(57)【要約】本発明は、ガングリオシドおよび他の糖脂質の実用的なインビトロ合成のための方法を提供する。この合成法は典型的には、酵素的合成、または酵素的および化学合成の組み合わせを含む。ひとつ以上の酵素的工程が好ましくは、有機溶媒の存在下で実施される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコシル化スフィンゴイド（ｓｐｈｉｎｇｏｉｄ）を酵素的に合成する方法であって、該方法は以下：
スフィンゴイドと、以下のａ）〜ｃ）を含むグリコシルトランスフェラーゼ反応混合物：
ａ）１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼ、
ｂ）各グリコシルトランスフェラーゼに対応するヌクレオチド糖、および
ｃ）グリコシルトランスフェラーゼ活性のために必要な他の反応物質；
とを、該糖（単数または複数）をヌクレオチド糖から該スフィンゴイドに転移させるのに十分な時間および適切な条件下で接触させて、該グリコシル化スフィンゴイドを形成する、工程を包含する方法であって；
ここで該方法は、以下からなる群から選択される少なくとも一つの効率を高める工程：
該グリコシルトランスフェラーゼ反応混合物と接触させる前に、該スフィンゴイドから脂肪酸を除去する工程；
該グリコシルトランスフェラーゼ反応混合物中に有機溶媒を含む工程；および
グリコシルトランスフェラーゼサイクルを使用して該ヌクレオチド糖を生成する工程、を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、該方法が、前記グリコシル化スフィンゴイドと、以下のａ）〜ｃ）を含む少なくとも１個の第二のグリコシルトランスフェラーゼ反応混合物：
ａ）１つ以上の追加のグリコシルトランスフェラーゼ、
ｂ）該追加のグリコシルトランスフェラーゼに対応するヌクレオチド糖、および
ｃ）該追加のグリコシルトランスフェラーゼ活性のために必要な他の反応物質；
とを十分な時間および適切な条件下で接触させて、前記糖を前記ヌクレオチド糖から前記グリコシル化スフィンゴイドに転移させる、工程を包含する、方法。
【請求項３】
前記方法が、少なくとも二つの前記効率を高める工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記グリコシルトランスフェラーゼがβ１，４ガラクトサミニルトランスフェラーゼであり、そして前記ヌクレオチド糖がＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記グリコシルトランスフェラーゼがシアリルトランスフェラーゼであり、前記ヌクレオチド糖がシアル酸またはシアル酸のアナログを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記スフィンゴイドが以下の式Ｉ
【化１】
2004512802.tif 000010
を有する化合物を含有する、請求項１に記載の方法：
ここで、Ｒ１は、Ｈ、Ｇｌｃβ１−、Ｇａｌβ１−およびラクトースβ１−からなる群から選択され；
Ｒ２は、ＣＨ２および
【化２】
2004512802.tif 000011
からなる群から選択され；
Ｒ３は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、
【化３】
2004512802.tif 000012
からなる群から選択され；
Ｒ４は、以下の（ｉ）〜（ｖｉ）：
（ｉ）Ｃ２〜Ｃ３６飽和、不飽和または多価不飽和アルキル；
（ｉｉ）α−ヒドロキシ−Ｃ２〜Ｃ３６アルキル；
（ｉｉｉ）ω−ヒドロキシ−Ｃ２〜Ｃ３６アルキル；
（ｉｖ）α，ω−ジヒドロキシ−Ｃ２〜Ｃ３６アルキル；
（ｖ）ＣｌＣＨ２−、Ｃｌ２ＣＨ−またはＣｌ３Ｃ−；および
（ｖｉ）以下の式
【化４】
2004512802.tif 000013
を有するアルカノイル基からなる群から選択され、
ここで、Ｒ６は、二価のＣ２〜Ｃ３６アルキルであるかまたは二価のα−ヒドロキシ−Ｃ２〜Ｃ３６アルキルのいずれかであり、そしてＲ７は、一価のＣ２〜Ｃ３６アルキルであるかまたは一価のα−ヒドロキシ−Ｃ２〜Ｃ３６アルキルのいずれかであり；および
Ｒ５は、飽和、不飽和または多価不飽和Ｃ２〜Ｃ３７アルキルからなる群から選択される。
【請求項７】
前記スフィンゴイドが以下の式
【化５】
2004512802.tif 000014
を有する化合物を含有する、請求項１に記載の方法：
ここで、Ｒ１は、Ｈ、Ｇｌｃβ１−、Ｇａｌβ１−、ラクトースβ１−およびオリゴ糖からなる群から選択され；
Ｒ２は、Ｈおよび飽和または不飽和Ｃ２〜Ｃ２６アルキル基、および保護基からなる群から選択され；そして
Ｒ３は、飽和、不飽和または多価不飽和Ｃ２〜Ｃ３７アルキル基、あるいは保護基である。
【請求項８】
前記スフィンゴイドが以下のａ）〜ｐ）からなる群から選択される、請求項７に記載の方法：
【化６】
2004512802.tif 000015
【請求項９】
前記スフィンゴイドがＮｅｕ５Ａｃ３Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒであり、前記グリコシルトランスフェラーゼがβ１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼであり、そして前記ヌクレオチド糖がＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃであり、そして生成物がＧａｌＮＡｃ４Ｎｅｕ５Ａｃ３Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｎｅｕ５Ａｃ３Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒが、Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒを、α２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃと接触させる工程を包含する方法を使用して生成される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒが、ＧｌｃＣｅｒを、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼおよびＵＤＰ−Ｇａｌと接触させる工程を包含する方法を使用して生成される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＧｌｃＣｅｒが、植物グリコシルセラミドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記スフィンゴイドが、Ｎｅｕ５Ａｃ８Ｎｅｕ５Ａｃ３Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒであり、前記グリコシルトランスフェラーゼがβ１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼであり、前記ヌクレオチド糖がＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃであり、そして前記生成物がＧａｌＮＡｃ４（Ｎｅｕ５Ａｃ８Ｎｅｕ５Ａｃ３）Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒである、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記スフィンゴイドがセラミドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記スフィンゴイドが一つ以上の糖類残基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法が、前記スフィンゴイドを前記グリコシルトランスフェラーゼ反応混合物と接触させる前に、一つ以上の糖類残基の除去をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ガングリオシドを酵素的に合成する方法であって、該方法は以下：
（ａ）式Ｇｌｃβ−ＯＲの化合物とβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼとを、ＵＤＰ−ガラクトースの存在下で、該ＵＤＰ−ガラクトースからガラクトースを転移させるのに十分な条件下で接触させて、式Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲを有する化合物を形成する工程；および
（ｂ）（ａ）において形成された該化合物とα２，３−シアリルトランスフェラーゼとを、ＣＭＰ−シアル酸の存在下で、該ＣＭＰ−シアル酸からシアル酸を転移させるのに十分な条件下で接触させて、式Ｓｉａα（２−３）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃ−β−ＯＲを有する化合物を形成する工程、を包含する方法であって；
ここで、Ｒはスフィンゴイドであり、そして該方法は、以下からなる群から選択される少なくとも一つの効率を高める工程：
該グリコシルトランスフェラーゼ反応混合物と接触させる前に、該スフィンゴイドから脂肪酸を除去する工程；
該グリコシルトランスフェラーゼ反応混合物中に有機溶媒を含む工程；および
グリコシルトランスフェラーゼサイクルを使用して、該ＵＤＰ−ガラクトースおよび該ＣＭＰ−シアル酸のいずれかまたは両方を生成する工程、を実施する工程を包含する、方法。
【請求項１８】
前記Ｒが、スフィンゴシン、フィトスフィンゴシン、スフィンガニンおよびセラミドからなる群から選択される、請求項１７に記載に方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法であって、該方法が、前記（ａ）において形成された化合物または前記（ｂ）において形成された化合物と、β１，４−ガラクトサミニルトランスフェラーゼとを、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの存在下でＧａｌＮＡｃが転移される条件下で接触させて、それぞれ式ＧａｌＮＡｃβ（１−４）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲまたはＧａｌＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲを有する化合物を形成させる工程、をさらに包含する、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、該方法が、式ＧａｌＮＡｃβ（１−４）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲまたはＧａｌＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲを有する化合物と、β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼとを、ＵＤＰ−Ｇａｌの存在下でＧａｌが転移される条件下で接触させて、式Ｇａｌβ（１−３）ＧａｌＮＡｃβ（１−４）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲまたはＧａｌβ（１−３）ＧａｌＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲを有するガラクトシル化合物を形成する工程、をさらに包含する、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、該方法が、前記ガラクトシル化合物とα２，３−シアリルトランスフェラーゼとを、ＣＭＰ−シアル酸の存在下で該ＣＭＰ−シアル酸からシアル酸を転移させるのに十分な条件下で接触させて、Ｓｉａα（２，３）Ｇａｌβ（１−３）ＧａｌＮＡｃβ（１−４）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲおよびＳｉａα（２，３）Ｇａｌβ（１−３）ＧａｌＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲからなる群から選択される式を有するシアリル化化合物を形成する工程、をさらに包含する、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、該方法が、前記シアリル化化合物と、α２，８−シアリルトランスフェラーゼおよびＣＭＰ−シアル酸とを、シアル酸残基が該ＣＭＰ−シアル酸から転移される条件下で接触させて、以下からなる群から選択される式を有する化合物：
【化７】
2004512802.tif 000016
を形成する工程、をさらに包含する、方法。
【請求項２３】
請求項１７に記載の方法であって、該方法が、前記式Ｓｉａα（２−３）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲを有する化合物と、α２，８−シアリルトランスフェラーゼおよびＣＭＰ−シアル酸とを、シアル酸残基が該ＣＭＰ−シアル酸から転移される条件下で接触させて、式Ｓｉａα（２−８）Ｓｉａα（２−３）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲを有する化合物を形成する工程、をさらに包含する、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、該方法が、前記式Ｓｉａα（２−８）Ｓｉａα（２−３）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲを有する化合物とβ１，４−ガラクトサミニルトランスフェラーゼとを、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの存在下でＧａｌＮＡｃが転移される条件下で接触させて、式ＧａｌＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−８）Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲを有する化合物を形成する工程、をさらに包含する、方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、該方法が、前記式ＧａｌＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−８）Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲを有する化合物とβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼとを、ＵＤＰ−Ｇａｌの存在下でＧａｌが転移される条件下で接触させて、式Ｇａｌβ（１−３）ＧａｌＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−８）Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲを有するガラクトシル化合物を形成する工程、をさらに包含する、方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、該方法が、前記ガラクトシル化合物とα２，３−シアリルトランスフェラーゼとを、ＣＭＰ−シアル酸の存在下で該ＣＭＰ−シアル酸からシアル酸を転移させるのに十分な条件下で接触させて、式Ｓｉａα（２−３）Ｇａｌβ（１−３）ＧａｌＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−８）Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲを有するシアリル化化合物を形成する工程、をさらに包含する、方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、該方法が、前記シアリル化化合物と、α２，８−シアリルトランスフェラーゼおよびＣＭＰ−シアル酸とを、シアル酸残基が該ＣＭＰ−シアル酸から転移される条件下で接触させて、式Ｓｉａα（２−８）Ｓｉａα（２−３）Ｇａｌβ（１−３）ＧａｌＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−８）Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲを有する化合物を形成する工程、をさらに包含する、方法。
【請求項２８】
請求項１７に記載の方法であって、該方法が、工程（ａ）において形成された前記化合物または（ｂ）において形成された前記化合物と、β１，３−グルコサミニルトランスフェラーゼとを、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの存在下でＧｌｃＮＡｃが転移される条件下で接触させて、それぞれ、式ＧｌｃＮＡｃβ（１−４）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲまたはＧｌｃＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲを有する化合物を形成する工程、をさらに包含する、方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、該方法が、前記式ＧｌｃＮＡｃβ（１−４）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲまたはＧｌｃＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲを有する化合物と、β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼまたはβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼとを、ＵＤＰ−Ｇａｌの存在下でＧａｌが転移される条件下で接触させて、以下からなる群から選択される式を有するガラクトシル化化合物：
【化８】
2004512802.tif 000017
を形成する工程、をさらに包含する、方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、該方法が、前記ガラクトシル化合物とα２，３−シアリルトランスフェラーゼとを、ＣＭＰ−シアル酸の存在下で該ＣＭＰ−シアル酸からシアル酸を転移させるのに十分な条件下で接触させて、以下からなる群から選択される式を有するシアリル化化合物：
【化９】
2004512802.tif 000018
を形成する工程、をさらに包含する、方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、該方法が、前記シアリル化化合物と、α２，８−シアリルトランスフェラーゼおよびＣＭＰ−シアル酸とを、シアル酸残基が該ＣＭＰ−シアル酸から転移される条件下で接触させて、以下からなる群から選択される式を有する化合物：
【化１０】
2004512802.tif 000019
を形成する工程、をさらに包含する、方法。
【請求項３２】
グリコスフィンゴイドを酵素的にガラクトシル化する方法であって、該方法が、該グリコスフィンゴイドと、β−ガラクトシダーゼおよび式Ｇａｌ−Ｘ（Ｘは脱離基である）を有する化合物とを、Ｇａｌ残基を該Ｇａｌ−Ｘから該グリコスフィンゴイドへ転移させるのに適切な条件下で接触させて、ガラクトシル化グリコスフィンゴイドを形成する工程、を包含する、方法。
【請求項３３】
前記グリコスフィンゴイドがグルコシルセラミドであり、前記ガラクトシダーゼがβ１，４−ガラクトシダーゼであり、そして前記ガラクトシル化グリコスフィンゴイドがラクトシルセラミドである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項３２に記載の方法であって、該方法が、前記ガラクトシル化グリコスフィンゴイドとシアリルトランスフェラーゼとを、ＣＭＰ−シアル酸の存在下で該ＣＭＰ−シアル酸からシアル酸を転移させるのに十分な条件下で接触させて、シアリル化ガラクトシルグリコスフィンゴイドを形成する工程、をさらに包含する、方法。
【請求項３５】
前記ガラクトシル化グリコスフィンゴイドがラクトシルセラミドであり、前記シアリルトランスフェラーゼがα２，３−シアリルトランスフェラーゼであり、そして前記シアリル化ガラクトシルグリコスフィンゴイドがガングリオシドＧＭ３である、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、ガングリオシドおよび同類の化合物のインビトロでの酵素的合成に関する。
【０００２】
（背景）
ガングリオシドは、しばしば細胞膜中で見出される３個の成分から成る糖脂質類である。一個以上のシアル酸残基はオリゴ糖または糖質の中心部分と結合し、次いで、一般に細胞膜中に組み込まれている疎水性脂質（セラミド）構造と結合する。セラミド部分は長鎖塩基（ＬＣＢ）部分および脂肪酸（ＦＡ）部分を含む。ガングリオシドならびに他の糖脂質およびそれらの構造は、一般に、例えばＬｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９８１）２８７〜２９５頁およびＤｅｖｌｉｎ、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，１９９２）で議論される。ガングリオシドは、糖質部分中の単糖類の数、ならびに糖質部分中に存在するシアル酸基の数および位置に従って分類される。モノシアロガングリオシドには記号表示「ＧＭ」が与えられ、ジシアロガングリオシドは「ＧＤ」と表され、そしてトリシアロガングリオシドは「ＧＴ」、テトラガングリオシドは「ＧＱ」と表される。ガングリオシドはさらに、結合したシアル酸残基（単数または複数）の位置（単数または複数）に依存して分類され得る。さらなる分類は、オリゴ糖の中心に存在する糖類の数に基づき、下付の「１」は４個の糖質残基（Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−セラミド）を有するガングリオシドを示し、下付の「２」、「３」および「４」はそれぞれ三糖類（ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−セラミド）ガングリオシド、二糖類（Ｇａｌ−Ｇｌｃ−セラミド）ガングリオシドおよび単糖類（Ｇａｌ−セラミド）ガングリオシドを表す。
【０００３】
ガングリオシドは脳の中、特に神経終末にもっとも多量に存在する。それらはアセチルコリンを含む神経伝達物質に対するレセプタ部位に存在し、インターフェロン、ホルモン、ウイルス、細菌毒素などを含む他の生物学的高分子に対する特異的レセプターとしてもまたはたらき得ると考えられている。ガングリオシドは、大脳の貧血性発作を含む神経系の障害の処置に使用されてきた。例えば、Ｍａｈａｄｎｉｋら、（１９８８）Ｄｒｕｇ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｒｅｓ．１５：３３７〜３６０；米国特許第４，７１０，４９０号および同第４，３４７，２４４号；Ｈｏｒｏｗｉｔｚ（１９８８）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．ａｎｄ　Ｂｉｏｌ．１７４：５９３〜６００；Ｋａｒｐｉａｔｚら、（１９８４）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．ａｎｄ　Ｂｉｏｌ．１７４：４８９〜４９７を参照のこと。
【０００４】
ある特定のガングリオシドは、ヒトの造血細胞の表面に見出され（Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄら、（１９７２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　２６０：２７２〜２７８；Ｍａｃｈｅｒら、（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１９６８〜１９７４；Ｄａｃｒｅｍｏｎｔら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　４２４：３１５〜３２２；Ｋｌｏｃｋら、（１９８１）Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅｌｌｓ７：２４７）、これは、これらの細胞の末端顆粒球性分化において役割を果たし得る。Ｎｏｊｉｒｉら、（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：７４４３〜７４４６。「ネオラクト」系列と呼ばれるこれらのガングリオシドは、式［Ｇａｌβ−（１，４）ＧｌｃＮＡｃβ（１，３）］ｎＧａｌβ（１，４）Ｇｌｃ（ここでｎ＝１〜４）を有する中性の中心のオリゴ糖構造を有する。これらのネオラクト系列ガングリオシドに含まれるのは、３’−ｎＬＭ１（ＮｅｕＡｃα（２，３）Ｇａｌβ（１，４）ＧｌｃＮＡｃβ（１，３）Ｇａｌβ（１，４）−Ｇｌｃβ（１，１）−セラミド）および６’−ｎＬＭ１（ＮｅｕＡｃα（２，６）Ｇａｌβ（１，４）ＧｌｃＮＡｃβ（１，３）Ｇａｌβ（１，４）−Ｇｌｃβ（１，１）−セラミド）である。
【０００５】
ガングリオシドの治療薬としての使用、ならびにガングリオシドの機能の研究は、所望のガングリオシドの簡便で有効な合成法によって促進される。３’−ｎＬＭ１および６’−ｎＬＭ１を合成するための、組み合わせた酵素的および化学的アプローチが記載されている（ＧａｕｄｉｎｏおよびＰａｕｌｓｏｎ（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：１１４９〜１１５０）。しかし、この方法および他のガングリオシド合成のための以前の利用可能な合成方法は、低能率であり、そして他の欠点を有する。従って、ガングリオシドを合成するためのより効果的な方法の必要性が存在する。本発明はこの必要性および他の必要性を満たす。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、ガングリオシドおよびオリゴ糖を含む他の化合物を含むグリコスフィンゴイド（ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｉｄ）のインビトロの合成方法を提供する。この方法は、シアル酸を含む糖質のスフィンゴイド（ｓｐｈｉｎｇｏｉｄ）前駆体への酵素的転移を包含する。特に、この方法はスフィンゴイド前駆体を、１個以上のグリコシルトランスフェラーゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼに対応する糖ドナー部分、およびグリコシルトランスフェラーゼ活性に必要な他の反応体と、糖（単数または複数）をドナー部分からスフィンゴイド前駆体に転移するのに十分な時間、適切な条件下で、接触させる工程を包含する。いくつかの実施態様において、１つ以上の酵素的反応が有機溶媒の存在下で実施され、これは糖化反応の効率を上げる。反応効率を上げる別の方法は、ヌクレオチドの糖ドナー部分を生成するためにグリコシルトランスフェラーゼサイクルを使用することである。酵素的段階は代表的にはセラミドからの脂肪酸部分の加水分解によって先行され、脂肪酸部分はグリコシルトランスフェラーゼ反応が完了した後に再結合され得る。本発明の方法を使用すると事実上１００％の効率が得られる。
【０００７】
１つの実施態様において、本発明は、ガングリオシドを形成するために、１個以上のシアル酸残基をグリコシル化セラミドに添加する方法を提供する。グリコシル化セラミドを、シアル酸がシアル酸ドナー部分からグリコシル化セラミドの糖部分に転移する条件下で、シアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸ドナー部分およびシアリルトランスフェラーゼ活性に必要な他の反応体と接触させる。
【０００８】
従って、本発明のいくつかの実施態様は、グリコスフィンゴイドの酵素的合成法を提供する。これはスフィンゴイドを、ａ）１個以上のグリコシルトランスフェラーゼ、ｂ）それぞれのグリコシルトランスフェラーゼに対応するヌクレオチド糖、およびｃ）グリコシルトランスフェラーゼ活性に必要な他の反応体、を含むグリコシルトランスフェラーゼ反応混合物と接触させる工程を包含する。この反応混合物を、ヌクレオチド糖からの糖（単数または複数）がスフィンゴイドに転移して、グリコシル化スフィンゴイドを形成するのに十分な時間、および適切な条件下でインキュベートする。この方法は、有機溶媒をグリコシルトランスフェラーゼ反応混合物に含める工程、およびヌクレオチド糖を生成するためにグリコシルトランスフェラーゼサイクルを使用する工程、から成る群から選択される少なくとも１つの効果的な促進工程を包含する。さらなる効率の向上が所望される場合、脂肪酸は、グリコシルトランスフェラーゼ反応より前にスフィンゴイドから除去され得る。
【０００９】
さらなる実施態様において、本発明の方法は、第１の反応混合物で生成したグリコシル化スフィンゴイドを、ａ）追加のグリコシルトランスフェラーゼ、ｂ）追加のグリコシルトランスフェラーゼに対応するヌクレオチド糖、およびｃ）追加のグリコシルトランスフェラーゼの活性に必要な他の反応体、を含む第２のグリコシルトランスフェラーゼ反応混合物と接触させる工程を、さらに包含する。反応混合物を、糖がヌクレオチド糖からグリコシル化スフィンゴイドに転移するのに十分な時間、および適切な条件下でインキュベートする。
【００１０】
（詳細な説明）
（定義）
以下の略語が本明細書中で使用される：
Ａｒａ＝アラビノシル；
Ｆｒｕ＝フルクトシル；
Ｆｕｃ＝フコーシル；
Ｇａｌ＝ガラクトシル
ＧａｌＮＡｃ＝Ｎ−アセチルガラクトサミニル；
Ｇｌｃ＝グルコシル；
ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミニル；
Ｍａｎ＝マンノシル；および
ＮｅｕＡｃ＝シアリル（代表的には、Ｎ−アセチルノイラミニル）。
【００１１】
還元性の末端の糖が実際に還元糖であろうとなかろうと、オリゴ糖は還元性の末端および非還元性の末端を有すると見なされる。承認された命名法によると、本明細書中でオリゴ糖は、左の非還元性末端および右の還元性末端で表される。本明細書中で記載された全てのオリゴ糖は、この名前または非還元糖の略語（例えば、Ｇａｌ）、続いてグリコシド結合の立体配置（αまたはβ）、環結合、結合中に含まれる還元糖類の環の位置、次いで還元糖類の名前または略語（例えば、ＧｌｃＮＡｃ）で記載される。２個の糖の間の結合は、例えば２，３，２→３，２−３（または２，３）と表現され得る。各々の糖類はピラノースである。
【００１２】
本明細書中で使用される「スフィンゴイド」は、スフィンゴシン、フィトスフィンゴシン、スフィンガニン、セラミドなどを包含する。天然に出現する化合物および合成的に生成する化合物の両方が包含される。
【００１３】
「グリコスフィンゴリピド」はスフィンゴイドまたはセラミドの糖質含有誘導体である。糖質残基はグリコシド結合によってスフィンゴイドのＯ−１と結合する。
【００１４】
用語「シアル酸」（略語「Ｓｉａ」）は９炭素でカルボキシル化された糖の任意のファミリーのメンバーを言う。もっとも一般的なシアル酸ファミリーのメンバーは、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノース−１−オン酸（しばしばＮｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃまたはＮＡＮＡと略される）である。このファミリーの第２のメンバーは、Ｎ−グリコリル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）であり、この中でＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基はヒドロキシル化されている。第三のシアル酸ファミリーのメンバーは２−ケト−３−デオキシ−ノヌロゾン（ｎｏｎｕｌｏｓｏｎｉｃ）酸（ＫＤＮ）である（Ｎａｄａｎｏら、（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１５５０〜１１５５７；Ｋａｎａｍｏｒｉら、（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２１８１１〜２１８１９）。９−置換シアル酸、例えば、９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃまたは９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃのような９−Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃおよび９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃもまた含まれる。シアル酸ファミリーの総説については、例えば、Ｖａｒｋｉ（１９９２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ　２：２５〜４０；Ｓｉａｌｉｃ　Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ，編．（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９２））を参照のこと。シアリル化手順において、シアル酸化合物の合成および使用は、例えば、１９９２年１０月１日に公開された国際特許公開ＷＯ９２／１６６４０記載される。
【００１５】
用語「単離された」は、通常はその天然の状態で見出される際の物質を伴う構成要素を実質的にまたは本質的にもたない物質をいうことを意味する。従って、いくつかの実施態様において、本発明の方法を使用して作成されたガングリオシドおよび他のグリコスフィンゴイドは、通常これらの化合物のインサイチュの環境に関連する物質は含まない。代表的には、本発明の単離された複合糖質は、銀染色ゲル上のバンド強度またな純度を決定する他の方法によって測定される場合、少なくとも約８０％純粋であり、通常、少なくとも約９０％純粋であり、好ましくは少なくとも約９５％純粋である。純度または等質性は、以下に記載されたような当業者に周知の多くの手段によって示され得る。
【００１６】
（好ましい実施態様の説明）
本発明は、ガングリオシド、グリコスフィンゴイドおよび他のグリコシル化構造を含む糖脂質を効果的に合成する方法を提供する。例えば、本発明は、ガングリオシドの生物学的機能の研究、ならびに治療的な適用に有用なガングリオシドの合成法を提供する。本発明の方法は、糖がドナー部分からセラミドまたはスフィンゴイドに転移するのに十分な時間、および適切な条件下で、グリコシル化されたまたはグリコシル化されていないセラミドあるいはスフィンゴイドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび糖ドナー部分と接触させる工程を包含する。いくつかの実施態様において、反応効率を高め得る有機溶媒の存在下で酵素的反応が行われる。他の好ましい実施態様において、脂肪酸部分は、グリコシルトランスフェラーゼ反応の前にセラミドまたはスフィンゴイドから除去され、従って酵素的転移の効果はさらに増加する。
【００１７】
（Ａ．グリコセラミド−およびスフィンゴイド−付随オリゴ糖の酵素的合成）
本発明は、特定の様式で、所望のガングリオシドまたは他のグリコスフィンゴリピドを得るために、１つ以上の糖部分を付加する方法を提供する。本発明の方法は、ガングリオシドおよび他のグリコスフィンゴイドを含むグリコスフィンゴイドを合成するために１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼの使用を包含する。所望の糖質を前駆体分子に結合するためのグリコシルトランスフェラーゼの使用によって、高い特異性を有する所望の結合が達成され得る。本発明の好ましい実施態様において、本発明の方法は、グリコシルトランスフェラーゼ反応前にスフィンゴイド前駆体から脂肪酸部分を除去する工程、および／または反応を促進する有機溶媒の使用を包含する。
【００１８】
本発明の所定の合成方法において使用される、グリコシルトランスフェラーゼ（単数および複数）の選択は、出発物質および所望の最終生成物として使用されるアクセプターに依存する。方法は１より多いグリコシルトランスフェラーゼの使用を包含し得、ここで１より多い糖質が付加される。複数のグリコシルトランスフェラーゼ反応が同時にまたは連続して行われ得る。大規模の反応に十分な量のグリコシルトランスフェラーゼを得るために、その酵素をコードする核酸は、当業者に公知の方法によって、組み替え型溶性酵素としてクローン化および発現され得る。
【００１９】
いくつかの実施態様において、本発明により、セラミドまたは他のグリコシル化されていないスフィンゴイドから出発してグリコスフィンゴリピドを合成することが可能となる。セラミド前駆体からのグリコセラミドの合成における初期の酵素は、所望の最終生成物に依存して、セラミドグリコシルトランスフェラーゼ（グルコシルセラミドについてＥＣ．２．４．１．８０）またはセラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ガラクトシルセラミドについてＥＣ．２．４．１．４５）のいずれかである（工程１）。グリコスフィンゴリピドの生合成の総説については、例えば、ＩｓｈｉｋａｗａおよびＨｉｒａｂａｙａｓｈｉ（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．８：１９８〜２０２を参照のこと。従って、本発明の方法が、出発物質としてグリコシル化されていないセラミドまたはスフィンゴイドを使用するグリコスフィンゴリピドの合成に使用される場合、反応混合物はこれらの酵素の１つを包含する。セラミドグルコシルトランスフェラーゼは種々の供給源から入手可能である。例えば、ヒトヌクレオチドの配列は公知であるため（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ５０８４０；Ｉｃｈｉｋａｗａら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：４６３８〜４６４３）、酵素を得るために組み替え法が使用され得る。ヒトセラミドガラクトシルトランスフェラーゼのヌクレオチド配列もまた報告され（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ６２８９９；ＫａｐｉｔｏｎｏｖおよびＹｕ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３２：４４９〜４５３）、従って酵素は容易に入手可能である。これらの反応で使用されるアクセプターは、任意のＮ−アシルスフィンゴシン、スフィンゴシンおよびジヒドロスフィンゴシンであり得る。グリコシルトランスフェラーゼに適切なドナーヌクレオチド糖はＵＤＰ−ＧｌｃおよびＣＤＰ−Ｇｌｃを包含し、一方ガラクトシルトランスフェラーゼはドナーとしてＵＤＰ−Ｇａｌを代表的に使用する。
【００２０】
他の実施態様において、シアリルトランスフェラーゼまたは他のグリコシルトランスフェラーゼに対するアクセプター糖質は、前駆体のインビボでの合成の際に修飾されるように前駆体分子上に存在する。例えば、出発物質としてグリコシルセラミドまたは他のグリコスフィンゴイドが使用され得る。このようなグリコスフィンゴイドはシアリル化され得るか、そうでなければ、前駆体にすでに存在する残基に追加の糖質残基を付加するために本発明の方法を使用してグリコシル化され得る。いくつかの実施態様において、追加の糖質残基は、予めグリコスフィンゴリピド出発物質のグリコシル化パターンの修飾なしで付加される。あるいは、本発明は、追加の糖質残基が付加する前に、グリコスフィンゴリピドのグリコシル化パターンを変える方法を提供する。開始のグリコスフィンゴリピドが、所望の糖質の付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼに適切なアクセプターを提供しない場合、グリコスフィンゴリピドは、当業者に公知の方法でアクセプターを包含するように修飾され得る。例えば、シアリルトランスフェラーゼに適切なアクセプターを提供するために、ガラクトース残基を、例えばＧａｌＮＡｃまたはグリコスフィンゴイドと結合した他の適切な糖質部分と結合させるためのガラクトシルトランスフェラーゼを使用することによって、適切なアクセプターが合成され得る。他の実施態様において、グリコスフィンゴイドが結合したオリゴ糖は、シアリルトランスフェラーゼに対するアクセプターまたは適切なアクセプターを得るのに適切な１つ以上の残基が付加し得る部分のいずれかを曝露するように、最初に全体または部分的に「トリム（ｔｒｉｍｍｅｄ）」され得る。グリコシルトランスフェラーゼおよびエンドグリコシダーゼのような酵素は、付加反応およびトリム反応に有効である。
【００２１】
ガングリオシドの合成における第２の工程は、第２の炭水化物残基であるガラクトースをグルコシルスフィンゴイドへ添加し、構造Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｒ（ここでＲは、セラミド（そして生成物はラクトシルセラミド（である）または他のスフィンゴイドである）を形成することを含む（工程２）。この反応は、ＵＤＰ−Ｇａｌ（グルコシルセラミドβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．３８））によって触媒され、これはまた、ラクトシルセラミドシンターゼとして呼ばれる。この酵素は、ラットから特徴付けられ（Ｎｏｍｕｒａら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１３５７０−７）、そしてヌクレオチド配列はニワトリ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏｓ．Ｕ１９８９０およびＵ１９８８９）およびマウス（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｌ１６８４０；Ｓｈａｐｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１０４２０−１０４２８）の対応するｃＤＮＡについて利用可能である。
【００２２】
代替の実施態様において、ガラクトシル化は、β−ガラクトシダーゼを使用して実施される。グリコスフィンゴイド前駆体は、Ｇａｌ−ＸからグルコシルセラミドヘのＧａｌ残基の転移について適切な条件下で、β−ガラクトシダーゼならびに式Ｇａｌ−Ｘを有する化合物（ここでＸはガラクトース残基の１位に結合した脱離基である）と接触する。適切な脱離基には、例えば、β−ｐ−ニブロフェニル、フェニル、メチル、メトキシメチル、およびメトキシエチルエーテルが挙げられる。他の活性化基は、例えば、Ｎｉｌｓｓｏｎら（１９８８）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：２５６およびその中の引用に記載される。ガラクトースを糖類へ添加するためのガラクトシダーゼの使用は、例えば、米国特許第５，４０３，７２６号および同第５，３７４，５４１号に記載される。
【００２３】
次の糖類の部分を添加する（工程３）ために使用されるグリコシルトランスフェラーゼは、合成される特定のグリコスフィンゴ脂質（ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ）に依存する。ある実施態様において、本発明は、１個以上のシアル酸残基をグリコシルセラミドヘ添加してガングリオシドを形成する方法を提供する。これらの方法は、シアリルトランスフェラーゼ（これは、ドナー基質ＣＭＰ−シアル酸からアクセプタオリゴ糖基質へシアル酸を転移する、グリコシルトランスフェラーゼのファミリーを含む）を利用する。少なくとも１５の異なる哺乳動物のシアリルトランスフェラーゼが記載され、そしてそれらの１３のｃＤＮＡが現在まで複製された（本明細書で使用される系統的学名については、Ｔｓｕｊｉら（１９９６）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ６：ｖ−ｘｉｖを参照のこと）。加えて、２個の細菌性のシアリルトランスフェラーゼが最近報告された（Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：１０４−１１０；Ｇｉｌｂｅｒｔら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２８２７１−２８２７６）。
【００２４】
シアリルトランスフェラーゼに対するアクセプタは、本発明の方法によって修飾されるグリコシルセラミドに存在する。適切なアクセプタは、例えば、ガラクトシルアクセプタ（例えば、Ｇａｌβ１，４ＧａｌＮＡｃ−、Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ−、ラクト−Ｎ−テトラオーゼ−、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−、Ｇａｌβ１，３Ａｒａ−、Ｇａｌβ１，６ＧｌｃＮＡｃ−、およびＧａｌβ１，４Ｇｌｃ−（ラクト−ス））を含む。当業者に公知の他のアクセプタ（例えば、Ｐａｕｌｓｏｎら（１９７８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：５６１７−５６２４を参照のこと）。典型的には、このアクセプタは、セラミドまたは他のグリコスフィンゴイド部分へ結合するオリゴ糖鎖の一部を形成する。
【００２５】
この反応において利用される特定のシアリルトランスフェラーゼは、合成されるガングリオシドに依存する。ガングリオシドＧＭ３について、例えば、α２，３シアリルトランスフェラーゼが、そのアクセプタＣＭＰ−シアル酸と共に、使用される。この反応について適切な酵素は、Ｉｓｈｉｉ（１９９７）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１４（ｓｕｐｐ．１）：Ｓ４９において記載される。
【００２６】
さらなるガングリオシドが、α２，３シアリルトランスフェラーゼ反応後または同時に、α２，３−シリアル化部分をα２，８−シアリルトランスフェラーゼと接触させることによって、合成され得る。α２，８−シアリルトランスフェラーゼは、α２，８に結合するシアル酸残基のα２，３−結合シアル酸への添加を触媒する。この方法によって、例えば、ガングリオシドＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ａ、ＧＴ１ｂ、ＧＴ１ｃ、およびＧＱ１ｂを合成し得る。これらのガングリオシドの構造は、上述したそれらと同様に、表２に示される。例えば、ガングリオシドＧＤ３を合成するために、α２，３シアリルトランスフェラーゼとの反応と同時にまたは後に、α２，８シアリルトランスフェラーゼが使用される。この反応に適切な酵素は、ＳＴ８ＳｉａＩであり（（ＧＤ３／ＧＴ３シンターゼ；ＥＣ２．４．９９．８；例えば、（ヒト）Ｎａｒａら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：７９５２−７９５６；Ｈａｒａｇｕｃｈｉら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１０４５５−１０４５９；Ｓａｓａｋｉら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１５９５０−１５９５６；Ｎａｋａｙａｍａら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３６８４−３６９１）およびマウス（Ｙｏｓｈｉｄａら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４６２８−１４６３３））、そしてこれは、α２，８結合中のシアル酸残基を予め添加したα２，３−結合シアル酸へ結合する。別のシアリルトランスフェラーゼであるＳＴ８ＧａｌＮＡｃＩＩＩは、ＧＭｌをＧＤｌに変換するために使用され得る。この酵素についてのラットｃＤＮＡは、複製されて、そして特徴付けられた（Ｓｊｏｂｅｒｇら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：７４５０−７４５９；ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｌ２９５５４）。他のα２，８−シアリルトランスフェラーゼには、ＳＴ８ＳｉａＩＩ、ＳＴＸ（Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２２６８５−２２６８８）およびＳＴ８ＳｉａＩＩＩ（これはアクセプタとしてＳｉａ２，３Ｇａｌ１，４ＧｌｃＮＡｃを使用する）が挙げられ、そしてこのため、ネオラクトガングリオシドを合成するための方法（Ｙｏｓｈｉｄａら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４６２８−１４６３３）において有用である。本発明の好ましい実施態様において、この２個のシアリルトランスフェラーゼ反応は、同時に実施される。
【００２７】
ガングリオシドのラクト−およびネオラクト−シリーズのシアリル化のため、シアリルトランスフェラーゼは、シアル酸を構造Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−およびＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−のそれぞれに転移することができる。適切なシアリルトランスフェラーゼは、表１に要約されるものを包含する。
【００２８】
【表１】
2004512802.tif 000002
シアリルトランスフェラーゼについての基質として役立つことに加えて、ラクトシルセラミドはまた、β１，４−ガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．９２）に対するアクセプタとして使用され得、これは、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃからラクトシルセラミドのＧａｌ部分への、ＧａｌＮＡｃの転移を触媒する。この酵素のヌクレオチド配列は、例えば、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｍ８３６５１；Ｎａｇａｔａら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２０８２−１２０８７）、ラット（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｄ１７８０９；Ｈｉｄａｒｉら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０１：９５７−９６５）、およびマウス（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｌ２５８８５；Ｓａｎｇｏら（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ２７：３６２−３６５）について適用できる。このため、この酵素は、組換え法によって容易に得られ得る。
【００２９】
得られたＧａｌＮＡｃβ４Ｇａｌβ４Ｇｌｃ−Ｃｅｒ部分から、ガングリオシドＧＭ２を合成するために、上述のように、α２，３シアリルトランスフェラーゼが使用される。ガングリオシドＧＤ２は、本発明の方法によって、つまりα２，８シアリルトランスフェラーゼが、続くまたは同時の、α２，３シアリルトランスフェラーゼとの反応との使用によって、合成され得る。あるいは、α２，６シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ；ＥＣ２．４．９９．３）は、α２，６結合にあるシアル酸残基を加えるために利用され得る（Ｋｕｒｏｓａｗａら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１４０２−１４０９）。
【００３０】
ＧａｌＮＡｃβ４Ｇａｌβ４Ｇｌｃ−Ｃｅｒ部分はまた、さらなるグリコスフィンゴ脂質の合成のためのアクセプタとして、使用され得る。例えば、本発明は、この化合物が、β１，３ガラクトシルトランスフェラーゼを使用して、ガラクトシル化される方法を提供する。この適用について適切なガラクトシルトランスフェラーゼは、例えば、Ｇｈｏｓｈら（１９９５）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１２：８３８−４７に記載される。
【００３１】
得られたＧａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ４Ｇａｌβ４Ｇｌｃ−Ｃｅｒ部分から、ガングリオシドＧＭ１ａおよびＧＭ１ｂを合成するために、本発明の方法は、この部分をα２，３シアリルトランスフェラーゼと接触させる工程を含む。例えば、この方法は、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩシアリルトランスフェラーゼ（ヒト：Ｓａｓａｋｉら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２７８２−２２７８７；ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ｘ７４５７０）を使用し得る。細菌性シアリルトランスフェラーゼはまた、この反応について適切である（表１）。
【００３２】
本発明はまた、α２，６Ｇａｌ結合にあるシアル酸を添加する方法を提供する。例えば、ＳＴ６ＧａｌＩの使用は、α２，６Ｇａｌ結合にあるシアル酸の添加を触媒し得る。この酵素は、市販され（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ　ＩＮ）、そしてそのｃＤＮＡはいくつかの生物より複製されており、これは、ラット（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２６２：１７７３５−１７７４３）、ヒト（Ｇｒｕｎｄｍａｎｎら（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１８：６６７；Ｚｅｔｔｌｍｅｉｓｌら（１９９２）特許ＥＰＯ４７５３５４；Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら（１９９０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：６４１−６４３；Ｂａｓｔら（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１１６：４２３−４３５）、マウス（Ｈａｍａｍｏｔｏら（１９９３）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１：１４１−１４５）およびニワトリ（Ｋｕｒｏｓａｗａら（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：３７５−３８１）を含む。他のガングリオシドは、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩを使用して、α２，６結合シアル酸をＧａｌβ３ＧａｌＮＡｃ部分へ加えて、合成され得る（ニワトリ、Ｋｕｒｏｓａｗａら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９０４８−１９０５３、ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ｘ７７７７５）。
【００３３】
シアリルトランスフェラーゼおよび他のグリコシルトランスフェラーゼは、単独で、またはさらなる酵素と組み合わせて、使用され得る。例えば、図２は、ラクトシルセラミドから出発したガングリオシドＧＤ２の合成の２個の経路の概略図を示す。それぞれの経路は、２個の異なるシアリルトランスフェラーゼ（α２，３ＳＴおよびα２，８ＳＴ）、ならびにＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの使用を含む。好ましい経路において、塩基での処理によって、ラクトシルセラミドから脂肪酸を除去する（工程１）。次いでアセチル化を行い（工程２）、その後、α２，３シアリルトランスフェラーゼによって、シアル酸をα２，３結合にあるガラクトース残基へ結合する（工程３）。シアリル化工程を行い（好ましくは、本明細書中で記述したように有機溶媒の存在下で）、それによってこの反応をほぼ完璧に行う。次いでＧａｌＮＡｃ残基を、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼを使用して、β１，４結合にあるガラクトースヘ添加する（工程５）。最後に、脂肪酸を添加し（例えば塩化ステロイルとの反応によって）、ガングリオシドを得る（工程６）。
【００３４】
当業者は、本明細書中で提供されるガイダンスを使用して、さらなるグリコシルトランスフェラーゼを、単独または組み合わせて選択し得、そしてこれは、目的の他のグリコスフィンゴ脂質の合成を触媒し得る。例えば、ラクトまたはネオラクトグリコスフィンゴ脂質を合成するために、上述の工程３のβ１，４ガラクトサミニルトランスフェラーゼをβ１，３ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼで置き換える。次いで、この反応の生成物を、β１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（ラクト）またはβ１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ（ネオラクト）と接触させることで、所望のようにガングリオシドを合成するのに適切なシアリルトランスフェラーゼ（単数または複数）に対するアクセプタを提供する。これらの方法において有用であるシアリルトランスフェラーゼの例は、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩであり、これはまた、α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）として呼ばれる。この酵素は、シアル酸の、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃグリコシドのＧａｌへの転移を触媒する（例えば、Ｗｅｎら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：２１０１１−２１０１９；Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｅｉｊｎｄｅｎら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６：３１５９を参照のこと）。シアル酸は、２個の糖間のα結合の形成と共に、Ｇａｌへ結合される。糖間のボンディング（結合）は、ＮｅｕＡｃの２位とＧａｌの３位との間に存在する。この特定の酵素は、ラット肝臓から単離され得（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：１３８４５）；ヒトｃＤＮＡ（Ｓａｓａｋｉら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２７８２−２２７８７；ＫｉｔａｇａｗａおよびＰａｕｌｓｏｎ（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１３９４−１４０１）およびゲノム（Ｋｉｔａｇａｗａら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９３１−９３８）ＤＮＡ配列は公知であり、組換え表現によるこの酵素の生成を容易にする。ある実施態様において、本発明の方法は、ラットＳＴ３ＧａｌＩＩＩを使用する。
【００３５】
同様に、上記の工程３におけるβ１，４−ガラクトサミニルトランスフェラーゼを、α１，４−（グロボ）またはα１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（イソグロボ）で置き換えることによって、グロボ−およびイソグロボ−グリコスフィンゴ脂質を合成し得る。これらの反応の生成物は、ＧａｌＮＡｃ残基の非還元Ｇａｌ残基への、β１，３ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼで触媒した添加を受ける。再度、この生成物の１個以上のシアリルトランスフェラーゼでの処理により、所望のガングリオシドを得る。
【００３６】
ガングリオシドおよび他のグリコスフィンゴ脂質は、上述したものに加えて、他の糖を含むことがある。例えば、フコース残基が存在することがある。よって、本発明は、フコシル化グリコスフィンゴ脂質を合成する方法を提供する。これらの方法は、活性化ヌクレオチド糖（ＧＤＰ−フコース）から適切なアクセプタへのフコース残基の転移を触媒するための、フコシルトランスフェラーゼの使用を含む。例えば、構造Ｆｕｃα２Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ４（Ｓｉａα３）Ｇａｌβ４Ｇｌ−Ｃｅｒを有するガングリオシドを得るために、ＧＭ１ａガングリオシドをα１，２−フコシルトランスフェラーゼと接触し得る（Ｗｉｅｇａｎｄｔ（１９７３）Ｈ．−Ｓ．Ｚｓｃｈｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３５４：１０４９−１０５６）。
【００３７】
本発明の方法は、非常に多くのガングリオシドおよび関連する構造体のいずれをも生成するのに有用である。目的の多数のガングリオシドは、Ｏｅｔｔｇｅｎ、Ｈ．Ｆ．編、Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ、ＶＣＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ、１９８９、１０〜１５頁、およびそれに引用される参照文献に記載される。特定の目的のガングリオシドは、例えば、脳に見られるもの、ならびに表２に列挙される他のソースを含む。
【００３８】
【表２】
2004512802.tif 000003
ある実施態様において、本発明は、グリコシルセラミドに存在する糖類の基のインビトロシアリル化のための方法を提供し、ここでこの方法は、適切なアクセプタを生成するために、第一にグリコシルセラミドを修飾する工程を含む。アクセプタを生成するための好ましい方法は、ガラクトシルトランスフェラーゼの使用を含む。これらの方法についての工程は以下を含む：
（ａ）式Ｇｌｃβ−ＯＲの化合物を、化合物Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲを形成するのに十分な条件下、ＵＤＰ−ガラクトースの存在下で、ガラクトシルトランスフェラーゼを用いて、ガラクトシル化する工程；および
（ｂ）（ａ）で形成した化合物を、シアル酸が非還元糖に転移されて化合物ＮｅｕＡｃα（２−３）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃ−β−ＯＲを形成する条件下で、α（２，３）シアリルトランスフェラーゼを使用して、シアル酸のＣＭＰ誘導体の存在下で、シアリルトランスフェラーゼを用いて、シアリル化する工程。この式において、Ｒはセラミドまたはスフィンゴイドである。ある実施態様において、この生成物はシアル酸残基がα２，３−結合シアル酸に転移されて化合物ＮｅｕＡｃα（２−８）ＮｅｕＡｃα（２−３）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃ−β−ＯＲを形成する条件下で、α２，８−シアリルトランスフェラーゼと接触される。
【００３９】
さらなる実施態様において、シアリル化工程（ｂ）の前または後のいずれかで、工程（ａ）で形成されたＧａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲ化合物はさらに修飾される。例えば、この方法は、さらなる以下の工程を含み得る：
（ｃ）ＧａｌＮＡｃ残基を、ＧａｌＮＡｃがオリゴ糖の非還元末端へ転移される条件下で、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの存在下で、この化合物をβ１，４−ガラクトサミニルトランスフェラーゼと接触させることによって、Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲへ添加し、ＧａｌＮＡｃβ（１−４）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲを形成する工程；および
（ｄ）Ｇａｌ残基を、Ｇａｌがオリゴ糖の非還元末端へ転移される条件下で、ＵＤＰ−Ｇａｌの存在下で、工程（ｃ）で形成される化合物をβ１−３−ガラクトシルトランスフェラーゼと接触させることによって、ＧａｌＮＡｃβ（１−４）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲへ添加し、Ｇａｌβ（１−３）ＧａｌＮＡｃβ（１−４）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲを形成する工程。
【００４０】
本発明のさらなる実施態様は、以下による、ガングリオシドの合成を含む：
（ｅ）工程（ｄ）の生成物を、シアル酸がＧａｌ残基のいずれかまたは両方へ転移される条件下で、工程（ｂ）に記載のように１個以上のシアリルトランスフェラーゼと接触させる工程。この反応は、例えば、α２，３−シアリルトランスフェラーゼを単独で、またはα２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびα２，８−シアリルトランスフェラーゼを含み得る。
【００４１】
出発物質として本発明の方法で使用され得るスフィンゴイドは、式Ｉ：
【００４２】
【化１１】
2004512802.tif 000004
を有するものを含むが、これに限定されず、ここで、Ｒ１は、Ｈ、Ｇｌｃβ１−、Ｇａｌβ１−、およびラクトースβ１−からなる群より選択され；
Ｒ２は、ＣＨ２および
【００４３】
【化１２】
2004512802.tif 000005
からなる群より選択され；
Ｒ３は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、
【００４４】
【化１３】
2004512802.tif 000006
からなる群より選択され；
Ｒ４は以下からなる群より選択され：
（ｉ）Ｃ２−Ｃ３６飽和、不飽和、または多価不飽和アルキル；
（ｉｉ）α−ヒドロキシ−Ｃ２−Ｃ３６アルキル；
（ｉｉｉ）ω−ヒドロキシ−Ｃ２−Ｃ３６アルキル；
（ｉｖ）α，ω−ジヒドロキシ−Ｃ２−Ｃ３６アルキル；
（ｖ）ＣｌＣＨ２−、Ｃｌ２ＣＨ−、またはＣｌ３Ｃ−；および
（ｖｉ）以下の式を有するアルカノイル基
【００４５】
【化１４】
2004512802.tif 000007
ここでＲ６は、二価のＣ２−Ｃ３６アルキルまたは二価のα−ヒドロキシ−Ｃ２−Ｃ３６アルキルのいずれかであり、そしてＲ７は、一価のＣ２−Ｃ３６アルキルまたは一価のα−ヒドロキシ−Ｃ２−Ｃ３６アルキルのいずれかであり；そして
Ｒ５は、飽和、不飽和、または多価不飽和Ｃ２−Ｃ３７アルキル基からなる群から選択される。
【００４６】
ある実施態様において、スフィンゴイドは、式ＩＩ：
【００４７】
【化１５】
2004512802.tif 000008
を含み、ここでＲ１は、Ｈ、Ｇｌｃβ１−、Ｇａｌβ１−，ラクトースβ１−、およびオリゴ糖からなる群より選択され；
Ｒ２は、Ｈ、飽和または不飽和Ｃ２−Ｃ２６アルキル基、および保護基からなる群より選択され；そして
Ｒ３は、飽和、不飽和、または多価不飽和Ｃ２−Ｃ３７アルキル基、あるいは保護基である。
【００４８】
従って、本発明は、式ＩＩＩ：
【００４９】
【化１６】
2004512802.tif 000009
を有するグリコスフィンゴイドを合成する方法を与える。
【００５０】
ここで、Ｘ１は、スフィンゴイド（例えば、セラミドまたはスフィンゴシン）であり；
Ｘ２およびＸ４は、それぞれ独立して、−Ｈ、Ｓｉａα２−３−、Ｓｉａα２−６−、Ｓｉａα２−８−Ｓｉａα２−３−、およびＦｕｃα１−２−からなる群から選択され；
Ｘ３は、任意であり、存在する場合には、ＧａｌＮＡｃβ１−４−、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４−、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４−、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３−、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３−、ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４−、およびＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−３−からなる群から選択される。
【００５１】
１つの実施態様において、スフィンゴイドはＮｅｕ５Ａｃ３Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒであり、グリコシルトランスフェラーゼはβ１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼであり、糖ヌクレオチドはＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃであり、生成物はＧａｌＮＡｃ４Ｎｅｕ５Ａｃ３Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒである。Ｎｅｕ５Ａｃ３Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒは、Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒをα２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃと接触させる工程を含む方法を使用して生成され、または他の方法によって得られ得る。同様に、Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒは、ＧｌｃＣｅｒをβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼおよびＵＤＰ−Ｇａｌと接触させる工程を含む方法を使用して生成され得、または他に得られ得る。さらなる実施態様において、スフィンゴイドはＮｅｕ５Ａｃ８Ｎｅｕ５Ａｃ３Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒであり、グリコシルトランスフェラーゼはβ１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼであり、糖ヌクレオチドはＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃであり、生成物はＧａｌＮＡｃ４（Ｎｅｕ５Ａｃ８Ｎｅｕ５Ａｃ３）Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒである。
【００５２】
本発明はまた、以下：
（ａ）ＵＤＰ−ガラクトースの存在下、ＵＤＰ−ガラクトースからガラクトースを転移するのに十分な条件下で、式Ｇｌｃβ−ＯＲの化合物をβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼと接触させ、式Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲを有する化合物を生成する工程；および
（ｂ）ＣＭＰ−シアル酸の存在下、ＣＭＰ−シアル酸からシアル酸を転移するのに十分な条件下で、（ａ）で生成された化合物をα２，３−シアリルトランスフェラーゼと接触させ、式Ｓｉａα（２−３）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃ−β−ＯＲを有する化合物を生成する工程；
を包含するガングリオシドを、酵素的に合成する方法を与える。
【００５３】
ここでＲは、スフィンゴイドである。例えば、スフィンゴイドには、スフィンゴシン、フィトスフィンゴシン、スフィンガニン、およびセラミドが挙げられ得る。
【００５４】
本発明の方法は、以下：ａ）グリコシルトランスフェラーゼ反応混合物に有機溶媒を含める工程；およびｂ）グリコシルトランスフェラーゼサイクルを使用して、ＵＤＰ−ガラクトースおよびＣＭＰ−シアル酸のうちのどちらか一方または両方ともを生成する工程；からなる群から選択される、少なくとも１つの効率向上工程を実行する工程を包含する。現在好ましい実施態様において、脂肪酸は、ガラクトシルトランスフェラーゼ反応に先立ってスフィンゴイドから除去され、同じまたは異なる脂肪酸がグリコシルトランスフェラーゼ反応の生成物に付加される。
【００５５】
別の実施態様において、本方法は、さらに、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの存在下、ＧａｌＮＡｃが転移される条件で、工程ａ）で生成する化合物または工程ｂ）で生成する化合物をβ１，４−ガラクトサミニルトランスフェラーゼと接触させて、それぞれ式ＧａｌＮＡｃβ（１−４）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲまたは式ＧａｌＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲを有する化合物を生成する工程を包含する。
【００５６】
本方法は、さらに、ＵＤＰ−Ｇａｌの存在下、Ｇａｌが転移される条件で、式ＧａｌＮＡｃβ（１−４）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲまたは式ＧａｌＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲを有する化合物をβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼと接触させて、式Ｇａｌβ（１−３）ＧａｌＮＡｃβ（１−４）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲまたは式Ｇａｌβ（１−３）ＧａｌＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲを有するガラクトシル化化合物を生成する工程を包含し得る。
【００５７】
数種の実施態様において、本方法は、さらに、ＣＭＰ−シアル酸の存在下で、ＣＭＰ−シアル酸からシアル酸を転移するのに十分な条件下で、ガラクトシル化化合物をα２，３−シアリルトランスフェラーゼと接触させて、Ｓｉａα（２，３）Ｇａｌβ（１−３）ＧａｌＮＡｃβ（１−４）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲおよびＳｉａα（２，３）Ｇａｌβ（１−３）ＧａｌＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−３））Ｇｌｃβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲからなる群から選択された式を有するシアリル化化合物を生成する工程を包含する。シアリル化化合物は、シアル酸残基がＣＭＰ−シアル酸から転移される条件下で、α２，８−シアリルトランスフェラーゼおよびＣＭＰ−シアル酸と接触させて、以下：
Ｓｉａα（２，８）Ｓｉａα（２，３）Ｇａｌβ（１−３）ＧａｌＮＡｃβ（１−４）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲ；
Ｓｉａα（２，８）Ｓｉａα（２，３）Ｇａｌβ（１−３）ＧａｌＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲ；
Ｓｉａα（２，８）Ｓｉａα（２，３）Ｇａｌβ（１−３）ＧａｌＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲ；
Ｓｉａα（２，３）Ｇａｌβ（１−３）ＧａｌＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２，８）Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲ；および
Ｓｉａα（２，８）Ｓｉａα（２，３）Ｇａｌβ（１−３）ＧａｌＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２，８）Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲ、
からなる群から選択される式を有する化合物を形成し得る。
【００５８】
他の実施態様において、本発明は、ジシアリルガングリオシドを酵素的に合成する方法を与える。これらの方法は、シアル酸残基がＣＭＰ−シアル酸から転移される条件下で式Ｓｉａα（２−３）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃ−β−ＯＲを有する化合物をα２，８−シアリルトランスフェラーゼおよびＣＭＰ−シアル酸と接触させて、式Ｓｉａα（２−８）Ｓｉａα（２−３）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃ−β−ＯＲを有する化合物を生成する工程を包含し得る。例えば、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの存在下、ＧａｌＮＡｃが転移される条件で、式Ｓｉａα（２−８）Ｓｉａα（２−３）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃ−β−ＯＲを有する化合物をβ１，４−ガラクトサミニルトランスフェラーゼと接触させ、式ＧａｌＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−８）Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲを有する化合物を生成することによって、さらなる糖類残基がこの化合物に付加され得る。
【００５９】
別の実施態様において、本発明のこれらの方法は、さらに、ＵＤＰ−Ｇａｌの存在下、Ｇａｌが転移される条件で、式ＧａｌＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−８）Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲを有する化合物をβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼと接触させ、式Ｇａｌβ（１−３）ＧａｌＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−８）Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲを有するガラクトシル化化合物を生成する工程を包含する。この化合物は、ＣＭＰ−シアル酸の存在下、ＣＭＰ−シアル酸からシアル酸を転移するのに十分な条件で、ガラクトシル化化合物をα２，３−シアリルトランスフェラーゼと接触させて、式Ｓｉａα（２−３）Ｇａｌβ（１−３）ＧａｌＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−８）Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲを有するシアリル化化合物を生成する工程によってシアリル化され得る。所望である場合、シアル酸残基がＣＭＰ−シアル酸から転移される条件下で、シアリル化化合物をα２，８−シアリルトランスフェラーゼおよびＣＭＰ−シアル酸と接触させ、式Ｓｉａα（２−８）Ｓｉａα（２−３）Ｇａｌβ（１−３）ＧａｌＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−８）Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲを有する化合物を生成する工程によって、さらなるシアル酸が付加され得る。
【００６０】
本発明はまた、ラクト−およびネオラクト−化合物の生成方法を与える。これらの方法は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの存在下、ＧｌｃＮＡｃが転移される条件下で、Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲまたはＳｉａα（２−３）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃ−β−ＯＲをβ１，３−グルコサミニルトランスフェラーゼと接触させて、式ＧｌｃＮＡｃβ（１−４）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲまたは式ＧｌｃＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲを有する化合物をそれぞれ生成する工程を包含し得る。これらの生成物は、次には、ＵＤＰ−Ｇａｌの存在下、Ｇａｌが転移する条件で、β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ラクトについて）またはβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ネオラクトについて）と接触させて、以下：
Ｇａｌβ（１−３）ＧｌｃＮＡｃβ（１−４）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲ（ラクト）；
Ｇａｌβ（１−４）ＧｌｃＮＡｃβ（１−４）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲ（ネオラクト）；
Ｇａｌβ（１−３）ＧｌｃＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲ（ラクト）；および
Ｇａｌβ（１−４）ＧｌｃＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲ（ネオラクト）、
からなる群から選択される式を有するガラクトシル化化合物を生成し得る。
【００６１】
別の実施態様において、これらの生成物は、ＣＭＰ−シアル酸の存在下、ＣＭＰ−シアル酸からシアル酸を転移するのに十分な条件で、ガラクトシル化化合物をα２，３−シアリルトランスフェラーゼと接触させ、以下：
Ｓｉａα（２−３）Ｇａｌβ（１−３）ＧｌｃＮＡｃβ（１−４）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲ；
Ｓｉａα（２−３）Ｇａｌβ（１−４）ＧｌｃＮＡｃβ（１−４）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲ；
Ｓｉａα（２−３）Ｇａｌβ（１−３）ＧｌｃＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲ；および
Ｓｉａα（２−３）Ｇａｌβ（１−４）ＧｌｃＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲ、
からなる群から選択される式を有するシアリル化化合物を生成する工程によってシアリル化される。
【００６２】
これらのシアリル化化合物は、次には、シアル酸残基がＣＭＰ−シアル酸から転移される条件下で、α２，８−シアリルトランスフェラーゼおよびＣＭＰ−シアル酸と接触させて、以下：
Ｓｉａα（２−８）Ｓｉａα（２−３）Ｇａｌβ（１−３）ＧｌｃＮＡｃβ（１−４）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲ；
Ｓｉａα（２−８）Ｓｉａα（２−３）Ｇａｌβ（１−４）ＧｌｃＮＡｃβ（１−４）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲ；
Ｓｉａα（２−３）Ｇａｌβ（１−３）ＧｌｃＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−８）Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲ；
Ｓｉａα（２−３）Ｇａｌβ（１−４）ＧｌｃＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−８）Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲ；
Ｓｉａα（２−８）Ｓｉａα（２−３）Ｇａｌβ（１−３）ＧｌｃＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲ；および
Ｓｉａα（２−８）Ｓｉａα（２−３）Ｇａｌβ（１−４）ＧｌｃＮＡｃβ（１−４）（Ｓｉａα（２−３））Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−ＯＲ、
からなる群から選択される式を有する化合物を生成し得る。
【００６３】
特定の目的のスフィンゴイドには、例えば、スフィンゴシン、フィトスフィンゴシン、スフィンガニン、およびセラミドが挙げられる。スフィンゴイドは、天然に存在し得、あるいは合成的にまたは半合成的に生成され得る。本発明の方法を使用して生成し得る半合成的に生成されたガングリオシド誘導体の１つの例には、上記の式ＩＩのＲ２が脂質部分２−ジクロロアセチルアミドを含むＮ−ジクロロアセチルスフィンゴシン化合物（Ｋｈａｒｌａｍｏｖら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：６３０３〜６３０７（例えば、ＬＩＧＡ２０）およびＳｃｈｎｅｉｄｅｒら（１９９４）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ　４４：７４８に記載される）がある。数種の実施態様において、ジクロロアセチルスフィンゴシン（ｄｉｃｌｏｒｏａｃｅｔｙｌｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）化合物は、式ＩＩにおいて４−トランス−オクタデセンであるＲ３を有する。
【００６４】
本発明はまた、ガングリオシドおよび他のスフィンゴ糖脂質のアナログを合成する方法を与える。例えば、糖類ドナーとして作用する活性化されたヌクレオチドに糖アナログを付加する場合を除いて、上に記載のグリコシルトランスフェラーゼが使用され得る。アナログは、アナログ−ヌクレオチドが目的のグリコシルトランスフェラーゼにドナーとしてなお作用し得るように選ばれる。ガングリオシドを合成することに使用される適切なアナログの例は、例えば、米国特許第５，３５２，６７０号に記載される。
【００６５】
（Ｂ．脂肪酸の除去）
数種の実施態様において、本発明の方法は、グリコシルトランスフェラーゼを用いる反応に先立つグリコセラミドまたはスフィンゴイドからの脂肪酸部分の除去を包含する。スフィンゴ糖脂質から脂肪酸部分を除去する方法は、当業者に公知である。標準的な炭水化物およびスフィンゴ糖脂質化学の方法論が、例えば、Ｐａｕｌｓｏｎら（１９８５）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓ．１３７：３９〜６２；Ｂｅｉｔｈ−Ｈａｌａｈｍｉら（１９６７）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓ．５：２５〜３０；ＡｌａｉｓおよびＶｅｙｒｉｅｒｉｅｓ（１９９０）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓ．２０７：１１〜３１；ＧｒｕｄｌｅｒおよびＳｃｈｍｉｄｔ（１９８５）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓ．１３５：２０３〜２１８；Ｐｏｎｐｉｐｏｍら（１９７８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．１７１７〜１７２０；Ｍｕｒａｓｅら（１９８９）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓ．１８８：７１〜８０；Ｋａｍｅｙａｍａら（１９８９）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓ．１９３：ｃ１〜ｃ５；Ｈａｓｅｇａｗａら（１９９１）Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｃｈｅｍ．１０：４３９〜４５９；ＳｃｈｗａｒｚｍａｎｎおよびＳａｎｄｈｏｆｆ（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３１９〜３４１；ＧｕａｄｉｎｏおよびＰａｕｌｓｏｎ（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：１１４９〜１１５０（補足部分も含み、これはまた、本明細書中で参考として援用される）に記載されるように使用され得る。例えば、脂肪酸部分の加水分解は、塩基加水分解によってもたらされ得る。
【００６６】
一旦、グリコシル化反応が完了されると、同じであるかまたは異なる脂肪酸をグリコシル化反応の生成物に付加し得る。脂肪酸を結合するための方法は、当業者に公知である。
【００６７】
（Ｃ．有機溶媒の使用）
数種の実施態様において、グリコシルトランスフェラーゼ反応は、有機溶媒の存在下で行われる。現在好ましい実施態様において、脂肪酸部分が最初に上に記載のように加水分解される。酵素的触媒作用は、有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、クロロホルムなど、単一かまたは組み合わせるかのどちらか一方）の存在下で行われ得る。反応混合物中の有機溶媒の割合は、典型的には少なくとも約３％、より好ましくは少なくとも約５％、最も好ましくは少なくとも約８％である。反応混合物は、典型的には約２５％以下の有機溶媒を、より好ましくは約２０％以下の、最も好ましくは約１０％以下の有機溶媒を含む。現在好ましい実施態様では、反応混合物は、約８〜１０％のメタノールを含む。
【００６８】
反応混合物中の有機溶媒の使用は、以前に記載されたグリコシルセラミドの酵素的な合成方法を越えた数種の利点を与える。ネオラクト系列のガングリオシド６’−ｎＬＭ１の合成のための以前から公知の方法は、シアル酸に基づいて５％より低い収率で終了した（Ｈａｓｅｇａｗａら（１９９１）Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｃｈｅｍ．１０：４３９〜４５９）。反応混合物中に界面活性剤の存在を組み合わせての脂肪酸の除去を含む、引き続き報告された方法は、単に３０〜４０％の収率を得た（ＧａｕａｄｉｎｏおよびＰａｕｌｓｏｎ、上に記載）。本発明によって与えられる有機溶媒の使用は、以前に得られえたよりもずっと高い収率になるだけではなく、グリコシルセラミドのグリコシル部分への接近可能性を増加させるために、界面活性剤の必要性もまた排除する。これは得られたガングリオシドの精製を容易にする。しかし、界面活性剤もまた、本発明の方法に使用され得る。
【００６９】
（Ｄ．グリコシルトランスフェラーゼ反応条件）
本発明の方法でのグリコシル化工程は、好ましくは、酵素的に行われる。好ましい実施態様において、複数の酵素的工程が２以上の異なるグリコシルトランスフェラーゼを含む単一の反応混合物中で行われる。例えば、反応混合物中にシアリルトランスフェラーゼとガラクトシルトランスフェラーゼとの両方を含むことによって、同時にガラクトシル化工程およびシアリル化工程が行われ得る。この実施態様において、酵素および基質は最初の反応混合物中で合わせられ得、または好ましくは、第２のグリコシル化トランスフェラーゼサイクルのための酵素および試薬が、一旦、第１のグリコシル化トランスフェラーゼサイクルが完了に近づくと、反応媒体に加えられ得る。単一の容器内で順に２つのグリコシルトランスフェラーゼサイクルを行うことによって、全収率は、中間体種が単離される手順よりも改善される。さらに、余分な溶媒および副生成物の掃除および処分が減少される。
【００７０】
酵素の量または濃度は、活性ユニット（これは触媒の初期速度の尺度である）で表現される。１活性ユニットは、所与の温度（典型的には３７℃）およびｐＨ値（典型的には７．５）で１分につき１μｍｏｌの生成物の生成を触媒する。従って、酵素の１０ユニットは、１０μｍｏｌの基質が３７℃の温度および７．５のｐＨ値で一分間に１０μｍｏｌの生成物に転換される酵素の触媒量である。酵素は、溶液内で遊離して利用され得、またはポリマーなどの支持体に結合され得る。従って、反応混合物は、いくらかの沈澱物が反応の間に形成し得るものの、初めは実質的に均一である。
【００７１】
グリコシル化反応は、適切なグリコシルトランスフェラーゼおよびアクセプターに加えて、グリコシルトランスフェラーゼに対する糖ドナーとして働く活性化された糖ヌクレオチドを含む。本反応はまた、グリコシルトランスフェラーゼ活性を促進する他の成分を含み得る。これらの成分には、二価のカチオン（例えば、Ｍｇ＋２またはＭｎ＋２）、ＡＴＰ再生のために必要な材料、ホスフェートイオン、および有機溶媒が挙げられ得る。プロセスに使用される多様な反応物の濃度および量は、温度およびｐＨ値などの反応条件、ならびにグリコシル化される糖類アクセプターの選択および量を含む多くの因子に依存する。反応媒体はまた、必要であれば、可溶化界面活性剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎまたはＳＤＳ）および有機溶媒（メタノールまたはエタノールなど）を含み得る。
【００７２】
最適化された反応において、上記成分は、約６〜約８．５のｐＨ値を有する水性反応媒体（溶液）内での混合によって合わされ得る。媒体は、Ｍｇ＋２またはＭｎ＋２などの酵素補因子と結合するキレーターを欠いている。媒体の選択は、ｐＨ値を所望のレベルに維持する媒体の能力に基づく。従って、数種の実施態様において、媒体は、好ましくはＨＥＰＥＳを用いて、約７．５のｐＨ値に緩衝される。緩衝液が使用されない場合、媒体のｐＨは、塩基の添加によって約６〜８．５、好ましくは約７．２〜７．８に維持されるべきである。適切な塩基は、ＮａＯＨ、好ましくは６ＭのＮａＯＨである。
【００７３】
上記のプロセスが行われる温度は、凍結するよりちょうど上から最も敏感な酵素が変成する温度までに及び得る。この温度範囲は、好ましくは、約０℃〜約１１０℃、より好ましくは約２０℃〜約３０℃であり、または好熱性の有機体についてはより高い。
【００７４】
このように生成した反応混合物は、グリコシルトランスフェラーゼが高い割合のアクセプターをグリコシル化するのに十分な時間の間、維持される。生成物のうちのいくらかは、しばしば、通常２４時間内で得られる回収可能量で数時間後に検出され得る。工業規模の調製のために、本反応は、しばしば、約８〜２４０時間、より典型的には約２４時間と約４８時間との間の時間で進行させれらる。
【００７５】
数種の現在好ましい実施態様において、グリコシル化工程は、１以上の反応成分が再生されるハーフサイクルまたはフルサイクルを使用して行われる。グリコシルトランスフェラーゼサイクルおよびハーフサイクルは、米国特許第５，７２８，５５４号に記載される。例えば、ガラクトシル化工程はガラクトシルトランスフェラーゼサイクルの一部として行われ得、シアリル化工程は好ましくはシアリルトランスフェラーゼサイクルの一部として行われる。これらのうちの各々で、他の種および酵素の好ましい条件および説明、および他のもの、サイクルが記載された。例えば、同一出願人に譲渡された米国仮特許出願第６０／０７１，０７６号（１９９８年１月１５日に出願）および米国特許出願番号第０８／６２８，５４３号（１９９６年４月１０日に出願）を参照のこと。
【００７６】
例として、グリコシルセラミドのシアリル化は、シアリルトランスフェラーゼサイクルを用いて達成され得、これは、ＣＭＰ−シアル酸シンテターゼを利用したＣＭＰ−シアル酸リサイクルシステムを含む。ＣＭＰ−シアル酸は、比較的高価なので、このシアル酸供与体部分のインサイチュでの合成は、本願方法によって、提供される経済的利点を向上させる。シアリルトランスフェラーゼサイクルは、例えば、米国特許第５，３７４，５４１号に記載される。この実施態様において用いられるＣＭＰ−シアル酸再生システムは、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、ヌクレオシド三リン酸、リン酸供与体、リン酸供与体からヌクレオシド二リン酸へリン酸を転移させることが可能なキナーゼ、およびヌクレオシド三リン酸からＣＭＰへ末端のリン酸を転移させることが可能なヌクレオシド一リン酸キナーゼを含む。
【００７７】
この再生システムにはまた、シアル酸をＣＭＰに転移するＣＭＰ−シアル酸シンテターゼも使用する。ＣＭＰ−シアル酸シンテターゼは、当該分野で周知の手順によりシンテターゼ酵素を含有する細胞および組織から単離および精製され得る。例えば、Ｇｒｏｓｓら（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６８：５９５；Ｖｉｊａｙら（１９７５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０：１６４；Ｚａｐａｔａら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４７６９；およびＨｉｇａら（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：８８３８を参照のこと。この酵素の遺伝子はまた、配列決定された。Ｖａｎｎら、（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：１７５５６を参照のこと。この遺伝子の過剰発現は、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃのグラムスケールの合成における使用について報告されている。Ｓｈａｍｅｓら（１９９１）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１：１８７を参照のこと。この酵素はまた、市販されている。
【００７８】
ＣＭＰ−シアル酸再生システムによる使用のために適切なヌクレオシド三リン酸は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、イノシン三リン酸（ＩＴＰ）およびチミジン三リン酸（ＴＴＰ）である。好ましいヌクレオシド三リン酸は、ＡＴＰである。
【００７９】
ヌクレオシド一リン酸キナーゼは、ヌクレオシド一リン酸のリン酸化を触媒する酵素である。本発明のＣＭＰ−シアル酸再生システムに関連して使用されるヌクレオシド一リン酸キナーゼ（ＮＭＫ）またはミオキナーゼ（ＭＫ；ＥＣ２．７．４．３）は、ＣＭＰのリン酸化を触媒するのに使用される。ＮＭＫは、市販されている（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）。
【００８０】
リン酸供与体およびリン酸供与体から活性化ヌクレオチドへリン酸の転移を触媒するキナーゼの触媒量はまた、ＣＭＰ−シアル酸再生システムの一部である。再生システムのリン酸供与体は、リン酸化された化合物、すなわちヌクレオシドリン酸をリン酸化するのに使用され得るリン酸基である。リン酸供与体の選択において唯一の制限は、リン酸供与体のリン酸化および脱リン酸化の形態が、どちらも実質的に、シアリル化されたガラクトシルグリコシドの形成に関与する反応のいずれをも妨害し得ないということである。好ましいリン酸供与体は、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）およびアセチルホスフェートである。特に好ましいリン酸供与体は、ＰＥＰである。
【００８１】
シアル酸サイクルにおける使用のための特定のキナーゼの選択は、使用されるリン酸供与体に依存する。アセチルホスフェートが、リン酸供与体として使用される場合、キナーゼはアセチルキナーゼである。ＰＥＰがリン酸供与体として使用される場合、キナーゼはピルベートキナーゼ（ＰＫ；ＥＣ２．７．１．４０）である。他のキナーゼは、当業者に周知のように他のリン酸供与体とともに使用され得る。キナーゼは、市販されている（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）。
【００８２】
このグルコシル化の方法の自給および循環的特徴によって、いったん全ての反応物および酵素が存在すれば、化学量論的な最初の基質（例えば、遊離のＮｅｕ５ＡｃおよびＰＥＰ）が消費されるまでこの反応は継続する。
【００８３】
このシアリル化サイクルにおいて、ＣＭＰは、添加したＡＴＰの存在下、ヌクレオシド一リン酸キナーゼによりＣＤＰに転換される。添加したホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）の存在下、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）によって、ＡＴＰは、その副生成物であるＡＤＰから触媒的に再生される。さらに、ＣＤＰはＣＴＰに転換され、この転換は、ＰＥＰの存在下ＰＫによって触媒される。ＣＴＰは、シアル酸と反応し、無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）およびＣＭＰ−シアル酸を形成し、この後者の反応は、ＣＭＰ−シアル酸シンテターゼにより触媒される。ガラクトシルグリコシドのシアリル化に続き、放出されたＣＭＰは再生システムに再度入り、ＣＤＰ、ＣＴＰおよびＣＭＰ−シアル酸を再形成する。形成されたＰＰｉは、以下に記載するように捕捉され、副生成物として無機ホスフェート（Ｐｉ）を形成する。ピルベートもまた、副生成物である。
【００８４】
副生成物であるピルベートもまた、別の反応において使用され得、この反応においてＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）およびピルベートがＮｅｕＡｃアルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．３）の存在下で反応し、シアル酸を形成する。従って、このシアル酸は、ＭａｎＮＡｃおよび触媒量のＮｅｕＡｃアルドラーゼによって置換され得る。ＮｅｕＡｃアルドラーゼはまた、逆反応（ＮｅｕＡｃからＭａｎＮＡｃおよびピルベートヘ）を触媒するが、生成したＮｅｕＡｃは、放出された無機ピロホスフェートの無機ピロホスファターゼ（ＰＰａｓｅ）触媒分解と共役したＣＭＰ−シアル酸シンテターゼによって触媒されたＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを介して、反応サイクルに不可逆的に取り込まれる。シアル酸およびその９置換誘導体の酵素によるこの合成ならびに異なったシアリル化反応スキームにおける得られたシアル酸の使用は、１９９２年１０月１日に公開された国際出願ＷＯ９２／１６６４０で開示される。
【００８５】
本明細書中で使用される、用語「ピロホスフェート捕捉剤」とは、本発明の反応混合物から無機ピロホスフェートを取り除くのに役立つ物質をいう。無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃの調製の副生成物である。生成するＰＰｉは、フィードバックして他の酵素を阻害し、その結果グリコシル化が減少し得る。しかし、ＰＰｉは酵素的に、またはＰＰｉ結合物質による隔離のような物理的手法により分解され得る。好ましくは、ＰＰｉは、無機ピロホスファターゼ（ＰＰａｓｅ；ＥＣ３．６．１．１）、市販されているＰＰｉ異化酵素（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）、およびピロホスフェート捕捉剤として役立つこの酵素または類似の酵素、を使用して加水分解することにより除去される。ＰＰｉまたはＰｉをこの反応混合物から取り除く１つの方法は、媒体中で２価の金属カチオン濃度を維持することである。特に、このカチオンおよび生成される無機ホスフェートは、非常に低溶解性の錯体を形成する。ピロホスフェートとの沈殿によって失われるカチオンを補充することで、反応速度は保持され得、そして反応は完了し得る（すなわち１００％の転換）。補充は、連続的に（例えば、自動化によって）または不連続的に実施され得る。このようにカチオン濃度が維持される場合、このトランスフェラーゼ反応サイクルが駆動されて完了し得る。
【００８６】
グリコシルトランスフェラーゼサイクルに関して、このプロセスで使用される様々な反応物質の濃度または量は、温度およびｐＨ値のような反応条件、ならびにグリコシル化され受容体サッカリドの選択および量を含む、多数の要因に依存する。グリコシル化のプロセスは、酵素の触媒量の存在下、活性化するヌクレオチド、活性化された供与体糖の再生および生成するＰＰｉの捕捉を可能にするので、このプロセスは、上記で記載した化学量論的な基質の濃度または量によって制限される。本発明の方法に従って、使用され得る反応物質濃度の上限は、このような反応物質の溶解性によって決定される。好ましくは、グリコシル化が、受容体が消費されるまで進み、従って糖タンパク質に存在するサッカリド基を完全にシアリル化するように、活性化するヌクレオチド、リン酸供与体、供与体糖および酵素の濃度を選択する。
【００８７】
いくつかの現在、好ましい実施態様において、グリコシル化反応は、受容体と以下を含む細胞とを接触させることにより実施される：ａ）ヌクレオチド糖を生成するための酵素システム、およびｂ）このヌクレオチド糖から受容体へ糖の転移を触媒し所望のグリコスフィンゴイド（ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｉｄ）を生成する組換えグリコシルトランスフェラーゼ。この細胞は一般に、透過性にされそして反応混合物に添加される。複数のグリコシルトランスフェラーゼ工程を必要とする反応に関して、１種より多くの組換えグリコシルトランスフェラーゼを含み、そして全てのグリコシルトランスフェラーゼに対応するヌクレオチド糖を生成する細胞を使用し得る。１種以上のグリコシルトランスフェラーゼをそれぞれ含む細胞型の混合物が使用され得、または複数のグリコシルトランスフェラーゼシステムが一種の細胞型に存在し得る。適切な方法は、例えば、各表題が「Ｌｏｗ　Ｃｏｓｔ　Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ　Ｏｆ　Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ」の同一人に譲渡された特許出願（１９９８年１１月１８日（代理人整理番号１４１３７−０１３８００ＵＳ）および１９９８年１１月１９日（代理人整理番号１４１３７−０１３８１０ＵＳ）出願）に記載される。
【００８８】
上記のプロセスによって生成された生成物は、精製せずに使用され得る。しかし、生成物を回収することが通常好ましい。糖脂質およびガングリオシドを精製するために、糖脂質調製のための標準的な方法が使用され得る（例えば、Ｌｅｄｅｅｎら（１９７３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２１：８２９を参照のこと）。例えば、糖脂質は、Ｋａｎｎａｇｉら（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１４８６５に記載されるようにして、クロロホルム／メタノール（２：１）およびイソプロピルアルコール／ヘキサン／水（５５：２５：２０）により反応混合物から抽出され得る。得られた抽出液は、クロロホルム／メタノール／水（３：２：１）のＦｏｌｃｈ分配によって分配される。得られた抽出液の上相にはガングリオシドを含有し、そして下相には糖脂質を含有する。ガングリオシド（少なくとも１個のシアル酸部分を含有するグリコスフィンゴリピド）を含有する上相は、ＬｅｄｅｅｎおよびＹｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．８３：１３９（１９８２）に詳細に記載されるようにＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフィーを使用して単離され、そして中性および酸性分画に分離される。この得られたガングリオシドは、プールされ、凍結乾燥され、そしてクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解させる。このＦｏｌｃｈ分配の下相は、糖脂質を含有する。これらは、Ｓｙｍｉｎｇｔｏｎによって開示されるように溶媒系としてクロロホルム／メタノール／水（６０：３５：８）を用いた分取用の薄層クロマトグラフィーによって、単離および分離される。
【００８９】
グリコシル化サッカリドの回収のための他の標準的な周知の技術（例えば薄層または厚層クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを含む）が適切である。好ましい精製の方法は、本明細書中の以下および本明細書に示す文献で議論したように、膜濾過、より好ましくは逆浸透膜、または回収のために１個以上のカラムクロマトグラフィーの技術を利用することを含む。例えば、膜が約３０００から約１０，０００の分子量カットオフを有する膜濾過は、タンパク質を取り除くのに使用され得る。次にナノ濾過または逆浸透は、塩を除去および／または可溶性オリゴサッカライド生成物を精製するのに使用され得る（例えば、米国特許出願第０８／９４７，７７５号、１９９７年１０月９日出願を参照のこと）。ナノ透過膜は、逆浸透膜の一種である。これは、使用する膜に依存して、一価の塩は通すが、しかし多価の塩および約１００ダルトンから約７００ダルトンよりも大きい非荷電の溶質は保持する。従って、典型的な用途において、本発明の方法により調製されるサッカリドは、膜に保持され、そして混入している塩は、膜を通り抜ける。
【００９０】
所望のオリゴサッカリドを含むガングリオシドおよび糖脂質を同定するために、免疫化学糖脂質分析が、Ｍａｇｎａｎｉら（１９８０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０９：３９９の手順に従って実施され得る。簡単に述べると、上記のガングリオシドのプールは、薄層クロマトグラフィーにより、クロマトグラフィーにかけられる。次いで、薄膜プレートは、目的のオリゴサッカリドに特異的に結合する１２５Ｉ標識された抗体とともにインキュベートする（例えば、ＳＬＸに特異的に結合するＦＨ６）。標識された抗体とのインキュベートに続いて、このプレートを放射線検出フィルムに暴露させ、そして現像する。Ｘ線フィルムの黒色のスポットは、モノクローナル抗体に結合するガンリオシドに対応し、そしてこれらのガングリオシドは、シリカプレートの対応する区域を削り落とし、クロロホルム／メタノール／水でガングリオシドを溶出することで回収される。糖脂質をまた、乾燥し、クロロホルムに再懸濁し、類似の薄層系で展開し、そして放射線標識された抗体でプローブする。
【００９１】
本発明の方法を使用して生成したオリゴサッカリドを分析し得る他の方法は、当業者にとって公知である。例えば、炭水化物単位は、例えば、アルカリ性のβ−脱離によりグリコスフィンゴイドまたはグリコシルセラミドから放出され、例えば、そしてゲル濾過によりセラミド部分またはスフィンゴイド部分から分離され得る。次に得られたオリゴサッカライドは、ゲル濾過、ＨＰＬＣ、薄層クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーの組合わせを使用することによって互いに分離され、そして完全に分析され得る。精製されたオリゴサッカリド単位の完全な構造分析は、モノサッカリド単位、これらの環状態、立体配置（ＤまたはＬ）、アノマー結合（αまたはβ）、糖とこの配列との間の結合の位置、の決定を必要とする。さらに、任意の置換基の位置が確定される。メチル化分析を用いて、モノサッカリド間のグリコシド結合の位置が決定される。糖残基のアノマーの立体配置は、５００−ＭＨｚ１Ｈ　ＮＭＲ分光法を使用して決定され得る。完全な構造的な炭水化物分析を行うために用いられる条件および方法は、一般にＢｅｅｌｅｙ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＢｕｒｄｏｎおよびＫｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ編，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８５），Ｈｏｕｎｓｅｌｌ，「Ｇｌｙｃｏａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第７６巻、１９９８、ならびにＥｌ　Ｒａｓｓｉ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ａｎｄ　Ｃａｐｉｌｌａｒｙ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｌｔｄ，第５８巻（１９９４）に記載される。
【００９２】
オリゴサッカリドの糖を完全に帰属するためのさらなる技術は、ＦＡＢ−ＭＳ（高速原子衝撃質量分析法）、ＨＰＡＥ（高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィー）および１Ｈ−ＮＭＲを含む。これらの技術は、相補的である。これらの技術がどのようにオリゴサッカライドの構造を完全に帰属するのに使用されるのかについての最近の例は、Ｓｐｅｌｌｍａｎら、（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６４：１４１００およびＳｔａｎｌｅｙら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１１３７４による分析に見出され得る。他の方法は、陽イオン高速原子衝撃質量分析法（ＦＡＢ−ＭＳ）およびガスクロマトグラフィー−電子衝突質量分析法（ＧＣ／ＥＩ−ＭＳ）によるメチル化分析を含む（ＥＰＯ出願第８９３０５１５３．２を参照のこと）。
【００９３】
Ｅ．ガングリオシドおよび他のグリコスフィンゴイドについての使用
本発明の方法を使用して作られるガングリオシドおよび他の化合物は、例えば、抗原として、診断試薬、または治療剤としての様々な用途に使用され得る。例えば、ガングリオシドは、脊髄および他の神経系傷害（例えば、Ｓｋａｐｅｒら（１９８９）Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．３：１７３；Ｓａｍｓｏｎ（１９９０）Ｄｒｕｇ　Ｄｅｖｅｌ．Ｒｅｖ．１９：２０９〜２２４を参照のこと）、脳卒中、くも膜下出血、認識欠損症（Ｋｈａｒｌａｍｏｖら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：６３０３−６３０７）、パーキンソン病（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ（１９９８）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４５：３６３〜７３）、グルタミン酸神経毒性（Ｃｏｓｔａら（１９９４）　Ｉｎ　Ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ，Ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｅｍｉａ，ａｎｄ　Ｈｅｐａｔｉｃ　Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ，ＧｒｉｓｏｌｉｎおよびＦｅｌｉｐｏ編，Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９４，ｐ．１２９）、および他の状態を処置するに有用であると報告されてきた。総説として、例えば、Ｎｏｂｉｌｅ−Ｏｒａｚｉｏら（１９９４）Ｄｒｕｇｓ　４７：５７６〜５８５を参照のこと。ガングリオシドは、しばしば腫瘍に関連する局所的な免疫抑制に関与するので（Ｒｏｄｄｅｎら（１９９１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７４：６０６〜６１９）、これらのガングリオシドをブロックしまたは破壊する薬剤は、免疫系へ腫瘍が近づきにくいことを減少させるのに有用である。ガングリオシドの免疫抑制効果は、例えば移植された臓器の拒絶を抑えるのに有用である。ガングリオシドはまた、癌に対するワクチンとして有用である（例えば、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／００７５７（公開番号ＷＯ９４／１６７３１）を参照のこと）。アジュバンドを含めることおよび／または抗原送達系を使用すること（例えば、プロテオソーム、細菌の外膜タンパク質など）は、ガングリオシドのワクチンとしての有効性を増強し得る（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら（１９９３）Ｖａｃｃｉｎｅ　１１：１１９９）。
【００９４】
従って、本発明はまた、様々な状態を処置するのに使用され得る薬理学的組成物を提供する。薬学的に組成物は、本発明の方法を使用して合成されるガングリオシドまたはグリコスフィンゴイドを、薬学的に受容可能なキャリアとともに含有する。本発明の薬学的組成物は、様々な薬物送達系における使用に適切である。本発明で使用するための適切な処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，第１７版（１９８５）に見出される。薬剤送達のための方法の簡単な総説は、例えば、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：１５２７〜１５３３（１９９０）を参照のこと。
【００９５】
この薬学的組成物は、非経口の、鼻腔内の、局所の、経口のまたはエアゾルによるかもしくは経皮的のような局所の投与、予防的なおよび／または治療的な処置を意図したものである。一般に、薬学組成物は、非経口で、例えば静脈内に投与される。従って、本発明は、受容可能なキャリア、好ましくは水性キャリア（例えば水、緩衝化水、生理食塩水、ＰＢＳなど）に溶解または懸濁される化合物を含有する非経口の投与のための組成物を提供する。この組成物は、生理学的条件に近づけるために必要に応じて薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調整および緩衝剤、張度性調整剤、湿潤剤、界面活性剤など）を含有し得る。
【００９６】
これらの組成物は、従来の滅菌技術により滅菌され得るか、または濾過滅菌され得る。これにより得られた水溶液は、そのままで用いるためにパッケージされ得るか、または凍結乾燥され得、この凍結乾燥された調製物は、投与に先立って、滅菌水性キャリアと組み合わせられる。調製物のｐＨは、典型的には、３〜１１の間であり、より好ましくは５〜９であり、そして最も好ましくは、７〜８である。
【００９７】
いくつかの実施態様において、本発明を用いて作られるガングリオシドおよび他のグリコスフィンゴイド（ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｉｄ）は、標準的な小胞形成脂質から形成されるリポソーム中に組込まれ得る。種々の方法が、例えば以下に記載されるようにリポソームの調製に利用可能である：Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、および同第４，８３７，０２８号。種々の標的化薬剤を用いたリポソームの標的化（例えば、本発明のガングリオシドのオリゴ糖成分）が、当該分野において周知である（例えば、米国特許第４，９５７，７７３号および同第４，６０３，０４４号を参照のこと）。
【００９８】
ガングリオシドおよび他のグリコスフィンゴイドを含有する組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与され得る。治療的な適用において、組成物は、その疾患およびそれらの合併症の症状の、治癒または少なくとも部分的な停止に十分な量で、上述のような疾患をすでに罹患した患者に、投与される。これを達成するのに十分な量が、「治療的に有効な用量」として定義される。この使用に有効な量は、この疾患の重篤度、ならびに患者の体重および一般的な状態に依存するが、一般的な範囲は、７０ｋｇの患者について１日当たり、約０．５ｍｇ〜約４０ｇのオリゴ糖であり、１日当たり約５ｍｇ〜約２０ｇの化合物が投薬量として、より一般的に用いられる。
【００９９】
組成物の単独または複数の投与は、処置医により選択された、用量レベルおよびパターンで実行され得る。任意の事象において、薬学的処方物は、患者を有効に処置するのに十分な量の本発明のオリゴ糖を、提供するべきである。
【０１００】
ガングリオシドおよび他のグリコスフィンゴイドはまた、診断試薬としての使用が見出され得る。本発明の方法により作製されるガングリオシドを含有する診断試薬、または特定のガングリオシドに結合する部分（例えば、レクチンおよび抗体）は、例えば、以下を含むいくつかの状態の診断に有用である：ファブリー病（−Ｇａｌ−−Ｇａｌ−−ＧａｌＣｅｒ）、ファーバー病（セラミド；Ｎ−アシルスフィンゴシン）、ゴシェ病（グルコセレブロシド）、ＧＭ１ガングリオシドーシス（ＧＭ１ガングリオシド）、異染性白質萎縮症（スルファチド；硫酸セレブロシド）、サンドホッフ病（ＧＭ２ガングリオシド）、テイ‐サックス病（ＧＭ２ガングリオシド）。この使用のために、これらの化合物は、例えば、１２５Ｉ、１４Ｃまたはトリチウムのような放射性同位元素を含む、適切な標識で標識化され得る。
【０１０１】
本発明の方法を用いて作製されるガングリオシドおよび他のグリコスフィンゴイドは、これらの化合物と特異的に反応するモノクローナルまたはポリクローナル抗体の産生のための免疫原として用いられ得る。種々の免疫グロブリン分子の産生および操作のために、当業者が利用可能な多くの技術が、本発明において使用され得る。抗体は、当業者に周知の種々の手順により産生され得る。所望の場合、抗体の産生は、試験動物への化合物の投与に先立って、ガングリオシドまたは他のグリコスフィンゴリピドの免疫原性タンパク質（例えば、ＫＬＨ）への結合のより増強され得る（ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００７５７、公開番号ＷＯ　９４／１６７３１を参照のこと）。ガングリオシドおよび他のグリコスフィンゴリピドに対する抗体の使用には、癌の診断が挙げられ、そしてこれらは、例えば、米国特許第４，８８７，９３１号に記載される。
【０１０２】
例えば、マウス、ウサギ、ウマなどの非ヒトモノクローナル抗体の産生は、周知であり、そして例えば、本発明のオリゴ糖を含む調製物での動物の免疫化により達成され得る。免疫化された動物から得た抗体産生細胞は、不死化およびスクリーニングされるか、または所望の抗体の産生のためにまずスクリーニングされ、そして次いで不死化される。モノクローナル抗体産生の一般的な手順の記載については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８８）を参照のこと。
【０１０３】
以下の実施例は、例示のために提供され、本発明を限定しない。
【０１０４】
（実施例１）
（リソ−ラクトシル（ｌｙｓｏ−ｌａｃｔｏｓｙｌ）セラミドのシアリル化）
本実施例は、リソ−ラクトシルセラミドのシアリル化のための反応条件を記載する。ラクトシルセラミドは、ウシバターミルクから得られ、そして脂肪酸部分を、リソ−ラクトシルセラミドを形成するために、塩基加水分解により取り除いた。ＨＥＰＥＳ緩衝液（２００ｍＭ、８％ＭｅＯＨを含む、ｐＨ７．５、５０μＬ）中のリソ−ラクトシルセラミド（１．０ｍｇ、１．６μｍｏｌ）およびＣＭＰ−シアル酸（２．４６ｍｇ、純度６５％、２．４０μｍｏｌ）の混合物を、２０分間超音波処理した。次いで、α２，３シアリルトランスフェラーゼ（１０μＬ、５Ｕ／ｍＬ、５０ｍＵ）を添加し、続いてアルカリホスファターゼ（１μＬ、１．０×１０５Ｕ／ｍＬ、１００Ｕ）を加えた。この反応混合物を室温に保った。１日後、さらなるα２，３シアリルトランスフェラーゼ（１０μＬ、５Ｕ／ｍＬ、５０ｍＵ）を加えた。さらに４日後、さらなるα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（１０μＬ、５Ｕ／ｍＬ、５０ｍＵ）の一部を加えた。さらに、もう１日室温に置いた後、薄層クロマトグラフィーにより、反応がほぼ完了したことが示された。
【０１０５】
（実施例２）
（ウシバターミルクから得たラクトシルセラミドからのＧＭ２の合成）
ウシバターミルクから得たラクトシルセラミドからのガングリオシドＧＭ２の合成のために２つの回路を示した模式図を、図１に示す。左に示した回路において、脂肪酸は、シアリル化に先立って、ラクトシルセラミドから取り除かれず、そしてこの反応は、有機溶媒の存在下では行なわれない。対照的に、右側の反応は、有機溶媒の存在下で行い、そして脂肪酸を除去する。
【０１０６】
まず初めに、脂肪酸を、塩基および水での処理によりラクトシルセラミドから加水分解する（工程１）。次いで、シアル酸残基を、α２，３−シアリルトランスフェラーゼ、好ましくはＳＴ３ＧａｌＩＶを用いて、ガラクトース残基に酵素的に転移させることにより付加する（工程２）。この反応は、有機溶媒の存在下において実行し得る。次いで、ＧａｌＮＡｃ残基を、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼを用いて、β１，４結合中のガラクトースに結合させる（工程３）；この工程は、有機溶媒の存在下において、実行されてもよいし、または実行されなくてもよい。最後に、脂肪酸部分を、所望のＧＭ２ガングリオシドを得るために、スフィンゴシンに再結合させる。典型的に、この反応は、シアリル化の間の有機溶媒の存在に起因してほぼ完了まで進行する。
【０１０７】
各々の工程の効率は、ＴＬＣまたは他の分析的方法によって、モニターされ得る。反応は、典型的に、９０％より多くの収率が得られる場合に、完了したと考えられる。
【０１０８】
（実施例３）
（植物グルコシルセラミドからのガングリオシドの合成）
この実施例は、前駆体として植物グルコシルセラミドを用いた、ＧＭ２ガングリオシドの合成のための３つの代替的な手順を記載する（図３）。回路１において、β１，４−ガラクトシダーゼを、グルコシルセラミドへの、Ｇａｌ残基の転移を触媒するために用いる。同時に、Ｇａｌにシアル酸残基が結合するように、シアリルトランスフェラーゼ回路において、α２，３−シアリルトランスフェラーゼを用いる。次に、β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼを、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃと、またはＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ回路の一部としてのいずれかで、反応混合物に加える。この工程において、ＧａｌＮＡｃ残基を、α２，３結合でＧａｌ残基に結合する。
【０１０９】
グリコシルセラミドへのＧａｌの付加が、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素により触媒されるという点で、回路２は、回路１に示した合成と異なり、これは、糖受容体としてガラクトシルトランスフェラーゼ回路またはＵＤＰ−Ｇｌｃ／Ｇａｌのいずれかを用いる。シアリル化およびＧａｌＮＡｃの付加を上述のように行なって、ＧＭ２を得る。
【０１１０】
回路３において、最初に脂肪酸を、グリコシルトランスフェラーゼ工程に先立って、水性の塩基での処理によって取り除く。ガラクトシル化、シアリル化、およびＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ反応は、回路２において実行されるように実行される。ＧａｌＮＡｃ残基の付加に続いて、脂肪酸が分子に結合される。脂肪酸は、本来植物グルコシルセラミドにおいて見出される物と同じであり得るか、または異なり得る。図３に示した実施例において、活性型Ｃ１８脂肪酸を使用して、ＧＭ２の合成を生じる。一般的に、グリコシル化反応に先立って脂肪酸を取り除いた場合より高い効率が、観察される。
【０１１１】
各工程の効率は、ＴＬＣまたは他の分析法によりモニターし得る。
【０１１２】
（実施例４）
（グリコシルセラミドからのガングリオシドＧＭ２の合成）
この実施例は、前駆体としてグリコシルセラミドを用いた、ＧＭ２および他のガングリオシドの合成のための３つの代替的な手順を記載する（図４）。回路１において、β１，４−ガラクトシダーゼを、グリコシルセラミドへのＧａｌ残基の転移を触媒するために用いる。同時に、α２，３−シアリルトランスフェラーゼを、シアル酸残基のＧａｌへの結合のためにシアリルトランスフェラーゼ回路において用いる。次に、β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼを、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ回路の一部のいずれかとともに反応混合物に添加する。この工程において、ＧａｌＮＡｃ残基を、α２，３結合でＧａｌ残基に結合する。
【０１１３】
グリコシルセラミドへのＧａｌの付加が、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素により触媒されるという点において、回路２は、回路１に示される合成と異り、これは、ガラクトシルトランスフェラーゼ回路またはアクセプター糖としてＵＤＰ−Ｇｌｃ／Ｇａｌのいずれかを用いる。シアリル化およびＧａｌＮＡｃの付加を、上述のように行なって、ＧＭ２を得る。
【０１１４】
回路３において、最初に脂肪酸を、グリコシルトランスフェラーゼ工程に先立って、水性塩基での処理によって取り除く。ガラクトシル化、シアリル化、およびＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ反応を、回路２において実行されるように実行する。ＧａｌＮＡｃ残基の付加に続いて、脂肪酸を分子に結合する。図４に示した実施例において、活性型Ｃ１８脂肪酸を用いて、ＧＭ２の合成を得る。一般的に、グリコシル化反応に先立って脂肪酸を取り除いた場合より高い効率が、観察される。
【０１１５】
それぞれの合成回路後、さらなるグリコシルトランスフェラーゼを使用して、さらに複合体ガングリオシドを得るために、さらなるサッカライド残基を付加し得る。各工程の効率は、ＴＬＣおよび他の分析法を用いてモニターし得る。
【０１１６】
（実施例５）
（ＧＭ２ガングリオシドの合成）
この実施例は、脱アシル化、２つの連続的な酵素的グリコシル化、そして最終的な化学的アシル化によるラクトシルセラミドからのガングリオシドＧＭ２の調製を記載する。この反応順序は、全収率の３０％のＧＭ２を提供した。この合成に用いるスキームを、図５に示す。
【０１１７】
（方法）
（Ａ．ＫＯＨによる加水分解の手順）
ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）中のラクトシルセラミド（１００ｍｇ、０．１０４ｍｍｏｌ）およびＫＯＨ（１．１２ｇ）の混合物を、密封した管中で１０５〜１１０℃で２４時間加熱した。次いで、反応物を、ＡｃＯＨにより酸性化し、次いで濃縮した。この残渣をＣ−１８カラムにロードし、そしてメタノールおよび水（５０：５０〜１０：０）で溶出してラクトシルスフィンゴシンを得た（４６ｍｇ、収率７１％）。
【０１１８】
（Ｂ．ヒドラジンによる加水分解の手順）
ラクトシルセラミド（１００ｍｇ、０．１０４ｍｍｏｌ）およびヒドラジン（５ｍＬ）の混合物を、密封した管中で１４５〜１５５℃で２４時間加熱した。次いで、反応物を、ＡｃＯＨにより酸性化し、そして濃縮した。この残渣をＣ−１８カラムにロードし、そしてメタノールおよび水（５０：５０〜１００：０）で溶出してラクトシルスフィンゴシン（ｌａｃｔｏｓｙｌｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）を得た（４１ｍｇ、収率６３％）。
【０１１９】
（Ｃ．シアリルトランスフェラーゼ反応の手順）
ＨＥＰＥＳ緩衝液（２００ｍＭ、８％ＭｅＯＨ含有、ｐＨ７．５、２．０ｍＬ）中のリソ−ラクトシルセラミド（３８ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）およびＣＭＰ−シアル酸（９３ｍｇ、０．０９１５ｍｍｏｌ）の混合物に、α−２，３シアリルトランスフェラーゼ（０．６ｍＬ、３Ｕ）およびアルカリホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（４００Ｕ）を加えた。反応混合物を室温に保った。１日後、α−２，３シアリルトランスフェラーゼ（０．５Ｕ）をさらに加えた。室温において１３日後、反応混合物を、Ｃ−１８逆相カラムにロードし、そしてＨ２ＯおよびＭｅＯＨ（１００：０〜０：１００）で溶出して生成物を得る（２４ｍｇ、４３％）。
【０１２０】
（Ｄ．ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ反応の手順）
ＨＥＰＥＳ緩衝液（２００ｍＭ、８％ＭｅＯＨ含有、ｐＨ７．５、５０μＬ）中のシアリル化リソ−ラクトシルセラミド（１．０ｍｇ、１．６μｍｏｌ）およびＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（２．４６ｍｇ、純度６５％、２．４０μｍｏｌ）の混合物を、２０分間超音波処理した。β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ（１０μＬ、５Ｕ／ｍＬ、５０Ｕ）を加え、続いてアルカリホスファターゼ（１μＬ、１．０×１０５Ｕ／ｍＬ、１００Ｕ）を加えた。この反応混合物を室温に保った。１日後、β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ（１０μＬ、５Ｕ／ｍＬ、５０Ｕ）をさらに加えた。さらに４日後、さらなるβ１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ（１０μＬ、５Ｕ／ｍＬ、５０ｍＵ）を加えた。さらにもう１日室温においた後、ＴＬＣは、反応がほぼ完了したことを示した。逆相カラム（Ｃ−１８）精製により、生成物を得た（１００％）。
【０１２１】
（Ｅ．アシル化の手順）
上述の生成物（１６ｍｇ、１４．３μｍｏｌ）およびＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）のＴＨＦ溶液（２．０ｍＬ）に、０℃でステアリン酸クロリド（ｓｔｅｒｉｃ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（４．３ｍｇ、μｍｏｌ）を加えた。この反応物を２時間攪拌した後、この生成物を、逆相カラムクロマトグラフィー（Ｃ−１８）カラムにより精製し、メタノールおよび水（２０：８０〜１００：０）により、生成物を得た（２０ｍｇ、１００％）。
【０１２２】
（結果および考察）
ラクトシルセラミドは、細菌または哺乳動物のいずれのα−２，３シアリルトランスフェラーゼについても、非常に弱い基質であることが見出されたので、酵素的グリコシル化に先立って、ラクトシルスフィンゴシンに変換した（模式図参照のこと）。異なる塩基性加水分解条件が研究され、そしてＭｅＯＨ中のＫＯＨまたは無水ヒドラジンとの反応は、比較収率（それぞれ７１％および６３％）を与えた。シアリルトランスフェラーゼの触媒反応が、ゆっくりであることが見出され、室温において１３日後、この反応は、４３％の単離収率でシアリルラクトシルフィンゴシンを生成し、３２％のラクトシルフィンゴシンを回収した。ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼによって触媒された反応および最後の化学的アシル化は、全て良好に進行し、それぞれ定量的な収率で対応する生成物を与えた。
【０１２３】
本明細書中に記載されるこの実施例および実施態様は、単に例示を目的としたものであり、そしてそれらを考慮しての種々の改変および変更は、当業者に示唆され、かつこの添付の特許請求の範囲の適用そして範囲の精神および権限に含まれることが理解される。本明細書に引用された全ての刊行物、特許、および特許出願は、これによって全ての目的のために参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、出発物質としてウシのバター乳から得られたラクトシルセラミドを使用する酵素的合成による、ガングリオシドＧＭ２の２つの合成方法の模式図である。
【図２】
図２は、ウシのバター乳から得られたラクトシルセラミドからガングリオシドＧＤ２を合成する２つの方法の模式図を示す。
【図３】
図３は、出発物質として植物のグルコシルセラミドを使用するＧＭ２ガングリオシドの３つの合成経路を示す。
【図４】
図４は、グルコシルセラミドから出発するＧＭ２および他のガングリオシドの３つの合成経路を示す。
【図５】
図５は、ラクトシルセラミドから、脱アシル化、２つの連続する酵素的なグリコシル化、および最後に化学的なアシル化を経由してガングリオシドＧＭ２を合成するのに使用されたスキームを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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