(57)【要約】血管内皮成長因子レセプタ−３のみを活性化する方法が開発された。この方法は、ポリペプチドを有する組成物を動物に投与するものであり、ここで、前記組成物は、単数又は複数のリンパ管内皮細胞の増殖、分化、遊走、又は生存を刺激する能力を有する。ＶＥＧＦレセプタ−３を選択的に活性化する方法、リンパ管内皮細胞の増加によって特徴付けられる腫瘍性疾患をスクリーニングする方法、及び、リンパ管内皮細胞を同定する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
そのような治療を必要とする動物において、リンパ管内皮細胞のみの増殖および／又は維持を刺激するための方法であって、以下の工程、
前記細胞に対して、配列識別番号２又は配列識別番号４又は配列識別番号６のアミノ酸配列又は、単数又は複数のリンパ管内皮細胞のみの増殖、分化、遊走、又は生存を刺激する能力を有するそのフラグメントに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを有する組成物の有効量を投与する工程、を有する、リンパ管内皮細胞のみの増殖および／又は維持を刺激するための方法
【請求項２】
前記ポリペプチドは、配列識別番号２又は配列識別番号４又は配列識別番号６のアミノ酸配列又はそのフラグメントに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１の方法。
【請求項３】
ＶＥＧＦレセプタ−３のみを活性化させる方法であって、以下の工程、
配列識別番号２又は配列識別番号４又は配列識別番号６のアミノ酸配列又はそのフラグメントと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを有する組成物を有効量、前記レセプタを有する細胞に投与する工程、を有する、ＶＥＧＦレセプタ−３のみを活性化させる方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドは、配列識別番号２又は配列識別番号４又は配列識別番号６のアミノ酸配列又はそのフラグメントに対して９５％の配列同一性を有する、請求項３の方法。
【請求項５】
前記方法はイン・ヴィヴォで行われる、請求項３の方法。
【請求項６】
前記方法はイン・ヴィトロで行われる、請求項３の方法。
【請求項７】
リンパ管内皮細胞の増加によって特徴付けられる腫瘍性疾患状態が疑われる動物において、腫瘍性疾患をスクリーニングする方法であって、以下の工程、
前記動物からのサンプルを得る工程、
前記サンプルを、配列識別番号２又は配列識別番号４又は配列識別番号６のアミノ酸配列又はそのフラグメントに対して、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドに晒す工程、
前記サンプルを洗浄する工程、そして、
前記サンプル中のＶＥＧＦレセプタ−３の存在、量又は分布を検出することによって前記疾患をスクリーニングする工程、ここで、潜在的腫瘍成長部又はその周囲のリンパ管内皮細胞内又は細胞上のＶＥＧＦレセプタ−３の発現の増加の検出は、腫瘍性疾患を示す、を有する、腫瘍性疾患をスクリーニングする方法。
【請求項８】
リンパ管細胞のみを同定する方法であって、以下の工程、
生物からサンプルを得る工程、
前記サンプルを、配列識別番号２又は配列識別番号４又は配列識別番号６のアミノ酸配列又はそのフラグメントに対して、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドに晒す工程、
前記サンプルを洗浄する工程、そして、
前記ポリペプチドの前記レセプタに対する結合を適当な手段によって検出する工程、を有する、リンパ管細胞のみを同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明は、一般に、マウス血管内皮成長因子−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）を使用して、血管内皮成長因子レセプタ−３（ＶＥＧＦＲ−３）のみを活性化する方法、そして、組織のリンパ管新生（ｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を促進し、維持する方法、に関する。
【０００２】
哺乳動物の血管系の二つの主要な構成要素は、内皮細胞と平滑筋細胞である。内皮細胞は、哺乳動物のすべての血管とリンパ管との内表面の内層を形成する。新しい血管の形成は、二つの異なるプロセス、即ち、脈管形成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）又は血管新生 （ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）によって起こりうる（リソー，ダブリュ（Ｒｉｓａｕ， Ｗ．），Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：６７１−６７４（１９９７）を参照）。脈管形成は、初期胚の原始血管叢の形成に於いて起こるもののような、内皮細胞前駆体の成熟内皮細胞への目的部位（インサイチュ）での分化と、これらの細胞の血管を形成するための連携作用、とによって特徴付けられる。これに対して、血管新生、即ち、既存の血管の成長と分岐とによる血管の形成、は、後の胚形成に於いて重要であり、成体に於いて起こる血管の成長をつかさどる。血管新生は、内皮細胞の増殖、細胞外マトリクスの分解、血管の分岐、それに続く細胞接着事象、を含む生理学的に複雑なプロセスである。成体に於いて、血管新生は、厳密に制御され、正常な状況では女性の生殖系に限定される。しかしながら、血管新生は、組織損傷に応答してスイッチ・オンされることが可能である。重要な事実として、固型腫瘍は、周囲の組織に於いて血管新生を誘発させることができ、これによって、腫瘍の成長を維持し転移の形成を促進する（フォークマン，ジェイ（Ｆｏｌｋｍａｎ， Ｊ．） Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１：２７−３１，（１９９５））。複雑な血管新生プロセスの背後に存在する分子機構についてはほとんど理解されていない。
【０００３】
リンパ管は、動脈、静脈及び毛細管と構造において大幅に異なる。リンパ管は、極度に透過性が高く、基底板の無い、薄い内皮の内層によって特徴付けられる。単純な端部対端部の細胞結合と相互嵌合、特に内皮細胞間の結合がリンパ管の特徴である。更に、リンパ管には、通常、周皮細胞や平滑筋細胞などの支持細胞が欠如している（リーク，エル（Ｌｅａｋ， Ｌ．）， Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ２： ３６１−３９１， １９７０； リーク，エル（Ｌｅａｋ， Ｌ．）， Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ５０： ３００−３２３， １９７１及びリーク（Ｌｅａｋ）及びジャミュアー（Ｊａｍｕａｒ）， Ａｍ Ｒｅｖ Ｒｅｓｐａｉｒ Ｄｉｓ． １２８： Ｓ５９−Ｓ６５， １９８３）。リンパ管とリンパ管以外の管との構造及び細胞構成の相違は、リンパ内皮細胞は、非常に分化した形態の内皮細胞を表しているかもしれないことを示唆している（タイプラエ，ジェイ（Ｔａｉｐｌａｅ， Ｊ．）他， Ｃｕｒ． Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２３７： ８５−９６， １９９９）。
【０００４】
リンパ系の主な機能は、組織からの体液の戻りを提供し、多くの管外物質を血液に戻し輸送することである。更に、成熟の過程において、リンパ球は、血液を離れて、リンパ器官及びその他の組織を通って遊走し、リンパ管に入り、胸管を介して血液に戻る。専用の小静脈、高内皮小静脈（ＨＥＶ）、が再びリンパ球に結合し、それらの組織内への管外溢出を引き起こす。このように、リンパ管、そして特にリンパ節、は、免疫学上、及び種々の腫瘍の発達と転移とにおいて重要な役割を果たしている。血管と違って、リンパ系の胚起源は明らかでなく、その起源については少なくとも三種類の理論が存在する。リンパ管は、それらに対して利用可能な公知の特異的マーカが存在しないため、同定することが困難である。
【０００５】
リンパ管は、最も一般的には、リンパ管造影法の補助によって研究されている。リンパ管造影法において、Ｘ線造影剤がリンパ管に直接注入される。造影剤は、リンパ系の輸出管（ｅｆｆｅｒｅｎｔ ｄｒａｉｎａｇｅ ｖｅｓｓｅｌ）に沿って分布され、リンパ節に集められる。この造影剤は、リンパ節で最大半年間留まることができ、その間に、Ｘ線分析によって、リンパ節のサイズと構造の追求が可能である。この診断は、リンパ腫等のリンパ節及びリンパ悪性腫瘍での転移を有するガン患者において特に重要である。しかしながら、当該技術において、リンパ組織を造影化するための更に改良された材料及び方法が必要とされている。
【０００６】
血管新生は、又、それが疾患の様々な続発症に役割を果たす、又は、それらに直接関わる、多数の病理状態にも関係している。いくつかの具体例として、種々の肝臓疾患に関連する新血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、糖尿病の新血管新生続発症、高血圧症の新血管新生続発症、外傷後の新血管新生、頭部外傷による新血管新生、慢性肝感染（たとえば、慢性肝炎）の新血管新生、高温又は低温外傷による新血管新生、ホルモンの過多に関連する機能障害、血管腫の形成、及び血管新生術後の再狭窄、が挙げられる。
【０００７】
血管新生は、非常に多くの生理的又は病理的プロセスに於いて重要な役割を果すものである為、血管新生の制御に関連する因子について鋭意研究されてきた。血管新生の調節には、多数の成長因子が関連していることが示されており、これらには、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）、及び肝細胞成長因子 （ＨＧＦ）が含まれる。たとえば、フォークマン，ジェイ（Ｆｏｌｋｍａｎ， Ｊ．）等， Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２６７：１０９３１−１０９３４（１９９２）を参照。
【０００８】
内皮細胞特異的成長因子の特定のファミリ、即ち、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）とそれらに対応するレセプタ、とが、内皮細胞成長及び分化の刺激と、分化細胞の或る種の機能との主要な原因となっていることが示唆された。これらの因子は、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリのメンバであり、主として内皮レセプタチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を介して作用するものと考えられる。前記ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリの成長因子は、システイン−ノットスーパーファミリの成長因子に属し、それは、又、ニューロトロフィンとトランスフォーミング成長因子−βを含む。
【０００９】
ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリに於いて８種類のタンパク質が同定されている。即ち、二つのＰＤＧＦ（Ａ及びＢ）と、ＶＥＧＦと、ＶＥＧＦに密接に関連する５つのメンバである。ＶＥＧＦに密接に関連する５つのメンバとは、ルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ（Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）とヘルシンキ大学の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０２９５７（ＷＯ９６／２６７３６）及び米国特許第５，８４０，６９３号及び第５，６０７，９１８号に記載のＶＥＧＦ−Ｂ、ヨウコフ （Ｊｏｕｋｏｖ）他のＥＭＢＯ Ｊ． １５：２９０−２９８（１９９６）、リー（Ｌｅｅ）他のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ９３：１９８８−１９９２（１９９６）及びヒューマン・ゲノム・サイエンス（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）社の米国特許第５，９３２，５４０号及び第５，９３５，５４０号に記載のＶＥＧＦ−Ｃ又はＶＥＧＦ２、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６（ＷＯ９８／０７８３２）及びアチェン（Ａｃｈｅｎ）他のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ９５：５４８−５５３（１９９８）に記載のＶＥＧＦ−Ｄ、マグリオーネ（Ｍａｇｌｉｏｎｅ）他のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ８８：９２６７−９２７１（１９９１）に記載の胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）、そしてヒューマン・ゲノム・サイエンス社の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７２８３（ＷＯ９６／３９４２１）に記載のＶＥＧＦ３である。各ＶＥＧＦファミリメンバは、ＶＥＧＦに対して３０％ないし４５％のアミノ酸配列同一性を有する。これらＶＥＧＦファミリメンバは、前記システイン−ノットモチーフを形成する６つのシステイン残基を含むＶＥＧＦホモロジードメインを共有している。ＶＥＧＦファミリの機能的特徴としては、内皮細胞に対する様々なレベルのマイトジェン活性、血管透過性の誘発、及び血管新生及びリンパ管新生特性がある。
【００１０】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、複数のソースから単離されているホモダイマー糖タンパク質である。単一のＶＥＧＦ遺伝子の選択的（Ａｌｔｅｒａｔｉｖｅ）ｍＲＮＡスプライシングによってＶＥＧＦの５つのアイソフォームが生まれる。ＶＥＧＦは内皮細胞に対する高度に特異的なマイトジェン活性を示す。ＶＥＧＦは、胚時期の脈管形成と成体期の血管新生における新しい血管新生において重要な調節機能を有する（カルメリート（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ）他， Ｎａｔｕｒｅ， ３８０：４３５−４３９， １９９６； フェラーラ（Ｆｅｒｒａｒａ）他， Ｎａｔｕｒｅ， ３８０： ４３９−４４２， （１９９６）， フェラーラ（Ｆｅｒｒａｒａ）及びデイヴィス−スミス（Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ）， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ．， １８： ４−２５， （１９９７）で検討）。ＶＥＧＦが果たす役割の重要性は、一つのＶＥＧＦ対立遺伝子の不活性化によって、血管系の発達不全によって胚が致死することを示す研究に示されている（カルメリート（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ）他， Ｎａｔｕｒｅ， ３８０： ４３５−４３９， （１９９６）； フェラーラ（Ｆｅｒｒａｒａ）他， Ｎａｔｕｒｅ， ３８０： ４３５−４３９； フェラーラ（Ｆｅｒｒａｒａ）他， Ｎａｔｕｒｅ， ３８０： ４３９−４４２， （１９９６））。ＶＥＧＦの単離と性質は、既に研究されている。フェラーラ（Ｆｅｒｒａｒａ）他， Ｊ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ４７： ２１１−２１８， （１９９１）及びコノリー（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ）， Ｊ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ４７： ２１９−２２３， （１９９１）を参照。
【００１１】
更に、ＶＥＧＦは、単球に対して強い化学誘引活性を示し、内皮細胞中でプラスミノーゲン活性化因子およびプラスミノーゲン活性化因子インヒビタを誘発し、更に、微小血管透過性を誘発することができる。後者の活性により、それは、時として血管透過性因子（ＶＰＦ）と称される。ＶＥＧＦは、又、ある種の造血細胞に対して化学誘引性である。最近の文献に、ＶＥＧＦが樹状細胞の成熟を阻止し、それによって、腫瘍に対する免疫応答の効果を低減させることが示されている（多くの腫瘍はＶＥＧＦを分泌する）（ガブリロリッチ（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ）他， Ｂｌｏｏｄ ９２： ４１５０−４１６６， （１９９８）； ガブリロリッチ（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ）他， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５： ２９６３−２９７０， （１９９９））。
【００１２】
ＶＥＧＦ−Ｂは、ＶＥＧＦに類似の血管新生及びその他の特性を有するが、組織に於ける分布と発現はＶＥＧＦと異なる。特に、ＶＥＧＦ−Ｂは、心臓で強く発現され、肺では弱くしか発現せず、これに対してＶＥＧＦはその反対である。このことは、ＶＥＧＦとＶＥＧＦ−Ｂとは、それらが多く組織において同時発現（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓ）されるという事実にも拘わらず、機能的な相違を有する可能性があることを示唆している。
【００１３】
ＶＥＧＦ−Ｂは、細胞内レチノイン酸結合タンパク質タイプ−Ｉ（ＣＲＡＢＰ−Ｉ）と相互作用する可能性のある細胞タンパク質のスクリーニングによる酵母コ−ハイブリッド相互作用トラップスクリーニング技術（ｙｅａｓｔ ｃｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｔｒａｐ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を使用して単離された。その単離と特徴は、ＰＣＴ／ＵＳ９６／０２９５７とオロフソン（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ， ９３： ２５７６−２５８１， （１９９６）に、詳細に記載されている。
【００１４】
ＶＥＧＦ−Ｃは、ＶＥＧＦＲ−３を発現するようにトランスフェクトされた細胞を使用して、内皮細胞特異性レセプタチロシンキナーゼＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ４）のチロシンリン酸化を作り出す培地の能力をスクリーニングすることによって、ＰＣ−３前立腺癌細胞ライン（ＣＲＬ１４３５）の馴化培地から単離された。ＶＥＧＦ−Ｃは、組換えＶＥＧＦＲ−３との親和性クロマトグラフィを使用して精製され、ＰＣ−３ｃＤＮＡライブラリからクローニングされた。その単離と特徴付けは、ヨウコフ（Ｊｏｕｋｏｖ）他， ＥＭＢＯ Ｊ．， １５： ２９０−２９８， （１９９６）に詳細に記載されている。
【００１５】
ＶＥＧＦ−Ｄは、ハイブリダイゼーションプローブとして、“Ｓｏａｒｅｓ Ｂｒｅａｓｔ ３ＮｂＨＢｓｔ”と命名されたヒトｃＤＮＡライブラリから得られた発現配列タグでのスクリーニングによって、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社から市販されているヒト胸ｃＤＮＡライブラリから単離された（アチェン（Ａｃｈｅｎ）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ， ９５： ５４８−５５３， （１９９８））。その単離と特徴付けは、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６（ＷＯ９８／０７８３２）に詳細に記載されている。
【００１６】
ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６には、ＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣと命名された、ＶＥＧＦ−Ｄの生物活性フラグメントの単離も記載されている。このフラグメントは、アフィニティタグペプチドＦＬＡＧ（登録商標）に結合されたＶＥＧＦ−Ｄアミノ酸残基９３−２０１から成る。前記国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６（ＷＯ９８／０７８３２）の全開示をここに参考文献として合体させる。
【００１７】
ＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子は成体ヒトにおいて広く発現されるが、もちろん、至るところに発現されるものではない。ＶＥＧＦ−Ｄは、心臓と、肺と骨格筋において強く発現する。中間レベルのＶＥＧＦ−Ｄが、脾臓と、卵巣と、小腸と、結腸で発現し、より低いレベルの発現は、腎臓、すい臓、胸腺、前立腺、睾丸で起こる。脳、胎盤、肝臓又は末梢血白血球からのＲＮＡからはＶＥＧＦ−Ｄ  ｍＲＮＡは検出されなかった。
【００１８】
ＰｌＧＦは、（妊娠の）満期の胎盤ｃＤＮＡライブラリから単離された。その単離と特徴付けは、マグリオーネ（Ｍａｇｌｉｏｎｅ）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ， ８８： ９２６７−９２７１， （１９９１）に詳細に記載されている。今のところ、その生物学的機能はよく理解されていない。
【００１９】
ＶＥＧＦ３は、結腸組織由来のｃＤＮＡから単離された。ＶＥＧＦ３は、ＶＥＧＦに対して約３６％の同一性と約６６％の類似性を有すると言われている。ＶＥＧＦ３をコードする遺伝子の単離方法は明らかでなく、その生物活性の特徴付けは開示されていない。
【００２０】
二つのタンパク質間の類似性は、それらのタンパク質の一方のアミノ酸配列と、保守的アミノ酸置換とを第２のタンパク質の配列と比較することによって決定され、これに対して同一性は、保守的アミノ酸置換を含まずに決定される。
【００２１】
上述したように、前記ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリメンバは、主として、レセプタチロシンキナーゼに結合することによって作用する。一般に、レセプタチロシンキナーゼは、特定の成長因子（単数又は複数）に結合可能な細胞外ドメインと、通常はそのタンパク質のアルファヘリックス部分である膜貫通ドメインと、レセプタが、たとえば、タンパク質リン酸化によって調節されることが可能な膜近傍ドメインと、レセプタの酵素成分であるチロシンキナーゼドメインと、多くのレセプタにおいて、チロシンキナーゼのその基質の認識と結合に関与するカルボキシル−末端テールとから成る糖タンパク質である。
【００２２】
２つの異なるサブクラスに属する、５つの内皮細胞特異性レセプタチロシンキナーゼ、すなわち、三つの血管内皮細胞成長因子レセプタ、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１），ＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ４）と、そして、Ｔｉｅファミリの２つのレセプタ、Ｔｉｅ及びＴｉｅ−２（Ｔｅｋ）が同定されている。これらのレセプタは、その特異性と親和性において互いに異なる。これらのすべては、シグナル伝達に必要な、内因性のチロシンキナーゼ活性を有する。ＶＥＧＦＲは、細胞外ドメインの７免疫グロブリンホモロジードメインと、キナーゼ挿入配列によって分離されたチロシンキナーゼ細胞内ドメインとを有する、前記血小板由来成長因子レセプタファミリと同属の、サブクラスＩＩＩレセプタチロシンキナーゼである。
【００２３】
ＶＥＧＦに結合することが知られているレセプタチロシンキナーゼは、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３のみである。ＶＥＧＦＲ−１とＶＥＧＦＲ−２は、高い親和性でＶＥＧＦと結合し、ＶＥＧＦ−１は、更に、ＶＥＧＦ−ＢとＰｌＧＦにも結合する。ＶＥＧＦ−Ｃは、ＶＥＧＦＲ−３のリガンドであることが示されており、それは、更にＶＥＧＦＲ−２を活性化する（ヨウコフ（Ｊｏｕｋｏｖ）他， Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ， １５： ２９０−２９８， （１９９６））。ＶＥＧＦ−Ｄは、ＶＥＧＦＲ−２とＶＥＧＦＲ−３との両方に結合する（アチェン（Ａｃｈｅｎ）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９５： ５４８−５５３， （１９９８））。Ｔｉｅ−２（Ｔｅｋ）のリガンドは、リジェネロン・ファーマシューティカルス社（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．）の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／１２９３５（ＷＯ９６／１１２６９）に記載されている。Ｔｉｅのリガンドはまだ同定されていない。
【００２４】
最近、新規な１３０−１３５ｋＤａＶＥＧＦアイソフォーム特異的レセプタが精製され、クローニングされた（ソーカー（Ｓｏｋｅｒ）他， Ｃｅｌｌ， ９２： ７３５−７４５， １９９８）。このＶＥＧＦレセプタは、ヘパリンに対して弱い親和性を示す、エクソン７コード配列を介してＶＥＧＦ１６５アイソフォームに特異的に結合することが分かった（ソーカー（Ｓｏｋｅｒ）他， Ｃｅｌｌ， ９２： ７３５−７４５， （１９９８））。驚くべきことに、このレセプタは、初期段階の神経形態形成に関与するレセプタである、ヒトのニューロピリン−１（ＮＰ−１）と同じであることが示された。ＰｌＧＦ−２も、ＮＰ−１と相互作用するようである（ミグダル（Ｍｉｇｄａｌ）他， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７３： ２２２７２−２２２７８， （１９９８））。
【００２５】
ＶＥＧＦＲ−１，ＶＥＧＦＲ−２及びＶＥＧＦＲ−３は内皮細胞によって異なった発現をする。一般に、ＶＥＧＦＲ−１とＶＥＧＦＲ−２とは共に、血管内皮において発現され（オールリッチス（Ｏｅｌｒｉｃｈｓ）他， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ８： １１−１８， （１９９２）； カイパイネン（Ｋａｉｐａｉｎｅｎ）他， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７８： ２０７７−２０８８， （１９９３）； デュモント（Ｄｕｍｏｎｔ）他， Ｄｅｖ． Ｄｙｎ．， ２０３： ８０−９２， （１９９５）； フォン（Ｆｏｎｇ）他， Ｄｅｖ． Ｄｙｎ．， ２０７： １−１０， （１９９６））、ＶＥＧＦＲ−３は、ほとんど、成体組織のリンパ内皮中に発現される（カイパイネン（Ｋａｉｐａｉｎｅｎ）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ， ９： ３５６６−３５７０， （１９９５））。ＶＥＧＦＲ−３は、又、腫瘍の周囲の血管系にも発現される。
【００２６】
ＶＥＧＦＲ−１は、主として発達中において内皮細胞に発現されるものではあるが、それは、胚形成の初期段階中に造血前駆細胞中にも見つけることができる（フォン（Ｆｏｎｇ）他， Ｎａｔｕｒｅ， ３７６： ６６−７０， （１９９５））。成体において、単球と、マクロファージも、このレセプタを発現する（バーレオン（Ｂａｒｌｅｏｎ）他， Ｂｌｏｏｄ， ８７： ３３３６−３３４３， （１９９５））。胚においては、ＶＥＧＦＲ−１が全部ではないが、大半の血管において発現される（ブレア（Ｂｒｅｉｅｒ）他， Ｄｅｖ． Ｄｙｎ．， ２０４： ２２８−２３９， （１９９５）； フォン（Ｆｏｎｇ）他， Ｄｅｖ． Ｄｙｎ．， ２０７： １−１０， （１９９６））。
【００２７】
レセプタＶＥＧＦＲ−３は、胚の初期発生中には内皮細胞上に広く発現される、が、胚形成が進行するにつれて、静脈内皮、更に、その後はリンパ内皮とに限定されてくる（カイパイネン（Ｋａｉｐａｉｎｅｎ）， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５４： ６５７１−６５７７， １９９４； カイパイネン（Ｋａｉｐａｉｎｅｎ）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９２： ３５６６−３５７０， １９９５）。ＶＥＧＦＲ−３は、成体組織においてはリンパ内皮細胞上に発現される。このレセプタは、胚形成中の脈管発達に必須である。
【００２８】
ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２，ＶＥＧＦＲ−３，Ｔｉｅ及びＴｉｅ−２の脈管形成、血管新生および／又はリンパ管新生中に於ける必須の特異的な役割は、マウス胚中でこれらのレセプタを不活性化する標的変異によって立証されている。ＶＥＧＦＲ遺伝子の破壊によって、脈管構造の発達に異常が起こり、これによって、懐胎期間中の胚の致死が起こる。完全に不活性化されたＶＥＧＦＲ−１遺伝子を有する胚の分析は、このレセプタが内皮の機能組織化に必要であることを示唆している（フォン（Ｆｏｎｇ）他， Ｎａｔｕｒｅ， ３７６： ６６−７０， １９９５）。しかしながら、ＶＥＧＦＲ−１の細胞内チロシンキナーゼドメインの欠失からは、正常な脈管構造を備えた生育可能なマウスが生まれる（ヒラツカ（Ｈｉｒａｔｓｕｋａ）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９５： ９３４９−９３５４， １９９８）。これらの違いの根底となる理由についてはまだ説明されていないが、チロシンキナーゼを介したレセプタシグナル伝達が、ＶＥＧＦＲ−１の適切な機能のために必要とされないことを示唆している。ＶＥＧＦＲ−２の不活性化対立遺伝子を有する同型接合体マウスの分析は、このレセプタが内皮細胞増殖、造血、及び脈管形成に必要であることを示唆している（シャラビー（Ｓｈａｌａｂｙ）他， Ｎａｔｕｒｅ， ３７６： ６２−６６， １９９５； シャラビー（Ｓｈａｌａｂｙ）他， Ｃｅｌｌ， ８９： ９８１０−９９０， １９９７）。マウスにおけるＶＥＧＦ−３の両方のコピーの標的不活性化によって、管腔に欠損を有する異常な組織化がされた大きな脈管によって特徴付けられる血管形成の欠陥が生じ、性交後９．５日において心膜腔での体液貯留と心血管不全が引き起こされた （デュモント（Ｄｕｍｏｎｔ）他， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８２： ９４６−９４９， １９９８）。これらの知見に基づき、ＶＥＧＦＲ−３は、一次血管網がより大きな血管に成熟するために必要であるということが提案されている。しかしながら、これらのマウスにおいては、リンパ系の発達に於けるＶＥＧＦＲ−３の役割は研究することはできなかった。その理由は、リンパ系が現れる前に胎仔が死亡したからである。それでも、ＶＥＧＦＲ−３は、胚及び成体時期中におけるリンパ内皮細胞に於けるその特異的発現により、リンパ系の発達とリンパ管新生とにおいて役割を果たしていると推定される。これは、ＶＥＧＦＲ−３のリガンドである、ＶＥＧＦ−Ｃの、トランスジェニックマウスの皮膚に於ける異所性発現によって、リンパ内皮細胞増幅と、真皮において血管の拡張が生じたという知見によって支持される。更に、このことは、ＶＥＧＦ−Ｃが、リンパ内皮において一次機能を有し、ＶＥＧＦと共通の、血管新生と透過性調節とに於ける二次機能を有している可能性があることを示唆している（ヨウコフ（Ｊｏｕｋｏｖ）他， ＥＭＢＯ Ｊ．， １５： ２９０−２９８， １９９６）。
【００２９】
ヒトＶＥＧＦレセプタ−３のホモログが、マウスとウズラからクローニングされた（フィナーティー（Ｆｉｎｎｅｒｔｙ）， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ８： ２２９３−２２９８， １９９３ 及びエイチマン（Ｅｉｃｈｍａｎｎ）他， Ｇｅｎｅ， １７４： ３−８，１９９６）。それらは、進化において比較的保存されており、ウズラはヒトレセプタに対して７０％のアミノ酸同一性を有し、類似のリガンドレセプタ結合を有する。
【００３０】
ＶＥＧＦのレセプタを媒介した作用に拮抗することが可能な薬剤の開発が大きな注目を浴びている（マルティニ−バロン（Ｍａｒｔｉｎｙ−Ｂａｒｏｎ）及びマーメ（Ｍａｒｍｅ）， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６： ６７５−６８０， １９９５）。ＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体は、腫瘍関連血管新生を抑制することによってイン・ヴィヴォで腫瘍の成長を抑えることが示されている（キム（Ｋｉｍ）他， Ｎａｔｕｒｅ ３６２： ８４１−８４４， １９９３）。腫瘍の成長に対する類似の抑制作用が、ＶＥＧＦのアンチセンスＲＮＡ（サレー（Ｓａｌｅｈ）他， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６： ３９３−４０１， １９９６）又は、優性阻害ＶＥＧＦＲ−２変異体（ミラウアー（Ｍｉｌｌａｕｅｒ）他， Ｎａｔｕｒｅ ３６７： ５７６−５７９， １９９４）のいずれかの発現により得られたモデル系において観察されている。
【００３１】
しかしながら、中和抗体での腫瘍抑制研究は、ＶＥＧＦ以外の他の血管新生因子が関連しているかもしれないことを示唆している（キム，ケイ（Ｋｉｍ， Ｋ．）他， Ｎａｔｕｒｅ ３６２： ８４１−８４４， １９９３）。更に、悪性メラノーマにおけるＶＥＧＦ以外の血管新生因子の活性が、すべてのメラノーマがＶＥＧＦを発現するわけではないという知見によって示唆されている（イッサ，アール（Ｉｓｓａ， Ｒ．）他， Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ ７９： ４１７−４２５， １９９９）。
【００３２】
ＶＥＧＦファミリの種々のメンバの生物機能は現在解明されつつある。特に注目されているのは、ＶＥＧＦ−ＤとＶＥＧＦ−Ｃとの特性である。これらのタンパク質は、それぞれ血管内皮細胞とリンパ内皮細胞とに局在するＶＥＧＦＲ−２とＶＥＧＦＲ−３との両方に結合する。それらは一次構造において互いに密接に関連している（４８％のアミノ酸同一性）。これら両因子は、イン・ヴィトロで内皮細胞に対してマイトジェン性である。最近、ＶＥＧＦ−Ｃは、マウス角膜モデルと、トリの漿尿膜とにおいて血管新生性であることが示され（カオ（Ｃａｏ）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５： １４３８９−１４３９４， １９９８）、組織虚血の環境において血管新生を誘導することができた（ウィッチェンビッチェラー（Ｗｉｔｚｅｎｂｉｃｈｌｅｒ）他， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５３： ３８１−３９４， １９９８）。更に、ＶＥＧＦ−Ｃは、トリの漿尿膜（オー（Ｏｈ）他， Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １８８： ９６−１０９， １９９７）とトランスジェニックマウスモデル（ジェルテック（Ｊｅｌｔａｃｈ）他， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６： １４２３−１４２５， １９９７）とにおいてリンパ管新生を刺激した。ＶＥＧＦ−Ｄは、ウサギの角膜において血管新生性であることが示された（マルコンシニ（Ｍａｒｃｏｎｃｉｎｉ）他， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６： ９６７１−９６７６， １９９９）。ＶＥＧＦ−Ｄのリンパ管形成能力は、まだ報告されていないが、ＶＥＧＦ−Ｄは、ＶＥＧＦ−Ｃと同様、リンパ管形成のシグナルであると考えられている（タイペール（Ｔａｉｐａｌｅ）他， Ｃｕｒ． Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２３７： ８５−９６， １９９９）レセプタであるＶＥＧＦＲ−３に結合し、これを活性化することからすると、ＶＥＧＦ−Ｄがリンパ管新生性である可能性は非常に高い。転移は血管か若しくはリンパ管を介して広がるので、ＶＥＧＦ−ＤとＶＥＧＦ−Ｃは腫瘍の悪性にとって特に重要であるかもしれない。従って、血管新生又はリンパ管新生を活性化する分子は悪性に貢献する可能性がある。これはＶＥＧＦに関しては既にそうであることが証明されている。ＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子の発現は、悪性にとって重要であることが知られている転写因子であるｃ−Ｆｏｓによって誘導されることが特に銘記される（オルランディニ（Ｏｒｌａｎｄｉｎｉ）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１１６７５−１１６８０， １９９６）。ｃ−Ｆｏｓが悪性に寄与するメカニズムは、血管新生因子をコードする遺伝子のアップレギュレーションであると推測される。ｃ−Ｆｏｓを欠如した腫瘍細胞は、恐らくは、血管新生を誘導する能力の欠如の故、悪性化することがない（サエズ，イー（Ｓａｅｚ， Ｅ．）他， Ｃｅｌｌ ８２： ７２１−７３２， １９９５）。このことは、腫瘍化中にｃ−Ｆｏｓによってアップレギュレーションされる血管新生因子が存在することを示唆している。
【００３３】
図１に示すように、ヒトＶＥＧＦ−Ｄの主要な細胞内形態は、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦホモロジードメイン（ＶＨＤ）と、Ｎ−及びＣ−末端プロペプチドからなるホモダイマープロペプチドである。分泌後、このポリペプチドは、タンパク質分解的に切断される（スタッカー，エス・エイ（Ｓｔａｃｋｅｒ， Ｓ．Ａ．）他， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４： ３２１２７−３２１３６， １９９９）。タンパク質分解的プロセッシング（後ろ向きの矢印によって示される位置での）によって、部分的にプロセッシングされた形態と、ＶＨＤのダイマーから成る完全にプロセッシングされた成熟形態とが生じる。ヒトＶＥＧＦ−Ｄでは、ＶＨＤは、全長ＶＥＧＦ−Ｄの残基９３〜２０１から成り、ＶＥＧＦＲ−２とＶＥＧＦＲ−３との両方に対する結合部位を含む。前記成熟形態は、未プロセッシング形態よりもはるかに高い親和性でＶＥＧＦＲ−２とＶＥＧＦＲ−３との両方に結合する（スタッカー，エス・エイ（Ｓｔａｃｋｅｒ， Ｓ．Ａ．）他， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４： ３２１２７−３２１３６， １９９９）。
【００３４】
ＶＥＧＦ−Ｄのマウスホモログのクローニングの記載も、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６（ＷＯ９８／０７８３２）に見られる。マウスの場合、２つのアイソフォームが存在することがわかった。長いほうのアミノ酸配列はｍＶＥＧＦ−Ｄ１と命名され、短い配列はｍＶＥＧＦ−Ｄ２と命名されている。ｍＶＥＧＦ−Ｄ１とｍＶＥＧＦ−Ｄ２とをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、それぞれ配列識別番号１と３とに示されている。ｍＶＥＧＦ−Ｄ１とｍＶＥＧＦ−Ｄ２の推定アミノ酸配列は、それぞれ配列識別番号２と４とに示されている。これらのアミノ酸配列間の相違点は次の通りである。
ｉ）ｍＶＥＧＦ−Ｄ２との比較において、ｍＶＥＧＦ−Ｄ１の残基３０の後には、５つのアミノ酸（ＤＦＳＦＥ）（配列識別番号５）が挿入されている、
ｉｉ）ｍＶＥＧＦ−Ｄ１では残基３１７の後、ｍＶＥＧＦ−Ｄ２では残基３１２の後、にＣ末端が完全に分岐しており、その結果、ｍＶＥＧＦ−Ｄ１の方がｍＶＥＧＦ−Ｄ２よりもかなり長くなっている。
【００３５】
ＶＥＧＦ−Ｄは、マウスとヒトとの間において高度に保存されている。ヒトＶＥＧＦ−Ｄのアミノ酸残基の８５％がマウスＶＥＧＦ−Ｄ１において同一である。又、マウスＶＥＧＦ−Ｄの主要な細胞内形態は、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦホモロジードメイン（ＶＨＤ）と、Ｎ−及びＣ−末端プロペプチドからなるホモダイマープロペプチドである、と予想される。マウスＶＨＤは、全長マウスＶＥＧＦ−Ｄ２（配列認識番号４）の残基９２〜２０１ （配列識別番号６）から成る。
【００３６】
発明の要旨
本発明は、一般に、マウス血管内皮成長因子−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）を使用した、血管内皮成長因子レセプタ−３（ＶＥＧＦＲ−３）のみの活性化に関係する、組織のリンパ管新生を促進及び／または維持する方法、に関する。
【００３７】
第１の態様に拠れば、本発明は、リンパ管内皮細胞のみの増殖の刺激および／又は維持するための方法を提供する。この方法は、前記内皮細胞に対して、配列識別番号２又は配列識別番号４又は配列識別番号６のアミノ酸配列又はそのフラグメントを有するポリペプチドを有する組成物を有効量、投与する工程を有する。好ましくは、前記ポリペプチドは、配列識別番号２又は配列識別番号４又は配列識別番号６のアミノ酸配列又はそのフラグメントに対して、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する。
【００３８】
ここで使用される「そのフラグメント」という文言は、配列識別番号２又は配列識別番号４又は配列識別番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、単数又は複数のリンパ管内皮細胞のみの増殖、分化、遊走又は生存を刺激する能力を有するポリペプチドのフラグメントをいう。
【００３９】
第２の態様において、本発明は、ＶＥＧＦレセプタ−３のみを活性化させる方法を提供し、この方法は、配列識別番号２又は配列識別番号４又は配列識別番号６のアミノ酸配列又はそのフラグメントを有するポリペプチドを有する組成物を有効量、このレセプタを有する細胞に投与する工程を有する。好ましくは、前記ポリペプチドは、配列識別番号２又は配列識別番号４又は配列識別番号６のアミノ酸配列又はそのフラグメントに対して、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する。この方法は、イン・ヴィヴォ又はイン・ヴィトロで実施可能である。
【００４０】
前記ポリペプチドは、ＶＥＧＦレセプタ−３を特異的に活性化するので、このポリペプチドは、ＶＥＧＦ−２レセプタが活性化されない状況において内皮細胞増殖を刺激するために使用することができる。従って、本発明は、ＶＥＧＦレセプタ−２ではなく、ＶＥＧＦレセプタ−３を特異的に活性化させる方法を提供する。
【００４１】
更に、マウスＶＥＧＦ−Ｄをコードする核酸配列の自然発生対立遺伝子バリアントから得られるマウスＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドのバリアントも本発明の範囲に含まれる。対立遺伝子バリアントは当該技術において周知であり、単数又は複数のヌクレオチドの置換、欠失又は付加を有するが、そのコードされるポリペプチドの機能が実質的に変化しない、別形態の核酸配列を表す。
【００４２】
バリアントを作り出すためにアミノ酸置換が使用される場合、その置換は保存的である、すなわち、１つのアミノ酸が類似のサイズで類似の電荷特性を有するものによって置き換えられる。
【００４３】
ここでの使用において、「保守的置換」とは、１つのアミノ酸が、別の生物的に類似の残基によって置換されることをいう。保存的置換の具体例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、システイン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、ノルロイシン、又はメチオニンなどの１つの疎水性残基の、別の残基との置換、又は、１つの極性残基の、別の残基との置換、たとえば、アルギニンのリジンとの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸との置換、グルタミンのアスパラギンとの置換、等、がある。互いに置換可能な中性親水性アミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、及びスレオニンがある。「保守的置換」という用語は、更に、未置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することも含む。
【００４４】
従って、本発明の文脈において、保守的置換は、１つのアミノ酸の類似の性質を有する別のアミノ酸との置換として当該技術において認識されている。保守的置換の具体例を、ＷＯ９７／０９４３３から引用する次の表１に示す。
【００４５】
【表１】
2004501091.tif 000002
【００４６】
あるいは、保守的アミノ酸は、下記の表２に示されているように、レーニンジャー（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ）， （Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， 第２版； Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｐｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ． ＮＹ：ＮＹ （１９７５）， ｐｐ．７１−７７）に記載されているようにグループ分けすることができる。
【００４７】
【表２】
2004501091.tif 000003
【００４８】
保守的置換の具体例を下記の表３に示す。
【００４９】
【表３】
2004501091.tif 000004
【００５０】
ここでの使用において、「マウスＶＥＧＦ−Ｄ」という用語は、総称的に、配列識別番号２又は配列識別番号４又は配列識別番号６のアミノ酸配列、そして、そのフラグメントを有するポリペプチド、及び、ここに定義されるマウスＶＥＧＦ−Ｄの生物活性を有するその他のバリアントを指す。当業者は、前記ポリペプチドの生物活性に影響を与えることなく、自然発生可能な、または、工学的に操作されるアミノ酸配列においてかなりの範囲があることを認識するであろう。前記バリアントポリペプチドは、配列識別番号２又は配列識別番号４又は配列識別番号６のアミノ酸配列およびそのフラグメントに対して、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有することが好ましい。百分率配列同一性は、従来方法によって測定される。たとえば、アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）他， Ｂｕｌｌ． Ｍａｔｈ． Ｂｉｏ．， １９８６４８６０３−６１６及びヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）及びヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９９２８９１０９１５−１０９１９を参照。
【００５１】
配列識別番号２又は配列識別番号４又は配列識別番号６のアミノ酸配列又はそのフラグメントに対して、少なくとも９０％の同一性を有する前記ポリペプチドは、適当な製薬用キャリアと組み合わせて使用することができる。その結果得られる組成物は、治癒的有効量のクレームされたポリペプチドと、その薬剤的に許容可能な非毒性の塩、そして、薬用的に許容可能な固体又は液体のキャリア又はアジュバンドとを有する。そのようなキャリア又はアジュバンドの具体例としては、非限定的に、生理食塩水、緩衝生理食塩水、リンゲル溶液、鉱油、タルク、コーンスターチ、ゼラチン、ラクトース、白糖、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸カルシウム、塩化ナトリウム、アルギン酸、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、シックナー、安定剤、懸濁剤、そしてこれらの組み合わせがある。それらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、クリーム、軟膏（ｓａｌｖｅ）、エリキシル、シロップ、ウェーファー、軟こう剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、又は、その他の従来形状のものとすることができる。その製剤形態は、その投与形態に応じて調製される。配列識別番号２又は配列識別番号４又は配列識別番号６のアミノ酸配列又はそのフラグメントに対して、少なくとも９０％の同一性を有する前記ポリペプチドを有する組成物は、前記活性化合物を、約０．１〜９０重量％、最も一般的には、約１０〜３０重量％含む。
【００５２】
筋肉内投与用として、好ましくは、塩酸塩等の、クレームされたポリペプチドの適当な可溶性塩形態の、殺菌製剤、をパイロジェンフリー水（蒸留）、生理的食塩水又は５％グルコース溶液などの薬用希釈液に溶解させて投与することができる。適当な不溶性形態の前記化合物は、水性ベース、又は、オレイン酸エチル等の長鎖脂肪酸の薬剤的に許容可能なオイルベース中の懸濁剤として調合、投与することができる。
【００５３】
第３の態様に拠れば、本発明は、リンパ管内皮細胞中の変化によって特徴付けられる腫瘍性疾患をスクリーニングおよび／又は診断する方法を提供する。この方法は、リンパ管内皮細胞中の増加によって特徴付けられる疾患状態が疑われる動物からのサンプルを得る工程と、前記サンプルを、配列識別番号２又は配列識別番号４又は配列識別番号６のアミノ酸配列又はそのフラグメントに対して、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドに晒す工程と、前記サンプルを洗浄する工程、そして、前記サンプル中のＶＥＧＦレセプタ−３の存在、量又は分布を検出することによって前記疾患をスクリーニングする工程とを有し、ここで、潜在的腫瘍成長部又はその周囲のリンパ管内皮細胞内又は細胞上のＶＥＧＦレセプタ−３の発現の増加の検出は、腫瘍性疾患を示す。
【００５４】
この明細書の目的のために、「サンプル」という用語は、非限定的に、組織サンプル、血液、血清、血漿、尿、腹水、又は、胸水を得ることを含むことが明瞭に理解されるであろう。好ましくは、前記組織はヒト組織である。
【００５５】
本発明によるポリペプチドは、更に、検出可能な標識によって標識し、インサイチュでＶＥＧＦレセプタ−３を同定するために利用することができる。前記ポリペプチドは、適当な、画像処理のための、超磁性、常磁性、高電子密度、エコジェニック（ｅｃｏｇｅｎｉｃ）、又は放射性の物質／標識に共有又は非共有結合させることができる。診断アッセイ用として、放射性又は非放射性標識を使用することができる。放射性標識の具体例としては、１２５Ｉや３２Ｐ等の、放射性原子又は基がある。非放射性標識の具体例としては、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ等の酵素標識又は、フルオレセイン−５−イソシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光標識がある。標識は、直接的又は間接的、共有結合的又は非共有結合的に行うことができる。
【００５６】
尚、この明細書の目的のために、「有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉は、「非限定的に含む」ということを意味することが明瞭に理解されるであろう。それに対応する意味が「有する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という単語にも適用される。
【００５７】
好適実施例の詳細な説明
例１：　マウスＶＥＧＦ−Ｄの発現と精製
マウスＶＥＧＦ−Ｄのレセプタ結合特性をテストするために、マウスＶＥＧＦ−ＤのＶＥＧＦホモロジードメイン（ＶＨＤ）の発現用にプラスミドを作成した。全長マウスＶＥＧＦ−Ｄ２（配列識別番号４）の残基９２〜２０１（配列認識番号６）をコードするＤＮＡフラグメントを、全長マウスＶＥＧＦ−ＤｃＤＮＡＳ（配列認識番号１、又は３）を有するプラスミドをテンプレートとして使用して、Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼでのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。次に、その正確性をヌクレオチド配列決定によって確認した、前記増幅されたＤＮＡフラグメントを、発現ベクタｐＥＦＢＯＳＳＦＬＡＧ（ウォルター・アンド・エリザ・ホール・インスティテュート・フォア・メディカル・リサーチ（Ｗａｌｔｅｒ ａｎｄ Ｅｌｉｚａ Ｈａｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （ＷＥＨＩ），メルボルン、オーストラリアのクレア・マクファーレン（Ｃｌａｒｅ ＭｃＦａｒｌａｎｅ）博士から贈与）に挿入した。前記ｐＥＦＢＯＳＳＦＬＡＧベクタは、マウスインターロイキン−３（ＩＬ−３）遺伝子由来のタンパク質分泌のためのシグナル配列をコードするＤＮＡと、ＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチド（ＩＢＩ／Ｋｏｄａｋ）を含んでいる。前記ＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチドは、 Ｍ２モノクローナル抗体（ＩＢＩ／Ｋｏｄａｋ）等の市販の抗体によって認識することができる。前記ＶＥＧＦ−Ｄ  ＰＣＲフラグメントを、ＩＬ−３シグナル配列が、切断ＶＥＧＦ−Ｄ配列のすぐ上流側である前記ＦＬＡＧ（登録商標）配列からすぐ上流側となるように前記ベクタに挿入した。三つのすべての配列は同じリーディングフレームにあったので、哺乳類細胞のｐＥＦＢＯＳＳＦＬＡＧ−マウスＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣのトランスフェクションから生じるｍＲＮＡの翻訳によって、前記ＩＬ−３シグナル配列をそのＮ末端として、そして、そのあとに、前記ＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチドと、前記切断ＶＥＧＦ−Ｄ配列とを有するタンパク質が得られるであろう。前記シグナル配列の切断と、その後の前記細胞からのタンパク質の分泌によって、Ｎ末端に近接するＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチドによってタグされたＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドが得られるであろう。このタンパク質を、マウスＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣと命名した。
【００５８】
ＦＬＡＧタグ切断ＶＥＧＦ−Ｄコンストラクトをコードする発現カセットを、ｐＡＰＥＸ−３発現ベクタにサブクローニングし、次に、Ｆｕｇｅｎｅ（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ））媒介トランスフェクションを使用して２９３ＥＢＮＡ−１細胞で一過的に発現させた。７日間のインキュベーション後、馴化培地を収集し（約１５０ｍｌ）、それを、製造業者に従ってＭ２（抗ＦＬＡＧ）ビーズ（ＩＢＩ／Ｋｏｄａｋ）を使用した親和性クロマトグラフィにかけた。
【００５９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥと免疫ブロッティング
親和性クロマトグラフィから生じたマウスＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣと精製ヒトＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣ（比較目的のために）とを、ウェスタンブロッティングによって分析した。約５０ｎｇの各タンパク質を、還元（２％　β−メルカプトエタノール）条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーと別々に混合し、煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解した。これらタンパク質を、ニトロセルロースにトランスファーし、Ｍ２抗体によってブロットした。図２に見られるように、ヒトとマウスの両方のＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣサブユニットが２２ｋＤａの予想された分子量を有している。
【００６０】
例２：　 ＶＥＧＦレセプタ−２及び−３に対するマウスＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣ結合のバイオアッセイ
マウスＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣのＶＥＧＦＲ−２とＶＥＧＦＲ−３とに結合し、クロスリンクする能力をバイオアッセイでテストした。図３と４は、それぞれＶＥＧＦＲ−２／−３バイオアッセイを使用したマウスＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣの分析結果を図示している。前記バイオアッセイは、マウスＶＥＧＦＲ−２又はヒトＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインと、マウスエリスロポエチンレセプタ（ＥｐｏＲ）の膜貫通および細胞質ドメインとから成るキメラレセプタを発現するＢａ／Ｆ３細胞を使用して行われた。これらの細胞ラインは、前記キメラレセプタにクロスリンクするリガンドが供給されない限り、ＩＬ−３が不在である場合死亡する。前記ＶＥＧＦＲ／ＥｐｏＲキメラレセプタのクロスリンクは、細胞の生存と増殖を刺激するＥｐｏＲ細胞質ドメインからのシグナル伝達を誘導する。
【００６１】
前記細胞を、１０％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、５０ｍＭのＬ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、そしてインターロイキン−３（ＩＬ−３）源として、１０％のウォルター・アンド・エリザ・ホール・インスティテュート・フォア・メディカル・リサーチ（ＷＥＨＩ）−３Ｄ−馴化培地とを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。ＶＥＧＦＲ−２−ＥｐｏＲ又はＶＥＧＦＲ−３−Ｅｐｏキメラレセプタを発現する細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で三回と、ＩＬ−３を含まない完全培地で１回、洗浄した。細胞（１０４）を、前記テスト試薬の希釈液又は培地のみを含有する９６−ウェルマイクロタイターウェルに分取した。細胞を、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で３７℃で４８時間インキュベートした。細胞の増殖を、収集の４時間前に、１μＣｉの３Ｈ−チミジンを添加することによって定量化した。３Ｈ−チミジンの導入を、セル−ハーベスターとβ線計測によって測定した。
【００６２】
上述したように、前記キメラレセプタの活性化は、前記細胞を、そのＩＬ−３に対する依存から救済し、それらの細胞をＩＬ−３の不在下で増殖させた。ＶＥＧＦＲ−２とＶＥＧＦＲ−３との両方に対するリガンドであるヒトＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣは、これらの細胞ラインの成長を、特異的かつ用量依存的に刺激する（それぞれ、図３と図４を参照）。マウスＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣは、ＶＥＧＦＲ−３／ＥｐｏＲ細胞ラインの成長を、特異的かつ用量依存的に刺激することができたが、ＶＥＧＦＲ−２／ＥｐｏＲ細胞ラインに対しては、４μｇ／ｍｌもの高い濃度でも有意な作用を及ぼさなかった（それぞれ、図４と図３とを参照）。アッセイを繰り返し実施した。エラーバーは、＋／−１．０の標準偏差を示している。この予想外の知見は、マウスＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣは、ＶＥＧＦＲ−２の活性化リガンドではないということを示している。前記Ｂａ／Ｆ３−ＶＥＧＦＲ−２−ＥｐｏＲ細胞ラインに発現したキメラＶＥＧＦＲ−２／ＥｐｏＲレセプタのＶＥＧＦＲ−２細胞外ドメインは、マウスＶＥＧＦＲ−２由来のものであったことが銘記される。従って、マウスＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣがこれらの細胞の生存と増殖とを誘導することが出来ないことは、前記キメラレセプタのこのリガンドと細胞外ドメインとの間の種差によるものではなかった。
【００６３】
以上の記載と例は、単に本発明を例示するために記載されたものであり、それを限定することを意図されたものではない。当業者は、本発明の精神及び本質を具体化してここに開示された実施例の改変を見出すことができるであろうから、本発明は、付随のクレームの範囲及びその均等物に含まれるすべてのバリエーションを含むものと広く解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＶＥＧＦ−Ｄプロセッシングの略図
【図２】
ヒト（Ｈ）及びマウス（Ｍ）のＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣのウェスタンブロッティング分析の結果を示す図
【図３】
ヒト及びマウスＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣを使用したＶＥＧＦＲ−２バイオアッセイの結果を示す図
【図４】
ヒト及びマウスＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣを使用したＶＥＧＦＲ−３バイオアッセイの結果を示す図
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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