(57)【要約】本発明は、グルコースに応答してインスリン産生を維持しながらも、連続した連続継代において安定な様式で増殖され得る、中間の分化段階の膵臓幹細胞が存在するとの知見に関連する。これらの細胞は、培養において増大可能かつ安定であるという両方の点で有利であり、そして後期発生段階、すなわち、原型島細胞へと誘導され得るという点で有利である。本発明はさらに、これらの中間の分化段階の細胞を選択し、そして初期段階または後期段階の膵臓細胞を選択的に除去する培養技術を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
９０％　ＰＤＸ−１陽性、および１：１００と１０００：１との間のインスリン：アクチンのｍＲＮＡ比を有するという特性を保持しながら、第１培養容器から第２容器へと１平方センチメートルあたり約１８０細胞の初濃度で継代されて１平方センチメートルあたり約１，８００細胞へと増大する能力を有する、増殖する膵臓細胞の細胞培養物を調製する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）増殖する膵臓細胞を単離する工程；
（ｂ）成長ホルモンを含み、そして１％以下の血清総容積を有する培養培地へと該細胞を移植して、１：１００と１０００：１との間のインスリン：アクチンｍＲＮＡ比を有しかつＰＤＸ−１陽性である細胞を選択的に増殖させる工程；および
（ｃ）該細胞を継代して、９０％　ＰＤＸ−１陽性、および１：１００と１０００：１との間のインスリン：アクチンのｍＲＮＡ比を有するという特性を保持しながら、第１培養容器から第２容器へと１平方センチメートルあたり約１８０細胞の初濃度で継代して１平方センチメートルあたり約１，８００細胞へと増大する能力を有する、増殖する膵臓細胞の細胞培養物を提供する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記細胞が、第１培地の総容積の１％と４％との間の血清を含む第１培地中で維持された後に、成長ホルモンおよび総容積の１％以下の血清を含む第２培地へと移植される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、第１培地の総容積の４％を超える血清を含む第１培地中で維持された後に、成長ホルモンおよび総容積の１％以下の血清を含む第２培地へと移植される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が、第１培地の総容積の約４％を超える血清を含む第１培地から、成長ホルモンおよび総容積の１％未満の血清を含む第２培地へと、逐次低くなる量の血清を有する培地への連続継代によって移植される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記単離された増殖する膵臓細胞が、ＰＤＸ−１陽性表現型およびＰＤＸ−１陰性表現型の混合物を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞培養物が、１：１０と１００：１との間のインスリン：アクチンｍＲＮＡ比を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ｃｋ−１９陽性細胞の被包被膜および内部細胞塊を含む培養膵臓細胞の凝集物を産生する方法であって、ここで、該凝集物は、５０〜５０００の膵臓細胞を含み、そして５０ミクロンと３００ミクロンとの間の直径を有し、該方法は、以下の工程：
（ａ）基材上で膵臓細胞を培養する工程；
（ｂ）該基材から該細胞を除去する工程；
（ｃ）ＰＤＸ−１陽性膵臓細胞を、工程（ｂ）によって産生された基材に再度播種する工程；および
（ｄ）工程（ｃ）の細胞を工程（ｃ）の基材上で培養して、ｃｋ−１９陽性細胞の周囲の被膜および内部細胞塊を含む培養膵臓細胞の凝集物を提供する工程であって、ここで、該凝集物は、５０〜５０００の膵臓細胞を含み、そして５０ミクロンと３００ミクロンとの間の直径を有する、工程
を包含する、方法。
【請求項８】
前記工程（ａ）または工程（ｃ）の培養する工程が、成長ホルモンおよび１％未満の総容積の血清を含む培地中で行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物に膵臓内分泌機能を提供する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）請求項７に記載の方法によって培養膵臓細胞の凝集物を産生する工程；および
（ｂ）該凝集物を該哺乳動物内に移植する工程
を包含する、方法。
【請求項１０】
前記細胞が、１リットルあたり１ｍｇ〜２ｍｇの間の組換え成長ホルモンを含む培地中で継代される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、組換えヒト成長ホルモンを含む培地中で継代される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が、上皮増殖因子を含む培地中で継代される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法によって産生される、増殖する膵臓細胞の培養物。
【請求項１４】
９０％　ＰＤＸ−１陽性、および１：１００と１０００：１との間のインスリン：アクチンのｍＲＮＡ比を有するという特性を保持しながら、第１培養容器から第２容器へと１平方センチメートルあたり約１８０細胞の初濃度で継代して１平方センチメートルあたり約１，８００細胞へと増大する能力を有する、増殖する膵臓細胞の培養物。
【請求項１５】
請求項７に記載の方法によって産生される、膵臓細胞の凝集物。
【請求項１６】
培養膵臓細胞の凝集物であって、ＣＫ−１９陽性細胞の被包被膜および内部細胞塊を含み、ここで、該凝集物は、５０〜５０００の膵臓細胞を含み、そして５０ミクロンと３００ミクロンとの間の直径を有する、凝集物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、米国仮出願第６０／２１５，６３４号（２０００年６月３０日出願）および米国仮出願第６０／２４６，３０６号（２０００年１１月１１日出願）および米国仮出願（出願番号未割当て）（２００１年５月１７日出願）の利益を主張する。
【０００２】
（連邦政府によって支援された研究および開発の下で行われた発明に対する権利についての言及）
該当なし。
【０００３】
（コンパクトディスクで提出された「配列表」、表またはコンピュータプログラム表の付属書の言及）
該当なし。
【０００４】
（発明の分野）
本発明は、グルコースに応答してインスリン産生を維持しながらも、連続した連続継代において安定な様式で増殖され得る、中間の分化段階の膵臓幹細胞が存在するとの知見に関連する。これらの細胞は、培養において増大可能（ｅｘｐａｎｄａｂｌｅ）かつ安定の両方であり、そして後期発生段階へと誘導され得るという点で有利である。本発明はさらに、これらの中間の分化段階の細胞を選択し、そして初期段階または後期段階の膵臓細胞を選択的に除去する培養技術を提供する。
【０００５】
（発明の背景）
哺乳動物膵臓は、胚前腸芽から発生する。胚芽が成長するにつれ、管系は、分岐形態形成によって発達する。腹側および背側の原基が融合した後、新たな器官が成長し、そして２つの連結した構造（外分泌系および内分泌系）へと成熟する。膵臓の大部分は、消化酵素を産生する腺房細胞から構成される。内分泌系は、β細胞（これは、インスリンを産生する）、α細胞（これは、グルカゴンを産生する）およびδ細胞（これは、ソマトスタチンを産生する）を含む。内分泌細胞は、島と呼ばれるクラスターへと組織化される。
【０００６】
動物研究は、β細胞形成の少なくとも２つの機構（管前駆体細胞からの新生および成熟β細胞の複製）を示した。分化したβ細胞の複製は、生後、成人期まで維持される。β細胞の複製は、例えば、高グルコース注入、部分的膵切除の結果としておよび妊娠中、インスリンについての需要の増大によって加速される。これらの条件下で、β細胞塊は、細胞肥大（個々の細胞の容積の拡大）および過形成（β細胞の数の増加）の両方を通して迅速に増大する。
【０００７】
Ｉ型、すなわち、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）では、β細胞に対する自己免疫攻撃に起因して、β細胞の数の明確な減少が存在する。Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１４：１３６０−１３６８（１９８６）。Ｉ型糖尿病についての処置は、Ｉ型糖尿病を患っている被験体におけるβ細胞数の増加を含み得る。Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．１４１：１９２６−１９２９（２０００）。
【０００８】
島細胞を用いる糖尿病についての別の処置は、免疫適合ドナー由来の膵臓組織を移植レシピエントへと移植することを含む。代表的に、移植レシピエントは、免疫抑制剤治療を受けて移植された器官の拒絶を防ぐことが必要とされる。近年開発された免疫抑制剤レジメンは、ヒトにおける臨床的島移植の結果を改善した。この技術は実験的なままであるが、島細胞移植が器官全体の膵臓移植と同じ機能を果たし得る場合、このずっと単純な外科手順は、糖尿病の処置において重要な役割を果たす。
【０００９】
ヒトの島の移植は、糖尿病についての強力な処置としての見込みを示すが、この手順の有用性を現在制限する多数の障害が存在する。１つの顕著な障害は、この手順において使用するために充分な数の島細胞を産生できないことである。現在、移植のために島を得るために用いられるこの手順は代表的に、膵臓組織の単離、周囲の細胞から個々の細胞を遊離させる膵臓組織の酵素消化、および勾配遠心分離精製技術の使用を含む。勾配遠心分離精製技術は、当該分野で周知であり、そして多くの島移植センターによって実施される。不幸なことに、標準的な手順を用いて処理された単一の膵臓からの島の収率は通常、移植には不充分である。従って、この手順に対する代替物が求められており、そして開発されている。胎児組織または異種移植組織の使用が開発されているが、倫理的問題、供給源材料の入手可能性、および免疫拒絶もしくは異種栄養性病原体についての懸念がこのようなアプローチを複雑にさせている。
【００１０】
今日まで、膵臓内分泌疾患を処置するための移植における使用のために膵臓細胞を単離、培養および増大する能力はわかりにくいままであった。島および島細胞は膵臓組織から単離され得るが、この単離された材料は、適切に保存されない場合、ほんの短期間しか生存可能でなく、そしてほんの短期間しか内分泌機能を果たし得ないままである。膵臓幹細胞を単離し、そしてインビトロで分化を誘導するための種々のアプローチが報告されている（Ｐｅｃｋら，Ａｎｎ　Ｍｅｄ　３３：１８６−１９２（２００１）；Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒら，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　１４：７９９９−８００４（２０００）；米国特許第６，００１，６４７号；同第５，９２８，９４２号；同第５，８８８，９１６号；ＰＣＴ刊行物ＷＯ　００／７８９２９および同ＷＯ　００／４７７２１を参照のこと）。しかし、以前の方法論は、いくつかの制限を受けた。単離後の膵臓細胞集団の増大は一般に、血清含有培地中での増殖期間を必要とした（例えば、米国特許第５，８８８，９１６号を参照のこと）。このことは、費用および安全性の問題を引き起こす。さらに、このような方法によって満足のいく細胞増殖は達成されるが、得られる細胞集団は、膵臓細胞分化のマーカーを保持することも、インスリンを産生する能力を保持することもないかもしれず、そしてしばしば、生存可能でかつ高ホルモン産生性の細胞へと一貫して分化することができない。
【００１１】
それほど望ましくない細胞型と比較して上皮細胞集団の増殖を促進し得る無血清選択的培地（Ｓｔｅｐｈａｎら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１４０：５８４１−５４（１９９９）を参照のこと）は、これらの制限のうちのいくつかを克服する可能性を提供する。無血清培養条件は、成体組織から単離された膵臓細胞の培養について報告されている。Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒら，前出；ＷＯ　００／７８９２９を参照のこと。しかし、これらの手順は、完全には満足できない。特別な培養基材を必要とする血清含有培地中での培養期間は、依然として必須であり、そして分化のための細胞の無血清培地への移行は、これらの細胞が増殖する能力をなくす。必要とされるのは、膵臓ホルモンを産生する可能性を保持しながらインビトロで増殖し得る細胞を一貫して生じる膵臓細胞材料を単離および培養する一般的方法である。このような細胞集団は、移植後に糖尿病状態を逆転させ得、ならびに、インビトロでの膵臓内分泌ホルモンについての供給源として役立ち得、そして膵臓の発生および疾患の研究のためのモデル系を提供し得る。本発明は、これらおよび他の必要性を満たす。
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、膵臓細胞をインビトロで培養するための方法および組成物を提供する。１つの局面では、本発明は、増殖する膵臓細胞の細胞培養物を調製する方法を提供し、この方法は、増殖する膵臓細胞を単離する工程、成長ホルモンおよび総容積の１％未満の血清を含む上皮選択的培養培地へとこの細胞を移植する工程、および培養における少なくとも１回の継代を通してこの細胞を培養する工程を包含する。この方法は、１平方センチメートルあたり約１８０細胞から、１平方センチメートルあたり約１，８００細胞へと増大され得る細胞集団を生じ、これは、以下によって特徴付けられる：少なくとも９０％の細胞が転写因子ＰＤＸ−１／ＩＰＦ−１について陽性であり、そしてこの集団のインスリン：アクチンｍＲＮＡ比が１：１００と１０００：１との間である。本発明の特定の実施形態では、少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の細胞は、ＰＤＸ−１について陽性に染まる。本発明の１つの実施形態では、この細胞は、１平方センチメートルあたり約９０細胞から増大され得、そして１平方センチメートルあたり約３６，０００細胞へと増大され得る。他の実施形態では、インスリン：アクチンｍＲＮＡ比は、１：１０と１００：１との間である。本発明のいくつかの実施形態では、インスリン：アクチンｍＲＮＡ比は、刺激されていないレベルのインスリンｍＲＮＡである。
【００１３】
本発明の１つの実施形態では、１％未満の血清を含む培養培地へと細胞を移す前に、この細胞は、培地の容積の１％と４％との間で血清を含む培地中で維持される。別の実施形態では、この細胞は、容積の４％以上の血清を含む培地中で維持される。いくつかの実施形態では、維持期間は２４時間未満であり、一方、他の実施形態では、この維持期間は、１日間と１４日間との間の任意の数の日数のような、何日間もである。本発明のいくつかの実施形態では、１％より多くの血清または４％よりも多くの血清を含む培地からの細胞の移植は、ますます少ない量の血清を含む培地へと細胞を連続して移植しながら、徐々に行われる。他の実施形態では、１％よりも多くの血清または４％よりも多くの血清を含む培地からの細胞の移植は、１回の培地の変更または何回かの継代によって１つの工程で達成される。本発明の１つの実施形態では、単離された膵臓細胞は、ＰＤＸ−１陽性表現型とＰＤＸ−１陰性表現型との混合物を有し、そして１％未満の血清を含む培地中での細胞の増殖は、ＰＤＸ−１陽性細胞を選択的に増殖させる。
【００１４】
別の局面では、本発明は、高レベルの内分泌ホルモンを発現する、より分化した細胞へと膵臓細胞を成熟させる方法を提供する。この方法は、基材上で膵臓細胞を培養して基材を馴化する工程、この基材からこの細胞を除去する工程およびこの基材上に膵臓細胞を再度播種して、内部細胞塊を含むサイトケラチン−１９陽性細胞の被包被膜を含む、膵臓細胞の凝集物を生じる工程を含み、ここで、この凝集物は、５０〜５０００の細胞を含み、そして５０ミクロンと３００ミクロンとの間の直径を有する。１つの実施形態では、内部細胞塊の少なくとも１つの細胞は、ＰＤＸ−１、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチンおよびＫＳ１／４からなる群より選択される内分泌発生のマーカーについて陽性に染まる。他の実施形態では、より高い比率の内部細胞塊（例えば、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の細胞）が、内分泌発生のマーカーについて陽性に染まる。１つの実施形態では、凝集物を産生するための少なくとも１つの培養工程は、成長ホルモンおよび容積の１％未満の血清を含む培地中で行われる。他の実施形態では、膵臓細胞の出発培養物は、少なくとも９０％のＰＤＸ−１陽性であり、そして１：１００と１０００：１との間のインスリン：アクチンｍＲＮＡ比を有する。
【００１５】
別の局面では、本発明は、哺乳動物に膵臓内分泌機能を提供するための方法を提供し、この方法は、基材上で膵臓細胞を培養する工程、この基材からこの細胞を除去する工程、この基材上で膵臓細胞を再度播種する工程、この細胞を、ｃｋ−１９陽性細胞の被包被膜および内部細胞塊を有する凝集物を形成させる工程、ならびにこの凝集物を哺乳動物内に移植して膵臓内分泌機能を提供する工程を包含する。
【００１６】
なお別の局面では、本発明は、少なくとも９０％の細胞がＰＤＸ−１について陽性に染まる特性および集団のインスリン：アクチンｍＲＮＡ比が１：１００と１０００：１との間にあるという特性を保持しながら、１平方センチメートルあたり約１８０細胞の初濃度で第２容器への第１培養容器から継代して、１平方センチメートルあたり約１，８００細胞まで増大させる能力を有する、増殖する膵臓細胞の培養物を提供する。
【００１７】
別の局面では、本発明は、培養膵臓細胞の凝集物を提供し、この凝集物は、ｃｋ−１９陽性細胞の周囲被膜および内部細胞塊を含み、ここで、この凝集物は、５０〜５０００の膵臓細胞を含み、そして約５０ミクロンと３００ミクロンとの間の直径を有する。
【００１８】
（定義）
細胞の状況における「凝集物」とは、三次元構造体をいう。
【００１９】
「ＣＫ−１９」は、４０Ｋｄの酸性ケラチンである、サイトケラチン１９である。
【００２０】
「インスリン：アクチンｍＲＮＡ比」は、ゲルスキャナーを用いてバンド密度によって、またはインスリンおよびアクチンについて異なるラベルを用いるリアルタイムＰＣＲによって、測定される（実施例３を参照のこと）。これは、細胞の集団をまたがった平均である。
【００２１】
「移植する」は、レシピエントへの細胞の移植または配置である。これは、被包細胞および例えば、アルギネートマトリックス中での非被包細胞を含む。この細胞は、皮下に、筋肉内に、門脈内に、または腹腔内に（ｉｎｔｅｒｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ）、当該分野で公知の方法によって配置され得る。
【００２２】
表面に付着した単層として増殖する細胞の「継代」とは通常、播種した培養容器の、部分的にコンフルエントな状態からコンフルエントな状態への移行であって、この時点で細胞が培養容器から取り出されて、より低い密度で培養容器中に再度は種される移行をいう。しかし、細胞は、コンフルエンスに達する前に継代され得る。継代は代表的に、細胞が増殖してコンフルエントに達するにつれて、細胞集団の増大をもたらす。細胞集団の増大は、最初の播種密度に依存するが、代表的に、１〜１０、１〜５、１〜３または１〜２倍の増大である。従って、継代することは一般に、細胞が培養において複数回細胞分裂し得ることを必要とする。
【００２３】
細胞の「集団」とは、特定の単離手順または培養手順によって得られた複数の細胞をいう。本発明の選択プロセスは、比較的均質な特性を有する集団を生じるが、細胞の集団は、マーカー発現または他の表現型についてアッセイした場合、不均質であり得る。細胞集団の特性は一般に、特定の特性を有する個々の細胞の百分率（例えば、特定のマーカーについて陽性に染まる細胞の百分率）または集団全体について測定した場合の特性のバルク平均値（例えば、細胞集団から作製された溶解産物中のｍＲＮＡの量）によって規定される。
【００２４】
「９０％　ＰＤＸ−１陽性」とは、ランダムに選択された細胞の統計的サンプリングをいう。標準的免疫化学技術が用いられ、そして陽性に染色された細胞が顕微鏡下で目視で計数される。百分率は、適切に制御された（すなわち、同一の細胞を調製し、そして類似のアイソタイプの抗体であるがＰＤＸ−１に特異的ではない抗体を用いる）サンプルとの比較によって決定される。
【００２５】
「血清」とは、血液から得られた、血球以外の材料をいう。血清は代表的に、血球を凝固させるかまたは遠心分離および線維素除去によって血球を物理的に分離することによって得られる。本明細書中で用いられる場合、血清は、その生物学的活性によって機能的に定義され得る：血清は一般に、培養培地に添加された場合に培養中の哺乳動物細胞の増殖を支持する。血清は、種々の種（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ、ニワトリなど）および種々の発生段階（例えば、胎児、若年期または成体）から得られ得る。特定の実施形態では、「血清」とはまた、分画した血清または他の供給源（例えば、Ｓｅｌｅｃｔ　Ｓｏｙｔｏｎｅ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））から得られた血清補充製品もしくは血清置換製品、または他の市販の製品をいう。このような血清等価物は、完全または部分的に定義され得る。
【００２６】
「被膜（ｍａｎｔｌｅ）」とは、内部細胞塊を三次元で取り囲む細胞の膜をいう。
【００２７】
（詳細な説明）
本発明は、グルコースに応答してインスリン産生を維持しながらも、連続した連続継代において安定な様式で増殖され得る、中間の分化段階の膵臓幹細胞が存在するとの知見に関する。これらの細胞は、培養において増大可能かつ安定の両方であり、そして後期発生段階、すなわち、原型島細胞へと誘導され得るという点で有利である。過去には、人工インスリン産生器官において使用するための膵臓原型細胞を単離および培養するという試みは失敗した。なぜなら、後期段階の膵臓細胞は充分には培養されず、そして早期段階の細胞の過剰増殖はインスリンを産生しない細胞培養物をもたらすからである。
【００２８】
膵臓原型細胞のこれらのより早期の培養方法は、部分的に失敗した。なぜなら、この培養条件は、細胞を適切な分化段階で選択しなかったからである。膵臓組織由来の早期段階の原型細胞が高濃度の血清を含有する培養培地中で過剰増殖することは、本発明の知見である。上皮細胞の増殖を選択する培地中で膵臓組織を培養することによって、培養において継代され得るが、内分泌ホルモンを分泌する能力を保持する、中間の分化細胞の有利な部分集団が選択される。このような上皮選択的培地の例は、低血清培地または無血清培地であり、そして特に、成長ホルモン（ＧＨ）の供給源を含有する低血清培地である。
【００２９】
無血清の、上皮選択的培地への成長ホルモンの添加は、少なくとも２つの利点を有する。第１に、これは、所望の中間細胞の増殖速度を増強し、そしてより重要なことには、これは、この細胞培養物のグルコース刺激応答を増大させる。
【００３０】
（Ｉ．表現型アッセイ）
本発明の方法の実施において、特定の培養段階で膵臓細胞の表現型をアッセイすることが有用である。特定のタンパク質の発現は、細胞の正体または分化状態と相関するので、細胞は、マーカー遺伝子またはマーカータンパク質の発現について分析されて、それらの正体または分化状態が評価され得る。例えば、新鮮に単離した膵臓組織では、アミラーゼの発現は、この細胞を外分泌腺房細胞と同定し、一方、インスリンの発現は、この細胞を内分泌島細胞と同定する。同様に、初期分化段階の島細胞は通常、サイトケラチンｃｋ−１９について陽性であり、一方、成熟島細胞は、ｃｋ−１９のより少ない発現を示す。
【００３１】
表現型特性は、細胞毎の様式で、または集団平均としてアッセイされ得る。アッセイ形式は、アッセイ技術の特定の必要要件および方法論に依存する。従って、ＦＡＣＳ分析によって固定切片または懸濁細胞で行われる免疫組織化学によるマーカー発現のアッセイは、個々の細胞が発現する所定のマーカーについて、頻度および強度を測定する。一方、細胞集団全体についてのインスリン対アクチンｍＲＮＡ発現比の平均のような特性を測定することが所望され得る。このような場合、アッセイは代表的に、細胞プールからｍＲＮＡを収集し、そしてインスリンメッセージおよびアクチンメッセージの総量を測定することによって行われる。多くの表現型特性は、細胞または集団のいずれかに基づいてアッセイされ得る。例えば、インスリン発現は、分泌顆粒中のインスリンの存在について個々の細胞を染色することによってか、または細胞プールを溶解して総インスリンタンパク質についてアッセイすることによってかのいずれかでアッセイされ得る。同様に、ｍＲＮＡ量は、細胞集団について、細胞を溶解してｍＲＮＡを収集することによって、またはインサイチュハイブリダイゼーションによって個々の細胞に基づいて測定され得る。
【００３２】
（細胞分化マーカー）
膵臓細胞の集団を同定するために用いられ得る、多数の細胞マーカーが存在する。単離されて培養されたドナー細胞は、分化した膵臓細胞の種々の表現型指標および遺伝子型指標を提示し始める。これらの指標またはマーカーにおける変化は、初期増殖期の後であるかまたは単離および精製の直後であるかにかかわらず、無血清環境への膵臓細胞のシフトに対する応答であると考えられる。表現型指標および遺伝子型指標の例としては、調節される（例えば、アップレギュレートされるかまたはダウンレギュレートされるかのいずれか）条件的前駆細胞集団中に存在する種々の分子マーカーが挙げられる。これらの分子マーカーとしては、ｃｋ−１９が挙げられ、ｃｋ−１９は、膵臓の条件的幹細胞のマーカーであると仮定される。
【００３３】
代表的に、哺乳動物幹細胞は、最終的な発達終点まで成熟するにつれて、多数の発達段階を経る。発達段階はしばしば、発達中の細胞に存在するかまたは存在しない、マーカーを同定することによって決定され得る。ヒト内分泌細胞は同様の様式で発達するので、本明細書に開示される方法は、細胞が幹細胞様表現型から偽島表現型へと移行するときの、細胞を同定するための種々のマーカーの使用を意図する。
【００３４】
本発明の方法によって増殖または分化するように誘導されたマーカーの発現は、正常なヒト膵臓の発達におけるマーカー発現の順番に対していくらかの類似性を保有する。発達の非常に初期では、始原上皮細胞は、ホメオドメイン核因子である初期細胞マーカーであるＰＤＸ−１を発現する。細胞が発達するにつれ、細胞は、出芽するようになり、そして管を形成する。これらの細胞は、上皮管細胞についてのマーカーであるサイトケラチン１９を発現し、そしてＰＤＸ−１を一時的に発現して、発生的に内分泌細胞となる。これらの細胞が発達するにつれて、これらは、インスリン、ソマトスタチンまたはグルカゴンを発現する能力を獲得する。最終的な分化細胞は、１つしか発現し得ず、そしてα細胞（グルカゴン）、β細胞（インスリン）およびδ細胞（ソマトスタチン）となる。本発明の中間の細胞集団は、充分には分化していない発達段階にあると考えられ、増殖する能力および成熟内分泌細胞へと分化する可能性を保持している。この細胞が発達経路における前駆体の実際の例であるか、または単純にインビトロの操作の結果であるかにかかわらず、本発明の方法によって得られた中間段階の細胞は、増殖し得、そして内分泌ホルモンを発現し得、それゆえ、任意の型の島細胞における不全を修正するために用いられる可能性を有する。
【００３５】
目的のマーカーは、膵臓において時間的パターンおよび組織特異的パターンで発現される分子である（Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ，Ａｎｎ　Ｎ　Ｙ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　８８０：３８−４９（１９９９）を参照のこと）。これらの分子マーカーは、以下の３つの一般的カテゴリーに分けられる：転写因子、ノッチ（ｎｏｔｃｈ）経路マーカーおよび中間フィラメントマーカー。転写因子マーカーの例としては、ＰＤＸ−１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｎｋｘ−６．１、Ｉｓｌ−１、Ｐａｘ−６、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３およびＨＥＳ−１が挙げられる。ノッチマーカーの例としては、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、Ｄｌｌ１およびＲＢＰｊｋが挙げられる。中間フィラメントマーカーの例としては、ｃｋ−１９およびＮｅｓｔｉｎが挙げられる。
【００３６】
培養または単離された細胞におけるタンパク質マーカーおよび核酸マーカーの発現を評価するための方法は、当該分野で標準的であり、そして以下を含む：定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロットおよびインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編，２００１年補遺）を参照のこと）および免疫アッセイ（例えば、切片化した材料の免疫組織化学的分析）、ウェスタンブロッティング、ならびに、インタクトな細胞において接近可能なマーカーについては、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９８）を参照のこと）。内分泌細胞分化の従来の組織化学的マーカーもまた用いられ得る。免疫組織化学によって調べられるべき細胞は、検鏡のためにガラスチャンバスライド上で培養され得る。あるいは、従来の組織培養において増殖した細胞は、この培養物から手で取り出され、そしてパラフィン中に切片化のために包埋され得る。ＰＤＸ−１抗体は、Ｌｅｏｎａｒｄ　Ｊ．ら，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１９９３年１０月７日，（１０）１２７５−８３の教示に従って作製され得る。
【００３７】
細胞分化マーカーは変動し、そして従来の免疫組織化学によって検出され得る。一般的に適用可能なプロトコルが以下に続く。
【００３８】
染色プロセスは、スライドのチャンバ部分を除去することで始まる。細胞は、緩衝液中で非常に穏やかにリンスされ、そしてパラホルムアルデヒド溶液中で固定された。次いで、細胞は、正常な血清を含むブロッキング溶液中で室温でインキュベートされる。細胞は、ブロッキング溶液中で、非イオン性界面活性剤を用いて透過化された。以下に列挙した通りの一次抗体は、適切な希釈でブロッキング溶液中に調製され、細胞に添加され、そしてインキュベートされる。一次抗体とのインキュベートに続いて、細胞は、緩衝液中でリンスされ、そしてブロッキング溶液中で再度ブロッキングされた。
【００３９】
適切な希釈でブロッキング溶液中に調製された二次抗体は、細胞中に添加され、そして暗所にてインキュベートされる。インキュベーション後、この細胞はリンスされ、核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素で対比染色された。過剰の流体は除去され、そしてスライドが取り付けられ、そしてカバースライドで覆われる。スライドは乾燥し、そして暗所において保存される。
【００４０】
あるいは、この細胞は、免疫細胞化学のためにＡＢＣ法を用いて調製され得る。手短には、この細胞はパラフィン中に包埋され、そしてパラフィン切片を有するスライドは３７℃にて一晩乾燥される。この細胞は、パラフィン除去され、そして過酸化水素メタノール溶液中に浸漬されて、内因性ペルオキシダーゼ活性が阻害される。スライドは、０．０１クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で３０分間煮沸されて、特定のエピトープが回収される。スライドは緩衝液でリンスされ、そして湿潤チャンバ中で室温にて正常な血清を用いてブロックされた。
【００４１】
ブロッキング溶液中で調製された一次抗体（表Ａは、通常用いられる一次抗体および二次抗体を列挙する）は、サンプルに添加され、そして湿潤チャンバ中でインキュベートされる。スライドは洗浄され、そしてブロッキング溶液中に調製された二次抗体とともにインキュベートされる。スライドは緩衝液で再度リンスされ、そして商業的なキット（例えば、Ｄａｋｏ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）からのアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ試薬またはＡＢＣ複合体とともにインキュベートされた。スライドは、再度リンスされ、そして金のラップ中でジアミノベンジジン発色溶液；尿素過酸化水素と共にインキュベートされる。蒸留水を用いた洗浄の後、スライドはＭａｙｅｒのＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ中に５分間に浸漬され、次いで、スライドは、水が無色になって核が青色になるまで、流れる水道水中に保持される。スライドは脱水され、そして観察のために取り付けられる（表Ａは、通常用いられる一次抗体および二次抗体を列挙する）。
【００４２】
【表４】
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（インスリンｍＲＮＡ発現）
膵臓細胞の正体、分化または成熟度を特徴付けるために用いられ得る１つのマーカーは、インスリンｍＲＮＡのレベルである。例えば、本発明の中間の細胞集団は、規定された範囲内のインスリンｍＲＮＡの発現を示す。インスリンｍＲＮＡを定量するための方法としては、ノーザンブロット、ヌクレアーゼ保護およびプライマー伸長が挙げられる。１つの実施形態では、ＲＮＡは、培養細胞の集団から抽出され、そしてプロインスリンメッセージの量が定量的逆転写ＰＣＲによって測定される。逆転写の後、インスリンｃＤＮＡは、インスリンｃＤＮＡ配列にハイブリダイズするプライマー、および増幅産物の量がサンプル中に存在するｍＲＮＡの量に関連する増幅条件を用いてサンプルから特異的かつ定量的に増幅される（例えば、Ｚｈｏｕら，Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２７２：２５６４８−５１（１９９７）を参照のこと）。反応速度定量手順は、出発ｍＲＮＡレベルが決定され得る精度に起因して好ましい。
【００４３】
頻繁に、インスリンｍＲＮＡの量は、構成的に発現されるｍＲＮＡ（例えば、アクチン）に対して正規化され、アクチンは、アクチン特異的プライマーを用いて同じＲＮＡサンプルから特異的に増幅される。従って、インスリンｍＲＮＡの発現レベルは、インスリンｍＲＮＡ増幅産物の、アクチンｍＲＮＡ増幅産物に対する比として、または単に、インスリン：アクチンｍＲＮＡ比として報告され得る。他の膵臓ホルモン（例えば、ソマトスタチンまたはグルカゴン）をコードするｍＲＮＡの発現は、同じ方法によって定量され得る。
【００４４】
（グルコース刺激インスリン分泌）
β細胞の重要な機能の１つは、グルコースレベルに従ってそのインスリン分泌を調整することである。代表的に、静的グルコース刺激（ＳＧＳ）アッセイは、増殖している付着膵臓細胞で行われて、これらの細胞が異なるグルコースレベルに応答してインスリンを分泌し得るか否かを同定し得る。細胞は一般に、ほぼコンフルエントになるまで適切な基材上で培養される。ＳＧＳ試験の３日前、培養培地は、同様の特徴だがインスリンを欠き、そして１ｇ／Ｌのグルコースのみを含む培地によって置換される。この培地は、毎日、３日間にわたって変更され、そしてＳＧＳ試験が４日目に行われる。
【００４５】
この試験の前に、培養培地は、グルコースおよびインスリンの分析のために収集され得る。この試験のために細胞を調製するために、細胞は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）＋０．５％　ＢＳＡで２回洗浄され（各洗浄について５分間にわたってインキュベートされる）、次いでＤＰＢＳ単独で１回洗浄される（これもまた５分間にわたってインキュベートされる）。洗浄後、この細胞は、６０ｍｇ／ｄｌグルコースを含む、１０ｍｌ（１００ｍｍディッシュ中）または５ｍｌ（６０ｍｍディッシュ中）のＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒｓ　ＳＧＳ溶液（ＫＲＢ−６０）を用いて、３７℃のインキュベーター中で３０分間にわたってインキュベートされる。次いで、このインキュベーションは繰り返される。
【００４６】
ＳＧＳアッセイを実施するために、細胞は、３ｍｌ（１００ｍｍディッシュ）または４ｍｌ（Ｔ７５フラスコ）または２ｍｌ（６０ｍｍディッシュ）ＫＲＢ−６０中で、３７℃で２０分間にわたってインキュベートされる。この培地は吸引され、そしてスピンされ、そしてＬＧ−１（低グルコース刺激工程）として、インスリンアッセイのために収集される。次いで、ＫＲＢ−４５０＋テオ（４５０ｍｇ／ｄｌグルコースおよび１０ｍＭテオフィリンを有するＫＲＢ）は、上記と同じ容量で添加され、そして細胞は、上記と同じ条件下で培養される。上清は、ＨＧ（高グルコース刺激）としてインスリンアッセイのために収集される。次いで、この細胞は、ＫＲＢ−６０と共に再度インキュベートされ、そしてこの培地はＬＧ−２として収集され、そして次のときにはＬＧ−３として収集される。この培地は、インスリン分析のために収集され、そしてインスリン含量が放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または他の適切なアッセイによって決定されるまで−２０℃で保存される。
【００４７】
ＳＧＳ試験の結果はしばしば、ＬＧ−１インスリン値によって割ったＨＧインスリン値として規定される、刺激指数として表現される。一般に、約２以上の刺激指数は、ＳＧＳアッセイにおいて陽性の結果であるとみなされるが、他の値（例えば、１．５、２．５、３．０、３．５など）を用いて特定の細胞集団を規定し得る。
【００４８】
制御された実験では、ウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ）および組換えヒト成長ホルモンは、中間の分化の細胞からの所望のレベルのインスリン放出を維持することが見出された。
【００４９】
（ＩＩ．膵臓細胞を単離する方法）
本発明は、とりわけ、連続した複製を行い得るが、治療目的に適切な、より成熟した細胞へと分化するように誘導され得る、膵臓細胞の培養物を作製する方法を提供する。従って、本発明のいくつかの方法は、最初の工程として、膵臓からの細胞の単離を必要とする。膵臓から収集された細胞は、内分泌的分泌および外分泌的分泌をし得る分化した細胞を生じ得る、多様な集団である。これらの分化した細胞は、膵臓内分泌分子（例えば、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴンおよび他の内分泌ホルモン）ならびに膵臓外分泌分子（例えば、アミラーゼ）を発現する。さらに、培養した細胞集団の一部は、培養において複製および増大し得る。本発明の中間細胞集団は、条件的幹細胞の分化、成熟内分泌細胞の脱分化、または他の膵臓細胞集団の分化形質転換によって、全てまたは部分的に生じ得る。以下に記載の培養方法は、種々の抽出条件および培養条件を活用して、膵臓細胞の種々の集団を作製する。
【００５０】
（ドナー供給源）
ドナー供給源は、培養膵臓細胞由来の１以上のドナー膵臓、または膵臓内分泌ホルモンおよび膵臓外分泌ホルモンを産生し得る細胞を生じ得る他の供給源であり得る。好ましい実施形態では、その後の培養のために分離された細胞は、１以上の寄贈された膵臓から得られる。本明細書中に記載される方法は、寄贈された膵臓の齢に依存しない。従って、胚から成体の齢にわたるドナーから単離された膵臓材料が用いられ得る。
【００５１】
別の実施形態では、膵臓細胞は、培養された供給源から単離される。例えば、「Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌｓ」との発明の名称の、Ｓｏｏｎ−Ｓｈｉｏｎｇらに対する米国特許第５，７６２，９５９号の微小カプセル化方法に従って調製された細胞は、ドナー細胞の供給源として収集され得る。
【００５２】
中間細胞集団の作製のための出発材料はまた、本明細書中に開示される方法によって作製された、膵臓細胞のクローン集団を含む。従って、本発明の１つの実施形態では、本明細書中に開示された単離方法、分離方法および培養方法は、クローニングされた単一の膵臓細胞から誘導された中間の集団を生成するために、クローニング手順と結び付けられる。このような手順は、中間細胞集団のインビトロでの遺伝的操作のために特に適切である。
【００５３】
（膵臓細胞集団の単離）
一旦、膵臓がドナーから収集されたら、これは代表的に、種々の方法を用いて、培養するための個々の細胞または細胞の小さな群を生じるように処理される。１つのこのような方法は、回収された膵臓組織が酵素消化のために清浄および調製されることを要する。酵素処理は、回収された組織の実質が、より小さな単位の膵臓細胞材料へと解離されるように、結合組織を消化するために用いられる。収集された膵臓組織は、収集された器官の全体的構造から、膵臓細胞材料、部分構造および個々の膵臓細胞を分離するために１以上の酵素を用いて処理される。コラゲナーゼ、ＤＮＡｓｅ、Ｌｉｂｅｒａｓｅ調製物（米国特許第５，８３０，７４１号および同第５，７５３，４８５号を参照のこと）ならびに他の酵素は、本明細書中に開示される方法での使用が意図される。
【００５４】
単離された供給源材料は、１以上の所望の細胞集団を富化するためにさらに処理され得る。しかし、未分画膵臓組織もまた、培養のために一旦解離されたら、本発明の培養方法において、さらなる分離をすることなく直接用いられ得、そして中間細胞集団を生じる。１つの実施形態では、単離された膵臓細胞材料は、密度勾配（例えば、Ｎｙｃｏｄｅｎｚ、ＦｉｃｏｌｌまたはＰｅｒｃｏｌｌ）を通した遠心分離によって精製される。例えば、米国特許第５，７３９，０３３号に記載される勾配方法は、処理された膵臓材料について島を富化するための手段として用いられ得る。ドナー供給源から収集された細胞の混合物は代表的に、不均質であり、従って、細胞、細胞、δ細胞、管細胞、腺房細胞、条件的前駆細胞および他の膵臓細胞型を含む。
【００５５】
代表的な精製手順は、多数の層または界面への、単離された細胞材料の精製をもたらす。代表的に、２つの界面が形成される。上の界面は島が豊富であり、そして代表的に１０％〜１００％の島細胞を懸濁して含む。第二の界面は代表的に、島細胞、腺房細胞および管細胞を含む細胞の混合集団である。底の層はペレットであり、ペレットは、勾配の底に形成される。この層は代表的に、主に（＞８０％）腺房細胞を、いくつかの捕獲された島およびいくつかの管細胞を含む。管の樹成分は、さらなる操作のために別々に収集され得る。
【００５６】
さらなる操作のために選択される画分の細胞密度（ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｃｙ）は、どの勾配画分が選択されるか、および各単離の最終結果に依存して変動する。島細胞が所望の細胞型である場合、単離された画分内に適切に富化された島細胞集団は、少なくとも１０％〜１００％の島細胞を含む。他の膵臓細胞型および濃度はまた、富化後に収集され得る。例えば、本明細書中に記載される培養方法は、用いられた精製勾配に依存して、第２の界面、ペレットまたは他の画分から単離された細胞について用いられ得る。
【００５７】
１つの実施形態では、中間膵臓細胞培養物は、島富化（上の）画分から作製される。しかし、さらに、それぞれ、島細胞、腺房細胞および管細胞の混合された細胞集団、または管樹成分、腺房細胞およびいくつかの捕獲された細胞の混合された細胞集団を代表的に含む、より不均質な第２の界面および底の層の画分もまた培養において用いられ得る。両方の層が、本明細書中に記載される中間段階の集団を生じ得る細胞を含むが、各層は、開示された方法について用いるための特定の利点を有し得る。例えば、島が富化された上の画分を用いることは、特定の利点を有し得る。この島が富化された画分は、より進んだ分化段階の、より多くの細胞を含み得、従って、ショック方法論において、より有効であり得、この方法論は、既存の中間段階集団を選択することによって起動し得る。あるいは、より不均質な第２の画分および第３の画分もまた、利点を有し得る。第２の（下の）界面は、内分泌発達のより初期の段階の、より多くの細胞を含み得、従って、離脱方法論によって即座の（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ）集団を作製する際に、より効率的であり得、この方法論は、それほど分化していない前駆体由来の中間段階の細胞の発達を促進すると理論付けられる。しかし、本発明の方法は、これらの理論によって束縛されず、そして上の界面画分および下の界面画分の両方は、ショック方法論および離脱方法論のいずれについても、受容可能な結果を生じる。
【００５８】
（ＩＩＩ．高血清培地中での膵臓細胞の維持および増殖）
（Ａ．一般的細胞培養手順）
一旦膵臓細胞が入手および単離されたら、これらは、所望の中間段階集団の増殖を、または他の実施形態では、より成熟した細胞型の分化を選択する条件下で培養される。一般的細胞培養方法論は、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌｓ：Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第４版，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ（２０００）に見出され得る。代表的に、膵臓細胞は、他の哺乳動物細胞に適切な条件下で、例えば、加湿インキュベーター中で３７℃で、５％　ＣＯ２の雰囲気下で培養される。細胞は、当該分野で公知の種々の基材（例えば、負の表面電荷を有する、ホウケイ酸ガラス製のチューブ、ボトル、ディッシュ、クローニングリング、プラスチック製の組織培養チューブ、ディッシュ、フラスコ、マルチウェルプレート、増大した増殖表面積（ＧＳＡ）または食道ドップラーモニタ（Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ　Ｄｏｐｐｌｅｒ　Ｍｏｎｉｔｏｒ；ＥＤＭ）仕上げを有する容器、ＧＳＡを増大させるための複数の内部シートを有するフラスコ、Ｆｅｎｗａｌバッグおよび他の培養容器）で培養され得る。
【００５９】
一旦膵臓細胞材料が収集され、そして培養について選択されたら、または一旦集団がコンフルエントになり、そして新たな基材に移植されたら、細胞の集団は、培養のために適切な組織培養容器へと播種される。播種密度は、開示された方法を用いて培養される膵臓細胞の生存率に影響を有し得、そして特定の培養条件について最適な播種密度は、種々の密度の範囲で細胞を播種し、そして得られる細胞の生存率および増殖速度をモニタリングすることによって経験的に決定され得る。ある範囲の播種密度は、ホルモン分泌細胞を培養において産生する際に有効であることが示されている。代表的に、細胞濃度は、１枚の１００ｍｍ培養ディッシュあたり約１０２細胞〜約１０８細胞、例えば、１枚の１００ｍｍ培養ディッシュあたり１０２細胞、１０３細胞、１０４細胞、１０５細胞、１０６細胞、１０７細胞または１０８細胞の範囲に及ぶが、より低い細胞濃度が、クローニング手順のために用いられ得る。他の培養容器についての細胞濃度は、種々の培養容器について相対基材表面積および／または培地気体交換表面積を計算することによって調整され得る。例えば、代表的な１００ｍｍ培養ディッシュは、５５平方センチメートルの基材表面積（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，前出を参照のこと）を有し、そして１枚のディッシュあたり１０，０００細胞の細胞濃度は、１平方センチメートルあたり約１８０細胞に相当し、一方、１枚のディッシュあたり１００，０００細胞の細胞濃度は、１平方センチメートルあたり約１，８００細胞に相当する。培養容器の表面積に関する細胞濃度は、培養表面積あたりの適切な培地容積（０．２ｍｌ／ｃｍ２〜０．５ｍｌ／ｃｍ２が静置培養について代表的な範囲である）を用いることによって、培地容積に関する細胞濃度に関連付けられ得る。１０倍の増大が生じたか否かを決定するために、細胞は、酵素消化によって取り出され、そして既知容積の流体中で顕微鏡下で計数される。細胞はまた、増殖および分化を促進する規定の細胞外マトリクス成分（例えば、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍマトリクスおよび好ましくはコラーゲンＩＶまたはラミニン）で予めコーティングした培養表面で増殖され得る。
【００６０】
標準的な細胞培養増殖技術は、本発明の実施のために適切である。細胞が、培養表面に付着して増殖する場合、この細胞は代表的に、８０％〜９０％コンフルエンスが達成されるまで単層として増殖し、この時点で、この細胞は、タンパク質分解消化によって表面から遊離され、そして新たな容器中での培養のために１：２または１：３に分けられる。この細胞のより高い希釈（一般に、１：４〜１：１０の範囲の間）もまた適切であるが、さらに低い細胞濃度は、クローニング手順において適切である。タンパク質分解酵素およびキレート剤の濃度は通常、細胞が無血清培地（例えば、０．０２５％トリプシンおよび０．５３ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に継代される場合、より低くされる。培養培地は代表的に、毎週交換されるか、または培地のｐＨが新鮮な培地が必要とされることを示すときに交換される。
【００６１】
本発明の膵臓細胞は、種々の培地において培養され得る。本明細書中で記載されるように、特定の成分（特に血清）を含むかまたは欠く培地は、単離手順および増殖手順の特定の段階で好ましい。例えば、膵臓から新たに単離された細胞は、高血清培地中で維持されて、細胞が単離手順から回復するのを可能とし得る。逆に、低血清培地は、本明細書中に記載される中間段階集団の選択および増殖に有利に働く。最終的に、中間段階細胞の成熟は、特定の培地を用いる。従って、多数の培地処方は、本発明の実施において有用である。本明細書で開示される培地処方は、例示的な目的のためであり、そして培地の重要でない成分は、本明細書中に記載されるアッセイを用いて、細胞集団の複製または分化に対するバリエーションの影響をアッセイすることによって、単純に省略、置換、変更または添加され得る。例えば、Ｓｔｅｐｈａｎら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１４０：５８４１−５４（１９９９）を参照のこと。
【００６２】
培養培地は通常、基本培地を含み、基本培地は、無機塩、緩衝剤、アミノ酸、ビタミン、エネルギー源およびいくつかの場合、タンパク質代謝、核酸代謝、炭水化物代謝または脂質代謝に関与する有機中間体および前駆体の形態のさらなる栄養素を含む。基本培地としては、Ｆ１２、ＥａｇｌｅのＭＥＭ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ　１６４０、Ｆ１２とＤＭＥＭとの１：１混合物などが挙げられる。Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，前出を参照のこと。細胞の増殖を支持するために、基本培地には通常、増殖因子、他のタンパク質、ホルモンおよび微量元素の供給源が補充される。これらの補充物は、細胞の増殖、維持および／または分化を促進し、他の培地成分中の不純物または毒素を相殺し、そして基本培地中に欠けている微量元素を提供する。多くの培養培地では、血清は、これらの補充物の供給源である。血清は、種々の哺乳動物供給源（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ウマなど）から、および成体、若年期または胎仔の供給源から補充され得る。Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，前出を参照のこと。胎仔ウシ血清は、通常用いられる補充物である。血清の濃度は、総培地溶液の百分率として、血清の容積に関して表され、そして代表的には、約０．１％〜約２５％、例えば、約０．１％、約０．２％、約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１５％、約２０％または約２５％の範囲にわたる。いくつかの適用では、基本培地には、血清というよりも、増殖因子、ホルモンおよび微量元素の規定のまたは半規定の混合物が補充される。血清置換補充物についての処方は、本明細書中に開示される；他のものは、当該分野で公知であるかまたは商業的供給源から入手可能である（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，前出を参照のこと）。いくつかの実施形態については、血清の濃度は、低くされるが除去されず、そして規定または半規定の補充混合物が規定培地に添加される。高濃度または低濃度の血清を含む培地についての好ましい適用は、本明細書中に記載される。
【００６３】
（Ｂ．高血清中の単離された細胞の維持および増殖）
ドナー膵臓から収集された細胞は通常、ドナーの死と単離手順の開始との間に、温かい虚血または冷たい虚血の期間を経ている。さらに、単離手順の間に、膵臓細胞は通常、タンパク質分解消化ならびに機械的ストレスおよび剪断ストレスに供される。特定の理論によって束縛されることを望まないが、これらの細胞によって経験された種々の外傷は、膵臓幹細胞集団（例えば、条件的前駆細胞）の増大をもたらす種々の細胞プロセスをアップレギュレートし得る。中間細胞集団は、単離または精製後に細胞を低血清培地中に直接配置することによって満足のいく効率で作製され得る。それにもかかわらず、単離手順の間に細胞によって経験された外傷は、細胞の生存および培養への適応に有害な影響を有し得るので、新鮮に単離された細胞を、高濃度の血清（例えば、＞４％）を含む安定化培地中で維持して、培養プロセスの効率を改善することがときどき所望される。この維持期間は、短くでもよい（例えば、一晩）。必要に応じて、細胞は、高血清培地中で長期の増殖期間にわたって維持され得る。
【００６４】
安定化のための高血清培地は代表的に、少なくとも４％の血清を含み、そしていくつかの実施形態では、より高濃度の血清（例えば、１０％または２０％）を含む。安定化または増殖のために用いられる培地は、多くの商業的供給源から入手可能な、そしてＭｏｏｒｅら，Ｊ　Ａｍ　Ｍｅｄ　Ａｓｓｏｃ　１９９：５１９−５２４（１９６７）によって記載される、基本培地（例えば、ＲＰＭＩ　１６４０）から誘導され得る。維持または増殖のための例示的な高血清培地としては、培地３（ＲＰＭＩ　１６４０＋１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、２ｍＭグルタミン、５μＭ　ＺｎＳＯ４および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ））および培地７（ＲＰＭＩ　１６４０＋１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、２ｍＭグルタミン、５μＭ　ＺｎＳＯ４および２０％　ＦＢＳ）が挙げられる。高血清培地はまた、特定の容積の高血清培地（例えば、培地３または培地７）を特定の容積の無血清培地（例えば、ＳＭ９５、ＳＭ９６またはＳＭ９８（本明細書中に記載される））と混合して所望の血清濃度（例えば、４％〜９％）に達することによって誘導され得る。
【００６５】
収集後の安定化のために、細胞は、培養容器中で、高血清培地中で比較的高密度（例えば、７０ｍｌの培地７（２０％　ＦＢＳ）中で１０９細胞）で便利に培養される。しかし、より低い細胞密度および血清濃度もまた用いられ得る。細胞は代表的に、比較的短時間（例えば、一晩）にわたって元の容器中で維持されて、収集手順からの回復が可能にされる。
【００６６】
維持期間後、細胞は、本明細書中に記載されるように、中間細胞集団の選択および増殖のために低血清培地へと移植され得る。必要に応じて、細胞は、高血清培地中で培養されて、混合細胞集団の増殖が可能にされ得る。代表的な実施形態では、維持培養からの細胞は、培地３（１０％　ＦＢＳ）、培地７（２０％　ＦＢＳ）または培地３と培地７との混合物（１５％　ＦＢＳ）を含む新たな培養容器中に再度播種される。細胞は代表的に、この培地中で７日間〜１０日間にわたって培養され、その間に、これらはコンフルエンスまで増殖し得る。一旦細胞がコンフルエンスに到達したら、これらは、本明細書中に記載される中間細胞集団の選択的増大のために低血清培地中へと継代され得る。
【００６７】
（ＩＶ．上皮細胞選択的培地中での培養による、中間分化段階の膵臓幹細胞の優先的増大）
一旦膵臓細胞が単離されたら、細胞は選択的培地へと移植されて、増殖している中間段階集団の出現が促進される。この選択的培地は、膵臓内分泌ホルモンを分泌する能力を保持する細胞の増殖、または高レベルの膵臓内分泌ホルモンを分泌する、より分化した細胞へと成熟する可能性を保持する細胞の増殖に好都合である。一般に、選択的培地は、線維芽細胞および間葉細胞を犠牲にして、上皮細胞または上皮様細胞の増殖に好都合であるが、純粋な上皮培養物は、本発明の方法における膵臓細胞の有利な使用のために必要とされるとは示されていない。代表的に、上皮選択的培地は、培養中での一定期間の増殖（例えば、各継代における集団の増大に依存して、２回、３回、４回または５回の継代）後に、ほぼ純粋な（例えば、＜１０％の線維芽細胞または間葉細胞）細胞の集団を生じる。
【００６８】
胚組織からの上皮細胞増殖に好都合なように用いられている１つの型の選択的培地は無血清培地である（例えば、Ｓｔｅｐｈａｎら，前出；ＰｅｅｈｌおよびＨａｍ，Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　１６：５２６−４０（１９８０）を参照のこと）。成長ホルモンの供給源を含む、上皮特異的培地、そしてより好ましくは低血清培地が、成体哺乳動物から、膵臓細胞発達のマーカー（例えば、ＰＤＸ−１）を保持するが、適切な条件下でさらに分化して高レベルの膵臓内分泌ホルモンを発現し得る、増殖する膵臓細胞の別個の集団を選択するために用いられ得ることは、本発明の知見である。膵臓細胞の培養に適切な特定の上皮選択的培地は本明細書中に開示されるが、上皮細胞または上皮様細胞の優先的増大に好都合な、当該分野で公知の他の培地処方もまた用いられ得る。
【００６９】
上皮選択的低血清培地への移植は、高血清培地中での一定期間の維持（「離脱（ｗｅａｎｉｎｇ）」）後に、または単離および分離手順後に細胞を選択的低血清培地中へ直接移植すること（「ショック」）によって、達成され得る。いずれの方法論も、本明細書中の実施例に示すように、所望の中間細胞集団の作製のために適切である。
【００７０】
ウシ下垂体抽出物［ＢＰＥ］および組換えヒト成長ホルモンを用いる制御された実験では、下垂体抽出物が、ＢＰＥが存在しないものと比較して、増殖速度において有益な増大を与えることが決定された。組換え成長ホルモンは、ＢＰＥに伴った増殖速度を有意に回復し得た。
【００７１】
（Ａ．選択的低血清培地の調製）
この状況で用いられる場合、［低血清培地」とは、約１％未満の血清を有する培地をいう。従って、無血清培地は、一種の低血清培地である。０％と１％との間の血清、例えば、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％または０．９％の血清の濃度を有する培地は、適切な濃度の血清を無血清培地へと添加することによってか、または無血清培地と血清含有培地とを混合して所望の濃度の血清を達成するかのいずれかによって調製され得る。
【００７２】
完全無血清培地は、基本培地（例えば、ＳＭ９６または１：１　Ｆ１２／ＤＭＥＭ）に増殖因子、他のタンパク質、ホルモンおよび微量元素の混合物（これは、血清によって提供される生物学的機能を代理する）を補充することによって調製される。無血清培地の利点は、補充混合物の組成が、所望でない細胞（例えば、腺房細胞または結合組織細胞（例えば、線維芽細胞））の増殖を防止しながら、所望の細胞集団（例えば、中間細胞集団）の増殖を促進するために、容易に操作され得ることである。補充混合物はまた、より成熟した細胞への幹細胞集団の分化を促進するために、または高速度の増殖を維持するために幹細胞集団の分化を妨害するために、操作され得る。
【００７３】
（１．成長ホルモン）
成長ホルモン（ＧＨ）を含む低血清上皮選択培養培地が、中間分化の有益な膵臓細胞集団の出現を促進することは、本発明の知見である。特定の理論によって束縛されることを望まないが、細胞増殖を支持する、血清中に通常見出されるマイトジェン性物質をＧＨが代理し得るが、血清は、それほど望ましくない細胞集団（例えば、線維芽細胞および間葉細胞）の過剰増殖を促進する他のマイトジェン性因子を含むことが仮定される。それゆえ、ＧＨを含有する補充混合物での血清の置換は、中間の分化状態の細胞集団の増殖を選択する。無血清培地中でのＧＨの機能は、本発明の代替実施形態では他の補充成分で置換され得るが、天然抽出物中の、または組換えタンパク質としての、ＧＨの容易な入手可能によって、ＧＨ含有培地は、本明細書中に開示された方法について適切な上皮選択培地となる。
【００７４】
成長ホルモン（ソマトトロピンとしても公知）は、下垂体前葉において合成され、正常な身体の成長および乳汁分泌を促進し、そして細胞代謝の種々の局面に影響を与える、ポリペプチド性ホルモンである。ＧＨは、細胞に直接的影響、ならびにＩＧＦ−Ｉおよび類似の分子によって媒介される間接的影響の両方を有する；インタクトな膵臓では、島細胞の増殖は、ＧＨならびに相同なホルモンプロラクチンおよびラクトゲンの発現に結び付けられている（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｊ　Ｍｏｌ　Ｍｅｄ　７７（１）：６２−６（１９９９）を参照のこと）。ヒトでは、成熟ＧＨは、１９１アミノ酸残基を含み、そして２２ｋＤａの分子量を示す。しかし、通常観察されるジスルフィドダイマーに加えて、ヒトＧＨの一部（残基１〜４３および４４〜１９１）から作製される２つのペプチドが血清中に検出されており、そして成体島組織に対して別個の効果を有する（Ｌｅｗｉｓら，Ｅｎｄｏｃｒ　Ｊ　４７増補：Ｓ１−８（２０００）を参照のこと）。ヒトＧＨの種々の天然に存在する、誘導体、改変体、代謝産物および操作された誘導体が公知であり、これらとしては、グリコシド化ＧＨ、メチオニルＧＨ、２０ｋＤａ　ＧＨ、アセチル化ＧＨ、タンパク質分解切断ＧＨ、脱アミド（ｄｅｓａｍｉｄｏ）ＧＨ、スルホキシドＧＨおよび短縮形態のＧＨが挙げられる。
【００７５】
ＧＨは、ホルモンの保存されたファミリーのメンバーであり、このファミリーは、ヒトにおけるＧＨ−Ｖ１およびＧＨ−Ｖ２、コリオマンモトロピンおよびプロラクチン、ならびに他の脊椎動物由来のタンパク質（例えば、齧歯類の胎盤性ラクトゲンＩおよびＩＩならびに他のウシおよびヒツジのラクトゲン、マウスのプロリフェリン（ｐｒｏｌｉｆｅｒｉｎ）Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ、ならびにプロリフェリン関連タンパク質、ウシプロラクチン関連タンパク質Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ、ラットプロラクチン様タンパク質ＡおよびＢ、ならびに種々の魚由来のソマトラクチンを含む。このファミリーのメンバーは、以下のコンセンサス配列によって特徴付けられる：Ｃ−ｘ−［ＳＴ］−ｘ（２）−［ＬＩＶＭＦＹ］−ｘ−［ＬＩＶＭＳＴＡ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＴＡＬＩＶ］−ｘ（７）−［ＬＩＶＭＦＹ］−ｘ（６）−［ＬＩＶＭＦＹ］−ｘ（２）−［ＳＴＡ］−ＷまたはＣ−［ＬＩＶＭＦＹ］−ｘ（２）−Ｄ−［ＬＩＶＭＦＹＳＴＡ］−ｘ（５）−［ＬＩＶＭＦＹ］−ｘ（２）−［ＬＩＶＭＦＹＴ］−ｘ（２）−Ｃ。
【００７６】
本発明の実施のために適切な成長ホルモンは、種々の天然供給源および人工供給源から入手され得る。同種のＧＨをしばしば必要とするＧＨの治療的用途とは対照的に、霊長類種、哺乳動物種または脊椎動物種の範囲由来のＧＨは、膵臓細胞の培養のための低血清培地の処方において用いられ得る。成長ホルモンの便利な供給源は、ウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ）であり、これは、天然のＧＨの豊富な供給源である。ＢＰＥ（７５μｇ／ｍｌタンパク質）は、培養培地中に約０．１μｌ／ｍｌ〜約１００μｌ／ｍｌ、好ましくは０．５μｌ／ｍｌ〜５０μｌ／ｍｌ、そして最も好ましくは５μｌ／ｍｌまたは３７．５ｍｇ／ｌで含まれ得る。他の種から入手可能な下垂体抽出物（例えば、ブタ、ヒツジなど）もまた、同様の濃度で用いられ得る。下垂体抽出物中に存在する他の因子は、その効果を増強し得るが、満足のいく結果がまた、精製したＧＨを用いて、および組換えＧＨを用いて達成され得る。組換えウシＧＨおよび組換えヒトＧＨは、広範に入手可能であり、そしてＧＨ活性の適切な供給源である。組換えＧＨは、培養培地に、０．０１ｍｇ／ｌと１００ｍｇ／ｌとの間、好ましくは０．１ｍｇ／ｌと１０ｍｇ／ｌとの間、より好ましくは約０．２ｍｇ／ｌ、約０．５ｍｇ／ｌ、約０．７５ｍｇ／ｌ、約１ｍｇ／ｌ、約１．２５ｍｇ／ｌ、約２ｍｇ／ｌまたは５ｍｇ／ｌ、そして最も好ましくは約１．２５ｍｇ／Ｌで添加され得、ここで、１ｍｇの組換えタンパク質は、３ＩＵのＧＨにほぼ等価である。
【００７７】
（２．他の補充物）
完全無血清培地のために基本培地へと添加される代表的成分としては、以下が挙げられる：組換えヒトインスリン（０．１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（０．１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ）、上皮増殖因子（０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ）、エタノールアミン（０．１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ）、アプロチニン（０．１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ）、グルコース（０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ）、ホスホエタノールアミン（０．１μＭ〜１００μＭ）、トリヨードチロニン（０．１ｐＭ〜１００ｐＭ）、セレン（０．１ｎＭ〜１００ｎＭ）、ヒドロコルチゾン（０．０１μＭ〜１００μＭ）、プロゲステロン（０．１ｎＭ〜１０ｎＭ）、フォルスコリン（０．１μＭ〜１００μＭ）、ヒレグリン（０．１ｎＭ〜１００ｎＭ）およびウシ下垂体抽出物（０．１μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ）。細胞増殖を支持するために全ての補充成分が必要とされるわけではない；特定の補充物についての最適な濃度または必要性は、単一成分を省略するかまたはその濃度を低減し、そして細胞増殖に対する影響を観察することによって経験的に決定され得る（Ｓｔｅｐｈａｎら，前出を参照のこと）。
【００７８】
一般に、補充成分は、同じ生物学的特性を有する天然産物または合成産物によって置換され得る。例えば、トリヨードチロニン、ヒドロコルチゾンおよびプロゲステロンは全て、同じ細胞内レセプター（甲状腺レセプター、グルココルチコイドレセプターおよびプロゲステロンレセプター）を活性化することが公知の天然または合成のホルモンによって置換され得る。インスリンおよびＥＧＦは代表的に、組換えＤＮＡ方法論によって産生されるヒトタンパク質であるが、天然の供給源から精製されたポリペプチドによって、他の種由来のポリペプチドによって、またはインスリンレセプターおよびＥＧＦレセプターの他のアゴニストによって、置換され得る。ＧＨは、いくつかの場合、ＧＨレセプターの他のアンタゴニストによって置換され得る。同様に、ＥｒｂＢ３レセプターのリガンドであるヒレグリンは、ヒレグリンアイソフォームならびに他のＥｒｂＢ３アゴニスト（例えば、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３およびＮＲＧ４、感覚ニューロンおよび運動ニューロン由来因子、ニューレスチン（ｎｅｕｒｅｓｔｉｎ）ならびにＥｂｐ−１、ヒレグリンα、ヒレグリンβ、ヒレグリンγ、ニューレグリン−１およびニューレグリン−２（ＮＲＧ−１α；ＮＲＧ−１β、ＮＲＧ−２αおよびＮＲＧ−２β））によって置換され得る。
【００７９】
例示的な無血清培地としては、基本培地ＳＭ９６および完全培地ＳＭ９５（これは、以下の表に示されるように補充されたＳＭ９６からなる）が挙げられる。ＳＭ９８は、Ｓｔｅｐｈａｎら，前出によって記載された培地補充物１４Ｆの改変物が補充された、１：１のＦ１２／ＤＭＥＭからなる。ＳＭ９８は、１４Ｆよりも少ないヒレグリン（８ｎｇ／ｍｌに対して１ｎｇ／ｍｌ）を含む。従って、ＳＭ９８は、以下が補充された、１：１のＦ１２／ＤＭＥＭからなる：組換えヒトインスリン、１０μｇ／ｍｌ；トランスフェリン、１０μｇ／ｍｌ；上皮増殖因子、１０ｎｇ／ｍｌ；エタノールアミン、６１ｎｇ／ｍｌ；アプロチニン、２５μｇ／ｍｌ；グルコース、５ｍｇ／ｍｌ；ホスホエタノールアミン、１４１ｎｇ／ｍｌ；トリヨードチロニン、３．３６５ｐｇ／ｍｌ；セレン、４．３２５ｎｇ／ｍｌ；ヒドロコルチゾン、１８１ｎｇ／ｍｌ；プロゲステロン、３．１５ｎｇ／ｍｌ；フォルスコリン、４１０ｎｇ／ｍｌ；ヒレグリン、１ｎｇ／ｍｌ；およびウシ下垂体抽出物、７５μｇ／ｍｌ。ＳＭ９５およびＳＭ９８中のＥＧＨおよびヒレグリンの例示的供給源は、組換えヒトＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ　Ｅ９６４４）およびヒトヒレグリン−１のＥＧＦドメイン（アミノ酸１７６〜２４６）（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ　３９６−ＨＢ／ＣＦ）である。
【００８０】
【表５】
2004502425.tif 000003
【００８１】
【表６】
2004502425.tif 000004
【００８２】
【表７】
2004502425.tif 000005
（Ｂ．低血清培地への細胞の移植）
本明細書中に記載される場合、低血清培地へと膵臓細胞の培養物を移植することは、中間分化状態を有する、規定された細胞集団の選択を促進する。この細胞集団は、継代培養された場合増殖し続けるが、膵臓マーカー（例えば、ＰＤＸ−１）の高い発現レベルを維持する。刺激されていない、この集団は、比較的低レベルの膵臓内分泌ホルモン（例えば、インスリン）を分泌するが、本発明の方法に従って成熟して、高分泌細胞が得られ得る。低血清培地へと膵臓細胞の培養物を移植するために、細胞は、高血清培地から低血清培地へと離脱され得るか、または単離後に低血清培地中に直接配置され得る。ＳＭ９５およびＳＭ９８のような培地は、適切な低血清培地であるが、ＳＭ９５は、膵臓細胞の成熟の際にわずかに改善されたインスリン分泌を生じる。
【００８３】
離脱手順において、細胞は、高血清培地中で一定期間にわたって維持され、次いで、中間細胞集団の選択的増殖のために低血清培地へと移植される。この維持期間は、本明細書中上記のように、短くてもよい（例えば、一晩）。あるいは、細胞は、低血清培地への移植前に高血清培地中で増殖され得る。従って、１つの実施形態では、膵臓細胞は、単離され、精製され、次いで１０％添加された血清を有する培地（例えば、培地３）を含む培養容器中にプレーティングされる。細胞は、ほぼコンフルエントになるまで増殖させられ、次いで中間集団の選択のために低血清培地または無血清培地（例えば、ＳＭ９５またはＳＭ９８）へと継代される。得られる細胞集団は、免疫組織化学染色によって調べた場合、９０％より多くがＰＤＸ−１陽性であり、そして１：１００と１０００：１との間のインスリン：アクチンｍＲＮＡ比を維持する。
【００８４】
離脱手順の別の実施形態では、培地中の血清の濃度は、細胞を継代培養する際に毎回、または培地を除去して再度配置する際に毎回、培地を順次低下する濃度の血清で置換することによって、徐々に低下される。例えば、この培養手順の１つの実施形態では、単離された膵臓細胞は、培地７（２０％　ＦＢＳ）中で一晩、最初に維持され、次いで培地３（１０％　ＦＢＳ）中で７〜１０日間にわたって増殖される。ほぼコンフルエンスに達したら、細胞は、４％血清を含む培地（６０％　ＳＭ９５および４０％培地３）を有する新たな容器へと継代培養される。さらに、ほぼコンフルエントになるまでの増殖後、細胞は、血清を含まない培地（１００％　ＳＭ９５）を有する新たな容器へと継代培養される。細胞は、増殖し続け、そしてその後の継代の際に、純粋なＳＭ９５培地中に継代培養される。
【００８５】
離脱手順の各工程の間の血清の濃度は重要ではない；従って、細胞を１０％血清中での増殖から０％血清へと徐々に離脱する場合、連続した培地変更は、約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％の血清を含み得る。このような中間濃度の血清を有する培地は、培地３（１０％　ＦＢＳ）とＳＭ９５またはＳＭ９８（０％　ＦＢＳ）とを適切な比で混合することによって調製され得る。一般に、細胞を新たな培地に継代するかまたは細胞に新たな培地を与える場合、以前の培地からのいくらかの残りの血清が、新たな培地中へと持ち越され得る。従って、培養培地中の血清の百分率は、添加された新たな培地中の血清の濃度と正確には等しくないかもしれない。しかし、通常の細胞培養プロトコルでは、ごく少量の培地が持ち越され、続いて培地の交換を続けることによって希釈される。いずれにせよ、持ち越された残りの血清の存在は、本発明の方法を妨害しない。所望の場合、培養培地中の血清の量は、特定の百分率の血清を有することが既知の培地と問題の培養培地との間で血清特異的成分（例えば、アルブミン、グロブリン、フェチュインなどの免疫アッセイ）の濃度を比較することによって決定され得る。
【００８６】
膵臓細胞の培養物はまた、高血清培地中で細胞を維持することなく、１回の工程で、低血清培地中へと移植され得る。この「ショック」方法論では、細胞は通常、低血清培地を有する培養容器中に、単離手順後直ちにプレーティングされる。このような実施形態では、単離された膵臓細胞の最初の継代は、１％未満の血清を有する培地（例えば、ＳＭ９５またはＳＭ９８）中で実施される。
【００８７】
ショック方法論の代替の実施形態では、細胞は、１％と４％との間の血清、例えば、約１．３３％、１．５％、１．６６％、２％、２．３３％、２．５％、２．６６％、３％、３．３３％、３．５％または３．６６％の血清を含む培地中に最初に継代される。細胞が密度勾配によって精製された場合、これらは一般に、血清を含む培地中で洗浄または回収され得る。細胞が低血清培地中で洗浄されない場合、細胞の最初の継代のための培養培地は、単離手順からの中間濃度の血清を含む。例示的な実施形態では、密度勾配界面からの細胞は、１容積の培地７（２０％血清）中に収集される。この容積に、５容積の無血清培地（例えば、ＳＭ９５）が添加されて、３．３３％の最終血清濃度が得られる。次いで、細胞は、この培地中で１回の継代にわたって増殖される。その後の継代または培地変更は低血清培地を用いて実施され、その結果、細胞が１％以下の血清を含む培地中で増殖されて、中間細胞集団（すなわち、中間の分化の細胞）が選択されることとなる。
【００８８】
ショック方法論または離脱方法論のいずれかを用いると、低血清培地中での膵臓細胞の培養物は、適切な培養条件下で増殖し続け、膵臓内分泌細胞に対して特異的な特定のマーカーを発現するが、成熟島集団とは異なる、中間細胞集団の出現を促進する。本発明の１つの実施形態では、この中間細胞集団は、膵臓内分泌マーカーＰＤＸ−１のその高発現（代表的に、少なくとも９０％の細胞はＰＤＸ−１について陽性に染まり、そしてＰＤＸ−１の染色は、細胞の核に濃縮する傾向がある）によって、およびそのインスリンｍＲＮＡ発現パターンによって区別される。この実施形態では、中間集団の大部分の細胞は、インスリン発現について陽性であるが、この集団中のインスリン遺伝子発現の平均レベルは比較的低い（代表的に、インスリン：アクチンｍＲＮＡ比は、１：１０と１００：１との間である）。いくつかの実施形態では、ショック方法論によって産生される中間細胞集団は、グルコース負荷に対して陽性の応答を維持し、ＳＧＳ試験によってアッセイされた場合、２以上の刺激指数を生じる。他の実施形態では、離脱方法論によって産生された中間集団は、さらに成熟するまでＳＧＳアッセイにおいて負のスコアとなる。
【００８９】
本発明の方法によって産生された中間細胞集団は代表的に、増殖する能力および高分泌内分泌細胞へとさらに分化する能力の両方を保持する。増殖能力は一般に、第１の密度で播種された培養物が、第２の密度へと増大する能力によって評価される；例えば、１平方センチメートルあたり１８０細胞でプレーティングされた細胞は、１回の継代で１ｍｌあたり１，８００細胞へと増大し得る。増殖と継代とのサイクルの繰り返しによって、単離された膵臓細胞の出発集団は、内分泌マーカー（例えば、ＰＤＸ−１およびインスリンｍＲＮＡ発現）を保持し、かつ成熟した高分泌内分泌細胞へと分化する能力を保持しながら、約１０，０００倍以上（例えば、約１００倍、５００倍、１０００倍、５０００倍、１０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、５００，０００倍または１，０００，０００倍）増大し得る。
【００９０】
この中間段階の集団の細胞は、さらに操作されることなく、膵臓内分泌機能の回復または増強のために哺乳動物中に移植され得る。中間集団の細胞はまた、島細胞の発達およびホメオスタシス（例えば、薬物スクリーニング、島形態形成または自己免疫応答）についてのモデル系として用いられ得る。しかし、本発明の１つの実施形態では、中間段階の集団由来の細胞は、培養中にさらに成熟して、高レベルの膵臓内分泌ホルモンを分泌する細胞を産生する。
【００９１】
（Ｖ．高インスリン産生凝集物への中間細胞の成熟）
適切な培養条件下では、本発明の中間段階の膵臓細胞は、高レベルの膵臓内分泌ホルモンを発現する別の型の細胞へと成熟する。代表的に、このプロセスは、この細胞に、凝集物または偽島として公知の細胞クラスター（これは、膵臓中の成熟した島に特有の形態学的特徴および免疫組織化学的特徴のいくつかを獲得する）を形成させることを含む。膵臓細胞の増殖によって予め馴化された基材が、凝集物発達の一貫性の増強を提供し、そしてより本物の島の形態を生じることは本発明の知見である。
【００９２】
この手順のための好ましい出発材料は、本発明の方法によって産生された中間段階の細胞の培養物であるが、ＰＤＸ−１陽性条件的幹細胞を含む他の細胞集団が用いられ得る。中間段階の細胞集団をコンフルエンスになるまで単に増殖させた場合、細胞の中心または凝集物が出現し得る。凝集物の形成はまた、本発明の特定の方法によって生成される細胞に特異的な処理方法によって誘導され得る（例えば、ショック方法論によって生成される中間集団は、コラゲナーゼでの処理によって凝集物を形成するように誘導され得る）。しかし、一貫した凝集物形成は、細胞が、膵臓細胞を培養するために以前に用いられた基材上で培養される場合、増強される。特定の理論によって束縛されることを望まないが、中間段階の細胞の増殖は、特定の細胞外マトリクス分子の蓄積または細胞外マトリクスの特定の空間的配置を刺激し得る。細胞を除去して新たな細胞をこのマトリクスに播種した場合、このマトリクスは、インビボでの島と類似した形態学的特性および生化学的特性を有する凝集物への細胞の分化を促進する。
【００９３】
代表的実施形態では、膵臓細胞が単離され、そして本発明の方法に従って増殖される。次いで、細胞は、基材上に継代培養され、その間に、これらは、単層としてコンフルエントになるまで増殖する。一旦細胞が単層を形成したら（最初の継代培養物の播種密度に依存して、代表的には約５日間）、これらは、トリプシン処理によって除去される。低下させた濃度のトリプシン（代表的には、標準的細胞培養技術において用いられる濃度の１／２または１／４）が、マトリクスの大規模な分解を防ぐために好ましい。あるいは、細胞の単層は、界面活性剤を用いて基材を抽出することによって除去され得、界面活性剤は、細胞を除去するが、分泌されたマトリックスを残す（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　７７：４０９４−８（１９８０）を参照のこと）。
【００９４】
凝集物形成を誘導するために、膵臓細胞は、この予め馴化された基材上で培養される。便利には、基材上で予め増殖され除去された細胞は、分けられ、そして馴化基材に再度播種され得る。しかし、基材を馴化させる培養物と基材に播種される培養物とが同じ培養物である必要はない。従って、１つの細胞培養物は、基材を馴化させるために基材上で増殖され、この細胞は除去され、そして別の培養物由来の細胞は馴化基材上に播種されて凝集物形成を促進し得る。馴化細胞は、その後培養される細胞と同じまたは異なるドナーまたは種に由来し得る。
【００９５】
上記のように予め馴化された基材上で増殖された細胞は、代表的な単層としてよりもむしろ、細胞凝集物として増殖する。これらの凝集物は、約５０〜約５０００の細胞を含み、そして直径が約５０ミクロン〜約３００ミクロンである。切片化し、そして免疫組織化学染色によって調べた場合、これらの凝集物は、特徴的形態を提示する。１細胞の厚みでかつ管マーカーサイトケラチン１９について陽性に染まる、連続した被膜層は、サイトケラチン１９染色を一般に欠く内部細胞塊を取り囲む。内部塊は代表的に、膵臓内分泌ホルモン、ＫＳ１／４およびＰＤＸ−１について陽性に染まる細胞を含む。特定の理論によって束縛されることを望まないが、この形態は、外被膜を含む管様幹細胞が内分泌前駆体細胞を生じ、これが内部細胞塊内で、より成熟した内分泌細胞へと分化する機構を示唆する。従って、本発明の方法によって産生された細胞凝集物は、インビボで内分泌膵臓細胞を生じる発達プロセスを模倣する。従って、これらの凝集物は哺乳動物中に移植されて、膵臓内分泌機能を増強または回復し得る。
【００９６】
哺乳動物への移植およびその後の内分泌機能のモニタリングは、島移植のために通常用いられる方法に従って実施され得る；例えば、Ｒｙａｎら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ　５０：７１０−１９（２００１）；Ｐｅｃｋら，Ａｎｎ　Ｍｅｄ　３３：１８６−９２（２００１）；Ｓｈａｐｉｒｏら，Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ　３４３（４）：２３０−８（２０００）；Ｃａｒｌｓｓｏｎら，Ｕｐｓ　Ｊ　Ｍｅｄ　Ｓｃｉ　１０５（２）：１０７−２３（２０００）およびＫｕｈｔｒｅｉｂｅｒ，ＷＭ，Ｃｅｌｌ　Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，１９９９を参照のこと。好ましい移植部位としては、肝臓および腎臓皮膜が挙げられる。移植された凝集物に対する免疫反応に問題がある場合、種々のアプローチを用いて、移植された凝集物の免疫認識を妨害し得る。これらとしては、以下が挙げられる：免疫細胞による接近を妨害するための凝集物のカプセル化（米国特許第５，７６２，９５９、同第５，５５０，１７８号および同第５，５７８，３１４号を参照のこと）、凝集物形成の前に細胞を遺伝子操作して、宿主によって認識される抗原を除去すること（米国特許第６，００１，６４７号を参照のこと）および免疫抑制レジメンでの宿主の処理（Ｒｙａｎら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ　５０：７１０−１９（２００１）を参照のこと）。
【００９７】
（実施例）
以下の実施例は、本願発明を例示するために提供されるが、本願発明を限定するためには提供されない。
【００９８】
（実施例１：離脱によるＰＤＸ−１陽性の中間細胞集団の作製）
ＨＤ３５７は、５７歳の女性白人器官ドナーであった。膵臓組織を、機械的破壊およびＨＢＳＳ中のＬｉｂｅｒａｓｅ（１．５ｍｇ／ｍｌ）を用いた消化によって解離させた。解離した細胞を、米国特許第５，７３９，０３３号に記載されるように、ＰＩＰＳの溶液中での三層密度勾配分離（ＵＷ溶液中でのＮｙｃｏｄｅｎｚ（Ｎｙｃｏｍｅｄ　ＡＳ，Ｎｏｒｗａｙ））によって分画した。４０ｍｌの１．１１４ｇ／ｍｌ　ＰＩＰＳ溶液中の、２．６ｍｌの解離膵臓組織の底部層、８０ｍｌの１．０９０ｇ／ｍｌ　ＰＩＰＳの中間層および７０ｍｌ　ＲＰＭＩ　１６４０＋２％　ＦＢＳの上部層を積層することによって、密度勾配を２５０ｍｌ遠心管中に準備した。遠心分離を、１，５００ＲＰＭで、ブレーキなしで６分間、０５，ＡＲＣローターを備えたＳｏｒｖａｌｌ　ＲＣ−３Ｃ　Ｐｌｕｓを用いて実施した。以下の３つの別々の組織集団が、勾配分離後に収集された：上部層と第２層との間の上（島が富化される）界面、中間層と底部層との間の下界面、およびペレット画分。収集された細胞画分を培地７（第ＩＩＩ節Ｂ）で洗浄して勾配溶液を除去し、その後培養した。上部界面からの総島収量は、１２８，０００ＩＥＱ（精製後細胞の検鏡によって決定され、そして１５０μｍの標準的島に対する島容積によって正規化された島当量）であり、純度は７９％であった。
【００９９】
下の界面由来の約５％の純度の２０，０００ＥＱの膵臓細胞を、３５ｍｌの培地７（２０％　ＦＢＳ）を有するＴ１６２培養フラスコ中で一晩培養した（Ｐ０）。１日目に、この培地を、継代培養（第ＩＩＩＢ節）を行わずに培地３（１０％　ＦＢＳ）に交換した。９日目に、この培地を、継代培養を行わずに１／３　ＳＭ９８および２／３培地３（合計６．６７％　ＦＢＳ）に交換した。１３日目に、この細胞をＰ１に継代し、そしてＳＭ９８（０％　ＦＢＳ）を有する１００ｍｍ組織培養ディッシュ中で培養した。細胞をさらに７回の継代（Ｐ２〜Ｐ８）にわたって継代した。継代時に、細胞の一部を、免疫細胞化学分析のためにチャンバスライド上で培養した。
【０１００】
染色プロセスを、スライドのチャンバ部分を除去して開始した。細胞を、カルシウム／マグネシウムを有するＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝化生理食塩水）で３分間にわたって３回、非常に穏やかにリンスした。次いで、この細胞を、室温で、ＤＰＢＳ中の氷冷４％パラホルムアルデヒド溶液中で１０分間にわたって固定し、続いて、カルシウム／マグネシウムを有するＤＰＢＳ中で各々３分間、３回リンスした。細胞を、ブロッキング溶液（ＴＢＳ／３％　ＢＳＡ／１％正常ヤギ血清）中で１時間にわたって室温でインキュベートした。次いで、細胞を、１０分間〜１５分間にわたってブロッキング溶液中の０．３％　ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて透過化した。適切な希釈でブロッキング溶液中に１０００：１希釈されたウサギ抗ＰＤＸ−１一次抗体（Ｓｃｒｉｐｐｓ製）を細胞に添加し、そして４℃にて一晩インキュベートした。ＰＤＸ−１抗体を、Ｌｅｏｎａｒｄ　Ｊ．ら，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１９９３年１０月７日，（１０）１２７５−８３の教示に従って作製し得る。
【０１０１】
一次抗体とのインキュベーション後、細胞を、カルシウム／マグネシウムを含まないＤＰＢＳ中で３分間にわたってリンスした。さらに２回のリンス後、細胞をブロッキング溶液中で３０分間にわたって室温で再度ブロックした。二次抗体（ブロッキング溶液中に２００：１希釈されたヤギ抗ウサギＩｇＧ−ローダミン結合体）をこの細胞に添加し、そして暗所にて１時間〜２時間にわたって室温でインキュベートした。
【０１０２】
インキュベーション後、細胞を、カルシウムもマグネシウムも含まないＤＰＢＳ中で３回、それぞれ３分間にわたってリンスした。核を、ＤＰＢＳ中のＨｏｅｃｈｓｔ色素（１０，０００：１）で５分間にわたって対比染色し、続いてＤＰＢＳ中で１回リンスした。過剰な流体を、ペーパータオルで軽くたたいて除去した。スライドに３〜４滴の水性マウント培地をマウントし、そしてカバースライドで覆った。スライドを暗所にて２時間にわたって室温で乾燥させ、そして縁部をマニキュア液でシールした。スライドを暗所にて４℃で保存した後に、Ｏｌｙｍｐｕｓ　ＡＸ　７０蛍光顕微鏡で検鏡した。本質的に１００％のＨＤ３５７　Ｐ８細胞がＰＤＸ−１について陽性に染まった。
【０１０３】
（実施例２：ショックによる、ＰＤＸ−１陽性の中間細胞集団の作製）
ヒトドナー番号３６９（ＨＤ３６９）は、４８歳のラテンアメリカ系男性であり、体重が８０ｋｇであり、そしてＣＭＶ以外は、大部分のウイルス学試験について陰性であった。温かい虚血時間は存在せず、冷たい虚血時間は１５時間であった。膵臓は太っていたが、明らかな損傷は存在しなかった。主な膵臓管にカニューレ挿入し、そして試験の間に見出された明らかな漏出は存在しなかった。酵素の注入は満足がいくものであった。静的消化は１９分間かかり、そしてチャンバ消化は１８分間持続した。この消化によって、精製前に約２７０，０００　ＩＥＱが得られた。冷たい虚血の長さに起因して、島のほぼ３分の１は、不明確であり、インタクトな被膜を有さなかった。
【０１０４】
３層の密度勾配遠心分離を、実施例１の手順に従って実施した。いくつかの島がフラグメントへと解離して見出され、そして上の界面における島の純度は５４．３％であり、最終的な島の収量は約１４９，０００ＩＥＱであった。
【０１０５】
上の界面由来の約６，０００ＩＥＱ（純度約５４％）を８ｍｌの培地７（２０％　ＦＢＳ）中に収集し、そして２ｍｌのアリコート３つおよび０．５ｍｌのアリコート３つに分けた。これらの画分を、処理した非コーティングプラスチック組織培養ディッシュ中で培養した。細胞を、３つの群に分配した。群１は、以下からなっていた：ａ）２ｍｌの培地７および１０ｍｌの培地ＳＭ９５（合計３．３３％のＦＢＳ）中の１，５００ＩＥＱ（これを、１００ｍｍ培養ディッシュに播種した）、ならびにｂ）０．５ｍｌの培地７および３ｍｌの培地ＳＭ９５（合計２．８６％のＦＢＳ）中の４００ＩＥＱ（これを、６０ｍｍ培養ディッシュに播種した）。群２は以下からなっていた：ａ）２ｍｌの培地７および１０ｍｌの培地ＳＭ９６（合計３．３３％のＦＢＳ）中の１，５００ＩＥＱ（これを、１００ｍｍ培養ディッシュ中に播種した）、ならびにｂ）０．５ｍｌの培地７および３ｍｌの培地ＳＭ９６（合計２．８６％のＦＢＳ）中の４００ＩＥＱ（これを、６０ｍｍ培養ディッシュ中に播種した）。群３は以下からなっていた：ａ）２ｍｌの培地７および１０ｍｌの培地ＳＭ９８（合計３．３３％のＦＢＳ）中の１，５００ＩＥＱ（これを、１００ｍｍ培養ディッシュ中に播種した）、ならびにｂ）０．５ｍｌの培地７および３ｍｌの培地ＳＭ９８中の４００ＩＥＱ（これを、６０ｍｍ培養ディッシュ中に播種した）（合計２．８６％のＦＢＳ）。このディッシュを、３７℃で、５％　ＣＯ２の存在下で１４日間にわたって、継代１回目までインキュベートした。培地を１週間に２回、無血清培地に交換した。
【０１０６】
継代１回目（１４日目）に、細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡを約１０分間用いて培養ディッシュの底部から解離し、次いで１０％　ＦＢＳ　ＨＢＳＳ培地を用いて洗浄した。各群において、１００ｍｍディッシュおよび６０ｍｍディッシュの両方からの細胞を合わせ、そして３枚の１００ｍｍディッシュ中に播種した。
【０１０７】
継代２回目（２０日目）に、細胞をトリプシン処理し、そして１対２の比で継代培養した。ＳＭ９５およびＳＭ９８中の細胞は、増殖し、そして１週間以内にコンフルエントになった。ＳＭ９５中での６回の継代後、細胞を固定し、そして実施例１に記載した通りにＰＤＸ−１発現について染色した。ほぼ１００％の細胞は、ＰＤＸ−１について陽性に染まった。
【０１０８】
（実施例３：中間細胞集団のインスリン発現）
ＰＤＸ−１陽性の中間細胞集団を、ヒトドナーから、実施例２のショック方法に従って作製した、そして無血清培地中で繁殖させた。継代１回目から継代６回目までの細胞を、インスリンおよびアクチンのｍＲＮＡの発現についてアッセイした。
【０１０９】
ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ　＃７４１０４）を用いて製造業者の指示に従って単離した。手短には、溶解緩衝液（１０ｃｍプレートあたり６５０μｌ）をこの細胞に添加し、使い捨て細胞スクレーパー（Ｆｉｓｈｅｒ＃０８７７３２）を用いて収集し、次いでＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ＃７９６５４）を用いて破壊した。総ＲＮＡを溶解産物から単離し、次いでＲｉｂｏＧｒｅｅｎ　ＲＮＡ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ＃Ｒ−１１４９０）を用いて定量した。ＲＮＡサンプルを、ｃＤＮＡ合成まで−８０℃で凍結保存した。各サンプルの二連のアリコート（各々０．５μｇ）を、２０ｐｍｏｌｅのオリゴ（ｄＴ）１６を用い、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ　ＲＴキット（ＱＩＡＧＥＮ＃２０５１１１）を製造業者の指示に従って用いて逆転写し、次いで各ｃＤＮＡサンプルを、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて１００μｌになるように希釈し、そして−２０℃にて保存した。リアルタイムＰＣＲを、２μｌの各ｃＤＮＡサンプルおよび示したプライマーを用いて、Ｒｏｃｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒで実施した。アクチンおよびインスリンを、ハイブリッドプローブプロトコルおよびＤＮＡ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎミックス（Ｒｏｃｈｅ＃２１５８８２５）を製造業者の指示に従って用いて測定した。ＰＣＲを、並行して増幅された各産物の検量線との比較によって定量した。
【０１１０】
【表８】
2004502425.tif 000006
この結果は、平均のインスリン対アクチンｍＲＮＡ比が、継代１回目から継代６回目まで、２１１と１．９９との間の範囲にあることを示した。
【０１１１】
【表９】
2004502425.tif 000007
ショック方法によって作製された中間集団はまた、グルコース負荷に応答してインスリンを分泌する能力についてアッセイされた。示した培養物からのほぼコンフルエントなプレートを、刺激グルコース分泌試験（ＳＧＳ）を用いてインスリン分泌についてアッセイした。
【０１１２】
【表１０】
2004502425.tif 000008
（実施例４：低血清培地中での増殖によるＰＤＸ−１陽性の中間細胞の選択）
本実施例は、低血清培地中での増殖による中間段階の集団の選択を例示する。単離した膵臓細胞を、血清含有培地条件から無血清培養培地条件へと移行させた。このことは、インスリン発現膵臓培養物をもたらす、内分泌前駆細胞の所望の集団を富化および選択するために役立つ。膵臓細胞を、実施例１の通りにドナー膵臓から単離した。島が富化された上の界面層Ａおよび下の界面Ｂならびにペレット画分を、血清含有培地（２０％ウシ胎仔血清を有する培地７）中で最初に増殖させた（継代０回目、ＰＯ）。一晩のインキュベーション後、培養物を、より少ない血清を含む培地（１０％ウシ胎児血清を有する培地３）に切り替え、そして７日間〜１０日間培養した。この期間の最後に、ほぼコンフルエントな培養物をトリプシン処理（トリプシン／ＥＤＴＡ）し、そして選択のための規定された無血清培地（ＳＭ９８またはＳＭ９５）中に、１：３の比で継代した（Ｐ１）。培養物に毎週補給し、そして８０％〜９０％のコンフルエンスに達したときに１：２の比で継代した。
【０１１３】
細胞培養前の層Ｂ中の細胞集団は不均質であり、そして腺房細胞（アミラーゼ陽性）、いくつかの成熟した島（インスリン、グルカゴン、ソマトスタチンに陽性の細胞）、およびいくつかの管成分（サイトケラチン１９）から構成されていた（表１を参照のこと）。増殖プロセスおよび選択プロセスに供された、富化された集団は、これらのマーカーのタンパク質および遺伝子の発現パターンにおいて多くの変化を提示した（表２および表３）。継代０回目（Ｐ０）には、細胞集団は依然として不均質であり、そして有意な割合（２０％〜５０％）がアミラーゼ陽性であり、サイトケラチン１９陽性（８５％〜９５％）であり、そしてほんの１％〜３％の細胞がインスリンについての陽性染色を示した。これらの予め離脱された初期インスリン陽性培養細胞は小さく、インスリンについて陽性に染まる、多くの小さな細胞質顆粒を含み、ＰＤＸ−１（膵臓ホメオボックスドメインタンパク質−１）について強く染まる小さな丸い核を有し、そしてサイトケラチン１９についての細胞質染色を示さなかった；それゆえ、新たに富化された膵臓材料中に存在する成熟した成体島から誘導されたようであった。この小さなインスリン陽性細胞集団は、細胞を継代して血清含有培地から無血清培地へと移行させるにつれて減少し、そして継代４回目（Ｐ４）までにもはや検出可能でなかった。継代２回目〜継代４回目（Ｐ２〜Ｐ４）では、第２の異なるインスリン陽性集団が検出され得た（総細胞の２％〜４０％）。離脱細胞のこの集団は、インスリンについて陽性に染まる楕円形の核および核周囲細胞質顆粒を有し、そしてＰＤＸ−１陽性核を有する、より大きな細胞からなっていた（継代６回目である図１を参照のこと）。サイトケラチン１９および／または核増殖抗原Ｋｉ６７の同時発現は、有意な割合のこれらの細胞において観察された。大きなインスリン陽性細胞は、継代４回目〜継代８回目（Ｐ４〜Ｐ８）では、細胞集団の１０％〜６０％を構成していた。インスリン陽性細胞の百分率は離脱プロセスの間に上昇するが、総インスリンＲＮＡ発現レベルは減少した。このことは、初期インスリン陽性細胞集団と比較して、大きなインスリン陽性細胞中の、１細胞あたりの、より低いインスリンＲＮＡ発現を示す。離脱されても、血清含有培地から無血清培地（ＳＭ９８またはＳＭ９５）へと移行されてもいない細胞は、検出可能なレベルのインスリンを発現せず、核というよりも細胞質にある傾向のある弱いＰＤＸ−１発現を示し、そしてより大きな割合（離脱集団における＜１０％と比較して、＞３０％）の離脱されていないこれらの細胞は、腺房マーカーアミラーゼを発現し続けた。増殖した膵臓細胞の選択の間のホルモン遺伝子発現レベルにおける変化をまた、定量的ＲＴ−ＰＣＲによってモニタリングした（表３）。
【０１１４】
【表１】
2004502425.tif 000009
データをパラフィン切片から得て、そして示されたマーカーを発現する総細胞の百分率として示す。
【０１１５】
【表２】
2004502425.tif 000010
データを、示されたマーカーを発現する総細胞の百分率として示す。
【０１１６】
【表３】
2004502425.tif 000011
（実施例５：インスリン分泌凝集物を形成する中間細胞の成熟）
ドナー膵臓ＨＤ３８１の消化から得られたヒト膵臓組織を、培地７（２０％　ＦＢＳ）中で２日間にわたって培養した。培地を、３日間にわたって培地３（１０％　ＦＢＳ）へと交換した。この時間の間に、ほとんど単層として増殖した細胞集団が発達した（継代０回目）。この培養物を、ＳＭ　９８（０％　ＦＢＳ）培地中の新たな組織培養プレート中に５日間にわたって継代培養して、内分泌前駆細胞を選択した（継代１回目）。ほぼ全ての細胞がこの培養物において単層として増殖した。
【０１１７】
継代１回目の培養物を、新たなプレートへと継代培養し、ここで、この培養物は、単層として増殖し続けた（継代２回目）。継代１回目の培養物をまた、リサイクルしたプレート中に継代培養し、このプレートから、継代培養のためにトリプシン処理によって継代１回目の細胞を除去した。リサイクルしたプレートでは、細胞は単層として増殖するのを停止した。むしろ、細胞は、約５０ミクロンと約３００ミクロンとの間の寸法を有する、約５０細胞から約５０００細胞の凝集物を形成した。単層増殖物の４回の連続した継代からの細胞を、リサイクルしたプレートに継代培養した。各場合において、新たなプレートで培養した細胞は、単層として繁殖し、一方、リサイクルしたプレートで培養した細胞は細胞凝集物を形成した。
【０１１８】
細胞凝集物のサンプルを、手で拾い、４％ホルマリン中で固定し、そしてパラフィンブロック中に包埋した。スライドのための切片を約６μｍの厚さに切断した。パラフィン除去（ｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｚａｔｉｏｎ）のために、スライドを以下の試薬中に逐次浸漬した：１０分間にわたって２回、キシレン；１分間にわたって３回、１００％エタノール；１分間にわたって１回、９５％エタノール；１分間にわたって１回、７０％エタノール。スライドを、０．３％過酸化水素メタノール溶液中に３０分間にわたって室温で浸漬して、内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害した。スライドを、０．０１クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で３０分間にわたって煮沸して、特定のエピトープを回復させた。スライドをＰＢＳで各々５分間、３回リンスし、そして湿潤チャンバ中で室温で、３０分間〜６０分間にわたって、ＰＢＳ中の１０％正常ヤギ血清中でブロックした。ブロッキング溶液中に調製した、Ｄａｋｏ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ０８８８）からの一次（ＣＫ−１９特異的）抗体をサンプルに添加し、そして湿潤チャンバ中で室温で６０分間にわたってインキュベートした。スライドを、ＰＢＳで３回、５分間にわたって洗浄し、そしてブロッキング溶液中に調製された二次抗体（ビオチン化抗ＩｇＧ）と共に、湿潤チャンバ中で室温で３０分間にわたってインキュベートした。スライドを、ＰＢＳで５分間にわたって３回リンスし、そしてアビジン−西洋ワサビペルオキシド（ａｖｉｄｉｎ−ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄｅ）またはＡＢＣ複合体（Ｄａｋｏ）と共に室温で３０分間にわたってインキュベートした。スライドを、ＰＢＳで５分間にわたって３回リンスし、そしてビアミノベンジジン発色溶液とともに１０分間にわたってインキュベートした。蒸留水での２回の洗浄後、スライドをＭａｙｅｒのＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ中に５分間にわたって浸漬し、次いで、水が無色になりかつ核が青くなるまで、流れる水道水中でリンスし続けた。スライドを、以下の試薬中に順次浸漬することによって脱水した：７０％エタノール、１分間；９５％エタノール、１分間；１００％エタノール、１分間、３回；キシレン、一晩。スライドをマウント培地中にマウントし、そして４℃で保存した。
【０１１９】
膵臓マーカーおよびホルモンに対する抗体のパネルでの染色は、凝集物が、ＣＫ−１９について大部分陰性の細胞の内部塊を取り囲む、１層の厚さのＣＫ−１９陽性細胞の被膜からなることを示した（被膜がこの処理によって部分的に撹乱されている、図２を参照のこと。内部塊の細胞は不均質に染まったが、内部細胞塊内には、膵臓内分泌ホルモン（インスリン、ソマトスタチンおよびグルカゴン）ならびにＫＳ１／４およびＰＤＸ−１について陽性に染まる細胞が見出され得る。ＣＫ−１９陽性被膜細胞のうちの約５０％もまたＰＤＸ−１陽性であった。
【０１２０】
単層培養物のインスリンレベルおよび種々の継代において凝集した細胞のインスリンレベルを比較した。細胞を高塩緩衝液で溶解し、そして溶解産物中のインスリンの量を、１２５Ｉ標識インスリンを用いる競合放射免疫アッセイによって決定した。値を、Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３２５８の存在下での蛍光によって測定した溶解産物の総ＤＮＡ含量に対して正規化した。新たに単離された膵臓島のインスリン含量を、比較のために決定した。継代３回目の凝集物についての比較を示す：
【０１２１】
【表１１】
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本明細書中に記載される実施例および実施形態は、例示の目的のためのみであること、そしてそれらを考慮した種々の改変または変更が当業者に示唆され、そして本出願および添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内に含まれるべきであることが理解される。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、その全体が全ての目的のために本明細書中に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１（ａおよびｂ）は、ＰＤＸ−１陽性染色を示す、培養膵臓細胞の２枚のマイクロ写真である。（ａ）は、非特異的抗体を用いたコントロールであり、そして（ｂ）は、ＰＤＸ−１特異的抗体で染色した細胞である。
【図２】
図２（ａおよびｂ）は、ＣＫ−１９陽性細胞の被膜を示す、培養膵臓細胞の凝集物の２枚のマイクロ写真である。（ａ）は、非特異的抗体を用いたコントロールであり、そして（ｂ）は、ＣＫ−１９特異的抗体で染色した細胞である。
【図３】
図３は配列表を示す。
【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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