(57)【要約】糸状菌によるベンズアルデヒドの生体内変換によるＲ−フェニルアセチルカルビノールの生産方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状菌によるベンズアルデヒドの生体内変換によるＲ−フェニルアセチルカルビノールの生産方法。
【請求項２】
糸状菌がクモノスカビ属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、タマチョレイタケ属（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、モニリア属（Ｍｏｎｉｌｉａ）、ペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）の群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
糸状菌がクモノスカビ属、フザリウム属、ケカビ属の群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
糸状菌がリゾプス・ジャバニカス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｊａｖａｎｉｃｕｓ）またはムコール・ルキシー（Ｍｕｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ベンズアルデヒドの生体内変換がピルビン酸の存在下で行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ベンズアルデヒド１モル当たり１〜２モルのピルビン酸が添加される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
生体内変換が糸状菌の抽出物により行われる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
抽出物がピルビン酸脱炭酸酵素を含有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ピルビン酸脱炭酸酵素が安定化される、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、糸状菌によるベンズアルデヒドの生体内変換によるＲ−フェニルアセチルカルビノール（Ｒ−ＰＡＣ）の生産方法に関する。
【０００２】
Ｒ−フェニルアセチルカルビノールは、医薬化合物であるエフェドリンとプソイドエフェドリン（ｐｓｅｕｄｏｅｐｈｅｄｒｉｎｅ）生産における中間体であり、現在、酵母培養物によるベンズアルデヒドの生体内変換を介して生産されている。生体内変換は、酵素ピルビン酸脱炭酸酵素により触媒される。この触媒は、微生物全体（例えばサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンディダ・アティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ））、または微生物（例えば、サッカロミセス・セレビシアエ、カンディダ・アティリス、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ））の無細胞抽出物を使用して行うことができる。
【０００３】
ピルビン酸脱炭酸酵素の遺伝子が、糸状菌ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）（Ａｌｖａｒｅｚら、１９９３）、アスペルギルス・パラジチカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）（Ｓａｎｃｈｉｓら、１９９４）、およびアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）（Ｌｏｃｋｉｎｇｔｏｎら、１９９７）から単離されている。
【０００４】
文献では、糸状菌の以下の株が、アシロイン縮合を行うと報告されている：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）によるベンズアルデヒドの発酵では、ＮａＢＨ４で処理後にジオールが検出された（Ｃａｒｄｉｌｌｏら、１９９１）。基質としてベンズアルデヒドではなく非環式不飽和アルデヒドを用いるアシロイン縮合について、ムコール・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）が報告されている（ＳｔｕｍｐｆとＫｉｅｓｌｉｃｈ、１９９１）。
【０００５】
本発明の目的は、全体の収率、エナンチオマー純度、微生物触媒の安定性と安全性、または方法のコストに関して、先行技術の方法より有利であるべき、ベンズアルデヒドの生体内変換によるＲ−フェニルアセチルカルビノールの微生物生産の方法を提供することであった。
【０００６】
本発明の第１の実施形態は、糸状菌によるベンズアルデヒドの生体内変換によるＲ−フェニルアセチルカルビノールの生産方法である。
【０００７】
糸状菌は、ＡｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓとＭｉｍｓ（ＡｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓとＭｉｍｓ、１９７９）に従って分類される。本発明に好適なものは、亜門である子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔｉｎａ）、接合菌類（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔｉｎａ）、および担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔｉｎａ）であり、特にクモノスカビ属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、タマチョレイタケ属（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、モニリア属（Ｍｏｎｉｌｉａ）、ペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）の群から選択されるものである。特に好適なものは、リゾプス・ジャバニカス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、ニューロスポラ・クラッサ、ポリポルス・ユーカリプトルム（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｅｕｃａｌｙｐｔｏｒｕｍ）、フザリウム・ラテリチウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｌａｔｅｒｉｔｉｕｍ）、モニリア・シトフィラ（Ｍｏｎｉｌｉａ ｓｉｔｏｐｈｉｌａ）、ペシロミセス・リラシナス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｌｉｌａｃｉｎｕｓ）、ムコール・ルキシー（Ｍｕｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ）の種のものであり、これらは、さらに後述の実験の欄で定義される。
【０００８】
これらの糸状菌は、当業者に周知であり、公知の技法（Ｏｎｉｏｎｓら、１９８１）により容易に単離できるか、または公的な寄託施設から得ることができる。
【０００９】
好適な糸状菌の前選択は、各真菌が糖からエタノールを生産する能力により行うことができる（Ｓｉｎｇｈら、１９９２；Ｓｋｏｒｙら、１９９７）。
【００１０】
ベンズアルデヒドのＲ−ＰＡＣへの生体内変換には、アセトアルデヒド供給源の存在が必要であり、これは、アセトアルデヒド自体またはピルビン酸（ｐｙｒｕｖａｔｅ）でもよい。好適なものは、ピルビン酸、特にベンズアルデヒド１モル当たり１〜２モル、好ましくは１．５モルの量のピルビン酸の添加である。
【００１１】
糸状菌は、真菌菌糸全体としてまたはピルビン酸脱炭酸酵素を含有する抽出物の形で生体内変換に使用することができる。抽出物とは、真菌の可溶性または可溶化型の酵素を意味する。抽出物は通常、精製のグレードがより高いため、真菌菌糸全体より高い比酵素活性を有する酵素を含有する。
【００１２】
抽出物の酵素、特にピルビン酸脱炭酸酵素は、場合によっては、例えば酵素の天然の補助因子、バッファー、塩を加えることによって、安定化させることができる。抽出物のピルビン酸脱炭酸酵素はまた、固定化型で使用することもできる。
【００１３】
生体内変換プロセスは通常、溶媒として水の中で、好ましくはｐＨ ６．５〜７．０の範囲で行われる。温度は、０〜６０℃の広い範囲で変動してもよく、好ましくは１０〜４０℃、特に好ましくは２０〜３０℃である。
【００１４】
このプロセスは、連続的にまたはバッチ式として行うことができる。
【００１５】
以下の実施例は、本発明のさらなる実施形態と詳細を示す。
【００１６】
実施例１
ピルビン酸脱炭酸酵素活性の測定
ピルビン酸脱炭酸酵素活性（カルボリゲーション（ｃａｒｂｏｌｉｇａｔｉｏｎ）活性）は、２５℃で２０分の、基質であるピルビン酸とベンズアルデヒドからのフェニルアセチルカルビノール生成により測定した。サンプルは、２００μｌの酵素溶液と２００μｌの２倍濃縮基質溶液（５０ｍＭ ＭＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ ７．０）中８０ｍＭベンズアルデヒド、２００ｍＭピルビン酸、３Ｍエタノール、２ｍＭピロリン酸チアミン、２０ｍＭ ＭｇＳＯ４）を含有した。１単位（Ｕ）は、１分間に１μモルのフェニルアセチルカルビノールを生産する酵素の量として定義された。タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄに従って評価した。フェニルアセチルカルビノール濃度は、ＨＰＬＣによりＡｌｌｔｉｍａ Ｃ８カラムを使用して、フェニルアセチルカルビノール標準物質に対するピーク面積に基づいて測定した。フェニルアセチルカルビノールエナンチオマーの測定のために、Ｃｈｉｒａｃｅｌ ＯＤカラムを使用した。
【００１７】
実施例２
真菌菌糸由来の抽出物を用いる生体内変換
以下の糸状菌株の粗抽出物を、ベンズアルデヒドとピルビン酸とをフェニルアセチルカルビノールに変換する能力について試験した：
リゾプス・ジャバニカス ＮＲＲＬ １３１６１
リゾプス・ジャバニカス ＮＲＲＬ ２８７１
リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ） ＮＲＲＬ ６２０１
リゾプス・オリザエ ＮＲＲＬ １５０１
アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ） ＮＲＲＬ ６９４
アスペルギルス・タマリイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔａｍａｒｉｉ） ＮＲＲＬ ４２９
ニューロスポラ・クラッサ ＡＴＣＣ ９２７７
ニューロスポラ・クラッサ ＡＴＣＣ ９６８３
ポリポルス・ユーカリプトルム ＵＮＳＷ ８０５４００
フザリウム・ラテリチウム ＵＮＳＷ ８０７１００
フザリウム種 ＵＮＳＷ ８７１９００
モニリア・シトフィラ ＮＲＲＬ １２７５
ペシロミセス・リラシナス ＮＲＲＬ １７４６
ムコール・ルキシー ＡＴＣＣ ４４２６０
ＮＲＲＬは、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（現在は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｏｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を意味する。
ＵＮＳＷは、Ｎｅｗ Ｓｏｕｔｈ Ｗａｌｅｓ大学を意味する。
【００１８】
菌株を、綿栓したエルレンマイヤーフラスコ（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ−ｆｌａｓｋ）中で３０℃で、初期ｐＨ ６で１０ｇ／ｌの酵母エキス、２０ｇ／ｌのペプトン、９０ｇ／ｌのグルコースからなる液体培地中で増殖させた。２３０ｒｐｍで２０〜７０時間振盪すると、高速バイオマス生産のための酸素が得られた。次にフラスコをパラフィルムで覆って、６０ｒｐｍで２３〜２９時間振盪した。
【００１９】
菌糸を、ブフナー（Ｂｕｃｈｎｅｒ）漏斗に採取し、バッファーで２回洗浄した。凍結した菌糸を、摩砕物質としてガラスビーズを使用して乳鉢中で摩砕して粉末にした。破壊バッファーを加え、抽出物を遠心分離して清澄化し、一定の容量に調整した。すなわち、粗抽出物は、培養物容量に対して約４倍に濃縮された。これらを分注して−７０℃で保存した。
【００２０】
生体内変換は、２ｍｌのネジ止め（ｓｃｒｅｗｅｄ）ガラスバイアル中で１．２ｍｌのスケールで、８０％ｖ／ｖの粗抽出物と、１００ｍＭベンズアルデヒドと１５０ｍＭピルビン酸の基質濃度で、２０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＴＰＰ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼインヒビター（ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））の錠剤 １錠／２５ｍｌと５０ｍＭ ＭＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ ７．０）の存在下で行った。
【００２１】
バイアルを３５ｒｐｍで２２．５℃で縦に回転させた。２０分後と２０時間後に、３００μｌのサンプルを取り、３０μｌの１００％［ｗ／ｖ］のトリクロロ酢酸（ｔｒｉｃｈｌｏｒｉｃ ａｃｉｄ）に加えた。遠心分離してタンパク質を除去した後、ＨＰＬＣによりフェニルアセチルカルビノールについて上清を分析した。
【００２２】
図１に示すように、クモノスカビ属、フザリウム属およびケカビ属から、最も高い比カルボリゲーション活性が得られ、タンパク質１ｍｇあたり０．２７〜０．４５ Ｕであった。クモノスカビ属の株からはまた、２０ｍｌの培養物から回収することができた最も多い総量のピルビン酸脱炭酸酵素（８．１〜１５．５ Ｕ）が得られた。
【００２３】
クモノスカビ属とケカビ属由来の粗抽出物で、２０分で３．８〜６．５ｇ／ｌのフェニルアセチルカルビノールの最も良好な初期生産性が得られた（図３を参照）。クモノスカビ属とフザリウム属は、７８〜８４ｍＭの最も高い最終フェニルアセチルカルビノール濃度を与えた（１１．７〜１２．６ｇ／ｌ、図４を参照）。これは、初期ベンズアルデヒド濃度に基づき、理論収率の７８〜８４％であった。これらの結果は、実験条件を最適化することなく得られた。
【００２４】
最終生体内変換サンプルからのＲ−フェニルアセチルカルビノールのエナンチオマー過剰を、以下の表に示す。
【００２５】
2004502430.tif 000002
【００２６】
実施例３
真菌菌糸全体を用いた生体内変換
菌糸全体を使用して、以下の糸状菌株を、ベンズアルデヒドをフェニルアセチルカルビノールに変換する能力について試験した：
リゾプス・ジャバニカス ＮＲＲＬ １３１６１
リゾプス・ジャバニカス ＮＲＲＬ ２８７１
リゾプス・オリザエ ＮＲＲＬ ６２０１
リゾプス・オリザエ ＮＲＲＬ １５０１
アスペルギルス・オリザエ ＮＲＲＬ ６９４
アスペルギルス・タマリイ ＮＲＲＬ ４２９
【００２７】
菌株を、綿栓したエルレンマイヤーフラスコ中で３０℃で、ＹＥＰＧ培地（９０ｇ／ｌのグルコース、１０ｇ／ｌの酵母エキス、２０ｇ／ｌのペプトン、初期ｐＨ ６）中で増殖させた。クモノスカビ属の株を２３０ｒｐｍで１２時間振盪し、アスペルギルス属の株は４８時間振盪した。ピルビン酸脱炭酸酵素を誘導するために、培養物を無菌のネジ止めガラスバイアルに移し、３０℃で３．５時間放置した。ガスが高率で生じ、ピルビン酸脱炭酸酵素の高い活性を示した。
【００２８】
培養ブロスを捨て、１００ｍＭ ベンズアルデヒドを含む等量のＹＥＰＧを加えた。培養物をネジ止めガラスバイアル中で３０℃で２３０ｒｐｍで振盪した。１００ｍＭ ベンズアルデヒドから１２時間で０．２〜０．７ｍＭ フェニルアセチルカルビノールしか生産されず、さらに１２時間後もフェニルアセチルカルビノール濃度は増加しなかった。少量ではあったが、菌糸を前もって破砕することなく、ベンズアルデヒドからフェニルアセチルカルビノールを生産できた。
【００２９】
実施例４
リゾプス・ジャバニカス ＰＤＣによるベンズアルデヒドの生体内変換
リゾプス・ジャバニカスのＰＤＣを、アセトン沈殿により部分的に精製した。
【００３０】
反応物組成：
０．６〜２Ｍ （好ましくは２Ｍ）ＭＯＰＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７
２０ｍＭ ＭｇＳＯ４
１ｍＭ ＴＰＰ
１５０〜６００ｍＭ ピルビン酸（ピルビン酸／ベンズアルデヒド比＝１．５）
１００〜３９４ｍＭ ベンズアルデヒド
７．２ Ｕ／ｍｌのＰＤＣカルボリガーゼ（ｃａｒｂｏｌｉｇａｓｅ）活性
（１単位カルボリガーゼ活性は、４０ｍＭ ベンズアルデヒドと１００ｍＭ ピルビン酸から１分でｐＨ７および２５℃で１μモルのＰＡＣを生産する酵素量として定義される）
【００３１】
反応は、ＰＤＣ酵素を加えることにより開始した。６℃で１８時間混合後、サンプルを１０％［ｗ／ｖ］のトリクロロ酢酸で２０倍希釈して、反応を停止させた。遠心分離してタンパク質を除去し、ＰＡＣ濃度をＨＰＬＣにより分析した。
【００３２】
結果
結果を図５に示す。リゾプス・ジャバニカス ＰＤＣで、４３ｇ／ｌまでのＰＡＣ濃度が得られた。初期ベンズアルデヒドについてのＰＡＣの収率は、２９５ｍＭ 初期ベンズアルデヒドについては８６％で、３９４ｍＭ 初期ベンズアルデヒドについては７３％であった。エナンチオマー過剰（ｅｅ値）は、９８．７であった。
【００３３】
生体内変換からの報告された最も高いＰＡＣ濃度は、酵母カンディダ・アティリスから部分的に精製されたＰＤＣを使用した２８．６ｇ／ｌ（ＳｈｉｎとＲｏｇｅｒｓ、１９９６；Ｒｏｇｅｒｓ， ＳｈｉｎおよびＷａｎｇ、１９９７）と、酵母トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）を用いた発酵法の３０．２ｇ／ｌである（ＪＰ２０００−９３１８９Ａ）。
【００３４】
参考文献
Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ， Ｃ．Ｊ．， Ｍｉｍｓ， Ｃ．Ｗ．：「菌類学入門（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ）」、第３版、１９７９、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、ＵＳＡ
Ａｌｖａｒｅｚ， Ｍ．Ｅ．， Ｒｏｓａ， Ａ．Ｌ．， Ｔｅｍｐｏｒｉｎｉ， Ｅ．Ｄ．， Ｗｏｌｓｔｅｎｈｏｌｍｅ， Ａ．， Ｐａｎｚｅｔｔａ， Ｇｌ， Ｐａｔｒｉｔｏ， Ｌ． Ｍａｃｃｉｏｎｉ， Ｈ．Ｊ．Ｆ．：「ニューロスポラ・クラッサ中の８〜１０ｎｍの細胞質繊維の５９ｋＤａポリペプチド成分はピルビン酸脱炭酸酵素である（Ｔｈｅ ５９−ｋＤａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ ｏｆ ８−１０−ｎｍ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｆｉｌａｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ｉｓ ａ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）」、Ｇｅｎｅ １３０， ２５３−２５８ （１９９３）
Ｂｒａｄｆｏｒｄ， Ｍ．Ｍ．：「タンパク質−色素結合の原理を使用するマイクログラム量のタンパク質の迅速かつ高感度定量法（Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｒａｍ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ）」、Ａｎｌａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７２， ２４８−２５４ （１９７６）
Ｃａｒｄｉｌｌｏ， Ｒ．， Ｓｅｒｖｉ， Ｓ．， Ｔｉｎｔｉ， Ｃ．：「ピルビン酸脱炭酸酵素活性を有する微生物による不飽和アルデヒドの生体内変換（Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ａｌｄｅｈｙｄｅｓ ｂｙ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｗｉｔｈ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３６， ３００−３０３ （１９９１）
Ｄａｌｂｏｇｅ， Ｈ．， Ｌａｎｇｅ， Ｌ．：「新しい微生物の生体触媒を同定するための分子技法の使用（Ｕｓｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｎｅｗ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ）」、Ｔｉｂｔｅｃｈ １６， ２６５−２７２ （１９９８）
Ｌｏｃｋｉｎｇｔｏｎ， Ｒ．Ａ．， Ｂｏｒｌａｃｅ， Ｇ．Ｎ．， Ｋｅｌｌｙ， Ｊ．Ｍ．：「アスペルギルス・ニデュランスのピルビン酸脱炭酸酵素と嫌気的生存（Ｐｙｒｕｖａｔｅ Ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ａｎｄ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）」、Ｇｅｎｅ １９１， ６１−６７ （１９９７）
Ｏｎｉｏｎｓ， Ａ．Ｈ．Ｓ．， Ａｌｌｓｏｐｐ， Ｄ．， Ｅｇｇｉｎｓ， Ｈ．Ｏ．Ｗ．：「Ｓｍｉｔｈの工業的菌類学入門（Ｓｍｉｔｈ’ｓ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ）」、第７版、１９８１， Ｅｄｗａｒｄ Ａｒｎｏｌｄ， ＧＢ
Ｓａｎｃｈｉｓ， Ｖ．， Ｖｉｎａｓ， Ｉ．， Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｉ．Ｎ．， Ｊｅｅｎｅｓ， Ｄ．Ｊ．， Ｗａｔｓｏｎ， Ａ．Ｊ．， Ａｒｃｈｅｒ， Ｄ．Ｂ．：「アスペルギルス・パラジチカス由来のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（Ａ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）」、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． １１７， ２０７−２１０ （１９９４）
Ｓｈｉｎ， Ｈ．Ｓ． Ｒｏｇｅｒｓ， Ｐ．Ｌ．：「部分的に精製したピルビン酸脱炭酸酵素（ＰＤＣ）を使用するベンズアルデヒドからのＬ−フェニルアセチルカルビノール（Ｌ−ＰＡＣ）の生産（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ−Ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌｃａｒｂｉｎｏｌ（Ｌ−ＰＡＣ） ｆｒｏｍ ｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ ｕｓｉｎｇ ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｉｆｉｉｅｄ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ （ＰＤＣ）」、Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ． ４９， ５２−６２ （１９９６）
Ｒｏｇｅｒｓ， Ｐ．Ｌ．， Ｓｈｉｎ Ｈ．Ｓ．， Ｗａｎｇ， Ｂ．：「Ｌ−エフェドリン生産のための生体内変換（Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｌ−ｅｐｈｅｄｒｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）」、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５６， ３３−５９ （１９９７）
Ｓｉｎｇｈ， Ａ．， Ｋｕｍａｒ， Ｐ．Ｋ．Ｒ．， Ｓｃｈｕｅｇｅｒｌ， Ｋ．：「糸状菌によるセルロース化合物性物質のエタノールへの生物変換（Ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｔｏ ｅｔｈａｎｏｌ ｂｙ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ）」、Ａｄｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｅｎｇ． ／ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ４５， ３０−５５ （１９９２）
Ｓｋｏｒｙ， Ｃ．Ｄ．， Ｆｒｅｅｒ， Ｓ．Ｎ．， Ｂｏｔｈａｓｔ， Ｒ．Ｊ．：「エタノール生産性糸状菌のスクリーニング（Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｅｔｈａｎｏｌ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ）」、Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｌｅｔｔ． １９， ２０３−２０６ （１９９７）
Ｓｔｕｍｐｆ， Ｂ．， Ｋｉｅｓｌｉｃｈ， Ｋ．：「ケカビ属の種による非環式不飽和アルデヒドのアシロイン縮合（Ａｃｙｌｏｉｎ ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｙｃｌｉｃ ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ａｌｄｅｈｙｄｅｓ ｂｙ Ｍｕｃｏｒ ｓｐｅｃｉｅｓ）」、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３４， ５９８−６０３ （１９９１）
ＪＰ ２０００−９３１８９Ａ
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、粗抽出物中の比カルボリゲーション活性を示す。誤差棒は、菌株当たり３つの培養物からの最小と最大の結果を示す。
【図２】
図２は、２０ｍｌの培養物を含有するフラスコ当たりの総カルボリゲーション活性を示す。誤差棒は、菌株当たり３つの培養物からの最小と最大の結果を示す。
【図３】
図３は、フェニルアセチルカルビノール（ＰＡＣ）の初期生産性を示す。誤差棒は、菌株当たり３つの培養物からの最小と最大の結果を示す。
【図４】
図４は、初期ベンズアルデヒド濃度に基づくフェニルアセチルカルビノール（ＰＡＣ）濃度と理論収率を示す。誤差棒は、菌株当たり３つの培養物からの最小と最大の結果を示す。
【図５】
図５は、リゾプス・ジャバニカスのＰＤＣを用いたＰＡＣ生産に及ぼす基質濃度の効果を示す。
【図１】
2004502430.tif 000003
【図２】
2004502430.tif 000004
【図３】
2004502430.tif 000005
【図４】
2004502430.tif 000006
【図５】
2004502430.tif 000007
【国際公開パンフレット】
2004502430.tif 000008
2004502430.tif 000009
2004502430.tif 000010
2004502430.tif 000011
2004502430.tif 000012
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【手続補正書】
【提出日】平成14年5月28日(2002.5.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クモノスカビ属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、タマチョレイタケ属（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、モニリア属（Ｍｏｎｉｌｉａ）、ペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）の群から選択される糸状菌によるベンズアルデヒドの生体内変換によるＲ−フェニルアセチルカルビノールの生産方法。
【請求項２】
糸状菌がクモノスカビ属、フザリウム属、ケカビ属の群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
糸状菌がリゾプス・ジャバニカス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｊａｖａｎｉｃｕｓ）またはムコール・ルキシー（Ｍｕｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ベンズアルデヒドの生体内変換がピルビン酸の存在下で行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ベンズアルデヒド１モル当たり１〜２モルのピルビン酸が添加される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
生体内変換が糸状菌の抽出物により行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
抽出物がピルビン酸脱炭酸酵素を含有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ピルビン酸脱炭酸酵素が安定化される、請求項７に記載の方法。
【国際調査報告】
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