(57)【要約】ニトロソ化剤を含む組成物を、嚢胞性繊維症の患者に投与する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
嚢胞性繊維症の処置方法であって、ニトロソ化剤を含む組成物を嚢胞性繊維症を有する患者に投与する段階を含む方法。
【請求項２】
ニトロソ化剤がＳ−ニトロソグルタチオンおよび亜硝酸エチルからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組成物が粉末またはエアロゾルとして製剤化され、そして鼻粘膜およびオステオメアタル・コンプレックスに投与する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
組成物が約１００〜約１５０ｍｃｇ／ｋｇのＧＳＮＯを含み、そして組成物がドライパウダー吸入器、定量噴霧式吸入器、またはウルトラソニック、スーパーソニックもしくは呼吸作動型ネブライザーからなる群から選択される他のネブライザー・システムにより送達される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
組成物が、さらに、Ｓ−ニトロソチオールを異化する酵素のインヒビターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
組成物がバトクプロイン二硫酸塩および／または金チオグルコースとともに０．０５ｍｌ／ｋｇの１０ｍＭ ＧＳＮＯを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＣＦＴＲの発現および成熟を促進する方法であって、呼吸器上皮を、ニトロソ化剤を含む組成物と接触させることを含む方法。
【請求項８】
ニトロソ化剤がＳ−ニトロソグルタチオンおよび亜硝酸エチルからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０００年１０月１６日に出願された米国仮出願第６０／２４０，７０８号の利益を主張し、引用によりこれを本願に包含させる。
【０００２】
背景
嚢胞性繊維症（ＣＦ）は、常染色体劣性遺伝病である。発症した患者の平均余命は３０年である。この早期の死亡は、主に（とりわけ患者の９５％で）肺疾患に関し、気道における粘液クリアランスの障害ならびに細菌および真菌の過度の異常増殖に関連した進行性呼吸不全の結果、死に至る。該肺疾患は、
１）気道上皮における、過多のナトリウムおよび過少の塩素が上皮膜を通過するような、塩および水輸送の異常；
２）気道上皮細胞の内側からのグルタチオン輸送における欠陥；
３）塩、水およびグルタチオン輸送の異常に部分的に関連した、高濃度の分泌および酸化的損傷；
４）濃厚分泌液に関連した繊毛運動性の障害；
５）シュードモナス アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびアスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）のような脱窒素作用生物の慢性的なコロニー形成；ならびに
６）好中球および他の炎症性細胞の補充に伴うそして気管支収縮メディエーターの放出に伴う慢性気管支収縮ならびに、これらすべての因子の結果として、慢性の、進行性悪化の、呼吸困難
により特徴付けられる。
【０００３】
嚢胞性繊維症は膜結合型クロライドチャネル、嚢胞性肺繊維症膜透過制御タンパク質（ＣＦＴＲ）における変異により引き起こされる。最もありふれた、対立遺伝子の７０％を占める、変異は１番目のＡＴＰ結合ドメイン上の５０８位での３塩基対（１アミノ酸）の欠失、すなわち（ΔＦ５０８）変異である。これは、小さなフォールディング・エラーのため、インタクトかつ潜在的な機能性タンパク質が小胞体において分解されるクラスＩＩ変異と呼ばれる。この分解は、インビトロで低温療法によりならびにグリセリンおよびフェニルブチレートのような化合物での処置により回避され得る。これらの処置により、細胞表面上に（ΔＦ５０８）ＣＦＴＲが機能的に発現する。最近では、小胞体（ＥＲ）におけるＣＦＴＲの分解がユビキチン−プロテアソーム系により仲介される、と提案されている。我々は、Ｓ−ニトロソグルタチオン（ＧＳＮＯ）が低酸素誘導性因子１−μのような翻訳後／分解制御タンパク質の発現を安定させるユビキチン−プロテアソーム経路を阻害する予備的な証拠を得ている。
【０００４】
さらに、ＧＳＮＯは、いくつかの確立された理由で嚢胞性繊維症において興味深い。我々は１９９３年に、それが気道における内因性の化合物であることならびに気管支拡張剤としての活性を有することを示した。ＧＳＮＯはまた、アミロイド感受性ナトリウム輸送を阻害する気道クリアランスを増大させ、そして気道表層液（ａｉｒｗａｙ ｌｉｎｉｎｇ ｆｌｕｉｄ）の塩および水の保持を増大させる繊毛打頻度（ｃｉｌｉａｒｙ ｂｅａｔ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）を増加させることも知られている。それは、ウイルス、細菌および寄生虫の複製を阻害する、確立された抗微生物特性を有する。我々は最近、軽症の嚢胞性繊維症の患者の気管支肺胞洗浄液においてＧＳＮＯのレベルが低いことを発見した。すべてのこれらの確立された機能は、ＣＦにおいて有益な効果を有し得る。
【０００５】
驚くべきことに、我々は、（ΔＦ５０８）変異を有するホモ接合体の細胞の１００μＭ ＧＳＮＯでの処置がＣＦＴＲの発現を増加させそしてＣＦＴＲの成熟を増加させることを発見した（図１参照）。我々は、また、ＣＦＴＲの生成を促進するのに有効な濃度（１０ｍＭ ＧＳＮＯ溶液の約０．０５ｍｌ／ｋｇでの投与）でのＧＳＮＯの吸入の結果、酸素化が改善されることも発見した。最後に、我々は、ＧＳＮＯがＣＦにおいて十分に許容されそして有害な全身作用がないことを示した。したがって、低いレベルのＧＳＮＯを置き換えることは十分に許容され、実際に有益であり、そして細胞表面上に発現する機能性ＣＦＴＲの量を増加させ得るので、その使用は該疾患を有する人々に利益を与え得る。
【０００６】
発明の要約
本発明はＣＦ患者を処置するための組成物および方法を目的とする。該方法は、５００ｎｍｏｌ／ｋｇ（１７５ｍｃｇ／ｋｇ）以上の濃度のＳ−ニトロソグルタチオン、または亜硝酸エチルのような他のニトロソ化剤を、嚢胞性繊維症を有する患者の上皮表面に、上皮表面のＣＦＴＲにおけるＳ−ニトロソ化剤の適切な濃度および上皮の機能を保証する目的で、送達することを含む。本発明の組成物は、噴霧または他のエアロゾル処置により嚢胞性繊維症を有する患者への投与が可能な薬学的に許容される担体中に、ニトロソ基供与体、例えばＧＳＮＯおよび他のＳ−ニトロソチオール（ＳＮＯｓ）を含むが、これらに限定されない。
【０００７】
図面の簡単な説明
図１
Ｓ−ニトロソグルタチオンは、ΔＦ５０８変異を有するヒトＣＦＴＲタンパク質の成熟を安定化しそして可能にする。ΔＦ５０８に関してホモ接合性の患者からの膵臓腺癌細胞（ＣＦＰＡＣ−１）をコンフルエントまで増殖させ、そして培養液単独（コントロール）または５００ｎＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭまたは１００ｍＭ ＧＳＮＯで６時間処理した。細胞を回収し、溶解させ、ＮＰ４０緩衝液中に再懸濁させ、そして抗−ＣＦＴＲ抗体を用いてウエスタンブロット解析を行った。結果を図１に示す。ここで、レーンＡは未成熟非グリコシル化タンパク質（１４０ｋＤａ）の発現を示し、レーンＢは部分的に成熟したタンパク質（約１６０ｋＤａ）の発現を示し、そしてレーンＣは成熟タンパク質（１８０ｋＤａ）の発現を示す。
【０００８】
未成熟非グリコシル化タンパク質（１４０ｋＤａ）の発現の増加は、小胞体における未成熟タンパク質の分解の減少を反映している。１８０ｋＤａ（成熟タンパク質）のバンドの出現は小胞体におけるタンパク質の成熟を反映しており、発現の形態は３つの実験の細胞表面上に発現することが可能である。タンパク質の完全な成熟はΔＦ５０８変異に対応する。
【０００９】
図２
Ｓ−ニトロソチオールのレベルは嚢胞性繊維症の気道において低い。軽症の嚢胞性繊維症の対象およびコントロールの対象に気管支肺胞洗浄を施した。洗浄液を冷凍し（−８０℃）、一酸化窒素への確立された還元方法（１ｍＭシステイン、１００μＭ ＣｕＣｌ；５０℃、ｐＨ６．５）、続いて化学ルミネセンス分析を用いてＳ−ニトロソチオールのブラインド分析をした。Ｓ−ニトロソチオールは、２人のＣＦ患者においてのみ測定可能であり、そしてＲａｎｋ Ｓｕｍ分析により、数値がコントロールよりも小さいことが示された（ｐ＜０．０１）。
【００１０】
図３
１０ｍＭ ＧＳＮＯの０．０５ｍｌ／ｋｇでの吸入により、ＣＦを有する患者における酸化が改善される。プラセボ制御された二重盲検法において、ＣＦを有する患者に、１０ｍＭ リン酸緩衝性生理食塩水（ＰＢＳ）中のＧＳＮＯ（ｎ＝９）または１０ｍＭ ＰＢＳのみ（ｎ＝１１）を、ネブライザーにより投与した。２つの群を年齢、生命徴候、酸素飽和度、肺活量、ＦＥＶ１、およびＦＥＦ２５−７５（ｐ＝７）に関して調和させた。処置前のベースラインからの酸素飽和度の変化を、時間の関数として記録する。結果を図３に示す。ここで、実線はＧＳＮＯ群を表し、そして破線はＰＢＳ単独群を表す。図３において示されるように、ＧＳＮＯ群の対象は、研究を通して維持されたままのＰＢＳ群よりも、酸素飽和度が大きく改善された（ＡＮＯＶＡによりｐ＜０．００１）。
【００１１】
図４
吸入されたＳ−ニトロソグルタチオンは、ＣＦにおいて呼気中の一酸化窒素（ＮＯ）の濃度を増加させた。提供されたデータは図３において記載された２つのグループを示すが、（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｓｏｃｉｅｔｙのガイドラインにしたがって、オフラインの化学ルミネッセンスで測定された）呼気中の一酸化窒素濃度に関するものである。結果を図４に示す。ここで、実線はＧＳＮＯ群を表し、そして破線はＰＢＳ単独群を表す。図４において示されるように、呼気中のＮＯにおけるベースラインからの変化は、すべての時点でＧＳＮＯ群が高い（ＡＮＯＶＡによりｐ＜０．００１）。３０分における変化は５分における変化ほど明白ではないが、３０分における酸化は５分のそれと同じくらい劇的に改善されていることに注意せよ。ＧＳＮＯ処置後の比較的低いレベルの呼気中ＮＯと結び付けて、この知見により、改善された酸化に対するＧＳＮＯの効果は一酸化窒素ラジカルを形成するための分解を必要とせず、その代わりに、気道タンパク質とのトランスニトロソ化反応に関与し得ることが示される。これらのＳ−ニトロシル化反応は、平滑筋の弛緩、抗菌効果およびイオンチャネルの機能の修飾に極めて重要であり得る。
【００１２】
図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ、５Ｅおよび５Ｆ
吸入されたＳ−ニトロソグルタチオンは、ＣＦ患者において十分に許容される。図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ、５Ｅおよび５Ｆ（ここで、実線はＧＳＮＯ群を表し、そして破線はＰＢＳ単独群を表す。）において示されるように、酸素飽和度が増加したそして呼気中のＮＯが増加した図３に関連して記載された実験プロトコールを用いて、ＧＳＮＯを投与された患者において生命徴候または肺機能の急性の変化は全く観察されなかった。
【００１３】
発明の詳細な説明
本明細書において使用されているように、「処置」なる用語は、特定の障害もしくは病状に関連した徴候の緩和および／または該障害の予防もしくは排除を含む。特に、ＣＦの処置は、次の１またはそれ以上を引き起こすことを含む：ＣＦＴＲ活性の上昇、気道の水和作用の増大、粘膜繊毛クリアランス、気管支拡張および抗菌効果の改善。
【００１４】
本明細書において使用されているように、「有効な量」なる用語は、選択された効果を引き起こすのに十分な量を意味する。例えば、有効な量のＧＳＮＯとは、ＣＦに関連した徴候を緩和するのに十分な量である。
【００１５】
本発明は、ＣＦ患者への投与に適した形態のＳ−ニトロソチオールを含みそして呼吸器管の上皮表面への接触を最大にするように製剤化された組成物の使用を目的とする。Ｓ−ニトロソグルタチオンはいくつかの内因性Ｓ−ニトロソチオールの中で最も豊富に存在する。それは、特異的ＧＳＮＯ異化酵素がアップレギュレートされない限りは、例えばＳ−ニトロソシステインと比較して独特に安定である。このような酵素には、γ−グルタミル−トランスペプチダーゼ、グルタチオン依存性ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、およびチオレドキシン−チオレドキシンレダクターゼが含まれ得る。さらに、ＧＳＮＯの殺菌効果を制限し得る原核生物の酵素が存在し得ることの証拠が存在する。この理由で、原核または真核生物のＧＳＮＯの異化作用の阻害剤の共投与が、時には必要とされ得る。この種類の阻害剤には、１μＭの気道濃度を得るために０．０５ｍｌ／ｋｇで１ｍＭ溶液として投与されるアシビシンが含まれるが、これに限定されるものではない。
【００１６】
部分的に、Ｓ−ニトロソチオールの投与は、ＣＦに関連するイオンチャネルの異常性を反転させ、そしてＣＦの気管支収縮特性を緩和する。本発明の方法は、特に適当なＣＦのための抗菌治療の新規経路を提供する。なぜなら、多くの患者が、入手可能なすべての従来の抗生剤に対して耐性の微生物を有するからである。本発明は、また、一酸化窒素をＣＦの気道に送達し、そして驚くべきことに、ＣＦＴＲの発現および成熟を増加させる。
【００１７】
ＧＳＮＯの代わりに本発明の使用に適したさらなるＮＯ供与体およびトランスニトロソ化剤には、一般式Ｘ−ＮＯ；
〔式中、Ｘ＝ＲＳであり、そしてＲはシステイン、ホモシステイン、Ｎ−アセチルシステイン、システイニル グリシン、アルブミン、および他のタンパク質からなる群から選択されるか；代わりに、Ｘはエチル、プロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、メチル、およびアルキル炭化水素基である。〕
の化合物が含まれる。また、活性のある化合物としてニトログリセリンも含まれる。なぜなら、ニトロ部分（ニトロソ化種として）およびグリセリン（代謝されてグリセロールとなる）の両方がＣＦＴＲの発現を増加させ得るからである。
【００１８】
１つの実施態様において、本発明は５００ｎｍｏｌ／ｋｇ（１７５ｍｃｇ／ｋｇ）以上の濃度のＳ−ニトロソグルタチオン、または硝酸エチルもしくは亜硝酸エチルのような他のニトロソ化剤を、嚢胞性繊維症を有する患者の上皮表面に送達することからなる。該方法は、上皮表面のＣＦＴＲに適当な濃度のＳ−ニトロソ化剤を提供し、そしてＣＦの徴候を緩和するために上皮の機能を提供する。ＧＳＮＯ，他のＳＮＯ類、および／または阻害剤の分解を伴うまたは伴わないＮＯ＋供与体を含むこれらの噴霧処置は、ＣＦの気道における粘液の蓄積、気管支収縮および細菌の増殖を予防するために４、６または８時間ごとのように周期的に投与され得るか、あるいは気管支収縮の激化、粘液プラグ形成、および細菌性気管支炎／細気管支炎の間、嚢胞性繊維症の患者に急速に投与され得る。したがって、本発明のＳ−ニトロソ化剤は、嚢胞性繊維症の肺疾患の予防的治療として、または嚢胞性繊維症の救急治療として、または慢性閉塞性肺疾患および気管支拡張症の軽減を提供するために、エアロゾル化された形態で投与され得る。
【００１９】
１つの実施態様にしたがって、エアロゾル化されたＳ−ニトロソグルタチオンおよび／または他のＳ−ニトロソチオールは、下記の計算にしたがって、０．０５ｍｌ／ｋｇの投与量で１０ｍＭの濃度で投与される：
ａ．　正常な対象の気道におけるＳ−ニトロソオグルタチオンの濃度は、一般に、（気管支肺胞洗浄液で希釈されていない試料中で）２００ｎＭ〜２μＭである。
ｂ．　肺炎の患者における気道のＳ−ニトロソグルタチオンのレベルは、１０μＭを超え得る。
ｃ．　気道表層液／細胞外肺水分の体積は、正常な対象において、１０ｍｌ／ｋｇのオーダーである。
ｄ．　従来のネブライザーシステムを用いる気道下部への最大直接送達は、投与された量の２０％である。
ｅ．　Ｓ−ニトロソグルタチオンは、ヒト気道平滑筋の組織標本において約１０μＭのＩＣ５０を有する。
ｆ．　したがって、気道中に（１×１０−２ ｌ／ｋｇの体積において５×１０−５ ｌ／ｋｇ×１×１０−２Ｍ ＧＳＮＯ）×０．２＝１０×１０−６Ｍの濃度となり、これは生理学的に適当かつ薬理学的に活性な範囲である。
【００２０】
１つの好ましい実施態様において、１０ｍＭ ＧＳＮＯのエアロゾルが、１日あたり、０．０５ｍｌ／ｋｇの投与量で、ＣＦの気道に送達される。追加的な実施態様には、
１）ドライパウダー吸入器による同様の濃度での使用、および２）エアロゾル、気管支鏡法による下部呼吸器管へのより高い濃度での送達、３）内視鏡的逆行性膵胆管造影法による送達、４）胃腸管粘膜を経由するエアロゾル製剤の送達、５）鼻粘膜およびオステオメアタル・コンプレックスへのアトマイザーによる、６）エウスタキオ管、精管、子宮頚部または卵管への、送達を含む。この投与は、目的として、気道の通常のＧＳＮＯレベルの回復を有する。この点に関して、気管支肺胞洗浄を受けた軽症の嚢胞性繊維症患者のうちの大部分（１７人のうちの１５人）は、気道中に検出不可能なレベルのＳＮＯを有するが、コントロールの患者は検出可能なレベルである（１μＭほど。本方法に関するかなりの希釈効果にもかかわらず。）（図２）。
【００２１】
ＣＦに関連した広範囲の徴候は、吸入用ニトロソ化剤の使用により処置され得る。例えば、約０．１５〜約０．０３、さらに好ましくは約０．０５ｍｌ／ｋｇでの１０ｍＭ濃度のＧＳＮＯの吸入投与の使用は、気管支収縮（気道平滑筋の収縮）の処置、および嚢胞性繊維症における低酸素症の処置に使用され得る。さらに、吸入用Ｓ−ニトロソグルタチオンは、嚢胞性繊維症を有する患者における肺機能の長期間の悪化、呼吸困難、咳、慢性気道感染症、気管支拡張症、肺拡張不全、気胸、および呼吸不全を予防するために使用され得る。これらの病状は、気道上皮における機能性ＣＦＴＲの成熟および発現の欠損のために起こる。理想的な投与量は、ネブライザーにより送達される、１０ｍＭ ＧＳＮＯの０．０５ｍｌ／ｋｇである。一定の状況では、別の投与量が適用され得る。
【００２２】
１つの実施態様にしたがって、本発明において使用されるＳ−ニトロソチオール組成物は、経口投与形態に製剤化される。注意すべきことに、ＧＳＮＯは酸性ｐＨで安定である。嚢胞性繊維症を有するたいていの患者は、膵臓性重炭酸塩の分泌が減少しており、そしてＧＳＮＯは十二指腸を越えた消化管系において生体利用可能であることが予期される。理想的な投与量は、１５０ｍｃｇ／ｋｇのオーダーである。これは、１日６回まで投与され得る。しかしながら、異なる投与量および頻度が、時には、必要とされそして／または要求され得る。該方法は、経口投与形態で、胎便イレウス、胎便イレウスと同等の疾患、および／または難治性吸収不良を有する嚢胞性繊維症患者における胃腸上皮機能を増加させるためにＧＳＮＯを投与することを含む。
【００２３】
別の実施態様において、嚢胞性繊維症を有する患者におけるＳ−ニトロソチオール、例えばＳ−ニトロソグルタチオンの外科的投与は、副鼻腔の排液系における、その腔自体における、エウスタキオ管における、肝胆汁性集合管系における、膵管における、子宮頚部における、卵管における内視鏡的注入を含む機能異常管上皮構造を用いて行われ得る。さらに、ＣＦＴＲタンパク質の機能の欠損に関連した変異によって、水和のための分泌および内臓清掃のための分泌を不可能にする上皮の機能を増大させる目的での精管への外科的投与は、また、本発明に包含される。
【００２４】
例えば、水性Ｓ−ニトロソチオール製剤は、洞および洞骨（ｓｉｎｕｓ ｏｓｔｅａｅ）ならびにエウスタキオ管を清掃するための、肝胆汁性沈積から起こる胆汁鬱帯の内視鏡的逆行性膵胆管造影法的（ＥＲＣＰ）処置のための、膵炎の処置および予防のための、子宮頚部または卵管における濃厚粘液の内視鏡的処置のための、そして精管における非特異的粘液から起こる男性の不妊症の処置および予防のための、外科的方法において使用され得る。これらすべての適応症は、異常なＣＦＴＲ発現により特徴付けられるＣＦを有する患者に限定される。
【００２５】
多くの変法が当業者にとって明らかである。したがって、本発明は特許請求の範囲によって限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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2004511515.tif 000020
2004511515.tif 000021
【国際調査報告】
2004511515.tif 000022