(57)【要約】本発明はガリエララクトンで知られる物質の薬剤としての利用に関し、肝臓又は他の臓器の線維症疾患、脳血管障害、ＣＮＳ又はＰＮＳに影響する自己免疫疾患、慢性の神経変性疾患、精神障害、抹消神経症、痛み、心臓血管障害、消化器系の炎症疾患、アミロイドーシス、腫瘍の予防及び／又は抑制、特に炎症過程の治療のための薬剤としての利用に関する。また、このような疾患の予防及び／又は治療用の薬剤を製造するためのガリエララクトンの利用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患の予防及び／又は抑制のためのガリエララクトン。
【請求項２】
肝臓又は他の臓器の線維症疾患、脳血管障害、ＣＮＳ又はＰＮＳに影響する自己免疫疾患、慢性の神経変性疾患、精神障害、抹消神経症、痛み、心臓血管障害、消化器系の炎症疾患、アミロイドーシス、腫瘍の予防及び／又は抑制のためのガリエララクトン。
【請求項３】
疾患の予防及び／又は治療用の薬剤を製造するためのガリエララクトンの利用。
【請求項４】
肝臓又は他の臓器の線維症疾患、脳血管障害、ＣＮＳ又はＰＮＳに影響する自己免疫疾患、慢性の神経変性疾患、精神障害、抹消神経症、痛み、心臓血管障害、消化器系の炎症疾患、アミロイドーシス、腫瘍の予防及び／又は治療のための請求項３に記載の利用。
【請求項５】
ガリエララクトン及び薬学的に許容される賦形剤を含む薬剤。
【請求項６】
疾患の予防及び／又は治療のための、以下の１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、δ／ｐｐｍ、ＣＤＣｌ３）のデータを有するガリエララクトン：６．８５（ｄ）；２．５３（ｍ）；０．９０（ｍ）；２．１３（ｍ）；２．３２（ｍ）；１．０２（ｍ）；１．７１（ｍ）；１．６０（ｍ）；１．９５（ｍ）；４．６４（ｍ）；１．０５（ｍ）。
【請求項７】
疾患の予防及び／又は治療のための、以下の１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、δ／ｐｐｍ、ＣＤＣｌ３）のデータを有するガリエララクトン：１７０．４；１３０．６；１４９．６；２８．６；３２．７；４２．７；３１．０；３１．０；９０．０；８１．３；２０．５。
【請求項８】
疾患の予防及び／又は治療のための、以下の赤外吸収スペクトルの特性ピークを有するガリエララクトン：３４３５ｃｍ−１、２９６１乃至２９３３ｃｍ−１、１７４２ｃｍ−１、１６７０ｃｍ−１、１４６０ｃｍ−１。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はガリエララクトンの名称で知られる物質の薬剤、特に炎症過程の治療のための薬剤としての利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
炎症は炎症部位に隣接しない臓器系においてさえも生じる多くの変化により識別される。炎症に伴う全身の変化は用語“急性期応答”に包含される。これは慢性の炎症の現象にも適用される（Ｐｅｒｓｐｅｃｔ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ．， １９９３， ３６： ６１１−２２）。重要な部分は肝臓におけるいわゆる急性期タンパク質（ＡＰタンパク質）の合成速度の変化による急性期応答の進展にある（Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， １９９９， ３４０： ４４８−５４）。急性期応答は感染、外傷、手術、火傷、臓器損傷及び悪性疾患の進行段階で生じる。急性期応答の主要な仲介物質はインターロイキン−６（ＩＬ−６）である（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９８７， ８４： ７２５１−５）。
【０００３】
ＩＬ−６はヤヌスキナーゼ（Ｊａｋ）族のチロシンキナーゼ、並びに、転写のシグナルトランスデューサ及び活性化因子（Ｓｔａｔ）族の転写因子を細胞内シグナル導入の主要な仲介物質として利用する。ＩＬ−６は転写因子Ｓｔａｔ３及びＳｔａｔ１のリン酸化従って活性化を誘導する（より小さい範囲で）（Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９４， ２６４： １４１５−２１； Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９７， ２７７： １６３０−５）。活性化の後、Ｓｔａｔ３及びＳｔａｔ１は細胞核に移動し、ＤＮＡ上の結合部位に結合後、その中にＡＰタンパク質の遺伝子発現を引き起こす（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， １９９８， ３３４： ２９７−３１４）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
現在の技術の状態に相当する炎症過程の治療、例えばコルチコステロイドでの治療は、不必要な副作用を伴わないことがない。上述又は以下に言及する疾患において同時に細胞の代謝のどこでも間に起こることがなくＩＬ−６−誘導ＡＰタンパク質の不必要な発現又は不必要なほど強い発現を減少又は抑制する治療薬が望まれている。この理由のため、Ｓｔａｔ３は非有益な、過度の（自己制限のない）急性期応答、例えば、肝硬変の場合に見られるような応答に対する新しい活性物質を開発するための適当な目標と考えられる。
【０００５】
【発明の実施の形態】
ガリエララクトンと称される下記式（１）の化合物は、ＩＬ−６誘導急性期タンパク質の過剰な発現により誘導される炎症過程の治療に著しく適していることが意外にも見出された。ついでながら、この物質はＩＬ−６のシグナル誘導に対して他の物質では未だ開示されていない特有の効果を有している。
【０００６】
【化１】
2004501970.tif 000002
【０００７】
式（１）のガリエララクトンは、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．１９９０、４５ｃ：１０９３−８（及び１９８９年、カイザースラウテルン大学、アール、ハウツェルの論文）に開示されており、この論文又は１９９５年、カイザースラウテルン大学、エイチ−ジェイ、ネールの論文に記載されているように菌類のガリエラルーファ（Ｇａｌｉｅｌｌａ ｒｕｆａ）（アスコミコティナ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門、ディスコミコティナ（Ｄｉｓｃｏｍｙｃｏｔｉｎａ）綱、ペジザレス（Ｐｅｚｉｚａｌｅｓ）目、サルコソマラシアエ（Ｓａｒｃｏｓｏｍａｒａｃｅａｅ）科、ガリエラ（Ｇａｌｉｅｌｌａ）属）から単離することができる。薬剤としての利用の報告は現在までに見られない。ガリエラルーファは、例えば、１９８１年、ニューヨークでアルフレッド  エイ．ノップにより発行されたゲイリィ  エイチ．リンコフ及びキャロル  ネーリングのジ  オーデュボン  ソサイエティ  フィールド  ガイド  トゥ  ノース  アメリカン  マッシュルーム（Ｇａｒｙ Ｈ． Ｌｉｎｃｏｆｆ、Ｃａｒｏｌ Ｎｅｈｒｉｎｇ、Ｔｈｅ Ａｕｄｕｂｏｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｆｉｅｌｄ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｕｓｈｒｏｏｍｓ、Ａｌｆｒｅｄ Ａ． Ｋｎｏｐｆ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８１）に記載がある。
【０００８】
ガリエララクトンは以下に記載される物理的及び化学的特性を有している。ガリエララクトンは、極性溶媒（メタノール、ピリジン、エチルアセテート、アセトニトリル、ｔ−ブチルメチルエーテル（ｔＢＭＥ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）及び水）に容易に溶解し、非極性溶媒（シクロヘキサン、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン）にほとんど溶解しない白色結晶を形成する。マススペクトル（表１）により先ず分子量１９４Ｄａ及び分子式Ｃ１１Ｈ１４Ｏ３を立証することができた。なお、下表１には、ＡＰＣＩ（正の極性、断片化装置電圧：７０Ｖ、気化器温度：４００°Ｃ）；ＣＩでのガリエララクトンのマススペクトルにおける相対度数を示している。
【０００９】
【表１】
2004501970.tif 000003
【００１０】
構造は二次元の等核及び異核ＮＭＲ分光分析法（１Ｈ及び１３Ｃ）により解明した。それぞれの核に対するＮＭＲシグナルの帰属を下表２に示す。ガリエララクトンの紫外線（ＵＶ）吸収スペクトルは２１９ｎｍで最大を示す。赤外線吸収スペクトルの特性ピーク及びその帰属を下表３に示す。なお、下表２において、重水素置換クロロホルム（ＣＤＣｌ３）中のガリエララクトンの１Ｈ（５００ＭＨｚ）（δ／ｐｐｍ；多重性）ＮＭＲ及び１３Ｃ（１２５ＭＨｚ）（δ／ｐｐｍ）ＮＭＲのデータを示し、クロロホルム／重水素置換クロロホルム（ＣＨＣｌ３／ＣＤＣｌ３）のシグナルを対照として用いた。また、下表３において、ガリエララクトンの赤外線吸収スペクトルにおける特性ピークの官能基に対する帰属を示す。
【００１１】
【表２】
2004501970.tif 000004
【００１２】
【表３】
2004501970.tif 000005
【００１３】
本発明はまた薬学的に活性なガリエララクトンの誘導体及びガリエララクトンに類似したその利用に関する。
【００１４】
１９３０年代、臓器系の変化に通じる炎症現象は最初に詳細に調査された。これにより、肺炎球菌で誘導された肺炎の急性期における患者血漿中のＣ−反応タンパク質（肺炎球菌のＣ多糖類と反応するためそう称される）の発見に導かれた。それ以来、炎症に伴う全身の変化は用語“急性期応答”にまとめられ、これは慢性の炎症現象に対しても適用される。
【００１５】
ある程度不定の差異が急性期応答の２つの様子の間にある：一方は、血漿中の多くのタンパク質、いわゆる急性期タンパク質（ＡＰタンパク質）の濃度変化を示し（表４）、他方は、行動及び一般的な生理状態に変化を生じる（表５）。後者は、もちろん、前者により生じる。もし炎症疾患の間に、血漿中濃度の少なくとも２５％が増加（ポジティブＡＰタンパク質）又は減少（ネガティブＡＰタンパク質）すると、そのタンパク質を定義によりＡＰタンパク質に包含する（例えば、Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １９８２， ３８９： ４０６−１８）。ＡＰタンパク質の濃度変化を主に肝臓における合成速度の変化が誘導する。なお、下表４には、ヒトＡＰタンパク質を示す（Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． １９９９， ３４０： ４４８−５４）。また、下表５には、急性期に生じる現象を示す。
【００１６】
【表４】
2004501970.tif 000006
【００１７】
【表５】
2004501970.tif 000007
【００１８】
個々のタンパク質の誘導レベルは幅広く変化する。例えば、セルロプラスミンの血漿中レベルはちょうど５０％増加するのに対して、Ｃ−反応タンパク質は１０００のファクタで増加する。
【００１９】
＜転写のシグナルトランスデューサ及び活性化因子３の阻害因子の薬学的効果及びＩＬ−６−依存遺伝子発現の薬学的効果＞
転写のシグナルトランスデューサ及び活性化因子３（Ｓｔａｔ３）は、プロモータ配列にクラスＩＩのＩＬ−６応答性要素（ＩＬ−６ＲＥ　ＩＩ、急性期応答性因子と同義、ＡＰＲＥ）（５’−ＴＴＮＮＮＮＡＡ−３’又は５’−ＴＴＮＮＮＮＮＡＡ−３’）を有する遺伝子の発現のコントロールに特別な役割を果たすと推測する。この程度までは、Ｓｔａｔ３は転写因子である。しかしながら、遺伝子発現のコントロールにおけるＳｔａｔ３の生理活性は、以下の調整の原則に従う：ＩＬ−６受容体及び２つのｇｐ１３０分子で構成される受容体複合体に対するＩＬ−６の結合はｇｐ１３０−関連キナーゼＪａｋ１、Ｊａｋ２及びＴｙｋ２の活性化の結果となる。これらは最初にｇｐ１３０の細胞質部位におけるチロシン残基をリン酸化し、従って、Ｓｔａｔ１及びＳｔａｔ３のＳＨ２ドメインのための結合部位となる。Ｓｔａｔが結合した後、特異的なチロシン残基でＪａｋによりリン酸化され、続いて同種２量体又は異種２量体を形成する。活性化した２量体は核心部に移動してＩＬ−６ＲＥ　ＩＩに結合し、続いて目標遺伝子の転写を誘導する。細胞核への移動中又は細胞の核中で、２量体はまた、まだ知られていないセリンキナーゼにより特異的なセリン残基がリン酸化する（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， １９９８， ３３４： ２９７−３１４）。
【００２０】
他の転写因子と比較してＳｔａｔ３の重要な特徴は、Ｓｔａｔ３が一次の転写因子であることである。一次の転写因子は既に細胞内に不活性な形態で存在しており、それらの効果を極めて速やかに発揮可能とするために適切な刺激により活性化する。一次の転写因子は、関連遺伝子の活性化、並びに、続く転写及び移動においてのみ形成されるものではない。
【００２１】
上述したｇｐ１３０−関連キナーゼＪａｋ１、Ｊａｋ２及びＴｙｋ２は他の細胞内のシグナル導入経路、そこから不必要な効果の結果となるため阻害されることのない経路、にも含有されるので、ｇｐ１３０−関連キナーゼはＳｔａｔ３−仲介遺伝子発現の選択的阻害のための適当な目標とは考えられない。対照に、ＤＮＡ結合部位（ＩＬ−６ＲＥ  ＩＩ、上述参照）に対するＳｔａｔ３の結合を選択的に妨げる化学的化合物は、Ｓｔａｔ３−及び従ってＩＬ−６−仲介の疾患過程を抑制するための薬剤として有用であると考えられる。
【００２２】
Ｓｔａｔ３は、第１に、プロモータ内にＳｔａｔ３結合配列（ＩＬ−６ＲＥ  ＩＩ）を有する遺伝子を含む全ての病態生理学過程を増進することができる。これらは炎症疾患、敗血症ショック、続発性アミロイドーシスのような変性疾患又は肝硬変のような他の慢性の炎症疾患における免疫学的合併症の重大な原因部分となる特異的な遺伝子である。表５はＳｔａｔ３活性が増加されるときに生じる変化を要約している。
【００２３】
急性期応答は、感染症、外傷、手術、火傷、臓器損傷及び悪性疾患の進行状態と関連して生じる。
【００２４】
急性期応答の主要な仲介物質はインターロイキン−６（ＩＬ−６）である。ＩＬ−６は更に多くの生理的過程に影響を及ぼす。言及されている例は、骨代謝、造血、免疫応答、炎症過程、神経細胞の発達、及び細胞増殖である。しかしながら、肝硬変の進展におけるＩＬ−６の役割は極めて重大で重要である（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １９９４， １０７： ７８９−９８）。肝硬変の患者では、ＩＬ−６の血漿中レベル及び臓器不全、並びに、抹消単球によるＩｇＡ及びＩｇＧの分泌の増加の間に正の相関関係があることが見出されている（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １９９２， １０３： １２９６−３０１； Ｊａｍａ １９９５； ２７４： ５８−６５）。更に、ＩＬ−６が肝臓におけるフィブリノゲンの発現を誘導することが示されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９６， ２７４： １３７９−８３）。これらの変化は、結果として肝硬変に通じる疾患のある肝臓の線維組織発達における中心部分と考えられる（Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ １９９８， ３： ２０２−１３）。
【００２５】
本発明のガリエララクトンによる効果はＩＬ−６シグナル誘導の特異的な阻害に基づいている。ガリエララクトンは、それ故、炎症過程及びそれらの余病の予防及び／又は治療のために一般的に適している。
【００２６】
Ｓｔａｔ３は細胞増殖の調整、細胞の生存及び細胞分化における基本的因子でもある（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０００， １９： ２５４８−２５５６）。例えばラット腫瘍及びヒト前立腺腫瘍において、Ｓｔａｔ３が本質的に活性化されること及びこの活性化が腫瘍の悪性潜在性と相関していることを示すことができる（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０００， ６０： １２２５−１２２８）。Ｓｔａｔ３の阻害は前立腺腫瘍細胞の増殖を著しく阻害する。これらの結果は、Ｓｔａｔ３の活性化が前立腺腫瘍細胞の増殖のための基本であること及びその阻害は前立腺腫瘍を治療するための治療学的な大きな潜在性を有していることを示す。
【００２７】
Ｓｔａｔ３の活性化の重要性は他のタイプの腫瘍、例えば頭部及び頸部癌の用語に要約される腫瘍、胸部癌及び子宮癌（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０００， １７： ２３−２８）、及びメラノーマ（皮膚癌）、卵巣上の腫瘍、グリオーマ（脳腫瘍）及び肺腫瘍（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｔｏｄａｙ １９９９， ５： ４０６−４１２）についても記載されている。
【００２８】
急性期応答の仲介物質としてよく記載される機能以外に、ＩＬ−６は神経系における細胞機能の重要な調整物としても記載されている。いくつかの研究に、ＩＬ−６は中枢神経系（ＣＮＳ）における生理学的及び病態生理学的過程の両者に含まれることが示されている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９７， １５： ３０７−３３９）。
【００２９】
成人のＣＮＳ（実質組織及び脳脊髄液）において、ＩＬ−６レベルは低いか又は検出限界以下である。しかしながら、ＩＬ−６レベルの重要な増加は、ＣＮＳ損傷、炎症及び疾患の一般的な特徴として生じる。増加したＩＬ−６レベルは、例えば、多発性硬化症の動物モデル（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９０， ２０： ２３３−２３５）及び多発性硬化症の患者（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １９９３， ５： ５８３−５８８）における脳ホモジェネート又は脳脊髄液、パーキンソン病の動物モデル（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １９９９， ２６： ６８０−６８３）及びパーキンソン病の患者（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １９９９， ８０： １３５−１３９）、アルツハイマー病で苦難する患者（Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ １９９５， ８９： ５４４−５５１）、神経症の痛みのある動物モデル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９８， ６２： ２２８−２３５）、及びＣＮＳ感染症の種々のタイプ（例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９８， ７１： ３２０−３２３）において見出されている。これらの状況下におけるＩＬ−６の主要な発生源は星状神経膠細胞、小グリア細胞、ニューロン及び、あるケースでは移動する免疫細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １９９２， ２６３： Ｃ１−Ｃ１６）であると思われる。
【００３０】
ＩＬ−６のＣＮＳでの効果については、保護機能であるに違いないと推測されるけれども、あまり知られてはいない。この理論は、ＣＮＳにおける種々のタイプの細胞に対するＩＬ−６の生存及び分化の増進効果を示している生体外の観測から基本的に派生する。ＣＮＳにおけるＩＬ−６発現を伴う遺伝子変異動物の研究は、しかしながら、ＩＬ−６産出の調整異常が多くのＣＮＳ疾患の神経病理学及び病態生理学に対して寄与することを示唆する。２つの異なる研究法をＣＮＳにおけるＩＬ−６の過剰発現のために選択的に採用する：ラットニューロン特異性エノラーゼ（ＮＳＥ−ＩＬ６マウス）のプロモータのコントロール下におけるＣＮＳニューロンでのヒトＩＬ−６の発現（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １９９５， ７： ２４４２−２４４９）及びマウスＧＦＡＰプロモータ（ＧＦＡＰ−ＩＬ６マウス）のコントロール下における星状神経膠細胞でのマウスＩＬ−６の発現（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ＵＳＡ １９９３， ９０： １００６１−１００６５）。ＮＳＥ−ＩＬ６モデルでは、反応性グリオーシスは脳全体に見られたが、これはニューロンの細胞群、ＣＮＳ血管系又は行動変化の一般的な病理学と関連していなかった。これとは対照的に、厳格なニューロン又は血管の病理学、更に反応性の神経膠症の過程は、ＧＦＡＰ−ＩＬ６マウスについて記載されている。従って、ＧＦＡＰ−ＩＬ６マウスは、神経変性疾患、脳における炎症過程、脳血液関門の機能の障害及び脳波計による活性の変化の明確な兆候を示す。これらの変化は、著しい学習の不足、並びに、障害のある運動神経の調整、運動失調症及び震えのような多くの運動神経の障害と関連している。
【００３１】
ガリエララクトンは以下の予防及び治療に特に適している。すなわち、
・  肝臓及びその他の臓器の線維症疾患、
・  例えば、卒中、脳又は脊髄に対する外傷性損傷及びそれらの余病のような脳    血管障害、
・  例えば、多発性硬化症、末梢自己免疫神経症のようなＣＮＳ又はＰＮＳに影    響する自己免疫疾患、
・  例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病のような慢性の神経変性疾患、
・  例えば、抑鬱症、不安症、精神病のような精神障害、
・  例えば、糖尿病性の神経症のような原因が変化する末梢神経症、
・  中枢及び末梢の両者の病態生理学機構により引き起こされる痛み、
・  冠状動脈疾患、動脈硬化症及び再狭窄症のような心臓血管障害、
・  クローン病（限局性腸炎）のような消化器系の炎症疾患、
・  慢性関節リウマチのようなアミロイドーシス及び
・  頭部及び頸部癌、胸部癌、子宮癌、並びに、前立腺癌及びメラノーマ、卵巣
腫瘍、グリオーマ、肺カルシノーマ、及び悪液質−誘導腫瘍のようなＳｔａ
ｔ３−依存腫瘍。
【００３２】
本発明は、他に不活性で、非毒性の、薬学的に適した賦形剤及び担体を含みガリエララクトンを含む薬剤の調製物又はガリエララクトンから構成される薬剤の調製物、並びに、これらの調製物を製造するための方法も包含する。
【００３３】
ガリエララクトンはこれらの調製物中に重量で最終混合物の０．１乃至９９．５％の濃度で存在し、好ましくは重量で０．５乃至９５％である。
【００３４】
ガリエララクトン以外に、薬剤の調製物は薬学的に活性な物質を含有してもよい。
【００３５】
上述した薬剤の調製物は、例えば賦形剤又は担体と共に、既知の方法により従来のように製造することができる。
【００３６】
ガリエララクトンは、体重に対して全量約０．０１乃至１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは全量約１ｍｇ／ｋｇ乃至５０ｍｇ／ｋｇが２４時間ごとに、個々の投与量に適した形状で、所望の結果を得るために通常に投与される。
【００３７】
しかしながら、治療される患者の特質及び体重、個々の薬剤に対する反応、疾患の特質及び厳しさ、調製物及び投与のタイプ、及び時間又は投与間隔に特に依存して、一定量から適切に離れることが有益である。
【００３８】
効果は以下の実施例により例示されるが、実施例からいずれの制限も推定されるものではない。
【００３９】
【実施例】
（実施例Ａ）
＜ヒト肝臓カルシノーマ細胞におけるＩＬ−６−仲介遺伝子発現の阻害＞
以下のバイオアッセイは、ＩＬ−６−及びＳｔａｔ３−仲介遺伝子発現の阻害を検出するための基本的な典型的な実験について行った。
【００４０】
用いた初期ベクタは、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の遺伝子をレポータ遺伝子として含有するベクタｐＴＫ／ＳＥＡＰ（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １９９６， ２２６： ２１４−２１）である（図１参照）。このベクタは制限酵素ＮｈｅＩで線形化され、脱リン酸化されている。Ｓｔａｔ３及びＳｔａｔ１タンパク質の結合部位を含有する下式（２）のオリゴヌクレオチドがリン酸化され、つなげられエタノールで沈殿された。特徴的なコンカテマのはしごはポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により確認された。
【００４１】
【化２】
2004501970.tif 000008
【００４２】
線形化されたベクタはコンカテマにつなげられた。上述したＳｔａｔ３／１の識別配列を有するオリゴヌクレオチドの８連続して挿入されたコピーを含有するベクタが選択された（図２参照）。これは、Ｓｔａｔ３／１結合部位により調整される方法で製造された再構成プラスミドにおけるＳＥＡＰ発現の結果となる。この発現した構造物は、ＤＮＡ配列が分析され、ヒト肝臓カルシノーマ細胞株ＨｅｐＧ２（米国、メリーランド州２０８５２、ロックビルの１２３０１パークレーンドライブのアメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， １２３０１ Ｐａｒｋｌａｎｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２， ＵＳＡ））にトランスフェクトされた。
【００４３】
（評価方法）
ＨｅｐＧ２細胞は、５％炭酸ガスを含む湿度のある大気中３７°Ｃで、１０％胎児牛血清及びペニシリン／ストレプトマイシン（１００ｉｕ）を添加した５０ｍｌのＤＭＥＭ（エッゲンシュタインのディーゼルシュトラーセ、５、７６３４４、ギブコ  ベーアールエル、ライフ  テヒノロジ  ゲーエムベーハー社（Ｇｉｂｃｏ， ＢＲＬ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ， Ｄｉｅｓｅｌｓｔｒ． ５， ７６３４４ Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ））中で、６００ｍｌの細胞培養ボトル内で培養された。培養液は実験開始の２４時間前に交換された。実験当日、細胞はトリプシン処理により脱着され、１０００×ｇ、４°Ｃで遠心分離された。上澄み液はデカンテーションされ、細胞ペレットは０．２ｍｌの冷却したＨｅｂｓ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、０．７ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、６ｍＭのデキストロース、ｐＨ７．０５）に再懸濁された。細胞数は計数チャンバを用いて決定され、６−８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整された。
【００４４】
プラスミドＤＮＡの部分１００μｇは、滅菌したエレクトロポレーションの容器（電極スペース０．４ｃｍ）に入れられ、４００μｌの細胞懸濁液がそれぞれの容器に加えられ十分に混合された。この混合物は氷上で１０分間前培養された。エレクトロポレーションは２００ボルト及び９６０μＦで時定数４０−６０ｍｓ（ミュンヘン、バイオラッド社のジーン　パルサＴＭ（Ｇｅｎｅ ＰｕｌｓｅｒＴＭ， ＢｉｏＲＡＤ， Ｍｕｎｉｃｈ））で行われた。室温で１０分間培養した後、細胞は１０％胎児牛血清及びペニシリン／ストレプトマイシン（１００ｉｕ）を添加した２１ｍｌの最適ＭＥＭ培養液（Ｇｉｂｃｏ， ＢＲＬ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ， Ｄｉｅｓｅｌｓｔｒ． ５， ７６３４４ Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ）中に懸濁され、２００μｌの細胞懸濁液がピペットで９６ウェルのマイクロタイタープレートのそれぞれのウェルに入れられた。
【００４５】
細胞はエレクトロポレーション後２４時間培養された。１０％胎児牛血清及びペニシリン／ストレプトマイシン（１００ｉｕ）を添加した最適ＭＥＭ培養液は、０．５％胎児牛血清及びペニシリン／ストレプトマイシン（１００ｉｕ）を添加した最適ＭＥＭ培養液に交換された。テスト化合物は、予め後者にそれぞれの濃度で入れられた。更に、ＩＬ−６（最終濃度：１０ｎｇ／ｍｌ）はインデューサとしてそれぞれの混合物に添加された。刺激された及び刺激されない混合物はコントロールとして用いられた。
【００４６】
細胞に対する混合物の細胞毒性効果は２４時間後に顕微鏡により調査された。更に２４時間後、ＳＥＡＰ活性はホスファ−ライトＴＭ（Ｐｈｏｓｐｈａ−ＬｉｇｈｔＴＭ）（ランゲンのパーキン−エルマ  アプライド  バイオシステムズ社（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｌａｎｇｅｎ））を用いて、選定した条件下で分析された試料におけるＳＥＡＰ濃度に直接比例する化学発光評価法で決定された。化学発光は９６ウェルのマイクロタイタープレートで光度計（フランクフルト／エム、ラブシステムズからのラブシステムズ  ルミノスカン  ＲＴ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ ＲＴ ｆｒｏｍ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ／Ｍ））を用いて測定された。
【００４７】
例えば、ＩＬ−６で誘導後、ＳＥＡＰ合成の最大値の半分を阻害する式（１）の化合物（ガリエララクトン）の濃度（ＩＣ５０）は５０−１００ｎＭである。この化合物は従って、ＩＬ−６−誘導及びＳｔａｔ３−仲介ＳＥＡＰ合成の強力な阻害剤と考えられる。
【００４８】
（実施例Ｂ）
＜Ｓｔａｔ３のチロシン−７０５及びセリン−７２７リン酸化、並びに、Ｓｔａｔ１のチロシン−７０１リン酸化に対する効果＞
ＩＬ−６−依存の細胞内シグナル導入における重要なステップは、Ｓｔａｔ３のチロシン−７０５及びＳｔａｔ１のチロシン−７０１のリン酸化である。このリン酸化の阻害はＩＬ−６−依存のシグナルカスケードを中断し、そうでなければ見ることのできるＩＬ−６−誘導の目標遺伝子の発現は生じない。しかしながら、Ｓｔａｔ３及びＳｔａｔ１リン酸化を阻害する阻害剤は他のシグナルカスケードに重要な効果も有しており、それ故、製薬上利用可能なＩＬ−６−依存の遺伝子発現の阻害剤は、薬理学効果を示す濃度範囲で、Ｓｔａｔ３又はＳｔａｔ１リン酸化にほんのわずかに影響するか又は少しも影響するべきではない。
【００４９】
この理由から、Ｓｔａｔ３及びＳｔａｔ１のＩＬ−６−誘導リン酸化の阻害の更なる例示のために、以下のバイオアッセイが行われた。
【００５０】
この実験の方法は以下の通りである：
ＨｅｐＧ２細胞をシャーレ（直径：１０ｃｍ）にまく（１０％胎児牛血清及びペニシリン／ストレプトマイシン（１００ｉｕ）を添加した最適ＭＥＭ培養液で細胞密度：５×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌ）。５％炭酸ガスを含む湿度のある大気中３７°Ｃで２４時間培養する。培養液を、０．５％胎児牛血清及びペニシリン／ストレプトマイシン（１００ｉｕ）を添加した新鮮な最適ＭＥＭ培養液に交換し更に４８時間培養する。培養液を、０．５％胎児牛血清及びペニシリン／ストレプトマイシン（１００ｉｕ）を添加した新鮮な最適ＭＥＭ培養液に交換し、種々の濃度のテスト物質を添加し、６０分間培養する。エタノールに溶解された物質の５μｌ、又はエタノールのみ（コントロール）、を混合液（１０ｍｌ）に対して添加した。ＩＬ−６を添加する（最終濃度５０ｎｇ／ｍｌ）ことにより細胞を誘導する。
【００５１】
２０分後、培養液を除去し細胞層を氷冷したＰＢＳ（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、８．１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４）それぞれ１．５ｍｌで２回洗浄する。抽出緩衝液（１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＥＧＴＡ、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１：５０の完全なプロテアーゼ阻害剤混合物（ドイツ国、６８３０５マンハイムのサンドホーファ　シュトラーセ　１１６のロッシュ　ディアグノスティクス　ゲーエムベーハー社、ロッシュ　モレキュラ　バイオケミカルス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ， Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｓａｎｄｈｏｆｅｒ Ｓｔｒ， １１６， ６８３０５ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、ｐＨ７．５））１．５ｍｌを添加し、細胞スクレーパで細胞を剥がし１０ｍｌの遠心分離チューブに移す。シャーレを抽出緩衝液１．５ｍｌで洗浄し、得られた懸濁液のポイント７と混合する。懸濁液を４°Ｃ、３０分間（３０００×ｇ）でペレットにする。上澄み液を新しい遠心分離チューブに移す。プロテインＡ−セファロース（ＰＢＳ中５０：５０）の９０μｌを添加し４°Ｃ、２時間エンド−オーバ−エンドで回転する。懸濁液を４°Ｃ、５分間（３０００×ｇ）でペレットにする。上澄み液を新しい遠心分離チューブに移す。Ｓｔａｔ３抗体の５μｌを添加し４°Ｃ、一晩エンド−オーバ−エンドで回転する。プロテインＡ−セファロース（ＰＢＳ中５０：５０）の９０μｌを添加し４°Ｃ、２時間エンド−オーバ−エンドで回転する。懸濁液を４°Ｃ、５分間（３０００×ｇ）でペレットにする。上澄み液を捨てる。ペレットを洗浄緩衝液１（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．２％のＮＰ−４０、ｐＨ７．５）で２回、洗浄緩衝液２（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．２％のＮＰ−４０、ｐＨ７．５）で１回、及び、洗浄緩衝液３（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で１回洗浄する。懸濁液を４°Ｃ、１０分間（３０００×ｇ）でペレットにし、上澄み液を慎重に除去する。洗浄緩衝液３の８０μｌ及びＳＤＳゲル緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのジチオスレイトール、２％のＳＤＳ、０．１％のブロモフェノールブルー、１０％のグリセロール）の４０μｌをペレットに添加した後、後者はウォーターバスで５分間煮沸する。懸濁液を４°Ｃ、１分間（１００００×ｇ）でペレットにする。
【００５２】
上澄み液の２０μｌは５％のスタッキングゲルを有する６．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（１６×１８ｃｍ）の電気泳動（７°Ｃ、１０Ｖ／ｃｍ、２５ｍＭのＴｒｉｓ、２５０ｍＭのグリシン、０．１％のＳＤＳ、ｐＨ８．３）で分画される。電気泳動の終了後、ゲルは電気泳動緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ、１９２ｍＭのグリシン、２０％のメタノール、ｐＨ８．３）で平衡化された。タンパク質はエレクトロブロッタ（ミュンヘン、バイオラッド社のトランス−ブロットＳＤ（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ ＳＤ、ＢｉｏＲａｄ、Ｍｕｎｉｃｈ））を用いて２５Ｖで織物により強化されたニトロセルロース膜（ダーゼルのシュライヒェル＆シュル社、オプチトラン（Ｏｐｔｉｔｒａｎ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｌｌ、Ｄａｓｓｅｌ））上に移動された。
【００５３】
それぞれの抗体を適用する前に、膜はブロッキング緩衝液Ｉ（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、５％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳、０．１％のＴｗｅｅｎ２０）内４°Ｃで一晩培養された。リン酸−Ｓｔａｔ３の一次抗体はブロッキング緩衝液  ＩＩ（２５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、５％（ｗ／ｖ）の牛血清アルブミン、０．１％のＴｗｅｅｎ２０）で１：２５００に希釈され、膜と共に４°Ｃで一晩培養された。二次抗体の方法は、この場合にブロッキング緩衝液Ｉを用いる以外は同様にされた。抗体を適用している間に、洗浄が洗浄緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０）で２０分間の数回行われた。タンパク質を見えるようにするために選定された二次抗体は西洋わさび由来ペルオキシダーゼとの結合体とされた。検出はこの場合には化学発光法により製造者の情報（米国、ビバリのニュー  イングランド  バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＵＳＡ））に従い行われた。
【００５４】
式（１）の化合物（ガリエララクトン）はＳｔａｔ３又はＳｔａｔ１のリン酸化に対して、テストしたいずれの濃度（１６μｇ／ｍｌまで、１６５μＭと等価）でも何の効果も有していなかった。
【００５５】
図３はＳｔａｔ３のチロシンリン酸化に対するガリエララクトンの効果を示している。チロシンリン酸化はリン酸−Ｓｔａｔ３（Ｔｙｒ７０５）抗体を用いて検出した（上の列）。同じブロットを細長く切り出しＳｔａｔ３抗体（より低い列）で処理した。
【００５６】
図４はＳｔａｔ３のセリンリン酸化に対するガリエララクトンの効果を示している。セリンリン酸化はリン酸−Ｓｔａｔ３（Ｓｅｒ７２７）抗体を用いて検出した（上の列）。同じブロットを細長く切り出しＳｔａｔ３抗体（より低い列）で処理した。
【００５７】
図５はＳｔａｔ１のチロシンリン酸化に対するガリエララクトンの効果を示している。チロシンリン酸化はリン酸−Ｓｔａｔ１（Ｔｙｒ７０１）抗体を用いて検出した（上の列）。同じブロックを細長く切り出しＳｔａｔ１抗体（より低い列）で処理した。
【００５８】
（実施例Ｃ）
＜活性化、すなわちチロシン７０５−リン酸化したＳｔａｔ３の２量体のＤＮＡ結合に対する効果＞
活性化したＳｔａｔ３の２量体の、目標遺伝子のプロモータにおける結合部位に対するＤＮＡ結合は、これらの遺伝子の転写活性化のための基本的な必要条件である。同時に、このステップはＳｔａｔ３に特異的であり、すなわちこのステップの阻害は、他のシグナルカスケードに同時に影響することなく、ＩＬ−６−誘導及びＳｔａｔ３−仲介の目標遺伝子発現を特異的に阻害する結果となる。リン酸化され活性化されたＳｔａｔ３の２量体のＤＮＡ結合能力に対する種々の化合物の効果を、電気泳動の移動シフト評価（ＥＭＳＡｓ、ゲルシフト評価）を行うことにより分析した。
【００５９】
（評価方法）
方法は、Ｎａｔｕｒｅ、１９９３、３６２：７９−８３及びＭｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９８、１８：２１０８−１７に記載されているようにした。用いたＤＮＡプローブはｍ６７ＳＩＥ識別配列（Ｓ２）（ワイルド−タイプ）を有する３２Ｐ−ラベルした下式（３）の２重鎖オリゴヌクレオチドである（ＥＭＢＯ Ｊ．， １９９５， １４： １４２１−９）。
【００６０】
【化３】
2004501970.tif 000009
【００６１】
式（１）の化合物（ガリエララクトン）は例えば１６ｎｇ／ｍｌ（８２ｎＭ）の濃度でも識別配列に対する活性化Ｓｔａｔ３の２量体の結合を完全に阻害する。それがｍ６７ＳＩＥプローブに結合するチロシン７０５残基をリン酸化したＳｔａｔ３であることは、リン酸−Ｓｔａｔ３（チロシン７０５）−特異的抗体で前培養され誘導されたコントロールの混合物で示すことが可能である（図６参照）。
【００６２】
図６における意味は以下の通りである：
−　Ｃｏｍｐ．（１００×）：未ラベルのプローブが１００倍過剰に添加された　　コントロールの混合物。
−　ｏ．Ｐ．：細胞抽出液が添加されていない混合物。
−　ｐ−Ｓｔａｔ３−Ａｂ：リン酸−Ｓｔａｔ３（チロシン７０５）−特異的抗
体の１μｇが添加された混合物。
−　Ｓｔａｔ３−Ａｂ：Ｓｔａｔ３抗体の１μｇが添加された混合物。
【００６３】
（実施例Ｄ）
＜慢性的なインターロイキン−６治療後の中枢神経系の一次ニューロンに対するＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸エステル−仲介カルシウム流入の阻害＞
一次ニューロンの培養は、ベー．エンゲルセン及びアール．ビェルクヴィーク（Ｂ．Ｅｎｇｅｌｓｅｎ ａｎｄ Ｒ．Ｂｊｅｒｋｖｉｇ）［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（Ｅｄｉｔｏｒ） Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７， ２７７−２７９］により開示されたようにして６乃至８日齢ラットの小脳から得られた。組織を除去した後、単細胞はパパインを用いて得られ、１ウェル当たり２０００００細胞の密度でポリ−Ｄ−リジンでコートされたマイクロタイタープレート（９６ウェル）にまかれた。細胞は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％の熱不活性化した馬血清、２５ｍＭのＫＣｌ、３０ｍＭのグルコース、２ｍＭのグルタミンで構成される増殖用培養液で培養された。グリア細胞の数を最小にするために、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（２０μｇ／ｍｌ）が、培養１日目及び４日目に添加された。このようにして得られた培養は９５％以上のニューロンで構成された。
【００６４】
ヒト再構成インターロイキン−６（ＩＬ−６）は生理食塩液（ハンクス  バランスド  塩溶液（Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ））に溶解され、培養開始後１、４、７及び１１日目にニューロン培養に添加された（最終濃度５ｎｇ／ｍｌ）。それぞれのＩＬ−６添加の１０分前に細胞はガリエララクトンで処理された（最終濃度１μＭ）。
【００６５】
培養開始後１２日目、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸エステル（ＮＭＤＡ）−誘導された細胞内カルシウムレベルの変化は蛍光プレートリーダ（アセント  フルオロスキャン（Ａｓｃｅｎｔ Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ））を用いて測定した。これのため、細胞に０．００３％のプルロニック酸の存在するフルオ−３アセトメチルエステル５．５μＭを生理食塩液中３７°Ｃで６０分間負荷した。培養用培養液を除去し、新鮮な塩溶液に交換した。細胞をグリシン（最終濃度５μＭ）の存在するＮＭＤＡ（最終濃度２００μＭ）添加により刺激し、蛍光光度は１５秒間隔で１分間以上測定した（励起４８５ｎｍ、放射５３０ｎｍ）。細胞内カルシウム濃度は、［Ｃａ２＋］ｉ＝Ｋｄ・（Ｆ−Ｆｍｉｎ）／（Ｆｍａｘ−Ｆ）の式により算出した。ここで、Ｋｄは室温でのフルオ−３の解離定数（４５０ｎＭ）を示し、Ｆは測定した蛍光光度を示し、Ｆｍａｘは２０μＭのイオノマイシンの添加により決定される最大の蛍光光度を示し、Ｆｍｉｎはフルオ−３を負荷していない細胞で測定される最小の蛍光光度を示す。
【００６６】
算術平均は全４回の測定で得られた細胞内カルシウム濃度から求め、刺激していないコントロール（基礎カルシウム濃度）からの変化の百分率を算出した。
【００６７】
ラット小脳の一次ニューロンのガリエララクトン又はＩＬ−６による慢性的な治療は、基礎カルシウムレベルに対して効果を示さなかった（図７、左から１番目及び２番目）。ＮＭＤＡの添加は、１分間の測定時間の間における平均細胞内カルシウム濃度の基礎レベルに対する約１５０％の増加となり、ガリエララクトンの慢性的な投与の後多少減少した（図７、左から３番目及び４番目）。未処理の培養と比較して、ＮＭＤＡ−仲介細胞内カルシウムの応答は、ＩＬ−６で慢性的に処理された培養において示唆的に強化された（図７、右から２番目）。ガリエララクトンの添加は、ＩＬ−６−誘導のＮＭＤＡ−仲介されたカルシウム流入に対する強化を完全に阻害した（図７、右から１番目）。
【００６８】
（実施例Ｅ）
＜ラットにおける６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨ−ＤＡ）損傷＞
ドーパミン作用性の黒質線状体及び線条横紋の神経伝達の変性疾患はパーキンソン病の主要な特性を表す。パーキンソン病の臨床像は、大脳内に神経毒の６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨ−ＤＡ）注射を受けたラットの動物モデルにおいてかなりの程度でシミュレートすることができる。
【００６９】
記載した実験のために、雄ラット（ドイツ国、ハルラン　ヴィンケルマン社（Ｈａｒｌａｎ Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、実験開始の体重；２００乃至２５０ｇ）が用いられた。実験動物はコントロールされた条件下（湿度、温度）、１２時間の投光／暗闇のサイクルで飼育された。動物は、実験を行わないときには自由に水及び飼料を摂取可能とされた。以下に記載された実験方法は、関係政府機関により承認され監視された。
【００７０】
動物には、手術の当日、損傷の３０分前に、６−ヒドロキシドーパミンの代謝を抑制するため及び６−ヒドロキシドーパミンのノルアドレナリン性機構への取り込みを避けるために、パルギリン（米国、ミズーリ州セントルイスのシグマ社；５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）及びデスメチルイミプラミン塩酸（シグマ社；２５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を与えた。ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した後、実験動物は定位のフレームに固定した。黒質線状体の神経伝達の損傷を、０．０１％強度のアスコルビン酸／塩溶液の４μｌに溶解した８μｇの６−ＯＨ−ＤＡ・ＨＢｒ（米国ミズーリ州のシグマ社）の１回の注射により引き起こした。溶液は１μｌ／ｍｉｎでゆっくり注入した。ケーニッヒ及びクリッペル注射位置を：前後２．４ｍｍ、側面１．４９ｍｍ、腹部−２．７ｍｍとした。注射後、注射針は神経毒の拡散を促進するためにそのまま５分間残した。
【００７１】
手術後、動物は暖かいプレート上におき、モニタしながら覚醒したら、ケージに戻し飼料及び水を自由に摂取させた。
【００７２】
行動テストは、最大ダメージ発生後、神経毒注射３週間後に行われた。活性物質のグループでは、動物は手術後１日から手術後２８日の実験終了まで活性物質で治療された。
【００７３】
損傷後の運動神経の欠乏は、文献（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １９９５， ６７： ８３７−８４８）に記載されているようにはしごテスト（前足協調テスト）により計測した。結果を図８に示す。ガリエララクトンは、１．０及び３．０ｍｇ／ｋｇ、ｂｉｄ、ｉ．ｐ．の投与後、前足の繊細な運動神経のコントロールを改善した（図８、“＊＊＊”を付した２つのバー）。
【００７４】
（実施例Ｆ）
＜腫瘍細胞株に対する細胞毒性を決定するための増殖阻害テスト＞
ヒト結腸細胞株ＳＷ４８０及びＨＴ２９（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２２８及びＨＢＴ−３８）、マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６Ｆ１０、並びに、ヒト前立腺腫瘍細胞株ＬＮＣａＰ−ＦＧＣ、ＰＣ−３及びＤＵ１４５（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１０９９５、ＣＲＬ−１４３５、ＨＴＢ−８１）は、１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培養液でルーシャーレで増殖された。これは次にトリプシン処理され１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩに細胞数５００００ｃｅｌｌｓ／ｍｌで採取された。１ウェル当たり１００μｌの細胞懸濁液が９６−マイクロウェルのプレートに入れられ、炭酸ガスインキュベータ内３７°Ｃで１日間培養された。更に１００μｌのＲＰＭＩ培養液及びガリエララクトンを添加したＤＭＳＯの１μｌが添加された。増殖は６日後にモニタされた。この目的ため、初期濃度５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ水溶液（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−ｙｌ）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム・臭化物）４０μｌが各マイクロウェルに添加された。培養は炭酸ガスインキュベータ内３７°Ｃで５時間行われた。培養液は分離除去され、１ウェル当たり１００μｌのｉ−プロパノールが添加された。１００μｌの水で３０分間振動後、死滅がタイターテック  マルチスキャン  ＭＣＣ／３４０（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＭＣＣ／３４０）（フロー法（ｆｌｏｗ））を用いて５４０ｎｍで測定された。
【００７５】
種々の腫瘍細胞株に対する細胞毒性効果は、下表６にＩＣ５０（μＭのガリエララクトン濃度）として示される：
【００７６】
【表６】
2004501970.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【図１】
用いた制限酵素による開裂部位を伴う開始ベクタｐＴＫ／ＳＥＡＰのベクタマップ、及び単一の開裂部位の選択を示す。分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、チミジンキナーゼプロモータ（ＴＫＰｒｏ）、ＳＶ４０ウィルスのｍＲＮＡポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０ｐｏｌｙ（Ａ））、ｐＵＣプラスミドファミリからの複製の起源（ｏｒｉ）、多重クローニング部位（ＭＣＳ）及びファージｆｌの複製の一本鎖起源（ｆｌ）の遺伝子も示す。
【図２】
単一の開裂部位の選択を伴うｐＭＷ−ＩＲＦ７のベクタマップを示す。
【図３】
Ｓｔａｔ３のチロシンリン酸化におけるガリエララクトンの効果を示す。チロシンリン酸化はリン酸−Ｓｔａｔ３（Ｔｙｒ７０５）抗体（上の列）を用いて検出した。同じブロットを細長く切り出しＳｔａｔ３抗体（より低い列）で処理した。
【図４】
Ｓｔａｔ３のセリンリン酸化におけるガリエララクトンの効果を示す。セリンリン酸化はリン酸−Ｓｔａｔ３（Ｓｅｒ７２７）抗体を用いて検出した（上の列）。同じブロットを細長く切り出しＳｔａｔ３抗体（より低い列）で処理した。
【図５】
Ｓｔａｔ１のチロシンリン酸化に対するガリエララクトンの効果を示す。チロシンリン酸化はリン酸−Ｓｔａｔ１（Ｔｙｒ７０１）抗体を用いて検出した（上の列）。同じブロットを細長く切り出しＳｔａｔ１抗体（より低い列）で処理した。
【図６】
ＤＮＡ識別配列への活性化したＳｔａｔ３の２量体の結合に対するガリエララクトンの効果を示す。用いたプローブ：ｍ６７ＳＩＥ；誘導時間２０分；細胞株：ＨｅｐＧ２。
【図７】
慢性的なＩＬ−６の投与により誘導された、ラット小脳の一次ニューロンにおけるＮＭＤＡ−仲介カルシウム流入の強化に対するガリエララクトンによる阻害を示す。ＩＬ−６の存在下で培養された小脳ニューロンをガリエララクトンで処理し、ＮＭＤＡ−誘導された細胞内カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）の変化は蛍光定量法で決定した。１分間の測定時間の間の平均カルシウム濃度を算出し、基礎細胞内カルシウム濃度に対する百分率として表した。データは６回繰り返して行われた実験の代表から得た。バーの下の“＋”はニューロンが右側に示した物質でそれぞれ処理されたことを意味する；“−”は処理されていないことを示す。ＳＥＭは平均の標準誤差である。
【図８】
ガリエララクトンは、一方的な６−ヒドロキシドーパミンによる黒質の損傷後４週の前足の繊細な運動神経のコントロールを示唆的に改善する。ガリエララクトンは手術後１日目から１日に２回（ｂｉｄ）腹腔内（ｉ．ｐ．）に投与（１、３及び１０ｍｇ／ｋｇの投与量）した。繊細な運動神経のコントロールははしごテストで定量した。見せかけの手術をした動物（ｓｈａｍグループ；適当な外科的な干渉をし、６−ヒドロキシドーパミンを投与していない動物）では提供した飼料片の収集における平均成功割合は１００％と等しかった。他の全ての値は相応して計算した。データは、１グループ当たりｎ＝１２の動物で行った実験から得た。ＳＥＭは平均の標準誤差である。
＊＊＊：０．１％以下の誤差の確率で統計的に有意（ｐ＜０．００１）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
2004501970.tif 000013
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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