(57)【要約】ＶＳＶの他にＨＣＶ、ＧＢＣ／ＨＧＶ、およびＢＶＤを含むフラビウイルス科ウイルスならびにリポタンパク質との複合体を形成することができるその他のウイルスによる感染を防止する方法であって、その方策は、複合体が形成される場合には、複合体の形成を阻止すること、一旦形成した複合体の形成を阻止すること、そのような複合体の構造を変化させて細胞受容体との相互作用を阻害すること、受容体に対する抗体を用いて複合体に対して細胞受容体を遮断すること、可溶性リポタンパク質受容体またはそのフラグメントを用いてリポタンパク質複合体の細胞受容体との結合を遮断すること、または細胞のＬＤＬ受容体活性をダウンレギュレートすることである方法。
2004529080.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポタンパク質との複合体を形成することができるウイルスによる細胞の感染を防止する方法であって、前記リポタンパク質複合体の形成を阻止することおよび前記ウイルスおよびリポタンパク質を解離させることのうち少なくとも１つを含む方法。
【請求項２】
ウイルスが、フラビウイルス科ウイルスもしくは水疱性口内炎ウイルス、またはＬＤＬまたはＶＬＤＬと複合体を形成するその他のウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞の感染が、前記リポタンパク質複合体の形成を阻害することによって防止される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記リポタンパク質複合体の形成が、前記リポタンパク質のウイルス結合部位に対するリガンドまたは抗体により阻害される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記リポタンパク質複合体の形成が、前記ウイルスのリポタンパク質結合部位に対するリガンドまたは抗体により阻害される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
細胞の感染が、前記ウイルスおよびリポタンパク質を解離させることによって防止される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
リポタンパク質との複合体を形成することができるウイルスによる細胞の感染を防止する方法であって、細胞にリパーゼを導入することを含み、前記リパーゼが、ウイルス−リポタンパク質複合体の構造変化を引き起こすことができる方法。
【請求項８】
細胞の感染を防止する方法であって、有効量の抗低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体抗体（抗ＬＤＬＲ）を導入することを含み、前記抗ＬＤＬＲが、ＬＤＬ受容体のリガンド結合ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１〜３７５）に含まれる少なくとも１つのエピトープと結合する方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つのエピトープが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸２５〜６５、または６５〜３７４間にある、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのエピトープが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸２５〜６５間に含まれるＬＤＬ受容体のリガンド結合ドメインの第一繰り返し中にある、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞の感染を防止する方法であって、有効量の抗アポリポタンパク質（ａｐｏ）Ｂ１００抗体を導入することを含み、前記抗ａｐｏＢ１００抗体が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸２８３５と４１８９間のａｐｏＢ１００のＬＤＬ受容体結合ドメインに含まれる少なくとも１つのエピトープと結合する方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのエピトープが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸２９８０〜３０８４間のａｐｏＢ１００のＬＤＬ受容体結合ドメインに含まれる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞の感染を防止する方法であって、有効量の抗ａｐｏＥ抗体を導入することを含み、前記抗ａｐｏＥ抗体が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸１〜１９１または２１６〜２９９間のａｐｏＥのＬＤＬ受容体結合ドメインに含まれる少なくとも１つのエピトープと結合する方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのエピトープが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸１３９〜１６９間のａｐｏＥのＬＤＬ受容体結合ドメインに含まれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
細胞の感染を阻害する方法であって、ＬＤＬ受容体のリガンド結合ドメインの可溶性第５繰り返し（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１９３〜２３１）を含む有効量のペプチドを導入することを含み、前記ペプチドフラグメントがａｐｏＢおよびａｐｏＥのうち少なくとも１つの受容体結合ドメインと結合する方法。
【請求項１６】
前記ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸６６〜３５４を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸６６〜３７５を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸２５〜３５４を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸２５〜３７５を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１〜３５４を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１〜３７５を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記ペプチドが可溶性ＬＤＬ受容体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
生物体の感染を治療する方法であって、治療上有効な量の抗ａｐｏＥ抗体または抗ａｐｏＢ抗体のうち少なくとも１つを投与することを含む方法。
【請求項２４】
生物体の感染を治療する方法であって、ＬＤＬ受容体の可溶性第５繰り返し（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１９３〜２３１）を含む治療上有効な量のペプチドを投与することを含む方法。
【請求項２５】
前記ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸６６〜３５４を含む、請求項２４に記載の生物体の感染を治療する方法。
【請求項２６】
前記ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸６６〜３７５を含む、請求項２４に記載の生物体の感染を治療する方法。
【請求項２７】
前記ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸２５〜３５４を含む、請求項２４に記載の生物体の感染を治療する方法。
【請求項２８】
前記ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸２５〜３７５を含む、請求項２４に記載の生物体の感染を治療する方法。
【請求項２９】
前記ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１〜３５４を含む、請求項２４に記載の生物体の感染を治療する方法。
【請求項３０】
前記ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１〜３７５を含む、請求項２４に記載の生物体の感染を治療する方法。
【請求項３１】
前記ペプチドが可溶性ＬＤＬ受容体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を含む、請求項２４に記載の生物体の感染を治療する方法。
【請求項３２】
フラビウイルス科ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、またはＬＤＬまたはＶＬＤＬと複合体を形成するその他のウイルスによる生物体の感染を防止する方法であって、前記生物体の細胞上のリポタンパク質受容体を遮断することを含む方法。
【請求項３３】
前記リポタンパク質受容体に対する抗体を遮断剤として用いる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
哺乳動物における感染を防止する方法であって、ＬＤＬ受容体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のリガンド結合ドメイン中の少なくとも１つのエピトープと結合する抗ＬＤＬＲ抗体の有効量を導入することを含む方法。
【請求項３５】
前記抗ＬＤＬＲ抗体が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸２５〜６５間に含まれるリガンド結合ドメインの第一繰り返し中の少なくとも１つのエピトープと結合し、感染の前記防止がコレステロール代謝に有害な効果を伴わずに起きる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
細胞の感染を防止する方法であって、前記細胞のリポタンパク質受容体活性をダウンレギュレートすることを含む方法。
【請求項３７】
生物体の感染を治療するための医薬組成物であって、ＬＤＬ受容体のリガンド結合ドメインの可溶性第５繰り返し（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１９３〜２３１）を含むペプチドの治療上有効な量および製薬的に許容される坦体または希釈剤を含む薬剤組成物。
【請求項３８】
前記ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸６６〜３５４を含む、請求項３７に記載の薬剤組成物。
【請求項３９】
前記ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸６６〜３７５を含む、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
前記ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸２５〜３５４を含む、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
前記ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸２５〜３７５を含む、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
前記ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１〜３５４を含む、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１〜３７５を含む、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
前記ペプチドが可溶性ＬＤＬ受容体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を含む、請求項３７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０００年１０月２５日出願のＡｇｎｅｌｌｏ等による米国仮出願番号６０／２４３，５９４の優先権を主張し、これを参照により本明細書に組み込むこととする。
【０００２】
（連邦政府資金による研究に関する陳述）
本特許出願を援助する研究は、部分的に国立保健研究所グラント１Ｒ２１ＡＩ４０６７２によって資金提供された。
【０００３】
（発明の背景）
発明の分野
本発明は、リポタンパク質と複合体を形成することができるウイルスの細胞エンドサイトーシスを阻害する方法に関する。より具体的には、本発明は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）または超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）と複合体を形成することができるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ＧＢ型ウイルスＣ／Ｇ型肝炎ウイルス（ＧＢＣ／ＨＧＶ）およびウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）を含む他のフラビウイルス科ウイルス、ならびに水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、およびその他のウイルスによる感染を低密度リポタンパク質受容体を介する細胞中へのこのようなウイルスの侵入を阻止することによって防止する方法に関する。
【０００４】
関連技術の説明
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は、欧米において最もよく見られる血液性感染症であり、慢性肝炎および肝細胞癌の主な原因である。細胞培養系ではＨＣＶが容易に複製されないため、ＨＣＶ感染および増殖の機序を解明することは困難とされてきた。
【０００５】
ＨＣＶ感染と混合型クリオグロブリン血症との関連性が最近になって証明された。すなわち、混合型クリオグロブリン血症の研究から、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＨＣＶエンドサイトーシスの機序に関する間接的証拠が得られている。混合型クリオグロブリン血症は、血液中の低温沈殿性免疫グロブリンと関係している全身性血管炎である。ＨＣＶ感染と混合型クリオグロブリン血症との強い関連性が証明され（Ｍｏｎｔｉ等（１９９５）Ｑ．Ｊ．Ｍｅｄ．８８、１１５〜２６）、ポリクローナルＩｇＧおよびモノクローナルＩｇＭからなるＩＩ型混合クリオグロブリン中にＨＣＶが特異的に集積することが明らかにされた（Ａｇｎｅｌｌｏ他（１９９２）Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７、１４９０〜５）。また、超低密度リポタンパク質がＩＩ型クリオグロブリン中のＨＣＶと選択的に会合していることも分かった（Ａｇｎｅｌｌｏ、Ｖ．、（１９９７）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｈｔｏｌ．１９、１１１〜１２９）。Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＩＳＨ）を用いたＩＩ型クリオグロブリン血症における皮膚の血管病変に関する研究では、想定された複製型（マイナス鎖）ウイルスではなく、ＨＣＶのＲＮＡビリオン型（プラス鎖）ウイルスが皮膚の血管病変におけるケラチノサイト中で検出され、同一患者の正常な皮膚におけるケラチノサイト中では検出されなかった（Ａｇｎｅｌｌｏ他（１９９７）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．４０、２００７〜１５）。さらに、正常な皮膚に比べて、皮膚の血管炎病変におけるケラチノサイト上でＬＤＬ受容体がアップレギュレートされていることが明らかになった（Ａｇｎｅｌｌｏ他（１９９７）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．４０、２００７〜１５）。さらに、抗βリポタンパク質が感染血清からＨＣＶを沈殿させることが明らかとなった（Ｔｈｏｍｓｓｅｎ他、（１９９２）Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１、２９３〜３００）。
【０００６】
しかしながら、ＨＣＶに関する細胞受容体、すなわち細胞中にＨＣＶが侵入すると想定される部位、および感染が開始する機序は不明のままであった。細胞受容体の候補としてＣＤ８１分子が提唱されたが（（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２、９３８）、この仮説は未確認のままである。
【０００７】
ＨＣＶの細胞侵入、すなわちエンドサイトーシス、の機序を解明できないことが、ＨＣＶ感染を阻止するための薬物療法を開発する妨げとなった。これまでは、インターフェロンα（ＩＦＮ）がＨＣＶ患者を治療するのに用いられる主な薬物であったが、ＩＦＮは部分的に有効であるに過ぎない。具体的には、ＩＦＮを単独で用いた場合には５〜４０％、リバビリンと併用した場合には６０％までのウイルス寛解率を維持した。これらの薬物はウイルスの複製を阻害すると考えられているが、両薬物の作用機序はいまだ具体的に明らかになっていない。
本発明の目的は、ウイルスの細胞エンドサイトーシスを阻害する方法を開発するために細胞中へのＨＣＶ侵入の機序を確認し、それによって感染を阻止することである。
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、リポタンパク質との複合体を形成することができるＶＳＶの他にＨＣＶ、ＧＢＣ／ＨＧＶ、およびＢＶＤＶを含むフラビウイルス科ウイルスならびにその他のウイルスの細胞エンドサイトーシスを、ＬＤＬ受容体を介するこれらのウイルスのエンドサイトーシスを抑止することによって阻止する方法に関する。具体的には、本発明は、リポタンパク質との複合体を形成することができるウイルスによる感染を、リポタンパク質とウイルス間の複合体の形成を阻止すること、形成したそのような複合体を解離させること、そのような複合体の構造を変化させて細胞受容体との相互作用を阻害すること、受容体に対する抗体を用いて複合体の細胞受容体を遮断すること、可溶性リポタンパク質受容体またはそのフラグメントを用いてリポタンパク質複合体の細胞受容体との結合を遮断すること、または細胞のＬＤＬ受容体活性をダウンレギュレートすることによって阻止する方法に関する。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
本発明の目的は、ＨＣＶ感染を防止するための治療方法を発見するためにＨＣＶのエンドサイトーシスの機序を解明することである。
発明者は、ＨＣＶおよびフラビウイルス科ウイルスファミリーの他のメンバーがＬＤＬ受容体によるエンドサイトーシスを受けることを最終的に確認した。この結論を支持する直接証拠は、抗ＬＤＬ受容体抗体およびＨＣＶのエンドサイトーシスを阻止することが知られているＬＤＬエンドサイトーシスの生化学的阻害剤を用いるＬＤＬ受容体阻害試験により得られた。さらに、ＣＤ８１が細胞内へのＨＣＶの侵入を仲介しないことが確定した。さらに、ＬＤＬはＨＣＶの細胞内侵入の主な機序であると考えられているが、ＨＣＶを接種したＬＤＬ欠失線維芽細胞中で少量のＨＣＶが検出され、ＨＣＶエンドサイトーシスのもう１つの機序が存在することが示唆された。
【００１０】
以前に、発明者は、ＬＤＬ受容体を介するＨＣＶのエンドサイトーシスには、ウイルスと、ＨＤＬではなくＶＬＤＬまたはＬＤＬとの間で複合体を形成することが必要であるという未知の発見を行った。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験の他に、ヒトＬＤＬ受容体トランスジェニックマウスを用いるｉｎ  ｖｉｖｏ試験は、生物体におけるＨＣＶのエンドサイトーシスの機序およびＨＣＶを阻止する可能性のある治療剤の生理学的効果を研究するためのモデルを提供する。具体的には、ＬＤＬ受容体を介するＨＣＶのエンドサイトーシスがｉｎ  ｖｉｖｏで明らかにされ、アトルバスタチンおよびインターフェロンαの効果が調べられた。インターフェロンは、ＬＤＬ受容体をダウンレギュレートし、ＨＣＶのエンドサイトーシスを減少させることが分かった。
【００１１】
ＨＣＶのＬＤＬ受容体仲介性エンドサイトーシスの妨害が感染を防止するか否かを判定するため、ヒト以外でＨＣＶに生産的に感染させることができる唯一の動物種であるチンパンジーで試験を行った。ＨＣＶ感染チンパンジーでは、感染についてのＬＤＬ受容体に対する抗体の投与の効果を、ＨＣＶ感染の治療に現在使用されている薬物であるＩＦＮによる治療と比較した。
【００１２】
本発明を、その範囲に制限をつけることなく以下の実施例を参照してより詳細に説明する。
材料および方法
シクロヘキサンジオン、フェニルアルシンオキシド（ＰＡＯ）、ヘパリン硫酸、およびエチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入し、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンヨウ素（ＤｉＩ）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）から購入した。精製ＩｇＧ２ａマウスモノクローナル抗ＬＤＬ受容体抗体（Ｃ７クローン）は、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から入手した。抗ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）エンベロープ抗体ウシ血清α４９は、Ｍａｒｃ  Ｓ．Ｃｏｌｌｅｔｔ博士（Ｖｉｒｏ  Ｐｈａｒｍａ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＰＡ）より提供を受けた。マウスモノクローナルＩｇＧ２ａ抗ＣＤ１６、抗ＣＤ１９、および抗トランスフェリン（ＣＤ７１）は、Ｉｍｍｕｎｏ  Ｔｅｃｈ（Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ）から購入した。抗μは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）から購入した。抗アポリポタンパク質（αａｐｏ）ＥおよびＡ−Ｉは、Ｃｏｒｔｅｘ（Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）から購入し、αａｐｏＢは、Ｓｉｇｍａから購入した。精製マウスモノクローナルＩｇＧαａｐｏ  Ｅ（１Ｄ７）、αａｐｏ  Ａ−Ｉ（３Ｇ１０）、およびαａｐｏ  Ｂ（４Ｇ３）は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｔｔａｗａ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｏｔｔａｗａ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）から購入した。マウスＩｇＧのＦ（ａｂ’）２調製物は、マウスモノクローナル抗体を３７℃においてｐＨ３．５の３％ペプシン（Ｓｉｇｍａ）で３０分から１０時間処理することにより調製した。ＨＲ１０／３０Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いるカラムクロマトグラフィーによりＦ（ａｂ’）２フラグメントを単離した。ＢＶＤＶ非含有ドナー子ウシ血清は、Ｂｏｙｔ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｎｅｏｓｈｏ、ＭＯ）から購入した。正常血清からのＶＬＤＬ、ＬＤＬ、および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の調製には臭化カリウム密度勾配超遠心分離法を用い、これらのリポタンパク質を感染血清からのＨＣＶと複合体形成させた。ＶＬＤＬバンド、ｄ＝０．９５〜１．００６ｇ／ｍｌ、ＬＤＬバンド、ｄ＝１．０１９〜１．０６３ｇ／ｍｌ、およびＨＤＬバンド、ｄ＝１．０６３〜１．２１ｇ／ｍｌ、ならびにリポタンパク質を含まないＨＣＶ、ｄ＞１．２１ｇ／ｍｌ、を吸引により単離し、次いで０．０１％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有するＨａｎｋｓの平衡塩類溶液（Ｓｉｇｍａ）に対して透析した。単離したＨＣＶ−ＶＬＤＬをデオキシコレートで処理することによりＨＣＶとＶＬＤＬに解離させ、以前に記載されたようにショ糖密度勾配超遠心分離法により分画した（Ｐｒｉｎｃｅ他（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔ．３、１１〜１７）。レシチンで前処理したＳｕｐｅｒｏｓｅ６カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上のカラムクロマトグラフィーによりリポタンパク質を含有しない高密度ＨＣＶ分画をさらに分画した。空隙容量中に存在するＨＣＶのピークは少量の免疫グロブリンに汚染されており、固定化したｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｅｄｈａｍ、ＭＡ）を用いて除去した。少量のタンパク質を検出するための免疫ブロット法（ドットブロット）は、以前に記載されたように行った（Ａｇｎｅｌｌｏ他（１９８６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４、１８０９〜１４）。アッセイの感度は、ＩｇＧおよびＩｇＭについては１００ｐｇであり、アポリポタンパク質ＢおよびＥについては２００ｐｇであった。リポタンパク質は、市販のキット（Ｓｉｇｍａ）を用いるＬｏｗｒｙアッセイにより定量した。高度精製ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、およびＨＤＬは、Ｃｏｒｔｅｘから購入した。ＤｉＩによるＬＤＬの標識化は、以前に記載されたように行った（Ａｒｎｏｌｄ他（１９９２）ｉｎ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｃｏｎｖｅｒｓｅ、Ｃ．Ａ．、Ｓｋｉｎｎｅｒ、Ｅ．Ｒ．編（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ｐｐ．１４５〜１６８）。
【００１３】
ＨＣＶ（３×１０８ミリリットル当たりのゲノム等量［ｇＥ／ｍｌ］）、ＧＢウイルスＣ／Ｇ型肝炎ウイルス（ＧＢＣ／ＨＣＶ）（２×１０９ｇＥ／ｍｌ）、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）用のストックとして、感染したヒト血清を用いた。ＢＶＤＶのＮＹ−１株は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＮＡＤＬ）から入手し、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、インディアナ株、およびＲＳウイルスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手した。ウシ鼻甲介（ＢＴ）および腎臓（ＭＤＢＫ）細胞株、ＨｅｐＧ２、肝細胞と生化学的に類似した肝臓癌細胞（Ｋｎｏｗｌｅｓ他（１９８０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２０９、４９７〜４９９）、Ｄａｕｄｉ、Ｂ細胞リンパ芽球状細胞株、Ｍｏｌｔ−４細胞株ＨＥｐ２、扁平上皮癌細胞株、ならびに正常線維芽細胞（ＭＲＣ−５）は、ＡＴＣＣから入手した。Ｂリンパ球系Ｇ４およびＥ１１は、それぞれＩＩ型クリオグロブリン血症患者および関節リウマチ患者からの末梢Ｂ細胞とのＦ３Ｂ６ヒト−マウスヘテロハイブリドーマの融合体から作製した。普通の患者からクローニングされた３５Ｇ６末梢Ｂ細胞株の発生は、以前に記載されている（Ｋｎｉｇｈｔ他（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８、１９０３〜１９１１）。４種類のＬＤＬ受容体陰性細胞株、ＧＭ００４８８Ｃ、ＧＭ０２０００Ｆ、ＧＭ００７０１Ｂ、およびＧＭ３０４０Ｂは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ）から入手した。ＢＶＤＶ（ＣＲＩＢ）感染に耐性の細胞は、Ｒ．Ｏ．Ｄｏｎｉｓ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｂｒａｓｋａ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）により提供を受けた。
【００１４】
ＬＤＬ受容体アッセイ：１０％ＢＶＤＶ非含有子ウシ血清を添加したＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）培地または１０％リポタンパク質欠乏性ＢＶＤＶ非含有培地を添加したＲＰＭＩ培地中で細胞を培養し、ＬＤＬ受容体の発現をアップレギュレートさせた。次いで、ｐＨ７．２のリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）で細胞を２回洗浄した。サイトスピン調製物を作製し、アセトンで固定し、５％正常マウス血清でブロックし、５μｇ／ｍｌの精製ＩｇＧ２ａモノクローナル抗ＬＤＬ受容体抗体、続いてフルオレセイン（ＦＩＴＣ）標識ヤギ抗マウス［Ｆ（ａｂ）’２］第二抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）の１：５０希釈液と共にスライドをインキュベートすることによりＬＤＬ受容体を可視化した。付着細胞、ＭＤＢＫ、ＣＲＩＢ、線維芽細胞、ＨｅｐＧ２、およびＨＥｐ２上のＬＤＬ受容体の証明は、細胞の単層を培養してスライド上に固定したこと以外は同様に行った。
【００１５】
細胞によるＤｉＩ−ＬＤＬのエンドサイトーシスの証明は、以前に記載されたように、５％ＣＯ２中３７℃で２時間２×１０５個の細胞を２０μｇ／ｍｌのＤｉＩ−ＬＤＬと共にインキュベートすることにより行った（Ｙｅｎ他（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ１７７、５５〜６７）。細胞を冷たいＰＢＳで２回洗浄して１％緩衝パラホルムアルデヒドで固定し、蛍光顕微鏡試験のためにサイトスピン調製物を作製するか、懸濁液中の細胞をフローサイトメトリーにより分析した。フローサイトメトリー分析は、５７５ＢＰフィルタを用いるＥｐｉｃ  ＸＬ−ＭＣＬサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｉａｍｉ、ＦＬ）を使用して行った。シクロヘキサンジオンで処理したＤｉＩ−ＬＤＬを用いてＤｉＩ−ＬＤＬの非特異的結合を測定し、ＤｉＩ−ＬＤＬ結合から差し引くと、培養細胞に対して特異的なＤｉＩ−ＬＤＬ結合が得られた。
【００１６】
ＨＣＶ  ＲＮＡおよびエンドサイトーシスアッセイ：ＨＣＶ  ＲＮＡは、以前に記載されたように、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＩＳＨ）により検出した（Ａｇｎｅｌｌｏ他（１９９８）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２８、５７３〜８４）。ＨＣＶについてのＩＳＨ法の特異性は、３×１０７ｇＥ／ｍｌのＨＣＶまたは２４時間で細胞中に病理学的変化を生じたアデノウイルスもしくはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の希釈液のどちらかを接種したヒト線維芽細胞の単層を比較することによって測定した。３７℃における２４時間のインキュベーション後、ＩＳＨによりＨＣＶ  ＲＮＡについて培養液をアッセイした。ＨＣＶのエンドサイトーシスアッセイは以前に記載されたように行った（Ａｇｎｅｌｌｏ他（１９９８）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２８、５７３〜８４）。５×１０５個のＤａｕｄｉ細胞に３×１０７ｇＥのＨＣＶまたはＧＢＣ／ＨＧＶを接種し、３７℃で３時間インキュベートし、３回洗浄し、ＩＳＨにより細胞質内のＨＣＶ  ＲＮＡまたはＧＢＣ／ＨＧＶ  ＲＮＡについてアッセイした。ＧＢＣ／ＨＧＶ  ＲＮＡについてのＲＴ−ＰＣＲおよびＩＳＨアッセイは、以前に記載されたように行った（Ｌｉｕ他（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ７９、１４９〜１５９）。ＨＣＶ−リポタンパク質組み換え体による試験にも同一の方法を用いた。正常ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬまたはシクロヘキサンジオン処理ＶＬＤＬもしくはＬＤＬの各々１００マイクログラムを、リポタンパク質を含まないＨＣＶ１０６ｇＥおよび免疫グロブリンと共に３７℃で３０分間インキュベートし、次いでＤａｕｄｉ細胞に添加した。
【００１７】
細胞溶解性ウイルスのＢＶＤＶ、ＮＡＤＬ、ＶＳＶ、およびＨＳＶについては、それぞれのウイルスの様々な希釈液を細胞の単層と共に４℃で１時間インキュベートし、冷たいＰＢＳで３回洗浄し、新鮮培地と共にインキュベートした。ＢＶＤＶおよびＶＳＶの場合には７２時間目に、ＨＳＶの場合には４８時間目に完全な細胞溶解を生じるウイルス希釈液を選択した。細胞質内ＢＶＤＶの免疫蛍光検出は、抗ＢＶＤＶ血清およびＦＩＴＣ標識抗ウシ第二抗体の１：５０希釈液を用い、アセトン固定スライド上で行った。細胞中のＢＶＤＶの存在は、ＢＶＤＶ特異的プライマー（Ｐｅｌｌｅｒｉｎ他（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２０３、２６０〜８）を用いるＲＴ−ＰＣＲにより確認した。
【００１８】
阻害試験：抗体（抗ＬＤＬ受容体、５〜２０μｇ／ｍｌ；対照抗血清、５〜２００μｇ／ｍｌ）または阻害剤の様々な希釈液によるＬＤＬ受容体の遮断は、様々な濃度の抗血清または阻害剤により３７℃で１５分間前処理し、細胞を洗浄することなくウイルスを接種することにより行った。インキュベーション期間中の抗血清の添加は４５分間隔で行った。シクロヘキサンジオンによるＬＤＬおよびＶＬＤＬの処理は、以前に記載されたように行った（Ｓｈｅｐｈｅｒｄ他（１９７９）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．２０、９９９〜１００６）。細胞変性ウイルスによる実験では、４℃でウイルスを接種する前に５０μｇ／ｍｌの抗ＬＤＬ受容体抗体により４℃で３０分間細胞を前処理した。
【００１９】
ＰＡＯによるエンドサイトーシスの阻害は、以前に記載されたように最終ＰＡＯ濃度０．１〜１００μＭの範囲で細胞を前処理することにより評価し（Ｋｒｅｕｔｚ他（１９９６）Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．４２、１３７〜１４７）、次いでＬＤＬまたはＨＣＶのエンドサイトーシスを、それぞれＤｉＩ−ＬＤＬアッセイまたはＨＣＶ−ＩＳＨにより、以前に記載されたように評価した。
【００２０】
実施例１：ＬＤＬ受容体を介するＨＣＶのエンドサイトーシス
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＨＣＶのエンドサイトーシスが接種材料中のＨＣＶの力価と相関することは以前に立証されている。ＩＳＨにより測定されるＨＣＶ  ＲＮＡが陽性の細胞の割合は、ＲＴ−ＰＣＲにより測定される細胞当たりのＨＣＶのｇＥ数と直接相関していた（Ａｇｎｅｌｌｏ他（１９９８）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２８、５７３〜８４）。また、ＨＣＶ  ＲＮＡについてのＩＳＨ染色の強度とＲＴ−ＰＣＲによる細胞当たりのｇＥ  ＨＣＶとの間には大ざっぱな相関が認められた。ＨＣＶに関するこのＩＳＨアッセイの特異性を図１に示す。ＨＣＶを接種して２４時間後にＨＥｐ２細胞が褐色に染色されたことは、プラスストランドＨＣＶの存在を示している（図１Ａ）。対照的に、ＲＳウイルスまたはアデノウイルス（それぞれ図１Ｂおよび１Ｃ）を接種したＨＥｐ２細胞は、同じＩＳＨを用いてＨＣＶに関する染色を示さない。
【００２１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて細胞によるＨＣＶのエンドサイトーシスをさらに検討すると、抗ＬＤＬ受容体抗体またはＤｉＩ−ＬＤＬ取り込みを用いることにより様々なヒト細胞培養液がＬＤＬ受容体を有していることが明らかとなった。次いで、これらの細胞株に高力価ＨＣＶ陽性ヒト血清を接種した。次いで、ＩＳＨを用いて細胞内ＨＣＶ  ＲＮＡを検出した。ＨＣＶのエンドサイトーシスが細胞上のＬＤＬ受容体発現のレベルと相関するか否かを判定するため、ＬＤＬ受容体に関するよく知られているリポタンパク質の変調効果を用い、リポタンパク質欠乏培地中で培養することにより細胞上のＬＤＬ受容体数を増加（アップレギュレート）させた。様々な培養細胞株によるＬＤＬのエンドサイトーシスにおける相対的な差は、ＤｉＩ−ＬＤＬの特異的取り込みにより証明されると思われる。表１に示すように、ＨｅｐＧ２細胞の特異的ＤｉＩ−ＬＤＬ取り込みは、アップレギュレートしない末梢Ｂ細胞株Ｇ４の取り込みの４倍を超えていた。これらのＢ細胞をアップレギュレートすると、アップレギュレートしないＨｅｐＧ２細胞に匹敵するＬＤＬ取り込みを生じた。これらの結果は、抗ＬＤＬ受容体抗体染色を用いる免疫蛍光試験およびＤｉＩ−ＬＤＬ取り込みにより確認された。具体的には、図２Ａに示すように、Ｇ４細胞上のＬＤＬ受容体のアップレギュレーションが抗ＬＤＬ受容体抗体で可視化された。図２Ｂは、アップレギュレートされたＧ４細胞によるＤｉＩ−ＬＤＬ５μｇの取り込みを示している。図２Ｃに示すように、過剰の非標識ＬＤＬによりＤｉＩ−ＬＤＬの取り込みを完全に阻害することができる。ＩＳＨを用いて立証されるように、Ｇ４細胞のＬＤＬ受容体がアップレギュレートされた結果、ＨｅｐＧ２細胞（図３Ｅ）およびＤａｕｄｉ細胞（図３Ｇ）（高密度のＬＤＬ受容体を有していることも知られている（Ｙｅｎ他（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１７７、５５〜６７））上で７０〜８０％の細胞がＬＤＬ受容体陽性に染色された。
【表１】
2004529080.tif 000003
【００２２】
抗ＬＤＬ受容体抗体またはＤｉＩ標識ＬＤＬを用いる免疫蛍光検査法により、ＩＳＨによりＨＣＶが陽性である細胞の割合は、ＬＤＬ受容体が陽性である細胞の割合と相関していることが分かった。アップレギュレートされた場合にルーチン培地中で５〜３０％の弱い陽性細胞を示した末梢Ｂ細胞（図３Ａ）によるＨＣＶのエンドサイトーシスは、各々７０〜８０％陽性であったＨｅｐＧ２細胞（図３Ｅ）およびＤａｕｄｉ細胞（図３Ｇ）に匹敵する陽性細胞の割合および染色の強度（図３Ｂ）を示した。
【００２３】
ＬＤＬ受容体がＨＣＶのエンドサイトーシスを仲介する直接証拠は、抗ＬＤＬ受容体抗体によりエンドサイトーシスを阻害することによって得られた。ＨＣＶのエンドサイトーシスは、細胞を抗ＬＤＬ受容体抗体と共にプレインキュベートすることにより用量依存的に阻害されると思われる。十分な抗ＬＤＬ受容体抗体の濃度では、Ｇ４細胞とＨｅｐＧ２細胞の双方についてウイルスのエンドサイトーシスの完全な阻害が立証されると思われる。図３Ｄに示すように、アップレギュレートされたＧ４細胞によるＨＣＶエンドサイトーシスは、抗ＬＤＬ受容体抗体による細胞の前処理によって阻害される。同様に、ＨｅｐＧ２細胞によるＨＣＶエンドサイトーシスは、抗ＬＤＬ受容体抗体により遮断される（図３Ｆ）。これらの実験における接種材料として、感染血清またはＩＩ型クリオグロブリンから単離したＶＬＤＬ−ＨＣＶ複合体を用いて同様の結果が得られた。抗ＬＤＬ受容体の最小阻害濃度の２０倍までの濃度で、対照マウスＩｇＧ２ａまたは特異的細胞表面抗原に対する抗血清について阻害は観察されなかった。末梢Ｂ細胞およびＤａｕｄｉ細胞上のμ重鎖、ＣＤ−１９、およびＣＤ−１６表面抗原に対する抗血清ならびにＨｅｐＧ２細胞上のトランスフェリン受容体に対する抗血清は、これらの細胞によるＨＣＶのエンドサイトーシスを阻害しなかった。さらに、エンドサイトーシス阻害剤ＰＡＯにより濃度２μＭでＤａｕｄｉ細胞を処理すると、ＨＣＶのエンドサイトーシスを完全に阻害した（図３Ｇ、３Ｈ）。
【００２４】
ＨＣＶのエンドサイトーシスにおけるＬＤＬ受容体の役割は、ＬＤＬ受容体に結合しないことが知られているＨＤＬではなく、ＬＤＬおよびＶＬＤＬによる競合的阻害を立証することにより確認された。肝臓癌細胞（ＨｅｐＧ２）またはＢ細胞（Ｇ４およびＥ１１）を用い、２５〜１００μｇ／ｍｌのＬＤＬまたはＶＬＤＬはＨＣＶのエンドサイトーシスを完全に阻害したが、２００μｇ／ｍｌまでの濃度（それぞれＬＤＬおよびＶＬＤＬよりも５〜２０倍および１０〜４０倍モル過剰）のＨＤＬは阻害しなかった。ＶＬＤＬおよびＬＤＬに見られる主なアポリポタンパク質であるアポリポタンパク質ＥおよびＢのＬＤＬ受容体結合部位における重要なアルギニン残基を変化させることが知られているシクロヘキサンジオン（Ｓｈｅｐｈｅｒｄ他（１９７９）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．２０、９９９〜１００６）によるＬＤＬまたはＶＬＤＬの処理は、ＬＤＬまたはＶＬＤＬによる阻害を消失させた。さらに、ヘパリン硫酸２５単位／ｍｌまたは２μＭＥＧＴＡはＨＣＶのエンドサイトーシスを阻害した。どちらもリポタンパク質のＬＤＬ受容体エンドサイトーシスの公知の阻害剤である（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ他（１９９５）Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２５、４７９〜４８５）。
【００２５】
さらに、ＣＤ８１はＨＣＶのエンドサイトーシスを仲介しないことが明らかとなった。図４Ａおよび４Ｂに示すように、二重免疫蛍光顕微鏡法を用い、Ｄａｕｄｉ細胞上のＬＤＬ受容体およびＣＤ８１抗原の存在を立証した。細胞遠心分離法（ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）によりプラスに帯電したスライド上でＤａｕｄｉ細胞を調製し、室温（ＲＴ）で５分間冷アセトン−メタノール１：１中で固定し、空気乾燥し、正常マウス血清および５％正常ウサギ血清を含有するｐＨ７．４のリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）（ブロッキングバッファー）によりＲＴで１５分間ブロックした。次いで、ブロッキングバッファー（ＲＴ）中のＪＳ−６４抗ＣＤ８１マウスモノクローナル抗体（ＩｍｍｕｎｏＴｅｃｈ、Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ）の１：５０希釈液およびビオチン化ウサギ抗抗ＬＤＬ受容体抗体の１：１００希釈液と共に３０分間スライドをインキュベートし、ＰＢＳで４回洗浄し、次いでブロッキングバッファーに溶かしたフルオレセインイソチオシアニン（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎｉｎｅ）（ＦＩＴＣ）標識抗マウスＩｇＧの１：５０希釈液およびストレプトアビジン−フィコエリトリ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｅｉｎ）の１：２００希釈液と共に暗所で３０分間インキュベートした。第一の抗体を省略して調製した陰性対照は蛍光を示さず、この細胞株上にＬＤＬ受容体とＣＤ８１が共に存在することを示した。次いで、ＲＰＭＩ１６４０（２ｍＭ  Ｌ−アルギニンおよび２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有する１０％リポタンパク質欠乏ドナー子ウシ血清）の最終容積９００μｌ／管の１２×７５培養管中で、培地単独（図４Ｃおよび４Ｄ）、５μｇ／ｍｌ抗ＬＤＬ受容体抗体（図４Ｅ）、または６μｇ／ｍｌＪＳ−６４モノクローナル抗ＣＤ８１抗体（図４Ｆ）と共に１０５個のＤａｕｃｉ細胞をＲＴで３０分間プレインキュベートした。３本の管の各々にＨＣＶ陽性血清（３×１０７ｇＥ／ｍｌ）１００μｌを加えた（図４Ｄ〜Ｆ）。陰性対照にはＰＢＳ１００μｌを加えた（図４Ｄ）。さらに、培養インキュベーター中、３７℃で３時間、管をインキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、１％緩衝ホルマリン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）０．３ｍｌを加えることにより固定した。細胞を処理し、以前に記載されたようにＩＳＨを行った。ＨＣＶに曝露しなかった細胞は陰性であった（図４Ｃ）。ＨＣＶ陽性血清でのみ処理した細胞でＨＣＶエンドサイトーシスが見られた（図４Ｄ）。ＨＣＶ接種前の抗ＬＤＬ受容体抗体によるＤａｕｄｉ細胞の前処理は、ウイルスのエンドサイトーシスを阻害したが（図４Ｅ）、抗ＣＤ８１抗体による前処理は阻害しなかった（図４Ｆ）。可溶性ＬＤＬ受容体の適当な可溶性フラグメントのみを用いて阻害を実現することができる。例えば、８４１アミノ酸のＬＤＬ受容体（図６Ｂ）の以下のフラグメントはエンドサイトーシスを阻害するのに有効のはずである。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸６６〜３５４；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸６６〜３７５；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸２５〜３５４；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸２５〜３７５；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１〜３５４；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ���１〜３７５；および特に、ＬＤＬ受容体の可溶性第５繰り返しに相当するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１９３〜２３１。
【００２６】
さらに、可溶性ＣＤ８１ではなく、可溶性ＬＤＬ受容体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）によるＤａｕｄｉ細胞によるＨＣＶのエンドサイトーシスの阻害が立証された（図５）。ＨＣＶを接種し３７℃で２時間インキュベートしたＤａｕｄｉ細胞は、褐色の細胞質染色を示し、ＨＣＶのプラスストランドの存在を示した（図５Ｂ）。３７℃で３０分間の可溶性ＬＤＬ受容体による前処理は、非接種対照細胞（図５Ａ）に匹敵する染色を欠くことから明らかなように、ＨＣＶのエンドサイトーシスを完全に阻害する（図５Ｃ）。しかしながら、可溶性ＣＤ８１による前処理はエンドサイトーシスを阻害しなかった（図５Ｄ）。
【００２７】
リポタンパク質がＨＣＶのエンドサイトーシスに関与しているか否かを判断するため、これまでに特徴が明らかにされた、アポリポタンパク質（αａｐｏＥ  ＩＤ７（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ他（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８、１２３４８〜１２３５４）、αａｐｏＢ  ４Ｇ３（Ｐｅａｓｅ他（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５、５５３〜５６８）、およびαａｐｏＡ−Ｉ３Ｇ１０（Ｍａｒｃｅｌ他（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６、３６４４〜３６５３）に対する様々な抗血清を用いて阻害試験を行った。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを調製し、すべての試験に用いた。調製物の阻害活性を正常血清から単離したＤｉＩ標識ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、およびＨＤＬに対して試験した。エンドサイトーシスを阻害するための最適なＦ（ａｂ’）２抗体濃度および条件を決定した。最適条件には、インキュベーション期間中に前処理後のＦ（ａｂ’）２の添加が必要であり、ＶＬＤＬエンドサイトーシスの最大阻害にはαａｐｏＥとαａｐｏＢが共に必要であったが、ＬＤＬエンドサイトーシスの最大阻害にはαａｐｏＢで十分であった。これらの条件の下で、実現したＨＣＶエンドサイトーシスの最大阻害は６５％であり、残りの陽性細胞はわずかな染色を示したに過ぎなかった。αａｐｏＡ−Ｉによる前処理では１０％阻害が得られ、残りの陽性細胞は、対照に比べても染色の減少は示さなかった。インキュベーション中のαａｐｏＡ−Ｉの添加は、阻害を増加させなかった。αａｐｏＥとαａｐｏＢが共に必要とされ、インキュベーション中のＦ（ａｂ’）２添加が阻害を増加させるという知見は、ＶＬＤＬ代謝の複雑さおよび３７℃におけるＦ（ａｂ’）２結合の解離に起因している可能性が高かった。したがって、ＶＬＤＬ単独またはＶＬＤＬとＬＤＬの双方がＨＣＶのエンドサイトーシスを仲介するのか否かを判断することはできないであろう。さらに、完全な阻害が実現できていないため、ＬＤＬ受容体によるＨＣＶの直接エンドサイトーシスを除外することができなかった。
【００２８】
単離したＨＣＶ−リポタンパク質複合体のエンドサイトーシス実験ならびにＨＣＶおよびリポタンパク質についての再結合実験から、ＬＤＬ受容体を介するＨＣＶのエンドサイトーシスにおけるリポタンパク質の役割に関するより決定的データが得られた。ＨＣＶ−ＶＬＤＬ複合体の解離によるＨＣＶの単離には成功しなかった。しかしながら、高濃度のＨＣＶを含有する血清の密度勾配分画法は、ＨＣＶリポタンパク質分画ばかりでなくリポタンパク質を含まない高密度のＨＣＶ分画を生じた。高密度のＨＣＶ分画に混入している免疫グロブリンを除去すると、再結合試験のための「遊離」ＨＣＶ分画が得られた。様々な分画のエンドサイトーシスの比較を表２に示す。ＨＣＶ−ＨＤＬまたは高密度ＨＣＶではなく、ＨＣＶ−ＶＬＤＬまたはＨＣＶ−ＬＤＬ分画がエンドサイトーシスを受けた。「遊離」ＨＣＶへ正常血清から単離したＨＤＬではなくＶＬＤＬまたはＬＤＬを添加した結果、エンドサイトーシスが回復した。ＶＬＤＬまたはＬＤＬのシクロヘキサンジオン処理は、救出を打ち消した。
【表２】
2004529080.tif 000004
【００２９】
さらに、ＬＤＬ受容体のリガンド結合ドメイン（図６Ａ）がａｐｏＢ１００（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：２）上の残基２９８０〜３０８４または残基２８３５〜４１８９間に少なくとも１個のエピトープを含むａｐｏＢ１００上の特異的結合部位によりＬＤＬと結合することが分かった。結合は、ＬＤＬ受容体分子（図６Ｂ）（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ：１）の残基１９３〜２３２または６６〜３７５間の少なくとも１個のエピトープにより仲介される。ＶＬＤＬのＬＤＬ受容体との結合は、ａｐｏＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）上の残基１〜１９１および２１６〜２９９の間に少なくとも１個のエピトープを含むａｐｏＥ上の特異的結合部位により仲介される。ａｐｏＥとの結合は、ＬＤＬ受容体分子の第５繰り返し配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１９３〜２３１）により仲介される（図６Ａ、Ｂ）。ＬＤＬ受容体のリガンド結合ドメインの第１繰り返しは、ＬＤＬおよびＶＬＤＬのどちらとの結合にも関与していないが、第１繰り返し中の少なくとも１個のエピトープを対象とする抗体は、ＬＤＬまたはＶＬＤＬと複合体を形成したＨＣＶのエンドサイトーシスを阻害する。
【００３０】
ＬＤＬ受容体を欠く線維芽細胞（Ｍａｈｌｅｙ他（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２、７２７９〜７２８７）を用いてさらに試験を行った。これらの細胞にＨＣＶを接種すると、ほんの弱いエンドサイトーシスを示し、リポタンパク質欠乏培地中で細胞をプレインキュベートしても増加せず、抗ＬＤＬ受容体抗体による阻害もされなかった。さらに、この低レベルのエンドサイトーシスは、過剰のＶＬＤＬで競合的に阻害することはできなかった。
【００３１】
実施例２：エンドサイトーシスを受けたＨＣＶの複製
ＨＣＶの複製は、ＨｅｐＧ２（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ他（１９９５）Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２５、４７９〜４８５）およびＤａｕｄｉ（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ他（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８、１２３４８〜１２３５４）細胞培養液中で報告されている。複製を確認するために、ＨｅｐＧ２、ＤａｕｄｉおよびＧ４細胞の長期培養をＩＳＨにより連続的に試験した。ＨｅｐＧ２細胞では、１週間までにプラスストランドＨＣＶのみが細胞中に検出されたが、３週目には８５％の細胞がプラスストランドＨＣＶを含み、６５％がマイナスストランドＨＣＶを含んでいた。４週目には、細胞はＨＣＶに関して陰性となった。Ｄａｕｄｉ細胞では、１０日目まではプラスストランドのみが検出されたが、１５および２０日目にはプラスストランドおよびマイナスストランドゲノム配列が８０％の細胞に存在した。細胞は培養４週目に死滅した。Ｇ４細胞では１週までにＨＣＶのプラスストランドのみが検出され、細胞は１週後に死滅した。
【００３２】
実施例３：他のフラビウイルス科ウイルスのエンドサイトーシス
ペスチウイルスのＢＶＤＶに汚染されていることが知られている市販のウシ血清（Ｎｕｔｔａｌｌ他（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ、２６６、８３５〜８３７およびＹａｎａｇｉ他（１９９６）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７４、１３２４〜１３２７）について検討した。ウシ血清を含有する培地中でルーチン的に培養されたヒト細胞株は、抗ＢＶＤＶ抗体を用いる免疫蛍光検出法により細胞質内ＢＶＤＶに関して陽性であることが分かった。ＢＶＤＶの存在は、ＢＶＤＶ特異的プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによって確認された。マイナスストランドＢＶＤＶは感染に非許容性の（複製を許容しない）細胞中には検出されなかった。ＢＶＤＶ陽性のヒト非許容性細胞は、非汚染培地における４週間の培養期間が終わると陰性になった。非許容細胞によるＢＶＤＶのエンドサイトーシスは、対照抗トランスフェリン受容体抗体ではなく、抗ＬＤＬ受容体抗体により完全に阻害されると考えられる。
【００３３】
ＢＶＤＶの細胞変性ＮＡＤＬ株および許容性細胞であるＢＴまたはウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞を用いると、対照抗血清ではなく、抗ＬＤＬ受容体抗体は、３日目に細胞変性効果および陽性蛍光を阻害した（図７Ａ〜Ｄ）。抗ＢＶＤＶ抗体を用いる免疫蛍光検出法は、７２時間のインキュベーション後に細胞変性ＢＶＤＶ（ＮＡＤＬ株）によるＢＴ細胞単層の感染を示した（図７Ａ；位相差顕微鏡法を用いて同領域を図７Ｂに示す）。抗ＬＤＬ受容体抗体によるＢＴ細胞単層のプレインキュベーションは感染を完全に阻害する（図７Ｃ；位相差顕微鏡法による同領域を図７Ｄに示す）。感染の５日後には、阻害された細胞と対照細胞は共に完全に細胞溶解した。ＶＳＶおよびＨＳＶを用いて同様の試験を行った。ＨＳＶに関しては抗ＬＤＬ受容体による感染の阻害は見られなかった。図７Ｅは、ＨＳＶを接種したＭＲＣ−５線維芽細胞を示している。ウイルスではなく抗ＬＤＬ受容体抗体で処理した対照ＭＲＣ−５細胞に比べ、単層の広範な細胞溶解および破壊が４８時間後に明らかとなった（図７Ｉ）。抗ＬＤＬ受容体抗体による単層の前処理は、細胞溶解および細胞死を阻止しなかった（図７Ｆ）。図７Ｇは、ＶＳＶを接種したＭＲＣ−５細胞を示しており、単層の細胞変性および破壊を招いている。抗ＬＤＬ受容体抗体による単層の前処理は、細胞破壊のある程度の阻害を示した（図７Ｈ）。
【００３４】
ＬＤＬ受容体によるＢＶＤＶのエンドサイトーシスに関する別の証拠は、ＢＶＤＶに耐性の細胞株であり、許容性ウシ腎臓細胞株ＭＤＢＫに由来するＣＲＩＢを用いて得られた。図８に図示するように、ＢＶＤＶの侵入を許さないＣＲＩＢ細胞（Ｆｌｏｒｅｓ他（１９９５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２０８、５６５〜５７５）ではＬＤＬのエンドサイトーシスも見られない。具体的に、図８Ｅは、抗ＢＶＤＶ抗体を用いる免疫蛍光検出法による７２時間のインキュベーション後のＢＶＤＶのＮＹ−１非細胞変性菌株によるＭＤＢＫ細胞の感染を示している（位相差顕微鏡法による同領域を図８Ｆに示す）。対照的に、ウイルスを接種したＣＲＩＢ細胞株には免疫蛍光検出法によってＢＶＤＶは認められなかった（図８Ｇ；位相差顕微鏡法による同領域を図８Ｈに示す）。しかしながら、ＤｉＩ−ＬＤＬ染色のないことがＬＤＬ受容体およびＬＤＬのエンドサイトーシスがないことのより感度の良い印であるのは、ＤｉＩ−ＬＤＬの蓄積がコレステロール代謝の途中でＬＤＬ受容体によるＬＤＬの速やかな代謝回転から生じるためである。ＭＤＢＫ細胞はＤｉＩ−ＬＤＬの激しい取り込みを示している（図８Ａ；位相差顕微鏡法を用いた同領域を図８Ｂに示す）。図８Ｃは、ＣＲＩＢ細胞によるＤｉＩ−ＬＤＬのエンドサイトーシスの欠如を示している（位相差顕微鏡法を用いた同領域を図８Ｄに示す）。
【００３５】
フラビウイルス科の３番目のメンバーであるＧＢ型ウイルスＣ／ＨＧＶ（ＧＢＣ／ＨＧＶ）は、血中でリポタンパク質と会合すると報告されている（Ｓａｔｏ等（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２２９、７１９〜７２５）。図９に図示するように、ＬＤＬ受容体が仲介するこのウイルスのエンドサイトーシスに関する証拠も得られた。具体的に、ＧＢＣ／ＨＧＶを接種したＤａｕｄｉ細胞は、このウイルスに特異的なＩＳＨを用いて細胞質中のＨＧＶビリオンの存在を示す（図９Ａ）。抗ＬＤＬ受容体抗体による細胞のプレインキュベーションは、ウイルスの取り込みをＩＳＨの検出限界以下に減少させた（図９Ｂ）。
【００３６】
実施例４：ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＨＣＶのエンドサイトーシス
ＬＤＬ受容体はコレステロール代謝を制御している。したがって、遺伝的異常によって引き起こされる受容体の欠乏は、高コレステロール血症（ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｍｉａ）の結果として致命的な疾患を引き起こす。実施例１〜３により明らかなように、抗ＬＤＬ受容体抗体のＬＤＬ受容体との結合は、細胞培養におけるＨＣＶのエンドサイトーシスを阻害するが、抗体のＬＤＬ受容体との結合が高コレステロール血症によるｉｎ  ｖｉｖｏにおける恐ろしい生理学的結果を引き起こすか否かをこれらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験から判断することはできない。また、受容体上の結合部位に対して抗体と競合すると思われる循環における大量のリポタンパク質によるｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＨＣＶのエンドサイトーシスを遮断することにおいて抗ＬＤＬ抗体が有効であるかどうかを判断することはできない。抗ＬＤＬ受容体抗体は、抗体そのものが疾患を引き起こす場合には、ＨＣＶ感染を治療するためにＨＣＶを治療するための治療剤として使用することはできないと思われる。
【００３７】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＨＣＶのＬＤＬ受容体仲介性エンドサイトーシスの機序を解明し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗ＬＤＬ抗体投与に関する実行可能性および毒性試験のモデルを得るために、ヒトＬＤＬ受容体トランスジェニック（ｈＬＤＬＲ  Ｔｇ）マウスを開発した。これらのマウスは肝細胞上でヒトＬＤＬ受容体を過剰発現する。マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターの制御の下でヒトＬＤＬ受容体のリガンド結合ドメインの完全コード領域（図６Ａ、Ｂ）がトランスジェニックマウスに存在する。これらのマウスに挿入されたヒトＬＤＬ受容体遺伝子のバージョンは、マウスＬＤＬ受容体遺伝子と区別できるように、完全遺伝子のイントロン５〜７の配列を欠いている。ｈＬＤＬＲ遺伝子はカドミウム（Ｃｄ）または亜鉛（Ｚｎ）の存在下に発現される。すなわち、遺伝子の過剰発現は、低レベルのコレステロールによって明らかにされたように、７日間飲料水でＺｎＳＯ４を与えられたトランスジェニックマウスを生じる。
【００３８】
肝臓における肝細胞中のＬＤＬ受容体を介するＨＣＶのエンドサイトーシスは、トランスジェニックマウスを用いて明らかにされるであろう（図１０）。ＨＣＶ（３．２×１０６ｇＥ）の接種の１時間後に採取したｈＬＤＬＲ  Ｔｇマウスの肝生検の切片上で行ったＨＣＶ  ＲＮＡについてのＩＳＨは腹腔内に褐色の細胞質染色を示し、ビリオン形態（プラスストランド）のＨＣＶの存在を示した（図１０Ａ）。ＨＣＶ接種１時間前の抗ＬＤＬ受容体抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメント１．９ｍｇによる前処理はＨＣＶのエンドサイトーシスを完全に阻害する（図１０Ｂ）。マウスＩｇＧ２ｂのＦ（ａｂ’）２フラグメント（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）（マウス抗ＬＤＬ受容体抗体にマッチしたアイソタイプ）１．９ｍｇによる前処理はＨＣＶのエンドサイトーシスを阻害しなかった（図１０Ｃ）。ＬＤＬ受容体に対する抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントをこれらのマウスで用い、抗原と結合して補体を活性化する分子のＦｃ部分によって引き起こされる可能性のある毒性を取り除いた。肝臓１グラム当たり１ｍｇの投与量で注入した場合にはＦ（ａｂ’）２抗体によるマウスに対する有害作用はなく、ごくわずかに血中コレステロール値が上昇したが一過性であった（表３）。
【表３】
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【００３９】
ｈＬＤＬ  ＴｇマウスにおけるＨＣＶのエンドサイトーシスの同様の阻害は、可溶性の第５繰り返しペプチドを用いて得られると考えられる（図１１）。ＨＣＶ  ＲＮＡについてのＩＳＨを用い、リガンド結合ドメインであるＬＤＬ受容体の第一ドメインの３９アミノ酸第５繰り返しによるｈＬＤＬＲ  Ｔｇマウスの肝細胞によるＨＣＶのエンドサイトーシスの阻害を明らかにした。ＨＣＶ（５．０×１０６ｇＥ）の接種の１時間後に採取したｈＬＤＬＲ  Ｔｇマウスの肝生検の切片上で行ったＨＣＶ  ＲＮＡについてのＩＳＨは腹腔内に褐色の細胞質染色を示し、ビリオン形態（プラスストランド）のＨＣＶの存在を示した（図１１Ｂ）。前述のように、ＨＣＶ接種１時間前の抗ＬＤＬ受容体抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメント１．９ｍｇによる前処理はＨＣＶのエンドサイトーシスを完全に阻害する（図１１Ａ）。同様に、ＨＣＶ接種１時間前の第５繰り返しペプチド１ｍｇによる前処理はＨＣＶのエンドサイトーシスを完全に阻害する（図１１Ｃ）。
【００４０】
実施例５：ＩＦＮおよびアトルバスタチンの効果
スタチン系薬物は、ＬＤＬ受容体をアップレギュレートすることによって血中コレステロールを低下させる。ＨＣＶの接種前にｈＬＤＬＲ  Ｔｇマウスにアトルバスタチンを投与すると、ＬＤＬ受容体活性およびウイルスのエンドサイトーシスが増加する（図１２）。具体的に、アトルバスタチン０．５ｍｇで前処理した後でＨＣＶを接種したＴｇマウスの肝切片は、蛍光染色によりＬＤＬ受容体のアップレギュレーションを示す（図１２Ｃ；図１２Ｆは、ＨＣＶ  ＲＮＡに対してＩＳＨを用いる同一マウスの肝切片の肝細胞によるＨＣＶのエンドサイトーシスが増加したことを示している）。対照的に、ＩＦＮ０．１Ｍｕで前処理し、次いでＨＣＶを接種したＴｇマウスの肝切片による蛍光のないことは、生理的食塩水で前処理し、ＨＣＶを接種し、接種１時間後に致死させた対照肝切片（図１２Ａ；図１２ＤにおいてＨＣＶ  ＲＮＡのためのＩＳＨによって示される褐色の細胞内染色は、肝細胞におけるＨＣＶの局在化に対応する）に比べてＬＤＬ受容体のダウンレギュレーションを示す（図１２Ｂ；図１２Ｅは、ＩＳＨシグナルを示さず、肝細胞によるＨＣＶエンドサイトーシスの欠如を示す）。３匹のマウスの肝臓についての定量的ＨＣＶ試験は、（Ｄ）、（Ｅ）および（Ｆ）におけるＩＳＨ試験と一致していた。対照マウスは肝臓１ｍｇ当たり４３ＨＣＶｇＥを有し、ＩＦＮ治療マウスは肝臓１ｍｇ当たり９．３ＨＣＶｇＥを有し、アトルバスタチン前処理マウスは肝臓１ｍｇ当たり１６３ＨＣＶｇＥを有していた。したがって、ＨＣＶの治療薬であるＩＦＮは、ＬＤＬ受容体をダウンレギュレートし、ＨＣＶのエンドサイトーシスを減少させる。
【００４１】
アトルバスタチンと共にＩＦＮを投与すると、アトルバスタチンによるＬＤＬ受容体のアップレギュレーションおよびエンドサイトーシスの増加が打ち消される（図１３）。前述のように、アトルバスタチン０．５ｍｇで前処理し、次いでＨＣＶを接種したＴｇマウスの肝切片は、ＨＣＶ接種の前に生理的食塩水で前処理した対照マウス（図１３Ａ；図１３Ｄは、ＨＣＶ  ＲＮＡに対してＩＳＨを用いる同一マウス切片を示す）と比較した場合に、蛍光染色によりＬＤＬ受容体のアップレギュレーションを示す（図１３Ｂ；図１３Ｅは、ＨＣＶ  ＲＮＡに対してＩＳＨを用いる同一マウスの肝切片の肝細胞によるＨＣＶのエンドサイトーシスが増加したことを示している）。対照的に、アトルバスタチン０．５ｍｇとＩＦＮ０．５Ｍｕの両者で前処理し、続いてＨＣＶを接種したマウスの肝切片は、図１３Ｂに見られるＬＤＬ受容体のアップレギュレーションがＩＦＮによって打ち消されたことを示している（図１３Ｃ；図１３Ｆは、ＩＳＨを用いる同一マウスの肝切片からＨＣＶ  ＲＮＡに関するシグナルが検出されず、ＨＣＶのエンドサイトーシスの欠如を示している）。これらの結果は、ＬＤＬ受容体の変調に関してＩＦＮとアトルバスタチンは反対の効果を有し、薬剤による受容体のダウンレギュレーションは感染を防止できることを支持している。
【００４２】
実施例６：チンパンジーにおける感染の防止の証明
ＨＣＶに生産的に感染させることができるヒト以外の唯一の種はチンパンジーである。ＨＣＶに感染したヒトの研究から、ＩＦＮの投与は、ＩＦＮ１０Ｍｕの注入後２４時間以内に血中ＨＣＶ濃度の急速な低下をもたらすことが明らかとなっている。同一のＨＣＶチンパンジーにおいて（試験は１週間をおいて行う）ＩＦＮ１０ＭｕまたはＬＤＬ受容体に対するＦ（ａｂ’）２抗体２５ｍｇ／ｋｇによる治療を比較すると、ＩＦＮでは１８時間でウイルス血症に５０％の低下が見られ（図１４Ａ）、それに比べてＬＤＬ受容体に対する抗体では同時点で８６％の低下であった（図１４Ｂ）。両試験では、処理後２時間で最高となるコレステロールのわずかな減少が見られた。したがって、ＬＤＬ受容体に対する抗体の感染に対する効果はＩＦＮの効果より大きいと考えられる。
【００４３】
ＨＣＶ感染に対する現在の治療法であるインターフェロンアルファ（ＩＦＮα）の効果は、ＬＤＬ受容体のダウンレギュレーションによって部分的に仲介されている可能性がある。ＩＦＮαは、ＩＬ−１によるＩＬ−１受容体仲介性刺激を遮断するインターロイキン１（ＩＬ−１）受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ）（Ｔｉｌｇ他（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０、４６８７〜４６９２）を誘導することが知られている。ＩＬ−１はＬＤＬ受容体活性を増加させることが知られているため（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ（１９９６）Ｂｌｏｏｄ８７、２０９５〜２１４７）、ＩＦＮαはＩＬ−１ＲＡ産生を刺激することによってＬＤＬ受容体活性のダウンレギュレーションを間接的に引き起こし、それによってＩＬ−１によるＩＬ−１受容体仲介性刺激を減少させると思われる。ＬＤＬ受容体の発現に関するＩＦＮのより直接的なその他の効果も存在する可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＨＣＶについてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成法の特異性を示している。（Ａ）ＨＣＶ接種後２４時間のＨＥｐ２細胞。（Ｂ）ＲＳ（呼吸器合胞体）ウイルスとインキュベートしたＨＥｐ２細胞。（Ｃ）アデノウイルスとインキュベートしたＨＥｐ２細胞。元の倍率は５００倍である。
【図２】
Ｇ４細胞におけるＬＤＬ受容体のアップレギュレーションを示している。（Ａ）抗ＬＤＬ受容体抗体を用いて可視化したアップレギュレートされたＧ４細胞上のＬＤＬ受容体。（Ｂ）アップレギュレートされたＬＤＬ受容体を有するＧ４細胞によるＤｉＩ−ＬＤＬの取り込み。（Ｃ）Ｇ４細胞によるＤｉＩ−ＬＤＬのエンドサイトーシスの阻害。（Ｄ）Ｇ４細胞によるＤｉＩ−ＬＤＬのエンドサイトーシスの阻害を示す位相差顕微鏡法。元の倍率は５００倍である。
【図３】
リンパ球および肝臓癌細胞上のＬＤＬ受容体を介してＨＣＶのエンドサイトーシスが行われ、エンドサイトーシスの量は細胞中のＬＤＬ受容体の濃度と相関することを示している。（Ａ）ＬＤＬ受容体がアップレギュレートされていないＨＣＶ接種Ｇ４細胞のＨＣＶ  ＩＳＨ。（Ｂ）ＬＤＬ受容体がアップレギュレートされているＧ４細胞中のＨＣＶ  ＩＳＨ。（Ｃ）（Ｂ）で示したより高倍率の下でのアップレギュレートされたＬＤＬ受容体を有するＨＣＶ感染Ｇ４細胞。（Ｄ）ＨＣＶ接種前に抗ＬＤＬ受容体抗体で前処理したＬＤＬ受容体がアップレギュレートされたＧ４細胞。（Ｅ）ＩＳＨが示すように、ＨｅｐＧ２肝臓癌細胞株によるＨＣＶの取り込み。（Ｆ）ＨＣＶのエンドサイトーシスを阻止するためのＬＤＬ受容体抗体によるＬＤＬ受容体の遮断。（Ｇ）ダウディ（Ｄａｕｄｉ）細胞のＨＣＶ陽性血清とのインキュベーション。（Ｈ）ＨＣＶのエンドサイトーシスを阻止するためのＤａｕｄｉ細胞のＰＡＯによる前処理。（Ａ）、（Ｂ）、（Ｅ）および（Ｆ）の元の倍率は５００倍であり、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｇ）および（Ｈ）の元の倍率は１２５０倍である。
【図４】
ＬＤＬ受容体はＨＣＶのエンドサイトーシスを仲介するがＣＤ８１は仲介しないことを示している。（Ａ）および（Ｂ）二重免疫蛍光検査法によるＤａｕｄｉ細胞上にＬＤＬ受容体およびＣＤ８１抗原が存在することの証明。（Ｃ）〜（Ｆ）Ｄａｕｄｉ細胞によるＨＣＶのエンドサイトーシスおよび抗ＬＤＬ受容体抗体によるエンドサイトーシスの阻害の証明。（Ｃ）ＨＣＶに曝露されていないＤａｕｄｉ細胞。（Ｄ）ＨＣＶを接種されたＤａｕｄｉ細胞。（Ｅ）ＨＣＶ接種Ｄａｕｄｉ細胞の抗ＬＤＬ受容体前処理。（Ｆ）ＨＣＶ接種Ｄａｕｄｉ細胞の抗ＣＤ８１前処理。元の倍率は５００倍である。
【図５】
Ｄａｕｄｉ細胞によるＨＣＶのエンドサイトーシスに対する可溶性ＬＤＬ受容体および可溶性ＣＤ８１の効果を比較している。（Ａ）非接種対照細胞。（Ｂ）ＨＣＶを接種した細胞。（Ｃ）ＨＣＶ接種前に可溶性ＬＤＬ受容体で処理した細胞。（Ｄ）ＨＣＶ接種前にＣＤ８１で処理した細胞。
【図６】
ＬＤＬ受容体を図示している。（Ａ）ＬＤＬ受容体タンパク質およびその組織の図（（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３、１３２８２）。（Ｂ）ＬＤＬ受容体のアミノ酸配列。
【図７】
ＨＣＶ以外のフラビウイルス科ウイルスのエンドサイトーシスおよびＶＳＶによるエンドサイトーシスを示している。（Ａ）抗ＢＶＤＶ抗体を用いる免疫蛍光検査によって示す細胞変性ＢＶＤＶによるＢＴ細胞単層の感染。（Ｂ）位相差顕微鏡法によって示す細胞変性ＢＶＤＶによるＢＴ細胞の感染。（Ｃ）免疫蛍光検査によって示すＢＴ細胞の抗ＬＤＬ受容体抗体とのプレインキュベーション。（Ｄ）位相差顕微鏡法によって示すＢＴ細胞の抗ＬＤＬ受容体抗体とのプレインキュベーション。（Ｅ）ＭＲＣ−５線維芽細胞のＨＳＶ接種。（Ｆ）抗ＬＤＬ受容体抗体による前処理後のＭＲＣ−５細胞のＨＳＶ接種。（Ｇ）ＭＲＣ−５細胞のＶＳＶによる感染。（Ｈ）抗ＬＤＬ受容体による前処理後のＭＲＣ−５細胞のＶＳＶ接種。（Ｉ）抗ＬＤＬ受容体で処理し、ウイルスでは処理していない対照ＭＲＣ−５細胞。（Ａ）〜（Ｄ）の元の倍率は５００倍であり、（Ｅ）〜（Ｉ）の元の倍率は２５０倍である。
【図８】
ＭＤＢＫ細胞のＤｉＩ−ＬＤＬエンドサイトーシスをＣＲＩＢ細胞のＤｉＩ−ＬＤＬエンドサイトーシスと比較している。（Ａ）ＭＤＢＫ細胞によるＤｉＩ−ＬＤＬの激しい取り込み。（Ｂ）ＭＤＢＫ細胞によるＤｉＩ−ＬＤＬ取り込みの位相差顕微鏡法。（Ｃ）ＢＶＤＶ感染に耐性のＣＲＩＢ細胞株において明らかとなったＤｉＩ−ＬＤＬのエンドサイトーシスの欠如。（Ｄ）ＣＲＩＢ細胞によるＤｉＩ−ＬＤＬ取り込みの欠如の位相差顕微鏡法。（Ｅ）ＢＶＤＶのＮＹ−１非細胞変性株によるＭＤＢＫ細胞の感染。（Ｆ）ＭＤＢＫ細胞のＢＹ−１感染の位相差顕微鏡法。（Ｇ）ＣＲＩＢ細胞のＢＶＤＶのＮＹ−１株接種。（Ｈ）ＣＲＩＢ細胞のＢＶＤＶのＮＹ−１株接種の位相差顕微鏡法。元の倍率は５００倍である。
【図９】
抗ＬＤＬ受容体抗体によるＧＢウイルスＣ／ＨＧＶ（ＧＢＣ／ＨＧＶ）感染の阻害を示している。（Ａ）Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成を用いるＤａｕｄｉ細胞のＨＧＶ接種。（Ｂ）抗ＬＤＬ受容体抗体とプレインキュベートしたＤａｕｄｉ細胞のＨＧＶ接種。元の倍率は１２５０倍である。
【図１０】
ヒトＬＤＬ受容体を発現するトランスジェニックマウスの肝細胞によるＨＣＶのエンドサイトーシスおよび抗ＬＤＬ受容体抗体によるエンドサイトーシスの阻害を示している。ＨＣＶ  ＲＮＡのＩＳＨ：（Ａ）ＨＣＶ接種後のＬＤＬ受容体トランスジェニックマウスの肝生検の切片；（Ｂ）ＨＣＶ接種前に抗ＬＤＬ受容体のＦ（ａｂ）’２フラグメントで前処理したＬＤＬ受容体トランスジェニックマウスの肝生検の切片；（Ｃ）マウスＩｇＧ２ｂのＦ（ａｂ）’２フラグメントで前処理したＬＤＬ受容体トランスジェニックマウスの肝生検の切片。
【図１１】
ヒトＬＤＬ受容体を発現するトランスジェニックマウスの肝細胞によるＨＣＶのエンドサイトーシスを示し、抗ＬＤＬ受容体抗体およびＬＤＬ受容体の第一ドメイン（ＶＬＤＬ上のＬＤＬ受容体結合部位に結合する結合ドメイン）の３２アミノ酸第５繰り返しによるエンドサイトーシスの阻害を比較している。ＨＣＶ  ＲＮＡのＩＳＨ：（Ａ）ＨＣＶ接種前に抗ＬＤＬ受容体抗体のＦ（ａｂ）’２フラグメントで前処理したＬＤＬ受容体トランスジェニックマウスの肝生検の切片；（Ｂ）ＨＣＶ接種後のＬＤＬ受容体トランスジェニックマウスの肝生検の切片；（Ｃ）ＨＣＶ接種前に第５繰り返しペプチドで前処理したＬＤＬ受容体トランスジェニックマウスの肝生検の切片。
【図１２】
アトルバスタチン前処理によるＬＤＬ受容体のアップレギュレーションおよびＩＦＮ前処理によるダウンレギュレーションならびにＨＣＶを接種したＬＤＬ受容体トランスジェニックマウスにおけるＨＣＶのエンドサイトーシスとＬＤＬ受容体の変調との関連性を示している。（Ａ）生理的食塩水で前処理しＨＣＶを接種した対照マウスの肝切片。赤色の蛍光染色は、どの薬物でも処理していない肝細胞中のＬＤＬ受容体の局在化に対応している。（Ｂ）ＩＦＮで前処理しＨＣＶを接種したマウスの肝切片。（Ｃ）アトルバスタチンで前処理しＨＣＶを接種したマウスの肝切片。（Ｄ）（Ａ）と同じマウスの肝切片で、褐色の細胞内染色は肝細胞におけるＨＣＶの局在化に対応している。（Ｅ）（Ｂ）と同じマウスの肝切片で、ＩＳＨシグナルは検出されない。（Ｆ）（Ｃ）と同じマウスの肝切片で、（Ａ）で認められるより濃い褐色の染色は、肝細胞によるＨＣＶのエンドサイトーシスの増加を示している。元の倍率は５００倍である。
【図１３】
ヒトＬＤＬ受容体トランスジェニックマウスにおけるＩＦＮによるＨＣＶのエンドサイトーシスに関するアトルバスタチンの効果の消失を示している。（Ａ）生理的食塩水で前処理しＨＣＶを接種した対照マウスの肝切片。赤色の蛍光染色は、ＬＤＬ受容体の活性を示している。（Ｂ）アトルバスタチンで前処理しＨＣＶを接種したマウスの肝切片。（Ｃ）アトルバスタチンおよびＩＦＮで前処理しＨＣＶを接種したマウスの肝切片。（Ａ）および（Ｂ）で認められた蛍光に比べて蛍光が認められないことは、（Ｂ）で認められたＬＤＬ受容体のアップレギュレーションがＩＦＮによって打ち消されたことを示し、ＬＤＬ受容体の発現に関してこの２つの薬物が相反する効果を有していることを裏付けている。（Ｄ）（Ａ）と同じマウスの肝切片で、褐色の細胞内染色は肝細胞におけるＨＣＶの局在化に対応している。（Ｅ）（Ｂ）と同じマウスの肝切片で、（Ａ）で認められるより濃い褐色の染色は、ＨＣＶのエンドサイトーシスの増加を示している。（Ｆ）（Ｃ）と同じマウスの肝切片で、ＩＳＨシグナルの欠如は、ＨＣＶのエンドサイトーシスの欠如を示し、アトルバスタチンの効果がＩＦＮによって打ち消されることを裏付けている。
【図１４】
同一のチンパンジーにおいて血清ＨＣＶおよびＬＤＬコレステロール濃度に関するＩＦＮ（Ａ）およびＦ（ａｂ）’２マウスｍＡｂ抗ＬＤＬ受容体（Ｂ）の効果を比較している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2004529080.tif 000013
【図９】
2004529080.tif 000014
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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