのに適合しうる。
【００４６】
以下の好ましい実施態様の中で述べているテスト表面キャリアは、生物学的捕捉試薬のアレイがコーティングされた製品テスト表面を受け入れる正方形のウェルを提供する。市販のマイクロタイター・プレートは、テスト表面キャリアを構築するためのテンプレートとして機能することができるが、この特定の応用のために設計された改良プレートについて述べる。このマイクロタイター・フォーマットのプレート設計は、所望の任意タイプのテスト表面を供給するのに使用できるが、特に光学的薄膜表面との使用に良好に適している。光学的薄膜表面は、検出システムの光学サポートまたは表面および光学パスの設計に応じて、上側の表面反射を介して、あるいは透過測定について分析することができる。生成される信号は、使用されるテスト表面の関数である。たとえば、ガラス・サポートを、蛍光もしくは化学ルミネセンスのタグまたはマーカとともに使用してもよい。測定は、反射または透過モードで行うことができる。改良されたテスト表面キャリアまたはマイクロタイター・プレートは、現存するマイクロタイター・プレートのフットプリントを維持し、そのためあらゆる既成の自動化された標本処理装置と互換性を有する。したがって、改良されたテスト表面キャリアは、ハイスループットの応用に適している。
【００４７】
アレイを反応させた後、信号生成の方法とは無関係に、当業者によって一般に採用されている種々のイメージ分析ツールは、アレイのポジション、アレイ内のエレメントの数、およびアレイ内のエレメントの位置を画定し、または位置決定することをユーザに要求する。概してこれは、ユーザに、アレイのサイズの選択、および選択したパラメータと調和するグリッドの生成を要求することによって達成される。ユーザは、続いて反応済みアレイのイメージの上にグリッドをドラッグし、各グリッドのエレメントが適切なアレイのエレメントに対応していることを確実にする。このようにしてユーザは、アレイ内の要素のスキュー、食い違い、あるいは中心ずれを解消できる。これらの現存するツールのパフォーマンスは、大量のエレメントを伴う場合であっても単一のアレイの分析には良好に適するが、任意の頻度の分析を伴う大量のアレイの分析には、エレメントの数が限られている場合であってもあまり適していない。ソフトウエアとして、あるいは本発明の必要なステップを実行するべくプログラムされた汎用もしくは専用コンピュータとして提供される新しい『スポット見つけ出し』方法は、中程度から高いスループット応用を好適に扱う。
【００４８】
以上述べた本発明の要約は、限定するものではなく、本発明のこのほかの特徴ならびに利点は、特許請求の範囲はもとより、以下の好ましい実施態様の詳細な説明から明らかなものとなるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
上に論じたとおり、本発明は、アレイ状の光学的薄膜テスト表面の分析に関連して述べられている。当業者であれば理解されるであろうが、これらの方法、ソフトウエア、およびハードウエアは、一般的にアレイの分析に適用できる。薄膜イメージングの場合、イメージ分析ステーションが次のうちの１ないしは複数、好ましくはそれぞれを含む：すなわち、光学テスト・デバイス；ＣＣＤカメラ；同軸拡散光源；光学偏光器；延長鏡筒；焦点レンズ；オプションの自動ズームおよび自動焦点機能；ｘｙステージ（閉ループポジション・コントロール付き／なし）；サポート構造；計器ハウジング；光源用電源；ステージ・コントローラ；マニュアル・ステージ・コントロール用のジョイスティック；ソフトウエアおよびハードウエア・コントロールのためのコンピュータもしくは等価物；ユーザ・インターフェース；モニタ；およびソフトウエアである。
【００５０】
テスト表面キャリアは、それぞれが個別的な捕捉位置のパターン化されたアレイを包含する、アレイ状の光学的薄膜テスト表面（１ないしは複数）を供給すべく設計されたフォーマティング・デバイスであり、試薬の供給およびアッセイの処理を提供し、安定した態様でｘｙステージに収まる表面を含む。供給プラットフォームは、標準顕微鏡スライドの形状であってもよく、あるいは任意のウェル数の標準マイクロタイター・プレートとして構成してもよい。好ましい実施態様は、テスト表面を受け入れる方形のウェルを使用する。テスト表面キャリアを使用して、非薄膜応用のためにテスト表面を供給することもできる。
【００５１】
光学的薄膜テスト表面を適切な寸法に切断、切り取り、あるいはそのほかの分離を行い、その後、テスト表面キャリア内に接着または融着させてもよい。テスト表面キャリアは、１ないしは複数の光学的薄膜テスト表面を、テスト表面キャリアの構成に応じて保持することができる。テスト表面キャリアについての好ましい構成は、一般的な市販マイクロタイター・プレートに対応するウェル間隔を有する９６ウェルのマイクロタイター・プレートである。好ましい実施態様においては、各ウェルが７ｍｍ×７ｍｍの光学的薄膜テスト表面を有する；したがって、プレート内のウェルが好適に正方形になる。このほかの光学的薄膜テスト表面構成（たとえば、矩形、円形等）が使用される場合には、各ウェルを適切に設計してそのテスト表面に適応させればよい。マイクロタイター・プレートを使用して分析方法にテスト表面を供給するときは、信号生成の方法に関わりなく、個別のアレイ表面をテスト表面キャリアの寸法に適切なサイズに処理する必要がある。
【００５２】
顕微鏡スライドがテスト表面キャリアの場合には、単一の１”×３”のテスト表面をテスト・デバイス内にマウントするか、より小さい帯または正方形をいくつか、１”×３”のサイズを維持してテスト・キャリア内にマウントすることができる。
【００５３】
使用されるアッセイのフォーマットもしくは検出手段にかかわらず、テスト表面上に捕捉試薬のアレイを固定化することによってテスト表面を準備する。捕捉試薬は、種々の分析物、遺伝子、遺伝子生成物、ゲノムＤＮＡ、小分子、ＳＮＰ、あるいはそのほかの目的とする物質について標本を調べるべく設計された物質の複雑な組み合わせであってもよい。捕捉試薬のそれぞれは、ターゲットの核酸配列、タンパク質、糖質、脂質、ホルモン、あるいはそのほかの分析物を特異的に捕捉することができる。例として述べれば、捕捉試薬は、標本内のある範囲のサイトカインに特異的な抗体であってもよい。あるいは、捕捉試薬は、特定の疾病のマーカまたは表示である遺伝子の組み合わせに特異的なオリゴヌクレオチドのセットであってもよい。また捕捉試薬は、嚢胞性繊維症（ＣＦ）等の所定の疾病に特有のキャリア状態を表示する特定の遺伝子におけるＳＮＰ突然変異体に特異的なオリゴヌクレオチドのセットであってもよい。あるいはまた捕捉試薬を、アレルギ・スクリーニングのためのアレルゲンのパネルに特異的な、もしくは呼吸性感染症のような感染症の原因物質の鑑別診断のためのバクテリア性および／またはウイルス性抗原に特異的な抗体（もしくは遺伝子についてのオリゴヌクレオチド）であってもよい。
【００５４】
個別のアレイのイメージ分析用に設計されたソフトウエアは、アレイ内の各テスト・エレメントについて、位置ならびに信号強度を自動的に識別し、検証する。アレイを自動的に処理するため、好ましい実施態様は、可能な場合にまず、イメージ内のテスト表面のエッジの位置を決定する。エッジが見つかった場合には、そのエッジの外側のイメージのエリアをその後の考察から除外する。次に、イメージ内の正しいサイズ、形状、および強度の、可能性のある特徴の位置を決定する。この種の特徴の数をカウントする。この種の特徴カウントは、イメージ内の標本のタイプを決定するために使用される。たとえば、反応済みの患者標本は、特定の範囲内に特徴カウントを有することになる；ブランクは、異なる範囲を有する；空のウェルは、カウントについてさらに別の代表的な範囲を有することになる。標本のタイプが決定されると、ヒューリスティック規則のセットが適用されて、擬似的なノイズの特徴を排除する。たとえば、テスト表面のエッジの少数ピクセル以内のスポットは、実際の反応というよりは洗浄問題に起因する可能性がより高く、その後の考察から除外することができる。次にアルゴリズムは、残りのスポット位置からグリッド構造の位置決定を試みる。クラスタリング・アルゴリズムおよび追加のヒューリスティックを適用して、スポット・グリッドの行ならびに列の位置を定義することができる。反応済みゾーンをほとんどもしくはまったく含まない行ならびに列のポジションは、より多くのスポットを含むほかの行ならびに列のポジションならびに間隔から見積もることができる。最後に、スポットをグリッド内の位置に調和させ、信号を測定する。スポット・ポジションおよび信号強度の表が、さらに分類を行うために生成される。ここで説明するソフトウエアおよびテスト表面キャリアは、概して非薄膜応用にも適している。次に、スポット・ポジションおよび信号に関する表を生成するための方法の一実施態様を、図１を参照して説明する。
【００５５】
システムのソフトウエア要件は、イメージ取り込みプロトコル、ステージ移動ならびにポジション・コントロール、アレイの識別、アレイエレメントの識別、アレイエレメントの定量化、スキューに関するアレイの補正、アレイエレメントによる結果テーブルの生成、背景の取り込み、背景の補正、データ処理ならびに解釈、および結果のレポーティングを含む。イメージ取り込みおよびステージ・コントロールについては、多数の市販ソースが利用できる。ＣＣＤカメラおよびステージのサプライヤは、これらの機能に使用可能であり、したがって最終的なソフトウエア・パッケージに組み込み可能なソフトウエアも提供している。スキャナリティックス（Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ）は、イメージ取り込みおよびステージ・コントロールと、そのほかのイメージ済みアレイの収集ならびに分析のためのソフトウエア・プロトコルを統合したイメージ分析パッケージを提供している。しかしながら、このソフトウエアは、小さいアレイであってもその分析に非常に多くのユーザのインタラクションを必要とする。
【００５６】
テスト表面の設計
光学的薄膜アッセイにおいて使用するための光学的薄膜テスト表面は、この分野で周知である。たとえば、すべての表、図面、および特許請求の範囲を含めてその全体がここに援用される米国特許第５，６２９，２１４号を参照されたい。広範な硬質材料を用いて基板を形成することが可能であり、それにはガラス、溶融シリカ、プラスチック、セラミック、金属、および半導体材料も含まれる。基板は、所望の任意の厚さにすることができる。柔軟な光学的基板は、プラスチックおよび類似材料の薄いシートを含む。ほとんどの基板は、その後に続く層をそれらの上に析出させる前に、当業者に周知の標準的な溶媒、プラズマ・エッチング、あるいは酸クリーニングを必要とするだけである。
【００５７】
光学的薄膜テスト表面は、概して反射表面であり、好ましくはシリコンもしくはシリコン・コートした基板材料である。反射ベースのアッセイにおける使用について、基板選択時の主要な要件は、上側表面だけにおいて反射が生じること、あるいは生じさせられることである。ガラス等の多くの固体材料、およびシリコン、金属等の半導体材料の表面は、それらが研磨されていれば、充分に滑らかであり、鏡面反射を提供する。反射表面の準備は、基板上における金属薄膜の気相成長によって容易に達成することもでき、その後に続く層の付着もまた、当業者に周知の手法によって提供される。たとえば、ガラス基板のもっとも上側の表面に、それより下側の表面からの不要な反射を防止する層をコーティングしてもよい。
【００５８】
反射表面は、サポート材料上への反射防止（ＡＲ）膜スタックの塗布ができることが望ましい。ＡＲ層の使用は、基礎をなす基板が透過性であることを前提とするが、透過モードの検出における使用の場合にも適切でありうる。反射防止膜スタックは、光学的テスト表面上の膜の厚さが変化するときの、弱め合う干渉を介した信号生成を可能にする。通常、基板（ガラス、石英等）は、材料の薄い層によってコーディングされ、その結果、膜の外側および基板の外側からの反射が弱め合う干渉によって互いに相殺される。単一層のコーティングを伴う反射ビームの正確な相殺には、２つの要件がある：すなわち、これらの反射の位相差が正確に１８０度（πラジアン）であり、それらが同一の強度を有することである。単一層の反射防止膜の厚さは、相殺のための適正な位相を達成するために、１／４波長の奇数倍とする必要がある。３もしくはそれを超える数の反射表面が関係している場合には、任意の位相および相対的な強度を慎重に選択することによって完全な相殺を達成することが可能になる。これは、２層の反射防止コーティングの基礎であり、層が利用可能な材料の屈折率に適合され、その逆ではない。材料の所定の組み合わせについて、設計波長においてゼロ反射率をもたらす層の厚さの組み合わせが、通常は２つ存在する。多くの光学システム（特に、イメージング・システム）は、多色（複数の波長の）光を使用する。システムがフラットなスペクトル応答を有するためには、広帯域もしくはダイクロイック反射防止コーティングを用いて透過光学系をコーティングする。
【００５９】
光学的テスト表面からの反射もしくは透過された光の弱め合う干渉は、ディジタル（たとえばＣＣＤ）カメラを用いて色における変化として、あるいはグレイスケール・カメラを使用する場合であれば、グレイスケール値の変化として検出することができる。反射表面はまた、反射防止膜スタックのない場合の楕円偏光法に類似の分析にも適するが、これは、光学パスの検出側に追加の偏光エレメントを必要とすることがある。この場合、反射光学サポート上の薄膜を使用して入射光内に位相変化を生成することが可能であり、検出器においてそれが反射もしくは透過された光の強度における変化として直接測定される。
【００６０】
一般的な反射防止膜スタックは、シリコン基板上に窒化シリコンをコーティングする。このスタックは、ブルーの波長に対して反射を防止し、金色の背景を生成する。ターゲット分子の捕捉によって表面の厚さが変化したとき、反射防止される波長がシフトし、パープル−ブルー色が生成される。
【００６１】
光学的薄膜テスト表面が用意された後に考慮しなければならないことは、小分子、ポリペプチド、タンパク質、環状ポリペプチド、ペプチド模倣体、アプタマー、抗体、ｓｃＦｖｓ、多糖類、レセプタ、ポリヌクレオチド、および／またはポリヌクレオチド類似体等の捕捉試薬の付着である。たとえば、共有結合形の付着、静電付着、疎水性付着等によって表面に分子を付着させるための方法が、この分野においてよく知られている。その種の材料は、光学的アッセイにおける信号の提供に充分な量の捕捉試薬の結合のために充分なサイトが利用できる場合には、光学的薄膜テスト表面に直接付着させることができる。好ましくは、光学的薄膜テスト表面と捕捉試薬の間に付着層を介挿することができる。付着層を使用して、たとえば効果的な結合のために捕捉試薬を表面から広げることができる。それに加えて、デンドリマー、スター・ポリマー、分子自己集合ポリマー、ポリメリック・シロキサン、および膜形成ラテックスからなる群等の多価分子から形成される付着層を使用して、光学的薄膜テスト表面上の結合サイトの数を拡大することができる。
【００６２】
光学的薄膜デバイス用に、好ましくは次に示すようにして表面を処理する。簡明のため、ＡＲコーティング済み表面について述べるが、ＡＲ層はオプションである。ＡＲ層は、概して視覚的分析、比色分析、またはグレイスケール・イメージングに必要とされる。楕円率における変化のモニタリングは、ＡＲ層があることを必要としない。気相成長プロセスによって窒化シリコンの層をシリコン・ウエーファ（直径は決定的でない）にコーティングする。厚さおよび屈折率は、応用に調和するべく選択される。好ましい設定は、厚さが５００Å＋／−１５Åであり、屈折率が１．９８５＋／−０．０１５である。このほかのＡＲ材料も適切であり、当業者には周知である。
【００６３】
ＡＲコーティング済みウエーファは、スピン・コーティング・プロセスにおいて、分岐シロキサンの層がコーティングされる。シロキサンは、好ましい付着層であるが、このほかの表面の化学的変性も可能である。次に、長鎖アミノ酸（ポリフェニルアラニン−ポリリシン）の層が、溶液コーティング・プロセスによってシロキサン層上にコーティングされる。ポリフェニルアラニン−ポリリシン表面は、捕捉試薬のアレイの共有結合形付着のためのアミンの層を、シロキサン化表面に対する付着のための充分な疎水性特性とともに提供する。多くのタンパク質系の捕捉試薬のように共有結合形付着が必要ない場合には、この層は必要ないかもしれない。高度の表面操作、アッセイの厳格性、あるいは洗浄が要求されない表面は、捕捉試薬の受動接着で充分でありうる。異なる共有結合形付着スキームのためのこのほかの表面の変性は、当業者に周知である。アミンは、続いて別のアミンに反応する多数の化学試薬によって活性化可能である。表面のアミンを活性化してもよく、あるいは捕捉試薬上のアミンを活性化してもよい。活性化されたアミンは、続いて対応する未変性アミンと反応する。このほかの化学物質には、反応基としてチオール、アルデヒド、イミドエステル、ヒドラジン、イソシアネート等が含まれる。
【００６４】
アレイの製造
テスト表面は、いろいろな密度のアレイでスポッティングすることができる。個別のアレイ内のスポットの数は、実施する分析に依存する。同一アレイの複数の複製を、テスト表面の個別的なセクションに適用することが可能であり、製造表面上の個別のアレイの分離は何らかのタイプの物理的バリアに頼ってもよく、頼らなくてもよい。また、一意的な内容の複数のアレイ（それぞれが、アレイ内に多数のエレメントを有する）をテスト表面に適用してもよい。これにおいても個別のアレイの分離にある種の物理的バリアを使用することができる。
【００６５】
いくつかの応用については、特定の捕捉試薬のアレイ内に複数のコピーを提供することが望ましいかもしれない。たとえばＳＮＰが、遺伝学的特徴についてスクリーニングされる母集団内に高い頻度を有している場合に、そのＳＮＰ用に２つの捕捉プローブの複数コピーを組み込むと適切であろう。あるいは、特定の病原性生物体もしくは生物体の菌株に特異的な捕捉試薬は、アレイ内の追加のコピーから恩典を受けることができる。したがって単一の分析において、アレイ内の決定的なエレメントを容易に検証することが可能になる。それに加えて、分析物もしくは疾病プロファイルに特異的な捕捉試薬を検査し、コントロール試薬および方向付け試薬をアレイ内に提供することもできる。
【００６６】
それぞれの応用のための捕捉試薬レイアウトの設計における主要な考慮事項の１つは、アレイの列または行においてその数の信号を型に嵌めて生成できることである。この設計要素は、以下に述べる自動化されたアレイ識別アルゴリズムにとって重要である。各列および行内において充分なエレメントが信号を生成し、取り込み済みイメージの処理の間に、各列および行の最適かつ迅速な識別を提供しなければならない。
【００６７】
アレイに関する捕捉試薬の設計ならびにスクリーニングは、多くの因子を伴う。アレイ内に固定化されたすべての捕捉プローブは、完成したテスト表面から求められる感度ならびに特異性を維持しつつ、共通の反応条件の下に作用しなければならない。したがって、試薬のスポッティングは、テスト表面上に一様なスポット・サイズを作り出すために類似した表面張力を提供するべく設計されなければならない。また試薬のスポッティングは、それぞれの捕捉試薬を、アレイ内の個別的かつ一意的なゾーンとして維持する表面張力を（存在する場合には表面の化学的性質に関連して）提供する必要がある。しかしながら、同時にこれらは、表面に対する特定の捕捉試薬の接着を促進するか、あるいは使用される付着の化学的性質を最大化する環境を提供しなければならない。さらに試薬のスポッティングは、表面の反応の固定時間の間に、極めて少量のスポッティングされた捕捉試薬の乾燥の防止が必要となることがある。
【００６８】
捕捉試薬は、いくつかの異なるスポッティング技術を用いる個別的なスポットとして塗布することができる。スポッティング技術によるアレイのエレメントの、その数に応じた生成が可能な場合には、テスト表面上にアレイを構成する全ての捕捉試薬を同時に塗布することが可能である。続いてスポッティング・ヘッドまたはテスト表面は新しいポジションに調製され、次のアレイが生成される。あるいは、完全なアレイが生成するまで、各捕捉試薬を個別に、かつ逐次的にテスト表面上の特定のポジションに塗布することもできる。製造を容易にするためには、多数のアレイ（バルク・テスト表面のサイズに依存する）が同時的もしくは逐次的な態様で生成できるバルク・テスト表面に対して捕捉試薬を塗布することが好ましい。捕捉試薬がバルク・テスト表面上に固定化された後に、これを処理して、テスト表面キャリア内での固定化のための多数の個別的なアレイとすることができる。たとえば、４インチのシリコン・ウエーファを７ｍｍ2のテスト・ピースに分割すると、約１２４のアレイを作ることができる。
【００６９】
アレイスポッティング技術を使用したアレイ状の光学的薄膜テスト表面の製造においては、最終的なアレイの表面プロファイルにおける逸脱が背景信号として、あるいはアッセイ内の擬似的なテスト位置として観察されることがあるため、表面の擦過の回避に充分な注意を払わなければならない。また採用するアレイスポッティング方法の選択は、（しばしば、疎水性の）光学的表面に対する必要な捕捉試薬の供給の必要性と、光学的スタックに対するダメージの回避の必要性をバランスさせなければならない。
【００７０】
アレイ上の特定の個別的な位置を、正または負のコントロール、信号強度標準、および『基準スポット』の目的で維持することもできる。後者の場合においては、当業者が理解されるように、アレイスポッティング方法からの背景信号が最小化されることを前提とすると、未反応アレイ上の捕捉位置がアッセイに対して検出不能になる。ここで１６スポットの４×４のアレイを考えると、各コーナのスポットもまたほかのコーナ・スポットから区別できなくなる；したがって、アレイの適切な『左上』位置の決定が不可能となり得る。アレイ上の１ないしは複数のあらかじめ決定済みの、未反応状態で観察できる位置を使用すれば、その後の製造の間もしくはイメージ分析の間のいずれかにおいて捕捉位置の相対的な向きを決定することができる。
【００７１】
バルクもしくは製造レベルのテスト表面上にすべてのアレイが生成された後、追加の処理が必要となることがある。これには、インキュベート、洗浄ならびに乾燥プロセス、安定性あるいは非特異的結合の低減のためのオーバーコーティング・プロセスが含まれる。これらの処理のすべては、テスト表面キャリア内に組み込むためのテスト表面サイズへのバルク・テスト表面の切断、切り取り、レーザ・カッティング、あるいはそのほかの方法による分割の前に行われる。特定の応用については、テスト表面の構成が、テスト表面キャリアの下側表面上に直接行われる。バルク・テスト表面上に個別のアレイの複数のコピーが生成される場合には、アレイの部分が、アレイにダメージを与えることなく個別のアレイに切断もしくはそのほかの分離を行う分離プロセスのための充分な周囲エリアを含まなければならない。この、個別のテスト表面の外側エッジもまた、テスト表面をテスト表面キャリア内にマウントする配置装置にとって重要になる。これは、その装置のための接触ポイントである。完全な個別のテスト表面が生成された後は、それらをテスト表面キャリア内に配置しなければならない。キャリアに対する何らかの形式のテスト表面の接着が必要になる。これは、接着剤、ヒート・シール、化学溶接、あるいはそのほかの、テスト表面の構成、キャリア、および処理に対する捕捉試薬の安定性ならびに敏感性を適切に扱う手法を用いて達成することができる。個別のテスト表面は、適切な向き、限られた量の傾き（平面度）、および限られた量のスキューでキャリア内に挿入されなければならない。
【００７２】
本発明においては、テスト表面キャリア内の必要な平面度を獲得するために、傾きの許容範囲を、好ましくは水平面に対して＋／−約１０°、より好ましくは水平面に対して＋／−約５°、もっとも好ましくは水平面に対して＋／−約１°としてそれぞれのアレイをキャリア内に配置することを必要とする。
【００７３】
アレイ内に使用される捕捉試薬の数は、実行されるテストの分析要件、選択されたフォーマット内のテスト表面のサイズ、および塗布される捕捉試薬のスポットのサイズに基づいて決定される。一例として述べれば、嚢胞性繊維症のためのＣＦＴＲ遺伝子内におけるＳＮＰ突然変異体（２５の突然変異体および６の多型）について患者の標本を分析する上で少なくとも５９のオリゴヌクレオチドのアレイが望ましい。２５の突然変異体および多型のうちの３つについて、１対の捕捉プローブがスポッティングされる。捕捉プローブの１つは、野生型の配列に対して特異的であり、１つは、分析されることになる特定のＳＮＰポジションにおける遺伝子の突然変異体の配列に対して特異的である。多型のうちの３つは、単一の捕捉プローブを必要とする。検出される突然変異体のパネルは、アメリカン・カレッジ・オブ・メディカル・ジェネティクス（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）からの推奨に基づいている。
【００７４】
テスト表面キャリアの設計および製造
市販されている正方ウェルの９６ウェル・プレートを、テスト表面キャリアとして使用することができるが、新しく設計されたキャリアを用いて、デバイスのパフォーマンスならびに製造歩留まりにおける劇的な改善を得ることが可能である。このキャリアは、９６ウェル・フォーマットの処理に利用できる装置が広く入手できることから、そのフォーマットを維持する。図２Ａ〜２Ｆを参照されたい。改善されたテスト表面キャリアは、標準的な９６ウェル・プレートの全体的な寸法を維持し、その結果、９６ウェル・プレートを伴う作業用に設計されたすべてのロボットと互換性を有する。図２Ａ〜２Ｄを参照されたい。
【００７５】
テスト表面の配置および配向を改善するために、ウェルの高さを下げて、ウェルを満たすために必要な試薬の体積を６５０μｌから３２０μｌまで減少させた。これは、ウェル内にテスト表面を配置するためにロボットが順応しなければならない深さを縮小し、可能性としてウェルの壁からもたらされる影からのイメージング・アーティファクトを減らす。テスト表面に塗布可能な試薬の体積における減少は、アッセイのパフォーマンスに有意の影響を与えるものではないが、アッセイ・プロトコルの間における試薬コストに肯定的な影響を与えることができる。また、より浅いウェル設計は、アッセイ・プロトコルにおける洗浄ステップを改善するべく作用すると見られる。
【００７６】
この改善された設計により、市販の９６ウェル・プレートに対して改善された幾何学的許容範囲を伴うキャリアが得られる。『幾何学的許容範囲』は、ウェル中心からウェル中心までの測定値の相対的な差、ウェル壁のプロファイル、ウェル底の半径、全体的な平面度、およびキャリア内の全体的なねじれを意味する。これにおいてもこれが、キャリア内におけるテスト表面の自動化された位置決めをはじめ、反応済みテスト表面のイメージ分析をより容易にする。すべての幾何学的許容範囲は、＋／−０．５°に設定される。
【００７７】
改善されたキャリアのためのモールド設計は、キャリアの外側表面をマットに、あるいは微細模様付きに見せる特徴を含む。またこれは、たとえばすべてのウェルまたは凹部の右上コーナおよび左下コーナにパターン認識ターゲットを含み、これは認識可能な特徴（例示の実施態様においては滑らかで光沢のある円）として現れることになる。これらの特徴は、自動化されたテスト表面位置決め装置に、配向ならびに位置決めマークを提供し、その結果、テスト表面がウェルに供給されたときにマシンの視覚を使用してアライメントを評価することができる。またこれらを最終的なイメージ分析プロセスに使用して、必要な場合にはイメージングに先行してウェルのアライメント、識別、位置および／または間隔を改善することができる。それに加えてキャリアの各ウェルは、ウェルの各側に２つずつ、合計８つの、ウェル内におけるテスト表面の支持を補助するべく設計されたアライメント・リブを含む。これらのリブは、ウェル内におけるテスト表面のアジマス（『ねじれ』または『スキュー』）配置をコントロールすることができる。リブは、テスト表面がウェル内に位置決めされるとき、そのエッジに当接する。図２Ｅを参照されたい。アライメント・リブの内側が、ウェルの壁から延びる拡張されたウインドウ・フレーム機能であり、それもまたテスト表面を支持し、ウェル内におけるテスト表面の平面度の維持を補助する。この機能は、接着剤の施与のためのポケットを提供することから接着剤の施与を自動化する能力を向上させることが可能であり、またマシンの視覚システムを使用してこの拡張されたウインドウに対する接着剤の施与をコントロールすることができる。配置されたテスト表面がウェル内に確実にシールされると、それが、分析の間にテスト表面の下側に閉じ込められる試薬、ウォッシュ等の体積を最小化する上で役立つ。この特徴は、この後に続くアッセイ・ステップにおける汚染の最小化にも役に立つことができる。
【００７８】
イメージ分析機器の設計および製造
光学コンポーネント設計のための許容可能な開始ポイントは、スキャナリティックス（Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ）のエリスポット（Ｅｌｉｓｐｏｔ）計測器である。しかしながら、より堅牢なサポート構造および計測器ハウジングが、型にはまった大量使用には必要になる。イメージ分析機器は、少なくとも０．５”の検出器表面を伴い、１０μｍ×１０μｍピクセルより小さく、少なくとも６４０×４８０ピクセルのアレイを有するＣＣＤカメラを含む。好ましい最小スキャン・エリアは６．３ｍｍ×４．８ｍｍである。カメラは、ディジタル温度補償を提供し、少なくとも８ビットのディジタル・オフセット・コントロールを有するものであるが、好ましくは１２ビットもしくはそれ以上である。最小飽和容量は２５，０００エレクトロンが好ましい。少なくとも８ビット、好ましくは１２ビットのダイナミック・レンジ、および１６ＭＨｚのスキャン・レートが好ましい。読み出しノイズは、１６エレクトロンを超えない。スペクトル・レンジは２８０〜１０００ｎｍである。アンチ−ブルーミング・ファクタについても１０００を超えることが好ましい。
【００７９】
カメラは、適切な焦点距離ならびに深度を提供するために延長鏡筒もしくはそのほかの位置決め光学ハードウエア上にマウントする必要がある。任意の所望の倍率の光学系を、光学パスのこの部分に含める。
【００８０】
薄膜応用には白黒カメラが好ましいが、カラー・カメラも許容可能である。
【００８１】
一実施態様においては、焦点、イメージまでの距離、および倍率を含めた光学パスがプリセットされ、調整が不要になる。応用に関する別の実施態様においては、アレイのサブセクション上への焦点における値が存在することがあり、調節可能なズームならびに焦点が必要になることがある。調節可能なズームならびに焦点は、追加のモータ・コントロールならびにソフトウエアを必要とする。その種の自動ズーム、自動焦点延長鏡筒のセットアップの１つは、タレース・オプテム（Ｔｈａｌｅｓ  Ｏｐｔｅｍ）から入手できる。
【００８２】
信号生成方法が薄膜の変化であり、一様な強度で広い表面をカバーするときには、拡散光源が好ましい。鏡面反射表面が使用される場合においても、拡散光源が鏡面からの反射の中のアーティファクトを最小化する。光源についての強度ならびに波長の要件は、使用されるテスト表面ならびに薄膜信号生成方法に依存する。光源は、一定かつ一様な照明を提供する必要がある。薄膜生成方法は、ランダム偏光または直線偏光された白色光源を使用することができる。直線偏光された光を使用して、鏡面反射からのアーティファクトを抑えることもできる。光源にフィルタリングを行って、モノクローム入射光を提供することもできる。光源から光学パス内の入力ポートに光を指向するためには、光ファイバ・ケーブルを使用することが可能である。同軸拡散モジュールは、光学システムへの入力光を提供するための１つのオプションである。
【００８３】
充分に剛直であり、重量のあるベースを含むサポート・システムを提供して、ステージが種々のポジションに移動するときのステージの振動を最小化する必要がある。厚さ０．５”のアルミニウム・プレートは、この目的に適している。プレートのサイズは、ステージならびに光学コンポーネントの寸法に依存するが、概して１５”×１８”で充分である。迷表面反射を最小化するために、アルミニウムをアルマイト化するか、つや消しのブラックでペイントする必要がある。
【００８４】
サポート・プレートは、種々のポジションにボア・ホールを含むことになる。それらのいくつかは、ｘｙステージ用のサポート・ペグの取り付けに使用され、別のいくつかはカメラおよび光学コンポーネントの取り付けに用いられるサポート構造の取り付けに使用される。リュドル・バイオポイント（Ｌｕｄｌ  Ｂｉｏｐｏｉｎｔ）のｘｙステージについては、４つのサポート・ペグがサポート・プレートに取り付けられる。続いて、適切な寸法のソケット・ヘッド・キャップねじを用いて、ステージがそれらのペグ上にセットされる。サポート・ペグの高さは、モータおよびコントロール・ケーブルがサポート・プレートを避け、あらゆる拘束を受けないように選択するが、ペグの高さは可能な限り低く、最大の安定性を維持する。サポート・ペグの直径は、ステージ内の加工されたポジションと整合し、かつサポート・プレートに対するステージの安定した取り付けを提供するに充分な大きさで好適に設計される。
【００８５】
図３は、イメージ分析ステーションのアセンブリを例示している。まず、ズーム７０ＸＬモジュール（オプテム（Ｏｐｔｅｍ）部品番号＃３９９５１０−３０９）からレンズ・キャップを取り外す。続いて下側モジュール・カプラ（オプテム（Ｏｐｔｅｍ）部品番号＃３３−０３−６３）内の上側の止めねじを、規定のアレン・レンチを用いて緩める。ズーム７０ＸＬモジュールを下側モジュール・カプラ内に、下側モジュール・カプラの外側表面と面一になるまでセットし、止めねじを締める。下側レンズ・キャップを０．５ｘＴＶ鏡筒（オプテム（Ｏｐｔｅｍ）部品番号＃２９−９０−７０）から取り外し、ズーム７０ＸＬモジュールの上側セクションに回し嵌めする。下側モジュール・カプラの下側の止めねじを、規定のアレン・レンチを用いて緩め、裏側に光供給鏡筒を伴う同軸照明ハウジング（オプテム（Ｏｐｔｅｍ）部品番号＃３０−１４−００）の上に面一にセットする（すべてのオプテム（Ｏｐｔｅｍ）のラベルがほかのコンポーネントの正面を向く必要がある）。止めねじを締める。偏光ユニット（オプテム（Ｏｐｔｅｍ）部品番号＃２９−６９−０２）を同軸照明ハウジングの上に回し嵌めする。光ファイバ・ハウジング（オプテム（Ｏｐｔｅｍ）部品番号＃３０−１６−０２）を偏光器の上に回し嵌めする。光ファイバ・ハウジング上のねじを緩め、１０ｍｍの光ファイバ・アダプタ（オプテム（Ｏｐｔｅｍ）部品番号＃３０−１６−０１）を挿入する。ねじを締める。以上で光学モジュールを取り付ける準備が整う。
【００８６】
自動ズームおよび自動焦点機能が望ましい場合には、このアセンブリを次のように修正する。０．５ｘＴＶ鏡筒（オプテム（Ｏｐｔｅｍ）部品番号＃２９−９０−７０）を自動ズーム／焦点ユニット（オプテム（Ｏｐｔｅｍ）部品番号＃３９−２８−３０）の上に回し嵌めする。自動ズーム／焦点ユニットの部品である取り付け済みの同軸照明ハウジング上のねじを緩め、１０ｍｍの光ファイバ・アダプタ（オプテム（Ｏｐｔｅｍ）部品番号＃３０−１６−０１）を挿入する。ねじを締める。以上でユニットを取り付ける準備が整う。
【００８７】
サポート・フレームをベンチ・トップに置き、ベースをベンチのエッジまでスライドさせてベースの下側にボトムのボア・ホールが見えるようにする。２つのラバー・サポート脚をあてがい、接着剤に充分な圧力を掛け、その後、２つの１０３２×１／２ソケット・ヘッド・キャップねじを用いて取り付ける。ベースを回転し、このステップをベース・プレートの後縁について繰り返す。図４を参照されたい。左（図５Ａ〜５Ｄ）および右（図６Ａ〜６Ｄ）のサポート・ブラケットをバック・サポート部品（図７Ａ〜７Ｃ）に、各側において３つのソケット・ヘッド・キャップねじを用いて取り付け、このアセンブリを図４に示されているポジションに固定化する。カメラ・サポート・プレート（図８Ａ〜８Ｂ）を、４つのソケット・ヘッド・キャップねじを用いて左右のサポート・ブラケットのトップに取り付ける。
【００８８】
モータ付きステージ・コンポーネントを４つのステージ・サポート・ペグ上に、ステージ上のモータがサポート構造の裏になるように、４つの１０３２×１／２”ソケット・ヘッド・キャップねじを用いてマウントする。ｘおよびｙステージ・コントロール・ケーブルをラベルが付けられたモータに取り付け、クランピング・メカニズムを正しい位置までスライドさせる。許容可能なステージは、リュドル・エレクトロニクス（Ｌｕｄｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）のバイオポイント（Ｂｉｏｐｏｉｎｔ）またはバイオプレシジョン（ＢｉｏＰｒｅｃｉｓｉｏｎ）ステージであり、いずれになるかはフィードバック・コントロールの必要性に依存する。コントロール・ケーブルの他端を、バック・サポート・プレートの中心ホールに通す（図７Ａ〜７Ｃ）。ステージをコントロールするためのコントロール・ボックスおよびジョイスティックをサポート・フレームの横に配置する。電源ケーブルをコントロール・ボックスに取り付けた後、サージ保護付き電源アウトレットまたは電源調和ユニットに差し込む。ジョイスティックのコントロール・ケーブルをコントロール・ボックスに取り付け、コンピュータのシリアル・ポート・ケーブルをコントロール・ボックス上の適切なスロットに取り付ける。
【００８９】
規定のレンチを用いて、３つのリニア・ステージのそれぞれについて１つのマイクロメータを螺合する。正面から見たときにマイクロメータがプラットフォームの右側になり、オープン・スライド構造がアセンブリの上側表面になるように完成したリニア・ステージの１つをカメラ・サポート・プレート上に配置する（図８Ａ〜８Ｂ）。そのリニア・ステージを、４つの４４０×１／２”ソケット・ヘッド・キャップねじを用いてサポート・プレートに固定化する。これは、ｙ軸方向のカメラの平行移動を可能にする。リニア・ステージは、サーモ・オリエル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｏｒｉｅｌ）またはニューポート（Ｎｅｗｐｏｒｔ）から購入することができる。
【００９０】
２番目の完成したリニア・ステージを、最初のリニア・ステージに対して９０°に向けて配置し、４つの４４０×１／２”ソケット・ヘッド・キャップねじを用いて固定化する。マイクロメータは機器の後ろに位置決めされ、オープン・スライド構造は、このアセンブリの上側表面になる。これは、ｘ軸方向のカメラの平行移動を可能にする。角度付きブラケット（ニューポート（Ｎｅｗｐｏｒｔ））をこの２番目のリニア・ステージに、４つの４４０×１／２”ソケット・ヘッド・キャップねじを用いて、ブラケットの一方の面が機器の正面を向き、他方がリニア・ステージをカバーするように固定化する。
【００９１】
３番目の完成したリニア・ステージを、角度付きブラケットの正面に、マイクロメータが下を指すように、かつオープン・スライド構造が角度付きブラケットから外を向くようにして取り付ける。これは、ｚ軸方向のカメラの平行移動を可能にする。
【００９２】
延長鏡筒サポート・ブロック（図９Ａ〜９Ｃ参照）を、４つの６３２×３／８”ソケット・ヘッド・キャップねじを用いてこのリニア・ステージに取り付ける。完成した光学アセンブリを、延長鏡筒がサポート・ブロックのウェル内にセンタリングされ、７０ＸＬズーム・モジュールの上側部分がサポート・ブロックのボトムとなる（ボトムに当接する）ように配置し、そこで保持する。２つの半円形クランプ（図１０Ａ〜１０Ｂ参照）を使用し、各クランプについて２つの６３２×３／８”ソケット・ヘッド・キャップねじを用いて延長鏡筒をサポート・ブロックに取り付ける。光学アセンブリがハウジング内において真っすぐに、確実に取り付けられていることを確認する。
【００９３】
ＣＣＤカメラを光学アセンブリの延長鏡筒の上端に、カメラのねじ溝を用いて取り付ける。カメラは、カメラ・マウント・プレートの表面がシステムの正面を向いて方形化される必要がある。カメラ・コントロール・コードをカメラのトップに差し込み、バック・サポート・プレートの中心ホールにケーブルを通す。
【００９４】
光ファイバ束の一端を光学アセンブリの光ファイバ・アダプタ内に挿入し、止めねじを締めて光ファイバ・ケーブルを固定する。光ファイバ束を、バック・サポート・プレートの中心ホールに通す。
【００９５】
光源をベンチ上のステージ・コントローラの隣に配置し、その電源コードならびにプラグをサージ保護付き電源アウトレットまたは電源調和ユニットに取り付ける。光ファイバ・ケーブルの他端を光源のアウトレット・ポートに送り込み、止めねじを締め込む。光学コンポーネントおよびステージを覆うようにハウジング・アセンブリを慎重にスライドさせ、すべてのケーブルがハウジング内のインセットを通って送り込まれるようにする。光ファイバならびにカメラ・ケーブルは、中心サポート構造を通して送り込み、ステージ・ケーブルは、横のインセットから送り込む。ハウジング・アセンブリは、０．５ｃｍの厚さのポリカーボネート・シートを適切な寸法に切断することによって作られている。ポリカーボネートの部分が、アルミニウムのレールおよびラバー・ガスケットを用いて、図４に示されているとおりのベース・サポート・プレートに適合する正方形のカバーに結合される。ポリカーボネートはブロンズまたはスモークに着色されており、この検出システムが背景光に敏感な場合に周囲室内光からの干渉を除去するための補助となる。左側および下側左正面のポリカーボネート・パネルをヒンジ付きのアルミニウム・サポート・レールにシールし、２つのアクセス・パネルを構成する。サイド・パネルは、メンテナンスもしくはクリーニングの必要時に完全なシステムへのアクセスを提供する。フロント・パネルは、ステージ位置決めインサート内へテスト表面キャリアを配置するためのアクセスを提供する。それぞれのヒンジ付きパネルにはハンドルが取り付けられ、ドアをシールするための磁石ロック機能が含められる。またポリカーボネート・ハウジングは、測定中および測定間のステージならびに光学パスを塵埃および汚染からも保護する。ハウジングは、高さが２３．７５”であり、この機器のもっとも高い部分となるカメラならびにそのケーブルの上側クリアランスを確保する。ポリカーボネートのリア部分は、種々のコンポーネントからコンピュータもしくは適切なコントローラへ延びるすべてのケーブル用の出口のためのカット・アウトを含む。
【００９６】
カバーを付けたシステムを、サポート・ベースのボトム部分をわずかに露出させてベンチの正面に向けて慎重にスライドさせ、３つの１０３２−１／２”ソケット・ヘッド・キャップねじを用いてカバーをベースに取り付ける。ドアへのアクセスのために、フロント・パネル内に３つのねじが必要になる。機器を回転し、裏側について、２つのねじを用いてこの取り付けプロトコルを繰り返す。機器を適正な向きに回転し、エッジから機器が充分に離れるようにベンチの中心に配置する。
【００９７】
コンピュータ・モニタ、キーボード、マウス、およびコンピュータ・タワーを光源およびステージ・コントローラの隣に配置する。電源コードをモニタに取り付けてサージ保護付き電源アウトレットに差し込む。モニタにコンピュータ接続を取り付ける。製造者のマニュアルに従ってコンピュータ・タワー・ケースを開き、イメージ取り込みボードおよび必要なステージ・コントロール・ボードを取り付ける。ケースを再び閉じる。コンピュータ・タワーに電源コードを取り付け、サージ保護付き電源アウトレットまたは電源調和ユニットに差し込む。ステージ・コントロール・ケーブルをボードのインターフェースに取り付ける。カメラ・ケーブルをシリアル・ポート・プラグインに取り付ける。製造者のマニュアルに従ってモニタ・ケーブル、マウス・ケーブル、およびキーボード・ケーブルをコンピュータ・タワーに取り付ける。
【００９８】
このシステムによって分析されることになるテスト表面は、顕微鏡スライドと類似に構成することができ、ｘｙステージは、スライドをステージ内の再現可能に位置決めするための、スライドを固定するインサートを含むことになる。テスト表面は、任意のウェル・サイズのウェル付きプレートのボトムにマウント可能であり、その場合においてもインサートが使用されて、ステージ内にプレートは再現可能に固定される。
【００９９】
ソフトウエア設計
生物学的、あるいは化学的なアレイのイメージ分析のためのソフトウエア・パッケージの最終目標は、ユーザの干渉をまったく必要としないということになろう。初期セットアップならびに較正を超えたすべてのステップは、自動的に生じるべきである。適切なセットアップならびに較正のステップは、光源からの初期の光の強度の設定を含み、またステージ位置決めコントロールを用いたテスト表面のアライメントのマニュアル検証も含まれることになる。すべてのステップがソフトウエアのコントロールの下に置かれることが好ましい。
【０１００】
ここに開示されている実施態様は、多様な方法で具体化することができる。たとえば、開示されている方法を、ソフトウエアまたはファームウエアのいずれとしても具体化することが可能である。さらに別の実施態様は、たとえばフィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ）を含めたハードウエア実装とすることができる。
【０１０１】
現在までのところ、この最終目標における主要な制限は、スポット・サイズならびに形状の変動、反射、スポットの行および列の『波打ち』を扱い、その後、アレイ内のエレメントの数および位置を正しく評価する、テスト表面上のアレイの位置の識別、およびイメージ内のアレイのスキューに関する補正である。また、スポットの形態における変動、あるいはスポットの冗長性が低いか、もしくはアレイの各行ならびに列内にほとんどエレメントがないアレイを扱うことが、プロセスの完全な自動化を拒んでいた。収集したデータの質的および量的な処理は可能である。
【０１０２】
最初の議論のために、正のアレイエレメントが明るい背景上の暗い特徴として視覚化されることを前提とする。しかしながら、このアルゴリズムは、暗い背景上の白いエレメントの検出、あるいは別の色に対する特定の色の検出に容易に適合することが可能であり、本質的に、正のアレイエレメントとその背景の間に充分なコントラストを生み出す任意の状況に適合することができる。
【０１０３】
イメージ分析アルゴリズムの実施態様は、テスト目的で実行されるような専用ユーザ・インターフェースを介したアルゴリズムの実行を可能にするアプリケーション・プログラミング・インターフェース（ＡＰＩ）を、イメージ取り込みおよびレポーティング・プログラムのようなより汎用のソフトウエア・パッケージに対する拡張として提供する。さらにこのＡＰＩの背後のアルゴリズムのモジュール化は、オペレーティング・システムを横断するポータビリティを強化する。たとえば、このアルゴリズムをマイクロソフト・ウインドウズ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標））上のダイナミック・リンク・ライブラリ（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｎｋ  Ｌｉｂｒａｒｙ）（ＤＬＬ）として、あるいはリナクス（Ｌｉｎｕｘ）上のシェアード・ライブラリ（Ｓｈａｒｅｄ  Ｌｉｂｒａｒｙ）としてパッケージすることが可能である。それに加えてＡＰＩは、システムの別の部分に使用されているプログラミング言語に対してより依存しないものである。たとえば、このアルゴリズムがＣで具体化されている場合であっても、Ｃ＋＋、デルファイ、ビジュアル・ベーシック、およびジャバで記述されたほかのプログラムによる使用が可能である。
【０１０４】
アレイ内のスキューは、テスト表面の生成におけるいくつかのステップで発生する可能性がある。個別の捕捉試薬の塗布に使用されるスポッティング技術が、スポットの系統的な配置誤りを導く可能性があり、それが結果としてスキューのあるアレイをもたらす。個別のテスト表面の生成に使用される分離プロセスが、方形化からの逸脱あるいは一様でないエッジの生成によるスキューを導く可能性がある。位置決め装置が、方形からわずかに外れたキャリア内にテスト表面を配置する可能性がある。テスト表面バルク材料の内在的な弓反りが、テスト・キャリア自体のあらゆる弓反りと同様に最終的に位置決めされたアレイのスキューを生成する可能性がある。エッジは、個別のテスト表面についての物理的なエッジであってもよく、あるいは残りのイメージまたはテスト表面に対するコントラストを提供する個別のアレイの分離に使用される物理的バリアまたはマーキングであってもよい。
【０１０５】
適切なスポット見つけ出しアルゴリズムが、所望の結果を達成する上での最初のステップになる。このプロトコルは、イメージング済みアレイ内のねじれを扱うだけでなく、イメージング済みアレイの平面度、アレイの全体的な品質不良、アレイ内の非特異的結合、および照明不足を扱うことになる。この種のアルゴリズムの１つは、最初のステップにおいてテスト表面のイメージを『方形化』する。これは、アレイの個別のエレメントの配置誤りによらないイメージ内のスポットの列および行内の左右もしくは上下のあらゆるドリフトを抑える。
【０１０６】
テスト表面を方形化することは、ピクセルの和の２つのベクトルの形成を必要とする。１つのベクトルは、イメージ内のピクセルのすべての列の和を表す。他方は、イメージ内のピクセルのすべての行の和を表す。これらの和のベクトルのそれぞれについて、ベクトルの一次導関数の二乗が生成される。ヌクレオサイト（ＮｕｃｌｅｏＳｉｇｈｔ）イメージング・ステーションで使用されるイメージ・サイズを用いる場合、これが、カーネル・サイズ２０もしくは分析するイメージならびに信号に適切な値のサビツキ−ゴーレイ（Ｓａｖｉｔｓｋｙ−Ｇｏｌａｙ）フィルタを使用することによって達成される。それぞれの二乗後の導関数内の２つの強いピークは、エッジを表す。エッジの品質は、二乗後の導関数内のピークの高さから評価することができる。二乗後の導関数に関する標準偏差の倍数を、エッジについての品質評価基準として使用することができる。二乗後の導関数内のピークが、平均から標準偏差の数倍より高くない場合には、方形化オペレーションを続ける上では不充分すぎるとしてエッジを不適格にすることができる。
【０１０７】
満足の得られるエッジが検出された場合には、イメージの回転について単純なサーチを行い、二乗後の一次導関数内のもっとも強いピークを生成する。基本的に０．２５度の回転を試行し、上記の和および微分のステップを繰り返す。この二乗後の導関数内のピークのサイズが減少した場合には、回転の方向を逆転する。減少しなければ追加の回転を行い、結果として得られたピークの強さを評価する。このプロセスを、ピークが極大値を通過するまで反復する。ピークの強度の減少が観察されたポイントにおいて、そこからオリジナルのイメージの回転を１ステップだけ戻す。この『後退』は、最良のピーク強度をもたらした回転までイメージを戻す。これは、テスト表面の辺がもっとも垂直および水平に近くなる回転に対応する。回転サーチの間のいずれの時点においても４つの辺がすべて一致しない場合には、『投票』アルゴリズムを使用して、サーチを先に進めるべきか否かを決定する。その場合には、サーチを先に進めるためには、４つの辺のうちの３つが改善（より高いピークの高さ）を経験していなければならない。
【０１０８】
テスト表面のイメージの方形化後に、イメージ内におけるスポットのグリッドの位置決定を試みる。スポットが比較的規則的な行および列に並べられていることから、ピクセルの行および列の和は、スポットの行および列のポジションにおいて明瞭なピークを示す傾向にある。これらのピクセル和におけるピークを使用し、スポット・グリッドを全体として位置決定することができる。このプロセスが機能するためには、イメージ内においてテスト表面の４つの辺がすべて検出されていなければならず、それ以外ではプロセスが停止する。実際上は、ピクセル列または行についての和の最大値から各ピクセル列または行ごとの和の減算を行うことによって最初に和を『反転』する。これは、和における正に向かうピークがスポットの列または行の存在を表す形式にデータを変換する。続いて反転後のピクセル和の二次導関数を、１つは水平のピクセル和について、もう１つは垂直ピクセル和について生成する。サビツキ−ゴーレイ（Ｓａｖｉｔｓｋｙ−Ｇｏｌａｙ）スムージング／微分多項式を使用して導関数を生成する。スムージングのカーネルのサイズは、重要でない詳細を抑圧するために、一般に用いられるより大きく設定する。これは、スポットの行および列のポジションを損なうことなく、幅情報をスムージングする。
【０１０９】
二次導関数の領域を、テスト表面のエッジ間の最小値に関してサーチする。テスト表面のエッジから『インセット』させてサーチを開始および終了すれば、サーチ・エリアがさらに縮小される。テスト表面の幅あるいは高さの約３％のインセットが、良好に機能すると見られる。このインセットは、テスト表面のエッジにおける二次導関数における大きな変化からサーチを遠ざける。二次導関数における最小値は、和のピークを表す。最小値が有効であると見なすためには、その絶対値があらかじめ決定済みの『カットオフ』値を超えていなければならない。ピークがこのカットオフに適合しているとき、そのポジションを後の使用のために記録する。
【０１１０】
二次導関数のピークのサーチは、アレイ内のほかの列もしくは行に対してその列の占有度が最小となるとき、スポットの列または行のためのサーチ時の扱いがわずかに異なる。アルゴリズムは、高い占有度の列または行を検出し、検出されていない列のポジションを補間する。アルゴリズムは、補間した列または行の有効性を、検出済みの列または行の間の間隔を吟味することによって確認する。間隔は、ほぼ規則的である必要がある。異質な行もしくは列が検出されるときは、間隔があまり規則的でない。空のウェルもしくは未反応テスト表面の場合のように、検出された強いピークの数が不充分なときは、アルゴリズムはその先の分析を停止し、分析が停止された理由を示すコードを返す。このコードは、ユーザが失敗の理由を見ることができるように、結果テーブル内に返される。
【０１１１】
すべての必要なスポットの行ならびに列が検出され、かつ補間されると、アルゴリズムは、個別のスポットのポジションをさらに精密にするために、この後にアルゴリズム内において使用されるグリッドの開始ポジションを移動する。次に、すべての必要なイメージの処理を行う。たとえば、スムージング、膨張処理等がある。アルゴリズムの現在のバージョンは、カーネル・サイズを３．０として中央値・フィルタリング演算を行う。選択されるカーネルのサイズは、分析されるイメージおよび信号に依存することになる。
【０１１２】
次のステップは、処理後のイメージに対する適応閾値の適用である。これは、続く分析ステップのためにイメージを二値化する。適応閾値は、テスト表面上の背景内における変動、テスト表面の傾きに起因する照明における変動等があるために高い信頼性をもってイメージの二値化できる単一の閾値が存在しないことから使用される。平均適応閾値、および中央値適応閾値がともに使用された。一方が他方に勝るということは確認されなかった。
【０１１３】
この時点において形態学的な閉鎖（収縮処理およびそれに続く膨張処理）が適用される。このプロシージャは、閾値適用後のイメージ内の、その後に続くスポット−サーチ・アルゴリズムを擾乱することのある小さな『ホール』を閉じる。この閉鎖に使用されるカーネルのサイズは小さく、収縮処理について２ピクセル、膨張処理について３ピクセルである。収縮処理用のより大きなカーネルは、背景領域を接続することがわかった。膨張処理用のより大きなカーネルは、接続された背景領域の分断をいくらか助けることがわかった。量的な分析については、このステップが望ましくないことがある。
【０１１４】
閾値適用済みのイメージのバージョンが得られた後、適切なサイズならびに形状のスポットについてその吟味を行う。デフォルトのグリッドが使用されて、反応済みスポットが現れるべきところが評価される。プログラムは、各グリッドのセル内において、セル内の文字どおりの中心ピクセルを吟味することによってサーチを開始する。そのピクセルがブラックであれば、プログラムは、次のホワイト・ピクセルについて水平および垂直方向をサーチすることによって中心を探す。このサーチによってその開始ポイントが水平もしくは垂直いずれかの中心でないと示されると、開始ポイントを中心に移動し、サーチ・ステップを繰り返す。ほとんどの現実のスポットについて、中心の決定にわずかなサーチ・ステップしか必要にならない。いずれの場合においても、中心サーチ・ステップの数は、薄膜イメージの分析の場合、５ステップまでに限定される。
【０１１５】
セルの中心において吟味された最初のピクセルがブラックでなかった場合にアルゴリズムは、そのセルを４つの象限に分割し、各象限の平均の強度を評価し、もっとも暗い象限の中心において再びサーチの開始を試みる。そのもっとも暗い象限の中心ピクセルもホワイトであるときにはサーチが停止する。そうでなければ、スポットの中心のためのサーチが、手前の段落で述べたとおりに進められる。検出されたスポットの幅および高さが指定範囲内にあり、幅対高さの比もまた指定範囲内にあれば、グリッド・セルが新しい位置に移動される。
【０１１６】
グリッド内のすべてのセルがサーチされた後、それらが吟味されて隣接セルが同一の位置に移動されていないかについての決定が行われる。このタイプの『衝突』は、最初のグリッド位置が、テスト表面上の実際のスポットの位置をほぼ２分するときに生じ得る。衝突したすべてのセルは、それらのオリジナルの位置に戻される。
【０１１７】
衝突を取り消した後、高い信頼性をもって検出された許容可能なサイズならびに形状のスポットの吟味を、開始ポジションから、系統的な水平ならびに垂直のオフセットについて行う。プログラムは、列１、３、５、および７内の高い信頼性をもって検出されたすべてのスポットの水平ポジションの、それらの開始ポジションからの差を平均することによって水平オフセットを決定する。同様にプログラムは、グリッドの第１行および最後の行内の高い信頼性をもって検出されたスポットを調べることによって垂直オフセットを決定する。これらの行および列は、分析物の１つの特異的なセットのために使用され、テスト表面上における異なる分析物レイアウト用に変更することができる。垂直ならびに水平オフセットが決定されると、オリジナル・グリッドの位置をそれらのオフセットによって調整し、閾値適用済みのイメージを再適用し、スポット・サーチを繰り返す。このステップの後に衝突が観察されることはなかったが、それでもアルゴリズムは、衝突を調べ、検出された場合にはそれらを取り消すことになる。
【０１１８】
２回目のサーチ・ステップで追加の強いスポットが検出されることはまれであるが、これによって、弱いもしくは未反応スポットについてはるかに良好な評価済みの位置が提供される。調整を行わない場合には、背景信号の評価が、未反応スポットについて良好でなくなり、弱いスポットが全体的に失われてしまうことがある。
【０１１９】
スポット・サーチ・アルゴリズムが完了した後、それぞれのセルに関する『信号』が、各セルの中心の円形領域（直径２２ピクセル）の平均強度を中心回りの『フレーム』内に配置されたピクセルの平均強度から減ずることによって決定される。いまのところこのフレームは、辺が３５ピクセルであり、２ピクセルの厚さのフレームが使用され、言い換えると約２７０ピクセルが平均に寄与する。矩形フレームの使用が重要であるとは考えられていない；これは、演算上の便宜に過ぎない。ピクセルの選択は、個別のエレメント・サイズ（スポット・サイズ）および倍率等のイメージ取り込みパラメータに基づく。
【０１２０】
各セルについての信号を獲得するために、暗い中心領域の平均強度を、より明るい周囲フレームの平均強度から減じる。より明るいピクセルが、より高い強度値を表すことから、この方法で計算を行うと、より『強い』スポットについてより正になる信号が生成される。テスト表面についてすべての信号処理が完了すると、イメージ上の信号の計算のために使用された位置が、各スポットの中心における小さな『＋』記号の形式でマークされる。実際のプレートのランの間には、ユーザが確認できない速さで生じるが、各ウェルのイメージが、後に必要となったときの参照のために、これらのマーカを伴って記録される。
【０１２１】
プログラムは、スポッティング、分割、テスト・キャリアの配置、ステージの移動、あるいはユーザによるアライメントの問題に起因してテスト表面にアライメント誤りがある場合であってもスポット・グリッドの位置を決定する。テスト表面が反応済みスポットを有しており、テスト表面のすべての辺を見ることが可能であり、イメージ内において明瞭であれば、アルゴリズムが正確にスポットの位置を決定する必要がある。空のウェルおよびテスト表面が作られていないウェルは、通常、分析プロセスの早い時期に検出される。これらのウェルが検出されたときには、それらに対してその後の分析が行われない。アルゴリズムが、特定のウェルは分析するべきでないと決定した場合には、ユーザに対して分析が失敗した理由を知らせることのできるコードを返す。
【０１２２】
アルゴリズムが特定のウェルについてデータ・テーブルを生成するとき、そのテーブルには、イメージ内の各スポットのポジションをはじめ、背景、前景、および正味の信号が含められる。この情報が、完全に自動化されたプレートの実行において使用される必要はないが、個別のテスト表面をマニュアルで分析するときに使用することができる。アルゴリズムは、各スポットの中心位置に小さいマーカ、すなわち『＋』記号を追加する。このマーカを伴ったイメージが、完全に自動化されたプレートの実行の間に保存される。スポットの検出の正否についての疑問が生じた場合には、イメージを検索し、マーカの位置をチェックすることが可能である。
【０１２３】
有用な場合には、閾値を超えるピクセルの数もしくはそのほかの計算からアレイエレメントの面積を計算することができる。識別されたエレメントについて個別のピクセルの応答を記録すること、あるいはピクセルの強度のヒストグラムを生成することも可能である。このほかのデータ表示も可能であり、この分野で周知である。
【０１２４】
スポット見つけ出しアルゴリズムの好ましいアプローチは、イメージの上にグリッド（アレイ内のエレメント数に対応する）を配置する必要性を、アレイ内の個別のエレメントの配置を単純に識別し、確認するアプローチに置き換えることである。アルゴリズムは、アレイ内の個別のエレメントを識別するために、最初にそのエレメントが、分析されるアレイのサイズに期待されるサイズ、形状、およびポジションと概略で等しいことを決定しなければならない。このため、ハフ変換が適用される。アルゴリズムは、使用する正確な変換に応じて、ラインまたは円等の幾何学的基本要素を特にサーチする。また、実空間またはイメージ内のオブジェクトの位置に対応することになる変換空間内の最大値を探すこともできる。これらの変換は、種々の惑星のイメージ内のクレータの検出および技術図面のディジタル化に使用されている。クレータ検出手法は、照明が一様でないとき、あるいは背景が一様でないときに機能することから有用である。またこれは、円が正確にアレンジされていないとき、および円が周囲より明るい、あるいは周囲より暗い場合、および円の直径が一定でないときにも機能する。
【０１２５】
このプロトコル内のステップは、任意のイメージについて反応済みスポットの位置のリストを作成する。続いて、プリセットした選択規則に基づいて、これらのスポット位置のいずれがノイズであるか決定し、ノイズを除去する。実際のスポット位置であると決定されたスポットには、あらかじめ決定済みのアレイマップに基づいて、アレイ内の特定のエレメントが割り当てられる。未反応スポットには、アレイ内の識別済みエレメントの間隔に基づいてアレイ内の位置が割り当てられる。各割り当て済み位置についての識別データから、アレイ内の各エレメントの有無、または絶対値を設定することができる。
【０１２６】
薄膜検出アッセイに特有の特徴は、膜厚もしくは結合した質量が色の変化をもたらし、第２のカラー・フリンジに移動する非常に強い反応について、その反応が、グレイスケール測定において背景より明るいスポットを生成するということである。したがって、正のスポットは、背景より暗くてもよく、背景より明るくてもよく、いずれも有効な肯定的結果である。それに加えて、形成されるスポットは、一様な厚さのものではない。図１１Ａ〜１１Ｃを参照されたい。このタイプのテスト表面の場合、およびこのほかの信号生成方法について、選択されたアルゴリズムが、暗いスポット、強い反応のスポット、および一様でないスポットに対して、ノイズの多い背景が存在する場合であっても未反応スポットと見なすことなく、正しく検出し、正の信号を割り当てることが重要である。アッセイ・プロトコル内において背景が生成される場合には、未反応スポットが、暗い背景内の明るいスポットとして現れることができる（図１１Ｃ参照）。イメージ処理方法は、このタイプの処理問題を適切に扱わなければならない。
【０１２７】
この場合、ハフ変換アプローチ単独は、その処理時間が長すぎることから制限因子となる。このタイプの薄膜アッセイにおいて生成されるイメージが、ほかの応用においても同様となるが、スポットの中心において明から暗に変化する強い信号の勾配を有する。未反応スポットもまた、強い勾配を有するが、それはスポットの中心に向かって暗から明に変化する。図１２Ａ〜１２Ｂを参照されたい。
【０１２８】
これらの表面について、最良のパフォーマンスを伴う処理アルゴリズムは、図１の方法１００に示されているとおり、次のプロセスから構成される。最初に、これはオプションのプロセスとなるが、テスト表面のイメージの位置を決定する。続いて、イメージをクロッピングしてプレートのウェルからイメージの暗いエッジを除去する。これもまたオプションのステップであるが、吟味するデータの量を縮小し、アルゴリズムの動作をより高速化することができる。またこれは、イメージの周囲のノイズが検出されないか、あるいは吟味されないという利点も有する。クロッピングを達成するために、垂直および水平両方の方向でイメージの投影が作成される。これら２つの投影の一次導関数が、３次の、カーネル・サイズが２１エレメントのサビツキ−ゴーレイ（Ｓａｖｉｔｓｋｙ−Ｇｏｌａｙ）スムージング／微分多項式を使用して生成される。特定の応用、デバイス・フォーマット、および信号生成方法に基づいて、このほかの値が選択されてもよい。次に、これらの導関数が二乗され、二乗後の導関数の平均値より標準偏差の４倍分高い最初のピークについて、エッジから中心に向かってスキャンが行われる。それぞれの二乗後の導関数からこのようにして検出された２つのピークの中心は、関連する軸に沿ったテスト表面のエッジの位置であると見なされる。テスト表面のエッジが検出された後（ブロック１０２）、イメージがこれらのエッジ位置まで、通常はイメージ・サイズにおいて約２５％のピクセルが削られる縮小を表すクロッピングが行われる（ブロック１０４）。テスト表面のエッジが検出されなかった場合には、ブロック１０４のステップがバイパスされ、イメージ・サイズの縮小を伴わずに処理が継続される。
【０１２９】
二乗後の導関数においてピークの検出のために使用される、平均値より標準偏差の４倍分高い値は、経験的に到達した値である。選択された値は、実際のテスト表面のエッジとして反射を擬似的に検出することを排除するために設定される。より低い値は、誤って反射をテスト表面のエッジとみなす。カットオフをそれと同じ高さに設定することは、実際のテスト表面の品質およびイメージ内のテスト表面の回転に制約を課する。非特異的結合によってテスト表面のエッジが欠けているか、平坦でなく、あるいは不明瞭な場合には、クロッピング・オペレーションが失敗することがある。同様に、テスト表面が約４ないし５度を超えて回転された場合には、クロッピング・オペレーションが失敗することがある。許容可能な回転角度は、このほかの、全体的な明るさ、テスト表面上の背景の『明瞭さ』等のテスト表面イメージの品質によって変化する。
【０１３０】
前述したとおり、イメージのクロッピングの失敗は、スポット見つけ出しアルゴリズムにとって致命的でない。単に、より長い分析をもたらし、より多くの擬似的なノイズ・スポットの扱いが必要になるかもしれないというだけである。
【０１３１】
ブロック１０６においては、イメージの勾配が、水平および垂直両方の方向において生成される。勾配は、アンドウ（シゲル・アンドウ著『コンシステント・勾配・オペレータズ（Ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｏｐｅｒａｔｏｒｓ）』、ＩＥＥＥトランザクションズ・オン・パターン・アナリシス・アンド・マシン・インテリジェンス（ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ）、２２（３）：２５２−２６５、２０００年）によって提案された係数の５×５セットを用いてイメージの畳込みを行うことにより生成される。垂直勾配を水平勾配で除した値のアークタンジェントをとると、勾配の方向が求まる（ブロック１０８）。いずれかの方向の勾配がシステム上で表現可能な最小の単精度浮動小数点数の絶対値より小さい場合には、その方向が０に設定される。ここで注意を要するが、勾配方向ならびに次に説明する二乗後の勾配の大きさの生成および閾値の適用の順序は、重要であると考えられていない。ブロック１１０においては、水平および垂直方向の勾配を二乗し、結果を合計してイメージの勾配の二乗後の大きさを求める。より伝統的なアプローチでは、合計の二乗根によってイメージの勾配の大きさを生成することになる。二乗根のステップを排除することによって、高速化が提供され、二乗根演算に伴って生じる可能性のある数字ドメイン問題にアルゴリズムをさらすことがなくなる。二乗後の勾配の大きさは、閾値演算によって二値化することができる（ブロック１１２）。二乗後の勾配の大きさの平均より大きい二乗後の勾配の大きさを有するすべてのピクセルは、イメージの閾値適用後バージョンにおいて１にセットされる。それより小さい二乗後の勾配の大きさを有するすべてのピクセルは０にセットされる。
【０１３２】
二乗後の勾配の大きさの平均の倍数を使用したイメージへの閾値の適用には経験から到達した。標本イメージの吟味は、平均の倍数が良好に機能することを示した。平均の１倍の値は、薄膜イメージについて良好に機能すると見られる。二乗後の勾配の大きさのこのほかの測定、たとえば分散または中央値の倍数も使用することができる。代表的なイメージの全体的な品質は、カットオフの選択にも影響する。このステップは、残りのアルゴリズムが機能するために絶対的に必要というものではない。しかしながらこれは、残りの作業の焦点を目的とするピクセル上に当てる。これは通常、イメージ・ピクセルの約９０％をその後の吟味から排除し、分析を著しく高速化する。
【０１３３】
アルゴリズムにおける次のステップは、ブロック１１４において、勾配方向、勾配の大きさ、および許容可能スポット半径からの情報を結合して、許容可能なスポットのポジションを明らかにするオリジナル・イメージの変換を生成することである。
【０１３４】
円のエッジにおいて、勾配は、接線に垂直なラインに沿って『ポイントする』。勾配は、明るい背景上の暗い円であるか、あるいは暗い背景上の明るい円であるかによって、円の中心に向かって、あるいはそれから離れる方向をポイントすることができる。完全に明確な円については、その円の中心に向かう勾配に沿ってポイントするすべてのラインが、その円の中心で交わることになる。円が理想的な形状から逸れるに従って、交差がぼやけてくるが、それでもその円の中心の位置を決定する傾向はある。
【０１３５】
勾配の向きは、明るい背景から暗い円への遷移を構成するときには、円の中心に向かってポイントしていると定義される。これにより、明るい背景上の暗い円、テスト表面の物理的特性から白い中心を囲む暗いリングを有する白い円、およびインジケータがはがれて、暗いリングが明るい背景上に残された『ドーナツ』について、勾配が円の中心をポイントする。未反応スポットが暗い、非特異的結合材料によって囲まれている場合には、暗い背景によって囲まれた明るいスポットによって、勾配が望ましく円の中心から離れる方向をポイントする。アルゴリズムのこのステップのために、新しい、空の（オール０）イメージが作られる。閾値適用済みの二乗後の勾配の大きさに含まれるすべての非ゼロ・ピクセルについて、勾配の方向が検索される。勾配の方向は、可能な円の中心に向かってポイントする線分の構築に使用される。許容可能な円の半径によって線分のエンド・ポイントが決定される。新しく作成されたイメージ内の、線分内のピクセルに対応するすべてのピクセルは、『票』を受け取る。すなわち、すべてのこの種のピクセルは、その強度が１インクリメントされる。閾値適用済みの二乗後の勾配の大きさに含まれる連続するピクセルが吟味され、線分が生成され、新しいイメージ内の、適切なサイズの円の中心に対応するピクセルは、より多くの票を蓄積する傾向を有する。プロセスの終了時には、勾配の大きさおよび方向がオリジナルのイメージの表現に変換され、それにおいては円の中心が背景より高い強度値を有する。図１３を参照されたい。このアプローチは光学的薄膜テスト表面を扱うために設計されたが、アルゴリズムは、これらのタイプのイメージ変数がイメージの解釈に否定的に影響し得る任意の検出フォーマットを扱うことができる。
【０１３６】
このステップの現在の具体化は、線分がピクセルの中心を正確に通らないときに隣接ピクセル間で票を『分ける』という意味においては最適化を行っていない。またブレセンハムのライン発生器のような線分の生成に関する最適化も含んでいない。その種の改良は、必要であれば行ってもよいが、これまでのところそれに該当していない。
【０１３７】
二乗後の勾配の大きさの場合と同様に、閾値演算の適用は、変換の二値化したバージョンを生成する（図１のブロック１１６）。この場合、閾値評価基準が、変換からの最大票カウントの分数倍を使用することになる。経験的な研究から、最大票カウントの１／７の閾値が、薄膜イメージに良好に機能することが示された。したがって、閾値適用済みの変換においては、変換からのピクセルであって、最大票カウントの１／７より大きい票カウントを伴うピクセルに対応するピクセルが１にセットされる。そのほかのすべては０にセットされる。このほかにも機能すると見られる別の閾値評価基準を考えることは可能である。最大票カウントの分数倍を使用することによって、多くの擬似的なスポットが空のウェルのイメージ内において検出される。非常に多くの票を受け取るピクセルが存在しないことから、しばしば１０００を超える多くのピクセルが閾値を超えるに充分な票を受け取る。このアルゴリズムの後の段階で、これらのイメージおよび擬似的なスポットが解釈不能であると宣言され、それらが削除される。
【０１３８】
通常、閾値適用済み変換内のスポットは、連続するピクセルのグループによって表現される。アルゴリズムのこの段階では、ブロック１１８において、これらの連続するピクセルが検出される。同一の連続する領域内のすべてのピクセルに同じラベルが割り当てられる。小さい正の整数が使用されてスポット番号が表される。閾値適用済みイメージ内のそれぞれの連続するピクセルの領域については、１つのピクセルだけを使用してそのスポットの位置を表すことができる（ブロック１２０）。変換ならびにラベルを付した領域からの情報を結合し、その領域内のピクセルのうち、変換内のもっとも票の多かったピクセルに対応するピクセルを１にセットする。その領域内のほかのすべてのピクセルは０にセットする。スポットもしくはスポットおよびノイズが、２もしくはそれを超える数の隣接しない領域によって閾値適用済み変換の中に表されるということがしばしば生じる。アルゴリズムの次のステップにおいては、最初の抑圧の段階からのピクセルを、近隣について調べる。『近さ』は、変換の生成に使用したスポット・サイズの評価基準と同じものを使用して定義される。２もしくはそれを超える数のピクセルが、互いの許容可能スポット半径内にあると決定されると、変換内のもっとも多くの票を伴う単一ピクセルを除くすべてを０にセットし、それによって近隣を削除する（ブロック１２２）。
【０１３９】
アルゴリズム内のこのステップによって、すべての許容可能なスポットが検出され、そのスポットの位置をもっともよく表している単一ピクセルにローカライズされる。スポット・サイズによる選択を除けば、このアルゴリズムは、このポイントに対して完全に一般的であり、任意のスポット位置タスクに適用できる。この後に続くアルゴリズム内のステップは、アレイのレイアウトの知識を適用して各スポットをアレイのエレメントに関連付け、テスト表面上のどこで測定を行うかを決定する。これらのステップは、アレイのレイアウトに調和する『グリッド』を構築する。
【０１４０】
グリッド内の候補行および列は、『リーダ−フォロワ』アルゴリズムとして知られているクラスタリング・アルゴリズムによって評価される。使用されるクラスタリングの評価基準は、ハフ変換において使用された最大スポット・サイズの評価基準と同じものに基づいている。ブロック１２４においては、特定のスポットもしくはクラスタをノイズとして削除することができ、かつスポット・グリッドの位置を決定することができる。擬似的なクラスタは、テスト表面のエッジと近すぎる場合に削除することができる。このステップは、前述したクロッピング段階の間におけるテスト表面のエッジの検出の成功に依存する。クラスタがエッジから所定の決定的な距離内に検出された場合には、おそらくはそれらは、削り取り、ウォッシュ効果、あるいはそのほかのデブリに起因するものとして削除する。
【０１４１】
テスト表面に適用された標本のタイプを決定するために、残りのスポットがあればそれをカウントする。スポットのカウントは、ブランク、患者の標本、高濃度標本、あるは空のウェルの間で標本を仕切るために使用される。これらの標本に関するスポットのカウントの範囲は、いずれかの正当な標本タイプによって生成されていないと見られるカウントも存在することから、隣接している必要はない。
【０１４２】
この段階において、残りのスポットならびにクラスタの有効化にヒューリスティック規則が使用される。クラスタが、特定の位置について規定された条件に適合しない場合には、それが削除され、次のクラスタが吟味される。クラスタリング情報が、アレイ内の行ならびに列のすべてのポジションを完全に指定していないということはまれではない。たとえば、図１２Ａ〜１２Ｂのアレイにおいて、８番目の列にスポットが現れておらず、候補クラスタを生成していない。この場合にアルゴリズムは、欠落しているクラスタのポジションの補間を試みる。たとえば、７つの正当な列だけが検出されたとき、アルゴリズムは検出済みの列の間隔を調べ、欠落している列がエッジの１つであるかグリッドの内側の列であるかを決定する。これを決定した後、検出済みクラスタからの間隔情報に基づいて、欠落している列について評価したポジションを作成することができる。
【０１４３】
すべての必要なグリッドの行ならびに列が検出されるか、クラスタ情報から評価された後、グリッドの行および列の各交点にもっとも近いスポットを見つけ出すために候補スポットのリストが吟味される。一致が見つかれば、グリッドの位置が、そのスポットの位置に移動される。適切な候補スポットが検出されなかった場合には、グリッドの交点は移動されない。スポットがグリッドの位置と『充分に近い』か否かについての評価基準もまた、ハフ変換ステップにおいて使用された許容可能スポット半径に基づく。
【０１４４】
各グリッド位置に関する信号は、そこでスポットが検出されたか否かによらず、最大許容可能スポット半径内の勾配の大きさの和によって生成される（ブロック１２６）。スポットがグリッド位置の近傍で検出された場合には、手前のステップにおいて決定されたとおり、信号がそのスポットの位置において測定される。そうでなければ信号が、グリッド・ポイントの理論的位置において測定される。取り込みソフトウエア・パッケージに、小さいプラス（『＋』）記号がマークされた測定位置の中心ポイントを伴うイメージを返すことができる（ブロック１２８）。これらの信号の値は、測定の中心の位置とともに、インターフェース／取り込みソフトウエア・パッケージに戻される情報のテーブルの構築に使用され、そのテスト表面に関する読み値として記録される。
【０１４５】
閾値適用済みのバージョンではなく、完全な勾配の大きさに対してスポット変換を適用すると、検出器の感度を増加することができる。検出の後、検出されたスポット周囲の勾配の平均を求めることによって信号を測定することができる。クラスタ検定規則から調整が求められることがある。アルゴリズムを通じて使用されている多数の種々のカットオフは、感度もしくはスポット信号の差別化の向上のために、より厳しくない値の設定が必要とされることもある。これは、擬似的なスポットの検出の向上、あるいはアルゴリズムの出力における背景の影響とバランスさせなければならない。特に、投票の除数は、より大きな数に修正される必要がある。１つのアプローチは、現存するアルゴリズムを使用してグリッドを見つけ出し、その後閾値を使用する１ないしは複数のインタラクティブなパスを続けて、より敏感なスポット検出をもたらすこととなろう。最初のアルゴリズムは、適切なスポット位置の確認に使用されることになり、２番目のアルゴリズムは、その位置におけるスポットの真の強度を決定するために使用されることになる。
【０１４６】
当業者であれば容易に明らかになろうが、本発明もしくはその実施態様の範囲からの逸脱を伴うことなく、ここで述べた方法および応用に対するそのほかの適切な修正ならびに適合を行うことができる。本発明を詳細に説明した今、本発明を限定する意図ではなく例示のみを目的として含めた以下に示す例を参照することによってより明確にそれを理解することになろう。
【実施例１】
【０１４７】
ＰＣＲ増幅に続く標本から嚢胞性繊維症（『ＣＦ』）に関連するゲノムターゲットＤＮＡ配列を検出するべく設計されたアレイについて説明する。テスト表面は、相補的な固定化された取り込み配列に対してターゲット配列のハイブリダイゼーションを検出する光学的薄膜テスト表面である。生成される光学信号は、ハイブリダイゼーション事象に起因する光学的な厚さにおける変化の関数である。この光学表面は、特定の波長が減衰されるか、除去され、特定の色の変化をもたらすように入射白色光を反射する。光学的な厚さにおける変化がない場合には、反射される光は元のもしくはバックグラウンドの色を維持する。
【０１４８】
ＣＦ表面によって検出されたゲノム配列は、ＣＦＴＲ遺伝子内において２５の突然変異体および多型に特異的であり、次の表に示す。
【０１４９】
【表１】
2006526151.tif 000003
【０１５０】
各ＣＦ光学的薄膜テスト表面は、６４エレメントのアレイを含む。アレイは、これら２５の突然変異体のそれぞれについて変異体と野生型のポジションのペアを含む。それに加えてＣＦ表面は、６つの多型を検出するポジションを含む。９つのプローブの配列が、６４エレメントのアレイ内において、これらの多型を検出する。さらにこのアレイは、５９のＣＦエレメントに加えて３つの基準マーカ（ＦＭ）および２つのプロセス・コントロールを含む。
【０１５１】
試薬の準備
１Ｘ  Ｈｙｂ  緩衝液
２５０ｍＬ      ２０Ｘ  ＳＳＣ
１０ｍＬ      １０％  ＳＤＳ
５ｇｍｓ      カゼイン
ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリーＨ2Ｏで１リットルとする
ｐＨ＝      ７．０＋／−０．２
不溶性沈殿物が直ちに形成される。完全に溶解するまで５０℃まで加熱する。０．２μセルロース・アセテート・フィルタ・ユニットを用いて濾過する。５０ｍＬの円錐管に分ける。使用するまで２℃〜８℃で貯蔵する。
【０１５２】
変性溶液
５ｍＬ      ２Ｎ  ＮａＯＨ
４ｍＬ      ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ
９１ｍＬ      ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリーＨ2Ｏ
０．２μセルロース・アセテート・フィルタ・ユニットを用いて濾過する。室温で貯蔵する。
【０１５３】
抗ビオチン／ＨＲＰ  １ｍｇ／ｍＬコンジュゲートストック
０．５ｍＬのＨ2Ｏ中に０．５ｍｇボトルのコンジュゲートを再溶解させ、室温で１５分間放置する。
【０１５４】
使用するまで２℃〜８℃で貯蔵する。コンジュゲートは、ジャクソン・イミューノリサーチ・ラボラトリーズ・インク（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ）から購入する。
【０１５５】
ウォッシュＡ
５ｍＬ      ２０Ｘ  ＳＳＣ
１０ｍＬ      １０％  ＳＤＳ
９８５ｍＬ      ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリーＨ2Ｏ
ＰＨ＝      ７．０＋／−０．２
０．２μセルロース・アセテート・フィルタ・ユニットを用いて濾過する。室温で貯蔵する。
【０１５６】
ウォッシュＢ
５ｍＬ      ２０Ｘ  ＳＳＣ
９９５ｍＬ      ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリーＨ2Ｏ
ＰＨ＝      ７．０＋／−０．２
０．２μセルロース・アセテート・フィルタ・ユニットを用いて濾過する。室温で貯蔵する。
【０１５７】
アッセイのセットアップ
使用前に１Ｘ  Ｈｙｂ  緩衝液を５０℃で約２０分間、あるいは完全に溶解するまで予熱する。
【０１５８】
ＴＭＢ基質の一部を取り出し、それを少なくとも１５分間にわたって室温まで暖める。１枚のプレートの分析には、合計で１４．４ｍＬが必要となるが、分析するプレート当たり１６ｍＬを超える分配はしない。
【０１５９】
１Ｘ  Ｈｙｂ  緩衝液を用いて抗ビオチン／ＨＲＰコンジュゲートストックを１／１０００の割合で希釈することによって、分析するいくつかのプレート用に充分なコンジュゲート（１５ｍＬ／プレート）を準備する。必要になるまで室温で放置する。希釈済みコンジュゲートは、最長で１時間使用することができる。
【０１６０】
ＣＦプレートをヒート−シールの出荷ポーチから取り出すが、アッセイの開始前は、接着プレート・シールを外さない。
【０１６１】
アッセイ方法
接着プレート・シールを外し、１８０ｕＬの１Ｘハイブリダイゼーション緩衝液を、テスト表面を擁するそれぞれのウェルに加える。プレート・シールを戻し、ＳＯＬＯ  ＨＴヒート・ブロック（もしくは等価物）内において５１℃で３０分間予熱する。この３０分間のインキュベーションの２０分後にステップ２を開始する。
【０１６２】
注意：プレートの温度の操作は、適正なハイブリダイゼーション結果に決定的となる。周囲温度がアッセイの温度に影響しうることから、慎重に監視する必要がある。
【０１６３】
ＰＣＲ増幅サンプルを管またはプレートに加え、充分な水を加えて合計で１０ｕＬの体積にする。１０ｕＬの変性溶液をアンプリコンに加え、ピペットマン（ｐｉｐｅｔｍａｎ）を用いて一度上下する。室温で１０分間インキュベートする。
【０１６４】
プレート・シールを取り除き、保管しておく。ＣＦプレート内のそれぞれのウェルから、５０μＬの暖めたハイブリダイゼーション緩衝液を取り出し、変性ＰＣＲ産物に加える。変性ＰＣＲ産物を混合し、全体積（約７０μＬ）を適切なＣＦウェル内のハイブリダイゼーション緩衝液に加える。ピペットマン（ｐｉｐｅｔｍａｎ）を用いて吸引および分配を繰り返して完全に混合する。プレート・シールを用いてプレートをカバーする。５１℃で１０分間インキュベートする。
【０１６５】
ヒート・ブロックからプレートを取り出し、プレート・シールを外す。室温において、ウォッシュＡを勢いよく流しながらプレートの洗浄を行い（４回）、続いてウォッシュＢを勢いよく流しながらプレートの洗浄を行う（４回）。
【０１６６】
注意：プレートの洗浄は、適切なウォッシュ溶液の流れをウェルが満たされるまでウェルのコーナへ向けることによって行う。各洗浄の後は、溶液を捨てる。最終洗浄の後、ウェルを振り、上下を逆にしてベンチの上でたたいて過剰な体積を取り除くか、確認済みプログラムに設定されたプレート・ウォッシャを使用する。
【０１６７】
（５）ハイブリダイゼーション緩衝液中に希釈した１ｕｇ／ｍＬの抗ビオチン抗体／ＨＲＰコンジュゲート１２５ｕＬを、各ウェルに加える。カバーを付けずに室温で１０分間インキュベートする。
【０１６８】
ウォッシュＢを勢いよく流して洗浄する（６回）。
【０１６９】
１５０μＬのＴＭＢ基質を各ウェルに加える。室温で５分間インキュベートする。
【０１７０】
各ウェルに水を満たすことによって洗浄を行い（５回）、その後、各ウェルにメタノールを加えることによって乾燥し（３回）、最後に過剰なメタノールを吸い取る。イメージ分析システムを用いた分析の前までに、残りのメタノールを蒸発させる。
【実施例２】
【０１７１】
この実験は、イメージングする標本のｘ方向およびｙ方向における傾きに対するイメージ分析ステーションのパフォーマンス許容範囲を決定するために計画された。反応済みおよび未反応ゾーンを伴うテスト表面をゴニオメータ上に配置し、それを、９６ウェル・プレートのウェル内のテスト表面の分析において使用されるものと同じ被写界深度、焦点レベル、および解像度の光学視野内に配置した。ゴニオメータは、テスト表面に印加される傾き角に対する非常に細かい調整を可能にする。テスト表面は、まずｘ方向に印加された傾きについて、次にｙ方向に印加された傾きについて評価された。種々の正および負の傾き角において、単一の反応済みスポットについての読み値が、次の表に示すとおり獲得された。
【０１７２】
【表２】
2006526151.tif 000004
【０１７３】
データは、ｘ方向およびｙ方向において同一であった。
【０１７４】
−２°から６度までは、コントラストにおける損失が５％に満たない。これは、３σの標準偏差において＋／−４°の傾きプロセスの変動を許容し、これはイメージ・ステーションにおける優れた許容度である。真の０°に対する表面のわずかなポジション・オフセットが、範囲がゼロにセンタリングされていないという事実の原因である。
【実施例３】
【０１７５】
イメージ分析ステーションを使用して測定される反応済みスポットの信号に周囲光がどのような影響を及ぼすかについて確立するために、複数の反応済み表面を含むプレートをステージのプレート・ホルダに設置し、イメージング用カメラの下に位置調整した。反応済みテスト表面上の種々のスポットの信号強度を、周囲室内光ありおよびなしの状態で測定した。偏光器を４５°（中央のポイント）のダイアル・レンジにセットし、ダイアル・マークがトップ・ポジションのすぐ左となる中程度の入力強度を表すランプ・ポジションで３つの反応済み表面の測定を行った。測定は、異なるテスト表面上の多数の標本ポジションにおいて行われた。室内光あり、およびなしにおけるウェルＣ８内のすべてのスポット・ポジションに関する個別のスポット強度の相互依存は９３．７％である。室内光あり、およびなしにおけるウェルＥ８内のすべてのスポット・ポジションに関する個別のスポット強度の相互依存は９４．６％である。このように、周囲光が光学的薄膜アレイの分析に与える影響は、ごくわずかである。
【実施例４】
【０１７６】
この実験は、イメージ分析ステーションのための適切な光強度の設定、および偏光器のポジションを決定するために計画された。９６ウェル・プレート内に反応済みおよび未反応ゾーンを伴ういくつかの個別のテスト表面を選択し、種々の組み合わせの光設定および偏光器ポジションを用いて分析した。偏光器ハウジングは９０°の回転があり、信号（偏光なし）の飽和を生じるポジションにポジション＃１のラベルを付し、０°のポジションと見なした。ポジション＃１から９０°となる正反対のポジションにポジション＃２のラベルを付し（かつ９０°のポジションとし）、偏光器の中央のポイント、すなわち４５°にポジション＃３のラベルを付した。光の電源は、５を中央ポイントの設定として１から９までの番号が付された光設定を有する。
【０１７７】
許容可能な光／偏光器の組み合わせは、背景を飽和させる（すなわち、１２ビットＣＣＤの場合に４０５９のグレイスケール値をもたらす）ことなく、負と正のスポットの間に最大のコントラストをもたらし、信号のポテンシャル・ロスのため完全に交差した偏光器設定を使用せず、信号強度ならびにコントラストが失われることからもっとも低い光設定を使用せず、ランプの寿命を短縮することからもっとも高い光設定を使用せず、かつテスト表面にわたって照明と欠陥を平衡させ、鏡面反射を補正するような偏光を使用する。
【０１７８】
テストした設定の組み合わせを次の表に示す。
【０１７９】
【表３】
2006526151.tif 000005
【０１８０】
全体的に最良の照明条件は、条件４、８、および９において得られる。これらの条件はすべて、正と負の良好な分離をもたらす。条件５および６もまた可能な設定である。データに対する偏光器の影響をより慎重に考察するため、データを種々の偏光器設定におけるグレイスケール差対光設定としてプロットした。条件４（偏光器設定６７．５°、光設定１）および条件８（偏光器０°、光設定４）が、もっとも良好な信号差をもたらしたが、４５°の偏光器設定において獲得された信号強度は、光設定から極めて独立している。光の強度における軽微な変動が時間とともに生じ得ること、および４５°の偏光器設定が信号の品質に影響を与えないことから、これは非常に好ましい条件である。光設定は、偏光器が使用されないとき光の設定が信号に有意の影響を与え、偏光器のフル設定（９０°）およびより低い光設定（ランプの寿命および品質を保存することになる）においては、信号の生成に照明が不充分となる。
【０１８１】
偏光器の完全な欠如、つまり０°の偏光器設定もおそらくは許容可能であるが、ここでは４５°の設定において光設定に依存しないというこれの利点を利用するため、その偏光器設定を選択した。また光の偏光がない場合においては、中程度のランプ設定でシステムが飽和するが、飽和は最良の条件ではない。中程度のランプ設定は、すべての信号コントラストにわたって最良をもたらすと見られ、好ましいランプ設定である。光および偏光器設定に対する許容度は、極めて高い。
【実施例５】
【０１８２】
ランごとの再現性の研究も行い、光学認識のセットアップおよびプレートの読みに関係する誤差を決定した。この評価には、２４のテスト表面を含む９６ウェル・プレートを使用した。各テスト表面は、実施例１に示されているとおり、６４エレメントのアレイを有する。各テスト表面上において現像されるスポットの数は、分析に使用される入力標本の遺伝子型に依存した。プレートの名称は０２１２０２である。
【０１８３】
各ランのセットアップに伴う内在的な変動性を知ることは興味深い。これを決定するため、同一の機器上において１つのプレートのランを独立させて５回行った。これには、各ランの独立性を確実にするために、それぞれの回ごとの新たなセットアップが必要となる。各個別のランの間における相関を、エクセル（Ｅｘｃｅｌ）上の相関データ分析パッケージを使用して計算した。相関ρは、共分散およびそれぞれの標準偏差を次の態様で使用して計算する。
ρX,Y＝Ｃｏｖ（Ｘ，Ｙ）／（σX×σY）
【０１８４】
このプロシージャは、整列された分離されたポットを有する非常にクリーンなプレートであるプレート０２１２０２上において実施された。このプレートは、Ａ、Ｄ、およびＨの３つの行にテスト表面を有する。このプレートのランは、テスト表面直線化機能およびスポット見つけ出し機能を統合して行われた。プレート０２１２０２上のテスト表面のすべてが同一のホモ接合／ヘテロ接合の突然変異体を有しているわけではない。この相違を解消するため、ホモ結合テスト表面内の突然変異体／欠落の野生型のスポットのためのデータ・ポイントを、その特定のスポットについての平均化において無視した。ヘテロ結合スポット内においては、突然変異体スポットを除去した。５Ｔ、７Ｔ、および９Ｔスポットについては、チップのほとんどが７Ｔスポットを示したことから、５Ｔおよび９Ｔスポットが現れたときにはそれらを削除し、また７Ｔが現れないものは無視した。スポット４および６は現れないが、スポット５は現れる。言い換えると、大半の反応は維持された。このように調和しないスポットを除去して相関データを計算した結果を次の表に示す。
【０１８５】
【表４】
2006526151.tif 000006
【０１８６】
プレート０２１２０２に関するランの間の相関は秀逸である。もっとも小さい相関は、ラン４とラン２の間の９９．９０７％である。これらのわずかな差のすべては、獲得された標準偏差の中に含まれる。
【０１８７】
ランとランの間の一貫性は非常に良好である。計算された相関は、０２１２０２プレート上におけるもっとも大きい矛盾がラン３とラン２の間であり、０．８％台になることを示している。これおよびこのほかの差は、スポット全体にわたる平均化に関係する標準偏差において充分に説明がつく。これらの結果は、プレート間のデータにおけるあらゆる不一致が、おそらくはオペレータによって行われる光学ランプの設定もしくはマニュアル位置合わせにおける不整合に起因しないことを示している。これは、ユーザズ・マニュアルのいくつかの操作ガイドラインに従っている限り正しい。アライメントは、スポットを可能な限りアライメント・グリッドの正方形に適合させるように行われなければならない。
【実施例６】
【０１８８】
この実験の最終目標は、イメージ分析のための新しいスポット見つけ出しアルゴリズムの使用の妥当性確認である。スポット見つけ出しアルゴリズムは、グリッドのデフォルト配置の外にスポットの位置を決定することによってスポット配置のより大きな多様性を考慮するべく設計された。この機能は、ランの開始時に系統的なアライメント誤りを持たせたコーナ・テスト表面（９６ウェル・プレートのコーナ）を用いてテストされた。分析されたプレートは、実施例１に示されるＣＦアレイを用いてスポッティングされた光学的薄膜テスト表面を含む。信号の解釈は、標本遺伝子型の分類用に開発されたソフトウエア・パッケージを用いて行った。この実験のために、レポートされた分類を入力標本の既知の遺伝子型と比較する。この新しいソフトウエア・アルゴリズムの組み込みの前後におけるパフォーマンスの一貫性の比較結果を検討し、オリジナルのスポット見つけ出しルーチンと比較したときの機能の喪失を確定する。スポット信号ならびに強度値の解釈は、これらの比較を行うときに考察する。
【０１８９】
この実験は、前述のイメージ分析システムおよび、ＥＷ０４２５０２で指定される９６ウェル・プレートを用いて行われた。プレートは、初期アライメント・ポジションを変化させながら８回にわたって個別に分析した。光の強度は、一度設定した後、全体を通じて同一に維持した。初期アライメント・グリッドは、イメージ内のテスト表面のエッジを維持しつつ、４つのコーナのテスト表面について系統的に調整した。
【０１９０】
ラン１−正常アライメント：ドットのアレイを正直に包含するようにグリッドを位置決めする。
ラン２−４つのコーナ・ウェルのそれぞれにおいてスポットの左側にグリッドを配置した。
ラン３−スポットの右側にグリッドを配置した。
ラン４−スポットの上側にグリッドを配置した。
ラン５−スポットの下側にグリッドを配置した。
ラン６−スポットの左上にグリッドを配置した。
ラン７−４つのコーナのそれぞれから対角方向外側にグリッドを配置した。ウェルＡ１がスポットの左上、ウェルＡ１２がスポットの右上、ウェルＨ１がスポットの左下、ウェルＨ１２がスポットの右下である。
ラン８−４つのコーナのそれぞれから対角方向内側にグリッドを配置した。ウェルＡ１：右下、ウェルＡ１２：左下、ウェルＨ１：右上、ウェルＨ１２：左上である。
【０１９１】
それぞれの誤りアライメントの後に遺伝子型についてプレートのランを行い、分析した。結果のデータを比較し、このスポット見つけ出しアルゴリズムが実際にアライメント誤りのための調整を行い、誤差を補償したか否かを決定した。この比較においては、遺伝子型の判定ならびに強度値がともに使用されている。
【０１９２】
遺伝子型の分類においては、いくつかの不一致が生じた。アライメント誤りのタイプに対応する傾向は見られなかった。次の表に、それぞれのランについて誤りのあった遺伝子型分類の数を示す。
【０１９３】
【表５】
2006526151.tif 000007
【０１９４】
これらの誤り判定には、１つを除いて、すなわちウェルＡ４を除いてすべてエラー・コード２４が与えられた。コード２４は、テスト表面を含むウェルが未定義のエッジを伴うことを示す。これは、エッジがイメージングされるエリアの外になること、プラスチック・ウェルのサイドの反射、陰影妨害、またはチップのエッジおよびコーナが明確な直線でない分割後のチップによって生じ得る。例外のウェルＡ４は、ラン３を除くすべてのランにおいて同様に解釈された。製造者からの過剰な接着剤が、キャリア内におけるテスト表面の位置決めのためのプロセスと関連して扱われる散発的な問題をもたらしている。
【０１９５】
定量的データ分析については、野生型の変動係数（『ＣＶ』）値が、それぞれのランはもとよりすべてのラン全体にわたって計算された。これらは、アライメント誤りのタイプと発生したエラーのタイプの間に相関があるように見えない。たとえば、ラン１の（正常）アライメントでは１つのエラーが生じたが、ラン４（スポット下側のグリッド）ではエラーを生じなかった。すべてのエラー（ラン３のウェルＡ４を除く）は、『不良チップ』用に予約されているタイプ２４である。これらは明確に定義されたエッジおよびコーナを伴わないテスト表面である。これらのケースでは、４コーナのウェルをこのように実質的にスキューさせた結果、エッジに影響を与える陰影妨害／反射効果が作り出された。これは、スポット見つけ出しアルゴリズムの範囲外の問題である。
【０１９６】
異なる結果についてのＣＶ値は、非常に類似した傾向に従っている。すべてのランの平均の間におけるＣＶを図１４に示すが、最大偏差は１．２％である。この結果は、ウェルがイメージの種々の位置において位置決定されるにもかかわらず、解釈における等価性を示している。
【０１９７】
図１５は、個別のランのそれぞれについての強度比（背景対信号）を示している。これにおいてもデータが類似の傾向に従っている。最大の偏差は、スポット７１１＋１におけるものであり、それにおいてはラン３についての比が、ラン５のそれよりほぼ０．２単位低い。この間隔は、より多くのデータの考察とともに狭まるものと期待される。
【０１９８】
図１６は、同じグラフをホモ接合スポットについて示している。この場合、最大の差は、ラン３とラン８の間であり、０．０４単位台である。
【０１９９】
上記の差は、再現性の研究において期待された範囲内である。このことは、期待されたドメイン内にスポットがない場合であってもスポット見つけ出しアルゴリズムがスポットの位置を決定できることを例証している。
【０２００】
種々の位置において、また理想的な状態に達しない場合の上に例示した種々の倍率についてスポットを見つけ出す柔軟性は、このアルゴリズムを組み込むことによって全体的なプロセスが改善されることを示している。
【０２０１】
ここで述べ、あるいは引用した論文、特許、ならびに特許出願、およびそのほかすべての文書ならびに電子的に利用可能な情報は、その全体が、それぞれの個別の文献が明確にかつ個別に示されて、参照によって組み込まれる場合と同じ範囲まで参照によってこれに援用される。出願人は、これらの論文、特許、ならびに特許出願、およびそのほかの文書からのあらゆる資料ならびに情報をこの出願に物理的に統合する権利を保留する。
【０２０２】
以上のとおり例示的に説明してきた本発明は、特にここで開示していないいずれかの要素もしくは複数の要素、限定もしくは複数の限定がなくても適切に実施できる。たとえば、『・・からなる』、『含む』、『包含する』等の表現は、限定を伴うことなく広義に解釈されるべきである。それに加えて、ここに採用されている用語ならびに表現は、限定ではなく説明の用語として使用されており、その種の用語ならびに表現には、ここに示し、説明した特徴もしくはその部分の等価物を排除する意図はまったくなく、逆に請求されている本発明の範囲内において種々の修正が可能であることが認識される。したがって、好ましい実施態様ならびにオプションの特徴によって明瞭に本発明を開示しているが、ここに開示され、それらの中で具体化されている本発明の修正ならびに変形に当業者が頼ることが可能であり、かつそれらの修正ならびに変形が本発明の範囲内であると見なされることは理解されるべきである。
【０２０３】
ここでは、本発明を広く一般的に説明してきた。一般的な開示内に含まれる、より狭い形式ならびにその亜属もまた本発明の部分を構成する。これには、条件付き、あるいは種属からいずれかの内容を除去する消極的限定を伴う本発明の一般的な記述も含まれ、削除される実質が特にここで引用されているか否かによらない。
【０２０４】
このほかの実施態様は、特許請求の範囲内に含まれる。それに加えて、本発明の特徴ならびに側面は、マーカッシュ・グループの表現で記述されており、当業者であれば、マーカッシュ・グループの個別の構成要素もしくは構成要素のサブグループの表現においても本発明が記述されることを認識するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２０５】
【図１】スポットのポジションおよび強度の表を生成するための方法の一実施態様を例示したフローチャートである。
【図２Ａ】本発明に従ったテスト表面キャリアの一実施態様を例示した説明図である。
【図２Ｂ】本発明に従ったテスト表面キャリアの一実施態様を例示した説明図である。
【図２Ｃ】本発明に従ったテスト表面キャリアの一実施態様を例示した説明図である。
【図２Ｄ】本発明に従ったテスト表面キャリアの一実施態様を例示した説明図である。
【図２Ｅ】本発明に従ったテスト表面キャリアの一実施態様を例示した説明図である。
【図２Ｆ】本発明に従ったテスト表面キャリアの一実施態様を例示した説明図である。
【図３】一実施態様に従ったイメージ分析機器のための光学パス・コンポーネントのアセンブリを例示した説明図である。
【図４】イメージ分析機器のためのベース・サポート・プレートの実施態様を例示した説明図である。
【図５】イメージ分析機器のためのサイド・サポート・ブラケットの実施態様を例示した説明図である。
【図６】イメージ分析機器のためのサイド・サポート・ブラケットの実施態様を例示した説明図である。
【図７】イメージ分析機器のためのバック・サポートの実施態様を例示した説明図である。
【図８】イメージ分析機器のためのカメラ・サポート・プレートの実施態様を例示した説明図である。
【図９】イメージ分析機器のための延長鏡筒ブラケットの実施態様を例示した説明図である。
【図１０】イメージ分析機器のための延長鏡筒クランプの実施態様を例示した説明図である。
【図１１】本発明に従ったアレイ内のスポット形成を例示した説明図である。
【図１２】スポットのアレイ内における勾配を例示した説明図である。
【図１３】勾配の大きさおよび方向のための投票サークル変換を例示した説明図である。
【図１４】ランのセットに関するすべてのスポットの平均について一例のＣＶ値を示した説明図である。
【図１５】ランのセットについて強度の比を例示した説明図である。
【図１６】図１５に例示した情報をホモ接合スポットについて示した説明図である。
【図１】
2006526151.tif 000008
【図２Ａ】
2006526151.tif 000009
【図２Ｂ】
2006526151.tif 000010
【図２Ｃ】
2006526151.tif 000011
【図２Ｄ】
2006526151.tif 000012
【図２Ｅ】
2006526151.tif 000013
【図２Ｆ】
2006526151.tif 000014
【図３】
2006526151.tif 000015
【図４】
2006526151.tif 000016
【図５】
2006526151.tif 000017
【図６】
2006526151.tif 000018
【図７】
2006526151.tif 000019
【図８】
2006526151.tif 000020
【図９】
2006526151.tif 000021
【図１０】
2006526151.tif 000022
【図１１】
2006526151.tif 000023
【図１２】
2006526151.tif 000024
【図１３】
2006526151.tif 000025
【図１４】
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【図１５】
2006526151.tif 000027
【図１６】
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【国際調査報告】
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2006526151.tif 000030
2006526151.tif 000031
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