(57)【要約】本発明は、タンパク加水分解物であって、タンパク含有基質の加水分解により得ることができ、遊離アミノ酸及びペプチドを含み、タンパク加水分解物中に存在する少なくとも１種の遊離アミノ酸のモル分率が、遊離アミノ酸へと完全に加水分解された、同一タンパク含有基質の加水分解物におけるものに比し、少なくとも２．５倍、好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも３．５倍高く、タンパク加水分解物における少なくとも１種の遊離アミノ酸のモル分率が少なくとも２５％であり、かつ、タンパク加水分解物におけるアミノ酸指数（ＡＡＱ）が少なくとも１０％であることを特徴とするタンパク加水分解物に関する。これらのタンパク加水分解物は、食品の製造において使用することができ、これらのタンパク加水分解物により、新規で予期せぬフレーバーが提供される。更に、これらのタンパク加水分解物は、パーソナルケア用途に用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク加水分解物であって、
タンパク含有基質の酵素加水分解により得ることができ、
遊離アミノ酸及びペプチドを含み、
タンパク加水分解物中に存在する少なくとも１種の遊離アミノ酸のモル分率が、遊離アミノ酸へと完全に加水分解された同一タンパク含有基質の加水分解物におけるものに比し、少なくとも２．５倍、好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも３．５倍高く、
タンパク加水分解物における少なくとも１種の遊離アミノ酸のモル分率が少なくとも２５％であり、かつ、
タンパク加水分解物におけるアミノ酸指数（ＡＡＱ）が少なくとも１０％である
ことを特徴とするタンパク加水分解物。
【請求項２】
ＡＡＱが、１５〜５０％、好ましくは１５〜４０％、より好ましくは１０〜３０％である請求項１に記載のタンパク加水分解物。
【請求項３】
タンパク含有基質の加水分解が、酵素加水分解、好ましくはエンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼによる酵素加水分解である請求項１又は２に記載のタンパク加水分解物。
【請求項４】
少なくとも１種の遊離アミノ酸が、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ又はＴｈｙから選ばれ、好ましくは該アミノ酸が、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ又はＡｒｇから選ばれ、最も好ましくは該アミノ酸が、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ又はＡｒｇから選ばれる請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク加水分解物。
【請求項５】
濃縮液、ペースト、パウダー又は顆粒状形態にある請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク加水分解物。
【請求項６】
タンパク含有基質が、ホエータンパク、ヘモグロビン、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ライス、グルテン又は大豆タンパクから選ばれる請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク加水分解物。
【請求項７】
食品組成物の風味を改良できる請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク加水分解物。
【請求項８】
タンパク加水分解物を製造する方法であって、
水性条件下、５〜７５℃及びｐＨ３〜９で、タンパク含有基質を、エンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼにより加水分解し、それによりエンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼの組み合わせ作用で、タンパク含有基質から少なくとも１種の遊離アミノ酸を放出させる工程と、エンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼのインキュベーションを、タンパク加水分解物中に存在する少なくとも１種の遊離アミノ酸のモル分率が、遊離アミノ酸へと完全に加水分解された同一タンパク含有基質の加水分解物におけるものに比し、少なくとも２．５倍、好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも３．５倍高いタンパク加水分解物を得るのに適する時間行う工程を含み、
タンパク加水分解物における少なくとも１種の遊離アミノ酸のモル分率が少なくとも２５％であり、かつ、
タンパク加水分解物におけるアミノ酸指数（ＡＡＱ）が少なくとも１０％であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク加水分解物を含む食品組成物。
【請求項１０】
発酵食品、好ましくは以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかのものである請求項９に記載の食品組成物：
（ａ）チーズ、ここで、アミノ酸がＭｅｔである；
（ｂ）発酵ソーセージ、ここで、アミノ酸がＬｅｕ又はＰｈｅである；
（ｃ）ビール、ここで、アミノ酸がＬｅｕ、Ｖａｌ又はＩｌｅである；
（ｄ）ワイン、ここで、アミノ酸がＡｒｇ又はＬｅｕである；又は
（ｅ）ウイスキー、ここで、アミノ酸がＶａｌである。
【請求項１１】
反応フレーバーである請求項９に記載の食品組成物。
【請求項１２】
以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかであることを特徴とするタンパク加水分解物：
（ａ）遊離ロイシンのモル分率が少なくとも２５％であるか又は遊離リシンのモル分率が少なくとも２５％であるホエータンパク加水分解物；
（ｂ）遊離ロイシンのモル分率が少なくとも２５％であるトウモロコシタンパク加水分解物；
（ｃ）遊離アルギニンのモル分率が少なくとも２５％であるか又は遊離リシンのモル分率が少なくとも２５％である大豆タンパク加水分解物；
（ｄ）遊離Ｇｌｕのモル分率が少なくとも２５％であるＢＳＡタンパク加水分解物；又は
（ｅ）遊離ロイシンのモル分率が少なくとも２５％であるヘモグロビン加水分解物。
【請求項１３】
食品組成物を製造する際の、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク加水分解物の使用。
【請求項１４】
発酵タンパク加水分解物を製造する方法であって、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク加水分解物を、食品用微生物を用いて発酵させることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク加水分解物及び食品組成物（ｆｏｏｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）におけるそれらの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
種々の源からの加水分解タンパクが、食品工業界において幅広く使用されている。例えば、それらは、通常、脱水スープにおける成分として、フレーバーとして、及び、例えば、メイラード反応後の食品フレーバーを得るために他の加工食品中において使用される。それらは、また、種々の疾患及び代謝障害に罹患した患者用の栄養補助剤としての医薬用途が見い出されている。比較的新しい開発においては、それらが、医薬が不要な消費者、運動選手又は減量目的の者などのための製品において、又はパーソナルケア用途において使用されている。更に、現場で、加水分解タンパクは、発酵食品におけるフレーバーの開発において重要な役割を果している。後者においては、使用される微生物学的スタータ培地により、通常、原材料がアミノ酸へ加水分解される原因であるタンパク分解酵素が排出される。これらのアミノ酸の代謝的変化により、例えば、発酵乳製品（ｄａｉｒｙ ｐｒｏｄｕｃｔ）、例えばチーズ又はヨーグルト、種々のミート製品、ビール及びワインに特徴的な強力なフレーバー化合物及び揮発物が生じる。
【０００３】
従来のタンパク加水分解物は、タンパク源を過酷な化学的条件に付することにより製造されるが、そのような加水分解物を酵素加水分解により得ることに興味が集中してきている。化学的及び酵素的経路の双方とも、最大効率及び最低コストでタンパク源から高レベルのアミノ酸を放出させることを目的とする。このため、安価に入手可能なタンパク源、例えば、大豆ミール及び小麦グルテンが、加水分解を製造するために評判の良い基質である。可能な限り多くのアミノ酸を遊離するために、酵素的経路においては、数種のエンド−及びエキソ−プロテアーゼの複合混合物のいずれかを利用するか（例えばＷＯ ９４／２５５８０参照）、又は、エンドプロテアーゼを、単一であるが広範なスペクトルのエキソプロテアーゼと組み合わせる（ＷＯ−Ａ−９８／２７８２７）。全てのケースにおいて、その目的は、加水分解の程度を高くすること及び多様な遊離アミノ酸を含む最終製品を得ることである。
【０００４】
遊離アミノ酸自体により、多くの味影響がもたらされ、これらの味影響は、非常に基本的なもの（苦味、甘味、酸味及び”旨味”）であり、かつ、これらの味を感じるのに必要なアミノ酸濃度は高い。個々のアミノ酸の閾値は、０．３〜８０ミリモル／リットルであり得る。このような高い閾値にもかかわらず、遊離アミノ酸は、多くのメカニズムを介して非常に低い濃度範囲で主要知覚作用をもたらし得る。
これらのメカニズムの１つは、遊離グルタミン酸を包含し、強力な風味強化作用をもたらし得るが、これは、グルタミン酸と５’−リボヌクレオチドとの相互作用による。適切な濃度の５’−リボヌクレオチド、例えば５’−ＩＭＰ及び５’−ＧＭＰと組み合わせる場合、グルタミン酸により生じる旨味の検知閾値が、ほとんど２つのオーダー規模で低減されることが知られている。
【０００５】
他のフレーバー強化メカニズムは、メイラード反応を包含する。遊離アミノ酸と比較すると、遊離アミノ酸が糖と反応したメイラード反応生成物は、特により強い味及び香りの特徴を示す。メイラード反応においては、圧倒的に、その遊離アミノ酸について報告されているものより数オーダー規模で低減された閾値を有する複合フレーバー及び香り系が開発されているかもしれない。
メイラード反応生成物は、高温で、通常、食品製造の際の調理、焼成又はローストの間に形成される。これらの処理の間に、色及び一連の芳香（ａ ｌａｒｇｅ ａｒｒａｙ ｏｆ ａｒｏｍａｓ）の双方が発展する。これらの反応において、アミノ基が最初の工程として還元化合物と反応し、最終的に、反応経路の全系列へと進行する。食品に含まれるアミノ化合物は、主に、遊離アミノ酸及びタンパクであり、還元化合物は、主に、還元糖を意味する。メイラード反応に影響を及ぼす要因としては、含まれる糖及びアミノ酸のタイプ並びに物理的要因、例えばｐＨ、温度、水分活性（ａｗ）、反応時間などが挙げられる。
【０００６】
単糖及び二糖の双方がメイラード反応において機能し得る。一般には、アルドースはケトースより反応性が高く、ペントースはヘキソース又は二糖より反応性が高く、また、糖のタイプが生じるフレーバー化合物の量に大きく影響する一方、反応に包含されるアミノ酸は、形成されるフレーバーの性質を大きく左右するとされる。例えば、メイラード反応系に純粋なメチオニンが包含されることにより、植物性又はシチューノート（ｓｔｅｗｅｄ ｎｏｔｅ）がもたらされるケースが多く、純粋なシステインではミート様フレーバーがもたらされ、純粋なプロリン、ヒドロキシプロリン及びロイシンでは、ベーカリー芳香がもたらされる（Ｒ． Ｆ． Ｈｕｒｒｅｌｌ， Ｆｏｏｄ Ｆｌａｖｏｕｒｓ， Ｐａｒｔ Ａ： Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅｄｓ．： Ｉ． Ｄ． Ｍｏｒｔｏｎ ａｎｄ Ａ． Ｊ． Ｍａｃｌｅｏｄ）。これらの結果は、食品成分中に存在するような数種のアミノ酸の混合物よりむしろ純粋なアミノ酸を用いることにより得られるので、その結果が単に天然的状況の全体的単純化を示すのみであることが明らかである。同様に、食品中に天然的に存在する糖は、味及び芳香の開発に対し更に複雑化・影響する。
【０００７】
メイラード反応とは別に、アミノ酸は、また、周囲温度で重大な化学的変化を受け得る。後者のタイプの変化は、酵素依存性であり、発酵食品、例えばビール、ヨーグルト、チーズの熟成、及びミート及びワインの熟成工程において極めて一般的である。これらの発酵工程においては、遊離アミノ酸が、使用される原材料又は微生物学的スタータのいずれかからのタンパク分解酵素活性により使用される原材料から遊離される。熟成期間に、微生物学的代謝活性により、遊離アミノ酸は、感覚的特性が高められた誘導体へ転化される。例えば、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−バリンにより、ビール発酵の際に価値あるフーゼルアルコール、例えばアミルアルコール及びイソブタノールの形成が導かれる。Ｌ−ロイシンは、例えば３−メチルブタナール及び３−メチルブタノールなどの保存ミート（ｃｕｒｅｄ ｍｅａｔ）化合物用前駆物質として知られるが、Ｌ−フェニルアラニンによりベンズアセトアルデヒドが導かれ得る。同様に、チーズ揮発物、例えばメタンチオール及びジメチルジスルフィドが、チーズにおけるメチオニンの存在に由来し、及びメチルプロパン酸及びメチルプロパナールがバリンに由来することが分かった。従って、ワイン製造に使用され、おいしいワインを提供することが知られている”サーリー（ｓｕｒｌｉｅ）”法は、存在するアミノ酸、例えばアスパラギン酸、アルギニン、アラニン、ロイシン及びリシンの量の増加に基づく。
【０００８】
従来のタンパク加水分解法（ＷＯ ９４／２５５８０及びＷＯ ９８／２７８２７）では、全ての利用可能なアミノ酸を放出することを目的とし、そのように多くの異なるアミノ酸が存在すると、最終製品において所望の味又は芳香がぼやけたものとなるであろう。
ＷＯ ９８／１４５９９は、こうじ菌から得られる数種のポリペプチド、及び、これらのポリペプチドを（特異的又は特異的でない）エンドペプチダーゼ及び（特異的又は特異的でない）エキソペプチダーゼと組み合わせて製造される加水分解物に関するものである。ＷＯ ９８／１４５９９は、上昇した、例えば１．１倍高い含量のＬｅｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ及び／又はＰｒｏを有する加水分解物を記載するが、そのような加水分解物の使用を記載していない。
ＥＰ−Ａ−７９９５７７は、Ｐｈｅ（フェニルアラニン）含量が低減されたホエータンパク加水分解物を記載する。このホエータンパク加水分解物は、ＰＫＵ（フェニルケトン症）に罹患した患者用の食品として使用される。
フォークトら（Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５１ （１９９４） ｐｐ． ７−１４）は、種子タンパクのインビトロでのタンパク分解による、ココア特有の芳香前駆物質の製造を記載する。ココア特有の芳香前駆物質は、単に、１つの基質、ココアビシリン類グロブリンタンパクの特異的加水分解により得ることができる。
【０００９】
【発明の内容】
本発明によれば、所望のフレーバー作用が、本発明のタンパク加水分解物中の単一の所望の遊離アミノ酸のモル分率が、同一タンパク含有基質の酸加水分解により得られるものに比し、少なくとも２．５倍高い（濃縮係数）である場合に得ることができる。本発明により、そのようなタンパク加水分解物が、多くの場合、選択タンパク含有基質と、酵素との特定の組み合わせにより得られることが証明される。
【００１０】
本発明は、他のもののうち、タンパク加水分解物であって、
タンパク含有基質の酵素加水分解により得ることができ、
遊離アミノ酸及びペプチドを含み、
タンパク加水分解物中に存在する少なくとも１種の遊離アミノ酸のモル分率が、遊離アミノ酸へと完全に加水分解された同一タンパク含有基質の加水分解物におけるものに比し、少なくとも２．５倍、好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも３．５倍高く、従って、濃縮係数が、少なくとも２．５、好ましくは少なくとも３、より好ましくは３．５であり、
タンパク加水分解物における少なくとも１種の遊離アミノ酸のモル分率が少なくとも２５％であり、かつ、
タンパク加水分解物におけるアミノ酸指数（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｑｕｏｔｉｅｎｔ）（ＡＡＱ）が少なくとも１０％である
ことを特徴とするタンパク加水分解物を提供する。
【００１１】
本発明は、更に、本発明のタンパク加水分解物を含む食品組成物に関する。
本発明は、更に、タンパク加水分解物を製造する方法であって、
水性条件下、５〜７５℃及びｐＨ３〜９で、タンパク含有基質を、エンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼにより加水分解し、それによりエンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼの組み合わせ作用で、タンパク含有基質から少なくとも１種の遊離アミノ酸を放出させる工程と、エンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼのインキュベーションを、タンパク加水分解物中に存在する少なくとも１種の遊離アミノ酸のモル分率が、遊離アミノ酸へと完全に加水分解された同一タンパク含有基質の加水分解物におけるものに比し、少なくとも２．５倍、好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも３．５倍高いタンパク加水分解物を得るのに適する時間行う工程を含み、
タンパク加水分解物における少なくとも１種の遊離アミノ酸のモル分率が少なくとも２５％であり、かつ、
タンパク加水分解物におけるアミノ酸指数（ＡＡＱ）が少なくとも１０％であることを特徴とする方法に関する。
【００１２】
更に、本発明は、以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかであるタンパク加水分解物に関する：
（ａ）遊離ロイシンのモル分率が少なくとも２５％であるホエータンパク加水分解物又はトウモロコシタンパク加水分解物；
（ｂ）遊離リシンのモル分率が少なくとも２５％であるホエータンパク加水分解物；
（ｃ）遊離アルギニンのモル分率が少なくとも２５％である大豆タンパク加水分解物；
（ｄ）遊離リシンのモル分率が少なくとも２５％である大豆タンパク加水分解物；
（ｅ）遊離ロイシンのモル分率が少なくとも２５％であるヘモグロビン加水分解物；又は
（ｆ）遊離グルタミン酸のモル分率が少なくとも２５％であるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）加水分解物フラクション。
【００１３】
一般に、ＡＡＱは４０％未満であり、好ましくは、ＡＡＱは１５〜３０％である。一般に、少なくとも１種のアミノ酸のモル分率は８０％未満であり、好ましくは、このモル分率は２５〜５０％、より好ましくは２５〜４０％である。
好ましくは、タンパク含有基質の加水分解は、酵素加水分解、より好ましくはエンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼによる酵素加水分解である。
本発明のタンパク加水分解物を含む食品組成物は、例えば、発酵、加工、調理及び／又は還元糖との反応後に、改良された風味を示すことを見い出した。
組成物中のある遊離アミノ酸のモル分率は、その遊離アミノ酸の組成物中におけるモル濃度を、その同一組成物中における全ての遊離アミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン及びバリン）のモル濃度の合計で割った値×１００％としたものとして定義する。本願明細書において合計又は全てのアミノ酸とは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン及びバリンの合計を意味する。
【００１４】
酵素加水分解された組成物中におけるある遊離アミノ酸のモル分率及びタンパク含有基質を完全に加水分解することにより得た組成物中におけるある遊離アミノ酸のモル分率の測定は、材料及び方法の項で記載する。
更に、酵素加水分解の間に遊離される、遊離Ｇｌｎ及びＧｌｕ、及び、遊離Ａｓｎ及びＡｓｐのそれぞれの量の合計は、強酸での完全な加水分解後に得られる遊離Ｇｌｕ及びＡｓｐの量に匹敵するものとして取り扱った（酸加水分解によりＧｌｎ及びＡｓｎ残留物が脱アミド化され、”更なる”遊離Ｇｌｕ及び遊離Ａｓｐが生じる）。一般に、Ｇｌｕ及びＧｌｎについては、Ｇｌｕ及びＧｌｎのモル分率の合計が、遊離アミノ酸に完全に加水分解された同一タンパク含有基質の加水分解物におけるＧｌｕ及びＧｌｎのモル分率の合計に比し、少なくとも２．５倍（濃縮係数）、好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも３．５倍高い。遊離アミノ酸の濃縮係数は、タンパク加水分解物中に存在する遊離アミノ酸のモル分率を、遊離アミノ酸に完全に加水分解されたタンパク加水分解物中に存在する遊離アミノ酸のモル分率で割った値を意味する。Ｇｌｕ／Ｇｌｎ比が知られている場合、例えば、単一鎖タンパクのケース（実施例８参照）においては、Ｇｌｕ及びＧｌｎは別々に計算することができる。Ａｓｐ及びＡｓｎについては、Ａｓｐ及びＡｓｎのモル分率の合計は、タンパク含有基質を遊離アミノ酸へ完全に加水分解した同一タンパク含有基質の加水分解物中におけるＡｓｐ及びＡｓｎのモル分率の合計に比し、少なくとも２．５倍、好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも３．５倍高い。本発明において、用語”遊離アミノ酸へ完全に加水分解”又は”タンパク含有基質を遊離アミノ酸へ完全に加水分解”とは、ウォーターズ（米国のミルフォードＭＡ）の方法に従って行った、タンパク含有基質の酸加水分解を意味し、その方法は、材料及び方法の項に記載する。
【００１５】
本発明のタンパク加水分解物は、ある遊離アミノ酸が比較的高いモル分率で存在することにより特徴付けられる。従って、これらのタンパク加水分解物の全体的加水分解の程度は依然として制限される。本願明細書において、アミノ酸指数（ＡＡＱ）は、加水分解の程度を測定するために使用する。ＡＡＱは、タンパク含有基質を遊離アミノ酸へ完全に加水分解することにより得られた加水分解物中に存在するアミノ酸の全量に対する、タンパク含有基質を酵素加水分解することにより得られた加水分解物中に存在する遊離アミノ酸の全量である。ＡＡＱは、パーセントで表す。ＡＡＱは、加水分解物中に存在する全ての遊離アミノ酸のモル濃度の合計値を、タンパク含有基質を遊離アミノ酸へ完全に加水分解した時の加水分解物中に存在する全てのアミノ酸のモル濃度の合計値で割ることにより計算することができる（×１００％）。本発明のタンパク加水分解物は、ＡＡＱが１０〜５０％であってもよく、好ましくは１０〜４０％である。
【００１６】
好ましいアミノ酸は、所望の、食品適合性フレーバー（味及び芳香）化合物を生じ得るアミノ酸である。例えば、適切な糖グリシンを用いる加熱によりビーフブロス様フレーバー性質が生じ、ロイシンではチョコレート又はパンの皮様フレーバー性質が生じ、フェニルアラニンではチョコレート又はキャラメル様フレーバー性質が生じ、かつ、リシンではポテト又はボイルしたミート様フレーバー性質が生じ得ることが知られている。
本発明の特定のアミノ酸又は一連のアミノ酸が濃縮されたタンパク加水分解物は、選択された糖との組み合わせで使用することにより、特定のフレーバー性質を食品又は食品成分に付与し得る。この特定のフレーバー性質は、パン、特にその皮の焼成の間に生じるように、食品製造の際の調理、焼成又はロースト工程で生じ得る（ここで、本発明のタンパク加水分解物は、ドウ又はドウ上に添加している）。しかしながら、タンパク加水分解物及び適切な糖が、また、前反応（他の食品成分の不在下）することにより、適切なフレーバー成分を得ることができる。
【００１７】
微生物の作用による遊離アミノ酸のフレーバー化合物への転化は、メイラード反応を含む転化より報告が非常に少ない。多くのアミノ酸が、発酵製品、例えばチーズ、発酵ソーセージ及びビールなどの芳香発生を指摘されているが、疎水性アミノ酸、例えばバリン、ロイシン、イソロイシン及びフェニルアラニン並びに硫黄含有アミノ酸、例えばメチオニンが、特に重要であることが知られている。ワインの熟成には、高レベルの遊離アルギニン、リシン及びアラニンが特に著しい。
特に、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ及びＬｙｓは、適切な糖を用いて加熱すると、所望のフレーバー化合物を提供することが知られる化合物である。更に、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ及びＡｌａは、適切な微生物による発酵の際に、フレーバー化合物に良好に転化され得るアミノ酸として知られる。本発明の好ましい態様においては、遊離アミノ酸が、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ又はＴｈｙから選ばれ、より好ましくは該アミノ酸が、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ又はＡｒｇから選ばれ、最も好ましくは該アミノ酸が、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ又はＡｒｇから選ばれる。
【００１８】
本発明に従って使用可能なタンパク含有基質は、ヒト又は動物の消費に適切なタンパク含有材料である。好ましくは、タンパク含有材料のタンパク含量は、実在的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ）なものであり、それは、少なくとも２０％ｗ／ｗがタンパクであることを意味する。好ましくは、タンパク含有基質は、質量／乾燥質量をベースとして、少なくとも４０％のタンパク、より好ましくは少なくとも５０％のタンパク、最も好ましくは少なくとも７０％のタンパクを含有する。
本発明に従って使用可能なタンパク含有基質の例としては、大豆タンパク、小麦グルテン、ナタネタンパク、エンドウ豆タンパク、アルファルファタンパク、ヒマワリタンパク、豆科マメタンパク、ワタ又はゴマタンパク、トウモロコシタンパク、大麦タンパク、モロコシタンパク、ポテトタンパク、ライスタンパク、コーヒータンパク、動物由来タンパク、例えば乳タンパク（例えばカゼイン、ホエータンパク）、卵白、魚タンパク、ミートタンパク（ゼラチン、コラーゲンを含む）、血液タンパク（例えばヘモグロビン）、毛髪、羽毛及びフィッシュミールが挙げられる。好ましいタンパク含有基質としては、ホエータンパク、ヘモグロビン、ゼラチン、カゼイン、トウモロコシタンパク、大豆タンパク及びグルテンが挙げられる。
【００１９】
本発明のタンパク加水分解物は、特定のアミノ酸が選択的に濃縮されているので、関連最終製品（食品組成物）の通常の成分に属するタンパク含有基質が好ましいことが明らかである。特定のアミノ酸が例外的に濃縮された更なるタンパク含有基質は、タンパク加水分解物用の源として好ましい。後者のタンパク含有基質の典型例は、ホエータンパク（Ｌｅｕ及びＬｙｓが濃縮）、小麦グルテン（Ｇｌｎ及びＰｒｏが濃縮）、化学的脱アミド化された小麦グルテン（Ｇｌｕ及びＰｒｏが濃縮）、トウモロコシタンパク（Ｌｅｕ及びＰｒｏが濃縮）、ヘモグロビン（Ｌｅｕ、Ｈｉｓ及びＶａｌが濃縮）、フィッシュ濃縮物又はカゼイン（Ｍｅｔ及びＬｙｓが濃縮）、ピーナッツ（Ａｒｇが濃縮）、ライスプロテイン（Ｐｈｅ及びＡｒｇが濃縮）、及び、例えば、トリプトファンが濃縮されたホエーのβ−ラクトアルブミン（ｌａｃｔａｂｕｍｉｎｅ）フラクションとしてのタンパクフラクションである。得られるタンパク加水分解物は、食品用フレーバーを提供することができ、及び好ましくは、これらのフレーバーは、タンパク含有基質に関連しない。例えば、ココアタンパク加水分解物は、ココアフレーバーを提供し得ると予想されるが、ホエー又はライスタンパク加水分解物がココアフレーバーを提供し得ることは予想されない。好ましくは、本発明のタンパク加水分解物は、タンパク含有基質源に関連しない新規かつ予期せぬフレーバーを提供する。例えば、ホエータンパク加水分解物は、ホエータンパクフレーバーの代わりに、例えば、ミート、チーズ又はココアフレーバーを提供する。
【００２０】
本発明のタンパク加水分解物は、タンパク含有基質を、適切なエンド−プロテアーゼ及びエキソプロテアーゼを用いて加水分解することにより得ることができる。従来の酵素タンパク加水分解方法（ＷＯ ９４／２５５８０； ＷＯ ９８／２７８２７）では、典型的に、広範な特異性を有する数種のエンド及びエキソプロテアーゼの粗混合物を使用するが、本発明の加水分解方法では、エンド及びエキソプロテアーゼの組み合わせ選択を慎重に行う必要がある。タンパク含有基質の酸加水分解物に比し、あるアミノ酸が少なくとも２．５倍濃縮されたタンパク加水分解物を、タンパク含有基質の酵素加水分解により生じるのに適するエンド及びエキソプロテアーゼは、好ましくは、ある又は選択された一連のアミノ酸残留物の近隣での開裂の優先性を有する。更に、タンパク含有基質の酸加水分解物に比し、あるアミノ酸が少なくとも２．５倍濃縮されたタンパク加水分解物を、タンパク含有基質の酵素加水分解により生じるのに適切なエンド及びエキソプロテアーゼの双方は、好ましくは純粋なものであり、それは、エンド及び／又はエキソプロテアーゼが、主に、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％及び最も好ましくは少なくとも９５％の単一のタンパク分解活性を有することを意味する。エキソペプチダーゼの選択性の程度に依存して、純粋な又はより低純度のエンドプロテアーゼが必要とされる。エンドプロテアーゼの選択性の程度に依存して、純粋な又はより低純度のエキソプロテアーゼが必要とされる。エンド及びエキソプロテアーゼの選択性は、所望のタンパク加水分解物が得られるように少なくともオーバーラップすべきである。例えば、同一タンパク含有基質の酸加水分解物に比し、遊離アミノ酸ロイシンが少なくとも２．５倍多いタンパク加水分解物を得るためには、ロイシンに対して幾らかの選択性を有するエンド及びエキソプロテアーゼが必要とされる。高純度のプロテアーゼは、例えば、粗タンパク分解酵素生成物の精製により、又は、過剰産生の組換えＤＮＡ株を用いて酵素を製造することにより得ることができる。本発明において適切なプロテアーゼは、好ましくは、食品用途に利用可能な商業的なもの及び／又は組換体である。タンパク分解活性をコードする遺伝子を、この遺伝子を過剰発現する宿主生物体においてクローニングする、ｒＤＮＡ−技術を用いて製造されるプロテアーゼは、通常、酵素活性の汚染が低い酵素生成物を提供し、従って、高価な回復工程を必要としない場合がある。クローニング遺伝子を過剰発現する宿主生物体としては、酵母、菌類又はバクテリア（例えばサッカロミセス、クライベロミセス、アスペルギウス、トリコデルマ、大腸菌、バチラスなど）がよく知られている。
【００２１】
本発明に従ってタンパク加水分解物を得るために、タンパク含有基質を、エンド及びエキソプロテアーゼの組み合わせを用いて加水分解することができ、ここで、エンド及びエキソプロテアーゼの少なくとも１つ、好ましくはエンド及びエキソプロテアーゼの双方が、純粋で、特定の一連のアミノ酸に対して選択的なものであり、又は、アミノ酸を優先的に放出するが、これらのアミノ酸は、タンパク加水分解物中において濃縮されていることが意図されたものである。
適切なエンドプロテアーゼは、動物、植物又は微生物由来のものであってもよい。これらのものとしては、組換え型酵素、例えば、遺伝子工学的技術により得られる酵素が挙げられる。あるアミノ酸の近隣を優先的に開裂する、好ましい選択的エンドプロテアーゼとしては、トリプシン（ＥＣ ３．４．２１．４）、エラスターゼ（ＥＣ ３．４．２１．３６）、キモトリプシン（ＥＣ ３．４．２１．１）、サーモリシン（ＥＣ ３．４．２４．２７）、プロリルオリゴペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．２１．２６）、グルタミルエンドペプチダーゼＩ（ＥＣ ３．４．２１．１９）、微生物コラゲナーゼ（ＥＣ ３．４．２４．３）、ペプチジル−Ａｓｐメタロペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．２４．３３）、グリシルエンドペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．２２．２５）、サッカロリシン（ＥＣ ３．４．２４．３７）、中性プロテアーゼ（ＥＣ ３．４．２４．２８）、ストレプトグリシンＢ（ＥＣ ３．４．２１．８１）、グルタミルエンドペプチダーゼＩＩ（ＥＣ ３．４．２１．８２）、加工プロリン特異性ペチジル−プロリルシス−トランスのイソメラーゼ、及びレンネット様特異性、例えばミクロビアルレンネットを有する酵素、例えばケカビ属ペプシン（ＥＣ ３．４．２３．２３）が挙げられる。特定のアミノ酸の近隣の開裂についての優先性が強くはないが、選択された群のアミノ酸のほぼ近隣を開裂する、好ましい非選択的エンドプロテアーゼとしては、例えばサブチリシン（ＥＣ ３．４．２１．１４）及びパパイン（ＥＣ ３．４．２２．２）が挙げられる。
【００２２】
適切なエキソペプチダーゼ（又はエキソプロテアーゼ、その用語は可換である）は、カルボキシペプチダーゼ及び／又はアミノペプチダーゼを含み得る。これらの細胞外酵素は、動物、植物又は微生物材料に由来するものであってもよい。それらのものとしては、組換え型酵素、例えば遺伝子工学的技術により得られるものが挙げられる。
あるアミノ酸の近隣を優先的に開裂する、好ましい選択的カルボキシペプチダーゼとしては、Ａ．ニガー由来のカルボキシペプチダーゼＢ（ＥＣ ３．４．１７．２）、ＣＰＤ−Ｉ（ｐｅｐ Ｇ）及びＣＰＤ−ＩＩ（ｐｅｐ Ｆ）が挙げられる（ダル　デガンらのＡｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ５８（７）： ２１４４−２１５２， １９９２）。
あるアミノ酸の近隣を開裂する優先性は強くないが、いずれかのアミノ酸残基の近隣をほとんど開裂する、好ましい非選択的カルボキシペプチダーゼとしては、Ｐ． ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ由来のＣＰＤ−Ｓ１及びＳ． ｃｅｒｅｖｉｓａｅ由来のＣＰＤ−Ｙが挙げられる（ダル　デガンらのＡｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ， ５８（７）： ２１４４−２１５２， １９９２）。
あるアミノ酸の近隣を優先的に開裂する、好ましい選択的アミノペプチダーゼとしては、プロリルイミノペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．１１．５）、アエロモナスプロテオリティカ（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａ）由来の微生物ロイシルアミノペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．１１．１０）又はアスペルギルス由来のロイシルアミノペプチダーゼ、及びＥＰ ７７３９９０に記載されたようなメチオニルアミノペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．１１．１８）及びフェニルアラニン特異性アミノペプチダーゼが挙げられる。
【００２３】
あるアミノ酸の近隣を開裂する優先性が強くないが、いずれかのアミノ酸の近隣をほとんど開裂する、好ましい非選択的アミノペプチダーゼとしては、好熱アミノペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．１１．１２）が挙げられる。
エンド及びエキソプロテアーゼの好ましい組み合わせとしては以下のものが挙げられる：
（ａ）ストレプトグリシンＢ又はトリプシン又はパパインエンドプロテアーゼとＣＰＤ ＩＩ（Ａｒｇ又はＬｙｓ放出用）；
（ｂ）キモトリプシン又はサーモリシン又は中性プロテアーゼとＣＰＤ Ｉ（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ又はＴｒｐ放出用）；
（ｃ）サーモリシン又は中性プロテアーゼと微生物ロイシルアミノペプチダーゼ又はアスペルギルス由来のロイシルアミノペプチダーゼ（Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ又はＶａｌ放出用）；
（ｄ）中性プロテアーゼ又はサブチリシンとＣＰＤ Ｉ（Ｐｈｅ又はＡｌａ放出用）；
（ｅ）エラスターゼとＣＰＤ Ｉ（Ａｌａ放出用）；
（ｆ）レンネット様プロテアーゼとアスペルギルス由来のロイシルアミノペプチダーゼ又はメチオニルアミノペプチダーゼ（Ｍｅｔ放出用）；
（ｇ）工学的プロリン特異性ペプチジル−プロリルシス−トランスのイソメラーゼ（シプロアーゼ（ｃｙｐｒｏａｓｅ））とプロリルアミノペプチダーゼ（Ｐｒｏ放出用）；
（ｈ）プロリン特異性エンドプロテアーゼと麦芽酵素又はＣＰＤ−Ｙ（Ｐｒｏ放出用）；及び
（ｉ）グルタミルエンドペプチダーゼとＣＰＤ−Ｉ（Ｇｌｕ放出用）。
【００２４】
最も濃縮された状態でアミノ酸を有し、かつ、最適な味を有するタンパク加水分解物を得るためには、エンド及びエキソプロテアーゼの好ましい組み合わせを、適切な又は選択されたタンパク含有基質と組み合わせるのがよい。好ましい選択的酵素の組み合わせを、１種又は２種以上の所望のアミノ酸が比較的濃縮されたタンパク含有基質と共にインキュベートすることにより、好ましい酵素と基質の組み合わせが確立され得る。
濃縮されたタンパク加水分解物を得るのに好ましい酵素と基質の組み合わせとしては、以下のものが挙げられる：
（ａ）ホエータンパクとトリプシン又はパパイン及びカルボキシペプチダーゼＣＰＤ ＩＩ（Ｌｙｓ又はＡｒｇ濃縮）、又はホエータンパクとサーモリシン及びアエロモナスプロテオリティカアミノペプチダーゼ又は他のロイシルアミノペプチダーゼ（Ｌｅｕ濃縮）；
（ｂ）トウモロコシタンパクとサーモリシン及びロイシルアミノペプチダーゼ（Ｌｅｕ濃縮）；
（ｃ）ライスタンパクとサーモリシン及びアスペルギルス由来のロイシルアミノペプチダーゼ（Ｐｈｅ及びＬｅｕ放出用）；
（ｄ）グルテンと工学的プロリン特異性ペプチジル−プロリルシス−トランスのイソメラーゼ（シプロアーゼ）及びプロリルアミノペプチダーゼ（Ｐｒｏ放出用）；
（ｅ）コーンタンパクとサーモリシン及びロイシンアミノペプチダーゼ（Ｌｅｕ濃縮）；
（ｆ）大豆タンパク単離物とトリプシン又はパパイン及びカルボキシペプチダーゼＣＰＤ ＩＩ（Ａｒｇ及びＬｙｓ濃縮）；
（ｇ）ＢＳＡとグルタミルエンドペプチダーゼ及びＣＰＤ−Ｉ（Ｇｌｕ放出用）；及び
（ｈ）ヘモグロビンとサーモリシン及びロイシルアミノペプチダーゼ（Ｌｅｕ濃縮）。
【００２５】
基質及び酵素（エンド及びエキソプロテアーゼ）の組み合わせにより、例えば、以下のタンパク加水分解物が生じ得る：
−ホエータンパク加水分解物であって、遊離ロイシンのモル分率が少なくとも２５％、好ましくは少なくとも２７％、より好ましくは少なくとも３０％であり、又は、遊離リシンのモル分率が好ましくは少なくとも２５％、好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％のもの；
−コーンタンパク加水分解物であって、遊離ロイシンのモル分率が少なくとも２５％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも３５％であるもの；
−大豆タンパク加水分解物であって、遊離アルギニンのモル分率が少なくとも２５％、好ましくは少なくとも３０％であり、又は、遊離リシンのモル分率が少なくとも２５％であるもの；
−ＢＳＡ加水分解物であって、遊離グルタミン酸のモル分率が少なくとも２５％のもの；及び
−ヘモグロビン加水分解物であって、遊離ロイシンのモル分率が少なくとも２５％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも３５％のもの。
【００２６】
本発明のタンパク加水分解物は、タンパク含有基質と適切な酵素、エンド及びエキソプロテアーゼとを、タンパク加水分解に適するｐＨ及び温度条件下でインキュベートすることにより製造することができる。適切なｐＨ及び温度は、プロテアーゼの最適条件に依存し、それは、ｐＨ約３〜９、温度約５〜７５℃で変動し得る。例外的にこれらの範囲外の条件が酵素にとって最適であるかもしれない。
タンパク加水分解のための酵素及び条件は、本発明の所望のタンパク加水分解物が得られるように選択する。例えば、ロイシンが濃縮されたホエータンパク加水分解物を得ることが望まれる場合、ホエータンパク基質を選択し、ロイシン特異性エンド及びエキソプロテアーゼを用いて、該エンド及びエキソプロテアーゼがホエータンパクからロイシンを特異的に放出するのに適する条件下で加水分解する。例えば、ホエーの加水分解を、５時間、サーモリシン及びアエロモナスプロテオリティカロイシルアミノペプチダーゼを用いて、ｐＨ８、４０℃で行って、ホエータンパク加水分解物を得るが、該タンパク加水分解物中に存在する遊離ロイシンのモル分率は、遊離アミノ酸に完全に加水分解された同一ホエータンパク基質の加水分解物におけるものに比し、少なくとも２．５倍高い。遊離アミノ酸に完全に加水分解されたホエータンパク加水分解物との比較のために、ホエータンパクをウォーターズに従って酸加水分解する（米国のミルフォードＭＡ； 材料及び方法の項を参照）。
【００２７】
本発明のタンパク加水分解物を得るために、タンパク含有基質を水に添加して、水性サスペンションを得る。タンパク含有基質は、乾燥質量のタンパク含有基質／全質量のサスペンションをベースとして、１〜１８％、好ましくは３〜１５％、より好ましくは５〜１３％の量で添加することができる。その量は、タンパク含有基質の水中への溶解性に依存し得る。エンド及びエキソプロテアーゼは、タンパク含有基質が添加される水中に予め存在していてもよく、又はエンド及びエキソプロテアーゼを、タンパク含有基質の水性サスペンションの製造後に添加してもよい。タンパク含有基質、エンド及びエキソプロテアーゼは、一緒にインキュベートすることができ、又は、エキソプロテアーゼを、タンパク含有基質とエンドプロテアーゼのインキュベーション後にインキュベートしてもよく、ここで、場合により、エンドプロテアーゼは、エキソプロテアーゼのインキュベーションの開始前に不活性化されていてもよい。温度及びｐＨなどの条件は、好ましくは、酵素を水又はサスペンションに添加する前に合わせる。一度酵素（エンド及びエキソプロテアーゼ）及びタンパク含有基質が直接接触すると、タンパク加水分解が開始する。タンパク加水分解の間、ｐＨは、一定のｐＨに制御してもしなくてもよい。ｐＨを一定に制御する場合（又はｐＨを所定の範囲内に保つ場合）、そのｐＨは、例えば、食品適合性の酸又はアルカリのいずれかを添加することにより調節することができる。例えば、水酸加水分解ナトリウム又はカリウムを、食品適合性アルカリとして使用することができ、また、塩酸を食品適合性酸として使用することができる。
【００２８】
所望のタンパク加水分解物が水性サスペンション中に生じたら、好ましくは、タンパク加水分解を、存在する酵素を不活性化することにより停止する。不活性化は、ｐＨを低下させて５未満とするか又はｐＨを上昇させて８より高くし、併せて、サスペンションを加熱して少なくとも７０℃より高く、好ましくは少なくとも９０℃とすることにより行うことができる。例外的に、この範囲外の条件が、プロテアーゼの不活性化に必要とされるかもしれない。しかしながら、不活性化は、水性サスペンション中に存在するアミノ酸及びペプチドに影響しないものとすべきである。当該技術分野における当業者は、プロテアーゼを不活性化する最適条件を選択することができる。
【００２９】
本発明のタンパク加水分解物を含む水性サスペンションは、好ましくは、例えば、パウダー又はペースト形態のタンパク濃縮物を得るために、更に処理されるであろう。タンパク加水分解物を含む水性サスペンションは、例えば、遠心分離し、及び／又は（限外）ろ過し、次いで、例えば蒸発により濃縮し、及び場合によりいずれかの都合の良い方法で乾燥、例えばスプレードライ、凍結乾燥、流動乾燥処理、又はこれらの方法の組み合わせ処理してもよい。当該技術分野における当業者は、選択される方法が、生成物の配合（及びその更なる使用）に依存するであろうことを理解するであろう。例えば、タンパク加水分解物を特定の糖と組み合わせて、加熱により特定の反応生成物を得ることが意図される場合、タンパク加水分解物は、不本意な（不十分な）メイラード反応をもたらすであろう過酷な条件には付されないであろう。タンパク加水分解物を食品発酵工程に使用することが意図される場合、タンパク加水分解物の回収のための条件は、発酵により所望のフレーバーを生じるであろう遊離アミノ酸に影響を及ぼさないものとすべきである。最終タンパク加水分解物製品は、好ましくは、濃縮形態、例えば濃縮液体、ペースト、パウダー又は顆粒状物で配合される。濃縮製品は、少なくとも２０％の乾燥材料（乾燥材料の質量／全質量）、好ましくは少なくとも３０％の乾燥材料（乾燥材料の質量／全質量）、より好ましくは少なくとも４０％の乾燥材料（乾燥材料の質量／全質量）を含む。顆粒状物又はパウダーは、少なくとも８０％の乾燥材料（乾燥材料の質量／全質量）、好ましくは少なくとも９０％の乾燥材料（乾燥材料の質量／全質量）を含む。
【００３０】
あるいはまた、タンパク加水分解物を含む、タンパク加水分解後に得られる水性サスペンションを、反応フレーバー又は発酵フレーバーの製造に直接使用してもよい。例えば、反応フレーバーの製造においては、例えば、遠心分離又は濃縮後の、タンパク加水分解物を含む水性サスペンションに糖を補って、その後加熱してもよい。反応後、反応フレーバー組成物を、例えば、加熱製品の濃縮及び／又は乾燥により得ることができる。発酵フレーバーの製造においては、遠心分離又は濃縮後の、タンパク加水分解物を含む水性サスペンションを、食品用微生物と共に、該微生物がタンパク加水分解物を発酵するのに適する条件下でインキュベートしてもよい。発酵後、発酵フレーバーを、例えば、発酵製品の濃縮及び／又は乾燥により得ることができる。
【００３１】
エンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼを用いるタンパク含有基質の酵素加水分解後に得られる遊離アミノ酸及びペプチドを含むタンパク加水分解物であって、その中に存在する少なくとも１種の遊離アミノ酸のモル分率が、遊離アミノ酸に完全に加水分解された同一タンパク含有基質の加水分解物におけるものに比し、少なくとも２．５倍、好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも３．５倍高いものは、食品を含む数種の用途に用いることができる。本発明のタンパク加水分解物は、例えば、毛髪及び皮膚を処理するための化粧品中に使用することができ、又は、耐久力（ｐｈｙｓｉｃａｌ ｅｎｄｕｒａｎｃｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ）強化のためのスポーツドリンクに添加することができる。特に、本発明のタンパク加水分解物は、食品、発酵食品及び発酵食品フレーバーの製造において用いるのに適しており、また、反応フレーバー組成物の製造において用いるのに適しており、該反応フレーバー組成物は、タンパク加水分解物が糖と反応して得られる。注目すべき及び顕著なフレーバー特性は、本発明のタンパク加水分解物を上記食品製造において使用した際に得ることができる。本発明のタンパク加水分解物は、好ましくは、食品の風味を改善することができる。
【００３２】
本発明のタンパク加水分解物は、上述したような発酵食品成分又は製品の製造において使用することができる。発酵食品成分又は製品は、少なくとも１つの発酵工程により製造され、そこでは、処理される食品に内生的な酵素を活性的に入れ込むか又は食品用微生物を食品と共にインキュベートして発酵食品を得る。発酵食品の例は、例えば、ミート製品、例えばハム又はソーセージ、ヨーグルト、チーズ、ビール、ウイスキー、ワイン及びシャンパンである。発酵食品フレーバーは、発酵食品から得られるフレーバーである。これらの発酵食品フレーバーは、本発明のタンパク加水分解物を食品用微生物と共にインキュベートし、それにより、タンパク加水分解物を発酵させて、所望のフレーバーとすることにより得ることができる。
本発明のタンパク加水分解物を用いて発酵食品を製造する方法は、発酵食品の発酵前又はその間にタンパク加水分解物を添加する工程を包含するであろう。製品の内生的酵素又は発酵微生物により、特定のアミノ酸が、このタイプの発酵食品に特徴的な付加的フレーバーに転化される。また、このタイプの発酵食品に特徴的でないフレーバーをこの方法で製造して、驚くべき新規な風味を有する発酵食品を得ることができる。
【００３３】
発酵食品は、例えば、チーズであってもよく、ここで、酸加水分解物に比して少なくとも２．５倍高いモル分率の遊離アミノ酸は、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ又はＰｈｅである。このケースにおいて、アミノ酸が濃縮されたなタンパク加水分解物は、牛乳の凝固工程の直前又はその間に牛乳に添加することができる。存在する遊離アミノ酸の損失を最小限とするために、加水分解物を、製造工程においていくらか遅れて添加してもよい。例えば、チェダーチーズの製造において、加水分解物を、その塩と共に、チップ化凝乳に直接添加してもよい。同様に、本発明のタンパク加水分解物を酵素改質チーズに添加して、天然チーズの芳香の発生を更に促進することができる。そのような乳製品の改善のためには、タンパク加水分解物は、好ましくは、乳タンパク、例えばカゼイン又はホエーから誘導されたものである。
発酵食品はビールであってもよく、ここで、そのモル分率が、酸加水分解物のものに比し少なくとも２．５倍高いモル分率の遊離アミノ酸が、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＶａｌである。このケースにおいて、タンパク加水分解物は、ライス又は大麦又はコーンタンパクから得られたものであってもよく（例えば最終製品ラガービールの芳香性質を改善するため）、又は、それは、小麦グルテンから得られたものであってもよい（例えば最終製品小麦ビールの香気成分を改善するため）。ビールの製造において、アミノ酸が濃縮されたタンパク加水分解物は、ビール酵母による発酵が行われる容器の渦流（ｗｈｉｒｌｐｏｏｌ）、遠心分離及びアップストリームの直後に添加してもよい。
【００３４】
発酵食品は、また、発酵された又は保存されたミート製品であってもよく、ここでそのタンパク加水分解物は、ミート又は血液タンパクから得られたものであってもよく、また、酸加水分解物におけるものに比し少なくとも２．５倍高いモル分率の遊離アミノ酸がＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ又はＧｌｙであってもよい。発酵ミート製品について、タンパク加水分解物は、他の化合物、例えば塩及びデキストロースなどと共に、又は微生物スタータ培地と共に導入してもよい。保存ミート製品について、タンパク加水分解物を使用し、これを適切な量のグルコース、塩及び亜硝酸塩と共に溶解することにより、”醸造物”を製造することができる。酸と芳香形成微生物、例えばラクトバチラス及びスタフィロコッカスカルノーサスとの適切な混合物の接種により、１０〜２２℃の温度での接種の数日後に芳香醸造物が生じる。酸性ｐＨ値を中和するためのジホスフェートの添加の際、醸造物をミート、例えばハムに注入してもよい。ミートの調理、好ましくは芳香をその中に保持するためのバッグにおけるものにより、最終的に、安全で食味の良い製品が得られる。アミノ酸が濃縮されたタンパク加水分解物からの揮発性フレーバー化合物の形成を刺激するために、適切な微生物スタータ株が不可欠である。本発明のタンパク加水分解物は、また、亜硝酸塩と組み合わせて使用して、乾燥保存ハムを製造することが可能である。
【００３５】
本発明のタンパク加水分解物は、反応フレーバーの製造において使用することができる。タンパク加水分解物及び糖を含有する組成物を、その後、反応させて、反応フレーバー組成物を得る。糖は、例えば、アルドース及びケトース並びに二糖、例えばキシロース、キシルロース、グルコース、フルクトース、マルトース、スクロース又はそれらの混合物から選択することができる。
タンパク加水分解物及び少なくとも１種の還元糖を加熱して、メイラード反応として知られる一連の反応を開始させる。アミノ基（特に遊離アミノ酸のもの）は、最初の工程として還元化合物と反応する。他の反応経路の全体的な系が続き、最終的に、（複雑な）反応フレーバー組成物が得られる。本発明のタンパク加水分解物の使用により、新たなタイプのフレーバーを得ることができる。これらの（反応）フレーバーを食品に添加して、食品の風味を改善することができる。反応フレーバーを製造するために、アミノ酸が濃縮されたタンパク加水分解物及び所望の糖を、水中に適切な比で溶解し、次いで、加熱する。全ての水を蒸発した後、加熱工程は、直ちに停止するか又は継続して１２０℃付近又は１８０℃程度まで加熱する。後者のインキュベーション条件により、非常に異なるフレーバー及び芳香性質が得られる。最終的に、乾燥した反応製品をパウダーとして回収し、フレーバー成分として使用することができる。
【００３６】
あるいはまた、タンパク加水分解物及び糖の反応は、水及び例えば油又は脂肪を含有するか又は全体的に水を含まない混合物中において行うことができるが、これは、例えば、糖及び加水分解物を、本質的に水を含まない系、例えばポリアルコール中に溶解することによる。この最後の方法の利点は、１００℃を超える温度でさえ、反応が液体中において進行すること、及び、最終製品が、フレーバー成分の投与が促進される液体形態にあることである。
【００３７】
材料及び方法
単離された大豆タンパクを、ルーカスマイアー（ドイツのハンブルグ）製のソイアミン９０ ＨＶとして得た。
コーングルテン（トウモロコシグルテン）を、セレスター（ドイツのクレーフェルト）製のマイシン１３８７５として得た。
ホエータンパクを、ハヴェノホーグウェト（オランダのＧｏｒｉｎｃｈｅｍ）製のＷＰＣ ８０又はＷＰＣ ７５のいずれかとして得た。
ヘモグロビンを、ハリメクス（オランダのＬｏｅｎｅｎ）製のＨＧＰ ｐｏ−ｆｅｅｄ（約９０％タンパク）として得た。
ウシ血清アルブミンを、シグマ−アルドリッチ製の純度９８％のフラクションＶパウダーとして得た。
【００３８】
Ｋ．ラクチス（ＡＴＣＣ ８５８５）は、ＡＴＣＣ： Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９， ＵＳＡから得て；バイテックＬＳ−２５プラススタータ培地は、ラクトバチラス及びスタフィロコッカスカルノーサスの混合物を含み、かつ、Ｇｅｗｕｒｚｍｕｌｌｅｒ （オランダのＤｏｅｔｉｎｃｈｅｍ）から商業的に入手可能である。パンの焼成実験において使用した酵母は、ＤＳＭ Ｇｉｓｔ （オランダのデルフト）製の新鮮なブロック酵母菌として得た。チーズスタータ培地ＤＳ ５ ＬＴ１を、また、ＤＳＭ Ｇｉｓｔから得た。
酵素を、購入し、それ自体を使用し、又は更なる精製工程を行うか行わずに実験サンプルとした。アエロモナスアミノペプチダーゼ及びサーモリシンをシグマから購入した。購入したアエロモナスアミノペプチダーゼは、タンパク１ｍｇあたりで５０〜１５０（シグマ）ユニットの活性を有していた。貯蔵液として、６３０シグマユニット／ｍｌの活性に相当する、水１ｍｌあたりで１５．３ｍｇの固体を含む（として得られる）ものを製造した。購入したサーモリシンは、タンパク１ｍｇあたりで５０〜１００（シグマ）ユニットの活性を有していた。貯蔵液として、２２００シグマユニット／ｍｌの活性に相当する、水１ｍｌあたりで５０ｍｇの固体を含む（として得られる）ものを製造した。トリプシン（２００ ＦＩＰ−Ｕ／ｇ）を、メルク（ドイツのダルムシュタッド）から購入し、乾燥パウダーとして用いた。
【００３９】
サーモアーゼ（Ｔｈｅｒｍｏａｓｅ） Ｃ１６０（サーモリシン）（ｌｏｔ ｎｒ． Ｐ９ＥＢ７６１） １，６５０，０００ ＰＵ （プロテアーゼユニット）／ｇを、大和化成ＫＫ（日本の大阪）から得た。
３５０，０００ ＬＡＰユニット／ｇの活性を有するコロラーゼ（Ｃｏｒｏｌａｓｅ）ＬＡＰ（アスペルギルス由来のロイシルアミノペプチダーゼ）（ｂａｔｃｈ １９９９−０７−２０）を、ロームエンジーム（ドイツのダルムシュタッド）として得た。
約５０００ＮＦ／ｍｇの活性を有するコルプリン（Ｃｏｌｌｕｐｕｌｉｎｅ）液（パパイン）を、ＤＳＭ Ｇｉｓｔ（フランスのＳｅｃｌｉｎ）から得た。
Ｂ．インターメディウス由来のグルタミルエンドペプチダーゼを、Ｓｈｅｖｅｌｅｖ， Ａ． Ｂ．らのＰｌａｓｍｉｄ （２０００）， ４３（３）， １９０−１９９に記載されたように、Ｂ．サブチリス培地から単離した。記載の条件下で、Ｚ−Ｇｌｕ−ｐＮＡに対する精製酵素の活性は、ミリグラムあたりで約１ユニットであった。
【００４０】
カルボキシペプチダーゼＣＰＤ−ＩＩ（ＰｅｐＦ）を、ｐｅｐＦ遺伝子の複数のコピーを含む過剰産生Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）株の培地ろ過により得た。発表されたｐｅｐＦ配列情報（バン　デン　ホンバーグらの（１９９４） Ｇｅｎｅ １５１， ７３−７９）を用いて、オリゴヌクレオチドプライマーを設計したが、これは、当該技術分野における当業者に知られているＰＣＲ反応を用いて、Ａ．ニガーのグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）プロモーターと５’−非コード配列を、ＡＴＧ開始コドンからＴＡＡ終止コドンまでのｐｅｐＦ構造遺伝子に直接融合させたものである。構造遺伝子のグルコアミラーゼプロモーターへの融合についての類似する例が報告されている（ＥＰ−Ａ−０ ４２０ ３５８、ＥＰ−Ａ−０ ４６３ ７０６及びＷＯ ９９／３８９５６）。最初に、ｐｅｐＦ構造遺伝子を、Ａ．ニガーのＧＡＭ４（ＣＢＳ５１３．８８）染色体ＤＮＡからＰＣＲ増幅し、精製した。第２に、ｇｌａＡ遺伝子のプロモーター領域を、３’−末端に、ｐｅｐＦ構造遺伝子の５’−末端をオーバーラップするプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。第３に、２つのＰＣＲフラグメントを、融合ＰＣＲを介してｇｌａＡプロモーターのオリゴヌクレオチドプライマー５’、及び逆方向にｐｅｐＦの停止コドンをオーバーラップするオリゴヌクレオチロプライマーに融合させた。第４に、得られた融合フラグメントを、Ａ．ニガー発現ベクターｐＧＢＴＯＰ８（ＷＯ ９９／３８９５６）中においてクローニングし、ｇｌａＡプロモーター、ＰｅｐＦ構造遺伝子及びｇｌａＡターミネーターを含む融合プラスミドを得た。本質的に、ＷＯ ９９／３８９５６に記載されたように、このプラスミドをＮｏｔ Ｉで消化し、Ｘｈｏ Ｉで消化したｐＧＢＢＡＡＳ−１を用いて同時軽質転換を、Ａ．ニガーのＧＡＭ４（ＣＢＳ５１３．８８）に対して行った。アセトアミドプレートでの成長のために選択される形質転換体を、コロニーＰＣＲにより分析して、既知の技術を用いて、ｐｅｐＦ発現カセットの存在を調べた。Ａ．ニガーのＰｅｐＦ形質転換体を、先に記載したような方法（ＷＯ ９９／３８９５６）を用いて、振とうフラスコ中において培養した。３４℃で６日間成長させた後、培養物を限外ろ過して、菌糸体を除去した。ＣＰＤ ＩＩ酵素を、ダル　デガンらにより記載された方法（Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｃｒｏｂｉｏｌ． ５８ （７） ｐｐ２１１４４−２１５２ （１９９２））の単純化バージョンを用いて精製した。適切な量の緩衝液Ａでの希釈後、限外ろ過を、Ａｋｔａ系におけるＱセファロースＦＦカラムにおいて行った。緩衝液Ａは、５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．０とし、かつ、緩衝液Ｂは、１Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．０とした。溶出を、１０％緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ中）から５０％緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ中）への勾配で行った。活性フラクションを、ｐＨ４．１で合成ペプチドＦＡ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−ＯＨ （Ｂａｃｈｅｍ）に対する酵素活性のベースとしてプールした。最終的な、実質的に精製された酵素の活性は、１１７６ Ｕ／ｍｌであり、５０ｍＭ酢酸ナトリウム／１ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ４．１）中の５ｍＭ ＦＡ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−ＯＨにおいてアッセイした。加水分解の速度は、３３���ｎｍで、数分間、２５℃とした。１ユニットを、１分あたりに分解された基質１マイクロモルとして定義した。
【００４１】
カルボキシペプチダーゼＣＰＤ−１（ＰｅｐＧ）の単離を、Ａ．ニガーの培養ブロスから、また、ＣＡＢＳ−セファロース工程を省略したことを除いてはＦ．ダル　デガンら（Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ５８（７）， ｐｐ． ２１４４−２１５２ （１９９２））に従って行った。最終的な、実質的に精製された酵素の活性が、与えられているようなこの酵素についての活性測定プロトコールを用いて、２５℃でｐＨ４．５でＦＡ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＯＨおいて１５０ユニット／ｍｌであることを確認した。
バチラス　ステアロサーモフィラス（株ＮＣＩＭＢ ８９２４）からのアミノペプチダーゼＩＩを、ストールら（ＢＢＡ ４３８ （１９７６） ２１２−２２０）に記載の手順に従って単離した。酵素の純度は、天然及び変性（ＳＤＳ）状態下でのゲル電気泳動により試験した。単離した酵素の同定は、酵素のアミノ末端の９つのアミノ酸のエドマン分解により行った。酵素を、ＣｏＣｌ２の添加により活性化した。ローリー試薬を用いて、最終酵素溶液のタンパク濃度が、１ｍｌあたりで７．２ｍｇタンパクであると評価した。ロイシン−ｐ−ニトロアニリドを基質として用いて、この溶液のエキソペプチダーゼ活性を、１ｍｌあたりで４２０ユニットとして評価した。活性試験を、ｐＨ７．２、基質１リットルあたり３ミリモルで、１５分間、２５℃で行い、かつ、吸収を、ブランクに対して４００ナノメーターで測定した。
【００４２】
加水分解物中における遊離アミノ酸のモル濃度の測定
種々のタンパク基質に対する酵素インキュベーションを、実施例に記載のｐＨ及び温度条件下で撹拌しながら行った。インキュベーションの停止は、示した時間インターバル後に、最大許容速度で、１５分間、エッペンドルフ遠心機において又はＨｅｒｅａｕｓ Ｍｅｇａｆｕｇｅ ３．０Ｒにおいて遠心分離して、非溶解タンパク基質を除去することにより行った。次いで、上澄のｐＨを調整し、９５℃で加熱して、残留タンパク分解活性を失活させた。形成された更なる沈澱物を、別の遠心分離により除去した。除去後、上澄をアミノ酸分析を行うまで凍結保存した。あるいはまた、上澄を凍結乾燥して、実験における更なる試験を可能にした。
アミノ酸分析を、ウォーターズのアミノ酸分析系（米国のミルフォードＭＡ）の操作マニュアルに記載されたようなピコタグ（ＰｉｃｏＴａｇ）法に従って上澄について行った。アミノ酸分析は、サンプル材料を解凍直後に行った。その終了までに、適切なサンプルを溶融液から得て、希酸へ添加し、かつ、均質化した。後者の溶液から、新たなサンプルを採取し、乾燥し、フェニルイソチオシアネートを用いて誘導した。存在する種々の誘導アミノ酸をＨＰＬＣ法を用いて定量化した。
【００４３】
遊離アミノ酸に完全に加水分解した加水分解物中における遊離アミノ酸のモル濃度の測定
遊離アミノ酸を得るためのタンパク加水分解物の酸加水分解は、ウォーターズに従って６Ｎ ＨＣｌでの気相加水分解により行った。要約すれば、この手段は次のとおりである。酵素加水分解後に得られた透明タンパク含有上清のサンプルを、希ＨＣｌ溶液中において均質化した。得られた溶液を、次いで、ウォーターズによる気相加水分解に付した。この酸加水分解後、アミノ酸を、ピコタグ法（上記参照）に従って誘導及び分析した。
酸加水分解の間にＴｒｐ及びＣｙｓが分解するので、これらのアミノ酸は、記載のデータ中には含まれない。しかしながら、Ｇｌｎ及びＡｓｎ残留物は酸加水分解の間にＧｌｕ及びＡｓｐへ転化されるので、通常は、ＧｌｕとＧｌｎとの値、及びＡｓｐとＡｓｎとの値を一緒に合わせて、酸加水分解前に得られるデータとの比較を可能にした。唯一、実施例８においては、以下の異なる手段である。
【００４４】
【実施例】
実施例１
アミノ酸、ロイシン及びバリンを、パンの皮様香気を発するメイラード生成物と関連付けた。パンの焼成の間にそのような香気が生じるのを促進するためには、これらの２種のアミノ酸が比較的濃縮された天然タンパク加水分解物を生じさせるのが有利であった。選択的アミノ酸濃縮を達成するために、ロイシン及びバリンが比較的濃縮されたタンパク基質を、選択的エンドプロテアーゼ及び選択的エキソプロテアーゼと組み合わせた。微生物起源の酵素サーモリシンは、バルキーな疎水性アミノ酸、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ及びＰｈｅのアミノ末端鎖でペプチド結合を開裂することが知られている。
種々の選択的アミノペプチダーゼが科学文献において知られているが、それらの大抵のものは、哺乳類組織から単離され、又は膜結合することが知られている。後者の２つの特徴から、これらの酵素は、食品用及び低コスト用途のための魅力に欠けたものとなる。例外的なものは、アエロモナスプロテオリティカ由来の細菌性アミノペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．１１．１０）である。この酵素は、微生物起源のものであり、特に溶解性であり、また、疎水性アミノ酸に対する明らかな優先性を示し、かつ、アスパラギン酸、グルタミン酸及びシステイン酸のみが除去に対して特に抵抗性である（ｐｒｅｓｃｏｔｔ， Ｊ． Ｍ． ａｎｄ Ｗｉｌｋｅｓ， Ｓ． Ｈ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ： ４５， ５３０ （１９７６））。
【００４５】
望ましくないアミノ酸を付随的に放出することなしに可能な限り多くのロイシンを放出するためには、酵素加水分解に使用するタンパク基質を慎重に選択すべきことが明らかである。多くの商業的に入手可能なタンパク基質のうち、ホエータンパク単離物、ヘモグロビン及びトウモロコシタンパク単離物のみが、ロイシン及びバリンを比較的濃縮して含む。本実施例では、ホエータンパク単離物（ＷＰＣ ８０）を使用した。
タンパク基質、サーモリシン及びアエロモナスプロテオリティカアミノペプチダーゼを、全て同時に、以下に記載の条件下でインキュベートした。インキュベーション５時間後、液体を、材料及び方法の項に記載したように処理した。沈澱した又は溶解しなかった材料を、エッペンドルフ遠心機において最大速度で１５分間の遠心分離により除去した。上清を除去し、−２０℃で凍結保存した。
上清のサンプルを、解凍直後に、ウォーターズ（米国のミルフォードＭＡ）のピコタグ法に従ってアミノ酸含量について分析した。
表１に、６Ｎ ＨＣｌ加水分解後に存在するアミノ酸の分布を、酵素を用いたインキュベーション後にみられるアミノ酸の分布との比較で記載する。全ての関連アミノ酸について、濃縮係数、モル分率及びＡＡＱ値を、記載の定義に従って計算した。モル分率及び濃縮係数は、全てのアミノ酸について記載する（それぞれ、Ｔ＋Ａｅ及びＴ＋Ａｅ／６Ｎ ＨＣｌとして記載する表１参照）。Ｔｒｐ及びＣｙｓ値は省略し、Ｇｌｕ及びＧｌｎ、Ａｓｐ及びＡｓｎ値は、合わせて表１において１つの値とした。
【００４６】
表１：基質ホエータンパク単離物
2004511241.tif 000002
【００４７】
注：
Ｔ＋Ａｅ＝サーモリシン＋アエロモナスプロテオリティカアミノペプチダーゼでの処理後のアミノ酸のモル分率；他に記載のない限り、全ての更なる実施例において、酵素の添加量は、材料及び方法の項に記載したような酵素製造物でのものを意味する。
６Ｎ ＨＣｌ＝酵素インキュベーション後の加水分解ホエータンパクを６Ｎ ＨＣｌ加水分解（ウォーターズ）した後に得られるアミノ酸のモル分率。
Ｔ＋Ａｅ／６Ｎ ＨＣｌ＝Ｔ＋Ａｅ−インキュベーション後のＡＡのモル分率／６Ｎ ＨＣｌ加水分解後のＡＡのモル分率。
この欄（Ｔ＋Ａｅ／６Ｎ ＨＣｌ）は、遊離アミノ酸の濃縮係数を示す。
条件：１０％（ｗ／ｗ）ＷＰＣ ８０を含有する、１００ミリモル／リットルのリン酸緩衝液２マイクロリットルに、２０マイクロリットルのサーモリシン（シグマ）及び３３マイクロリットルのアエロモナスプロテオリティカアミノペプチダーゼを添加した。インキュベーションを５時間、４０℃、ｐＨ８．０で行った。
使用した２種の酵素の選択性が制限されているにもかかわらず、それらとホエータンパク単離物との組み合わせにより、印象的な結果が得られた：ロイシン、イソロイシン及びバリンは一緒に全ての遊離アミノ酸の５０％を大きく超える（ホエーの酸加水分解を利用して得ることができるものより少なくとも３倍高い）。それにもかかわらず、イソロイシン及びバリンのモル分率（共に２１．５％）は本実験において低過ぎ、加水分解物中において全体としてロイシンのみ（モル分率３３．３％）が適合（ｃｏｍｐｌｙ）する。このインキュベーションにおけるＡＡＱレベルは、約１５％であった。
【００４８】
実施例２
実施例１においては、ホエータンパク単離物を、サーモリシン及びアエロモナスプロテオリティカから得られる選択的アミノペプチダーゼを用いてインキュベートしたが、この目的は、このケースにおいてロイシンとなる特定のアミノ酸の関連期間における収率を最大化することであった。満足の行く結果が得られたが、その結果が、使用したエンドプロテアーゼの選択性によるのか又はエキソプロテアーゼの選択性によるのかが依然として不明であった。
本実施例においては、インキュベーションを、サーモリシンと、アエロモナス由来の選択的アミノペプチダーゼ又はバチラス　ステアロサーモフィラス由来の広範スペクトルアミノペプチダーゼＡＰＩＩのいずれかとを用いて行った。広範スペクトル好熱性アミノペプチダーゼＡＰＩＩは、先の材料及び方法の項に記載したバチラス　ステアロサーモフィラス株ＮＣＩＭＢ８９２４から単離した。
酵素インキュベーションを表２の下に記載した条件下で行い、その後、反応を停止し、実施例１に記載したように処理した。比較的短いインキュベーション時間を選択して、可能な限り、アエロモナスアミノペプチダーゼに対するアミノペプチダーゼＡＰＩＩの不特異的開裂パターンを最小化した。
【００４９】
表２：基質ホエータンパク単離物
2004511241.tif 000003
【００５０】
注：
Ｔ＋Ａｅ＝サーモリシン＋アエロモナスプロテオリティカアミノペプチダーゼ
Ｔ＋ＡＰ＝サーモリシン＋Ｂ．ステアロサーモフィラスＡＰＩＩ
６Ｎ ＨＣｌ＝酵素インキュベーション後に６Ｎ ＨＣｌ加水分解（ウォーターズ）したホエータンパク
条件：Ｔ＋ＡＰ：１ミリモル／リットルのＣｏＣｌ２及び１０％（ｗ／ｗ）ＷＰＣ ８０を含有する、１００ミリモル／リットルのリン酸緩衝液１８５０マイクロリットルに、１０マイクロリットルのサーモリシン（シグマ）及び１４０マイクロリットルのＢ． サーモフィラスＡＰＩＩを添加した。インキュベーションを、１時間、６０℃、ｐＨ８．０で行った。
Ｔ＋Ａｅ：実施例１と同様であるが、インキュベーション時間は１時間のみとした。
サーモリシン及びアエロモナスアミノペプチダーゼの組み合わせ作用により、利用可能な遊離アミノ酸モル分率３６％を示すロイシン（酸加水分解により得られるものより少なくとも３倍高いものであった）、３．３の濃縮係数が生じた。両インキュベーションは、約１２％のＡＡＱ値を示した。
サーモリシン及びＡＰＩＩでのインキュベーションにおいて、ロイシンは、２２％を示し、酸加水分解により得られるものに比しちょうど約２倍高く、少なくとも２５％のモル分率の要件を満たしていない。サーモリシン及びアエロモナスアミノペプチダーゼは、従って、ホエータンパクからのロイシンの放出の好ましい組み合わせを示す。
【００５１】
実施例３
実施例１及び２においては、ホエータンパク単離物の選択的分解を、種々の酵素でのインキュベーション後に存在する遊離アミノ酸含量を分析することにより証明した。実施例２においては、サーモリシンとアエロモナスアミノペプチダーゼの組み合わせにより、酸加水分解物の場合に比し、ロイシンが有意に濃縮された（３．３倍の）加水分解物が生じることが示された。サーモリシンをＢ． ステアロサーモフィラスＡＰＩＩ酵素と組み合わせることにより、酸加水分解物の場合に比し、ロイシン含量が濃縮された、即ち２．１の係数の加水分解物が生じた。
そのような相違が、メイラード反応における注目すべき香り作用をもたらし得るか否かを確認するために、多くの実験を行った。最初の実験では、０．１３ｇの純粋なロイシンを、グルコース（０．１９ｇ）、フルクトース（０．１９ｇ）、マルトース（０．３９ｇ）又はスクロース（０．３９ｇ）と、水中において、撹拌下に、１３５℃の温度で反応させた。本実験の目的は、いずれの糖が、存在する過剰なロイシンとの組み合わせで香りを放出するのに最も効果的であるかを見い出すことであった。加熱約９０分後、存在する全ての水を蒸発した。加熱約６０分後（幾らかの水が散逸）、グルコース及びフルクトースを含むバイアルに、甘いパンの皮のような香りが生じ始めたが、マルトース及びスクロースを含有するバイアルには、カカオの印象しかなかった。１３５℃で１００分間の加熱後、グルコース及びフルクトースにより弱い香りが生じたが、マルトース及びスクロースでは、より強い甘いパンの皮のような香りが生じた。
【００５２】
フルクトースを用いるインキュベーションにより、最も強いパンの皮のような香りが生じたので、この糖を、実施例２に記載の加水分解物でのメイラード反応を行うために選択した。
各インキュベーションにおいて存在する全遊離アミノ酸についてのデータを用いて、３つの反応バイアルを、遊離アミノ酸が同量含まれるように製造した（２ミリリットル中に約４０マイクロモル）。必要であれば、幾らかの水を添加して、３つのバイアルのそれぞれの量を同一とした。最終的に、少々過剰モルのフルクトースを（５５マイクロモル）、各バイアルに添加し、かつ、反応の開始を、バイアルを１２７℃に加熱することにより行った。
全ての水の消費後、経験を積んだパネラーに、各バイアルから放たれる香りについてのコメントをもらった。彼らのコメントを表３に要約する。
使用した基質では、重要な乳特性が初期の香り性質の特徴であるとされる。香りの放出における有意な差は、サーモリシンとＡＰＩＩで処理したサンプル対サーモリシンとアエロモナスアミノペプチダーゼで処理したサンプルに起因し得る。サーモリシンとＡＰＩＩでの消化において得られるようなほんの２．１の特定のアミノ酸の濃縮係数は、メイラード反応において香りを十分に誘導するのに不適切であるのが明らかである。
【００５３】
表３
2004511241.tif 000004
【００５４】
注：
Ｔ＋Ａｅ＝サーモリシン＋アエロモナスプロテオリティカアミノペプチダーゼで製造したホエータンパク加水分解物
Ｔ＋ＡＰＩＩ＝サーモリシン＋バチラス　ステアロサーモフィラスＡＰＩＩで製造したホエータンパク加水分解物
【００５５】
実施例４
実施例３においては、本発明のタンパク加水分解物が、メイラード実験において特定の芳香を生じ得ることを証明した。本実施例での目的は、本発明のタンパク加水分解物を使用して、微生物でのインキュベーションにおいて特定の芳香形成を刺激することが可能であることを証明することである。
商業的なヘモグロビンパウダー（オランダのハリメクス製ＨＧＰ Ｐｏ−Ｆｅｅｄ）を出発物質として、５％（ｗ／ｗ）サスペンションを蒸留水中において製造し、その後、ｐＨを、４Ｎ ＨＣｌを用いて７．０に調整した。
【００５６】
このサスペンションの一部５００ｍｌを、工業的サーモリシン（日本の大和化成製サーモアーゼ Ｃ１６０）でインキュベートし、また、別の５００ｍｌを、前記サーモリシンと工業的ロイシン特異性のアスペルギルス由来のアミノペプチダーゼ（ロームエンジーム（ドイツ）からのコロラーゼＬＡＰ）を用いてインキュベートした。サスペンション５００ｍｌあたり、２．５ｇのサーモアーゼパウダーを添加し、コロラーゼＬＡＰ液体は０．２ｍｌとした。双方の酵素インキュベーションを５０℃で４時間行い、次いで、反応の停止を、４Ｎ ＨＣｌを用いて液体をｐＨ３．０に酸性化することにより行った。即座に、２つの酸性化サスペンションを遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｅｇａｆｕｇｅ ３．０Ｒにおいて３５００ｒｐｍで３０分）して、ヘムをヘモグロビンから沈澱させ、２つの上清を収集し、９５℃で３０分間の加熱処理に付した。サーモアーゼ及びコロラーゼＬＡＰでのインキュベーションにより誘導された上清のうち、少量のサンプルをアミノ酸分析のために用いた。その後、双方の上清を凍結乾燥した。サーモアーゼのみを用いてインキュベートしたサスペンションは２０ｇの乾燥パウダーを生じ、また、２つの酵素を用いてインキュベートしたサスペンションは１８ｇの乾燥パウダーを生じた。
【００５７】
エンド−（即ちサーモアーゼ）及びエキソプロテアーゼ（即ちコロラーゼＬＡＰ）の双方を用いてインキュベートすることにより製造したヘモグロビン加水分解物中に存在する遊離アミノ酸の分析により、非常に濃縮されたロイシン、イソロイシン及びメチオニンが示された（表４）。しかしながら、イソロイシン及びメチオニンの双方のモル分率の値は、必要とされる２５％より低く、従って、ロイシンのみが適合する。材料及び方法の項に要約した手段に従って測定した調製物のアミノ酸指数は１５％であり、ロイシンのモル分率は３７％であった。サーモアーゼのみを用いてヘモグロビンをインキュベートすることによるアミノ酸の遊離は非常に限られたものであり、従って、これらのデータは表において省略してある。
【００５８】
表４：基質ヘモグロビン
2004511241.tif 000005
【００５９】
注：
Ｔ＋Ｃ＝サーモアーゼ＋コロラーゼＬＡＰ
６Ｎ ＨＣｌ＝酵素インキュベーション後に６Ｎ ＨＣｌ加水分解したヘモグロビン
条件：５００ｍｌ水ｐＨ７中の、２．５ｇのサーモアーゼパウダー及び２００マイクロリットルのコロラーゼＬＡＰを用いて５０℃で４時間インキュベートされたヘモグロビン５％（ｗ／ｗ）。
【００６０】
本発明に従って特定のアミノ酸が濃縮されたタンパク加水分解物が、異なる発酵工程において特定の芳香を生じ得ることを証明するために、多くの実験を行った。
第１の実験では、酵母菌クライベロミセス　ラチスを、サーモアーゼ又はサーモアーゼ／コロラーゼＬＡＰ−加水分解ヘモグロビンのいずれかを補充した最小培地中において成長させ、その後、２つの発酵ブロスの芳香について、経験を積んだパネラーに比較してもらった。４０ｇのＮａＣｌ／リットル、１４．２ｇのＮａ２ＨＰＯ４及び０．３４ｇのＫＮＯ３／リットルを含む最小培地を、最終ｐＨ５．５に調整し、かつ、サーモアーゼ−加水分解ヘモグロビンパウダー又はサーモアーゼ／コロラーゼＬＡＰ−加水分解ヘモグロビンパウダーのいずれかを０．５ｇ／リットル補充した。２つの培地を、デュプロ（ｄｕｐｌｏ）でボトルに詰め（１００ｍｌボトル中５０ｍｌ）、１２０℃で２０分間滅菌した。温度が３０℃に達した後、ボトルに、Ｋ．ラチス（ＡＴＣＣ ８５８５）を十分に成長させた１％前培地を接種し、それを遠心分離し、同一量の生理的食塩水中に再懸濁して、前培地で使用したＹＥＰＤ培地中に存在する遊離アミノ酸の大部分を除去した。その後、ボトルを閉じ、２０℃で７日間撹拌なしにインキュベートした。ボトルを再び開口した際、２つの培地上の空気の香りをパネラー数人に嗅いでもらった。彼らの所見を表５に記載した。
【００６１】
第２の実験においては、種々のラクトバチラス及びスタフィロコッカス　カルノーサスを含有する商業的なミートスタータ培地（ｍｅａｔ ｓｔａｒｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ）を、最小培地中において、サーモアーゼ−又はサーモアーゼ／コロラーゼＬＡＰ−加水分解ヘモグロビンパウダーのいずれかを補充した、デキストロース及び亜硝酸塩の存在下で成長させた。インキュベーション後、２つの発酵ボトルの香りを、経験を積んだパネラーに比較してもらった。本実験においては、培地には、６ｇのデキストロース／リットル、２０ｇのクロロゾ塩／リットル（クロロゾ塩は、フェルステーヘン（オランダのロッテルダム）により供給される商業的製品であり、ＮａＣｌ中に０．６％亜硝酸塩を含む）、及びサーモアーゼ−又はサーモアーゼ／コロラーゼＬＡＰ加水分解ヘモグロビンパウダーのいずれかを１ｇ／リットル含ませた。２つの培地のｐＨ値を５．５に調整し、かつ、培地１リットルあたり０．３ｇのバイテックＬＳ−２５プラススタータ培地で接種し、即ち、培地の前滅菌なしとした。発酵を密閉ボトル中（１００ｍｌボトル中に５０ｍｌ）において、２２℃で３０時間、次いで、１５℃で２日間、及び次いで６℃で３日間行った。この期間、双方の発酵物のｐＨを約４．０に低減させた。
発酵物の香りは、前述のように、ボトルの開口直後に試験した。パネラーの所見を表５に記載する。
【００６２】
表５：異なるヘモグロビン加水分解物が補充され、かつ、異なる微生物スタータ培地が接種された最少培地の香りの印象
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【００６３】
第３の実験では、本発明のロイシンが濃縮されたヘモグロビン調製物を、工業的に製造された乾燥発酵ソーセージ（セルベラートタイプ）において試験した。
このため、サーモアーゼのみ又はサーモアーゼ＋コロラーゼＬＡＰを含み、かつ、表４に記載した規定に合う、大部分のヘモグロビン加水分解物を製造した。凍結乾燥後、各パウダー７５ｇを、ミート、コラーゲン、脂肪、調理済外皮、デキストロース、アスコルビン酸ナトリウムの混合物８ｋｇ（２つ）に添加し、十分に混合した。塩（０．６％亜硝酸塩）及びコショウ以外に、後に加水分解物を添加することによりもたらされる芳香の相違の確認を図るために、他の種は導入しなかった。ミートドウの第３部分に対しては、加水分解物を添加しなかった。加水分解物の添加前に、ミートドウは、約１７％のミートタンパクを含んでいた。バイテックＬＳ−２５プラスを、３つの全ての製造物中においてスタータ培地として使用した。
１８℃で２１日間及び４９日間のインキュベートをして少なくとも２０％の水を除いた後、ソーセージをスライスし、経験を積んだパネラーにより評価してもらった。高レベルで遊離ロイシンを含むヘモグロビン加水分解物を含有するドウから製造したソーセージは、加水分解物を添加していないバターから製造したソーセージに比し、より強いブロス様風味を有するとみなされた。サーモアーゼのみを接種した加水分解物を含有するソーセージの風味は、遊離ロイシンが高レベルで濃縮されたドウに比し弱いが、参照材料に比し強い、中間的なものであった。
【００６４】
実施例５
本発明の加水分解物は、単独の使用で、ソーセージに対してより高いブロス様芳香性質を与えることができないが、より強いパンの香りを有するパンを焼成するためには有用である。
ホエータンパク及びヘモグロビンと同様に、トウモロコシタンパクは、ロイシンが非常に濃縮されているが、これらの代替品に比しパンへの導入に適しており、これは、その特徴的な穀物の香りに由来する。実施例４で使用したサーモアーゼ及びコロラーゼＬＡＰの同一の組み合わせを用いて、トウモロコシタンパク（セレスター（ドイツのクレーフェルト）からのマイシン１３８７５）を表６の説明書きに特定した条件下で消化した。インキュベーション後、酵素の不活性化を、４Ｎ ＨＣｌを用いてそのｐＨを５．０に低減することにより行い、次いで、９５℃で４５分間加熱した。アミノ酸分析のサンプルを採取し、その後、材料の残りを凍結乾燥した。
【００６５】
酵素加水分解物及び６Ｎ ＨＣｌ加水分解物のアミノ酸分析により、遊離ロイシンが大量に生成され、そのＡＡＱが３２％で、その濃縮係数が５．８であり、そのモル分率が４１．８％であることが示された。ロイシン以外に、他のアミノ酸のいずれも要件を満たしていなかった。
ドウへの添加前に、１．１１、５．５６及び１１．１３ｇの凍結乾燥加水分解物を２０ｍｌの水中に溶解した。２０ｍｌの水の一部に加水分解物を含ませた。次いで、これらの２０ｍｌ水部分のそれぞれを、以下のものを含むパンのドウと混合した：２０００ｇの小麦粉、４０ｇの塩、４４ｇの新鮮な酵母菌、並びに、８０ｍｇのアスコルビン酸、５０ｍｇのフェルミジームＰ２００及び１２０ｍｇのフェルミジームＨＳ２０００（いずれもＤＳＭベーカリーイングレディエンツ（オランダのデルフト）を含有する別の水１１５０ｍｌ。
３０℃で３５分間の前発酵後、ドウを更に３４℃で７５分間発酵させた。焼成を２８０℃で１０分間行い、次いで、更に、２２５℃で２０分間行った。翌日、パンをスライスし、経験をつんだパネラーにより評価してもらった。
最も低い加水分解物用量（ドウ３１００ｇあたり１．１１ｇ）では、パンの香りに目立った影響はみられなかった。しかしながら、最も高い添加レベル（ドウ３１００ｇあたり１１．１３ｇ）では、強い小麦粉の香りが生じ、それは、加水分解物を添加しなかったパンと明らかに区別可能であった。不本意なことに、この高い添加レベルは、全体的ローフ量（ｌｏａｆ ｖｏｌｕｍｅ）に対しては負の影響を有していた。５．５６ｇの加水分解物の添加により、強い芳香効果は下がったが、ローフ量に対して悪影響を及ぼさなかった。
【００６６】
表６：基質コーンタンパク
2004511241.tif 000007
【００６７】
注：
Ｔ＋Ｃ＝サーモアーゼ＋コロラーゼＬＡＰ
６Ｎ ＨＣｌ＝酵素インキュベーション後に６Ｎ ＨＣｌ加水分解したトウモロコシタンパク
条件：６％（ｗ／ｗ）マイシンを含有する水５００ｍｌに対して、２．５ｇのサーモアーゼと０．２ｍｌのコロラーゼＬＡＰを添加した。インキュベーションを、初期ｐＨ７、５０℃で４時間行った。
【００６８】
実施例６
本実施例では、この特定の基質についての酵素の新たな組み合わせを用いてホエータンパク単離物（ＷＰＣ ７５）からのリシン又はロイシンの選択的な濃縮さを説明する。形成される２つの加水分解物を使用して、チーズの官能特性に影響を与えた。
種々の芳香発生工程におけるロイシンの役割を、ここで適切に説明する。リシンを用いて、メイラード反応においてポテト様風味を生じさせることが知られている。更にリシンは、チーズ及び”サーリー（ｓｕｒ ｌｉｅ）”ワインなどの発酵製品の風味の発達と関連付けされている。
ホエータンパク単離物は、リシン及びロイシンが非常に濃縮されているが、アルギニン含量が比較的低い。ロイシンを選択的に放出するために、サーモアーゼ及びコロラーゼＬＡＰの酵素の組み合わせを再び使用した（表７参照）。リシンを選択的に遊離するために、ホエータンパクを、最初に、インキュベートしたが、これは、すい臓トリプシン（メルク製）を用いて行って、アルギニン又はリシンのカルボキシル側での開裂を生じさせ、次いで、低ｐＨで、Ａ．ニガーのカルボキシペプチダーゼＣＰＤ ＩＩを用いて行った。ＣＰＤ ＩＩは、塩基性アミノ酸、例えばＡｒｇ及びＬｙｓを放出することについて強い優先性を示した。後者のインキュベーションの詳細を表８に記載する。
酵素インキュベーション及びその後の処理は、材料及び方法の項に記載した。サーモアーゼ及びコロラーゼＬＡＰの組み合わせにより得られたデータから、ロイシンのみが、基準を満たし、３．１の濃縮係数、１９．１％のＡＡＱ値及び３４．１％のモル分率値を有することが明らかである（表７）。トリプシン及びＣＰＤ ＩＩを用いるインキュベーションにおいて、リシン及びアルギニンの双方が、最終加水分解物中において非常に過度に示されたが、リシンのみが基準を満たし、１７．３の濃縮係数、１０．４％のＡＡＱ値、及び４４％のモル分率値を有していた（表８）。
【００６９】
表７：基質ホエータンパク
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【００７０】
注：
Ｔ＋Ｃ＝サーモアーゼ＋コロラーゼＬＡＰ
６Ｎ ＨＣｌ＝酵素インキュベーション後に６Ｎ ＨＣｌ加水分解したホエータンパク
条件：ＷＰＣ ７５を５００ｍｌの水中に溶解して、濃度を６％とし、その後、０．１ｇのサーモアーゼと０．２０ｍｌのコロラーゼＬＡＰを添加した。インキュベーションは、ｐＨを７に調節しながら５０℃で４時間行った。
【００７１】
表８：基質ホエータンパク
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【００７２】
注：
Ｔｒ＋Ｆ＝トリプシン＋ＣＰＤ ＩＩ
６Ｎ ＨＣｌ＝酵素インキュベーション後に６Ｎ ＨＣｌ加水分解したホエータンパク
条件：ＷＰＣ ７５を１００ｍｌの水に溶解して、濃度を６％（ｗ／ｗ）とした。次いで、０．１ｇのトリプシンパウダー（メルク）を添加し、かつ、初期ｐＨ７、６０℃で２時間インキュベートした。４Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨを５に低減した後、０．２ｍｌの精製ＣＰＤ ＩＩを添加し、かつ、消化をｐＨ５、４０℃で更に３時間継続した。
【００７３】
加水分解物中に残存する微量の活性プロテアーゼにより、チーズに深刻な苦味が生じ得るため、両加水分解物を、チーズへの添加前に、ｐＨ５、９５℃で４５分間の加熱処理に付した。
チーズの官能特性に対する両加水分解物の影響を試験するため、オランダのＮＩＺＯにより開発されたＣｈ−イージーモデルを採用した（Ｇ．スミットらのＶｏｅｄｉｎｇｓｍｉｄｄｅｌｅｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ８（１９９５） １９−２１）。低温殺菌したＣｈ−イージーベースを３０℃に冷却し、その後、レギュラースタータ培地（このケースにおいては、ＤＳＭ（オランダのデルフト）製のＤＳ ５ ＬＴ１）を、依然として液状のＣｈ−イージーベース２００ｇあたり、凍結乾燥加水分解物のいずれか１つ５００ｍｇと共に添加した。参照材料には、加水分解物を添加しなかった。ガラス棒での撹拌後、液状ペーストを無菌的に小カップへ移し、その中において材料を固定した。Ｃｈ−イージーの熟成を１８℃で２週間行い、その後、種々の製品について、経験を積んだ風味パネラーに評価してもらった。
添加なしの参照材料と比較して、ロイシンが濃縮された加水分解物を添加したＣｈ−イージー材料は、とても強い香り及びフレーバー特性を示し、その特性は、古い及び成熟したチーズから予想できるであろう。リシンが濃縮された加水分解物を添加したＣｈ−イージー材料は、より控えめな香り及び風味特性を生じ、パネラーは、このチーズを参照材料の場合と区別するのが困難であるとした。
添加を伴うチーズのテクスチャーは、添加なしのチーズのテクスチャーに類似することが証明された。
【００７４】
実施例７
実施例６においては、酵素を適切に組み合わせることにより、本発明の異なるタンパク加水分解物を、単一の動物タンパク源から製造することができることを証明した。驚くべきことに、同一の原材料から得られる加水分解物が、適切な微生物スタータ培地でのインキュベーションの際に異なる芳香特性をもたらし得る。
この実施例においては、本発明の方法の多用性の証明を、工業的に重要な植物性タンパクを異なる酵素に付することにより行う。再び、異なるアミノ酸が濃縮された、本発明の加水分解物を得ることができる。このケースにおいては、単一の遊離アミノ酸としてのアルギニン又は２種の異なる遊離アミノ酸としてのアルギニンとリシンのいずれかである。そのような異なる加水分解物がメイラード又は発酵工程において区別可能な芳香を生じる可能性は、先に十分に例示した。そのような芳香強化性とは別に、遊離アルギニンは、また、必須の食品栄養素であるとされており、ホルモン分泌、酸化窒素形成及びヒトの創傷治癒刺激と関連付けられている。更に、アルギニンが濃縮されたタンパク加水分解物は、パーソナルケア用途に有用な特性を有することが求められている。本発明の加水分解物は、また、それ自体で有用である。
本実験においては、大豆タンパク単離物（ソイアミン９０ ＨＶ）を、最初に、植物性タンパク（パパイン又はコルプリン（Ｃｏｌｌｕｐｕｌｉｎｅ））及び微生物由来のカルボキシペプチダーゼ（ＣＰＤ ＩＩ）の組み合わせを用いてインキュベートして、遊離アルギニンが濃縮された、本発明の加水分解物を得た。表９に記載のデータから、このアミノ酸のみが全ての基準を満たし、濃縮係数４．２、及びモル分率及びＡＡＱ値についてそれぞれ２６．９％及び１０．３％の値を有していた。
【００７５】
表９：基質大豆タンパク単離物
2004511241.tif 000010
【００７６】
注：
Ｃｏ＋Ｆ＝コルプリン＋ＣＰＤ ＩＩ
６Ｎ ＨＣｌ＝酵素インキュベーション後の６Ｎ ＨＣｌ加水分解した大豆タンパク加水分解物
条件：大豆タンパク単離物を２００ｍｌの水中に溶解し、濃度を６％（ｗ／ｗ）とし、その後、そのｐＨを７．２に調製し、１ｍｌのコルプリンを添加した。インキュベーションを６０℃で２時間行った。その後、ｐＨを５に低減し、０．５ｍｌのＣＰＤ ＩＩを添加し、消化を、更に３時間、４０℃、初期ｐＨ７．１５で及び３時間、４０℃、ｐＨ５で継続した。
第２インキュベーションにおいては、大豆タンパク単離物のインキュベーションを、動物源のプロテアーゼ（メルク製トリプシン）及び微生物ＣＰＤ ＩＩの組み合わせを用いて行った。この第２インキュベーションにおいては、アルギニン及びリシンの双方が全ての基準を満たし、濃縮係数がそれぞれ５．５及び３．９で、モル分率値がそれぞれ３４．７及び２６．２％であり、ＡＡＱ値が１１．７％であった。第２インキュベーションの詳細を表１０に記載する。
【００７７】
表１０：基質大豆タンパク単離物
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【００７８】
注：
Ｔｒ＋Ｆ＝トリプシン＋ＣＰＤ ＩＩ
６Ｎ ＨＣｌ＝酵素インキュベーション後に６Ｎ ＨＣｌ加水分解した大豆タンパク単離物
条件：大豆タンパク単離物を、２００ｍｌの水中に溶解し、濃度を６％（ｗ／ｗ）とした。ｐＨを７．０に調整した後、０．２ｇのトリプシンパウダー（メルク）を添加し、６０℃で２時間３０分インキュベートした。その後、ｐＨを５．０に低減し、０．５ｍｌのＣＰＤ ＩＩを添加し、４０℃で更に３時間インキュベートした。
【００７９】
実施例８
多くの芳香形成工程における遊離グルタミン酸の本質的役割は文献に記載されており、ＭＳＧ、グルタミン酸のナトリウム塩が、単一の最重要風味強化成分として認識されている。この点を鑑みると、本発明のタンパク加水分解物が、メイラード又は発酵工程のいずれかにおける有意な芳香利点との関連性で遊離グルタミン酸を濃縮して含む態様を含むことを明らかにするのが重要である。
本発明の加水分解物中においてグルタミン酸が濃縮されていることを証明する際の一般的な問題は、この濃縮係数の測定にある。濃縮係数を測定するには、遊離及び結合グルタミン酸のレベルについての定量データが必要とされる。不本意なことに、結合グルタミン酸については証明することができず、なぜなら、６Ｎ ＨＣｌでの処理の間、結合グルタミンが脱アミノ化され、グルタミン酸に転化されるからである。後者の問題を解決するために、本実施例においては、グルタミン酸のグルタミン残基に対する比が正確に知られているタンパク基質の１つを用いた。入手可能なこの情報を利用して、６Ｎ ＨＣｌ処理後の遊離グルタミン酸の濃度を、単純な掛け算により得た。
Ｇｌｕ対Ｇｌｎ比が９１〜２９のウシ血清アルブミン（シグマ）（Ｄａｉｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｍｉｌｋ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ； Ｐ． Ｗａｌｓｔｒａ ｅｄ； Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．）を使用し、精製グルタミルエンドペプチダーゼと精製ＣＰＤ Ｉとの混合物を用いて表１１の下に記載の条件下で消化した。
データによれば、得られる加水分解物中におけるグルタミン酸の飽和率は、２．７であった。そのモル分率及びＡＡＱの値は、それぞれ、２６．３及び１９．３であった。
【００８０】
表１１：基質ウシ血清アルブミン
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【００８１】
注：
ＥＧ＋Ｇ＝グルタミルエンドペプチダーゼ＋ＣＰＤ Ｉ
６Ｎ ＨＣｌ＝酵素インキュベーション後に６Ｎ ＨＣｌ加水分解したウシ血清アルブミン
条件：ウシ血清アルブミンを２ｍｌの水中に溶解し、濃度を５％（ｗ／ｗ）とし、その後、ｐＨを８．０に調整し、１ｍｇのグルタミルエンドプロテアーゼを添加し、５０℃で３時間３０分間インキュベートした。その後、ｐＨを５．０に低減し、０．０５ｍｌのＣＰＤ Ｉを添加し、更に２５分間５０℃でインキュベートした。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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