(57)【要約】以下の特徴：本来のコドンが、哺乳動物細胞において増強された翻訳をもたらすコドンにより交換されている、切断型非機能的タンパク質の産生を生じる欠失を含む、および哺乳動物宿主におけるE6またはE7タンパク質の免疫原性を増強しうる高度に免疫原性のポリペプチドである融合パートナーをコードする、の組み合わせにより特徴づけられる、HPVのE6またはE7融合タンパク質をコードするDNA配列が記載される。さらに、前記DNA配列によりコードされる改変されたE6またはE7タンパク質および前記DNA配列を含む発現ベクター、ならびにこれらの化合物のいくつかの使用が記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の特徴：
(a)少なくとも20％の本来のコドンが、哺乳動物細胞において増強された翻訳をもたらすコドンにより交換されている；
(b)切断型非機能的タンパク質の産生を生じる変異を含む；および
(c)哺乳動物宿主におけるE6またはE7タンパク質の免疫原性を増強できる高度に免疫原性のポリペプチドである融合パートナーをコードする
の組み合わせにより特徴づけられる、HPVのE6またはE7融合タンパク質をコードするDNA配列。
【請求項２】
HPVタンパク質がE7タンパク質である請求項１記載のDNA配列。
【請求項３】
少なくとも50％の本来のコドンが、哺乳動物細胞において増強された翻訳をもたらすコドンにより置換されている請求項１または２記載のDNA配列。
【請求項４】
変異が、翻訳の未成熟停止をもたらすフレームシフト点変異である請求項１〜３いずれか記載のDNA配列。
【請求項５】
高度に免疫原性の融合パートナーがHbsAgまたはその免疫原性部分である請求項１〜４いずれか記載のDNA配列。
【請求項６】
高度に免疫原性の融合パートナー(EHBsAg-S-F)が、図８に記載されたアミノ酸配列を含む請求項５記載のDNA配列。
【請求項７】
HPVがHPV-16またはHPV-18である請求項１〜6いずれか記載のDNA配列。
【請求項８】
パート(a)および(b)が、Flag-タグを含むかまたは含まない図１、２、３または４に記載されたDNA配列のコード領域を含む請求項２〜７いずれか記載のDNA配列。
【請求項９】
Flag-タグを含むかまたは含まない図５または９に記載されたDNA配列のコード領域を含む請求項２〜８いずれか記載のDNA配列。
【請求項１０】
請求項１〜９いずれか記載のDNA配列を含む発現ベクター。
【請求項１１】
プラスミドまたは組換えウイルスである請求項１０記載の発現ベクター。
【請求項１２】
プラスミドまたは組換えウイルスが、pIRES-Neo2、pTet-On、pHSVPUC、HSVアンプリコンまたはSFVベクターである請求項１１記載の発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１〜９いずれか記載のDNA配列または請求項１０〜１２いずれか記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１〜９いずれか記載のDNA配列によりコードされるE6またはE7タンパク質。
【請求項１５】
適切な条件下で請求項１３記載の宿主細胞を培養する工程を含む、請求項１４記載のE6またはE7タンパク質の産生方法。
【請求項１６】
薬学的に許容されうるキャリア中に、請求項１〜９いずれか記載のDNA配列、請求項１０〜１２いずれか記載の発現ベクター、請求項１４記載のE6もしくはE7タンパク質、または請求項１５記載の方法により産生されるE6もしくはE7タンパク質を含有してなる医薬組成物。
【請求項１７】
HPV感染またはHPV感染に関連する腫瘍の予防または治療のためのワクチンの調製のための請求項１〜９いずれか記載のDNA配列、請求項１０〜１２いずれか記載の発現ベクター、請求項１４記載のE6もしくはE7タンパク質、または請求項１５記載の方法により産生されるE6もしくはE7タンパク質の使用。
【請求項１８】
ポリクローナルまたはモノクローナル抗体の産生のための請求項１４に記載されるかまたは請求項１５記載の方法により産生されるE6またはE7タンパク質の使用。
【請求項１９】
HPVに感染した被験体における特定の抗体または細胞傷害性Tリンパ球の検出のためのアッセイにおける請求項１４に記載されるかまたは請求項１５記載の方法により産生されるE6もしくはE7タンパク質の使用。
【請求項２０】
トランスジェニックマウス株の作製のための請求項１〜９いずれか記載のDNA配列または請求項１０〜１２いずれか記載の発現ベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、以下の特徴：本来のコドンが、哺乳動物細胞において増強された翻訳をもたらすコドンにより交換されている、切断型非機能的タンパク質の産生を生じる欠失を含む、および哺乳動物宿主におけるE6またはE7タンパク質の免疫原性を増強しうる高度に免疫原性のポリペプチドである融合パートナーをコードする、の組み合わせにより特徴づけられるHPVのE6またはE7融合タンパク質をコードするDNA配列に関する。さらに、本発明は、前記DNA配列によりコードされた改変されたE6またはE7タンパク質、および前記DNA配列を含む発現ベクターに関する。最終的に、本発明は、上記化合物のいくつかの使用、特にHPV感染またはHPV感染に関連する腫瘍の治療または予防に有用である有効なワクチンとしての使用に関する。
【０００２】
子宮頸の癌（子宮頸癌、CC）は、世界中の女性において2番目に多い一般の癌であり、発展途上国においては１番多い。CCは、子宮頸上皮内腫瘍形成(CIN)分類1〜3として知られる重篤度を増加する前癌状態の中間期を介して発達し、後者は約50％の患者において10〜20年の期間をかけて侵襲性癌の発達をもたらす。女性における全体的な癌の発病率の11％より多くは、ヒト乳頭腫ウイルス(HPV)感染による。HPV型16および18での感染は、子宮頸に感染するのに最も有力なウイルス型であるHPV遺伝子型16を有するCINおよびCCの発達に関連している。これらのHPV型によりコードされたE6およびE7タンパク質は、異常な細胞増殖を誘導することによるCCの病因論に関与すると考えられる。E6およびE7の発現は、HPV関連CCに由来する組織および腫瘍細胞において一貫して検出される。さらに、HPV型16および18に由来するE6およびE7遺伝子は、培養における上皮細胞の形質転換に十分である(zur Hausen, Biochim. Biophys. Acta 1288(2)(1996):F55-78)。
【０００３】
HPV型16および18によりコードされたE6およびE7タンパク質は、宿主による腫瘍拒絶に対する有効な免疫学的標的でありうるというますます多くの証拠がある。HPVに関連する腫瘍形成の治療および予防に有用でありうる有効な予防的および治療的ワクチンを開発するための努力がなされている。HPV型16および18のタンパク質に対する免疫応答を誘導するためにこれまでに使用されてきた異なるストラテジーは、(a)合成抗原ペプチドの使用、(b)組換え微生物 (組換えカルメット−ゲラン菌；BCG) の使用、(c)野生型ウイルス遺伝子を使用するDNAワクチンの使用、ならびに(d)ウイルス様粒子(VLP)の使用である。
【０００４】
しかしながら、不運にも、上記ストラテジーは、安全で効率のよいワクチンの開発をこれまで妨げているという種々の不利な点を示す。合成抗原ペプチドの使用に関しては、HPV特異的免疫反応性ペプチドの同定が非常に複雑であることが力説されている。それは、有効な広域スペクトルのワクチンのための多数でかつ大量のペプチドを必要とする。さらに、合成ペプチドは、天然のタンパク質で通常見出され、それゆえにワクチンとして十分に効率的ではない翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、硫酸化、リン酸化）を含まない。HPV 6bのL1後期タンパク質またはHPV 16のE7初期タンパク質を発現するBCGベースワクチン送達系は、免疫原として使用されている。しかしながら、これらの系で得られる免疫応答は、タンパク質／アジュバントワクチンにより惹起されるものよりさらに少なく、したがって、この系は、単一成分ワクチンストラテジーとして有用である見込みはないと考えられる。DNAワクチンに関しては、野生型HPV遺伝子の発現は、サイトメガロウイルス(CMV)のものなどの強いプロモーターから発現される場合であってさえ非常に低いことが観察されている。ウイルス様粒子(VLP)の使用に関しては、真のVLPが特定のHPV型のL1（カプシド）タンパク質から作製されることが述べられている。したがって、それらは、有用であるとしても、治療用ワクチンとしてよりむしろ予防用としてのみでありうる。例えば、HPV-16 E7のエピトープを含む偽型VLPがまた説明されており、予防用および治療用ワクチンとして有用でありうる。しかしながら、重要な限定は、VLPが昆虫細胞または酵母中で産生されることである。これまでに、哺乳動物細胞における適切な産生系は、確立されていない。したがって、ヒト細胞において生じる翻訳後修飾に依存する重要なエピトープは、これらの系において失われる。
【０００５】
したがって、HPV感染またはHPVに関連する腫瘍の治療または予防のための安全で有効なワクチン、好ましくは遺伝子ワクチンを提供することが、本発明の目的である。
【０００６】
本発明によれば、これは特許請求の範囲に規定される主題により達成される。本発明は、好ましくは前記DNA配列を含むベクター、例えばプラスミドベクター、単純ヘルペスウイルス１型アンプリコン(amplicon)または組換えセムリキ森林熱ウイルスベクターを投与することにより、宿主動物において腫瘍形成性のHPVのE6および／またはE7タンパク質への免疫応答を誘導するためのDNA配列を提供する。前記DNA配列は、免疫原性であるが、細胞形質転換を誘導し得ない融合タンパク質としてHPVタンパク質をコードする。本発明のDNA配列は、以下の特徴により特徴づけられる。
【０００７】
(a)HPV E6/E7遺伝子のDNA配列が、ヒト遺伝子に近いコドンを使用するために改変されている、(b)遺伝子が、それを非機能的にするための欠失により改変されている、それによりその腫瘍形成能力をなくす（欠失は好ましくは点変異であり、なぜならこれらは潜在的な本質的エピトープの損失をもたらすためである）、(c)HPV遺伝子は、宿主においてその免疫原性を増強するために高度に免疫原性のタンパク質に融合されており（これらの融合は、HPVタンパク質エピトープのマスキングを生じないことが予期され、なぜなら融合した断片がこの問題を避けるのに十分な長さであるからである）、ならびに、好ましくは、HPV遺伝子の発現は、組換え、複製−欠失HSV、SFVまたは高度にコピーされたプラスミドベクターまたはこれらの組合せにより提供される。
【０００８】
このアプローチは、種々の利点、すなわち以下のことを提供する。
(a)ヒトに近いコドン使用をなすためにHPV遺伝子において導入されるサイレント変異の結果として、HPVタンパク質のより高度な発現レベルが得られる。これは、野生型HPV遺伝子の使用と比較して免疫試験においてより効率のよい宿主応答を生じる。
【０００９】
(b)本発明により生じるHPV遺伝子およびタンパク質は、ヒト細胞において発現され、細菌、酵母または昆虫細胞などの他の系において発現されるタンパク質とは異なり、それらはヒト細胞において発現されるタンパク質に通常見出される翻訳後修飾を含む。これは、宿主免疫系によるHPVタンパク質の十分な認識に重要である。
【００１０】
(c)HPVタンパク質は、高度に免疫原性であることが知られているタンパク質に融合して発現されるので、それらは宿主動物において強い免疫応答を惹起する。
【００１１】
(d)HPVタンパク質は、インビトロにおいても宿主動物においても細胞形質転換していない。なぜなら、それらは、十分な長さのポリペプチドとして発現する場合がないからである。HPV融合遺伝子は、その機能が果たされない不完全なタンパク質を発現する。さらに、HPVタンパク質は、細胞質タンパク質との融合物として発現され、したがって、それらはその機能を発揮する細胞核に達し得ない。
【００１２】
(e)HPVタンパク質は、好ましくは、特定の配列で標識されて発現され、それは、市販の抗体の助けを借りてウエスタンブロットにおいておよび免疫蛍光法により容易に検出されうる。
【００１３】
(f)種々のウイルスベクターの組み合わせおよびプラスミドベクターを有するこれらの組み合わせは、より効率のよい免疫化を確実にする。なぜなら、それは、前のブーストにおいて惹起された免疫反応によるベクターの中和を妨げるからである。
【００１４】
したがって、本発明は、以下の特徴：
(a)少なくとも20％の本来のコドンが、哺乳動物細胞において増強された翻訳をもたらすコドンにより交換されている；
(b)切断型非機能的タンパク質の産生を生じる変異を含む；ならびに
(c)哺乳動物宿主におけるE6またはE7タンパク質の免疫原性を増強しうる高度に免疫原性のポリペプチドである融合パートナーをコードする
の組み合わせにより特徴づけられる、HPVのE6またはE7融合タンパク質をコードするDNA配列に関する。
【００１５】
表現「本来のコドン」は、対応するHPVの野生型バージョンにおいて見出されるコドンのことを言う。
【００１６】
表現「哺乳動物細胞において増強された翻訳」は、本発明で説明されるように、好ましいヒトコドンからもっぱらなるオープンリーディングフレームを作製し、したがって、哺乳動物細胞においてコードするタンパク質の増強された発現をもたらす、HPV配列におけるサイレント変異の導入から生じる遺伝子のことを言う。
【００１７】
用語「切断型非機能的タンパク質の産生を生じる変異」は、タンパク質の非機能的バージョンの産生をもたらす任意の変異のことを言う。好ましくは、かかる変異は、タンパク質の切断型バージョンをもたらす。適切な変異の例としては、少なくとも１つのコドンが欠失している変異、または翻訳の未成熟末端を生じる変異が挙げられる。かかる変異は、例えば、終止コドンによる特定のアミノ酸をコードするコドンの置換、フレームシフト変異を生じる１つまたは２つのヌクレオチドの挿入または欠失などである。用語「非機能的タンパク質または遺伝子」は、本発明の変異体HPV遺伝子およびタンパク質が「インビトロでもインビボでも形質転換していない」ことを意味し、これは、標準試験により証明されるように、E6またはE7遺伝子およびタンパク質が腫瘍形成表現型に細胞を形質転換する能力が、除去されていることを意味している。当業者は、特定の変異が、所望の特徴（すなわち、「非形質転換」である）を有するE6またはE7遺伝子またはタンパク質をもたらすかどうかを標準手順により容易に決定しうる。これらは、以下を含む。
【００１８】
１）インビトロ：NIH 3T3細胞および一次ヒトケラチノサイトの形質転換アッセイ。形質転換遺伝子（オンコジーン）は、形質転換された病巣がNIH 3T3細胞への腫瘍または組換えDNAのトランスフェクションから生じるアッセイの使用により常套的に同定されている(Todaroら、PNAS USA 51:66-73, 1964; Jainchillら、J. Virol. 4: 549-553, 1969; Anderssonら、Cell 16: 63-75, 1979)。これらの細胞は、接触阻止、非腫瘍形成細胞株として維持されるマウス線維芽細胞である。活性化オンコジーンを含むDNAの伝達は、腫瘍形成特性を有する形態的に変化した細胞の病巣を時折生じさせるであろう。
【００１９】
２）インビボ：腫瘍形成試験は、マウスまたはヒト形質転換細胞を用いた接種による免疫不全マウスにおいて常套的に行なわれる。HeLa細胞などのHPV により感染された子宮頸癌に由来するHPV E6およびE7遺伝子および細胞株を発現するようにトランスフェクトされた細胞は、腫瘍形成性であることが示されている(Lichyら、Cell Growth Differ.3: 541-548, 1992; Stanbridge, Nature 260: 17-20, 1976) 。
【００２０】
好ましい態様において、本発明のDNA配列は、前記特性を有するHPV E7タンパク質をコードする。
【００２１】
さらに好ましい態様において、本発明のDNA 配列の少なくとも50％の本来のコドンが、哺乳動物細胞において増強された翻訳をもたらすコドンにより置換されている；適切な置換の例は、例えば、図１および２に示されるものである。
【００２２】
さらに好ましい態様において、本発明のDNA 配列は、翻訳の未成熟停止を生じるフレームシフト点変異を含む。
【００２３】
当業者は、E6またはE7タンパク質に対する融合パートナーとして適切であり、哺乳動物、特にヒトにおいて高度に免疫原性であるポリペプチドまたはその一部を知っている。適切なポリペプチドの例としては、以下のものが挙げられる。
【００２４】
１）Ｂ型肝炎ウイルス小エンベロープタンパク質(HBsAg-S) 。このタンパク質は、宿主由来の膜と共に自己集合し、空のサブウイルス粒子を形成する能力を有し、プレゴルジ区画の管腔に放出され、次いで分泌される(Ganem, 「Hepadnaviridae and their replication」p2703-37, Fields, Knipe and Howley（編）、Fields Virology 第３版、1996, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia)。E6またはE7は、サブウイルス粒子の表面に曝露されたままであるタンパク質のＣ末端に融合されうる。
【００２５】
２）セムリキ森林熱ウイルス(SFV)のE2糖タンパク質。E2は、SFVビリオンのスパイク成分であり、抗体を中和するための主要な抗原である(Schlesinger and Schlesinger「Togaviridae: the viruses and their replication」、Fields, Knipe and Howley（編）、Fields Virology 第３版、1996, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia)。E6またはE7は、ウイルスエンベロープまたはE2発現細胞の原形質膜の表面上に曝露されるE2タンパク質のＮ末端に融合されうる。
【００２６】
３）ヒトアミロイドβタンパク質前駆体(APP) 。APP は、大きな細胞外領域と小さな細胞質の残りとを有する膜貫通タンパク質である。それは、通常プロテアーゼにより切断され、アルツハイマー病を罹患する患者のプラークに見出される40アミノ酸βペプチド（アミロイド）、または細胞外マトリックスに関連しうるp3と呼ばれるより小さい断片を生じる（「Principles of neural Science」, Kandel, Schwartz, and Jessel,(編) 第３版、1991, Elsevier, New York）。E6およびE7は、 APPの細胞外部分に挿入され得、βペプチドまたはp3断片と共に放出されると考えられている。
【００２７】
４）ヒトクロモグラニンＢ(hCgB)。hCgBは、制御された分泌経路に関するタンパク質であるが、トランスフェクションの際にHeLa細胞など制御された経路を有さない細胞において構成的に分泌されることが示されている(Kaether, and Gerdes, FEBS Letters 369: 267-271,1995 )。E6またはE7は、hCgBのＣ末端に融合されうる。
【００２８】
５）高度に免疫原性であることが公知である細菌βガラクトシダーゼ(Fijikawa ら、Virology 204:789-793, 1994) 。E6またはE7は、タンパク質のＮまたはＣ末端に融合されうる。融合産物が核に拡散しうる可溶性非膜タンパク質であるので、E6またはE7は、欠失（不活性）変異体である。代替的には、シグナルペプチドが、産物を細胞表面に標的化する融合物に添加される。
【００２９】
６）E6またはE7のＮ末端またはＣ末端の半分の互いの融合、および得られた任意の上記タンパク質に融合したキメラポリペプチド。
【００３０】
本発明は、排他的ではないが、特に、HPV-16およびHPV-18遺伝子型のE6およびE7遺伝子およびタンパク質に関する。しかしながら、本発明は、腫瘍形成または他の病理学の潜在性を有しうるかかるHPV 遺伝子型および他のHPV 遺伝子型のバリアントに及ぶことが認められるであろう。
【００３１】
好ましい態様において、本発明は、HPV-16のE6およびE7ならびにHPV-18のE6およびE7を、完全にまたはかかるタンパク質のＮ末端またはＣ末端の半分を含む欠失断片のいずれかとして含み、互いに、および上記ポリペプチドまたはその一部に融合したポリプロテインをコードするキメラ遺伝子に関する。これは、免疫原として単一の産物を使用するHPV-16およびHPV-18に対する免疫化を可能にする。
【００３２】
当業者は、上記リストのタンパク質１〜４へのE6および／またはE7の融合が、核への前者の転移を廃止し、したがって、それらの機能を妨げることを認めるであろう。さらに、融合タンパク質の分泌または表面曝露は、免疫系によりその認識を促進することが意図される。
【００３３】
特定の好ましい態様において、本発明は、パート(a)および(b)が、Flag-タグを含むかまたは含まない図１、２、３または４に記載されたDNA配列のコード領域を含むDNA配列に関する。さらにより好ましくは、Flag-タグを含むかまたは含まない図５に記載されたDNA配列のコード領域を含む本発明のDNA配列の態様である。
【００３４】
好ましくは、DNA配列をコードする変異体HPV E6およびE7タンパク質は、ベクターまたは発現ベクターに存在する。当業者は、その例に精通している。大腸菌用の発現ベクターの場合、これらは、例えば、pGEMEX、pUC誘導体、pGEX-2T、pET3b、T7ベース発現ベクターおよびpQE-8である。酵母における発現に対して、例えばpY100およびYcpad1が言及されるべきである一方、例えばpKCR、pEFBOS、cDM8、pMSCND、およびpCEV4が哺乳動物細胞における発現に対して示されるべきである。バキュロウイルス発現ベクターpAcSGHisNT-Aは、昆虫細胞における発現に対して特に適切である。本発明のDNA配列はまた、適切な発現カセットを含む組換えウイルスに含まれうる。本発明において使用されうる適切なウイルスとしては、バキュロウイルス、ワクシニア、シンドビスウイルス、SV40、センダイウイルス、アデノウイルス、AAVウイルスまたはパルボウイルス(MVMまたはH-1)などが挙げられる。ベクターはまた、MoMULV、MoMuLV、HaMuSV、MuMTV、RSVまたはGaLVなどのレトロウイルスでありうる。特定の好ましいプラスミドおよび組換えウイルスは、piRES-Neo2(Clontech, Heidelberg, Deutschland) 、pTET-On(Clontech)、pHSVPUC(Gellerら、PNAS USA 87 (1990)、8950-8954)、HSVアンプリコンおよび組換えSFVベクターである。哺乳動物における発現のために、本発明のDNA配列は、適切なプロモーター、例えばヒトサイトメガロウイルス「最初期プロモーター」(pCMV)、SV40エンハンサーおよび初期プロモーター、SRαプロモーター(Takabeら、Mol. Cell. Biol. 8: 466-472, 1988)、Tet-On/ Tet-Off遺伝子発現系、HSV-1の最初期E4/5プロモーター(Gellerら、PNAS USA 87:8950-8954, 1990)に作動可能に連結される。
【００３５】
上記改変を保有するDNA配列をコードするE6およびE7タンパク質を作製するためおよび本発明のDNA配列を含む発現ベクターを構築するために、当該分野で公知の一般法を使用することが可能である。これらの方法としては、例えばSambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第２版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYに記載のような例えば、インビトロ組換え技術、合成法およびインビボ組換え法が挙げられる。
【００３６】
さらに、本発明は、上記DNA配列またはベクターを含む宿主細胞に関する。これらの宿主細胞としては、細菌、酵母、昆虫および動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞が挙げられる。大腸菌株HB101、DH1、x1776、JM101、JM109、BL21、XL1BlueおよびSG 13009、酵母株サッカロミセス・セレビジエ、昆虫細胞sf9および動物細胞L、A9、3T3、FM3A、BHK、ヒトSW13、CHO、COS、VeroおよびHeLaが好ましい。これらの宿主細胞を形質転換する方法、形質転換株を表現型により選択する方法、および上記ベクターを使用することによる本発明のDNAを発現する方法は、当該分野で公知である。
【００３７】
本発明はまた、上記DNA配列によりコードされるHPV E6またはE7タンパク質に関する。HPV E6またはE7タンパク質は、単離された精製物質として、したがって他のタンパク質を含まずに提供される。かかるHPVタンパク質は、好ましくはヒト細胞において発現され、細菌、酵母または昆虫細胞などの他の系において発現されるタンパク質とは異なり、ヒト細胞において発現されるタンパク質中に通常見出される翻訳後修飾を含む。これは、宿主免疫系によるHPVタンパク質の十分な認識に対して決定的に重要でありうる。
【００３８】
さらに、本発明は、上記E6またはE7タンパク質を産生する方法に関し、それにより、例えば本発明の宿主細胞が、タンパク質の合成を可能にする条件下で培養され、タンパク質が続いて培養細胞および／または培養培地から単離される。組換え産生されたタンパク質の単離および精製は、調製用クロマトグラフィーならびにモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーを伴う親和性および免疫学的分離を含む通常の手段により行なわれうる。
【００３９】
本発明はまた、本発明のDNA配列もしくは発現ベクターを含有してなる医薬組成物、または代替的には薬学的に許容されうるキャリア中の前記DNA配列によりコードされるHPV E6またはE7タンパク質に関する。
【００４０】
最後に、本発明は、本発明のDNA配列、発現ベクター、またはHPV E6もしくはE7タンパク質の種々の使用に関する。好ましい使用は、以下である。
【００４１】
(a)HPV感染またはHPV感染に関連する腫瘍の予防または治療のためのワクチンの調製。好ましくは、ワクチンは、適切なプロモーターの制御下で適切なベクター（例えば上記ベクターまたはプロモーター）に挿入された本発明のDNA配列に基づく遺伝子ワクチンである。かかるワクチンは、HPVによるかまたはHPVに感染し、ウイルスタンパク質を発現する腫瘍または病巣由来の細胞の拒絶による考えられうる感染に対する保護またはその治療によりかかる応答から利益を得うる被験体において体液性および／または細胞性免疫応答を刺激するために使用されうる。
【００４２】
(b)治療剤として有用でありうるポリクローナルまたはモノクローナル抗体の産生。かかる抗体は、周知の方法により作製されうる。
【００４３】
(c)HPVに感染した被験体における特異的な抗体または細胞傷害性Tリンパ球の検出、すなわち、診断アッセイにおける使用。適切なアッセイフォーマット(RIA、ELISAなど)は、当業者に周知である。
【００４４】
(d)例えば、テトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下で本発明のDNA配列を用いるトランスジェニックマウス株の作製。かかるマウス株は、HPVに対するワクチンを試験するのに有用でありうる。
【００４５】
本発明を実施例により説明する。
【００４６】
実施例１：HPVタイプ16のE7遺伝子の変異誘発および発現
HPV-16 E7遺伝子を、好ましいヒトコドンからなるオープンリーディングフレームを作製する64個のサイレント変異を導入するためにインビトロで変異誘発した。さらに、変異E7遺伝子をヘキサ-ヒスチジン-タグおよびFlag-タグに融合した。
【００４７】
変異E7遺伝子を、以下のプライマー：
2004531253.tif 000002
2004531253.tif 000003
を用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の連続した工程により合成的に作製した。
【００４８】
最初のPCR工程において、プライマー（b）および（e）（PCR1）ならびにプライマー（c）および（f）（PCR2）を用いて、テンプレートを使用しない鎖伸長によりそれぞれの断片を作製した。第２の工程では、PCR1およびPCR2の産物を用いてプライマーを使用しない一本鎖断片を増幅した（PCR3）。第３の工程では、PCR3の産物をテンプレートとして用いて、プライマー（a）および（d）を用いて完全なE7遺伝子を増幅した（PCR4）。
【００４９】
最後のPCR工程では、PCR4の産物（EE7）を、以下を増幅するためのテンプレートとして使用した：（1）プライマー（g）および（i）を使用することにより、Ｎ末端でヘキサ-His-タグ（HHHHHH-エピトープ）およびC末端でFlag-タグ（DYKDDDDK-エピトープ）をコードする配列に融合した完全なE7配列を合成した（タグを有する増強されたE7：EE7T）；（2）プライマー（h）および（i）を使用することにより、最初の35残基を欠失した切断型E7（EE7TΔ1）（上記のようにHis-およびFlag-タグを含む）を合成した。
【００５０】
変異タグE7遺伝子をアガロースゲル電気泳動によりPCR反応混合物から単離し、NheIおよびEcoRIで二重消化し、同じ制限酵素で予め消化したプラスミドpIRES-Neo2（Clontech, Heidelberg, Deutschland）のマルチクローニングサイトにクローニングした。DH5α細菌の形質転換後、単一クローンを同定し、配列決定した。正確な配列を有するクローンを拡大し、対応するプラスミドを精製するために使用した。対照として、野生型E7遺伝子および最初の35残基を欠失した切断型変異体を、上記に記載されるEE7T変異体と同じ方法で両者にタグを付け、PCR（E7TおよびE7TΔ1遺伝子）によりクローン化し、続いてpIRES-Neo2プラスミドのNhelおよびEcoRI部位に挿入した。
【００５１】
PCR4由来のEE7産物をpBluescriptベクター（Stratagene, Amsterdam, Niederlande）にまたクローン化し、26〜32および70〜74残基を欠失する二重欠損変異体を生じる変異誘発に使用した。以下のように増幅のためのテンプレートとしてPCR4由来のEE7産物を使用した：（1）プライマー（g）および（i）を使用することにより、残基26〜32および70〜74を欠失し、上記のようなHis-およびFlag-タグを有するEE7T欠失変異体（EE7TΔ2,3）を作製した、（2）プライマー（h）および（i）を使用することにより、最初の35残基および残基70〜74が欠失し、上記のようにHis-およびFlag-タグを有する切断型EE7T（EE7TΔ1,3）を作製した。
【００５２】
実施例２：哺乳動物細胞におけるEE7T融合遺伝子の発現
上記実施例１記載のEE7T融合遺伝子の発現を、E7T対照と比較して免疫蛍光およびウェスタンブロット分析によりインビトロで試験した。上記プラスミドを、マウス（C-26）、サル（Vero 2-2）、およびヒト（HeLa）起源の真核細胞株を用いて一過性トランスフェクションのために使用した。細胞株Vero 2-2は、HSV-1 IE2（ICP27）遺伝子およびプロモーターを含む。この株は、最初に、R.M. Sandri-Goldinら（Smithら、Virology 186 (1992), 74-86）により確立された。発現の異なる時間で、細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、免疫検出のために処理するか、またはSDS付加緩衝液中に溶解してウェスタンブロットにより解析した。両方の場合で、E7融合タンパク質を、ヘキサ-His（抗-His-タグAb-1、Calbiochem-Novabiochem, Bad Soden, Deutschland）またはFlagエピトープ（抗-Flag M2、Sigma-Alderich, Steinheim, Deutschland）に対して特異的なマウスモノクローナル抗体で検出した。
【００５３】
免疫蛍光調製物のイメージ解析により、トランスフェクト細胞の核中の変異タンパク質の発現を示した（図６）。Flagエピトープに対するモノクローナル抗体でプローブしたウェスタンブロットは、変異誘発E7遺伝子（上記のEE7およびその欠失変異体）の発現が、野生型コドンからなる等価なE7遺伝子（VE7およびその欠失変異体）よりも少なくとも２桁高かったことを示した（図７）。
【００５４】
実施例３：E7/HBsAg融合遺伝子のクローニングおよび発現
E7の抗原性潜在力を増強するために、タグを付けたEE7オープンリーディングフレームとB型肝炎ウイルスの表面抗原（HbsAg）をコードする遺伝子との間で融合タンパク質を作製した。融合遺伝子を、HbsAgおよびEE7遺伝子のPCRクローニングにより作製した。プラスミドpRc/CMV-HBs(S)（Aldevron, Fargo, USA）は、プライマー5'-CTC GAG GAT TGG GGA-3'および5'-GAT ATC AAT GTA TAC CCA AAG A-3'を用いてHbsAg遺伝子を増幅するためのテンプレートとして働く。得られる断片は、EcoRV部位によって置換された終止コドンを除くHbsAgオープンリーディングフレームの全配列を含む。変異体EE7T遺伝子は、実施例１に記載される全長EE7遺伝子をテンプレートとして用いて、5'末端のオリゴヌクレオチドに対して5'-GAT ATC GAG GAG GAC GAG ATC GA-3'または5'-GAT ATC ATG CAC GGC GAC A-3'および3'-末端オリゴヌクレオチドに対して実施例１に記載されるオリゴヌクレオチド（i）をプライマーとして用いて変異体EE7T遺伝子を増幅した。このようにして増幅したEE7T遺伝子を、EcoRVで切断し、上記で作製されたHbsAgの3'末端に連結し、完全なEE7遺伝子またはEE7TΔ1またはΔ欠失変異体のいずれかを発現するHbsAg- EE7T融合遺伝子を作製した。
【００５５】
HbsAg-EE7T融合遺伝子をプラスミドpIRESNeo2のポリリンカーにクローン化し、マウス（C-26; 腫瘍ライブラリー、DKFZ, Heidelberg, Germany）、サル（Vero 2-2）、およびヒト（HeLa）起源の真核細胞株を用いて一過性トランスフェクションのために使用した。
【００５６】
実施例４：
１．増強HPV遺伝子の形質転換研究
HPV16およびHPV18由来のE6およびE7が形質転換能力を有することを示す実験的証拠が蓄積している。強い異種プロモーターの制御下で発現した場合、これらの遺伝子は、確立されたマウス細胞を形質転換すること（Kandaら、J.Viol. 62: 610-613, 1988; Vousdenら、Oncogene Res. 3:167-175, 1989）、および初代マウスおよびヒト包皮ケラチノサイトを不死化すること（Halbertら、J.Virol. 65:473-478, 1991; Hudsonら、J.Virol. 64: 519-526, 1990; Sedmanら、J.Virol. 65:4860-4866）が示された。
【００５７】
本発明の増強された遺伝子およびそれらの誘導体（HPV遺伝子が少なくとも50％の欠失を有する図５および他のもの等の融合タンパク質）の形質転換能力を、マウスNIH 3T3細胞および初代ヒトケラチノサイトを用いて標準的な方法により試験した。それらの野生型対応物および空プラスミドベクターを、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。
【００５８】
HPV増強遺伝子およびその融合DNA構築物をプラスミドpIRESNeo2（Clontech, Heidelberg, Deutschland）のマルチクローニングサイトにサブクローン化した。得られたプラスミドを大腸菌内で増幅し、樹脂（Quiagen, Hilden, Deutschland）上で精製し、溶出し、エタノール沈殿し、滅菌脱イオン水に再懸濁させた。DNA量および純度を、260および280nmでの吸収の分光光度測定およびアガロースゲル電気泳動により測定した。NIH 3T3細胞（ATCC, Manassas）を、L-グルタミンおよび10％ウシ胎仔血清を補充したDulbeccoの改変イーグル培地上で維持した。
【００５９】
プラスミドDNAでのNIH 3T3細胞のトランスフェクションを、本質的に製造業者により記載されるようにFuGeneTM 6トランスフェクション試薬（Roche, Mannheim, Deutschland）を用いて行った。100mmディッシュ中に3x10で播種した細胞を、翌日、３μgの試験プラスミドでトランスフェクトした。各トランスフェクションを３連で行った。37℃での48時間のインキュベーション後、トランスフェクト細胞をトリプシン処理により除去し、軟寒天でコロニー形成についてアッセイするか、３つの100mmディッシュにサブクローン化し、500μg/mlの濃度でジェネテシン（Life Technologies, karlsruhe、Deutschland）を含有する培地で選択を行う前に、37℃でさらに24時間インキュベートした。軟寒天中でのコロニー形成のアッセイのために、トリプシン処理した細胞を、60mmディッシュ当たり105細胞で成長培地中の0.4％寒天に播種し、37℃でインキュベートした。２連のディッシュを、２週間後にコロニー形成について得点づけた。ネオマイシン耐性コロニーを、サブコンフルエント細胞単層へのジェネテシンの添加により選択し、細胞をトリプシン処理し、上記のように軟寒天におけるコロニー形成についてアッセイした。
【００６０】
プラスミドDNAでの初代ヒトケラチノサイトのトランスフェクションを、上記のFuGeneTM６トランスフェクション試薬を用いて行った。ケラチノサイトを30mmディッシュでKGM培地で増殖させた（KMK2キット、Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland）。細胞を５継代で５μgのDNAでトランスフェクトした。コンフルエンスに達した後、培養物を1:2の比で分割し、１ml当たり100μgのジェネテシンで選択を行った。
【００６１】
試験した全てのHPV増強融合遺伝子は、軟寒天中でNIH 3T3細胞の病巣を作製することに失敗し、初代ヒトケラチノサイトを不死化した。
【００６２】
２．増強HPV遺伝子の免疫原性研究
増強HPV遺伝子をプラスミドpHSVPUC（Gellerら、PNAS USA87:8950-8954, 1990）にサブクローン化し、得られた組換え構築物を他で記載されるように（Cid-ArreguiおよびLim、Cid-ArreguiおよびGarcia（編）、「Viral Vectors: Basic Science and Gene Therapy」、BioTechniques Books, Eaton Publishing, Natick）アンプリコンHSV-1ベクターを作製するために使用し、これらをBALB/cマウスにおける免疫化研究のために使用した。０日目に、５匹のマウス（８週齢、雌）のグループを各免疫化実験に用いた。生理食塩血清中の50μlの懸濁物中の103〜104ウイルス粒子を皮下に播種した。14日目に、第２の用量の製剤を同じ方法で適用した。28日目に、マウスを放血させた。
【００６３】
E6およびE7への血清抗体応答を、標準的な手順を用いて組換えE6またはE7タンパク質で被覆したプレートを用いて測定した。血清を、１mg/mlカゼイン、0.5％Tween20、0.002％アルファズリン（alphazurine）Aを含有するPBS pH7.2で希釈した。
【００６４】
プレートを洗浄した後、適切な希釈度で0.1ml/ウェルの試験血清を添加し、プレートを38℃で１時間インキュベートした。結合抗体を検出するために、上記のように補充したPBS pH7.2中の0.1mlの0.1μg/mlの西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG+IgM（HおよびL鎖特異的）を添加した。プレートを20℃で１時間インキュベートし、0.5％Tween 20を有するPBS pH7.2で６回洗浄した。次いで、0.1mlの基質TMB（3,3',5,5'テトラメチルベンジジン、Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland）を添加した。20℃での10分のインキュベーションの後、50μlの0.5M H2SO4の添加により反応を停止させた。比色測定を垂直ビーム分光光度計で450nmで行った。
【００６５】
増強HPV E6およびE7遺伝子を別々にまたは本発明に記載のように融合遺伝子として発現するベクターで免疫した全てのマウスは、免疫化後に非増強対照により導かれるよりも明らかに高い有意な応答を生じた。
【００６６】
実施例５：合成EHBsAg-S融合遺伝子の作製
Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）の小さい抗原（HBsAg-S）は、ヌクレオカプシドの参加を有さない空粒子に細胞由来脂質膜とともに自己集合する能力を有するエンベロープタンパク質である。これらのサブウイルス粒子は、22nmの直径の球状または糸状の形態として作製される。これは、プレゴルジ画分の管腔に出芽し、次いでカーゴとして分泌される。サブウイルス粒子が、変性または可溶性ウイルスタンパク質よりも有効な免疫応答を誘導すると考えられる。さらに、それらは、複製可能でなく、非感染性である。
【００６７】
本実施例は、HBsAg-SのＣ末端に融合された発癌性生殖HPV型のE6および／またはE7遺伝子のB-およびT-細胞エピトープを含有する組換えHBsAg-S粒子の開発、およびマウスにおいてこれらの粒子により誘導される体液性免疫応答を記載する。
【００６８】
１．合成HBsAg-S遺伝子の作製および発現
合成HBsAg-S遺伝子は、インビトロで作製され、これは完全に、好ましいヒトコドンからなるオープンリーディングフレームを作製する155個のサイレント変異を含む。５’末端のインフレームのEcoRV部位で開始する遺伝子の融合を可能にするEcoRV制限部位を作製する２つの余分のコドン（GATATC）を終止コドンのすぐ前に付加した。得られた遺伝子をEHBsAg-S-F（融合用増強HBsAg）と命名した。
【００６９】
合成EHBsAg-S-F遺伝子は、以下のオリゴヌクレオチド：
2004531253.tif 000004
2004531253.tif 000005
を用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の連続工程により作製された。
【００７０】
合成EHBsAg-F遺伝子は、以下の４つのPCR工程を介して作製された：
【００７１】
第１の工程では、プライマーEH1およびEH2（PCR 1A用）、EH3およびEH4（PCR 1B用）、EH5およびEH6（PCR 1C用）、EH7およびEH8（PCR 1D用）、EH9およびEH10（PCR 1E用）、ならびにプライマーEH11およびEH12（PCR 1F用）を用いて、テンプレートを使用せずに鎖伸長により断片を作製した。
【００７２】
第２の工程では、PCR 1Aおよび1B（PCR 2A用）、1Cおよび1D（PCR 2B用）、ならびに1Eおよび1F（PCR 2C用）の産物を利用して、プライマーEH1およびEH4（PCR 2A）、EH5およびEH8（PCR 2B）、ならびにEH9およびEH12（PCR 2C）を用いてユニークな断片を増幅した。
【００７３】
第３の工程では、PCR 2Aおよび2Bの産物を使用して、プライマーを用いることなくユニークな断片（PCR 3）を増幅した。
【００７４】
最後のPCR工程では、PCR3および2Cの産物を混合して使用し、プライマーEH1およびEH12を用いてユニークな断片（PCR 4）を増幅した。
【００７５】
得られる全長EHBsAg-S-F遺伝子（715塩基対長、図８）を、アガロースゲル電気泳動によりPCR反応混合物から単離し、精製し、pIRES-Neo2プラスミド（Clontech）のポリリンカーにおけるユニークなEcoRV部位にクローン化した。得られるプラスミド（pIN-EHBsAg-S-F）を、DH5α細菌から精製し、EHBsAg-F遺伝子の配列を、ポリリンカーの上流および下流にハイブリダイズするプライマーを用いてDNA配列決定により確認した。
【００７６】
EHBsAg-S-F遺伝子の発現を、一過性トランスフェクト細胞の免疫蛍光およびウェスタンブロット分析により試験した。この目的のために、プラスミドpIN-EHBsAg-Fを、EffecteneTM（Qiagen）またはFuGeneTM（Roche）を用いて、マウス（C-26）、サル（Vero 2-2）、およびヒト（HeLa）起源の真核生物細胞株にトランスフェクトした。発現の異なる時間に（24および48時間）、細胞をパラホルムアルデヒドで固定化し、免疫蛍光のために処理するか、またはSDSローディングバッファー中で溶解させ、ウェスタンブロットにより解析した。両方の場合に、EHBsAg-S-Fタンパク質を、HBsAg-Sに特異的なマウスモノクローナル抗体（Aldevron）を用いて検出した。
【００７７】
免疫蛍光調製物のイメージ解析は、トランスフェクトした細胞のゴルジ画分におけるHBsAgタンパク質の発現を示した。HBsAgに対するモノクローナル抗体でプローブしたウェスタンブロットは、EHBsAg-S遺伝子を用いて、野生型HBsAg-S遺伝子をトランスフェクションのために用いた場合よりも約５〜10倍高い発現レベルを示した。
【００７８】
２．合成EHBsAg-S融合遺伝子の作製
合成HPV遺伝子とのEHBsAg-S-Fの融合は、実施例１に記載され、図３に示されるEE7T合成遺伝子に関する以下に記載のストラテジーに従って作製された。5'末端にEcoRV部位を含むHPV-16 EE7T遺伝子が、以下のプライマー：
2004531253.tif 000006
を用いるPCRによってpIRESNeo2/EE7Tプラスミドから増幅された。
【００７９】
プライマー167HLF5'および167HL3aのペアを、全長EE7Tを増幅するために使用した。ペア167HSF5'および167HL3aを用いて、最初の35コドンを欠失した切断型EE7T遺伝子（EE7TΔ1）を増幅した。得られた断片をT4-DNAポリメラーゼ、T4-ポリヌクレオチドキナーゼで連続的に処理し、EcoRVで制限し、QiaexII（Qiagen）を用いて精製した。最後に、断片を、EcoRVおよびStuIで切断したプラスミドpIN-EHBsAg-S-Fに別々に挿入した。得られた融合（それぞれ、プラスミドpIN-EHBsAg-S-EE7TおよびpIN-EHBsAg-S-16EE7T、図９、およびpIN-EHBsAg-S-16EE7T?1）の配列を配列決定により確認した。
【００８０】
EHBsAg-S-16EE7T遺伝子の発現を、一過性トランスフェクト細胞の免疫蛍光およびウェスタンブロット解析により試験した。プラスミドpIN-EHBsAg-S-16EE7TおよびpIN-EHBsAg-S-16EE7T?1を、 EffecteneTM（Qiagen）またはFuGeneTM（Roche）を用いて、マウス（C-26）、サル（Vero 2-2）、およびヒト（HeLa）起源の真核生物細胞株に別々にトランフェクトした。発現の異なる時間に（24および48時間）、細胞をパラホルムアルデヒドで固定化し、免疫蛍光（図１０）のために処理するか、またはSDSローディングバッファー中で溶解させ、ウェスタンブロットにより解析した。両方の場合、EHBsAg-S-16EE7Tタンパク質を、HBsAg-S（Aldevron）および抗flag抗体（M2 mAb, Sigma）に対して特異的なマウスモノクローナル抗体を用いて検出した（図１１）。
【００８１】
３．合成EHBsAg-S-16EE7T融合遺伝子でのマウスの免疫化
EHBsAg-S-16EE7T融合タンパク質の免疫原性を、BALB/cマウスにおいて試験した。０日目に、３匹のマウス（10〜12週齡、雌）の８つグループを、40μlのバッファーTN（50mM Tris-HCl pH7.4, 100mM NaCl, 0.5mM EDTA）中のEHBsAg-S-16EE7Tを発現する104個の感染性単位の単純ヘルペスアンプリコンで皮下（背部、頭部近く）に、筋肉内（前脛骨筋）または皮下および筋肉内の両方に播種した。第２の用量を、15日目に全ての群に投与した。
【００８２】
全てのマウスを15および25日目に放血させた。EHBsAg-S-16EE7Tに対する血清抗体応答をEIAにより測定した。Nunc96マルチウェルプレートを、50mM炭酸バッファーpH9.5中の４M尿素中に10μg/mlで0.1ml/ウェルにて２時間37℃にてインキュベートすることにより組換えHBsAg-Sタンパク質で被覆した。バッファーを吸引し、プレートを、PBS pH7.2中の1mg/mlのカゼインの0.2ml/ウェルで37℃にて１時間インキュベートした。次いで、プレートをPBS pH7.2、0.5％（v/v）Tween20で６回洗浄した。試験血清をPBS pH7.2、0.5％（v/v）Tween20で希釈し、1mg/mlのカゼインを添加し、プレートを37℃で１時間インキュベートした。次いで、プレートをPBS pH7.2、0.5％（v/v）Tween20で６回洗浄した。結合抗体を0.1ml/ウェルのPBS pH7.2、0.5％（v/v）Tween20、1mg/mlのカゼイン中の0.1μg/mlの西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG+IgMを添加することにより検出した。プレートを20℃で１時間インキュベートし、PBS pH7.2、0.5％（v/v）Tween20で６回洗浄し、0.1mlの酵素基質（3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン/H2O2）とともに10分間インキュベートした。反応を、50μlの0.5M H2SO4の添加により停止した。呈色をプレートリーダーで450nmにて測定した（図１２）。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１はHPV16 EE7T-配列を示す。HPV-16の変異誘発E7遺伝子（EE7T）のヌクレオチド配列および由来するアミノ酸配列（一文字コード）が示される。好ましいヒトコドンのオープンリーディングフレームを作製するために導入されるサイレント変異は、太字で表される。ヘキサ-His-タグおよびFlag-タグをコードする配列に下線を付する。停止コドンをアスタリスクで示す。
【図２】図２はHPV16 EE6T-配列を示す。変異誘発E6遺伝子のヌクレオチド配列および由来するアミノ酸配列（一文字コード）が示される。好ましいヒトコドンのオープンリーディングフレームを作製するために導入されたサイレント変異は太字で表される。ヘキサ-His-タグおよびFlag-タグをコードする配列に下線を付する。停止コドンをアスタリスクで示す。
【図３】図３は、HPV18 EE7T-配列を示す。HPV-18（EE7T）の変異誘発E7遺伝子のヌクレオチド配列および由来するアミノ酸配列（一文字コード）が示される。好ましいヒトコドンのオープンリーディングフレームを作製するために導入されたサイレント変異が太字で表される。ヘキサ-His-タグおよびFlag-タグをコードする配列に下線を付する。停止コドンをアスタリスクで表す。
【図４】図４は、HPV18 EE6T-配列を示す。HPV-18の変異誘発E6遺伝子（EE6T）のヌクレオチドおよび由来するアミノ酸配列（一文字コード）が示される。好ましいヒトコドンのオープンリーディングフレームを作製するために導入されたサイレント変異は太字で表される。ヘキサ-his-タグおよびFlag-タグをコードする配列に下線を付する。停止コドンをアスタリスクで表す。
【図５】図５は、HbsAg-EE7T融合遺伝子を示す。HbsAg-EE7T融合タンパク質のヌクレオチドおよび由来のアミノ酸配列（一文字コード）が示される。融合断片を３点により分離する。好ましいヒトコドンのオープンリーディングフレームを変換するためにHPV-16のE7遺伝子（EE7T）に導入されたサイレント変異は太字で表される。Flag-タグをコードする配列に下線を付する。停止コドンをアスタリスクで表す。
【図６】図６は、変異遺伝子EE7TおよびE7TによりコードされるHPV-16E7融合タンパク質の発現の共焦点イメージ分析を示す。カーバースリップ上で増殖したVero細胞を、「FuGene」トランスフェクション試薬（Roche, Basel Schweiz）を用いてプラスミドpIRES-Neo2/EE7TまたはplRES-Neo2/E7Tいずれかでトランスフェクトした（Roche, Basel Schweiz）。細胞を48時間インキュベートし、２％パラホルムアルデヒドで固定化し、0.2％Triton X-100で透過処理し、抗Flag M2モノクローナル抗体（Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschlandおよびcy2に結合したヤギ抗マウス抗体（Dianova, Hamburg, Deutschland））との連続したインキュベーションにより染色した。
【図７】図７は、EE7TおよびE7T遺伝子によりコードされるHPV-16 E7融合タンパク質の発現のウェスタンブロット解析を示す。HeLa細胞を図６に記載されるようにトランスフェクトした。24時間後、細胞をSDS緩衝液中で溶解させ、タンパク質をPAGE（15％ポリアクリルアミド）により分離し、PVDF膜、Immobilion-P、Millipore、Eschborn、Deutxsch）に移し、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した抗Flag M2モノクローナル抗体にハイブリダイズさせ、活性をECLアッセイにより検出した。
【図８】図８は、合成EHBsAg-S-F遺伝子の配列およびその翻訳を示す。好ましいヒトコドンのオープンリーディングフレームを作製するために導入されたサイレント変異は上付き文字で表される。EcoRV部位の配列に下線を付する。アミノ酸配列を一文字コードによりヌクレオチド配列の下に示す。
【図９】図９は、EHBsAg-S-16EE7T融合遺伝子の配列を示す。EE7Tの最初のコドンに下線を付する。
【図１０】図１０は、pIN-EHBsAg-S-EE7TでトランスフェクトされたVero細胞の免疫蛍光を示す。細胞をトランスフェクションの48時間後に溶解させ、４％パラホルムアルデヒドで融合し、PBS中の0.1％（v/v）Triton X-100で透過処理し、ブロックした。EHBsAg-S-EE7T融合タンパク質の免疫検出を抗Flag M2抗体（Sigma）、続いてCy2（緑色）結合抗マウス抗体（Molecular Probes）を用いて行った。核をヨウ化プロビジウムで対比染色した。
【図１１】図１１は、pIN-EHBsAg-S-EE7TでトランスフェクトされたVero細胞のウエスタンブロット解析を示す。細胞をトランスフェクションの48時間後に溶解させ、当量の抽出物を10％SDS-アクリルアミドゲルに負荷した。PVDF膜に移し、ブロッキングした後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Sigma）に結合した抗Flag M2抗体を用いて免疫検出を行った。
【図１２】図１２は、BALB/cマウスにおいて処理されたEHBsAg-S-16EE7T融合タンパク質の免疫原性を示す。
【図１】
2004531253.tif 000007
【図２】
2004531253.tif 000008
【図３】
2004531253.tif 000009
【図４】
2004531253.tif 000010
【図５（ａ）】
2004531253.tif 000011
【図５（ｂ）】
2004531253.tif 000012
【図６】
2004531253.tif 000013
【図７】
2004531253.tif 000014
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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