(57)【要約】野生のリコペルシコン種を起源とするＦｒｋ２遺伝子に対して、リコペルシコン・エスカレンタムを起源とするＦｒｋ２遺伝子を区別する分子マーカーであって、前記マーカーは、標準的なトマト品種に一般的に存在する比に比べてトマトの果実において高められたフルクトース対グルコース比に対するマーカーである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生のリコペルシコン種に由来するＦｒｋ２遺伝子に対して、リコペルシコン・エスカレンタムに由来するＦｒｋ２遺伝子を区別する分子マーカーであって、標準的なトマト品種に一般的に存在する比に比べてトマトの果実における高められたフルクトース対グルコース比に対するマーカー。
【請求項２】
野生種に由来する対立遺伝子が、標準的なトマト品種に一般的に存在する比に比べて、完熟トマトの果実におけるフルクトース対グルコース比を高める、野生種に由来する対立遺伝子を有するＦｒｋ２に連鎖した遺伝子に対する分子マーカー。
【請求項３】
マーカーがＦｒｋ２遺伝子の一部である請求項２記載の分子マーカー。
【請求項４】
トマトの第４染色体上に位置するＦｇｒ遺伝子座を標識するもう１つのマーカーとの相互作用において、標準的なトマト品種に一般的に存在する比に比べて、トマト果実で高められたフルクトース対グルコース比に対するマーカーである分子マーカー。
【請求項５】
リコペルシコン・ヒルスツムを起源とするＦｒｋ２遺伝子に対して、リコペルシコン・エスカレンタムを起源とするＦｒｋ２遺伝子を区別する請求項１記載の分子マーカー。
【請求項６】
Ｆ２Ｆ＝ＣＧＣＣＣＧＣＴＧＡＧＴＴＧＡＡＴＣＴＴＧＡＴＣＴＴ及びＦ２Ｒ＝ＣＡＣＡＡＧＧＡＣＡＴＧＧＣＧＧＡＴＴＣＡＴＣＡＴＣを含み、Ｆ２Ｆ及びＦ２Ｒと呼ばれるプライマーによって生成され、ＥｃｏＲＩ制限酵素によってさらに消化される増幅産物をさらに含む請求項１記載のマーカー。
【請求項７】
以下のヌクレオチド配列を有する断片を含む請求項６記載のマーカー。
【化１】
2004516803.tif 000009
【請求項８】
以下のアミノ酸配列を有する断片を含む請求項６記載のマーカー。
【化２】
2004516803.tif 000010
【請求項９】
少なくとも１つのリコペルシコン・エスカレンタムの植物体をリコペルシコン種と交配して交雑種の種子を生産する工程と、
交雑種（Ｆ１）の種子を回収する工程と、
Ｆ１種子から植物体を育成する工程と、
Ｆ１植物を受粉させる工程と、
Ｆ１植物により生産される種子を回収する工程と、
Ｆ１植物により生産される種子からの植物体を育成する工程と、
Ｆ１植物の種子から育成された植物体から生産される完熟果実のグルコース及びフルクトースを測定する工程と、
野生のリコペルシコン種を起源とするＦｒｋ２遺伝子に対して、リコペルシコン・エスカレンタムを起源とするＦｒｋ２遺伝子を区別するマーカーを提供し、前記マーカーがトマトの果実において高められたフルクトース対グルコース比に対するマーカーである工程と、
少なくとも１つの前記追加マーカーを用いて、標準的なリコペルシコン・エスカレンタムの比よりも高いフルクトース対グルコース比を含む所望の特性を有するトマトの果実によってトマトの植物体を選抜する工程とを含む、優れた味覚特性を有するトマトを生産するトマト植物体の育成方法。
【請求項１０】
野生のリコペルシコン種を起源とするＦｒｋ２遺伝子に対して、リコペルシコン・エスカレンタムを起源とするＦｒｋ２遺伝子を区別するマーカーを提供し、前記マーカーがトマトの果実において高められたフルクトース対グルコース比に対するマーカーである工程と、
少なくとも１つの前記追加マーカーを用いて遺伝子を発見する工程とを含む、優れた味覚特性を有するトマトを生産する前記遺伝子を発見する方法。
【請求項１１】
野生のリコペルシコン種を起源とするＦｒｋ２遺伝子に対して、リコペルシコン・エスカレンタムを起源とするＦｒｋ２遺伝子を区別するマーカーを提供し、前記マーカーがトマトの果実において高められたフルクトース対グルコース比に対するマーカーである工程と、
少なくとも１つの前記追加マーカーを用いて遺伝子のプロモータ領域を発見する工程とを含む、優れた味覚特性を有するトマトを生産する前記遺伝子のプロモータ領域を発見する方法。
【請求項１２】
前記遺伝子をクローニングすることをさらに含む請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
所望の特性を有するトマト果実を持った前記植物体を増殖させる工程をさらに含む請求項９記載の方法。
【請求項１４】
増殖させる工程が、栄養繁殖の工程を包含する請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
増殖させる工程が、種子による繁殖を包含する請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
請求項９の方法に従って生産されるトマト植物体。
【請求項１７】
請求項１６に基づいたトマト植物体により生産されるトマトの果実。
【請求項１８】
生育した場合、請求項１６に基づいたトマト植物体を産出するトマトの種子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般的に、優れた味覚特性を有するトマトの育成方法及び優れた味覚特性を有するトマト、特に、完熟トマト果実におけるフルクトース対グルコースの比を決める遺伝子の分子マーカーに関する。
【０００２】
（背景技術）
味覚特性は、加工したトマト及び新鮮な市場トマトの双方について果実の質の主な決定因子である（Ｓｔｅｖｅｎｓ， Ｍ．Ａ．，『トマト果実の質の成分の遺伝』Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ ４：２７４−３１０， １９８６を参照のこと）。
トマトにおける味覚の主要な成分の１つは、可溶性の糖含有物である。
既知の市販のトマトの品種すべて（リコペルシコン・エスカレンタム・ミル（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ Ｍｉｌｌ））の可溶性糖含有物には、主として似たようなモル比で存在するヘキソース糖である、グルコース及びフルクトースが挙げられる（１：１〜１：１．３）（Ｄａｖｉｅｓ Ｊ．Ｎ． ａｎｄ Ｈｏｂｓｏｎ Ｇ．Ｅ．，『トマト果実の構成要素−環境、栄養及び遺伝子型の影響』ＣＲＣ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ， １５：２０５−２８０， １９８１； Ｄａｖｉｅｓ Ｊ．Ｎ． ａｎｄ Ｋｅｍｐｔｏｎ Ｒ．Ｊ．，『完熟中のトマト果実の個々の糖における変化』Ｊ． Ｓｃｉ． Ｆｄ． Ａｇｒｉｃ．， ２６：１１０３−１１１０， １９７５を参照のこと）。
市販のリコペルシコン・エスカレンタム品種では、二糖スクロースも存在するが、新鮮な重量の０．５％を滅多に越えない濃度である。リコペルシコン・ヒルスツムのようなリコペルシコンの特定の野生種は高濃度のスクロースを蓄積し、それは新鮮な重量の４％に達する可能性がある（Ｍｉｒｏｎ， Ｄ． ａｎｄ Ｓｃｈａｆｆｅｒ， Ａ．Ａ．，『発育中のリコペルシコン・エスカレンタムの果実及びスクロースを蓄積しているリコペルシコン・ヒルスツムにおけるＳＰＳ、ＳＳ及び転化酵素の活性』Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ９５：６２３−６２７， １９９１を参照のこと）。
高いスクロースの存在下では、このような果実は低いレベルのヘキソースである、フルクトース及びグルコースを、典型的には新鮮な重量のそれぞれ１％未満で蓄積する（Ｄａｖｉｅｓ Ｊ．Ｎ．，『リコペルシコンにおけるスクロースの産出とその性質について』Ｎａｔｕｒｅ， Ｖｏｌ． ２６６， ５８６−５８７， １９６６）。
しかしながら、このような果実では、フルクトース対グルコースの比は異常に高く、１．５：１を超える。
【０００３】
典型的には、植物栽培者は、果汁試料の屈折計測定により測定され、ブリックス（果実の糖度の単位）として表される可溶性全固形分（ＴＳＳ）を高めることによって甘味成分を改善しようと努める。
しかしながら、この測定によっては、糖成分間は区別されない。
フルクトースはグルコース及びスクロースの双方よりも有意に甘く（Ｂｉｅｓｔｅｒ， Ａ．Ｍ．，『炭水化物の研究：Ｉ．純粋な糖の相対的な甘味』Ａｍｅｒ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ７３：３８７−４００， １９２５を参照のこと）、相対的に高いフルクトース含有量を持ったトマトには、優れた味覚特性という観点から明確な有利な点が与えられる。
【０００４】
出願者と譲渡者の米国特許出願第５，８１７，９１３号に記載された選択方法を用いて、高いフルクトース対グルコース比を持ったトマトが開発されており、その開示は参考として本明細書に組み入れられる。
要約すれば、この方法は、リコペルシコン・エスカレンタムの植物とリコペルシコン・ヒルスツムの植物を交雑し、続いて、新鮮な重量の１．３％を超えるフルクトースのレベルと共に、１．８を超えるフルクトース対グルコース比で完熟果実を子孫選抜（ｐｒｏｇｅｎｉｅｓ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ；後代選択）することから成る。
記載された方法における完熟果実の糖の分析は、例えば、個々の糖のクロマトグラフィ分離によるような、完熟果実の直接的な化学分析を介する。
【０００５】
分子マーカーは、明らかな利点と共に、植物及び動物の育成における選抜方法として用いられてきた。（Ｈｉｌｌｅｌ Ｊ．， Ｓｃｈａａｐ Ｔ．， Ｈａｂｅｒｆｅｌｄ Ａ．， Ｊｅｆｆｒｅｙｓ Ａ．Ｊ．， Ｐｌｏｔｚｋｙ Ｙ．， Ｃａｈａｎｅｒ Ａ．， ａｎｄ Ｌａｖｉ Ｕ．，『ゲノム選抜：十分な遺伝子交雑に対するＤＮＡフィンガープリントの適用』Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １２４：７８３−７８９， １９９０； Ｔａｎｋｓｌｅｙ， Ｓ．Ｄ．， Ｇａｎａｌ， Ｍ．Ｗ．， Ｐｒｉｎｃｅ， Ｊ．Ｐ．， ｅｔ ａｌ．，『トマト及びジャガイモのゲノムの高密度分子連鎖地図』Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １３２：１１４１−１１６０， １９９２； Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ Ｖ．Ｍ．， Ｈｏ Ｊ．Ｙ．， Ｗｕ Ｆ．Ｆ．， Ｍｉｌｌｅｒ Ｎ． ａｎｄ Ｋａｌｏｓｈｉａｎ Ｉ．，『トマトにおける線虫の耐性遺伝子、Ｍｊに厳密に連鎖したＰＣＲによるマーカー』Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．， ８７：７５７−７６３， １９９４； Ｃｈａｇｕ’ｅ Ｖ．， Ｍｅｒｃｉｅｒ Ｊ．Ｃ．， Ｇｕｅｎａｒｄ Ｍ．， ｄｅ Ｃｏｕｒｃｅｌ Ａ．， ａｎｄ Ｖｅｄｅｌ Ｆ．，『バルク区分解析によるトマトにおけるＳｗ−５に連鎖したＲＡＰＤマーカーの同定及び第９染色体上へのマッピング』Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．， ９２：１０４５−１０５１， １９９６を参照のこと）。
完熟トマトの果実における糖の濃度及びプロフィールを調節するための、遺伝的アプローチを含むいくつかの戦略が検討されている。
しかしながら、そのような方面に向けた正確な育成には、低下した糖を評価することが必要であり、それは、高価で時間のかかるＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）によって行われる。
ＤＮＡマーカーはこの問題を緩和する可能性があり、苗木の段階で遺伝素材の同定及び選抜を可能にし、従って、労力と時間を軽減する可能性がある。
最近数年間、ＤＮＡマーカーを用いた、トマト、ジャガイモ及びトウモロコシのような数種の植物種のゲノム・マッピングを目的として国際的な試みに努力が注ぎ込まれてきた（Ｈｅｌｅｎｔｊａｒｉｓ Ｔ．， Ｓｌｏｃｕｍ Ｍ．， Ｗｒｉｇｈｔ Ｓ．， Ｓｃｈａｅｆｅｒ Ａ． ａｎｄ Ｎｅｉｎｈｕｉｓ Ｊ．，『制限断片長多型を用いたトウモロコシ及びトマトにおける遺伝子連鎖地図の構築』Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．， ７２：７６１−７６９， １９８６； Ｔａｎｋｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９９２を参照のこと）。
多数の育成及び遺伝子解析のための十分なツールであること（Ｈｉｌｌｅｌ Ｊ．， Ｄｕｎｎｉｎｇｔｏｎ， Ｅ．Ａ．， ａｎｄ Ｓｉｅｇｅｌ Ｐ．Ｂ．，『鳥類の育成と遺伝子解析におけるＤＮＡマーカー』Ｐｏｕｌｔ． Ｓｃｉ． Ｒｅｖ．， ４：１６９−１８６， １９９２で概説された）以外に、ＤＮＡマーカーは、関心のある遺伝子のクローニングに有用な当初の配列情報及びプローブを提供する。
最近、高等植物における位置クローニングによる遺伝子単離及び候補遺伝子の同定の成功例がいくつか報告されている（Ｔａｎｋｓｌｅｙ， Ｓ．Ｄ．， Ｇａｎａｌ， Ｍ．Ｗ． ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ， Ｇ．Ｂ．，『染色体標識：大きなゲノムの植物におけるマップに基づいたクローニングに関するパラダイム』Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．， １１：６３−６８， １９９５； Ｆｏｌｋｅｒｔｓｍａ Ｒ．Ｔ．， Ｓｐａｓｓｏｖａ Ｍ．Ｉ．， Ｐｒｉｎｓ Ｍ．， Ｓｔｅｖｅｎｓ Ｍ．Ｒ．， Ｈｉｌｌｅ Ｊ．， ａｎｄ Ｇｏｌｄｂａｃｈ Ｒ． Ｗ．，『リコペルシコン・エスカレンタム・ｃｖ． スティーブンスの細菌性人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリの構築及びＳｗ−５遺伝子座を物理的にマッピングするためのその応用』Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ５：１９７−２０７， １９９９）。
【０００６】
分子連鎖地図は、主として制限断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカーから構成される。
ＲＦＬＰ解析には、クローニングしたプローブ、制限酵素によるゲノムＤＮＡの切断及び時間のかかるＤＮＡの転移、標識及びハイブリッド形成工程が必要である。
さらに十分な多型アッセイは、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）から得ることができ、ＲＦＬＰ解析に比べて解析されるＤＮＡは実質的に少ない量が求められる（Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．， Ｓｃｈａｒｆ Ｓ．， Ｆａｌｏｏｎａ Ｆ．Ａ．， Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ．Ｂ．， Ｈｏｒｎ Ｇ．Ｔ．， Ｅｒｌｉｃｈ Ｈ．Ａ．， ａｎｄ Ａｒｎｈｅｉｍ Ｎ．，『ｂ−グロビン配列の酵素的増幅及び鎌状赤血球貧血の診断のための制限部位解析』Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３０：１３５０−１３５４， １９８５を参照のこと）。
ＰＣＲに基づいたマーカーを同定するいくつかの方法が開発されており、関心のある遺伝子に連鎖したＤＮＡ配列の検出に有用であることが見い出されている。
このような技術には、無作為増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ； Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｊ．Ｇ．Ｋ．， Ｋｕｂｌｉｋ Ａ．Ｒ．， Ｌｉｖａｋ Ｋ． Ｊ．， Ｒａｆａｌｓｋｉ Ｊ．Ａ． ａｎｄ Ｔｉｎｇｅｙ Ｓ． Ｖ．，『任意のプライマーで増幅されたＤＮＡ多型は遺伝子マーカーとして有用である』Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １８：６５３１−６５３５， １９９０を参照のこと）、マイクロサテライト又は単純配列反復解析（ＳＳＲ； Ｔａｕｔｚ， Ｄ．，『多型ＤＮＡマーカーのための一般供給源としての単純配列の超可変性』Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １７：６４６３−６４７１， １９８９を参照のこと）、単純配列反復の単一プライマーを用いた内部ＳＳＲ多型（Ｇｕｐａｔａ Ｍ．， Ｃｈｙｉ Ｙ．Ｓ．， Ｒｏｍｅｒｏ−Ｓｅｖｅｒｓｏｎ Ｊ． ａｎｄ Ｏｗｅｎ Ｊ．Ｌ．，『単純配列反復の単一プライマーを用いた進化的に離れたゲノムからのＤＮＡマーカーの増幅』Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．， ８９：９９８−１００６， １９９４を参照のこと）、及び増幅された制限断片多型解析の技術（ＡＦＬＰ； Ｚａｂｅａｕ Ｍ． ａｎｄ Ｖｏｓ Ｐ．，『選択的な制限断片の増幅：ＤＮＡフィンガープリントの一般的方法』欧州特許出願第９２４０２６２９．７号［公開番号第０５３４８５８Ａ１号］を参照のこと）が挙げられる。
上述したＰＣＲ技術によって、ＲＦＬＰ解析よりもさらに微小な配列多型を検出することができ、少ない量のＤＮＡを必要とするにすぎない。
ＲＡＰＤ及びＳＳＲ解析は、それを実施するのに多型ＤＮＡ領域における標的ＤＮＡ配列の情報を前もって手にする必要がないので、コストが低く、行うのが容易である。
しかしながら、このような技術は、通常任意の遺伝子座について単一の対立遺伝子しか同定することができず、従って、ホモ接合体とヘテロ接合体の遺伝子型を区別することができないという欠点を共有する。
ＡＦＬＰはさらに高価であり、これも通常、任意の遺伝子座における単一の対立遺伝子しか検出することができないが、現在利用されているその他のＰＣＲに基づいた技術よりも単一のアッセイにおいてはるかに多数の多型遺伝子座を検出する能力を有する。
マイクロサテライト又はＳＳＲも、対立遺伝子特異的なプライマーを必要とし、一回のアッセイで１つの多型遺伝子座しか検出できないので高価ではあるが、任意の遺伝子座において１つより多い対立遺伝子を同定することができ、従ってホモ接合体とヘテロ接合体の遺伝子型を区別することができるという利点を有する。
【０００７】
異なった遺伝子型のＰＣＲ解析において長さの多型を直接得ることができない場合、ＰＣＲの増幅解析に続いて増幅産物の制限酵素切断を行うことができる。
制限酵素の切断があとに続く係るＰＣＲ解析は、切断増幅多型配列と呼ばれることが多く（ＣＡＰＳ； Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙ Ａ．， ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ． Ｍ．，『共優性の生態型特異的なＰＣＲに基づいたマーカーを用いたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの突然変異をマッピングする方法』Ｐｌａｎｔ Ｊ．， ４：４０３−４１０， １９９３； Ｊａｒｖｉｓ Ｐ．， Ｌｉｓｔｅｒ Ｃ．， Ｓｚａｂｏ Ｖ．， ａｎｄ Ｄｅａｎ Ｃ．，『Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの組換え近交系を用いて作成したＲＦＬＰ地図へのＣＡＰＳマーカーの統合』Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２４：６８５−６８７， １９９４を参照のこと）、任意の遺伝子座において１つより多い対立遺伝子を検出することができ、従って、ホモ接合体とヘテロ接合体の遺伝子型を区別することができる。
【０００８】
完熟トマトの糖含有物に関して選抜する場合、完熟果実の段階でのみ選抜することとは対照的に、分子マーカーは苗木の段階で選抜することができるという利点を有する。
その上、分子マーカーを用いた選抜によって、完熟トマトの糖含有物のような表現型の特徴についての選抜の有効性を限定することができる植物の表現型への環境条件の影響の効果が除かれる。
【０００９】
酵素、フルクトキナーゼ（ＥＣ２．７．１．４）は、リン酸部分を供与する基質としてＡＴＰのようなヌクレオシド三リン酸を用いて、フルクトースをリン酸化する。
それはそれとして、該酵素は、植物組織においてフルクトース対グルコースの比を調節できる可能性がある。
Ｆｒｋ１及びＦｒｋ２と名付けられた相違するフルクトキナーゼをコードする少なくとも２つの遺伝子が、リコペルシコン・エスカレンタムからクローニングされ、配列決定されている（Ｋａｎａｙａｍａ Ｙ．， Ｄａｉ， Ｎ．， Ｇｒａｎｏｔ， Ｄ．， Ｐｅｔｒｅｉｋｏｖ， Ｍ．， Ｓｃｈａｆｆｅｒ， Ａ ａｎｄ Ｂｅｎｎｅｔｔ， Ａ．Ｂ．，『相違するフルクトキナーゼ遺伝子はトマトにおいて差次的に発現される』Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １１３：１３７９−１３８４， １９９７を参照のこと）。
このような２つのリコペルシコン・エスカレンタムの遺伝子の配列は、それぞれＦｒｋ１及びＦｒｋ２についてジーンバンク受入番号Ｕ６４８１７及びＵ６４８１８として記載されている。
【００１０】
リコペルシコンの野生種は、果実において改変された炭水化物代謝及び糖含有量を持つ果実を生産するトマト植物体の生産に利用されてもよい炭水化物代謝に関する遺伝的変異源として役立ってもよいことが明らかにされている（イスラエル特許出願第１２１３７３号、ＰＣＴ国際出願  ＰＣＴ／ＩＬ９８／００３３６号、国際公開ＷＯ９９／０４６２１号）。
【００１１】
先の特許出願において（イスラエル特許出願第１２１３７３号、ＰＣＴ国際出願  ＰＣＴ／ＩＬ９８／００３３６号、国際公開ＷＯ９９／０４６２１号）、トマトのゲノムにおける遺伝子座に関連し、完熟トマトの果実においてフルクトース／グルコースの比を高める分子マーカーが記載されている。
この遺伝子座はＦｇｒと命名され、トマトの第４染色体上に位置している（Ｌｅｖｉｎ， Ｉ．， Ｇｉｌｂｏａ， Ｎ．， Ｙｅｓｅｌｓｏｎ， Ｅ．， Ｓｈｅｎ， Ｓ．， ａｎｄ Ｓｃｈａｆｆｅｒ Ａ．Ａ．，『Ｆｇｒ、完熟トマトの果実においてフルクトース／グルコースの比を調節する主要な遺伝子座』Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．， １９９９印刷中）。
【００１２】
（発明の開示）
本発明は、標準的なトマト品種に一般的に存在する比に比べて、完熟トマトにおいてフルクトース対グルコースの比を高めるように作用する追加的な遺伝子に関する分子マーカーを提供しようとするものである。
本特許出願において、我々は、対立遺伝子が野生のリコペルシコン種（リコペルシコン・ヒルスツム）に由来し、完熟トマトの果実においてフルクトース対グルコースの比を調節する、トマトの第６染色体に位置する追加的な遺伝子座に対する分子マーカーを記載する。
該マーカーは、遺伝子、フルクトキナーゼ２（Ｆｒｋ２）又はＦｒｋ２に連鎖する遺伝子に関するものであり、Ｆｒｋ２の野生種に由来する対立遺伝子は完熟トマトの果実においてフルクトース対グルコースの比を高め、先に性状分析され、トマトの第４染色体上に位置する遺伝子座（Ｆｇｒ）と相互作用する。
フルクトース対グルコースの比を高めた望ましい特性を持ったトマトの種子、植物体及び／又は果実を生産し、この比をさらに高めるために、Ｆｒｇ遺伝子座を標識するマーカーと共に、新しく記載されるマーカー又は遺伝子を使用することができる。
【００１３】
従って、本発明の好ましい実施態様に基づいて、完熟トマトの果実においてフルクトース対グルコースの比を決定する遺伝子に対する追加の分子マーカー又は遺伝子が提供される。
【００１４】
本発明の好ましい実施態様に基づいて、マーカーは、Ｆ２Ｆ及びＦ２Ｒと呼ばれるプライマーによって生成される増幅産物を包含し、Ｆ２Ｆプライマーは、ヌクレオチド配列ＣＧＣＣＣＧＣＴＧＡＧＴＴＧＡＡＴＣＴＴＧＡＴＣＴＴを含み、Ｆ２Ｒは、ヌクレオチド配列ＣＡＣＡＡＧＧＡＣＡＴＧＧＣＧＧＡＴＴＣＡＴＣＡＴＣを含む。
このようなプライマーは、リコペルシコン・エスカレンタムのフルクトキナーゼ２をコードする遺伝子（ジーンバンク受入番号Ｕ６４８１８）のヌクレオチド配列に基づいて設計される。
【００１５】
リコペルシコン・ヒルスツム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）を起源とするＦｒｋ２遺伝子に対してリコペルシコン・エスカレンタムを起源とするＦｒｋ２遺伝子を区別するために使用することができるマーカーは、ヒルスツムに由来するＦｒｋ２の遺伝子が、フルクトース対グルコース比の上昇と関連しているのでフルクトース／グルコース比を高めるために使用することができる。
マーカー又は類似のものが、その他の野生リコペルシコン種を起源とするフルクトキナーゼ２遺伝子に対して、リコペルシコン・エスカレンタムを起源とするＦｒｋ２遺伝子を区別することができるのは合理的である。
【００１６】
さらに、本発明の好ましい実施態様に基づいて、マーカーは、以下のリコペルシコン・ヒルスツムに由来するフルクトキナーゼ２遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部を包含する、又は少なくとも一部である。
【化３】
2004516803.tif 000002
【００１７】
さらに、本発明の好ましい実施態様に従って、マーカーは、以下のリコペルシコン・ヒルスツムに由来するフルクトキナーゼ２遺伝子のアミノ酸配列の少なくとも一部を包含する、又は少なくとも一部である。
【化４】
2004516803.tif 000003
【００１８】
さらにその上、本発明の好ましい実施態様に基づいて、Ｆ２Ｆ及びＦ２Ｒにより生じた増幅産物を制限酵素ＥｃｏＲＩにて切断し、リコペルシコン・ヒルスツムに由来する対立遺伝子とリコペルシコン・エスカレンタムに由来する対立遺伝子を区別する制限断片長多型を生じる。
【００１９】
本発明の好ましい実施態様に基づいて、少なくとも１種のリコペルシコン・エスカレンタムの植物をリコペルシコン種（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｓｐｐ．）と交配して雑種作物を生産する工程、交雑種（Ｆ１）の種子を回収する工程、Ｆ１種子から植物体を育てる工程、Ｆ１植物を受粉させる工程、Ｆ１植物により生じた交雑種の種子を回収する工程、Ｆ１植物により生じた種子から植物体を育てる工程、Ｆ１植物の種子から育った植物体から生産された完熟果実のグルコースとフルクトースの含有量を測定する工程、野生のリコペルシコン種を起源とするＦｒｋ２遺伝子に対してリコペルシコン・エスカレンタムを起源とするＦｒｋ２遺伝子を区別するマーカーを提供し、その際、マーカーはトマト果実における上昇したフルクトース／グルコース比のマーカーである工程、及び標準的なリコペルシコン・エスカレンタムの比を上回るフルクトース／グルコース比を含めた所望の特性を有するトマト果実でトマト植物体を選抜するためにマーカーを使用する工程を含む、優れた味覚特性を有するトマトを生産するトマト植物体を育成する方法も提供される。
【００２０】
本発明の好ましい実施態様に従って、野生リコペルシコン種を起源とするＦｒｋ２遺伝子に対してリコペルシコン・エスカレンタムを起源とするＦｒｋ２遺伝子を区別するマーカーを提供し、その際、マーカーはトマト果実における上昇したフルクトース／グルコース比のマーカーである工程及び遺伝子又は前記遺伝子のプロモータ領域を見つけるためにマーカーを使用する工程含む、優れた味覚特性を有するトマトを生産する遺伝子又は前記遺伝子のプロモータ領域を見い出す方法も提供される。
【００２１】
本発明の好ましい実施態様に基づいて、方法はさらに遺伝子をクローニングすることを包含する。
【００２２】
さらに、本発明の好ましい実施態様に基づいて、方法は、所望の特性を有するトマト果実を持った植物体を増殖させる工程を包含する。
【００２３】
本発明のいかなる方法によっても、トマトの植物体、トマトの果実及び／又はトマトの種子を生産してもよい。
【００２４】
（発明を実施するための最良の形態）
ここで、完熟果実が、標準のトマト品種で見い出されるよりも平均で高いフルクトース対グルコースの比を有することを決定する遺伝子組成を持つトマト植物体を育成プログラムにおいて選抜する方法に関して参照される。
植物素材を生育する方法は、出願者及び譲渡者の米国特許第５，８１７，９１３号に記載されているとおりである。
ここで、発明を説明する以下の実施例が参照される。
【００２５】
植物素材の説明及び完熟果実における糖含有量の分析
２つの親株を交配することによって作成されたＦ１、Ｆ２及びＦ３集団と共に、本試験のために、完熟果実におけるフルクトース対グルコースの比が有意に異なるリコペルシコン・エスカレンタムの親株を選抜した。
高いフルクトース対グルコース比の育成株は、米国特許第５，８１７，９１３号に記載されるような、野生種リコペルシコン・ヒルスツム（ＬＡ１７７７）からの高いフルクトース対グルコース比の特性の遺伝子交雑に由来する。
【００２６】
可溶性の糖を測定するために以下の手順を実施した。
Ｍｉｒｏｎ ａｎｄ Ｓｃｈａｆｆｅｒ （１９９１）に記載されるように、新鮮重量で約５００ｍｇの果実部分を８０％のエタノールに入れ、７０℃まで加熱することにより組織から可溶性の糖を抽出した。
Ｍｉｒｏｎ ａｎｄ Ｓｃｈａｆｆｅｒ （１９９１）のように製造元の指示書に従って、バイオラッドのファスト・カーボハイドレート・カラムを用いてＨＰＬＣにより糖をクロマトグラフィ分離した。
スクロース、グルコース及びフルクトースは、屈折計による保持時間によって同定し、糖の標準値と比較して定量した。
【００２７】
ＰＣＲ法、Ｆ２Ｆ及びＦ２Ｒプライマーによって作成したＰＣＲ増幅マーカー及び結果の分析の説明
完熟果実において相違するフルクトース対グルコース比を持つ２つの親株から、及び２つの親株を交配することによって生じたＦ１、Ｆ２及びＦ３集団の個々の植物体からゲノムＤＮＡを抽出した。
Ｆ２及びＦ３集団の個々の植物体は、フルクトース対グルコース比の特徴に関して、Ｆ２集団では１〜２．５の範囲で、Ｆ３集団では１．１〜７．７の範囲で分離した。
従って、Ｆ２及びＦ３集団からの個々の植物体は、フルクトース対グルコース比の特徴について容易にランク付けすることができた。
Ｆｕｌｔｏｎ， Ｔ．Ｍ．， Ｃｈｕｎｗｏｎｇｓｅ， Ｊ ａｎｄ Ｔａｎｋｓｌｅｙ， Ｓ．Ｄ． （１９９５）『トマト及びその他の葉状植物からのＤＮＡの抽出のためのミニプレップ・プロトコール』（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ １３：２０７−２０９）のとおりにゲノムＤＮＡを抽出した。
簡単に言えば、２．５容量のＤＮＡ抽出緩衝液（０．３５Ｍのソルビトール、０．１Ｍのトリス塩基、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）、２．５容量の核溶解用緩衝液（０．２Ｍのトリス、０．０５ＭのＥＤＴＡ、２ＭのＮａＣｌ、５％のＣＴＡＢ）、１容量の５％（１ ｐａｒｔ ５％）サルコシル及び０．３グラム／１００ｍｌの亜硫酸水素ナトリウムの存在下で５０〜１００ｍｇの葉組織を粉砕した。
６５℃にて１２０分インキュベートした後、クロロホルム：イソアミル（２４：１）でＤＮＡを抽出し、イソプロパノールで沈殿し、７０％エタノールで洗浄し、乾燥してｄｄＨ２Ｏに再希釈した。
【００２８】
Ｆ２Ｆ及びＦ２Ｒプライマーを合成した（英国、ギブコＢＲＬ社）。
このようなプライマーは、リコペルシコン・エスカレンタムのフルクトキナーゼ２をコードする遺伝子（ジーンバンク受入番号Ｕ６４８１８）のヌクレオチド配列に基づいて設計された。
相違するフルクトース対グルコース比を持った親株間の多型についてポリメラーゼ鎖増幅反応によってスクリーニングするために鋳型ＤＮＡの存在下でこのようなプライマーを使用した。
種々の制限酵素によってＰＣＲ産物を消化し、ＥｃｏＲＩがかかる制限断片長多型を生じることが見い出された。
【００２９】
Ｆｒｋ２遺伝子座に関する増幅反応物（最終容量２５μｌ）は、１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、２５ｍＭのＴＡＰＳ（２５℃にてｐＨ９．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのｂ−メルカプトエタノール、それぞれ０．２ｍＭのデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、それぞれ１０ｎｇの２つのプライマー（Ｆ２Ｆ、Ｆ２Ｒ）、及び１単位の熱安定性Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（イスラエル、ＭＡＤＩ社のスーパーノバＴａｑポリメラーゼ）を含有した。
反応は自動熱サイクラー中で行われた（米国、マサチューセッツ州、ウォータータウンのＭＪリサーチ社）。
９４℃にて１．５分最初にインキュベートし、続いて９４℃１分間の変性、５５℃１分間のアニーリング及び７２℃１．５分間の重合を３４サイクル行った。
サイクルが終了した後、７２℃にて最後の重合を７分間行った。
製造元の指示書（米国、マサチューセッツ州、バーバリのニューイングランド・バイオラボ社）に従ってＥｃｏＲＩで消化（３７℃、１時間）した後、１．５％寒天ゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色することにより、増幅産物を視覚化した。
Ｆｇｒに関する個々の植物体それぞれの遺伝子型は、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９９／０４６２１号に以前記載されたとおりに決定された。
【００３０】
遺伝子型−表現型の関係
Ｆ２及びＦ３集団から得られた結果を用いて分散の分析を行い、マーカーとフルクトース対グルコース比の特徴との関係の影響及びこのような変動成分によって説明されるフルクトース対グルコースの変動の比率を決定した。
得られたＤＮＡマーカーは、Ｆ２及びＦ３集団においてフルクトース対グルコース比の特徴に高く且つ有意に関係していることが見い出された（表１，２，３，４）。
マーカーとフルクトース対グルコース比の特徴との関係は、対数差のスコアにて極めて有意であり、Ｆ２及びＦ３集団で観察されたフルクトース対グルコース比における全変動のそれぞれ４８．５％及び６１．９％でそれらの間に統計的に有意な相互作用があった（それぞれ、表２，４）。
【００３１】
結論的には、提示された結果は、
１．  Ｆ２Ｆ及びＦ２Ｒを用いた増幅反応によって得られたＤＮＡマーカーは、完熟トマトの果実におけるフルクトース対グルコース比をコードする追加の主要遺伝子と強く関係し、
２．  同定された遺伝子は、直接的に又は間接的に（Ｆｇｒ遺伝子座との相互作用を介して）フルクトース対グルコース比を調節することができる。
【００３２】
表１  Ｆ２集団におけるフルクトキナーゼ２、Ｆｇｒ、及びフルクトース対グルコース比の関係
【表１】
2004516803.tif 000004
異なった文字は０．０５レベルの差異での統計的な有意差を表すことを意味する。文字Ｅ及びＨは、エスカレンタム及びヒルスツムの遺伝子型に由来し、ＨＥはそれらのヘテロ接合体を示す。
【００３３】
表２  Ｆ２集団におけるフルクトース対グルコース比に対するフルクトキナーゼ２遺伝子座、Ｆｇｒ遺伝子座及びそれらの間の相互作用の影響を概算する分散分析
【表２】
2004516803.tif 000005
【００３４】
表３  Ｆ３集団におけるフルクトキナーゼ２、Ｆｇｒ、及びフルクトース対グルコース比の関係
【表３】
2004516803.tif 000006
【００３５】
表４  Ｆ３集団におけるフルクトース対グルコース比に対するフルクトキナーゼ２遺伝子座、Ｆｇｒ遺伝子座及びそれらの間の相互作用の影響を概算する分散分析
【表４】
2004516803.tif 000007
【００３６】
リコペルシコン・ヒルスツムのフルクトキナーゼＩＩ遺伝子の配列
リコペルシコン・ヒルスツムに由来するフルクトキナーゼＩＩ対立遺伝子についてホモ接合体（Ｆｒｋ２−ＩＩＨＨ）の植物体の熟す前の果実から全ＲＮＡを抽出した。
ＴＲＩｚｏｌ試薬システム（米国、メリーランド州、ゲーサーズバーグのギブコＢＲＬライフテクノロジーズ）を用いてＲＮＡの抽出を行った。
スーパースクリプト増幅前システム（英国、ギブコＢＲＬライフテクノロジーズ）を用いて、最初のｃＤＮＡ鎖合成の鋳型として全ＲＮＡを用いた。
調製されたｃＤＮＡは、フルクトキナーゼＩＩ（Ｆｒｋ２ＨＨ）をコードする遺伝子の４つの重なり合う断片を増幅するＰＣＲにおけるテンプレートとして用いた。
寒天ゲルからＤＮＡ断片を切り出し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩキット（米国、カリフォルニア州、ラホヤのバイオ１０１社）を用いて精製した。
次いで、製造元の指示書に従ってｐＧＥＭ−Ｔ及びｐＧＥＭ−Ｔイージー・ベクター・システム（米国、ウィスコンシン州、マジソンのプロメガ・コーポレーション）を用いて、ｐＧＥＭ−Ｔイージー・ベクターでＰＣＲ断片をクローニングした。
Ｔ７及びＳＰ６の両方の相補プライマーに基づいて、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７自動ＤＮＡシーケンサー（米国、カリフォルニア州、フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ）を用いて、４つの増幅された断片のそれぞれの４つの別々のクローンを配列決定した。
【００３７】
リコペルシコン・ヒルスツムに由来するフルクトキナーゼＩＩ遺伝子（Ｆｒｋ２ＨＨ）のヌクレオチド配列は以下のとおりである。
【化５】
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【００３８】
本発明は、上記で特に示され、記載されたものによって限定されないことは当業者によって十分理解されるだろう。
むしろ、本発明の範囲は、上述の特徴の組合せ及び小組合せを包含し、及び前述の記載を読んで当業者が思い付くような、従来技術にない、特徴の改変及び変更を包含する。
【国際公開パンフレット】
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