(57)【要約】特徴となるのは、単一の高分子を検知及び／又は特徴付けするのに使用可能であると共に、ＤＮＡ又はＲＮＡの配列決定及び／又はＤＮＡ二次構造の決定に使用可能な一個以上の固体ナノ細孔を実施するデバイス及びシステムである。本発明の固体化したナノ細孔において、ナノ細孔の幅及び／又は長さは、ナノ細孔を含む絶縁部材の形成中に固定した関係に維持された劈開結晶の鋭縁部により定義又は構築される。本発明の別の態様は、直線又は２Ｄの電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイを特徴とし、ナノ細孔は、絶縁部材の上面に形成される溝と、絶縁部材の下面に形成される溝との交差点に位置する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子を特徴付けるためのデバイスであって、
対向する表面間に延びる貫通開口部を含む絶縁部材を備え、
前記貫通開口部の幅は、前記絶縁部材を形成する際に互いに対して固定された関係で配置された複数の結晶により確定される、
デバイス。
【請求項２】
前記複数の結晶の縁部は、所定の角度で互いに交差し、前記絶縁部材を形成する際に、この配置において維持される、請求項１記載のデバイス。
【請求項３】
前記縁部は、十分に小さな領域を形成又は定義するため、前記絶縁部材を構成する分子は、前記絶縁部材を形成する際に、この領域に入り込めない、請求項２記載のデバイス。
【請求項４】
絶縁材料の分子は、前記縁部に対して配向され、これにより、前記絶縁材料は、前記交差点を中心とした輪郭を形成することを強いられ、これにより、前記絶縁部材内に前記貫通開口部を定める、請求項２記載のデバイス。
【請求項５】
生体分子を特徴付けるための方法であって、
対向する表面間に延びる貫通開口部を含む絶縁部材を提供するステップにして、前記貫通開口部の幅は、前記絶縁部材を形成する際に互いに対して固定された関係で配置された複数の結晶により確定される、ステップと、
特徴付けするべき前記生体分子を少なくとも一方が含むイオンリザーバ間に前記絶縁部材を位置付けるステップと、
前記生体分子を、前記提供された絶縁部材の前記貫通開口部に通過させるステップと、  を備える方法。
【請求項６】
更に、
前記生体分子を前記貫通開口部に通過させる際にイオン電流及びイオン電流の変化を検出するステップと、
前記検出したイオン電流及びその変化に基づいて、前記生体分子を特徴付けるステップと、を備える、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＲＮＡ二次構造を決定するための方法であって、
対向する表面間に延びる貫通開口部を含む絶縁部材を提供するステップにして、前記貫通開口部の幅は、前記絶縁部材を形成する際に互いに対して固定された関係で配置された複数の結晶により確定される、ステップと、
特徴付けするべき前記生体分子を少なくとも一方が含むイオンリザーバ間に前記絶縁部材を位置付けるステップと、
前記ＲＮＡの一方の端部を光ピンセットに対して作用可能に結合するステップと、
前記貫通開口部を介して前記ＲＮＡ分子を引っぱる際に当該一方の端部における力を測定するステップと、
を備える方法。
【請求項８】
電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイであって、
絶縁材料部材を備え、
前記絶縁材料層は、その第一の表面において第一の方向で縦に延びる複数以上の溝を有するように構成配置され、
前記絶縁材料部材は、その第二の表面において第二の方向で縦に延びる溝を有するように構成配置され、前記第一及び第二の表面は、互いに対向し、
前記第二の方向は、前記第一の方向に対して角度を成しており、
前記溝は、前記第一及び第二の表面のそれぞれにおいて、前記第一の表面の前記溝のそれぞれと、前記第二の表面の前記溝との交差位置において、ナノ細孔を備える開口部が形成されるように形成される、
電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイ。
【請求項９】
前記絶縁材料部材は、第一の層及び第二の層から形成され、前記第一の層の表面は、前記絶縁材料部材の前記第一の表面であり、前記第一の層は、前記絶縁部材の第一の表面に形成された前記複数の溝を含み、前記第二の層の表面は、前記絶縁材料部材の前記第二の表面であり、前記第二の層は、前記絶縁部材の第二の表面に形成された前記溝を含む、請求項８記載の電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイ。
【請求項１０】
前記第一及び第二の層は、前記絶縁材料部材を形成するために、それぞれに対して結合又は固定されたものである、請求項９記載の電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイ。
【請求項１１】
絶縁材料部材は、その前記第二の表面において第二の方向で縦に延びる複数の溝を有するように構成配置される、請求項８記載の電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイ。
【請求項１２】
前記絶縁材料層は、その第一の表面において第一の方向で縦に延びる複数以上の溝の複数の組を有するように構成配置され、各組の前記溝は、別の組の溝に接続されない、請求項１１記載の電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイ。
【請求項１３】
前記溝は、前記第一及び第二の表面のそれぞれにおいて、溝の各組の前記第一の表面の前記溝のそれぞれと、前記第二の表面の前記複数の溝の一本との交差位置において、ナノ細孔を備える開口部が形成されるように形成される、請求項１２記載の電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイ。
【請求項１４】
生体分子を特徴付けるための方法であって、
絶縁材料部材を含む電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイを提供するステップにして、前記絶縁材料部材は、その第一の表面において第一の方向で縦に延びる複数以上の溝と、その第二の表面において第二の方向で縦に延びる溝とを有するように構成配置され、前記第二の方向は、前記第一の方向に対して角度を成しており、前記溝は、前記第一及び第二の表面のそれぞれにおいて、ナノ細孔を有する開口部が前記第一の表面の前記溝のそれぞれと前記第二の表面の前記溝との交差位置に形成されるように、形成されるステップと、
特徴付けするべき前記生体分子を少なくとも一方が含むイオンリザーバ間に前記電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイを位置付けるステップと、
前記生体分子を、前記提供された電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイの前記ナノ細孔の一つに通過させるステップと、
を備える方法。
【請求項１５】
更に、
前記生体分子を前記ナノ細孔の前記一つに通過させる際にイオン電流及びイオン電流の変化を検出するステップと、
前記検出したイオン電流及びその変化に基づいて、前記生体分子を特徴付けるステップと、を備える、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ＲＮＡ二次構造を決定するための方法であって、
絶縁材料部材を含む電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイを提供するステップにして、前記絶縁材料部材は、その第一の表面において第一の方向で縦に延びる複数以上の溝と、その第二の表面において第二の方向で縦に延びる溝とを有するように構成配置され、前記第二の方向は、前記第一の方向に対して角度を成しており、前記溝は、前記第一及び第二の表面のそれぞれにおいて、ナノ細孔を有する開口部が前記第一の表面の前記溝のそれぞれと前記第二の表面の前記溝との交差位置に形成されるように、形成されるステップと、
特徴付けするべき前記生体分子を少なくとも一方が含むイオンリザーバ間に前記電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイを位置付けるステップと、
前記ＲＮＡの一方の端部を光ピンセットに対して作用可能に結合するステップと、
前記ナノ細孔の一つを介して当該前記ＲＮＡ分子を引っぱる際に当該一方の端部における力を測定するステップと、を備える方法。
【請求項１７】
対向する表面を有する絶縁部材と、
当該対向する表面間に延びる貫通開口部と、
を備えるナノ細孔。
【請求項１８】
当該貫通開口部の幅は、約１０ｎｍ未満である、請求項１７記載のナノ細孔。
【請求項１９】
複数のナノ細孔を備えるナノ細孔アレイであって、各ナノ細孔は、
対向する表面を有する絶縁部材と、
当該対向する表面間に延びる貫通開口部と、を備えるナノ細孔アレイ。
【請求項２０】
当該貫通開口部は、約１０ｎｍ未満の幅を有する、請求項１９記載のナノ細孔アレイ。
【請求項２１】
当該ナノ細孔のそれぞれは、電気的にアドレス可能である、請求項１９記載のナノ細孔アレイ。
【請求項２２】
対向する表面を有する絶縁部材と当該表面間に延びる貫通開口部とを備えるナノ細孔を作成するための方法であって、
所定の位置に固定された複数の結晶を互いに対して固定することで確定された幅を有する開口部を形成するステップと、
互いに対して所定の位置に固定された当該複数の結晶上に絶縁材料を注ぎ、これにより、当該絶縁材料の対向する表面を介して延びる当該開口部を有する前記絶縁材料を形成することで、絶縁部材を形成するステップと、
当該複数の結晶を除去するステップと、を備え、
これにより、対向する表面を有する絶縁部材と当該表面間に延びる貫通開口部とを備えるナノ細孔を作成する方法。
【請求項２３】
対向する表面を有する絶縁部材と当該表面間に延びる貫通開口部とを備えるナノ細孔であって、
所定の位置に固定された複数の結晶を互いに対して固定することで確定された幅を有する開口部を形成するステップと、
互いに対して所定の位置に固定された当該複数の結晶上に絶縁材料を注ぎ、これにより、当該絶縁材料の対向する表面を介して延びる当該開口部を有する前記絶縁材料を形成することで、絶縁部材を形成するステップと、
当該複数の結晶を除去するステップと、を備え、
これにより、対向する表面を有する絶縁部材と当該表面間に延びる貫通開口部とを備えるナノ細孔を作成する方法により作成される、ナノ細孔。
【請求項２４】
対向する第一及び第二の表面を有する絶縁部材と当該表面間に延びる一つ以上の貫通開口部とを備えるナノ細孔アレイを作成するための方法であって、
第一の方向で縦に延びる一本以上の溝を前記第一の表面に形成するステップと、
前記第一の方向に対して角度を成す第二の方向で縦に延びる一本以上の溝を前記第二の表面に形成するステップと、
前記第一の表面の前記一本以上の溝と、前記第二の表面の前記一本以上の溝との交差位置において材料を除去するステップと、を備え、
これにより、対向する表面を有する絶縁部材と当該表面間に延びる一つ以上の貫通開口部とを備えるナノ細孔を作成する方法。
【請求項２５】
前記結晶の前記縁部は、互いに距離（Ｓｅ）の間隔を空け、前記結晶距離間隔は、（Ｓｅ／Ｔｍ）≦０．５を満たすように設定され、ここでＴｍは、前記絶縁部材を構成する前記材料の分子の厚さとなる、請求項２記載のデバイス。
【請求項２６】
前記結晶の前記縁部は、互いに距離（Ｓｅ）の間隔を空け、前記結晶距離間隔は、約１Å乃至約１０Åの範囲になるように設定される、請求項２記載のデバイス。
【請求項２７】
前記貫通開口部は、２０Å以下の長さを有する、請求項１記載のデバイス。
【請求項２８】
前記貫通開口部は、２Å≦ｄ≦１０Åの関係を満たす長さ（ｄ）を有する、請求項１記載のデバイス。
【請求項２９】
前記提供した絶縁部材の前記貫通開口部は、２０Å以下の長さを有する、請求項５記載の方法。
【請求項３０】
前記提供した絶縁部材の前記貫通開口部は、２Å≦ｄ≦１０Åの関係を満たす長さ（ｄ）を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３１】
前記結晶の前記縁部は、互いに距離（Ｓｅ）の間隔を空け、前記結晶距離間隔は、（Ｓｅ／Ｔｍ）≦０．５を満たすように設定され、ここでＴｍは、前記絶縁部材を構成する前記材料の分子の厚さとなる、請求項５記載の方法。
【請求項３２】
前記結晶の前記縁部は、互いに距離（Ｓｅ）の間隔を空け、前記結晶距離間隔は、約１Å乃至約１０Åの範囲になるように設定される、請求項５記載の方法。
【請求項３３】
前記提供した絶縁部材の前記貫通開口部は、２０Å以下の長さを有する、請求項７記載の方法。
【請求項３４】
前記提供した絶縁部材の前記貫通開口部は、２Å≦ｄ≦１０Åの関係を満たす長さ（ｄ）を有する、請求項７記載の方法。
【請求項３５】
前記結晶の前記縁部は、互いに距離（Ｓｅ）の間隔を空け、前記結晶距離間隔は、（Ｓｅ／Ｔｍ）≦０．５を満たすように設定され、ここでＴｍは、前記絶縁部材を構成する前記材料の分子の厚さとなる、請求項７記載の方法。
【請求項３６】
前記結晶の前記縁部は、互いに距離（Ｓｅ）の間隔を空け、前記結晶距離間隔は、約１Å乃至約１０Åの範囲になるように設定される、請求項７記載の方法。
【請求項３７】
対向する表面を有する絶縁部材と当該表面間に延びる複数の貫通開口部とを備える二次元ナノ細孔アレイを作成するための方法であって、
各開口部について、所定の位置に固定された複数の結晶を互いに対して固定することで確定された幅を有する、前記複数の開口部のそれぞれを形成するステップと、
各開口部について、互いに対して所定の位置に固定された当該複数の結晶のそれぞれに絶縁材料を注ぎ、これにより、当該絶縁材料の対向する表面を介して延びる当該各開口部を有する前記絶縁材料を形成することで、絶縁部材を形成するステップと、
各開口部について、当該複数の結晶を除去するステップと、を備え、
これにより、対向する表面を有する絶縁部材と当該表面間に延びる複数の貫通開口部とを備える二次元ナノ細孔を作成する方法。
【請求項３８】
ナノ細孔アレイを作成する方法であって、
対向する表面を有する絶縁部材と当該表面間に延びる貫通開口部とをそれぞれ含む複数のナノ細孔組立体を提供するステップと、
前記貫通開口部が少なくとも貫通開口部の一次元アレイを形成するように、前記複数のナノ細孔組立体を組み立てるステップと、
を備え、
複数のナノ細孔組立体を提供する当該ステップは、各ナノ細孔組立体について、
所定の位置に固定された複数の結晶を互いに対して固定することで確定された幅を有する開口部を形成するステップと、
互いに対して所定の位置に固定された当該複数の結晶上に絶縁材料を注ぎ、これにより、当該絶縁材料の対向する表面を介して延びる当該開口部を有する前記絶縁材料を形成することで、絶縁部材を形成するステップと、
当該複数の結晶を除去するステップと、
を実行するステップを含み、
これにより、対向する表面を有する絶縁部材と当該表面間に延びる貫通開口部とを備えるナノ細孔を作成する方法。
【請求項３９】
前記複数のナノ細孔組立体を組み立てる当該ステップは、前記貫通開口部が貫通開口部の二次元アレイを形成するように、前記複数のナノ細孔組立体を組み立てるステップを含む、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記複数の提供されたナノ細孔組立体のそれぞれの前記貫通開口部は、２０Å以下の長さを有する、請求項３８乃至３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記複数の提供されたナノ細孔組立体のそれぞれの前記貫通開口部は、２Å≦ｄ≦１０Åの関係を満たす長さ（ｄ）を有する、請求項３８乃至３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
開口部を形成する当該ステップは、前記結晶の縁部の間隔を互いに距離（Ｓｅ）にするステップを含み、前記距離は、（Ｓｅ／Ｔｍ）≦０．５の関係を満たすように設定され、ここでＴｍは、前記絶縁部材を構成する前記材料の分子の厚さとなる、請求項３８乃至３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
開口部を形成する当該ステップは、前記結晶の縁部の間隔を互いに距離（Ｓｅ）にするステップを含み、前記距離は、約１Å乃至約１０Åの範囲になるように設定される、請求項３８乃至３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
ＤＮＡ又はＲＮＡの配列決定を行うための方法であって、
対向する表面間に延びる貫通開口部を含む絶縁部材を提供するステップにして、前記貫通開口部の幅は、前記絶縁部材を形成する際に互いに対して固定された関係で配置された複数の結晶により確定される、ステップと、
前記貫通開口部の少なくとも内面を、ＤＮＡ／ＲＮＡを特徴付けるＡ、Ｔ、Ｇ、又はＣ塩基の一つを含むＰＮＡによりコーティングするステップと、
配列決定するべき前記ＤＮＡ／ＲＮＡを少なくとも一方が含むイオンリザーバ間に前記絶縁部材を位置付けるステップと、
前記ＤＮＡ／ＲＮＡの一方の端部を光ピンセットに対して作用可能に結合するステップと、
前記貫通開口部を介して当該ＤＮＡ／ＲＮＡを引っぱる際に当該一方の端部における力を時間の関数として測定するステップと、
時間の関数としての前記測定された力を、Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣ塩基の一つに相関させるステップとを備え、
これにより、前記ＤＮＡ又はＲＮＡの配列を作成する方法。
【請求項４５】
ＤＮＡ又はＲＮＡの配列決定を行うための方法であって、
対向する表面を有する絶縁部材と当該表面間に延びる貫通開口部とをそれぞれ含む複数のナノ細孔組立体を提供するステップと、
前記貫通開口部が少なくとも貫通開口部の一次元アレイを形成するように、前記複数のナノ細孔組立体を組み立てるステップと、
前記複数のナノ細孔組立体のそれぞれの前記貫通開口部の少なくとも内面を、ＤＮＡ／ＲＮＡを特徴付ける前記Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣ塩基の一つを含むＰＮＡによりコーティングするステップと、
配列決定するべき前記ＤＮＡ／ＲＮＡを含むイオンリザーバが前記複数のナノ細孔組立体の少なくとも一つの側面に配置されるように、前記ナノ細孔組立体の前記絶縁部材を位置付けるステップと、
前記少なくとも一つのナノ細孔組立体の前記貫通開口部のために、前記ＤＮＡ／ＲＮＡの一方の端部を光ピンセットに対して作用可能に結合するステップと、
当該少なくとも一つのナノ細孔組立体の前記貫通開口部を介して当該ＤＮＡ／ＲＮＡを引っぱる際に当該一方の端部における力を時間の関数として測定するステップと、
時間の関数としての前記測定された力を、Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣ塩基の一つに相関させ、これにより前記ＤＮＡ又はＲＮＡの配列決定を行うステップとを備え、
複数のナノ細孔組立体を提供する当該ステップは、各ナノ細孔組立体について、
所定の位置に固定された複数の結晶を互いに対して固定することで確定された幅を有する開口部を形成するステップと、
互いに対して所定の位置に固定された当該複数の結晶上に絶縁材料を注ぎ、これにより、当該絶縁材料の対向する表面を介して延びる当該開口部を有する前記絶縁材料を形成することで、絶縁部材を形成するステップと、
当該複数の結晶を除去するステップと、
前記貫通開口部の少なくとも内面を、ＤＮＡ／ＲＮＡを特徴付ける前記Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣ塩基の一つを含むＰＮＡによりコーティングするステップと、
を実行するステップを含む、
方法。
【請求項４６】
更に、ＤＮＡ／ＲＮＡを特徴付ける前記Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣ塩基の一つを含むＰＮＡのコーティングを備え、前記コーティングは、前記貫通開口部の少なくとも内面をコーティングするために付与される、請求項１記載のデバイス。
【請求項４７】
更に、ＤＮＡ／ＲＮＡを特徴付ける前記Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣ塩基の一つを含むＰＮＡのコーティングを備え、前記コーティングは、前記第一及び第二の表面の前記溝のそれぞれの前記交差位置において形成された前記開口部の少なくとも内面をコーティングするために付与される、請求項８記載の電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイ。
【請求項４８】
更に、ＤＮＡ／ＲＮＡを特徴付ける前記Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣ塩基の一つを含むＰＮＡのコーティングを備え、前記コーティングは、前記貫通開口部の少なくとも内面をコーティングするために付与される、請求項１７記載のナノ細孔。
【請求項４９】
更に、ＤＮＡ／ＲＮＡを特徴付ける前記Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣ塩基の一つを含むＰＮＡのコーティングを備え、前記コーティングは、前記複数のナノ細孔のそれぞれについて、前記貫通開口部の少なくとも内面をコーティングするために付与される、請求項１９記載のナノ細孔アレイ。
【請求項５０】
ＤＮＡ又はＲＮＡの配列決定を行うための方法であって、
請求項４６の前記デバイス、請求項４７の前記電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイ、請求項４８の前記ナノ細孔、及び請求項４９の前記ナノ細孔アレイのうち、任意の一つを提供するステップと、
前記デバイス、前記電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイ、前記ナノ細孔、及び前記ナノ細孔アレイのうち、任意の一つを、配列決定するべき前記ＤＮＡ／ＲＮＡを少なくとも一方が含むイオンリザーバ間に位置付けるステップと、
前記ＤＮＡ／ＲＮＡの一方の端部を光ピンセットに対して作用可能に結合するステップと、
前記貫通開口部を介して当該ＤＮＡ／ＲＮＡを引っぱる際に当該一方の端部における力を時間の関数として測定するステップと、
時間の関数としての前記測定された力を、Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣ塩基の一つに相関させるステップとを備え、
これにより、前記ＤＮＡ又はＲＮＡの配列を作成する方法。
【請求項５１】
更に、前記貫通開口部の少なくとも内面を、ＤＮＡ／ＲＮＡを特徴付ける前記Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣ塩基の一つを含むＰＮＡによりコーティングするステップを備える、請求項２２記載のナノ細孔を作成する方法。
【請求項５２】
更に、前記一つ以上の貫通開口部の少なくとも内面を、ＤＮＡ／ＲＮＡを特徴付ける前記Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣ塩基の一つを含むＰＮＡによりコーティングするステップを備える、請求項２４記載のナノ細孔アレイを作成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子を特徴付けると共に、ＤＮＡ及びＲＮＡの配列決定を行うために使用されるデバイスに関し、更に詳しくは、生体分子の迅速な特徴付け及び高スループットＤＮＡ配列決定において使用するナノ細孔及び／又はナノ細孔アレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノメートルスケールの膜チャネルを介した核酸及びその他の生物学的分子の輸送は、自然界の至る所に存在する。例としては、核膜孔を介したＲＮＡ分子及び転写因子の移動と、ファージ感染においてバクテリア膜を介して注入されたウイルスＤＮＡと、膜タンパク質による特定のオリゴヌクレオチドの摂取とが含まれる。こうしたナノスケールチャネルの機能、及び生体分子がナノスケールチャネルをどのように移動するかを理解することは、現代の分子生物学及び生物物理学の主要な課題である。近年、ナノ細孔生物物理学の魅力的な分野が、分子生物学、ナノテクノロジ、及び単一分子生物物理学の学際的領域に生じている。１９９４年、Ｂｅｒｚｒｕｋｏｖ、Ｖｏｄｙａｎｏｙ、及びＰａｒｓｅｇｉａｎは、生物学的ナノ細孔をコールタカウンタとして使用して、個別の分子をカウントできることを証明した。１９９６年、Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ、Ｂｒａｎｄｉｎ、Ｂｒａｎｔｏｎ、及びＤｅａｍｅｒ（ＫＢＢＤ）の画期的な論文において［Kasianowicz, LJ, Brandin, E, Branton, D. & Deamer, D. W. 膜チャネルを使用した個別のポリヌクレオチド分子の特徴付け、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93, 13770-13773 (1996)］、ナノ細孔イオン伝導度を検知メカニズムとして使用する、一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ分子の超高速単一分子配列決定について、野心的な考え方が提案された。その後、いくつかのグループは、この目的を達成する潜在的な候補として、α溶血素タンパク質細孔の可能性を探究してきた。
【０００３】
ＫＢＢＤ法に従ったナノ細孔のイオン伝導度を使用したＤＮＡ配列決定には、イオン溶液の二つのリザーバを隔てる絶縁壁が関与し、壁は非常に小さな孔を含み、一本鎖ＤＮＡ分子の一本鎖のみが細孔を通り抜け可能となる。二つのリザーバに電圧を印加する時、ナノ細孔のほぼ全体で電位降下が発生する。二つの金属の点接触抵抗又は伝導度の場合と同様に、二つのイオンリザーバ間の電気伝導度又は抵抗は、ナノ細孔の伝導度又は抵抗でもある。ＤＮＡ分子の低い移動性のため、ナノ細孔を介したイオン伝導度は、ナノ細孔を介して流れるＮａ+及びＣｌ-の流動に支配される。イオン伝導度は、ＤＮＡ分子がナノ細孔に入る時に低下する。
【０００４】
伝導度低下の量は、チャネルの最も狭い部分の内部にあるＤＮＡ分子の部分の物理的サイズの尺度となる。ＤＮＡ分子の化学基（ヌクレオチド）は僅かに異なるサイズを有するため、ナノ細孔伝導度の時間依存性を測定することで、ＤＮＡ分子のヌクレオチドの一般的情報を測定できるはずである。
【０００５】
ＫＢＢＤ法の基礎的前提は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子がナノ細孔を介して移動する時、異なる原子組成を有するため、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を構成する四種類のヌクレオチドがイオン電流において異なる閉塞効果を有し得るということである。ナノ細孔を介した電圧駆動ＤＮＡ転位の基本概念は、（ａ）α溶血素を使用した電圧駆動ＤＮＡ転位実験の概略図と（ｂ）１Ｍ  ＫＣｌ、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ｐＨ８．５）緩衝液においてポリ（ｄＡ）を使用した代表的な転位事象とを示す図１に例示されている。
【０００６】
この考え方を実現し得ることを示唆する有望な予備データが存在している。例えば、ポリアデニン（ＤＮＡ）のホモポリマは、ポリシトシンより僅かに低い閉塞レベルを発生させ、室温条件下において、塩基当たり数μ秒の速度で転位することが証明されている。こうした発見は、実際に、迅速なＤＮＡ配列決定法の実現にとって非常に有望である。
【０００７】
ＫＢＢＤ法は、脂質二重層膜に埋め込まれたα溶血素タンパク質イオンチャネルを天然のナノ細孔として使用する。７０個のシトシンヌクレオチド及び３０個のアデニンヌクレオチドで構成されたＤＮＡポリマは、ナノ細孔伝導度において測定可能な信号を発生させることが実証されている。しかしながら、天然のナノ細孔は長いチャネルであり、通常は長さ３０ｎｍであるため、多くのヌクレオチドが転位中の任意の時点でチャネル内部に存在し、イオン伝導度に対する個別のヌクレオチドの影響が失われてしまう。ともかく、ナノ細孔伝導度において、Ｃ及びＡヌクレオチド間で差異を確認できる事実は、単一のヌクレオチドの長さ（０．４ｎｍまで）に相当する長さを有するナノ細孔を作成可能であれば、最終的にナノ細孔伝導度に対する単一のヌクレオチドの効果を確認できるはずであることの表れとなる。
【０００８】
更に、最近では、窒化ケイ素固体膜において直径１．５ｎｍの単一のナノ細孔を作成するための信頼性の高いナノ彫刻アプローチが実証されている（ハーバード大学物理学部のＧｏｌｏｖｃｈｅｎｋｏのグループ）。このアプローチにおいて、収束イオンビームリソグラフィと、フィードバックモニタリング付きの低エネルギスパッタリングとを使用する処理ステップは、極めて再現性及び信頼性が高いが、しかしながら、こうしたナノ細孔は、単一のヌクレオチドを測定するには長さが長すぎる（＞１０ｎｍ）。J. Li, D Stein, C McMullan, D Branton, M. J. Aziz, and J. A. Golovchenko; ナノメートル長さスケールでのイオンビーム彫刻、Nature 412, 166-169 (2001).
Ｍｅｌｌｅｒらによる最近の実験では、電流遮断の量と、ＤＮＡ分子がナノ細孔チャネルを通過するのに要する時間には大きな変動があることが発見された。A. Meller, L. Nivon, and D Branton, ナノ細孔を介した電圧駆動ＤＮＡ転位、Phys. Rev. Lett. 86, 3435-3438 (2001). 図２には、遮断電流とポリマの長さとの対比（左パネル）、及び同じポリマでの転位速度とポリマの長さとの対比（右パネル）を例示するヒストグラムが図示されている。結果として、標準的なＤＮＡ転位実験において個別の塩基を観察するためには、こうした変動の（複数の）起源の十分な理解が必要であることが確認できる。実際、駆動力の影響下でナノ細孔を通過する直線上の柔軟な分子（ＤＮＡ等）の物理的過程については、理解が乏しく、イオン電流データからサイズ情報を抽出するのは困難になっている。ポリマ端部の変動の影響（エントロピ障壁）、ＤＮＡチャネルの相互作用等、この問題の様々な態様を扱ったいくつかの論文が存在する。実験的な側では、ＤＮＡ転位プロセスを一定速度（可能であれば低速）又は一定力で測定することが非常に望ましい。以前のα溶血素細孔を介したＤＮＡ転位の温度依存型の測定は、ＤＮＡの熱運動が、遮断電流におけるノイズのソースであることを示唆している。ＤＮＡがα溶血素細孔の内部にある間に、転位プロセスを停止させる努力は、継続的に試みられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
理想的には、ＤＮＡ分子が細孔内部に完全に広がった際に、イオン電流を測定したい（例えば、光ピンセットを使用（図３参照））。こうした実験において、ＤＮＡの熱運動によるイオン電流の変動は、低減又は回避できる。更に、分子を静止状態に保持し、イオン電流におけるノイズを更に低減するために信号の平均化を使用できる。しかしながら、これを行うためには、（ａ）一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡに付着させ、その後、後者を光ピンセットにより保持されたビーズに（例えば、ストレプトアビジンビオチンリンカを使用して）付着させ［光ピンセット概論、ｗｗｗ．ｎｂｉ．ｄｋ／〜ｔｗｅｅｚｅｒ／ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ｈｔｍ参照］、次に（ｂ）一本鎖ＤＮＡを細孔に通過させ、別のビーズを使用して（同じく、ストレプトアビジンビオチンリンカを使用して）反対側で捕獲する必要がある。こうした全てのプロセスは、光学的捕獲を除いて、確率論的であり、非常に時間がかかる。この考え方を実施するためには、ナノ細孔アレイのような高スループットデバイスを使用する必要があり、アレイ内の各細孔は、電気的に、更には独立して、アドレス可能となる必要がある。
【００１０】
現在、絶縁材料において固体ナノ細孔を製造する二種類の方法が成功している。一方法は、窒化ケイ素のイオンビーム彫刻の使用を含み、他方は、結晶シリコンでのビームリソグラフィ及びウェットエッチング、及びその後の酸化を使用する。一般に、こうした手法は、説明した方法でナノ細孔を使用できることを立証するために使用されているが、高スループットを有する固体ナノ細孔デバイスを生産するためには使用されていない。
【００１１】
ＵＳＰ６，４２８，９５９では、試料において二本鎖核酸の存在を決定する方法を説明している。こうした方法において、流体サンプル中に存在する核酸は、例えば、流体試料への電場の印加により、ナノ細孔を介して転位させる。ナノ細孔を介した電流の大きさは、転位プロセス中に監視され、大きさの変化は、ナノ細孔を介した一本鎖又は二本鎖分子の通過に関連する。こうした方法は、例えば、ノーザンブロットアッセイ、サザンブロットアッセイ、アレイに基づくハイブリダイゼーションアッセイのようなハイブリダイゼーションアッセイ等、試料中の二本鎖核酸の存在の検出が望ましい様々な用途で使用される。
【００１２】
合成材料を使用して形成可能な新しいナノ細孔と、こうしたナノ細孔を使用及び作成するための方法を提供することが望ましい。更に、長さ１０ｎｍ以下のナノ細孔を提供することが望ましい。ナノ細孔の直線アレイ又はナノ細孔の二次元アレイを産出するデバイス及び方法を提供することが望ましい。更に、独立して電気的にナノ細孔をアドレス可能である、こうした直線及び二次元ナノ細孔アレイを提供することが、特に望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、単一の高分子を検知及び／又は特徴付けするのに使用可能であると共に、ＤＮＡ又はＲＮＡを配列決定する一個以上の固体ナノ細孔を実施するデバイス及びシステムを特徴とする。こうしたデバイス及びシステムは、分子生物学及び単一分子生物物理学において広範な用途を有する。迅速なＤＮＡ配列決定に有用であるのに加えて、本発明のデバイス及びシステムは、単一分子生物物理学、分子生物学、及び生化学を一部として含む多様な用途において使用できる。例えば、本発明のナノ細孔デバイス及びシステムは、ＲＮＡ分子の二次構造を調べる分子櫛としての使用と、空気中及び／又は水中の生物戦物質及び不純物／汚染物質の検出における使用とが考えられる。
【００１４】
本発明の一態様によれば、絶縁材料の部材を含むデバイスが特徴付けられ、絶縁部材は、ナノ細孔を内部に備える貫通開口部を含むように構成配置される。貫通開口部は、原子的な鋭縁部を形成するように劈開された複数の結晶を備え、結晶は、絶縁材料を形成する際に、固定した関係で配置される。特定の実施形態において、結晶縁部は、所定の角度、更に詳しくは約９０度の角度で、互いに交差する。しかしながら、９０度より小さい又は大きい角度で互いに交差し、これにより、異なる断面又は異なる断面形状を有するナノ細孔を形成する結晶縁部も、本発明の範囲内に含まれる。
【００１５】
交差する劈開結晶縁部は、基本的に、十分に小さな領域を形成又は定義するため、絶縁材料を構成する分子は、この領域に入り込めない。これにより、絶縁材料の分子は、劈開縁部に対して配向され、したがって、交差点を中心とした輪郭を形成することを強いられるため、貫通開口部を内部に備える小さな穴が残る。特定の実施形態において、結晶は、この技術で周知であるＧａＡｓ結晶である。しかしながら、本発明は、例えば、ＮａＣｌ結晶のように、当業者に公知であると共に、絶縁部材を備えた絶縁材料を形成する際に、劈開及び固定した関係での保持に役立つ同様の特徴を有する他の結晶を使用して実施可能である。
【００１６】
特定の実施形態において、絶縁材料は、流動可能なものとして特徴付けられる材料であり、ナノ細孔を形成するプロセスの終わり及び通常の動作条件（例えば、室温）の間に固化する材料である。例示的な実施形態において、絶縁部材は、液体ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、ポリスチレン、又はＰＭＭＡ等の硬化可能ポリマで作成され、開口部を介したナノ細孔を形成するためにＧａＡｓ結晶が使用される。この手法は、長さ又はチャネル長さ２０Å（オングストローム／１０-10ｍ）以下、更に詳しくはチャネル長さ２０Å以下、又は更に詳しくはチャネル長さ約４Å、更に具体的には、次の関係、即ち、２Å≦ｄ≦１０Å又は４Å≦ｄ≦１０Åの一方を満たすチャネル長さ（ｄ）を有するナノ細孔を産出する。
【００１７】
例示的な例では、一般的な半導体基板材料であるＧａＡｓ結晶を劈開させ、原子的な鋭縁部を形成する。劈開結晶は、その後、こうした二つの結晶縁部が数オングストロームの距離内に集められ、標準のＳＴＭ電子機器を使用し、電子トンネル電流をフィードバックメカニズムとして使用して（ＧａＡｓ結晶がドーピングされ、限られた導電率を有すると仮定する）、固定状態に保持されるように配置される。更に特定の実施形態において、結晶縁部の間隔は、１Å乃至１０Åの範囲であり、更に具体的には、約２Åである。
【００１８】
更なる実施形態において、結晶縁部は、結晶縁部間の間隔が絶縁材料の分子の厚さ（Ｔｍ）未満になるように、互いに間隔を空ける。更に具体的な実施形態において、結晶縁部間の間隔（Ｓｅ）は、次の関係、即ち、Ｓｅ／Ｔｍ≦０．５を満たすように設定される。
【００１９】
次に、硬化可能ポリマである液体ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）を切縁部の領域に注ぎ込んで硬化させ、二つの結晶縁部は固定状態で保持する。本明細書で示唆したように、二つの縁部間の交差点では、縁部間の距離が小さく、ポリマの分子はこの領域に入り込めない。更に、ポリマの分子は、有利なことに、それぞれの劈開縁部に平行に配向され、交差点を中心に輪郭を形成するように強制され、小さな穴を残す。こうした方法において、ナノ細孔の幅及び長さは、二つの縁部間の距離と、ポリマの直径により制御される。
【００２０】
絶縁部材の最終形態での硬化又は形成に続いて、結晶は、例えば、洗浄することで除去される。別の例示的実施形態において、貫通開口部を形成するために使用される結晶は、ＮａＣｌ結晶であり、ＮａＣｌ結晶はＨ2Ｏによる洗浄で除去される。
【００２１】
更に特徴となるのは、生体分子の特徴付け、ＤＮＡの配列決定、及びＲＮＡ二次構造の決定を一部として含む多数の分析プロセスのいずれかを実行するために、本発明のナノ細孔デバイスを利用するシステム及び方法である。こうした方法は、ナノ細孔を含んだ、上で説明したような絶縁部材を提供するステップを含み、ナノ細孔の直径及び長さは、絶縁部材の形成中に固定した関係で維持された劈開結晶の鋭縁部により定義され、更に、方法は、二つのイオンリザーバ間に配置されるように絶縁部材を位置付けるステップを含む。こうした方法は、更に、生体分子又はＤＮＡをナノ細孔に通過させるステップと、イオン電流又はその他の物理的パラメータの変化に基づいて、生体分子又はＤＮＡを特徴付けるステップとを含む。ＲＮＡ二次構造を決定する方法について、方法は、更に、ＲＮＡの一方の端部を光ピンセットに対して作用可能に結合するステップと、ナノ細孔を介してＲＮＡ分子を引っぱる際に当該一方の端部における力を測定するステップとを含む。
【００２２】
本発明の別の態様によれば、特徴となるのは、高スループットの生体分子の分析及びＤＮＡの配列決定が可能となるように構成配置された、電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイである。特定の一実施形態において、電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイは、ナノ細孔の直線又は一次元アレイを含む。別の実施形態において、電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイは、ナノ細孔の二次元アレイを含む。別の実施形態において、二次元アレイは、複数以上の直線アレイの形態となる。更なる実施形態において、直線及び二次元ナノ細孔アレイは絶縁材料において形成及び配置されるため、ナノ細孔のそれぞれは、例えば、標準のパッチクランプの仕組みにより提供される電流を使用して、独立してアドレス可能となる。
【００２３】
特定の実施形態において、電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイは、絶縁材料層を含む。絶縁材料層は、その第一の表面において第一の方向で縦に延び、互いに対して平行となる一本以上の溝を有するように構成配置される。絶縁材料層は、更に、その第二の表面において第二の方向で縦に延びる溝が絶縁材料層に形成されるように構成配置され、第一及び第二の表面は、互いに対向する。更に、第二の方向は、第一の方向に対して角度を成しており、更に詳しくは、第一及び第二の方向は、互いに直交し、或いは互いに対して約９０度の角度を成す。
【００２４】
溝は、更に、第一及び第二の表面のそれぞれにおいて、一方の表面から他方の表面へ下向きに延びるように形成され、第一の表面の溝のそれぞれと、第二の表面の溝との交差位置において、ナノ細孔を備える開口部が形成されるようになる。これにより、絶縁材料では、第一の表面の複数の溝のそれぞれと、第二の表面に形成された溝との交差位置に、複数のナノ細孔が、直線又は一次元アレイにおいて形成される。
【００２５】
上で示したように、更なる実施形態において、絶縁材料層は、その第二の第一の表面において、第二の方向で縦に延び、互いに対して平行となる複数以上の溝を有するように構成配置される。複数の溝は、更に、第二の表面において、一方の表面から他方の表面へ下向きに延びるように形成され、第一の表面の溝のそれぞれと、第二の表面の溝のそれぞれとの交差位置において、ナノ細孔を備える開口部が形成されるようになる。これにより、絶縁材料では、第一の表面と第二の表面との複数の溝のそれぞれの交差位置に、複数のナノ細孔が、二次元アレイにおいて形成される。更に特定の実施形態において、溝はＶ字形となる。
【００２６】
例示的な実施形態において、絶縁材料層は、当業者に公知であると共に、絶縁材料層を形成するために使用される材料に適した多数の手法のいずれかを使用して接合又は固定された、第一の副層と第二の副層とにより形成される。第一の副層は、対向する表面間で延びる複数の溝を含むように構成配置され、対向する表面の一方は、絶縁材料表面の第一の表面を備える。同様に、第二の副層は、対向する表面間で延びる溝を含むように構成配置され、対向する表面の一方は、絶縁材料表面の第二の表面を備える。更なる実施形態では、本明細書で示したように、第二の副層は、対向する表面間でそれぞれが延びる複数の溝を含むように構成及び準備可能であり、対向する表面の一方は、絶縁材料表面の第二の表面を備える。互いに接合又は固定される時、第一の及び第二の副層は、絶縁材料層の第一及び第二の表面が互いに対向すると共に、第一の副層の溝が第二の副層の一本以上の溝に対して角度を成すように配向され、更に詳しくは、第一及び第二の副層は、それぞれの副層の溝が互いに直交するように、或いは互いに対して約９０度の角度となるように配向される。
【００２７】
特定の実施形態において、第一及び第二の副層の各溝の先端の少なくとも一部は、開口されるように構成配置され、各溝は、互いに分離されるように、第一及び第二の副層のそれぞれにおいて形成される。開口部分は、更に、第一の副層の溝のそれぞれと、第二の副層の一本以上の溝のそれぞれとの交差位置において、ナノ細孔を備える開口部が形成されるように準備される。これにより、絶縁材料では、第一の副層の複数の溝のそれぞれと、第二の副層のそれぞれの溝との交差位置に、複数のナノ細孔が、直線又は一次元アレイにおいて形成される。更に特定の実施形態において、溝はＶ字形となり、Ｖ字形の溝の先端の一部は、開口されるように形成される。
【００２８】
典型的な例示実施形態において、第一及び第二の副層は、シリコンウェーハを備え、溝は、ＫＯＨ溶液中で酸化物又は窒化物マスクを使用して、シリコンウェーハに形成される。こうした手法により、溝、更に詳しくはＶ字形の溝は、エッチング速度及びエッチング時間を制御することで、高い精度（例えば、２０ｎｍ以内）で形成できる。シリコンウェーハの表面に溝をエッチングした後、第一及び第二の副層を共に接合する。接合後、組立体を酸化してＳｉＯ2を形成し、全てのシリコン面を絶縁する。
【００２９】
更に特徴となるのは、生体分子の特徴付け、ＤＮＡの配列決定、及びＲＮＡ二次構造の決定を一部として含む多数の分析プロセスのいずれかを実行するために、本発明の電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイを利用するシステム及び方法である。こうした方法は、上で説明したもの等の直線又は二次元の電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイを提供するステップと、二つのイオンリザーバ間に配置されるように絶縁部材を位置付けるステップを含む。こうした方法は、更に、生体分子又はＤＮＡを直線又は二次元アレイの任意の一個以上のナノ細孔に通過させるステップと、イオン電流又はその他の物理的パラメータの変化に基づいて、生体分子又はＤＮＡを特徴付けるステップとを含む。ＲＮＡ二次構造を決定する方法について、方法は、更に、ＲＮＡの一方の端部を光ピンセットに対して作用可能に結合するステップと、直線又は二次元アレイに含まれる任意の一個のナノ細孔を介してＲＮＡ分子を引っぱる際に当該一方の端部における力を測定するステップとを含む。
【００３０】
本発明の別の態様によれば、特徴となるのは、ＰＮＡ機能化ナノ細孔デバイス及びそれに関連するシステムである。こうしたＰＮＡ機能化は、本明細書で説明した一個以上のナノ細孔と、少なくとも一個以上のナノ細孔の少なくとも内部表面を覆うように付与されたＰＮＡコーティングとを含むナノ細孔デバイスである。更に特定の実施形態において、ＰＮＡ材料は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を形成する塩基の一つにより特徴付け又は構成されるように合成される。関連する方法は、ＤＮＡ／ＲＮＡ分子の一方の端部を光ピンセットに対して作用可能に結合するステップと、直線又は二次元アレイに含まれる任意の一個のナノ細孔を介して分子を引っぱる際に当該一方の端部における力を測定するステップとを含む。方法は、更に、力における変動を時間の関数として決定することでＤＮＡ／ＲＮＡ分子の配列を決定するステップと、変動を、ＰＮＡコーティングを特徴付ける一塩基とＤＮＡ又はＲＮＡにおいて見られる多数の塩基の任意の一個との間での結合効果に相関させるステップとを含む。
【００３１】
本発明のその他の態様及び実施形態については、以下に説明する。
【００３２】
本発明の性質及び所望の目的の完全な理解のために、いくつかの図の全てを通じて同様の参照符号が対応する部分を示す添付図面の各図と併せて、以下の詳細な説明を参照する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
次に、同様の参照符号が同様の部分を指す図面の様々な図を参照すると、図３乃至５には、本発明の一態様による、ナノ細孔１２を含むナノ細孔絶縁部材１０を作成するためのプロセスを例示する様々なビューが図示されている。更に詳しくは、図３は、硬化可能ポリマを使用して本発明の絶縁部材１０のナノ細孔１２を形成するための切縁部のメカニズムを例示する模式図であり、図４は、結晶の二つの切縁部間の距離を制御する例示的なフィードバックメカニズムの概略図であり、図５は、ＧａＡｓ結晶が除去された後の絶縁部材１０の一部の三次元図である。
【００３４】
本発明の一態様によれば、部材の厚さに渡って延びるナノ細孔１２を内部に含むように特に構成配置されたナノプローブ絶縁部材１０が提供される。更に特定の実施形態において、絶縁部材は、当業者に公知であると共に、本発明の絶縁部材での使用に適した多数の絶縁材料のいずれかにより構築される。使用中、絶縁ナノプローブ部材１０は、イオン溶液の二つのリザーバを分離するように配置され、絶縁部材は、好ましくは一本鎖ＤＮＡ分子の一本の鎖のみが通過するように寸法を定めた穴、即ち、ナノ細孔１２を含む。更に、二つのリザーバに電圧を印可した時、有利なことに、ナノ細孔の全体で電位降下が発生する。
【００３５】
本発明の絶縁部材１０を作成する一手法について、以下で説明する。しかしながら、ナノ細孔を備える貫通開口部を定めるメカニズムを提供するために固定した関係で結晶を維持するのに適した、その他の方法又は手法が考えられる。こうした方法は、有利なことに、長さ又はチャネル長さが約２０Å（オングストローム／１０-10ｍ）以下となるように制御可能なナノ細孔、更に詳しくはチャネル長さ約１０Å以下、又は更に詳しくはチャネル長さ約４Å、更に具体的には、次の関係、即ち、２Å≦ｄ≦１０Å又は４Å≦ｄ≦１０Åの一方を満たすチャネル長さ（ｄ）となるナノ細孔を有する絶縁部材を産出する。本明細書で示したように、こうした用途のナノ細孔を形成する従来の手法では、特徴付けの対象となるＤＮＡ鎖の長さを超える長さをナノ細孔が有する構造が生じ、特徴付けに不正確さをもたらす可能性がある。
【００３６】
この手法の例示として、結晶は、原子的な鋭縁部を形成するように劈開され、こうした二つの劈開結晶は、互いに数オングストロームの距離内に集められる。加えて、結晶は、図３の図に示したように、結晶縁部が約９０度の角度で互いを切断するように配置される。二つの結晶は、図４に示したもの等、標準のＳＴＭ（走査トンネル顕微鏡）電子機器を使用し、電子トンネル電流をフィードバックメカニズムとして使用して、固定した関係で保持される。二つの縁部間の交差点においては、縁部間の距離が小さく、特定のサイズより大きな分子は、この領域に入り込めない。言い換えると、交差点は、所望の幅より大きな幅を有する分子がこの領域に入り込めないように構築される。更に特定の実施形態において、結晶の縁部は、１Å乃至１０Åの範囲、更に具体的には約２Åになるように、互いに間隔を空ける。更なる実施形態において、結晶縁部は、結晶縁部間の間隔が絶縁材料の分子の厚さ（Ｔｍ）未満になるように、互いに間隔を空ける。更に具体的な実施形態において、結晶縁部間の間隔（Ｓｅ）は、Ｓｅ／Ｔｍ≦０．５の関係を満たすように設定される。
【００３７】
本発明での使用が考えられる結晶には、広範な結晶が含まれ、特定の典型的な例示実施形態において、結晶は、一般的な半導体材料であるＧａＡｓ結晶と、ＮａＣｌ結晶とを含む。しかしながら、本発明は、当業者に公知であると共に、絶縁部材を備えた絶縁材料を形成する際に、劈開及び固定した関係での保持に役立つ同様の特徴を有する他の結晶を使用して実施可能である。
【００３８】
このように配置された時、結晶は、交差する劈開結晶縁部を鋳型として使用する（例えば、ナノモールディング）。互いに固定した関係で結晶を配置した後、硬化可能ポリマである液体ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）等の絶縁材料（例えば、流動可能な絶縁材料）を、切縁部の領域に注ぎ込んで硬化させ、二つの結晶縁部は固定状態で保持する。縁部間の距離は、この禁止領域に分子が入り込めないように小さく設定される。したがって、絶縁部材１０を形成する絶縁材料に含まれる分子は、いわゆる禁止領域内へのアクセスを得ることを妨げられる。交差点近くのポリマで考えられる分子配座の一つも、図３に図示されている。絶縁材料の分子は、有利なことに、それぞれの劈開縁部に平行に配向され、交差点を中心に輪郭を形成するように強制され、一定の幅及び長さの小さな穴を残す。小さな穴の幅及び長さは、二つの縁部間の距離と、絶縁材料（例えば、ポリマ）の直径により制御される。
【００３９】
更なる実施形態において、このように絶縁部材１０が形成された後、絶縁部材においてナノ細孔又は開口部を制御可能に形成するために使用された結晶は、形成された穴に関して絶縁材料に感知可能な影響を与えない、当業者に公知の多数の手法のいずれかを使用して除去され、例えば、ＮａＣｌ結晶の場合、水で洗浄することで除去される。結晶の除去に続いて、図５に例示したもののような部材において、所望の幅及び長さを有する開口部が形成される。ＤＮＡ分子の化学基（ヌクレオチド）は僅かに異なるサイズを有するため、ナノ細孔伝導度の時間依存性を測定することで、ＤＮＡ分子のヌクレオチドを特定可能であり、したがって、ＤＮＡ分子を配列決定できる。これにより、絶縁材料において、ナノ細孔が形成され、ナノ細孔は、生体分子の特徴付け、更に詳しくは、生体分子の高速の特徴付けの目的にとって望ましい幅及び長さを有する。したがって、こうした絶縁部材１０は、法医学、ＤＮＡの迅速な配列決定、及び研究を含む広範な用途において大きな有用性を有するものとなる。本明細書で示したように、伝導度降下の量は、チャネルの最も狭い部分の内部にあるＤＮＡ分子の部分の物理的サイズの尺度となる。
【００４０】
図６を参照すると、本発明の別の態様による、電気的にアドレス可能なナノ細孔１１２アレイ、更に詳しくはナノ細孔の直線アレイを含むデバイス１００の斜視図が図示されている。デバイス１００は、上面１１２及び底面１１４を有する絶縁部材１１０を含む。複数の溝１１６は、絶縁部材に含まれる材料にとって適した、当業者に公知の多数の手法のいずれかを使用して、上面に形成される。上面１１２の溝１１６は、上面から所定の距離で、底面１１４に向かって全般的に下方へ延びるように、絶縁部材１１０に形成される。これに対して、底面１１４の溝１１８は、底面から所定の距離で、上面１１２に向かって全般的に上方へ延びるように、絶縁部材１１０に形成される。
【００４１】
加えて、上面１１２の溝１１６と、底面１１４の溝１１８との間の交差点において、絶縁部材は、絶縁部材１１０に開口部又はナノ細孔１２２が提供され、上面の溝１１６のそれぞれが流体的に底面の溝１１８に結合されるように構成配置される。溝１１６、１１８及びナノ細孔の形成については、下で更に詳細に説明する。
【００４２】
更に特定の実施形態において、絶縁部材１１０は、絶縁部材を形成するために使用される材料に適した、当業者に公知の多数の手法のいずれかを使用して接合された、或いはその他の形で互いに固定された、第一の層１２０ａ及び第二の層１２０ｂを含む。この特定の実施形態において、上面の溝１１６は、第一の層１２０に含まれ、底面の溝は、第二の層に含まれる。
【００４３】
ナノ細孔１２２は、例えば、迅速な生体分子の特徴付けのための所望の幅及び長さを有するナノ細孔を形成するのに使用される適切な材料に適した、多数の手法のいずれかを使用して、絶縁部材、或いは第一及び第二の層のそれぞれに形成される。特定の一実施形態において、第一及び第二の層１２０ａ、ｂは、共に接合又は固定され、ナノ細孔１１６は、上面及び底面の溝１１６、１１８の交差位置に形成される。別の特定の実施形態において、上面及び底面の溝１１６、１１８の先端の一部は、交差点に近接して、各溝に開口部が含まれるように形成され、第一及び第二の層１２０ａ、ｂを共に接合又は固定した時、溝の鋭縁部の開口部は、ナノ細孔を形成するように整合される。
【００４４】
加えて、例示した実施形態において、溝１１６、１１８は、深いＶ字形の溝を提供するように、上面及び底面１１２、１１４に形成される。これは制限的なものではなく、その他の場合に本発明の溝の機能に適合及び一致する、当業者に公知であるような他の形状も、本発明において使用されると考えられる。
【００４５】
特定の例示的実施形態において、絶縁部材１１０と第一及び第二の層とは、最初にシリコン材料から形成され、その後、絶縁部材の更なる処理の後で酸化させ、絶縁材料であるＳｉＯ2を形成する。開始物質はシリコンだが、これは制限とみなされるものではなく、本発明では、使用する材料に適した手法を使用して、本明細書で説明したようなナノ細孔１２２の直線アレイを作成可能な、その他の材料を使用することが考えられる。
【００４６】
更に具体的には、シリコン材料には、当業者に公知であるマイクロ機械加工手法を施し、溝１１６、１８８及びナノ細孔１２２を形成する。特に、溝及びナノ細孔は、ＫＯＨ溶液中で酸化物又は窒化物マスクを使用して相対的に高い精度で、或いはビームリソグラフィ及びウェットエッチング手法を使用して、シリコンウェーハにエッチングされる。当業者に公知である従来又は標準のウェットエッチング手順により、図６に例示したような極めて均一な溝を製造可能であることが分かっている。
【００４７】
更なる実施形態において、第一及び第二の層１２０ａ、ｂを構成するシリコンウェーハ
は、共に接合又は固定し、上面の溝１１６と底面の溝１１８との交差位置において、溝を形成するのに使用したものと同様のプロセスを使用して、溝の先端を更にエッチングし、貫通する開口部を形成する。更に別の実施形態において、溝１１６、１１８の形成中、溝の先端又は谷の一部、特に、上面及び底面の溝の交差に近接した部分は、先端のこうした部分に開口部を形成するために更にエッチングされる。第一及び第二の層は、接合又は互いに対して固定され、開口部の鋭縁部は、交差位置においてナノ細孔を形成する。このようにして、一方では、溝の鋭縁部を互いに９０°で向き合わせて二枚のシリコンウェーハを接合することにより、他方では、互いに対して９０°の溝を有するシリコンウェーハの一方又は両方の側から直接的にエッチングすることにより、「鋭縁部」細孔が生じる。当業者に公知であるように、表面のエッチングは、エッチング速度及びエッチング時間を制御することで、正確に制御できる。第一及び第二の層１２０ａ、ｂを形成するシリコンウェーハ又は材料のこうしたエッチング及び接合に続いて、組立体を酸化してＳｉＯ2を形成して全てのシリコン面を絶縁し、これにより、作用可能な形態の絶縁部材を形成する。
【００４８】
更なる実施形態では、作用可能な形態となるように絶縁部材１１０を作成した後、形成されたナノ細孔が所望の幅を有するかを判断するために、例えば、電子顕微鏡を使用して、ナノ細孔１１２を更に検査する。所望の幅を有しておらず、任意のナノ細孔の幅が臨界幅未満である場合には、ナノ細孔を高エネルギ電子ビームに晒し、ナノ細孔の寸法を修正する。下で更に十分に説明するように、小さな穴は、電子ビームに晒される時、表面張力により自然に収縮し、電子ビームをオフにすると、材料は急冷され、その形状を保持する。
【００４９】
以下では、この修正プロセスについて、例えば、加速電圧３００ｋＶで動作する市販の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用したものを更に例示する。電子顕微鏡においては、高い電子強度により試料が損傷又は変形することが周知であり、一般には、この影響を最小化することを試みる。しかしながら、本発明ではこの影響を使用して、酸化ケイ素のナノ細孔の寸法を制御された形で修正する。細孔が約５０ｎｍ以下の初期直径を有する場合、細孔は、約１０6乃至１０7Ａ／ｍ2の電子強度により収縮することが分かっている。
【００５０】
この手法の効力は、これまでにない精度で、ナノ細孔の直径を微調整できる可能性にある。所望の直径に達した時には、ビーム強度を低下又は消滅させることで、収縮プロセスを数秒以内に停止できる。加えて、細孔直径の変化は、顕微鏡の画像化メカニズムを使用してリアルタイムで監視できる。大まかな収縮は、電子強度を高めることで、少なくとも一桁速く実行可能であり、最終的な制御のために徐々に速度を低下させることができる。精度は、最終的には、顕微鏡の解像度により制限される。実際には、酸化ケイ素の表面粗度のため、約１ｎｍに制限される。この手法により提供される制御のレベルは、約１０ｎｍの最終解像度を有する従来の電子ビームリソグラフィに比べ、少なくとも一桁高い。そのため、こうした修正手法の使用は、５０ｎｍを下回る直径の任意の細孔をナノメートルサイズの細孔に縮小できることから、溝及びナノ細孔を形成するリソグラフィプロセスにおいて必要な寸法の制御を低減するメカニズムを提供する。
【００５１】
上の電子ビームプロセスを使用して観察された増大及び収縮に付随する物理的過程は、粘性を有する酸化ケイ素の表面張力により決定される。この状態において、構造は変形し、低い自由エネルギＦを有する構成となる。単純な自由エネルギの考察により、半径ｒ＜１／２ｈである細孔の表面エネルギは、ｒを減少させて低減可能であり、半径ｒ＞１／２ｈである細孔の表面エネルギは、ｒを増加させて増大可能であることが示唆される。二種類のケースを区別する「臨界直径」は、シリコンの厚さにより決まり、正確な比は細孔の形状に応じて変化する。このスケーリング因数は、任意のスケールにおいて有効であり、我々の細孔において観察された力学の的確な説明となる。
【００５２】
こうした本発明の手法の利点は、サブナノメートルの解像度の直接的な視覚フィードバックにより、ナノメートルスケールの試料の修正が可能となることである。プロセスは、標準のシリコン処理と、市販のＴＥＭ顕微鏡とに基づく。電子ビームでの微調整が最終ステップとして実行されるため、細孔を定めるリソグラフィにおいては、＜５０ｎｍの適度な解像度が求められる。ＳＯＩに基づくプロセスを使用することで、この要件は、電子ビームリソグラフィにより簡単に達成され、光リソグラフィのみでも達成できるものとなる。最近報告された「イオンビーム彫刻」手法と比較した、本発明の手法の他の利点は、電子ビームがガラス質の酸化ケイ素を軟化させ、変形と、表面張力による低速での駆動とを可能にすることから、本発明の手法が細孔を囲む材料の化学組成を変化させないことである。更に、電子顕微鏡がリアルタイムの視覚フィードバックを提供し、所望の形態が達成された時には、電子ビーム強度を低下させ、ＳｉＯ2を急冷して、当初のガラス状態にする。
【００５３】
次に図８を参照すると、ナノ細孔１１６の二次元アレイにより構成された、本発明による電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイ２００の概略図が図示されている。図６に図示した例示実施形態において、二次元アレイは、単一の絶縁部材１０に形成された二組以上の直線アレイにより構成される。例示実施形態において、上面の溝１１６ａ、ｂは、直線アレイの一つに一組の溝１１６ａが存在し、他の直線アレイのそれぞれに別の一組の溝１１６ｂが存在するように形成される。更なる実施形態において、上面１１２又は第一の層１２０ａの溝１１６ａ、ｂは、各直線アレイの溝が別の直線アレイの溝から分離されるように、或いは別の直線アレイの溝に接続されないように形成される。例えば、シリコンウェーハの上面において溝がエッチングされる時、材料は、有利な形で、溝の端部間において上面から除去されない。
【００５４】
上記は制限とみなされるものではなく、上面の溝を相互接続し、これにより上面の溝の単一の組が形成されるように、本発明による二次元アレイ上面溝１１６を構成可能にすることも、本発明の範囲内にある。例えば、下で説明するようなＲＮＡ二次構造の分析等、分析又は特徴付けにとってイオン電流が重要ではない場合、二次元アレイは、上面の溝を相互接続して、溝の単一の組が形成されるように構成できる。
【００５５】
次に図７を参照すると、ナノ細孔１２２の直線アレイを更に含んだ、電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイ１００を含む、本発明による電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイデバイス３００の斜視図が図示されている。明確にするため、一本の上面溝１１６のみを図示又は例示している。しかしながら、これは制限とみなされるものではなく、直線アレイ１００は、複数以上、例えば、１００本の上面溝を含み、これにより、１００個のナノ細孔を形成することが可能である。更に、直線アレイが例示されているが、デバイスが図８に示したアレイを含んだ二次元アレイ２００を含むことも、本発明の範囲内にある。
【００５６】
上記の説明において、本発明の電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイデバイス３００で使用されると考えられる、電気的にアドレス可能なアレイ１００、２００の更に詳細な説明を例示する図６及び図８を参照されたい。更に、電極及び流体ポートは、例示の目的で図示されている。実際のデバイスでは、電極及び流体ポートは密封される。
【００５７】
本発明による電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイデバイス３００は、アレイの上面及び底面を密封する当業者に公知であるようなカバースリップ３０２を含む。電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイ１００の製造に続いて、カバースリップ３０２は、使用する材料に適した、当業者に公知である多数の手法のいずれかを使用して、その上面及び底面に固定又は接合される。これは、好ましくは、電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイ１００、２００が作用可能な状態（例えば、特定の分析手法に適した所望の幅及び長さのナノ細孔）を有すると判断された後で実行される。加えて、電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイデバイス３００には、当業者に公知であるように、ポンプ線及び電極（例えば、Ａｇ／ＡｇＣｌ線）が適切に配置される。当業者に公知であるように、分析、データ収集、及び収集データ分析用の試料を供給する目的で、その他のデバイス、装置、及びシステム（図示なし）が、電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイデバイス３００に相互接続される。
【００５８】
次に図８Ａ、Ｂを参照すると、本発明の別の態様による二次元ナノ細孔アレイ５００の様々な図が示されている。本発明のこの態様による二次元アレイ５００は、図８Ａを参照すると、複数以上の本発明の単一のナノ細孔組立体５１０を備え、そのそれぞれは、好ましくは本明細書で説明した手法の一つを使用して形成されたナノ細孔５１２を含む。更に詳しくは、図８Ａには、本発明のこの態様の二次元アレイ５００の部分的に切断された上面図が図示されており、図８Ｂには、単一のナノ細孔組立体を介した図８Ａのアレイの側面図が図示されている。望ましい特徴を有する本発明によるナノ細孔組立体５１２を作成する手法については、図３乃至５に関する上記の説明を参照されたい。更に、下で説明されていない電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイの更なる詳細、特徴、及び特性については、上記の図７の説明を参照されたい。ナノ細孔組立体５１０に加えて、二次元ナノ細孔アレイ５００は、上部部材５２０と底部部材５３０とを含む。
【００５９】
ナノ細孔組立体５１０は、各ナノ細孔組立体の第一の体積５１４が互いに切り離され、電気的に分離可能となるように、二次元アレイ５００において構成及び配置される。上部部材５２０は、各ナノ細孔組立体の第一の体積５１４が互いに切り離され、電気的に分離可能となる状態が同様に維持されるような形で、ナノ細孔組立体５１０のそれぞれの（複数の）上面に取り付け又は固定される。上部部材５２０は、更に、各ナノ細孔組立体５１０の第一の体積５１４と流体的に連絡する一個の開口部が存在するように上部部材に配置された、複数以上の貫通開口部５２２を含む。
【００６０】
同様に、底部部材５３０は、各ナノ細孔組立体５１０の（複数の）下面に固定され、各ナノ細孔組立体の通路５１６と、底部部材とは、ナノ細孔５１２を通過した材料を収容する一つ以上の体積を定め、通過した材料を適切に取り扱い、更に処理できるようになる。
【００６１】
上部及び底部部材５２０、５３０は、使用目的にとって適切で、ナノ細孔組立体の（複数の）表面（例えば、本明細書で説明したカバースリップ３２０）に固定可能である当業者に公知の多数の材料のいずれかにより作成される。上部部材５２０の貫通開口部５２２は、当業者に公知である多数の手法のいずれかを使用して形成される。こうした貫通開口部５２２のサイズ及び深さは、材料が第一の体積５１４へ容易に通過できるようなものにして、貫通開口部を通過する際に材料が損傷する可能性を最小化する。貫通開口部５２２のサイズ又は直径は、ナノ細孔５１２にとって望ましい特徴と同じものを満たすように設定する必要はないと認識されたい。
【００６２】
こうした配置及び構成により、アレイを構成する他の任意のナノ細孔から分離して、各ナノ細孔に電気的にアドレス可能な、二次元ナノ細孔アレイ５００が生じる。したがって、分析、処理、及び／又は評価の対象となる材料は、任意の一個のナノ細孔を通過した材料（例えば、ＤＮＡ）を、独自に又は独立して、特定、特徴付け、分析、処理、又は評価可能となるように、ナノ細孔５１２のそれぞれに導入できる。こうした二次元アレイ５００は、高スループットを示すのに加え、ナノ細孔５１２のそれぞれを通過した材料の詳細、特性、又は特徴を提供する能力を維持する。
【００６３】
ナノ細孔組立体５１０は、更に、機械的及び接着剤固定手法を一部として含む、当業者に公知の多数の手法のいずれかを使用して固定化され、ナノ細孔組立体の集合は、事実上、単一の構造を形成するようになる。例えば、ナノ細孔組立体は、接着剤を使用して互いに固定できる。更に特定の実施形態において、上部部材５２０、底部部材５３０、及びナノ細孔組立体５１０は、単一の構造を形成するように互いに固定される。
【００６４】
例示した実施形態において、二次元アレイ５００は、ナノ細孔５１２又はナノ細孔組立体５１０の４×４マトリクスにより構成される。これは制限となるものではなく、これより多い又は少ないナノ細孔又はナノ細孔組立体でアレイを構成することも、本発明の範囲内にある。例えば、本発明による二次元アレイ５００は、１０００個以上のナノ細孔５１２、又は１０００個以下のナノ細孔５１２により構成できる（例えば、１００×１００ナノ細孔のマトリクスを備えるアレイ）。更に、正方形のアレイ（例えば、ｘ及びｙ方向に同数のナノ細孔５１２）が例示されているが、これは制限となるものではなく、一方の軸線に沿ったナノ細孔の数が他方の軸線に沿ったナノ細孔の数と異なるようにナノ細孔組立体を配置することも、本発明の範囲内にある（例えば、１００×７５のナノ細孔アレイ）。更に、ナノ細孔組立体は、ナノ細孔５１２の数が一方の軸線に沿って変化し（例えば、１００及び７０個のナノ細孔で変化）、他方の軸線に沿ったナノ細孔の数が一方の軸線に沿った数と全般的に異なったもの（例えば、７５個のナノ細孔）となるように配置できると考えられる。
【００６５】
上記では、複数以上、更に詳しくは、多数のナノ細孔組立体５１２を備える二次元アレイ５００について説明しているが、シリコンウェーハを処理するために本明細書で説明した手法を使用して、シリコンウェーハに形成された第一の体積にそれぞれが流体的に結合されたナノ細孔の二次元アレイを形成し、各ナノ細孔に独立して電気的にアドレスできるように、各第一の体積を互いに分離することも、本発明の範囲内にある。
【００６６】
本明細書で示したように、イオン電流を使用した迅速なＤＮＡ配列決定のプロセスは、これまでに実現されておらず、更に、こうしたプロセスは、アデニンとグアニンとの識別、及びシトシンとチアミンとの識別に使用可能にはなっていない。α溶血素タンパク質ナノ細孔を使用して、プリン基（アデニン及びグアニン）及びピリミジン基内のヌクレオチドを区別する最近の試みも成功していない。しかしながら、従来技術のプロセスの欠点は、本発明のデバイスにより克服される。例えば、一実施形態において、本発明の電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイデバイス３００は、更に、ＤＮＡがナノ細孔を通過する際の熱運動に起因すると考えられる信号ノイズを低減するように構成配置される。更に詳しくは、電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイデバイス３００は、ナノ細孔１２２を介してＤＮＡ分子を静止状態で保持する二つの光トラップ又は光ピンセットを形成するために、アレイデバイスのいずれかの側に対物レンズ３２０を備えて構成配置される。これにより、ナノ細孔の近辺及び／又は内部でのＤＮＡ分子の微動により発生するイオン電流信号のノイズは、大幅に低減される。更に、分子を静止状態で保持することで、信号平均化手法を使用して、イオン電流のノイズを更に低減できる。
【００６７】
分子を静止状態で保持することについては、以下の例示的な例から最も良く理解できるが、分析／特徴付けを受ける品目にとって更に適切な他の手法を応用及び適用することは、当業者にとって十分に可能となる。一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡに取り付け、次に、ストレプトアビジンビオチンリンカを使用して、後者をビーズ４００に取り付け、このビーズを光ピンセットにより保持する。次に、ナノ細孔１２２を介して一本鎖ＤＮＡを駆動し、同様に光ピンセットにより保持された別のビーズ４００を同じくストレプトアビジンビオチンリンカと共に使用して、反対側で捕獲する。ナノ細孔１２２を介し分子を静止させて保持する状態は、図９に例示されている。例示した実施形態において、ビーズ４００又はマイクロスフィアは、ポリスチレンのマイクロスフィア又はビーズである。
【００６８】
図１０には、本発明の電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイデバイス３００（図中のＥＡＮＡ）に関する、例示的な光学及びビデオシステム５００とその構成要素の一般的な配置とが図示されている。こうした光学及びビデオシステム５００は、光ピンセットと、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  １３５倒立顕微鏡に基づいたデジタルビデオ顕微鏡システムとを備える。更なる実施形態において、例示したアルゴンイオンレーザは、半導体に基づく赤外線レーザに置き換え、マイクロスフィア上の生体分子の光による損傷を最小化できる。システムは、二つの対物レンズを含み、標準の光学顕微鏡の集光レンズは、１００倍油浸対物レンズに置き換えられる。更に、試料の照明は、非焦点ダイオード光源を使用し、対物レンズを介して達成できる。
【００６９】
この技術で広く知られるように、レーザ物理学の下位分野には、光トラップがあり、光ピンセットは、光トラップの一例である。強く集束させたレーザ光線は、所定のサイズ範囲の粒子（例えば、誘電体の粒子）を捕獲及び保持する能力を有する。この手法により、原子及び分子（巨大分子を含む）と小さな誘電球体とのような粒子を研究及び操作することが可能となる。光ピンセットの使用に関するレビューは、A. Ashkin「レーザを使用した天然粒子の光トラップ及び操作」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 94, pp. 4853-4860, May 1977において見ることができる。
【００７０】
この技術において公知であるように、長い（一本鎖）ＲＮＡ（リボ核酸）分子は、相補的塩基の局所的対合のため、部分的に折り畳まれ、二次構造を形成する場合がある。こうしたＲＮＡの二次構造は、分子の特性にとって、一次配列より重要であると考えられる。例えば、タンパク質合成のためにＤＮＡ（デオキシリボ核酸）の遺伝情報を運ぶメッセンジャＲＮＡから、翻訳中にアミノ酸をリボソームに運ぶトランスファＲＮＡ（ｔＲＮＡ）まで、細胞内のＲＮＡ分子の多様な機能は、大部分が二次構造により生じる。ＲＮＡ二次構造を素早く決定する物理的手法を開発することは、新たな単一分子生物物理学の分野の主要な目標である。
【００７１】
本発明では、ＲＮＡを取り付けたマイクロスフィア又はビーズ４００を含む緩衝液を下面の溝１１８に流し、ナノ細孔１２２に電場によるバイアスをかける。時折、ＲＮＡ分子は、電場により、ナノ細孔１２２を介して引き込まれる。この事象は、細孔の近辺にある局所化されたマイクロスフィア又はビーズ４００を探すことで特定できる。その後、電場をオフにして、ＲＮＡに二次構造を形成させる。次に、図１１を更に参照すると、マイクロスフィア又はビーズ４００は、光ピンセットを使用してゆっくりと引き離し、ＲＮＡ分子が細孔１２２を介して（上方へ）引っぱられる際に、ビーズにおける力が測定される。ナノ細孔１２２の入口でのＲＮＡ塩基対の連続的な破損は、時間の関数となる力の変動として現れ、したがって、試験分子の二次構造に関する情報を明らかにする。この状況は、ＲＮＡの二次構造に関する事前の知識がなければ力対時間のトレースにおいて特徴を特定するのが困難となる、ＲＮＡを二つの端部で引っぱる以前のＲＮＡプリング実験とは全く異なることに留意されたい。本発明は、ＲＮＡ分子の二次構造に関する事前の知識を必要としない。
【００７２】
次に図１２Ａ、Ｂを参照すると、本発明のナノ細孔又はナノ細孔アレイを使用してＤＮＡ又はＲＮＡの特徴付け（例えば、配列決定）を行う別の手法が概略的に図示されている。更に詳しくは、これらの概略図は、本発明によるＰＮＡ機能化ナノ細孔６００を使用した配列決定手法を例示ししている。ＰＮＡのない本発明によるナノ細孔デバイス、装置、又は組立体の様々な手法及び配置についての上記の説明を参照されたい。明確にするために、以下の説明及び図においては、単一のナノ細孔を参照することで、本発明の手法及びデバイスを例示する。しかしながら、下で説明した手法及びデバイスを、直線アレイ又は二次元アレイを形成するために配置した複数以上のナノ細孔での使用に適合させることも、本発明の範囲内にある。
【００７３】
ナノ細孔６０２を形成した後、ナノ細孔の少なくとも一部、例えば、ナノ細孔６０２の少なくとも内面をコーティングするために、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を付与して、ＰＮＡコーティング６０４を形成する。このようにコーティングされたＰＮＡコーティング６０４及びナノ細孔６０２を、本明細書では、ＰＮＡ機能化ナノ細孔６００と呼ぶ。ナノ細孔上のＰＮＡコーティング６０４は、ＰＮＡ機能化ナノ細孔６００の開口部６０６を通過する任意のＤＮＡ／ＲＮＡに露出される。特定の実施形態において、ＰＮＡは、基本的に、ＤＮＡ又はＲＮＡの塩基の一つ（例えば、アデノシン、チミジン、グアニン、シトシン、ウラシル）により構成されるように合成される。更に具体的には、ＰＮＡの合成は、ＰＮＡを特徴付ける又は構成する一塩基がＤＮＡ／ＲＮＡによるＰＮＡ機能化ナノ細孔６００の通過に顕著な効果を有する設定となるように、更に詳しくは、ＤＮＡ／ＲＮＡを構成可能な様々な塩基に応じて異なる効果を有する設定となるように行われる。
【００７４】
例示として、特に図１２を参照すると、ＰＮＡコーティング６０４は、基本的にアデノシン塩基のみを有することで構成又は特徴付けされるものである（以降、Ａ−ＰＮＡと呼ぶ）。結果として、Ａ−ＰＮＡは、ＤＮＡを構成する特定の塩基、ＤＮＡ／ＲＮＡにおける塩基の配列、及びＰＮＡコーティング６０４とＤＮＡ／ＲＮＡ鎖との間の距離（例えば、結合距離）に応じて、機能化ナノ細孔６００でのＤＮＡ／ＲＮＡの鎖の通過に対して異なる効果を有する（例えば、水素結合）。例えば、Ａ及びＴ塩基間には強い結合効果が存在し、結果として、ＤＮＡ／ＲＮＡ鎖には比較的大きな力が加わり、これにより、機能化ナノ細孔６００内の鎖の運動を遅延させる。
【００７５】
本明細書で説明したような当業者に公知の手法を使用して、移動又はその他のパラメータ（例えば、一定距離を移動する時間）を遅延させる力が決定又は検出され、検出／決定されたパラメータは、Ａ−ＰＮＡがＤＮＡのＴ、Ａ、Ｇ、又はＣ塩基と結合している場合に提示されるパラメータに、そのパラメータが対応するかを決定するために評価される。例示的な一手法において、ＤＮＡ／ＲＮＡ鎖の端部は、ＰＮＡ機能化ナノ細孔６００を介して駆動され、ストレプトアビジンビオチンリンカと共にビーズ４００を使用して、反対側で捕獲される。この技術で公知である光ピンセットを使用して、ビーズ４００を保持する。更なる例示的な実施形態において、ビーズ４００又はマイクロスフィアは、ポリスチレンのマイクロスフィア又はビーズである。
【００７６】
マイクロスフィア又はビーズ４００は、光ピンセットを使用してＰＮＡ機能化ナノ細孔６００からゆっくりと引き離し、ＤＮＡ／ＲＮＡ分子が機能化ナノ細孔を介して引っぱられる際に、ビーズにおける力が測定される。本明細書で示したように、ＤＮＡ／ＲＮＡ分子を構成する塩基により、異なる力が分子に加わり、機能化ナノ細孔６００を介した分子の運動に影響を与える。こうした異なる影響は、時間の関数となる力の変動として現れ、したがって、少なくとも、試験分子を構成するＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ塩基の配列に関する情報を明らかにする。本発明の好適な実施形態について、具体的な用語を使用して説明したが、こうした説明は、例示的な目的のみを有し、以下の請求項の趣旨又は範囲から逸脱することなく、変更及び変形を行ってよいと理解される。
【００７７】
出典の明示による援用
本明細書で開示した全ての特許、公開特許出願、及びその他の参考文献は、出典を明示することによりその開示内容全体を本願明細書の一部とする。
【００７８】
等価物
当業者は、通常の実験のみを使用することで、本明細書で説明した本発明の特定の実施形態の多数の等価物を認識し、或いは確認できるであろう。こうした等価物は、添付特許請求の範囲に包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１Ａ】ナノ細孔を介した電圧駆動ＤＮＡ転位の基本概念を例示する図であり、更に詳しくは、α溶血素を使用した電圧駆動ＤＮＡ転位実験の概略図
【図１Ｂ】ナノ細孔を介した電圧駆動ＤＮＡ転位の基本概念を例示する図であり、更に詳しくは、１Ｍ  ＫＣｌ、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ｐＨ８．５）緩衝液においてポリ（ｄＡ）を使用した代表的な転位事象を例示する図
【図２Ａ】遮断電流とポリマの長さとの対比を例示するヒストグラム
【図２Ｂ】同じポリマでの転位速度とポリマの長さとの対比を例示するヒストグラム
【図３】硬化可能ポリマを使用してナノ細孔を形成するための切縁部のメカニズムを例示する模式図
【図４】二つの切縁部間の距離を制御する例示的なフィードバックメカニズムの概略図
【図５】ＧａＡｓ結晶が除去された後の硬化ポリマの一部の三次元図
【図６】本発明の態様による電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイの斜視図
【図７】明確化のためデバイスの上側に一本のみの溝を備えたナノ細孔の直線アレイを有する、本発明による電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイの斜視図
【図８】ナノ細孔の二次元アレイを有する、本発明による電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイの概略図
【図８Ａ】本発明の複数以上の単一ナノ細孔組立体を備える二次元アレイの部分切断上面図
【図８Ｂ】単一ナノ細孔組立体を介した図８Ａのアレイの側面図
【図９】ビーズ及び光ピンセットを使用して、ナノ細孔を介して分子を静止させて保持する状態を例示する説明図
【図１０】本発明の電気的にアドレス可能なナノ細孔アレイデバイスに関する、例示的な光学及びビデオシステムとその一般的な配置とのブロック図
【図１１】ＲＮＡの二次構造（群）に関連する情報を取得する手法を例示する概略図
【図１２Ａ】本発明によるＰＮＡ機能化ナノ細孔を使用した配列決定手法を例示する概略図
【図１２Ｂ】本発明によるＰＮＡ機能化ナノ細孔を使用した配列決定手法を例示する概略図
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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