(57)【要約】本発明は、特に、アポトーシス細胞死がＣｒｍＡの発現により抑制される条件下での、ヒト細胞培養物における増強されたサイトカイン産生のための組成物および方法に関する。１つの局面において、本発明は、サイトカインの産生のためのヒト細胞組成物を提供する。ここで、この細胞は、抗アポトーシスタンパク質をコードする配列の発現、および該抗アポトーシスタンパク質をコードする配列を発現しない対応する親細胞株によって示されるサイトカイン産生のレベルの少なくとも２倍（２×）のレベルのサイトカイン産生によって特徴付けられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上のサイトカインの産生において使用するためのヒト細胞株であって：
抗アポトーシスタンパク質をコードする配列の発現、および該抗アポトーシスタンパク質をコードする配列を発現しない対応する親細胞株によって示されるサイトカイン産生のレベルの少なくとも２倍（２×）のレベルのサイトカイン産生によって特徴付けられるヒト細胞株、
を含む、ヒト細胞株。
【請求項２】
前記抗アポトーシスタンパク質は、ＣｒｍＡである、請求項１に記載の細胞株。
【請求項３】
１つ以上のサイトカインを産生し得るヒト親細胞株を入手する工程；
該細胞を、
（ｉ）第一のプロモーターに作動可能に連結されるＣｒｍＡをコードする配列、および
（ｉｉ）ヒト細胞における発現のために必要なさらなる制御エレメント、
を含む第一の発現ベクターを該細胞株の細胞に導入することによって、
改変する工程；ならびに
ＣｒｍＡ発現細胞についてスクリーニングおよび選択する工程、
を包含する、
プロセスによって調製される、１つ以上のサイトカインの産生において使用するためのヒト細胞株。
【請求項４】
前記プロセスは、
前記ＣｒｍＡ発現細胞を、増強されたサイトカイン産生を生じるに有効な様式で処置する工程であって、該形質転換されそして処置された細胞株は、対応する形質転換されていない親細胞株によるサイトカイン産生の少なくとも２倍（２×）のレベルのサイトカイン産生によって特徴づけられる、工程、
をさらに包含する、
請求項３に記載のヒト細胞株。
【請求項５】
前記プロセスは、さらに、
前記細胞を、
（ｉ）第二のプロモーターに作動可能に連結されるＰＫＲをコードする配列；および
（ｉｉ）ヒト細胞における発現に必要なさらなる制御エレメント、
を含む第二の発現ベクターを、前記細胞株の細胞に導入する工程であって、前記第一の発現ベクターの該細胞への該導入は、該第二の発現ベクターの該細胞への該導入の前、同時または後である、工程；ならびに
ＰＫＲ過剰発現細胞についてスクリーニングおよび選択する工程、
を包含する、請求項３に記載のヒト細胞株。
【請求項６】
前記プロセスは、さらに、
増強されたサイトカイン産生を生じるのに有効な様式で、前記ヒト細胞株の前記改変された細胞を処置する工程であって、前記形質転換されそして処置された細胞株は、前記対応する形質転換されていない親細胞株によるサイトカイン産生レベルの少なくとも２倍（２×）のレベルのサイトカイン産生によって特徴付けられる、工程、
を包含する、請求項５に記載のヒト細胞株。
【請求項７】
前記処置は、初回刺激および誘導の一方または両方に前記形質転換された細胞を供することを意味する、請求項６に記載のヒト細胞株。
【請求項８】
前記初回刺激は、酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）またはインターフェロンβに前記形質転換された細胞をさらすことを意味する、請求項７に記載のヒト細胞株。
【請求項９】
前記誘導は、センダイウイルス、脳心筋炎ウイルスおよび単純ヘルペスウイルスからなる群より選択される微生物誘導因子に前記形質転換された細胞を曝すことを意味する、請求項７に記載のヒト細胞株。
【請求項１０】
前記微生物誘導因子はセンダイウイルスである、請求項９に記載のヒト細胞株。
【請求項１１】
前記誘導は、ポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）（ポリＩＣ）、またはポリｒ（Ｉ）：ポリｒ（Ｃ）（ポリｒＩＣ）、ヘパリン、硫酸デキストラン、シクロヘキシミド、アクチノマイシンＤ、酪酸ナトリウム、カルシウムイオノフォアおよび硫酸コンドロイチンからなる群より選択される少なくとも１つの非微生物誘導因子に前記細胞をさらすことを意味する、請求項７に記載のヒト細胞株。
【請求項１２】
前記非微生物誘導因子は、ポリＩ：Ｃ、シクロヘキシミドおよびアクチノマイシンＤである、請求項１１に記載のヒト細胞株。
【請求項１３】
前記処置は、初回刺激および誘導の一方または両方に前記形質転換された細胞を供することを意味する、請求項４に記載のヒト細胞株。
【請求項１４】
前記初回刺激は、酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）またはインターフェロンβに前記形質転換された細胞をさらすことを意味する、請求項１３に記載のヒト細胞株。
【請求項１５】
前記誘導は、センダイウイルス、脳心筋炎ウイルスおよび単純ヘルペスウイルスからなる群より選択される微生物誘導因子に前記形質転換された細胞を曝すことを意味する、請求項１３に記載のヒト細胞株。
【請求項１６】
前記微生物誘導因子はセンダイウイルスである、請求項１５に記載のヒト細胞株。
【請求項１７】
前記誘導は、ポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）（ポリＩＣ）、またはポリｒ（Ｉ）：ポリｒ（Ｃ）（ポリｒＩＣ）、ヘパリン、硫酸デキストラン、シクロヘキシミド、アクチノマイシンＤ、酪酸ナトリウム、カルシウムイオノフォアおよび硫酸コンドロイチンからなる群より選択される少なくとも１つの非微生物誘導因子に前記細胞をさらすことを意味する、請求項１３に記載のヒト細胞株。
【請求項１８】
前記非微生物誘導因子は、ポリＩ：Ｃ、シクロヘキシミドおよびアクチノマイシンＤである、請求項１７に記載のヒト細胞株。
【請求項１９】
前記親ヒト細胞株はまた、ＰＫＲを発現し得、そして前記プロセスは、さらに、
ＰＫＲ活性、発現および／または産生における少なくとも２倍（２×）の増加を示すＰＫＲ過剰発現細胞についてスクリーニングおよび選択する工程、
を包含する、請求項３に記載のヒト細胞株。
【請求項２０】
前記プロセスは、さらに、
前記細胞株の前記ＣｒｍＡを発現しおよびＰＫＲを過剰発現する細胞を、増強されたサイトカイン産生を生じるのに有効な様式で処置する工程であって、前記形質転換されそして処置された細胞株は、対応する形質転換されていない親細胞株によるサイトカイン産生のレベルの少なくとも２倍（２×）のレベルのサイトカイン産生によって特徴付けられる、工程、
を包含する、請求項１９に記載のヒト細胞株。
【請求項２１】
前記処置は、初回刺激および誘導の一方または両方に前記形質転換された細胞を供することを意味する、請求項２０に記載のヒト細胞株。
【請求項２２】
前記初回刺激は、酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）またはインターフェロンβに前記形質転換された細胞をさらすことを意味する、請求項２１に記載のヒト細胞株。
【請求項２３】
前記誘導は、センダイウイルス、脳心筋炎ウイルスおよび単純ヘルペスウイルスからなる群より選択される微生物誘導因子に前記形質転換された細胞を曝すことを意味する、請求項２１に記載のヒト細胞株。
【請求項２４】
前記微生物誘導因子はセンダイウイルスである、請求項２３に記載のヒト細胞株。
【請求項２５】
前記誘導は、ポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）（ポリＩＣ）、またはポリｒ（Ｉ）：ポリｒ（Ｃ）（ポリｒＩＣ）、ヘパリン、硫酸デキストラン、シクロヘキシミド、アクチノマイシンＤ、酪酸ナトリウム、カルシウムイオノフォアおよび硫酸コンドロイチンからなる群より選択される少なくとも１つの非微生物誘導因子に前記細胞をさらすことを意味する、請求項２１に記載のヒト細胞株。
【請求項２６】
前記誘導は、ポリＩ：Ｃ、シクロヘキシミドおよびアクチノマイシンＤに前記細胞をさらすことを意味する、請求項２５に記載のヒト細胞株。
【請求項２７】
前記第一の発現ベクターは、さらに、第一の選択マーカーをコードする核酸配列を含み、そして
前記ＣｒｍＡ発現細胞についてスクリーニングおよび選択する工程は、前記改変された細胞を、ＣｒｍＡ発現細胞について選択するための第一の選択因子を含む培地中で培養することを意味する、
請求項３に記載のヒト細胞株。
【請求項２８】
前記第二の発現ベクターは、さらに、第二の選択マーカーをコードする核酸配列を含み、そして
前記ＰＫＲ過剰発現細胞についてのスクリーニングおよび選択する工程は、前記改変された細胞を、ＰＫＲ過剰発現細胞について選択するための前記第二の選択マーカーに特異的な第二の選択因子を含む培地中で培養することを意味する、
請求項５に記載のヒト細胞株。
【請求項２９】
ヒト細胞株において１つ以上のサイトカインを産生するための改良された方法において、該改良は、細胞の生存性およびサイトカイン産生の量を増加させることに関し、
親ヒト細胞株を、（ｉ）抗アポトーシスタンパク質発現を生じるに有効な改変；（ｉｉ）サイトカイン調節因子の過剰発現を生じるに有効な改変；（ｉｉｉ）初回刺激；および（ｉｖ）誘導のうち１つ以上の条件下に親のヒト細胞株で培養する工程であって、該サイトカイン産生の量は対応する形質転換されていない親細胞株によるサイトカイン産生のレベルの少なくとも２倍（２×）である、工程による改良である、
方法。
【請求項３０】
抗アポトーシスタンパク質発現を生じるに有効な改変は、
（ｉ）第一のプロモーターに作動可能に連結されるＣｒｍＡをコードする配列；
（ｉｉ）ヒト細胞中のＣｍｒＡの発現に必要なさらなる制御エレメント、
を含む第一の発現ベクターを、前記細胞株の細胞に導入する工程；ならびに
ＣｒｍＡ発現細胞についてスクリーニングおよび選択する工程、
を包含する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第一の発現ベクターは、さらに、第一の選択マーカーをコードする核酸配列を含み、そして前記ＣｒｍＡ発現細胞をスクリーニングおよび選択する工程は、ＣｒｍＡ発現細胞を選択するための第一の選択因子を含む培地中で前記改変された細胞を培養することを意味する、
請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
サイトカイン調節因子の過剰発現を生じるに有効な改変は、
（ｉ）第二のプロモーターにＰＫＲ作動可能に連結された前記コード配列；
（ｉｉ）ヒト細胞における発現に必要なさらなる制御エレメント、
を含む第二の発現ベクターを、前記ＣｒｍＡ発現細胞株の細胞株に導入する工程であって、前記第一の発現ベクターの該細胞への導入は、該第二の発現ベクターの該細胞への導入の前、同時または後である、工程；ならびに
ＰＫＲ過剰発現細胞についてスクリーニングおよび選択する工程、
を意味する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記第二の発現ベクターは、さらに、第二の選択マーカーをコードする核酸配列を含み、そして
前記ＰＫＲ過剰発現細胞についてのスクリーニングおよび選択する工程は、ＰＫＲ過剰発現細胞について選択するための、第二の選択マーカーに特異的な第二の選択因子を含む培地中で、前記改変された細胞を培養すること、
を意味する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ヒト親細胞株はまたＰＫＲを発現し得、そして前記プロセスは、ＰＫＲの活性、発現および／または産生において少なくとも２倍（２×）の増加を示す、ＰＫＲ過剰発現細胞について、スクリーニングおよび選択する工程をさらに包含する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記初回刺激は、酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）およびインターフェロンβの一方または両方に前記細胞をさらすことを意味する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記誘導は、センダイウイルス、脳心筋炎ウイルスおよび単純ヘルペスウイルスからなる群より選択される微生物誘導因子に前記形質転換された細胞を曝すことを意味する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記微生物誘導因子はセンダイウイルスである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記誘導は、ポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）（ポリＩＣ）、またはポリｒ（Ｉ）：ポリｒ（Ｃ）（ポリｒＩＣ）、ヘパリン、硫酸デキストラン、シクロヘキシミド、アクチノマイシンＤ、酪酸ナトリウム、カルシウムイオノフォアおよび硫酸コンドロイチンからなる群より選択される少なくとも１つの非微生物誘導因子に前記細胞をさらすことを意味する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
前記非微生物誘導因子は、ポリＩ：Ｃ、シクロヘキシミドおよびアクチノマイシンＤである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記１つ以上のサイトカインは、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）、インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；インターロイキン−２（ＩＬ−２）；インターロイキン−３（ＩＬ−３）；インターロイキン７（ＩＬ−７）；インターロイキン−８（ＩＬ−８）；インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）；およびインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト細胞培養における増強されたサイトカイン産生のための組成物および方法に関する。これは、サイトカイン合成に伴うアポトーシスを（特に、サイトカイン調節因子の過剰発現の条件下で）阻害することによる。
【背景技術】
【０００２】
（参考文献）
【０００３】
【表１】
2004537269.tif 000002
【０００４】
【表２】
2004537269.tif 000003
【０００５】
【表３】
2004537269.tif 000004
（発明の背景）
ウイルス、細菌および寄生生物を含む病原体による感染は、宿主の免疫系の活性化および種々の分子（サイトカインなど）のシグナル伝達を生じ、免疫系の多様な分岐の可動化を生じる。サイトカインは、局所的および／または全身性の細胞内制御因子として作用する強力な、多様な働きを有する（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ）ポリペプチドの迅速に増大する集合である（以下を参照のこと：Ｂａｌｋｗｉｌｌ  ａｎｄ  Ｂｕｒｋｅ，１９８９；  Ｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋ，１９８８；およびＣｌａｒｋ  ａｎｄ  Ｋａｍｅｎ，１９８７．）。サイトカインは、免疫、炎症および造血のような多くの生物学的過程において重要な役割を果たし、そして線維芽細胞、内皮細胞、マクロファージ／単球およびリンパ球を含む、多様な細胞型によって産生される。今日までに、多くの数のサイトカインが同定されており、これには、インターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、増殖因子（例えば、上皮増殖因子）および分化因子（例えば、コロニー刺激因子（ＣＳＦ））が含まれる。
【０００６】
一般に、薬学上および産業上の両方において適用を有するサイトカインおよび多くの他のタンパク質は、天然のタンパク質を細胞培養物から精製すること、または昆虫、微生物またはヒトの細胞においてそのタンパク質を組み換え産生することのいずれかによって生産される。天然のサイトカインおよび他のタンパク質は、それらが所定のサイトカインまたはタンパク質のネイティブの形態の完全なレパートリーを含むことおよび適切な構造を有するという点において好ましい。しかし、そのようなネイティブな形態のサイトカインおよびタンパク質は、生産するのに高価であり、そして時間がかかる。
【０００７】
組み換え産生されるサイトカインおよび他のタンパク質は、作製するのにそれほど高価ではないが、外来の抗原を含み得、それらが投与される被検体による免疫応答を生じ得るか、あるいは、ネイティブの形態に対する構造（すなわち、グリコシル化パターン）上の改変に起因してより弱く活性であり得る。一般に、サイトカインおよび他のタンパク質の産生のために現在ある方法は、これらの因子（ｉ）そのタンパク質のネイティブのフォールディングのために適切なグリコシル化を可能にしない可能性がある微生物系、または（ｉｉ）低い産生レベルのヒト細胞における発現に基づく。
【０００８】
従って、天然のサイトカインおよび他のタンパク質の産生を増強するための方法であって、そのサイトカインおよび他のタンパク質の産生をより安価にする方法は有利である。
【０００９】
ｐ１／ｅｌＦ２キナーゼと呼ばれるｄｓＲＮＡ活性化タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）、ＤＡＩすなわちｄｓＲＮＡ活性化されたインヒビターについてｄｓＩ、およびｐ６８（ヒト）キナーゼまたはｐ６５（マウス）キナーゼは、その酵素活性化が、ｄｓＲＮＡもしくは内部ｄｓＲＮＡ構造およびその後の自己リン酸化を提示する単鎖ＲＮＡへの結合を必要とするセリン／スレオニンキナーゼである  （Ｇａｌａｂｒｕ  ａｎｄ  Ｈｏｖａｎｅｓｓｉａｎ，１９８７；  Ｍｅｕｒｓ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。ＰＫＲは、米国特許第６，１５９，７１２号（これは、本明細書において明示的に参考として援用される）において記載されるように、インターフェロンを含む多数の有用なサイトカインの発現において重要な役割を果たす。
【００１０】
ＰＫＲが、腫瘍サプレッサーおよびアポトーシスのインデューサーとして機能し得ることもまた示唆されている。（例えば、以下を参照のこと：Ｃｌｅｍｅｎｓ  ａｎｄ  Ｂｏｍｍｅｒ，１９９９；  Ｋｏｒｏｍｉｌａｓ，ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、ここで、最近の結果は、活性形態のＰＫＲの発現がアポトーシスのトリガーとなることを示す。このことは、おそらく、Ｆａｓレセプターのアップレギュレーションによる（Ｄｏｎｚｅ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。Ｙｅｕｎｇ，Ｍ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６；  Ｙｅｕｎｇ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｌａｕ，Ａ．Ｓ．，１９９８もまた参照のこと。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
まとめると、これらの結果は、サイトカイン誘導の間細胞の寿命を延長し、それにより細胞によるサイトカインおよび他のタンパク質の産生を増強するために、ＰＫＲ発現細胞株におけるアポトーシス細胞死を阻害することが望ましいことを示唆している。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、１つの局面において、哺乳動物細胞培養物において１つ以上のサイトカインを産生するための方法を包含する。
【００１３】
本発明は、サイトカインの産生のためのヒト細胞組成物を提供する。ここで、この細胞は、抗アポトーシスタンパク質をコードする配列の発現、および該抗アポトーシスタンパク質をコードする配列を発現しない対応する親細胞株によって示されるサイトカイン産生のレベルの少なくとも２倍（２×）のレベルのサイトカイン産生によって特徴付けられる。
【００１４】
関連する局面において、本発明は、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）、インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；インターロイキン−２（ＩＮ−２）；インターロイキン−３（ＩＬ−３）；インターロイキン７（ＩＬ−７）；インターロイキン−８（ＩＬ−８）；インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）；およびインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）からなる群より選択される１つ以上のサイトカインの活性、発現または産生の増強を示すヒト細胞組成物を生産するための方法を提供する。
【００１５】
そのようなサイトカイン産生細胞における発現のための、好ましい抗アポトーシスタンパク質は、ｅＩＦ−２ａ、ＦＡＤＤ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、ＢＡＫまたはＢＡＸの改変および変異形態；抗アポトーシスタンパク質（例えば、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、および関連するホモログ（特に、ＣｒｍＡ））を含む。
【００１６】
そのようなサイトカイン産生ヒト細胞組成物は、サイトカインを産生し得るヒト親細胞株を改変することによって調製され得る。この改変は、ＣｒｍＡをコードする配列および選択マーカーをコードする核酸配列を含む第一の発現ベクターを導入すること、およびその改変された細胞をＣｒｍＡ発現細胞について選択するための選択因子の存在下で培養することによる。
【００１７】
本発明を実施するにおいて、抗アポトーシスタンパク質産生細胞は、さらに、（１）初回刺激および／または誘導によって増強された細胞産生を生じるに有効な様式で処置され得るか、あるいは（２）ＰＫＲのようなサイトカイン調節因子をコードする配列および選択マーカーをコードする核酸配列を含む第二の発現ベクターを導入すること、ＣｒｍＡおよびＰＫＲを発現する細胞の選択および続いて初回刺激および／または誘導によって改変され得る。
【００１８】
初回刺激（ｐｒｉｍｉｎｇ）は、酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）またはインターフェロンβのような多数の因子のいずれかに形質転換された細胞をさらすことによって達成され得る。誘導とは、センダイウイルス、脳心筋炎ウイルスまたは単純ヘルペスのような微生物誘導因子；あるいはポリ（Ｉ）ポリ（Ｃ）（ポリＩＣ）、またはポリｒ（Ｉ）：ポリｒ（Ｃ）（ポリｒＩＣ）、ヘパリン、硫酸デキストラン、シクロヘキシミド、アクチノマイシンＤ、酪酸ナトリウム、カルシウムイオノフォアおよび硫酸コンドロイチンからなる群より選択される少なくとも１つの非微生物誘導因子に前記細胞をさらすことを意味する。
【発明の効果】
【００１９】
アポトーシスを阻害することによって、本発明の細胞株組成物および方法は、サイトカイン産生の増加および／またはその細胞がサイトカインを産生するように機能する時間の増加を示す。
【００２０】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、添付の図面とともに以下の本発明の詳細な説明を読むと、より詳細に明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
他に示さない限り、本明細書において使用されるすべての技術および科学の用語は、それらが本発明の当業者にとってと同じ意味を有する。実施者は、当該分野における定義および用語について、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，およびＡｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３を参照されたい。本発明は、記載された特定の方法論、プロトコル、および試薬に限定されないことが理解されるべきである。なぜなら、それらは変動し得るからである。
【００２２】
本明細書において引用されるすべての刊行物は、本明細書において、本発明に関連してしようされ得る、組成物および方法論を記載および開示する目的のために、明示的に参考として援用される。
【００２３】
「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」核酸構築物または配列は、それが発現される細胞においてネイティブではない配列の部分を有する。制御配列に関していうとき、異種とは、天然において、その発現をその制御配列が現在制御する同じ遺伝子を制御するように機能しない制御配列（すなわち、プロモーターまたはエンハンサー）をいう。一般に、異種核酸配列は、その細胞にとって内因性ではないか、またはそれが存在するゲノムの部分ではなく、そして感染、トランスフェクション、微量注入、エレクトロポレーションなどによってその細胞に加えられている。「異種」核酸構築物は、ネイティブの細胞において見いだされる制御配列／ＤＮＡをコードする配列の組み合わせと同じまたは異なる、制御配列／ＤＮＡをコードする配列の組み合わせを含み得る。
【００２４】
本明細書において用いられる用語「ベクター」とは、異なる宿主細胞の間の移入のために設計された核酸構築物をいう。「発現ベクター」とは、外来細胞において異種ＤＮＡフラグメントを取り込み、そして発現する能力を有するベクターをいう。多くの原核生物性および真核生物性の発現ベクターが市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内にある。クローニングベクターまたは発現ベクターは、さらなるエレメントを含み得、例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有し得、従って２つの生物（例えば、発現のためのヒト細胞ならびにクローニングおよび増殖のための原核生物宿主）において維持されることを可能にする。クローニングベクターおよび発現ベクターは、代表的に選択マーカーを含む。
【００２５】
本明細書において使用される用語「選択マーカーをコードするヌクレオチド配列」とは、哺乳動物細胞において発現させ得るヌクレオチド配列をいい、ここで、選択マーカーの発現が選択因子の存在下で増殖する能力を、その発現された遺伝子を含む細胞に付与する。
【００２６】
本明細書において使用される用語「プロモーター」とは、下流の遺伝子の転写を指向するように機能する核酸配列をいう。プロモーターは、一般に、標的遺伝子が発現される宿主細胞に適切である。プロモーターは、他の転写調節核酸配列および翻訳調節核酸配列（これらは「制御配列」とも呼ばれる）とともに、所定の遺伝子を発現するのに必要である。一般に、転写調節配列および翻訳調節配列としては、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始配列、転写停止配列、翻訳開始配列、翻訳停止配列、エンハンサー配列およびアクチベーター配列が挙げられるが、それらに限定されない。プロモーターは、構成性または誘導性であり得、そして天然に存在するプロモーター、操作されたプロモーターまたはハイブリッドプロモーターであり得る。
【００２７】
用語「制御配列」とは、特定の宿主生物において作動可能に連結されるコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物にとって適切である制御配列としては、例えば、プロモーター、必要に応じてオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が挙げられる。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが知られる。
【００２８】
本明細書において使用される用語「作動可能に連結される」とは、組み換えＤＮＡ構築物またはベクターに関連するとき、選択されたコード配列の作動可能な制御のために互いに直接連結される、組み換えＤＮＡ構築物またはベクターのヌクレオチド成分をいう。一般に、「作動可能に連結される」ＤＮＡ配列は、連続しており、そして分泌リーダーの場合には、連続しかつ読み枠にある。しかし、エンハンサーは、連続である必要はない。連結は、便利な制限部位での連結によって達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドのアプタマーまたはリンカーを、従来実施されるように用いる。
【００２９】
本明細書において使用される用語「遺伝子」とは、コード領域の前および後の領域（例えば、５‘非翻訳領域（５’ＵＴＲ）すなわち「リーダー」配列、および３‘ＵＴＲすなわち「トレーラー」配列、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）の間の介在配列（イントロン））を含んでいても含んでいなくてもよいポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味する。
【００３０】
本明細書において使用される用語「配列同一性」とは、配列アラインメントプログラムを用いてアラインメントされる、２つ以上のアラインメントされた配列における核酸またはアミノ酸の配列同一性を意味する。
【００３１】
用語「％相同性」は、本明細書における用語「％同一性」と、本明細書において交換可能に用いられ、そして配列アラインメントプログラムを用いてアラインメントされるとき、２つ以上のアラインメントされた配列の間の核酸またはアミノ酸の配列同一性のレベルをいう。例えば、本明細書において使用されるように、８０％相同性とは、定義されるアルゴリズムによって決定される８０％配列同一性と同じものを意味し、従って所定の配列のホモログは、一本の所定の配列にわたって８０％を超える配列同一性を有する。例示的なレベルの配列同一性とは、本明細書において記載されるように、ＰＫＲ配列に対して８０％、８５％、９０％、または９５％またはそれより高い配列同一性が挙げられるがそれらに限定されない。
【００３２】
２つの配列の間の同一性を決定するために使用され得る例示的なコンピュータプログラムとしては、ＢＬＡＳＴプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰおよびＴＢＬＡＳＴＮ）のスイート（これは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/においてインターネットにおいて公に利用可能である）が挙げられるがそれらに限定されない。Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９９０  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７もまた参照のこと。
【００３３】
配列検索は、ＧｅｎＢａｎｋ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓおよび他の公のデータベースにおける核酸配列に対して所定の核酸配列を評価する場合、代表的に、ＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて実施される。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓおよび他の公のデータベースにおけるアミノ酸配列に対してすべての読み枠において翻訳された核酸配列の検索について好ましい。ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸは両方とも、１１．０のオープンギャップペナルティ（ｏｐｅｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）、１．０のエクステンデッドギャップペナルティ（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）のデフォルトパラメータを用いて実行され、そしてＢＬＯＳＵＭ−６２マトリクスを利用する  ［Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７を参照のこと］。
【００３４】
２つ以上の配列の間の「％同一性」を決定するために、選択された配列の好ましいアラインメントは、例えば、１０．０のオープンギャップペナルティ、０．１のエクステンデッドギャップペナルティおよびＢＬＯＳＵＭ３０類似性マトリクスを含むデフォルトパラメータを用いて操作される、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．５におけるＣＬＵＳＴＡＬ−Ｗプログラムを用いて行われる。
【００３５】
核酸配列は、２つの配列が、中程度から高度なストリンジェンシーハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の下で互いに特異的にハイブリダイズする場合、参照核酸配列に対して「選択的にハイブリダイズ可能」であると考えられる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体またはプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づく。例えば、「最大ストリンジェンシー」は、代表的に、約Ｔｍ−５℃（そのプローブのＴｍより５℃低い）において生じ；「高度のストリンジェンシー」は、Ｔｍより約５〜１０℃低く生じ；「中程度のストリンジェンシー」は、そのプローブのＴｍより約１０〜２０℃低く生じ；ならびに「低いストリンジェンシー」は、Ｔｍの約２０〜２５℃低く生じる。機能的には、最大ストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性またはほぼ厳密な同一性を有する配列を同定するために用いられ得；他方、高度のストリンジェンシー条件は、そのプローブに対して約８０％以上の配列同一性を有する配列を同定するために用いられる。
【００３６】
中程度および高度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、当該分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ，１９８９、９節  および１１節、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９３を参照のこと。これらは本明細書において明示的に参考として援用される）。高度のストリンジェンシー条件の例としては、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性キャリアＤＮＡ中での約４２℃でのハイブリダイゼーション、続いて２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中での室温での２回の洗浄、ならびに０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中での４２℃での２回のさらなる洗浄が挙げられる。
【００３７】
本明細書において使用される「組み換え体」は、異種核酸配列の導入によって改変された細胞またはベクター、あるいはそのように改変された細胞に由来する細胞に関する言及を含む。従って、例えば、組み換え体細胞は、その細胞のネイティブ（非組み換え体）形態内における同一の形態中に見いだされない遺伝子を発現するか、あるいは意図的な人為的介入の結果として、発現されるかまたは全く発現されない下で、そうでなければ異常に発現されるネイティブ遺伝子を発現する。
【００３８】
本明細書において使用される用語「形質転換される」、「安定に形質転換される」または「トランスジェニック」とは、哺乳動物細胞について参照する場合、２世代以上にわたって維持される、そのゲノム中に組み込まれた非ネイティブ（異種）核酸配列を有する、哺乳動物細胞を意味する。
【００３９】
本明細書において使用される用語「発現」とは、遺伝子の核酸配列に基づいてポリペプチドが産生されるプロセスをいう。このプロセスは、転写および翻訳の両方を含む。
【００４０】
用語「サイトカイン調節因子発現」とは、サイトカイン調節因子遺伝子の転写および翻訳をいい、これらの産物は、前駆体ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後プロセシングされたポリペプチドおよびそれらの誘導体を含み、マウスまたはサルの酵素のような他の種に由来するサイトカイン調節因子を含む。
【００４１】
同様に、用語「ＰＫＲ発現」とは、ＰＫＲコード核酸配列の転写および翻訳をいい、これらの産物は、前駆体ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後プロセシングされたポリペプチドおよびそれらの誘導体を含み、マウスまたはサルの酵素のような他の種に由来するＰＫＲを含む。例示として、ＰＫＲ発現のための分析としては、ＰＫＲ活性についての自己リン酸化アッセイおよびｅＩＦ２αリン酸化アッセイ、タンパク質発現についてのウエスタンブロット、ならびにＰＫＲ  ｍＲＮＡ発現についてのノーザンブロットおよび逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が挙げられる。
【００４２】
「選択的スプライシング」とは、多数のポリペプチドのアイソフォームが単一の遺伝子から生成されるプロセスであり、そしてその遺伝子のいくつか（であるがすべてではない）の転写物のプロセシングの間の非連続的なエキソンを一緒にスプライシングすることを包含する。従って、特定のエキソンは、いくつかの代替的エキソンのうちの任意の一つと接続されてメッセンジャーＲＮＡを形成し得る。選択的スプライシングされたｍＲＮＡは、いくつかの部分が共通し、他方で他の部分が異なるポリペプチド（「スプライス変異体」）を生成する。
【００４３】
本明細書において使用される用語「生物学的活性」および「生物学的に活性」とは、培養中の細胞株における特定のタンパク質に帰する活性をいう。そのようなタンパク質の「生物学的活性」は、培養条件に依存していくらか変動し得、ある範囲の活性として一般に報告されることが理解される。従って、タンパク質の「生物学的に不活性な」形態とは、天然において見いだされるようなタンパク質の活性を阻害する様式で改変されたタンパク質の形態をいう。
【００４４】
本明細書において使用される用語「サイトカイン調節因子の生物学的活性」および「生物学的に活性なサイトカイン調節因子」とは、酵素活性などのような、特定のサイトカイン調節因子またはそのサイトカイン調節因子の任意のフラグメント、誘導体もしくはアナログに伴う任意の生物学的活性をいう。
【００４５】
本明細書において使用される用語「正常レベルのサイトカイン調節因子活性」および正常レベルのサイトカイン調節因子発現」とは、特定の型の改変も誘導も初回刺激も感染もされていない細胞（例えば、特定の型の親の細胞株）において存在すると判定された、サイトカイン調節因子の活性または発現のレベルをいう。そのような「正常な」サイトカイン調節因子の活性または発現は、サイトカイン調節因子をコードするベクターでトランスフェクトされず、刺激も（誘導も初回刺激も）感染もされていない、所定の型の細胞について一般に観察される範囲のサイトカイン調節因子の活性または発現として報告されることが理解される。
【００４６】
同様に、用語「ＰＫＲの生物学的活性」および「生物学的に活性なＰＫＲ」とは、酵素活性のようなＰＫＲ、またはＰＫＲのフラグメント、誘導体もしくはアナログに伴う任意の生物学的活性をいい、特に、真核生物翻訳開始因子２（ｅＩＦ−２）およびＮＦ−κＢのような転写因子のような基質のリン酸化を含む自己リン酸化活性およびキナーゼ活性を包含する。
【００４７】
同様に、用語「正常レベルのＰＫＲ活性」および「正常レベルのＰＫＲ発現」とは、特定の型（例えば、特定の細胞株）の刺激も感染もされていない細胞に存在すると判定されるレベルのＰＫＲの活性または発現をいう。そのような「正常」ＰＫＲの活性または発現は、ＰＫＲをコードするベクターでトランスフェクトされておらず、刺激も（誘導も初回刺激も）感染もされていない所定の型の細胞について一般に観察される範囲のＰＫＲの活性または発現として報告されることが理解される。
【００４８】
「正常な」サイトカイン調節因子の活性または発現の範囲は、培養条件に依存していくらか変動し得る。例えば、Ｕ９３７細胞株は、ＶｅｒｏまたはＮａｍａｌｗａの細胞株についてのＰＫＲ活性の正常範囲とは異なる、ＰＫＲ活性の正常範囲を有し得る。同様に、ＰＫＲの過剰発現とは、ＰＫＲをコードするベクターでトランスフェクトされておらず、刺激も（誘導も初回刺激も）感染もされていない所定の型の細胞について一般に観察される正常範囲のＰＫＲ発現より多い発現レベルを意味する。従って、ＰＫＲの「過剰発現」とは、ＰＫＲをコードする配列を含むベクターの導入によって改変されておらず、ＰＫＲの過剰発現について選択されておらず、刺激も（誘導も初回刺激も）感染もされていない所定の型の細胞について一般的に観察されるものよりも大きな範囲のＰＫＲの活性、発現または産生を意味する。
【００４９】
１つの好ましい局面において、サイトカイン調節因子過剰発現とは、使用される特定の培養条件下で同じ細胞株について、正常レベルのサイトカイン調節因子の活性、発現または産生よりも、少なくとも１５０％（１．５倍すなわち１．５×）、好ましくは少なくとも２００％、３００％または４００％、または５００％あるいはそれより多いレベルのサイトカイン調節因子の活性、発現または産生を意味する。換言すれば、サイトカイン調節因子を過剰発現する細胞株は、代表的に、サイトカイン調節因子過剰発現を生じるに有効な様式では選択も改変も処置もされていない同じ型の細胞によって代表的に示されるレベルのサイトカイン調節因子の発現または産生よりも、少なくとも１．５倍およびより好ましくは２倍（２×）、３倍（３×）、４倍（４×）、５倍（５×）またはそれより多いレベルのサイトカイン調節因子の産生または発現を示す。
【００５０】
いくつかの場合において、ＰＫＲのようなサイトカイン調節因子を過剰発現する細胞株は、使用される特定の培養条件の下で、そしてサイトカイン調節因子過剰発現を生じるに有効な様式で選択も処置もされていない同じ型の細胞によって代表的に示されるよりも、１０倍（１０×）またはそれより多いレベルのサイトカイン調節因子の発現または産生を示す。例示として、用語「ＰＫＲ過剰発現を生じるに有効な様式で処置される」とは、細胞に（異種または自己起源の）ＰＫＲコード配列の選択、刺激（初回刺激または初回刺激および誘導）および／または感染のうちの１つ以上を意味する。
【００５１】
本明細書において使用される用語「正常レベルのサイトカイン」および「正常レベルのタンパク質」とは、活性、発現および産生に関しては、サイトカイン調節因子の過剰発現を生じるに有効な様式で処置されていない特定の型の細胞に存在すると判定されるレベルのサイトカインまたは他のタンパク質の活性、発現または産生をいう。例としては、サイトカイン調節因子の活性、発現または産生の増強を生じる様式では選択も処置もされていない、野生型細胞株、および導入されたサイトカイン調節因子コード配列を含まない細胞株が挙げられる。そのような「正常な」サイトカインまたは他のタンパク質の活性、発現または産生は、所定の細胞株について代表的に観察される範囲の活性、発現または産生として報告され、そして培養条件に依存していくらか変動し得ることが理解される。
【００５２】
従って、「正常な」サイトカインの活性または発現の範囲は、培養条件に依存していくらか変動し得る。用語「増強されたレベルの」および「正常レベルより多い（を超える）」とは、サイトカインまたはタンパク質の活性、発現または産生に関して、交換可能に使用され得る。この用語は、使用される特定の培養条件の下で同じ細胞株の親の細胞（ここで、その親の細胞は、サイトカインまたはタンパク質の活性、発現、または産生における増大を生じるに有効な様式で選択も改変も処置もされていない）によって示されるレベルのサイトカインまたはタンパク質の活性、発現または産生よりも、少なくとも１５０％（１．５倍すなわち１．５×）、好ましくは少なくとも２００％、３００％または４００％、あるいは５００％またはそれより多いレベルのサイトカインまたはタンパク質の活性、発現または産生をいう。いくつかの場合において、サイトカインまたはタンパク質の活性、発現または産生における増大は、親の細胞株の活性、発現または産生よりも１０倍（１０×）またはそれより多い。
【００５３】
本明細書において使用される用語「精製された」および「単離された」とは、一般的に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのいずれかの分子であって、その分子が見いだされるかまたは産生される環境の他の成分から分離された分子をいう。例えば、単離または精製されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、代表的に、それらが見いだされたかまたは産生された環境の成分のうち７５％以上から分離されている。単離または精製されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それらが見いだされる環境の成分のうち、好ましくは、少なくとも８０％〜８５％、およびより好ましくは少なくとも９０％、９５％またはそれより多く分離されている。例えば、「精製された」または「単離された」サイトカインとは、そのサイトカインが、それらが産生された細胞培養培地における成分のうち、少なくとも７５％以上、好ましくは少なくとも８０％〜８５％またはそれより多く、およびより好ましくは少なくとも９０％またはそれより多く分離されたことを意味する。
【００５４】
本明細書において使用される用語「アポトーシス細胞死」、「プログラム化された細胞死」および「アポトーシス」とは、細胞分化の特定の段階および特定に刺激に応答して生じる細胞事象の複雑なカスケードから生じるかまたはそれに関連する任意の細胞死をいう。アポトーシス細胞死は、死ぬ細胞の核において細胞質の濃縮およびクロマチンの濃縮によって特徴付けられる。このプロセスは、ＤＮＡが多数の２００塩基対への断片化およびＲＮＡの分解ならびに壊死細胞死におけるような突然の細胞の溶解を伴わない組織化された様式でのタンパク質分解を伴う。
【００５５】
本明細書において使用される用語「アポトーシス細胞死を阻害する」とは、細胞株がサイトカインまたは他のタンパク質の発現もしくは産生の目的のために培養される時間にわたり細胞死のプロセスを部分的または完全に阻害することを意味する。そのような阻害は、一般的に、アポトーシス細胞死の量が、アポトーシスを阻害するに有効な様式で改変されていない細胞株において観察されるアポトーシス細胞死の量に比較して、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、およびより好ましくは８０％もしくはそれより多く減少していることを意味する。
【００５６】
サイトカイン産生細胞株の場合において、そのような阻害は、一般的に、アポトーシス細胞死の量が、アポトーシスを阻害するに有効な様式で改変されていないＰＫＲ過剰発現細胞株において観察されるアポトーシス細胞死の量に比較して、少なくとも２０％、好ましくは５０％およびより好ましくは８０％もしくはそれより多く減少していることを意味する。
【００５７】
サイトカインに関する上記の定義はまた、本発明の方法によって生産される「他のタンパク質」（例えば、ＣｍｒＡ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬおよび関連するホモログ）についても適用される。従って、ＣｍｒＡ、Ｂｃｌ−２またはＢｃｌ−ＸＬの「過剰発現」はそれぞれ、ＣｒｍＡ、Ｂｃｌ−２またはＢｃｌ−ＸＬをコードするベクターでトランスフェクトされておらず、アポトーシスを受けるように刺激されていない所定の型の細胞について一般的に観察される範囲よりも多い範囲のＣｒｍＡ、Ｂｃｌ−２またはＢｃｌ−ＸＬの活性または発現を意味する。
【００５８】
本明細書において使用される用語「改変された形態の」とは、アポトーシスに関連するタンパク質（ｅＩＦ−２ａすなわちｅＩＦ−２α、ｅＩＦ−３、ＦＡＤＤ、Ｂｃｌ−ＸＬ、ＢＡＫ、ＢＡＸなどに例示される）に関して、ネイティブのタンパク質の誘導体または改変体形態を意味する。すなわち、「改変された形態の」タンパク質は、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失または挿入を含む誘導体ポリペプチド配列を有し、ここで、アミノ酸置換が特に好ましい。このアミノ酸の置換、挿入または欠失は、そのタンパク質の生物学的活性と干渉するそのポリペプチド配列内の任意の残基において生じ得る。改変体または誘導体のタンパク質をコードする、対応する核酸配列は、その遺伝子またはそれをコードする配列の「変異された」かまたは「改変された」と考えられ、そして本発明の範囲内に包含される。
【００５９】
（ＩＩ．サイトカイン調節因子およびサイトカイン産生）
多くの因子が、細胞（例えば、ヒト細胞）中でのサイトカインの誘導および／または増強された発現に関与していることが知られている。これらの因子として、サイトカイン特異的転写調節因子および他のタンパク質特異的転写調節因子（例えば、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ−１、ＩＲＦ−３、およびＩＲＦ−７）、サイトカインレセプター、核因子κＢ（ＮＦ−ｋＢ）、アクチベータータンパク質−１（ＡＰ−１）、核因子ＩＬ−６（ＮＦ−ＩＬ６）、ならびに、特にＰＫＲが挙げられる。
【００６０】
これらの因子のいずれかの発現または活性の増強は、一般的に、正常よりも高い、１つ以上のサイトカインコード遺伝子の発現を引き起こす。
【００６１】
ＰＫＲは、サイトカインおよび他のタンパク質の発現を調節し得るタンパク質の例として、本明細書中で使用されるが；他のサイトカインおよびタンパク質増強因子（本明細書中で、「サイトカイン調節因子」または「ＣＲＦ」と示される）が、ＰＫＲの代わりに使用され得ることが理解される（例えば、（１）プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）インデューサー、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＧＦおよびＰＤＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＧＦ、ＴＮＦ−α、またはＴＮＦ−β、ＩＬ−１、ＩＦＮ（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、あるいはケモカイン（ＩＬ−８、マクロファージ炎症タンパク質［ＭＩＰ−１ａおよびＭＩＰ−１ｂ］、ならびに単球化学走性タンパク質［ＭＣＰ］）；（２）他の細胞シグナル伝達因子（例えば、ＰＭＡ、カルシウムイオノフォア、酪酸ナトリウム、またはエンドトキシン；（３）ポリＩ：Ｃ、二本鎖ＲＮＡ、またはウイルスアナログ；（４）ＰＫＲを活性化し得る細胞ストレスシグナル（熱ショック、病原菌感染（例えば、ウイルス感染）が挙げられる）；または（５）増強されたサイトカイン産生を引き起こす、このようなサイトカイン調節因子の発現を増強する任意の因子）。
【００６２】
（Ａ．ＰＫＲ）
ＰＫＲは、キナーゼ活性を有することが知られている、唯一同定されたｄｓＲＮＡ結合タンパク質である。ＰＫＲは、セリン／スレオニンキナーゼであり、その酵素の活性化には、ｄｓＲＮＡの結合および引き続く自己リン酸化を必要とする（Ｍｅｕｒｓら、１９９０；Ｆｅｎｇ  ＧＳら、１９９２）。
【００６３】
インビボで最も特徴付けられているＰＫＲの基質は、真核生物開始因子−２（ｅＩＦ−２）のαサブユニットであり、この基質は、一旦リン酸化されると、最終的に、細胞タンパク質合成およびウイルスタンパク質合成の阻害を引き起こす（Ｈｅｒｓｈｅｙ，Ｊ．Ｗ．Ｂ．、１９９１）。ＰＫＲは、二本鎖ＲＮＡにより活性化された場合、インビトロで開始因子ｅＩＦ−２αをリン酸化することが実証されている（Ｃｈｏｎｇら、１９９２）。ＰＫＲのこの特定の機能は、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βの抗ウイルス活性および抗増殖活性の媒介を担う機構の１つであることが示唆されている。ＰＫＲのさらなる生物学的機能は、例えば、核因子ｋＢ（ＮＦ−ｋＢ）の遊離および活性化を引き起こすＩｋＢのリン酸化によるシグナル伝達因子としてのその推定的な役割である（Ｋｕｍａｒ  Ａら、１９９４）。
【００６４】
ＰＫＲが、インターフェロン（ＩＦＮ）発現の転写活性化を媒介することが以前に実証された（Ｄｅｒ  ＤおよびＬａｕ  ＡＳ、１９９５）。ＩＦＮは、それらの同族レセプターに結合することによりそれらの生物学的活性を誘導し、その後、シグナル伝達を通じてＩＦＮにより刺激された遺伝子（ＩＳＧ）を誘導する。このようなＩＳＧは、少なくとも２つの細胞内経路（特定のリボヌクレアーゼの活性化およびＩＦＮ調節された、二本鎖ＲＮＡ活性化キナーゼ（ＰＫＲ）の活性化を介するＲＮＡの分解）によりＩＦＮの生物学的活性を媒介すると考えられえている。この観察を一致して、ＰＫＲに対してアンチセンスなオリゴヌクレオチドでＵ９３７細胞をトランスフェクトすることによる内因性ＰＫＲ活性の抑制またはＰＫＲ欠損変異体の発現は、ウイルス感染に応答したＩＦＮの誘導を減少させた（Ｄｅｒ  ＤおよびＬａｕ  ＡＳ、１９９５）。
【００６５】
要約すると、ＰＫＲは、（１）複雑なレセプター系（ＩＦＮ、ＴＮＦ、およびＦａｓを含む）に対するシグナル伝達、（２）サイトカイン遺伝子の転写活性化、（３）アポトーシスの開始、および（４）ｅＩＦ−２αのリン酸化によるタンパク質合成の阻害、に関連する。ＰＫＲに起因するさらなる活性として、（１）ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βの抗ウイルス活性および抗増殖活性の媒介、（２）生理学的ストレスに対する非感染細胞の応答、および（３）細胞増殖の調節、における役割が挙げられる（ＣｌｅｍｅｎｓおよびＥｌｉａ、１９９７；Ｚａｍａｎｉａｎ−Ｄａｒｙｏｕｓｈら、１９９９）。
【００６６】
ＰＫＲは、腫瘍サプレッサーおよびアポトーシスのインデューサーとして機能し得ることもまた示唆されている（例えば、Ｃｌｅｍｅｎｓ  ＭＪら、１９９９；Ｙｅｕｎｇ、Ｌａｕら、１９９６；Ｋｏｒｏｍｉｌａｓら、１９９２を参照のこと）。近年の結果は、ＰＫＲの活性形態の発現が、おそらく、Ｆａｓレセプターのアップレギュレーションを通じてアポトーシスを誘導することを示す（Ｄｏｎｚｅ  Ｏら、１９９９）。
【００６７】
（ＩＩＩ．アポトーシス）
アポトーシスまたはプログラムされた細胞死は、正常な発達の中心的な部分である細胞に固有のプロセスであり、厳密に調節されており、そして発達、宿主防御、および癌遺伝子の抑制のために重要である（Ｏｒｒｅｎｉｕｓ  １９９５；Ｓｔｅｌｌａｒ  １９９５；Ｖａｕｘ  １９９３において総説されている）。アポトーシスは、胎児の発達の間（Ｃｏｈｅｎ、１９９２）、器官の形成の制御において（Ｎａｇａｔａら、１９９５；Ｖａｕｘ、１９９３）、および成体においてホメオスタシスの目的のために、生物にとって多くの利点を提供する。一旦アポトーシスが行なわれると、細胞は、タンパク質合成および種々の形態学的／生理学的変化（特徴的なオリゴヌクレオソームラダーとして検出される、細胞質凝縮、核クロマチン凝縮、膜小疱形成、および１８０塩基対（ｂｐ）の倍数のＤＮＡフラグメントを生じる内部ヌクレオソームリンカー部位での最終的なＤＮＡ分解が挙げられる）の新たなラウンドを行う（Ｌｅｖｉｎｅ  ＡＪ、１９９３）。瀕死の細胞は、最終的に、膜結合アポトーシス体に断片化し、マクロファージまたは隣接細胞によって迅速に貪食および消化される。
【００６８】
アポトーシスは、望ましくない細胞および潜在的に危険な細胞（ウイルス感染細胞、自己免疫疾患における自己反応性リンパ球、または悪性細胞が挙げられる）を除去するための防御機構として機能する（Ｏｅｈｍら、１９９２；Ｙｏｎｅｈａｒａら、１９８９；Ｖａｕｘ、１９９３）。アポトーシスは、変異原性化学物質、発癌物質、またはＵＶ照射に頻繁に曝される組織における癌細胞の発達の危険を最小限に抑えるための手段として関与する。
【００６９】
悪性腫瘍に対するさらなる防御は、免疫系の活性化に応答して産生される炎症誘発性サイトカインであるＴＮＦ−αによりもたらされる。ＴＮＦ−αは、形質転換宿主細胞のアポトーシス死を誘導し得る（Ｈｅｌｌｅｒ、１９９２、Ｙｅｕｎｇ、１９９６）。
【００７０】
アポトーシスの調節不全は、疾患プロセスの病原論に寄与し得る（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、１９９５）。これは、疾患（癌、ＡＩＤＳ、虚血性発作、および神経変性障害が挙げられる）の発達において重要な役割を果たしていると考えられる。例えば、神経変性疾患（ニューロンの特定のサブタイプの成熟前の死に関連するアルツハイマー病およびパーキンソン病が挙げられる）において、細胞死の阻害および不適切な細胞死は両方とも、宿主に対して有害であり得ることを、証拠が示唆している（Ｋｏｓｉｋ  ＫＳ、１９９２）。細胞アポトーシスの不適切な抑制または生来の不全はまた、細胞の悪性形質転換を引き起こすことが示されている（Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ、１９９２）。
【００７１】
アポトーシスに関連する個々のプロト癌遺伝子は、アポトーシスを起こした細胞において発現され得、そして個々のプロト癌遺伝子の発現の調節は、このプロセスに影響を及ぼすことが観察されている。プロト癌遺伝子の例として、ｃｅｄ−３、ｃｅｄ−４、ｃｅｄ−９、およびＩｃｅのような他の遺伝子に加えて、ｃ−ｍｙｃ、Ｆａｓ（ＡＰＯ−１）、ｐ５３、およびＢｃｌ−２が挙げられる（Ｓｔｅｌｌａｒ、１９９５；Ｃｏｈｅｎ、１９９３）。
【００７２】
（Ａ．アポトーシスにおけるＰＫＲおよびＴＮＦ−αの役割）
炎症誘発性サイトカインの原型となるＴＮＦは、病原体除去、抗ウイルス活性、および腫瘍破壊のプロセスの間に、活性化された免疫細胞により産生される細胞障害性タンパク質である。しかし、ＴＮＦ−αは、造血の代謝性の妨害、浪費、および抑制を誘導するので、高レベルのＴＮＦ−αは、インビボで有害であり得る。細胞レベルにおいて、ＴＮＦ−αは、スーパーオキシドラジカルの生成、リソソーム酵素の活性化（Ｌａｒｒｉｃｋら、１９９０；Ｌｉｄｄｉｌら、１９８９）、およびエンドヌクレアーゼ活性の活性化によるＤＮＡの断片化（Ｒｕｂｉｎら、１９８８）を誘導し、アポトーシスを引き起こす。
【００７３】
種々の機構が、ＴＮＦ−αに関連するアポトーシスについて提案されている（Ｄｅｒｓｓｌｅｒら、１９９２；Ｏｂｅｉｄら、１９９３）。（１）ＴＮＦ−α処置により、いくつかのセリン／スレオニンプロテインキナーゼ（ＰＫＲが挙げられる）が活性化されること；（２）ＴＮＦ−αおよびＰＫＲは、ＮＦ−ｋＢを動員すること；（３）ＰＫＲは、ＴＮＦ−αシグナル伝達経路において中心的な役割を果たすこと；および（４）腫瘍サプレッサー遺伝子ｐ５３は、ＴＮＦ−α誘導性アポトーシスプロセスにおいて役割を果たすこと、が示されている（Ｇｕｙら、１９９２；Ｖａｎ  Ｌｉｎｔら、１９９２、ＹｅｕｎｇおよびＬａｕら、１９９６を参照のこと）。
【００７４】
（ＩＶ．アポトーシスの抑制または遅延）
本発明は、アポトーシス細胞死プロセスを抑制することによる、哺乳動物細胞培養物におけるサイトカインの増強された産生のための方法を提供する。アポトーシスを阻害することにより、本明細書中に記載される細胞株は、培養物中でより長い寿命を有し、そしてサイトカインの生合成の増大および／またはサイトカインを産生する細胞機能が増大する時間の増加を示す。
【００７５】
１つの局面において、本発明は、アポトーシスの抑制または遅延を引き起こすのに効果的な様式で、細胞培養物中で細胞を改変することにより、サイトカイン産生または他のタンパク質の産生を調節するための方法を提供する。本明細書中に記載されるように、本発明者らは、細胞株が、１つ以上のさらなる改変、初回刺激、および誘導と組み合わせて、アポトーシスの抑制または遅延を引き起こすのに効果的な様式で改変され得、それによって、同一条件下で培養されたそのように改変されていない親細胞株と比較して、正常レベルを超えるサイトカインまたは他のタンパク質の産生が達成されることを観察した。
【００７６】
別の局面において、本発明は、サイトカインまたは他のタンパク質を産生する方法を提供する。この方法は、その発現がアポトーシスを阻害するのに有効なタンパク質をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結された、宿主細胞において機能するプロモーターを有する発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を培養する工程を包含する。
【００７７】
哺乳動物細胞培養物におけるアポトーシス細胞死プロセスの抑制は、任意の多くのアポトーシスの阻害に関するストラテジーにより達成され得る。これらのストラテジーとして、（１）アポトーシスを阻害し得るタンパク質の過剰発現（例として、ＣｒｍＡ、Ｂｃｌ−２ａ、およびＢｃｌ−ＸＬ、またはそれらのホモログが挙げられるがこれらに限定されない）；（２）ｅＩＦ２−α（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ａ４５７４９７）リン酸化の抑制（例えば、相同組換えまたは部位特異的変異誘発を用いたそれぞれの内因性遺伝子の変異により調製された、ｅＩＦ２−αまたは真核生物翻訳開始因子（ｅＩＦ−３）の変異形態を過剰発現することによる抑制（それによって、ＰＫＲの下流基質を阻害することによる抑制））；（３）内因性ＦＡＤＤ活性の抑制（例えば、相同組換えまたは部位特異的変異誘発を用いた内因性ＦＡＤＤ遺伝子の変異により調製された、ＦＡＤＤの変異形態の過剰発現による抑制）；または（４）Ｂｃｌ−２ａの１つ以上の前アポトーシス対応物（例えば、ＢＡＸ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ２２４７３）、ＢＡＫ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＥ２２１６６６）、および／またはＢｃｌ−ＸＳ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ２０１２２））についての内因性遺伝子の、相同組換えまたは部位特異的変異誘発によるか、あるいは１つ以上のＢＡＸ、ＢＡＫ、およびＢｃｌ−ＸＳの遺伝子切除または遺伝子欠失による変異による、トランスドミナント変異体の使用、が挙げられる。
【００７８】
本発明の１つの好ましい局面において、選択された遺伝子（例えば、ＣｒｍＡ、Ｂｃｌ−２ａ、Ｂｃｌ−ＸＬ、またはそれらのホモログ）は、宿主細胞において過剰発現され、アポトーシス細胞死の抑制または遅延を引き起こす。他の場合において、内因性遺伝子発現の抑制は、アポトーシス細胞死の抑制または遅延を引き起こし得、そして内因性遺伝子の変異、相同組換えまたは部位特異的変異誘発、遺伝子欠失または遺伝子切除、あるいは標的遺伝子の切除または変更された発現を引き起こすのに有効な任意の方法を含むがこれらに限定されない方法によりもたらされ得る。
【００７９】
細胞死は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いた細胞の染色によってか、または細胞のアポトーシス死に特異的なアッセイ（例えば、アネキシンＶを用いる染色による（Ｖｅｒｍｅｓら、１９９５））の使用によって検出され得る。細胞のネクローシス死は、関連する細胞の形態の顕微鏡観察と細胞生存性についてのアッセイの組合せとの結果を評価することによって細胞のアポトーシス死から区別され得る。
【００８０】
上記のように、アポトーシスは、事実上アポトーシスのプロセスを遮断することに関連するタンパク質の発現を増加することによって阻害され得る。あるいは、アポトーシスは、事実上アポトーシスのプロセスを促進することに関連するタンパク質の発現を減少すること（例えば、このようなタンパク質の修飾された形態または改変された形態を発現するのに有効な様式において細胞を修飾すること）によって阻害され得る。
【００８１】
（Ａ．サイトカイン応答修飾因子Ａ（ＣｒｍＡ）の発現の増強）
ポックスウイルスは、様々なサイトカイン応答修飾（Ｃｒｍ）タンパク質をコードし、これらは、免疫応答に重要な多数のヒトタンパク質に相同の配列を所有する（Ｚｈｏｕ  Ｑら、１９９７；Ｄｂａｉｂｏ  ＧＳら、１９９８）。牛痘ウイルスサイトカイン応答修飾因子Ａ（ＣｒｍＡ）は、セリンプロテアーゼおよびシステインプロテアーゼの両方を阻害し（Ｔｅｗａｒｉ，Ｍら，１９９５）、そして血清回収（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ｗら，１９９５）、ＦａｓもしくはＴＮＦレセプターの活性化（Ｋｏｕｓｔｕｒａ，ＭＪら、１９８９；Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ，ＡＭら、１９９６）、またはニワトリの神経細胞の一次培養物における神経増殖因子の回収（Ｏｒｔｈ，Ｋら，１９９６）によって誘導されるアポトーシスの強力なインヒビターであることが実証されている。ＣｒｍＡは、ＩＬ−１β変換酵素（ＩＣＥ）に対する競合インヒビターとして優先的な活性を有することが示されている（Ｍｕｚｉｏ，Ｍら，１９９６）だけでなく、アポトーシスに関連するＩＣＥファミリーの他のメンバーのタンパク質溶解活性の弱い阻害も示す（例えば、Ｄｂａｉｂｏ  ＧＳら，１９９８およびＤｂａｉｂｏ  ＧＳら，１９９７）。
【００８２】
ＩＬ−１β変換酵素（ＩＣＥ）１ファミリーに属するプロテアーゼは、アポトーシスのプロセスの中心であると考えられ；これらのプロテアーゼがその活性型において過剰発現される場合にアポトーシスは誘導されること（Ｍｉｕｒａ，Ｍら，１９９３）；およびこれらのプロテアーゼが特異的に阻害される場合にアポトーシスは阻害されること（Ｔｅｗａｒｉ，Ｍら，１９９５）の観察に一部基づく。
【００８３】
スフィンゴ脂質セラミドは、近年多数の異なる系におけるアポトーシスの強力なインデューサーであることが示されている（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ  Ｂら，１９９８およびＷｅｇｅｎｋｎｅｃｈｔ  Ｂら，１９９８を参照のこと）。さらに、ＴＮＦ−α、Ｆａｓライゲーション、血清回収、いくつかの化学治療薬、およびγ−照射（これら全てはアポトーシスを誘導すると報告されている）は、セラミドの細胞レベルを上昇することが示されており、セラミドの生物学的活性は、アポトーシスの種々のインデューサーによって共有される経路に共通であることが示唆される（Ｊａｙａｄｅｖ，Ｓら，１９９５；Ｈａｉｍｏｖｉｔｚ−Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ａ，ら，１９９４；およびＴｅｐｐｅｒ，Ｃ．Ｇ，ら，１９９５）。
【００８４】
ＦａｓレセプターおよびＴＮＦ−αレセプター１の両方からのアポトーシス死シグナルが、ＦＡＤＤ（ＴＮＦ−αレセプターファミリーのメンバーと関連する新しいシグナル伝達分子のファミリーに属する「死のドメイン（ｄｅａｔｈ  ｄｏｍａｉｎ）」含有タンパク質）経由で作用することが観察された。ＦＡＤＤのドミナントネガティブな変異の発現が、セラミドの蓄積、ＩＣＥ−関連プロテアーゼ活性化、およびＦａｓ抗体を用いる処置後のアポトーシスを阻害することが示された。外因的に提供されたセラミドは、この遮断を回避し、そしてアポトーシスを生じ得た（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ，Ａ．Ｍら，１９９６）。
【００８５】
ＴＮＦ−αを用いた処置後のＭＣＦ−７細胞におけるセラミドの蓄積は、ＣｒｍＡによって完全に阻害されることが観察され、ＣｒｍＡが、ＴＮＦ−αに対する応答においてセラミド生成のアポトーシスの上流のシグナルを標的化することを示唆した。外因性のセラミドは、ＣｒｍＡによって遮断を回避し、アポトーシスを生じることが示された（Ｄｂａｉｂｏら，１９９７）。
【００８６】
対照的に、Ｂｃｌ−２は、セラミド生成と干渉することなくＴＮＦ−αにより誘導される細胞死およびセラミドにより誘導される細胞死の両方から保護される。このことは、Ｂｃｌ−２がセラミド経路のさらに下流で機能することを示唆する（Ｄｂａｉｂｏら、１９９７）。
【００８７】
（Ｂ．Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬまたはそのホモログの増強された発現）
Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーが、アポトーシスのインヒビターまたはプロモーターのいずれかとして作用することが示された。Ｂｃｌ−２は、その発現が、Ｂ細胞の悪性腫瘍（Ｒｅｅｄによって広範に論表される）における染色体の転座によって増加される遺伝子として発見された。Ｂｃｌ−２は、大多数の濾胞性非ホジキンリンパ腫において活性化され、そして他の悪性腫瘍（例えば、前立腺癌）においてほとんど活性化されないことが見出されている。その活性はまた、いくつかの良性の状態（例えば、リンパ節および扁桃腺の濾胞性肥大）において見出されている。
【００８８】
リンパ球細胞、繊維芽細胞、神経細胞および造血細胞を含むが、これらに限定されない多数の型の細胞において、Ｂｃｌ−２の発現が、アポトーシスを遅延またはさらに予防することが示されている。逆に、多数のこれらの系におけるＢｃｌ−２の下方制御は、アポトーシスを促進することが示されている。Ｂｃｌ−２は、代表的にインタクトな細胞の核エンベロープ、小胞体、およびミトコンドリアに見出される膜関連タンパク質である。
【００８９】
遺伝子産物のＢｃｌ−２ファミリーは、一般にアポトーシスのプロセスに関与する。Ｂｃｌ−２ａおよびＢｃｌ−ＸＬは、抗アポトーシスタンパク質と考えられ（ＢｏｉｓｅおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ，１９９５；Ｓｃｈｅｎｄｅｌ，１９９８）、そしてリンパ球細胞および骨髄細胞における先の研究は、細胞増殖の維持および細胞死の予防におけるＢｃｌ−２ａの役割を示している（Ｃｏｈｅｎ，１９９３）。さらに、Ｂｃｌ−２ａは、おそらく反応性酸素種の生成を減少すること（Ｋａｎｅら，１９９３）によって、神経細胞のアポトーシスの予防において有意な役割を果たす（Ｇａｒｃｉａら，１９９２）。
【００９０】
多くの細胞の生存性は、サイトカインまたは増殖因子の一定の供給または間欠的な供給に依存する。このようなサイトカインまたは増殖因子が存在しない場合、細胞はアポトーシスを受ける。タンパク質のＢｃｌ−２ファミリーは、サイトカインによって媒介されるアポトーシスのプロセスに不可欠である。Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ＸＬの過剰発現は、サイトカインが回収される場合、アポトーシスを抑制することが示されている。ＢＡＸおよびＢＡＫの過剰発現は、サイトカインレセプターから入ってくるシグナルを無効にし、そしてアポトーシスを誘導することが示されている。
【００９１】
本発明の１つの例示的な適用において、Ｂｃｌ−２過剰発現細胞を、ｐＳＶ−２−Ｂｃｌ２発現プラスミドを用いて標的細胞株をトランスフェクトすることによって作製した（Ｒｅｅｄら，１９８８；Ｒｅｅｄら，１９８１）。Ｂｃｌ−２過剰発現細胞を、作製し、選択し、そしてさらにサイトカインおよび他のタンパク質を生成するのに有効な様式で培養し、次いで、培養物を、以下の実施例４にさらに記載されるように、サイトカイン生成またはタンパク質生成について分析した。
【００９２】
（Ｃ．ｅＩＦ２−αリン酸化の抑制）
ＰＫＲが、前単球Ｕ９３７細胞を含む細胞におけるＴＮＦ誘導アポトーシスおよびｐ５３媒介アポト−シスにおいて重大な役割を果たすことが、実証されている（Ｙｅｕｎｇ，Ｍ．Ｃ．ら，１９９６；Ｙｅｕｎｇ，Ｍ．およびＬａｕ，Ａ．Ｓ．，１９９８）。ＰＫＲアンチセンス発現プラスミドまたはＰＫＲ変異発現プラスミドを用いてＵ９３７細胞をトランスフェクトすることによる、ＰＫＲ活性の抑制は、細胞をＴＮＦまたは内毒素誘導細胞毒性に対してより耐性にする。ｅＩＦ−２αは、ＰＫＲの生理学的基質であるため、そのＰＫＲによるリン酸化は、アポトーシスを誘導するのに十分であることが示されている。
【００９３】
一貫して、ＴＮＦ誘導アポトーシスは、ｅＩＦ−２のαサブユニットのリン酸化の増加に関連している（Ｓｒｉｖａｓｔａｖｅら，１９９８）。
【００９４】
前述のように、ｅＩＦ−２αは、リン酸化後の細胞およびウイルスのタンパク質合成の阻害に寄与する。この因子のリン酸化部位を変異することによる、ｅＩＦ−２αのＰＫＲ媒介リン酸化の抑制が、培養された細胞株におけるＰＫＲ過剰発現のアポトーシスへの影響を阻害する手段を提供することが理解される。
【００９５】
改変体ｅＩＦ−２αタンパク質を、強いウイルス性プロモーターの制御下で、修飾された形態のｅＩＦ−２αについてのコード配列を含むベクターを用いて、リンパ系細胞において発現した。ｅＩＦ−２ａの修飾形態を発現する細胞を、作製し、選択し、さらに目的のサイトカインまたは他のタンパク質の生成をもたらすのに有効な様式で培養し、そして目的のサイトカインまたは他のタンパク質の生合成について分析した（データは示されていない）。
【００９６】
（Ｄ．内因性ＦＡＤＤ活性の抑制）
Ｆａｓレセプターは、ＴＮＦおよび神経増殖因子レセプタースーパーファミリーのメンバーである（Ｓｔｅｌｌａｒ，１９９５）。Ｆａｓレセプターに対するＦａｓリガンドの結合に続いて、アポトーシスは、ＦＡＤＤ、ＦＬＩＣＥおよびＴＲＡＤＤを含むすぐ下流のエフェクターを介して開始される。ＦＡＤＤは、ＣＤ９５リガンドおよびＴＮＦ誘導アポトーシスに欠かせない死のドメインを有する細胞質タンパク質である。
【００９７】
これらのタンパク質の、そのそれぞれのレセプターへの結合は、カスパーゼプロテアーゼカスケードの活性化を生じ、そしてアポトーシスを促進する。Ｆａｓ発現および結果としてのアポトーシスが、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞においてＰＫＲ活性によって調節されることが、先に実証されている（Ｄｏｎｚｅら，１９９９）。ＰＫＲキナーゼ活性が欠損しているトランスドミナントネガティブな変異体でトランスフェクトされた細胞において、Ｆａｓ、ＴＮＦＲ−１、ＦＡＤＤ（Ｆａｓ関連死のドメイン）、ＦＬＩＣＥ、ＢａｄおよびＢＡＸの発現を、抑制し、そしてこの細胞は、アポトーシス誘導剤に対して耐性であった。さらに、ＦＡＤＤが欠損しているマウスの線維芽細胞は、ｄｓＲＮＡ媒介細胞死にほとんど耐性であった（Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎら，１９９８）。
【００９８】
改変体の非機能的ヒトＦＡＤＤ遺伝子およびマウスＦＡＤＤ遺伝子を、野生型ＦＡＤＤ遺伝子から作製した（Ｃｈｉｎｎａｉｙｅｎら，１９９５；Ｙｅｈ，ら，１９９８）。変異遺伝子を使用して、ＰＫＲ媒介細胞毒性に結果として耐性を有するＦＡＤＤ活性を欠損するマウスＦＡＤＤ−／−細胞を作製した（Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ，ら，１９９８）。この結果は、Ｆａｓ媒介細胞死プロセスが、アポトーシスの阻害を可能にする、修飾されたＦＡＤＤ遺伝子を発現する細胞において阻害されるか、または除去されること、およびＦＡＤＤのこの不活性型の阻害効果が、ＰＫＲ活性化によって回避されないことを示唆する。
【００９９】
本発明の実行における使用について、変異されたＦＡＤＤ  ｃＤＮＡ配列を、強いウイルス性プロモーターの制御下で、挿入されたフラグメントを効果的に発現するベクター中に挿入した。修飾された形態のＦＡＤＤを発現する細胞を、作製し、選択し、さらにサイトカインの生成をもたらすのに効果的な様式で培養し、そして目的のサイトカインまたは他のタンパク質の生合成について分析した（データは示されていない）。
【０１００】
（Ｅ．Ｂｃｌ−２のプロアポトーシス対応物の阻害）
一般的に、ＢＡＸ、ＢＡＫ、Ｂｃｌ−Ｘｓおよびその他は、プロアポトーシスタンパク質である（ＢｏｉｓｅおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ，１９９８）。ＢＡＸ、ＢＡＫおよびＢｃｌ−Ｘｓの過剰発現は、細胞生存性と関連するサイトカイン媒介シグナル伝達からのシグナルを無効にし、そしてアポトーシスを誘導することが示されている。
【０１０１】
変異または改変ヒトＢＡＸ、ＢＡＫ、またはＢｃｌ−Ｘｓ  ｃＤＮＡ配列は、挿入されたフラグメントを発現するのに効果的なベクター中に挿入され得る。修飾された形態のヒトＢＡＸ、ＢＡＫ、またはＢｃｌ−Ｘｓを発現する細胞を、これによって作製し、選択し、さらに目的のサイトカインまたは他のタンパク質の生成を生じるのに有効な様式で培養し、次いで、以下に示されるように目的のサイトカインまたは他のタンパク質の生合成について分析した。
【０１０２】
１つの好ましい実施形態において、本発明の実行における使用のための修飾されたｅＩＦ−２ａ、ＦＡＤＤ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、ＢＡＫまたはＢＡＸタンパク質は、天然に見出されるようなそれぞれのタンパク質の誘導型または改変型である。すなわち、この誘導ポリペプチドまたはタンパク質は、少なくとも１つのアミノ酸置換、欠損または挿入を含む。アミノ酸置換、挿入または欠損は、そのタンパク質の生物学的活性に干渉する限り、ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列内の任意の残基で生じ得る。
【０１０３】
このような天然タンパク質の修飾型または改変型は、通常、修飾タンパク質または改変タンパク質をコードするＤＮＡを生成する、当該分野において公知のカセット変異もしくはＰＣＲ変異または別の技術を用いて、ｅＩＦ−２ａ，ＦＡＤＤ，Ｂｃｌ−Ｘｓ、ＢＡＫまたはＢＡＫタンパク質をコードする核酸配列における１つ以上のヌクレオチドの部位特異的変異によって調製され、そしてその後細胞培養において組換え形態でＤＮＡを発現する。
【０１０４】
部位特異的変異は、与えられたタンパク質をコードするＤＮＡへの１つ以上のヌクレオチド配列の変化を誘導する手段を提供する。部位特異的変異の技術は、一般に当該分野において公知であり、そして代表的に、一本鎖形態および二本鎖形態の両方で存在するファージベクターを用いる。
【０１０５】
本明細書中に記載される天然タンパク質の変異型、修飾型または改変型は、適切な核酸配列の点指向性変異または部位指向性変異によってか、または標的遺伝子または対応するタンパク質の機能または活性の阻害を達成する相同組換え（ノックインまたはノックアウト）によって作製され得ることが理解される。
【０１０６】
１つの例示的なアプローチにおいて、修飾されたｅＩＦ−２ａ、ＦＡＤＤ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、ＢＡＫまたはＢＡＫタンパク質をそれぞれコードする遺伝子の酵母およびヒト形態両方についてのｃＤＮＡ配列が、プロモーターの制御下で発現ベクター中に挿入される。例示的なプロモーターは、構成プロモーターおよび誘導プロモーターの両方を含み、これらの例としては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、記載されるようなｔｅｔオンまたはｔｅｔオフ系におけるｔｅｔ応答エレメント（ＴＲＥ）を含むプロモーター（ＣｌｏｎＴｅｃｈおよびＢＡＳＦ）、βアクチンプロモーター、および特定の金属塩の添加によって上方制御され得るメタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｅｎｅｉｎ）プロモーターが挙げられる。
【０１０７】
改変または変異の場合、非機能的ヒトＢＡＸ、ＢＡＫ、またはＢｃｌ−Ｘｓ遺伝子は、異種核酸構築物中に組み込まれ、そしてＢＡＸ、ＢＡＫ，またはＢｃｌ−Ｘｓ活性をそれぞれ欠損する形質転換細胞を作製するために使用され、アポトーシスが阻害される。アポトーシスにおけるこのような生物学的に不活性な形態のＢＡＸ、ＢＡＫ、またはＢｃｌ−Ｘｓの阻害効果は、サイトカイン調節因子（例えば、培養された細胞株におけるアポトーシス細胞死におけるＰＫＲ）の過剰発現の刺激効果を回避する方法を提供する。
【０１０８】
（Ｖ．増強されたサイトカイン活性、発現または産生）
（Ａ．サイトカイン調節因子過剰発現）
１つのアプローチにおいて、哺乳動物細胞中でサイトカイン調節因子の発現を増加させる工程は、サイトカイン活性、発現または産生を増加させるために使用される。従って、１つ以上のサイトカイン調節因子が正常な構成的レベルより多く発現する哺乳動物細胞株、またはサイトカイン調節因子発現が正常レベルより高くなるように誘導され得る哺乳動物細胞株は、サイトカインの産生に有用である。
【０１０９】
所定のサイトカインを産生するために使用される細胞は、任意の哺乳動物供給源由来の１つ以上のサイトカイン調節因子（例えば、ＰＫＲ）を過剰発現し得る。
【０１１０】
例えば、ＰＫＲをコードする核酸配列を含むベクターは、細胞に導入され得、この細胞によってＰＫＲの過剰発現が生じる。このようなベクターにおける使用のために例示的なコード配列としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３５６６３で見出されるヒトｐ６８ＰＫＲ遺伝子由来のコード配列、マウスＰＫＲ遺伝子、ウサギ網状赤血球またはヒト末梢血単核細胞において正常に見出されるＰＫＲの形態、ならびに酵母ＧＣＮ２およびヘミン（ｈｅｍｉｎ）調節されたインヒビターを含む他のｅＩＦ−２αキナーゼ（Ｗｅｋ  ＲＣ，１９９４）。好ましいアプローチにおいて、ＰＫＲのヒトｐ６８キナーゼ形態が、ヒト細胞株中に過剰発現される。
【０１１１】
いくつかの場合において、過剰発現した１つ以上のサイトカイン調節因子は、変異体、改変体形態またはサイトカイン調節因子のネイティブ形態のアナログ（例えば、ＰＫＲの場合において、サイトカインのｄｓＲＮＡ活性および他のタンパク質の転写を媒介し得る非天然タンパク質キナーゼ（通常、ネイティブなＰＫＲタンパク質をコードする遺伝子の改変によって得られる））である。発現に際して、所定のサイトカイン調節因子の変異体または改変体形態は、活性を増加または低減され得る。
【０１１２】
本発明に従って、細胞におけるアポトーシスを阻害することにより、細胞生存度が、例示的サイトカイン調節因子を過剰発現する細胞において増加され得、増強されたサイトカイン産生を生じるということが、発見されている（実施例１および４を参照のこと）。
【０１１３】
特にＰＫＲに関して、ＰＫＲインヒビターであるｐ５３の抑制が、増強されたＰＫＲ活性を生じることが実証されている（Ｔａｎ  ＳＬら、１９９８）。あるいは、血清および増殖因子（例えば、ＩＬ−３）の欠乏が、細胞におけるＰＫＲ活性を誘導するために使用され得るか、またはＰＫＲ発現が、ＰＫＲをコードする核酸配列の発現を制御するプロモーターと相互作用する調節因子によって増強され得る。内因性ＰＫＲをコードする核酸配列の発現の場合、例示的な調節因子としては、インターフェロン誘導性ＧＡＳエレメント、ＩＬ−６感受性ＮＦ−ＩＬ６およびＡＰＲＦエレメントおよびＮＦ−κＢエレメントが挙げられる（例えば、Ｊａｇｕｓ  Ｒ．ら、１９９９およびＷｉｌｌｉａｍｓ  ＢＲ，１９９９を参照のこと）。
【０１１４】
（Ｂ．サイトカイン調節因子を過剰発現する細胞株の生成）
サイトカイン調節因子を過剰発現または過剰産生する細胞は、（ｉ）１つ以上のサイトカイン調節因子を発現し得る親細胞株の制限希釈クローニング、サイトカイン調節因子活性、発現および／または産生についてのスクリーニング、ならびにサイトカイン調節因子活性、発現および／または産生における少なくとも２倍（２×）の増加を示すサブクローンについての選択；あるいは（ｉｉ）サイトカイン調節因子活性、発現および／または産生における少なくとも２倍（２×）の増加を生じるに効果的な条件下で、サイトカイン調節因子をコードする核酸配列を細胞に導入することによるサイトカイン調節因子を発現し得る親細胞株の改変、によって得られ得る。
【０１１５】
次いで、ＰＫＲを過剰発現または過剰産生する細胞は、本明細書中に参考として明確に援用される、同時所有に係る米国特許出願番号０９／６５７，８８１にさらに記載されるように、（ｉ）ＰＫＲを発現し得る親細胞株の制限希釈クローニング、ＰＫＲ活性、発現および／または産生についてのスクリーニング、ならびにＰＫＲ活性において少なくとも２倍（２×）の増加を示すサブクローンについての選択；あるいは（ｉｉ）ＰＫＲ活性、発現および／または産生において少なくとも２倍（２×）の増加を生じるに効果的な条件下で、ＰＫＲをコードする核酸配列を細胞内に導入することによる、ＰＫＲを発現し得る親細胞株の改変、によって得られ得る。
【０１１６】
（Ｉ．内因性サイトカイン調節因子活性、発現および／または産生の増加）
１つの実施形態において、本発明は、内因性サイトカイン調節因子コード配列を過剰発現または過剰産生するネイティブな細胞株、および１つ以上のサイトカインの産生のためのこのような細胞の使用を提供する。
【０１１７】
この実施形態の１つの好ましい局面において、内因性サイトカイン調節因子を過剰発現または過剰産生するネイティブな細胞株は、細胞によるサイトカイン産生を増強するように、抗アポトーシス遺伝子での細胞の形質転換および／または初回刺激および／または誘導によって改変される。
【０１１８】
本方法の実施において、サイトカイン調節因子および１つ以上のサイトカインを発現し得る細胞株（本明細書中「親細胞株」という）が同定され、そして、当業者によって慣用的に使用される標準法を使用して、単一細胞の限定希釈クローニングに供される。一般に、サブクローニング工程は、少なくとも３回、好ましくは少なくとも５回、典型的には５〜１０回、９６ウェルプレート中で実施される。サブクローニングは、親細胞株を培養するために典型的に使用される培養条件を使用して、約３００，０００〜５００，０００個の細胞／ｍｌの集団を得るように増殖させられる。次いで、このサブクローンは、特定のサイトカイン調節因子について当該分野において公知の方法を使用して、転写（ｍＲＮＡ）レベルおよび／またはタンパク質レベル（ウエスタンブロット）および／または生物学的活性を評価することによって、サイトカイン調節因子発現についてアッセイされる。
【０１１９】
例示の目的で、ＰＫＲ活性についてのアッセイとしては、自己リン酸化アッセイ（Ｄｅｒら、１９９５）、ｅＩＦ２αリン酸化についてのアッセイ（Ｚａｍａｎｉａｎ−Ｄａｒｙｏｕｓｈら、１９９９）およびキナーゼアッセイ（ＰＫＲの免疫沈降およびキナーゼについてのインビトロアッセイによって実施される（Ｚａｍａｎｉａｎ−Ｄａｒｙｏｕｓｈら、２０００））が挙げられる。
【０１２０】
サイトカイン調節因子発現および／または産生の分析に一般に適用可能な例示的なアッセイとしては、タンパク質アッセイ（例えば、ウエスタンブロット）、およびｍＲＮＡについてのアッセイ（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）およびノーザンブロッティング、ドットブロッティング）、またはサイトカイン調節因子をコードする核酸配列に基づいた適切に標識されたプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。
【０１２１】
親細胞株のサイトカイン調節因子発現または産生のレベルより少なくとも２倍（２×）、好ましくは３倍（３×）、４倍（４×）、５倍（５×）もしくはそれ以上高いレベルのサイトカイン調節因子発現または産生を示すサブクローンが、選択される。いくつかの場合において、このように選択されたサブクローンは、親細胞株の発現または産生のレベルの１０倍（１０×）以上高いレベルのサイトカイン調節因子発現または産生を示す。
【０１２２】
次いで、選択されたサブクローンは、増強されたサイトカイン産生を生じるに効果的な様式で、改変および／または処理される。改変されるは、一般に、抗アポトーシス遺伝子での細胞の形質転換を意味するが、処理は、一般に、以下にさらに詳述されるように、細胞によるサイトカイン産生を増強するための初回刺激および／または誘導を意味する。
【０１２３】
（２．宿主細胞におけるサイトカイン調節因子をコードする核酸の発現）
本発明はまた、サイトカイン調節因子をコードする核酸配列を含む発現ベクターで形質導入、形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。培養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、形質導入、形質転換またはトランスフェクションの前に予め親細胞株について使用されたものであり、そして当業者に明らかである。
【０１２４】
１つのアプローチにおいて、この細胞株中にＰＫＲが過剰発現されるようにＰＫＲをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結された、宿主細胞株において機能するプロモーターまたは生物学的に活性なプロモーターフラグメントまたは１つ以上（例えば、一連）のエンハンサーを有する発現ベクターを用いて、哺乳動物細胞株がトランスフェクトされる。
【０１２５】
このアプローチの好ましい局面において、細胞は、抗アポトーシス遺伝子を含むベクターで最初にトランスフェクトされ、選択され、そして首尾よい形質転換体はさらに、サイトカイン調節因子を過剰発現する細胞株を産生するように改変される。
【０１２６】
サイトカイン調節因子の過剰発現によって、サイトカイン調節因子活性の正常レベルより高いことが意味される。典型的には、「正常な」サイトカイン調節因子活性または発現は、サイトカイン調節因子活性または発現の範囲として報告され、これは、サイトカイン調節因子をコードするベクターでトランスフェクトされておらず、プライムもしくは導入されておらず、そして感染されていない。対応する親細胞株について、一般に観察される。所定の型の細胞についての正常なサイトカイン調節因子活性の範囲が、培養条件にいくらか依存して変化し得ることは、理解される。
【０１２７】
正常なサイトカイン調節因子発現より高いは、対応する親細胞株によって産生または発現される正常なサイトカイン調節因子レベルの少なくとも１５０％、好ましくは少なくとも２００％、３００％または４００％、より好ましくは５００％以上を意味する。サイトカイン調節因子過剰発現細胞株は、サイトカイン調節因子過剰発現について構成的であり得るか、またはサイトカイン調節因子過剰発現について誘導性であり得る。
【０１２８】
１つの好ましいアプローチにおいて、サイトカイン調節因子過剰発現細胞株は、サイトカイン誘導に利用可能なサイトカイン調節因子のレベルを調節するために、サイトカイン調節因子過剰発現を誘導し得る。
【０１２９】
（Ｃ．増強されたサイトカイン産生）
増強されたサイトカイン調節因子発現が、サイトカイン活性、発現または産生を増強する手段として本明細書中で記載されるが、サイトカイン活性、発現または産生を増強するためにサイトカイン調節因子発現を測定したり直接増加させたりする必要がないことは、理解される。
【０１３０】
１つの代替のアプローチにおいて、サイトカイン産生は、サイトカイン調節因子（例えば、ＰＫＲ、ＩＲＦ−３、ＩＲＦ−７、ＮＦ−ＫＢまたは別の転写因子）、または抗アポトーシスタンパク質をコードする異種性核酸構築物のいずれかをコードする異種性核酸構築物の挿入を伴ってかまたは伴わずに増加され得る。１つの例において、これは、サブクローニングによって選択された抗アポトーシスタンパク質の増強された発現を有する細胞株（例えば、増強されたレベルのＣｒｍＡを発現する細胞株）について選択することによって達成される。このような細胞株は、サブクローニングによる選択の前または後に、サイトカイン調節因子をコードする異種性核酸構築物を導入することによって、改変され得る。
【０１３１】
本明細書中で詳述される場合、適切な方法論を使用する初回刺激および／または誘導によって処理された細胞は、サイトカイン産生の増加を示す。換言すると、本発明は、サイトカイン調節因子発現を増強するための細胞の選択または改変のいずれかを含まない、増強されたサイトカイン活性、発現または産生のための方法および組成物を含む。しかし、適切な条件下で細胞がプライムおよび／または誘導される場合に、このような増強されたサイトカイン調節因子発現が発生し得、増加したサイトカイン産生を生じ得ることは、理解される。
【０１３２】
増強されたまたは「正常より高い」サイトカイン活性、産生または発現は、対応する親細胞株によって示されるサイトカイン活性、産生または発現のレベルの少なくとも１５０％、好ましくは、少なくとも２００％、３００％または４００％、より好ましくは５００％以上を意味する。正常なサイトカイン活性、産生または発現より増強されたかまたは高いサイトカイン活性、産生または発現を示す細胞株は、サイトカイン発現について構成的であるかまたはサイトカインについて誘導性であり得る。
【０１３３】
（ＶＩ．アポトーシスの阻害ならびに増強されたサイトカイン発現および産生）
同様に、本発明を実施する際に使用するための細胞株は、最適なサイトカイン産生についてサイトカイン調節因子発現と組合わせてアポトーシスを調節するために、アポトーシスプロセスを干渉するタンパク質の過剰発現について誘導性である。
【０１３４】
（Ａ．アポトーシスの阻害）
通常、サイトカイン産生は、１つ以上のサイトカイン調節因子および１つ以上のサイトカインの過剰発現によって特徴付けられる細胞株においてアポトーシスを阻害することによって増加され得る。
【０１３５】
１つの好ましい実施形態において、本発明は、第１のプロモーターの制御下において、細胞中のアポトーシスを阻害し得るタンパク質のコード配列を発現するのに効果的な、第１の異種性核酸構築物または発現ベクターでトランスフェクトされた細胞株を提供する。アポトーシスを阻害し得る例示的なタンパク質としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＣｒｍＡ、Ｂｃｌ−２ａ、Ｂｃｌ−ＸＬ、真核生物翻訳開始２α因子（ｅＩＦ−２α）または真核生物翻訳開始因子（ｅＩＦ−３）の改変形態、Ｆａｓ関連死ドメイン（ＦＡＤＤ）の改変形態、Ｂｃｌ−ＸＳの改変形態、Ｂｃｌ−２相同アンタゴニスト／キラー（ＢＡＫ）の改変形態およびＢＡＸ（例えば、Ｂｃｌ−２ａまたはＢｃｌ−ＸＬ）の改変形態。
【０１３６】
この実施形態の１つの局面において、同じ細胞株は、以下に効果的な様式で改変される：（ｉ）アポトーシスを阻害し得るタンパク質（「抗アポトーシス」タンパク質）についてのコード配列を発現すること；および（ｉｉ）１つ以上のサイトカイン調節因子（例えば、ＰＫＲ）についてのコード配列を発現するたこと。通常、このコード配列は、異種性核酸構築物を分離する目的で細胞に導入される。例えば、第１の異種性核酸構築物または発現ベクターは、典型的には、抗アポトーシスタンパク質（例えば、ＣｍＡ）についてのコード配列、第１のプロモーター、および第１の選択マーカーをコードする核酸配列を含む。同様に、第２の異種性核酸構築物または発現ベクターは、典型的には、１つ以上のサイトカイン調節因子（例えば、ＰＫＲ）についてのコード配列、第２のプロモーター、および第２の選択マーカーをコードする核酸配列を含む。しかしながら、両方のコード配列は、単一のベクターを使用して細胞中に導入され得る。
【０１３７】
本発明のこの局面を実施する際に、この細胞は、（１）抗アポトーシスタンパク質をコードする第１のコード配列、第１のプロモーター、第１の選択マーカーをコードする核酸配列およびサイトカイン調節因子をコードする第２のコード配列、第２のプロモーターおよび第２の選択マーカーをコードする核酸配列を含む単一のベクターでトランスフェクトされ得；（２）（上記のような）第１および第２の発現ベクターで同時にトランスフェクトされ得；（３）第１の発現ベクター、選択された安定なトランスジェニック細胞株、次いで、この選択された細胞は、第２の発現ベクターおよび選択された２重の形質転換体でトランスフェクトされ得；（４）選択された安定なトランスジェニック細胞株のみを有する第１の発現ベクターでトランスフェクトされ得るか；または（５）第２の発現ベクター、選択された安定なトランスジェニック細胞株、次いで、この選択された細胞は、第１の発現ベクターおよび選択された２重の形質転換体でトランスフェクトされ得る。
【０１３８】
好ましいアプローチにおいて、上記の（１）〜（５）のいずれか１つに記載されるように調製される安定なトランスジェニック細胞株は、初回刺激および／または誘導されて下にさらに以下に記載されるようにサイトカイン産生をさらに増強する。
【０１３９】
（Ｂ．サイトカイン産生をさらに増強するための細胞の処理）
本発明の別の局面において、アポトーシスを阻害するのに効果的なタンパク質を発現する細胞株は、サイトカイン産生の増加を生じるのに効果的な様式で初回刺激および／または処置（導入）される。
【０１４０】
この細胞株は、細胞株がサイトカイン産生の増加を生じるのに効果的な様式で１種類以上の選択、改変、初回刺激および処理（導入）に供される前またはその後に、アポトーシスを阻害するのに効果的な様式で改変され得る。
【０１４１】
１つの好ましいアプローチにおいて、この方法は、以下：（ａ）抗アポトーシスタンパク質についてのコード配列（例えば、ＣｒｍＡをコードする遺伝子）を含む異種性核酸構築物をその細胞株の細胞に導入することによって、アポトーシスを阻害するのに効果的な様式でサイトカインを産生し得る細胞株を改変し、外因性サイトカイン調節因子をコードする核酸配列を細胞に導入することによってその因子を発現するのに効果的な様式でその細胞株をさらに改変し、その細胞を増殖させてサイトカイン調節因子過剰発現細胞株（これはまた、抗アポトーシス遺伝子を発現する）を産生する工程；または（ｂ）内因性サイトカイン調節因子をコードする核酸配列を過剰発現する細胞を選択し、その細胞を増殖させてサイトカイン調節因子過剰発現細胞株を産生し、そして抗アポトーシスタンパク質についてのコード配列（例えば、ＣｒｍＡをコードする遺伝子）を含む異種性核酸構築物をその細胞株の細胞に導入することによってその細胞株をアポトーシスを阻害するのに効果的な様式でさらに改変して、サイトカイン調節因子過剰発現細胞株（これはまた、抗アポトーシス遺伝子を発現する）を産生する工程；または（ｄ）内因性抗アポトーシス遺伝子（例えば、ＣｒｍＡホモログ）の高レベルの発現を示す細胞を選択する工程；または（ｅ）内因性抗アポトーシス遺伝子（例えば、ＣｒｍＡホモログ）の高レベルの発現を示す細胞を選択し、そしてその細胞株を、内因性サイトカイン調節因子をコードする核酸配列をその細胞に導入することによってこの因子を発現するのに効果的な様式でさらに改変し、そしてその細胞を増殖させてサイトカイン調節因子過剰発現細胞株（これはまた、抗アポトーシス遺伝子を発現する）を産生する工程；ならびに／あるいは（ｆ）初回刺激および／または誘導する工程を含む。
【０１４２】
初回刺激は、処理または誘導と組み合わせて適用する際に、初回刺激剤で細胞を前処理して１つ以上のサイトカインの増強された産生を生じる、周知の事象である。例示的な初回刺激剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）および他のホルボールエステル、カルシウムイオノフォア、インターフェロン−α、インターフェロン−γ、インターフェロン−β、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ、ＥＧＦまたはケモカイン（ＩＬ−８、ＭＣＰまたはＭＩＰ）、ブチル酸ナトリウム、エンドトキシン、キナーゼ活性化因子（例えば、ＰＫＲ、ＰＡＣＴのタンパク質活性化因子）、または翻訳活性化因子（ＮＦ−ＫＢ、ＩＲＦ−３およびＩＲＦ−７を含むＩＲＦ）。適切な初回刺激剤濃度は、科学文献中に見出され得、例えば、５〜５０ｎＭの範囲（好ましくは約１０ｎＭ）のＰＭＡの濃度が適切である。
【０１４３】
誘導または処理とは、微生物（例えば、ウイルス、細菌または真菌）誘導因子の添加、誘導因子のように作用し得る微生物（例えば、エンドトキシンまたは細菌細胞壁を含む抽出物）の抽出物、または細胞培養物に対する非微生物誘導因子のことを指す。
【０１４４】
非微生物誘導の例示的な方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）またはポリｒ（Ｉ）：ポリｒ（Ｃ）（ポリＩＣ）のような二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）への曝露；低分子（例えば、ポリアニオン、ヘパリンデキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、シクロヘキシミド、アクチノマイシンＤ、カルシウムイオノフォアまたは酪酸ナトリウム）への曝露およびサイトカインへの曝露。
【０１４５】
ウイルス誘導の例示的な方法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：（１）生ウイルス（例えば、センダイウイルス、脳心筋炎ウイルスまたは単純ヘルペスウイルス）への曝露；（２）前述のキラーウイルスへの曝露；または（３）単離された二本鎖ウイルスＲＮＡへの曝露。さらに、サイトカイン誘導は、特定の細胞内においてサイトカイン産生を刺激することが知られている特定のサイトカインを添加することによって産生または増強され得る。
【０１４６】
導入剤の添加後、典型的には、導入され、分泌されたサイトカインが所望のレベルを得られるまで、細胞は、さらにインキュベートされる。３７℃で少なくとも１２〜４８時間、そして７２〜９６時間までのインキュベーションが、一般的に十分である。
【０１４７】
この方法の１つの例示的な適用において、細胞は、ＩＦＮ−βで約２４時間プライムされ、続いて最終濃度までの残りの時間の間にアクチノマイシンＤを加えながらポリＩ：Ｃおよびシクロヘキシミドを含む培地に約５時間曝露される。
【０１４８】
この方法の別の例示的な適用において、細胞は、ＩＦＮ−βで約２４時間初回刺激され、次いでウイルス誘導因子（例えば、センダイウイルス（ＳＶ））で約１時間処理することによって導入し、続いて、最終濃度までの残りの時間の間にアクチノマイシンＤを加えながらポリＩ：Ｃおよびシクロヘキシミドを含む培地に約５時間曝露させる。
【０１４９】
実施例１は、ＣｒｍＡ発現細胞株の産生、ＣｒｍＡ発現細胞株の超誘導（ｓｕｐｅｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）およびウイルス誘導を記載する。実施例２は、例示的なベクター、トランスフェクション方法およびサイトカイン調節因子過剰発現細胞株（これはまた、抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−ＸＬを発現し、本発明の実施における使用に適切である）の産生を記載する。実施例３は、例示的なサイトカイン調節因子過剰発現細胞株およびサイトカイン調節因子過剰発現細胞株（これはまた、抗アポトーシスタンパク質を発現する）によるサイトカイン産生を記載する。
【０１５０】
（ＶＩＩ．発現ベクターおよび宿主細胞の形質転換）
（Ａ．発現ベクター）
例示の目的で、異種性核酸構築物または発現ベクターを、ＣｒｍＡ、Ｂｃｌ−ＸＬおよびＰＫＲを発現するトランスジェニック細胞株の産生のために調製した（実施例１および２を参照のこと）。特に、導入可能である市販の供給源および選択されたヒト細胞内における複製から、適切なプラスミドまたは他のベクターを得ることはベクター構築の分野において周知であり、ここで、このプラスミドはまた、選択マーカー、挿入部位、および適切なコントロールエレメント（例えば終止配列）を備え得る。このプラスミドは、それ自身のプロモーターまたは標準的なベクターにおいて交換され得るプロモーターを有しても有さなくてもよい。
【０１５１】
本発明を実施する際に使用するための異種性核酸構築物または発現ベクターとしては抗アポトーシスタンパク質についてのコード配列単独またはサイトカイン調節因子についてのコード配列との組み合わせが挙げられる。用語「抗アポトーシスタンパク質」は、直接的にアポトーシスを阻害するタンパク質（例えば、ＣｒｍＡ、Ｂｃｌ−２ａまたはＢｃｌ−ＸＬ）またはアポトーシスに関連するタンパク質の改変形態（例えば、真核生物のｅＩＦ−２α、ｅＩＦ−３、ＦＡＤＤ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、ＢＡＫまたはＢＡＸ（例えば、Ｂｃｌ−２ａまたはＢｃｌ−ＸＬ）の改変形態）を示し得ることが理解される。
【０１５２】
このようなコード配列の改変形態、このフラグメントおよびスプライシング改変体は、本発明の範囲内に含まれる。さらに、このベクターは、コード配列単独またはさらなるコード配列（例えば、融合タンパク質またはシグナルペプチドコード配列）との組合せを含み得る。
【０１５３】
当業者に公知である切断、連結および細菌の形質転換の標準的な方法は、本発明の実施の際の使用のためのベクターを構築するのに使用される。一般的には、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら、１９９３；およびＧｅｌｖｉｎ、Ｓ．Ｂ．ら１９９０（これらの全ては、本明細書中で参考として明示的に援用される）を参照のこと。本明細書中に開示されるベクターおよび方法は、抗アポトーシスタンパク質およびサイトカイン調節因子についてのコード配列の発現に適切である。任意のベクターは、導入される哺乳動物細胞において複製可能であり生存可能である限り、使用され得る。多くの適切なベクターおよびプロモーターは、当業者に公知であり、市販されている。ヒト細胞における使用に適切なクローニングベクターおよび発現ベクターはまた、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ＦＭら、１９８９に記載され、本明細書中で参考文献として明示的に援用される。この適切なＤＮＡ配列は、種々の手段によってプラスミドまたはベクター（本明細書中で「ベクター」として集合的に述べられる）内に挿入され得る。通常、このＤＮＡ配列は、標準的な手順によって適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。このような手順はおよび関連するサブクローニング手順は、当業者の知識の範囲内であるとみなされる。
【０１５４】
本発明は、上記の１つ以上の核酸コード配列を含む異種性核酸構築物の使用に関する。この構築物は、プラスミドまたはウイルスベクターのようなベクターを含み、そのベクター中に本発明の配列は順方向または逆方向で挿入される。
【０１５５】
ベクターは、典型的には、選択マーカー、挿入部位、種子配列のような適切なコントロールエレメントを備える。このベクターは、調節配列を含み得、この調節配列は、非コード配列（例えば、イントロンおよび制御エレメント）、すなわち、宿主細胞において（および／またはベクターもしくは改変された可溶性タンパク質抗原コード配列が正常には発現されない宿主細胞環境において）コード配列の発現に効果的で、コード配列に作動可能に結合されるプロモーターおよびターミネーターエレメントまたは５’および／もしくは３’非翻訳領域を含む。
【０１５６】
プロモーターは、構成的または誘導性であり得、そして天然に存在する、操作されたプロモーターまたはハイブリッドプロモーターであり得る。例示的なプロモーターとしては、構成的プロモーターと誘導性プロモーターの両方を含み、これらの例としては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、記載されるようなｔｅｔ−ｏｎシステムまたはｔｅｔ−ｏｆｆオフシステム（ＣｌｏｎｅＴｅｘｈおよびＢＡＳＦ）におけるｔｅｔ応答性エレメント（ＴＲＥ）を含むプロモーター、βアクチンプロモーターおよび特定の金属塩の付加によって上方制御され得るメタロチエネインプロモーターがある。多くの適切なベクターおよびプロモーターは、当業者に公知であって、市販されており、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載される。
【０１５７】
このような発現ベクターにおける使用のための選択マーカーは、一般的に、当該分野で公知であり、適切な選択マーカーの選択は、宿主細胞に依存する。選択マーカー遺伝子の例は、抗生物質または他の毒素に対する耐性を付与するタンパク質をコードし、これらの抗生物質または他の毒素としては、アンピシリン、メトトレキサート、テトラサイクリン、ネオマイシン（ＳｏｕｔｈｅｒｎおよびＢｅｒｇ，Ｊ．、１９８２）、ミコフェノール酸（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ、１９８０）、ピューロマイシン、ゼオマイシンまたはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎら、１９８５）が挙げられる。
【０１５８】
細胞は、標準的な手順（これらとしては、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、リポフェクション、またはリポフェクタミン処理が挙げられる）を使用してトランスフェクトされ、そして適切な抗生物質中で選択される。組換えＤＮＡ技術を使用する、ネイティブタンパク質の改変形態のクローニングおよび発現のための手順は、一般に、当該分野で公知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９２およびＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９（これらは、本明細書中に参考として明確に援用される）に記載される。
【０１５９】
（Ｂ．核酸コード配列）
本発明に従って、所定のサイトカイン調節因子（ＣＲＦ）または抗アポトーシスタンパク質（アポトーシスに関連するタンパク質の改変形態を含む）をコードするポリヌクレオチド配列には、これらのタンパク質のスプライス改変体、フラグメント、融合タンパク質、改変形態またはこれらの機能的等価物が含まれ、本明細書中で、まとめて、「ＣＲＦコード核酸配列または抗アポトーシスタンパク質コード核酸配列」と呼ぶ。
【０１６０】
遺伝コードの固有の縮重性に起因して、実質的に同じかまたは機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他の核酸配列が、ＣＲＦコード核酸配列または抗アポトーシスタンパク質コード核酸配列をクローニングおよび発現するために使用され得る。従って、所定のＣＲＦコード核酸配列または抗アポトーシスタンパク質コード核酸配列について、遺伝コードの縮重性の結果として、同じアミノ酸配列をコードする多くのコード配列が生成され得ることが理解される。例えば、トリプレットＣＧＴは、アミノ酸アルギニンをコードする。アルギニンは、代替的に、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＡＧＡおよびＡＧＧによってコードされる。従って、コード領域におけるこのような置換が、本発明に包含される配列改変体内にあることが理解される。いずれかおよび全てのこれらの配列改変体は、ＣＲＦコード核酸配列または抗アポトーシスタンパク質コード核酸配列のネイティブ形態について本明細書に記載された様式と同じ様式で利用され得る。
【０１６１】
「改変体」ＣＲＦコード核酸配列または抗アポトーシスタンパク質コード核酸配列は、ネイティブポリペプチド配列から１アミノ酸以上変更された「改変体」ＣＲＦアミノ酸配列または抗アポトーシスアミノ酸配列をコードし得、これらの両方が、本発明の範囲内に包含される。同様に、ＣＲＦまたは抗アポトーシスタンパク質に関連して、用語「〜の改変（された）形態」とは、ネイティブのＣＲＦコード核酸配列または抗アポトーシスタンパク質コード核酸配列あるいはネイティブのＣＲＦアミノ酸配列または抗アポトーシスアミノ酸配列の、誘導体または改変体を意味する。代表的に、ネイティブＣＲＦまたは抗アポトーシスタンパク質あるいはそのタンパク質のコード配列の「改変形態」は、それぞれ、少なくとも１つのアミノ酸または核酸の置換、欠失または挿入を含む、誘導体配列を有する。
【０１６２】
同様に、本発明の実施における使用のためのポリヌクレオチドには、ネイティブＣＲＦまたは抗アポトーシスタンパク質およびそのスプライス改変体をコードする配列、そのタンパク質コード配列に対して相補的な配列、ならびにＣＲＦコードポリヌクレオチドまたは抗アポトーシスタンパク質コードポリヌクレオチドの新規フラグメントが含まれる。これらのポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態であり得るか、またはＤＮＡの形態であり得、そしてこれらには、メッセンジャーＲＮＡ、合成ＲＮＡおよび合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡが含まれる。このＤＮＡは、二本鎖であっても一本鎖であってもよく、そして一本鎖である場合、コード鎖であっても非コード（アンチセンス、相補的）鎖であってもよい。
【０１６３】
当業者に理解されるように、いくつかの場合、天然に存在しないコドンを有するヌクレオチド配列を生成することが有利であり得る。特定の真核生物宿主によって好ましいコドン（Ｍｕｒｒａｙ，Ｅ．ら、１９８９）は、例えば、ＣＲＦまたは抗アポトーシスタンパク質の発現率を増加するためにか、または天然に存在する配列から生成される転写物よりも望ましい特性（例えば、より長い半減期）を有する組換えＲＮＡ転写物を生成するために、選択され得る。
【０１６４】
ネイティブのＣＲＦコードヌクレオチド配列または抗アポトーシスタンパク質コードヌクレオチド配列は、種々の理由（細胞によるＣＲＦまたは抗アポトーシスタンパク質のクローニング、プロセシングおよび／または発現を改変する変更が挙げられるが、これらに限定されない）で、そのコード配列を変更するために操作され得る。
【０１６５】
（１．サイトカイン調節因子および抗アポトーシスタンパク質）
１つのアプローチにおいて、本発明の実施における使用のための異種核酸構築物または発現ベクターは、その活性形態が所望されるタンパク質のコード配列（例えば、サイトカイン調節因子（ＣＲＦ）のコード配列（本明細書中で、ＰＫＲによって例示される）または抗アポトーシスタンパク質のコード配列（本明細書中で、ＣｒｍＡ、Ｂｃｌ−２またはＢｃｌ−ＸＬによって例示される））を含む。
【０１６６】
本発明の１つの一般的な実施形態において、ＣＲＦコード核酸配列または抗アポトーシスタンパク質コード核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋに見出されるネイティブコード配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、８０％、８５％、９０％または９５％以上の配列同一性を有する。例えば、ヒトＰＫＲの発現に有用なコード配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３５６６３で見出される配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは、８０％、８５％、９０％または９５％以上の配列同一性を有する。
【０１６７】
サイトカイン調節因子コード核酸配列または抗アポトーシスタンパク質コード核酸配列の場合、置換、挿入または欠失は、そのコードされるアミノ酸配列が、ネイティブのサイトカイン調節因子または抗アポトーシスタンパク質の生物学的活性を維持する限り、その配列内の任意の残基で生じ得る。
【０１６８】
（Ｂ．細胞株の選択）
目的の１以上のサイトカインまたはタンパク質を産生し得る、任意の多くの公知の細胞型が、本発明の方法において使用され得る。本発明の実施において、選択された細胞株は、サイトカイン調節因子コード核酸配列および／または抗アポトーシスタンパク質コード核酸配列を発現するような様式で改変される。サイトカインまたは他のタンパク質を産生し得る哺乳動物細胞株は、当該分野で公知の多くの方法（初代細胞株の単離、または商業的供給源からの樹立された細胞株の入手）によって得られ得る。
【０１６９】
従って、本発明は、対応する親細胞株と比較して、サイトカインの増強された産生または発現を生じるのに効果的な、１回以上の選択、改変、刺激および誘導に供された細胞を含む、細胞株を提供する。
【０１７０】
本発明の実施における使用に適切な例示的な細胞株としては、線維芽細胞または免疫細胞、Ｂ細胞（例えば、Ｎａｍａｌｗａ、２９３、Ｒａｊｉ）、単球（例えば、Ｕ９３７、ＴＨＰ−１）、Ｔ細胞、好中球、ナチュラルキラー細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ−３８細胞、Ｆｌｏｗ  １０００細胞、Ｆｌｏｗ  ４０００細胞、ＦＳ−４、ＦＳ−７細胞、ＭＧ−６３細胞、ＣＣＲＦ−ＳＢ細胞、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＷＩＬ２細胞およびＴ９８Ｇ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７１】
ヒト細胞は、本発明の実施に好ましい。本発明の１つの例示的適用において、ヒト細胞株（例えば、Ｎａｍａｌｗａ）は、アポトーシスを阻害するのに効果的な様式で改変され、そしてサイトカインまたは他のタンパク質の増強された産生を生じるのに効果的な様式で、さらに改変、刺激および／または処理される。あるいは、これらの細胞を、アポトーシスを阻害するのに効果的な様式で改変し、そして限界希釈サブクローニングによってサイトカイン調節因子発現について選択して、サイトカイン調節因子発現サブクローンを得て、次いで、これらのサブクローンを、サイトカインまたは他のタンパク質の増強された産生を生じるのに効果的な様式で刺激および／または処理する。本発明の実施において使用され得る適切な初代細胞型の例としては、単球／マクロファージ系統の細胞、リンパ球系統の細胞（Ｔ細胞およびＢ細胞を含む）、マスト細胞、線維芽細胞、骨髄細胞、ケラチノサイト、骨芽細胞由来の細胞、メラノサイト、内皮細胞、血小板、種々の他の免疫系細胞、肺上皮細胞、膵臓実質細胞、グリア細胞、ならびにこのような細胞型由来の腫瘍細胞が挙げられるが、これらに限定されない。改変、刺激および／または誘導された細胞は、親細胞株を培養するために使用される条件下で培養される。
【０１７２】
一般に、細胞は、代表的には、５〜１０％の血清（例えば、胎仔ウシ血清）を補充した、生理学的な塩および栄養素を含有する標準的な培地（例えば、標準ＲＰＭＩ、ＭＥＭ、ＩＭＥＭまたはＤＭＥＭ）中で培養される。培養条件もまた、標準的であり、例えば、培養物は、所望のレベルのサイトカインの発現または産生が達成されるまで、定置培養または回転培養において３７℃でインキュベートされる。サイトカインの回収を容易にするのに効果的な条件下での細胞の培養としては、無血清および／または無タンパク質培地あるいは無血清培地中での培養が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７３】
所定の細胞株についての好ましい培養条件は、科学文献に見出され得るか、そして／または、細胞株の供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／」））から見出され得る。初代細胞株（例えば、線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、内皮細胞、樹状細胞および単球）についての好ましい培養条件は、一般に、科学文献において利用可能である。
【０１７４】
本発明のさらなる適用において、アポトーシスを阻害するように処理される細胞は、目的の所定の組換えサイトカインまたはタンパク質を発現させるために一般的に使用され、その目的のサイトカインまたはタンパク質の発現が、サイトカイン調節因子（例えば、ＰＫＲ）に関連しない、細胞株（例えば、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞）を含む。
【０１７５】
（ＶＩＩＩ．サイトカイン）
サイトカインは、それらの同族のレセプターへの結合、それに続く、種々の生化学プロセスの刺激を導くシグナル伝達によって、それらの生物学的活性を誘発する。いくつかの場合、このようなレセプターの発現は、特定のシグナルによって調節され、例えば、サイトカインは、正または負のフィードバックループに関与し得、それによって、同じかまたは異なるサイトカインに対するレセプターの発現を調節し得る。このようなレセプターは、そのサイトカインを産生する同じ型の細胞または異なる型の細胞のレセプターであり得る。
【０１７６】
サイトカインは、免疫応答および炎症応答を媒介および調節するのに役立つ。一般に、サイトカイン産生は、一過的であり、そして産生は、ｍＲＮＡ転写物の産生を生じる短期間の転写の間に生じ、このｍＲＮＡ転写物もまた、短命であり、そして翻訳後制御機構に供される。近年の研究は、共通のシグナル伝達経路（「Ｊａｋ／ＳＴＡＴ」経路）が種々のサイトカインによって使用されることを示している（Ａｂｂａｓら、１９９７）。
【０１７７】
サイトカインの細胞供給源は、各々個々のサイトカインに顕著に特徴的であり、個々のサイトカインは、複数の異なる細胞型によって産生され得ることが、理解される。さらに、所定のサイトカインは、（１）１より多い細胞型に対して作用し得、（２）同じ細胞に対して１より多い効果を有し得、（３）別のサイトカインと共有する活性を有し得、そして（４）他のサイトカインの合成または効果に影響し得る（例えば、アンタゴナイズすることによってか、またはそれらの効果を相乗作用させることによって）。
【０１７８】
産生されるサイトカインは、以下の１以上であり得る：インターフェロン（ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βを含む）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびＴＮＦ可溶性レセプター（ｓＴＮＦ−Ｒ）を含む）；インターロイキン（ＩＬ）（ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１１およびＩＬ−１２を含む）；コロニー刺激因子（顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含む）；脈管形成因子（線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む）；血小板由来増殖因子１および血小板由来増殖因子２（ＰＤＧＦ１およびＰＤＧＦ２）；ケモカイン（Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｕｐｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｎｏｒｍａｌｌｙ  Ｔ−Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ（ＲＡＮＴＥＳ）を含む）；マクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ）（例えば、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−２α）；単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ）；抗脈管形成因子（アンギオスタチンを含む）；エンドスタチン白血病阻害因子（ＬＩＦ）；毛様体神経栄養因子；カルジオトロフィンおよびオンコスタチン（オンコスタチンＭを含む）。
【０１７９】
本発明の方法はまた、細胞培養物中で産生され得る多くのタンパク質のいずれかの発現を増加させるために使用され得る。例示的なタンパク質としては、インスリン、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、成長ホルモンおよび第ＶＩＩＩ因子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８０】
サイトカインの１つの例示的なグループであるインターフェロン（ＩＦＮ）は、ウイルス感染または腫瘍細胞の増殖に応答して産生される。これらの糖タンパク質は、それらの抗ウイルス効果に加えて、抗腫瘍活性および免疫調節活性を有する。１９９４年より、ＩＦＮは、米国において、特定の臨床徴候に対するＦＤＡ承認を受けている。近年、ＩＦＮ−βの２つの調製物（一方は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて産生され、他方は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において産生される）が、多発性硬化症に罹患している患者について承認された。このＣＨＯ細胞産生産物は、多くの患者において所望でない効果（例えば、注射部位の組織壊死）を引き起こすことに加えて、抗ＩＦＮ抗体、およびインターフェロン免疫複合体の形成を誘導することが示されている。さらなる欠点が、細菌産生ＩＦＮに対しても認められ、これらとしては、抗体の誘導および種々の疾患におけるＩＦＮ−αの限定された効力が挙げられ、これらは、その組換え処方物における全てのサブタイプの欠失に一部起因し得る。以前の研究は、抗体形成によって反映される拒絶の発生率が、天然ＩＦＮ−αについての１．２％のみと比較して、細菌産生ＩＦＮについて２０〜３８％ほどに高くあり得ることを示している（Ａｎｔｏｎｅｌｌｉら、１９９１；Ａｎｔｏｎｅｌｌｉら、１９９７）。
【０１８１】
本発明は、改善された細胞株産生サイトカイン組成物を提供することに関し、この組成物は、組換え処方物中の不適切なグリコシル化もしくはネイティブのサブタイプの完全補体の欠失に起因する、患者に投与された場合の免疫応答の誘発、制限された効力のような所望でない副作用を欠く。
【０１８２】
本明細書中に記載される方法は、増大されたサイトカイン産生を生じるのに有効である。本発明の１つの好ましい局面において、細胞株の改変、培養条件、初回刺激および誘導の１つ以上の組み合わせが、サイトカイン産生における有意な増加（例えば、本明細書中に記載されるような細胞の改変も、処理も、初回刺激も誘導もない同じ条件下で同じ細胞により示されるレベルと比較して、少なくとも２００％（２倍または２×）、２５０％（２．５倍または２．５×）、３００％（３倍または３×）、４００％（４倍または４×）、５００％（５倍または５×）、好ましくは１０００％（１０倍または１０×）またはそれ以上のサイトカインの産生または発現を示す増加）を生じる。いくつかの場合において、本発明の方法は、１００倍（１００×）〜１０００倍（１０００×）またはそれ以上のサイトカイン産生の増加を生じる。
【０１８３】
（ＩＸ．サイトカインまたは他のタンパク質の産生の評価、サイトカインの単離および精製）
（Ａ．サイトカインまたは他のタンパク質の産生の評価）
改変、初回刺激および／または誘導の１つ以上に供された細胞株によるサイトカインまたは目的の他のタンパク質の発現を評価するために、タンパク質レベルおよびＲＮＡレベルで、または発現される個々のサイトカインもしくは他のタンパク質に対して特定の機能的バイオアッセイを使用することによって、アッセイを実施し得る。
【０１８４】
例として、所定のサイトカインの産生および／または発現を、例えば、サイトカインの活性、発現および／または産生についてのアッセイによって、直接サンプル中で測定し得る。このようなアッセイとしては、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノーザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡまたはＲＮＡの分析）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）、または適切に標識されたプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーション（サイトカインコード核酸配列に基づく）および従来のサザンブロッティングが挙げられる。
【０１８５】
あるいは、タンパク質発現は、免疫学的方法（例えば、細胞、組織切片の免疫組織化学的染色、または組織培養培地のイムノアッセイ（例えば、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡ））により評価され得る。このようなイムノアッセイを使用して、サイトカインまたは他のタンパク質の発現を定性的かつ定量的に評価し得る。このような方法の詳細は、当業者に公知であり、そしてこのような方法を実施するための多くの試薬が、市販されている。
【０１８６】
精製形態のサイトカインまたは他のタンパク質は、代表的に、種々のイムノアッセイにおいて使用するための発現タンパク質に特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかを産生するために使用される（例えば、Ｈａｒｌｏｗら、１９８８を参照のこと）。代表的なアッセイとしては、ＥＬＩＳＡ、競合的イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット、間接的免疫蛍光アッセイなどが挙げられる。一般に、市販の抗体および／またはキットは、実施例１におけるインターフェロンβの分析および実施例４におけるインターフェロンαの分析において例示されるように、公知のサイトカインまたは他のタンパク質の発現レベルの定量的イムノアッセイのために使用され得る。
【０１８７】
（Ｂ．サイトカインの単離および精製）
一般に、細胞培養物中で産生されるサイトカインは、培地に分泌され、そして例えば、この細胞培養培地から不必要な成分を除去することによって、精製または単離され得る。代表的に、サイトカインは、選択された特性（例えば、特定の結合因子（例えば、抗体またはレセプター）に対する結合親和性を有するサイトカイン、または選択された分子量範囲を有するか、または等電点の範囲を有するサイトカインを分離するために、分画される。
【０１８８】
一旦、所定のサイトカインまたは他のタンパク質の増加した産生が達成されると、それにより産生されたサイトカインまたは他のタンパク質は、細胞培養物から精製される。このような精製に適切な代表的な手順としては、以下が挙げられる：抗体−アフィニティカラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカゲルまたは陽イオン交換樹脂（例えば、ＤＥＡＥ）のクロマトグラフィー；エレクトロフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；および例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を使用するゲル濾過。種々のタンパク質精製方法が使用され得、そしてこのような方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，１９９０；Ｓｃｏｐｅｓ，１９８２に記載される。選択される精製工程は、例えば、使用される産生プロセスの性質、および産生される特定のサイトカインまたはタンパク質の性質に依存する。
【０１８９】
特定の例が上に記載されるが、多くの改変が可能であること、およびこれらの例は、例示の目的のためのみに提供され、特定されない限りは、本発明を制限しないことが、当業者に明らかである。
【０１９０】
本明細書中で引用される全ての特許および参考文献は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【実施例】
【０１９１】
（実施例１）
（トランスジェニックＣｒｍＡ発現細胞株の調製および特徴付け）
（Ａ．トランスジェニックＣｒｍＡ発現細胞株の調製）
ＣｒｍＡのコード配列を、ＭｉｚｕｓｈｉｍａおよびＮｅｇａｔａ（ＮＡＲ  １８，５３２２，１９９０）により記載されるｐＥＦ  Ｂｏｓベクター（Ｈｕａｎｇら、１９９７により記載されるベクターに基づく）にインフレームで挿入することによって、ｐＥＦ  ＦＬＡＧ−ｃｒｍＡ−ｐｕｒｏ発現ベクターを構築した。ｐＥＦ  ＦＬＡＧ−ｃｒｍＡ−ｐｕｒｏは、強力な伸長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーターの制御下で抗アポトーシスＣｒｍＡタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１４２１７；牛痘ウイルス白痘改変体（ＣＰＶ−Ｗ２）（ＣｒｍＡ）遺伝子、完全コード配列）をコードし、ｐＧＫプロモーターの制御下でピューロマイシン耐性遺伝子をコードする、全長ｃＤＮＡを含む。注目すべきさらなる特徴は、ＣｒｍＡを発現する細胞株の検出を容易にするために、ＣｒｍＡ核酸配列に加えられたＮ末端ＦＬＡＧエピトープのコード配列（Ｈｏｐｐら、１９８８）である。
【０１９２】
このベクターはまた、（ｉ）ポリアデニル化シグナルおよびｍＲＮＡの安定性を増大する転写終結配列；（ｉｉ）エピソーム複製および単純なベクターレスキューのためのＳＶ４０起点；（ｉｉｉ）アンピシリン耐性遺伝子、ならびにＥ．ｃｏｌｉにおける選択および維持のためのＣｏｌＥ１起点；ならびに（ｉｖ）ｐＥＦ  ＦＬＡＧ−ｃｒｍＡ−ｐｕｒｏでのトランスフェクション後のプラスミド含有真核生物細胞の選択および同定を可能にするピューロマイシン耐性マーカー（Ｐｕｒｏ）、を含む。
【０１９３】
トランスフェクションの１日前に、ＭＧ−６３細胞を、５×１０４／ウェルで、６ウェルプレートに播種した。２μｇのｐＥＦ  ＦＬＡＧ−ｃｒｍＡ−ｐｕｒｏプラスミドＤＮＡを、１００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（血清、タンパク質および抗生物質を欠く）中に懸濁した。リポフェクタミン試薬（Ｇｉｂｃｏ，１０μｌ）を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ無血清培地で、１００μｌまで希釈した。これらの２つの溶液を穏やかに混合した後、この混合物を、室温で４５分間インキュベートして、ＤＮＡ−リポソーム複合体を形成させた。ＭＧ−６３細胞の処理の直前に、６００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ無血清培地を、このＤＮＡ−リポソーム混合物を含む反応管に添加して、最終のトランスフェクション溶液を得た。この細胞を、ＰＢＳで洗浄し、続いて、最終のＤＮＡ−リポソーム混合物を添加し、そして３７℃で４時間インキュベートした。その後、１ｍｌのＭＥＭ−５％  ＦＢＳを添加して、さらに１６時間インキュベートした。培養上清を、穏やかに吸引することによって除去し、そして新鮮な細胞増殖培地（５％  ＦＢＳを補充したＭＥＭ）を添加した。４８時間のインキュベーションの後、選択マーカーのジェネティシン（Ｇ４１８、５００μｇ／ｍｌ）を含有する新鮮な培地（５％  ＦＢＳを含むＭＥＭＥ）を添加して、当該分野で公知の標準的な方法を使用して、安定なトランスフェクト体について選択した。要約すると、安定な形質転換体の大量集団を、３〜４週間５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いて選択することによって得た。
【０１９４】
（Ｂ．トランスジェニックＣｒｍＡ発現細胞株の特徴付け）
（１．増加した細胞生存度）
野生型（ＷＴ）ＭＧ−６３細胞およびＣｒｍＡ発現（ＣｒｍＡ−＃２）ＭＧ−６３細胞を、以下の手順を使用して、センダイウイルス（ＳＶ）の誘導および超誘導（ＳＩ；Ｉｎｏｕｅ  Ｉら、１９９１）によって、処理した。
【０１９５】
細胞を、２４ウェルプレートに、２．５×１０４細胞／ウェルの細胞密度で播種し、続いて、５％のＣＯ２濃度で、３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を、ＩＦＮ−β（１００ＩＵ／ｍｌ）で２４時間プライムした。次いで、２％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充した２００μｌのＭＥＭ培地中の１０００血球凝集素単位のＳＶを各ウェルに添加し、そして１時間インキュベートし、続いて、ポリＩ：Ｃ（１００μｇ／ｍｌ）およびシクロへキシミド（５μｇ／ｍｌ）を含有する３００μｌの新鮮な培地を添加し、そしてさらに５時間インキュベートすることによって、細胞を誘導した。アクチノマイシンを、最後の１時間の間に４μｇ／ｍｌの最終濃度になるまで添加した。インキュベーションプロセスの後、この処理した細胞を、ＰＢＳで３回洗浄して、全てのインデューサーを除去し、そして２％  ＦＢＳを含有する新鮮なＭＥＭ中に再懸濁した。
【０１９６】
センダイウイルス（ＳＶ）±でも超誘導法（ｓｕｐｅｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）（ＳＩ）でも処理されていない野生型（ＷＴ）ＭＧ−６３細胞およびＣｒｍＡ発現（ＣｒｍＡ−＃２）ＭＧ−６３細胞を、コントロール（ＵＴ）として使用した。各細胞型の生存度を、標準的なヨウ化プロピジウムＦＡＣＳアッセイを使用して、測定した。図１に示されるように、ＣｒｍＡ発現は、ＳＶ／ＳＩ誘導性細胞死を阻害し、このことは、ＳＶ誘導およびＳＩ処理の２０時間後のＣｒｍＡ発現細胞についての８０％までの生存度により示される。対照的に、同じ条件に暴露された野生型ＭＧ−６３細胞のわずか２０％しか、このプロセス後に生存しなかった。
【０１９７】
（２．サイトカインの増大された産生）
細胞を、２０時間インキュベートし、次いで、各ウェルから培養培地を収集し、そしてＥＬＩＳＡによって、インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）についてアッセイした。このＩＦＮ−β  ＥＬＩＳＡは、供給業者により記載されるようにして行った（Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｂｅｔａ  ＥＬＩＳＡキット；ＴＦＢ，Ｉｎｃ．により供給され、ＦＵＪＩＲＥＢＩＯ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎにより製造される）。図２に示されるように、ＭＧ−６３野生型対応物と比較して、ＣｒｍＡ＃２  ＭＧ−６３細胞により有意により多くのＩＦＮ−βが産生された。
【０１９８】
ＣｒｍＡ発現（ＣｒｍＡ−＃２）ＭＧ−６３細胞を、０ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭ、および８ｍＭのヌクレオシドアナログ２−アミノプリン（２−ＡＰ）（ＰＫＲの公知のインヒビター）を含有する培地中で、超誘導（ＳＩ）処理に供した。
【０１９９】
初回刺激の前日に、５％のＣＯ２濃度、３７℃、２．５×１０４細胞／ウェルの密度で、２４ウェルプレートに細胞を播種することによって、ＳＩ（超誘導）処理を行った。インキュベーション後、この細胞を、ＩＦＮ−β（１００ＩＵ／ｍｌ）で２４時間初回刺激し、次いで、５００μｌの新鮮な培地（ポリＩ：Ｃ（１００μｇ／ｍｌ）およびシクロへキシミド（５μｇ／ｍｌ）を含有する）を添加し、そしてこの細胞を、さらに５時間インキュベートし、アクチノマイシンＤを、最後の１時間の間に、４μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。インキュベーションプロセスの後、この処理した細胞を、ＰＢＳで３回洗浄して、全てのインデューサーを除去し、そして２％  ＦＢＳを含有する新鮮なＭＥＭ中に再懸濁した。
【０２００】
図３に示されるように、２−ＡＰは、用量依存様式で、ＩＦＮ−βの産生を阻害し、このことは、ＰＫＲが、ＩＦＮ−β発現の調節において役割を果たすことを裏付ける。
【０２０１】
（３．ウエスタンブロットによるＦｌａｇ−ＣｒｍＡタンパク質の分析）
上に示すように調製された親の野生型細胞株（ＭＧ−６３−ＷＴ）およびＣｒｍＡ形質転換体（ＭＧ−６３−ＣｒｍＡ−＃２）の細胞を、１００ｍｍ皿中で１００％コンフルエンスまで培養した。細胞を、冷リン酸緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、細胞スクレーパーを使用して、１．５ｍｌの微小遠心チューブに回収した。ＰＢＳでのさらなる洗浄に続いて、細胞を溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ［ｐＨ７．５］、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．２５％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＫＣＬ、１ｍＭ  ジチオトレイトール、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１×Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｃｏｃｋｔａｉｌ  ［Ｒｏｃｈｅ］）中で、１０分間インキュベーションし、次いで、１０，０００ｇで１０分間遠心分離した。溶解物の上清を新規の微小遠心分離チューブに移し、そのタンパク質濃度を製造業者によって提供されるプロトコルに従って、ＢＲＬキットを使用して測定した。
【０２０２】
１００μｇのタンパク質を含む細胞溶解物を、４〜１２％  ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＭＯＰＳゲル上に乗せ、電気泳動的分離にかけ、その後、ゲルをＰＶＤＦ膜にブロッティングした。この膜を、さらに５％ミルク−ＰＢＳ中で、一晩ブロットし、そして、Ａ．Ｓｔｒａｓｓｅｒ博士（Ｒｏｙａｌ  Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の好意によって提供された一次ラット抗Ｆｌａｇ抗体の１／５００の希釈液に、１時間に曝した。ブロットされた膜を、ＰＢＳ  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、二次抗ラットＨＲＰ結合抗体（１：２０００）で、１時間インキュベーションした。Ｆｌａｇ−ＣｒｍＡタンパク質の存在を、ＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、検出した。
【０２０３】
ＣｒｍＡ発現プラスミドでトランスフェクトされた細胞の各々のサンプルは、発現を示さない親の野生型コントロール細胞（ＭＧ６３−ＷＴ）に対比して、高レベルのＦｌａｇ−ＣｒｍＡ発現を示した。
【０２０４】
（実施例２）
（ＰＫＲを過剰発現し、ＰＫＲおよび抗アポトーシスタンパク質を発現するＮａｍａｌｗａ細胞株）
（Ａ．ｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｂｃｌ−ＸＬの調製）
ｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｂｃｌ−ＸＬベクター（Ｈｕａｎｇら、１９９７）は、強力な延長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーターと作動的に連結した抗アポトーシスＢｃｌ−ＸＬタンパク質をコードする全長ｃＤＮＡを含む。ベクターのさらなる顕著な特性は、Ｂｃｌ−ＸＬタンパク質に加えられ、高レベルのＢｃｌ−ＸＬを発現する細胞株の選択を容易にする、Ｎ末端ＦＬＡＧエピトープである（Ｈｏｐｐら、１９８８）。
【０２０５】
このベクターはまた、ｉ）ｍＲＮＡ安定性を増強するポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列；ｉｉ）エピソームの複製および単純なベクターの救出のためのＳＶ４０起点；ｉｉｉ）Ｅ．ｃｏｌｉを選択し、維持するためのアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起点；ならびにｉｖ）Ｂｃｌ−ＸＬおよびＰＫＲのトランスフェクション後の、プラスミド含有真核生物細胞の選択および同定を可能にするピューロマイシン耐性マーカー（Ｐｕｒｏ）を含む。
【０２０６】
（Ｂ．ｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＰＫＲの調製）
ｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＰＫＲべクターは、配列ＭＤＹＫＤＤＤＤＫをコードするＮ末端ＦＬＡＧ  ｔａｇ（Ｈｏｐｐら、１９８８）を含むように、ポリメラーゼ増幅反応によって改変され、真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入された、ヒト全長ＰＫＲ分子（５５１アミノ酸；Ｍｅｕｒｓら、１９９０；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号第ＮＭ００２７５９）をコードするｃＤＮＡを含み、その結果、ＦＬＡＧ−ＰＫＲコード配列は、ＣＭＶプロモーターの制御下で発現された。
【０２０７】
ｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＰＫＲと名づけられたベクターは、ＰＫＲ転写に適切な、以下を含む種々の特徴を含む：ｉ）高レベルのｍＲＮＡ発現のためのヒトＣＭＶの最初期の遺伝子由来のプロモーター配列；ｉｉ）ｍＲＮＡ安定性を強化するためのウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子由来のポリアデニル化シグナルおよび転写終結因子；ｉｉｉ）エピソームの複製および単純なベクターの救出のためのＳＶ４０起点；ｉｖ）Ｅ．ｃｏｌｉを選択し、維持するためのアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起点；ならびにｖ）トランスフェクション後、プラスミド含有真核生物細胞の選択および同定を可能にするＧ４１８耐性マーカー（Ｎｅｏ）。
【０２０８】
ｐＴＲＥ−ＰＫＲと名づけられた、第２のＰＫＲベクターを、同じＰＫＲ  ｃＤＮＡをＣｌｏｎｔｅｃｈから得られるｐＴＲＥプラスミドの制限／挿入部位に挿入することによって調製した。このｐＴＲＥプラスミドは、最初に記載されたＰＫＲベクターの作製に使用されたｐＦＬＡＧに類似するが、挿入された遺伝子の制御に使用されるＣＭＶプロモーターの上流に、テトラサイクリン応答性エレメントを含む。実施例４で報告される研究において、ＴＲＥの機能は、活用されず、形質転換された細胞における、２つのＰＫＲベクターのそのような操作は、本質的に同様であると予想された。
【０２０９】
（Ｃ．６Ａ細胞株の調製）
ヒトＢリンパ芽球腫細胞株Ｎａｍａｌｗａ（ＷＴ）を、プラスミドｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｂｃｌ−ＸＬおよびｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＰＫＲで、続けてトランスフェクトした。安定なトランスフェクトを、８００μＦ、３００Ｖに設定された、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（＋１０％  ＦＢＳ）中の１５μｇのｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｂｃｌ−ＸＬプラスミドで、４ｘ１０６の対数増殖中のＮａｍａｌｗａ細胞をエレクトロポレーションすることによって得た。安定な形質転換体の大量の集団を、３〜４週間で、２μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）で選択することによって得、これを以下のようにフローサイトメトリーによって、Ｂｃｌ−ＸＬ発現についてスクリーニングした。大量の形質転換体を、洗浄し、アセトンで浸透し、続いて、２μｇ／ｍｌのマウス抗ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体（ＩＢＩ）で染色し、次いで、フィコエリスリン結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（１μｇ／ｍｌ；Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で染色した。細胞を、ＦＡＣＳｃａｎで分析し、生存細胞および死滅細胞を、それらの前方および側方光散乱特性に基づいて、Ｂｃｌ−ＸＬ発現細胞をそれらの蛍光強度のレベルによって区別した。次いで、高レベルのＢｃｌ−ＸＬを発現する形質転換体（Ｎａｍａｌｗａ−Ｂｃｌ−ＸＬ）を、ｐｃＤＮＡ  ＦＬＡＧ−ＰＫＲによってトランスフェクトした。
【０２１０】
高レベルのＢｃｌ−ＸＬを発現する、安定なトランスフェクト体を、８００μＦ、３００Ｖに設定された、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（＋１０％  ＦＢＳ）中の１５μｇのｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＰＫＲプラスミドで、４×１０６の対数増殖中のＮａｍａｌｗａ−Ｂｃｌ−ＸＬ細胞をエレクトロポレーションすることによって得た。安定な形質転換体の大量の集団を、３〜４週間で、２ｍｇ／ｍｌのゲネチシン（Ｇ４１８，Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）で選択することによって得た。続いて、クローン株を、限定希釈クローニングによって得、ウエスタンブロット分析によってＢｃｌ−ＸＬおよびＰＫＲ発現について分析した（Ｈｕａｎｇら、１９９７）。タンパク質を２μｇ／ｍｌの抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体、続いて、ヤギ抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼ結合およびＥＣＬ検出（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して同定した。例示的なＢｃｌ−ＸＬ陽性細胞株およびＰＫＲ陽性細胞株を６Ａと示した。
【０２１１】
（Ｄ．Ａ９細胞株の調製）
高レベルのＰＫＲを発現する、安定なトランスフェクト体を、８００μＦ、３００Ｖに設定された、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（＋１０％  ＦＢＳ）中の１５μｇのｐＴＲＥ−ＰＫＲプラスミドで、４×１０６の対数増殖中のＮａｍａｌｗａ細胞をエレクトロポレーションすることによって得た。安定な形質転換体の大量の集団を、３〜４週間で、２ｍｇ／ｍｌのゲネチシン（Ｇ４１８，Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）で選択することによって得た。続いて、クローン株を、限定希釈クローニングによって得、ウエスタンブロット分析によってＰＫＲ発現について分析した（Ｈｕａｎｇら、１９９７）。
【０２１２】
（実施例３）
（トランスジェニックＢｃｌ−ＸＬおよびＰＫＲ発現Ｎａｍａｌｗａ細胞株の特徴付け）
（１．増加した細胞生存度）
野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＷＴ）ならびに実施例３からのＡ９細胞および６Ａ細胞を、ＰＫＲ過剰発現およびサイトカイン誘導の条件下で、培養物内で、細胞生存度について試験した。具体的にいうと、ＰＫＲおよびＢｃｌ−ＸＬで二重トランスフェクトされたＮａｍａｌｗａ細胞（６Ａ細胞株）、ＰＫＲトランスフェクトＮａｍａｌｗａ細胞（Ａ９細胞株）ならびに親Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＷＴ）を、１０％ＦＢＳを補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で、２．５×１０５細胞／ｍｌで培養した。細胞を、２０ｍＭ  ＰＭＡ（初回刺激剤）で２０時間処理し、続いて、２００μｇ／ｍｌのポリｒ（Ｉ）：ポリｒ（Ｃ）および１０μｇ／ｍｌのＤＥＡＥデキストラン（ポリＩＣ誘導）で７２時間処理するか、またはセンダイウイルスの２００ＨＡＵ／１×１０６細胞で４８時間処理するかいずれかを行った。処理に続いて、細胞生存度をＦＡＣＳｃａｎ上で、フローサイトメトリーによって評価した。
【０２１３】
図４Ａは、センダイウイルスの誘導に続いて、細胞生存度が、ＰＫＲトランスフェクトＮａｍａｌｗａ細胞（Ａ９細胞株）および親のＮａｍａｌｗａ細胞（ＷＴ）について類似しており、より高い生存度は、ＰＫＲおよびＢｃｌ−ＸＬで二重トランスフェクトされたＮａｍａｌｗａ細胞（６Ａ細胞株）について観察されたことを示す。
【０２１４】
図４Ｂは、ポリＩＣ誘導に続いて、細胞生存度が、ＰＫＲおよびＢｃｌ−ＸＬで二重トランスフェクトされたＮａｍａｌｗａ細胞（６Ａ細胞株）および親のＮａｍａｌｗａ細胞（ＷＴ）について類似しており、より低い生存度は、ＰＫＲトランスフェクトＮａｍａｌｗａ細胞（Ａ９細胞株）について観察されたことを示す。
【０２１５】
（２．インターフェロン−αの増加された発現）
ＩＦＮ−α産生のレベルをまた、共にＰＫＲ過剰発現条件下の、ポリＩＣおよびセンダイウイルスによるサイトカイン誘導後の３つの細胞株において分析した。培養物の上清を、回収し、ＥＬＩＳＡキットの製造業者（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって提供された手順に従って、ＥＬＩＳＡにより、ＩＦＮ−αレベルについて分析した。
【０２１６】
図５Ａに示された結果は、センダイウイルスの誘導に続いた、ＰＫＲおよびＢｃｌ−ＸＬで二重トランスフェクトされたＮａｍａｌｗａ細胞（６Ａ細胞株）によるＩＦＮ−α産生が、ＰＫＲトランスフェクトＮａｍａｌｗａ細胞（Ａ９細胞株）および親のＮａｍａｌｗａ細胞（ＷＴ）によるＩＦＮ−α産生より有意に高いことを示す。
【０２１７】
図５Ｂに示された結果は、ポリＩＣ産出に続いた、ＰＫＲトランスフェクトＮａｍａｌｗａ細胞（Ａ９細胞株）およびＰＫＲおよびＢｃｌ−ＸＬで二重トランスフェクトされたＮａｍａｌｗａ細胞（６Ａ細胞株）によるＩＦＮ−α産生は、親のＮａｍａｌｗａ細胞（ＷＴ）によるＩＦＮ−α産生より有意に高いことを示す。
【０２１８】
前記から、本発明の種々の目的および特徴が、どのように満たされるかが見られ得る。当業者は、前の記述から、本発明の広い教示が種々の形態で実行され得ることを、ここで理解し得る。従って、本発明は、特定の実施形態およびその例と共に記載されてきたが、本発明の正当な範囲をそのように限定するべきではない。添付された特許請求の範囲によって規定されるように、種々の変化および改変は、本発明の範囲から逸脱することなくなされ得る。
【図面の簡単な説明】
【０２１９】
【図１】図１は、センダイウイルスを用いた超誘導およびウイルス誘導の後の、親の野生型（ＷＴ）のおよびＣｒｍＡを発現（Ｃｒｍ−＃２）するＭＧ−６３細胞における細胞生存性についてのヨウ化プロピジウムアッセイの結果を示す。
【図２】図２は、センダイウイルスを用いた超誘導およびウイルス誘導の後の、親の野生型（ＷＴ）のおよびＣｒｍＡを発現する（ＣｒｍＡ−＃２）ＭＧ−６３細胞におけるインターフェロンβの産生を示す。
【図３】図３は、超誘導の後の、ＣｒｍＡを発現する（ＣｒｍＡ−＃２）ＭＧ−６３細胞におけるインターフェロンβ産生に対する、０、２ｍＭ、４ｍＭおよび８ｍＭの２−アミノプリン（２−ＡＰ；ＰＫＲインヒビター）の効果を示す。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、それぞれ、センダイウイルスおよびポリＩＣによるサイトカイン誘導の後の、生存性の６Ａ細胞株、Ａ９細胞株およびＷＴ細胞株の百分率を示す。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ、センダイウイルスおよびポリＩＣによるサイトカイン誘導の後の、生存性の６Ａ細胞株、Ａ９細胞株およびＷＴ細胞株において産生されたＩＦＮ−αレベルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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