(57)【要約】本発明は、鎮痛分子が血液脳関門を通り抜けるようにベクターへの結合によってベクター化される、モルヒネ、その誘導体及びその代謝物から選択される前記鎮痛分子からなる化合物、並びに疼痛治療に有効な薬剤を調製するための前記化合物の利用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液脳関門を通して鎮痛分子を輸送することが可能なベクターに結合される、モルヒネ、その誘導体及びその代謝物から選択される前記鎮痛分子からなり、前記ベクターは、次の式Ｉ又はＩＩ：
ＢＸＸＢＸＸＸＸＢＢＢＸＸＸＸＸＸＢ      （Ｉ）
ＢＸＸＸＢＸＸＸＢＸＸＸＸＢＢＸＢ        （ＩＩ）
（式中：‐Ｂ基は、同一又は異なり、側鎖が塩基性基を有するアミノ酸残基を表し、かつ
‐Ｘ基は、同一又は異なり、脂肪族又は芳香族アミノ酸残基を表す）のいずれかに対応する線状ペプチド、又はＤ及び／又はＬ配置のアミノ酸からなるレトロ形状の式（Ｉ）又は（ＩＩ）の前記ペプチド、又は式（Ｉ）又は（ＩＩ）のペプチドの少なくとも５つの、かつ好ましくは少なくとも７つの連続したアミノ酸の配列からなる、それらの断片であることを特徴とする化合物。
【請求項２】
Ｂ基は、アルギニン、リシン、ジアミノ酢酸、ジアミノ酪酸、ジアミノプロピオン酸及びオルニチンから選択されることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｘ基は、グリシン、アラニン、バリン、ノルロイシン、イソロイシン、ロイシン、システイン、システインＡｃｍ、ペニシラミン、メチオニン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、プロリン、Ａｂｕ、アミノ酸‐１‐カルボン酸シクロヘキサン、Ａｉｂ、２‐カルボン酸アミノテトラリン、４‐ブロモフェニルアラニン、ｔ‐ロイシン、４‐クロロフェニルアラニン、βシクロヘキシルアラニン、３，４‐ジクロロフェニルアラニン、４‐フルオロフェニルアラニン、ホモロイシン、βホモロイシン、ホモフェニルアラニン、４‐メチルフェニルアラニン、１‐ナフチルアラニン、２‐ナフチルアラニン、４‐ニトロフェニルアラニン、３‐ニトロチロシン、ノルバリン、フェニルグリシン、３‐ピリジルアラニン、［２‐チエニル］アラニンから選択されることを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載の化合物。
【請求項４】
ベクターに対する鎮痛分子の結合位置は、前記ベクターのＮ‐末端又はＣ‐末端の端部のレベルか、又は側鎖のレベルに位置付けられることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
鎮痛分子及びベクターの間の結合は、ベクターか、鎮痛分子か、両方に対して当然に存在するか、又は導入される官能基によって行われることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
官能基は、‐ＯＨ、‐ＳＨ、‐ＣＯＯＨ、又は‐ＮＨ２基から選択されることを特徴とする請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
鎮痛分子及びベクターの間の結合は、生理学的培地中、又は細胞内部で、共有結合、疎水結合、イオン結合、開裂可能な結合、又は開裂不可能な結合から選択される結合であることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
鎮痛分子及びベクターの間の結合は、直接結合であることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の化合物。
【請求項９】
鎮痛分子及びベクターの間の結合は、結合剤により実施される間接結合であることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の化合物。
【請求項１０】
結合剤は、アルキル、アリール、アラルキル又はペプチド基、アルキル、アリール又はアラルキルエステル、アルデヒド又は酸、マレイミル安息香酸(acide maleymil benzoique)、マレイミルプロピオン酸(acide maleymil propionique)誘導体及びスクシンイミジル誘導体のような無水、水硫、又はカルボキシル基、臭化又は塩化シアン誘導基、カルボニルジイミダゾール、スクシンイミドエステル、又はスルホン酸ハロゲン化物を含む二又は多官能価剤から選択されることを特徴とする請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
鎮痛分子及びベクターの間の結合は、少なくとも１つのジスルフィド架橋を含むことを特徴とする請求項１から１０のいずれかに記載の化合物。
【請求項１２】
鎮痛分子は、モルヒネであることを特徴とする請求項１から１１のいずれかに記載の化合物。
【請求項１３】
ベクターは、前記モルヒネ分子の６位のレベルに固定されることを特徴とする請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
鎮痛分子は、モルヒネ‐６‐グルクロニドであることを特徴とする請求項１から１１のいずれかに記載の化合物。
【請求項１５】
ベクターは、前記モルヒネ‐６‐グルクロニド分子のグルクロニド残基のカルボン酸のレベルに固定されることを特徴とする請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
疼痛治療に有効な薬剤を調製する医薬組成物における請求項１から１５のいずれかに記載の化合物の利用。
【請求項１７】
医薬組成物は、全身、非経口、経口、直腸、経鼻、経皮、肺投与に適した形状を呈することを特徴とする請求項１６に記載の利用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鎮痛分子が血液脳関門を通り抜けるようにベクターへの結合によってベクター化される前記鎮痛分子からなる化合物、並びに疼痛治療に有効な薬剤を調製するための前記化合物の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
モルヒネは、中度及び強度の疼痛治療に最も利用される化合物の１つとなっている。残念なことに、モルヒネによる治療は、しばしば多幸感又は傾眠、呼吸抑制、便通抑制、吐き気、嘔吐、及び特に耐性誘発及び依存症候群のような望ましくない効果を伴う（チャーニー(Cherny)ら、１９９６年）。モルヒネは、動物又は患者への投与後、大きな肝臓初回通過効果を受け、そのことは、結果として低く、投与方法により変化する生物学的利用能を招く。モルヒネは、主にＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素によって触媒作用を及ぼされるエナンチオ選択的グルクロン酸抱合を受け、かつ肝臓は、その生体内変化の主要部位であるように思える。モルヒネから誘導される主要なものの１つは、その代謝物、モルヒネ‐６‐グルクロニド（Ｍ６Ｇ）である。
【０００３】
この代謝物もまた、鎮痛活性を有する。生体外で行われた阿片剤への配位子‐受容体結合の調査は、Ｍ６Ｇがオピオイド受容体に結合され、かつモルヒネよりもμ受容体に関して３〜５倍親和性が低いことを証明した（クリステンセン(Christensen)及びヨルゲンセン(Jorgensen)、１９８７年；フランシス(Frances)ら、１９９２年）。μ受容体は、２つのタイプがある：すなわち非常に高親和力及び低容量のμ１受容体、並びに低親和力及び高容量のμ２受容体である（パスターナック(Pasternak)及びウッド(Wood)、１９８６年）。μ１受容体への結合は、棘上タイプの鎮痛反応及びアセチルコリンのターンオーバー減少を引き起こし、他方μ２受容体への結合は、脊椎タイプの鎮痛反応を引き起こし、かつ呼吸抑制、便通抑制及び依存と関連した幾つかの兆候の原因となる。
【０００４】
モルヒネ及びその活性代謝物、Ｍ６Ｇは、その鎮痛効果の主要な作用場所である、脳内に配分される前に血液脳関門（ＢＨＥ）を越えねばならない。モルヒネは、塩基であり、そのｐＫａは、８〜９に位置付けられ、従って血液ｐＨで僅かにイオン化され、かつその脳浸透は、単純拡散として記載された。その代謝物、Ｍ６Ｇは、血液ｐＨで強烈にイオン化される酸（ｐＫａ２〜３）である。その親水性により、Ｍ６Ｇの浸透は、脳内で非常に限定される。
【０００５】
モルヒネ及びＭ６Ｇの等しい分量での脳室内投与が、Ｍ６Ｇに関して、モルヒネよりも５０〜１００倍大きな鎮痛効果を生じさせることが証明された（パスターナック(Pasternak)ら、１９８７年；フランシス(Frances)ら、１９８２年；ステイン(Stain)ら、１９９５年）。それに反して、全身注射により、２つの分子は、ほぼ同じ鎮痛活性を有する。これらの結果は、Ｍ６Ｇの脳内への浸透がモルヒネのそれと比べて非常に限定されることを明瞭に示す。
【０００６】
血液脳関門は、それらを越えよう試みる分子を種々の方法で妨害する内皮細胞からなる。それらは、互いに結合される密封された接合によって表される物理的関門となり、かつ傍細胞を経るあらゆる通過を、そこでのエンドサイトーシス活性が弱いだけに一層妨げる。これら全ては、脳細胞外空間への血漿の分子通過を強く限定する。
【０００７】
このようにして、出願人は、その研究作業の範囲内で、プロテグリン(Protegrine)及びタキプレシン(Tachyplesine)のような天然ペプチドから誘導される線状ペプチドのようなベクターが、ＢＨＥを通って活性分子を輸送することを明らかにした。プロテグリン及びタキプレシンは、構造がジスルフィド架橋によって保持されるヘアピンタイプである天然ペプチドである。これらの架橋は、ヒト細胞に対して観察される細胞溶解活性において重要な役割を演じる。これらの架橋の不可逆性減少により、膜受容体に頼らない受動機構によって哺乳類の細胞膜を迅速に通り抜ける能力を有する、無細胞毒性の線状ペプチドを得ることが可能になる。
【０００８】
これらの線状ペプチドに関する作業及び結果、並びに血液脳関門を通した活性分子のベクターとしての利用は、出願人による１９９８年１１月３０日に提出された仏国特許出願第９８／１５０７４号及び１９９９年１１月２６日に提出された仏国特許出願第９９／０２９３８号に記載された。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、血液脳関門を通して鎮痛分子をベクター化することが可能なベクターに結合される、前記鎮痛分子からなる化合物を対象とする。
【００１０】
好ましくは、血液脳関門を通して前記鎮痛分子をベクター化することが可能なベクターは、プロテグリン又はタキプレシン族から誘導される線状ペプチドである。
【００１１】
プロテグリン族から誘導されるペプチドとは、次の式Ｉ：
ＢＸＸＢＸＸＸＸＢＢＢＸＸＸＸＸＸＢ      （Ｉ）
に対応するあらゆるペプチドを、かつタキプレシン族から誘導されるペプチドとは、次の式ＩＩ：
ＢＸＸＸＢＸＸＸＢＸＸＸＸＢＢＸＢ        （ＩＩ）
（式中：‐Ｂ基は、同一又は異なり、側鎖が塩基性基を有するアミノ酸残基を表し、かつ‐Ｘ基は、同一又は異なり、脂肪族又は芳香族アミノ酸残基を表す）に対応するあらゆるペプチド、又はＤ及び／又はＬ配置のアミノ酸からなるレトロ形状の式（Ｉ）又は（ＩＩ）の前記ペプチド、又は式（Ｉ）又は（ＩＩ）のペプチドの少なくとも５つの、かつ好ましくは少なくとも７つの連続したアミノ酸の配列からなる、それらの断片を意味する。
【００１２】
例として、次のＢ及びＸの意味を挙げることができる：
Ｂは、アルギニン、リシン、ジアミノ酢酸、ジアミノ酪酸、ジアミノプロピオン酸及びオルニチンから選択される。
【００１３】
Ｘは、グリシン、アラニン、バリン、ノルロイシン、イソロイシン、ロイシン、システイン、システインＡｃｍ、ペニシラミン、メチオニン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、プロリン、Ａｂｕ、アミノ酸‐１‐カルボン酸シクロヘキサン、Ａｉｂ、２‐カルボン酸アミノテトラリン、４‐ブロモフェニルアラニン、ｔ‐ロイシン、４‐クロロフェニルアラニン、βシクロヘキシルアラニン、３，４‐ジクロロフェニルアラニン、４‐フルオロフェニルアラニン、ホモロイシン、βホモロイシン、ホモフェニルアラニン、４‐メチルフェニルアラニン、１‐ナフチルアラニン、２‐ナフチルアラニン、４‐ニトロフェニルアラニン、３‐ニトロチロシン、ノルバリン、フェニルグリシン、３‐ピリジルアラニン、［２‐チエニル］アラニンから選択される。
【００１４】
鎮痛分子の非限定的な例として、本発明は、エンケファリン、モルヒネのようなオピオイドから選択される化合物、非ステロイド性抗炎症化合物（ＮＳＡＩＤ）、Ｃｏｘ２阻害化合物、ＮＭＤＡ受容体作動化合物、カルシウムチャネル遮断化合物、ニューロペプチド及び特にモルヒネ誘導体を考察する。モルヒネ誘導体の例として、モルヒネ代謝物、及び特にＭ６Ｇのような、鎮痛活性を有するが、それ自体では血管脳関門を通り抜けないものを挙げることができる。
【００１５】
好ましくは、本発明の枠内で利用される鎮痛分子は、モルヒネ、その誘導体の１つ又はその代謝物の１つである。非常に好ましくは、かかる代謝物は、Ｍ６Ｇである。
【００１６】
鎮痛分子の結合位置は、ベクターペプチドのＮ‐末端又はＣ‐末端の端部のレベルか、又は側鎖のレベルでも良い。
【００１７】
‐ＯＨ、‐ＳＨ、‐ＣＯＯＨ、‐ＮＨ２のような官能基は、ベクターか、鎮痛分子か、両方に対して当然に存在するか、又は導入されても良い。
【００１８】
ベクター及び鎮痛分子の間の結合は、化学的性質、並びにベクター及び鎮痛分子の寸法を考慮に入れて許容可能なあらゆる結合手段によって行われ得る。結合は、生理学的培地中、又は細胞内部で、共有、疎水、又はイオン、開裂可能、又は開裂不可能でも良い。
【００１９】
このベクター及び鎮痛分子の間の結合は、直接的又は間接的に行われても良い。
【００２０】
結合が、間接的に行われる時、好適には結合剤を利用することができる。本発明の枠内で利用可能な結合剤の非限定的な例として、アルキル、アリール、アラルキル又はペプチド基、アルキル、アリール又はアラルキルエステル、アルデヒド又は酸、マレイミル安息香酸(acide maleymil benzoique)、マレイミルプロピオン酸(acide maleymil propionique)誘導体及びスクシンイミジル誘導体のような無水、水硫、又はカルボキシル基、臭化又は塩化シアン誘導基、カルボニルジイミダゾール、スクシンイミドエステル、又はスルホン酸ハロゲン化物を含む二又は多官能価剤を挙げることができる。
【００２１】
好適には、少なくとも１つのジスルフィド架橋を含む結合を利用し、該結合は、化合物注射後の血漿中での安定性を特徴とし、次に一旦、本発明の化合物が血液脳関門を通り抜けると、前記ジスルフィド架橋は、活性鎮痛分子を発散しながら減少する。結合は、ベクターのいかなる部位においても行われ得る。
【００２２】
ベクター化鎮痛化合物は、ベクターに６位が結合したモルヒネ誘導体からなる。
【００２３】
非常に好ましくは、鎮痛分子がモルヒネである時、ベクターは、前記モルヒネ分子の６位のレベルに固定される。
【００２４】
更に非常に好ましくは、鎮痛分子がモルヒネ‐６‐グルクロニドである時、ベクターは、前記モルヒネ‐６‐グルクロニド分子のグルクロニド残基のカルボン酸のレベルに固定される。
【００２５】
本発明は、疼痛治療に有効な薬剤を調製する医薬組成物における鎮痛分子の前記ベクター化化合物の利用も対象とする。
【００２６】
好ましくは、医薬組成物は、全身、非経口、経口、直腸、経鼻、経皮、肺投与に適した形状を呈する。
【００２７】
本発明は、ベクターに結合される鎮痛分子からなる少なくとも１つのベクター化化合物を含む医薬組成物を患者に投与することからなる疼痛治療法を同様に対象とし、前記ペプチドは、プロテグリン又はタキプレシン族誘導体である。
【００２８】
添付して提出する図面は、本発明のベクター化化合物を得ることを可能にした実験作業の結果、出願人が得た様々な結果を図解する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明は、出願人が行った研究の枠内で実行した実験作業の記載を読めば、より良く理解されるであろうが、それらは、限定的性質を有すると解釈されるべきでない。
【００３０】
Ｉ．テスト化合物の調製
Ｉ．１．ベクター化Ｍ６Ｇの化学合成
ａ）ベクターペプチドの合成
ペプチドＳｙｎＢ３を、Ｆｏｃ／ｔｕ戦略により固相上に集め、トリフルオロ酢酸により開裂し、かつ保護を取り除き、次に逆相で分取高圧クロマトグラフィーによって精製し、かつ凍結乾燥する。その純度（＞９５％）及びその同一性を、分析ＨＰＬＣ及び質量分析法によって確認する。
【００３１】
ｂ）ベクターペプチドに対するリンク(maillon)ＣｙＡ‐３ＭＰの結合
配列ＲＲＬＳＹＳＲＲＲＦ（添付の配列リスト中の配列番号１）のペプチドＳｙｎＢ３（１モル当量）を、２モル当量のＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）の存在下で、溶剤ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）中で、１モル当量の反応体ＳＰＤＰ（Ｓ‐ピリジニウムスクシンイミジルメルカプトプロピオネート）で３０分間培養する。結果として生じたペプチドＰｙ‐ＳＳ‐３ＭＰ‐ＳｙｎＢ３を、エーテルに沈殿させ、次に逆相で分取高圧クロマトグラフィーによって精製し、かつ凍結乾燥する。その純度（＞９５％）及びその同一性を、分析ＨＰＬＣ及び質量分析法によって確認する。
【００３２】
１モル当量のペプチドＰｙ‐ＳＳ‐３ＭＰ‐ＳｙｎＢ３を、４モル当量のＤＩＥＡの存在下で、溶剤ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）中で、４モル当量のＣｙＡ，ＨＣｌ（塩酸システアミン）で３０分間培養する。結果として生じたペプチドＣｙＡ‐ＳＳ‐３ＭＰ‐ＳｙｎＢ３を、エーテルに沈殿させ、次に逆相で分取高圧クロマトグラフィーによって精製し、かつ凍結乾燥する。その純度（＞９５％）及びその同一性を、分析ＨＰＬＣ及び質量分析法によって確認する。
【００３３】
ｃ）ＣｙＡ‐ＳＳ‐３ＭＰ‐ＳｙｎＢ３に対するＭ６Ｇの結合
１モル当量のＭ６Ｇを、溶剤ＤＭＦ中で、４モル当量のＤＩＥＡの存在下で、２モル当量のＰｙＢＯＰで培養する。
【００３４】
ＤＭＦ中に溶解した１モル当量のペプチドＣｙＡ‐ＳＳ‐３ＭＰ‐ＳｙｎＢ３を、次に反応混合物に加え、次に３０分間培養する。形成した生成物Ｍ６Ｇ‐ＣｙＡ‐ＳＳ‐３ＭＰ‐ＳｙｎＢ３を、エーテルに沈殿させ、次に逆相で分取高圧クロマトグラフィーによって精製し、かつ凍結乾燥する。その純度（＞９５％）及びその同一性を、分析ＨＰＬＣ及び質量分析法によって確認する。
【００３５】
Ｉ．２．テスト化合物
以下の表１は、テストした様々な化合物を要約している。
【００３６】
【表１】
2004529886.tif 000002
【００３７】
ＩＩ．鎮痛効果の比較
ＩＩ．１．利用した試験：加熱板テスト
ａ）実験条件
加熱板テストは、エディー・エヌビー(Eddy NB)ら著、シンセティック・アナルジシックス．１‐メサドン・アイサマーズ・アンド・デリヴァティヴズ(Synthetic analgesics. 1 - Methadone isomers and derivatives)、J. Pharmacol. Exp. Ther.１９５０年、９８号、ｐ．１２１‐１３７に記載された実験手順に従って行われる。
【００３８】
５５℃に加熱した板の上に置いたマウスは、前脚をなめることにより、又は稀には跳躍により疼痛を表現する。その場合、反応時間を書き留める。調査化合物を、１ｍｇ／ｋｇの分量でマウスの尾静脈レベルで静脈内投与する。その場合、反応時間を５〜９０分後（図２に示す結果）及び５〜１８０分後（図３に示す結果）に測定する。
【００３９】
ｂ）結果
第一段階で発明者は、遊離Ｍ６Ｇ化合物の鎮痛活性を、ペプチドＳｙｎＢ３によるＭ６Ｇのベクター化によって得られる化合物のそれに対して比較した。得られた結果は、図２に示され、またベクター化Ｍ６Ｇ（化合物２）の鎮痛効果が、遊離Ｍ６Ｇ（化合物１）により得られるそれよりも、遥かに著しいことを明瞭に示す。この鎮痛効果は、効きが遅く、かつ投与後９０分後でも持続する。
【００４０】
もう一つの実験において、ベクター化Ｍ６Ｇ（化合物２）の効果を、１ｍｇ／Ｋｇの同じ分量でモルヒネ（化合物３）のそれと比較した。この実験の結果（図３）は、ベクター化Ｍ６Ｇ（化合物２）が、投与後１２０分までに至る時間で、モルヒネよりも遥かに大きい鎮痛効果を有することを明瞭に示す。
【００４１】
ＩＩ．２．利用した試験：テールフリックテスト
ａ）実験条件
マウスの尾を、赤外線源の前に置く。５５℃の表面温度を生じさせるように、光を尾の腹側表面に集束させる。マウスが尾を動かすとすぐに、反応時間を測定する。調査化合物を、皮下投与する。基本時間を得るために生成物の投与前に、３回の測定を行う。次に鎮痛化マウスの百分率を、マウスの全体数で除した、基本時間の少なくとも２倍である反応時間を有するマウスの数で表す。分量ＥＤ５０は、５０％の鎮痛化マウスを与える濃度を示す。
【００４２】
ｂ）結果
第一段階で、我々は、２つの投与方法、すなわち静脈内及び皮下により、モルヒネ又は遊離Ｍ６Ｇ化合物の鎮痛効果を、ペプチドＳｙｎＢ３によるＭ６Ｇのベクター化によって得られる化合物のそれに対して比較した。我々は、５０％のマウスに鎮痛効果を与える分量を表すＥＤ５０を、各生成物に対し、「テールフリック」モデルにおいて決定した。表２は、５０％のマウスにおいて鎮痛効果を誘発するために必要な分量が、ベクター化Ｍ６Ｇ（化合物２）に関して、モルヒネ（化合物３）又は遊離Ｍ６Ｇ（化合物１）よりも遥かに低かったことを示す。このことは、ベクター化Ｍ６Ｇの鎮痛効果が他のテストした生成物のそれより遥かに著しいことを明瞭に示す。
【００４３】
【表２】
2004529886.tif 000003
【００４４】
第二段階で、我々は、マウスにおいて鎮痛効果の持続時間を測定した。表３は、ベクター化Ｍ６Ｇが、Ｍ６Ｇ又はモルヒネより、鎮痛的な効果を有するだけでなく、この効果が長く続くことも示す。
【００４５】
【表３】
2004529886.tif 000004
【００４６】
ＩＩＩ．受容体への親和力の比較
ａ）実験条件
組織のホモジェネートを、子ウシの脳から調製する（μ１及びμ２に関して視床、及びδに関して前頭皮質）。［３Ｈ］［Ｄ‐Ａｌａ２，Ｄ‐Ｌｅｕ５］エンケファリン（ＤＡＤＬＥ）（０．７ｎＭ）を、１０ｎＭの［Ｄ‐Ｐｅｎ２，Ｄ‐Ｐｅｎ５］エンケファリン（ＤＰＤＰＥ）、及び漸増濃度の遊離又はベクター化Ｍ６Ｇの存在下で、３ｍｌの組織ホモジェネート（１ｍｌ当り１５ｍｇの組織）で培養する。これらの条件で、μ１の結合部位への特異的結合を観察する。μ２受容体に関して、［Ｄ‐Ａｌａ２，ＭｅＰｈｅ４，Ｇｌｙ（ｏｌ）５］エンケファリン（ＤＡＭＧＯ）（１ｎＭ）を、５ｎＭの［Ｄ‐Ｓｅｒ２，Ｌｅｕ５］エンケファリン‐Ｔｈｒ６（ＤＳＬＥＴ）、及び漸増濃度の遊離又はベクター化Ｍ６Ｇの存在下で、３ｍｌの組織ホモジェネートで培養する。δ受容体に関して、組織を遊離又はベクター化Ｍ６Ｇの存在下で、［３Ｈ］［Ｄ‐Ｐｅｎ２，Ｄ‐Ｐｅｎ５］エンケファリンで培養する。非特異的結合は、１μＭのレバロルファンの標識を付けた配位子への付加によって決定される。
【００４７】
ｂ）結果
Ｍ６Ｇは、非常に高い親和力で、μ受容体に結合されるモルヒネの活性代謝物である。我々は、μ１、μ２及びδ受容体への、遊離Ｍ６Ｇ（化合物１）の親和力を、ベクター化Ｍ６Ｇ（化合物２）のそれと比較した。
【００４８】
結果は、Ｍ６Ｇにリンカー及びベクターペプチド（ＳｙｎＢ３）を付加することが、親和力を、μ１受容体へは約３倍、かつμ２受容体へは１０倍増加させることを示している。これに反して、δ受容体への結合は、同じに留まっている。
【００４９】
【表４】
2004529886.tif 000005
【００５０】
ＩＶ．脳内の浸透の比較
ａ）実験条件：インサイチュ脳灌流
マウス（２０〜２５ｇ、イファ‐クレド(Iffa-Credo)；フランス、ラルブレル(l'Arbresle)）に、麻酔をかける。総頚動脈の露出後、右側外頚動脈を、内頚動脈と分岐のレベルで結合し、かつ総頚動脈を、心臓、及びカテーテル（ポリエチレンカテーテル、ＩＤ：０．７６）埋め込み部位の間に結合する。予めヘパリン溶液（１００単位／ｍｌ）で満たした該カテーテルを、総頚動脈中に挿入する。マウスを、灌流緩衝液（ＮａＣｌ・１２８ｍＭ、ＮａＨＣＯ３・２４ｍＭ、ＫＣｌ・４．２ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４・２．４ｍＭ、ＣａＣｌ２・１．５ｍＭ、ＭｇＳＯ４・０．９ｍＭ、及びＤ‐グルコース・９ｍＭ）で灌流させる。この緩衝液を濾過し、次に、７．４に近いｐＨを保ち、かつ灌流中に脳に酸素を補給するために、Ｏ２９５％／ＣＯ２５％を含む混合物で気泡を立てる。
【００５１】
マウスを、遊離Ｍ６Ｇ（化合物１；比活性８４ｍＣｉ／ｍｇ）又はベクター化Ｍ６Ｇ（化合物２；比活性１４．３ｍＣｉ／ｍｇ）を含む緩衝液で灌流させる。灌流開始直前に、灌流中に灌流液の逆流を回避するため、心室切断により心臓を停止させる。右半球を６０秒間、１０ｍｌ／分の速度で灌流させ、その後マウスの頭部を切断する。その時右半球中の放射能量を測定し、かつ脳浸透指数（Ｋｉｎ）を計算する。
【００５２】
ｂ．結果
この調査において、我々は、遊離Ｍ６Ｇ（化合物１）のＢＨＥ中の浸透を、ベクター化Ｍ６Ｇ（化合物２）のそれと比較した。２つの生成物を、マウスの脳内に灌流させた。緩衝液中での６０秒の灌流後、生成物の浸透を、μｌ／秒／ｇでＫｉｎ又は流入定数によって評価する。図４は、ベクターＳｙｎＢ３によるＭ６Ｇのベクター化が、緩衝液中での６０秒の灌流後、その脳内の通過を約１００倍増加させることを示す。
【００５３】
Ｖ．呼吸抑制の比較
ａ．実験条件
呼吸抑制は、ラットにおいて調査した。生成物を、皮下により動物に注射し、一定時間後に、血液のアリコートを予め埋め込んだカテーテルを経由して大腿動脈から採取する。調査の間、動物を、静かな場所に置く。採血後に、酸素飽和（ＳＯ２）及びＣＯ２圧力（ＰＣＯ２）を測定する。ＳＯ２の値は、Ｏ２の％で測定する。
【００５４】
ラットに、ＥＤ５０、５ｘＥＤ５０、１０ｘＥＤ５０に対応する各生成物の３つの分量で注射した（表５参照）。０〜１５０分に及ぶ時間（３０、６０、９０、１２０、１５０分）の後、血液を採取し、かつＯ２飽和（ＳＯ２）及びＣＯ２圧力を測定する。
【００５５】
【表５】
2004529886.tif 000006
【００５６】
ｂ．結果
モルヒネは、中度及び強度の疼痛治療に最も利用される物質であるが、その利用により、患者において呼吸抑制が誘発される。従って、我々は、ベクター化Ｍ６Ｇの効果をモルヒネ及び遊離Ｍ６Ｇのそれと比較した。
【００５７】
分量ＥＤ５０（図５、Ａ）で、ベクター化Ｍ６Ｇ又はＭ６Ｇに関していかなる効果も観察されなかった。我々は、それでもモルヒネに関して３０〜９０分の間の、若干のＯ２飽和の減少に気付いた。
【００５８】
分量５ｘＥＤ５０及び１０ｘＥＤ５０（図５、Ｂ及びＣ）で、モルヒネ及びＭ６Ｇは、非常に著しい酸素飽和の減少を誘発した。酸素比率は、３０〜９０分の間に、ほぼ５０％に低下した。それに反して、ベクター化Ｍ６Ｇに関し、注目に値するいかなる減少も得られなかった。
【００５９】
分量１０ｘＥＤ５０（図５、Ｃ）で、遊離Ｍ６Ｇで観察された激しい減少は、６０分の時間に、数匹の動物の死を引き起こした。
【００６０】
図５に示す結果は、ベクター化Ｍ６Ｇ生成物が、遊離Ｍ６Ｇ又はモルヒネよりも良好な鎮痛効果を有するだけでなく、モルヒネに関連した副作用を著しく減少させることを同様に可能にすることを証明している。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】モルヒネ代謝物である、モルヒネ‐６‐グルクロニド（Ｍ６Ｇ）のベクター化化合物の化学合成を概略的に表す。
【図２】化合物１（モルヒネ）及び化合物２（ベクター化Ｍ６Ｇ）の間の鎮痛効率の比較調査の結果を図解する。
【図３】化合物１（モルヒネ）、化合物２（ベクター化Ｍ６Ｇ）及び化合物３（遊離Ｍ６Ｇ）の間の鎮痛効率の比較調査の結果を図解する。
【図４】遊離Ｍ６Ｇ（化合物１）のＢＨＥ中の浸透の、ベクター化Ｍ６Ｇ（化合物２）のそれとの比較調査を図解する。
【図５】呼吸抑制に関するモルヒネ、ベクター化Ｍ６Ｇ及び遊離Ｍ６Ｇの効果の比較調査の結果を図解する。化合物は、分量ＥＤ５０（図５、Ａ）、分量５ｘＥＤ５０（図５、Ｂ）及び分量１０ｘＥＤ５０（図５、Ｃ）で利用された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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