(57)【要約】本発明は、コンパニオンアニマル体内の核酸が受ける損傷を減少させることを目的として使用する栄養構成成分を提供する。該栄養構成成分は、ビタミンE、ビタミンCおよびカロテノイドである。コンパニオンアニマル体内の核酸の損傷を減少させることを目的とする食品の製造にこれらの構成成分を使用することができる。
2004537315.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンパニオンアニマル体内のDNAの損傷を減少させることを目的する食品の製造において使用することを特徴とする、ビタミンE、ビタミンCおよびカロテノイドの使用法。
【請求項２】
タウリンを追有することを特徴とする請求項１記載の使用法。
【請求項３】
カロテノイドが、β−カロチン、ルテインまたはリコピンのうちのひとつまたはそれ以上であることを特徴とする請求項１または２記載の使用法。
【請求項４】
ビタミンEの含有量が食餌400kcalあたり25IUまたはそれ以上であることを特徴とする請求項１から３のうちのいずれか１項記載の使用法。
【請求項５】
ビタミンCの含有量が食餌400kcalあたり10mgまたはそれ以上であることを特徴とする請求項１から４のうちのいずれか１項記載の使用法。
【請求項６】
カロテノイドの含有量が食餌400kcalあたり0.01mgまたはそれ以上であることを特徴とする請求項１から５のうちのいずれか１項記載の使用法。
【請求項７】
タウリンの含有量が食餌400kcalあたり80mgまたはそれ以上であることを特徴とする請求項２から６のうちのいずれか１項記載の使用法。
【請求項８】
食品がドライタイプ、ウェットタイプまたは半生タイプであることを特徴とする請求項１から７のいずれか１項記載の使用法。
【請求項９】
動物体内における核酸の損傷を減少させる方法であって、ビタミンE、ビタミンCおよびカロテノイドを含有する食品をコンパニオンアニマルに与えることを含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記食品がタウリンを追有することを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
カロテノイドが、β−カロチン、ルテインまたはリコピンのうちのひとつまたはそれ以上であることを特徴とする請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
ビタミンEの含有量が食餌400kcalあたり25IUまたはそれ以上であることを特徴とする請求項９から１１のうちのいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
ビタミンCの含有量が食餌400kcalあたり10mgまたはそれ以上であることを特徴とする請求項９から１２のうちのいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
カロテノイドの含有量が食餌400kcalあたり0.01mgまたはそれ以上であることを特徴とする請求項９から１３のうちのいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
タウリンの含有量が食餌400kcalあたり80mgまたはそれ以上であることを特徴とする請求項９から１４のうちのいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
構成成分を同時、別異に、または連続して与えることを特徴とする請求項９から１５のうちのいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
実施例のひとつまたはそれ以上を参考とする本明細書の記載に従うことを特徴とするビタミンE、ビタミンCおよびカロテノイドの使用法。
【請求項１８】
実施例のひとつまたはそれ以上を参考とする本明細書の記載に従うことを特徴とするコンパニオンアニマル体内の核酸の損傷を減少させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コンパニオンアニマル（伴侶動物）体内の核酸がうける損傷を減少させるために使用する栄養構成成分を提供する。
【背景技術】
【０００２】
種特異的な寿命の決定を含むメカニズムを解明することは、生物学的加齢に関する未解決の疑問のうちのひとつである。
【０００３】
進化の理論によれば、寿命が長い種は、ストレスに対する細胞の抵抗性が高められているなどの、より丈夫な体質によって寿命を保つことができるという説が提唱されている。呼吸およびその他の代謝活性のなどの正常な細胞過程は、細胞微環境に様々なストレスをかけている。酸化ストレス、熱エネルギー、ならびにイオンおよびpH の変化などを含むこれらのストレスは、正常な生化学的反応において生じ、それらすべてが細胞器官（例えば、ミトコンドリア、ゴルジ体、サイトソル、原形質膜、細胞骨格、リソソームおよび核など）および細胞巨大分子（例えば、タンパク質、多糖類、核酸、脂質、リン脂質など）に損傷を与えることが知られている。そのようなストレスによって生じた損傷のうちの一部は非可逆性である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、細胞器官または細胞巨大分子などの細胞微環境中のひとつまたはそれ以上の構成成分が受ける損傷を減少させることが所望されている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、核酸が受ける損傷を減少させるために使用する栄養性介入を提供する。
【０００６】
細胞器官および細胞巨大分子に影響を与える因子は多岐にわたると考えられている。例えば、環境的影響（温度、圧力）、地理的因子、表現型因子および栄養性介入（食餌）などが挙げられる。
【０００７】
本発明は、細胞巨大分子、すなわち核酸分子が受ける損傷を減少させるために使用する栄養性介入を決定し、提供する。
【０００８】
従って、本発明は、コンパニオンアニマル体内の核酸が受ける損傷を減少させるための食品の製造におけるビタミンE、ビタミンCおよびカロテノイドの使用法を提供する。
【０００９】
核酸とは、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）である。
【００１０】
ビタミンEは、トコフェロール類およびトコトリエノール類と称されるものを含む生物学的に類似したの数種の化合物の集合名称であり、同一の生物学的活性を有する。動物組織内において最も生物学的に活性な（ならびに、最も活性が強い抗酸化剤である）ビタミンEの生物学的型はα−トコフェロールである。ビタミンEはイン・ビボ（in vivo）では合成できない。細胞膜の集積性が消失すると、細胞および器官の機能が逆に変化するが、ビタミンEは、細胞膜の集積性が消失することを防ぐ。
【００１１】
ビタミンEの単位は国際単位（IU）で表され、α−トコフェロール１IUは、１mgのα−トコフェロールと等価である。その他のビタミンE化合物は、α−トコフェロールと比較した生物力価によって定められたIUを有しており、それらは、マクドウェル（McDowell）, L. R.（1989年）、「ビタミンE：動物栄養におけるビタミン類（Vitamin E: vitamins in Aminal Nutrition）」第４章96ページ（アカデミック・プレス（Academic Press）社、イギリス）に記載されている。
【００１２】
本発明の第一の態様に従うビタミンEは、任意の型のものを用いることができる。トコフェロールまたはトコトリエノールである。例えば、α−トコフェロール（ｄ−αまたはｄｌ−α）、β−トコフェロール（ｄ−βまたはｄｌ−β）、γ−トコフェロール（ｄ−γまたはｄｌ−γ）、δ−トコフェロール、アルファートコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノールまたはδ−トコトリエノールなどである。好ましくは、α−トコフェロールである。
【００１３】
ビタミンEの供給源は特に限定しない。好ましいビタミンEの供給源としては、ビタミンEアセタート（例えば、トコフェロールアセタートなど）、ビタミンEアセタート吸着質またはスプレードライビタミンEアセタートなどが挙げられる。天然の供給源も使用できるが、合成による供給源が好ましい。
【００１４】
ビタミンEの投与形態は特に限定しない。食餌、食品またはサプリメント（栄養補助食品）の形態にすることができる。本明細書においては、「食品」とは、すべての食品、食餌およびサプリメントを包括する。固体、半固体または液体の任意の形態にすることができる。
【００１５】
サプリメントは、本発明に従う構成成分のうちのひとつまたはそれ以上の成分を十分量含んでいない食餌または食品に補充を行うために特に有用である。サプリメント中の構成成分濃度を利用して、動物の食餌または食品中の成分レベルを「上積み」することができる。このことは、動物の食餌に一定量のサプリメントを混入する、または、一定量のサプリメントを追加して動物に与えることによって実施可能である。サプリメントは、本発明の構成成分のうちのひとつまたはそれ以上を非常に高濃度含有する食品として調製することができ、その場合は、動物に与えるときに希釈する。サプリメントは、固体（例えば、粉末など）、半固体（例えば、食物様の硬度／ゲル）、液体を含む任意の形態に加工することができ、また別の形態としては、タブレットもしくはカプセルの形態にすることができる。液体は、食物と混合する、または、スプーンもしくはピペット様の器具を用いるなどして直接動物に与えることにより、簡便に利用することができる。サプリメントは、本発明の構成成分のうちのひとつまたはそれ以上を多量に含有しており、または、少なくとも２部からなるパックを組み合わせた形態であり、各部は、構成成分のうちのひとつまたはそれ以上を要求されたレベルで含有している。
【００１６】
好ましくは、ビタミンEは、市販のペットフード製品または市販の食餌性サプリメントに混ぜ込む。ペットフード製品は、ドライタイプ（乾燥品）、半生タイプ（半乾燥品）、ウェットタイプ（含湿品）または液体（ドリンク）品などの状態である。ウェットタイプとしては、缶またはホイル容器に詰めた固体であり、含湿度が70〜90％である食品を含む。ドライタイプは、ウェットタイプと同様な組成であるが、含湿度が５〜15％であり、ビスケット様粒子として成形した食品を含む。食餌、食品またはサプリメントはパッケージ詰めすることが好ましい。そのようにすることにより、消費者は、パッケージ容器から、食品中の原材料を確認することができ、また、自分の犬または猫に適していることを確認することができる。パッケージ容器は、金属（通常は、缶または柔軟性ホイルなどの形態である）、プラスチック、紙または厚紙などで作ることができる。任意の製品中の含湿度は、使用することができる、または必要とされるパッケージ容器の種類によって異なる。
【００１７】
本発明に従う食品は、コンパニオンアニマルが食餌として摂取することができる任意の製品を包含する。従って、本発明は、標準的な食餌用製品、ならびに、ペットフードスナック類（例えば、棒状スナック、ビスケットおよび甘味製品など）を含む。好ましくは、食品は調理済み品である。食品は、肉または動物由来の材料（例えば、牛肉、鶏肉、七面鳥肉、羊肉、血漿、骨髄など、またはそれらのうちの２種またはそれ以上の混合物）に混入することができる。別の方法としては、食品は、タンパク質源を提供することを目的として、肉を用いない（好ましくは、大豆グルテン、トウモロコシグルテン、または大豆製品などのような肉の代替品をふくむ）ことができる。そのような製品は、大豆タンパク質濃縮物、乳タンパク質、グルテンなどのようなタンパク質源を追有する。さらにそのような製品は、１種またはそれ以上の穀物（例えば、小麦、トウモロコシ、米、オーツ麦、大麦など）などのようなデンプン質源を含む場合、またはデンプン質を含まない場合がある。市販されている一般的なドライタイプのドッグフードおよびキャットフードは、約30％の粗タンパク質、約10〜20％の脂質を含み、残りは食物繊維および灰分を含む炭水化物である。一般的なウェットタイプまたはモイストタイプの製品は、乾燥状態を基準として、約40％の脂質、50％のタンパク質を含み、残りは食物繊維と灰分である。本明細書に記載しているように、特に本発明は、猫または犬用の食餌、食品またはサプリメントとして販売される食品に関する。
【００１８】
本発明のコンパニオンアニマルは特に制限はない。ヒトに対するものではない。コンパニオンアニマルとしては、イエネコ（ネコ）およびイエイヌ（イヌ）、ならびに、馬、魚類、鳥類、ウサギおよびモルモットなどが挙げられる。本明細書において使用している「イエイヌ」および「イエネコ」とは、特に、Felis domesticusおよびCanis domesticusをさす。
【００１９】
製品（固体、液体またはその他の任意の状態）中のビタミンＥ濃度は容易に測定することができる。例えば、HPLC法などによって測定することができる。
【００２０】
好ましくは、本発明の第一の態様に従う食品中のビタミンEは、食餌400kcalにつき25IU以上のレベルである。本明細書において、kcalあたりの濃度とは、代謝可能な摂取総エネルギーのkcalに基づくものである。カロリー濃度の決定については、「犬の栄養要求量（Nutritional Requirements of Dogs）」（国立研究協議会（National Research Council）（アメリカ合衆国））（ナショナル・アカデミー・プレス（National Adacemy Press）、ワシントンDC）（1985年）（ISBN: 0-309-03496-5）、または、「猫の栄養要求量（Nutritional Requirements of Cats）」（国立研究協議会（National Research Council）（アメリカ合衆国））（ナショナル・アカデミー・プレス（National Adacemy Press）、ワシントンDC）（1986年）（ISBN: 0-309-03682-8）を用いて行うことができる。猫に対して好ましいレベルは、30IU／400kcal以上、35IU／400kcal以上、40IU／400kcal以上、45IU／400kcal以上、50IU／400kcal以上、55IU／400kcal以上、約100IU／400kcalまで、またはそれ以上である。犬に対して好ましいレベルは、30IU／400kcal以上、40IU／400kcal以上、45IU／400kcal以上、50IU／400kcal以上、55IU／400kcal以上、60IU／400kcal以上、65IU／400kcal以上、約100IU／400kcalまで、またはそれ以上である。
【００２１】
本発明の第一の態様においてはビタミンC（アスコルビン酸）も含む。
【００２２】
ビタミンCは水溶性の物質である。ビタミンCは、ネコおよびイヌにおいてデ・ノボ（de novo）合成される。なぜならば、イン・ビボ（in vivo）合成されることにより、イヌおよびネコの体内におけるビタミンCサプリメントの効果についてはこれまで研究されていなかったからである。特に、抗酸化剤として、およびビタミンEサプリメントとの組み合わせにおいて、ビタミンCサプリメントがネコおよびイヌに与える効果については研究されていない。
【００２３】
本発明の第一の態様に従うビタミンCは、任意の形態で用いることができる。液体、半固体または固体の形態にすることができる。好ましくは、リン酸カルシウムを含むような熱安定性の形態である。
【００２４】
ビタミンＣの供給源は特に限定しない。好ましいビタミンＣ供給源としては、結晶性アスコルビン酸（できれば純粋なもの）、エチルセルロース被覆アスコルビン酸、アスコルビン酸のリン酸カルシウム塩、アスコルビン酸−２−一リン酸塩もしくは、アスコルビル−２−一リン酸塩（痕跡量の二リン酸塩および三リン酸塩、リン酸カルシウムを含む）、または新鮮肝臓などが挙げられる。
【００２５】
製品（固体、液体またはその他の任意の形態）中のビタミンＣ濃度は容易に測定することができる。例えば、HPLC法などによって測定することができる。
【００２６】
ビタミンＥをビタミンＣと組み合わせて使用することに関してさらに有用な点は、協同作用の可能性があることである。このことは、ビタミンEは脂溶性であり、ビタミンCは水溶性であるという事実によって裏付けられている。アスコルビン酸は、膜内のα−トコフェロールラジカルを迅速に還元し、α−トコフェロールにする。本発明の第一の態様に従うビタミンCの好ましい濃度は、対照食餌（ネコまたはイヌにおけるビタミンCの総摂取量は、５mg／400kcal）を与えられている動物と比較して、体内の血漿ビタミンCレベルを約25％（好ましくは25％以上）上昇させるような濃度である。このようなビタミンCレベルの上昇を達成できないようなレベルであっても、本発明の第一の態様の範囲内である。本発明の第一の態様に従うビタミンCのレベルとしては、食餌400kcalあたり10、12、15、17、20、22、25、27、30、32、38、40、42、48から約50mgの範囲である。ネコに対して好ましい範囲としては、さらに、10〜48mg／400kcalであり、イヌに対して好ましい範囲としては、さらに、12〜50mg／400kcalである。55mg／400kcal以上のレベルではさらなる効果は観察されず、避けたほうがよい。
【００２７】
本発明の第一の態様においてはカロテノイドを含む。
【００２８】
カロテノイド類は、植物性食品、とくに果物および野菜、ならびに植物を食する動物の組織内に多く見られる赤、橙色および黄色の染料群である。親油性化合物である。カロテノイド類の中には、ビタミンAの前駆体として作用するものもあれば、そうでないものもある。そのような特性は、抗酸化活性とは無関係である。
【００２９】
カロテノイド類は、強力な抗酸化剤として作用する。カロテノイド類は、動物種によって吸収量が異なる。カロテノイド類は、２つの主要な群に分類することができる；ひとつはカロチン類であり、もうひとつはキサントフィル類（酸化化合物を含む）である。一般的なカロテノイド類としては、β−カロチン、α−カロチン、リコピン、ルテイン、ゼアキサンチンおよびアスタキサンチンなどが挙げられる。カロテノイド類がネコまたはイヌの食餌において必須食品であることは証明されていない。ヒトおよびイヌと異なり、ネコは、腸粘膜内に前駆体β−カロチンを活性ビタミンAに転換するために必要な酵素を有しない（カロチン分子を解裂するのに必要なジオキシゲナーゼ酵素を持っていない）ため、β−カロチンを活性ビタミンAに転換することができない。
【００３０】
本発明は、ネコおよびイヌによってカロテノイド類が吸収され（血漿中濃度が上昇し）、DNAが受ける損傷を減少させることに寄与できることを示すものである。さらに、本発明は、市販の製品にカロテノイド類を混入することにより、カロテノイド類が吸収されることを示している。上述したように、本発明の第一の態様に従う構成成分は協同作用することができる。ビタミンEはβ−カロチンの酸化を保護することができ、β−カロチンを節約する作用を有する。ビタミンEは、β−カロチンの化学結合を酸化から保護すると考えられる。
【００３１】
カロテノイド類の供給源は特に限定せず、天然および合成の供給源を利用することができる。特に、好ましい供給源は天然由来のものであり、マリーゴールドミール（マリーゴールド粕）およびアルファルファミール（アルファルファ粕）（ルテインの供給源として）；トマトミール（トマト粕）、レッドパーム油、トマト粉末、トマトの絞りかす／パルプ（β−カロチンおよびリコピンの供給源として）などが挙げられる。高レベルのカロテノイドを含有する油類、ならびに合成された純粋なカロテノイド類（ルテイン、ビオラキサンチン、クリプトキサンチン、ビキシン、ゼアキサンチン、アポ−EE（アポ−８−カロテン酸エチルエステル）、カンタキサンチン、シトラナキサンチン、アキネノン、リコピンおよびカプサンチンなど）なども供給源として挙げられる。カロテノイド類の総レベルとしては、好ましくは、0.01mg／400kcal以上、または0.2mg／400kcal以上、または１mg／400kcal以上、または２mg／400kcal以上である。
【００３２】
カロテノイド類の濃度としては、次のようなものが好ましい：
β−カロチン：0.01〜1.5mg／400kcal、好ましくは、0.5〜１mg／400kcal
リコピン：0.01〜1.5mg／400kcal、好ましくは、0.5〜１mg／400kcal
ルテイン：0.05〜1.5mg／400kcal、好ましくは、0.5〜１mg／400kcal。
【００３３】
特に、本発明は、第一の態様に基づいてカロテノイド類の組み合わせを提供する。
【００３４】
カロテノイド類の組み合わせに使用する好ましい供給源としては；
レッドパーム油およびマリーゴールドミール
トマト粉末、マリーゴールドミールおよびアルファルファ
トマトの絞りかすおよびマリーゴールドミール
などが挙げられる。
【００３５】
製品中のカロテノイドレベルは容易に測定することができる。例えば、HPLC法によって測定することができる。
【００３６】
本発明の第一の態様においてはタウリンを含有する。
【００３７】
タウリンは、広範な動物種において見出される異質なアミノ酸である。タウリンは、ネコにとっては必須食品であるが、これは、ネコはイヌと異なり、前駆体アミノ酸からタウリンを合成することができないからである。タウリンは、酸化剤を含む毒性組成物から細胞膜を保護すると考えられている。動物の食餌中のビタミンタウリンレベルを上げることによって遊離のラジカルを減少させることができ、故に、特に、本発明のその他の構成成分と組み合わせることにより、動物体内においてDNAが受ける損傷を減少させることができる。
【００３８】
本発明の第一の態様に従うタウリンは、任意の形態で用いることができる。粉末、結晶、半固体または液体の形態で用いることができる。
【００３９】
タウリンの供給源は特に限定しない。好ましいタウリンの供給源としては、アミノエチルスルホン酸（C2H7NO3S）が挙げられる。供給源としては、天然のものも合成のものも用いることができる。
【００４０】
本発明の第一の態様に従って使用するタウリンの適切な濃度は、製品（例えば、そのような製品は、ドライタイプまたは缶詰などである）を加工する際にある程度の範囲に定められている。ネコの血漿中のタウリンレベルを正常範囲（＞60μmol／L）に維持するためには、缶詰（モイストタイプ）の食餌では１日につき、体重１ｋｇあたり少なくとも39mgのタウリンを供給する必要があり、また、ドライタイプの食餌では、１日につき、体重１kgあたり少なくとも19mgを供給する必要がある。本発明の第一の態様に従えば、高温法によらない製品（缶詰など）においては、タウリンの好ましいレベルは、約80mg／400kcal以上であり、より好ましくは約100mg／400kcal以上であり、さらに好ましくは、400kcalあたり120、150、180、200、220、250、280、300、320、350、400およびそれ以上である。高温法などによって加工を行う製品においては、本発明に従うタウリンのレベルは、好ましくは約380mg／400kcal以上であり、より好ましくは約400mg／400kcal以上であり、さらに好ましくは、400kcalあたり420、450、480、500、520、550、600、620、650、700およびそれ以上である。
【００４１】
製品（固体、液体またはその他の任意の形態）中のタウリン濃度は容易に測定することができる。例えば、HPLC法によって測定することができる。
【００４２】
上述したように、本発明は、ビタミンEおよびその他の構成成分を含む。好ましくは、缶詰またはドライタイプのペットフード中における構成成分の有用な組み合わせとしては；
ビタミンE、ビタミンC、タウリン、レッドパーム油およびマリーゴールドミール
ビタミンE、ビタミンC、タウリン、トマト粉末、マリーゴールドミールおよびアルファルファ
ビタミンE、ビタミンC、タウリン、トマト粉末およびマリーゴールドミール
ビタミンE、ビタミンC、タウリン、トマト粉末およびアルファルファ
ビタミンE、タウリン、トマトの絞りかすおよびマリーゴールドミール
などが挙げられる。
【００４３】
本発明に従う組み合わせは；
製品加工（ト゛ライタイフ゜）後の400kcalあたりの活性成分量
ビタミンC         20mg（アスコルビン酸として）
ビタミンE         50IU
タウリン          200mg（ウェットタイプの製品では500mg）
ルテイン          0.17mg
リコピン          0.03mg
β−カロチン      0.01mg
である。
【００４４】
本発明に従うさらに有用な組み合わせは；
ビタミンE         50IU／400kcal
ビタミンC         20mg／400kcal
タウリン          500mg／400kcal
β−カロチン      0.5〜１mg／400kcal
リコピン          １mg／400kcal
ルテイン          0.5〜１mg／400kcal
である。
【００４５】
本発明に従う食品についてのその他の有用な構成成分としては、微量のミネラル（直接的な抗酸化作用を有するわけではないが、抗酸化金属酵素系内の補因子として作用する）、セレン（抗酸化剤であるセレン酵素、グルタチオンペルオキシダーゼの必須部分）、銅、亜鉛、およびマンガン（抗酸化剤である金属酵素のCu-Zn−スーパーオキシドジスムターゼおよびMn−スーパーオキシドジスムターゼの中心部を形成する）などが挙げられる。
【００４６】
本発明の第二の態様としては、動物体内において核酸が受ける損傷を減少させる方法を提供し、そのような方法としては、ビタミンE、ビタミンCおよびカロテノイドを含む食品を動物に与えることを含む。
【００４７】
第一の態様において好ましいすべての特徴は、第二の態様に対しても適用することができる。
【００４８】
第二の態様に基づく方法に従えば、構成成分は、同時、別異にまたは連続して投与または摂取することができる。
【００４９】
酸化によるDNA損傷の進行においては、フリーラジカル種が関与していることを示唆する証拠が増えるにつれ、DNA損傷のレベルを正確に評価する必要性がある多数の変性性疾患の病因に関連づけることが新たに注目されている。正常なヒト細胞においてDNAの損傷が顕著なレベルで検出された場合には、正常な代謝過程の副産物として生成したフリーラジカル種（例えば、ヒドロキシルラジカル種など）の攻撃によるものであることが想起される。
【００５０】
損傷を起こす可能性があるフリーラジカル種を抑止するための多様な防御機構が存在する。第一次の抗酸化防御としては、酵素類（カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼなど）が挙げられる。第二次の抗酸化防御としては、フリーラジカルによって誘起されたDNAの損傷部分を除去するための切除および修復過程が挙げられる。これらの防御機構が存在するにも関わらず、細胞内で損傷が生じ、未修復DNAが蓄積することによって多様な疾患が引き起こされると考えられている。
【００５１】
単細胞電気泳動法、より一般的にはコメットアッセイとして知られている方法は、核酸の損傷（特にDNAの損傷）を測定するための簡便かつ非常に感度の高い方法であり、細胞１個のレベルにおいてDNAの損傷を評価することができるという利点も有する。該アッセイの基本原理は、すべての細胞型に存在するDNAは、フリーラジカルの攻撃によって損傷を受け、突然変異を起こし、または組換えを行う可能性があるということである。DNA修復酵素（例えば、DNAエンドヌクレアーゼ類など）は、DNA内の損傷を受けた部分を除去する。このことは、DNA内に空隙を残す、または「DNA鎖の解裂」を起こさせる効果がある。コメットアッセイは、そのような鎖の解裂部分を検出および定量することを目的として設計されている。
【００５２】
これまで、コメットアッセイは、多様な研究に用いられている。例えば、毒性研究（シン（Singh）, N. P.、マッコイ（McCoy）, M. T.、ティス（Tice）, R. R.およびシュナイダー（Schneider）, E. L.(1988)、個々の細胞内における低レベルのDNA損傷を定量するための簡便な方法（A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells）（Exp. Cell Biol. 175: 184-191）、運動誘導性の損傷（ハートマン（Hartmann）, D.（1994）、加齢に対するフリーラジカル理論：機能的寿命の延長（Free-radical theory of ageing: Increasing the functional life span ）（Ann. NY. Acad. Sci. 717: 1-15））、ならびに、細胞増殖の測定およびDNA修復機構（デュシー（Duthie）, S. J.およびコリンズ（Collins）, A. R.（1977）、ヒト細胞内で過酸化水素によってDNAが損傷を受けたことにより細胞増殖、解毒酵素およびDNA修復に与える影響（The influence of cell growth, detoxifyng enzymes and DNA repair of hydrogen peroxide-mediated DNA damage in human cells）（コメットアッセイを用いて測定）（Free Radic. Biol. Med. 22: 717-724））などが挙げられる。
【００５３】
フリーラジカルによる損傷のレベルを正確に測定する能力を得ること、および、食餌介入をどのように行うことによってネコおよびイヌにおけるそのような損傷を減少させることができるかが重要である。発明者らは、栄養的研究の一環として、ネコおよびイヌの血液サンプル中でフリーラジカル攻撃によって誘起させたDNA損傷のレベルを測定することを目的として、コメットアッセイ（シン（Singh）ら（同上）によって記載された原法を改良したもの）を開発し、有効性を確認した。
【００５４】
コメットアッセイは、反応性酸素種などのフリーラジカル種がDNA鎖を攻撃し、鎖を解裂させることにより、DNAのスーパーコイル構造を解き、消失させるという原理に基づいている。白血球などの細胞は、アガロース内に包埋して顕微鏡のスライドガラス上に乗せ、界面活性剤で溶解させてアルカリ条件下において電気泳動を行う。ヌクレオソームは含まないが、スーパーコイル構造は保持しているDNAを含む核様体が形成する。DNA内に存在する解裂部によってスーパーコイル構造が部分的にゆるみ、次に、DNAのループが自由に広がり、はっきりとした「尾」領域を有する彗星（コメット）型構造を形成する。「尾」領域は、アルカリ性電気泳動を行った場合に、核様体の「頭」から移動してきた、伸びて壊れたDNAループを有する。
アルカリ条件により、壊れたループ内の鎖が解け、アルカリに不安定な部位のDNA解裂が起こり、コメットの「頭」と「尾」が形成される。
【００５５】
蛍光染色後、染色の濃度は、確認済みの視覚評価系および／またはコンピューター画像分析パッケージによって定量した、DNAが損傷を受けているDNA量と関連していた。DNAの損傷を測定する２つの方法について評価を行った。ひとつは、内因性（バックグラウンド）のDNA損傷であり、これは、細胞内で自然に生じるDNA鎖の解裂の指標となるものである。２つめは、人為的に誘導された（過酸化水素で処理した細胞の）DNAの損傷であり、これは、外因性の損傷に対する酸化抑制抵抗性を反映している。
【００５６】
内因性および外因性のDNA損傷から、二次疾患の進行に関与する損傷のレベルが上昇していた（または、損傷の原因となるストレスが上昇していた）ことが示唆された。
【００５７】
コメットアッセイには以下のような利点があることも明らかになっている：
ネコおよびイヌからの血液サンプルは少量でよい
細胞１個のレベルにおいてDNAの損傷を検出できる感度を有する
ハイスループットアッセイを行うことができる
実施が容易であり、適用範囲が広く、安価である。
【００５８】
コメットアッセイを用いることにより、内因性および外因性のDNA損傷に対して食餌が及ぼす影響を識別することができ、従って、栄養補助を変えることによってネコおよびイヌのDNA損傷のレベルを調整するという効果を研究するための簡便なバイオアッセイとして提唱することができる。
【実施例】
【００５９】
以下の実施例を参照にしながら本発明を説明していくことにする。
【００６０】
実施例１：イヌおよびネコの白血球におけるDNA損傷のレベルを評価するための単細胞ゲル電気泳動アッセイ（コメットアッセイ）に関する有効性の確認
栄養補助を行うことにより、フリーラジカルによって引き起こされる損傷から細胞を保護するという効果についての研究に利用することを目的とし、イヌおよびネコの系においてコメットアッセイを開発し、有効性を確認した。
【００６１】
材料および方法
細胞の調製
すべてのネコおよびイヌは、ペット栄養研究のためのウォルサムセンター（Waltham Centre for Pet Nutrition）においてペット用のネコおよびイヌと同様の条件下で飼育し、研究期間中は市販の完全食を与えた。12匹の健康な成猫（7.2±4.8才）および12匹の健康な成犬（4.5±2.3才）の頸静脈から少量の血液サンプル（5ml）を採取してリチウムヘパリンバイアルに入れ、PBSaで１：１に希釈した。Histopaque 1083 gradients（シグマ（ Sigma ）社、イギリス）を用い、1000gで40分間遠心分離することによって白血球を単離した。10mlのPBSaで白血球を２回洗浄し、700gで10分間遠心分離した後、計数し、90％ウシ胎仔血清（シグマ（ Sigma ）社）および10％のジメチルスルホキシド（シグマ（ Sigma ）社）の混合液中、１×106個／mlとし、−80℃で保存した。一般的に、生存率（トリパンブルー染色によって評価）は約95％であった。
【００６２】
過酸化水素処理
DNA損傷は、白血球をH2O2に接触させる（濃度範囲は０〜250μM、PBSaで希釈）ことによってイクス・ビボ（ex vivo）で誘導し、内因性のDNA損傷のバックグラウンドレベル以上にDNAの損傷が顕著に増加するために必要なH2O2の至適レベルを決定した。37℃の水浴中で白血球を迅速に融解し、PBSaで２回洗浄し、700gで15分間遠心分離し、２×105個／mlとなるようにPBSaに再懸濁した。PBSa中のH2O2濃度が０μM、10μM、50μM、100μM、および250μMである溶液中に細胞を再懸濁し、氷上で５分間インキュベートした。処理した白血球は、４℃、700gで15分間遠心分離し、スライド調製用とした。
【００６３】
スライドの調製
２層のアガロースゲルを調製した。１層目は、完全に艶消しした顕微鏡用スライドガラス上に、95℃のPBSa中で調製した１％（w/v）の高融点（HMP）アガロース（シグマ（ Sigma ）社）をピペットで85μｌのせ、18mm×18mmのカバーガラスをかけ、４℃で10分間固定した。過酸化水素処理および未処理の白血球をPBSaで２回洗浄し、700gで15分間遠心分離して、１％（w/v）の低融点（LMP）アガロース（シグマ（ Sigma ）社）85μｌ中に２×105個となるように再懸濁した。次に、固定したHMPアガロース層上にピペットを用いて細胞懸濁液をのせ、18mm×18mmのカバーガラスをかけ、４℃で10分間固定した。カバーガラスをはずし、用時調製した冷溶解液中にスライドガラスを浸漬した。
【００６４】
細胞の溶解
細胞のタンパク質を除去することを目的として、予め冷却しておいた溶解液（2.5MのNaCl、100mMのEDTAナトリウム、10mMのTris（NaOH粒を用いてpHを10に調整）、１％のTritonX-100（v/v）（使用直前に添加））中にスライドガラスを４℃で60分間浸漬した。
【００６５】
アルカリ処理および電気泳動
細胞溶解に続き、スライドガラスをゲル電気泳動装置内に入れ、用時調製した電気泳動緩衝液（300mMのNaOH、１mMのEDTA、pH13）中、暗所において室温で40分間インキュベートし、その後、暗所において４℃、30分間かけて25V（300mA）で電気泳動を行った。
【００６６】
中和および染色
電気泳動を行った後、中和緩衝液（0.4MのTris-HCl、pH7.5）にスライドガラスを浸漬し、４℃で５分間３回穏やかに洗浄することにより、アルカリおよび界面活性剤を除去した。各スライドガラスに50μｌのSYBR Green（トレヴィジェン（Trevigen）社、メリーランド州ギャザースバーグ）を加えてDNAを染色し、カバーガラスをのせ、しめった密閉容器に入れ、観察するまで暗所に保存した。SYBR Greenは、損傷したDNAを染色するために選択したが、これは、別のDNA染色法よりも優れたSYBR Greenの検出感度およびアッセイ解析の改良について記載したワード（Ward）,T.H.およびマープレス（Maples）,B.による研究（「SYBR Green Iおよび単細胞電気泳動アッセイの感度の改良（SYBR GreenI and the improved sensitivity of the single-cell electrophoresis assay）」（Int. J. Rad. Biol. (2000)76: 61-65））に従ったものである。
【００６７】
DNA損傷に関する評価
DNAの損傷について、視覚およびコンピューターによる画像分析を行ったが、分析法は、以下の文献に記載されているプロトコールに従った：コリンズ（Collins）, A. R.、ダンシスカ（Dunsiska）, M.、ゲディック（Gedik）, C. M.およびステティナ（Stetina）, R.、「酸化によるDNA損傷：信頼性のある生物指標はあるのか？（Oxidative damage to DNA: Do we have a reliable biomarker?）」、Enrion. Health Pers. 104(3): 465-469(1996)、ならびにコリンズ（Collins）, A. 、ダンシスカ（Dunsiska）, M.、フランクリン（Franklin）, M.、ソモロフスカ（Somorovska）, M.、ペトロウスカ（Petrouska）, H.、デュシー（Duthie）, S.、フィリオン（Fillion）, L.、パナイオティディス（Panayiotidis）, M.、ラスロヴァ（Raslova）, K.およびヴァウガン（Vaughan）, N.、「ヒトの生体モニター実験におけるコメットアッセイ：信頼性、有効性および実用性（Comet assay in human biomonitoring studies: reliability, validation and application）」、Envir. Mol. Mutagen. 30: 139-146(1997)。スライドガラスは、ツァイス（Zeiss）社の倒立蛍光顕微鏡上、460nmにおいて250倍で観察した。重複しないように任意に選択した細胞について、確認されたコメットの尾の長さの移動距離およびコメットの尾のに占めるDNAの相対的割合に基づき、０〜４までの任意に定めたスケール（すなわち、０＝DNAの損傷なし、〜４＝DNAの損傷が広範囲に広がっている、まで）に従って視覚的に評価を行った。各スライドガラスにおける損傷の総合評価は、各損傷段階に属する細胞数に段階値をかけ、すべての段階の総和を求めることによって行った（第４段階に100個の細胞が属している場合、400という最大の数値になる）。視覚評価がコンピューターによる画像分析と相関しているか否かを評価することを目的として、KOMET 4.0分析パッケージ（キネティック・イメージング（Kinetic Imaging）社、イギリス、リバプール）を用い、同一細胞についてDNA損傷の評価を行った。尾の中のDNAの割合、尾の長さ（コメット頭部の先端から測定）および尾のモーメントを含む多様な客観的測定を行った。
【００６８】
尾のモーメントは次の式に従って計算した：
尾のモーメント＝尾の長さ×尾のDNAの％／100
統計的分析
線形回帰分析を用い、視覚評価の値をコンピューターによる画像分析から得られた値と相関させた。イクス・ビボ（ex vivo）でDNAの損傷を誘導するために使用したH2O2濃度の違いにおける統計的有意差を判断することを目的として、二因子ANOVAならびにStudent-Newman-Kleuls検定を行った。
【００６９】
結果
本実験の目的は、ネコおよびイヌの白血球におけるDNA損傷のレベルを評価するためのコメットアッセイの使用法を開発し、有効性を確認することであった。DNAの損傷は、確認されたコメットの尾の長さおよび評価分類に従って分類した尾の中のDNAの割合を用い、視覚的に段階０（DNAの損傷なし）から段階４（DNAの損傷が広範囲に広がっている）まで評価した。ネコおよびイヌの白血球がDNAの損傷を受けやすいことを示すため、細胞懸濁液を０〜250μMのH2O2で５分間処理した。次に、視覚評価系を用い、SYBR Green染色をしたコメットについて、DNA損傷のレベルを評価した。視覚評価系を用い、未処理サンプルと比較した場合、ネコおよびイヌのサンプルにおいて、10〜250μMのH2O2の濃度範囲にわたり、DNAの損傷が統計的に有意に増加していることがわかった（ｐ＜0.001）。イヌおよびネコのサンプルにおいて250μMのH2O2を用いた場合には、他のどの濃度を用いた場合よりも顕著にDNAの損傷を誘導したが（図１および２）、ネコのサンプルにおいて10〜100μMのH2O2を用いた場合（図１）、イヌのサンプルにおいて50〜100μMのH2O2を用いた場合（図２）を比較すると、DNA損傷のレベルに大差はなかった。
【００７０】
本研究の第二の目的は、尾の中のDNAの割合、尾のモーメントおよび尾の長さをパラメーターとするコンピューターによる画像分析とコメットの視覚評価（０〜４までのスケールによる）とを比較することであった。図３、４および５は、ネコの白血球コメットの視覚評価がコンピューターによる画像分析と非常に良く相関していることを示しており、これは、尾の中のDNAの割合（R2＞0.99）、尾のモーメント（R2＞0.95）および尾の長さ（R2＞0.90）に対して直線回帰によって判断したものである。イヌの白血球コメットについて、視覚評価とコンピューターによる画像分析とを相関させた場合も同様の傾向が観察され、尾の中のDNAの割合ではR2＞0.97、尾のモーメントではR2＞0.95、および尾の長さではR2＞0.91であった（図６、７および８）。
【００７１】
実施例２：抗酸化剤を与えたネコと対照ネコにおけるDNAの損傷レベルに関するコメットアッセイを用いた評価
動物
すべてのネコは、ペット栄養研究のためのウォルサムセンター（Waltham Centre for Pet Nutrition）においてペット用のネコと同様の条件下で室内飼育した。被験対照群は、14匹の短毛種のイエネコ（成猫、9.2±2.1才）で構成され、市販の完全栄養食を与えて飼育した。抗酸化剤添加群は、14匹の短毛種のイエネコ（成猫、8.7±1.9才）で構成され、市販の同一の缶詰食を与えて飼育したが、この缶詰食には以下の抗酸化剤が添加されている（表１）。すべてのネコについて、２年以上にわたって各群の食餌を与えた。
【表１】
2004537315.tif 000003
【００７２】
少量の血液サンプル
全血試料を容量５mlのリチウムヘパリン管に採取した。次に、コメット分析用に白血球細胞フラクションを精製し、全血から分離した。
【００７３】
コメットアッセイ
コメットアッセイは、上の実施例１の記載に従って実施した。
【００７４】
統計分析
独立二サンプルｔ検定を用いてデータの組を比較した。結果は図９および図１０に示す。
【００７５】
考察
コメットアッセイに使用するサンプルとしては、体内の多様な組織が想定されているが、白血球が身体の正確な状態を示す良好なマーカーであると考えた。白血球は、原形質膜中の多不飽和脂肪酸の割合が高く、また、正常機能の一部としてフリーラジカル種の産生が高められていることから、白血球は、フリーラジカル種による損傷の影響をより受けやすい。過酸化水素は、DNAの損傷、染色体の変性および遺伝子の突然変異を引き起こす最も強力な原因のひとつと考えられており、Fenton反応を介し、DNA分子の近傍で非常に反応性の高いヒドロキシルラジカル種（OH・）を生成することによって作用する。
【００７６】
H2O2＋Fe2+→OH・＋OH-＋Fe3+
本実験の結果から、サプリメントを与えていない対照ネコと比較すると、サプリメント添加群のネコでは、内因性および外因性のDNA損傷のレベルが顕著に低下したことが示された。このことは、サプリメントを与えたネコにおいては、酸化抑制耐性が非常に高まることにより、内因性および外因性のフリーラジカル種の攻撃に対するDNAの感受性低下および攻撃を受ける頻度の減少がもたらされたこと、ならびに、DNAを不安定にし、突然変異を起こさせ、機能不全にするような損傷が減少したことを示している。
【００７７】
内因性のDNA損傷により、損傷レベルの上昇（または、損傷を引き起こす酸化ストレスの上昇）は二次疾患の発症に関与していることが示唆された。この考え方は変性性疾患の進行に当てはめることができる。さらに、DNAの損傷および突然変異は、以下の帰結に至る場合がある：
（ａ）DNA損傷を介して細胞サイクルが抑制されることによる、免疫細胞の増殖不全
（ｂ）ある種の突然変異を有する細胞に対してイン・ビボ（in vivo）選択が行われた結果、増殖率が低下し、感染に対する免疫応答が最適状態でなくなること
（ｃ）DNA損傷が臨界レベルに達したことが引き金となってアポトーシスレベルが上昇したために起こる、免疫細胞の型数の減少。
【００７８】
結論として、ネコに抗酸化剤を与えることにより、内因性および外因性のDNA損傷のレベルが低下したことから、フリーラジカル種の攻撃による損傷に対するDNAの感受性低下、および、DNAの修復レベル上昇の可能性により、変性性疾患に対する罹患度が低下することを示唆している。
【００７９】
実施例３：抗酸化剤を与えたイヌと対照イヌにおけるDNAの損傷レベルに関するコメットアッセイを用いた評価
年齢および性を統一したゴールデンレトリバーの同腹子を４匹ずつ２群に分け、６週齢からコメットアッセイ用のサンプリングを行った15ヶ月齢までの間、サプリメントを添加した完全バランス食を与えて体重を維持した。ひとつの群には抗酸化剤混合物を与えたが、その成分を表２に示す。
【表２】
2004537315.tif 000004
【００８０】
少量の血液サンプル
全血試料を容量５mlのリチウムヘパリン管に採取した。次に、コメット分析用に白血球細胞フラクションを精製し、全血から分離した。
【００８１】
コメットアッセイ
コメットアッセイは、上の実施例１の記載に従って実施した。
【００８２】
統計分析
独立二サンプルｔ検定を用いてデータの組を比較した。
【００８３】
結果は図１１に示す。
【００８４】
考察
本実験の結果から、サプリメントを与えていない対照子イヌと比較すると、サプリメント添加群の子イヌでは、内因性および外因性のDNA損傷のレベルが顕著に低下したことが示された（ｐ＝0.150）。
【００８５】
結論として、子イヌにサプリメントを与えることによって内因性のDNA損傷が減少したことから、フリーラジカル種の攻撃による損傷に対するDNAの感受性低下、および、DNAの修復レベル上昇の可能性により、一般的に、加齢過程を含む感染症および変性性疾患に対する罹患度が低下することを示唆している。
【００８６】
実施例４：抗酸化剤を与えた成犬と対照成犬におけるDNAの損傷レベルに関するコメットアッセイを用いた評価
年齢および性を統一した雑種の成犬を20匹ずつ２群に分け、16週間の試験期間中、サプリメントを添加した完全バランス食を与えて体重を維持した。コメットアッセイための試料採取は、０週目および８週目に行った。ひとつの群のイヌには抗酸化剤混合物を与えたが、その成分を表３に示す。
【表３】
2004537315.tif 000005
【００８７】
少量の血液サンプル
全血試料を容量５mlのリチウムヘパリン管に採取した。次に、コメット分析用に白血球細胞フラクションを精製し、全血から分離した。
【００８８】
コメットアッセイ
コメットアッセイは、上の実施例１の記載に従って実施した。
【００８９】
統計分析
独立二サンプルｔ検定を用いてデータの組を比較した。
【００９０】
結果は図１２〜１５に示す。
【００９１】
考察
本実験の結果から、AOX-サプリメントを与えなかった対照群のイヌと比較して、サプリメントを与え始めて２ヶ月後のイヌでは、内因性（ｐ＝0.001）および外因性（ｐ＝0.003）のDNAの損傷レベルが顕著に低下していることが示された（図１３）。ベースラインにおいては、２つの群間で内因性または外因性のDNAの損傷レベルに有意差は認められなかった（図１２）。同様に、対照群においては、サプリメントを与え始めて２ヶ月後に採取したサンプルをベースラインと比較しても、内因性または外因性のDNAの損傷レベルに大きな変化は認められなかった（図１４および１５）。しかしながら、AOX-サプリメントを与え初めて２ヶ月後における、サプリメント添加群のイヌの内因性および外因性のDNAの損傷レベルをベースライン値と比較すると、内因性のDNA損傷（ｐ＝0.041；図１４）および外因性のDNA損傷（ｐ＝0.005；図１５）は顕著に減少していた。
【００９２】
実施例５：抗酸化剤を与えたイヌと対照イヌにおけるDNAの損傷レベルに関するコメットアッセイを用いた評価
８週間サプリメントを与えた後、コメットアッセイによって測定したところ、対照群のイヌと比較して、AOX-サプリメントを与えたイヌでも、内因性および外因性のDNA損傷が有意に減少していたことが示された（ｐ＜0.005）。イヌにおけるこれらの新規な知見から、抗酸化剤を与えることにより、DNA損傷が減少するという保護的効果が発揮されることが示された。
【００９３】
材料および方法
動物
年齢（平均4.4±1.85才）および性を統一した雑種の成犬を20匹ずつ２群に分けて研究に使用した。すべてのイヌにワクチン（イヌジステンパーウイルス、パルボウイルスおよびアデノウイルス）を接種し、臨床上健康であるとみなした。    イヌはすべて、ペット栄養研究のためのウォルサムセンター（Waltham Centre for Pet Nutrition）（イギリス、レスターシャー）において飼育されたものだが、そこではイヌたちは、特別な目的で建築され、環境的に恵まれた設備内で生活し、センターの研究倫理および英国内務省基準に従って取り扱われた。
【００９４】
実験計画
すべてのイヌに対して基本食を与えたが、これは、ウェットタイプの食餌（ペディグリー（登録商標）、マスターフーズ（Masterfoods）社、イギリス、メルトンモーブレー）およびドライタイプの食餌（チャピー（登録商標）コンプリート、マスターフーズ（Masterfoods）社、イギリス、ピーターバラ）をエネルギーベースで50：50の割合で含む、栄養的に完全かつバランスのとれた食餌である。基本食は、実験開始前の12週間与え、正常体重を維持するため、kgW0.75あたりの予測代謝エネルギーが460kJとなるようにした。対照群には、16週間の試験期間中、基本食を与え、一方、抗酸化剤（AOX）−サプリメント添加群も同様に基本食を与え、さらに、16週間の試験期間中、１日１回、抗酸化剤混合物（ビタミンC、ビタミンE、タウリン、ルテイン、リコピンおよびβ−カロチン）を経口投与した。体重の変化の原因に応じて食餌摂取量を変更した。
【００９５】
DNA損傷の状態を調べるため、０週目および８週目にサンプルを採取した。  DNAの損傷を分析するため、０週目および８週目に少量の血液サンプルを採取してリチウムヘパリン管（LIP社）に入れ、リン酸緩衝生理食塩水（PBSa）で１：１に希釈した。Histpaque 1083 gradients（シグマケミカル（ Sigma Chemical ）社）、イギリス）を用い、1000gで40分間遠心分離することにより、白血球を単離した。白血球は、10mlのPBSaで２回洗浄し、700gで10分間遠心分離した後、計数し、90％のウシ胎仔血清（シグマ（ Sigma ）社）および10％のジメチルスルホキシド（シグマ（ Sigma ）社）の混合液中で、１×106個／mlとし、使用まで−80℃以下で保存した。一般的に、生存率（トリパンブルー染色によって評価）は約98％であった。コメットアッセイによって測定したDNAの損傷は、実施例１に従って調べた。DNA鎖の解裂については、H2O2処理および未処理の単離イヌ白血球を用いて分析した。コメットの評価は、画像分析ソフトウェア（KOMET 4.0分析パッケージ（キネティックイメージング（Kinetic Imaging）社、イギリス、リバプール））およびコリンズ（Collins）らの上述の方法（1996年、1997年）を用い、確認済みの視覚評価系（１サンプルあたり細胞100個）に基づいて行った。
【００９６】
統計分析
Windows用のSPSS（バージョン10.0.0、SPSS社、イリノイ州シカゴ）を使用してデータを評価した。ANOVA中の群相互作用により、ある時間までに群間の差異が示唆された場合には、各時間点において別異にｔ−検定を行うことにより、より詳細な検討を行った。対および非対ｔ−検定を利用してDNA損傷のデータを分析した。分析前に、全ての変数を正規化した。ｐ＜0.05であった場合に有意差があるとみなした。データは、平均±SEMで表している。
【００９７】
結果
DNAの損傷
０週目においては、２つの群間で、内因性または外因性のDNA損傷レベルに有意差はなかった（図１６）。サプリメント投与８週間後では、対照イヌと比較して、AOX-サプリメントを与えたイヌにおいては、内因性（ｐ＜0.005）および外因性（ｐ＜0.005）のDNA損傷レベルが顕著に低下していた（図１７）。対照群のイヌでは、サプリメント投与８週間後に採取したサンプルをベースラインレベルと比較した場合に、内因性または外因性のDNA損傷レベルに明らかな変化が表れなかった（データは示していない）。しかしながら、AOX-サプリメントを与えた群のイヌでは、サプリメント投与８週間後において、内因性および外因性のDNA損傷レベルをベースラインレベルと比較した場合に、内因性のDNA損傷および外因性のDNA損傷（ｐ＜0.05）の著しい低下が観察された（ｐ＜0.005）（データは示していない）。
【００９８】
考察
本データは、０週目（サプリメント投与前）においては、２つの群間においてDNAの損傷に差異はなかったが、サプリメント投与８週間後においては、内因性および外因性のDNA損傷が顕著に減少していたことを示している。内因性の損傷が減少したことから、抗酸化剤を投与したことにより、フリーラジカル種の攻撃に対するDNA保護力の増強、および／または、損傷を受けたDNAの修復率の上昇が示唆された。H2O2を外部から添加して白血球にDNA鎖の解裂を起こさせるイン・ビトロ（in vitro）チャレンジ試験においても、抗酸化剤による保護またはフリーラジカル種の攻撃に対する抵抗性が示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】DNA損傷の誘導に与える過酸化水素の濃度変化（０〜250μM／ml）の影響を示すグラフ。結果は12匹のネコによる平均±SEMで示している。ｐ＜0.001における平均に対する統計的有意差を異なる文字で示している。
【図２】DNA損傷の誘導に与える過酸化水素の濃度変化（０〜250μM／ml）の影響を示すグラフ。結果は12匹のイヌによる平均±SEMで示している。ｐ＜0.001における平均に対する統計的有意差を異なる文字で示している。
【図３】DNAが損傷しているすべての細胞型に対し、尾のDNAの割合について、ネコの白血球を視覚評価したものとコンピューター画像分析したものとの関係を示したグラフ。結果は平均±SEM（各型ともｎ＝100）で表している。
【図４】DNAが損傷しているすべての細胞型に対し、尾のモーメントについて、ネコの白血球を視覚評価したものとコンピューター画像分析したものとの関係を示したグラフ。結果は平均±SEM（各型ともｎ＝100）で表している。
【図５】DNAが損傷しているすべての細胞型に対し、尾の長さについて、ネコの白血球を視覚評価したものとコンピューター画像分析したものとの関係を示したグラフ。結果は平均±SEM（各型ともｎ＝100）で表している。
【図６】尾の中のDNAの割合について、イヌの白血球を視覚評価したものとコンピューター画像分析したものとの関係を示したグラフ。結果は平均±SEM（各型ともｎ＝100）で表している。
【図７】イヌの白血球について、DNAが損傷しているすべての細胞型に対し、尾のモーメントを視覚評価したものとコンピューター画像分析したものとの関係を示したグラフ。結果は平均±SEM（各型ともｎ＝100）で表している。
【図８】DNAが損傷しているすべての細胞型に対し、尾の長さについてイヌの白血球を視覚評価したものとコンピューター画像分析したものとの関係を示したグラフ。結果は平均±SEM（各型ともｎ＝100）で表している。
【図９】ネコの対照群およびサプリメント投与群における内因性のDNA損傷を示すグラフ。各群から求めた平均値を標準偏差（SEM）と共に示している。
【図１０】ネコの対照群およびサプリメント投与群における外因性のDNA損傷を示すグラフ。各群から求めた平均値を標準偏差（SEM）と共に示している。
【図１１】子イヌの対照群およびサプリメント投与群における内因性のDNA損傷を示すグラフ。各群から求めた平均値を標準偏差（SEM）と共に示している。
【図１２】サプリメント投与前のイヌの対照群およびAOXサプリメント投与群における内因性および外因性のDNA損傷を示すグラフ。各群から求めた平均値を示している。
【図１３】サプリメント投与２ヶ月後のイヌの対照群およびAOXサプリメント投与群における内因性および外因性のDNA損傷を示すグラフ。各群から求めた平均値を示している。
【図１４】イヌのサプリメント非投与群およびAOXサプリメント投与群において、ベースラインおよびサプリメント投与２ヶ月後の内因性DNA損傷の結果の比較を示すグラフ。
【図１５】イヌのサプリメント非投与群およびAOXサプリメント投与群において、ベースラインおよびサプリメント投与２ヶ月後の外因性DNA損傷の結果の比較を示すグラフ。
【図１６】サプリメント投与前のイヌの対照群および抗酸化剤（AOX）サプリメント投与群における内因性および外因性のDNA損傷を示すグラフ。各群から求めた平均値を示している。結果は平均（±SEM）として表し、ｎ＝20である。有意差は認められなかった。
【図１７】サプリメント投与２ヶ月後のイヌの対照群および抗酸化剤（AOX）サプリメント投与群における内因性および外因性のDNA損傷を示すグラフ。各群から求めた平均値を示している。結果は平均（±SEM）として表し、ｎ＝20である。＊は有意差がｐ＜0.005であることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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