(57)【要約】本発明は、新規の単離されたＡＲＰ／ＢＲＰポリヌクレオチド、及びＡＲＰ／ＢＲＰポリヌクレオチドによりコードされた膜に結合したか、又は分泌されたポリペプチドを提供する。ＡＲＰ及びＢＲＰタンパク質多量体をも提供する。ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチド、又はＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチドの誘導体、変異型、突然変異型、若しくは断片、ＡＲＰ／ＢＲＰ多量体ポリヌクレオチド、あるいは抗体に免疫特異的に結合する抗体をさらに提供する。本発明は、ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチド、多量体、ポリヌクレオチド、及び抗体を幅広い範囲の病理的状態、例えば生殖障害の検出及び治療に利用する、並びに他の用途に利用する方法を、加えて提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２又は４に少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸分子、あるいは上記核酸分子の相補体。
【請求項２】
前記核酸分子が、配列番号１又は３のヌクレオチドの配列を含む核酸分子に相補的な核酸配列にストリンジェントな条件下、ハイブリダイズする、請求項１に記載の単離された核酸分子、あるいは上記核酸分子の相補体。
【請求項３】
前記核酸分子が、配列番号２又は４のアミノ酸配列、あるいは配列番号２又は４のアミノ酸配列中に１以上の保存的な置換を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
前記核酸分子が、配列番号２又は４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１に記載の核酸分子、あるいは上記核酸分子の相補体。
【請求項５】
前記核酸分子が、配列番号１又は３のヌクレオチドの配列を含む、請求項１に記載の核酸分子、あるいは上記核酸分子の相補体。
【請求項６】
前記核酸分子が、ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を持つ、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記核酸分子が、アミノ酸配列ＷＥＫＰＩ（配列番号５）をコードする隣接したヌクレオチドを含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項８】
以下の：
（ａ）  配列番号２のアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードし；そして
（ｂ）  アミノ酸配列ＷＥＫＰＩ（配列番号５）をコードする隣接したヌクレオチドを含む；
により表される単離された核酸分子、あるいは上記核酸分子の相補体。
【請求項９】
１００ヌクレオチド未満の長さで、かつ、配列番号１又はそれらの相補体の、少なくとも６つの隣接したヌクレオチドを含む核酸分子。
【請求項１０】
請求項１に記載の核酸分子を含む核酸ベクター。
【請求項１１】
請求項１に記載の単離された核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項１２】
以下の：
ａ）  配列番号２又は４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ）  配列番号２又は４のアミノ酸配列を含むポリペプチド断片、ここで、上記断片は、配列番号２の、少なくとも６つの隣接したアミノ酸を含む；
ｃ）  配列番号２又は４のアミノ酸配列を含むポリペプチドの誘導体；
ｄ）  配列番号２又は４のアミノ酸配列を含むポリペプチドのアナログ；
ｅ）  配列番号２又は４のアミノ酸配列を含むポリペプチドのホモログ；並びに
ｆ）  配列番号２又は４のアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然の対立遺伝子変異型、ここで上記ポリペプチドは、ストリンジェントな条件下で配列番号１又は３の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子によりコードされる、
から成る群から選ばれるポリペプチドに少なくとも８０％同一な単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチド又はそれらの断片が、
ａ）  糖タンパク質ホルモンレセプターに結合するか；
ｂ）  ＬＧＲオーファンＧ−タンパク質結合レセプターに結合するか；
ｃ）  糖タンパク質ホルモンに結合するか；又は
ｄ）  シスチン・ノット・タンパク質に結合する、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチド又はそれらの断片が、１以上の部位でグリコシル化されている、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記ポリペプチド又はそれらの断片が、グリコシル化されていない、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記ポリペプチド又はそれらの断片が、シスチン・ノット・ドメインを含む、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１２に記載のポリペプチドに相当する第１ポリペプチド、及び第２ポリペプチドを含むタンパク質多量体。
【請求項１８】
ＡＲＰポリペプチド、及び第２ポリペプチドを含むタンパク質多量体。
【請求項１９】
前記第２ポリペプチドが、前記第１ポリペプチドと同一である、請求項１７又は１８に記載のタンパク質多量体。
【請求項２０】
前記第２ポリペプチドが、アルファ糖タンパク質サブユニットである、請求項１７に記載のタンパク質多量体。
【請求項２１】
前記第２ポリペプチドが、ベータ糖タンパク質サブユニットである、請求項１８に記載のタンパク質多量体。
【請求項２２】
前記第２ポリペプチドが、シスチン・ノット・タンパク質である、請求項１７又は１８に記載のタンパク質多量体。
【請求項２３】
前記第２ポリペプチドが、配列番号１８のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のタンパク質多量体。
【請求項２４】
前記タンパク質多量体が、二量体である、請求項１７又は１８に記載のタンパク質多量体。
【請求項２５】
請求項１２に記載のポリペプチドに選択的に結合する抗体、並びに上記抗体の断片、ホモログ、アナログ、及び誘導体。
【請求項２６】
請求項１７又は１８に記載のタンパク質多量体に選択的に結合する抗体、並びのそれらの断片、ホモログ、アナログ、及び誘導体。
【請求項２７】
核酸分子が発現される条件下、請求項１１の宿主細胞を培養するステップを含むＢＲＰポリペプチドの製造方法。
【請求項２８】
サンプル中の請求項１２に記載のポリペプチドの存在を検出する方法であって、上記サンプルを、請求項１２に記載のポリペプチドに選択的に結合する化合物と接触させ、そして請求項１２に記載のポリペプチドに結合した化合物が存在するかどうかを決定することを含む上記方法。
【請求項２９】
サンプル中の請求項１に記載の核酸分子の存在を検出する方法であって、上記サンプルを、上記核酸分子に選択的に結合する核酸プローブ又はプライマーと接触させ、そして請求項１に記載の核酸分子に結合した上記核酸プローブ又はプライマーが上記サンプル中に存在するかどうかを決定することを含む上記方法。
【請求項３０】
請求項１２に記載のポリペプチドの活性を調節する方法であって、請求項１２に記載のポリペプチドを含む細胞サンプルを、上記ポリペプチドの活性を調節するのに十分な量で上記ポリペプチドに結合する化合物と接触させることを含む上記方法。
【請求項３１】
対象の生殖障害の治療又は予防方法であって、上記対象の上記生殖障害の治療又は予防に十分な量で、以下の：
ａ）  ＡＲＰ／ＢＲＰ核酸；
ｂ）  ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチド；及び
ｃ）  ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体；
から成る群から選ばれる治療薬をそれを必要とする対象に投与することを含む上記方法。
【請求項３２】
対象の生殖障害の治療又は予防方法であって、上記対象の上記生殖障害の治療又は予防に十分な量で投与される、請求項１７又は１８に記載のタンパク質多量体を含む治療薬を、それを必要とする対象に投与することを含む上記方法。
【請求項３３】
治療又は予防としての有効量の、以下の：
ａ）  ＡＲＰ／ＢＲＰ核酸；
ｂ）  ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチド；及び
ｃ）  ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体、
から成る群から選ばれる治療薬、並びに医薬として許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３４】
治療又は予防としての有効量の、請求項１７又は１８に記載のタンパク質多量体から成る群から選ばれる治療薬、並びに医薬として許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３５】
治療又は予防としての有効量の、請求項３３又は３４に記載の医薬組成物を含む１以上の容器を含むキット。
【請求項３６】
生殖障害の活性又は潜在若しくは素因のモジュレーターのスクリーニング方法であって、以下の：
ａ）  試験化合物を、請求項１に記載のポリペプチドに関連する病理に関して高いリスクの、ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチドを遺伝子組み換えにより発現する試験動物に投与し、
ｂ）  ステップ（ａ）の化合物を投与した後に、上記試験動物における上記ポリペプチドの活性を測定し、そして
ｃ）  上記試験動物における上記タンパク質の活性を、上記ポリペプチドを投与していない対照動物における上記ポリペプチドの活性と比較し、ここで、上記対照動物に対する、上記試験動物における上記ポリペプチドの活性の変化は、上記試験化合物が生殖障害の潜在又は素因のモジュレーターであることを指標する、を含む上記方法。
【請求項３７】
前記試験動物が、試験タンパク質導入遺伝子を発現するか、又は野生型に対して高められたレベルでのプロモーターの制御下、上記導入遺伝子を発現する遺伝子組み換えによる試験動物であり、かつ、上記プロモーターが、上記導入遺伝子の天然遺伝子プロモーターではない、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
対象における生殖障害の存在又は素因を判断する方法であって、以下の：
ａ）  対象からのサンプルの中のＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチド又はＡＲＰ／ＢＲＰ多量体の量を計測し；そして
ｂ）  ステップ（ａ）での上記ポリペプチドの量を、対照サンプル中に存在する上記ポリペプチドの量と比較する、
を含み、ここで、対照サンプルと比較するとき、ステップ（ａ）での上記ポリペプチド又は多量体のレベルの変化が疾患の状態を指標する上記方法。
【請求項３９】
対象における生殖障害の存在又は素因を判断する方法であって、以下の：
ａ）  哺乳動物の対象からのサンプル中のＡＲＰ／ＢＲＰ核酸の量を計測し；そして
ｂ）  ステップ（ａ）での上記核酸の量を対照サンプル中に存在する上記核酸の量と比較する、
を含み、ここで、対照サンプルと比較するとき、ステップ（ａ）での上記核酸のレベルの変化が疾患の状態を指標する上記方法。
【請求項４０】
細胞内の内因性遺伝子の産物としてＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチドを発現させる方法であって、以下の：
（ａ）  上記内因性遺伝子に作用できるように結合している転写制御要素を含むＤＮＡ構築物により細胞をトランスフェクトし、それにより遺伝子組み換え細胞を製造し、及び／又は
（ｂ）  上記内因性遺伝子に作用できるように結合している増幅可能な遺伝子を挿入しうる、増幅可能な遺伝子及びＤＮＡターゲッティング配列を含むＤＮＡ構築物により細胞をトランスフェクトし、それにより遺伝子組み換え細胞を製造し、そして
（ｃ）  上記遺伝子組み換え細胞を培養し、所望であれば、上記内因性遺伝子の複数のコピーを含む細胞を選択する、
を含み、ここで、上記ポリペプチドが、野生型細胞に比べて変更されたレベルで発現される上記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、ポリヌクレオチド及びそのようなポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド、並びに、上記ポリヌクレオチド及び上記ポリペプチドを製造するためのベクター、宿主細胞、抗体、組み換え法に関する。
【０００２】
本発明の背景
糖タンパク質ホルモン、特に脳下垂体前葉で合成され、そして分泌されることが最初に発見されたものは、種々の生理学的機能の重要な役割を担う可能性がある。これらの機能は、例えば代謝、体温調節、成長、及び生殖を含みうる。脳下垂体糖タンパク質、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）は、絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、すなわち胎盤性性腺刺激ホルモンに構造が類似している。これらのホルモンは、タンパク質のシスチン・ノット・ファミリー（ｃｙｓｔｉｎｅ ｋｎｏｔ ｆａｍｉｌｙ）に属し、かつ、アルファ及びベータ・サブユニットの多量体を形成する。種の中で、既知のホルモンの各々に関するアルファ鎖は、一致する。対照的に、ベータ鎖は、配列が異なり、そして特定のホルモンに特異性を授ける。
【０００３】
本発明の概要
本発明は、一つには、糖タンパク質の新規ベータ及びアルファ・サブユニットをコードする新規ポリヌクレオチド配列の発見に基づく。前記コードされたタンパク質を、それぞれ、ベータ関連タンパク質（ＢＲＰ）又はアルファ関連タンパク質（ＡＲＰ）と名付けた。集合的に、これらのポリヌクレオチド及びポリペプチドを、ＡＲＰ／ＢＲＰと言及する。
【０００４】
１の側面において、本発明は、ベータ関連ポリペプチド（ＢＲＰ）、又はそれらの断片、ホモログ、アナログ、又は誘導体をコードする単離された核酸分子（配列番号１及び３、図１に示すとおり）を提供する。前記核酸は、例えば図２（配列番号２及び配列番号４）のポリペプチドと少なくとも７５％一致するポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。前記核酸は、例えばゲノムＤＮＡ断片であるか、又はｃＤＮＡ分子でありうる。
【０００５】
本発明は、タンパク質の多量体、例えば、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドの多量体をも提供する。前記第１ポリペプチドは、ＡＲＰ又はＢＲＰポリペプチドでありうる。
【０００６】
前記第２ポリペプチドは、アルファ糖タンパク質サブユニット又はベータ糖タンパク質サブユニット、すなわちＡＲＰ又はＢＲＰでありうる。又は、前記第２ポリペプチドは、シスチン・ノット・タンパク質でありうる。
【０００７】
同様に、本発明に含まれるものは、本明細書中に記載の核酸分子を含むベクター、又は本明細書中に記載のベクター若しくは核酸を含む細胞である。
【０００８】
本発明は、ＡＲＰ／ＢＲＰ核酸分子を含むベクターにより形質転換された宿主細胞にも向けられる。
【０００９】
本発明は、免疫応答を誘発するのに十分な量の以下のポリペプチドを哺乳動物に投与することにより、本明細書中に開示したいずれかの核酸分子又はよってコードされたポリペプチド又はタンパク質の多量体に対する哺乳動物の免疫応答を誘発する方法を提供する。
【００１０】
さらなる側面において、本発明は、ＡＲＰ、ＢＲＰ、又はそれらのヘテロ−若しくはホモ−多量体、又は他のゴナドトロピンからのアルファ又はベータ・サブユニットを有するそれらの多量体に特異的に結合する抗体を提供する。前記抗体は、例えばモノクローナル又はポリクローナル抗体、及びそれらの断片、ホモログ、アナログ、及び誘導体でありうる。本発明は、ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体及び医薬として許容される担体又は希釈剤を含む医薬組成物をも含む。本発明は、前記核酸分子のいずれかにコードされたポリペプチド上のエピトープに結合する単離された抗体にも向けられる。
【００１１】
１の側面において、本発明は、ＡＲＰ／ＢＲＰ核酸及び医薬として許容される担体又は希釈剤を含む医薬組成物を含んでいる。さらなる側面において、本発明は、実質的に精製されたＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチド、例えばＡＲＰ／ＢＲＰ核酸によってコードされたＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチド、並びにそれらの断片、ホモログ、アナログ、及び誘導体のいずれかを含む。他の側面において、本発明は、ＡＲＰ／ＢＲＰ多量体及び医薬として許容される担体又は希釈剤を含む医薬組成物を含んでいる。本発明は、ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチド及び医薬として許容される担体又は希釈剤を含む医薬組成物をも含んでいる。
【００１２】
さらに、本発明は、先に述べられた核酸分子のいずれかによってコードされたポリペプチドに結合する抗体、及びネガティブコントロール抗体を含むキットに向けられる。
【００１３】
本発明は、さらにＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチドの製造方法を提供する。前記方法は、がＡＲＰ／ＢＲＰ核酸を含む細胞、例えばＡＲＰ／ＢＲＰ核酸を含むベクターを準備し、核酸によってコードされたＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチドを発現するのに十分な条件下で上記細胞を培養することを含んでいる。次に、発現されたＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチドは、前記細胞から回収される。
【００１４】
前記細胞は、例えば原核細胞又は真核細胞であるかもしれない。好ましくは、より高度な真核細胞、例えば哺乳動物である。
【００１５】
本発明は、非天然の制御要素の挿入、及び／又は内因性の遺伝子配列に動作できるように連結した増幅可能な遺伝子の挿入後の、内因性の配列からの、野生型細胞に対して修飾されたレベルでＡＲＰ／ＢＲＰ又はこれらのポリペプチドの多量体を発現する細胞をさらに提供する。
【００１６】
本発明は、ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチド又は多量体を化合物と接触させ、上記化合物がＡＲＰ／ＢＲＰ又は多量体ポリペプチドに結合するかどうかを決定することによる、ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチド又は多量体に結合する化合物の同定方法にも向けられる。
【００１７】
本発明は、ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチド又は多量体を化合物と接触させ、上記化合物がＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチド又は多量体の活性、ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチド又は多量体への結合、ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチドをコードする核酸への結合を修飾するかどうか決定することにより、ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチド又は多量体の活性を調節する化合物にも向けられる。
【００１８】
他の側面において、本発明は、対象の生殖障害、例えば排卵障害又は不妊症の存在又はその素因の決定方法を提供する。前記方法は、対象からのタンパク質サンプルを準備し、そして上記対象サンプル中のＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチド又は多量体の量を計測することを含んでいる。次に、前記対象サンプル中のＡＲＰ／ＢＲＰの量は、対照タンパク質サンプル中のＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチド又は多量体の量と比較される。対照タンパク質サンプル中のＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチド又は多量体の量と相対的な対象のタンパク質サンプル中のＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチド又は多量体の量の変化は、対象が生殖障害を有することを示す。好ましくは、対照サンプルは、同等な個体、すなわち似通った年、性別又は生殖障害を有する疑いがあることを除く他の全身状態の個体に由来する。又は、対照サンプルは、対象が生殖障害を有する疑いのない時の対象由来である。ある実施例において、ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチド又は多量体は、ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体を使用して発見される。
【００１９】
他の側面において、本発明は、対象の生殖障害、例えば排卵障害又は不妊症の存在、又はその素因を決定する方法を提供する。前記方法は、対象からの核酸サンプル、例えばＲＮＡ又はＤＮＡあるいはその両方を準備し、そして対象の核酸中のＡＲＰ／ＢＲＰ核酸の量を計測することを含んでいる。次に、対象の核酸中のＡＲＰ／ＢＲＰ核酸サンプルの量が、対照サンプル中のＡＲＰ／ＢＲＰ核酸の量と比較される。対照サンプル中のＡＲＰ／ＢＲＰの量に相対的な前記サンプル中のＡＲＰ／ＢＲＰ核酸の量の変化は、対象が生殖障害をゆうすることを示す。
【００２０】
他の側面において、本発明は、病理的な状態、例えば対象の生殖障害の治療方法を提供する。前記方法は、ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチド、多量体、又は抗体を、病理的な状態を緩和するのに十分な量で対象に投与することを含んでいる。
【００２１】
別段の規定のない限り、本明細書中に使用される全ての技術的、及び科学的用語は、この発明の属する技術分野の当業者に理解されているのと同じ意味を持っている。本明細書中に記載のものに類似するか又はそれに相当する方法及び材料が本発明の実施又は試験に使用されうるが、好適な方法及び材料は以下に記載される。本明細書中で触れた全ての刊行物、特許出願、特許、及びに他の参考文献を、本明細書中にそれらの全体を援用する。抵触の場合において、定義を含む本明細書が規制するであろう。さらに、材料、方法、及び実施例は、ただ説明し、かつ、制限しない。
【００２２】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な明細書及び請求項から明らかである。
【００２３】
本発明の詳細な説明
本発明は、糖タンパク質ベータ及びアルファ・サブユニットに関連するするポリペプチドをコードする新規核酸配列の発見にある程度基づく。ベータ・サブユニットに関連する本発明のポリペプチド及び核酸は、本明細書中でベータ関連タンパク質（ＢＲＰ）と言及され、それに対しアルファ・サブユニットに関連する本発明のポリペプチド及び核酸は、本明細書中でアルファ関連タンパク質（ＡＲＰ）と言及される。本明細書中で使用される時、「ＡＲＰ／ＢＲＰ」は、本発明のベータ関連、及びアルファ関連の核酸及びポリペプチドの両者を参照すべきことを意味する。以下の表１は、本明細書中に使用される配列記述子を描写する。
【００２４】
【表１】
2004527214.tif 000003
【００２５】
本発明は、新規糖タンパク質ベータ・サブユニットをコードしているヌクレオチド配列を含む（図１を参照のこと；配列番号１、及び３）。コードされたポリペプチドのアミノ酸配列は、図２に示される（配列番号２、及び４）。ＧＣＧ Ｓｐｓｃａｎ解析は、図３に示されるようなシグナル配列を推測した（配列番号１０）。
【００２６】
ＢＲＰポリペプチドをコードする核酸を、第１４染色体からのゲノムＤＮＡ配列に含まれるＢＡＣ中に同定した（ジェンバンク登録番号ＡＬ１１８５５）。翻訳開始部位及び終止コドンを含む見かけ上の完全長のＢＲＰコーディング領域が、ＢＡＣ中で同定された。ＢＲＰコーディング領域は、２つのエクソンと１つのイントロンを含んでいる。ＢＲＰ ＤＮＡ配列は、１２９のアミノ酸のポリペプチドをコードする３８７のヌクレオチドを含んでいる（配列番号２）。
【００２７】
ＢＲＰ核酸配列は、最初から最後のシステイン残基をコードする部分の間で、ＦＳＨベータ・サブユニットに対して約５０％の同一性を示す。 ＢＲＰタンパク質の推測される成熟コーディング領域は、３０〜３５ ％の同一性をホルモンの糖タンパク質ファミリーのベータ・サブユニットに対して示す。
【００２８】
ＡＲＰ／ＢＲＰ、タンパク質中の特定可能なドメインの存在は、ソフトウェア・アルゴリズム、例えばＰＲＯＳＩＴＥ、ＤＯＭＡＩＮ、Ｂｌｏｃｋｓ、Ｐｆａｍ、ＰｒｏＤｏｍａｉｎ、及びＰｒｉｎｔｓを用いた検索により決定され、次にＩｎｔｅｒｐｒｏウェブサイト（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ）を用いて交差性ドメイン合致（又は番号）によってＩｎｔｅｒｐｒｏ番号を決定する。ＤＯＭＡＩＮの結果、ＡＲＰ／ＢＲＰを、逆位特異性ＢＬＡＳＴ解析を用いてＣｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＤＤ）から収集した。このＢＬＡＳＴ解析ソフトウェア・サンプル・ドメインは、Ｓｍａｒｔ及びＰｆａｍ情報収集により発見した。
【００２９】
糖タンパク質ホルモン・ベータ・サブユニット・スーパーファミリーのタンパク質の他の既知のメンバーと一致するヒトＢＲＰは、表２に示されるように糖タンパク質ホルモン・ベータ鎖ドメイン及びシスチン・ノット・ドメインを含んでいる。
【００３０】
【表２】
2004527214.tif 000004
【００３１】
「Ｅ値」又は「期待」値は、検索されたデータベース内に、ただ偶然にアラインされた配列がクエリー配列に対してそれらの類似性を達成しうる可能性を示す数字である。期待値（Ｅ）は、特定のサイズのデータベースを検索する時、当業者が単に偶然に発見することが「期待」できるヒット数を説明する指標である。それが２つの配列の間の一致に割り当てられるスコア（Ｓ）により指数関数的に減少する。本質的に、Ｅ値は配列間の一致のために存在するランダムなバックグラウンド・ノイズを説明する。期待値は、結果を報告するための重要性しきい値を作製する好都合な方法として使われる。ブラスティングのために使われるデフォルト値は、一般に０．０００１に設定される。期待値は、一致の重要性を報告するためのＰ値（確率）の代わりに使われもする。例えば、当業者（ｏｎｅ）がヒットに割り当てたＥ値は、特定のサイズのデータベースにおいて、当業者がただ偶然に同様のスコアにより１の一致を発見することを期待しうることを意味すると解釈されうる。ゼロのＥ値は、当業者が、ただ偶然に同様のスコアでの一致を発見することが期待できないことを意味する。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／を参照のこと。
【００３２】
糖タンパク質ホルモン・ベータ鎖ドメイン・コンセンサス配列を持つヒトＢＲＰ、並びに糖タンパク質ホルモン・ベータ・スーパーファミリーの他のメンバーのタンパク質のアラインメントを、表３に示す。黒く輪郭を描いたアミノ酸残基は、部位の同一性を示す；灰色のアミノ酸残基は、保存的なアミノ酸置換の部位を示す。
【００３３】
【表３】
2004527214.tif 000005
【００３４】
糖タンパク質ホルモン・ベータ鎖ドメイン・コンセンサス配列を持つヒトＢＲＰ、並びにシスチン・ノット・スーパーファミリーの他のメンバーのタンパク質のアラインメントを、表４に示す。
【００３５】
【表４】
2004527214.tif 000006
【００３６】
ヒトＢＲＰの推定のシグナルペプチド及びシステインパターンは、絨毛性性腺刺激ホルモンのベータ・サブユニットのｃｙｓ残基２６及び１１０に対応するシートベルト・システインの欠如を除いて、先に報告された糖タンパク質ホルモン・サブユニットのそれに類似する。（図７Ａを参照のこと）。さらに、ヒトＢＲＰタンパク質のグリコシル化パターンが、既知の糖タンパク質ホルモン・ベータ・サブユニットのそれと異なる。（図７Ｂを参照のこと）。
【００３７】
多組織発現（ＭＴＥ）解析は、脳下垂体におけるＢＲＰ発現を確認した。
【００３８】
同様に、本発明は、新規糖タンパク質アルファ・サブユニットをコードしているヌクレオチド配列を含む。（図１２を参照のこと；配列番号１７、１９、及び２１）。ＧＣＧ Ｓｐｓｃａｎ解析は、ＡＲＰのシグナル配列を推定した。（配列番号２８、２９、及び３０）。前記コードされたポリペプチドのＡＲＰアミノ酸配列を、図１３に示される（配列番号１８、２０、及び２２）。
【００３９】
ＡＲＰコード配列は、第１１染色体からのゲノムＤＮＡ配列を含むＢＡＣ中に存在する。（ジェンバンク登録番号ＡＣ０００１５９）。翻訳開始部位及び終止コドンを含む完全長のＡＲＰコーディング領域が、ＢＡＣ中に確認された。ＡＲＰのノーザン解析が、約８００〜９００塩基の単一ｍＲＮＡ種を確認する（図１７）。ＡＲＰコーディング領域は、３つのエクソンと２つのイントロンを既知のアルファ・サブユニット遺伝子における第２及び第３イントロンの位置に類似した位置に含んでいる（図１６を参照のこと）。ＡＲＰ ＤＮＡ塩基配列は、１２９のアミノ酸を持つことが推測されるポリペプチドをコードする３８７の塩基を持つ（配列番号１８）。
【００４０】
ＡＲＰ核酸配列は、ホルモンの糖タンパク質ファミリーのアルファ・サブユニットに対し２１％の同一性を、そしてベータ・サブユニットに対し１４％の同一性を示す。ＡＲＰタンパク質の推測される成熟コーディング領域は、ホルモンの糖タンパク質ファミリーのアルファ・サブユニットに対し２２％の同一性を、そしてベータ・サブユニットに対し１３％の同一性を示す。
【００４１】
その上、ペプチドは、各々のホルモン・ユニットに特有な二次的な構造的モチーフを共有する。
【００４２】
他のアルファ・サブユニット・タンパク質と同様に、ＡＲＰは、第２ループの（開始メチオニンから数えて）Ａｓｎ８１にＮ連結グリコシル化部位を持つ。このグリコシル化部位及び位置は、全てのアルファ・サブユニットで保存されて、完全なホルモン活性のために極めて重要であることがいくつかのホルモンに関して示された。第２ループは、性腺刺激ホルモン及びＴＳＨのアルファ・サブユニットで見られるループに長さが類似している。ＡＲＰのループ配列の終わりは、性腺刺激ホルモン及びＴＳＨのアルファ配列に一致する。アルファにおけるこれらの終末部位は、ベータ・サブユニットとの接触部位であり、そして第２及び第３ループとの交差接触部位であることが知られていている。第２のＮ連結グリコシル化部位も、ベータ・サブユニットの部位と類似した位置でＡＲＰタンパク質の第３ループに存在する。
【００４３】
ＡＲＰは、その配列の中心近くにシステイン対を持ってもいる。この配列は、アルファ・サブユニットの第５９及び６０システインに相当する。この特徴はベータ・サブユニットでは見られないが、しかし、つからないそれがＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーのメンバーを含む他のシスチン・ノット・タンパク質に見られる。新しい配列中のシステイン対の存在は、第５９アミノ酸と第８７アルファ・アミノ酸のシステイン間のアルファに似たジスルフィド結合を示唆する。
【００４４】
多組織発現（ＭＴＥ）解析は、膵臓と脳下垂体のＡＲＰ発現を確認した。
【００４５】
同様に、本発明は、ＡＲＰとＢＲＰタンパク質の多量体（すなわち重合体で）を含む。本明細書中で使用されるとき、「多量体」及び「重合体」は、互換的に使われる。例えば、多量体は二量体である。本発明のＡＲＰ及びＢＲＰポリペプチド、又はそれらの断片は、例えば他に関連がある糖タンパク質ホルモン（例えば黄体形成ホルモン（ＬＨ）、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び胎盤性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ））のそれに対して類似した、変更した又は高められた活性を有する糖タンパク質ホルモンを製造するために他のアルファ又はベータ糖タンパク質サブユニットと一緒に多量体を形成するかもしれない。多量体は、ホモ重合体（すなわち、ＡＲＰ−ＡＲＰ、ＢＲＰ−ＢＲＰ）か、又は第２ポリペプチドを持つヘテロ重合体であるかもしれない。前記第２ポリペプチドは、例えば、ＡＲＰ又はＢＲＰと同じ種からであるかもしれない。あるいは、第２ポリペプチドは、異なる種からであるかもしれない。好ましくは、第２ポリペプチドはヒトからである。第２ペプチドは、糖タンパク質ホルモン・ベータ又はアルファ・サブユニットであるかもしれない。あるいは、第２ペプチドは、シスチン・ノット・タンパク質、例えばＮＧＦ、ＨＣＧ、ＰＤＧＦ、及びＴＧＦ−ベータ２である。例えば、ＢＲＰヘテロ重合体は、ＢＲＰタンパク質及びアルファ糖タンパク質サブユニット又はそれらの断片を含んでいる。アルファ糖タンパク質サブユニットの例は、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号ＡＡＨ１０９５７及びＣＡＣ４３２３４を含んでいる。好ましくは、ＢＲＰポリペプチドは、ＡＲＰポリペプチドを持つ多量体を形成する。あるいは、ＡＲＰヘテロ重合体は、ＡＲＰポリペプチド及びベータ糖タンパク質サブユニットを含んでいる。ベータ糖タンパク質サブユニットの例は、ジェンバンク登録番号Ｐ０１２２５及びＰ１８８４２を含んでいる。好ましくは、ＡＲＰポリペプチドは、ＢＲＰポリペプチドを持つ多量体を形成する。
【００４６】
これらの先に記載した糖タンパク質に対するＡＲＰ及びＢＲＰポリペプチドの類似性は、ＡＲＰ及びＢＲＰ核酸、ポリペプチド、タンパク質多量体、抗体、並びに本発明の関連化合物がさまざまな生殖及び細胞増殖障害を治療、予防、又は診断に有用であることを証明する。これらの障害は、例えば排卵障害（すなわち、濾胞発達刺激及び排卵誘発）、生殖能力に関係する障害、甲状腺機能低下、又は脳下垂体機能若しくは脳下垂体標的器官に影響する新陳代謝の障害、例えば副腎、甲状腺、生殖腺、及び肝臓を含んでいる。さらに、ＢＲＰ及びＡＲＰ核酸、ポリペプチド、並びにタンパク質多量体は、精子形成を刺激、甲状腺細胞の機能の増強（すなわち、甲状腺ホルモン産生及びヨウ化物捕捉の増加）、性腺機能の調節、性腺ホルモン産生の調節、生殖能力の促進又は抑制に有用でありうる。ＢＲＰ及びＡＲＰ核酸、並びにポリペプチドは、これらの障害を調節する新規薬剤の確認に有用でありうる。
【００４７】
ＡＲＰ／ＢＲＰ核酸
本発明の１つの側面は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質若しくは核酸をコードする単離された核酸分子、又はそれらの生物学的に活性な部分、並びにＡＲＰ／ＢＲＰをコードする核酸（例えばＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡ）を確認するためのハイブリダイゼーション・プローブとしての使用、及びＡＲＰ／ＢＲＰ核酸分子の増幅若しくは突然変異のためのＰＣＲプライマーとしての断片の使用に十分な核酸断片に関する。本明細書中に使用されるとき、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、ヌクレオチド・アナログを用いて製造したＤＮＡ若しくはＲＮＡのアナログ、それらの誘導体、断片、及びホモログを含むことが意図される。核酸分子は、１本鎖又は２本鎖であることができるが、好ましくは２本鎖ＤＮＡである。
【００４８】
同様に、本発明は、セル内の内因性のＡＲＰ／ＢＲＰゲノム配列の発現を修飾しうるＤＮＡ構築物を含む。そのような構築物は、ＤＮＡ調節配列及びＤＮＡターゲティング配列を含んでいる。ＤＮＡターゲティング配列は、細胞内のゲノム配列による相同的（ｈｏｍｏｇｏｕｓ）な組み換えを受けることが可能になり、それにより内因性のＡＲＰ／ＢＲＰゲノム配列に作動するようにＤＮＡ制御連結部を配置する。
【００４９】
さらに本発明に含まれるのは、細胞内の内因性のＡＲＰ／ＢＲＰ ゲノム配列の発現物を増幅しうるＤＮＡ構築物である。そのような構築物は、増幅可能な遺伝子及びＤＮＡターゲティング配列を含んでいる。ＤＮＡターゲティング配列は、細胞内のゲノム配列との相同的な組み換えを受けることが可能になり、よってＡＲＰ／ＢＲＰ ゲノム配列が増幅されうるような内因性のＡＲＰ／ＢＲＰ ゲノム配列の動作可能な接続部に増幅可能な遺伝子を配置しうる。
【００５０】
「プローブ」は、好ましくは、少なくとも約１０のヌクレオチド（ｎｔ）、１００ ｎｔ、又は、例えば約６，０００ ｎｔほどの使用に依存して長さの変わる核酸配列に関する。プローブは、同一であるか、類似するか、又は相補的な核酸配列の検出に使われる。より長い長さプローブが通常天然又は組み換えの起源から得られ、高度に特異的で、オリゴマーよりハイブリダイズするのがずっと遅い。プローブは、１本−又は２本鎖であり、ＰＣＲ、膜ベースのハイブリダイゼーション技術、又はＥＬＩＳＡ様の技術に特異性を持つように設計されうる。
【００５１】
「単離された」核酸分子は、核酸の天然起源中に存在する他の核酸分子から引き離されたものである。好ましくは、「単離された」核酸は、それから核酸が誘導される生体のゲノムＤＮＡの中で本来核酸の側面に位置する配列（すなわち、核酸の５’及び３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、さまざまな態様において、単離されたＡＲＰ／ＢＲＰ核酸分子は、それから核酸が誘導される細胞（例えば、精巣又は脳下垂体）のゲノムＤＮＡの中で本来核酸分子の側面に位置する、約５ ｋｂ、４ ｋｂ、３ ｋｂ、２ ｋｂ、１ ｋｂ、０．５ ｋｂ、又は０．１ ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含むことができる。しかも、ｃＤＮＡ分子のような「単離された」核酸分子は、組み換え技術により産生されるとき、他の細胞性物質又は培地を実質的に含まず、あるいは化学的に合成されるとき、化学的な前駆物質又は他の化学薬品を実質的に含まない。
【００５２】
本発明の核酸分子、例えば配列番号１、３、１７、１９、及び２１のヌクレオチド配列を有する核酸分子、あるいはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの相補体は、標準の分子生物学の技術と本明細書中に提供される配列情報を用いて単離されうる。配列番号１、３、１７、１９、及び２１の核酸配列の全部又はその一部をハイブリダイゼーション・プローブとして使用することにより、ＡＲＰ／ＢＲＰ分子を標準的なハイブリダイゼーション及びクローニング技術を使って単離しうる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， （ｅｄｓ．）， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９；及びＡｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．， （ｅｄｓ．）， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９９３．に記載のとおり）。
【００５３】
本発明の核酸は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、あるいはゲノム ＤＮＡを標準のＰＣＲ増幅技術による鋳型及び適当なオリゴヌクレオチド・プライマーとして使用して増幅されうる。そのように増幅された核酸は、適切なベクター中にクローン化されて、そしてＤＮＡ配列解析によって特徴づけられる。さらに、ＡＲＰ／ＢＲＰヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準の合成技術、例えば自動化されたＤＮＡ自動合成機を使うことによって準備されうる。
【００５４】
本明細書中に使用されるとき、用語「オリゴヌクレオチド」は、一連のつながれたヌクレオチド残基に関し、上記オリゴヌクレオチドには、ＰＣＲ反応に使用されるのに十分な数のヌクレオチド塩基を有する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム又はｃＤＮＡ配列に基づくか、又はそこから設計され、そして特定の細胞又は組織中の同一の、類似の、又は相補的なＤＮＡ又はＲＮＡの増幅、確認、又は存在の解明に使われる。オリゴヌクレオチドは、約１０ ｎｔ、５０ ｎｔ、又は１００ ｎｔの長さ、好ましくは、約１５ ｎｔ〜３０ ｎｔの長さを有する核酸配列の一部を含む。１の態様において、１００ ｎｔ未満の長さの核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、さらに配列番号１、３、１７、１９、及び２１又はそれらの相補体の６つの隣接しているヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、化学的に合成され、そしてプローブとして使用されうる。
【００５５】
他の態様において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１、３、１７、１９、及び２１に示されたヌクレオチド配列の相補体である核酸分子を含む。他の態様において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１、３、１７、１９、及び２１に示されたヌクレオチド配列、又はこのヌクレオチド配列の一部の相補体である核酸分子を含む。配列番号１、３、１７、１９、及び２１に示されたヌクレオチド配列にわずかな不一致又は不一致なしに水素結合し、それにより安定な２本鎖を形成する、配列番号１、３、１７、１９、及び２１に示されたヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、配列番号１、３、１７、１９、及び２１に示されたヌクレオチド配列に十分に相補的である。
【００５６】
本明細書中に使用されるとき、用語「相補的である」は、核酸分子のヌクレオチド・ユニット間のワトソン−クリック型又はフーグスティーン型塩基対形成に関し、そして用語「結合」は、２のポリペプチド若しくは化合物、又は関連したポリペプチド若しくは化合物、あるいはそれらの組み合わせ物の間の物理的又は化学的な相互作用を意味する。結合は、イオン、非イオン、ファン・デル・ワールス、疎水性相互作用などを含む。物理的な相互作用は、直接的であるか又は間接的であるかもしれない。間接的な相互作用は、他のポリペプチド又は化合物の効果を通して又はそれらによるかもしれない。直接的な結合は、他のポリペプチド又は化合物の効果を通して又はそれらにより発生するものではなく、むしろ他の実質的な化学的介在のない相互作用に関する。
【００５７】
１の側面において、本発明の単離された核酸分子は、例えばアミノ酸配列ＷＥＫＰＩ（配列番号５）をコードする隣接しているヌクレオチドを含むＢＲＰ核酸を含む。
【００５８】
あるいは、本発明の単離された核酸分子は、例えばアミノ酸配列ＬＨＰＦＮＶ（配列番号２４）をコードする隣接しているヌクレオチドを含むＢＲＰ核酸を含み、代わりの態様において、本発明の単離された核酸分子は、例えばアミノ酸配列ＬＫＫＶＫＶ（配列番号２５）をコードする隣接しているヌクレオチドを含むＢＲＰ核酸を含む。
【００５９】
場合により、本発明の単離された核酸分子は、アミノ酸配列ＬＨＰＦＮＶ（配列番号２４）及びＬＫＫＶＫＶ（配列番号２５）をコードする隣接しているヌクレオチドを含む。
【００６０】
しかも、本発明の核酸分子は、配列番号１、３、１７、１９、及び２１の核酸配列の一部だけ、例えばプローブ若しくはプライマーとして使われる断片、又はＡＲＰ／ＢＲＰの生物学的に活性な部分をコードする断片を含むことができる。
【００６１】
本明細書中に提供された断片は、それぞれ核酸の場合には特異的にハイブリダイゼーションに、又はアミノ酸の場合にはエピトープの特異的な認識に十分な長さの、少なくとも６の（隣接している）核酸、又は少なくとも４の（隣接している）アミノ酸の配列と定義され、かつ、完全長配列未満の多くともいくつかの部分である。断片は、選択の核酸又はアミノ酸配列のいずれかの隣接している部分から誘導される。誘導体は、本来の化合物から直接に又は修飾、若しくは部分的な置換により形成された核酸配列又はアミノ酸配列である。アナログは、本来の化合物に類似しているが、同一ではない、しかしある成分、若しくはか側鎖に関してそれと異なる構造を持つ核酸配列又はアミノ酸配列である。アナログは、合成又は異なる進化論的な起源からであるかもしれず、かつ、野生型と比較して類似の又は反対の代謝活性を持つかもしれない。ホモログは、異なる種由来の特定の遺伝子の核酸配列又はアミノ酸配列である。
【００６２】
誘導体又はアナログが以下に記載の修飾された核酸又はアミノ酸を含むとき、誘導体及びアナログは、完全長であるか又は完全長でないかもしれない。本発明の核酸又はタンパク質の誘導体又はアナログは、制限されることなく、様々な態様において、同じサイズの核酸又はアミノ酸配列に渡り、又はアラインメントが本技術分野で知られているコンピュータ相同性プログラムによってなされるアラインされた配列と比較したとき、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、又は９５％の同一性（８０〜９５％の好ましい同一性を持つ）で本発明の核酸又はタンパク質に実質的に相同的な部位を含む分子、あるいはストリンジェント、中程度のストリンジェント、又は低いストリンジェント条件下、当該タンパク質をコードする配列の相補体にハイブリダイズしうる核酸をコードするものを含む。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９９３，及び以下を参照のこと。
【００６３】
「相同的な核酸配列」又は「相同的なアミノ酸配列」、あるいはそれらの変異型は、先に議論されているようにヌクレオチド・レベル又はアミノ酸レベルでの相同性によって特徴づけられた配列に関する。相同的なヌクレオチド配列は、ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチドのアイソフォームについてコードしたそれらの配列をコードする。アイソフォームは、例えばＲＮＡの選択的スプライシングの結果として同じ生体の異なる組織で発現されうる。あるいは、アイソフォームは、異なる遺伝子によってコードされうる。本発明において、相同的なヌクレオチド配列は、制限されることなく、哺乳動物を含み、よってマウス、ラット、ウサギ、犬、猫、雌牛、馬、及び他を生体を含みうるむヒト以外の種のＡＲＰ／ＢＫＰポリペプチドについてコードするヌクレオチド配列を含む。相同的な核酸配列は、制限されることなく、天然の対立遺伝子変異体及び本明細書中で示したヌクレオチド配列の突然変異を含みもする。相同的なヌクレオチド配列は、しかしＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでいない。相同的な核酸配列は、配列番号１、３、１７、１９、及び２１の保存的なアミノ酸置換（以下を参照のこと）、並びにＡＲＰ／ＢＲＰ活性を持つポリペプチドをコードするそれらの核酸配列を含む。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の生理活性が以下で述べられる。
【００６４】
ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチドは、ＡＲＰ／ＢＲＰ核酸のオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）によってコードされる。本発明は、その核酸配列のＯＲＦ、及び配列番号４のポリペプチドをコードする配列番号３の核酸配列の広がりを含んでいる核酸配列を含んでいる。
【００６５】
「オープンリーディングフレーム」（「ＯＲＦ」）は、もしかするとポリペプチドに翻訳されることができたヌクレオチド配列に対応する。ＯＲＦを含んでいる核酸の広がりは、停止コドンで中断しない。完全なタンパク質に関するコード配列を提供するＯＲＦは、ＡＴＧ「開始」コドンで始まって、３つの「停止」コドン、すなわちＴＡＡ、ＴＡＧ又はＴＧＡ、の１つで終わる。本願発明の目的のために、ＯＲＦは、開始コドン、停止コドン、又はその両方の有無にかかわらず、コード配列のいずれかの部分であるかもしれない。ＯＲＦが本物の細胞性タンパク質をコードするための良い候補物と考えられるために、最小限のサイズの要求が、例えば５０以上のアミノ酸のタンパク質をコードするＤＮＡの広がりにしばしば設定される。
【００６６】
ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子のクローニングから決定されたヌクレオチド配列は、他の細胞タイプ、例えば他の組織のＡＲＰ／ＢＲＰ相同体、並びに他の哺乳動物からのＡＲＰ／ＢＲＰ相同体の同定、及び／又はクローニングに使用するために設計されたプローブ及びプライマーの製造を可能にする。プローブ／プライマーは、一般に実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、一般に、少なくとも約１２、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、又は４００の連続した配列番号１、３、１７、１９、及び２１のヌクレオチド配列のセンス鎖、又は配列番号１、３、１７、１９、及び２１のヌクレオチド配列のアンチ−センス鎖、あるいは配列番号１、３、１７、１９、及び２１のヌクレオチド配列の天然の突然変異にストリンジェント条件下、ハイブリダイズするヌクレオチド配列の一部を含む。
【００６７】
ＡＲＰ／ＢＲＰヌクレオチド配列に基づいたプローブは、同一又は相同タンパク質をコードしている転写産物、又はゲノム配列を見つけるために使われることができる。様々な態様において、プローブは、そこに結合された標識基をさらに含み、例えば、上記標識基は、放射性同位元素、蛍光性化合物、酵素、又は酵素補助因子であるかもしれない。そのようなプローブは、例えば、対象からの細胞サンプル中のＡＲＰ／ＢＲＰコード核酸のレベルを計測することによって、例えばＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡレベルの検出、又はゲノム ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子が突然変異又は欠失していないかどうか決定する、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質を誤って発現する細胞又は組織を確認するための診断テストキットの一部として使われることができる。
【００６８】
「ＡＲＰ／ＢＲＰの生理活性部分を持つポリペプチド」は、用量依存性の有無にかかわらず特定の生物学的アッセイで計測されるような、成熟型を含め、本発明のポリペプチドの活性に類似を示すが、しかし同一である必要はないポリペプチドに関する。「生物学的に活性なＡＲＰ／ＢＲＰのポリペプチド」をコードする核酸断片は、ＡＲＰ／ＢＲＰの生物活性（ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の生理活性は以下に記載）を持つポリペプチドをコードする配列番号１、３、１７、１９、及び２１の一部を単離し、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質のコードされた部分を発現させ（例えば、インビトロにおける組み換え発現により）、そしてＡＲＰ／ＢＲＰのコードされた部分の活性を評価するすることにより準備しうる。
【００６９】
ＡＲＰ／ＢＲＰ変異型
本発明は、遺伝子コードの縮重に起因し、その結果として配列番号１、３、１７、１９、及び２１に示されるヌクレオチド配列によりコードされるものと同じＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質をコードする、配列番号１、３、１７、１９、及び２１に示されるヌクレオチド配列と異なる核酸分子をさらに組み込む。他の態様において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号２、４、１８、２０、及び２２に示されたアミノ酸配列を持つタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００７０】
配列番号１、３、１７、１９、及び２１に示されるＡＲＰ／ＢＲＰヌクレオチド配列に加え、アミノ酸配列の変化を導くＤＮＡ配列多型は、集団中（例えば、本集団）に存在するかもしれないことは、当業者により認識される。ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子中のそのような遺伝的多型は、天然の対立遺伝子による個体群内の個体中に存在するかもしれない。本明細書中に使用されるとき、用語「遺伝子」及び「組み換え遺伝子」は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、好ましくは哺乳動物のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、をコードしているオープンリーディングフレームを含んでいる核酸分子に関する。そのような天然の対立遺伝子変異は、一般にＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子のヌクレオチド配列の１〜５％の相違をもたらす。そのようなヌクレオチド変異、並びに天然の対立遺伝子変異の結果であり、そしてＡＲＰ／ＢＲＰの機能上の活性を変えるわけではない得られたＡＲＰ／ＢＲＰのアミノ酸多型のいずれか及びその全ては、本発明の範囲内にあることが意図される。
【００７１】
しかも、他の種からのＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質をコードしている核酸分子、及びそれにより配列番号１、３、１７、１９、及び２１の配列と異なるヌクレオチド配列を有するものは、本発明の範囲内にあることが意図される。本発明のＡＲＰ／ＢＲＰ ｃＤＮＡの天然の対立遺伝子変異体及び相同物は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、標準のハイブリダイゼーション技術によるハイブリダイゼーション・プローブとしてｃＤＮＡｓ、又はそれらの一部を用いて本明細書中に開示したＡＲＰ／ＢＲＰ核酸とそれらの相同性にに基づいて単離されうる。例えば、可溶性ＡＲＰ／ＢＲＰ ｃＤＮＡは、膜に結合させたＡＲＰ／ＢＲＰに対するその相同性に基づいて単離しうる。同様に、膜に結合させたＡＲＰ／ＢＲＰ ｃＤＮＡは、可溶性ＡＲＰ／ＢＲＰに対する相同性に基づいて単離しうる。
【００７２】
したがって、他の態様において、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも６ヌクレオチドの長さであり、かつストリンジェント条件下、配列番号１、３、１７、１９、及び２１のヌクレオチド配列を含む核酸分子とハイブリダイズする。他の態様において、核酸は、少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、又は１２５０ヌクレオチドの長さである。他の態様において、本発明の単離された核酸分子は、コーディング領域にハイブリダイズする。本明細書中に使用されるとき、用語「ストリンジェント条件下のハイブリダイズ」は、互いに少なくとも６０％相同性のヌクレオチド配列が一般に互いにハイブリダイズを保持するハイブリダイゼーション及び洗浄のため条件を説明することが意図される。
【００７３】
ホモログ（すなわち、他の種由来のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質をコードしている核酸）又は他の関連配列（例えば、パラロガス）は、核酸のハイブリダイゼーション及びクローン化のために本技術分野で周知の方法を使用した、プローブとして特異的な配列の全部又はその一部を用いた、低い、中程度の、又は高いストリンジェントなハイブリダイゼーションにより得ることができる。
【００７４】
本明細書中に使用されるとき、表現「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、その条件下でプローブ、プライマー、又はオリゴヌクレオチドがその標的配列にハイブリダイズするが、しかし他の配列にはハイブリダイズしない条件に関する。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、そして、異なる状況下で異なる。より長い配列が、短い配列よりも高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般的に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度及びｐＨでの特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように設定される。Ｔｍは、（所定のイオン強度、ｐＨ、及び核酸濃度下）標的配列に相補的なプローブの約５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。一般に標的配列は過剰に存在しているので、Ｔｍで５０％のプローブが平衡状態を生じる。一般に、ストリンジェント条件は、ｐＨ ７．０〜８．３で、塩濃度が約１．０ Ｍナトリウム・イオン未満、一般に約０．０１〜１．０ Ｍナトリウム・イオン（又は他の塩）、そして温度は、短いプローブ、プライマー、又はオリゴヌクレオチド（例えば、１０ ｎｔ〜５０ ｎｔ）に関して少なくとも約３０℃、及びより長いプローブ、プライマー、及びオリゴヌクレオチドに関して少なくとも約６０℃である。ストリンジェント条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の添加により達成されもする。
【００７５】
ストリンジェント条件は、当業者により知られ、そしてＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， （ｅｄｓ．）， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）， ６．３．１−６．３．６．に見ることができる。好ましくは、互いに少なくとも６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％相同な配列が互いにハイブリダイズを保持するような条件である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の制限されない例は、６Ｘ ＳＳＣ、５０ ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．５）、１ ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のＦｉｃｏｌｌ、０．０２％のＢＳＡ、及び５００ ｍｇ／ｍｌの６５℃で変性されたサケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中のハイブリダイゼーション、続く５０℃での０．２Ｘ ＳＳＣ、０．０１％のＢＳＡによる１回以上の洗浄である。ストリンジェントな条件下、配列番号１、３、１７、１９、及び２１の配列にハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子は、天然の核酸分子に相当する。本明細書中に使用されるとき、「天然の」核酸分子は、天然に生じるヌクレオチド配列を持つＲＮＡ又はＤＮＡ分子に関する（例えば、天然のタンパク質をコードする）。
【００７６】
第２の態様において、中程度のストリンジェント条件下、配列番号１、３、１７、１９、及び２１のヌクレオチド配列を含んでいる核酸分子、又はそれらの断片、アナログ、若しくは誘導体にハイブリダイズしうる核酸配列が提供される。中程度のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の制限されない例は、６Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、０．５％のＳＤＳ、１００ ｍｇ／ｍｌの５５℃で変性されたサケ精子ＤＮＡ中のハイブリダイゼーション、続く３７℃での１Ｘ ＳＳＣ、０．１％のＢＳＡによる１回以上の洗浄である。使用される他の中程度のストリンジェント条件は、当業者に周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， １９９３， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ， ａｎｄ Ｋｒｉｅｇｌｅｒ， １９９０， ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＡＮＤ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ．を参照のこと。
【００７７】
第３の態様において、低いストリンジェント条件下、配列番号１、３、１７、１９、及び２１のヌクレオチド配列を含んでいる核酸分子、又はそれらの断片、アナログ、若しくは誘導体にハイブリダイズしうる核酸配列が提供される。低いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の制限されない例は、３５％のホルムアミド、５Ｘ ＳＳＣ、５０ ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．５）、５ ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のＦｉｃｏｌｌ、０．２％のＢＳＡ、１００ ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％ （ｗｔ／ｖｏｌ）のデキストラン硫酸塩中の４０℃でのハイブリダイゼーション、続く５０℃での２Ｘ ＳＳＣ、２５ ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．４）、５ ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．１％のＳＤＳによる１回以上の洗浄である。使用される他の中程度のストリンジェント条件は、当業者に周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， １９９３， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ， ａｎｄ Ｋｒｉｅｇｌｅｒ， １９９０， ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＡＮＤ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ； Ｓｈｉｌｏ ａｎｄ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ， １９８１， Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７８： ６７８９−６７９２．を参照のこと。
【００７８】
保存的な突然変異
個体群中に存在するＡＲＰ／ＢＲＰ配列の天然の対立遺伝子変異体に加えて、当業者は、変化が突然変異によって配列番号１、３、１７、１９、及び２１のヌクレオチド配列内に導入されることができ、それによってＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の機能上の能力を変えないで、コードされたＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質のアミノ酸配列の変化を導くことをさらに認識する。例えば、「必須でない」アミノ酸残基のアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換は、配列番号１、３、１７、１９、及び２１の配列中に成されうる。「必須でない」アミノ酸残基は、生理活性を変えることなしにＡＲＰ／ＢＲＰの野生型配列から変わりうるが、一方「必須の」アミノ酸残基は、生理活性に必要とされる。例えば、本発明のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の間で保存されるアミノ酸残基は、変更により特に制御しにくいことが推測される。
【００７９】
さらに、図５として示されたアラインメントにより示したとおり、本発明のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質ファミリーのメンバーの間で保存されるアミノ酸残基は、変更により特に制御しにくいことが推測される。例えば、本発明のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、ＡＲＰ／ＢＲＰファミリー・メンバー及びＡＲＰ／ＢＲＰホモログ中の部分に一般に保存されている少なくとも１つのシスチン・ノット・ドメインを含みうる。そのように、これらの保存されたドメインは、突然変異に耐えられそうにない。しかし、他のアミノ酸残基（例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質メンバーの間で保存されないか又は半保存だけされているもの）は、活性に必須ではないかもしれず、故に変更を受け入れうる。
【００８０】
本発明の他の側面は、活性に必須でないアミノ酸残基の変化を含んでいるＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質をコードしている核酸分子に関する。そのようなＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、配列番号２、４、１８、２０、及び２２からのアミノ酸配列と異なるが、しかし生物活性は保持する。１つの態様において、単離された核酸分子は、配列番号２、４、１８、２０、及び２２のアミノ酸配列に少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、上記核酸分子によってコードされたタンパク質は、配列番号２、４、１８、２０、及び２２に少なくとも約６０％相同、より好ましくは配列番号２、４、１８、２０、及び２２に少なくとも約７０％相同、より好ましくは配列番号２、４、１８、２０、及び２２に少なくとも約８０％相同、より一層好ましくは配列番号２、４、１８、２０、及び２２に少なくとも約９０％相同、そして最も好ましくは配列番号２、４、１８、２０、及び２２に少なくとも約９５％相同である。
【００８１】
配列番号２、４、１８、２０、及び２２のタンパク質に相同的なＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質をコードする単離された核酸は、コードされたタンパク質に１以上のアミノ酸の置換、付加、又は欠失が導入されるような配列番号１、３、１７、１９、及び２１のヌクレオチド配列への１以上のヌクレオチドの置換、付加、又は欠失の導入によって作製されうる。
【００８２】
突然変異は、部位指定突然変異誘発及びＰＣＲ介在突然変異誘発のような標準的な技術により配列番号１、３、１７、１９、及び２１に導入されうる。好ましくは、保存的なアミノ酸置換は、少なくとも１の推測された必須でないアミノ酸残基で行われる。「保存的なアミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似した側鎖を持つアミノ酸残基と交換されるものである。類似した側鎖があるアミノ酸残基のファミリーは、本技術分野で規定されている。これらのファミリーは、塩基性の側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性の側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性の側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、無極性の側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐の側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、そして芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸を含んでいる。このように、ＡＲＰ／ＢＲＰ中の推測された必須でないアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基と置き換えられる。あるいは、他の態様において、突然変異は、ＡＲＰ／ＢＲＰコード配列の全部又は一部に沿ってランダムに、例えば飽和突然変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって導入されることができて、活性を保つ突然変異体を確認するために得られた突然変異体をＡＲＰ／ＢＲＰ生物活性についてスクリーンしうる。配列番号１、３、１７、１９、及び２１のの突然変異誘発に続き、コードされたタンパク質は本技術分野で知られるいずれかの組み換え技術によって発現されることができて、上記タンパク質の活性を決定しうる。
【００８３】
１の態様において、突然変異ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、（１）他のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、他の細胞表面タンパク質、又はそれらの生理活性部分とのタンパク質：タンパク質相互作用を形成する能力、（２）突然変異ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質及びＡＲＰ／ＢＲＰリガンドの間の複合体形成、（３）突然変異体ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の細胞内の標的タンパク質又はそれらの生理活性部分に結合する能力；（例えば、アビジン・タンパク質）についてアッセイされうる。
【００８４】
さらに他の態様において、突然変異ＡＲＰ／ＢＲＰは、糖タンパク質ホルモン・ファミリーのメンバーの活性を遂行する能力、例えば複合体形成、すなわち、（ｉ） ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質と糖タンパク質受容体、（ｉｉ）タンパク質のシスチン・ノット・ファミリーに非常に相同的なタンパク質；（ｉｉｉ）受容体ファミリー・メンバー・タンパク質と対を成したＬＧＲオーファンＧ−プロテインを持つＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質；そして（ｉｖ） ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質と糖タンパク質ホルモンの間の結合についてアッセイされうる。
【００８５】
アンチセンス
本発明の他の側面は、配列番号１、３、１７、１９、及び２１のヌクレオチド配列、又はそれらの断片、アナログ、又は誘導体を含んでいる核酸分子にハイブリダイズしうるか、あるいはそれに相補的な単離されたアンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的な、例えば２本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的な又はｍＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。特定の側面において、ＡＲＰ／ＢＲＰコード鎖の約１０、２５、５０、１００、２５０、若しくは５００ヌクレオチド、又はその全体、あるいはそれらの一部のみに相対的な配列を含むアンチセンス核酸分子が提供される。配列番号２、４、１８、２０、及び２２のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の断片、ホモログ、誘導体、及びアナログ、あるいは配列番号１、３、１７、１９、及び２１のＡＲＰ／ＢＲＰ核酸配列に相補的なアンチセンス核酸をさらに提供する。
【００８６】
１の態様において、アンチセンス核酸分子は、ＡＲＰ／ＢＲＰをコードしているヌクレオチド配列のコード鎖の「コーディング領域」に対するアンチセンスである。用語「コーディング領域」は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含んでいるヌクレオチド配列の部位に関する（例えば、図４を参照のこと）。他の態様において、アンチセンス核酸分子は、ＡＲＰ／ＢＲＰをコードしているヌクレオチド配列のコード鎖の「非コーディング領域」に対するアンチセンスである。用語「非コーディング領域」は、アミノ酸に翻訳されないコーディング領域の側面に位置する５’及び３’配列に関する（すなわち、５’及び３’非翻訳領域とも称される）。
【００８７】
本明細書中に開示したＡＲＰ／ＢＲＰをコードしているコード鎖配列（例えば、配列番号１、３、１７、１９、及び２１）を考えると、本発明のアンチセンス核酸は、ワトソンとクリック、又はフーグスティーンの法則に従って設計される。アンチセンス核酸分子は、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡのコーディング領域全体に相補的でありうるが、より好ましくは、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡのコーディング又は非コーディング領域の部分だけに対するアンチセンスのオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲んでいる部位に相補的であるかもしれない。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０ヌクレオチドの長さであるかもしれない。本発明のアンチセンス核酸は、本技術分野で知られている手順を用いたる化学合成又は酸素的な連結反応を使って組み立てられうる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンス・オリゴヌクレオチド）は、天然のヌクレオチド、あるいは分子の生物学的な安定性を増やすように、又はアンチセンスとセンス核酸の間で形成された２本鎖の物理的な安定性を増すように設計された様々に修飾されたヌクレオチドを使って化学的に合成されうる、例えばホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換されたヌクレオチドが使用されうる。
【００８８】
アンチセンス核酸の製造に使用されうる修飾されたヌクレオチドの例は、以下の：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ウィブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６−ジアミノプリンを含む。あるいは、アンチセンス核酸は、アンチセンス方向でサブクローニングされた発現ベクターを使って生物学的に製造されうる。ターゲット核酸に（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、以下の小節でさらに説明される着目の標的核酸に対してアンチセンス方向である）。
【００８９】
本発明のアンチセンス核酸分子は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質をコードしている細胞ｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡにハイブリダイズ、又は結合し、それにより、例えば転写及び／又は翻訳を阻害することで上記タンパク質の発現を阻害するように、一般に対象に投与されるか又はｉｎ ｓｉｔｕで産生される。ハイブリダイゼーションは、安定した２本鎖を形成するために慣習的なヌクレオチド相補性によるか、又は、例えばアンチセンス核酸分子の場合、それは二重らせんの主な溝における特定の相互作用を通してＤＮＡの２本鎖に結合する。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例は、組織部位への直接的な注入を含んでいる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選ばれた細胞を狙うために修飾されて、そして全身に投与されうる。例えば全身投与のために、アンチセンス分子は、それらが選ばれた細胞表面上に発現される受容体又は抗原に特異的に結合するように、例えば上記アンチセンス核酸分子を細胞表面受容体又は抗原に結合するペプチド又は抗体に連結することにより修飾されうる。アンチセンス核酸分子は、本明細書中に記載されるベクターを使って細胞にデリバリーされることもできる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強いｐｏｌ ＩＩ又はｐｏｌ ＩＩＩ プロモーターの制御下に置かれるベクター構築物が好ましい。
【００９０】
さらに他の態様において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。ａ−アノマー核酸分子は、相補的なＲＮＡと特異的な２本鎖ハイブリッドを形成する、ここで通常のβ−ユニットに反して、上記の鎖は互いに平行になる（Ｇａｕｌｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５： ６６２５−６６４１）。アンチセンス核酸分子は、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５： ６１３１−６１４８）、又はキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ． （１９８７） ＦＥＥＳ Ｌｅｔｔ ２１５： ３２７−３３０）を含むこともできる。
【００９１】
リボザイム及びＰＮＡ部分
制限されることのない例として、核酸の修飾は、修飾された塩基、及びその糖リン酸骨格が修飾されたか又は誘導体化された核酸を含む。これらの修飾は、例えば対象での治療のための適用においてアンチセンス結合核酸として、それらが使われうるように、修飾された核酸の化学的安定性を高めるための少なくとも一部で実行される。
【００９２】
１の態様において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それらが相補的な部位を持つ１本鎖核酸、例えばｍＲＮＡを開裂しうるリボヌクレアーゼ活性を持つ触媒ＲＮＡ分子である。よって、リボザイム（例えば、シュモクザメ・リボザイム（Ｈａｓｅｌｈｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１）に記載）は、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡ転写産物の触媒作用による開裂に使われることができ、それによってＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡの翻訳を阻害する。ＡＲＰ／ＢＲＰコードする核酸に特異性を持つリボザイムは、本明細書中に記載のＡＲＰ／ＢＲＰ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいて設計されうる（すなわち、配列番号１、３、１７、１９、及び２１）。例えば、テトラヒメナＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体は、組み立てられることができ、ここでて活性部位のヌクレオチド配列は、ＡＲＰ／ＢＲＰをコードするｍＲＮＡ中の開裂すべきヌクレオチド配列に相補的である。例えば、Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ． Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ４，９８７，０７１；、及びＣｅｃｈ ｅｔ ａｌ． Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，１１６，７４２を参照のこと。あるいは、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡは、ＲＮＡ分子のプールから特異的なリボヌクレアーゼ活性がある触媒ＲＮＡを選ぶために使われることができる。例えば、Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．， （１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１−１４１８を参照のこと。
【００９３】
あるいは、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子発現は、標的細胞におけるＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成するための、ＡＲＰ／ＢＲＰの制御部位（例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰプロモーター及び／又はエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を狙うことによって阻害されうる。一般的に、Ｈｅｌｅｎｅ． （１９９１） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． ６： ５６９−８４； Ｈｅｌｅｎｅ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６６０：２７−３６；及びＭａｈｅｒ （１９９２） Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４： ８０７−１５を参照のこと。
【００９４】
様々な態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰの核酸は、例えば安定性、ハイブリダイゼーション、又は分子の可溶性を改善するために塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格を修飾しうる。例えば、核酸のデオキシリボース・リン酸骨格は、ペプチド核酸を生じるために修飾されうる（Ｈｙｒｕｐ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ４： ５−２３を参照のこと）。本明細書中に使用されるとき、用語「ペプチド核酸」又は「ＰＮＡｓ」は、核酸擬態、例えばデオキシリボース・リン酸骨格が偽ペプチド骨格により置き換えられ、そして本来の４の核酸塩基だけが保持されているＤＮＡ擬態に関する。ＰＮＡｓの中性骨格は、低いイオン強度条件下でのＤＮＡ及びＲＮＡに特異的なハイブリダイゼーションを可能にすることが示された。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐ ｅｔ ａｌ． （１９９６）前記； Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ ｅｔ ａｌ． （１９９６） ＰＮＡＳ ９３： １４６７０−６７５に記載の標準的な固相ペプチド合成プロトコールを使って実施されうる。
【００９５】
ＡＲＰ／ＢＲＰのＰＮＡｓは、治療及び診断上の用途で使われることができる。例えば、ＰＮＡｓは、例えば転写の誘発、又は翻訳の停止、又は複製の阻害により、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンス、又は抗遺伝子剤として使われることができる。ＡＲＰ／ＢＲＰのＰＮＡｓは、例えば遺伝子の単独塩基対の突然変異の例えばＰＮＡ定方向ＰＣＲクランピングによる解析に；他の酵素との組み合わせで使われるとき、合成制限酵素、例えばＳＩヌクレアーゼとして（Ｈｙｒｕｐ Ｂ． （１９９６）前記）；ＤＮＡ塩基決定及びハイブリダイゼーションのためのプライマー又はプローブとして（Ｈｙｒｕｐ ｅｔ ａｌ． （１９９６）， ａｂｏｖｅ；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ （１９９６）、前記）使われることもできる。
【００９６】
他の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰのＰＮＡｓは、例えば親油基、若しくは他の補助基をＰＮＡに結合することにより、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラを形成することにより、又はリポソーム、若しくは本技術分野で知られているドラッグ・デリバリーの他の技術の使用でそれらの安定性又は細胞への摂取を高めるために修飾されうる。例えば、ＰＮＡとＤＮＡの有利な性質を組み合わせる、ＡＲＰ／ＢＲＰのＰＮＡ−ＤＮＡキメラが、製造される。そのようなキメラは、ＰＮＡ部分が高い結合親和性と特異性を提供しながらＤＮＡ部分での相互作用するＤＮＡ認識酵素、例えばＲＮａｓｅ Ｈ及びＤＮＡポリメラーゼを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基のスタッキング、核酸塩基間の結合の数、及び配向性の点で選ばれた適切な長さのリンカーを使って連結されうる（Ｈｙｒｕｐ （１９９６）前記）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐ （１９９６）前記、及びＦｉｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２４： ３３５７−６３に記載のとおり実施されうる。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホルアミダイト・カップリング化学を用いた固体支持体上で合成され、そして修飾されたヌクレオシドアナログ、例えば５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジン・ホスホルアミダイトがＰＮＡとＤＮＡの５’末端の間で使用されうる（Ｍａｇ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １７： ５９７３−８８）。次にＰＮＡモノマーは、段階的につながれ、５’ＰＮＡ ＳＥＱｍｅｎｔ及び３’ＤＮＡ ＳＥＱｍｅｎｔを有するキメラ分子を製造する（Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６）前記）。あるいは、キメラ分子は、５’ＤＮＡ ＳＥＱｍｅｎｔ及び３’ＰＮＡ ＳＥＱｍｅｎｔを用いて合成されうる。Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ （１９７５） ＢｉｏｏｒｇＭｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ５： １１１９−１１１２４を参照のこと。
【００９７】
他の態様において、オリゴヌクレオチドは、他の付加基、例えばペプチド（例えば、インビボにおいて宿主細胞を狙うため）、又は細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６：６５５３−６５５６； Ｌｅｍａｉｔｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８４：６４８−６５２； ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． Ｗ０８８／０９８１０を参照のこと）、若しくは血液脳関門（例えば、ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． Ｗ０８９／１０１３４を参照のこと）を横切る輸送を容易にする薬剤を含む。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションを引き起こす開裂剤（例えば、Ｒｒｏｌ ｅｔ ａｌ．， １９８８， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６を参照のこと）又は挿入剤（例えば、Ｚｂｎ， １９８８， Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ． ５： ５３９−５４９を参照のこと）により修飾されうる。この目的にために、オリゴヌクレオチドを、他の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーションを引き起こす架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションを引き起こす開裂剤などに結合させる。
【００９８】
ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子に関係しているヌクレオチド多型
本発明は、１以上の多型ＡＲＰ／ＢＲＰ配列を含んでいる核酸配列を含んでいる。同様に、ＡＲＰ／ＢＲＰ配列における多型を占有する塩基を発見する方法、並びにＡＲＰ／ＢＲＰ配列多型に基づくＡＲＰ／ ＢＲＰに関連した病理の治療のための個別化された治療剤を発見する方法を含む。
【００９９】
ヌクレオチド多型は、一塩基多型（ＳＮＰ）であるかもしれない。ＳＮＰは、対立遺伝子配列の間の変化に富む部位である、１のヌクレオチドによって占有された多型部位で生じる。前記部位は、通常対立遺伝子の高度に保存された配列（例えば、集団の１／１００又は１０００／１未満のメンバーで変化する配列）に先行されて、そして続かれている。一塩基多型は、通常、多型部位での１のヌクレオチドの他のものへの置換により生じる。転位は、他のプリンによる１のプリンの置き換えか、又は他のピリミジンによる１のピリミジンの置き換えである。塩基転換は、ピリミジンによるプリンの置き換えであり、その逆も同様である。一塩基多型は、参照の対立遺伝子と関係してヌクレオチドの欠失、又はヌクレオチドの挿入から生じることもできる。
【０１００】
例えば、本発明による多型は、第３４２ヌクレオチドのアデノシンがシトシンによって置き換えられるＡＲＰ遺伝子の配列多型を含んでいる（図２７）。これは、ＡＲＰポリペプチド配列の１１４位でのＬｅｕのＰｈｅへのアミノ酸の変化をもたらす。ある態様において、多型配列は、第３４２ヌクレオチドが、アデノシン以外のいずれかのヌクレオチドであるＡＲＰ遺伝子のヌクレオチド配列を含んでいる。
【０１０１】
ある態様において、多型配列は、完全長のいずれかのＡＲＰ／ＢＲＰを含んでいる。他の態様において、多型配列は、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜７５ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、又は１０〜２５ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドを含んでいる。
【０１０２】
ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質
本発明の１の側面は、単離されたＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、及びそれらの生理活性部分、又はそれらの誘導体、断片、アナログ、若しくはホモログに関する。同様に、抗−ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体を惹起するための免疫原としての使用にふさわしいポリペプチド断片を提供する。１の態様において、天然のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、細胞か組織起源から標準的なタンパク質精製技術を用いた適切な精製スキームによって単離しうる。他の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、組み換えＤＮＡ技術によって製造される。組み換え発現の代わりに、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質又はかポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を使って化学的に合成されうる。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、１以上の部位でグリコシル化されうる。あるいは、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質はグリコシル化されない。
【０１０３】
「単離された」又は「精製された」タンパク質、又はそれらの生理活性部分は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質がそれに由来する、細胞又は組織起源からの細胞性物質又は他の夾雑タンパク質を実質的に含まず、あるいは化学的に合成されるとき、化学的前駆物質、又は他の化学薬品を実質的に含まない。用語「細胞性材料を実質的に含まない」は、それが単離されるか、又は組み換えにより産生される細胞の細胞の成分から分離されるタンパク質中のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の前処理を含んでいる。１の態様において、用語「細胞性物資を実質的に含まない」は、約３０（乾燥重量）％未満の非ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質（本明細書中で「夾雑タンパク質」とも呼ばれている）、より好ましくは約２０ ％未満の非ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、よりさらに好ましくは約１０ ％未満の非ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、そして最も好ましくは約５％未満の非ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質を有するＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質前処理を含んでいる。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質又はそれらの生理活性部分が組み換えにより産生されるとき、同様に、培地を実質的に含まないことが好ましい、すなわち、培地は、タンパク質調製物の量の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満に相当する。
【０１０４】
用語「化学的な前駆物質又は他の化学薬品を実質的に含まない」は、タンパク質の合成に関係している化学的な前駆物質又は他の化学薬品から分離されるタンパク質中のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の前処理を含んでいる。１の態様において、用語「化学的な前駆物質又は他の化学薬品を実質的に含まない」は、約３０（乾燥重量）％未満の化学的な前駆物質又は非ＡＲＰ／ＢＲＰ化学薬品、より好ましくは約２０ ％未満の化学的な前駆物質又は非ＡＲＰ／ＢＲＰ化学薬品、よりさらに好ましくは約１０ ％未満の化学的な前駆物質又は非ＡＲＰ／ＢＲＰ化学薬品、そして最も好ましくは約５％未満の化学的な前駆物質又は非ＡＲＰ／ＢＲＰ化学薬品を有するＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質前処理を含んでいる。
【０１０５】
ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の生理活性部分は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質のアミノ酸配列、例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の完全長より少ないアミノ酸を含み、かつＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の少なくとも１の活性を示す、配列番号２、４、１８、２０、及び２２に示されるアミノ酸配列、に十分に相同であるか、又はそれから誘導されるアミノ酸配列を含んでいる。一般に、生理活性部分は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の少なくとも１の活性を有するドメイン又はモチーフを含む。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の生理活性部分は、例えば１０、２５、５０、１００のアミノ酸、又はそれ以上の長さのポリペプチドでありうる。
【０１０６】
１つの態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の生理活性部分は、タンパク質の糖タンパク質ファミリー特有のシスチン・ノット・ドメインを少なくとも１つ含む。
【０１０７】
さらに他の態様において、ＡＲＰタンパク質の生理活性部分は、タンパク質の糖タンパク質ホルモン・ファミリーに特有な第２ループのＮ連結グリコシル化部位の少なくとも１つか、場合によりホルモンのアルファ・サブユニットを含む。
【０１０８】
本発明のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の生理活性部分は、先に規定の構造的ドメインの少なくとも１つを含んでいることは理解されている。しかも、タンパク質の他の部位が削除された他の生理活性部分は、組み換え技術によって準備されて、天然のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の機能上の活性の１以上について評価されうる。
【０１０９】
１の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、配列番号２、４、１８、２０、及び２２に示されるアミノ酸配列を有する。他の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、配列番号２、４、１８、２０、及び２２に実質的に相同であり、かつ、配列番号２、４、１８、２０、及び２２のタンパク質の機能上の活性を保持し、けれども以下に詳細に記載されるように天然の対立遺伝子変異又は突然変異誘発によりアミノ酸配列が異なる。それ故に、他の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、配列番号２、４、１８、２０、及び２２のアミノ酸配列に少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列を含むタンパク質であり、かつ、配列番号２、４、１８、２０、及び２２のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の機能上の活性を保持する。
【０１１０】
他の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、配列番号２のシスチン・ノット・ドメインに５５％相同なアミノ酸配列を有するタンパク質である（例えば、アミノ酸残基３０〜１２９又はアミノ酸残基２１〜１２４について）。本発明の他の態様は、配列番号２、４、１８、２０、及び２２のシスチン・ノット・ドメインを有する単離されたＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、並びにそれに少なくとも６５％、好ましくは７５％、８５％、又は９５％相同なアミノ酸配を特徴とする（例えば、アミノ酸残基３１〜１２４について）。１の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、配列番号２、４、１８、２０、及び２２のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の機能上の活性を保持する。
【０１１１】
ＡＲＰ／ＢＲＰ多量体
同様に、ＡＲＰとＢＲＰのタンパク質多量体（すなわち、重合体）が本発明によって提供される。例えば、多量体は、二量体、三量体、又は四量体である。多量体は、ＡＲＰ、若しくはＢＲＰタンパク質又はそれらの生理活性部分、あるいはそれらの誘導体、断片、アナログ、若しくはホモログ、及び第２ポリペプチドを含む。多量体のポリペプチドは、共有的に、例えば、ジスルフィド結合、又は非共有的に相互に作用する。あるいは、多量体のポリペプチドは、化学的に連結する。
【０１１２】
本発明のＡＲＰ及びＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチド又はそれらの断片は、例えば、他の関連する糖タンパク質ホルモン（例えば黄体形成ホルモン（ＬＨ）、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び胎盤性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ））のそれに対して類似の、変更された、又は高められた活性を持つ機能的な糖タンパク質ホルモンを製造するために他のアルファ又はベータ糖タンパク質サブユニットを持つ、多量体を形成するかもしれない。多量体は、ホモ重合体（すなわち、ＡＲＰ−ＡＲＰ、ＢＲＰ−ＢＲＰ）、又は第２ポリペプチド有するヘテロ重合体であるかもしれない。第２ポリペプチドは、ＡＲＰかＢＲＰの同じ種からであるかもしれない。あるいは、第２ポリペプチドは、異なる種からであるかもしれない。好ましくは、第２ポリペプチドは、例えば、ＢＲＰタンパク質及びアルファ糖タンパク質サブユニット又はそれらの断片を含んでいるＢＲＰヘテロ重合体である。あるいは、第２ポリペプチドは、シスチン・ノット・タンパク質である。アルファ糖タンパク質サブユニットの例は、ジェンバンク登録番号ＡＡＨ１０９５７及びＣＡＣ４３２３４を含んでいる。好ましくは、ＢＲＰポリペプチドは、ＡＲＰポリペプチドを有する多量体を形成する。より好ましくは、ＢＲＰポリペプチドは、配列番号１８のポリペプチド及びそれらの生理活性部分、又はそれらの誘導体、断片、アナログ、若しくはホモログを有する多量体を形成する。あるいは、ＡＲＰヘテロ重合体は、ＡＲＰポリペプチドとベータ糖タンパク質サブユニットを含んでいる。ベータ糖タンパク質サブユニットの例は、ジェンバンク登録番号Ｐ０１２２５及びＰ１８８４２を含んでいる。好ましくは、ＡＲＰポリペプチドはＢＲＰポリペプチドを有する多量体を形成する。
【０１１３】
同様に、抗−ＡＲＰ又はＢＲＰ多量体抗体を惹起するための免疫原としての使用に好適なポリペプチド断片を提供する。１の態様において、天然のＡＲＰ又はＢＲＰ多量体は、細胞又は組織起源から標準的なタンパク質精製技術を用いて適切な精製スキームによって単離されうる。他の態様において、ＡＲＰ又はＢＲＰ多量体は、組み換えＤＮＡ技術によって産生される。組み換え発現の代わりに、ＡＲＰ又はＢＲＰ多量体は、標準的なペプチド合成技術を使って化学合成されうる。ＡＲＰ又はＢＲＰ多量体は、１以上の部位でグリコシル化されうる。あるいは、ＡＲＰ又はＢＲＰ多量体は、グリコシル化されない。
【０１１４】
２以上の配列の間の相同性の決定
２のアミノ酸配列又は２の核酸配列のパーセント相同性を決定するために、上記配列を最適な比較のためにアラインした（例えば、第２アミノ又は核酸配列との最適なアラインメントのためにギャップを第１アミノ酸又はヌクレオチド配列配列に導入されうる）。対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドは、その後比較される。第１配列の位置が第２配列の対応する位置と同じアミノ酸残基又ヌクレオチドによって占められているとき、そして分子は、そのポジションで相同である（すなわち、本明細書中に使用されるとき、アミノ酸又は核酸の「相同性」は、アミノ酸又は核酸「同一性」に相当する）。
【０１１５】
核酸配列の相同性は、２つの配列の間の同一性の程度として決定されうる。相同性は、本技術分野で知られるコンピュータプログラム、例えばＧＣＧプログラム・パッケージで提供されたＧＡＰソフトウェアを使って決定されうる。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ １９７０ ＪＭｏｌ Ｂｉｏｌ ４８： ４４３−４５３を参照のこと。核酸配列比較のために以下の設定：５．０のギャップ作成ペナルティー及び０．３のギャップ伸張ペナルティーでＧＣＧ ＧＡＰソフトウェアを使用したとき、先に言及したアナログ核酸配列のコード領域は、配列番号１、３、１７、１９、及び２１に示されるＤＮＡ配列のＣＤＳ（コーディング）部分と、好ましくはの少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の同一性の程度を示す。
【０１１６】
用語「配列の同一性」は、２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が特定の部位の比較に基づき残基ごとの同一性の程度に関する。用語「配列の同一性のパーセンテージ」は、比較領域上の２つの最適にアラインされた配列を比較し、同一の核酸塩基（核酸の場合、例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、又はＩ）が両配列に生じる位置の数を計測して、合致位置の数を得、合致した位置の数を比較領域内の合計位置数（すなわち、ウインドウ・サイズ）で割り、そして結果を１００を掛けて、配列の同一性のパーセンテージを得ることにより計算される。用語「十分な同一性」は、本明細書中に使用されるとき、比較部位の上の参照配列と比較して少なくとも８０パーセントの配列相同性、好ましくは少なくとも８５パーセントの同一性、そしてしばしば９０〜９５パーセントの配列同一性、より通常、少なくとも９９パーセントの配列同一性を持つ配列を含むポリヌクレオチド配列の特徴を意味する。
【０１１７】
キメラ及び融合タンパク質
本発明は、ＡＲＰ／ＢＲＰキメラ、又は融合タンパク質をも提供する。本明細書中に使用されるとき、ＡＲＰ／ＢＲＰ「キメラ・タンパク質」又は「融合タンパク質」は、場合により非−ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチドと結合したＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチドを含む。あるいは、ＡＲＰ／ＢＲＰ融合タンパク質は、多量体、例えばホモダイマー、又はヘテロダイマーである。「ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチド」は、ＡＲＰ／ＢＲＰに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドに関し、一方「非ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチド」は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質に実質的に相同ではないタンパク質、例えばＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質及び同じ若しくは異なる生物に由来するものと異なるタンパク質に対応するアミノ酸配列を持つポリペプチドに関する。ＡＲＰ／ＢＲＰ融合タンパク質の中で、ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチドは、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の全部か又は一部に相当する。１の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰ融合タンパク質は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の少なくとも１の生理活性部分を含む。他の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰ融合タンパク質は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の少なくとも２の生理活性部分を含む。さらに別の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰ融合タンパク質は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の少なくとも３の生理活性部分を含む。融合タンパク質の中で、用語「利用できるように連結された」は、ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチドと非ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチドが互いにフレーム単位で融合されることを示すように意図される。非ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチドは、ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合される。
【０１１８】
例えば、１の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰ融合タンパク質は、第２タンパク質の細胞外ドメイン利用できるように連結された、ＡＲＰ／ＢＲＰシスチン・ノット・ドメイン又は糖タンパク質ホルモン・ベータ・サブユニット・ドメインを含む。そのような融合タンパク質は、ＡＲＰ／ＢＲＰ活性を調節する化合物のためのスクリーニング・アッセイにさらに利用されうる（そのような検定が以下で詳細に述べられる）。
【０１１９】
１つの態様において、融合タンパク質は、ＡＲＰ／ＢＲＰ配列がＧＳＴ（すなわち、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合しているＧＳＴ−ＡＲＰ／ＢＲＰ融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は、組み換えＡＲＰ／ＢＲＰの精製を容易にしうる。
【０１２０】
他の態様において、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種のシグナル配列を含んでいるＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質である。例えば、天然のＢＲＰシグナル配列ＭＫＬＡＦＬＬＬＧＰＭＡＬＬＬＬＡＧＹＧＣＬＧ（配列番号１０、すなわち配列番号２の第１〜２３アミノ酸について）取り除かれ、そして他のタンパク質からのシグナル配列と置き換えられうる。あるいは、天然のＡＲＰシグナル配列ＭＰＭＡＳＰＱＴＬＶＬＹＬＬＶＬＡＶＴＥＡＷＧ（配列番号２８、すなわち、配列番号１８の第１〜２５アミノ酸について）取り除かれ、そして他のタンパク質からのシグナル配列と置き換えられうる。ある宿主細胞（例えば、哺乳類の宿主細胞）において、ＡＲＰ／ＢＲＰの発現及び／又は分泌は、異種のシグナル配列の使用を通して高められうる。特定の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質のシグナル配列は、ＡＲＰ／ＢＲＰの分泌を促進するために、取り除かれ、ｈＣＧベータ・サブユニットのシグナル配列（ＭＥＭＦＱＧＬＬＬＬＬＬＬＳＭＧＧＴＷＡ；配列番号１１）により置き換えられる。
【０１２１】
さらに他の態様において、ホルモンの天然の第２ループ・ドメインにより交換されたＡＲＰ／ＢＲＰ第２ループ・ドメインを持つ既知の糖タンパク質ホルモンを含む。例えば、ＢＲＰタンパク質の第２ループ・ドメインを含むアミノ酸ＥＴＷＥＫＰＩＬＥＰＰＹＩＥＡＨＨＲＶ（配列番号１２）は、代替の活性を持つｈＣＧアナログを製造するためにＣＧベータ・サブユニット中に配置されうる。得られた融合タンパク質を、図１０に示す（配列番号１３）。
【０１２２】
さらなる態様において、融合タンパク質は、既知の糖タンパク質ホルモン・ベータ・サブユニット、例えばＦＳＨ、ＴＳＨ、ＬＨ、又はｈＣＧからの異種のシートベルト・ドメインを含んでいるＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質である。例えば、これは、アルファ・サブユニットとの相互作用を安定させるか、又は受容体結合に影響を与えるかもしれない。例えば、最後のシステインに至るまでのＢＲＰタンパク質の配列は、ＦＳＨベータの第９５〜１１１残基に融合される（図１１を参照のこと；配列番号１４）。様々な態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の第１〜７５アミノ酸内のいずれかのアミノ酸をシステインにより置き換えることによりさらに修飾される。１つの態様において、システインは、ＢＲＰの５１位のグリシンと置き換わる。代わりの態様において、システインは、ＢＲＰの５２位のロイシンと置き換わる。
【０１２３】
１つの態様において、融合タンパク質は、主にシスチン・ノット・ドメインを含むＡＲＰ／ＢＲＰ配列が免疫グロブリン・タンパク質ファミリーのメンバー由来の配列と融合した、ＡＲＰ／ＢＲＰ免疫グロブリン融合タンパク質である。本発明のＡＲＰ／ＢＲＰ−免疫グロブリン融合タンパク質は、医薬組成物に組み入れられて、そしてＡＲＰ／ＢＲＰリガンドと細胞の表面上のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の間の相互作用を阻害するために対象に投与され、それによって生体内でのＡＲＰ／ＢＲＰ仲介信号変換を抑制しうる。ＡＲＰ／ＢＲＰ−免疫グロブリン融合タンパク質は、ＡＲＰ／ＢＲＰの同系統のリガンドの生物学的利用能に影響を及ぼすために使用されうる。ＡＲＰ／ＢＲＰリガンド／ＡＲＰ／ＢＲＰ相互作用の阻害作用は、増殖及び分化の障害の両方の治療のため、並びに細胞生存の調節（例えば、促進又は抑制）のために治療として有用かもしれない。しかも、本発明のＡＲＰ／ＢＲＰ−免疫グロブリン融合タンパク質は、ＡＲＰ／ＢＲＰリガンドを精製する、対象における抗−ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体の製造のために免疫原としての使用され、そしてＡＲＰ／ＢＲＰとＡＲＰ／ＢＲＰリガンドの相互作用を阻害する分子を確認するためのスクリーニング・アッセイに使用されうる。
【０１２４】
本発明のＡＲＰ／ＢＲＰキメラ又は融合タンパク質は、標準的な組み換えＤＮＡ技術によって製造されうる。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡは、慣例の技術により、例えば、連結のために平滑末端又はスタッガー末端、適切な末端を提供する制限酵素消化、適切な、付着末端の埋め合わせ、好ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、及び酵素的な連結を利用することにより、フレーム単位で１つに連結される一緒に結紮される。他の態様において、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ自動合成機を含む慣例の技術によって合成されうる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅が、キメラ遺伝子配列を製造するためにその後にアニールされ、そして再増幅されうる２の連続した遺伝子断片の間の相補的な張り出しを生むアンカー・プライマーを使って、実行されうる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．） ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９２を参照のこと）。しかも、多くの発現ベクターが、すでに融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をコードした市販されている。ＡＲＰ／ＢＲＰをコードする核酸は、融合部分がＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質にフレーム単位で連結されるようにそのような発現ベクター中にクローン化されうる。
【０１２５】
ＡＲＰ／ＢＲＰアゴニスト及びアンタゴニスト
本発明は、ＡＲＰ／ＢＲＰアゴニスト（擬態）又はＡＲＰ／ＢＲＰアンタゴニストとして機能するＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の変異型にも関する。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の変異型は、突然変異誘発、例えば別個の点突然変異又はＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の切り詰め、によって製造されうる。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質のアゴニストは、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の天然型の生理活性と実質的に同じものか、又はその一部保持しうる。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質のアンタゴニストは、例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質に関与する細胞のシグナリング・カスケードの下流又は上流のメンバーに拮抗して結合することにより、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の天然型の活性の１以上を阻害しうる。このように、特異的な生物学的な効果は、限定された機能の変異型を用いた処置により引き出されうる。１の態様において、タンパク質の天然型の生理活性の一部を有する変異型による対象の治療は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の天然型による治療に関係する、対象におけるより少ない副作用しかない。
【０１２６】
ＡＲＰ／ＢＲＰアゴニスト（擬態）かＡＲＰ／ＢＲＰアンタゴニストとして機能するＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の変異型は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質アゴニストかアンタゴニスト活性に関してＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の突然変異型、例えば切り詰め突然変異型の組み合わせライブラリーのスクリーニングによって確認しうる。１の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰ変異型のふ入りのライブラリーが、核酸レベルでの組み合わせ突然変異誘発により製造され、ふ入りの遺伝子ライブラリーによってコードされる。ＡＲＰ／ＢＲＰ変異型のふ入りのライブラリーは、例えば潜在的なＡＲＰ／ＢＲＰ配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして発現可能であるか、もしくはより大きな融合タンパク質のセットとして（例えば、ファージ・ディスプレイのために）そこにＡＲＰ／ＢＲＰ配列のセットを含んでいるような遺伝子配列の中への合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素的な連結によって製造されうる。縮重オリゴヌクレオチド配列からの種々の潜在的なＡＲＰ／ＢＲＰ変異型のライブラリーを製造するために使われることができる方法がある。縮重した遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ自動合成機により実行されることができ、次にこの合成遺伝子は適切な発現ベクター中に連結されうる。遺伝子の縮重セットの使用は、潜在的なＡＲＰ／ＢＲＰ配列の所望のセットをコードしている配列の全ての、１つの混合物としての提供を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法が、本技術分野で知られている（例えば、Ｎａｒａｎｇ （１９８３） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３； Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ． （１９８４） ＡｎｎｕＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ ５３：３２３； Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６； Ｉｋｅ ｅｔ ａｌ． （１９８３） ＮｕｄＡｃｉｄＲｅｓ １１：４７７を参照のこと）。
【０１２７】
ポリペプチド・ライブラリー
さらに、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質コード配列の断片のライブラリーが、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質変異型のスクリーニング及び続く選定のためのＡＲＰ／ＢＲＰ断片のふ入りの集合を製造するために使用されうる。１の態様において、コード配列断片のライブラリーは、ニック付けが１分子につき１度だけ生じる条件下でヌクレアーゼによりＡＲＰ／ＢＲＰコード配列の２本鎖ＰＣＲ断片を処理し、２本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを復元して異なるニック付けされた産物からのセンス／アンチセンス対を含む２本鎖ＤＮＡを形成させ、ＳＩヌクレアーゼで処理することにより再形成された２本鎖から１本鎖部分を除去し、そして得られた断片ライブラリーを発現ベクター中に連結することにより製造される。この方法で、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の様々なサイズのＮ末端及び内部断片をコードする発現ライブラリーを得ることができる。
【０１２８】
点突然変異若しくは切り詰めにより製造された組み合わせライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、及び選ばれた性質を持つ遺伝子産物に関するｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのためのいくつかの技術が本技術分野で知られている。そのような技術が、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の組み合わせ突然変異誘発によって製造された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングのために適応可能である。高い処理量解析に耐えられる、大きな遺伝子ライブラリーのスクリーニングのために最も広く使用される技術は、複製可能な発現ベクター中へ遺伝子ライブラリーをクローン化し、、ベクターの得られたライブラリーにより適当な細胞を形質転換し、そして所望の活性の検出がその産物が検出されるであろう上記遺伝子をコードしているベクターの分離を容易にする条件下で組み合わせ遺伝子を発現させることを一般に含む。ライブラリーの機能性突然変異型の程度を高める新しい技術である、レクルーシブ・アンサンブル突然変異誘発（Ｒｅｃｒｕｓｉｖｅ ａｎｓｅｍｂｌｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）は、でＡＲＰ／ ＢＲＰ変異型を確認するためにスクリーニング・アッセイと組み合わせて使用されうる（Ａｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｒｖａｎ （１９９２） ＰＮＡＳ ８９：７８１１−７８１５； Ｄｅｌｇｒａｖｅ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６：３２７−３３１）。
【０１２９】
抗−ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体
本発明は、いずれかのポリペプチド、例えば本発明のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質かＡＲＰ／ＢＲＰ多量体、に免疫特異的に結合する抗体及び抗体断片、例えばＦａｂ又は（Ｆａｂ）２を取り込む。
【０１３０】
単離されたＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、又はそれらの一部若しくは断片は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体を準備するための標準的な技術を用いたＡＲＰ／ＢＲＰに結合する抗体を製造するための免疫原として使用されうる。完全長のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質が使用されうるが、代わりに、本発明は、免疫原として使用するためのＡＲＰ／ＢＲＰの抗原性ペプチド断片を提供する。ＡＲＰ／ＢＲＰの抗原性ペプチドは、配列番号２、４、１８、２０、及び２２に示されたアミノ酸配列の少なくとも４のアミノ酸残基を含み、そしてペプチドに対してもたらされた抗体がＡＲＰ／ＢＲＰとの特異的な免疫複合体を形成するようなＡＲＰ／ＢＲＰのエピトープを含む。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも６、８、１０、１５、２０、又は３０のアミノ酸残基を含む。より長い抗原性ペプチドは、用途、および当業者に周知の方法により、より短い抗原性ペプチドを上回って好ましいときがある。
【０１３１】
本発明の特定の態様において、抗原性ペプチドに含まれた少なくとも１のエピトープは、タンパク質の表面にあるＡＲＰ／ＢＲＰの部位、例えば親水性部位である。ターゲッティング抗体産生の方法として、親水性及び疎水性の部位を示すヒドロパシー・プロットが、例えばフーリエ変換のあり又はなしのいずれかのＫｙｔｅ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ法、又はＨｏｐｐ Ｗｏｏｄｓ法を含む本技術分野で周知の方法のいずれかによって製造される。例えば、Ｈｏｐｐ ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８： ３８２４−３８２８； Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ １９８２， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５７： １０５−１４２を参照のこと、これらの全体を本明細書中に援用する。図８、及び９に示されるＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質配列のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、及びＨｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓ疎水性解析は、第２ループの部位（ループ推測は、ｈＣＧベータ・サブユニット結晶構造からの相同性に基づく）が、特に親水性であり、従って、ターゲッティング抗体産生に有用な表面残基をコードすることが見込まれることを示す。
【０１３２】
特定の態様において、抗原性ペプチドは、アミノ酸配列ＣＥＴＷＥＫＰＩＬＥＰＰＹＩＥＡＨＨＲＶＣ（配列番号１５）を含む。さらに他の特定の態様において、抗原性ペプチドは、アミノ酸配列ＥＴＷＥＫＰＩＬＥＰＰＹＩＥＡＨＨＲＶ（配列番号１６）を含む。
【０１３３】
本明細書中に開示のように、配列番号２、４、１８、２０、及び２２のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質配列、又はそれらの誘導体、断片、アナログ、若しくはホモログは、これらのタンパク質成分を免疫特異的に結合する抗体の製造の免疫原として利用されうる。本明細書中に使用されるとき、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわちＡＲＰ／ＢＲＰのような抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含んでいる分子に関する。このような抗体は、制限されることなく、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、１本鎖、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ’）２断片、及びＦａｂ発現ライブラリーを含む。特定の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質に対する抗体が開示される。本技術分野に知られている様々な手順が、配列番号２、４、１８、２０、及び２２のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質配列、又はそれらの誘導体、断片、アナログ、若しくはホモログに対するポリクローナル又はモノクローナル抗体の製造のために使用される。これらのタンパク質のいくつかが以下で議論される。
【０１３４】
ポリクローナル抗体の製造のために、様々な適当な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、又は他の哺乳動物）が、天然タンパク質、又はそれらの合成変異型、若しくはそれらの誘導体の注入によって免疫される。適当な免疫原性調製物は、例えば組み換えにより発現されたＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、又は化学的に合成されたＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチドを含むことができる。調製物はさらにアジュバントを含むことができる。免疫応答の増強のために使われたさまざまなアジュバントは、制限されることなく、フロイント（完全、及び不完全）、無機ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性剤（例えば、リゾレシチン、プルロニック・ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、ジニトロフェノールなど）、アジュバント、例えばカルメット−ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）及びコリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、又は類似した免疫刺激剤を含む。所望であれば、ＡＲＰ／ＢＲＰに対する抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離され、そしてさらに、周知の技術、例えばＩｇＧ画分を得るためのプロテインＡクロマトグラフィーによって精製されうる。
【０１３５】
本明細書中に使用されるとき、用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、ＡＲＰ／ＢＲＰの特定のエピトープと免疫反応しうる抗原結合部位を１種類のしか含んでいない抗体分子の集合に関する。よって、モノクローナル抗体組成物は、それが免疫反応する、特定のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質に対する単一結合親和性を一般に示す。特定のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、又はそれらの誘導体、断片、アナログ、又はモログに対するモノクローナル抗体を準備するために、連続継代細胞系の培養による抗体分子の製造を提供するいずれかの技術が利用される。そのような技術は、制限されることなく、モノクローナル抗体を製造するためのハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， １９７５ Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５−４９７を参照のこと）；トリオーマ技術；Ｂ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ， ｅｔ ａｌ．， １９８３ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４： ７２を参照のこと）、及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ， ｅｔ ａｌ．， １９８５ Ｉｎ： ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ， ＡｌａｎＲ， Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ． ７７−９６を参照のこと）を含む。モノクローナル抗体は、本発明の実施に利用され、そしてハイブリドーマの使用により（Ｃｏｔｅ， ｅｔ ａｌ， １９８３．Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０： ２０２６−２０３０を参照のこと）、又はインビトロのエプスタイン・バー・ウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ）とＢ細胞の形質転換より（Ｃｏｌｅ， ｅｔ ａｌ．， １９８５ Ｉｎ：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ． ７７−９６を参照のこと）製造されうる。先の引用のそれぞれを、それらの全体で本明細書中に援用する。
【０１３６】
本発明によると、技術は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質に特異的な１本鎖抗体の製造のために適合されうる（例えば、米国特許番号第４，９４６，７７８号を参照のこと）。さらに、方法論が、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、又はそれらの誘導体、断片、アナログ、又はホモログに対し所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速で、効果的な同定を可能にするＦａｂ発現ライブラリーの構築のために適合させられる（例えば、Ｈｕｓｅ， ｅｔ ａｌ， １９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６： １２７５−１２８１を参照のこと）。非抗体は、本技術分野で周知の技術によって「ヒト化」されうる。例えば米国特許番号第５，２２５，５３９号を参照のこと。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質に対するイディオタイプを含んでいる抗体断片は、制限されることなく：（ｉ）抗体分子のペプシン消化によって製造されたＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉ） Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を減らすことによって製造されたＦａｂ断片；（ｉｉｉ）パパイン及び還元剤を用いた抗体分子の処理により製造されたＦａｂ断片、及び（ｉｖ） Ｆｖ断片を含む本技術分野で知られている技術によって製造されうる。
【０１３７】
その上、組み換え抗ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体、例えば標準的な組み換えＤＮＡ技術を使って製造されうる、両部分及び非部分を含んでいるキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、本発明の範囲内にある。そのようなキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、本技術分野で知られている組み換えＤＮＡ技術、例えば、国際出願第ＵＳ８６／０２２６９号；欧州特許出願第１８４，１８７号；欧州特許出願第１７１，４９６号；欧州特許出願１７３，４９４号；ＰＣＴ国際公開番号第８６／０１５３３号；米国特許番号第４，８１６，５６７号；米国特許番号第５，２２５，５３９号；欧州特許出願第１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａ／．（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３； Ｌｉｕ ｅｔａｌ． （１９８７）ＰＮＡＳ８４：３４３９−３４４３； Ｌｍｅｔａｌ． （１９８７） ＪＩｍｍｕｎｏｌ． １３９：３５２１−３５２６； Ｓｍｅｔａｌ． （１９８７） ＰＮＡＳ ８４：２１４−２１８； Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ （１９８７） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４７：９９９−１００５； Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９； Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ． （１９８８） ＪＮａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８０：１５５３−１５５９）； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−１２０７； Ｏｉ ｅｔ ａｌ． （１９８６） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４； Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−５２５； Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｆａｌ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；及びＢｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８８） ＪＩｍｍｕｎｏｌ １４１：４０５３−４０６０に記載の方法の使用によって製造されうる。先の引用のそれぞれを、それらの全体で本明細書中に援用する。
【０１３８】
１つの態様において、所望の特異性を有する抗体のスクリーニング方法論は、制限されることなく、免疫酵素法（ＥＬＩＳＡ）、及び本技術分野に知られている他の免疫学の介在する技術を含む。特定の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の特定のドメインに対して特異的な抗体の選択は、そのようなドメインを有するＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の断片に結合するハイブリドーマの産生により促進される。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質内のシスチン・ノット・ドメイン、又はそれらの誘導体、断片、アナログ、又はホモログに特異的な抗体が、本明細書中に提供されもする。
【０１３９】
抗ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の局在及び／又は計量に関連する本技術分野に知られている方法で使用されうる（例えば、適当な生理学的サンプル中のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質のレベルの計測への使用、診断方法への使用、タンパク質の画像化への使用など）。与えられた態様において、抗体由来の結合ドメインを含んでいる、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、又はそれらの誘導体、断片、アナログ、若しくはホモログに対する抗体は、医薬として活性な化合物［以下「治療薬（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」］として利用される。
【０１４０】
抗−ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、標準的な技術、例えばアフィニティー・クロマトグラフィー又は免疫沈降によりＡＲＰ／ＢＲＰの単離に使用されうる。抗ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体は、細胞からの天然のＡＲＰ／ＢＲＰ、及び宿主細胞で発現された組み換えにより生み出されたＡＲＰ／ＢＲＰの精製を容易にしうる。しかも、抗−ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体は、（例えば、細胞ライセート又は細胞上清中の） ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の発現の量及びパターンを評価するためにＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の検出に使用されうる。抗ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体は、例えば与えられた投与計画の効能を決定するために臨床の試験手順の一部として組織のタンパク質レベルを観察するために診断的に使用されうる。検出は、抗体の検出可能な物質への結合（すなわち、物理的な連結）により容易にしうる。検出可能な物質の例は、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生体発光物質、及び放射性物質を含んでいる。適当な酵素の例は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを含む；好適な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンを含む；好適な蛍光物質の例は、アンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、又はフィコエリトリンを含む；発光物質の例は、ルミノールを含む；生体発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンを含む、そして好適な放射性物質の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、又は３Ｈを含む。
【０１４１】
ＡＲＰ／ＢＲＰの組み換え発現ベクター及び宿主細胞
本発明の他の側面は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、ＡＲＰ／ＢＲＰ多量体、又はそれらの誘導体、断片、アナログ、若しくはホモログをコードしている核酸を含んでいるベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書中に使用されるとき、用語「ベクター」は、そこに連結された他の核酸を運ぶことができる核酸分子に関する。ベクターの１つの種類は、追加のＤＮＡ ＳＥＱｍｅｎｔｓを連結しうる環状の二本鎖ＤＮＡループを言及する「プラスミド」である。ベクターの他の種類は、ウイルス・ベクターであり、追加のＤＮＡ ＳＥＱｍｅｎｔｓをウイルス・ゲノム中に連結しうる。あるベクターは、それらが導入される宿主細胞中での自律的増殖が可能である（例えば、細菌の複製開始点を持つ細菌ベクターとエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入により宿主細胞のゲノムに統合され、それによって宿主のゲノムと一緒に複製される。しかも、あるベクターは、それらが使用可能な状態で連結されている遺伝子を発現に導くことができる。そのようなベクターを、本明細書中で「発現ベクター」と呼ぶ。一般的に、組み換えＤＮＡ技術に有用な発現ベクターは、多くの場合プラスミドの形態である。本明細書において、プラスミドがベクターの最も一般に使用されている形態であるため、「プラスミド」及び「ベクター」は互換的に使用されうる。しかし、本発明は、同等の機能にかなう他の形態の発現ベクター、例えばウイルス・ベクター（例えば、複製を欠くレトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）を含むように意図される。
【０１４２】
本発明の組み換え発現ベクターは、宿主細胞の核酸の発現に好適な形態で本発明の核酸を含み、それは、組み換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に利用できるように連結されている、発現のために使用される宿主細胞に基づき選ばれた１以上の制御配列を含むことを意味する。組み換え発現ベクター内で、「利用できるように連結された」は、（例えば、生体外の転写／翻訳系で、又はベクターが宿主細胞に導入される時の宿主細胞で）着目のヌクレオチド配列がヌクレオチド配列の発現を可能にするやり方で制御配列に連結していることを意味するように意図される。用語「制御配列」は、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニレーション・シグナル）を含むことが意図される。そのような制御配列は、例えばＧｏｅｄｄｅｌ； ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＯＹ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （１９９０）に記載されている。制御配列は、多くの種類の宿主細胞のヌクレオチド配列の本質的な発現を導くものと、ある宿主細胞だけで（例えば、組織特異的な制御配列）ヌクレオチド配列の発現を導くものを含んでいる。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような因子に依存しうることは、当業者によって認識される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入されることができ、それによって本明細書中に記載された核酸によってコードされている融合タンパク質又はペプチドを含めたタンパク質又はペプチドを製造しうる（例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、ＡＲＰ／ＢＲＰの突然変異型、融合タンパク質など）。
【０１４３】
本発明の組み換え発現ベクターは、原核細胞又は真核細胞のＡＲＰ／ＢＲＰの発現のために設計されうる。例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰは、エッシェリシア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、又は哺乳動物の細胞で発現されうる。好適な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ， ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （１９９０）でさらに議論される。あるいは、組み換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター制御配列及びＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写及び翻訳されうる。
【０１４４】
真核細胞におけるタンパク質の発現は、ベクターが融解又は非融合タンパク質の発現を導く構成的であるか又は誘導的なプロモーターを含むベクターを有するＥ．コリにより最も頻繁に実行される。融解ベクターは、相当数のアミノ酸をそこにコードされたタンパク質、通常組み換えタンパク質のアミノ末端に加える。そのような融解ベクターは、一般に３つの目的にかなう：（１）組み換えタンパク質の発現の増加；（２）組み換えタンパク質の可溶性の増加；そして（３）アフィニティー精製のリガンドとして働くことによる組み換えタンパク質の精製の助け。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解性開裂部位が、融合部分からの組み換えタンパク質の分離を可能にし、続いて融合タンパク質を精製するために融合部分と組み換えタンパク質の接合部に導入される。そのような酵素とそれらの同系統の認識配列は、ファクターＸａ、トロンビン、及びエンテロキナーゼを含んでいる。典型的な融合発現ベクターは、それぞれグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース Ｅ結合タンパク質、プロテインＡをターゲットの組み換えタンパク質に融合した、ｐＧＥＸ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ； Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ （１９８８） Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓ．）、及びｐＲＴＴＳ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎ．Ｊ．）を含む。
【０１４５】
好適な誘導的な非融合Ｅ．コリ発現ベクターの例は、ｐＴｒｃ （Ａｍｒａｎｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）、及びｐＥＴ １ｌｄ （Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ， ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （１９９０） ６０−８９）を含んでいる。
【０１４６】
Ｅ．コリにおいて組み換えタンパク質発現を最大限にする１つの戦略は、組み換えタンパク質のタンパク質分解性開裂の能力が損なわれた宿主細菌によりタンパク質を発現することである。Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ， ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （１９９０） １１９−１２８を参照のこと。他の戦略は、各々のアミノ酸についての個々のコドンがＥ．コリで優先的に利用されるような発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列に変えることである（Ｗ＆ｄａｅｔａｌ．， （１９９２） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：２１１１−２１１８）。本発明の核酸配列のそのような変更は、標準的なＤＮＡ合成技術によって実行されうる。
【０１４７】
他の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰ発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）における発現のためのベクターの例は、ｐＹｅｐＳｅｃ１ （Ｂａｌｄａｒｉ， ｅｔ ａｌ．， （１９８７） ＥＭＢＯＪ ６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ （Ｋｕｒｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ， （１９８２） Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８ （Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．， （１９８７） Ｇｅｍ ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．）、及びｐｉｃＺ （ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．）を含んでいる。
【０１４８】
あるいは、ＡＲＰ／ＢＲＰは、バキュロウイルス発現ベクターを用いた昆虫細胞で発現されうる。培養された昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）におけるタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルス・ベクターは、ｐＡｃ系（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｍｏｔ ＣｅｌｌＢｉｏｌ ３：２１５６−２１６５）及びｐＶＬ系（Ｌｕｃｌｄｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ （１９８９） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９）を含んでいる。
【０１４９】
さらに他の態様において、本発明の核酸は、哺乳動物の発現ベクターを用いた哺乳動物の細胞で発現される。哺乳動物の発現ベクターの例は、ｐＣＤＭ８ （Ｓｅｅｄ （１９８７） Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ （Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ ６： １８７−１９５）を含んでいる。哺乳動物の細胞で使用されるとき、発現ベクターの制御機能はしばしばウイルスの制御要素によって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、及びシミアン・ウイルス４０由来である。原核細胞及び真核細胞のための他の好適な発現系に関しては、Ｓａｉｎｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ． ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８９の第１６及び１７章を参照のこと。
【０１５０】
他の態様において、組み換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞種で優先的に核酸の発現を導きうる（例えば、組織に特有の制御要素が核酸の発現に使われる）。組織に特有の制御要素が、本技術分野で知られている。好適な組織特異的プロモーターの制限されることのない例は、アルブミン・プロモーター（肝臓に特有； Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １：２６８−２７７）、リンパに特有のプロモーター（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｂａｔｏｎ （１９８８） Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４３：２３５−２７５）、特にＴ細胞レセプター （Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ （１９８９） ＥＭＢＯＪ ８：７２９−７３３）、及び免疫グロブリンのプロモーター（Ｂａｎｅｒｊｉ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｃｅｌｌ ３３：７２９−７４０； Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ （１９８３） Ｃｅｌｌ ３３：７４１−７４８）、ニューロンに特有のプロモーター（例えば、ニューロフィラメント・プロモーター； Ｂｙｍｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ （１９８９） ＰＮＡＳ ８６：５４７３−５４７７）、膵臓に特有のプロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ （１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２−９１６）、及び乳腺に特有のプロモーター（例えば、ミルク乳漿プロモーター； Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ４，８７３，３１６ ａｎｄ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ２６４，１６６）を含む。発達的に調節されたプロモーターが、取り込まれもする、例えば、ネズミｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒａｓｓ （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４−３７９）及びα−フェトプロテイン・プロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ （１９８９） ＧｅｎｅｓＤｅｖ ３：５３７−５４６）。
【０１５１】
本発明は、アンチセンス方向で発現ベクター中にクローン化した本発明のＤＮＡ分子を含む組み換え発現ベクターをさらに提供する。すなわち、ＤＮＡ分子が利用可能な状態で、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現を（ＤＮＡ分子の転写により）可能にするやり方で制御配列と連結される。アンチセンス方向でクローン化された核酸に利用できるように連結された制御配列は、様々な細胞種においてアンチセンスＲＮＡ分子の連続的な発現を導くことが選択されうる、例えば、ウイルスのプロモーター及び／又はエンハンサー、又は制御配列は、構成的な、アンチセンスＲＮＡの組織に特有の、又は細胞種に特有の発現を導くことを選択しうる。アンチセンス発現ベクターは、活性はベクターが導入された細胞種によって決定されうる高い効率の制御部位のコントロール下でアンチセンス核酸を製造する、組み換えプラスミド、ファージミド、又は弱毒化ウイルスの形態であるかもしれない。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節についての論議については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．， ”Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ，” Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｖｏｌ． １（１） １９８６を参照のこと。
【０１５２】
本発明の他の側面は、本発明の組み換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」及び「組み換え宿主細胞」は、本明細書中で互換的に使われる。そのような用語が特定の対象細胞だけに関するのでなく、そのような細胞の子孫又は潜在的な子孫にも関すると理解される。ある修飾が突然変異又は環境的な影響のいずれかにより次の世代に生じるかもしれないので、実際、そのような子孫は親細胞と同じでないかもしれないが、それでも本明細書中に使用される用語の範囲内に含まれている。
【０１５３】
宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であるかもしれない。例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、細菌の細胞、例えばＥ．コリ、昆虫細胞、酵母、又は哺乳動物の細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はＣＯＳ細胞）で発現されうる。他の好適な宿主細胞は、当業者によりに知られる。
【０１５４】
ベクターＤＮＡは、慣例の形質転換又はトランスフェクション技術により原核細胞又は真核細胞に導入されうる。本明細書中に使用されるとき、用語「形質転換」及び「トランスフェクション」は、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共同沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン−仲介トランスフェクション、リポフェクション、又は電気穿孔法を含む、外来性の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための本技術分野によって認められた種々の技術に関する。宿主細胞の好適な形質転換又はトランスフェクション方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ． ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８９）、及び他の実験室マニュアルに見ることができる。
【０１５５】
哺乳動物細胞の安定したトランスフェクションのために、使用される発現ベクター及びトランスフェクション技術に依存して、細胞のごく一部だけが外来性のＤＮＡをそれらのゲノムに統合することが知られている。これらの要素を確認して、選ぶために、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質への寛容）をコードする遺伝子が一般に着目の遺伝子と同じく宿主細胞に導入される。様々な選択可能なマーカーは、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、及びメトトレキサートのような薬物への抵抗を授けるものを含んでいる。選択可能なマーカーをコードしている核酸は、ＡＲＰ／ＢＲＰをコードしているのと同じベクターにより宿主細胞に導入されうるか、又は別々のベクターで導入されうる。安定的に導入された核酸を持つトランスフェクト細胞は、薬物選択によって確認されうる（例えば、選択可能な標識遺伝子を組み込まれた細胞は生き残るが、一方他の細胞は死ぬ）。
【０１５６】
培養状態の原核又は真核宿主細胞のような本発明の宿主細胞は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の製造（すなわち、発現）に使用されうる。それ故に、本発明は、本発明の宿主細胞を用いたＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の製造方法をさらに提供する。１の態様において、前記方法は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質が製造されるような好適な培地中で本発明の宿主細胞（ＡＲＰ／ＢＲＰをコードしている組み換え発現ベクターがその中に導入されている）を培養することを含む。他の態様において、前記方法は、培地又は宿主細胞からのＡＲＰ／ＢＲＰの単離をさらに含む。
【０１５７】
トランスジェニック動物
本発明の宿主細胞は、ヒト以外のトランスジェニック動物を製造することにも使用されうる。例えば、１の態様において、本発明の宿主細胞は、ＡＲＰ／ＢＲＰをコードする配列が導入された受精卵母細胞又は胚幹細胞である。次に、そのような宿主細胞は、外因性のＡＲＰ／ＢＲＰ配列がそれらのゲノムに導入された非トランスジェニック動物、又は内因性のＡＲＰ／ＢＲＰ配列が変えられた相同組み換え動物を作製するために使用されうる。そのような動物は、ＡＲＰ／ＢＲＰの機能及び／又は活性を調査するため、及びＡＲＰ／ＢＲＰ活性のモジュレーターを確認して及び／又は評価するために役立つ。本明細書中に使用されるとき、「トランスジェニック動物」は、動物細胞の１つ以上が導入遺伝子をそれに含んでいるでいる、非動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはラット又はマウスのようなげっ歯動物である。トランスジェニック動物の他の例は、非霊長類、羊、犬、雌牛、ヤギ、鶏、両生類などを含んでいる。導入遺伝子は、トランスジェニック動物がそれから作り上げられる細胞のゲノムに統合され、成熟した動物のゲノム内に残る外因性のＤＮＡであり、それによって、トランスジェニック動物の１以上の細胞種又は組織においてコードされた遺伝子産物の発現を導く。本明細書中に使用されるとき、「相同組み換え動物」は、内因性のＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子が内因性の遺伝子と動物の細胞、例えば、動物の発生初期の動物の幹細胞に導入された外因性のＤＮＡ分子の間の相同組み換えによって変更された、非動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスである。
【０１５８】
本発明のトランスジェニック動物は、ＡＲＰ／ＢＲＰをコードする核酸を、例えばマイクロインジェクション、レトロウイルス感染により、受精卵母細胞の前核に導入し、そして卵母細胞を偽妊娠雌フォスター動物により発育させることにより作製されうる。配列番号１、３、１７、１９、及び２１のＡＲＰ／ＢＲＰ ｃＤＮＡ配列は、導入遺伝子として非動物のゲノムに導入されうる。あるいは、マウスＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子のようなＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子のヒト以外の相同物は、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｃＤＮＡ （先にさらに記載される）へのハイブリダイゼーションに基づき単離することができ、そして導入遺伝子として使用される。イントロン配列及びポリアデニル化シグナルは、導入遺伝子の発現の効率を高めるために導入遺伝子に含まれることもできる。組織に特有な制御配列は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の発現を特定の細胞に導くために利用できるようにＡＲＰ／ＢＲＰ 導入遺伝子と連結されうる。特定の動物、例えばマウスの胚操作及びマイクロインジェクションによるトランスジェニック動物の製造方法は、本技術分野の慣習となり、そして例えば、米国特許番号第４，７３６，８６６号；同第４，８７０，００９号；及び同第４，８７３，１９１号；並びにＨｏｇａｎ １９８６， Ｉｎ： ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ ＴＨＥ ＭＯＵＳＥ ＥＭＢＲＹＯ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．に記載される。類似した方法が、他のトランスジェニック動物の製造のために使われる。トランスジェニック創始動物は、  そのゲノム中のＡＲＰ／ＢＲＰ導入遺伝子の存在、及び／又は動物の組織、若しくは細胞におけるＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡの発現に基づき確認されうる。次に、トランスジェニック創始動物は、導入遺伝子を担持する追加の動物を飼育するために使用されうる。しかも、ＡＲＰ／ＢＲＰをコードしている導入遺伝子を担持するトランスジェニック動物は、さらに他の導入遺伝子を担持する他のトランスジェニック動物に飼育されうる。
【０１５９】
相同組み換え動物の作製のために、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子をそれによって変更、例えば機能的に分裂させるために欠失、付加、又は置換が導入されたＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の少なくとも一部を含むベクターが、準備される。ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子は、遺伝子（例えば配列番号１、３、１７、１９、及び２１のｃＤＮＡ）でありうるが、より好ましくはＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の非相同体である。例えば配列番号１、３、１７、１９、及び２１のＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子のマウス相同体は、マウス・ゲノム中の内因性のＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の変更に好適な相同組み換えベクターの構築に使用されうる。１の態様において、ベクターは、相同組み換えにより、内因性のＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子が機能的に分裂させられる（すなわち、もはや機能性タンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターとも呼ばれる）ように設計される。
【０１６０】
あるいは、ベクターは、相同組み換えにより、内因性のＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子が突然変異するか、又は他の方法により変更されるが、まだ機能性タンパク質をコードするように設計されうる（例えば、上流の制御部位が変更され、それによって内因性のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の発現を変えることができる）。相同組み換えベクター内で、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の変更部分は、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の追加の核酸により５’と３’末端で挟まれており、ベクターにより担持された外因性ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子と胚幹細胞の内因性ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の間で生じる相同組み換えを可能にする。さらなるフランキングＡＲＰ／ＢＲＰ核酸は、内因性遺伝子による相同組み換えの成功のために十分な長さである。一般に、数キロベースのフランキングＤＮＡ（５’及び３’末端の両方）が、ベクターに含まれている。相同組み換えベクターの記載に関して、例えばＴｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｃｅｌｌ ５１：５０３を参照のこと。ベクターは、（例えば、電気穿孔法）によって胚幹細胞系に導入されて、導入されたＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子が相同的に内因性のＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子と組み換えられた細胞が選ばれる（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｃｅｌｌ ６９：９１５を参照のこと）。
【０１６１】
次に、選択された細胞は、凝集キメラを形成するために動物（例えば、マウス）の胚盤胞に注入される。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ １９８７， Ｉｎ： ＴＥＲＡＴＯＣＡＲＣＩＮＯＭＡＳ ＡＮＤ ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ： Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ， Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， ｅｄ． ＩＲＬ， Ｏｘｆｏｒｄ， ｐｐ． １１３−１５２を参照のこと。次に、キメラ胚は、好適な偽妊娠雌フォスター動物に移植され、そしてこの胚を妊娠させる。
【０１６２】
それらの生殖細胞に相同組み換えＤＮＡを持つ子孫は、導入遺伝子の生殖細胞系列伝達により動物の全ての細胞が相同組み換えＤＮＡを含んでいる動物を飼育するために使用されうる。相同組み換えベクター及び相同組み換え動物の構築方法は、Ｂｒａｄｌｅｙ （１９９１） Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２：８２３−８２９；ＰＣＴ国際公開番号第９０／１１３５４号；同第９１／０１１４０号；同第９２／０９６８号；及び同第９３／０４１６９号にさらに記載されている。
【０１６３】
他の態様において、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選ばれたシステムを含んでいる、トランスジェニックしたヒト以外の動物が、製造されうる。そのようなシステムの１つの例が、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ・システムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ・システムの記載は、例えばＬａｋｓｏ ｅｔ ａｌ． （１９９２） ＰＮＡＳ ８９：６２３２−６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ・システムの他の例は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＦＬＰリコンビナーゼ・システムである（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１−１３５５）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ・システムが導入遺伝子の発現の調節に使用されるとき、Ｃｒｅリコンビナーゼと選ばれたタンパク質の両者をコードしている導入遺伝子を含んでいる動物が必要とされる。そのような動物は、例えば、一方が選ばれたタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、もう一方がリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む２種類のトランスジェニック動物を交配させることによる、「二重」トランスジェニック動物の構築を通して提供されうる。
【０１６４】
本明細書中に記載の非トランスジェニック動物のクローンは、Ｗｉｌｍｕｔ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３に記載される方法により製造されることもできる。手短に言えば、トランスジェニック動物からの細胞、例えば、体細胞は、単離され、かつ、成長周期を終了して、そしてＧＯ相に入るように誘導されうる。次に、静止状態の細胞は、静止状態の細胞が単離されたのと同じ種の動物から摘出された卵母細胞に、例えば電気のパルスの使用を通して融合されうる。次に、組み換え卵母細胞は、桑実胚又は未分化胚芽細胞に発達するように培養されて、そして偽妊娠雌フォスター動物に移される。この雌フォスター動物の子孫の出産は、単離された細胞、例えば体細胞、からの動物のクローンである。
【０１６５】
医薬組成物
本発明のＡＲＰ／ＢＲＰ核酸分子、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、ＡＲＰ／ＢＲＰ多量体、及び抗−ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体（本明細書中で「活性化合物」とも呼ばれる）、及びそれらの誘導体、断片、アナログ、及びホモログは、投与に好適な医薬組成物に組み入れられることができる。そのような組成物は、核酸分子、タンパク質、又は抗体、及び医薬として許容される担体を一般に含む。本明細書中に使用されるとき、「医薬として許容される担体」は、薬剤投与に適合するいずれか又は全ての溶剤、分散媒体、コート剤、抗菌及び抗真菌剤、等張及び崩壊遅延剤などを含むことが意図される。好適な担体は、最新版のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、本明細書中に援用された本分野の標準的な参考文献に記載されている。そのような担体又は希釈剤の好ましい例は、制限されることなく、水、生理食塩液、フィンガー溶液（ｆｉｎｇｅｒ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、デキストロース溶液、及び５％の血清アルブミンを含む。リポソーム及び不揮発性油のような非水性媒体が、使用されることもできる。医薬として活性な物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用が、本技術分野で周知である。いずれかの慣例の媒体又は薬剤が活性化合物と両立しない範囲を除いて、組成物におけるしれらの使用が意図される。補足的な活性化合物が、組成物に組み入れられることもできる。
【０１６６】
本発明の医薬組成物は、それの意図された投与経路に適合するように配合される。投与経路の例は、腸管外、例えば静中、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所的）、経粘膜、及び直腸投与を含んでいる。腸管外、皮内、又は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁は、以下の成分を含むことができる：注射用蒸留水、生理食塩液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶剤のような無菌の希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウムのような酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤；酢酸、クエン酸、又はリン酸のような緩衝物質、及び塩化ナトリウム又はデキストロースのような張度の調整のための薬剤。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムのような酸又は塩基で調節されうる。腸管外の製剤は、アンプル、使い捨ての注射器、又はガラス若しくはプラスチックで作られた複数回投与用のバイアルに包含されうる。
【０１６７】
注射可能な使用に好適な医薬組成物は、無菌の水溶液（ここでは水溶性）、又は懸濁液、並びに無菌の注射可能な溶液若しくは懸濁液の即席調製のための無菌の粉末を含んでいる。静中投与のために、好適な担体は、生理食塩液、静菌性の水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ， Ｎ．Ｊ．）、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含んでいる。全ての場合において、組成物は、無菌でなければ成らず、そして扱いやすい注射針通過性がある位に流動的であるべきである。それは製造と貯蔵の条件下で安定であり、そして細菌及びカビのような微生物の汚染作用に備えて保存されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液状ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物を含む溶剤又は分散媒体であるかもしれない。適切な流動率は、例えばレシチンのようなコーティング剤の使用により、分散剤の場合の必要な粒径の維持により、及び界面活性剤の使用によって保持されうる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって成し遂げられることができる。多くの場合で、組成物に等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビット、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の延長された吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に含むことによって引き起こされうる。
【０１６８】
無菌の注射可能な溶液は、先に列挙された成分の１つ、又は組み合わせを有する適当な溶液中に必要量の活性化合物（例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質又は抗−ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体）を組み入れ、必要により続けてろ過滅菌することにより準備しうる。一般的に、分散剤は、活性化合物を基本的な分散媒体、及び先に列挙した必要とされる他の成分を含んでいる無菌の媒質に組み入れることによって準備される。無菌の注射可能な溶液の準備のための無菌の粉末の場合、調製方法は、前もってろ過滅菌したそれらの溶液からの有効成分、及びいずれかのさらなる所望の成分の粉末を得る真空乾燥及び冷凍乾燥である。
【０１６９】
経口的組成物は、一般に不活性な希釈剤又は食用担体を含んでいる。それらはゼラチンカプセルに封入されるか、又は錠剤に押し固められる。経口的な治療投与の目的のために、活性化合物は賦形剤と組み合わされて、錠剤、トローチ、又はカプセルの形態で使用されうる。うがい薬としての使用のための流体担体を用いた経口的組成物が、準備されることもでき、ここで上記流体担体中の化合物は、経口的に用いられて、スウィシュされ（ｓｗｉｓｈｅｄ）、吐かれるか又は飲み込まれる。医薬として適合する接着剤、及び／又はアジュバント物質が、組成物の一部として含まれることができる。錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、以下の成分のいずれかか、又は類似した性質の化合物を含むことができる：微細結晶性セルロース、トラガントゴム、又はゼラチンのような結合剤；デンプン又はラクトースのような賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、又はコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム又はＳｔｅｒｏｔｅｓのような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような滑剤；ショ糖又はサッカリンのような甘味料；あるいはペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジ香料のような香料。
【０１７０】
吸入による投与のために、化合物は、加圧された容器又は適当な噴射剤、例えば二酸化炭素のような気体を含んでいるディスペンサー、又はネブライザーからエアロゾル・スプレーの形態でデリバリーされる。
【０１７１】
全身的な投与が、経粘膜的又は経皮的な手段によるかもしてない。経粘膜的又は経皮的な投与のために、通り抜けるべき関門に対して適切な浸透剤が製剤で使われる。そのような浸透剤は、一般に本技術分野で知られていて、例えば経粘膜的投与のために、洗浄薬、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体を含んでいる。経粘膜的投与は、スプレー式点鼻薬又は坐剤の使用により達成されうる。経皮的投与のために、活性化合物は本技術分野で一般に知られている軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ， ｓａｌｖｅｓ）、ゲル、又はクリームの中に配合される。
【０１７２】
化合物は、直腸のデリバリーのための坐剤（例えば、カカオ脂及び他のグリセリドのような慣例の坐剤基剤による）、又は停留浣腸の形態で調製されることもできる。
【０１７３】
１つの態様において、活性化合物は、体からの迅速な排除から化合物を保護する担体、例えばインプラント及びマイクロカプセル化デリバリー・システムを含む徐放製剤と一緒に調整される。生物分解性がある、生体適合性重合体、例えばエチレンビニルアセテート、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、及びポリ乳酸酸が使用されうる。そのような製剤の調製方法は、当業者にとって明白である。材料は、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．から商業的に得ることもできる。リポソーマル懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞を狙うリポソームを含む）は、医薬として許容された担体として使用されることもできる。これらは、例えば米国特許番号第４，５２２，８１１号に記載のような、当業者に知られる方法に従って調製されるかもしれない。
【０１７４】
投与の容易さと投与量の統一のための投与単位形態の経口又は腸管外の組成物を処方することは特に有益である。本明細書中に使用されるとき、投与単位形態は、治療される対象に関して単一の投与量として適した物理的に別個の単位に関する；各々の単位は、所望の薬剤の担体との関連で所望の治療効果を生じるように計算された活性化合物の所定の分量を含む。本発明の投与単位形態に関する詳細は、活性化合物の独特な特徴、及び成し遂げられるべき特定の治療効果、並びに個体の治療のための上述の活性化合物を配合することの本技術分野に固有な制限により影響され、そして直接的に依存している。
【０１７５】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入されて、遺伝子治療ベクターとして使用されうる。遺伝子治療ベクターは、例えば静脈内注射、局所的な投与（米国特許番号第５，３２８，４７０号を参照のこと）、又は定位注入（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） ＰＮＡＳ ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）により対象にデリバリーされうる。遺伝子治療ベクターの製剤は、遺伝子治療ベクターを許容される希釈剤中に含むことができるか、又は遺伝子デリバリー媒質が組み込まれた徐放基質を含むことができる。あるいは、完璧な遺伝子デリバリー・ベクターが組み換え細胞から原型を保って製造されている場合、例えば、レトロウイルス・ベクター、製剤は１以上の、遺伝子デリバリー・システムを製造する細胞を含むことができる。
【０１７６】
医薬組成物は、投与に関する規格と一緒に容器、包み（ｐａｃｋ）、又はディスペンサーに含まれうる。
【０１７７】
本発明の使用及び方法
シスチン・ノット・ドメインを含む可溶性タンパク質、例えば糖タンパク質ホルモン及び他の増殖因子は、（ｉ）Ｇタンパク質共役受容体、（ｉｉ）他のシスチン・ノット・タンパク質、（ｉｉｉ）糖タンパク質ホルモン・スーパーファミリー・メンバー、（ｉｖ）チロシンキナーゼ増殖因子受容体に結合することが知られている。これらスーパーファミリー・メンバーは、相当数の機能を調節する多機能タンパク質である。従って、シスチン・ノット・ドメインを含む本明細書中に記載の核酸分子、タンパク質、タンパク質ホモログ、多量体、及び抗体は、以下の方法の１以上で使用されうる：（ａ）スクリーニング・アッセイ、（ｂ）検出アッセイ（例えば、組織適合試験）（ｃ）予測的な医学（例えば、診断アッセイ、兆候アッセイ、臨床試験の観察、及び薬理ゲノム学）、並びに（ｄ）治療方法（例えば、治療法及び予防法）。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、他の細胞タンパク質と相互作用して、その結果、（ｉ）ＡＲＰ／ＢＲＰ関連タンパク質活性のモジュレーション；（ｉｉ）細胞増殖の調節；（ｉｉｉ）細胞分化の調節；そして（ｉｖ）生殖機能の調節のために使用されうる。
【０１７８】
本発明の単離された核酸分子は、以下にさらに記載のとおり、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の発現（例えば、遺伝子治療用途の宿主細胞中の組み換え発現ベクターにより）、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡ（例えば、生物学的サンプルにおいて）又はＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の遺伝子の損傷の検出、並びにＡＲＰ／ＢＲＰ活性を調節するために使用されうる。さらに、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、ＡＲＰ／ＢＲＰポリペプチド、多量体、若しくは核酸の活性若しくは発現を調節する薬物、又は化合物のスクリーン、並びにＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質若しくは多量体の不十分であるか、又は過度の産生によって特徴づけられる障害の治療、あるいはＡＲＰ／ＢＲＰ野生型タンパク質若しくは多量体と比較して低下したか、又は異常な活性を有するＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質か若しくは多量体の製造に使用されうる。（例えば、脳下垂体機能又は脳下垂体の標的器官、例えば副腎、甲状腺、生殖腺、又は肝臓が影響する生殖障害、例えば癌、排卵の障害、不妊症、性機能低下、又は新陳代謝の障害）。さらに、本発明の抗−ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の検出及び単離、並びにＡＲＰ／ＢＲＰ活性の調節に使用されうる。
【０１７９】
本願発明は、先に記載したスクリーニング・アッセイによって同定された新規物質、並びに本明細書中に記載の治療のためのそれらの使用にさらに関する。
【０１８０】
スクリーニング・アッセイ
本発明は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、若しくはＡＲＰ／ＢＲＰ多量体に結合するか、あるいは、例えばＡＲＰ／ＢＲＰ発現、若しくはＡＲＰ／ＢＲＰ活性に刺激又は妨害作用を持っているモジュレーター、すなわち候補物質又は試験化合物又は物質（例えば、ペプチド、ペプチド擬態、小分子、又は他の薬物）を確認する方法（本明細書中で「スクリーニング・アッセイ」とも呼ばれる）を提供する。
【０１８１】
１の態様において、本発明は、膜結合型ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、若しくはポリペプチド、又はそれらの生理活性部分に結合するか、あるいはそれらの活性を調節する候補物質又は試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。以下：生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平行面固相又は溶液相ライブラリ；デコンヴォルーションを要する合成ライブラリー方法；「ｏｎｅ−ｂｅａｄ ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ」ライブラリー方法；及びアフィニティー・クロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリー方法を含む本技術分野で知られている組み合わせライブラリー法のおびただしい数のアプローチのいずれかを使って本発明のテスト化合物を得ることができる。生物学的ライブラリ・アプローチは、ペプチド・ライブラリに限られているが、一方で、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチド・オリゴマー、又は化合物の小分子ライブラリーに適用できる（Ｌａｍ （１９９７） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ １２：１４５）。
【０１８２】
分子ライブラリーの合成方法の例は、本技術分野、例えば以下の： ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０：６９０９； Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ． ９１：１１４２２； Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３７：２６７８； Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３； Ｃａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ３３：２０５９； Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ３３：２０６１；及びＧａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ． （１９９４） ＪＭｅｄ Ｃｈｅｍ ３７：１２３３で見ることができる。
【０１８３】
化合物のライブラリーは、溶液で（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ （１９９２） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１）、又はビーズで（Ｌａｍ （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４）、又はチップ上に（Ｆｏｄｏｒ （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６）、細菌で（Ｌａｄｎｅｒ Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，２２３，４０９）、胞子で（Ｌａｄｎｅｒ Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ２，２２３，４０９）、プラスミドで（Ｃｕｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９）、又はファージにより（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０； Ｄｅｖｌｉｎ （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６； Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ． ８７：６３７８−６３８２； Ｆｅｌｉｃｉ （１９９１） ＪＭｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２：３０１−３１０； Ｌａｄｎｅｒ 前記）提供される。
【０１８４】
１つの態様において、アッセイは、細胞表面上に膜結合型ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、又はＡＲＰ／ＢＲＰ多量体若しくはそれらの生理活性部分を呈する細胞を、試験化合物と接触させ、そしてＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質に又は多量体に結合する試験化合物の能力を計測する細胞ベースのアッセイである。例えば、細胞は、哺乳動物起源又は酵母である。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質又は多量体に結合する試験化合物の能力の計測は、例えば試験化合物を、試験化合物のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、若しくはそれらの生理活性タンパク質への結合が複合体中の標識化合物の検出により計測できるような放射性同位元素又は酸素ラベルとの結合により達成される。例えば、試験化合物は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、又は３Ｈで直接的又は間接的に標識されることができて、そして放射性放出の直接的なカウント又はシンチレーション・カウンティングによって放射性同位元素が検出される。あるいは、試験化合物は、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はルシフェラーゼにより酵素的に標識されることができて、適切な基質の産物への転換の定量によりこの酸素ラベルを検出した。１の態様において、アッセイは、細胞表面上に膜結合型のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、若しくはそれらの生理活性部分を発現する細胞をＡＲＰ／ＢＲＰに結合する既知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成し、アッセイ混合物を試験化合物と接触させ、そしてＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定することを含み、ここで、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質と相互作用する試験化合物の能力の決定は、既知の化合物と比較して時のＡＲＰ／ＢＲＰ若しくはそれらの生理活性部分に優先的に結合する試験化合物の能力の決定することを含む。
【０１８５】
他の態様において、アッセイは、細胞表面上に膜結合型のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、若しくは多量体、又はそれらの生理活性部分を発現する細胞を試験化合物と接触させ、そしてＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、若しくは多量体、又はそれらの生理活性部分の活性を調節（例えば、刺激又は、抑制）する試験化合物の能力を決定することを含む細胞ベースのアッセイである。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、若しくはそれらの生理活性部分の活性を調節する試験化合物の能力の決定は、例えばＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質のＡＲＰ／ＢＲＰ標的分子との結合又は相互作用を計測することにより達成される。本明細書中で使用されるとき、「標的分子」は、本来ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質と結合又は相互作用する分子であり、例えばＡＲＰ／ＢＲＰと相互作用するタンパク質を呈する細胞表面上の分子、第２細胞の表面上の分子、細胞外の環境中の分子、細胞膜の内側面に関係している分子、又は細胞質分子である。ＡＲＰ／ＢＲＰ標的分子は、非ＡＲＰ／ＢＲＰ分子又はＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、あるいは本発明のポリペプチドであるかもしれない。１の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰ標的分子は、細胞膜を通って、そして細胞の中への細胞外シグナル（例えば、膜結合ＡＲＰ／ＢＲＰ分子への化合物の結合によって生じたシグナル）の伝達を容易にするシグナル経路の構成要素である。例えば、標的は、触媒活性がある第２の細胞間のタンパク質、又はＡＲＰ／ＢＲＰと下流のシグナリング分子のつながりを容易にするタンパク質であるかもしれない。
【０１８６】
ＡＲＰ／ＢＲＰ標的分子に結合するか又はそれらと相互作用するＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の能力の決定は、直接的な結合の計測のための先に記載の方法の１つにより達成される。１の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰ標的分子に結合するか又はそれらと相互作用するＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の能力の決定は、標的分子の活性の計測により達成されうる。例えば、標的分子の活性は、標的（すなわち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など）の細胞の第２メッセンジャーの誘導の検出、適切な基質標的の触媒／酵素活性の検出、（検出可能な標識、例えばルシフェラーゼ、をコードする核酸に利用できるように連結されたＡＲＰ／ＢＲＰ応答性制御要素を含む）リポーター遺伝子の誘導の検出、あるいは細胞応答、例えば細胞生存、細胞分化、又は細胞増殖の検出によって決定されうる。
【０１８７】
さらに他の態様において、本発明のアッセイは、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質又はそれらの生理活性部分を試験化合物と接触させ、そしてＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質又はそれらの生理活性部分に結合する試験化合物の能力を確認することを含む、細胞を含まないアッセイである。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質への試験化合物の結合は、先に記載のとおり直接的又は間接的に決定されうる。１の態様において、アッセイは、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、若しくはそれらの生理活性部分ＡＲＰ／ＢＲＰの結合する既知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成し、アッセイ混合物を試験化合物と接触させ、そしてＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定することを含み、ここで、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質と相互作用する試験化合物の能力の決定は、既知の化合物と比較して時のＡＲＰ／ＢＲＰ若しくはそれらの生理活性部分に優先的に結合する試験化合物の能力の決定することを含む。
【０１８８】
他の態様において、アッセイは、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、又はそれらの生理活性部分を発現する細胞を試験化合物と接触させ、そしてＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、又はそれらの生理活性部分の活性を調節（例えば、刺激又は、抑制）する試験化合物の能力を決定することを含む、細胞を含まないアッセイである。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質を調節する試験化合物の能力の決定は、例えば直接的結合の計測のための先に記載の方法の１つによりＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質のＡＲＰ／ＢＲＰ標的分子との結合を計測することにより達成される。代わりの態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質を調節する試験化合物の能力の決定は、ＡＲＰ／ＢＲＰ標的タンパク質をさらに調節するＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の活性を計測することにより達成される。例えば、適当な基質における標的分子の触媒／酵素活性は、前期のとおり確認されうる。
【０１８９】
さらに他の態様において、細胞を含まないアッセイは、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、若しくはそれらの生理活性部分ＡＲＰ／ＢＲＰの結合する既知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成し、アッセイ混合物を試験化合物と接触させ、そしてＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定することを含み、ここで、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質と相互作用する試験化合物の能力の決定は、ＡＲＰ／ＢＲＰ標的分子に優先的に結合するか、又はその活性を調節するＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の能力を決定することを含む。
【０１９０】
本発明の細胞を含まないアッセイは、ＡＲＰ／ＢＲＰの溶液形態又は膜結合形態の両方の使用に耐えられる。ＡＲＰ／ＢＲＰの膜結合形態を含んでいる細胞を含まないアッセイの場合に、膜結合形態のＡＲＰ／ＢＲＰが溶液状態で保持されるような溶解補助剤を利用することが望ましいかもしれない。そのような溶解補助剤の例は、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（商標） Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（商標） Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（商標）、イソトリデシポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−プロパン・スルホネート、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンミニオール−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、又は３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンミニオール−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホンネート（ＣＨＡＰＳＯ）のような非イオンの界面活性剤を含む。
【０１９１】
本発明の前述のアッセイ方法の１以上の態様において、一方若しくは両方のタンパク質の非複合形態からの複合形態の分離を容易にするために、並びにアッセイの自動化に適応させるためにＡＲＰ／ＢＲＰ又はその標的分子を固定することが望ましい。ＡＲＰ／ＢＲＰへの試験化合物の結合、又は候補化合物の存在又は不存在下での標的分子とＡＲＰ／ＢＲＰの相互作用は、反応物を含むのに好適ないずれの容器でも達成されうる。そのような容器の例は、マイクロタイタープレート、試験管、及びマイクロ遠沈管を含んでいる。１の態様において、タンパク質の一方又は両方の基質への結合することを可能にするドメインを付加した融合タンパク質が提供されうる。例えばＧＳＴ−ＡＲＰ／ＢＲＰ融合タンパク質又はＧＳＴ−標的融合タンパク質を、グルタチオン・セファロース・ビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）又はグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート吸着させることができ、次にそれを試験化合物、あるいは試験化合物と吸着させていない標的タンパク質若しくはＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質のどちらかと結合させ、そしてこの混合物を複合体形成を招く条件下（例えば、塩及びｐＨについて生理学的な条件で）でインキュベートする。インキュベーションに続いて、ビーズ又はマイクロタイタープレートのウェルを、洗浄してあらゆる非結合成分を除去し、固定化された基質がビーズの場合には、複合体が、前述のように、例えば直接的に又は間接的に決定される。あるいは、複合体は、基質から分離され、そして標準的な技術を使って、ＡＲＰ／ＢＲＰ結合又は活性のレベルが決定されうる。
【０１９２】
基質にタンパク質を固定するための他の技術は、本発明のスクリーニング・アッセイでも使用されうる。例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰ又はその標的分子は、ビオチンとストレプトアビジンの抱合を利用して固定化されうる。ビオチン化されたＡＲＰ／ＢＲＰ又は標的分子は、本技術分野で周知の技術を用いてビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシニミド）から調製することができ（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ）、そしてストレプトアビジンによりコートされた９６ウェル・プレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）のウェル内に固定化される。あるいは、ＡＲＰ／ＢＲＰ又は標的分子に応答性だが、標的分子とＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の結合を邪魔することのない抗体は、プレートのウェルに誘導体化されて、結合していない標的又はＡＲＰ／ＢＲＰを抗体抱合によってウェル内に捕捉しうる。そのような複合体の検出方法は、前述のＧＳＴ−固定化複合体に加えて、ＡＲＰ／ＢＲＰ又は標的分子に応答する抗体を用いた複合体の免疫検出、並びにＡＲＰ／ＢＲＰ又は標的分子に関係している酵素活性の検出を基にした酵素結合アッセイを含んでいる。
【０１９３】
他の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰ発現のモジュレーターは、細胞を候補化合物に接触されて、細胞のＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を測定する方法で確認される。候補物質化合物の存在下のＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現のレベルが、候補化合物の不存在下のＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルと比較される。次に、候補化合物は、この比較に基づいてＡＲＰ／ＢＲＰ発現のモジュレーターとして確認されうる。例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現が候補化合物の存在下でその不存在下よりも多い（統計的に有意に多い）とき、候補化合物は、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現の刺激薬と確認される。あるいは、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現が候補化合物の存在下でその不存在下よりも少ない（統計的に有意に少ない）とき、候補化合物は、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現の阻害剤と確認される。細胞におけるＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現のレベルは、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質を検出するために本明細書中に記載の方法によって決定されうる。
【０１９４】
本発明のさらに他の側面において、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、ＡＲＰ／ＢＲＰと結合、又は相互作用してＡＲＰ／ＢＲＰ活性を調節する他のタンパク質（「ＡＲＰ／ＢＲＰ結合タンパク質」若しくは「ＡＲＰ／ＢＲＰ−ｂｐ」）を確認するために「餌タンパク質」として二重ハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）アッセイ、又は三重ハイブリッド・アッセイで使用されうる（例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，２８３，３１７； Ｚｅｒｖｏｓ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２； Ｍａｄｕｒａｅｔａｌ． （１９９３） ＪＢｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８：１２０４６−１２０５４； Ｂａｒｔｅｌ ｅｔａｌ． （１９９３） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４； Ｉｗａｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６；及びＢｒｅｎｔ ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）。そのようなＡＲＰ／ＢＲＰ結合結合タンパク質は、例えばＡＲＰ／ＢＲＰ経路の上流又は下流要素としてＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質によるシグナルの伝播に関係していることが見込まれもする。
【０１９５】
二重ハイブリッド・システムは、分離可能なＤＮＡ結合及び活性化ドメインから成る、ほとんどの転写因子の基準の性質に基づく。要するに、このアッセイは、２種類の異なるＤＮＡ構築物を利用する。１つの構築物において、ＡＲＰ／ＢＲＰをコードする遺伝子を、既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合領域をコードする遺伝子に融合させる。他の構築物において、正体不明のタンパク質（「えじき（ｐｒｅｙ）」又は「サンプル」）のＤＮＡ塩基配列のライブラリーからのＤＮＡ塩基配列を、既知の転写因子の活性化領域をコードする遺伝子に融合させる。「餌（ｂａｉｔ）」及び「えじき」タンパク質が、生体内においてＡＲＰ／ＢＲＰ依存性複合体を形成する相互作用が可能である時、転写因子のＤＮＡ結合及び活性化領域は、緊密な近似をもたらす。この近似は、転写因子に応答する転写制御部位に利用できるように連結されたリポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写を可能にする。リポーター遺伝子の発現は、検出されることができて、そして機能的な転写因子を含む細胞コロニーが単離されて、ＡＲＰ／ＢＲＰと相互作用するタンパク質をコードするクローン化された遺伝子を得るために使用されうる。
【０１９６】
本願本発明は、前記のスクリーニング・アッセイにより同定された確認された新規薬剤、及び本明細書中に記載のような治療のためのそれらの使用にさらに関する。
【０１９７】
組織適合試験
本発明のＡＲＰ／ＢＲＰ配列は、わずかな生物学的なサンプルから個体を確認することに使用されることもできる。この技術において、個体のゲノムＤＮＡは、１以上の制限酵素で消化されて、識別のための独特なバンドをもたらすためにサザンブロットで探られる。本発明の配列は、ＲＦＬＰ（「制限断片長多型」米国特許番号第５，２７２，０５７号に記載）のための追加のＤＮＡ標識として有用である。
【０１９８】
さらに、本発明の配列は、個体ゲノムの選ばれた部分における塩基ごとの実際のＤＮＡ塩基配列を決定する代替技術を提供することに使用されうる。このように、本明細書中に記載のＡＲＰ／ＢＲＰ配列は、配列の５’及び３’末端からの２つのＰＣＲプライマーを作ることに使用されうる。次に、これらのプライマーは、個体のＤＮＡを増幅し、続いてそれを配列決定するために使われる。
【０１９９】
このやり方で準備される個体からの対応するＤＮＡ塩基配列のパネルは、各々の個体が対立遺伝子の相違によるそのようなＤＮＡ塩基配列のユニークな組み合わせを持つ時、独特な個体の識別を提供しうる。本発明の配列は、個体と組織からそのような識別配列を得ることに使用されうる。本発明のＡＲＰ／ＢＲＰ配列は、特徴的にゲノムの一部を表す。対立遺伝子変異は、これらの配列のコーディング領域にある程度発生し、非コーディング領域により高い頻度で発生する。ヒトの個体間の対立遺伝子変異は、５００塩基当たり約１つの頻度で発生すると見積もられる。対立遺伝子変異の多くが、制限断片長多型（ＲＦＬＰｓ）を含む一塩基多型（ＳＮＰｓ）による。
【０２００】
本明細書中に記載の各々の配列は、ある程度まで個体からのＤＮＡを識別の目的のために比較しうる標準として使用されうる。より多数の多型が非コーディング領域で生じるので、より少ない配列しか個体を識別するのに必要ではない。配列番号２、４、１８、２０、及び２２の非コーディング配列は、各々が１００塩基の非コーディング増幅配列をもたらす多分１０〜１，０００のプライマーのパネルにより明確な個々の識別を十分に提供しうる。推測されたコード配列、例えば配列番号２、４、１８、２０、及び２２のそれが使用されたとき、十分な個体の識別のためのより適切なプライマーの数は５００〜２，０００である。
【０２０１】
予測的な医学
本発明は、診断上のアッセイ、兆候アッセイ、薬理ゲノム学、及び臨床試験の観察が兆候（推測）目的のために使用され、それによって予防に個体を処置する予測的な医学の分野に関しもする。それ故に、本発明の１の側面は、それによって個体が、異常なＡＲＰ／ＢＲＰ発現又は活性、例えば生殖障害、不妊症、排卵の障害に関係する病気又は障害に冒されているが、あるいは障害が進行する危険性があるかを決定するための、生物学的なサンプル（例えば血液、血清、細胞、組織）の状況中のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、ＡＲＰ／ＢＲＰ 多量体、及び／又は核酸の発現、並びにＡＲＰ／ＢＲＰ及びＡＲＰ／ＢＲＰ多量体の活性を決定するための診断アッセイに関する。本発明は、個体がＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、多量体、核酸の発現又は活性に関係している障害を進行させる危険があるかどうかを決定するための兆候（又は予測的）アッセイをも提供もする。例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子内の突然変異は、生物学的サンプルでアッセイされうる。そのようなアッセイは、それによりＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、核酸の発現又は活性に特徴づけられたか、又は関連する障害の兆候に先立ち個体を処置するための兆候または予測的な目的のために使われることができる。
【０２０２】
本発明の他の側面は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、多量体、核酸の発現、又は個体のＡＲＰ／ＢＲＰ活性を測定し、それによってその個体について適切な治療又は病気を予防する薬剤を選ぶ方法（「薬理ゲノム学」とも呼ばれる）を提供する。薬理ゲノム学は、個体（例えば、特定の物質に応答する個体の能力を決定するために検査された個体の遺伝子型）個体の遺伝子型に基づいた個体の治療又は予防処置のための作用物質（例えば、薬物）の選定を可能にする。
【０２０３】
本発明のさらに他の側面は、臨床試験におけるＡＲＰ／ＢＲＰの発現又は活性への作用物質（例えば、薬物若しくは化合物）の影響を観察することに関する。
【０２０４】
これら及び他の作用物質は、以下のセクションにおいてより詳細に記載される。
【０２０５】
診断上のアッセイ
生物学的なサンプルのＡＲＰ／ＢＲＰの存在又は不存在を検出する模範的な方法は、試験対象から生物学的サンプルを得て、ＡＲＰ／ＢＲＰの存在が生物学的サンプルで検出されるように、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、ＡＲＰ／ＢＲＰ多量体又はＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出できる化合物又は作用物質と生物学的サンプルを接触させることを含む。ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを検出するための作用物質は、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡかゲノムＤＮＡにハイブリダイズしうる標識核酸プローブである。例えば、核酸プローブは、完全長のＡＲＰ／ＢＲＰ核酸、例えば配列番号１、３、１７、１９、及び２１の核酸、又は少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０、又は５００ヌクレオチドの、かつ、ストリンジェントな条件下、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであるようなそれらの一部でありうる。本発明の診断上のアッセイに使用するための他の好適なプローブが、本明細書中に記載されている。
【０２０６】
ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質又はＡＲＰ／ＢＲＰ多量体を検出するための作用物質は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質又はＡＲＰ／ＢＲＰ 多量体に結合しうる抗体、好ましくは検出可能な標識を持つ抗体である。抗体は、ポリクローナル、又はより好ましくは、モノクローナルである。完全な抗体又はそれらの断片（例えば、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２）が使用されうる。プローブ又は抗体に関して、用語「標識された」は、連結（すなわち、物理的な連結）によるプローブ又は抗体の直接的な標識付け、並びに直接的に標識された作用物質との反応性によるプローブ又は抗体の間接的な標識付けを含むように意図される。間接的な標識付けの例は、蛍光標識された二次抗体を用いた一次抗体の検出、及び蛍光標識されたストレプトアビジンで検出されるようなビオチンによるＤＮＡプローブの末端の標識付けを含んでいる。用語「生物学的サンプル」は、対象から単離した組織、細胞、及び生体液、並びに対象の中に存在する組織、細胞、及び流体を含むように意図される。すなわち、本発明の検出方法は、インビトロにおける、並びにインビトロにおける生物学的サンプル中のＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡ、タンパク質、ゲノムＤＮＡを検出するために使用されうる。例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰ ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術は、ノーザン・ハイブリダイゼーション及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含んでいる。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の検出のためのインビトロ技術は、酵素結合免疫吸収検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降、及び免疫螢光法を含んでいる。ＡＲＰ／ＢＲＰゲノムＤＮＡの検出のためのインビトロ技術は、サザン・ハイブリダイゼーションを含んでいる。さらに、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の検出のためのインビボ技術は、標識された抗ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体を対象の中へ導入することを含んでいる。例えば、抗体は、対象中でのその存在及び所在が標準的な映像技術によって検出されうる放射性マーカーで標識されうる。
【０２０７】
１の態様において、生物学的サンプルは、試験対象からのタンパク質分子を含んでいる。あるいは、生物学的サンプルは、試験対象からのｍＲＮＡ分子又は試験対象からのゲノムＤＮＡ分子を含むことができる。好ましい生物学的サンプルは、対象から慣例の手段によって単離された末梢血液白血球サンプルである。
【０２０８】
他の態様において、方法は、対照の対象から対照生物学的サンプルを得、この対照サンプルを、生物学的なサンプル中のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、多量体、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡを検出するようなＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、多量体、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡの検出が可能な化合物又は作用物質と接触させ、そして上記対照サンプル中のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡの存在を、試験サンプル中のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、多量体、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡの存在と比較することを含む。
【０２０９】
本発明は、生物学的サンプル中のＡＲＰ／ＢＲＰの存在を検出するためのキットをも含む。例えば、キットは、以下の：生物学的サンプル中のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、多量体、又はｍＲＮＡを検出しうる標識化合物又は作用物質；生物学的サンプル中のＡＲＰ／ＢＲＰの量を測定するための手段；そしてサンプルのＡＲＰ／ＢＲＰの量を標準と比較するための手段を含むことができる。化合物又は作用物質は、好適な容器により包装されうる。キットは、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質又は核酸を検出するためにキットを使うため規格をさらに含むことができる。
【０２１０】
兆候アッセイ
本明細書中に記載の診断上の方法は、異常なＡＲＰ／ＢＲＰ発現又は活性に関係している病気か、又は障害を持つか、あるいはそれらを進行させる危険がある対象を確認するためにさらに利用されうる。例えば、本明細書中に記載のアッセイ、例えば先の診断上のアッセイ又は以下のアッセイは、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、多量体、核酸の発現又は活性に関係している障害、例えば癌、排卵の障害、不妊症、若しくは性機能低下を持つか、又はそれらを進行させる危険がある対象を確認するために利用されうる。あるいは、兆候アッセイは、病気又は障害を持つか、あるいは進行させる危険がある対象を確認するために利用されうる。このように、本発明は、対象から得られ、そしてＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、多量体、又は核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）の存在が検出される、試験サンプル中の異常なＡＲＰ／ＢＲＰ発現又は活性関係している病気又は障害を確認する方法を提供し、ここでＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、多量体、又は核酸の存在を、異常なＡＲＰ／ＢＲＰ発現又は活性に関係している病気又は障害を持つか、又はそれらを進行させる危険がある対象に関する診断に用いる。本明細書中に使用されるとき、「試験サンプル」は、着目のの対象から得られた生物学的サンプルに関する。例えば、試験サンプルは、生体液（例えば、血清）、細胞サンプル、又は組織であるかもしれない。
【０２１１】
さらに、本明細書中に記載の兆候のアッセイは、対象が、異常なＡＲＰ／ＢＲＰ発現又は活性に関係している病気又は障害の処置のために作用物質（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、偽ペプチド、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、又は他の薬物候補物質）を与えられることができるかどうかを決定するために使用されうる。例えば、そのような方法は、癌、排卵の障害、不妊症、又は性機能低下のような障害のための作用物質で対象が効果的に治療されうるかどうかを決定するために使用されうる。このように、本発明は、異常なＡＲＰ／ＢＲＰ発現に活性に関係している障害を治療ための作用物質により対象が効果的に治療されうるかどうか確認するための方法を提供することができ、ここで試験サンプルを得、そしてＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質又は核酸を検出する（例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質又は核酸の存在は、異常なＡＲＰ／ＢＲＰ発現若しくは活性に関係している障害を治療するための作用物質が対象に与えられうるかを診断する）。
【０２１２】
本発明の方法は、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の遺伝子の損傷を検出することにも使用されることができ、それによって、損傷遺伝子を持つ対象が異常な細胞増殖及び／又は分化によって特徴づけられる障害について危険があるかどうかを決定する。様々な態様において、前記方法は、対象からの細胞サンプルにおける、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質をコードしている遺伝子の完全性に影響する少なくとも１の変更、あるいはＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の誤発現によって特徴づけられる損傷遺伝子の存在又は不存在を検出することを含んでいる。例えば、そのような遺伝子の損傷は、（１）ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子からの１以上のヌクレオチドの欠失；（２） ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子への１以上のヌクレオチドの付加；（３） ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の１以上のヌクレオチドの置換、（４）ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の染色体の転位；（５） ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写レベルの変更、（６） ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子、例えばゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常な修飾、（７） ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写の非野生型のスプライシング・パターンの存在、（８） ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の非野生型レベル、（９） ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の対立遺伝子欠失、そして（１０） ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の不適切な転写後修飾の少なくとも１つの存在を確かめることによって検出されうる。本明細書中に記載のとおり、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子中の損傷を検出するために使用されうる本技術分野で知られている多数のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的サンプルは、対象から慣例の手段によって単離された末梢血液白血球サンプルである。しかし、例えば頬の粘膜細胞を含め、有核の細胞を含んでいるいずれの生物学的サンプルでも使用されうる。
【０２１３】
ある態様において、損傷の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許番号第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号を参照のこと）、例えばアンカーＰＣＲ若しくはＲＡＣＥ ＰＣＲ、あるいはライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０；及びＮａｋａｚａｗａ ｅｔ ａｌ． （１９９４） ＰＮＡＳ ９１：３６０−３６４を参照のこと）におけるプローブ／プライマーの使用を含み、後者は、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の点突然変異の検出に特に役立つかもしれない（Ａｂｒａｖａｙａ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２３：６７５−６８２を参照のこと）。この方法は、患者からの細胞のサンプルを収集し、サンプルの細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡ、又はその両方）を分離し、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子（存在する場合には）のハイブリダイゼーション及び増幅が生じるような条件下、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子に特異的にハイブリダイズする１以上のプライマーと上記核酸サンプルを接触させ、そして増幅産物の存在又は不存在を検出するか、あるいは増幅産物のサイズを測定し、そして、対照サンプルと長さを比較するステップを含む。ＰＣＲ及び／又はＬＣＲは、本明細書中に記載の突然変異を検出するために使われる技術のいずれかに関連する予備的な増幅ステップとして使用されることが望ましいと予想される。
【０２１４】
当業者が周知の技術を用いた増幅分子の検出が続く、代替の増幅方法は、以下の：自立した配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ， ｅｔ ａｌ， １９８９， Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−ベータ・レプリカ−ゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ， １９８８， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、又は全ての他の核酸増幅方法を含む。そのような分子が非常に少ない数であれば、これらの検出スキームは核酸分子の検出に特に有用である。
【０２１５】
代替の態様において、サンプル細胞からのＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の突然変異は、制限酵素開裂パターンの変化によって確認されうる。例えば、サンプル及び対照ＤＮＡを単離し、（場合により）増幅し、１以上の制限エンドヌクレアーゼで消化し、そして断片長サイズをゲル電気泳動法によって決定し、そして比較する。サンプルと対照ＤＮＡの間の断片長サイズの相違は、サンプルＤＮＡにおける突然変異を示す。しかも、配列特異的リボザイムの使用（例えば、米国特許番号第５，４９３，５３１号を参照のこと）は、リボザイム開裂部位の構築又は損失による特定の突然変異の存在についてのスコアに使用されうる。
【０２１６】
他の態様において、ＡＲＰ／ＢＲＰにおける遺伝子突然変異は、サンプルと対照核酸、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ、を何百又は何千ものオリゴヌクレオチド・プローブを含む高密度アレイ（Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｍｕｔａｔｉｏｎ ７： ２４４−２５５； Ｋｏｚａｌ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２： ７５３−７５９）にハイブリダイズさせることによって確認しうる。例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰの遺伝子突然変異は、Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．の前記に記載の発光ＤＮＡプローブを含んでいるニ次元アレイにより確認しうる。要するに、プローブの第１ハイブリダイゼーション・アレイが、一連の重複プローブの線形アレイを作ることによって配列間の塩基変化を確認するためにサンプル及び対照ＤＮＡの長い広がりを通してスキャンするために使用されうる。このステップは、点突然変異の同定を可能にする。このステップには、検出される全ての変異型又は突然変異に相補的なより小さくて、特殊なプローブ配列を使うことによって特定の突然変異の特徴付けを可能にする第２のハイブリダイゼーション・アレイが続く。各々の突然変異アレイは、一方が野生型遺伝子に相補的であり、そして他方が突然変異型遺伝に相補的である、平行なプローブ・セットから構成される。
【０２１７】
さらに他の態様において、本技術分野で知られている種々の配列応答のいずれかは、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の直接的な配列決定に、そしてサンプルＡＲＰ／ＢＲＰの配列と対応する野生型（対照）配列を比較することによって突然変異の検出に使用されうる。配列応答の例は、Ｍａｘｉｍ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ （１９７７） ＰＮＡＳ ７４：５６０、又はＳａｎｇｅｒ （１９７７） ＰＮＡＳ ７４：５４６３により開発された技術に基づくものを含んでいる。同様に、質量分析での配列決定を含む診断上のアッセイ（Ｎａｅｖｅ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：４４８）を遂行する時、種々の自動化された配列決定手順の全てを利用しうると意図される（例えば、ＰＣＴ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．ＷＯ ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ａｄｖ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ ３６：１２７−１６２； ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９３） ＡｐｐｌＢｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３８： １４７−１５９を参照のこと）。
【０２１８】
ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子における突然変異の検出のための他の方法は、開裂剤からの保護がＲＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ２本鎖のミスマッチ塩基を検出するために使用される方法を含んでいる（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２）。概して、「ミスマッチ開裂」の本技術分野の技術は、組織サンプルから得た潜在的な突然変異型ＲＮＡ又はＤＮＡと野生型ＡＲＰ／ＢＲＰ配列を含む（標識された）ＲＮＡ又はＤＮＡのハイブリダイズにより形成されるヘテロ２本鎖を提供することによって始まる。ニ重鎖の２本鎖は、例えば対照とサンプル鎖の間のミスマッチ塩基対により生じるであろう、２本鎖の１本鎖部位を開裂する作用物質で処理される。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡの２本鎖は、ＲＮａｓｅにより、そしてＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、Ｓ１ヌクレアーゼにより酵素的にミスマッチ部位を消化するために処理されうる。他の態様において、ＤＮＡ／ＤＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡの２本鎖のいずれかは、ミスマッチ部位を消化するためにヒドロキシルアミン又は四酸化オスミウム、及びピペリジンにより処理されうる。ミスマッチ部位の消化の後に、得られた物質は、変性ポリアクリルアミドゲルを用いてサイズによって分けられ、突然変異部位が決定される。例えばＣｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ （１９８８） Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：４３９７； Ｓａｌｅｅｂａ ｅｔ ａｌ （１９９２） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２１７：２８６−２９５を参照のこと。１の態様において、対照ＤＮＡ又はＲＮＡは検出のために標識されうる。
【０２１９】
さらに他の態様において、ミスマッチ開裂反応は、細胞のサンプルから得られたＡＲＰ／ＢＲＰ ｃＤＮＡの点突然変異の検出及びマッピングにための規定のシステムとにおける２本鎖ＤＮＡのミスマッチ塩基対を確認する１以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を利用する。例えば、Ｅ．コリのｍｕｔＹ酵素はＧ／ＡミスマッチのＡを開裂し、ＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼはＧ／ＴミスマッチのＴを開裂する（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １５：１６５７−１６６２）。典型的な例によると、ＡＲＰ／ＢＲＰ配列に基づいたプローブ、例えば野生型ＡＲＰ／ＢＲＰ配列は、試験細胞からのｃＤＮＡ又は他のＤＮＡ産物とハイブリダイズする。２本鎖は、ＤＮＡミスマッチ修復酵素により処理され、開裂産物がもしあれば電気泳動プロトコールなどにより検出される。例えば、米国特許番号第５，４５９，０３９号を参照のこと。
【０２２０】
他の態様において、電気泳動移動度の変化は、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の突然変異の確認に使われる。例えば、１本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）は、突然変異型と野生型核酸の間の電気泳動移動度の相違を検出するために使われた（Ｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ： ８６：２７６６、Ｃｏｔｔｏｎ （１９９３） ＭｕｔａｔＲｅｓ ２８５：１２５−１４４；Ｈａｙａｓｈｉ （１９９２） Ｇｅｎｅｔ Ａｎａｌ Ｔｅｃｈ Ａｐｐｌ ９：７３−７９をも参照のこと）。サンプル及び対照ＡＲＰ／ＢＲＰ核酸の一本鎖ＤＮＡ断片は、変性されて、そして再生される。１本鎖核酸の２次構造は、配列に従って変わり、電気泳動移動度において得られた変化は、１塩基の変化さえ検出を可能にする。ＤＮＡ断片は、標識されるか又は標識されたプローブで検出されうる。アッセイの感度は、２次構造が配列の変化により敏感であるＲＮＡ（ＤＮＡよりも）を使うことによって高められうる。１の態様において、対象方法は、電気泳動移動度の変化に基づく２本鎖のヘテロ二重鎖分子を分離するためのヘテロ二重鎖解析を利用する（Ｋｅｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ ７：５）。
【０２２１】
さらに他の態様において、変性剤のグラジエントを含むポリアクリルアミドゲルによる突然変異型、又は野生型断片の移動は、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）を使ってアッセイされる（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５）。ＤＧＧＥがアッセイ方法として使われる時、ＤＮＡは、例えばＰＣＲによる約４０のｂｐの高融点ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプに付加により完全に変性しないことを確実にするために修飾される。さらなる態様において、対照とサンプルＤＮＡの移動度の違いの確認のために変性剤濃度勾配の代わりに温度勾配が使われる（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ ａｎｄ Ｒｅｉｓｓｎｅｒ （１９８７） Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ ２６５：１２７５３）。
【０２２２】
点突然変異の検出のための他の技術の例は、制限されることなく、選択的なオリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーション、選択的な増幅、又は選択的なプライマー伸長を含む。例えば、オリゴヌクレオチド・プライマーは、既知の突然変異が主に実施され、次に完璧な一致の場合のみにハイブリダイゼーションしうる条件下で標的ＤＮＡとハイブリダイズさせることにより調製される（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３；Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：６２３０）。そのオリゴヌクレオチドがハイブリダイジング膜に接着し、かつ、標識された標的ＤＮＡにハイブリダイズするとき、そのような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅標的ＤＮＡ又は相当数の異なる突然変異型にハイブリダイズする。
【０２２３】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術は、すぐ利用できる本発明と一緒に使用されうる。特異的増幅のためのプライマーとして使われたオリゴヌクレオチドは、（増幅が差異的なハイブリダイゼーションに依存するような）分子の中心に（Ｇｉｂｂｓ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １７：２４３７−２４４８）、又は適切な条件下でミスマッチがポリメラーゼ伸長を妨げるか又は減らしうるできる、１つのプライマーの極端な３’末端（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ （１９９３） Ｔｉｂｔｅｃｈ １１：２３８）に着目の突然変異を担持するかもしれない。加えて、開裂に基づく検出を生み出すために突然変異部位に新規制限部位を導入することが望ましい（Ｇａｓｐａｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ （１９９２） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ６：１）。ある態様において、増幅は、増幅のためのＴａｑリガーゼを用いて実施されもすると予想される（Ｂａｒａｎｙ （１９９１） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８ ８：１８９）。そのような場合、連結は、完璧な一致が３’末端の５’配列に存在した場合に限り起こり、増幅の有無を捜すことによって特定の部位での既知の突然変異の存在の検出を可能にする。
【０２２４】
本明細書中に記載の方法は、例えば本明細書中に記載のプローブ核酸又は抗体試薬の少なくとも１つを含んでいる、例えばＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子に関与する疾患又は病気の症状又は家族歴を示す患者の臨床的診断に都合よく使用されうる、あらかじめ包装された診断キットの利用によって実施されうる。
【０２２５】
さらに、ＡＲＰ／ＢＲＰが発現されているあらゆる細胞種又は組織、好ましくは、末梢血液白血球が、本明細書中に記載の兆候アッセイで利用されうる。しかし、例えば頬の粘膜細胞を含む、有核細胞を含むあらゆる生物学的サンプルが使用されうる。
【０２２６】
薬理ゲノム学
本明細書中に記載のスクリーン・アッセイにより同定された、ＡＲＰ／ＢＲＰ若しくはＡＲＰ／ＢＲＰ多量体の活性（例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子発現）に対して刺激又は阻害効果を持つ作用物質又はモジュレーターは、異常なＡＲＰ／ＢＲＰ活性に関係した障害（例えば、癌、排卵の障害、不妊症、又は性機能低下）を治療（予防に又は治療に）するために個体に投与されうる。そのような治療に関連して、個体の薬理ゲノム学（すなわち、個体の遺伝子型と外来の化合物又は薬物へのその個体の応答の間の関係の研究）が考えられるかもしれない。治療薬の代謝の相違は、薬理学的に活性な薬剤の投与量と血中濃度の関係が変わることによって重大な毒性又は治療の失敗をもたらしうる。このように、個体の薬理ゲノム学は、個体の遺伝子型の考慮に基づいた予防又は治療処置のための効果的な作用物質（例えば薬物）の選定をもたらす。そのような薬理ゲノム学は、適切な投与量、及び治療計画の決定にさらに使用されうる。それ故に、個体のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の活性、ＡＲＰ／ＢＲＰ核酸の発現、又はＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の突然変異内容は、個体の治療又は予防処置のための適切な作用物質の選択を決定しうる。
【０２２７】
薬理ゲノム学は、罹患したヒトにおける薬物の変化した性質及び異常な作用による、薬物に対する応答の臨床的に重要な遺伝的な変化に対応する。例えば、をＥｉｃｈｅｌｂａｕｍ， Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ， １９９６， ２３：９８３−９８５、及びＬｉｎｄｅｒ， Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ， １９９７，４３：２５４−２６６参照のこと。一般に、２種類の薬理ゲノム学の条件は、区別されうる。体に対する薬剤の作用の様式を変化させる１つの因子として伝達される遺伝的条件（薬物作用を変える）、又は薬物に対する体の作用の様式を変化させる１つの因子として伝達される遺伝的条件（薬物代謝を変える）。これらの薬理ゲノム学の条件は、稀な欠陥又は多型のいずれかとして生じうる。例えば、主な臨床合併症がオキシダント系薬物（抗マラリア薬、サルファ薬、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取、及びソラマメの消費後の溶血であるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）欠損は、遺伝性の酵素病である。
【０２２８】
説明的な態様として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強さ及び継続時間の両者が主な決定要因である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）、並びにシトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多型の発見は、ある患者が期待されている薬物効果を得ないのか、又は標準的で、安全な量の薬物を飲んだ後に過度の薬物反応と深刻な毒性を示したりする理由に関する説明を提供した。これらの多型は、集団中に、高代謝群（ＥＭ）及び低代謝群（ＰＭ）の２つの発現型を呈する。ＰＭの有病数は異なる集団の間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６コードする遺伝子は、高度に多型であり、そして全部が機能性ＣＹＰ２Ｄ６の欠損に導く、いくつかの突然変異がＰＭで確認された。それらが標準的な服用を受けた場合、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｃ１９の低代謝群は、過度の薬物反応と副作用をかなりの頻度で経験する。代謝産物が活性な治療部分である場合、ＰＭは、ＣＹＰ２Ｄ６によって形成された代謝産物モルヒネにより仲介されるコデインの無痛効果について証明されたような治療応答を示さない。他の異常は、標準的な服用に応答しないいわゆる超高代謝群である。最近、超高代謝群の分子的機序が、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅が原因であると確認された。
【０２２９】
このように、個体のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、ＡＲＰ／ＢＲＰ多量体の活性、ＡＲＰ／ＢＲＰ核酸の発現、又はＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の突然変異の内容が、それによって個体の治療又は予防処置に適切な作用物質の選択を決定しうる。さらに、薬理ゲノム学の研究は、個体の薬物反応性発現型の同定に薬物代謝酵素をコードしている多型対立遺伝子を適用するために使われうる。投薬又は薬物選択に適用されるとき、この知識は、本明細書中に記載の典型的なスクリーニング・アッセイの１つによって確認されたモジュレーターのようなＡＲＰ／ＢＲＰモジュレーターを持つ対象を処置する場合に、有害反応又は治療の失敗を避けて、その結果、治療又は予防効果を高めることができる。
【０２３０】
臨床試験中の効果の観察
ＡＲＰ／ＢＲＰ若しくはＡＲＰ／ＢＲＰ多量体の発現又は活性に対する（例えば、異常な細胞増殖、及び／又は分化を調節する能力）作用物質（例えば、薬物、化合物）の影響の観察は、基本的な薬物スクリーニングだけでなく臨床試験でも用いられることができる。例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子発現、タンパク質レベルを増加させるか、又はＡＲＰ／ＢＲＰ活性を上方制御する、本明細書中に記載のスクリーニング・アッセイにより同定された作用物質の有効性は、低下したＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子の発現、タンパク質レベル、又は下方制御されたＡＲＰ／ＢＲＰ活性を示している対象の臨床試験により観察されうる。あるいは、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子発現、タンパク質レベルを低下させるか、ＡＲＰ／ＢＲＰ活性を下方制御する、スクリーニング・アッセイによって同定された作用物質の有効性は、ＡＲＰ／ＢＲＰ遺伝子発現、タンパク質レベルを増加させるか、又はＡＲＰ／ＢＲＰ活性を上方制御を示している対象の臨床試験で観察されうる。そのような臨床試験において、ＡＲＰ／ＢＲＰ、並びに、好ましくは、例えば癌、排卵の障害、不妊症、又は性機能低下と関連する他の遺伝子の発現又は活性が、特定の細胞の免疫応答性の「出力」又はマーカーとして使用されうる。
【０２３１】
例えば、そして制限としてでなく、（例えば、本明細書中に記載のスクリーニング・アッセイで同定される）ＡＲＰ／ＢＲＰ活性を調節する作用物質（例えば、化合物、薬物、又は小分子）を用いた処理により細胞内で調節される、ＡＲＰ／ＢＲＰを含めた遺伝子を確認しうる。このように、例えば臨床試験で、細胞増殖障害に対する作用物質の効果を調査するために、細胞が単離され、そしてＲＮＡが準備され、そしてＡＲＰ／ＢＲＰ及び障害に関連した他の遺伝子の発現レベルについて分析される。遺伝子発現のレベル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、本明細書中に記載のノーザンブロット解析、又はＲＴ−ＰＣＲ、あるいは本明細書中に記載の方法の１つによる産生されたタンパク質の測定、あるいはＡＲＰ／ＢＲＰ又は他の遺伝子の活性レベルの計測により定量されうる。この方法において、遺伝子発現パターンは、作用物質に対する細胞の生理学的な応答を表わしたマーカーとしての役目をする。それ故に、この応答状態は、作用物質による個体の処置の前、及びその間の様々な時点で決定される。
【０２３２】
１の態様において、本発明は、以下の（ｉ）作用物質の投与前の対象から投与前サンプルを得、；（ｉｉ） 投与前サンプルのＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出し、；（ｉｉｉ）対象から１点以上の投与後サンプルを得；（ｉｖ）投与以後サンプルのＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの発現又は活性のレベルを検出し；（ｖ）投与前サンプルのＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡと投与後サンプル又はサンプルのＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、ｍＲＮＡ、又はゲノム ＤＮＡの発現又は活性レベルを比較し；そして（ｖｉ）対象に対する作用物質の投与量を適宜に変える、ステップを含む作用物質（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、偽ペプチド、核酸、小分子、又は本明細書中に記載のスクリーニング・アッセイによって確認された他の薬物候補物質）を用いた対象の処置の有効性を観察する方法を提供する。例えば、作用物質の増加した投与は、検出されるより高いレベルまでＡＲＰ／ＢＲＰの発現又は活性を増加させるために、すなわち、作用物質の有効性を増加させるために望ましいかもしれない。あるいは、作用物質の減少した投与は、検出されるより低いレベルまでＡＲＰ／ＢＲＰの発現又は活性を減少させるために、すなわち、作用物質の有効性を減少させるために望ましいかもしれない。
【０２３３】
処置方法
本発明は、異常なＡＲＰ／ＢＲＰ発現又は活性に関係している障害、例えば細胞の増殖障害又は再生障害の危険がある（それに感受性の）か、又は障害を持つ対象を処置する予防、又は治療方法の両方を提供する。さらに、ＢＲＰ及びＡＲＰ核酸、ポリペプチド、及びタンパク質多量体は、精子形成を刺激するため、甲状腺細胞の機能を高めるため（すなわち、甲状腺ホルモン製造とヨウ化物捕捉の増加）、性腺機能を調節するため、性腺ホルモン製造を調節するため、生殖能力を促進するか又は抑制するために使用されうる。
【０２３４】
障害
レベル又生理活性の増加により特徴づけられる（病気又は障害で苦しんでいない対象に関係する）病気及び障害は、活性が拮抗する（すなわち、減少又は抑制）治療薬により処置される。活性が拮抗する治療薬は、治療のためであるか又は予防のための様式で投与されるかもしれない。利用されうる治療薬は、制限されることなく、（ｉ）前述のペプチド、又はそれらのアナログ、誘導体、断片、又はホモログ；（ｉｉ）前述のペプチドに対する抗体；（ｉｉｉ）前述のペプチドをコードする核酸；（ｉｖ）相同組み換えによって前述のペプチドの内因性機能の「ノックアウト」に利用される、「機能障害」である（すなわち、前述のペプチドに対するコード配列のコード配列内の非相同性挿入による）、アンチセンス核酸及び核酸の投与（例えばＣａｐｅｃｃｈｉ， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２を参照のこと）；（ｖ）前述のペプチドとその結合パートナーの間の相互作用を変更するモジュレーター（すなわち、本発明でさらなる偽ペプチド若しくは本発明のペプチドに特異的な抗体を含む阻害剤、アゴニスト、及びアンタゴニスト）、あるいは（ｖｉ）前述のタンパク質多量体を含んでいる。
【０２３５】
レベル又生理活性の減少により特徴づけられる（病気又は障害で苦しんでいない対象に関係する）病気及び障害は、活性を増加させる（すなわち、そのアゴニストである）治療薬により処置される。活性を増加させる治療薬は、治療のためであるか又は予防のための様式で投与されるかもしれない。利用されうる治療薬は、制限されることなく、前述のペプチド、又はそれらのアナログ、誘導体、断片、又はホモログ；あるいは生理活性を増加させるアゴニストを含む。
【０２３６】
増加又は減少レベルは、（例えば、バイオプシー組織から）患者組織サンプルを得、そしてインビトロでＲＮＡ又はペプチドレベル、発現されたペプチドの構造、及び／又は活性（又は前述のペプチドのｍＲＮＡ）についてアッセイすることによる、ペプチド及び／又はＲＮＡの定量化により、容易に検出されうる。本技術分野で周知な方法は、制限されることなく、免疫学的アッセイ法（例えば、ウェスタンブロット解析、免疫沈降、続くドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学などにより）、及び／又はｍＲＮＡｓの発現を検出するためのハイブリダイゼーション・アッセイ法（例えば、ノーザン・アッセイ、ドット・ブロット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなど）を含む。
【０２３７】
予防方法
１の側面において、本発明は、ＡＲＰ／ＢＲＰ発現又は少なくとも１のＡＲＰ／ＢＲＰ活性を調節する作用物質を対象に投与することによって、対象における異常なＡＲＰ／ＢＲＰの発現又は活性に関係している病気又は症状を防ぐ方法を提供する。異常なＡＲＰ／ＢＲＰ発現又は活性によって引き起こされたか、又はそれに導かれた病気の危険がある対象は、例えば本明細書中に記載された診断上又は兆候のアッセイのいずれかの組み合わせにより確認されうる。予防な作用物質の投与は、病気か障害が予防されるか、あるいはその進行が遅れるような、ＡＲＰ／ＢＲＰ異常に特徴的な症状の兆候より前に存在しうる。ＡＲＰ／ＢＲＰ異常の種類に依存して、例えば、ＡＲＰ／ＢＲＰアゴニスト又はＡＲＰ／ＢＲＰアンタゴニスト作用物質が対象の処置のために使用されうる。適切な作用物質が、本明細書中に記載のスクリーニング・アッセイに基づき決定されうる。本発明の予防方法は、さらに以下の小節で議論される。
【０２３８】
治療方法
本発明の他の側面は、治療目的のためのＡＲＰ／ＢＲＰの発現又は活性を調節する方法に関する。本発明の調節方法は、細胞に関係しているＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質活性の１以上の活性を調節する作用物質に細胞を接触させることを伴う。ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質活性を調節する作用物質は、本明細書中に記載の作用物質、例えば核酸又はタンパク質、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質の天然の同系統のリガンド、ペプチド、ＡＲＰ／ＢＲＰ偽ペプチド、又は他の小分子であるかもしれない。１の態様において、前記作用物質は、１以上のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質活性を促進する。そのような促進作用物質の例は、活性ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質、及び細胞に導入されたＡＲＰ／ＢＲＰをコードしている核酸分子を含んでいる。他の態様において、作用物質は１以上のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質活性を阻害する。そのような阻害作用物質の例は、アンチセンスＡＲＰ／ＢＲＰ核酸分子、及び抗ＡＲＰ／ＢＲＰ抗体を含んでいる。これらの調節方法は、インビトロ（例えば、作用物質を伴う細胞の培養により）、あるいはインビボ（例えば、作用物質を対象に投与することにより）で実施されうる。そのように、本発明は、ＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質若しくは核酸分子の異常な発現又は活性によって特徴づけられる病気又は障害に苦しむ個体の処置方法を提供する。１の態様において、前記方法は、ＡＲＰ／ＢＲＰの発現又は活性を調節（例えば、上方制御又は下方制御）する作用物質（例えば、本明細書中に記載のスクリーニング・アッセイによって同定された作用物質）、又は作用物質の組み合わせ物を投与することを含む。他の態様において、前記方法は、低下したか、又は異常なＡＲＰ／ＢＲＰ発現又は活性を償うために治療としてのＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質又は核酸分子を投与することを含む。
【０２３９】
ＡＲＰ／ＢＲＰ活性の促進は、ＡＲＰ／ＢＲＰが異常に下方制御されている状況、及び／又は高められたＡＲＰ／ＢＲＰ活性が有益な影響を与えることが見込まれる状況で望ましい。そのような状況の１つの例は、対象が異常な細胞増殖及び／又は分化（例えば、癌）によって特徴づけられる障害を有する場合である。そのような状況の他の例は、対象が生殖障害（例えば、排卵の障害又は不妊症）を有する場合である。
【０２４０】
治療薬の生物学的効果の確認
本発明の様々な態様において、好適なインビトロ又はインビボのアッセイは、特定の治療薬の効果、及びその投与が罹患組織の処置に必要とされるかどうかを決定するために利用される。
【０２４１】
様々な特定の実施例において、治療薬がその細胞種への所望の効果を発揮するかどうか確認するために、インビトロのアッセイが、患者の障害に関与している種類の代表的な細胞を用いて実施される。治療に使用するのための化合物は、対象で試験する前に、制限されることなく、ラット、マウス、ニワトリ、雌牛、猿、ウサギなどを含む好適な動物モデル系で試験されうる。同様に、インビボ試験のために、本技術分野で知られている動物モデル系のいずれかが対象への投与より前に使用されうる。
【０２４２】
生殖障害
前述のタンパク質及び多量体は、生殖機能に関係している。それ故に、本発明の治療薬は、生殖に関する病気か障害の治療又は予防処置に役立つかもしれない。生殖障害は、女性及び男性の療法の生殖障害を含んでいる。女性の生殖障害の例は、排卵の障害（すなわち、濾胞の発達の促進及び排卵の誘発）、月経前症候群、卵巣嚢胞、子宮内膜症、子宮平滑筋腫、不妊症、骨盤内炎症性疾患、膣痙、及び閉経含んでいる。男性の生殖障害の例は、陰茎の障害、陰嚢障害、前立腺障害、及び不妊症を含んでいる。
【０２４３】
さらに、ＢＲＰ及びＡＲＰ核酸、ポリペプチド、及びタンパク質多量体が、精子形成の促進、甲状腺細胞の機能を増強（すなわち、甲状腺ホルモンの産生及びヨウ化物の捕捉の増強）、性腺機能の調節、性腺ホルモン産生の調節、生殖能力の促進又は抑制に使用されうる。
【０２４４】
悪性腫瘍
前述のタンパク質及び多量体は、細胞増殖の調節に関係している。それ故に、本発明の治療薬は、細胞の過剰増殖及び／又は細胞増殖の制御喪失（例えば、癌、悪性腫瘍、及び腫瘍）に関係する病気又は障害の治療又は予防処置に役立つかもしれない。そのような過剰増殖障害の調査のために、例えば、Ｆｉｓｈｍａｎ， ｅｔ ａｌ， １９８５． ＭＥＤＩＣＩＮＥ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｊ．Ｂ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡを参照のこと。
【０２４５】
本発明の治療薬は、悪性腫瘍及びそれに関連する障害を治療又は予防する効能について本技術分野に知られているいずれかの方法によりアッセイされる。そのようなアッセイは、制限されることなく、患者の腫瘍由来の形質転換細胞又は細胞を利用したインビトロのアッセイ、並びに癌又は悪性腫瘍の動物モデルを用いたインビボのアッセイを含む。潜在的に効果的な治療薬は、例えば対照との比較で、培養状態の腫瘍由来細胞又は形質転換細胞の増殖を阻害するか、又は動物モデルの腫瘍の復帰を引き起こすものである。
【０２４６】
本発明の実施において、いったん悪性腫瘍又は癌が、活性を調節すること（すなわち、阻害すること、拮抗すること、又は作用させること）による処置の影響を受けやすいことが示されれば、その癌又は悪性腫瘍は、それ以降タンパク質機能の調節に役立つ治療薬の投与により治療又は予防される。
【０２４７】
前癌状態
癌又は悪性腫瘍の治療又は予防処置に有効な本発明の治療薬は、前癌状態の治療及び／又は新生物又は悪性腫瘍状態への前癌進行の予防のために投与されもする。そのような予防又は治療のための使用は、新生物又は癌への進行に先立つことが知られているか、又は疑われる、特に過形成から成る非新生物の細胞成長、化生、又は最も特に、異形成が生じた状態で望ましい。そのような異常な細胞成長の調査のために、例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓ ＆ Ａｎｇｅｌｌ， １９７６． ＢＡＳＩＣ ＰＡＴＨＯＬＯＧＹ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｗ．Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡを参照のこと。
【０２４８】
過形成は、組織又臓器において、その構造又は機能の重大な変化なしに、細胞数の増加に関与する制御された細胞増殖の形態である。例えば、子宮内膜の過形成は、多くの場合子宮内膜癌に先行することが証明されている。化生は、ある種類の成熟又は完全に分化した細胞が他の種類の成熟細胞によって置き換えられた制御された細胞成長の形態である。化生は、上皮又は結合組織細胞で生じるかもしれない。異型性は、一般に癌の前駆体と考えられて、主に上皮で見つかる。異形成は、非新生物の細胞成長の最も無秩序な形態で、そして個々の細胞の均一性及び細胞の構造上の方向性の喪失に関与する。異形成は、慢性的な刺激又は炎症が存在する場所に特徴的に起こり、そして多くの場合、頚部、気道、口腔、及び胆嚢に見られる。
【０２４９】
あるいは、又はさらに、患者由来の細胞サンプル中の過形成、化生又は異形成症として特徴づけられた異常な細胞成長の存在、インビボ又はインビトロのいずれかで示された１以上の形質転換されたか、又は悪性の表現型の特徴の存在は、前述のタンパク質の活性を調節する能力を所有する治療薬の予防／治療のための投与の好ましさを表わしている。形質転換された表現型の特徴は、制限されることなく：（ｉ） 形態的な変化；（ｉｉ）ゆるんだ基層付着；（ｉｉｉ）細胞間接触阻害の喪失；（ｉｖ）足場依存性の損失；（ｖ）プロテアーゼ放出；（ｖｉ）糖輸送の増加；（ｖｉｉ）血清要求量の減少；（ｖｉｉｉ）胎性抗原の発現、（ｉｘ） ２５０ ｋＤａｌ細胞表面タンパク質の喪失などを含む。例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓ， ｅｔ ａｌ， １９８６．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＡＴＨＯＬＯＧＹ， Ｗ．Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡを参照のこと。
【０２５０】
本発明の特定の態様にいて、悪性腫瘍の以下の素因の１以上を示す患者は、有効量の治療薬の投与によって処置される：（ｉ）悪性腫瘍に関係する染色体の転座（例えば、慢性骨髄性白血病に対応するフィラデルフィア染色体（ｂｃｒ／ａｂｌ）、及び濾胞性リンパ腫に対応するｔ（１４；１８）など）；（ｉｉ）家族性ポリポーシス又はガードナー症候群（結腸癌の有力な兆候）；（ｉｉｉ）単クローン性免疫グロブリン血症の未決定な重要性（複数のミエローマの有力な前駆物質）、並びに（ｉｖ）メンデルの（遺伝子の）遺伝パターンを示す癌又は前癌性の病気（例えば、結腸の家族性ポリポーシス、ガードナー症候群、遺伝性外骨症、多発性内分泌腺腫症、ポイツ・ジェガー症候群、フォン・レクリングハウゼン神経線維腫症、でん粉状の製造の髄様甲状腺癌、そして褐色細胞腫、網膜芽細胞腫、頚動脈小体の腫瘍、皮膚の黒色癌、眼内の黒色癌、色素性乾皮症、毛細血管拡張性運動失調、Ｃｈｅｄｉａｋ−Ｈｉｇａｓｈｉ症候群、白皮症、Ｆａｎｃｏｎｉ’ｓ再生不良性貧血及びＢｌｏｏｍ’ｓ症候群）を有する一等親以内のヒト。
【０２５１】
他の態様において、本発明の治療薬は、乳、結腸、卵巣、肺、すい臓、又は子宮癌、あるいはメラノーマ若しくは肉腫への進行を防ぐために患者に与えられる。
【０２５２】
過剰増殖及び増殖不全（ｄｙｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）障害
本発明の１の態様において、治療薬は、過剰増殖又は良性の増殖不全障害の治療又は予防薬処置のために投与される。本本発明の治療薬の過剰増殖性の病気又は障害の治療又は予防における効能は、本技術分野に知られているいずれかの方法によってアッセイされる。そのようなアッセイは、インビトロ細胞増殖アッセイ、過剰増殖性の病気又は障害の動物モデルを使ったインビトロ又はインビボのアッセイなどを含んでいる。治療薬の潜在的な効果は、例えば対照と比較して、培養において細胞増殖を促進するか、動物モデルにおいて成長、若しくは細胞増殖を引き起こすかもしれない。
【０２５３】
本発明の特定の態様は、肝硬変（瘢痕化が正常な肝臓再生プロセスに追い付いた状態）の治療又は予防；瘢痕化過程が正常な更新を邪魔する皮膚を醜くするケロイド（肥大性瘢痕）の形成の治療；乾癬（皮膚の過度の増殖と適切な細胞の運命付けの遅れにより特徴づけられる代表的な皮膚状態）；良性腫瘍；繊維嚢胞性状態、並びに組織肥大（例えば、良性前立腺肥大）に向けられる。
【０２５４】
サイトカイン及び細胞増殖／分化活性
本発明のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、サイトカイン、細胞増殖（誘発又は阻害）又は細胞分化（誘発又は阻害）活性を示するか、あるいはある細胞集団において他のサイトカインの産生を誘発するかもしれない。全ての既知のサイトカインを含めて、今まで発見した多数にタンパク質因子は、１以上の因子依存性細胞増殖アッセイにおいて活性を示して、ゆえに上記アッセイはサイトカイン活性の好都合な確認として役立つ。本発明のタンパク質の活性は、制限されることなく、３２Ｄ、ＤＡ２、ＤＡ１Ｇ、Ｔ１０、Ｂ９、Ｂ９／１１、ＢａＦ３、ＭＣ９／Ｇ、Ｍ＋（ｐｒｅＢ Ｍ＋）、２Ｅ８、ＲＢ５、ＤＡ１、１２３、Ｔ１１６５、ＨＴ２、ＣＴＬＬ２、ＴＦ−１、Ｍｏ７ｅ、及びＣＭＫを含む細胞系に関する相当数のルーチンな因子依存した細胞増殖アッセイのうちのいずれかにより証明される。
【０２５５】
本発明のタンパク質の活性は、数ある手段の中でも、以下の方法：制限されることなく：ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ， Ｅｄ ｂｙ Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ （第３章及び第７章）； Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ．， ＪＩｍｍｕｎｏｌ １３７：３４９４−３５００， １９８６； Ｂｅｒｔａｇｎｏｉｌｉ ｅｔａｌ， ＪＩｍｍｕｎｏｌ １４５：１７０６−１７１２，１９９０； Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌｌｍｍｕｎｏｌ １３３：３２７−３４１，１９９１； Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ， ｅｔ ａｌ， ＪＩｍｍｕｎｏｌ １４９：３７７８−３７８３，１９９２； Ｂｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ， ＪＩｍｍｕｎｏｌ １５２：１７５６−１７６１，１９９４を含むＴ細胞又は胸腺細胞増殖に関するアッセイによって、計測されうる。
【０２５６】
サイトカインの産生、及び／又は脾臓細胞、リンパ腺細胞、又は胸腺細胞の増殖に関するアッセイは、制限されることなく、Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ ａｎｄ Ｓｈｅｖａｃｈによる：ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ． Ｖｏｌ １， ｐｐ． ３．１２．１−１４， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｔｏｒｏｎｔｏ １９９４；に、及びＳｃｈｒｅｉｂｅｒによる：ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｄｓ． Ｖｏｌ １ ｐｐ． ６．８．１−８， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｔｏｒｏｎｔｏ １９９４に記載のものを含む。
【０２５７】
造血細胞及び白血球細胞の増殖及び分化に関するアッセイは、制限されることなく、Ｂｏｔｔｏｍｌｙ ｅｔ ａｌ．，による： ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ， ｅｄｓ． Ｖｏｌ １ ｐｐ． ６．３．１−６．３．１２， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｔｏｒｏｎｔｏ １９９１； ｄｅＶｒｉｅｓ ｅｔａｌ， ＪＥｘｐ Ｍｅｄ １７３：１２０５−１２１１，１９９１に； Ｍｏｒｅａｕ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３３６：６９０−６９２， １９８８； Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ ＡｃａｄＳｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ． ８０：２９３１−２９３８， １９８３； Ｎｏｒｄａｎによる： ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ， ｅｄｓ． Ｖｏｌ １ ｐｐ． ６．６．１−５に， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｔｏｒｏｎｔｏ １９９１； ＳｎａＳａ． ｅｔａｌ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ ＡｃａｄＳｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ． ８３：１８５７−１８６１，１９８６； Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １１−Ｂｅｎｎｅｔｔ， ｅｔ ａｌ．，による： ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ， ｅｄｓ． Ｖｏｌ １ ｐｐ． ６．１５．１ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｔｏｒｏｎｔｏ １９９１に； Ｃｉａｒｌｅｔｔａ， ｅｔ ａｌ．，による： ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ， ｅｄｓ． Ｖｏｌ １ ｐｐ． ６．１３．１， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｔｏｒｏｎｔｏ １９９１に記載のものを含む。
【０２５８】
（増殖及びサイトカイン産生の計測により、特にＡＰＣ−Ｔ細胞相互作用、並びに直接的なＴ細胞効果に影響するタンパク質を同定する）抗原に対するＴ細胞クローン応答に関するアッセイは、制限されることなく、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ （第３章、第６章、第７章）； Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ ＵＳＡ ７７：６０９１−６０９５， １９８０； Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ， ＥｕｒＪ Ｉｍｍｕｎ １１：４０５−４１１， １９８１； Ｊａｋａｉｅｔａｌ，ＪＩｍｍｕｎｏｌ １３７：３４９４−３５００，１９８６； Ｔａｋａｉ ｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ １４０：５０８−５１２， １９８８に記載のものを含む。
【０２５９】
免疫刺激又は抑制活性
本発明のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質は、制限されることなく、それに対するアッセイが本明細書中に記載されているところの活性を含む免疫刺激又は免疫抑制活性を示すかもしれない。タンパク質は、（重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）を含む）様々な免疫の欠損及び障害の処置、例えば、Ｔ及び／又はＢリンパ球の成長及び増殖の（上方又は下方）調節、並びにＮＫ細胞と他の細胞集団の細胞溶解活性の達成に役立つかもしれない。これらの免疫欠損は、遺伝子に関するか、又は生体（例えば、ＨＩＶ）、並びに細菌又はカビの感染症により引き起こされるか、又は自己免疫疾患から起こるかもしれない。より特に、生体、細菌、真菌又は他の感染症により引き起こされる感染症は、ＨＩＶ、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ミコバクテリア、リーシュマニア種、マラリア種、及びカンジダ症のような様々な真菌感染の感染症を含めて、本発明のタンパク質を使って治療できる。もちろん、この件に関して、免疫システムの増強が一般に望ましい、すなわち、癌の治療とき、本発明のタンパク質が有用でもある。
【０２６０】
本発明のタンパク質を用いて処置されうる自己免疫疾患は、例えば結合組織疾患、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチを含んでいる、自己免疫性肺炎、Ｇｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａｒｒｅ症候群、自己免疫性甲状腺炎、インシュリン依存型糖尿病、重症筋無力症、移植片対宿主病、及び自己免疫性炎症性眼病を含む。本発明のそのようなタンパク質は、アレルギー反応及び症状、例えば喘息（特にアレルギー性喘息）、又は他の呼吸の問題の処置に有用であるかもしれない。（免疫の抑制が望まれる） （例えば、臓器移植を含む）他の条件も本発明のタンパク質を用いて治療できるかもしれない。
【０２６１】
相当数の方法により免疫応答に本発明のタンパク質を用いることが可能でもある。下方制御は、すでに進行中又は免疫応答の誘導を防ぐかもしれない免疫応答を抑制又は遮断する形式の中にあるかもしれない。活性化されたＴ細胞の機能は、Ｔ細胞応答を抑制するか、又はＴ細胞の特異的な寛容を誘発するか、あるいはその両方により抑制されうる。Ｔ細胞応答の免疫抑制は、一般に抑制的な作用物質にＴ細胞の継続的な暴露を必要とする、活性な非抗原特異的プロセスである。Ｔ細胞の非反応性又は無能力の誘発を伴う寛容は、一般に抗原特異的であり、そして寛容化剤（ｔｏｌｅｒｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）への暴露を終えた後に持続する点で免疫抑制と見分けられる。
【０２６２】
実施面から、寛容は、寛容化剤の不存在下、特定の抗原に対する再暴露におけるＴ細胞応答の欠損によって証明されうる。
【０２６３】
例えば、活性的にされたＴ細胞による高レベルのリンホカイン合成を妨げる、１以上の抗原機能の下方制御又は予防（制限されることなく、Ｂリンパ球抗原機能（例えば、Ｂ７）を含む）は、組織、皮膚、及び臓器移植の状況、及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に有用である。例えば、Ｔ細胞機能の遮断は、組織移植の組織破壊の減少をもたらしうる。一般に、組織移植組織で、移植組織の拒絶は、Ｔ細胞によるそれが異物であるとの認識を通して始まり、移植組織を破壊する免疫反応が続く。移植に先立ち、Ｂ７リンパ球抗原の免疫の細胞上のその天然のリガンド（例えば、Ｂ７−２活性があるペプチドの可溶性、単量体型、単独で、あるいは他のＢリンパ球抗原（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−３）の活性を持つか、又は抗体をブロックするペプチドの単量体型との結合状態で）との相互作用を阻害するか又は遮断する分子の投与は、同時刺激シグナルの伝達なしに免疫細胞上の天然のリガンド（ｓ）への分子の結合を導きうる。この問題のＢリンパ球抗原機能をブロッキングは、Ｔ細胞のような免疫細胞によるサイトカイン合成を妨げ、それにより免疫抑制剤として働く。しかも、同時刺激の不足は、Ｔ細胞の活性化に十分でもあり、それによって対象の寛容を誘発する。Ｂリンパ球の抗原を遮断する試薬による長期の寛容の誘導は、これらの遮断試薬の繰り返し投与の必要を回避するかもしれない。対象における十分な免疫抑制又は寛容を達成するために、Ｂリンパ球抗原の機能を遮断する必要もあるかもしれない。
【０２６４】
臓器移植の拒絶反応又はＧＶＨＤの予防における特定のブロッキング試薬の効能は、ヒトでの効能を予測させる動物モデルを用いて評価されうる。使用しうる適切なシステムの例は、ラットにおける異質遺伝型の心臓移植片、及びマウスにおける異種の膵臓の島細胞移植片を含み、Ｌｅｎｓｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：７８９−７９２ （１９９２）、及びＴｕｒｋａ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｉ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ８９：１１１０２−１１１０５ （１９９２）に記載のとおりその両方がインビボにおけるＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質の免疫抑制性の効果の検査に使用されている。さらに、ＧＶＨＤのマウス・モデル（Ｐａｕｌ ｅｄ．， ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９， ｐｐ． ８４６−８４７を参照のこと）が、インビボにおいて、その病気の進行におけるＢリンパ球抗原機能遮断の効果を確認するために使用されうる。
【０２６５】
抗原機能を妨げることは、自己免疫疾患の処置のために治療として有用でありもする。多くの自己免疫疾患は、自己組織に対して反応せいであり、そしてサイトカインの製造を促進するＴ細胞、並びに病気の病理学に関係している自己抗体の不適切な活性化の結果である。自己応答性Ｔ細胞の活性化を防ぐことは、病徴を減らすか又は除くかもしれない。Ｂリンパ球抗原の受容体：リガンド相互作用を崩壊させることによってＴ細胞の同時刺激を妨げる試薬の投与は、Ｔ細胞活性化を抑えて、そして自己抗体又は病気プロセスに関係しているＴ細胞由来のサイトカインの産生を防ぐために使用されうる。その上、ブロッキング試薬は、長期の病気の軽減をもたらしうる自己応答性Ｔ細胞の抗原特異的寛容を誘発するかもしれない。自己免疫疾患を防ぐか又は軽くするブロッキング試薬の効能は、相当数のよく特徴づけられた自己免疫疾患の動物モデルを用いて決定されうる。例は、マウスの実験的な自己免疫脳炎、ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウス又はＮＺＢハイブリッドマウスの全身的な狼瘡エリテマトーデス、マウスの自己免疫性コラーゲン関節炎、ＮＯＤマウス及びＢＢラットの糖尿病、マウスの実験的な重症筋無力症を含んでいる（Ｐａｕｌ ｅｄ．， ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９， ｐｐ． ８４０−８５６を参照のこと）。
【０２６６】
免疫応答を上方調節する手段としての抗原機能（好ましくは、Ｂリンパ球抗原機能）の上方調節は、治療に有用かもしれない。免疫応答の上方調節は、免疫応答を高めるか、又は最初の免疫応答を引き出す形で存在している。例えば、Ｂリンパ球抗原機能を促進することを通して免疫応答を高めることは、ウイルス感染の場合に有用かもしれない。さらに、インフルエンザ、風邪、及び脳炎のような全身的な重大な病気は、意図的にＢリンパ球抗原の促進型の投与によって軽減されるかもしれない。
【０２６７】
あるいは、抗ウイルス免疫応答は、患者からＴ細胞を取り除く、本発明のペプチドの発現、又は本発明の可溶性ペプチドの促進型と一緒にウイルス抗原のパルス状のＡＰＣｓによりインビトロにおいてＴ細胞を同時刺激する、並びに患者にインビトロにおいて活性化されたＴ細胞を再導入することよって感染患者で高められうる。抗生体免疫応答を高める他の方法は、患者から感染細胞を単離し、上記細胞がそれらの表面にタンパク質の全部若しくはその一部を発現するように本明細書中に記載の本発明のタンパク質をコードしている核酸によりそれらをトランスフェクトし、そしてこのトランスフェクト細胞を患者の中に再導入することである。ここで、感染細胞は、Ｔ細胞に同時刺激シグナルをデリバリーし、そしてそれによりＴ細胞を活性化する。
【０２６８】
他の適用において、抗原機能（好ましくは、Ｂリンパ球抗原機能）の上方調節又は増強は、腫瘍免疫の誘導に有用かもしれない。本発明の少なくとも１のペプチドをコードする核酸によりトランスフェクトされた腫瘍細胞（例えば、肉腫、メラノーマ、リンパ腫、白血病、神経芽細胞腫、悪性腫瘍）は、対象における腫瘍特異的寛容の克服のために対象に投与されうる。所望であれば、腫瘍細胞はペプチドの組み合わせを発現するようにトランスフェクトされうる。例えば、患者から得られた腫瘍細胞は、単独でＢ７−２様の活性があるペプチドの、又はＢ７−１様の活性及び／又はＢ７−３様の活性があるペプチドと一緒での発現に導く発現ベクターによりｅｘ ｖｉｖｏでトランスフェクトされうる。トランスフェクトされた腫瘍細胞は、トランスフェクト細胞の表面上のペプチドの発現をもたらすために患者に戻される。あるいは、遺伝子治療技術は、インビボでのトランスフェクションのために腫瘍細胞を標的に使用しうる。
【０２６９】
腫瘍細胞表面におけるＢリンパ球抗原の活性を持つ本発明のペプチドの存在は、トランスフェクト腫瘍細胞に対するＴ細胞介在免疫応答を誘発するためにＴ細胞への同時刺激シグナルの必要性を提供する。さらに、  ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ分子を欠くか、又はＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ分子の十分な量の再発現できない腫瘍細胞は、ＭＨＣクラスＩα鎖タンパク質及びβ２ミクログロブリンタンパク質又はＭＨＣクラスＩＩの１本鎖タンパク質、及びＭＨＣクラスＩＩβ鎖タンパク質の全部又は一部（例えば、細胞ドメインの切断部分）をコードする核酸によりトランスフェクトされうる。Ｂリンパ球抗原（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３）の活性を持つペプチドと結合状態の適切なクラスＩ又はクラスＩＩ ＭＨＣの発現は、トランスフェクト腫瘍細胞に対するＴ細胞介在免疫応答を誘発する。場合により、ＭＨＣクラスＩＩに関連するタンパク質、例えば不変鎖の発現を妨げるアンチセンス構築物をコードしている遺伝子が、腫瘍関連抗原の提示、及び腫瘍特異的免疫の誘発を促進するためにＢリンパ球抗原の活性を持つペプチドをコードするＤＮＡと一緒に同時トランスフェクトされることもできる。このように、対象のＴ細胞介在免疫応答の誘導は、対象の腫瘍特有的寛容を克服するのに十分であるかもしれない。
【０２７０】
本発明のタンパク質の活性は、数ある手段の中でも、以下の方法によって測られうる：胸腺細胞又は脾細胞細胞毒性のための好適なアッセイは、制限されることなく、以下の：ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ． Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ （第３章、第７章）； Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７８：２４８８−２４９２，１９８１； Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２８：１９６８−１９７４， １９８２； Ｈａｎｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３５：１５６４−１５７２，１９８５； Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３７：３４９４−３５００，１９８６； Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４０：５０８−５１２， １９８８； Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７８：２４８８−２４９２，１９８１； Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２８：１９６８−１９７４，１９８２； Ｈａｎｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３５：１５６４−１５７２， １９８５； Ｔａｋ＆ｉｅｔａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ’１３７：３４９４−３５００， １９８６； Ｂｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１：１９９２−１９９８； Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４０：５０８−５１２， １９８８； Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３３：３２７−３４１，１９９１； Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５３：３０７９−３０９２， １９９４に記載のものを含む。
【０２７１】
Ｔ細胞依存性免疫グロブリン応答及びアイソタイプ・スイッチング（中でも、Ｔ細胞依存性抗体応答を調節する、及びＴｈ１／Ｔｈ２特性に影響するタンパク質を同定する）ためのアッセイは、制限されることなく：Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４４：３０２８−３０３３， １９９０；及びＭｏｎｄ ａｎｄ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｉｎ： ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ． Ｃｏｌｉｇａｎｅｆ ａｌ， （ｅｄｓ．） Ｖｏｌ １ ｐｐ． ３．８．１−３．８．１６， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｔｏｒｏｎｔｏ １９９４に記載のものを含む。
【０２７２】
リンパ球混合培養法（ＭＬＲ）アッセイ（中でも、大部分のＴｈ１とＣＴＬ応答を産むタンパク質を同定する）は、制限されることなく：ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ， ｅｄｓ． Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ （第３章、第７章）； Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３７：３４９４−３５００，１９８６； Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４０：５０８−５１２， １９８８； Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４９：３７７８−３７８３， １９９２に記載のものを含む。
【０２７３】
樹状細胞依存性アッセイ（中でも、未熟なＴ細胞を活性化する樹状細胞により発現されたタンパク質を同定する）は、制限されることなく：Ｇｕｅｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３４：５３６−５４４， １９９５； Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７３：５４９−５５９，１９９１； Ｍａｃａｔｏｎｉａ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５４：５０７１−５０７９，１９９５； Ｐｏｒｇａｄｏｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８２：２５５−２６０， １９９５； Ｎａｉｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６７：４０６２−４０６９，１９９３； Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：９６１−９６５， １９９４； Ｍａｃａｔｏｎｉａ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６９：１２５５−１２６４，１９８９； Ｂｈａｒｄｗａｊ ｅｔ． ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ ９４：７９１−８０７， １９９４；及びＩｎａｂａ ｅｔａｌ．， ＪＥｘｐ Ｍｅｄ １７２：６３１−６４０，１９９０に記載のものを含む。
【０２７４】
リンパ球の生存／アポトーシスについてのアッセイ（中でも、超抗原の誘導の後のアポトーシスを防ぐタンパク質、及びリンパ球の恒常性を調節するタンパク質を同定する）は、制限されることなく：Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ， Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １３：７９５−８０８， １９９２； Ｇｏｒｃｚｙｃａ ｅｔ ａｌ， Ｌｅｕｋｅｍｉａ ７：６５９−６７０，１９９３； Ｇｏｒｃｚｙｃａ ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：１９４５−１９５１，１９９３； Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ ６６：２３３−２４３， １９９１； Ｚａｃｈａｒｃｈｕｋ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４５：４０３７−４０４５， １９９０； Ｚａｍａｉ ｅｔａｌ， Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １４：８９１−８９７，１９９３； Ｇｏｒｃｚｙｃｕｅｔａｌ．ＪｎｔｅｒｎａｔＪＯｎｃｏｌ １：６３９−６４８，１９９２に記載のものを含む。
【０２７５】
Ｔ細胞の関係づけ及び発達の初期ステップに影響を与えるタンパク質に関するアッセイは、制限されることなく：Ａｎｔｉｃａ ｅｔａｌ， Ｂｌｏｏｄ ８４：１１１−１１７， １９９４； Ｆｉｎｅ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５５： １１１−１２２，１９９４； Ｇａｌｙｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８５：２７７０−２７７％， １９９５； Ｔｏｔｅ ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ ＡｃａｄＳｃｉ ＵＳＡ ８８：７５４８−７５５１，１９９１に記載のものを含む。
【０２７６】
組織成長活性
本発明のＡＲＰ／ＢＫＰタンパク質又はＡＲＰ／ＢＲＰ多量体は、骨、軟骨、腱、靭帯、及び／又は神経組織成長、又は再生のため、並びに創傷治癒及び組織の修復と置き換えのため、そして火傷、切開、及び潰瘍の処置に使用される組成物にも有用性を持っているかもしれない。
【０２７７】
骨が普通に形成されないとき、周囲の軟骨及び／又は骨の成長を誘発する本発明のタンパク質は、骨破損及び軟骨損傷か、又はヒト及び他の動物における変節の治療への適用を持っている。本発明のタンパク質を利用したそのような製剤は、閉じている、並びに開いている骨折の減少、及び人工関節の改善された固定にも予防的に使用される。骨形成剤によって誘発された新たな骨形成は、  先天的か、外傷が誘発したか、又は癌切除が誘発した頭蓋及び顔面の欠損の修復に寄与し、化粧用の形成外科にも有用である。
【０２７８】
本願発明のタンパク質は、歯周疾患の処置、及び他の歯の修復過程でも使用されうる。そのような作用物質は、骨形成細胞を引き付けるか、骨形成細胞の成長を促進するか、又は骨形成細胞の前駆細胞の分化を誘発するための環境を提供するかもしれない。本発明のタンパク質は、例えば骨及び／又は軟骨修復の刺激を通して、あるいは炎症過程によって仲介された炎症又は組織破壊（コラゲナーゼ活性、破骨細胞活性など）の過程をブロックすることによって骨粗鬆症又は変形性関節症の処置に有用でもある。
【０２７９】
本発明のタンパク質に起因するかもしれない組織再生活性の他のカテゴリーは、腱／靭帯形成である。そのような組織が正常に形成されない所の周囲に腱／靭帯様の組織の又は他の組織の形成を誘発する、本発明のタンパク質は、ヒト及び他の動物における腱又は靭帯の裂傷、形成異常、及び他の腱又は靭帯の欠損の治療における適用がある。タンパク質を誘発している腱／靭帯様の組織に利用されるそのような製剤は、腱又は靭帯組織への損害を防ぐために予防的に使用され、並びに腱又は靭帯の骨又は他の組織への固定に使用され、そして腱又は靭帯組織の欠陥の修復に使用される。本発明の組成物によって誘発された腱／靭帯様の組織の新たな形成は、先天的、外傷に誘発された、又は他の起源の他の腱又は靭帯の欠損の修復に寄与して、かつ、腱か靭帯の接着又は修復のための美容整形手術に有用である。本発明の組成物は、腱又は靭帯形成細胞を引き付けるか、腱又は靭帯形成細胞の成長を促進するか、腱又は靭帯形成細胞の前駆細胞の分化を誘発するか、又は又はインビボで効果組織に戻すために、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて腱／靭帯細胞、若しくは前駆細胞の成長を誘発するための環境を提供するかもしれない。本発明の組成物は、腱炎、ｃＡＲＰ／ＢＲＰａｌ管症候群及び他の腱又は靭帯の欠損の処置にも有用かもしれない。前記組成物は、本技術分野で周知の適切な基質及び／又は担体としての封鎖剤をも含んでいるかもしれない。
【０２８０】
本発明のタンパク質は、神経系の細胞の増殖、並びに神経及び脳組織の再生に、すなわち、神経系の細胞か神経組織に変性、死滅、又は外傷を含む中枢及び末梢神経系の病気、及びニューロパシー、並びに力学的及び外傷的な障害の処置のために有用でありもする。より特に、タンパク質は、末梢神経傷害、末梢性ニューロパシー、及び局所的なニューロパシーのような末梢神経系の病気、並びにアルツハイマー、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、及びシャイ−ドレーガー症候群のような中枢神経系の病気の処置に使用されうる。本発明に従って処置されるさらなる症状は、脊髄障害、頭外傷、及び脳血管障害、例えば脳卒中のような力学的及び外傷的な障害を含んでいる。化学療法又は他の医学療法から起こっている末端的なニューロパシーも、本発明のタンパク質を用いて治療できるかもしれない。
【０２８１】
本発明のタンパク質は、制限されることなく、床擦れ、血管機能不全に関係する潰瘍、手術及び外傷性の創傷などを含む非回復創傷のより良い又はより速い閉鎖に有用でもある。
【０２８２】
同様に、本発明のタンパク質は、他の組織、例えば臓器（例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮を含む）、筋（平滑、骨格、心）、及び脈管（脈管の内皮細胞を含む）の発生又は再生のための、あるいはそのような組織を含め細胞の成長を促進するための活性を示しもすると思われる。所望の効果の一部は、正常な組織の再生を可能にする繊維性瘢痕化の阻害又は調節による。本発明のタンパク質は、血管形成活性をも示すかもしれない。
【０２８３】
本発明のタンパク質は、腸の保護又は再生、並びに肺又は肝臓の線維化、様々な組織の再灌流障害、並びに全身的なサイトカイン損傷から起こった症状の処置にも有用かもしれない。
【０２８４】
本発明のタンパク質は、前駆組織又は細胞から前記の組織への分化の促進又は抑制に；あるいは前記の組織の成長の抑制にも有用かもしれない。
【０２８５】
本発明のタンパク質の活性は、数ある手段の中でも、以下の方法によって測られうる：
組織発生活性に関するアッセイは、制限されることなく：国際特許公開番号第９５／１６０３５号（骨、軟骨、腱）；国際特許公開番号第９５／０５８４６号（神経、神経系）；国際特許公開番号第９１／０７４９１号（皮革、内皮）に記載のものを含む。
【０２８６】
創傷治癒活性に関するアッセイは、制限されることなく：Ｗｈｉｔｅｒ， ＥＰＩＤＥＲＭＡＬ ＷＯＵＮＤ ＨＥＡＬＩＮＧ， ｐｐ． ７１−１１２ （Ｍａｉｂａｃｈ ａｎｄ Ｒｏｖｅｅ， ｅｄｓ．）， Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．， Ｃｈｉｃａｇｏ， ａｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｅａｇｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｍｅｎｚ， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ ７１：３８２−８４ （１９７８）に記載のものを含む。
【０２８７】
アクチビン／インヒビン活性
本発明のＡＲＰ／ＢＲＰタンパク質又はＡＲＰ／ＢＲＰ多量体は、アクチビン−又はインヒビン−関連活性をも示すかもしれない。インヒビンは、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を抑制するそれらの能力によって特徴づけられ、一方アクチビンは、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を促進するそれらの能力によって特徴づけられる。このように、単独で又はインヒビン・ファミリーのメンバーとのヘテロ多量体で、本発明のタンパク質は、雌の哺乳動物の生殖能力及び雄の哺乳動物の精子形成を減少させるインヒビンの能力に基づいた避妊薬として有用かもしれない。十分な量の他のインヒビンの投与は、これらの哺乳動物の不妊症を誘発しうる。あるいは、ホモダイマー又はインヒビン−ｂグループの他のタンパク質サブユニットとのヘテロダイマーの本発明のタンパク質は、下垂体前葉の細胞からのＦＳＨ放出を促進するアクチビン分子の能力に基づく、生殖能力増強療法として有用かもしれない。例えば、米国特許番号第４，７９８，８８５号を参照のこと。本発明のタンパク質は、雌牛、羊、及び豚のような家畜の一生涯の生殖実績を増やすために、性的に未熟な哺乳動物の生殖能力の発現の向上のためにも有用かもしれない。
【０２８８】
本発明のタンパク質の活性は、数ある手段の中でも、以下の方法によって計測される：
アクチビン／インヒビン活性に関するアッセイは、制限されることなく：Ｖａｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ９１：５６２−５７２， １９７２； Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：７７９−７８２， １９８６； Ｖａｌｅ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：７７６−７７９， １９８６； Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１８：６５９−６６３， １９８５； Ｆｏｒａｇｅ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３：３０９１−３０９５，１９８６に記載のものを含む。
【０２８９】
化学走化性／化学運動性活性
本発明のタンパク質又は多量体は、例えば、単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮細胞、及び／又は内皮細胞を含む哺乳動物の細胞に対して化学走化性又は化学運動性活性（例えば、ケモカインとしての作用）を持っているかもしれない。化学走化性及び化学運動性タンパク質は、所望の細胞集団を所望の作用点に動員されるか、又は引き付けるために使用されうる。化学走化性又は化学運動性タンパク質は、組織への創傷及び他の外傷の処置、並びに局所的感染の処置に特別な利益を提供する。例えば、腫瘍又は感染部位へのリンパ球、単球、又は好中球の動員は、腫瘍又は感染物質に対する改善された免疫応答をもたらすかもしれない。
【０２９０】
特定の細胞集団の指向性の配向性又は動きを直接的に又は間接的に刺激しうるとき、タンパク質又はペプチドは、このような細胞集団について化学走化性活性を持つ。好ましくは、前記タンパク質又はペプチドは、直接的に細胞の指向性の動きを刺激する能力がある。特定のタンパク質が細胞集団について化学走化性活性を持つかどうかは、このタンパク質又はペプチドを細胞化学走性に関する既知のアッセイのいずれかに用いることで容易に確認されうる。
【０２９１】
本発明のタンパク質の活性は、数ある手段の中でも、以下の方法によって計測される：
化学走化性活性（化学走性を誘発又は妨げるタンパク質を同定する）に関するアッセイは、膜を横切る細胞の移行を誘発するタンパク質の能力、並びに他の細胞集団にある細胞集団の接着を誘発するタンパク質の能力を計測するアッセイから成る。移動及び接着に関する好適なアッセイは、制限されることなく：ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ， Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ． （第６章、第１２章， ＭＥＡＳＵＲＥＭＥＮＴ  ＯＦ ＡＬＰＨＡ ＡＮＤ ＢＥＴＡ ＣＨＥＭＯＫＩＮＥＳ ６．１２．１−６．１２．２８）； Ｔａｕｂ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９５：１３７０−１３７６， １９９５； Ｌｉｎｄ ｅｔ ａｌ． ＡＰＭＳ １０３：１４０−１４６，１９９５； Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２５： １７４４−１７４８； Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５２： ５８６０−５８６７， １９９４； Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５３： １７６２−１７６８， １９９４に記載のものを含む。
【０２９２】
受容体／リガンド活性
本発明のタンパク質又は多量体は、受容体、受容体リガンド、又は受容体／リガンド相互作用の阻害剤、若しくはアゴニストとしての活性をも発揮するかもしれない。そのような受容体及びリガンドの例は、制限されることなく、サイトカイン受容体とそれらのリガンド、受容体キナーゼとそれらのリガンド、受容体ホスファターゼとそれらのリガンド、細胞間相互作用に関与する受容体とそれらのリガンド（制限されることなく、細胞接着分子（セレクチン、インテグリンとそれらのリガンド）、及び抗原提示に関与する受容体／リガンド対、抗原認識及び発達に関する細胞性及び体液性免疫受容体を含んでいる）を含んでいる。受容体及びリガンドは、関連した受容体／リガンド相互作用の阻害剤の可能性があるペプチド又は小分子のスクリーニングにも有用である。本発明のタンパク質（制限されることなく、受容体及びリガンドの断片を含む）は、受容体／リガンド相互作用の阻害剤としてそれら自体が有用であるかもしれない。
【０２９３】
本発明のタンパク質の活性は、数ある手段の中でも、以下の方法によって計測されうる：
受容体−リガンド活性に関する好適なアッセイは、制限されることなく：ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ， Ｅｄ ｂｙ Ｃｏｌｉｇａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ （第７．２８章， Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｓｔａｔｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ７．２８．１−７．２８．２２）， Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ ＵＳＡ ８４：６８６４−６８６８，１９８７； Ｂｉｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．  １６８：１１４５−１１５６，１９８８； Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６９：１４９−１６０ １９８９； Ｓｔｏｌｔｅｎｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ １７５：５９−６８，１９９４； Ｓｔｉｔｔｅｔａｌ．， Ｃｅｌｌ ８０：６６１ −６７０，１９９５に記載のものを含んでいる。
【０２９４】
抗炎症活性
本発明のタンパク質又は多量体は、抗炎症活性をも示すかもしれない。抗炎症活性は、炎症応答に関係している細胞への刺激を提供することによって、細胞間相互作用（例えば、細胞接着）を抑制するか又は促進することによって、細胞の溢血を抑制するか又は促進して、炎症プロセスに関係している細胞の化学走化性を抑制するか又は促進することによって、あるいは炎症応答をより直接的に抑制するか又は促進する他の因子の産生を刺激するか又は抑制することによって成し遂げられうる。そのような活性を示すタンパク質は、制限されることなく、感染に関連する炎症（例えば、敗血症性ショック、敗血症、又は全身的な炎症応答症候群（ＳＩＲＳ））、虚血−再潅流傷害、致死性内毒素、関節炎、補体により仲介された超急性拒絶反応、腎炎、サイトカイン、若しくはケモカインによって誘発された肺傷害、炎症性腸疾患、クローン病、又はサイトカイン、例えばＴＮＦ、若しくはＩＬ−１の過剰産生によるものを含む炎症症状（慢性又は急性症状を含む）の処置に使用されうる。本発明のタンパク質は、抗原性の物質又は材料に対するアナフィラキシー及び過敏症の処置にも有用であるかもしれない。
【０２９５】
腫瘍抑制活性
腫瘍の免疫学的処置又は予防のための先に記載の活性に加え、本発明のタンパク質又は多量体は、他の抗腫瘍活性を示すかもしれない。タンパク質は、腫瘍成長を直接的に又は間接的に（例えば、ＡＤＣＣを経由して）抑制するかもしれない。タンパク質は、腫瘍組織又は腫瘍前駆組織に作用することにより、腫瘍成長を補助するのに必要な組織（例えば、血管形成に抑制により）の形成を抑制することにより、腫瘍成長を抑制する他の因子、作用物質、又は細胞種の製造を引き起こすことにより、あるいは腫瘍成長を促進する因子、作用物質、又は細胞種を抑制、除去又は阻害することにより示されるかもしれない。
【０２９６】
実施例
本実施例で頻繁に使用される特定の用語及び手順の簡単な説明を以下に提供する。
【０２９７】
「ＰＣＲ」は、ポリメラーゼ連鎖反応である。
【０２９８】
「ｃＤＮＡ」は、逆転写酵素により全部の、又はポリ（Ａ）＋ＲＮＡから合成された相補的ＤＮＡである。
【０２９９】
ＤＮＡの「消化」を、通常、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ （Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）から購入した制限エンドヌクレアーゼを用いて行った。緩衝液及び反応条件は、製造業者によって指定されたものと同様である。
【０３００】
ＰＣＲ ＤＮＡ断片及び制限エンドヌクレアーゼ消化から得られたＤＮＡ断片の「ゲル精製」を、適切な分子量標準と一緒にアガロースゲル中、電気泳動による反応混合物のサイズ分別により行った。電気泳動の後に、ＤＮＡを、臭化エチジウムにより可視化し、所望のサイズの断片をゲルから摘出し、次にＷｉｚａｒｄ（登録商標） ＰＣＲ Ｐｒｅｏｓ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用いてアガロースから分離した。
【０３０１】
精製ＤＮＡ断片の消化され、そして精製されたベクターＤＮＡ内への「連結」又は「挿入」を製造業者によって供給された緩衝液とＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ （Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）製のＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて行った。同様に、連結を、ベクター及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）製のキットに提供された試薬を用いて、トポイソメラーゼＩにより行った。
【０３０２】
「クローン化」は、連結反応からのＤＮＡにより好適なＥ．コリ宿主株の形質転換に関し、この形質転換株を増殖させ、そしてＱｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｉｔａ， ＣＡ製のキットを用いて細菌からプラスミドＤＮＡを精製する。
【０３０３】
プラスミドＤＮＡ鋳型、ＤＮＡオリゴヌクレオチド・プライマー（例えば、Ｔ７、Ｔ３、Ｍ１３Ｆ、Ｍ１３Ｒ、及び遺伝子特異的プライマー）、及びＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標） ＢｉｇＤｙｅ（商標） Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）からの試薬を用いた、サイクル配列決定反応により「ＤＮＡ塩基配列決定」を行った。反応条件及びサイクリング条件は、キット中に提供された規格に従って行った。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標） ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を、キャピラリー電気泳動及び未加工のＤＮＡ塩基配列の定量のために使用した。Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ （バージョン４．０．５、Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、及びＧＣＧ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅバージョン１０．１、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）ソフトウェアを、断片アセンブリー及びＤＮＡ塩基配列アラインメントのために使用した。
【０３０４】
「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」蛍光発生５’ヌクレアーゼ・アッセイを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標） ７７００ ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を用いて行った。反応を、２５ μｌの全反応容量中、３００又は９００ ｎｍｏｌｅの正及び逆プライマー、２５０ ｎｍｏｌｅのプローブ、及び様々な量の、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡから調製されたｃＤＮＡを伴う１Ｘユニバーサル・ミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）中で行った。普遍的なサイクリング指標を、ＰＣＲに用いた（５０℃ １０分；９５℃ １０分、続いて９５℃ １５秒、６０℃ １分の４０サイクル）。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイのためのプライマー及びプローブをＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ １．５（登録商標） Ｏｒｉｇｏ Ｄｅｓｉｇｎソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を用いて設計した。
【０３０５】
「未加工の培養上清の濃縮」は、タンパク質の重大な損失なしに、それによりタンパク質含量に関してサンプルを濃縮する、特定のサンプルの調整培地の容量を減少させるいずれかの方法に関する。この作業のために使われた方法は、名目上の分子量１０，０００ Ｄａ排除のポリエーテルスルホンの低タンパク質吸着性膜を横切るタンジェンシャル・フローろ過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）であった（Ｐａｌｌ Ｆｉｌｔｒｏｎ Ｕｌｔｒａｓｅｔｔｅ Ｐ／Ｎ ０５０１０Ｃ７０）。駆動力を、Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ Ｌ／Ｓぺリスター・ポンプ・ドライブ及びＰｈａｒＭｅｄサイズ１５ 薄壁チューブで垂直かどうか測られたモデル７５１８−１０ ｅａｓｙ−ｌｏａｄポンプ・ヘッドにより提供した。循環速度を、９００〜１１００ ｍｌ／分とし、そして可変流出制限の使用を通して背圧を〜１．５ ａｔｍに維持した。培養上清容量は、免疫アフィニティー精製のための開始材料を製造するために２５〜５０倍縮小した。
【０３０６】
「ＳＤＳページ」は、適用された電界の駆動力に応じた、硫酸ドデシル界面活性剤により処理したタンパク質サンプルが重合体ゲル基質中の移動度に基づき分別される技術群に関する。
【０３０７】
「ウェスタンブロッティング」は、膜下層に移された電気泳動により分けられたタンパク質を続いて特定の抗体の結合によって検出する全ての技術に関する。この作業で、電気泳動物が移ったポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜を、個々の図面に規定のとおり、種々の検出抗体との結合に使用した。
【０３０８】
「免疫アフィニティー・クロマトグラフィー」は、固定化抗体に対する１以上のサンプル成分の結合親和性に基づいてサンプルが分別される方法である。原則として、競合するリガンド、又は急激なｐＨ変化による固定化抗体の可逆的な変性を結合したサンプルの回収に使用しうる。この作業のために、捕捉されたタンパク質を、７．５から３．５へのｐＨ変化によって固定化抗体から抽出した。抽出されたタンパク質を含む画分をｐＨ紙で観察し、適当な量の１ Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ ９．２の添加によって直ちに中和した。結合タンパク質の溶出の直後に、固定化タンパク質の不可逆的な変性を最小限にするために、クロマトグラフィー樹脂をｐＨ ７．５に戻って平衡化した。
【０３０９】
実施例１：組織から抽出したＲＮＡ中のヒトＢＲＰ転写産物の検出
精巣、脳下垂体、肝臓、甲状腺、腎臓、膵臓、及びＫ−５６２ （慢性の骨髄性白血病）から精製されたポリ（Ａ）＋ＲＮＡをＣｌｏｎｔｅｃｈ （Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）から購入した。このＲＮＡを、２０μｌ反応量につき０．５〜１ μｇのＲＮＡ及び５０ ｎｇのランダムヘキサマーを含む、製造業者の推奨に従ったＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．（ｃａｔ＃１１９０４−０１８）製のＲＴ−ＰＣＲのためにＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（商標） Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを用いた相補的ＤＮＡ （ｃＤＮＡ）の合成に使用した。逆転写酵素を抜いた以外は同じ、対照反応を、ＲＮＡ調製の残余のゲノム ＤＮＡからのＰＣＲプライミングを観察するために実行した。逆転写酵素のあり、又はなしでなされた反応を、それぞれ「＋ＲＴ」又は「−ＲＴ」指定した。
【０３１０】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイに使用したＢＲＰ正及び逆プライマーは、それぞれ５’−ＧＧＧＣＣＴＴＣＧＧＡＴＣＡＣＣＡＣ−３’（配列番号７６）及び５’−ＴＣＧＡＴＧＡＴＧＧＧＣＴＴＣＡＡＴＡＴＡＧＧ−３’（配列番号４６）であった。ＡＲＰ／ＢＲＰに対するプローブは、５’−６ＦＡＭ−ＣＣＴＧＧＧＡＧＡＡＡＣＣＣＡＴＴＣＴＧＧＡＡＣＣＣ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号４７）であった。蛍光性プローブはＢＲＰの２つのコーディング・エクソンの予測された接合部に及ぶため、このアッセイは、特異的にスプライシングされたｍＲＮＡ転写物を検出することが意図される。ＴａｑＭａｎ ＰＣＲを、２５μｌの全反応量中で、２５ ｎｇ又は５０ ｎｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡから調製された鋳型ｃＤＮＡを用いて行った。
【０３１１】
ＢＲＰ ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲ実験の結果を表５に示す。
【０３１２】
【表５】
2004527214.tif 000007
【０３１３】
この結果は、スプライシングされたヒトＢＲＰ ｍＲＮＡ転写産物が脳下垂体及び精巣のポリ（Ａ）＋ＲＮＡで再現性を持って検出されうることを示す。ＢＲＰ転写産物は、試験した他のＲＮＡサンプルで検出されなかったが、細胞の小さな亜集団、又はこれらの組織及び他の組織の特定の発達段階、又は生理学的な状態の間のＢＲＰ発現を除外することはできない。
【０３１４】
サンプル１〜３について、β−アクチンＰｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を、ｃＤＮＡ合成の効率を評価するために使われた。２５μｌの反応物につき５０ ｎｇの入力ＲＮＡを用いて、各々のサンプルを三重で分析した。前記アッセイを製造業者の規格に従って行った。ｃＤＮＡ合成の効率的を証明する、平均ＣＴは、全３点のｃＤＮＡサンプル関しては１６であった。
【０３１５】
サンプル５〜９を、Ｏｒｉｇｅｎｅパネルを用いて得られた結果と比較のためにＡＲＰレベルを調べられた。ＡＲＰ ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを、反応につき２５ ｎｇの入力ＲＮＡを用いた。結果は、発現について以下の相対比を示した：膵臓（ＣＴ≒２０）＞脳下垂体（ＣＴ≒２２）＞精巣（ＣＴ≒２５）＞腎臓（ＣＴ≒２９）＞肝臓（ＣＴ≒３１）＞胎盤（ＣＴ≒３３）。これらの結果は、実施例４で報告されたものと一致していた。
【０３１６】
実施例２：ヒトＢＲＰに対応するｃＤＮＡクローンの単離
Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＬ１１８５５５（図４）からのＤＮＡ塩基配列、及びＰＲＩＭＥソフトウェア・プログラム （Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅバージョン１０．１、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ （ＧＣＧ）， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を、約５ ｋｂのイントロンによって分けられた２つの推測上のエクソンに含まれている、ＡＲＰ／ＢＲＰの予測されたコーディング領域の増幅のためのＰＣＲプライマーを設計するために使用した。正、及び逆プライマー（ＡＲＰ／ＢＲＰＣＤＳプライマーと呼ばれる）の配列は、それぞれ、５’−ＣＡＧＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＧＣＡＴＴＣＣＴＣ−３’（配列番号７７）、及び５’−ＧＣＣＴＣＡＧＡＴＧＧＴＣＴＣＡＣＡＣＴＣＣ−３’（配列番号４８）であった。
【０３１７】
ヒトＢＲＰタンパク質コーディング領域をクローン化するためのＰＣＲ反応を以下の成分を含む５０μｌの量で行った：４ ｍＭのＭｇＳＯ４、２００ ｎＭの正プライマー、２００ ｎＭの逆プライマー、各２００μＭのｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰ、１Ｘ Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）、０．５単位のＶｅｎｔＲポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）、及び２μｌの脳下垂体ｃＤＮＡ（前項に記載の１００ ｎｇ ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡから調製されたｃＤＮＡと同等物）。サイクリング条件は、９９．９℃ ２分、続いて９４℃ ３０秒間、６７℃ １５秒間、そして７５℃ ３０秒間の４０サイクルであった。これらの条件は、アガロースゲルにおいて、約４００塩基対（ｂｐ）の弱々しいバンドの検出をもたらした。この断片をゲル精製し、そしてＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標） ＴＯＰＯ（登録商標） ＰＣＲクローン化キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、 Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を用いてクローン化した。約４００ｂｐのＥｃｏＲＩ挿入断片を持つプラスミドを確認し、ｈＢＲＰｉｎ ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔと呼んだ（図１９）。ＤＮＡ塩基配列決定法の結果は、４００ ｂｐのＰＣＲ断片の正体がＢＲＰであることを立証した。断片のＤＮＡ塩基配列は、配列番号２と一致するアミノ酸翻訳を持つ配列番号１のそれに一致した。
【０３１８】
実施例３：哺乳動物細胞におけるヒトＢＲＰ融合タンパク質の発現のためのプラスミドの構築。
【０３１９】
ＡＰ−ＢＲＰ
以下のプライマー５’−ＣＴＣＧＡＧＧＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＴＧＣＧＣＡＣ−３’（配列番号４９）、及び５’−ＧＧＧＣＣＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＴＧＧＴＣＴＣＡＣＡＣＴＣＣ−３’（配列番号５０）を用いてアルカリホスファターゼ（ＡＰ）のＣ末端部位への（シグナル配列のない）予測的された成熟ヒトＢＲＰについてのコーディング領域の融合を行った。ＰＣＲ反応条件は以下のとおりであった：１００ μｌの反応容量中、４ ｍＭのＭｇＳＯ４、２００ ｎＭの各プライマー、各２００μＭのｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰ、１Ｘ Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）、１単位のＶｅｎｔＲポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）、及び１００ ｎｇのｈＢＲＰ／ＢＲＰｉｎ ｐＣＲ４ＢｌｕｎｔプラスミドＤＮＡ。サイクリング条件は、９９℃ ２分、続いて９４℃ ３０秒間、７０℃ ３０秒間の２５サイクルであった。得られたＰＣＲ断片をゲル精製し、そしてＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標） ＴＯＰＯ（登録商標） ＰＣＲクローン化キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、 Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を用いてクローン化した。期待の制限エンドヌクレアーゼ・バンディング・パターンを持つＢＲＰ−ＮＴＡＰ（図２０）と呼ばれるプラスミドを確認し、そして配列決定した。ＢＲＰ−ＮＴＡＰプラスミドＤＮＡをＸｈｏＩ及びＡｐａＩにより消化し、そしてＢＲＰコーディング領域を含んでいる挿入断片をゲル精製し、そしてＸｈｏＩ及びＡｐａＩ消化したＡｐｔａｇ−５ベクターＤＮＡ （ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ（登録商標） Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ， ＴＮ）に挿入した。これが、Ｎ末端の分泌アルカリホスファターゼ及びＢＲＰａｔのＣ末端から成る融合タンパク質の発現のために作り出したプラスミドをもたらした（ＡＰ−ＢＲＰｉｎ Ａｐｔａｇ−５、図２１）。
【０３２０】
ＢＲＰ−ＧＦＰ
ヒトＢＲＰのＣ末端への緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）の融合を以下のＰＣＲプライマー、５’−ＧＣＴＡＧＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＧＣＡＴＴＣＣＴＣ−３’（配列番号５１）、及び５’−ＴＡＴＣＧＡＴＧＧＴＣＴＣＡＣＡＣＴＣＣＧＴＧ−３’（配列番号５２）を用いて行った。ＰＣＲ反応条件は以下の通りだった：５０ μｌの反応容量中、４ ｍＭのＭｇＳＯ４、２００ ｎＭの各プライマー、各２００μＭのｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰ、１Ｘ Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）、１単位のＶｅｎｔＲポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）、及び５０ ｎｇのｈＢＲＰｉｎ ｐＣＲ４ＢｌｕｎｔプラスミドＤＮＡ。４９℃〜６９℃の範囲でアニーリング温度の１２点のグラジエントを試験するために１２の同一な５０μｌの反応液を準備した。サイクリング条件は、９９℃ ５分、続いて９４℃ ３０秒、４９〜６９．１℃ １５秒、及び７５℃ ３０秒の２５サイクルであった。６３〜６８℃のアニーリング温度を用いた反応からのＰＣＲ産物を、貯めて、ゲル精製した。末端へのｄＡ残基に付加にに加え、精製された断片を、Ｍｇ不含１Ｘ ＰＣＲバッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）、２ ｍＭ ＭｇＣｌ２、各２００ μＭのｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰを含む１００μｌの反応容量中、２．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）により処理した。７２℃ １５分間のインキュベーションの後、この断片をＷｉｚａｒｄ（登録商標） ＰＣＲ Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用いて精製した。ｄＡテールを持ったＢＲＰＰＣＲ断片を、製造業者によって指定されたプロトコールを用いてＣＴ−ＧＦＰ Ｆｕｓｉｏｎ ＴＯＰＯ（登録商標） ＴＡ発現式キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）に提供されたベクター内に挿入した。Ｎ末端がヒトＢＲＰ、そしてＣ末端がＣｙｃｌｅ３ ＧＦＰから成る融合タンパク質の発現のための発現ベクターを得た（ＢＲＰ−ＧＦＰｉｎ ｐｃＤＮＡ３．１、図２２）。融合構築物の構造を、ＤＮＡ塩基配列決定によって確認した（図２３）。
【０３２１】
ＦＬＡＧ−ＢＲＰ
Ｎ末端ＦＬＡＧタグを有するＢＲＰの発現のためのベクターを作り出すために、ＢＲＰ−ＮＴＡＰプラスミドをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化し、約４００ｂｐのヒトＢＲＰ挿入断片をゲル精製した。精製ＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化したｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１ （Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）に挿入した。１００ ｂｐのＰｓｔＩ断片を取り除くために、得られたプラスミド構築物（ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−ＢＲＰ−ＲＩ−ＢＡＭ）をＰｓｔＩにより消化し、４．９キロベースペア（ｋｂ）のベクター断片をゲル精製した。ＢＲＰ−ＮＴＡＰをＳｐｅＩとＳｔｕＩで消化し、４．３ ｋｂのベクターＤＮＡ断片をゲル精製し、次に以下の配列、５’−ＣＴＡＧＴＣＴＣＧＡＧＧＣＴＧＣＡＧＴＴＧＣＴＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧ−３’（配列番号５３）、及び５’−ＣＣＴＴＧＴＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＴＴＴＧＴＡＧＴＣＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＣＴＣＧＡＧＡ−３’（配列番号５４）を持つ相補的なオリゴヌクレオチドに連結した。クローン化の後に、正の配列を持つプラスミド構築物を同定し、そしてＰｓｔＩにより消化した。１００ ｂｐのＰｓｔＩ断片をゲル精製し、そしてｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−ＢＲＰ−ＲＩ−ＢＡＭ（前記）からの４．９ ｋｂのＰｓｔＩベクター断片に挿入した。正の配向性のＰｓｔＩ挿入断片を持つ構築物を同定し、配列決定して、ＦＬＡＧ−ＢＲＰ融合断片が、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１のマウスのプレプロトリプシン・シグナル配列をフレーム単位でコードすることを確認した。この発現ベクター・プラスミドをＦＬＡＧ−ＢＲＰｉｎ ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１（図２４）と呼んだ。ＦＬＡＧ−ＢＲＰ挿入断片を以下のプライマー、５’−ＴＴＴＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＣＴＴＣＴＧ−３’（配列番号５５）、及び５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＴＧＧＴＣＴＣＡＣＡＣＴＣ−３’（配列番号５６）を用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応条件は以下の通りだった：５０ μｌの反応容量中、４ ｍＭのＭｇＳＯ４、２００ ｎＭの各プライマー、各２００μＭのｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰ、１Ｘ Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）、１単位のＶｅｎｔＲポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）、及び５０ ｎｇのＦＬＡＧ−ＢＲＰｉｎ ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１プラスミドＤＮＡ。６５℃〜７５℃の範囲でアニーリング温度の１２点のグラジエントを試験するために１２の同一な５０μｌの反応液を準備した。サイクリング条件は、９９℃ ５分、続いて９４℃ ３０秒、６５〜７５℃ １５秒、及び７５℃ ３０秒の３０サイクルであった。６５〜７１℃のアニーリング温度を用いた反応からのＰＣＲ産物を、貯めて、ゲル精製した。この断片を、ＮｈｅＩとＢａｍＨＩで消化し、次にＮｈｅＩとＢａｍＨＩにより消化したｐＣＥＰ４プラスミドＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）に連結して、霊長類細胞発現ベクター・プラスミドＦＬＡＧ−ＢＲＰｉｎ ｐＣＥＰ４を得た（図２５）。ＤＮＡ塩基配列解析を、ＦＬＡＧ−ＢＲＰ融合タンパク質をコードする正し���配列を確認するために使用した。
【０３２２】
ＨＩＳ−ＡＲＰ
ＡＲＰのＮ末端の、（１）マウス・プレプロトリプシン・シグナルペプチド、（２） ６ヒスチジン−１グリシン・タグ（６Ｈｉｓｇ）、及び（３）エンテロキナーゼ開裂部位（ＥＫ）から成る融合タンパク質を得るために２段階のＰＣＲ増幅を行った。最初の段階で、１１．７３ ｎｇのＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ ｉｎ ｐＣＥＰ４プラスミドＤＮＡをプライマー、５’−ＣＴＣＴＴＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＧＣＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＴＡＡＧＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧ−３’（配列番号１０３）、及び５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＧＣＧＡＧＡＧＡＧＧＣＧＡＣＡＣＡＴＧ−３’（配列番号１０４）に対して鋳型として使用した。ＰＣＲを、１単位のＶｅｎｔＲポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）、４ ｍＭのＭｇＳＯ４、４２０ ｎＭの各プライマー、各２００μＭのｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰ、並びに１Ｘ Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を含む９つの同一の５３ μｌの反応容量中で行った。サイクリング条件は、９９℃ ５分、続いて９４℃ ３０秒、６８℃ ３０秒、及び７５℃ ３０秒の３０サイクルであった。ＰＣＲに続いて、１μｌの最初の段階の反応物を以下のプライマー、５’−ＴＴＴＧＣＴＡＧＣＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＣＴＴＣＴＧＡＴＣＣＴＡＧＣＴＣＴＴＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＧＣＴＣＡＴＣ−３’（配列番号１０５）、及び５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＧＣＧＡＧＡＧＡＧＧＣＧＡＣＡＣＡＴＧ−３’（配列番号１０６）を用いた第２段階の反応のための新しい試験管に移した。
【０３２３】
反応容量は１２０μｌであり、最初の段階と同じものである、全ての他の反応条件を備えた。反応ミックスの各１２μｌのアリコートを、６５℃〜７６℃の範囲でアニーリング温度の９点のグラジエントを試験するために使用した。サイクリング条件は、９９℃ ５分、続いて９４℃ ３０秒、６５〜７６℃ ３０秒、及び７５℃ ３０秒の３０サイクルであった。全ての条件が、期待されているサイズの断片を製造し、これをゲル精製し、ＮｈｅＩとＢａｍＨＩにより消化し、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標） ＰＣＲ Ｐｒｅｐ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて濃縮し、次にＮｈｅＩとＢａｍＨＩで消化されたｐＣＥＰ４ｉｎｔに挿入した。正しいサイズの挿入断片を持つプラスミドを同定し、６Ｈｉｓｇ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ ｉｎ ｐＣＥＰ４ｉｎｔと呼んだ（Ｈｉｓ−ＡＲＰと省略される）。融合タンパク質の構造をＤＮＡ塩基配列決定によって確認した。図４１Ｂに示される融合タンパク質のＤＮＡ塩基配列及びアミノ酸翻訳を有するプラスミドの図を図４１Ａに示す。
【０３２４】
実施例４：ヒトの組織から抽出されたＲＮＡ中のヒトＡＲＰ転写産物の検出
ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイに使用したヒトＡＲＰの正、及び逆プライマーは、それぞれ、５’−ＡＧＧＡＧＧＣＡＧＴＣＡＴＣＣＣＡＧＧ−３’（配列番号５７）、及び５’−ＴＧＣＣＴＴＧＧＣＧＧＴＣＡＣＴＴＣ−３’（配列番号５８）であった。ＡＲＰに対するプローブは、５’−６ＦＡＭ−ＴＧＣＣＡＣＴＴＧＣＡＣＣＣＣＴＴＣＡＡＴＧＴＧ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号５９）であった。蛍光性プローブは、ＡＲＰの最初の２つのコーディング・エクソンの予測された接合部に及ぶため、このアッセイは、特異的にスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物を検出することが意図される。
【０３２５】
ＡＲＰ ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイのためのｃＤＮＡ鋳型を提供するためにＨｕｍａｎ Ｒａｐｉｄ−Ｓｃａｎ（商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐａｎｅｌ（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）を使用した。前記パネルは、１０００Ｘ、１００Ｘ、１０Ｘ、及び１Ｘから連続的に希釈された、２４の組織からのｃＤＮＡを含んでいた。最も低い濃度の、１Ｘは、約１ ｐｇのｃＤＮＡであった。１０００Ｘ及び１００Ｘ希釈物を、ＡＲＰ ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイに使用した。１ＸのｃＤＮＡ濃度を含んだ二重のパネルからのウェルをヒトβ−アクチンｐｒｅ−ｄｅｖｅｌｏｐｅｄアッセイ試薬キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）に使用した。
【０３２６】
前記パネルは脳下垂体からのｃＤＮＡを含んでいないため、実施例１からの脳下垂体ｃＤＮＡを使用した。β−アクチンｐｒｅ−ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ＴａｑＭａｎ（登録商標）、及び脳下垂体ｃＤＮＡの希釈物を、Ｏｒｉｇｅｎｅパネルによる１０００Ｘ、１００Ｘ、１０Ｘ、及び１Ｘ ｃＤＮＡ希釈物と同等なおおよその量を決定するために使用した。結果は、５ ｐｇの脳下垂体ポリ（Ａ）＋ＲＮＡから準備したｃＤＮＡが、約３１のＣＴｓを示す１ＸのｃＤＮＡ濃度に相当することを示した。従って、５ ｎｇ及び０．５ ｎｇの脳下垂体のポリ（ａ）＋ＲＮＡからのｃＤＮＡを、それぞれＯｒｉｇｅｎｅパネル１０００Ｘ及び１００Ｘ ｃＤＮＡｓに相当すると見なした。
【０３２７】
結果を表６に示す。
【０３２８】
【表６】
2004527214.tif 000008
【０３２９】
この結果は、検査された組織サンプル、膵臓、脳下垂体、及び精巣組織が最も高いレベルのＡＲＰを含んでいることを示す。残りの組織は、より低いか又は検出不能なレベルのＡＲＰ ｍＲＮＡを有していた。
【０３３０】
実施例５：ラット組織中のＡＲＰ ｍＲＮＡの検出
ラットＲＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ （Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）から購入するか、又は液体窒素中で急速冷凍し、そして−８０℃で保存した臓器から調製した。重量が最大で４０ ｍｇまでの組織を、ＲＬＴバッファー（Ｒｎｅａｓｙ（登録商標）キット Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）中で４５秒間、携帯型乳棒（Ｋｏｎｔｅｓ， Ｖｉｎｅｌａｎｄ， ＮＪ）によって押しつぶし、続いて２１ゲージの針を１０回通過させて均質化した。ＲＬＴバッファー、又はＴｒｉｚｏｌ（登録商標）（ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）のいずれかの中で、より大きな組織を均質にするために、Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｐｏｌｙｔｒｏｎを使用した。使用した均質化バッファーのメーカーにより供給されたプロトコールに従ってＲＮＡを精製した。実施例１に記載のとおりｃＤＮＡを調製した。
【０３３１】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイで使用したラットＡＲＰの正、及び逆プライマーは、それぞれ、５’−ＡＧＧＣＡＧＣＣＧＴＣＣＣＡＡＴＣ−３’（配列番号６０）、及び５’−ＧＡＴＣＡＣＴＴＣＧＣＡＣＴＧＴＣＡＣＧＴＴ−３’（配列番号６１）であった。ラットＡＲＰに対するプローブは、５’−６ＦＡＭ−ＣＡＧＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＧＣＡＣＣＣＣＴＴ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号６２）であった。蛍光性プローブが、ＡＲＰの最初の２つのコーディング・エクソンの予測された接合部に及ぶため、このアッセイは、特異的にスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物を検出することが意図される。
【０３３２】
ＡＲＰ ｃＤＮＡをＴａｑＭａｎ（登録商標） ＰＣＲによりラットの脳下垂体、卵巣、精巣、眼、及びラット下垂体腺腫細胞株ＲＣ−４Ｂ／Ｃにおいて検出可能だった（データ未掲載）。（膣スミアによって決定される）発情前期、発情期、及び発情間期の７６日成熟雌動物から取ったラット脳下垂体組織から抽出した全ＲＮＡにおけるアッセイの結果は、ラットＡＲＰ ｍＲＮＡが発情周期中、調節されているため、生殖における役割を担っているかもしれないことを示唆した。ＡＲＰｍＲＮＡが発情期中減少を平らにするということで、ＡＲＰ ｍＲＮＡレベルを低下させる前記調節は、ＦＳＨβ ｍＲＮＡのそれの反対のものであるように思われるのに対し、ＦＳＨβ ｍＲＮＡレベルは、上昇する（表７）。
【０３３３】
【表７】
2004527214.tif 000009
【０３３４】
実施例６：ヒトＡＲＰに対応するｃＤＮＡクローンの単離
以下の正、及び逆ＰＣＲプライマー：それぞれ、５’−ＴＴＴＴＡＡＧＣＴＴＡＧＴＧＡＴＧＣＣＴＡＴＧＧＣＧＴＣＣＣＣ−３’（配列番号６３）、及び５’−ＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＧＴＡＧＣＧＡＧＡＧＡＧＧＣＧ−３’（配列番号６４）（終止コドンなし）によるＰＣＲのための鋳型としてＩＭＡＧＥ ２３３８９５０クローン（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ＡＬ）から精製したＤＮＡを使用した。ＰＣＲを、４単位のＶｅｎｔＲポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）、１ μＭの各正及び負プライマー、２ ｍＭのＭｇＳＯ４、各２５０μＭのｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰ、並びに１Ｘ Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）、及び１μｌのＩＭＡＧＥ ２３３８９５０プラスミドＤＮＡを含む１００ μｌの反応容量中で行った。サイクリング条件は、９４℃ １分、５６℃ ３５秒、及び７２℃ １分の３０サイクルであった。ＰＣＲから得られた約４００ｂｐの断片を、ゲル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩにより消化し、次にＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩにより消化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫＩＩベクターＤＮＡ（Ｓｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）中に連結した。挿入断片であるＡＲＰの同一性を確認するために、得られたプラスミド、ｐＢＳＳＫＩＩｈＡＲＰ．４（２６Ａ）をＤＮＡ塩基配列解析にかけた。ヒトＡＲＰタンパク質コード領域の配列（図２６Ｂ）が、配列番号１７と一致した。興味深いことに、配列番号２３に示したＤＮＡ塩基配列は、クローン化されたＡＲＰ ｉｎｓｅｒｔ ｉｎ ｐＢＳＳＫＩＩ ｈＡＲＰ．４及び配列番号１７の両者と比べた場合、一のヌクレオチド相違を持っている。この相違（Ａ→Ｃ）は、図２９で説明されて、第１１４残基でのＡＲＰアミノ酸配列のＬｅｕのＰｈｅへの変化をもたらす。ＥＳＴデータベースの検索は、ＡＲＰ−Ｐｈｅ型が支配的であり、そのためＡＲＰ−Ｌｅｕ型は集団内ではあまり一般的ではない可能性のある多型の変異型であることを明らかにした。ＡＲＰ−Ｐｈｅタンパク質をコードしたｃＤＮＡクローンを得るために、多型と一致しているＡ残基をＡＲＰ−Ｐｈｅ型がコードされるようにｐＢＳＳＫＩＩ ｈＡＲＰ．４のＣに変更した。これは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩＩのＴ３プロモーター配列に対応するプライマー、及び、５’−ＴＴＴＧＡＧＡＴＣＴＴＣＡＣＧＧＣＣＡＧＧＧ−３’（配列番号６５）による、ＰＣＲのための鋳型としてｐＢＳＳＫＩＩ ｈＡＲＰ．４を用いることにより行われた。反応条件及びサイクリング・パラメーターは、完全なＡＲＰコーディング領域をクローン化するために先に記載されたものと同様であった。得られたＰＣＲ断片を、ゲル精製し、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標） ＴＯＰＯ（登録商標） ＰＣＲクローン化キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、 Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を用いてクローン化した。ＤＮＡ塩基配列解析は、ｐＣＲｂｌｕｎｔ Ｐｈｅと呼ばれるプラスミドの突然変異の存在を立証した。ｐＣＲｂｌｕｎｔ Ｐｈｅからの精製ＤＮＡをＢｇｌＩＩとＮｏｔＩにより消化した。Ｐｈｅ突然変異を含むＡＲＰ断片を、ゲル精製し、ＢｇｌＩＩとＮｏｔＩにより消化されたｐＢＳＳＫＩＩ ｈＡＲＰ．４に挿入し、そしてＡＲＰ−Ｌｅｕ断片から精製した。ｐＢＳＳＫｎ ｈＡＲＰ−Ｐｈｅ （図２８Ａ）と呼ばれる、期待されているサイズの挿入断片を持つプラスミドを、同定し、ＤＮＡ塩基配列解析によって正しくＡＲＰ−Ｐｈｅ変異型（図２８Ｂ）をコードしたオープンリーディングフレームを持っていることを示した。
【０３３５】
実施例７：哺乳動物細胞におけるヒトＡＲＰ融合タンパク質の発現のためのプラスミドの構築。
【０３３６】
ＧＦＰ−ＡＲＰ
ｐＢＳＳＫＩＩ ＡＲＰ．４からのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ挿入断片をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩにより消化したｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）にサブクローニングした。正しい制限エンドヌクレアーゼ・バンド・パターンを持つクローンを同定した。１つをさらなる研究のために選び、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２−ＡＲＰ又はＡＲＰ−ＧＦＰ（図２９）と呼んだ。対応するアミノ酸翻訳と一緒に融合タンパク質ＯＲＦのＤＮＡ塩基配列を図３０に示す。
【０３３７】
ＡＰ−ＡＲＰ
サブクローニングを容易にするために、オリゴヌクレオチド・アダプター・カセット（５’−ＣＴＡＧＡＧＧＡＡＴＴＣＧＧＧＣＣ−３’（配列番号６６）、及び５’−ＣＧＡＡＴＴＣＣＴ−３’（配列番号６７））を、ｐＡＰｔａｇ５のポリリンカーのＸｂａＩとＡｐａｌ部位の間へのＥｃｏＲＩ部位を挿入するために使用し、そしてベクターｐＡＰｔａｇ５ （ＲＩ）を作製した。シグナルペプチドのないＡＲＰコーディング断片を得るために、ＰＣＲ増幅を、以下のプライマー、５’−ＴＴＴＴＣＴＡＧＡＡＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＴＣＡＴＣＣＣＡＧＧＣ−３’（配列番号６８）、及び５’−ＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＣＴＡＧＴＡＧＣＧＡＧＡＧＡＧＧＣＧ−３’（配列番号６９）、並びに鋳型としてｐＢＳＳＫＩＩ ＡＲＰ．４を用いて行った。３４０ ｂｐのＰＣＲ産物を、ＸｂａＩとＥｃｏＲＩで消化し、精製し、そしてＸｂａＩとＥｃｏＲＩで消化されたｐＡＰｔａｇ５ （ＲＩ）に挿入した。これが、Ｎ−末端をアルカリホスファターゼによりタグしたＡＲＰ−Ｌｅｕ変異型の発現に好適な、ｐＡＰｔａｇ５ （ＲＩ）と呼ばれるベクターを製造した。ＡＰタグされたＡＲＰ−Ｐｈｅの発現のためのベクターを構築するために、以下の断片を単離し、連結反応により結合してプラスミドｐＡＰｔａｇ５ （ＲＩ）−ＡＲＰ−Ｐｈｅ （図３１Ａ）を得た：ｐＡＰｔａｇ５ （ＲＩ）からの６．６ ｋｂ ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片、ｐＡＰｔａｇ５ （ＲＩ）−ＡＲＰ−Ｌｅｕからの２４０ ｂｐのＸｂａＩ−ＰｓｔＩ断片、及びｐＢＳＳＫＩＩ ＡＲＰ−Ｐｈｅからの８３ ｂｐのＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片。ＡＰ−ＡＲＰ接合部部位のＤＮＡ塩基配列を決定し、期待されているオープンリーディングフレームをコードすることが示された。
【０３３８】
ＦＬＡＧ−ＡＲＰ
ＦＬＡＧタグの上流にマウス・プレプロトリプシン・シグナルペプチドを持つ、ＡＲＰのＮ末端のＦＬＡＧから成る融合タンパク質を得るために、２段階のＰＣＲ増幅を行った。最初の段階で、ｐＢＳＳＫＩＩ ＡＲＰ−Ｐｈｅ （１μｌのプラスミドＤＮＡ）を、以下のプライマー、５’−ＡＧＴＴＧＣＴＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＴＣＡＴＣＣＣＡＧＧＣ−３’（配列番号７０）、及び５’−ＣＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＡＧＣＧＡＧＡＧＡＧＧＣＧＡＣＡＣＡＴＧ−３’（配列番号７１）に対する鋳型として使用した。ＰＣＲを、１単位のＶｅｎｔＲポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）、４ ｍＭのＭｇＳＯ４、１００ ｎＭの各プライマー、２００μＭの各ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰ、並びに１Ｘ Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を含む５０ μｌの反応容量中で行った。９６℃ ３０秒、７０℃ ３０秒の１６サイクルを増幅のために用いた。ＰＣＲに続いて、１０μｌの最初の段階の反応物を以下のプライマー、５’−ＴＴＴＧＣＴＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＣＴＴＣＴＧＡＴＣＣＴＡＧＣＴＣＴＴＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＧＣＴＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧ−３’（配列番号７２）、及び５’−ＣＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＡＧＣＧＡＧＡＧＡＧＧＣＧＡＣＡＣＡＴＧ−３’（ＳＥＱＩＤＮＯ７３）を用いた第２段階の反応のために新しい試験管に移した。全ての他の反応及びサイクリングが最初の段階と同じで、反応容量が１００μｌであった。ＰＣＲの第２段階から製造されたＰＣＲ断片を、ＮｈｅＩとＢａｍＨＩで消化し、次にＮｈｅＩとＢａｍＨＩで消化されたｐＣＥＰ４に挿入した。正しいサイズの挿入断片を持つプラスミドを同定し、そしてＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ ｉｎ ｐＣＥＰ４ （図３２）と呼んだ。
【０３３９】
ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−ｉｎｔ
ＡＲＰ遺伝子のイントロン−エクソン構造は、その親類、糖タンパク質アルファ・サブユニットのそれと類似している。糖タンパク質アルファ・サブユニットは哺乳動物細胞中での効率的な発現のためにイントロン又はゲノム断片を必要とするので（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ． ５，６７４，７１１）、ＡＲＰもこの必要性がある可能性がある。これを試験するために、ＦＬＡＧ−ＡＲＰ発現構築物を、ｍＲＮＡの５’非翻訳部位中のイントロンを用いて設計した。ｐＣＩｎｅｏ （Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）からのキメラ・イントロンを、５’ＫｐｎＩ部位 （５’−ＧＧＴＡＣＣＡＡＧＧＴＡＧＣＣＴＴＧＣＡＧＡＡＧＴＴ−３’（配列番号７４））、及び３’ＰｖｕＩＩ部位（５’−ＣＡＧＣＴＧＧＴＡＡＴＴＧＡＡＣＴＧＧＧＡＧＴＧＧＡ−３’（配列番号７５））を加えるように設計されたプライマーによりＰＣＲ増幅した。反応混合物は、１０ ｎｇのｐＣＩｎｅｏ ＤＮＡ、１Ｘ Ｐｆｕバッファー（Ｓｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）、１μＭの各プライマー、２００μＭの各ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰ、３．２ ｍＭのＭｇＳＯ４、並びに０．５ μｌのＰｆｕターボ・ポリメラーゼ（Ｓｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を２５ μｌの総量中に含む。サイクリング条件は、９５℃ １分、続いて９５℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、及び７２℃ １分の２０サイクルであった。サイクリング後に、反応物を１０分間７２℃でインキュベートし、次に４℃に冷却した。イントロンを含んでいる約２００ ｂｐのＰＣＲ断片をＰｖｕＩＩとＫｐｎＩにより消化し、ゲル精製して、ＰｖｕＩＩとＫｐｎＩにより消化されたｐＣＥＰ４に挿入した。正しいサイズの挿入断片を持つプラスミドｐＣＥＰ４ｉｎｔが同定した。イントロンの構造を、ＤＮＡ塩基配列決定によって確認した。ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ ｉｎ ｐＣＥＰ４をＮｈｅＩとＢａｍＨＩで消化した。４００ ｂｐの挿入断片をゲル精製し、そしてＮｈｅＩとＢａｍＨＩにより消化されたｐＣＥＰ４ｉｎｔ中にクローン化されてプラスミドＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ ｉｎ ｐＣＥＰ４ｉｎｔを設計した（図３３）。
【０３４０】
実施例８：ＡＲＰ及びＢＲＰによる哺乳動物細胞の一過性トランスフェクション
別段の記載のない限り、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞系（ＡＴＣＣ， ＣＲＬ １０８５２）をＡＲＰ及びＢＲＰ融合タンパク質の製造のために使用した。細胞培養を、成長、及びインキュベーション手順の間、３７℃、５％ ＣＯ２、９５％の湿気で維持した。Ｊｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ． （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２４： ５９６−６０１， １９９６）により記載されたリン酸カルシウム沈殿手順を、成長培地が１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、及び１％のＬ−グルタミンを補ったダルベッコ変性イーグル培地Ｆ−１２ （ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）であったことを除いて、一過性トランスフェクションに使用した。トランスフェクションの約１時間前に、成長培地を除き、トランスフェクション培地（２ ％のＦＢＳ、及び１％のＬ−グルタミンを補ったＤＭＥＭ／Ｆ−１２）と交換して、そしてリン酸カルシウム沈澱したＤＮＡを添加した。一般に、１枚の１００ ｍｍの皿につき１２．５μｇ〜２５μｇのＤＮＡを１種類のプラスミド・トランスフェクションのために使用した。同時トランスフェクションのために、１２．５μｇの各プラスミドＤＮＡの混合物を使用した。４〜６時間後に、トランスフェクション培地を成長培地に交換した。約２４時間後に、成長培地を補足してＤＭＥＭ／Ｆ−１２ （収集培地）に交換した。４８〜７２時間後に、収集培地を除き、残屑を取り除くために遠心分離し、解析又は濃縮のために保存し、そして新鮮な収集培地を細胞培養に添加した。さらに４８〜７２時間後、収集培地を除き、遠心分離し、保存し、そして細胞を廃棄した。培地の濃縮を製造業者によって指定されたプロコールにより、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ ＹＭ−１０ （Ａｍｉｃｏｎ）を用いて行った。
【０３４１】
実施例９： ＡＲＰ及びＢＲＰによる哺乳動物細胞の安定したトランスフェクション
収集培地を使用しなかった以外、先の一過性トランスフェクションについての記載のとおりｐＣＥＰ４誘導プラスミドによる安定したトランスフェクションを行った。トランスフェクションの約２日後に、成長培地を選択媒体（１０％のＦＢＳ、１％のＬ−グルタミン、及び２５０ μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを補ったＤＭＥＭ−Ｆ１２）と交換した。細胞が集密化し、そして凍結、及び製造規模の拡大のために分ける準備ができるまで選択培地を２〜３日ごとに交換した。
【０３４２】
実施例１０：培地中の分泌されたＧＦＰ融合タンパク質の検出
完全な、それらの天然シグナルペプチド配列を持つ、ＡＲＰ−ＧＦＰ及びＢＲＰ−ＧＦＰの両方を、培地中に分泌させ、Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ Ａｎｔｉ−ＧＦＰ ｓｔｒｉｐプレート（Ｐｉｅｒｃｅ １５１８８）を用いた融合タンパク質の捕捉、又は抗ＧＦＰウエスタンブロットによって検出できた。
【０３４３】
ウエスタンブロットによりＢＲＰ−ＧＦＰ融合タンパク質を分析するために、ＢＲＰ−ＧＦＰの一過性トランスフェクションからの１マイクロリットル、２マイクロリットル、及び５マイクロリットルの濃縮培地を分析した。ＣＯＳ−７細胞（複製不全ＳＶ４０により形質転換されたアフリカミドリザル腎臓細胞、ＡＴＣＣ細胞系１６５１）をこの実験のために使用した。１０％ ｖ／ｖのＦＢＳ、１％ ｖ／ｖの２００ ｍＭ Ｌ−グルタミン、及び１％ ｖ／ｖの１００ ｍＭ ピラベートを補った５００マイクロリットルのダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、１ウェルにつき１００，０００の細胞密度で細胞を２４ウェルプレート上に蒔き、そして無菌条件下、３７℃、５％ ＣＯ２、９５％湿気で培養した。翌日、製造業者の指示に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）と結合させる１マイクログラムのＢＲＰ−ＧＦＰプラスミドＤＮＡを各々のウェルに添加することによって、細胞をリポフェクションによってトランスフェクトした。トランスフェクションの翌日、細胞を無血清培地（１％ ｖ／ｖのＬ−グルタミン及び１％ ｖ／ｖのピルベートを補ったＤＭＥＭ）に交換し、更に培養３日後に、培地を、収集し、Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ遠心性濃縮器（ＹＭ−１０）を用いて濃縮し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ２−ＡＲＰを用いた類似のＣＯＳトランスフェクションからのＡＲＰ−ＧＦＰのサンプル（２マイクロリットル）、並びにＤＮＡを含まないトランスフェクション条件に晒されたＣＯＳ−７細胞からのサンプル（１マイクロリットル）をも分析した。５マイクロリットルのＢＲＰ−ＧＦＰサンプル（６．８５マイクログラムの総タンパク質）中に存在したときに、各々が大体同じ量の総タンパク質（タンパク質含量のＢＣＡ分析に基づく）を含むように、ＡＲＰ−ＧＦＰ及び対照サンプル量をが選んだ。
【０３４４】
１０％ ＮｕＰＡＧＥ（登録商標） Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｐｒｅｃａｓｔゲル及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの試薬を用いて電気泳動が実施した。サンプルを、純水（及び還元サンプルのために、１マイクロリットルの還元剤（０．５Ｍのジチオスレイトール））と合わせ、及び２．５マイクロリットルの４ｘ ＮｕＰＡＧＥ（登録商標） ＬＤＳサンプル・バッファー（Ｎｏｖｅｘ ＮＰ００７） そして１０マイクロリットルの最終容量となった。７０℃で５分間のこれらの希釈サンプルを加熱した後に、サンプルを１５ウェルのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １０％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲルに添加した。ＧＦＰ標準のサンプル（４ナノグラム、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をウエスタンブロットの正の対照として含んだ。Ｂｉｏ−Ｒａｄからの広範囲着色マーカー（カタログ＃ ７２８０７Ａ）をＢｉｏ−Ｒａｄからのビオチン化マーカーに加えて使用した。電気泳動を一定の電圧（１２５Ｖ）でＭＯＰＳ泳動バッファー（Ｎｏｖｅｘ ＮＰ００５）を用いて実施し、そしてサンプル・バッファーからのＳｅｒｖａ Ｂｌｕｅがゲルの底に届いた時に止めた。タンパク質をゲルからＮｕＰＡＧＥ転写バッファー及びＨｏｅｆｆｅｒ ＴＥ２２ Ｔｒａｎｓｐｈｏｒ装置（定電流−４００ｍＡを使用）を用いてＰＶＤＦ膜（Ｎｏｖｅｘ ＬＣ０００２）に移した。転写の後（ゲルからＰＶＤＦへの着色マーカーの移動によって確認した）に、膜上の非特異的結合部位を、４℃で一晩、１ｘカゼイン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ ＳＰ５０２０）と一緒に水中でインキュベートすることによりふさいだ。ブロッキングの後に、膜を、ＴＢＳＴ（１ＯＯ ｍＭ Ｔｒｉｓ／０．９％ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．５ ＋ ０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）中で緩やかに振とうしながら、各々の５分間ずつインキュベートすることにより３回洗浄した。次に、この膜を、ＴＢＳＴ中で１／２０００に希釈した１次抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄビオチン化ヤギ抗ＧＦＰ ６００１０６１５）の溶液中、室温で３０分インキュベートし、その後この膜を前記のとおりＴＢＳＴ中で３回洗浄した。結合した抗体の検出を、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ−ＡＰキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＡＫ５００１）からの試薬を用いて行った。
【０３４５】
図３４で明らかなように、ＢＲＰ−ＧＦＰ及びＡＲＰ−ＧＦＰの両者が、トランスフェクト細胞からの培地中で容易に検出された。非還元条件下、ＡＲＰ−ＧＦＰ及びＢＲＰ−ＧＦＰの両者が、還元サンプルで減少しているか又は不在の多量体形態を示す。
【０３４６】
実施例１１：分泌されたＦＬＡＧ融合タンパク質の検出、及びイントロンありとなしのＦＬＡＧ−ＡＲＰ発現の比較
ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞を、プラスミドＦＬＡＧ−ＢＲＰｉｎ ｐＣＥＰ４、ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ ｉｎ ｐＣＥＰ４及びＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ ｉｎ ｐＣＥＰ４ｉｎｔにより一過性トランスフェクトした。培養上清を収集し、濃縮した。１０μｌ、５μｌ、及び２μｌの各々のＡＲＰトランスフェクションからの濃縮上清、並びに５μｌのＢＲＰトランスフェクションからの濃縮した培養上清を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ （ＮｕＰＡＧＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をタンパク質サイズ分離のために使用した。サイズによって分別されたタンパク質をＰＶＤＦ膜に電気的に転写した。転写に続いて、膜を５％の粉末ドライミルク中４℃で一晩ブロッキングした。残りの手順を室温で行った。膜をＰＢＳＴ（リン酸緩衝生理食塩水、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）により５回洗浄し、次に５％のウシ血清アルブミン含有ＰＢＳ中、１：５００に希釈した抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ｆ３１６５）を含む溶液中で１時間処理した。ＰＢＳＴにより４回洗浄した後に、膜をＰＢＳＴ＋５％の粉末ドライミルク中、１：３０００に希釈されたヤギ抗マウスＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰコンジュゲート（Ｂｉｏ−Ｌａｄｓ ＃１７０−６５１６）を含む溶液中で１時間インキュベートした。膜をＴＢＳＴ（１０Ｘ濃縮液＃１７０−６４３５１からの１Ｘ Ｔｒｉｓ緩衝食塩液、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）により５回洗浄し、続いてＴｒｉｓ緩衝食塩液ｐＨ ９．５ （ＴＢＳ）によって１回洗浄した。ＨＲＰを、製造業者によって供給されたプロトコールを用いてＢＭ化学発光基質（ＰＯＤ） （Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ １５００６９４）により検出した。Ｔｙｐｈｏｏｎ ８６００ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｍｏｄｅ Ｉｍａｇｅｒ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｉｎｃ． Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）をＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ融合タンパク質からのシグナルの定量に使用した。ＦＬＡＧ−ＢＲＰ及びＦＬＡＧ−ＡＲＰを、それぞれＭｒ ２１．５ ｋＤａ、及びＭｒ ２４．２ ｋＤａのバンドとしてはっきりと検出可能であった（図３５）。ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ ｐＣＥＰ４ｉｎｔトランスフェクションのシグナルは、１０μｌ、５μｌ、及び２μｌの添加量についてのＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ ｐＣＥＰ４トランスフェクションのシグナルよりもそれぞれ１．９Ｘ、２．８Ｘ、１６Ｘ高かった。これらの結果は、イントロンの存在がＡＲＰタンパク質の発現を高めることを示し、そしてこの結果、発現構築物内にイントロン又はゲノミック・クローンを含むことがこのタンパク質の製造の最良の方法である。
【０３４７】
実施例１２：ＡＲＰ−ＢＲＰヘテロ複合体形成の証明
方法１：ＡＰ検出によるＧＦＰの捕捉
Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ Ａｎｔｉ−ＧＦＰ ｓｔｒｉｐプレート（ｐｉｅｒｃｅ １５１８８）を３回、２００μｌのＰＢＳＴにより洗浄した。ＡＰ−ＡＲＰ＋ＢＲＰ−ＧＦＰ （同時トランスフェクション）、ＡＰ−ＢＲＰ＋ＡＲＰ−ＧＦＰ （同時トランスフェクション）、及びＡＰ対照（ｐＡＰｔａｇ５による単独プラスミド・トランスフェクション）をコードするプラスミドによるＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ一過性トランスフェクションからの培養上清を、ＰＢＳで１：２、１：６、及び１：１０希釈した。希釈していない、及び希釈した培養上清の二重の１００μｌアリコーとを、ウェルに入れ、室温で２０分間インキュベートした。２００μｌのＰＢＳＴによる４回の洗浄の後に、５０μｌの蒸留水を培養上清により処理したウェルに加えた。検量線のために、５０μｌの、連続的に希釈したＡＰタンパク質（３９０ ｎｇ／ｍｌから６．１ ｎｇ／ｍｌまでの２倍希釈）を不用なものが取り除かれたウェルに添加した。さらなる対照のために、５０μｌの、培養上清の（蒸留されたＨ２Ｏ中） １：１０の希釈物を、総ＡＰを計測するためにこの時点で空のウェルに添加した。１ウェルにつき５０μｌのＡＰアッセイ試薬Ａ（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ（登録商標） Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ， ＴＮ）を、試験サンプルとＡＰ標準に添加した添加した。プレートの側面を軽く叩き試薬を混ぜ、次に１０分間３７℃でインキュベートした。各々のウェルへの１００μｌの０．５ Ｎ ＮａＯＨの追加によって反応を止めた。４０５ ｎｍの吸光度をプレートリーダーにより測定した。代表的なアッセイの結果を表８に示す。
【０３４８】
【表８】
2004527214.tif 000010
【０３４９】
方法２．ＦＬＡＧ検出によるＧＦＰの捕捉
ＦＬＡＧ−ＢＲＰ＋ＡＲＰ−ＧＦＰ （同時トランスフェクション）、ＦＬＡＧ−ＡＲＰ＋ＢＲＰ−ＧＦＰ （同時トランスフェクション）、ＦＬＡＧ−ＢＲＰ（単独プラスミド）、ＡＲＰ−ＧＦＰ（単独プラスミド）をコードするプラスミドによるＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ一過性トランスフェクションからの培養上清、並びにＤＮＡ不含対照を、方法１に記載した手順によるＧＦＰ捕捉に使用した。捕捉ステップ及びＰＢＳＴ洗浄の後に、１００μｌの、（ＰＢＳＴ中）１：５００に希釈した抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ｆ３１６５）を、各々のウェルに添加し、室温で１時間、又は４℃で一晩インキュベートした。２００ μｌのＰＢＳＴによりウェルを４回洗浄し、次に１００ μｌの、ヤギ抗マウスＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ）−ＡＰコンジュゲート（Ｂｉｏ−Ｌａｄｓ Ｓ２３２４２５）の（ＰＢＳＴによる）１：２０００希釈物を各々に添加した。２００ μｌのＰＢＳＴによる５回の洗浄の後に、５０ μｌの蒸留水を各々のウェルに添加し、そして捕捉されたタンパク質を計測するためＡＰアッセイ試薬Ａを方法１に記載のとおり使用した。結果を表９に示す。
【０３５０】
【表９】
2004527214.tif 000011
【０３５１】
方法３．抗ＦＬＡＧ−モノクローナル抗体による免疫沈降及びＡＰの検出
ＡＰ−ＡＲＰ＋ＢＲＰ−ＧＦＰ （同時トランスフェクション）、ＡＰ−ＢＲＰ＋ＡＲＰ−ＧＦＰ （同時トランスフェクション）、ＡＰ−ＢＲＰ＋ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ （同時トランスフェクション）、及びＡＰ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ＋ＦＬＡＧ−ＢＲＰ（同時トランスフェクション）をコードするプラスミドによるＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ一過性トランスフェクションからの培養上清（最初と２回目の４８〜７２時間の収集の両方）を、免疫沈降実験のために使用した。各々の免疫沈降反応のために、５０ μｌのＭＰＧビーズ（ＣＰＧ Ｉｎｃ．）を、磁性セパレータを用いて１ミリリットルのＰＢＳＴにより３回洗浄した。最後の洗浄の後に、ビーズを１ ｍｌのＰＢＳＴ中に再懸濁した。これに５μｌの、抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｆ３１６５）の４ μｇ／μｌ溶液を添加した。この混合物を回転装置を用いて室温で２０分間インキュベートした。１ ｍｌのＰＢＳＴによる５回の洗浄の後に、ビーズを０．５ ｍｌ又は０．１ ｍｌの試験培養上清サンプル中に再懸濁し、そして各々に１ ｍｌの全容量までＰＢＳＴを添加した。回転装置を用いて、ＦＬＡＧタグしたタンパク質を４℃で一晩捕捉した。ＰＢＳＴによりビーズを５回洗浄し、そして５０ μｌの蒸留水中に再懸濁した。５０μｌのＡＰアッセイ試薬Ａと一緒にインキュベートし、そしてＮａＯＨによる反応停止を方法１に記載のとおり行った。この反応を止めた後に、各々のウェルから別々の試験管に１００ μｌのアリコートを回収し、４００μｌの蒸留水で希釈した。４０５ ｎｍの吸光度を分光光度計により計測した。結果を表１０に示す。
【０３５２】
【表１０】
2004527214.tif 000012
【０３５３】
まとめて考えると、結果は、ＢＲＰ及びＡＲＰ融合タンパク質がヘテロ複合体を形成するために相互作用することを示す。従って、前記タンパク質の天然型が特定の生理活性を持つヘテロ複合体を形成するとも考えられる。
【０３５４】
実施例１３：ＦＬＡＧ−ＢＲＰの小規模製造
発現プラスミドＦＬＡＧ−ＢＲＰｉｎ ｐＣＥＰ４により安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞を、成長培地を用いて４つのＴ−１７５フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ， Ｃａｔ＃３５３１１２）内に広げた。大体集密になったとき、この細胞をトリプシン（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ＃ ２５３００−０５４）処理し、溜めて、６３２０ ｃｍ２のｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｙ（Ｎｕｎｃ Ｃａｔ＃ｌ ６４３２７）の播種に使用した。それらが集密に達するまで成長培地を必要とされるときに細胞に供給し、達したとき、成長培地を産生培地（１ ｍｇ／ｌ インシュリン、１２．２４ ｍｇ／ｌのクエン酸酸化鉄、及び０．００６８ ｍｇ／１のセレンを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２）と交換した。産生培地を２〜３日ごとに取り除き、新鮮な産生培地（１５００〜２２５０ ｍｌ）と交換して、数ロットを産生した。各々のロットを、採取後直ちにＧｅｌｍａｎ ０．４５μｍ ｍｉｎｉ−ｃａｐｓｕｌｅフィルター（Ｇｅｌｍａｎ， Ｃａｔ＃ １２１２３）を通してろ過し、次にＮａｌｇｅｎｅ ＰＥＴＧ瓶（Ｃａｔ＃ ２０１９−０５００、及び２０１９−１０００）に入れて、−８０℃で保存した。
【０３５５】
実施例１４：ヒトＢＲＰホモ複合体の認識
２の小規模産生ロットからの未加工培養上清の濃縮の後に、抗ＦＬＡＧ−アガロース・アフィニティー・ゲル（Ｓｉｇｍａ， ＃Ａ−１２０５）を用いて、ＦＬＡＧ−ＢＲＰを約７５％の同一性まで免疫アフィニティー精製した。この精製タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びＳｃｈａｇｇｅｒ ａｎｄ ｖｏｎ Ｊａｇｏｗ （Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９８７ Ｎｏｖ ｌ；１６６（２）：３６８−７９）のＴｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝系を用いた抗ＦＬＡＧ特異的ウエスタンブロットにより分析した。図３６は、見かけ上の分子量に関して並べた銀染色したゲル、及び抗ＦＬＡＧウエスタンブロットの像を示す。７０℃で１０分間、沸騰で２分間、及び２％のβ−メルカプトエタノールの存在下、沸騰で２分間の処置前の条件を選択した、なぜならこれらの条件下、ＦＳＨがそれぞれヘテロダイマー、解離したヘテロダイマー、還元された解離したヘテロダイマーとして存在するので選んだ（銀染色されたゲルによるＦＳＨ比較を参照のこと）。
【０３５６】
銀染色による両ロットのＭｒ ３６ ｋＤａの還元感受性バンドの検出は、精製ＦＬＡＧ−ＢＲＰタンパク質の少なくとも１部が共有結合ホモダイマーとして存在することを示唆している。この３６ ｋＤａのバンドは、一過性発現系又は免疫アフィニティー精製法の人為的な影響ではなさそうである。
【０３５７】
実施例１４：ＡＲＰ／ＢＲＰのｉｎ ｓｉｔｕ組織化学
動物及び組織の準備
成熟した生後６０日のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用した。動物は食物と水を自由摂取させた。組織切片を公表された手順に従って準備した（Ｆｌａｎａｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ３２７ ｐ１９−３１）
ラット組織へのＡＰ−Ｂ５ＡＲＰ又はＡＰ−Ｂ５結合のｉｎ ｓｉｔｕ解析
切片を２回、１ＯｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．６、５ｍＭ ＭｇＣｌ２バッファーにより室温で５分間洗浄し、次にブロッキング・バッファー（１Ｏ ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．６、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２．５％のＢＳＡ）中、室温で１時間プレインキュベートした。次に、切片を以下の処置の１つと一緒にインキュベートした：
１．ｐＡＰｔａｇ５ （ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ）（ＡＰ）によりトランスフェクトした２９３細胞からの調整培地
２．ＡＰ−ＢＲＰ ｉｎ ｐＡＰｔａｇ５ （ＡＰ−ＢＲＰ）によりトランスフェクトした２９３細胞からの調整培地
３．ＡＰ−ＢＲＰ ｉｎ ｐＡＰｔａｇ５ （ＡＰ−ＢＲＰ）、及びＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ ｉｎ ｐＣＥＰ４（ＡＰ−ＢＲＰ／ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ）によりトランスフェクトした２９３細胞からの調整培地
４．ＡＰ−ＢＲＰ ｉｎ ｐＡＰｔａｇ５、及びＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ ｉｎ ｐＣＥＰ４により同時トランスフェクトした２９３細胞からの調整培地、さらにＨｉｓ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ ＋ＦＬＡＧ−ＢＲＰ（ＡＰ−ＢＲＰ／ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ＋ＦＬＡＧ−ＢＲＰ／Ｈｉｓ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ）により同時トランスフェクトした２９３細胞からの調整培地
５．ＡＰ−ＢＲＰ ｉｎ ｐＡＰｔａｇ５ （ＡＰ−ＢＲＰ）、さらに部分的に精製したＦＬＡＧ−ＢＲＰ （ＡＰ−ＢＲＰ＋ＦＬＡＧ−ＢＲＰ）によりトランスフェクトした２９３細胞からの調整培地。
【０３５８】
ＡＰタンパク質とのインキュベーションを、ブロッキング・バッファー中で、室温で一晩実施した。インキュベーションの後に、次に切片をそして冷ブロッキング・バッファーにより６回洗浄し、アセトン（６０％）及びホルムアルデヒド（３％）を含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ ７．５）中で、３０秒間固定した。次に、固定した切片を、ＨＳバッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．５）中、洗浄し、内因性のアルカリホスファターゼ活性を不活化するために６５℃で３０分間加熱した。ＨＳバッファーを完全に除去した後に、ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ ＡＰアッセイ試薬Ｓを用いてＡＰ活性について、この切片を染色し、細胞表面に結合したＡＰ活性を検出した。
【０３５９】
他の態様
本発明は、その詳細な説明に関連して説明されている一方で、この先の説明が説明を意図し、本発明の範囲を制限しないことは理解され、上記本発明の範囲は、添付の請求項の範囲によって定義される。他の側面、利点、及び修飾は、前記請求項の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明による新規ベータ関連タンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１、及び３）の描写である。
【図２】
本発明による新規ベータ関連タンパク質の翻訳されたアミノ酸配列（配列番号２、及び４）の描写である。
【図３】
本発明によるベータ関連タンパク質の推測されたシグナル配列の描写である（配列番号１０）。
【図４−１】
ゲノム・コード配列及び産物を含むジェンバンク登録番号：ＡＬ１１８５５５の部分の描写である。エクソンは太字である。
【図４−２】
図４−１の続きである。
【図４−３】
図４−１の続きである。
【図５】
ヒトＢＲＰポリペプチド配列（ベータ５とも呼ばれる；配列番号２）とＬＨβ（配列番号６）；ＦＳＨβ（配列番号７）；ＣＧβ（配列番号８）；ＴＳＨβ（配列番号９）のアラインメントである。
【図６】
他の糖タンパク質ホルモン・ベータ・サブユニットと比較した、ＢＲＰ配列の同一性（対角線の上方の％値）、及び類似性（対角線の下方の％値）を説明する。ＢＬＡＳＴを用いて分析し、そして（コア成熟配列の全域で生じる同一性及び類似性を示す（すなわち、ｃｙｓ９［ｈＣＧ番号付け］からｃｙｓ１００まで）。
【図７Ａ】
ＢＲＰ構造の描写モデルである。パネルＡは、シートベルト・ドメインの欠如を説明する。
【図７Ｂ】
ＢＲＰ構造の描写モデルである。パネルＢは、ｈＣＧ及びＦＳＨと比較したＢＲＰ上のグリコシル化の位置を説明する。
【図８】
ヒトのＢＲＰのＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性プロットを説明する。
【図９】
ヒトのＢＲＰのＨｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓ疎水性プロットを説明する。
【図１０】
本発明によるＢＲＰ−ｈＣＧ融合タンパク質を説明する。太字のアミノ酸は、ｈＣＧから誘導されたアミノ酸配列を示す。下線部のアミノ酸は、ＡＲＰ／ＢＲＰから誘導されたアミノ酸配列を示す。
【図１１】
本発明によるＢＲＰ−ｈＦＳＨ融合タンパク質を説明する。太字のアミノ酸は、ｈＦＳＨから誘導されたアミノ酸配列を示す。下線部のアミノ酸は、ＡＲＰ／ＢＲＰから誘導されたアミノ酸配列を示す。
【図１２−１】
本発明による新規アルファ関連タンパク質のヌクレオチド配列の描写である（配列番号１７、１９、及び２１）。
【図１２−２】
図１２−１の続きである。
【図１２−３】
図１２−１の続きである。
【図１２−４】
図１２−１の続きである。
【図１３】
本発明による新規アルファ関連タンパク質の翻訳されたアミノ酸配列（配列番号１８、２０、及び２２）の描写である。「＾」は成熟タンパク質の推測された開始部位を示す。
【図４】
第１１染色体の広げられたゲノム断片の描写である（ホモ・サピエンス染色体１１ｑ１３ＢＡＣ Ｃｌｏｎｅ ｂ７９ｇ１７、ジェンバンク登録番号ＡＣ０００１５９）；配列番号２３。
【図１５】
ヒトのＡＲＰポリペプチド配列（配列番号１８）とＦＳＨα（配列番号２６）、及びＦＳＨβ（配列番号２７）のアラインメントである。赤い文字は、ｈＦＳＨα又はｈＦＳＨβで見つかったｈＡＲＰ中の同一残基を示す。黄色は、システインを意味する。
【図１６】
ゲノム・コード配列及び翻訳産物を含むジェンバンク登録番号ＡＣ０００１５９ （ＡＲＰ）の部分の描写である。エクソンは、図字及び下線部であり、そしてポリアデニル化シグナルは下線部である。
【図１７】
ＡＲＰ ｍＲＮＡのノーザンブロット解析の描写である。
【図１８】
Ａｒｐ遺伝子発現の多組織発現（ＭＴＥ）ブロット解析の描写である。
【図１９】
（Ａ） ＢＲＰのオープンリーディングフレームを含むプラスミド構築物「ｈＢＲＰ ｉｎ ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ」の図面である。ＤＮＡ配列及びオープンリーディングフレームのアミノ酸翻訳は、（Ｂ）にも示される。
【図２０】
（Ａ）分泌シグナルペプチドを持たないＢＲＰオープンリーディングフレーム含むプラスミド構築物「ＢＲＰ−ＮＴＡＰ」の図面である。ＤＮＡ塩基配列及びオープンリーディングフレームのアミノ酸翻訳は、（Ｂ）にも示される。
【図２１】
（Ａ） ＡＰ−ＢＲＰ融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むプラスミド構築物「ＡＰ−ＢＲＰ ｉｎ ｐＡＰｔａｇ５」の図面である。ＡＰ及び（太字の）ＢＲＰの一部のＤＮＡ塩基配列及びアミノ酸翻訳は、（Ｂ）にも示される。
【図２２】
ＢＲＰ−ＧＦＰ融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むプラスミド構築物「ＢＲＰ−ＧＦＰ ｉｎ ｐｃＤＮＡ３．１」の図面である。
【図２３】
プラスミド「ＢＲＰ−ＧＦＰ ｉｎ ｐｃＤＮＡ３．１」にコードされたＢＲＰ−ＧＦＰ融合タンパク質のＤＮＡ配列及びアミノ酸翻訳の描写である。
【図２４】
（Ａ） ＦＬＡＧ−ＢＲＰ融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むプラスミド構築物「ＦＬＡＧ−ＢＲＰ ｉｎ ｐＦＬＡＧＣＭＶ−１」の図面である。前記オープンリーディングフレームのＤＮＡ配列及びアミノ酸翻訳は、（Ｂ）に示される。矢印は融合タンパク質の構成要素を示す。ＢＲＰのアミノ酸配列は太字である。
【図２５】
プラスミド構築物「ＦＬＡＧ− ＢＲＰ ｉｎ ｐＣＥＰ４」の図面である。
【図２６】
ＡＲＰオープンリーディングフレームを含むプラスミド構築物「ｐＢＳ−ＳＫＩＩｈＡＲＰ．４」の図面である。オープンリーディングフレームのＤＮＡ配列及びアミノ酸翻訳は、（Ｂ）にも示される。
【図２７】
ＡＲＰ−Ｌｅｕタンパク質のＤＮＡ配列と対応する翻訳の描写である。単一ヌクレオチド部位の相違はＡＲＰ−Ｐｈｅ形式が同一であることでもたらされる。
【図２８】
（Ａ） ＡＲＰ−Ｐｈｅタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むプラスミド構築物「ｐＢＳ−ＳＫＩＩ ｈＡＲＰ−Ｐｈｅ」の図面である。ＤＮＡ配列及びアミノ酸翻訳は、（Ｂ）にも示される。
【図２９】
ＡＲＰ−ＧＦＰ融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むプラスミド構築物「ｐＥＧＦＰ−Ｎ２−ＡＲＰ」の図面である。
【図３０】
プラスミド「ｐＥＧＦＰ−Ｎ２−ＡＲＰ」にコードされたＡＲＰ−ＧＦＰ融合タンパク質のＤＮＡ配列及びアミノ酸翻訳の描写である。
【図３１】
（Ａ） ＡＰ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むプラスミド構築物「ｐＡＰｔａｇ５ （ＲＩ） ＡＲＰ−Ｐｈｅ」の図面である。前記オープンリーディングフレームのＤＮＡ配列及びアミノ酸翻訳は、（Ｂ）に示される。 矢印は融合タンパク質の構成要素を示す。ＡＲＰのアミノ酸配列は太字である。
【図３２】
（Ａ）ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むプラスミド構築物「ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ ｉｎ ｐＣＥＰ４」の図面である。前記オープンリーディングフレームのＤＮＡ配列及びアミノ酸翻訳は、（Ｂ）に示される。矢印は融合タンパク質の構成要素を示す。ＡＲＰのアミノ酸配列は太字である。
【図３３】
プラスミド構築物「ＦＬＡＧ−ＡＲＰ ｉｎ ｐＣＥＰ４」の図面である。
【図３４】
分泌されたＡＲＰ−ＧＦＰ及びＢＲＰ−ＧＦＰ融合タンパク質のウエスタンブロット解析の描写である。
【図３５】
分泌されたＦＬＡＧ−ＢＲＰ及びＦＬＡＧ−ＡＲＰ融合タンパク質のウエスタンブロット解析の描写である。
【図３６】
精製されたＢＲＰタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット解析の描写である。
【図３７】
ＡＰ−ＢＲＰが精巣細胞に結合し、そしてＦＬＡＧ−ＢＲＰにより置き換えられうることを示すラット精巣の顕微鏡写真である。パネルａ）ＡＰ単独、ｂ）ＡＰ−ＢＲＰ、ｃ）ＡＰ−ＢＲＰと３９０ ｎＭのＦＬＡＧ−ＢＲＰ。
【図３８】
ＡＰ−ＢＲＰ＋ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ同時トランスフェクションからのＡＰタグを付けられたタンパク質が卵巣細胞（黄体）に結合し、そしてＦＬＡＧ−ＢＲＰ／Ｈｉｓ−ＡＲＰ−Ｐｈｅにより置き換えられることを示したラット卵巣の顕微鏡写真である。パネルａ）ＡＰ単独、ｂ）ＡＰ−ＢＲＰ＋ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ、ｃ）ＡＰ−ＢＲＰ＋ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−ＰｈｅとＦＬＡＧ−ＢＲＰ／Ｈｉｓ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ同時トランスフェクションからの培養上清。
【図３９】
ＡＰ−ＢＲＰ＋ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ同時トランスフェクションからのＡＰタグを付けられたタンパク質が卵巣細胞（濾胞）に結合し、そしてＦＬＡＧ−ＢＲＰ／Ｈｉｓ−ＡＲＰ−Ｐｈｅにより置き換えられることを示したラット卵巣の顕微鏡写真である。パネルａ）ＡＰ単独、ｂ）ＡＰ−ＢＲＰ＋ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ、ｃ）ＡＰ−ＢＲＰ＋ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−ＰｈｅとＦＬＡＧ−ＢＲＰ／Ｈｉｓ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ同時トランスフェクションからの培養上清。
【図４０】
ＡＰ−ＢＲＰ＋ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ同時トランスフェクションからのＡＰタグを付けられたタンパク質が精巣細胞に結合し、そしてＦＬＡＧ−ＢＲＰ／Ｈｉｓ−ＡＲＰ−Ｐｈｅにより置き換えられることを示したラット精巣の顕微鏡写真である。パネルａ）ＡＰ単独、ｂ）ＡＰ−ＢＲＰ＋ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ、ｃ）ＡＰ−ＢＲＰ＋ＦＬＡＧ−ＡＲＰ−ＰｈｅとＦＬＡＧ−ＢＲＰ／Ｈｉｓ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ同時トランスフェクションからの培養上清。
【図４１】
（Ａ） ６Ｈｉｓｇ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むプラスミド構築物「６Ｈｉｓｇ−ＡＲＰ−Ｐｈｅ−ｐＣＥＰ４ｉｎｔ」の図面である。前記オープンリーディングフレームのＤＮＡ配列及びアミノ酸翻訳は、（Ｂ）に示される。矢印は融合タンパク質の構成要素を示す。ＡＲＰのアミノ酸配列は太字である。
【図１】
2004527214.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
2004527214.tif 000021
【図７Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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