(57)【要約】本発明は、ウイルスゲノム中にそれぞれが牛痘ＡＴＩプロモーターまたはその誘導体およびコード配列を含む、少なくとも２つの発現カセットを含む組換えポックスウイルスであって、そのコード配列の発現が前記プロモーターによって調節されていることを特徴とする、上記組換えポックスウイルスに関する。該ウイルスはワクチンとして、または薬学的調合物の一部として有用である。
2006515170.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスゲノム中にそれぞれが牛痘ＡＴＩプロモーターまたはその誘導体およびコード配列を含む、少なくとも２つの発現カセットを含む組換えポックスウイルスであって、そのコード配列の発現が前記プロモーターまたはその誘導体によって調節されていることを特徴とする、上記組換えポックスウイルス。
【請求項２】
少なくとも２つの発現カセットがポックスウイルスゲノム中の同じ挿入部位に挿入されている、請求項１記載の組換えポックスウイルス。
【請求項３】
少なくとも１つの発現カセットにおいて、ＡＴＩプロモーターがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列をもつ、請求項１または２のいずれか１つに記載の組換えポックスウイルス。
【請求項４】
少なくとも１つの発現カセットにおけるＡＴＩプロモーターが
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１による配列のサブ配列および 、
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１による配列またはそのサブ配列に対して、１つ以上のヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失および／またはヌクレオチド挿入を有する配列から選択され、その際当該サブ配列および配列がポックスウイルス中でプロモーターとして依然として活性を有する、ＡＴＩプロモーター誘導体である、請求項１または２のいずれか１つに記載の組換えポックスウイルス。
【請求項５】
ポックスウイルスがオルトポックスウイルス属（ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ）およびアヴィポックスウイルス属（ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ）を含む分類群より選択される、請求項１から４のいずれか１つに記載の組換えポックスウイルス。
【請求項６】
オルトポックスウイルス（ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）がワクシニアウイルスであり、アヴィポックスウイルス（ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）がカナリアポックスウイルス（ｃａｎａｒｙｐｏｘｖｉｒｕｓ）および鶏痘ポックスウイルス（ｆｏｗｌｐｏｘｖｉｒｕｓ）から選択される、請求項５記載の組換えポックスウイルス。
【請求項７】
ワクシニアウイルスが改変ワクシニアウイルス株アンカラ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  Ａｎｋａｒａ（ＭＶＡ））であり、特に、ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ（ＥＣＡＣＣ）にそれぞれ、番号Ｖ０００８３００８およびＶ００１２０７０７として寄託されているＭＶＡ−ＢＮおよびＭＶＡ５７５である、請求項６記載の組換えポックスウイルス。
【請求項８】
少なくとも１つの発現カセットが、ワクシニアウイルスコペンハーゲン株のゲノムに対して、ＭＶＡゲノムで元来より欠失している部位に挿入されている、請求項７記載の組換えポックスウイルス。
【請求項９】
少なくとも１つの発現カセットがポックスウイルスゲノムの遺伝子間領域に挿入されている請求項１から８のいずれか１つに記載の組換えポックスウイルス。
【請求項１０】
少なくとも１つのコード配列が少なくとも１つの抗原、抗原エピトープ、および／または治療化合物をコードする、請求項１から９のいずれか１つに記載の組換えポックスウイルス。
【請求項１１】
ワクチンまたは医薬としての、請求項１から１０のいずれか1つに記載の組換えポックスウイルス。
【請求項１２】
請求項１から１０のいずれか1つに記載の組換えポックスウイルスを含むワクチンまたは薬学的調合物。
【請求項１３】
ワクチンまたは医薬の製造のために、請求項１から１０のいずれか1つに記載の組換えポックスウイルスを使用する方法。
【請求項１４】
標的細胞中にコード配列を導入する方法であって、標的細胞に請求項１から１０のいずれか1つに記載のウイルスを感染させることを含む、上記導入する方法。
【請求項１５】
ペプチド、タンパク質および／またはウイルスの製造方法であって、
ａ）宿主細胞に請求項１から１０のいずれか1つに記載の組換えポックスウイルスを感染させる工程と、
ｂ）感染した宿主細胞を適当な条件下で培養する工程と、
ｃ）この宿主細胞が産生したペプチドおよび／またはタンパク質および／またはウイルスを単離および／または濃縮する工程と、
を含む、上記製造方法。
【請求項１６】
ヒトを含む動物生体における免疫応答に影響を与える、好ましくは免疫応答を誘導する方法であって、処置すべき動物またはヒトに、請求項１から１０のいずれか1つに記載のウイルス、または請求項１２に記載の調合物もしくはワクチンを投与する工程を含む、上記方法。
【請求項１７】
少なくとも１０２  ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）のウイルスを投与する工程を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１から１０のいずれか1つに記載のウイルスを含んでいる細胞
【請求項１９】
請求項１から１０のいずれか1つに記載の組換えウイルスの産生方法であって、ポックスウイルスのゲノム中に少なくとも２つの発現カセットを挿入する工程を含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、それぞれが牛痘ＡＴＩプロモーターまたはその誘導体およびコード配列を含む発現カセットを、少なくとも２つウイルスゲノム中に含む組換えポックスウイルスであって、そのコード配列の発現が前記プロモーターまたはその誘導体によって制御されていることを特徴とする、上記組換えポックスウイルスに関する。該ウイルスはワクチンまたは薬学的調合物の一部として有用である。
【背景技術】
【０００２】
組換えポックスウイルスは、感染細胞中で外来抗原を発現させるために、広く使用されている。また、組換えポックスウイルスは、ポックスウイルスベクターから発現される外来抗原に対する免疫応答を誘導するための極めて有望なワクチンとして、現在、試験されている。最も一般的なものに、アヴィポックスウイルスや、ワクシニアウイルスがある。特許文献１および特許文献２には、ＨＩＶ抗原およびＨＩＶタンパク質を発現させる組換えワクシニアウイルスワイス（Ｗｙｅｔｈ）株が開示されている。特許文献３には、レンチウイルス遺伝子を発現させる組換えワクシニアウイルスＮＹＣＢＨ株が開示されている。特許文献４には、ヒトレトロウイルス遺伝子を発現させる組換えワクシニアウイルスウェスタンリザーブ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ）株が開示されている。ウイルスゲノム中にＨＩＶ遺伝子を含む鶏痘ウイルスは、特許文献１および特許文献２に開示されている。
【０００３】
効果的な免疫応答を誘導するためには、それに対して免疫応答が誘導されるべき因子の単一なタンパク質だけの発現ではないことが望ましい。その代わりに、前記因子に対して広く効果的な免疫を獲得するために、できるだけ多くの異なる前記因子のタンパク質およびエピトープを発現することが望ましい。従って、予防接種にポックスウイルスをベクターとして使用する場合には、同一のポックスウイルスゲノム中にいくつかの異なる発現カセットを挿入することが有利である。特許文献１は、ＨＩＶ−１のｅｎｖ遺伝子およびＨＩＶ−１のｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子に対する発現カセットを持つ組換えポックスウイルスの構築を開示している。異なる発現カセットによりコードされるタンパク質の発現のために、異なるプロモーターすなわち、ワクシニアウイルスＤ１プロモーターおよび４０Ｋプロモーターを用いた。この方法の不利な点は、異なるプロモーターの活性が同一でない結果として、異なる発現カセットから発現されるタンパク質の量が異なることである。
【０００４】
ポックスウイルスゲノムにおける異なる発現カセット中のプロモーターが同一である場合には、ほぼ同一の発現量を得ることができる。しかし、この方法の不利な点は、相同／同一プロモーター配列の間で希望しない組換えが起こる危険性があるということである。実際に、ウイルスゲノムの異なる位置に３つのｐ７．５プロモーターを含む組換えワクシニアウイルスが作成されたが、相同プロモーター配列の間で組換えが生じた結果、組換えポックスウイルスの雑多なゲノム集団が生じたということが示されている（非特許文献１）。このようなウイルスゲノムの不安定性をもたらす雑多で不明確なゲノム集団は、もし予防接種に組換えポックスウイルスを用いるつもりの場合、特にヒトの予防接種に用いるつもりの場合には許容されない。
【特許文献１】米国特許第５，７３６，３６８号明細書
【特許文献２】米国特許第６，０５１，４１０号明細書
【特許文献３】米国特許第５，７４７，３２４号明細書
【特許文献４】欧州特許第０  ２４３  ０２９号明細書
【非特許文献１】Ｈｏｗｌｅｙら、Ｇｅｎｅ（１９９６）１７２，２３３−２３７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
少なくとも２つの、好ましくは、元来ポックスウイルスゲノムの一部でない遺伝子の発現カセットをもち、前記の少なくとも２つの異なる発現カセットによりコードされるタンパク質を類似した量で生産することができる、安定的な組換えポックスウイルスを提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この目的は、それぞれが牛痘ＡＴＩプロモーターまたはその誘導体およびコード配列を含む発現カセットを、少なくとも２つウイルスゲノム中に含む組換えポックスウイルスであって、そのコード配列の発現が前記プロモーターまたはその誘導体によって制御されていることを特徴とする、上記組換えポックスウイルスを提供することによって解決された。
【０００７】
本発明により、相同な配列の間、または同一のＡＴＩプロモーター配列の間でも検出可能な組換えが起こらないことが明らかにされ、２またはそれ以上のＡＴＩプロモーターのコピーを含むポックスウイルスが意外なことに安定であることが示された。これは、ウイルスゲノム中に２またはそれ以上のｐ７．５プロモーターを含むワクシニアウイルスと対照的である。
【０００８】
本発明では、ポックスウイルスは遺伝子の発現がＡＴＩプロモーターまたはその誘導体により制御されるいずれかのポックスウイルスでよい。従って、ポックスウイルスはコードポックスウイルス亜科(Chordopoxvirinae)およびエントモポックスウイルス亜科（Entomopoxvirinae）のサブファミリーのいずれかのウイルスでよい（Fields Virology 3rd edition, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, USA, Chapter: 83 , ISBN 0-7817-0253-4参照）。ヒトを含む哺乳類動物で、遺伝子を発現させるために組換えポックスウイルスを用いる場合には、サブファミリーがコードポックスウイルス亜科のウイルスが特に好ましい。コードポックスウイルス亜科サブファミリーへ属するとりわけ好ましい属は、オルトポックスウイルス属（Orthopoxviruses）、パラポックスウイルス属（Parapoxviruses）、アヴィポックスウイルス属（Avipoxviruses）、カプリポックスウイルス属（Capripoxviruses）、レポリポックスウイルス属（Leporipoxviruses）、およびスイポックスウイルス属（Suipoxviruses）である。最も好ましいのは、オルトポックスウイルス属とアヴィポックスウイルス属である。アヴィポックスウイルス属の例はカナリア痘ポックスウイルス（canarypoxviruses）と鶏痘ポックスウイルス（fowlpoxviruses）である。オルトポックスウイルス属の例はワクシニアウイルス（vaccinia virus）である。本発明で用いられるワクシニアウイルス株は、例えばコペンハーゲン（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）、テンプルオブへブン（Ｔｅｍｐｌｅ  ｏｆ  Ｈｅａｖｅｎ）、ワイス（Ｗｙｅｔｈ）、ウエスタンリザーブ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ）、エルストリー（Ｅｌｓｔｒｅｅ）、ＮＹＣＢＨなどのような任意のワクシニアウイルス株でよい。特に好ましいのは改変ワクシニアアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ（ＭＶＡ））である。ＭＶＡはワクシニアウイルスのアンカラ株（ＣＶＡ）をニワトリ胚繊維芽細胞で５１６代にわたって連続継代することで作成したものである（概要については、Ｍａｙｒ，Ａ．等、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ３，６−１４［１９７５］を参照されたい）。この長期間にわたる継代の結果、得られたＭＶＡウイルスではそのゲノム配列のうち約３１キロ塩基が欠失しているので、宿主細胞は鳥類細胞に著しく制限されると記載されている（Ｍｅｙｅｒ，Ｈ．等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１０３１−１０３８［１９９１］）。得られたＭＶＡは著しく非病原性であることが、さまざまな動物モデルで示されている（Ｍａｙｒ，Ａ．およびＤａｎｎｅｒ，Ｋ．［１９７８］Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．４１：２２５−３４）。また、このＭＶＡ株は、ヒト痘瘡疾患に対する免疫を与えるためのワクチンとして、臨床試験でも試験されている（Ｍａｙｒら、Ｚｂｌ．Ｂａｋｔ．Ｈｙｇ．Ｉ，Ａｂｔ．Ｏｒｇ．Ｂ  １６７，３７５−３９０［１９８７］、Ｓｔｉｃｋｌら、Ｄｔｓｃｈ．ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．９９，２３８６−２３９２［１９７４］）。
【０００９】
本発明では任意のＭＶＡ株を使用することができる。本発明で使用されるＭＶＡウイルス株の実例であって、ブダペスト条約の要件に従って寄託されているものに、英国ソールズベリー（Salisbury）のヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ：ＥＣＡＣＣ）にそれぞれ受託番号ＥＣＡＣＣ  Ｖ９４０１２７０７およびＥＣＡＣＣ  Ｖ００１２０７０７として寄託されているＭＶＡ  ５７２株およびＭＶＡ  ５７５株、ならびにＥＣＡＣＣ  Ｖ０００８３００８として寄託されているＭＶＡ−ＢＮがある。
【００１０】
最も好ましいＭＶＡ株はＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体である。ＭＶＡ−ＢＮの特徴、あるＭＶＡ株がＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体であるかどうかを調べることが可能な生物学的アッセイの説明、およびＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体の取得を可能にする方法は、国際公開第０２／４２４８０号明細書に開示されている。この特許出願の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００１１】
一般的に、ヒトを含む動物への予防接種または治療にウイルスを用いる場合には、ヒトを含む動物に害のないウイルスを用いるのが好ましい。
【００１２】
ヒトにとって特に安全なポックスウイルスは、ＭＶＡのような異種のワクシニアウイルス株や鶏痘ポックスウイルスおよびカナリア痘ポックスウイルスのようなアヴィポックスウイルスである。
【００１３】
ＭＶＡを増殖させるには真核細胞にこのウイルスを感染させる。これらの真核細胞は、各ポックスウイルスに感染しやすく、感染性ウイルスの複製および産生を許容する細胞である。これらの細胞はポックスウイルス種ごとに当業者によって知られている。ＭＶＡの場合、このタイプの細胞の例は、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）とＢＨＫ細胞である（Ｄｒｅｘｌｅｒ  Ｉ．，Ｈｅｌｌｅｒ  Ｋ．，Ｗａｈｒｅｎ  Ｂ．，Ｅｒｆｌｅ  Ｖ．およびＳｕｔｔｅｒ  Ｇ．, Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７９，３４７−３５２）。ＣＥＦ細胞は当業者に知られている条件で培養することができる。好ましくは、ＣＥＦ細胞を、静置フラスコまたはローラーボトル中、無血清培地で培養する。インキュベーションは好ましくは３７℃±２℃で４８〜９６時間行う。感染には、ＭＶＡを好ましくは０．０５〜１  ＴＣＩＤ５０の感染多重度（ＭＯＩ）で使用し、インキュベーションを好ましくは３７℃±２℃で４８〜７２時間行う。
【００１４】
牛痘ウイルスＡ型封入体タンパク質遺伝子のプロモーター（ＡＴＩプロモーター）の配列は当業者に知られている。これについては、Ｇｅｎｅｂａｎｋエントリー、アクセッション番号Ｄ００３１９を参照されたい。好ましいＡＴＩプロモーター配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示すが、その配列は次のとおりである：
５’  ＧＴＴＴＴ  ＧＡＡＴＡ  ＡＡＡＴＴ  ＴＴＴＴＴ  ＡＴＡＡＴ  ＡＡＡＴ  ３’。
【００１５】
本発明によれば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示すＡＴＩプロモーターを使用するか、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１による配列のサブ配列であってもよいＡＴＩプロモーターの誘導体を使用することができる。「ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１による配列のサブ配列」という用語は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１より短いＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の断片であって、プロモーターとして（特にワクシニアウイルス後期プロモーターとして）まだ活性であるものを表す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列の典型的な断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列のうち、少なくとも１０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも２５ヌクレオチドの長さを有する。サブ配列は、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド２５番目から２９番目、すなわちＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の３’末端に位置する５’−ＴＡＡＡＴ−３’という配列を含む。また、サブ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド２２番目から２９番目、すなわちＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の３’末端に位置する５’−ＴＡＡＴＡＡＡＴ−３’という配列も含むことができる。
【００１６】
本プロモーターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド２８番目から２９番目（上記の配列で下線を引いた部分）が５’  ＡＴＧ  ３’翻訳開始コドンの一部になるような形で、コード配列の上流に挿入することができる。もう１つの選択肢として、本プロモーターは、いくつかのヌクレオチドによって、翻訳開始コドンから隔てられていてもよい。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のプロモーターの３’末端と５’  ＡＴＧ  ３’開始コドン中のＡとの間のスペーサー（spacer）は、好ましくは１００ヌクレオチド未満、より好ましくは５０ヌクレオチド未満、さらに好ましくは２５ヌクレオチド未満である。ただしスペーサーは、本プロモーターが本プロモーターの下流に位置するコード配列の発現を誘導する能力を依然として持っている限り、さらに長くてもよい。
【００１７】
ＡＴＩプロモーターの誘導体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列またはサブ配列に対して、１つ以上のヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失および／またはヌクレオチド挿入を有する配列であることもでき、この場合、その誘導体はプロモーターとして（特にワクシニアウイルス後期プロモーターとして）まだ活性である。１つ以上のヌクレオチド置換を有する配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列のうち１つ以上のヌクレオチドが、異なるヌクレオチドに置換されている配列である。１つ以上のヌクレオチド挿入を有する配列は、１つ以上のヌクレオチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列の１つ以上の位置に挿入されている配列である。１つ以上のヌクレオチド欠失を有する配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列のうち１つ以上のヌクレオチドが１つ以上の位置で欠失している配列である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の誘導体では、欠失、置換および挿入が１つの配列内で組み合わされていてもよい。
【００１８】
本誘導体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列に対して、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の相同性を有する。最も好ましい態様では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列中、６個以下のヌクレオチド、さらに好ましくは３個以下のヌクレオチドが、置換、欠失および／または挿入を起こしている。
【００１９】
特に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド２５番目から２９番目、すなわちプロモーター中の配列５’−ＴＡＡＡＴ−３’は、最大のプロモーター活性が得られるように、残しておくことが好ましいかもしれない。また、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド２２番目から２９番目、すなわちプロモーター中の配列５’−ＴＡＡＴＡＡＡＴ−３’を残しておくことも好ましいかもしれない。
【００２０】
ＡＴＩプロモーターまたはそのサブ配列の位置に関する上述の記載は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列またはそのサブ配列に対して、１つ以上のヌクレオチド置換、欠失および／または挿入をもつ上記で定義された配列にも適用される。
【００２１】
当業者は、さまざまな先行技術文献を利用して、ワクシニアウイルスプロモーター（特にワクシニアウイルス後期プロモーター）として活性であるという生物学的活性を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のどの誘導体がまだ持っているかを予測することができる。これについては、Ｃｈａｋｒａｒｂａｒｔｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９７）２３，１０９４−１０９７や、ＤａｖｉｓｏｎおよびＭｏｓｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８９）２１０，７７１−７８４を参照されたい。また、ある断片がワクシニアウイルスプロモーター、特にワクシニアウイルス後期プロモーターとして依然として活性があるかどうかも、当業者は容易に確かめることができる。具体的には、配列誘導体をプラスミドコンストラクト中のレポーター遺伝子の上流にクローニングすることができる。そのコンストラクトを、ポックスウイルスに感染している真核細胞または細胞株、例えばＣＥＦまたはＢＨＫ細胞にトランスフェクトすることができる。感染に用いるポックスウイルスは同属由来のポックスウイルスが好ましく、上記プロモーターがゲノム中に挿入されるポックスウイルスよりも同一のポックスウイルスを用いるのがより好ましい。次に、レポーター遺伝子の発現を決定し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のプロモーターによって制御されるレポーター遺伝子の発現と比較する。本発明の誘導体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のプロモーター配列の活性と比較して、この試験系で少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも９０％のプロモーター活性を有する誘導体である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１より高いプロモーター活性を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の誘導体も、本発明の範囲に包含される。
【００２２】
本発明では、組換えポックスウイルスは少なくとも２つの発現カセットを含み、それぞれはＡＴＩプロモーターまたはその誘導体を含む。すなわち、組換えポックスウイルスのゲノムは２つ以上のＡＴＩプロモーターまたはその誘導体を含む。ウイルスゲノム中のＡＴＩプロモーターは同一のものでも異なるものでもよい。従って、すべてのＡＴＩプロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列を持ちうる。すべてのＡＴＩプロモーターがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列の同じ誘導体であってもよい。あるいはまた、１つ以上のＡＴＩプロモーターがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列をもつことができ、同一のポックスウイルスゲノム中の１つ以上のＡＴＩプロモーターがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列の誘導体であってもよい。このようなポックスウイルスゲノムが２つ以上のＡＴＩプロモーター誘導体を含む場合、これらの誘導体は同じものでも異なるものでもよい。さらにはまた、ポックスウイルスゲノム中のすべてのＡＴＩプロモーターが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列の異なる誘導体であってもよい。
【００２３】
概括的にいうと、本発明は少なくとも２つのＡＴＩプロモーターまたはその誘導体を、ポックスウイルスゲノム中に含む組換えポックスウイルスに関する。従って、上記ウイルスは例えば２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくはそれ以上のＡＴＩプロモーターまたは、その誘導体をウイルスゲノム中に含むことができる。
【００２４】
ＡＴＩプロモーターまたはその誘導体は通常、それぞれが牛痘ＡＴＩプロモーターまたはその誘導体、および上記プロモーターにより発現を制御されるコード配列を含む発現カセットの一部である。コード配列は、ＡＴＩプロモーターまたはその誘導体により発現が制御される任意の配列でよい。
【００２５】
１つの選択として、ポックスウイルス中の少なくとも１つのＡＴＩプロモーターは、既にポックスウイルスゲノムの一部である遺伝子の発現に使用することができる。このような遺伝子はもともとウイルスゲノムの一部であるものでも、既にポックスウイルスに挿入されている外来遺伝子でもよい。これらの場合には、ＡＴＩプロモーターはポックスウイルスゲノム中で、その発現がＡＴＩプロモーターにより制御される遺伝子の上流に挿入されている。
【００２６】
またそれに加えて、少なくとも１つのＡＴＩプロモーターまたはその誘導体は、ポックスゲノムに挿入されている発現カセットの一部であってもよい。ＡＴＩプロモーターまたはその誘導体およびコード配列を含む発現カセットは、ウイルスゲノム中の適当な任意の位置に挿入することができる。以下の例に拘束されることなく、適した挿入部位を以下より選択することができる。（ｉ）ＴＫ−遺伝子のような非必須遺伝子、（ｉｉ）当該遺伝子の機能が、ウイルスの増殖に用いられる細胞により補われる場合には、ウイルスの複製に必須の遺伝子、（ｉｉｉ）ポックスウイルスゲノム内の遺伝子間領域、「遺伝子間領域」という用語は、好ましくは、ウイルスゲノムのうち、２つの隣接した遺伝子間に位置する部分であって、コード配列を含んでいない部分を表す。（ｉｖ）ポックスウイルスゲノムの元来より欠失している部位。元来からの欠失部位をもつウイルスゲノムの例は、ＭＶＡのゲノムであり、当該ゲノム中ではワクシニアウイルス株コペンハーゲンのゲノムに対して、特定の領域が欠失している。
【００２７】
上記記載のように、挿入部位はこれらの好ましい挿入部位に限るわけではない。というのも、本発明では、ＭＶＡおよびワクシニアウイルス全般やアヴィポックスウイルスのような他のポックスウイルスの場合には、少なくとも１つの細胞培養系（例えばニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ細胞））で増幅および増殖することが可能な組換え体を得ることができる限り、発現カセットはウイルスゲノムのどこに挿入してもよいからである。
【００２８】
異なる発現カセット／ＡＴＩプロモーターまたはその誘導体はポックスウイルスゲノム中で異なる挿入部位に挿入することができる。
【００２９】
種々の理由により、ポックスウイルスゲノムの同じ挿入部位に２つ以上の発現カセットを挿入することが好ましい。しかし、そのような場合には、異なる発現カセット間で起こる相同組換えが排除されなければならない。相同組換えにより発現カセットの一部が欠失した組換えウイルスが生じてしまう。ポックスウイルスベクターゲノムの重要でない部分が欠失しても、生じた組換え体はまだ生体活性を有する。従って、同じ挿入部位に２つ以上の発現カセットを保持しているウイルスは淘汰されない。このような望まない組換えが生じるのを避けるために、従来技術では２つ以上の発現カセットを同じ挿入部位に挿入する場合には、異なるプロモーターを用いていた。本発明では、発現カセット中のプロモーター間で相同組換えが起こらないため、それぞれがＡＴＩプロモーターまたはその誘導体をもつ２つ以上の発現カセットを、同じ挿入部位に挿入することが可能である。
【００３０】
したがって、好ましい実施態様では、全てではないとしても少なくとも２つの発現カセットがポックスウイルスゲノムの同じ挿入部位に挿入される。この場合、異なる発現カセットどおしは異なる発現カセット間では、ポックスウイルス配列とは直接隣接しないか、または少なくとも異なる発現カセット間では、かなり短いポックスウイルス配列としか隣接しない。
【００３１】
組換えポックスウイルスの構築に必要な方法は当業者に知られている。例えば、発現カセットおよび／またはＡＴＩプロモーターもしくはその誘導体は、相同組換えによってポックスウイルスゲノムに挿入することができる。この目的を達成するには、発現カセットおよび／またはＡＴＩプロモーターもしくはその誘導体を挿入しようとするポックスウイルスゲノムの領域に相同な一連のヌクレオチドが隣接している発現カセットおよび／またはＡＴＩプロモーターもしくはその誘導体を含む核酸を、許容細胞株にトランスフェクトする。ＭＶＡに対する許容細胞はＣＥＦおよびＢＨＫ細胞である。これらの細胞にポックスウイルスを感染させると、感染した細胞では、上記の核酸とウイルスゲノムとの間で相同組換えが起こる。もう１つの選択肢として、まず細胞にポックスウイルスを感染させた後、その感染細胞に上記の核酸をトランスフェクトすることもできる。この場合も組換えが細胞内で起こる。次に、当技術分野で知られている方法によって、組換えポックスウイルスを選択する。組換えポックスウイルスの構築はこの特定方法に限定されるわけではなく、当業者に知られている適当な方法はどれでもこの目的に使用することができる。
【００３２】
ポックスウイルス中のＡＴＩプロモーターは、任意のコード配列の発現を制御するために使用することができる。コード配列は、好ましくは、少なくとも１つの抗原エピトープまたは抗原をコードすることができる。この場合は、組換えポックスウイルスを使って、生物（例えばヒトを含む哺乳動物）中の細胞に感染させた後、当該抗原を発現させることができる。この抗原／エピトープの提示により、その生物では、この抗原／エピトープが由来する因子に対する当該生物の予防接種につながりうる免疫応答が誘発されうる。より具体的に述べると、エピトープ／抗原は、より大きいアミノ酸配列、例えばポリエピトープ、ペプチドまたはタンパク質などの一部であることができる。そのようなポリエピトープ、ペプチドまたはタンパク質の例として、（ｉ）ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ヘルペスウイルス、デングウイルス（Denguevirus）、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス（mumps virus）、風疹ウイルス、肝炎ウイルスなどのウイルス、（ｉｉ）細菌、（ｉｉｉ）真菌に由来するポリエピトープ、ペプチドまたはタンパク質を挙げることができる。
【００３３】
異なる発現カセットから発現されるタンパク質、ペプチドまたはポリエピトープは、ウイルス、細菌、または真菌のような同一の因子より由来してもよい。一例として、発現カセットから発現されるすべての生成物がＨＩＶタンパク質でもよい。もしすべての生成物が同じ因子に由来する場合には、当該因子に対してとても広い免疫応答を誘導することができる。あるいはまた、異なる発現カセットから発現されるタンパク質、ペプチド、またはエピトープが異なる因子由来であってもよい。一例として、ある１つのポックスウイルスゲノム中の発現カセット由来の生成物が、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、および風疹ウイルスのような異なるウイルス由来のものであってもよい。この実施態様においては、いくつかの因子に対する免疫応答を誘導するために、ひとつの組換えポックスウイルスを用いることができる。
【００３４】
もう１つの選択肢として、コード配列は、インターロイキン、インターフェロン、リボザイムまたは酵素などの治療化合物をコードしてもよい。
【００３５】
組換えポックスウイルスは、当業者の知識に従って、動物またはヒトの身体に投与することができる。したがって本発明の組換えポックスウイルスは医薬（すなわち薬学的調合物）またはワクチンとして役立ちうる。
【００３６】
本薬学的調合物または本ワクチンは、組換えポックスウイルスに加えて、一般に、１つ以上の医薬的に許容できるかつ／または承認された担体、添加剤、抗生物質、保存剤、アジュバント、希釈剤および／または安定剤を含みうる。そのような補助物質は、水、食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などでありうる。適当な担体は、典型的には、緩徐に代謝される巨大分子、例えばタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体などである。
【００３７】
薬学的調合物またはワクチンを製造するには、組換えポックスウイルスを生理学的に許容できる形態に変換する。これは、痘瘡の予防接種に用いられるポックスウイルスワクチン（Ｓｔｉｃｋｌ，Ｈ．ら［１９７４］Ｄｔｓｃｈ．ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．９９，２３８６−２３９２に記載されているもの）を製造する際の経験に基づいて行うことができる。例えば、ポックスウイルスがＭＶＡの場合には、精製ウイルスは、約１０ｍＭのトリスおよび１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中に、５×１０８  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価で製剤化されて、−８０℃で保存される。ワクチン注射剤を製造するには、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に入っている本発明の組換えウイルス粒子１０１〜１０９個を、２％ペプトンおよび１％ヒトアルブミンの存在下に、アンプル（好ましくはガラスアンプル）中で凍結乾燥する。もう１つの選択肢として、ワクチン注射剤は、製剤中のウイルスの段階的凍結乾燥によって製造することもできる。この製剤は、さらに、例えばマンニトール、デキストラン、糖、グリシン、乳糖もしくはポリビニルピロリドンなどの添加剤、または、生体内投与に適した酸化防止剤もしくは不活性ガス、安定剤または組換えタンパク質（例えばヒト血清アルブミン）などの他の添加剤も含むことができる。組換えＭＶＡの凍結乾燥に適した典型的な製剤は、１０ｍＭトリス緩衝液、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１８．９ｇ／ｌデキストラン（ＭＷ３６０００〜４００００）、４５ｇ／ｌショ糖、０．１０８ｇ／ｌ  Ｌ−グルタミン酸一カリウム塩一水和物（ｐＨ７．４）を含む。次に、ガラスアンプルを密封して、４℃から室温で数ヶ月間保存することができる。しかし、必要がない限り、アンプルは−２０℃未満の温度で保存することが好ましい。
【００３８】
予防接種または治療を行うには、上記の凍結乾燥物を０．１〜０．５ｍｌの水性溶液、好ましくは水、生理食塩水またはトリス緩衝液に溶解し、それを全身的または局所的に、すなわち非経口投与、筋肉内投与、または当業者に知られている他の任意の投与経路によって、投与することができる。当業者であれば、投与様式、投与量および投与回数を、既知の方法で最適化することができる。
【００３９】
したがって、関連する一態様として、本発明は、ヒトを含む動物生体における免疫応答に影響を与える、好ましくは免疫応答を誘導する方法であって、処置すべき動物またはヒトに、本発明のウイルス、調合物またはワクチンを投与することを含む方法に関する。組換えポックスウイルスが組換えＭＶＡの場合には、ワクチン注射剤は、典型的には、少なくとも１０２、好ましくは少なくとも１０４、より好ましくは少なくとも１０６、さらに好ましくは１０８  から１０９  ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）のウイルスを含む。
【００４０】
さらに本発明は、標的細胞中に少なくとも２つのコード配列を導入する方法であって、標的細胞に本発明のウイルスを感染させることを含む方法に関する。標的細胞は、本ウイルスの複製が起こりうる細胞であってもよいし、組換えウイルスを感染させることはできるが、ウイルスの複製は起こらない細胞、例えば組換えＭＶＡの場合には、あらゆるタイプのヒト細胞などであってもよい。
【００４１】
さらに本発明は、ペプチド、タンパク質および／またはウイルスを製造する方法であって、宿主細胞に本発明の組換えウイルスを感染させた後、感染した宿主細胞を適当な条件下で培養し、さらに続いて、その宿主細胞が産生したペプチドおよび／またはタンパク質および／またはウイルスを単離および／または濃縮することを含む方法に関する。本発明のウイルスを製造（すなわち増幅）したい場合、細胞は、組換えＭＶＡの場合に、本ウイルスの複製が起こりうるＣＥＦまたはＢＨＫ細胞などの細胞である必要がある。本ウイルスがコードしているペプチド／タンパク質（好ましくはＡＴＩプロモーターまたはその誘導体が発現を制御しているコード配列によってコードされているタンパク質／ペプチド）を製造したい場合は、細胞は、本組換えウイルスを感染させることができ、ポックスウイルスがコードするタンパク質／ペプチドの発現を許容する細胞であれば、どの細胞でもよい。
【００４２】
さらに本発明は、本発明のウイルスに感染した細胞に関する。
（図面の簡単な説明）
（図１および図２）組換えベクターｐＢＮ７０（図１）およびｐＢＮ７１の概要を示す。
F1A137L は挿入領域のフランク１（Ｆｌａｎｋ１） 、F2A137L は挿入領域のフランク２（Ｆｌａｎｋ２）、F2rpt はフランク２の反復、prATI は ＡＴＩプロモーター、pr7.5 はｐ７．５プロモーター、 GUS は GUSコード領域、NS1 はNS1 コード領域、NPTII はネオマイシン耐性、IRES は内部リボソームエントリー部位、EGFPは強化緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）コード領域、AmpR はアンピシリン耐性遺伝子を示す。
（図３）ＭＶＡ−ｍＢＮ３０（図３Ａ）またはＭＶＡ−ｍＢＮ３１（図３Ｂ）を感染させた細胞における、ＮＳ１遺伝子の発現を測定するためのＲＴ−ＰＣＲアッセイの結果を示す。
【００４３】
Ａ）Ｍ：分子量マーカー、レーン１：プラスミドｐＢＮ７０を用いたアッセイ（ポジティブコントロール（positive control)）、レーン２：核酸の添加なしでのアッセイ（ネガティブコントロール(negative control)）、レーン３：ＭＶＡ−ｍＢＮ３０を感染させたＢＨＫ細胞から単離したＲＮＡで、逆転写酵素添加なしでのＰＣＲ、レーン４：ＭＶＡ−ｍＢＮ３０を感染させたＢＨＫ細胞から単離したＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ、レーン５：ＭＶＡ−ＢＮを感染させたＢＨＫ細胞から単離したＲＮＡで、逆転写酵素添加なしでのＰＣＲ、レーン６：ＭＶＡ−ＢＮを感染させたＢＨＫ細胞から単離したＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ。
【００４４】
Ｂ）Ｍ：分子量マーカー、レーン１：ＭＶＡ−ｍＢＮ３１を感染させた細胞からのＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ、レーン２：ゲノム中にＮＳ１遺伝子を含む異なる組換えＭＶＡを感染させた細胞からのＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ、レーン３：ＭＶＡ−ＢＮを感染させた細胞からのＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ、レーン４：ｍＢＮ３１を感染させた細胞からのＲＮＡを用いたＰＣＲ（逆転写酵素の添加なし）、レーン５：ゲノム中にＮＳ１遺伝子を含む、異なる組換えＭＶＡを感染させた細胞からのＲＮＡを用いたＰＣＲ（逆転写酵素の添加なし）、レーン６：ＭＶＡ−ＢＮを感染させた細胞からのＲＮＡを用いたＰＣＲ（逆転写酵素の添加なし）、レーン７：プラスミドｐＢＮ７１を用いたアッセイ（ポジティブコントロール（positive control)）、レーン２：核酸の添加なしでのアッセイ（ネガティブコントロール(negative control)）。
【００４５】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。しかしながら当業者は、これらの実施例が、決して本発明によって提供される技術の適用範囲を限定するものではないことを十分に理解している。
【実施例】
【００４６】
（ＭＶＡゲノムの単一部位において牛痘ウイルスＡＴＩプロモーターにより制御される２つの外来遺伝子の安定的挿入）
この実施例の目的は、両方ともＡＴＩプロモーターによって制御される２つの外来遺伝子の挿入が安定だということを明らかにすることであった。
【００４７】
（要約）
以下の実施例は、ウイルスゲノム中にＡＴＩプロモーターのコピーを２つ含む組換えＭＶＡの安定性を明らかにする。この目的を達成するために牛痘ＡＴＩプロモーターをＧＵＳ遺伝子（大腸菌β−グルクロニダーゼ）とデングウイルスの非構造（ＮＳ）１遺伝子とにそれぞれ融合させた。比較のために、ＧＵＳ遺伝子は、元来存在しているワクシニアウイルスｐｒ７．５プロモーターとも融合させた。ＡＴＩプロモーター−ＮＳ１遺伝子発現カセットおよびＡＴＩプロモーター−ＧＵＳ遺伝子発現カセットまたはｐ７．５プロモーター−ＧＵＳ遺伝子発現カセットを、ＭＶＡゲノムと相同な配列を含む組換えベクターに挿入した（図１および図２）。結果として得られたプラスミドｐＢＮ７０（ＡＴＩプロモーター−ＮＳ１遺伝子発現カセットおよびＡＴＩプロモーター−ＧＵＳ遺伝子発現カセット）およびｐＢＮ７１（ＡＴＩプロモーター−ＮＳ１遺伝子発現カセットおよびｐ７．５プロモーター−ＧＵＳ遺伝子発現カセット）において発現カセットは、発現カセットを挿入しようとするＭＶＡゲノム中の配列に相同な配列と隣接している。相同配列により発現カセットのＭＶＡゲノムの１３６−１３７遺伝子間領域（ＩＧＲ）への挿入が導かれる。ＣＥＦ細胞にＭＶＡ−ＢＮを感染させ、それぞれｐＢＮ７０およびｐＢＮ７１をトランスフェクトした。この細胞では、ＭＶＡゲノムと組換えプラスミドとの間で相同組換えが起こった結果、組換えＭＶＡゲノムが生じた。組換え体は数回のプラーク精製を行った後、ＣＥＦ細胞で継代した（継代の総数はプラーク精製を含めて２０回）。組換え体は、安定性、挿入遺伝子の発現、２つのプロモーターの２つの異なる構成を含む組換えＭＶＡコンストラクトの配列について試験を行った。配列の解析、ＰＣＲおよび機能の試験の結果、組換え断片が正確に挿入され、ＡＴＩプロモーターが２回ゲノム中に挿入されている場合でも、挿入が安定であることおよび機能していることが示された。
【００４８】
（材料および装置）
初代ＣＥＦ細胞、１０８  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価を有するＭＶＡ−ＢＮ、エフェクテントランスフェクションキット（Effectene transfection kit（Ｑｉａｇｅｎ））、ＶＰ−ＳＦＭ細胞培養培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ＤＮＡヌクレオスピンブラッドクイックピュアキット（DNA Nucleospin Blood Quick Pure Kit（Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ））、トリプルマスターＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、オリゴヌクレオチド（Oligos（ＭＷＧ））、塩基配列決定ＤＣＴＳクイックスタートキット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）。
【００４９】
（方法）
組換えベクターｐＢＮ７０およびｐＢＮ７１（図１および図２）は当業者によって知られている標準的な手順によりクローニングした。
【００５０】
６穴プレートのウェルで行われるトランスフェクション反応１つにつき５×１０５個のＣＥＦ細胞を播種し、ＶＰ−ＳＦＭ中３７℃および５％ＣＯ２で一晩維持した。１ウェルにつき０．５ｍｌのＶＰ−ＳＦＭ中で、細胞にＭＶＡ−ＢＮ（ＭＯＩ  ０．１）を感染させ、振盪機上、室温で、１時間インキュベートした。トランスフェクションは製造者の実験手順書（Ｑｉａｇｅｎ）に記載されているとおりに行った。
【００５１】
その結果得られた組換えウイルスは、選択的条件（Ｇ４１８、３００μｇ／ｍｌ）下で何回か継代し、精製クローンが生成されるまで、単一プラークを単離、増幅および解析した。
【００５２】
（結果）
・  組換えウイルスの構築
２つの異なるプロモーターの組み合わせ（ＡＴＩ−ＮＳ１／ＡＴＩ−ＧＵＳまたはＡＴＩ−ＮＳ１／ｐ７．５−ＧＵＳ）の下で、ＮＳ１−およびＧＵＳ−配列を発現する、２つの組換えＭＶＡを作製した。これらの配列を当業者に知られている方法により、選択カセットＩＲＥＳ／ＥＧＦＰ（内部リボソームエントリー部位／強化緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ））とともにＭＶＡゲノムの１３６−１３７ＩＧＲ（ＭＶＡゲノムのＯＲＦ  Ａ１３６ＬとＡ１３７Ｌの間の遺伝子間領域）部位に挿入した。これらのウイルスは選択的条件下で、２０回精製および継代を行った。両方の組換えＭＶＡを未精製ストックスケール（crude stock scale）まで増幅した（１ｘ１７５ｃｍ２  ｂｏｔｔｌｅ）。この実施例のＡＴＩプロモーター配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列と一致する。
【００５３】
・ＥＧＦＰコード領域の発現
ＩＧＲ１３６−１３７に挿入した試験遺伝子の機能性を測定するために、継代の間蛍光を観察した。もし挿入した遺伝子がこの部位で機能しない場合には、ＥＧＦＰの発現は検出されない。ＭＶＡ−ｍＢＮ３０とＭＶＡ−ｍＢＮ３１を感染させたＢＨＫでは、１３６−１３７ＩＧＲに挿入された遺伝子の転写がはっきりと見られた。
【００５４】
３．ＭＶＡ−ｍＢＮ３０とＭＶＡ−ｍＢＮ３１の１３６−１３７ＩＧＲのＰＣＲ解析
ＩＧＲ１３６−１３７における空ベクターのコンタミネーションの可能性を排除するために、および、ウイルスゲノムが期待する長さの挿入を含むかどうか調べるために、ＰＣＲ解析を行った。この目的を達成するために、挿入部位に隣接する領域で結合するプライマーを用いた。フランク１（ｆｌａｎｋ１）および２部位で結合するプライマーに対して期待されるＰＣＲバンドは（ｉ）組換えＭＶＡ−ｍＢＮ３０では３．４ｋｂ、（ｉｉ）組換えＭＶＡ−ｍＢＮ３１では３．５ｋｂおよび（ｉｉｉ）空のベクターＭＶＡ−ＢＮでは２１２ｂｐである。期待される長さのバンドがＭＶＡ−ｍＢＮ３０およびＭＶＡ−ｍＢＮ３１において確認され、これにより組換え体が正確なゲノム構造をもつことが示された。野生型ウイルスは、試験されたＭＶＡ−ｍＢＮ３０またはＭＶＡ−ｍＢＮ３１ＤＮＡ調整物中どちらでも確認されなかった。さらに空のベクターコントロール（control)ＭＶＡ−ＢＮ（空ベクター）の場合は、両方の組換えＭＶＡにおいて期待される２１２ｂｐの生成物であった。ネガティブコントロール(negative control)ではシグナルは検出されなかった。従って、選択圧により、組換えベクターを空ベクターＭＶＡ−ＢＮから効果的に選択および分離することができた。
【００５５】
４．１３６−１３７領域の塩基配列決定
塩基配列決定の結果より、ｍＢＮ３１およびｍＢＮ３０プロモーターおよびＧＵＳが塩基対の変化なしにＩＧＲ１３６−１３７部位に挿入されたことが示された。ｍＢＮ３０のＮＳ１でも塩基対配列中に変化は見られなかった。ｍＢＮ３１ではＮＳ１の塩基対配列中に４つの点突然変異があった（１３１５番目：Ｇに代わってＣ、１５８２番目：Ａに代わってＧ、１９６１番目：Ｃに代わってＡ、１９６３番目：Ｔに代わってＧ）。それらのうち２つは（１５８２および１９６３番目）アミノ酸置換を生じなかった。この塩基配列決定の結果から、これらの重要でない小さな変化にかかわりなく、両組換え体、ｍＢＮ３１およびｍＢＮ３０が完全なＮＳ１配列を含むことが明らかである。さらに、この塩基配列決定データから、ＮＳ１遺伝子が２つのＡＴＩプロモーターを含む組換えｍＢＮ３０に安定して含まれていると結論することができる。この実験により、２つの同一のＡＴＩプロモーター配列がウイルスゲノム中に含まれていても、組換え体が安定であることが明らかとなった。
【００５６】
５．組換え体ｍＢＮ３０およびｍＢＮ３１におけるＮＳ１遺伝子およびＧＵＳ遺伝子の発現解析
上記のＰＣＲおよび配列データにより、ＮＳ１遺伝子とＧＵＳ遺伝子が、組換え体ＭＶＡ−ｍＢＮ３０および３１のゲノム中に含まれていることが明らかとなった。これらの遺伝子がウイルスゲノムから発現されているかどうか調べるために、ＮＳ１領域のＲＴ−ＰＣＲおよび生成されるＧＵＳタンパク質の機能の試験および定量化を行った。
【００５７】
５．１  ＮＳ１領域のＲＴ−ＰＣＲ
この実験は、ＩＧＲ１３６−１３７部位に挿入されるＮＳ１遺伝子を含む組換えＭＶＡ−ｍＢＮ３０およびｍＢＮ３１が、ｍＲＮＡとしてＮＳ１を機能的に発現するかどうかを明らかにするために行った。ＢＨＫ細胞にウイルスＭＶＡ−ｍＢＮ３０およびｍＢＮ３１をそれぞれ感染させた。ＲＮＡをこれらの細胞から単離してＲＴ−ＰＣＲアッセイに用いた。この結果より、感染させたＢＨＫ細胞においてＮＳ１が両方のウイルスより発現していることが明らかである。逆転写の段階を省略した場合にＰＣＲシグナルが検出されなかったため、ウイルスＤＮＡのコンタミネーションは排除することができた。水のコントロール（control)では陰性であり、両ウイルスのプラスミドポジティブコントロール（positive control)では明確なＰＣＲバンドが見られた（図３）。
【００５８】
・ＧＵＳ活性測定
２０回継代後のＭＶＡ−ｍＢＮ３０およびｍＢＮ３１に挿入されたＧＵＳの発現を明らかにするために、ＧＵＳ活性を定量的に測定した。表１より、両組換えウイルスにおいてＧＵＳが発現していることが明確に示されたが、挿入のないＭＶＡ−ＢＮではＧＵＳ発現は計測できなかった。
【００５９】
【表１】
2006515170.tif 000003
【００６０】
２０回継代後のＭＶＡ−ｍＢＮ３０、ＭＶＡ−ｍＢＮ３１およびＭＶＡ−ＢＮにおけるＧＵＳ活性の測定。ＭＶＡ−ｍＢＮ３０およびＭＶＡ−ｍＢＮ３１は全体で２０回継代した。細胞に両組換えウイルスを感染させ、２４時間後に溶解緩衝液中に回収した。ＧＵＳ活性は当業者により知られている方法により測定した。活性の値は４１５ｎｍにおける吸光度により測定した。０．０５未満および２．０より大きい値は範囲外とした。
【００６１】
（判定基準）
・ＩＧＲ１３６−１３７のＰＣＲ解析
ネガティブコントロール(negative control)のレーンにはバンドが観察されず、ポジティブコントロール（positive control)において期待される大きさのバンドのみが観察される。ＭＶＡ−ＢＮでは２１２ｂｐの断片が期待される。
・領域１３６−１３７の塩基配列決定およびＰＣＲ
プライマーを用いたウイルスのターゲットＤＮＡのＰＣＲ増幅では、期待される長さの単一断片が現れる。配列が会合する結果として、期待する長さの二本鎖ＤＮＡ断片に相当する１つの連続的な配列が生じる。突然変異がこの領域で生じていない場合でも、短い一本鎖の伸張は許容される。さらに、連続的な配列の末端はＰＣＲ増幅産物の不均一な性質のため、一本鎖だけは許容される。試験サンプルの配列は参照配列またはそれぞれのデータベース配列に対して９７％以上の相同性を示す。
・ＮＳ１のＲＴ−ＰＣＲ
ネガティブコントロール(negative control)のレーンではバンドは観察されず、ポジティブコントロール（positive control)において期待される大きさのバンドのみが観察される。ｐＢＮ７１では９０９ｂｐ断片およびｐＢＮ７０では９０７ｂｐ断片が期待される。
【００６２】
（結論）
選択的条件下で２０回継代後、１３６−１３７ＩＧＲのＰＣＲ解析では、空ベクターのＭＶＡ−ｍＢＮ３１（ＡＴＩ−ＮＳ１／ｐ７．５−ＧＵＳ）またはＭＶＡ−ｍＢＮ３０（ＡＴＩ−ＮＳ１／ＡＴＩ−ＧＵＳ）へのコンタミネーションは見られなかった。ＭＶＡ−ｍＢＮ３０ではＡＴＩ部位で相同組換えが起こらなかったことがＰＣＲにより明らかになった。ＭＶＡ−ｍＢＮ３０とＭＶＡ−ｍＢＮ３１を（１）ストックに空のベクターが含まれてないこと、および両遺伝子が両方とも同じプロモーター下であっても同じＩＧＲ部位中にまだ挿入されていることを明らかにするための確定的なＰＣＲ（ｍＢＮ３０において）、（２）塩基配列が変化していないことを明らかにするための領域の塩基配列決定、および（３）定量的ＧＵＳアッセイによるＧＵＳの機能的発現およびＮＳ１のＲＴ−ＰＣＲ、により調べた。上記研究の結果は、同じプロモーターの制御下にある同じＩＧＲで２つの異なる遺伝子を二重に挿入しても、高い継代数のあとでもプロモーター部位での組換えは起こらないことを示すものである。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】組換えベクターｐＢＮ７０の概要を示す。
【図２】組換えベクターｐＢＮ７１の概要を示す。
【図３】ＭＶＡ−ｍＢＮ３０（図３Ａ）またはＭＶＡ−ｍＢＮ３１（図３Ｂ）を感染させた細胞における、ＮＳ１遺伝子の発現を測定するためのＲＴ−ＰＣＲアッセイの結果を示す。
【配列表】
2006515170.tif 000004
【図１】
2006515170.tif 000005
【図２】
2006515170.tif 000006
2006515170.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成17年2月3日(2005.2.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスゲノム中に、それぞれが牛痘ＡＴＩプロモーターまたはその誘導体または前記ＡＴＩプロモーターのサブ配列またはその誘導体およびコード配列を含む発現カセットを、少なくとも２つ含む組換えポックスウイルスであって、そのコード配列の発現が前記プロモーター、誘導体またはサブ配列によって制御されていて、前記牛痘ＡＴＩプロモーターの誘導体がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列と比較した場合に少なくとも６０％の相同性を有する配列、および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１での置換、欠失および／または挿入が多くても６ヌクレオチドである配列であり、前記牛痘ＡＴＩプロモーターのサブ配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列の少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有し、そして前記プロモーター、誘導体またはサブ配列がプロモーターとして活性であるという生物学的活性を有することを特徴とする、上記組換えポックスウイルス。
【請求項２】
プロモーター、誘導体またはサブ配列がワクシニアウイルス後期プロモーターとして活性であるという生物学的活性を有する、請求項１記載の組換えポックスウイルス。
【請求項３】
プロモーター、誘導体またはサブ配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の２５番目から２９番目または２２番目から２９番目のヌクレオチドを含む、請求項１または２のいずれか１つに記載の組換えポックスウイルス。
【請求項４】
組換えポックスウイルス中のプロモーター、誘導体またはサブ配列が同一である、請求項１から３のいずれか１つに記載の組換えポックスウイルス。
【請求項５】
少なくとも２つの発現カセットがポックスウイルスゲノム中の同一の挿入部位に挿入されている、請求項１から４のいずれか１つに記載の組換えポックスウイルス。
【請求項６】
少なくとも１つの発現カセットにおいて、プロモーターがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列をもつ、請求項１から５のいずれか１つに記載の組換えポックスウイルス。
【請求項７】
少なくとも１つの発現カセットにおけるプロモーターが、ＡＴＩプロモーターの誘導体またはＡＴＩプロモーターのサブ配列またはその誘導体である、請求項１から６のいずれか１つに記載の組換えポックスウイルス。
【請求項８】
ポックスウイルスがオルトポックスウイルス属（ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ）およびアヴィポックスウイルス属（ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ）を含む分類群より選択される、請求項１から７のいずれか１つに記載の組換えポックスウイルス。
【請求項９】
オルトポックスウイルス（ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）がワクシニアウイルスであり、アヴィポックスウイルス（ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）がカナリアポックスウイルス（ｃａｎａｒｙｐｏｘｖｉｒｕｓ）および鶏痘ポックスウイルス（ｆｏｗｌｐｏｘｖｉｒｕｓ）から選択される、請求項８記載の組換えポックスウイルス。
【請求項１０】
ワクシニアウイルスが改変ワクシニアウイルス株アンカラ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  Ａｎｋａｒａ（ＭＶＡ））であり、特に、ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ（ＥＣＡＣＣ）にそれぞれ、番号Ｖ０００８３００８およびＶ００１２０７０７として寄託されているＭＶＡ−ＢＮおよびＭＶＡ５７５である、請求項９記載の組換えポックスウイルス。
【請求項１１】
少なくとも１つの発現カセットが、ワクシニアウイルスコペンハーゲン株のゲノムに対して、ＭＶＡゲノムで元来より欠失している部位に挿入されている、請求項１０記載の組換えポックスウイルス。
【請求項１２】
少なくとも１つの発現カセットがポックスウイルスゲノムの遺伝子間領域に挿入されている請求項１から１１のいずれか１つに記載の組換えポックスウイルス。
【請求項１３】
少なくとも１つのコード配列が少なくとも１つの抗原、抗原エピトープ、および／または治療化合物をコードする、請求項１から１２のいずれか１つに記載の組換えポックスウイルス。
【請求項１４】
ワクチンまたは医薬としての、請求項１から１３のいずれか1つに記載の組換えポックスウイルス。
【請求項１５】
請求項１から１３のいずれか1つに記載の組換えポックスウイルスを含むワクチンまたは薬学的調合物。
【請求項１６】
ワクチンまたは医薬の製造のために、請求項１から１３のいずれか1つに記載の組換えポックスウイルスを使用する方法。
【請求項１７】
標的細胞中にコード配列を導入する方法であって、標的細胞に請求項１から１３のいずれか1つに記載のウイルスを感染させることを含む、上記導入する方法
【請求項１８】
ペプチド、タンパク質および／またはウイルスの製造方法であって、
ａ）宿主細胞に請求項１から１３のいずれか1つに記載の組換えポックスウイルスを感染させる工程と、
ｂ）感染した宿主細胞を適当な条件下で培養する工程と、
ｃ）この宿主細胞が生成したペプチドおよび／またはタンパク質および／またはウイルスを単離および／または濃縮する工程と、
を含む、上記製造方法。
【請求項１９】
ヒトを含む動物生体における免疫応答に影響を与える、好ましくは免疫応答を誘導する方法であって、処置すべき動物またはヒトに、請求項１から１３のいずれか1つに記載のウイルス、または請求項１５に記載の調合物もしくはワクチンを投与する工程を含む、上記方法。
【請求項２０】
少なくとも１０２  ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）のウイルスを投与する工程を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１から１３のいずれか1つに記載のウイルスを含んでいる細胞
【請求項２２】
請求項１から１３のいずれか1つに記載の組換えウイルスの生成方法であって、ポックスウイルスのゲノム中に少なくとも２つの発現カセットを挿入する工程を含む、上記方法。
【国際調査報告】
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