(57)【要約】本発明は、アンギュサイクリンの生合成に関与する、Streptomyces属より得られた遺伝子クラスターに関する。更に本発明は、上記遺伝子クラスターに含まれる遺伝子を、ドラッグスクリーニングのための抗生物質を製造するために用いる方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Streptomyces属細菌のレベロマイシン生合成経路に関与する遺伝子クラスターであって、Streptomyces sp.ゲノム由来の２つの隣接する9.5 kbのPstI断片に包含されることを特徴とする、単離精製されたＤＮＡ断片。
【請求項２】
配列番号１に記載の塩基配列、または該塩基配列と少なくとも９０％の相同性を有する配列からなることを特徴とする、請求項１のＤＮＡ断片。
【請求項３】
請求項１または２のＤＮＡ断片を、Streptomyces属細菌中で複製可能なプラスミドにクローニングしてなる組換え体ＤＮＡ。
【請求項４】
S. lividans TK24/pS11P2株を宿主として寄託した、受託番号 DSM 14172であるプラスミド pS11P2であることを特徴とする、請求項３の組換え体ＤＮＡ。
【請求項５】
S. lividans TK24/pS11P23株を宿主として寄託した、受託番号DSM 14173であるプラスミド pS11P23 であることを特徴とする、請求項３の組換え体ＤＮＡ。
【請求項６】
ハイブリッド化合物の製造方法であって、
請求項１または２のＤＮＡ断片をStreptomyces属宿主に導入して組み換え体菌株を得、
該組換え体菌株を培養して化合物を生成せしめ、そして
該化合物を単離する
ことを包含する製造方法。
【請求項７】
該Streptomyces属宿主がStreptomyces lividansであることを特徴とする、請求項６の方法。
【請求項８】
該Streptomyces属宿主がStreptomyces argillaceusであることを特徴とする、請求項６の方法。
【請求項９】
該Streptomyces属宿主がStreptomyces galilaeusであることを特徴とする、請求項６の方法。
【請求項１０】
該製造されるハイブリッド化合物が下記の構造（２）で表されるアンギュサイクリン系化合物であることを特徴とする、請求項６の方法。
【化１】
2004537281.tif 000008
【請求項１１】
該製造されるハイブリッド化合物が下記の構造（４）で表されるアンギュサイクリン系化合物であることを特徴とする、請求項６の方法。
【化２】
2004537281.tif 000009
【請求項１２】
ハイブリッド化合物の製造方法であって、
請求項１または２のＤＮＡ断片に由来するOrfs A, B, C, D, E, F, L, M, V, O, H, Q, R, Y, J, 1 および 2 からなる群より選ばれる少なくとも一つの遺伝子をStreptomyces属宿主に導入して組み換え体菌株を得、
該組換え体菌株を培養して化合物を生成せしめ、そして
該化合物を単離する
ことを包含する製造方法。
【請求項１３】
ドラッグスクリーニングのための新規な化合物を生成することを特徴とする、請求項１２の方法。
【請求項１４】
下記の構造（２）で表されるアンギュサイクリン系化合物である9-OMe-レベロマイシン。
【化３】
2004537281.tif 000010
【請求項１５】
下記の構造（４）で表されるアンギュサイクリン系化合物である11-OH-レベロマイシン。
【化４】
2004537281.tif 000011
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンギュサイクリン（angucycline）生合成に関与する、Streptomyces属より得られた遺伝子クラスターに関する。更に本発明は、上記遺伝子クラスターに含まれる遺伝子を、ドラッグスクリーニングのための抗生物質を生成するために用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アンギュサイクリンとして知られているテトラサイクリン系芳香族ポリケチド類（tetracyclic aromatic polyketides）が最初に培養細菌から単離されたのは、今から３０年以上前のことである。以来、アンギュサイクリン系列の抗生物質は天然の生理活性物質として急激にその数を増やしており、これらは抗菌剤、抗腫瘍剤や化学物質をスクリーニングするための様々なスクリーニング法によって発見されたものである。
【０００３】
これらの化合物は、II型ポリケチドシンターゼによるポリケチド経路によって微生物内で生合成される。ポリケチドはアンギュサイクリン系化合物に特徴的な折りたたみ構造を有する。即ち、アンギュサイクリン(angucycline)の名に示されるように、４位の環が角を形成するよう（an angular fashion）に配向している。そして形成されたアグリコンは次に起こる多様な化学反応、例えば、様々な位置で起こる酸化反応、水酸化反応、グリコシル化反応などによって修飾され、様々な構造を形成する。さらに、新薬の開発を目的としたアンギュサイクリン系化合物を製造するための化学合成についても報告されている。数種類のアンギュサイクリン系抗生物質については、生合成に関与する遺伝子クラスターがクローニングされ、部分的に特徴付けられている。例えば、Streptomyces fradiaeより得られたウルダマイシン（urdamycin）生合成に関与するクラスター、S. cyanogenus S136より得られたランドマイシン（landomycin）生合成に関与するクラスター、S. venezuelae ISP5230より得られたジャドマイシン（jadomycin）生合成に関与するクラスター、そしてActinomadura verrucososporaより得られたプラジミシン（pradimicin）生合成に関与するクラスター（以上順番にDecker et al., 1995, Wetrich et al., 1999, Han et al., 1994, Dairi et al., 1999）などが挙げられる。また、S. murayamaensisのキナマイシン（kinamycin）生合成に関与するクラスター（Gould et al., 1998）や、S. rimosusのテトラングロル（tetrangulol）およびテトランゴマイシン（tetrangomycin）生合成に関与するクラスターや、Streptomyces WP 4669株のPD 116740生合成に関与するクラスター（Hong et al., 1997）はクローニングされ、異種宿主で発現されている。また、Oki et al. による国際特許出願（WO 98/11230）にはプラジミシン生合成に関与する遺伝子クラスターが開示されている。
【０００４】
アンギュサイクリン系抗生物質は様々な生理活性作用を有する。抗腫瘍作用に加え、酵素阻害剤として作用するものもあれば、強い血小板凝集抑制剤として働くものもあるが、ほとんどは抗菌作用を有する。ケリアマイシン（kerriamycin）および抗生物質SS-228Yに関しては、インヴィヴォにおける細胞増殖抑制作用があることが報告されており、この作用によってエーリッヒ腹水腫瘍を接種したマウスの生存期間を延長することができる。また、ビネオマイシン（vineomycin）はマウスにおけるザルコーマ１８０固形ガンに対する抗ガン作用を有する。注目すべきは、アンギュサイクリン系抗生物質の中には、市販の様々な細胞増殖抑制剤に対する耐性を有した細胞系の成長をも抑制するものが報告されていることである。
【０００５】
アンギュサイクリン系抗生物質の化学合成、生合成、生理活性作用や分子構造などに関する文献については、Krohn and Rohr (1997)やRohr and Thiericke (1992)およびそれらに記載の参考文献などを参照されたい。
【０００６】
発明の概要
本発明は、Streptomyces属細菌、特にStreptomyces sp. H021に由来する、アンギュサイクリン生合成に関与する遺伝子クラスターに関する。遺伝子のクローニングに用いた株は、本発明者らが試験した種々の培養条件ではアンギュサイクリンを生成しなかった。しかし、該遺伝子クラスターのＤＮＡ断片をS. lividansまたはS. coelicolorで発現させたところ、レベロマイシン、5-OH-レベロマイシン、そして新規な化合物である11-OH-レベロマイシンが得られた。これらの化合物はアンギュサイクリン系に属する。さらに、該遺伝子クラスターをStreptomyces属宿主であるS. argillaceusおよびS. galilaeusに導入したところ、S. argillaceusは新規な化合物である9-O-メチルレベロマイシンを生成し、S. galilaeusは公知の化合物であるε-ロドマイシノンを生成した。
【０００７】
従って、本発明の主な目的は、Streptomyces属細菌のレベロマイシン生合成経路に関与する遺伝子クラスターであって、Streptomyces sp.ゲノム由来の２つの隣接する9.5 kbのPstI断片に包含されることを特徴とする、単離精製されたＤＮＡ断片を提供することにある。本発明の更なる目的は、上記ＤＮＡ断片からなる組み換え体ＤＮＡを提供することにある。本発明はまた、本発明のＤＮＡ断片をStreptomyces属宿主に導入し、それによってドラッグスクリーニングのためのアンギュサイクリン系化合物を得ることを包含する、ハイブリッド化合物、特にハイブリッド アントラサイクリンおよび芳香族ポリケチド類の製造方法に関する。
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明において用いた実験手法は当該技術分野において公知の方法である。本明細書中において詳細に説明されていない技術に関しては、Hopwood et al. "Genetic manipulation of Streptomyces: a laboratory manual", The John Innes Foundationや Norwich (1985) や、Sambrook et al. (1989) "Molecular cloning: a laboratory manual"などのマニュアルに記載されている。本明細書で言及した文献、特許および特許出願については添付した参考文献一覧に詳しい情報を記載したので、それらの内容は全て本明細書に組み込まれたものとする。
【０００９】
本発明は、特にアンギュサイクリンの生合成に関与する遺伝子クラスター（11P2）に関するものであって、その遺伝子クラスターはアンギュサイクリン系化合物を生成しないS. lividansによるレベロマイシンおよびその誘導体の生成を可能にする。本発明は特に、レベロマイシン生合成に関与する遺伝子をハイブリッド化合物の生成に用いる方法に関するものであり、遺伝子をS. lividansまたはミトラマイシン生成能を有するS. argillaceusで発現させて様々な位置において修飾が生じた化合物を生成する方法に関する。本発明は更に、糖の生合成に関与する遺伝子を包含する遺伝子断片11P23にも関する。
【００１０】
アンギュサイクリン系化合物の生合成に関与する遺伝子は、Streptomyces spp.、特にレベロマイシンの生合成に関与するケトシンターゼ Ｉ（KS I）の短い方の断片に対して陽性のハイブリダイゼーションシグナルを示す株、から単離される。本発明者らの実験に用いたドナー株であるStreptomyces sp. H021においてこれら遺伝子は発現されていないため、放線菌類、特にストレプトミセス属の放線菌類、の細菌をドナーとして用いることが好ましく、このような細菌はレベロマイシン KS Ｉ遺伝子に類似したプライマーを用いたＤＮＡフィンガープリンティングでスクリーニングすることができる。
【００１１】
レベロマイシン生成に関与する遺伝子を有する細菌は、公知のスクリーニング法を用いて土壌サンプルから単離することができるが、特にポリケチド（II型）のＤＮＡフィンガープリンティングが適している。ＤＮＡフィンガープリンティングに用いるプライマーは、配列 ５’−TSGCSTGCTTCGAYGSATC−３’（配列番号２１）および５’−TGGAANCCGCCGAABCCGCT−３’（配列番号２２）を共有する縮重したヌクレオチドオリゴマーである。上記プライマーを用いたＰＣＲにおいてアンギュサイクリンと類似したＤＮＡ断片をもたらした細菌株から遺伝子ライブラリーを構築するためのＤＮＡを抽出した。
【００１２】
レベロマイシン生合成に関与する遺伝子を有するStreptomyces属細菌株のゲノムＤＮＡを遺伝子ライブラリーの構築に使用した。クローニングに適した遺伝子断片は、切断頻度の高い制限酵素であれば、どれを用いても得ることができるが、典型的な例としてはSau3AIが用いられる。単離した断片は、プラスミド、ファージミド、ファージ、コスミドなどのいずれかの大腸菌ベクターに連結反応によって挿入することができるが、大きなＤＮＡ断片のクローニングが可能なコスミドベクターが好ましい。この目的では、pFD666(ATCC番号77286)などのコスミドベクターが適切であるが、その理由は約40 kbの断片をクローニングすることができるためである。Sau3AI断片の末端を付着末端にするpFD666のBamHI部位をクローニングに用いることができる。組換え体コスミドを包含する連結産物をファージ粒子にパッケージングするには、市販のキットを用いることができる。パッケージングした組換え体コスミドは数種類の大腸菌に感染させることが可能であり、いくつかの制限修飾系を欠失したE. coli XL1 Blue MRFが適切である。
【００１３】
遺伝子ライブラリーを構築するための宿主として大腸菌を用いるので、ハイブリダイゼーションはスクリーニング法として有利な方法である。ハイブリダイゼーション用のプローブは、レベロマイシン遺伝子クラスターより誘導された公知のどのような断片でもよいが、ケトシンターゼ Ｉのコード領域を増幅して得られる613ヌクレオチドの短い断片が好ましい。遺伝子ライブラリーを構築するためのコロニーをフィルターハイブリダイゼーション用のメンブランに転写するが、典型的な例としてはナイロンメンブランが用いられる。ハイブリダイゼーションの検出はどのような方法で行ってもよいが、特にDIG System（ドイツ国、Boehringer Mannheim, GmbH）が有利である。プローブはハイブリダイズしたＤＮＡと相同なため、Boehringer Mannheim社のマニュアルである「DIG System User's Guide for Filter Hybridization」に従って、ハイブリダイゼーション後の洗浄を６８℃の低塩濃度の溶液を用いたストリンジェントな条件下で行うことが好ましい。そのマニュアルによれば、上記条件下で洗浄した場合には、ＤＮＡ断片がプローブに結合するには少なくとも８０％、好ましくは９０％の相同性が必要である。
【００１４】
上記のプロトコルを用いたところ、約１、０００個のコロニーの内２つのクローンが陽性シグナルを示し、それらをＤＮＡ単離用に抽出した。クローンを特徴付ける方法としては制限酵素地図の作成が適当である。陽性のクローンを適当な制限酵素で消化し、ＤＮＡ断片同士の物理的連鎖地図を示すこともできる。本発明者らは、得られた陽性クローンをpFDH0211.1およびpFDH0216.1と命名した。発現について検討するには、コピー数の高いStreptomyces属プラスミドであるpIJ486を好適に用いた。しかし、Streptomyces属細菌中で安定に複製可能なプラスミドならばどのようなものを用いてもよい。クローンpFDH0211.1を、２つのPstI断片をそれぞれpIJ486中に挿入した組み換え体プラスミドとしてS. lividans TK24に導入した。そうして得られた二つの組換え体プラスミドをpS11P2およびpS11P23と命名し、いずれもH021ゲノムＤＮＡより得られた9.5 kb断片を含有していた。これらはさらにプロトプラスト形質転換によって他のStreptomyces属細菌株に導入した。
【００１５】
S. lividans TK24においては、pS11P2プラスミドはレベロマイシンならびにその5-OH誘導体および11-OH誘導体の生成を促した。同じプラスミドをS. argillaceusに導入したところ、9-O-メチルレベロマイシンの生成を促した。さらに、同じプラスミドをアクラビノン−ロディノース−ロディノースを生成するS. galilaeus H039に発現させたところ、対応する糖質からなる11-OH-アクラビノン（別名ε‐ロドマイシノン）の生成を促した。この結果は１１−ヒドロキシル化活性がpS11P2に含まれる遺伝子によってもたらされたことを示唆している。pS11P23プラスミドは、アクラビノン−ロドサミン−デオキシフコース−デオキシフコースを内生するS. galilaeus H075においては、典型的なアクラシノマイシン（aclacinomycin）の生成を促した。宿主として用いたStreptomyces属菌株に見られる種々の修飾は、コンビナトリアルな生合成における遺伝子の有用性を約束するものであり、新薬開発のための新規な化合物および新たな化学構造体の創造に寄与する。
【００１６】
塩基配列の解析はコンピュータを用いるいかなるプログラムで行ってもよく、例えばGCG社（米国、ウィスコンシン州、マディソン）のパッケージソフトなどを使うことができる。２つ隣接する断片、即ち、19016 bpからなる、クローニングに用いた11P2および11P23の配列を調べたところ、１７個の完全なオープンリーディングフレーム（ORF）が見出された。
【００１７】
本発明によれば、ジーンバンクから入手可能な遺伝子との相同性によって演繹される遺伝子の機能はそれぞれ以下のように推測される。Orf A, Orf B, およびOrf Cはそれぞれミニマルポリケチドシンターゼ（minPKS）、ケトシンターゼ ＩおよびII（KSIおよびKSII）そしてアシルキャリアタンパク質（ACP）をコードする。Orf Dはポリケチドケトレダクターゼをコードする。Orf EおよびOrf Mはオキシゲナーゼをコードする。Orf FおよびOrf Lはポリケチドシクラーゼをコードする。Orf VおよびOrf Oはレダクターゼをコードする。Orf HはdTDP−グルコース−4,6−デヒドラターゼをコードする。Orf QはNDP−ヘキソース−3-デヒドロキシラーゼをコードする。Orf S（の一部）はNDP−ヘキソース−2,3−デヒドラターゼをコードする。Orf Rは4−ケトヘキソースレダクターゼをコードする。Orf R1（の一部）は調節遺伝子である。Orf Jは耐性に関与する輸送タンパクをコードする。Orf 1は機能が不明のタンパクをコードする。そして、Orf 2はオキシドレダクターゼをコードする。（表１を参照。）
【００１８】
Streptomyces属の菌株、特に組換え体プラスミドを保持するS. lividans、S. argillaceus、S. galilaeusは、抗生物質の生成を可能とする培地中で培養する。レベロマイシンおよびその誘導体や、アクラシノマイシンおよびε−ロドマイシノンなどの化合物は、有機溶媒によって培養液から抽出し、その後クロマトグラフィー手法を用いて分離精製する。
【００１９】
本発明によれば、プラスミドpS11P2を保持するS. lividans TK24は、TK24/pS11P2と命名され、上記プラスミドを保持する細胞に対する選択性を高めるためにチオストレプトンを添加したE1培地中でレベロマイシン、5-OH-レベロマイシンおよび11-OH-ヒドロキシレベロマイシンを生成する。TK24/pS11P2と、11P2に隣接する領域を含有するプラスミドを保持したS. lividans TK24/pS11P2株は、ブダペスト条約に基づき、2001年3月13日にDSMZ ドイツ微生物・細胞培養収集所（住所：ドイツ連邦共和国  D-38124  ブラウンシュワイク  マッシェローデルウェッグ  1b）に寄託し、それぞれ受託番号DSM 14172およびDSM 14173を受けている。
【００２０】
19 kbのレベロマイシン生合成に関与する領域からサブクローニングした本発明のＤＮＡ断片は、いずれもStreptomyces属細菌中で複製可能なベクター中に挿入することができる。また、プラスミドを保持する株を培養することで生成物を得ることができる。
【００２１】
以下、本発明を更に詳細に説明するための実施例を記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
材料
実験に用いた制限酵素はPromega社（米国、ウィスコンシン州、マジソン）またはBoehringer Mannheim社（ドイツ国）より購入し、アルカリフォスファターゼはBoehringer Mannheim社より購入し、いずれも取り扱い説明書に従って使用した。プロテアーゼＫはPromega社（米国、ウィスコンシン州、マジソン）より購入し、リゾチームはSigma社（米国、ミズーリ州、セントルイス）より購入した。ハイブリダイゼーションに使用したHybondTM-N ナイロンメンブランはAmersham（英国、バッキンガム州）製、DIG DNAラベリングキットおよびDIG発光検出キット（DIG Luminescent Detection Kit）はBoehringer Mannheim製を使用した。アガロースからＤＮＡを単離するにはQiagen（ドイツ国、ヒルデン）製のQiaquickゲル抽出キットを使用した。シークエンシング用のテンプレートは、テンプレート作成システム（Template Generation System）F-700（フィンランド国、Finnzymes製）を用いて調製し、ＤＮＡのシークエンシングは自動ABI DNAシークエネーター（Perkin-Elmer製）を用い、その取り扱い説明書に従って行った。
【００２３】
細菌株およびその用途
Escherichia coli XL1 Blue MRF（カリフォルニア州、ラホラ、Stratagene社製）をクローニングに用いた。
Streptomyces sp. H021はフィンランド国トゥルクにて採取した土壌サンプルより単離し、ポリケチド生成能を有する細菌を見つけるために本発明者らが実施した、遺伝子に基づくスクリーニングの際に得られたポリケチドＤＮＡフィンガープリントに基づいて研究した。レベロマイシン生合成に関与する遺伝子クラスターはこの株からクローニングした。
【００２４】
クローニングした遺伝子の発現に使用した宿主株は以下のとおりである。
Streptomyces lividans TK24（米国特許第5,986,077号）。この株は、大腸菌で増殖させたＤＮＡをクローニングするための一次ホストとしても使用した。
Streptomyces galilaeus H075, DSM 11638 (FI 105554 B）はアクラビノン−ロドサミン−2-デオキシフコース−2-デオキシフコースを生成する。
Streptomyces galilaeus H039（Ylihonko et al. 1994）はアクラビノン−ロディノース−ロディノース−ロディノースを生成した。
Streptomyces argillaceus ATCC 12956はミトラマイシンを生成する。
【００２５】
プラスミド
大腸菌−Steptomyces属シャトルコスミドpFD666（ATCC 77286）を用いて染色体ＤＮＡのクローニングを行った。大腸菌クローニングベクターおよびpUC19はサブクローニングに用いた。
pIJ486はコピー数の高いプラスミドであり、英国、John Innes CentreのSir David Hopwood教授（Ward et al., 1986）より提供されたものである。プローブのクローニングには、TOPO TA クローニングキット（米国、Invitrogen社製）を取扱説明書に従って使用した。
【００２６】
栄養培地と溶液
全ＤＮＡの単離のためにH021株を培養する際には、TSB培地を用いた。全ＤＮＡの単離には、リゾチーム溶液（0.3 M ショ糖、25 mM トリス、pH8及び25 mM EDTA、pH8）を用いた。ＤＮＡの溶解にはTE緩衝液(10 mM トリス、pH8.0及び1 mM EDTA )を用いた。
【００２７】
トリプトン大豆ブロス（Tryptone Soya Broth、TSB）
1リットル当たり：３０ｇのOxoid Tryptone Soya Broth粉末。
【００２８】
ISP4
３７ｇ／リットルのBacto ISP-medium 4（Difco製）。
【００２９】
E1
2004537281.tif 000002
オートクレーブ滅菌前にpH7.4に調整した。
【００３０】
一般的な方法
ポリケチド代謝物は、ＴＬＣ（Kieselgel 60 F254 ガラスプレートを使用）及びＨＰＬＣで検出した。ＨＰＬＣは、Hewlett Packard社製の測定機器（1100シリーズ）を使い、Zorbax製カラム（SB-C18, 3 μm、4.6 x 150 mm）およびMeCN-H2O-HCO2H（30:70:1）の混合物の濃度勾配を用いて溶出した。
【００３１】
ＮＭＲスペクトルは、5 mmの普通形状（normal configuration）ＣＨプローブまたは5 mmの逆ＨＸ（inverse HX）プローブを搭載したJEOL社製 JNM-GX 400スペクトロメーターを用い、1Ｈは400 MHz、13Ｃは100 MHzで測定した。スペクトルは表２から４に記載した溶媒を用いて２６℃で測定し、13Ｃと1Ｈは共に内部標準となるTMSを0 ppmとした。電子衝撃質量分析スペクトルはVG Analytical社製のオーガニック質量分析計（Organic mass spectrometer）7070 Eを用いて得た。
【００３２】
チオストレプトン（５０μｇ／ｍｌ）を添加したISP4プレートを用い、プラスミドを保持する培養株を維持した。
【００３３】
実施例１．  レベロマイシン生合成に関与する遺伝子クラスターのクローニング
１．１  コスミドライブラリー
全ＤＮＡの単離のために、0.5%のグリシンを含有するTSB培地50 ml中でH021株を３日間培養した。12 ml容量のファルコンチューブを用い、3900 x gで１５分間の遠心分離によって細胞を回収し、回収した細胞を-２０℃で貯蔵した。12 mlの培養サンプルから回収した細胞をＤＮＡの単離に用いた。リゾチームを5 mg/ml含有するリゾチーム溶液5 mlを細胞に加え、３７℃で２０分間インキュベートした。1 mgのプロテアーゼＫを含有する10%SDS溶液500μｌを細胞に加え、６２℃で９０分間インキュベートしてサンプルとした。サンプルを氷冷し、600μｌの3M NaAc、pH 5.8、を加えて混合物とし、得られた混合物を平衡化フェノール（Sigma製）によって抽出した。これを1400 x gで１０分間遠心分離に付して相分離させた。等量のイソプロパノールを用いて水相からＤＮＡを沈殿させ、沈殿したＤＮＡをガラス棒に巻き取り、70%エタノールに浸漬して洗浄し、風乾した後、500μｌTE緩衝液に溶解した。
【００３４】
染色体ＤＮＡをSau3AIを用いて部分的に消化した。ＤＮＡ断片はアガロースゲル電気泳動により分離し、30〜50 kbの断片を0.3%の低ゲル化温度SeaPlaqueR（low gelling temperature SeaPlaqueR）アガロースから切り出した。ＤＮＡバンドは、６５℃に加熱してゲルから単離し、等量の平衡化フェノールで抽出し、2500 x gで１５分間の遠心分離で相分離を行った。フェノール相はさらにTE緩衝液で抽出し、遠心分離に付して水相をプールした。0.1容量のNaAc、pH5.8と2容量のエタノールを添加して２０℃で３０分放置し、その後、10 mlチューブ用アダプターを備えたSS-34ローターを用い、Sorvall社製遠心機RC5Cによって15000 rpmで３０分間遠心分離に付し、ＤＮＡを沈殿した。得られたペレットを風乾し、20μlのTE緩衝液に溶解した。このようにして単離した断片を、BamHIで消化したpFD666コスミドベクターに連結し、脱リン酸化した。次にＤＮＡをファージ粒子にパッケージングし、GigapackR III XL Packing Extract Kitを取扱い説明書に従って使用し、ファージを大腸菌に感染させた。
【００３５】
１．２  ハイブリダイゼーションによるクローンの同定
上記で感染させた細胞を、50 μg/mlのカナマイシンを含有するLBプレート上で培養し、HybondTM-N ナイロンメンブラン（Amersham製）に転写した。Boehringer Mannheim社のマニュアルである「The DIG System User's Guide for Filter Hybridization」に記載のプロトコルに従ってＤＮＡをメンブランに付着させた。生合成に関与するクラスターを保持するコロニーをスクリーニングするために用いたプローブは、Metsa-Ketela et al.（1999）の報告にあるように、縮重したプライマーでケトシンターゼ遺伝子の一部を増幅させることによって調製し、TOPO TA クローニングキット（米国、Invitrogen社製）を用いてクローニングした。プローブを保持するプラスミドをEcoRIで消化し、その断片をアガロースゲル電気泳動によりベクターから分離し、Qiaquickゲル抽出キット（Qiagen社製）を用いてゲルより単離した。Boehringer Mannheim社のマニュアルである「The DIG System User's Guide for Filter Hybridization」に従って、プローブをジゴキシゲニンで標識した。約１，０００個のコロニーに対して、上記プローブによるハイブリダイゼーションを６８℃で行うことでスクリーニングした。DIG発光検出キット（DIG Luminescent Detection Kit）（Boehringer Mannheim社製）を用いて陽性のコロニーを検出したところ、２個のコロニーが陽性シグナルを示し、これらをpFDH0211.および pFDH0216.1と命名した。陽性クローンの保持するコスミドは、5 mlの培養液からアルカリ溶菌法によって単離した。制限酵素分析の結果、クローニングされた断片は互いにオーバーラップし、少なくとも50 kbの連続したＤＮＡであることを示した。
【００３６】
１．３  シークエンシング用断片のサブクローニング
クローンpFDH0211.1をPstIで消化し、約9.5 kbの断片を２つ単離し、それらをPstIで消化したpUC19に連結して脱リン酸化した。この２つの断片はH021ゲノム中で隣接するように位置している。クローンはそれぞれp11P2およびp11P23と命名し、テンプレート作成システム（Template Generating System）F-700（フィンランド国、Finnzymes製）を用いてシークエンシング用のテンプレートとした。pFDH0211.1から調製した、11P2断片および11P23断片と部分的にオーバーラップするサブクローンのシークエンシングも行ったところ、その配列によって11P2断片と11P23断片は隣同士に位置していることが確認された。
【００３７】
E. coli XL1 Blue MRF' 細胞を、50μg/mlのカナマイシンを含有する5 mlのLB培地中で３７℃で一晩培養した。シークエンシング反応を行うに際しては、Sambrook et al.（1989）に記載のアルカリ溶菌法によってプラスミドを単離し、Qiagen製のQiaquickゲル抽出キットを用いて精製した。あるいは、Wizard Plus Minipreps DNA 精製システムキット（Promega製）を用い、取扱い説明書に従ってプラスミドを単離した。
【００３８】
ＤＮＡシークエンシングは、自動ABI DNAシークエンサー（Perkin-Elmer製）を用い、取扱い説明書に従って行った。
【００３９】
１．４  配列の分析およびそこから演繹された遺伝子の機能
GCGシークエンス分析ソフトウェアパッケージ（バージョン8）（米国、ウィスコンシン州、マジソン、Genetics Computer Group社製）を用いて配列を分析した。翻訳用のテーブルは、GTGも開始コドンとして使用するように変更した。コドン使用頻度は公知のデータ（Wright and Bibb, 1992）を用いて分析した。
【００４０】
CODONPREFERENCEプログラムによると、配列を決定したＤＮＡ断片は１７個の完全なオープンリーディングフレーム（ORF）と、３’末端と５’末端にそれぞれ一個ずつ他のORFを有していることがわかった。各遺伝子の機能は、塩基配列を翻訳して得たアミノ酸配列をデータバンクに登録されている公知の配列と比較することで決定した。本願で開示する配列データに参照した下記の表１にその結果を記載する。
【００４１】
【表１】
2004537281.tif 000003
【００４２】
１．５  発現クローニング
２つの9.5 kbのPstI断片をそれぞれプラスミドpIJ486にクローニングし、pS11P2、pS11P23と命名した。これらのプラスミドをS. lividans TK24に導入し、そこから単離してさらにS. argillaceusに導入した。更に、S. galilaeusの突然変異体であるH039中に導入し、続いてS. galilaeusの突然変異体であるH075に導入した。
【００４３】
実施例２．  11P2および11P23クラスターによって生成された化合物
２．１  培養と精製
最初に行ったHPLC-DAD分析の結果によると、TK24/pS11P2株、HO39/pS11P2株およびS. argillaceus/pS11P2株は、対応する親株に関連した化合物のほかにも未知の化合物を産生した。未知の産生物を精製し同定するために、各株を10リットルのスケールで培養した。７日間培養（E1培地、２８℃、300 rpm、空気混和量：10 リットル/min）した後、限外濾過により菌糸体を分離した。分離前に、培養液のpHを４〜５になるよう調節した。菌糸体は３回に分けてメタノール（3 x 1リットル）で抽出した。上澄み液は300 gのアンバーライトXAD-7樹脂で３０分間処理し、回収した後、2リットルのメタノールで抽出した。メタノール抽出物をすべて合わせ、200 mlに減圧濃縮した。
【００４４】
液体残渣をRP-18フラッシュカラム（5 x 6 cm）にロードし、メタノール/水混合液の下降する濃度勾配で、水７０％から開始して溶出した。画分をＴＬＣで分析し、その結果に基づいて画分をプールした。プールした画分はクロロフォルムを用いて抽出し、水で洗浄してから濃縮乾固した。乾燥した残渣をジクロロメタンで平行化したSiO2フラッシュカラム（2 x 10 cm）にロードした。カラムをジクロロメタン／メタノール混合液で展開し、ジクロロメタン／メタノール混合液中のメタノール濃度は25%となるまで段階的に増加させた。有効な画分をＴＬＣによって検出し、その分析結果に基づいてプールした。プールした画分は蒸発乾固し、分取ＨＰＬＣ（RP-18、250 x 10）に付した。溶出には、アセトニトリル−0.1% HCOOH混合液の下降する濃度勾配を用いた。プールした精製画分をクロロフォルムで抽出し、分光分析に付すために乾燥した。各菌株の産生物（1-6、図１）の生成率は10 mg/リットルに満たなかった。
【００４５】
２．２  同定
化合物の同定は、HMBC、HSQC、TOCSYおよびNOESYの標準的な組み合わせを用いて行った、炭素とプロトン共鳴の完全な帰属に基づいている。結果を下記の表２〜４に記す。この結果は、化合物（１）〜（３）のそれぞれの正確な分子量を示す質量分析(MS)データおよび化合物の構造と一致する分解パターンによっても確認された。化合物（４）〜（６）の構造はＮＭＲデータより演繹した。
【００４６】
化合物（１）〜（３）のMS結果：
（１）EIMS, m/z（相対強度）：338(M+/10), 320(35), 310(45), 295(15), 280(100)
（２）EIMS, m/z（相対強度）：368(M+/15), 350(100), 310(25), 279(15)
（３）EIMS, m/z（相対強度）：354(M+/5), 336(100), 326(7), 311(7), 296(10)
【００４７】
【表２】
2004537281.tif 000004
【００４８】
【表３】
2004537281.tif 000005
【００４９】
【表４】
2004537281.tif 000006
【００５０】
寄託微生物
下記の微生物をDSMZドイツ微生物・細胞培養収集所（住所：ドイツ連邦共和国  D-38124  ブラウンシュワイク  マッシェローデルウェッグ  1b）に寄託した。
2004537281.tif 000007
【００５１】
参考文献
Dairi, T., Hamano, Y., Furumai, T. and Oki, T. (1999).  Development of a self-cloning system for Actinomadura verrucosospora and identification of polyketide synthase genes essential for production of the angucyclic antibiotic pradimicin.  Appl. Environ. Microbiol. 65: 2703-2709.
Decker, H. and Haag, S. (1995).  Cloning and characterization of a polyketide synthase gene from Streptomyces fradiae Tu2717, which carries the genes for biosynthesis of the angucycline antibiotic urdamycin A and a gene probably involved in its oxygenation.  J. Bacteriol. 177: 6126-6136.
Gould J., Hong, S. and Carney, J. (1998).  Cloning and heterologous expression of genes from the kinamycin biosynthetic pathway of Streptomyces murayamaensis.  J. Antibiot. (Tokyo) 51: 52-57.
Han, L., Yang, K., Ramalingam, E., Mosher, R. and Vining, L. (1994).  Cloning and characterization of polyketide synthase genes for jadomycin B biosynthesis in Streptomyces venezulae ISP5230.  Microbiology 140: 3379-3389.
Hong, S., Carney, J. and Bould, S. (1997).  Cloning and heterologous expression of the entire gene clusters for PD 116740 from Streptomyces strain WP 4669 and tetrangulol and tetrangomycin from Streptomyces rimosus NRRL 3016.  J. Bacteriol. 179: 470-476.
Hopwood, D., Bibb, M., Chater, K., Keiser, T., Bruton, C., Kieser, H., Lydiate, D., Smith, C., Ward, J., and Schrempf, H. (1985).  Genetic manipulation of Streptomyces: a laboratory manual.  The John Innes Foundation, Norwich, United Kingdom.
Krohn, K. and Rohr, J. (1997) Angucyclines: total syntheses, new structures, and biosynthetic studies of an emerging new class of antibiotics.  Top. Curr. Chem. 188: 127-195.
Metsa-Ketela, M., Salo, V., Halo, L., Hautala, A., Hakala, J., Mantsala, P. and Ylihonko, K. (1999).  An efficient approach for screening minimal PKS genes from Streptomyces. FEMS Microbiol Lett. 180: 1-6.
Oki, Toshikazu, Dairi and Tohru, WO 98/11230.  Polyketide synthases of Actinomadura involved in pradimicin biosynthesis and the genes encoding them.  (Bristol-Myers Squibb Company, USA).
Rohr, J. and Thiericke, R. (1992).  Angucycline group antibiotics.  Nat. Prod. Rep., 9: 103-137.
Sambrook, J., Fritsch, E. and Maniatis, T. (1989).  Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed.  Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
Ward, J.M., Janssen, G.R., Kieser, T., Bibb, M.J., Buttner, M.J. and Bibb, M.J. (1986).  Construction and characterization of a series of multicopy promoter-probe plasmid vectors for Streptomyces using the aminoglycoside phosphotransferase from Tn5 as indicator.  Mol. Gen. Genet. 203: 468-478.
Westrich, L., Domann, S., Faust, B., Bedford, D., Hopwood, D. A. and Bechthold, A. (1999).  Cloning and characterization of a gene cluster from Streptomyces cyanogenus S136 probably involved in landomycin biosynthesis.  FEMS Microbiol. Lett. 170: 381-387.
Wright, F. and Bibb, M. (1992).  Codon usage in the G+C-rich Streptomyces genome.  Gene. 113: 55-65.
Ylihonko, K., Hakala, J., Niemi, J., Lundell, J. and Mantsala, P. (1994).  Isolation and characterization of aclacinomycin A-nonproducing Streptomyces galilaeus (ATCC 31615) mutants.  Microbiol. 140: 1359-1365.
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、レベロマイシン(1)、9-O-メチル−レベロマイシン(2)、5-OH−レベロマイシン(3)、11-OH-レベロマイシン(4)、19-メチル−SEK15(5)およびε−ロドマイシノン(6)の各構造を示す。使用した環構造の炭素番号も合わせて示す。
【図２】図２は、本発明の遺伝子クラスター（11P232）を示す。1〜9652からなるPstI断片は、変異体であるH075に相補性を示す11P23断片であり、9647〜19016からなる断片は、レベロマイシン生合成に関与する11P2断片である。
【配列表フリーテキスト】
【００５３】
配列番号２    OrfAの翻訳産物、推定される機能はケトシンターゼ Ｉ
配列番号３    OrfBの翻訳産物、推定される機能はケトシンターゼ II
配列番号４    OrfCの翻訳産物、推定される機能はアシルキャリアタンパク質
配列番号５    OrfDの翻訳産物、推定される機能はケトレダクターゼ
配列番号６    OrfEの翻訳産物、推定される機能はオキシゲナーゼ II
配列番号７    OrfFの翻訳産物、推定される機能はシクラーゼ
配列番号８    OrfLの翻訳産物、推定される機能はシクラーゼ
配列番号９    OrfMの翻訳産物、推定される機能はオキシゲナーゼ I
配列番号１０  OrfVの翻訳産物、推定される機能はレダクターゼ I
配列番号１１  OrfOの翻訳産物、推定される機能はレダクターゼ II
配列番号１２  OrfHの翻訳産物、推定される機能はdTDP−グルコース−4,6−デヒドラターゼ
配列番号１３  OrfQの翻訳産物、推定される機能はNDP−ヘキソース−3-デヒドラターゼ
配列番号１４  OrfSの翻訳産物、推定される機能はNDP−ヘキソース−2,3−デヒドラターゼ
配列番号１５  OrfRの翻訳産物、推定される機能は4−ケトレダクターゼ
配列番号１６  OrfYの翻訳産物、推定される機能はO−アシルトランスフェラーゼ
配列番号１７  OrfR1の翻訳産物、推定される機能は調節遺伝子
配列番号１８  OrfJの翻訳産物、推定される機能は輸送タンパク
配列番号１９  Orf1の翻訳産物、推定される機能は不明
配列番号２０  Orf2の翻訳産物、推定される機能はオキシドレダクターゼ
配列番号２１  人工的な配列の説明：オリゴヌクレオチドプライマー
配列番：２２  人工的な配列の説明：オリゴヌクレオチドプライマー
【図１】
2004537281.tif 000012
【図２】
2004537281.tif 000013
【国際公開パンフレット】
2004537281.tif 000014
2004537281.tif 000015
2004537281.tif 000016
2004537281.tif 000017
2004537281.tif 000018
2004537281.tif 000019
2004537281.tif 000020
2004537281.tif 000021
2004537281.tif 000022
2004537281.tif 000023
2004537281.tif 000024
2004537281.tif 000025
2004537281.tif 000026
2004537281.tif 000027
2004537281.tif 000028
2004537281.tif 000029
2004537281.tif 000030
2004537281.tif 000031
2004537281.tif 000032
2004537281.tif 000033
2004537281.tif 000034
2004537281.tif 000035
2004537281.tif 000036
2004537281.tif 000037
2004537281.tif 000038
2004537281.tif 000039
2004537281.tif 000040
2004537281.tif 000041
2004537281.tif 000042
2004537281.tif 000043
2004537281.tif 000044
2004537281.tif 000045
2004537281.tif 000046
2004537281.tif 000047
2004537281.tif 000048
2004537281.tif 000049
2004537281.tif 000050
2004537281.tif 000051
2004537281.tif 000052
2004537281.tif 000053
2004537281.tif 000054
2004537281.tif 000055
2004537281.tif 000056
2004537281.tif 000057
2004537281.tif 000058
2004537281.tif 000059
2004537281.tif 000060
2004537281.tif 000061
2004537281.tif 000062
2004537281.tif 000063
2004537281.tif 000064
2004537281.tif 000065
2004537281.tif 000066
2004537281.tif 000067
2004537281.tif 000068
2004537281.tif 000069
2004537281.tif 000070
2004537281.tif 000071
2004537281.tif 000072
【手続補正書】
【提出日】平成15年4月2日(2003.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３】
請求項１または２のＤＮＡ断片、あるいは該ＤＮＡ断片を構成する、請求項１で定義した２つの隣接する9.5 kbのPstI断片のいずれかを、Streptomyces属細菌中で複製可能なプラスミドにクローニングしてなる組換え体ＤＮＡ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項６】
ハイブリッドポリケチド化合物の製造方法であって、
請求項１または２のＤＮＡ断片をStreptomyces属宿主に導入して組み換え体菌株を得、
該組換え体菌株を培養して化合物を生成せしめ、そして
該化合物を単離する
ことを包含する製造方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１２】
ハイブリッドポリケチド化合物の製造方法であって、
請求項１または２のＤＮＡ断片に由来するOrfs A, B, C, D, E, F, L, M, V, O, H, Q, R, Y, J, 1 および 2 からなる群より選ばれる少なくとも一つの遺伝子をStreptomyces属宿主に導入して組み換え体菌株を得、
該組換え体菌株を培養して化合物を生成せしめ、そして
該化合物を単離する
ことを包含する製造方法。
【国際調査報告】
2004537281.tif 000073
2004537281.tif 000074
2004537281.tif 000075
2004537281.tif 000076
2004537281.tif 000077
2004537281.tif 000078
2004537281.tif 000079