(57)【要約】それぞれインテグリンＶＬＡ−５またはＶＬＡ−４結合部位を有するポリペプチドと細胞を接触させることによって、赤血球前駆細胞を増殖させるかまたは該細胞のアポトーシスを引き起こすための方法を記載する。こうした条件下で培養した細胞集団は、天然の、または誘導された造血欠損症を有する被験者の治療において、赤血球細胞発生の研究において、そして他の領域において、使用を見出す可能性がある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤血球前駆細胞の増殖を増進するための方法であって、ＶＬＡ−５結合部位を有するポリペプチドの存在下で、そして赤血球前駆細胞を前記ＶＬＡ−５結合部位に接着させながら、赤血球前駆細胞を含有する造血細胞集団を培養することを含んでなり、赤血球前駆細胞の増殖を増進するのに有効な条件下で、前記培養を行う、前記方法。
【請求項２】
ポリペプチドがフィブロネクチン断片である、請求項１の方法。
【請求項３】
ポリペプチドが組換え体である、請求項２の方法。
【請求項４】
造血細胞集団が、少なくとも約６０％、赤血球前駆細胞で構成される、請求項１−３のいずれかの方法。
【請求項５】
幹細胞因子の存在下で培養を行う、請求項１−４のいずれかの方法。
【請求項６】
造血細胞集団がヒト細胞集団である、請求項１−５のいずれかの方法。
【請求項７】
赤血球前駆細胞数を、少なくとも約１倍拡大するのに十分な期間、そしてそれに十分な条件下で、前記培養を行う、請求項１−６のいずれかの方法。
【請求項８】
赤血球前駆細胞数を、少なくとも約２倍拡大するのに十分な期間、そしてそれに十分な条件下で、前記培養を行う、請求項７の方法。
【請求項９】
造血細胞集団が、少なくとも約８０％、赤血球前駆細胞で構成される、請求項１−８のいずれかの方法。
【請求項１０】
前記ＶＬＡ−５結合部位が、前記ポリペプチド上の唯一の細胞結合部位である、請求項１−９のいずれかの方法。
【請求項１１】
赤血球前駆細胞のアポトーシスを誘導するための方法であって、ＶＬＡ−４結合部位を有するポリペプチドの存在下で、そして赤血球前駆細胞を前記ＶＬＡ−４結合部位に接着させながら、赤血球前駆細胞を含有する細胞集団を培養することを含んでなり、赤血球前駆細胞のアポトーシスを誘導するのに有効な条件下で、前記培養を行う、前記方法。
【請求項１２】
ポリペプチドがフィブロネクチン断片である、請求項１１の方法。
【請求項１３】
ポリペプチドが組換え体である、請求項１２の方法。
【請求項１４】
造血細胞集団が、少なくとも約６０％、赤血球前駆細胞で構成される、請求項１１−１３のいずれかの方法。
【請求項１５】
幹細胞因子の非存在下で培養を行う、請求項１１−１４のいずれかの方法。
【請求項１６】
造血細胞集団がヒト細胞集団である、請求項１１−１５のいずれかの方法。
【請求項１７】
細胞集団において、赤血球前駆細胞の少なくとも約１０％のアポトーシスを引き起こすのに十分な期間、そしてそれに十分な条件下で、前記培養を行う、請求項１１−１６のいずれかの方法。
【請求項１８】
細胞集団において、赤血球前駆細胞の少なくとも約２０％のアポトーシスを引き起こすのに十分な期間、そしてそれに十分な条件下で、前記培養を行う、請求項１７の方法。
【請求項１９】
造血細胞集団が、少なくとも約８０％、赤血球前駆細胞で構成される、請求項１１−１８のいずれかの方法。
【請求項２０】
前記ＶＬＡ−４結合部位が、前記ポリペプチド上の唯一の細胞結合部位である、請求項１１−１９のいずれかの方法。
【請求項２１】
請求項１−２０のいずれかにしたがって産生された細胞集団を、被験者に投与することを含んでなる、被験者を治療するための方法。
【請求項２２】
赤血球前駆細胞の増殖を増進する、造血細胞培養用の培地であって、ＶＬＡ−５結合部位を有するポリペプチドを含んでなる、前記培地。
【請求項２３】
請求項１−１０のいずれかにしたがった方法によって得られる増殖した赤血球前駆細胞を含んでなる、細胞組成物。
【請求項２３】
赤血球前駆細胞のアポトーシスを誘導する、造血細胞培養用の培地であって、ＶＬＡ−４結合部位を有するポリペプチドを含んでなる、前記培地。
【請求項２４】
請求項１１−２０のいずれかの方法によって得られる、細胞組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
背景
本発明は、一般的に、造血細胞に関し、そして特に、造血細胞、および特に赤血球系譜の細胞の増殖を調節するための、ＶＬＡ結合部位を有するポリペプチドの使用を伴う方法に関する。
【０００２】
さらなる背景として、造血前駆細胞および幹細胞間の接着性相互作用（ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）、並びに造血微小環境が、造血の維持に決定的な役割を果たす（１）（２）（３）（４）（５）。造血性増殖因子は、造血の強力な制御因子である。さらに、これらのタンパク質は、インテグリン受容体活性化の変化を介して、造血前駆細胞および細胞外マトリックスタンパク質間の接着を調節するのに関連付けられてきている（６）（７）（８）（９）。造血細胞の増殖、分化および生存を維持する際の、接着分子の単独の役割または該分子と増殖因子の役割は、それよりも理解されていないが（１０）（１１）、正常な造血性発生には、増殖因子受容体類およびインテグリン類間の協力が必要であると仮定されてきている（１２）。具体的には、最晩期抗原（ＶＬＡ）−４および／またはＶＬＡ−５などのインテグリン受容体類は、ユニークな方式で、受容体チロシンキナーゼと協力して、細胞事象に影響を与える可能性がある。これに関連して、受容体チロシンキナーゼ、ｃ−Ｋｉｔ、そのリガンドの幹細胞因子（ＳＣＦ）またはβ１インテグリン類が欠損しているマウスは、多様な重症度の造血欠損症を示し、正常血液発生において、これらのタンパク質が決定的な役割を持つことが示唆される（１）（１３）（１４）。しかし、現在まで、造血細胞の増殖および生存／アポトーシスに関連するような、接着が誘導する、これらのβ１インテグリン類およびｃ−Ｋｉｔ間の協力の性質を立証した研究はない。造血細胞において、これらの結果を仲介する際のインテグリン類およびｃ−Ｋｉｔ下流の多様な細胞内シグナル伝達カスケードの関与もまた、未知のままである。
【０００３】
研究によって、細胞外マトリックスタンパク質、フィブロネクチン（ＦＮ）の受容体類が、造血微小環境において、幹細胞および前駆細胞を含む、造血細胞の接着に関与していることが示されてきている（１５）（１６）（１７）（１８）（１９）（２０）。ＦＮは、造血微小環境全体で、高レベルで発現される（２１）（２２）。ＦＮ分子は、ヘパリン、コラーゲン、フィブリンおよびゼラチンに対する結合部位を含有し、ＦＮ分子が造血微小環境の構築を制御するのに重要な役割を果たすことが示唆される。造血細胞のＦＮへの結合は、少なくとも２つのインテグリン受容体類によって仲介される。ＶＬＡ−５は、最少結合配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）と共に２つの他の相乗結合部位を認識し、これらの結合部位はすべて、ＦＮ分子の細胞結合ドメイン内に位置する（２３）（２４）。ＶＬＡ−４は、合成ペプチドＣＳ−１およびＣＳ−５に定義される、ＦＮの選択的スプライシングＩＩＩＣＳ領域内の配列に結合する（２５）（２６）。これらの受容体は、正常造血発生に決定的な役割を果たす（１）（２７）（２８）。
【０００４】
ｃ−ＫｉｔまたはそのリガンドＳＣＦのヌル突然変異に関してホモ接合体である突然変異体マウスは、重症の貧血のため、胚発生中、または生後まもなく死ぬ（１４）（２９）（３０）（３１）。ｃ−Ｋｉｔの生存可能ホモ接合突然変異体もまた、重症の貧血、並びに未成熟および成熟赤血球前駆体両方の顕著な減少を示す。これらの突然変異体マウスからのデータは、正常赤血球発生における、ｃ−Ｋｉｔ仲介シグナル伝達の決定的な役割を示す（２９）（３０）。赤血球細胞とＦＮとの相互作用はまた、赤血球新生、特に赤血球分化の末期にも必須であると考えられる（３２）（３３）（３４）（３５）（３６）。赤血球前駆体は、ＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５インテグリン類を両方発現する（３７）（３８）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの成熟細胞の効率的な産生は、いくつかの系において、ＦＮへの接着を必要とする（３９）（４０）（４１）（４２）。さらに、抗ＶＬＡ−４抗体での正常マウスの処置は、赤血球新生を完全に遮断することが示されてきている（３２）。ｃ−Ｋｉｔおよびインテグリン類の間の協力のいくつかの証拠もまた、存在する。ＳＣＦへの曝露は、「裏返し（ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ）シグナル伝達」によって、ＦＮへの造血細胞の接着を増加させる（６）（９）（４３）（４４）（４５）（４６）（４７）。ｃ−Ｋｉｔ突然変異体マウス由来の造血前駆細胞は、間質細胞への基礎接着の減少を示し、そしてＳＣＦが誘導するＦＮへの接着は、ｃ−Ｋｉｔ受容体キナーゼ活性を必要とする。ＶＬＡ−４に対する抗体を注射した、ｃ−Ｋｉｔ突然変異体（Ｗ／ＷＶ）マウスは、赤血球前駆体を含む前駆体の動員に失敗する（１３）。総合すると、これらのデータは、正常赤血球発生における、ｃ−Ｋｉｔおよびインテグリン受容体類両方の役割を示唆する。
【０００５】
いくつかの細胞系において、受容体チロシンキナーゼ類およびインテグリン類の下流のシグナル伝達は、細胞事象を共調節するようである（４８）。非造血起源の細胞における、インテグリン類および受容体チロシンキナーゼ類の間の相互作用の性質を説明する、いくつかのモデルが提唱されてきており、これには、受容体活性化レベルでの、または下流シグナル伝達カスケード内での制御が含まれる。いくつかの場合、細胞表面から細胞質ゾルまたは核における標的へのシグナルの効率的な伝達に、インテグリン仲介接着が必要であることが示されてきている。線維芽細胞において、受容体チロシンキナーゼの自己リン酸化は、ＦＮなどのマトリックスタンパク質への接着によって増進可能である（４９）（５０）。さらに、増殖因子処理後の血小板由来増殖因子受容体および上皮増殖因子受容体リン酸化は、懸濁細胞に比較して、接着細胞でより高い（５１）（５２）（５３）。増殖因子で刺激した静止細胞、またはマトリックスタンパク質でコーティングした表面上に再度蒔いた懸濁細胞では、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＥＲＫおよびＰＩ−３キナーゼ経路が活性化される（４９）。ＭＡＰＫおよびＰＩ−３キナーゼカスケードの活性化における増殖因子および細胞接着間の相乗作用もまた、観察されてきている。Ａｋｔは、線維芽細胞において、接着および上皮増殖因子処理によって、相乗的に活性化されることが示されてきている。細胞生存の増加と相関する、これらのシグナル伝達の影響は、細胞生存におけるＰＩ−３キナーゼ／Ａｋｔ経路の重要な役割と一致する（５４）（５５）。Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＥＲＫおよびＰＩ−３キナーゼカスケードは、ｃ−Ｋｉｔ活性化の主要な細胞内標的であるようである。
【０００６】
赤血球細胞発生におけるｃ−Ｋｉｔおよびβ１インテグリンシグナルの重要性、並びに非造血起源の細胞における受容体チロシンキナーゼ類およびインテグリン類の間の既知の相互作用を考慮し；本発明者らはインテグリン類およびｃ−Ｋｉｔの同時連結は、赤血球系譜における、細胞内シグナル伝達経路の活性化およびそれに続く細胞の振る舞いに、有意な影響を有すると仮定した。ＦＮへの造血細胞の接着は、協調した連続する付着および脱離を伴う動的な過程であるため（１２）（５６）（５７）、ＶＬＡ−４またはＶＬＡ−５インテグリンに特異的に結合するＦＮペプチド上で増殖させた細胞培養を利用して、時間に渡り、ＥＰＣ生存／アポトーシスおよび増殖に対する、この動的過程の影響を調べた。
【０００７】
発明の概要
インテグリン最晩期抗原（ＶＬＡ）−４またはＶＬＡ−５に対する結合部位を含有する組換えペプチドは、赤血球前駆細胞（ＥＰＣ）における機能的および生化学的結果を調節するのに使用可能であることが見出された。ＥＰＣは、ＶＬＡ−５結合部位を含有する組換えポリペプチド（例えばＣＨ２７１）のみの存在下で、またはｃ−Ｋｉｔ活性化の存在下で培養すると、増殖の有意な増加を提供する可能性がある。ＥＰＣは、ＶＬＡ−４結合部位を含有する組換えポリペプチド（例えばＨ２９６）の存在下で培養すると、有意な細胞死を生じる可能性がある。ｃ−Ｋｉｔの活性化は、こうしたＶＬＡ−４結合部位含有ポリペプチド上で増殖させたＥＰＣの生存を増進するが、救済は部分的でしかない。Ｈ２９６上でのＥＰＣ生存の減少は、Ａｋｔ活性化の減少と相関し、一方、ＣＨ２７１上のＥＰＣ増殖の増加は、フォーカルアドヒージョンキナーゼ（ＦＡＫ）および細胞外制御キナーゼ（ＥＲＫ）経路活性化の有意な増進および持続と相関した。このように、ＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５の連結から発する、接着誘導シグナルは、ＥＰＣにおいて、別個の生物学的結果を生じ、これにはＶＬＡ−４を介した死、およびＶＬＡ−５を介した生存／増殖が含まれる。
【０００８】
したがって、本発明の１つの側面は、ＥＰＣの増殖を誘導するための方法であって、ＥＰＣの増殖を増加させるように、ＶＬＡ−５結合部位を有するポリペプチドの存在下で、ＥＰＣを含有する細胞培養を培養することを含んでなる、前記方法に関する。好ましい様式において、こうした培養は、ＥＰＣの少なくとも１倍の拡大、より好ましくは、ＥＰＣの少なくとも約３倍の拡大を達成するのに有効な条件下であろう。ポリペプチドは、望ましくは、組換え的に産生し、そして例えば、フィブロネクチンまたはＶＬＡ−５結合部位を有するフィブロネクチン断片であってもよい。さらに、ポリペプチドは、所望により、ＶＬＡ−５以外のＶＬＡ結合部位を含まなくてもよいし、または他のＶＬＡ結合部位を有してもよい。後者の場合、望ましくは、ＶＬＡ−５結合部位が、主な影響を示すであろう。必要な場合、これは、ポリペプチドが対応する結合部位を所持する、ＥＰＣ上に存在するＶＬＡ決定基に対して向けられる抗体を、培養中に含むことによって、容易にすることが可能である。細胞培養は、好適には、赤血球細胞、より好ましくは、赤血球前駆細胞で主に（５０％より多く）構成される。
【０００９】
本発明の別の側面は、患者（好ましくはヒト）を治療するための方法であって、患者に、直前に記載されるように増殖させた細胞培養を投与することを含んでなる、前記方法に関する。例えば、こうした方法は、遺伝的または先天性赤血球障害を誘導されている患者の治療に使用を見出す可能性がある。
【００１０】
別の側面において、本発明は、ＥＰＣのアポトーシスを誘導するための方法であって、ＥＰＣのアポトーシスを誘導するように、ＶＬＡ−４結合部位を有するポリペプチド、好ましくは組換え体の存在下で、ＥＰＣを含有する細胞培養を培養することを含んでなる、前記方法を提供する。こうした培養は、好ましくは、元来培養にあったＥＰＣの少なくとも約１０％の死、より好ましくは、元来培養にあったＥＰＣの少なくとも約２０％の死を誘導するのに有効な条件下であろう。ポリペプチドは、望ましくは、フィブロネクチンまたはＶＬＡ−４結合部位を有するフィブロネクチン断片である。さらに、ポリペプチドは、所望により、ＶＬＡ−４以外のＶＬＡ結合部位を含まないことが可能であるし、または他のＶＬＡ結合部位を有することが可能である。後者の場合、望ましくは、ＶＬＡ−４結合部位が、主な影響を示すであろう。必要な場合、これは、ポリペプチド上に存在する他のＶＬＡ結合部位（非ＶＬＡ−４）に対応する、ＥＰＣ上に存在するＶＬＡ決定基に対して向けられる抗体を、培養中に含むことによって、容易にすることが可能である。細胞培養は、所望により、赤血球細胞、例えば、赤血球前駆細胞で主に構成される。
【００１１】
本発明はまた、本発明の方法によって得ることが可能な細胞組成物も提供する。
さらなる側面において、本発明は、赤血球前駆細胞の増殖を増進する、造血細胞培養用の培地であって、ＶＬＡ−５結合部位を有するポリペプチドを含んでなる前記培地、および赤血球前駆細胞のアポトーシスを誘導する、造血細胞培養用の培地であって、ＶＬＡ−４結合部位を有するポリペプチドを含んでなる前記培地を提供する。
【００１２】
本発明の１つの目的は、ＥＰＣを増殖させるのに有効な方法、およびそれによって生じる増殖したＥＰＣ含有培養物を提供することである。
本発明の別の目的は、ＥＰＣのアポトーシスを誘導するのに有効な方法、およびそれによって生じる細胞培養物を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、本発明にしたがって産生されたＥＰＣ含有細胞培養物を投与することを含んでなる、患者を治療するための方法を提供することである。
本発明のさらなる目的と共に特徴および利点は、本明細書の説明から明らかであろう。
【００１４】
好ましい態様の説明
本発明の原理の理解を促進する目的のため、ここで、その特定の態様に対する言及を行うであろうし、そして特定の言い回しを用いて、該態様を説明するであろう。にもかかわらず、それによって、本発明の範囲を限定することは意図せず、本発明が関連する技術分野の当業者に、通常、思い浮かぶであろうように、本明細書に記載するような本発明の原理の改変、さらなる修飾およびさらなる適用を意図することが理解されるであろう。
【００１５】
広い側面において、本発明は、それぞれ、最晩期抗原（ＶＬＡ）−４またはＶＬＡ−５に対する結合部位を含有するポリペプチドを利用して、赤血球系譜の造血細胞の死または増殖を誘導するための方法を提供する。
【００１６】
赤血球前駆細胞（ＥＰＣ）を含有する造血細胞集団は、いかなる適切な供給源から得ることも可能である。例えば、自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）または同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）骨髄あるいは自己または同種異系末梢血細胞は、ヒト治療用のヒト赤血球前駆体を含有する細胞集団の潜在的な供給源である。骨髄細胞は、例えば腸骨稜、脛骨、大腿骨、胸骨、または別の骨腔から得ることが可能である。骨髄は、当該技術分野に公知であるように、骨からの吸引によって採取し、そしてプロセシングすることが可能である。骨髄は、同種異系移植の場合はドナーから、または自家移植の場合は患者から採取することが可能である。末梢血もまた、標準的技術にしたがって、患者またはドナーから収集することが可能である。これに関連して、収集前に、幹細胞を末梢血に動員するための既知の技術を用いることが可能であり、こうした技術には患者またはドナーへのサイトカインの投与が含まれる。
【００１７】
造血細胞集団では、望ましい場合、赤血球系譜の細胞、そして特に赤血球前駆細胞が濃縮（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）されていてもよい。これらの目的のため、遠心分離および／または選別法などの既知の分離技術を用いることが可能である。例えば、白血球は遠心分離分画によって分離可能である。造血前駆細胞は、１以上の細胞表面抗原、例えばＣＤ３４、ＣＤ７１またはｃ−ｋｉｔ受容体に基づき、対応する抗体、特にモノクローナル抗体と組み合わせて、一般的な造血細胞集団から分離することが可能である。こうした分離は、成熟血液細胞を本質的に含まない細胞集団を得るように、行うことが可能である。
【００１８】
こうした細胞表面抗原に対する抗体を利用する、いくつかの分離および濃縮スキームが知られる。これらには、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、磁気に基づく分離（例えば抗体コーティング磁気ビーズを使用するもの）、細胞毒素、フローサイトメトリー、およびそれらに匹敵するものが含まれる。造血前駆細胞および幹細胞が濃縮された細胞集団を得るためのこうした方法の実施は、十分に、技術分野で実施される技術の範囲内である。
【００１９】
造血幹細胞および前駆細胞濃縮後、細胞集団をさらにプロセシングして、赤血球系譜の細胞、および特に赤血球前駆細胞（ＢＦＵ−Ｅ）を濃縮することが可能である。例えば、細胞集団を、（７０）に記載されるように、ハリエニシダ（Ｕｌｅｘ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）凝集素などのレクチンと接触させることが可能である。こうした技術を用いて、少なくとも約６０％、そしてさらに約８０％から約１００％の赤血球前駆細胞を含有する集団を生じることが可能である。
【００２０】
あるいは、赤血球前駆細胞の樹立細胞株を利用することが可能である。例えば、Ｇ１Ｅ−ＥＲ２と称される、１つの既知のこうした細胞株は、発生の前駆体段階の初代細胞に似ている。これらの細胞は、グロビンおよび赤血球特異的転写因子発現、並びに分化に関して、初代赤血球前駆体と類似である（６２）（６３）。Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞が、初代赤血球前駆細胞と類似のレベルで、ｃ−Ｋｉｔ、ＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５を発現し、そしてＦＮペプチドに接着することもまた、見出されてきている。
【００２１】
選択した造血細胞培養を、ＶＬＡ−４結合部位および／またはＶＬＡ−５結合部位を有するポリペプチドと接触させる。ＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５抗原は、知られており、例えば（７１）の実施例に論じられる。ＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５結合部位を有するポリペプチドもまた知られ、そしてこれらには、例えば、ＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５結合部位を両方含有するフィブロネクチン、並びにＶＬＡ−４結合部位を有する血管内皮細胞接着分子（ＶＥＣＡＭ）が含まれる。
【００２２】
本発明で使用するためのフィブロネクチンまたは他のポリペプチドの断片は、天然または合成起源であってもよく、そして例えば（７２）（７３）（７４）に先に記載されるように、天然存在材料から実質的に純粋に調製することが可能である。これに関連して、本明細書において、実質的に純粋なフィブロネクチンまたはフィブロネクチン断片への言及は、天然にフィブロネクチンと共に存在する他のタンパク質を、これらが本質的に含まないことを意味するよう意図する。本発明で使用するための実質的に純粋なフィブロネクチンまたはフィブロネクチン断片はまた、例えば（７５）（７６）（７７）に一般的に記載されるように、組換え的に産生することも可能である。特に、成熟ヒトフィブロネクチンのアミノ酸配列である配列番号３、および図６に関連して、Ｈ−２７１（ヘパリン結合ドメインの残基Ａｌａ１６９０−Ｔｈｒ１９６０を含む）、Ｃ２７４（Ｐｒｏ１２４３−Ａｓｐ１５１６を含む−ＶＬＡ−４部位含有細胞結合ドメイン）、Ｈ２９６（Ａｌａ１６９０−Ｔｈｒ１９８５を含み、そしてヘパリン結合ドメインおよびＶＬＡ−４結合部位を有する）、ＣＨ２７１（Ｐｒｏ１２４３−Ａｓｐ１５１６およびＡｌａ１６９０−Ｔｈｒ１９６０を含む−ＶＬＡ−５含有細胞結合ドメインに加えてヘパリン結合部位）、ＣＨ２９６（Ａｌａ１６９０−Ｔｈｒ１９８５およびＡｓｐ１９６１−Ｔｈｒ１９８５を含む−ＶＬＡ−５部位含有細胞結合ドメインに加え、ヘパリン結合ドメインに加えて、ＶＬＡ−４部位）およびＣＣＳ１（Ｐｒｏ１２４３−Ａｓｐ１５１６およびＡｓｐ１９６１−Ｔｈｒ１９８５を含む−細胞結合ドメインに加えてＶＬＡ−４結合部位）と同定される組換え断片は、一般的に、これらの特許に記載されるように調製し、そして単独で、または本発明の他のポリペプチドと組み合わせて用いることが可能である。これらの断片、またはこれらを日常的に得ることが可能な断片は、やはり（７５）に記載されるように、ＦＥＲＭ  Ｐ−１０７２１（Ｈ２９６）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−２７９９（メチオニンを介してＨ２７１に結合したＣ２７７）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８００（メチオニンを介してＨ２９６に結合したＣ２７７）、およびＦＥＲＭ  ＢＰ−２２６４（Ｈ２７１）として、日本工業技術院微生物工業技術研究所（ｔｈｅ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｇｅｎｃｙ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に寄託されている大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）を培養することによって入手可能である。さらに、本明細書において利用可能なフィブロネクチン断片に関する、またはこうした断片の出発材料に関する有用な情報は、上述の組換え断片に関してさらに報告する（７８）に；ヒトフィブロネクチン遺伝子の構造を報告する（７９）に；そしてヒトフィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合ドメインに関して報告する（８０）に、見出すことが可能である。例えば３０または３５ｋｄ断片（３０／３５  ＦＮ）に、そして以下の実施例に報告するような多様な組換え断片に含まれるような、ＣＳ−１細胞接着ドメインを含有するフィブロネクチン断片を使用することが可能である。当業者は、必要な細胞結��活性が、機能するＶＬＡ−４結合およびＶＬＡ−５結合フィブロネクチンドメインの天然アミノ酸配列、並びに天然配列と異なるが、それでも十分に類似であり、細胞結合活性を示すアミノ酸配列両方によって、提供することが可能であると認識するであろう。これらの類似のアミノ酸配列は、対応する天然配列に実質的な配列相同性を示すであろうし、そしてアミノ酸が欠失している、置換されているおよび／または修飾されているが、それでもなお望ましい細胞結合特性を持つアミノ酸配列を提供するものを含む可能性がある。
【００２３】
これに関連し、関連するバイオテクノロジー技術は、対象の機能ドメインにおいて、アミノ酸の欠失、置換、付加または他の修飾を、日常的に行うことが可能である状況に進歩してきている。次いで、生じたアミノ酸配列を、望ましい細胞結合活性に関して日常的にスクリーニングすることが可能である。本明細書に提供する解説を考慮すると、これらの結合アッセイは、この分野の当業者には、日常的な実験にしか相当しないであろう。
【００２４】
フィブロネクチンの天然ＶＬＡ−４結合部位は、選択的スプライシングＩＩＩＣＳ領域の最初のほぼ２５アミノ酸によって形成される。天然ヒトフィブロネクチンＶＬＡ−４結合部位のアミノ酸配列は、したがって（配列番号１）：
Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ
である。
【００２５】
本発明を実施するのに好ましい様式において、その中に、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１に少なくとも約７０％同一性、より好ましくは少なくとも約８０％同一性、そして最も好ましくは少なくとも約９０％同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＬＡ−４結合ポリペプチドを用いるであろう。これに関連し、本明細書において、パーセントは、米国国立衛生研究所より入手可能なアドバンストＢＬＡＳＴコンピュータープログラム、バージョン２．０．８を用い、配列情報を比較することによって決定されるような、パーセント同一性を意味するよう意図する。ＢＬＡＳＴプログラムは、（８１）の並列法に基づき、そして（８２）（８３）（８４）に論じられるとおりである。簡潔には、ＢＬＡＳＴプログラムは、同一の並列シンボル（すなわちヌクレオチドまたはアミノ酸）数を、２つの配列のより短い方のシンボル総数で割ったものとして、同一性を定義する。該プログラムを用いて、比較しているタンパク質の全長に渡って、パーセント同一性を決定することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラム、ｂｌａｓｔｐの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）５００の記述；（２）１０の期待値；（３）Ｋａｒｌｉｎ−Ａｌｔｓｃｈｕｌパラメーターλ＝０．２７０；（４）Ｋａｒｌｉｎ−ＡｌｔｓｈｕｌパラメーターＫ＝０．０４７０；（５）ギャップペナルティ：存在１１、伸長１；（６）Ｈ値＝４．９４ｅ−３２４；（６）（８５）（８６）（８７）に記載されるようなＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスに見られる、マッチおよびミスマッチアミノ酸に関するスコアが含まれる。該プログラムはまた、（８８）のＳＥＧプログラムによって決定されるように、問い合わせ配列のマスクオフ部分に対して、ＳＥＧフィルターを用いる。
【００２６】
ヒトフィブロネクチンＶＬＡ−５結合部位のアミノ酸配列は（配列番号２）：Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ
である。
【００２７】
こうした配列は、例えば、ヒトフィブロネクチンのＶＬＡ−５含有細胞結合ドメインのすべてまたは一部、あるいは類似の機能ポリペプチドを含むことによって、ポリペプチドに取り込むことが可能である。上記のＶＬＡ−４でのように、ＶＬＡ−５に同様に結合するアミノ酸配列を有する他のポリペプチドもまた、本発明で使用可能である。特に、細胞結合にアミノ酸Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｐが必要であることが見出されているが、アミノ酸Ｓｅｒは、ポリペプチドにおいて、他のアミノ酸で置換されていてもよく、それでもなお、細胞結合活性を保持する。したがって、アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｘを有するポリペプチドを用いることが可能であり、式中、Ｘはセリンまたは配列に細胞結合活性を提供する別のアミノ酸である。
【００２８】
本発明に用いるポリペプチドは、ＶＬＡ−４またはＶＬＡ−５結合部位以外のＶＬＡ結合および／または他の細胞結合部位を含まないことが可能である（すなわち、ＶＬＡ−４またはＶＬＡ−５がポリペプチド上の唯一の細胞結合部位であることが可能である）。あるいは、用いるポリペプチドが他の細胞結合部位を有することが可能であるが、ＶＬＡ−４またはＶＬＡ−５結合部位は、造血細胞に対する主な影響を示すことが可能である。多数のＶＬＡ−４またはＶＬＡ−５結合部位を有するポリペプチド、例えば１から約１０のＶＬＡ−４またはＶＬＡ−５結合部位を有するポリペプチドを用いて、対応する受容体との相互作用のため、増加した数のリガンドを提供することもまた、可能である。
【００２９】
１種類よりも多い型の細胞結合部位を有するポリペプチドを使用する場合、望ましいもの以外の細胞結合部位への細胞の接着は、これらの結合部位または対応する細胞表面受容体を適切にマスキングするかまたはブロッキングすることによって、阻害することが可能である。例えば、細胞を、他の受容体に対する抗体の存在下で培養し、こうした受容体とこれらの対応する結合部位の相互作用を阻害するかまたはまったく排除することが可能である。したがって、例えば、ＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５結合部位を両方有するポリペプチドを用いる際、ＶＬＡ−４に対する抗体を用いて、ＶＬＡ−５相互作用および生物学的結果の優位性を促進することが可能である。一方、ＶＬＡ−４相互作用および結果の優位性は、培地にＶＬＡ−５に対する抗体を取り込むことによって、促進することが可能である。こうした抗体は、例えば、モノクローナル抗体であってもよい。ポリペプチド上の結合部位の対応するマスキングは、受容体タンパク質またはその断片を利用して達成することが可能である。
【００３０】
ＶＬＡ−４結合部位を含有するポリペプチドの存在下での造血細胞の培養を用いて、元来の培養中のＥＰＣの少なくとも約１０％のアポトーシスを達成することが可能である。より好ましくは、こうした培養は、ＥＰＣの少なくとも約２０％、そして最も好ましくはＥＰＣの少なくとも約３０％のアポトーシスを引き起こすであろう。こうした培養法は、混合造血細胞集団をプロセシングして、赤血球系譜の細胞数を減少させ、そして対応して、他の造血細胞系譜を濃縮する（ｅｎｒｉｃｈ）のに有用である可能性があると考えられる。生じた細胞培養を次いで、誘導された先天性または遺伝的障害を治療するために、造血再構成を必要とする患者において、移植のために用いることが可能である。こうした細胞培養および培養法はまた、診断アッセイにも、そして造血細胞に対する影響に関する薬学的剤のスクリーニング、例えば赤血球細胞のアポトーシスを阻害するかまたは妨げる剤のスクリーニングにも用いることが可能である。
【００３１】
ＶＬＡ−５結合部位を有するポリペプチドの存在下での造血細胞の培養を用いて、ＥＰＣの元来の数の少なくとも約１倍の拡大を達成するように、培養内のＥＰＣを増殖させることが可能である。より好ましくは、こうした培養は、ＥＰＣの少なくとも２倍、そして最も好ましくは少なくとも約３倍の拡大を達成するのに十分な期間、そしてそれに十分な条件下で、行われるであろう。以下の実施例に示すように、現在までの研究では、ＥＰＣは、培養において、約５または６倍過剰で拡大されてきている。
【００３２】
基本培地は、造血細胞の培養に適したものであろう。培地は、例えば、血清不含または血清充満培地であってもよい。多くのこうした培地は、一般的に知られ、そして本発明におけるそれらの選択および使用は、この分野で働く当業者の権限内である。細胞培養はまた、細胞増殖または発生をもたらすことが知られる他の剤の存在下で行うことも可能であり、こうした剤には、例えば、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン類（例えばＩＬ−６、ＩＬ３）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、およびそれらに匹敵するものなどのサイトカインが含まれる。
【００３３】
移植用に哺乳動物に投与するため、本発明の細胞培養の細胞を収集し、そして被験者に細胞を搬送するのに適した装置内に装填することが可能である。例えば、こうした装置は、シリンジ、またはそこから細胞を患者に移すことが可能な他の容器であってもよい。
【００３４】
好ましくは赤血球前駆細胞を含有する、本発明にしたがって産生した細胞集団は、単独で、または他の細胞集団と組み合わせて、患者に移植することが可能である。例えば、幹細胞または他の系譜未拘束細胞（例えば白血球系譜）が非常に濃縮された細胞集団を、本発明にしたがって増殖させた赤血球濃縮集団と共に、同時投与することが可能である。
【００３５】
ＥＰＣを含有する、本発明の拡大細胞培養物は、赤血球前駆細胞および／または成熟赤血球細胞レベルが減少している哺乳動物（ヒトを含む）に投与することが可能である。赤血球前駆細胞を含有する、本発明の拡大細胞集団は、赤血球形成不全または貧血の治療に使用可能である。こうした状態は、疾患、毒素または放射線と共に、遺伝的または先天性欠陥によって引き起こされる可能性がある。
【００３６】
ＥＰＣを含有する、本発明の細胞集団はまた、赤血球前駆体、例えば貧血または赤血球増加症などの病的状態で生じるこうした細胞の診断アッセイでも使用可能である。本発明の培養物および培養法はまた、分化および増殖などの側面を含む、赤血球細胞の発生の研究にも使用可能である。例えば、本発明の細胞培養物は、増殖、分化、細胞死（アポトーシスを含む）に関連する生物学的因子または薬学的剤と接触させて、活性を評価することが可能である。
【００３７】
慣用法を用いて、本発明にしたがって産生した細胞培養物を、直ちに用いることが可能であるし、または必要であれば適切な凍結保護剤の存在下で凍結し、そして使用のため、後に融解することが可能である。
【００３８】
【実施例】
本発明のさらなる理解および認識を促進するため、以下の特定の実施例を提供する。これらの実施例は、本発明の例であり、そして本発明を限定しないことが理解されるであろう。
【００３９】
一般的情報
細胞株
Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞は、先に記載されており、そしてＭｉｔｃｈ  Ｗｅｉｓｓ博士（Ｏｎｔｏｇｅｎｙ、マサチューセッツ州ボストン）から得た。別に特定されない限り、Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞は、１５％熱不活性化胚性幹細胞（ＥＳ）血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、組換えＥｐｏ（２Ｕ／ｍｌ）（Ａｍｇｅｎ、カリフォルニア州サウザンドオークス）、および組換えラット（ｒｒ）ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）（Ａｍｇｅｎ、カリフォルニア州サウザンドオークス）を含む、イスコーブの修飾ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、メリーランド州ガイザーズバーグ）中で増殖させた。飢餓実験では、細胞をＩＭＤＭ中で３回洗浄し、その後、血清および増殖因子を含まない同一培地中に、６から８時間、再懸濁した。
【００４０】
抗体およびフローサイトメトリー解析
フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート化モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）は、ｃ−ＫｉｔおよびＶＬＡ−５に対して向けられた。蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート化抗体は、ＶＬＡ−４に対して向けられた。すべてのＰＥおよびＦＩＴＣコンジュゲート化ＭｏＡｂは、アイソタイプ対照抗体を含めて、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（カリフォルニア州サンディエゴ）より購入した。Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞（１ｘ１０６）は、１μｇの一次ＭｏＡｂと、４℃で３０分間インキュベーションした。細胞は、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、そして蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州サンノゼ）によって解析した。
【００４１】
実施例１
赤血球前駆細胞上のｃ−Ｋｉｔ、ＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５の発現を示す細胞接着アッセイ
１．１  方法
組換えヒトＦＮペプチドＨ２９６およびＣＨ２７１（図１Ａ）は、宝酒造社、日本から得た。先に記載されるように（１８）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈したＦＮ断片１００ｎｍｏｌ／ｃｍ２で、非組織培養６ウェルプレートを一晩コーティングした。我々はまた、これらの多様な組換えＦＮへの接着は、インテグリン受容体ＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５を通じて、造血細胞に対して特異的に仲介されることも、先に示してきている（１８）。非特異的結合部位をブロッキングするため、ＰＢＳ中の２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と、プレートを３０分間インキュベーションした。その後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。２ｘ１０６因子飢餓Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのｒｒＳＣＦの存在下で、ＦＮペプチドに、３７℃で多様な時間、接着させた。インキュベーション後、培地でプレートを注意深くリンスすることによって、非接着細胞を収集し、そして細胞計数を行った。
【００４２】
１．２  結果
ｃ−Ｋｉｔ、並びにインテグリンＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５の間の潜在的な相互作用を研究するため、ＦＩＴＣまたはＰＥいずれかにカップリングさせた抗ｃ−Ｋｉｔ、抗ＶＬＡ−４および抗ＶＬＡ−５  ＭｏＡｂを用いたフローサイトメトリー解析によって、赤血球細胞表面上のｃ−Ｋｉｔ、ＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５発現を確認した。Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞は、均質にｃ−Ｋｉｔ（図１、パネルＢ）、ＶＬＡ−４（パネルＣ）、およびＶＬＡ−５（パネルＤ）を発現する。１００％のＧ１Ｅ−ＥＲ２細胞が、インテグリンＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５を発現する（図１；パネルＣおよびパネルＤ）。ＶＬＡ−４および／またはＶＬＡ−５が、ＦＮへのＧ１Ｅ−ＥＲ２細胞の接着を仲介することを確認するため、ＶＬＡ−４（Ｈ２９６）またはＶＬＡ−５（ＣＨ２７１）の単一結合ドメインを含有する２つの組換えペプチドを利用した（図１Ａ）（１１）（１８）。Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞をＦＮ−Ｈ２９６またはＣＨ２７１上に蒔き、そして２時間に渡って接着を測定した。ＦＮ断片への有意な接着は、ＶＬＡ−４またはＶＬＡ−５どちらによっても観察された。Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞は、ＶＬＡ−５を介して、６８％までＣＨ２７１に接着し、そしてＶＬＡ−４を介して、８０％、ＦＮ−Ｈ２９６に接着した（データ未提示）。初代赤血球前駆細胞を利用した先の研究によって、ＦＮと共にＦＮペプチドへの接着は類似のレベルであることが示されてきている（５８）。対照的に、大部分の細胞（８５％）は、ＢＳＡでコーティングしたプレートにおいては懸濁中にあった。これらの同一断片および他の造血細胞株または初代細胞を利用した先の研究において、我々は、遮断抗体を用いて、これらの断片に対する接着の特異性を示した（１８）。大部分のＥＰＣがＦＮペプチドに接着性であるため、そして先の研究によって、ＦＮへの造血細胞の接着が動的過程であることが示されているため、続く研究において、Ｈ２９６、ＣＨ２７１またはＢＳＡでコーティングしたプレート中でインキュベーションした細胞培養に対するこの過程の影響を調べた。
【００４３】
実施例２
Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞の増殖および生存に対するＦＮの影響
２．１  方法
チミジン取り込みを用いて、Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞の増殖に対するＦＮペプチドＨ２９６およびＣＨ２７１、並びにＳＣＦの影響をアッセイした。９６ウェル非組織培養プレートを、上述のようにＦＮペプチドでコーティングした。増殖因子飢餓Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞を、１００ｎｇ／ｍｌ  ｒｒＳＣＦの存在下または非存在下いずれかで、ウェルあたり５ｘ１０４細胞で４８時間蒔いた。続いて、１．０μＣｉの［３Ｈ］−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を、３７℃で６−８時間、各ウェルに添加した。その後、自動化細胞採取装置（９６ウェル採取装置、Ｂｒａｎｄｅｌ、メリーランド州ガイザーズバーグ）を用いて、細胞を採取し、そしてシンチレーションカウンター中でチミジン取り込みを測定した。製造者の指示（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）にしたがい、アネキシン−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピディウム（ＰＩ）を用いて細胞を染色することによって、Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞の細胞死（アポトーシスおよび壊死）に対するＦＮペプチドおよびＳＣＦの影響をアッセイした。２４ウェル非組織培養プレートを、上述のように、ＦＮペプチドＣＨ２７１およびＨ２９６でコーティングした。増殖因子飢餓Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞を、１００ｎｇ／ｍｌ  ｒｒＳＣＦの存在下または非存在下いずれかで、ウェルあたり５ｘ１０５細胞で４８時間蒔いた。続いて、細胞を採取し、そしてアネキシン−ＦＩＴＣおよびＰＩで染色し、そしてフローサイトメトリーによって解析した。
【００４４】
２．２  結果
２．１．１  ｃ−ＫｉｔおよびＶＬＡ−５間の協調は、Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞の増殖を増進する
赤血球細胞増殖におけるインテグリン類の役割は決定されてきていないが、研究によって、ＦＮが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ両方で、赤血球発生のための適切なニッチを提供するのに必要であることが示唆されてきている（３４）（３５）（３６）（３７）（３８）（３９）（４０）。インテグリン類が赤血球細胞の有糸分裂誘発の重要な仲介因子であるかどうか決定するため、ＳＣＦの存在下または非存在下、ＦＮペプチド上で培養したＧ１Ｅ−ＥＲ２細胞におけるＤＮＡ合成を測定した。ＦＮペプチド上で４８時間培養した後、［３Ｈ］チミジンを６時間添加し、そして［３Ｈ］チミジン取り込みを測定した。ＳＣＦを培養にまったく添加しない実験では、ＢＳＡまたはＣＨ２７１上で培養した因子飢餓Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞は、類似の増殖反応を示した（１１７０１±１２５７対１００８５±１１０８カウント／分［ｃｐｍ］、それぞれ平均±ＳＥＭ、ｐ＞０．０５）（図２；パネルＡ）。対照的に、Ｈ２９６上で培養した細胞は、５０％少ないＤＮＡ合成を生じた（５６８９±６１４ｃｐｍ、ｐ＜０．０５  対ＣＨ２７１）（図２；パネルＡ）。
【００４５】
ＳＣＦを培養に添加する実験では、ＦＮ−ＣＨ２７１（ＶＬＡ−５を介した接着を仲介）上で培養したＧ１Ｅ−ＥＲ２細胞は、懸濁中（ＢＳＡ）、ＳＣＦで刺激した細胞に比較して、有意により高い増殖を示した（２３１，３０１±１２１１４対１４５，１７３±１０８３２ｃｐｍ、それぞれ平均±ＳＥＭ、ｐ＜０．０５）（図２；パネルＢ）。対照的に、ＳＣＦの存在下であっても、これらの細胞のＨ２９６上での培養は、懸濁中で培養した細胞に比較して、減少した増殖と関連した（９８，０７０±５３２０対１４５，１７３±１０８３２ｃｐｍ、それぞれ平均±ＳＥＭ、ｐ＜０．０５）。ＰＩで染色した後、フローサイトメトリーで行う細胞周期解析によって、Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞をＣＨ２７１上で増殖させた培養では、Ｓ＋Ｇ２／Ｍへの細胞の進入が増加することが確認された（データ未提示）。したがって、これらの研究は、ＶＬＡ−４を介したＦＮへの赤血球細胞の接着によって、ＶＬＡ−５に比較して、異なる生物学的結果が刺激されることを立証する。
【００４６】
２．２．２．  Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞におけるＥＲＫ、ＡｋｔおよびＦＡＫシグナル伝達経路に対するＦＮの影響
ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ−１およびＥＲＫ−２）の活性化は、ホスホ特異的ＥＲＫ抗体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）を利用することによって、測定した。この抗体は、リン酸化によって、触媒的に活性化されている場合にのみ、ＥＲＫを検出する。Ａｋｔの活性化は、ホスホ特異的Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）抗体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いることによって、測定した。ＦＡＫの活性化および発現は、抗ＦＡＫ抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いることによって、測定した。すべての抗体は、１：２０００希釈で用いた。簡潔には、非組織培養６ウェルプレートは、上述のようにＦＮ断片でコーティングした。因子飢餓５−８ｘ１０６  Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞をＦＮコーティングウェル上に装填し、そしてＳＣＦの存在下または非存在下で、３７℃で多様な時間、培養した。その後、細胞を採取し、そして溶解緩衝液中で、４℃で３０分間溶解した。細胞溶解物は、４℃、１０，０００ｇで３０分間遠心分離することによって、清澄にした。等量のタンパク質を、１２％ポリアクリルアミド／ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル上で分画し、そして電気泳動的にニトロセルロース膜に移した。製造者の指示（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にしたがって、ウェスタンブロット解析を行った。
【００４７】
２．２．３．  ＶＬＡ−５およびｃ−Ｋｉｔ間の協調は、ＦＡＫおよびＭＡＰＫ（ＥＲＫ−１およびＥＲＫ−２）活性化の増進および持続を生じる
ＶＬＡ−５の結合後に生じる、赤血球前駆体の増殖増加が、下流キナーゼシグナル伝達経路の活性化と関連するかどうかを試験するため、ＦＡＫおよびＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ−１およびＥＲＫ−２）活性化を測定した。これらの経路は、先に、造血細胞におけるインテグリン仲介シグナル伝達に関連付けられてきている（５９）。Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞を７時間飢餓させ、多様な時間、ＶＬＡ−４またはＶＬＡ−５を介したＦＮへの接着を許容し、溶解し、そして抗ＦＡＫまたは抗ホスホＭＡＰＫ抗体を用いたウェスタンブロット解析に供した。ＳＣＦの存在下では、ＶＬＡ−５の結合は、刺激後１２時間という早さでＦＡＫ活性化を強く誘導し、４８時間で最大レベルに達した（図３Ａ）。ＶＬＡ−４誘導連結もまた、ＦＡＫ活性化を生じたが、ＶＬＡ−５を介した活性化に比較して、有意に減少したレベルであった（図３Ａ）。次に、ＭＡＰＫ（ＥＲＫ類）の活性化を調べ、そしてまず、懸濁中、ＳＣＦで刺激したＧ１Ｅ−ＥＲ２細胞において、ＥＲＫ類の活性化を測定した。ＳＣＦによるこれらの細胞の刺激は、ＥＲＫ−１およびＥＲＫ−２の、有意ではあるが、一過性でしかない活性化を生じた（図３Ｂ）。活性化はＳＣＦ刺激１０分後がピークであり、そしてその後、ベースラインまで落ちた。対照的に、ＶＬＡ−５の結合の存在下で、ＳＣＦは、刺激後１０分という早さで赤血球細胞においてＥＲＫ−１およびＥＲＫ−２活性化を強く誘導し、これは持続して、そして１２０分で最大レベルに達した（図３Ｃ）。再び、ＶＬＡ−４を介した結合もまた、ＥＲＫ−１およびＥＲＫ−２活性化を生じたが、ＶＬＡ−５に比較して、有意に減少したレベルであった（図３Ｃ）。これらのデータによって、ＶＬＡ−５を介した連結と関連する赤血球細胞の増殖増加は、部分的に、これらの細胞における、ＦＡＫ／ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ−１およびＥＲＫ−２）カスケード活性化の持続および増進のためである可能性があることが示唆される。
【００４８】
赤血球細胞のｃ−Ｋｉｔおよび／またはインテグリン仲介増殖におけるＥＲＫ経路の関与の度合いをさらに調べるため、ＭＡＰＫ（ＥＲＫ）カスケードの特異的薬理学的阻害剤（ＰＤ９８０５９）を利用した。因子飢餓Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞を、ＳＣＦおよびＰＤ９８０５９の存在下または非存在下、ＣＨ２７１またはＨ２９６上で、あるいは懸濁中で、培養した。共培養４８時間後、［３Ｈ］チミジンを６時間添加し、そして［３Ｈ］チミジン取り込みを測定した。一過性ＥＲＫ活性化の証拠にもかかわらず（上記、図３Ｂを参照されたい）、ＰＤ９８０５９は、ＳＣＦの存在下、懸濁中で増殖させたＧ１Ｅ−ＥＲ２細胞の増殖に最小限の影響しか持たなかった（図３Ｄ）。対照的に、Ｈ２９６およびＣＨ２７１上で培養したＧ１Ｅ−ＥＲ２細胞の増殖は、ＰＤ９８０５９の存在下で、それぞれ、６５％および３０％、阻害された。これらのデータによって、Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞のインテグリンおよびｃ−Ｋｉｔ刺激増殖は、ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ）経路の活性化に依存するが、この経路の使用の度合いは、ＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５の連結後、有意に異なることが示唆される。
【００４９】
２．２．４  Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞において、ＶＬＡ−４を介した接着は細胞死を誘導する
ＳＣＦは、ｃ−Ｋｉｔ陽性細胞の重要な生存因子であり、そしていくつかの細胞を増殖因子退薬が誘導するアポトーシスから保護することが示されてきている（２９）。ＦＮとのインテグリン仲介相互作用もまた、いくつかの細胞で、細胞生存およびアポトーシスを制御するのに重要な役割を果たすことが示されてきている。ＦＮ−Ｈ２９６上で培養した細胞で注目される、Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞増殖の減少が、部分的に、増加した細胞死のためであるかどうか決定するため、ＰＩおよびアネキシンＶ染色の組み合わせを用いて、ＳＣＦの存在下または非存在下、異なるＦＮペプチド上で、または懸濁中で（ＢＳＡ対照）培養したＧ１Ｅ−ＥＲ２細胞におけるアポトーシスを比較した。Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞は、６から８時間因子飢餓させ、そしてその後、ＳＣＦを含むまたは含まない培地中、懸濁中で、あるいはＨ２９６またはＣＨ２７１上で、４８時間、培養した。細胞を採取し、アネキシンＶおよびＰＩで染色し、そしてＦＡＣＳ解析を用いて、アポトーシス（アネキシンＶ＋／ＰＩ−）および壊死（アネキシンＶ＋／ＰＩ＋）細胞の割合に関してスコア付けした。ｃ−Ｋｉｔ刺激の非存在下で行った実験において、ＦＮ−Ｈ２９６上で培養したＧ１Ｅ−ＥＲ２細胞は、ＣＨ２７１上で培養した細胞に比較し、有意により多い細胞死を示した（５２％±１対３３．４％±１、それぞれ平均±ＳＤ、ｐ＜０．０５）（図４；パネルＡ）。懸濁中で増殖させた細胞の生存は、ＣＨ２７１上で増殖させた培養で観察されるものに類似であった（２９．３％±２対３３．４％±１、それぞれ平均±ＳＤ、ｐ＞０．０５）。これらのデータによって、ＶＬＡ−４を介したＦＮへの接着が、増殖因子の非存在下で、Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞のアポトーシスを刺激することが示唆される。
【００５０】
アポトーシスの逆転に対するｃ−Ｋｉｔ活性化の影響を調べるため、Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞を、ＳＣＦの存在下、ＦＮペプチド上で培養し、そしてアポトーシスを測定した。ＳＣＦの存在下、Ｈ２９６上で培養したＧ１Ｅ−ＥＲ２細胞は、ＳＣＦの非存在下で増殖させた細胞と比較して、生存の有意な改善を示した。しかし、救済は部分的でしかなく、そしてＣＨ２７１およびＳＣＦ上で培養した細胞に比較して、有意により低かった（２４．８％±５．３、ＶＬＡ−４対８．６％±０．２、ＶＬＡ−５、平均±ＳＤ、ｐ＜０．０５）（図４；パネルＢ）。ＳＣＦの存在下、懸濁培養中の生存細胞の割合は、ＣＨ２７１上で培養した細胞に見られるのと同様であった（７．４５％±１．４５、ＢＳＡ対８．６％±０．２、それぞれ平均±ＳＤ）。これらの結果によって、ＶＬＡ−４を介したＦＮへの接着後、赤血球細胞で見られる増殖の減少が、部分的に、アポトーシスをうける赤血球細胞数の増加のためであることが示唆される。
【００５１】
ＰＩ−３キナーゼの下流エフェクター、Ａｋｔは、アポトーシスの重要なアンタゴニストとして関連付けられてきている（５５）。先の研究は、Ａｋｔ活性化の減少をアポトーシス増進に関連付けてきている（５５）。さらに、いくつかの細胞では、Ａｋｔの恒常的活性化型の発現がアポトーシスを遮断する一方、Ａｋｔ阻害剤、ワートマニンの使用は、アポトーシスを増大することが示されてきている（６０）（６１）。したがって、上述の細胞培養条件で、Ａｋｔ活性化を測定した。ＶＬＡ−４またはＶＬＡ−５の連結はいずれも、赤血球細胞において、Ａｋｔ活性化を誘導したが、異なる度合いにであった（図５Ａ）。ＶＬＡ−４誘導Ａｋｔ活性化は、Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞において、ＶＬＡ−５仲介Ａｋｔ活性化に比較して、インキュベーション期間全体で、有意により低かった。ＶＬＡ−４付着を介したＡｋｔ活性化のこの３から４倍の減少は、調べたすべての時点で見られた（図５Ａ）。これらの細胞のアポトーシスを妨げる際のＡｋｔ活性化の重要性をさらに調べるため、ＳＣＦおよびワートマニンの存在下、ＣＨ２７１上で、または懸濁中で（ＢＳＡ対照）Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞を培養した。これらの培養条件下でのワートマニンの存在は、ＣＨ２７１上で増殖させたＧ１Ｅ−ＥＲ２細胞のアポトーシスの有意な増加を生じた（図５Ｂ）。総合すると、これらのデータは、ＰＩ−３キナーゼ／Ａｋｔシグナル伝達カスケードが、ｃ−Ｋｉｔおよびインテグリン類下流で赤血球細胞アポトーシスを仲介するのに重要な役割を果たすことを示唆する。ＶＬＡ−４を介したＦＮへのＧ１Ｅ−ＥＲ２細胞の接着は、Ａｋｔ活性化を有意に損ない、そしてこの障害が、懸濁中で、またはＶＬＡ−５を介してＦＮ上で増殖させた細胞に比較して、これらの細胞のアポトーシスが増進する機構である可能性がある。
【００５２】
実施例の考察
発生中の胚において、そして成体動物において、ｃ−Ｋｉｔおよびインテグリン仲介シグナル伝達は、赤血球細胞生存、増殖および分化に必要である（１）（１４）（２９）（３０）。したがって、赤血球前駆体は、生理学的に適切な脈絡において、ｃ−Ｋｉｔおよびインテグリン仲介シグナル伝達の機構を研究する、ユニークなモデルを提供する。ｃ−Ｋｉｔおよびインテグリン類の多面的反応を支配する機構に関する研究を容易にするため、既知のこうした細胞株である、発生の前駆段階の初代細胞に似た、Ｇ１Ｅ−ＥＲ２と称する細胞株を用いた。これらの細胞は、グロビンおよび赤血球特異的転写因子発現および分化に関して、初代赤血球前駆体に似ている（６２）（６３）。Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞が、ｃ−Ｋｉｔ、ＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５を発現し、そして初代赤血球前駆細胞に類似のレベルでＦＮペプチドに接着することもまた、見出されてきている。
【００５３】
赤血球細胞発生中のＦＮへの細胞接着の役割自体は、完全には決定されていないが、いくつかの研究によって、ＦＮが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ両方で、赤血球発生のための適切なニッチを提供し、そしてまた、赤血球細胞に増殖刺激を提供するのにも必要であることが示唆されてきている（３２）（３３）（３４）（３６）。ここに示す研究によって、懸濁中で、またはＶＬＡ−４結合部位を含有する培養中で増殖させた細胞に比較して、ＶＬＡ−５接着部位を含有する培養中で増殖させた細胞では、増殖が有意により増加し、そしてＥＲＫ類の活性化が増進することが立証される。さらに、我々の結果は、これらの２つの異なるβ１インテグリン受容体を介した接着を仲介するＦＮ上で増殖させた細胞において、ＦＡＫ、並びにＭＡＰキナーゼＥＲＫ−１およびＥＲＫ−２両方の活性化に、有意な定量的相違を示す。具体的には、Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞に対するＶＬＡ−４の結合は、ＶＬＡ−５結合部位を含有する培養中で増殖させた細胞に比較して、ＦＡＫ、ＥＲＫ−１およびＥＲＫ−２活性化の有意な減少を生じる。ＦＡＫ、ＥＲＫ−１およびＥＲＫ−２活性化の減少は、これらの細胞の増殖の減少と相関した。さらに、ＶＬＡ−５結合部位を含有するＦＮ上で培養した細胞は、特異的ＭＥＫ阻害剤ＰＤ９８０５９の増殖阻害効果により耐性であるため、活性化の相違は、細胞増殖に重要であるようである。
【００５４】
対照的に、ＶＬＡ−４を介した細胞の接着は、有意な細胞死を生じた。ＦＡＫおよびＭＡＰＫ活性化の減少に加え、ＶＬＡ−４を介した連結に反応した増殖の阻害は、これらの細胞において、Ａｋｔ活性化の有意な減少に相関した。ＳＣＦが誘導するｃ−Ｋｉｔの活性化は、これらの細胞において、アポトーシスを部分的に妨げたが、ＶＬＡ−５を介した接着を仲介するＦＮ上で、または懸濁中で増殖させた細胞に比較して、アポトーシスのこの逆転は不完全であった。線維芽細胞での研究は、インテグリン類および増殖因子類が、共同で、Ａｋｔ活性化を制御することが可能であることを示してきている。線維芽細胞において、Ａｋｔの活性化はアポトーシスの抑制を導くが、他の細胞では、活性化Ａｋｔは、増殖因子退薬に反応したアポトーシスから細胞を保護することが可能であり、そしてこれらの細胞において、アポトーシスは優性ネガティブＡｋｔ（６１）によって、加速される可能性がある。最近、我々は、膜会合ＳＣＦを介したｃ−Ｋｉｔの刺激によるＡｋｔの延長された活性化が、赤血球細胞生存／増殖と関連することを立証した（６４）。ＶＬＡ−４が仲介する連結が、Ａｋｔ活性化の減少、そしてその結果、より多いアポトーシスを生じるという我々の発見は、Ａｋｔが造血細胞生存に関係するという、これらの先の研究と一致する。インテグリン類および／または増殖因子受容体刺激を介した赤血球細胞生存におけるＰＩ−３キナーゼ依存Ａｋｔ活性化の重要な役割は、ＰＩ−３キナーゼ阻害剤ワートマニンの使用による、本明細書に提示した研究に、さらに示した。この結果によって、ＰＩ−３キナーゼ／Ａｋｔ経路が、赤血球細胞において、ｃ−Ｋｉｔおよびインテグリン類の下流の細胞死の重要なアンタゴニストであることが示唆される。
【００５５】
赤血球細胞の増殖および生存に対するＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５の連結の相対する影響の機構（類）は、明らかでない。Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞は、匹敵するレベルで、ＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５を両方発現するが、ＦＮに対するＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５の全体的なアビディティー（ａｖｉｄｉｔｙ）が異なるという可能性は排除できない。全体的なアビディティーにおけるこれらの相違が、異なる生物学的および生化学的結果を生じる可能性がある。あるいは、観察される相違は、ＦＮと、それぞれＶＬＡ−５およびＶＬＡ−４の特異的α５およびα４鎖の結合を介したユニークなシグナルの生成のためである可能性がある。例えば、赤血球前駆細胞を用いた、本明細書に提示した研究は、ＶＬＡ−４に比較して、ＶＬＡ−５結合部位を含有するＦＮの存在下で増殖させた細胞における、ＦＡＫの有意により高い活性化を立証する。これに関連して、ＶＬＡ−５およびｃ−Ｋｉｔを介したＦＡＫ活性化の増進が、Ｒａｓのより効率的な補充、およびしたがってＲａｆ−１、ＭＥＫ、およびＭＡＰＫの下流キナーゼカスケードを導く可能性がある。線維芽細胞において、このモデルを支持する証拠がある。接着が仲介するＦＡＫの自己リン酸化は、Ｓｒｃ補充、ＦＡＫのチロシンリン酸化の増加、並びにそれに続く、ＳｈｃおよびＧｒｂ２／Ｓｏｓ複合体を含むＳＨ２ドメインタンパク質の結合を導く（６５）（６６）（６７）。ＦＡＫ／Ｓｒｃ／Ｇｒｂ２複合体の形成による、ＭＡＰＫへのさらなるシグナル伝達の可能性が示唆される。さらに、ＦＡＫの過剰発現が、ＭＡＰＫのＲａｓ依存活性化を生じることを研究が示してきている（６８）。したがって、ＶＬＡ−５およびｃ−Ｋｉｔ活性化を介したＦＡＫリン酸化の増進は、ＶＬＡ−５を介した接着を仲介するＦＮ上で増殖させた細胞におけるＥＲＫ類の活性化の増進を説明する可能性がある。対照的に、初代ヒト歯周靭帯線維芽細胞を利用した最近の研究は、ＶＬＡ−４を介したＦＮへの接着がＦＡＫ発現の減少を生じることを示してきている。これらの細胞において、ＶＬＡ−４を介した接着後のＦＡＫ発現の変化は、カスパーゼカスケードの活性化のためであることが示された（６９）。したがって、これらの公表された結果に加えて、我々のデータは、赤血球細胞において、インテグリン連結の相対する影響が仲介される可能性がある機構を提供する。
【００５６】
長期ヒト骨髄培養を利用した、先の研究は、インテグリン受容体類を介した、骨髄支質への直接の接着に反応した、造血細胞増殖の阻害を立証した（１７）。本明細書に提示するデータによって、ＶＬＡ−５に比較して、ＶＬＡ−４が仲介するＦＮへの連結が、赤血球前駆体において、ユニークなシグナルを誘発することが示唆される。これらのシグナルの結果は、死対増殖であり、互いに異なる。総合すると、これらのデータは、造血細胞において、特定のインテグリン−ＦＮ相互作用が、細胞生存および増殖を制御することが可能であり、そしてこれらの影響は、リガンドが誘導する増殖因子受容体の刺激を介して調節可能であるという知見を支持する。
【００５７】
本発明は、特定の実施例を含む、前述の説明に詳細に例示され、そして記載されているが、こうした説明は例示であり、そして性質として限定するものでないとみなされるものとし、好ましい態様のみが示され、そして記載されてきており、そして本発明の精神内にある、すべての変更および修飾は保護されることが望ましいことが理解される。
【００５８】
参考文献
以下の参考文献、および本出願に引用される他の参考文献はいずれも、当該技術分野のレベルを示し、そして引用され、そして完全に示された箇所で、各々が個々に援用されているかのように、各々、本明細書に援用される。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
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【００６１】
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【００６２】
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【００６３】
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【００６４】
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【００６５】
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【００６６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】（Ａ）実施例で使用するフィブロネクチンペプチドの略図。ＦＮは、一連のＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ型反復で構成される。細胞結合活性を持つＦＮの領域は、インテグリンＶＬＡ−５に認識されるＲＧＤ含有細胞結合ドメイン（細胞）、非インテグリン依存高親和性ヘパリン結合部位（ＨＥＰ）、およびインテグリンＶＬＡ−４に認識される選択的スプライシング非ＩＩＩ型連結部位（ＩＩＩＣＳ）（ＣＳ−１）として示す。ＦＮ上のインテグリンＶＬＡ−４、ＶＬＡ−５認識部位と共にヘパリン結合部位は、矢印で示す。Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞上のインテグリン類およびｃ−Ｋｉｔの発現。（Ｂ）Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞を抗ｃ−Ｋｉｔ−ＰＥで染色し、そしてフローサイトメトリーによって解析した。細い線は、適切なアイソタイプ対照抗体で観察された、バックグラウンド染色のレベルを示す。太い線は、ｃ−Ｋｉｔ発現のレベルを示す。（Ｃ）Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞を抗ＶＬＡ−４−ＦＩＴＣで染色し、そしてフローサイトメトリーによって解析した。太い線は、ＶＬＡ−４発現のレベルを示す。（Ｄ）Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞を抗ＶＬＡ−５−ＰＥで染色し、そしてフローサイトメトリーによって解析した。太い線は、ＶＬＡ−５発現のレベルを示す。
【図２】ＳＣＦの非存在下または存在下での、Ｇ１Ｅ−ＥＲ２赤血球前駆体の増殖に対する、ＦＮペプチドへの接着の影響の比較。細胞は、ＳＣＦの非存在下（Ａ）または存在下（Ｂ）、ＢＳＡ上で、あるいはＶＬＡ−４（Ｈ２９６）またはＶＬＡ−５（ＣＨ２７１）を介した接着を仲介するＦＮペプチドでコーティングしたプレート上で培養した。増殖は、チミジン取り込みアッセイによって測定した。バーは、６つの重複測定で行った６つの異なる実験の平均チミジン取り込み（分あたりのカウント［ｃｐｍ］）（±ＳＥＭ）を示す。パネルＡ対Ｂの目盛りの相違に注目されたい。パネルＡ（＊）ｐ＜０．０５  ＶＬＡ−４（Ｈ２９６）対ＶＬＡ−５（ＣＨ２７１）およびＢＳＡ。パネルＢ（＊）ｐ＜０．０５  ＶＬＡ−４（Ｈ２９６）対ＶＬＡ−５（ＣＨ２７１）およびＢＳＡ；（＊＊）ｐ＜０．０５  ＶＬＡ−５（ＣＨ２７１）対ＢＳＡ。
【図３】インテグリン仲介接着後のＦＡＫおよびＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ類）活性化。因子飢餓Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞を、ＳＣＦの存在下、ＦＮペプチド上で培養し、そして示した時点で解析した。（Ａ）細胞溶解物を収集し、そして抗ＦＡＫ抗体を用いたウェスタンブロット解析に供した。下部のパネルは、リン酸化（ｐＦＡＫ）および未リン酸化（ＦＡＫ）ＦＡＫの位置を示す。上部のパネル（バー）は、ＦＡＫの相対リン酸化（４８時間を１００とする）を示す。バーは、３つの異なる実験の平均相対リン酸化（±ＳＥＭ）を示す。（＊）ｐ＜０．０５  ＶＬＡ−５（ＣＨ２７１）対ＶＬＡ−４（Ｈ２９６）。（ＢおよびＣ）因子飢餓Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞は未刺激で放置するか、あるいはＳＣＦの存在下、ＢＳＡ上で（Ｂ）、またはＶＬＡ−４（Ｈ２９６）およびＶＬＡ−５（ＣＨ２７１）を介した接着を仲介する、示したＦＮペプチド上で（Ｃ）、培養した。細胞溶解物を収集し、そしてリン酸化Ｔｈｒ２０２およびＴｙｒ２０４を特異的に検出する、ウサギ抗ホスホ−ＥＲＫ抗体を用いたウェスタンブロット解析に供した。下部のパネルは、各レーン中の総Ｅｒｋを示す。リン酸化ＥＲＫ−１（ｐＥｒｋ−１）およびＥＲＫ−２（ｐＥｒｋ２）の位置を示す。上部のパネル（バー）は、残基Ｔｈｒ２０２およびＴｙｒ２０４でのＥＲＫ−１およびＥＲＫ−２の相対リン酸化を示す。データは、１０分後（パネルＢ）（１０分後のレベルを１００とする）および１２０分後（パネルＣ）（１２０分後のレベルを１００とする）のＥＲＫ−１およびＥＲＫ−２のリン酸化に比較して示す。バーは、３つの異なる実験の平均相対リン酸化（±ＳＥＭ）を示す。（＊）ｐ＜０．０５  ＶＬＡ−５（ＣＨ２７１）対ＶＬＡ−４（Ｈ２９６）；（Ｄ）Ｇ１Ｅ−ＥＲ２赤血球前駆体は、ＳＣＦおよびＭＥＫ阻害剤（ＰＤ９８０５９）の存在下、ＢＳＡ上で、あるいはＦＮペプチドＨ２９６またはＣＨ２７１上で培養した。増殖は、チミジン取り込みアッセイによって測定した。バーは、６つの重複測定で行った、３つの独立の実験の増殖阻害（±ＳＥＭ）を示す。（＊）ｐ＜０．０５  ＶＬＡ−４（Ｈ２９６）対ＶＬＡ−５（ＣＨ２７１）およびＢＳＡ；並びに（＊＊）ｐ＜０．０５  ＶＬＡ−４（Ｈ２９６）およびＶＬＡ−５（ＣＨ２７１）対ＢＳＡ。
【図４】ＶＬＡ−４を介した連結は、Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞において、細胞死を誘導する。Ｇ１Ｅ−ＥＲ２赤血球前駆体は、ＳＣＦの非存在下（Ａ）、または存在下（Ｂ）、ＢＳＡ上で、あるいはＶＬＡ−４（Ｈ２９６）またはＶＬＡ−５（ＣＨ−２７１）への接着を仲介するＦＮペプチド上で、４８時間、培養した。細胞死は、材料および方法に記載するように、アネキシンＶおよびヨウ化プロピディウム（ＰＩ）染色を行うことによって定量化した。バーは、３つの重複測定で行った２つの独立の実験の総細胞死の割合（±ＳＤ）を示す。（＊）ｐ＜０．０５  ＶＬＡ−４（Ｈ２９６）対ＶＬＡ−５（ＣＨ２７１）およびＢＳＡ。
【図５】ＶＬＡ−４を介したＡｋｔ活性化の阻害は、Ｇ１Ｅ−ＥＲ２において、細胞死を増進する。（Ａ）ＶＬＡ−４（Ｈ２９６）接着を介したＳｅｒ４７３でのＡｋｔ活性化の減少。因子飢餓Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞は、未刺激のまま放置するか、あるいはＳＣＦの存在下、ＶＬＡ−４（Ｈ２９６）またはＶＬＡ−５（ＣＨ２７１）を介した接着を仲介するＦＮペプチド上で、多様な時間、培養した。続いて、多様な時点で、細胞溶解物を収集し、そしてリン酸化Ｓｅｒ４７３を特異的に検出する、ウサギ抗ホスホ−Ａｋｔ抗体を用いたウェスタンブロット解析に供した。下部のパネルは、各レーン中の総Ａｋｔを示す。活性化Ａｋｔ（ｐＡｋｔ）の位置を示す。上部のパネル（バー）は、Ａｋｔの相対リン酸化を定量的に示す。データは、１２０分後のＡｋｔのリン酸化（１００とする）に比較して示す。バーは、少なくとも３つの独立の実験の平均相対リン酸化（±ＳＥＭ）を示す。（＊）ｐ＜０．０５  ＶＬＡ−４（Ｈ２９６）対ＶＬＡ−５（ＣＨ２７１）。（Ｂ）Ｇ１Ｅ−ＥＲ２細胞は、ＳＣＦおよびＰＩ−３キナーゼ／Ａｋｔ阻害剤（ワートマニン）の存在下、ＢＳＡ上で、またはＦＮペプチドＣＨ２７１上で、４８時間、培養した。細胞死は、材料および方法に記載するように、アネキシンおよびヨウ化プロピディウム（ＰＩ）染色を行うことによって定量化した。バーは、３つの重複測定で行った２つの独立の実験の総細胞死の割合（±ＳＤ）を示す。（＊）ｐ＜０．０５  ＢＳＡ、ＶＬＡ−５（ＣＨ２７１）（ワートマニン）対ＢＳＡ、ＶＬＡ−５（ＣＨ２７１）（阻害剤なし）。
【図６】フィブロネクチンのα鎖構造およびいくつかの組換え断片との関連の図示。フィブロネクチンＩ、ＩＩおよびＩＩＩ型反復を示し、そしてＩＩＩ型反復に、１から１４の番号を付ける。細胞に対する３つの結合部位は、ＶＬＡ−５結合部位を含む細胞結合ドメイン（ＣＢＤ）の細胞、ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）のヘパリン、および選択的スプライシングＩＩＩＣＳ領域の最初の２５アミノ酸によって形成されるＶＬＡ−４結合部位ＣＳ１のＣＳ１として示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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2004516808.tif 000085