(57)【要約】本発明は、化学修飾されたプロスターゼ誘導体、その断片および相同体に関する。このような抗原は、製剤化することにより、前立腺腫瘍を治療するためのワクチンを提供することができる。プロスターゼタンパク質およびその相同体を精製する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘導体化されたチオール残基を含んでなるプロスターゼタンパク質抗原、その断片、またはその相同体。
【請求項２】
プロスターゼの誘導体化されたチオール残基がアルキル化されている、請求項１に記載の抗原。
【請求項３】
プロスターゼの誘導体化されたチオール残基がカルボキシアルキル化されている、請求項２に記載の抗原。
【請求項４】
プロスターゼの誘導体化されたチオール残基がカルボキシアミド化またはカルボキシメチル化されている、請求項３に記載の抗原。
【請求項５】
プロスターゼが、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１つに記載の抗原。
【請求項６】
活性部位に突然変異が導入されている、請求項１〜５のいずれか１つに記載の抗原。
【請求項７】
抗原が融合パートナーと連結されている、請求項１〜６のいずれか１つに記載の抗原を含んでなる融合タンパク質。
【請求項８】
融合パートナーが免疫学上の融合パートナー、または発現を高める融合パートナーである、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
融合パートナーがインフルエンザウイルス由来のＮＳ１タンパク質またはその断片である、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
抗原がさらにアフィニティータグを含んでなる、請求項１〜９のいずれか１つに記載の抗原。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１つに記載のタンパク質を含有するワクチン。
【請求項１２】
アジュバント、および／または免疫刺激性サイトカインもしくはケモカインをさらに含んでなる、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
アジュバントが３Ｄ−ＭＰＬ、ＱＳ２１、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、またはポリエチレンエーテルもしくはエステルのうちの１種以上を含んでなる、請求項１１または１２に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記タンパク質が水中油型または油中水型エマルジョン媒体中に混合されている、請求項１１または１３に記載のワクチン。
【請求項１５】
１種以上の他の抗原をさらに含んでなる、請求項１０〜１４のいずれか１つに記載のワクチン。
【請求項１６】
医療において使用するための、請求項１１〜１５のいずれか１つに記載のワクチン。
【請求項１７】
前立腺ガンまたは他の前立腺関連腫瘍に罹患した患者を免疫療法によって治療することを目的とするワクチンの製造のための、請求項１〜１０のいずれか１つに記載のタンパク質の使用。
【請求項１８】
プロスターゼ抗原、その断片、融合体または相同体を精製する方法であって、強力なカオトロピック剤と界面活性剤の両方を組み合わせて用いて該タンパク質を可溶化することを含んでなる、上記方法。
【請求項１９】
プロスターゼ抗原、その断片、融合体または相同体を製造する方法であって、該タンパク質を処理してタンパク質分子内および分子間ジスルフィド結合を還元し、該チオールをブロックして酸化的再結合を防止する工程を含んでなる、上記方法。
【請求項２０】
プロスターゼ抗原、その断片、融合体または相同体を精製する方法であって、該抗原、その断片、融合体または相同体を可溶化し、少なくとも１つのタンパク質分子内および分子間ジスルフィド結合を還元剤によって還元し、生成物を濾過し、得られた遊離チオール基をブロックすることを含んでなる、上記方法。
【請求項２１】
前記タンパク質を１以上のクロマトグラフィーに供する工程をさらに含んでなる、請求項１８〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２２】
クロマトグラフィー工程が、ｐＨ７．５〜１０で前記タンパク質をＩＭＡＣクロマトグラフィーにかけることを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ブロッキング試薬が安定な共有結合誘導体を誘導するよう選択される、請求項１９〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２４】
ブロッキング試薬がαハロ酸またはαハロアミドである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ブロッキング試薬がヨード酢酸またはヨードアセトアミドである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１８〜２５のいずれか１つに記載の方法によってプロスターゼタンパク質またはその誘導体を精製する工程、および得られたタンパク質を適当なアジュバント、希釈剤または他の製薬上許容される添加剤と混合する工程を含んでなる、ワクチンの製造法。
【請求項２７】
前立腺ガンに罹る可能性の高い、または罹患している患者に、医薬として活性のある量の、請求項１１〜１６のいずれか１つに記載のワクチンを投与することを含んでなる、前記患者の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、プロスターゼとして知られるタンパク質、すなわち前立腺特異的セリンプロテアーゼの、タンパク質誘導体に関するものであり、その精製および製造方法に関するが、さらにまた、そうした誘導体を含有する医薬組成物およびそれらの医学分野での使用に関する。特に、このような誘導体は、ガンのワクチン療法、特に前立腺ガンのワクチン療法および前立腺腫瘍の診断薬に有用である。
【０００２】
より詳細には、本発明の誘導体は、化学修飾されたプロスターゼタンパク質を包含し、ここにおいてこの抗原のジスルフィド橋は還元され、その結果得られたチオールはブロックされる。さらに、このようにブロックされたチオールを含有する、遺伝子的に改変されたプロスターゼタンパク質、および免疫または発現を増強する融合パートナーと結合したプロスターゼを含んでなる融合タンパク質も本発明に包含される。
【０００３】
また、本発明は、プロスターゼ誘導体の精製方法を提供し、さらに前立腺ガン患者、および前立腺腫瘍以外のプロスターゼ発現腫瘍、前立腺肥大ならびに前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）を免疫療法によって治療するためのワクチンの製剤化方法を提供する。
【０００４】
前立腺ガンは、男性の間で最も発症率の高いガンであり、５０歳以上の男性では罹患率は３０％と推定される。臨床的に確かな証拠から、ヒト前立腺ガンが骨に転移しやすいことは明らかであり、また、この病気はアンドロゲン依存性の状態からアンドロゲン不応性の状態へと進行することは避けられず、患者死亡の増加を招くと思われる（Ａｂｂａｓ Ｆ．， Ｓｃａｒｄｉｎｏ Ｐ． “Ｔｈｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ．”、Ｃａｎｃｅｒ （１９９７）； ８０： ８２７−８３３）。この罹患率の高い疾病が、現在、米国における男性のガン死亡の第２位の主原因となっている。
【０００５】
この疾病の治療に相当な研究がなされたにもかかわらず、前立腺ガンはいまだに治療が困難である。現在、治療は外科手術および／または放射線治療が基本であるが、これらの方法は症例のうちかなりの割合で無効である（Ｆｒｙｄｅｎｂｅｒｇ Ｍ．， Ｓｔｒｉｃｋｅｒ Ｐ．， Ｋａｙｅ Ｋ． “Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ”、Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ （１９９７）； ３４９： １６８１−１６８７）。いくつかの腫瘍関連抗原がすでに知られている。これらの抗原の多くは、免疫療法のための興味深い標的となるかもしれないが、十分に腫瘍特異的ではないか、または正常タンパク質と非常に近縁関係であるかのいずれかであるために、ひとたび強力な免疫応答によって標的とされると、器官特異的自己免疫の危険を負っている。重要でない器官に対する自己免疫応答は許容できるとはいえ、心臓、腸、および他の非常に重要な臓器に対する自己免疫は結果的に安全上受容し難い状態をもたらす可能性がある。前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）および前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）および前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）のような、すでに同定された前立腺特異的タンパク質の治療上の可能性は限定されており、その上これらのタンパク質は必ずしも前立腺ガンの存在や転移のレベルに相関するわけではない（Ｐｏｕｎｄ Ｃ．， Ｐａｒｔｉｎ Ａ．， Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ Ｍ．ら、”Ｎａｔｕｒａｌ Ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｆｔｅｒ ＰＳＡ Ｅｌｅｖａｔｉｏｎ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｒａｄｉｃａｌ Ｐｒｏｓｔａｔｅｃｔｏｍｙ．”， Ｊａｍａ （１９９９）； ２８１： １５９１−１５９７）（Ｂｏｓｔｗｉｃｋ Ｄ．， Ｐａｃｅｌｌｉ Ａ．， Ｂｌｕｔｅ Ｍ．ら、”Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ａｎｄ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．” Ｃａｎｃｅｒ （１９９８）； ８２： ２２５６−２２６１）。
【０００６】
腫瘍を拒絶するメカニズムが実際に存在することは、数十年来、認識されている。腫瘍抗原は、その生物のゲノムによってコードされ、したがって理論的には免疫寛容現象によって免疫系から認識されないにもかかわらず、時に、ガン患者において検出可能な免疫応答を引き起こすことがある。このことは、腫瘍によって発現される抗原に対する抗体またはＴ細胞応答によって証明される（Ｘｕｅ ＢＨ．， Ｚｈａｎｇ Ｙ．， Ｓｏｓｍａｎ Ｊ．ら、”Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ Ｐｒｏｓｔａｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ” Ｐｔｏｓｔａｔｅ （１９９７）； ３０（２）： ７３−７８）。腫瘍細胞の細胞表面マーカーを認識する抗体の投与によって比較的弱い抗腫瘍効果が観察される場合に、腫瘍細胞によって発現される抗原に対して強いＴ細胞応答を誘導すると、結果として、モデル動物（主としてマウス）において確立された腫瘍の完全な退縮をもたらすことができる。
【０００７】
細胞による腫瘍抗原の発現は、これらの抗原に対する免疫応答の誘導には十分でないことが現在認められている。腫瘍拒絶反応の開始には、一連の活性化シグナルの伝達を引き起こす、抗原提示細胞の介入に依存した一連の免疫増幅現象が必要である。
【０００８】
プロスターゼは、保存されたセリンプロテアーゼ触媒三つ組残基Ｈ−Ｄ−Ｓ、およびアミノ末端プレプロペプチド配列（潜在的な分泌機能を示す）を有する、２５４アミノ酸長の前立腺特異的セリンプロテアーゼ（トリプシン様）である（Ｐ． Ｎｅｌｓｏｎ， Ｌｕ Ｇａｎ， Ｃ． Ｆｅｒｇｕｓｏｎ， Ｐ． Ｍｏｓｓ， Ｒ． Ｇｅｌｉｎａｓ， Ｌ． ＨｏｏｄおよびＫ． Ｗａｎｄ， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｓｅ， ａｎ ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｗｉｔｈ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９９９） ９６， ３１１４−３１１９）。推定グリコシル化部位はすでに報告されている。予想される構造は他の既知のセリンプロテアーゼときわめて類似しており、成熟ポリペプチドは単一のドメインに折りたたまれることが示される。成熟タンパク質は２２４アミノ酸長であって、１つのＡ２エピトープは自然界でプロセシングされることが示される。
【０００９】
プロスターゼのヌクレオチド配列および推定ポリペプチド配列、ならびに相同体は、Ｆｅｒｇｕｓｏｎら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９９， ９６， ３１１４−３１１９）、ならびに国際特許出願番号ＷＯ ９８／１２３０２（さらに、対応する登録特許ＵＳ ５，９５５，３０６）、ＷＯ ９８／２０１１７（さらに、対応する登録特許ＵＳ ５，８４０，８７１およびＵＳ ５，７８６，１４８）（前立腺特異的カリクレイン）およびＷＯ ００／０４１４９（Ｐ７０３Ｐ）において開示される。
【００１０】
本発明は、化学修飾されたプロスターゼタンパク質誘導体、ならびにその断片および相同体を提供するが、ここにおいて、プロスターゼは誘導体化されたチオール残基を含んでなる。こうした誘導体は、前立腺腫瘍およびプロスターゼ発現腫瘍の治療に好適な治療用ワクチン製剤での使用に適している。
【００１１】
本発明のプロスターゼ断片は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号９に示すアミノ酸配列から選択される、少なくとも約１０個の連続したアミノ酸、望ましくは約２０個、さらに望ましくは約５０個、さらに望ましくは約１００個、より望ましくは約１５０個の連続したアミノ酸からなる。より詳細には、断片は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号９に示される、より大きな分子のなんらかの機能的特性、望ましくは免疫活性、を保持するものであり、本明細書で述べる方法（たとえば、ワクチン組成物、診断など）に有用である。特にこうした断片は、適当な担体に結合させるならば、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号９のタンパク質を認識する免疫応答を引き起こすことができる。
【００１２】
プロスターゼ相同体は、一般にかなりの配列類似性を共有するものであるが、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号９の全長にわたって、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号９の配列に対して少なくとも７０％の同一性、望ましくは少なくとも８０％の同一性、より望ましくは少なくとも９０％の同一性、さらにより望ましくは少なくとも９５％の同一性、もっとも望ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を示すアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを含む。このようなポリペプチドには、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号９のアミノ酸を含むポリペプチドが含まれる。
【００１３】
本発明によれば、プロスターゼ抗原、その断片または相同体を精製するための方法が提供される。その方法は、タンパク質を処理して、そのタンパク質の分子内および分子間のジスルフィド結合を還元すること、および得られたチオールをブロック（遮断）して酸化的再結合を防ぐこと（「還元／ブロック工程」と称する）を含んでなる。還元／ブロック工程は、精製工程の終わりに、精製された抗原に対して行うことができる。しかしながら、還元／ブロック工程は精製工程の間に行うことが望ましい。したがって、タンパク質を処理して、そのタンパク質の分子内および分子間のジスルフィド結合を還元すること、得られたチオールをブロックして酸化的再結合を防ぐこと、およびそのタンパク質を１以上のクロマトグラフィー工程に供することを含んでなる方法が提示される。好都合なことに、こうした工程は、タンパク質の収率を約１０倍増加させる。なぜならば、このような工程なしでは、タンパク質が凝集および沈殿して、それ以後の精製効率が低下するためである。最終純度および工程の一貫性も改善される。
【００１４】
最初に産物を尿素、塩酸グアニジンのような強力なカオトロピック剤中で可溶化することが望ましい。Ｅｍｐｉｇｅｎ ＢＢ（Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン）といった両性界面活性剤、または、たとえばＴｗｅｅｎ ８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）のような他の界面活性剤も使用することができる。もっとも効果的には、可溶化には、界面活性剤とカオトロピック剤の両方を使用することが必要であり、場合によっては還元剤の存在下で行うことも可能である。望ましくは可溶化／還元工程は同時に行い、必然的に界面活性剤、カオトロピック剤および還元剤の使用を伴う。
【００１５】
タンパク質のアルキル化の前に、可溶化され還元されたタンパク質を、望ましくはＶｉｂｒａｔｉｎｇ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ （ＶＭＦ）のような０．４５μｍフィルターを通して、濾過することが好ましい。
【００１６】
したがって、本発明の望ましい実施形態では、本発明のタンパク質の改良された精製方法が提供されるが、ここでタンパク質は強いカオトロピック剤と界面活性剤の両者の組み合わせを利用して可溶化される。界面活性剤は、０．１％から５％までの範囲が望ましいが、０．２％から２％までがより望ましく、０．５％から１％までが理想的で、０．５％がもっとも望ましい。望ましいＰＨ範囲は７から１０までであるが、７．５から９．５までがより望ましく、７．５から９までが好ましく、８．５が理想的である。
【００１７】
別の望ましい実施形態において、精製は、望ましくは強いカオトロピック剤と界面活性剤の両者を用いたタンパク質の可溶化という第１工程、第２に生成物の濾過、さらに続いて、グルタチオンに限定されるわけではないがそういった還元剤を用いた、少なくとも１つの、望ましくは実質的にすべての、好ましくはすべての、当該タンパク質の分子内および分子間ジスルフィド結合の還元、および遊離チオール基のブロック、ならびに得られたタンパク質を１以上のクロマトグラフィー工程に供することを包含する。
【００１８】
別の望ましい実施形態において、精製は、強いカオトロピック剤、界面活性剤および還元剤を用いた可溶化／還元という第１工程、第２に生成物の濾過、第３に遊離チオール基のブロック、さらに次に得られたタンパク質を１以上のクロマトグラフィー工程に供することを包含する。これは、精製タンパク質の収率を最大１００倍まで増加させる。
【００１９】
ブロッキング試薬はアルキル化剤が望ましい。このようなブロッキング試薬は、αハロ酸またはαハロアミドを包含するがそれに限定されない。より望ましくは、アルキル化剤はカルボキシアルキル化剤である。さらにいっそう望ましくは、カルボキシアルキル化剤はヨード酢酸またはヨードアセトアミドであって、それぞれタンパク質のカルボキシメチル化またはカルボキシアミド化（カルバミドメチル化）をもたらす。他のブロッキング試薬を使用してもよく、文献に記載されている（たとえば、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ 第ＩＩ巻、Ｈ． Ｎｅｕｒａｔｈ， Ｒ． Ｌ． ＨｉｌｌおよびＣ−Ｌ Ｂｏｅｄｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９７６、またはＣｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ第Ｉ巻、Ｒ． Ｌ． ＬｕｎｄｂｌａｄおよびＣ． Ｍ． Ｎｏｙｅｓ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８５を参照されたい）。このような他のブロッキング試薬の代表的な例としては、Ｎ−エチルマレイミド、クロロアセチルリン酸、Ｏ−メチルイソ尿素およびアクリロニトリルがある。ブロッキング試薬の使用は、プロスターゼ抗原および融合誘導体の酸化、ならびにその後の凝集を防止し、それ以降の精製のために修飾されたタンパク質の安定性を確保するので好都合である。全体としての利点は、精製収率の増加、精製産物の純度の増加、ならびに製造工程の一貫性である。
【００２０】
１以上のこうした精製工程は、イオン−金属キレートアフィニティークロマトグラフィーを必要とし、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーが望ましいが、これに限定されない。上記ポリペプチドはさらに精製工程を続行することによって高レベル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる可視化で８０％以上、望ましくは９０％以上の純度）へと精製することができる。追加の精製工程は、上記ＩＭＡＣカラムの前か後のどちらでも行うことができるＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ工程であって、これは高度に精製されたタンパク質をもたらす。こうして精製されたタンパク質は、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析すると、主要な単一バンドを示し、ウェスタンブロット分析は、１０％未満、望ましくは５％未満の宿主細胞タンパク質の混入を示す。
【００２１】
還元／ブロック処理により、好都合なことには、修飾されたタンパク質の注射後に、非修飾タンパク質と比べて少なくとも同程度に良好な、望ましくはより良好な抗体応答を引き出す結果が得られる。
【００２２】
本発明の実施形態において、ブロッキング試薬は安定な共有結合した不可逆的な誘導体を生じるように選択される（たとえば、αハロ酸またはαハロアミド）。しかしながら、精製後にブロッキング試薬を除去し、誘導体化されていないタンパク質を放出することができるように、別のブロッキング試薬を選択してもよい。
【００２３】
誘導体化された遊離チオール残基を有するプロスターゼタンパク質抗原、プロスターゼ融合タンパク質および相同体は新規であって、本発明の１態様を成す。より詳細には、アルキル化誘導体が本発明の好ましい実施形態である。カルボキシアミド化またはカルボキシメチル化誘導体は、より好適な本発明の実施形態である。本発明のプロスターゼタンパク質は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択されることが望ましい。本発明のプロスターゼ融合タンパク質は、配列番号３に示す配列を有することが望ましい。
【００２４】
本発明の望ましい実施形態において、本発明のタンパク質は、ポリヒスチジンテイルまたはＣ−ＬＹＴＡタグといったアフィニティータグを付加される。このような場合、ブロック工程後のタンパク質をアフィニティークロマトグラフィーにかけることが望ましい。好ましくは、アフィニティータグはヒスチジンテイルを含み、本発明のタンパク質のカルボキシ末端に融合されるが、これは５〜８個のヒスチジン残基を含むことが望ましく、少なくとも４個の残基が望ましく、６個のヒスチジン残基がもっとも望ましい。アフィニティーペプチドは隣接するヒスチジン残基を有することが望ましいが、少なくとも２個が望ましく、少なくとも４個がより望ましい。もっとも望ましいのは、該タンパク質が、直接隣り合う６個のヒスチジン残基を含むことである。このようなヒスチジンタグは組換えタンパク質の精製、特にＮｉキレートに基づくＩＭＡＣクロマトグラフィーによる精製、を助けるよう考案される。また別の望ましい実施形態において、タンパク質はカルボキシ末端にＣ−ＬＹＴＡタグを有する。望ましくは当該分子のＣ末端部分が使用される。Ｌｙｔａは、ペプチドグリカン骨格の特定の結合を特異的に分解する自己溶菌酵素である、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼ、アミダーゼＬＹＴＡ（ｌｙｔＡ遺伝子によってコードされる｛Ｇｅｎｅ， ４３ （１９８６） ｐｐ．２６５−２７２｝）を合成する肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来するものである。ＬＹＴＡタンパク質のＣ−末端ドメインが、コリンまたはＤＥＡＥのようなコリンアナログに対する親和性に関与している。こうした特性は、融合タンパク質の発現に有用な大腸菌（Ｅ， ｃｏｌｉ）Ｃ−ＬＹＴＡ発現プラスミドの開発のために利用されてきた。Ｃ−ＬＹＴＡ断片をアミノ末端に含有するハイブリッドタンパク質の精製が報告されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： １０， （１９９２） ｐｐ．７９５−７９８）。本明細書で使用されるように、望ましい実施形態は、残基１７８から始まるＣ末端に見られる、Ｌｙｔａ分子の反復部分を利用する。特に望ましい形態は、残基１８８−３０５を組み込む。このような選択的な融合体もまた新規であり、本発明の１態様を成す。ポリヒスチジンテイルを持つタンパク質ついては、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を行うことができる。金属イオンは、あらゆる適当なイオン、たとえば亜鉛、ニッケル、鉄、マグネシウムまたは銅とすることができるが、亜鉛またはニッケルが望ましい。結果的に最終産物中のエンドトキシン濃度が低くなるように、ＩＭＡＣバッファーは界面活性剤、好ましくはＴｗｅｅｎ ８０のような非イオン系界面活性剤、またはＥｍｐｉｇｅｎ ＢＢのような両性界面活性剤、を含有することが望ましい。
【００２５】
追加のクロマトグラフィー工程には、たとえばＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ工程があり、これはＩＭＡＣカラムの前後どちらで行ってもよい。ｐＨは７．５から１０までの範囲内とするが、７．５から９．５までがより望ましく、８から９の間が好ましく、８．５が理想的である。
【００２６】
こうして精製されたタンパク質は、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析すると、大きな単一バンドを与え、ウェスタンブロット分析による測定で１０％未満、望ましくは５％未満の宿主細胞の混入を示す。
【００２７】
本発明のタンパク質は、液体中に溶解した形態でも凍結乾燥形態でも提供されるが、凍結乾燥形態が望ましい形態である。一般に、１回のヒト投与量は、１〜１０００μｇ、望ましくは３０〜３００μｇのタンパク質を含むと予想される。
【００２８】
本発明のプロスターゼ抗原誘導体、またはその断片および相同体は、好ましい実施形態において、当該タンパク質の活性部位に、そのプロテアーゼ生物活性を相当低下させるかまたは望ましくは排除する突然変異をもつことができる。望ましい突然変異は、セリンプロテアーゼの触媒作用に関わるヒスチジンおよびアスパラギン酸残基の置換を包含する。望ましい実施形態において、プロスターゼは、活性部位、たとえばＰ７０３ＰＤＥ５配列（配列番号８に示す）のアミノ酸４３に相当するプロスターゼの残基７１（Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９９， ９６， ３１１４−３１１９）、にヒスチジン−アラニン突然変異を有する。したがって、化学修飾されたプロスターゼ（その配列は配列番号９に示される）は、本発明の望ましい実施形態である。本発明の突然変異の結果、タンパク質の触媒効率は、突然変異のないタンパク質と比較して著しく低下する（酵素の比活性で表される）。触媒効率の低下は、少なくとも１０３倍が望ましいが、少なくとも１０６倍がさらに望ましい。ヒスチジン−アラニン突然変異を受けたタンパク質を以後＊（星印）をつけて示す。
【００２９】
別の実施形態において、本発明のプロスターゼ抗原誘導体、またはその断片および相同体は、腫瘍関連プロスターゼまたはその断片もしくは相同体と、融合パートナーとして作用する異種タンパク質またはタンパク質の一部と、を含むプロスターゼ融合タンパク質である。当該タンパク質および融合パートナーを化学的に結合させることもできるが、異種発現系において組換え融合タンパク質として発現させることが望ましい。本発明の望ましい実施形態では、Ｔヘルパーエピトープを提供するのを助ける免疫学的融合パートナーと結合した、本発明のプロスターゼ誘導体またはその断片もしくは相同体を含む融合タンパク質が提供される。このように、融合パートナーは、外来タンパク質またはペプチドに特異的な多数のＴ細胞による活性化シグナルの分泌と関連したバイスタンダー・ヘルパー効果を通じて機能し、それによって、プロスターゼ成分に対する免疫誘導が、非融合タンパク質に比べて促進されると考えられる。異種パートナーは大多数のヒトのＴ細胞によって認識されるように選択される。別の実施形態において、本発明は、発現エンハンサーとして機能する融合パートナーと結合した、本発明のプロスターゼ誘導体またはその断片もしくは相同体を含む融合タンパク質を提供する。このような融合パートナーは、異種系におけるプロスターゼの発現を助け、そうした処理を受けていない組換えタンパク質と比べて、発現系における産生レベルを増加させることができる。
【００３０】
融合パートナーは、免疫学的融合パートナーでありかつ発現エンハンサーパートナーでもあることが好ましい。したがって、本発明は、実施形態において、融合パートナーと結合した腫瘍特異的プロスターゼ誘導体またはその断片を含む融合タンパク質を提供する。融合パートナーは、免疫学的融合パートナーとして、かつ発現エンハンサーパートナーとして、機能することが望ましい。その結果、本発明の望ましい形態において、融合パートナーはインフルエンザウイルス由来の非構造タンパク質、ＮＳ１（赤血球凝集素）またはその断片である。一般的にはＮ末端の８１アミノ酸が利用されるが、Ｔヘルパーエピトープを含んでいれば別の断片を使用することもできる（Ｃ． Ｈａｃｋｅｔｔ， Ｄ． Ｈｏｒｏｗｉｔｚ， Ｍ． ＷｙｓｏｃｋａおよびＳ． Ｄｉｌｌｏｎ， １９９２， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ７３， １３３９−１３４３）。ＮＳ１を免疫学的融合パートナーとする場合、さらに有利な点があり、それはより高い発現量が達成できることである。特に、このような融合体はそうでない組換えプロスターゼタンパク質より高い産生量で発現する。
【００３１】
望ましい実施形態において、融合体におけるプロスターゼ部分は、配列番号９（変異Ｐ７０３Ｐ）、配列番号５（Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ ＷＯ ９８／１２３０２）、配列番号６（Ｉｎｃｙｔｅ ＷＯ ９８／２０１１７）、配列番号７（ＰＮＡＳ （１９９９） ９６， ３１１４−３１１９）、および配列番号８（Ｃｏｒｉｘａ ＷＯ ００／０４１４９）を含んでなる群から選択される。さらにもっとも望ましい実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１（変異プロスターゼ）および配列番号３（非変異プロスターゼ）に示すように、変異プロスターゼに由来する５から２２６までのカルボキシ末端アミノ酸に融合した、ＮＳ１非構造タンパク質のＮ末端８１アミノ酸を含んでなる。
【００３２】
本発明のタンパク質は、適当な宿主細胞において発現されるが、酵母または細菌宿主細胞が望ましい。宿主細胞は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）であることが、より望ましい。さらにもっとも望ましい宿主細胞は大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）である。好ましい実施形態において、タンパク質はアフィニティータグ、たとえば５〜９個、望ましくは６個のヒスチジン残基、もっとも望ましくは少なくとも４個のヒスチジン残基を含むヒスチジンテイル、を伴って発現される。これらは、たとえばイオン金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）による精製を助けるという点で有利である。
【００３３】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、標準的なＤＮＡ合成法によって合成することができるが、その例としてはＤ． Ｍ． ＲｏｂｅｒｔｓらによってＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８５， ２４， ５０９０−５０９８に記載された酵素的連結反応、化学合成、ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素重合、もしくは例えば熱安定性ポリメラーゼを利用したＰＣＲ法、またはこれらの技法の組合せによる方法がある。ＤＮＡの酵素重合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、１０〜３７℃の温度で、通常は５０μｌ以下の容量で、必要に応じてヌクレオシド三リン酸ｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含有する適当なバッファー中で、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）のようなＤＮＡポリメラーゼを用いて行うことができる。ＤＮＡ断片の酵素的連結反応は、４℃から室温までの温度で、通常は５０ｍｌ以下の容量とし、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．４）、０．０１Ｍ ＭｇＣｌ２、０．０１Ｍジチオスレイトール、１ｍＭ スペルミジン、１ｍＭ ＡＴＰおよび０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンといった適当なバッファー中で、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼのようなＤＮＡリガーゼを用いて行うことができる。ＤＮＡポリマーまたは断片の化学合成は、下記に記載されるような固相法を用いて、常法のホスホトリエステル法、ホスフィット法またはホスホルアミダイト法によって行うことができる：”Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｚｙｎａｔｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ − Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（Ｈ． Ｇ． ＧａｓｓｅｎおよびＡ． Ｌａｎｇ編）、Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｗｅｉｎｈｅｉｍ （１９８２）、または他の科学刊行物、たとえばＭ． Ｊ． Ｇａｉｔ， Ｈ． Ｗ． Ｄ． Ｍａｔｔｈｅｓ， Ｍ． Ｓｉｎｇｈ， Ｂ． Ｓ． ＳｐｒｏａｔおよびＲ． Ｃ． Ｔｉｔｍａｓ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９８２， １０， ６２４３； Ｂ． Ｓ． ＳｐｒｏａｔおよびＷ． Ｂａｎｎｗａｒｔｈ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １９８３， ２４， ５７７１； Ｍ． Ｄ． ＭａｔｔｅｕｃｃｉおよびＭ． Ｈ． Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １９８０， ２１， ７１９； Ｍ． Ｄ． ＭａｔｔｅｕｃｃｉおよびＭ． Ｈ． Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， １９８１， １０３， ３１８５； Ｓ． Ｐ． Ａｄａｍｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， １９８３， １０５， ６６１； Ｎ． Ｄ． Ｓｉｎｈａ， Ｊ． Ｂｉｅｒｎａｔ， Ｊ． ＭｃＭａｎｎｕｓおよびＨ． Ｋｏｅｓｔｅｒ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９８４， １２， ４５３９； およびＨ． Ｗ． Ｄ． Ｍａｔｔｈｅｓら、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ， １９８４， ３， ８０１。
【００３４】
本発明のもう１つの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質の産生方法が提供される。本発明の方法は、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ − Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， １９８２−１９８９に記載されるような通常の組換え技法によって行われる。
【００３５】
より詳細には、本発明の方法は次の工程を含んでなることが望ましい：
ｉ）  宿主細胞において、当該タンパク質またはその免疫原性誘導体をコードするヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡポリマーを発現することができる、複製可能な、または組み込み型の発現ベクターを作製すること；
ｉｉ）  宿主細胞を前記ベクターで形質転換すること；
ｉｉｉ）  前記ＤＮＡポリマーの発現が前記タンパク質の産生を可能にする条件下で、前記形質転換宿主細胞を培養すること；および
ｉｖ）  上記の方法に従って、前記タンパク質を回収および精製すること。
【００３６】
「形質転換する」という用語は、ここでは外来ＤＮＡを宿主細胞に導入するという意味で用いられる。これは、たとえば、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ； Ｓ． Ｍ． ＫｉｎｇｓｍａｎおよびＡ． Ｊ． Ｋｉｎｇｓｍａｎ編； Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ； Ｏｘｆｏｒｄ， Ｅｎｇｌａｎｄ， １９８８に記載の通常の技法で使用される適当なプラスミドまたはウイルスベクターを用いた形質転換、トランスフェクション、または感染によって達成される。「形質転換された」または「形質転換細胞」という用語は、以後、所定の外来遺伝子を含有し発現する、結果的に得られた宿主細胞に適用することとする。好ましくは、本発明の組換え抗原は、単細胞性の宿主において、さらに望ましくは細菌系において、もっとも望ましくは大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）において発現される。
【００３７】
望ましい組換え戦略は、ＮＳ１融合タンパク質をコードする遺伝子構築物（この遺伝子構築物は、５’から３’方向に、当該タンパク質をコードするＤＮＡ配列に連結された、ＮＳ１をコードするＤＮＡ配列を含んでなる）を発現ベクターにクローニングして、ＮＳ１−カルボキシ末端Ｐ７０３Ｐ融合タンパク質をコードするＤＮＡフラグメントを作製することを含む。アフィニティーポリヒスチジンテイルは、融合タンパク質のカルボキシ末端に付加することができ、それによってアフィニティークロマトグラフィーによる簡略化された精製が可能になる。
【００３８】
複製可能な発現ベクターを作製するには、宿主細胞に適合するベクターを切断して、完全なレプリコンを有する線状ＤＮＡセグメントを取得し；その線状セグメントを、該線状セグメントと一緒になって、所望の産物をコードする１以上のＤＮＡ分子（たとえば、本発明のタンパク質またはその誘導体をコードするＤＮＡポリマー）と、連結反応条件下で結合させることもできる。
【００３９】
このように、ハイブリッドＤＮＡは、必要に応じて、前もって作製しても、ベクター構築の途中で作製してもよい。
【００４０】
ベクターの選択は、ある程度は、宿主細胞によって決定されるものであり、その宿主細胞は、原核細胞もしくは真核細胞とすることができるが、望ましくは大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、酵母またはＣＨＯ細胞である。適当なベクターとしては、プラスミド、バクテリオファージ、コスミドおよび組換えウイルスが挙げられる。発現およびクローニングベクターは、選択マーカーを含有することが望ましく、その結果当該マーカーを発現する宿主細胞のみが選択条件下で生存できる。選択遺伝子は、アンピシリン、テトラサイクリンまたはカナマイシンに対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子を含むが、これらに限定されない。また、発現ベクターは所定の宿主に適合する制御配列を含有する。たとえば、大腸菌のための、およびより一般的には原核生物のための発現制御配列には、プロモーターおよびリボソーム結合部位がある。β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）（Ｗｅｉｓｓｍａｎ １９８１， Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ３（Ｌ． Ｇｒｅｓｓｅｒ編））、ラクトース（ｌａｃ）（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ， １９７７， １９８： １０５６）およびトリプトファン（ｔｒｐ）（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． １９８０， ８， ４０５７）ならびにラムダ誘導ＰＬプロモーター系といったプロモーター配列が天然に存在する。さらに、天然には存在しない合成プロモーターも細菌プロモーターとして機能する。このような例には、たとえば、ｔｒｐおよびｌａｃプロモーター配列から誘導されたｔａｃ合成ハイブリッドプロモーターがある（Ｄｅ Ｂｏｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９８３， ８０， ２１−２６）。このような系は特に大腸菌に適している。
【００４１】
酵母に適合するベクターもマーカーを有しており、栄養要求性変異株に原栄養性を与える、または野生株に重金属耐性を与えることによって、成功裏に形質転換された細胞を選択することが、そのマーカーによって可能となる。酵母ベクターの制御配列には、たとえば、解糖系酵素のプロモーター（Ｈｅｓｓら、Ｊ． Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓ． １９６８， ７， １４９）、酸性ホスファターゼをコードするＰＨＯ５遺伝子、ＣＵＰ１遺伝子、ＡＲＧ３遺伝子、ＧＡＬ遺伝子プロモーター、および合成プロモーター配列がある。酵母での発現に有用な他の制御成分は、ターミネーターおよびリーダー配列である。リーダー配列は特に有用であるが、それは、リーダー配列が一般に疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードし、そのシグナルペプチドは細胞からのタンパク質の分泌を指令するためである。適当なシグナル配列は、分泌される酵母タンパク質の遺伝子によりコードされ、たとえば、酵母インベルターゼ遺伝子およびａ因子遺伝子、酸性ホスファターゼ、キラー毒素、ａ接合因子遺伝子、および最近では、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓのＩＮＵ１Ａ遺伝子由来の異種イヌリナーゼシグナル配列によってコードされ得る。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現に適したベクターが開発されている。
【００４２】
様々な誘導もしくは構成プロモーターに依拠した、様々なＰ． ｐａｓｔｏｒｉｓ発現ベクターを利用することができる（ＣｅｒｅｇｈｉｎｏおよびＣｒｅｇｇ， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ２０００， ２４： ４５−６６）。細胞質タンパク質および分泌タンパク質を生産するために、もっとも一般的に用いられるＰ． ｐａｓｔｏｒｉｓベクターは、非常に強力で、しかも厳密に制御されたアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターを含有する。このベクターはまた、ｈｉｓ４宿主における選択のため、Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ＨＩＳ４）遺伝子を含有する。異種タンパク質の分泌にはシグナル配列が存在することが必要であるが、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅプレプロα接合因子リーダー配列は、Ｐｉｃｈｉａ発現系に広く利用され、成功を収めている。発現ベクターは、発現株の安定性を最大にするためにＰ． ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムに組み込まれる。Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合と同様に、宿主ゲノムと共通する配列（ＡＯＸ１またはＨＩＳ４）内でのＰ． ｐａｓｔｏｒｉｓ発現ベクターの切断は、当該ゲノム遺伝子座へのベクターの組み込みを効率的にターゲッティングする相同的組換え現象を促す。一般に、発現カセットのコピーが複数組み込まれた組換え菌株は、単一コピー菌株より多く異種タンパク質を産生することができる。高コピー数の形質転換体を得るためのもっとも効果的な方法には、Ｐｉｃｈｉａを受容菌株とするスフェロプラスト法による形質転換が必要である（Ｃｒｅｇｇら、１９８５， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５： ３３７６−３３８５）。
【００４３】
複製可能な発現ベクターの調製は、たとえば先に引用したＭａｎｉａｔｉｓ らに記載の方法によって、ＤＮＡの制限、重合および連結反応に好適な酵素を用いて、常法に従って行われる。
【００４４】
組換え宿主細胞は、本発明にしたがって、形質転換条件下で、宿主細胞を本発明の複製可能な発現ベクターで形質転換することによって作製される。適当な形質転換条件は、従来から知られるとおりであり、たとえば先に引用したＭａｎｉａｔｉｓら、または”ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ”、第ＩＩ巻、Ｄ． Ｍ． Ｇｌｏｖｅｒ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ， １９８５、に記載される。
【００４５】
形質転換条件の選択は、形質転換される宿主の選択によって決まる。たとえば、本発明のポリヌクレオチドの形質転換剤として生きたウイルスベクターを用いるｉｎ ｖｉｖｏ形質転換が、上記に記載されている。大腸菌のような細菌宿主の形質転換は、宿主をＣａＣｌ２溶液で処理する（Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９７３， ６９， ２１１０）か、または塩化ルビジウム（ＲｂＣｌ）、ＭｎＣｌ２、酢酸カリウムおよびグリセロールからなる混合物を含む溶液で処理し、次に３−［Ｎ−モルフォリノ］−プロパンスルホン酸、ＲｂＣｌおよびグリセロールで処理してから、ポリヌクレオチド（このポリヌクレオチドは所望の配列を含有する発現ベクターであってもよい）を直接取り込ませることによって行うことができる。培養下の酵母細胞のような下等真核生物の直接取り込みによる形質転換は、Ｈｉｎｎｅｎら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９７８， ７５： １９２９−１９３３）の方法を用いて行うことができる。培養下の哺乳動物細胞は、細胞上へのベクターＤＮＡのリン酸カルシウム共沈を利用して形質転換することができる（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９７８， ５２， ５４６）。哺乳動物細胞にポリヌクレオチドを導入するための他の方法には、デキストラン介在トランスフェクション、ポリブレン介在トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソーム内への封入、および核内に直接ポリヌクレオチドを注入するマイクロインジェクションがある。
【００４６】
ＤＮＡポリマーの発現を可能にする条件下で、形質転換された宿主細胞を培養することは常法によって行われるが、たとえば、上記のＭａｎｉａｔｉｓら、および”ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ”に記載の通りである。したがって、細胞に栄養分を供給し、５０℃より低い温度で、望ましくは２５℃から３５℃の間で、もっとも望ましくは３０℃で培養する。インキュベーション時間は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはウェスタンブロットによって評価すると、細菌細胞内のポリペプチドの割合に応じて、数分から数時間まで変動すると考えられる。
【００４７】
宿主細胞がたとえば大腸菌のような細菌である場合、これを物理的、化学的、または酵素的に溶解し、その結果得られた細胞溶解物からタンパク質産物を単離することができる。宿主細胞が哺乳動物細胞である場合、産物は通常、培養液から、または無細胞抽出液から単離することができる。宿主細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのような酵母である場合には、産物は、一般に、溶解した細胞から、または培養液から単離し、さらにその後、従来の技法を用いて精製することができる。発現系の特異性は、当該ポリペプチドに対する抗体を用いたウェスタンブロットによって評価することができる。
【００４８】
また、本発明は、製薬上許容される賦形剤中に本発明のタンパク質を含んでなる医薬組成物を提供する。好ましいワクチン組成物は、少なくともＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓ（配列番号１）を含んでなる。前記タンパク質は、ブロックされたチオール基を有し、高純度に精製されており、たとえば宿主細胞の混入は５％未満であることが好ましい。このようなワクチンは、１以上の他の腫瘍関連抗原および誘導体を含んでいてもよい。たとえば、適当な他の関連抗原にはＰＡＰ−１、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、ＳＴＥＡＰ、およびＰ５０１Ｓ（ＷＯ ９８／３７４１８）がある。
【００４９】
ワクチンの調製は、一般にＶａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ（“Ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ”（Ｐｏｗｅｌｌ Ｍ． Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ Ｍ． Ｊ．編）（１９９５） Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されている。リポソーム内への封入は、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎの米国特許第４，２３５，８７７号に記載されている。
【００５０】
本発明のタンパク質は、本発明のワクチン製剤中で、アジュバントによって強化されることが望ましい。このようなアジュバントは市販されており、たとえばフロイント不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｄｅｔｒｏｉｔ， ＭＩ）；Ｍｅｒｃｋ Ａｄｊｕｖａｎｔ ６５（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｉｎｃ．， Ｒａｈｗａｙ， ＮＪ）；ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ）；水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウムといったアルミニウム塩；カルシウム、鉄または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖類；陽イオン性または陰イオン性に誘導体化された多糖類；ポリホスファゼン；生分解性ミクロスフェア；モノホスホリルリピドＡおよびｑｕｉｌ Ａがある。サイトカイン、たとえばＧＭ−ＣＳＦまたはインターロイキン−２、−７、もしくは−１２、およびケモカインをアジュバントとして使用することもできる。
【００５１】
本発明の製剤において、アジュバント組成物は主としてＴｈ１型の免疫応答を誘導することが望ましい。高レベルのＴｈ１型サイトカイン（たとえば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は、投与された抗原に対する細胞性免疫応答の誘導を助ける傾向がある。応答が主としてＴｈ１型である望ましい実施形態において、Ｔｈ１型サイトカインのレベルは、Ｔｈ２型サイトカインのレベルよりも非常に増加することとなる。これらのサイトカインのレベルは、標準アッセイを用いて容易に評価することができる。サイトカインファミリーの総説としては、ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７：１４５−１７３， １９８９を参照されたい。
【００５２】
このように、主としてＴｈ１型応答の誘導で使用するのに適したアジュバントには、たとえば、モノホスホリルリピドＡ、好ましくは３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）とアルミニウム塩との組み合わせがある。他の既知のアジュバントで、優先的にＴｈ１型免疫応答を誘導するものとしては、ＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチドがある。このオリゴヌクレオチドはＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されていないという特徴を有する。このようなオリゴヌクレオチドは公知であって、たとえばＷＯ ９６／０２５５５に記載されている。免疫刺激性ＤＮＡ配列も、たとえばＳａｔｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：３５２， １９９６に記載されている。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、単独で、もしくは他のアジュバントと組み合わせて使用することができる、たとえば増強された系は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドおよびサポニン誘導体の組合せを含むが、特にＷＯ ００／０９１５９およびＷＯ ００／６２８００に開示されるようなＣｐＧとＱＳ２１の組合せを含む。望ましくは、製剤はさらに水中油型エマルジョンおよび／またはトコフェロールを含んでなる。
【００５３】
別の望ましいアジュバントはサポニン、好ましくはＱＳ２１（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．， Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ， ＭＡ）であって、単独または他のアジュバントと混合して使用することができる。たとえば、増強された系は、モノホスホリルリピドＡおよびサポニン誘導体の組合せ、たとえばＷＯ ９４／００１５３に記載のＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの組合せ、またはＷＯ ９６／３３７３９に記載の、ＱＳ２１がコレステロールで抑えられている副作用の少ない組成物を含む。他の望ましい製剤は、水中油型エマルジョンおよびトコフェロールを含んでなる。ＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを水中油型エマルジョン中に含む、特に強力なアジュバント製剤が、ＷＯ ９５／１７２１０に記載されている。
【００５４】
ＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを水中油型エマルジョン中に含む、特に効力のあるアジュバント製剤が、ＷＯ ９５／１７２１０に記載されているが、これは好ましい製剤である。
【００５５】
他の好ましいアジュバントには、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ７２０ （Ｓｅｐｐｉｃ， フランス）、ＳＡＦ （Ｃｈｉｒｏｎ， カリフォルニア、米国）、ＩＳＣＯＭＳ （ＣＳＬ）、ＭＦ−５９ （Ｃｈｉｒｏｎ）、Ｄｅｔｏｘ （Ｒｉｂｉ， Ｈａｍｉｌｔｏｎ， ＭＴ）、ＲＣ−５２９ （Ｃｏｒｉｘａ， Ｈａｍｉｌｔｏｎ， ＭＴ）および他のアミノアルキルグルコサミニド４−リン酸（ＡＧＰ）がある。
【００５６】
他の望ましいアジュバントとしては、一般式（Ｉ）
ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ
で表されるアジュバント分子があるが、式中、ｎは１〜５０を表し、Ａは結合もしくは−Ｃ（Ｏ）−であり、ＲはＣ１−５０アルキルまたはフェニルＣ１−５０アルキルである。
【００５７】
本発明のある実施形態は、一般式（Ｉ）において、ｎが１〜５０、望ましくは４〜２４、より望ましくは９であり；Ｒ成分がＣ１−５０アルキル、望ましくはＣ４−Ｃ２０アルキル、より望ましくはＣ１２アルキルであり；Ａが結合である、ポリオキシエチレンエーテルを含んでなるワクチン製剤からなる。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は、０．１〜２０％の範囲とすべきであるが、０．１〜１０％が望ましく、０．１〜１％の範囲がもっとも望ましい。望ましいポリオキシエチレンエーテルは下記の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−９−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。ポリオキシエチレンラウリルエーテルのようなポリオキシエチレンエーテルは、Ｍｅｒｃｋ ｉｎｄｅｘ（第１２版：エントリー７７１７）に記載されている。上記のアジュバント分子はＷＯ ９９／５２５４９に記載されている。
【００５８】
上記の一般式（Ｉ）のポリオキシエチレンエーテルは、必要ならば、別のアジュバントと混合してもよい。たとえば、好ましいアジュバントの組合せは、係属中の英国特許出願ＧＢ ９８２０９５６．２に記載のＣｐＧとの組合せである。
【００５９】
したがって、本発明のある実施形態において、化学修飾されたプロスターゼ、より好ましくはアルキル化されたプロスターゼ、さらに好ましくはカルボキシアルキル化されたプロスターゼ、もっとも好ましくはカルボキシアミド化もしくはカルボキシメチル化されたプロスターゼを含んでなるワクチンが提供される。もっとも望ましいワクチンは、カルボキシアミド化もしくはカルボキシメチル化されたＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓを含んでなり、これは、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチド、モノホスホリルリピドＡまたはその誘導体、ＱＳ２１およびトコフェロールのうち１以上を水中油型エマルジョン中に含むアジュバントによって強化されている。
【００６０】
望ましくは、ワクチンは、サポニン、より望ましくはＱＳ２１を含んでなる。別の特に好適なアジュバント製剤は、ＷＯ ００／０９１５９およびＷＯ ００／６２８００に記載のＣｐＧおよびサポニンを含有し、好ましい製剤である。そうした特定の製剤においてもっとも好ましいサポニンはＱＳ２１であるが、ＷＯ ９６／３３７３９に記載のようにＱＳ２１がコレステロールで抑制されている、副作用を起こしにくい形態が望ましい。製剤は、水中油型エマルジョンおよびトコフェロールをさらに含むことが望ましい。
【００６１】
腫瘍細胞を標的とする抗原特異的免疫応答を引き起こしやすくするために、様々な送達媒体を医薬組成物およびワクチン中で使用することができる。送達媒体としては、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、単球といった抗原提示細胞（ＡＰＣ）および有効なＡＰＣとなるように遺伝子操作しうる他の細胞がある。こうした細胞は、抗原提示能力を強化するために、Ｔ細胞応答の活性化および／または維持を向上させるために、それ自体抗腫瘍効果を有するようにするために、および／または受容者と免疫学的に適合させる（すなわち合致したＨＬＡハロタイプ）ために、必ずしも必要というわけではないが、遺伝子操作することができる。ＡＰＣは一般に腫瘍および腫瘍周辺組織を含む様々な体液および器官から分離され、また自己由来細胞、同種異系細胞、同系細胞または異種細胞とすることができる。
【００６２】
本発明の特定の望ましい実施形態は、樹状細胞またはその前駆細胞を抗原提示細胞として使用する。樹状細胞は非常に強力なＡＰＣであって（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ ３９２ ： ２４５−２５１， １９９８）、予防または治療の抗腫瘍免疫を引き出すための生理的アジュバントとして有効であることが明らかとなっている（ＴｉｍｍｅｒｍａｎおよびＬｅｖｙ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｍｅｄ． ５０： ５０７−５２９， １９９９）。一般に、樹状細胞は、その典型的な形状（ｉｎ ｓｉｔｕでは星状、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは目視可能な著しい細胞質突起（樹状突起）をもつ）、効率よく抗原を取り込んでプロセシングして提示する能力、およびナイーブＴ細胞の応答を活性化する能力に基づいて同定される。もちろん、樹状細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで通常は樹状細胞には見られない特異的な細胞表面受容体もしくはリガンドを発現するように遺伝子操作することができるが、このような改変された樹状細胞は本発明により意図される。樹状細胞の代わりとして、抗原を取り込んだ樹状細胞から分泌される小胞（エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）と称する）をワクチンにおいて使用することができる（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ４： ５９４−６００， １９９８）。
【００６３】
樹状細胞および前駆細胞は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周辺組織浸潤細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血または他のなんらかの適当な組織もしくは体液から得ることができる。たとえば、樹状細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏで、末梢血から採取した単球の培養物にＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３および／またはＴＮＦαといったサイトカインを組み合わせて添加することによって分化させることができる。あるいはまた、培地にＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、リポ多糖ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガンドおよび／または樹状細胞の分化、成熟および増殖を誘導する他の化合物を組み合わせて添加することによって、末梢血、臍帯血もしくは骨髄から採取したＣＤ３４陽性細胞を樹状細胞に分化させることができる。
【００６４】
樹状細胞は「未成熟」および「成熟」細胞に都合よく大別されるが、これらは、簡単な方法で２つのはっきりした特徴を示す表現型に区別することが可能である。しかしながら、こうした命名法は、分化のあらゆる可能な中間段階を排除すると解釈されるべきではない。未成熟な樹状細胞は、抗原を取り込みプロセシングする高い能力を有するＡＰＣであると特徴づけられ、その能力はＦｃγ受容体およびマンノース受容体の高い発現と相関性がある。成熟表現型は、概してこれらのマーカーの発現は低いが、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ、接着分子（たとえば、ＣＤ５４およびＣＤ１１）、および共刺激分子（たとえば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６および４−１ＢＢ）といったＴ細胞活性化に関与する細胞表面分子の発現は高いという特徴を示す。
【００６５】
ＡＰＣは、一般に、プロスターゼ腫瘍タンパク質（またはその誘導体）をコードするポリヌクレオチドを用いてトランスフェクトして、その結果プロスターゼ腫瘍ポリペプチドまたはその免疫原性部分を細胞表面に発現させるようにすることができる。こうしたトランスフェクションはｅｘ ｖｉｖｏで行われるが、このようなトランスフェクト細胞を含んでなる組成物もしくはワクチンは、さらに、本明細書に記載するように、治療目的で使用することができる。あるいは、樹状細胞もしくは他の抗原提示細胞を標的とする遺伝子送達媒体を患者に投与して結果的にｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクションを起こすこともできる。樹状細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏトランスフェクションは例えば、通常、ＷＯ ９７／２４４４７に記載のような、当技術分野で公知のあらゆる方法、またはＭａｈｖｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７５： ４５６−４６０， １９９７に記載の遺伝子銃法を用いて実施することができる。樹状細胞の抗原の取り込みは、樹状細胞または前駆細胞を、プロスターゼ腫瘍ポリペプチド、ＤＮＡ（裸のＤＮＡもしくはプラスミドベクター内のＤＮＡ）またはＲＮＡとともにインキュベートする；または抗原を発現する組換え細菌もしくはウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、アデノウイルスまたはレンチウイルスベクター）とともにインキュベートすることによって達成される。
【００６６】
ワクチンおよび医薬組成物は、密封されたアンプルまたはバイアルのような、単回用量または複数回用量容器に入れて提供される。こうした容器は、使用するまで製剤の無菌性を保つために密閉することが望ましい。一般に、製剤は油性または水性媒体中の懸濁液、溶液もしくはエマルジョンとして保存することができる。また、ワクチンまたは医薬組成物は、使用直前に無菌の液状担体を加えることだけが必要な凍結乾燥状態で保存することもできる。
【００６７】
本発明はワクチンを製造する方法も提供するが、それは本明細書で明らかになった方法によってプロスターゼタンパク質またはその誘導体を精製する工程、およびその結果得られたタンパク質を適当なアジュバント、希釈剤もしくは他の製薬上許容される賦形剤と混合する工程を含んでなる。
【００６８】
本発明はまた、本発明のタンパク質を、３Ｄ−ＭＰＬのような製薬上許容される添加剤と混合することを含んでなるワクチン製剤の製造方法を提供する。
【００６９】
本発明の別の態様では、本発明のタンパク質を、前立腺ガンまたは他の前立腺関連腫瘍に罹った患者を免疫療法で治療するためのワクチン製造に使用する。前立腺ガンに罹る可能性の高い、または罹患している患者を治療する方法は、当該患者に医薬として活性のある量の本発明のワクチンを投与することを含んでなるが、そうした方法も本発明により意図される。
【００７０】
本発明は下記の実施例を参照することによってさらに説明される：
実施例Ｉ：
融合タンパク質ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−３−Ｈｉｓを発現する組換え大腸菌株の調製
１．タンパク質設計：
このような候補のために従うべき発現戦略としては、優れた発現レベルと容易な精製法の両方に対して最も期待がもてそうな組換えタンパク質についての最適な一次構造の設計が挙げられた。
【００７１】
組換えタンパク質がワクチン接種のために製剤化される際に、そのプロテアーゼ生物活性を維持することができる可能性は、現実にはきわめて低いが、そのタンパク質分解生物活性を実質的に減少させる、または好ましくは除去するために、活性部位の突然変異を行った。したがって、配列番号８の４３位のＨｉｓ残基を突然変異させてＡｌａ残基にした。
【００７２】
大腸菌において発現されるべき融合タンパク質ＮＳ１−ｐ７０３＊−Ｈｉｓの設計は、図１に記載される。この融合体は、インフルエンザウイルスの非構造タンパク質のＮ末端（８１アミノ酸）を含有し、次に前立腺抗原のプロセシングされていないアミノ酸配列（配列番号８に記載の、プロテアーゼ活性部位の４３位の残基のＨｉｓ→Ａｌａ突然変異を含有するｐ７０３ｐｄｅ５配列のアミノ酸５→２２６）が続き、Ｈｉｓテイルが続く。ヒスチジンテイルがプロスターゼに付加されることで、融合およびプロセシングされたタンパク質の用途の広い精製が可能となった。融合体の長さは３１３アミノ酸である。
【００７３】
得られたタンパク質の一次構造は、図２に記載の配列を有する。上記タンパク質に対応するコード配列は図３に示されるが、次にこれを大腸菌発現プラスミドのλｐＬプロモーターの制御下においた。
【００７４】
２．大腸菌発現系：
ＮＳ１を産生するために、ＮＳ１（インフルエンザウイルス由来の非構造タンパク質）の８１アミノ末端残基をコードするＤＮＡを発現ベクターｐＭＧ８１にクローニングした。このプラスミドは、挿入された外来遺伝子の転写および翻訳を駆動するためにλファージＤＮＡ由来のシグナルを利用する。ベクターは、λＰＬプロモーターＰＬ、オペレーターＯＬ、およびＮタンパク質が与えられたときに転写方向性の影響を取り除く２つの利用部位（ＮｕｔＬおよびＮｕｔＲ）を含有する（Ｇｒｏｓｓら、１９８５． Ｍｏｌ． ＆ Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５： １０１５）。ＰＬプロモーターを含有するベクターは、大腸菌溶原性宿主に導入され、プラスミドＤＮＡを安定化する。溶原性宿主菌株は、複製欠損λファージＤＮＡをゲノムに組み込んで含有する（Ｓｈａｔｚｍａｎら、１９８３； Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ中、Ｉｎｏｕｙａ（編）１−１４ページ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ＮＹ）。λファージＤＮＡは、ｃＩリプレッサータンパク質の合成を指令するが、このタンパク質はベクターのＯＬリプレッサーと結合して、ＲＮＡポリメラーゼがＰＬプロモーターに結合するのを妨げ、それによって挿入遺伝子の転写を妨げる。発現菌株ＡＲ５８のｃＩ遺伝子は、温度感受性突然変異を含んでいるため、ＰＬによって指令される転写は、温度変化によって調節することができる。すなわち、培養温度を上げるとリプレッサーが不活化し、外来タンパク質の合成が開始される。この発現系は、外来タンパク質、特に細胞にとって毒性となりうる外来タンパク質の、制御された合成を可能にする（ＳｈｉｍａｔａｋａおよびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ， １９８１， Ｎａｔｕｒｅ ２９２： １２８）。
【００７５】
３．大腸菌株ＡＲ５８：
ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓタンパク質の産生に使用する溶原性大腸菌株ＡＲ５８は、標準的なＮＩＨ大腸菌Ｋ１２株Ｎ９９の派生株である（Ｆ− ｓｕ− ｇａｌＫ２， ＬａｃＺ− ｔｈｒ−）。この菌株は、欠損溶原性λファージ（ｇａｌＥ：：ＴＮ１０， ｌ Ｋｉｌ− ｃＩ８５７ ＤＨ１）を含有する。Ｋｉｌ−表現型は、宿主の高分子合成の停止を妨げる。ｃＩ８５７突然変異は、ｃＩリプレッサーに温度感受性の損傷を与える。ＤＨ１欠失はλファージの適正なオペロンおよび宿主のｂｉｏ、ｕｖｒ３およびｃｈｌＡ遺伝子座を除去する。ＡＲ５８株は、ＳＡ５００派生株であらかじめ増殖させたＰλファージ系統（ｇａｌＥ：：ＴＮ１０，ｌ Ｋｉｌ− ｃＩ８５７ ＤＨ１）をＮ９９に形質導入することによって作製された。欠損溶原菌のＮ９９への導入は、隣接するｇａｌＥ遺伝子においてテトラサイクリン耐性をコードするＴＮ１０トランスポゾンの存在に基づいて、テトラサイクリンを用いて選択された。Ｎ９９およびＳＡ５００は、米国立衛生研究所のＭａｒｔｉｎ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ博士の研究室から得た大腸菌Ｋ１２株である。
【００７６】
４．組換えタンパク質ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓを発現するように設計されたベクターの構築：
下記を出発材料とした：
１）ＣＯＲＩＸＡから入手したｃＤＮＡプラスミド、ｐ７０３ｐｄｅ５（ＷＯ ００／０４１４９）、ここにおいて、Ｐ７０３Ｐの推定シグナル配列およびプロペプチドの一部が失われ（図１を参照のこと）、プロスターゼ抗原をコードする配列を含有している；
２）ＰＬプロモーターのロング版（ｌｏｎｇ ｖｅｒｓｉｏｎ）を含有するベクターｐＲＩＴ１４９０１；および
３）インフルエンザウイルス由来のＮＳ１コード領域の８１ａａを含有するプラスミドＰＭＧ８１。
【００７７】
図４に概要を示したクローニング戦略は下記の工程を含む：
ａ）ＮｃｏＩおよびＳｐｅＩ制限部位を有するｐ７０３配列のＰＣＲ増幅
ＣＯＲＩＸＡから入手したｃＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドセンスｃａｎ１３９：５’ＧＣＧ ＣＣＣ ＡＴＧ ＧＴＴ ＧＧＧ ＧＡＧ ＧＡＣ ＴＧＣ ＡＧＣ ＣＣＧ ３’およびオリゴヌクレオチドアンチセンスｃａｎ１３４：５’ＧＧＧ ＡＣＴ ＡＧＴ ＡＣＴ ＧＧＣ ＣＴＧ ＧＡＣ ＧＧＴ ＴＴＴ ＣＴＣ ３’ をＰＣＲ反応の鋳型とした；
ｂ）増幅された配列を市販のベクターＬｉｔｍｕｓ ２８ （ｂｉｏｌａｂｓ）に挿入し、中間体プラスミドｐＲＩＴ １４９４９を得る；
ｃ）センスオリゴヌクレオチドｃａｎ１４０：５’ ＣＴＧ ＴＣＡ ＧＣＣ ＧＣＡ ＧＣＧ ＴＧＴ ＴＴＣ ＣＡＧ ３’およびアンチセンスオリゴヌクレオチドｃａｎ１４１：５’ ＣＴＧ ＧＡＡ ＡＣＡ ＣＧＣ ＴＧＣ ＧＧＣ ＴＧＡ ＣＡＧ ３’ を用いて、プラスミドｐＲＩＴ １４９４９に含有されるｐ７０３配列の４３位残基のＨｉｓ→Ａｌａ指向性突然変異誘発を行い、結果としてプラスミドｐＲＩＴ １４９５０を得る；
ｄ）ＮｃｏＩ−ＳｐｅＩ断片をプラスミドｐＲＩＴ １４９５０から単離する；
ｅ）ｐＭＧ８１プラスミドから、ＢａｍＨＩ−ＮｃｏＩの制限部位の消化後、ＮＳ１断片（８１ａａ）を精製する；
ｆ）両方の断片を連結して、発現プラスミドｐＲＩＴ １４９０１ に連結した（ｐｒ ＰＬ ｌｏｎｇ）；
ｇ）ＮＳ１−ｐ７０３突然変異−Ｈｉｓ融合タンパク質を発現するプラスミドｐＲＩＴ １４９５２（図５を参照）を含有する大腸菌ＡＲ５８株形質転換体の選択、および特性付け。
【００７８】
こうして得られた組換え菌株は、３１３アミノ酸残基長の、Ｈｉｓテイルを有するＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊融合タンパク質を産生する。このアミノ酸配列は配列番号１に、そしてコード配列は配列番号２に記載する。
【００７９】
実施例ＩＩ：
組換えＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−３−Ｈｉｓ融合タンパク質の調製
１．細菌株Ｂ１２２５の増殖および誘導−ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−３−Ｈｉｓの発現：
硫酸カナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）を補足したＦＥＣ０１５ＡＡ培地４００ ｍｌを含有する２ Ｌフラスコ中で、プラスミドｐＲＩＴ１４９５２（菌株Ｂ１２２５）で形質転換されたＡＲ５８細胞を増殖させた。３０℃で、２００ｒｐｍで１６時間インキュベートした後、顕微鏡検査のため少量のサンプルをこのフラスコから採取した。
【００８０】
硫酸カナマイシン（５０ ｍｇ／Ｌ）を補足したＦＥＣ０１２ＡＦ培地８．７ Ｌを含有する２０−Ｌ発酵槽に上記の前培養物５０ｍｌを入れた。ｐＨはＮＨ４ＯＨ（２５％ ｖ／ｖ）の添加によって６．８に調整して維持し、温度は３０℃に維持した。通気速度は２０ Ｌ／分で一定に保ち、ｐＯ２は撹拌速度のフィードバック制御によって２０％飽和に調節した。頭部圧力は０．５バールに維持した。
【００８１】
この流加培養法は炭素源としてグリセロールを基本としている。供給溶液は、初速度０．０４ｍｌ／分で添加され、最初の３０時間の間に指数関数的に増加して、最低ｐＯ２レベル２０％を維持できるように増殖速度を制限した。
【００８２】
３０時間後、抗原ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓの細胞内発現を誘導するために発酵槽の温度を３９．５℃に急激に上昇させた。供給速度は全誘導期（１８時間）中、１．２８ｍｌ／分で一定に維持した。細菌の増殖および抗原の発現をモニターするために、増殖期および誘導期の間の双方で、培養液サンプルを採取した。またこれらの材料について、微生物学的同定および純度検査も行った。
【００８３】
発酵終了時に、バイオマスの光学密度は約１３０に達し、これは約５０ｇ／Ｌの乾燥細胞重量に相当する。最終容量は約１０．５ Ｌであった。抗原を含有する細胞を４℃で１時間、５０００ｇで遠心分離することによって培地から直接分離し、ペレットをビニール袋に入れて−７０℃で保存した。
【００８４】
２．タンパク質の抽出：
組換えＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓタンパク質は、大腸菌において封入体として発現されるが、これを細胞ホモジネートから様々な工程を用いて精製した（図６参照）。
【００８５】
簡単に説明すると、発酵集菌物から得た凍結濃縮した細胞を＋４℃で解凍した後、破砕バッファー（リン酸塩２０ ｍＭ − ＮａＣｌ ２ Ｍ − ＥＤＴＡ ５ ｍＭ ｐＨ ７．５）に再懸濁し、最終光学密度（ＯＤ６５０）を１２０とした。高圧ホモジナイザー（１０００バール）に２回通過させて細胞を破砕した。
【００８６】
実施例ＩＩＩ：
融合タンパク質ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓの特性決定
１．精製法：
ａ）序
上記のように、組換えタンパク質ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓは大腸菌において封入体の形で産生される。精製法の設定に関する重要な問題は、おそらくはジスルフィド結合による共有結合を介した、組換えタンパク質それ自体による、または宿主細胞混入物による組換えタンパク質の酸化であった。開発された方法は、目的の抗原に対して有効な免疫応答を起こす産物の能力を保持する一方で、高純度の産物を全体として許容できる収率で得るために、大規模な酸化現象を減少させることを目的とした。これは、ＧＭＰ材料を生産するために使用されている。
【００８７】
ｂ）精製工程の説明（図７）
破壊された細胞の懸濁液を０．４５μｍ膜を備えたＰａｌｌｓｅｐ ＶＭＦ（Ｖｉｂｒａｔｉｎｇ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）システム（Ｐａｌｌ−Ｆｉｌｔｒｏｎ）上で処理した。「ペレット画分」を、まず０．５％のＥｍｐｉｇｅｎ ＢＢ界面活性剤を含有する２０ ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．５を用いたダイアフィルトレーションによって洗浄した。洗浄された材料を、次に、４Ｍ塩酸グアニジンおよび２０ｍＭグルタチオンを含有する同一バッファー中で可溶化した。産物は０．４５μｍフィルターを通して回収し、透過液は酸化的再結合を防ぐために２００ｍＭヨードアセトアミドで処理された。
【００８８】
カルボキシアミド化された画分は、ＩＭＡＣ（Ｎｉｃｋｅｌ−Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に供した。最初にカラムを４Ｍ尿素、０．５％（ｖ：ｖ）のＴｗｅｅｎ ８０、および２０ｍＭイミダゾールを含有する２５ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ７８．５で平衡化した。サンプルをローディングした後、カラムを同じバッファーで洗浄した。次に、４００ｍＭイミダゾールを含有する前記バッファーでタンパク質を溶出した。
【００８９】
続いて陰イオン交換クロマトグラフィーを行う前に、４Ｍ尿素および０．５％（ｖ：ｖ）のＴｗｅｅｎ ８０を含有する２５ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ８．５を用いてＩＭＡＣ溶出液の伝導度を５ｍＳ／ｃｍ以下（３．５ｍＳ／ｃｍ）に低下させた。充填されたベッド支持体（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を希釈バッファーで平衡化した。サンプルをローディングし平衡化バッファーで洗浄した後、タンパク質を２５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する同一バッファーで溶出した。
【００９０】
次にＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ溶出液を、１０ Ｋｄカットオフ膜を備えたタンジェンシャルフローフィルトレーションユニット（Ｏｍｅｇａ， Ｆｉｌｔｏｎ）において、適当な保存バッファー（２５ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ８．０）に対してダイアフィルトレーションを行った。ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓを含有する限外濾過保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を、０．２２μｍ膜を通して滅菌濾過した。
【００９１】
全精製収率は非常に高かった：ホモジネート（ＤＯ１２０）１Ｌ当たり、精製物質２〜４ ｇ（平均２．５ ｇ）であった。
【００９２】
２．精製タンパク質の特性決定：
ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓ抗原の精製結果の検討は、還元および非還元の２条件における１２％のアクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された（図８）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（銀染色／クーマシー／ウェスタンブロッティング）によると、最適化した方法で精製された組換えタンパク質は、予想されるＭＷの位置に１つの主要なバンド、およびそれよりＭＷの小さい２つまたは３つのマイナーなバンドから構成されていた。これらすべてのバンドを考慮すると、純度は９５％以上と推定された。尿素および界面活性剤を用いた可溶化工程の導入は、全体としての精製収率の改善を可能にし、おおよそ１０倍増加した：発酵培養液１Ｌあたり３００ ｍｇまでの精製物質が得られたが、これはＳＤＳ−ＰＡＧＥで１つの主要なバンドを示す。さらに工程収率の１０倍の増加が、還元／カルボキシアミド化工程の導入によって達成された。宿主細胞混入物に関する最終産物の純度も改善し、そして還元物質と非還元物質の間での類似したパターンによって証明されるように、産物のさらなる酸化は回避された（図８、ゲル１，それぞれレーン５と比較したときのレーン７）。図８，ゲル１，レーン９および１０が示すように、素通り（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）画分（レーン９）にも洗浄画分（レーン１０）にもタンパク質が回収されなかったため、カルボキシアミド化タンパク質は界面活性剤、０．５％のＴｗｅｅｎ ８０およびカオトロピック剤、４Ｍ尿素の併用で処理したとき、ＩＭＡＣカラムに適正に結合したことを示す。図８，ゲル２は、還元（レーン３）および非還元（レーン５）バッファーにおけるＩＭＡＣ溶出液のパターンを示すが、これは酸化の安定化をさらに確認するものとなる。目的のタンパク質は連続した溶出画分（ゲル２，レーン６−８）において何も検出されない。他の残留混入物（エンドトキシン、ＤＮＡ）は、通常特定できる限界、それぞれ３０ＥＵおよび１００ｎｇ／１００μｇタンパク質以下であった。
【００９３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によると、精製物質は、凍結融解サイクル後、いくらか沈殿は見られたが、＋４℃および＋３７℃で安定であった（１週間）。この沈殿は、ショ糖の存在下で凍結を行えば避けることができる。
【００９４】
３．結論：
段階ごとに開発された精製法は、融合タンパク質の生産収率を１００倍増加させることを可能にした。回収される最終産物は、宿主細胞タンパク質による混入は極めて少なく、酸化パターンはより低く、凝集はより少なく、安定性はより高く、さらにバッチごとの一貫性は極めてより高いが、すべての特性が工業的応用のための大規模生産に適合する。
【００９５】
実施例ＩＶ：
ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓタンパク質を用いたワクチンの調製
１．ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓタンパク質を用いたワクチンの調製：
これらの実験に使用するワクチンは、ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−ＨｉｓをコードしＡＲ５８株に由来する大腸菌で発現された組換えＤＮＡから、アジュバント有無のいずれでも調製される。アジュバントとして、この製剤は３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）およびＱＳ２１を油／水エマルジョン中に含む混合物を含んでなる。アジュバント系ＳＢＡＳ２はすでにＷＯ ９５／１７２１０に記載されている。
【００９６】
３Ｄ−ＭＰＬは、グラム陰性細菌サルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）のリポ多糖（ＬＰＳ）から誘導された免疫促進剤である。ＭＰＬは脱アシル化され、リピドＡ部分のリン酸基を欠く。こうした化学的処理は毒性を劇的に減少させる一方、免疫促進特性を保持する（Ｒｉｂｉ， １９８６）。Ｒｉｂｉ ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙはＭＰＬを製造しＳＢ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓに供給する。Ｓｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓで行われた実験は、様々なビヒクルと組み合わせた３Ｄ−ＭＰＬが体液性免疫およびＴＨ１型の細胞性免疫の双方とも強く増強することを示した。
【００９７】
ＱＳ２１は、南米の樹木、バラ科キラヤ（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ）の樹皮から抽出された天然のサポニン分子である。樹皮の粗抽出物から個々のサポニンを分離するために開発された精製法が、特定のサポニン、ＱＳ２１の単離を可能にしたが、このＱＳ２１は親成分と比較してより強いアジュバント活性およびより低い毒性を示すトリテルペン配糖体である。ＱＳ２１はＭＨＣクラスＩ拘束性ＣＴＬをいくつかのサブユニット抗原に対して活性化すること、ならびに抗原特異的リンパ球増殖を刺激することが示された（Ｋｅｎｓｉｌ， １９９２）。Ａｑｕｉｌａ （正式にはＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）がＱＳ２１を製造し、ＳＢ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓに供給する。
【００９８】
Ｓｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓで行われた実験では、体液性免疫応答およびＴＨ１型の細胞性免疫応答の双方の誘導において、ＭＰＬおよびＱＳ２１の組合せが明白な相乗効果を示した。
【００９９】
油／水エマルジョンは、２種の油（トコフェロールおよびスクアレン）からなる有機相、および乳化剤としてＴｗｅｅｎ ８０を含有するＰＢＳの水相から構成される。このエマルジョンは、５％のスクアレン、５％のトコフェロール、０．４％のＴｗｅｅｎ ８０を含んでなり、平均粒径は１８０ ｎｍであって、ＳＢ６２として知られている（ＷＯ ９５／１７２１０を参照されたい）。
【０１００】
ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓで行われた実験は、３Ｄ−ＭＰＬ／ＱＳ２１ （ＳＢＡＳ２）へのこのＯ／Ｗエマルジョンの添加が様々なサブユニット抗原に対する３Ｄ−ＭＰＬ／ＱＳ２１ （ＳＢＡＳ２）の免疫促進特性をさらに増加させることを証明した。
【０１０１】
２．エマルジョンＳＢ６２の調製（２倍濃縮）：
Ｔｗｅｅｎ ８０をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解することで、ＰＢＳ中２％の溶液を得る。２倍濃縮エマルジョン１００ｍｌを提供するために、ＤＬαトコフェロール５ｇおよびスクアレン５ｍｌをボルテックスで撹拌して十分に混合する。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液９０ｍｌを添加して、十分に混合する。得られたエマルジョンを、次に、シリンジを通過させ、最終的にＭ１１０Ｓマイクロフルイディクスマシン（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ｍａｃｈｉｎｅ）を使用することによって微小流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｄ）する。その結果得られた油小滴のサイズは約１８０ｎｍである。
【０１０２】
３．ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓの凍結乾燥：
実施上は、すべての化合物を溶液として、０．２μｍ膜で濾過して滅菌を行う。製剤化は凍結乾燥当日に行った。
【０１０３】
配合の順序は：
2004501638.tif 000002
とした。
【０１０４】
すべての化合物の量は、最終的にＴｒｉｓ １０ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ８０ ０．２％、３．１５％のショ糖中に２５０−５０−１０μｇ ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓを有するように調整される。バイアルは、１．２５×（希釈液６２５μｌで再構成、５００μｌの注入）でいっぱいに満たした。
【０１０５】
Ｓｔｅｒｉｓ（ドイツ）から購入したＬｙｏｖａｃ ＧＴ６凍結乾燥装置を使用して、凍結乾燥サイクルを３日間下記のように実施した：
2004501638.tif 000003
【０１０６】
４．ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓ ＱＳ２１／３Ｄ−ＭＰＬ水中油型（ＡＳ０２）製剤の調製：
アジュバントは、油／水エマルジョンにおけるＭＰＬおよびＱＳ２１の組合せとして配合される。
【０１０７】
１）製剤組成（注入量：１００μｌ）；群１は、油／水エマルジョンにおいてＭＰＬおよびＱＳ２１の組合せ中に製剤化されたＰ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓ（２０μｇ）が与えられた。群２は、油／水エマルジョンにおいてＭＰＬおよびＱＳ２１の組合せ中のＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓ（２５μｇ）が与えられた。
【０１０８】
２）成分
2004501638.tif 000004
【０１０９】
３）製剤
製剤は注入当日にその場で調製された。
【０１１０】
３Ｄ−ＭＰＬおよびＱＳ２１を油／水エマルジョン中に含有する製剤（ＡＳ０２Ｂ製剤−群２および３）は次のように調製した：Ｐ７０３ｐ（２０μｇ）（群２）およびＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓ（２５μｇ）（群３）を１０倍濃度のＰＢＳ ｐＨ６．８およびＨ２Ｏ中に希釈した後、ＳＢ６２（５０μｇ）、ＭＰＬ（２０μｇ）、ＱＳ２１（２０μｇ）および保存剤として１μｇ／ｍｌチオメルサールの連続した添加を５分間隔で行った。すべてのインキュベーションは室温で撹拌しながら行った。
【０１１１】
アジュバントで強化されていない製剤（群４および５）は下記のように調製した：Ｐ７０３ｐ（２０μｇ）（群４）およびＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓ（２５μｇ）（群５）を１．５Ｍ ＮａＣｌおよびＨ２Ｏ中に希釈した後、保存剤として１μｇ／ｍｌチオメルサールを５分間隔で添加した。すべてのインキュベーションは室温で撹拌しながら行った。
【０１１２】
最終的なワクチンは、凍結乾燥されたＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓ調製物をアジュバントまたはＰＢＳ単独で再構成した後に得られる。
【０１１３】
タンパク質をＰＢＳに置き換えて、抗原を含まないアジュバント対照を調製した。
【０１１４】
実施例Ｖ：
ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓタンパク質を用いた免疫原性
１．マウスにおけるＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓの免疫原性。第１の実験：
この実験の目的は、アジュバント存在下または不在下における、大腸菌で産生された精製組換え突然変異型ＮＳ１−ｐ７０３＊−Ｈｉｓ分子を用いたワクチン接種によって、マウスで誘導される免疫応答を特性付けることであった。
【０１１５】
ａ）免疫感作プロトコル：
６〜８週齢の１０匹の免疫能力のあるＢａｌｂ／ｃマウス群に２週間間隔で２回、ＡＳ０２Ｂ（ＳＢ６ ５０μｌ／ＭＰＬ １０μｇ／ＱＳ２１ １０μｇ）中で製剤化された突然変異型ＮＳ１−Ｐ７０３−Ｈｉｓ ２５μｇ、またはそのように製剤化されていない同タンパク質を用いて、筋肉内にワクチン接種した。２回目の注射の１４日後、血液を採取し、抗Ｐ７０３抗体の存在について血清を試験した。
【０１１６】
ｂ）全ＩｇＧ抗体応答：
抗Ｐ７０３抗体応答を最後のワクチン接種から１４日後のマウスの血清で評価した。これは、コーティング抗原として、カルボキシアミド化された、またはカルボキシアミド化されないＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓを用いたＥＬＩＳＡによって行われた。宿主混入物に対する抗体が存在する可能性を調べるために大腸菌抽出物を使用した。
【０１１７】
ｃ）結果：
結果は、１）正常な対照マウスの血清と比較してカルボキシアミド化ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓタンパク質のみを注射したマウスの血清から証明されるように、より高い免疫応答（ＩｇＧ）がＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓによって誘導されること；２） ＡＳ０２Ｂアジュバンド中で製剤化されたＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓカルボキシアミド化分子を受けた動物において、高い抗体力価が見られること；および３）抗体は、カルボキシアミド化された分子（ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓ）およびカルボキシアミド化されない未処理型分子（ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓ ＮＣ）の双方を認識すること、を示す。
【０１１８】
またＮＳ１−ｐ７０３ｐ−Ｈｉｓ特異的ＩｇＧ応答のアイソタイププロファイルも測定した。図９に示すように、マウスがカルボキシアミド化ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓタンパク質のみを受けたときＩｇＧ１が検出されたが、ＡＳ０２アジュバントの存在によってアイソタイププロファイルはＴＨ１応答（よりＩｇＧ２ａ）の方向に進められた。
【０１１９】
２．マウスにおけるＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓの免疫原性。第２の実験（ＬＡＳ２００００７０３）：
この実験の目的は、大腸菌で産生されたカルボキシアミド化ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓ分子を用いたワクチン接種によってマウスにおいて生成した抗体が、カルボキシアミド化されないピキア（Ｐｉｃｈｉａ）産生Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓおよびカルボキシアミド化された同タンパク質と交差反応するか否かを決定することであった（実施例ＶＩＩＩを参照されたい）。ＮＳ１−ＯｓｐＡは無関係な抗原である。
【０１２０】
ａ）免疫感作プロトコル：
８週齢のＤＢＡ２（ｎ＝１０）マウス群は、０−１４−２８−４２日に、ＰＢＳバッファーか、または突然変異型カルボキシアミド化ＮＳ１−Ｐ７０３＊−Ｈｉｓ Ｃ ２５μｇのいずれかの筋肉注射を受けたが、後者はＡＳ０２Ｂ（ＳＢ６２ ２５μｌ／ＭＰＬ １０μｇ／ＱＳ２１ １０μｇ）もしくはＡＳ０１Ｂ中で製剤化されるか、または製剤化されていなかった。ＡＳ０１Ｂは、膜内にコレステロール（２５μｇ）（ＷＯ ９６／３３７３９）およびＭＰＬ（５μｇ）を含有するジオレオイルホスファチジルコリンの小さな単膜リポソーム（ｓｍａｌｌ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ＳＵＶ）にＱＳ２１（５μｇ）を添加することによって調製される。２回の注射後にマウスの半数を屠殺し、残りの半数は血清学的に評価するために４回のワクチン接種後に屠殺した。
【０１２１】
ｂ）全ＩｇＧ抗体応答：
抗Ｐ７０３抗体応答を最後のワクチン接種から１４日後にマウスの血清で評価した。これは、コーティング抗原として、ピキアが産生したカルボキシアミド化Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓ Ｃ、ピキアが産生したカルボキシアミド化されてないＰ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓ ＮＣおよび大腸菌が産生したカルボキシアミド化ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓ Ｃ抗原のいずれかを用いたＥＬＩＳＡによって行われた。２回の接種後に得られた結果を表１に示す。それらは、４回の接種後に確認された。
【０１２２】
【表１】表１（２回の接種後１４日）
2004501638.tif 000005
【０１２３】
ｃ）結果：
結果は、１）Ｐ７０３Ｐワクチン接種を受けたマウスで見られる抗体応答はＰＢＳバッファーをワクチン接種された対照マウスの血清で見られるものより高かった；２）アジュバントで強化されていないタンパク質で見られる応答と比較して、より強い免疫応答（全ＩｇＧ）がアジュバントＡＳ０２ＢおよびＡＳ０１Ｂで強化されたＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓによって誘導される；３）カルボキシアミド化されたピキア−産生Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓに対する応答は、カルボキシアミド化されないピキア−産生Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓに対する応答より有力であったことを示す。このことは、特定のＢ細胞エピトープがカルボキシアミド化工程によって生成されたことを示唆している。
【０１２４】
実施例ＶＩ：
非突然変異ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ−Ｈｉｓを発現する組換え大腸菌株の調製
１．ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ−Ｈｉｓ：
同様の方法で、ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ−Ｈｉｓを調製した。アミノ酸配列およびＤＮＡ配列を配列番号３および４に示す。
【０１２５】
簡単に説明すると、大腸菌においてＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ−Ｈｉｓ融合タンパク質を発現させるための戦略は、下記の工程を含んでいた：
ａ）出発材料としては、実施例Ｉに記載されたものと同じ出発材料（配列番号８に記載のｐ７０３ｐｄｅ５配列のアミノ酸５→２２６）；
ｂ）ｐ７０３非突然変異配列をクローニング制限部位に隣接させる、ＰＣＲ増幅；
ｃ）ＮＳ１遺伝子を含有するＰＭＧ８１ベクター（プロモーターｐＬロング）への挿入；
ｄ）受容菌株ＡＲ５８またはＡＲ１２０の形質転換；
ｅ）組換え菌株の選択。
【０１２６】
得られたタンパク質は、突然変異ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓタンパク質と同様の方法で精製することができる。得られたタンパク質の１次構造は図１０に記載の配列を有する。上記タンパク質に対応するコード配列は図１１に示される。
【０１２７】
実施例ＶＩＩ：
タンパク質Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓを発現する組換えピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）菌株の調製
１．タンパク質設計：
突然変異したＰ７０３Ｐタンパク質は、酵母ピキア・パストリスにおいて発現された。Ｐ７０３Ｐ ｃＤＮＡは潜在的な分泌機能を指示するアミノ末端プレプロペプチド配列を有する２５４アミノ酸ポリペプチドをコードする。酵母ピキア・パストリスにおいてプロセシングされた成熟Ｐ７０３Ｐタンパク質を分泌するために、天然のＰ７０３Ｐ分泌シグナル配列および推定プロペプチドコード配列をサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のαプレプロシグナル配列に置き換えた。突然変異したＰ７０３Ｐ（プロテアーゼ活性部位でＨｉｓ４０→Ａｌａ４０）のコード配列をサッカロミセス・セレビシアエαプレプロシグナル配列に融合させた。組換えタンパク質のＣ末端部分を、１グリシンおよび６ヒスチジンで延長した。
【０１２８】
３〜４コピーのＰ７０３Ｐ発現カセットおよびＨＩＳ４選択遺伝子を酵母ゲノムへ組み込むことによって、菌株Ｙ１７８６が得られた。炭素源としてメタノールを含有する培地で、Ｐ７０３Ｐタンパク質は効率よく分泌され、誘導の９６時間後に培地中に最大の収量で蓄積する。
【０１２９】
このクローニング戦略の結果として、ピキア組換え菌株、Ｙ１７８６は、遺伝子操作され、そのゲノム内にＰ７０３Ｐの突然変異した遺伝子の発現カセットを有している。分泌された組換え突然変異タンパク質のアミノ酸配列および対応するヌクレオチド配列を、それぞれ図１２および図１３に記載する。
【０１３０】
２．組み込み型ベクターｐＲＩＴ １５０４３の構築およびピキア・パストリス株ＧＳ１１５の形質転換：
出発材料は、組換えプラスミドｐＲＩＴ １４９５０とした（図４参照）。このプラスミドは、ＬＩＴＭＵＳ ２８大腸菌プラスミドのポリリンカーにおいてＮｃｏＩとＳｐｅＩ部位との間に挿入された、突然変異したＰ７０３Ｐコード配列を含有する。
【０１３１】
ｐＲＩＴ １４９５０において、Ｐ７０３Ｐコード配列は完全ではない。シグナルペプチドおよびプロペプチドを含有するＮ末端部分が回復されていない。しかしながら、成熟型のＰ７０３Ｐタンパク質に関する切断部位の予測に基づくと、ｐＲＩＴ １４９５０はバリン５から始まる完全な成熟型を含有する。
【０１３２】
組換えプラスミドｐＲＩＴ １５０４３を構築するために従うクローニング戦略、および発現カセットのピキアゲノムへの組み込みは、下記の工程を含んでいた：
ａ）プライマー７０３Ｐ５および７０３Ｐ３を用いたＰ７０３配列のＰＣＲ増幅。ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ制限部位をＰＣＲ断片の５’および３’末端にそれぞれ導入した。ＰＣＲ反応のための鋳型は、ｐＲＩＴ １４９５０プラスミドとした。
【０１３３】
オリゴヌクレオチドセンス７０３Ｐ５：
５’−ＧＡＣ ＣＧＣ ＴＣＧ ＡＧＡ ＡＡＡ ＧＡＡ ＴＧＡ ＴＧＧ ＴＴＧ ＧＧＧ ＡＧＧ ＡＣＴ ＧＣ−３’
オリゴヌクレオチドアンチセンス７０３Ｐ３：
５’−ＧＣＧ ＴＡＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＴＡＡ ＴＧＧ ＴＧＡ ＴＧＧ ＴＧＡ ＴＧＧ ＴＧＧ ＣＣＡ ＣＴＧ ＧＣＣ ＴＧＧ ＡＣＧ ＧＴ−３’
【０１３４】
ｂ）得られたＰＣＲ断片および市販のプラスミドｐＰＩＣ９（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を双方とも制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、アガロースゲルで精製し、連結し、コンピテントＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。得られた組換えプラスミドは、自動配列決定分析によって増幅されたＰ７０３Ｐ配列を確認した後、ｐＲＩＴ １５０４３と命名した（図１４参照）。
【０１３５】
ｃ）ｐＲＩＴ １５０４３を制限酵素Ｂｇｌ ＩＩで消化し、Ｐ７０３Ｐ発現カセットおよびＨＩＳ４遺伝子を有するＢｇｌ ＩＩ断片を精製し、ＧＳ１１５ピキア受容菌株の形質転換を行う。この菌株は、ＮＲＲＬ−Ｙ １１４３０（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｐｅｏｒｉａ， ＩＬ）に由来し、ｈｉｓ４栄養要求性突然変異を有する。
【０１３６】
ｄ）ＨＩＳ４＋形質転換細胞集団内で、低い頻度で存在する多コピー組換え菌株を同定するために、多数の個別の形質転換体（最低１００コロニー）を、Ｐ７０３Ｐ配列に特異的なＤＮＡプローブを用いたコロニー「ドットブロット」ハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。ドットブロットハイブリダイゼーションにおいて良好なシグナルを示した６個の候補株を選択し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティングによって産物のレベルについてスクリーニングした。こうした方法によって、菌株Ｙ１７８６が維持された。
【０１３７】
得られたタンパク質の一次構造は、図１２に記載の配列を有する。前記タンパク質に対応するコード配列は、図１３に示す。
【０１３８】
実施例ＶＩＩＩ：
ピキア菌株Ｙ１７８６によって産生される組換え突然変異型タンパク質の発現および特性決定
１．誘導条件：
Ｙ１７８６を３０℃で緩衝化グリセロール−複合培地（ＢＭＧＹ）で、Ｏ．Ｄ．２６０ｎｍが１〜２となるまで増殖させた。次に、細胞を集菌し、緩衝化メタノール−複合培地（ＢＭＭＹ−１％のメタノール）中で、元の培養容量の１／１０に再懸濁し、４日間インキュベートした（３０℃）。さらに０．５％のメタノールを２４時間ごとに添加した。
【０１３９】
２．無細胞上清におけるＰ７０３Ｐタンパク質の検出：
組換えタンパク質は分泌され、９６時間の誘導後には、最適の分泌状態で培地中に蓄積した。Ｄａｉｉｃｈｉで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、Ｐ７０３Ｐ組換えタンパク質は、＋２８ ｋＤａに単一の主要なバンドとして現れる（計算された分子量２４．８ ｋＤａ、および１つの潜在的グリコシル化部位に適合する）。他の２つのバンドは、タンパク質の二量体および三量体に対応すると考えられる。モノクローナル抗体 抗ｐｅｎｔａ−ｈｉｓ（ＱＩＡＧＥＮ）、ＣＯＲＩＸＡから入手したウサギポリクローナル抗Ｐ７０３Ｐ（１／１００）およびＳＢから得たウサギポリクローナル抗ＮＳ１／Ｐ７０３Ｐ（１／１０００）を用いてウェスタンブロット分析を行ったところ、３つの抗体すべてが２８ ｋＤａの唯一のバンドを認識することが示される。
【０１４０】
基準量の精製ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ−Ｈｉｓタンパク質を用いて、振盪フラスコ条件で４日間誘導後、分泌された天然型Ｐ７０３Ｐタンパク質の収率は培養上清１Ｌ当たり１０ ｍｇ（ＯＤ３０／ｍｌ）と推定された。
【０１４１】
３．精製法：
ａ）序
精製スキームは、次の順序の工程で構成される：
培養上清→濾過／０．２μｍ→ＩＭＡＣ→ＩＥＣ→ＵＦ→滅菌濾過
大腸菌の工程とは対照的に、カオトロピック剤も界面活性剤もこの工程の間に用いられなかった。このプロトコルには、精製工程中での分子の還元／カルボキシアミド化が含まれないが、この工程は精製法の最後に行われた。還元／カルボキシアミド化を含まない対照実験を実施した。精製タンパク質は、カルボキシアミド化されたもの、またはカルボキシアミド化されてないものもいずれも、実施例Ｖの第２の実験に記載の免疫学的実験に使用された。推定精製収率は、およそ５０ｍｇ精製物質／Ｌ培養上清である。精製物質の溶解性および安定性は良好であった。
【０１４２】
ｂ）精製工程の説明
一晩解凍した後、発酵上清［１Ｌ］を０．２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐａｋ １００， Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過した。濾液は完全に透明であった。濾過した上清をＩＭＡＣ（Ｎｉ−Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に供した。最初に、カラム（ＸＫ５０， Ｐｈａｒｍａｃｉａ； １００ｍｌ）をＰＢＳバッファーｐＨ７．５で平衡化した。サンプルをローディングした後、カラムを同一バッファーで洗浄した。次に、タンパク質を前記バッファーにおいてイミダゾール濃度を増加させる２０ ＣＶ直線濃度勾配で溶出した（０〜２００ｍＭ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析後、Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓについて陽性を示す画分をプールした。
【０１４３】
続いて陰イオン交換クロマトグラフィーを行う前に、ＩＭＡＣ溶出液の伝導度を２０ ｍＭリン酸バッファーｐＨ ７．５を用いて、約４ ｍＳ／ｃｍに低下させた。まず、充填されたベッド支持体（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ−ＸＫ５０カラム、６０ ｍｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を２０ ｍＭリン酸バッファーｐＨ ７．５で平衡化した。サンプルをローディングした後、洗浄工程を同一バッファーで行った。次にタンパク質を、ＮａＣｌ濃度が増加する２０ＣＶ直線濃度勾配（０〜５００ｍＭ）を含有する同一バッファーで溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析後、Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓについて陽性を示す画分をプールした。
【０１４４】
次に、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ溶出液を濃縮し、５０ ｃｍ２の ＰＬＣＧＣ １０ Ｋｄカットオフ膜（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ， Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を備えたタンジェンシャルフローフィルトレーションユニット（Ｌａｂｓｃａｌｅ， Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）において、２０ ｍＭリン酸バッファーｐＨ ７．５に対してダイアフィルトレーションを行った。Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓを含有する限外濾過保持液は、０．２２μｍ膜（Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ， Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して滅菌濾過した。
【０１４５】
この最初の限外濾過の透過液に産物の損失が見られたので、物質を回収するためにＯｍｅｇａ ５ Ｋｄカットオフ膜（Ｆｉｌｔｒｏｎ）を備えた撹拌式セル装置（Ａｍｉｃｏｎ）において、この透過液の濃縮を行った。濃縮された透過液を２０ ｍＭリン酸バッファーｐＨ ７．５に対して透析し（ビスキングチューブ（ｖｉｓｋｉｎｇ ｔｕｂｉｎｇ）において）、また０．２２μｍ膜（Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ， Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通過させる濾過によって滅菌した。
【０１４６】
ｂ）還元／カルボキシアミド化工程
精製された抗原を等量の２０ ｍＭ ＰＯ４バッファー−８ Ｍ ＧｕＨＣｌ−１％のＥｍｐｉｇｅｎ ＢＢ−４０ｍＭグルタチオン、ｐＨ ７．５で希釈し、暗所で１時間緩やかに撹拌しながら室温に放置した。次いでヨードアセトアミドを最終濃度１００ ｍＭまで添加し、高濃度のＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを７．５に調整することによって、タンパク質のカルボキシアミド化を行った。混合物を室温で暗所に、緩やかに撹拌しつつ３０分間放置した。０．２％のＴｗｅｅｎ ８０（最終濃度）の添加後、サンプルを２０ ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー−０．２％のＴｗｅｅｎ ８０ ｐＨ８．０に対して４℃で１８時間透析し、０．２２μｍ膜を通過させる濾過によって滅菌した。
【０１４７】
結論：
本発明者らは、化学修飾されたプロスターゼがマウスにおいて免疫原性があり、こうした免疫原性（抗体応答）はさらに上記のアジュバントの使用によって増強されうることを示した。
【０１４８】
本発明者らは、融合タンパク質ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓが、本発明に記載の最適化された方法を用いて精製される場合、高収率で一貫して生産できることを示したが、高収率および一貫性は双方とも拡大可能な工業的製法に適合する。本発明者らはさらに、本発明の方法が、還元／カルボキシアミド化工程を含まない方法と比較して、凝集が少なく、酸化も少なく、溶解性はより高く、安定性のより高い組換えタンパク質をもたらすことを示した。ジスルフィド結合を形成するチオールを誘導体化することによって、精製を改善することができる。
【０１４９】
また、本発明者らは、別法として、還元／カルボキシアミド化工程を精製法の最後に行うことができることを示した。
【０１５０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
大腸菌において発現される融合タンパク質ＮＳ１−ｐ７０３＊−Ｈｉｓの設計を示した図である。
【図２】
大腸菌において発現された融合タンパク質ＮＳ１−ｐ７０３＊−Ｈｉｓの一次構造（配列番号１）を示した図である。
【図３】
ＮＳ１１−８１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓのコード配列（配列番号２）を示した図である。
【図４】
大腸菌においてＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓを生産するためのクローニング戦略を示した図である。
【図５】
ＲＩＴ １４９５２のプラスミドマップを示した図である。
【図６】
大腸菌ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓの発酵工程を示した図である。
【図７】
大腸菌ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓの精製工程を示した図である。
【図８】
ＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓの特性決定。還元バッファー（ＳＢ＋）は（最終濃度として）７．２５％ ｖ／ｖグリセロール、１．４５％ ｗ／ｖ ＳＤＳ、０．５ Ｍ ２−メルカプトエタノール、０．００３３％ ｗ／ｖブロモフェノールブルーおよび５８ ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ ６．８を含有する。非還元バッファー（ＳＢ−）は２−メルカプトエタノールを含有しない。Ｐ２Ｆは抗原を含有するＶＭＦ透過液を表す。Ｐ２Ｆ Ｒ／Ｃは還元／カルボキシアミド化された抗原を含有するＶＭＦを示す。ＦＴはＩＭＡＣ素通り画分を表し（レーン９）、ＷはＩＭＡＣ洗浄画分を表す（レーン１０）。
【図９】
アジュバントＳＢＡＳ２で強化されたＮＳ１−Ｐ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓの免疫原性を示した図である。
【図１０】
大腸菌において発現された融合タンパク質ＮＳ１−ｐ７０３−Ｈｉｓの一次構造（配列番号３）を示した図である。。
【図１１】
ＮＳ１１−８１−Ｐ７０３Ｐ−Ｈｉｓのコード配列（配列番号４）を示した図である。
【図１２】
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）において発現されたタンパク質ｐ７０３＊−Ｈｉｓの一次構造（配列番号９）を示した図である。
【図１３】
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）において発現されたＰ７０３Ｐ＊−Ｈｉｓのコード配列（配列番号１０）を示した図である。
【図１４】
ｐＲＩＴ １５０４３のプラスミドマップを示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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