(57)【要約】【課題】本発明は牛乳、乳漿及び除タンパクからＭＵＣ１を分離する方法を提供する。【解決手段】（ａ）牛乳から誘導した乳漿を用意し、（ｂ）該乳漿を濃縮し、（ｃ）該乳漿をｐＨ４．０以下に酸性化し、（ｄ）得られた酸性の乳漿から可溶性タンパクを分離してＭＵＣ１−（ｅ）を残し、（（ｅ）は不溶性膜タンパクと低ｐＩタンパクを含有するフラクション）、（ｆ）ＭＵＣ１含有するフラクションからＭＵＣ１を分離する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
牛乳、乳漿又は除タンパク乳漿から、実施例に記載したようにＭＵＣｌを製造する方法。
【請求項２】
（ａ）牛乳から誘導した乳漿を用意し、（ｂ）該乳漿を濃縮し、（ｃ）該乳漿をｐＨ４．０以下に酸性化し、（ｄ）得られた酸性の乳漿から可溶性タンパクを分離してＭＵＣｌ−（ｅ）を残し、（（ｅ）は不溶性膜タンパクと低ｐＩタンパクを含有するフラクション）、（ｆ）ＭＵＣｌ含有フラクションからＭＵＣｌを分離することを特徴とする牛乳からＭＵＣｌを製造する方法。
【請求項３】
（ａ）牛乳から誘導した脱タンパク乳漿を乳漿タンパク可溶化性溶液で処理し、（ｂ）工程（ａ）で処理した乳漿を遠心処理して可溶性の上澄フラクションを回収し、（ｃ）バッファで洗ったＰＮＡ上にタンパクを吸着し、（ｄ）残溜液から該ＰＮＡを分離し、次いで（ｅ）該ＰＮＡからＭＵＣｌを溶離することを特徴とする牛乳からＭＵＣｌを製造する方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項の方法に従って製造したＭＵＣｌ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は牛乳、乳漿又は脱タンパク乳漿からＭＵＣｌを分離する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＭＵＣｌ即ち上皮性ムチンは高分子量の糖タンパクでありそして必須膜成分である。乳中でそれは哺乳腺中の乳汁分泌細胞から分泌した乳酸リンパ球膜（ＭＦＧＭ）と会合している。牛乳中においてムチンは脂リンパ球によって非常に強くは保持されていず、試料の冷却（又は冷凍）、攪拌又はエージング等の手段によって乳漿中に容易に放出される（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ等、１９９８）。
【０００３】
ヒト，牛、マウスを含むいくつかの哺乳類からのＭＵＣｌ遺伝子がクローンされた（Ｓｐｉｃｅｒ等、１９９５）。異なる哺乳種からのＭＵＣｌムチンはアミノ酸シーケンス中に比較的低い同族関係をもつにすぎないが、構造的にはそれらは関連している（Ｍａｔｈｅｒ、２０００）。このコアタンパクは多くの区別される領域からなっている。それはＮ−末端信号シーケンス、外質ドメイン中の本質的に高度にグリコシル化した２０−アミノ酸リピート、トランス膜アンカー及びプラスミン性テイルをもつ。このタンパクの多形現象（電気泳動ゲルにしばしば１以上のポリペブチド帯が表れる）はコアタンパク中に存在する異なる数のタンデムリピートによることが示された。セリン、スレオニン、プロリン、アラニン及びグリシンがこのアミノ酸の約６０％を占める。完全な牛ＭＵＣｌシーケンスは報告されていず、タンデムリピート、Ｎ−末端７２アミノ酸及びＣ−末端１９２アミノ酸が明らかにされている。
【０００４】
ＭＵＣｌの約５０％は炭水化物であり、そしてグリカンがムチン分子のある領域中でアミノ酸の３分の１といった多さで結合されうる。大半の結合はセリン及びスレオニンのヒドロキシル基を介してのもの（Ｏ−結合）だが、幾分かはアスパリジンのアミド基を介してのＮ−グルコシル化による（Ｐａｔｔｏｎ等、１９９５）、分子のほとんどの部分でのこのグリカンの密な充填がタンパク骨格のタンパク分解を防ぎ、ムチンの生化学的及び機能的特徴に重要な役割をはたしている。グリカンは長さが大きく変わり、１〜２０の残渣をもちうる。
【０００５】
牛乳は古くは２つのグループの研究者によってＭＦＧＭから精製された。Ｃａｗｓｔｏｎ等（１９７６）はセファロース６Ｂ及びヒドロキシルアパタイトカラムクロマトグラフィーによって牛乳脂リンパ球膜から糖タンパクＡ（後にＭＵＣｌと命名）を精製した。アミノ酸組成分析はセリン、プロリン及びスレオニン、アスパラギル酸及びグリシンが主成分であることを示した。別のグループ（Ｓｎｏｗ等、１９７７）はクロロホルム／メタノールでクリームを抽出し、ＳＤＳ（ナトリウムドデシルサルフェート）中でのセファデックスＧ−２００上の繰り返しのクロマトグラフィーにより、牛乳脂リンパ球膜から主要過ヨウ素酸塩−シップ陽性成分（糖タンパク−２）を精製した。この糖タンパクはＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ナトリウムドデシルサルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）によると９５％以上の純度であった。分子量は５％ゲル上で１８５，０００だが、１２．５％ゲル上では７０，０００に変わった。この糖タンパクは炭水化物を５０重量％含み、唾液酸（３０．５％）、Ｎ−アセチルグルコサミン（２２．３％）、ガラクトース（１５．９％）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（１４．０％）、マンノース（１１．１％）及びフコース（５．８％）が主要単糖類である。セリン、グルタミン酸、グリシンのアラニン及びスレオニンが主要アミノ酸である。これらのタンパクは後に牛ＭＵＣｌと命名された（Ｐａｔｔｏｎ等、１９９５）。
【０００６】
牛中のＭＵＣｌの遺伝的な多形現象は周知である（Ｐａｔｔｏｎ等、１９８９，１９９０，１９９２，Ｈｕｏｔｔ等、１９９５）。牛ＭＦＧＭタンパクのゲル電気泳動ではＰＡＳ（タンパクＡセファロース）又は銀ステイン法で容易にＭＵＣｌ帯を同定できる。遺伝的多形現象の故に、ＭＵＣｌは個々の動物から１つの分散帯として又は１つ又は２つ以上の区別される帯として現れる。見掛上Ｍに区分される約１５６，０００〜１９３，０００の５つのＭＵＣｌ帯が１１９頭のホルスタイン牛から同定された。８００頭の市販のホルスタインから集めた試料では、１８９，０００、１７７，０００及び１５６，０００のＭＵＣｌ形が最も一般的で、１５６，０００が幾分弱かった（Ｈｕｏｔｔ等、１９９５）。
【０００７】
ムチンは微生物に対する物理的バリア分子としてまた細胞表面上で潤滑剤として作用することが知られている。細胞表面上に広く分布したムチンは独特の長いフィラメント状の物性との組合せで細胞を保護する。ヒトのＭＵＣｌは頬の上皮細胞に対するＳ−有縁采Ｅコリの付着を阻害する（Ｓｃｈｒｏｔｅｎ等、１９９２）、精製したヒトのＭＵＣｌはまたロタウイルスと結合してその感染を阻害することも報告されている（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ等、１９９７）。
【０００８】
ヒトのＭＵＣｌは他の種と比較して広く検討されてきた。資源に限りがあることがその実用化を困難にしてきた。これに対し牛乳は数１００万ポンドといった多量が毎日市場で扱われており、ムチン製造の優れた原料となるうる。新鮮な牛乳中のＭＵＣｌはクリームフラクション中でＭＦＧＭと会合しているが、冷却処理後のスキムミルク中にほとんどが存在することが判明した（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ等、１９９８）。スキムミルクや乳漿フラクションからの牛のＭＵＣｌの精製についてのデータ発表はなくまた精製したＭＵＣｌタンパクは市販もされていない。
【０００９】
本発明の目的は市販原料である牛乳、乳漿又は高力価、高品質の乳漿製品からＭＵＣｌを分離し、精製する方法を提供することにある。
牛のＭＵＣｌの同定：
ＭＵＣｌ帯は炭水化物に特異的なＰＡＳステイン法で同定した。ＭＵＣｌは乳タンパクのなかで最も高分子量の糖タンパクであり、約５０％の炭水化物を含有するので、ＭＵＣｌ帯はＰＡＳステイン法で容易に同定できそしてコーマッシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ）ステイン剤では染まりにくい。前記した多くのホルスタインから染めた牛乳からのＳＤＳゲル上に示されたＭＵＣｌ帯の報告に基づき、本発明者等は分子量が１６０〜１９０Ｋｄの濃縮乳漿と脱タンパク乳漿中のＭＵＣｌ帯を同定した（図１）。
ゆるやかな電気泳動移動度（約１８０−１９０Ｋｄ）をもつこの帯がより強く且つより分散し、より速い移動度をもつものがより弱かった。
【００１０】
ムチン帯を確認するために、牛のＭＵＣｌに特異的なＣ−末端１６アミノ酸ペプチドを合成し、うさぎからつくった抗血清と共役させた。この抗体は免疫沈降で機能した。この高分子量帯は免疫沈降（ＩＰ）でＭＵＣｌであることを確認した（図２）。
ゆるやかな移動度と速い移動度のムチン帯のいずれもペプチド抗体によって沈降した。
【００１１】
本発明の目的はＭＵＣｌの改良された製造法を提供することにある。
これた及び他の目的はＭＵＣｌの改良された製造法を提供する本発明によって達成され、以下その好ましい態様を図面及び実施例をまじえて説明する。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は第１に、以下の牛乳、乳漿又は除タンパク乳漿から、実施例に記載したようにＭＵＣｌを製造する方法を提供する。
本発明は第２に、（ａ）牛乳から誘導した乳漿を用意し、（ｂ）該乳漿を濃縮し、（ｃ）該乳漿をｐＨ４．０以下に酸性化し、（ｄ）得られた酸性の乳漿から可溶性タンパクを分離してＭＵＣｌ−（ｅ）を残し、（（ｅ）は不溶性膜タンパクと低ｐＩタンパクを含有するフラクション）、（ｆ）ＭＵＣｌ含有フラクションからＭＵＣｌを分離することを特徴とする牛乳からＭＵＣｌを製造する方法を提供する。
本発明は第３に、（ａ）牛乳から誘導した脱タンパク乳漿を乳漿タンパク可溶化性溶液で処理し、（ｂ）工程（ａ）で処理した乳漿を遠心処理して可溶性の上澄フラクションを回収し、（ｃ）バッファで洗ったＰＮＡ上にタンパクを吸着し、（ｄ）残溜液から該ＰＮＡを分離し、次いで（ｅ）該ＰＮＡからＭＵＣｌを溶離することを特徴とする牛乳からＭＵＣｌを製造する方法を提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
ＭＵＣｌの分離：
酪農場から入手した冷却した牛乳を遠心処理して脱脂した。このスキムミルクをｐＨ４．６に調節し、カゼインをこのｐＨで沈殿させて、乳漿をつくり、これをムチン精製に用いた。Ｌｅ  Ｓｕｅｕｒチーズ工場から入手した牛漿もムチン精製の出発原料として用いた。
この乳漿をＵＦ膜で約３倍に濃縮し、ｐＨ３．５でセファデックスＳＰイオン交換樹脂と反応させて主要の乳漿タンパクを吸着させた。残渣をＭＦ膜で濃縮し水中に透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｅｄ）した。この濃縮した脱タンパク乳漿（ＤＰＷ）をＴＢＳ（ｐＨ８）又は１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）プラス０．５Ｍ  ＮａＣｌで１〜３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に全タンパクが約２〜３％になるように希釈した。この溶液を遠心処理し、上澄を上部の脂層を取って回収した。いくつかの異なる種類のレクチン及びペプチド抗体をムチン結合テストに供した。テストしたなかでビーナツ凝集素（ＰＮＡ）がムチンに最も特異的且つ多量に結合した。ＭＵＣｌ精製の最終工程としてＰＮＡ−アガロースアフィニテククロマトグラフィーを行った。１０％ラクトースで溶離後に、溶離液を濃縮し、ＵＦ膜によって蒸留水中に透析濾過し、凍結乾燥した。
【００１４】
【実施例】
下記の実施例は本発明の好ましい態様をさらに説明するものであり、いかなる事項においても限定されるものではない。別段の指示がなけば、全ての部及びパーセントは重量に基づく。
【００１５】
実施例１：牛乳の源
ラ  シューアー（Ｌｅ Ｓｕｅｕｒ）所在のダビスコ  チーズ  プラントは酪農場から購入された牛乳を提供した。
【００１６】
実施例２：牛乳漿の調製
牛乳漿をＫａｎａｍａｒｕ他（１９９３）従って又はラ  シューアー  チーズプラントから直接に調製した。主として、牛乳を遠心分離して最上部の脂肪層を除き且つスキンミルクを集めた。牛乳漿を、ｐＨを４．６に調整し且つ遠心分離によってカゼイン沈殿物を除いて得た。
【００１７】
実施例３：ＭＦ濃縮脱タンパク乳漿（ＤＰＷ）の調整
牛乳漿を遠心分離膜によって３倍に濃縮し、該濃縮牛乳漿をｐＨ約３．５に調整した。低ｐＨのこの乳漿をＳＰイオン−交換クロマトグラフィー処理に付し、主な乳漿タンパクを除いた。殆ど不溶性の膜タンパク及び低ｐＩ（等電点）値をもつタンパクを含有する残留物をダイアフィルトレーション処理に付し、精密ろ過を介して全タンパクの約１０〜１５％に濃縮した。
【００１８】
実施例４：乳漿からのＭＵＣ１の同定
４〜１５％のアクリルアミドゲルを使用して、ＭＦ膜濃縮乳漿及びＤＰＷタンパクを行い、そしてＰＡＳ−染色を使用して、グリコプロテイン、次いで全タンパクを染色するためにクーマシーブルー染色によって染色した（図１）。可能なＭＵＣ１は、高分子量バンドに対してより強力な染色をもち、分子量約１８０〜１９０ｋｄ及び１６０ｋｄの二つの拡散したＰＡＳバンドとして同定された。そしてこれらのバンドは報告されたクーマシーブルーによって染色できない。牛ＭＵＣ１のＣ末端アミノ酸配列は公開され（Ｓｐｉｃｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９５）、そして試験された全ての哺乳種の中で最も良好に保存されることが示された。牛ＭＵＣ１に対して特異的なＣ末端１６アミノ酸配列ペプチドがジンメド  シンセジス  インク（Ｇｅｎｅｍｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｉｎｃ．）及び同社によって家兎から製造された抗血清によって合成された。
免疫沈降が抗血清及び濃縮乳漿を混合することによって達成され、そしてその結果をＳＤＳ−ゲル上に示した（図２）。この免疫沈降の結果が二つの最も大きい分子量のグリコプロテインバンドがＭＵＣ１であることを確認した。
【００１９】
実施例５：ピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）−樹脂アフィニティークロマトグラフィーによる精製
濃縮された及びダイアフィルトレーションに付されたＤＰＷを、バッファーＡ（２−３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．５ＭＮａＣｌ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８）で約２〜３％全タンパク濃度に希釈し、室温で１時間一定の攪拌下で可溶化した。溶解混合物を２１，０００ｘｇで３０〜４０分間４〜６℃の温度で遠心分離した。最上の脂肪層を除き、中央の上澄み層をプールした。アガロース固定ＰＮＡをビクターラボラトリー（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から購入し、バッファーＢ（１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１ｍＭＣａＣｌ２ 、ｉｎ  ＴＢＳ、ｐＨ８）の数容量で洗った。バッファーＢで洗ったＰＮＡ−樹脂を可溶化タンパク混合物と混合し、室温で３０〜６０分間反応器中で攪拌して相互作用させた。未結合残留物をポンプで取り出し、この樹脂を、２８０ｎｍでの吸光度がゼロに接近するまで、バッファーＢで次いでＴＢＳバッファーで２〜３回洗った。ＭＵＣ１を、各回毎に、溶離バッファー（ＴＢＳ中の１０％ラクトース又は２００ｍＭガラクトース）の１〜２容量中で２０分間室温で攪拌して溶離し、二回以上繰り返した。溶離液をプールし、濃縮し、スペクトル限外ろ過膜（５０Ｋ）によって及び攪拌限外ろ過細胞中（３０ｋ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから）で蒸留水によってダイアフィルトレーションに付した。濃縮され且つダイアフィルトレーションに付されたＭＵＣ１は凍結乾燥され得る。
【００２０】
実施例６：精製ＭＵＣ１の純度
精製ＭＵＣ１を７．５％又は４〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、純度に付いてチェックした。図３は各レーン毎に約１０ｕｇのＭＵＣ１で充填された、ＰＡＳ次いでクーマシーブルーで染色された７．５％ゲルを示した。二つの主なグリコプロテイン結合を１８０〜１９０ｋｄ及び１６０ｋｄのそれぞれの分子量範囲に示し、そして６０〜７８ｋｄの分子量範囲をもつ三つの極めて微かな結合を示した。ベックマン分光光度計（ＤＵ６５０）による５６０ｎｍ波長での走査ゲルは、ＭＵＣ１結合が全タンパクの９０〜９５％以上を構成することを示した。
【００２１】
実施例７：精製ＭＵＣ１のアミノ酸組成及びシアル酸分析
精製牛ＭＵＣ１のアミノ酸組成分析をプロテイン  ケミカル  ラボラトリーユニバーシティ  オブ  テキサス  メジカル  ブランチ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｒａｎｃｈ） で実施した。タンパクは、ＭＵＣ１に対して報告されたものと一致して、シセリン、プロリン及びトレオニンに富んでいた。表１は、本発明の精製牛ＭＵＣ１のアミノ酸成分と他の二つの研究所（Ｃａｗｓｔｏｎ， ｅｔ ａｌ．， １９７６ 及び Ｓｎｏｗ， ｅｔ ａｌ．， １９７７ ）の成分との比較を示す。ＭＵＣ１中に重量で約１６％のシアル酸を得た。これはスノウ（Ｓｎｏｗ） 他（１３％）によって報告されたものに隣接する。
【００２２】
2004518700.tif 000002
【００２３】
実施例７：ＭＵＣ１のある種の物理特性
凍結乾燥ＭＵＣ１は白色をもった。７〜１０％の濃度で蒸留水に溶解したとき、薄い茶色かかった黄色であった。ゼイフカス  クロス  アーム（Ｚｅｉｆｆｕｃｈｓ Ｃｒｏｓｓ−Ａｒｍ）粘度計によって５％（ｗ／ｗ）精製のＭＵＣ１の粘度試験は３０．４ｃＳｔの粘度を示し、同時に、１０％（ｗ／ｗ）Ｂｉｐｒｏ溶液（ダビスコ  フードで作られた高度に精製された牛漿）はたった１．７２ｃＳｔの粘度をもった。
上記記載は当業者に本発明の実施をさせるためのものである。この記載を理解することによって当業者に明らかになる可能な変更及び変化の全てを詳細に説明するものではない。しかしながら、これらに全ての変更及び変化は、請求の範囲によって定義された記載等で明らかにされる本発明の範囲内に含まれる。請求の範囲は、記載が特に反対であることを指摘しない限り、本発明のために意図された目的を満たすために有効な全ての配置又は配列の指摘された要件及び手段を包含する。
【００２４】
【表１】
2004518700.tif 000003
【００２５】
本発明及びその作用効果は、下記の記載、特に添付した図面と共に理解されるとき、より良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＤＳゲル上の、１６０〜１９０Ｋｄの分子量をもつ、濃縮乳漿及び脱タンパク牛漿の可能なＭＵＣ１バンドを示す濃縮乳漿及びＤＰＷ（脱タンパク乳漿）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図２】高分子量バンドがＭＵＣ１であることを確認する、４〜１５％ＳＤＳ−ＭＥ  ＰＡＧＥ，ＭＵＣ１特異的パンタク抗体を使用する免疫沈降の結果、染色されたＰＡＳ−ＣＢＢ−銀を示す。
【図３】７．５％ＳＤＳ−ＭＥ  ＰＡＧＥ，ＰＡＳ及び染色されたクーマシーブルー  を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004518700.tif 000025
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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