(57)【要約】ＧＲＦ２相互作用タンパク質（ＧＲＦ２−ＩＰ）のタンパク質および複合体、並びにＧＲＦ２−ＩＰと相互作用するタンパク質、同様にこれらタンパク質をコードするポリヌクレオチド関する試薬およびその使用方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＲＦ２、ＧＲＦ２相互作用タンパク質、Ｎｄｒ相互作用タンパク質、Ｓｋｂ１相互作用タンパク質、ＰＰ２Ｃ相互作用タンパク質、ｐＩＣｌｎ相互作用タンパク質、４．１ＳＶＷＬ２相互作用タンパク質、ｓｍＤ１相互作用タンパク質、およびｓｍＤ３相互作用タンパク質からなる群より選択される少なくとも２種のタンパク質の組み合わせを含む、単離されたタンパク質複合体。
【請求項２】
タンパク質はそれぞれ哺乳動物起源である、請求項１に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項３】
タンパク質の少なくとも１種は融合タンパク質である、請求項１に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項４】
表１、２、３、４、５、６、７または８に示されたタンパク質のアミノ酸配列またはその相同体を有する、単離されたタンパク質または組換えタンパク質。
【請求項５】
請求項４に記載のタンパク質の完全長または部分的なコーディング配列のいずれかを含む、単離された核酸配列。
【請求項６】
タンパク質複合体のモジュレーターを同定する方法であって、
（ｉ）ＧＲＦ２、ＧＲＦ２相互作用タンパク質、Ｎｄｒ相互作用タンパク質、Ｓｋｂ１相互作用タンパク質、ＰＰ２Ｃ相互作用タンパク質、ｐＩＣｌｎ相互作用タンパク質、４．１ＳＶＷＬ２相互作用タンパク質、ｓｍＤ１相互作用タンパク質、およびｓｍＤ３相互作用タンパク質からなる群より選択された少なくとも２種のタンパク質のタンパク質複合体を含む反応混合物を作製し、
（ｉｉ）前記反応混合物と試験薬剤とを接触させ、そして、
（ｉｉｉ）下記の群：
（ａ）上記タンパク質複合体の存在度の変化、
（ｂ）上記複合体の活性の変化、
（ｃ）上記複合体の少なくとも１種の活性の変化、
（ｄ）上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体またはその成分の細胞内局在の変化、
（ｅ）上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体に依存する遺伝子の転写レベルの変化、
（ｆ）上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体に依存する遺伝子産物の存在度の変化、
（ｇ）上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体に依存する遺伝子産物の活性の変化、および、
（ｈ）上記反応混合物が細胞全体の場合、細胞中の第２メッセンジャーレベルの変化
より選択される、１以上の活性に関する試験薬剤の効果を測定する
ことを含む上記方法。
【請求項７】
ＧＲＦ２依存性の成長を調節できる薬剤を同定する方法であって、
（ｉ）ＧＲＦ２相互作用タンパク質、Ｎｄｒ相互作用タンパク質、Ｓｋｂ１相互作用タンパク質、ＰＰ２Ｃ相互作用タンパク質、ｐＩＣｌｎ相互作用タンパク質、４．１ＳＶＷＬ２相互作用タンパク質、ｓｍＤ１相互作用タンパク質、およびｓｍＤ３相互作用タンパク質からなる群より選択されたタンパク質を含む反応混合物を作製し、
（ｉｉ）前記反応混合物と試験薬剤とを接触させ、そして
（ｉｉｉ）下記の群：
（ａ）上記タンパク質複合体の存在度の変化、
（ｂ）上記複合体の活性の変化、
（ｃ）上記複合体の少なくとも１種の活性の変化、
（ｄ）上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体またはその成分の細胞内局在の変化、
（ｅ）上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体に依存する遺伝子の転写レベルの変化、
（ｆ）上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体に依存する遺伝子産物の存在度の変化、
（ｇ）上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体に依存する遺伝子産物の活性の変化、および、
（ｈ）上記反応混合物が細胞全体の場合、細胞中の第２メッセンジャーレベルの変化
より選択される試験薬剤の１以上の活性の効果を検出する
ことを含む上記方法。
【請求項８】
製薬上許容できる賦形剤と共に、分析で同定された１つ以上の薬剤を配合する工程をさらに含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
細胞と、請求項６または７に記載の分析に従って同定された薬剤とを接触させることを含む、細胞の成長状態を改変する方法。
【請求項１０】
細胞と、請求項６または７に記載の分析に従って同定された薬剤とを接触させることを含む、細胞のＲａｓ依存性増殖を抑制する方法。
【請求項１１】
細胞と、請求項６または７に記載の分析に従って同定された薬剤とを接触させることを含む、細胞の分化を誘導する方法。
【請求項１２】
請求項６または７に記載の分析に従って同定された薬剤の治療上有効な量を、細胞のＲａｓ依存性増殖に関与する症状を有する動物に投与することを含む、該症状の重篤度を軽減する方法。
【請求項１３】
細胞と、Ｒａｓシグナル伝達経路の一部の活性を抑制することができる薬剤とを接触させることを含む、細胞のＲａｓ依存性増殖を抑制する方法。
【請求項１４】
細胞と、Ｓｋｂ１のメチルトランスフェラーゼ活性の阻害剤とを接触させることを含む、細胞のＲａｓ依存性増殖を抑制する方法。
【請求項１５】
細胞と、Ｓｋｂ１のキナーゼ活性の阻害剤とを接触させることを含む、細胞のＲａｓ依存性増殖を抑制する方法。
【請求項１６】
細胞と、Ｓｋｂ１の正常な細胞下局在を抑制する薬剤とを接触させることを含む、細胞のＲａｓ依存性増殖を抑制する方法。
【請求項１７】
細胞と、ＰＰ２Ｃのホスファターゼ活性の阻害剤とを接触させることを含む、細胞のＲａｓ依存性増殖を抑制する方法。
【請求項１８】
細胞と、ｐＩＣｌｎの活性の阻害剤とを接触させることを含む、細胞のＲａｓ依存性増殖を抑制する方法。
【請求項１９】
請求項４に記載のタンパク質を生産するように遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項２０】
細胞中の異常なＧＲＦ２依存性シグナル伝達を検出する方法であって、
（ｉ）ＧＲＦ２相互作用タンパク質、Ｎｄｒ相互作用タンパク質、Ｓｋｂ１相互作用タンパク質、ＰＰ２Ｃ相互作用タンパク質、ｐＩＣｌｎ相互作用タンパク質、４．１ＳＶＷＬ２相互作用タンパク質、ｓｍＤ１相互作用タンパク質、またはｓｍＤ３相互作用タンパク質をコードする遺伝子の発現の改変されたレベル、
（ｉｉ）ＧＲＦ２相互作用タンパク質、Ｎｄｒ相互作用タンパク質、Ｓｋｂ１相互作用タンパク質、ＰＰ２Ｃ相互作用タンパク質、ｐＩＣｌｎ相互作用タンパク質、４．１ＳＶＷＬ２相互作用タンパク質、ｓｍＤ１相互作用タンパク質、またはｓｍＤ３相互作用タンパク質の安定性、翻訳後修飾、細胞下局在および／または酵素活性の改変されたレベル、および、
（ｉｉｉ）ＧＲＦ２相互作用タンパク質、Ｎｄｒ相互作用タンパク質、Ｓｋｂ１相互作用タンパク質、ＰＰ２Ｃ相互作用タンパク質、ｐＩＣｌｎ相互作用タンパク質、４．１ＳＶＷＬ２相互作用タンパク質、ｓｍＤ１相互作用タンパク質、またはｓｍＤ３相互作用タンパク質を含む複合体の活性の改変されたレベル
の１つ以上に関して細胞をスクリーニングする工程を含む、上記方法。
【請求項２１】
細胞と、Ｎｄｒのキナーゼ活性の阻害剤とを接触させることを含む、細胞のＲａｓ依存性増殖を抑制する方法。
【請求項２２】
細胞と、Ｎｄｒの正常な細胞下局在を抑制する薬剤とを接触させることを含む、細胞のＲａｓ依存性増殖を抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【関連出願の引用】
本願は、２０００年６月３０日付で出願された仮出願６０／２１５，５０４、および、２００１年１月２４日付で出願された仮出願６０／２６３６９０に対する優先権を主張し、当該明細書は、参照によって本明細書に含まれる。
【０００２】
【発明の背景】
Ｒａｓは、いわゆる「低分子量の」Ｇタンパク質のラージファミリーに関するプロトタイプである（１、２で述べられている）。Ｒａｓは、質量約２１ｋＤａのＧＴＰアーゼである。Ｒａｓは、２種の異なるコンフォメーションで存在し、１つはＧＤＰに結合したコンフォメーションであり、他方はＧＴＰに結合したコンフォメーションである。Ｒａｓは、これら２種の異なる形態で細胞のタンパク質の異なるセットに物理的に結合することができる。それによりＲａｓは、分子スイッチとして機能し得る。ヒトのガンにおいて、ＲａｓのＧＴＰ結合状態を促進する変異が頻繁に起こる。３種のヒトＲａｓ遺伝子（Ｈ、ＫおよびＮ）と、数ダースのＲａｓ関連低分子量Ｇタンパク質とがあり、これらはサブファミリーに細分化される（例えば、Ｒａｓ、Ｒｈｏ、Ｒａｂ、ＲａｎおよびＡｒｆサブファミリー）。Ｒａｓは進化の際に高度に保存されてきた。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅのような単細胞酵母ですらＲａｓ遺伝子を有し、ヒトＲａｓは、効果的に酵母のＲａｓ遺伝子と置換することができる。しかしながら、Ｒａｓ遺伝子がヒトの酵母で機能する際の経路は無関係であることが証明されている。出芽酵母においては、Ｒａｓは細胞外グルコースへの応答でアデニリルシクラーゼを活性化するように機能し、分裂酵母においては、Ｒａｓは交配に関与する。
【０００３】
ヒト、試験された他の哺乳動物種、および、Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓやＤ． ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのような真核生物モデルにおいて、Ｒａｓは、細胞に影響を与える様々な細胞外シグナル下流の分子スイッチとして機能する。ヒトおよびマウス細胞でＲａｓを活性化するシグナルとしては、様々なホルモン、成長因子、分化因子およびサイトカイン因子、細胞−細胞外基質の相互作用、および、カルシウム流入がある。これらシグナルに対する受容体としてはチロシンキナーゼがあり、そのいくつかは、成長因子受容体、インテグリン、およびＧタンパク質共役セルペンチン受容体（ＧＰＣＲ）である。
【０００４】
Ｒａｓは、細胞外シグナルの直接的なターゲットではない。Ｒａｓの不活性型と活性型との間の自発的な変換はごくわずかであり、なぜなら、ＲａｓはＧＤＰとＧＴＰとの両方に高い親和性で結合し（Ｋｄは約１０−１１Ｍ）、その内因性のＧＴＰアーゼ活性は弱いためである。別々のタンパク質が直接Ｒａｓと相互作用し、ヌクレオチド交換を触媒し、そのＧＴＰアーゼ活性を刺激する。ＲａｓのＧＴＰ結合状態へ活性化は、一般的にグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）と呼ばれるタンパク質が仲介する。ＧＥＦの刺激によって、Ｒａｓから結合したＧＤＰが放出され、続いて、自発的にＧＴＰ分子で置換されるが、このような置換は細胞内のＧＤＰより頻繁におこる。Ｒａｓの不活性化、すなわちＧＤＰ結合型へ再変換は、結合したＧＴＰのγリン酸を加水分解することによって起こり、その際の反応は、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）による一時的なＲａｓ−ＧＴＰの結合を必要とする。Ｒａｓ−ＧＥＦおよびＧＡＰは、マルチドメインタンパク質であって、これはシグナルで活性化された受容体にそれらをカップリングするためのモジュールを含む（３、４）。受容体活性化への応答におけるＧＥＦおよびＧＡＰの活性化のメカニズムにおいては、サイトゾルから細胞質膜の内部表面へＧＥＦおよびＧＡＰを再局在化させ、そこにＲａｓを閉じ込めると考えられる。ＧＥＦおよびＧＡＰが共に活性化されることによって、一時的に起こる低分子量Ｇタンパク質活性化を確実にする。
【０００５】
哺乳動物細胞において、Ｒａｓ・ＧＴＰは、Ｒａｆ１タンパク質キナーゼ、ホスファチジルイノシトール−３−ＯＨキナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、Ｒａｌ−ＧＤＳ、および他の既知の候補エフェクタータンパク質と相互作用可能である。細胞質膜でのＲａｓ−ＧＴＰとの相互作用により何とかしてＲａｆを活性化し、一連の下流タンパク質キナーゼを順に活性化するが、このようなキナーゼとしては、ＥＲＫキナーゼ（またはＭＥＫとして知られる）、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）（またはＥＲＫ（細胞外シグナル調節キナーゼ）として知られる）、およびリボゾームタンパク質Ｓ６キナーゼ（ＲＳＫ）がある（３で述べられる）。このような活性化タンパク質キナーゼのターゲットのなかで、様々な転写因子および他のシグナル伝達タンパク質は、Ｒａｓ活性化を起こす細胞外シグナルへの細胞性応答を仲介する（５）。Ｒａｓ−ＧＴＰとこれら異なるエフェクタータンパク質との相互作用を制御するメカニズムはわかっていない。
【０００６】
細胞分裂周期の刺激、および悪性の細胞形質転換の維持は、十分に確立されたＲａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫキナーゼカスケード（Ｒａｓで活性化された）、および、ＧＴＰアーゼのＲｈｏファミリー（Ｒｈｏそのもの、ＲａｃおよびＣｄｃ４２を含む）の両方が必要である。Ｒｈｏ、ＲａｃおよびＣｄｃ４２の活性化ＧＴＰ結合型は、分裂を促進し（６）、細胞質膜に局所的に接着する複合体と、特定のアクチン構造との形成を促進するが、これは血清飢餓マウスＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞で実証されており、ストレスファイバー（Ｒｈｏ・ＧＴＰ）、ラッフル（ｒｕｆｆｌｅｓ）／膜状突起（ｌａｍｅｌｌｉｐｏｄｉａ）（Ｒａｃ・ＧＴＰ）；および糸状突起（ｆｉｌｏｐｏｄｉａ）／微小突起（ｍｉｃｒｏｓｐｉｋｅ）（Ｃｄｃ４２・ＧＴＰ）が形成される。その結果、ＧＴＰアーゼのＲｈｏファミリーは、細胞内のアクチン構造の調節において主要な役割を有し、それゆえに、細胞の極性、形状、付着および運動性を制御する。このような細胞行動のパラメーターは、正常な細胞成長、分裂および分化と密接に関連しており、これら細胞の特徴の調節ミスは腫瘍細胞の増殖と転移に関連している。Ｒａｓのように、Ｒｈｏファミリータンパク質は特定のＧＥＦおよびＧＡＰによって調節される（７、８で述べられる）。
【０００７】
ＲａｓおよびＲｈｏファミリーＧＴＰアーゼによるシグナル伝達は、そのＧＥＦおよびＧＡＰのレベルに調節されるが、ここで当該ＧＥＦおよびＧＡＰは、ある場合において、同じタンパク質または直接相互作用するタンパク質に存在する。例えば、様々なシグナルは、ｐ１２０Ｒａｓ−ＧＡＰと、ｐ１９０Ｒｈｏ−ＧＡＰとの物理的な結合を刺激する（９、１０）。タンパク質ＧＲＦ２は、別々のＲａｓおよびＲａｃＧＥＦドメインおよび活性を有するが（１１〜１３）、それに対してＣＮｒａｓＧＥＦは、ｃＡＭＰ結合に対する応答においてＲａｓを活性化し、ｃＡＭＰが活性化されていなければＲａｐ１を活性化する（１４、１５）。それゆえに、ＧＥＦおよびＧＡＰを含むタンパク質複合体を介してシグナル伝達経路間の混線が起こる可能性がある。
【０００８】
これまで、哺乳動物／ヒト細胞において、ＲａｓＧＥＦの４種のクラスが同定されており、そのクラスとは、ＳＯＳ（Ｓｏｓ１およびＳｏｓ２）（１６）、ＧＲＦ（Ｒａｓ−ＧＲＦ１およびＲａｓ−ＧＲＦ２）（１７〜１９）、Ｒａｓ−　ＧＲＰ（Ｒａｓ−ＧＲＰ１およびＲａｓ−ＧＲＰ２）（２０）およびＣＮｒａｓＧＥＦ（２１）である。様々なＲａｓ特異的ＧＥＦは、マルチドメインタンパク質である。それらは類似のＲａｓ結合ドメイン（Ｃｄｃ２５ドメイン）を共有しているが、それらの異なる細胞シグナルを認識する能力によって区別される。ＳＯＳタンパク質は、タンパク質ＧＲＢ２（成長因子受容体結合タンパク質−２）を複合化し、ＧＲＢ２のＳＨ２ドメインを利用して、多くの成長因子およびサイトカイン因子の活性化ターゲットにおけるタンパク質−ホスホチロシン（ｐＴｙｒ）と結合する（２２、２３）。Ｒａｓ−ＧＲＦ１およびＲａｓ−ＧＲＦ２はカルモジュリンと結合し、カルシウムシグナルに対する応答においてＲａｓを活性化させる（１２、２４）。Ｒａｓ−ＧＲＰはジアシルグリセロール（ＤＡＧ）と結合し（２０）、それに対してＣＮｒａｓＧＥＦはｃＡＭＰに結合し（２１）、その結果、これらの相互作用によりインビボでＲａｓの活性化が起こる。このような「第２メッセンジャー」（ｐＴｙｒ、Ｃａ、ＤＡＧ、ｃＡＭＰ）との直接的または間接的な相互作用の結果として、ＲａｓＧＥＦは細胞質膜へ移動し、機能的に活性化する。それによりＧＥＦとＲａｓとの相互作用が可能になり、脂質によってそれらが共有結合で改変され、その結果、細胞質膜の内部表面と密接に結合する。
【０００９】
このようなＧＥＦ機能の上流の観点（すなわち、Ｒａｓのシグナル誘導による活性化、ＧＥＦ仲介による活性化）はかなり理解されているにも関わらず、結果生じる細胞応答を制御する下流での現象におけるＧＥＦの役割は、酵母からヒトに至るまで殆どわかっていない。
【００１０】
図１に示すように、ＧＲＦ２および関連タンパク質ＧＲＦ１は、類似した認識可能なドメインおよび配列モチーフの集合体を含む。ＧＲＦ１は脳で最も多く発現され、また膵臓特異的なアイソフォームも存在する（２５）。またマウスＧＲＦ２も脳で多く発現されるが、他の多くの組織にも存在する（１９）。マウスＧＲＦ２の遺伝子は第１３染色体（１３Ｃ３−Ｄ１）にマッピングされ、一方、ヒト遺伝子（ＲＡＳＧＲＦ２）では第５染色体の同遺伝子型領域（５ｑ１３）に存在する（２６）。ＧＲＦ１は別の遺伝子産物であり、その遺伝子は、マウスでは第９染色体（２７）、ヒトでは第１５染色体に存在する（２８）。
【００１１】
ＲａｓおよびＲａｓＧＥＦに関与する細胞経路は、酵母およびヒト細胞において異なることが述べられている（１で述べられる）。出芽酵母においては、ＣＤＣ２５遺伝子でコードされるＧＥＦは、細胞外グルコース濃度への応答においてＲａｓを活性化し、それによりアデニリルシクラーゼが活性化される。分裂酵母においては、ＲａｓＧＥＦはｓｔｅ６遺伝子でコードされ、これは交配に必須である。酵母ＧＥＦとは異なり、ヒト（およびげっ歯類）ＧＲＦタンパク質は２つのＰＨドメインとＤＨドメインとを含み、これはＧＲＦ２の場合、低分子量ＧＴＰアーゼＲａｃと結合し活性化することがわかっている（１３）。すなわちＧＲＦ２は二官能価のＧＥＦである。２つのＭＡＰＫシグナル伝達経路、すなわちＥＲＫおよびＳＡＰＫ（ストレス活性化タンパク質キナーゼ）が、ＧＲＦ２により活性化されることがわかっている。ＧＲＦ２によるＳＡＰＫ経路の活性化は、ＧＲＦ２のＤＨドメインを必要とする。このドメインはＲａｃと相互作用するため、活性化ＲａｃはＧＲＦ２をＳＡＰＫ経路にカップリングする可能性がある。従って、ＧＲＦ２によるＳＡＰＫの活性化は間接的であり、このシグナル伝達の連結を仲介する同一なタンパク質は、Ｒａｃ以外に同定されていない。ＧＲＦ２と直接相互作用することがわかっているタンパク質としては、カルモジュリン、ＲａｓおよびＲａｃがあり（１３、１９）、ならびに、ＧＲＦ１およびＧＲＦ２が互いに相互作用することが示唆されている（２９）。
【００１２】
分裂酵母においては、ＲａｓおよびＲａｃ関連タンパク質Ｃｄｃ４２を含む経路がある（３０）（図１参照）。この経路は、タンパク質キナーゼＯｒｂ６を含み、細胞周期と調和して働く細胞極性の維持や細胞の形態形成に必要とされる。Ｏｒｂ６キナーゼは有糸分裂の阻害剤である（３０）。Ｏｒｂ６のヒト相同体としては、Ｎｄｒが知られている。Ｎｄｒは、カルシウムシグナル（ＧＲＦ２のような）により活性化されリン酸化されるが、その機能は未知である（３１）。タンパク質キナーゼＳｈｋ１（またはＰａｋとして知られる）は、分裂酵母におけるＯｒｂ６の上流の活性化剤である。Ｓｈｋ１は、哺乳動物ｐ２１（ｏｄｃ４２／Ｒａｃ）活性化タンパク質キナーゼ（ＰＡＫ）の相同体である。分裂酵母のＳｋｂ１遺伝子産物（また出芽酵母においてはＨＳＬ７として知られる）は、Ｓｈｋ１に結合する高度に保存されたタンパク質であり、Ｏｒｂ６／Ｎｄｒと同様に、有糸分裂の負の調節因子である（３２）。Ｓｋｂ１欠損酵母変異体で発現される場合、酵母タンパク質をヒトＳｋｂ１タンパク質で置換することができ、タンパク質−メチルトランスフェラーゼ触媒活性を有することが報告されている（３３）。
【００１３】
酵母タンパク質Ｏｒｂ６／ＮｄｒおよびＳｋｂ１に対するヒトまたは哺乳動物の対応物が知られているが、酵母相同体により制御される経路と類似した経路において機能することは示されておらず、ＲａｓまたはＧＲＦ２と相互作用することも知られていない。ＧＲＦ２は、有糸分裂の調節に関与しない。
【００１４】
【発明の要約】
本発明は、Ｒａｓシグナル経路の成分を含むタンパク質複合体の発見に関し、より特定には、ＧＲＦ２仲介シグナル伝達に関与するタンパク質に関する。これらのタンパク質の様々な相互作用により、細胞の恒常性という特定の観点において、生化学的な性質に関する新しい情報と、細胞内のシグナル伝達経路の細胞性かつ生理学的な結果とが解明された。
【００１５】
本発明の１つの観点は、哺乳動物のＧＲＦ２タンパク質またはＧＲＦ２を含むタンパク質複合体と相互作用する能力を有するタンパク質の同定に基づく。我々は、ＧＲＦ２を「ベイト（ｂａｉｔ）」タンパク質として利用することによって生理的条件下でＧＲＦ２と複合体を形成する様々な異なるタンパク質を同定し、本明細書ではこのようなタンパク質を総合して「ＧＲＦ２相互作用タンパク質」または「ＧＲＦ２−ＩＰ」と称する。特定のＧＲＦ２−ＩＰを表１に列挙する。
【００１６】
我々は、特定のＧＲＦ２−ＩＰをベイトタンパク質として利用することによって、これらタンパク質とさらなるタンパク質複合体との関係に及んで解釈した。特に、本発明の他の観点は、セリン／スレオニンキナーゼＮｄｒと相互作用するタンパク質、または、セリン／スレオニンキナーゼＮｄｒを含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「Ｎｄｒ相互作用タンパク質」または「Ｎｄｒ−ＩＰ」と称する。代表的なＮｄｒ−ＩＰを表３Ａ〜Ｂに示す。同様に、本発明のさらに他の観点は、メチルトランスフェラーゼＳｋｂ１（またはＧＲＦ２−ＩＰ）を含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「Ｓｋｂ１相互作用タンパク質」または「Ｓｋｂ１−ＩＰ」と称する。代表的なＳｋｂ１−ＩＰを表４Ａ〜Ｂに示す。本発明のさらに他の観点は、ＧＲＦ２−ＩＰホスファターゼＰＰ２Ｃを含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「ＰＰ２Ｃ相互作用タンパク質」または「ＰＰ２Ｃ−ＩＰ」と称する。代表的なＰＰ２Ｃ−ＩＰを表５に示す。
【００１７】
我々は、ＧＲＦ２複合体への関連をよりいっそう拡張して、ベイトタンパク質としてＳｋｂ１相互作用タンパク質、ｐＩＣｌｎを選択した。従って、本発明のさらに他の観点は、ｐＩＣｌｎを含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「ｐＩＣｌｎ相互作用タンパク質」または「ｐＩＣｌｎ−ＩＰ」と称する。代表的なｐＩＣｌｎ−ＩＰを表２に示す。
【００１８】
また我々は、ＧＲＦ２複合体への関連をよりいっそう拡張して、ベイトタンパク質として、ｐＩＣｌｎ相互作用タンパク質、タンパク質４．１ＳＶＷＬ２（タンパク質４．１の多くのアイソフォームのうちの新規の型の一つ）を選択した。従って、本発明のさらに他の観点は、４．１ＳＶＷＬ２を含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「４．１ＳＶＷＬ２相互作用タンパク質」または「４．１ＳＶＷＬ２−ＩＰ」と称する。代表的な４．１ＳＶＷＬ２−ＩＰを表６に示す。
【００１９】
また我々は、ＧＲＦ２複合体への関連をよりいっそう拡張して、ベイトタンパク質として、さらに他のｐＩＣｌｎ相互作用タンパク質、ｓｍＤ１を選択した。従って、本発明のさらに他の観点は、ｓｍＤ１を含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「ｓｍＤ１相互作用タンパク質」または「ｓｍＤ１−ＩＰ」と称する。代表的なｓｍＤ１−ＩＰを表７に示す。
【００２０】
また我々は、ＧＲＦ２複合体への関連をよりいっそう拡張して、ベイトタンパク質として、さらに他のｐＩＣｌｎ相互作用タンパク質、タンパク質ｓｍＤ３を選択した。従って、本発明のさらに他の観点は、ｓｍＤ３を含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「ｓｍＤ３相互作用タンパク質」または「ｓｍＤ３」と称する。代表的なｓｍＤ３−ＩＰを表８に示す。
【００２１】
これら様々なＧＲＦ２／ＧＲＦ２−ＩＰ複合体、Ｎｄｒ／Ｎｄｒ−ＩＰ複合体、Ｓｋｂ１／Ｓｋｂ１−ＩＰ複合体、ＰＰ２Ｃ／ＰＰ２Ｃ−ＩＰ複合体、ｐＩＣｌｎ／ｐＩＣｌｎ−ＩＰ複合体、４．１ＳＶＷＬ２／４．１ＳＶＷＬ２−ＩＰ複合体、ｓｍＤ１／ｓｍＤ１−ＩＰ複合体、およびｓｍＤ３／ｓｍＤ３−ＩＰ複合体の順列（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）は、これらが相互作用することにより、ＧＲＦ２の様々な機能活性の調節に関与し、さらに、Ｒａｓ依存性シグナル伝達および細胞成長の調節に関連する。これらの機能活性としては、これらに限定されないが、（ｉ）生理学的なプロセス（例えば、細胞周期の制御、有糸分裂の調節、ＲＮＡ代謝、細胞骨格構造の調節、細胞分化およびアポトーシス）、（ｉｉ）ウイルス感染への応答、（ｉｉｉ）細胞内シグナル伝達、（ｉｖ）転写調節、および（ｖ）病態生理学的なプロセス（例えば、腫瘍形成や腫瘍の広がりなどの過増殖性疾患（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、神経変性疾患などの変性疾患、ウイルス感染）がある。
【００２２】
本発明の他の観点は、上述したタンパク質の完全長または部分的なコーディング配列のいずれかを含む単離された核酸配列を提供する。
【００２３】
本発明はさらに、その他の観点において、本発明のＧＲＦ２／ＧＲＦ２−ＩＰ複合体、Ｎｄｒ／Ｎｄｒ−ＩＰ複合体、Ｓｋｂ１／Ｓｋｂ１−ＩＰ複合体、ＰＰ２Ｃ／ＰＰ２Ｃ−ＩＰ複合体、ｐＩＣｌｎ／ｐＩＣｌｎ−ＩＰ複合体、４．１ＳＶＷＬ２／４．１ＳＶＷＬ２−ＩＰ複合体、ｓｍＤ１／ｓｍＤ１−ＩＰ複合体、およびｓｍＤ３／ｓｍＤ３−ＩＰ複合体、同様に、それらの個々の要素を利用する様々な方法を提供する。
【００２４】
好ましい実施形態において、タンパク質複合体の調節因子を同定する方法を提供し、当該方法は、（ｉ）ＧＲＦ２、ＧＲＦ２相互作用タンパク質、Ｎｄｒ相互作用タンパク質、Ｓｋｂ１相互作用タンパク質、ＰＰ２Ｃ相互作用タンパク質、ｐＩＣｌｎ相互作用タンパク質、４．１ＳＶＷＬ２相互作用タンパク質、ｓｍＤ１相互作用タンパク質、およびｓｍＤ３相互作用タンパク質からなる群より選択された少なくとも２種のタンパク質のタンパク質複合体を含む反応混合物を作製すること、（ｉｉ）前記反応混合物と試験薬剤とを接触させること、および（ｉｉｉ）１以上の活性に関する試験薬剤の効果を測定すること、を含み、ここで当該効果は、以下の（ａ）〜（ｈ）からなる群より選択される：（ａ）上記タンパク質複合体の存在度の変化、（ｂ）上記複合体の活性の変化、（ｃ）上記複合体の少なくとも１種の活性の変化　、（ｄ）上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体またはその成分の細胞内局在の変化、（ｅ）上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体に依存する遺伝子の転写量の変化、（ｆ）上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体に依存する遺伝子産物の存在度の変化、（ｇ）上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体に依存する遺伝子産物の活性の変化、および（ｈ）上記反応混合物が細胞全体の場合、細胞中の第２メッセンジャー量の変化。最も好ましい実施形態において、分析で同定された薬剤の１以上が、製薬上許容できる賦形剤と共に配合できる。
【００２５】
好ましい実施形態において、ＧＲＦ２依存性の成長を調節できる薬剤を同定する方法を提供し、当該方法は、（ｉ）ＧＲＦ２相互作用タンパク質、Ｎｄｒ相互作用タンパク質、Ｓｋｂ１相互作用タンパク質、ＰＰ２Ｃ相互作用タンパク質、ｐＩＣｌｎ相互作用タンパク質、４．１ＳＶＷＬ２相互作用タンパク質、ｓｍＤ１相互作用タンパク質、およびｓｍＤ３相互作用タンパク質からなる群より選択されたタンパク質を含む反応混合物を作製すること、（ｉｉ）前記反応混合物と試験薬剤とを接触させること、および（ｉｉｉ）試験薬剤の効果を１以上の活性に関して検出すること、を含み、ここで当該活性は、以下の（ａ）〜（ｈ）からなる群より選択される：（ａ）上記タンパク質複合体の存在度の変化、（ｂ）上記複合体の活性の変化、（ｃ）上記複合体の少なくとも１種の活性の変化、（ｄ）上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体またはその成分の細胞内局在の変化、（ｅ）上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体に依存する遺伝子の転写量の変化、（ｆ）上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体に依存する遺伝子産物の存在度の変化、（ｇ）上記反応混合物が細胞全体の場合、上記複合体に依存する遺伝子産物の活性の変化、および（ｈ）上記反応混合物が細胞全体の場合、細胞中の第２メッセンジャー量の変化。最も好ましい実施形態において、分析で同定された薬剤の１以上が、製薬上許容できる賦形剤と共に配合できる。
【００２６】
本発明の他の観点は、細胞の成長状態を改変する方法を提供し、当該方法は、細胞と、上述した分析により同定された本発明のタンパク質複合体を調節する薬剤、または、ＧＲＦ２依存性成長経路を調節する薬剤のいずれかとを接触させることを含む。
【００２７】
本発明の他の観点は、細胞のＲａｓ依存性増殖を抑制する方法を提供し、当該方法は、細胞と、上述した分析により同定された本発明のタンパク質複合体を調節する薬剤、または、ＧＲＦ２依存性成長経路を調節する薬剤のいずれかとを接触させることを含む。
【００２８】
本発明の他の観点は、細胞の分化を誘導する方法を提供し、当該方法は、細胞と、上述した分析により同定された本発明のタンパク質複合体を調節する薬剤、または、ＧＲＦ２依存性成長経路を調節する薬剤のいずれかとを接触させることを含む。
【００２９】
本発明の他の観点は、細胞のＲａｓ依存性増殖に関する症状の厳しさを軽減する方法を提供し、当該方法は、上述した分析により同定された本発明のタンパク質複合体を調節する薬剤、または、ＧＲＦ２依存性成長経路を調節する薬剤のいずれかの治療上有効な量を、前記症状を有する動物に投与することを含む。
【００３０】
本発明の他の観点は、細胞のＲａｓ依存性増殖を抑制する方法を提供し、当該方法は、細胞と、Ｒａｓシグナル伝達経路に含まれる活性の一部を抑制することができる薬剤とを接触させることを含む。
【００３１】
本発明の他の観点は、細胞のＲａｓ依存性増殖を抑制する方法を提供し、当該方法は、細胞と、Ｓｋｂ１のメチルトランスフェラーゼ活性の阻害剤とを接触させることを含む。
本発明の他の観点は、細胞のＲａｓ依存性増殖を抑制する方法を提供し、当該方法は、細胞と、Ｓｋｂ１のキナーゼ活性の阻害剤とを接触させることを含む。
【００３２】
本発明の他の観点は、細胞のＲａｓ依存性増殖を抑制する方法を提供し、当該方法は、細胞と、Ｓｋｂ１の正常な細胞内局在の阻害剤とを接触させることを含む。
本発明の他の観点は、細胞のＲａｓ依存性増殖を抑制する方法を提供し、当該方法は、細胞と、Ｎｄｒのキナーゼ活性の阻害剤とを接触させることを含む。
本発明の他の観点は、細胞のＲａｓ依存性増殖を抑制する方法を提供し、当該方法は、細胞と、Ｎｄｒの正常な細胞内局在の阻害剤とを接触させることを含む。
【００３３】
本発明の他の観点は、細胞のＲａｓ依存性増殖を抑制する方法を提供し、当該方法は、細胞と、ＰＰ２Ｃのホスファターゼ活性の阻害剤とを接触させることを含む。
本発明の他の観点は、細胞のＲａｓ依存性増殖を抑制する方法を提供し、当該方法は、細胞と、ｐＩＣｌｎの活性の阻害剤とを接触させることを含む。
本発明の他の観点は、表１〜９に列挙されたタンパク質およびその相同体を生産するように遺伝子操作された宿主細胞を提供する。
【００３４】
本発明の他の観点は、細胞中の異常なＧＲＦ２依存性シグナル伝達を検出する方法を提供し、当該方法は、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の１以上に関して細胞をスクリーニングする工程を含む：（ｉ）ＧＲＦ２相互作用タンパク質、Ｎｄｒ相互作用タンパク質、Ｓｋｂ１相互作用タンパク質、ＰＰ２Ｃ相互作用タンパク質、ｐＩＣｌｎ相互作用タンパク質、４．１ＳＶＷＬ２相互作用タンパク質、ｓｍＤ１相互作用タンパク質、またはｓｍＤ３相互作用タンパク質をコードした遺伝子の改変された発現量、（ｉｉ）ＧＲＦ２相互作用タンパク質、Ｎｄｒ相互作用タンパク質、Ｓｋｂ１相互作用タンパク質、ＰＰ２Ｃ相互作用タンパク質、ｐＩＣｌｎ相互作用タンパク質、４．１ＳＶＷＬ２相互作用タンパク質、ｓｍＤ１相互作用タンパク質、またはｓｍＤ３相互作用タンパク質の、安定性、翻訳後修飾、細胞内局在および／または酵素活性の、改変されたレベル、および（ｉｉｉ）ＧＲＦ２相互作用タンパク質、Ｎｄｒ相互作用タンパク質、Ｓｋｂ１相互作用タンパク質、ＰＰ２Ｃ相互作用タンパク質、ｐＩＣｌｎ相互作用タンパク質、４．１ＳＶＷＬ２相互作用タンパク質、ｓｍＤ１相互作用タンパク質、またはｓｍＤ３相互作用タンパク質を含む複合体の活性の改変されたレベル、である。
以下に、本発明の上記および他の観点を、添付の図面を参照しながら説明する。
【００３５】
【発明の詳述】
１．大要
本発明はＲａｓシグナル経路の成分を含むタンパク質複合体の発見に関し、より特定には、ＧＲＦ２仲介シグナル伝達に関与するタンパク質に関する。これらタンパク質の様々な相互作用は、細胞の恒常性という特定の観点において、生化学的な性質新しい情報と、細胞内のシグナル伝達経路の細胞性かつ生理学的な結果とが解明された。
【００３６】
本発明の一つの観点は、哺乳動物のＧＲＦ２タンパク質またはＧＲＦ２を含むタンパク質複合体と相互作用する能力を有するタンパク質を同定することに基づく。「ベイト（ｂａｉｔ）」タンパク質としてＧＲＦ２を利用することによって、我々は、生理的な条件下でＧＲＦ２と複合体を形成する様々な異なるタンパク質を同定し、このようなタンパク質を、本明細書では集合的に「ＧＲＦ２相互作用タンパク質」または「ＧＲＦ２−ＩＰ」と称する。特定のＧＲＴ２−ＩＰを表１に列挙する。
【００３７】
特定のＧＲＦ２−ＩＰをベイトタンパク質として利用することによって、このようなタンパク質と、さらなるタンパク質複合体との関係を拡張した。特に、本発明の他の観点は、セリン／スレオニンキナーゼＮｄｒと相互作用するタンパク質、または、セリン／スレオニンキナーゼＮｄｒを含む複合体を形成するタンパク質を同定することに関し、このようなタンパク質を本明細書では「Ｎｄｒ相互作用タンパク質」または「Ｎｄｒ−ＩＰ」と称する。代表的なＮｄｒ−ＩＰを表３Ａ〜Ｂに示す。同様に、本発明のさらに他の観点は、メチルトランスフェラーゼＳｋｂ１（またはＧＲＦ２−ＩＰ）を含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「Ｓｋｂ１相互作用タンパク質」または「Ｓｋｂ１−ＩＰ」と称する。代表的なＳｋｂ１−ＩＰを表４Ａ〜Ｂに示す。本発明のさらに他の観点は、ＧＲＦ２−ＩＰホスファターゼＰＰ２Ｃを含む複合体を形成するタンパク質を同定することに関し、このようなタンパク質を本明細書では「ＰＰ２Ｃ相互作用タンパク質」または「ＰＰ２Ｃ−ＩＰ」と称する。代表的なＰＰ２Ｃ−ＩＰを表５に示す。
【００３８】
ＧＲＦ２複合体への関連をよりいっそう拡張して、我々は、ベイトタンパク質として、Ｓｋｂ１相互作用タンパク質、ｐＩＣｌｎを選択した。従って、本発明のさらに他の観点は、ｐＩＣｌｎを含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「ｐＩＣｌｎ相互作用タンパク質」または「ＰＩＣｌｎ−ＩＰ」と称する。代表的なｐＩＣｌｎ−ＩＰを表２に示す。
【００３９】
ＧＲＦ２複合体への関連をよりいっそう拡張して、我々はまた、ベイトタンパク質として、ｐＩＣｌｎ相互作用タンパク質、タンパク質４．１ＳＶＷＬ２（タンパク質４．１の多くのアイソフォームのうちの新規の型の一つ）を選択した。従って、本発明のさらに他の観点は、４．１ＳＶＷＬ２を含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「４．１ＳＶＷＬ２相互作用タンパク質」または「４．１ＳＶＷＬ２−ＩＰ」と称する。代表的な４．１ＳＶＷＬ２−ＩＰを表６に示す。
【００４０】
ＧＲＦ２複合体への関連をよりいっそう拡張して、我々はまた、ベイトタンパク質として、さらに他のｐＩＣｌｎ相互作用タンパク質、ｓｍＤ１を選択した。従って、本発明のさらに他の観点は、ｓｍＤ１を含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「ｓｍＤ１相互作用タンパク質」または「ｓｍＤ１−ＩＰ」と称する。代表的なｓｍＤ１−ＩＰを表７に示す。
【００４１】
ＧＲＦ２複合体への関連をよりいっそう拡張して、我々はまた、ベイトタンパク質として、さらに他のｐＩＣｌｎ相互作用タンパク質、タンパク質ｓｍＤ３を選択した。従って、本発明のさらに他の観点は、ｓｍＤ３を含む複合体を形成するタンパク質の同定に関し、このようなタンパク質を本明細書では「ｓｍＤ３相互作用タンパク質」または「ｓｍＤ３」と称する。代表的なｓｍＤ３−ＩＰを表８に示す。
【００４２】
これら様々なＧＲＦ２／ＧＲＦ２−ＩＰ複合体、Ｎｄｒ／Ｎｄｒ−ＩＰ複合体、Ｓｋｂ１／Ｓｋｂ１−ＩＰ複合体、ＰＰ２Ｃ／ＰＰ２Ｃ−ＩＰ複合体、ｐＩＣｌｎ／ｐＩＣｌｎ−ＩＰ、４．１ＳＶＷＬ２／４．１ＳＶＷＬ２−ＩＰ複合体、ｓｍＤ１／ｓｍＤ１）−ＩＰ複合体、およびｓｍＤ３／ｓｍＤ３−ＩＰ複合体の順列は、これらが相互作用することにより、ＧＲＦ２の様々な機能活性の調節に関与し、さらに、Ｒａｓ依存性シグナル伝達および細胞成長の調節に関連する。これらの機能活性としては、これらに限定されないが、（ｉ）生理学的なプロセス（例えば、細胞周期の制御、有糸分裂の調節、ＲＮＡ代謝、細胞骨格構造の調節、細胞分化およびアポトーシス）、（ｉｉ）ウイルス感染への応答、（ｉｉｉ）細胞内シグナル伝達、（ｉｖ）転写調節、および（ｖ）病態生理学的なプロセス（例えば、腫瘍形成や腫瘍の広がりなどの過増殖性疾患、神経変性疾患などの変性疾患、ウイルス感染）がある。
【００４３】
従って、本発明において、治療および診断における使用のための利用可能な新規の分析および試薬が作製される。その上、以上の本発明の複合体の形成、または、１以上の本発明のタンパク質（ＧＲＦ２−ＩＰ、Ｎｄｒ−ＩＰ、Ｓｋｂ１−ＩＰ、ＰＰ２Ｃ−ＩＰ、ｐＩＣｌｎ−ＩＰ、４．１ＳＶＷＬ２−ＩＰ、ｓｍＤ１−ＩＰ、およびｓｍＤ３−ＩＰ）の内因性の活性に影響を与え得る薬剤を同定するために、、薬剤を発見する分析が提供される。このような薬剤は、治療上、細胞成長および／または分化を改変するのに有用である。
【００４４】
本発明はまた、１以上の本発明に係るＧＲＦ２−ＩＰ、Ｎｄｒ−ＩＰ、Ｓｋｂ１−ＩＰ、ＰＰ２Ｃ−ＩＰ、ｐＩＣｌｎ−ＩＰ、４．１ＳＶＷＬ２−ＩＰ、ｓｍＤ１−ＩＰ、およびｓｍＤ３−ＩＰタンパク質、または、このようなタンパク質を含む複合体の生産および／または単離に関する方法論、およびその方法論から得られた調製物に関する。特に、本発明に係るタンパク質、および、その配列にハイブリダイズする核酸プローブのコーディング配列を含む組換え発現系が考慮されている。
【００４５】
また本発明においては、本発明に係るＧＲＦ２−ＩＰ、Ｎｄｒ−ＩＰ、Ｓｋｂ１−ＩＰ、ｐＩＣｌｎ−ＩＰ、ＰＰ２Ｃ−ＩＰ、４．１ＳＶＷＬ２−ＩＰ、ｓｍＤ１−ＩＰ、およびｓｍＤ３−ＩＰタンパク質に特異的な抗体、同様に、このようなタンパク質を含む複合体に特異的な抗体も考慮される。本発明の複合体に特異的な抗体は、組織中で上記複合体を検出すること、および、それらの組織における分布を決定すること、に用いることができる。
【００４６】
２．定義
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で用いられる特定の用語を、以下にまとめる。
本明細書で用いられる「活性」という用語は、その最も広い概念における分子の機能を意味する。当該用語は、通常、これらに限定されないが、分子の生物学的、生化学的、物理学的または化学的な機能を含む。例えば、酵素活性、他の分子と相互作用する能力や、他の分子の機能を促進する、活性化する、安定化する、阻害する、抑制する、または不安定化する能力や、他の分子を改変する能力や、他の分子によって改変される能力や、安定性や、細胞の内部または外部の特定の細胞内局在に位置させる能力が全て、本明細書で用いられる用語の定義に含まれるように考慮される。
【００４７】
本明細書で用いられる「アゴニスト」という用語は、タンパク質複合体の形成を増大させる分子を意味するか、または、本発明の複合体または当該複合体中の分子に結合する場合、上記複合体の活性量を増加させる、もしくは、上記複合体の活性の持続時間を延長させる分子を意味する。アゴニストとしては、タンパク質、核酸、炭化水素、または他のいかなる分子が含まれ、例えば、複合体または当該複合体の分子に結合できる化学物質類、金属類、有機金属化合物剤などが挙げられる。またアゴニストとして、本発明の複合体のタンパク質要素から誘導された機能性ペプチドまたはペプチド断片も含まれ、または、タンパク質要素それ自身も含み得る。特定のペプチドの構造的特徴を模擬して設計された物理構造を有するペプチドミメティック、合成分子をアゴニストとして提供することもできる。その刺激は、直接的もしくは間接的でもよく、または、競合的もしくは非競合的メカニズムによるものでもよい。
【００４８】
本明細書で用いられる「動物」という用語は、哺乳動物を意味し、好ましくは ヒトのような哺乳動物である。
【００４９】
本明細書で用いられる「アンタゴニスト」という用語は、本発明の複合体または当該複合体中のタンパク質に結合する場合、上記複合体の活性またはそのタンパク質要素の量または持続期間を減少させる分子、または、形成された複合体の量を減少させる分子を意味する。アンタゴニストとしては、タンパク質（複合体の要素の結合領域で競合的に結合する抗体を含む）、核酸（遺伝子レベルで複合体の要素の発現を阻止するアンチセンス分子を含む）、炭化水素、または他のいかなる分子（例えば、化学物質類、金属類、有機金属化合物剤など）があり、これらは、複合体形成または活性を妨げるのに有効な程度で、哺乳動物型、好ましくはヒト型のＧＲＦ２−ＩＰ、Ｎｄｒ−ＩＰ、Ｓｋｂ１−ＩＰ、ｐＩＣｌｎ−ＩＰ、ＰＰ２Ｃ−ＩＰ、または４．１ＳＶＷＬ２−ＩＰ、ｓｍＤ１−ＩＰ、およびｓｍＤ３−ＩＰタンパク質に結合する。またアンタゴニストとしては、ＧＲＦ２−ＩＰ、Ｎｄｒ−ＩＰ、Ｓｋｂ１−ＩＰ、ｐＩＣｌｎ−ＩＰ、ＰＰ２Ｃ−ＩＰ、４．１ＳＶＷＬ２−ＩＰ、ｓｍＤ１−ＩＰ、およびｓｍＤ３−ＩＰタンパク質から誘導されたペプチドまたはペプチド断片、同様に、優性阻害性の点変異体がある。特定のペプチドの構造的特徴を模擬して設計された物理構造を有するペプチドミメティック、合成分子をアンタゴニストとして提供することもできる。その阻害は、直接的もしくは間接的でもよく、または、競合的もしくは非競合的メカニズムによるものでもよい。
【００５０】
「ベイト」または「ベイトタンパク質」という用語は、それと結合し得る他のタンパク質を見出すためのターゲットとして用いられるポリペプチドを意味する。一般的に、ベイトタンパク質は、ベイトタンパク質を含む複合体の単離を容易にするために、タグを付されるか、または、固定化される。
【００５１】
「結合」という用語は、２つの分子間の安定な結合を意味し、すなわち本発明においては、例えば、生理的条件下での静電性、疎水性、イオン性および／または水素結合による相互作用による、ＧＲＦ２およびＧＲＦ２−ＩＰ、ＮｄｒおよびＮｄｒ−ＩＰ、ＳｋｂおよびＳｋｂ１−ＩＰ、ｐＩＣｌｎおよびｐＩＣｌｎ−ＩＰ、ＰＰ２ＣおよびＰＰ２Ｃ−ＩＰタンパク質、４．１ＳＶＷＬ２および４．１ＳＶＷＬ２−ＩＰ、ｓｍＤ１およびｓｍＤ１−ＩＰ、ｓｍＤ３およびｓｍＤ３−ＩＰ間での安定な結合を意味する。
【００５２】
本明細書において、「細胞」、「宿主細胞」または「組換え宿主細胞」という用語は交換可能に用いられる。このような用語は、特定の被験細胞だけでなく、このような細胞の後代または可能性のある後代も意味すると解釈する。変異または環境的な影響のいずれかにより継代においてある種の改変が生じる可能性があるため、実際にはこのような後代は必ずしも親細胞と同一とはいえないが、本明細書で用いられる用語の範囲に含まれる。
【００５３】
「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」とは、第一のアミノ酸配列（ポリペプチドをコードする）と、第二のアミノ酸配列（上記タンパク質のいずれのドメインとも無関係で実質的に非相同なドメインを定義した）との融合物である。キメラタンパク質は、上記第一のタンパク質も発現する生物中で（異なるタンパク質にもかかわらず）見出される外来ドメインを提示し、またキメラタンパク質は、異なる生物種で発現されるタンパク質構造の、「種間」、「遺伝子間」等での融合物であり得る。
【００５４】
「ＧＲＦ２シグナル伝達経路の成分」または「ＧＲＦ２経路成分」という用語は、ＧＲＦ２シグナル伝達現象の仲介に関与するポリペプチドを意味する。ＧＲＦ２シグナル伝達経路の成分は、例えば、ＧＲＦ２に直接結合するタンパク質、ＧＲＦ２−ＩＰには結合するがＧＲＦ２それ自身には直接結合することのできないタンパク質等を含むものとする。このような成分は、シグナル伝達経路においてＧＲＦ２の上流または下流に位置し、ＧＲＦ２仲介シグナル伝達を作動または拮抗することができる。
【００５５】
「化合物」、「試験化合物」および「分子」という用語は、本明細書において交換可能に用いられ、例えば、これらに限定されないが、ペプチド、核酸、炭化水素、低分子の有機分子、天然産物の抽出物のライブラリー、および他のいかなる分子（これらに限定されないが、化学物質類、金属類および有機金属化合物を含む）を意味する。
【００５６】
「ＧＲＦ２仲介シグナル伝達に影響を及ぼす（または調節する）ことができる化合物」という成句は、ＧＲＦ２経路を介してシグナル伝達を阻害または強化する化合物を意味する。
【００５７】
「保存された残基」または「保存的なアミノ酸置換」という成句は、特定の共通の特性に基づいたアミノ酸の分類を意味する。個々のアミノ酸間の共通の特性を定義する機能的な方法は、同種生物の対応するタンパク質間におけるアミノ酸変化の正規化した頻度を分析することである（Ｓｃｈｕｌｚ， Ｇ． Ｅ． ａｎｄ Ｒ． Ｈ． Ｓｃｈｉｒｍｅｒ．， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。グループ間のアミノ酸が互いに優先的に交換する場合、従って、タンパク質構造全体に対する影響が互いに最も類似している場合、このような分析によってアミノ酸のグループを定義することができる（Ｓｃｈｕｌｚ， Ｇ． Ｅ． ａｎｄ Ｒ． Ｈ． Ｓｃｈｉｒｍｅｒ．， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。この方法によって定義されたアミノ酸グループの例を以下に示す。
【００５８】
（ｉ）ＧｌｕおよびＡｓｐ、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓからなる帯電したグループ、
（ｉｉ）Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓからなる正に帯電したグループ、
（ｉｉｉ）ＧｌｕおよびＡｓｐからなる負に帯電したグループ、
（ｉｖ）Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｉｐからなる芳香族グループ、
（ｖ）ＨｉｓおよびＴｒｐからなる窒素環グループ、
（ｖｉ）Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅからなる大きい脂肪族の非極性グループ、
（ｖｉｉ）ＭｅｔおよびＣｙｓからなるわずかに極性のグループ、
（ｖｉｉｉ）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、ＧｌｎおよびＰｒｏからなる小さい残基のグループ、
（ｉｘ）Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＭｅｔおよびＣｙｓからなる脂肪族グループ、および
（ｘ）ＳｅｒおよびＴｈｒからなる小さいヒドロキシルグループ。
【００５９】
上述したグループに加えて、各アミノ酸残基はそれ自身のグループを形成することができ、その個々のアミノ酸で形成されたグループは、当業界で一般的に用いられるアミノ酸の１文字表記および／または３文字表記で簡単に示される。
【００６０】
「ＤＥＡＤボックス型」、「ＤＥＡＤボックス型ドメイン」または「ＤＥＡＤボックス型モチーフ」という用語は、アミノ酸モチーフ：Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ（１文字コードではＤＥＡＤ）を意味する。ＤＥＡＤボックス型タンパク質とは、少なくとも１つのＤＥＡＤボックス型モチーフを含むタンパク質であり、遺伝子発現の転写後調節に関与するものと考えられている。ＤＥＡＤボックス型ドメインは多くの推定のＲＮＡヘリカーゼで見出されており、タンパク質と特定のＲＮＡまたはＲＮＡファミリーとの特異的な相互作用に寄与するものと考えられている（Ｌｏｓｔ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｎａｔｕｒｅ ３７２：９３−１９６；ａｎｄ Ｐａｕｓｅ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：９５３−９５９）。
【００６１】
「破壊（ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）ボックス型配列」または「破壊ボックス型モチーフ」という用語は、いくつかの細胞周期関連タンパク質のユビキチンが仲介する分解に必須なアミノ酸コンセンサス配列：ＲｘｘＬｘｘｘｘＮを意味する（Ｇｌｏｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３４９：１３２−１３８）。破壊 ボックス型配列は、タンパク質とその特異的なユビキチン化機構との間の要素を認識するように作用すると考えられている。
【００６２】
「ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列」という用語は、特定の個体中の１以上の遺伝子を意味し得る。当業界周知のように、特定のポリペプチドに関する遺伝子は、個体のゲノム中にシングルコピーまたは複数のコピーとして存在し得る。このような複製遺伝子は同一であるか、または、特定の改変（ヌクレオチド置換、付加または欠失がある）を含み、それでもなお、これらは全て実質的に同じ活性を有するポリペプチドをコードする。その上、ヌクレオチド配列中の特定の差異が個々の生物間で存在し、これは対立遺伝子（対立遺伝子）と呼ばれる。このような対立遺伝子の差異（ａｌｌｅｌｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ）により、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列において差異を生じることもあれば生じないこともあり、それでもなお同じ生物活性を有するタンパク質をコードする。
【００６３】
本明細書で用いられる「ドメイン」という用語は、その分子の他の部分とは異なる特定の構造や機能を含む、タンパク質中の領域を意味する。
【００６４】
本明細書で用いられる「遺伝子」または「組換え遺伝子」という用語は、本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を意味し、エキソンおよび（場合によっては）イントロン配列の両方を含む。「組換え遺伝子」は、ポリペプチドをコードする核酸、および、エキソンコーディング配列を含む核酸を意味するが、場合により染色体遺伝子由来のイントロン配列を含んでもよい。「イントロン」という用語は、タンパク質に翻訳されない所定の遺伝子に存在するＤＮＡ配列を意味し、通常、エキソンの間に見出される。
【００６５】
「ＧＩ」または「ＧＩ番号」または「ＧＩ　Ｎｏ．」という用語は、遺伝子および／またはタンパク質に関するデータベース照会番号（遺伝子バンクなど）を意味し、配列や他の関連情報を検索するのに有用である。
【００６６】
「ＧＲＦ２シグナル伝達経路」または「ＧＲＦ２仲介シグナル」という用語は、ＧＲＦ２またはＧＲＦ２と相互作用できるタンパク質を含むシグナル伝達現象を意味するものとする。
【００６７】
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間、または、２つの核酸分子間での配列類似性を意味する。相同性および同一性はいずれも、比較用に並べられた各配列の位置を比較することによって決定することができる。比較された配列中の対応する位置が同じ塩基またはアミノ酸で占有されていれば、その分子はその位置において同一であり、対応する部位が同じまたは類似のアミノ酸残基（例えば、立体構造的および／または電子的な性質において類似するもの）で占有されていれば、その分子はその位置において相同（類似）とされる。相同性／類似性または同一性の割合の表現は、比較配列と共有の位置の同一または類似のアミノ酸の数を意味する。「関連していない」または「非相同の」配列とは、本発明に係る配列と、４０％未満の同一性、好ましくは２５％未満の同一性しかもたない配列である。同様に、「相同」または「相同の」配列とは、互いに少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、さらに９５％〜９９％の同一性を有する配列を意味する。
【００６８】
「相同性」という用語は、類似の機能またはモチーフを有する遺伝子またはタンパク質を同定するのに用いられる数理学に基づく配列類似性の比較を意味する。本発明の核酸およびタンパク質配列は、公共データベースを用いて検索するための「問い合わせ配列」として用いることができ、例えば、他のファミリーメンバー、関連配列または相同体を同定することができる。このような検索は、ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−１０）を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、語長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）＝１２）を用いて行い、本発明の核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、語長＝３）を用いて行い、本発明のタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得ることができる。比較用のギャップ有り（ｇａｐｐｅｄ）アライメントを得るために、ギャップ有りＢＬＡＳＴを利用することができ、これはＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１７）：３３８９−３４０２で説明される。ＢＬＡＳＴおよびギャップ有りＢＬＡＳＴプログラムを利用する際、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照。
【００６９】
本明細書で用いられる「同一性」とは、配列の適合が最大になるように（すなわちギャップや挿入を考慮して）配列を並べた場合の、２以上の配列における対応する位置で同一なヌクレオチドまたはアミノ酸残基の割合を意味する。同一性は、既知の方法で容易に計算でき、この既知の方法としては、これらに限定されないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， Ａ． Ｍ．， ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ， Ｄ． Ｗ．， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ． Ｍ．， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｈ．Ｇ．， ｅｄｓ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， １９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７；ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｄｓ．， Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１；ａｎｄ Ｃａｒｉｌｌｏ， Ｈ．， ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｄ．， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．， ４８：１０７３（１９８８）で説明される方法がある。同一性を決定する方法は、試験された配列間で最大の適合が得られるように設計される。その上、同一性を決定する方法は、公共の利用可能なコンピュータープログラムでコード化されている。２つの配列間の同一性を決定するコンピュータープログラム方法としては、これらに限定されないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）：３８７ （１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３ −４１０ （１９９０） ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２ （１９９７））がある。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩおよび他の源により公に利用可能である（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．、ｅｔ ａｌ．， ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０ （１９９０）。また、周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するのに用いることができる。
【００７０】
「相互作用タンパク質」という用語は、他のタンパク質と直接または間接的のいずれかで相互作用するポリペプチドを含むものとする。直接的な相互作用とは、タンパク質が、互いに結合する能力によって（例えば、共免疫沈降または他の手段によって）単離されることを意味する。間接的な相互作用とは、互いに結合するために他の分子を必要とするタンパク質を意味する。あるいは、間接的な相互作用とは、互いが直接結合することは決してないが、仲介物を介して相互作用するタンパク質を意味する。例えば、Ｒａｓは、ＧＲＦ２と直接相互作用し、タンパク質４．１は、ｐＩＣｌｎと直接相互作用する（タンパク質４．１はｐＩＣｌｎベイトと共免疫沈降する）。しかしながら、タンパク質４．１は、ｐＩＣｌｎ仲介物によりＧＲＦ２と間接的に相互作用する（タンパク質４．１は、ＧＲＦ２ベイトと共免疫沈降しないことがわかった）。
【００７１】
本明細書で用いられる「単離された」という用語は、本発明に係るタンパク質およびタンパク質複合体に関しては、例えば、当該タンパク質または複合体が内在的に見出される細胞環境において、当該タンパク質または複合体と結合して通常存在しうるタンパク質の混入が本質的にないタンパク質またはタンパク質複合体の調製物を意味する。従って、単離されたタンパク質複合体は、例えばそれらの調節因子をスクリーニングする際のような単離中に通常「混入する」または上記複合体の研究を妨害する細胞成分から単離される。しかしながら、このような「単離された」複合体は他のタンパク質を組み込んでいてもよく、当該他のタンパク質は、調査される本発明に係るタンパク質またはタンパク質複合体によって調節される、ということが理解される。この場合において、このような追加のタンパク質としては、例えば、Ｒａｓ、ＧＥＦ、および、ＧＲＦ２複合体で仲介されるシグナル伝達カスケードに関与する他のタンパク質がある。
【００７２】
本明細書で用いられる「単離された」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸に関して、他のＤＮＡ、またはＲＮＡ（それぞれ高分子化合物（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）の天然資源に存在する）から分離された分子を意味する。好ましくは、例えば、単離されたポリペプチドをコードする核酸は、ゲノムＤＮＡの特定の遺伝子の天然で直接隣接する核酸配列の１０キロ塩基（ｋｂ）以下を含み、より好ましくはこのような天然に存在する隣接配列の５ｋｂ以下を含み、および最も好ましくはこのような天然に存在する隣接配列の１．５ｋｂ未満を含む。また、本明細書で用いられる「単離された」という用語は、細胞成分、ウイルス成分、または培地（組換えＤＮＡ技術で生産された場合）、または化学的な前駆物質もしくは他の化学物質（化学的に合成された場合）を実質的に含まない核酸またはペプチドを意味する。さらに、「単離された核酸」は、断片として天然に存在せず、自然状態で見出されない核酸断片を含むものとする。
【００７３】
「哺乳動物ＧＲＦ２」とは、Ｒａｓの活性化に関与するＧタンパク質交換因子と相互作用する哺乳動物タンパク質、および、ヒトＧＲＦ２の配列またはそれと実質的に同一な配列を有する配列のいずれかの配列を有する哺乳動物タンパク質のファミリーを意味し、例えば、ＧＲＦ２の非微生物性、望ましくは哺乳動物（例えば、マウス）の相同体がある。ヒトＧＲＦ２の配列（配列番号１）を以下に示す。
【００７４】
【化１】
2004501670.tif 000002
【００７５】
「哺乳動物Ｎｄｒ」とは、以下に示す配列（配列番号３）を有するヒトＮｄｒを含む哺乳動物タンパク質、および、実質的にそれと同一な配列を有するタンパク質（その哺乳動物相同体を含む）のファミリーを意味する。
【００７６】
【化２】
2004501670.tif 000003
【００７７】
「哺乳動物Ｓｋｂ１」とは、以下に示す配列（配列番号２）を有するヒトＳｋｂ１を含む哺乳動物タンパク質、および、実質的にそれと同一な配列を有するタンパク質（その哺乳動物相同体を含む）のファミリーを意味する。
【００７８】
【化３】
2004501670.tif 000004
【００７９】
「哺乳動物４．１ＳＶＷＬ２」とは、以下に示す配列（配列番号４）を有するヒト４．１ＳＶＷＬ２を含む哺乳動物タンパク質ファミリー、および、実質的にそれと同一な配列を有する哺乳動物タンパク質（その哺乳動物相同体を含む）のファミリーを意味する。また、上記４．１ファミリータンパク質の他の新規のメンバーの一つである４．１ＳＶＷＬ１を、以下に示す（配列番号５）。
【００８０】
【化４】
2004501670.tif 000005
【００８１】
ホモサピエンスの赤血球膜タンパク質４．１ｓｖｗｌ１（配列番号５）のｍＲＮＡの１０個のコンティグの翻訳および組み合わせは、ｃｄｓを用いて完成させた。
【００８２】
【化５】
2004501670.tif 000006
【００８３】
本明細書でタンパク質の「哺乳動物相同体」と称されるポリペプチドは、他の哺乳動物のパラログまたは他の哺乳動物のオーソログを意味する。
【００８４】
本明細書で用いられる「モチーフ」という用語は、特定の構造または機能を有するタンパク質で共通して見出されるアミノ酸配列を意味する。一般的に、コンセンサス配列は、特定のモチーフを表すために定義される。当該コンセンサス配列は、厳密に定義される必要はなく、位置の変異、退縮、長さの変異を含んでよい。当該コンセンサス配列をデータベース検索に用いて、アミノ酸配列中のモチーフの存在によって類似の構造または機能を有する他のタンパク質を同定することができる。特定のモチーフを有する他のタンパク質を同定するために、例えばＧｅｎＢａｎｋまたはＳｗｉｓｓＰｒｏｔのようなオンラインデータベースを、コンセンサス配列を用いて検索することができる。様々な検索アルゴリズムおよび／またはプログラムを用いることができ、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＥＮＴＲＥＺがある。ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴは、ＧＣＧ配列分析パッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）の一部として利用可能である。ＥＮＴＲＥＺは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄを介して利用可能である。
【００８５】
本発明の「非ヒト動物」としては、例えばげっ歯類、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、雌牛、ニワトリ、両生類、爬虫類などのような脊椎動物がある。好ましい非ヒト動物は、げっ歯類ファミリーから選択され、例えばラットおよびマウスであり、最も好ましくはマウスであるが、トランスジェニック両生類、例えばアフリカツメガエル属のメンバーや、トランスジェニックニワトリも、例えば、胚形成および組織のパターニングを理解するための重要なツールを提供することができる。本明細書において「キメラ動物」という用語は、組換え遺伝子が見出される動物、または、動物細胞のいくつか（しかし全てではない）で組換え体が発現される動物を意味するように用いられる。「組織特異的キメラ動物」という用語は、組換え遺伝子が、いくつかの組織で存在する、および／または発現される（ただし他の組織では存在する、および／または発現されない）ことを示す。
【００８６】
本明細書で用いられる「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および、場合によってはリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドを意味する。また、この用語は、ヌクレオチド類似体から生産されたＲＮＡまたはＤＮＡいずれかの等価物、類似体として、および、説明される実施形態に適用可能なものとして、一本鎖ポリヌクレオチド（センスまたはアンチセンスなど）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むものと理解されるべきである。
【００８７】
本明細書では、「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は交換可能に用いられる。
【００８８】
「ＰＥＳＴ配列」または「ＰＥＳＴモチーフ」という用語は、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリンおよびスレオニン残基が豊富なタンパク質の領域を意味する。ＰＥＳＴ配列は、ユビキチン経路を介した様々なタンパク質の分解シグナルとして作用するようである。ＰＥＳＴ領域は、タンパク質およびその特異的ユビキチン化機構の間の認識要素として作用すると考えられている。
【００８９】
「ＰＨ」とは、プレクストリンホモロジーを意味する。
「ＰＨドメイン」または「ＰＨモチーフ」という用語は、プレックストリンの約１００個のアミノ酸領域と相同性を有するポリペプチドを意味する。構造的な研究が示すところによれば、ＰＨドメインは、２つの逆平行β−シートおよび長いＣ末端αヘリックスを含む類似のコンフォメーションに折りたたまれる（Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． １９：３４９−３５３）。ＰＨドメインを有することがわかったタンパク質のなかでも、シグナル伝達または細胞骨格の構築において重要な役割を有するタンパク質のメンバーは、例えば、スペクトリン、ダイナミン、ホスホリパーゼＣ−γ、Ｂｔｋ、ＲａｓＧＡＰ、ｍＳＯＳ−１、Ｒａｃ、Ａｋｔである。様々なＰＨドメインの例は、Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， ＴＩＢＳ， １８：３４３−３４８， １９９３およびＧｉｂｓｏｎ， Ｔ． Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， ＴＩＢＳ， １９：３４９−３５３， １９９４に示される。他のＰＨドメインは、これらの出版物で説明されている配列アライメント技術および３次構造比較を用いて同定することができる。
【００９０】
本明細書で用いられる「表現型」とは、例えば、いずれか一つの特性を有する細胞の、または特性のいずれかのグループを有する細胞の、全体の物理学的、生化学的、および生理学的な性質を意味する。
【００９１】
「精製タンパク質」という用語は、タンパク質の調製物を意味し、好ましくは、単離形態のタンパク質、またあるいは、細胞または細胞溶解産物中で通常タンパク質と結合する他のタンパク質を実質的に含まないタンパク質を意味する。「他の細胞のタンパク質を実質的に含まない」（または本明細書では「他の混入タンパク質を実質的に含まない」ともいう）という用語は、２０％未満（乾燥重量で）の混入タンパク質、および好ましくは５％未満の混入タンパク質しか含まない各構成タンパク質の個々の調製物と定義される。各構成タンパク質の機能的形態は、以下の実施例で説明されるような、クローン化遺伝子を用いて調製される精製調製物であり得る。再構成タンパク質混合物を生成するのに用いられる構成タンパク質を調製することに言及する場合、「精製された」とは、指定の分子が他の生体高分子の非存在下で存在することを意味し、ここで他の生体高分子とは、例えば他のタンパク質（特に、精製調製物として、または、本発明に係る再構成混合物中のその機能において、構成タンパク質の特徴を実質的にマスクする、減少させる、混同させる、または改変するような他のタンパク質）である。本明細書で用いられる「精製された」という用語は、好ましくは少なくとも８０％（乾燥重量で）、より好ましくは９５〜９９重量％の範囲、および最も好ましくは少なくとも９９．８重量％の同じ型の生体高分子が存在することを意味する（しかしながら、水、緩衝液、および他の低分子、特に５０００未満の分子量を有する分子は存在してよい）。本明細書で用いられる「純粋な」という用語は、好ましくは、直前で述べた「精製された」と同じ数的限定を有する。「単離された」および「精製された」とは、天然状態（例えば、細胞の一部として）のタンパク質、または、細胞溶解産物の一部としてのタンパク質のいずれも含まれず、または、成分に分離されているが（例えば、アクリルアミドゲルで）純粋な（例えば、混入タンパク質を含まない）物質または溶液のいずれの状態でもないタンパク質も含まれない。また、本明細書で用いられる「単離された」という用語は、組換えＤＮＡ技術で生産された場合は細胞成分または培地、または、化学合成された場合は化学的な前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まない構成タンパク質を意味する。
【００９２】
「組換えタンパク質」という用語は、組換えＤＮＡ技術により生産される本発明のタンパク質を意味し、この際、通常、発現タンパク質をコードするＤＮＡは適切な発現ベクターに挿入され、次にそれを用いて宿主細胞に形質転換し、異種タンパク質を生産する。その上、組換えタンパク質をコードする組換え遺伝子に関して「から誘導された」という成句は、「組換えタンパク質」の意味の範囲内で、野生型タンパク質のアミノ酸配列、または、それに類似したアミノ酸配列（天然に存在するタンパク質を置換および欠失などで変異させることにより生成した）を有するタンパク質を含むものとする。
【００９３】
本明細書で用いられる「レポーター遺伝子構造」とは、転写調節配列に実施可能に連結した「レポーター遺伝子」を含む核酸である。レポーター遺伝子の転写は、これらの配列によって制御される。少なくとも１以上のこれら制御配列の活性は、ＧＲＦ２またはＧＲＦ２相互作用タンパク質を含むシグナル伝達経路によって直接的または間接的的に調節される。転写調節配列は、プロモーターおよび他の調節領域を含み、例えば、基質タンパク質のレベルへの応答してレポーター遺伝子の発現レベルを調節するエンハンサー配列などがある。
【００９４】
「半精製された（ｓｅｍｉ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」とは、タンパク質調製に関して、他の細胞性タンパク質またはウイルスタンパク質から予め分離されたタンパク質を意味する。例えば、全部の細胞溶解物に比べて、基質タンパク質を共に含む再構成された複合系のタンパク質は、混合物中の全ての他のタンパク質に対して少なくとも５０％の純度で混合物中に存在し、より好ましくは少なくとも７５％の純度、さらにより好ましくは９０〜９５％の純度で存在する。
【００９５】
本明細書で用いられる「半精製された細胞抽出物」という用語、あるいは、「分画された溶解物」という用語は、全部の細胞溶解物の少なくとも１つの成分を実質的に分離するように処理された細胞溶解物、または、全部の細胞溶解物の少なくとも１つの成分を実質的に高濃度にするように処理された細胞溶解物を意味する。本明細書で用いられる「実質的に分離する」とは、全部の細胞溶解物の成分の、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％を分離することを意味する。本明細書で用いられる「実質的に高濃度にする」とは、全細胞溶解物の少なくとも１つの成分を、全細胞溶解物の他の成分と比較して、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも３０％、さらにより好ましくは少なくとも約５０％まで高濃度にすることを意味する。分離または高濃度にされた成分は、ＧＲＦ２シグナル伝達経路の成分、例えば、ＧＲＦ２、ＧＲＦ２−ＩＰ、Ｎｄｒ−ＩＰ、Ｓｋｂ１−ＩＰ、ｐＩＣｌｎ−ＩＰ、ＰＰ２Ｃ−ＩＰ、４．１ＳＶＷＬ２−ＩＰ、ｓｍＤ１−ＩＰ、およびｓｍＤ３−ＩＰタンパク質等であり得る。また、「半精製された細胞抽出物」という用語は、所定の成分がコントロールされた細胞より実質的に多くなる、または実質的に少なくなるように細胞を処理した場合、細胞からの溶解物も含むものとする。例えば、ＧＲＦ２シグナル伝達経路の成分を全く（または非常に少量しか）生産しないように改変された細胞（例えば、組換えＤＮＡ技術により）は、細胞溶解により、半精製された細胞抽出物を生産する。
【００９６】
本明細書において「シグナル伝達」、「シグナル伝達」、「シグナル伝達経路」、「シグナル伝達経路」などの用語は交換可能に用いられ、細胞環境からの物理学的または化学的シグナルの細胞膜を介したプロセシングを意味し、これは、数種のメカニズムの１以上を介して生じ、当該メカニズムとしては、例えば、酵素（プロテアーゼ、または、リン酸化パターンまたは他の翻訳後修飾を改変し得る他の酵素）の活性化／不活性化、イオンチャンネルまたは細胞内のイオン貯蔵の活性化、グアニンヌクレオチド結合タンパク質中間体を介したエフェクター酵素の活性化、イノシトールリン酸の形成、アデニリルシクラーゼの活性化または不活性化、転写因子および／または活性化の直接的な活性化（または阻害）などがある。
【００９７】
本明細書で用いられる「低分子」とは、約５ｋＤ未満、最も好ましくは約２．５ｋＤ未満の分子量を有する組成物を意味するものとする。低分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティック、炭化水素、脂質または他の有機分子（炭素含有）または無機分子であり得る。多くの製薬会社は、化学的および／または生物学的な混合物の広範なライブラリーを所持しており、当該ライブラリーは一連の低分子、しばしば真菌、細菌、または藻類抽出物を含み、本発明のいずれかの分析でスクリーニング可能である。
【００９８】
本明細書で用いられる「特異的にハイブリダイズする」という用語は、ターゲット遺伝子配列、または、それらに相補的な配列、またはそれらの天然に存在する変異体の少なくとも１５、２５、５０または１００個の連続したヌクレオチドにハイブリダイズし、ターゲット遺伝子に比べて細胞性の核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）に対するバックグラウンドハイブリダイゼーションが、１５％未満、好ましくは１０％未満、およびより好ましくは５％未満であるような、本発明の核酸プローブ／プライマーの能力を意味する。
【００９９】
ポリペプチドに対して用いられる場合の「実質的な配列同一性」とは、２種の哺乳動物ペプチド配列が、デフォルトＧＡＰを用いるＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムによって並べられた場合、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性またはそれ以上の配列同一性を有することを意味する。好ましくは、同一でない残基の位置は、保存的なアミノ酸置換と区別される。例えば、電荷または極性などの化学的特性が類似するアミノ酸の置換によって、タンパク質の特性が影響を受けることはあまりない。例えば、アスパラギンに対してグルタミン、または、アスパラギン酸に対してグルタミン酸が挙げられる。
【０１００】
本明細書で用いられる「組織特異的プロモーター」という用語は、プロモーターとして作用するＤＮＡ配列、すなわち、プロモーターに操作可能に連結した選択ＤＮＡ配列の発現を調節するＤＮＡ配列を意味し、これらは、組織の特定の細胞、例えば泌尿器系由来の細胞（例えば、腎臓細胞）、または神経系由来の細胞（例えば、ニューロン性細胞）において、選択ＤＮＡ配列の発現に作用する。またこの用語は、最初はある組織での選択ＤＮＡの発現を調節するが、他の組織での発現を起こすような、いわゆる「ｌｅａｋｙ」プロモーターも同様に含む。
【０１０１】
本明細書で用いられる「トランスフェクション」という用語は、核酸が仲介する遺伝子の移動によって、核酸、例えば発現ベクターを、レシピエント細胞に導入することを意味する。本明細書で用いられる「形質転換」とは、細胞が外来性のＤＮＡまたはＲＮＡを取り込んだ結果として細胞が変化し、例えば、形質転換した細胞が本発明のポリペプチドの組換え型を発現するようなプロセス、または、形質転換された遺伝子からアンチセンス発現が起こり、その結果天然に存在する型の遺伝子の発現が行われなくなるようなプロセス、を意味する。
【０１０２】
本明細書で用いられる「形質転換遺伝子」という用語は、それが導入されるトランスジェニック動物または細胞にとって部分的または完全に異種な、すなわち外来の核酸配列、または、それが導入されるトランスジェニック動物または細胞の内在性遺伝子と相同な核酸配列を意味するが、これらは、それが挿入される細胞のゲノムを変化させるような方法で（例えば、天然の遺伝子の位置とは異なる位置に挿入されるか、または、それが挿入されることによりノックアウトが起こる）、動物のゲノムに挿入できるように設計されるか、または、動物のゲノムに挿入される。形質転換遺伝子は、選択核酸の最適な発現に必要な１以上の転写調節配列やその他いかなる核酸（例えばイントロンなど）を含んでもよい。
【０１０３】
本明細書で用いられる「トランスジェニック動物」とは、いかなる動物、好ましくはヒト以外の哺乳動物、鳥類または両生類であり、この場合、当業界周知のトランスジェニック技術のような人間が介入する方法で導入された異種核酸を上記動物の１以上の細胞に含む。マイクロインジェクションや組換えウイルスでの感染などの方法によって計画的に遺伝子操作して、核酸を細胞の前駆体に導入することによって、直接または間接的に核酸を細胞に導入する。遺伝子操作という用語は、典型的な異種交配、またはインビトロの受精というよりむしろ、組換えＤＮＡ分子の導入を指す。このような分子は、染色体に統合されてもよいし、または、染色体外で複製されるＤＮＡであってもよい。本発明で望ましい一般的なトランスジェニック動物において、形質転換遺伝子は、例えば、アゴニスト型またはアンタゴニスト型のいずれかの形態で、細胞にタンパク質の組換え型を発現させる。しかしながら、例えば、以下で説明するＦＬＰまたはＣＲＥリコンビナーゼ依存性の構造として、組換え遺伝子がサイレントであるトランスジェニック動物も含まれる。
【０１０４】
「転写調節配列」とは、本明細書で用いられる総称的な用語であり、それと操作可能に連結されるタンパク質のコーディング配列の転写を誘導または制御するＤＮＡ配列（例えば開始シグナル、エンハンサー、およびプロモーターなど）を意味する。好ましい実施形態において、組換えタンパク質遺伝子の転写は、発現が意図された細胞型における組換え遺伝子発現を制御するプロモーター配列（または他の転写調節配列）の制御下で行われる。また、組換え遺伝子も、タンパク質の天然に存在する形態の転写を制御する配列と同じかまたは異なる転写調節配列の制御下にあり得ることも理解されよう。
【０１０５】
本明細書で用いられる「ベクター」という用語は、それに連結した他の核酸を移送することができる核酸分子を意味する。好ましいベクターの一つの型としてエピゾームがあり、すなわちエピゾームとは、染色体外での複製が可能な核酸である。好ましいベクターは、それに連結した核酸の自律的な複製／発現が可能なベクターである。操作可能に連結した遺伝子の発現の指示が可能なベクターとは、本明細書では「発現ベクター」と称する。一般的に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、多くの場合「プラスミド」の形態であり、プラスミドとは、環状の二本鎖ＤＮＡのループであり、それがベクター形態の場合には染色体に結合しない。プラスミドは最も広く用いられる形態のベクターであるため、本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に用いられる。しかしながら、本発明では、同等の機能を有し、今後当業界で知られるようになる他の形態の発現ベクターも含むものとする。
【０１０６】
また「ＷＤ−４０モチーフ」は、当業界では「β−トランスデューシンリピート」または「ＷＤ−４０リピート」と呼ばれ、これは、配列の２つの末端（アミノ末端およびカルボキシル末端）において比較的よく保存された一連のアミノ酸を有する約２５〜５０個の連続したアミノ酸配列と概略的に定義できる（Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：８０２−８０８ （１９９１） ａｎｄ Ｎｅｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３７１：２９７ （１９９４）で述べられる）。ＷＤ−４０リピート含有タンパク質の少なくとも１つのＷＤ−４０リピートの保存されたセットは、一般的に、特定の位置に保存されたアミノ酸を含む。アミノ末端のセットは、２個の連続したアミノ酸から構成され、多くの場合、Ｇｌｙ、その後にＨｉｓを含む。カルボキシル末端のセットは、６〜８個の連続したアミノ酸から構成され、一般的に、その第一の位置にＡｓｐ、およびＴｒｐ、続いてその最後の２つの位置にＡｓｐを含む。ＷＤ４０リピートを特徴付ける一般式は、｛Ｘ６〜９４−［ＧＨ−Ｘ２３〜４１−ＷＤ］｝Ｎであり、式中、Ｘ６〜９４は、６〜９４個の連続したアミノ酸残基を示し、Ｘ２３〜４１は、２３〜４１個の連続したアミノ酸残基を示し、およびＮは、４〜８の整数を示す（Ｎｅｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３７１：２９７ （１９９４））。しかしながら、他のＷＤ４０リピートも当業者により認識できる。特定のタンパク質中のＷＤ−４０リピートの数は、２から８以上の範囲であり得る。
【０１０７】
「全部の溶解物」という用語は、単に細胞を溶解させて溶解物状にする工程の後に、例えば、分画したり、除去したり、付け加えたりする操作を行っていない細胞溶解物を意味する。
【０１０８】
「亜鉛（ｚｉｎｃ）フィンガードメイン」および「亜鉛フィンガーモチーフ」という用語は、以下の一般式で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを単離したペプチド、またはその部分的なペプチドを意味する：一般式Ｃ−Ｘ２，４−Ｃ−Ｘ３−［ＬＩＶＭＦＹＷＣ］−Ｘ８−Ｈ−Ｘ３，５−Ｈ、および／または、一般式Ｃ−Ｘ２，４−Ｃ−Ｘ３−Ｆ−Ｘ５−Ｌ−Ｘ２−Ｈ−Ｘ３，４−Ｈであり、式中、Ｘは任意のアミノ酸を示す（Ｐｒｏｓｉｔｅ　ＰＤＯＣ０００２８）。亜鉛フィンガーのフォールディングは、保存されたシステイン（Ｃ）およびヒスチジン（Ｈ）残基が結合して四面体状に配置された亜鉛イオンの周りで組織化される（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８５） ＥＭＢＯ Ｊ． ４：１６０９， ’Ｋｌｕｇ ａｎｄ Ｒｈｏｄｅｓ （１９８７） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． １２：４６４）。タンパク質は、その配列中に、ドメインの不完全または減縮されたコピーを含む亜鉛フィンガーモチーフを１つまたは複数含んでもよい。多数の亜鉛フィンガータンパク質が、亜鉛フィンガーを介してＤＮＡと相互作用するＤＮＡ結合タンパク質であることがわかっている。
【０１０９】
３．代表的な核酸および発現ベクター
以下に説明するように、本発明の一つの観点は、ＧＲＦ２−ＩＰ、Ｎｄｒ−ＩＰ、Ｓｋｂ１−ＩＰ、ｐＩＣｌｎ−ＩＰ、ＰＰ２Ｃ−ＩＰ、４．１ＳＶＷＬ２−ＩＰ、ｓｍＤ１−ＩＰ、またはｓｍＤ３−ＩＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸に関し、ここで上記タンパク質としては、例えば、表１〜９に示されたタンパク質、および／またはこのような核酸の等価物である。本明細書で用いられる「核酸」という用語は、断片および等価物を含むように意図される。等価物という用語は、ＧＲＦ２−ＩＰ、Ｎｄｒ−ＩＰ、Ｓｋｂ１−ＩＰ、ｐＩＣｌｎ−ＩＰ、ＰＰ２Ｃ−ＩＰ、４．１ＳＶＷＬ２−ＩＰ、ｓｍＤ１−ＩＰ、またはｓｍＤ３−ＩＰタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、例えば、他のタンパク質（ＧＲＦ２シグナル伝達経路の他の成分など）と結合する能力を保持するもの、または、タンパク質が内因性の酵素活性を有する場合は基質に作用するもの、と理解される。同等のヌクレオチド配列とは、１以上のヌクレオチド置換、付加または欠失により異なる配列（例えば対立遺伝子変異体）を含み、従って、例えば遺伝子コードの減縮により、表１〜９で示されたコーディング配列のヌクレオチド配列とは異なるコーディング配列を含む。また等価物は、ストリンジェントな条件下（すなわち、約１Ｍの塩濃度で形成された二本鎖ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）より約２０〜２７℃低い条件に等しい）で、表１〜９で示されたコーディング配列のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェント条件としては、例えば、約４５℃での６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、続いて５０℃での２．０×ＳＳＣによる洗浄が、当業者周知であるか、または、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）， ６．３．１−６．３．６）に記載されている。例えば、洗浄工程における塩濃度は、低いストリンジェンシー（５０℃で約２．０×ＳＳＣ）から、高いストリンジェンシー（５０℃で約０．２×ＳＳＣ）までの範囲から選択できる。加えて、洗浄工程における温度は、低いストリンジェント条件（室温、すなわち約２２℃）から、高いストリンジェント条件（約６５℃）にかけて増加しうる。一つの実施形態において、等価物は、表１〜９で示されるコーディング配列のヌクレオチド配列から誘導された核酸配列、および、進化的に関連する核酸配列をさらに含む。
【０１１０】
その上、通常認識されるように、特定の環境下では、本発明に係るＧＲＦ２−ＩＰ、Ｎｄｒ−ＩＰ、Ｓｋｂ１−ＩＰ、ｐＩＣｌｎ−ＩＰ、ＰＰ２Ｃ−ＩＰ、４．１ＳＶＷＬ２−ＩＰ、ｓｍＤ１−ＩＰ、およびｓｍＤ３−ＩＰタンパク質の相同体を提供することが有利な場合があり、当該相同体は、天然に存在する型のタンパク質の生物活性の部分集合だけを促進または阻害するために、アゴニスト（ミメティック）またはアンタゴニストのいずれか一方として限定された能力で機能する。従って、全ての特定のタンパク質の生物活性に向けられたアゴニストまたはアンタゴニストを用いた治療に比べて、限定された機能を有し、より少ない副作用の相同体を用いた治療によって、特定の生物学的な効果を引き出すことができる。例えば、アンタゴニスト型の相同体を生産することができ、当該相同体は、ＧＲＦ２シグナル伝達経路において他のタンパク質と結合する野生型（「元の（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）」）タンパク質の能力を妨害するが、内因性の酵素活性またはその他の複合体を形成する能力（例えば、細胞の他の調節メカニズムに関与し得るような）を実質的に妨害しない。
【０１１１】
本明細書ではＧＲＦ２経路成分ポリペプチドと称されるポリペプチド、例えば、ＧＲＦ２−ＩＰ、Ｎｄｒ−ＩＰ、Ｓｋｂ１−ＩＰ、ｐＩＣｌｎ−ＩＰ、ＰＰ２Ｃ−ＩＰ、４．１ＳＶＷＬ２−ＩＰ、ｓｍＤ１−ＩＰ、およびｓｍＤ３−ＩＰタンパク質は、好ましくは、表１〜９に記載のＧｅｎＢａｎｋ寄託物で示されるアミノ酸配列の全部または部分に相当するアミノ酸配列を有するか、または、これらタンパク質の一つと相同であり、例えば他のヒトパラログ、または哺乳動物オーソログなどがある。
【０１１２】
一般的に、ＧＲＦ２経路成分ポリペプチドの生物活性は、以下に示す１以上の性質によって特徴付けられる：真核細胞、特に哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）の細胞周期を調節する能力；真核細胞の増殖／細胞成長を調節する能力；または、細胞／組織の分化を調節する能力、である。また、本発明に係るポリペプチドは、他の細胞のタンパク質の動作に影響を与えることによって、細胞成長または増殖を調節することができる。ＧＲＦ２経路成分ポリペプチドは、タンパク質の野生型の機能の特異的なアゴニストでもよく、または、触媒的に不活性な変異体のような特異的なアンタゴニストでもよい。本発明に係るＧＲＦ２経路成分の他の生物活性とは、本明細書で説明されるほか、本発明の開示の観点において当業者に十分明白であるものも含まれる。
【０１１３】
一つの実施形態において、本発明の核酸は、天然に存在する脊椎動物のＧＲＦ２経路成分の遺伝子産物のアゴニストまたはアンタゴニストであるポリペプチド（例えば、表１〜９で示されたタンパク質）をコードする。好ましいＧＲＦ２経路成分は、表１〜９で示されたアミノ酸配列と同一または相同の成分である。好ましい核酸は、表１〜９で示されたアミノ酸配列と、少なくとも６０％相同、より好ましくは７０％相同、最も好ましくは８０％相同のポリペプチドをコードする。また、ＧＲＦ２経路成分の活性を有するポリペプチドをコードし、表１〜９で示された配列と少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、および最も好ましくは少なくとも約９８〜９９％相同な核酸も、本発明の範囲内に含まれる。好ましくは、当該核酸は、表１〜９で示されたヒトＧＲＦ２シグナル伝達経路の成分をコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を含むｃＤＮＡ分子である。
【０１１４】
また、遺伝子コードが減縮したことによって表１〜９で示されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列と異なる単離された核酸も、本発明の範囲内に含まれる。例えば、アミノ酸の数は、１以上のトリプレットで設計される。同じアミノ酸を明示するコドンまたは同義コドン（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣはヒスチジンの同義コドンである）により、アミノ酸配列またはタンパク質に影響を与えない「サイレント」変異が生じる。しかしながら、本発明に係るタンパク質のアミノ酸配列に変化を与えないＤＮＡ配列多型が、哺乳動物細胞中に存在することが予測される。特定のタンパク質をコードする核酸の１以上のヌクレオチド（ヌクレオチドの約３５％まで）のこのような変異が、自然の対立遺伝子変異により、所定の種の個体間で存在することが、当業者には明白である。このようなヌクレオチド変異のいずれかまたは全部、およびその結果生じるアミノ酸多型は、本発明の範囲内である。
【０１１５】
本発明は、真核細胞から誘導されたＧＲＦ２経路成分をコードする核酸に関し、当該核酸は、表１〜９に記載の配列で示されるＧＲＦ２経路成分と進化的に関連したアミノ酸配列を有し、ここで「進化的に関連した」とは、自然に生じる（例えば、対立遺伝子変異またはディファレンシャルスプライシングによって）アミノ酸配列を有するＧＲＦ２経路成分を意味し、同様に、例えば、コンビナトリアル変異誘発により生じるＧＲＦ２経路成分の突然変異体を意味する。
【０１１６】
また、本発明に係るタンパク質の生物学的に活性な部分をコードする核酸の断片も本発明の範囲内である。本明細書で用いられる、ＧＲＦ２経路成分の活性な部分をコードする核酸の断片とは、例えば、表１〜９で示されたタンパク質の完全長アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列より少ないヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、および、完全長タンパク質の生物活性の少なくとも一部を保持するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またあるいは、完全長タンパク質の生物活性のアンタゴニストとして機能的なヌクレオチド配列、を意味する。このような断片は、例えば、当該断片が誘導される完全長タンパク質に適切なものとして、ＧＲＦ２経路成分と他のタンパク質との相互作用を仲介するドメインを含むポリペプチドを含む。
【０１１７】
また、本発明の範囲内の核酸は、リンカー配列、改変された制限エンドヌクレアーゼ部位、および、このような組換えポリペプチドの分子クローニング、発現または精製に有用な他の配列を含んでもよい。
【０１１８】
以下に示される実施例で指示したとおり、ＧＲＦ２経路成分ポリペプチドをコードする核酸は、本明細書で説明されるプロトコール、同様に一般的に当業者既知のプロトコールに従って、いずれの脊椎生物からのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡから得ることができる。ＧＲＦ２経路成分ポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、例えば、細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞からのトータルｍＲＮＡを単離することによって得ることができる。続いて、多数の既知の技術のいずれかを用いて、二本鎖ｃＤＮＡｓを上記トータルｍＲＮＡから調製し、その後、適切なプラスミドまたはバクテリオファージベクターに挿入することができる。また、ＧＲＦ２経路成分をコードする遺伝子を、確立されたポリメラーゼ連鎖反応技術を用いて、本発明で提供されるヌクレオチド配列情報に従いクローニングすることができる。
【０１１９】
本発明の他の観点は、「アンチセンス」療法における単離された核酸の使用に関する。本明細書で用いられるアンチセンス療法とは、本発明に係るＧＲＦ２経路成分の一つをコードする細胞性のｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡを含む細胞環境下で特異的にハイブリダイズする（例えば、結合する）オリゴヌクレオチドプローブまたはそれらの誘導体を投与し、または、インサイチュで生成することによって、そのタンパク質の発現を阻害すること（例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって）を意味する。結合は、決まった塩基対の相補性によってなされ、または、例えば二本鎖ＤＮＡに結合する場合は、ダブルヘリックスの主溝における特異的な相互作用を介して結合が起こる。一般的に、アンチセンス療法とは、当業界で通常用いられる技術範囲を意味し、オリゴヌクレオチド配列への特異的な結合によるいかなる治療も含まれる。
【０１２０】
本発明のアンチセンス構造（構造）は、例えば、細胞中で転写される場合、ＧＲＦ２経路成分をコードする細胞のｍＲＮＡの少なくとも特有な部分に相補的なＲＮＡを生産する発現プラスミドとして提供される。あるいは、アンチセンス構造は、エクスビボで生成するオリゴヌクレオチドプローブであり、これは、細胞に導入された場合、ＧＲＦ２経路成分をコードするｍＲＮＡおよび／またはゲノム配列とハイブリダイズすることによって発現を阻害する。このようなオリゴヌクレオチドプローブとして好ましくは、内在性ヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼ）に耐性であり、従ってインビボで安定な、改変オリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いられる代表的な核酸分子は、ＤＮＡのホスホラミデート、ホスホチオエートおよびメチルホスホネート類似体である（米国特許第５，１７６，９９６号；第５，２６４，５６４号；および第５，２５６，７７５号も参照）。加えて、アンチセンス療法に有用なオリゴマーを構築する一般的な方法は、例えば、ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６；およびＳｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４８：２６５９−２６６８に記載される。
【０１２１】
従って、本発明の改変オリゴマーは、治療、診断、および研究の環境において有用である。治療用途において、当該オリゴマーは、一般的にアンチセンス療法に適切な方法で利用できる。このような療法のために、全身および局所的または部分的な投与を含む様々な投与様式にあわせて本発明のオリゴマーを配合することができる。通常、技術や配合については、Ｒｅｍｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｅａｄｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ）で見出すことができる。全身投与に関しては、注射が好ましく、例えば筋肉注射、静脈注射、腹膜内注射、結節内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌ）注射、および皮下注射があり、本発明のオリゴマーは、液体、好ましくは生理学的に適合可能な緩衝液（例えばハンクス液またはリンガー液）に配合することができる。加えて、当該オリゴマーは、固形状で配合され、使用直前に再溶解または懸濁することができる。また、凍結乾燥形態も含まれる。
【０１２２】
また、経粘膜または経皮の方法で全身投与することができ、また上記化合物を経口的に投与することもできる。経粘膜または経皮投与に関して、関門（ｂａｒｒｉｅｒ）を透過させるのに適した浸透剤が製剤に用いられる。このような浸透剤としては、一般的に当業界で知られており、例えば、経粘膜投与のための胆汁酸塩やフシジン酸誘導体がある。加えて、透過を促進するのに界面活性剤を用いることができる。経粘膜投与は、鼻内噴霧を介して、または、坐剤を用いてなされ得る。経口投与に関して、上記オリゴマーは、従来の経口投与形態、例えばカプセル、錠剤、およびトニックに配合される。局所投与に関して、本発明のオリゴマーは、一般的に当業界で既知の軟膏、軟膏剤（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリーム剤に配合される。
【０１２３】
治療での使用に加えて、本発明のオリゴマーは、診断試薬として用いることができ、当該診断試薬は、上記オリゴマーが特異的に結合するターゲットＤＮＡまたはＲＮＡ配列の存在または非存在を検出し、例えば、本発明の遺伝子の発現レベルを決定したり、本発明の遺伝子が遺伝学的な異常を含むかどうかを決定したりできる。
【０１２４】
本発明の他の観点において、本発明に係る核酸は発現ベクター中に供給され、当該発現ベクターは、目的のＧＲＦ２経路成分ポリペプチドをコードし、少なくとも１つの調節配列が操作可能に連結したヌクレオチド配列を含む。「操作可能に連結された」とは、ヌクレオチド配列を発現させるような方法でヌクレオチド配列が調節配列に連結されていることを意味するものとする。調節配列は、技術的に認識されており、ＧＲＦ２経路成分の活性を有するポリペプチドが発現するように選択される。従って、「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御因子を含む。代表的な調節配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ （１９９０））に記載される。例えば、ＤＮＡ配列が発現制御配列に操作可能に連結された場合、ＤＮＡ配列の発現を制御するような多様な発現制御配列のいずれもこれらベクター中で用いることができ、それによって本発明のＧＲＦ２経路成分をコードするＤＮＡ配列を発現する。このような有用な発現制御配列としては、例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルス前初期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣまたはＴＲＣ系、Ｔ７プロモーター（その発現はＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより指示される）、λファージの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質に関する制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖系酵素に関するプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母のα−交配因子プロモーター、バキュロウイルス系の多角体プロモーター、および、原核細胞もしくは真核細胞またはそのウイルスの遺伝子発現を制御することが知られている他の配列、およびそれらの様々な組み合わせ、が挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞および／または発現が望まれるタンパク質のタイプなどの要素に依存すると理解されるべきである。その上、ベクターのコピー数、コピー数を制御する能力、ベクターによりコードされた他のタンパク質（例えば抗生物質マーカー）のいずれかの発現も考慮されるべきである。
【０１２５】
本発明に係る遺伝子構造を用いて、本発明に係るＧＲＦ２経路成分ポリペプチドを培地で増殖させた細胞中で発現させ、例えば、タンパク質またはポリペプチド（精製のための融合タンパク質またはポリペプチドを含む）を生産することができることは、明白である。
【０１２６】
また、本発明は、１以上の本発明に係るＧＲＦ２−ＩＰ、Ｎｄｒ−ＩＰ、Ｓｋｂ１−ＩＰ、ｐＩＣｌｎ−ＩＰ、ＰＰ２Ｃ−ＩＰ、４．１ＳＶＷＬ２−ＩＰ、ｓｍＤ１−ＩＰ、およびｓｍＤ３−ＩＰタンパク質のコーディング配列を含む組換え遺伝子でトランスフェクトした宿主細胞に関する。当該宿主細胞は、どのような原核または真核細胞でもよい。例えば、本発明のポリペプチドは、微生物細胞（例えばＥ． ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を利用）、酵母、または哺乳動物細胞で発現させることができる。他の適切な宿主細胞が当業者既知である。
【０１２７】
従って、本発明はさらに、本発明に係るＧＲＦ２経路成分ポリペプチドを生産する方法に関する。例えば、ＧＲＦ２経路成分ポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトした宿主細胞を、上記ポリペプチド発現を起こすのに適した条件下で培養することができる。上記ポリペプチドは、細胞の混合物やポリペプチドを含む培地から分離・単離することができる。あるいは、上記ポリペプチドが細胞質中に保持される場合、その細胞を回収し、溶解し、そのタンパク質を単離する。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養物に適切な培地は、当業界周知である。上記ポリペプチドは、当業界で知られたタンパク質精製の技術を用いて、細胞培地、宿主細胞、またはその両方から単離することができ、上記精製技術としては、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、限外ろ過、電気泳動、および、ＧＲＦ２経路成分の特定のエピトープに特異的な抗体を用いたイムノアフィニティー精製がある。好ましい実施形態において、ＧＲＦ２経路成分は、その精製を促進するドメインを含む融合タンパク質であり、例えばＧＲＦ２経路成分−ＧＳＴ融合タンパク質である。
【０１２８】
従って、本発明に記載のＧＲＦ２経路成分のクローニングで得られたヌクレオチド配列は、上記タンパク質の全部または選択された部分をコードしており、これらは、微生物細胞または真核細胞のプロセスにより上記タンパク質の組換え形態を生産するのに用いることができる。標準的な方法として、ポリヌクレオチド配列を遺伝子構造（例えば発現ベクター）にライゲーションし、および、真核細胞（酵母、鳥類、昆虫または哺乳動物の細胞）または原核細胞（細菌細胞）のいずれかの宿主へ形質転換またはトランスフェクションする。本発明に従って、類似の方法またはその改変方法を用いて、微生物による方法または組織培養技術で組換えＧＲＦ２経路成分、またはその部分を調製することができる。
【０１２９】
クローニングされた遺伝子またはその部分を、原核細胞、真核細胞のいずれか、またはその両方で発現させるのに適切なベクターにライゲーションすることによって、組換えＧＲＦ２経路成分を生産することができる。組換えＧＲＦ２経路成分を生産するための発現媒体としては、プラスミドおよび他のベクターがある。例えば、ＧＲＦ２経路成分の発現に適切なベクターとしては、原核細胞（例えばＥ． ｃｏｌｉ）での発現用として、以下の型のプラスミド：ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミドおよびｐＵＣ由来プラスミドがある。
【０１３０】
酵母中で組換えタンパク質を発現させるための多数のベクターがある。例えば、ＹＥＰ２４、ＹＩＰ５、ＹＥＰ５１、ＹＥＰ５２、ｐＹＥＳ２、およびＹＲＰ１７は、遺伝子構造をＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに導入するのに有用なクローニングおよび発現媒体である（例えば、Ｂｒｏａｃｈ ｅｔ ａｌ．， （１９８３） ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ｅｄ． Ｍ． Ｉｎｏｕｙｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ｐ． ８３を参照；参照によって本明細書に含まれる）。これらのベクターは、ｐＢＲ３２２のｏｒｉの存在によりＥ． ｃｏｌｉ中で複製でき、および、酵母２μプラスミドの複製の決定基（決定基）によりＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で複製できる。加えて、薬剤耐性マーカー（例えばアンピシリン）も用いることができる。
【０１３１】
好ましい哺乳動物発現ベクターは、細菌でベクターの増殖を促進するような原核性の配列と、真核細胞で発現される１以上の真核性の転写単位とを両方含む。真核細胞のトランスフェクションに適切な哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来のベクターがある。これらのベクターのいくつかを、細菌性のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２）からの配列を用いて改変することによって、原核および真核細胞の両方で複製および薬剤耐性セレクションを容易にすることができる。あるいは、ウイルス誘導体、例えば、ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ−１）、またはエプスタイン−バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）も、真核細胞でのタンパク質の一過性発現に用いることができる。他のウイルス性発現系（レトロウイルス性を含む）の例は、以下の遺伝子治療運搬システムの説明で示される。プラスミドの調製や宿主生物の形質転換に用いられる様々な方法は、当業界周知である。原核および真核細胞の両方のための他の適切な発現系、同様に、一般的な組換え方法に関しては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄ， ｅｄ． ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９））の第１６章および第１７章を参照すること。いくつかの例においては、バキュロウイルス発現系を用いることによって組換えＧＲＦ２経路成分を発現させることが説明される。このようなバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来ベクター（例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（例えばｐＡｃＵＷ１）、およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクター（例えば、β−ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ）がある。
【０１３２】
完全長ＧＲＦ２経路成分のカルボキシル末端断片、すなわち短縮された変異体（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ）の発現が所望の場合、所望の配列を含むオリゴヌクレオチド断片に開始コドン（ＡＴＧ）を付加し、発現させることが必要である。メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）酵素を用いてＮ末端のメチオニンの位置を酵素的に開裂することができることは当業界周知である。ＭＡＰは、Ｅ． ｃｏｌｉ（Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ ｅｔ ａｌ．， （１９８７） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６９：７５１−７５７）およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍからクローニングされており、これらは組換えタンパク質でインビトロ活性を有する（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９８７） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８４：２７１８−１７２２）。従って、必要であれば、インビボで、すなわちこのような組換えポリペプチドをＭＡＰを生産する宿主（例えば、Ｅ． ｃｏｌｉまたはＣＭ８９またはＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で発現させることによって、または、インビトロで、すなわち精製ＭＡＰを用いて（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ等の方法で）、のいずれにおいても、Ｎ末端メチオニンの除去は達成できる。
【０１３３】
あるいは、異なるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む融合遺伝子の一部として、上記ポリペプチドに関するコーディング配列を含ませることができる。このタイプの発現系は、例えば、ＧＲＦ２経路成分の免疫原性の断片を生産したい場合の条件下で有用である。例えば、ロタウイルスのＶＰ６キャプシドタンパク質は、単量体形態またはウイルス粒子形態のいずれかで、ポリペプチドの部分に対する免疫学的な担体タンパク質として用いることができる。ＧＲＦ２経路成分の部分（それに対する抗体が生産される予定の）に対応する核酸配列は、後期のワクシニアウイルス構造タンパク質に関するコーディング配列を含む融合遺伝子構造に組み入れられ、ビリオン部分としてのタンパク質部分を含む融合タンパク質を発現する組換えウイルスのセットが生産される。また、Ｂ型肝炎表面抗原もその役割において同様に用いることができる。同様に、免疫原性を強化するために、ＧＲＦ２経路成分の部分およびポリオウイルスキャプシドタンパク質を含む融合タンパク質をコードするキメラ構造を製造することができる（例えば、欧州特許公報第０２５９１４９号；ａｎｄ Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３８５；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：３８５５；ａｎｄ Ｓｃｈｌｉｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６：２を参照）。
【０１３４】
ペプチドに基づく免疫化のための複数の抗原ペプチド系が利用でき、この際、所望のＧＲＦ２経路成分の部分は、有機化学によりオリゴマー状に分岐したリシンコア上に直接合成されたペプチドから得ることができる（例えば、Ｐｏｓｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） ＪＢＣ ２６３：１７１９ ａｎｄ Ｎａｒｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：９１４を参照）。また、ＧＲＴ２経路成分の抗原決定基も、細菌性の細胞により発現および提示され得る。
【０１３５】
免疫原性を強化するために融合タンパク質を利用することに加えて、融合タンパク質もタンパク質発現を促進するすることが広く認識されている。例えば、本発明のＧＲＦ２経路成分を、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として生成することができる。このようなＧＳＴ融合タンパク質を用いてＧＲＦ２経路成分の精製を簡単にすることができ、例えば、グルタチオンで誘導されたマトリックスの使用を介してなされる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｅｄｓ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， （Ｎ．Ｙ．：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９１）を参照）。
【０１３６】
他の実施形態において、精製リーダー配列（例えば、組換えタンパク質の所望の部分のＮ末端におけるポリ（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ開裂部位配列）をコードする融合遺伝子により、発現された融合タンパク質をＮｉ２＋金属樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することができる。その後、エンテロキナーゼで処理して精製リーダー配列を除去し、精製ＧＲＦ２経路成分を得る（例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉ ｅｔ ａｌ．， （１９８７） Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１１：１７７；ａｎｄ Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：８９７２を参照）。
【０１３７】
さらに他の実施形態において、相互作用する２種のタンパク質を含むように本発明に係る融合タンパク質を生成することができ、それにより、例えば、タンパク質複合体の共有結合型の変異体（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｖｅｒｓｉｏｎ）が形成される。例えば、本明細書においては、ＧＲＦ２およびＧＲＦ２−ＩＰ、ＮｄｒおよびＮｄｒ−ＩＰ、Ｓｋｂ１およびＳｋｂ１−ＩＰ、ｐＩＣｌｎおよびｐＩＣｌｎ−ＩＰ、ＰＰ２ＣおよびＰＰ２Ｃ−ＩＰ、４．１ＳＶＷＬ２および４．１ＳＶＷＬ２−ＩＰ、ｓｍＤ１およびｓｍＤ１−ＩＰ、またはｓｍＤ３およびｓｍＤ３−ＩＰポリペプチド部分を含む融合タンパク質が考慮される。特定の例においては、２種の異なるタンパク質間で相互作用が可能なフレキシブルなポリペプチドリンカー配列を含むことが望ましい。
【０１３８】
融合遺伝子を製造する技術が周知である。本質的には、異なるポリペプチド配列をコードする様々なＤＮＡ断片の連結は、従来技術に従ってなされ、すなわち、ライゲーションのために平滑末端とずれた末端（ｓｔａｇｇｅｒ−ｅｎｄｅｄ）とを用い、制限酵素消化して適切な末端にし、適切な相補末端で充填し、アルカリホスファターゼ処理して望ましくない連結を防ぎ、および酵素的にライゲーションすることによってなされる。他の実施形態において、融合遺伝子は、ＤＮＡ自動合成装置などの従来技術によって合成できる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子断片間の相補的なオーバーハングを生じるアンカープライマーを用いてなされ、その後、アニールすることによってキメラ遺伝子配列が得られる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｅｄｓ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：１９９２を参照）。
【０１３９】
４．代表的なポリペプチド
また本発明は、単離および／または精製された形態の本発明に係るＧＲＦ２経路成分を利用可能にし、当該成分は単離形態であるか、またあるいは、通常タンパク質と結合し得る他の細胞内のタンパク質または当該タンパク質を含む特定の複合体を実質的に含まない。「他の細胞のタンパク質を実質的に含まない」（また「他の細胞のタンパク質」とは、本明細書では「混入タンパク質」ともいう）という用語は、例えば、ＧＲＦ２経路成分の調製物が、２０％未満（乾燥重量で）の混入タンパク質、好ましくは５％未満の混入タンパク質しか含まないことと定義される。本明細書で説明されるクローン化遺伝子を用いて精製された調整物のような、ＧＲＦ２経路成分ポリペプチドの機能的な形態が初めて調製される。「精製された」とは、ポリペプチドに言及される場合、指定の分子が実質的に他の生体高分子、例えば他のタンパク質（混入タンパク質）の非存在下で存在することを意味する。本明細書で用いられる「精製された」という用語は、好ましくは少なくとも８０％（乾燥重量で）、より好ましくは９５〜９９重量％の範囲、最も好ましくは少なくとも９９．８重量％の同じ型の生体高分子が存在することを意味する（しかしながら、水、緩衝液、および他の低分子、特に５０００未満の分子量を有する分子は存在してよい）。本明細書で用いられる「純粋な」という用語は、好ましくは、直前で述べた「精製された」と同じ数的限定を有する。「単離された」および「精製された」とは、天然状態の天然物質、または、成分に分離されているが（例えば、アクリルアミドゲルで）純粋な（例えば、混入タンパク質、または、変性剤などのクロマトグラフィー試薬、および、例えば、アクリルアミドまたはアガロースなどのポリマーを含まない）物質または溶液のいずれの状態でもない天然物質はいずれも含まれない。
【０１４０】
本発明の他の観点は、完全長ＧＲＦ２経路成分から誘導されたポリペプチドに関する。本発明に係るタンパク質の単離されたペプチジル部分は、このようなポリペプチドをコードする核酸の対応する断片から組換えにより製造されたポリペプチドをスクリーニングすることによって得られる。加えて、断片は、従来のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相によるｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学のような当業界で知られた技術を用いて化学的に合成できる。例えば、本発明に係るタンパク質のいずれか一つは、所望の長さの断片（断片のオーバーラップを含まない）に任意に分割でき、また好ましくは、所望の長さのオーバーラップする断片に分割してもよい。上記断片を製造し（組換えまたは化学合成により）、試験することによって、特異的タンパク質複合体形成の、またはより一般的にはＧＲＦ２シグナル伝達経路のアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとして機能する上記ペプチジル断片を、例えばマイクロインジェクション分析によって同定することができる。
【０１４１】
治療または予防の有効性、または安定性（例えば、エクスビボでの貯蔵寿命や、インビボでのタンパク分解に対する耐性）を強化する等の目的で、本発明に係るＧＲＦ２経路成分の構造を改変することも可能である。このような改変ポリペプチドは、そのタンパク質の天然に存在する形態の少なくとも１つの活性を保持するように設計された場合、本明細書においてより詳細に説明されるＧＲＦ２経路成分と同等の機能を有するものと解釈される。このような改変ポリペプチドは、例えば、アミノ酸置換、欠失、または付加によって生産できる。
【０１４２】
例えば、イソロイシンまたはバリンでのロイシンの単独置換、グルタミン酸でのアスパラギン酸の単独置換、セリンでのスレオニンの単独置換、または、構造的に関連するアミノ酸での同類アミノ酸置換（すなわち、保存的な変異）は、結果生じる分子の生物活性に目立った影響を与えないことが合理的に予想できる。保存的な置換は、側鎖が関連したアミノ酸ファミリー間で起こる。遺伝的にコードされたアミノ酸は、以下の４つのファミリーに分けることができる：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非電荷、極性 ＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンであり、場合によって、これらはまとめて芳香族アミノ酸と分類される。同様の方法で、アミノ酸群を以下のように分類できる：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン、（３）脂肪族＝グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニンであり、ここでセリンおよびスレオニンは、場合により、脂肪族−ヒドロキシルとして別に分類される；（４）芳香族＝フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン；（５）アミド＝アスパラギン、グルタミン；および（６）硫黄含有＝システインおよびメチオニンである（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２ｎｄ Ｅｄ， ｅｄ． ｂｙ Ｌ． Ｓｔｒｙｅｒ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， １９８１を参照）。ポリペプチドのアミノ酸配列における変化により機能的な相同体が生じたかどうかは、変異ポリペプチドが野生型タンパク質と同じように細胞中で応答を発生させる能力を評価することによって、容易に調べられる。例えば、このようなＧＲＦ２経路成分の変異型を、他のポリペプチド、例えば他のＧＲＦ２経路成分と結合する能力に関して評価できる。２以上置換されたポリペプチドは、同じ方法で簡単に試験することができる。
【０１４３】
さらに本発明は、本発明に係るＧＲＦ２経路成分のコンビナトリアル変異体のセット、同様に、短縮された（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）変異体を生産する方法を考慮しており、当該方法は特に、ＧＲＦ２経路成分への結合において機能する可能性のある変異配列（例えば、相同体）を同定するのに有用である。このようなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、アゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとして作用し得るＧＲＦ２経路成分の相同体、またあるいは、新規の活性を全て共に有するＧＲＦ２経路成分の相同体を生産することである。コンビナトリアルで誘導された相同体として、天然に存在するＧＲＦ２経路成分に関連する選択的な効力を有する相同体が生産できる。このようなタンパク質を、組換えＤＮＡ構造で発現させることによって、遺伝子治療プロトコールに用いることができる。
【０１４４】
同様に、変異誘発により、対応する野生型タンパク質とは劇的に異なる細胞内の半減期を有する相同体を得ることができる。例えば、変化したタンパク質において、タンパク分解または他の細胞性プロセスに対する安定性を高くさせるか、または、低くさせることが可能であり、それによりＧＲＦ２経路成分の破壊あるいは不活性化をもたらす。このような相同体、およびそれらをコードする遺伝子は、そのタンパク質の半減期を調節することによって、ＧＲＦ２経路成分の発現を変えるのに利用できる。例えば、短い半減期により、より多くの一時的な生物学的効果を生じさせることができ、さらに、誘導性の発現系の場合には、組換えＧＲＦ２経路成分の細胞内レベルをより強く制御することができる。上述したように、このようなタンパク質、および、特にその組換え核酸構造は、遺伝子治療プロトコールに用いることができる。
【０１４５】
同様の方法において、ＧＲＦ２経路成分相同体は、現在のコンビナトリアル方法により、アンタゴニストとして作用するように生産でき、この場合、上記相同体は、対応する野生型タンパク質がＧＲＦ２仲介シグナル伝達を調節する能力を妨害することができる。
【０１４６】
本発明の方法の代表的な実施形態において、ＧＲＦ２経路成分相同体の集団に関するアミノ酸配列は並べられ、それにより、好ましくは、可能な最も高い相同性を得ることができる。このような変異体の集団は、例えば、１以上の種から得られた相同体、または、同じ種だが変異のために異なる相同体を含む。並べられた配列の各位置にみられるアミノ酸は、コンビナトリアル配列のディジェネレートセットが得られるように選択される。好ましい実施形態において、コンビナトリアルライブラリーは、それぞれ可能性のあるＧＲＦ２経路成分配列の部分を少なくとも含むポリペプチドのライブラリーをコードする遺伝子のディジェネレートライブラリーを用いて生産される。例えば、可能性のあるＧＲＦ２経路成分のヌクレオチド配列のディジェネレートセットが個々のポリペプチドとして、またあるいは、より大きい融合タンパク質のセットとして（例えば、ファージディスプレイのために）発現可能な遺伝子配列に、合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的にライゲーションできる。
【０１４７】
多くの方法によって、可能性のある相同体のライブラリーが、ディジェネレートオリゴヌクレオチド配列から生産できる。ディジェネレート遺伝子配列の化学合成は、ＤＮＡ自動合成装置を用いて行うことができ、次に、その合成遺伝子は、発現用の適切な遺伝子にライゲーションできる。遺伝子のディジェネレートセットの目的は、１つの混合物に、可能性のあるＧＲＦ２経路成分配列の所望のセットをコードする配列全てを含ませることである。ディジェネレートオリゴヌクレオチドの合成は当業界周知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ， ＳＡ（１９８３） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９８１） Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， Ｐｒｏｃ， ３ｒｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｓｙｍｐｏｓ． Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ｅｄ． ＡＧ Ｗａｌｔｏｎ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ｐｐ２７３−２８９；Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９８４） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９８４） Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６；Ｉｋｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １１：４７７を参照）。このような技術は、他のタンパク質の方向付けられた進化に用いられている（例えば、Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９２） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：２４２９−２４３３；Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．，（１９９０） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：６３７８−６３８２；同様に、米国特許第５，２２３，４０９号、第５，１９８，３４６号、および第５，０９６，８１５号を参照）。
【０１４８】
あるいは、変異誘発の他の形態をコンビナトリアルライブラリーを生産するのに利用することができる。例えば、ＧＲＦ２経路成分相同体（アゴニストおよびアンタゴニスト形態の両方）を生産し、スクリーニングによってライブラリーから単離され、ここで当該スクリーニングとしては、例えば、アラニンスキャニングによる変異誘発等を用いたスクリーニング（Ｒｕｆ ｅｔ ａｌ．，（１９９４） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１５６５−１５７２；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：３０９５−３０９９；Ｂａｌｉｎｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９３） Ｇｅｎｅ １３７：１０９−１１８；Ｇｒｏｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９３） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１８：５９７−６０１；Ｎａｇａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：２８８８−２８９２；Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０８３２−１０８３８；ａｎｄ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）、リンカースキャニング変異誘発によるスクリーニング（Ｇｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９３：６５３ −６６０；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２：２６４４−２６５２；ＭｃＫｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３１６）、飽和変異誘発によるスクリーニング（Ｍｅｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：６１３）、ＰＣＲ変異誘発によるスクリーニング（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １：１１−１９）、または、化学的な変異誘発などを含むランダム変異誘発によるスクリーニングがある。（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９２） Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ；ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９４） Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７：３２−３４）。リンカースキャニング変異誘発は、特にコンビナトリアルのセッティングにおいて、ＧＲＦ２経路成分の短縮された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）（生物活性）形態を同定するのに魅力的な方法である。
【０１４９】
点変異および短縮（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）により製造されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための方法、その方法に関して、特定の特性を有する遺伝子産物に関してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法について、広範な技術が当業界で知られている。このような技術は、通常、ＧＲＦ２経路成分相同体のコンビナトリアル変異誘発によって生成した遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用できる。大規模な遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広く用いられる技術は、一般的に、複製可能な発現ベクターに遺伝子ライブラリーをクローニングし、適切な細胞に形質転換することによりベクターのライブラリーを得て、所望の活性の検出により、生産物がすでに検出されている遺伝子をコードするベクターを比較的簡単に単離させるような条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。以下に説明される各分析例は、コンビナトリアル変異誘発技術により製造された大量のディジェネレート配列をスクリーニングするのに必要なハイスループット分析で処理することができる。
【０１５０】
スクリーニング分析の実施形態の例を説明すると、本発明に係るタンパク質のいずれか一つの候補のコンビナトリアル遺伝子産物が細胞またはウイルスの表面に表示され、特定の細胞またはウイルス粒子の、他のＧＲＦ２経路成分（例えばＧＲＦ２または表１〜９で示されたタンパク質）を結合させる能力が「パニング分析（ｐａｎｎｉｎｇ ａｓｓａｙ）」で検出される。例えば、ＧＲＦ２−ＩＰ　変異体のライブラリーを、細菌性の細胞表面膜タンパク質に関する遺伝子にクローニングすることができ（Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，　ＷＯ８８／０６６３０；Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０−１３７１；ａｎｄ Ｇｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９２） ＴＩＢＳ １８：１３６−１４０）、結果生じた融合タンパク質を、例えばＧＲＦ２−ＩＰに結合する蛍光標識された分子（例えばＦＩＴＣで標識されたＧＲＦ２）を用いたパニングによって検出し、可能性のある機能的な相同体に関するスコアを取る。蛍光顕微鏡により細胞を視覚的に観察、分離することができ、また、細胞の形態学が可能であれば、蛍光活性化セルソーターで細胞を分離することができる。前述の説明は、ＧＲＦ２−ＩＰとＧＲＦ２とが関与する相互作用を利用する実施形態に対して向けられているが、例えば、Ｎｄｒ−ＩＰ、Ｓｋｂ１−ＩＰ、ｐＩＣｌｎ−ＩＰ、ＰＰ２Ｃ−ＩＰ、４．１ＳＶＷＬ２、ｓｍＤ１、およびｓｍＤ３タンパク質およびその同種の結合パートナーを用いても同様の実施形態が可能であることが理解できる。
【０１５１】
同様の方法において、上記遺伝子ライブラリーは、ウイルス粒子の表面で融合タンパク質として発現させることができる。例えば、糸状ファージ系において、外来ペプチド配列を感染性のファージの表面上で発現させることができ、それにより２つの顕著な利点が得られる。第一に、これらのファージは非常に高濃度でアフィニティーマトリックスに適用できるため、多数のファージを同時にスクリーニングすることができる。第二に、各感染性ファージがその表面にコンビナトリアル遺伝子産物を表示するため、特定のファージが低い収率でしかアフィニティーマトリックスから回収されなかったとしても、そのファージを感染をさらに行うことによって増幅することができる。殆ど同一のＥ． ｃｏｌｉ糸状ファージＭ１３、ｆｄ、およびｆ１のグループがファージディスプレイライブラリーに最も頻繁に用いられるが、これは、ファージｇＩＩＩまたはｇＶＩＩＩコートタンパク質のいずれかも、ウイルス粒子の根本的なパッケージングを破壊することなく融合タンパク質を生成するのに用いることができるためである（Ｌａｄｎｅｒ等のＰＣＴ出願ＷＯ９０／０２９０９；Ｇａｒｒａｒｄ等のＰＣＴ出願ＷＯ９２／０９６９０；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：１６００７−１６０１０；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９３） ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５−７３４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８；ａｎｄ Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９２） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：４４５７−４４６１）。
【０１５２】
また本発明は、本発明に係るＧＲＦ２経路成分の減少を提供することによって、ミメティック、例えば、ペプチドまたは非ペプチド薬剤を生産することができ、当該ミメティックは、元のタンパク質が他の細胞内のパートナーに結合することを模擬できる。また、このような上述の変異誘発技術は、チオレドキシン系も同様に、特に、例えば、本発明に係るタンパク質の相互の結合を含むタンパク質−タンパク質相互作用に関与するＧＲＦ２経路成分の決定基のマッピングに有用である。説明すると、基質タンパク質の分子認識に関与するＧＲＦ２経路成分に決定的な残基を決定し、それを用いることによって、ＧＲＦ２経路成分から誘導されたペプチドミメティックを生産することができ、ここで上記ペプチドミメティックは、基質タンパク質に結合し、さらに、ＧＲＦ２経路成分の結合を抑制することによって、その生物活性を抑制するように作用する。他のポリペプチドとの結合に関与するＧＲＦ２経路成分のアミノ酸残基をマッピングするために、例えば、スキャニング変異誘発を用いることによって、ペプチドミメティック化合物を、結合に関与するそれら残基を模擬するように生産できる。例えば、このような残基の非加水分解性のペプチド類似体は、ベンゾジアゼピン（例えば、Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇ．Ｒ． Ｍａｒｓｈａｌｌ Ｅｄ， ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ， １９８８を参照）、アゼピン（例えば、Ｈｕｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇ． Ｒ． Ｍａｒｓｈａｌｌ Ｅｄ， ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ， １９８８を参照）、置換されたγラクタム環（Ｇａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇ．Ｒ． Ｍａｒｓｈａｌｌ Ｅｄ， ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ， １９８８）、ケト−メチレンプソイドペプチド（Ｅｗｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８６） Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２９：２９５；ａｎｄ Ｅｗｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ （９ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍの議事録） Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． Ｒｏｃｋｌａｎｄ， ＩＬ， １９８５）、β−ターンジペプチドコア（Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．， （１９８５） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２６：６４７；ａｎｄ Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，（１９８６） Ｊ． Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ １：１２３１）、およびβ−アミノアルコール（Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８５） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １２６：４１９；ａｎｄ Ｄａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８６） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １３４：７１）を用いて生産可能である。
【０１５３】
５．ヌクレオチドおよびポリペプチド配列の相同性検索
本発明のヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、データベース（ＧｅｎＢａｎｋ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＢＬＯＣＫＳ、およびＰｉｍａＩＩなど）に対する問い合わせ配列として用いることができる。これらのデータベースは、すでに同定された注釈付きの配列を含み、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｉｎｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌを表す）を用いて相同性（類似性）領域に関して検索可能である（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ Ｆ （１９９３） Ｊ． Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ Ｆ ｅｔ ａｌ （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−１０）。
【０１５４】
ＢＬＡＳＴにより、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の両方のアライメントを得て、配列類似性を決定することができる。アライメントの位置的な性質により、ＢＬＡＳＴは、正確な適合を決定すること、または、原核性（細菌の）または真核性（動物、真菌または植物）の起源由来であり得る相同体を同定することにおいて特に有用である。一次配列パターンおよび二次構造のギャップペナルティーを処理する場合、他のアルゴリズム（例えばＳｍｉｔｈ、Ｒ． Ｆ． ａｎｄ Ｔ． Ｆ． Ｓｍｉｔｈ（１９９２；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ５：３５−５１）で説明されたアルゴリズム；参照により本明細書に含める）を用いてもよい。本出願で開示したように、配列は、少なくとも４９ヌクレオチドの長さであり、不必要な塩基は１２％以下である（ここで、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴではなくＮを記録する）。
【０１５５】
ＢＬＡＳＴ法は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌに記載されるように（１９９３；Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９０：５８７３−７；参考により本明細書に含める）、問い合わせ配列とデータベース配列との間の適合を検索することにより、見出された全ての適合の統計学的な有意差を評価し、使用者が選択した有意な閾値を満たすような適合のみが報告される。好ましくは、この閾値は、ヌクレオチドに対しては１０〜２５、ペプチドに対しては３〜１５に設定される。
【０１５６】
６．代表的な抗体
本発明の他の観点は、ＧＲＦ２経路成分（例えば表１〜９に列挙されたもの）と特異的に反応する抗体に関する。例えば、本発明に係るタンパク質の配列に基づいたペプチドを用いて、特異的な抗血清またはモノクローナル抗体を標準的な方法により製造できる。哺乳動物（例えばマウス、ハムスターまたはウサギ）を、ペプチド（例えば、抗体応答を惹起できる抗原性断片）の免疫原性形態により免疫化することができる。タンパク質またはペプチドに免疫原性を与える技術は、担体への結合、または、当業界周知の他の技術を含む。例えば、本発明に係るタンパク質のいずれか一つのペプチジル部分は、アジュバントの存在下で投与できる。免疫化の進行は、血漿または血清中の抗体のタイターを検出することによってモニターできる。抗原として免疫原を用いて標準的なＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイを行うことによって、抗体レベルを評価することができる。
【０１５７】
免疫化した後、抗血清を得て、所望であれば、ターゲットタンパク質に対するポリクローナル抗体をさらに血清から単離してもよい。モノクローナル抗体を生産するために、抗体生産細胞（リンパ球）を免疫化動物から回収し、不死化細胞（例えば、ハイブリドーマ細胞を得るためのミエローマ細胞）を用いた標準的な体細胞融合法によって融合させることができる。このような技術は当業界周知であり、例えば、ハイブリドーマ技術（もとはといえばＫｏｈｌｅｒ およびＭｉｌｓｔｅｉｎにより開発された；（１９７５） Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−４９７）、同様に、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂａｒ ｅｔ ａｌ．， （１９８３） Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ， ４：７２）、および、ヒトモノクローナル抗体を生産するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， （１９８５） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． ｐｐ． ７７−９６）がある。ハイブリドーマ細胞は、ＧＲＦ２経路成分および単離されたモノクローナル抗体と特異的に反応する抗体の生産に関して、免疫化学的にスクリーニングすることができる。
【０１５８】
本明細書で用いられる「抗体」という用語は、その断片を含むものとし、当該断片はまた、本発明に係るタンパク質または当該タンパク質を含む複合体のいずれか一つと特異的に反応する。抗体は従来技術で断片化でき、さらに、抗体全体について上述したのと同じ方法を利用してスクリーニングできる。例えば、抗体をペプシン処理することによりＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる。得られたＦ（ａｂ’）２断片を処理して、ジスルフィド架橋を還元し、Ｆａｂ’断片を得ることができる。本発明の抗体はさらに、二重特異性分子およびキメラ分子、同様に一本鎖（ｓｃＦｖ）抗体を含むものとする。
【０１５９】
本発明に係る抗体は、三量体の抗体およびヒト化抗体を含み、これらは例えば米国特許第５，５８５，０８９号で説明されたように調製することができる。また一本鎖抗体も本発明の範囲内である。これら抗体および抗体断片の改変形態の全てを「抗体」という用語に含むものとし、より広い用語「ＧＲＦ２経路成分結合タンパク質」に含まれる。
【０１６０】
本発明に係るＧＲＦ２経路成分に対して向けられたモノクローナルおよびポリクローナル抗体（Ａｂ）の両方、および抗体断片（例えばＦａｂ’およびＦ（ａｂ’）２）は、個々のＧＲＦ２経路成分を選択的にブロックし、それにより細胞周期、細胞増殖、分化および／または生存を調節するのに用いることができる。
【０１６１】
一つの実施形態において、本発明に係る抗体は、発現ベクター（例えばλｇｔ１１、λｇｔｌ８〜２３、λＺＡＰ、およびλＯＲＦ８）に構築されたｃＤＮＡライブラリーを免疫学的にスクリーニングすることに用いることができる。このタイプのメッセンジャーライブラリーは、正しいリーディングフレームと方向で挿入されたコーディング配列を含み、融合タンパク質を生産することができる。例えば、λｇｔ１１は、アミノ末端がβ−ガラクトシダーゼアミノ酸配列からなり、そのカルボキシル末端が外来ポリペプチドからなる融合タンパク質を生産する。次に、ＧＲＦ２経路成分の抗原性エピトープ、例えば表１〜９に列挙されたＧＲＦ２経路成分に抗原として関連するタンパク質を、抗体で検出することができ、例えば、感染プレートから持ち上げたニトロセルロースフィルターと、抗ＧＲＦ２経路成分抗体とを反応させることによって検出される。次に、この分析でスコアを付けたファージを感染プレートから単離できる。このようにして、ＧＲＦ２経路成分相同体を検出し、他の源からクローニングできる。
【０１６２】
７．トランスジェニック動物
本発明のさらに他の観点は、ＧＲＦ２−ＩＰ、Ｎｄｒ−ＩＰ、Ｓｋｂ１−ＩＰ、ｐＩＣｌｎ−ＩＰ、ＰＰ２Ｃ−ＩＰ、４．１ＳＶＷＬ２−ＩＰ、ｓｍＤ１−ＩＰ、およびｓｍＤ３−ＩＰタンパク質に関する異種遺伝子を発現するトランスジェニック非ヒト動物、または、動物の組織または細胞型の少なくとも一つで、ＧＲＦ２−ＩＰ、Ｎｄｒ−ＩＰ、Ｓｋｂ１−ＩＰ、ｐＩＣｌｎ−ＩＰ、ＰＰ２Ｃ−ＩＰ、４．１ＳＶＷＬ２−ＩＰ、ｓｍＤ１−ＩＰ、およびｓｍＤ３−ＩＰタンパク質をコードする１以上のゲノム遺伝子を破壊したトランスジェニック非ヒト動物を提供する。例えば、１以上の遺伝子座で破壊を受けたトランスジェニックマウスを、例えば相同組換えにより製造することができる。
【０１６３】
他の観点において、本発明は、誤って発現したＧＲＦ２−ＩＰ、Ｎｄｒ−ＩＰ、Ｓｋｂ１−ＩＰ、ｐＩＣｌｎ−ＩＰ、ＰＰ２Ｃ−ＩＰ、４．１ＳＶＷＬ２、ｓｍＤ１、およびｓｍＤ３タンパク質に関する遺伝子の対立遺伝子を有する発育異常の動物モデルを提供する。例えば、特定の対立遺伝子が欠失したマウス、または、１以上の遺伝子のエキソンの全部または一部が欠失したマウスを飼育できる。このような対立遺伝子変異体がＧＲＦ２−ＩＰ、Ｎｄｒ−ＩＰ、Ｓｋｂ１−ＩＰ、ｐＩＣｌｎ−ＩＰ、ＰＰ２Ｃ−ＩＰ、４．１ＳＶＷＬ２、ｓｍＤ１、およびｓｍＤ３遺伝子に対して生産される場合、このようなマウスモデルは、ＧＲＦ２経路の異常調節により発症する病気の研究に用いることができる。
【０１６４】
従って、本発明は、本発明の形質転換遺伝子を含む細胞（その動物）からなるトランスジェニック動物に関し、好ましくは（ただし場合により）、動物の１以上の細胞で外来性のＧＲＦ２経路成分を発現するトランスジェニック動物に関する。ＧＲＦ２経路成分の形質転換遺伝子は、タンパク質の野生型をコードしてもよいし、または、その相同体（アゴニストおよびアンタゴニストの両方、同様にアンチセンス構造を含む）をコードしてもよい。好ましい実施形態において、形質転換遺伝子の発現は、例えば、所望のパターンに発現を制御するシス作用性配列 を利用して、細胞、組織または発生段階の特定の部分集合に制限される。本発明において、このような本発明に係るタンパク質のモザイク発現は、多くの形態の系列分析に必須であり、加えて、例えば、細胞周期の進行の効果（それにより、異なる正常な胚の組織の小さいパッチにおける発生を大きく改変し得る）を評価する手段を提供する。その結果に対して、組織特異的な調節配列および条件的な調節配列を用いて、特定の空間的なパターンで形質転換遺伝子の発現を制御することができる。その上、例えば、条件的な組換え系または原核性の転写調節配列によって、一時的な発現パターンを提供できる。
【０１６５】
形質転換遺伝子を発現させるための遺伝子技術は、インビボで部位特異的な遺伝子操作により調節でき、当業者既知である。例えば、遺伝学的システムを、リコンビナーゼ発現（ターゲット配列の遺伝子組換えを触媒する）を調節するのに利用できる。本明細書で用いられる「ターゲット配列」という成句は、リコンビナーゼにより遺伝子組換えされたヌクレオチド配列を意味する。ターゲット配列は、リコンビナーゼ認識配列を端に有しており、通常、リコンビナーゼ活性を発現する細胞中で切除または逆転される。リコンビナーゼで触媒された組換え現象は、ターゲット配列の組換えにより本発明に係るＧＲＦ２経路成分ポリペプチドの発現が活性化または抑制されるように設計することができる。例えば、組換えＧＲＦ２経路成分の遺伝子の発現を妨害するターゲット配列の切除を設計して、その遺伝子発現を活性化させることができる。このタンパク質発現の妨害は、様々なメカニズムによって生じ、例えば、ＧＲＦ２経路成分遺伝子をプロモーター要素または内部の停止コドンから空間的に分離することによって生じる。さらに、形質転換遺伝子が形成され、その際、遺伝子のコーディング配列の端にリコンビナーゼ認識配列が置かれ、はじめにプロモーター要素に関して３’から５’への方向で細胞にトランスフェクトされる。このような場合において、ターゲット配列の逆位により、プロモーター要素（転写の活性化を起こすプロモーターを含む）に関する方向にコーディング配列の５’末端を配置させて、本発明に係る遺伝子を再び方向付ける。
【０１６６】
例示された実施形態において、バクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系（Ｌａｋｓｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９２） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６；Ｏｒｂａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：６８６１−６８６５）またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ のＦＬＰリコンビナーゼ系（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１−１３５５；ＰＣＴ公告ＷＯ９２／１５６９４）のいずれを用いても、インビボの部位特異的遺伝子組換え系を製造することができる。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ配列の間に位置する介在ターゲット配列の部位特異的組換えを触媒する。ｌｏｘＰ配列は、Ｃｒｅリコンビナーゼが結合する３４塩基対のヌクレオチド反復配列であり、Ｃｒｅリコンビナーゼが仲介する遺伝子組換えに必要である。ｌｏｘＰ配列の方向により、Ｃｒｅリコンビナーゼが存在する場合に介在ターゲット配列が切除されるか逆転されるかが決定され（Ａｂｒｅｍｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５９：１５０９−１５１４）、すなわち、ｌｏｘＰ配列が直接リピートの向きである場合はターゲット配列の切除を触媒し、ｌｏｘＰ配列が逆転したリピートの向きである場合はターゲット配列の逆転が触媒される。
【０１６７】
従って、ターゲット配列の遺伝子組換えはＣｒｅリコンビナーゼの発現に依存する。リコンビナーゼの発現を、調節的な制御（例えば、組織特異的、発生段階特異的、外部から添加された薬剤での誘導または抑制）を受けやすいプロモーター要素で調節することができる。このような調節された制御により、リコンビナーゼ発現がプロモーター要素で仲介される細胞においてのみターゲット配列の遺伝子組換えが起こり得る。従って、ＧＲＦ２経路成分遺伝子の発現の活性化は、リコンビナーゼ発現の調節を介して調節できる。
【０１６８】
Ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系を用いて組換えＧＲＦ２経路構成タンパク質の発現を調節するために、Ｃｒｅリコンビナーゼと本発明に係るタンパク質との両方をコードする形質転換遺伝子を含むトランスジェニック動物の構築が必要である。Ｃｒｅリコンビナーゼと組換えＧＲＦ２経路成分遺伝子の両方を含む動物は、「ダブル」トランスジェニック動物の構築により得られる。このような動物を得る便利な方法は、２種のトランスジェニック動物（それぞれ形質転換遺伝子、例えば、ＧＲＦ２経路成分遺伝子とリコンビナーゼ遺伝子とを含む）を交配することである。
【０１６９】
リコンビナーゼの仲介で発現可能な形式でＧＲＦ２経路成分の形質転換遺伝子を含むトランスジェニック動物を最初に構築することから得られる利点は、本発明に係るタンパク質がトランスジェニック動物における発現に有害である可能性に由来する。このような場合において、初代集団（全ての組織において本発明に係る形質転換遺伝子がサイレントである）を繁殖させ、維持する。この初代集団の個体は、例えば１以上の組織でリコンビナーゼを発現する動物と交配させることができる。このようにして、初代集団（例えば、アンタゴニスト型のＧＲＦ２経路成分の形質転換遺伝子がサイレントである）を形成し、その初代の後代（特定の組織において、または、発生段階で細胞周期調節が破壊されることにより、例えば致死表現型になる）を研究に用いることができる。
【０１７０】
同様の条件的な形質転換遺伝子を、原核性のプロモーター配列を用いて得ることができ、この際、当該プロモーター配列は、形質転換遺伝子の発現を促進するために、原核性のタンパク質を同時に発現させる必要がある。代表的なプロモーターおよび対応するトランス活性化された原核性のタンパク質は、米国特許第４，８３３，０８０号に記載される。その上、条件的な形質転換遺伝子の発現は、遺伝子治療的な方法で誘導され、この場合、トランス活性化タンパク質、例えばリコンビナーゼまたは原核性のタンパク質をコードする遺伝子は組織に運搬され、細胞型に特異的な方法で発現が起こる。この方法により、ＧＲＦ２経路成分の形質転換遺伝子は、トランス活性化因子の導入によって「開始」されるまで、成人期にサイレントのままでいることができる。
【０１７１】
代表的な実施形態において、本発明の「トランスジェニック非ヒト動物」は、形質転換遺伝子を非ヒト動物の生殖細胞系に導入することによって製造される。様々な発生段階における胎児性のターゲット細胞を用いて、形質転換遺伝子を導入することができる。胎児性ターゲット細胞の発生段階に応じて、異なる方法を用いる。受精体はマイクロインジェクションのための最良のターゲットである。マウスにおいて、雌性前核は直径約２０マイクロメーターの大きさに達するので、１〜２ｐｌのＤＮＡ溶液を再現性よくインジェクションすることができる。遺伝子トランスファーのターゲットとして受精体を用いることは、殆どの場合インジェクションされたＤＮＡは初めの分割の前に宿主遺伝子に組み込まれるという大きい利点がある（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８５） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８２：４４３８−４４４２）。結果として、トランスジェニック非ヒト動物の全ての細胞が組み込まれた形質転換遺伝子を含むようになる。またこれは、一般的に、生殖細胞の５０％が形質転換遺伝子に隣接しているため、形質転換遺伝子の初代の子孫への効率的な伝達に反映される。本発明の実施において、受精体のマイクロインジェクションは、形質転換遺伝子の取り込みのために好ましい方法である。
【０１７２】
また、レトロウイルスの感染を用いて、形質転換遺伝子を非ヒト動物に導入することができる。発生中の非ヒト胚を、胚盤胞期までインビトロで培養することができる。この期間中、その分割球はレトロウイルスの感染に対するターゲットとなり得る（Ｊａｅｎｉｃｈ， Ｒ． （１９７６） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７３：１２６０−１２６４）。効率的な分割球の感染は、酵素処理により透明帯を取り除くことによってなされる（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｎｉｂｒｙｏ， Ｈｏｇａｎ ｅｄｓ． （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， １９８６））。形質転換遺伝子を導入するのに用いられたウイルスベクター系は、一般的に、形質転換遺伝子を有する複製欠損レトロウイルスである（Ｊａｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８５） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８２：６９２７−６９３１；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８５） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５２）。トランスフェクションは、ウイルス生産細胞の単分子層上で分割球を培養することによって容易かつ効率的に達成できる（上記のＶａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ；Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ ６：３８３ −３８８）。あるいは、感染は、後期で行ってもよい。ウイルスまたはウイルス生産細胞を胞胚腔に注入してもよい（Ｊａｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８２） Ｎａｔｕｒｅ ２９８：６２３−６２８）。トランスジェニック非ヒト動物を形成する細胞の部分集合においてのみ取り込みが起こるため、初代の殆どは形質転換遺伝子に関してモザイクである。さらに、初代において、形質転換遺伝子の様々なレトロウイルスの挿入は、ゲノム（通常、子孫で分離する）中の異なる位置でなされる。加えて、懐胎中期の胚の子宮内のレトロウイルス感染により、形質転換遺伝子を生殖細胞系に導入することができる（上記のＪａｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８２））。
【０１７３】
形質転換遺伝子の導入のためのターゲット細胞の第三の型は、胎性幹細胞（ＥＳ）である。インビトロで培養された移植前の胚からＥＳ細胞を得て、胚と融合させる（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８１） Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４−１５６；Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３０９：２５５−２５８；Ｇｏｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８６） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８３：９０６５−９０６９；ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２２：４４５−４４８）。ＤＮＡトランスフェクションまたはレトロウイルスが仲介する導入により、形質転換遺伝子を効率的にＥＳ　細胞に導入できる。その後、このような形質転換されたＥＳ細胞と、非ヒト動物の胚盤胞とを合わせることができる。その後、ＥＳ細胞は胚に定着し、生じるキメラ動物の生殖細胞系に寄与する。参考文献として、Ｊａｅｎｉｓｃｈ， Ｒ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１４６８−１４７４を参照すること。
【０１７４】
ノックアウトまたは破壊トランスジェニック動物の作製方法もまた一般的に知られている。例えば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏを参照すること（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８６）。また、リコンビナーゼ依存性ノックアウトも製造可能であり、例えば、ＧＲＦ２経路成分遺伝子の不活性化の組織特異的および／または一時的な制御が上述したように行われるように、相同組換えによりターゲット配列を挿入して製造される。
【０１７５】
８．ＧＲＦ２経路成分遺伝子および遺伝子産物の検出
また、本発明のＧＲＦ２経路成分で特異的に免疫活性な抗体は、タンパク質発現の存在度およびパターンを評価するために、組織サンプルの免疫組織化学的な染色に用いることができる。体液から単離された組織または細胞における１以上のＧＲＦ２経路成分のレベルを検出および評価するために、臨床的な試験方法の一部として、抗ＧＲＦ２経路成分の抗体を免疫沈降および免疫ブロッティングにおいて診断的に用いることができる。抗ＧＲＦ２経路成分抗体を用いる診断用分析において、例えば、新生物または過形成性の疾患の初期診断で補助となるように設計されたイムノアッセイ、例えば、サンプル中のガン細胞の存在、例えば、ＧＲＦ２経路成分遺伝子の発現レベルが改変された細胞を、正常な細胞に対して検出すること、が含まれる。
【０１７６】
加えて、ヌクレオチドプローブは本発明に係るＧＲＦ２経路成分のクローン化配列から製造することができ、それにより、インタクト組織および組織サンプルを、ＧＲＦ２経路成分をコードした核酸の存在に関して組織学的にスクリーニングすることができる。抗ＧＲＦ２経路成分の抗体の診断における使用と同様に、ＧＲＦ２経路成分をコードしたｍＲＮＡまたはゲノムＧＲＦ２経路成分の遺伝子配列に向けられたプローブの使用は、例えば、新生物または過形成性の疾患（例えば、不要な細胞成長）または不要な分化現象で明白な対立遺伝子変異の予測および治療的な評価のいずれにも用いることができる。
【０１７７】
抗ＧＲＦ２経路成分の抗体のイムノアッセイと、ヌクレオチドプローブとを併せて用いることによって、発育障害（ＧＲＦ２経路成分の発現（またはその欠失）に関連した数々の異常を含む）に対する分子機構の決定を促進することができる。例えば、ＧＲＦ２経路成分合成における変化と、コーディング配列の変異とを区別できる。
【０１７８】
一つの実施形態において、本発明の方法は、タンパク質分解、異常細胞増殖および／または分化を特徴とする障害に対するリスクを検体が有するかどうかを決定する方法を提供する。好ましい実施形態において、当該方法は、通常、脊椎動物の検体（好ましくはヒトまたは他の哺乳動物の検体）からの細胞サンプルにおいて、遺伝的な異常の存在または非存在を検出することを含むことを特徴とし、ここで当該遺伝的な異常は、少なくとも以下の（ｉ）または（ｉｉ）のいずれか一つを特徴とする：（ｉ）ＧＲＦ２経路成分の遺伝子の完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）に影響を及ぼす変性；または（ｉｉ）ＧＲＦ２経路成分の遺伝子の誤った発現。例証として、このような遺伝的な異常は、少なくとも以下の（ｉ）〜（ｉｘ）のいずれか一つの存在を確認することによって検出することができる：（ｉ）ＧＲＦ２経路成分の遺伝子からの１以上のヌクレオチドの欠失、（ｉｉ）１以上のヌクレオチドのＧＲＦ２経路成分の遺伝子への付加、（ｉｉｉ）ＧＲＦ２経路成分の遺伝子の１以上のヌクレオチドの置換、（ｉｖ）ＧＲＦ２経路成分の遺伝子の著しい染色体の配列換え、（ｖ）ＧＲＦ２経路成分の遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写レベルの著しい変化、（ｖｉ）ゲノムＤＮＡのメチル化パターン等におけるＧＲＦ２経路成分の遺伝子の異常な修飾、（ｖｉｉ）ＧＲＦ２経路成分の遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写の非野生型スプライシングパターンの存在、（ｖｉｉｉ）非野生型のＧＲＦ２経路構成タンパク質のレベル、および（ｉｘ）ＧＲＦ２経路構成タンパク質の不適切な翻訳後修飾。以下に示すように、本発明は、ＧＲＦ２経路成分の遺伝子における異常を検出するための多数の分析技術を提供し、さらに重要なことには、ＧＲＦ２仲介シグナル伝達依存性の異常な細胞成長、増殖および／または分化の基礎となる様々な分子レベルの原因を識別する能力を提供する。
【０１７９】
代表的な実施形態において、（精製）オリゴヌクレオチドプローブを含む核酸組成物が提供され、ここで当該オリゴヌクレオチドプローブは、ＧＲＦ２経路成分の遺伝子（例えば、表１〜９に列挙されたタンパク質をコードする遺伝子）または天然に存在するそれらの変異体、または５’または３’隣接配列、または、本発明に係るＧＲＦ２経路成分の遺伝子と自然に結合するイントロン部の配列、または、天然に存在するそれらの変異体など）のセンスまたはアンチセンス配列にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列の領域を含む。細胞の核酸をハイブリダイゼーションに利用しやすいようにし、プローブをサンプルの核酸に晒し、プローブとサンプル核酸とのハイブリダイゼーションを検出する。このような技術を用いて、ゲノムレベルまたはｍＲＮＡレベルいずれかにおける異常（欠失、置換等を含む）を検出することができ、同様に、ｍＲＮＡ転写レベルを測定することができる。
【０１８０】
特定の実施形態において、異常の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号を参照）（例えばアンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ　ＰＣＲ）で、またあるいは、ライゲーション連鎖反応（ｌｉｇａｔｉｏｎ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０；ａｎｄ Ｎａｋａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，（１９９４） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９１：３６０−１３６４を参照）でプローブ／プライマーを利用することを含み、その後者は、ＧＲＦ２経路成分の遺伝子における点変異を検出するのに特に有用である。
【０１８１】
単なる例証的な実施形態において、上記方法は、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を含む：（ｉ）患者から細胞サンプルを回収すること、（ｉｉ）核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたは両方）を前記サンプルの細胞から単離すること、（ｉｉｉ）前記核酸サンプルと１以上のプライマーとを接触させること、ここで当該プライマーは、ＧＲＦ２経路成分の遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こるような条件下で、特異的にＧＲＦ２経路成分の遺伝子にハイブリダイズする、および（ｉｖ）増幅産物の存在または非存在を検出すること、または、増幅産物のサイズを検出し、コントロールサンプルの長さと比較すること。
【０１８２】
さらに他の代表的な実施形態において、患者のサンプルからのゲノムＤＮＡを、１以上の制限エンドヌクレアーゼ（メチル化に感受性を有し、その認識部位がＧＲＦ２経路成分の遺伝子（隣接配列およびイントロン部の配列に含まれる）に存在する）で消化することによって、ＧＲＦ２経路成分の遺伝子の異常なメチル化パターンを検出することができる。例えば、Ｂｕｉｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９４） Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ３：８９３−８９５を参照すること。消化されたＤＮＡをゲル電気泳動で分離し、例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ配列から誘導されたプローブを用いてハイブリダイズする。ＧＲＦ２経路成分の遺伝子のメチル化状態は、サンプルＤＮＡから得られた制限パターンと、既知のメチル化標準の制限パターンとを比較することによって測定できる。
【０１８３】
さらに他の実施形態において、診断用分析が提供され、当該分析において、ＧＲＦ２経路成分の遺伝子産物（例えば生検細胞から単離された）の、他の細胞のタンパク質と結合する能力が検出される。例えば、他のＧＲＦ２経路成分または基質タンパク質より高いまたは低い結合親和性で結合するＧＲＦ２経路成分の変異体を検出することが望ましい。このような変異体は、例えば、微細な変異、例えば、診断用のＤＮＡ配列解析技術や上述したイムノアッセイでは検出不可能な点変異体から生じる。従って、本発明はさらに、診断用のスクリーニング分析を考慮しており、当該スクリーニング分析は、一般的に、１以上のＧＲＦ２経路成分の遺伝子をサンプル細胞からクローニングすること、および、組換え遺伝子産物と基質タンパク質、例えば、他のＧＲＦ２経路成分との相互作用を検出できるような条件下で、そのクローン化遺伝子を発現すること、を含む。以下に示す様々な薬剤スクリーニング分析の説明から明らかなように、広範な技術を用いて、ＧＲＦ２経路構成タンパク質が他の細胞成分と結合する能力を決定することができる。
【０１８４】
また、本発明に係る方法を用いて、充実性腫瘍の検出および／または予後を強化することができ、当該充実性腫瘍としては、例えば組織（これらに限定されないが、卵巣、肺、腸、膵臓、前立腺、精巣、肝臓、皮膚、胃、腎臓、頚部、結腸直腸、ならびに、頭部および首）の癌腫（特に上皮由来の癌腫）；黒色腫；および肉腫、例えば、カポジ肉腫および横紋筋肉腫がある。好ましい実施形態において、本発明に係る方法を用いて、悪性または前ガンの上皮ガンを評価できる。
【０１８５】
また、本発明の診断方法を治療の経過観察として用いることもでき、例えば、ＧＲＦ２経路成分またはその活性のレベルを定量することにより、現在行われている、または以前に行われたガン治療の有効性、同様に、患者の予後におけるこれらの治療効果を示すことができる。
【０１８６】
従って、本発明は、血管増殖性の障害の診断および表現形解析を補助するために、細胞のＧＲＦ２経路成分のアップレギュレーションを検出するのに利用可能な診断用分析および試薬を作製し、ここで上記血管増殖性の障害は、例えば、細胞の腫瘍化、または他の過形成性または腫瘍性転化プロセス、同様に細胞分化性の疾患、例えば、組織変性（例えば、神経変性）から生じる。
【０１８７】
９．遺伝子治療
本発明はＧＲＦ２仲介シグナル伝達を調節する方法を提供する。従って、本発明は、細胞増殖、分化および／または生存を調節する方法を提供し、当該方法を用いて、例えば、異常な細胞増殖、分化および／または生存に関する病気または状態を治療することができる。本発明の方法によって、ＧＲＦ２経路成分の治療剤は、異常な細胞増殖、分化および／または細胞の生存に関する病気に罹った被験者に投与される。
【０１８８】
様々な異常な細胞の血管増殖性の状態に対して、本発明のＧＲＦ２経路成分の遺伝子構造、ミメティックおよびアンタゴニストは、異常な細胞増殖を調節する一般的な方法を用いて、治療上の利益を提供することができる。例えば、本発明の遺伝子構造を遺伝子治療プロトコールの一部として用いることによって、例えば、タンパク質が誤って発現している細胞、または、ＧＲＦ２経路成分上流のシグナル伝達経路が機能障害を起こしている細胞において、ＧＲＦ２経路成分の機能を再生したり、または、例えば、優性阻害変異体を運搬することによって、野生型タンパク質の機能を阻害したりすることができる。
【０１８９】
説明すると、おそらくＧＲＦ２経路構成タンパク質の機能（または機能障害）に少なくとも部分的に依存する病的または異常な成長を示す細胞型としては、様々なガンや白血病、乾癬、骨疾患、線維増殖性疾患（例えば、結合組織、アテローム性動脈硬化症、および、他の平滑筋の血管増殖性の疾患を含む）、同様に、慢性炎症がある。血管増殖性の疾患に加えて、有糸分裂への異常な再開始による組織の脱分化、または調節タンパク質の障害による不要な分化のいずれかによって生じる細胞分化性の疾患の治療も含む。
【０１９０】
また、本発明に係るＧＲＦ２経路成分（例えば、アゴニストおよびアンタゴニスト型）またはアンチセンス核酸の遺伝子治療用の構造を一時使用することによって、インビボでの組織の再形成を、例えば、臓器の発生および維持について達成することができることも明白である。本発明に係る遺伝子構造を用いて、異なる細胞に対して血管増殖および細胞分化の可能性を制御することによって、損傷した組織を再形成したり、または、移植および移植組織の形態を改良したりできる。例えば、ＧＲＦ２シグナル伝達経路のアゴニストおよびアンタゴニストを用いて、物理学的、化学的または病的な傷害を受けた後の臓器を治療的に調節することができる。例えば、遺伝子治療を用いて、部分的な肝切除の後の肝臓を再生したり、または、肺気腫の治療における肺組織の再生を促進したりできる。
【０１９１】
本発明の１つの観点において、本発明に係るＧＲＦ２経路成分の発現構造、または、アンチセンス分子を生産するための発現構造を、生物学的に有効ないずれの担体、例えば、インビボで組換えＧＲＦ２経路成分の遺伝子を効果的に細胞にトランスフェクトできるいずれの製剤または組成物として投与することができる。方法は、ウイルスベクター中に本発明に係る遺伝子を挿入することを含み、当該ベクターとしては、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および単純疱疹ウイルス−１、または、組換え細菌性もしくは真核性プラスミドがある。ウイルスベクターを用いる場合、細胞を直接トランスフェクトすることができ、その一方で、プラスミドＤＮＡを用いる場合、例えば、カチオン性リポソーム（リポフェクチン）、または、誘導された（例えば、抗体が結合した）、ポリリシン包接体、グラマシジンＳ、人工ウイルスエンベロープまたは他の細胞内の担体など、同様に、遺伝子構造の直接注入、または、インビボで行われたＣａＰＯ４沈殿の補助によって運搬することもできる。適切なターゲット細胞の導入は遺伝子治療において重要な第一工程であるため、特定の遺伝子運搬システムの選択は、目的のターゲットの表現型や投与経路（例えば、局所的または全身的）などの要素に依存することが認識できる。
【０１９２】
インビボで本発明に係るタンパク質のいずれか一つをコードした核酸を細胞に導入する好ましい方法は、核酸（例えば、遺伝子産物をコードしたｃＤＮＡ）を含むウイルスベクターの使用による方法である。細胞のウイルスベクターの感染は、ターゲット化細胞の大規模な集団が上記核酸を受け取ることができるという利点がある。加えて、ウイルスベクター中にコードされた分子は、例えばウイルスベクターに含まれたｃＤＮＡによって、ウイルスベクター核酸を摂取した細胞中で効率的に発現させることができる。
【０１９３】
一般的に、レトロウイルスベクター　およびアデノ随伴ウイルスベクターは、インビボで外来性の遺伝子を特にヒトへ導入するために選択される組換え遺伝子運搬システムであると理解される。これらのベクターにより、遺伝子は細胞へ効率的に運搬され、導入された核酸は宿主の染色体ＤＮＡに安定して統合される。レトロウイルスを使用する際の主な必要条件は、特に、細胞集団における野生型ウイルスの拡散の可能性に関して、それらの使用の安全性を確認することである。複製能が欠損したレトロウイルスのみを生産する特殊化した細胞系（「パッケージング細胞」とよばれる）の開発により、遺伝子治療のためのレトロウイルスの有用性が高められ、および、欠損レトロウイルスは、遺伝子治療本発明に係る遺伝子導入のための使用においてよく特徴付けられる（文献として、Ｍｉｌｌｅｒ， Ａ．Ｄ．（１９９０） Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１を参照）。従って、組換えレトロウイルスを構築して、レトロウイルスのコーディング配列（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）の一部をＧＲＦ２経路成分ポリペプチドをコードした核酸で置換し、レトロウイルスの複製を不完全にすることができる。次に、その複製欠損レトロウイルスをビリオンにパッケージングして、標準的な技術によってヘルパーウイルスを用いることによりターゲット細胞を感染させることができる。組換えレトロウイルスを生産するプロトコール、および、インビトロまたはインビボでこのようなウイルスを細胞に感染させるプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， （ｅｄｓ．）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， （２００１）， Ｓｅｃｔｉｏｎｓ ９．９−９．１４ および他の標準的な実験マニュアルで見出すことができる。適切なレトロウイルスの例としては、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭがあり、これらはいずれも当業者周知である。環境栄養性および両栄養性レトロウイルス系の両方を調製するための適切なパッケージングウイルス系の例としては、ΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｅ、Ψ２およびΨＡＭがある。レトロウイルスは、インビトロおよび／またはインビボで、様々な遺伝子を多くの異なる細胞型に導入するために用いられており、当該細胞型としては、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋原細胞、肝細胞、骨髄 細胞がある（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３９５−１３９８；Ｄａｎｏｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ，（１９８８） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：６４６０−６４６４；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：３０１４−３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９０） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：６１４１−６１４５；Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９１） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：８０３９−８０４３；Ｆｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９１） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：８３７７−８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０２−１８０５；ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９２） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：７６４０−７６４４；Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９２） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１−６４７；Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９２） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：１０８９２−１０８９５；Ｈｗｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９３） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０：４１０４−４１１５；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０７１３６；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２４６８；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０５３４５；およびＰＣＲ出願ＷＯ９２／０７５７３を参照）。
【０１９４】
その上、ウイルス粒子表面上でウイルスパッケージングタンパク質を改変することによって、レトロウイルスの感染範囲、および、レトロウイルスに基づくベクターの結果を制限することができることがわかっている（例えばＰＣＴ出願ＷＯ９３／２５２３４、ＷＯ９４／０６９２０、およびＷＯ９４／１１５２４を参照）。例えば、レトロウイルスベクターの感染範囲を改変する方法としては：細胞の表面抗原に特異的な抗体と、ウイルスｅｎｖタンパク質とをカップリングする方法（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，（１９８９） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６：９０７９−９０８３；Ｊｕｌａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２） Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７３：３２５１−３２５５；ａｎｄ Ｇｏｕｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６３：２５１−２５４）；または、細胞表面リガンドと、ウイルスｅｎｖタンパク質とをカップリングする方法がある（Ｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：１４１４３−１４１４６）。カップリングとしては、タンパク質または他の変種（ｖａｒｉｅｔｙ）で化学的に架橋した形態があり（例えば、ラクトースを用いて、ｅｎｖタンパク質をシアロ糖タンパク質に変換する）、同様に、融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体／ｅｎｖ融合タンパク質）を生産することによる方法がある。この技術は、感染を特定の組織型に限定したり、または、方向付けるのに有用であるが、その一方で、環境栄養性ベクターを両栄養性ベクターに変換するのにも用いられる。
【０１９５】
本発明で有用な他のウイルス遺伝子運搬システムは、アデノウイルス誘導ベクターを利用する。興味のある遺伝子産物をコードするが、その正常な溶菌性ウイルスの生活環において複製する能力を不活化するように、アデノウイルスのゲノムを操作することができる（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｂｉｏ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４；ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９２） Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５を参照）。アデノウイルス系のＡｄ５型ｄｌ３２４または他のアデノウイルス系（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７等）から誘導された適切なアデノウイルスベクターは当業者周知である。組換えアデノウイルスは、特定の環境、すなわち、非分裂細胞には感染しないが、広範な細胞型に感染するのに用いることができる環境において有利であり、ここで当該細胞型としては、気道の上皮細胞（上記のＲｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９２））、内皮細胞 （Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９２） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：６４８２−６４８６）、肝細胞（Ｈｅｒｚ ａｎｄ Ｇｅｒａｒｄ，（１９９３） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：２８１２−２８１６）および筋細胞（Ｑｕａｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：２５８１−２５８４）がある。その上、ウイルス粒子は比較的安定で、精製および濃縮可能であり、さらに、上述したように、感染力の範囲に影響を与えるように改変することができる。加えて、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびそれらに含まれる外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムに統合されず、エピゾーム状態を維持し、それによって、導入されたＤＮＡが宿主ゲノム（例えば、レトロウイルスのＤＮＡ）に統合され得るような状況での挿入突然変異誘発の結果として生じる潜在的な問題を防ぐことができる。その上、アデノウイルスゲノムの外来ＤＮＡに対する環境収容力は、他の遺伝子運搬ベクターに比べて大きい（８キロベースまで）（上記のＢｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．；Ｈａｊ−Ａｈｍａｎｄ ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ（１９８６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ５７：２６７）。現在使用されており、従って本発明でも好ましい殆どの複製欠損アデノウイルスベクターは、ウイルスのＥｌおよびＥ３遺伝子の全部または一部を欠損しているが、アデノウイルス遺伝物質の８０％を保持する（例えば、上記のＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９７９） Ｃｅｌｌ １６：６８３；Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．；ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅ．Ｊ． Ｍｕｒｒａｙ， Ｅｄ．（Ｈｕｍａｎａ， Ｃｌｉｆｔｏｎ， ＮＪ， １９９１） ｖｏｌ． ７． ｐｐ． １０９−１２７を参照）。挿入されたＧＲＦ２経路成分の遺伝子は、例えば、Ｅ１Ａプロモーター、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）および関連リーダー配列、ウイルスＥ３プロモーター、または外部から付加されたプロモーター配列の制御下で発現させることができる。
【０１９６】
本発明に係るＧＲＦ２経路成分の遺伝子の運搬に有用なさらに他のウイルスベクター系は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。アデノ随伴ウイルスは、天然に存在する欠損ウイルスであって、当該ウイルスは、効率的な複製および増殖性の生活環のために、ヘルパーウイルスとして他のウイルス（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）を必要とする（文献として、Ｍｕｚｙｃｚｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２） １５８：９７−１２９を参照）。また、アデノ随伴ウイルスは、そのＤＮＡを非分裂細胞に統合させ、高頻度の安定な統合を示すことのできるわずかなウイルス種のひとつである（例えば、Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９２） ＡＭ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ７：３４９−３５６；Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３：３８２２−３８２８；ａｎｄ ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：１９６３−１９７３を参照）。ＡＡＶの３００塩基対しか含まないベクターをパッケージングして、統合させることができる。外来性のＤＮＡのためのスペースは、約４．５ｋｂに制限される。ＡＡＶベクター（例えばＴｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８５） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：３２５１−３２６０で説明される）を用いて、ＤＮＡを細胞に導入することができる。ＡＡＶベクターを用いて、様々な核酸を異なる細胞型に導入することができる（例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８４） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８１：６４６６−６４７０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８５） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４：２０７２−２０８１；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８） Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ２：３２−３９；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８４） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ５１：６１１−６１９；ａｎｄ Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：３７８１−３７９０を参照）。
【０１９７】
遺伝子治療で適用されてきた他のウイルスベクター系は、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、および数種のＲＮＡウイルスから誘導されたものであった。特に、ヘルペスウイルスベクターにより、中枢神経系の細胞および眼の組織で組換えＧＲＦ２経路成分の遺伝子を残存させるための特殊な方法を提供できる（Ｐｅｐｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９４） Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３５：２６６２−２６６６）。
【０１９８】
上述したウイルス導入方法に加えて、非ウイルス的な方法を用いて、動物の組織中でＧＲＦ２経路成分を発現させることもできる。遺伝子導入のための非ウイルス的な方法の殆どは、生体高分子の取り込みおよび細胞内の輸送に関する哺乳動物細胞で用いられる正常なメカニズムに頼っている。好ましい実施形態において、本発明の非ウイルス性の遺伝子運搬システムは、ターゲット化細胞による本発明に係るＧＲＦ２経路成分の遺伝子の取り込みのための細胞内経路に頼っている。この種の代表的な遺伝子運搬システムとしては、リポゾーム由来のシステム（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、ポリリシン包接体、および人工ウイルスエンベロープがある。
【０１９９】
代表的な実施形態において、ＧＲＦ２経路成分ポリペプチドをコードする遺伝子は、表面に正電荷を有するリポゾーム（例えば、リポフェクチン）、および（場合によって）ターゲット組織の細胞の表面抗原に対する抗体でタグを付されたリポゾーム（Ｍｉｚｕｎｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９２） Ｎｏ Ｓｈｉｎｋｅｉ Ｇｅｋａ ２０：５４７ ５５１；ＰＣＴ出願ＷＯ９１／０６３０９；日本国特許出願第１０４７３８１号；および欧州特許公報ＥＰ−Ａ−４３０７５）に捕獲され得る。例えば、神経膠腫細胞のリポフェクションは、神経膠腫関連抗原に対するモノクローナル抗体でタグを付されたリポゾームを用いて行うことができる（Ｍｉｚｕｎｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９２） Ｎｅｕｒｏｌ． Ｍｅｄ Ｃｈｉｒ． ３２：８７３−８７６）。
【０２００】
さらに他の例証的な実施形態において、遺伝子運搬システムは、遺伝子の結合剤（例えばポリリシン）で架橋された抗体または細胞表面リガンドを含む（例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／０４７０１、ＷＯ９２／２２６３５、ＷＯ９２／２０３１６、ＷＯ９２／１９７４９、およびＷＯ９２／０６１８０を参照）。例えば、本発明に係るＧＲＦ２経路成分の遺伝子構造を用いて、ポリカチオン（例えば、ポリリシン）に包接された抗体を含む可溶性ポリヌクレオチド担体によりインビボで特定の細胞にトランスフェクトさせることができる（米国特許第５，１６６，３２０号を参照）。また、エンドサイトーシスが仲介する本発明に係る核酸構造の有効な運搬を、エンドソーム構造からの遺伝子の逸脱を高める薬剤を用いて促進することができる、ということは明白である。例えば、アデノウイルス全体またはインフルエンザＨＡ遺伝子産物の融合ペプチドを運搬システムの一部として用いて、ＤＮＡ含有エンドソームの効率的な破壊を誘導することができる（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０−９２６；Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９２） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：７９３４；ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９３） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：２１２２）。
【０２０１】
臨床的な環境において、遺伝子運搬システムを、数多くの方法のいずれか（いずれも当業界でよく知られている）により患者に導入することができる。例えば、遺伝子運搬システムの医薬製剤を、例えば、静脈注射により全身に導入することができ、その構造のターゲット細胞における特異的が導入されるが、このような導入は、主に、遺伝子運搬媒体によって生じるトランスフェクションの特異性、遺伝子発現を制御する転写調節配列による細胞または組織での発現、またはその組み合わせによってなされる。他の実施形態において、組換え遺伝子の最初の運搬は、動物への導入が完全に局在化されるように限定される。例えば、遺伝子運搬媒体をカテーテルによって（米国特許第号５，３２８，４７０号を参照）、または、定位注入（ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によって（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９４） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９１：３０５４−３０５７を参照）導入することができる。
【０２０２】
１０．薬物スクリーニング分析
また本発明は、薬物を同定する分析方法を提供し、当該薬物は、正常または異常細胞の増殖および／または分化またはそれに関する疾患の病因論の観点において、本発明に係るＧＲＦ２経路成分または当該タンパク質の役割の正常な細胞における機能に対するアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかである。一つの実施形態において、当該分析は、本発明に係るＧＲＦ２経路成分のいずれか一つと他のＧＲＦ２経路成分との相互作用を阻害する薬剤を検出する。他の実施形態において、当該分析は、ＧＲＦ２経路成分またはＧＲＦ２経路成分複合体の内因性の生物活性、例えば、酵素活性、他の細胞成分への結合、細胞の区画化等を調節する薬剤を検出する。このような調節因子を、例えば、血管増殖性疾患および／または細胞分化性の疾患の治療に用いることができ、さらに、アポトーシスを調節することができる。
【０２０３】
様々な分析様式を用いられるが、本発明の開示の観点において、本明細書で明確に説明されていない分析様式も当業者によって理解される。タンパク質複合体、酵素活性、さらにＧＲＦ２仲介シグナル伝達経路が形成されるような状態に近い分析様式は、無細胞系（例えば、精製タンパク質または細胞溶解産物）に基づく分析、同様に、インタクト細胞を利用した細胞に基づく分析などの多くの異なる形態において可能である。また、簡単な結合分析を用いて、ＧＲＦ２経路成分の結合、またはＧＲＦ２経路成分または複合体の基質への結合を破壊することによって、ＧＲＦ２仲介シグナル伝達を阻害する薬剤を検出できる。ＧＲＦ２シグナル伝達阻害剤として作用する能力を試験される薬剤は、例えば、細菌、酵母または他の生物によって製造され（例えば、天然産物）、化学的に製造され（例えば、ペプチドミメティックを含む低分子）、または組換えによって製造される。好ましい実施形態において、試験薬剤としては、約２，０００ダルトン未満の分子量を有するペプチドまたはオリゴヌクレオチドのほかには、例えば、低分子の有機分子がある。
【０２０４】
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、所定の時間で調査される化合物数を最大化するために、ハイスループット分析が望ましい。本発明の、無細胞系でなされる分析（例えば精製または半精製タンパク質または溶解産物を用いて行われるような分析）は、しばしば「一次」スクリーニングとして行うことができ、この場合、当該スクリーニングにより、試験化合物で仲介される分子ターゲットの変化を迅速に展開し、比較的簡単に検出することができる。その上、一般的に、試験化合物の細胞毒性の効果および／または生物学的利用能は、インビトロ系では無視され、その代わりに、当該分析は、他のタンパク質との結合親和性の変化、または、分子ターゲットの酵素特性の変化に関して明白であるため、主として分子ターゲットにおける薬物の効果に焦点が当てられる。従って、可能性のある調節剤、例えば、ＧＲＦ２仲介シグナル伝達の活性化剤または阻害剤は、細胞溶解産物中で機能的なＧＲＦ２シグナル伝達経路を構成することによって得られる無細胞分析において検出することができる。その代わりの様式において、以下で説明されるように、溶解産物に基づく分析に対して多くの利益を提供する再構成タンパク質混合物として、当該分析を行うことができる。
【０２０５】
一つの観点において、本発明は、ＧＲＦ２仲介シグナル伝達を調節する薬物をスクリーニングするのに用いることができる分析を提供する。例えば、本発明の薬物スクリーニング分析は、ＧＲＦ２シグナル伝達経路の成分の結合を破壊する薬剤を検出できるように設計することができる。他の実施形態において、本発明に係る分析は、ＧＲＦ２シグナル伝達経路の成分の酵素活性の阻害剤を同定する。好ましい実施形態において、上記化合物は、メカニズムに基づく阻害剤であって、当該阻害剤は、ＧＲＦ２シグナル伝達経路の成分を化学的に改変し、さらに、上記成分の特異的な阻害剤であり、例えば、阻害定数が相同タンパク質に比べて１０倍、１００倍、またより好ましくは１０００倍異なる阻害剤である。
【０２０６】
本発明の分析の好ましいインビトロ実施形態において、ＧＲＦ２シグナル伝達経路は、少なくとも半精製タンパク質の再構成タンパク質混合物を含む。半精製された、とは、他の細胞タンパク質またはウイルスタンパク質から予め分離された再構成混合物において利用されるタンパク質を意味する。例えば、細胞溶解産物と比較して、ＧＲＦ２仲介シグナル伝達に関与するタンパク質は、混合物中の全ての他のタンパク質に対して少なくとも５０％の純度で、より好ましくは９０〜９５％の純度で混合物中に存在する。本発明に係る方法の特定の実施形態において、再構成タンパク質混合物は、高度に精製されたタンパク質を混合することによって得られ、この場合、再構成混合物が、ＧＲＦ２仲介シグナル伝達を測定する能力を妨害したり改変したりする可能性のある他のタンパク質（例えば細胞のタンパク質またはウイルス由来のタンパク質）を実質的に含まないようにする。
【０２０７】
一つの実施形態において、再構成タンパク質混合物の使用により、ＧＲＦ２シグナル伝達状態をより慎重に制御することができる。その上、ＧＲＦ２シグナル伝達経路の特定の段階の阻害剤を見出すのに好都合なシステムを引き出すことができる。例えば、再構成タンパク質の分析は、候補薬剤の存在または非存在下の両方で行い、それによってＧＲＦ２仲介シグナル伝達の阻害剤を検出することができる。
【０２０８】
候補の阻害剤の存在および非存在下でのＧＲＦ２仲介シグナル伝達の分析は、反応物を入れるのに適切ないかなる容器を用いて行うことができる。例としては、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心管がある。
【０２０９】
本発明の一つの実施形態において、ＧＲＦ２シグナル伝達経路の成分の結合を妨害する能力に基づいて阻害剤を検出する薬物スクリーニング分析が提供される。代表的な結合分析において、興味のある化合物と、ＧＲＦ２経路成分ポリペプチドから得られた混合物とを接触させる。例えば、当該混合物は、ＧＲＦ２と表１で示されるポリペプチドの１以上、ｐＩＣｌｎおよび表２で示されるポリペプチドの１以上、Ｎｄｒおよび表３Ａ〜Ｂで示されるポリペプチドの１以上、Ｓｋｂ１および表４Ａ〜Ｂで示されるポリペプチドの１以上、または、ＰＰ２Ｃおよび表５で示されるポリペプチドの１以上の混合物である。ＧＲＦ２ シグナル伝達複合体の検出および定量は、上記２種のポリペプチド間での複合体形成を阻害する（または強化する）ことに関する化合物の有効性 を決定するための手段を提供する。上記化合物の有効性は、試験化合物の様々な濃度を用いて得られたデータによる用量反応曲線を作製することによって評価できる。その上、コントロール分析を行い、比較用の基準線を得ることができる。コントロール分析において、複合体の形成は試験化合物の非存在下で定量される。
【０２１０】
ＧＲＦ２経路成分ポリペプチドの間またはＧＲＦ２経路成分と基質ポリペプチドとの間の複合体形成は、様々な技術によって検出することができ、その技術の多くは事実上上述されている。例えば、複合体形成における調節は、例えば、検出可能な標識タンパク質（例えば、放射標識した、蛍光標識、または酵素的に標識された）を用いて、イムノアッセイ、またはクロマトグラフィーによる検出によって定量することができる。
【０２１１】
一般的に、ポリペプチドのいずれか一つを固定することが望ましく、それにより、タンパク質のいずれか一つの複合化していない形態から複合体を分離することを容易にし、同様に、分析の自動化に便宜をはかることができる。例証的な実施形態において、タンパク質を不溶性マトリックスに結合させるようなドメインを付加された融合タンパク質が提供される。例えば、ＧＳＴ−ＧＲＦ２経路成分の融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）またはグルタチオン誘導マイクロタイタープレートに吸着させ、次に、可能性のある相互作用タンパク質（例えば、３５Ｓで標識したポリペプチド）および試験化合物を加え、複合体形成を助ける状態のもとでインキュベートすることができる。インキュベーション後、そのビーズを洗浄して、未結合の相互作用タンパク質の全てを除去し、マトリックスビーズに結合した放射標識を直接測定する（例えば、シンチラントに位置するビーズ）、または、例えばマイクロタイタープレートを用いた場合、複合体を解離させた後、上清を測定する。あるいは、未結合のタンパク質を洗浄で除いた後、複合体をマトリックスから解離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、およびマトリックス結合分画で見出された相互作用するポリペプチドのレベルを標準的な電気泳動技術を用いてゲルにより定量することができる。
【０２１２】
さらに他の実施形態において、ＧＲＦ２経路成分および可能性のある相互作用ポリペプチドを用いて、相互作用トラップ分析を行い（または米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｂｉｏ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４；ａｎｄ Ｉｗａｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６を参照）、その後、互いのタンパク質の結合を破壊する薬剤を検出することができる。
【０２１３】
特に、当該方法は、ハイブリッドタンパク質を発現するキメラ遺伝子を利用することができる。説明すると、第一のハイブリッド遺伝子は、転写活性因子のＤＮＡ結合ドメインのコーディング配列を含み、「ベイト」タンパク質（例えば、可能性のある相互作用タンパク質に結合するのに十分な長さのＧＲＦ２経路成分ポリペプチド）のコーディング配列のフレーム中に融合させることができる。第二のハイブリッドタンパク質は、転写活性化ドメインをコードしており、当該転写活性化ドメインは、「魚（ｆｉｓｈ）」タンパク質（例えば、ベイト融合タンパク質のＧＲＦ２経路成分ポリペプチド部分と相互作用するのに十分な長さを有する、可能性のある相互作用タンパク質）をコードする遺伝子のフレームに融合されている。上記ベイトおよび魚タンパク質が相互作用できる場合、例えば、ＧＲＦ２経路成分複合体を形成する場合、それらは近接した２つの転写活性因子ドメインを生じる。この近接により、転写活性因子に関与する転写調節部位に実施可能に連結したレポーター遺伝子の転写が起こり、レポーター遺伝子の発現を検出し、ベイトおよび魚タンパク質の相互作用を評価するのに用いることができる。
【０２１４】
本発明に従って、当該方法は、「ベイト」融合タンパク質を宿主細胞に提供することを含み、当該宿主細胞としては、好ましくは酵母細胞、例えば、Ｋｌｕｙｖｅｒｅｉ ｌａｃｔｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、およびＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａがあり、最も好ましくはＳ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＳ． ｐｏｍｂｅである。当該宿主細胞はレポーター遺伝子を含み、当該レポーター遺伝子は、ベイトタンパク質で用いられた転写活性因子のＤＮＡ結合ドメインのための結合部位を有し、遺伝子の転写が活性化された場合、レポーター遺伝子は検出可能な遺伝子産物を発現させることができる。第一のキメラ遺伝子は、宿主細胞の染色体に存在してもよいし、発現ベクターの一部として存在してもよい。
【０２１５】
また、宿主細胞は、宿主細胞で発現させることができる第一のキメラ遺伝子を含む。当該遺伝子は、キメラタンパク質をコードしており、（ｉ）レポーター遺伝子に応答する要素を宿主細胞中で認識するＤＮＡ結合ドメイン、および（ｉｉ）ベイトタンパク質（例えばＧＲＦ２経路成分ポリペプチド配列）を含む。
【０２１６】
また、第二のキメラ遺伝子が提供され、これは、宿主細胞中で発現させることができ、「魚」融合タンパク質をコードする。一つの実施形態において、魚および第二のキメラ遺伝子の両方を、プラスミドの形態で宿主細胞に導入することができる。しかしながら、好ましくは、第一のキメラ遺伝子は宿主細胞の染色体中に存在し、第二のキメラ遺伝子はプラスミドの一部として宿主細胞に導入される。
【０２１７】
好ましくは、第一のハイブリッドタンパク質のＤＮＡ結合ドメインと、第二のハイブリッドタンパク質の転写活性化ドメインとは、分離可能なＤＮＡ結合および転写活性化ドメインを有する転写活性因子から誘導される。例えば、これらの独立したＤＮＡ結合および転写活性化ドメインは、酵母ＧＡＬ４タンパク質で見出されることがわかっており、さらに、酵母ＧＣＮ４およびＡＤＲ１タンパク質で見出されることがわかっている。また、転写に関与する他のタンパク質の多くは分離可能な結合および転写活性化ドメインを有し、これらは本発明において有用であり、例えば、ＬｅｘＡおよびＶＰ１６タンパク質がある。他の（実質的に）転写不活性なＤＮＡ結合ドメインを本発明に係る構造に用いることができ、例えばＡＣＥ１、λｃＩ、ｌａｃリプレッサー、ｊｕｎまたはｆｏｓのドメインがあることが理解できる。他の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインは、異なるタンパク質からでもよい。ＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメインを使用することによって、特定の利点が得られる。例えば、酵母において、ＬｅｘＡ部分は、活性化機能を含まず、酵母遺伝子の転写になんの既知の影響ももたない。加えて、ＬｅｘＡの使用により、相互作用レベルの分析の感度を制御することができる（例えば、Ｂｒｅｎｔ等のＰＣＴ出願ＷＯ９４／１０３００を参照）。
【０２１８】
好ましい実施形態において、ベイトまたは魚タンパク質に関するいかなる酵素活性（例えば、優性阻害）が不活性化されており、または、ＧＲＦ２経路成分他の変異体を用いてもよい。
【０２１９】
例証的な実施例の続きとして、宿主細胞中で、ベイトおよび魚の融合タンパク質間で、ＧＲＦ２経路成分が仲介する相互作用が生じ、それによりドメインが活性化され、レポーター遺伝子の転写を活性化することができる。当該方法は、第一のキメラ遺伝子および第二のキメラ遺伝子を宿主細胞に導入し、ベイトおよび魚の融合タンパク質が、レポーター遺伝子が活性化されるのに十分な量で発現される状態のもとに当該細胞をさらすことによって行われる。ＧＲＦ２経路成分／相互作用タンパク質複合体の形成により、レポーター遺伝子の発現により生産された検出可能なシグナルが生じる。従って、試験化合物の存在下および試験化合物の非存在下の複合体の形成のレベルを、いずれの場合のレポーター遺伝子の発現レベルを検出することによって評価できる。様々なレポーター構造が本発明の方法に従って用いることができ、例えば、検出可能なシグナルを生産するレポーター遺伝子があり、当該検出可能なシグナルは、酵素シグナル、蛍光シグナル、リン光性シグナルおよび薬剤耐性からなる群より選択することができる。
【０２２０】
本発明の一つの観点は、再構成タンパク質の調製物、例えば、精製タンパク質の組み合わせを提供し、当該組み合わせとしては、ＧＲＦ２および表１に記載のポリペプチドの１以上、ｐＩＣｌｎおよび表２に記載のポリペプチドの１以上、Ｎｄｒおよび表３Ａ〜Ｂに記載のポリペプチドの１以上、Ｓｋｂ１および表４Ａ〜Ｂに記載のポリペプチドの１以上、または、ＰＰ２Ｃおよび表５に記載のポリペプチドの１以上がある。
【０２２１】
本発明の分析のさらなる実施形態において、本発明に係る分析をサポートする細胞培養技術の利点を利用して、ＧＲＦ２シグナル伝達経路を細胞全体で発生させることができる。例えば、以下で説明されるように、ＧＲＦ２シグナル伝達経路を、真核細胞培養系（哺乳動物や酵母細胞を含む）で構築することができる。インタクト細胞中で本発明に係る分析を行う利点は、阻害剤の治療的使用が必要となり得る環境によりいっそう近い環境で機能的な阻害剤を検出する能力を含み、例えば、薬剤の細胞への侵入を強化する能力がある。その上、例えば以下に示す実施例のような、インビボでの当該分析の実施形態のいくつかは、候補薬剤のハイスループット分析で処理することができる。
【０２２２】
ＧＲＦ２シグナル伝達経路の成分は、上記分析をサポートするように選択された細胞に内在するものでもよい。あるいは、当該成分のいくつかまたは全部が外来性の源より誘導されてもよい。例えば、融合タンパク質は、組換え技術（例えば発現ベクターの使用によって）によって細胞に導入してもよいし、同様に、融合タンパク質自身または当該融合タンパク質をコードしたｍＲＮＡをマイクロインジェクションすることによって細胞に導入してもよい。
【０２２３】
いずれの場合においても、ＧＲＦ２仲介シグナル伝達現象（例えば、ＧＲＦ２経路成分基質の翻訳後修飾（例えばリン酸化）の調節、ＧＲＦ２シグナル伝達への応答における遺伝子の転写の調節など）の検出を促進するために、細胞を候補の阻害剤でインキュベートした後に最終的に処理する。再構成タンパク質混合物または溶解産物で行われた分析に関して上述したように、候補の阻害剤の有効性は、ＧＲＦ２経路成分ポリペプチドの直接的な特徴を測定することによって評価でき、当該測定としては、電気泳動法による分子量の移動、または、結合分析における検出がある。これらの実施形態に関して、一般的に、候補の薬剤でのインキュベーションの終わりに細胞を溶解させ、その溶解産物を、再構成タンパク質混合物または溶解産物（例えば上述した方法）で用いられたのと大体同じ方法で検出工程において操作することができる。
【０２２４】
また、ＧＲＦ２シグナル伝達経路の間接的な測定は、ＧＲＦ２仲介シグナル伝達現象によって調節されたＧＲＦ２経路成分に関する生物活性を検出することによって達成することができる。上述したように、ＧＲＦ２経路成分ポリペプチドを含む融合タンパク質および酵素活性の使用は、本発明に係る分析の代表的な実施形態であり、当該方法において、検出手段は、関連する酵素活性を定量することによってＧＲＦ２経路成分ポリペプチドを間接的に測定することによる。
【０２２５】
プロテインキナーゼ活性の阻害剤の同定
タンパク質キナーゼは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）またはグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）からのリンのターゲット化タンパク質への移動を触媒して、リン酸化タンパク質およびアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）またはグアノシン二リン酸（ＧＤＰ）とをそれぞれ生産する酵素である。ＡＴＰまたはＧＴＰは、まず加水分解されて、ＡＤＰまたはＧＤＰ、および無機リン酸を形成する。次に、無機リン酸はターゲット化タンパク質に付着する。キナーゼによりターゲット化されたタンパク質基質は、構造タンパク質であり、膜成分（例えば細胞壁、または、機能的タンパク質である他の酵素）で見出される。
【０２２６】
タンパク質キナーゼは、しばしば、それらがリン酸化するアミノ酸残基に基づいて２つのグループに分割される。第一のグループは、いわゆるセリン／スレオニンキナーゼであり、例えば、サイクリックＡＭＰおよびサイクリックＧＭＰ依存性タンパク質キナーゼ、カルシウムおよびリン脂質依存性タンパク質キナーゼ、カルシウムおよびカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ、カゼインキナーゼ、細胞分裂周期タンパク質キナーゼ等がある。通常、これらのキナーゼは、細胞質性か、または、できればタンパク質を固定することにより細胞の粒子分画に結合している。
【０２２７】
第二のキナーゼのグループは、いわゆるチロシンキナーゼであり、チロシン残基をリン酸化する。これらは、かなり少量でしか存在しないが、細胞調節において均一な重要な役割を果たす。これらのキナーゼは数種の受容体を含み、当該受容体は、成長因子やホルモンのような分子に対するものであり、例えば、上皮成長因子受容体、インスリン受容体、血小板由来成長因子受容体等のような分子に対する数種の受容体である。研究が示すところによれば、多くのチロシンキナーゼは、膜貫通型タンパク質であり、その受容体ドメイン（細胞の外側に位置する）およびそのキナーゼドメイン（内側に位置する）を共に有する。
【０２２８】
本明細書で用いられる「キナーゼ」とは、ＡＴＰまたはＧＴＰから基質ポリペプチドへリン酸基を移動させることができる酵素的に活性なポリペプチドを意味する。キナーゼは、単独の未改変ポリペプチドで活性であるか、または、付加的な活性のための因子を必要とすることもあり、当該因子としては、例えば、他のポリペプチド（例えば、サイクリン依存性タンパク質キナーゼに対するサイクリンサブユニットのような結合パートナー）、コファクター（例えば、マグネシウム、マンガン、カルシウムなど）および／または翻訳後修飾（例えば、リン酸化、糖付加など）がある。
【０２２９】
試験分子がキナーゼ活性を阻害する有効性を評価するためのインビトロ分析は、精製キナーゼポリペプチドまたはポリペプチド複合体を用いて行うことができる。精製キナーゼは、完全長分子の組換え産物、または生物学的に活性なそれらの変異体または誘導体によって得ることができる。組換えポリペプチドを生産する方法は上述したとおりである。キナーゼポリペプチドの組換え産物のための宿主細胞としては、これらに限定されないが、細菌（例えばＥ． ｃｏｌｉ）、酵母、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス系を用いた）、哺乳動物細胞、または他の真核細胞がある。複数のサブユニットのキナーゼ複合体のポリペプチド構成要素を、同じ宿主細胞で共に生産することができ、この場合、その宿主細胞は、各ポリペプチドをコードするＤＮＡで共にトランスフェクトされる。キナーゼポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、宿主細胞（または、それらが分泌される場合は、培地）から精製することができ、一般的に、この方法は、各ポリペプチドを、「タグ」配列（例えばヘマグルチニン（「ＨＡ」）、Ｈｉｓ（ヘキサヒスチジンのようなポリヒスチジン）、ｍｙｃまたはＦＬＡＧ）と共に発現させ、タグを付されたポリペプチドをアフィニティークロマトグラフィーによって精製することによってなされ、当該アフィニティークロマトグラフィーにおいては、例えば、ポリヒスチジンに対してはニッケルカラムを用い、またはｍｙｃまたはＦＬＡＧに対してはモノまたはポリクローナル抗体を用いることができる。キナーゼ活性に必要な翻訳後修飾は、生産中に宿主細胞で自然に起こり得るが、精製成分を用いてなされてもよい。例えば、バキュロウイルス発現系を用いた昆虫細胞でのＣｄｋ２／サイクリンＡ共発現により、細胞から活性キナーゼ複合体（すなわち、活性化したスレオニンリン酸化を含む）を単離することができる。あるいは、別々に発現されたＣｄｋ２およびサイクリンＡポリペプチドを混合して、ＡＴＰの存在下でＣｄｋ活性化キナーゼまたは「Ｃａｋ」とインキュベートし、活性化Ｃｄｋ２／サイクリンＡペアを生産することができる。
【０２３０】
本発明の分析において有用なキナーゼ基質としては、タンパク質、タンパク質断片またはペプチド（Ｋｅｍｐ， Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ． ２００：１２１−１３４，（１９９１））がある。多くのタンパク質キナーゼの基質は、市販されており、例えばヒストンＨ１は、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼの一般的に用いられる基質であり、および多くの腫瘍遺伝子がチロシン残基でリン酸化されることがわかっている。あるいは、キナーゼ分析で用いることができる基質ポリペプチドを同定するために、各ペプチドが少なくとも１種のセリン、スレオニンおよび／またはチロシン残基を含むペプチドライブラリーを特異性が未知のタンパク質キナーゼの基質として用いることができる（Ｓｏｎｇｙａｎｇ， Ｚ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ４：９７３−９８２（１９９４） ａｎｄ Ｓｏｎｇｙａｎｇ ＆ Ｃａｎｔｌｅｙ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ８７：８７−９８（１９９８））。簡単に言えば、ペプチドの混合ライブラリーを、ＡＴＰの存在下で、タンパク質キナーゼによるリン酸化で処理することができる。次に、リン酸化ペプチドを残りのライブラリーから分離し、配列分析で処理することができる。個々のリン酸化ペプチドは、その後のキナーゼ分析の基質として用いることができ、また、そのキナーゼに対するコンセンサス基質配列を、上記キナーゼの基質として作用し得るライブラリーからの全てのペプチドの分析に基づいて決定することができる。
【０２３１】
一般的に、タンパク質キナーゼ活性を測定する方法は、放射性の検出方法に基づく。このような方法において、興味のあるキナーゼを含むサンプルを、γ−３２Ｐ−ＡＴＰまたはγ−３２Ｐ−ＧＴＰの存在下で、活性化剤および基質とインキュベートする。しばしば、一般的で廉価な基質（例えばヒストンまたはカゼイン）が用いられる。適切なインキュベーション期間の後、反応物を保存し、ゲル電気泳動によって、または、フィルターに基質を結合させることによってリン酸化基質と遊離のリン酸とを分離し、洗浄して過剰な放射活性標識された遊離のＡＴＰを除去する。基質に取り込まれた放射標識されたリン酸の量は、シンチレーション計数またはリン光イメージ分析によって測定できる。あるいは、基質のリン酸化は、ホスホセリン、ホスホスレオニンまたはホスホチロシン残基に特異的な抗体（例えば、抗ホスホセリン、Ｓｉｇｍａ＃Ｐ３４３０；抗ホスホスレオニン、Ｓｉｇｍａ＃Ｐ３５５５；および抗ホスホチロシン、Ｓｉｇｍａ＃Ｐ３３００）を用いた免疫蛍光法によって検出できる。
【０２３２】
代表的な実施形態において、キナーゼ活性の阻害剤である薬剤を同定するための分析は、溶液中で行われる。活性キナーゼは、ガンマ標識されたＡＴＰ（例えば３２Ｐ−ＡＴＰ）と、基質（例えばヒストンＨ１、カゼインなど）と、および試験分子と混合され、これらは、同時または連続的に溶液に加えられる。インキュベーション期間の後、基質を単離し、基質が含む標識の量を分析する。
【０２３３】
一つの好ましい分析は、「シンチレーション近接アッセイ」または「ＳＰＡ」（Ｃｏｏｋ， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ， １：２８７−２９４（１９９６））とよばれ、当該分析において、ビオチン化基質（例えばヒストンＨ１または網膜芽腫ペプチド）をストレプトアビジンでコーティングされた非多孔質性ビーズに付着させ、シンチレーション液で充填される。マイクロタイタープレート（例えば９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレート）を用いて、上記ビーズを、活性キナーゼ、ガンマ標識されたＡＴＰおよび試験分子とインキュベートすることができる。放射標識したリン酸基が活性キナーゼの活性を介して基質へ移動したら、放射性のリン酸基により放出されたフォトンをシンチレーションカウンターを用いて記録する。キナーゼ活性を阻害するのに有効な試験分子を含むウェルにおいて検出される放射性の計測数は、コントロールウェルに比べて少ない。
【０２３４】
また、他のインビトロ分析で処理して、試験分子を評価することができる。このような分析の一つにおいて、基質をマイクロタイタープレートのウェルに付着させ、続いて、活性ホロ酵素複合体、ガンマ標識されたＡＴＰ（または他の適切な検出因子）および試験分子を連続的または同時に加えることができる。短時間のインキュベーション（秒〜分単位）の後、その溶液を各ウェルから除去してプレートを洗浄し、次に、キナーゼ活性により基質に付加された標識されたγリン酸の量を測定することができる。
【０２３５】
これらの分析の他のバリエーションは、当業者に明白である。例えば、基質は、ビーズ、あるいはその代わりに各ウェルの底部にに付着させることができる；次に、当該ビーズを、試験分子、標識されたＡＴＰ、および活性ホロ酵素複合体と共にインキュベーションした後、溶液から除去し、次に、基質に取り込まれた標識の量を測定することができる。
【０２３６】
一般的に、各タイプの分析において、試験分子は濃度の範囲にわたり評価され、および、一連の適切なコントロールは結果を評価する上での正確さを求めるために用いられる。いくつかの場合において、「相乗」効果の可能性を分析するために、２以上の試験分子を一緒に評価することが有用である。
【０２３７】
他の実施形態において、キナーゼが基質をリン酸化する能力を阻害する試験薬剤の能力は、基質分子の活性を測定することによって達成できる。例えば、基質分子がキナーゼによってリン酸化に関して活性化される場合、基質分子の活性は、キナーゼの活性を測定するための手段として分析される。キナーゼと試験分子とをインキュベートした際に、基質の活性化のレベルが減少すれば、キナーゼ阻害剤である可能性を示す。例えば、分析は、以下に示すような分析によって行うことができ、すなわち、基質による細胞性の第２メッセンジャー（例えば、細胞内のＣａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など）の誘導を検出することによって、基質の触媒性／酵素活性を検出することによって、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー（例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）をコードする核酸に操作可能に連結された基質応答性の調節要素を含む）の誘導を検出することによって、または、ターゲットが調節する細胞応答を検出することによって、分析を行うことができる。
【０２３８】
ホスファターゼ活性の阻害剤の同定
タンパク質ホスファターゼ活性の決定は、リン酸化された基質から遊離した３２Ｐを定量することによって決定することができる（例えば、Ｈｏｎｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：１９４０１−０４（１９９０）；Ｈｏｎｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４０：５７７−８３（１９９１）；ａｎｄ Ｃｒｉｔｚ ａｎｄ Ｈｏｎｋａｎｅｎ， ＮｅｕｒｏＰｒｏｔｏｃｏｌｅｓ ６：７８−８３（１９９５）を参照）。一般的に、ホスファターゼ分析は、ホスファターゼと３２Ｐで放射標識した基質とを混合することによって行うことができる。次に、遊離した３２Ｐを残存した放射標識した基質から分離し、上清中の放射活性レベルをシンチレーション計測によって測定する。例えば、ＧＳＴが融合した放射標識した基質を、ホスファターゼとインキュベートすることができる（Ｔｏｎｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：６７３１−６７３７（１９８８））。次に、その基質をグルタチオンアガロースビーズを用いて反応物から分離する。次に、上清中に残存した放射活性の量を用いて、ホスファターゼ活性レベルを定量することができる。あるいは、放射標識した基質とホスファターゼとをインキュベートした後、その反応物をＳＤＳゲルを用いて分離し、遊離した３２Ｐを残存した放射標識した基質から分離することができる。未処理の基質と比較した基質における放射活性の減少は、ホスファターゼ活性レベルの決定に用いることができる。放射標識した基質の定量は、ゲル上のバンドを切り出し、シンチレーション計測するか、または、リン光イメージ分析によって測定することができる。
【０２３９】
本発明の分析において有用なホスファターゼ基質としては、リン酸化タンパク質、タンパク質断片、ペプチドまたは人工基質がある。ホスファターゼ分析のための代表的な基質としては、これらに限定されないが、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、リン酸化リゾチーム（例えば、ホスホチロシン還元カルボキシアミドメチル化およびマレイル化リゾチーム（ＲＣＭＬ）およびホスホセリン（ＲＣＭＬ））、リン酸化ミエリン塩基性タンパク質、チロシンリン酸化ＥＧＦＲペプチド（ＤＡＤＥｐＹＬＩＰＱＱＧ）、チロシンリン酸化ｖ−ａｂｌペプチド（ＥＤＮＤＹＩＮＡＳＬ）、リン酸化ｐ４２ｍａｐｋなどがある（Ｔｏｎｋｓ， ＮＫ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：６７３１−６７３７（１９８８）；Ｚｈａｎｇ， Ｚ−Ｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：４４４６−４４５０（１９９３）；Ｃｈａｒｌｅｓ， ＣＨ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５２９２−５２９６（１９９３）；Ｈａｎｎｏｎ， ＧＪ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１７３１−１７３５（１９９４）；およびＺｈａｎｇ， Ｚ Ｙ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：１６０５２−１６０５５（１９９５））。
【０２４０】
ホスファターゼ阻害剤を決定するために、リン酸化基質の付加の後、または、それと同時に、試験分子をホスファターゼ分析に加えることができる。ホスファターゼ活性レベルを測定し、試験分子非存在下での活性のレベルと比較する。遊離した３２Ｐの量が減少していれば、または、基質における放射活性が減少していれば、試験分子がホスファターゼ阻害活性を有することが示される。既知のホスファターゼ阻害剤（例えばオカダ酸）の付加は陽性コントロールとして用いることができる。
【０２４１】
メチルトランスフェラーゼ活性の阻害剤の同定
メチルトランスフェラーゼ活性は、ドナー基質とアクセプター基質との間での放射標識したメチル基の移動を測定することによって決定できる。例えば、［３Ｈ］ＡｄｏＭｅｔ（ＮＥＮ ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ． Ｎｅｔ１１５）を、アクセプター基質およびメチルトランスフェラーゼと共に、ドナー基質と混合することによって分析することができる。インキュベーション後、ドナー基質をろ過することによって、または、ＳＤＳゲルで分離することによって反応物から分離する。次に、取り込まれた［３Ｈ］メチルの量を、シンチレーション計数によって、または、リン光イメージ分析によって測定する。検出された放射活性の量は、メチルトランスフェラーゼ活性に比例する。本発明の分析において有用なメチルトランスフェラーゼのアクセプター基質としては、核酸、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡのオリゴヌクレオチド、特に少なくとも１つのシトシン（Ｃ）ヌクレオチドを含む上記オリゴヌクレオチドがある（Ｓｍｉｔｈ， ＳＳ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：４７４４−４７４８（１９９２））。
【０２４２】
メチルトランスフェラーゼ阻害剤を決定するために、アクセプター基質の添加の前に、またはと同時に、試験分子をメチルトランスフェラーゼ分析に加えることができる。メチルトランスフェラーゼ活性のレベルを測定し、試験分子非存在下での活性のレベルと比較する。アクセプター基質に取り込まれた［３Ｈ］メチルの量が減少していれば、試験分子はメチルトランスフェラーゼ阻害活性を有することが示される。
【０２４３】
他の実施形態において、ＧＲＦ２経路成分ポリペプチドの生物活性は、ターゲット化細胞の表現型の変化をモニターすることによって評価できる。例えば、検出手段は、転写調節要素を含むレポーター遺伝子構造であってもよく、ここで当該転写調節要素は、いくつかの形態で、ＧＲＦ２経路成分またはＧＲＦ２経路成分の基質タンパク質のレベルに依存する。ＧＲＦ２経路成分は、レポーター遺伝子構造のＤＮＡ要素に結合するドメインを有する融合タンパク質として提供され得る。付加された融合タンパク質のドメインは、そのＤＮＡ結合能力によって、レポーター遺伝子の転写を増加または減少させるドメインであり得る。いずれの場合においても、融合タンパク質中に上記ドメインが存在することによって、レポーター遺伝子をＧＲＦ２仲介シグナル伝達経路に応答させることができる。従って、レポーター遺伝子の発現レベルは、ＧＲＦ２経路成分の発現レベルに応じて変化する。
【０２４４】
レポーター遺伝子産物は、検出可能な標識であって、例えばルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼであり、これらは無傷の細胞中で生産される。その後の細胞の溶解物において、標識を測定することができる。しかしながら、溶解工程を省略することが好ましく、一般的に、標識を測定するために細胞溶解工程を用いることは、標識の検出が細胞全体中で達成できない場合においてのみ用いられることが好ましい。
【０２４５】
その上、本発明に係る分析の細胞全体の実施形態において、レポーター遺伝子構造は、発現の際に選択可能なマーカーを提供することができる。レポーター遺伝子は、検出可能な遺伝子産物（ＲＮＡまたはタンパク質であり得る）を発現するいずれの遺伝子を含む。好ましいレポーター遺伝子は、容易に検出可能なものである。また、レポーター遺伝子は、融合遺伝子の形態で構造に含ませることができ、ここで当該融合遺伝子は、所望の転写調節配列を含むか、または、他の望ましい特性を示す遺伝子を有する。例えば、レポーター遺伝子の生産物は、抗生物質または他の薬物に対する耐性を付与する酵素、または、宿主細胞における欠陥を補足する酵素（すなわち、チミジンキナーゼまたはジヒドロ葉酸レダクターゼ）であり得る。説明すれば、細菌性のトランスポゾン遺伝子Ｔｎ５　ｎｅｏでコードされたアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼを、細胞中に存在するＧＲＦ２経路成分ポリペプチドのレベルに応答するプロモーター要素の転写調節下に置いてもよい。このような本発明に係る分析の実施形態は、特にハイスループット分析で処理することができ、この場合、ＧＲＦ２仲介シグナル伝達経路の阻害として細胞増殖を簡単に測定できる。
【０２４６】
レポーター遺伝子の他の例としては、これらに限定されないが、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）（Ａｌｔｏｎ ａｎｄ Ｖａｐｎｅｋ（１９７９）， Ｎａｔｕｒｅ ２８２：８６４−８６９）ルシフェラーゼ、および他の酵素検出系、例えばβ−ガラクトシダーゼ；ホタルのルシフェラーゼ（ｄｅＷｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９８７）， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７：７２５−７３７）；細菌性のルシフェラーゼ（Ｅｎｇｅｂｒｅｃｈｔ ａｎｄ Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ（１９８４）， ＰＮＡＳ １：４１５４−４１５８；Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）、Ｂｉｏｃｈｅｒｎｉｓｔｒｙ ２３：３６６３−３６６７）；アルカリホスファターゼ（Ｔｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８２：２３１−２３ ８， Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８３） Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎ． ２：１０１）、ヒト胎盤で分泌されるアルカリホスファターゼ（Ｃｕｌｌｅｎ ａｎｄ Ｍａｌｉｍ（１９９２） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２１６：３６２−３６８）がある。
【０２４７】
レポーター遺伝子からの転写量は、当業者既知の適切な方法のいずれかを用いて測定することができる。例えば、特異的なｍＲＮＡ発現は、ノーザンブロットを用いて検出することができ、または、特異的なタンパク質産物は、特徴的な染色、ウェスタンブロットまたは内因性の活性により同定することができる。
【０２４８】
好ましい実施形態において、レポーター遺伝子産物は、その産物と結合する内因性の活性によって検出される。例えば、レポーター遺伝子は、酵素活性によって色、蛍光、または発光に基づく検出シグナルを生じる遺伝子産物をコードし得る。
【０２４９】
次に、レポーター遺伝子の発現量と、試験化合物非存在下の同じ細胞の発現量とを比較するか、または、レポーター遺伝子の発現量と、ＧＲＦ２仲介シグナル伝達経路成分を含まない実質的に同一な細胞における転写量とを比較することができる。
【０２５０】
１１．実施例
以上、本発明を一般的に説明したが、以下の実施例を参照することによって本発明をより容易に理解することができ、当該実施例は、本発明の特定の観点および実施形態を単に説明する目的のためであって、本発明を限定する意図はない。
【０２５１】
実施例１：ＧＲＦ２相互作用タンパク質の同定
細胞性プロセスにおけるＧＲＦ２シグナル伝達経路およびその役割をよりよく理解するために、共免疫沈降反応実験を反復して行い、ＧＲＹ２シグナル伝達に関与するタンパク質−タンパク質相互作用を綿密にまとめた。以下で説明される実験において、エピトープタグを付したマウスＧＲＦ２の誘導体（Ｆｌａｇ−ＧＲＦ２）を用いて、ヒト胚の腎臓上皮細胞（ＨＥＫ２９３）からＧＲＦ２関連タンパク質を単離した。Ｆｌａｇ−ＧＲＦ２関連タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したトリプシン消化タンパク質をマススペクトロメトリー分析することによって同定した。この方法によって、ヒトタンパク質ｐＩＣｌｎ、Ｎｄｒ、Ｓｋｂ１およびＰＰ２Ｃを含むこれらヒト細胞から回収されたＧＲＦ２と結合する様々なタンパク質が見出された。次に、同様の実験でこれらタンパク質をベイトとして用いて、これらＧＲＦ２相互作用タンパク質と結合するタンパク質を単離した。
【０２５２】
免疫沈降反応
Ｆｌａｇ−エピトープタグを付したマウスＲａｓ−ＧＲＦ２発現ベクターおよびヒト２９３細胞由来の細胞系クローン１３（またはｃｌ．１３）およびクローン２１（またはｃｌ．２１）（これらはマウスＦｌａｇ−Ｒａｓ−ＧＲＦ２（ＧＲＦ２）を安定して発現する）は、Ｆａｍ等（１２）で説明される。Ｆｌａｇ−Ｒａｓ−ＧＲＦ２タンパク質（ＧＲＦ２）を一時的に発現させるため、ヒト胚腎臓細胞系２９３を、リポフェクトアミンプラス（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いてトランスフェクトした。４８時間（ｈまたはｈｒ）後、トランスフェクトされた細胞（約１×１０８細胞）をトリス−塩類液（２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１４０ｍＭのＮａＣｌ、８ｍＭのＫＣｌ、７００μＭのＮａ２ＨＰ０４、５．５ｍＭのグルコース）で洗浄し、リシスバッファー（ＫＬＢ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ４０、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、および０．２ｍＭのＡＥＢＳＦ（４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライド））で溶解させた。続いて、遠心分離して不溶性物質を除去し、澄んだ溶解産物を、セファロース−４Ｂ（溶解産物１ｍｌにつき１０μｌの充填セファロース）で、穏やかに混合しながら（転倒させることにより）４０℃で２０分間インキュベートした。次に、その上清を、固定化抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体（Ｍ２−アガロース、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；溶解産物１ｍｌにつき１μｌの充填Ｍ２−アガロース）を用いて、穏やかに混合しながら４℃で６０分間インキュベートした。上記Ｍ２−アガロースを１ｍｌのＫＬＢを含まないＡＥＢＳＦで２回洗浄し、１ｍｌの５０ｍＭの重炭酸アンモニウムで１回洗浄した。Ｍ２−アガロースからのＦｌａｇ−Ｒａｓ−ＧＲＦ２および関連タンパク質を特異的に溶出するために（競合させることにより）、Ｍ２−アガロースビーズを、５０ｍＭの重炭酸アンモニウム（４００μｇ／ｍｌのＦｌａｇペプチド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む）で再懸濁した。４℃で３０分経過した後、Ｍ２−アガロースビーズを遠心分離によって除去し、溶出したタンパク質を真空遠心分離により凍結乾燥させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液に再懸濁した。
【０２５３】
ＦＬＡＧ−ｐＩＣｌｎ、ＦＬＡＧ−Ｎｄｒ、ＦＬＡＧ−Ｓｋｂ１およびＦＬＡＧ−ＰＰ２Ｃ融合タンパク質を用いた共免疫沈澱反応実験を、ＧＦＲ−２タンパク質に対して上述したように行った。ＦＬＡＧ−Ｎｄｒの免疫沈降は、オカダ酸（ホスファターゼ阻害剤）で処理した細胞を用いて、または、ＦＬＡＧ−Ｎｄｒ（Ｋ１１８Ａ）変異融合タンパク質（Ｎｄｒのキナーゼ不活性型）を用いて、行った。ＦＬＡＧ−Ｓｋｂ１の免疫沈降は、共発現ＧＲＦ２または非共発現ＧＲＦ２のいずれかの細胞で行われた。
【０２５４】
サンプル調製およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
再懸濁されたサンプルを最終濃度１×ＳＤＳのサンプル緩衝液（ｐＨ８．８に調節）中で沸騰させた。次に、このサンプルを１％アクリルアミド（Ｆｉｓｈｅｒ）を含むように調整し、２３℃で１時間インキュベートした。４〜１５％のアクリルアミド−トリス−ＨＣｌグラージェントゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＢｉｏＲａｄ）でサンプルを分離した。そのゲルをまず製造者説明書に従ってＧＥＬＣＯＤＥブルー染色試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）で染色した。クローン１３で誘導された細胞溶解物からのＭ２免疫沈降物に特有な染色されたタンパク質バンドを単離し、マススペクトロメトリーによる分析のために調製した（次の章を参照）。次に、そのゲルをＳｈｅｖｃｈｅｎｋｏ ９６で説明された方法（ただし以下の点で異なる：５０％エタノール、１０％酢酸で固定し、５０％エタノールですすぎ、０．０００４％チオ硫酸ナトリウムを現像溶液に加え、および反応を１％酢酸中で止めた）に従って銀染色した。クローン１３で誘導された細胞溶解物からのＭ２免疫沈降物に特有な銀染色されたバンドを単離し、マススペクトロメトリーによる分析のために調製した。
【０２５５】
マススペクトロメーター分析のためのサンプル調製
ゲル内消化およびペプチド抽出を、Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ ９６に従って行った（ただし以下の点で異なる：システインをアクリルアミドで改変し（上述したとおり）、そのため、ＤＴＴ還元およびヨードアセトアミド工程を省略した）。簡単に言えば、そのゲルスライスを重炭酸アンモニウムで洗浄し、次に、１００％アセトニトリルで脱水した。そのゲルスライスを氷上で消化用緩衝液（５０ｍＭの重炭酸アンモニウム、５ｍＭのＣａＣｌ２、および１２．５ｎｇ／μｌのトリプシンを含む）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＭａｎｎｈｅｉｍまたはＰｒｏｍｅｇａ）を用いて元に戻し、トリプシンを含まない消化用緩衝液で３７℃で一晩インキュベートした。２０ｍＭの重炭酸アンモニウムを１回交換して、さらに、５０％アセトニトリル中の５％ギ酸を２回交換して、ペプチドを抽出した。サンプルを真空遠心分離で量が１０μｌになるまで濃縮した。
【０２５６】
結果
ＧＲＦ２経路成分相互作用タンパク質
ＦＬＡＧ−ＧＲＦ２免疫沈降実験で得られたタンパク質の、代表的なクーマシーブルーおよび銀で染色されたゲルを図２に示す。これらタンパク質を上記ゲルから単離し、上述したマススペクトロメトリー分析により同定した。
図３Ａおよび３Ｂに、ＦＬＡＧ−Ｎｄｒ（オカダ酸存在下で）免疫沈降実験から単離されたポリペプチドの代表的なスペクトルを示す。ＢＬＡＳＴ分析を用いて、これらのポリペプチドをスピンドリンタンパク質の断片と同定した。
図４Ａおよび４Ｂに、ＦＬＡＧ−Ｎｄｒ（オカダ酸存在下で）免疫沈降実験から単離されたポリペプチドの代表的なスペクトルを示す。ＢＬＡＳＴ分析を用いて、これらのポリペプチドがＥＳＴ７０５５８２のコーディング配列を含むことを同定した。この新規のタンパク質は、ＭＯＢ様タンパク質に対する相同性を有する。
【０２５７】
図５に、ＥＳＴ６５９３３１８およびＥＳＴ５３３９３１５のコーディング配列を含むタンパク質の完全長タンパク質配列を示す。当該タンパク質を同定するのに用いられたペプチドを一重下線で、または隣接ペプチドを二重下線で示す。完全長ｃＤＮＡを、ＥＳＴ６５９３３１８の５’末端に特異的なプライマーおよびオリゴｄＴプライマーを用いたＰＣＲ増幅でクローニングした。予想タンパク質は、分子中央に６個のＷＤ４０リピートと、特有なＮおよびＣ末端配列とを含む。
【０２５８】
図６に、ＭＯＢ関連タンパク質（ＥＳＴ７０５５８２またはＥＳＴ８９２２６７１のコーディング配列を含む）およびスピンドリンのタンパク質配列を示す。タンパク質同定に用いられた５種のペプチドを下線で示した。
図７に、本発明で同定されたＭＯＢ関連タンパク質（図中、上部の７配列）と、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳ． ｐｏｍｂｅのＭＯＢ１タンパク質とを比較したアライメントを示す。
図８は、図７のＭＯＢ関連タンパク質の関係を示す系統樹である。
【０２５９】
ＧＲＦ２と相互作用することが同定されたタンパク質の概要を表１に示す。ＧＲＦ２は、様々なタンパク質と相互作用し、例えば、シグナル伝達経路および細胞周期調節（Ｓｋｂ１、ＮｄｒおよびＰＰ２Ｃ、機能が未知のタンパク質（ＥＳＴ６５９３３１８のコーディング配列を有する）、構造タンパク質（ＡＢＰ−２８０およびスペクトリン）、ＲＮＡ結合（ｈｎＲＮＰＨおよびＫＩＡＡ０１２２）、延長因子（ＥＦ１ａ）、および、アダプタータンパク質と考えられるｐＩＣｌｎに関与するタンパク質が含まれる。
【０２６０】
ｐＩＣｌｎと相互作用することが同定されたタンパク質の概要を表２に示す。ＰＩＣｌｎは、様々なタンパク質と相互作用し、例えば、メチルトランスフェラーゼ（Ｓｋｂ１）、タンパク質キナーゼ（Ｎｄｒ）、機能が未知のタンパク質（ＥＳＴ６５９３３１８のコーディング配列を含む）、および、ＲＮＡ代謝に関与する様々なタンパク質（ｈｎＲＮＰＫ（ＲＯＫ）、ｓｎＲＮＰタンパク質、タンパク質４．１、ＫＩＡＡ０９８７、Ｇａｒ１、ｇｅｍｉｎ４およびＳＭＮ）が含まれる。
【０２６１】
Ｎｄｒタンパク質キナーゼと相互作用することが同定されたタンパク質の概要を表３Ａ〜Ｂに示す。オカダ酸（ホスファターゼ阻害剤）の存在下で、Ｎｄｒ相互作用タンパク質は、機能が未知のタンパク質（ＥＳＴ６５９３３１８のコーディング配列を含む）、数種のＭＯＢ関連タンパク質（ＥＳＴ７０５５８２のタンパク質のコーディング配列、および、機能未知のタンパク質８９２２６７１を含む）、細胞分裂に関与するタンパク質（スピンドリン）、および、シグナル伝達で誘導されたタンパク質（プロラクチン誘導タンパク質またはＰＩＰ）を含む（表３Ａ）。不活性Ｎｄｒキナーゼを用いた（ＫＩ１８Ａ　Ｎｄｒは結合するが、ＡＴＰを加水分解できない）を用いた共免疫沈降実験により、Ｎｄｒが、数種のシャペロンタンパク質（ＣＤＣ３７、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ７１およびＨｓｐ７ｃ）を含む様々なタンパク質と相互作用することがわかった（表３Ｂ）。
【０２６２】
Ｓｋｂ１メチルトランスフェラーゼと相互作用することが同定されたタンパク質の概要を表４Ａ〜Ｂに示す。Ｓｋｂ１は、ＧＲＦ２を共発現する細胞から共免疫沈降される場合、ＧＲＦ２およびｐＩＣｌｎを含む様々なタンパク質と相互作用し（表４Ａ）、一方でＧＲＦ２が共発現されない場合、ＲＡＣＫ１および機能が未知のタンパク質（ＥＳＴ６５９３３１８のコーディング配列を含む）と相互作用することが示された（表４Ｂ）。
ＰＰ２Ｃと相互作用することが同定されたタンパク質の概要を表５に示す。
【０２６３】
ＧＲＦ２、ｐＩＣｌｎ、Ｓｋｂ１、ＮｄｒおよびＰＰ２Ｃ相互作用タンパク質のいくつかの簡単な説明を以下に記す。各相互作用タンパク質を共免疫沈降させることができるベイトタンパク質が記載される。いくつかの場合において、同じ相互作用タンパク質が、複数のベイト（すなわち、２以上のＧＲＦ２、ｐＩＣｌｎ、Ｓｋｂ１、ＮｄｒおよびＰＰ２Ｃ）で共免疫沈降された。同様に、上記ベイトタンパク質は、場合によって、相互作用タンパク質として、他のベイトと共免疫沈降されるようである（すなわち、Ｓｋｂ１は、相互作用タンパク質としてＧＲＦ２ベイトと共免疫沈降された）。
【０２６４】
ＡＢＰ−２８０（または、フィラミン１もしくは非筋肉性のフィラミンともいう）は、周辺の細胞質に局在する２８０ｋＤａのアクチン結合タンパク質である。ＡＢＰ−２８０は、そのＣ末端を介してホモ二量体化され、そのＮ末端を介してアクチンと結合する。ＡＢＰ−２８０はＧＲＦ２と共免疫沈降することが示された。
【０２６５】
α−チューブリンは主要な微小管成分の一つであり、β−チューブリンとの二量体として機能する。α／β−チューブリン二量体は、２モルのＧＴＰと結合するこの二量体は２分子のＧＴＰと結合するが、その一はα−チューブリンの結合部位とは交換不可能である。α−チューブリンは、ＰＰ２Ｃと共免疫沈降することがわかった。
【０２６６】
ＣＤＣ３７は、約５０ｋＤａのタンパク質であり、不安定な腫瘍キナーゼをターゲットとし、それらを分子シャペロンＨｓｐ９０に向ける。この相互作用は、シグナル伝達経路の確立に重要であると考えられる。ＣＤＣ３７のターゲットとしては、Ｃｄｋ４、Ｒａｆｌおよびｖ−ｓｒｃがある。またＣＤＣ３７は、細胞の形質転換においてｃ−ｍｙｃおよびサイクリンＤに協力するようである（Ｓｔｅｐａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２９：４４６２−４４７３（２０００））。
【０２６７】
ＣＤＣ３７は、安定化に関与し、それによりＮｄｒキナーゼの活性を高める可能性がある。ＣＤＣ３７は、キナーゼ不活性ＫＩ１８Ａ　Ｎｄｒ変異体と結合することがわかった。
ＥＧ５は、Ｓｋｂ１−ＩＰとして単離される。これは、二極性の紡錐体形成に必須なキネシン関連モーターである。
ＥＧ５に関して、ｐ３４ｃｄｃ２によるリン酸化は、ヒトＥｇ５の紡錐体結合を調節する。
【０２６８】
延長因子１α（ＥＦ−１ａ）は、タンパク質合成中のアミノアシル−ｔＲＮＡと８０ｓリボゾームとのＧＴＰ依存性結合に関与する。これは、細胞質に局在するセリン／スレオニンリンタンパク質である。ＥＦ−１ａがＰＰ２Ｃに結合することがわかった。
【０２６９】
ＥＳＴ６０２８５４９は、機能未知のタンパク質に対応する配列を有するポリペプチドをコードし、ベイトとしてＧＲＦ２と共免疫沈降することがわかった。
【０２７０】
ＥＳＴ６５９３３１８は、約４２ｋＤａの機能が未知のタンパク質（「タンパク質ＥＳＴ６５９３３１８」）に対応する配列を有するポリペプチドをコードする。当該タンパク質は、６個のＷＤ４０リピートと、特有のＮおよびＣ末端を含む。ＷＤ４０リピートは、多様な機能（シグナル伝達とＦ−ボックス型タンパク質とに関与する機能を含む）を有するタンパク質中で見出された。タンパク質ＥＳＴ６５９３３１８は、Ｓｋｂ１と強く相互作用するようであり、これは、Ｓｋｂ１とＧＲＦ２との両方でも共免疫沈澱するという事実に基づく。多数の他のタンパク質（例えば、ＲＮＡ代謝に関与するタンパク質）がｐＩＣｌｎのみと共免疫沈澱し、Ｓｋｂ１およびＧＲＦ２反応ではみられなかった。これは、ＥＳＴ６５９３３１８でコードされるタンパク質がＳｋｂ１のコレギュレーターまたはコファクターである可能性を示す。ＥＳＴ６５９３３１８でコードされたタンパク質は、ＧＲＦ２、ｐＩＣｌｎ、ＮｄｒおよびＳｋｂ１と共免疫沈澱することがわかった。
【０２７１】
ＥＳＴ７０５５８２は、同定されていないタンパク質に対応する配列を有するポリペプチドをコードし、当該ポリペプチドは、〜３０ｋＤａのタンパク質としてＳＤＳゲル上を移動し、３つの異なるバンドとして観察され、これはすなわち翻訳後修飾されたことを示す（「タンパク質ＥＳＴ７０５５８２」）。ＢＬＡＳＴ検索の結果により、このタンパク質と、Ｓ． ｐｏｍｂｅおよびＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＭＯＢタンパク質（細胞周期調節、隔壁形成および細胞質分裂に関与すると考えられる）とは顕著な相同性を有することが示された。酵母において、Ｎｄｒ関連キナーゼＤＢＦ２は、後期有糸分裂中、適切に進行するのに必要であり、ＭＯＢ１タンパク質に結合し、ＭＯＢ１タンパク質を介して作用する。ＭＯＢ１はリンタンパク質であり、その活性は、細胞周期を制御することが示された。タンパク質ＥＳＴ７０５５８２は、オカダ酸の存在下で、Ｎｄｒタンパク質キナーゼで共免疫沈澱された。ある最近の結果によれば、ＭＯＢはＮｄｒキナーゼの基質であることが初めて示された。図１９に示すように、ＧＳＴ融合タンパク質として発現された組換えＭＯＢは、活性Ｎｄｒにより特異的にリン酸化される。
【０２７２】
Ｇａｒ１は、プレｒＲＮＡスプライシングに必要な、プレｒＲＮＡのシュードウリジル化に関与する核小体のタンパク質である（Ｂｏｕｓｑｕｅｔ−Ａｎｔｏｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １６：４７７０−４７７６ （１９９７））。Ｇａｒ１は、ＲＮＡ結合において補助的な役割を有する２つのグリシン／アルギニン豊富なドメインを含む（Ｂａｇｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７３：１０８６８−７３ （１９９８））。これらのドメインは、ｈｎＲＮＰで見出されたのと類似したＲＧＧリピートを有する。また、Ｃ末端の先端は配列ＦＲＧＲＧＨを含み、当該配列は、メチルトランスフェラーゼによるメチル化の基質（例えばＳｋｂ１）となり得る。実際には、ＲＮアーゼ処理酵母抽出物からのＧａｒ１は、酵母タンパク質ＲＭＴ１による非対称なアルギニンジメチル化のインビトロ基質であることがわかっている。Ｇａｒ１は、Ｃｂｆ５ｐタンパク質（シュードウリジンシンターゼタンパク質）と結合することがわかっている。シュードウリジンシンターゼ相同体ジスケリン（ｄｙｓｋｅｒｉｎ）の変異により、先天性角化異常症（Ｈｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．１９：３２−３８（１９９８））、骨髄障害に関連する病気および他の疾患を発症することがわかっている。またＧａｒ１は、ＲＮＡドメインと結合するリボ核タンパク質であるヒトテロメラーゼと結合し、インビボでの染色体安定性および機能に必須であることがわかっている（Ｄｒａｇｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２０：３０３７−３０４８（２０００））。Ｇａｒ１免疫沈降は、ｐＩＣｌｎ反応においてのみ起こった。
【０２７３】
Ｇｅｍｉｎ４は、ＳＭＮ（ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎｓ）タンパク質と免疫沈降するタンパク質と同定された。ＳＭＮは、ｓｎＲＮＰの細胞質の構築およびプレｍＲＮＡスプライシングに関与する大型のタンパク質複合体の一部である。Ｇｅｍｉｎ４は、ｓｍＢ、ｓｍＤ１〜３およびｓｍＥと直接相互作用し、細胞質中のＵｓｎＲＮＡと結合する。またＧｅｍｉｎ４は、ｇｅｍｓおよび核小体に局在し（スプライシング因子と共に）、プレｒＲＮＡプロセシングに関与する（Ｃｈａｒｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４８：１１７７−１１８６ （２０００））。Ｇｅｍｉｎ４は、ＤＥＡＤボックス型タンパク質ｇｅｍｉｎ３、推定のＡＴＰアーゼ／ヘリカーゼタンパク質と直接相互作用することによって、ＳＭＮ複合体と結合し、これは、ｇｅｍｉｎ４がｇｅｍｉｎ３のコファクターである可能性を示す。Ｇｅｍｉｎ４は、既知のタンパク質モチーフ／ドメインを含まないが、グリシン残基の近くの位置に多くのアルギニン残基を含んでおり、これは、メチルトランスフェラーゼに対する可能性のある基質（例えばＳｋｂ１）であることを示す。Ｇｅｍｉｎ４は、ｐＩＣｌｎと結合するが、ＧＲＦ２、Ｎｄｒ、Ｓｋｂ１またはＰＰ２Ｃとは結合しないことだけがわかった。
【０２７４】
ＧＲＦ２は、ＲａｓやＲａｃとは異なるドメインおよび活性を有する二官能価のグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）である。ＧＲＦ２は、２つのプレックトリン相同（ＰＨ）ドメインと、ＤＨドメインとを含む。ＧＲＦ２は、ベイトとしてＳｋｂ１と免疫沈降するすることがわかった。
【０２７５】
ｈｎＲＮＰ　Ｈ１（異種核のリボ核タンパク質Ｈ１またはＲＯＨ１）は、核タンパク質であり、プレｍＲＮＡと結合するｈｎＲＮＰ複合体の成分である。ｈｎＲＮＰ　Ｈ１は、ポリＲＧ（Ａｒｇ／Ｇｌｙ）配列に結合し、３つのＲＮＰ／ＲＲＭ　ＲＮＡ結合モチーフを含むことがわかっている。ｈｎＲＮＰ　Ｈ１は、ＧＲＦ２およびＳｋｂ１と結合することがわかっている。
【０２７６】
異種核のリボ核タンパク質複合体Ｋ（ｈｎＲＮＰＫまたはＲＯＫ）は、〜６６ｋＤａのタンパク質であり、シチジン豊富なプレｍＲＮＡｓに結合し、その成熟ｍＲＮＡへのプロセシングを促進する。また、ｈｎＲＮＰＫは、転写にも関与する可能性がある（Ｍｉｃｈｅｌｏｔｔｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １６：２３５０−２３６０ （１９９６））。ｈｎＲＮＰＫ（および他のｈｎＲＮＰ）は、ＲＮＡ結合に関与する可能性のあるＲＧＧボックス型モチーフ（アミノ酸Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙのリピートで構成される）を含む。ｈｎＲＮＰＫは、インビボでメチル化可能であり、また、インビトロでは非対称なアルギニンメチルトランスフェラーゼによりおそらくＲＧＧボックス上でメチル化可能である（Ｌｉｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １５：２８００−２８０８（１９９５））。ｈｎＲＮＰのアルギニンのメチル化は、その核の搬出を促進する可能性がある（遺伝子 ＆ Ｄｅｖ． １２：６７９−６９１）。ｈｎＲＮＰＫはｐＩＣｌｎとだけ結合した。
【０２７７】
Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７１およびＨｓｐ７ｃは全て、熱ショックタンパク質である。Ｈｓｐ９０は、ＣＤＣ３７により方向付けられるように、不安定な腫瘍キナーゼと特異的に結合することが知られている。これらタンパク質は、安定化に関与し、それによりＮｄｒキナーゼの活性を高める可能性がある。Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７１およびＨｓｐ７ｃは全て、キナーゼ不活性Ｋ１１８Ａ　Ｎｄｒタンパク質と免疫沈降することがわかった。
【０２７８】
機能未知のタンパク質８９２２６７１は、約３０ｋＤａとしてＳＤＳゲル上を泳動し、ＭＯＢファミリーのタンパク質と顕著な相同性を有することがわかった。このタンパク質は、オカダ酸の存在下で、Ｎｄｒと結合することがわかった。ある最近の研究結果によれば、ＭＯＢがＮｄｒキナーゼの基質であることが初めて示された。図１９で示すように、ＧＳＴ融合タンパク質として発現した組換えＭＯＢは、活性Ｎｄｒにより特異的にリン酸化される。
【０２７９】
ＫＩＡＡ０１２２は、機能が未知の亜鉛フィンガータンパク質である。その配列は、ヒトＫＧ−１細胞系からのｃＤＮＡクローンから推測された。そのＮ末端およびＣ末端の半分はそれぞれＲＮＡ結合ドメインを含む（ＲＲＭ／ＲＮＰタイプ）。ＫＩＡＡ０１２２は、ＧＲＦ２と結合することがわかった。
【０２８０】
ＫＩＡＡ０９８７タンパク質は、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーからの同定されていない遺伝子のコーディング配列から推測された（Ｎａｇａｓｅ ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ Ｒｅｓ． ６：６３ ７０ （１９９９）。ＫＩＡＡ０９８７タンパク質は、タンパク質４．１と関連し、それにより類似の機能を有するようである。ＫＩＡＡ０９８７の免疫沈降は、ベイトタンパク質としてｐＩＣｌｎを用いた場合にのみ達成された。
【０２８１】
Ｎｄｒは、Ｓｅｒ２８１およびＴｈｒ４４４において、カルシウム調節に関する活性と、リン酸化を増加させる活性とを有するセリン／スレオニンキナーゼである。Ｎｄｒは、Ｄｂｆ２（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｏｒｂ６（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、Ｗａｒｔｓ／Ｌａｔｓ（ショウジョウバエ属）およびＣＯＴ−１（アカパンカビ属）キナーゼと相同である。Ｏｒｂ６は、ｐ３４（ｃｄｃ２）有糸分裂のキナーゼを作用させることによって、分裂間期に細胞極性を維持し、有糸分裂を遅らせるのに必要である。Ｎｄｒは、ＨａｎｋｓおよびＱｕｉｎｎによって定義された１２個のタンパク質キナーゼのサブドメイン全て（Ｈａｎｋｓ ａｎｄ Ｑｕｉｎｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２００：３８−６２ （１９９１））、核局在シグナル（ＮＬＳ）として機能し得る塩基性アミノ酸の数種の保存されたクラスター（Ｍｉｌｌｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：５０２２−５０２６ （１９９５））を含む。我々の実験により、Ｎｄｒは、ＧＲＦ２、ｐＩＣｌｎおよびＳｋｂ１と結合することが見出され、Ｓｋｂ１との複合体において機能する可能性が示された。加えて、Ｎｄｒがオカダ酸により活性化された場合、Ｎｄｒは、ＭＯＢ様タンパク質と結合することがわかった（表３Ａ）。ＭＯＢは活性Ｎｄｒキナーゼの基質であることが初めて示された（図１９）。予備的な結果によれば、ＧＲＦ２の存在により、オカダ酸および／またはイオノマイシンで処理された細胞中でＮＤＲキナーゼ活性を高めることができるということがさらに示される（図１９）。これは、ＮｄｒがＧＦＲ２相互作用タンパク質であるという発見と一致する。
【０２８２】
ｐＩＣｌｎはもともと、アフリカツメガエルの卵母細胞において、塩素の導入で誘導される膨潤に関連する塩素チャンネルであると考えられている。ヒトｐＩＣｌｎのアミノ酸配列は、ラット腎臓およびイヌ腎臓上皮の細胞系ＭＤＣＫから単離された相同体と、それぞれ９０．２％および９２．７％の同一性を有する。哺乳動物のあいだでｐＩＣｌｎは保存されているが、これまで出芽酵母Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは相同体は同定されていない。しかしながら、少なくとも１種のＳ． ｐｏｍｂｅ相同体（ＧＩ：３１８３３９６）がＰＳＩ　ＢＬＡＳＴを用いて同定可能である。我々が発見したところによれば、ｐＩＣｌｎは、基質に特異的な部分集合を有するＳｋｂ１メチルトランスフェラーゼを共に運搬するアダプタータンパク質として作用する可能性がある。ＲＮＡ代謝に関与するタンパク質は、Ｓｋｂ１によるメチル化に関する可能性のある基質である。ｐＩＣｌｎは、ＧＲＦ２と共発現される場合、ＧＲＦ２およびＳｋｂ１と結合することがわかった。
【０２８３】
プロラクチン誘導タンパク質（ＰＩＰ）の発現は、プロラクチンまたはアンドロゲンで誘導され、乳ガンのマーカーとして用いられる（Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ８１：１００２−１００８（１９９９））。ＰＩＰは、プロラクチンおよび受容体チロシンキナーゼとの間での混線に関与することが示唆されているシグナルペプチド配列をそのＮ末端に有する。これに一致して、プロラクチンは、いくつかの受容体チロシンキナーゼからのＲａｓシグナル伝達を阻害することが示されている（Ｄ’Ａｎｇｅｌｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏ． Ｅｎｄｒｏｃｒｉｎｏｌ． １３：６９２−７０４（１９９９） ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：２１５７４−２１５７８（１９９６））。ＰＩＰは、オカダ酸の存在下で、Ｎｄｒと共免疫沈降することが示された。
【０２８４】
タンパク質４．１は、少なくとも２種のアイソフォームを有し（アイソフォームＡは〜１３０ｋＤａ、および、アイソフォームＢは〜８４ｋＤａ）、これらはいずれもｐＩＣｌｎで免疫沈降する。２種の新規の形態、４．１ＳＶＷＬ１および４．１ＳＶＷＬ２が近年クローニングされた。タンパク質４．１は、最初は、赤血球（核を有さない）における細胞骨格のタンパク質であることが示され、骨格ネットワークを安定化する役割を有すると考えられている。ｐＩＣｌｎは、タンパク質４．１のアイソフォームＢのＣ末端と相互作用することが以前に示されている。この相互作用は、塩素チャンネルとしてのｐＩＣｌｎの機能に関与すると考えられている（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９２：１４４２−１４４７（１９９８））。しかしながら、近年の研究によれば、タンパク質４．１は、核にも存在し、スプライシングプロセスに関与するタンパク質を強化するスペックルドメインに局在することが示されている（Ｌａｌｌｅｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １１１：１９６３−１９７１（１９９８））。タンパク質４．１は、多くのＡｒｇ残基を含み、そのうちのいくつかは、メチルトランスフェラーゼによるメチル化に関する可能性のある部位（例えばＳｋｂ１）であるＲＧまたはＧＲの形態である。タンパク質４．１のアイソフォームＡおよびＢは、いずれもｐＩＣｌｎのみと結合することがわかった。４．１ＳＶＷＬ２を「ベイト」として用いて、４．１ＳＶＷＬ２と相互作用する多くのタンパク質を同定した。それらを「４．１ＳＶＷＬ２−ＩＰ」の「４．１ＳＶＷＬ２相互作用タンパク質」と指定し、表６に列挙する。
【０２８５】
我々は、１４−３−３タンパク質の全てのファミリーがタンパク質４．１ベイト４．１ＳＶＷＬ２と相互作用することを初めて示す。タンパク質４．１種は、細胞周期の際に細胞中で空間的に再編成されることがわかっていることから、この研究結果により、４．１ＳＶＷＬ２は、細胞の何らかのシグナル伝達／細胞周期の機能に関与する可能性を示す。タンパク質４．１種は、分裂間期には核質および細胞膜に局在し、有糸分裂時には有糸分裂の紡錐体の形態、細胞質分裂時には中間体の形態である。従って、１４−３−３タンパク質は、それらのタンパク質４．１種との結合を介してこれらのプロセスに関与する可能性がある。
【０２８６】
タンパク質ホスファターゼ２Ｃ（ＰＰ２Ｃ）は、Ｍｎ２＋またはＭｇ２＋依存性のＳｅｒ／Ｔｈｒタンパク質ホスファターゼである（Ｄａｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １５：６７９８−６８０９ （１９９６））。ＰＰ２Ｃは、真核生物における細胞性ストレス応答を調節するのに必須であることがわかっている。またＰＰ２Ｃは、ｃｄｋを脱リン酸化することによって細胞周期調節において機能する可能性がある（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：３４７４４−９）。ＰＰ２Ｃは、ＧＲＦ２と共免疫沈降することがわかった。
【０２８７】
ＲａｎＢＰ８（ＧＩ：５４５４０００）は、Ｓｋｂ１と免疫沈降し、ＲａｎＧＴＰアーゼと相互作用することが知られている（Ｇｏｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １３８：６５−８０， １９９７）。しかしながら、その機能は未知である。ＲａｎＧＴＰアーゼは、有糸分裂の開始の調節、および、有糸分裂の紡錐体形成の誘導に関与する。他のＲａｎ結合タンパク質はＲａｎのＧＴＰアーゼ活性を調節するため、ＲａｎＢＰ８は類似の機能を有する可能性が考えられる。従って、ＲａｎＢＰ８は、有糸分裂の調節にも関与する可能性がある。これはまた、Ｓｋｂ１も、終期の際の有糸分裂のスピンドルポールボディ（ＳＰＢ）に局在するという我々の予備的な結果と一致し（図１７）、Ｓｋｂ１／ＲａｎＢＰ８／Ｒａｎ経路が存在し、ＲａｎＢＰ８が有糸分裂の調節におけるＳｋｂ１に対する重要なターゲットである可能性を示す。
【０２８８】
活性化タンパク質キナーゼＣ１の受容体（ＲＡＣＫ１）。活性化の際に、ＰＫＣは、可溶性フラクションから細胞粒子画分に転座する。アイソザイム特異的ＲＡＣＫは、活性化の際に、異なるＰＫＣアイソザイムを別の細胞内部位に転座させることに関与することが示唆されている。ＲＡＣＫ１は、ＷＤ４０リピートを含み、β−アドレナリン受容体キナーゼの膜への固定化に関与するＧタンパク質のβサブユニットの相同体である。ＲＡＣＫ１は、ＧＲＦ２と結合することがわかった。
【０２８９】
Ｓｋｂ１は、ミエリン塩基性タンパク質およびヒストンをメチル化するアルギニンメチルトランスフェラーゼである（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：３１５３１−３１５４２ （１９９９））。Ｓｋｂ１は、ｐＩＣｌｎアミノ酸配列のＣ末端の最後の２９個のアミノ酸を介してｐＩＣｌｎと相互作用することがわかっている（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１０８１１−１０８１４ （１９９８）；Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４０４（３）：３２１−８ （１９９８））。Ｓｋｂ１は、ＧＲＦ２およびｐＩＣｌｎの両方と免疫沈降した。我々の近年の研究結果によれば、Ｓ１ｃｂ１は、終期の際に細胞の分裂溝に局在することが示される（図１７）。Ｓｋｂ１の分裂溝への局在は、有糸分裂の際のそのＳ． ｐｏｍｂｅ相同体の局在と一致する（Ｂａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２００１ ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ Ｃ１０００９６２００）。
【０２９０】
またＳｋｂ１は、スピンドルポールボディにも局在する可能性がある（図１７）。近年の発見の観点によれば、Ｓｋｂ１は、ＲａｎＢＰ８（ＧＩ：５４５４０００）、機能が未知のＲａｎＧＴＰアーゼ結合タンパク質と共免疫沈澱することが説明されている。上述したように、ＲａｎＧＴＰアーゼは、有糸分裂の開始の調節と、有糸分裂の紡錐体形成の誘導とに関与する。他のＲａｎ結合タンパク質はＲａｎのＧＴＰアーゼ活性を調節することから、ＲａｎＢＰ８が類似の機能を有する可能性が考えられる。従って、ＲａｎＢＰ８は、有糸分裂の調節において、Ｓｋｂ１／ＲａｎＢＰ８／Ｒａｎ経路で機能する可能性がある。
【０２９１】
内在性Ｓｋｂ１は、核スペックルに似た構造で見出された（図１８）。Ｓｋｂ１の核局在はｐＩＣｌｎ、Ｓｋｂ１相互作用タンパク質がｓｎＲＮＰと免疫沈降するという発見と一致しており、スペックル様の核構造で保存される。またこれはは、ｐＩＣｌｎが、Ｓｋｂ１およびその基質のいくつか（例えば、ｓｍＤ１およびｓｍＤ３）を共に運搬するアダプタータンパク質として作用するというモデルと一致する。
【０２９２】
ＳＭＮ（生存運動ニューロン）タンパク質は細胞質に局在し、そこでコアのｓｍタンパク質と結合して、ｓｎＲＮＰ構築に関与する。核において、ＳＭＮはスプライシングが必要であり、コイルドボディに結合するｇｅｍｓに存在する。またＳＮＷは、ｇｅｍｉｎ２、３および４との複合体中に存在し（しかしながら、ｇｅｍｉｎ４およびＳＭＮは直接相互作用しない）、それにより、ｓｎＲＮＰの再生またはリサイクルに関与する可能性がある（Ｃｈａｒｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４８：１１７７−１１８６（２０００））。ＳＭＮは、棘筋の萎縮を患う患者において頻繁に欠失しているか、または変異している（Ｌｅｆｅｂｖｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ８０：１５５−１６５（１９９５））。ＳＭＮタンパク質は、ｐＩＣｌｎのみと結合することがわかった。
【０２９３】
ｓｍタンパク質（核内低分子リボ核タンパク質ポリペプチド）であるｓｍＤ１〜３、ｓｍＢ／Ｂ’、ｓｍＧ、ｓｍＥおよびｓｍＦは、コアｓｎＲＮＰ（核内低分子リボ核タンパク質粒子）のタンパク質成分である。これらは、細胞質中で、ＵｓｎＲＮＡと共にｓｎＲＮＰに組み立てられ、その複合体は、核に戻され、そこでプレｍＲＮＡスプライシングが起こる。ｓｍタンパク質であるｓｍＤ１、ｓｍＤ２、ｓｍＤ３、ｓｍＢ／Ｂ’、ｓｍＥおよびｓｍＧは、ｐＩＣｌｎと共免疫沈降することがわかった。ｓｍＤ３、ｓｍＤ１およびｓｍＢ／Ｂ’は、ｐＩＣｌｎと相互作用することがアフィニティークロマトグラフィーを用いて以前に示されている（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １９：４１１３−４１２０（１９９９））。ｓｍＥがｐＩＣｌｎと免疫沈降することはこれまでに示されておらず、標識されたｓｍＤ２およびｓｍＥを用いた実験によれば、バックグラウンドに対して弱い結合しか示されていない（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １９：４１１３−４１２０（１９９９））。数種のｓｍタンパク質のＣ末端は、ＲＧリピートを含む。ｓｍＤ１およびｓｍＤ３の上記リピート中のＡｒｇ残基が、インビボで対称的にジメチル化されることが近年証明された（Ｂｒａｈｍｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：１７１２２−１７１２９ （２０００））。全身性エリテマトーデスの患者は、インビボで、対称的にジメチル化されたｓｍタンパク質に対する自己抗体を生産する（Ｂｒａｈｍｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：１７１２２−１７１２９ （２０００））。ｓｍタンパク質は、ｐＩＣｌｎの存在下でのみ免疫沈降することがわかった。ｓｍタンパク質を含む複合体をさらに特徴付けるために、ｓｍＤ１およびｓｍＤ３を「ベイト」として用いて、「ｓｍＤ１−ＩＰ」および「ｓｍＤ３−ＩＰ」を同定した。これら２種のスクリーニングで同定されたタンパク質を表７および８にそれぞれ列挙した。
【０２９４】
スピンドリン（またはＳｐｉｎ）は、約３０ｋＤａのタンパク質であり、マウス卵母細胞において、分裂中期と終期との間における紡錐体ミメティックとの結合を増加させることがわかっている（Ｏｈ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２４：４９３−５０３ （１９９７））。スピンドリンは、マウスにおいて、最初の有糸分裂の細胞周期の、減数分裂周期の際と、分裂中期の際とにリン酸化される。リン酸化はＳｅｒ／Ｔｈｒ残基上で起こり、Ｍｏｓ　ＭＡＰキナーゼによって少なくとも部分的に調節される。スピンドリンと分裂中期Ｉの紡錐体との結合が減少し、これはＭｏｓ−ｎｕｌｌ変異体でみられることから、スピンドリンが紡錐体と結合するのにリン酸化が必要である可能性を示す（Ｏｈ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ５０：２４０−２４９（１９９８））。スピンドリンは、オカダ酸の存在下で、Ｎｄｒと共免疫沈降することがわかった。
【０２９５】
ＧＩ１３５４３９２２は、新規のｓｕｄＤ様ヒトタンパク質であり、Ｓｋｂ１およびｐＩＣｌｎの両方と結合する（と共免疫沈降する）ことが可能であると同定された。アスペルギルス属のｓｕｄＤはもともと、ｂｉｍＤ６変異体の遺伝子外サプレッサーとして同定された（Ａｎａｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ２１１：３２３−３２９， １９９８）。ＢｉｍＤ６変異は有糸分裂の異常を引き起こし、それにより染色体は紡錘微細管に適切に付着できなくなり、染色体消失の増加を引き起こす。ｂｉｍＤ６変異はｓｕｄＡにより抑制することができるため、ＢＩＭＤが染色体凝縮に関与する可能性が示唆されており、ＢＩＭＤはＳＭＣタンパク質をコードし、クロマチン濃縮および分離に関与する。ｓｕｄＡの発現中は、ｓｕｄＤの低温感受性変異が抑制される。またｓｕｄＤは、染色体凝縮および分離に関与する可能性がある。
【０２９６】
ｓｕｄＤの相同体は、多くの種（古細菌、酵母（Ｒｉｏ１タンパク質）およびホモサピエンスを含む）に存在するようである。ヒトｓｕｄＤ相同体が以前に同定されているが、これはＳｋｂ１およびｐＩＣｌｎとの複合体に関して示したタンパク質とは異なる。ｓｕｄＤ様タンパク質のヒト相同体がさらに２種存在し（ＡＦ２５８６６１およびＦＬＪ１１１５９）、それらと他のｓｕｄＤファミリータンパク質とのアライメントを図２０に示す。
【０２９７】
これらタンパク質は全て、ＲＩＯドメインと称する保存されたドメインを含む。このドメインの機能は報告されていない。しかしながら、ｐｓｉ　ＢＬＡＳＴ検索により、ｓｕｄＤとタンパク質キナーゼとがいくらか相同性を有することが明らかになり、この相同領域は、ＲＩＯドメインとオーバーラップする。このようなｓｕｄＤ様タンパク質は、Ｓｋｂ１による有糸分裂の調節に関する重要なターゲットとなり得る。
【０２９８】
Ｍｏｂ様タンパク質ＦＬＪ１０７８８をベイトとして用いた場合、ＬＡＴＳ１が相互作用タンパク質として回収された（表９）。ＬＡＴＳ１はキナーゼのＮｄｒファミリーの他のメンバーであるため、および、ＬＡＴＳ１は腫瘍抑制因子であるため、Ｍｏｂタンパク質もＬＡＴＳ１および２の基質であるかどうかを観察することは興味深い。有糸分裂／細胞質分裂の際に、ＬＡＴＳおよびＮｄｒがこれらタンパク質をわずかに異なる位置でターゲットとすることが可能である。
【０２９９】
最終的に、予備的なウェスタンブロットにより、Ｓｋｂ１は哺乳動物ＰＡＫ種と相互作用することが示されたが、用いられた抗体は哺乳動物ＰＡＫアイソフォーム３種全てと交叉反応することが知られているため、ＰＡＫの正確な不明確である。Ｓｋｂ１−ＰＡＫ相互作用は酵母における発見と一致する。我々の知る限りでは、哺乳動物におけるこのような相互作用はこれまでに報告されていない。
【０３００】
タンパク質相互作用研究からの結論
アクチン依存性の細胞極性、および、分裂間期の際の細胞分裂に関して調節された制限（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ）の両方を維持して、細胞分裂周期の有糸分裂期における細胞分裂の開始を導く経路において、哺乳動物ＮｄｒおよびＳｋｂ１タンパク質に対する分裂酵母の対応物は、ＲａｓおよびＲａｃ関連タンパク質Ｃｄｃ４２の下流で機能する。
【０３０１】
従って、ヒト細胞における細胞分裂のレギュレーターとして機能し得るＧＲＦ２　を含むタンパク質複合体が同定された。この複合体の破壊または機能的な不活性化は、細胞分裂周期の際の異なる正常な制限に影響を及ぼし、細胞中のアクチン構造の正常な調節を破壊し得る。正常な細胞周期の進行、または、ＲａｓまたはＲａｃのＧＴＰ結合型を促進する腫瘍化変異の結果として、この複合体の構築、維持、および活性は、ＲａｓまたはＲａｃの活性化により影響を受けることがある。一つの可能性として、ＲａｓのＧＴＰ結合型を促進する腫瘍性変異は、ＧＲＦ２複合体を破壊し、それによって細胞分裂の際の制限を除去することができる。
【０３０２】
ＧＲＦ２は、タンパク質キナーゼＮｄｒおよび候補のメチルトランスフェラーゼＳｋｂ１を含むタンパク質複合体に関係する。従って、ＧＲＧ２複合体は、細胞の形と細胞周期のＧ２／Ｍ移行とを調節する分裂酵母タンパク質と類似したタンパク質を含む（３４）。ＧＲＦ２のように、Ｎｄｒはカルシウムイオノフォアによりインビボで活性化され、カルシウム結合タンパク質のカルモジュリン／Ｓ１００ファミリーのタンパク質と結合する。
【０３０３】
ＧＲＦ２およびＮｄｒを含むタンパク質複合体は、細胞周期の際の不適切な細胞分裂および複合体の破壊（正常には細胞分裂に必要な現象として起こるが、不適切な細胞分裂や増殖の原因となる）を防ぐように機能し得ることが考えられる。Ｒａｓの腫瘍性の変異により細胞の形質転換および腫瘍形成が促進されるが、これは、正常には細胞分裂を制限し、細胞の形を制御するように機能するタンパク質複合体が破壊されることによる。
【０３０４】
このタンパク質複合体に影響を及ぼす薬剤が、細胞分裂に影響を及ぼすことがある。例えば、ＧＲＦ２および関連タンパク質ＧＲＦ１（またはＲａｓ−ＧＲＦとして知られる）は、非分裂性の、脳で最終分化した神経細胞で大量に発現される。本明細書で説明されたＧＲＦ２複合体は、ＧＲＦ２発現細胞の増殖を防ぐように機能し得る。従って、この複合体を阻害することによって、脳および他の神経組織における神経成長および組織再生を促進することができる。ＧＲＦ２（ならびに、ＮｄｒおよびＳｋｂ１）は多くの他の細胞組織で発現されるため、ＧＲＦ２複合体をターゲットとする薬剤はこれら組織の増殖を刺激することができる。ＧＲＦ２複合体成分の活性化は有糸分裂を阻害するか、または、細胞の形を変え、それによって細胞増殖を制限または阻害する。
【０３０５】
有糸分裂の阻害剤として、および、細胞の形のレギュレーターとしてのＧＲＦ２複合体の活性は、ヒトの発ガン現象で必要な工程がこの複合体の不活性化であるという示唆と類似している。ヒトＲａｓ遺伝子のいわゆる活性化変異により、Ｒａｓタンパク質をＧＴＰに結合させ、ＧＲＦ２複合体の構築、維持および／または機能を減じ、それによって腫瘍形成を促進させる。
【０３０６】
ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）は、アルギニン残基で対称的にジメチル化されていることがわかっている。ほとんどの同定されたメチルトランスフェラーゼは、アルギニンに対する非対称的なジメチル化活性を有する。Ｓｋｂ１は、基質としてミエリン塩基性タンパク質を用いることのできる唯一のクローン化アルギニンメチルトランスフェラーゼである。Ｓｋｂ１の触媒ドメインは、最低限、クローン化アルギニンメチルトランスフェラーゼでよく保存されている（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：３１５３１−３１５４２（１９９９））。従って、Ｓｋｂ１は、対称的なジメチルアルギニンを形成することができるＩＩ型のアルギニンメチルトランスフェラーゼである可能性がある。
【０３０７】
ｐＩＣｌｎは、その基質の特異的な部分集合を有するＳｋｂ１メチルトランスフェラーゼを共に運搬するアダプタータンパク質としての役割を有する可能性がある。上記で列挙したＲＮＡ代謝タンパク質、または、それに強く結合するタンパク質は、Ｓｋｂ１によるメチル化の基質である可能性がある。ｓｍタンパク質Ｄ１およびＤ３はＳｋｂ１の基質であることが予測され、なぜなら、それらはインビボでそのＣ末端で見出されたＲＧリピート上で対称的にジメチル化されることがわかっているためである（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：１７１２２−１７１２９（２０００））。これらタンパク質のメチル化は、それらとｓｎＲＮＰの他の成分との相互作用、または、それらと核輸送担体との相互作用に影響を及ぼす可能性がある。ＲＮＡ代謝に関与する多くのタンパク質がｐＩＣｌｎと免疫沈降するという発見により、Ｓｋｂ１が、ＲＮＡ代謝の調節（例えば、ｍＲＮＡスプライシング、プレｒＲＮＡ代謝、場合によってテロメラーゼ機能を含む）に関する全体的な経路に関与する可能性が示される。
【０３０８】
また、ｈｎＲＮＰＫおよびＧａｒ１も、それらとｐＩＣｌｎとの結合、および、そのアミノ酸配列中にＲＧが豊富なドメインが存在することに基づいて、Ｓｋｂ１の基質であることが予測される。また、タンパク質４．１、ＫＩＡＡ０９８７、ｇｅｍｉｎ４およびＳＭＮも、それらが大規模なＲＧリピートを含まないにも関わらず、Ｓｋｂ１の基質である可能性がある。この予測の裏付けとして、ミエリン塩基性タンパク質が、これは１つのアルギニン残基しか含まないが、メチルトランスフェラーゼの基質である、ということが近年示された（Ｉｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２９：７４３−５１（１９９７））。
【０３０９】
Ｓｋｂ１の酵母相同体（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅについてはＭｃＭｉｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １９：６９２９−６９３９ （１９９９）；Ｓ． ＰｏｍｂｅについてはＧｉｌｂｒｅｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１４７８１−１４７８６（１９９８））が、細胞周期調節に関与することが示された。Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、ｐＩＣｌｎ相同体を有さず、また、そのｓｍタンパク質のＣ末端にＲＧリピートが存在しないようである。しかしながら、ｐＩＣｌｎは、アフリカツメガエルからヒトにかけて保存されている。これに関する一つの考えられる理由としては、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ において、ＲＮＡスプライシングの複雑さが他の真核生物に比べて低減されることがある。Ｓ． ｐｏｍｂｅではスプライシングはより複雑であるため、Ｓ． ｐｏｍｂｅはｐＩＣｌｎ相同体を有するはずと予測され得る。ＰＳＩ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、我々は、Ｓ． ｐｏｍｂｅからｐＩＣｌｎに相同性を有する機能未知のタンパク質を見出した。加えて、Ｓ． ｐｏｍｂｅからのｓｍＤ１は、そのＣ末端に多数のＲＧリピートを有し、一方で、ｓｍＤ３は、２つの可能性のあるアルギニンメチル化部位を有する。これらの観察結果により、ｐＩＣｌｎ相同体は、Ｓ． ｐｏｍｂｅにおいて、ヒトの場合と類似の機能を提供し得ることが示される。
【０３１０】
実施例２：マススペクトロメトリー分析によるｐＩＣｌｎ相互作用タンパク質の同定
タンパク質相互作用の研究により、ヒトの生物学に対して広い洞察が提供されてきた。タンパク質−タンパク質（およびタンパク質−低分子）相互作用は、細胞の成長および発生、構造、操作、複製、および選択的除去を制御する代謝およびシグナル伝達経路を構築するため、それらは重要である。タンパク質の役割は、それと他のタンパク質との相互作用に反映される（３５）。従って、複数のタンパク質の複合体の同定および逆重畳積分は、タンパク質機能および細胞調節をよりよく理解するための方法である。タンパク質−タンパク質相互作用におけるエラーによりヒトの病気を示すことができるため（例えば、（３６）参照）、タンパク質−タンパク質相互作用の系統的な定義は、治療介入のための新規のターゲットを同定するための多大な発展性を秘めている。
【０３１１】
タンパク質複合体を捕獲するためにタンパク質−タンパク質相互作用の高親和性特徴を開発する方法と、超高感度のタンパク質同定技術の適用とを組み合わせることによって、タンパク質の機能を測定することができる。数年に渡り、マススペクトロメトリー（ＭＳ）に基づく様々な技術が、タンパク質分析分野で優位を占めていた。その理由の一つとして、マススペクトロメトリーは、タンパク質の明瞭な同定、および、ペプチドおよびタンパク質の質量の正確な測定に関して、他の技術を超える莫大な利益を提供することが挙げられる。
【０３１２】
我々は、親和性に基づくタンパク質複合体精製方法を示し、低いフェムトモル量のタンパク質の同定に適用できるようなマススペクトロメトリーの原理を再検討する。特に、我々は、タンパク質−タンパク質相互作用に関与するタンパク質を同定するために、ＭＳ、ＤＮＡおよびタンパク質データベースを利用する。
【０３１３】
タンパク質複合体のワンステップバッチによる吸着
免疫沈降によるタンパク質単離技術、およびそのタンパク質複合体回収の利点は、よく確立されている（３７）。この方法は、ワンステップバッチによる吸着である。この方法による相互作用タンパク質の回収率は、その結合定数（より特定には、結合と解離との割合）および存在度（すなわち、細胞あたりのコピー数）；細胞抽出物中の溶解性および濃度；および、安定性の関数であり、ここで上記安定性とは、実験条件下での相互作用タンパク質の内因性の安定性、および、抽出物中での酵素による攻撃（それらを破壊するかまたはそれらの相互作用を破壊する）に対するそれらの耐性の両方を意味する。
【０３１４】
免疫複合体からの結合タンパク質の溶出は、遊離ペプチドを用いてベイトタンパク質およびベイト関連タンパク質を置換することによってなされ、ただし、抗体または固定マトリックスに非特異的に吸着したタンパク質、またあるいは、不溶性形態で回収されたタンパク質は溶出させないことにより、この方法に高度の特異性をもたらす。捕獲されたタンパク質複合体を特異的に溶出させるための代替法は、部位特異的プロテアーゼを用いて、エピトープタグに近接するように操作された部位を切断することである。この特異的な溶出工程においては、様々なタンパク質相互作用に寛容であるように設定された細胞抽出物調製条件、および、免疫沈降が補足される。この方法は、前から存在する比較的強く相互作用する（すなわち、サブマイクロモルのＫｄ）タンパク質複合体を回収するのに好都合である。この方法は、分析の際に顕著な「ノイズ」を与えてしまう大量の非特異的相互作用タンパク質の回収には不適切である点において有利であるが、少量で存在する（すなわち、細胞あたり数千コピー未満）および／またはマイクロモル〜ミリモル範囲の結合定数を有する相互作用タンパク質を回収するその能力を明らかに制限する。
【０３１５】
この免疫親和性法の適用は、クロマトグラフィー工程に組み入れることができ、その際、細胞抽出物は固定化抗体充填カラムを通過する。この方法により、少量しか存在しない抗原（例えば、エピトープでタグを付した「ベイト」タンパク質）および関連タンパク質の回収を高めることができる。
【０３１６】
エピトープでタグを付したタンパク質複合体：ＦＬＡＧ−ＰＩＣＬｎおよび関連タンパク質の細胞トランスフェクションおよび免疫沈降
この実験において、タンパク質配列ＤＹＫＤＤＤＤＫを有するＦＬＡＧエピトープ（Ｓｉｇｍａ）を「ベイト」タンパク質ｐＩＣＬｎのアミノ末端に導入した。ｐＩＣＬｎは、広範に発現される２６ｋＤａであり、ホモサピエンスからアフリカツメガエルに至る種で保存されている。ｐＩＣＬｎの正確な機能はまだ研究中であるが、初めは塩素チャンネルとして機能することが推測され、より最近にはスプライセオソームの調節に関与することがわかっている（３８、３９）。
【０３１７】
ヒト胎児の腎臓細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）を本質的に上述したような方法を用いて細胞をトランスフェクションした２日後、その溶解物から免疫沈降によりタグを付されたｐＩＣＬｎを回収した（１２）。ＨＥＫ２９３細胞は効率的にトランスフェクトされる（４０）。２９３Ｔ変異株は、ＳＶ４０ウイルスのラージＴ抗原を発現し、トランスフェクトされたプラスミドを増幅してプラスミドがコードするｃＤＮＡの生産をさらに高めることができる。リン酸カルシウム／ＤＮＡ沈殿物の形態で１０μｇのプラスミドＤＮＡ（ｐＣＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−ｐＩＣＬｎ）を加えることによって、約２×１０７個の細胞がトランスフェクトされた（４１）。脂質が仲介するＤＮＡトランスフェクション法を用いても同等の結果が得られた（４１）。トランスフェクトされた細胞を、溶解バッファー（１ｍｌ）［２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、０．２ｍＭのＡＥＢＳＦ（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ）］を加えることにより溶解し、２０，０００×ｇで３０分間遠心分離することによって透明にした。細胞溶解物およびタンパク質を０〜４℃の間の温度に維持した。架橋アガロースビーズ（Ｍ２、Ｓｉｇｍａ）に共有結合した抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（５μｇ）を加えることにより、その澄んだ溶解物を免疫沈降させた。その混合物を穏やかに倒置することにより６０分間攪拌した。不溶性分画と結合した免疫複合体を遠心分離によって（１０００×ｇ、２分間）回収し、溶解バッファーへの再懸濁を３サイクル行うことによって洗浄し、続いて、上述したように遠心分離した。免疫複合体を、２５０μｌの５０ｍＭ重炭酸アンモニウム（使用直前に調製された）（４００μＭのＦＬＡＧペプチドを含む）に再懸濁することによって、ビーズから溶出した。３０分間インキュベートした後、ビーズを遠心分離によって取り除き、ＦＬＡＧペプチドと溶出したタンパク質とを含む上清を凍結乾燥した。
【０３１８】
タンパク質を標準的な一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により解析し、製造者の推奨法に従ってコロイド状のクーマシーブルー染色液（ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ， Ｐｉｅｒｃｅ）で染色した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのためのサンプル調製中に、混入タンパク質（例えばヒト皮膚から誘導されたケラチン）が入らないように注意した。染色ゲルによれば、ベイトタンパク質ｐＩＣＬｎに加えて数種のタンパク質が見出された（図９）。これらタンパク質のいくつかは他の方法ですでに同定されているが、同定されていないものもあった。例えば、タンパク質４．１、Ｓｋｂ１、ＩＢＰ４２、ｓｍＢ／Ｂ′、およびｓｍＤ３は、アフィニティークロマトグラフィーにより、または、酵母２ハイブリッド系により、相互作用することが示された（３９、４２、４３）。それに比べ、ｓｍＥおよびｓｍＧについては、ｐＩＣｌｎとの複合体に関してこれまで示されていなかった。
これらタンパク質を同定するのに用いられた解析方法、および代替法を以下に説明する。
【０３１９】
マススペクトロメトリー用のサンプル調製
回収された免疫沈降タンパク質のＭＳによる同定を促進するために、１以上のタンパク質種を含む染色バンドをポリアクリルアミドゲルから切り出し、インサイチュでのトリプシン処理によりポリペプチドに分解し、およびＭＳ分析に適した溶液に移し、ＭＳ分析に適するように濃縮した（図１０で説明される）。タンパク質をゲル内で処理する技術は、標準化したプロトコールに改良されている。いわゆる「ゲル内消化」法は、ゲル片に含まれたタンパク質を酵素的に断片化し、生じたペプチドを抽出することに関して開発されている（４４）。配列解析グレードに改変されたトリプシンは、タンパク質のハイスループット同定に選択された酵素である。一般的なゲル内消化プロトコールの概要を図１１に示す。この方法において、興味のあるバンドをゲルから切り出し、還元およびアルキル化してシステイン架橋を壊し、システイン架橋が再形成されるのを防いだ。対応する緩衝液で平衡化した後、そのゲル片をトリプシン溶液で膨潤させ、酵素をゲル中に入り込ませた。一般的に一晩、３７℃で消化を行った。生じたペプチドを抽出物し、ＭＳ分析用に調製した。
【０３２０】
タンパク質同定のためのマススペクトロメーター
一般的に、マススペクトロメーターは、少なくとも３つの部品、すなわちイオン化装置、質量分離装置、および検出器で構成される。マススペクトロメトリーは非常に強力な分離技術であるが、気相で帯電する分子を分離することしかできないことを理解することが重要である。その上、マススペクトロメーターは、１度に正または負に帯電した分析物のどちらかしか分離できない。本来、ほとんどのマススペクトロメーターは分子のイオン化を行わないため、イオン化という用語は紛らわしい。それよりも、イオン化という用語は、分析物を気相へ移動させ、同時に、その電荷を維持し、および／または、サンプルの環境からの電荷を一般的にプロトンの形態で捉えることに関する。ペプチドおよびタンパク質の研究において、主として、２つのサンプルイオン化技術、すなわちマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）（４５〜４７）およびエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）（４８）が優位を占めている。
【０３２１】
ＭＡＬＤＩマススペクトロメーター、ペプチドおよびタンパク質分析
ＭＡＬＤＩイオン化は、興味のあるサンプル、この場合ペプチドおよびタンパク質を酸性化マトリックスを用いて共結晶化する技術である（４９）。上記マトリックスは低分子であり、特定の波長、一般的には紫外線（ＵＶ）の範囲で吸収し、吸収エネルギーを熱として放散する。エネルギーをマトリックスに迅速に（数ｎｓで）運ぶために、一般的にパルスレーザー光線が用いられる。このような迅速なエネルギー運搬により、マトリックスは迅速にその表面から分離し、気相中にマトリックスのプリューム（ｐｌｕｍｅ）と、再結晶化された分析物とが生成する。脱離プロセス中、または、マトリックス分子と相互作用することにより分子のガスプリュームを導入した後に、分析物が変化を受けているかどうかははっきりしない。しかしながら、最終結果として、気相に存在する帯電した分析物の小さい空洞が得られる。これまで、ＭＡＬＤＩは、主に、飛行時間型（ＴＯＦ）マススペクトロメーターと並列して連結されている。飛行時間型マススペクトロメーターの機能は、分析物が固定された経路の長さ（ＴＯＦチューブまたはチャンバー）を通過して飛行するのにかかる時間を測定することである。従って、プリューム中に存在する帯電した分析物は、適切なタイムディレイ後にＴＯＦチューブに移送される。分析物をＴＯＦチューブに動かすために、ＭＡＬＤＩプレートに高圧が適用して、プレートとＴＯＦチャンバーの入り口との間に強い電場を発生させる。より小さい分析物は、チャンバー入り口により大きい分析物より迅速に到達する（すなわち、一定の運動エネルギーを適用して、分析物の異なる速度が得られる）。飛行すると、検出器に向かって移動する間に、分析物は無電界領域に存在し、チューブに沿って分離する。再び、少ない質量の分析物はチューブに沿ってより速く移動し、より大きい質量の分析物より前に検出器に到達する。検出器は、レーザーショットとタイムディレイとを順に有し、ペプチドおよびタンパク質イオンが時間中に到達する度に、それらを測定する。既知の質量および電荷を有する標準物質を用いて質量範囲を測定することによって、所定のイオンの飛行時間を質量に変換することができる。最終結果として、イオン（タンパク質またはポリペプチド）質量に対して観察された強度を比較したスペクトルが得られる。
【０３２２】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳは、最新のマススペクトロメーターを用いて簡単に実行できる。一般的に、興味のあるサンプル（この場合ペプチドまたはタンパク質）とマトリックス混合物とを混合し（図１２参照）、続いて、研磨されたステンレス鋼プレート（ＭＡＬＤＩプレート）上にスポットする。市販のＭＡＬＤＩプレートは、１プレートあたり９６サンプルを置くことができる。次に、ＭＡＬＤＩプレートをＭＡＬＤＩマススペクトロメーターの減圧室に挿入する。次に、パルスレーザーを活性化し、上述したように飛行時間の獲得を始める。次に、質量を含むＭＳスペクトルを集め、ペプチド／タンパク質の電荷比を得る。ＭＡＬＤＩによりイオン化された分子の電荷は、通常１である。
【０３２３】
近年、ＭＡＬＤＩイオンソース技術も、ハイブリッド直交型マススペクトロメーターと連結される。この設計において、ＭＡＬＤＩイオン化法は、本質的には上述したとおりである（ただしわずかな変更を含む）。しかしながら、ＴＯＦ検出器は直交型マススペクトロメーター（例えば、ＰＥ−Ｓｃｉｅｘ社製のＱ−Ｓｔａｒ）で置き換えられ、直交型マススペクトロメーターは、四重極、それに続く衝突セル、およびパルス垂直型ＴＯＦ　ＭＳから構成される。ハイブリッド機器（ＭＡＬＤＩ−Ｑ−Ｓｔａｒ）は、ペプチド混合物に含まれるペプチドの質量を高解像度でマッピングでき、および、衝突誘導解離による選択されたペプチドの効率的な断片化を選択できるという利点を有する。これらの断片化パターンは、ペプチドのアミノ酸配列に関する情報を含む。
【０３２４】
ＥＳＩマススペクトロメーター、ペプチドおよびタンパク質分析
また、タンパク質およびペプチド混合物をマススペクトロメーターに導入するために、エレクトロスプレーイオン化も広く利用されている。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）（４８）は、大気圧で分析物を液相から気相へ移すことができる。イオン化プロセスは、小さいチューブのチップとマススペクトロメーターの入り口との間に電場を印加することによって達成される。その電場によりチップの先端に帯電液が誘導され、電荷／表面の比を最小化するテイラーコーンと呼ばれるコーンが形成される。コーン先端から液滴を遊離させ、マススペクトロメーターの入り口に送る。遊離した液滴から溶媒を蒸発させ、液滴をより小さい液滴にフラグメンテーションするプロセスを繰り返し行う。このプロセスにより、多数の液滴は消失するサイズになり、溶媒がなくなって帯電した分析物が気相に存在するようになる。さらに、液滴が収縮すると同時に、ｐＨが減少し、分析物のプロトン化が起こる。従って、トリプシン処理タンパク質を扱う場合、ＥＳＩにより多価の分析物が共通して得られる。
【０３２５】
一般的に、エレクトロスプレーイオン化は、酸連四重極、イオントラップ、またはハイブリッド四重極−時間飛行型マススペクトロメーター（（５０）で述べられる）と連結させて用いられる。エレクトロスプレーイオン化は、分離技術（例えばＨＰＬＣ、ＬＣおよびＣＥ）との組み合わせが容易である点で、ＭＡＬＤＩに対して相当な利点がある。またＥＳＩは、サンプルの連続注入に用いることができる。さらに、トリプシン消化物から多価ペプチドが得られる傾向により、衝突誘導解離と関連して、従来のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦまたはハイブリッドＭＡＬＤＩ−Ｑ−Ｓｔａｒ装置のいずれかで達成されたスペクトルより増強されたＭＳ／ＭＳスペクトルを発生させることができる。
【０３２６】
エレクトロスプレーイオン化およびＭＡＬＤＩ−Ｑ−Ｓｔａｒ装置はいずれも、衝突誘起解離によって、選択されたペプチドのアミノ酸配列に関するフラグメンテーションパターン（ＭＳ／ＭＳスペクトル）を発生させる（図１０）。一般的に、ＭＳ／ＭＳスペクトルの発生は、２つの独立した実験を必要とする。第一の通過において、ペプチド混合物（トリプシン消化物）は、マススペクトロメーターによる質量−電荷（ｍ／ｚ）比にしたがって分離され、最も強いペプチドのピークのリストが立証される。第二の通過において（図１３に示す）、特定のｍ／ｚ種（第一の通過分析で同定された）、おそらくは特有のペプチドイオンのみをマススペクトロメーターに入らせるように、装置を調節する。これらのイオンは衝突セルに向けられ、その運動エネルギーが増加する。衝突セル中で、そのイオンと十分な運動エネルギーを有する不活性ガス分子とが衝突して、ペプチド結合が破壊される。このプロセスは衝突誘起解離、ＣＩＤと呼ばれ、同じ「親」イオンから誘導された帯電した断片および中性の断片の両方が生じる。最終的に、新しく生じた帯電した断片は、そのｍ／ｚに従ってマススペクトロメーターで分離され、ＭＳ／ＭＳスペクトルを得る。適切な衝突エネルギーを印加することによって、主としてペプチド結合で断片化が起こり、断片のラダーが得られる。特定のピーク間の質量の差が１つのアミノ酸の損失に相当する。次に、連続する質量間での質量差を特定のイオンタイプ（すなわち、ｙまたはｂ系のイオン；図１３を参照）に関して測定してラダー状に並べることによって、ペプチド配列を再構成することができる。
【０３２７】
一般的に、ペプチド質量はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦまたはＭＡＬＤＩ−Ｑ−Ｓｔａｒマススペクトロメーターを用いれば低いｐｐｍ（百万分率）まで正確に測定される。トリプシン消化で観察されたペプチド質量の集合は、ペプチド質量フィンガープリンテイングとよく称呼される方法でタンパク質／ＤＮＡデータベースの検索に用いられ得る（５１−５３）（図１４）。この方法において、データベースにエントリーされたタンパク質は、それらの予測されたトリプシン消化パターンに適合するペプチド質量数に従って階級付けされることができる。市販のソフトウェアは、データベースのサイズ、ペプチドに適合する番号、および異なるペプチドに基づいたスコア付けの方法を提供するものである。観察されたペプチド数、測定の正確さ、特定の種のゲノムの大きさに従って、明瞭に同定することができる。
【０３２８】
ＭＳ／ＭＳスペクトルは、タンパク質同定に用いることができる情報の第二のセットである。ＭＳ／ＭＳスペクトルは、特定のペプチドのアミノ酸配列に関する断片化パターンを含む。一般的に、ＭＳ／ＭＳスペクトル分析はかなり集約的である。これらのスペクトルの解釈に用いられる方法は、必要な使用者の介入のレベルに従って３つのサブグループに分類することができる。
【０３２９】
第一のサブグループにおいては、スペクトルの解釈は必要ではない。スペクトルに含まれる情報は、データベースに含まれるタンパク質／ＤＮＡ配列情報と直接関係づけられる。この特定の作業のために、様々なアルゴリズムが開発されている。これらのアルゴリズムにより、タンパク質およびＤＮＡデータベースに対して自動的に未解釈のＭＳ／ＭＳスペクトルを検索し、そのいくつかは無料で利用でき（非営利団体のもの）、ウェブ上でアクセス可能である。Ｍａｔｒｉｘ ＳｃｉｅｎｃｅｓのＭａｓｃｏｔ（ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）、およびＵＣＳＦのＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ）が最も一般的に用いられるウェブベースのＭＳ／ＭＳ検索エンジンである。タンパク質同定は、一般的に、同じタンパク質に適合するペプチドの数により明確である。普及している他のアルゴリズムとしては、「Ｓｅｑｕｅｓｔ」がある（５４〜５６）。提示されたいずれのＭＳ／ＭＳスペクトルに関して、このアルゴリズムは、上位５００個の等重のペプチドをタンパク質／ＤＮＡデータベースから検索し、対応する予想スペクトルが得られる（図１５）。高速フーリエ変換を用いて頻度ドメインで多重化させることによって、予想スペクトルを迅速に測定スペクトルに適合させる。次に、相関パラメーター（予測スペクトルと測定スペクトルとの間の適合のクオリティーを示す）を推測する。高い相互相関は、測定スペクトルとの高い適合を示す。このアルゴリズムを用いてわずか１種のペプチドをタンパク質同定したとしても、多くのペプチドがデータベース中で同じ登録物にマッチするため、タンパク質の由来の明瞭な同定をよく達成することができる。Ｓｅｑｕｅｓｔアルゴリズムは、集中的に計算するので、ハイスループットに対してデマンドがデュアルＣＰＵサーバーをすぐに麻痺させることがある。本質的にＳｅｑｕｅｓｔが遅いのは、それが最高にマッチする５００個の等重のペプチドを見出そうとするためである。このリストをコンパイルするために繰り返しスキャンされるデータベースが大規模であればあるほど、この機能にかかる時間は長くなる。ソフトウェアの改良バージョン（Ｔｕｒｂｏ−Ｓｅｑｕｅｓｔという）は、データベースを前処理して整えるため、検索時間が大幅に改良される。
【０３３０】
第二のサブグループにおける方法は全て、ＭＳ／ＭＳスペクトルの部分的な解釈を行うため、人間の介入が必要である。有力な方法は、しばしば「配列タグ」と呼ばれるが（５７〜５９）（図１６）、ＭＳ／ＭＳスペクトルにおける数個の特定の断片間の質量間隔を読み取り、ペプチド配列の短い区間（タグ）を得ることからなる。このタグと残基の質量情報とを用いて、等重のペプチドに関してタンパク質データベースから得られた配列と、計算質量とを比較し、ペプチドの由来を確認することができる。それぞれのＭＳ／ＭＳスペクトルは、タグの作製、それに続くデータベース検索が必要である。多くのペプチドが同じタンパク質にマッチすることによって、タンパク質の明瞭な同定が確立される。数年に渡り、配列タグを用いてデータベース検索するために、このテーマに関する様々なバリエーションが開発されてきた。大規模プロテオミクスに関する努力における「配列タグ」法の主な制約は、ＭＳ／ＭＳスペクトルの必要な部分解釈を手作業で行うために必要とされる労力と専門知識である。この問題を解決するために、配列タグを自動的に作製する試みが行われている。
【０３３１】
最後のサブグループは、タンパク質のデノボ配列解析（６０、６１）と呼ばれ、これはしばしば適合情報がデータベースで得られない場合の最後の方策として用いられ、ＭＳ／ＭＳスペクトルのクオリティーは良好である。ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルはラダー型の情報を含み、これは、原理的にはそのアミノ酸配列を示す。経験豊富なマススペクトロメトリー技師は、抽出物ＣＩＤスペクトルからペプチド配列を手作業で抽出することができる（デノボ配列解析）。
【０３３２】
研究中のデータのクオリティーおよび種の複雑さによって、ペプチドＭＳ／ＭＳスペクトルとタンパク質配列登録物との間で一つの確信的な適合があれば、タンパク質またはタンパク質ファミリーを同定するのに十分である。低い適合度および／または部分的な適用範囲のデータベースを扱う場合、および、ＳＮＰデータベースにアクセスするためには、同定されたペプチドがタンパク質に対して特有でない場合、明瞭な同定に必要な配列の適用範囲は、相同タンパク質に対して増加する。同じタンパク質に対するマッチする続いて得られるペプチドＭＳ／ＭＳはいずれも、さらに同定の信頼度を増すことは明らかである。
【０３３３】
これらＭＳに基づく方法それぞれの最終結果により、分析用に提示されたタンパク質または新規のタンパク質の部分アミノ酸配列の同一性がもたらされる。
【０３３４】
結果
ペプチド混合物のＭＳ分析により、ペプチドの質量（ＭＳスキャン）、それらのアミノ酸配列（ＭＳ／ＭＳスキャン）、および、場合によって翻訳後修飾（例えばリン酸基）の存在に関する情報を提供することができる。
【０３３５】
本明細書で説明した分析方法は、タンパク質混合物に寛容であり、電気泳動におけるタンパク質の共移動はＭＳ分析により独立して同定される。本研究で説明された実施例において、タンパク質ｓｍＧは、ｓｍＥに関し、ｓｍＥを含む同じゲル断片で同定された（ＭＳおよびＭＳ／ＭＳデータは示さず）。本明細書で報告した特定の発見は、タンパク質ｐＩＣｌｎがスプライセオソーム機構と直接相互作用することによってＲＮＡプロセシングの調節に関与するという示唆と一致する。興味深いことに、データによればｐＩＣＬｎ様々なタンパク質−タンパク質相互作用に関与することが示されているが、簡単に認識できるタンパク質−タンパク質相互作用ドメインは全く含んでいない。我々は、ｐＩＣＬｎは新規のタンパク質相互作用ドメインおよび／または結合部位を含む可能性がある、と結論付ける。
【０３３６】
この情報で概説されたワンステップの親和性による精製法の魅力的な活性の特徴は、細胞中に存在するタンパク質複合体を捕獲するように設計されていることである。可能性のある制限は、異常発現のレベルが「正常な」レベルを超過する、および、２９３細胞の細胞環境がベイトタンパク質に対する生理学的な結合パートナーを供与しない、ということである。タグの位置がタンパク質機能を妨害する可能性がある。これは、２以上の親和性タグを用いて、それを興味のあるタンパク質のアミノ末端およびカルボキシル末端両方に適用することによって、部分的に処理される。この方法のバリエーションとして、生理学的なレベルのベイトタンパク質を発現する安定な細胞系をつくること、または、野生型タンパク質に対して向けられた抗体を用いて内在性ベイトおよびベイト関連タンパク質を捕獲することがある。様々な関連する細胞型および細胞状態から内在性タンパク質複合体を捕獲する能力は、プロテオミクスにおける挑戦であり続ける。
【０３３７】
タンパク質−タンパク質相互作用を測定するための酵母２−ハイブリッド法は広範囲の二元的なタンパク質親和性に適しているが、その一方で、誤った陽性結果、すなわち、相互作用するタンパク質ペアを同定するが、必ずしもインビボで結合するとは限らない結果が発生しやすい。ワンステップの親和性による捕獲方法は、いくつもの弱い相互作用の付加的な効果により安定化された複数のタンパク質複合体を精製する可能性がある。この方法の考えられる制限は、初期データがタンパク質複合体における接点の個々のポイントを示していないことである。これは、相互作用を検証する必要性を強調する。タンパク質相互作用を検証する一つのメカニズムは、疑わしい複合体の各メンバー上にエピトープタグを順に置くことによって、複合体を通して「検証する」ことである。これは、相互作用を検証することに役立ち、数種のタンパク質で構成される複合体の二元的な相互作用を逆重畳積分するための情報を提供する。
【０３３８】
【表１】
2004501670.tif 000007
【０３３９】
【表２】
2004501670.tif 000008
【０３４０】
【表３】
2004501670.tif 000009
【０３４１】
【表４】
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【０３４２】
【表５】
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【０３４３】
【表６】
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【０３４４】
【表７】
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【０３４５】
【表８】
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【０３４６】
【表９】
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【０３４７】
【表１０】
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【０３４８】
【表１１】
2004501670.tif 000017
【０３４９】
【表１２】
2004501670.tif 000018
【０３５０】
【表１３】
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【０３５１】
【表１４】
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【０３５２】
【表１５】
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【０３５３】
【表１６】
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【０３５４】
【表１７】
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【０３５５】
【表１８】
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【０３５６】
【表１９】
2004501670.tif 000025
【０３５７】
【表２０】
2004501670.tif 000026
【０３５８】
対等物
詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、これらは単に解説のためだけに提供されることを理解すべきであり、なぜなら、本明細書の詳細な説明から、本発明の本質および範囲内での様々な変化および改変が当業者には明白であるためである。
上述で補足説明された参考文献の全文を以下に報告するが、これらは参照することにより本明細書に含める。
【０３５９】
参考文献
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【０３６０】
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【０３６１】
２１． Ｐｈａｍ， Ｎ．， Ｉ． Ｃｈｅｇｌａｋｏｖ， Ｃ． Ａ． Ｋｏｃｈ， Ｃ． Ｌ． ｄｅ Ｈｏｏｇ， Ｍ． Ｆ． Ｍｏｒａｎ， ａｎｄ Ｄ． Ｒｏｔｉｎ． ２０００． Ｔｈｅ ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｆａｃｔｏｒ ＣＮｒａｓＧＥＦ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｒａｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｃＡＭＰ ａｎｄ ｃＧＭＰ ［Ｉｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｃｉｔａｔｉｏｎ］． Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １０：５５５−８．
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【０３６２】
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【０３６４】
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５７． Ｍａｎｎ， Ｍ．， ａｎｄ Ｍ． Ｗｉｌｍ． １９９４． Ｅｒｒｏｒ−ｔｏｌｅｒａｎｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ ｂｙ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ６６：４３９０−９．
５８． Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ， Ｓ． Ｄ．， Ｄ． Ｔｈｏｍａｓ， ａｎｄ Ｒ． Ａ． Ｂｒａｄｓｈａｗ． １９９６． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｐａｒｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｌ−ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １７：８７７−９１．
５９． Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｍ． Ｒ．， Ｋ． Ｏｕ， Ｒ． Ｄ． Ａｐｐｅｌ， Ｊ Ｃ． Ｓａｎｃｈｅｚ， Ｊ． Ｘ． Ｙａｎ， ０． Ｇｏｌａｚ， Ｖ． Ｆａｒｎｓｗｏｒｔｈ， Ｐ． Ｃａｒｔｉｅｒ， Ｄ． Ｆ． Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ， Ｋ． Ｌ． Ｗｉｌｌｉａｍｓ， ａｎｄ Ａ． Ａ． Ｇｏｏｌｅｙ． １９９６． Ｒａｐｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ“ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ” ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２２１：６０９−１３．
６０． Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ， Ａ．， Ｉ． Ｃｈｅｒｎｕｓｈｅｖｉｃｈ， Ｗ． Ｅｎｓ， Ｋ． Ｇ． Ｓｔａｎｄｉｎｇ， Ｂ． Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ｍ． Ｗｉｌｍ， ａｎｄ Ｍ． Ｍａｎｎ． １９９７． Ｒａｐｉｄ ‘ｄｅ ｎｏｖｏ’ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｎｏｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ， ｉｓｏｔｏｐｉｃ ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ａ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ／ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ． Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ １１：１０１５ −２４．
６ｌ． Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ， Ｉ． Ａ． １９９５． Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔ． Ｒｅｖ． １４：４９−７３．
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
Ｒａｓ−ＧＲＦ２の機能ドメインを示す。
【図１Ｂ】
分裂酵母において既知のＧＲＦ２経路を示す。
【図１Ｃ】
ＮｄｒおよびＳｋｂ１の結合を示すと仮定されたＧＲＦ２複合体を示す。
【図２】
ヒト細胞から単離されたＧＲＦ２結合パートナーのゲル分離であり、ＧＲＦ２結合パートナーのゲル上の位置を示す。
【図３Ａ】
ＦＬＡＧ−Ｎｄｒ（オカダ酸存在下で）免疫沈降実験から単離されるポリペプチドの代表的なスペクトルである。ＢＬＡＳＴ分析を用いて、これらのポリペプチドをスピンドリンタンパク質の断片と同定した。
【図３Ｂ】
ＦＬＡＧ−Ｎｄｒ（オカダ酸存在下で）免疫沈降実験から単離されるポリペプチドの代表的なスペクトルである。ＢＬＡＳＴ分析を用いて、これらのポリペプチドをスピンドリンタンパク質の断片と同定した。
【図４Ａ】
ＦＬＡＧ−Ｎｄｒ（オカダ酸存在下で）免疫沈降実験から単離されるポリペプチドの代表的なスペクトルである。ＢＬＡＳＴ分析を用いて、これらのポリペプチドがＥＳＴ７０５５８２のコーディング配列を含むことを同定した。この新規のタンパク質は、ＭＯＢ様タンパク質に対する相同性を有する。
【図４Ｂ】
ＦＬＡＧ−Ｎｄｒ（オカダ酸存在下で）免疫沈降実験から単離されるポリペプチドの代表的なスペクトルである。ＢＬＡＳＴ分析を用いて、これらのポリペプチドがＥＳＴ７０５５８２のコーディング配列を含むことを同定した。この新規のタンパク質は、ＭＯＢ様タンパク質に対する相同性を有する。
【図５】
ＥＳＴ６５９３３１８およびＥＳＴ５３３９３１５のコーディング配列を含むタンパク質の完全長タンパク質配列である。当該タンパク質を同定するのに用いられたペプチドを一重下線、または隣接ペプチドを二重下線で示す。その完全長ｃＤＮＡを、ＥＳＴ６５９３３１８の５’末端とオリゴｄＴプライマーとの特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅によりクローニングした。予想タンパク質は、分子中央に６個のＷＤ４０リピートと、特有のＮおよびＣ末端配列とを含む。
【図６】
ＭＯＢ関連タンパク質（ＥＳＴ７０５５８２またはＥＳＴ８９２２６７１のコーディング配列を含む）およびスピンドリンのタンパク質配列である。タンパク質同定に用いられたペプチドを下線で示す。
【図７Ａ】
本発明で同定されたＭＯＢ関連タンパク質（図中、上の７配列）と、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳ． ｐｏｍｂｅからのＭＯＢ１タンパク質とを比較したアライメントである。
【図７Ｂ】
図７Ａのアライメントの続きである。
【図７Ｃ】
図７Ａのアライメントの続きである。
【図８】
図７のＭＯＢ関連タンパク質の関係を示す系統樹である。
【図９】
Ｆｌａｇ−ｐＩＣｌｎおよび関連タンパク質の免疫沈降である。細胞溶解物を抗ＦＬＡＧアガロースで免疫沈降させ、結合タンパク質をＦＬＡＧペプチドで溶出させた。溶出したタンパク質を４〜１５％グラージェントＳＤＳゲルで分離し、クーマシーブルーで染色した。レーン１は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞溶解物である。レーン２は、ＦＬＡＧ−ｐＩＣｌｎを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解物である。タンパク質分子量マーカーの分子量を示す（Ｍ．Ｗ．）。マススペクトロメトリーで同定されたタンパク質の部分集合を標識する。本明細書で説明されたＭＳおよびＭＳ／ＭＳ分析の結果として、ｓｍＥおよびｓｍＧを含むことがわかった染色されたタンパク質のバンドを矢印で示す。
【図１０】
タンパク質消化物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析の概略図である。上述したように、興味のある切り出しバンドを消化し、生成したペプチドを抽出する。そのペプチド混合物を、マトリックス溶液（本明細書中で説明された）と共にＭＡＬＤＩプレート上に置く。液体を乾燥させた後、そのプレートをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置の減圧室に置く。そのサンプルを気相に迅速に移送し、スポット上にレーザー光線を当てることによってＴＯＦ装置で分析する。消化物に含まれていたペプチドの質量電荷比（ｍ／ｚ）を示すＭＳスペクトルが得られる。
【図１１】
タンパク質のゲル消化、および、マススペクトロメトリー分析のペプチド回収のプロトコールである。
【図１２】
マススペクトロメトリーサンプルの調製プロトコールである。ＺｉｐＴｉｐを用いて脱塩し、サンプルをＭＡＬＤＩプレートに載せ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ分析する。
【図１３Ａ】
タンパク質消化物のＭＳ／ＭＳ分析の概略図である。上述したように、興味のある切り出しバンドを消化し、生成したペプチドを抽出する。ペプチド混合物を、エレクトロスプレーイオン化によりＭＳに注入する。ＭＳスペクトルを得た後、所定のｍ／ｚを有するペプチドをスペクトルから抽出し、断片化用に選択する。選択されたペプチドをガス分子を用いた衝突誘起解離（ＣＩＤ）により断片化する。
【図１３Ｂ】
タンパク質消化物のＭＳ／ＭＳ分析の概略図である。ペプチド結合で断片化が起こり、優先的にｂ型またはｙ型のプロトン化した断片が生じ、それにより断片は電荷を維持する（図示したとおり）。次に生成した断片をそのｍ／ｚ比に従って分離する。選択されたペプチドのアミノ酸配列に関する情報を含むＭＳ／ＭＳスペクトルが得られる。
【図１３Ｃ】
タンパク質消化物のＭＳ／ＭＳ分析の概略図である。ペプチド結合で断片化が起こり、優先的にｂ型またはｙ型のプロトン化した断片が生じ、それにより断片は電荷を維持する（図示したとおり）。次に生成した断片をそのｍ／ｚ比に従って分離する。選択されたペプチドのアミノ酸配列に関する情報を含むＭＳ／ＭＳスペクトルが得られる。
【図１４】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで得られた質量測定結果に基づくタンパク質同定のプロセス、すなわちペプチドマスフィンガープリンティングである。図１において矢印で示されたｓｍＥバンドの分析である。測定質量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで得られたＭＳスペクトルから抽出される。次にその質量を、タンパク質データベースのコンピュータ内での解析から得られた計算質量と合わせる。最大数適合したデータベース登録を、可能性のある同定として一般的に印をつける。この場合、問題のバンドは、ヒトの核内低分子リボ核タンパク質ポリペプチドＥと同定された。
【図１５】
未解釈のＭＳ／ＭＳスペクトル、すなわちＳｅｑｕｅｓｔを用いたデータベース検索に基づくタンパク質同定の例である。このソフトウェアは、質量情報を用いて、データベースから５００個の関連ペプチドを同定する。次に予想スペクトルをその５００個のスペクトルから得て、実測スペクトルと相関させ、相関信頼値を得る。次に、最もよく適合したペプチドを可能性のある同定として選択する。たった一つのペプチドを用いて同定を行ったとしても、同じタンパク質中の異なるペプチドに適合するＭＳスペクトルの冗長性（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）により、明瞭なタンパク質同定を達成することができる。Ｓｅｑｕｅｓｔ分析は、図１において矢印で示したバンドを処理することによってなされた。そのＭＳ／ＭＳスペクトルは、酸化されたメチオニン（Ｍｏｘ）を有するペプチドＶＭｏｘＶＱＰＩＮＬＩＦＲとして同定され、このバンド中のタンパク質を、核内低分子リボ核タンパク質ポリペプチドＥと同定した。また、他のペプチドから得られたＭＳ／ＭＳスペクトルもこのタンパク質と適合しており、同定が確認された。追加のペプチドは、共に移動した別のタンパク質、すなわち核内低分子リボ核タンパク質ポリペプチドＧ（ｓｍＧ；データは示さず）を含むバンドを示した。
【図１６】
データベース検索とＭＳ／ＭＳスペクトルの部分的な解釈、すなわち配列ｔａｇに基づいたタンパク質（ｓｍＥ）同定の例である。配列ｔａｇ方法を用いて、図１において矢印で示されたバンドのトリプシン消化物から単離されたペプチドから得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを分析した。そのＭＳ／ＭＳスペクトルを部分的に解釈すると、アミノ酸配列の小さいストレッチが得られる。次に、ペプチドの質量、その配列ｔａｇ成分、およびｔａｇ前後での差し引きの質量を用いて、データベースを検索する。ペプチドが適合した場合、リストは通常スコアリングスキームを示さないで得られる。そのＭＳ／ＭＳスペクトルは、酸化されたメチオニン（Ｍｏｘ）を有するペプチドＶＭｏｘＶＱＰＩＮＬＩＦＲとして同定し、これは核内低分子リボ核タンパク質ポリペプチドＥとして同定された。また、他のペプチドから得られたＭＳ／ＭＳスペクトルもこのタンパク質に適合し、同定が確認された。
【図１７Ａ】
ＦＬＡＧ−Ｓｋｂ１の終期における局在である。分裂溝における局在は、有糸分裂中のＳ． ｐｏｍｂｅ でみられる局在と一致する。
【図１７Ｂ】
ＦＬＡＧ−Ｓｋｂ１の終期における局在である。分裂溝における局在は、有糸分裂中のＳ． ｐｏｍｂｅ でみられる局在と一致する。
【図１８Ａ】
核スペックルに似た構造における内在性Ｓｋｂ１の局在である。Ｓｋｂ１の核局在は、ｐＩＣｌｎ、Ｓｋｂ１相互作用タンパク質はｓｎＲＮＰｓで共に免疫沈降し、またスペックル様の核構造中に保存される、という発見と一致する。またこれは、ｐＩＣｌｎが、Ｓｋｂ１とその基質のいくつか（例えば、ｓｍＤ１やｓｍＤ３）を共に運搬するアダプタータンパク質として機能するというモデルと一致する。
【図１８Ｂ】
核スペックルに似た構造における内在性Ｓｋｂ１の局在である。Ｓｋｂ１の核局在は、ｐＩＣｌｎ、Ｓｋｂ１相互作用タンパク質はｓｎＲＮＰｓで共に免疫沈降し、またスペックル様の核構造中に保存される、という発見と一致する。またこれは、ｐＩＣｌｎが、Ｓｋｂ１とその基質のいくつか（例えば、ｓｍＤ１やｓｍＤ３）を共に運搬するアダプタータンパク質として機能するというモデルと一致する。
【図１９Ａ】
ＧＲＦ２の存在により、オカダ酸および／またはイオノマイシンで標的化された細胞中のＮｄｒキナーゼ活性が高められる可能性があることを示す。これは、ＧＲＦ２がオカダ酸の存在によりＮｄｒと共に免疫沈降するという発見と一致する。オカダ酸とイオノマイシンとを用いた二重の処理により、オカダ酸のみでの処理と比べてＮｄｒ活性がわずかに減少した。これは、イオノマイシン処理において、担体としてＤＭＳＯが存在することによる可能性がある。
【図１９Ｂ】
ＧＲＦ２の存在により、オカダ酸および／またはイオノマイシンで標的化された細胞中のＮｄｒキナーゼ活性が高められる可能性があることを示す。これは、ＧＲＦ２がオカダ酸の存在によりＮｄｒと共に免疫沈降するという発見と一致する。オカダ酸とイオノマイシンとを用いた二重の処理により、オカダ酸のみでの処理と比べてＮｄｒ活性がわずかに減少した。これは、イオノマイシン処理において、担体としてＤＭＳＯが存在することによる可能性がある。
【図２０Ａ】
ｓｕｄＤ関連タンパク質のアライメントである。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ（ｓｕｄＤ）およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＲＩＯ１）からのｓｕｄＤタンパク質と、すでに同定されたヒトｓｕｄＤタンパク質（ＨｓｓｕｄＤ）と、他のヒトｓｕｄＤ関連タンパク質（ＧＩ１３５４３９２２；ＡＦ２５８６６１；ＦＬＪ１１１５９）とを、共に並べた。影をつけた領域は保存領域を示し、最も暗い領域は、最も高度に保存された領域を示す。
【図２０Ｂ】
図２０Ａのアライメントの続きである。
【図２０Ｃ】
図２０Ａのアライメントの続きである。
【図２０Ｄ】
図２０Ａのアライメントの続きである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【国際公開パンフレット】
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2004501670.tif 000208
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004501670.tif 000209
【国際調査報告】
2004501670.tif 000210
2004501670.tif 000211
2004501670.tif 000212
2004501670.tif 000213
2004501670.tif 000214