(57)【要約】タンパク質の可能なＮ末端N-ミリストイル化をそれらのアミノ酸配列から測定するための２工程操作。第一の工程において、アミノ酸配列のＮ末端セグメントから計算される決定を誘導する新規演算アルゴリズムが適用されて可能な基質タンパク質を測定する。標的の減少されたリストが第二の工程で実験確認にかけられてもよい。決定に使用されるスコアー関数は単一位置におけるアミノ酸型選好を評価するだけでなく、既知のミリストイル化タンパク質の平均の性質からの偏りの一般の傾向を示し、又は補償効果について試験された幾つかの位置に関する物理化学的要件からの偏りにペナルティを課する。リスク評価のために、スコアーが偽陽性予測の可能性に変えられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質をそれらのアミノ酸配列の知識からＮ末端N-ミリストイル化により同定する方法であって、
(a)  疑問タンパク質の一次構造のＮ末端セグメントのコンピュータ分析及び
(i)  感受性プロフィール抽出、
(ii)  物理的性質要件、
(iii)  多くの位置にわたる補償効果
に基づくスコアー系を適用することにより候補物質の状態を決める工程、及び
(b)  a)で選択されたタンパク質がミリストイル-CoA：タンパク質N-ミリストイルトランスフェラーゼの基質であるか否かを実験確認により測定する工程
を含むことを特徴とするタンパク質の同定方法。
【請求項２】
工程a)で得られたスコアーを偽陽性予測の可能性に変える、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
多くの既知の脂質修飾の中で、N-ミリストイル化(N-myristoylation)は研究された最良の一つであり、幾つかの総説（Towlerら, 1988b; Gordonら, 1991; Han及びMartinage, 1992; Johnsonら, 1994; Boutin, 1997）の主題であった。しかしながら、細胞調節、シグナル伝達、アポトーシス（Zhaら, 2000）に関する重要性及び多様な医療治療に関する潜在性（Felsted, Glover,及びHartman 1995; Parangら, 1997; Sikorskiら, 1997; Gunaratneら, 2000）が再発見され、ミリストイル-CoA：タンパク質N-ミリストイルトランスフェラーゼの最初の構造が公表された（Westonら, 1998; Bhatnagarら, 1998）後に、このトピックが次第に増大する関心を得ていた。
稀なC14飽和脂肪酸は幾つかの真核生物及びウイルスのタンパク質のＮ末端グリシン（Kamps, Buss,及びSefton, 1985; Towlerら, 1987）に特異的なアミド結合（Olson, Towler,及びGlaser, 1985）により最もしばしば同時翻訳的に結合される（Olson及びSpizz, 1986; Wilcox, Hu,及びOlson, 1987）。一般に、脂質部分の結合は膜及びタンパク質会合に重要な役割を果たす疎水性の増大をもたらす。ミリスチン酸は細胞中の全脂肪酸の１％未満に相当するが（Khandwala及びKasper, 1971）、その特異的な長さがその他の一層疎水性の脂質修飾により促進される高度に安定な会合とは対照的にその他のタンパク質又は膜との可逆的相互作用の可能性を与える（Peitzsch及びMcLaughlin, 1993）。
ミリストイル化は、例えば、コンコプロテインp60v-src（Resh, 1994）について知られているような膜固定(membrane anchoring)に必要とされ得るが、必ずしも充分である必要はない。ミリストイル化タンパク質のリストは種々のキナーゼ、ホスファターゼ、シトクロムb5レダクターゼ、NOシンターゼ、多くのＧプロテインのαサブユニット、ADPリボシル化因子、ミリストイル化アラニンに富むＣキナーゼ基質(MARCKS)及びその他の膜又は骨格結合構造タンパク質、Ca2+結合／EFハンドタンパク質だけでなく、幾つかのウイルスタンパク質を含む。
【０００２】
ウイルスについて、タンパク質の脂質修飾はそれを宿主細胞の原形質膜に誘導することによりしばしば必須であり、又はそれはウイルス構造の集合（Moscufo, Simons,及びChow, 1991）及び一般の複製（Raulin, 2000）に必要である。多くのウイルスはそれらのミリストイル化オンコプロテインにより病的プロセスに直接に関与する（Arbelaez, Bernal,及びPatarca, 1999）。
ミリストイル化は常に単なる固定機能(anchoring function)に変えられるとは限らない。その脂肪酸はまた逆にアシル化タンパク質それ自体のドメインに折り畳むことができ、スイッチとして作用するCa2+イオンの結合により再度調節されて外部に延長し得る（Amesら, 1996）。可逆的膜会合（リン酸化又はタンパク質分解開裂により誘発される）のためのミリストイルスイッチのその他の例がMARCKS（McLaughlin及びAderem, 1995）及びHIV-1 Gag前駆体（Zhou及びResh, 1996）に見られる。
ミリストイル化の最も多い形態はＮ末端グリシンに完全に特異性であるミリストイル-CoA：タンパク質N-ミリストイルトランスフェラーゼ(NMT)（Rajuら, 2000）により触媒作用される。提案された発明は基質のアミノ酸配列からのこの酵素活性についてのタンパク質基質の認識のみに集中している。
現在進行している広範囲にわたる配列決定努力は多量のゲノムデータをもたらし、これは、次の工程で、コードされたタンパク質の詳細な特性決定を必要とする。N-ミリストイル化への上記導入はこの脂質修飾の大きな重要性を強調する。それ故、後ゲノム時期では、ミリストイル化されるタンパク質の知識はその機能的特性決定に無益の付加的な情報である。
【０００３】
3H標識ミリスチン酸のとり込みをしばしば含む、脂質修飾を正確に同定するのに必要な実験操作は、非常に労力を要し、かつ時間を浪費する。更に、関連タンパク質間の配列類似性は非常に高く（しばしば、NMTにより認識される領域内の単一突然変異のみ）、それ故、明白な実験確認がしばしば省かれる。
代わりに、その配列は利用できるパターン検索手段、例えば、PROSITE（Hofmannら, 1999; Bucher及びBairoch, 1994）（これは1990年４月に最後にアップデートされた）により提供されたミリストイル化モチーフのコンセンサス配列との一致について言及される。このパターンはそのモチーフについて不均衡に少量の現在利用できる情報のみを有し、高度に非現実的な数のミリストイル化部位の陽性同定そして、その現在の状態では、偽陰性の予測でさえをも生じる。
現在利用できる単一位置をベースとするアルゴリズム（例えば、PROSITEパターンによる検索）は補償効果を処理し得ない。これはミリストイル化部位の予測が現在まで不十分に成功した重要な理由である。その配列状況は特異な軽視された残基よりも極めて重要である。例えば、或る位置にある単一の嵩高のアミノ酸は基質認識が起こるサイズ制限溝中で良く寛容されるかもしれないが、直接隣接する第二のものはおそらくそうではないであろう。こうして、最も近い位置は前にあったものの余分のサイズを補償する必要があるであろう。
更に、酵素へのペプチド基質の結合は誘導フィットの意味で高度に協力的なプロセスである。それ故、保存アミノ酸残基だけでなく、更に離れた位置が互いの結合に影響を有し得る。
【０００４】
酵母NMTに関する基質特異性の広範囲の速度論的測定（Towlerら, 1988b）は単純パターン（例えば、PROSITEモチーフ）により反映し得ない配列状況のこの重要性を強調していた。
NMTは真核生物間に遍在すると考えられる。しかしながら、種間でオーバーラップするが特有の（Towlerら, 1988a）基質特異性が存在し、これが幾つかの観察（Duronioら, 1991）により明らかになった。PROSITEパターンは種依存性基質特異性を処理する特有の特徴を含まない。
最後に、PROSITEを使用してミリストイル化部位を同定することは研究配列中のモチーフの性質を推定しないで二進法的決定（イエス／ノー）に制限される。
N-ミリストイル化についての現在利用できる予測手段の不満足な性能のために、偽陽性予測の数を有意に減少することができ、かつ大規模のデータベース注釈さえも可能にする有効かつ信頼できる手段についての要望がある。提案された発明はミリストイル化されると従来知られていなかったタンパク質の同定を目的とする配列データベース検索において候補タンパク質の妥当な前選択及び著しいスピードアップを可能にする。
【０００５】
本発明の目的はまた大きなタンパク質配列データベースから、Ｎ末端ミリストイル化の候補であるタンパク質を同定するのに信頼できる方法（予測手段）を提供することであった。
本発明の基礎となる問題の解決は下記の考慮に基づいている。承認された統計的相関関係方法を使用することにより、全ての既知の基質のＮ末端の位置についての特徴、ひいては、酵素による認識に関する明らかな単一位置要件が確認される。補償効果の重要性が配列位置の夫々の相関関係独立性を特性決定するフィッシャー基準の実現可能性により評価される。
先に有効に収集された情報を利用するために、NMTによる認識のためのモチーフとしての配列の性質を確認する、スコアー関数が（例えば、プロフィールアプローチのように）単一位置で独立にアミノ酸型選好を評価する項に変えられるべきではないが、物理的性質制限だけでなく、多くの配列位置からの補償効果をまた含むべきである。それ故、PSICアルゴリズムを使用するプロフィールをベースとする合計スコアー（Sunyaevら, 1999;Ｓプロフィール）を保存された物理的性質に特別な項（Spptと要約される）と組み合わせる複合予測関数がつくられた。
Ｓ＝Ｓプロフィール＋Sppt
コンピュータプログラムで実行され、Ｃプログラミング言語で書かれた場合、ユーザーは研究されるべきである配列中の分類学的パラメーターの組及び読みを選択し得る。
次いで、Ｓプロフィールが疑問配列について計算され、既知の基質の選択された学習の組から抽出されたプロフィールに従ってスコアーを付けられる。保存された物理的性質はミリストイル化されると既に確かめられた配列から検索された場合にガウスのような分布に従うと推定される。疑問配列中の相当する位置についての平均からの偏差がその偏差の程度に比例するスコアーについてのペナルティーをもたらす。こうして、基質認識に関する物理的化学的要件との不一致が一層ひどい場合、そのペナルティーは一層高いであろう。
【０００６】
総合スコアーはＳプロフィール及び全ての物理的性質の項（これらはそれらがペナルティーであるとの定義については負である）の合計である。配列がNMTによりプロセシングされるか、又はされないかの閾値にアドレスするために、得られたスコアーが学習組のスコアーと比較され、予測の下限が実験で確かめられたミリストイル化部位の最も低いスコアーに定められる。その予測は一層高いスコアーを有するタンパク質がまたNMTの有利な基質であるべきであるということである。同時に、この簡単なアプローチは予測関数スコアーの相対的サイズで酵素に対する自然に生じる異なるアフィニティーを常に反映し得るとは限らない。
更なる実験確認が候補配列及び予測の全般の信頼性の推定について実現可能であるか否かのより良い判断のために、スコアーが一般化された極値分布関数（Eisenhaberら, 2001）を適用する偽陽性予測の可能性に変えられる。
配列スペース中で、正確なモチーフが或る可能性で偶然に生じ得る。正確に予測される配列のスコアーが非ミリストイル化タンパク質のスコアーとは大きく異なる程、偽陽性予測の可能性は低く、また予測の信用度は高いであろう。今日の利用できる配列例から学習されたその現行のパラメーター化による本発明の予測方法はＮ末端グリシンを有する1000の非関連配列の中で５未満の偽陽性帰属でもって大規模データベース注釈でさえも可能にする。
【０００７】
（発明の要約）
第一の局面において、本発明は候補タンパク質をそれらのアミノ酸配列の知識からＮ末端N-ミリストイル化により同定する方法であって、
(a)  疑問タンパク質の一次構造のＮ末端セグメントのコンピュータ分析及び
(i)  感受性プロフィール抽出、
(ii)  物理的性質要件、
(iii)  多くの位置にわたる補償効果(compensatory effects)
に基づくスコアー系を適用することにより候補物質の状態を決める工程、及び
(b)  a)で選択されたタンパク質がミリストイル-CoA：タンパク質N-ミリストイルトランスフェラーゼの基質であるか否かを実験確認により測定する工程
を含むことを特徴とするタンパク質の同定方法に関する。
工程b)は減少された候補リストからのタンパク質を用いて行なわれる。
【０００８】
好ましい実施態様において、工程(a)で得られたスコアーが偽陽性予測(false-positive prediction)の可能性に変えられる(a1)。こうして、スコアー関数を一般化された極値分布の形態の精密な統計学で補完することにより、研究配列のミリストイル化シグナルの性質測定が提供し得る。
本発明の方法は単一標的研究（例えば、治療標的としてのタンパク質を同定することを目的とする研究）及び大規模生物分子配列データベーススキャンの両方で行ない得る。
第二の局面において、本発明はプロフィールをベースとする合計スコアー（Ｓプロフィール；(i)）をSppt（(ii)及び(iii)）として要約される、補償効果を含む保存された物理的性質に関する特別な項と組み合わせる複合予測アルゴリズムに関する。
Ｓ＝Ｓプロフィール＋Sppt
感受性プロフィール抽出(i)
感受性プロフィール抽出(i)について、PSICアルゴリズム（Sunyaevら, 1999）が使用され、これは配列特異性重さ及びアライメント位置特異性重さの両方を帰属する強力なプロフィール抽出技術である（Eisenhaber, Bork,及びEisenhabar, 1999; Sunyaevら, 1999）。この技術により、既知のミリストイル化タンパク質の完全学習組のＮ末端（可能な出発メチオニンを除く）のギャップのない多重アライメントからの所定のモチーフ位置ｉにおけるアミノ酸型ａの修正された相対的出現度p(a,i)が測定される。
この多重アライメントはしばしば二三の位置のみに影響するわずかな配列変化で多くの高度に同様のアライメントを含むことが強調されるべきである。最大の情報を抽出するために、アライメント位置ｉにおけるアミノ酸型ａの観察の有効回数n(a,i)effが演算され、最後にp(a,i)が
【０００９】
【数１】
2004537996.tif 000002
【００１０】
として測定される。
その合計は全てのアミノ酸型ｂについて行なわれる。値n(a,i)effは考えられるアライメントカラム中の共通のアミノ酸型ａを有する配列の総合類似性に依存すると考えられる。アライメント位置ｉで同じアミノ酸型ａを有する配列のサブセット中の同じアライメント位置f(a,i)の頻度が類似性の目安として使用され、ランダム配列中のn(a,i)effについて同じアライメント位置の可能性に等しいと定められる。n(a,i)effに関する式
【００１１】
【数２】
2004537996.tif 000003
【００１２】
の解はそのアライメント中の位置ｉにおけるアミノ酸ａの独立の観察の回数を推定する。値qbは配列データベース中のアミノ酸型ｂの省略時の頻度である。
最終プロフィールマトリックスSi(a)は
【００１３】
【数３】
2004537996.tif 000004
【００１４】
として計算される（Sunyaevら, 1999）。これらの値は総計してそれらの特定領域内の位置スコアーに達する単一位置ｉのサブスコアーを表す。
【００１５】
【数４】
2004537996.tif 000005
【００１６】
位置サブスコアーは最後に主要位置の重要性を強調する、重み係数α領域、及び配列領域の異なる長さについて補償する、標準化条件αプロフィールで調節されたＳプロフィールに入る。
【００１７】
【数５】
2004537996.tif 000006
【００１８】
それ故、完全プロフィールスコアーの項Ｓプロフィールは以下のように詳述し得る。
【００１９】
【数６】
2004537996.tif 000007
【００２０】
そのプロフィールは学習組の全てのエントリーについて強制的Ｎ末端グリシン後の約40のアミノ酸について演算される。疑問配列に関するスコアーは位置２〜17のみについて計算される。後者の位置範囲は無関係配列と比較されたＮ末端N-ミリストイル化タンパク質中の検出可能な性質の偏りを示す配列セグメントに相当する。
物理的性質要件及び補償効果（(ii)及び(iii)）
Spptを構成する物理的性質(P)に関する多くの残基相関関係の項の関数形態は学習組中の値範囲からの明らかな偏りがペナルティを課されるような様式で選択される。同時に、学習組から抽出されたコンセンサスシグナルとのコンプライアンスがゼロスコアー（正のスコアーではない）をもたらす。
【００２１】
【数７】
2004537996.tif 000008
【００２２】
これによって、Sppt中の物理的項の形態はミリストイル-CoA：タンパク質N-ミリストイルトランスフェラーゼ中のポリペプチド結合部位の要件の現在のおおよその理解を反映し得ることが認識される。或る配列位置における異なるアミノ酸型のおそらくの特定の役割が良く識別されないかもしれない。明確に、それは種間で異なり得る。その現在の式では、Sppt
【００２３】
【数８】
2004537996.tif 000009
【００２４】
は以下のことを記載する下記の項を含む。
・側鎖容積制限及び位置２及び３の残基に関する相互の容積補償だけでなく、位置７及び９の間の嵩高さの補償、触媒クレフト内の夫々の総合のサイズ制限（位置２〜11）（項T0、T3及びT8）；
・位置２及び３の疎水性の制限された程度、位置８、９及び10だけでなく、位置２と５の間の疎水性補償（項T1、T4及びT7）；
・最適マッチング疎水性の平均により評価される、あまりにも多くの疎水性残基を含むべきではないスペーサー領域（位置６〜17）（項T2）；
・位置３〜５の選択的結合領域における可撓性補償（項T5）；
・位置５及び６に関する或る種の極性要件（項T6）。
【００２５】
これらの９つの物理的条件の夫々がその重要性に従って重みづけられ、プロフィール演算からのスコアーと匹敵すべき可能性分布関数の自然対数の形態で上記合計に入る。ガウスのような分布が許容値範囲外の値について推定された（上記Tj(P)に関する式を参照のこと）。
更に、Spptにまた加えられる一定閾値によるペナルティがある。
・シグナルペプチド配列を排除するために、それらの疎水性領域の典型的な構造上の特徴は４アミノ酸の配列ウインドー中の疎水性が或る閾値を越える場合にペナルティを課せられる（項T9及びT10）。
・ペナルティはまた組成分析及び速度論的測定と一致する特別な位置における異常な残基について課せられる（項T11）。
Spptを導入する目的は学習組と較べて非典型的な内在性配列の性質のためにおそらくミリストイル化の候補ではないとして配列を排除することにある。
偽陽性予測の可能性の推定(a1)
更に、予測関数を良く知らないユーザーのため、また得られたスコアーをその他の特徴について計算されたスコアー（例えば、GPI-固定部位の予測；Eisenhaberら, 1999）と比較するために、工程a)のプログラムにより生じたスコアーの解読を促進することが探求された。この問題は、本発明の好ましい実施態様において、偽陽性予測の可能性、即ち、無関係配列中の同じ又は一層良好なスコアーを有するモチーフマッチの偶然の出現の可能性を計算することにより統計理論のフレームワークにおいて工程(a1)を更に適用することにより解決された。スコアーＳが正常に分布される場合、閾値Sthよりも大きくあるべきスコアーＳの可能性Ｐは一般化分析形態（Eisenhaberら, 2001）による極値分布（Altschulら, 1994）により記載される。
【００２６】
【数９】
2004537996.tif 000010
【００２７】
夫々の分類学的グループに関する無関係配列（非ミリストイル化タンパク質）の組に関するスコアーが計算され、最良の妥当な多項フィット（ｉは２から６の間である）が一般化極値分布を記載するために評価される。こうして、研究配列のスコアーが偽陽性予測の可能性に変換し得る。
本発明の方法は配列の三つのグループを区別する。第一のグループは陽性スコアーを得る配列からなる。偽陽性であるそれらの可能性は異なる分類学的パラメーター組について最大0.5％である。NMT結合ポケットの要件の現在の理解に基づいて、それらは“或る”ミリストイル化部位として予測されるかもしれない。第二のグループはトワイライトゾーンとして見られる。何とならば、-2〜０のスコアーを有する確認されたミリストイル化部位があるからである。それらは“可能”として予測し得る。何とならば、-2より大きいスコアーを有する可能性が適当に高いからである（最大2.8％）。-2より低いスコアーを有する配列が第三のグループに相当し、本発明のプログラムによりN-ミリストイル化のタンパク質候補として予測されないであろう。
【００２８】
N-ミリストイル化の実験確認
選択されたタンパク質がミリストイル-CoA：タンパク質N-ミリストイルトランスフェラーゼの基質であるか否かは、特に、候補の数があまりにも大きくない場合に、当業界でそれ自体知られている方法により工程b)に従って実験で確認し得る。
タンパク質へのミリスチン酸の結合を確認するのに本発明に有益である幾つかの方法が文献に記載されていた。異なる組織及び全ての可能な生物からの多数のミリストイル化タンパク質を同定する目的のために、NMT及び候補タンパク質の両方を組換え形態（エシェリキア・コリ中で逐次発現される）で得るためのin vitro細菌同時発現系（Duronioら, 1990; Knollら, 1995）が使用し得る（実施例６を参照のこと）。この方法のみが候補タンパク質のin vitroミリストイル化を示すが、それはタンパク質がNMTの基質であり得るか否かを明らかに述べる。
単離及び精製はタンパク質の特性（例えば、親油性、細胞下の区画：膜結合、サイトゾル等）に強く依存する。それ故、関係するタンパク質の性質に適すると報告された操作に従うことが重要である。
ウイルスタンパク質のミリストイル化を測定するために、Schultz及びOroszlan, 1983の方法（以下の実施例６を参照のこと）が使用し得る。
頻繁に使用されるタンパク質精製方法はSDS-PAGE、続いて候補タンパク質に特異的な抗体による免疫沈殿による更なる同定である。この方法において、3H標識ミリステートのとり込み（媒体への添加による）が単離プロセス及び精製プロセス中に関係するタンパク質を監視することを助ける。
N-ミリストイル化を同定するのに一層正確な方法はFAB-MS（高速原子衝撃質量スペクトル法；Carrら, 1982）又は組み合わせ分析方法（Neubert及びJohnson, 1995）、例えば、GC-MS（ガスクロマトグラフィー-質量スペクトル法）又はHPLC-ESI-MS（高圧液体クロマトグラフィー-電子噴霧イオン化-質量スペクトル法）の使用である。この方法において、Ｎ末端N-ミリストイル化がタンパク質又はその断片の質量スペクトル法により得られた分子量をタンパク質のアミノ酸配列に基づいて計算された質量と比較することにより確かめられる。質量の不一致はミリストイルアンカーの質量に相当すべきである。
本発明において使用し得る方法のその他の適当な例はカルシウム-ミリストイルスイッチタンパク質（Zozulya, Ladant,及びStryer, 1995）又はADP-リボシル化因子（Randazzo及びKahn, 1995）の発現及び特性決定である。タンパク質結合アシル基の高分解能の構造決定のために、それがNeubert及びJohnson, 1995に言及されている。更なる詳細が実施例６に含まれる。
【００２９】
予測方法の実証
本発明者らは以下にリストされる幾つかの一般に認められている試験及び予測データと実験データの間の比較を行なって本発明において提案された方法を実証した。夫々の試験は下記の節及び／又はこの明細書の最後の実施例の一つに一層詳しく説明される。
・自己コンシステンシー試験（実施例１）
・全スコアーＳに関するジャックナイフ試験（実施例２）
・Spptに関するジャックナイフ試験（一方、Ｓプロフィールは全学習組で計算された）（実施例２）
・ミリストイル化されないと報告されるタンパク質に関するスコアー（実施例３）
・実験速度論的データとの相関関係（実施例４）
・別の予測方法との比較（実施例５）
選択されたパラメーター組がＮ末端ミリストイル化に関する利用できる情報を充分に記載するか否かを明瞭にするために、選択された学習組がそれ自体で予測し得るか否かが研究された（自己コンシステンシー試験）。
多くの予測技術は過剰パラメーター化を問題としている。即ち、あまりにも小さい学習組がパラメーターのあまりにも大きい組と過剰フィットされることがあり、その結果、それは現在の学習データを完全に予測するが、実際には生物学的問題を完全には記載することができない。結果として、学習組に密接に逐次関連する配列のみが予測されるであろう。所謂ジャックナイフ試験又は交差実証試験がこのような場合について試験するように設計される。このスキームにおいて、予測配列が学習操作から排除される。
【００３０】
ジャックナイフ試験の二つの型が適用された。第一の試験において、予測配列が完全学習操作（プロフィール偏りを含む）から排除された。ジャックナイフ試験の第二の別法において、プロフィールマトリックス計算が全ての配列で実行されたが、予測配列がSpptのみの計算について除外された。第一のジャックナイフ試験はパラメーター過剰フィッティングについて全操作をチェックするが、第二の試験は選択された物理的性質の項のパラメーターに特別な対照である。
科学文献はそれらのＮ末端グリシンにもかかわらずミリストイル化されないと報告されるタンパク質のリストを提供する。また、本発明の方法の性能が偽陽性予測についてのこれらの潜在的候補について試験された。
最後に、酵素に対する幾つかのオクタペプチドに関するアフィニティー定数の間の回帰及びそのプログラムにより生じた夫々のスコアーが分析された。
要するに、本発明はタンパク質の一次構造のみに頼るＮ末端N-ミリストイル化の同定のための新規な方法を提供する。この技術はまた大きい生物分子配列データベースからの標的の選択に有益である。
本発明の重要な要素、即ち、ソフトウェア手段で実行される新規なアルゴリズムは、強力なプロフィール抽出方法PSICにより単一位置におけるアミノ酸型選好を評価するだけでなく、既知のミリストイル化タンパク質の平均の性質からの偏りの一般の傾向を示し、又は多くの配列位置を含む補償効果について試験された幾つかの位置について物理的-化学的要件からの偏りにペナルティを課する。偽陽性帰属のリスクの定量のために、スコアーが精密な統計アプローチを使用して偽陽性予測の可能性に変えられた。本発明において提案された方法の高い信頼性を考慮して、大きい生物分子配列データベースをスキャンし、Ｎ末端ミリストイル化についてタンパク質基質を自動的に注釈することが始めて実現可能になる。こうして、提案された発明は多量のデータが演算アプローチのみでマスターし得る後ゲノム時期で精密な手段である。
【００３１】
実施例１
自己コンシステンシー試験
試験候補タンパク質の組のミリストイル化モチーフの情報は選択された学習組に由来していた。しかしながら、この知識が本発明の予測方法のパラメーターに成功裏に変換されたか否かをチェックするために、プログラムが学習組それ自体を予測する方法を調べた。
本発明のプログラムは真核生物−菌類＋ウイルスの組内の368のエントリーのうちの359(97.6％)を予測し得ることが示された。菌類の特定パラメーター（これらは異なる基質特異性との一致を維持するのに非常に限定的である）では、全ての22の菌類エントリー(100％)が陽性に予測された。
予測し得なかった９のエントリー（表１を参照のこと）は注意を引く。何とならば、それらがモチーフのコンセンサス記載との重大な不一致を示すからである。幾つかのARF（ADPリボシル化因子）がミリストイル化されることが示されていた（Randazzo及びKahn, 1995）。しかしながら、表１にリストされたエントリーは実験で確かめられたタンパク質のモチーフを共有せず、潜在的としてのみ注釈される（-2より低いスコアー）。
プログラムによるペナルティが基質位置２、３及び４を有するサイズ制限ポケットに収容し難い三つの連続の大きい疎水性残基のために生じる。負に荷電されたアスパルテートの狭いリング内に位置される重要な位置５にあるイソロイシン又はバリンはまた強く不利にされるべきである。オクタペプチドGNAAAARRからGPAAAARRへの突然変異がミリストイル化されるようになる能力の損失をもたらした（Towlerら, 1988b）。それ故、STK HYDAT (P17713)中の２位のプロリンは基質の可撓性を著しく低下することにより同様の効果を有し得る。
得られた結果はこれらの９のエントリーがN-ミリストイル化コンセンサスパターンにマッチしないことを示す。それ故、これらのタンパク質はNMTに良好な基質ではあり得ないことが推定される。
【００３２】
実施例２
ジャックナイフ試験
第一のアプローチにおいて、予測すべきである配列を完全学習操作（プロフィール計算及び物理的性質計算の両方）から除外した。配列及び位置特異性の重みづけによるプロフィール抽出に使用した方法は、同様の配列を有するサブセットにもかかわらず、小さい相違でさえもが抽出された情報に寄与するという利点を有する。それ故、プロフィールマトリックスについて計算された値は同族体のサブセットからの配列が除外される場合でさえも変化する。真核生物及びウイルスの大きい組（菌類を含まない）について、368の配列のうちの353（95.9％）がミリストイル化部位を有すると依然として予測される。一層小さい菌類の組からの22の配列のうちの21（95.5％）がそのプログラムにより認識されて残る。予想したように、自己コンシステンシー試験内で予測し得なかったエントリーがもう一度予測限界外である。加えて、或る種の非常に特有であるが、依然として信頼できる配列はそれらが除外され、予想したようにプロフィールに寄与しないでそれ以上予測し得ない場合にプロフィールマトリックスの重要なシフトを生じる。
第二のジャックナイフ試験はSpptパラメーターが学習組から安定に誘導されることを示す。それ故、予測すべきである配列をＳプロフィールではなくSpptの計算から除外して、全試験中に一定のプロフィールマトリックスをもたらした。両方のパラメーター組について、自己コンシステンシー試験からの予測精度に達したという事実（夫々、真核生物−菌類＋ウイルスについて97.6％、菌類について100.0％）は学習組が物理的性質の項の信頼できる測定に充分に大きいことを意味する。同時に、第一のジャックナイフ試験の結果は配列の学習組がプロフィールパラメーターの安定な誘導に依然としてあまりにも小さいことを示す。将来利用できるようになり得る拡大された学習組は正確な陽性予測の率を更に改良するであろう。この記載に概説されたアプローチに変化を生じなくても、また関連ソフトウェアを変更しないでも、後日に利用し得る実験で確かめられたＮ末端ミリストイル化を有するタンパク質配列をまた含むアップデートされた学習組が提供された方法で適用し得ることが注目されるべきである。
【００３３】
実施例３
ミリストイル化されないと報告されたタンパク質に関するスコアー
総説の一つ（Boutin, 1997）はミリストイル化について研究されたが、それらのＮ末端グリシンにもかかわらずミリスチン酸を結合として有していなかったタンパク質を用いたTsunasawa（Tsunasawa, Stewart,及びSherman, 1985）によるデータに基づく表をリストしている。表２は本発明の方法がこれらの配列について生じるスコアーを表す。実験と完全に一致して、それらのいずれもが陽性と予測されないであろう（表２はTsunasawa（Tsunasawa, Stewart,及びSherman, 1985）及びBoutin（Boutin, 1997）によるデータに基づく）。それはミリストイル化されないと報告されたタンパク質をそれらが本発明のアルゴリズムにより得るスコアーとともにリストする。属性“可能”による予測の閾値は-2.0より高いスコアーであり、こうして、それらのいずれもがモチーフの現在の理解に従って、また文献と合致してミリストイル化部位を有しない。
【００３４】
実施例４
実験速度論的データとの予測Ｎ末端N-ミリストイル化の相関関係
サッカロミセス・セレビジエからの酵素ミリストイル-CoA：タンパク質N-ミリストイルトランスフェラーゼがその基質特異性を調べるために広範囲の速度論的測定にかけられていた（Towlerら, 1988b）。アフィニティー定数又はミリストイル化速度の信頼できる定量は提供されたデータ内の粗い不一致により見られるように困難な仕事である。例えば、オクタペプチドGNAAAARR及びGSSKSKPKのKmは一つの論文（Rocqueら, 1993）では夫々31μM、105μMと特定され、一方、それより先の刊行物は同オクタペプチドについて別の値をリストしている（Km〔GNAAAARR〕＝60μM；Km〔GSSKSKPK〕＝40μM）（Towlerら, 1988b）。これらの結果はそれらが多くの因子（温度、溶液等のような）に依存しているので一連の実験内でのみ比較し得ることが明らかであり、同じグループからであるが、異なる人々による実験は正確に同じ値を与えないであろう。しかしながら、どの基質が他よりも良好に結合していることを証明する、アフィニティーの関係は一定に留まるべきである。
所定の場合には、Kmの比は一層低下し、GSSKSKPKがGNAAAARRよりも良好に結合すると推定された従来のデータとの論争上、GNAAAARRをGSSKSKPKよりも３倍高いアフィニティー（一層低いKm）と証明する。
それにもかかわらず、本発明の方法により予測されたスコアーは実験データ（図：酵母基質から実験で誘導されたKmの負の対数と菌類パラメーター組で計算されたスコアーの間の相関関係）の殆どと少なくとも定性的に一致する。種依存性基質特異性の検討にも使用された更に最近の刊行物（Rocqueら, 1993）に従って、夫々のオクタペプチドに関するスコアーが計算され、これらは全て共通のリンカー領域で延長されるべきであった。cAMP依存性タンパク質キナーゼの誘導体GNAAAARR中の単一突然変異はアフィニティーの負の対数に比例するスコアーの増加又は減少を生じる。しかしまた、GARASVLSはその比率を維持し、単一位置偏りだけでなく、配列状況（多重突然変異後）がアルゴリズムにより少なくとも一部認識されることを示す。
不運なことに、GLYASKLSだけでなくGSSKSKPKは位置２〜４におけるそれらのまれなアミノ酸のためにプロフィールパラメーター化を問題としている。勿論、それらは陽性と予測されるが、それらのスコアーは別の配列に関する実験から誘導されたアフィニティーのオーダーを満足しない。最後に、GSSKSKPKに関するスコアーは先に公表された値について良好に適合し、どの実験結果が一層正確であるかという疑問を生じる。
しかしながら、残りの配列は酵素に対する一層高いアフィニティーを有する基質について一層高いスコアーで予想された挙動を示す（図）。
【００３５】
実施例５
普通に使用される予測方法との新規予測関数の比較
今までのところ、ミリストイル化部位の予測のための唯一利用できる手段はPROSITEによるパターン検索であった。幾つかのその他の適用についてのその価値とは別にして、この特別なモチーフの複雑さを考慮すれば、それは適切ではない。10年前にわたって最新のものにして、単一位置におけるアミノ酸型の制限されたサブセットのみを可能にする概念はNMTによる認識について配列状況への依存性を反映することができないであろう。
その現在の状態において、このアプローチはミリストイル化が実験により確かめられたタンパク質（ARF6 HUMAN 〔P26438〕、ARF6 CHICK 〔p26990〕、GCAP BOVIN 〔P46065〕、HIA1 DICDI 〔P13231〕、HIA2 DICDI 〔P42526〕、HIPP HUMAN 〔P41211〕、HIPP RAT 〔P32076〕、NCAH DROME 〔P42325〕、NECD BOVIN 〔P29554〕、NECX APLCA 〔Q16982〕及びこれらの配列との広い類似性を共有する多くのその他のもの等）について偽陰性予測を一層生じる。勿論、PROSITEのアップデーティングはこの欠陥を修正するが、結果としてまた偽陽性の数を著しく増大する。何とならば、更なるアミノ酸の許容は弱いパターンを更に一層普通にするからである。
ミリストイル化されないと報告されたタンパク質についての予測（表２、100％正しくは予測されない）と比較して、PROSITEパターン認識は意図的なアップデート後にこれらの配列のうちの３（62.5％正確）、更には５（わずかに37.5％正確）についてミリストイル化部位を予測するであろう。
表３は現在のモチーフによるPROSITEパターン検索（旧式、偽陰性予測を生じる）及び大きいデータベースにわたって修正されたバージョン（最新）と比較された本発明の手段の性能を示す。また、同表は本発明者らのアルゴリズムと比較された完全SWISSALLデータベースにわたるPROSITEパターン検索の予測の数をリストする。かなりの比較のために、PROSITE検索をＮ末端グリシン（おそらく前のメチオニンの後の）に制限し（これは通常のPROSITEパターンでは実行されない）、それにより高度に非現実的な数の予測を生じた。PROSITEはタクソン特異性基質選好間を区別することができないので、予測アルゴリズムを真核生物配列及びウイルス配列を含むが、菌類からの配列を含まない学習組から誘導された一層厳密ではないパラメーター組に減少した。
最後に、或る種のアミノ酸に限定された既知のミリストイル化タンパク質の情報を使用することにより、PROSITEアプローチは特有のモチーフ（その場合、残基の突然変異が補償効果のために活力のあるNMTの基質を依然としてもたらす）を見出すことができないであろう。比較からわかるように、配列位置の相関関係の問題は簡単なプロフィール又はパータン検索単独では取り組み得ない。
【００３６】
実施例６
予測ミリストイル化の実験確認
演算アプローチは、多くの入手し得るタンパク質の中で、Ｎ末端ミリストイル化に無関係の例が選択し得ないという実用的な利点を有する。こうして、候補の得られるリストは非常に小さくなる。高スコアーのヒットはこのタンパク質修飾のための或る種の基質である。また、既存の技術で実験によりN-ミリストイル化について低いスコアーを有する残りのヒットをチェックすることが実現可能である。
タンパク質へのミリスチン酸の結合を確かめるのに幾つかの方法がある。異なる組織及び全ての可能な生物からの多数のミリストイル化タンパク質を同定する目的のために、組換えNMT及び候補タンパク質（エシェリキア・コリ中で逐次発現される）を使用するin vitro細菌同時発現系が極めて有効である（Duronioら, 1990）。しかしながら、これは候補タンパク質のin vitroミリストイル化のみを示すが、それにもかかわらず、それがNMTの基質であり得るか否かを明らかに述べる。この綿密な方法の詳細について、Knollら, 1995を参照のこと。
【００３７】
1.E. coli同時発現系（Knollら, 1995）を使用することによる真核生物タンパク質のN-ミリストイル化の測定
a)E. coliをNMT（Westonら, 1998; Bhatnagarら, 1998）及び候補タンパク質の発現を誘導するプラスミドで形質転換する。次に、アンピシリン及びカナマイシンに対する同時の耐性をルリアブロースプレート中100μg/mlの夫々について選択する。
b)形質転換体からのプラスミドDNAを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化を使用して両方のプラスミドが存在することを確かめる。
c)二重形質転換体の20mlの培養液をルリアブロース＋抗生物質中で0.5-0.7のA600まで37℃で増殖させ、IPTGを1mMまで添加する（NMT誘導）。
d)その培養液を40分間インキュベートし、次いでナリジキシン酸を50μg/mlで添加する（候補タンパク質誘導）。
e)培養液のアリコート2mlを〔3H〕ミリステート（培養液1ml当り50-100μCi；標識は培養液の添加の前にN2のもとに管中で乾燥されるべきである）を含むポリプロピレン管に直ちに添加する。
f)細胞を37℃で30分間インキュベートし、次いで５分間にわたって氷の上に置く。
g)細胞を4000gで10分間にわたって遠心分離することにより集め、食塩加リン酸緩衝液(PBS)1mlで洗浄する。細胞懸濁液を微小遠心分離管に移し、もう一度遠心分離する。
h)細胞を溶解緩衝液（0.24Mのトリス、pH 6.8、培養液1ml当り２％のSDS）50μl中で再度懸濁させ、５分間沸騰し、次いで５分間にわたって遠心分離する。上澄みを貯蔵する。BCAタンパク質アッセイ（ピアス、ロックフォード、IL）を使用して、全タンパク質含量を測定する。ミリストイル化の最終分析をSDS-PAGE（レーン当りタンパク質100μgを装填する）及びフルオログラフィーにより行なう。
【００３８】
2.ウイルスタンパク質のN-ミリストイル化の測定（Schultz及びOroszlan, 1983）
a)細胞培養物の放射能標識
〔3H〕-ミリスチン酸（0.5mCi）を最小容積の70％のエタノールに溶解し、10％のウシ胎児血清を補給したイーグル改良必須培地1ml中で希釈する。夫々のウイルス生産細胞系のT25フラスコを５分間にわたってこの培地1mlで標識する。その標識期間の終了時に、細胞をすすぎ、溶解し、記載されたようにして（Schultz, Rabin,及びOroszlan, 1979）適当な一特異性抗血清及びプロテインA-セファロース（ファーマシア・ファイン・ケミカルズ、ピスキャットアウェー、N.J.）で免疫沈殿させる。線形勾配7.5〜17％のポリアクリルアミドゲルによるドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）はLaemmli, 1970の定式化に従う。ゲルをフルオログラフィー（Laskey及びMills, 1975）のためにPPO（2,5-ジフェニルオキサゾール；アメーシャム社（アーリントン・ハイツ、Ill.））で含浸する。
b)ウイルスタンパク質の精製
ウイルスタンパク質を標識し、以下のように逆相高性能液体クロマトグラフィーにより精製する。ウイルス粒子を90分間にわたって105000gでTNE緩衝液（0.05Mのトリス塩酸塩〔pH 7.5〕、150mMのNaCl、1mMのEDTA）中20％の蔗糖のクッション中でペレットにすることにより培養物（これは〔3H〕-ミリステート（0.5mCi/ml）で一夜にわたって標識されていた）の培地から回収する。排出されたペレットを6Mのグアニジン塩酸塩に溶解し、トリフルオロ酢酸でpH 2に調節し、μボンダパックC18カラム（ウォーターズ・アソシエーツ、ミルフォード、マサチューセッツ）に適用する。勾配溶離クロマトグラフィーをウォーターズ・アソシエーツモデル660溶媒プログラマー、二つのモデル6000M溶媒送出ポンプ、及び206nmにセットされたモデル450可変波長検出器で行なう。逆相高性能液体クロマトグラフィー用の溶媒は0.1％のトリフルオロ酢酸又は有機相としての0.1％のトリフルオロ酢酸を含むプロパノールである。タンパク質を周囲温度で０％から60％までのアセトニトリルの１時間の線形勾配、続いて50℃で20％から60％までのプロパノールの15分間の線形勾配で溶離する（Henderson, Sowder,及びOroszlan, 1981）。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
【表２】
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【００４１】
【表３】
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【００４２】
参考文献
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【００４３】
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【００４４】
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【００４５】
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【００４６】
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【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】酵母基質から実験で誘導されたKmの負の対数と菌類パラメーター組で計算されたスコアーの間の相関関係を示す。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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