(57)【要約】本発明は、ＨＩＶ薬物に対する表現型耐性と相互に関連付けられるＨＩＶ−１逆転写酵素および／もしくはプロテアーゼ遺伝子の新規突然変異、突然変異の組合せもしくは突然変異の特徴を提供する。より具体的には、本発明は、薬物耐性とウイルスの突然変異の特徴を相互に関連付けるための、ＨＩＶの標的集団の遺伝子型の特徴づけの使用、および表現型の解釈への本情報のその後の相関に関する。本発明はまた、データベース、薬物開発すなわち薬物設計および薬物改変、治療および処置の設計、臨床管理ならびに診断的分析における本発明の突然変異の特徴の利用方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）・４４Ｄ、７７Ｌ、１１５Ｆ、１１８Ｉ、１８４Ｖ、２０８Ｙ、２１０Ｗ、２１１Ｋ、２１４Ｆ、２１５Ｆ、２１５Ｙ、２１９Ｅ、２１９Ｎおよび２１９Ｑから選ばれる最低１種の突然変異とｄ４Ｔに対する耐性との間の相関に対応する一組の記録；
・突然変異１８１Ｉとラミブジンに対する耐性との間の相関に対応する記録；
・１１５Ｆおよび１８４Ｖから選ばれる最低１種の突然変異とアバカビルに対する耐性との間の相関に対応する一組の記録；
・６２Ｖ、７５Ｔ、７７Ｌ、１１６Ｙおよび１５１Ｍならびに全部のヌクレオシド類似物に対する耐性の組合わせに対応する記録；
・１０１Ｈ、１０１Ｐ、１０３Ｈ、１０３Ｓ、１０３Ｔ、１０６Ｍ、１８１Ｓおよび１９０Ｑから選ばれる最低１種の突然変異とネビラピンに対する耐性との間の相関に対応する一組の記録；
・１０１Ｈ、１０１Ｐ、１０３Ｈ、１０３Ｎ、１０３Ｓ、１０３Ｔ、１０６Ｍ、１８１Ｃ、１８１Ｓおよび１９０Ｑから選ばれる最低１種の突然変異とデラビルジンに対する耐性との間の相関に対応する一組の記録；
・１０１Ｈ、１０１Ｐ、１０３Ｈ、１０３Ｓ、１０３Ｔ、１０６Ｍ、１８１Ｓ、１９０Ｑおよび２３６Ｌから選ばれる最低１種の突然変異とエファビレンズに対する耐性との間の相関に対応する一組の記録；
・１８４Ｖおよび４１Ｌおよび２１５Ｙの組合わせに対応する記録（ここで、１８４Ｖ耐性突然変異はジドブジンに対する４１Ｌおよび２１５Ｙ突然変異の影響を復帰させる）；
・ネビラピンに対する感受性を増大させる２３６Ｌ突然変異に対応する記録
から選ばれる最低一組の記録を含んで成る、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素中の最低１種の突然変異の存在および逆転写酵素阻害剤に対する最低１種の株のＨＩＶの耐性を相互に関連付けるデータベース；
（ｉｉ）５４Ｌ、５４Ｍ、５４Ｖおよびコドン８４のいずれかの突然変異から選択される少なくとも突然変異とプロテアーゼ阻害剤に対する耐性の間の相関に対応する一組の記録を含んで成る、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロテアーゼ中の最低１種の突然変異の存在およびプロテアーゼ阻害剤に対する最低１種の株のＨＩＶの耐性を相互に関連付けるデータベース
から選ばれる最低１個のデータベースを含んで成るコンピュータシステム。
【請求項２】
コドン８４の突然変異が８４Ａ、８４Ｃおよび８４Ｌから選択される、請求項１記載のコンピュータシステム。
【請求項３】
プロテアーゼ阻害剤が、アムプレナビル、サキナビル、ネルフィナビル、リトナビルおよびインジナビルから選択される、請求項１ないし２のいずれか１つに記載のコンピュータシステム。
【請求項４】
ＨＩＶプロテアーゼ中の最低１種の突然変異が、ＨＩＶプロテアーゼ中のコドン１０および／もしくはコドン９０の最低１種の突然変異と組合わせられる、請求項１ないし３のいずれか１つに記載のコンピュータシステム。
【請求項５】
ＨＩＶプロテアーゼ中の最低１種の突然変異が、１０Ｉ、２０Ｒ、２０Ｔ、２４Ｉ、３３Ｆ、３３Ｉ、３３Ｌ、３６Ｉ、４６Ｌ、７１Ｔ、７１Ｖ、７７Ｉ、７７Ｖ、８２Ｉ、８２Ｖもしくは９０Ｍから選択される、ＨＩＶプロテアーゼ中の最低１種の突然変異と組合わせられる、請求項１ないし４のいずれか１つに記載のコンピュータシステム。
【請求項６】
（ａ）ＨＩＶに感染した患者からサンプルを収集すること；
（ｂ）該サンプルが、４４Ｄ、７７Ｌ、１１５Ｆ、１１８Ｉ、１８４Ｖ、２０８Ｙ、２１０Ｗ、２１１Ｋ、２１４Ｆ、２１５Ｆ、２１５Ｙ、２１９Ｅ、２１９Ｎおよび２１９Ｑから選ばれる最低１種の突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含んで成るかどうかを決定すること；
（ｃ）段階ｂ）の前記最低１種の突然変異の存在を使用して、抗ウイルス治療の有効性を評価すること
を含んで成る、ＨＩＶに感染した患者の前記抗ウイルス治療としてのｄ４Ｔの有効性の評価方法。
【請求項７】
（ａ）ＨＩＶに感染した患者からサンプルを収集すること；
（ｂ）該サンプルが、少なくとも突然変異１８４Ｉを有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含んで成るかどうかを決定すること；
（ｃ）段階ｂ）の前記最低１種の突然変異の存在を使用して、抗ウイルス治療の有効性を評価すること
を含んで成る、ＨＩＶに感染した患者の前記抗ウイルス治療としてのラミブジンの有効性の評価方法。
【請求項８】
（ａ）ＨＩＶに感染した患者からサンプルを収集すること；
（ｂ）該サンプルが、１１５Ｆおよび１８４Ｖから選ばれる最低１種の突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含んで成るかどうかを決定すること；
（ｃ）段階ｂ）の前記最低１種の突然変異の存在を使用して、抗ウイルス治療の有効性を評価すること
を含んで成る、ＨＩＶに感染した患者の前記抗ウイルス治療としてのアバカビルの有効性の評価方法。
【請求項９】
（ａ）ＨＩＶに感染した患者からサンプルを収集すること；
（ｂ）該サンプルが、６２Ｖ、７５Ｔ、７７Ｌ、１１６Ｙおよび１５１Ｍから選ばれる最低１種の突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含んで成るかどうかを決定すること；
（ｃ）段階ｂ）の前記最低１種の突然変異の存在を使用して、抗ウイルス治療の有効性を評価すること
を含んで成る、ＨＩＶに感染した患者の前記抗ウイルス治療としてのヌクレオシド類似物の有効性の評価方法。
【請求項１０】
（ａ）ＨＩＶに感染した患者からサンプルを収集すること；
（ｂ）該サンプルが、１０１Ｈ、１０１Ｐ、１０３Ｈ、１０３Ｓ、１０３Ｔ、１０６Ｍ、１８１Ｓ、１９０Ｑおよび２３６Ｌから選ばれる最低１種の突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含んで成るかどうかを決定すること；
（ｃ）段階ｂ）の前記最低１種の突然変異の存在を使用して、抗ウイルス治療の有効性を評価すること
を含んで成る、ＨＩＶに感染した患者の前記抗ウイルス治療としてのネビラピンの有効性の評価方法。
【請求項１１】
（ａ）ＨＩＶに感染した患者からサンプルを収集すること；
（ｂ）該サンプルが、１０１Ｈ、１０１Ｐ、１０３Ｈ、１０３Ｎ、１０３Ｓ、１０３Ｔ、１０６Ｍ、１８１Ｃ、１８１Ｓ、１９０Ｑおよび２３６Ｌから選ばれる最低１種の突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含んで成るかどうかを決定すること；
（ｃ）段階ｂ）の前記最低１種の突然変異の存在を使用して、抗ウイルス治療の有効性を評価すること
を含んで成る、ＨＩＶに感染した患者の前記抗ウイルス治療としてのデラビルジンの有効性の評価方法。
【請求項１２】
（ａ）ＨＩＶに感染した患者からサンプルを収集すること；
（ｂ）該サンプルが、１０１Ｈ、１０１Ｐ、１０３Ｈ、１０３Ｓ、１０３Ｔ、１０６Ｍ、１８１Ｓ、１９０Ｑおよび２３６Ｌから選ばれる最低１種の突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含んで成るかどうかを決定すること；
（ｃ）段階ｂ）の前記最低１種の突然変異の存在を使用して、抗ウイルス治療の有効性を評価すること
を含んで成る、ＨＩＶに感染した患者の前記抗ウイルス治療としてのエファビレンズの有効性の評価方法。
【請求項１３】
（ａ）ＨＩＶに感染した患者からサンプルを収集すること；
（ｂ）該サンプルが、１８４Ｖ、４１Ｌおよび２１５Ｙから選ばれる最低１種の突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含んで成るかどうかを決定すること；
（ｃ）段階ｂ）の前記最低１種の突然変異の存在を使用して、抗ウイルス治療の有効性を評価すること
を含んで成る、ＨＩＶに感染した患者の前記抗ウイルス治療としてのジドブジンの有効性の評価方法。
【請求項１４】
（ａ）ＨＩＶに感染した患者からサンプルを収集すること；
（ｂ）該サンプルが、５４Ｌ、５４Ｍ、５４Ｖおよびコドン８４のいずれかの突然変異から選ばれる最低１種の突然変異を有するＨＩＶプロテアーゼをコードする核酸を含んで成るかどうかを決定すること；
（ｃ）段階ｂ）の前記最低１種の突然変異の存在を使用して、抗ウイルス治療の有効性を評価すること
を含んで成る、ＨＩＶに感染した患者の前記抗ウイルス治療としてのプロテアーゼ阻害剤の有効性の評価方法。
【請求項１５】
コドン８４の突然変異が８４Ａ、８４Ｃおよび８４Ｌから選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ＨＩＶプロテアーゼ中の最低１種の突然変異が、ＨＩＶプロテアーゼ中のコドン１０および／もしくはコドン９０の最低１種の突然変異と組合わせられる、請求項１４もしくは１５記載の方法。
【請求項１７】
ＨＩＶプロテアーゼ中の最低１種の突然変異が、１０Ｉ、２０Ｒ、２０Ｔ、２４Ｉ、３３Ｆ、３３Ｉ、３３Ｌ、３６Ｉ、４６Ｌ、７１Ｔ、７１Ｖ、７７Ｉ、７７Ｖ、８２Ｉ、８２Ｖもしくは９０Ｍから選択されるＨＩＶプロテアーゼ中の最低１種の突然変異と組合わせられる、請求項１４ないし１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
ｉ）５４Ｌ、５４Ｍ、５４Ｖもしくはコドン８４のいずれかの突然変異から選ばれる最低１種の突然変異を含有するＨＩＶプロテアーゼを提供すること；
ｉｉ）前記ＨＩＶプロテアーゼに対する、薬物耐性株のＨＩＶに対し有効な薬物の表現型の応答を決定すること；および
ｉｉｉ）前記表現型の応答を使用して前記薬物の有効性を決定すること
を含んで成る、前記薬物の同定方法。
【請求項１９】
請求項１８記載の方法を使用して同定される薬物。
【請求項２０】
前記表現型の応答が、組換えウイルスアッセイを使用して決定される、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）ＨＩＶに感染した患者からサンプルを収集すること；
（ｂ）該サンプルが、４４Ｄ、７７Ｌ、１１５Ｆ、１１８Ｉ、１８４Ｖ、２０８Ｙ、２１０Ｗ、２１１Ｋ、２１４Ｆ、２１５Ｆ、２１５Ｙ、２１９Ｅ、２１９Ｎおよび２１９Ｑから選ばれる最低１種の突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含んで成るかどうかを決定すること；
（ｃ）段階ｂ）の前記最低１種の突然変異の存在を使用して、抗ウイルス治療を設計すること
を含んで成る、ＨＩＶに感染した患者を処置するためのｄ４Ｔを用いる治療の設計方法。
【請求項２２】
（ａ）ＨＩＶに感染した患者からサンプルを収集すること；
（ｂ）該サンプルが、少なくとも突然変異１８４Ｉを有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含んで成るかどうかを決定すること；
（ｃ）段階ｂ）の前記最低１種の突然変異の存在を使用して、抗ウイルス治療を設計すること
を含んで成る、ＨＩＶに感染した患者を処置するためのラミブジンを用いる治療の設計方法。
【請求項２３】
（ａ）ＨＩＶに感染した患者からサンプルを収集すること；
（ｂ）該サンプルが、１１５Ｆおよび１８４Ｖから選ばれる最低１種の突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含んで成るかどうかを決定すること；
（ｃ）段階ｂ）の前記最低１種の突然変異の存在を使用して、抗ウイルス治療を設計すること
を含んで成る、ＨＩＶに感染した患者を処置するためのアバカビルを用いる治療の設計方法。
【請求項２４】
（ａ）ＨＩＶに感染した患者からサンプルを収集すること；
（ｂ）該サンプルが、６２Ｖ、７５Ｔ、７７Ｌ、１１６Ｙおよび１５１Ｍから選ばれる最低１種の突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含んで成るかどうかを決定すること；
（ｃ）段階ｂ）の前記最低１種の突然変異の存在を使用して、抗ウイルス治療を設計すること
を含んで成る、ＨＩＶに感染した患者を処置するためのヌクレオシド類似物を用いる治療の設計方法。
【請求項２５】
（ａ）ＨＩＶに感染した患者からサンプルを収集すること；
（ｂ）該サンプルが、１０１Ｈ、１０１Ｐ、１０３Ｈ、１０３Ｓ、１０３Ｔ、１０６Ｍ、１８１Ｓ、１９０Ｑおよび２３６Ｌから選ばれる最低１種の突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含んで成るかどうかを決定すること；
（ｃ）段階ｂ）の前記最低１種の突然変異の存在を使用して、抗ウイルス治療を設計すること
を含んで成る、ＨＩＶに感染した患者を処置するためのネビラピンを用いる治療の設計方法。
【請求項２６】
（ａ）ＨＩＶに感染した患者からサンプルを収集すること；
（ｂ）該サンプルが、１０１Ｈ、１０１Ｐ、１０３Ｈ、１０３Ｎ、１０３Ｓ、１０３Ｔ、１０６Ｍ、１８１Ｃ、１８１Ｓ、１９０Ｑおよび２３６Ｌから選ばれる最低１種の突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含んで成るかどうかを決定すること；
（ｃ）段階ｂ）の前記最低１種の突然変異の存在を使用して、抗ウイルス治療を設計すること
を含んで成る、ＨＩＶに感染した患者を処置するためのデラビルジンを用いる治療の設計方法。
【請求項２７】
（ａ）ＨＩＶに感染した患者からサンプルを収集すること；
（ｂ）該サンプルが、１０１Ｈ、１０１Ｐ、１０３Ｈ、１０３Ｓ、１０３Ｔ、１０６Ｍ、１８１Ｓ、１９０Ｑおよび２３６Ｌから選ばれる最低１種の突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含んで成るかどうかを決定すること；
（ｃ）段階ｂ）の前記最低１種の突然変異の存在を使用して、抗ウイルス治療を設計すること
を含んで成る、ＨＩＶに感染した患者を処置するためのエファビレンズを用いる治療の設計方法。
【請求項２８】
（ａ）ＨＩＶに感染した患者からサンプルを収集すること；
（ｂ）該サンプルが、１８４Ｖ、４１Ｌおよび２１５Ｙから選ばれる最低１種の突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含んで成るかどうかを決定すること；
（ｃ）段階ｂ）の前記最低１種の突然変異の存在を使用して、抗ウイルス治療を設計すること
を含んで成る、ＨＩＶに感染した患者を処置するためのジドブジンを用いる治療の設計方法。
【請求項２９】
（ａ）ＨＩＶに感染した患者からサンプルを収集すること；
（ｂ）該サンプルが、５４Ｌ、５４Ｍ、５４Ｖおよびコドン８４のいずれかの突然変異から選ばれる最低１種の突然変異を有するＨＩＶプロテアーゼをコードする核酸を含んで成るかどうかを決定すること；
（ｃ）段階ｂ）の前記最低１種の突然変異の存在を使用して、抗ウイルス治療を設計すること
を含んで成る、ＨＩＶに感染した患者を処置するためのプロテアーゼ阻害剤を用いる治療の設計方法。
【請求項３０】
コドン８４の突然変異が８４Ａ、８４Ｃおよび８４Ｌから選択される、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
ＨＩＶプロテアーゼ中の最低１種の突然変異が、コドン１０および／もしくはコドン９０のＨＩＶプロテアーゼ中の最低１種の突然変異と組合わせられる、請求項２９もしくは３０記載の方法。
【請求項３２】
ＨＩＶプロテアーゼ中の最低１種の突然変異が、１０Ｉ、２０Ｒ、２０Ｔ、２４Ｉ、３３Ｆ、３３Ｉ、３３Ｌ、３６Ｉ、４６Ｌ、７１Ｔ、７１Ｖ、７７Ｉ、７７Ｖ、８２Ｉ、８２Ｖもしくは９０Ｍから選択されるＨＩＶプロテアーゼ中の最低１種の突然変異と組合わせられる、請求項２９ないし３１のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、核酸診断薬および標的核酸配列中の塩基変異の同定の分野に向けられる。より具体的には、本発明は、薬物耐性とウイルスの突然変異の特徴を相互に関連付けるための、ＨＩＶの標的集団のこうした遺伝子型の特徴づけの使用、およびこの情報の表現型の解釈とのその後の関連すなわち相関に関する。本発明はまた、薬物開発すなわち薬物設計、薬物改変および薬物開発、治療および処置の設計、臨床管理ならびに診断的分析における本発明の突然変異の特徴の利用方法にも関する。
【０００２】
レトロウイルス阻害剤は多様な方法でウイルス複製をブロックするかもしれない。例えば、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）は、逆転写酵素による、伸張するウイルスＤＮＡへの取り込みにおいて、天然のヌクレオシド三リン酸と競争する。天然のヌクレオシドとこれらの化合物を区別する化学修飾がＤＮＡ鎖の終止事象をもたらす。現在利用可能であるＮＲＴＩは、ジドブジン（ＺＤＶ）、ジダノシン（ｄｄＩ）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、スタブジン（ｄ４Ｔ）、ラミブジン（３ＴＣ）およびアバカビル（ＡＢＣ）を包含する。
【０００３】
ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤（ＮｔＲＴＩ）はＮＲＴＩと同一の作用様式を有するが、しかしそれらは既に一リン酸化されそして従ってそれらはより少ない代謝段階を必要とするためにそれらは異なる。アデフォビル（ビス−ＰＯＭ−ＰＭＥＡ）およびビスＰＯＣ　ＰＭＰＡがこの処置カテゴリーに属する。
【０００４】
非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）は、ウイルスの逆転写酵素酵素の活性部位もしくはその近くに非競争的結合してそれによりその活性を阻害することによりＨＩＶの逆転写酵素を阻害する、構造的に多様な化合物の一群である。この群の利用可能な化合物はネビラピン（ＮＶＰ）、デラビルジン（ＤＬＶ）およびエファビレンズを包含する。
【０００５】
プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）はペプチド模倣性であり、そしてウイルスのプロテアーゼ酵素の活性部位に結合してそれにより感染性ビリオンの構造および酵素成分を産生するのに必要な前駆体タンパク質の切断を阻害する。現在利用可能であるＰＩは、サキナビル（ＳＱＶ）、リトナビル（ＲＴＶ）、インジナビル（ＩＤＶ）ネルフィナビル（ＮＦＶ）、アムプレナビル（ＡＰＶ）およびＡＢＴ−３７８（ロピナビル）を包含する。
【０００６】
抗レトロウイルス治療の選択肢は、新たな作用物質が利用可能になっているためかなり改善した。抗レトロウイルス治療についての現在の指針は、初期処置に、１種のＰＩおよび２種のＮＲＴＩもしくは１種のＮＮＲＴＩおよび２種のＮＲＴＩのような三剤併用治療レジメンを推奨する。これらの併用レジメンは強力な抗レトロウイルス活性を示し、そしてＨＡＡＲＴ（高度に活性の抗ウイルス治療）と称される。
【０００７】
加えて、血漿ＨＩＶ−１　ＲＮＡ定量アッセイの開発および標準化は、重要な処置応答モニタリングのツールとしてのウイルス負荷量（ｖｉｒａｌ ｌｏａｄ）の測定値の使用に至った。抗レトロウイルス治療の最終目標は、長期ベースで検出限界より下まで血漿ウイルス血症を低下させることである。しかしながら、かなり多数の患者においては、ウイルス複製の最大の抑制が達成されず、また、この最終目標が達成される者について、かなりの数がウイルス負荷量の反動を経験している。ウイルス負荷量のデータは失敗の原因に関する情報を提供しない。
【０００８】
なぜ治療が失敗するかは、レジメンの不十分な抗ウイルス活性、薬物代謝および薬動力学における個体の変動、投与レジメンを守ることの困難性、毒性による処置中断の要求、ならびにウイルスの薬物耐性を包含する多数の要因によるかもしれない。さらに、薬物耐性が至適以下の抗レトロウイルス治療で処置された患者で発生するかもしれないか、もしくは、患者が薬物耐性のＨＩＶ−１に感染しているかもしれない。薬物耐性は治療の失敗の主理由でないかもしれないとは言え、多くの症例で、阻害剤の存在下でウイルス複製を可能にするいずれかの状況が、耐性バリアントの選択のための段階を設定する。
【０００９】
ウイルスの薬物耐性は、阻害剤の存在下で複製を高める、ウイルスのいずれかの変化と定義することができる。ＨＩＶ−１の薬物耐性は１９８９年に最初に記述され、そして、その時点で唯一の処置の選択肢を代表したジドブジン単剤治療で処置されていた患者を伴った。Ｌａｒｄｅｒ，Ｂ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４３、１７３１−１７３４（１９８９）を参照されたい。耐性の出現は、単独の抗レトロウイルス薬物での患者の処置の経過の間にほとんど常に観察されている。同様に、抗レトロウイルス化合物の存在下での数回の複製によるウイルス培養物のインビトロ継代は、その複製周期が使用される化合物に対しもはや感受性でないウイルスの選択につながる。耐性の発生はまた、二剤ＮＲＴＩ併用治療の導入とともに、ならびにより強力なＮＮＲＴＩおよびＰＩの投与の間にも観察されている。個々の抗レトロウイルス剤は耐性が発生する速度が異なる。すなわち、耐性の変異株についての選択は処置の数週間以内に起こるかもしれないか、もしくは耐性はより長い処置期間後に出現するかもしれない。
【００１０】
インビボもしくはインビトロ選択により生成された耐性のウイルス単離物の広範囲の遺伝子分析は、耐性が一般に、ウイルスゲノムのいくつかの特定の部位（１個もしくは複数）でヌクレオチド配列を変える突然変異により引き起こされることを示した。ＨＩＶ−１について観察かつ報告されかつ薬物耐性と相互に関連付けられる突然変異のパターンは非常に多様である。すなわち、いくつかの抗レトロウイルス剤は唯一の単一遺伝子変化を必要とする一方、他者は耐性が出現するために複数の突然変異を必要とする。薬物耐性と関連付けられたＨＩＶゲノム中の突然変異の要約が集成されている。Ｓｃｈｉｎａｚｉ，Ｒ．Ｆ．，Ｌａｒｄｅｒ，Ｂ．Ａ．とＭｅｌｉｏｒｓ，Ｊ．Ｗ．１９９７．Ｉｎｔ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ　Ｎｅｗｓ．５、１２９−１４２（１９９７）を参照されたい。加えて、突然変異を伴う電子的一覧表もまた、ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ、ｗｗｗ．ｈｉｖｂ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕおよびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｉｖｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｗｅｂ．ｃｏｍで入手可能になっている。
【００１１】
抗レトロウイルス化合物に対する遺伝子変異体の感受性の程度は、例えばジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）で見出されるところの野性型ウイルス（ＨＩＶ　ＩＩＩ／Ｂ／ＬＡ１参照配列）（その配列はこれにより引用することにより組み込まれる）に関して本明細書で表されることに注目されるべきである。感受性は、一般に、ＩＣ５０もしくはＩＣ９０値（ＩＣ５０もしくはＩＣ９０値はウイルス集団のそれぞれ５０％もしくは９０％が複製することから阻害される薬物濃度である）の比として表される。加えて、遺伝子の突然変異は通常、野性型ウイルスに関して書かれる。すなわち、Ｋ１０１Ｎはコドン１０１のリシンのアスパラギンでの置換を指す。しかしながら、本発明の突然変異は、本発明の実施内にあるために列挙される野性型例に依存しない。例えば、突然変異１０１Ｎは、突然変異前に１０１にリシンが存在したかどうかに関係なく、１０１のコドンでのアスパラギンを指す。
【００１２】
もちろん、抗レトロウイルス薬物は、大部分は相互との組合わせでより長い時間の期間の間投与されるため、また、新たな抗レトロウイルス薬が開発されておりかつ現在の薬物に追加されているため、新たな耐性と相互に関連付けられる遺伝子変異体が発見されている。抗レトロウイルス剤の組合わせが耐性の特徴に影響する可能性があることがとりわけ重要である。例えば、多様なＮＮＲＴＩ耐性と相互に関連付けられる突然変異が、ＮＮＲＴＩ−ジドブジン併用治療で選択され、また、多様なＮＲＴＩ耐性と相互に関連付けられる突然変異が二剤ＮＲＴＩ併用治療で選択された。後者の場合には、結果は全ＮＲＴＩに対する高レベルの多剤耐性である。
【００１３】
さらに、ウイルス耐性が発生すれば、救済治療の選択肢は各薬物の分類内の交差耐性により厳しく制限されるかもしれない。最近、より良好な臨床管理のためにウイルスの薬物感受性の変化の特徴づけに関心が集中している。これは、耐性の出現を最小限にしかつ患者の長期予後を改善するために治療の変更が要求される場合についてと同じくらい、初期処置について重要である。治療レジメンの選択は、循環しているウイルス集団の耐性の特徴の知識により支持されることができる。加えて、治療の組合わせは、それらが特定の一ウイルス集団を抑制するという立証された潜在能力を有する作用物質を包含する場合に有効であることのより大きな機会を有することができる。
【００１４】
これらおよび他の利点を達成するため、また、本明細書に例示かつ広範に記述されるところの本発明の目的によれば、本発明は、一局面において、ＨＩＶ逆転写酵素中の最低１種の突然変異の存在および逆転写酵素阻害剤（ＲＴＩ）に対する最低１種の株のＨＩＶの耐性を相互に関連付けるデータベース；ならびに／もしくはＨＩＶプロテアーゼ中の最低１種の突然変異の存在およびプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）に対する最低１種の株のＨＩＶの耐性を相互に関連付けるデータベースを含んで成るコンピュータシステムを提供する。より具体的には、該データベースは、突然変異と薬物耐性との間の相関に対応する一組の記録を含んで成る。
【００１５】
さらなる一態様において、本発明は、ＮＮＲＴＩもしくはＮＲＴＩ耐性株のＨＩＶに対し有効な薬物の同定方法を提供し、該方法は：本明細書に記述される最低１種の突然変異を含有するＨＩＶ逆転写酵素を含んで成る最低１種の株のＨＩＶを提供すること、該株のＨＩＶに対する該薬物の表現型の応答を決定すること、および該表現型の応答を使用して該薬物の有効性を決定すること、の段階を含んで成る。なおさらなる一態様において、本発明は、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）耐性株のＨＩＶに対し有効な薬物の同定方法を提供し、ここでＨＩＶの該株は、本明細書に記述される最低１種の突然変異を含有するＨＩＶプロテアーゼ、前記株のＨＩＶに対する前記薬物の表現型の応答を決定すること、および該表現型の応答を使用して該薬物の有効性を決定することを含んで成る。別の態様において、本発明は本発明の方法を使用して同定される薬物を提供する。
【００１６】
本発明はまた：ＨＩＶに感染した患者からサンプルを収集すること；該サンプルが、本明細書で記述される最低１種の突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素もしくは本明細書で記述される最低１種の突然変異を有するＨＩＶプロテアーゼをコードする最低１種の核酸を含んで成るかどうかを決定すること；および該核酸の存在を使用してＨＩＶに感染した患者に対する治療を設計することを含んで成る、該患者を処置するための治療の設計方法も提供する。
【００１７】
本発明はまた、上述された最低１種の突然変異を含んで成る最低１種のＮＮＲＴＩもしくは最低１種のＮＲＴＩに対し耐性の単離されたＨＩＶ逆転写酵素複合物、および上述された最低１種の突然変異を含んで成る、ＰＩに対し耐性の単離されたＨＩＶプロテアーゼ複合物も包含する。
【００１８】
前述の一般的記述および以下の詳述される記述の双方は単に例示的かつ説明的であり、そして特許請求されるところの本発明を制限しないことが理解されるべきである。
【００１９】
（発明の詳細な記述）
本発明は、一局面において、抗ＨＩＶ薬物に対する表現型の耐性と相互に関連付けられるＨＩＶ−１逆転写酵素および／もしくはプロテアーゼ遺伝子の新規突然変異もしくは突然変異の特徴を提供する。より具体的には、本発明はまた、ウイルスの突然変異の特徴を薬物耐性と相互に関連付けるための、ＨＩＶの標的一集団の遺伝子型の特徴づけの使用、および表現型の解釈との本情報のその後の相関にも関する。本発明はまた、データベース、薬物開発すなわち薬物設計、ならびに薬物改変、治療および処置の設計、臨床管理ならびに診断的分析における本発明の突然変異の特徴の利用方法にも関する。
【００２０】
本発明は：
４４Ｄ、７７Ｌ、１１５Ｆ、１１８Ｉ、１８４Ｖ、２０８Ｙ、２１０Ｗ、２１１Ｋ、２１４Ｆ、２１５Ｆ、２１５Ｙ、２１９Ｅ、２１９Ｎおよび２１９Ｑから選ばれる最低１種の突然変異とｄ４Ｔに対する耐性との間の相関に対応する最低一組の記録、
突然変異１８１Ｉとラミブジンに対する耐性との間の相関に対応する記録、
１１５Ｆおよび１８４Ｖから選ばれる最低１種の突然変異とアバカビルに対する耐性との間の相関に対応する最低一組の記録。
６２Ｖ、７５Ｔ、７７Ｌ、１１６Ｙおよび１５１Ｍ、ならびに全部のヌクレオシド類似物に対する耐性の組合わせ
１０１Ｈ、１０１Ｐ、１０３Ｈ、１０３Ｓ、１０３Ｔ、１０６Ｍ、１８１Ｓおよび１９０Ｑから選ばれる最低１種の突然変異とネビラピンに対する耐性との間の相関に対応する最低一組の記録、
１０１Ｈ、１０１Ｐ、１０３Ｈ、１０３Ｎ、１０３Ｓ、１０３Ｔ、１０６Ｍ、１８１Ｃ、１８１Ｓ、１９０Ｑおよび２３６Ｌから選ばれる最低１種の突然変異とデラビルジンに対する耐性との間の相関に対応する最低一組の記録、
１０１Ｈ、１０１Ｐ、１０３Ｈ、１０３Ｓ、１０３Ｔ、１０６Ｍ、１８１Ｓ、１９０Ｑおよび２３６Ｌから選ばれる最低１種の突然変異とエファビレンズに対する耐性との間の相関に対応する最低一組の記録、
１８４Ｖおよび４１Ｌおよび２１５Ｙの組合わせ（ここで、１８４Ｖ耐性突然変異はジドブジンに対する４１Ｌおよび２１５Ｙ突然変異の影響を復帰させる）
ネビラピンに対する感受性を増大させる２３６Ｌ突然変異
を含んで成る、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素中の最低１種の突然変異の存在および逆転写酵素阻害剤に対する最低１種の株のＨＩＶの耐性を相互に関連付ける最低１個のデータベース、
５４Ｌ、５４Ｍ、５４Ｖ、８４Ａ、８４Ｃおよび８４Ｌから選択される少なくとも突然変異と、アムプレナビル、サキナビル、ネルフィナビル、リトナビル、インジナビルから選択されるプロテアーゼ阻害剤に対する耐性の間の相関に対応する最低一組の記録
を含んで成る、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロテアーゼ中の最低１種の突然変異の存在およびプロテアーゼ阻害剤に対する最低１種の株のＨＩＶの耐性を相互に関連付ける最低１個のデータベース
を含んで成るコンピュータシステムに関する。
【００２１】
本発明は、さらに：
（ａ）ＨＩＶに感染した患者からサンプルを収集すること；
（ｂ）該サンプルが：
ｉ）４４Ｄ、７７Ｌ、１１５Ｆ、１１８Ｉ、１８４Ｖ、２０８Ｙ、２１０Ｗ、２１１Ｋ、２１４Ｆ、２１５Ｆ、２１５Ｙ、２１９Ｅ、２１９Ｎおよび２１９Ｑ、ならびにｄ４Ｔに対する耐性、
１８４Ｉおよびラミブジンに対する耐性、
１１５Ｆおよび１８４Ｖ、ならびにアバカビルに対する耐性、
６２Ｖ、７５Ｔ、７７Ｌ、１１６Ｙおよび１５１Ｍ、ならびに全部のヌクレオシド類似物に対する耐性、
１０１Ｈ、１０１Ｐ、１０３Ｈ、１０３Ｓ、１０３Ｔ、１０６Ｍ、１８１Ｓおよび１９０Ｑ、ならびにネビラピンに対する耐性、
１０１Ｈ、１０１Ｐ、１０３Ｈ、１０３Ｎ、１０３Ｓ、１０３Ｔ、１０６Ｍ、１８１Ｃ、１８１Ｓ、１９０Ｑおよび２３６Ｌ、ならびにデラビルジンに対する耐性、
１０１Ｈ、１０１Ｐ、１０３Ｈ、１０３Ｓ、１０３Ｔ、１０６Ｍ、１８１Ｓ、１９０Ｑおよび２３６Ｌ、ならびにエファビレンズに対する耐性、
１８４Ｖおよび４１Ｌおよび２１５Ｙ（ここで１８４Ｖ耐性突然変異は、ジドブジンに対する４１Ｌおよび２１５Ｙ突然変異の影響を復帰させる）
ネビラピンに対する感受性を増大させる２３６Ｌ突然変異
から選ばれる最低１種の突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする第一の核酸
ｉｉ）５４Ｌ、５４Ｍ、５４Ｖ、８４Ａ、８４Ｃおよび８４Ｌ、ならびにアムプレナビル、サキナビル、ネルフィナビル、リトナビル、インジナビルから選択されるプロテアーゼ阻害剤に対する耐性から選択される最低１種の突然変異を有するＨＩＶプロテアーゼをコードする第二の核酸、
から選択される最低１種の突然変異を有するＨＩＶをコードする最低１種の核酸を含んで成るかどうか決定すること、
（ｃ）前記最低１種の核酸の存在を使用して、前記抗ウイルス治療の有効性を評価すること
を含んで成る、ＨＩＶに感染した患者の抗ウイルス治療の有効性の評価方法に関する。
【００２２】
本発明は、さらに：
ｉ）ａ）４４Ｄ、７７Ｌ、１１５Ｆ、１１８Ｉ、１８４Ｖ、２０８Ｙ、２１０Ｗ、２１１Ｋ、２１４Ｆ、２１５Ｆ、２１５Ｙ、２１９Ｅ、２１９Ｎおよび２１９Ｑ、ならびにｄ４Ｔに対する耐性、
１８４Ｉおよびラミブジンに対する耐性、
１１５Ｆおよび１８４Ｖ、ならびにアバカビルに対する耐性。
６２Ｖ、７５Ｔ、７７Ｌ、１１６Ｙおよび１５１Ｍ、ならびに全部のヌクレオシド類似物に対する耐性
１０１Ｈ、１０１Ｐ、１０３Ｈ、１０３Ｓ、１０３Ｔ、１０６Ｍ、１８１Ｓおよび１９０Ｑ、ならびにネビラピンに対する耐性、
１０１Ｈ、１０１Ｐ、１０３Ｈ、１０３Ｎ、１０３Ｓ、１０３Ｔ、１０６Ｍ、１８１Ｃ、１８１Ｓ、１９０Ｑおよび２３６Ｌ、ならびにデラビルジンに対する耐性、
１０１Ｈ、１０１Ｐ、１０３Ｈ、１０３Ｓ、１０３Ｔ、１０６Ｍ、１８１Ｓ、１９０Ｑおよび２３６Ｌ、ならびにエファビレンズに対する耐性、
１８４Ｖおよび４１Ｌおよび２１５Ｙ（ここで１８４Ｖ耐性突然変異は、ジドブジンに対する４１Ｌおよび２１５Ｙ突然変異の影響を復帰させる）
ネビラピンに対する感受性を増大させる２３６Ｌ突然変異
から選ばれる最低１種の突然変異を含有する最低１種のＨＩＶ逆転写酵素
ｂ）５４Ｌ、５４Ｍ、５４Ｖ、８４Ａ、８４Ｃおよび８４Ｌ、ならびにアムプレナビル、サキナビル、ネルフィナビル、リトナビル、インジナビルから選択されるプロテアーゼ阻害剤に対する耐性から選ばれる最低１種の突然変異を含有するＨＩＶプロテアーゼを含んで成る最低１種の株のＨＩＶ
を含んで成る最低１種の株のＨＩＶを提供すること；
ｉｉ）前記株のＨＩＶに対する前記薬物の表現型の応答を決定すること；ならびに
ｉｉｉ）前記表現型の応答を使用して、前記薬物の有効性を決定すること
を含んで成る、薬物耐性株のＨＩＶに対し有効な薬物の同定方法に関する。
【００２３】
本発明は、ＨＩＶに感染した個体を処置するために有効な薬物の同定方法を提供する。本発明はさらに、個体のＨＩＶ治療を評価するための表現型分類方法を提供する。
【００２４】
本発明はさらに：
ｉ）ＨＩＶに感染した患者からサンプルを収集すること；
ｉｉ）該サンプルが
ａ）４４Ｄ、７７Ｌ、１１５Ｆ、１１８Ｉ、１８４Ｖ、２０８Ｙ、２１０Ｗ、２１１Ｋ、２１４Ｆ、２１５Ｆ、２１５Ｙ、２１９Ｅ、２１９Ｎおよび２１９Ｑ、ならびにｄ４Ｔに対する耐性、
１８４Ｉおよびラミブジンに対する耐性、
１１５Ｆおよび１８４Ｖ、ならびにアバカビルに対する耐性。
６２Ｖ、７５Ｔ、７７Ｌ、１１６Ｙおよび１５１Ｍ、ならびに全部のヌクレオシド類似物に対する耐性
１０１Ｈ、１０１Ｐ、１０３Ｈ、１０３Ｓ、１０３Ｔ、１０６Ｍ、１８１Ｓおよび１９０Ｑ、ならびにネビラピンに対する耐性、
１０１Ｈ、１０１Ｐ、１０３Ｈ、１０３Ｎ、１０３Ｓ、１０３Ｔ、１０６Ｍ、１８１Ｃ、１８１Ｓ、１９０Ｑおよび２３６Ｌ、ならびにデラビルジンに対する耐性、
１０１Ｈ、１０１Ｐ、１０３Ｈ、１０３Ｓ、１０３Ｔ、１０６Ｍ、１８１Ｓ、１９０Ｑおよび２３６Ｌ、ならびにエファビレンズに対する耐性、
１８４Ｖおよび４１Ｌおよび２１５Ｙ（ここで１８４Ｖ耐性突然変異は、ジドブジンに対する４１Ｌおよび２１５Ｙ突然変異の影響を復帰させる）
ネビラピンに対する感受性を増大させる２３６Ｌ突然変異
から選ばれる最低１種の突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする最低１種の核酸
ｂ）５４Ｌ、５４Ｍ、５４Ｖ、８４Ａ、８４Ｃおよび８４Ｌ、ならびにアムプレナビル、サキナビル、ネルフィナビル、リトナビル、インジナビルから選択されるプロテアーゼ阻害剤に対する耐性から選ばれる最低１種の突然変異を有するＨＩＶプロテアーゼをコードする最低１種の核酸
を含んで成るかどうかを決定すること、
ｉｉｉ）前記最低１種の核酸の存在を使用して、前記患者のための治療を設計すること
を含んで成る、ＨＩＶに感染した患者を処置するための治療の設計方法を提供する。
【００２５】
優先的に、１０Ｉ、２０Ｒ、２０Ｔ、２４Ｉ、３３Ｆ、３３Ｉ、３３Ｌ、３６Ｉ、４６Ｌ、７１Ｔ、７１Ｖ、７７Ｉ、７７Ｖ、８２Ｉ、８２Ｖもしくは９０Ｍから選択される最低１個の付加的な突然変異が、ＨＩＶプロテアーゼ核酸中に存在する。より優先的な、コドン５４の突然変異を有するＨＩＶプロテアーゼ核酸は、コドン１０および９０から選択される最低１個の付加的な突然変異を含んで成り、そしてアムプレナビル、インジナビル、ネルフィナビル、リトナビルおよびサキナビルから選択されるプロテアーゼ阻害剤に対する耐性を賦与する。一態様において、本発明は、本発明の最低１種の突然変異を含んで成るキメラＨＩＶウイルスを提供する。
【００２６】
理論に関して制限されるべきでなく、本発明は、突然変異を耐性の表現型と相互に関連付けるための遺伝子型および表現型の耐性試験を必要とする組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ）アプローチを利用してよい。上で挙げられた技術の特定の組合わせなしでは、突然変異と耐性との間のこの相関は検出されていないとみられる。慣例の臨床実施からの単離物におけるこれらの遺伝子型および表現型の特徴の観察結果に加え、部位特異的突然変異体が、これらの突然変異が実際にこのパターンの薬物耐性の基礎を形成することを確認するために生成された。
【００２７】
抗レトロウイルス薬物に対するＨＩＶの耐性は、ＨＩＶ−１ゲノム中の突然変異を同定することにより、また、耐性と相互に関連することが既知の突然変異パターンについての検索により抗レトロウイルス薬物に対するＨＩＶ−１の耐性を推察することにより、遺伝子型レベルで決定してよい。あるいは、抗レトロウイルス薬物に対するＨＩＶの耐性は、阻害剤の存在下でウイルスを培養することにより、および、該薬物がウイルス複製をどの程度阻害するかを測定することにより、表現型レベルで決定してよい。この場合、表現型に対する全部の突然変異の相互作用の影響、これまで未知のもしくは以前に同定されていない遺伝子変化の影響、背景の遺伝子型の影響などを測定する。ＨＩＶ−１中の突然変異の検出のためのアッセイは、ウイルスゲノム配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅に基づいてよい。これらの増幅された配列をその後、ハイブリダイゼーションもしくは配列決定技術のいずれかを使用して分析する。ハイブリダイゼーションに基づくアッセイはプライマー特異的ＰＣＲを包含し、これはＤＮＡ合成の選択的プライミングを可能にするよう設計された合成オリゴヌクレオチドを利用する。Ｌａｒｄｅｒ，Ｂ．Ａ．ら、ＡＩＤＳ　５、１３７−１４４（１９９１）；Ｒｉｃｈｍａｎ，Ｄ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６４、１０７５−１０８１（１９９１）；Ｇｉｎｇｅｒａｓ，Ｔ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６４、１０６６−１０７４（１９９１）を参照されたい。プライマー配列が３’橋で標的配列（野性型もしくは突然変異体）に合致する場合にのみ、標的配列の増幅が可能であり、そしてＤＮＡフラグメントが産生される。プライマー配列の知識は、該プライマー配列により包括される領域についてのみならず検討中のウイルス単離物の配列を推察することを可能にする。他のハイブリダイゼーションに基づくアッセイは、ディファレンシャルハイブリダイゼーション（Ｅａｓｔｍａｎ，Ｐ．Ｓ．ら、Ｊ．Ａｃｑ．Ｉｍｍ．Ｄｅｆ．Ｓｙｎｄｒ．Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．９、２６４−２７３（１９９５）；Ｈｏｌｏｄｎｉｙ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９、３５１０−３５１６（１９９５）；Ｅａｓｔｍａｎ，Ｐ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．３３、２７７７−２７８０（１９９５）。）；ラインプローブアッセイ（Ｌｉｎｅ　Ｐｒｏｂｅ　Ａｓｓａｙ）（ＬｉＰＡＪ　ＨＩＶ−１１　ＲＴ、インノジェネティックス（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ））（Ｓｔｕｙｖｅｒ，Ｌ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐ．４１、２８４−２９１（１９９７）。）；およびジーンチップ［ＧＥＮＥＣＨＩＰ］（商標）技術（アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ））（Ｄ’Ａｑｕｉｌａ，Ｒ．Ｔ．Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎｏｓｔ．Ｖｉｒｏｌ．３、２９９−３１６（１９９５）；Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ　３６４、５５５−５５６（１９９３）；Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ　２２７、３９３−３９５（１９９７）を包含する。他方、ＤＮＡ配列決定アッセイは、配列決定された領域の全ヌクレオチドに関する情報を提供する。標的配列がＰＣＲにより増幅される。配列決定の結果は、野性型の参照配列に比較してのプロテアーゼ遺伝子および逆転写酵素遺伝子中の位置のアミノ酸変化として報告してよい。遺伝子型分類報告中に包含される変化は、薬物耐性に関連する多形を明示することが既知の位置の突然変異に制限されてよい。薬物耐性と関連しない位置の多形は必要とされない。
【００２８】
表現型分類アッセイは、野性型の感受性参照ウイルスと比較した、特定の阻害剤の存在下で成長する複製するウイルスの能力を測定する。結果として、これらのアッセイは、特定の阻害剤に対するウイルスの耐性もしくは感受性の程度を直接測定する。応用可能な表現型分類アッセイは、限定されるものでないが：臨床的ＨＩＶ−１単離物中のウイルスの薬物耐性の決定のための最初に標準化されたアッセイであったＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）ｐ２４抗原アッセイ（Ｊａｐｏｕｒ，Ａ．Ｊ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３７、１０９５−１１０１（１９９３）；Ｋｕｓｕｍｉ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６、８７５−８８５（１９９２）；ならびに、ＲＴ阻害剤に対する表現型の耐性を評価することの一代替手段として最初に記述された組換えウイルスアッセイ（ＲＶＡ）（Ｋｅｌｌａｍ，Ｐ．とＬａｒｄｅｒ，Ｂ．Ａ．、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３８、２３−３０（１９９４）；およびＰａｕｗｅｌｓ，Ｒ．ら、２ｎｄ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　ｏｎ　ＨＩＶ　Ｄｒｕｇ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，イタリア・レイク・マジョーレ、要旨集　５１（１９９８）を挙げることができる。
【００２９】
遺伝子型分類アッセイで真実であるとおり、組換えウイルスアッセイは、ＰＣＲによってのウイルスの標的配列の増幅で開始する。アンプリコンが、欠失されたアンプリコン中に存在するものに相同な配列をもつプロウイルスの実験室クローンに組み込まれる。これはキメラウイルスのストックを生成させる。該ウイルスを、多様な濃度の薬物の存在下で成長するそれらの能力について試験する。結果は、各阻害剤についてのＩＣ５０値を計算することにより、およびμＭ濃度で表されるＩＣ５０値として結果を報告することにより、もしくは同時に試験された野性型の感受性の実験室ウイルスについて見出されたＩＣ５０値に対するキメラウイルスについて見出されたＩＣ５０値の比をコンピュータ計算することにより得る。後者の場合には、耐性は野性型の感受性ＨＩＶ−１株に比較した「耐性の倍数（ｆｏｌｄ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）」として表される。個体の試験のための大量の試験および短い応答時間に対する必要性に合致するために、最新の世代の表現型分類アッセイはさらなる改変を受けた。感受性試験のためのレポーター遺伝子系の使用は、実験室の自動化および標準化の実施を可能にする。Ｐａｕｗｅｌｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　２０、３０９−３２１（１９９８）；Ｐａｕｌｏｕｓ，Ｓ．ら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　ｏｎ　ＨＩＶ　Ｄｒｕｇ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ａｎｄ　Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ，米国フロリダ州セントピーターズバーグ、要旨集　４６（１９９７）；およびＤｅｅｋｓ，Ｓ．Ｇ．ら、２ｎｄ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　ｏｎ　ＨＩＶ　Ｄｒｕｇ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，イタリア・レイク・マジョーレ、要旨集　５３（１９９８）を参照されたい。
【００３０】
アンチヴァイログラム［Ａｎｔｉｖｉｒｏｇｒａｍ］（商標）アッセイ（ビルコ（Ｖｉｒｃｏ））（国際特許出願第ＷＯ　９７／２７４８０号明細書）は、ｇａｇ／ＰＲ／ＲＴ配列について相応して欠失されたプロウイルスＨＩＶ−１クローン中への患者由来のＨＩＶ−１　ｇａｇ／ＰＲ／ＲＴ配列の相同的組換えに基づく。Ｐａｕｗｅｌｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　２０、３０９−３２１（１９９８）を参照されたい。類似のアッセイ（フェノセンス　ヴァイロロジック（Ｐｈｅｎｏｓｅｎｓｅ　ＶｉｒｏＬｏｇｉｃ））は、欠失されたＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子中に挿入された指標遺伝子ルシフェラーゼを担持する、対応して欠失されたプロウイルスベクター中への患者由来のＰＲ／ＲＴ配列の酵素的連結に基づく。Ｄｅｅｋｓ，Ｓ．Ｇ．ら、２ｎｄ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　ｏｎ　ＨＩＶ　Ｄｒｕｇ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，イタリア・レイク・マジョーレ、要旨集　５３（１９９８）、Ｈｅｒｔｏｇｓら　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４４（３）５６８−５７３（２０００）（それらの開示は引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００３１】
要約するために、ハイスループットの表現型分類および遺伝子型分類アッセイの開発は、３０，０００を越える臨床単離物の表現型の耐性のデータおよび遺伝子型配列を含有するデータベースの確立を可能にした。データベースの相関的データ分析および突然変異クラスター分析は、付随する耐性を伴う突然変異パターンについての検索を可能にする。その一例は事実上の表現型分類である（ＰＣＴ／ＥＰ０１／０４４４５号明細書を参照されたい）。
【００３２】
一態様において、遺伝子型および表現型の情報に基づき処置薬の耐性の発生もしくは感受性を正確に予測するための、また、処置薬の耐性の遺伝子的基礎を正確に定義するためのニューラルネットワークを使用することができる。（２０００年６月８日出願の米国特許出願第０９／５８９，１６７号明細書、ＰＣＴ／ＥＰ０１／０６３６０号明細書（それらの開示は引用することによりそっくりそのまま本明細書に明らかに組み込まれる）を参照されたい）。
【００３３】
下の表１は、抗レトロウイルス薬物での処置後の臨床単離物中に出現する最も普遍的に発生する耐性と相互に関連付けられた突然変異のいくつかを列挙する。
【００３４】
【表１】
2004512032.tif 000002
【００３５】
本発明は、限定されるものでないが、多剤耐性突然変異に加えてプロテアーゼ阻害剤および逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ、ＮｔＲＴＩおよびＮＮＲＴＩ）に対する耐性を賦与する突然変異を上げることができる、いずれかの型のＨＩＶ処置治療に対する耐性に関連付けられる突然変異を企図する。
【００３６】
一態様において、本発明はプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）に対する耐性を賦与する突然変異を企図する。表１は全部のＰＩについての突然変異の２つのカテゴリー、すなわち一次および二次突然変異を列挙する。一次突然変異は特定の薬物に対する耐性の発生の主要な寄与体（ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｒ）であるかもしれない。二次突然変異は、処置の経過の間に後に出現しかつまた耐性にもつながるか、もしくはＰＩ投与を受けたことのないウイルス単離物中に天然の多形として既に存在するかのいずれかである。多数の二次突然変異は、同時に数種のＰＩ阻害剤に対する耐性を高める。これは、この分類の阻害剤に対する広範な交差耐性につながるかもしれないが、とは言えそれらの二次突然変異の微妙な多様な表現型の影響が存在するかもしれない。
【００３７】
理論に関して制限されることなく、プロテアーゼ遺伝子中で発生する突然変異は、プロテアーゼによるポリタンパク質の切断効率を損なうかもしれない。突然変異されたプロテアーゼによる部位のより効率的な切断を可能にする補償突然変異が、ｇａｇ切断部位で見出された。ＰＩ耐性と相互に関連付けられる突然変異を獲得した、プロテアーゼで処置された患者からの臨床単離物のいくつかの研究は、ｇａｇ　ｐ７／ｐ１および／もしくはｐ１／ｐ６部位での突然変異が突然変異体ウイルスの複製効率を有意に上昇させたことを示した。
【００３８】
本発明の実施内での他の突然変異は、ＮＲＴＩおよびＮＮＲＴＩに対する耐性を賦与するかもしれない。例えば、ＮＲＴＩジドブジンに対する耐性を典型的に賦与する突然変異は、Ｍ４１Ｌ、Ｄ６７Ｎ、Ｋ７０Ｒ、Ｌ２１０Ｗ、Ｔ２１５ＹおよびＫ２１９Ｑである。ＨＩＶ−１逆転写酵素中の複数の突然変異もまた、ジドブジンおよび他のＮＲＴＩに対する高レベルの耐性を賦与するかもしれない。複数の突然変異は、存在する場合に相乗的に作用するかもしれず、そして、感受性は、耐性と相互に関連付けられる突然変異の数が増大する際に低下する。例えば、ジダノシンに対する耐性と相互に関連付けられる突然変異はＬ７４Ｖ、Ｋ６５Ｒである。ラミブジンに対する耐性もまた、突然変異Ｍ１８４ＶおよびＭ１８４Ｉの出現と相互に関連付けられ、これらはジダノシンおよびザルシタビンに対する低レベルの耐性に加えて非常に高い耐性レベルを賦与する。ラミブジンに対する低レベルの耐性はまた１８４突然変異の非存在下でも存在するかもしれない一方、アバカビルに対する耐性は突然変異Ｋ６５Ｒ、Ｌ７４Ｖ、Ｙ１１５ＦおよびＭ１８４Ｖと相互に関連付けられる。
【００３９】
本発明の別の態様は、多剤耐性突然変異（ＭＤＲ）、およびとりわけＮＲＴＩに対するＭＤＲに関する。例えば、ＲＴの突然変異群、Ａ６２Ｖ、Ｖ７５Ｔ、Ｆ７７Ｌ、Ｆ１１６ＹおよびＱ１５１Ｍは、一緒になって全部のヌクレオシド類似物に対する耐性を引き起こす。
【００４０】
非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）に対する耐性を賦与する突然変異もまた本発明により企図される。例えば、ネビラピンについて耐性と相互に関連付けられる突然変異はＡ９８Ｇ、Ｌ１００Ｉ、Ｋ１０３Ｎ、Ｖ１０６Ａ、Ｖ１０８Ｉ、Ｙ１８１Ｃ／Ｉ、Ｙ１８８ＣおよびＧ１９０Ａである。これらの突然変異は、デラビルジンについてＫ１０３／Ｎ／Ｔ、Ｙ１８１ＣおよびＰ２３６Ｌであり、また、エファビレンズに対する耐性については、該突然変異はＬ１００Ｉ、Ｋ１０１Ｅ、Ｋ１０３Ｎ、Ｖ１０８Ｉ、Ｖ１７９Ｄ、Ｙ１８１ＣおよびＹ１８８Ｌである。
【００４１】
本発明の別の局面は復帰突然変異に関する。例えば、Ｍ１８４Ｖラミブジン耐性突然変異は、ジドブジン耐性突然変異Ｍ４１ＬおよびＴ２１５Ｙの影響を減少させる一方、Ｌ７４Ｖジダノシン耐性突然変異は、ジドブジン耐性突然変異Ｔ２１５Ｙの影響を減少させる。しかしながら、記述される復帰効果が表現型的に有意であるかどうかは、存在する突然変異の組合わせに依存するかもしれない。
【００４２】
別の態様において、突然変異は阻害剤に対する感受性を増大させるかもしれない。例えば、デラビルジン突然変異Ｐ２３６Ｌは、ネビラピンによる阻害に対するこの突然変異体の感受性を増大させ、また、ラミブジン耐性突然変異Ｍ１８４Ｖは、非突然変異体配列より上の、アデフォビルおよびＰＭＰＡに対する増大された感受性を引き起こす。この増大された感受性は、高められた処置の転帰に反映されると思われる。
【００４３】
本発明の実施内のＨＩＶ−１逆転写酵素の新規突然変異（表２）およびそれらの相互に関連付けられる表現型の薬物耐性は、限定されるものでないが表２に示されるものを挙げることができる。
【００４４】
【表２】
2004512032.tif 000003
【００４５】
表２中の単一の突然変異もしくは突然変異のいずれかの組合わせの存在が、ｄ４Ｔまたは相互に関連付けられた分類からの１種もしくはそれ以上の他の処置に対する耐性を賦与するかもしれない。さらに、本明細書に記述されるもののようなツールを使用する場合、同定された突然変異およびある分類の処置に対する相互に関連付けられる突然変異を取得するかもしれない。従って、本発明はまた、相互に関連付けられた分類の薬物で武装された、列挙された突然変異および突然変異の新たな組みわせを、付加的なＰＩ、ＮＲＴＩ、ＮＮＲＴＩに対する耐性もしくはＭＤＲ耐性のような新たな耐性の表現型を予測するのに使用することができることを提供する。加えて、突然変異の組合わせの存在は、同一のもしくは異なる薬物耐性の特徴を賦与するかもしれない。
【００４６】
本発明はまた、本発明の相関の使用方法にも引き寄せられる。一態様において、本発明は：ＨＩＶ逆転写酵素中の最低１種の突然変異の存在と逆転写酵素阻害剤（ＲＴＩ）に対する最低１種の株のＨＩＶの耐性；もしくはＨＩＶプロテアーゼ中の最低１種の突然変異の存在とプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）に対する最低１種の株のＨＩＶの耐性、の間の相関を含んで成るデータベースを提供する。
【００４７】
さらなる一態様において、該データベースは、処置プログラムの開発または適切なＨＩＶ治療もしくは併用治療の決定において医師を補助するかもしれない。例えば、バーチャルフェノタイプ［ＶｉｒｔｕａｌＰｈｅｎｏｔｙｐｅ］（商標）アッセイ系はＨＩＶ−１薬物耐性をモニタリングするための診断ツールである。該系は、抗ＨＩＶ−１薬物の臨床試験における耐性の発生を研究するため、ＨＩＶ−１に感染した患者の改善された臨床管理のため、および薬物耐性の疫学的局面を研究するために使用することができる。それは、抗レトロウイルス薬物に曝露されていたもしくは薬物耐性ＨＩＶ−１株に感染している患者の血漿中を循環するＨＩＶ−１集団の薬物感受性の迅速な決定を見込む。
【００４８】
本発明はまた、患者由来のＨＩＶ−１遺伝物質の遺伝子配列の決定、および抗ウイルス薬物耐性の可能な存在に関して該患者のＨＩＶ株で見出される配列の変異の解釈を１試験に組合わせる、バーチャルフェノタイプ［ＶｉｒｔｕａｌＰｈｅｎｏｔｙｐｅ］（商標）で使用されるもののような方法を使用するＨＩＶ−１薬物耐性のモニタリング方法も提供する。一態様において、多様なヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、ジドブジン（ＡＺＴ）、ジダノシン（ｄｄＩ）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、スタブジン（ｄ４Ｔ）、ラミブジン（３ＴＣ）およびアバカビル、ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤アデフォビル（ＰＭＥＡ）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤ネビラピン、デラビルジンおよびエファビレンズ、ならびにプロテアーゼ阻害剤サキナビル、リトナビル、インジナビルおよびネルフィナビルに対する耐性に関連する突然変異が評価される。
【００４９】
ＨＩＶ−１薬物耐性のモニタリング方法はまた、ウイルス単離物の表現型の薬物耐性試験と組合わせでも使用してよい。例えば、一態様において、患者のウイルスＲＮＡから単離かつ増幅されるプロテアーゼ（ＰＲ）および逆転写酵素（ＲＴ）遺伝子配列より構成されるキメラＨＩＶ−１株の構築に基づく表現型試験が利用される。これらの株はその後、それからＰＲ／ＲＴ遺伝子配列が欠失された標準的な実験室の同質遺伝子（ＨＸＢ２）ＨＩＶ−１　ＤＮＡ構築物とＣＤ４＋　Ｔ細胞の内側で組換えてよい。その後、該組換え株を、上で挙げられた抗ウイルス薬物の存在下で成長させてよく、そして、ウイルス単離物の感受性を、野性型の実験室参照株に対する該薬物のＩＣ５０を上回る患者単離物に対する該薬物のＩＣ５０の変化の倍数の値として表してよい。
【００５０】
一態様において、試験されるべきサンプルを患者から調製し、そして、遺伝子型アッセイを、自動化された集団に基づく完全な配列分析（ＡＢＩ）により実施する。従って、使用される配列決定法は、配列決定される領域の全ヌクレオチドに関する情報を提供するかもしれない。配列決定の結果は、野性型の参照配列に比較したプロテアーゼ遺伝子および逆転写酵素遺伝子中の位置のアミノ酸変化として報告してよい。遺伝子型分類報告中に包含される変化は、薬物耐性に関連する多形を明示することが既知の位置の突然変異に限定してよい。薬物耐性と関連しない位置の多形は必要とされない。
【００５１】
なおさらなる一態様において、配列決定された患者ウイルスの領域、該試験により検出された突然変異、および／もしくは得られた証拠の解釈を示す報告が生成されるかもしれない。該解釈は、抗レトロウイルス薬物、既知の耐性に関連する突然変異が同定されている薬物（１種もしくは複数）、および／または観察された突然変異が該薬物に対する耐性をどの程度暗示するかを包含してよい。
【００５２】
相互に関連付けられた遺伝子型および表現型の知識は、新たな化合物についてのウイルスの標的に関する触媒部位の知識と一緒になって、新たな分子の構築およびＨＩＶに対する新たな（併用）処置の実施を調整するためにもまた利用してよい。
【００５３】
別の態様において、本発明は：ＨＩＶに感染した患者からサンプルを収集すること；および、該サンプルが、最低１種の突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素もしくは最低１種の突然変異を有するＨＩＶプロテアーゼをコードする最低１種の核酸を含んで成るかどうかを決定することを含んで成る、ＨＩＶに感染した患者の抗レトロウイルス治療の有効性の評価方法に引き寄せられる。サンプルは、血漿サンプル、血液細胞もしくは他の組織であってよい。さらに、本発明は、ＨＩＶの遺伝子型耐性診断を改善する潜在能力を有し、そして、原則として、より良好な治療につながりかつある条件下では生命を救う可能性さえある。
【００５４】
さらなる一態様において、本発明はＮＮＲＴＩもしくはＮＲＴＩ耐性ＨＩＶに対し有効な薬物の同定もしくは設計方法を提供し、該方法は：最低１種の突然変異を含有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含んで成る最低１種の株のＨＩＶを提供すること、および薬物に対する該ＨＩＶ株の表現型の応答を決定すること、の段階を含んで成る。なおさらなる一態様において、本発明はＰＩ耐性株のＨＩＶに対し有効な薬物の同定方法を提供し、ここで該株のＨＩＶは、最低１種の突然変異を含有するＨＩＶプロテアーゼ、および前記薬物に対する前記株のＨＩＶの表現型の応答を決定することを含んで成る。本発明はまたＨＩＶ単離物の耐性の解釈にも有用である。それはまたＨＩＶの完全な配列分析でも使用することができる。加えて、本発明は、ハイブリダイゼーションに基づくＨＩＶ分析のため、もしくは薬物の設計、開発、試験およびマーケッティングにおける応用を有する。さらなる一態様において、本発明は本発明の方法により設計される薬物を包含する。
【００５５】
本発明はまた、最低１種のＮＮＲＴＩもしくは最低１種のＮＲＴＩに対する耐性と、上述された最低１種の突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素の存在を相互に関連付けること、または最低１種のＰＩに対する耐性と、最低１種の突然変異を有するＨＩＶプロテアーゼの存在を相互に関連付けることを含んで成る、ＨＩＶに感染した患者を処置するための治療の設計方法も提供する。
【００５６】
本発明の比較突然変異の同定は、改善された抗レトロウイルス薬物処置プログラムにつながるかもしれない。上で概説されたとおり、薬物治療に対する乏しいウイルス学的応答が、１種、数種、もしくは最悪の場合には全部の利用可能な抗レトロウイルス薬物に対する遺伝子型および／もしくは表現型のウイルス耐性の存在と相互に関連付けられるかもしれないことを立証する十分な証拠が存在する。結果として、本発明の相関を使用する耐性試験は、血漿ウイルス負荷量を低下させるためにもはや貢献しない薬物を同定するためのツールとして使用してよい。
実施例
実施例１。ＨＩＶ−１逆転写酵素中の突然変異パターンの同定および相互に関連付けられる表現型の耐性。
【００５７】
血漿サンプルを、欧州および米国の慣例の臨床実施から、ＨＩＶ−１に感染した個体から得、そしてドライアイス上で実験室に発送し、そして分析まで−７０℃で保存した。表現型分析は組換えウイルスアッセイを使用して実施した。Ｋｅｌｌａｍ，Ｐ．とＢ．Ａ．Ｌａｒｄｅｒ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ　Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ　３８：２３−３０（１９９４）；Ｈｅｒｔｏｇｓ，Ｋ．ら、Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２６９−２７６（１９９８）を参照されたい。簡潔には、プロテアーゼ（ＰＲ）および逆転写酵素（ＲＴ）のコーディング配列を、ＨＩＶ−１特異的プライマーを用いて患者由来のウイルスＲＮＡから増幅した。ＰＲ−ＲＴが欠失されたプロウイルスクローン中へのアンプリコンの相同的組換えの後に、生じる組換えウイルスを収穫し、力価測定し、そして抗レトロウイルス薬物に対するインビトロ感受性試験に使用した。この分析の結果は、参照の野性型ウイルス単離物（ＩＩＩＢ／ＬＡＩ）で試験された場合に得られた特定の薬物のＩＣ５０の平均（μＭ）に関する、患者由来の組換えウイルス単離物で試験された場合の同一の薬物のＩＣ５０の平均（μＭ）の増大の倍数を反映する、耐性の倍数の値として表した。
【００５８】
遺伝子型分析は、自動化された集団に基づく完全な配列分析（ＡＢＩ）により実施した。遺伝子型分析の結果は、野性型（ＨＸＢ２）参照配列に比較した逆転写酵素遺伝子に沿った位置のアミノ酸変化として報告する。バーチャルフェノタイプ［ＶｉｒｔｕａｌＰｈｅｎｏｔｙｐｅ］（商標）インタープリテーショナル（ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎａｌ）によるクラスター分析は、臨床単離物の遺伝子配列を含有するデータベース中での突然変異パターンの発生の検出、および同一の単離物の対応する耐性の特徴との関連を可能にした。（ＰＣＴ／ＥＰ０１／０４４４５号明細書を参照されたい）
モデル化研究のため、突然変異を、クイックチェンジ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）Ｊ部位特異的突然変異誘発キット、ストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）７、ストラタジーン　クローニング（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）システムズ、米国カリフォルニア州ラホヤを使用して、野性型の実験室ＨＩＶ−１株、ＨＸＢ２のＲＴ遺伝子中で生成させた。
臨床単離物の分析
表３は、多様なレベルのジドブジン（ＺＤＶ）およびラミブジン（３ＴＣ）に対する表現型の耐性を伴う臨床単離物中のＲＴ中の突然変異４４Ｄ／Ａ、１１８Ｉ、１８４Ｖ、２１５Ｙおよび４１Ｌの頻度を報告する。ここで記述される突然変異体単離物は臨床単離物のプールから引き出した。
【００５９】
表３は、多様なレベルのジドブジン（ＺＤＶ）およびラミブジン（３ＴＣ）に対する表現型の耐性を伴う臨床単離物中のＲＴ中の突然変異４４Ｄ／Ａ、１１８Ｉ、１８４Ｖ、２１５Ｙおよび４１Ｌの頻度を報告する。ここで記述される突然変異体単離物は臨床単離物のプールから引き出した。
【００６０】
【表３】
2004512032.tif 000004
【００６１】
ＺＤＶおよび３ＴＣ双方に対し感受性である単離物（ＷＴ）（ｎ＝１９５）：上に列挙された６種の突然変異のいずれかの頻度は低かった。
【００６２】
ＺＤＶに対し耐性である単離物（＞１０倍、ｎ＝２２０）：表３は、ＺＤＶ耐性と相互に関連付けられる突然変異２１５Ｙ、４１Ｌおよび７０Ｒが、この範疇および全部の３ＴＣ耐性の範疇全体で頻度が高かったことを示す。突然変異１８４Ｖは高耐性の３ＴＣ分類（＞５０倍）で優勢の突然変異であった一方、１８４Ｖは中間の３ＴＣ耐性群でまれであり、また、低レベル耐性群および３ＴＣ感受性群には存在しなかった。突然変異４４Ｄ／Ａおよび１１８Ｉは全部の３ＴＣ耐性の範疇に存在した。
【００６３】
３ＴＣに対し耐性である単離物（＞１０倍、ｎ＝２９５）：表３は、高レベルの３ＴＣ耐性と相互に関連付けられる突然変異１８４Ｖの頻度が、全部のＺＤＶ耐性の範疇（低、中間および高）で高く、また、ＺＤＶ感受性および中間の耐性の群で優勢の突然変異であったことを示す。ＺＤＶに対する耐性が増大した際に、ＺＤＶ耐性と相互に関連付けられる突然変異４１Ｌ、７０Ｒおよび２１５Ｙの頻度も増大した一方、突然変異１８４Ｖの頻度は減少した。突然変異４４Ｄ／Ａおよび１１８Ｉはまた、ＺＤＶに対する耐性が増大した際に頻度も実質的に増大した。
【００６４】
該結果は、これまでのところ、３ＴＣに対する低いおよび中間の耐性は突然変異１８４Ｖの存在に関係しなかったことを示す。実際、この突然変異はこれらの分類において実施上存在しなかった。表３は、突然変異４４Ｄ／Ａおよび１１８Ｉが、ＺＤＶ耐性突然変異２１５Ｙ、４１Ｌおよび７０Ｒの存在下でのみ高頻度で存在したことをさらに示す。ＺＤＶに対し感受性であった単離物において、３ＴＣ耐性が１０倍より大きかったとしても、ＺＤＶ耐性と相互に関連付けられる突然変異の頻度は低くかつ４４Ａ／Ｄおよび１１８Ｉもまたまれであった。この群では、１４８Ｖの高頻度が３ＴＣに対する耐性を説明した。
部位特異的突然変異誘発により生成された突然変異体の分析
表４は、多様な突然変異体を薬物感受性アッセイで試験した場合に得られた耐性の倍数の値と一緒に、野性型のＨＸＢ２の背景に導入されたコドン変化を示す。突然変異１８４Ｖを担持する全６種の突然変異体が３ＴＣに対し高度に耐性であった。それらのうち２種が４４Ｄ／Ａおよび１１８Ｉ双方を担持した一方、１種（ＳＤＭ２３）を除いて全部がＺＤＶ耐性と相互に関連付けられる突然変異を担持した。
【００６５】
【表４】
2004512032.tif 000005
【００６６】
突然変異体の全部は予測されたＺＤＶ耐性もしくは感受性パターンに従った。同時に、３種の突然変異がコドン４４での変化を、３種がコドン１１８での変化を、そして３種がコドン４４および１１８双方での変化を伴い生成された。これら３群のそれぞれ内で、２種の突然変異体はＺＤＶに対する耐性と関連付けられる位置の変化もまた担持した一方、１種の突然変異体はそれらのコドンが野性型のままであった。表４に列挙された薬物耐性の値は、コドン４４および１１８での突然変異の存在は、単独でもしくは一緒に、突然変異１８４Ｖにより引き起こされる３ＴＣに対する高い耐性（＞６２倍）と識別可能な、３ＴＣに対する中間の耐性（８ないし３２倍）を引き起こす可能性があることをはっきりと示す。さらに、３ＴＣに対する中間の耐性は、位置４４および／もしくは１１８の突然変異がＺＤＶ耐性の背景（４１Ｌ、６７Ｎ、２１０Ｗ、２１５Ｙ）で起こった場合にのみ観察された一方、突然変異１８４Ｖにより引き起こされる耐性は、明らかにＺＤＶ耐性に関係しなかった。
臨床サンプル中でのＲＴの位置４４もしくは１１８の変化の存在と抗レトロウイルス治療との間の関係
表４から推論することができるとおり、位置４４および１１８の変化は、Ｍ１８４Ｖ置換を伴いもしくは伴わずにウイルスサンプル中に存在するかもしれないが、しかし、それらはＺＤＶ耐性とともにサンプル中により高い発生率で出現した。従って、４４Ｄもしくは１１８Ｉを含有したＨＩＶ単離物を伴う患者に投与された抗レトロウイルス処置を見ることは興味深かった。われわれは、抗レトロウイルス歴が入手可能であった患者から発する４４Ｄを伴う８６サンプルおよび１１８Ｉを伴う８８サンプルのサブセットを同定した。処置歴によるこのサブセットから４４もしくは１１８の変化の発生率に関する結論を引き出すことは可能でなかったとは言え、これは無作為化試験でなかったため、この分析は、にもかかわらず、これらの位置での突然変異につながるかもしれない条件に何らかの光をあてた。
【００６７】
４４Ｄのサブセットについて、５０／８６サンプルは、サンプル日にラミブジンを受領していた患者から発し、そしてこのサブセット中の５例の患者は、サンプル日前かつサンプル日まで３ＴＣを決して受領していなかった。全５例の患者がいずれかの時点でジドブジン／ジダノシンを受領しており、また、全ＨＩＶ単離物は位置１８４で野性型であった。ジドブジン処置経験は、歴史的理由上期待されるとおり広範囲であった。１例の患者を除く全例が、他のＮＲＴＩと組合わせでジドブジンを受領したことがあり、また、７０／８６例は過去にジドブジン単剤治療もまた受領していた。ジドブジン投与を受けたことがないことが報告された１例の患者は、スタブジンを受領したことがあった。このサンプルは４１Ｌおよび２１５Ｙを含有した。
【００６８】
１１８Ｉサブセットについての結果は、５５／８８サンプルがサンプル日にラミブジンを服用していた患者から発し、そして２例の患者はラミブジンを決して受領していなかった（双方はジドブジンおよびジダノシンを受領していた）ため、同様であった。大部分の患者（８３／８８例）は他のＮＲＴＩと組合わせでジドブジンを受領しており、また、７０例はジドブジン単剤治療もまた受領していた。５／８８例のジドブジンを投与されたことがない患者はスタブジンを受領していた。数例の患者について、４４Ｄもしくは１１８Ｉの進化を示す連続的サンプルが入手可能であった。
【００６９】
これらの結果は、ＨＩＶ−１　ＲＴ中の突然変異Ｅ４４Ｄ／ＡおよびＶ１１８Ｉが、それらがＺＤＶ耐性の背景を所有する臨床単離物中で発生する場合に３ＴＣに対する低ないし中間レベルの耐性を賦与することを示す。遺伝子型でおよび表現型で特徴づけられた臨床単離物のクラスター分析、ならびに部位特異的突然変異誘発実験からの結果は、実際にコドン４４および１１８の突然変異が、ＺＤＶ耐性と相互に関連付けられる突然変異が存在するという制限を伴い、３ＴＣに対する低および中間レベルの耐性と相互に関連付けられることを確認する。加えて、処置歴が入手可能でありかつ以前のＺＤＶ曝露が徹底的であることが示された臨床サンプルの分析は、突然変異４４Ｄ／Ａおよび１１８ＩがＺＤＶ突然変異の情況で出現したため、われわれの大量の臨床データの組から得られた結果を確認した。
【００７０】
突然変異４４Ｄ／Ａおよび１１８Ｉはそれぞれ、３ＴＣに対する耐性を独立に生成させることが可能である。部位特異的突然変異誘発を用いた実験は、３ＴＣ耐性に対するそれらの表現型の影響に関して、２種の突然変異体の間の相乗効果の存在を示さない。
実施例２。ＨＩＶ−１の複数のヌクレオシド耐性の遺伝子的基礎の決定
８９２種のＨＩＶ−１サンプルを、標準的な組換えに基づく表現型アッセイを使用して、およびＤＮＡ配列分析により、処置に失敗する患者からのわれわれの耐性データベース中で調査した。複数のヌクレオシド耐性はＲＴコーディング領域中の複雑な突然変異パターンと相互に関連付けられた。血漿サンプルを、抗レトロウイルス治療を受領していた患者から得た。選択は、＞１０００コピーのＨＩＶ−１　ＲＮＡ／ｍｌに基づき、また、この研究の目的上、このレベルの血漿ＨＩＶ−１を伴う患者は処置に失敗しているとみなした。
【００７１】
ウイルスＲＮＡを、製造元の説明書に従ってキアアンプ［ＱＩＡＡＭＰ］（商標）ウイルスＲＮＡ抽出キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ・ヒルデン）を使用して２００μＬの患者血漿から抽出した。ｐｏｌ遺伝子の一部を包含するｃＤＮＡを、以前に記述されたとおりエキスパンド［Ｅｘｐａｎｄ］（商標）逆転写酵素（ベーリンガー　マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ））を使用して生じさせた。Ｈｅｒｔｏｇｓ　Ｋ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｎｏｔｈｅｒ．４２：２６９−２７６（１９９８）を参照されたい。その後、プロテアーゼおよびＲＴ領域をコードする２．２ｋｂのフラグメントを、記述された（同上）ところのＰＣＲプライマーおよび条件を使用するネステッドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。この遺伝物質をその後、表現型分類および遺伝子型分類双方の実験で使用した。
【００７２】
ＭＴ−４細胞（Ｈａｒａｄａ　Ｓ．ら　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９：５６３−５６６（１９８５）。）を、記述されたとおりに、ｐｏｌ遺伝子のＰＣＲ産物およびプロテアーゼ−ＲＴ欠失ＨＩＶ−１分子クローンｐＧＥＭ３＿ＰＲＴでコトランスフェクトした。Ｈｅｒｔｏｇｓ　Ｋ．ら　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｎｏｔｈｅｒ．４２：２６９−２７６（１９９８）を参照されたい。これは、ドナーのＰＣＲフラグメントからのプロテアーゼ／ＲＴを含有する生存可能な組換えウイルスをもたらした。ヌクレオシド類似物に対する表現型の感受性を、記述された（同上）ところのＭＴ−４細胞ウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）保護アッセイを使用して決定した。耐性の倍数の値は、患者の組換えウイルスについてのＩＣ５０の平均を野性型対照ウイルス（株ＨＸＢ２−Ｄ）についてのＩＣ５０の平均により割ることにより得た。患者血漿サンプルから得られたＰＣＲ産物を、ジデオキシヌクレオチドに基づく配列分析により遺伝子型分類した。サンプルは、ビッグダイ［ＢｉｇＤｙｅ］（商標）ターミネーターキット（アプライド　バイオシステムズ　インク（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）（ＡＢＩ））を使用して配列決定し、そしてＡＢＩ　３７７　ＤＮＡシークェンサーで分離した。
【００７３】
ＲＴのコーディング領域中の突然変異を、ＨＩＶ−１　ｐｏｌ遺伝子を包含する野性型ＨＸＢ２−Ｄ　ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ制限酵素フラグメントの部位特異的突然変異誘発により創製し、そしてｐＧＥＭ３（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））中にクローン化した。単一および複数のヌクレオチド変化を、エクサイト［ＥｘＳｉｔｅ］（商標）突然変異誘発キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））に導入した。全部の突然変異体クローンを、ＲＴ全体のＤＮＡ配列分析により確認した。ＰＣＲフラグメントを、突然変異されたクローンから調製し、そして換えられたＲＴコーディング領域を、上述されたところの相同的組換えによりＨＩＶ−１　ＨＸＢ２−Ｄの遺伝子的背景に導入した。その後、ヌクレオシド類似物に対するこれらの組換えウイルスの感受性を、ＭＴ−４細胞ＣＰＥ保護アッセイ（同上）により決定した。
表現型の感受性分析
組換えウイルスアッセイ（アンチヴァイログラム［Ａｎｔｉｖｉｒｏｇｒａｍ］（商標））を使用して、ＡＺＴ、３ＴＣ、ｄ４Ｔ、ｄｄＩおよびｄｄＣに対するサンプルの感受性を同時に決定した。この分析から、３０２サンプルが、これらの阻害剤の最低４種に対する（野性型対照ウイルスに関して）ＩＣ５０の４倍もしくはそれ以上の増大を伴い同定された。従って、かなりの数のＭＤＲウイルスが該サンプル集団中に存在した。
複数のヌクレオシド耐性のサンプルの遺伝子型分析
遺伝子型分析を、ジデオキシヌクレオチド配列決定により全８９２サンプルで実施した。複数の突然変異の複雑なパターンが、ＭＤＲサンプルのＲＴコーディング領域で見られた。これらは、ＡＺＴおよび３ＴＣ耐性突然変異（とりわけ１８４Ｖ／Ｉを伴う４１Ｌ、６７Ｎ、２１０Ｗおよび２１５Ｙ）、ならびにコドン６９（Ｔ６９Ａ／Ｎ）および／もしくは７５（Ｖ７５Ｍ）の突然変異の組合わせを包含した。この分析は、ＭＤＲ群中のコドン１５１突然変異クラスターの発生を強調した。加えて、アミノ酸挿入およびコドン６７と７０の間の再配列の新規一ファミリーもまたＭＤＲ群中で優勢であった。これら２パターンの突然変異は、高レベルの表現型の複数のヌクレオシド耐性と相互に関連付けられ（図２）、２７サンプルはコドン１５１クラスターを有し、また、４５サンプルは挿入および再配列（典型的には、Ｔ６９Ｓ置換、次いで２アミノ酸の挿入）を有した。これらの多様な群についてのｄ４Ｔ、ｄｄＩおよびｄｄＣに対するＩＣ５０の増大の倍数の平均を図２に示す。この分析は、コドン６９挿入突然変異体が高程度のｄ４ＴおよびｄｄＣ耐性を有した（＞１０倍）ことを示し、これはコドン１５１クラスターでもまた見られた。しかしながら、ＡＺＴおよび３ＴＣ耐性突然変異ならびにＴ６９Ａ／ＮもしくはＶ１７５Ｍを伴うサンプルは、これらの薬物に対する控えめなレベルの耐性のみを示した（図２）。驚くべきことでなく、図２に示される全４群は、ＡＺＴおよび３ＴＣに対し高度に耐性であった（＞５００倍のＡＺＴ　ＩＣ５０の増大の倍数の平均および３ＴＣについて＞３０倍）。これは、多くのＭＤＲサンプルがＡＺＴ耐性（例えば４１Ｌ、６７Ｎ、２１０Ｗおよび２１５Ｙ）ならびに３ＴＣ耐性（Ｍｅｔ１８４Ｖ／Ｉ）を賦与する突然変異を含有したためであった。
ＲＴのコドン６７ないし７０領域で見られる多様な挿入のスペクトル
ＲＴのコドン６７ないし７０領域中の挿入の広範囲の多様性を表３に要約する。最大の群（ｎ＝１６）はＴ６９Ｓ置換、次いで２個のＳ残基の挿入を有した。次に最大の群（ｎ＝１０）もまたＴ６９Ｓ置換を、しかしこの場合はＳ−Ｇの異なる挿入を有した。６９Ｓｅｒの後に挿入された多数の異なる二重アミノ酸をもつサンプルもまた同定された。加えて、コドン６８と６９との間の２もしくは３アミノ酸の挿入もまた見られた。これらの挿入の位置はＴ６９およびＬ７０が連続的であったという事実に基づいた。いくつかのサンプルでは、共通の６７ＮのＡＺＴ耐性突然変異よりむしろコドン６７の置換（Ａ６７Ｇ／Ｓ／Ｇ）がまれに観察された。２サンプルでは、コドン７０の欠失が観察され（コドン６８と６９との間の３残基の挿入後）、また、挿入を伴わないＴ６９Ｓの単一置換が４サンプルで見られた（表３）。挿入された残基はコドン使用頻度に関していかなる明らかなパターンも示さなかった。例えば、Ｓ−Ｓ挿入はまれにＳ６９コドンの直接反復物であり、Ｓ６９の単純な反復はＲＴ中でのこれらの挿入の出現を説明することができなかったことを示唆した。
コドン６９の挿入に関する患者の治療パターン
コドン６９の挿入は常にＡＺＴ耐性突然変異の背景、とりわけＴ２１５Ｙ／Ｆに存在した。そのサンプルがこの研究で分析された患者の多くからの処置歴が、ＡＺＴ治療、次いでヌクレオシドおよびプロテアーゼ阻害剤を用いる併用治療の普遍的パターンを示した（データは示されない）ため、これは驚くべきでないかもしれない。図３は、３例の患者についての典型的な処置パターンを示し、ウイルス学的分析のために時間サンプルを得たことを示した。コドン６９の挿入を選択する原因であるヌクレオシド類似物（１種もしくは複数）を正確に決定することは、これらの処置歴から可能でなかった。患者１からの連続的サンプルは、３ＴＣ／ｄ４Ｔ併用治療の期間の間の６９Ｓ−［Ｓ−Ｓ］から６９Ｓ−［Ｓ−Ｇ］への興味深い推移を示した。
部位特異的突然変異誘発により構築されるＨＩＶ−１変異体の感受性分析
ＭＤＲウイルスと相互に関連付けられる観察された突然変異パターンの重要性を検討するために、われわれは、定義された遺伝子的背景（ＨＸＢ２−Ｄ）における特定の変化を伴う部位特異的突然変異誘発により一連のウイルスを構築した。ＡＺＴ突然変異の背景におけるＴ６９ＡもしくはＶ７５Ｍは、３ＴＣ、ｄ４Ｔ、ｄｄＩもしくはｄｄＣに対する耐性をほとんどもしくは全く賦与しなかった。単独もしくは２個のＡＺＴ耐性突然変異（２１０Ｗおよび２１５Ｙ）と一緒のいずれかの６９Ｓ−［Ｓ−Ｓ］を伴う変異体もまた構築した。加えて、また挿入と頻繁に相互に関連付けられる置換、Ａ６２の潜在的役割を、６９Ｓ−［Ｓ−Ｓ］および２１０Ｗ／２１５Ｙの背景にこの突然変異を追加することにより検討した。６種のヌクレオシド類似物についての感受性データを表４に要約する。これらのデータは、６９Ｓ−［Ｓ−Ｓ］挿入単独は、複数のヌクレオシド耐性を賦与しなかったことを示した。事実、このウイルスは３ＴＣに対する感受性の有意の減少のみを有した。対照的に、挿入物およびＡＺＴ耐性突然変異を伴う変異体は、ＡＺＴ、３ＴＣ、ｄ４Ｔ、ｄｄＣおよびアバカビル（４−［（２−アミノ−６−シクロプロピル−アミノ）−９Ｈ−プリン−９−イル］−２−シクロペンテン−１−メタノール、１５９２Ｕ８９）に対する減少された感受性を有し、６９の挿入およびＡＺＴ突然変異がＭＤＲの表現型を賦与したことを確認した。
実施例３：ｄ４Ｔに対するＨＩＶ−１の耐性の遺伝子的基礎を定義するための神経ネットワークの使用
３種の神経ネットワークモデル（９ＲＴ、２６ＲＴおよび６０ＲＴモデル）が、突然変異パターンがｄ４Ｔ耐性にどのように影響するかを検討するために開発された。９ＲＴモデルは、ｄ４Ｔ耐性（６２Ｖ、６９Ｄ、６９Ｎ、６９ＳＸＸ、７５Ｉ、７５Ｔ、７７Ｌ、１１６Ｙおよび１５１Ｍ）に関連するスタンフォード配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｉｖｂ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ）に列挙される９種の突然変異に基づいた。他のモデルは、ｄ４Ｔ耐性のサンプル中に存在する次の１７もしくは５１種のいずれかの最も頻度の高いＲＴ突然変異を追加することに基づいた。従って、２６ＲＴ突然変異モデルは、９ＲＴ突然変異モデル、およびｄ４Ｔ耐性サンプル中の１７種の最も頻度の高い突然変異を包含した。これら１７種の突然変異は、４１Ｌ、４４Ｄ、６７Ｎ、７０Ｒ、７５Ａ、７５Ｍ、１１５Ｆ、１１８Ｉ、１８４Ｖ、２０８Ｙ、２１０Ｗ、２１４Ｆ、２１５Ｆ、２１５Ｙ、２１９Ｅ、２１９Ｎおよび２１９Ｑであった。６０ＲＴ突然変異モデルは、２６ＲＴ突然変異モデル、およびｄ４Ｔ耐性サンプル中の３４種の次に最も頻度の高い突然変異よりなった。これら３４種の突然変異は、２０Ｒ、３５Ｉ、３９Ａ、４３Ｅ、６０Ｉ、６５Ｒ、１２２Ｋ、１２３Ｅ、１３５Ｔ、１６２Ｃ、１７７Ｅ、１９６Ｅ、２００Ａ、２０７Ｅ、２１１Ｋ、２２８Ｈ、２７２Ａ、２７７Ｋ、２８６Ａ、２９３Ｖ、２９７Ｋ、３２９Ｌ、３５６Ｋ、３５７Ｔ、３５８Ｋ、３５９Ｓ、３６０Ｔ、３７１Ｖ、３７５Ｖ、３７６Ａ、３８６Ｉ、３９０Ｒ、３９９Ｄおよび４００Ａであった。どの突然変異がこの改善された予測に寄与していたかを発見するために、改善されたサンプルＩＳ９−２６およびＩＳ９−６０を、試験の組での９−モデルおよび２６−モデルならびに９−モデルおよび６０−モデルの表現型の出力（ｏｕｔｐｕｔ）を比較することにより同定した。改善されたサンプルの対応する遺伝子型を収集かつ分析し、改善されたサンプルに含有された全部の余分の突然変異をスクリーニングし、そしてＩＳ９−２６およびＩＳ９−６０中で見出された各突然変異の頻度を計算し、そしてサンプル全体で見出されている突然変異のものと比較した。２つの頻度のより高い差異を伴う全突然変異を同定し、そしてｄ４Ｔに対する耐性の賦与においてある役割を演じているとみなした。本実施例では閾値頻度を９％に設定した。以下の突然変異を９−および２６−モデルから同定した。すなわち、４１Ｌ（４４％〜７９％）、４４Ｄ（１３％〜２６％）、６７Ｎ（３６％〜５６％）、７０Ｒ（２１％〜３０％）、１１８Ｉ（２１％〜３６％）、２１０Ｗ（３４％〜６５％）および２１５Ｙ（４４％〜８１％）。以下の突然変異を９−および６０−モデルから同定した。すなわち、４１Ｌ（４４％〜７３％）、６７Ｎ（３６％〜５６％）、１８１Ｉ（２１％〜３２％）、２１０Ｗ（３４％〜６２％）、２１１Ｋ（４９％〜５９％）および２１５Ｙ（４４％〜７４％）。結論として、これらの結果は、最低１７種のＲＴ突然変異（ここで同定された８種およびスタンフォード・データベースから上で同定された９種）が、ＡＺＴ耐性突然変異を包含するｄ４Ｔ耐性を賦与しているかもしれないことを示す。該結果は、また耐性を賦与しているかもしれない１０種の他の突然変異もまた同定した。すなわち、１８４Ｖ（３６％〜４２％）、２１４Ｆ（８８％〜９４％）、７５Ａ（０．７％〜０．６％）、７５Ｍ（４％〜８％）、１１５Ｆ（１％〜０．２％）、２０８Ｙ（１３％〜２１％）、２１５Ｆ（９％〜１１％）、２１９Ｅ（５％〜４％）、２１９Ｎ（４％〜１１％）および２１９Ｑ（１２％〜１６％）。
実施例４
耐性の増大の倍数の平均およびＨＩＶ逆転写酵素遺伝子配列中の１０１突然変異の影響の概観。耐性の増大の倍数は、野性型の参照実験室ＨＩＶ−１株についての薬物のＩＣ５０の平均に関する同一の薬物のＩＣ５０の平均の増大から計算する。突然変異の影響を、ネビラピン、デラビルジンおよびエファビレンズで検討した。結果は増大の倍数の平均およびその標準偏差として表す。
【００７４】
【表５】
2004512032.tif 000006
【００７５】
表５：位置１０１の逆転写酵素突然変異および逆転写酵素阻害剤に対する耐性に対するそれらの対応する影響の概観。データは、実験室参照株（ＷＴ）に比較した耐性の増大の倍数として表す。
実施例５
耐性の増大の倍数の平均およびＨＩＶ逆転写酵素遺伝子配列中の１０３突然変異の影響の概観。耐性の増大の倍数は、野性型の参照実験室ＨＩＶ−１株についての薬物のＩＣ５０の平均に関する同一の薬物のＩＣ５０の平均の増大から計算する。結果は増大の倍数の平均およびその標準偏差として表す。
【００７６】
【表６】
2004512032.tif 000007
【００７７】
表６：位置１０３の逆転写酵素突然変異および逆転写酵素阻害剤に対する耐性に対するそれらの対応する影響の概観。データは、実験室参照株（ＷＴ）に比較した耐性の増大の倍数の平均として表す。
実施例６
耐性の増大の倍数の平均およびＨＩＶ逆転写酵素遺伝子配列中の１８１突然変異の影響の概観。耐性の増大の倍数は、野性型の参照実験室ＨＩＶ−１株についての薬物のＩＣ５０の平均に関する同一の薬物のＩＣ５０の平均の増大から計算する。結果は増大の倍数の平均およびその標準偏差として表す。
【００７８】
【表７】
2004512032.tif 000008
【００７９】
表７：位置１８１の逆転写酵素突然変異および逆転写酵素阻害剤に対する耐性に対するそれらの対応する影響の概観。データは、実験室参照株（ＷＴ）に比較した耐性の増大の倍数として表す。
実施例７
耐性の増大の倍数の平均およびＨＩＶ逆転写酵素遺伝子配列中の１９０突然変異の影響の概観。耐性の増大の倍数は、野性型の参照実験室ＨＩＶ−１株についての薬物のＩＣ５０の平均に関する同一の薬物のＩＣ５０の平均の増大から計算する。結果は増大の倍数の平均およびその標準偏差として表す。
【００８０】
【表８】
2004512032.tif 000009
【００８１】
表８：位置１９０の逆転写酵素突然変異および逆転写酵素阻害剤に対する耐性に対するそれらの対応する影響の概観。データは、実験室参照株（ＷＴ）に比較した耐性の増大の倍数として表す。
実施例８。８４Ａ突然変異（背景において）によるプロテアーゼ阻害剤の耐性の増大の倍数
表９：耐性の増大の倍数の平均およびＨＩＶプロテアーゼ配列中の８４Ａ突然変異の影響の概観。耐性の増大の倍数は、野性型の参照実験室ＨＩＶ−１株についての薬物のＩＣ５０の平均に関する同一の薬物のＩＣ５０の平均の増大から計算する。
【００８２】
【表９】
2004512032.tif 000010
【００８３】
【表１０】
2004512032.tif 000011
【００８４】
【表１１】
2004512032.tif 000012
【００８５】
この表は、ＰＲ突然変異の背景における８４Ａ突然変異が、検討されたプロテアーゼ阻害剤に対する付加的影響を賦与することを例示する。これは、突然変異の複雑な背景においてさえ、８４Ａ突然変異がある影響を有することを示す。８４Ａ突然変異は８４Ｖと比較して異なった耐性の特徴を表し、そして、突然変異の存在のみならずしかしまた正確な正体もまた重要であることを教示する。
実施例９。８４Ｌ突然変異（背景において）によるプロテアーゼ阻害剤の耐性の増大の倍数
表１０　耐性の増大の倍数の平均およびＨＩＶプロテアーゼ配列中の８４Ｌ突然変異の影響の概観。耐性の増大の倍数は、野性型の参照実験室ＨＩＶ−１株についての薬物のＩＣ５０の平均に関する同一の薬物のＩＣ５０の平均の増大から計算する。
【００８６】
【表１２】
2004512032.tif 000013
【００８７】
サンプルの遺伝子型分類は、８４Ｌ突然変異が、同一の背景における８４Ｖ突然変異から得られた結果に比較してプロテアーゼ耐性に結び付けられることを表す。
実施例１０　８４Ｃ突然変異（および背景において）によるプロテアーゼ阻害剤の耐性の増大の倍数
表１１　耐性の増大の倍数の平均およびＨＩＶプロテアーゼ配列中の８４Ｃ突然変異の影響の概観。耐性の増大の倍数は、野性型の参照実験室ＨＩＶ−１株についての薬物のＩＣ５０の平均に関する同一の薬物のＩＣ５０の平均の増大から計算する。
【００８８】
【表１３】
2004512032.tif 000014
【００８９】
唯一の８４Ｃ突然変異はプロテアーゼ阻害剤に対する耐性を賦与する。８４Ｃ突然変異の出現はネルフィナビル耐性を暗示するが、しかしそれに制限されない。
実施例１１　５４Ｍ突然変異（背景において）によるプロテアーゼ阻害剤の耐性の増大の倍数
表１２：多様なプロテアーゼ突然変異の背景における５４Ｍ突然変異の影響およびプロテアーゼ阻害剤耐性に対するそれらの対応する影響。検討された化合物についての影響は、野性型の実験室ＨＩＶ株について決定されたＩＣ５０の平均に対するＩＣ５０の変化の倍数の平均として表す。
【００９０】
【表１４】
2004512032.tif 000015
【００９１】
【表１５】
2004512032.tif 000016
【００９２】
実施例１２　５４Ｌ突然変異（背景において）によるプロテアーゼ阻害剤の耐性の増大の倍数
表１３：多様なプロテアーゼ突然変異の背景における５４Ｌ突然変異の影響およびプロテアーゼ阻害剤耐性に対するそれらの対応する影響。検討された化合物についての影響は、野性型の実験室ＨＩＶ株について決定されたＩＣ５０の平均に対するＩＣ５０の変化の倍数の平均として表す。
【００９３】
【表１６】
2004512032.tif 000017
【００９４】
【表１７】
2004512032.tif 000018
【００９５】
実施例１３　５４Ｖ突然変異（背景において）によるプロテアーゼ阻害剤の耐性の増大の倍数
表１４：多様な突然変異の背景中のプロテアーゼ耐性に対する５４Ｖの影響および薬物耐性に対するそれらの対応する影響。検討された化合物についての影響は、野性型の実験室ＨＩＶ株について決定されたＩＣ５０の平均に対するＩＣ５０の変化の倍数の平均として表す。
【００９６】
【表１８】
2004512032.tif 000019
【００９７】
【表１９】
2004512032.tif 000020
【００９８】
本明細書で引用される全部の参考文献、特許および特許出願は、そっくりそのまま引用することにより組み込まれる。
【００９９】
多様な改変および変形を、本発明の技術思想もしくは範囲から離れることなく本発明の組成物および方法において行うことができることが当業者に明らかであろう。従って、本記述は本発明の改変および変形を包含することを意図しているが、但し、それらは付属として付けられる請求の範囲およびそれらの同等物の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【図１】
発明にかかる、ＭＤＲ患者由来の組換えＨＩＶ変異体のヌクレオシド類似物の感受性。組換えウイルスを、実施例２に記述されたとおり患者血漿サンプルから生じさせ、そして（ａ）ｄ４Ｔ、（ｂ）ｄｄＣおよび（ｃ）ｄｄＩに対する感受性について試験した。野性型対照に関するＩＣ５０値の増大の倍数の平均（耐性の倍数の平均）を、多様な遺伝子型をもつウイルスの群、すなわち、ＡＺＴおよび３ＴＣ耐性突然変異の背景においてコドン１５１−Ｍ多剤耐性クラスター（ｎ＝２７）、６９Ｄ／Ｎ（ｎ＝１９５）もしくは７５Ｍ（ｎ＝４３）をもつウイルス、ならびにＡＺＴ耐性突然変異の背景においてコドン６９挿入突然変異体（ｎ＝４５）について示す。誤差の棒は標準誤差を示す。総数（ｎ＝３１０）が、少ない少数派が６９Ｄ／Ｎおよび７５Ｍ二重突然変異体でありかつ双方の群で表されるために、記述された３０２のＭＤＲサンプル数より多いことに注意されたい。
【図２】
発明にかかる、そのＨＩＶ−１単離物がコドン６９挿入を発生した３例の患者の処置歴。各患者（１、２もしくは３）が特定の一処置を受領した時間の期間を示す、ヌクレオシド類似物治療（ＡＺＴ、３ＴＣ、ｄｄＣ、ｄｄＩもしくはｄ４Ｔ）を水平の棒で示す。遺伝子型および表現型の分析のための血漿サンプルを得た時点を、検出された特異的なコドン６９挿入と一緒に矢印により示す。これらの患者が受領していたかもしれないヌクレオシドのほかのいずれの他の治療も、この図上には示されない。
【図１】
2004512032.tif 000021
【図２】
2004512032.tif 000022
【国際公開パンフレット】
2004512032.tif 000023
2004512032.tif 000024
2004512032.tif 000025
2004512032.tif 000026
2004512032.tif 000027
2004512032.tif 000028
2004512032.tif 000029
2004512032.tif 000030
2004512032.tif 000031
2004512032.tif 000032
2004512032.tif 000033
2004512032.tif 000034
2004512032.tif 000035
2004512032.tif 000036
2004512032.tif 000037
2004512032.tif 000038
2004512032.tif 000039
2004512032.tif 000040
2004512032.tif 000041
2004512032.tif 000042
2004512032.tif 000043
2004512032.tif 000044
2004512032.tif 000045
2004512032.tif 000046
2004512032.tif 000047
2004512032.tif 000048
2004512032.tif 000049
2004512032.tif 000050
2004512032.tif 000051
2004512032.tif 000052
2004512032.tif 000053
2004512032.tif 000054
2004512032.tif 000055
2004512032.tif 000056
2004512032.tif 000057
2004512032.tif 000058
2004512032.tif 000059
2004512032.tif 000060
2004512032.tif 000061
2004512032.tif 000062
2004512032.tif 000063
2004512032.tif 000064
2004512032.tif 000065
2004512032.tif 000066
2004512032.tif 000067
2004512032.tif 000068
2004512032.tif 000069
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004512032.tif 000070
【国際調査報告】
2004512032.tif 000071
2004512032.tif 000072
2004512032.tif 000073
2004512032.tif 000074
2004512032.tif 000075
2004512032.tif 000076
2004512032.tif 000077