(57)【要約】本発明は、多型CYP3A5ポリヌクレオチドに関する。更に本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子またはベクター、並びに本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子により遺伝子操作された宿主細胞に関する。更に本発明は、分子変異型ポリペプチドまたはそれらの断片の作製法、分子変異型ポリペプチドを発現することが可能な細胞の作製法、並びに本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子によりコードされたまたは本発明の方法によるもしくは本発明の方法により作製された細胞から入手可能であるようなポリペプチドまたはそれらの断片に関する。更に本発明は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体にも関する。加えて本発明は、トランスジェニック非ヒト動物に関する。本発明は更に、1種または複数の前述のポリヌクレオチド、遺伝子、ベクター、ポリペプチド、抗体または宿主細胞を含む固形支持体にも関する。更に、多型を同定する方法、プロドラッグまたは薬物または阻害剤を同定しかつ入手する方法も、本発明に包含されている。加えて本発明は、薬学的組成物を製造する方法および疾患を診断する方法にも関する。更に本発明は、本発明のポリヌクレオチドを検出する方法に関する。更に診断的および薬学的組成物が本発明に含まれる。その上さらに本発明は、本発明のポリヌクレオチド、遺伝子、ベクター、ポリペプチドまたは抗体の使用に関する。最後に本発明は、診断キットに関する。
2004527229.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド：
(a)配列番号:54、56、58、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、106、108、110、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、128、129、130、131、133、134、135、136、137、138、139、140、142、143、149、151、153、155、157、159、161、163、165、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、193、195、197、199、201、207、208、209、210、211、212、213、214、216、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、231、232、233、235または236の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号:127、132、141、215、229、または234のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；
(c)CYP3A5遺伝子にハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであり、位置-20643、-20555、-20359、-20367、-20329、-20323、-20310、-6200、-6177、-4336、-3990、-3868、-3844、-3557、-1617、-795、-86、-74、136、174から176、230、3705、3709/3710、5215、5235、5516、7182、7207、7303、7424/7427、12907、13028、13077、13173、13226、13376、14720、14836、14903、15788、16079、16931/16932、16993、17163、19069、19165、19208、27050、27131/27132、27526、31499、31551または31611に対応する位置でのヌクレオチド交換、少なくとも1個のヌクレオチドのヌクレオチド欠失、または少なくとも1個の付加ヌクレオチドを有する、ポリヌクレオチド；
(d)CYP3A5遺伝子にハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであり、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220が+1に番号付けられ、および位置174832が+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、ここで位置27341が+8614に番号付けられる)の位置-20555、-20329、-20323、-4336、-3868、-3844、-795、-86、230、5235、5516、7182、7303、12907、13028、13376、19069または19165に対応する位置に、Aを有し、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220が+1に番号付けられ、および位置174832が+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、ここで位置27341が+8614に番号付けられる)の位置-20367、-6200、-74、3705、5215、7207、14836、17163、19208または27526に対応する位置に、Tを有し、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220が+1に番号付けられ、および位置174832が+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、ここで位置27341が+8614に番号付けられる)の位置-6177、-3990、13077、14720、14903、16993または27050に対応する位置に、Gを有し、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220が+1に番号付けられ、および位置174832が+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、ここで位置27341が+8614に番号付けられる)の位置-20643、-20310、-3557、-1617、136、13173、13226、15788、16079、31499、31551または31611に対応する位置に、Cを有し、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220が+1に番号付けられ、および位置174832が+8613に番号付けられる)の位置174から176に対応する位置に、ヌクレオチド欠失を有し、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220が+1に番号付けられ、および位置174832が+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、ここで位置27341が+8614に番号付けられている)の位置3709/3710または27131/27132に対応する位置に、付加ヌクレオチドを有し、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220が+1に番号付けられ、および位置174832が+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、ここで位置27341が+8614に番号付けられる)の位置16931/16932に対応する位置に、3個の付加ヌクレオチドを有し、またはCYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220が+1に番号付けられ、および位置174832が+8613に番号付けられる)の位置7424から7427に対応する位置に、2個のヌクレオチドの欠失および挿入された9個の付加ヌクレオチドを有する、ポリヌクレオチド；
(e)CYP3A5ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドまたはそれらの断片、ここでポリペプチドが、CYP3A5ポリペプチド(アクセッション番号:NP_000768.1)の位置30、100、130、149または488に対応する位置にアミノ酸置換、またはCYP3A5ポリペプチド(アクセッション番号:NP_000768.1)の位置30から34または346から348に対応する位置に少なくとも1個のアミノ酸交換もしくは終止コドンを含む、ポリヌクレオチド；ならびに
(f)CYP3A5ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドまたはその断片であり、ここでポリペプチドが、CYP3A5ポリペプチド(アクセッション番号:NP_000768.1)の位置30から34に対応する位置でのHGLFKからYGTF.へのアミノ酸置換(ピリオドが終結を意味する)、CYP3A5ポリペプチド(アクセッション番号:NP_000768.1)の位置100に対応する位置でのSからYへのアミノ酸置換、CYP3A5ポリペプチド(アクセッション番号:NP_000768.1)の位置130に対応する位置でのRからQへのアミノ酸置換、CYP3A5ポリペプチド(アクセッション番号:NP_000768.1)の位置149に対応する位置でのIからTのアミノ酸置換、CYP3A5ポリペプチド(アクセッション番号:NP_000768.1)の位置346から348に対応する位置でのTYDからYL.(ピリオドが終結を意味する)のアミノ酸置換、または、CYP3A5ポリペプチド(アクセッション番号:NP_000768.1)の位置488に対応する位置でのIからTへのアミノ酸置換を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
癌、または心臓血管疾患、糖尿病およびAIDSを含む疾患に関連している、請求項1記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
DNAまたはRNAである、請求項1から2のいずれか1項記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項1から2のいずれか1項記載のポリヌクレオチドを含む遺伝子。
【請求項５】
ヌクレオチド欠失、付加および／または置換が、対応する野生型遺伝子と比べ、変異型遺伝子の変更された発現を生じる、請求項4記載の遺伝子。
【請求項６】
請求項1〜3いずれか1項記載のポリヌクレオチドまたは請求項4または5記載の遺伝子を含む、ベクター。
【請求項７】
ポリヌクレオチドが、原核細胞もしくは真核細胞またはそれらの単離された画分において発現することができる発現制御配列に機能的に連結される、請求項6記載のベクター。
【請求項８】
請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、請求項4もしくは5記載の遺伝子または請求項6または7記載のベクターにより遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項９】
分子変異型CYP3A5ポリペプチドまたはそれらの断片を作製する方法であって、
(a)請求項8記載の宿主細胞を培養する工程；および
(b)タンパク質または断片を培養物から回収する工程を含む、方法。
【請求項１０】
請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、請求項4もしくは5記載の遺伝子または請求項6もしくは7記載のベクターを用いて細胞を遺伝子操作することを含む、分子変異型CYP3A5ポリペプチドを発現することが可能である細胞を作製する方法。
【請求項１１】
請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、請求項4または5記載の遺伝子によりコードされるか、もしくは、請求項9記載の方法によるかまたは請求項10記載の方法により作出された細胞から入手可能である、ポリペプチドまたはそれらの断片。
【請求項１２】
請求項11記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１３】
請求項1または5記載のヌクレオチド交換から生じる、1個または複数のアミノ酸置換を含むエピトープを特異的に認識する、請求項12記載の抗体。
【請求項１４】
モノクローナルまたはポリクローナルである、請求項12または13記載の抗体。
【請求項１５】
請求項1〜4のいずれか1項記載の少なくとも1個のポリヌクレオチド、請求項5もしくは6記載の遺伝子または請求項7もしくは8記載のベクターを含む、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１６】
マウス、ラットまたはゼブラフィッシュである、請求項15記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１７】
1種または複数種の請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、請求項4もしくは5記載の遺伝子、請求項6もしくは7記載のベクター、請求項11記載のポリペプチド、請求項12もしくは13記載の抗体、または請求項8記載の宿主細胞を、固定化された形状で含む、固形支持体。
【請求項１８】
膜、ガラスチップ、ポリプロピレンチップまたはシリコンチップであり、オリゴヌクレオチド複合したビーズまたは光学フィルター基板上に集成されたビーズアレイである、請求項17記載の固形支持体。
【請求項１９】
多型を同定するインビトロ法であって、
(a)複数の個体亜群から、請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチドまたは請求項4もしくは5記載の遺伝子を単離する工程であり、ここでひとつの亜群が、CYP3A5関連疾患を有病せず、かつ少なくともひとつまたは複数の更なる亜群が、CYP3A5関連疾患を有病している、工程；および
(b)CYP3A5関連疾患を有病していないひとつの亜群のポリヌクレオチドまたは遺伝子の核酸配列を、CYP3A5関連疾患を有病する少なくともひとつまたは複数の更なる亜群と比較することにより、多型を同定する工程を含む、方法。
【請求項２０】
CYP3A5ポリペプチドの分子変異型の活性を変調することが可能なプロドラッグまたは薬物を同定しかつ入手する方法であって、
(a)請求項11記載のポリペプチド、請求項17もしくは18記載の固形支持体、請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチドを含む分子変異型遺伝子を発現している細胞、請求項4もしくは5記載の遺伝子、または請求項6もしくは7記載のベクターを、プロドラッグまたは薬物活性に関してスクリーニングされる化合物と、薬物活性に反応して検出可能なシグナルを提供することが可能な成分の存在下で、接触させる工程；ならびに
(c)プロドラッグまたは薬物活性から生じたシグナルの存在もしくは非存在、またはシグナルの増加もしくは減少を検出する工程であり、ここでシグナルの非存在、存在、増加または減少が、プロドラッグまたは薬物の推定の指標である工程を含む、方法。
【請求項２１】
CYP3A5ポリペプチドの分子変異型の活性阻害剤を同定しかつ入手する方法であって、
(d)請求項11記載のタンパク質、請求項17もしくは18記載の固形支持体、または請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチドを含む分子変異型遺伝子を発現している細胞、または請求項4もしくは5記載の遺伝子、または請求項6もしくは7記載のベクターを、阻害活性に関してスクリーニングされる化合物と、薬物活性に反応して検出可能なシグナルを提供することが可能な成分の存在下で、接触させる工程；ならびに
(e)阻害活性から生じたシグナルの存在もしくは非存在、またはシグナルの増加もしくは減少を検出する工程であり、ここでシグナルの非存在または減少が、阻害活性の推定の指標である工程を含む、方法。
【請求項２２】
細胞が、請求項10記載の方法により得られる請求項9記載の細胞であるか、もしくは請求項15または16記載のトランスジェニック非ヒト動物により得ることができる、請求項20または21記載の方法。
【請求項２３】
CYP3A5ポリペプチドの分子変異型の活性を変調することが可能なプロドラッグまたは薬物を同定しかつ入手する方法であって、
(a)請求項8記載の宿主細胞、請求項10記載の方法により得られた細胞、請求項11記載のポリペプチドまたは請求項17もしくは18記載の固形支持体を、CYP3A5ポリペプチドにより結合されることがわかっている第一の分子と接触させ、ポリペプチドおよび第一の分子の第一の複合体を形成する工程；
(b)第一の複合体をスクリーニングされる化合物と接触させる工程；ならびに
(c)化合物が、該第一の複合体の該第一の分子と置き換わるかどうかを測定する工程を含む、方法。
【請求項２４】
CYP3A5ポリペプチドの分子変異型またはその遺伝子産物の活性を変調することが可能な阻害剤を同定しかつ入手する方法であって、
(a)請求項8記載の宿主細胞、請求項10記載の方法により得られた細胞、請求項11記載のタンパク質または請求項17もしくは18記載の固形支持体を、CYP3A5ポリペプチドにより結合されることがわかっている第一の分子と接触させ、タンパク質および第一の分子の第一の複合体を形成する工程；
(b)第一の複合体をスクリーニングされる化合物と接触させる工程；および
(c)化合物が、該第一の複合体の該第一の分子と置き換わるかどうかを測定する工程を含む、方法。
【請求項２５】
測定工程が、タンパク質および化合物の第二の複合体の形成を測定することを含む、請求項23または24記載の方法。
【請求項２６】
測定工程が、タンパク質に結合していない第一の分子の量を測定することを含む、請求項23〜25のいずれか1項記載の方法。
【請求項２７】
第一の分子が標識されている、請求項23〜26のいずれか1項記載の方法。
【請求項２８】
請求項20〜27のいずれか1項記載の方法の工程；および、薬学的に許容できる形状に、同定されかつ入手された化合物またはそれらの誘導体を製剤化する更なる工程を含む、薬学的組成物の製造法。
【請求項２９】
被験者からの試料中の請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチドまたは請求項4もしくは5記載の遺伝子の存在を決定することを含む、CYP3A5遺伝子の分子変異型の存在に関連した障害、またはこのような障害の易罹患性を診断する方法。
【請求項３０】
請求項11記載のポリペプチドまたは請求項12〜14のいずれか1項記載の抗体の存在を決定することを更に含む、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
被験者からの試料中の請求項11記載のポリペプチドまたは請求項12〜14のいずれか1項記載の抗体の存在を決定することを含む、CYP3A5遺伝子の分子変異型の存在に関連した障害、またはこのような障害の易罹患性を診断する方法。
【請求項３２】
障害が、癌または心臓血管系疾患、糖尿病およびAIDSを含む疾患である、請求項29〜31のいずれか1項記載の方法。
【請求項３３】
PCR、リガーゼ連鎖反応、制限酵素消化、直接的配列決定、核酸増幅技術、ハイブリダイゼーション技術、質量分析またはイムノアッセイ法を含む、請求項29〜32のいずれか1項記載の方法。
【請求項３４】
試料中の請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチドまたは請求項4もしくは5記載の遺伝子の検出法であって、
(a)請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチドまたは請求項4もしくは5記載の遺伝子と固形支持体上の固定化された標的の間の相互作用を可能にする条件下で、請求項17または18記載の固形支持体を、試料と接触させる工程；および
(b)ポリヌクレオチドまたは遺伝子の、固形支持体上の固定化された標的への結合を決定する工程を含む、方法。
【請求項３５】
請求項34記載の方法の工程を含む、疾患を診断するインビトロ法であって、ポリヌクレオチドまたは遺伝子の、固形支持体上の固定化された標的との結合が、疾患の存在もしくは非存在または該疾患有病の指標である、方法。
【請求項３６】
請求項1〜4のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、請求項3もしくは4記載の遺伝子、請求項6もしくは7記載のベクター、請求項11記載のポリペプチドまたは請求項12もしくは13記載の抗体を含む、診断用組成物。
【請求項３７】
請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、請求項4もしくは5記載の遺伝子、請求項6もしくは7記載のベクター、請求項11記載のポリペプチドまたは請求項12もしくは13記載の抗体を含む、薬学的組成物。
【請求項３８】
疾患の診断のための診断用組成物を調製するための、請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、配列番号:104を含むポリヌクレオチド、配列番号:145を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、請求項4もしくは5記載の遺伝子、請求項6もしくは7記載のベクター、請求項11記載のポリペプチド、配列番号:145を含むポリペプチド、または請求項12もしくは13記載の抗体の使用。
【請求項３９】
疾患の治療のための薬学的組成物を調製するための、請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、配列番号:104を含むポリヌクレオチド、配列番号:145を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、請求項4もしくは5記載の遺伝子、請求項6もしくは7記載のベクター、請求項11記載のポリペプチド、配列番号:145を含むポリペプチド、または請求項12もしくは13記載の抗体の使用。
【請求項４０】
CYP3A5遺伝子の変異型アリルを含むゲノムを有する被験者において疾患を診断するための診断用組成物を調製するための：
(a)配列番号:82、88、104または112の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号:127、132、141または145のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；
(c)CYP3A5遺伝子にハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであり、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220が+1に番号付けられ、および位置174832が+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、ここで位置27341が+8614に番号付けられている)の位置3709/3710または27131/27132に対応する位置に、少なくとも1個の追加ヌクレオチドを、もしくはCYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220が+1に番号付けられ、および位置174832が+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、ここで位置27341が+8614に番号付けられる)の位置7303または27289に対応する位置に、ヌクレオチド交換を有する、ポリヌクレオチド；
(d)CYP3A5遺伝子にハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであり、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220が+1に番号付けられ、および位置174832が+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、ここで位置27341が+8614に番号付けられている)の位置3709/3710に対応する位置に、追加のGヌクレオチドを、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220が+1に番号付けられ、および位置174832が+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、ここで位置27341が+8614に番号付けられている)の位置27131/27132に対応する位置に、追加のTヌクレオチドを、または、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220が+1に番号付けられ、および位置174832が+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、ここで位置27341が+8614に番号付けられている)の位置7303もしくは27289に対応する位置にAを有する、ポリヌクレオチドからなる群より選択されたポリヌクレオチドの使用であって、
ここでアリルが、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220が+1に番号付けられ、および位置174832が+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、ここで位置27341が+8614に番号付けられている)の位置6986に対応する位置にAを有するポリヌクレオチドの、使用。
【請求項４１】
CYP3A5遺伝子の変異型アリルを含むゲノムを有する被験者において疾患を診断するための診断用組成物の調製するための、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220が+1に番号付けられ、および位置174832が+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、ここで位置27341が+8614に番号付けられている)の位置14690に対応する位置にAを有するポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドの使用であって、
アリルが、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220が+1に番号付けられ、および位置174832が+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、ここで位置27341が+8614に番号付けられている)の位置6986に対応する位置にAを有するポリヌクレオチドの、使用。
【請求項４２】
被験者がアフリカ系アメリカ人である、請求項40または41記載の使用。
【請求項４３】
疾患が、癌または心臓血管系疾患、糖尿病およびAIDSを含む疾患である、請求項38〜41のいずれか1項記載の使用。
【請求項４４】
請求項1〜3のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、請求項4もしくは5記載の遺伝子、請求項6もしくは7記載のベクター、請求項11記載のポリペプチド、請求項12または13記載の抗体、請求項8記載の宿主細胞、請求項15もしくは16記載のトランスジェニック非ヒト動物、または、請求項17もしくは18記載の固形支持体を含む、一塩基多型の検出のための、診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多型CYP3A5ポリヌクレオチドに関する。更に本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子またはベクター、並びに本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子で遺伝子操作された宿主細胞に関する。更に本発明は、分子変異型ポリペプチドまたはそれらの断片の作出法、分子変異型ポリペプチドを発現することが可能な細胞の作出法、並びに本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子によりコードされたポリペプチドまたはそれらの断片、もしくはこの方法によりまたは本発明の方法により作出された細胞から入手可能なものに関する。更に本発明は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体に関する。更に本発明は、トランスジェニック非ヒト動物に関する。本発明は同じく、1個または複数の前述のポリヌクレオチド、遺伝子、ベクター、ポリペプチド、抗体または宿主細胞を含む固形支持体にも関する。更に、多型を同定する方法、プロドラッグまたは薬物または阻害剤を同定しかつ入手する方法も、本発明に包含されている。加えて本発明は、薬学的組成物の製造法および疾患の診断法に関する。更に本発明は、本発明のポリヌクレオチドの検出法に関する。更に本発明は、診断用組成物および薬学的組成物が含まれる。更にまた本発明は、本発明のポリヌクレオチド、遺伝子、ベクター、ポリペプチドまたは抗体の使用にも関する。最後に本発明は、診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
CYP3A酵素は、薬物代謝において特に重要な役割を果たす。これは、広い物質スペクトルと組合わせた、肝におけるそれらの豊富な発現に起因している。実際、CYP3Aアイソザイムは、集合的に肝CYPタンパク質の最大部分を含み(Thummel、Annu Rev Pharmacol Toxicol、38:389-430(1998))、およびこれらは現在使用されている全薬物の45％〜60％の代謝に関与している(Li、Toxicology、104:1-8(1995)；Evans、Science、286:487-91(1999))と推定されている。CYP3Aアイソザイムは、薬物に加え、ステロイドホルモン、毒物および発癌性物質を含む、様々な他の化合物を代謝する。例えば、CYP3Aアイソザイムは、肝癌の病因に強力に関与したマイコトキシンであり、アフリカおよびアジアの多くの地域において若年死の主要な原因となっている(Henry、Science、286:2453-4(1999))、アフラトキシンB1(Wang、Biochemistry、37:12536-45(1998)；Gillam、Arch Biochem Biophys、317:374-84(1995)；Li、Cancer Res、57:641-5(1997))を代謝する。
【０００３】
CYP3Aアイソザイムの肝発現および活性は、個人間で変動があり、この変動性は、CYP3A基質である薬物の開発および適用において頻繁に遭遇する有害な相互作用の理由である。変動するCYP3A発現は、CYP3Aにより代謝される環境の発癌性物質によって引き起された癌に対する個人の背景因子に影響を及ぼすことも自明のことと見なされる。個人のCYP3A活性を制御する因子の解明は、その基質による療法において個人向けの用量調節を可能にし、更にいくつかの一般的癌に対して増大したリスクを持つ亜集団の同定にもつながると考えられる。しかしかなりの努力が払われたにも関わらず、CYP3Aの活性および発現を左右する因子に関する理解は限られたものである。これにはいくつかの理由がある。平均的ヒト肝臓は、最大4種のCYP3A遺伝子産物を発現することができる(Gellner、Pharmacogenetics、 11:111-121(2001))が、肝CYP3Aプールに対するそれらの各々の寄与は、依然議論の的である。酵素的方法による個人のCYP3Aタンパク質間の識別は、基質特異性の重複のため、およびそれらの触媒活性に対し再構成条件がかなり影響を及ぼすために困難であることが証明されている。RNAおよびタンパク質の分析から、CYP3A4は、バルク量の肝CYP3Aタンパク質を産生し、かつその発現は高度に変動することが示されている(Thummel、Annu Rev Pharmacol Toxicol、38:389-430(1998))。他のCYP3A遺伝子の寄与は、余りわかっていない。CYP3A5は、肝臓における第二の最も重要なCYP3Aタンパク質であるが、入手できるデータには矛盾があり、その理由は、その発現はヒト肝臓の10％〜97％に存在することが報告されているからであると広く考えられている(Aoyama、J Biol Chem、264:10388-95(1989)；Wrighton、Mol Pharmacol、38:207-13(1990)；Schuetz、Pharmacogenetics、4:11-20(1994)；Jounaidi、Biochem Biophys Res Commun、221:466-70(1996)；Boobis、Br J Clin Pharmacol、42:81-9(1996))。これらの不一致の考えられる理由は、小さい試料サイズ、人種間差およびCYP3A5発現の測定に使用したプローブの貧弱な特異性である。第三のCYP3AであるCYP3A7は、当初、ヒト胎児肝において説明され、そこでは総CYPタンパク質の約50％を占めていた(Wrighton、Biochem Pharmacol、37:3053-5(1988))。より最新の研究は、成人肝におけるCYP3A7の構成的または誘導的発現を示しているが、その定量は、特異的抗体がないことが足枷となっている。同様に最近同定されたファミリーの第四のメンバーであるCYP3A43に関する入手可能な、タンパク質発現データはない(Gellner、Pharmacogenetics、11:111-121(2001))。
【０００４】
臨床試験は、個体間のCYP3A変動性の主要部分が遺伝的要因により引き起されることを示している(Ozdemir、Pharmacogenetics、10:373-88(2000))が、遺伝的要因の正体は依然不明である。CYP3A5に関して、タンパク質変異型(Thr398Asn)が、CYP3A5発現欠損の個体5名中2名において発見された(Jounaidi、Biochem Biophys Res Commun、221:466-70(1996))が、その意義については、非常に多数の肝試料についておよび機能試験においては証明されていない。加えてこの遺伝子の増大した発現および活性に関連しているふたつの連結した多型からなるハプロタイプが、CYP3A5遺伝子の5'隣接領域において説明されている(Paulussen、Pharmacogenetics、10:415-24(2000))。しかし、少数の試料セット(n=29)が、遺伝子型および表現型について分析されたのみである。更に前述の文献において明らかにされている一塩基多型(SNP)は、CYP3A5の機能障害および／または調節不能(dysregulation)の並びにそれらにより引き起される問題点の信頼できる予測には適していない。この文献は、更なるハプロタイプの存在を示唆していない。
【０００５】
従って、薬物代謝の機能障害または調節不能を基にした様々な疾患および障害を診断および治療するための改善された手段および方法は、依然使用可能ではないが、しかしそれにも関わらず非常に望まれている。従って本発明の基礎となる技術的課題は、先に特定した必要性を満たすものである。
【発明の開示】
【０００６】
この技術的課題の解決は、「特許請求の範囲」に特徴付けられた態様を提供することにより達成される。
【０００７】
従って、本発明は、下記からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに関する：
(a)配列番号:54、56、58、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、106、108、110、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、128、129、130、131、133、134、135、136、137、138、139、140、142、143、149、151、153、155、157、159、161、163、165、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、193、195、197、199、201、207、208、209、210、211、212、213、214、216、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、231、232、233、235または236の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号:127、132、141、215、229、または234のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；
(c)CYP3A5遺伝子にハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであり、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220は+1に番号付けられ、および位置174832は+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、ここで位置27341は+8614に番号付けられる)の位置-20643、-20555、-20359、-20367、-20329、-20323、-20310、-6200、-6177、-4336、-3990、-3868、-3844、-3557、-1617、-795、-86、-74、136、174から176、230、3705、3709/3710、5215、5235、5516、7182、7207、7303、7424/7427、12907、13028、13077、13173、13226、13376、14720、14836、14903、15788、16079、16931/16932、16993、17163、19069、19165、19208、27050、27131/27132、27526、31499、31551または31611に対応する位置のヌクレオチド交換、少なくとも1個のヌクレオチドのヌクレオチド欠失、または少なくとも1個の付加ヌクレオチドを有する、ポリヌクレオチド；
(d)CYP3A5遺伝子にハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであり、ここでポリヌクレオチドが、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220は+1に番号付けられ、および位置174832は+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、ここで位置27341は+8614に番号付けられる)の位置-20555、-20329、-20323、-4336、-3868、-3844、-795、-86、230、5235、5516、7182、7303、12907、13028、13376、19069または19165に対応する位置に、Aを有し、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220は+1に番号付けられ、および位置174832は+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、ここで位置27341は+8614に番号付けられる)の位置-20367、-6200、-74、3705、5215、7207、14836、17163、19208または27526に対応する位置に、Tを有し、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220は+1に番号付けられ、および位置174832は+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、ここで位置27341は+8614に番号付けられる)の位置-6177、-3990、13077、14720、14903、16993または27050に対応する位置に、Gを有し、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220は+1に番号付けられ、および位置174832は+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、ここで位置27341は+8614に番号付けられる)の位置-20643、-20310、-3557、-1617、136、13173、13226、15788、16079、31499、31551または31611に対応する位置に、Cを有し、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220は+1 に番号付けられ、および位置174832は+8613に番号付けられる)の位置174から176に対応する位置に、ヌクレオチド欠失を有し、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220は+1に番号付けられ、および位置174832は+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、ここで位置27341は+8614に番号付けられている)の位置3709/3710または27131/27132に対応する位置に、付加ヌクレオチドを有し、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220は+1に番号付けられ、および位置174832は+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、ここで位置27341は+8614に番号付けられる)の位置16931/16932に対応する位置に、3個の付加ヌクレオチドを有し、またはCYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220は+1に番号付けられ、および位置174832は+8613に番号付けられる)の位置7424から7427に対応する位置に、2個のヌクレオチド欠失および挿入された9個の付加ヌクレオチドを有する、ポリヌクレオチド；
(e)CYP3A5ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドまたはそれらの断片、ここでポリペプチドは、CYP3A5 ポリペプチド(アクセッション番号:NP_000768.1)の位置30、100、130、149または488に対応する位置にアミノ酸置換、またはCYP3A5ポリペプチド(アクセッション番号:NP_000768.1)の位置30から34または346から348に対応する位置に少なくとも1個のアミノ酸交換もしくは終止コドンを含むポリヌクレオチド；ならびに
(f)CYP3A5ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドまたはその断片であり、CYP3A5ポリペプチド(アクセッション番号:NP_000768.1)の位置30から34に対応する位置でのHGLFKからYGTF.へのアミノ酸置換(ピリオドは終結を意味する)、CYP3A5ポリペプチド(アクセッション番号:NP_000768.1)の位置100に対応する位置でのSからYへのアミノ酸置換、CYP3A5ポリペプチド(アクセッション番号:NP_000768.1)の位置130に対応する位置でのRからQへのアミノ酸置換、CYP3A5ポリペプチド(アクセッション番号:NP_000768.1)の位置149に対応する位置でのIからTへのアミノ酸置換、CYP3A5ポリペプチド(アクセッション番号:NP_000768.1)の位置346から348に対応する位置でのTYDからYL.(ピリオドは終結を意味する)へのアミノ酸置換、または、CYP3A5ポリペプチド(アクセッション番号:NP_000768.1)の位置488に対応する位置でのIからTへのアミノ酸置換を含むポリヌクレオチド。
【０００８】
本発明の状況において、「ポリヌクレオチド」という用語または「ポリペプチド」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの様々な変異型を意味する。該変異型は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの参照または野生型配列に加え、構造または組成がそれらから異なる変異型を含む。これらのポリヌクレオチドの参照または野生型配列は、アクセッション番号:AF280107.1およびAC005020.2である。本発明のポリペプチドの参照または野生型配列は、アクセッション番号:NP_000768.1である。構造または組成の差異は、通常、ヌクレオチドまたはアミノ酸の1つまたは複数の置換、1つまたは複数の付加および／または1つまたは複数の欠失によって生じる。好ましくは該ヌクレオチドの1つまたは複数の置換、1つまたは複数の付加または1つまたは複数の欠失は、本発明のポリペプチドの対応する1つまたは複数のアミノ酸の1種または複数の変化を生じる。この変異型ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、本発明の該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの断片も含む。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに加え前述のそれらの断片は、CYP3A5機能不全または調節不能に関連づけられるという特徴がある。好ましくは、本発明において言及される該機能不全または調節不能は、疾患もしくは障害または該疾患もしくは障害の有病を引き起す。好ましくは、以下に詳細に説明するように、該疾患は、癌、もしくは心臓血管系疾患、糖尿病およびAIDSを含む疾患、または本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドに起因した機能不全または調節不能により引き起される他の疾患である。
【０００９】
本発明ポリヌクレオチドは、CYP3A5遺伝子と少なくとも70％、好ましくは少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含み、ここで該ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド交換、少なくとも1個のヌクレオチドのヌクレオチド欠失、または少なくとも1個の付加ヌクレオチドを、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220は+1に番号付けられ、および位置174832は+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、ここで位置27341は+8614に番号付けられる)の位置-20643、-20555、-20359、-20367、-20329、-20323、-20310、-6200、-6177、-4336、-3990、-3868、-3844、-3557、-1617、-795、-86、-74、136、174から176、230、3705、3709/3710、5215、5235、5516、7182、7207、7303、7424/7427、12907、13028、13077、13173、13226、13376、14720、14836、14903、15788、16079、16931/16932、16993、17163、19069、19165、19208、27050、27131/27132、27526、31499、31551または31611に対応する位置に有する。
【００１０】
本明細書において使用される「ハイブリダイズ」という用語は、CYP3A5の機能不全または調節不能に関連している本発明のポリヌクレオチドまたはその一部にハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドを意味する。従って該ハイブリダイズするポリヌクレオチドは、該機能不全および調節不能にも関連している。その結果、該ポリヌクレオチドは、RNAまたはDNA調製の、各々、ノーザンブロットまたはサザンブロット分析におけるプローブとして有用であることもでき、もしくはそれらの各サイズに応じて、PCR分析におけるオリゴヌクレオチドプライマーとして使用することができる。同じく本発明は、例えば電気泳動移動度シフト分析(EMSA)による、DNA-タンパク質相互作用の分析に有用であるハイブリダイズするポリヌクレオチドも含む。好ましくは、該ハイブリダイズするポリヌクレオチドは、長さが少なくとも10個、より好ましくは少なくとも15個のヌクレオチドを含む一方で、プローブとして使用される本発明のハイブリダイズするポリヌクレオチドは、長さが好ましくは少なくとも100個、より好ましくは少なくとも200個、または最も好ましくは少なくとも500個のヌクレオチドを含む。いかにして核酸分子とのハイブリダイゼーション実験を行うかは、当該技術分野において周知であり、すなわち当業者は、どのハイブリダイゼーション条件を、本発明により使用すべきかを知っている。このようなハイブリダイゼーション条件は、「Molecular Cloning A Laboratory Manual」(Cold Spring Harbor Laboratory(1989)ニューヨーク)のような標準的教科書において言及されている。本発明では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、すなわち本発明のCYP3A5ポリペプチドとは異なるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドのような無関係のポリヌクレオチドとはクロスハイブリダイズしない条件下で、CYP3A5機能不全または調節不能に関連している本発明のポリヌクレオチドまたはその一部にハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドが好ましい。
【００１１】
核酸ハイブリダイゼーションは、当業者には容易に理解されるように、塩濃度、温度または有機溶媒などの条件に加え、塩基組成、相補鎖の長さおよびハイブリダイズする核酸の間のヌクレオチド塩基ミスマッチの数により影響を受けると考えられる。ストリンジェントな温度条件は一般に、30℃、典型的には37℃を超える温度を含み、および好ましくは45℃を超える。ストリンジェントな塩条件は、通常1000mM未満、典型的には500mM未満、および好ましくは200mM未満である。しかし、これらのパラメータの組合せは、いずれか単独のパラメータの測定よりもはるかに重要であると考えられる。例えばWetmurおよびDavidsonの論文(1968)を参照のこと。プローブ配列も、ある条件下で二重鎖DNAに特異的にハイブリダイズし、三重鎖またはより高次のDNA複合体を形成することができる。このようなプローブの調製および適当なハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野において周知である。
【００１２】
「配列同一性の割合(％)」または「同一」という用語は核酸配列の状況において、最大の対応になるように並置した場合に同じであるふたつの配列内の残基を指す。配列長の同一性の比較は、少なくとも9個のヌクレオチド、一般的には少なくとも20個のヌクレオチド、より一般的には少なくとも24個のヌクレオチド、典型的には少なくとも28個のヌクレオチド、より典型的には少なくとも32個のヌクレオチド、および好ましくは少なくとも36個のヌクレオチドまたはそれ以上の一続きのヌクレオチドを超えることができる。ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる当該技術分野において公知の多くの様々なアルゴリズムが存在する。例えば、ポリヌクレオチド配列は、GCG Ver.6.6のプログラムにおいてFastaを用い比較することができる。Fastaは、クエリー配列とサーチ配列の間の最も良く重複した領域のアラインメントおよび％配列同一性を提供する(Pearson、1980、本明細書に参照として組入れられている)。例えば、核酸配列間の％配列同一性は、GCG Ver.6.1で提供されたように、Fastaをそのデフォルトのパラメータで用い決定することができ(ワードサイズ6およびスコア化マトリックスのためのNOPAM因子)、これは本明細書に参照として組入れられている。
【００１３】
本明細書において使用される「対応する」という用語は、位置が、各々先行するヌクレオチドおよびアミノ酸の数によってのみ決定されないことを意味する。欠失され、置換されまたは1個または複数の付加ヌクレオチドを含むことがある本発明の所定のヌクレオチドまたはアミノ酸の位置は、遺伝子またはポリペプチドのどこかで欠失または付加されたヌクレオチドまたはアミノ酸のために変動し得る。従って本発明の「対応する位置」に従い、ヌクレオチドまたはアミノ酸は示された数と異なることはあるが、依然類似した近傍のヌクレオチドまたはアミノ酸を有し得ることは理解されなければならない。交換され、欠失されるかまたは付加されたヌクレオチドもしくはアミノ酸を含み得る該ヌクレオチドまたはアミノ酸も、「対応する位置」という用語に含まれる。該ヌクレオチドまたはアミノ酸は例えば近隣と一緒に、遺伝子発現の調節、対応するRNAの安定性またはRNAの編集に関与し、並びに本発明のタンパク質の機能ドメインまたはモチーフをコードし得る配列を形成することができる。
【００１４】
例えば「位置3709/3710」は、該ポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの対応する野生型バージョンの位置3709と位置3710の間に挿入された1個または複数の付加ヌクレオチドを含むことを意味する。同じことが、同じ様式で描かれた前述の態様、すなわち斜線(/)で区切られた2個の連続する位置番号に関して、必要な変更を加えて、他の位置番号全てに当てはまる。例えば「位置7424から7427」は、該ポリヌクレオチドが、該ポリヌクレオチドの対応する野生型バージョンの位置7424と位置7427の間に欠失された、1個または複数の欠失ヌクレオチドを、および／または、該ポリヌクレオチドの対応する野生型バージョンの位置7424と位置7427の間に挿入されている1個または複数の付加ヌクレオチドを含むことを意味する。同じことが、同じ様式で描かれた前述の態様に関して、必要な変更を加えて、他の位置番号全てに当てはまる。
【００１５】
多型の番号付けは、並置されかつ連結されたゲノム配列AF280107.1およびAC005020.2にあてはめられ、ここで配列AF280107.1の位置174832(これは+8613と番号付けられている)でのTは、配列AC005020.2の位置27340に関係している。配列AC005020.2の位置27341のヌクレオチドAは+8614と番号付けられている。最大+8613までの位置に対応する位置への多型の番号付けは、ゲノム配列AF280107.1に言及し、位置+8614およびそれ以上に対応する位置への多型の番号付けは、ゲノム配列AC005020.2を指す。
【００１６】
本発明に従い、CYP3A5遺伝子の遺伝的変異の様式および集団分布は、多くの異なる個体からのヒト該遺伝子の関連領域の配列分析により分析される。CYP3A5遺伝子を含む全ての遺伝子の個別の遺伝的構成(makeup)を収容している個体のゲノムDNAは、個体の血液試料から容易に精製することができるという事実は周知である。これらの個体のDNA試料は、次にその血液試料を提供した個体に存在するCYP3A5遺伝子のアリルの配列組成の分析に使用される。この配列分析は、該遺伝子の関連領域のPCR増幅、それに続くPCR産物の精製、引き続きの確立された方法(例えば、ABIダイターミネーターサイクルシークエンシング)による自動DNA配列決定により行われた。
【００１７】
ヒト血液ゲノムDNAからのPCR産物の直接DNA-配列決定により、個々の遺伝子型を決定しかつ新規CYP3A5遺伝子の変異型を同定する試みにおいて考慮されるべき重要なパラメータのひとつは、ヒトは各々、各常染色体遺伝子の2つの遺伝子コピー(二倍性)を収容している(通常、非常に稀な異常な例外がある)という事実である。そのために、ホモ接合型配列変種のみではなく、ヘテロ接合型変種も明白に同定することができるように配列の評価には多大な注意が払われなければならない。CYP3A5遺伝子(ホモ接合型およびヘテロ接合型)の新規多型の同定および特徴付けの様々な工程の詳細は、下記「実施例」に説明されている。
【００１８】
過去20年以上にわたり、遺伝的不均質性が、薬物応答の変動の重大な原因として次第に認められてきている。多くの科学情報(Meyer、Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.、37:269-296(1997)およびWest、J. Clin. Pharmacol.、37:635-648(1997))が、いくつかの薬物は、一部の患者において、他のものよりもより良く作用するかまたは高度に毒性であることさえあり得ることをこと、並びにこれらの患者の薬物に対する応答の変動は、分子的基礎に関連し得ることを明確に示している。この「薬理遺伝学」的概念は、薬物に対する応答と患者の遺伝的プロファイルの間の相関関係に照準を合わせている(Marshall、Nature Biotechnology、15:954-957(1997)；Marshall、Nature Biotechnology、15:1249-1252(1997))。この薬物療法に関する集団変動性の概念において、薬理遺伝学は、副作用を伴わずに特定の薬物に反応する患者の同定および選択に有用な道具を提唱している。この同定／選択は、例えば患者の血液白血球からのDNA遺伝子型決定による、遺伝的多型の分子診断、並びに疾患の特徴付けを基にすることができる(Bertz、Clin. Pharmacokinet.、32:210-256(1997)；Engel、J. Chromatogra. B. Biomed. Appl.、678:93-103(1996))。米国における民間健康保険医療団体およびヨーロッパの多くの国々における政府の公衆衛生サービスなどの保健医療基金に関して、この薬理遺伝学的アプローチは、不必要な薬物、無効な薬物および副作用のある薬物の膨大なコストが存在することが原因となっている、保健医療の改善および間接費の低下の両方針を提示することができる。
【００１９】
本発明の変異型遺伝子の突然変異は、時々、単独でまたは組合せのいずれかにおいて、アミノ酸の1つまたは複数の欠失、1つまたは複数の挿入および特に1つまたは複数の置換を生じる。当然、野生型遺伝子または他の突然変異体型においてこのような突然変異を遺伝子操作することも可能である。該遺伝子のDNA配列へこのような修飾を導入する方法は、当業者には周知であり；例えば、Sambrookの「Molecular Cloning A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor Laboratory(1989)ニューヨークを参照のこと。
【００２０】
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の変更の性質を調査するために、インターネットから入手することが可能であるRASMOLなどのソフトウェアプログラムを使用することができる。更に構造モチーフの折畳みのシミュレーションおよびコンピュータによる再設計を、他の適当なコンピュータプログラムを用いて行うことができる(Olszewski、Proteins、25:286-299(1996)；Hoffman、Comput. Appl. Biosci.、11:675-679(1995))。コンピュータは、詳細なタンパク質モデルの立体配置的およびエネルギー的な分析のために使用されうる(Monge、J. Mol. Biol.、247:995-1012(1995)；Renouf、Adv. Exp. Med. Biol.、376:37-45(1995))。これらの分析は、特定の突然変異の薬物の結合および／またはプロセシングに対する影響の同定に使用することができる。
【００２１】
通常、本発明のポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質のアミノ酸配列における該アミノ酸の欠失、付加または置換は、1個または複数のヌクレオチドの置換、挿入または欠失、もしくはそれらの組合せに起因している。好ましくは、該ヌクレオチドの置換、挿入または欠失は、CYP3A5ポリペプチド(アクセッション番号:NP_000768.1)の30から34の位置に対応する位置での、HGLFKからYGTF.へのアミノ酸置換(ピリオドは終結を意味する)、CYP3A5ポリペプチド(アクセッション番号:NP_000768.1)の位置100に対応する位置でのSからYへのアミノ酸置換、CYP3A5ポリペプチド(アクセッション番号:NP_000768.1)の位置346から348に対応する位置でのTYDからYL.へのアミノ酸置換(ピリオドは終結を意味する)、またはCYP3A5ポリペプチド(アクセッション番号:NP_000768.1)の位置398に対応する位置でのTからNへのアミノ酸置換をもたらし得る。
【００２２】
本発明に従い検出されたCYP3A5遺伝子の突然変異を、表2A-Eに列記している。突然変異分析の方法は、標準プロトコールに従い、かつ「実施例」に詳細に説明している。一般にこのような方法は、表現型スペクトルに加え、機能不全に関連した疾患または状態並びに薬物代謝に関連した疾患の重複する臨床特性の評価に関し、本発明に従い使用される。有利なことに、該突然変異体の特徴付けは、例えば癌療法並びに心臓血管系疾患、糖尿病およびAIDSを含む疾患において使用される薬物のような、改善された薬物開発の基礎を成すことができる。この方法は、例えばハプロタイプ分析、一本鎖高次構造多型分析(SSCA)、PCRおよび直接配列決定、またはTaqMan(登録商標)分析を包含している。多くの患者の徹底的な臨床特徴付けを基に、次に表現型をこれらの突然変異に加え、例えばJounaidiの論文(Biochem Biophys Res Commun、221:466-470(1996))など、先に説明されている突然変異と相関させることができる。
【００２３】
同じく本発明で言及したポリヌクレオチドには、先に特定したポリヌクレオチド、すなわち前述のポリヌクレオチドにより構成されたまたは下記表に列記された突然変異を少なくとも2個、好ましくは3個含むヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを、少なくとも2個、好ましくは少なくとも3個を含むポリヌクレオチドも含まれる。従って、本発明に従い決定されたハプロタイプは、CYP3A5座位において少なくとも2個、好ましくは3個の該突然変異により特徴付けすることができる。更に本発明のポリヌクレオチドは、先に特定された、例えば先行技術において説明されたもの以外に、少なくとも1個のヌクレオチド欠失、付加および／または置換を含むことができる；例えば、Jounaidi、Biochem Biophys Res Commun、221:466-470(1996)、Paulussen、Pharmacogenetics、10:415-424(2000)、Kuehl、Nature Genetics、27:383-391(2001)、またはChou、Drug Metab Dispos、29:1205-1209(2001)。
【００２４】
これは、CYP3A5遺伝子および／または該ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドにおける該突然変異の、遺伝子のこのような突然変異体型または先に説明されたタンパク質により模倣され得る類似の突然変異体型を生じる患者における薬物の薬理学的プロファイルに対する相乗作用の研究を可能にする。この相乗作用の分析は、先に説明したような薬物代謝に関連した機能不全または疾患の発症へのより深い洞察を提供することが期待される。このより深い洞察から、薬物代謝に関連した機能不全または疾患に関連した診断用組成物および薬学的組成物の開発は、大きな利益を得ると考えられる。
【００２５】
更に驚くべきことに、CYP3A5の機能不全または調節不能に関するいわゆる陽性予測力は、本発明のポリヌクレオチドを基に顕著に増大することができ、その結果先行技術を基にした陽性陽性力とは対照的に信頼できる予測ができることが発見された。本発明に従い同定されかつ下記実施例において詳細に説明されているひとつの肝試料を除いて全ての増大したCYP3A5タンパク質発現(17/18例)は、この遺伝子座の内側または上流の個別の位置での少なくとも3種の変異型(ch-v-021、ch-v-026、ch-v-015)からなるハプロタイプと同時分離する。これら3種の変異型の遺伝子型同定は、いかなる場合にも擬陽性予測を生じることはなく、推定された陽性予測力は、これら3変異遺伝子型については約99.95％になる。これは、Paulussenの論文(Pharmacogenetics、10:415-424(2000))に説明されたハプロタイプについて決定された陽性予測力約65％とは著しい対照をなしている。更に本発明のポリヌクレオチドを基におよび下記実施例に説明されたように、Paulussenの論文(Pharmacogenetics、10:415-424(2000))に説明されたSNPは、該文献において報告されたものとは対照的に、CYP3A5偽遺伝子座位に対し5'側の配列中のCYP3A5遺伝子の転写開始部位のおよそ20kb上流に位置することがわかっている。
【００２６】
従って本発明のポリヌクレオチドを基に特徴付けられたこれらのハプロタイプは、CYP3A5発現の信頼できるマーカーから予想された基準を満たしている。当業者には明らかであるように、本発明から推定された遺伝的知識を使用し、ここでは患者の遺伝子型の正確かつ信頼できる特徴付けがなされる。有利なことに、癌、心臓血管系疾患、糖尿病およびAIDSを含む疾患などの、CYP3A5の機能不全または調節不能に関連した疾患または疾患有病を予測することができ、従って予防的または治療的措置を適用することができる。更に前述に従い、所定の薬物が通常でない作用をもたらす場合、適切な個体の療法を、本発明のポリヌクレオチドに関する被験者個体の遺伝的構成の知識を基に設計することができ、かつ改善された療法を、以下に更に考察されるように開発することができる。
【００２７】
最後に、本発明により言及されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、法医学的マーカーとしても有用であり、これは、例えば暴力犯罪またはいずれか他の暴力により殺害または死傷され、かつ周知の通常の法医学的方法では識別することができない対象の識別を改善する。対象のゲノム内の本発明のポリヌクレオチドにより構成された多型の検出を基にした法医学的方法の適用は、顔面の特徴のような他の身体特徴による識別が不可能であるような深刻な状況で(死)体の外観が損なわれている場合に特に良く適している。これは、例えば、通常完全に外観が損なわれる水中で死骸が発見されたような場合である。本発明のポリヌクレオチドの供給を基にした有利な方法は、実行のためには組織または細胞の最小量のみを必要としている。この組織または細胞は、血痕、毛根、上皮鱗屑、唾液滴、精液などであることができる。このような最小量の組織または細胞が対象の識別に必要とされるので、本発明のポリヌクレオチドにより構成された多型は、暴力または強姦のような犯罪の有罪者を立証するための法医学的マーカーとして使用することもできる。更に、本発明のポリヌクレオチドで構成されたポリヌクレオチドを使用し、父子鑑定を証明することができる。本明細書において言及した法医学的方法に従い、本発明のポリヌクレオチドの存在または非存在が決定され、かつ識別されるべき対象から明らかに得られた参照試料と比較される。本発明のポリヌクレオチにより構成された多型を、対象試料中の本発明のポリヌクレオチドの存在または非存在の検出を必要とする法医学的方法は、例えば、組織または細胞の最小量のみが法医学的試料として入手可能であるような場合に特に良く適したPCRを用いた技術であることができる。他方で、十分な組織または細胞が入手可能な場合、本発明のポリヌクレオチドの存在または非存在を検出するために、ハイブリダイゼーションを用いた技術を行うことができる。これらの技術は、当業者に周知であり、かつ更に骨折ることなく本明細書において言及された個別の目的に適合することができる。結論として、前述の局面が使用可能であることに関しては、改善されかつ信頼できる予測を可能にする本発明の法医学的手段のおかげである。
【００２８】
前述のことを踏まえて、好ましくは本発明のポリヌクレオチドは、癌、または心臓血管系疾患、糖尿病およびAIDSを含む疾患に関連している。
【００２９】
本明細書において使用される「癌」という用語は、当該技術分野においてよく知られておりかつ特徴付けられている。いくつかの癌の変種が存在し、本発明に準じた意味として該用語が構成されている。癌の指標となる症状の詳細なリストは、例えばPschyrembelのような教科書的知識を参照のこと。
【００３０】
更なる態様において、本発明は、DNAまたはRNAであるポリヌクレオチドに関連している。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、DNA、cDNA、ゲノムDNA、RNA、または合成により作製されたDNAもしくはRNA、またはこれらのポリヌクレオチドのいずれかを単独または組合せのいずれかで含む組換えにより作製されたキメラ核酸分子であることができる。好ましくは、該ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドを含むように従来型の遺伝子操作において使用された、ベクターの、特にプラスミド、コスミド、ウイルスおよびバクテリオファージの一部である。このようなベクターは、更に適当な宿主細胞における適当な条件下での該ベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子のような遺伝子を含むことができる。
【００３２】
本発明は更に、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子に関する。遺伝子は、アミノ酸配列をコードしている構造エレメントに加え、該遺伝子の発現の調節に関与した調節エレメントを含むことは、当該技術分野において周知である。構造エレメントは、アミノ酸配列をコードしているか、もしくはアミノ酸配列をコードしていないが、それにもかかわらずRNAの安定性またはRNAの核外輸送を調節することによりRNA機能に関与しているようなRNAをコードしているエキソンにより表わされる。
【００３３】
遺伝子の調節エレメントは、プロモーターエレメントまたはエンハンサーエレメントを含むことができ、これらは両者とも遺伝子発現の転写制御に関連している。プロモーターは、遺伝子の構造エレメントの上流に見いだされることは当該技術分野において十分周知である。しかしエンハンサーエレメントのような調節エレメントは、遺伝子の全遺伝子座に分布して見いだされる。このエレメントは、例えばイントロン中、遺伝子のエキソンを分離しているゲノムDNA領域に存在することができる。このイントロンは、更に適切な遺伝子発現に必要とされる調節エレメントを含むことができる。イントロンは、通常遺伝子のエキソンと共に転写され、エキソン配列およびイントロン配列の両方を含む新生RNA転写産物を生じる。このイントロンをコードしたRNA配列は、通常、RNAスプライシングとして既知のプロセシングにより除去される。しかし、該プロセスは、RNA転写産物上に存在する調節配列も必要とし、該調節配列はイントロンによりコードされ得る。
【００３４】
加えて、転写制御および適切なRNAプロセシングおよび／または安定性の制御におけるそれらの機能に加え、遺伝子の調節エレメントは、遺伝子座位の遺伝的安定性の制御にも関与している。該エレメントは、例えば組換え事象を制御するか、もしくは染色体におけるDNAのある構造またはDNAの配置を維持するために使用する。
【００３５】
従って多型は、前述のアミノ酸配列をコードしている遺伝子のエキソンに加え、先に考察したプロセスに関与した調節領域において生じることができる。例えばイントロンを含むその全体内の遺伝子座位のヌクレオチド配列の分析は、先の望ましさを踏まえている。本発明のポリヌクレオチドにより構成された多型を基に、下記実施例において説明されたほとんどの白人種の肝臓におけるCYP3A5タンパク質の発現増大の機序は、増大された転写および遺伝子転写産物の安定化に関与する可能性があることはわかっている。
【００３６】
従って、本発明の遺伝子のより好ましい態様において、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換は、変異型遺伝子の、対応する野生型遺伝子と比べ変更された発現を生じる。
【００３７】
別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明の遺伝子を含むベクターに関する。
【００３８】
このベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルスまたはレトロウイルスベクターであることができる。レトロウイルスベクターは、複製コンピテントまたは複製欠損であることができる。後者の場合、ウイルス増殖は、一般に相補的である宿主／細胞においてのみ生じると考えられる。
【００３９】
本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子は、宿主において増殖するための選択マーカーを含むベクターに結合することができる。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿などの沈殿物中に、または帯電した脂質または炭素ベースのクラスターとの複合体中に導入される。ベクターがウイルスであるならば、宿主細胞へ適用する前に、適当なパッケージング細胞株を用い、インビトロにおいてパッケージングすることができる。
【００４０】
より好ましい本発明のベクターの態様において、ポリヌクレオチドは、発現制御配列に機能可能に連結され、原核細胞もしくは真核細胞またはそれらの単離された画分における発現を可能にする。
【００４１】
該ポリヌクレオチドの発現は、好ましくは翻訳可能なmRNAへの、ポリヌクレオチドの転写を含む。真核細胞、好ましくは哺乳類細胞における発現を確実にする調節エレメントは、当業者に周知である。これらは通常、転写開始を確実にする調節配列、並びに選択的に転写終結および転写産物の安定化を確実にするポリ-Aシグナルを含む。追加の調節エレメントは、転写に加え翻訳のエンハンサーを含むことができる。原核宿主細胞における発現を許容する可能性のある調節エレメントは、例えば、大腸菌におけるlac、trpまたはtacプロモーターを含み、真核宿主細胞における発現を許容する調節エレメントの例は、酵母におけるAOX1またはGAL1プロモーター、または哺乳類および他の動物細胞におけるCMVプロモーター、SV40プロモーター、RSVプロモーター(ラウス肉腫ウイルス)、CMVエンハンサー、SV40エンハンサーまたはグロビンイントロンである。このような調節エレメントは、転写開始に寄与するエレメントの他にも、該ポリヌクレオチドの下流に、転写終結シグナル、例えばSV40-ポリ-A部位またはtk-ポリ-A部位なども含むことができる。この状況において、Okayama-Berg cDNA発現ベクター pcDV1(Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogene)、pSPORT1(GIBCO BRL)のような適当な発現ベクターが当該技術分野において公知である。好ましくは、該ベクターは、発現ベクターおよび／または遺伝子導入もしくは標的化ベクターである。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシパピロマウイルスなどのウイルス由来の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの標的化された細胞集団への送達に使用することができる。当業者に周知の方法を用い、組換えウイルスベクターを構築することができ；例えば、Sambrookの「Molecular Cloning A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor Laboratory(1989)ニューヨークおよびAusubelの「Current Protocols in Molecular Biology」Green Publishing Associates and Wiley Interscience、ニューヨーク(1994)に説明された技術を参照のこと。または、本発明のポリヌクレオチドおよびベクターは、標的細胞へ送達するためにリポソームへ再構成することができる。
【００４２】
「それらの単離された画分」という用語は、本発明のベクターからRNAを転写するまたは転写および翻訳することが可能な、真核細胞もしくは原核細胞または該細胞を含む組織の画分を意味する。該画分は、RNAの転写またはRNAの転写およびそのRNAのポリペプチドへの翻訳に必要とされるタンパク質を含む。該単離された画分は、例えば赤血球のような真核細胞の核および細胞質画分であることができる。
【００４３】
本発明は更に、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子または本発明のベクターにより遺伝子操作された宿主細胞に関する。
【００４４】
この宿主細胞は、原核または真核細胞であることができる；前記参照。宿主細胞中に存在する本発明のポリヌクレオチドまたはベクターは、宿主細胞のゲノムに組込まれるか、もしくはこれは染色体外で維持され得る。この局面において、本発明の組換えDNA分子は、「遺伝子標的化」および／もしくは「遺伝子置換」のために、突然変異体遺伝子の回復のために、または相同組換えによる突然変異体遺伝子の作出のために使用することができることも理解されると考えられる；例えば、Mouellic、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87:4712-4716(1990)；Joyner、Gene Targeting, A Practical Approach、Oxford University Press参照のこと。
【００４５】
宿主細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれか、例えば細菌、昆虫、真菌、植物、動物またはヒト細胞であることができる。好ましい真菌細胞は、例えば、サッカロミセス属（Saccharomyces）のものであり、特にS.セレビシアエ種のものである。「原核」という用語は、本発明の変異型ポリペプチドの発現のためのポリヌクレオチドにより形質転換またはトランスフェクションされ得る全ての細菌を含むことを意味する。原核生物宿主は、例えば、大腸菌、ネズミチフス菌(S. typhimurium)、セラチア・マルセスセンス（Serratia marcescens）および枯草菌（Bacillus subtilis）のように、グラム陰性菌に加えグラム陽性菌を含む。本発明の変異型ポリペプチドの突然変異体型をコードしているポリヌクレオチドを、当業者に一般に公知の技術のいずれかを用い、宿主を形質転換またはトランスフェクションするために使用することができる。
【００４６】
融合された機能的に連結された遺伝子の調製および細菌または動物細胞におけるそれらの発現の方法は、当該技術分野において周知である(Sambrook、前記)。そこに説明された遺伝子構築体および方法を、例えば原核生物宿主における、本発明の変異型ポリペプチドの発現に使用することができる。一般に、挿入されたポリヌクレオチドの効率的転写を促進するプロモーター配列を含む発現ベクターは、その宿主と一緒に使用される。この発現ベクターは典型的には、複製起点、プロモーター、およびターミネーター、更には形質転換された細胞の表現型選択を提供することが可能である特異的遺伝子を含む。形質転換された原核生物宿主は、最適細胞増殖を達成するために発酵槽において増殖され、かつ当該技術分野において公知の技術に従い培養することができる。本発明のタンパク質は、その後、増殖培地、細胞溶解液、または細胞膜画分から単離することができる。微生物的にまたは別のやり方で発現された本発明のポリペプチドの単離および精製は、例えば、分取的クロマトグラフィー分離およびモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の使用に関連したもののような免疫学的分離などの、いずれか通常の手段によることができる。
【００４７】
従って更なる態様において、本発明は、前述の宿主細胞を培養すること；および、培養物から該タンパク質または断片を回収することを含む、分子変異型ポリペプチドまたはそれらの断片を作出する方法に関連している。
【００４８】
別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子または本発明のベクターで細胞を遺伝子操作することを含む、分子変異型ポリペプチドを発現することが可能な細胞を作出する方法に関連している。
【００４９】
本発明の方法により入手可能な細胞は、例えば、D. L. Spector、R. D. Goldman, L. A. Leinwandの著書(「Cells, a Lab manual」CSH Press、1998)に記された方法に従い薬物を試験するために使用することができる。更にこれらの細胞を使用し、既知の薬物およびそれらの未知の誘導体を、それらのCYP3A5遺伝子における突然変異により引き起された欠損を補完する能力について試験することができる。これらの態様について、宿主細胞は、好ましくは野生型アリル、好ましくはCYP3A5遺伝子の両アリルを欠き、および／またはそれらから突然変異されたものを少なくとも1種有する。理想的には、本発明のポリヌクレオチドにより構成されたアリルを含む遺伝子は、相同置換により、野生型遺伝子座に導入される。または、突然変異されたアリルの正常アリルに勝る強力な過剰発現および同様のレベルで正常アリルを過剰発現している組換え細胞株との比較は、スクリーニングおよび分析システムとして使用することができる。前述の方法により入手可能な細胞は、以下に言及したスクリーニング法に使用することもできる。
【００５０】
更に、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子によりコードされた、もしくは前述の方法によるかまたは前述の方法により作製された細胞から入手可能な、ポリペプチドまたはそれらの断片に関する。
【００５１】
この状況において、本発明の変異型ポリペプチドは更に当該技術分野において公知の常法により修飾することができることも理解される。本発明に従い該変異型タンパク質を提供することにより、それらの生物学的活性またはそれらの阻害に関連した部分を決定することも可能である。本明細書において使用される「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は交換可能である。更に、これらの用語により含まれるものは、標準的教科書的知識である。
【００５２】
本発明は更に、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体に関する。
【００５３】
有利なことに、抗体は、先に定義したように1個または複数のアミノ酸置換を含むエピトープを特異的に認識または結合する。本発明の変異型ポリペプチドに対する抗体は、本発明に従い精製されたタンパク質またはそれらに由来した(合成的)断片を抗原として用い、周知の方法により調製することができる。モノクローナル抗体は、例えば、KohlerおよびMilstein、Nature、256:495(1975)、並びにGalfre、Meth. Enzymol.、73:3(1981)に最初に説明された技術により調製することができ、これは、マウス骨髄腫細胞の免疫感作した哺乳類から得た脾細胞への融合を含んでいる。本発明の好ましい態様において、該抗体は、該ペプチドまたはポリペプチドへ特異的に結合する、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒトまたはヒト化された抗体、霊長類化された、キメラ化されたまたはそれらの断片であり、更に、二重特異性抗体、合成抗体、抗体断片、例えばFab、FvもしくはscFv断片など、またはこれらのいずれかの化学修飾された誘導体を含む。更に、前述のポリペプチドの抗体またはそれらの断片は、例えば、HarlowおよびLaneの「Antibody, A Laboratory Manual」 CSH Press、コールドスプリングハーバー、1988に説明された方法を用いて得ることができる。これらの抗体は、例えば、本発明の変異型ポリペプチドの免疫沈降および免疫局在化に加え、例えば、組換え生物内における該変異型ポリペプチドの存在のモニタリング、並びに本発明に係るタンパク質と相互作用する化合物の同定に使用することができる。例えば、ビアコア（BIAcore）システムにおいて使用されるような表面プラスモン共鳴を用い、本発明のタンパク質のエピトープに結合するファージ抗体の効率を増大することができる(Schier、Human Antibodies Hybridomas、7:97-105(1996)；Malmborg、J. Immunol. Methods、183:7-13(1995))。
【００５４】
好ましい態様において、本発明の抗体は、先に定義したようなヌクレオチド交換から得られた1個または複数のアミノ酸置換を含むエピトープを特異的に認識する。
【００５５】
ホスホチロシン残基のような修飾されたアミノ酸を特異的に認識する抗体は、当該技術分野において周知である。同様に、本発明において、エピトープ内の単独のアミノ酸交換であっても特異的に認識する抗体を、前述の周知の方法により作製することができる。
【００５６】
前述のことを考慮し、より好ましい態様において、本発明の抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルである。
【００５７】
本発明は、前述のような、少なくとも1種の本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子または本発明のベクターを含むトランスジェニック非ヒト動物にも関する。
【００５８】
本発明は同じく、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの、生殖細胞、胚細胞、幹細胞または卵またはそれらに由来した細胞への導入を含むトランスジェニック非ヒト動物を作出する方法も包含している。非ヒト動物は、以下に説明した本発明の方法に従い使用することができ、かつ非トランスジェニックの健常動物であるか、もしくは疾患または障害を、好ましくは本発明の遺伝子の少なくとも1個の突然変異により引き起された疾患を有することができる。このようなトランスジェニック動物は、これらのポリペプチドまたは少なくともそれらの機能ドメインは高等真核生物、特に哺乳類の種間で保存されているので、例えば、前述の変異型ポリペプチドの変異型形と関連させた薬物の薬理学的試験に良く適している。トランスジェニック胚の作製およびそれらのスクリーニングは、例えば、A. L. Joyner編集の「Gene Targeting, A Practical Approach」(1993)、Oxford University Pressに説明されているように行うことができる。胚のDNAは、例えば適当なプローブによるまたはPCR技術を基にしたサザンブロットを用いて分析することができる。
【００５９】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、本発明のポリヌクレオチドもしくはベクターを含むかまたは前述の方法により得られた、トランスジェニックマウス、ラット、ハムスター、イヌ、サル、ウサギ、ブタ、カエル、線虫(Caenorhabditis elebgans)などの線形動物、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)のようなショウジョウバエ、またはシビレエイまたはゼブラフィッシュのような魚類であることができ、好ましくはここで該ポリヌクレオチドまたはベクターは、該非ヒト動物のゲノムに安定して組込まれ、その結果、該ポリヌクレオチドまたはベクターの存在が、本発明の変異型ポリペプチドの発現につながることが好ましい。これは、同じまたは異なる本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子の1種または数種のコピーを含むことができる。この動物は、癌、または心臓血管系疾患、糖尿病およびAIDSを含む疾患、または本発明の研究のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能不全もしくは調節不能により引き起される任意の他の疾患に関する研究モデルを含む、多くの実用性を有し、その結果、癌疾患、または心臓血管系疾患、糖尿病およびAIDSを含む疾患、または本発明の研究のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能不全もしくは調節不能により引き起される任意の他の疾患に関する療法、治療などの開発において新規で価値のある動物を提供する。従って、この場合、マウスまたはラットのような哺乳類が、好ましい実験動物である。
【００６０】
従って、好ましい態様において、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、マウス、ラットまたはゼブラフィッシュである。
【００６１】
多くの報告により、該動物が、薬物代謝およびその欠損または癌の研究のためのモデル生物として特に良く適していることを明らかにされた。有利なことに、トランスジェニック動物は、当該技術分野において周知の様々な適当な技術の利用可能性のために、該モデル生物を使用し容易に作出することができる。
【００６２】
本発明は更に、1個または複数の本発明のポリヌクレオチド、遺伝子、ベクター、ポリペプチド、抗体または宿主細胞を固定化された形で含む固形支持体にも関する。
【００６３】
本明細書において使用される「固形支持体」という用語は、該固定化された標的を担持するのに適した柔軟性のあるまたは柔軟性のない支持体を指す。該固形支持体は、均質または非均質であることができる。例えば、該固形支持体は、柔軟性および固定化に関して同じまたは異なる特性を有する異なる物質からなることができるか、もしくは例えば該固形支持体は、同じく柔軟性および固定化特性を含む複数の特性を示すひとつの物質からなることができる。該固形支持体は、ガラスチップ、ポリプロピレンチップまたはシリコンチップ、膜、オリゴヌクレオチドが複合したビーズまたはビーズアレイを含むことができる。
【００６４】
「固定化された」という用語は、関心対象の分子種が、固形支持体に、好ましくはそれへの共有結合により、固定されていることを意味する。この共有結合は、分子種の分子の性質に応じて決まる様々な手段により達成することができる。更に、この分子種は、静電気力、疎水性もしくは親水性相互作用、またはファンデルワールス力により、固形支持体上に固定することもできる。前述の物理化学的相互作用は、典型的には分子間の相互作用において生じる。例えば、ビオチン化されたポリペプチドは、アビジンで被覆された固形支持体上に、前述の種類の相互作用により固定され得る。更に抗体のようなポリペプチドは、抗体被覆された固形支持体上に固定することができる。更に固定化は、固形支持体の化学特性によって左右される。例えば核酸分子は、UV架橋または加熱のような標準技術により膜上に固定化することができる。
【００６５】
本発明の好ましい態様において、該固形支持体は、膜、ガラスチップまたはポリプロピレンチップまたはシリコンチップであり、オリゴヌクレオチドが複合したビーズまたは光学フィルター基板上に集成されているビーズアレイである。
【００６６】
更に本発明は、多型を同定するためのインビトロ法に関し、該方法は：
(a)複数の個体亜群から、本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子を単離する工程であり、ここでひとつの亜群は、CYP3A5関連疾患を有病せず、かつ少なくともひとつまたは複数の更なる亜群は、CYP3A5関連疾患を有病する、工程；および
(b)CYP3A5関連疾患を有病しない該ひとつの亜群の該ポリヌクレオチドまたは該遺伝子の核酸配列を、CYP3A5関連疾患を有病する少なくともひとつまたは複数の更なる亜群と比較することによる、多型を同定する工程を含む。
【００６７】
本明細書において使用される「有病」という用語は、個体が、CYP3A5機能不全または調節不能に関連している1種または複数の疾患に罹患しやすいか、もしくは既に1種または複数の該疾患に罹患していることを意味する。これにより、ひとつのCYP3A5関連疾患は、別のCYP3A5関連疾患についての易罹患性を決定するために使用することができ、例えば、損なわれた薬物代謝は、例えば癌などの有病の指標となり得る。更に該疾患を発症することに関する有病の指標である症状は、当該技術分野において非常に良く知られており、かつPschyrembelのような標準の教科書において十分に説明されている。
【００６８】
有利なことに、CYP3A5の機能不全もしくは調節不能に関連した本発明の多型またはそれを基にした1種または複数の疾患は、該疾患非有病の亜群に対して、該疾患有病の個体亜群において強化(enrich)されるはずである。従って前述の方法は、1種または複数のCYP3A5関連疾患またはそれらの易罹患性の指標である多型の迅速かつ信頼できる検出を可能にする。有利なことに、表現型の予備選択のために、非常に多数の非有病の個体を、全般的に多型についてスクリーニングすることができる。これにより、1種または複数のCYP3A5関連疾患に相関していない多型を含む参照配列を得ることができる。該参照配列を基に、関連する多型を効果的かつ信頼できるように決定することが可能である。
【００６９】
更なる態様において、本発明は、下記工程を含む、CYP3A5ポリペプチドの分子変異型の活性を変調することが可能なプロドラッグまたは薬物を同定しかつ入手する方法に関する：
(a)本発明のポリペプチド、固形支持体、または本発明のポリヌクレオチドを含む分子変異型遺伝子を発現している細胞、本発明の遺伝子もしくはベクターを、プロドラッグまたは薬物活性に関してスクリーニングされる化合物と、薬物活性に反応して検出可能なシグナルを提供することが可能な成分の存在下で、接触させる工程；および
(b)プロドラッグまたは薬物の活性から生じたシグナルの存在もしくは非存在、またはシグナルの増加もしくは減少を検出する工程を含み、ここでシグナルの非存在、存在、増加または減少は、プロドラッグまたは薬物の推定の指標である工程。
【００７０】
本発明の方法において「化合物」という用語は、単独の物質または同一であるかもしくは同一でない複数の物質を含む。
【００７１】
1つまたは複数の該化合物は、化学的に合成されるかまたは微生物発酵により産生することができるが、これは、例えば、植物、動物または微生物などからの細胞抽出物のような試料中に含まれることもできる。更に該化合物は、当該技術分野において公知であるが、これまでのところ各々阻害剤として有用であることはわかっていなくともよい。複数の化合物は、培地に添加、または本発明の細胞もしくは非ヒト動物へ注射することができる。
【００７２】
本発明の方法において1つまたは複数の化合物を含有する試料が同定される場合は、結果として、問題の化合物を含有することが同定された当初の試料から化合物を単離すること、または更に例えば当初の試料が複数の異なる化合物からなる場合は、それを再分割し、その結果1試料当りの異なる物質の数を低下し、かつ当初の試料の再分割でこの方法を反復することのいずれかが可能である。その後、該試料または化合物が望ましい特性を示すかどうかを、例えば本明細書または文献(Spectorら、「Cells mannual」；前記)に説明された方法により、決定することができる。これらの試料の複雑性に応じて、前述の工程は数回、好ましくは本発明の方法により同定された試料が限定数のまたはただひとつの物質のみを含むようになるまで行うことができる。好ましくは、該試料は、化学的および／または物理的特性が類似した物質を含み、かつ最も好ましくは該物質は、同一である。本発明の方法は、当業者は、例えば先行技術において説明されたその他の細胞ベースのアッセイ法に従うか、または本明細書に記された方法を用いかつ変更することにより、容易に実行しかつ設計することができる。更に当業者は、例えば必要に応じてある種の化合物を前駆体に転換する酵素のような、本発明の方法を行うためには更にどの化合物を使用することができるかを容易にわかると思われる。本発明の方法のこのような適合は、十分当業者の技術内であり、かつ過剰な実験を伴わずに行うことができる。
【００７３】
本発明に従い使用することができる化合物は、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、小有機化合物、リガンド、ペプチド模倣体、PNAなどを含む。該化合物は、本発明の作用物質または拮抗物質として作用してもよい。該化合物は更に、既知の薬物の機能的誘導体または類似体であることもできる。化学誘導体および類似体の調製法は、当業者に周知であり、例えば、Beilstein、「Handbook of Organic Chemistry」Springer編集、New York(175、Fifth Avenue, New York, N.Y. 10010 U.S.A.)および「Organic Synthesis」、Wiley(New York, USA)に説明されている。更に該誘導体および類似体は、当該技術分野において公知の方法または説明された方法に従いそれらの作用を試験することができる。更に、ペプチド模倣体および／または適当な薬物誘導体および類似体のコンピュータを使った設計を、例えば以下に説明した方法に従い、使用することができる。このような類似体は、公知のCYP3A5基質および／または阻害剤および／または修飾因子の基本的構造を有する可能性のある分子を含む；下記参照。
【００７４】
適当なコンピュータプログラムを、相補的構造モチーフのコンピュータを使用した検索により、推定の阻害剤と本発明のポリペプチドの相互作用部位の同定に使用することができる(Fassina、Immunomethods、5:114-120(1994))。タンパク質およびペプチドのコンピュータを使用した設計のための更なる適当なコンピュータシステムは、例えば、Berry、Biochem. Soc. Trans.、22:1033-1036(1994)；Wodak、Ann. N. Y. Acad. Sci.、501:1-13(1987)；Pabo、Biochemistry、25:5987-5991(1986)などの、先行技術において説明されている。前述のコンピュータ解析から得られた結果は、例えば公知の阻害剤、類似体、拮抗物質または作用物質の最適化に関する本発明の方法と組合わせて使用することができる。適当なペプチド模倣体および他の阻害剤も、連続的化学修飾による、ペプチド模倣体コンビナトリアルライブラリーの合成および得られた化合物の例えば本発明に記された方法による試験により同定することができる。ペプチド模倣体コンビナトリアルライブラリーの製造法および使用法は、例えば、Ostreshの論文(Methods in Enzymology、267:220-234(1996))およびDornerの論文(Bioorg. Med. Chem.、4:709-715(1996))などの先行技術に説明されている。更に、該化合物および本発明のポリペプチドの三次元構造および／または結晶構造は、ペプチド模倣薬物の設計に使用することができる(Rose、Biochemistry、35:12933-12944(1996)；Rutenber、Bioorg. Med. Chem.、4:1545-1558(1996))。該化合物を、例えば化学的または生化学的標準技術により、いかにして得るかは良く知られている。従って更に本発明の方法は、該化合物を製造または生産する手段も含む。要約すると、本発明は、CYP3A5関連疾患の具体的形態、例えば、薬物代謝の機能不全または癌を治療するために、具体的用量で使用することができる化合物を同定しかつ入手する方法を提供する。
【００７５】
先の定義は、必要な変更を加えて、下記に説明された全ての方法に適用される。
【００７６】
更なる態様において、本発明は、CYP3A5ポリペプチドの分子変異型の活性の阻害剤を同定しかつ入手する方法に関し、これは下記工程を含む：
(a)本発明のタンパク質、固形支持体、もしくはポリヌクレオチドを含む分子変異型遺伝子を発現している細胞または本発明の遺伝子もしくはベクターを、阻害活性に関してスクリーニングされる化合物と、薬物活性に反応して検出可能なシグナルを提供することが可能な成分の存在下で、接触させる工程；および
(b)阻害活性から生じたシグナルの存在もしくは非存在、またはシグナルの増加もしくは減少を検出する工程を含み、ここでシグナルの非存在または減少は、阻害活性の推定の指標である工程。
【００７７】
本発明の方法の好ましい態様において、該細胞は、本発明の方法により得られた細胞であるか、または前述のようなトランスジェニック非ヒト動物から得ることができる。
【００７８】
より更なる態様において、本発明は、CYP3A5ポリペプチドの分子変異型の活性を変調することが可能なプロドラッグまたは薬物を同定しかつ入手する方法に関し、これは下記の工程を含む：
(a)宿主細胞、本発明の方法により得られた細胞、本発明のポリペプチドまたは固形支持体を、CYP3A5ポリペプチドにより結合されることがわかっている第一の分子と接触させ、該ポリペプチドと該第一の分子の第一の複合体を形成する工程；
(b)該第一の複合体をスクリーニングされる化合物と接触させる工程；並びに
(c)該化合物が、該第一の複合体の該第一の分子と置き換わるかどうかを測定する工程。
【００７９】
有利なことに、この方法において、該測定工程は、該タンパク質と該阻害剤候補の第二の複合体の形成を測定する工程を含む。好ましくは、該測定工程は、該タンパク質に結合していない該第一の分子の量の測定を含む。
【００８０】
特に好ましい前述の方法の態様において、該第一の分子は、例えば放射性標識または蛍光標識を伴う、本発明のポリペプチドの作用物質または拮抗物質または基質および／または阻害剤および／または修飾因子である。
【００８１】
更に別の態様において、本発明は、CYP3A5ポリペプチドの分子変異型の活性を変調することが可能な阻害剤を同定しかつ入手する方法に関し、これは下記の工程を含む：
(a)宿主細胞または本発明の方法により得られた細胞、本発明のタンパク質または固形支持体を、CYP3A5ポリペプチドにより結合されることがわかっている第一の分子と接触させ、該タンパク質と該第一の分子の第一の複合体を形成する工程；
(b)該第一の複合体をスクリーニングされる化合物と接触させる工程；並びに
(c)該化合物が、該第一の複合体の該第一の分子と置き換わるかどうかを測定する工程。
【００８２】
本発明の方法の好ましい態様において、該測定工程は、該タンパク質および該化合物の第二の複合体の形成を測定することを含む。
【００８３】
別の好ましい本発明の方法の態様において、該測定工程は、該タンパク質に結合していない該第一の分子の量を測定することを含む。
【００８４】
更に好ましい本発明の方法の態様において、該第一の分子は、標識されている。
【００８５】
本発明は更に、前述の方法の工程；並びに、同定されかつ得られた化合物またはそれらの誘導体を薬学的に許容できる形状内に製剤化する更なる工程を含む、薬学的組成物の製造法に関する。
【００８６】
本発明の方法に従い同定された治療に有用な化合物は、前述のような患者に処方しかつ投与することができる。用法および治療量は、当業者は適切に決定することができ、かつ「薬学的組成物」という用語の定義に関しては下記参照のこと。
【００８７】
更に本発明は、前述の方法の工程；並びに、薬物またはプロドラッグを、本発明の方法で診断された被験者の疾患の治療的適用および予防または緩和に適した形状に製剤化する工程を含む、薬学的組成物の調製法を包含している。
【００８８】
薬物またはプロドラッグは、それらのインビボ投与後、排泄により、または1個もしくは複数の活性または不活性代謝産物への代謝により除去されるかのいずれかである(Meyer、J. Pharmacokinet. Biopharm.、24:449-459(1996))。従って本発明の方法に従い同定されかつ入手された実際の化合物または阻害剤の使用よりもむしろ、患者内でその活性型に転換されるプロドラッグとしての対応する製剤を用いることができる。プロドラッグおよび薬物の適用に関して行われる予防的測定は、文献に説明されている；Ozama、J. Toxicol. Sci.、21:323-329(1996)の総説参照。
【００８９】
本発明の方法の好ましい態様において、該薬物またはプロドラッグは、下記に定義されるような医薬品の誘導体である。
【００９０】
本発明は、被験者からの試料中の本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子の存在を決定することを含む、CYP3A5遺伝子の分子変異型の存在に関連する障害またはこのような障害の易罹患性の診断法にも関する。
【００９１】
本発明のこの態様に従い、障害の状態またはこのような障害の易罹患性を試験する方法は、例えば、サザンブロットまたはノーザンブロットまたはインサイチュ分析の形で、本発明のポリヌクレオチド遺伝子または核酸を用いることにより実施することができる。該核酸配列は、この遺伝子のコード領域、または例えばイントロンのような非コード領域のいずれかにハイブリダイズすることができる。相補配列が本発明の方法において使用される場合は、再度該核酸分子を、ノーザンブロットに使用することができる。加えて、該試験は、例えば遺伝子転写の実際のブロックと一緒に行うことができ、従って治療との関連性があると予想される。更に、プライマーまたはオリゴヌクレオチドも、前述のCYP3A5遺伝子または対応するmRNAのひとつへのハイブリダイズに使用することができる。当然、ハイブリダイゼーションに使用される核酸は、例えば放射性または他のマーカーの取込みまたは結合により都合良く標識することができる。このようなマーカーは、当該技術分野において周知である。該核酸分子の標識は、常法により実施することができる。
【００９２】
加えて、変異型CYP3A5遺伝子の存在または発現は、対応する核酸配列のいずれかに特異的にハイブリダイズするプライマー対を用い、かつ標準の手法に従いPCR反応を実行することにより、モニタリングすることができる。前述のプローブまたはプライマーの特異的ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で生じることが好ましい。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、当該技術分野において周知であり；例えば、Sambrookらの「Molecular Cloning-A Laboratory Manual」第二版、(CSH Press、コールドスプリングハーバー、1989)；「Nucleic Acids Hybridaisation, A Practical Approach」HamesおよびHiggins編集、(IRL Press、オックスフォード、1985)を参照のこと。更に被験者から得られたmRNA、cRNA、cDNAまたはゲノムDNAは、配列決定し、本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子における突然変異の特徴的フィンガープリントであり得る突然変異を同定することができる。本発明は更に、このようなフィンガープリントを、被験者から得たDNAまたはRNAのRFLPにより作製する方法を含み、選択的にこのDNAまたはRNAは、分析前に増幅してもよく、この方法は当該技術分野において周知である。RNAフィンガープリントは、例えば、適当なRNA-酵素、例えばRNase T1、RNase T2などまたはリボザイムによる、被験者から得たRNA試料の消化、並びに前述のようなRNA断片の例えば電気泳動による分離および検出により行うことができる。
【００９３】
更なる前述の本発明の態様の変更は、当業者は、本開示から過剰な実験を伴わず；例えば実施例を参照することで、容易に考案することができる。本発明の追加の態様は、該決定が、本発明の抗体またはそれらの断片の使用により実施される方法に関する。本発明の方法において使用される抗体は、ヒスチジンフラッグまたはビオチン分子などの検出可能なタグにより標識することができる。
【００９４】
本発明は、被験者からの試料中の本発明のポリペプチドまたは抗体の存在を決定することを含む、CYP3A5遺伝子の分子変異型の存在に関連した障害またはこのような障害に対する易罹患性を診断する方法に関する。
【００９５】
前述の方法の好ましい態様において、該障害は、癌、または心臓血管系疾患、糖尿病およびAIDSを含む疾患である。
【００９６】
本発明の好ましい態様において、前述の方法は、PCR、リガーゼ連鎖反応(LCR)、制限酵素消化、直接的配列決定、核酸増幅技術、ハイブリダイゼーション技術またはイムノアッセイ法を含む。これらの技術は当該技術分野において十分に周知である。
【００９７】
更に本発明は、試料中の本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子を検出する方法に関し、これは下記の工程を含む：
(a)本発明のポリヌクレオチドもしくは遺伝子と固形支持体上の固定化された標的の相互作用を可能にする条件下で、前述の固形支持体を、試料と接触させる工程；および
(b)該ポリヌクレオチドまたは該遺伝子の、固形支持体上の該固定化された標的への結合を決定する工程。
【００９８】
本発明は更に、前述の方法の工程を含む疾患を診断するインビトロ法に関し、ここで該ポリヌクレオチドまたは遺伝子の、該固形支持体上の固定化された該標的との結合は、該疾患の存在もしくは非存在または該疾患有病の指標である。
【００９９】
本発明は更に、本発明のポリヌクレオチド、遺伝子、ベクター、ポリペプチドまたは抗体を含む、診断用組成物に関する。
【０１００】
加えて本発明は、本発明のポリヌクレオチド、遺伝子、ベクター、ポリペプチドまたは抗体を含む、薬学的組成物に関する。
【０１０１】
例えば抗体を含有するこれらの薬学的組成物は、例えば、経口、局所的、非経口または吸入などの、薬物投与に一般的に使用されるいずれかの経路により、簡便に投与することができる。許容できる塩は、酢酸塩、メチルエステル、塩酸塩、硫酸塩、塩化物などを含む。これらの化合物は、一般的な手法に従い薬物を標準の薬学的担体と一緒にすることにより調製された一般的な剤形で投与することができる。これらの手法は、所望の調製に適するような成分の混合、顆粒化および圧縮または溶解を含む。薬学的に許容できる特性または希釈剤の形状および特性は、それと一緒にされる活性成分の量、投与経路または他の周知の変動量により決定付けられることは理解されると思われる。1つまたは複数の担体は、その製剤中の他の成分と相溶性があり、かつそのレシピエントに有害でないという意味で、「許容でき」なければならない。使用される薬学的担体は、例えば、固体または液体のいずれかであることができる。固体担体の例は、乳糖、白土、ショ糖、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などである。液体担体の例は、リン酸緩衝生理食塩水、シロップ、ピーナツ油およびオリーブ油のような油分、水、乳液、様々な種類の湿潤剤、滅菌液などである。同様に、担体または希釈剤は、当該技術分野において周知の徐放性物質、例えばモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどを単独でまたはワックスと共に含むこともできる。
【０１０２】
用量用法は、担当医および他の臨床の要因により；好ましくは、先に説明された方法のいずれかひとつに従い、決定されると考えられる。医療分野においては周知であるように、ある患者に関する用量は、多くの要因により決まり、これは患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される具体的化合物、性別、投与時間および経路、全身の健康状態、並びに同時に投与される他の薬物を含む。進行は定期的評価により経過観察することができる。
【０１０３】
更に、本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子の突然変異された変種をコードしているRNAに特異的にハイブリダイズするアンチセンス-オリゴヌクレオチドを含有するか、もしくは突然変異された本発明のポリペプチドを特異的に認識するが機能的野生型は実質的に認識しない抗体を含むような薬学的組成物の使用は、細胞内の突然変異型の濃度が低下されるべき症例において考慮される。
【０１０４】
本発明のおかげで、具体的な薬物選択、用量用法および治療を受ける対応する患者を、本発明に従い決定することができる。誤薬の誤患者への誤投与量での処方を避ける情報と共に、処方者が考慮している患者群によって決まる用量調節を予測することができる推奨用量が、製品表示に記載されている。
【０１０５】
別の態様において、本発明は、疾患の診断のための診断用組成物を調製するための、ポリヌクレオチド、配列番号:104を含むポリヌクレオチド、配列番号:145を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、本発明の遺伝子、ベクターまたはポリペプチド、配列番号:145を含むポリペプチド、または本発明の抗体の使用に関する。
【０１０６】
本発明の機能的および発現可能なポリペプチドをコードしている遺伝子は、次に関心対象のタンパク質を産生する細胞へ導入することができる。遺伝子治療は、エクスビボまたはインビボ技術による治療用遺伝子の細胞への導入を基にしているが、これは遺伝子導入の最も重要な用途のひとつである。インビトロまたはインビボ遺伝子治療に適したベクターおよび方法は、文献に説明されており、これらは当業者に公知であり；例えば、Giordano、Nature Medicine、2:534-539(1996)；Schaper、Circ. Res.、79:911-919(1996)；Anderson、Science、256:808-813(1992)；Isner、Lancet、348:370-374(1996)；Muhlhauser、Circ. Res.、77:1077-1086(1995)；Wang、Nature Medicine、2:714-716(1996)；国際公開公報第94/29469号；国際公開公報第97/00957号、またはSchaper、Current Opinion in Biotechnology、7:635-640(1996)およびそこに引用された文献を参照のこと。この遺伝子は、細胞への直接導入またはリポソームもしくはウイルスベクター(例えばアデノウイルス、レトロウイルス)による導入のために、設計することができる。好ましくは、該細胞は、生殖系列細胞、胚細胞、もしくは卵細胞、またはそれら由来のものであり、最も好ましくは該細胞は幹細胞である。前述のことから明らかであるように、本発明の用途において、核酸配列が調節エレメントに機能可能に連結され、特異的細胞への本発明のポリペプチドの発現および／または標的化が可能になることが好ましい。本発明に従って使用することができる適当な遺伝子送達系は、リポソーム、受容体媒介型送達系、裸のDNA、並びにヘルペスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどのようなウイルスベクターなどを含み得る。遺伝子治療のための核酸の体内の特定部位への送達は、同じくWilliams(Proc. Natl. Acad. Sci. USA、88:2726-2729(1991))に説明されたような、遺伝子銃送達系を用いて達成される。組換えDNAにより細胞をトランスフェクションする標準的方法は、分子生物学の当業者に周知であり、例えば国際公開公報第94/29469号を参照し；更に前述のものを参照のこと。遺伝子治療は、本発明の組換えDNA分子またはベクターの患者への直接的投与によるか、またはエクスビボにおける本発明のポリヌクレオチドまたはベクターによる細胞のトランスフェクションおよび患者へのトランスフェクションした細胞の注入により行うことができる。
【０１０７】
配列番号:104を含むポリヌクレオチドおよび配列番号:145を含むポリペプチドは既に、Jounaidiらの論文に記されている(Jounaidi、Biochem Biophys Res Commun、221:466-70(1996))。しかし、Jounaidiらは、単に各アミノ酸およびヌクレオチド配列を開示したに過ぎず、特に前記障害および疾患に関する、該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの薬学的および診断的価値については何ら示唆していない。
【０１０８】
更なる態様において、本発明は、疾患を治療するための薬学的組成物の調製に関する、ポリヌクレオチド、配列番号:104を含むポリヌクレオチド、配列番号:145を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、本発明の遺伝子、ベクター、ポリペプチド、配列番号:145を含むポリペプチドまたは本発明の抗体の使用に関係する。
【０１０９】
別の態様において、本発明は：
(a)配列番号:082、088、104、112、126、131または140の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号:127、132、141または145のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；
(c)CYP3A5遺伝子にハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであり、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220は+1に番号付けられ、および位置174832は+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、ここで位置27341は+8614に番号付けられている)の位置3709/3710または27131/27132に対応する位置に、少なくとも1個の付加ヌクレオチドを、もしくはCYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220は+1に番号付けられ、および位置174832は+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、ここで位置27341は+8614に番号付けられる)の位置7303または27289に対応する位置に、ヌクレオチド交換を有する、ポリヌクレオチド；
(d)CYP3A5遺伝子にハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであり、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220は+1に番号付けられ、および位置174832は+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、ここで位置27341は+8614に番号付けられている)の位置3709/3710に対応する位置に、追加のGヌクレオチドを、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220は+1に番号付けられ、および位置174832は+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、ここで位置27341は+8614に番号付けられている)の位置27131/27132に対応する位置に、追加のTヌクレオチドを、または、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220は+1に番号付けられ、および位置174832は+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、ここで位置27341は+8614に番号付けられている)の位置7303もしくは27289に対応する位置にAを有する、ポリヌクレオチドからなる群より選択されたポリヌクレオチドの、
CYP3A5遺伝子の変異型アリルを含むゲノムを有する被験者において疾患を診断するための診断用組成物の調製ための使用であり、
ここで該アリルが、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220は+1に番号付けられ、および位置174832は+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、ここで位置27341は+8614に番号付けられている)の位置6986に対応する位置にAを有するものを包含している。
【０１１０】
本明細書において言及された用語の定義は、前述の使用に必要な変更を加えて適用する。
【０１１１】
特に「被験者」という用語は、動物を意味する。好ましくは、該動物は、先に言及した動物種に属する。更に「被験者」という用語は、ヒトを包含している。本発明における使用に従いヒトは、全ての存在する人種群および亜群、例えば、白人種、アフリカ系アメリカ人またはアジア人から選択される。しかし本発明の使用に特に良く適しているのは、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220は+1に番号付けられおよび位置174832は+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、位置27341は+8614に番号付けられている)の位置6986に対応する位置でのCYP3A5アリルのAの存在または非存在のモニタリングを基にした疾患の診断または疾患有病が、かなりの数の被験者におけるCYP3A5発現に関して偽陽性の推定を生じることが明らかにされているアフリカ系アメリカ人である。このCYP3A5アリルは、Kuehlの論文(Nature  Genetics、27:383-391(2001))に、CYP3A5*1アリルとして詳細に説明されている。CYP3A5*1アリルは、前記引用のKuehlの論文において言及された、CYP3A5核酸配列の位置22893でのAの存在により特徴付けられる。該アリルの対立遺伝子頻度は、アフリカ系アメリカ人において特に高いが、これは他の人種群または亜群においても存在する。しかし本発明に従い、CYP3A5*1アリルを基にした診断試験において擬陽性の結果が得られた被験者のCYP3A5発現は、本発明の使用に従う(a)から(d)において定義したようなポリヌクレオチドの存在または非存在の更なる診断により正確に予測することができることがわかった。例えば、先に定義したように付加ヌクレオチドをCYP3A5遺伝子の位置27131/27132に対応する位置に有するポリヌクレオチドは、本発明に従い、アフリカ系アメリカ人のおよそ10％に存在し、これはエキソン11にフレームシフト突然変異を生じていることがわかっている。本発明は、CYP3A5*1アリルの1つまたは複数の多型を含むCYP3A5の改善された発現を生じるハプロタイプと、低下した発現を生じるハプロタイプの間を識別する手段および方法を提供し、ここで前述のようなハプロタイプは、CYP3A5*1アリルの1つまたは複数の多型に加え、先に(a)から(d)において言及されたポリヌクレオチドにより構成された同時分離する多型を含む。従って、前述の本発明の使用を基に、被験者のCYP3A5活性の信頼できる診断を行うことができる。
【０１１２】
本発明は更に、CYP3A5遺伝子の変異型アリルを含むゲノムを有する被験者の疾患の診断のための診断用組成物の調製のための、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220は+1に番号付けられ、および位置174832は+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、ここで位置27341は+8614に番号付けられている)の位置14690に対応する位置にAを有するポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドの使用にも関し、ここで該アリルは、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1、ここで位置166220は+1に番号付けられ、および位置174832は+8613に番号付けられ、並びにアクセッション番号:AC005020.2、ここで位置27341は+8614に番号付けられている)の位置6986に対応する位置にAを有する。
【０１１３】
本明細書において言及された用語の定義は、前述の使用に必要な変更を加えて適用する。
【０１１４】
本発明に従い、前記引用のKuehlの論文において説明された、CYP3A5*1およびCYP3A5*6アリルを構成している1つまたは複数の多型は、かなりの数の被験者において同時分離され、かつこれにより低下したCYP3A5発現を生じる他のハプロタイプを構成することも示されている。CYP3A5*6アリルは、CYP3A5のエキソン7の不適切なスプライシング、CYP3A5タンパク質の位置184にフレームシフトおよび未熟終結を生じることも示されている。結果的に、被験者におけるCYP3A5の発現レベルに関する偽陽性の結果が、CYP3A5*1アリルを基にした診断試験において得られうる。しかしこの偽陽性の結果は、CYP3A5*6アリルの1つまたは複数の多型の存在または非存在の更なる診断により、本発明の使用に従い避けることができる。従って、本発明の前述の使用を基に、被験者のCYP3A5活性の信頼できる診断を行うことができる。
【０１１５】
前述のことを考慮し、好ましい前述の用途の態様において、被験者は、アフリカ系アメリカ人である。
【０１１６】
先に考察したように、偽陽性と診断される被験者の数は、フレームシフト突然変異を生じる前記(a)から(d)の下で定義されたポリヌクレオチドを含むもの、またはCYP3A5*6アリルにより構成されたものを含むもののような、CYP3A5アリルの高い対立遺伝子頻度に起因している。この対立遺伝子頻度は、アフリカ系アメリカ人の群において特に高い。本発明に従い、CYP3A5*6アリルはアフリカ系アメリカ人の約13.3％に存在することがわかった。従ってこの人種群内で、CYP3A5発現の予測不良から浮かび上がる問題点は、他の人種群よりもより深刻である。
【０１１７】
本発明の使用のより好ましい態様において、該疾患は、癌、または心臓血管系疾患、糖尿病およびAIDSを含む疾患である。
【０１１８】
最後に、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、遺伝子、ベクター、ポリペプチド、抗体、宿主細胞、トランスジェニック非ヒト動物または固形支持体を含む、多型を検出するための診断キットに関する。
【０１１９】
本発明のキットは、更に選択マーカーのような成分およびトランスジェニック細胞および動物の作出に適した選択培地用の成分を含んでも良い。本発明のキットは、本発明の方法を実行するために行うことができ、かつとりわけ、例えば診断分野におけるまたは研究道具としてのように、様々な用途において使用される。本発明のキットの部品は、バイアル内に個別包装されるか、もしくは適当な容器または多容器ユニット内に組合わせて包装されることができる。キットの製造は、当業者に公知の標準の手法に従うことが好ましい。このキットは、本発明の前述の方法のいずれに従い、例えばラジオイムノアッセイ法または酵素イムノアッセイ法のようなイムノアッセイ技術、または好ましくは、先におよび「実施例」中で本明細書において説明されたような核酸ハイブリダイゼーションおよび／もしくは増幅技術を使用し、ポリペプチド、遺伝子、またはポリヌクレオチドの突然変異型の発現を検出する方法に加え、本発明の非ヒトトランスジェニック動物を使用する場合の薬物動態学試験に使用することができる。
【０１２０】
ここで本発明を、下記の生物学的「実施例」を参照し説明するが、これらは単に例証的なものであり、本発明の範囲の限定として構成されるものではない。
【０１２１】
実施例1：ヒト血液からのゲノムDNAの単離、CYP3A5遺伝子断片の作製および精製
ゲノムDNAは、キアゲン（Qiagen）血液および組織DNA単離キットを用い、血液または肝の試料から単離した。スクリーニングに使用したオリゴヌクレオチドは、ヒトCYP3A遺伝子座の最近決定された配列および編成(organisation)を基に設計した(Gellner、Pharmacogenetics、11:111-121(2001))。プライマー配列およびPCR断片長は、表1Aに示した。増幅された断片を、PCR精製カラム(Qiagen)を用いてプロセシングし、かつPE ABI 3700 DNA解析器（PE ABI 3700 DNA Analysers）において、PCRと同じプライマーを用い配列決定した。これらの配列は、PHRED/PHRAP/POLYPHRED/CONSEDソフトウェアパッケージ(University of Washington、シアトル、WA、米国)を用い、多型の存在について分析した。
【０１２２】
総RNAを、追加のDNase I消化を直接カラム上で行った以外は、RNイージー（RNeasy）キット(Qiagen)を製造業者の指示に従い使用し、肝試料から単離した。cDNAプールを、ランダムヘキサマープライマーおよびスーパースクリプト（Superscript）逆転写酵素(Life Technologies)を用い、総RNAの1μgから作製した。1回のTaqManアッセイ法に使用したcDNAは、総RNAの40ngに由来した。CYP3A5 mRNAの発現レベルは、ABI 7700配列検出システム（ABI 7700 Sequence Detection System）(PE Biosystems)を用い、リアルタイム定量的PCRにより定量した。オリゴヌクレオチドおよびプローブは、プライマーエクスプレス（Primer Express) (PE Biosystems)プログラムにより設計した。定量的PCRに使用したオリゴヌクレオチドは、以下のものであった：フォワード5'- TTG TTG GGA AAT GTT TTG TCC TAT C -3'(配列番号:237)およびリバース5'- ACA GGG AGT TGA CCT TCA TAC GTT -3' (配列番号:238)。TaqManプローブ(5'- TCA GGG TCT CTG GAA ATT TGA CAC AGA GTG CTA-3'；配列番号:239)は、5'側レポーター色素6-カルボキシ-フルオロセイン(FAM)および3'側消光剤6-カルボキシ-テトラメチルローダミン(TAMRA)で標識した。この実験は、PEバイオシステムズ（PE Biosystems）により開発された標準のプロトコールに従い行った。CYP3A5に対するアッセイ特異性は、インビトロにおいて発現した等量のCYP3A4、CYP3A5、CYP3A7およびCYP3A43 cDNA種を用いて行った。プローブの特異性は、CYP3A5 cDNAの方がCYP3A7 cDNAよりも104倍高かったが、CYF3A4 cDNAおよびCYP3A43 cDNAは、全く検出されなかった。CYP3A5アッセイ法の直線範囲を、10〜106標的分子の間で決定した。CYP3A5発現レベルは、先に開発されたTaqManアッセイ法(PE Biosystems)により決定された18S mRNA種の発現を用いて正規化した。
【０１２３】
実施例2：CYP3A5遺伝子座内の遺伝的変種の決定
CYP3A5遺伝子座内の配列の多型を、ゲノムDNA(断片サイズ：264-997bp)からのPCR増幅、並びに白人種起源の19-217試料、アフリカ系アメリカ人起源の36-45試料、中国人起源の34-47試料、日本人起源の41-50試料、および韓国人起源の31-47試料の各PCR産物の配列決定により決定した。これらのPCR断片は、CYP3A5の全タンパク質-コード領域、3'-UTRの一部、5'-UTRの全てに加え、CYP3A5転写開始部位とこの遺伝子の上流に位置したL1_5'UTR_ORF反復単位の間の6203bp配列を包含している(図3)。加えて本発明者らは、CYP3A5プロモーターとして当初説明され、増大したCYP3A5タンパク質発現と同時分離することが最近報告されたような配列内に局在化したふたつの連鎖した一塩基多型(SNPs、ch-v-020、ch-v-021、表2A-E)を遺伝子型同定した(Paulussen、Pharmacogenetics、10:415-24(2000))。これらの結果は更に、両変異型の同時分離を示している。最近決定された全CYP3A遺伝子座の配列を用い(Gellner、Pharmacogenetics、11:111-121(2000))、本発明者らは、CYP3A偽遺伝子の5'側に隣接した配列において、CYP3A5の第一のエキソンの上流およそ20kbにこれらの変異型を配置した(図3のPS2)。更に本発明者らは、表1Bに列記したプライマーおよびプローブを用いるTaqMan(登録商標)アッセイ法により、CYP3A5遺伝子のイントロン3に位置した一塩基多型を遺伝子型同定した(ch-v-048；Kuehl、Nature Genetics、27:383-391(2001))。この分析は、配列検出システム(PE Biosystems)において行った。
【０１２４】
Paulussenらにより説明されたふたつの連鎖したSNPを含む全部で29種の変異型(Paulussen、Pharmacogenetics、10:415-24(2000))を、白人種試料のスクリーニングにおいて検出し、およびそれらのアリル頻度を、0.3％〜11.9％の間と推定した(表2A)。6種の変異型は、CYP3A5の転写開始部位の上流6kb配列内に位置する。14種の変異型は、イントロン内、または5'-UTRまたは3'-UTR内に位置するが、4種は、タンパク質-コード配列内に認められた。後者において、3種の変異型は、アミノ酸置換を生じ、かつひとつはCYP3A5タンパク質の未熟終結を生じている(表2A)。g.7303C＞A変異型(ch-v-009、表2A)は、エキソン4におけるS100Yアミノ酸交換を生じている。g.3705C＞T変異型(ch-v-005)は、エキソン2におけるH30Yアミノ酸交換につながっている。クローニングおよび配列決定は、この変異型のg.3709-3710insG変異型(ch-v-006)への物理的連結を明らかにした。後者の変異型は、オープンリーディングフレームのシフトを生じ、これはタンパク質配列の位置34(K34.)における切断につながる。T398N変異型(ch-v-001、表2A)は、最初にJounaidi(Jounaidi、Biochem Biophys Res Commun、221:466-70(1996))により説明されたが、これは試験した80個体の中の3種において認められた。
【０１２５】
白人種において認められた4種のタンパク質変更する変異型のいずれもが、アフリカ系アメリカ人、中国人、日本人および韓国人の試料においては見つからなかった(表2A-E)。しかし、とりわけ、本発明者らは、変更されたCYP3A5アミノ酸配列を生じるこれらの試料において、4種の新規変異型を見つけた(ch-v-017、ch-v-043、ch-v045、ch-v-068、表2B-E)。エキソン11のg.27131-27132insT(ch-v-017)変異型(ch-v-017、表2B、2D)は、45種のアフリカ系アメリカ人試料中の9種および50種の日本人試料中の1種において発見された。この変異型は、オープンリーディングフレームのシフトを生じ、これはタンパク質配列の位置348(D348.)における切断につながる。変異型ch-v-043、ch-v-045およびch-v-068は、アミノ酸交換につながる。
【０１２６】
実施例3：CYPA5タンパク質発現の遺伝的決定因子の同定
下記において、白人種のCYP3A5遺伝子変異型の頻度を、CYP3A5タンパク質発現の関数として分析した。この目的のために、表2Aに示した変異型のアリル頻度を、HE肝およびLE肝について個別に計算した(図3)。9種の変異型(ch-v-020、ch-v-021、ch-v-026、ch-v-034、ch-v-007、ch-v-008、ch-v-011、ch-v-014およびch-v-015)の頻度は、HE肝において有意に増大した(全てχ2＞13.3、df＝1、p＜0.01、Bonferroni相関)。1種を除き、全ての試験したHE肝(17/18、94％)は、3種の変異型(ch-v-021、ch-v-026およびch-v-015)についてヘテロ接合型であった。これらの試料の16種は、更にch-v-020についてもヘテロ接合型であった。1種のHE試料は、この変異型については遺伝子型同定しなかった。対照的に、LE肝は、野生型(155/168、92.3％)、変異型ch-v-021およびch-v-26についてのヘテロ接合型(9/168、5.4％)、または変異型ch-v-015についてのヘテロ接合型(4/168、2.4％)のみであった。しかし、LE肝において、3種全ての変異型は、同時に生じることはなかった(表3)。これらの結果は、これら3種の変異型のいずれかを、増大したCYP3A5発現の有用であるが不完全なマーカーとして定義した。これらの変異型ch-v-034、ch-v-008、ch-v-O11およびch-v-14は、前述の3種の変異型(ch-v-021、ch-v-026およびch-v-015)についてヘテロ接合型の試料のサブセットにおいてのみ生じた。
【０１２７】
スクリーニングした試料中の変異型ch-v-021、ch-v-026およびch-v-O15の分布は、これらがハプロタイプを構成していることを、強力に示唆している。以下において、これら3種の変異型が、独立して組換えられるかまたは組換えられないかの仮説を検証した。それらの独立した遺伝形質を推定し、変異型の全ての組合せの予想される3遺伝子座の遺伝子型頻度を算出し、かつそれらを認められた頻度と比較した。その差異には、高度に有意性がある(χ2＝93.6；クラスは「全て野生型」、「単独の変異型ヘテロ接合型またはホモ接合型」、「2種または3種の変異型ヘテロ接合型またはホモ接合型」；df＝1；p＜＜0.001)。予想されたよりもより多くの2または3種の変異型を伴う個体およびより少ない1種の変異型のみを伴う個体が存在した。この結果は、これら3種の変異型中の連鎖を示唆している。変異型の3種の対に関する連鎖不均衡パラメータDにより、連鎖の程度を推定した。ハプロタイプ頻度に関する最大尤度の推定値を用い、変異型対ch-v-021／ch-v-015およびch-v-026／ch-v-015については、Dは0.041と算出され、これはその理論上の最大値の80％であり、並びに変異型ch-v-021およびch-v-026については0.065と算出され、これはその理論上の最大値の100％に相当する。
【０１２８】
各変異遺伝子型を示している個体がHE(陽性予測値)である確率は、変異型ch-v-021およびch-v-026については、各々65％であると推定され、およびch-v-015変異型については81％であると推定される。3種の変異型の組合せ全てについて、陽性予測値は、本発明者らの試料セットにおいては100％である。しかしこれらの変異型は、増大したタンパク質発現のためにシスの位置にあることが必要であると想定すると、3種の変異型全てを示している個体がLEである確率が若干存在することは明らかである。これらの結果は、少なくともアリルch-v-021／ch-v-026およびアリルch-v-O15は実際に存在し(遺伝子型2および3参照、表3)、その結果これら2種のアリルの組合せを伴う遺伝子型の存在が前提であることを示している。シスで3種の変異型全てを有さないこれらの3倍のヘテロ接合型の頻度に関する最大尤度の推定値は、スクリーニングした全ての試料の0.05％または3種の変異型全てについてヘテロ接合型もしくはホモ接合型試料の0.61％である。別の表現をすると、スクリーニングした白人種100名について、統計学的に、その中の約9名が3種の変異型全てについてヘテロ接合型もしくはホモ接合型であり、かつこれらの約0.05がシスで3種の変異型全てを有さないと考えられる。従って、3変異遺伝子型の陽性予測力は約99.95％であると予想することができる。当然、わずかに2種の変異型、ch-v-021／ch-v-015またはch-v-26／ch-v-15のいずれかの組合せについて同じ値が達成されると考えられる。
【０１２９】
単独のHE肝において、他の17のHE試料において認められた先の9種の変異型のいずれも、検出されなかった。この試料中において認められた変異型のより周到な試験は、各々、イントロン4内の変異型(ch-v-018)およびイントロン5内のそれ(ch-v-019)を明らかにした。これらの変異型は、この試料に特有であり、その理由はこれらはあらゆる他のスクリーニングされた試料においては認められないからである。これらは、あらゆる他のスクリーニングされた人種においても認められなかった。これらの変異型はそれら自身が転写産活性化の原因物質であるかどうか、もしくはこれらは他の現時点で未検出の変異型に連結されているかどうかは、依然不明である。
【０１３０】
実施例4：CYP3A5タンパク質発現の検出
白人種肝試料中のCYP3A4およびCYP3A5のタンパク質発現を、CYP3A4およびCYP3A5特異的抗体(Gentest)を用いウェスタンブロットにより決定した。肝ミクロソームは、既報のように調製した(Zanger、Biochemistry、27:5447-54(1988))。総タンパク質のホモジネイトを得るために、粉末化した肝組織を、0.1M トリス-Cl(pH7.4)、1mM EDTA、1mM Pefa Bloc SC、1μg/mlロイペプチン、1μg/mlペプスタチン中で、ポッターエルベージャムホモジナイザー（Potter Elvehjem homogenisator）(ガラス／テフロン)を用い、1000rpmで2分間均質化した。次にホモジネイトを、バンデリン ソノプラスHD 200（Bandelin Sonoplus HD 200）で音波処理し、-80℃で保存した。ウェスタンブロットのために、ミクロソームタンパク質ホモジネイト12.5μgまたは総タンパク質ホモジネート40μgを、10％SDS-ポリアクリルアミドゲルにおいて分離した。PVDF膜への電気泳動による転写を、タンクブロットセル（TankBlot Cell）(BioRad)において1.5時間定圧(100V)および10℃で行った。転写後、これらの膜を、5％ミルク、TBS、0.1％ツイーン（Tween）20中で60分間インキュベーションし、非特異的抗体結合を低下した。一次抗体(Gentest、1:500希釈)のいずれかとのインキュベーションは、1％ミルク、TBS、0.1％ツイーン20中で60分間行い、これらを、同じ溶液中の二次抗体(抗-ウサギIgG-POD Fab-断片、Dianova、1:10000希釈)で30分間行った。CYP3A4またはCYP3A5タンパク質バンドを、スーパーシグナルドュラ（Supersignal Dura）(Pierce)およびデジタルCCDカメラ(LAS-1000、Fuji)により検出した。シグナルの定量は、AIDA(Raytest)により行った。タンパク質発現レベルは、組換えCYP3A4およびCYP3A5タンパク質を発現しているミクロソーム(Gentest)から得た検量線を基に算出した。
【０１３１】
ホモジネイトまたはミクロソーム画分は、186例のヒト肝から調製し、かつCYP3A5特異的抗体を用いるウェスタンブロットにより調べた。CYP3A5タンパク質は、分析した全ての試料において検出され、その発現は明らかな2峰性を示した(図1A)。168例の肝(〜90％)で、更にLE(低発現)と称されるものは、このアッセイ法の定量下限(LLOQ)に近いまたはそれ以下の発現を示した(0.3pmol/1mgのホモジネイトタンパク質および1.0pmol/1mgのミクロソームタンパク質)。18種の試料(〜10％)で、更にHE(高発現)と称されるものは、非常に高いCYP3A5発現レベルを示した。この発現は、1.6〜2.9pmol/1mgのホモジネイトタンパク質(2.3±0.5；n＝6)および3.9〜15.5pmol/1mgのミクロソームタンパク質(9.7±4.1；n＝12)であった。LE肝におけるCYP3A5発現レベルとしてのこのアッセイ法のLLOQを考慮すると、HE肝は、LE肝よりも平均8〜10倍多いCYP3A5タンパク質を発現している。
【０１３２】
次に、HE肝における一緒にしたCYP3A5およびCYP3A4タンパク質発現に対するCYP3A5の貢献を調べた。これらの肝におけるCYP3A4発現は、0.9〜82.6pmol/1mgのホモジネイトタンパク質(n＝6)および4.5〜295pmol/1mgのミクロソームタンパク質(n＝11)であった。HE肝におけるCYP3A4変動性のレベルおよび範囲は、LE肝におけるものと類似していた(データ示さず)。図1Bは、17種のHE肝における一緒にしたCYP3A5およびCYP3A4タンパク質プールにおけるCYP3A5の分担を示している。CYP3A5の貢献は、3％〜74％の範囲を変動する。平均的HE肝において、両タンパク質を一緒にしたプールにおけるCYP3A5の分担は、24％である。LE肝におけるこのタンパク質の実際の発現レベルとしてのCYP3A5アッセイ法のLLOQを考慮すると、これらの肝の対応する値はおよそ1.6％である。
【０１３３】
実施例5：CYP3A5 mRNA発現の決定
8種の白人種HE肝および8種のLE肝におけるCYP3A5 mRNAの発現を、CYP3AS特異的TaqManプローブを用いて調べた。図2Aに図示したように、CYP3A5 mRNAレベルの分布は2峰性を示し、これはCYP3A5タンパク質の発現において認められたものと完全に一致した(Fisherの直説法、p＝＜＜0.001)。HE肝(n＝8)における、総RNA 1ng当りの3A5転写産物の数は、LE肝(n＝8)のものよりも平均8.5倍高かった。
【０１３４】
下記のように、HEおよびLE肝のCYP3A5転写産物のアリル起源を調べた。この目的のために、この遺伝子の3'-UTR(非翻訳領域)の一部を、PCRにより増幅し、かつこの領域に位置したT＞C変異型(表2Aの変異型ch-v-015；)についてヘテロ接合型である鋳型として、ゲノムまたはcDNA試料を用いて配列決定した。予想されたように、両アリルが、ゲノムDNAを鋳型として用いた配列において示される(図2B)。両アリルは、LE(ch-v-021およびch-v-26についてホモ接合型野生型、ch-v-015についてヘテロ接合型)肝からPCR増幅したcDNAの配列においても同等に示された。対照的に、Cアリルのみが、HE肝由来のCYP3A5 3'-UTR cDNAの同じ部分で認められた。このことは、HE肝のCYP3A5転写産物の総プールにおけるCアリルを収容している染色体由来の転写産物の過剰発現を示している。
【０１３５】
実施例6：組換えCYP3A5タンパク質のインビトロ突然変異誘発および発現
タンパク質配列の変化につながる白人種の5種の多型を検出した。それらの中のふたつはch-v-006およびch-v-017であり、これらは、タンパク質の切断につながり、従って機能タンパク質は恐らくコードしていない。ch-v-005はch-v-006へ物理的に連結してのみ発見されたので、得られたタンパク質変異型は同じく恐らく機能しないと考えられる。タンパク質変異型ch-v-009およびch-v-001の作用を決定するために、これらの変異型を、異種細菌発現系において分析した。
【０１３６】
原核生物発現ベクターpKK233-2(Pharmacia)において、修飾したCYP3A5 cDNAを、インビトロ突然変異誘発の出発物質として用いた(図5)。変異型ch-v-009およびch-v-001は、各々、QuikChange突然変異誘発キット(Stratagene)を使用する、インビトロ突然変異誘発により、プラスミドへ導入した。突然変異のうまくいった導入および他の望ましくない突然変異が存在しないことは、配列決定により確認した。当初のプラスミドに加え、2種の突然変異誘発されたプラスミドを用い、CYP3Aタンパク質の最適発現が既に得られている株の大腸菌TOPP3細胞を形質転換した。各突然変異体プラスミドの8種の個別のコロニー全てを、発現試験のために選択した。Eiseltらの論文に説明されたように、細菌を増殖および誘導した(Eiselt、Pharmacogenetics、11:447-58(2001))。発現は、IPTG/δ-ALAによる誘導後48時間および72時間で分析した。Domanskiらの論文に説明されたように細胞を収集した(Domanski、Arch Biochem Biophys、350:223-32(1998))。最終的P450含量は、還元した一酸化炭素(CO)の差スペクトルにより測定した(Omura、J. Biol. Chem.、239:2370-2378(1964))。
【０１３７】
可溶化したCYP3A5の30〜50nmolを突然変異誘発していないCYP3A5の培養物1Lから回収できたにもかかわらず、2種のCYP3A5変異型 S100YおよびT398Nの発現は、培養物1L当り3nmol P450タンパク質よりも低いことが決定された。多くの例において、「P450」ピークは、予想された典型的448〜450nmピークよりもむしろ454〜458nmにシフトしていた。突然変異誘発されたコロニーにおける低レベルの発現は、タンパク質精製に際する無駄な試みであった。先の実験は、これらのCYP3A5変異型により示された発現レベルと同程度に低い発現レベルが、他の細菌株の使用または増殖温度の調節により、顕著に改善できないことを示唆している。従って、これらの結果は、S100YまたはT398N置換を含むCYP3A5タンパク質変異型は、大腸菌発現系において安定していないこと、およびch-v-009またはch-v-001を含む変異型は、機能タンパク質をコードしていないことを強く示唆している。変異型ch-v-001(T398N)の陰性発現の結果は、5種のCYP3A5欠損個体の中の2種でこの多型を最初に検出した研究(Jounaidi、Biochem Biophys Res Commun、221:466-70(1996))と一致している。
【０１３８】
実施例7：CYP3A5遺伝子型により予想される薬物代謝の推定
CYP3A5タンパク質は、酸化により多くの薬物を分解し、その結果これらは最早治療的活性はない。従って、CYP3A5基質である薬物は、増強されたCYP3A5活性を持つ患者において、適当な時間間隔においては、治療的活性血漿中濃度に到達しない。これらの患者においては、これらの薬物はより高い投与量でなければならない。他方で、低下したCYP3A5活性を有する患者において、これらの薬物は、薬物の毒性レベルを避けるために、より低い用量で投与されなければならない。表4にCYP3A5遺伝子型および推奨用量の指定を示す。
【０１３９】
CYP3A5代謝が薬理学的活性物質の形成につながる場合において、増強された酵素活性は、低減された用量により中和されるにも関わらず、低下されたCYP3A5活性は、増大された用量により合致される。
【０１４０】
（表１Ａ）CYP3A5上流領域内の多型のスクリーニングに使用したプライマーおよびCYP3A5遺伝子
2004527229.tif 000003
Ref.：参照配列。プライマーの位置は、アクセッション番号(1)AF280107.1および(2)AC005020.2のGenBank配列を指す。
【０１４１】
（表１Ｂ）TaqManアッセイ法による多型部位ch-v-048(g.6986G＞A)でのヌクレオチド状態の決定に使用したプライマー(配列番号:202および203)およびプローブ(配列番号:204および205)
2004527229.tif 000004
Ref.：参照配列。プライマーの位置は、アクセッション番号AF280107.1のGenBank配列を指す。プローブは、5'末端で蛍光色素により標識し、かつ暗色消光物質(DQ)で標識し、かつ副溝バインダー(MGB)を用いている。
【０１４２】
（表２Ａ）白人種起源の試料中に検出されたCYP3A5多型
2004527229.tif 000005
2004527229.tif 000006
変異型ch-v-013に関して、全ての変異型はひとつのホモ接合型個人を除き、ヘテロ接合型において検出された。1変異型は、究極的には未熟終結につながるフレームシフトを生じている。
【０１４３】
（表２Ｂ）アフリカ系アメリカ人起源の試料中に検出されたCYP3A5多型
2004527229.tif 000007
2004527229.tif 000008
1変異型は、究極的には未熟終結につながるフレームシフトを生じている。
【０１４４】
（表２Ｃ）中国人起源の試料中に検出されたCYP3A5多型
2004527229.tif 000009
【０１４５】
（表２Ｄ）日本人起源の試料中に検出されたCYP3A5多型
2004527229.tif 000010
【０１４６】
（表２Ｅ）韓国人起源の試料中に検出されたCYP3A5多型
2004527229.tif 000011
表2A-E：変異型は、各人種群別について個別に、遺伝子に沿ったそれらの局在に従い列記している。多型の専門語は、Antoarakisらの論文(Antonarakis、Hum Mutat、11:1-3(1998))を基にし、ゲノム参照配列として一緒にした配列AF280107.1およびAC005020.2を用い、ここでAF280107.1における位置166220のATGのAは+1である。配列状況：上側に示した参照アリル配列と下側に示した変異型配列の多型部位でのローカルアラインメント。点は、各位置のヌクレオチドが同一であることを示している。N：分析した試料の数。
【０１４７】
（表３）CYP3A5遺伝子型および表現型
2004527229.tif 000012
3種の変異型は全て、ヘテロ接合状態においてのみ検出された。HE＝高く発現している肝、LE＝低く発現している肝、数字は、各々特有の遺伝子型を有するLEおよびHE肝を示す。増大したCYP3A5発現は、個別の遺伝子型と共に同時分離する。
【０１４８】
（表４）CYP3A5による期待される薬物代謝
2004527229.tif 000013
2004527229.tif 000014
No.：試行する(running)遺伝子型番号
遺伝子型：アリル組合せから生じる可能性のあるCYP3A5遺伝子型。上側の表に、使用した正確なアリル名の原則を示した。下側の表はより詳細なアリルのリストであり、各々、ふたつの相同染色体における8種の座での変異型の全ての組合せを示している(座1-8は、各々、CYP3A5遺伝子(アクセッション番号:AF280107.1)の位置-20291、-6177、3705、3709/3710、7303、27131/27132、27289および31611に対応する位置を意味し、ここで位置166220は+1と番号付けられ、かつ位置174832は+8613と番号付けられる。)。各変異型は、表2A-Eに列記された3文字配列番号により定義される。配列番号中のワイルドカード(x)は、その表現型がこの染色体のこの遺伝子座では、変異型とは無関係であることを示している。xで置換され得る各遺伝子座について可能性のある変異型は、表2A-Eから抽出することができる。例えば、遺伝子座4の08xは、配列番号081または082を意味し、遺伝子座5の08xは、配列番号087または088のいずれかを意味する。
酵素活性：タンパク質濃度から算出した酵素活性であり、これにより遺伝子型059-061-079-081-111-107/060-062-079-081-111-108の平均タンパク質濃度を、100％と定義した。
用量設定：CYP3A5により分解／活性化される薬剤の用量設定要因は、遺伝子型059-061-079-081-111-107/060-062-079-081-111-108に必要な用量に相関している。要因は、専らCYP3A5によって代謝されることのない薬剤については、CYP3A5酵素の活性分担に応じて、重みを付ける必要があると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
本発明は図面により説明される。
【図１】A：6名のLE(低発現)および6名のHE(高発現)している白人種肝から調製したミクロソームにおけるCYP3A5タンパク質発現のウェスタンブロット分析。B：ウェスタンブロットにより決定された17個のHE肝における一緒にされたCYP3A5/CYP3A4タンパク質プールに対するCYP3A5およびCYP3A4の相対的寄与。
【図２】LEおよびHE白人種肝のCYP3A5転写産物の発現レベルおよびアリル供給源。A：8名のLE(低発現、白棒)および8名のHE(高発現、灰色棒)の肝試料中のCYP3A5 mRNAのTaqMan分析。B：変異型ch-v-015(表2A)について異種の試料中のCYP3A5の3'-UTR部分の配列。PCRに使用した鋳型は、ゲノムDNA(左側パネル)、LE肝由来のcDNA(中央パネル)およびHE肝由来のcDNA(右側パネル)であった。
【図３】白人種におけるCYP3A5遺伝変異型の対立遺伝子頻度。A：8-168 LE個体由来のDNA試料中。B：7-18 HE個体由来のDNA試料中。図の下側の棒は、CYP3A5遺伝子の偽エキソンPS2、エキソン1および2並びにエキソン1-13の局在化を概略的を示している。矢印は、重複境界を示す(Gellner、Pharmacogenetics、11:111-121(2001)).
【図４】ゲノム配列およびペプチド配列：多型が検出された増幅された領域を含むゲノムDNA配列、並びにアミノ酸置換を伴うポリペプチド配列。ヌクレオチド配列は、5'-3'方向に列記されている。小文字で記した文字は、非コード配列を示し、大文字で記した文字は、コード配列を示す。プライマー領域は下線を付けている。変異部位は枠で囲んでいる。ペプチド配列は1文字コードで示した。‖印は、欠失が生じる位置を示す。配列番号:198において、TaqMan(登録商標)プローブのハイブリダイズ部位は、太字で示している。
【図５】インビトロ突然変異誘発のための出発物質として使用されるプラスミドのCYP3A5 cDNA挿入領域。クローニング部位には、下線を付けている。CYP3A5 cDNAの修飾された5'および3'領域は、小文字で示している。タンパク質レベルでの5'側修飾MALLLAVFアミノ酸配列は、大腸菌における発現を増大するために導入した(Gillam、Arch Biochem Biophys、317:374-84(1995))。タンパク質レベルでの3'側修飾His6タグは、その後の精製を向上させるために導入した。CYP3A5挿入断片の未修飾部分は、配列決定によりNP_000768.1の基礎となるヌクレオチド配列であるアクセッション番号NM_000777.1に相当するCYP3A5 cDNAと同じであることが証明された。ch-v-009およびch-v-001に対応する位置は、枠で囲んでいる。
【図１】
2004527229.tif 000015
【図２】
2004527229.tif 000016
【図３】
2004527229.tif 000017
【図４−１】
2004527229.tif 000018
【図４−２】
2004527229.tif 000019
【図４−３】
2004527229.tif 000020
【図４−４】
2004527229.tif 000021
【図４−５】
2004527229.tif 000022
【図４−６】
2004527229.tif 000023
【図４−７】
2004527229.tif 000024
【図４−８】
2004527229.tif 000025
【図４−９】
2004527229.tif 000026
【図４−１０】
2004527229.tif 000027
【図４−１１】
2004527229.tif 000028
【図４−１２】
2004527229.tif 000029
【図４−１３】
2004527229.tif 000030
【図４−１４】
2004527229.tif 000031
【図４−１５】
2004527229.tif 000032
【図４−１６】
2004527229.tif 000033
【図４−１７】
2004527229.tif 000034
【図５】
2004527229.tif 000035
【国際公開パンフレット】
2004527229.tif 000036
2004527229.tif 000037
2004527229.tif 000038
2004527229.tif 000039
2004527229.tif 000040
2004527229.tif 000041
2004527229.tif 000042
2004527229.tif 000043
2004527229.tif 000044
2004527229.tif 000045
2004527229.tif 000046
2004527229.tif 000047
2004527229.tif 000048
2004527229.tif 000049
2004527229.tif 000050
2004527229.tif 000051
2004527229.tif 000052
2004527229.tif 000053
2004527229.tif 000054
2004527229.tif 000055
2004527229.tif 000056
2004527229.tif 000057
2004527229.tif 000058
2004527229.tif 000059
2004527229.tif 000060
2004527229.tif 000061
2004527229.tif 000062
2004527229.tif 000063
2004527229.tif 000064
2004527229.tif 000065
2004527229.tif 000066
2004527229.tif 000067
2004527229.tif 000068
2004527229.tif 000069
2004527229.tif 000070
2004527229.tif 000071
2004527229.tif 000072
2004527229.tif 000073
2004527229.tif 000074
2004527229.tif 000075
2004527229.tif 000076
2004527229.tif 000077
2004527229.tif 000078
2004527229.tif 000079
2004527229.tif 000080
2004527229.tif 000081
2004527229.tif 000082
2004527229.tif 000083
2004527229.tif 000084
2004527229.tif 000085
2004527229.tif 000086
2004527229.tif 000087
2004527229.tif 000088
2004527229.tif 000089
2004527229.tif 000090
2004527229.tif 000091
2004527229.tif 000092
2004527229.tif 000093
2004527229.tif 000094
2004527229.tif 000095
2004527229.tif 000096
2004527229.tif 000097
2004527229.tif 000098
2004527229.tif 000099
2004527229.tif 000100
2004527229.tif 000101
2004527229.tif 000102
2004527229.tif 000103
2004527229.tif 000104
2004527229.tif 000105
2004527229.tif 000106
2004527229.tif 000107
2004527229.tif 000108
2004527229.tif 000109
2004527229.tif 000110
2004527229.tif 000111
2004527229.tif 000112
2004527229.tif 000113
2004527229.tif 000114
2004527229.tif 000115
2004527229.tif 000116
2004527229.tif 000117
2004527229.tif 000118
2004527229.tif 000119
2004527229.tif 000120
2004527229.tif 000121
2004527229.tif 000122
2004527229.tif 000123
2004527229.tif 000124
2004527229.tif 000125
2004527229.tif 000126
2004527229.tif 000127
2004527229.tif 000128
2004527229.tif 000129
2004527229.tif 000130
2004527229.tif 000131
2004527229.tif 000132
2004527229.tif 000133
2004527229.tif 000134
2004527229.tif 000135
2004527229.tif 000136
2004527229.tif 000137
2004527229.tif 000138
2004527229.tif 000139
2004527229.tif 000140
2004527229.tif 000141
2004527229.tif 000142
2004527229.tif 000143
2004527229.tif 000144
2004527229.tif 000145
2004527229.tif 000146
2004527229.tif 000147
2004527229.tif 000148
2004527229.tif 000149
2004527229.tif 000150
2004527229.tif 000151
2004527229.tif 000152
2004527229.tif 000153
2004527229.tif 000154
2004527229.tif 000155
2004527229.tif 000156
2004527229.tif 000157
2004527229.tif 000158
2004527229.tif 000159
2004527229.tif 000160
2004527229.tif 000161
2004527229.tif 000162
2004527229.tif 000163
2004527229.tif 000164
2004527229.tif 000165
2004527229.tif 000166
2004527229.tif 000167
2004527229.tif 000168
2004527229.tif 000169
2004527229.tif 000170
2004527229.tif 000171
2004527229.tif 000172
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004527229.tif 000173
2004527229.tif 000174
【国際調査報告】
2004527229.tif 000175
2004527229.tif 000176
2004527229.tif 000177
2004527229.tif 000178
2004527229.tif 000179
2004527229.tif 000180