(57)【要約】コード付きキャリヤーの非定位置および／または定位置アレイを使用した生体系の多重分析のための装置、方法、構成およびキットを含むシステム。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多重細胞実験を実施するためのシステムであって、検出可能に明瞭な第１のコードをそれぞれが有する第１のマイクロキャリヤー・クラスと、検出可能に明瞭な第２のコードをそれぞれが有する第２のマイクロキャリヤー・クラスとを含むマイクロキャリヤー・セットを含み、第１のマイクロキャリヤー・クラスが第１の細胞集団を担持し、第２のマイクロキャリヤー・クラスが第２の細胞集団を担持し、そのため、それぞれのマイクロキャリヤー上のコードに従って細胞集団を識別することによって、マイクロキャリヤー・セットを同じ多重実験で分析することができるシステム。
【請求項２】
前記マイクロキャリヤーと結合した細胞集団を識別するための検出可能に明瞭なコードを有する１つまたは複数の追加のマイクロキャリヤー・クラスをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
薬物発見目的で、少なくとも１つの細胞集団が修飾される、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
潜在的な薬物ターゲットまたは薬物ターゲット・セットを発現させるために、少なくとも１つの細胞集団が修飾される、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
異なる核ホルモン・レセプターを発現させるために、少なくとも１つの細胞集団が修飾される、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
少なくとも１つの細胞集団を、細胞レセプター活性を活性化させ、抑制し、または強化するモジュレーター候補として選択された１種または数種の化合物に曝露させた、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
細胞レセプター活性を検出するための機構をさらに含む、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
検出機構が、分光学的方法、流体力学的方法または画像化方法を使用する、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
それぞれのマイクロキャリヤー・クラスが１つまたは複数のマイクロキャリヤーを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
コードが光学的に検出可能である、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
コードが電磁放射で検出可能である、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
コードが定位置コードである、請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
マイクロキャリヤーが組織サンプルを担持する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１４】
マイクロキャリヤー・クラスがそれぞれ、患者サンプルの異なる位置の組織のサンプルを担持する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１５】
マイクロキャリヤー・クラスがそれぞれ、コア・サンプルの軸に沿って異なる位置の組織のサンプルを担持する、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
マイクロキャリヤー・クラスがそれぞれ、組織切片をより小さな組織片に分割することによって得た組織サンプルを担持する、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１７】
細胞成分の細胞内分布を検出するために、１つまたは複数の細胞集団が修飾される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１８】
細胞成分が、細胞周期調節因子、核ホルモン・レセプター、キナーゼ、ホスファターゼ、イオン、脂質、炭水化物および潜在的な薬物ターゲットから成る群から選択される、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
細胞成分の量を検出するために、１つまたは複数の細胞集団が修飾される、請求項１に記載のシステム。
【請求項２０】
細胞のＤＮＡ含量を定量するために、１つまたは複数の細胞集団が核染料で標識される、請求項１に記載のシステム。
【請求項２１】
細胞の形態変化を検出するために、少なくとも１つの細胞集団が少なくとも２種類の異なる標識を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項２２】
細胞質分裂モジュレーションの指標として細胞当たりの核数を検出するために、１つまたは複数の細胞集団が細胞質標識および核標識で標識される、請求項１に記載のシステム。
【請求項２３】
１つまたは複数の細胞集団が標識された核を有し、小核の形成を引き起こす有毒因子に曝露された、請求項１に記載のシステム。
【請求項２４】
１つまたは複数の細胞集団が標識された核を有し、小核の形成を引き起こす有毒因子に曝露されており、潜在的な小核形成阻害因子としてモジュレーターを試験する、請求項２３に記載のシステム。
【請求項２５】
紡錐体欠陥を検出するために、１つまたは複数の細胞集団が標識された微小管を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項２６】
紡錐体欠陥を検出するために、１つまたは複数の細胞集団が標識された微小管形成中心を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項２７】
紡錐体欠陥を検出するために、１つまたは複数の細胞集団が標識された微小管および微小管形成中心を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項２８】
１つまたは複数の細胞集団が腫瘍生検材料または針吸引液から得た細胞集団である、請求項１に記載のシステム。
【請求項２９】
１つまたは複数の細胞集団が、特定の遺伝子または遺伝子セットの１種または数種のＤＮＡマーカーで標識される、請求項１に記載のシステム。
【請求項３０】
ＤＮＡマーカーがＨＥＲ−２である、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３１】
第１のマイクロキャリヤー・クラスが、第１のターゲットまたはターゲット・セットによって特性づけられた細胞集団を担持し、第２のマイクロキャリヤー・クラスが、第２のターゲットまたはターゲット・セットによって特性づけられた細胞集団を担持し、そのため第１および第２のターゲットに対する潜在的モジュレーターの効果を、単一の多重検定で検出することができる、請求項１に記載のシステム。
【請求項３２】
第１のターゲットまたはターゲット・セットに対する潜在的モジュレーターの所望の効果が、第２のターゲットまたはターゲット・セットに対する潜在的モジュレーターの所望の効果とは異なる、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
潜在的モジュレーターと第１のターゲットまたはターゲット・セットとの間の相互作用が、有益な治療上の効能を指示し得る、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３４】
潜在的モジュレーターと第２のターゲットまたはターゲット・セットとの間の相互作用が、有害な薬物副作用を指示し得る、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３５】
マイクロキャリヤー・セットが、検出可能に明瞭な第３のコードをそれぞれが有する第３のマイクロキャリヤー・クラスを含み、第３のマイクロキャリヤー・クラスが、毒性学パネルによって特性づけられた細胞型を担持する、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３６】
ウェルの定位置アレイをさらに含み、１つまたは複数のウェルが第１、第２および第３のマイクロキャリヤー・クラスの混合物を含み、そのため、所望ターゲット、非所望ターゲットおよび毒性学パネルに対する潜在的なモジュレーターの効果を単一の多重検定で判定することができる、請求項３５に記載のシステム。
【請求項３７】
表面をさらに含み、マイクロキャリヤー・セットの多クラス部分が表面上の調査部位に任意に分配されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項３８】
調査部位でマイクロキャリヤーの少なくとも１つの画像を取得するように構成された画像化装置をさらに含む、請求項３７に記載のシステム。
【請求項３９】
画像からのコード情報を使用して、細胞に対する実験を解釈する画像解析システムをさらに含む、請求項３８に記載のシステム。
【請求項４０】
コードが複数の色の組合せによって定義される、請求項１に記載のシステム。
【請求項４１】
それぞれのコードが、少なくとも２つの異なる色の光学的に識別可能なマークを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項４２】
表面がガラスである、請求項３７に記載のシステム。
【請求項４３】
画像化装置が、調査部位でマイクロキャリヤーのディジタル画像を取得する、請求項３８に記載のシステム。
【請求項４４】
画像化装置がＣＣＤカメラを含む、請求項４３に記載のシステム。
【請求項４５】
画像化装置が顕微鏡を含む、請求項３８に記載のシステム。
【請求項４６】
画像化装置が共焦点光学構造を含む、請求項３８に記載のシステム。
【請求項４７】
マイクロキャリヤーがそれぞれ細胞結合領域およびコード領域を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項４８】
細胞結合領域とコード領域が実質的に一致した、請求項４７に記載のシステム。
【請求項４９】
細胞結合領域とコード領域が互いと少なくとも部分的に重なり合う、請求項４７に記載のシステム。
【請求項５０】
細胞結合領域とコード領域とが互いから実質的に分離されている、請求項４７に記載のシステム。
【請求項５１】
マイクロキャリヤーが実質的に平らな幾何形状を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項５２】
マイクロキャリヤーがカード形である、請求項１に記載のシステム。
【請求項５３】
マイクロキャリヤーが円筒形である、請求項１に記載のシステム。
【請求項５４】
それぞれのマイクロキャリヤーが、約１０ミクロンから約４ミリメートルの長さまたは直径を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項５５】
８１平方ミリメートルあたり約１、４または１６ウェルの密度を有するマイクロプレートをさらに含み、マイクロプレートが、マイクロプレートの少なくとも１つのウェルの中に第１および第２のクラスからのそれぞれ少なくとも１つのマイクロキャリヤーを有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項５６】
フロー・チャンネルと、フロー・チャンネルに沿って配置され、マイクロキャリヤーがフロー・チャンネルを通過するときにマイクロキャリヤー上のコードを検出するように構成された検出ステーションとを含むマイクロキャリヤー検出装置をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項５７】
細胞フィンガー・プリントを決定するためシステムであって、検出可能に明瞭な第１のコードをそれぞれが有する第１のマイクロキャリヤー・クラスと、検出可能に明瞭な第２のコードをそれぞれが有する第２のマイクロキャリヤー・クラスとを含むマイクロキャリヤー・セットを含み、第１のマイクロキャリヤー・クラスが、第１の細胞成分に特異的に結合する第１の細胞セレクターを少なくとも有し、第２のマイクロキャリヤー・クラスが、第２の細胞成分に特異的に結合する第２の細胞セレクターを少なくとも有し、そのため、特定の細胞集団と第１および第２のマイクロキャリヤーとの間の相互作用を検出することによって、細胞集団のフィンガー・プリント分析を決定することができるシステム。
【請求項５８】
１つまたは複数の細胞成分がレセプターまたは他の細胞表面マーカーである、請求項５７に記載のシステム。
【請求項５９】
マイクロキャリヤー・セットが、検出可能に明瞭なコードと、異なる細胞成分に特異的に結合する異なる細胞セレクターとをそれぞれが有する１つまたは複数の追加のマイクロキャリヤーを含む、請求項５７に記載のシステム。
【請求項６０】
１つまたは複数の細胞セレクターが抗体である、請求項５７に記載のシステム。
【請求項６１】
互いに対して任意に分布した示差的なコードを有する複数の粒子を含み、それぞれの粒子が組織サンプルを支持し、それぞれのコードが、粒子上の組織サンプルについての情報を指示する組織アレイ。
【請求項６２】
組織の多重分析のための構成であって、
光学的に検出可能なコードをそれぞれが含む複数のキャリヤーと、
複数のそれぞれのキャリヤーと結合した組織サンプルと
を含み、
コードが組織についての情報を提供する
構成。
【請求項６３】
細胞集団の多重分析のための構成であって、
容器内にあってそれぞれがコードを含む複数のキャリヤーと、
それぞれのキャリヤーと結合した細胞集団と
を含み、
コードが細胞集団を識別し、細胞集団がレポーティング特性を含む
構成。
【請求項６４】
間接的なレポーティング特性が、形態、生存能力、有糸分裂指数、細胞アイデンティティ、アポトーシス、タンパク質のレベル、ＲＮＡのレベル、タンパク質の細胞内分布、小器官の細胞内分布、核の完全性、細胞周期内の位置、ＲＮＡの細胞内分布、遺伝子の核内分布、リン脂質の細胞内分布、糖脂質の細胞内分布、または細胞検体の細胞内分布およびレベルのうちの少なくとも１つの尺度である、請求項６３に記載の構成。
【請求項６５】
間接的なレポーティング特性が、総核ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、特定の染色体、染色体セット、特定の遺伝子、染色体領域、繰返し配列、組込み外来ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、未処理または処理ＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、任意の型のタンパク質、細胞表面レセプター、ＥＣＭタンパク質、イオン・チャンネル、内在性膜タンパク質、核レセプター、細胞周期レギュレーター、転写因子、ヌクレオソームタンパク質、脂質誘導体、ホルモン、ペプチドホルモン、ステロイドホルモンおよびイオンのうちの少なくとも１つの尺度である、請求項６３に記載の構成。
【請求項６６】
間接的なレポーティング特性が、抗体、実質的に相補的なポリヌクレオチドまたは染料によって顕現する、請求項６３に記載の構成。
【請求項６７】
識別子が細胞の処理または増殖条件を識別し、処理または増殖条件が、電磁放射、熱、放射線、ホルモン、完全細胞、細胞抽出物、細胞基質、フィーダ層、組織抽出物、胚抽出物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質、小分子、イオン強度、増殖因子、ステロイドホルモン、合成分子、合成分子の組合せ、薬物候補、および成長阻害物質への曝露のうちの少なくとも１つを含む、請求項６３に記載の構成。
【請求項６８】
細胞の多重分析のための構成であって、
容器内にあってそれぞれがカラー・コードを含む複数のキャリヤーと、
それぞれのキャリヤーと結合した細胞集団と
を含み、
カラー・コードが細胞集団の識別子を提供する
構成。
【請求項６９】
細胞の多重分析のための構成であって、
容器内にあって、それぞれが電磁的に可読のコードを含む複数のキャリヤーと、
それぞれのキャリヤーの表面と結合した細胞集団と
を含み、
表面に直角に細胞集団を通して見たときに、少なくともコードの一部分が検出可能である
構成。
【請求項７０】
細胞の多重分析のための構成であって、
容器内にあってそれぞれがコードを含む複数のキャリヤーと、
それぞれのキャリヤーと非選択的に結合した細胞集団と
を含み、
コードが細胞集団の識別子を提供し、複数の細胞のうちの少なくとも一部の細胞が、電磁的に検出可能な外因性または内因性のレポーティング特性を含む
構成。
【請求項７１】
コード付きマイクロキャリヤーを作製する方法であって、
感光性フィルムをベース画像に曝露して、フィルム上に画像の複製が記録されるようにすること、および
フィルムを複数の部分に切断して複数のコード付きマイクロキャリヤーを作製すること
を含む方法。
【請求項７２】
ベース画像が光学的に示差的なパターンを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
パターンが白黒パターンである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
パターンが複数の色を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
ベース画像を印刷によって得る、請求項７１に記載の方法。
【請求項７６】
曝露段階が、ベース画像をカメラで撮影することによって実行される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７７】
カメラが３５ｍｍカメラである、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
それぞれの部分の最大特性寸法が約０．１ｍｍから５ｍｍの間である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７９】
それぞれの部分の最大特性寸法が約０．１ｍｍから２ｍｍの間である。請求項７１に記載の方法。
【請求項８０】
それぞれの部分の最大特性寸法が約０．１ｍｍから１ｍｍの間である。請求項７１に記載の方法。
【請求項８１】
生体サンプルにコードを付すための方法であって、
感光性フィルムをベース画像に曝露して、フィルム上に画像の複製が記録されるようにすること、
フィルム上に生体サンプルを固定化すること、および
フィルムを複数の部分に切断すること
を含む方法。
【請求項８２】
切断段階を固定化段階の前に実行する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
固定化段階を切断段階の前に実行する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
生体サンプルにコードを付すための方法であって、
感光性フィルムをベース画像に曝露して、フィルム上に画像の複製が記録されるようにすること、および
フィルムを複数の部分に切断すること
を含み、
それぞれの部分がコード付き画像の一部を含み、
さらに、
生体サンプルをフィルムの部分に付着させること
を含む方法。
【請求項８５】
生体サンプルにコードを付すための方法であって、
感光性フィルムをベース画像に曝露して、フィルム上に画像の複製が記録されるようにすること、
フィルムを複数の部分に予め切断し、溶解可能な付着物質によって前記部分を共通の表面に付着した状態に維持すること、
予め切断したフィルム上に生体サンプルを固定化し、またはｉｎ ｓｉｔｕで合成すること、および
付着物質を溶解し、それによって複数の部分を解放すること
を含み、
それぞれの部分が、生体サンプルの一部およびコード付き画像の一部を含む
方法。
【請求項８６】
分子間相互作用を検出するための方法であって、
第１のコード付きマイクロキャリヤーを第１の分子と結合させて、第１のマイクロキャリヤー・アセンブリーを形成すること、
第１のコード付きマイクロキャリヤーから区別可能な第２のコード付きマイクロキャリヤーを、第１の分子から区別可能な第２の分子と結合させて、第２のマイクロキャリヤー・アセンブリーを形成すること、
第１および第２のマイクロキャリヤー・アセンブリーを少なくとも１種の検出可能な種に曝露すること、および
もしあるのであれば、第１のマイクロキャリヤー・アセンブリーと少なくとも１種の検出可能な種との間の相互作用、および第２のマイクロキャリヤー・アセンブリーと少なくとも１種の検出可能な種との間の相互作用を検出すること
を含む方法。
【請求項８７】
第１のコード付きマイクロキャリヤーと第２のコード付きマイクロキャリヤーが、電磁的に検出可能なコードによって区別可能である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
第１のコード付きマイクロキャリヤーと第２のコード付きマイクロキャリヤーが、電磁的に検出可能な定位置カラー・コードによって区別可能である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
第１および第２のコード付きマイクロキャリヤーが少なくとも実質的に平らである、請求項８６に記載の方法。
【請求項９０】
第１および第２のコード付きマイクロキャリヤーが少なくとも実質的に円筒形である、請求項８６に記載の方法。
【請求項９１】
第１および第２のコード付きマイクロキャリヤーがフィルムから形成される、請求項８６に記載の方法。
【請求項９２】
第１および第２の分子が、抗体、リガンドおよびレセプターから成る群から選択される、請求項８６に記載の方法。
【請求項９３】
第１および第２の分子が化合物ライブラリーの構成要素である、請求項８６に記載の方法。
【請求項９４】
第１および第２の分子が、発現ライブラリーの構成要素、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質、炭水化物または他の生体分子である、請求項８６に記載の方法。
【請求項９５】
少なくとも１種の検出可能な種が、ウィルス、細胞および組織から成る群から選択される、請求項８６に記載の方法。
【請求項９６】
少なくとも１種の検出可能な種が膜表面分子である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
少なくとも１種の検出可能な種が、第１の検出可能な種、および第１の検出可能な種から区別可能な第２の検出可能な種を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項９８】
第１および第２のマイクロキャリヤー・アセンブリーと第１および第２の検出可能な種との間の検出された相互作用に基づいて、第１および第２の検出可能な種のタンパク質発現パターン（またはフィンガー・プリント）を決定することをさらに含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
第１の検出可能な種と第２の検出可能な種が同じ型の細胞であり、第１の検出可能な種が健康な種、第２の検出可能な種が病気の種である、請求項９７または９８に記載の方法。
【請求項１００】
第１の検出可能な種と第２の検出可能な種が同じ型の細胞であり、第１の検出可能な種が第１の病期、第２の検出可能な種が第２の病期にある、請求項９７または９８に記載の方法。
【請求項１０１】
第１の検出可能な種と第２の検出可能な種が同じ型の細胞であり、第１の検出可能な種が第１の病気に感染しており、第２の検出可能な種が第２の病気に感染している、請求項９７または９８に記載の方法。
【請求項１０２】
病気が癌である、請求項９９、１００または１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
少なくとも１種の検出可能な種が少なくとも、第１および第２の検出可能な種から区別可能な第３の検出可能な種をさらに含む、請求項９７または９８に記載の方法。
【請求項１０４】
曝露段階が、第１および第２のマイクロキャリヤー・アセンブリーを少なくとも１種の検出可能な種と混合することを含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項１０５】
相互作用を検出する段階が、対象とするタンパク質を識別するために実行される、請求項８６に記載の方法。
【請求項１０６】
別の研究のための薬物候補を得るために、対象とするタンパク質を分離する段階をさらに含む、
請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
検出段階が、それぞれのマイクロキャリヤーと結合した固有のコードに基づいて、第１および第２のマイクロキャリヤー・アセンブリーを識別することを含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項１０８】
検出段階が、マイクロキャリヤー・アセンブリーの少なくとも１つのディジタル画像を取得することを含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項１０９】
曝露段階および検出段階が顕微鏡スライド上で実行される、請求項８６に記載の方法。
【請求項１１０】
曝露段階および検出段階がマイクロプレート・ウェル中で実行される、請求項８６に記載の方法。
【請求項１１１】
少なくとも１つの検出可能な種から成る区別可能な複数のセットに対して、曝露段階および検出段階を繰り返すことをさらに含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項１１２】
第１のコード付きマイクロキャリヤーが第１のコードを有し、第２のコード付きマイクロキャリヤーが第２のコードを有し、第１のコードと第１の分子、および第２のコードと第２の分子の関係記録を維持することをさらに含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項１１３】
事前結合させたコード付きキャリヤーの非定位置アレイを生成する方法であって、
第１のキャリヤーを第１の細胞分析物質と事前結合させること
を含み、
第１のキャリヤーが、第１の細胞分析物質の態様を識別する第１のコードを含み、
さらに、
第２キャリヤーを第２の細胞分析物質と事前結合させること
を含み、
第２のキャリヤーが、第２の細胞分析物質の態様を識別する第２のコードを含み、
さらに、
事前結合させた第１のキャリヤーと事前結合させた第２のキャリヤーを一緒にすること
を含む方法。
【請求項１１４】
細胞分析のための構成であって、
第１の細胞分析物質と事前結合させた第１のキャリヤー
を含み、
第１のキャリヤーが、第１の細胞分析物質の態様を識別する第１のコードを含み、
さらに、
第２の細胞分析物質と事前結合させた第２のキャリヤー
を含み、
第２のキャリヤーが、第２の細胞分析物質の態様を識別する第２のコードを含む
構成。
【請求項１１５】
第１および第２の細胞分析物質が、トランスフェクション物質、細胞セレクター、モジュレーターおよび局所捕獲物質から成る群から選択される、請求項１１４に記載の構成。
【請求項１１６】
第１および第２の細胞分析物質がそれぞれ、少なくとも２種類の細胞分析物質を含む、請求項１１５に記載の構成。
【請求項１１７】
ライブラリー・スクリーニングの方法であって、
第１のライブラリー・プールを第１のキャリヤーと結合させること
を含み、
第１のプールが第１および第２のライブラリー・メンバーを含み、第１のキャリヤーが第１のプールを識別する第１のコードを含み、
さらに、
第２のライブラリー・プールを第２のキャリヤーと結合させること
を含み、
第２のプールが第３および第４のライブラリー・メンバーを含み、第２のキャリヤーが第３および第４のライブラリー・メンバーを識別する第２のコードを含み、
さらに、
ターゲットと第１および第２のそれぞれのプールとの間の相互作用を試験すること
を含む方法。
【請求項１１８】
第１のライブラリー・メンバーと第２のライブラリー・メンバー、および第３のライブラリー・メンバーと第４のライブラリー・メンバーをそれぞれ、第１のキャリヤーおよび第２のキャリヤーの実質的に重なり合う領域と結合させる、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
第１および第２のプールをそれぞれ、第１および第２、並びに第３および第４のライブラリー・メンバーを含む混合物として結合させる、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２０】
第１、第２、第３および第４のライブラリー・メンバーが、レセプター、リガンド、薬物、抗体、ペプチド、タンパク質、核酸、ファージ、ウィルス、細菌および真核細胞から成る群から選択される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２１】
ターゲットが、レセプター、リガンド、薬物、抗体、ペプチド、タンパク質、核酸、ファージ、ウィルス、細菌および真核細胞から成る群から選択される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２２】
ターゲットが、異なる複数のターゲットの混合物を含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２３】
相互作用が、ターゲットと第１、第２、第３および第４のライブラリー・メンバーのうちの少なくとも１つのメンバーとの間の安定な結合である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２４】
相互作用が、ターゲット、第１、第２、第３および第４のライブラリー・メンバーのうちの１つによって誘発される表現型応答である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２５】
試験が、
第１のキャリヤーと第２のキャリヤーのうちの一方に対応する陽性信号キャリヤーを見つけること
を含み、
陽性信号キャリヤーが、ターゲットと相互作用する陽性ライブラリー・プールを含み、
試験がさらに、
陽性信号キャリヤー上の第１のコードと第２のコードうちの一方を読み取って、陽性ライブラリー・プールを、第１のライブラリー・プールと第２のライブラリー・プールのうちの一方として識別すること
を含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２６】
２次スクリーニング中に、ターゲットと複数のそれぞれのライブラリー・メンバーとの間の相互作用を個別に測定することをさらに含み、複数のライブラリー・メンバーが陽性プールの中に含まれる、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
ライブラリー・スクリーニングの方法であって、
第１のライブラリー・プールを第１のキャリヤーと結合させ、第２のライブラリーを第２のキャリヤーと結合させ、第３のライブラリーを第３のキャリヤーと結合させ、第４のライブラリーを第４のキャリヤーと結合させること
を含み、
第１および第３のキャリヤーが第１のコードを含み、第２および第４のキャリヤーが第２のコードを含み、
さらに、
第１および第２のキャリヤーを第１の位置に配置し、第３および第４のキャリヤーを第２の位置に配置すること
を含み、
第１のコードと第１の位置が第１のプールを識別し、第２のコードと第１の位置が第２のプールを識別し、第１のコードと第２のプールが第３のプールを識別し、第２のコードと第２の位置が第４のライブラリーを識別し、
さらに、
ターゲットと第１、第２、第３および第４のそれぞれのプールとの間の相互作用を試験すること
を含む方法。
【請求項１２８】
第１、第２、第３および第４のプールがそれぞれ複数のライブラリー・メンバーを含み、これらの複数のライブラリー・メンバーを、第１、第２、第３および第４のそれぞれのキャリヤー上の重なり合う領域と結合させる、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
第１、第２、第３および第４のプールがそれぞれ複数のライブラリー・メンバーを含み、これらの複数のライブラリー・メンバーを混合物として結合させる、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３０】
第１、第２、第３および第４のプールがそれぞれライブラリー・メンバーを含み、ライブラリー・メンバーが、レセプター、リガンド、薬物、抗体、ペプチド、タンパク質、核酸、ファージ、ウィルス、細菌および細胞から成る群から選択される、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３１】
ターゲットが、レセプター、リガンド、薬物、抗体、ペプチド、タンパク質、核酸、ファージ、ウィルス、細菌および細胞から成る群から選択される、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３２】
ターゲットが、異なる複数のターゲットの混合物を含む、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３３】
相互作用が、安定な結合と表現型応答のうちの少なくとも一方を含む、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３４】
試験が、
第１、第２、第３および第４のキャリヤーのうちの１つのキャリヤーに対応する陽性信号キャリヤーを見つけること
を含み、
陽性信号キャリヤーが、ターゲットと相互作用する陽性ライブラリー・プールを含み、
試験がさらに、
陽性信号キャリヤー上の第１、第２、第３および第４のコードのうちの１つのコードを読み取り、第１の位置と第２の位置のうちの一方の位置の陽性信号キャリヤーの場所を突き止めて、陽性ライブラリー・プールを、第１、第２、第３および第４のライブラリー・プールのうちの１つとして識別する
ことを含む、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３５】
２次スクリーニング中に、ターゲットと複数のそれぞれのライブラリー・メンバーとの間の相互作用を個別に測定することをさらに含み、複数のライブラリー・メンバーが陽性プールの中に含まれる、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
第１および第２の位置がマイクロプレートのウェルによって定義される、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３７】
ライブラリー・スクリーニングのための構成であって、
第１のコードを有する第１のキャリヤーと第１のキャリヤーと結合した第１のライブラリー・プールとを含む第１のキャリヤー・アセンブリーと、
第２のコードを有する第２のキャリヤーと第２のキャリヤーと結合した第２のライブラリー・プールとを含む第２のキャリヤー・アセンブリーと
を含む構成。
【請求項１３８】
第１、第２、第３および第４のプールがそれぞれ複数のライブラリー・メンバーを含み、これらの複数のライブラリー・メンバーを、第１、第２、第３および第４のそれぞれのキャリヤーの実質的に重なり合う領域と結合させる、請求項１３７に記載の構成。
【請求項１３９】
第１、第２、第３および第４のプールがそれぞれ複数のライブラリー・メンバーを含み、これらの複数のライブラリー・メンバーを混合物として結合させる、請求項１３７に記載の構成。
【請求項１４０】
ライブラリー・スクリーニングのための構成であって、
第１のコードを有する第１のキャリヤーと第１のキャリヤーと結合した第１のライブラリー・プールとを含む第１のキャリヤー・アセンブリーと、
第２のコードを有する第２のキャリヤーと第２のキャリヤーと結合した第２のライブラリー・プールとを含む第２のキャリヤー・アセンブリーと
を含み、
第１および第２のキャリヤーが第１の位置に配置され、
さらに、
第１のコードを有する第３のキャリヤーと第３のキャリヤーと結合した第３のライブラリー・プールとを含む第３のキャリヤー・アセンブリーと、
第２のコードを有する第４のキャリヤーと第４のキャリヤーと結合した第４のライブラリー・プールとを含む第４のキャリヤー・アセンブリーと
を含み、
第３および第４のキャリヤーが第２の位置に配置される
構成。
【請求項１４１】
非定位置アレイ内の逆トランスフェクションされた細胞を多重分析する方法であって、
第１のコード付きキャリヤーを第１のトランスフェクション物質と事前結合させること
を含み、
第１のコード付きキャリヤーが第１のコードを含み、第１のコードが第１のトランスフェクション物質に対応し、
さらに、
第２のコード付きキャリヤーを第２のトランスフェクション物質と事前結合させること
を含み、
第２のコード付きキャリヤーが第２のコードを含み、第２のコードが第２のトランスフェクション物質に対応し、
さらに、
事前結合させた第１および第２のコード付きキャリヤーをそれぞれ第１および第２の細胞集団と結合させ、それによって第１および第２の細胞集団がそれぞれ第１および第２のトランスフェクション物質で逆トランスフェクションされるようにすること、および
第１および第２の細胞集団の特性を測定すること
を含む方法。
【請求項１４２】
第１および第２のコードを読み取ることをさらに含む、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
事前結合段階が、第１および／または第２のトランスフェクション物質をトランスフェクション・エンハンサーに曝露することを含む、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４４】
トランスフェクション・エンハンサーが脂質である、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
事前結合が、それぞれのトランスフェクション物質をコード付きキャリヤーと結合させる前に、それぞれトランスフェクション物質をゲル形成物質と混合することを含む、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４６】
ゲル形成物質がゼラチンである、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
第１および第２のコードが定位置カラー・コードである、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４８】
結合の前に、事前結合させた第１のキャリヤーと第２のキャリヤーを一緒にすることをさらに含む、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４９】
事前結合させた第１および第２のキャリヤーを候補モジュレーターで処理することをさらに含む、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
候補モジュレーターが薬物候補である、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
第１および第２のトランスフェクション物質が少なくとも実質的に核酸である、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１５２】
第１および第２のトランスフェクション物質がプラスミド発現ベクターである、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
プラスミド発現ベクターが、エフェクター・タンパク質またはリポータ・タンパク質を発現する、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
第１および第２のトランスフェクション物質が、構造上または機能上関係するタンパク質をコードする、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５５】
第１および第２のトランスフェクション物質が、野生型親タンパク質の突然変異誘導体をコードする、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５６】
測定が多重フォーマットで実施される、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１５７】
測定がさらに、第１または第２のコードを特性に連結することを含む、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１５８】
測定が、スライド上またはマイクロプレート上で実施される、請求項１４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本出願は、米国特許法第１１９条ならびに適用可能な外国法および国際法に基づいて、以下の米国仮特許出願の優先権を主張する：２０００年１０月１８日出願の出願第６０／２４１，７１４号、２０００年１２月２８日出願の出願第６０／２５９，４１６号、２００１年５月２４日出願の出願第６０／２９３，８６３号、２００１年６月１８日出願の出願第６０／２９９，２６７号、２００１年６月２０日出願の出願第６０／２９９，８１０号、２００１年７月２４日出願の出願第６０／３０７，６４９号、２００１年７月２４日出願の出願第６０／３０７，６５０号、２００１年８月６日出願の出願第６０／３１０，５４０号、２００１年９月４日出願の出願第６０／３１７，４０９号、２００１年９月７日出願の出願第６０／３１８，１５６号、およびＳｉｍｏｎ Ｇｏｌｄｂａｒｄを発明者とする２００１年１０月１０日出願の「ＬＩＢＲＡＲＹ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＵＳＩＮＧ ＣＯＤＥＤ ＣＡＲＲＩＥＲＳ」という名称の出願第      号。これらの出願はその全体が、あらゆる目的に対し参照によって本出願に組み込まれる。
【０００２】
さらに以下の米国特許は、その全体が、あらゆる目的に対し参照によって本出願に組み込まれる：１９７３年１１月１３日発行の第３，７７２，０９９号、１９７５年７月２９日発行の第３，８９７，２８４号、１９７６年６月２２日発行の第３，９６４，２９４号、１９７６年６月２９日発行の第３，９６６，５９９号、１９７６年９月１４日発行の第３，９８０，５６１号、１９７７年１０月１１日発行の第４，０５３，４３３号、１９７８年５月２日発行の第４，０８７，３２７号、１９７８年１２月２６日発行の第４，１３１，０６４号、１９８０年４月８日発行の第４，１９７，１０４号、１９８２年５月１１日発行の第４，３２９，３９３号、１９８２年８月１０日発行の第４，３４３，９０４号、１９８２年１２月１４日発行の第４，３６３，９６５号、１９８３年６月２８日発行の第４，３９０，４５２号、１９８４年９月４日発行の第４，４６９，６２３号、１９８７年１月６日発行の第４，６３４，６７５号、１９８７年２月３日発行の第４，６４０，０３５号、１９８７年３月１０日発行の第４，６４９，１１４号、１９８７年３月２４日発行の第４，６５２，３９５号、１９８８年２月２３日発行の第４，７２７，０４０号、１９８９年５月２３日発行の第４，８３３，０８３号、１９８９年１２月１９日発行の第４，８８８，２９４号、１９９０年３月６日発行の第４，９０６，５７７号、１９９０年５月１日発行の第４，９２１，７９２号、１９９０年１０月１６日発行の第４，９６３，４９０号、１９９１年１月８日発行の第４，９８２，７３９号、１９９１年５月２８日発行の第５，０１９，５１２号、１９９２年１月７日発行の第５，０７９，１６１号、１９９２年１月１４日発行の第５，０８１，０３６号、１９９２年３月１７日発行の第５，０９６，８１４号、１９９２年３月３１日発行の第５，１００，７８３号、１９９２年３月３１日発行の第５，１００，７９９号、１９９２年５月１９日発行の第５，１１４，８５３号、１９９２年６月３０日発行の第５，１２６，２６９号、１９９３年８月３日発行の第５，２３３，３６９号、１９９５年４月２５日発行の第５，４０９，８３９号、１９９５年９月１９日発行の第５，４５１，５０５号、１９９６年１月２３日発行の第５，４８６，８５５号、１９９６年１１月５日発行の第５，５７１，４１０号、１９９８年１月１３日発行の第５，７０８，１５３号、１９９８年４月２１日発行の第５，７４１，４６２号、１９９８年６月２日発行の第５，７６０，３９４号、１９９８年６月２３日出願の第５，７７０，４５５号、１９９８年７月１４日発行の第５，７８０，２５８号、１９９８年６月２３日発行の第      号、１９９８年１０月６日発行の第５，８１７，７５１号、１９９８年１１月２４日発行の第５，８４０，４８５号、１９９９年１０月５日発行の第５，９６１，９２３号、１９９９年１１月９日発行の第５，９８１，１８０号、１９９９年１１月２３日発行の第５，９８９，８３５号、１９９９年１１月２３日発行の第５，９９０，４７９号、２０００年２月１５日発行の第６，０２５，２００号、２０００年８月８日発行の第６，１００，０２６号、および２０００年８月１５日発行の第６，１０３，４７９号。
【０００３】
さらに以下のＰＣＴ特許出願は、その全体が、あらゆる目的に対し参照によって本出願に組み込まれる：１９９７年３月２０日出願のＰＣＴ／ＩＬ９７／００１０５号、１９９８年１０月１４日出願のＰＣＴ／ＵＳ９８／２１５６２号、１９９８年１０月２７日出願のＰＣＴ／ＵＳ９８／２２７８５号、１９９９年１月１５日出願のＰＣＴ／ＵＳ９９／００９１８号、１９９９年１月２２日出願のＰＣＴ／ＵＳ９９／０１３１５号、１９９９年２月１５日出願のＰＣＴ／ＧＢ９９／００４５７号、１９９９年２月２４日出願のＰＣＴ／ＵＳ９９／０４０００号、１９９９年２月２４日出願のＰＣＴ／ＵＳ９９／０４００１号、１９９９年６月２４日出願のＰＣＴ／ＵＳ９９／１４３８７号、１９９９年７月２日出願のＰＣＴ／ＧＢ９９／０２１０８号、１９９９年１０月１２日出願のＰＣＴ／ＳＥ９９／０１８３６号、１９９９年１２月２８日出願のＰＣＴ／ＵＳ９９／３１０２２号、２０００年９月１８日出願のＰＣＴ／ＵＳ００／２５４５７号、２０００年１０月２日出願のＰＣＴ／ＵＳ００／２７１２１号、２０００年１０月２日出願のＰＣＴ／ＵＳ００／４１０４９号、および２０００年１０月１８日出願のＰＣＴ／ＵＳ００／１０１８１号。
【０００４】
さらに以下の米国特許出願は、その全体が、あらゆる目的に対し参照によって本出願に組み込まれる：２０００年４月１４日出願の出願第０９／５４９９７０号および２０００年１０月１９日出願の出願第０９／６９４０７７号。
【０００５】
本発明は生体系の分析に関する。詳細には本発明は、コード付きキャリヤー（ｃｏｄｅｄ ｃａｒｒｉｅｒ）の非定位置（ｎｏｎｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ）および／または定位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ）アレイを使用した、生体系の多重分析（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ）に関する。
【０００６】
【従来の技術】
細胞は、生体系の基本的な構造単位である。したがって細胞の理解は、細胞生物学、生化学、分子生物学などの細胞内現象、ならびに生理学などの多細胞現象の理解に欠くことができないものである。細胞は、生物から直接に得た細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した細胞を使用して研究することができる。生物学者は、細胞を分析することによって、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質および炭水化物などを含む生体分子間、ならびにこのような分子から成る分子集合間の複雑な機能上の関係の多くを学んできた。さらに生物学者は、細胞を使用して、細胞生物学の基本原理を理解し、ヒトの病気を治療しヒトの健康を向上させる薬物候補をスクリーニングすることの価値を学んだ。
【０００７】
細胞実験はしばしば、動物またはヒトで実験する前の予備実験として使用される。例えば薬物スクリーニングでは、動物試験に使用する少数の候補化合物を識別するためにしばしば培養細胞が使用される。これらのスクリーニングで細胞を使用すると、実験動物の命が救われ、実験動物に関連したコストが低減し、哺乳動物などの後生動物で可能な数よりもはるかに多くの実験を実施することができる。さらに、胚幹細胞、成人幹細胞などの１次細胞の分離手法およびｉｎ ｖｉｔｒｏ培養条件が改良されるにつれて、ｅｘ ｖｉｖｏ細胞を用いたよりいっそう多くの細胞分析が実施されるであろう。
【０００８】
細胞ベースの試験またはスクリーニング・システムの威力は、不朽化された安定な細胞系統の巨大なアレイの開発に研究者を駆りたてた。研究者は、これらの安定な細胞系統を、多くの異なる生物、組織および発生段階から得た。この巨大なアレイのサンプリングは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎおよび他の細胞貯蔵機関（ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）から可能である。細胞系統はそれぞれ、その起源、遺伝子型、不朽化の方法、培養条件および環境履歴に基づく明瞭に異なった特性を有するので、全ての実験または化合物スクリーニングに適当な細胞系統はない。実際、細胞系統はそれぞれ固有の特性を有するので、バイオテクノロジー業界および基礎研究者はともに、所与の実験、化合物スクリーニングまたは研究に対して可能な限り多くの細胞系統を分析することによって大きな利益を得る。しかし、細胞を用いた薬物スクリーニングおよび他の分析で高いスループットを求めると、試験する細胞集団の数が限定される。
【０００９】
細胞分析の速度および効率を高める努力が続けられている。具体的には、ディジタル制御されたシステムは、細胞培養、処理およびデータ収集の多くの局面を自動化する能力を提供する。例えば、細胞を平板培養し、栄養を与え、処理し、回収し、その特性を測定するロボット能力を有する機械が既に開発されている。さらに、自動画像化システムは、細胞集団、単一の細胞および細胞内小器官の特性を分析することができる。適当なシステムが、１９９４年１０月１１日発行の米国特許第５，３５５，２１５号および１９９９年１１月２３日発行の米国特許第５，９８９，８３５号に記載されている。これらの特許は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００１０】
このような進歩にもかかわらず、現行のシステムは依然として力ずく（ｂｒｕｔｅ ｆｏｒｃｅ）の方法を使用している。具体的には、現行のシステムは、異なった細胞集団を、別々の容器、例えば多ウェル・マイクロタイター皿の個々のウェルの中で増殖させ、処理し、かつ／または分析している。現行のシステムではこのようにしないと、（１）分析から得られた検定結果と（２）起源、遺伝子型、増殖条件、特定の試験および／または薬物処理などの細胞識別情報とを結びつけることができない。しかし、この力ずくの方法は、細胞の型および処理の数が増えるにつれてますます法外なものになる。例えば、高スループット・スクリーニングでは、別々のサンプル・ウェルの中で１日に１００，０００サンプルを分析することは一般的だが、これには、標準サイズの９６ウェル・マイクロプレートを積み上げて、１日に高さ４０フィート超、１年では高さ３マイル超に相当するマイクロプレートが必要であり、加えて関連試薬も必要である。したがって、より効率的な細胞分析システムが求められている。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、装置、方法、構成およびキットを含む、コード付きキャリヤーの非定位置および／または定位置アレイを使用した生体系の多重分析システムを提供する。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、装置、方法、構成およびキットを含む、コード付きキャリヤー、特に非定位置アレイ中のコード付きキャリヤーを使用した細胞および／または細胞分析物質（ｃｅｌｌ−ａｎａｌｙｓｉｓ ｍａｔｅｒｉａｌ）の多重分析システムを提供する。このシステムはさまざまな利点を提供し、例えば、複数の細胞集団および／または細胞分析物質を単一の容器の中で一緒に試験し分析することができる。マイクロタイター・プレート、ミクロ流体工学（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）およびロボティクスの継続した改良と相まって、このシステムは、分析する細胞型および細胞パラメーターの数、ならびにスクリーニングする薬物候補などの細胞分析物質の数を拡張することによってスループットを増大させることができる。したがって、本発明を使用して、有益な治療薬を識別し、細胞の理解を向上させることができ、それに伴って、ヒトの病気を治療しヒトの健康を向上させる利点も提供する。より一般的には、本発明を使用して、対象とする代謝反応または生理反応を抑制または増強する細胞型、リガンド、または細胞型とリガンドの組合せを識別することができる。
【００１３】
本発明は、従来技術のシステムに優るいくつかの利点を有し、これには潜在的に、（１）多重化に起因するスループットの向上、（２）アレイ構成の柔軟性、（３）それぞれの容器が多くの型の物質を含むことができることによりサンプル容器数を減らすことができることによる取扱いの単純化、（４）流体ディスペンサ、サンプル・ハンドラおよびサンプル・リーダを含む既存の検定および機器との適合可能性、（５）例えばＦＩＳＨをスライド上ではなく管の中で実施するなど、高価な試薬の消費量の低減、（６）さまざまな細胞型をより高密度で使用できることによる情報量の増大、および（７）１つのウェルの中での特異性と効力の同時試験、が含まれる。
【００１４】
図１に、コード付きキャリヤー１１２を使用した本発明の諸態様に基づく多重細胞分析システム１１０を示す。コード付きキャリヤー１１２は検出可能なコード１１６を含むキャリヤー１１４である。キャリヤーは支持構造を提供し、細胞１１８および／または細胞分析物質を１２０に示すようにキャリヤーと結合させてキャリヤー・アセンブリー１２２を形成することができる。この結合は、分析の一部または全体の間、コードと細胞（および／または細胞分析物質）の間の連結を維持する。したがってコードは、細胞、細胞分析物質および／または分析の他の態様についての情報を標示することができる。例示的なキャリヤー、コード、細胞、細胞および細胞分析物質をキャリヤーと結合させる方法、ならびにコード化される情報についてはそれぞれ、以下のセクションＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＶおよびＶＩＩで説明する。
【００１５】
異なったコードを有するキャリヤー・アセンブリー、例えばアセンブリー１２２、１２４および１２６を検定場所、一般に容器１２８の中で一緒にして、コード付きアレイ１３０を形成することができる。コード付きアレイは非定位置アレイとすることができる。非定位置アレイは、アレイ内のキャリヤー・アセンブリーが互いに対して任意に、またはランダムに分布することができるアレイを意味する。非定位置アレイでは、異なった２つ以上の細胞集団、例えば細胞１３２、１３４、１３６を一緒に処理し、分析し、かつ／またはスクリーニングすることができる。したがって、２つ以上のメンバー集団を有する細胞集団および／または細胞分析物質のライブラリーを、非定位置アレイとして形成することができる。例示的なコード付き非定位置および／または定位置アレイ、ならびにライブラリーについては下記セクションＶＩＩＩおよびＩＸで説明する。
【００１６】
細胞は、モジュレーター１３８、１４０、１４２などの細胞分析物質に細胞を曝露することによって分析することができる。１４４に示した曝露によって、細胞と細胞分析物質の間の相互作用を試験し、または相互作用を可能にすることができる。細胞分析物質は、１種または数種の（１）モジュレーター、（２）リガンド／レセプター、（３）トランスフェクション物質（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｍａｔｅｒｉａｌ）、（４）細胞セレクター（ｃｅｌｌ ｓｅｌｅｃｔｏｒ）、（５）局所捕獲物質（ｌｏｃａｌ ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、（６）生物学的実体（細胞、ウィルス、組織など、ならびにそれらの成分）、および／または（７）標識を含むことができる。モジュレーター（１）および／またはリガンド／レセプター（２）は細胞を変化させ、細胞と物理的に相互作用し、かつ／または細胞と他の細胞分析物質との相互作用を調節または定義することができる。トランスフェクション物質（３）は、外来性の試験物質を細胞に導入して、細胞の１つまたは複数の特性に影響を及ぼし、かつ／または特性をレポートすることができる。細胞セレクター（４）は、より大きな細胞集団の中のある細胞群を精製し、その細胞群に分析を限定し、かつ／またはその細胞群を識別することができる。局所捕獲物質（５）は、細胞に付着した成分および／または細胞から放出された成分の分析を可能にする。生物学的実体（６）も細胞分析物質として機能することもでき、例えば、細胞分析物質ライブラリーのメンバーを担持しかつ／または発現し、かつ／あるいは細胞−細胞相互作用の分析を可能にする。標識（７）は、細胞、細胞構造、細胞成分および／または細胞分析物質の検出を容易にする。例示的な細胞分析物質および細胞分析物質の使用方法については下記セクションＩＶで説明する。
【００１７】
分析は例えば、細胞分析物質の選択、ならびに細胞分析物質を細胞および／またはキャリヤーに曝露するタイミングおよび期間によって決定される。細胞分析物質は、細胞とキャリヤーを結合させる前、結合の最中、および／または結合後に、細胞および／またはキャリヤーに曝露することができる。例えば、細胞結合前の細胞分析物質のキャリヤーへの曝露では、細胞とは非依存性に細胞分析物質をキャリヤーに連結させることができる。これを事前結合と呼ぶ。したがって、それぞれのキャリヤー上のコードが、キャリヤーに連結した細胞分析物質についての情報を標示するようにすることができ、また、細胞結合の前に、細胞分析物質のコード付き非定位置アレイを形成することができる。このアレイは、細胞分析物質のコード付きライブラリーと考えることができる。例示的な細胞分析物質のコード付きライブラリー、ならびに曝露および事前結合の方法については、下記セクションＶＩおよびＩＸで説明する。
【００１８】
細胞分析物質への細胞の曝露によって、細胞成分、細胞構造または細胞の存在、不在、レベル、分布、外観、挙動および／または他の特性などの検出可能な細胞特性１４６を生み出し、または変化させることができる。あるいはまたは加えて、細胞と細胞分析物質との間の相互作用の存在、不在、レベルまたは機能上の結果を細胞特性とすることもできる。例示的な細胞特性については下記セクションＸで説明する。
【００１９】
分析の一部として、１４８に示すキャリヤー・アセンブリーのコードの読取りおよび細胞特性の測定を実施する。この読取りおよび測定段階は、個々のコード付き非定位置アレイ１３０ごとに実行し、または、図に示すように適当な複雑さをコードに加えて、複数のコード付き非定位置アレイを１５２に示すように一緒にすることによって生み出された非定位置混合物１５０に対して実行することができる。キャリヤー・アセンブリーのコードの読取りおよび細胞特性の測定によって、コードが標示する情報を細胞特性に連結させることができる。例えば、図１に示すように、それぞれのコードは、特定のキャリヤーと結合した細胞集団（および細胞型）１３２、１３４または１３６を識別する。さらにコードはそれぞれ、それぞれのコード付きアレイ内で細胞を曝露したモジュレーター１３８、１４０または１４２を識別する。したがってこの例では、キャリヤー・アセンブリー１５４が持つ変更された細胞特性１４６とコード（「２」）によって、細胞型１３２およびモジュレーター１４０が変更された特性に連結される。したがってこの分析例は、モジュレーター１４０が、細胞集団１３４および１３６に比べて細胞集団１３２を特異的に調節することを指示している。コードの読取りおよび細胞特性の測定の例示的な方法については下記セクションＸＩで説明する。
【００２０】
以下のセクションでは、本発明の以下の諸態様を詳細に説明する：（ｉ）キャリヤー、（ｉｉ）コード、（ＩＩＩ）細胞、（ＩＶ）細胞分析物質、すなわち（Ａ）モジュレーター、（Ｂ）リガンド／レセプター、（Ｃ）トランスフェクション物質、（Ｄ）細胞セレクター、（Ｅ）局所捕獲物質、（Ｆ）生物学的実体および（Ｇ）標識、（Ｖ）細胞および細胞分析物質とキャリヤーの結合、（ＶＩ）細胞およびキャリヤーの細胞分析物質への曝露、（ＶＩＩ）コード化情報、（ＶＩＩＩ）アレイ、（ＩＸ）ライブラリー、（Ｘ）細胞特性、（ＸＩ）測定方法、および（ＸＩＩ）実施例。
【００２１】
Ｉ． キャリヤー
キャリヤーは一般に、非定位置および／または定位置検定用のコードと関連づけられた細胞または細胞分析物質を支持することができる構造を含む。キャリヤーは、その意図された機能を実行する能力と整合した適当な任意のサイズ、形状および構成を有することができる。
【００２２】
キャリヤーのサイズは、細胞の挙動、キャリヤーの操作性および検定の性質に関係した競合する考慮事項に基づいて選択することができる。一般に、キャリヤーは大きければ大きいほど、細胞（および／または細胞分析物質）を収容する容量も大きく、したがって、より大きなキャリヤーほど、そのキャリヤー結合または正常な表現型挙動が近傍の細胞からのコミュニティ効果に依存する細胞を、効果的に分析することができる。さらに、キャリヤーは一般に、自体が支持する分子、細胞または他の成分と少なくとも同じ大きさでなければならない。しかし、液体中でのキャリヤーの取扱いおよび分布に関係するいくつかの態様では、小さなキャリヤーのほうが効率的な場合がある。具体的には、小さいキャリヤーは、容器内の安静な位置から容易に再懸濁させることができ、懸濁したときにはゆっくりと沈降する。さらに、小さなキャリヤーは、懸濁液の状態で例えばピペットを使用して簡単に別の場所へ移すことができる。しかし、洗浄段階を何度も繰り返す分析など、いくつかのケースでは、キャリヤーがすぐに沈降し、再懸濁しにくい大きなキャリヤーの特性のほうが望ましいことがある。さらに、光学分析などの他のケースでは、キャリヤーが光の波長よりも大きく、視野よりも小さいことが好ましい。したがってキャリヤーのサイズは、特定の応用に基づくこれらの競合考慮事項間の効果的なバランスが保たれるように調整することができる。多重細胞実験用の好ましいキャリヤーは、粒子またはマイクロキャリヤーと呼ばれる、長さまたは直径が一般に約１０ミクロンから約４ミリメートルの小さなキャリヤーである。特に好ましい１つの粒子寸法は約３６０×５００ミクロンである。ウェルの密度がプレート１枚あたり９６、３８６または１５３６であるマイクロプレートを使用して、本発明の多数の応用を実施することができる。マイクロプレート・ウェルの中で多重細胞実験を実施するときには、１つのウェルの中で、少なくとも２つ以上のマイクロキャリヤーを同時に見ることができるように、マイクロキャリヤーは十分に小さくなければならない。したがって、マイクロキャリヤーの最大寸法が、特定の構成または密度のマイクロプレートのウェルの寸法によって決まることがある。最小寸法については、マイクロキャリヤーが、少なくとも１つの細胞を支持できる大きさでなければならない。したがって、多重細胞実験用のマイクロキャリヤーは通常、少なくとも約１００ミクロンの面積を有する。
【００２３】
キャリヤーの形状および構成は例えば、競合考慮事項間の相互関係によって決定される。好ましい形状には、少なくとも実質的に平らな形状、例えばウェーハまたはシート形、および少なくとも実質的に円筒形の形状が含まれる。後に説明するとおり、好ましい材料には、ガラス（ゾル−ゲル、セラミックスなど）、複合材、プラスチック、フィルム、金属、生体材料のマトリックス、および／またはこれらの組合せ、ならびに／あるいは固体および／またはゲルを含む他の材料が含まれる。
【００２４】
下記実施例１３で説明するとおり、キャリヤーはガラスから作製することができる。ガラスは親水性であり、したがって容易に濡れるので、ガラス・キャリヤーは、多くの型の細胞および細胞分析物質を修飾なしで直接に結合させるのに適している。さらに、多くのガラスは、光学検定で一般に使用される可視および紫外波長での吸収および自己蛍光が小さい。例示的な材料には、ソーダ石灰ガラス、ホウケイ酸ガラスなどがある。
【００２５】
キャリヤーはプラスチックから作製することもできる。プラスチックは疎水性なので、プラスチック・キャリヤーは本来、細胞または細胞外基質物質を結合させるのにガラスほどには適していない。しかし、後に説明するように接着プロモーターまたは細胞セレクターで処理することによって、プラスチック・キャリヤーを結合に適したものにすることができる。例えば、ポリスチレンなどのプラスチックは、照射、化学修飾、またはより親水性の細胞付着構造を提供する他の方法によって、誘導体化することができる。蛍光によって細胞を分析するときには、ある種のプラスチックの蛍光放射が細胞分析を妨害する可能性がある。しかし、低蛍光プラスチックはこのような分析に適している。細胞結合と蛍光測定の両方に適した例示的な材料には、ＰＥＲＭＡＮＯＸ（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）、メタクリル酸エステルなどが含まれる。蛍光測定に影響を及ぼすであろうプラスチックの成分は、当業者には一般に周知である。
【００２６】
下記実施例１２で説明するように、キャリヤーは、標準写真フィルムなどのフィルムから作製することもできる。
【００２７】
キャリヤーまたはその一部分、例えばキャリヤーの外層または内部領域を、ゲルから作製することもできる。例えば、ゲル・コーティングは適当な細胞付着層を提供し、内部ゲル部分は、細胞または細胞分析物質を担持し、あるいはより良好な貯蔵または取扱い特性を提供することができる。例示的な材料には、ゼラチン、アガロース、ポリアクリルアミドおよび／または他の適当なゲル形成材料が含まれる。
【００２８】
他の例示的なキャリヤーは、先に相互参照の項に掲載した、参照によって本明細書に組み込まれる特許および特許出願に記載されており、これには、２０００年４月１４日出願の出願第０９／５４９，９７０号および２０００年１０月１９日出願の出願第０９／６９４，０７７号が含まれる。
【００２９】
ＩＩ． コード
コード付きキャリヤーはそれぞれ、キャリヤーに連結した少なくとも１つのコードを含む。コードは一般に、異なるキャリヤーを区別することができる機構を含んでいる。この検出可能なコードは例えば、キャリヤー粒子またはその一部分のサイズ、形状、構成および／または外観に基づく。検出可能なコードは、光学的に検出可能なコード、光学的に検出可能な定位置カラー・コードなどのコードとすることができる。コードは、キャリヤー上の２つ以上の位置に出現する（すなわち繰り返される）ことができ、また、（２つ以上の異なる目的に使用することができる）２つ以上の異なるコードが同じキャリヤー上に出現することができる。
【００３０】
コードは非定位置コードとすることができる。非定位置コードは、キャリヤー内の位置によっては定義されないキャリヤーの全体的な特徴および／または部分特徴に関係する。これらの特徴および部分特徴には例えば、粒径、形状、構成および／または他の検出可能な特性が含まれる。例示的な非定位置コードは、少なくとも２種類の異なる物質を使用する。これらの物質は、吸収、蛍光、固有偏光、回折、反射および／あるいは測定可能な程度に明瞭に異なった他の特性が互いに異なっている。これらの非定位置コードは、これらの異なる物質からの信号の存在の有無および／または信号の他の特性を、例えば波長に対する信号の強度を測定して決定することによって読み取ることができる。
【００３１】
あるいはまたは加えて、コードを定位置コードとすることができる。定位置コードは、粒子内のさまざまな位置における（１種または数種の）物質の存在の有無、アイデンティティ（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、量および／または特性に基づく。これらの位置すなわちコード要素は、ランダムとし、かつ／または事前に定義しておくことができ、例えば、キャリヤー上でのコード要素の物理的な配置、および／または個々のコード要素の互いに対する相対位置に依存するようにすることができる。例示的な定位置コードは、粒子の内部または表面の異なる位置、例えば領域、スポット、線、同心円、記号、形などのところに、異なる量および／または型の物質を配置することを含む。それぞれの位置は、測定可能な光学的特性を提供することができ、これらの位置が全体として光学コードを定義する。光学コードは例えば、吸収、反射、励起、発光スペクトルなど、明瞭に異なった波長依存特性を有する、カラー・コードと呼ばれるコード要素を含む。コードは、整然とまたは雑然と並べられた空間的に異なった区画の中に情報が配置された空間コードとすることができる。他の定位置コードでは、単一の物質の異なる位置の特性を、例えば物質の表面特性を変更することによって検出可能に変更することができる。このような変更によって物質の異なる位置に明瞭に異なった光学特性を生み出し、例えば干渉フィルタを効果的に作製することができる。定位置コードは、それぞれのコード位置のコード物質のアイデンティティ、量および／または他の特性を、例えば位置に対する強度を測定して決定することによって読み取ることができる。量、位置および／または値は、相対量、位置および／または値、あるいは絶対量、位置および／または値とすることができる。さらに、異なる型のコードを組み合わせて、他の型のコードを形成することもできる。
【００３２】
定位置コード付きシステムは、多数の識別コードを小さな面積に効率的に表示することを可能にし、より小さなキャリヤー粒子およびより小さなサンプル・サイズの使用を可能にする。サイズの制限が、高価な試薬を使用するマイクロアレイ実験または高スループット応用に対して特に重要となることがある。
【００３３】
コードは、キャリヤー全体あるいはキャリヤーの１つまたは複数の部分を含む、キャリヤー上の適当な位置に配置することができる。キャリヤーの１つの部分にだけ配置されたコードはキャリヤーを、少なくとも１つのコード領域と少なくとも１つの非コード領域に分割することができる。このようなコードは連続コード部分となり、または不連続コード部分を含む。不連続コード部分は、サンプルを担持するように設計された１つまたは複数の検定または測定部分によって分離されたコード要素を含むことができる。キャリヤーはさらに、コードとは独立に使用して、コードを読み取りかつ／または解釈する前にキャリヤーの方向また位置を調整する、方向または位置合せマークを含むことができる。適当な方向マークは、粒子上の定義された位置に、コード領域および／または非コード領域に対して配置されたスポット、十字、および／あるいは他の形状またはパターンを含む。
【００３４】
コードはさらに、検定で使用する細胞および／または細胞分析物質に対して適当な位置に配置することができる。したがって、コードと細胞（および／または他の物質）は、キャリヤー上の非オーバーラップ位置（両サイドを含む）、キャリヤー上のオーバーラップ位置、またはキャリヤー上の同一の広がりをもつ位置に配置することができる。
【００３５】
定位置コードを有する例示的なキャリヤーは、下記実施例１２、１３および１５、ならびに先に相互参照の項に掲載した、参照によって本明細書に組み込まれる特許および特許出願に記載されており、これには、２０００年４月１４日出願の出願第０９／５４９，９７０号および２０００年１０月１９日出願の出願第０９／６９４，０７７号が含まれる。
【００３６】
ＩＩＩ． 細胞
コード付きキャリヤーを使用して細胞を分析し、またはコード付きキャリヤーを使用した分析に細胞を使用することができる。細胞は一般に、膜２重層によって少なくとも部分的に境界され、２つ以上の実体に複製および分割する能力を有する生物学的実体を含み、またはこのような実体の子孫である生物学的実体を含む。本発明はさらに、細胞（下記参照）から得た生体物質、および／またはウィルス、ファージ、ウイロイド、プリオンなどの細胞に感染する生物学的実体から得た生体物質を使用して実施することができる。
【００３７】
細胞の例には例えば、動物、植物、真菌、酵母および原生動物の細胞； 網状赤血球、成熟赤血球などの脱核または突然変異誘導体、あるいはその子孫；その脱核誘導体およびこれらの間の融合を含む真核細胞、すなわち核を有する細胞が含まれる。さらに細胞には、卵子、精子などの配偶子が含まれる。細胞にはさらに、細菌、古細菌などの原核生物が含まれる。
【００３８】
細胞から誘導される生体物質の例には例えば、抽出物、溶解物、分画および小器官などが含まれる。小器官には例えば、核、核小体、ミトコンドリア、エンドソーム、ゴルジ装置、ペルオキシソーム、リソソーム、小胞体、葉緑体、細胞骨格網、核基質、核ラミナ、軸索、樹状突起、膜が含まれる。抽出物および溶解物には例えば、核抽出物、小器官抽出物およびそれらの分画、完全細胞抽出物、組織ホモジェネートならびに細胞質ゾルが含まれる。生体物質にはさらに、リボソーム、スプライセオソーム、核膜孔、ＤＮＡポリメラーゼ複合体、ＲＮＡポリメラーゼ複合体などの不均一高分子アセンブリーが含まれる。
【００３９】
Ａ． 生物由来の細胞
適当な細胞は、研究（基礎、臨床、バイオテクノロジー研究など）、薬物設計、薬物発見および／または他の経済的、政治的または人道的理由で研究される生物を含む、適当な生物から得ることができる。例示的な生物には、類人猿、ネコ、ウシ、イヌ、ウマ、ヒト、サル、ネズミ、ブタ、ヒツジなどの哺乳動物が含まれる。例示的な生物にはさらに、鳥類、爬虫類、両生類（例えばＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓなどのカエル）、魚類（例えばマス、サケ、金魚、ミノカサゴ ）などの哺乳動物以外の脊椎動物が含まれる。例示的な生物にはさらに、ショウジョウバエ類（例えばＤ． ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびＤ． ｓｉｍｕｌａｎｓ）、線虫類（例えばＣ． ｅｌｅｇａｎｓ）、ウニ類（例えばＳｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ）、粘菌類（例えばＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）の種など、哺乳動物ではない無脊椎動物が含まれる。例示的な生物にはさらに、酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、原生動物（例えば病原性および非病原性原生動物）などの単細胞真核生物が含まれる。例示的な生物にはさらに、例えばＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、米、トウモロコシ、ジャガイモ、豆、テーダマツ、非維管束植物などの植物が含まれる。
【００４０】
適当な細胞は例えば、生物の野生型、突然変異体、トランスジェニック、キメラ接合体、桑実胚、胞胚、胚、胎児、新生児、若年性、成人または他の発生段階から直接に得た１次細胞である。１次細胞は、生物の異なった細胞型、組織、器官または領域を起源とすることができ、またはそれらの混合物とすることができる。１次細胞の例には、血液幹細胞、ＢおよびＴリンパ球、赤血球、好中球、好酸球、マスト細胞、顆粒球、巨核球、マクロファージ、脂肪細胞、グリア細胞、星状細胞、神経芽細胞、ニューロン、骨格筋芽細胞または筋管、平滑筋筋芽細胞、心筋芽細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、骨細胞、内分泌細胞、外分泌細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、軟骨細胞、内胚葉、中胚葉または外胚葉から誘導された細胞、および／または栄養膜などの胚外誘導体が含まれる。
【００４１】
Ｂ． 組織由来の細胞
適当な細胞は、任意の源からの１つまたは複数の組織から得ることができる。組織は一般に、生物またはその培養外植体内で一時的にまたは永続的に空間的に近接した一群の細胞を含む。この空間的近接は、自然におよび／または人為的に起こることができ、これは、本来の、すなわち正常な状態および／または誘導された、すなわち病気にかかった状態を表す。人為的な近接には例えば、組織移植（器官または組織の移植、異種移植、同種移植などを含む）、および皮膚移植などの個々の生物内での組織の移動が含まれる。病気にかかった組織には、（１）遺伝子欠損、（２）汚染物質、毒素、放射線などの環境傷害、（３）無制御増殖、（４）異常分化、（５）異常細胞移動、（６）ウィルス、細菌、原生動物、酵母、真菌類および／または寄生生物などの感染、または（７）これらの任意の組合せ、に起因する異常組織を含む。本発明で使用するのに適した例示的な病気組織は、外科的に、または吸引液、例えば針生検の吸引液から得た腫瘍物質である。
【００４２】
組織は、野生型、突然変異体、トランスジェニックまたはキメラ接合体、桑実胚、胞胚、胚、胎児、新生児、若年、青年または成人生物由来とすることができる。適当な生後組織の例には、（１）心筋、平滑筋および骨格筋を含む筋肉、（２）脊髄、脳などの中枢または末梢神経系からの神経組織、（３）他の心組織、（４）腎臓、（５）肝臓、（６）脾臓、（７）食道、胃、小腸、大腸および結腸を含む消化器系の部分、（８）膵臓、（９）胆嚢、（１０）心臓、静脈および動脈を含む循環器系組織ならびに造血系細胞、（１１）胸腺およびリンパ節などの免疫組織、（１２）副腎、（１３）骨、（１４）軟骨、ならびに（１５）乳房上皮などの任意の上皮組織などが含まれる。組織にはさらに、以上の組織の天然の組合せおよび人為的組合せが含まれる。
【００４３】
組織は、コード付きキャリヤーとともに使用する前に個々の細胞に少なくとも部分的にまたは完全に分離し、あるいは、完全な状態で、または切片としてキャリヤーに適用することができる。組織をキャリヤーと結合させ、コード付き組織アレイを形成する例示的な方法については下記実施例５で説明する。
【００４４】
Ｃ． 臨床診断用の細胞
本発明のいくつかの応用は、出生前または出生後のヒトまたは他の動物から得た細胞を使用した臨床診断に適している。出生前細胞の例には、羊水、割球、絨毛膜絨毛、胎児血および他の胎児組織から得られた細胞が含まれる。出生後細胞の例には、骨髄穿刺液、リンパ、全血、血清、血漿、胸水、皮膚生検、腫瘍生検または外科手技から得られた細胞が含まれる。出生後細胞の追加の例には、尿、便、唾液、鼻水、粘液質、涙、汗、精液、脊髄液、乳汁、痰などの他の体液および／または分泌液から得られた細胞、または先に述べた組織から得られた細胞が含まれる。
【００４５】
Ｄ． 株化細胞系統由来の細胞
１次細胞および組織、またはその培養誘導体以外に、適当な細胞は株化細胞系統から得ることができる。これらの株化細胞系統は、ウィルス性、腫瘍化、物理的、化学的、突然変異誘発性、自然および／またはトランスジェニック転換を含む適当な任意の方法によって作り出すことができる。さらに、細胞には例えば、遺伝子修飾（例えば物理的および／または化学的処理、照射、トランスフェクション、感染または注入による）、および／または後成的修飾（例えばメチル化または他の分子修飾、トランスポゾン機能、染色体刷り込み、酵母接合型スイッチング、および／またはテロメア・サイレンシングによる）などの適当な任意の方法によって修飾された株化細胞系統の特性づけられた、またはまだ特性づけられていない誘導体が含まれる。
【００４６】
ＩＶ． 細胞分析物質
１種または数種の細胞分析物質に細胞を曝露して、細胞および／または細胞分析物質を変化させ、標識し、分析しおよび／または分離することができる。細胞分析物質は一般に、細胞と相互作用することができる任意の物質または条件を含み、これには、以下で説明する（Ａ）モジュレーター、（Ｂ）リガンド／レセプター、（Ｃ）トランスフェクション物質、（Ｄ）細胞セレクター、（Ｅ）局所捕獲物質、（Ｆ）生物学的実体、および（Ｇ）標識標識などが含まれる。
【００４７】
Ａ． モジュレーター
細胞分析物質はモジュレーターを含むことができる。本明細書ではモジュレーターを生体修飾因子（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｅｒ）とも呼ぶ。モジュレーターは一般に、細胞の特性、あるいは２つ以上の細胞または細胞内成分間の相互作用に影響を及ぼす潜在能力を有する任意の作用物質または条件を含む。表現型モジュレーターは、後のセクションＸで説明するとおり、測定可能な細胞特性に影響を及ぼすことができる。相互作用モジュレーターは、細胞、細胞成分、非細胞性実体および／または他の種間の相互作用、例えばレセプターとリガンドの間の対合に影響を及ぼすことができる。以下で説明するとおり、モジュレーターは、化学、生物および／または物理モジュレーターであることができる。
【００４８】
モジュレーターは、合成または天然の元素、分子、ポリマー、共有結合した分子またはポリマー、非共有結合した分子またはポリマー、異種多成分アセンブリー、あるいはこれらの混合物を含む、化学モジュレーターであることができる。化学モジュレーターの例には、既知のまたは潜在的な生物活性を有する化合物；薬物スクリーニング用の化合物ライブラリー； １本鎖、２本鎖または３本鎖の直鎖、枝分かれ鎖または環状鎖の形態の天然または合成ＤＮＡまたはＲＮＡ分子；効能を高めるために操作されたペプチド核酸などの被修飾誘導体を含む、合成アンチセンス・オリゴヌクレオチド；ペプチドまたはペプチド・ライブラリー；およびタンパク質またはタンパク質の混合物が含まれる。化学モジュレーターにはさらに、雰囲気ガスの組成、イオン強度、栄養混合物などの一般的な媒質構成が含まれる。
【００４９】
モジュレーターはさらに、ウィルス、病原体を含む原核生物、細胞断片、（細胞、組織、生物または胚からの）抽出物などの生物モジュレーターであることができる。他の生物モジュレーターには発現ライブラリーが含まれる。発現ライブラリーは一般に、細胞から構成された任意のライブラリーを含み、ライブラリーのメンバーは外来性の物質を発現し、または内因性の物質を過剰発現する。発現ライブラリーの例には、抗体、レセプターまたはリガンドを提示するファージ・ディスプレイ・ライブラリーなどのファージ・ライブラリー；外来性の核酸配列を発現する細菌ライブラリー；およびｃＤＮＡまたはゲノム発現ライブラリーあるいは他の発現ベクターから構成された真核細胞ライブラリーが含まれる。
【００５０】
モジュレーターはさらに物理モジュレーターであることができる。物理モジュレーターには、温度の変動、圧力、物体への近接、重力場の強度または方向、電磁場の強度または方向、電磁放射（Ｘ線、ガンマ線、紫外光、可視光、赤外光、マイクロ波など）の波長または強度、あるいは亜原子粒子衝撃のアイデンティティ、エネルギーまたは周波数などの任意の環境条件または処理が含まれる。
【００５１】
いくつかのモジュレーター、特に化学および生物モジュレーターは、例えば細胞表面レセプターに結合することによって、細胞表面または細胞表面の近くで作用することができ、あるいは、任意の機構、例えば、レセプター取込み機構、輸送体、チャンネル、非特異性エンドサイトーシス、または細胞内への受動的な分配によって細胞の内部に輸送されることができる。あるいは、このようなモジュレーターを適当な任意の輸送因子と組み合わせて細胞内への導入を容易にすることができる。このような輸送因子の例には、注射器、リン酸カルシウム共沈物、リポソーム、ウィルス、ポリエチレングリコール、熱、衝撃負荷、および／またはエレクトロポレーションが含まれる。
【００５２】
Ｂ． リガンド／レセプター
細胞分析物質はさらに、リガンドおよび／またはレセプターを含むことができる。リガンドおよびレセプターは一般に、物理的に相互作用している相手物質から成る高親和性特異的結合対を含む。例示的なレセプターおよびリガンド対を表１に示す。
【表１】
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【００５３】
リガンドは、天然のレセプターと正常に結合し機能する生理学的リガンドであることができる。あるいは、合成によってリガンドおよび／またはレセプターを得ることもでき、これらが、正常な生理学的役割を持たないこともある。リガンドは、（１）レセプターへの結合の結果として表現型応答を促進し、すなわちアゴニストとして作用し、（２）結合しても表現型応答を促進せず、したがってアンタゴニストまたは単純な結合相手として作用し、または（３）アゴニスト／アンタゴニスト混合応答を促進することができる。
【００５４】
Ｃ． トランスフェクション物質
細胞分析物質はさらに、１種または数種のトランスフェクション物質を含むことができる。本明細書ではトランスフェクション物質をトランスフェクト可能物質（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｂｌｅ）とも呼ぶ。トランスフェクション物質は一般に、細胞へ導入することができる天然または合成の任意の物質を含む。トランスフェクション物質は細胞特性を生み出し、細胞特性を変更し、かつ／または細胞特性についてレポートし、あるいは細胞特性をレポートすることができる。
【００５５】
トランスフェクション物質は、トランスフェクション物質の細胞への取込みを促進しまたは容易にする能力を有する任意の輸送因子または処理を使用して、細胞へ導入することができる。例示的な輸送因子／処理には、注射器；リン酸カルシウム共沈物などの微粒子担体；リポソームなどの小胞またはミセル；ウィルスまたはファージ；ポリエチレングリコール；熱；衝撃負荷；および／あるいはエレクトロポレーションが含まれる。
【００５６】
コード付きキャリヤー上でのトランスフェクションには、古典的トランスフェクションまたは逆トランスフェクションが含まれる。古典的トランスフェクションでは、細胞をコード付きキャリヤーと結合させ、次いでトランスフェクション物質に曝露する。逆トランスフェクションでは、トランスフェクション物質をコード付きキャリヤーと事前に結合させ、一般にコード付きキャリヤーと結合したトランスフェクション物質に細胞を曝露する。逆トランスフェクションについては下記実施例９で説明する。
【００５７】
トランスフェクションは、安定トランスフェクションまたは一過性トランスフェクションであることができる。安定トランスフェクションでは、トランスフェクションさせた物質が、ゲノム組込みまたはエピソーム複製などによって、分裂の間、細胞内に安定的に維持される。一過性トランスフェクションでは一般に、トランスフェクションさせた物質が一時的に導入される。一時的に導入された物質は一般に、細胞インキュベーションを続けるにつれて希釈および／または分解される。
【００５８】
トランスフェクション物質は一般に、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）ポリマー、これらの合成誘導体などの遺伝物質（核酸）、またはこのような遺伝物質の混合物である。トランスフェクション物質を、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、すなわちペプチド結合によって接合したヌクレオチドなどの核酸誘導体とすることもできる。トランスフェクション物質はさらに、タンパク質または他の生体分子とすることができる。
【００５９】
トランスフェクション物質は後述するとおり、エフェクターおよび／またはレポーターであることができ、あるいはエフェクターおよび／またはレポーターをコードし、エフェクターおよび／またはレポーターの発現を導くことができる。エフェクターまたはレポーター遺伝子は例えばＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含み、細菌または他の非脊椎動物の細胞の中で増殖することができるウィルス・ベクターまたはシャトル・ベクターの中に含めることができる。ベクターは、選択可能なマーカー／薬物耐性、複製開始点、エフェクター発現などを提供する追加の遺伝子および制御配列を含むことができる。例示的なエフェクターおよび／またはレポーター遺伝子ベクターは、真核および原核細胞の中で機能する特徴を有するＤＮＡプラスミドである。
【００６０】
各トランスフェクション物質は、細胞に曝露され、逆トランスフェクションの場合にはさらに各キャリヤーと結合したトランスフェクト可能物質の混合物を含むことができる。例えば、細胞は、表現型エフェクターをコードする遺伝物質および１種または数種のレポーター遺伝子に曝露することができる。一般に、いくつかのトランスフェクション物質を細胞に同時にトランスフェクションすることができるので、トランスフェクション物質の組合せが適当であることがある。
【００６１】
ｉ． エフェクター
エフェクターは一般に、表現型の変化および／または結合相互作用などの検出可能な応答を細胞集団内に引き起こす能力を有する任意の物質を含む。エフェクターは例えば、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは（１つまたは複数の）化学的実体である。
【００６２】
エフェクター・タンパク質は、野生型または突然変異型の完全長のタンパク質、または完全長のタンパク質の断片であることができる。例示的なエフェクター・タンパク質には、レセプター、リガンド、酵素、基質、輸送体、転写因子、構造タンパク質、調節因子などが含まれる。
【００６３】
エフェクターＲＮＡは、トランスフェクションさせた核酸から発現させることができ、または、細胞に直接にトランスフェクションすることができる。例示的なエフェクターＲＮＡには、センス転写産物に相補的なプラスミド・コード化アンチセンス転写産物などのアンチセンスＲＮＡが含まれる。あるいは、アンチセンスＲＮＡを細胞に直接にトランスフェクションすることができ、アンチセンスＲＮＡには合成ＲＮＡ誘導体が含まれる。さらに、エフェクターＲＮＡには例えば、タンパク質をコードするウィルスＲＮＡおよび／またはＲＮＡ；ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡｓ、ｈｎＲＮＡ、他のリボ核タンパク質複合体中のＲＮＡなどの構造ＲＮＡ；およびリボザイムなどのセンスＲＮＡが含まれる。エフェクターＲＮＡにはさらに、ＰＴＧＳ（転写後遺伝子サイレンシング：ｐｏｓｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）を開始しかつ／または仲介するＰＴＧＳ薬と呼ばれる物質が含まれる。ＰＴＧＳ薬は一般に、合成または酵素によって誘導され、かつ／またはトランスフェクションさせた核酸によってコードされた（ＲＮＡｉおよび小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などを含む）２本鎖ＲＮＡ誘導体である。コードされた２本鎖ＲＮＡは、自己アニールさせた転写産物上の逆方向反復として、または分子間アニールさせた別個の転写産物として発現させことができる。２本鎖ＲＮＡは、完全２本鎖または部分１本鎖であることができ、ＰＴＧＳの開始または仲介に有効な任意の長さを持つことができる。
【００６４】
エフェクターＤＮＡを細胞にトランスフェクションすることができる。例示的なエフェクターＤＮＡには、合成アンチセンス・オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド誘導体が含まれる。例示的なエフェクターＤＮＡにはこの他、構造または酵素ＤＮＡが含まれる。エフェクターＤＮＡにはさらに、例えば内因性部位からの転写因子を滴定するための転写因子のタンパク質結合部位が含まれる。
【００６５】
ｉｉ． レポーター
レポーター遺伝子は一般に、検定の一局面について直接にまたは間接的にレポートする能力を有する任意のポリヌクレオチドを含む。レポーター遺伝子は一般に、（１）調節領域、ならびに（２）発現ＲＮＡおよび／またはタンパク質レポーターをコードする転写領域を含む。
【００６６】
調節領域には例えば、レポーター遺伝子の転写開始、延長および／または終結の頻度または速度、ならびに／あるいは関係する翻訳局面の決定を助ける任意の制御配列が含まれる。制御配列には例えば、複合または単純エンハンサー、ＴＡＴＡボックス、イニシエーター部位、転写因子結合要素、ＲＮＡ構造決定基、および／またはＲＮＡポリメラーゼまたは補因子相互作用部位などが含まれる。例示的な制御配列には、特性づけされた遺伝子および／またはウィルス（βアクチン、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ４０など）からのプロモーターおよびプロモーター断片が含まれる。例示的な制御配列にはこの他、核ホルモン・レセプター（エクジソン、デキサメタゾンまたはエストロゲン応答レセプターなど）、インターフェロン調節因子、金属応答因子、ＳＰ１、ＡＰ−１、ＮＦ−ｋａｐｐａＢなどの、調節された、または構成的に活性な転写因子の合成結合部位が含まれる。制御配列はさらに、Ｇタンパク結合レセプター（すなわちＧＰＣＲまたは「７回膜貫通タンパク質（ｓｅｖｅｎ−ｐａｓｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）」）、インターロイキン・レセプターおよび／または核ホルモン・レセプターなどのレセプター・クラスに応答することができる。
【００６７】
レポーター物質は、トランスフェクション先の細胞の特性をレポートし測定するＲＮＡおよび／またはタンパク質であることができる。レポーターＲＮＡは、コード配列、非コード配列および／または任意の配列であることができる。レポーター・タンパク質のレベルまたは活性も細胞特性をレポートすることができる。細胞特性は、細胞の内部または周囲のタンパク質または他のレポーターの物理的な位置の変化によっても明らかにすることができる。例示的なレポーター・タンパク質は、内部蛍光、酵素活性および／または１つまたは複数の他の測定可能な特性によって容易に検出可能なタンパク質である。レポーター・タンパク質の例には、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼおよびルシフェラーゼが含まれる。
【００６８】
Ｄ． 細胞セレクター
細胞分析物質はさらに、細胞セレクターを含むことができる。細胞セレクターは一般に、一方の細胞型とコード付きキャリヤーとの結合を他方の細胞型とそのキャリヤーとの結合よりも差別的に促進する任意の細胞分析物質を含む。差別的細胞結合は、細胞表面（または内部）の分子または複合体のレベル、局所的または全体的電荷分布、局所的または全体的疎水性、表面幾何構造、および／あるいは強磁性体または常磁性特性などの細胞の適当な化学的、物理的または生物学的特性に基づく細胞セレクターによって促進することができる。選択ターゲットとして使用することができる細胞表面分子には、レセプターおよび／または関連タンパク質、輸送体、チャンネルまたは他の膜貫通タンパク質、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリカンなどが含まれる。例示的な細胞セレクターには、細胞制限表面分子または複合体に結合する抗体、細胞表面レセプターまたは細胞外基質タンパク質に特異的なリガンド、あるいは細胞選択的結合を示すレクチンが含まれる。
【００６９】
細胞セレクターは細胞分析にいくつかの利点を提供することができる。例えば、細胞セレクターを使用して、細胞混合物から特定の細胞型を精製することができ、そのため、それぞれのキャリヤー上のコードによって、キャリヤー上に存在する細胞の型または他の態様を識別することができる。さらに、細胞セレクターは、細胞混合物中に存在する細胞型を別個の精製段階なしで分析することを可能にする。その結果、細胞セレクターによって、複数の細胞型、例えば血液中の複数の細胞系統の多重分析が容易になる可能性がある。
【００７０】
細胞セレクターを使用する例示的な方法については下記実施例８および１０で説明する。
【００７１】
Ｅ． 局所捕獲物質
細胞分析物質はさらに、局所捕獲物質を含むことができる。局所捕獲物質は一般に、コード付きキャリヤーと結合した細胞から放出された成分の検出を可能にする、そのコード付きキャリヤーに連結された任意の細胞分析物質を含む。検出される成分には例えば、小胞融合、直接輸送、膜を横切る拡散を含む、分泌または他の放出機構、あるいは細胞死、化学処理などによる膜破壊によって細胞外に放出される任意の成分が含まれる。小胞融合によって放出される成分の例には、自己分泌、傍分泌また内分泌によって細胞に作用するホルモンまたは調節分子が含まれる。このような調節分子には例えば、本明細書ではサイトカインと呼ぶ、細胞の挙動に影響を及ぼす任意の放出タンパク質またはペプチドが含まれる。ただしこれらに限定されるわけではない。サイトカインの例には、インターロイキン（ＩＬ−１、−２など）、インターフェロン（α、βおよびγ）、腫瘍壊死因子、ＧＭ−ＣＳＦ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１など）、インスリン、カルシトニン、血管作動性腸管ペプチド、オシトシン、他の神経ペプチドなどが含まれる。放出成分にはさらに、非タンパク質メッセンジャー（ステロイド・ホルモン、レチノイド、甲状腺ホルモン、プロスタグランジン、脂質誘導体、環状ヌクレオチド、無機イオンなど）、および神経伝達物質（カテコールアミン、ドーパミン、セロトニンなど）が含まれる。放出成分の例にはこの他、ウィルス、ウィルス断片、ウィルス成分、原核または成熟核病原体、寄生生物、共生生物が含まれる。
【００７２】
局所捕獲物質は、放出成分と選択的に結合する結合物質であることができ、かつ／または放出成分に検出可能に応答することができる。捕獲物質は、細胞と捕獲物質が近接することによって、コード付きキャリヤー上の細胞から放出された成分と優先的に結合し、またはこれを捕獲することができる。例示的な結合物質は、放出成分上のエピトープを認識する抗体である。抗体と複合体を形成した放出成分は、抗体が結合していない別のエピトープなど、適当な手段によって検出することができる。放出成分の捕獲は一般に、捕獲物質の立体配座の変化、使用可能なエピトープまたは他の検出可能な領域の共有結合性修飾または付加、放出成分が寄与する活性などの、放出成分によって少なくとも部分的に決定される局所捕獲物質の変化によって検出することができる。細胞によって分泌された分子の検出をｉｎ ｓｉｔｕで実施することができる。分泌された生成物は、抗体による捕獲によって細胞の内部または周囲で検出される。この方法は、細胞増殖培地中の分泌生成物を測定する方法よりも感度が高くなる可能性があり、キャリヤーと結合した個々の細胞の分泌情報を提供することができる。
【００７３】
コード付きキャリヤーに連結させた局所捕獲物質を使用する例示的な方法は下記実施例１０で説明する。
【００７４】
Ｆ． 生物学的実体
細胞分析物質はさらに、生物学的実体を含むことができる。「細胞」と呼ばれる生物学的実体には例えば、完全な細胞、組織、ウィルス、ファージ、および／あるいはこれらの修飾された誘導体、断片または抽出物が含まれる。生物学的実体は、セクションＩＶ（Ｆ）で説明するように、モジュレーター、リガンド、レセプター、細胞セレクターおよび／または標識として機能することができる。生物学的実体はさらに、セクションＩＶ（Ａ）で説明したように、モジュレーターおよび／またはリガンド・ライブラリーの発現媒体として機能することができる。
【００７５】
生物学的実体は、適当な任意の機構によって細胞分析を容易にすることができる。生物学的実体を、ファージ、細菌、または真核細胞の発現および／またはディスプレイ・ライブラリーなどの適当なライブラリーを発現させる媒体とすることができる。生物学的実体はさらに、キャリヤー上の分析中の細胞集団に影響を及ぼすことができる分泌されたモジュレーターなどのキャリヤー制限細胞分析物質を生み出すことができる。
【００７６】
適当な生物学的実体は、詳細な説明の項の他の場所、具体的にはセクションＩＩＩで説明した。
【００７７】
Ｇ． 標識
細胞分析物質はさらに、標識を含むことができる。標識は一般に、その存在および／または特性が細胞特性の尺度を与える試薬を含む。ここでは、試薬が、他の物質を検出し、測定し、調査しまたは生成する目的に使用される物質を含み、試薬の特性が、適当な光を用いた照明に応答した吸収、光ルミネセンスなど、外部刺激に対する応答を含む。細胞成分、細胞内構造および／または細胞の特性の検出、定量、位置決定および／または分析を可能にするために、細胞を１種または数種の標識に曝露し、かつ／または細胞を１つまたは複数の標識と反応させることができる。標識は、細胞の内部、表面および／または周囲の成分または構造に選択的に結合し、かつ／あるいはこのような成分または構造と反応することができる。適当な標識は、修飾されていない形態で直接に検出することができ、あるいは、別の修飾または細胞分析中のタグへの曝露によって、検出可能なタグに共有結合または非供給結合することができる。例示的な標識（またはタグ）は光学的に検出可能な標識（またはタグ）であり、これには、染料、染色剤、修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子、抗体、リガンドおよび／またはポリヌクレオチド・アプトマー（ａｐｔｏｍｅｒ）が含まれる。
【００７８】
以下のセクションでは、標識化に関係する以下の例示的な３つのトピックについて説明する。（ｉ）ＤＮＡおよびＲＮＡ標識。ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを標識する戦略およびその有用性について説明する。（ｉｉ）抗体標識。免疫反応性細胞成分の標識としての抗体を使用することについて説明する。（ｉｉｉ）種々の標識。細胞特性測定の比較的に非特異的ないくつかの戦略を説明する。
【００７９】
ｉ． ＤＮＡおよびＲＮＡ標識
染料などの任意の適当な標識を使用して、細胞中の完全なＤＮＡまたはＲＮＡの分布および存在量を測定することができる。一般に染料は、２重らせんへのインターカレーションによって、または副溝（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ）の中での相互作用によって２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡに結合する。適当な染料は、米オレゴン州ＥｕｇｅｎｅのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社から販売されており、これには例えば、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウムおよび／またはエチジウム・ホモダイマーなどが含まれる。
【００８０】
特定の染色体、存在量および細胞内分布、染色体内領域、遺伝子または他のヌクレオチド配列の頻度は一般に、ＤＮＡの１本鎖領域への相補ポリヌクレオチドのハイブリッド形成によって測定することができる。相補ポリヌクレオチドには例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいは塩基、糖残基またはリン酸主鎖で修飾されたペプチド核酸などの関連核酸が含まれる。さらに、標識化中に導入されたポリヌクレオチドは、蛍光染料などの光学的に検出可能な物質に接合させることができ、または２次試薬を用いて間接的に測定することができる。一般に、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの他のポリヌクレオチドは、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＦＩＳＨ）によって光学的に検出可能にすることができる。これらの目的に適した試薬は、多くの販売業者から販売されており、これには、米カリフォルニア州Ｓａｎ ＲａｍｏｎのＢｉｏＧｅｎｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米カリフォルニア州ＣａｒｐｉｎｔｅｒｉａのＤＡＫＯ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米イリノイ州Ｄｏｗｎｅｒｓ ＧｒｏｖｅのＶｙｓｉｓ社、英ＬｏｎｄｏｎのＩＤ Ｌａｂｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、英ＢａｎｂｕｒｙのＣｙｔｏｃｅｌｌ社、英ＣａｍｂｒｉｄｇｅのＣａｍｂｉｏ社、および独ＡｌｔｌｕｓｓｈｅｉｍのＭｅｔａｓｙｓｔｅｍｓ社が含まれる。
【００８１】
出生前診断では、適当な相補ポリヌクレオチドと反応させることによって、微小欠失症候群（ｍｉｃｒｏｄｅｌｅｔｉｏｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を特性づけることができる。本発明を用いて検出可能な微小欠失症候群の例には、ＣＨＡＲＧＥシーケンス、ネコ鳴き症候群（Ｃｒｉ ｄｕ ｃｈａｔ）、ディ・ジョージ（ＤｉＧｅｏｒｇｅ）症候群、ミラー−ダイカー（Ｍｉｌｌｅｒ−Ｄｉｅｋｅｒ）症候群、スミス−マジェニス（Ｓｍｉｔｈ−Ｍａｇｅｎｉｓ）症候群、口蓋心顔面症候群、ウィリアムズ症候群および／またはウォルフ症候群が含まれる。
【００８２】
相補ポリヌクレオチドでのハイブリッド形成による特定の遺伝子の分析も細胞特性を提供することができる。この手段を使用して、細胞の遺伝子型を決定し、または他の方法で細胞を特性づけることができる。例えば、これを遺伝子型決定戦略として使用し、ＤＮＡ領域のコピー数を識別して、例えば、特定の遺伝子が２倍体、１倍体または異数体である頻度を決定することができる。さらに、これを使用して、遺伝子の再編成、欠失または増幅を決定することができる。ＡＭＬ１、ＡＰＣ、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＢＡＸ、ＢＣＬ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＤＨ１、ＣＤＨ１３、ＣＤＫＮ１ＡまたはＢ、ＣＤＫＮ２Ａ−Ｄ、ＣＭＡＲ、Ｃ−ＭＹＣ、ＤＡＮ、ＤＢＣＣＲ１、ＤＣＣ、ＤＬＣ１、ＤＰＣ４、ＥＲＢＢ２、ＢＲＣＣ１、ＥＸＴ１、ＥＸＴ３、ＦＨＩＴ、ＦＯＳ、ＦＯＳＢ、ＨＥＲ−２／ＮＥＵ、Ｈ−ＲＡＳ、１Ｄ３、ＩＮＧ１、ＪＵＮ、ＫＩＴ、Ｋ−ＲＡＳ、ＬＥＵ１、ＬＥＵ２、ＭＣＣ、ＭＥＮ１、ＭＳＨ１、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＭＴＳ１、ＮＦ２、Ｎ−ＭＹＣ、Ｎ−ＲＡＳ、ＰＭＳ１、Ｐ７３、ＰＰＲ２Ｒ１Ｂ、ＰＲＬＴＳ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＲＢ２、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＳＴＫ１１／ＬＫＢ１１、ＴＥＬ、ＴＮＦＲ２、ＴＯＰ１、ＴＰ５３、ＴＳＣ２、ＶＨＬ、ＷＴ１、ＷＴ２、ＸＰＡ、ＸＰＣおよび／またはＸＲＣＣＩなどの腫瘍プロモーターまたはサプレッサを含む、腫瘍中の特定の遺伝子の増幅、再編成および／または欠失が、癌の進行、重症度、場合によっては適当な治療法を指示することがある。
【００８３】
ハイブリッド形成法によってＲＮＡを間接的に測定して、細胞特性の測定を可能にすることができる。特定のＲＮＡ配列は、相補ポリヌクレオチド物質と反応させた後に、ＤＮＡ検出で使用される方法と同様の方法を使用して測定することができる。
【００８４】
ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ標識を使用する例示的な方法については実施例３および４、ならびに詳細な説明の項の他の場所で説明する。
【００８５】
ｉｉ． 抗体標識
抗体を、標識または標識の成分として使用することができる。多種多様な生体分子に対して開発されたさまざまな抗体が適当であり、これには、ＤＮＡ；ＲＮＡ；リン酸化、ユビキチニル化（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化、グリコシル化、メチル化、アセチル化、硫酸化、プロリンまたはリシン・ヒドロキシル化、カルボキシ末端アミド化およびγ−カルボキシル化によって生み出される特定共有結合誘導体を含む特定のタンパク質； 脂質および特定のリン脂質；ホルモン；シグナリング分子；ならびに特定の糖および多糖と反応する抗体が含まれる。標識化に使用される抗体には例えば、適当な方法、例えばヌード・マウスの腹水腫瘍などの培養ハイブリドーマ、あるいは大腸菌などの細菌または酵母での発現によってクローン化したＤＮＡによって生成したモノクローナル抗体が含まれる。あるいは、抗体は、抗体を生み出す能力を有する免疫系を用いた任意の生物の免疫化によって生み出されたポリクローナル抗体とすることができる。適当な生物には、ラクダ、ウシ、ロバ、ヤギ、モルモット、ウマ、サル、マウス、ブタ、ウサギ、ラット、ヒツジなどが含まれる。
【００８６】
細胞集団内のターゲット化合物への抗体の結合は、適当な任意の機構を使用して検出することができる。例えば、ターゲットに結合する抗体、すなわち１次抗体を、蛍光染料、酵素抱合体などの検出可能な物質に直接に接合させることができる。あるいは、ターゲットに結合する抗体を、２次試薬を使用して間接的に測定することもできる。例えば、１次抗体に結合する能力を有する２次抗体または他の試薬は、光学的に検出可能な接合物質を含むことができる。抗体検出の他のバリエーションは例えば、弱い信号の増幅、またはビオチンまたはジゴキシゲニン接合１次または２次抗体との使用に特に適している。
【００８７】
より一般的には、結合選択性を有する任意の組成物が標識化成分として有用である可能性がある。これには例えば、ファージ・ディスプレイ、２ハイブリッド・システム、スプリット・ハイブリッド・システム、選択／増幅結合部位選択（ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：ＳＡＡＢ）、あるいは他のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ結合選択検定またはシステムによって生み出されたタンパク質、ペプチドおよびヌクレオチド・アプトマーが含まれる。これらの試薬は本来、光学的に検出可能であり、光学的に検出可能な物質に接合し、または追加の試薬を用いて間接的に測定することができる。ここでは、結合選択性または結合特異性が一般に、特定の結合相手には結合するが、残りのほとんどの部分には結合しないことを意味する。特異的な結合は、結合係数によって特性づけることができる。一般に、特異的結合係数の範囲は１０−４Ｍから１０−１２Ｍ、好ましい特異的結合係数の範囲は、１０−８または１０−９Ｍから１０−１２Ｍ以下である。
【００８８】
ｉｉｉ． 種々の標識
標識はさらに、選択的分配、選択的輸送、選択的検出可能性および／または代謝標識化などの選択的結合以外の機構を介した細胞特性の測定を可能にする試薬または他の種を含むことができる。
【００８９】
選択的分配を示す標識は、特定の細胞内環境中に優先的に分配するが、細胞集団中の特定の生体分子への高親和性の結合を伴わない。例えば、膜染料は、膜内部の疎水性環境中へ優先的に分配する。
【００９０】
選択的輸送を示す標識は、細胞の内側または細胞内区画に優先的に輸送される。これらの標識は、細胞内区画の形態、完全性、活性または頻度あるいは輸送経路の活性を識別する際に有用である。
【００９１】
選択的検出可能性を示す標識は、ある種の環境条件下に限って検出可能である。例えば、リソソーム指示薬は、リソソームの低ｐＨ条件下で光学的に検出可能だが、細胞の他の場所では検出されない。
【００９２】
代謝プロセスに感応する標識は、細胞内の代謝プロセスの存在および／または活性を測定するのに使用することができる。例えば、放射性標識などの標識を、合成経路などの代謝プロセスによって細胞中の物質に組み込むことができる。あるいは、標識を、細胞内の代謝プロセスによって光学的に検出可能にすることができ、したがって直接に検出可能にすることができる。
【００９３】
Ｖ． 細胞および細胞分析物質とキャリヤーの結合
細胞および／または細胞分析物質をキャリヤーと結合させ、それによって、キャリヤー上のコードを細胞および／または細胞分析物質に連結させることができる。細胞または細胞分析物質とキャリヤーとの間の結合は一般に、分析の間、有効な接着または付着を維持する、キャリヤーと細胞または細胞分析物質との間の任意の安定または半安定相互作用を含む。細胞集団と呼ばれる１種または数種の一群の細胞、および／あるいは１種または数種の細胞分析物質をキャリヤーと結合させて、キャリヤー・アセンブリーを作製することができる。この結合は、直接的または間接的な結合とすることができ、結合、付着または接着を含むことができる。本明細書では以後、用語「結合」と用語「結合」とを、細胞または細胞分析物質とキャリヤーとの結合を意味するものとして相互交換可能に使用する。結合は、静電的相互作用、共有結合、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス相互作用、および／または疎水−親水相互作用などを含む、適当な任意の機構を仲立ちとすることができる。一般に、結合は、キャリヤー、細胞、細胞分析物質、またはこれらの適当な組合せの適当な選択、処理および／または修飾によって容易にすることができる。
【００９４】
上記セクションＩおよび下記実施例１２、１３および１５の説明のとおり、結合は、例えばキャリヤーの材料、幾何形状および結合領域を適当に選択することによって容易にすることができる。細胞および細胞分析物質は、キャリヤーの外部または内部領域と結合させることができる。したがって、キャリヤーは、細胞が結合できるように、比較的に平らなまたは穏やかな輪郭の外部結合表面を含むことができる。さらに、結合表面を（例えばゾル−ゲルを使用して）望みどおりに処理または構成して、細胞または細胞分析物質の結合を促進することができるように、キャリヤーは修飾可能な結合表面を含むことができる。あるいは、キャリヤーを、細胞または細胞分析物質を、キャリヤーの内部に移動させ、またはキャリヤーの内部に直接に収容することを可能にするゲルまたは多孔質ポリマーなどの多孔質材料とすることができる。
【００９５】
細胞または細胞分析物質と一緒にする前または後に、キャリヤーを適当に処理することによって、結合を容易にすることができる。適当な処理には例えば、化学反応、電荷修飾、温度変化、光、放射および／または乾燥などが含まれる。したがっていくつかの応用では、キャリヤー表面を前処理し、または他の方法で修飾して、細胞または細胞分析物質の静電結合、あるいは所与のケースでは細胞または細胞分析物質のファンデルワールス結合または共有結合が促進されるようにすることができる。例えば、結合表面を、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ゼラチン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、ポリエチレンイミン、アルブミン、ＢＩＯＭＡＴＲＩＸ ＥＨＳ（Ｎｕｎｃ Ｎａｌｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）、ＢＩＯＢＯＮＤ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ社）、ＣＥＬＬ−ＴＡＫおよび／またはＭＡＴＲＩＧＥＬ（ともにＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）、あるいは細胞、組織または胚からの抽出物などの接着プロモーターでコーティングすることができる。あるいは、結合させた細胞層、例えば胚性幹細胞を培養するのに使用される線維芽細胞の層によって、細胞を間接的に接着することができる。あるいは、またはこれに加えて、特定の分子または細胞の結合を促進する方法、例えばアビジンおよび／またはビオチンを用いる方法、または固定化したレクチンでの修飾によって、結合表面を修飾することができる。
【００９６】
いくつかのケースでは、特異的結合対（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐａｉｒ：ＳＢＰ）間の相互作用によって、すなわち、対の一方のメンバーを細胞または細胞分析物質と結合させ、対の残りのメンバーをキャリヤーと結合させることによって、細胞または細胞分析物質とキャリヤーとの結合を容易にすることができる。特異的結合対のメンバー間の相互作用は一般に非共有結合性の相互作用であり、これらの相互作用は易可逆性であり、または本質的に非可逆的である。適当な特異的結合対の例を表２に示す。
【表２】
2004537712.tif 000003
【００９７】
さらに、細胞または細胞分析物質とキャリヤーとをその中で一緒にする媒質を適当に選択し、かつ／または処理することによって結合を容易にすることができる。例えば、このような媒質には、例えば細胞とキャリヤーの間に架橋を形成し、かつ／または細胞、細胞分析物質および／またはキャリヤーに関連した結合阻害因子の効果を打ち消すことによって、細胞または細胞分析物質とキャリヤーとの間の相互作用に関与し、または他の方法でこの相互作用を促進する結合メディエータが含まれる。結合メディエータは、例えば細胞、細胞分析物質および／またはキャリヤー上の特定の基または分子に結合することによって、特異的に作用することができる。ビオチンは、細胞または細胞分析物質上およびキャリヤー上のアビジンまたはストレプトアビジンに結合し、架橋を形成することによって、特異的結合メディエータとして作用する可能性がある。結合メディエータはさらに、例えば細胞または細胞分析物質上およびキャリヤー上の複数の基または分子クラスまたはカテゴリーに結合することによって、低特異性または非特異性メディエータとして作用することもできる。Ｃａ２＋イオンは、細胞または細胞分析物質上およびキャリヤー上の負電荷に結合し、これらを架橋することによって、比較的に非特異的な結合メディエータとして作用する可能性がある。
【００９８】
細胞または細胞分析物質とキャリヤー（または処理したキャリヤー）との結合は間接的に実施することができる。結合は、やはりキャリヤーと結合した他の細胞または細胞分析物質との相互作用を介して実施することができる。例えば、細胞とキャリヤーの間接的な結合を、細胞分析物質によって、例えば、キャリヤーと事前に結合させておいたリガンド、細胞セレクターまたは他の細胞分析物質に細胞を結合させることによって仲介することができる。結合によって細胞のその後の分析を容易にすることができる。あるいは、細胞分析物質（または細胞）を介した細胞（または細胞分析物質）とキャリヤーとの結合または結合の存在、不在またはレベルによって細胞特性を提供することができる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、細胞とキャリヤーの結合、またはその後の細胞分析を、細胞を固定することによって促進し、または容易にすることができる。この手順は一般に細胞を殺し、いくつかのケースでは、高分子間に共有結合性の架橋を生み出し、またはそれらを変性させることによって高分子を安定な構成にロックすることができる。（１）パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド、（２）メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトンなどのアルコールまたは他の有機溶媒、（３）酸化剤、（４）水銀剤、および／または（５）ピクリン酸塩を含む、適当な任意の固定剤を使用することができる。細胞は、キャリヤーと結合させる前、結合中、および／または結合後に固定することができ、あるいは、固定しなくてもよい。
【０１００】
細胞または細胞分析物質は、適当な任意の方法によってキャリヤー上に分布させ、またはキャリヤーと結合させることができる。いくつかの実施形態では、細胞または細胞分析物質をキャリヤーと混合して、細胞または細胞分析物質が、キャリヤーの使用可能な全ての部分と結合できるようにすることができる。他の実施形態では、結合を少なくとも実質的に、キャリヤーの１つまたはいくつかの表面に制限することができる。細胞または細胞分析物質をキャリヤーと一緒にして、細胞または細胞分析物質がキャリヤーの一部分と選択的に遭遇し、したがってその部分と結合するようにすることができる。例えば、キャリヤーを、組織培養容器の底などの水平な表面にランダムに、ただし実質的に単層として分布させる。次いで、細胞懸濁液を容器に加え、キャリヤーの上面に細胞を沈降させる。
【０１０１】
細胞および／または細胞分析物質とキャリヤーとの結合を、例えば基板上にキャリヤーを配列しまたは基板上でキャリヤー形成することによって定位置アレイとして提供されたキャリヤーを用いて実施することもできる。個々の細胞集団または細胞分析物質をアレイ内のキャリヤー上に配置し、あるいは、単一の細胞集団または細胞分析物質をアレイと一緒にし、アレイの例えばアクセス可能な面と結合させることができる。細胞または細胞分析物質とアレイ内のキャリヤーとを結合させた後に、定位置アレイからキャリヤーを取り出すことによってキャリヤーの分布をランダムにして、非定位置アレイを作り出すことができる。アレイ内に分布したキャリヤーと細胞の結合は、例えば患者サンプルからの限られた数の細胞をより経済的に使用することを可能にする。キャリヤー・アレイを使用した組織とキャリヤーの結合については実施例５で説明する。ただしこの方法は、この詳細な説明の項で例示した任意の細胞に対して適当なものにすることができる。
【０１０２】
ＶＩ． 細胞およびキャリヤーの細胞分析物質への曝露
細胞および／またはキャリヤーを、さまざまな目的で細胞分析物質に曝露することができる。曝露は一般に、細胞特性に影響を及ぼす機会を細胞分析物質に与え、かつ／あるいは細胞および／またはキャリヤーを細胞分析物質と物理的に近接させる任意の処理を含む。曝露には例えば、混合、一体化、プローブ使用、スクリーニング、インキュベーション、反応、結合および／または適用が含まれる。曝露は、適当な任意の時期に適当な任意の期間、実施することができる。したがって、曝露は、細胞結合の前、最中および／または後に実施することができる。曝露の結果として、細胞分析物質を、キャリヤー、および／またはキャリヤーと結合した細胞と結合させることができる。キャリヤーと結合した細胞分析物質は一般に、キャリヤー上のコードに少なくとも実質的に連結されている。
【０１０３】
結合を細胞依存性結合とすることができる。すなわち、結合を、キャリヤーと結合した細胞の存在に依存させることができる。下記実施例７および８、ならびに詳細な説明の項の他の場所で説明するように、例えば、細胞との結合を使用して、細胞と細胞分析物質の間、またはリガンドとレセプターの間の表現型相互作用または結合相互作用を測定し、あるいは、細胞結合相手を識別しかつ／または分離することができる。あるいはまたは加えて、細胞との結合を使用し、セクションＩＶ（Ｇ）で説明したように細胞を標識して、細胞特性を測定することができる。
【０１０４】
結合を細胞非依存性、または少なくとも実質的に細胞非依存性とすることもできる。細胞分析物質とキャリヤーの細胞非依存性結合は、セクションＶで説明したように、具体的な応用に応じて、細胞結合の前、最中、および／または後に実施することができる。細胞結合の前に実施するとき、細胞分析物質とキャリヤーの連結は事前結合（ｐｒｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）と記述することができる。事前結合ではキャリヤー・コードを使用して、下記セクションＶＩＩで説明するように、細胞分析物質および／またはその起源、量などの細胞分析物質の態様についての情報を標示し、あるいは細胞分析物質および／または細胞分析物質の態様を識別することができる。
【０１０５】
細胞非依存性結合、特にトランスフェクション物質、取り込まれたモジュレーターなどの細胞分析物質との細胞非依存性結合は、一時的であることが好ましい。一時的な結合では、安定な結合と不安定な結合との間のバランスをとる必要がある場合がある。細胞分析物質とコード付きキャリヤーとの間の細胞非依存性結合は、細胞結合および／または分析の間、細胞分析物質の一部をキャリヤー上に保持できる十分に安定なものでなければならない。しかし、この結合を、トランスフェクション物質または取り込まれたモジュレーターが分析の間に放出されて、キャリヤーと結合した細胞によって取り込まれるように一時的なものとすることができる。一時的結合は、ゼラチンなどのゲル形成物質によって形成されたゲルなどのゲルまたはキャリヤー・マトリックスに細胞分析物質を取り込ませることによって媒介することができる。
【０１０６】
細胞非依存性結合は一般に、１つまたは複数の既知のまたは決定可能なコードを有する一団のコード付きキャリヤーと１種または数種の細胞分析物質を混合し、あるいは他の方法で細胞分析物質をコード付きキャリヤーに曝露することによって実施される。安定結合または一時的結合を実施した後、異なる細胞分析物質に結合した複数のキャリヤーを、管、マイクロプレート・ウェルなどの単一の容器の中で一緒にして、細胞分析物質の非定位置アレイまたはライブラリーを生み出すことができる。
【０１０７】
事前結合には例えば、機能上異なった（または類似した）２種以上の細胞分析物質の組合せをコード付きキャリヤーと連結させることが含まれる。例えば、コード付きキャリヤーを、トランスフェクション物質と細胞セレクターの組合せ、細胞セレクターと局所捕獲物質の組合せ、または他の適当な２種以上の細胞分析物質の組合せと連結させることができる。複数の細胞分析物質とキャリヤーの事前結合は、逐次的におよび／または同時に実施することができる。それぞれのキャリヤー上のコードを使用して、キャリヤー上に存在する細胞分析物質の組合せについての情報を標示し、またはこの組合せを識別することができる。これについては下記セクションＶＩＩで詳細に説明する。事前結合させた細胞分析物質の組合せを使用する例示的な方法については下記実施例１０で説明する。
【０１０８】
ＶＩＩ． コード化情報
キャリヤー上のコードは、例えばキャリヤー、キャリヤーと結合した細胞および／または細胞分析物質、細胞に曝露させた細胞分析物質、前処理条件、後処理条件、検定条件、あるいはこれらの組合せなどに関するコード化された情報を標示する。いくつかの実施形態では、下記セクションＶＩＩＩでは説明するように、コードが、自体が位置するアレイの定位置または非定位置識別と組み合わされた追加のまたはより詳細な情報を標示する。
【０１０９】
コードは例えば、キャリヤーおよび／またはキャリヤーの特性についての情報を標示する。この情報は例えば、製造、構成、サイズ、光学特性、コーティング、前処理、またはキャリヤーの他の態様に関する。
【０１１０】
コードはさらに、キャリヤーと結合した細胞についての情報を標示することができる。この情報は例えば、細胞または細胞の態様を識別する。具体的には、コードによって例えば、細胞の型；患者情報、生検の期日または場所、起源生物種、起源組織および／または発生段階などの細胞の起源；細胞の遺伝子型；表現型特性；後成条件；転換方法；事前培養履歴；細胞にトランスフェクションした物質；注入した物質；レポーター遺伝子またはタンパク質；および／または継代数などを識別することができる。
【０１１１】
コードはさらに、キャリヤーと結合した１種または数種の細胞分析物質、および／あるいはキャリヤーと結合した細胞に曝露した１種または数種の細胞分析物質についての情報を標示することができる。このような情報には例えば、細胞分析物質のアイデンティティおよび／または濃度、細胞分析物質への曝露の時期および／または期間、あるいは、細胞分析物質または細胞分析物質の使用についての他の情報が含まれる。
【０１１２】
コードはさらに、そのキャリヤーを用いて実行中の検定についての情報を標示することができる。この情報には例えば、時刻、温度、濃度、検定段階の順序、測定モードなどが含まれる。
【０１１３】
ＶＩＩＩ． アレイ
それぞれのキャリヤー上にコードが存在することによって、異なるキャリヤー・アセンブリーを分析の間に一緒にし、追跡し、非定位置アレイの一部として多重分析することができる。「非定位置」アレイとは、アレイ内でのキャリヤーの相対位置がサンプルの識別または結果の解釈に使用されないことを意味する。調製および／または分析のために非定位置アレイを、適当な容器または他の支持体の中または表面に支持することができる。支持体には、ビーカ、ビン、毛細管、遠心管、チップ、フロースルー・チャンネル（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｈａｎｎｅｌ）、マイクロプレート・ウェル、顕微鏡スライドおよび試験管などが含まれる。ただしこれらに限定されない。非定位置アレイ実験は、例えば混合物、溶液または懸濁液中などでの湿式または乾式実験として、あるいは適当な支持体上で乾燥させて実施することができる。多重分析は、曝露の前、コードの読取りの前、または特性の測定の前を含む任意の分析段階で、異なるサンプルを一緒にする分析である。アレイの構成が、２つ以上の異なる細胞集団、細胞分析物質または検定条件などを含む場合、そのアレイ構成は「多重」構成である。
【０１１４】
非定位置アレイは一般に、別々に形成された異なるキャリヤー・アセンブリーを一緒にすることによって生成される。それぞれの異なるキャリヤー・アセンブリーまたは関連キャリヤー・アセンブリー・セットは一般に、位置的に異なった場所、例えば別々の容器の中で形成される。異なるアセンブリーは位置的に異なる区画の中で形成されまたは処理されるので、その場所で、コードを、細胞集団、細胞分析物質および／または検定条件に正確に連結させることができる。しかし、結合を実施した後は、異なるコードを有する異なったアセンブリーを単一の区画の中で一緒にして、非定位置アレイを生成することができる。非定位置アレイでは、異なったコードを有する異なるキャリヤー・アセンブリーは、互いに対してランダムにまたは任意に分布する。
【０１１５】
親非定位置アレイのキャリヤー・アセンブリー混合物を分配すると、実質的に同じ同胞アレイを作り出すことができる。これらの同胞アレイを、例えばマイクロプレート内の識別可能な位置に配置して、部分定位置アレイを形成することができる。したがって、これらの同胞アレイを、異なった細胞、細胞分析物質および／または検定条件に曝露することができ、マイクロプレート内のそれらの位置に基づいて追跡することができる。あるいはまたは加えて、同胞アレイを互いに対して非定位置とすることができる。例えば、同胞アレイを、標識を付けたマイクロ遠心管、明瞭に異なるマイクロプレートなどの別個の容器に入れることができる。このケースでは、それぞれの同胞アレイが、アレイを識別する非定位置コードに基づいて識別可能である。このアレイ識別コードは、容器によって、例えば容器に付けた記号またはコードを識別することによって維持することができる。あるいは、それぞれの同胞アレイの区別態様によってアレイを識別することもできる。例えば、それぞれのアレイに、アレイを識別する異なる（１つまたは複数の）追跡キャリヤーを含むことができる。追跡キャリヤーは一般に、同胞アレイを区別する任意のアレイ構成要素を含む。したがって、キャリヤー上のコードは、キャリヤーを提供した特定のアレイの定位置または非定位置識別に基づいて、より正確な、またはより完全なサンプル情報を標示することができる。
【０１１６】
場合によっては、コードに適当な複雑さを加えることによって、図１のコード付きアレイ１３０などの複数の非定位置アレイを一緒にして、情報を失うことなくより大きな非定位置アレイとすることができる。キャリヤー・アセンブリー上で実行された分析間の違いは、アセンブリーを一緒にしまたは位置的に分離したときの分析段階によって決定することができる。
【０１１７】
非定位置アレイはさらに、例えばコードを読み取り、レポート特性を測定する能力を有するアレイ装置内のランダムな固定位置を採用することができる。このような装置は、２０００年１０月１９日出願の米国特許出願第０９／６９４，０７７号に記載されている。この出願は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１１８】
ＩＸ． ライブラリー
多重検定はライブラリーの使用を含むことができる。ライブラリーは一般に、分子、リガンド、モジュレーター、トランスフェクション物質、レセプター、抗体および／または細胞（ファージ、ウィルス、完全な細胞、組織および／または細胞抽出物）などの、共通の特性によって関係づけられた２つ以上の異なるメンバーから成る集合を含む。したがってライブラリーは、２つ以上の異なる細胞、２つ以上の異なる抗体、２つ以上の異なるリガンド、２つ以上の異なるレセプター、あるいは異なるタンパク質を発現することによって区別される２つ以上の異なるファージまたは完全細胞集団などから成る集合を含むことができる。
【０１１９】
コード付きライブラリーは、２つ以上のライブラリー・メンバーを異なったコード付きキャリヤーと結合させることによって形成することができる。したがって、２つ以上の異なった細胞集団を異なるコードと結合させて、コード付き細胞ライブラリーを形成することができる。他の例では、トランスフェクション物質、モジュレーター、ファージ、リガンド、抗体、レセプターおよび細胞セレクターなどのコード付きライブラリーを、コード付きキャリヤー上に形成することができる。異なるクラスの２つ以上のライブラリー・メンバーをそれぞれのコードと結合させることによって、組合せコード付きライブラリーを形成することができる。いくつかの実施形態では、単一のクラスからの複数のライブラリー・メンバーを、それぞれのコード付きキャリヤーと結合させることができる。この複数のライブラリー・メンバーをプールと呼ぶ。この方法は、スクリーニングまたは他の分析のためのコード付きライブラリー・プールを生み出す。本発明は、幅広い潜在的なライブラリー・サイズに容易に適合させることができる多重アレイ・システムおよび方法を提供する。コード付きライブラリー、コード付き組合せライブラリーおよびコード付きライブラリー・プールを形成し使用する例示的な方法については、詳細な説明の項の他の場所で詳細に説明する。
【０１２０】
Ｘ． 細胞特性
細胞と細胞分析物質の間の相互作用が、１つまたは複数の細胞特性を提供し、かつ／または１つまたは複数の細胞特性に影響を及ぼす可能性がある。細胞特性は一般に、キャリヤーと結合した個々の細胞または細胞集団の測定可能な任意の態様を含む。細胞特性には例えば、細胞または細胞集団の表現型、遺伝子型、生化学的および／または物理的特性、ならびに／あるいは細胞と細胞分析物質の間の相互作用の存在、レベル、質および／または効果が含まれる。細胞特性は、モジュレーターまたは他の細胞分析物質への曝露を用いて、またはこのような曝露なしで分析することができる。
【０１２１】
適当な細胞表現型の例には例えば、細胞生存；細胞集団数；有糸分裂指数；細胞集団密度；細胞集団配列；細胞形状；細胞サイズ；細胞の外観；細胞周期分布；特異的細胞周期停止；アポトーシスの頻度；物理／環境モジュレーターに対する応答；細胞アイデンティティ／分化；細胞形質転換；細胞付着性；小器官の数、外観および／または位置；成分の取込み、排出または細胞内輸送など、が含まれる。適当な遺伝子型の例には例えば、倍数性、遺伝子増幅、遺伝子再編成、外来性ＤＮＡの存在および／または量などが含まれる。生化学的特性には例えば、細胞成分の量、細胞内配置または分布、修飾、パートナーシップ（物理的結合）および／あるいは活性が含まれる。例示的な細胞成分には例えば、特異遺伝子、トランスフェクションしたＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡレポーターなどの内因性または外因性核酸が含まれる。例示的な細胞成分にはこの他、内因的にコードされた細胞タンパク質などのタンパク質、およびレポーター遺伝子から発現されたＧＦＰ、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼなどの外因的にコードされたレポーター・タンパク質が含まれる。例示的な細胞成分にはこの他、局所捕獲物質によって検出される分泌された細胞成分の存在またはレベルが含まれる。後に詳細に説明するように、例示的な細胞成分にはこの他、ペプチド、脂質、炭水化物、ホルモン、代謝産物、イオンなどが含まれる。
【０１２２】
細胞特性は直接にまたは間接的に検出することができる。直接に検出される細胞特性は、例えば位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡などの光学的手段によって測定することができ、このような細胞特性には例えば、細胞数、細胞分布、細胞形態、細胞外基質構造、ＧＦＰ信号、または直接に測定される細胞の他の態様が含まれる。直接に測定される細胞特性を使用すると、細胞を生きたまま分析することができる。対照的に、間接的に検出される細胞特性は、検出可能な信号を提供しまたは生成する１種または数種の標識で細胞を標識した後に測定することができる。使用する標識の型に応じて、標識化は、生きた細胞、あるいは固定しかつ／または膜透過性にした細胞に実施することができる。
【０１２３】
Ａ． 直接に測定される細胞特性
直接に測定される細胞特性は多くの応用で有用である。例えば、細胞の総数、密度、相対配列および外観は、細胞付着性、細胞増殖、細胞アイデンティティ／分化、毒性、細胞−細胞相互作用、細胞移動性および細胞形質転換などに関する情報、ならびにこれらの細胞特性に対するモジュレーターまたは他の細胞分析物質の効果に関する情報を提供する。
【０１２４】
レポーターは、直接に測定される他の型の細胞特性を提供することができる。レポーターは一般に、物質の存在量、位置および／または環境についての情報を提供する検出可能な任意の物質を含む。例えば、レポーターは、ｐＨ； Ｃａ＋２、Ｚｎ＋２、ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰのレベル；または酵素活性などの細胞の特性についての情報を提供することができる。レポーターは一般に、一時的に導入された外来遺伝物質、または細胞分裂中も安定的に維持される外来遺伝物質によってコードされる。しかし、レポーターが細胞に固有のものであることもあり、またはレポーターをコードする遺伝子の突然変異による細胞固有分子の修飾によって生み出されることもある。本発明で使用するのに適した直接に検出可能なレポーターの例は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。適当なＧＦＰ変異体も、例えば米カリフォルニア州Ｐａｌｏ ＡｌｔｏのＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から市販されている。これらのＧＦＰ変異体は、青色、黄色および赤色光の優勢な放射を含む、ＧＦＰとは大幅に異なった発光スペクトルを有することがある。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、細胞集団が、レポーターをコードするヌクレオチド配列に連結した対象とする遺伝子調節配列を有するレポーター融合遺伝子を含む。このような融合遺伝子は、遺伝子調節配列を介して作用するさまざまなモジュレーターに応答した、測定すべきレポーター遺伝子の発現を可能にすることができる。これらの実施形態によって、対象とする遺伝子をオンまたはオフにするモジュレーターまたは他の細胞分析物質の識別を容易にすることができる。直接に検出されるＧＦＰなどのレポーター、およびβガラクトシダーゼなどの通常は間接的に検出されるレポーターを、これらのレポーター融合遺伝子に含めることができる。
【０１２６】
他の実施形態では、細胞集団が、遺伝的にコードされたレポーター融合タンパク質を含む。レポーター融合タンパク質はそれぞれ、レポーター・タンパク質に連結した対象とするタンパク質を有する。したがって、レポーター・タンパク質は、対象とするタンパク質の検出可能なタグの働きをする。この戦略は、レポーター・タンパク質タグを介して対象とするタンパク質の特性を測定することを可能にする。例えば、対象とするタンパク質が、特徴的なまたは調節された細胞内分布を有する場合、例えばモジュレーターに応答した、または他の細胞分析物質への曝露に応答した分布の変化を測定することができる。したがって、レポーター融合タンパク質の細胞内分布を調節しまたは変化させるモジュレーターおよび／または他の細胞分析物質の能力を試験することができる。ＧＦＰなどの直接に検出されるレポーターおよびβガラクトシダーゼなどの通常は間接的に検出されるレポーターを、レポーター融合タンパク質に含めることができる。
【０１２７】
Ｂ． 間接的に測定される細胞特性
間接的に測定される細胞特性は例えば、適当な標識または標識セットで細胞を標識した後に出現する。標識は一般に、光学的に検出可能な特性などの検出可能な特性を含み、または生み出す。したがって、異なった光学的特性を有する標識、例えば実質的に重なり合わない励起および／または発光スペクトルを有する蛍光染料を適当に選択することによって、コード付き細胞集団の２つ以上の細胞特性を測定することができる。
【０１２８】
間接的に測定される細胞特性は例えば、細胞および／または細胞分析物質の内部、表面および／または近くに存在する成分または構造の存在または不在、絶対または相対レベル、細胞内位置または分布、頻度、完全性、外観、活性、パートナーシップ、および／あるいは検出可能な他の任意の特性の尺度を提供する。成分には例えば、ヌクレオチド、その代謝産物などの小分子が含まれ、これには、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰおよび補酵素Ａ；糖およびその代謝産物；アミノ酸およびその代謝産物；リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質、トリグリセリド、コレステロール、ステロイド、イソプレノイドおよび脂肪酸を含む脂質およびその代謝産物；ならびにカルシウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、塩化物イオンなどのイオンが含まれる。成分にはさらに、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＤＭ（ｄｏｕｂｌｅ ｍｉｎｕｔｅ）ミニクロモソームＤＮＡ、ウィルスＤＮＡ、トランスフェクションしたＤＮＡ、あるいは他の外来性または内因性ＤＮＡ配列を含む、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）などの高分子；リボソームＲＮＡ、トランスファＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、構造ＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを含むリボ核酸（ＲＮＡ）；ペプチド、およびリンタンパク質、糖タンパク質などの共有結合によって特異的に修飾されたタンパク質誘導体を含むタンパク質；ならびにグリコーゲンおよびセルロースを含む多糖が含まれる。
【０１２９】
ｉ． ＤＮＡに関係した細胞特性
ＤＮＡの測定によって細胞特性を提供することができる。ＤＮＡに関係した細胞特性には例えば、総ＤＮＡ；総ゲノムＤＮＡ；総ミトコンドリアＤＮＡまたは他のオルガネラＤＮＡ； ＤＭ染色体の頻度；染色体または染色体セットの頻度、核内／細胞内分布または完全性；染色体領域の頻度、細胞内分布または完全性が含まれる。染色体領域は、動原体、異質染色質、動原体異質染色質、真正染色質、３重らせん、メチル化配列、末端小粒、反復配列、遺伝子、遺伝子のエクソン、遺伝子のイントロン、遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、遺伝子のインシュレーター、遺伝子の５’非翻訳領域、遺伝子の３’非翻訳領域、ヌクレアーゼ過敏部位、活性トランスポゾン、不活性トランスポゾン、座制御領域、基質付着領域、あるいは既知または未知の機能を有する他の染色体領域から選択される。ＤＮＡに関係する細胞特性にはさらに、自然にまたは人為的に導入された外来ＤＮＡ配列の頻度、細胞内分布または完全性が含まれる。
【０１３０】
ＤＮＡに関係する細胞特性は細胞機能の諸態様を明らかにすることができる。例えば総核ＤＮＡは、アポトーシスを起こし、非常に明るく染色されるコンパクトな前核を有する細胞の割合の尺度を提供することができる。さらに、総核ＤＮＡの分析は、倍数性、有糸分裂細胞の頻度、全体的な核の形態、したがって細胞の状態、健康状態および有糸分裂指数の指示を提供することができる。総ＤＮＡはさらに、細胞周期チェックポイントの欠陥を含む細胞周期の進行を変更するモジュレーターまたは細胞分析物質の能力の指示を提供することができる。例えば、小核、より大きな核、不規則な形状の核、細胞あたり複数ある核、Ｍ期に染色体が凝縮したときに検出可能な異数性、および／または核間架橋を含む、核形態の変化を測定することができる。
【０１３１】
染色体、染色体内領域または遺伝子の分析も細胞特性を提供することができる。細胞が患者のサンプルから得られたものであるとき、細胞特性を診断目的に使用することができる。この場合には、ＤＮＡレポート特性を遺伝子型決定戦略として使用し、ＤＮＡ領域のコピー数または完全性を識別して、例えば、細胞が、そのＤＮＡ領域について２倍体、１倍体または異数体であるか、あるいは欠失または増幅されているのかどうかを判定することができる。腫瘍内の特定の遺伝子またはＤＮＡ領域のこれらの変化が、癌診断および／または治療を含む予後を提供する可能性がある。
【０１３２】
ｉｉ． ＲＮＡに関係した細胞特性
ＲＮＡの測定によっても細胞特性を提供することができる。さまざまなＲＮＡの分析が、例えば全体的な遺伝子活性、特定の遺伝子またはレポーターの転写活性、および／あるいはタンパク質合成およびＲＮＡスプライシングに関与するＲＮＡを含む構造または触媒ＲＮＡの存在量または細胞内分布の測定に有用である。例えば、ＲＮＡの存在の有無は、細胞、ウィルスまたはトランスフェクションした遺伝子の発現レベルの指示を提供する。さらに、異常なＲＮＡ転写産物の測定も細胞特性を提供することができる。この場合、異常な転写産物は、遺伝子の突然変異または再編成、あるいは１次ＲＮＡ転写産物をメッセンジャーＲＮＡへスプライシングする際の欠陥または誤りの尺度を提供することができる。
【０１３３】
ｉｉｉ． タンパク質に関係した細胞特性
タンパク質の存在の有無、レベル、修飾、細胞内位置または分布、および／あるいは機能特性の測定も細胞特性として使用することができる。例えば、特定のタンパク質またはタンパク質セットの分析が、細胞のアイデンティティ；生物種起源；発生段階；転換状態；細胞周期中の位置；増殖状態；所与の信号伝達経路の状態；熱ショック、チェックポイント、アポトーシスなどの細胞プログラムの開始；転移ポテンシャル；薬物感受性または有効性；あるいは所与の輸送経路の使用または完全性などの指示を提供するのに有用であることがある。さらに、小器官などの異なった細胞内領域の中に存在するタンパク質の分析は、小器官、疾病状態、および／あるいは細胞構造または機能の他の態様についての情報を提供することができる。
【０１３４】
ｉｖ． 脂質に関係した細胞特性
脂質の存在、レベル、細胞内分布、修飾、パートナーシップおよび／または他の特性の測定は細胞特性を提供することができる。脂質は一般に、代謝において、細胞の膜のところで信号分子などとして多様な役割を果たす、例えば、ホスファチジルイノシトール−３−ホスファート（ＰｔＩｎｓ３Ｐ）は、細胞内トラフィックの調節とさまざまな信号伝達経路の両面で基本的な役割を有する。ＰｔＩｎｓ３，４Ｐ、ＰｔＩｎｓ３，５Ｐ、ＰｔＩｎｓ４Ｐなどの他のホスホイノシチドも、細胞機能の調節において基本的な役割を果たすようである。これらの脂質および他の多くの脂質の分析は、多くの型の多重分析において重要である。
【０１３５】
ＸＩ． 測定方法
コード付き細胞集団の特性の測定およびこれと結合したキャリヤーのコードの読取りは、細胞集団に対する検定手順の前、最中、および／または後に実施することができる。読取り段階および測定段階は一般に、任意の順序で実行することができ、それぞれの段階は、特定のキャリヤーに対して選択的に実行することができる。例えば、いくつかのケースでは、陽性信号を示すキャリヤーなど、特定の細胞特性を示すキャリヤー上のコードだけを読み取ることができる。あるいは、アレイ内のキャリヤーの中で特定のコードを有するキャリヤーの細胞特性だけを測定することができる。さらに、これらの段階は、スライド、マイクロプレート、毛細管など適当な任意の基板、および顕微鏡、フィルム・スキャナ、プレート・リーダなどの適当な任意の検出装置を使用して実行することができる。
【０１３６】
コード、細胞特性および他の測定量は、適当な任意の測定方法を使用して決定することができる。測定量は一般に、測定、計数および／または比較が可能な任意の対象とする特性または態様を含む。検出方法には例えば、分光学的方法、流体力学的方法および画像化方法が含まれ、特に、複数のサンプルの高スループット分析に適合可能な方法が含まれる。検出方法にはさらに視覚的な分析が含まれる。測定量は、定量的および／または定性的にレポートすることができる。測定量には例えば、存在または不在、あるいは相対および／または絶対量などが含まれる。
【０１３７】
分光学的方法は一般に、電磁放射（光または波状粒子）と物質との相互作用を含み、例えば、相互作用によって変化した電磁放射のある特性を監視することを含む。例示的な分光学的方法には、吸収、ルミネセンス（光ルミネセンス、化学ルミネセンスおよび電気化学ルミネセンスを含む）、磁気共鳴（核共鳴および電子スピン共鳴を含む）、散乱（光散乱、電子散乱および中性子散乱を含む）、円偏光２色性、回折および旋光などが含まれる。例示的な光ルミネセンス法には、蛍光強度（ＦＬＩＮＴ）、蛍光偏光（ＦＰ）、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、蛍光寿命（ＦＬＴ）、全内反射蛍光（ＴＩＲＦ）、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、光退色後の蛍光回復（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｆｔｅｒ ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ：ＦＲＡＰ）， およびこれらのリン光相似物、ならびに生物ルミネセンス共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）などが含まれる。
【０１３８】
同じおよび／または異なる分光学的方法を使用して、コードを読み取り、細胞特性を測定することができる。例えば、コードと細胞特性をともに、可視光などの電磁放射の吸収によって検出することができる。実施例１２および１３で説明するものなど、明瞭に異なったコード領域と非コード領域を有するキャリヤーは、単一の分光学的方法を用いた分析に適している。あるいはまたは加えて、実施例１５で説明するように、コードと細胞特性は、異なる分光学的方法および／または検出方法を用いて測定することができる。
【０１３９】
流体力学的方法は一般に、分子または他の物質とその近傍、その溶媒および／またはマトリックスとの相互作用を含み、流体力学的方法を使用して、分子のサイズおよび／または形状を特性づけ、またはサンプルをその成分に分離することができる。例示的な流体力学的方法には例えば、クロマトグラフィ、沈降法、粘度法、電気泳動法などが含まれる。
【０１４０】
画像化法は一般に、サンプルまたはその成分を視覚化することを含む。例示的な画像化法には、光学顕微鏡法、電子顕微鏡法などが含まれる。例示的な画像化データにはアナログおよびディジタル画像などが含まれる。
【０１４１】
コードを読み取り、細胞特性を測定する例示的な方法は、相互参照の項に掲載した、参照によって本明細書に組み込まれる特許および特許出願、具体的には２００１年７月２４日出願の米国仮特許出願第６０／３０７，６４９号に詳述されている。
【０１４２】
ＸＩＩ． 実施例
以下の実施例は、コード付きキャリヤーならびに細胞および／または細胞分析物質の非定位置アレイを製作し使用する方法を含む、本発明の選択された態様および実施形態を説明する。これらの実施例は例示目的で本明細書に含めたのであって、本発明の全体の範囲を限定し、または定義することを意図したものではない。実施例には特に、（１）コード付き細胞アレイを作製する方法、（２）分化モジュレーターの多重スクリーニング、（３）出生前サンプルの多重スクリーニング、（４）遺伝子増幅の多重分析、（５）非定位置組織アレイを作製する方法、（６）細胞特性の多重分析、（７）レセプター／リガンド検定システム、（８）コード付きキャリヤーを使用した生物検定、（９）逆トランスフェクションを使用した多重細胞分析システム、（１０）コード付き細胞分析物質アレイを使用した多重細胞分析、（１１）コード付きキャリヤーを使用したライブラリー・スクリーニング・システム、（１２）フィルム・ベースのコード付きキャリヤー、（１３）表面積強化および／または磁気部分を有するコード付きキャリヤー、（１４）コード付きキャリヤー上の細胞集団からの細胞測定、および（１５）コード付きキャリヤー実施形態、コードの読取りおよび特性の測定が含まれる。
【０１４３】
【実施例】
実施例１ コード付き細胞アレイを作製する方法
図２〜４に示したこの実施例は、１つまたは複数の細胞集団を１つまたは複数のコードと結合させる方法を説明する。
【０１４４】
図２に、コード付き細胞集団を調製する方法１７０を示す。この方法では、単一の細胞集団１７２を、単一のコード１７６を有する単一の型のコード付きキャリヤー１７４と結合させる。細胞１７２は懸濁集団として提供される。細胞１７２は例えば、容器、例えば組織培養皿、プレート、フラスコまたは多ウェル・プレートでのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養を直接の起源とすることができる。あるいは細胞１７２を、生体を直接の起源とする、例えば患者生検に由来する吸引液からの、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養を実施していない細胞とすることもできる。さらに細胞１７２は、（１）トリプシンなどのプロテアーゼを用いたインキュベーションなどの酵素処理、（２）機械的分離、（３）カルシウム・レベルなどのイオン条件の調整または（４）ｐＨの変更を含む適当な任意の方法によって、互いから、または基質から分離することができる。あるいは細胞１７２は、細胞集合体、細胞シートまたは組織断片を含む、キャリヤー１７４と結合させるのに適した任意の形態で提供することができる。例示的な細胞および結合方法は上記セクションＩＩＩおよびＶに含まれている。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、細胞１７２を生きたままキャリヤー１７４と結合させる。生きた細胞は、より効率的にキャリヤー１７４に付着させることができる。さらに、生きた細胞は、死んだ細胞では無効なモジュレーター、トランスフェクション物質などのいくつかの細胞分析物質に有効に曝露させることができる。あるいは、キャリヤー１７４と結合させる前に、細胞１７２を固定し、または他の方法で細胞１７２を殺すことができる。例えば、キャリヤーとの結合に不適当な時期に、または不適当な場所で細胞１７２を収集しておくこともできる。生きているか、または死んでいるかにかかわらず、重力を媒介とした細胞１７２のキャリヤー１７４上への沈降または遠心処理を含む適当な任意の方法によって、細胞１７２を１７８に示すようにキャリヤー１７４と一緒にして、キャリヤーと結合した細胞集団１８０をキャリヤー・アセンブリー１８２の一部として生み出す。
【０１４６】
図３に、実質的に等しい複数の非定位置兄弟細胞アレイを形成する方法２００を示す。この実施例では、３つの異なる細胞型または細胞集団１７２、２０２、２０４をそれぞれ、異なったコード１７６、２１０、２１２を有する異なるクラスのコード付きキャリヤー１７４、２０６、２０８と結合させる。結合した細胞集団１８０、２１４、２１６がそれぞれ、キャリヤー・アセンブリー１８２、２１８、２２０上に含まれている。これらのキャリヤー・アセンブリーを２２２に示すように混合することによって、コード付き細胞ライブラリーを表す非定位置アレイ２２４を生み出す。非定位置アレイ２２４を１種または数種の細胞分析物質に直接に曝露し、かつ／または２２６に示すように分配して、複数の非定位置同胞アレイ２２９から成る定位置または非定位置アレイ・セット２２８を形成することができる。図示のとおり、それぞれの同胞アレイは、異なるキャリヤー・アセンブリー型の類似した表現を有することができるが、これらを、１種または数種の細胞分析物質から成る異なった細胞分析物質セットに曝露することができる。
【０１４７】
図４に、コード付き細胞集団を調製する方法２３０を示す。この方法では、親細胞集団を、異なったコードを有するコード付きキャリヤーと結合させる。細胞２３２を細胞群２３４、２３６、２３８に分割し、これらの細胞群をそれぞれ、異なるコード２４６、２４８、２５０を有する異なるクラスのコード付きキャリヤー２４０、２４２、２４４と結合させる。コード付きキャリヤー型と細胞群はそれぞれ、別々の容器２５１の中で一緒にし、結合させ、これによって細胞とコードの間の正確な連結を保証する。細胞２３２をコード付きキャリヤー２４０、２４２、２４４と結合させて、細胞−キャリヤー・アセンブリー２５８、２６０、２６２上に含まれる結合した細胞集団２５２、２５４、２５６から成る細胞集団アレイ・セットを生み出す。この時点では、結合した細胞集団どうしは実質的に同じである。しかし、これらの細胞集団を異なる方法で処理することができる。例えば、図１に例示したように、これらの細胞集団を別々の細胞−キャリヤー・アセンブリー・セットと一緒にし、かつ／または異なった細胞分析物質に曝露することができる。さらに、やはり図１に示したように、このようなコード付き細胞集団は、コードおよび特性の読取り／測定の前に一緒にすることができる。別々の容器で異なったキャリヤー・アセンブリーを形成する代わりに、細胞２３２を、混合された異なったキャリヤー群と結合させることもできる。次いで、混合されたキャリヤー群をキャリヤー・コードに従って選別し、これによって関連キャリヤー・アセンブリーごとにまとめることができる。
【０１４８】
実施例２ 分化モジュレーターの多重スクリーニング
この実施例は、分化促進活性について薬物候補をスクリーニングする多重細胞検定を説明する。７つの異なる成人または胚性幹細胞系統の骨芽細胞への分化を測定する。細胞系統は平板培養し、増殖させ、組織培養フラスコ内の細胞分裂しない線維芽細胞から成るフィーダ層上で継代させる。細胞はリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、トリプシンを用いた消化によって培養基質から取り出す。
【０１４９】
異なる７つの光学コードを有するコード付きキャリヤーをガラスから調製し、ゼラチンを５％含むＰＢＳ溶液を用いた１０分間のインキュベーションによってコーティングする。組織培養プレートなどの７つの平底容器の底全体にキャリヤーを分散させて、それぞれの容器の中に、単一のコードを有するキャリヤーの単層を作り出す。キャリヤーは、３つの空間区画またはコード要素を含むように設計されている。第１および第２のコード要素はそれぞれ、コード要素を透過する可視光スペクトルに基づいて赤（Ｒ）、青（Ｂ）または黄（Ｙ）とすることができ、一方、第３の区画は色コード情報を持たず、コードの方向決定を容易にする。７つのコード（クラス）から成る適当なコード・セットは、９つの可能なコード、すなわちＲＲ、ＲＢ、ＲＹ、ＢＲ、ＢＢ、ＢＹ、ＹＲ、ＹＢおよびＹＹの中から選択される。コード付きキャリヤーのサイズは約２５０×２５０×２５ミクロンである。このコード付きキャリヤーの幾何形状は、重力に従った共通の方向を向けるのに有利であり、沈降させ、静かに撹拌した後にそれぞれのキャリヤーは一般に、２つの大面の一方が水平に配置される。
【０１５０】
上記の７つのそれぞれの細胞系統から成る単細胞懸濁液を、７つのコード付きキャリヤー・クラスのうちの１つを含む７つの容器の中にフィーダ細胞とともに入れる。細胞は、それぞれの容器の底まで沈降させ、容器の中に存在するコード付きキャリヤーの上面に付着させる。それぞれの容器に加えた細胞は、コード付きキャリヤー上に、容器の底面の５０％を覆う融合性の単一層を形成する。
【０１５１】
効果的に付着させるために数時間から一晩放置した後、それぞれの容器から細胞−キャリヤー・アセンブリーをピペットによって媒質と一緒に取り出し、取り出した７種の細胞−キャリヤー・アセンブリーを別の１つの容器の中で一緒にする。静かに混合して、７つの異なるコード付き細胞集団を含む非定位置アレイを作り出した後、この組成物の一定量を標準９６ウェル・マイクロプレートのウェルに分配して、非定位置同胞（ｓｉｂｌｉｎｇ）アレイを形成する。それぞれのウェルには、それぞれの細胞型を少なくとも約１０回表現し、同時にウェルの底にが沈んだときのキャリヤーの重なり合いが最小限になる、適当な数のコード付きキャリヤーを導入する。キャリヤーの１つの表面の面積は約（２５０ミクロン×２５０ミクロン）、すなわち約０．０６ｍｍ２であり、一方、９６ウェル・マイクロプレートの標準ウェルの底面の面積は約６４ｍｍ２である。したがって、被覆率をウェルの面積の１０％とすると、約１１０個のキャリヤーが加えられ、１細胞系統あたりでは平均１６キャリヤーとなる。
【０１５２】
潜在的分化促進化合物の効果を試験するため、それぞれのウェルに別々の候補化合物を加える。それぞれの化合物と一緒に細胞を、適当な分化条件下で、分化を試験するのに適当な時間、インキュベートする。この例では、骨芽細胞への分化を促進する能力について３日後に化合物をスクリーニングする。期間終了後、媒質を除去し、パラホルムアルデヒドを用いて同胞アレイを固定し、骨芽細胞特定マーカーの抗体である米カリフォルニア州Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ ＦｒａｎｃｉｓｃｏのＺｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社のモノクローナル抗オステオカルシンで標識する。続いて、テキサス・レッド共役ヤギ抗マウス２次抗体（Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を用いたインキュベーションによって、結合した１次抗体を検出する。ウェルの中のそれぞれの細胞−キャリヤー・アセンブリーをｉｎ ｓｉｔｕで分析する。すなわち、適当なフィルタを用いた透過顕微鏡法によってカラー・コードを読み取り、蛍光顕微鏡法によって、それぞれのキャリヤーと結合した細胞からの蛍光信号を測定する。
【０１５３】
実施例３ 出生前サンプルの多重スクリーニング
この実施例は、遺伝的、表現型、生化学的および／または物理的異常に関して出生前サンプルをスクリーニングする多重検定システムを説明する。この検定システムはさらに、性別、健康状態および／または血統などの予測因子を含む他の任意の細胞特性を、出生前サンプルから測定することができる。以下の具体的実施例は、胎児、未着床胚および絨毛膜絨毛サンプルを検査する方法を例示する。
【０１５４】
３．１ 胎児サンプルの分析
この実施例は、遺伝子欠損に関して胎児サンプルをスクリーニングする多重細胞検定を説明する。妊娠１５〜１６週の複数の女性の羊水から胎児の細胞を羊水穿刺によって得、これを培養する。それぞれの胎児サンプルの細胞を次いで、上記実施例２のそれなどの異なったコード付きキャリヤー・クラスと結合させる。この場合にはまず最初に、それぞれのコード付きキャリヤー・クラスを、狭い間隔の平面アレイとして配置する。次いでこの平面アレイに、それぞれの胎児サンプルの細胞を加えてキャリヤーと結合させる。結合させた後、それぞれのキャリヤーに付着した細胞を、４％パラホルムアルデヒドＰＢＳ溶液を用いて室温で１０分間処理することによって固定する。
【０１５５】
生み出されたそれぞれの患者サンプルとキャリヤーのアセンブリーを、微小遠心管、マイクロプレート・ウェルなどの１つの容器の中で一緒にして、サンプルの親非定位置アレイを作製し、次いで、これを個別の複数の反応容器に、定位置または非定位置フォーマットで分配して、異なるプローブを用いるＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）分析用の同胞アレイを形成する。個々の容器は、いずれも米イリノイ州Ｄｏｗｎｅｒｓ ＧｒｏｖｅのＶｙｓｉｓ社から販売されているＬＳＩ ＤｉＧｅｏｒｇｅ／ＶＣＦＳ Ｒｅｇｉｏｎプローブ、ＬＳＩ Ｗｏｌｆ−Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ Ｓｙｎｄｒｏｍｅプローブ、ＬＳＩ ＬＩＳ１ Ｍｉｌｌｅｒ−Ｄｉｅｋｅｒ Ｍｉｃｒｏｄｅｌｅｔｉｏｎプローブ、およびＡＮＥＵＶＹＳＩＯＮ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔプローブを用いてハイブリッド形成させる。ハイブリッド形成および洗浄の後、それぞれの同胞アレイのキャリヤー・アセンブリーを顕微鏡スライド上に広げ、透過顕微鏡法によって走査してコードを読み取る。さらに、蛍光顕微鏡法によって細胞を分析し、特定の染色体微小欠失、異数性、３染色体性または他の欠陥に関して胎児性サンプルを検査する。
【０１５６】
３．２ 未着床胚の分析
この実施例は、遺伝子病に関して未着床胚をスクリーニングする代表的な多重細胞検定を説明する。７つの異なる未着床胚から割球を得、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する。得られた細胞培養をそれぞれ、７つのコード付きキャリヤー・クラスの１つと結合させ、固定し、これらを一緒にして、実施例２で説明したように非定位置コード付き細胞アレイを作製する。このアレイを異なる複数の容器に分配して同胞アレイを形成し、ＦＩＳＨのための処理を、例えば実施例３．１で説明したように実施する。次いで、それぞれの容器のキャリヤーを顕微鏡スライド上に広げ、コードを読み取り、蛍光ＦＩＳＨ信号を測定する。
【０１５７】
３．３ 絨毛膜絨毛の分析
この実施例は、遺伝子病に関する絨毛膜絨毛サンプルの多重スクリーニングを説明する。妊娠１０から１２週の７人の女性から絨毛膜絨毛サンプルを、プラスチック・カテーテルを用いて子宮頚を通して集め、これをｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する。次いで、培養細胞を実施例３．１および３．２と同様に処理する。
【０１５８】
実施例４ 遺伝子増幅の多重分析
この実施例は、ＨＥＲ−２遺伝子の増幅に関して患者サンプルをスクリーニングする代表的な検定を説明する。胸部小結節の針吸引生検を７人の患者に実施する。集められた細胞を、例えば実施例２で説明したように７つのコード付きキャリヤー・クラスと結合させ、固定し、Ｖｙｓｉｓ社のＰＡＴＨＶＹＳＩＯＮ ＨＥＲ−２ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｋｉｔを用いてＦＩＳＨ用に処理する。実施例３．１および３．２と同様にキャリヤー・アセンブリーを分析し、それぞれの患者サンプルのＨＥＲ−２増幅のレベルおよび／または頻度を測定する。
【０１５９】
同じ方法または同様の方法を使用して、患者サンプルを検査し、癌腫、肉腫、神経腫、白血病などを含む任意の癌または腫瘍を識別し、特性づけ、病期を決定し、診断し、予後を判定し、それに対する薬物投与または治療計画を選択することができる。
【０１６０】
実施例５ 非定位置組織アレイを作製する方法
図５〜１６に示すこの実施例は、多重組織分析用の非定位置組織アレイを作製する方法を説明する。
【０１６１】
何世紀もの間、病理学者は、ヒトの組織サンプルを研究し、特性づけてきた。現在の高度に発展した病理学は、正常な組織および病気の組織を固定し、切片化し、染色して、それぞれの組織の特性を比較し対比するさまざまな手法を提供する。より最近に病理学者は、少なくとも部分的に分子生物学から導かれた、組織中のパラメーターを識別する手法を導入した。例えば、ＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法は、腫瘍サンプル、患者生検材料などの病気組織中の染色体、染色体内領域および特定の遺伝子のコピー数および核内分布を調べる能力を病理学者に与えた。ＦＩＳＨ法および免疫組織化学（ＩＨＣ）はさらに、ＲＮＡおよびタンパク質レベルでのｉｎ ｓｉｔｕ遺伝子発現を研究して、特定のＲＮＡまたはタンパク質の状態、病気の予後および提案された治療法の間の相関を向上させる目的にも使用されている。
【０１６２】
標準技術では、病理学者は、固定し、包埋した組織の薄い切片を顕微鏡スライドなどの基板上に固定化した後に、ｉｎ ｓｉｔｕ手法によって無傷組織を分析する。病理学者は一般に、顕微鏡スライドのすりガラス部分に鉛筆で書き込むことによってスライドに標識をつける。この標識は、ＦＩＳＨ、ＩＨＣなどのその後の操作の間、組織切片の起源を識別する。しかし、この標準の組織調製法は、高スループット分析または多重分析には適さない。
【０１６３】
新しい組織分析法の出現に加え、組織分析に使用可能な試薬の数の爆発的増加が、この標準組織調製法の非効率性および不適格性をさらに増大させた。例えば、ヒト・ゲノムの配列決定では、病理学者がそれを使用する能力をはるかにしのぐ速度で、ＦＩＳＨ用の新しい分析ツールが開発されている。にもかかわらず、これらのツールを使用して健常者および病気の患者の組織を研究することの価値を疑うものはほとんどない。例えば、薬物療法、腫瘍の表現型、腫瘍の遺伝子型、患者の遺伝子型および腫瘍の遺伝子発現を注意深く相関させることによって、遠くない未来に、個人個人に合わせた非常に効果的な癌治療が提供される可能性がある。
【０１６４】
組織分析のスループットを向上させる１つの方法は、それぞれの組織サンプルから核酸、タンパク質などの物質を抽出する方法である。例えば、定位置核酸アレイを使用して、６０の腫瘍細胞系統から成る米国国立癌研究所の細胞系統セット中の多数の遺伝子の発現レベルを測定する有意義な作業が進行中である。腫瘍生検材料から直接に分離したＲＮＡを用いた同様の分析も進行中である。しかし、組織サンプルを均質化することによって、これらの研究は、組織中の単一の細胞および一群の細胞の分析によって得られる貴重な情報を破棄してしまっている。
【０１６５】
定位置アレイ中の組織切片を分析する方法が開発された。これらの方法は、以上に概説した問題のいくつかを克服しようとするものであって、参照によって本明細書に組み込まれる以下のＰＣＴ特許出願に記載されている：１９９９年１０月２８日出願のＰＣＴ／ＵＳ９９／２５３７０号、１９９９年２月２４日出願のＰＣＴ／ＵＳ９９／第０４０００号、および１９９９年２月２４日出願のＰＣＴ／ＵＳ９９／０４００１号。しかしこれらの方法は、比較的に柔軟性に欠ける定位置アレイに依存しており、修正が難しい。例えば、これらの方法では、（例えば以前に作製したアレイ中の）特定の組織をより対象とする高い他の組織に置き換えることが容易でない。さらに、これらの定位置アレイは、非常に小さな容積での分析に適合させることができず、局所的に反応が不均一な領域を生じやすい。したがって、高スループット組織分析用のより柔軟なアレイ・フォーマットが依然として求められている。
【０１６６】
この実施例は、組織をコード付きキャリヤーと結合させ、コード付き組織の非定位置アレイを作製する方法を説明する。これらの方法およびアレイは、例えば複数の組織サンプルを単一の容器内で一緒に検査し分析することができるなど、さまざまな利点を有する。マイクロタイター・プレート、ミクロ流体工学およびロボティクスの継続した改良と相まって、これらの方法および構成は、分析する組織サンプルおよび組織型の数を拡張することによって、スループットを増大させることができる。
【０１６７】
図５に、非定位置組織アレイを例示する構成２９０を示す。非定位置組織アレイは、組織−キャリヤー・アセンブリーの中に含まれる任意の数の異なる組織型を含むことができる。組織２９２、２９４、２９６をそれぞれ、異なったコード３０４、３０６、３０８を有するコード付きキャリヤー２９８、３００、３０２と結合させることによって、それぞれの組織−キャリヤー・アセンブリーを調製する。これらの組織−キャリヤー・アセンブリーを一緒にして、１つまたは複数の容器３１０の中で、非定位置アレイ中の組織サンプルの多重分析を実施することができる。非定位置アレイでは、それぞれのキャリヤーが、互いに同じおよび／または互いに異なるコードを有することができ、それぞれのキャリヤーを、互いに同じおよび／または互いに異なる型の組織と結合させることができる。しかし、キャリヤー上のコードがキャリヤーと結合した組織についての情報を標示する。
【０１６８】
組織は、上記セクションＩＩＩで例示した任意の源から得ることができる。生きた組織または未固定の死んだ組織をキャリヤーと結合させることができる。あるいは、セクションＶで例示したように組織を固定することもできる。固定した組織をキャリヤーと直接に（すなわち「そのまま」）結合させることができ、または、結合させる前に、例えばミクロトームで切片にすることによってさらに処理することができる。適当なミクロトームには例えば、回転、振動、鋸、ハンド、低温槽、凍結ミクロトームなどが含まれる。組織切片は、パラフィン、合成樹脂などの凝固材料中に包埋した固定組織から作製することができる。典型的な例では、まず最初に、徐々に疎水性を高め水分含量を減らした一連の有機溶媒中でのインキュベーションによって固定組織を脱水し、次いで適当な包理材料に含浸する。組織は、厚さ約０．５から４０ミクロン、約１から２０ミクロン、または約２から１０ミクロンに切断することができ、組織の幅は、組織のサイズ、それぞれのキャリヤーの幅、および／または単一の組織切片と結合しているキャリヤーの数に基づいて決定することができる（下記参照）。
【０１６９】
組織切片は標準の包理なしで提供することもできる。例えば、固定剤を用いて前処理し、または前処理せずに、組織を低温保存剤の存在下で直接に凍結させ、切断して切片にする。あるいは、組織を液体の中に入れて切断し、または何も処理せずに直接に切断する。
【０１７０】
５．１ 組織切片とキャリヤーの結合
図６に、図５のアレイ２９０に示したものなどのコード付き組織キャリヤーを作製する方法３３０を示す。組織または組織片３３２、３３４、３３６は、一般にその中に組織が包埋されたパラフィン・ブロック（図示せず）として提供される。組織切片２９２、２９４、２９６は、破線で示された切断面３４０に沿って３３８に示すように切断することによって、それぞれの組織から得ることができる。これらの切片は、組織から順番に得られたものなので、連続切片と呼ばれる。しかし、中間の切片が廃棄され、または他の目的に使用された不連続組織切片を使用することもできる。３４２に示すように切片２９２、２９４、２９６をそれぞれ、異なったコード３０４、３０６、３０８を有するコード付きキャリヤーと結合させる。コード付き組織とも呼ばれる組織−キャリヤー・アセンブリー２９８、３００、３０２を形成するため、キャリヤーは一般に、切片が接着することができる表面３４４を提供する。セクションＶで例示したように、表面３４４を前処理しておいて組織の接着を促進することもできる。キャリヤー上への組織切片の配置は、水浴の表面に切片を浮かべる方法、米ニュージャージー州ＨａｃｋｅｎｓａｃｋのＩｎｓｔｒｕｍｅｄｉｃｓ社から市販されているテープ転移システムなどのテープ転移システムを使用する方法を含む、適当な任意の方法を使用して容易にすることができる。配置された組織切片の安定な付着は、加熱および／または乾燥などの追加の処理によって強化することができる。コード付き組織２９８、３００、３０２を一緒にして、コード付き組織ライブラリーとも呼ばれる非定位置コード付き組織構成を生み出すことができる（図５参照）。
【０１７１】
５．２ 組織−コード結合の代替戦略
図７に、コード付き組織キャリヤーを作製する代替戦略３７０を示す。ここでは、組織３８０の組織切片３７２、３７４、３７６、３７８をそれぞれ、３８２に示すように、異なったコード３８６、３８８、３９０、３９２を有するコード付きキャリヤー３８４と結合させる。したがって、同じ組織から得られた切片から、異なったコードを有するキャリヤー・アセンブリー３９４、３９６、３９８、４００が生み出される。これらの異なったキャリヤー・アセンブリーを次いで、他のコード付き組織とともに異なる非定位置アレイに入れ、図４に例示し、詳細な説明の項の他の場所で説明したアレイと同様に、異なる細胞分析物質に曝露することができる。
【０１７２】
単一の組織から調製した一部または全てのコード付き組織を、異なる細胞分析物質に曝露するのではなしに、同じ細胞分析物質セットを用いて分析して、例えば組織３８０の特性の３次元分析を提供することができる。この場合、コード３８６、３８８、３９０、３９２は、元の組織内での切片３７２、３７４、３７６、３７８の相対位置についての情報を提供する。あるいはまたは加えて、コード付き組織キャリヤーを異なる反応条件に曝露して、組織３８０の異なる特性を分析することもできる。この場合にはコードが、組織切片に曝露した細胞分析物質、例えば標識と、切片の組織起源／元の組織内での切片の相対位置の両方を識別する。以上の組織分析はいずれも、単一の組織を用いて、または起源の異なる複数の組織を用いて実行することができる。
【０１７３】
５．３ 単一のコードを有するコード付きキャリヤーのアレイの形成
図８および９に、共通のコードを有するコード付きキャリヤーの整然と並べられたアレイ４３０を示す。後に詳述するように、このようなアレイを使用して後の組織とキャリヤーの結合を容易にすることができる。アレイ４３０は、同一のコード４３４を有するコード付きキャリヤー４３２を含む。キャリヤー・アレイを形成するため、それぞれのキャリヤー４３２を基板４３６上に配列することができる。例示的なアレイには、（１）正方形、長方形、六角形アレイなどの規則正しい、一様なまたは整然としたアレイ、および（２）ランダム・アレイなどの不規則な、一様でない、または雑然としたアレイが含まれる。
【０１７４】
キャリヤー・アレイは、適当な任意の機構を使用して構築することができる。例えば、キャリヤー・アレイは、まず最初にキャリヤー４３２を先に形成し、後に基板４３６上に配置し固定化する多段階プロセスを使用して構築することができる。キャリヤーを配置する段階とキャリヤーを固定化する段階は、同時にまたは逐次的に実施することができ、また、キャリヤーに対して１つずつまたはひとまとめに実施することができる。固定化段階では、基板および／またはキャリヤーに接着剤を使用することができる。いくつかの実施形態では、活性化可能な接着剤を使用してキャリヤーを全部一緒に固定化することができる。このような接着剤は、熱および／または照射などによって活性化することができ、基板４３６の表面の活性化可能な固有の特性によって提供することができる。
【０１７５】
組織とキャリヤーを結合させた後にアレイを解体することができる。例えば、基板からキャリヤーを分離し、かつ／またはキャリヤーとキャリヤーの間で基板を複数の部分に分割することができる。接着剤または基板、あるいはその両方を溶解することによって、基板からキャリヤーを分離することができる。例えば、いくつかの実施形態ではキャリヤーを、パラフィンで包埋された組織切片と結合させる。これらの実施形態では、パラフィン切片をキャリヤーに適用した後に溶剤を用いてパラフィンを除去して、その後の細胞分析物質への曝露を容易にすることができる。したがって、パラフィンで包埋された組織切片の分析ではキシレンなどの有機溶剤を用いた処理が含まれる場合がある。この場合には、基板および／または接着剤をキシレン可溶とする。
【０１７６】
基板を切断し、または他の方法で分割することができる任意の方法を使用してキャリヤー間の隙間の領域４３８に沿って基板を切り離すことによって、基板を複数の部分に分割することができる。これらの方法には例えば、（１）鋭利な切刃、パンチなどの機械的手段、（２）引裂きなどの手による手段（３）エッチングなどの化学的手段および／または（４）レーザー切断などの光学的手段が含まれる。案内線、ミシン目および／またはスコーリングを含む適当な任意の機構を使用して分割を容易にすることができる。いくつかの実施形態では、基板を予め複数の部分に切断しておき、ゼラチンなどの可溶性の付着物質によってこれらの部分を互いに、および／または共通の表面に付着させておくことができる。その後に付着物質を溶解すれば基板を分割することができる。
【０１７７】
５．４ コード付きキャリヤー・アレイを形成する代替方法−１
図１０に、定義されたコードを有する整然と並べられたコード付き組織キャリヤー・アレイを作製する方法４５０を示す。ここでは、例えば参照によって本明細書に組み込まれる２０００年１０月１９日出願の米国特許出願第０９／６９４，０７７号に記載されているように、コード付きファイバーをその長軸に対して直角に切断することによって、等しいコードを有するコード付きキャリヤーを生み出す。具体的には、１本または数本のコード付きファイバー４５２を、少なくとも概ね平行に基板４５４上に配置し、固定化する。コード付きファイバー４５２を４５６に示すように、ファイバーの長軸に対して少なくとも実質的に直角に、その下の基板の完全性を損なうことなく選択的に切断することによって、同一のコード４６０を有する線状キャリヤー・アレイ４５８を生み出すことができる。図１０には、全てのアレイが共通のコードを有する線状アレイが示されている。しかし他の実施形態では、それぞれの線状アレイまたは列が異なったコードを有する。例えば、１列めがコード１を有し、２列めがコード２を有するというようにすることができる。
【０１７８】
５．５  コード付きキャリヤー・アレイを形成する代替方法−２
図１１に、同一のコードを有するコード付きキャリヤー・アレイを作製する他の方法４８０を示す。ここでは、本明細書に参照によって組み込まれる２０００年１０月１９日出願の米国特許出願第０９／６９４，０７７号に記載されているように、コード付きシートをその平面に垂直に切断することによって、等しいコードを有するコード付きキャリヤーを生み出す。具体的には、コード４８６を含むコード付きシート４８２を基板４８４上で固定化する。この例では、シート内の多くの位置が同じコードを担持する。コード付きシート４８２を、間隔を置いて配置された複数の平面４８８、４９０に沿って、シートに対して少なくとも実質的に垂直に、その下の基板の完全性を損なうことなく選択的に切断することによって、同一のコードを有する複数のキャリヤー４９２を、定位置アレイとして生み出す。
【０１７９】
５．６ 代替コード付きアレイ
図１２に、異なるコード５１４を有するコード付きキャリヤー５１２の整然と並んだアレイ５１０を示す。ここでは、基板５１６がコード付きキャリヤーを、コードが整然と昇順で並んだ構成として固定化する。アレイ５１０は、コード付きキャリヤーを手で、および／またはロボットによって、あるいは後述するようにして、整然としたアレイに配置することによって、準備することができる。
【０１８０】
５．７ 代替コード付きキャリヤー・アレイを形成する方法。
図１３に、同一のコードおよび／または異なるコードを有する整然と並んだコード付きキャリヤー・アレイ５４２を作製する方法５３０、５４０を示す。方法５３０では、キャリヤーとして使用するのに適した材料から成る無コード・シート５４４を基板５４６に付着させる。一般に、シートと基板とでは、５５０に示すようにシート５４４をキャリヤー５４８に分割する処理に対する感度が異なる。分割は、レーザー、あるいはキャリヤーとキャリヤーを分割する上記実施例５．３で説明した手段などの他の適当な分割手段を用いて実施することができる。分割によって、コードのないキャリヤー５５２を基板５４６上に生み出すことができる。次いで、５５６に示すようにキャリヤー５４８上にコード５５４を配置して、コード付きキャリヤー５５８のアレイ５４２を提供することができる。いくつかの実施形態では、マイクロリソグラフィによってコードおよび分割境界線を印刷することができる。
【０１８１】
方法５４０は、基板５４６上に配置されたコード付き材料シート５６０から開始される。コード付きシートは、シート上の適当な位置にコード５５４を配置することによって形成することができる。例えば、シートの表面にコードを成形するなどによって、シートの形成と同時にコードを生み出すことができる。あるいは、例えばコードを印刷し、またはフィルムを使用することによって、シートを形成した後にコードを生み出すことができる。５６２に示すようにシートを複数のキャリヤー５５８に分割して、アレイ５４２を形成する。方法５３０および５４０のいくつかの実施形態では、基板を使用せず、かつ／または後に例示するように組織と結合させた後にシートを分割する。
【０１８２】
５．８ 組織をキャリヤーと結合させる代替方法
図１４に、組織をキャリヤーと結合させる方法５８０を示す。ここでは、組織５８４を切断することによって組織切片５８２を作製する。それぞれの組織切片は、組織部分５８６および支持媒質５８８を含むことができる。支持媒質５８８は一般に、切断時に組織５８４を支持しかつ／または保持することができる任意の物質、例えばパラフィンを含む。一般に、組織および組織切片という用語には支持媒質５８８が含まれる場合がある。組織５８４は、一般に基板５９４上のアレイ５９２のキャリヤー５９０の断面積に等しいか、またはそれよりも小さい断面積を有する切片５８２を提供することができる。それぞれのキャリヤーは一般に、組織と結合させる前にコード（図示せず）を持っているが、いくつかの実施形態では組織結合の後にコードをキャリヤーに付与することができる。それぞれのキャリヤー５９０の接近可能な表面に５９６に示すように組織切片５８２を適用して、組織−キャリヤー・アセンブリー５９８を作製する。切片５８２は別々にキャリヤー５９０に配置することができるので、キャリヤーは、ロボットによる切片の配置を容易にするために規則的なアレイ６００として、または手動またはロボットによる配置向けにやや雑然としたアレイとして提供することができる。６０２に示すようにコード付き組織キャリヤー５９８を切り離し、並びを崩して、非定位置アレイ６０４を作り出すことができる。
【０１８３】
図１５に、組織をキャリヤーと結合させる他の方法６２０を示す。組織６２４から組織切片６２２を作製する。切片６２２は、組織部分６２６および支持媒質６２８を含むことができる。切片６２２を、段階６３０に示すように、共通のコードおよび／または異なったコード６３６を有する複数のコード付きキャリヤー６３４を含むコード付きアレイ６３２と結合させる（この図では１つのキャリヤー上の１つのコードしか示されていない）。アレイ６３２は基板６３８上に配置することができ、一般に、キャリヤー６３４の共平面によって形成された実質的に平らな共通の領域を含む。この結合では、アレイ６３２の複数のキャリヤー６３４の上に切片が広がり、切片がこれらのキャリヤーに付着するように切片６２２をアレイ６３２に適用して、組織−アレイ・アセンブリー６４０を形成する。６４４に示すように、キャリヤーをそのアレイ内の位置から解放することによって、個々の組織−キャリヤー・アセンブリー６４２を作り出す。このアレイ崩しは、（１）キャリヤーとキャリヤーの間の組織接合部６４６を破壊し、（２）キャリヤーをアレイとして保持している基板接合部を破壊することによって実施することができる。これらのプロセスはともに、切断、先に説明した他の分割方法など、適当な任意の方法を用いて実施することができる。組織接合部６４６はあるいは、基板の完全性または基板への付着を破壊した後にコード付きキャリヤーを撹拌することによって引き裂くことができる。
【０１８４】
図１６に、図１４の方法の修正バージョン６７０を示す。具体的には、組織６７６を切断するときに、複数の組織切片６７２をリボン６７４として形成する。リボンを形成するためには、隣接する組織切片を端−端接合部６７８のところで接着させる任意の標準切断プロトコルを使用することができる。例えば、回転ミクロトームによって生み出されるパラフィン包埋組織の連続切片は一般に、端と端が接着してリボン６７４を形成する。６８４に示すように、コード付きキャリヤー６８２の線状アレイ６８０に組織リボン６７４を適用して、組織−キャリヤー・アレイ６８６を形成することができる。キャリヤー・アレイ６８０のそれぞれのキャリヤーの幅または間隔を、リボン６７４の切片の幅または間隔と実質的に等しくして、それぞれの切片のキャリヤーへの正確な適用を容易にすることができる。切片間の接合６７８は一般に脆弱なので、切り離された個別の組織−キャリヤー・アセンブリー６８８は、基板（使用する場合）からキャリヤー６８２を分離する間に簡単に形成することができる。
【０１８５】
実施例６ 細胞特性の多重分析
図１７〜２２に示すこの実施例は、患者検査サンプルのアレイを含む細胞および／または細胞分析物質の非定位置アレイの多重分析に適した選択された細胞特性を説明する。これらの細胞特性は、細胞成分の細胞内分布、細胞周期中の遷移、特定の細胞周期の停止、細胞毒性、および／または遺伝子増幅などの細胞機能のさまざまな態様に影響を及ぼすモジュレーターに関するスクリーニングに使用することができる。さらに、これらの細胞特性は、詳細な説明の項で説明する他の任意の分析に対して使用することもできる。
【０１８６】
６．１ 細胞内分布の多重分析
図１７に、細胞成分の細胞内分布を測定する方法７１０を示す。細胞内分布を細胞特性として使用して、細胞機能の諸態様を変化させるモジュレーターをスクリーニングすることができる。このケースでは、細胞周期レギュレーター、サイクリンＢの細胞内分布を測定する。細胞分裂を受けている細胞では、サイクリンＢは細胞質に存在しているが、細胞周期のＧ２期後期に細胞核に移動する。したがって、細胞集団内のサイクリンＢの細胞内分布は、有糸分裂指数、成長状態、および／あるいはＧ２期または細胞周期の他の期間での細胞周期の停止などの細胞特性を判定し、または指示する。
【０１８７】
サイクリンＢは、サイクリンＢに対して特異的な抗体で細胞内のサイクリンＢを標識することによって測定することができる。あるいは、ＧＦＰ−サイクリンＢ融合タンパク質を発現するように細胞を操作することもできる。ＧＦＰ−サイクリンＢ融合タンパク質は、融合していないサイクリンＢと細胞内の共通の位置に存在し、光で励起させると直接に検出可能な蛍光を発すると予想され、したがって生きた細胞中で検出することができる。基準として、かつ／または他の細胞特性の測定を可能にするため、ＤＡＰＩなどの核染料によって細胞をさらに標識することができる。
【０１８８】
図１７の細胞７１２、７１４は、サイクリンＢ分布の予想される２つのパターンを示し、７１６に示すようにＧ２期後期へ移行し、Ｇ２期後期から他の期間へ移行する単一の細胞周期を表す。細胞７１２では、サイクリンＢ信号７１８が細胞質中に観察され、ＤＡＰＩ核信号７２０とはオーバーラップしていない。対照的に、細胞周期のＧ２期後期にあたる細胞７１４では、図示のように、サイクリンＢ信号とＤＡＰＩ信号が核の中に共在している。
【０１８９】
このように分析した増殖中の正常な細胞集団（「対照」）では、細胞７１４と同じように見える検出可能なある割合の細胞と、細胞７１２と同じように見える大部分の細胞とがあると予想される。したがって複数のモジュレーターを分析して、細胞質サイクリンＢまたは核サイクリンＢを含む細胞の割合を変化させるモジュレーターを識別することができる。例えば、サイクリンＢが核に入ることを直接的にまたは間接的に妨害するモジュレーターは、個々の細胞の多くが細胞７２２のように見える細胞集団を生み出す。他のモジュレーターでは、細胞７１４に見られるような核サイクリンＢパターンが細胞集団内で増大し、または支配的になる可能性がある。
【０１９０】
他の実施形態では、他のＧＦＰ融合タンパク質および／または他の細胞標識を使用して、他のタンパク質の分布を調節するモジュレーターを識別する。ＧＦＰへの融合および／または標識付けのための例示的なタンパク質および／または他の細胞成分／構造は、セクションＩＶおよびＸ、ならびに詳細な説明の項の他の場所に含まれている。
【０１９１】
６．２ 細胞成分の多重定量
図１８に例示するように、細胞成分のレベルを細胞特性として使用することができる。方法７３０では核成分を定量する。しかし、細胞内または広範囲に分布した任意の細胞成分を分析することができる。細胞をＤＡＰＩなどのＤＮＡ標識に曝露することによって、細胞７３６、７３８中のＤＮＡ含有量７３２、７３４を出現させる。静止および循環中の２倍体細胞のＤＮＡレベルは、細胞周期中の位置に応じて、染色体コピー数として２Ｎ（Ｇ０／Ｇ１）から４Ｎ（Ｇ２／Ｍ）の間にある。したがって、ＤＮＡ含有量は例えば、細胞周期中の位置；異数性を含む倍数性；細胞周期の期間；集団中のＧ０／Ｇ１、Ｓ、およびＧ２／Ｍ期細胞の相対比；ならびに／またはチェックポイント機能などの細胞周期機能に関係する細胞特性の指示を提供する。さらに、モジュレーターおよび／または他の細胞分析物質を使用して細胞集団内の平均ＤＮＡ含有量を変化させ、これによって対象とする細胞分析物質の識別を可能にすることができる。対象とするこのような物質は、細胞周期中の特定の時点（Ｇ２など）で細胞を停止させ、その細胞周期の細胞を取り出し、より急速な有糸分裂速度に細胞をシフトし、および／または化合物／モジュレーターの効果を打ち消すことなどができる。
【０１９２】
６．３ 核頻度の多重分析
図１９に、細胞質分裂を妨害し、または他の方法で細胞質分裂影響を及ぼすモジュレーターを識別するために、細胞内の核数を測定する方法７５０を示す。細胞７５２は、細胞骨格アクチンを検出する細胞質標識７５４およびＤＡＰＩなどの核の標識７５６で標識されている。細胞質と核の両方を標識することによって、それぞれの細胞の中の核の数を容易に決定することができる。分析の一部として、モジュレーターなどの細胞分析物質に細胞を、一般に標識する前に曝露することができる。細胞質分裂を中断させ、または妨害するモジュレーターは、２つ以上の核７５６または４倍体ＤＮＡ含有量を含む細胞７５８を生成すると予想される。
【０１９３】
６．４ 小核形成の多重分析
図２０に、小核形成に影響を及ぼすモジュレーターおよび／または他の細胞分析物質を識別する方法７７０を示す。小核の形成は、細胞に対する毒性または発癌物質の指標であり、細胞周期の進行および／またはチェックポイント機能の欠陥などから生じる可能性がある。したがって多くの有毒物質が小核の形成を促進する。
【０１９４】
方法７７０では、７７４に示すように細胞７７２を有毒物質で処理する。細胞内の全ＤＮＡを標識して、細胞７７２内の核７７６および小核７７８の検出を可能にする。さらに７８０に示すように、モジュレーターなどの細胞分析物質に細胞を、一般にＤＮＡを標識する前に曝露することができる。段階７７４と７８０の結果を比較することによって指示されるように、小核形成を阻害することによって有毒物質の作用を変化させる有効なモジュレーターを識別することができる。他の実施形態では、小核形成を促進する有毒物質をスクリーニングするための多重分析を実行することができる。
【０１９５】
６．５ 紡錐体欠陥の多重分析
図２１に示す方法８００は、非定位置アレイ中の細胞を紡錐体欠陥に関して分析して、紡錐体欠陥を生み出し、その形成を促進し、かつ／または阻害するモジュレーターなどの細胞分析物質を識別する方法を示す。有糸分裂細胞８０２、８０４の微小管８０６および／または微小管形成中心８０８（ＭＴＯＣ；分裂間期中は中心体と呼ばれる）を標識する。微小管は、ＧＦＰ−チューブリン融合タンパク質、抗チューブリン抗体などのα−またはβ−チューブリン指示薬を使用して識別することができる。ＭＴＯＣは、γ−チューブリン標識を用いて識別することができる。ＤＮＡ／染色体８１０は、ＤＮＡ染料、ヒストン標識などの適当な標識を用いて標識することができる。対照細胞８０２は一般に、凝集した染色体が中期板のところに整列し、染色体が両極に向かって移動する正常な双極紡錐体を示す。対照的に、細胞８０４によって例示される病気の細胞、あるいは有効なモジュレーターまたは他の細胞分析物質に曝露した細胞では例えば、微小管形成中心の数が増加し、紡錘糸を形成することができず、染色体が中期板上に整列できず、染色体の数が増加し、倍数性を示し、かつ／または分裂間期細胞中の中心体の数が増加する。
【０１９６】
６．６ 遺伝子増幅の多重分析
図２２に示す方法８２０は、遺伝子コピー数、遺伝子増幅および／または他の遺伝的異常を細胞特性として使用して、患者の生検材料、腫瘍サンプルまたは他の臨床サンプルを多重分析する方法を示す。遺伝子増幅はしばしば、無制御増殖および腫瘍形成の原因（および効果）である。遺伝子増幅を試験するためには、患者の例えば胸部生検材料から細胞８２２、８２４を得る。これらの細胞をコード付きキャリヤーと結合させ、例えば染色体１７の領域を識別するため対照標識で標識する。対照標識は対照信号８２６を生成する。さらに、細胞を、診断ＤＮＡマーカー、例えばＨＥＲ−２に対するマーカーで標識して、試験信号８２８を生成させる。正常２倍体細胞８２２は、それぞれの細胞の細胞周期中の位置に応じて、２つ、３つまたは４つの染色体対照信号を示す（図には２つ示されている）。病気の細胞８２４も、同様の数の対照信号８２６を示すことができる。しかし、病気の細胞８２４では増幅領域８３０で試験信号８２８が増強される。他の実施形態では、他の診断ＤＮＡ標識によって、病態の診断または予後であることが知られている他のＤＮＡ配列または領域を識別することができる。
【０１９７】
実施例７ レセプター／リガンド検定システム
図２３〜２８に示すこの実施例は、コード付きキャリヤーを用いた多重検定システムの使用して、レセプター・リガンド、および／またはレセプター／リガンド相互作用のモジュレーターを識別し、かつ／または特性づける方法を説明する。
【０１９８】
分子薬理学は、細胞レベルおよび亜細胞レベルでの薬物の研究であり、薬物の組成、使用および効果が含まれる。表３Ａに、古典的分子薬理学法（ｃｌａｓｓｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｐｐｒｏａｃｈ）を示す。この方法は、研究および理解すべき生体機能または活性の識別から開始される（すなわちこの方法は解決すべき問題の識別から開始される）。例えば、古典的分子薬理学法の下では、特定の病気などの所与の表現型が識別され、その表現型に対する治療法を見つけるための実験経路が開発される。実験は一般に、所与の表現型に至る生体経路の一部であると識別されたリガンドの分離または精製から始まる。残念なことにこの方法は、時間と費用がかかる可能性のあるプロセスである。その表現型に関連した特定のリガンドを識別した後、追加の実験を実施して、リガンドおよびその生体機能を特性づける。この実験によって、リガンドと相互作用する、特定のレセプター、レセプター・クラスなどの高親和性パートナーを識別することができる。残念なことに、これもまた時間と費用がかかる可能性があるプロセスである。レセプターまたはレセプター・クラスを識別した後、リガンドとレセプターの間の相互作用に影響を及ぼす能力に関して、さまざまな化合物をスクリーニングする。相互作用に対する効果は直接的または間接的効果であり、この効果は、レセプターと相互作用するリガンドの能力を増大させ、または低下させる。望ましい方法でリガンド−レセプター相互作用に影響を及ぼす対象とする化合物を見つけ出したら、薬物、ワクチン、治療用化合物などの臨床応用への展開の可能性に関して、この対象とする化合物を調べることができる。
【表３】
2004537712.tif 000004
【０１９９】
本発明は、逆分子薬理学および／またはコード付きキャリヤーを使用して、レセプター・リガンドおよび／またはレセプター／リガンド相互作用のモジュレーターを識別し、かつ／または特性づける、改良型分子薬理学検定システムを提供する。逆分子薬理学法（ｒｅｖｅｒｓｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｐｐｒｏａｃｈ）は、薬物候補および他の潜在的な治療化合物の発見に導く可能性がある情報を求めて、発展中の生命情報科学の分野で蓄積された大規模な知識データベースを探索する。言い換えると、解決すべき特定の生物学的問題を探す代わりに、逆分子薬理学法では、既に存在する解答または容易に見つかる解答を探し、次いで、それらの解答を用いて解決することができる問題を識別する。
【０２００】
表３Ｂに、レセプターおよび／またはリガンドに関係した薬物の探索に使用できるコード付きキャリヤーの使用とともに使用可能な新しい逆分子薬理学法を示す。ここでは、病気経路などの特定の生体機能に関連していることが分かっている、またはそう考えられている特定のレセプターまたはレセプター・クラスを、特性づけられた、またはまだ特性づけられていないさまざまなリガンドに曝露する。活性を示すリガンドおよびレセプターを分離し、リガンド−レセプター相互作用に影響を及ぼす能力に関して化合物をスクリーニングする。ターゲット化合物を識別した後、研究者は、分離されたリガンドおよびレセプターの生体機能を特性づけることを選択してもよい。すなわち、研究者は、病気経路および／または通常の生理においてリガンドおよびレセプターが果たす特定の役割を定義しようと試みることができる。しかし、リガンドおよびレセプターの特定の機能の知識の有無にかかわらず、臨床開発を実施することができる。逆分子薬理学法は一般に、古典的分子薬理学法に比べて必要な発見作業がかなり少なくてすみ、したがって、古典的方法よりも速く、より安価に、より少ない労力でターゲット化合物を識別することができる。
【０２０１】
図２３に、逆分子薬理学法８５０をコード付きキャリヤーとともに使用する方法を示す。まず最初に、８５２に示すように、レセプターまたは他の対象とする分子に対応することが分かっている、または対応しそうな核酸配列を、遺伝子バンクなどの公的なまたは民間のデータベースなどから識別する。これらの核酸配列を分析して、８５４に示すように、対象とするレセプターまたは他の分子の発現パターンを例えば遺伝子マイクロアレイを介して決定する。８５６に示すように、核酸配列をクローン化し、発現ベクターに入れて、対象とするレセプターまたは他の分子の発現を誘導する。次に、任意の順序で、これらの配列を８５８に示すように細胞または他の発現媒体（大腸菌、植物、酵母など）にトランスフェクションし、８６０に示すように細胞を、セクションＶで説明したように区別可能なコード付きキャリヤーに付着させ、または他の方法で結合させる。一般に、トランスフェクション先の１つまたは少数の細胞系統をそれぞれの型のキャリヤーと結合させて、キャリヤー上のコードを読み取ることによってトランスフェクションした配列を識別できるようにする。次に、キャリヤーおよびキャリヤーと結合した細胞系統を使用して、８６２に示すように、完全細胞、ウィルス、ファージ、組織、抽出物などの生物学的実体／細胞を単独でまたは一緒に調査し、またはスクリーニングすることができる。あるいは８６４に示すように、キャリヤーおよび細胞を使用して、潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストから成る化合物ライブラリー、発現ライブラリーなどのライブラリーのメンバーをスクリーニングすることができる。最後に、８６６および８６８に示すように、応答を引き出す生物学的実体および／またはライブラリー・メンバーを分離し、かつ／または識別し、それを使用して、８７０に示すようにそれらの生物学および／または薬理学を研究し、その結果、先に説明したとおり８７２に示すように新薬または他の応用の開発に結びつける。
【０２０２】
この方法はさらに、多成分レセプターまたは必要なレセプター結合タンパク質／高分子の識別を容易にする。例えば、細胞集団に複数の発現配列をランダムにトランスフェクションし、次いで培養して、別個の細胞系統を生み出すことができる。このような多トランスフェクション細胞系統が、１つまたは複数のリガンドに反応することが示されたら、トランスフェクション媒体のシグネチャ配列を含む細胞ＤＮＡ断片を分離し、分離された断片の配列を決定することによって、トランスフェクションした成分の配列を識別することができる。
【０２０３】
対象とするレセプターまたは他の分子は一般に、細胞の外面、原形質膜の表面または付近、あるいは細胞の内部に、結合相手すなわちリガンドと相互作用して生体応答を生じさせ、または細胞特性を変化させる分子または分子集合体を含む（セクションＸ参照）。例示的な細胞表面レセプターには例えば、Ｇタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）、イオン・チャンネル結合レセプター（例えば伝達物質ゲート型イオン・チャンネル）、酵素結合レセプター（例えばタンパク質キナーゼ）、およびサイトカイン・レセプター（例えばインターロイキン、リンホカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子、血小板活性化因子および腫瘍壊死因子のレセプター）などが含まれる。例示的な細胞内レセプターには例えば、ステロイド・ホルモン・レセプター（例えばコルチソル、エストラジオールおよびテストステロンのレセプター）、甲状腺ホルモン・レセプター（例えばチロキシンのレセプター）、およびレチノイド・レセプター（例えばレチノイン酸のレセプター）などの核ホルモン・レセプターが含まれる。例示的な結合相手には例えば、抗体、抗原、細胞、細胞信号成分、薬物、ペプチド、汚染物質、プリオン、タンパク質、組換えタンパク質（野生型、突然変異体、あるいは野生型、突然変異体および／または変性タンパク質を含む融合タンパク質）、トキシン、ウイロイド、ウィルスなどが含まれる。細胞信号成分には例えば、内分泌ホルモン（例えばアドレナリン、コルチソル、エストラジオール、グルカゴン、インスリン、テストステロン、チロキシンなど）、局所メディエータまたはパラクリン信号（例えば上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、神経発育因子（ＮＧＦ）、ヒスタミン、一酸化窒素など）、神経伝達物質（例えばアセチルコリン、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）など）、および接触依存性信号分子（例えばデルタ（ｄｅｌｔａ）など）が含まれる。
【０２０４】
対象とするレセプター、レセプター合成経路または他の分子をコードする核酸配列は適当な方法を使用して識別することができる。これらの方法は、データバンクを調べて、所望の機能を表示する既知のタンパク質と相同性を有する既存の配列を見つけることを含む。これらの方法はさらに、既知の配列を修飾し、かつ／または新規の配列を例えば組合せ法を使用して合成することによって、新しい配列を生成することを含む。
【０２０５】
識別された核酸配列はトランスフェクション物質とも呼ばれ、これを、安定的または一過性の古典的または逆トランスフェクションを含む適当な任意の方法を使用して、細胞にトランスフェクションすることができる。細胞は、この配列を転写、翻訳し、少なくとも部分的に機能性の形態で発現しなければならない。細胞は一般に真核細胞である。場合によっては、３つ以上の核酸配列を同じ細胞にトランスフェクションすることができ、そのため、それらのそれぞれの遺伝子産物間の相互作用を識別し、かつ／または研究することができる。他の例示的な細胞はセクションＩＩＩに、例示的なトランスフェクション物質およびトランスフェクションの方法はセクションＩＶ（Ｃ）に含まれている。
【０２０６】
共有結合性および／または非共有結合性の相互作用を含む適当な任意の方法を使用して、細胞をコード付きキャリヤーと結合させることができる。付着細胞および／または実質的に平らな粒子を含む実施形態などいくつかの実施形態では、キャリヤー上で細胞を直接に増殖させることができる。細胞結合の例示的な追加の方法はセクションＶに含まれている。
【０２０７】
コード付き細胞集団（すなわち細胞と結合したコード付きキャリヤー）を使用し、（１）コード付き細胞集団を生物学的実体、ライブラリー・メンバーおよび／または他の細胞分析物質に曝露し、（２）結合の程度などの細胞集団の特性に対する効果および／または生物活性に対する結合の効果（表現型効果）によって相互作用を検出することによって、生物学的実体および／またはライブラリー・メンバーを調査し、または問い合わせることができる。相互作用は、例えば結合したリガンドの数を数えることによって直接に検出することができる。相互作用は、例えば結合によってもたらされた表現型効果によって間接的に検出することもできる。相互作用を検出する適当な方法は、比色、ルミネセンス（例えば蛍光、リン光または化学ルミネセンス）、結合または関連生物活性を反映した出力信号を有する他の検定などのリポータ検定を使用する方法が含まれる。例示的なリポータ検定には、リポータ遺伝子の発現が、リガンドによるレセプターの活性化に応答するプロモーターによって制御される遺伝子発現検定が含まれる。検定の結果は、例えば結合の有無または結合の変化の有無などのように定性的にレポートすることができる。あるいはまたは加えて、例えば結合の絶対または相対量、あるいは結合の絶対または相対変化のように、検定の結果を定量的にレポートすることもできる。細胞分析物質を細胞に曝露する例示的な追加の方法はセクションＶＩに含まれている。他の例示的な細胞特性および相互作用はセクションＸに含まれている。
【０２０８】
コード付きキャリヤーの使用は多重化を可能にする。具体的には、結合したコード付きキャリヤー上のコードによって、それぞれの異なったコード付きサンプルは識別できるので、複数のコード付きサンプルを、少なくとも実質的に任意の位置で一緒に混合して、非定位置または部分定位置アレイとし、リガンドあるいはモジュレーターなどの他の刺激物に曝露することができる。このようにして、所与のリガンドへの曝露によって影響を受けた細胞集団を識別することができる。さらに、所与の細胞集団と相互作用する能力を有するリガンド・セットおよびそのモジュレーターを識別し、これらのリガンドおよび／またはモジュレーターをさらに特性づけ、新薬および／または新しい治療への展開の可能性について研究することができる。いくつかの実施形態では、複数の細胞集団を複数のリガンドに同時に曝露することができ、その任意の組合せが、リガンドが仲介する細胞特性の変化を表示する場合には、複数の細胞集団および複数のリガンドを個別に研究することができる。他の実施形態では、複数の細胞集団を、アゴニストおよびアンタゴニストのライブラリーに単独でまたは組合せで曝露することができる。次いで、細胞集団と相互作用するアゴニストおよび／またはアンタゴニストを識別し、薬物発見の可能性に関して研究する。コードの付いた粒子がなければ、異なる細胞集団は一般に、別々の容器、例えばマイクロプレートのそれぞれのウェルの中で、それぞれに増殖させ、処理し、分析しなければならないだろう。例示的なモジュレーターはセクションＩＶ（Ａ）に、非定位置および部分定位置アレイはセクションＶＩＩＩに含まれている。
【０２０９】
７．１ Ｇタンパク質結合レセプターの分析
以下では、コード付きキャリヤーを用いた多重分析の、Ｇタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）の分子薬理学への応用を説明する。図２４〜２６を参照されたい。
【０２１０】
ＧＰＣＲは、細胞膜を横切って信号を変換する一般に７パスの膜内外細胞表面レセプターの大きなスーパーファミリである。ＧＰＣＲは、ホルモン、局所メディエータおよび神経伝達物質を含む、甚だしく多様な細胞外信号分子に対する応答を媒介する。これらの信号分子の構造および機能はさまざまであり、信号分子は例えば、タンパク質、小さなペプチド、あるいはアミノ酸または脂肪酸の誘導体である。さらに、それぞれの信号分子には異なるレセプターまたはレセプター・セットが存在する。ＧＰＣＲは、五感、すなわち聴覚、視覚、嗅覚、触覚および味覚のそれぞれにさまざまな程度に関与し、数多くの病気に関係する。現在、処方薬の６０パーセントがＧＰＣＲアゴニストまたはアンタゴニストである。現在、機能不明の約２００の「オーファン（ｏｒｐｈａｎ）」レセプターを含む約６００のＧＰＣＲが識別されている。これらのＧＰＣＲをスクリーニングに使用することができる。「オーファン」レセプターは、その未知の機能のために逆分子薬理学法に特に適している。
【０２１１】
図２４に、本発明の態様に基づく多重ＧＰＣＲ検定法８９０を示す。一般に、異なるＧＰＣＲをコードする核酸８９６を８９４に示すように細胞８９２にトランスフェクションする。この細胞を、８９８に示すようにコード付きキャリヤー９００と結合させて細胞−キャリヤー・アセンブリー９０２を形成する。結合したそれぞれの細胞集団９０４は異なったＧＰＣＲ ９０６を発現する。このトランスフェクション段階は、細胞とコード付きキャリヤーを結合させる前または後に実施することができる。結合後にトランスフェクションするときには、古典的トランスフェクションまたは逆トランスフェクションとすることができる。方法８９０では、１０の異なるＧＰＣＲレセプター配列８９６、およびサイクリックＡＭＰ応答要素によって制御されたβガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）リポータ遺伝子（ＣＲＥ−β−Ｇａｌ）９０８をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションする。ＣＲＥ−β−Ｇａｌリポータは一般に、多くのＧＰＣＲ、特にＧｓおよびＧｑタンパク質サブユニットを含むＧタンパク質複合体に結合するレセプターに結合したリガンドまたはアゴニストによって生成された増加したｃＡＭＰに応答する。方法８９０では、ＣＲＥ−β−Ｇａｌリポータ９０８をそれぞれ含み異なるＧＰＣＲレセプター９０６を発現する、１０の異なるコード付き細胞集団９０４が生成される。細胞集団をそれぞれ、異なったコード９１０を有するコード付きキャリヤー９００と結合させる。
【０２１２】
段階９１２に示すように、コード付き細胞集団９０４を一緒にして非定位置アレイ９１４を形成する。９１６に示すようにこのアレイを分配して、位置的に定義可能な複数の非定位置同胞アレイ９２０を含む定位置アレイ９１８を形成する。同胞アレイは、マイクロプレート９２２のウェルの中に位置的に分配されている。それぞれの同胞アレイ９２０は、コード付き細胞集団９０２の実質的に同じ表現を有し、または少なくとも一般に、それぞれのコード付き細胞集団を含むことができる。次いで、９２４および９２６に示すように、それぞれのアレイ９２０を、有望なアゴニスト９２８に曝露する。適当なインキュベーションの後、９３０に示すように、Ｘ−Ｇａｌと反応させることによってそれぞれの細胞集団内のβ−Ｇａｌの発現を測定する。β−Ｇａｌ発現の測定およびキャリヤー上のコードの読取りが９３２に示されている。特定のアゴニスト９３６に応答する相互作用している細胞集団９３４は、色素産生β−Ｇａｌ基質であるＸ−Ｇａｌに曝露すると、β−Ｇａｌタンパク質のレベル／活性の増大のために青く変化する。β−Ｇａｌタンパク質活性の増大は、ＣＲＥ−β−Ｇａｌリポータの活性化によって生じ、細胞集団のＧＰＣＲレセプターと特定のアゴニストとの間の結合相互作用によって起こる。どのアゴニストに応答してどの集団が青に変化したかを判定することによって、特定のレセプター−アゴニスト相互作用を識別する。細胞集団にはコードが付いているので、結果を細胞型と相関させることができる。例えば、図２４に示すように、相互作用している細胞集団９３４だけがアゴニスト９３６への曝露に応答して陽性のβ−Ｇａｌ信号を示し、結合したキャリヤー上のコード「５」を読み取ることによってこの細胞集団が識別される。
【０２１３】
表４には、図２４の方法８９０のアゴニスト結合特異性とβ−Ｇａｌ信号との間の関係がより一般的に表現されている。特定のアゴニスト＃１が、コード付きキャリヤー１上で発現したＧＰＣＲ（ＧＰＣＲ１）とだけ相互作用することができる場合 、ＧＰＣＲ１を含む細胞集団だけが青く変化する。特定のアゴニスト＃２が、キャリヤー２上のＧＰＣＲ２とだけ相互作用することができる場合には、アゴニスト＃２は、コード付きキャリヤー２と結合した細胞に対して同様の効果を示す。しかし、ＧＰＣＲ１〜１０と相互作用する非特異性アゴニストは、コード１〜１０を有するキャリヤーと結合した細胞集団の中で陽性のβ−Ｇａｌ信号を生成する。
【表４】
2004537712.tif 000005
【０２１４】
方法８９０の代替実施形態では、１）異なったリポータ遺伝子を異なる細胞集団にトランスフェクションし、２）それぞれの非定位置アレイを、モジュレーターおよび／またはリガンド、１種または数種の局所捕獲物質、ならびに／あるいは１種または数種の標識の混合物を含む２種以上の細胞分析物質に曝露し、３）異なる細胞集団中の無関係のレセプター型を含む他の型のレセプターを細胞にトランスフェクションし、かつ／または４）トランスフェクションしたレセプターではなく内因性のレセプターに対する細胞分析物質の効果を測定することができる。方法８９０の追加の例示的な実施形態は詳細な説明の項の他の場所に含まれている。
【０２１５】
図２５および２６は、多重ＧＰＣＲ（および他の）検定システム９４０と現在使用されている検定システム９４２とを比較して、多重化を使用すると検定段階を減らしまたは排除することができることを示す図である。具体的には、システム９４０で、異なったレセプター（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３）を発現する細胞系統９４４の非定位置アレイを使用することによって、それぞれのレセプターと相互作用するリード化合物（リード１、２、３）を、単一の多重ライブラリー・スクリーニング９４５で識別する。対照的に、システム９４２は、それぞれのレセプターに対して異なったスクリーニング９４６を実行する。
【０２１６】
本発明の諸態様に基づく多重ＧＰＣＲ検定システムは、他の非多重システムに優る多くの利点を含む。これらの利点には例えば、時間、労働および高価な物質（例えば化学ライブラリー）に係る経費節減が含まれる。これらの利点にはさらに、検定の特異性および感度、ならびに多様なＧＰＣＲまたはＧＰＣＲファミリへの集中を可能にする内蔵された内部対照が含まれる。
【０２１７】
７．２ 効力と特異性の組合せスクリーニング
コード付きキャリヤーを用いた多重分析を使用して、モジュレーターの効力、特異性および毒性を測定するスクリーニングを単一のスクリーニング段階で実施することができる。対照的に、従来の高スループット・モジュレーター・スクリーニングは一般に、少なくとも２つの異なったスクリーニング段階を用いて実施される。最初のスクリーニング段階の間に高い効力を示すモジュレーターを識別する。第２のスクリーニング段階では、最初のスクリーニング段階で識別した高効力モジュレーターの特異性および毒性を判定する。したがって、従来のスクリーニングでは、特定の高効力、低毒性モジュレーターを識別するのに、コード付きキャリヤーを用いた多重方法に比べて、追加の時間、労力および費用が必要となる可能性がある。さらに、従来の２段階スクリーニング法では、効力は低いが高い特異性を示す有用なモジュレーターを見落とす可能性がある。このようなモジュレーターは、一組のリード化合物誘導体を合成し試験することによってリード化合物の効力を増大させる誘導体化戦略において重要なリード化合物となる可能性がある。従来のスクリーニング法とは対照的に、コード付きキャリヤーを用いた多重スクリーニングは、効力は低いが特異性は高いリード化合物を識別するのによく適している。
【０２１８】
図２７の多重分析９５０は、コード付きキャリヤーを用いた多重スクリーニングによって、ターゲットに対するモジュレーターの毒性および特異性を単一のスクリーニングで測定する方法を示す。分析は、９５２に指示されたマイクロプレート・ウェル（１〜２０）の中で実施する。それぞれのウェルはスクリーニングする異なるモジュレーターを保持している。所望ターゲット９５４、非所望ターゲット９５６または毒性指示物質９５８を発現し、かつ／または担持する細胞系統をそれぞれ、異なるクラスのコード付きキャリヤーと結合させ、これらを一緒にして非定位置アレイを形成し、これらを分配してそれぞれのウェルの中に同胞アレイを形成する。所望ターゲット９５４は例えば関係するレセプター・ファミリに対応し、非所望ターゲット９５６は例えば他のレセプターに対応する。所望ターゲットまたは非所望ターゲットを担持するそれぞれの細胞系統はさらに、所望ターゲットまたは非所望ターゲットの活性化に応答するリポータ遺伝子も担持している。さらに、毒性パネルは例えば、既知の有毒作用を有するレセプター、一般に毒性化合物に応答するリポータ遺伝子、または詳細な説明の項の別の場所に例示された他の適当な毒性指示物質に対応する。
【０２１９】
それぞれのウェルの中で細胞系統を潜在的なモジュレーターに曝露すると、細胞系統ごとに信号が生み出される。それぞれのターゲットおよび毒性指示物質に対するモジュレーターの作用によって生成された相対信号９６０がｚ軸に沿ってプロットされている。図示のとおり、いくつかのウェルが、所望のターゲットに対して効力９６２、９６４、９６６、９６８を示すモジュレーターを保持している。しかし、効果９６４、９６６、９６８を生み出すモジュレーターはさらに、非所望ターゲット９５６にも影響を及ぼす非特異性効果９７０、および／または毒性パネル９５８内の信号を示す毒性効果９７２も示している。このように、多重分析９５０によって、特異的かつ非毒性の効果９６２を生み出すウェル＃２のモジュレーター／化合物が識別される。
【０２２０】
多重分析９８０は、異なる効力および特異性を有する化合物をモジュレーター・スクリーニングで識別する方法を示す。図２８を参照されたい。ここでは、Ｓ１〜Ｓ２６で指示された異なるレセプターを発現する細胞系統を異なったコード付きキャリヤーと結合させ、これらを一緒にして多重分析用の非定位置アレイとする。細胞系統はそれぞれ、レセプター活性をレポートするｚ軸に沿った相対信号９８２としてプロットされた信号を生じる。この信号は例えば、レセプターの活性化または他の適当なレセプター活性の尺度にリポータ遺伝子が応答することによって提供される。この非定位置アレイを分配して同胞アレイを形成し、それぞれの同胞アレイを３３種の異なった化合物９８４の１つに曝露する。測定可能な効果を有する２つの化合物が識別された。第１の化合物＃３は、比較的に強いが特定のレセプターに限定されない非特異性の信号９８６を生成する。対照的に、第２の化合物＃２４は弱いがより特異性の信号９８８を示す。信号９８８は、従来のモジュレーター・スクリーニングでは信号９８６などのより強い信号によってマスクされると思われるので、見落とされる可能性がある。しかし、化合物＃２４は、更なる研究のための重要なリード化合物となる可能性があり、一方、化合物＃３は、追加の分析を実施しなくても非特異性と識別される。
【０２２１】
７．３ レセプター／リガンド方法および構成の他の例
番号を付けた以下のパラグラフは本発明の他の態様を示す。ただしこれらに限定されるわけではない。
【０２２２】
１． レセプター／リガンド相互作用を識別し、かつ／または特性づける方法であって、（１）第１のレセプターを発現する第１の細胞集団を第１のコード付きマイクロキャリヤーと結合させて、第１のコード付き細胞集団を得ること、（２）第２のレセプターを発現する第２の細胞集団を第２のコード付きマイクロキャリヤーと結合させて、第２のコード付き細胞集団を得ること、（３）第１および第２のコード化付き細胞集団を少なくとも１種のリガンドに曝露すること、および（４）少なくとも１種のリガンドと第１および第２のコード付き細胞集団との間の任意の相互作用を検出することを含む方法。
【０２２３】
２． 曝露段階の前に、第１の細胞集団と第２の細胞集団を一緒にすることをさらに含む、パラグラフ１に記載の方法。
【０２２４】
３． 曝露段階を多重フォーマットで実行する、パラグラフ１に記載の方法。
【０２２５】
４． 第１および第２の細胞集団を表面に堆積させることをさらに含む、パラグラフ１に記載の方法。
【０２２６】
５． 少なくとも１種のリガンドと第１および第２のコード付き細胞集団との間の任意の相互作用に影響を及ぼす能力に関して、化合物をスクリーニングすることをさらに含む、パラグラフ１に記載の方法。
【０２２７】
６． 第１および第２のコード付き細胞集団の少なくとも一方と相互作用する少なくとも１種のリガンドを薬物候補として識別することをさらに含む、パラグラフ１に記載の方法。
【０２２８】
７． 第１および第２の細胞集団にそれぞれ、第１および第２のレセプターをコードする核酸配列をトランスフェクションした、パラグラフ１に記載の方法。
【０２２９】
８． 第１および／または第２のレセプターが細胞表面レセプターである、パラグラフ１に記載の方法。
【０２３０】
９． 第１および第２のレセプターがＧタンパク質結合レセプターである、パラグラフ８に記載の方法。
【０２３１】
１０． 第１のレセプターおよび／または第２のレセプターが細胞内レセプターである、パラグラフ１に記載の方法。
【０２３２】
１１． リガンドが、ホルモン、局所メディエータおよび神経伝達物質から成るグループから選択される、パラグラフ１に記載の方法。
【０２３３】
１２． リガンドが、抗体、抗原、細胞、薬物、汚染物質、プリオン、タンパク質、組換えタンパク質、トキシン、ウイロイドおよびウィルスから成るグループからの選択される、パラグラフ１に記載の方法。
【０２３４】
１３． 第１および第２のコード付きマイクロキャリヤーがそれぞれ、光学的に検出可能なコードによっての特性づけられる、パラグラフ１に記載の方法。
【０２３５】
１４． コードが複数のコード部分から構成され、複数のコード部分が不連続である、パラグラフ１３に記載の方法。
【０２３６】
１５． コードが定位置カラー・コードである、パラグラフ１３に記載の方法。
【０２３７】
１６． 任意の相互作用を検出する段階が、レセプターに結合したリガンドを検出することを含む、パラグラフ１に記載の方法。
【０２３８】
１７． 任意の相互作用を検出する段階が、レセプターに結合したリガンドによってもたらされる表現型の変化を検出することを含む、パラグラフ１に記載の方法。
【０２３９】
１８． 検出段階が、比色またはルミネセンス検定を実行して、レセプターに結合したリガンドによって調節される遺伝子発現を検出することを含む、パラグラフ１７に記載の方法。
【０２４０】
１９． 検出段階が、曝露段階の後に第１および第２の細胞集団のディジタル画像を得ることを含む、パラグラフ１に記載の方法。
【０２４１】
２０． 検出段階が、第１および第２のコード付きマイクロキャリヤーを含むウェルからの平均された信号を得ること、平均された信号が陽性かどうかを判定すること、および信号が陽性である場合に、第１および第２のコード付きマイクロキャリヤーからのそれぞれの個々の信号を測定することを含む、パラグラフ１に記載の方法。
【０２４２】
２１． 個々の信号が、少なくとも１つのディジタル・イメージを得ることによって測定される、パラグラフ２０に記載の方法。
【０２４３】
２２． 検出段階からの検定結果を、対応するマイクロキャリヤー上のコードに関係づけることをさらに含む、パラグラフ１に記載の方法。
【０２４４】
実施例８ コード付きキャリヤーを使用した生物検定
図２９〜３３に示したこの実施例は、化合物ライブラリー、発現ライブラリーおよび／または細胞集団と結合させたコード付きキャリヤーを、フィンガープリンティング、プロテオミクス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）および／または分子スクリーニングなどに対して使用する方法を説明する。
【０２４５】
生体系はとてつもなく複雑である。１個の生物は何千ものさまざまな細胞を含み、１つの細胞は何千ものさまざまな分子を含み、ＤＮＡなどの１つの分子は何千ものさまざまな機能領域を含む。さらに、これらのさまざまな細胞、分子および機能領域は、ほとんど無限ともいえる数の方法で互いと相互作用することができる。
【０２４６】
この複雑さにもかかわらず、生体系の研究は伝統的に、１つの細胞、１つの分子および１つの機能領域の逐次研究によって進歩した。しかし、薬剤学、ゲノミクス、プロテオミクスなどにおける最近の関心は、少なくとも準同時（ｑｕａｓｉ−ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）の研究を要求し、これがマイクロプレート、マイクロアレイなどの多重システムの開発につながった。これらの多重システムは、１日あたり数万ないし数十万サンプルの高スループット分析を可能にする。
【０２４７】
その成功にもかかわらず、現在の多重システムはいくつかの短所を持っている。マイクロプレート検定は一般に、かなりの量の試薬を消費し、平均コストを１サンプルあたり２５セント、またはそれ以上にまで押し上げ、乏しいサンプルで実行することができる検定の回数を制限する。マイクロアレイ検定で消費される試薬の量はマイクロプレート検定よりも少ないかもしれないが、マイクロアレイのサイズの小ささ、および制限された幾何形状が、細胞などの大型の試薬での有用性を低下させる可能性がある。マイクロアレイ検定はさらに、マイクロアレイの作製のために高価な機器を必要とする。マイクロプレート検定およびマイクロアレイ検定はともに、予め定義された位置にサンプルを配置することを要求し、そのため、柔軟性が制限され、高価な検出システムの使用が必要となる。
【０２４８】
本発明は、生体系を分析する多重検定システムを提供する。この実施例は、細胞およびタンパク質フィンガープリンティング、細胞表現型の決定、プロテオミクス、分子スクリーニングなどを含むさまざまな応用に多重検定システムの使用する方法を説明する。いくつかの実施形態では、検定システムが、（１）コード付きキャリヤーを、細胞セレクター、リガンド、レセプター、抗体および／またはモジュレーターを含む細胞分析物質と結合させ、（２）結合させた細胞分析物質を１つまたは複数の細胞集団に曝露して、細胞分析物質と細胞集団との間の相互作用を試験することを含む。検定は例えば、キャリヤーと結合した細胞分析物質と試験中の細胞との間の相互作用の存在、不在、程度、性質および／または含意を決定することを含む。相互作用には例えば、細胞集団の細胞分析物質への結合、細胞集団および／または細胞分析物質に対して発揮される表現型効果、ならびに／あるいは曝露段階によって生み出される他の測定可能な効果が含まれる。検定にはさらに、モジュレーターのアイデンティティおよび／またはこれらの相互作用に対する効果を決定することが含まれる。キャリヤーは、結合させたコードに基づいて区別可能であり、そのため、複数のサンプルを１つの容器の中で一緒に混合して、細胞混合物、候補モジュレーター、環境条件などの検定条件に同時に曝露することができる。
【０２４９】
８．１ 細胞分析物質とコード付きキャリヤーの結合
コード付きキャリヤーは、一般に細胞結合の前にキャリヤーに付着させることによって対象とする細胞分析物質と結合させることができる。適当な細胞分析物質には例えば、細胞セレクター、モジュレーター、リガンド、レセプターおよび／または抗体が含まれ、これらはライブラリーとして提供することができる。細胞分析物質は、細胞分析物質（およびキャリヤー）の形態に基づいて、直接にまたは間接的に付着させることができる。一般に、直接に付着させることができる細胞分析物質には、化合物ライブラリーなどの細胞非依存性の物質、および精製または未精製の分泌または抽出生体分子または生体分子複合体が含まれる。あるいは、キャリヤーは細胞分析物質に、例えば対象とする細胞分析物質を発現している発現媒体とキャリヤーを結合させることによって、間接的に付着させることができる。発現媒体には一般に、成熟核または原核細胞、ウィルス、ファージ、組織、これらの断片（例えば小器官または抽出物）などの細胞が含まれる。これらの発現媒体は、対象とする細胞分析物質または種を自然に発現することができるが、より一般的には、ディスプレイ・ライブラリーなどの適当な発現ライブラリーの一部として対象とする種を発現するように誘導される。例えば、それぞれのキャリヤーを、ファージ・ライブラリーの１つまたは複数のメンバー・ファージ集団と結合させることができる。それぞれのファージ集団は、所与の細胞集団によって発現された特定のタンパク質に向けられた特定の抗体を表示することができる。あるいは、それぞれのファージ集団は、所与の細胞集団の中に存在するレセプター（またはリガンド）と結合することができ、それらの細胞の測定可能な変化を潜在的に生み出すリガンド（またはレセプター）を表示することができる。
【０２５０】
例示的な細胞分析物質はセクションＩＶに含まれており、細胞分析物質および発現媒体（細胞）をコード付きキャリヤーと結合させる例示的な方法はセクションＶに含まれている。
【０２５１】
８．２ キャリヤー・アセンブリーの曝露および相互作用の測定
コード付きキャリヤーを対象とする細胞分析物質と結合させて、キャリヤー・アセンブリーを形成することができる。キャリヤー・アセンブリーを使用して、相互作用を試験するために、細胞および／またはライブラリーの少なくとも１つのメンバーを調べ、または問い合わせることができる。キャリヤー・アセンブリーを、細胞および／または少なくとも１つのライブラリー・メンバーに曝露し、次いで、結合または表現型の効果などの相互作用に関して試験する。
【０２５２】
８．３ 結合の検出
相互作用は、細胞分析物質と細胞の間の結合として測定することができる。キャリヤー（詳細にはキャリヤーと結合した細胞分析物質）と調査中の細胞および／または少なくとも１つのライブラリー・メンバーとの間の結合は、セクションＩＶ（Ｇ）で説明した標識などの適当な任意の方法を使用して検出することができる。この結合は本質的に興味深く、または発現量などの尺度として興味深い。一般に、調査中の細胞には、キャリヤー・アセンブリーに曝露する前および／または後に適当なマーカーを使用して標識する。このようなマーカーには例えば、ルミネセンス（光ルミネセンス（例えば蛍光、リン光）および化学ルミネセンスを含む）、吸収、散乱、反射、および／または物理的または機能的方向（例えば心筋細胞集団のそれ）を使用して検出可能な光学マーカーが含まれる。これらのマーカーにはさらに、他の機構、例えば放射能、質量、形態、活性および／または機能などを使用して検出可能な他の目印が含まれる。キャリヤーは、結合の検出の前および／または後に、一般に結合したコードを読み取ることによって識別することができる。結合などの細胞特性を測定する例示的な方法、およびコードを読み取る例示的な方法はセクションＸおよびＸＩに含まれている。
【０２５３】
以下の検出方法は、細胞の光学的検出に適している。まず最初に、スペクトル、偏光および／または寿命などのいくつかの光学的特性によって区別可能なさまざまな発光団を細胞に担持する。細胞の内部（例えば細胞質）および／または細胞の外部（例えば細胞表面）に標識を付ける。次に、光学顕微鏡、画像検出器（例えば電荷結合素子（ＣＣＤ））などの光学検出システムを使用して、細胞を可視化する。標識化、曝露および／または検出段階は、顕微鏡スライド、チャンバー・スライド（ｃｈａｍｂｅｒ ｓｌｉｄｅ）、マイクロプレート・ウェルなどを含む適当な基板上で実行することができる。
【０２５４】
８．４ 応用
この例で提示する検定システムは、以下の例で説明するように、細胞またはタンパク質フィンガープリンティング、細胞表現型の決定、プロテオミクス（例えば比較プロテオミクス）、分子（例えばリガンド、レセプター）スクリーニングなどを含むさまざまな応用で使用することができる。これらの応用は一般に、結合相互作用に関する情報を使用して、ライブラリー・メンバーおよび／または細胞集団を識別し、特性づけ、かつ／または比較することを含む。
【０２５５】
本発明によって提供される検定システムおよび関連の応用は、従来のシステムに優る１つまたは複数の利点を有する。例えば本発明は、高スループット・レベルでの比較タンパク質発現用の検定を提供する。これらの検定は例えば、リガンドおよび／またはレセプター（例えば抗体）を、タンパク質を識別し、測定し、かつ／または分離し、タンパク質結合に関連した構造的および／または機能的変化を分析するツールとして使用する。検定は、病気、病期、発生段階などによって多重化することができる。検定は、成熟核または原核細胞（細菌）、ウィルス、ファージ、組織などの細胞とともに使用することができ、この場合、細胞の２次標識化によって分析の複雑さを増大させることができる。これらの検定は診断にも有用であり、病気の識別および治療を容易にする。
【０２５６】
８．５ フィンガープリンティング
図２９に、コード付きキャリヤーを使用してさまざまな病期をフィンガープリンティングするシステム１０００を示す。区別可能なコード１００４を有するコード付きキャリヤー１００２を、異なる抗体１００６、１００８、１０１０、レセプター、リガンドなどの対象とする分子を含む細胞分析物質と事前結合させておく。先に述べたように対象とする分子は、細胞によって発現されたときに直接に、または間接的に結合させることができる。一般に、それぞれの型のキャリヤーを、１つまたは２、３の型の抗体と結合させて、コード付き抗体、すなわち抗体−キャリヤー・アセンブリー（１０１２）を生成する。１０１４に示すようにコード付き抗体を一緒にして、コード付き抗体の非定位置アレイ１０１６を作製する。この非定位置アレイを、１０１８に示すように、ある病期の細胞集団１０２０（または対象とする他の細胞）に曝露する。次に、段階１０２２に示すように、それぞれのキャリヤーに結合した細胞の数を測定し、それぞれのキャリヤー・アセンブリー上のコードを読み取る。段階１０２２では、細胞集団１０２０とそれぞれの抗体１００６、１００８、１０１０との間の結合相互作用を測定する。この例では、細胞集団１０２０は抗体１００６と効率的に結合し、抗体１００８とはそれほどでもなく、抗体１０１０とは全く相互作用していない。一般に、異なる抗体は、細胞集団に存在するそれぞれの抗体の高親和性エピトープの数に基づいて異なる効率で細胞集団と結合する。したがって、抗体１００６に対するエピトープが存在することが予想され、抗体１００８に対するエピトープは存在量が低く、または変更された構造を持ち、抗体１０１０に対するエピトープは少ないか、または存在しない。抗体１００６、１００８、１０１０が特定の細胞タンパク質を認識する場合、ある病期の細胞中のこれらのタンパク質の発現レベルをこの分析から決定することができる。
【０２５７】
タンパク質の発現パターン、すなわちフィンガー・プリントは、さまざまなキャリヤー・アセンブリーとさまざまな細胞集団との間の結合の存在、不在および／または程度をカタログ化することによって決定することができる。異なるキャリヤー・アセンブリーは、それらのコードを読み取ることによって識別することができる。結合の存在、不在および／または程度は、（例えば標識化の後に）光学分析などの適当な任意の手法を使用して結合した細胞の数を数え、または他の方法で特性づけることによって決定することができる。例示的な標識化方法はセクションＩＶ（Ｇ）に含まれており、測定方法はセクションＸＩに含まれている。
【０２５８】
フィンガー・プリントはさまざまな目的に使用することができる。最初に、フィンガー・プリントを使用して、特定のタンパク質発現パターンを特定の病期に結びつけるデータベースを作成することができる。後に、このデータベースを使用して、組織生検材料を含むさまざまな源からの細胞の異なる病期を識別することができる。さらに、細胞集団の病期に基づいて異なる結合パターンを表示することが分かっている１）抗体および／またはリガンド、２）タンパク質および／またはレセプターなどの対象とする分子はそれぞれ、新しい１）薬物または２）薬物ターゲットの手がかりとなる可能性がある。
【０２５９】
より一般的には、この方法を使用して、対象とする分子に関して、その結合特性が異なる２つ以上の細胞集団を区別することができる。例えば、これらの２つ以上の細胞集団は、発生段階、（例えば分化、刺激、アポトーシスなどの前後）、病期（例えば健常と病気状態、病気の初期と後期、第１の病気クローンと第２の病気クローンなど）、またはあるモジュレーターへの曝露（例えば化学物質、ホルモン、温度変化、機械的攻撃など）によって区別される同じ細胞型の集団とすることができる。あるいは、これらの２つ以上の集団は、神経細胞、筋肉細胞、脂肪細胞など、基本的に異なる細胞型の集団とすることもできる。異なる細胞集団間の結合特性の差異は、細胞集団の細胞表面および／または細胞内部（例えば細胞が膜透過性となっている場合）の差異を反映したものである可能性がある。例示的な細胞およびモジュレーターはセクションＩＩＩおよびＩＶ（Ａ）にそれぞれ含まれている。
【０２６０】
８．６ プロテオミクス
高スループット比較プロテオミクス（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ＨＴＣＰ）に対するコード付きキャリヤーの使用を図３０に示す。プロテオミクスは、タンパク質の発現および活性の研究を含み、一般にウィルス、細胞、組織などのタンパク質の識別、および病気の伝播などにおけるこれらのタンパク質の役割の決定を含む。ここでは、コード付きキャリヤーを、（１）抗体などの対象とする細胞分析物質と直接に、かつ／または間接的に事前結合させておき、次いで（２）区別可能な２つ以上の細胞集団に曝露する。特定の１つまたは複数の細胞集団に優先的にまたは排他的に結合する分子を識別し、かつ／またはこれらを分離して、さらなる研究に供することができる。
【０２６１】
図３０に、単一疾患型（ｓｉｎｇｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ）高スループット比較プロテオミクス（ＳＤ−ＨＴＣＰ）を実行する方法１０３０を示す。この例では、正常な細胞集団１０３２および病気にかかった細胞集団１０３４を、例えば正常細胞が青く、病気の細胞が赤く見えるカラー・マーカーを使用して事前に標識し、区別できるようにしておく（細胞標識化の例示的な方法はセクションＩＶ（Ｇ）および実施例８．３に含まれている）。次いで正常細胞および病気の細胞を、１０３６に示すようにコード付き抗体ライブラリー１０３８に曝露する。ライブラリー１０３８は、抗体集団１０４０、１０４２、１０４４、１０４６をそれぞれのコード付きキャリヤー１０４８と結合させて抗体−キャリヤー・アセンブリー１０５０を形成し、次いで、この抗体−キャリヤー・アセンブリーを１０５２に示すように一緒にしてコード付きライブラリー１０３８を形成することによって形成する。曝露の後、１０５４に示すように、細胞集団１０３２、１０３４とコード付きライブラリー１０３８との結合を測定し、キャリヤー・コードを読み取る。図３０の最下段に示すように、抗体集団１０４０は細胞集団１０３２とだけ結合し、抗体集団１０４２は両方の細胞集団と結合し、抗体集団１０４４は細胞集団１０３４とだけ結合し、抗体集団１０４６はどちらの細胞集団とも結合しない。したがって、病気の細胞とだけ結合する１０４４などの抗体集団を識別し、かつ／またはこれを分離してさらなる研究に供することができる。モジュレーター、レセプター、他のタンパク質および／またはペプチドを使用して表面マーカーを捕獲することもできるので、上記の方法は、リガンドとして抗体を使用することに限定されない。
【０２６２】
方法１０３０を、３つ以上の細胞集団を分析して多疾患型（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ）高スループット比較プロテオミクス（ＭＤ−ＨＴＣＰ）を実行するように適合させることができる。この場合には、正常細胞集団および病気にかかった複数の細胞集団を異なったカラー・マーカーを使用して予め標識しておき、次いでコード付き抗体ライブラリーに曝露する。複数の病気細胞集団は、異なる病気の細胞集団、および／または同じ病期の異なる病期の細胞集団とすることができる。これらの研究の結果を使用して、病気および／または病期を特性づけ、新薬を開発し、かつ／または情報データベースを構築することができる。
【０２６３】
表５に、４つのメンバーを含むコード付き抗体ライブラリーを使用したＭＤ−ＨＴＣＰの可能な結果を示す。コード付き抗体ライブラリーを、正常細胞、乳癌、腺管癌および卵巣癌に対応する明瞭に標識された４つの細胞集団に曝露する。検出可能な細胞結合は「＋」、結合の不在は「−」で指示されている。この結果によれば、抗体１００１０は、腺管癌細胞を除く全ての細胞集団と結合し、抗体１０１１０は腺管癌に対して特異的であり、抗体１０１０１は、３つの全ての癌細胞集団と結合するが、正常細胞とは結合せず、抗体１０００１は非特異的である。したがって、抗体１０１１０は、腺管癌の識別、特性付けおよび／または治療に有用である可能性がある。さらに、抗体１０１０１は、多くの癌または全ての癌の識別、特性付けおよび／または治療に適当である可能性がある。
【表５】
2004537712.tif 000006
【０２６４】
より一般的には、この方法を使用して、ウィルス、ファージ、成熟核または原核細胞、組織などの細胞の任意の分子成分の存在および／または存在量を特性づけ、かつ／または比較することができる。調査される分子成分は一般に細胞表面分子を含むが、細胞が膜透過性になっている場合にはさらに細胞質分子を含むことができる。
【０２６５】
８．７ 分子スクリーニング−１
方法１０６０は、コード付きキャリヤーを使用して、対象とする分子に関して発現ライブラリーをスクリーニングする方法を示す。図３１を参照されたい。異なったコード１０６４を有するコード付きキャリヤー１０６２を、異なるＧタンパク質結合レセプター１０６６、１０６８、１０７０などの異なる分子および／または異なる濃度の分子を発現する細胞集団（図示せず）と結合させて、キャリヤー・アセンブリー１０７２を作製する。細胞集団には例えば、ウィルス、ファージ、完全細胞、組織、抽出物などが含まれる。異なる分子には例えば、翻訳前および／または翻訳後に修飾された膜タンパク質を含む任意の細胞表面分子が含まれる。１０７４に示すようにキャリヤー・アセンブリーを一緒にして非定位置アレイを作製し、次いでこのアレイを、１０７６に示すように、メンバー集団１０７８、１０８０、１０８２に曝露する。これらのメンバー集団は、可能なリガンドを発現するタンパク質ファージ・ディスプレイ・ライブラリーなど、異なるタンパク質の可能なコンパニオン分子を発現する媒体の発現ライブラリーのメンバーである。この発現ライブラリーは、セクションＩＶ（Ｇ）で例示した方法などの適当な任意の方法を使用して標識することができる。１０８４に示すように、キャリヤーに結合する発現ライブラリーのメンバーを識別する。この例では、コード「２」を有するコード付きキャリヤーが、レセプター集団１０６８との相互作用を介して集団１０７８の一部（または全て）と結合する。このキャリヤーを、１０８６に示すように、例えば浮選または機械的操作によって非定位置アレイから選別する。メンバー集団１０７８を、１０８８に示すように、化学的方法（例えばｐＨ、イオン強度などの変化）、および／または機械的方法（例えば振盪、回転、電界および／または磁界への曝露など）などの適当な任意の方法を使用してキャリヤーから分離する。分離したメンバー１０７８をクローン化する。このメンバーによって発現されるコンパニオン分子は、コード付き細胞集団によって発現されたレセプターのアゴニスト、アンタゴニストなどの可能なモジュレーターとして特性づけ、研究することができる。
【０２６６】
８．８ 分子スクリーニング−２
図３２および３３は、血清マーカーを識別し、かつ／または特性づける現行の方法１０９０と本発明の諸態様に基づく高スループット比較プロテオミクス法１１００とを比較した図である。血清マーカーは、血清中に存在する可溶性の分子または細胞と結合した分子であり、その存在、濃度、構造および／または他の特性を、その異常を含む関連生物活性の指示薬として使用することができる。知られている血清マーカーには、（１）ダウン症候群に対するα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、非抱合型エストリオール（ｕＥ３）、およびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、（２）前立腺癌に対する前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、（３）乳癌に対するＣＡ１５−３（別名ＭＵＣ１）、（４）卵巣癌に対する血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などがある。これらのマーカーを、診断および／またはターゲットなどに使用して、病気の識別および治療を容易にすることができる。
【０２６７】
方法１０９０は、正常細胞に比べて癌細胞で差別的に発現される遺伝子を識別し、選抜する核酸ベースの方法を使用する。選抜されたそれぞれの遺伝子を使用して、コードされたタンパク質を発現させ、コードされたタンパク質に特異的な抗体を産生させて、最終的には臨床試験へ進む。
【０２６８】
対照的に、図３３に示した方法１１００はＨＴＣＰ法を使用して、臨床上重要な対象とする物質をより直接的に識別する。正常細胞および複数の病気細胞を明瞭に標識し、これらを使用して、潜在的な血清マーカーのライブラリー、あるいは潜在的な血清マーカーと結合する抗体またはリガンドのライブラリーを、例えば図３０に示した戦略を使用してスクリーニングする。これらのライブラリーを、識別可能な分泌モチーフをコードする配列のほうに偏らせることができ、病気の細胞で発現または過剰発現する配列を過剰提示する減法ライブラリー（ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ ｌｉｂｒａｒｙ）とすることができ、あるいは病気の細胞のエピトープに対して形成された抗体ライブラリーとすることができる。
【０２６９】
ライブラリー・スクリーニングは血清マーカーを識別し、かつ／または血清マーカーに結合する抗体、リガンドなどの試薬を識別することができる。場合によっては、ＨＴＣＰを使用して識別されたライブラリー・メンバーが部分コード配列を表すことがある。この部分コード配列は、変化した活性を有し、例えば優性陰性誘導体（ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）またはアンタゴニストとして作用するペプチドまたは部分タンパク質をコードすることができる。コードされた優勢な陰性誘導体はレセプターと正常に結合することができるが、正常には機能しない。このような優勢陰性誘導体は、薬物リードとして、または臨床治療において有用である可能性がある。より一般的には、ＨＴＣＰ法を使用して、血清の他に、リンパ、乳汁、粘液、汗、唾液、精液、涙、尿、便などを含む生体液および／または分泌物中の適当なマーカーまたはターゲットを識別し、かつ／または特性づけることができる。
【０２７０】
実施例９ 逆トランスフェクションを使用した多重細胞分析システム
図３４〜３６に示すこの実施例は、逆トランスフェクションを使用してコード付きキャリヤー上の細胞に逆トランスフェクションする方法を説明する。トランスフェクション物質をコード付きキャリヤー上に配列し、次いで細胞と一緒にして、トランスフェクション物質を細胞に逆トランスフェクションする。これによって得られる逆トランスフェクションされた細胞のアレイを、生体系の定位置および／または非定位置多重分析に使用することができる。
【０２７１】
トランスフェクションは生体系を研究する強力な手段である。トランスフェクションは細胞に外来物質を導入する手法である。トランスフェクションの一方法では、外来物質が、エフェクター・タンパク質をコードするポリヌクレオチド・ベースの遺伝子発現ベクターである。エフェクター・タンパク質の発現は、エフェクター・タンパク質自体および宿主細胞の表現型応答についての生化学的または機能的情報を提供する。あるいはまたは加えて、トランスフェクションした遺伝子発現ベクターが、細胞の特性をレポートするリポータ・タンパク質またはＲＮＡをコードすることもできる。例えば、トランスフェクションしたリポータ遺伝子が、容易に測定されるリポータ・タンパク質（またはＲＮＡ）の発現を制御する遺伝子調節配列を含む。トランスフェクションした遺伝子調節配列は内因性調節配列になりすますことができ、この場合、リポータ・タンパク質のレベルは、遺伝子発現および細胞表現型の指示薬の働きをする。さらに、細胞トランスフェクションによって、アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはアンチセンス・ポリヌクレオチド発現ベクターを導入することができる。アンチセンス核酸のトランスフェクションでは、遺伝子の発現を妨げることによってその遺伝子の機能を試験することができる。したがって、細胞トランスフェクションは、新薬の識別、ならびにタンパク質の機能および細胞生物学の理解においてしばしば極めて重大な役割を果たす。
【０２７２】
分子生物学者は、本明細書では古典的トランスフェクションと呼ぶ、付着細胞のトランスフェクションに広く使用されているトランスフェクション手順を開発した。古典的トランスフェクションでは一般に、カバー・ガラスなどの基板に付着させた細胞に核酸を提示する。脂質などのトランスフェクション・エンハンサーを用いた核酸および／または細胞の適当な処理によって、細胞内への核酸の取込みを促進することができる。
【０２７３】
古典的トランスフェクションの普及にもかかわらず、この方法は、マイクロアレイを含む高スループット応用に適合させることが難しい。具体的には、マイクロアレイのサンプル間の流体移動に対する境界を欠くマイクロアレイは、古典的トランスフェクションに適さない。例えば、トランスフェクションに使用されるほとんどの細胞は、生存のために不断の流体浴を必要とするため、予め付着させた細胞層上のアレイの定義された位置に異なる核酸を配置することは実際的でない。したがって、核酸を細胞層に局所的に追加しようとしても、それは、流体（および核酸）のランダムな移動によって妨げられるであろう。
【０２７４】
Ｓａｂａｔｉｎｉ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓは、細胞および核酸を基板上に配置する順番を逆にすることによって逆トランスフェクション戦略を提供している。この戦略は、参照によって本明細書に組み込まれる２０００年９月１８日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ００／２５４５７号に記載されている。この Ｓａｂａｔｉｎｉ戦略では、核酸を基板上に配置してから細胞を基板に付着させる。そのため、基板上での核酸アレイの形成には基板を浸す流体が不要である。したがって、基板の離散領域にさまざまな核酸が、例えば印刷された平面アレイとして付着される。続いて、この印刷核酸アレイに細胞集団を付着させて、対応する細胞アレイ・パターン中に核酸をトランスフェクションさせる。
【０２７５】
定位置トランスフェクション用の印刷核酸平面アレイが魅力的であるにもかかわらず、Ｓａｂａｔｉｎｉ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓの戦略は柔軟性を欠いている。例えば、印刷アレイは印刷後に修正することが難しい。したがって、アレイからサンプルを取り出すこと、または基板上の使用可能なスペースが尽きている場合に追加のサンプルを追加することが難しい。このように柔軟性にかけるため、新しい候補の追加またはスクリーニング戦略の変更のために、予め印刷したアレイを破棄し、代わりに新しく印刷したアレイを使用する必要が生じる場合がある。固定された平面アレイの他の欠点は、費用がかかることと再現性が低いことである。平面アレイは高価な試薬を過剰使用する可能性がある。これは、試薬は一般に、アレイの表面全体に均一に分布させる必要があり、そのため試薬の所要量が増大するためである。薬物または反応条件にアレイ全体を均一に曝露させることも問題となる可能性がある。さらに、平面アレイは、マイクロタイター・プレートと両立しない可能性がある。現代の薬物発見の高スループット環境ではマイクロタイター・プレートとの両立は標準の要件なので、これは重大な欠点である。
【０２７６】
この実施例は、トランスフェクション物質および逆トランスフェクションされた細胞のアレイを作製し、使用する方法および構成を提供する。これらの方法および構成は、検出および区別が可能なコードを有するコード付きキャリヤーを含む。コード付きキャリヤーを核酸などのトランスフェクション物質と結合させて、コード付きのトランスフェクション物質を作り出す。このコード付きトランスフェクション物質を一緒にして、結合したコードに基づいて識別可能なトランスフェクション物質の定位置および／または非定位置アレイを作製することができる。トランスフェクション物質のアレイを細胞集団と結合させて、細胞を、それぞれのコードおよびトランスフェクション物質に連結させることができる。細胞集団は、それぞれのトランスフェクション物質の一部を内在化させ、それによって、それぞれのトランスフェクション物質の細胞集団への定位置および／または非定位置逆トランスフェクションを導く。コードを読み取り、トランスフェクションされた細胞集団の特性を測定することによって、それぞれのトランスフェクション物質の細胞集団に対する効果を分析することができる。コードと特性の連結は、それぞれのキャリヤー上で測定された特性を、対応するトランスフェクション物質に関係づけることを可能にする。この方法（特に非定位置法）は、以前のトランスフェクション法および分析法に比べ、柔軟性、コストおよび信頼性をかなり向上させることができる。例えば、非定位置アレイを使用して、トランスフェクション物質のライブラリー、ならびに／もしくは物理モジュレーターならびに／あるいは化学的／生物学的モジュレーター、リガンドおよび／または抗体のライブラリーの逆トランスフェクションされた細胞に対する効果を、多重マイクロタイター・フォーマットを使用してスクリーニングし、かつ／または分析することができる。
【０２７７】
９．１ コード付きキャリヤーとトランスフェクション物質の結合
トランスフェクション物質を、細胞から独立した方法で、コード付きキャリヤーと事前結合させることができる。この細胞非依存性の結合は、キャリヤー上のコードが、トランスフェクション物質、またはその起源などのトランスフェクション物質の特性についての情報を標示し、あるいはトランスフェクション物質またはその特性を識別することを可能にする。
【０２７８】
トランスフェクション物質とキャリヤーの事前結合では、安定な結合と不安定な結合との間のバランスをとる必要がある場合がある。事前結合は、その後の細胞結合および逆トランスフェクション操作の間、トランスフェクション物質の一部をキャリヤー上に保持できる十分に安定なものでなければならない。しかし、この事前結合を、トランスフェクション物質が放出されて、キャリヤーに付着した細胞によって取り込まれるように一時的なものとすることができる。一時的な結合は、ゼラチンなどのゲル形成物質によって形成されたものなどのゲル・マトリックスにトランスフェクション物質を取り込ませることによって媒介することができる。キャリヤーの処理または細胞が結合を不安定にする能力を有する場合には、キャリヤーとトランスフェクション物質との間の安定な結合も適当である場合がある。例えば、細胞が、キャリヤーからトランスフェクション物質を引き離し、または安定に結合したウィルス粒子からのトランスフェクション物質の放出を活性化することがある。
【０２７９】
細胞非依存性結合は一般に、１種または数種のトランスフェクション物質を、既知のまたは判定可能な１つまたは複数のコードを有するコード付きキャリヤー集団と混合し、または別の方法で曝露することによって実施することができる。この結合を、乾燥、温度変化、光、放射線、化学反応、または例えば先に説明したゲル形成物質などの結合プロモーターを用いた処理を含む適当な任意の処理によって容易にすることができる。後述するように、事前結合はさらに、逆トランスフェクション・エンハンサーを用いたトランスフェクション物質の処理を含むことができる。安定結合または一時的結合を実施した後に、異なるトランスフェクション物質と結合したキャリヤーを、管、マイクロプレート・ウェルなどの１つの容器の中で一緒にして、トランスフェクト可能物質の非定位置アレイを作製することができる。
【０２８０】
９．２ トランスフェクション物質およびライブラリー
逆トランスフェクションで使用するのに適したトランスフェクション物質は上記セクションＩＶ（Ｃ）に記載されている。トランスフェクション物質を使用して、コード付きトランスフェクト可能物質のライブラリーをキャリヤー上に形成することができる。トランスフェクション物質のライブラリーは２つ以上のメンバーを有し、通常は、メンバー間で関連づけられた特性を含む。例えば、ライブラリーは、核ホルモン・レセプター、Ｇタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）などの構造的および／または機能的に関連したタンパク質のファミリをコードし、または含むことができる。ライブラリーはさらに、タンパク質の野生型および突然変異誘導体をコードすることができる。さらに、ライブラリーは、生物、組織、細胞型、患者サンプル、病態、発生段階、腫瘍、血液、遺伝的背景などからの定義された、またはランダムな相補またはゲノムＤＮＡをコードすることができ、それぞれの相補またはゲノムＤＮＡは、既知のまたは未知の構造および／または機能を有することができる。さらに、ライブラリーは、異なった調節配列および／またはリポータ配列を有する２つ以上のリポータ遺伝子をコードすることができる。
【０２８１】
９．３ コード付きキャリヤーと細胞の結合
キャリヤーをトランスフェクション物質と事前結合させた後に、それぞれのコード付きキャリヤーを細胞と結合させることができる。細胞結合は、コード付きキャリヤーと直接に、あるいはセクションＩＶ（Ｄ）で説明した細胞セレクターを使用して、または付着プロモーターを使用して間接的に実施することができる。細胞結合は、細胞集団をキャリヤー・コードに連結する。細胞集団は、適当な任意の細胞または細胞混合物を含むことができる。
【０２８２】
事前結合および／または細胞結合の後にコード付きキャリヤーを混合して、非定位置アレイを形成することができる。それぞれのケースで、コード付きキャリヤーに関連づけられたコードを使用して、結合したトランスフェクション物質および／または細胞集団を識別することができる。
【０２８３】
例示的な細胞および細胞結合手順は、上記セクションＩＩＩおよびＶ、ならびに詳細な説明の項の他の場所に記載されている。さらに、例示的なアレイは上記セクションＶＩＩＩに記載されている。
【０２８４】
９．４ 逆トランスフェクション
逆トランスフェクションは一般に、最初にキャリヤーをトランスフェクション物質と結合（事前結合）させ、次にキャリヤーを細胞集団と結合させた後に、トランスフェクション物質を細胞にトランスフェクションすることを含む。（逆または古典的）トランスフェクションは、細胞外から細胞内へトランスフェクション物質を移動させる、能動または受動輸送を含む任意の取込み機構を含むことができる。例えば、トランスフェクションは、細胞の表面膜を通したエンドサイトーシス、感染、能動輸送または拡散によって進行する。
【０２８５】
トランスフェクション物質および／または細胞を、トランスフェクションを促進する、脂質、リン酸カルシウム、ポリエチレングリコール、グリセリン、熱、電界などの適当な任意のトランスフェクション・エンハンサーに曝露することができる。トランスフェクション物質のトランスフェクション・エンハンサーへの曝露は、トランスフェクション物質とキャリヤーの事前結合の前、最中および／または後に実施することができる。同様に、細胞をトランスフェクション・エンハンサーに曝露する時期も任意である。例示的な一実施形態では、事前結合段階でトランスフェクション物質をキャリヤーと結合させ、次いで脂質トランスフェクション・エンハンサーに曝露し、最後に細胞と結合させる。例示的な代替実施形態では、事前結合段階の前および／または最中に、トランスフェクション物質を脂質トランスフェクション・エンハンサーに曝露する。
【０２８６】
逆トランスフェクションの他の態様は、以下の特許出願に記載されている：２０００年９月１８日出願のＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／２５４５７号、および２００１年７月２４日出願の米国仮特許出願第６０／３０７，６５Ｏ号。これらの出願は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２８７】
９．５ コードの読取りおよび細胞特性の測定
逆トランスフェクションによって、コード付きキャリヤーと結合したトランスフェクションされた１つまたは複数の細胞集団が生じる。逆トランスフェクションに続いて、コードを読み取り、細胞集団の特性を測定し、かつ／または分析することができる。コードを読み取り、細胞特性を測定する例示的な方法は上記セクションＸＩ、および詳細な説明の項の他の場所に含まれている。
【０２８８】
コードを使用して、キャリヤーおよび結合したサンプルを測定前および測定中に識別し、測定後に、関連結果を追跡することができる。コードは、細胞特性の測定の前、最中、および／または後に読み取ることができる。いつコードを読み取るにせよ、コードは、測定された細胞特性に連結され、または連結することができなければならない。この連結は、キャリヤーと事前結合させたトランスフェクション物質（またはトランスフェクション物質の一態様）を識別し、この連結によってさらに、細胞集団、細胞集団に曝露したモジュレーター、または他の任意の実験パラメーターを含む、キャリヤーに関係づけられた他の態様を識別することができる。コードによって関係づけることができる例示的な情報はセクションＶＩＩに含まれている。
【０２８９】
細胞特性には例えば、逆ランスフェクションされたそれぞれの細胞または細胞集団全体の分子または細胞態様が含まれ、この態様をキャリヤーに連結させることができる。適当な例示的な特性は上記セクションＸに記載されている。
【０２９０】
９．６ モジュレーター
逆トランスフェクションされたコード付きキャリヤー上の細胞集団を、モジュレーター、リガンド、抗体、標識および／または他の適当な任意の細胞分析物質に曝露することができる。モジュレーター、リガンドおよび／または抗体には例えば、細胞集団、トランスフェクション物質、またはトランスフェクション物質によってコードされ、トランスフェクション物質から発現される物質の測定可能な特性に影響を及ぼす可能性がある任意の薬物、ホルモン、リガンド、増殖因子、増殖阻害因子または他の作用因子が含まれる。例示的なモジュレーターおよび他の適当な細胞分析物質は上記セクションＩＶに含まれている。
【０２９１】
例示的なモジュレーターおよび／またはリガンドには、薬物スクリーニングを実施するのに使用される薬物候補が含まれる。逆トランスフェクションは、薬物スクリーニングの直接または間接のターゲットを提供することができる。したがって、そのターゲットに対する任意の効果を、コード付きキャリヤー上に存在する細胞集団の測定可能な特性とすることができる。例えば、ターゲットを、細胞モジュレーターによって活性を調節することができるリポータ遺伝子とすることができる。あるいはまたは加えて、モジュレーターによってターゲットを直接に結合させることができる。例えば、ターゲットを、モジュレーターによってその活性を抑制しまたは活性化することができるレセプターとすることができる。
【０２９２】
９．７ コード付き非定位置アレイを用いた逆トランスフェクション
図３４に、トランスフェクション可能なＤＮＡ分子のコード付き非定位置アレイを作製する方法１１５０、およびこのコード付きアレイを用いた細胞の逆トランスフェクションを示す。より一般にはこの方法は、ＲＮＡ分子または他の任意のトランスフェクション物質とともに使用することができる。
【０２９３】
コード付きキャリヤー１１５２を、異なった発現ベクターの形態のＤＮＡ分子であるトランスフェクション物質１１５４、１１５６、１１５８と事前結合させる。それぞれのキャリヤー種は異なった（１つまたは複数の）コードを有し、異なったトランスフェクション物質またはトランスフェクション物質セットと結合する。この図に示した３つのキャリヤー種は、例えば基板上の異なる位置に置くことによって、あるいは異なる基板上、または異なった容器１１６０の中に置くことによって空間的に互いに分離される。事前結合は、例えばキャリヤーをＤＮＡでコーティングすることによって実施することができる。キャリヤーは単層として配列し、またはランダムに積み上げることができる。事前結合の後、１１６８に示すように、得られた３つのコード付きＤＮＡ１１６２、１１６４、１１６６を一緒にして、トランスフェクション可能なコード付きＤＮＡの非定位置ライブラリー・アレイ１１７０を作製する。アレイ内のそれぞれのＤＮＡのアイデンティティは、連結したそれぞれのキャリヤー上に存在するコードによって維持される。ＤＮＡは、事前結合段階およびその後の段階中の任意の時期に、トランスフェクション・エンハンサーで処理することができる。
【０２９４】
細胞１１７２とアレイを一緒にすることによって、細胞１１７２を、トランスフェクション可能なコード付きＤＮＡのアレイ１１７０と結合させる。結合には、細胞を含む液体をコード付きキャリヤーの上に流すなど、適当な任意の方法を使用することができる。この例では、単一の細胞集団１１７４が、それぞれのコード付きキャリヤーと結合する細胞亜集団を与える。しかし、アレイ１１７０を同胞アレイに分割し、それぞれの同胞アレイを異なる細胞集団と結合させるなど、より複雑な操作を実施することもできる。
【０２９５】
最下段の拡大図１１７６、１１７８に示すように、コード付きキャリヤーと結合させた細胞亜集団１１８０は、キャリヤーと事前結合させたトランスフェクション可能ＤＮＡ １１５４の取込みによって、１１８２に示すように逆トランスフェクションされる。この段階は例えば、自然発生的に、かつ／または先に説明したトランスフェクション・プロモーターの作用によって起こり、一般に、トランスフェクション可能ＤＮＡの一部が細胞の中に入る。細胞は一般に、キャリヤーとトランスフェクション物質の結合相互作用とは異なる結合相互作用によってキャリヤーと結合する。逆トランスフェクションの結果、トランスフェクション可能ＤＮＡ１１５４が発現される。この例では、発現したＤＮＡが、内在性膜レセプターなどの細胞表面タンパク質１１８４を生み出す。
【０２９６】
９．８ 逆トランスフェクション細胞アレイを使用したリガンド／モジュレーター・スクリーニング
図３５に、逆トランスフェクションされた細胞のアレイを使用してリガンドおよび／またはモジュレーターをスクリーニングする方法１２００を示す。この方法は、薬物発見目的のＤＮＡトランスフェクションに関して説明されるが、より一般には、任意のトランスフェクション物質とともに適当な任意の目的に使用することができる。
【０２９７】
コード付きキャリヤー１２０２をトランスフェクション可能ＤＮＡ１２０４と事前結合させる。１２１２に示すように、得られたＤＮＡ−キャリヤー・アセンブリー１２０６、１２０８、１２１０を一緒にして、コード付きＤＮＡの非定位置親アレイ１２１４を作製する。１２１６に示すように、アレイの部分をマイクロプレート１２１８に移すことによって親アレイ１２１４を分割することができる。それぞれの部分が、親アレイ１２１４と実質的に同じＤＮＡ−キャリヤー・アセンブリー表現を有する同胞アレイ１２２０である。同胞アレイ１２２０は全体として定位置セット１２２２を提供する。あるいは、アレイ１２１４を分割し、例えば親アレイ１２１４の部分を別々に識別可能な容器に移すことによって、同胞アレイの非定位置セットを形成することもできる。
【０２９８】
１２２６に示すように、細胞集団１２２４をそれぞれの同胞アレイ１２２０と一緒にすることによって、定位置セット１２２２を細胞１２２４と結合させる。検定の意図が細胞系統間の変動を見ることにあるのか、またはリガンドおよび／またはモジュレーター間の変動を見ることにあるのかによって、ウェルごとに同じ細胞集団を使用し、かつ／または異なる細胞集団を使用することができる。この例では、単一の細胞集団をマイクロプレート・ウェルに分配して、分配しておいたコード付きＤＮＡ同胞アレイと結合させる。いくつかの実施形態では、細胞結合を、親アレイ１２１４の部分をマイクロプレート１２１８に移す（段階１２１６）前、または個々のコード付きトランスフェクション可能ＤＮＡを一緒にする（段階１２１２）前に実施することができる。さらに、いくつかの実施形態では、コード付きキャリヤーと細胞の結合をトランスフェクション物質をキャリヤーに曝露する前に実施することができ、したがってここに示した逆トランスフェクションではなく古典的トランスフェクションを実施することができる。
【０２９９】
細胞結合の最中および／または後に、それぞれのキャリヤーと事前結合したＤＮＡは、例えば先に説明した方法で、キャリヤーと結合した細胞に逆トランスフェクションする。
【０３００】
逆トランスフェクションによって、逆トランスフェクションしたＤＮＡが発現して、例えば先に説明したような遺伝子産物を生み出す。１２３０に示すように、逆トランスフェクションの前、最中および／または後に候補リガンドおよび／またはモジュレーター１２２８を細胞に曝露する。ここで、それぞれのリガンド／モジュレーター１２２８のアイデンティティは、曝露中はその位置によって、あるいは外部からマークした容器または内部的にマークしたアレイの中では位置によらずに追跡することができる。しかし、特に位置情報などのアレイ識別情報を破壊するその後の操作の間は、リガンド／モジュレーターのアイデンティティをコードに持たせることもできる。
【０３０１】
リガンド／モジュレーターとともに適当にインキュベーションした後、１２３２に示すように、それぞれのキャリヤー細胞集団の特性を測定し、キャリヤー上のコードを読み取る。ここでは、特性およびコードをそれぞれ、細胞およびキャリヤーの光学特性を測定することによって決定する。それぞれのマイクロプレート・ウェルは、１つまたは複数の型のコード付きキャリヤー、したがって１つまたは複数の型の逆トランスフェクションＤＮＡを含むことができる。その結果、この例のそれぞれのマイクロプレート・ウェルは、トランスフェクションされた３つの異なる細胞集団に対するリガンド／モジュレーターの効果についての情報を提供する。ただし、トランスフェクションされた適当な任意の数の細胞集団を混合物として提供することができる。したがって、単一のウェルまたは単一の容器の中の非定位置アレイによって提供される情報を分析することによって、逆トランスフェクションされた多くの異なる細胞集団からの情報を得ることができる。
【０３０２】
９．９ アンチセンス核酸の逆トランスフェクション
コード付きキャリヤーと結合した細胞へのアンチセンス核酸およびＰＴＧＳ薬の逆トランスフェクションを使用して、以下に例示するような遺伝子機能を研究することができる。
【０３０３】
ヒト・ゲノムの配列決定によって全てのヒト遺伝子が識別された。これらの遺伝子の機能の決定は、しばしば機能ゲノミクス（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ）と呼ばれるはるかに大変な作業である。一般に、特定の遺伝子の機能を決定するには、その遺伝子の発現を変化させ、次いで生理学的パラメーターを測定する。どのパラメーターを選択して測定するかは、生命情報科学の影響を強く受けるが、比較的に任意である。このようなパラメーターには例えば、信号カスケードの活性化、細胞表面レセプターの抑制、遺伝子または遺伝子セットの発現レベル、細胞周期の進行に対する効果などがある。
【０３０４】
ターゲット遺伝子の発現レベルを変化させるためには、遺伝子を過剰発現させ、十分に発現させず（ノックダウン）、または遺伝子発現を完全に妨げる（ノックアウト）。ターゲット遺伝子の発現を変化させるのにはさまざまな手法が使用可能だが、一般的な手法は、対象とする遺伝子の発現を妨げるアンチセンスＲＮＡまたはＰＴＧＳ薬（ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡなどの２本鎖ＲＮＡ）の発現である。アンチセンスＲＮＡまたはＰＴＧＳ薬は、対象とする遺伝子のセンス転写産物の少なくとも一部分と相補的であり、かつ／またはこれと重なり、一般に、対象とする遺伝子の発現を低下させ、場合によっては発現を遮断する。しかし、アンチセンスＲＮＡまたはＰＴＧＳ薬を使用する方法は、現在使用可能な豊富なゲノム情報を効果的に分析するためにより効率的な検定システムを必要とする。
【０３０５】
本発明は、アンチセンス核酸またはアンチセンス発現ベクターを細胞に逆トランスフェクションする、コード付きキャリヤーを用いた多重検定システムを提供する。アンチセンス核酸は例えば、ペプチド核酸などの修飾された核酸を含む合成ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、あるいは、アンチセンスＲＮＡ転写産物を生み出すプラスミドなどのアンチセンス発現ベクターである。アンチセンス核酸の効果は、リポータ遺伝子活性、または他の適当な細胞特性を監視することによって測定することができる。適当な細胞特性は、セクションＩＶおよびＸ、ならびに詳細な説明の項の他の場所に例示されている。
【０３０６】
本発明はさらに、２本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡをコードするベクターなどのＰＴＧＳ薬を細胞に逆トランスフェクションする、コード付きキャリヤーを用いた多重検定システムを提供する。逆（または古典的）トランスフェクションする２本鎖ＲＮＡは例えば、合成ＲＮＡ、酵素によってｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ転写系で）で生成したＲＮＡ 、あるいは細胞内で発現させ、分離しまたは（例えば細胞融合によって）直接に使用するＲＮＡとすることができる。あるいは、２本鎖ＲＮＡは、トランスフェクションした核酸から発現させることもできる。例えば、２本鎖ＲＮＡを、自己アニールする逆方向反復として、または分子間でアニールする別個の２つの転写産物として発現させることができる。例示的なＰＴＧＳ薬はセクションＩＶ（Ｃ）に詳細に説明されている。
【０３０７】
方法１２４０は、細胞活性を調節する遺伝子を識別するためのアンチセンス発現ベクターの逆トランスフェクションを示す。図３６を参照されたい。方法１２４０では、選択の生理学的パラメーターに関して容易に検定できる細胞１２４１を使用する。この例では、細胞１２４１が、信号カスケードが活性化されているときにリポータ遺伝子を発現させるように操作された安定なリポータ細胞系統である。具体的には、リポータ細胞１２４１は、ＮＦ−ｋａｐｐａＢカスケードが活性化されているときにＧＦＰを発現する。それぞれ異なったコード１２４３を有する別個のコード付きキャリヤー・クラス１２４２を、異なる発現ベクター１２４４、１２４５、１２４６、１２４７と結合させて、ＤＮＡ−キャリヤー・アセンブリー１２４８を形成する。それぞれの発現ベクターは対象とする遺伝子のアンチセンスＲＮＡを発現する。
【０３０８】
リポータ細胞１２４１を１２４９に示すようにキャリヤー・アセンブリー１２４８と一緒にして、ＤＮＡ−キャリヤー・アセンブリーと結合した細胞の非定位置アレイ１２５０、１２５１を形成する。細胞１２４１をＤＮＡ−キャリヤー・アセンブリー１２４８と結合させている最中、および／または結合させた後に、ＤＮＡ発現ベクター１２４４〜１２４７は細胞に逆トランスフェクションする。逆トランスフェクションの後、それぞれの発現ベクターはアンチセンスＲＮＡを発現し、発現したアンチセンスＲＮＡは、対応する対象とする遺伝子の発現を低下させ、または停止させる。１２５２および１２５３に示すように、逆トランスフェクションされた細胞をＧＦＰ発現に関して検定する。図３６の最下段には、検出可能な、または増大したＧＦＰ発現が細胞の内側の星１２５４として示されている。
【０３０９】
１２５２で測定した左側の細胞群は、ＮＦ−ｋａｐｐａＢ経路のアクチベーター１２５５で処理したアレイ１２５０から得られたものである。ほとんどの遺伝子は、ＮＦ−ｋａｐｐａＢ経路にとって必要ではないと予想されるので、ほとんどのＤＮＡキャリヤー・アセンブリーは、ＧＦＰ発現を示す細胞を含む。しかし、細胞１２５６など、ＧＦＰを発現しない細胞を含むキャリヤーは、アンチセンス・ベクター１２４７を識別し、したがって、アンチセンス・ベクター１２４７がターゲットとする陽性調節遺伝子を識別する。ＮＦ−ｋａｐｐａＢ経路の活性化または機能のためには陽性調節遺伝子の活性が必要である。
【０３１０】
ＮＦ−ｋａｐｐａＢ経路の陰性レギュレーターは、ＮＦ−ｋａｐｐａＢ経路アクチベーターで処理しなかったアレイ１２５１を使用して識別する。ほとんどの遺伝子は、ＮＦ−ｋａｐｐａＢ経路の陰性レギュレーターをコードしていないと予想されるので、図３６の右下のコード「１」、「３」および「４」を有するキャリヤーに例示されているように、逆トランスフェクションされたほとんどの細胞はＧＦＰ信号を示さない。しかし、アンチセンス発現ベクター１２４５を逆トランスフェクションした細胞１２５７では、ＧＦＰ信号１２５４が検出可能である。このことは、対応するアンチセンス・ターゲット遺伝子がＮＦ−ｋａｐｐａＢ経路の陰性レギュレーターであることを示唆している。これは、ターゲット遺伝子の発現レベルの低下によって経路が活性化されたことによるものである。
【０３１１】
この多重分析を、２つ以上の生理学的パラメーターを測定するように修正することができる。図３６の方法１２４０では、複数のターゲット遺伝子を、単一の生理学的パラメーター、ＮＦ−ｋａｐｐａＢ信号の調節におけるそれらの陽性または陰性の関与に関して検定する。あるいは、対象とする遺伝子のアンチセンス核酸またはアンチセンス発現ベクターを、異なるクラスのコード付きキャリヤーと事前結合させる。次いで、異なった細胞経路を測定する異なるリポータ細胞系統を、逆トランスフェクションおよびターゲット遺伝子発現の低下のために、それぞれのキャリヤー・クラスと結合させる。例えば、ＮＦ−ｋａｐｐａＢ、ＣＲＥＢ、Ｇｓ−ＧＰＣＲ、ＮＦＡＴ、ＥＬＫ、ＭＡＰキナーゼなどの異なる信号カスケードの活性化に応答してＧＦＰを発現するリポータ細胞系統を使用することができる。アンチセンス核酸をリポータ細胞系統に逆トランスフェクションした後、経路アクチベーターの存在する条件、または存在しない条件でのＧＦＰ発現に関して細胞系統を分析して、これらの信号経路の陽性または陰性の調節に対象とする遺伝子が関与しているかどうかを判定することができる。この方法は、複数の生理学的表示に対する単一の遺伝子の役割を測定するものである。代替実施形態では、最初に、リポータ細胞系統をコード付きキャリヤーと結合させ、次いで、逆トランフェクションではなく古典的トランスフェクションを実施する。他の実施形態では、複数のアンチセンス核酸を複数のリポータ細胞系統に逆トランスフェクションすることができる。これらの実施形態では、複数の経路に対する複数の遺伝子の役割が多重分析されると考えられる。例えば、先に述べた信号経路に対するそれぞれのリポータ細胞系統に、複数の異なるコード付きキャリヤー上の異なるアンチセンス・ベクターを逆トランスフェクションすることができる。
【０３１２】
９．１０ センス核酸のトランスフェクション
他の多重細胞トランスフェクション検定では、細胞集団（または集団内の個々の細胞）についての情報を、センス発現ベクターまたは核酸の逆または古典的トランスフェクションによって決定することができる。センス発現ベクターまたは核酸は、対象とするタンパク質、特にレギュレーターの野生型、突然変異体または融合誘導体をコードすることができる。センス核酸（またはセンス・コード核酸）のこれらのトランスフェクションを使用して、レギュレーターに応答しない細胞を識別することができる。細胞は、さまざまな理由から応答しないことがあり、これは一般に、レギュレーターのターゲットの構造（すなわち突然変異、修飾など）または発現レベルの変化による。例えば、細胞は、ターゲットの非結合誘導体を発現することができ、または、ターゲットがタンパク質であるときにターゲットを過剰発現させることができる。同様に、ターゲットが核酸であるとき、この核酸は増幅または突然変異することができ、そのため、トランスフェクションされたレギュレーターの過剰発現はほとんど効果を持たない。
【０３１３】
実施例１０ 細胞分析物質のコード付きアレイを使用した多重細胞分析
図３７〜３９に示すこの実施例は、局所捕獲物質などの細胞分析物質と事前結合させたコード付きキャリヤーのアレイを使用した生体系の多重分析方法および構成を説明する。
【０３１４】
胚発生の間に細胞は、成熟した生体に存在する多くの細胞型に分化する。これらの細胞型は非常に異なる、しかししばしば定型の表現型を示す。これらの表現型の範囲は、遺伝子発現における単純な相違から、複雑な形態的、構造的相違まで多岐にわたる。したがって、個々の細胞を識別するため、および識別された細胞の生理を理解するために、しばしば複数の測定が使用される。多くの場合、研究者は、細胞を染色して、複数のマーカーが対象とする細胞を識別し、細胞の特性を検定するようにしなければならない。残念なことに、この染色法にはいくつかの欠点があり、特に、細胞集団内の対象とする細胞の存在量が低い場合、または対象とする細胞からのデータ信号が弱い場合に顕著に現れる。
【０３１５】
対象とする細胞の存在量が低いことを克服する１つの方法は、対象とする細胞に特異的な表面タンパク質によって、混合された細胞集団から対象とする細胞を精製する方法である。この精製によって細胞の表面タンパク質を染色する必要を排除することができる。この精製はさらに、比較的に均一な濃縮された細胞集団を提供する働きをし、これによってデータ信号をより強くすることができる。しかし、複数の細胞型の生理に対する多くの化合物の効果を評価しようとするとき、この精製戦略は一般に非実際的である。
【０３１６】
胸腺細胞からのサイトカイン発現の測定は、細胞集団に低い存在量で存在している対象とする細胞の研究にまつわる問題を明確に示している。例えば、ある研究者が、ＣＤ−４、ＣＤ−８胸腺細胞などの複数の細胞型による、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）などの複数のサイトカインの分泌の検定に関心を持ったとする。この場合、それぞれのサイトカインの信号はしばしば非常に弱く、そのため、良好なデータを得るためには特別なプロトコルが必要となるため、２重染色は一般に使用されないであだろう。したがって研究者は例えば、まず最初に、個々の細胞型、ＣＤ−４およびＣＤ−８をそれぞれ、例えば固体支持体に付着させた細胞型特異抗体を使用して精製し、次いで、それぞれの細胞プールを複数の管に分割し、例えば特定のサイトカイン抗体を用いてそれらのサイトカイン分泌を検定する必要がある。それぞれの細胞型を得るために時間とコストのかかる別個の細胞精製段階が必要であることに加えて、この精製法法ではさらに、精製された細胞集団から検出できるサイトカインの数が限定される。一般に、それぞれの管の中の細胞では、光学的に区別可能な限られた数のサイトカイン抗体しか測定できず、その数は一般に最大４または５個でしかない。
【０３１７】
サイトカイン産生の測定に関連した問題は、複雑な細胞表現型および表現型と薬物候補との間の相互関係を測定し、理解する際の問題を代表している。細胞表現型を測定し、変更する分析ツールは絶えず開発されている。これらの分析ツールは、特異抗体、プローブとしての遺伝子配列、トランスフェクションのための発現およびレポーター・ベクター、ならびに化合物ライブラリーを含む。
【０３１８】
非常に多くの分析ツールが使用可能であることによって、これらのツールを単独で、または組合せで効果的に使用する作業がますます困難になっている。これらの分析ツールをより効率的に使用する努力は一般に、サンプルを操作し測定する速度に注がれた。例えば、サンプルを保持する超高密度マイクロプレートが、サンプルのより効率的なマイクロフルイディック操作、およびより迅速なサンプル測定とともに開発された。しかし、細胞型と分析ツールの組合せがそれぞれ別々のマイクロプレート・ウェルに入れられるので、発見または理解目標を満たすだけの十分な数の細胞／ツールを分析するのに、途方もなく多くのマイクロプレートおよびマイクロプレート操作が必要となる可能性がある。
【０３１９】
本発明は、局所捕獲物質などの細胞分析物質と事前結合させたコード付きキャリヤー・アレイを使用した生体系の多重分析方法および構成を提供する。コード付きキャリヤーは、検出および区別が可能なコードを有するキャリヤーまたはキャリヤー・クラスである。コード付きキャリヤーを、１種または数種の細胞分析物質に曝露し、その細胞分析物質と事前結合させる。これを、事前結合させた他のコード付きキャリヤーと一緒にして、定位置および／または非定位置アレイを作製することができる。それぞれのキャリヤー上の細胞分析物質は、連結されたコードに基づいて識別することができる。さらに、それぞれのキャリヤー上の細胞分析物質によって、キャリヤーに実施する分析の態様を予め決定することもできる。事前結合の後、これらの分析アレイを、細胞集団または細胞集団のサブセットと結合させて、コードおよび細胞分析物質に細胞集団を連結させることができる。続いて、細胞集団の特性を測定し、コードを読み取って、これによってキャリヤーごとに細胞分析物質を特性に連結させる。
【０３２０】
それぞれのコード付きキャリヤー上の細胞分析物質は、細胞および／または細胞形質成分の分析を容易にし、または直接に促進する。細胞分析物質は機能的にはっきり異なっていることがある。例えば、細胞分析物質は、細胞集団の内部の物質、細胞集団の表面の物質、および／または細胞集団から放出された物質のレベルおよび／または位置の測定を容易にすることができる。あるいはまたは加えて、細胞分析物質は候補リガンド、モジュレーターであることができ、かつ／または外来性遺伝物質を細胞集団の中へ導入することができる。あるいはまたは加えて、細胞分析物質は、結合した細胞集団を選択し、かつ／または識別することができる。機能的に異なった２つ以上の細胞分析物質を使用すると、２つ以上のパラメーターをアレイ内のキャリヤー間で変化させることができる。例えば、２つ以上のパラメーターには、細胞集団に関係した生体物質、細胞集団にトランスフェクションした物質、細胞集団に曝露された候補モジュレーター、および／またはキャリヤーと結合した細胞集団のレベルおよび／または位置が含まれる。この事前結合法は、単純なまたは複雑な細胞混合物中の異なった細胞型を、複雑な、または長時間の細胞精製および細胞操作を使用せずに、精製し、特性づけ、トランスフェクションし、かつ／またはさまざまな薬物スクリーニングで試験することを可能にする。さらに、この方法は、複数の細胞表現型をそれぞれのキャリヤー上で問い合わせることを可能にする。
【０３２１】
１０．１ 細胞分析物質
事前結合に適した細胞分析物質は一般に、細胞をコード付きキャリヤーと結合させる前にコード付きキャリヤーと結合させることができ、かつ、分析のために細胞を補強することができ、あるいは、細胞の特性に影響を及ぼしかつ／または細胞の特性を検出することができる任意の細胞分析物質を含む。適当な細胞分析物質は、上記セクションＩＶで説明したモジュレーター、リガンド／レセプター、トランスフェクション物質、細胞セレクター、局所捕獲物質、細胞および／または標識を含む任意のカテゴリーから選択することができる。したがって、事前結合に使用する細胞分析物質は、コード付きキャリヤーに結合する細胞の型を選択し、細胞をキャリヤーと結合させた後に細胞の表現型に影響を及ぼし、かつ／またはキャリヤー上の細胞の特性を測定することを容易にすることができる。
【０３２２】
１０．２ コード付きキャリヤーと細胞分析物質の事前結合
この例では、事前結合によって、１種または数種の細胞分析物質をコード付きキャリヤーに連結させる。したがって事前結合は、キャリヤー上のコードが、連結された細胞分析物質についてのコード化情報を標示することを可能にする。
【０３２３】
事前結合では、安定な連結と不安定な連結との間のバランスをとる必要がある場合がある。細胞分析物質とコード付きキャリヤーとの間の連結は、その後の細胞との結合の間、細胞分析物質の一部をキャリヤーに連結された状態に保持できる十分に安定なものでなければならない。しかし、この連結を、トランスフェクション物質、内在化されたモジュレーターなどの細胞分析物質が放出されて、キャリヤーに付着した細胞によって取り込まれるように十分に一時的なものとすることができる。不安定な一時的な連結は、ゲル形成物質、例えばゼラチンによって形成されたゲルなどのゲルまたはキャリヤー・マトリックスに細胞分析物質を取り込ませることによって媒介することができる。
【０３２４】
事前結合は一般に、１種または数種の細胞分析物質を、１つまたは複数の既知の、または決定可能なコードを有するコード付きキャリヤー集団と混合し、または他の方法でコード付きキャリヤー集団に曝露することによって実施される。細胞分析物質とキャリヤーの連結は、乾燥、温度変化、光、放射線、化学反応、またはゲル形成物質などの結合プロモーターを用いた処理を含む適当な任意の処理によって容易にすることができる。安定な連結または一時的な連結を達成した後、連結された異なる細胞分析物質（および異なるコード）を有するキャリヤーを、管、マイクロプレート・ウェルなどの１つの容器の中で一緒にして、細胞分析物質の非定位置アレイまたはライブラリーを作製することができる。
【０３２５】
トランスフェクション物質をキャリヤーと事前結合させて、キャリヤーがある細胞型または細胞集団と結合しているときでないとトランスフェクション物質を利用できないようにすることができる。トランスフェクション物質の放出または曝露が、後にキャリヤーと結合させる細胞型または細胞集団に依存することがある。例えば、トランスフェクション物質は、特定の酵素、開裂活性、または特定の細胞によって分泌される相互作用破壊物質の影響を受けやすい連結を介してキャリヤーに付着させることができる。この連結は、ペプチド、特異核酸配列、またはグリコシド結合などによる連結、あるいはレセプター／リガンド対などの非共有結合性相互作用による連結とすることができる。このように、連結を破壊する適当な「活性化」または放出物質を発現する特定の細胞によってはじめて、トランスフェクション物質がトランスフェクション対して使用可能となる（放出される）ようにすることができる。
【０３２６】
事前結合には例えば、２種類以上の機能的に異なった（または同様の）細胞分析物質の組合せにコード付きキャリヤーを連結させることが含まれる。例えば、コード付きキャリヤーは、トランスフェクション物質と細胞セレクターの組合せ、細胞セレクターと局所捕獲物質の組合せ、または２種類以上の細胞分析物質から成る他の適当な組合せに連結させることができる。複数の細胞分析物質とキャリヤーの事前結合は、逐次的に、かつ／または同時に実施することができる。それぞれのキャリヤー上のコードを使用して、キャリヤーに連結された細胞分析物質の組合せを識別することができる。
【０３２７】
事前結合の例示的な方法、および細胞分析物質によって標示することができるコード化情報についての詳細はそれぞれ、セクションＶおよびＶＩＩに記載されている。
【０３２８】
１０．３ コード付き細胞分析物質アレイと細胞の結合
コード付きキャリヤーを細胞分析物質と事前結合させた後に、キャリヤーを細胞と結合させることができる。結合は、細胞がキャリヤーに付着し、かつ／またはキャリヤーに連結された細胞分析物質と細胞が相互作用することを可能にする任意の機構を使用して実施することができる。細胞は、コード付きキャリヤーと直接に結合させ、かつ／またはキャリヤーに連結された細胞セレクター、細胞付着プロモーターなどの作用物質を使用することができる。一般的または特異的な細胞付着プロモーターには例えば、抗体、ゼラチン、ポリリジン、フィブロネクチンおよび他の細胞外マトリックス・タンパク質が含まれる。結合によって１つまたは複数の細胞をコード付きキャリヤーと連結させて、キャリヤーと結合した細胞集団を提供することができる。細胞集団は、患者サンプル由来の細胞および細胞混合物を含む、任意の源または源混合物によって提供することができる。
【０３２９】
細胞分析物質との事前結合および／または細胞との結合の後に、コード付きキャリヤーを混合して、非定位置アレイを形成することができる。それぞれのケースで、それぞれのコード付きキャリヤーに連結されたコードを使用して、結合した細胞分析物質および／または細胞集団の態様を識別することができる。
【０３３０】
例示的な細胞および細胞結合手順は、上記セクションＩＩＩおよびＶに詳細に記載されている。
【０３３１】
１０．４ コードの読取りおよび細胞特性の測定
細胞を、細胞分析物質のコード付きアレイと結合させた後、細胞集団の特性を測定し、キャリヤーのコードを読み取ることができる。例示的な細胞特性、およびコードを読み取り、細胞特性を測定する例示的な方法は、セクションＸおよびＸＩ、ならびに詳細な説明の項の他の場所に詳細に記載されている。
【０３３２】
１０．５ 細胞セレクター／局所捕獲物質組合せアレイ
図３７に、非定位置アレイを使用して、それぞれのコード付きキャリヤーを、機能的に異なった２種類の細胞分析物質、細胞セレクターおよび局所捕獲物質と事前結合させる方法１２６０を示す。この方法は、サイトカイン検定の前の細胞の逐次精製を排除し、１回の反応で５０種以上ものサイトカインを分析する能力を提供する。
【０３３３】
コード付きキャリヤー１２６２を細胞セレクター抗体１２６４、１２６６と事前結合させる。抗体１２６４、１２６６はそれぞれ、ある細胞型と、その細胞表面マーカー、ＣＤ−４またはＣＤ−８によって結合する抗体である。さらに、コード付きキャリヤーを、分析対象のサイトカインＩＦＮ−γまたはＩＬ−２をそれぞれ認識する局所捕獲物質、抗体１２６８、１２７０と事前結合させる。キャリヤー・アセンブリー１２７２はそれぞれ、細胞セレクターと局所捕獲物質の可能な４つの組合せのうちの１つを支持している。１２７４に示すように、これらのキャリヤー・アセンブリーを一緒にして、キャリヤー・アセンブリーの非定位置アレイ１２７６を提供する。
【０３３４】
この検定では、血液中に見られるものなどの異なったＴ細胞集団を含み、ＣＤ−４胸腺細胞１２８０およびＣＤ−８胸腺細胞１２８２を含む細胞サンプル１２７８を使用する。この細胞サンプルを１２８４に示すようにアレイ中のキャリヤー・アセンブリーと一緒にする。１２８６に示すように、ＣＤ−４またはＣＤ−８を発現する細胞だけが、キャリヤー上のそれらのそれぞれの抗体と結合する。したがって、ＣＤ−４細胞は、コード「１」または「３」を有するキャリヤーによって選択され、ＣＤ−８細胞は、コード「２」または「４」を有するキャリヤーによって選択される。この選択は実質的に、特定のそれぞれの細胞型を細胞混合物から「精製」する働きをする。
【０３３５】
コード付きキャリヤーに付着している間に、細胞は、その生理が指令するサイトカインを分泌し続ける。例えば、ＣＤ−４胸腺細胞はＩＬ−２を分泌し、ＣＤ−８胸腺細胞はＩＬ−２およびＩＦＮ−γを分泌する。選択された細胞が、細胞が分泌しているサイトカインに対する抗体を含むコード付きキャリヤー上にある場合、分泌されたサイトカインは、所望のインキュベーション期間の間にコード付きキャリヤーの対応する抗体によって捕獲される。分泌されたサイトカインの検出は、キャリヤー・アセンブリー上に固定化された捕獲抗体が認識するものとは異なるサイトカイン上のエピトープを認識する２次抗体を追加することによって実施する。この２次抗体は、蛍光団を用いて直接に標識し、または蛍光標識した３次抗体によって検出することができる。
【０３３６】
それぞれのサイトカインの分泌は一般に、一対の特異捕獲抗体／検出抗体対を用いて測定される。捕獲されたそれぞれのサイトカインは、捕獲されたサイトカイン上の露出したエピトープと結合する２次検出抗サイトカイン抗体を使用して検出する。したがって、それぞれの事前結合（捕獲）抗体／検出抗サイトカイン抗体対の少なくともいくつかの抗体が、サイトカイン上の異なったエピトープと結合しなければならない。さらに、事前結合（捕獲）抗体と検出抗サイトカイン抗体は区別可能でなければならない。例えば、事前結合抗体および検出抗体は、検出抗体の選択的２次標識化を可能にするために異なった種から得ることができ、または検出可能なタグを検出抗体に付けておくことができる。
【０３３７】
１２８８に示すように、それぞれのキャリヤー上のコードを読み取り、それぞれのキャリヤーに関連したサイトカイン信号を測定すれば、ＣＤ−４細胞とＣＤ−８細胞のどちらがサイトカインＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−２を分泌しているかを判定することができる。サイトカイン信号１２９０は、コード「２」、「３」および「４」を有するキャリヤー上で検出可能であり、このことは、ＣＤ−４細胞はＩＬ−２を産生し（ＩＦＮ−γは産生しない）、ＣＤ−８細胞はＩＬ−２およびＩＦＮ−γを産生することを示している。
【０３３８】
選択された細胞を、他の細胞内または細胞外細胞マーカーに対して対比染色すると、この方法の有用性を高めることができる。例えば、癌または他の病気マーカーに関して細胞をさらに染色することができる。これを上記の例に適用すると、どの細胞型がどのサイトカインを分泌しているのかだけでなく、それらの細胞が癌性であったかどうかも突き止めることができよう。
【０３３９】
図３７に示した方法は、細胞表面マーカー、細胞外分子に対する応答、または細胞外分子を識別する任意の検定に適用することができる。さらに、この方法は、２種類の細胞分析物質／アイテム／分子のコード付きキャリヤーへの付着だけに限定されない。
【０３４０】
１０．６ モジュレーター／局所捕獲物質組合せアレイ
図３８に、事前結合させたコード付きキャリヤーを使用して、サイトカイン産生モジュレーターとサイトカイン刺激因子の間の機能上の相互作用を測定する方法１３３０を示す。方法１３３０では、それぞれの型のコード付きキャリヤー１３３２を、２成分から成る異なる細胞分析物質の組合せと事前結合させる。第１の成分は、キャリヤーに連結されたサイトカイン産生モジュレーター１３３４、１３３６、１３３８である。第２の成分は、サイトカイン１３４０、１３４２の局所捕獲抗体である。
【０３４１】
非定位置アレイを以下のように形成し、処理する。それぞれのキャリヤー型を適当な細胞分析物質の組合せと事前結合させて、キャリヤー・アセンブリー１３４４を作製する。次いで、１３４６に示すように、これらのキャリヤー・アセンブリーを一緒にし、別々の容器に等分して、同種の非定位置アレイまたは同胞アレイ１３４８を作製する。あるいは、事前結合の後に、キャリヤー・アセンブリーを直接に等分して他のキャリヤー・アセンブリーと一緒にし、同胞アレイを形成することもできる。１３５２に示すように、対象とする細胞集団１３５０を同胞アレイと結合させる。キャリヤーと細胞の結合は、キャリヤーを等分／分配して別個の同胞アレイ１３４８にする前または後に実施することができる。次いで、それぞれの同胞アレイを活性化リガンド／サイトカイン刺激因子１３５４、１３５６、１３５８で処理する。
【０３４２】
それぞれの刺激因子とともにアレイ１３４８を適当な時間インキュベーションした後に、１３６０に示すようにサイトカイン産生を測定する。図３７の方法１２６０で概説したように、第２の検出抗体を使用して、捕獲されたサイトカイン上の露出したエピトープと結合させ、検出する。検出されたサイトカイン信号１３６２が２つの星で示されており、これは、刺激因子１３５６によって規定された調節されていないサイトカイン・レベルを指示する。
【０３４３】
対象とする結果例を最下段に示す。結果はいずれも、サイトカイン１３６４、１３６６の産生を促進する刺激因子１３５６で処理した細胞からのものである。コード「１」を有するキャリヤー・アセンブリーに示されているように、細胞のサイトカイン１３６４の産生は、モジュレーター１３３４の事前結合の影響を受けておらず、サイトカイン１３６４の調節されていない、刺激されたレベル（２つ星）が測定されている。対照的に、コード「３」を有するキャリヤー・アセンブリーでは、サイトカイン１３６４の信号が検出されず、これは、モジュレーター１３３６が刺激因子１３５６のアンタゴニストであることを指示している。最後に、コード「６」を有するキャリヤー・アセンブリーでサイトカイン１３６６の信号が増大（４つ星）しており、これは、モジュレーター１３３８がサイトカイン１３６６の産生を増強することを指示している。
【０３４４】
１０．７ モジュレーター／トランスフェクション物質組合せアレイ
図３９の方法１３９０に、事前結合させたコード付きキャリヤーの使用を使用して、逆トランスフェクションさせた発現ベクターから発現されたレセプターの活性を調節する潜在的なリガンド／モジュレーターの能力を測定する方法を示す。この例では、プラスミドまたは他のベクターの形態のＤＮＡをコード付きキャリヤーと事前結合させて、逆トランスフェクションを促進し、トランスフェクションを実施した同じキャリヤー上の細胞が発現する異なるレセプターの問い合わせを可能にする。レセプターによるシグナリングは、やはり逆トランスフェクションによって導入されるレポーター遺伝子によってレポートされる。
【０３４５】
この例では、それぞれの型のコード付きキャリヤーを、２成分から成る異なった細胞分析物質の組合せと事前結合させる。第１の成分は、それぞれのコード付きキャリヤー１３９８に連結させたモジュレーター１３９２、１３９４、１３９６である。第２の成分は、トランスフェクション物質、すなわち（ｉ）対象とする既知のまたは候補レセプター・タンパク質をコードする発現ベクターと、（ｉｉ）レセプター活性を測定するレポーター遺伝子との混合物である。異なったトランスフェクション物質混合物１４００、１４０２、１４０４をそれぞれコード付きキャリヤー型と事前結合させる。その結果得られる事前結合したキャリヤー・アセンブリー１４０６は、モジュレーターとトランスフェクション物質の全９通りの組合せを含む。
【０３４６】
方法１３９０のその後の段階には、アレイの形成、細胞結合、逆トランスフェクション、レセプター調節およびレポーター遺伝子測定が含まれる。１４０８に示すように、これらのキャリヤー・アセンブリー１４０６を一緒にして、非定位置アレイ１４１０を作製する。１４１４に示すように、細胞集団１４１２をアレイ１４１０と一緒にして、細胞集団をキャリヤー・アセンブリーと結合させる。次いで、活性化特異レセプター・リガンド１４１６の存在下で、細胞−アレイ混合物を適当な時間、インキュベートする。このインキュベーションによって、それぞれのキャリヤーと結合した細胞内へのＤＮＡ１４００、１４０２、１４０４の逆トランスフェクション、および逆トランスフェクションしたＤＮＡからのレセプター発現を起こさせる。その結果、レセプターは、特異リガンド１４１６によって活性化され、かつ／または事前結合させたモジュレーター１３９２、１３９４、１３９６によって調節される。逆トランスフェクションしたレポーターＤＮＡからのレポーター遺伝子発現は、事前結合させたそれぞれのモジュレーターによるリガンド−レセプター調節の程度に依存する。この例では、逆トランスフェクションされた細胞からのレポーター遺伝子発現が信号星１４１８によって表され、２つ星は、調節されていないリガンド刺激レポーターの発現のレベルを指示する。
【０３４７】
１４２０に示すようにレポーター遺伝子発現を測定しコードを読み取ることによって得られたいくつかの結果例を図３９の最下段に示す。コード「１」を有するコード付きキャリヤー・アセンブリーは２つの信号星１４１８を示し、これは、リガンド１４１６による発現レセプターの活性化によって媒介された正常なレポーター遺伝子活性を指示している。したがってモジュレーター１３９２は測定可能な効果を持たない。対照的に、コード「５」を有するキャリヤー・アセンブリーは、検出可能なレポーター遺伝子活性を示さず、これは、モジュレーター１３９４のアンタゴニスト作用１４２２を指示している。最後に、コード「９」を有するキャリヤー・アセンブリーは、トランスフェクションしたレポーター遺伝子の活性がモジュレーター１３９６の活性によって増強されたことを示し、このことは、モジュレーター１３９６が、ＤＮＡ１４０４がコードするレセプターに対してアゴニスト作用１４２４を有することを示唆している。
【０３４８】
実施例１１ コード付きキャリヤーを使用したライブラリー・スクリーニング・システム
図４０に示すこの実施例は、コード付きキャリヤーと結合させたライブラリー・メンバー・プールを含む部分定位置または非定位置アレイを使用してライブラリーをスクリーニングするシステムを説明する。
【０３４９】
関連する生体物質の集合はしばしばライブラリーとして構築される。例えば、発現タンパク質、レセプター、リガンド、化合物および遺伝子のライブラリーは関連する分子の集合を提供し、そのなかから有用な分子を識別し、かつ／または分離することができる。特定のパートナー分子に結合する能力、特定の生体効果を媒介する能力など、所望の特性を有する分子を識別することができる。さらなる試験および分析を可能にするために分子を分離することができる。例えば、ライブラリー・スクリーニングを使用して、化合物ライブラリーの薬物スクリーニングにおいてリード化合物を識別し、分離することができる。リード化合物は、例えば薬物候補として動物実験または臨床試験に直接に適している可能性がある。リード化合物はさらに、第２のライブラリー・スクリーニングで使用する、より特異的な第２の化合物ライブラリーを選択し、または開発するモデルとして働くことができる。
【０３５０】
ほとんどのスクリーニングは特異的な、したがってまれな特性を使用してライブラリー・メンバーを識別しようとする。残念なことに、特定の特性を使用してライブラリー・メンバーが識別される確率は一般に、スクリーニングする候補または異なるライブラリー・メンバーの数に比例する。したがって、多くの候補ライブラリー・メンバーを試験する複雑度（ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ）の高いライブラリー・スクリーニングは一般に、少数のライブラリー・メンバーしか試験しない複雑度の低いライブラリー・スクリーニングよりも、有用なライブラリー・メンバーを識別する可能性が高い。
【０３５１】
その重要性にもかかわらず、複雑度の高いライブラリー・スクリーニングの複雑度はしばしば、実際にスクリーニングできるライブラリー・メンバーの数によって制限される。例えば、既存の化合物ライブラリーは数百万のメンバーを有し、組合せ戦略によって生み出される合成ライブラリーは１０億以上のメンバーを有することができる。このような高複雑度ライブラリーのメンバーをそれぞれ個別に試験するスクリーニングは時間とコストがかかり、多くの場合に非実際的であろう。
【０３５２】
このようなライブラリー・スクリーニングにかかる時間およびコストを低減する努力は、試験システムの中でライブラリー・メンバーを混合しプールとして分析する「ライブラリー・プール」の使用に注がれてきた。しかし、プールはサイズごとに異なった利点および欠点があるため、ライブラリー・プールの使用には、ライブラリー・プールのサイズを選択する方法など、それ自体に困難な問題がある。小さなプールは、プールのメンバーが生成する陽性信号を検出するのに十分に高い信号対雑音比を提供し、陽性のプールから個々の陽性メンバーを識別するのに追加のスクリーニングをほとんど必要としない。しかし、陽性プールを識別するために１次スクリーニングで多数の小さなライブラリー・プールをスクリーニングする必要がある。対照的に、大きなプールは、少数のライブラリー・プールをスクリーニングして、より多くのライブラリー・メンバーの中から探索することができる。しかし、大きな陽性プールから単一のライブラリー・メンバーを識別するために追加のいくつかのスクリーニングが必要となることがあり、大きなプールの信号対雑音比は小さすぎて、陽性信号を確実に識別できない可能性がある。したがって、小さなプールの利点と大きなプールの利点を結合したライブラリー・スクリーニング法が有用であろう。
【０３５３】
本発明は、コード付きキャリヤーと結合させたライブラリー・メンバー・プールを含む、ライブラリーのスクリーニング方法および構成を提供する。それぞれのライブラリー・プールのメンバーを混合物として結合させ、メンバーがキャリヤー上の重なり合った領域を占めるようにし、または、メンバーが、キャリヤー上に割り当てられた異なった空間位置をとることができる。いくつかの実施形態では、キャリヤーおよびそれと結合したライブラリー・プールを、コードとキャリヤーの位置の組合せによってプールを識別することができる部分定位置アレイとして配置することができる。部分定位置アレイは、複数の異なるコード付きキャリヤーおよびそれと結合したライブラリー・プールがアレイのそれぞれの位置で互いに対してランダムに配置された、非定位置態様を含むことができる。さらに、キャリヤーのコードと位置の組合せがライブラリー・メンバー・プールを識別する場合には、複数の位置で１つのコードを使用することができる。他の実施形態では、コード付きキャリヤーの非定位置アレイを使用して、ライブラリー・メンバー・プールと結合させたそれぞれのキャリヤーを用いてライブラリーをスクリーニングすることができる。
【０３５４】
部分定位置アレイまたは非定位置アレイをターゲットととの相互作用に関して試験して、陽性信号キャリヤーを見つける。キャリヤー上のコードを読み取り、部分定位置アレイの場合にはコードをアレイ内のキャリヤーの位置と組み合わせて、ターゲットと相互作用する陽性ライブラリー・プールを識別する。陽性ライブラリー・プールのサブプールまたは個々のメンバーをスクリーニングする追加の１つまたは複数のスクリーニングを実施して、ターゲットと相互作用する特定のライブラリー・メンバーを識別することができる。
【０３５５】
本発明は、他のライブラリー・スクリーニング法に優る少なくともいくつかの利点を潜在的に提供する。第１に、それぞれのライブラリー・メンバー・プールをキャリヤーと結合させ、それによってライブラリー・プール・メンバーが提供する任意の相互作用およびその結果生じる陽性信号をキャリヤーの近傍に限定することができる。この近接効果によってより大きな信号対雑音比が得られ、したがって、アレイ内の単一の位置でより多くのライブラリー・メンバーをスクリーニングすることができる。第２に、陽性ライブラリー・メンバー・プールを１つの位置の複数のプールの中から識別することができるので、陽性信号は分析を、比較的に少数のライブラリー・メンバーに限定する。したがって、追加のプール・スクリーニングのサイズおよび程度が低減される。最後に、１つのキャリヤー・コード・セットを、アレイ内の異なる位置で繰り返し使用することができ、これによって、製造する必要がある異なるコードを有するキャリヤーの数を減らすことができる。これらの利点の結果、本発明は、複雑度の高いライブラリーをスクリーニングするのに必要な時間およびコストをかなり減らすことができる。
【０３５６】
１１．１ ライブラリーおよびライブラリー・プール
本発明は、ライブラリーを配列しスクリーニングする方法を提供する。ライブラリーは一般に、共通の特性によって関係づけられた２つ以上の異なるメンバーから成る、分子、ウィルス、細胞および／または組織などの集合体を含む。したがって、ライブラリーは、２つ以上の異なる化合物、レセプター、リガンド、薬物、抗体、ペプチド、タンパク質、核酸、さまざまなタンパク質を発現するファージ、ウィルス、細菌または真核細胞などの集合体を含むことができる。ライブラリーは、ｃＤＮＡライブラリー、組合せ合成ライブラリーなどのように酵素経路または合成経路によって作り出し、細菌ライブラリーなどのように天然源から構築し、あるいは２つ以上の合成および／または天然源からの混合集合体とすることができる。追加の例示的なライブラリーは上記セクションＩＸに含まれている。
【０３５７】
ライブラリー・プールは一般に、ライブラリーの１つ、またはより一般的には２つ以上のメンバーから成るサブセットを含む。例えばライブラリーのメンバーが別々に維持されるとき、プールは、ライブラリーからの特定の数のメンバーによって定義することができ、ライブラリーの既知のサブセットを含むことができる。例えば、定義された１０５のメンバーを有する化学ライブラリーは、それぞれちょうど１００のメンバーから成る１，０００のプールを提供することができる。１００のそれぞれのメンバーは既知である。あるいは、プールは、ライブラリーのおおよその割合を表すことができ、例えばライブラリーがライブラリー・メンバーの混合集団として維持されるとき、プールは、ライブラリー・メンバーの識別されないサブセットを含むことができる。この場合、その混合集団をランダムにサンプリングして、ライブラリー・プールを提供することができる。例えば、ファージ・ディスプレイ・ライブラリーは混合物中に、約１０９ファージ／ｍＬタイターで約１０７のメンバーを含むことができる。部分標本１ｎＬは、ライブラリーをランダムにサンプリングして、それぞれ約１，０００メンバーから成るライブラリー・プールを生み出す。
【０３５８】
１１．２ ライブラリー・プールとコード付きキャリヤーの結合
ライブラリー・プールをコード付きキャリヤーと結合させて、コードおよび任意選択でキャリヤーの位置に基づいて識別可能なコード付きライブラリー・プールを提供する。コード付きキャリヤーおよびそれと結合したライブラリー・プールをプール−キャリヤー・アセンブリーと呼ぶ。
【０３５９】
結合は一般に、ライブラリー・プールのメンバーをコード付きキャリヤーと空間的に近接した状態に維持する任意の結合機構を含む。ライブラリー・プールとキャリヤーは、共有結合性連結または非共有結合性相互作用によって結合させることができる。さらに、ライブラリー・プールとキャリヤーの間の相互作用は直接的な相互作用でも、または間接的な相互作用でもよい。
【０３６０】
ライブラリー・プールのメンバーと対応するコード付きキャリヤーとは、適当な任意の組合せで結合させることができる。例えば、ライブラリー・プールのメンバーを前もって混合しておき、次いでキャリヤーと同時に結合させることできる。あるいは、ライブラリー・プールのメンバーまたは一群のメンバー（すなわちサブプール ）を、キャリヤーと逐次的に結合させることもできる。メンバーまたはサブプールは、キャリヤーの実質的に重なり合った領域と結合して、キャリヤー上に、非定位置混合ライブラリー・プールを形成することができる。あるいは、メンバーまたはサブプールは、キャリヤー上の異なった位置を占めることができる。異なった位置は、キャリヤー上のメンバーまたはサブプールを識別するキャリヤー内の位置識別を提供する。
【０３６１】
例示的なキャリヤー、コード、ならびにライブラリー結合方法はそれぞれ、上記セクションＩ、ＩＩおよびＶに含まれている。
【０３６２】
１１．３ 部分定位置および非定位置ライブラリー・アレイ
ライブラリー・プールと結合したコード付きキャリヤーを分配して、ライブラリー・スクリーニング用のライブラリー・アレイを提供することができる。ライブラリー・アレイは、部分定位置または非定位置アレイとすることができる。
【０３６３】
部分定位置アレイは一般に、結合したキャリヤーの位置とコードの組合せに基づいてそれぞれのライブラリー・プールを識別することができるアレイを含む。部分定位置アレイでは、キャリヤーのコードまたは位置を、別のライブラリー・プールを担持する他のキャリヤーと共用することができる。具体的には、アレイ内の２か所以上の位置で同じコードを使用することができ、２型以上のコード付きキャリヤーをアレイ内の同じ位置に配置することができる。ただし、コードと位置の組合せが、ライブラリー・アレイ内の１つのライブラリー・プールに固有の識別子を提供する。コードおよび位置に従ってライブラリー・プールを識別することによって、有限のキャリヤー・コード・セットを使用して、任意のサイズのライブラリーを担持し、スクリーニングすることができる。部分定位置アレイを形成するためには、一般にライブラリー・プールと結合させた後に、コード付きキャリヤーをアレイ内のそれぞれの位置に配置する。アレイは、マイクロプレートなどの固定位置フォーマットの容器、あるいはマークまたは標識によって個別に識別可能な位置に拘束されない容器によって提供することができる。
【０３６４】
非定位置アレイは一般に、それぞれのライブラリー・プールを、定位置アレイの場合のようにキャリヤーの位置を考慮せずに、結合したキャリヤーのコードだけに基づいて識別することができるアレイを含み、そのためキャリヤーの混合物中でキャリヤーが不定または任意の位置をとることができる。例示的な定位置および非定位置アレイは上記セクションＶＩＩＩに詳細に説明されている。
【０３６５】
１１．４． ターゲット相互作用の試験
ライブラリー・プールの部分定位置または非定位置ライブラリー・アレイをターゲット相互作用に関して試験して、ターゲットと相互作用するライブラリー・プールを識別することができる。陽性ライブラリー・プールは、ライブラリー・スクリーニングにおいて陽性の相互作用信号を提供するライブラリー・プールであり、陽性信号を決定する１つまたは複数のライブラリー・メンバーを含むことができる。
【０３６６】
試験は一般に、相互作用が起こる十分な時間、ターゲットをライブラリー・プールと混合し、次いで、相互作用の存在、程度および／または性質を測定することを含む。
【０３６７】
ターゲットには一般に、分子、分子複合体、ウィルス、細胞、組織など、それに対する特異的な相互作用パートナーが望まれる対象とする物質が含まれる。したがってターゲットには例えば、１種または数種の化合物、レセプター、リガンド、薬物、抗体、ペプチド、タンパク質、核酸、ファージ、ウィルス、細菌または真核細胞などが含まれる。後に示すように、複数のターゲットから成る混合物をターゲットとして使用して、相互作用しているライブラリー・プールに関して複数のそれぞれのターゲットを同時にスクリーニングすることができる。
【０３６８】
相互作用は一般に、ライブラリー・メンバー・プールをターゲットに曝露することによって媒介される測定可能な任意の効果を含む。このような相互作用は一般に、プールの１つまたは複数のメンバーにターゲットが直接にまたは間接的に作用することによって起こり、あるいはその逆にプールのメンバーがターゲットに作用することによって起こる。測定可能な効果には例えば、プールのメンバーとターゲットとの間の結合および／または他の物理的な相互作用が含まれる。この例では一般に、結合が、相互作用の試験中に検出可能な十分に長く続くターゲットとライブラリー・メンバーの間の任意の相互作用を含む。測定可能な効果とは例えば、例えば光学的に検出可能な標識などの検出可能なマーカーでターゲットが標識されているときに測定可能なターゲットとライブラリー・メンバーの対合である。あるいは、測定可能な効果が、ライブラリー・メンバーに対するターゲットの作用、またはターゲットに対するライブラリー・メンバーの作用によって誘発される表現型応答である。表現型応答には一般に、生物学的実体から誘発される任意の機能応答が含まれる。表現型応答の例には、レポーター遺伝子活性の変化；増殖；分化；アポトーシス；壊死；細胞内小器官の数、位置または形状の変化；物質分泌の変化；物質輸送の変化；細胞周期の変更または停止；遺伝子発現の変化；タンパク質、イオン、ホルモン、脂質、炭水化物などの細胞物質のレベル、位置または形態の変化などが含まれる。他の例示的な相互作用は上記セクションＸに含まれている。
【０３６９】
１１．５ 相互作用の測定およびコードの読取り
ターゲットとライブラリー・アレイ内のライブラリー・プールとの間の相互作用は、ターゲットをライブラリー・プールに曝露した後に測定する。コード付きキャリヤーは、アレイ内でのｉｎ ｓｉｔｕ条件で分析し、または、顕微鏡スライド、フロー・サイトメータなどの適当な分析場所へ移して分析することができる。それぞれのキャリヤー上のコードの読取りおよび位置の決定は、相互作用の測定前、測定中または測定後に実施することができる。例えば、相互作用がまれな、または相互作用が定性的な結果（例えば有／無）を与えるライブラリー・スクリーニングでは、相互作用が検出されたキャリヤーのコードだけを読み取るのが効率的である。対照的に、相互作用がよく起こる、または相互作用が定量的な（例えば等級分けされた）結果を与えるライブラリー・スクリーニングでは、コードおよび検定結果をどの順序で読み取っても効率的は変わらない。
【０３７０】
コードを読み取り相互作用を測定する例示的な方法は上記セクションＸＩで詳細に説明されている。
【０３７１】
１１．６ ２次スクリーニング
ターゲットとの相互作用が陽性であったライブラリー・プールは、２次スクリーニングによってさらに特性づけることができる。２次スクリーニングは一般に、ライブラリー・プールの個々のメンバーまたはサブプールを、ターゲットとの相互作用に関して試験することを含み、１つまたは複数の狭小化逐次スクリーニングで実施することができる。試験は、先に概説した戦略に従って実施することができるが、この場合には、ライブラリー・プールがライブラリーとして作用し、ライブラリー・プールからのサブプールまたは個々のメンバーがライブラリー・プールとして作用する。この場合には、それぞれのサブプールまたは個々のメンバーを、部分定位置または非定位置アレイ内のコード付きキャリヤーと結合させ、相互作用に関して再試験する。２次スクリーニングにおけるサブプールまたは個々のライブラリー・メンバーとコード付きキャリヤーとの結合の選択は、陽性ライブラリー・プールの複雑度、使用可能なキャリヤー・コードの数、それぞれのライブラリー・スクリーニングを実行するのにかかる時間などの適当な基準によって決定することができる。
【０３７２】
１１．７ 高複雑度ライブラリー・スクリーニング
方法１４５０に、部分定位置コード付きライブラリー・アレイを使用した高複雑度ライブラリー１４５２のスクリーニングを示す。図４０を参照されたい。高複雑度ライブラリーは、抗体、ペプチド、化学ライブラリーなどののように約１０７を超えるメンバーを含むことができる。
【０３７３】
図４０の上部は、異なったコード１４５８を有する１００個のコード付きキャリヤー１４５６と結合し、非定位置アレイ１４６０を形成した約１，０００個のライブラリー・メンバーから成るプール１４５４を示す。それぞれのアレイ１４６０は、それぞれ合計約１，０００個のメンバーを含む１００個のライブラリー・プールを含む。これらのアレイを、マイクロプレート１４６２内のサンプル・ウェル「Ａ１」など、定位置アレイ内の定義された位置に配置する。１００個のキャリヤーから成る同じまたは異なるキャリヤー・セット、およびライブラリー１４５２からの約１，０００個のライブラリー・メンバーから成る異なるプール１４５４を使用して、異なる複数の非定位置アレイを作製する。これらの異なる非定位置アレイ１４６０をそれぞれ、定位置アレイ内の異なる定義された位置に配置し、それによって、キャリヤー・コードとアレイ内での位置の組合せに基づいてそれぞれのライブラリー・プールを識別できるようにする。方法１４５０の具体的な実施例では、３８４ウェル・マイクロプレートなど、３８４の位置を有する定位置アレイが使用される。１００個の異なるキャリヤー・コードがあるとすると、約３８，４００個のプール、すなわち約３．８×ｌ０７個のライブラリー・メンバーを、１つの部分定位置アレイでスクリーニングすることができる。
【０３７４】
図４０の中央部分は、この１次スクリーニングで相互作用を試験するための定位置アレイへのターゲット１４６４の追加を示す。この例では、トランスフェクションされた細胞をターゲット１４６４として使用し、相互作用を、トランスフェクションされた細胞内の表現型応答として測定する。具体的には、細胞に、（ｉ）Ｇプロテイン結合レセプターなどの細胞表面レセプターの発現ベクターと、（ｉｉ）レセプター・アゴニスト（またはアンタゴニスト）と結合したレセプターに応答して、測定可能なレポーター応答を与えるレポーター遺伝子をトランスフェクションする。ライブラリー・プールを、レポーター応答を生み出すそれらの能力に関して試験する。陽性プールは、検定の設定のしかたに応じて、レポーター遺伝子活性を刺激するレセプター・アゴニスト、またはレポーター遺伝子活性を抑制するレセプター・アゴニストを含み、それによって陽性プールと結合したキャリヤー上で測定可能な陽性信号を生み出す。１４６６に示すように、コードを読み取り、アレイ内のキャリヤーの位置を突き止めることによって、陽性ライブラリー・プールを識別する。この例では、サンプル・ウェル「Ｂ５」が、コード「２」を有するキャリヤー上で陽性信号１４６８を示した。したがって、このキャリヤーと結合した１，０００個のライブラリー・メンバーのうちの少なくとも１つのキャリヤーが陽性信号を発している。
【０３７５】
図４０の下部は、陽性プールの個々のライブラリー・メンバーを分析する２次スクリーニングを示す。１４７０に示すように、陽性プールのライブラリー・メンバーをそれぞれコード付きキャリヤーと結合させ、非定位置アレイまたは部分定位置アレイとする。それぞれのプール中のライブラリー・メンバーの数（１，０００）がコードの数（１００）よりも大きいので、ここでは部分定位置アレイ１４７２が好ましい。１次スクリーニングと同様に、ライブラリー・メンバーとの結合によって１００個のコード付きキャリヤーの非定位置アレイを形成し、アレイ内の１つの位置に配置する。しかし、このケースでは、１，０００個のメンバーから成るプールではなしに、単一のライブラリー・メンバーをキャリヤーと結合させる。したがって、アレイのそれぞれの位置１４７４は１００個のライブラリー・メンバーを含む。他の９つの位置に、同じ１００個のコード付きキャリヤーを使用して、別の非定位置アレイを形成して、陽性プールに由来する部分定位置アレイ１４７２を形成する。
【０３７６】
ライブラリー、コード付きキャリヤーおよびスクリーニング・プロトコルは一般に、検定に対して適宜、選択することができる。ここで示した数、ターゲットおよび他の詳細は例に過ぎない。したがって、ライブラリーの複雑度、ライブラリー・プールのサイズ、異なるキャリヤー・コードの数、非定位置アレイ中のキャリヤーの数、および定位置アレイ中の位置の数は全て、適当な任意の値を独立にとることができる。さらに、２次スクリーニングを含むスクリーニングでは、先に述べたとおり、単一のメンバーおよび／またはライブラリー・サブプールを試験することができ、個々の陽性ライブラリー・メンバーを識別するために追加のスクリーニングが必要となることもある。さらに、トランスフェクションを実施していない細胞、細菌、ファージ、ウィルス、分子など、他のターゲットを使用することもできる。
【０３７７】
実施例１２ フィルム・ベースのコード付きキャリヤー
図４１〜４５に示すこの実施例は、非定位置および／または定位置アレイで使用される感光性フィルムを含むコード付きキャリヤーを説明する。
【０３７８】
コード付きキャリヤーを作製する方法は多数ある。しかし、これらの方法は複雑であったり、かつ／または実施に費用がかかったりする。キャリヤーの寸法が極めて小さい場合、例えば４００ミクロン以下である場合には特にそうである。したがって、コード付きキャリヤーを作製する単純かつ安価な方法が求められている。
【０３７９】
本発明は、生体サンプルおよび／または他のサンプルの分析に使用するコード付きキャリヤー、ならびにコード付きキャリヤーを製作する方法を提供する。このキャリヤーは、生体サンプルの多重分析に特に有用である。
【０３８０】
図４１に、本発明の諸態様に基づくコード付きキャリヤーまたはコード付き粒子を作製する方法１５５０を示す。方法１５５０では、１５５４に示すように、感光性フィルム１５５２をベース画像またはパターンに曝露して、フィルム画像の複製１５５６を例えばフィルム上のパターンとして形成し、これによってフィルムにコードを付与する。次いで、コード付きフィルム１５５８を、同じまたは異なるコードを有する、核酸、ポリマー、タンパク質、細胞、組織切片などの生体試料のキャリヤーとして使用するのに適した複数の小さなコード付き粒子に切断する。あるいは切断の前に、１５６２に示すように、組織切片１５６０などの生体サンプルをコード付きフィルム１５５８に固定化してオープン・サンドイッチ１５６４を作製する。図４１および４２を参照されたい。次いでフィルム／サンプル・サンドイッチ１５６４を、１５６６に示すように複数のセグメント１５６８に分割する。いずれにしても、生体サンプルが固定化されたそれぞれのフィルム断片、すなわちキャリヤーは、複製画像１５５６の画像部分またはコード部分１５７０を含む。したがって、画像部分１５７０は識別可能なコードとして機能し、これによってコード付きキャリヤー、したがってそれと結合させた生体試料を識別し、分析全体を通じて追跡することができる。
【０３８１】
ベース画像は一般に、撮影し、感光性フィルム上に投影し、または他の方法で感光性フィルム上に再現することができる任意の画像を含む。画像は再現可能なパターンを含んでも、または含まないくてもよい。適当な画像は例えば、縞、格子、反復形（斑点など）などの容易に識別可能なパターンを含む。いくつかの実施形態では画像が異なる色の縞の反復パターンを含む。
【０３８２】
フィルム１５５２は一般に、写真画像を記録することができ、かつ／または写真画像を記録するのに使用される感光性物質の薄いシートまたはストリップを含む。感光性物質には、感光性乳剤がコーティングされ、写真ネガまたは透明ポジを作るのに使用されるセルロース誘導体および熱可塑性樹脂が含まれる。ただしこれらに限定されるわけではない。コードおよび応用の性質に応じて、白黒またはカラー・フィルムを含む適当な任意のフィルムを使用することができる。市販フィルムは適当であるが、いくつかの市販フィルムは本質的に蛍光フィルムであり、この蛍光が、コードの読取り、ならびに／あるいはルミネセンスおよび／または比色検定の結果の読取りを妨害することがある。これらのケースでは、フィルムの蛍光とは別の検出可能な波長および／または他の特性を使用して、コードおよび／または検定結果を読み取ることができる。
【０３８３】
フィルムはベース画像に、適当な任意の手法を使用して曝露することができる。例えば、カメラなどの適当な検出装置を使用してベース画像を撮影することによって、フィルムをベース画像に曝露することができる。簡単に説明すると、カメラのシャッタが開くと、レンズが、カメラの視野の中の物体からの光をフィルム上へ集中させる。このような光は例えば、物体からの反射、透過および／または発光によって生じる。フィルムの感光性化学物質がこの露光に反応する。フィルムを現像すると、反応した領域の特性、例えば色および／または不透明度などが変化し、そのために、ベース画像がフィルム上にフィルム画像として記録され、ネガが作られる。カラー・フィルムは一般に３原色、すなわち青、黄、赤に対応する３つの染料を利用する。より一般的には、フィルムはベース画像またはパターンに、例えば直接レーザーまたはＣＲＴ書込みを使用して光または他の放射を、画像化光学系を使用しまたは使用せずにフィルム上へ直接に導くことによって、曝露することができる。
【０３８４】
先に述べたとおり、本発明のコード付きキャリヤーは多重分析に特に有用である。多重分析は一般に、一緒にプールされた異なる源からのいくつかの異なるサンプルに対して実験を実施することを含む。この多重方法では、研究者の時間と費用をかなり節約することができ、異なるサンプル源からの結果をうまく比較することができる。しかし、多重分析ではさらに、実験の結果を解釈するために、どのサンプルがどの源からのものであるかを判定する必要がある。そのため、異なる源からのサンプルを、識別可能な異なるマーカーまたはコードで標識することがしばしば望ましい。
【０３８５】
最も単純な多重分析は、異なる２つの型のサンプル、例えば種類および／または条件などが異なる第１のサンプルおよび第２のサンプルの研究を含む。これらのサンプルは、Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３、ＨｅＬａ細胞などの異なる型の細胞、組織、あるいは腎臓および子宮組織などを含むことができる。あるいはまたは加えて、これらのサンプルは、異なる時期および／または異なる条件などで採取した同じ型の細胞、組織などを含むことができる。
【０３８６】
２型のサンプルの多重分析を使用して、特定の化学物質で処理する前および後の特定の組織または他のサンプルに実験を実施し、組織に対するその化学物質の効果を試験することができる。このような実験では、処理の前に組織サンプルを採取し（処理前サンプル）、処理の後に組織サンプルを採取する（処理後サンプル）。処理前サンプルを第１のコードで標識し、処理後サンプルを区別可能な第２のコードで標識する。これを実施するためには、２つの異なるベース画像を撮影し、また他の方法でフィルム上にベース画像を再現して、２つの異なる複製またはコード付き画像を形成する。第１のコード付き画像を表示しているフィルムに処理前サンプルを固定化し、第２のコード付き画像を表示しているフィルムに処理後サンプルを固定化する。その後、このサンドイッチをキャリヤーまたは粒子に切断する。次いでこれらのキャリヤーを一緒にし、プールされた全てのキャリヤーまたは一部のキャリヤーに実験を実施する。キャリヤーが表示するパターン（またはコード付き画像部分）を検出することによって、所与のキャリヤーが処理前サンプルの組織を支持しているのか、または処理後サンプルの組織を支持しているかが分かる。
【０３８７】
より複雑な多重分析は例えば、３つ以上のサンプル、例えば種類および／または条件などが異なる第１、第２および第３のサンプルの研究を含む。
【０３８８】
多重分析では、サンプルを一緒にした後にさまざまなサンプルを区別するため、フィルム（および一般にフィルム画像）をキャリヤー（および画像部分）に分割した後も、フィルム上に記録された画像が区別可能でなければならない。したがって、キャリヤーにコードを付与するのに使用される画像／画像部分は、使用者が異なるサンプルを区別できるように選択する。
【０３８９】
フィルム画像は、フィルムを所与のサイズのフィルム片に切断したときに１こまのフィルムから得られるそれぞれのキャリヤー上の画像部分が同一となるように設計することができる。例えば、図４３の方法１５９０は、文字「Ｘ」の反復パターンであるフィルム画像１５９４を有する１こまのフィルム１５９２を示している。１５９８に示すように、それぞれの「Ｘ」の間の線１５９６に沿って切断すると、それぞれのキャリヤー１６００は画像部分１６０２として１つの「Ｘ」を含む。したがって、識別コードとして「Ｘ」を有する全てのキャリヤーが同じ生体サンプルの一部を担持するようにすることができる。
【０３９０】
あるいは、フィルムを所与のサイズのフィルム片に切断したときに１こまのフィルムから得られる２つ以上のキャリヤー上の画像部分を互いに区別できるようフィルム画像を設計することができる。このケースでは、画像部分に分割されたときに、フィルム画像が少なくとも２つの異なったコード（およびコード付きキャリヤー）を生み出す。いくつかの実施形態では、１こままたは数こまのフィルムから得られる全てのキャリヤーが異なるコードを有し、これは、組合せ応用またはｉｎ ｓｉｔｕ合成で特に有用である。２つの切断寸法の一方に沿って異なるコード付きキャリヤーを形成する方法の一例１６２０を図４４に示す。この例では、１こまのフィルム１６２２が垂直の帯１６２６から成るフィルム画像１６２４を含み、垂直帯の幅がフィルムに沿って左から右へ狭くなる。線１６２８に沿って１６３０に示すように切断すると、フィルムの最も左側のキャリヤー１６３２は４本の帯を有し、キャリヤー１６３４は左から右へ５本、６本、７本の帯を有し、フィルムの最も右側のキャリヤー１６３６は８本の帯を有する。したがって、図４１の方法１５５０のように組織切片と結合させると、４本の帯を有しているキャリヤーは、組織の最も左側の部分を担持していると判定され、５本から７本の帯を有しているキャリヤーは、組織の中央部分央を担持していると判定され、８本の帯を有しているキャリヤーは、組織の最も右側の部分を担持していると判定される。他の実施形態ではキャリヤーが、帯の数は同じだが、帯のサイズ、位置、色、強度などの帯の特性によって判定される異なるコードを有する。他の実施形態ではキャリヤーが、帯以外のキャリヤーの特性によって判定されるコードを有する。
【０３９１】
フィルム画像は、キャリヤー全体あるいはキャリヤーの１つまたは複数の部分を含む、キャリヤー上の１つまたは複数の適当な位置にコードが配置されるように設計することができる。キャリヤーの一部にだけ配置されたコードは事実上、キャリヤーをコード領域と非コード領域に分割する。次いで、所望ならば細胞検定などの検定を、たとえ細胞またはサンプルが両方の領域でキャリヤーと結合しているとしても、コードと検定の間の可能な干渉を減らすために、非コード領域だけで実行することができる。これらの検定では事実上、非コード領域または非コード領域の一部が検定または測定領域を構成する。
【０３９２】
フィルム画像はさらに、コードとは独立に使用して、コードを解釈する前にキャリヤーの画像の位置を合わせることができる位置合せマークなどの追加の（すなわち非コード）特徴を含むことができる。適当な位置合せマークには、キャリヤー上の定義された位置にコードおよび／または非コード領域に対して配置されたスポット、十字および／または他の形状が含まれる。
【０３９３】
図には、５×５の正方形格子に切断されたフィルムが示されているが、フィルムは、任意の数の形状および任意の数のサイズに切断することができる。フィルムを分割せずに個々のこまをキャリヤーとして使用することができる。しかし一般に、キャリヤーは個々のこまよりも小さいことが望ましい。したがって、フィルムは、キャリヤーおよび／または応用の特性に応じて直径約０．００１から３５ｍｍ、約０．０１から５ｍｍ、または約０．１から１ｍｍの最大特性寸法を有する粒子に切断することができる。一般に、フィルムが薄くフィルムの粒子が細かいほど小さな粒子をうまく調製することができる。標準写真フィルムの厚さは約０．１３０ｍｍであり、したがって最大寸法はこの値よりもいくぶん大きい。
【０３９４】
フィルムおよび／またはサンドイッチは、フィルムを部分に切断し、または他の方法で分割することができる、例えば、鋭利な切刃、パンチなどの機械的手段、引裂きなどの手による手段、エッチングなどの化学的手段、および／またはレーザー切断などの光学的手段を含む任意の方法を使用して分割することができる。案内線、ミシン目および／またはスコーリングを含む適当な任意の機構を使用して分割を容易にすることができる。いくつかの実施形態では、フィルムを予め複数の部分に切断しておき、ゼラチンなどの可溶性の付着物質によってこれらの部分を互いに、および／または共通の表面に付着させておくことができる。次いで、生体サンプルなどのサンプルを予め切断したフィルム上で固定化し、またはサンプルをｉｎ ｓｉｔｕ合成する前または後に、付着表面を溶解することによって、個々の粒子を生み出すことができる。
【０３９５】
粒子は、サンプルをキャリヤー上に固定化する前および／または後に、別個のコード付きキャリヤーに分割することができる。したがっていくつかの実施形態では、適当なコード・パターンを有するフィルムを第１のフィルム片セットに切断し、一組のサンプルをこれらのフィルム片に貼り付け、フィルム片および貼付したサンプルをさらに第２のフィルム・セットに切断して、これを分析に使用することができる。
【０３９６】
コード付きキャリヤーの使用方法は、詳細な説明の項の他の場所に記載されている。実験を実施した後に、キャリヤーが表示するパターンまたは画像部分を見ることによって、それぞれのキャリヤー上に固定化されたサンプルの由来を決定することができる。一般に、キャリヤーは、顕微鏡および／またはフィルム・スキャナを用いて観察するが、より一般的には、適当な任意の検出装置を使用することができる。フィルムは所望の解像度で走査することができる。好ましい解像度はフィルムの粒子径によって限定される。一般に、フィルムは６〜１０ミクロン／画素の解像度で走査される。
【０３９７】
使用可能な異なるコードの数は、キャリヤーのサイズ、キャリヤーの粒子径および選択されるベース画像間の相互作用によって決まる。最も一般的なフィルムの厚さは１３０から１７０ミクロンである。この厚さで、キャリヤーが（視認および走査が可能なように）平らに横たわるためには、キャリヤーの幅が約４００ミクロン以上でなければならない。コード特徴のサイズおよび／または密度は、フィルムの粒子径によって決定される。例えば、一連の縞、帯または他の特徴を含むコード付き画像を選択する場合には一般に、それぞれの帯の幅が約４〜５画素であることが望ましく、したがってそれぞれの縞の幅は一般に２５〜５０ミクロンとなる。したがって、それぞれのキャリヤーは１０本以上の帯を有することができる。カラー・フィルムを使用する場合には、帯の色をそれぞれ別の色にすることができ、その結果、可能なコードの総数はほとんど無限である。専用または特注フィルムを使用すれば、フィルムの粒子径および／またはベースの厚さを低減することができ、キャリヤー粒子をよりいっそう小さくすることができる。
【０３９８】
１２．１ カラー・コード付き粒子の具体例
カラー・コード付き粒子を作製する方法の具体例を説明する。色付き４本縞の繰返しパターンを有するカラー・チャートをインク・ジェット・プリンタで印刷し、３５ｍｍカメラで撮影する。フィルムを現像し、約０．５ｍｍの正方形に切断する。これらの正方形フィルム片をスライド・フレームに載せ、フィルム・スキャナを用いて約６ミクロン／画素の解像度で走査する。このカラー・パターンは、４本縞パターンが約２００ミクロンごとに繰り返され、眼およびコンピュータによって容易に認識される。
【０３９９】
１２．２ 代替カラー・コード付き粒子
図４５は、本発明に基づいて製作された代替カラー・コード付き粒子１６５０の画像である。この粒子は、コード領域１６５２、領域１６５２とは空間的に別個の非コード検定または測定領域１６５４、位置合せ領域１６５６および枠１６５８を含む。コード領域は、粒子または粒子型を識別するためのコードを含めるのに使用することができる。検定領域は、そこに貼り付けられた細胞、組織または他のサンプルの検定に使用することができる。位置合せ領域は、コードを読み取り、解釈する前、および／またはサンプルを分析する前に、検出システムの位置合せに使用することができる。位置合せ領域は、互いに対して、かつコード領域および検定領域に対して予め定義された位置に配置された非対称な一組のスポット１６６０を含む。枠は、粒子の外形または粒子の使用可能な領域を画定するのに使用することができ、製造中および／または使用中に粒子を他の粒子から分離する案内線として使用することができる。
【０４００】
実施例１３ 表面積拡張部分および／または磁気部分を有するコード付きキャリヤー
図４６〜４９に示すこの実施例は、非定位置および／または定位置アレイで使用される、凹部および／または磁気部分を有するコード付きキャリヤーを説明する。
【０４０１】
微小粒子などの粒子は、充てん材、トレーサー、キャリヤーまたはタグとして数多くの用途を有する。例えば粒子は、物質を追跡し、かつ／または後の識別のために物質に印を付ける識別標識として有用である。粒子の一般的な有用性は１つには、個々の粒子を目立たないようにし、または肉眼では全く見えないようにするその小さなサイズに由来する。さらに、小さな粒子は例えば流体環境中での取扱いが容易である。
【０４０２】
多くの利用法があるにもかかわらず、サイズが小さいために、生物検定における生体サンプルのコード付きマイクロキャリヤーとしての粒子の有効な使用が制限される可能性がある。具体的には、小さなサイズの粒子は、細胞および／または細胞分析物質を付着させるのに使用可能な表面積を小さくする傾向があり、これによって１つの粒子上で分析できるサンプルの量が制限される。さらに、小さなサイズの粒子は、例えば分析中に結合させた細胞、細胞成分および／または細胞分析物質を分離しまたは精製するために、分析後に粒子を選別しまたは分離するのを難しくする可能性がある。したがって、全体としてのサイズは小さいが表面積は大きいコード付きキャリヤーが有用であろう。さらに、分析の最中または後に他のキャリヤーから容易に分離することができるコード付きキャリヤーも有用であろう。
【０４０３】
本発明は、広い表面積および／または磁気部分を有するコード付きキャリヤーを提供する。コード付きキャリヤーは、キャリヤーの１つまたは複数の側面に形成された凹部および／または延長部分などの１つまたは複数の表面積拡張部分を含むことができる。凹部には例えばくぼみまたは貫通穴などが含まれ、延長部分には例えば突起またはフラップ（ｆｌａｐ）などが含まれる。凹部のほうが壊れにくく、絡まりにくく、あるいは運動または混合を妨げにくいので、延長部分よりも凹部のほうが好ましい。凹部の場合のキャリヤーの外部結合表面に少なくとも概ね平行な内部結合表面のように、表面積拡張部分によって比較的に平らな結合表面を提供することができる。さらに、表面積拡張部分を、キャリヤーのコード領域とは空間的に異なるそれぞれのキャリヤーの検定領域に形成することができる。さらに、表面積拡張部分をそれぞれのキャリヤーの中央部に配置し、コード領域を、中央部分の両側または一方の側に配置することができる。あるいはまたは加えて、コード付きキャリヤーは磁気部分を含むことができる。磁気部分には例えば、キャリヤーおよびコードに付着され、埋め込まれ、または他の方法で結合させた磁性材料が含まれる。凹部および／または磁気部分を有するコード付きキャリヤーを、非定位置および／または定位置アレイで使用して、サンプル容量を大きくし、キャリヤーの選別をより効率的にし、かつ／または生物検定でキャリヤーをより汎用的に使用することができる。
【０４０４】
１３．１ 凹部を有するコード付きキャリヤー
１つまたは複数の凹部を含むようにコード付きキャリヤーを形成することができる。凹部は一般に、キャリヤーの任意の凹形部分を含み、所望の形状を有することができる。凹部をキャリヤーの対向する面と面の間に延ばして貫通穴を形成することができ、または凹部をキャリヤーの内部に延ばし、途中で終端させることができる。一般に、凹部は、キャリヤーの外面と流体連絡した内部結合表面を提供する。内部結合表面は、平らなキャリヤーの外部上面および底面に平行な概ね平らな表面を含むことができる。凹部は、長方形の境界を有する直線構成を有し、または円筒形、楕円形などの他の適当な幾何形状を有することができる。
【０４０５】
キャリヤーは一般に１つまたは複数の凹部を含むことができる。これらの凹部は、同様のサイズおよび／または形状を有することができ、互いに対しておよび／またはキャリヤーに対して少なくとも概ね平行な方向を有することができる。例えば、凹部は、キャリヤーの１つの側面から始まり、キャリヤーの対向する側面まで延びることができる。あるいはまたは加えて、少なくとも一部の凹部が異なるサイズ、形状または方向を有することができる。
【０４０６】
凹部は、キャリヤーの非コード領域および／またはコード領域に配置することができる。凹部を非コード領域に配置し、コードを、空間的に異なった概ね重ならない領域に形成することができる。例えば、凹部を中央に配置し、その１つまたは複数の側にコードを配置することができる。さらに、凹部を中央部分を横切る貫通穴として形成し、コード要素を、キャリヤーの両側または片側に配置することができる。あるいは凹部を、キャリヤーのコード領域の少なくとも一部分に配置することができる。例えば、凹部がコード領域と部分的に重なり、または特にコード領域がキャリヤーのかなりの部分を形成しているときに凹部がコード領域の中に完全に含まれる。
【０４０７】
１３．２ 凹部を有するコード付きキャリヤーの形成
コード付きキャリヤーの凹部は、キャリヤーを製造する前、最中または後に形成することができる。
【０４０８】
凹部はキャリヤーを製造する前に形成することができ、例えば、特にキャリヤーが異なる構造から成る複合体として製造されるときにはそうすることができる。この場合、少なくとも１つの構造体が予め形成された凹部を含み、構造を接合することによって予め形成された凹部を粒子の中に配置することができる。
【０４０９】
凹部は、キャリヤー製造中に形成することもできる。例えば、構成構造体をオフセット位置で接合することによって凹部を形成することができる。あるいは、凹部を含むようにキャリヤーを成形することによって凹部を形成することができる。
【０４１０】
凹部は、キャリヤー製造後に形成することもできる。例えば、切断または穿孔装置を用いて凹部を導入することができる。他の実施形態では、キャリヤーの一部分の構造変更または除去を促進する物理的または化学的改質因子（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）によって凹部を形成することができる。物理的または化学的改質因子には例えば、酸、塩基、酸化剤、還元剤などの腐食剤；光；あるいはキャリヤーの特性を局所的または全体的に変化させる他の処理が含まれる。キャリヤーの一部を、例えばマスクまたはテンプレートを使用して改質因子に局所的に曝露することができる。あるいは、キャリヤー全体を改質因子に曝露するが、改質因子に対するキャリヤーの感受性が部分によって異なる。例えば、２種類のガラスなど、改質因子に対して感受性の第１の材料と改質因子に対して抵抗性の第２の材料から成る複合体としてキャリヤーを形成することができる。
【０４１１】
１３．３ 磁気部分を有するコード付きキャリヤー
コード付きキャリヤーは１つまたは複数の磁気部分を含むことができる。磁気部分は一般に、適当な磁石によって磁化され、または引き寄せられるキャリヤーの領域を含む。磁気部分は例えば、磁石または強磁性材料にキャリヤーを付着させ、かつ／または磁石または強磁性材料によってキャリヤーを移動／回転させることを可能にする。磁気部分を使用して、キャリヤーを他のキャリヤーから分離することができる。あるいは、コードの読取りおよびサンプルの分析のために、磁気部分を使用してキャリヤーまたは一群のキャリヤーを回転させ、したがってある方向に向けることができる。磁気部分は、予め磁化された材料または誘導的に磁化される材料を含むことができる。磁気部分の適当な材料には例えば、鉄、ニッケル、コバルトなどの強磁性材料が含まれる。
【０４１２】
磁気部分は外部および／または内部に取り付けることができる。磁気部分は、キャリヤーの離散した領域に配置し、またはキャリヤー全体に配置することができる。磁気部分は、キャリヤー形成時にキャリヤーの中に埋め込み、またはキャリヤー形成後に、例えば結合によってキャリヤーに取り付けることができる。磁気部分は、キャリヤーの質量に対し適当な磁石によって引力が生み出されるだけの十分な質量を提供する、円筒、シート、ビーム、ビーズまたは他の構造を含む適当な任意の形状を有することができる。いくつかの実施形態では、キャリヤー全体を強磁性材料から形成することができる。
【０４１３】
１３．４ コード領域および非コード領域を有するガラス・キャリヤー
図４６に、コード領域および非コード領域を含むガラス・キャリヤーの一実施形態１６７０を示す。ただしこのキャリヤーは凹部および磁気部分を含んでいない。キャリヤー１６７０は、細胞および／または細胞分析物質を付着させるための上または下結合表面１６７４、１６７６を有する中央に配置された非コード領域ないし検定領域１６７２を含む。非コード領域は、無色の透明ガラスから構築することができる。非コード領域の両側には、不連続コード要素１６８０、１６８２から形成されたコード領域１６７８がある。この特定の例ではコード要素１６８０、１６８２が、可視光の吸収スペクトルを決定し、したがってそれぞれのコード要素に識別色を与える光制限物質（ｏｐｔｉｃａｌ ｌｉｍｉｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を含む着色ガラス・ストリップである。
【０４１４】
キャリヤー１６７０は、透明および着色ガラスのブロックまたは繊維を使用して製造することができる。ブロックまたは繊維を並べ融着させて、キャリヤーの中にコード領域と非コード領域のアセンブリーを形成する。具体的には、コード要素および中央の非コード領域に対して別個のブロックまたは繊維を使用する。融着後、アセンブリーを引っ張って繊維にする。得られた繊維を所望の長さに切断してコード付きキャリヤーを形成する。
【０４１５】
１３．５ 凹部および／または磁気部分を有するキャリヤー
図４７に、単一の凹部１７０２を有するキャリヤーの一実施形態１７００を示す。キャリヤー１７００は、中央に配置された非コード領域１７０４およびその両側に配置されたコード領域１７０６を含む。凹部１７０２は非コード領域１７０４に含まれており、このケースでは、キャリヤーの対向する側面１７０８と１７１０の間に延びる貫通穴である。凹部は、凹部の壁１７１５によって提供された内部結合表面１７１２、１７１４を画定する。内部結合表面は、キャリヤーの壁１７１５によって形成された上下の外部結合表面と少なくとも概ね平行である。コード領域１７０６は、非コード領域１７０４の両側のコード要素１７１６から形成されている。この特定の例ではコード要素１７１６が、可視光の吸収スペクトルを決定し、したがってそれぞれのコード要素に識別色を与える光制限物質を含む。
【０４１６】
図４８に、複数の凹部１７３２を有するキャリヤーの一実施形態１７３０を示す。図４７のキャリヤー１７００と同様に、複数の凹部がそれぞれ、キャリヤーの上下の結合表面に少なくとも概ね平行な内部結合表面を画定している。それぞれの凹部は、外壁または内壁１７３４によって上下に境界されている。キャリヤー１７３０はさらに、２つのコード要素１７１６間に埋め込まれた強磁性円筒の形態の磁気部分１７３６を含む。キャリヤー１７３０は３つの凹部および磁気部分を含んでいるが、代替実施形態では、凹部を０、１または２個、あるいは４つ以上含み、かつ／あるいは磁気部分を含まないキャリヤーを形成することができる。
【０４１７】
キャリヤー１７００と１７３０は同様の方法を使用して製造することができる。ガラスのブロックまたは繊維を並べ、融着させて、キャリヤーの中にコード領域と非コード領域から成る一般配置を形成する。具体的には、それぞれのコード要素１７１６、それぞれの壁１７１５または１７３４、および凹部１７０２または１７３２に対して別個のブロックを使用する。融着後、アセンブリーを引っ張って繊維にする。その間に、ワイヤなどの磁気部分１７３６を挿入し埋め込むことができる。アセンブリーを所望のサイズまで引っ張った後、得られた繊維を所望の長さに切断する。凹部を形成させるため、後に凹部となる位置に除去可能な材料を配してアセンブリーを形成する。このケースでは、それぞれの凹部の位置に酸感受性ガラスを使用し、キャリヤーの他の構造を形成するのには耐酸性ガラスを使用する。キャリヤーの酸処理によって酸感受性ガラスを食刻し、キャリヤーから除いて凹部を形成する。
【０４１８】
１３．６ 磁気選別したサンプルの分析
図４９に、磁気部分を有するコード付きキャリヤーを使用して、細胞抽出物からタンパク質などの結合成分を精製し分析する方法１７６０を示す。図４９の最上部に示すように、タンパク質１７６２、１７６４、１７６６、１７６８をそれぞれ、異なるコード１７７８を有する異なるクラスのコード付きキャリヤー１７７０、１７７２、１７７４、１７７６と結合させる。キャリヤーはさらに、キャリヤーの中に埋め込まれた磁気部分１７８０を含む。得られたタンパク質−キャリヤー・アセンブリーを１７８２に示すように一緒にして、タンパク質プローブの非定位置アレイ１７８４を形成する。次いで、細胞または組織抽出物１７８６をアレイ１７８４と一緒にして、抽出物１７８６中の特定の成分をキャリヤーに結合させる。次いで、段階１７８８に示すように、タンパク質−キャリヤー・アセンブリーを測定して、結合抽出物成分によって生じた陽性信号１７９０を識別する。
【０４１９】
陽性信号を示す個々のキャリヤーを取り出し、さらに分析することができる。段階１７９２に示すように、陽性信号を示すキャリヤー（コード「３」）に磁気要素１７９４を手動または自動で近づけて、キャリヤーを磁気要素に引きつけることができる。段階１７９６に示すように、陽性信号を示し共通のコードを有する複数のキャリヤーを管１７９８の中で一緒にすることができる。次いで、段階１８００に示すように、抽出物１７８６由来の結合成分をキャリヤーから溶離し、さらに分析することができる。このケースでは、単一の種を表す溶離成分を質量分析法によって分析して、この単一の種の構造特徴を決定する。
【０４２０】
他の実施形態では、磁気キャリヤーを使用して、完全細胞、組織、ファージ、ウィルス、小器官、タンパク質、核酸、炭水化物、ホルモン、リガンドおよび化合物などを精製することができる。
【０４２１】
実施例１４ コード付きキャリヤー上の細胞集団からの細胞尺度
図５０〜５５に示すこの実施例は、細胞集団に対する効果または細胞集団間の差異を、コード付きキャリヤーの非定位置および／または定位置アレイを使用して分析する方法を説明する。
【０４２２】
コード付きキャリヤーは異なるレベルの細胞分析、すなわち細胞集団レベルの分析および個々の細胞レベルの分析に適している。集団レベルの分析は、薬物候補などのモジュレーターの細胞集団全体に対する効果を測定するのに有用である。例えば、いくつかの光学検定では、生データが、顕微鏡またはスキャナを用いてある解像度で取得した細胞集団の画像として得られる。生データは例えば画像の形態で提示され、またはヒストグラムなどの画像情報の要約図として提示される。画像内のそれぞれの位置すなわち画素で測定された強度によって、その画素は、ヒストグラムの適当な強度ビン（ｂｉｎ）または区間に配置される。強度（強度区間）に対して度数（すなわち画素数）をプロットすると、画像内の画素の強度の全体分布を示すヒストグラムが得られる。したがってこのヒストグラムは、それぞれの強度区間に含まれる画素の度数をまとめたものである。画像したがって細胞集団から有用な測定値を抽出するために、多くの方法によってこのヒストグラムを操作することができる。例えば、平均強度、メジアン強度、モード強度または他の分布態様を使用することができる。しかし、この測定値からさらに、トランスフェクションされていない細胞、応答しない細胞、不均質な応答、細胞のない領域などによって生じる背景を除去しなければならない。
【０４２３】
製薬業界では、検定の情報価値を特性づける共通の方法としてｚ値（ｚ−ｖａｌｕｅ）を使用している。ｚ値は下式によって計算される。
【数１】
2004537712.tif 000007
【０４２４】
上式で、「Ｍｅａｎ」は、刺激を与えた（刺激）細胞（ＳＴＩＭ）および刺激を与えなかった（無刺激）細胞（ＵＮＳＴＩＭ）の平均応答を表し、「ＳＤ」は応答の標準偏差を表す。刺激および無刺激は、試験製薬化合物との反応での実際の細胞応答が一般に存在する範囲の両端である。目標は、応答範囲（分母の平均応答の差）をできるだけ大きくし、応答変動性（分子の標準偏差の和）できるだけ小さくすることである。こうすることによってｚ値は１に近づく。したがって、背景を除去し、刺激集団と無刺激集団とを比較したときにｚ値を最大化することによって、細胞集団の状態を情報価値の高い（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ）方法で特性づける方法が必要である。
【０４２５】
本発明は、細胞集団に対する効果または細胞集団間の差異を、コード付きキャリヤーの非定位置および／または定位置アレイを使用して分析する方法を提供する。画素強度のヒストグラムをそれぞれの細胞集団の画像から作成する。背景画素を除去し、背景に対応する強度成分を残りの全ての画素から差し引くことによって、ヒストグラムを補正する。この補正された信号ヒストグラムが細胞尺度（ｃｅｌｌ ｍｅａｓｕｒｅ）を定義する。細胞尺度は、一般に約９０％〜９５％である所与のパーセンテージの画素以上の強度を有する補正後のヒストグラムの最大強度ビンに対応する。この細胞尺度は、トランスフェクション効率、細胞のない領域のパーセンテージおよび細胞応答の全体的な不均一性の差に基づく変動を排除することによって、他の細胞集団と比較するためのその細胞集団のより有用な尺度を提供する。
【０４２６】
１４．１ ヒストグラムからの背景の除去
図５０に、細胞集団の分析、例えば画像から得られた一般的なヒストグラム１８５０を示す。ヒストグラム１８５０は一般に、背景に対応するハイ・モード（ｈｉｇｈ ｍｏｄｅ）１８５２および染色された細胞に対応するロング・テール（ｌｏｎｇ ｔａｉｌ）１８５４を含む。背景の強度レベルはいくつかの因子によって変動し、ほとんどの因子がヒストグラムのシフトまたはスケーリングの原因となる（例えば光強度、曝露時間など）。モード１８５２が明瞭である場合、背景は、モードのパーセントの２倍の百分位数として推定することができる。言い換えると、モード以下の強度を有する画素の百分位数をＰｍｏｄｅとすると、百分位数２Ｐｍｏｄｅをヒストグラムの新しい原点として使用することができる。
【０４２７】
図５１および５２に、図５０のヒストグラム１８５０に新しい原点を割り当てることによってこのヒストグラムを信号ヒストグラム１８６０と背景ヒストグラム１８７０とに分割する方法を示す。背景よりも強い信号は以前に百分位数２Ｐｍｏｄｅであった位置から始まり、その強度値はゼロから出発する。
【０４２８】
１４．２ 情報価値の高い細胞尺度の実験的決定
モジュレーターに対する異なる応答をシミュレートするために、１つの細胞集団のβガラクトシダーゼ活性を測定した。したがって、ｉｎ ｓｉｔｕ βガラクトシダーゼ検定の展開時間を変化させることによって、細胞を「刺激」した。展開系列は、８つの時間点（０、１０、３０、６０、９０、１２５、１５５および１８５分）から成り、これらの時間点から対応する細胞画像を得た。細胞画像はそれぞれ、培養皿上の細胞の１つの領域に対応させた。この領域は、約０．５ｍｍ×０．５ｍｍのコード付きキャリヤー表面に対応する。それぞれの時間点について、４×、２×および１×に対応する３つの異なる倍率で画像を取得して、情報量がｚ値にどのように影響するかを求めた。時刻０で細胞は無刺激であると考えられた。最後の時間点（１８５分）では細胞は刺激を受けていると考えられた。このデータを使用して、検定尺度と呼ぶ刺激の程度を測定するヒストグラム・ベースの方法を開発した。
【０４２９】
背景を除去した後、刺激の程度（検定尺度）を、ある分布の位置尺度として評価することができる。平均、高位初期積率（ｈｉｇｈｅｒ ｉｎｉｔｉａｌ ｍｏｍｅｎｔ）および百分位数を含むいくつかの尺度を試した。ｚ値から判断して最も良いのは、約９０〜９５％の範囲のＰｈｉｇｈ百分位数値を有する百分位数尺度であった。
【０４３０】
所与の割合「ｐ」に対する百分位数強度Ｈ（ｐ）は下式によって定義される。
【数２】
2004537712.tif 000008
【０４３１】
この式で、Ｎは、背景を差し引くかどうかに応じて、未処理のヒストグラム中の画素、または補正後の（信号）ヒストグラムに残った画素の総数である。それぞれの強度ビン「ｉ」の中の画素数「Ｈｉｓｔ（ｉ）」を総画素数Ｎで割って、そのビンの中の全画素の割合を求める。これらの割合を最小強度から最大強度まで合計して、画素の割合「ｐ」または百分位数を対応する強度ビン「Ｈ（ｐ）」に関係づける累積ヒストグラムを得る。言い換えると、Ｈ（ｐ）は、累積分布中のパーセンテージが割合「ｐ」（×１００）にほぼ等しい最大ヒストグラム・ビンまたは強度区間である。
【０４３２】
データの品質または検定条件に基づいて異なる細胞尺度を使用することができる。ヒストグラムのモードが明瞭な場合、刺激尺度Ｓ（検定尺度）は下式のように定義することができる。
【数３】
2004537712.tif 000009
【０４３３】
あるいは、モードが明瞭でない場合、良好な検定尺度は上下の百分位数の差である。
【数４】
2004537712.tif 000010
【０４３４】
上式で、Ｐｈｉｇｈは９０〜９５％、Ｐｌｏｗは５〜１０％である。
【０４３５】
Ｓのグラフを図５３〜５５に示す。刺激は背景を除去した後に計算し、時間（分）に対してプロットした。３つのグラフ１９００、１９１０、１９２０は、異なる画像倍率４×（図５３）、２×（図５４）および１×（図５５）から得たデータに対応する。示された４本の曲線はそれぞれ、異なる１つの領域（０．５ｍｍ×０．５ｍｍ）に対応する。ｚ値１９０２、１９１２、１９２２は、（楕円で囲んだ）最も長い３つの展開時間のｚ値の平均として計算した。図示のとおり、３つの異なる倍率のｚ値に有意な差はない（０．７８、０．８０、０．８２）。この結果は、細胞集団の刺激の分析には、使用した最も低い倍率である１×で十分であることを示唆している。
【０４３６】
実施例１５ コード付きキャリヤーの実施形態、コードの読取り、特性の測定
図５６〜６２に示すこの実施例は、多重細胞分析システムで使用するのに適したコード付きキャリヤーを説明する。さらにこの実施例は、コード付きキャリヤー上のコードを読み取り、細胞特性を測定する光学的方法を説明する。
【０４３７】
コンビナトリアル・ケミストリーの発展およびヒト・ゲノム解析計画から得られる情報によって薬物発見の方法および速度は劇的に変化した。検定では、数百万の化合物から成る化学ライブラリーが同時に試験される。これらの化合物の活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは無細胞（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）生化学プロセスに対するそれらの効果によって測定される（Ｇｏｎｚａｌｅｚ ａｎｄ Ｎｅｇｕｌｅｓｃｕ， １９９８、Ｓｕｎｄｂｅｒｇ， １９９８）。ゲノミクス、プロテオミクスなどの新しい研究分野が薬物発見プロセスに常に刺激を与え続けている。ますます高速かつ効率的なシステムに新しい分子が送り込まれ、試験されている。これらのシステムは、総称して高スループット・スクリーニング（ＨＴＳ）システムと呼ばれている（このようなシステムの例は以下の米国特許に記載されている：特許第５，２３３，３６９号、特許第５，４８６，８５５号、特許第４，９８２，７３９号および特許第５，５７１，４１０号。これらの特許は参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０４３８】
ＨＴＳシステムは、製薬産業における薬物発見の標準となっており、これらのシステムの多くが現在市販され、日常的に使用されている（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、１９９８）。しかし、これらのシステムは、ＤＮＡ増幅、ＲＮＡ転写、タンパク質合成などの単一の生化学レベルでの化合物の効果しか示さず（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ， １９９８）、生体の生理全体に対する化合物の効果を分析しないので、その用途は限られている。化学ライブラリーの活性をｉｎ ｖｉｖｏで研究する必要性のこの高まりによって、特定の病態における分析化合物の役割をｉｎ ｖｉｔｒｏ（無細胞）検定よりも詳細に模倣する細胞ベースのＨＴＳ検定が生み出された。
【０４３９】
活性な化合物の発見は新薬開発の端緒でしかない。発見プロセスのその後の段階は、実験動物モデルの生理的または生化学的変化を示すように設計される。これは費用がかかり、時に予測不可能な手順である。したがって、ターゲットおよび化合物の数がともに劇的に増加しているとき、製薬業界は、ターゲット確認および化合物発見の時間を短縮することを必要としている。さらに、米国およびヨーロッパにおける新しい規制および社会的圧力により、動物試験の実施がより困難かつ非常に制限されるようになった。したがって、活性化合物の高スループット・スクリーニングを、動物を直接に使用せずに、低コストで行える、ｉｎ ｖｉｖｏでの検定の開発は製薬業界にとって極めて重要である。
【０４４０】
１５．１ 細胞ベースの高スループット・スクリーニング
細胞ベースのＨＴＳの必要に応えるため、いくつかの企業が、化合物活性をｉｎ ｖｉｖｏで測定する機器を設計した。これらのシステムの例が、ＦＬＩＰＲシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社。米カリフォルニア州Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＳＡＩＣ）社のイメージング・プレート・リーダ（米ワシントン州Ｓｅａｔｔｌｅ）、およびＡｒｒａｙＳｃａｎＩＩシステム（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ社。米ベンシルベニア州Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ）である。
【０４４１】
これらの細胞ベースＨＴＳを実行する方法は、ユニフォーム・マイクロパターン・アレイ（米国特許第６，１０３，４７９号。この特許は参照によって本明細書に組み込まれる）、マイクロタイター・ウェル・ベースの細胞アレイ（米国特許第５，９８９，８３５号。この特許は参照によって本明細書に組み込まれる）、細胞系統の多重付着／染色用の複合装置（米国特許第６，０２２，７００号。この特許は参照によって本明細書に組み込まれる）などさまざまである。これらの細胞検定の応用は数多い。例えば、米国特許第５，７８０，２５８号（この特許は参照によって本明細書に組み込まれる）には、肥満を調節できる薬物の発見に細胞ベースのスクリーニング法を使用することが記載されている。Ａｐｐｅｌら（１９９９）は、細胞ベースの検定を使用して新しい抗癌剤を分析することを記載しており、Ｋｏｓｏｖｓｋｙ（２０００）は、野生型および突然変異型遺伝子を発現するトランスフェクションさせた細胞を使用して、対象とする特定の遺伝子に対する化合物の活性を研究することを記載している。さらに、ノックアウトおよびノックイン・トランスジェニック・マウスの細胞の使用は、薬物発見においてますます重要となっている（Ｐｏｌｉｔｅｓ， １９９６、Ｙａｍａｍｕｒａ， １９９９、ｄｅ ｌａ Ｂｒｏｕｓｓｅ ａｎｄ Ｃｈｅｎ， １９９８）。これは、化合物に対する応答を明確に定義された遺伝子に関連づけることができるからである。最後に、微小組織切片（「組織マイクロアレイ」）の形態の細胞ベースの検定が、関連発癌遺伝子の発現を研究する目的に使用されている（Ｋｏｎｏｎｅｎら、１９９８、Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ， Ｏ． −Ｐ， １９９８）。
【０４４２】
これらの進歩にもかかわらず、細胞ベースのスクリーニング検定には依然として２つの重大な欠点がある。第１に、現在のほとんどの検定では、細胞に対する化合物の活性が、そのスポットまたはマイクロタイター・ウェルに存在する全ての細胞全体の活性として測定される。単一の細胞の活性およびそれに関連した形態変化は測定されない。生化学活性の測定は、試験位置（ウェル）に存在する全ての細胞間で平均される。いくつかの生化学プロセスは個々の細胞内のｉｎ ｓｉｔｕ条件でより正確に測定できるので、単一の細胞のｉｎ ｓｉｔｕでの変化は極めて重要である（Ｔａｙｌｏｒ， １９９２、Ｔａｙｌｏｒ， ２０００）。第２に、使用可能な現在の方法を使用すると、対象とする（１種または数種の）化合物を、さまざまな細胞型のうちの１つまたは２、３のグループに対してしか試験できない。複数の細胞型を含む細胞ベースの検定を生み出すことは現在のところ技術的に困難であり、経済的には実行不可能である。しかし、「細胞ライブラリー」に対して化学ライブラリーを試験するこのレベルの多重分析は、新しい抗癌剤の開発などの多くの応用で極めて重要である（Ａｐｐｅｌら、１９９９）。
【０４４３】
本発明は、個々の細胞の測定を可能にし、事実上無数の細胞型を含む細胞ベースのＨＴＳを効率的かつ安価に製造する方法を記述する。
【０４４４】
１５．２ キャリヤーの構造、使用および測定の概要
本発明は一般に、１つまたは複数の選択された観察波長または例えば偏光、カラムネーション（ｃｏｌｕｍｎａｔｉｏｎ）、位相差、透過、反射、蛍光などの光学モダリティ（ｍｏｄａｌｉｔｙ）で、細胞付着表面に付着した細胞の微小構造を観察し、このような細胞を識別するための細胞支持粒子を提供する。いくつかの実施形態では、この粒子が細胞キャリヤーであり、キャリヤーが複数の光学光ガイドを有し、光ガイドがそれぞれ上面および下面を有し、上面と下面が光学的に連絡し、そのため上面が光ガイドの入口を形成し、下面が光ガイドの出口を形成し、光ガイドの入口から入った光が光ガイドを伝わって、光ガイドの出口から光ガイドを出ていき、光ガイドが、１つまたは複数の選択された観察波長または光学モダリティで光学的にニューラルであり、光ガイドが全体として細胞付着表面を形成し、少なくとも１種の光制限物質が少なくとも１つの光ガイドの中に存在して光ガイドの間で空間光学コードを形成し、光ガイドの間で空間光学コードを形成し、光制限物質がそれぞれ、１つまたは複数の観察波長または光学モダリティで光学的に中立であり、１つまたは複数の検出波長または光学モダリティで照明したときに、光制限物質がそれぞれ、このような細胞による光学干渉を生じることなく、またはコード識別を妨げない軽度の干渉を生じるだけで検出可能であり、コードが、このような細胞の少なくとも１つの特性を識別し、細胞微小構造が、キャリヤーからの光学干渉を生じることなく観察可能であり、コードが、このような細胞からの光学干渉を生じることなく検出可能である。
【０４４５】
光学モダリティは組合せで、または別々に、波長、透過を含む光路、反射、表面プラズモン共鳴、陰影、暗視野、蛍光、位相差、回折、蛍光偏光、蛍光染色を含む染色、および透過、位相、エピ（ｅｐｉ）、暗視野、蛍光などにおける光源と光検出器の関係を包含する。例えば、表面蛍光照明を使用して、蛍光顕微鏡法に適した光条件下で細胞微小構造を顕現させる蛍光−微小構造特異染料で染色した細胞微小構造を観察することができる。次いで、透過または表面照明顕微鏡条件でキャリヤーのコードを観察することよって、１つまたは複数の細胞が付着したキャリヤーを「解読」する。当業者は、透過顕微鏡法が一般に細胞構造を顕現させず、したがって細胞を光学的に中立にする、すなわち解読光学システムから「見えない」ようにすることを理解しよう。一方、光学物質をコード区画または位置に空間的に配置することによって生み出される光学コードは反対に、蛍光システムから見えない。これは、このような場合には光学物質が、先に述べたように細胞微小構造を観察するのに使用する蛍光顕微鏡システム下では蛍光を発しないように選択されるからである。要するに、コード、コード構造またはキャリヤーからの光学干渉を生じることなく微小構造あるいは他の細胞特性または事象を観察するために、および空間コードとしてキャリヤーに含まれるコードを観察し、解読するのために、並列または直交システムが選択される。他の例として、位相差を使用して細胞に関連した特徴または事象を検出することができ、蛍光を使用してコードを顕現化し解読することができる。本発明が企図する選択的直交視／解読スキームを与えるのは、細胞−コード付きキャリヤー系内の物体への光の透過、および細胞−コード付きキャリヤー系内の物体からの発光、影または反射として定義される選択的照明である。より好ましくはコード方式が、単なる強度の違いとは異なる少なくとも２つの異なるスペクトル特性を含む。
【０４４６】
他の態様では、本発明が、１つまたは複数の選択された観察波長または光学モダリティで、細胞付着表面に付着した細胞の微小構造を観察し、このような細胞を識別するための装置を提供する。この装置は、細胞付着表面を画定する細胞キャリヤーを含み、キャリヤーが複数の光学光ガイドを有し、光ガイドがそれぞれ上面および下面を有し、上面と下面が光学的に対向し、そのため上面が光ガイドの入口を形成し、下面が光ガイドの出口を形成し、光ガイドの入口から入った光が光ガイドを伝わって、光ガイドの出口から光ガイドを出ていき、光ガイドが、１つまたは複数の選択された観察波長または光学モダリティで光学的に透明であり、上面が全体として滑らかな細胞付着表面を形成し、少なくとも１種の光制限物質が少なくとも１つの光学光ガイドの中に存在し、光制限物質がそれぞれ、１つまたは複数の観察波長または光学モダリティで光学的に透明であり、１つまたは複数の検出波長または光学モダリティで照明したときに、光制限物質がそれぞれ、このような細胞による光学干渉を生じることなく検出器によって光学的に検出可能であり、コードが、このような細胞の少なくとも１つの特性をコードし、細胞微小構造が、キャリヤーからの光学干渉を生じることなく観察可能であり、空間光学コードが、このような細胞からの光学干渉を生じることなく検出可能である。
【０４４７】
本発明の他の態様は、細胞付着表面に付着した細胞の微小構造を、１つまたは複数の選択された観察波長または光学モダリティで観察し、このような細胞を識別する方法を提供する。この方法は、
（ｉ）複数の細胞キャリヤーを用意する段階
を含み、
キャリヤーがそれぞれ複数の光学光ガイドを有し、光ガイドがそれぞれ上面および下面を有し、上面と下面が光学的に連絡し、そのため上面が光ガイドの入口を形成し、下面が光ガイドの出口を形成し、光ガイドの入口から入った光が光ガイドを伝わって、光ガイドの出口から光ガイドを出ていき、光ガイドが、１つまたは複数の選択された観察波長または光学モダリティで光学的に中立であり、光ガイドが全体として細胞付着表面を形成し、少なくとも１種の光制限物質が少なくとも１つの光ガイドの中に存在して光ガイドの間で空間光学コードを形成し、コードが、このような細胞の少なくとも１つの識別可能な特性を識別し、光制限物質がそれぞれ、１つまたは複数の選択された観察波長または光学モダリティで光学的に中立であり、光制限物質がそれぞれ、このような細胞による光学干渉を生じることなく検出可能であり、空間光学コードが、このような細胞からの光学干渉を生じることなく検出可能であり、
さらに、
（ｉｉ）細胞照明源を用いてこのような細胞を、１つまたは複数の観察波長または光学モダリティで照明する段階
を含み、
細胞照明源が、光制限物質からの光学干渉を生じることなく選択された細胞微小構造を照明するように適合され、
さらに、
（ｉｉｉ）選択された細胞微小構造を観察する段階と、
（ｉｖ）光制限物質照明源を用いて光制限物質を、１つまたは複数の検出波長または光学モダリティで照明する段階
を含み、
光制限物質照明源が、細胞微小構造からの光学干渉を生じることなく光制限物質を照明するように適合され、
さらに、
（ｖ）空間光学コードを形成している光制限物質を検出器を用いて検出し、コードを解読してこのような細胞を識別する段階
を含むことが好ましい。
【０４４８】
本発明は、予め定義された領域またはウェルの中に異なる細胞型を置くのではなく、細胞をキャリヤーに付着させることによって多重化を達成する。これらのキャリヤーは、識別可能な物理特性（サイズ、色、形状）を有し、あるいは、キャリヤーの識別を可能にし、したがってキャリヤーに付着した細胞型の識別を可能にするコード（カラー・バー・コード、蛍光シグネチャなど）を含むことができる。一般に、細胞と結合したキャリヤーを容器（例えば管、マイクロタイター・ウェル）に入れ、対象とする化合物と反応させる。反応後、反応した細胞と結合したキャリヤーを平らな表面の上に載せ、次いで走査機器または顕微鏡によって分析する。機器は、そのコード付きキャリヤーによって細胞型を識別し、細胞のその化合物との反応性をｉｎ ｓｉｔｕで測定する。あるいは、機器は細胞の反応性を、反応を起こさせた同じ容器の中で、キャリヤーを識別し、細胞の化合物に対する応答を分析する同じプロセスに従って直接に分析する。
【０４４９】
一実施形態では、異なる細胞型（例えば細胞系統）を区別可能なキャリヤーに付着させる。細胞と結合した異なるキャリヤーのグループを、レポート検体（通常は蛍光染料）とともに、異なる試験活性化合物をそれぞれが含む別個の容器に入れる。走査機器によってこれらの異なる容器を走査し、それぞれのキャリヤーおよび化合物への曝露によってそれぞれの細胞に起こった生化学的変化によって細胞を識別する。
【０４５０】
別の実施形態では、異なる形態の癌の患者の腫瘍生検材料に由来する細胞懸濁液を得、続いてコード付きキャリヤーに付着させる。次いで、キャリヤーに付着させた細胞を対象とするマーカー（抗体、ＤＮＡプローブ）で標識し、スライドに載せる。このスライドで、キャリヤーの識別およびマーカーに対する細胞の反応性の分析を実施する。この実施形態は、遺伝子発現の分野で特に興味深く、高価で製造が難しい組織マイクロアレイなどのシステムにとって代わる可能性がある。この方法を使用して、新規の遺伝子および重要な遺伝的変化を識別して、異なるマーカーの腫瘍学における診断、予後および治療上の価値を決定することができる。この方法はさらに、多くの異なる悪性疾患の分子的変化の同時スクリーニングを容易にすると考えられる。これらの腫瘍細胞アレイの他の応用は治療法の選択であろう。例えば、Ｈｅｒ−２遺伝子を過剰発現する腫瘍細胞はヘルセプチン（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）によく応答し、発現レベルの低い細胞はこの治療法にあまり応答しないであろう。
【０４５１】
遺伝子発現技術の制癌薬発見への応用は、臨床腫瘍標本の不均質で複雑な性質のため複雑となる。これらの腫瘍から得られる細胞系統の使用によって単純化された方法が提供される。例えば、米国立癌研究所の薬物発見プログラムで使用される６０の細胞系統を、この１０年にわたって一度に１つずつ７０，０００以上の異なる化合物で独立に治療した６０人の患者になぞらえることができる。これらの細胞での薬物活性パターンは薬物の作用および耐性の機構について詳細な情報を提供するので、これによって大きな機会が与えられる（Ｐａｕｌｌ，ら、１９８９、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ， １９９２）。これらの細胞系統または他の細胞型をコード付きキャリヤーに付着させて、治療薬のスクリーニングおよび分析を容易にすることができる。
【０４５２】
他の実施形態では、培養細胞あるいは動物またはヒトの非固体組織または腫瘍（血液サンプル、骨髄など）から分離した細胞を使用して、ホルモンまたは化学療法薬物をスクリーニングすることができる。これによって、白血病およびリンパ腫の分析を改善することができると思われる。さらに、細胞学標本（細針吸引液、膀胱または子宮頸部洗浄液、子宮頸細胞など）をコード付きキャリヤー上へ堆積させて分析することができる。細胞は、キャリヤーに付着させる前または後に懸濁液中で固定し、確立された染色手順で処理することができる。
【０４５３】
他の実施形態では、トランスジェニックまたはモデル生物の標本を細胞懸濁液に変換し、キャリヤーに付着させることができる。これによって、所定の遺伝子に対する応答を、それらが細胞内に存在しないこと、または同じ遺伝的背景を有するトランスジェニック生物間でのそれらの示差的な機能によって測定することができる細胞アレイが生み出される。
【０４５４】
本発明の使用の他の例は、高スループット・ゲノミクス、プロテオミクスなどのマイクロアレイ技術との結合である。この結合によって、さまざまな腫瘍型での多数の遺伝的変化または遺伝子発現パターンの頻度についての情報が提供されるであろう。特定の一実施形態では、乳癌の発達において重要な遺伝子を表す複数のＤＮＡ配列を分析することができるｃＤＮＡアレイを得ることができる。特定の遺伝子が関連するいくつかの発現パターンを示した後、次いでそれをプローブとして使用して、さまざまな臨床サンプルから得た腫瘍細胞をスクリーニングすることができる。コード付き粒子に付着させた細胞は、価値ある情報を生み出すスクリーニング処理を単純にして、胸部癌腫の分子的特性と臨床特性との間の関係を明らかにする。
【０４５５】
１５．３ キャリヤーの実施形態および測定方法
図５６に細胞キャリヤー２０５０を示す。キャリヤー２０５０を使用して、細胞が細胞付着表面２０５２に付着しているときに、１つまたは複数の選択された観察波長または光学モダリティで細胞内の微小構造を観察し、このような細胞を識別することができる。キャリヤー２０５０は複数の光学光ガイド２０５４を有し、光ガイドはそれぞれ上面２０５６および下面２０５８を有し、上面と下面は光学的に連絡し、そのため上面が光ガイドの入口を形成し、下面が光ガイドの出口を形成し、光ガイドの入口から入った光２０６０が光ガイドを伝わって、光ガイドの出口から光ガイドを出ていき、光ガイドが、１つまたは複数の選択された観察波長または光学モダリティで光学的に中立であり、光ガイドが全体として細胞付着表面２０５２を形成し、図示されていない１種または数種の光制限物質が少なくとも１つの光ガイドの中に存在して光ガイドの間で空間光学コードを形成し、光制限物質がそれぞれ、１つまたは複数の選択された観察波長または光学モダリティで光学的に中立であり、１つまたは複数の検出波長または光学モダリティで照明したときに、光制限物質がそれぞれ、このような細胞による光学干渉を生じることなく検出器によって光学的に検出可能であり、コードが、このような細胞の少なくとも１つの特性を識別し、細胞微小構造が、キャリヤーからの光学干渉を生じることなく観察可能であり、コードが、このような細胞からの光学干渉を生じることなく検出可能である。
【０４５６】
図５７に、コード付きキャリヤー２０８０の他の実施形態を示す。キャリヤー２０８０は概ね平らなウェーハの形態の形状を有し、粒子とすることができる。キャリヤー２０８０の周縁は、他のキャリヤーとともに懸濁細胞培養液中に懸濁させた場合に、キャリヤー２０８０の縁が、他のキャリヤーと結合した細胞と接触しその細胞を傷つける可能性があるポイントあるいは鋭いまたは粗い縁を持たないように形作られている。キャリヤー２０８０は、キャリヤー内の異なった位置に並べられたコード要素２０８２を含む。それぞれのコード要素は、それぞれのコード要素に検出可能な特徴を与える、この図では異なる色で示された潜在的な複数の光学特性のうちの１つを有する。
【０４５７】
図５８に、実質的に平らな細胞結合表面を含むキャリヤーの他の実施形態２１１０を示す。キャリヤー２１１０は図５７のキャリヤー２０８０と似ているが、コード要素２０８２の数が少ない。
【０４５８】
図５９に、円筒形スタック配置を有するコード付きキャリヤーの一実施形態２１４０を示す。層２１４２はそれぞれ、潜在的な複数の光学特性の１つを有するコード要素として機能する。コード要素はそれぞれ、カラー・コードを形成する検出可能な色を含む。したがって、スタック中のそれぞれの層２１４２は、異なる空間コード区画を表し、それぞれの層には、光学的に検出可能なＭ＞２個の目印のうちの１つが配置される。
【０４５９】
図６０は、２型のコード付きキャリヤー、すなわち概ね平らなキャリヤー２１７０と円筒形キャリヤー２１７２のコード、細胞特性および読取り／測定システムを比較した図である。左側に示すように、それぞれのキャリヤー上のコード２１７４は、キャリヤーと結合した細胞からの干渉をあまり受けずに検出可能である。図の中央に示すように、代替測定モードを使用すると、コードからの干渉をあまり受けずに、それぞれのキャリヤーと結合した細胞２１７６の特性が測定可能である。図６０の右側は、キャリヤー２１７０および２１７２を分析する異なる型の測定システムを示す。平らなキャリヤー２１７０は、スライドなどの平らな表面（図示せず）に配置される。検出器２１７８および／またはスライドを水平方向に互いに対して動かして、スライド上のこのキャリヤーおよび他のキャリヤーを走査することができる。対照的に、円筒形キャリヤー２１７２はフロー・ベースのシステムを使用して分析される。このシステムでは、毛細管２１８０などの管路中を（矢印で示すように）キャリヤーが流れて検出器２１７８の前を通過する。
【０４６０】
図６１に、概ね平らなキャリヤー２２１６上で２２１２に示すようにコードを読み取り、２２１４に示すように細胞特性を測定する検出システム２２１０を示す。キャリヤーは、顕微鏡スライド２２１８とカバー・ガラス２２２０の間に配置される。光源２２２２が、２２２４に示すようにコード要素２２２６を透過する光を送る。それぞれのコード要素はその光学特性に基づいて光を吸収する。検出器２２２８は、コード要素によって透過／吸収された光の強度、波長および／または他の特性、ならびにキャリヤー内のコード要素の相対または絶対位置を決定し、これによってキャリヤー・コードを読み取る。分析のこの部分の間、細胞２２３０は一般に目に見えない。
【０４６１】
図６１の右側では細胞の蛍光を測定する。２２３４に示すように、光源２２３２が細胞およびキャリヤーに励起光を導く。しかし、キャリヤーは実質的に非蛍光性であり、したがって分析のこの部分の間、キャリヤーは目に見えない。使用する細胞および標識の特性に基づいて、細胞２２３０は光２２３６を発し、光は検出器２２３８へ反射され、検出器は、発射された光の強度、分布および／または他の特性を、任意選択で波長の関数として測定する。
【０４６２】
図６２に、円筒形キャリヤー２２５６上で２２５２に示すようにコードを読み取り、２２５４に示すように細胞特性を測定する検出システム２２５０を示す。このフロー・ベースのシステムでは、毛細管２２５８を使用してキャリヤー２２５６が分析位置まで運ばれる。光源２２６０は、２２６２に示すように、キャリヤー２２５６の長軸に沿ってキャリヤーのそれぞれのコード要素２２６４に光を送る。検出器２２６６は、それぞれのコード要素が透過した光のキャリヤー内での相対および／または絶対位置、ならびに光の強度、波長および／または他の特性を測定する。
【０４６３】
図６２の右側に示すように、代替の光学モードを使用して細胞特性を測定する。光源２２６８は励起光２２７０を送り、細胞２２７２が蛍光を発するようにする。図６１に関して先に説明したと同様に発光２２７４を検出器２２７６によって測定する。
【０４６４】
図６１および６２のシステム２２１０および２２５０はともに、コード付きキャリヤーが提供する細胞付着表面に付着した細胞の中の微小構造を観察する装置を使用する。細胞は、１つまたは複数の選択された観察波長または光学モダリティで観察し、それぞれのキャリヤー上のコードに基づいて識別する。この装置は、細胞付着表面を画定する細胞キャリヤーを含み、キャリヤーは複数の光学光ガイドを有し、光ガイドはそれぞれ上面および下面を有し、上面と下面は光学的に対向し、そのため上面が光ガイドの入口を形成し、下面が光ガイドの出口を形成し、光ガイドの入口から入った光は光ガイドを伝わって、光ガイドの出口から光ガイドを出ていき、光ガイドは、１つまたは複数の選択された観察波長または光学モダリティで光学的に透明である。図６１の平らな実施形態の上面および下面、ならびに図６２の側面がそれぞれ細胞付着表面を形成する。図５６〜６２のキャリヤーの着色領域、すなわち明るい領域および暗い領域は１種または数種の光制限物質を表し、少なくとも１種の光制限物質が少なくとも１つの光学光ガイドの中に存在して、光ガイドの間で空間光学コードを形成し、光制限物質がそれぞれ、観察光源からの１つまたは複数の観察波長または光学モダリティで光学的に透明であり、光源からの１つまたは複数の検出波長または光学モダリティで照明したときに、光制限物質がそれぞれ、このような細胞による光学干渉を生じることなく検出器によって光学的に検出可能であり、コードが、このような細胞の少なくとも１つの特性をコードし、細胞微小構造が、キャリヤーからの光学干渉を生じることなく観察可能であり、空間光学コードが、このような細胞からの光学干渉を生じることなく検出可能である。
【０４６５】
任意選択で上記の装置を本発明の他の態様で使用することができる。この態様は、細胞付着表面に付着した細胞内の微小構造を、１つまたは複数の選択された観察波長または光学モダリティで観察し、このような細胞を識別する方法を提供する。この方法は、
（ｉ）複数の細胞キャリヤーを用意する段階
を含み、
キャリヤーがそれぞれ複数の光学光ガイドを有し、光ガイドがそれぞれ上面および下面を有し、上面と下面が光学的に連絡し、そのため上面が光ガイドの入口を形成し、下面が光ガイドの出口を形成し、光ガイドの入口から入った光が光ガイドを伝わって、光ガイドの出口から光ガイドを出ていき、光ガイドが、１つまたは複数の選択された観察波長または光学モダリティで光学的に中立であり、光ガイドが全体として細胞付着表面を形成し、１種または数種の光制限物質が少なくとも１つの光ガイドの中に存在して光ガイドの間で空間光学コードを形成し、コードが、このような細胞の少なくとも１つの識別可能な特性を識別し、光制限物質がそれぞれ、１つまたは複数の選択された観察波長または光学モダリティで光学的に中立であり、光制限物質がそれぞれ、このような細胞による光学干渉を生じることなく光学的に検出可能であり、空間光学コードが、このような細胞による光学干渉を生じることなく検出可能であり、空間光学コードが、このような細胞からの光学干渉を生じることなく検出可能であり、
さらに、
（ｉｉ）細胞照明源を用いてこのような細胞を、１つまたは複数の観察波長または光学モダリティで照明する段階
を含み、
細胞照明源が、光制限物質からの光学干渉を生じることなく選択された細胞微小構造を照明するように適合され、
さらに、
（ｉｉｉ）選択された細胞微小構造を観察する段階と、
（ｉｖ）光制限物質照明源を用いて光制限物質を、１つまたは複数の検出波長または光学モダリティで照明する段階
を含み、
光制限物質照明源が、細胞微小構造からの光学干渉を生じることなく光制限物質を照明するように適合され、
さらに、
（ｖ）空間光学コードを形成している光制限物質を検出器を用いて検出し、コードを解読してこのような細胞を識別する段階
を含むことが好ましい。
【０４６６】
１５．４ 参考文献
以下の文献には、先に挙げた実施例１５の選択された諸態様についての追加情報が記載されている。
１． Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ， Ｐ．Ｂ． （１９９８） Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２：５９７−６０３．
２． Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ｊ．Ｅ． ａｎｄ Ｎｅｇｕｌｅｓｃｕ， Ｐ．Ａ． （１９９８）． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈ ９：６２４−６３１．
３． Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８）． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２：３９７−４０３．
４． Ｙａｍａｍｕｒａ， Ｋ． （１９９９） Ｐｒｏｇ． Ｅｘｐ． Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｓ． ３５：１３−２４．
５． Ｐｏｌｉｔｅｓ， Ｈ．Ｇ．（１９９６） Ｉｎｔｌ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｐａｔｈｏｌ． ７７：２５７−２６２．
６． Ｓｕｎｄｂｅｒｇ， Ｓ．Ａ． （２０００） Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １１：４７−５３．
７． Ａｐｐｅｌ， Ｊ．Ｒ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ４：９１−１０２．
８． Ｔａｙｌｏｒ， Ｄ．Ｌ． （１９９２） Ａｍ． Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ ８０：３２２−３３５．
９． Ｋｏｎｏｎｅｎ Ｊ．， ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４： ８４４−８４７．
１０． Ｐａｕｌｌ， ｅｔ ａｌ．， ＪＮＣＩ ８１：１０８８， １９８９．
１１． Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：３４３， １９９２．
１２． Ｕｎｇｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：１１３， ２０００．
【０４６７】
以上に記載した開示は、独立した有用性を有する異なる複数の発明を包含する。これらのそれぞれの発明についてはその好ましい形態を開示したが、多数の変更が可能なので、本明細書に開示し説明したその特定の実施形態については本発明を限定するものととらえるべきではない。本発明の内容は、本明細書に開示したさまざまな要素、特徴、機能および／または特性の新規かつ不明の全ての組合せおよび副組合せを含む。同様に、請求項に、単数／複数の別が明示されていない要素またはその同等物が記載されている場合、２つ以上の要素の使用が要求されておらず、または排除されていない場合でも、その請求項は、１つまたは複数の要素の組込みを含むものと理解すべきである。上記の請求項は、開示の発明の１つを対象にした新規かつ不明のある組合せおよび副組合せを特に示すと考えられる。特徴、機能、要素および／または特性の他の組合せおよび副組合せにおいて具体化される発明は、本出願の請求項の補正、あるいは本出願または関連出願での新しい請求項の提示によって請求することができる。このような補正された請求項または新しい請求項も、異なる発明を対象にしたものであるか、または同じ発明を対象にしたものであるかにかかわらず、また、原請求項の範囲とは異なり、これよりよりも幅広く、これよりも幅狭く、またはこれと等しいかどうかにかかわらず、この開示の発明の内容の範囲に含まれるものとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】コード付きキャリヤーを使用した本発明の諸態様に基づく多重細胞分析システムの概略図である。
【図２】細胞集団をコード付きキャリヤー・クラスと結合させる本発明の諸態様に基づく方法の概略図である。
【図３】異なる細胞集団を異なるコード付きキャリヤー・クラスと結合させて非定位置細胞アレイを形成する、本発明の諸態様に基づく方法の概略図である。
【図４】細胞集団を異なるコード付きキャリヤー・クラスと結合させる本発明の諸態様に基づく方法の概略図である。
【図５】本発明の諸態様に基づくコード付き組織構成の概略図である。
【図６】図５のコード付き組織構成中に存在するものなどの組織−キャリヤー・アセンブリーを作製する本発明の諸態様に基づく方法の概略等角図である。
【図７】組織−キャリヤー・アセンブリーを作製する本発明の諸態様に基づく代替方法の概略等角図である。
【図８】同一のコードを有する本発明の諸態様に基づく整然と並べられたコード付きキャリヤー・アレイの概略上面図である。
【図９】概ね図８の線９−９に沿ってとった図８のアレイの側断面図である。
【図１０】同じコードを有する線状コード付きキャリヤー・アレイを作製する本発明の諸態様に基づく方法の概略上面図である。
【図１１】同じコードを有するコード付きキャリヤー・アレイを作製する本発明の諸態様に基づく代替方法の概略上面図である。
【図１２】異なるコードを有する本発明の諸態様に基づく整然と並べられたコード付きキャリヤー・アレイの上面図である。
【図１３】異なるコードを有する整然と並べられたコード付きキャリヤー・アレイを作製する本発明の諸態様に基づく２つの方法の概略上面図である。
【図１４】組織をコード付きキャリヤー・アレイと結合させる本発明の諸態様に基づく方法の概略図である。
【図１５】組織をコード付きキャリヤー・アレイと結合させる本発明の諸態様に基づく代替方法の概略図である。
【図１６】線状組織切片アレイを線状キャリヤー・アレイと結合させる本発明の諸態様に基づく方法の概略図である。
【図１７】多重細胞／モジュレーター分析のための細胞特性として細胞成分の細胞内分布を決定する、本発明の諸態様に基づく方法の概略図である。
【図１８】多重細胞／モジュレーター分析のための細胞特性としてＤＮＡ含有量を測定する、本発明の諸態様に基づく方法の概略図である。
【図１９】多重細胞／モジュレーター分析のための細胞特性として細胞あたりの核数を測定する、本発明の諸態様に基づく方法の概略図である。
【図２０】多重細胞／モジュレーター分析のための細胞特性として小核の存在および／または数を測定する、本発明の諸態様に基づく方法の概略図である。
【図２１】有糸分裂細胞を分析する本発明の諸態様に基づく方法の概略図であって、多重細胞／モジュレーター分析のための細胞特性としての有糸分裂紡錘体の外観および／または機能活性を示す図である。
【図２２】多重患者サンプル分析および／または細胞分析のための細胞特性として正常細胞および病気細胞の遺伝子コピー数を測定する、本発明の諸態様に基づく方法の概略図である。
【図２３】コード付きキャリヤーの多重分析を使用して新規の逆分子薬理学検定を実行する本発明の諸態様に基づく方法を示す流れ図である。
【図２４】Ｇタンパク質結合レセプター（すなわち７回貫通膜レセプター）研究への新規の逆分子薬理学法の本発明の諸態様に基づく応用を示す概略図である。
【図２５】新規の薬物および／または他の有益な化合物を発見するための多重ライブラリー・スクリーニングの、本発明の諸態様に基づく新規の逆分子薬理学法を示す流れ図である。
【図２６】図２５と比較するために、新規の薬物および／または他の有益な化合物を発見するための現行のスクリーニング法を示す流れ図である。
【図２７】コード付きキャリヤーを使用して、所望ターゲット、非所望ターゲットおよび毒性学パネルに作用する複数のモジュレーターの特異性および毒性の差を識別する、本発明の諸態様に基づく多重分析を示す３次元プロットである。
【図２８】コード付きキャリヤーを使用して、モジュレーター（化合物）の効力および特異性を識別する、本発明の諸態様に基づく多重分析を示す３次元プロットである。
【図２９】コード付きファージ・ディスプレイ・ライブラリーを用いた本発明の諸態様に基づく病期フィンガープリンティング法の概略図である。
【図３０】コード付きキャリヤーを使用して高スループット比較プロテオミクスを実行する本発明の諸態様に基づく方法の概略図である。
【図３１】ファージ・ディスプレイ・ライブラリーを使用して対象とするレセプターに対応するリガンドを識別し精製する、本発明の諸態様に基づく方法の概略図である。
【図３２】対象とする血清マーカーを識別する現行の高スループット・プロテオミクス法を示す流れ図である。
【図３３】コード付きキャリヤーを使用して対象とする血清マーカーを識別する本発明の諸態様に基づく多疾患型高スループット・プロテオミクス法を示す流れ図である。
【図３４】逆トランスフェクションを使用してトランスフェクションされた細胞の非定位置アレイを作製する本発明の諸態様に基づく方法の概略図である。
【図３５】図３４の非定位置細胞アレイを使用してモジュレーターをスクリーニングする本発明の諸態様に基づく方法の概略図である。
【図３６】逆トランスフェクションさせたアンチセンス核酸によって媒介されたレポーター遺伝子活性の変化を分析する本発明の諸態様に基づく多重分析法の概略図である。
【図３７】細胞セレクターおよび局所捕獲物質と事前結合させたコード付きキャリヤーを使用した本発明の諸態様に基づく多重分析法の概略図である。
【図３８】候補サイトカイン産生モジュレーターおよびサイトカイン捕獲物質と事前結合させたコード付きキャリヤーを使用した本発明の諸態様に基づく多重分析法の概略図である。
【図３９】トランスフェクション物質および候補モジュレーターと事前結合させたコード付きキャリヤーを使用した本発明の諸態様に基づく多重分析法の概略図である。
【図４０】コード付きキャリヤーの部分定位置アレイを使用した本発明の諸態様に基づくライブラリー・スクリーニングの方法の概略図である。
【図４１】フィルム／サンプル・サンドイッチを使用してフィルムからコード付きキャリヤーを作製する本発明の諸態様に基づく方法の概略図である。
【図４２】概ね図４１の線４２−４２に沿って切った図４１のフィルム／サンプル・サンドイッチの断面図である。
【図４３】単一のコードを有する複数のキャリヤーを作り出す本発明の諸態様に基づく方法の概略図である。
【図４４】異なるコードを有する複数のキャリヤーを作り出す本発明の諸態様に基づく方法の概略図である。
【図４５】カラー・コードを有する本発明の諸態様に基づくキャリヤーの上面図である。
【図４６】凹部のない本発明の諸態様に基づくコード付きキャリヤーの等角図である。
【図４７】凹部を有する本発明の諸態様に基づくコード付きキャリヤーの等角図である。
【図４８】複数の凹部および磁気部分を有する本発明の諸態様に基づくコード付きキャリヤーの等角図である。
【図４９】磁気部分を含むコード付きキャリヤーを使用して細胞成分を精製、分析する本発明の諸態様に基づくシステムの概略図である。
【図５０】細胞集団の分析データの強度分布を示す本発明の諸態様に基づくヒストグラムである。
【図５１】背景データの除去および新しい原点の割当てを示す、図５０のヒストグラムから導かれた本発明の諸態様に基づくヒストグラムである。
【図５２】背景データを図５１の新しい原点に対して示す、図５０のヒストグラムから導かれた本発明の諸態様に基づくヒストグラムである。
【図５３】倍率４倍で画像化した細胞集団の細胞尺度「Ｓ」（刺激）を、βガラクトシダーゼ検定中の反応時間の関数としてプロットした本発明の諸態様に基づくグラフである。
【図５４】倍率２倍で画像化した細胞集団の細胞尺度「Ｓ」（刺激）を、βガラクトシダーゼ検定中の反応時間の関数としてプロットした本発明の諸態様に基づくグラフである。
【図５５】倍率１倍で画像化した細胞集団の細胞尺度「Ｓ」（刺激）を、βガラクトシダーゼ検定中の反応時間の関数としてプロットした本発明の諸態様に基づくグラフである。
【図５６】本発明の諸態様に基づく平面コード付きキャリヤーの等角図である。
【図５７】本発明の諸態様に基づく他の平面コード付きキャリヤーの等角図である。
【図５８】本発明の諸態様に基づく他の平面コード付きキャリヤーの等角図である。
【図５９】本発明の諸態様に基づく円筒形コード付きキャリヤーの等角図である。
【図６０】それぞれのキャリヤーのコードを読み取り、細胞特性を測定する間のキャリヤーの異なる外観、および検出器に対するそれぞれのキャリヤーの配置を示す、本発明の諸態様に基づく平面および円筒形キャリヤーの一連の図である。
【図６１】平面キャリヤーのコードを読み取り、キャリヤーと結合した細胞の特性を測定する本発明の諸態様に基づくシステムの側立面図である。
【図６２】円筒形キャリヤーのコードを読み取り、キャリヤーと結合した細胞の特性を測定する本発明の諸態様に基づくシステムの側立面図である。
【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図３２】
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【図３３】
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【図４０】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004537712.tif 000255
【国際調査報告】
2004537712.tif 000256
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