(57)【要約】本明細書において、第二遺伝子が内部リボソーム接近部位の翻訳制御下にある，標的細胞特異的異種転写調節因子（ＴＲＥ）の転写制御下において共転写される第一遺伝子および第二遺伝子を含む、複製受容能のあるアデノウイルスベクターが開示される。そのようなベクターの調製法および使用法もまた提供される。癌治療および遺伝子治療のような適用において、ベクターは標的細胞特異的なウイルス複製を提供する。
2004511203.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一遺伝子および第二遺伝子が標的細胞特異的異種転写調節因子（ＴＲＥ）の転写制御下にあり、第二遺伝子が、その内在性プロモーターにおける突然変異または内在性プロモーターの欠失を有し、かつ内部リボソーム接近部位（Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ；ＩＲＥＳ）の翻訳制御下にあり、ベクターが、遺伝子に機能的に連結されＩＲＥＳを欠く標的細胞特異的ＴＲＥを含むアデノウイルスベクターよりも高い、標的細胞に対する特異性を表す、単一のｍＲＮＡとして共転写される第一（ｆｉｒｓｔ）遺伝子および第二（ｓｅｃｏｎｄ）遺伝子を含む、複製受容能のある（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）アデノウイルスベクター。
【請求項２】
第一遺伝子および第二遺伝子の少なくとも１つがアデノウイルス遺伝子である、請求項１記載のベクター。
【請求項３】
第一遺伝子および第二遺伝子の両方がアデノウイルス遺伝子である、請求項２記載のベクター。
【請求項４】
第一アデノウイルス遺伝子および第二アデノウイルス遺伝子の少なくとも１つがウイルス複製に必須である、請求項２記載のベクター。
【請求項５】
ウイルス複製に必須であるアデノウイルス遺伝子が、アデノウイルス初期遺伝子である、請求項４記載のベクター。
【請求項６】
アデノウイルス初期遺伝子がＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２、またはＥ４を含む、請求項５記載のベクター。
【請求項７】
ウイルス複製に必須であるアデノウイルス遺伝子がアデノウイルス後期遺伝子である、請求項４記載のベクター。
【請求項８】
第一アデノウイルス遺伝子および第二アデノウイルス遺伝子の両方がウイルス複製に必須である、請求項３記載のベクター。
【請求項９】
第一アデノウイルス遺伝子および第二アデノウイルス遺伝子の少なくとも１つがアデノウイルス初期遺伝子である、請求項８記載のベクター。
【請求項１０】
第一アデノウイルス遺伝子および第二アデノウイルス遺伝子の少なくとも１つがアデノウイルス後期遺伝子である、請求項８記載のベクター。
【請求項１１】
第一アデノウイルス遺伝子がＥ１Ａであり、第二アデノウイルス遺伝子がＥ１Ｂである、請求項８記載のベクター。
【請求項１２】
Ｅ１Ａの内在性プロモーターが欠失している、請求項１１記載のベクター。
【請求項１３】
Ｅ１Ａが、不活性化したＥ１ＡエンハンサーＩを有する、請求項１１記載のベクター。
【請求項１４】
Ｅ１Ｂの内在性プロモーターが不活性化している、請求項１１記載のベクター。
【請求項１５】
Ｅ１Ｂの１９ｋＤａ領域が欠失している、請求項１１記載のベクター。
【請求項１６】
Ｅ１Ａの内在性プロモーターが不活性化しており、かつ、Ｅ１Ｂの内在性プロモーターが不活性化している、請求項１１記載のベクター。
【請求項１７】
Ｅ１Ｂの１９ｋＤａ領域が欠失している、請求項１６記載のベクター。
【請求項１８】
Ｅ１Ａが、不活性化したＥ１ＡエンハンサーＩを有する、請求項１６記載のベクター。
【請求項１９】
内部リボソーム接近部位（ＩＲＥＳ）がＥＭＣＶ由来である、請求項１記載のベクター。
【請求項２０】
ＩＲＥＳがＶＥＧＦ由来である、請求項１記載のベクター。
【請求項２１】
ＩＲＥＳがＨＣＶの５’ＵＴＲ；ＢｉＰの５’ＵＴＲ；またはＰＤＧＦの５’ＵＴＲを含む、請求項１記載のベクター。
【請求項２２】
ＴＲＥが、癌細胞である標的細胞に対して特異的である、請求項１記載のベクター。
【請求項２３】
癌細胞が、前立腺癌細胞、乳癌細胞、肝臓癌細胞、黒色腫細胞、膀胱細胞または結腸癌細胞を含む、請求項２２記載のベクター。
【請求項２４】
ＴＲＥが、プロバシン（ＰＢ）ＴＲＥ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）ＴＲＥ、ムチン（ＭＵＣ１）ＴＲＥ、α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）ＴＲＥ、ｈＫＬＫ２ ＴＲＥ、チロシナーゼＴＲＥ、ヒトウロプラキンＩＩ（ｈＵＰＩＩ）ＴＲＥまたは癌胎児性抗原（ＣＥＡ）ＴＲＥを含む、請求項２２記載のベクター。
【請求項２５】
第一アデノウイルス遺伝子の内在性プロモーターが欠失している、請求項９記載のベクター。
【請求項２６】
第一アデノウイルス遺伝子がＥ１Ａである、請求項２５記載のベクター。
【請求項２７】
第一アデノウイルス遺伝子および／または第二アデノウイルス遺伝子のエンハンサー領域が欠失している、請求項９記載のベクター。
【請求項２８】
第一遺伝子がＥ１Ａであり、エンハンサーがＥ１ＡエンハンサーＩである、請求項２７記載のベクター。
【請求項２９】
ＴＲＥが内在性サイレンサー因子を欠失している、請求項１記載のベクター。
【請求項３０】
アデノウイルスベクターがＥ３領域を含む、請求項１記載のベクター。
【請求項３１】
アデノウイルスがＥ３領域を含む、請求項１１記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３２】
導入遺伝子をさらに含む、請求項１１記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３３】
メラノサイト特異的ＴＲＥの転写制御下にある遺伝子を含むアデノウイルスベクター。
【請求項３４】
遺伝子がアデノウイルス遺伝子である、請求項３３記載のベクター。
【請求項３５】
アデノウイルス遺伝子が複製に必須な遺伝子である、請求項３４記載のベクター。
【請求項３６】
導入遺伝子が第一遺伝子および第二遺伝子と共転写され、該導入遺伝子が別々の内部リボソーム接近部位（ＩＲＥＳ）の翻訳制御下にある、請求項３２記載のベクター。
【請求項３７】
ＩＲＥＳがＥＭＣＶ由来である、請求項３６記載のベクター。
【請求項３８】
ＩＲＥＳがＶＥＧＦ由来である、請求項３６記載のベクター。
【請求項３９】
アデノウイルス死タンパク質遺伝子（ＡＤＰ）をさらに含む、請求項３０記載のベクター。
【請求項４０】
導入遺伝子が細胞毒性遺伝子である、請求項３２記載のベクター。
【請求項４１】
第一アデノウイルス遺伝子がウイルス複製に必須であり、第二アデノウイルス遺伝子がアデノウイルス死タンパク質遺伝子（ＡＤＰ）である、請求項１記載のベクター。
【請求項４２】
第一アデノウイルス遺伝子がＥ１Ａである、請求項４１記載のベクター。
【請求項４３】
Ｅ１Ａの内在性プロモーターが欠失している、請求項４２記載のベクター。
【請求項４４】
Ｅ１ＡがＥ１ＡエンハンサーＩの欠失を有する、請求項４２記載のベクター。
【請求項４５】
第一遺伝子がウイルス複製に必須であり、かつ第二遺伝子がＥ３である、請求項１記載のベクター。
【請求項４６】
第一遺伝子がＥ１Ａである、請求項４５記載のベクター。
【請求項４７】
請求項１記載のベクターを含む組成物。
【請求項４８】
薬学的に許容されうる賦形剤をさらに含む、請求項４７記載の組成物。
【請求項４９】
請求項３０記載のベクターを含む組成物。
【請求項５０】
薬学的に許容されうる賦形剤をさらに含む、請求項４９記載の組成物。
【請求項５１】
請求項１記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５２】
請求項３０記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５３】
Ｅ１Ｂが１９ｋＤａ領域の一部または全部を欠失している、標的細胞特異的異種ＴＲＥの転写制御下にあるＥ１Ｂを含むアデノウイルスベクター。
【請求項５４】
請求項５３記載のアデノウイルスベクターを含む宿主細胞。
【請求項５５】
標的細胞特異的ＴＲＥを含む、複製受容能のあるアデノウイルスベクターを増殖させる方法であり、以下の段階を含む方法：
アデノウイルスベクターが細胞に入り、それにより該アデノウイルスベクターが増殖されるように、請求項１記載のアデノウイルスベクターを、標的細胞特異的ＴＲＥを機能させる哺乳動物細胞と組み合わせる段階。
【請求項５６】
標的細胞における選択的細胞毒性を与える方法であり、以下の段階を含む方法：
細胞を請求項４１記載のアデノウイルスベクターと接触させ、それによりベクターが細胞に入る段階。
【請求項５７】
ベクターが細胞に入る、標的細胞の遺伝子型を改変する方法であり、以下の段階を含む方法：
細胞を請求項１記載のアデノウイルスベクターと接触させる段階。
【請求項５８】
腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であり、以下の段階を含む方法：
アデノウイルスベクターが腫瘍細胞に入って、腫瘍細胞に対する選択的細胞毒性を表すように、腫瘍細胞を請求項４１記載のアデノウイルスベクターと接触させる段階。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、標的細胞において優先的に複製する、内部リボソーム接近部位を含む、新奇の、複製受容能のあるアデノウイルスベクターに関連する。本発明はまた、内部リボソーム接近部位を含むアデノウイルスベクターを用いた細胞の形質導入に関連する。
【０００２】
背景
変化した細胞増殖、特に超増殖を伴う疾患は、重大な健康問題である。例えば、医学研究における数多くの進歩に関わらず、癌は依然として、米国における第二の主要な死因である。産業化した国家においては、およそ５人に１人が癌のために死亡する。外科的切除術、放射線治療および化学療法のような、臨床的医療の従来法は、特に固形腫瘍について著しい失敗率を有する。良性腫瘍に帰結するような新形成は、腫瘍塊の外科的除去により通常完全に治癒する。腫瘍が周囲組織への侵襲によって明らかになるような、悪性になった場合には、根絶するのははるかに困難になる。一旦悪性腫瘍が転移すると、根絶される可能性ははるかに低い。
【０００３】
基底細胞癌を除外しても、米国のみにおいてでさえ、年間百万例を超える癌の新症例が存在し、当国において癌は年間５０万例を超える死亡の原因である。全世界においては、最も一般的な５つの癌は、肺癌、胃癌、乳癌、大腸／直腸癌、および子宮頸癌であり、年間当たりの新たな症例の総数は、６００万例を超える。
【０００４】
米国においては、移行上皮癌（ＴＣＣ）が、膀胱のあらゆる腫瘍の９０％−９５％の原因である。扁平上皮癌（ＳＣＣ）が５％−１０％であり、腺癌がおよそ１％−２％である。扁平上皮細胞および腺腫因子はしばしば、移行細胞腫瘍、特に重度の腫瘍に関連して認められる。膀胱癌は、概して、表在性および侵襲性の疾患に分けられる。決定的な要因は、粘膜に限定される腫瘍と、基底膜を貫通し、固有層にまで拡張した腫瘍との間の識別である。「表在性膀胱腫瘍」という用語は、筋層を侵襲していない腫瘍を表すために一般に使用される。侵襲性腫瘍は、固有筋層、膀胱周囲の線維脂肪組織、または近接する構造を侵襲したものと記載される。上皮内癌（ＣＩＳ）は、非常に変化しやすい経過をたどる膀胱のＴＣＣの重度および攻撃的な症状発現である。
【０００５】
多くの尿路上皮細胞特異的なタンパク質について説明がなされており、ウロプラキンもその１つである。ＵＰＩａおよびＵＰＩｂ（各々２７ ｋＤａおよび２８ ｋＤａ）、ＵＰＩＩ（１５ ｋＤａ）、およびＵＰＩＩＩ（４７ ｋＤａ）を含むウロプラキン（ＵＰ）は、尿路上皮斑の主要タンパク質である内在性膜タンパク質群の一員である。これらの斑は哺乳動物の尿路上皮の先端表面の大部分を占め、尿路上皮先端表面の透過性関門および／または物理的安定器としての役割を担い得る。ウー（Ｗｕ）ら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１３７１６−１３７２４を参照されたい。ＵＰは膀胱特異的なタンパク質であり、移行上皮癌の約８８％を含む、著しい比率の尿路上皮由来の腫瘍において発現される。モル（Ｍｏｌｌ）ら（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ． １４７：１３８３−１３９７；およびウー（Ｗｕ）ら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８：１２９１−１２９７を参照されたい。ヒトＵＰＩＩの発現の調節については研究がなされ、異種遺伝子上において尿路上皮特異的な転写を与えることのできる、マウスＵＰＩＩ遺伝子の上流の３．６ ｋｂ領域が同定された（Ｌｉｎら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：６７９−６８３）。米国特許第５，８２４，５４３号および第６，００１，６４６号も参照されたい。
【０００６】
皮膚およびその他の部位のメラノサイトに由来する悪性新生物である黒色腫は、世界中で発生数が増加しつつある。米国癌共同委員会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ）では、ヒトにおいて生じる眼球外黒色腫の以下の５つの異なる形態を認識している：悪性黒子由来黒色腫；表在拡大型黒色腫；結節型黒色腫；末端部黒子様黒色腫；および分類されないもの。既知の黒色腫関連抗原は、３つの主要な群に分類できる：腫瘍関連の精巣特異的抗原であるＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、およびＰＲＡＭＥ；メラノサイト分化抗原であるチロシナーゼ、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１（Ｔ細胞により認識される黒色種抗原に対する）、ｇｐ１００、チロシナーゼ関連タンパク質−１（ＴＲＰ−１）、チロシナーゼ関連タンパク質−２（ＴＲＰ−２）；ならびに突然変異したまたは異常に発現された抗原であるＭＵＭ−１、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）、β−カテニン、ｇｐ１００−ｉｎ４、ｐ１５、およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ。例えば、カーキン（Ｋｉｒｋｉｎ）ら（１９９８）Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ． １５：１９−３２を参照されたい。チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、およびＴＲＰ−２は、メラニン生合成に関する酵素であり、メラノサイトにおいて特異的に発現される。ＭＡＲＴ−１の抗原性エピトープは、黒色腫ワクチンを開発する目的で広く研究されてきた。免疫優性エピトープ、ＭＡＲＴ−１（２７−３５）は、ＭＡＲＴ−１に対して生じる大多数のＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞クローンにより認識されることが報告されている。これらのＭＡＲＴ−１（２７−３５）に特異的なＣＴＬは、エピトープを発現する自己腫瘍細胞系を特異的に溶解する。フォーレ（Ｆａｕｒｅ）およびコーリルスキー（Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ）（１９９８）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８：７７−８６を参照されたい。しかし、その他の研究者は、そのようなＣＴＬの存在は重要な臨床反応を伴わないことを報告した。リボルティーニ（Ｒｉｖｏｌｔｉｎｉ）ら（１９９８）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８：５５−６３を参照されたい。
【０００７】
癌治療に対する、主要な、実に圧倒的な障害は、選択性の問題である。即ち、正常な細胞の機能に影響を与えずに、腫瘍細胞の増殖を阻害する阻害能である。例えば、前立腺癌の従来的な化学療法においては、治癒比（即ち、正常な細胞致死に対する腫瘍細胞致死の比率）は１．５：１にすぎない。ゆえに、新形成の治療および予防のための、より効果的な治療法および薬学的組成物が必要である。
【０００８】
したがって、特に治療を成功させることが困難な癌に対する、より特異的かつ標的指向性の形態の癌治療の開発が特に重要である。比較的非特異的な、およびしばしば重大な毒性をもたらす従来的な癌治療とは対照的に、悪性細胞を選択的に阻害するまたは殺す一方、無傷の健常な細胞はそのまま残す、より特異的な治療法の適用様式が要求される。
【０００９】
関心対象の遺伝子が悪性細胞に導入される遺伝子治療は、多くの癌の治療へのアプローチとして試みられてきた。例えば、前立腺癌の遺伝子治療の説明については、ブーリカス（Ｂｏｕｌｉｋａｓ）（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １７：１４７１−１５０５を参照されたい。関心対象の遺伝子は、別の化合物を用いた治療によって毒性物質に転換されるタンパク質をコードできる、または、プロドラッグを薬物に転換する酵素をコードできる。例えば、チミジンキナーゼをコードする単純ヘルペスウイルス遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）の導入は、条件付きでガンシクロビルに感受性の細胞を変化させる。ジルストラ（Ｚｊｉｌｓｔｒａ）ら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５；マンスール（Ｍａｎｓｏｕｒ）ら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３６：３４８；ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）ら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：１２３４；アデア（Ａｄａｉｒ）ら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：４５７４；カペッチ（Ｃａｐｅｃｃｈｉ）（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８を参照されたい。または、関心対象の遺伝子は、例えばジフテリア毒素のような、直接的に毒性である化合物をコードできる。これらの治療を癌細胞特異的に変えるため、関心対象の遺伝子を、癌細胞において特異的に（即ち優先的に）活性な転写調節因子（ＴＲＥ）の調節下に置く。細胞特異的なエンハンサーおよび／またはプロモーターをもつＴＲＥを用いることにより、細胞特異的または組織特異的な発現が達成できる。概して、ヒューバー（Ｈｕｂｅｒ）ら（１９９５）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １７：２７９−２９２を参照されたい。
【００１０】
遺伝子転移のために、多くのウイルスベクターおよび非ウイルス送達系（例えばリポソーム）が開発された。遺伝子転移のために提案されたウイルスのうち、アデノウイルスは最も容易に生産および精製されるものの１つである。アデノウイルスはまた、形質導入（即ち、関心対象の遺伝子の標的細胞への導入）の効率が高く、効率的な形質導入のために細胞増殖を必要としないという利点がある。さらに、アデノウイルスは、インビトロおよびインビボにおいて、広範な種類の細胞に感染させることができる。アデノウイルスおよびアデノウイルスベクター系の開発に関する一般的なバックグラウンドの参照については、グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６−４６７；タキフ（Ｔａｋｉｆｆ）ら（１９８１）Ｌａｎｃｅｔ １１：８３２−８３４；バークナー（Ｂｅｒｋｎｅｒ）ら（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１：６００３−６０２０；グラハム（Ｇｒａｈａｍ）（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ ３：２９１７−２９２２；ベット（Ｂｅｔｔ）ら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：５９１１−５９２１；およびベット（Ｂｅｔｔ）ら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：８８０２−８８０６を参照されたい。
【００１１】
アデノウイルスは一般に、宿主細胞の感染に続く、溶菌複製サイクルを経る。感染した細胞の溶解に加えて、アデノウイルスの複製過程は宿主細胞のｍＲＮＡの輸送および翻訳をブロックし、したがって細胞タンパク質の合成を阻害する。アデノウイルスおよびアデノウイルス複製の総説については、シェンク（Ｓｈｅｎｋ），Ｔ．およびホルウィッツ（Ｈｏｒｗｉｔｚ），Ｍ．Ｓ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版、フィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ），Ｂ．Ｎ．ら編、ラベンプレス社、ニューヨーク（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９９６）、第６７章および第６８章を各々参照されたい。
【００１２】
遺伝子転移に使用される場合、アデノウイルスベクターはしばしば、複製欠損であるように設計される、したがって標的細胞において複製しないように意図的に設計される。これらのベクターにおいては、初期アデノウイルス遺伝子産物Ｅ１Ａおよび／またはＥ１Ｂは、しばしば欠失し、形質導入される遺伝子は一般に、欠失したウイルスゲノムのＥ１Ａおよび／またはＥ１Ｂ領域に挿入される。ベット（Ｂｅｔｔ）ら（１９９４）、上記を参照されたい。そのようなベクターは、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂの機能をトランスに与える２９３系のようなパッケージング細胞系において増殖される。グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら（１９８７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ３６：５９−７２；グラハム（Ｇｒａｈａｍ）（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ６８：９３７−９４０を参照されたい。複製欠損のアデノウイルスベクターの、遺伝子の効率のよい形質導入のための媒体としての使用は、特に、ストラトフォード・ペリコーデット（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ）（１９９０）；Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：２４１−２５６；ローゼンフェルド（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ）（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４；ワン（Ｗａｎｇ）ら（１９９１）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ． ３０９：６１−６６；ジャッフェ（Ｊａｆｆｅ）ら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ． １：３７２−３７８；クアンティン（Ｑｕａｎｔｉｎ）ら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：２５８１−２５８４；ローゼンフェルド（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ）（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５；ストラトフォード・ペリコーデット（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ）ら（１９９２）Ｊ． Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ９０：６２６−６３０；レガルレサル（Ｌｅ Ｇａｌ Ｌｅ Ｓａｌｌｅ）ら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９８８−９９０；マストランゲリ（Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ）ら（１９９３）Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９１：２２５−２３４；ラゴット（Ｒａｇｏｔ）ら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６１：６４７−６５０；ハヤスキ（Ｈａｙａｓｋｉ）ら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６９：２３８７２−２３８７５；およびベット（Ｂｅｔｔ）ら（１９９４）、上記、によって記載されている。
【００１３】
複製欠損のアデノウイルスによる癌の治療においては、宿主免疫応答が二段階で反復投与量の持続期間を制限する。第一に、アデノウイルス送達媒体のキャプシドタンパク質自体は免疫原性である。第二に、ウイルス後期遺伝子は形質導入された細胞において頻繁に発現され、細胞性免疫を誘導する。ゆえに、遺伝子発現の一過性の性質と連結された、サイトカイン、腫瘍抑制遺伝子、リボザイム、自殺遺伝子、またはプロドラッグを活性薬物に転換する遺伝子を反復して投与する能力は、遺伝子転移媒体、および、転移媒体のウイルス遺伝子産物の双方の免疫原性により制限される。これらの制限にも関わらず、遺伝子治療のためのアデノウイルスベクターの開発は、ウイルスを、それ自体をエフェクターとするのではなく、関心対象の遺伝子を導入するための媒体として使用することにほぼ完全に焦点を当ててきた。実際、アデノウイルスベクターの複製は、多くは宿主の免疫応答により、望ましくない結果であるとみなされてきた。
【００１４】
しかし、さらに近年、アデノウイルスベクターのエフェクターとしての使用について説明がなされた。国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４０８０、ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４０８４、ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４１３３、ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４１３２、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１６３１２、ＰＣＴ／ＵＳ９５／００８４５、ＰＣＴ／ＵＳ９６／１０８３８、ＰＣＴ／ＥＰ９８／０７３８０および米国特許第５，９９８，２０５号を参照されたい。アデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子は、ラオ（Ｒａｏ）ら（１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第８９巻：７７４２−７７４６）に開示されている。
【００１５】
近年、アデノウイルス複製に関連した細胞毒性効果を利用する、複製受容能のあるアデノウイルスベクターが、選択的な細胞増殖阻害をもたらすための作用物質として記載された。そのような系においては、ウイルス複製に必須な遺伝子の発現を調節するために、細胞特異的な転写調節因子（ＴＲＥ）が使用され、ゆえにウイルス複製はＴＲＥが機能的であるような細胞に制限される。例えば、国際出願番号ＰＣＴ／ＥＰ９９／０７３８０、ヘンダーソン（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ）ら、米国特許第５，６９８，４４３号；ハーレンベック（Ｈａｌｌｅｎｂｅｃｋ）ら、ＰＣＴ／ＵＳ９５／１５４５５および米国特許第５，９９８，２０５号；ロドリゲス（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ）ら（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７：２５５９−２５６３を参照されたい。
【００１６】
国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４０８０は、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、プロバシン（ＰＢ）、α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、カリクレイン（ｈＫＬＫ２）、ムチン（ＭＵＣ１）および癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の発現を制御するものなどの、異種ＴＲＥを含む、複製受容能のある標的細胞特異的なアデノウイルスベクターを開示する。ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４０８４は、肝臓癌細胞などの、ＡＦＰを発現する細胞において特異的に複製する、α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）ＴＲＥを含む、複製受容能のあるアデノウイルスベクターを開示している。
【００１７】
内部リボソーム接近部位（ＩＲＥＳ）は、複数のタンパク質コード領域が連なるバイシストロニック（ｂｉｃｙｓｔｒｏｎｉｃ）またはマルチシストロニック（ｍｕｌｔｉｃｙｓｔｒｏｎｉｃ）なＲＮＡ転写産物内の内部開始コドン（通常ＡＵＧ）からの翻訳を開始する配列である。ＩＲＥＳは、脳心筋炎ウイルスおよび関連ピコルナウイルスにおいて特徴付けられた。例えば、ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）ら（１９９５）ＲＮＡ １：９８５−１０００およびヘルマン（Ｈｅｒｍａｎ）（１９８９）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １４（６）：２１９−２２２を参照されたい。カルジオウイルス、ライノウイルス、アフタウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）フレンドマウス白血病ウイルス（ＦｒＭＬＶ）およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）のようなその他のウイルス由来のｍＲＮＡにおいても、ＩＲＥＳ配列は検出される。ＩＲＥＳの細胞ＲＮＡにおける存在についてもまた記載されている。ＩＲＥＳを含む細胞ｍＲＮＡの例には、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子２、インシュリン様増殖因子、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇ、および酵母転写因子ＴＦＩＩＤおよびＨＡＰ４をコードするものが含まれる。例えば、マセジャック（Ｍａｃｅｊａｋ）ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５３：９０−９４；オー（Ｏｈ）ら（１９９２）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ６：１６４３−１６５３；ヴァグナー（Ｖａｇｎｅｒ）ら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． １５：３５−４４；ヒー（Ｈｅ）ら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：７２７４−７２７８；ヒー（Ｈｅ）ら（１９９６）Ｇｅｎｅ １７５：１２１−１２５；トマニン（Ｔｏｍａｎｉｎ）ら（１９９７）Ｇｅｎｅ １９３：１２９−１４０；ガンボット（Ｇａｍｂｏｔｔｏ）ら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：４５−５３；キャオ（Ｑｉａｏ）ら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：３７３−３７９を参照されたい。ＩＲＥＳ因子を含む発現ベクターについては記載されている。例えば、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／０３６９９および国際出願番号ＰＣＴ／ＥＰ９８／０７３８０を参照されたい。
【００１８】
したがって、細胞特異的な複製がさらに増強され得る一方で、非標的細胞（即ち非癌性細胞）における複製の程度が最小化されるような、より改善された、複製受容能のあるアデノウイルスベクターが引き続き求められている。
【００１９】
本明細書において言及される全ての特許および刊行物の開示は、その全ての内容が参照として組み入れられる。
【００２０】
発明の概要
本発明は、標的細胞特異的異種転写調節因子（ＴＲＥ）の転写制御下において共転写される第一遺伝子および第二遺伝子を含む、改善された、複製受容能のあるアデノウイルスベクターであり、第二遺伝子が内部リボソーム接近部位（ＩＲＥＳ）の翻訳制御下にあるアデノウイルスベクターを提供する。ある態様において、第一遺伝子および第二遺伝子は単一のｍＲＮＡとして共転写され、第二遺伝子はその内在性プロモーターにおける突然変異またはその欠失を有する。本発明はさらに、アデノウイルスベクターを用いた宿主細胞および方法を提供する。
【００２１】
ある局面において、第一遺伝子および／または第二遺伝子は、アデノウイルス遺伝子であり、別の局面において、第一アデノウイルス遺伝子および／または第二アデノウイルス遺伝子は、ウイルスの複製に必須である。必須遺伝子は、例えばＥ１Ａ；Ｅ１Ｂ；Ｅ２；および／もしくはＥ４を含むウイルス初期遺伝子、またはウイルス後期遺伝子であってよい。別の局面において、初期遺伝子はＥ３である。
【００２２】
ある態様において、第一遺伝子はアデノウイルス遺伝子であり、第二遺伝子は治療的遺伝子である。別の態様において、双方の遺伝子はアデノウイルス遺伝子である。さらなる態様において、第一アデノウイルス遺伝子はＥ１Ａであり、第二アデノウイルス遺伝子はＥ１Ｂである。任意に、例えばＥ１Ａのような、ウイルス複製に必須な共転写アデノウイルス遺伝子の１つについての内在性プロモーターは、その遺伝子がただ標的細胞特異的なＴＲＥの転写制御下だけにあるように、欠失している、および／または突然変異している。
【００２３】
別の局面において、本発明は、標的細胞特異的なＴＲＥの調節下におけるウイルス複製に必須なアデノウイルス遺伝子を含むアデノウイルスベクターであり、該アデノウイルス遺伝子がその内在性プロモーターの突然変異またはそれにおける欠失を有するようなアデノウイルスベクターを提供する。ある態様において、アデノウイルス遺伝子はウイルス複製に必須である。別の態様において、アデノウイルス遺伝子は、Ｅ１Ａプロモーターが欠失しており、かつ、Ｅ１Ａ遺伝子が、細胞特異的な異種ＴＲＥの転写制御下にあるようなＥ１Ａである。別の態様において、アデノウイルス遺伝子は、Ｅ１Ｂプロモーターが欠失しており、かつ、Ｅ１Ｂ遺伝子が、細胞特異的な異種ＴＲＥの転写制御下にあるようなＥ１Ｂである。
【００２４】
別の局面において、本発明は、Ｅ１Ｂが、アポトーシスを阻害することが示された産物をコードする、Ｅ１Ｂの１９ｋＤａ領域における欠失またはその突然変異を有するような、標的細胞特異的なＴＲＥの調節下にあるＥ１Ｂを含むアデノウイルスベクターを提供する。
【００２５】
その他の態様において、第一アデノウイルス遺伝子および／または第二アデノウイルス遺伝子のエンハンサー因子が不活性化される。本発明は、Ｅ１Ａエンハンサーが不活性化された、Ｅ１Ａを含むアデノウイルスベクターを提供する。さらに別の態様において、本発明は、Ｅ１Ａプロモーターが不活性化され、Ｅ１ＡエンハンサーＩが不活性化された、Ｅ１Ａを含むアデノウイルスベクターを提供する。さらなる態様において、本発明は、その内在性サイレンサー因子を不活性化されたＴＲＥを含むアデノウイルスベクターを提供する。
【００２６】
細胞特異的な発現を行う任意のＴＲＥが、開示されるベクターにおいて使用できる。ある態様において、ＴＲＥは例えば、前立腺癌細胞、乳癌細胞、肝臓癌細胞、黒色腫細胞、膀胱ｂｌａｄｄｅｒ細胞および／または結腸癌細胞に特異的なＴＲＥを含む。別の態様において、ＴＲＥは、プロバシン（ＰＢ）ＴＲＥ；前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）ＴＲＥ；ムチン（ＭＵＣ１）ＴＲＥ；α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）ＴＲＥ；ｈＫＬＫ２ ＴＲＥ；チロシナーゼＴＲＥ；ヒトウロプラキンＩＩ ＴＲＥ（ｈＵＰＩＩ）および癌胎児性抗原（ＣＥＡ）ＴＲＥを含む。別の態様において、標的細胞特異的なＴＲＥとは、細胞状態特異的ＴＲＥである。さらにその他の態様において、標的細胞特異的なＴＲＥとは、組織特異的なＴＲＥである。
【００２７】
さらなる態様において、アデノウイルスベクターは、細胞特異的なＴＲＥの調節下において共転写される、少なくとも１つの付加的な遺伝子を含む。別の態様において、付加的な共転写遺伝子は、ＩＲＥＳの翻訳制御下にある。
【００２８】
本発明の別の局面において、アデノウイルスベクターは、例えば細胞毒性遺伝子のような導入遺伝子をさらに含む。ある態様において、導入遺伝子は、第一遺伝子および第二遺伝子と同じＴＲＥの転写制御下にあり、任意に、内部リボソーム接近部位の翻訳制御下にある。別の態様において、導入遺伝子は、第一遺伝子および第二遺伝子の転写を制御するＴＲＥと同じ細胞において機能的な異なるＴＲＥの転写制御下にあり、任意に、ＩＲＥＳの翻訳制御下にある。
【００２９】
本発明はまた、本明細書に記載される、複製受容能のあるアデノウイルスベクターを含む組成物を提供する。ある態様において、組成物は薬学的に許容されうる賦形剤をさらに含む。本発明はまた、本明細書に記載される、複製受容能のあるアデノウイルスベクターを含むキットを提供する。
【００３０】
開示されるアデノウイルスベクターを含む宿主細胞もまた提供される。宿主細胞は、ベクターの増殖に使用されるもの、および治療目的のためにベクターが導入されるものを含む。
【００３１】
別の局面において、標的細胞特異的なＴＲＥを機能させる哺乳動物細胞に特異的な、本発明の複製受容能のあるアデノウイルスベクターを増殖するための方法であり、アデノウイルスベクターが細胞に入り、それによって、該アデノウイルスが増殖されるように、本明細書に記載されるアデノウイルスベクターを標的細胞特異的なＴＲＥを機能させるような哺乳動物細胞と組み合わせる段階を含む方法が提供される。
【００３２】
別の局面において、それによってベクターが細胞に入る、本明細書に記載されるアデノウイルスベクターと細胞を接触させる段階を含む、標的細胞における選択的な細胞毒性を与えるための方法が提供される。
【００３３】
本発明は、アデノウイルスベクターが腫瘍細胞に入って、腫瘍細胞に対して選択的な細胞毒性を表すように、本発明のアデノウイルスベクターと腫瘍細胞を接触させる段階を含む、腫瘍細胞、特に標的腫瘍細胞の増殖を抑制する方法をさらに提供する。
【００３４】
別の局面において、生物試料における細胞を本発明のアデノウイルスベクターと接触させる段階、およびアデノウイルスベクターの複製があればそれを検出する段階を含む、標的細胞特異的なＴＲＥを機能させる細胞を検出するための方法が提供される。
【００３５】
別の局面において、アデノウイルスベクターが細胞に入る、本明細書に記載されるように、細胞をアデノウイルスベクターと接触させる段階を含む、標的細胞の遺伝子型を改変するための方法が提供される。
【００３６】
本発明は、アデノウイルス遺伝子がメラノサイト特異的なＴＲＥの転写制御下にある、アデノウイルス遺伝子を含むアデノウイルスベクターを提供する。別の態様において、メラノサイト特異的なＴＲＥはヒトのものである。別の態様において、メラノサイト特異的なＴＲＥは、メラノサイト特異的なプロモーターおよび異種エンハンサーを含む。その他の態様において、メラノサイト特異的なＴＲＥは、メラノサイト特異的なプロモーターを含む。その他の態様において、メラノサイト特異的なＴＲＥは、メラノサイト特異的なエンハンサーおよび異種プロモーターを含む。その他の態様において、メラノサイト特異的なＴＲＥは、メラノサイト特異的なプロモーターおよびメラノサイト特異的なエンハンサーを含む。
【００３７】
いくつかの態様において、メラノサイト特異的なＴＲＥの転写制御下にあるアデノウイルス遺伝子は、複製に必須なアデノウイルス遺伝子である。いくつかの態様において、複製に必須なアデノウイルス遺伝子は初期遺伝子である。別の態様において、初期遺伝子はＥ１Ａである。別の態様において、初期遺伝子はＥ１Ｂである。さらに別の態様において、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂの双方は、メラノサイト特異的なＴＲＥの転写制御下にある。さらなる態様において、複製に必須であるアデノウイルス遺伝子はＥ１Ｂであり、Ｅ１Ｂは１９ｋＤａ領域において欠失を有する。
【００３８】
いくつかの態様において、メラノサイト特異的なＴＲＥは、チロシナーゼ遺伝子の５’隣接領域に由来する。その他の態様において、メラノサイト特異的なＴＲＥは、チロシナーゼ関連タンパク質−１遺伝子の５’隣接領域に由来する。その他の態様において、メラノサイト特異的なＴＲＥは、チロシナーゼ関連タンパク質−２遺伝子の５’隣接領域に由来する。その他の態様において、メラノサイト特異的なＴＲＥは、ＭＡＲＴ−１遺伝子の５’隣接領域に由来する。その他の態様において、メラノサイト特異的なＴＲＥは、黒色腫において異常に発現された遺伝子の５’隣接領域に由来する。
【００３９】
その他の態様において、本発明は、（ａ）メラノサイト特異的なＴＲＥの転写制御下にあるアデノウイルス遺伝子；および（ｂ）Ｅ３領域を含むアデノウイルスベクターを提供する。これらの態様のうち幾つかにおいては、Ｅ３領域はメラノサイト特異的なＴＲＥの転写制御下にある。
【００４０】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載されるメラノサイト特異的なアデノウイルスベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００４１】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載されるメラノサイト特異的なアデノウイルスベクターを含む薬学的組成物を提供する。
【００４２】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載されるメラノサイトアデノウイルスベクターを含むキットを提供する。
【００４３】
別の局面において、ベクターが細胞に入るように、本明細書に記載されるアデノウイルスベクターと細胞を接触させる段階を含む、標的細胞（即ち、メラノサイト特異的なＴＲＥを機能させるまたは誘導する細胞）における選択的な細胞毒性を与えるための方法が提供される。
【００４４】
別の局面において、メラノサイトに特異的なアデノウイルスを増殖するための方法であり、本明細書に記載されるメラノサイト特異的なアデノウイルスベクターをメラノサイトと組み合わせ、それにより該アデノウイルスが増殖される段階を含む方法が提供される。
【００４５】
本発明は、アデノウイルスベクターが黒色腫細胞に入り、黒色腫細胞に対して選択的な細胞毒性を表すように、本発明のメラノサイト特異的なアデノウイルスベクターと黒色腫細胞を接触させる段階を含む、黒色腫細胞の増殖を抑制する方法をさらに提供する。
【００４６】
別の局面において、生物試料における細胞を、本明細書に記載されるメラノサイトアデノウイルスベクターと接触させる段階、および、アデノウイルスベクターの複製があればそれを検出する段階を含む、生物試料における、黒色腫細胞を含むメラノサイトを検出するための方法が提供される。
【００４７】
発明を実施するための形態
本発明者らは、標的細胞特異的異種転写調節因子（ＴＲＥ）の転写制御下において共転写される第一遺伝子および第二遺伝子を含み、第二遺伝子が内部リボソーム接近部位（ＩＲＥＳ）の翻訳制御下にある、改善したアデノウイルスベクターを見出し構築した。ある態様において、第一遺伝子および第二遺伝子は、単一のｍＲＮＡとして共転写され、第二遺伝子はその内在性プロモーターにおける突然変異またはその欠失を有する。別の態様において、少なくとも遺伝子の１つはアデノウイルス遺伝子であり、さらに別の態様において、双方の遺伝子が、ウイルスの複製に必須なアデノウイルス遺伝子を含むアデノウイルス遺伝子である。アデノウイルスベクターは（直接的および／または間接的な）細胞毒性に寄与する、および／または、細胞死を引き起こす遺伝子を含み得る。細胞毒性に寄与するアデノウイルス遺伝子の例は、これらに限定されないが、アデノウイルス死タンパク質遺伝子を含む。
【００４８】
本発明のいくつかの局面において、標的細胞特異的なＴＲＥの転写制御下において共転写される第一遺伝子および第二遺伝子を含み、第二遺伝子がＩＲＥＳの翻訳制御下にあるアデノウイルスベクターは、遺伝子に機能的に連結された、標的細胞特異的なＴＲＥを含みＩＲＥＳを欠くアデノウイルスベクターよりも、標的細胞に対するより高い特異性を表す。いくつかの態様において、標的細胞特異的なＴＲＥの存在による、第一遺伝子および第二遺伝子の優先的な転写および／または翻訳により特異性が与えられる。その他の態様において、特異性は、複製に必須な遺伝子の転写を行う標的細胞特異的なＴＲＥによる、標的細胞におけるアデノウイルスベクターの優先的な複製により与えられる。
【００４９】
本明細書においては、その内在性プロモーターにおける突然変異またはその欠失を有する、ウイルスの複製に必須なアデノウイルス遺伝子を含有する、ＩＲＥＳを含むアデノウイルスベクターもまた開示される。本明細書において開示されるある態様において、アデノウイルスベクターは、その内在性プロモーターの欠失を有するアデノウイルス初期遺伝子Ｅ１Ａを含む。本明細書において開示される別の態様において、アデノウイルスベクターは、その内在性プロモーターの欠失を有するアデノウイルス初期遺伝子Ｅ１Ｂを含む。本明細書において開示されるその他の態様において、Ｅ１Ｂの１９ｋＤａ領域は欠失している。
【００５０】
別の局面において、本明細書において開示されるアデノウイルスベクターは、その内在性エンハンサーにおける突然変異またはその欠失を有するような、ウイルスの複製に必須なアデノウイルス遺伝子を含む。ある態様において、アデノウイルスベクターは、その内在性プロモーターの突然変異またはそれにおける欠失を有する、アデノウイルス初期遺伝子Ｅ１Ａを含む。ある態様において、アデノウイルスベクターは、Ｅ１ＡエンハンサーＩの突然変異またはそれにおける欠失を有する、アデノウイルス初期遺伝子Ｅ１Ａを含む。さらなる態様において、アデノウイルスベクターは、その内在性プロモーターの突然変異またはそれにおける欠失を有する、およびＥ１Ａエンハンサーの突然変異またはそれにおける欠失を有する、アデノウイルス初期遺伝子Ｅ１Ａを含む。さらなる態様において、アデノウイルスベクターは、その内在性プロモーターの突然変異またはそれにおける欠失を有する、アデノウイルス初期遺伝子Ｅ１Ａ、および、その内在性プロモーターの突然変異またはそれにおける欠失を有する、アデノウイルス初期遺伝子Ｅ１Ｂを含む。さらなる態様において、アデノウイルスベクターは、その内在性プロモーターの突然変異またはそれにおける欠失を有する、および、Ｅ１ＡエンハンサーＩの突然変異またはそれにおける欠失を有する、アデノウイルス初期遺伝子Ｅ１Ａ、および、その内在性プロモーターの突然変異またはそれにおける欠失を有する、アデノウイルス初期遺伝子Ｅ１Ｂを含む。本明細書において開示されるその他の態様において、Ｅ１Ｂの１９ｋＤａ領域が欠失している。
【００５１】
本発明の複製受容能のあるアデノウイルスベクターは、これまではアデノウイルスベクターの望ましくない局面と考えられていたもの、即ち、それらの複製および可能性のある共同性の免疫原性を利用する。ウイルス複製についての細胞特異的な要求物によって、流出感染は予防される。特定の理論に縛られるわけではないが、アデノウイルスタンパク質の産生が、広くまたは特異的に、アデノウイルスタンパク質を産生する標的細胞に対する免疫系を活性化および／または刺激する役割を担い得ることが注目される。この種の免疫刺激は、患者がしばしば中等度から重篤な免疫無防備状態になる癌の状況においては、重要な考察事項となり得る。
【００５２】
２つまたはそれ以上の遺伝子の翻訳を連結する遺伝子間ＩＲＥＳ因子を含む、本発明のアデノウイルスベクターは、ベクターにおける相同的な調節領域の存在に基づく相同的組換えについてのあらゆる潜在性が除かれた場合、２つまたはそれ以上の望ましい遺伝子の発現を促進するために同一の調節領域を用いるベクター構築物に係る改善を反映する。本明細書に記載されているように、ＩＲＥＳを含むアデノウイルスベクターは安定であり、ある態様において、ＩＲＥＳを含まないベクターよりも高い特異性を提供する。遺伝子間ＩＲＥＳを含むアデノウイルスベクターの別の利点は、第二のＴＲＥよりもむしろＩＲＥＳを使用することにより、治療的遺伝子のような付加的な遺伝子のために、ベクターにおける付加的な空間を提供できるということである。
【００５３】
したがって、ＩＲＥＳの調節下にある第二遺伝子を含むアデノウイルスベクターは、高レベルの標的細胞特異性を維持し、標的細胞において安定を保つ。よって、本発明のある局面において、本明細書において開示されるウイルスベクターは、マルチシストロニック転写産物の生成が、標的細胞特異的異種ＴＲＥにより制御される、マルチシストロニック転写産物内に少なくとも１つのＩＲＥＳを含む。ＩＲＥＳの調節下にある第二遺伝子を含むアデノウイルスベクターについては、ＩＲＥＳの翻訳制御下にある遺伝子の内在性プロモーターが、第二遺伝子の転写を妨げないように欠失されることが好ましい。ＩＲＥＳが開始コドンを含む場合、第二遺伝子がＩＲＥＳとインフレームであることが好ましい。ＡＴＧのような開始コドンがＩＲＥＳにおいて存在する場合、第二遺伝子の開始コドンが除去され、ＩＲＥＳおよび第二遺伝子がインフレームであることが好ましい。または、ＩＲＥＳが開始コドンを含まない場合、または開始コドンがＩＲＥＳから除去されている場合、第二遺伝子の開始コドンが使用される。ある態様において、アデノウイルスベクターは、細胞特異的異種ＴＲＥの転写制御下にある、アデノウイルス必須遺伝子、Ｅ１Ａ遺伝子およびＥ１Ｂ遺伝子、および、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂの間に導入されたＩＲＥＳを含む。ゆえに、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂの双方は、共通の転写制御下にあり、Ｅ１Ｂコード領域の翻訳は、ＩＲＥＳの存在によって得られる。ある態様において、Ｅ１Ａはその内在性プロモーターを欠失している。別の態様において、Ｅ１Ａはある内在性エンハンサーを欠失しており、さらにさらなる態様において、Ｅ１Ａはその内在性プロモーターを欠失し、Ｅ１ＡエンハンサーＩを欠失している。別の態様において、Ｅ１Ｂはその内在性プロモーターを欠失している。本明細書において開示されるその他の態様において、Ｅ１Ｂの１９ｋＤａ領域が欠失している。
【００５４】
標的細胞に対する細胞毒性を提供するため、細胞毒性効果をもつ１つまたはそれ以上の導入遺伝子をベクターにおいて存在させることができる。さらに、または代わりに、アデノウイルス死タンパク質（ＡＤＰ）遺伝子のような、細胞毒性および／または細胞死に寄与するアデノウイルス遺伝子を、任意に異種ＴＲＥの選択的な転写制御下、および任意にＩＲＥＳの翻訳制御下にあるように、ベクターに含み得る。
【００５５】
細胞毒性活性を持続することが望ましい、および／または耐性がある任意の細胞が標的細胞となり得るが、標的細胞の例には、新生物形成細胞が含まれる。標的細胞特異的なＴＲＥを含むアデノウイルスベクターを、インビトロまたはインビボにおいて、標的細胞および非標的細胞の混合物と組み合わせることにより、標的細胞においてベクターが優先的に複製し、細胞毒性効果および／または細胞溶解効果を生じる。選択的な細胞毒性活性および／または細胞溶解活性によって一旦標的細胞が破壊されれば、ベクターの複製は著しく減少し、流出感染の可能性および望ましくないバイスタンダー効果を減少させる。標的細胞特異的なＴＲＥが機能的であるような望ましくない標的細胞、例えば癌細胞の存在について、混合物（例えば、生検またはその他の適切な生物試料のようなもの）を引き続いてモニタリングするために、インビトロの培養を維持できる。本発明のアデノウイルスベクターはまた、標的細胞を含む望ましい生物試料が動物個体から除去され、標的細胞特異的なＴＲＥを含む本発明のアデノウイルスベクターへの曝露を受け、その後、動物個体内において置き換えられる、エクスビボにおける手順においても使用できる。
【００５６】
一般的技術
本発明の実施は、他に指示されない限り、当技術分野の範囲内である、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来的技術を使用する。そのような技術は、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ）」第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；「オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」（Ｍ．Ｊ． Ｇａｉｔ編、１９８４）；「動物細胞培養（Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）」（Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；「酵素学における方法論（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」（アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．））；「実験免疫学ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（Ｄ．Ｍ． Ｗｅｉ ＆ Ｃ．Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；「哺乳動物細胞のための遺伝子転移ベクター（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ）」（Ｊ．Ｍ． Ｍｉｌｌｅｒ ＆ Ｍ．Ｐ． Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７および年刊最新版）；「ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）」（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；「免疫学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（Ｊ．Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎら編，１９９１および年刊最新版）のような文献において、完全に記載される。
【００５７】
アデノウイルスに関連する技術については、特に、フェルグナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）およびリンゴールド（Ｒｉｎｇｏｌｄ）（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３７：３８７−３８８；バークナー（Ｂｅｒｋｎｅｒ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）（１９８３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １１：６００３−６０２０；グラハム（Ｇｒａｈａｍ）（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ． ３：２９１７−２９２２；ベット（Ｂｅｔｔ）ら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：５９１１−５９２１；ベット（Ｂｅｔｔ）ら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：８８０２−８８０６を参照されたい。
【００５８】
定義
本明細書において使用されるように、「内部リボソーム接近部位」または「ＩＲＥＳ」とは、シストロン（タンパク質コード領域）のＡＴＧのような開始コドンへの内部リボソームの直接接近を促進し、それにより遺伝子のキャップ非依存的な翻訳を導く因子を指す（Ｊａｃｋｓｏｎ ＲＪ、Ｈｏｗｅｌｌ ＭＴ、Ｋａｍｉｎｓｋｉ Ａ（１９９０）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １５（１２）：４７７−８３；ならびにＪａｃｋｓｏｎ，ＲＪおよびＫａｍｉｎｓｋｉ，Ａ（１９９５）ＲＮＡ １（１０）：９８５−１０００を参照されたい）。本発明は、シストロンの開始コドンへの内部リボソームの直接接近を促進できる任意のＩＲＥＳ因子の使用を包含する。本明細書において用いられる「ＩＲＥＳの翻訳制御下にある」とは、翻訳がＩＲＥＳと関連し、キャップ非依存的な仕方で進むことを意味する。当技術分野において既知の「ＩＲＥＳ」の例は、これらに限定されないが、ピコルナウイルスから得られるＩＲＥＳ（Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９０、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １５（１２）：４７７−４８３）；および、例えば免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｅｚら（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． １８（１１）：６１７８−６１９０）、線維芽細胞増殖因子２、およびインシュリン様増殖因子、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇ、酵母転写因子ＴＦＩＩＤおよびＨＡＰ４のような、ウイルスｍＲＮＡまたは細胞ｍＲＮＡ源から得られるＩＲＥＳを含む。ＩＲＥＳはまた、カルジオウイルス、ライノウイルス、アフタウイルス、ＨＣＶ、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦｒＭＬＶ）およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）のような異なるウイルスにおいて報告されている。本明細書において用いられるように、「ＩＲＥＳ」とは、その変異がシストロンの開始コドンへの内部リボソームの直接接近を促進できる限り、ＩＲＥＳ配列の機能的な変異を包含する。好ましい態様において、ＩＲＥＳは哺乳動物性である。その他の態様において、ＩＲＥＳはウイルス性または原生生物性である。本明細書において開示される、ある実施的な態様において、ＩＲＥＳは脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）（Ｎｏｖｏｇｅｎより市販されている、Ｄｕｋｅら（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６６（３）：１６０２−１６０９）から得られる。本明細書において開示される、別の実施的な態様において、ＩＲＥＳはＶＥＧＦ由来のものである。表１および表２は、本発明において有用な、様々なＩＲＥＳ配列を開示する。
【００５９】
「マルチシストロニック転写産物」とは、１つより多くのタンパク質コード領域、またはシストロンを含むｍＲＮＡ分子を指す。２つのコード領域を含むｍＲＮＡは、「バイシストロニック転写産物」と称される。「５’近接の」コード領域またはシストロンとは、その翻訳開始コドン（通常ＡＵＧ）がマルチシストロニックｍＲＮＡ分子の５’末端に最も近いコード領域である。「５’遠位の」コード領域またはシストロンとは、その翻訳開始コドン（通常ＡＵＧ）がｍＲＮＡの５’末端に最も近い開始コドンではないものである。「５’遠位の」および「下流」という用語は、ｍＲＮＡ分子の５’末端に近接でないコード領域を指すために、同意語として使用される。
【００６０】
本明細書において使用されるように、「共転写される」とは、ポリヌクレオチドの２つ（またはそれ以上）のコード領域が単一の転写調節因子の転写制御下にあることを意味する。
【００６１】
「遺伝子」とは、ポリヌクレオチドのコード領域を指す。「遺伝子」は、非コード配列および／または制御因子を含んでもよく、含まなくてもよい。
【００６２】
本明細書において使用されるように、「転写応答因子」または「転写調節因子」、または「ＴＲＥ」とは、ＴＲＥを機能させる宿主細胞において、機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を増加するポリヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列である。ＴＲＥは、エンハンサーおよび／またはプロモーターを含み得る。「転写制御配列」とはＴＲＥである。「標的細胞特異的な転写応答因子」または「標的細胞特異的なＴＲＥ」とは、特異的な細胞型、即ち、標的細胞において優先的に機能するポリヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列である。したがって、標的細胞特異的なＴＲＥは、標的細胞特異的なＴＲＥを機能させる標的細胞において機能的に連結されたポリヌクレオチド配列を転写する。本明細書において使用されるように、「標的細胞特異的な」という用語は、細胞型特異性、組織特異性、発生段階特異性、および腫瘍特異性、ならびに与えられる標的細胞の癌性状態特異性を含むことが意図される。「標的細胞特異的なＴＲＥ」とは、細胞型特異的ＴＲＥおよび細胞状態特異的なＴＲＥ、ならびに「複合（ｃｏｍｐｒｏｓｉｔｅ）」ＴＲＥを含む。「複合ＴＲＥ」という用語は、細胞型特異的ＴＲＥおよび細胞状態特異的ＴＲＥの両方を含むＴＲＥを含む。標的細胞特異的なＴＲＥはまた、例えばＳＶ４０またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーターを含む、異種成分を含み得る。組織特異的かつ標的細胞特異的なＴＲＥの例は、プロモーターおよびエンハンサーの両方を含むＣＭＶ ＴＲＥである。
【００６３】
本明細書においてさらに詳細が記載されるように、標的細胞特異的なＴＲＥは、これらに限定されないが、標的細胞特異的なプロモーター；および標的細胞特異的なエンハンサー；異種プロモーターおよび標的細胞特異的なエンハンサー；標的細胞特異的なプロモーターおよび異種エンハンサー；異種プロモーターおよび異種エンハンサー；ならびにそれらの多量体を含む、任意の数の構成を含み得る。標的細胞特異的なＴＲＥのプロモーターおよびエンハンサー成分は、望ましい標的細胞特異的な転写活性が得られる限り、関心対象のコード配列からの任意の向きおよび／または距離にあることができる。転写の活性化は、当技術分野において既知の（および下記においてさらに詳細が記載される）多くの方法において測定できるが、一般には、標的細胞特異的なＴＲＥの調節下にある（即ち、機能的に連結された）コード配列のｍＲＮＡまたはタンパク質産物の検出および／または定量により測定される。本明細書において議論されるように、標的細胞特異的なＴＲＥは、様々な長さ、および様々な配列組成のものであってよい。本明細書において使用されるように、「細胞状態特異的なＴＲＥ」という用語は、これらに限定されないが、細胞状態特異的なＴＲＥを機能させる細胞、即ち、異常な生理学的状態を含む、特定の生理学的条件を表す細胞において機能的に連結されたポリヌクレオチドにおいて優先的に機能する、即ち、転写活性化を与える。「細胞の状態」とはゆえに、可逆性であるおよび／または進行性である、所与の、または特定の、細胞の生理学的状態（または条件）を指す。生理学的状態は、内部または外部から生み出し得る；例えば、（低酸素条件に対する反応のような）ある代謝状態であってよい、または、熱または電離放射線によって生み出し得る。「細胞状態」とは、正常な条件下においては不可逆性である細胞の分化状態に関連する「細胞型」とは別のものである。一般に（必須ではないが）、本明細書において議論されるように、細胞状態は、その例が下記に与えられる異常な生理学的状態において具体化される。
【００６４】
標的細胞特異的なＴＲＥの「機能的部分」とは、機能的に連結された遺伝子またはコード領域が標的細胞において優先的に発現されるように、機能的に連結された遺伝子またはコード領域上における標的細胞特異的な転写を与えるものである。
【００６５】
「転写活性化」または「転写における増加」によって、標的細胞（即ち、標的細胞）における転写が、基底レベル以上に、少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５倍、好ましくは少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約２０倍、より好ましくは少なくとも約５０倍、より好ましくは少なくとも約１００倍、より好ましくは少なくとも約２００倍、さらにより好ましくは少なくとも約４００−約５００倍、さらにより好ましくは少なくとも約１，０００倍、増加されることが意図される。基底レベルは一般に、非標的細胞（即ち、異なる細胞型）における（存在する場合の）活性レベル、または、標的細胞系において調べられる、標的細胞特異的なＴＲＥを欠くレポーター構築物の（存在する場合の）活性レベルである。
【００６６】
標的細胞特異的なＴＲＥの「機能的に保存された変異体」とは、別の標的細胞特異的なＴＲＥとは異なるが、（下記に議論されるように）活性化の程度は変化し得るとしても、標的細胞特異的な転写活性をさらに維持する標的細胞特異的なＴＲＥである。標的細胞特異的なＴＲＥにおける差異は、例えば単一塩基突然変異、塩基の付加、欠失、および／または修飾から生じる、直鎖配列における差異による可能性がある。差異はまた、糖、および／または標的細胞特異的なＴＲＥの塩基間の連結における変化によって生じ得る。例えば、ＴＲＥの配列内におけるある点突然変異は、転写因子の結合および転写刺激を減少することが示された。ブラックウッド（Ｂｌａｃｋｗｏｏｄ）ら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：６０−６３およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）ら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７２：２７４９３−２７４９６を参照されたい。当業者には、転写因子結合部位およびその周囲における、塩基のある変化は、転写の刺激および細胞特異性に負の影響を及ぼす可能性がより高い一方、転写因子の結合に関わらない塩基における変化はそのような影響を持つ可能性が低いことが認識される。ある突然変異はまた、ＴＲＥ活性を増加できる。塩基の変化による影響を調べる試験は、ゲル移動度シフトアッセイ法、または、ＴＲＥ機能的細胞およびＴＲＥ非機能的細胞における、これらの変化を含むベクターのトランスフェクションのような、当技術分野において既知の任意の方法により、インビトロまたはインビボにおいて実施できる。さらに、当業者には、配列の転写制御能を変化させずに、ＴＲＥ配列に対して点突然変異および欠失を生じさせ得ることが認識される。
【００６７】
本明細書において使用されるように、特定の遺伝子由来のＴＲＥは、それが由来する遺伝子により言及され、該遺伝子を発現する宿主細胞において機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を制御するポリヌクレオチド配列である。例えば、本明細書において使用されるように、「ヒト腺性カリクレイン転写調節因子」または「ｈＫＬＫ２−ＴＲＥ」とは、前立腺細胞のような、アンドロゲン受容体を発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞）のような、ｈＫＬＫ２−ＴＲＥを機能させる宿主細胞において機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を増加する、ポリヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列である。ゆえにｈＫＬＫ２−ＴＲＥは、アンドロゲン受容体の結合に対して反応性であり、少なくともｈＫＬＫ２プロモーターおよび／またはｈＫＬＫ２エンハンサーの一部（即ち、ＡＲＥまたはアンドロゲン受容体結合部位）を含む。
【００６８】
本明細書において使用されるように、「プロバシン（ＰＢ）転写調節因子」または「ＰＢ−ＴＲＥ」とは、アンドロゲン受容体を発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞、さらにより好ましくは前立腺細胞）のような、ＰＢ−ＴＲＥを機能させる宿主細胞において機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を選択的に増加する、ポリヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列である。ゆえにＰＢ−ＴＲＥは、アンドロゲン受容体の結合に対して反応性であり、少なくともＰＢプロモーターおよび／またはＰＢエンハンサーの一部（即ち、ＡＲＥまたはアンドロゲン受容体結合部位）を含む。
【００６９】
本明細書において使用されるように、「前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）転写調節因子」または「ＰＳＡ−ＴＲＥ」、または「ＰＳＥ−ＴＲＥ」とは、アンドロゲン受容体を発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞、さらにより好ましくは前立腺細胞）のような、ＰＳＡ−ＴＲＥを機能させる宿主細胞において機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を選択的に増加する、ポリヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列である。ゆえにＰＳＡ−ＴＲＥは、アンドロゲン受容体の結合に対して反応性であり、少なくともＰＳＡプロモーターおよび／またはＰＳＡエンハンサーの一部（即ち、ＡＲＥまたはアンドロゲン受容体結合部位）を含む。
【００７０】
本明細書において使用されるように、「癌胎児性抗原（ＣＥＡ）転写調節因子」または「ＣＥＡ−ＴＲＥ」とは、ＣＥＡを発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞、さらにより好ましくはヒト細胞）のような、ＣＥＡ−ＴＲＥを機能させる宿主細胞において機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を選択的に増加する、ポリヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列である。ＣＥＡ−ＴＲＥは、ＣＥＡ産生細胞に関連する転写因子および／または補因子に対して反応性であり、少なくともＣＥＡプロモーターおよび／またはエンハンサーの一部を含む。
【００７１】
本明細書において使用されるように、「α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）転写調節因子」または「ＡＦＰ−ＴＲＥ」とは、ＡＦＰを発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞、さらにより好ましくはヒト細胞）のような、ＡＦＰ−ＴＲＥを機能させる宿主細胞において（機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の）転写を選択的に増加する、ポリヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列である。ＡＦＰ−ＴＲＥは、ＡＦＰ産生細胞に関連する転写因子および／または補因子に対して反応性であり、少なくともＡＦＰプロモーターおよび／またはエンハンサーの一部を含む。
【００７２】
本明細書において使用されるように、「ムチン遺伝子（ＭＵＣ）転写調節因子」または「ＭＵＣ１−ＴＲＥ」とは、ＭＵＣ１を発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞、さらにより好ましくはヒト細胞）のような、ＭＵＣ１−ＴＲＥを機能させる宿主細胞において（機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の）転写を選択的に増加する、ポリヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列である。ＭＵＣ１−ＴＲＥは、ＭＵＣ１産生細胞に関連する転写因子および／または補因子に対して反応性であり、少なくともＭＵＣ１プロモーターおよび／またはエンハンサーの一部を含む。
【００７３】
本明細書において使用されるように、「尿路上皮細胞特異的転写応答因子」または「尿路上皮細胞特異的ＴＲＥ」とは、尿路上皮特異的ＴＲＥを機能させる宿主細胞、即ち標的細胞において機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を増加する、ポリヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列である。様々な尿路上皮細胞特異的ＴＲＥが既知であり、尿路上皮細胞に関連する細胞タンパク質（転写因子および／または補因子）に反応性であり、少なくとも尿路上皮特異的プロモーターおよび／または尿路上皮特異的エンハンサーの一部を含む。本明細書においては、尿路上皮細胞特異的ＴＲＥの活性を測定し、したがって与えられる細胞が尿路上皮細胞特異的ＴＲＥを機能させるかどうかを決定する方法が記載される。
【００７４】
本明細書において使用されるように、「メラノサイト細胞特異的転写応答因子」または「メラノサイト細胞特異的ＴＲＥ」とは、メラノサイト特異的ＴＲＥを機能させる宿主細胞、即ち標的細胞において、機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を増加する、ポリヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列である。様々なメラノサイト細胞特異的ＴＲＥが既知であり、メラノサイト細胞に関連する細胞タンパク質（転写因子および／または補因子）に反応性であり、少なくともメラノサイト特異的プロモーターおよび／またはメラノサイト特異的エンハンサーの一部を含む。本明細書においては、、メラノサイト細胞特異的ＴＲＥの活性を測定し、したがって与えられる細胞がメラノサイト細胞特異的ＴＲＥを機能させるかどうかを決定する方法が記載される。
【００７５】
「Ｅ１Ｂ １９ｋＤａ領域」（「Ｅ１Ｂ １９ｋＤａゲノム領域」と互換的に使用される）とは、Ｅ１Ｂ １９ｋＤａ産物をコードするアデノウイルスＥ１Ｂ遺伝子のゲノム領域を指す。野生型Ａｄ５においては、Ｅ１Ｂ １９ｋＤａ領域は１７１４位のヌクレオチドと２２４４位のヌクレオチドの間に位置する２６１ ｂｐの領域である。Ｅ１Ｂ １９ｋＤａ領域は、例えばラオ（Ｒａｏ）らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９：７７４２−７７４６において記載されている。本発明は、欠失または突然変異がＥ１Ｂ １９ｋＤａに関連するアポトーシスの阻害を低減または除去する限り、Ｅ１Ｂ １９ｋＤａ領域の一部または全部の欠失、およびＥ１Ｂ １９ｋＤａ領域が突然変異した態様を包含する。
【００７６】
本明細書において使用されるように、標的細胞特異的ＴＲＥは、これらに限定されないが、標的細胞特異的プロモーター；標的細胞特異的エンハンサー；標的細胞特異的プロモーターおよび標的細胞特異的エンハンサー；標的細胞特異的プロモーターおよび異種エンハンサー；異種プロモーターおよび標的細胞特異的エンハンサー；ならびにそれらの多量体を含む、任意の数の構成を含み得る。標的細胞特異的ＴＲＥのプロモーターおよびエンハンサー成分は、望ましい標的細胞特異的転写活性が得られる限り、関心対象のコード配列から任意の向きおよび／または距離にあることができる。転写活性化は、当技術分野において既知の（および下記においてさらに詳細が記載される）多くの方法で測定できるが、一般には、標的細胞特異的ＴＲＥの調節下にある（即ち、機能的に連結された）コード配列のｍＲＮＡまたはタンパク質産物の検出および／または定量によって測定される。
【００７７】
本明細書において使用されるように、「優先的に複製する」とは、アデノウイルスが非標的細胞よりも標的細胞においてより多く複製することを意味する。好ましくは、標的細胞において非標的細胞におけるよりも著しく高い効率でアデノウイルスが複製する；好ましくは、少なくとも約２倍高く、好ましくは、少なくとも約５倍高く、より好ましくは、少なくとも約１０倍高く、さらにより好ましくは、少なくとも約５０倍高く、さらにより好ましくは、少なくとも約１００倍高く、さらにより好ましくは、少なくとも約４００−５００倍高く、さらにより好ましくは、少なくとも約１，０００倍高く、最も好ましくは、少なくとも約１×１０６倍高い。最も好ましくは、アデノウイルスは標的細胞においてのみ複製する（つまり、非標的細胞においては複製しない、または非常に低レベルで複製する）。
【００７８】
本明細書において使用されるように、「ベクター」という用語は、１つまたはそれ以上の細胞型の形質導入／トランスフェクションのために設計されたポリヌクレオチド構築物を指す。ベクターは、例えば、挿入されたヌクレオチドの単離、増殖および複製のために設計される「クローニングベクター」、宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現のために設計される「発現ベクター」、または、組換えウイルスまたはウイルス様粒子の産生をもたらすために設計される「ウイルスベクター」、または、１つ以上の種類のベクターの特質を含む「シャトルベクター」であってよい。
【００７９】
「アデノウイルスベクター」または「アデノウイルス性ベクター」（互換的に使用される）とは、本発明のポリヌクレオチド構築物を含む。本発明のポリヌクレオチド構築物は、これらに限定されないが、ＤＮＡ、アデノウイルスの被膜に被包されたＤＮＡ、別のウイルスまたはウイルス様形態（単純ヘルペス、およびＡＡＶのようなもの）にパッケージングされたＤＮＡ、リポソームに被包されたＤＮＡ、ポリリジンと複合体化されたＤＮＡ、合成ポリカチオン分子と複合体化されたＤＮＡ、トランスフェリンと結合されたＤＮＡ、免疫学的に分子を「覆う」ために、および／または半減期を増加するためにＰＥＧのような化合物と複合体化されたＤＮＡ、および非ウイルスタンパク質に結合されたＤＮＡを含む、幾つかのうち任意の形態にあるものであってよい。好ましくは、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。本明細書において使用されるように、「ＤＮＡ」とは、塩基Ａ、Ｔ、ＣおよびＧを含むのみならず、メチル化ヌクレオチド、非電荷結合およびチオアート（ｔｈｉｏａｔｅ）のようなヌクレオチド間修飾、糖類似体の使用、およびポリアミドのような修飾されたおよび／または代替的なバックボーン構造などの、これらの塩基の任意の類似体または修飾型も含む。本発明の目的のためには、アデノウイルスベクターは標的細胞において複製受容能がある。
【００８０】
本明細書において互換的に使用される「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドの重合体化した形態を指す。これらの用語は、単鎖、二重鎖または三重鎖のＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはプリン塩基およびピリミジン塩基、またはその他の天然の、化学的、生化学的に修飾された、非天然または誘導ヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。ポリヌクレオチドのバックボーンは、糖およびリン酸基（ＲＮＡまたはＤＮＡにおいて典型的に認められるように）を、または、修飾または置換された糖またはリン酸基を含み得る。または、ポリヌクレオチドのバックボーンは、ホスホルアミド酸のような合成サブユニットのポリマーを含み得、したがってオリゴデオキシヌクレオシドホスホルアミド酸（Ｐ−ＮＨ２）または混合ホスホルアミド酸−リン酸ジエステルオリゴマーであってよい。ペイロッツ（Ｐｅｙｒｏｔｔｅｓ）ら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４：１８４１−８；チャターヴェディ（Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ）ら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４：２３１８−２３；シュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）ら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４：２９６６−７３を参照されたい。ホスホロチオアート結合を、リン酸ジエステル結合の代わりに使用できる。ブラウン（Ｂｒａｕｎ）ら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４１：２０８４−９；ラティマー（Ｌａｔｉｍｅｒ）ら（１９９５）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３２：１０５７−１０６４を参照されたい。さらに、二重鎖ポリヌクレオチドは、相補鎖を合成し、適切な条件下において鎖をアニールすること、またはＤＮＡポリメラーゼを適切なプライマーと共に用いて相補鎖を新たに合成することのいずれかにより、化学合成単鎖ポリヌクレオチド産物から得ることができる。（配列番号の引用のような）ポリヌクレオチド配列の参照はまた、相補的な配列をも含む。
【００８１】
以下は、限定ではないポリヌクレオチドの例である：遺伝子または遺伝子断片、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体のような修飾ヌクレオチド、ウラシル、フルオロリボースおよびチオアートのようなその他の糖類および結合基、およびヌクレオチド分枝を含み得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断できる。ポリヌクレオチドは、例えば標識成分との結合によって、合成後、さらに修飾できる。この定義に含まれる修飾のその他の種類は、キャップ、天然に生じるヌクレオチドの類似体との１つまたはそれ以上の置換、およびポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識成分、その他のポリヌクレオチド、または固形支持体に付着させる方法の導入である。好ましくは、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。本明細書において使用されるように、「ＤＮＡ」とは、塩基Ａ、Ｔ、ＣおよびＧを含むのみならず、それらの任意の類似体または、メチル化ヌクレオチド、非電荷結合およびチオアートのようなヌクレオチド間修飾、糖類似体の使用、およびポリアミドのような修飾されたおよび／または代替的なバックボーン構造などの、それらの塩基の修飾型も含む。
【００８２】
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域が、他方の配列に対して、ある割合（例えば、８０％、８５％、９０％、または９５％）の「配列同一性」をもつということは、整列化された場合、２つの配列の比較において塩基のその割合は同じであることを意味する。このアラインメントおよび相同性または配列同一性の割合は、例えば「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）補遺３０、第７．７．１８節において記載されるもののような、当技術分野において既知のソフトウェアプログラムを用いて決定できる。好ましい整列化プログラムは、ＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）であり、好ましくは以下のデフォルトパラメータを用いる：ミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）＝ ２；オープンギャップ（ｏｐｅｎ ｇａｐ）＝ ０；エクステンドギャップ（ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ）＝ ２。
【００８３】
「転写制御下にある」とは、当技術分野においてはよく理解される用語であり、ポリヌクレオチド配列、通常ＤＮＡ配列の転写が、転写の開始に寄与する、または転写を促進する因子に、それが使用可能なように（操作的に）連結されることに依存することを示す。「機能的に連結された」とは、因子がそれらを機能させるように並んでいる、並列を指す。
【００８４】
「Ｅ３領域」（「Ｅ３」と互換的に使用される）は、当技術分野においてはよく理解される用語であり、Ｅ３産物（本明細書において議論される）をコードするアデノウイルスゲノムの領域を意味する。一般に、Ｅ３領域は、アデノウイルスゲノムの約２８５８３位と３０４７０位の間に位置する。Ｅ３領域は、例えばウォルド（Ｗｏｌｄ）ら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９：２３７−２７４を含む、様々な刊行物において記載されている。
【００８５】
Ｅ３領域の「一部」とは、全Ｅ３領域より小さいことを意味し、それ自体が、ポリヌクレオチドの欠失、および、１つまたはそれ以上のＥ３領域のポリペプチド産物をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００８６】
本明細書において使用されるように、「細胞毒性」とは、当技術分野においてはよく理解される用語であり、細胞の通常の生化学的または生物学的活性が弱められている（即ち、阻害されている）状態を指す。これらの活性は、これらに限定されないが、代謝；細胞の複製；ＤＮＡ複製；転写；翻訳；分子の取り込みを含む。「細胞毒性」とは、細胞死および／または細胞溶解を含む。当技術分野においては、色素排除テスト、３Ｈ−チミジンの取り込み、およびプラーク試験のような、細胞毒性を示すアッセイ法が知られている。
【００８７】
本明細書において使用されるように、「選択的細胞毒性」という用語は、標的細胞特異的ＴＲＥを機能させない細胞（非標的細胞）において、本発明のアデノウイルスベクターにより与えられる細胞毒性と比較した場合、標的細胞特異的ＴＲＥを機能させるまたは誘導する細胞（標的細胞）において、本発明のアデノウイルスベクターにより与えられる細胞毒性を指す。そのような細胞毒性は、例えば、プラーク試験により、標的細胞を含む腫瘍のサイズにおける減少または安定化、または、腫瘍細胞に特徴的なマーカーまたは組織特異的マーカー、例えば癌マーカーの、血清レベルの減少または安定化により測定できる。
【００８８】
アデノウイルスの文脈において、「異種ポリヌクレオチド」または「異種遺伝子」または「導入遺伝子」とは、野生型アデノウイルスには存在しない、任意のポリヌクレオチドまたは遺伝子である。好ましくは、導入遺伝子は、アデノウイルスべクターによる導入以前には標的細胞においても発現されない、または存在しない。好ましい導入遺伝子の例は下記に提供される。
【００８９】
アデノウイルスの文脈において、「異種」のプロモーターまたはエンハンサーとは、アデノウイルス遺伝子に関連しない、または由来しないものである。
【００９０】
アデノウイルスの文脈において、「内在性」プロモーター、エンハンサー、またはＴＲＥは、アデノウイルスに特有である、または由来する。プロモーターの文脈において、「不活性化」とは、内在性プロモーターの一部または全部において突然変異または欠失があること、即ち、例えば点突然変異または挿入のように、内在性プロモーターに、プロモーターを機能できなくする修飾または変化があることを意味する。
【００９１】
標的細胞特異的ＴＲＥの文脈において、「異種」のプロモーターまたはエンハンサーとは、参照標的細胞特異的ＴＲＥが由来する遺伝子以外の遺伝子に由来するものである。
【００９２】
腫瘍の成長を「抑制すること」とは、本明細書に記載されるアデノウイルスベクターとの接触がない、即ちアデノウイルスベクターによるトランスフェクションがない場合の成長と比較した場合に抑制される成長状態を示す。腫瘍細胞の増殖は、これらに限定されないが、腫瘍サイズの測定、３Ｈ−チミジン取り込みアッセイ法を用いた、腫瘍細胞が繁殖しているかどうかの決定、または腫瘍細胞の計測を含む、当技術分野において既知の任意の方法によって評価できる。腫瘍細胞の増殖を「抑制すること」とは、任意のまたは全ての以下の状態を意味する：腫瘍の成長の減速、遅延、および停止、および腫瘍の縮小。
【００９３】
本明細書において使用されるように、「新生物形成細胞」、「新形成」、「腫瘍」、「腫瘍細胞」、「癌」および「癌細胞」（互換的に使用される）という用語は、細胞繁殖の調節の著しい欠損（即ち、非制御細胞分裂）によって特徴付けられる、異常な成長の表現型を示すように、相対的に自律増殖を表す細胞を指す。新生物形成細胞は悪性または良性のものであってよい。
【００９４】
「宿主細胞」とは、本発明のアデノウイルスベクターのレシピエントであり得る、またはレシピエントであった、個々の細胞または細胞培養を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫細胞を含み、子孫細胞は、天然の、偶発的な、または意図的な突然変異および／または変化により、（形態学的に、または全ＤＮＡ相補性において）元の親細胞に必ずしも完全に同一である必要はない。宿主細胞は、本発明のアデノウイルスベクターを用いて、インビボまたはインビトロにおいてトランスフェクションされたまたは感染した細胞を含む。
【００９５】
「複製」および「増殖」とは、互換的に使用され、本発明のアデノウイルスベクターの再生能または繁殖能を指す。これらの用語は、当技術分野においてはよく理解される。本発明の目的のためには、複製はアデノウイルスタンパク質の産生に関わり、一般にアデノウイルスの再生が行われる。複製は、バースト試験またはプラーク試験のような、当技術分野において標準的な、本明細書に記載されるアッセイ法を用いて測定できる。「複製」および「増殖」とは、これらに限定されないが、ウイルス遺伝子発現；ウイルスタンパク質、核酸またはその他の成分の産生；ウイルス成分の完全なウイルスへのパッケージング；および細胞溶解を含む、ウイルス生産の過程に、直接または間接に関わる任意の活性を含む。
【００９６】
「ＡＤＰコード配列」とは、ＡＤＰまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドである。ＡＤＰの文脈において、ＡＤＰの「機能的断片」とは、アデノウイルスの複製に関して、細胞毒性活性、特に細胞溶解を表すものである。細胞毒性活性の測定法は、当技術分野において既知であり、本明細書に記載される。
【００９７】
ＡＤＰポリペプチドを「コードする」ポリヌクレオチドとは、ＡＤＰポリペプチドまたはその断片を産生するために転写および／または翻訳できるものである。そのようなポリヌクレオチドのアンチセンス鎖もまた、配列をコードすると言われる。
【００９８】
「ＡＤＰポリペプチド」とは、少なくともＡＤＰのアミノ酸配列の一部または領域を含み、ＡＤＰに関連する機能、特に細胞毒性、とりわけ細胞溶解を示すポリペプチドである。本明細書において議論されるように、これらの機能は、当技術分野において既知の技術を用いて測定できる。例えば、ＡＤＰポリペプチドを提供できる、保存的なアミノ酸置換による、ある配列変異が使用できることが理解される。
【００９９】
本明細書において使用されるように、「アンドロゲン受容体」またはＡＲとは、機能がアンドロゲンに特異的に結合することであり、特異的結合の結果として、アンドロゲン反応因子（ＡＲＥ）を認識および結合し、それに続いてＡＲが転写活性を制御できるようなタンパク質を指す。ＡＲは、活性化された場合に細胞アンドロゲン反応性因子に結合する核受容体である。正常な細胞においては、ＡＲはアンドロゲンによって活性化されるが、正常ではない細胞（悪性細胞を含む）においては、ＡＲは、アンドロゲン以外のホルモンを含む非アンドロゲン性物質によって活性化され得る。「アンドロゲン受容体」という用語には、機能が十分保存される限り、アミノ酸の付加、挿入、切断および欠失に特徴付けられるもののような、アンドロゲン受容体の突然変異形態が包含される。突然変異体は、機能が十分保存される限り、アミノ酸の付加、挿入、切断および欠失を有するアンドロゲン受容体を含む。この文脈において、機能的なアンドロゲン受容体は、アンドロゲン、および、アンドロゲンの結合後は、ＡＲＥの両方に結合するものである。
【０１００】
配列番号「に記載された」ポリヌクレオチド配列とは、その配列がその配列番号における同一の連続配列として存在することを意味する。本用語は、配列番号の一部または領域、および配列番号内に含まれる全長配列を包含する。
【０１０１】
「生物試料」とは、個体から得られ、診断アッセイ法またはモニタリングアッセイ法において使用できる、様々な試料型を包含する。本定義は、血液試料および生物学的起源をもつその他の液体試料、生検検体または組織培養またはそれに由来する細胞のような固形組織試料、およびその子孫細胞を包含する。本定義はまた、試薬を用いた処理、可溶化、またはタンパク質またはポリヌクレオチドのようなある成分についての増加によるように、その獲得後に任意の方法において処理された試料をも含む。「生物試料」という用語は、臨床的試料を包含し、また培養における細胞、細胞上清、細胞溶解産物、血清、血漿、生物学的液体、および組織試料をも含む。
【０１０２】
「個体」とは、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物は、これらに限定されないが、家畜、狩猟動物、げっ歯類、霊長類、およびペットを含む。
【０１０３】
「有効量」とは、臨床的な結果を含む、有益なまたは望ましい結果をもたらすのに十分な量である。一回の有効量を、１回またはそれ以上の投与において投与できる。本発明の目的のためのアデノウイルスベクターの有効量は、疾患状態の進行を緩和、改善、安定化、逆転、減速または遅延させるのに十分な量である。
【０１０４】
所与のＴＲＥは、自然界においてその遺伝子に関連する場合、所与の遺伝子「に由来する」。
【０１０５】
「発現」とは、転写および／または翻訳を含む。
【０１０６】
本明細書において使用されるように、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語およびその同系語は、それらの包括的な意味において使用される；つまり、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語およびその対応する同系語と同等である。
【０１０７】
「ある（ａ）（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」とは、文脈により他に明らかに指示されない限り、複数の言及を含む。
【０１０８】
内部リボソーム接近部位（ＩＲＥＳ）
ＩＲＥＳ因子は、ピコルナウイルスｍＲＮＡにおいて最初に発見された（Ｊａｃｋｓｏｎ ＲＪ、Ｈｏｗｅｌｌ ＭＴ、Ｋａｍｉｎｓｋｉ Ａ（１９９０）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １５（１２）：４７７−８３、および、Ｊａｃｋｓｏｎ ＲＪおよびＫａｍｉｎｓｋｉ Ａ（１９９５）ＲＮＡ １（１０）：９８５−１０００）を参照されたい。本発明は、標的細胞特異的異種ＴＲＥの転写制御下において共転写される第一遺伝子および第二遺伝子を含み、第二遺伝子（即ち、コード領域）が内部リボソーム接近部位（ＩＲＥＳ）の翻訳制御下にある、改善されたアデノウイルスベクターを提供する。任意のＩＲＥＳは、それらがベクターにおいて必要な機能を示す限り、本発明のアデノウイルスベクターにおいて使用できる。本発明において使用できるＩＲＥＳの例には、表１において提供され、表２において参照されるものが含まれる。ＩＲＥＳ因子の例には、配列が表１（配列番号：１）に記載されている、ノバゲン社（Ｎｏｖａｇｅｎ）から市販されている脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）（Ｄｕｋｅら（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６６（３）：１６０２−９）が含まれる。本明細書において開示されるＩＲＥＳ因子の別の例は、ＶＥＧＦ ＩＲＥＳ（Ｈｕｅｚら（１９９８）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １８（１１）：６１７８−９０）である。このＩＲＥＳは短いセグメントをもち、その配列は表１に記載されている（配列番号：２）。
【０１０９】
ＩＲＥＳは、下流シストロンの開始コドンへの内部リボソームの直接接近を促進し、キャップ非依存的な翻訳を導く。ゆえに、下流シストロンの産物は、ポリタンパク質の断裂またはモノシストロニックｍＲＮＡの生成のいずれかを必要とせずに、バイシストロニック（またはマルチシストロニック）ｍＲＮＡから発現できる。ゆえに、本発明のある実施的な態様において、ＩＲＥＳの翻訳制御下にあるＥ１Ｂを含むアデノウイルスベクターは、標的細胞特異的ＴＲＥの調節下にあるバイシストロニックＥ１Ａ−Ｅ１Ｂ ｍＲＮＡからＥ１Ｂを翻訳させる。図７は、本発明のアデノウイルス構築物の概略図を提供する。
【０１１０】
内部リボソーム接近部位はおよそ４５０ヌクレオチド長であり、主要な配列の適度な保存および二次構造の強固な保存により特徴付けられる。ＩＲＥＳの最も重要な主要な配列の特徴は、その開始がＩＲＥＳの３’末端のおよそ２５ヌクレオチド上流に位置する、ピリミジンに富む部位である。ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）ら（１９９０）を参照されたい。
【０１１１】
ピコルナウイルスＩＲＥＳの３つの主要なクラスが、同定および特徴付けされた：（１）カルジオウイルス（ｃａｒｄｉｏｖｉｒｕｓ）およびアフタウイルス（ａｐｈｔｈｏｖｉｒｕｓ）クラス（例えば、脳心筋炎ウイルス、Ｊａｎｇら（１９９０）Ｇｅｎｅ Ｄｅｖ ４：１５６０−１５７２）；（２）エンテロウイルスおよびライノウイルスクラス（例えば、ポリオウイルス、Ｂｏｒｍａｎら（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ． １３：３１４９−３１５７）；および（３）Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）クラス（Ｇｌａｓｓら（１９９３）Ｖｉｒｏｌ １９３：８４２−８５２）。最初の２つのクラスについては、２つの一般原則が適用される。第一に、ＩＲＥＳの４５０ヌクレオチド配列のほとんどは、リボソームの結合および翻訳の開始に寄与する特定の二次構造および三次構造を維持するように機能する。第二に、リボソーム接近部位は、保存されたピリミジンの連続した配列のおよそ２５ヌクレオチド下流である、ＩＲＥＳの３’末端に位置するＡＵＧ ３塩基連鎖（ｔｒｉｐｌｅｔ）である。翻訳開始は、リボソーム接近部位（カルジオウイルス）または次の下流ＡＵＧ（エンテロウイルス／ライノウイルスクラス）のいずれかにおいて起こり得る。アフタウイルスにおいては、開始は双方の部位において起こる。
【０１１２】
ＨＣＶおよびウシウイルス性下痢性ウイルス（ＢＶＤＶ）または古典的豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）のようなペスチウイルスは、３４１ヌクレオチド長および３７０ヌクレオチド長の５’ＵＴＲを各々もつ。これらの５’ＵＴＲ断片は、同様のＲＮＡ二次構造を形成し、適度に有効なＩＲＥＳ機能を有し得る（Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａら（１９９２）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６６；１４７６−１４８３；Ｆｒｏｌｏｖ Ｉら（１９９８）ＲＮＡ ４：１４１８−１４３５）。表１は、ＨＣＶゲノム配列からの５’ＵＴＲ領域を表す（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ１４８５３）。
【０１１３】
リーシュマニアＲＮＡウイルス１（ＬＲＶ１）は、二重鎖ＲＮＡウイルスである。その１２８ヌクレオチド長の５’ＵＴＲは、キャップ非依存的な翻訳を促進するためのＩＲＥＳ活性をもつ（Ｍｅｇａら（１９９５）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５：４８８４−４８８９）。この断片はまた、保存されたステムループ二次構造を形成し、少なくともその前部は必須である。
【０１１４】
近年の研究により、フレンドマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）５’ＵＴＲおよびラットレトロトランスポゾンウイルス様３０Ｓ（ＶＬ３０）の配列の双方が、レトロウイルス起源のＩＲＥＳ構造を含むことが示された（Ｔｏｒｒｅｎｔら（１９９６）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ７：６０３−６１２）。これらの断片はまた、レトロウイルス由来のベクターにおいて使用された場合、パッキングシグナルとして機能的である。トリ細網内皮症ウイルスＡ型（ＲＥＶ−Ａ）の研究により、そのＩＲＥＳはパッケージング／二量体化（Ｅ／ＤＬＳ）配列の下流に位置し、最小のＩＲＥＳ配列は、５’先導領域の１２９ヌクレオチド断片（４５２−５８０）内、ｇａｇ ＡＵＧコドンのすぐ上流にあると考えられることが示される（Ｌｏｐｅｚ−Ｌａｓｔｒａら（１９９７）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ８：１８５５−１８６５）。
【０１１５】
真核細胞においては、翻訳は通常、開始因子の調節下において、キャップを付加されたｍＲＮＡ ５’末端からのリボソーム読み取りによって開始される。しかし、幾つかの細胞ｍＲＮＡは、キャップ非依存的な翻訳を仲介するためのＩＲＥＳ構造をもつことが認められている（ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅら（１９９９）Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３１：８７−１０６）。例は、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）（Ｍａｃｅｊａｋら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５３：９０−９４）、ショウジョウバエのアンテナペディアｍＲＮＡ（Ｏｈら（１９９２）Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｄｅｖ ６：１６４３−１６５３）、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）（Ｖａｇｎｅｒら（１９９５）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５：３５−４４）、血小板由来増殖因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら（１９９７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２：９３５６−９３６２）、インシュリン様増殖因子ＩＩ（Ｔｅｅｒｉｎｋら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２６４：４０３−４０８）、および翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇ（Ｇａｎら（１９９６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１：６２３−６２６）である。表１は、ＢｉＰおよびＰＤＧＦの５’非コード領域を示す。近年、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）もまた、ＩＲＥＳ因子をもつことが認められた（Ｓｔｅｉｎら（１９９８）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １８：３１１２−３１１９；Ｈｕｅｚら（１９９８）　Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １８：６１７８−６１９０）。
【０１１６】
ピリミジンの連続した配列を除いて、ヌクレオチド配列自体はＩＲＥＳ機能に重要であるとは考えられない。特定の理論に縛られるわけではないが、ＩＲＥＳの機能について可能な説明は、それが、哺乳動物のリボソーム（リボソームタンパク質および／またはリボソームＲＮＡ成分のいずれか）、および／または開始因子、および／またはリボソームおよび／または開始因子と相互作用するＲＮＡ結合タンパク質との相互作用に寄与する三次元構造におけるその配列の特定の単鎖領域を配向する、二次構造および／または三次構造を形成するというものである。ＩＲＥＳの三次元構造が、１つまたはそれ以上のＲＮＡ結合タンパク質により決定される、または安定化されることもまた可能である。ゆえに、同様の三次元構造において同様の単鎖領域をもつ合成ＩＲＥＳ配列を考案することができる。
【０１１７】
ある場合においては、１つまたはそれ以上のトランス作用細胞タンパク質がＩＲＥＳ機能のために必要でありうる。例えば、ＨＡＶおよびエンテロウイルス／ライノウイルスＩＲＥＳは、網赤血球溶解産物においてはインビトロにおいて不十分に機能する。ＨｅＬａ、Ｋｒｅｂｓ ＩＩ腹水、またはＬ細胞からの細胞質抽出物によって網赤血球溶解産物を補足することにより、エンテロウイルス／ライノウイルスＩＲＥＳの活性は回復される。例えば、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら（１９７９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９７：３９６−４０５；およびドーナー（Ｄｏｒｎｅｒ）ら（１９８４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ５０：５０７−５１４を参照されたい。ＨＡＶ ＩＲＥＳのインビトロの活性は、肝臓細胞質の抽出物によって刺激される。グラス（Ｇｌａｓｓ）ら（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９３：１０４７−１０５０を参照されたい。これらの観察により、細胞特異的な翻訳制御は細胞特異的ＩＲＥＳの使用によって達成できることが示される。さらに、ウイルス複製の細胞特異性をさらに増加するため、協働する細胞特異的転写調節因子および細胞特異的翻訳制御因子をベクターに含み得る。例えば、ＡＦＰ−ＴＲＥおよびＨＡＶ−ＩＲＥＳの組み合わせは、肝細胞におけるベクターの優先的な複製を行うために使用することができる。ゆえに、ある実施的な態様において、ベクターは、バイシストロニックＥ１Ａ−Ｅ１Ｂ ｍＲＮＡの転写を制御するＡＦＰ−ＴＲＥを含み、Ｅ１Ｂの翻訳は、ＥＣＭＶ ＩＲＥＳによって制御される。別の実施的な態様において、ベクターは、バイシストロニックＥ１Ａ−Ｅ１Ｂ ｍＲＮＡの転写を制御するプロバシンＴＲＥを含み、Ｅ１Ｂの翻訳は、ＥＣＭＶ ＩＲＥＳによって制御される。さらに別の実施的な態様において、ベクターは、バイシストロニックＥ１Ａ−Ｅ１Ｂ ｍＲＮＡの転写を制御するＣＭＶ−ＴＲＥを含み、Ｅ１Ｂの翻訳は、ＥＣＭＶ ＩＲＥＳによって制御される。
【０１１８】
本発明において使用できるＩＲＥＳの例は、表１および表２において提供されるものを含む。本発明において使用できるＩＲＥＳ配列は、以下のように試験することができる。試験ベクターは、例えば試験されるＩＲＥＳの翻訳制御下に置かれた、ルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子をもつように作製される。望ましい細胞型を、望ましいＩＲＥＳレポーター遺伝子を含むベクターを用いてトランスフェクションし、レポーター遺伝子の存在を検出するためのアッセイ法を実施する。ある実施的な例においては、試験ベクターは、ＣＭＶプロモーターによって転写促進される、共転写されるクロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）およびルシフェラーゼをコードする遺伝子を含み、ルシフェラーゼコード遺伝子は、試験されるＩＲＥＳによって翻訳促進される。宿主細胞は、当業者に既知の方法により、試験ベクターを用いて一過的にトランスフェクションされ、ルシフェラーゼの存在についてアッセイされる。
【０１１９】
ＩＲＥＳは、当技術分野において既知の標準的な組換え法および合成法を用いて、および実施例において記載されるように、調製されうる。クローニングの便宜のため、使用されるＩＲＥＳ断片末端に制限酵素認識部位を組み込むことができる。
【０１２０】
転写応答因子（ＴＲＥ）
本発明のアデノウイルスベクターは、特定の標的細胞における操作的に連結された遺伝子の優先的な発現を行う標的細胞特異的ＴＲＥを含む。ＴＲＥは、組織または腫瘍に存在する細胞型によって、組織特異的、腫瘍特異的、発生段階特異的、細胞状態特異的等であってよい。
【０１２１】
細胞特異的および組織特異的な転写調節因子、およびその同定、単離、特徴付け、遺伝子操作の方法、および操作的に連結されたコード配列の制御のための使用は、当技術分野においてよく知られている。ＴＲＥは、単一の遺伝子の転写制御配列に由来できる、または、異なる遺伝子に由来する配列を、機能的ＴＲＥを作製するために組み合わせることができる。細胞特異的ＴＲＥは、例えば前立腺細胞または肝細胞のような、限られた集団（または種類）の細胞において優先的に機能する。したがって、ある態様において、使用されるＴＲＥは、以下の細胞型の任意のものにおいて優先的に機能する：前立腺；肝臓；乳房；尿路上皮細胞（膀胱）；結腸；肺；卵巣；膵臓；胃；および子宮の細胞。その他の態様において、以下においてまたは以下の期間、細胞状態に従って、ＴＲＥは機能的である：低酸素条件（低酸素症）；Ｓ期のような細胞周期のある段階；温度上昇；電離放射線。
【０１２２】
当技術分野において既知のように、ＴＲＥの活性は誘導可能である。誘導可能なＴＲＥは一般に、誘発因子の不在下においては低い活性を示し、誘発因子の存在下においては上方制御される。誘発因子には、例えば、核酸、ポリペプチド、小分子、有機化合物および／または温度、圧力または低酸素のような環境条件が含まれる。誘導可能なＴＲＥは、ある時点またはある位置においてのみ発現が望まれる場合に、または誘導物質を用いて発現レベルを定量するのが望ましい場合に、好ましい可能性がある。本明細書およびＰＣＴ／ＵＳ９８／０４０８０において記載されるように、例えば、ＰＳＥ−ＴＲＥ、ＰＢ−ＴＲＥおよびｈＫＬＫ２−ＴＲＥからの転写活性は、アンドロゲンによって誘導できる。したがって、本発明のある態様において、アデノウイルスベクターは誘導可能な異種ＴＲＥを含む。
【０１２３】
ＴＲＥ多量体はまた、開示されるベクターにおいて有用である。例えば、ＴＲＥは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのプロモーター断片の縦列のコピーを含み得る。または、ＴＲＥは、１つまたはそれ以上のエンハンサー領域と共に、１つまたはそれ以上のプロモーター領域を含み得る。ＴＲＥ多量体はまた、異なる遺伝子からのプロモーターおよび／またはエンハンサー配列を含み得る。ＴＲＥのプロモーターおよびエンハンサー成分は、望ましい細胞特異的転写活性が得られる限り、互いに関して任意の向きにあることが可能であり、関心対象のコード配列から任意の向きおよび／または任意の距離にあることができる。
【０１２４】
開示されるベクターは、ＴＲＥが機能的である標的細胞において複製が優先的に増強されるように設計される。同じ標的細胞においてＴＲＥが機能的である限り、１つのベクターにおいて１つ以上のＴＲＥが存在できる。しかし、与えられるＴＲＥは、１つ以上の種類の標的細胞において機能的であり得ることに注意することが重要である。例えば、ＣＥＡ−ＴＲＥは、細胞型のうちとりわけ、胃癌細胞、結腸直腸癌細胞、膵臓癌細胞および肺癌細胞において機能する。
【０１２５】
本ベクターにおける使用のためのＴＲＥは、サイレンサーを含んでもよく、含まなくてもよい。サイレンサーの存在（即ち、当技術分野において既知の負の制御因子）は、非標的細胞における転写（およびそれにしたがった複製）の停止を補助する可能性がある。ゆえに、サイレンサーの存在は、非標的細胞においてより効果的に複製を妨げることにより、細胞特異的ベクターの複製を増強し得る。または、サイレンサーの欠如は、標的細胞における複製を刺激し、ゆえに標的細胞特異性を増強し得る。
【０１２６】
当業者には容易に理解されるように、ＴＲＥはポリヌクレオチド配列であり、それ自体が、様々な配列置換に渡って機能を示し得る。ヌクレオチドの置換、付加、および欠失の方法は当技術分野においては既知であり、容易に利用可能な機能的アッセイ法（ＣＡＴまたはルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ法等）は、標準技術の１つによって、配列変異体が必要な細胞特異的転写制御機能を示すかどうかを決定させる。ゆえに、核酸の置換、付加および／または欠失を含む、ＴＲＥの機能的に保存された変異体は、本明細書において開示されるベクターにおいて使用できる。したがって、変異ＴＲＥは、標的細胞における機能を維持するが、最大の機能を示す必要はない。実際、望ましい結果を達成するために、ＴＲＥの最大転写活性化活性は、常に必要ではなく、ＴＲＥの断片によって与えられる誘導レベルは、ある適用については十分であり得る。例えば、疾患状態の治療または緩和に使用される場合、例として、標的細胞が特に毒性でない場合、および／または疾患の拡張が比較的限定される場合は、最大よりも少ない反応性で十分であり得る。
【０１２７】
ある塩基修飾は、発現レベルおよび／または細胞特異性の増強をもたらす可能性がある。例えば、当技術分野において既知のように、ＴＲＥ内における核酸配列の欠失または付加は、転写制御タンパク質結合部位を、正常な構造において存在するよりも互いにより近く、もしくは遠くに移動させ得る、またはそれらがＤＮＡらせんの反対側になり、それによりＴＲＥと結合した転写因子の間の空間的関係が変化し、転写の減少もしくは増加をもたらすように、それらを回転させ得る。ゆえに、特定の理論に縛られるわけではないが、本開示により、ＴＲＥのある修飾が、細胞特異性の増強を含む、ＴＲＥによって行われる発現レベルの調節をもたらす可能性が予測される。発現レベルの増強の達成は、新生物形成成長のより攻撃的な形態の場合において、ならびに／または細胞死のより急速および／もしくは攻撃的なパターンが必ず起きる場合（例えば、免疫無防備状態の個体における）において、特に望ましい。
【０１２８】
ＴＲＥにより行われる転写活性（阻害および増強の両方を含む）は、当技術分野において既知の（および下記においてより詳細が記載される）多くの方法において測定できるが、一般には、ｍＲＮＡおよび／またはＴＲＥの調節下にある（即ち、機能的に連結された）配列によってコードされるタンパク質産物の検出および／または定量によって測定される。
【０１２９】
本明細書において議論されるように、ＴＲＥは多様な長さ、および多様な配列組成のものであってよい。異種ＴＲＥのサイズは、ウイルスベクターの容量によって部分的に決定され、その容量は、ベクターの予想される形態に依存する（以下を参照されたい）。導入遺伝子（以下に議論される）および／または付加的な制御配列のような、望まれ得る、その他の配列の挿入のための潜在的余地を提供するため、一般にＴＲＥについては、最小サイズが好ましい。好ましい態様において、そのような付加的な制御配列はＩＲＥＳである。しかし、付加的な配列が予想されない場合、または、例えば、アデノウイルスベクターが維持され、ウイルスパッケージングの制限なく送達される場合、結果的に生じるアデノウイルスベクターが複製受容能を保つ限り、より大きなＴＲＥ配列が使用できる。
【０１３０】
アデノウイルスベクターを、ウイルス配列の欠失を必要とせずに、ゲノムサイズの総計約５％、またはおよそ１．８ ｋｂまでの外部の配列と共にパッケージングできる。非必須配列がアデノウイルスゲノムから除去される場合、付加的な４．６ ｋｂの挿入物を（即ち、約６．４ ｋｂの全挿入能について）許容できる。欠失できる非必須アデノウイルス配列の例は、Ｅ３配列および、Ｅ４ ＯＲＦ６をコードするもの以外のＥ４配列である。
【０１３１】
非特異的な複製を最小化するため、内在性（例えば、アデノウイルス）ＴＲＥは、好ましくはベクターから除去される。標的細胞特異的複製の促進に加えて、内在性ＴＲＥの除去はまた、アデノウイルスベクターがウイルス粒子内にパッケージングされる場合に特に重要となり得る、ベクターにおけるより大きな挿入能を提供する。さらにより重要なことには、内在性ＴＲＥの欠失は、それによって異種ＴＲＥが欠失され内在性ＴＲＥがその各々のアデノウイルスコード配列の転写制御を行う（ゆえに非特異的な複製をさせる）ような、組換え事象の可能性を妨げる。ある態様において、アデノウイルスベクターは、アデノウイルス遺伝子の内在性転写制御配列が欠失し、１つまたはそれ以上の異種ＴＲＥに置き換えられるように構築される。しかし、内在性ＴＲＥは、十分な細胞特異的複製の優先性が保存される場合は、アデノウイルスベクターにおいて維持できる。これらの態様は、内在性ＴＲＥと複製遺伝子コード部分間に異種ＴＲＥを挿入することによって構築される。必要な細胞特異的複製の優先性は、異種ＴＲＥを機能させる細胞におけるアデノウイルスベクターの複製を、機能させない細胞における複製と比較するアッセイ法を行うことによって決定される。
【０１３２】
一般にＴＲＥは、標的細胞におけるベクターの複製を、ＴＲＥの不在下における複製の基底レベルと比較して、少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５倍、好ましくは少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約２０倍、より好ましくは少なくとも約５０倍、より好ましくは少なくとも約１００倍、より好ましくは少なくとも約２００倍、さらにより好ましくは少なくとも約４００倍−５００倍、さらにより好ましくは少なくとも約１，０００倍増加する。認められる差異は、経験的に（例えば、ＲＮＡブロットアッセイ法、リボヌクレアーゼプロテクション法または当技術分野において既知のその他のアッセイ法を用いたｍＲＮＡレベルの測定によって）決定でき、ベクターの予想される使用および／または望ましい結果に依存する。
【０１３３】
特異的な標的細胞に導入させる、複製受容能のあるアデノウイルスベクターは、標的細胞において優先的に機能するＴＲＥを用いて生じさせ得る。本発明のある態様において、標的細胞は腫瘍細胞である。腫瘍細胞特異的な異種ＴＲＥ、およびそれら各々の標的細胞の限定しない例は以下を含む：プロバシン（ＰＢ）、標的細胞、前立腺癌（ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４１３２）；α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）；標的細胞肝臓癌（ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４０８４）；ムチン様糖タンパク質ＤＦ３（ＭＵＣ１）、標的細胞、乳癌（ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４０８０）；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、標的細胞、結腸直腸癌、胃癌、膵臓癌、乳癌、および肺癌（ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４１３３）；ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ；ｕＰＡ）およびそのレポーター遺伝子、標的細胞、乳癌、結腸癌、および肝臓癌（ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４０８０）；Ｅ２Ｆ１（細胞周期Ｓ期特異的プロモーター）；標的細胞、途絶された網膜芽腫遺伝子機能をもつ腫瘍、およびＨＥＲ−２／ｎｅｕ（ｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕ）、標的細胞、乳癌、卵巣癌、胃癌、および肺癌（ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４０８０）；チロシナーゼ、標的細胞、本明細書に記載されるような黒色腫細胞およびウロプラキン、標的細胞、本明細書に記載されるような膀胱細胞。付加的な標的細胞特異的ＴＲＥの同定、単離、特徴付けおよび利用のための方法は、当業者には容易に利用可能である。
【０１３４】
さらに、腫瘍特異的ＴＲＥは、以下の典型的な遺伝子からの組織特異的なＴＲＥと関連させて使用できる（ＴＲＥが特異的に機能的であるような組織は括弧内）：低酸素反応性因子、血管内皮増殖因子受容体（内皮）、アルブミン（肝臓）、第ＶＩＩ因子（肝臓）、脂肪酸シンセターゼ（肝臓）、フォン・ビルブラント因子（脳内皮）、α−アクチンおよびミオシン重鎖（双方とも平滑筋）、シンセターゼＩ（小腸）、Ｎａ＋−Ｋ＋−Ｃｌ−輸送体（腎臓）。付加的な組織特異的ＴＲＥは当技術分野において知られている。
【０１３５】
本発明のある態様において、標的細胞特異的な、異種ＴＲＥは腫瘍細胞特異的である。ベクターは、単一の腫瘍細胞特異的ＴＲＥ、または、同じ細胞において腫瘍細胞特異的および機能的な複数の異種ＴＲＥを含み得る。別の態様において、ベクターは、腫瘍細胞特異的な１つまたはそれ以上の異種ＴＲＥを含み、付加的に、組織特異的な１つまたはそれ以上の異種ＴＲＥを含むことにより、全てのＴＲＥが同じ細胞において機能的となる。
【０１３６】
前立腺特異的ＴＲＥ
一つの態様において、アデノウイルスベクターは、前立腺細胞に特異的な異種ＴＲＥを含む。前立腺細胞において優先的に機能し、アデノウイルスの複製を前立腺腫瘍の標的にするのに利用可能なＴＲＥとして、例えば、前立腺特異的抗原遺伝子（ＰＳＡ−ＴＲＥ、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ、米国特許第５，６９８，４４３号）、腺性カリクレイン−１遺伝子（ヒト遺伝子由来ｈＫＬＫ２−ＴＲＥ、ＰＣＴ／ＵＳ ９８／１６３１２）、およびプロバシン遺伝子（ＰＢ−ＴＲＥ、ＰＣＴ／ＵＳ ９８／０４１３２）由来のＴＲＥが含まれるが、これらに限定されない。これら三つの遺伝子は全て、前立腺細胞で優先的に発現しており、その発現はアンドロゲンにより誘導される。一般に、アンドロゲン誘導に応答性のある遺伝子の発現は、アンドロゲン受容体（ＡＲ）に仲介される。
【０１３７】
前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）
ＰＳＡは前立腺上皮細胞のみにおいて合成され、これらの細胞が正常であるか、過形成性であるか、または悪性であるかに関わらず合成される。組織特異的発現をするため、ＰＳＡは良性の前立腺過形成（ＢＰＨ）や前立腺癌（ＣａＰ）に対する優れたバイオマーカーである。ＰＳＡの通常の血清中濃度は、典型的には５ ｎｇ／ｍｌ未満であり、その上昇はＢＰＨやＣａＰを示す。ランドウォール（Ｌｕｎｄｗａｌｌ）ら（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２１４：３１７；ランドウォール（Ｌｕｎｄｗａｌｌ）（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １６１：１１５１；およびリーグマン（Ｒｉｅｇｍａｎｎ）ら（１９９１）Ｍｏｌｅｃ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎ． ５：１９２１を参照されたい。
【０１３８】
特に前立腺細胞において、アンドロゲン依存性の細胞特異性を提供するＰＳＡ遺伝子領域は、約６．０ｋｂを含んでいる。シューア（Ｓｃｈｕｕｒ）ら（１９９６）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：７０４３−７０５１を参照されたい。ヒトにおいて約１．５ｋｂにわたるエンハンサー領域は、ＰＳＡ遺伝子の転写開始点に対して−５３２２位から−３７３９位の間に位置している。これらのエンハンサー配列内には、アンドロゲン受容体と結合する配列であるアンドロゲン応答性因子（ＡＲＥ）が存在する。また、ＰＳＡプロモーター配列の座標は、転写開始点に対しておよそ−５４０位から＋８位である。エンハンサーとプロモーターの近接により、完全に機能する最小の前立腺特異的ＴＲＥ（ＰＳＡ−ＴＲＥ）が得られる。このＰＳＡ遺伝子の約６．０ｋｂの領域以外の部分も、必要な機能が維持される限り、本明細書記載のベクター内で利用可能である。
【０１３９】
ヒト腺性カリクレイン（ｈＫＬＫ２）
ヒト腺性カリクレイン（ｈＫＬＫ２、ｈＫ２タンパク質をコードする）は前立腺のみにおいて発現し、その発現はアンドロゲンにより主に転写の活性化を通じて上方制御される。ウォルフ（Ｗｏｌｆ）ら（１９９２）Ｍｏｌｅｃ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ６：７５３−７５２；モーリス（Ｍｏｒｒｉｓ）（１９８９）Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． １６：３４５−３５１；クイ（Ｑｕｉ）ら（１９９０）Ｊ． Ｕｒｏｌ． １４４：１５５０−１５５６；およびヤング（Ｙｏｕｎｇ）ら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３１：８１８−８２４を参照されたい。様々な腫瘍や前立腺癌の患者の血清内で見いだされるｈＫ２のレベルは、ｈＫ２抗原が前立腺癌の有意なマーカーである可能性を示している。チャールズワース（Ｃｈａｒｌｅｓｗｏｒｔｈ）ら（１９９７）Ｕｒｏｌｏｇｙ ４９：４８７−４９３を参照されたい。ｈＫ２の発現が、解析した２５７の根治前立腺切除標本のそれぞれから検出された。ダルソン（Ｄａｒｓｏｎ）ら（１９９７）Ｕｒｏｌｏｇｙ ４９：８５７−８６２を参照されたい。特異的抗体を用いて検出したｈＫ２発現の強度および程度の上昇が、良性の上皮から高程度の前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）および腺癌まで観察された。
【０１４０】
ｈＫＬＫ２プロモーターの活性が説明され、転写開始点に対して−２２５６位までの領域がこれまでに明らかになっている。シェドリッチ（Ｓｃｈｅｄｌｉｃｈ）ら（１９８７）ＤＮＡ ６：４２９−４３７を参照されたい。ｈＫＬＫ２プロモーターはアンドロゲン応答性であり、かつプロモーターのみがレポーター遺伝子の発現を制御するようなプラスミド構築物においては、レポーター遺伝子の発現は、アンドロゲン存在下で約１０倍に上昇する。ムター（Ｍｕｒｔｈａ）ら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３２：６４５９−６４６４を参照されたい。ｈＫＬＫ２のエンハンサー活性は転写開始点に対して約−１２，０１４位から−２２５７位のポリヌクレオチド配列内にみられ、この配列をｈＫＬＫ２プロモーターおよびレポーター遺伝子に機能的に連結させた場合、前立腺細胞における機能的に連結された配列の転写は、アンドロゲン非存在下の転写レベルと比べて、アンドロゲン存在下では約３０倍から約１００倍のレベルにまで上昇する。この誘導は一般にエンハンサー配列の向きや位置には依存しない。またエンハンサー活性は、以下の領域においても示されている：（全て、転写開始点に対して）約−３９９３位から約−３６４３位、約−４８１４位から約−３６４３位、約−５１５５位から約−３３８７位、約−６０３８位から約−２３９４位。
【０１４１】
したがってｈＫＬＫ２エンハンサーをｈＫＬＫ２プロモーターまたは異種プロモーターと機能的に連結させてｈＫＬＫ２転写調節因子（ｈＫＬＫ２−ＴＲＥ）を形成することが可能である。その後ｈＫＬＫ２−ＴＲＥを異種ポリヌクレオチドに機能的に連結させて、連結した遺伝子をｈＫＬＫ２−ＴＲＥ特異的に転写調節し、したがってその発現を増加させることが可能である。
【０１４２】
プロバシン
ラットのプロバシン（ＰＢ）遺伝子は最初にラットの背外側前立腺で特徴付けられた、アンドロゲンおよび亜鉛制御タンパク質をコードする。ドッド（Ｄｏｄｄ）ら（１９８３）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５８：１０７３１−１０７３７；マツシク（Ｍａｔｕｓｉｋ）ら（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ６４：６０１−６０７；およびスイートランド（Ｓｗｅｅｔｌａｎｄ）ら（１９８８）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ８４：３−１５を参照されたい。げっ歯類前立腺の背外側葉は、ヒトの前立腺の末梢帯域に最も相同であると考えられており、ヒトの前立腺癌の約６８％はこの領域から生じると考えられている。
【０１４３】
ＰＢ−ＴＲＥは、プロバシンコード配列の上流の約０．５ｋｂ断片であり、転写開始点に対して約−４２６位から約＋２８位に存在することが示されている。ＰＢ遺伝子由来のこの最小プロモーター配列は、トランスジェニックマウスにおいて機能的に連結された異種遺伝子の前立腺特異的で発生およびホルモンにより調節される発現を行うための、十分な情報を提供することが示されている。グリーンバーグ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）ら（１９９４）Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ８：２３０−２３９を参照されたい。
【０１４４】
α−フェトタンパク質
α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）は癌胎児性のタンパク質で、その発現レベルは組織や発生段階により大きく変化するものの、主に内胚葉起源の発生中の組織に限られている（卵黄嚢、胎児肝臓、および腸）。ＡＦＰの血清濃度は大多数の肝臓癌の患者で上昇しており、とくに病気が進行した患者で高レベルのＡＦＰが見られることから、ＡＦＰは臨床上の関心対象である。患者における高レベルの血清ＡＦＰは、周囲の正常な肝臓においてではなく、肝細胞癌（ＨＣＣ）におけるＡＦＰの発現に起因することが示されている。したがってＡＦＰ遺伝子の発現は肝臓癌の特徴となり得る。ＡＦＰ−ＴＲＥは例えばＰＣＴ／ＵＳ ９８／０４０８４に記載されている。
【０１４５】
公開された報告によると、ＡＦＰ−ＴＲＥは、ＡＦＰ産生細胞に関連する細胞タンパク質（転写因子および／または補因子）、例えばＡＦＰ結合タンパク質（例えば米国特許第５，３０２，６９８号参照）に応答し、少なくともＡＦＰプロモーターおよび／またはＡＦＰエンハンサーの一部を含む。ＡＦＰ遺伝子からは細胞特異的ＴＲＥが同定されている。例えば、ヒトＡＦＰ特異的エンハンサー活性のクローニングおよび特徴付けが、ワタナベ（Ｗａｔａｎａｂｅ）ら（１９８７）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：４８１２−４８１８において説明されている。５’ＡＦＰ調節領域（プロモーター、推定サイレンサー、およびエンハンサーを含む）は、転写開始点から約５ｋｂ上流に含まれている。
【０１４６】
ＡＦＰ調節領域内において、ヒトＡＦＰエンハンサー領域は、ＡＦＰ遺伝子の転写開始点に対して約−３９５４位から約−３３３５位の間に位置している。ヒトＡＦＰプロモーターは、約−１７４位から約＋２９位の領域を含んでいる。この二つの遺伝的要素の近接により、完全に機能的なＡＦＰ−ＴＲＥがもたらされる。イド（Ｉｄｏ）ら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５：３１０５−３１０９は、ＨＣＣ細胞内での発現に特異的な２５９ｂｐのプロモーター断片（−２３０位から＋２９位）を記載している。ＡＦＰエンハンサーは、転写開始点に対して−３９５４位から−３３３５位の間に位置しており、ＡおよびＢと示される二つの領域を含んでいる。プロモーター領域は典型的なＴＡＴＡボックスおよびＣＡＡＴボックスを含む。ＡＦＰ−ＴＲＥが少なくとも一つのエンハンサー領域を含むことが好ましい。ＡＦＰ−ＴＲＥが両方のエンハンサー領域を含むことがさらに好ましい。
【０１４７】
ＡＦＰ−ＴＲＥを含むベクターに対する好適な標的細胞は、ＡＦＰ−ＴＲＥを機能させる任意の細胞型である。好ましくは、ＡＦＰを発現または産生する細胞であり、ＡＦＰを発現している腫瘍細胞も含まれるが、これに限定されない。このような細胞の例としては、肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞、性腺およびその他の生殖細胞の腫瘍（特に内胚葉洞腫瘍）、脳腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、膵臓の腺房細胞癌（Ｋａｗａｍｏｔｏら（１９９２）Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ３９：２８２−２８６）、一次胆嚢腫瘍（Ｋａｔｓｕｒａｇｉら（１９８９）Ｒｉｎｓｈｏ Ｈｏｓｈａｓｅｎ ３４：３７１−３７４）、子宮体腺癌（ｕｔｅｒｉｎｅ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞（Ｋｏｙａｍａら（１９９６）Ｊｐｎ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ８７：６１２−６１７）、ならびに任意の前述の転移（肺、副腎、骨髄および／または脾臓において起こり得る）が挙げられる。いくつかの例では、ある種の膵臓癌および胃癌から肝臓への転移性疾患によりＡＦＰが産生される。ＡＦＰ−ＴＲＥの標的細胞として特に好ましいのは、肝細胞癌細胞および任意のその転移である。
【０１４８】
当技術分野における標準的なイムノアッセイ法、例えば、ＡＦＰタンパク質産生レベルを測定するための、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡもしくはタンパク質免疫ブロット（ウェスタンブロット）を利用し、および／または、ＡＦＰ ｍＲＮＡレベルを測定するためのＲＮＡブロッティング（ノーザンブロット）を用いて、ＡＦＰ産生を測定できる（およびしたがってＡＦＰ産生細胞を同定できる）。または、そのような細胞を、ＡＦＰ−ＴＲＥを転写的に活性化する（すなわちＡＦＰ−ＴＲＥの機能を可能にする）能力により同定することができ、かつ／または特徴付けることができる。
【０１４９】
またＡＦＰ−ＴＲＥに関しては共有されている（ｃｏ−ｏｗｎｅｄ）ＰＣＴ Ｗ０９８／３９４６５も参照されたい。より詳細がそこで述べられているように、ＡＦＰ−ＴＲＥは任意の数の構造を含むことができ、ＡＦＰプロモーター；ＡＦＰエンハンサー；ＡＦＰプロモーターおよびＡＦＰエンハンサー；ＡＦＰプロモーターおよび異種エンハンサー；異種プロモーターおよびＡＦＰエンハンサー；ならびにそれらの多量体、などを含むがこれに限定されない。ＡＦＰ−ＴＲＥの構成要素のプロモーターおよびエンハンサーは、所望のＡＦＰ細胞特異的転写活性が得られる限り、任意の方向および／または関心対象のコード配列からの任意の距離でよい。本発明のアデノウイルスベクターはＡＦＰ−ＴＲＥ内在性サイレンサー因子を含むことが可能であり、または、ＡＦＰ−ＴＲＥ内在性サイレンサー因子は除去されることも可能である。
【０１５０】
ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子
ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）タンパク質およびその細胞表面受容体であるウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）は、最も頻繁に発生する腫瘍の多くで発現しており、癌転移において重要なタンパク質を代表するものだと思われる。両タンパク質とも、乳癌、大腸癌、前立腺癌、肝臓癌、腎臓癌、肺癌、および卵巣癌と関連がある。ｕＰＡおよびｕＰＡＲの転写を調節する配列因子は精力的に研究されている。リシオ（Ｒｉｃｃｉｏ）ら（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３：２７５９−２７７１；カニオ（Ｃａｎｎｉｏ）ら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：２３０３−２３０８を参照されたい。
【０１５１】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）
ＣＥＡは１８０，０００ダルトンの腫瘍関連性糖タンパク質抗原で、結腸直腸癌、胃癌、および膵臓癌などの消化管の内胚葉由来の腫瘍、ならびに乳癌および肺癌などのその他の腺癌にみられる。ＣＥＡ陽性の腫瘍をもつ患者の大多数において循環ＣＥＡが検出できることから、ＣＥＡは臨床的関心対象となっている。肺癌においては、全例の約５０％で循環ＣＥＡがみられ、腺癌ではしばしば高濃度（２０ｎｇ／ｍｌを上回る）のＣＥＡが検出される。胃癌患者の約５０％は血清学的にＣＥＡ陽性である。
【０１５２】
ＣＥＡ遺伝子の５’隣接配列は、細胞特異的活性をもつことが示されている。ＣＥＡプロモーター領域は、遺伝子の５’隣接領域における転写開始点に対して−の最初の約４２４塩基であり、ＣＥＡ産生細胞では非産生ＨｅＬａ細胞に比べて高プロモーター活性を提供するという長所から、細胞特異的活性をもつことが示された。シュレーウェ（Ｓｃｈｒｅｗｅ）ら（１９９０）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０：２７３８−２７４８を参照されたい。さらに細胞特異的エンハンサー領域も見いだされている。ＰＣＴ／ＧＢ／０２５４６を参照されたい。ＣＥＡプロモーター、推定サイレンサー、およびエンハンサー因子は、転写開始点から約１４．５ｋｂ上流までの領域内に含まれていると考えられる。Ｒｉｃｈａｒｄｓら（１９９５）ＰＣＴ／ＧＢ／０２５４６を参照されたい。リチャード（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）ら（１９９５）前記、によるＣＥＡ遺伝子の５’隣接領域のさらなる同定により、二つの上流領域（一つは約−１３．６ｋｂから約−１０．７ｋｂの間、もう一つは約−６．１ｋｂから約−４．０ｋｂの間）が多量体化（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚｅｄ）プロモーターと結合したときに、ＣＥＡ産生ＬｏＶｏ細胞およびＳＷ１４６３細胞において、レポーター構築物の高レベルかつ選択的な発現をもたらすことが示された。リチャード（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）ら（１９９５）前記、はまた、プロモーター領域を、転写開始点に対して約−９０位から約＋６９位の間に局在化させ、約−４１位から約−１８位の間の領域が発現に必須であった。ＰＣＴ／ＧＢ／０２５４６は、以下の配列を含む断片を含む、細胞特異的活性をもつ一連の５’隣接ＣＥＡ断片を記載している：全て転写開始点に対して、約−２９９位から約＋６９位；約−９０位から約＋６９位；−１４，５００位から−１０，６００位；−１３，６００位から−１０．６００位；および−６，１００位から−３，８００位。さらに、細胞特異的転写活性を、−４０２位から＋６９位のＣＥＡ断片に機能的に連結された遺伝子も有する。
【０１５３】
本明細書で開示したベクターにおいて使われるＣＥＡ−ＴＲＥは、ヒトの細胞を含む哺乳動物細胞に由来するが、これに限定されない。したがってベクターが必要とする望ましい機能が示される限り、いかなるＣＥＡ−ＴＲＥでも利用可能である。
【０１５４】
ムチン
ＭＵＣ１遺伝子のタンパク質産物（ムチン、ＭＵＣ１タンパク質、エピシアリン（ｅｐｉｓｉａｌｉｎ）、多形上皮ムチンまたはＰＥＭ、ＥＭＡ、ＤＦ３抗原、ＮＰＧＰ、ＰＡＳ−Ｏ、もしくはＣＡ１５．３抗原として知られる）は通常、主に、胃、膵臓、肺、気管、腎臓、子宮、唾液腺、乳腺の腺または管を裏打ちする上皮細胞の頂端表面で発現している。ゾッター（Ｚｏｔｔｅｒ）ら（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｖ． １１−１２：５５−１０１；およびガーリング（Ｇｉｒｌｉｎｇ）ら（１９８９）Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ４３：１０７２−１０７６を参照されたい。しかし、ムチンはヒトの乳癌の７５％〜９０％で過剰発現している。クーフェ（Ｋｕｆｅ）ら（１９８４）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ３：２２３−２３２を参照されたい。総説としてはヒルケンス（Ｈｉｌｋｅｎｓ）（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｖ． １１−１２：２５−５４；およびテイラー−パパジミトリオー（Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ）ら（１９９０）Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． Ａｌｌｉｅｄ Ｓｃｉ． ３４：１４４−１５０を参照されたい。ムチンタンパク質の発現は、乳癌の分化の程度と関連している。ランディ（Ｌｕｎｄｙ）ら（１９８５）Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｔｒｅａｔ． ５：２６９−２７６を参照されたい。
【０１５５】
ヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７およびＺＲ−７５−１におけるＭＵＣ１遺伝子の過剰発現は、転写レベルで起こることが示されている。クーフェ（Ｋｕｆｅ）ら（１９８４）、前述；コバリック（Ｋｏｖａｒｉｋ）ら（１９９３）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：９９１７−９９２６；およびアベ（Ａｂｅ）ら（１９９０）Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． １４３：２２６−２３１を参照されたい。細胞特異的転写に関与していると思われるＴＲＥを含む、転写開始点に対して約−０．９ｋｂを含む、ＭＵＣ１遺伝子の制御配列が単離されている。アベ（Ａｂｅ）ら（１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：２８２−２８６、コバリック（Ｋｏｖａｒｉｋ）ら（１９９３）、前述；およびコバリック（Ｋｏｖａｒｉｋ）（１９９６）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：１８１４０−１８１４７を参照されたい。
【０１５６】
ＭＵＣ１−ＴＲＥはヒト細胞を含む哺乳動物細胞に由来するが、これに限定されない。好ましくは、ＭＵＣ１−ＴＲＥはヒトである。ある態様において、ＭＵＣ１−ＴＲＥはＭＵＣ１遺伝子の全５’隣接配列の０．９ｋｂを含む。他の態様において、ＭＵＣ１−ＴＲＥはプロモーターに機能的に連結された以下の配列を含む：（ＭＵＣ１遺伝子の転写開始点に対して）約−７２５位から約＋３１位、約−７４３位から約＋３３位、約−７５０位から約＋３３位、および約−５９８位から約＋４８５位。
【０１５７】
ｃ−ｅｒｂＢ２／ＨＥＲ−２／ｎｅｕ
ｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕ遺伝子（ＨＥＲ−２／ｎｅｕまたはＨＥＲ）は、１８５ｋＤの上皮細胞増殖因子受容体に関連した膜糖タンパク質をコードする形質転換遺伝子である。ヒトにおいてｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕタンパク質は、胎児の発生の時期に発現し、成人では、多くの正常な組織の上皮においてそのタンパク質は（免疫組織化学により）わずかに検出可能である。ｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕ遺伝子の増幅および／または過剰発現は、乳癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、胃癌、および肺癌を含む多くのヒトの癌と関連している。ｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕタンパク質の過剰発現による臨床上の結果は、乳癌および卵巣癌において最も研究されている。乳房の管内の腫瘍の２０％から４０％、および卵巣癌の３０％で、ｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕタンパク質の過剰発現が起こっており、かつこれは両疾患のサブカテゴリーにおける不十分な予後と関連している。
【０１５８】
ヒト、ラット、およびマウスのｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕ ＴＲＥが同定されており、ｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕを発現する細胞に特異的な転写活性をもつことが示されている。タル（Ｔａｌ）ら（１９８７）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７：２５９７−２６０１；ハドソン（Ｈｕｄｓｏｎ）ら（１９９０）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：４３８９−４３９３；グーテクラス（Ｇｒｏｏｔｅｃｌａｅｓ）ら（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５４：４１９３−４１９９；イシイ（Ｉｓｈｉｉ）ら（１９８７）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：４３７４−４３７８；およびスコット（Ｓｃｏｔｔ）ら（１９９４）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：１９８４８−１９８５８を参照されたい。
【０１５９】
メラノサイト特異的ＴＲＥ
黒色腫タンパク質をコードするいくつかの遺伝子は、正常な組織の大部分ではサイレント（ｓｉｌｅｎｔ）であるが、黒色腫／メラノサイトで頻繁に発現されることが示されている。様々なメラノサイト特異的ＴＲＥが知られており、それらはメラノサイトに関連した細胞タンパク質（転写因子および／または補因子）に応答し、かつメラノサイト特異的プロモーターおよび／またはメラノサイト特異的エンハンサーの少なくとも一部を含む。一つまたは複数のメラノサイト特異的遺伝子の発現を制御する既知の転写因子には、小眼球症と関連のある転写因子ＭＩＴＦが含まれる。ヤスモト（Ｙａｓｕｍｏｔｏ）ら（１９９７）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：５０３−５０９を参照されたい。一つまたは複数のメラノサイト特異的遺伝子の発現を制御するその他の転写因子には、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ＴＲＰ−１、およびＴＲＰ−２が含まれる。
【０１６０】
メラノサイト特異的ＴＲＥの活性の測定方法、および、所与の細胞がメラノサイト特異的なＴＲＥを機能させるかどうかの判定方法は、本明細書に記載されている。
【０１６１】
いくつかの態様において、本発明で用いられるメラノサイト特異的ＴＲＥはヒト、ラットおよびマウスを含むがこれに限定されない、哺乳動物細胞由来である。任意のメラノサイト特異的ＴＲＥが、本発明のアデノウイルスベクターに使われ得る。黒色腫細胞内で特異的または優先的に発現するげっ歯類およびヒトの５’隣接配列が文献に記載されており、したがって本研究の実施のために利用可能であり、本明細書においては詳細を記述する必要はない。以下は利用可能なメラノサイト特異的ＴＲＥのいくつかの例である。ヒトチロシナーゼ遺伝子の５’隣接領域のプロモーターおよびその他の制御因子が記載されており、配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ１６０７３およびＤ１０７５１として登録されている。キクチ（Ｋｉｋｕｃｈｉ）ら（１９８９）Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １００９：２８３−２８６；およびシバタ（Ｓｈｉｂａｔａ）ら（１９９２）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：２０５８４−２０５８８を参照されたい。また、ヒトチロシナーゼ遺伝子のメラノサイト特異的発現を増強するシス作用性因子が定義されている。この因子はチロシナーゼ遠位因子（ＴＤＥ）として知られる２０ｂｐの配列を含み、ＣＡＴＧＴＧモチーフを含み、かつヒトチロシナーゼ遺伝子の転写開始点に対して約−１８７４位から約−１８３５位に位置している。ヤスモト（Ｙａｓｕｍｏｔｏ）ら（１９９４）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １４：８０５８−８０７０を参照されたい。ヒトチロシナーゼ遺伝子の約−２０９位から＋６１位の配列を含むプロモーター領域が、メラノサイト特異的発現を指示することが見出された。シバタ（Ｓｈｉｂａｔａ）（１９９２）を参照されたい。同様に、マウスチロシナーゼの５’隣接領域が解析され、配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ００４３９およびＸ５１７４３として登録されている。クルッペル（Ｋｌｕｐｐｅｌ）ら（１９９１）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：３７７７−３７８８を参照されたい。マウスのＴＲＰ−１遺伝子に対する最小のプロモーターが同定され、かつ転写開始点に対して−４４位から＋１０７位のヌクレオチドを含むことが報告された。ローウィング（Ｌｏｗｉｎｇｓ）ら（１９９２）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １２：３６５３−３６６２を参照されたい。ヒトＴＲＰ−２遺伝子のメラノサイト特異的発現に必要な二つの調節領域が同定された。ヨコヤマ（Ｙｏｋｏｙａｍａ）ら（１９９４）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：２７０８０−２７０８７を参照されたい。ヒトのＭＡＲＴ−１プロモーター領域が説明され、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ５５２３１として登録されている。メラノサイト特異的プロモーター活性が、ヒトＭＡＲＴ−１遺伝子の５’隣接領域の２３３ｂｐの断片において見いだされた。バターフィールド（Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ）ら（１９９７）Ｇｅｎｅ １９１：１２９−１３４を参照されたい。基本的なヘリックス−ループ−ヘリックス／ロイシンジッパーを含む転写因子である小眼球症関連転写因子（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ；ＭＩＴＦ）が、チロシナーゼおよびＴＲＰ−１遺伝子の転写活性化に関与していることが説明された。ヤスモト（Ｙａｓｕｍｏｔｏ）ら（１９９７）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：５０３−５０９を参照されたい。
【０１６２】
いくつかの態様において、メラノサイト特異的ＴＲＥは、表３に記載されたヒトチロシナーゼ遺伝子の５’隣接領域に由来する配列を含む。これらの態様のいくつかでは、メラノサイト特異的ＴＲＥは、転写開始点に対して約−２３１位から約＋６５位（配列番号：１０の約２４４位から約５４６位）のヌクレオチドであるチロシナーゼを含み、かつさらにヒトチロシナーゼの転写開始点に対して約−１９５６位から約−１７１６位（配列番号：１０の約６位から約２４３位）のヌクレオチドを含みうる。またメラノサイト特異的ＴＲＥは、約−１９５６位から約−１７１６位のヌクレオチドと近接した約−２３１位から約＋６５位のヌクレオチドも含みうる。ヒトチロシナーゼの転写開始部位に対して約−１９５６位から約−１７１６位のヌクレオチドは、相同的または異種性のどちらかのプロモーターをもつ機能的に連結されたレポーター遺伝子に、メラノサイト特異的発現を付与し得ることが説明されている。従って、いくつかの態様においてメラノサイト特異的ＴＲＥは、異種プロモーターに機能的に連結された約−１９５６位から約−１７１６位のヌクレオチドを含む。
【０１６３】
メラノサイト特異的ＴＲＥはまた多量体を含んでもよい。例えば、メラノサイト特異的ＴＲＥは、少なくとも二つ、少なくとも三つ、少なくとも四つ、または少なくとも五つの、連続した直列のチロシナーゼプロモーター断片を含んでもよい。または、メラノサイト特異的ＴＲＥは、一つまたは複数のチロシナーゼエンハンサー領域をともなった一つまたは複数のチロシナーゼプロモーター領域を有することができる。これらの多量体はまた、異種プロモーターおよび／または異種エンハンサーの配列を含んでもよい。
【０１６４】
細胞状態特異的ＴＲＥ
本発明のアデノウイルスベクターにおいて利用する細胞状態特異的ＴＲＥは、任意の生物種に由来することができるが、好ましくは哺乳動物に由来する。細胞状態に対して応答する発現、または細胞状態と関連した発現をする多くの遺伝子が説明されている。細胞状態に関連したこれらのＴＲＥのいずれも、細胞状態特異的ＴＲＥを作製するのに利用され得る。
【０１６５】
細胞状態の例の一つに細胞周期がある。細胞周期に関連した発現をする遺伝子の例えばＥ２Ｆ−１が挙げられる。Ｅ２Ｆ−１は広範に発現する成長調節遺伝子であり、Ｓ期に転写活性のピークを示す。ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）ら（１９９４）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ８：１５１４−１５２５を参照されたい。ＲＢタンパク質は、ＲＢファミリーのその他のメンバー同様、Ｅ２Ｆ−１と特異的な複合体を形成し、それにより転写活性化能を阻害する。したがって、Ｅ２Ｆ−１に応答するプロモーターはＲＢによる下方制御を受ける。多くの腫瘍細胞においてＲＢの機能が乱されており、これがＥ２Ｆ−１応答プロモーターの抑制解除をもたらし、次に細胞分裂の調節解除をもたらす。
【０１６６】
したがってある態様において本発明は、アデノウイルス遺伝子、好ましくは複製に必須の遺伝子が、細胞状態特異的ＴＲＥの転写制御下におかれ、細胞状態特異的ＴＲＥが細胞周期により活性化されるＴＲＥを含む、Ｅ３を含むアデノウイルスベクターを提供する。一つの態様として、細胞周期により活性化されるＴＲＥはＥ２Ｆ１ ＴＲＥである。
【０１６７】
細胞状態により制御される遺伝子のその他の群に、低酸素条件（ｈｙｐｏｘｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）に応答して発現が増加するものがあげられる。ブーン（Ｂｕｎｎ）およびポイトン（Ｐｏｙｔｏｎ）（１９９６）Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ． ７６：８３９−８８５；ダックス（Ｄａｃｈｓ）およびストラットフォード（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ）（１９９６）Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７４：５１２６−５１３２；ギレミン（Ｇｕｉｌｌｅｍｉｎ）およびクラスノー（Ｋｒａｓｎｏｗ）（１９９７）Ｃｅｌｌ ８９：９−１２を参照されたい。一般的に腫瘍細胞は血管を構成する内皮細胞よりも成長が早いという事実にいくらか起因して、多くの腫瘍では血液の供給が不足しており、腫瘍内に低酸素の部位を生じる。フォルクマン（Ｆｏｌｋｍａｎ）（１９８９）Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８２：４−６；およびカリノースキ（Ｋａｌｌｉｎｏｗｓｋｉ）（１９９６）Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ． ９：３７−４０を参照されたい。低酸素応答の重要な介在物質には転写複合体ＨＩＦ−１または低酸素誘導性因子（ｈｙｐｏｘｉａ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ）−１が挙げられ、これは血管内皮増殖因子、およびエノラーゼ１を含む解糖系の酵素をコードするいくつかの遺伝子を含む、いくつかの遺伝子の制御領域内の低酸素応答性因子（ＨＲＥ）と相互作用する。マウスのＨＲＥ配列は同定され特徴づけされている。ファース（Ｆｉｒｔｈ）ら（１９９４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：６４９６−６５００を参照されたい。ラットのエノラーゼ１プロモーターに由来するＨＲＥが、ジャン（Ｊｉａｎｇ）ら（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７：５３２８−５３３５に記載されている。ラットのエノラーゼ１プロモーター由来のＨＲＥを表３に示す。
【０１６８】
したがってある態様においてアデノウイルスベクターは、ＨＲＥを含む細胞状態特異的ＴＲＥの転写制御下にある、アデノウイルス遺伝子、好ましくは複製に必須のアデノウイルス遺伝子を含む。ある態様において、細胞状態特異的ＴＲＥは表３に示されたＨＲＥを構成する。
【０１６９】
その他の細胞状態特異的ＴＲＥとして、熱誘導性（すなわち熱ショック）プロモーター、ならびに電離放射線および紫外線を含む照射暴露（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｅｘｐｏｓｕｒｅ）応答性のプロモーターが含まれる。例えば、初期増殖応答−１（ｅａｒｌｙ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｓｐｏｎｓｅ−１；Ｅｇｒ−１）遺伝子のプロモーター領域は、電離放射線誘導性の因子を含む。ハラハン（Ｈａｌｌａｈａｎ）ら（１９９５）Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １：７８６−７９１；およびサイ−モリス（Ｔｓａｉ−Ｍｏｒｒｉｓ）ら（１９８８）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． １６：８８３５−８８４６を参照されたい。熱誘導性因子を含む熱誘導性プロモーターが報告されている。例えばウェルシュ（Ｗｅｌｓｈ）（１９９０）「生物学および薬学におけるストレスタンパク質（Ｓｔｒｅｓｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、モリモト（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ）、ティセア（Ｔｉｓｓｅｒｅｓ）、およびジョーゴパウロス（Ｇｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ）編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；ならびにペリシック（Ｐｅｒｉｓｉｃ）ら（１９８９）Ｃｅｌｌ ５９：７９７−８０６を参照されたい。すなわちいくつかの態様において、細胞状態特異的ＴＲＥは電離放射線応答性因子を含む。ある態様において、このＴＲＥはＥｇｒ−１遺伝子の５’隣接配列を含む。その他の態様において、細胞状態特異的ＴＲＥは熱ショック応答性因子を含む。
【０１７０】
上に挙げた細胞状態特異的ＴＲＥは、本発明において機能すると考えられるＴＲＥの非制限的な例として提供される。当技術分野において、さらなる細胞状態特異的ＴＲＥが知られており、また同様に、細胞状態特異的ＴＲＥと思われるものの細胞状態特性を同定および検査するための方法も知られている。
【０１７１】
尿路上皮細胞特異的ＴＲＥ
あらゆる尿路上皮細胞特異的ＴＲＥが、本発明のアデノウイルスベクター内で利用され得る。多くの尿路上皮細胞特異的タンパク質が説明されているが、その中にウロプラキン（Ｕｒｏｐｌａｋｉｎ）がある。ＵＰＩａおよびＵＰＩｂ（それぞれ２７ｋＤａおよび２８ｋＤａ）、ＵＰＩＩ（１５ｋＤａ）、ならびにＵＰＩＩＩ（４７ｋＤａ）を含むウロプラキン（ＵＰ）は、尿路上皮プラークの主要なタンパク質である複合膜タンパク質群のメンバーである。これらのプラークは哺乳動物の尿路上皮の頂端表面の大部分を占め、かつ透過障壁および／または尿路上皮頂端表面の物理的安定化剤としての役割を果たしうる。ウー（Ｗｕ）ら（１９９４）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：１３７１６−１３７２４を参照されたい。ＵＰは膀胱特異的タンパク質で、移行上皮癌の８８％を含む、有意な割合の尿路上皮由来の腫瘍において発現している。モール（Ｍｏｌｌ）ら（１９９５）Ａｍ． Ｊ． ｐａｔｈｏｌ． １４７：１３８３−１３９７；およびウー（Ｗｕ）ら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８：１２９１−１２９７を参照されたい。ヒトＵＰＩＩの発現制御が研究されており、マウスのＵＰＩＩ遺伝子の上流３．６ｋｂの領域が、異種遺伝子における尿路上皮特異的転写をもたらし得るとして同定されている（Ｌｉｎら（１９９５）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：６７９−６８３を参照されたい）。
【０１７２】
尿路上皮細胞特異的ＴＲＥとして好ましいものには、ウロプラキンＵＰＩａ、ＵＰＩｂ、ＵＰＩＩ、およびＵＰＩＩＩ、ならびにウロヒンジン（ｕｒｏｈｉｎｇｉｎ）由来のＴＲＥが含まれる。ウロプラキンＴＲＥは、意図されるアデノウイルスの用途次第で、かつ必要とする機能が標的細胞または宿主細胞で示されれば、任意の生物種に由来し得る。重要なことに、尿路上皮細胞特異的ＴＲＥを含むアデノウイルス構築物は、膀胱内の尿路上皮細胞に隣接する平滑筋細胞とは対照的に、尿路上皮細胞において、選択的な複製が可能であることが認められている。
【０１７３】
ウロプラキン
ｈＵＰＩＩ遺伝子に由来する尿路上皮特異的ＴＲＥが本明細書に記載されている。すなわちいくつかの態様において、本発明のアデノウイルスベクターは、表３に示すｈＵＰＩＩ遺伝子の５’隣接領域に由来する２．２ｋｂの配列を含む尿路上皮細胞特異的ＴＲＥの転写制御下にある、アデノウイルス遺伝子、好ましくは複製に必須なアデノウイルス遺伝子を含む。他の態様において、本発明のアデノウイルスベクターは、表３に示す４３０位から２２３９位のヌクレオチドの、ｈＵＰＩＩ遺伝子の５’隣接領域に由来する１．８ｋｂの配列を含む尿路上皮細胞特異的ＴＲＥの転写制御下にある、アデノウイルス遺伝子、好ましくは複製に必須なアデノウイルス遺伝子を含む。別の態様において、尿路上皮細胞特異的ＴＲＥは、表３に示した２．２ｋｂの配列の機能的な部分、または表３に示した４３０位から２２３９位の１．８ｋｂのヌクレオチド配列の機能的な部分、例えば、ｈＵＰＩＩの５’隣接領域の２００ｂｐ断片を含む、２０００ｂｐ以下の断片、１５００ｂｐ以下、もしくは１０００ｂｐ以下、６００ｂｐ以下、または少なくとも２００ｂｐの断片を含む。
【０１７４】
マウスのＵＰＩＩ（ｍＵＰＩＩ）遺伝子に位置する３．６ｋｂの５’隣接配列は、異種遺伝子に尿路上皮細胞特異的転写をもたらすが、これは本発明のベクターに有益な尿路上皮細胞特異的ＴＲＥの一つである（表３）。より小さいＴＲＥ（すなわち、３５００ｂｐ以下、より好ましくは約２０００ｂｐ、１５００ｂｐ、または１０００ｂｐ未満）が好ましい。ｍＵＰＩＩの３．６ｋｂ断片に由来する、より小さなＴＲＥは、好ましい尿路上皮細胞特異的ＴＲＥ群の一つである。特に発明者らは、異種遺伝子の尿路上皮細胞特異的発現をもたらす、ｍＵＰＩＩ遺伝子の５’非翻訳（ＵＴＲ）領域の５４０ｂｐを含む、ｍＵＰＩＩ遺伝子の５’隣接ＤＮＡ由来の約６００ｂｐの断片を同定した。
【０１７５】
すなわちいくつかの態様において、本発明のアデノウイルスベクターは、表３に示すマウスＵＰＩＩ遺伝子の５’隣接領域に由来する３．６ｋｂの配列を含む尿路上皮細胞特異的ＴＲＥの転写制御下にある、アデノウイルス遺伝子、好ましくは複製に必須なアデノウイルス遺伝子を含む。別の態様において、尿路上皮細胞特異的ＴＲＥは、表３に示した３．６ｋｂの配列の機能的な部分、例えば、５’ＵＴＲの５４０ｂｐの断片を含む３５００ｂｐ以下、２０００ｂｐ以下、１５００ｂｐ以下、または１０００ｂｐ以下の断片を含む。尿路上皮細胞特異的ＴＲＥはまた、ｍＵＰＩＩの５’隣接領域３．６ｋｂまたは本明細書記載の任意のそれらの断片と実質的に同一の配列でもあり得る。
【０１７６】
尿路上皮細胞特異的ＴＲＥ活性の測定方法の例として、化学合成、部位特異的変異誘発、ＰＣＲおよび／または組み換え法などの、当技術分野において既知の方法を用いて、ポリヌクレオチド配列またはそのような配列のセットを作成できる。試験される配列は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子によりコードされる）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ遺伝子によりコードされる）、緑色蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、および西洋ワサビペルオキシダーゼを含むがこれに限定されない、適切なレポーター遺伝子を含むベクターに挿入される。これらベクターおよびアッセイ法は、とりわけ市販の供給源から容易に利用可能である。このように構築したプラスミドを、推定標的細胞特異的ＴＲＥにより制御されるレポーター遺伝子の発現を検査するために、リン酸カルシウム沈降法、エレクトロポレーション、リポソーム（リポフェクション）、およびＤＥＡＥデキストランなどの、当技術分野において既知のトランスフェクション法を用いて、適切な宿主細胞にトランスフェクトする。適切な宿主細胞としては、ＫＵ−１、ＭＹＰ３（非腫瘍原性のラット尿路上皮細胞株）、８０４Ｇ（ラットの膀胱癌細胞株）、培養ヒト尿路上皮細胞（ＨＵＣ）、ＨＣＶ−２９、ＵＭ−ＵＣ−３、ＳＷ７８０、ＲＴ４、ＨＬ６０、ＫＧ−１、およびＫＧ−１Ａを含むがこれに限定されない、任意の尿路上皮細胞型が含まれる。ＬＮＣａＰ、ＨＢＬ−１００、ＨＬＦ、ＨＬＥ、３Ｔ３、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｕＨ７、ＣＡＤＯ−ＬＣ９およびＨｅＬａなどの非尿路上皮細胞が対照として使われる。結果は、標準的な方法を用いてレポーター遺伝子の発現レベルを測定することで得られる。尿路上皮細胞および対照の間での発現の比較が、転写活性の有無を示す。
【０１７７】
様々な尿路上皮細胞特異的ＴＲＥ間の比較は、単一の尿路上皮細胞株内の発現レベルを測定および比較することにより評価可能である。尿路上皮細胞特異的ＴＲＥの絶対転写活性は、標的細胞の性質、送達様式および尿路上皮細胞特異的ＴＲＥの型、ならびに選択的に転写が活性化されるコード配列などの、いくつかの要因に依存すると考えられることが理解される。使われた様々なプラスミドの大きさを補償する（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｅ）ため、活性はトランスフェクトされたプラスミドのモルあたりの相対活性として表される。または、転写（すなわちｍＲＮＡ）のレベルは、標準的なノーザン解析およびハイブリダイゼーション技法を用いて測定可能である。トランスフェクションのレベル（すなわちトランスフェクション効率）は、ＣＭＶ即時型プロモーターのような異なるＴＲＥの制御下で、異なるレポーター遺伝子をコードするプラスミドを同時トランスフェクトすることで測定される。この解析はまた、負の調節領域、すなわちサイレンサーを示すことも出来る。
【０１７８】
または、推定尿路上皮細胞特異的ＴＲＥを、尿路上皮細胞特異的ＴＲＥを機能させる細胞に対してアデノウイルスの複製の優先性をもたらす能力について評価することができる。このアッセイ法のため、推定尿路上皮細胞特異的ＴＲＥに機能的に連結された複製に必須なアデノウイルス遺伝子を含む構築物が、尿路上皮細胞へトランスフェクトされる。これらの細胞におけるウイルスの複製は、例えばこれらの細胞中の野生型のアデノウイルスによるウイルスの複製および／または非尿路上皮細胞における構築物によるウイルスの複製と比較される。
【０１７９】
ＴＲＥの構成
本発明で使われるＴＲＥは、様々な構成で存在することが可能である。あるＴＲＥは多量体を含むことが可能である。例えば、あるＴＲＥは少なくとも二つ、少なくとも三つ、少なくとも四つ、または少なくとも五つの、連続した直列の標的細胞特異的ＴＲＥを含むことが可能である。これらの多量体はまた、異種プロモーターおよび／またはエンハンサー配列を含んでもよい。
【０１８０】
選択的に、転写終結因子または転写「サイレンサー」を、標的細胞特異的ＴＲＥの上流に配置することができ、したがって標的細胞特異的ＴＲＥの転写制御下において、コードセグメントの望ましくない読み過ごし転写が予防される。さらに選択的には、標的細胞特異的ＴＲＥの転写制御下に位置するべきコードセグメントの内在性プロモーターを欠失させることができる。
【０１８１】
標的細胞特異的ＴＲＥはサイレンサーを欠失してもよいし、欠失しなくてもよい。サイレンサー（すなわち負の制御因子）の存在は、非許容（ｎｏｎ−ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ）細胞（すなわち非標的細胞）において転写（およびしたがって複製）の停止を補助しうる。したがって、サイレンサーの存在は、非標的細胞におけるアデノウイルスベクターの複製をより効果的に妨げることにより、標的細胞特異的複製の増強をもたらしうる。または、サイレンサーの欠如は、標的細胞における効率的な複製を補助しうり、したがって標的細胞におけるより効率的な複製による標的細胞特異的複製の増強をもたらす。
【０１８２】
また本発明は、二次ｍＲＮＡの翻訳がＩＲＥＳと関連する、バイシストロニックｍＲＮＡの転写を調節する標的細胞特異的ＴＲＥを含むことが理解される。アデノウイルスベクターはさらに、標的細胞特異的ＴＲＥと同じ遺伝子に機能的に連結されてもよいし、連結されなくてもよい、追加の異種ＴＲＥを含みうる。例えば、ＴＲＥ（例えば細胞型特異的なまたは細胞状態特異的なＴＲＥ）は、標的細胞特異的ＴＲＥの第二の型と並列し得る。「並列する」とは、標的細胞特異的ＴＲＥおよび第二のＴＲＥが同じ遺伝子の転写を制御する、という意味である。これらの態様として、標的細胞特異的ＴＲＥおよび第二ＴＲＥは、以下を含む配置でよいが、これに限定されない：（ａ）互いに隣り合う（すなわち隣接している）；（ｂ）両方とも、転写を制御される遺伝子の５’側である（すなわち両者の間に介在配列が存在し得る）；（ｃ）一つのＴＲＥは遺伝子の５’側でありもう一方のＴＲＥは３’側である。
【０１８３】
当業者において容易に認識されるように、標的細胞特異的ＴＲＥはポリヌクレオチド配列であり、様々な配列順列について機能を示すことが可能である。ヌクレオチドの置換、付加、および欠失の方法が当技術分野において知られており、容易に利用可能な機能測定法（ＣＡＴまたはルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ法など）は、当業者が配列変種（ｖａｌｉａｎｔ）が標的細胞特異的転写機能に必要であることが示されるか否かを決定することを可能にする。それゆえ本発明はまた、核酸の置換、付加および／または欠失を含む、本明細書で開示されたＴＲＥ核酸配列の機能を保持した変種も含んでいる。本明細書で開示される配列の変種は、本明細書で開示された任意の尿路上皮細胞特異的ＴＲＥ配列に対して、例えば、好ましくはミスマッチ ＝ ２、オープンギャップ ＝ ０、エクステンドギャップ ＝ ２のデフォルトパラメータを用いた、ＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）による測定により、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれを上回る同一性を有しうる。標的細胞特異的ＴＲＥ配列の変種はまた、本明細書で開示された任意の標的細胞特異的ＴＲＥ配列に対して、６８℃で０．１×ＳＳＣという高ストリンジェンシーにおいてハイブリダイズし得る。
【０１８４】
ハイブリダイゼーションの条件に関しては、本明細書で開示されたＴＲＥ配列にハイブリダイズする能力により配列が決定されるならば、必要な配列同一性が高いほど、ハイブリダイゼーションの条件はよりストリンジェントになる。すなわち本発明はまた、本明細書で開示されたＴＲＥの少なくとも連続した約１５ヌクレオチド（またはそれ以上、例えば連続した２３ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、または１００ヌクレオチド）を含む配列にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを含む。ハイブリダイゼーションの条件はストリンジェントであると考えられる：すなわち、８０℃（またはより高い温度）および６Ｍ ＳＳＣ（またはより低濃度のＳＳＣ）など。別のストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件のセットとしては、６８℃および０．１×ＳＳＣが挙げられる。ハイブリダイゼーション反応に関する考察については、下記を参照されたい。
【０１８５】
ハイブリダイゼーション反応を、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で実施することが可能である。当技術分野において公知かつ公表されている、ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増大させる条件としては、例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９）のｐ７．５２を参照されたい。（ストリンジェンシーを増大させるための）関連のある条件の例には以下が含まれる：インキュベーション温度 ２５℃、３７℃、５０℃、および６８℃；緩衝液の濃度 １０×ＳＳＣ、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ（ＳＳＣが０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび１５ｍＭのクエン酸緩衝液である場合）および他の緩衝液系を用いたそれらの等価物；ホルムアミド濃度 ０％、２５％、５０％、および７５％；インキュベーション時間 ５分から２４時間まで；洗浄段階 １回、２回またはそれ以上；洗浄インキュベーション時間 １分、２分または１５分；ならびに洗浄液 ６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣまたは脱イオン水。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例示的なセットは、６８℃および０．１×ＳＳＣである。
【０１８６】
「Ｔｍ」とは、実験の条件下で、ワトソンクリック塩基対による逆平行方向に水素結合した相補鎖により作製されたポリヌクレオチドの二重鎖の５０％が、単鎖へと解離する時の摂氏温度である。Ｔｍは以下のような標準的な公式にしたがい推定され得る：
【数１】
Ｔｍ＝８１．５ ＋ １６．６ｌｏｇ［Ｘ＋］ ＋ ０．４１（％Ｇ／Ｃ）− ０．６１（％Ｆ）− ６００／Ｌ
式中、［Ｘ＋］は陽イオン（通常はナトリウムイオン、Ｎａ＋）の濃度ｍｏｌ／Ｌ、（％Ｇ／Ｃ）は二重鎖における全残基に対する割合としてのＧおよびＣ残基の数、（％Ｆ）は溶液中のホルムアミドの割合（ｗｔ／ｖｏｌ）、Ｌは二重鎖の各鎖におけるヌクレオチド数である。
【０１８７】
特定の理論に縛られるわけではないが、本発明者らは、ある修飾により発現レベルの増加を含む発現レベルの結果を変調しうると述べている。発現レベルの結果の変調、好ましくは発現レベルの増加の達成は、癌がより攻撃的な型である場合、または（例えば個体の免疫無防備状態により）より速いおよび／もしくは攻撃的な細胞殺傷パターンが確認されている場合などにおいては、特に望ましい。
【０１８８】
ＴＲＥ活性の測定
ＴＲＥ活性は例えば下記のように測定が可能である。ＴＲＥのポリヌクレオチド配列またはそのような配列のセットを、化学合成、部位特異的変異誘発、ＰＣＲおよび／または組み換え法などの、当技術分野において既知の方法を用いて作成することが出来る。試験される配列を、プロモーター（ＴＲＥにプロモーター因子が存在しない場合）および、以下を含むがこれに限定されない、レポータータンパク質をコードする適切なレポーター遺伝子を含むベクターに挿入できる：クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子によりコードされる）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ遺伝子によりコードされる）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、および西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）。これらのベクターおよびアッセイ法は、とりわけ市販の供給源から、容易に利用可能である。このように作製したプラスミドを、推定ＴＲＥにより制御されるレポーター遺伝子の発現について試験するために、リン酸カルシウム沈降法、エレクトロポレーション、リポソーム、ＤＥＡＥデキストラン媒介性移入、微粒子銃または直接注入などの当技術分野において既知のトランスフェクション法を用いて、適切な宿主細胞にトランスフェクトする。ＴＲＥ活性は、レポーター遺伝子由来のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の検出および／または定量により測定される。レポータータンパク質産物は、直接（例えば免疫化学的に）、または、もしあれば適切な基質を用いてその酵素活性を通じて、検出可能である。一般的に、ＴＲＥの細胞特異的活性を決定するには、ＴＲＥレポーター遺伝子構築物を様々な細胞型へ導入する。おのおのの細胞型におけるＴＲＥ活性量を測定し、ＴＲＥを欠くレポーター遺伝子構築物の活性量と比較する。もし、異なる細胞型と比較して、一つの細胞型が選択的に機能的であるならば、ＴＲＥは細胞特異的であると決定される。
【０１８９】
アデノウイルス初期遺伝子
本発明のアデノウイルスベクターは、第二遺伝子がＩＲＥＳの翻訳制御下にある、標的細胞特異的ＴＲＥの制御下で共転写される二つ以上の遺伝子を含む。一つまたは複数の遺伝子はアデノウイルスの遺伝子であってよく、好ましくは複製に必須のアデノウイルス遺伝子である。Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ４または任意の後期遺伝子など、アデノウイルス複製に必須の任意の遺伝子が有用である。アデノウイルスはまたＥ３も含んでもよい。さらに、一つまたは複数の遺伝子が導入遺伝子または異種遺伝子であることが可能である。任意の様々なアデノウイルス血清型が利用可能であり、例えばＡｄ２、Ａｄ５、Ａｄ１２およびＡｄ４０が利用可能である。説明の目的のため、本明細書においてはＡｄ５血清型を例示する。
【０１９０】
Ｅ１Ａ遺伝子はウイルス感染直後（０時間から２時間の間）、他のどのウイルス遺伝子よりも前に発現する。Ｅ１Ａタンパク質は、トランス作用性の正の転写調節因子で、他の初期ウイルス遺伝子Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４およびプロモーター近位の主要後期遺伝子の発現に必要とされる。その名称にも関わらず、主要な後期プロモーターにより発現するプロモーター近位遺伝子もまた、Ａｄ５感染後の初期の間に発現する。フリント（Ｆｌｉｎｔ）（１９８２）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ６５１：１７５−２０８；フリント（Ｆｌｉｎｔ）（１９８６）Ａｄｖａｎｃｅｓ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１：１６９−２２８およびグランド（Ｇｒａｎｄ）（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２４１：２５−３８を参照されたい。機能的Ｅ１Ａ遺伝子の非存在下では、ウイルスＤＮＡの複製に必要な遺伝子産物が産生されないために、ウイルス感染は進行しない。ネビンス（Ｎｅｖｉｎｓ）（１９８９）Ａｄｖ． Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ． ３１：３５−８１を参照されたい。ウイルスゲノム中で、Ａｄ５ Ｅ１Ａの転写開始点は４９８の位置で、Ｅ１Ａタンパク質のＡＴＧ開始点は５６０の位置である。
【０１９１】
Ｅ１Ｂタンパク質は、後期ｍＲＮＡが核から細胞質へ輸送されるのにトランスで必要である。Ｅ１Ｂ発現の欠損は、後期ウイルスタンパク質の発現を弱め、宿主細胞のタンパク質合成を止めることが出来なくなる。Ｅ１Ｂのプロモーターは、Ａｄ４０とＡｄ５の宿主の間における違いを決定する因子として関連づけられている：臨床的にＡｄ４０は腸内ウイルスである一方、Ａｄ５は急性結膜炎の原因となる。バイリー（Ｂａｉｌｅｙ）ら（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９３：６３１；バイリー（Ｂａｉｌｅｙ）ら（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０２：６９５−７０６を参照されたい。Ａｄ５のＥ１Ｂプロモーターは、一つのＳｐ１およびＴＡＴＡボックスに対する高親和性認識部位から成り、Ａｄ５の１６３６位から１７０１位のヌクレオチドにおよぶ。
【０１９２】
アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ（１９Ｋ）タンパク質は、アポトーシスの強力な阻害因子であり、Ｅ１Ａと協同で一次細胞の発癌性の形質転換を起こす（Ｒａｏら、１９９２、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、８９：７７４２−７７４６）。増殖性アデノウイルスの感染の間、Ｅ１Ａは宿主細胞のＤＮＡ合成を刺激し、それにより細胞に細胞周期の異常進行をもたらす。細胞周期の脱制御（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）に応答して、宿主細胞はアポトーシスを起こす。防御機構として、Ｅ１Ｂ １９ｋＤａタンパク質はこのＥ１Ａ誘導性アポトーシスを阻害し、細胞が自殺を図る前にウイルス子孫の構築の完了を可能にする。Ｅ１Ｂ １９ｋＤａは複数の機構により抗アポトーシス機能を実行する。Ｅ１Ｂ １９ｋＤａは例えばＥ１ａ、ｐ５３、ＴＮＦを含む複数の刺激によるアポトーシスを阻害する。野生型Ａｄ５では、Ｅ１Ｂ １９ｋＤａの領域は１７１４位から２２４４位の間に位置する。Ｅ１Ｂ １９−Ｋｄａ領域については例えばラオ（Ｒａｏ）らＰｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９：７７４２−７７４６などに記載されている。
【０１９３】
好ましい態様において、Ｅ１Ａの上流に細胞特異的ＴＲＥを位置させ、Ｅ１ＡとＥ１Ｂの間に内部リボソーム接近部位を位置させることにより、細胞特異的な様式でＡｄゲノムのＥ１ＡおよびＥ１Ｂの領域の発現が細胞特異的に促進される。
【０１９４】
アデノウイルスのＥ２領域は、７２ｋＤ ＤＮＡ結合タンパク質、８０ｋＤ 前駆終結タンパク質、およびウイルス性ＤＮＡポリメラーゼを含むアデノウイルスゲノムの複製に関係するタンパク質をコードする。Ａｄ５のＥ２領域は、それぞれ初期Ｅ２（Ｅ２ ｅａｒｌｙ）および後期Ｅ２（Ｅ２ ｌａｔｅ）と名付けられ、７６．０マップ単位および７２．０マップ単位にマッピングされた二つのプロモーターから、右方向へ転写される。後期Ｅ２プロモーターが感染後期の間に一時的に活性であり、Ｅ１Ａトランス活性化タンパク質に依存しないのに対して、初期Ｅ２プロモーターはウイルス複製の初期の間に重要である。
【０１９５】
Ａｄ５の初期Ｅ２プロモーターは、２７，０５０位から２７，１５０位のヌクレオチドの間に位置し、主要なおよび重要でない転写開始点（後者はＥ２の転写の約５％を占める）、二つの非正準（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ）ＴＡＴＡボックス、二つのＥ２Ｆ転写因子結合部位、およびＡＴＦ転写因子結合部位から成る。Ｅ２プロモーターの構造の詳細についてはスワミナサン（Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ）ら（１９９５）Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ． ａｎｄ Ｉｍｍ． １９９、第三巻、１７７−１９４を参照されたい。
【０１９６】
後期Ｅ２プロモーターは反対鎖（ｃｏｕｎｔｅｒｓｔｒａｎｄ）にコードされる遺伝子のコード配列と重複しており、したがって遺伝子操作に適さない。しかし、初期Ｅ２プロモーターは反対鎖における３３ｋＤのタンパク質をコードする配列と数塩基のみ重複している。特に、ＳｐｅＩ制限酵素部位（Ａｄ５の２７，０８２位）は上述の３３ｋＤタンパク質の終止コドンの一部であり、便利なことに主要な初期Ｅ２転写開始点およびＴＡＴＡボックスと、Ｅ２ｆおよびＡＴＦ結合部位上流から分割している。したがってＳｐｅＩ末端をもつ異種ＴＲＥをＳｐｅＩ部位に挿入することで、Ａｄ５の内在性の初期Ｅ２プロモーターが破壊され、Ｅ２転写のＴＲＥ制御性発現が可能になる。
【０１９７】
Ｅ３領域とは、Ｅ３産物をコードするアデノウイルスゲノム中の領域を指す。Ｅ３領域については、例えばウォルズ（Ｗｏｌｄ）ら（１９９５）Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９：２３７−２７４を含む、様々な出版物で説明されている。一般的にＥ３領域は、アデノウイルスゲノムの約２８５８３位から約３０４７０位のヌクレオチドの間に位置している。本発明で利用するためのＥ３領域は、任意の血清型のアデノウイルスに由来しうる。Ｅ３配列はＥ３領域由来の配列を含むポリヌクレオチド配列である。いくつかの態様において配列はＡＤＰをコードする。その他の態様において、配列はＡＤＰ以外をコードし、ＡＤＰのみをコードする配列は除外される。当技術分野においてよく知られているように、ＡＤＰコード領域は、Ｙリーダーを含む、約２９４６８ｂｐから約２９７７３ｂｐのアデノウイルスゲノム内のＥ３領域に位置し、ＡＤＰの位置はＡｄ５では約２８３７５ｂｐから約２９７７３ｂｐである。その他の血清型におけるその他のＡＤＰ領域も当技術分野において既知である。Ｅ３配列は欠失、挿入、融合、および置換を含むが、これに限定されない。Ｅ３配列はまた、Ｅ３領域、またはＥ３領域の一部を含みうる。「Ｅ３配列」は「Ｅ３領域」に限定されないため、本明細書における「Ｅ３領域」または「Ｅ３配列」についてのどちらかの記載は、この単語が互換的であることを示さない。本発明を目的とした機能的Ｅ３配列の決定のためのアッセイ法に関しては、本明細書で記載されている。
【０１９８】
Ｅ４遺伝子は多くの転写産物をもち、２つのポリペプチド（オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）３および６の産物をコードする。これらは細胞転写因子であるＥ２Ｆ−１およびＤＰ−１のヘテロニ量体と相互作用することで、ウイルスゲノムＤＮＡ複製の刺激、および後期遺伝子発現の刺激を行う。ＯＲＦ６タンパク質が活性のためにＥ１Ｂ ５５ｋＤタンパク質との相互作用を必要とするのに対し、ＯＲＦ３タンパク質は必要としない。ＯＲＦ３およびＯＲＦ６がコードする機能的タンパク質の非存在下では、プラーク形成の効率は野生型ウイルスと比べて１０−６未満である。
【０１９９】
細胞特異的な複製をさらに増加させるために、Ｅ４ ＯＲＦ６遺伝子産物とＥ１Ｂ ５５ｋＤタンパク質間の相互作用の利点を利用することが可能である。例えば、Ｅ４ ＯＲＦ１−３を欠失させた場合、ウイルスＤＮＡ複製および後期遺伝子の合成は、Ｅ４ ＯＲＦ６タンパク質に依存するようになる。Ｅ１Ｂ領域が細胞特異的ＴＲＥにより制御されるベクター内におけるそのような欠失を作製することにより、Ｅ１ＢおよびＥ４の両機能が、Ｅ１Ｂを制御する細胞特異的ＴＲＥに依存するようなウイルスが得られる。
【０２００】
開示されるベクターに関連する後期遺伝子は、ウイルス粒子のタンパク質をコードするＬ１、Ｌ２、およびＬ３である。これらの遺伝子（典型的には構造タンパク質をコードする）は全て、アデノウイルスの複製に必要であると考えられる。全ての後期遺伝子は、Ａｄ５の５９８６位から６０４８位の間に位置する主要後期プロモーター（ＭＬＰ）の制御下にある。
【０２０１】
一つの態様において、アデノウイルス初期遺伝子は細胞特異的異種ＴＲＥの転写制御下にある。さらなる態様において、初期遺伝子は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４を含む群より選択される。別の態様において、アデノウイルス後期遺伝子は、細胞特異的異種ＴＲＥの転写制御下にある。さらなる態様において、二つ以上の初期遺伝子が、同じ標的細胞内で機能する異種ＴＲＥの制御下にある。異種ＴＲＥは同一でも異なっていてもよく、または一方が他方の変種でもよい。さらなる態様において、二つ以上の後期遺伝子が、同じ標的細胞内で機能する異種ＴＲＥの制御下にある。異種ＴＲＥは同一でも異なっていてもよく、または一方が他方の変種でもよい。さらに別の態様において、一つまたは複数の初期遺伝子および一つまたは複数の後期遺伝子が、同じまたは異なる異種ＴＲＥの転写制御下にあり、ここでＴＲＥは同じ標的細胞内で機能する。
【０２０２】
本発明のいくつかの態様において、アデノウイルスベクターは必須Ｅ１Ａ遺伝子を含み、Ｅ１Ａプロモーターが除去されている。その他の態様において、アデノウイルスベクターは必須Ｅ１Ａ遺伝子を含み、Ｅ１ＡエンハンサーＩが除去されている。またさらにその他の態様において、Ｅ１Ａプロモーターが除去され、かつＥ１ＡエンハンサーＩが除去されている。その他の態様において、（Ｅ１Ｂは翻訳的に結合されるように）内部リボソーム接近部位（ＩＲＥＳ）がＥ１Ｂの上流に挿入され、標的細胞特異的ＴＲＥはＥ１Ａに機能的に連結される。さらにその他の態様において、（Ｅ１Ｂが翻訳的に結合されるように）ＩＲＥＳはＥ１Ｂの上流に挿入され、標的細胞特異的ＴＲＥはＥ１Ａに機能的に連結され、これによりＥ１Ａプロモーターおよび／またはエンハンサーＩは維持されてもよく、されなくてもよい（すなわち、Ｅ１Ａプロモーターおよび／またはエンハンサーＩの除去は可能であるが、必須ではない）。さらにその他の態様においてＥ１Ｂの１９ｋＤａ領域が除去される。
【０２０３】
ＩＲＥＳの制御下にある第二遺伝子を含むアデノウイルスベクターとしては、内在性プロモーターが第二遺伝子の転写を妨害しないように、ＩＲＥＳの転写制御下にある遺伝子の内在性プロモーターが除去されていることが好ましい。もしＩＲＥＳが開始コドンを含むならば、第二遺伝子はＩＲＥＳと同じフレーム内であることが好ましい。ＩＲＥＳ内にＡＴＧのような開始コドンが含まれるなら、第二遺伝子の開始コドンが除去され、かつＩＲＥＳと第二遺伝子がインフレームであることが好ましい。または、ＩＲＥＳが開始コドンを含まない場合、またはＩＲＥＳから開始コドンが除去されている場合には、第二遺伝子の開始コドンが使われる。
【０２０４】
アデノウイルス死タンパク質（ＡＤＰ）遺伝子および遺伝子産物
アデノウイルスベクターの構築において、一つまたは複数のＴＲＥおよび／もしくは導入遺伝子の挿入を促進するために、Ｅ３領域はしばしば除去される。しかしいくつかの態様において、Ｅ３領域内にコードされるアデノウイルス死タンパク質（ＡＤＰ）は、アデノウイルスベクター内に保持される。ＡＤＰ遺伝子は主要後期プロモーター（ＭＬＰ）の制御下にあり、宿主細胞の溶解促進に重要なタンパク質（ＡＤＰ）をコードすると考えられる。トレフソン（Ｔｏｌｌｅｓｆｓｏｎ）ら（１９９２）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６：３６３３；およびトレフソン（Ｔｏｌｌｅｓｆｓｏｎ）ら（１９９６）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０：２２９６を参照されたい。したがって、ウイルスベクターにＡＤＰ遺伝子を含めることは、ベクターをより強力にし、より効率的な治療および／または必要な投与量の低下を可能にする。
【０２０５】
ＡＤＰをコードする配列は、ＰＣＲなどの当技術分野における既知の技術を利用して、好ましくは（Ａｄ２が、ＡＤＰが最も完全に特徴づけられている株であるため）Ａｄ２より得られる。好ましくはＹリーダー（後期遺伝子の正確な発現に重要な配列である）を得て、ＡＤＰをコードする配列と機能的に連結させて配置する。さらに（Ｙリーダーを含む、または含まない）ＡＤＰコード配列は、ＡＤＰコード配列の発現がＭＬＰにより行われるような、例えばＥ３領域などのアデノウイルスゲノム内へ導入される。ＡＤＰをコードする配列はもちろん、Ｅ４領域などアデノウイルスゲノムのその他の位置にも挿入されうる。またＡＤＰをコードする配列は、その他のウイルスＴＲＥまたは標的細胞特異的ＴＲＥ（下記を参照されたい）を含むがこれに限定されない異種ＴＲＥと、機能的に連結されうる。別の態様において、ＡＤＰ遺伝子は、その翻訳がＩＲＥＳと関連しているようなマルチシストロニックなｍＲＮＡの一部として転写されるような、ウイルスゲノム中に存在する。
【０２０６】
Ｅ３を含む標的細胞特異的アデノウイルスベクター
いくつかの態様において、アデノウイルスベクターはＥ３領域またはＥ３領域の一部を含む。アデノウイルスのＥ３領域を含めることにより、本発明の標的細胞特異的アデノウイルスベクターの細胞毒性を増強させることが可能である。Ｅ３領域を含むアデノウイルスベクターは、高レベルの特異性を維持し得、Ｅ３領域を欠くベクターと比べて、インビボにおいて（ａ）細胞毒性が有意に高く、（ｂ）細胞外ウイルス収量を含むより高いウイルス収量を産生し、（ｃ）より大きなプラークを形成し、（ｄ）より迅速な細胞死をもたらし、（ｅ）腫瘍をより効果的に殺し得る。本発明のアデノウイルスベクターはＥ３領域またはＥ３領域の一部を含んでもよい。Ｅ３が含まれると、例えば複製および合成の増加など、アデノウイルスベクターにおける機能性が観察可能かつ測定可能になるので、Ｅ３の機能的に等価な変腫（機能性が本質的に維持され、保存され、または増強されもしくは減少されたりさえする）を作製し得ることが理解される。例えばＥ３の一部などが使われ得る。一部は包含的でなく（ｎｏｎ−ｉｎｃｌｕｓｉｖｅｌｙ）、以下のどちらかでありうる：（ａ）好ましくは３’末端における、欠失；（ｂ）Ｅ３の一つまたは複数の様々なオープンリーディングフレームの包含。Ａｄ−Ｅ３領域にコードされる以下の五つのタンパク質が同定され特徴づけされている。（１）１９ｋＤａの糖タンパク質（ｇｐ１９ｋ）はアデノウイルスの初期タンパク質の中で最も豊富なものの一つで、主要組織適合複合体Ｉ型分子の細胞表面への輸送を阻害し、したがってペプチド認識および細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によるＡｄ感染細胞の排除の両方に障害を与えることが知られている。（２）Ｅ３ １４．７ｋタンパク質およびＥ３ １０．４ｋ／１４．５ｋのタンパク質複合体は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が媒介する細胞毒性および炎症性の応答を阻害する。（３）Ｅ３ １０．４ｋ／１４．５ｋタンパク質複合体は、炎症を阻害しうり、かつ効率的なウイルスの複製のための静止状態の感染細胞を活性化しうる、表皮増殖因子受容体を下方制御する。（４）アデノウイルス２および５由来のＥ３ １１．６ｋタンパク質（アデノウイルス死タンパク質、ＡＤＰ）は、細胞死および感染細胞からのウイルスの放出を促進すると考えられる。Ｅ３がコードする３つのタンパク質（３．６ｋ、６．７ｋ、および１２．５ｋ）の機能は知られていない。分子量７．５ｋＤａの９番目のタンパク質が存在することが想定されているが、野生型アデノウイルスに感染した細胞内では検出されていない。ウォルズ（Ｗｏｌｄ）ら（１９９５）Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９：２３７−２７４を参照されたい。Ｅ３領域は図６に模式的に示されている。これらの完全なＥ３、その一部、またはその変種は、当技術分野における標準的な知見または技術を用いることで、容易に構築され得る。完全なＥ３領域を用いることが好ましい。
【０２０７】
本発明のアデノウイルスベクターにおいて、Ｅ３は、天然のアデノウイルスの転写調節因子による転写制御下にあってもよいし、なくてもよい。Ｅ３プロモーターは、アデノウイルスの血清型間で高度に保存されている必須タンパク質であるウイルス粒子タンパク質ＶＩＩＩのコード配列内に位置している。いくつかの態様においてＥ３は、標的細胞特異的ＴＲＥを含むがこれに限定されない、異種ＴＲＥの転写制御下にある。すなわちある態様において本発明は、標的細胞特異的なＴＲＥの転写制御下にあるＥ３領域（またはＥ３の一部）を含むアデノウイルスベクター、好ましくは複製受容能のあるアデノウイルスベクターを提供する。他の態様において、Ｅ３領域は天然のアデノウイルスＴＲＥの転写制御下にあり、さらにベクターは標的細胞特異的ＴＲＥの転写制御下にあって複製に必須なアデノウイルス遺伝子から成る。他の態様において、Ｅ３領域は標的細胞特異的ＴＲＥの転写制御下にあり、さらにベクターは標的細胞特異的ＴＲＥの転写制御下にあって複製に必須なアデノウイルス遺伝子を含む。
【０２０８】
標的細胞特異的ＴＲＥの転写制御下にある導入遺伝子
本発明によって、標的細胞特異的ＴＲＥの制御下にある一つまたは複数のアデノウイルス遺伝子に加えて、導入遺伝子もまた標的細胞特異的ＴＲＥの制御下、および選択的にＩＲＥＳの翻訳制御下にある様々なその他の複製受容能のあるアデノウイルスベクターが作製可能である。導入遺伝子は、治療的導入遺伝子およびレポーター遺伝子を含むが、これに限定されない。
【０２０９】
レポーター遺伝子
例えば標的細胞特異的ＴＲＥを、Ｅ１ＡまたはＥ１Ｂなどの初期遺伝子のすぐ上流に、かつこれに機能的に連結させて、アデノウイルスベクターへ導入することが可能である。さらにこの構築物は、ＩＲＥＳの翻訳制御下にある第二の共転写遺伝子を含んでもよい。第二遺伝子はレポーター遺伝子であり得る。レポーター遺伝子は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子によりコードされる）、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、緑色蛍光タンパク質、西洋ワサビペルオキシダーゼを含むがこれに限定されない、適切なレポータータンパク質をコードすることが可能である。生物試料内の推定癌細胞の検出のため、生物試料は、レポーター遺伝子（例えばルシフェラーゼ）が標的細胞特異的ＴＲＥの制御下にある、修飾アデノウイルスとともに処理され得る。標的細胞特異的ＴＲＥの機能を可能にする細胞内において、標的細胞特異的ＴＲＥは転写的に活発であると考えられ、ルシフェラーゼが産生されると考えられる。この産生が、例えばヒト宿主または生物試料内の癌細胞を含む標的細胞の検出を可能にすると考えられる。または、条件付きで生存に必須である産物（例えば抗生物質耐性マーカー）をコードする遺伝子が標的細胞特異的ＴＲＥの転写制御下にあるような、アデノウイルスを構築することが可能である。このアデノウイルスが生物試料内へ導入されると、標的細胞は抗生物質耐性になると考えられる。その後、非癌性の細胞を殺すために抗生物質を培地へ導入することが可能である。
【０２１０】
治療用導入遺伝子
導入遺伝子はまた、望ましくない標的細胞を排除するように細胞毒性を増強するなど、治療上の効果をもたらし得る遺伝子を含む。このように様々な遺伝的能力が標的細胞、特に癌細胞へ導入され得る。例えばある場合においては、例えば癌性標的細胞の相対的な不応性または特別な病原力に起因して、細胞毒性活性の程度および／または速度を増強することが望ましい可能性がある。これは、標的細胞特異的な細胞毒性活性を、例えばＨＳＶ−ｔｋおよび／またはシトシンデアミナーゼ（ｃｄ）の細胞特異的発現と共役させることで達成することが可能であり、５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）を代謝することができる細胞を、化学療法剤５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に与える。このような種類の導入遺伝子の利用は傍観者効果をもたらし得る。
【０２１１】
アデノウイルスベクターにより導入され得るその他の望ましい導入遺伝子には、ジフテリア毒素Ａ鎖、リシン、またはアブリンなどの細胞毒性タンパク質をコードする遺伝子（Ｐａｌｍｉｔｅｒら（１９８７）Ｃｅｌｌ ５０：４３５；Ｍａｘｗｅｌｌら（１９８７）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７：１５７６；Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒら（１９８８）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ２：４５３；Ｍｅｓｓｉｎｇら（１９９２）Ｎｅｕｒｏｎ ８：５０７；Ｐｉａｔａｋら（１９８８）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：４９３７；Ｌａｍｂら（１９８５）Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １４８：２６５；Ｆｒａｎｋｅｌら（１９８９）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ９：４１５）、アポトーシスを開始することが出来る因子をコードする遺伝子、その他の能力のうち、増殖に必須なタンパク質をコードするｍＲＮＡに向けられ得る、アンチセンス転写産物もしくはリボザイムをコードする配列、たとえば構造タンパク質、または転写因子、病原体が細胞内で増殖する際のウイルス性またはその他の病原性タンパク質、ヌクレアーゼ（例えばＲＮａｓｅＡ）もしくはプロテアーゼ（例えばオーシン（ａｗｓｉｎ）、パパイン、プロテイナーゼＫ、カルボキシペプチダーゼなど）の操作された細胞内腫をコードする、またはＦａｓ遺伝子をコードする遺伝子などが含まれる。その他の関心対象の遺伝子としては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−χ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＮＧＦなどの、サイトカイン、抗原、膜貫通細胞タンパク質などが含まれる。正のエフェクター遺伝子は初期に利用可能であり、複製により細胞毒性活性がおこる。
【０２１２】
宿主細胞
本発明はまた、本明細書に記載されたアデノウイルスベクターを含む（すなわちアデノウイルスベクターで形質転換された）宿主細胞を提供する。適切な複製起点などその宿主内での維持に必要な配列が存在する限り、原核生物および真核生物のどちらの宿主細胞も利用可能である。便宜的に、選択的マーカーもまた提供される。宿主系は当技術分野において既知であり、本明細書で詳細を記載する必要はない。原核生物の宿主細胞には細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、マイコバクテリウム（ｍｉｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）が含まれる。真核宿主細胞には酵母、昆虫、トリ、植物、線虫（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓまたはｎｅｍａｔｏｄｅ）、および哺乳動物の宿主細胞が含まれる。菌類（酵母を含む）の宿主細胞の例には、酵母菌（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クライベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、Ｃ． アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）およびＣ． グラブラタ（ｇｌａｂｒａｔａ）を含むカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種、アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）がある。哺乳動物細胞の例としては、ヒト培養標的細胞（ＨＵＣ）、ＫＵ−１、ＭＹＰ３（ラット非腫瘍原性標的細胞株）、８０４Ｇ（ラット膀胱腫瘍細胞株）、ＨＣＶ−２９、ＵＭ−ＵＣ−３、ＳＷ７８０、ＲＴ４、ＨＬ６０、ＫＧ−１、およびＫＧ−１Ａがある。ＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、ＬＮＣａＰ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ）（ＨＥＫ）細胞、およびアフリカミドリザル細胞、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞、または両生類起源のその他の細胞なども利用され得る。
【０２１３】
組成物およびキット
本発明はまた、本明細書に記載のアデノウイルスベクターを含む、医薬品の組成物を含む、組成物を含む。このような組成物は、インビボでの投与、例えばある個体における形質導入の程度および／または細胞死滅の有効性を測定する場合に有用である。組成物は、本発明のアデノウイルスベクターおよび、生理的に許容されうる緩衝剤などの適切な溶剤を含んでもよい。これらは当技術分野においてよく知られている。その他の態様において、これらの組成物はさらに薬学的に許容されうる賦形剤を含む。薬学的に許容されうる賦形剤中に、有効量の本発明のアデノウイルスベクターを含んでもよい。これらの組成物は、単位剤形の、無菌非経口溶液または懸濁液、無菌経口溶液または懸濁液、水中油型または油中水型の乳濁剤などとしての、個体への全身的なまたは局所的な投与に適している。非経口および経口の薬物送達のための製剤は、当技術分野において既知であり、「レミントン薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１９版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９９５）に記載されている。組成物はまた、凍結乾燥および／または再構成された形状の本発明のアデノウイルスベクター（アデノウイルスなどのウイルスとして封入されたものを含む）を含む。
【０２１４】
本発明はまた、本発明のアデノウイルスベクターを含むキットを含む。これらのキットは、診断および／またはモニターのため、好ましくはモニターのために、利用可能である。これらのキットを利用する手順を、臨床研究室、実験研究室、開業医、または私的個人により、実施することが可能である。本発明をとりいれたキットは、生検標本などの適切な生物試料において、膀胱癌細胞の存在を検出することを可能にする。
【０２１５】
本研究のキットは、適切に封入された本明細書に記載のアデノウイルスベクターを含む。選択的に、キットは、手順において有用な追加的組成物を提供してもよく、緩衝液、展開剤、ラベル、反応面、検出手段、対照試料、説明書、および解釈上の情報などを含むが、これに限定されない。
【０２１６】
本発明のアデノウイルスベクターの調製
本発明のアデノウイルスベクターを、当技術分野において標準的な組み換え技術を用いて調製できる。一般的には標的細胞特異的ＴＲＥが、関心対象のアデノウイルス遺伝子、好ましくはアデノウイルス複製遺伝子、より好ましくは一つまたは複数の初期複製遺伝子（後期遺伝子も利用可能であるが）の５’側へ挿入される。標的細胞特異的ＴＲＥを、（もし配列が既知であれば）オリゴヌクレオチド合成または組み換え法（ＰＣＲおよび／または制限酵素など）を利用して調製できる。天然のアデノＤＮＡ配列中の、またはＰＣＲもしくは部位特異的変異誘発などの方法により導入された、便利な制限酵素部位は、標的細胞特異的ＴＲＥのための挿入部位を提供する。すなわち、標的細胞特異的ＴＲＥをアニール（すなわち挿入）するための便利な制限酵素部位を、ＰＣＲのような標準的な組み換え方法を用いてＵＰ−ＴＲＥの５’側および３’側へと操作できる。
【０２１７】
本発明のアデノウイルスベクターの作製に利用するためのポリヌクレオチドは、化学合成および組み換え法など、当技術分野において標準的な方法を用いて得られうり、ならびに／または生物供給源から得られうる。
【０２１８】
標的細胞特異的ＴＲＥの制御下にある望ましい因子（例えばＥ１Ａ）とともに複製に必須な因子を全て含むアデノウイルスベクターは、一方がアデノウイルスの左部分を提供し、もう一方が右部分を提供するプラスミドであり、そのうち一つまたは複数が標的細胞特異的ＴＲＥの制御下にある少なくとも一つのアデノウイルス遺伝子を含む二つのプラスミドの相同組み換えまたはインビトロライゲーションにより、都合よく調製される。相同組み換えが使われた場合には、二つのプラスミドは少なくとも約５００ｂｐの配列重複を共有していなければならない。望ましくは各プラスミドは独立に操作されうり、その後、適切な補完遺伝子またはアデノウイルス増殖のための標的細胞特異的ＴＲＥからの転写開始に適切な転写因子を提供する、受容能のある宿主に同時トランスフェクトされる。プラスミドは一般に、陽イオン性リポソーム（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）などの適切な形質導入法を用いて、２９３細胞などの適切な宿主細胞へ導入される。または、アデノウイルスゲノムの右部分および左部分のインビトロライゲーションを、アデノウイルスゲノムの複製に必須な全部分を含む組み換えアデノウイルス誘導体を構築するのに利用できる。バークナー（Ｂｅｒｋｎｅｒ）ら（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１：６００３−６０２０；ブリッジ（Ｂｒｉｄｇｅ）ら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６３：６３１−６３８を参照されたい。
【０２１９】
便宜上、アデノウイルスの必須部分を提供するプラスミドが利用可能である。プラスミドｐＸＣ．１（ＭｃＫｉｎｎｏｎ（１９８２）Ｇｅｎｅ １９：３３−４２）は野生型Ａｄ５の右末端を含む。ｐＢＨＧ１０（Ｂｅｔｔら（１９９４）Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｏｎｔｏ）はＥ３が欠失したＡｄ５の右末端を提供する。Ｅ３の欠失により、ウイルス内に、内在性エンハンサー／プロモーターを欠失することなしに３ｋｂの標的細胞特異的ＴＲＥを挿入するための余地が提供される。Ｅ３遺伝子はＥ４の反対鎖（ｒ鎖）に位置している。ベット（Ｂｅｔｔ）ら（１９９４）を参照されたい。または、ｐＢＨＧＥ３（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）の利用により、完全長のＥ３を含むＡｄ５の右末端が提供される。
【０２２０】
初期遺伝子の操作のため、ウイルスゲノム上において、Ａｄ５ Ｅ１Ａの転写開始点は４９８位であり、Ｅ１ＡコードセグメントのＡＴＧ開始点は５６０位である。この領域は標的細胞特異的ＴＲＥの挿入に利用可能である。制限酵素部位はポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を利用することにより導入され得り、ここで利用されるプライマーはＡｄ５ゲノムに限定されうるか、またはＡｄ５ゲノムＤＮＡを保有するプラスミドの一部を含みうる。例えば、ｐＢＲ３２２が使われる際には、プライマーはｐＢＲ３２２骨格中のＥｃｏＲＩ部位、およびＡｄ５の１３３９位のＸｂａＩ部位を利用できる。その領域の中央で重複するプライマーがヌクレオチド配列の変更を導入することにより固有の制限酵素部位がもたらされるような二段階ＰＣＲを行うことにより、その部位に標的細胞特異的ＴＲＥを挿入することが可能である。
【０２２１】
Ｅ１Ｂを調節するために標的細胞特異的ＴＲＥ因子を挿入するのに、同様の戦略が利用可能である。Ａｄ５のＥ１Ｂプロモーターは、Ｓｐ１およびＴＡＴＡボックスに対して高親和性の単一認識部位から成る。この領域はＡｄ５の１６３６位から１７０１位のヌクレオチドに及ぶ。標的細胞特異的ＴＲＥをこの領域へ挿入することにより、Ｅ１Ｂ遺伝子の細胞特異的転写を提供することが可能である。Ｅ１Ｂを制御する標的細胞特異的ＴＲＥを導入するための鋳型として、Ｅ１Ａを調節する細胞特異的応答因子で修飾された左側領域を利用することにより、得られるアデノウイルスベクターはＥ１ＡおよびＥ１Ｂ両方の発現のための細胞特異的転写因子に依存すると考えられる。さらなる態様において、Ｅ１Ｂの１９ｋＤａ領域は除去される。
【０２２２】
同様に、標的細胞特異的ＴＲＥをＥ２遺伝子の上流に挿入し、その発現を細胞特異的にすることが可能である。初期Ｅ２プロモーターは、Ａｄ５の２７０５０位から２７１５０位にマッピングされ、主要なおよび重要でない転写開始点（後者はＥ２の転写の約５％を占める）、二つの非正準ＴＡＴＡボックス、二つのＥ２Ｆ転写因子結合部位、ならびにＡＴＦ転写因子結合部位（Ｅ２プロモーター構造の詳細な総説はＳｗａｍｉｎａｔｈａｎら（１９９５）Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ． Ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９、第三巻、１７７−１９４を参照されたい）から構成される。
【０２２３】
後期Ｅ２プロモーターは、反対鎖にコードされる遺伝子のコード配列と重複しており、したがって遺伝子操作の影響を受けにくい。しかし、初期Ｅ２プロモーターは反対鎖の３３ｋＤのタンパク質をコードする遺伝子とほんの数塩基しか重複していない。特に、ＳｐｅＩ制限酵素部位（Ａｄ５の２７０８２位）は上述の３３ｋＤタンパク質の終止コドンの一部であり、便利なことに主要な初期Ｅ２転写開始点およびＴＡＴＡ結合タンパク質部位と、Ｅ２ＦおよびＡＴＦ結合部位を分割する。したがってＳｐｅＩ末端をもつ標的細胞特異的ＴＲＥを第一鎖のＳｐｅＩ部位に挿入することで、Ａｄ５の内在性初期Ｅ２プロモーターは破壊され、Ｅ２の転写物が標的細胞に限定した発現をもたらすはずである。
【０２２４】
Ｅ４に関しては、アデノウイルスゲノムの右部分を利用しなければならない。Ｅ４転写開始点は主に約３５６０５位に、ＴＡＴＡボックスは約３５６３１位に、ＯＲＦ Ｉの最初のＡＵＧ／ＣＵＧは約３５５３２位にある。ビルタネン（Ｖｉｒｔａｎｅｎ）ら（１９８４）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ５１：８２２−８３１を参照されたい。他の遺伝子に対する上述の戦略のどれかを使うことにより、ＵＰ−ＴＲＥが転写開始点に対して−に導入され得る。Ｅ４領域に標的細胞特異的ＴＲＥが挿入された完全長のアデノウイルスの構築には、同時トランスフェクトおよび相同組み換えがＷ１６２細胞において実施され（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら（１９８３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８０：５３８３−５３８６）、これによりＥ４タンパク質がトランスに提供され、これらのタンパク質合成における欠損を補完する。
【０２２５】
Ｅ３領域を含むアデノウイルス構築物を作製できる、ここでＥ３含有アデノウイルスプラスミド、例えばＢＨＧＥ３（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｏｎｔｏ）とＥ３非含有アデノウイルスプラスミドの間で相同組み換えが実施される。
【０２２６】
または、Ｅ３領域を含むアデノウイルスベクターを、アデノウイルス構築物、またはアデノウイルスプラスミド構築物と一緒に、例えば２９３細胞などの細胞に導入することが可能であり、ここでこれらは、Ｅ３領域を含むアデノウイルスを産生するために相同組み換えされうる。この場合、Ｅ３含有アデノウイルスベクターおよびアデノウイルス構築物またはプラスミド構築物は、アデノウイルスの相補的な領域を含む。例えば、一方が左側、他方が右側領域を含み、相同組み換えを可能にするために十分な配列重複をもつ。
【０２２７】
または本発明のＥ３含有アデノウイルスベクターを、（例えば制限ヌクレアーゼおよび／またはＰＣＲを用いる）標準的な組み換え法、化学合成、またはこれらの任意の組み合わせを含む、その他の従来法を用いて構築することが可能である。さらにＥ３領域の部分欠損を、分子生物学の標準的な技術を利用して作製することが可能である。
【０２２８】
ＩＲＥＳのベクターへの挿入は、制限酵素消化、ライゲーション、およびＰＣＲなどを含むが、これに限定されない、当技術分野において既知でありかつ本明細書において前述の方法および技術により達成される。ＩＲＥＳのＤＮＡコピーを、化学合成により、または、例えばピコルナウイルスＩＲＥＳの、ｃＤＮＡのコピーの作製により得ることが可能である。例えばＥＭＣＶ ＩＲＥＳの説明についてはデュケ（Ｄｕｋｅ）ら（１９９５）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６（３）：１６０２−９、およびＶＥＧＦ ＩＲＥＳの説明についてはウェルツ（Ｈｕｅｚ）ら（１９９８）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １８（１１）：６１７８−９０を参照されたい。内部翻訳開始配列は、マルチシストロニックｍＲＮＡ中の５’末端コード領域の上流に存在するように、ベクターゲノム内の部位へ挿入される。例えば、バイシストロニックなＥ１Ａ−Ｅ１ＢのｍＲＮＡの産生が、標的細胞特異的ＴＲＥの制御下にある、アデノウイルスベクターの好ましい態様において、Ｅ１Ｂプロモーターが除去されまたは不活性化され、かつＩＲＥＳ配列がＥ１ＡとＥ１Ｂの間に位置する。カルジオウイルスおよびある種のアフタウイルスのＩＲＥＳ配列は、ＩＲＥＳの３’末端に、リボソーム接近部位としておよび翻訳開始部位としてはたらくＡＵＧコドンを含んでいる。したがって、タンパク質の翻訳を制御する、タンパク質の翻訳開始コドンを置換するために、この種のＩＲＥＳがベクターへ導入される。しかし、エンテロウイルス／ライノウイルス型のＩＲＥＳ内では、ＩＲＥＳの３’末端のＡＵＧはリボソーム接近のみに使われ、翻訳は下流の次のＡＵＧコドンにおいて開始される。したがって、もしエンテロウイルス／ライノウイルスのＩＲＥＳを下流コード領域の翻訳調節のためにベクター内で利用するならば、下流遺伝子のＡＵＧ（またはその他の翻訳開始コドン）をベクター構築物に残しておく。
【０２２９】
ポリヌクレオチドをアデノウイルス粒子へ封入する方法は当技術分野において既知であり、かつ共有されている国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４０８０号中でも記載されている。
【０２３０】
アデノウイルスベクターの送達
アデノウイルスベクターを、裸のポリヌクレオチド（通常はＤＮＡ）構築物を含むが、これに限定されない、様々な形状で用いることが可能である。またはアデノウイルスは、陽イオンリポソームまたはポリリジンなどのその他の陽イオン化合物など細胞への侵入を容易にする薬剤と複合体化された；（アデノウイルスベクターをより免疫原性にしうる）感染性アデノウイルス粒子へ封入された；ＨＳＶまたはＡＡＶなどその他の粒子状ウイルスの型へと封入された；免疫応答を増強または抑制する薬剤（ＰＥＧなど）と複合体化された；ＤＯＴＭＡ（商標）、ＤＯＴＡＰ（商標）、およびポリアミンなどのインビボトランスフェクションを容易にする薬剤と混合されたポリヌクレオチド構築物を含むことができる。
【０２３１】
アデノウイルスポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターが（キャプシドを含む）アデノウイルス全体に封入されているならば、アデノウイルス自身は標的化を増強するためにさらに選択され得る。例えば、アデノウイルス繊維は、細胞受容体との一次接触を媒介し、向性の助けとなる。例えばアンバーグ（Ａｍｂｅｒｇ）ら（１９９７）Ｖｉｒｏｌ． ２２７：２３９−２４４を参照されたい。もし、アデノウイルス血清型の特定の亜属が、標的細胞型に向性を示す、および／または非標的細胞型への親和性を減少させたならば、そのような亜属は細胞毒性および／または細胞溶解性の細胞特異性をさらに増すために利用することが可能である。
【０２３２】
アデノウイルスベクターは、リポソームならびに、リン酸カルシウム沈降法、エレクトロポレーション、直接注射、および静脈内注入などの当技術分野において既知の一段階トランスフェクション法を含むがこれに限定されない、様々な方法で標的細胞へ送達され得る。送達手段は、特定のアデノウイルスベクター（形状を含む）、ならびに、標的細胞の型および局在性（すなわち細胞がインビトロであるかインビボであるか）に大部分依存する。
【０２３３】
封入されたアデノウイルスを使う場合、アデノウイルスベクターを、生理学的に許容可能な適切な担体で、約１０４から約１０１４の投与量で投与できる。感染多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）は一般に約０．００１から約１００の範囲であると考えられる。ポリヌクレオチド構築物（すなわちウイルスとして封入されていない）として投与する場合には、約０．０１μｇから約１０００μｇのアデノウイルスベクターを投与することが可能である。アデノウイルスベクターは、使用意図および宿主の免疫応答可能性に依存してもしくは一回または複数回投与されうり、または、複数回同時注入として投与されうる。もし免疫応答が望ましくなければ、強い免疫応答無しに投与を繰り返すことが出来るよう、様々な免疫抑制剤を使用することで免疫応答を減少させ得る。ＨＳＶなどの別のウイルスとして封入されている場合は、投与量はその特定のウイルスについての標準的な知見（例えば公表論文などから容易に得ることができる）に基づいており、かつ経験的に決定されうる。
【０２３４】
本発明のアデノウイルスベクターの使用法
本ベクターを、広範囲の様々な目的で使用することが可能であり、これは、望ましい、または意図される結果により変わると考えられる。すなわち、本発明は上述のアデノウイルスベクターの使用法を含む。
【０２３５】
一つの態様において、標的細胞特異的ＴＲＥを機能させる細胞に、好ましくは標的細胞に選択的細胞毒性を与える方法が提供され、この方法はそのような細胞と本明細書記載のアデノウイルスベクターを接触させる段階を含む。細胞毒性は、色素排除法、３Ｈ−チミジン取り込み、および／または溶解などの、当技術分野における標準的アッセイ法を利用することで測定されうる。
【０２３６】
別の態様において、標的細胞特異的ＴＲＥを機能させる細胞、好ましくは標的細胞、好ましくは癌細胞に特異的なアデノウイルスを増殖させるための方法が提供される。これらの方法は、アデノウイルスベクターを細胞と混合させ、それによってアデノウイルスを増殖させる段階を伴う。
【０２３７】
別の態様は、細胞混合物と本発明のアデノウイルスベクターを混合させる段階を含む、標的細胞特異的ＴＲＥを細胞混合物中で機能させる細胞を殺傷する方法を提供する。細胞混合物は一般に正常細胞および宿主細胞特異的ＴＲＥを機能させる癌細胞の混合物であり、インビボの混合物でもよいし、インビトロの混合物でもよい。
【０２３８】
本発明はまた、生物試料において、癌細胞など、標的細胞特異的ＴＲＥを機能させる細胞を検出する方法を含む。これらの方法は特に、実験的または臨床的な設定のどちらにおいても、個体（すなわち哺乳動物）の臨床的および／または生理学的な条件をモニターするのに有用である。ある態様において、生物試料の細胞をアデノウイルスベクターと接触させ、アデノウイルスベクターの複製を検出する。または、試料を、レポーター遺伝子が標的細胞特異的ＴＲＥの制御下にあるアデノウイルスと接触させることが可能である。そのようなアデノウイルスを生物試料に導入した場合、レポーター遺伝子の発現が、標的細胞特異的ＴＲＥを機能させる細胞の存在を示す。または、細胞の生存に条件付きで必要な遺伝子が標的細胞特異的ＴＲＥの制御下に位置するようなアデノウイルスを構築することが可能である。この遺伝子は、例えば抗生物質耐性をコードし得る。その後で、生物試料は抗生物質で処理される。抗生物質耐性を表す生存細胞の存在により、標的細胞特異的ＴＲＥを機能させる細胞の存在が示される。適切な生物試料とは、癌細胞などの標的細胞特異的ＴＲＥを機能させる細胞が存在しうる、または存在することが疑われ得るものである。一般に、哺乳動物において、適切な臨床上の試料とは、癌細胞など標的細胞特異的ＴＲＥを機能させる癌性細胞の存在が疑われるものである。そのような細胞は、例えば、針生検またはその他の外科的手段により得られうる。接触させる細胞は、選択的濃縮および／または可溶化など、アッセイ条件を促進させるために処理され得る。これらの方法においては、標的細胞特異的ＴＲＥを機能させる細胞は、当技術分野において標準的な、アデノウイルス増殖を検出するインビトロアッセイ法を用いて検出されうる。そのような標準的アッセイ法の例は、バースト（ｂｕｒｓｔ）アッセイ法（ウイルス収量を測定する）およびプラークアッセイ法（細胞あたりの感染粒子を測定する）を含むが、これに限定されない。増殖はまた、標準的な検出方法である特異的なアデノウイルスＤＮＡ複製の測定によっても検出されうる。
【０２３９】
本発明はまた、標的細胞の遺伝子型を修飾する方法も提供し、この方法は標的細胞を本明細書記載のアデノウイルスベクターと接触させる段階を含み、アデノウイルスベクターは細胞へ侵入する。
【０２４０】
本発明はさらに、腫瘍細胞、好ましくは標的細胞特異的ＴＲＥを機能させる腫瘍細胞の増殖を抑制する方法を提供し、この方法は、アデノウイルスベクターが腫瘍細胞に侵入して腫瘍細胞に対して選択的な細胞毒性を示すように、腫瘍細胞を本発明のアデノウイルスベクターに接触させる段階を含む。これらの方法に関しては、アデノウイルスベクターを、（下記へ挙げたような）化学療法剤、放射線および／または抗体など、腫瘍抑制のためのその他の治療様式と組み合わせて使ってもよいし、使わなくてもよい。
【０２４１】
本発明はまた、個体における腫瘍細胞マーカーのレベルを低下させる方法も提供し、この方法は個体へ本発明のアデノウイルスを投与する段階を含み、アデノウイルスベクターは標的細胞特異的ＴＲＥを機能させる細胞に対して選択的細胞毒性である。腫瘍細胞マーカーにはＣＫ−２０が含まれるが、これに限定されない。腫瘍細胞マーカーのレベルの測定法は当業者に公知であり、かつ腫瘍細胞マーカーに特異的な抗体を用いる酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの免疫学的アッセイ法を含むが、これに限定されない。一般に、生物試料は検査されるべき個体より得られ、ＥＬＩＳＡなどの適切な測定法が生物試料に対して実施される。これらの方法では、アデノウイルスベクターは、（下記へ挙げるような）化学療法剤、放射線および／または抗体などの腫瘍抑制のためのその他の治療様式と組み合わせて使ってもよいし、使わなくてもよい。
【０２４２】
本発明はまた、有効量の本明細書記載のアデノウイルスベクターが個体へ投与されるような、治療方法も提供する。アデノウイルスベクターを用いた治療は、上述の癌を有する個体において示されている。また、病気が切除された個体および癌の家族歴をもつ個体など、癌（単一の細胞を含む）の発症の危険にさらされていると考えられる個体においても示される。本発明のアデノウイルスベクター投与の適切性の決定はとりわけ、血清学的徴候および組織生検の組織学的な検査などの、査定可能な臨床学的パラメータに依存すると考えられる。一般的には、薬学的に許容されうる賦形剤中にアデノウイルスベクターを含む薬学的組成物が投与される。薬学的組成物は上述である。これらの方法では、アデノウイルスベクターは、（下記へ挙げるような）化学療法剤、放射線および／または抗体などの腫瘍抑制のためのその他の治療様式と組み合わせて使ってもよいし、使わなくてもよい。
【０２４３】
投与されるアデノウイルスベクターの量は、アデノウイルスベクターがその他の治療様式と組み合わせて使われたかどうかはもちろん、投与経路、個体の病状、病気の病原力（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅｎｅｓｓ）の程度、利用された特定の標的細胞特異的ＴＲＥ、特定のベクター構築物（すなわちどのアデノウイルス遺伝子が標的細胞特異的ＴＲＥの制御下にあるか）、などのいくつかの因子に依存すると考えられる。
【０２４４】
封入されたアデノウイルスとして投与される場合、約１０４から約１０１４、好ましくは約１０４から約１０１２、より好ましくは約１０４から約１０１０投与される。ポリヌクレオチド構築物（すなわちウイルスとして封入されていない）として投与される場合、約０．０１μｇから約１００μｇ好ましくは０．１μｇから約５００μｇ、より好ましくは約０．５μｇから約２００μｇが投与されうる。二つ以上のアデノウイルスベクターを、同時にまたは連続的に投与することが可能である。典型的には投与を、あらゆる応答をモニターしながら、定期的に行う。投与を、例えば腫瘍内、静脈内または腹腔内で行うことが可能である。
【０２４５】
本発明のアデノウイルスベクターは、単独で、または所望の目的を促進する化学療法剤などの他の活性剤と組み合わせて、利用することが可能である。膀胱腫瘍の増殖を抑制するのに適切な化学療法剤の例としては、カルメット−ゲラン桿菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔ−Ｇｕｅｒｉｎ；ＢＧＣ）、マイトマイシン−Ｃ、シスプラチン、チオテパ、ドキソルビシン、メトトレキセート、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（商標））、イホスファミド、硝酸ガリウム、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、カルボプラチン、シクロホスファミド、ビンブラスチン、ビンクリスチン、フルオロウラシル、エトポシド、ブレオマイシンが挙げられる。併用治療の例としては、ＣＩＳＣＡ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、およびシスプラチン）、ＣＭＶ（シスプラチン、メトトレキセート、ビンブラスチン）、ＭＶＭＪ（メトトレキセート、ビンブラスチン、ミトキサントロン、カルボプラチン）、ＣＡＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、シスプラチン）、ＭＶＡＣ（メトトレキセート、ビンブラスチン、ドキソルビシン、シスプラチン）が挙げられる。放射線もまた化学療法剤と併用されうり、例えば放射線とシスプラチンが併用され得る。化学療法剤の投与は一般的に膀胱内（膀胱へ直接）または静脈内である。
【０２４６】
以下の実施例は説明のために提供されるものであり、本発明を限定するものではない。
【０２４７】
実施例
実施例１：ＡＦＰ−ＴＲＥおよびＥＭＣＶ ＩＲＥＳを含む、複製受容能のあるアデノウイルスベクターの構築
表１に記載した脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）ＩＲＥＳを、以下のように、ＡＦＰ発現細胞に特異的な複製受容能のあるアデノウイルスベクターのＥ１Ａ領域とＥ１Ｂ領域の間に導入した。表１は、表４に列挙したプライマーＡ／Ｂにより、ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社のｐＣＩＴＥベクターからＰＣＲ増幅された５１９塩基対のＩＲＥＳセグメントを示している。Ｅ１Ａプロモーター領域内の９８塩基対を、Ａｄ５の最左側の１６ｍｕを含むプラスミドであるｐＸＣ．１において欠失させた。プラスミドｐＸＣ．１（ＭｃＫｉｎｎｏｎ（１９８２）Ｇｅｎｅ、１９：３３−４２）は、ベクターｐＢＲ３２２内に末端逆反復配列、パッケージング配列、ならびにＥ１ａ遺伝子およびＥ１ｂ遺伝子を含む、アデノウイルス５の２２位〜５７９０位のヌクレオチド由来の野生型Ａｄ５の左側の端を含む。ｐＢＨＧ１０（Ｂｅｔｔら（１９９４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９１：８８０２−８８０６；Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｔｒｏｎｔｏ）は、Ｅ３が欠失した、Ａｄ５の右末端を提供する。得られるプラスミドＣＰ３０６（ＰＣＴ／ＵＳ９８／１６３１２）は、ＣＰ６２４作製のための重複ＰＣＲにおける骨格として使用した。Ｅ１ａおよびＥ１ｂの間にＳａｌＩ部位を配置するために、プライマーＣ／Ｄ、Ｅ／Ｆ（表４）を用い、ｐＸＣ．１由来でありかつＥ１ａプロモーターを欠失しているプラスミドである、ＣＰ３０６を増幅した。鋳型としてＣＰ３０６およびプライマーＣ／Ｄ、Ｅ／Ｆを使用した１回目のＰＣＲの後、得られた２種のＤＮＡ断片を、プライマーＣ／Ｆによる別の回の重複ＰＣＲのために一緒に混合した。重複ＰＣＲ産物を、平滑末端ライゲーションによりベクターへクローニングした。得られたプラスミドＣＰ６２４（表５）は、Ｅ１ａ／Ｅ１ｂ遺伝子間領域に１００ｂｐの欠失を含み、この接合部にＳａｌＩ部位を導入している。このプラスミド上で、内在性Ｅ１ａプロモーターが欠失し、Ｅ１ａポリアデニル化シグナルおよびＥ１ｂプロモーターが、ＳａｌＩ部位で置換されている。次にＣＰ６２５のＳａｌＩ断片をＣＰ６２４のＳａｌＩ部位にクローニングし、ＣＰ６２７を作製した（表５）。ＣＰ６２７は、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳと結合しているアデノウイルス必須遺伝子Ｅ１ａおよびＥ１ｂを有する。ＣＰ６２７において、一連の様々な腫瘍特異的プロモーターは、Ｅ１ａの前のＰｉｎＡＩ部位に配置され、Ｅ１発現を転写制御することができる。
【０２４８】
【表４】
2004511203.tif 000003
【０２４９】
肝臓癌特異的ウイルスの作製のため、表３に示した約０．８ｋｂ ＡＦＰプロモーター断片を、ＣＰ６２７のＰｉｎＡＩ部位へ配置し、これによりプラスミドＣＰ６８６を得た。完全長ウイルスゲノムを、ＣＰ６８６とアデノウイルスゲノムの右腕を含むプラスミドの間の組換えにより得た。ウイルス組換えにおいて使用された右腕は、無傷のＥ３領域を含むｐＢＨＧＥ３（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、およびＥ３領域に欠失を含むｐＢＨＧ１１またはｐＢＨＧ１０（Ｂｅｔｔら、（１９９４））であった。
【０２５０】
無傷のＥ３領域を含む右腕を用いたＣＰ６８６の組換えにより得られたウイルスを、ＣＶ８９０と称した。欠失Ｅ３領域を含む右腕（ｐＢＨＧ１０）を用いたＣＰ６８６の組換えにより得られたウイルスを、ＣＶ８４０と称した。全てのウイルスゲノムの構造を、対応する特異的領域の診断用であるＰＣＲ増幅を行って確認した。
【０２５１】
従って、ＣＶ８９Ｏと称されたアデノウイルスベクターは、０．８ｋｂ ＡＦＰプロモーター、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ａプロモーターの欠失、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、Ｅ１Ｂ、Ｅ１Ｂプロモーターの欠失および無傷のＥ３領域を含む。アデノウイルスベクターＣＶ８４０は、ＡＦＰプロモーター、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ａプロモーターの欠失、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、Ｅ１Ｂ、Ｅ１Ｂプロモーターの欠失および欠失したＥ３領域を含む。
【０２５２】
【表５】
2004511203.tif 000004
【０２５３】
実施例２：プロバシンＴＲＥおよびＥＭＣＶ ＩＲＥＳを有する、複製受容能のあるアデノウイルスベクターの構築
表３に示したようなプロバシンプロモーターを、プラスミドＣＰ６２７のＰｉｎＡＩ部位へ挿入し（実施例１参照）、Ｅ１Ａの上流にプロバシンプロモーター、およびＥ１ＡとＥ１Ｂの間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳを含むＣＰ６２８を作製した。完全長ウイルスゲノムは、ＣＰ６２８とアデノウイルスゲノムの右腕を含むプラスミドの間の組換えにより得た。ウイルス組換えに使用した右腕は、無傷のＥ３領域を含むｐＢＨＧＥ３、およびＥ３領域が欠失したｐＢＨＧ１１またはｐＢＨＧ１０であった。全てのウイルスゲノムの構造を、対応する特異的領域の診断用であるＰＣＲ増幅を行い確認した。
【０２５４】
従って、ＣＶ８３４と称されるアデノウイルスは、プロバシンプロモーター、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ａプロモーターの欠失、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、Ｅ１Ｂ、Ｅ１Ｂ内在性プロモーターの欠失および欠失したＥ３領域を含む。
【０２５５】
実施例３：ｈＣＭＶ−ＴＲＥおよびＥＭＣＶ ＩＲＥＳを有する、複製受容能のあるアデノウイルスベクターの構築
本来ｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社、ＰａｌｏＡｌｔｏ）起源のプラスミドＣＰ６２９由来のｈＣＭＶ前初期遺伝子（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ；ＩＥ）プロモーターを、プラスミドＣＰ６２７のＰｉｎＡＩ部位へ挿入し（実施例１参照）、Ｅ１Ａの上流にＣＭＶ ＩＥプロモーターおよびＥ１ＡとＥ１Ｂの間にＩＲＥＳを含む、ＣＰ６２９を作製した。完全長ウイルスゲノムは、ＣＰ６２９とアデノウイルスゲノムの右腕を含むプラスミドの間の組換えにより得た。ウイルス組換えに使用した右腕は、無傷のＥ３領域を含むｐＢＨＧＥ３、およびＥ３領域の欠失を含むｐＢＨＧ１１またはｐＢＨＧ１０であった。全てのウイルスゲノムの構造を、対応する特異的領域の判断用であるＰＣＲ増幅を行い確認した。
【０２５６】
従って、ＣＶ８３５と称されるアデノウイルスは、ｈＣＭＶ−ＩＥプロモーター、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ａプロモーターの欠失、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、Ｅ１Ｂ、Ｅ１Ｂ内在性プロモーターの欠失および欠失したＥ３領域を含む。ＣＶ８３５は、ｈＣＭＶエンハンサーを欠失しており、したがって組織特異的ではない。ｈＣＭＶ ＩＥエンハンサー配列をＣＶ８３５に添加することにより、ベクターを組織特異的とする。
【０２５７】
実施例４：Ｅ１発現を制御する様々なＴＲＥを用いたＩＲＥＳ含有アデノウイルスベクターの複製
一般に弱いプロモーターとみなされているプロバシンプロモーター（ＣＶ８３６およびＣＶ８３４）、ならびに一般に強力なプロモーターとみなされているヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子（ＨＣＭＶ−ＩＥ）プロモーター（ＣＶ８３７およびＣＶ８３５）を含むアデノウイルスベクターのウイルス複製を、ウイルス収量アッセイ法で特徴付けた。
【０２５８】
プロバシンプロモーターを含むアデノウイルスベクター（ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４１３２参照）であるＣＶ８３６およびＣＶ８３４、ならびにＨＣＭＶ−ＩＥプロモーターを含むアデノウイルスベクターであるＣＶ８３７およびＣＶ８３５を、ウイルス複製（致死率の指標）および特異性に関する細胞株のパネルに対して試験した。２９３細胞株（産生株）、ＬＮＣａｐ細胞株およびＨｅｐＧ２細胞株を、６ウェル組織培養プレートに、ウェル１個あたり０．５×１０６個となるよう播種し、３７℃で２４時間インキュベーションし、その後ＣＶ８３６、ＣＶ８３４またはＣＶ８３７およびＣＶ８３５に、２プラーク形成単位／細胞（ＰＦＵ／細胞）の感染多重度（ＭＯＩ）で、３７℃で４時間感染した。感染期間の最後に、培地を置換して、細胞を３７℃で更に７２時間インキュベーションして、ユー（Ｙｕ）ら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５９：１４９８−１５０４により記載されたウイルス収量アッセイ法のために収集した。結果を図３に示す。
【０２５９】
データにより、Ｅ３領域に欠失を有する野生型ＡＤ５のようなＩＲＥＳが欠如した対照ウイルスと比較して、Ｅ１ＡとＥ１Ｂの間の遺伝子間領域中のＩＲＥＳ因子の存在はウイルス複製に有意に作用しないことが明らかにされた。ＣＶ８３４において、組織の細胞毒性の喪失は、ウイルス構造中のプロバシンプロモーターの弱さにより引き起されると考えられる。
【０２６０】
実施例５：二重ＴＲＥベクターの単一ＴＲＥ／ＩＲＥＳ含有ベクターとの比較
２種の肝臓癌特異的アデノウイルスベクターであるＣＶ７９０およびＣＶ７３３（各々、ＣＮ７９０およびＣＮ７３３とも称される）を作製して特徴決定した。ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４０８４を参照されたい。これらのウイルスは二つのＡＦＰ ＴＲＥを含み、一つはＥ１Ａの上流にあり、および一つはＥ１Ｂの上流にある。ＣＶ７９０は無傷のＥ３領域を含む一方、ＣＶ７３３においてはＥ３領域が欠失している点で、これらは異なる。これらの２種のウイルスの複製を、新たに作製したＩＲＥＳ含有ウイルスであるＣＶ８９０およびＣＶ８４０（実施例１参照）と比較した。
【０２６１】
ウイルス複製を、様々な細胞型において、実施例４に説明したようなウイルス収量アッセイ法を用いて比較した。細胞を各型のウイルスに感染させ、感染から７２時間後、ウイルス収量をプラークアッセイ法により決定した。図４Ａおよび図４Ｂは、様々な細胞型における様々なウイルスについてのウイルス収量を示している。結果により、Ｅ１Ｂ翻訳がＩＲＥＳにより調節されている、Ｅ１ＡとＥ１Ｂの間にＩＲＥＳを含むベクター（ＣＶ８９０およびＣＶ８４０）は、２９３細胞および肝細胞癌細胞のようなＡＦＰ産生細胞において、正常なアデノウイルスおよび二重ＡＦＰ ＴＲＥを有するウイルスと同程度複製することが示された。ＳＫ−Ｈｅｐ−１（肝細胞）、ＰＡ−１細胞（卵巣癌）およびＬＮＣａＰ細胞（前立腺細胞）において、ＩＲＥＳ含有ウイルスは、二重ＴＲＥまたは野生型アデノウイルスと同様に複製せず、このことは、ＩＲＥＳ含有ウイルスが肝臓癌細胞に対しより高い特異性を有することを示唆している。これらの結果に基づいて、ＩＲＥＳ含有ベクターは、二重ＴＲＥベクターと変わらない複製レベルを有するが、より安定しており、かつより良好な標的細胞特異性を有すると結論付けられる。
【０２６２】
実施例６：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳを含むウロプラキンアデノウイルス構築物
ウロプラキンＩＩ配列（マウスおよび／またはヒト）に加えＥＭＣＶ内部リボソーム接近部位（ＩＲＥＳ）を含む、多くのＥ３含有ウイルス構築物を調製した。これらのウイルス構築物を、表６に概略する。これらのベクターは全て、Ｅ１Ａプロモーターを欠如しており、Ｅ１Ａエンハンサーを保持していた。
【０２６３】
５１９塩基対のＥＭＣＶ ＩＲＥＳセグメントを、プライマーＡ／Ｂを用いて、ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社のｐＣＩＴＥベクターからＰＣＲ増幅した：
2004511203.tif 000005
（ＧＴＣＧＡＣはＳａｌＩ部位である）。
【０２６４】
ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ因子を、ＰＣＲ平滑末端ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＣＲ（登録商標）平滑末端ベクター）にライゲーションした。
【０２６５】
ＣＰ１０６６
ＣＰ６２０由来のマウスＵＰＩＩの１．９ｋｂ（−１８８５位から＋１位）断片を、ＡｆｌＩＩＩ（平滑化）およびＨｉｎｄＩＩＩで消化して、ＸｈｏＩ（平滑化）およびＨｉｎｄＩＩＩで消化したＣＰ６２０由来のｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃへ挿入し、ＣＰ１０６６を作製した。
【０２６６】
ＣＰ１０８６
１．９ｋｂのマウスＵＰＩＩ挿入物を、ＰｉｎＡＩで消化して、同様にＰｉｎＡＩで切断したＣＰ２６９（Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂ内在性プロモーターを欠失している、ＣＭＶ駆動（ｄｒｉｖｉｎｇ）Ｅ１ＡおよびＩＲＥＳ駆動Ｅ１Ｂ）へライゲーションした。
【０２６７】
ＣＰ１０８７
１ｋｂ（−１１２８位から＋１位）ヒトＵＰＩＩを、ＣＰ６６５からＰｉｎＡＩで切り出して、ＰｉｎＡＩで切断されたＣＰ６２９へ挿入し、精製した（ＣＭＶ溶離のため）。
【０２６８】
ＣＰ１０８８
２．２ｋｂ（−２２２５位から＋１位）ヒトＵＰＩＩを、ＣＰ６５７から、プライマー
2004511203.tif 000006
を用いて増幅し、ＰｉｎＡＩを用いて消化して、ＰｉｎＡＩを用いて切断したＣＰ６２９とライゲーションした。
【０２６９】
ＣＰ６２７は、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂの接合部に脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来の内部リボソーム接近部位（ＩＲＥＳ）を有するＡｄ５プラスミドである。まず、ＣＰ３０６（Ｙｕら、１９９９）を、プライマー対９６．７４．３／９６．７４．６および９６．７４．４／９６．７４．５で増幅した。
【０２７０】
これら２種のＰＣＲ産物を混合し、プライマー対９６．７４．３および９６．７４．５を用いて増幅した。得られたＰＣＲ産物は、Ｅ１Ａ−Ｅ１Ｂ遺伝子間領域に１００ｂｐの欠失および接合部に新たなＳａｌＩ部位を含む。ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ断片を、ｐＣＩＴＥ−３ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）から、プライマー９６．７４．１および９６．７４．２を用いて増幅した。ＩＲＥＳを含むＳａｌＩ断片をＳａｌＩ部位に配置し、バイシストロニックＥ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂカセットを持つＣＰ６２７を作製した。ＣＰ６２９は、プライマー９９．１２０．１および９９．１２０．２を用いてｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）から増幅され、ＣＰ６２７のＰｉｎＡＩ部位へクローニングされたＣＭＶプロモーターを有するプラスミドである。
【０２７１】
ＣＰ６５７は、ｐＧＬ３Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）においてヒトＵＰＩＩ遺伝子の２．２ｋｂの５’隣接領域を有するプラスミドである。２．２ｋｂ ｈＵＰＩＩを、プライマー１００．１１３．１および１００．１１３．２を用いてＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ産物からＰＣＲにより増幅して、ｐＧＥＭ−ＴへＴＡクローニングし、ＣＰ６５５を作製した。
【０２７２】
ＳａｃＩＩ（平滑末端）およびＫｐｎＩを用いて消化した２．２ｋｂ挿入物を、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃへ、ＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）およびＫｐｎＩにおいてクローニングし、ＣＰ６５７を作製した。
【０２７３】
ＣＰ１０８９
１ｋｂ（−９６５から＋１）マウスＵＰＩＩを、ＰｉｎＡＩによりＣＰ２６３から消化して、ＰｉｎＡＩで切断したＣＮ４２２（Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂ内在性プロモーターの欠失を有するＰＳＥ起動Ｅ１ＡおよびＧＫＥ起動Ｅ１Ｂ）へ挿入して、精製し、更にＥａｇＩで消化して、ＥａｇＩを用いてＣＰ６６９から切断した１ｋｂ（−１１２８位から＋１位）のヒトＵＰＩＩにライゲーションした。
【０２７４】
ＣＰ１１２９
ＰｉｎＡＩ部位を有する１．８ｋｂ ｈＵＰＩＩ断片を、プライマー１２７．５０．１および１２７．２．２を用いてＣＰ６５７から増幅して、ＣＰ６２９のＰｉｎＡＩ部位へクローニングした。
【０２７５】
ＣＰ１１３１
ＣＰ６８６を、ＣＰ６２９中のＣＭＶプロモーターの、ＣＰ２１９由来のＡＦＰ断片との置換により構築した。１．４ｋｂ ＤＮＡ断片を、ＢｓｓＨＩＩによる消化によりＣＰ６８６から切り離し、Ｋｌｅｎｏｗを充填し（ｆｉｌｌｉｎｇ）、その後ＢｇｌＩＩで消化した。次にこのＤＮＡ断片を、同様に切断したＣＰ６８６へクローニングし、ＣＰ１１９９を作製した。ＣＰ１１９９において、Ｅ１Ｂ １９ＫＤａ領域のほとんどが欠失していた。ＰｉｎＡＩ部位を有する１．８ｋｂ ｈＵＰＩＩ断片を、プライマー１２７．５０．１および１２７．２．２を用いたＰＣＲによりＣＰ６５７から増幅して、同様に消化したＣＰ１１９９へ挿入し、ＣＰ１１３１を作製した。
【０２７６】
前記プラスミドを全て、ｐＢＨＧＥ３と同時トランスフェクションし、ＣＶ８７４（ＣＰ１０８６由来）、ＣＶ８７５（ＣＰ１０８７由来）、ＣＶ８７６（１０８８由来）およびＣＶ８７７（ＣＰ１０８９由来）、ＣＶ８８２（ＣＰ１１２９由来）ならびにＣＶ８８４（ＣＰ１１３１由来）を作製した。ＣＰ１０８８、ＣＰ１１２９およびＣＰ１１３１を、各々、ＣＶ８７６、ＣＶ８９２およびＣＶ８８４構築のために、ｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社）により１１日〜１４日間ｐＢＨＧＥ３と同時トランスフェクションした。ｐＢＨＧＥ３は、ミクロビクス（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）社から購入し、前述した。細胞を、３回の凍結融解サイクルにより溶解させ、１週間かけて２９３細胞においてプラーク形成させた。単一のプラークを採取して、２９３細胞における３日〜５日間の感染により増幅した。ウイルスＤＮＡを、溶解物から単離して、ＰＣＲにより、Ｅ１領域で、ＣＶ８７６についてはプライマー３１．１６６．１／５１．１７６を用いて、ＣＶ８８２およびＣＶ８８４についてはプライマー１２７．５０．１／５１．１７６を用いて、ならびにＥ３領域で、３種全てのウイルスについてプライマー３２．３２．１／２を用いて、構築物を確認した。
【０２７７】
【表６】
2004511203.tif 000007
ウイルスを、前述のように試験して特徴付けした。
【０２７８】
プライマー配列：
2004511203.tif 000008
【０２７９】
実施例７：チロシナーゼＴＲＥおよびＥＭＣＶ ＩＲＥＳを有する、複製受容能のあるアデノウイルスベクターの構築
ＣＰ６２１は、ＰｉｎＡＩ断片にヒトチロシナーゼエンハンサー因子およびプロモーター因子を含むプラスミドである。この断片を、ＣＰ６２７のＰｉｎＡＩ部位にライゲーションし、ＣＰ１０７８を作製した。ＣＰ１０７８をｐＢＨＧＥ３と組合せ、新規黒色腫特異的ウイルスであるＣＶ８５９を作製した。表３は、チロシナーゼプロモーターおよびエンハンサーを含むＰｉｎＡＩ断片のポリヌクレオチド配列を示している。
【０２８０】
実施例８：プロバシンＴＲＥおよびＶＥＧＦ ＩＲＥＳを有する、複製受容能のあるアデノウイルスベクターの構築
実施例１に記載したのと類似した戦略を用いて、マウス血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）遺伝子由来のＩＲＥＳ断片を増幅して、ＣＰ６２８へＳａｌＩ部位でクローニングした。表１は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ｍＲＮＡから入手可能なＩＲＥＳ断片を示している。この断片を、Ｅ１ａ／Ｅ１ｂ遺伝子間領域にクローニングするために、２種の長いオリゴヌクレオチド小片（ｐｉｅｃｅ）を合成した。センスオリゴヌクレオチドを表に示すが、一方第二の小片は、これに対応するアンチセンスなものである。これら２種を一緒にアニーリングし二本鎖を作製した後、二本鎖をＳａｌＩ消化に供し、得られた断片を、ＣＰ６２８上のＳａｌＩ部位にクローニングした。得られたプラスミドＣＰ６３０は、Ｅ１ａの前にプロバシンプロモーターを、およびＥ１ｂの前にＶＥＧＦ ＩＲＥＳ因子を有する。このプラスミドを用い、ＶＥＧＦ ＩＲＥＳ因子を含む前立腺癌特異的ウイルスを構築した。
【０２８１】
実施例９：ＡＦＰ−ＴＲＥおよびＶＥＧＦ ＩＲＥＳを有する、複製受容能のあるアデノウイルスベクターの構築
実施例１に記載したのと類似した戦略を用いて、ＡＦＰ ＴＲＥを含むＰｉｎＡＩ断片を得ることができる。このＡＦＰ ＴＲＥを、ＣＰ６２８上のＥ１Ａの前のＰｉｎＡＩ部位にクローニングし、プラスミドＣＰ１０７７を得た。このプラスミドは、Ｅ１転写制御のためのＡＦＰ ＴＲＥ、および、Ｅ１ｂ前にＶＥＧＦ ＩＲＥＳ因子を有している。ＣＰ１０７７を、ｐＢＨＧＥ３を用いて組換え、ＣＶ８５８と称する肝臓特異的アデノウイルスを作製することができる。
【０２８２】
実施例１０：ｈＫＬＫ２−ＴＲＥおよびＥＭＣＶ ＩＲＥＳを有する、複製受容能のあるアデノウイルスベクターの構築
実施例１に類似した戦略を用い、表３に示したようなヒト腺性カリクレインＩＩ由来のＴＲＥ断片を、ＣＰ６２７のＰｉｎＡＩ部位へクローニングした。得られたプラスミドＣＰ１０７９を、ｐＢＨＧＥ３と同時トランスフェクションし、ＣＶ８６０を作製した。
【０２８３】
実施例１１：複製受容能のある肝細胞癌特異的ＣＶ７９０およびドキソルビシンならびに肝細胞癌特異的ＣＶ８９０およびドキソルビシンを用いた、Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍異種移植片の治療
ＣＶ７９０は、ＡＦＰ産生肝細胞癌特異的なアデノウイルスであり、Ｅ３領域と同一のＡＦＰプロモーターおよびエンハンサー（表３に示した８２２塩基対のプロモーター）の制御下にあるＥ１ＡおよびＥ１Ｂを有する。ＣＶ８９０アデノウイルス構築物もまた、８２２ｂｐ ＡＦＰプロモーター（制限部位に対するヌクレオチドを含む８２７ｂｐ）の転写制御下にある、Ｅ１Ａ遺伝子およびＥ１Ｂ遺伝子を有する肝細胞癌特異的または肝臓特異的なアデノウイルス変異体であり、ここでＥ１Ｂは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳの転写制御下にあり、無傷のＥ３領域を有する。従ってＣＶ８９０構造は、ＡＦＰ／Ｅ１Ａ、ＩＲＥＳ／Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４と読まれる。ＣＶ７９０およびドキソルビシンならびにＣＶ８９０およびドキソルビシンの併用の効力のインビボ試験を、以下に記載した小さい変更を伴う、実施例４に詳述したプロトコールによって実行した。
【０２８４】
化学療法剤と併用したＣＶ７９０およびＣＶ８９０の試験における異種移植片として、肝臓癌Ｈｅｐ３Ｂ細胞を使用した。ウイルスＣＶ７９０またはＣＶ８９０を、ヌードマウスの尾静脈を通じて１×１０１１粒子の単回静脈内注射により投与した。ウイルス送達の１日後、ドキソルビシン一回量を、各動物へ、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により投与した。ドキソルビシン単独およびドキソルビシンとウイルス療法の併用の両方に関して、ドキソルビシン用量は１０ｍｇ／ｋｇであった。腫瘍体積を、６週間にわたり週１回測定した。腫瘍を、外径により２次元で毎週測定して、体積を式［長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）２］／２により概算した。
【０２８５】
図８は、二重ＴＲＥを含むＣＶ７９０と比較した、ＩＲＥＳを含むＣＶ８９０の抗腫瘍活性を示す。図８で明らかであるように、相対腫瘍体積は、ＣＶ７９０を投与した場合よりもＣＶ８９０を投与した場合の方が少なかった。更に、肝細胞癌のＣＶ７９０／ドキソルビシンおよびＣＶ８９０／ドキソルビシン療法は両方とも、相乗的結果を示した。ＣＶ７９０／ドキソルビシンまたはＣＶ８９０／ドキソルビシンのいずれかによる治療の４日後、相対腫瘍体積は、１０％未満であった。ウイルス単独またはドキソルビシン単独のいずれかで治療されたマウスと異なり、ＣＶ７９０／ドキソルビシンまたはＣＶ８９０／ドキソルビシンのいずれかで治療したマウスについての、４日後の相対腫瘍体積は増加しなかった。対照マウスにおける６日目に、相対腫瘍体積はＣＶ７９０試験においておよそ１０００％であり、ＣＶ８９０試験においておよそ６００％であった。ウイルス単独で治療されたマウスの相対腫瘍体積は、２５０％（ＣＶ７９０）および５２０％（ＣＶ８９０）であるのに対し、ドキソルビシン単独で治療されたマウスについての相対腫瘍体積は４５０％であり、ＣＶ７９０試験において２８０％であり、ＣＶ８９０試験において５００％であった。
【０２８６】
実施例１２：メラノサイト特異的ＴＲＥ含有アデノウイルス構築物のインビトロ特徴決定
メラノサイト細胞特異的アデノウイルスベクターの開発に際し特に有用な目的とは、黒色腫の患者を治療することである。メラノサイト特異的ＴＲＥの活性を測定する方法、およびそれにより所与の細胞がメラノサイト特異的ＴＲＥを機能させるかどうかを決定する方法を以下に説明する。
【０２８７】
細胞および培養法
例えばＨｅｐＧ２細胞（肝臓）；Ｌｏｖｏ細胞（結腸）；ＬＮＣａｐ細胞（前立腺）；ＰＭＥＬ細胞（黒色腫）；ＳＫＭｅｌ細胞（黒色腫）；Ｇ３６１細胞（黒色腫）およびＭｅＷｏ細胞などの宿主細胞を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から９継代で入手した。ＭｅＷｏ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ １６４０培地（ＲＰＭＩ社）において維持した。ルシフェラーゼ発現についてアッセイするＭｅＷｏ細胞を、１０％ストリップ（ｓｔｒｉｐ）−血清（Ｔ３、Ｔ４、およびステロイドを除去するためにチャコール／デキストラン処理したウシ胎仔血清；Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔ社、Ｃａｌａｂａｓｅｓ、ＣＡ）ＲＰＭＩ中において維持した。
【０２８８】
ＭｅＷｏ細胞のトランスフェクション
トランスフェクションのために、ＭｅＷｏ細胞を、細胞密度が６ｃｍ培養皿（Ｆａｌｃｏｎ社、ＮＪ）１個当り５×１０５個細胞になるよう、完全ＲＰＭＩ中に播種した。Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＡＰ（登録商標）；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社、ＡＬ）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ（商標）；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社、ＡＬ）の１：１モル比脂質混合物と複合させた後、ＤＮＡをＭｅＷｏ細胞へ導入し、ＤＮＡ／脂質複合体を、血清非含有ＲＰＭＩにおいて、２：１のモル比で調製した。典型的には、ＤＮＡ８μｇ（２４．２ｎｍｏｌ）を、不完全ＲＰＭＩ ２００μＬに希釈して、５０ｎｍｏｌのトランスフェクション用脂質を含むＲＰＭＩ ２００μＬへと、成分の均質な混合を確実にするためにゆっくり攪拌しながら滴下した。ＤＮＡ／脂質複合体を、室温で１５分間アニーリングさせ、その後それらをＭｅＷｏ細胞へ添加した。培地をＭｅＷｏ細胞から取除いて血清非含有ＲＰＭＩ １ｍＬで置換し、ＤＮＡ／脂質複合体を滴下した。細胞を、複合体と共に、３７℃、５％ＣＯ２下で、４時間〜５時間インキュベーションした。培地を除去して、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。その後これらの細胞をトリプシン処理し、１０％ストリップ−血清ＲＰＭＩ（フェノールレッド非含有）中で再懸濁した。細胞を、不透明な９６ウェル組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ社、ＮＪ）に、１００ μＬ培地につき細胞密度４０，０００細胞／ウェルで再度播種し、アッセイした。
【０２８９】
プラークアッセイ法
前述のアデノウイルス構築物がメラノサイト中で優先的に複製するかどうかを決定するために、プラークアッセイ法を行った。プラーク形成効率を、下記の細胞型について評価した：黒色腫細胞（ＭｅＷｏ細胞）、前立腺癌細胞株（ＬＮＣａｐ細胞）、乳房正常細胞株（ＨＢＬ−１００細胞）、卵巣腫瘍細胞株（ＯＶＣＡＲ−３細胞、ＳＫ−ＯＶ−３細胞）、およびヒト胚性腎細胞（２９３細胞）。２９３細胞株はＡｄ５ Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂタンパク質を発現するため、プラーク形成効率のための陽性対照としてはたらく。メラノサイト特異的ＴＲＥを含む構築物の分析のために、上述の細胞株などの、メラノサイト特異的ＴＲＥを機能させることができる細胞、およびＨｕＨ７細胞、ＨｅＬａ細胞、ＰＡ−１細胞またはＧ３６１細胞などのこのように機能させない細胞を使用した。プラークアッセイ法を下記のように行った。集密細胞の単層を、感染の前に、６ウェル皿に１８時間播種した。単層を、各ウイルスの１０倍連続希釈液で感染させた。単層を４時間血清非含有培地（ＭＥＭ）中で感染させた後、培地を取除き、０．７５％低融点アガロースおよび組織培養培地の溶液で置換した。感染の２週間後、プラークをスコア化した。
【０２９０】
実施例１３：ＣＥＡ−ＴＲＥおよびＥＭＣＶ ＩＲＥＳを有する、複製受容能のあるアデノウイルスベクターの構築
実施例１に類似した戦略を用い、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）（表３、配列番号：１４）由来のＴＲＥ断片を用い、ＣＶ８７３と称されるウイルスを構築した。ＣＥＡ−ＴＲＥを含むＰｉｎＡＩ断片を、転写制御のために、Ｅ１Ａ ＣＰ６２７の前のＰｉｎＡＩ部位にクローニングした。得られたプラスミドＣＰ１０８０をｐＢＨＧＥ３と共に用い、ＣＶ８７３を作製した。
【０２９１】
実施例１４：抗腫瘍活性のインビトロおよびインビボにおけるアッセイ法
尿路上皮細胞特異的アデノウイルスベクター開発における特に有用な目的は、膀胱癌患者の治療である。実行可能性の最初の指標は、細胞株およびＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスにおいて皮下増殖した腫瘍異種移植片に対する細胞毒性活性についてのベクター（または複数）の試験である。
【０２９２】
ＣＶ８７６のインビトロ特徴決定
ＣＶ８７６のウイルス収量アッセイ法
５×１０５個の２９３細胞、ＲＴ−４細胞、ＳＷ７８０細胞、ＰＡ−１細胞、Ｇ３６１細胞、ＭＫＮ１細胞、ＨＢＬ−１００細胞、繊維芽細胞（肺由来）および平滑筋細胞（膀胱由来）を、６ウェルプレートの各ウェルに播種した。２４時間後、培地を吸引して、ＭＯＩ ２ｐｆｕ／細胞でＣＶ８０２（Ｅ３を有する野生型Ａｄ５）またはＣＶ８７６を含有する１ｍＬの血清非含有ＲＰＭＩ １６４０で置換した。３７℃で４時間インキュベーションした後、細胞を予め温めたＰＢＳで洗浄し、２ｍＬの完全ＲＰＭＩ １６４０を各ウェルに添加した。３７℃で更に７２時間放置後、これらの細胞を培地にスクラップ（ｓｃｒａｐ）して、３回の凍結融解サイクルにより溶解させた。溶解物を、ウイルス産生について、８日間〜１０日間、２９３細胞に対し半固形アガロース下での３つ組のプラークアッセイ法で試験した。
【０２９３】
全ての被験細胞において良好に増殖する、野生型Ａｄ５であるＣＶ８０２とは異なり、ＣＶ８７６は、許容細胞（２９３細胞、ＲＴ−４細胞およびＳＷ７８０細胞）において、非許容細胞（ＰＡ−１細胞、Ｇ３６１細胞、ＭＫＮ１細胞、ＨＢＬ−１００および初代細胞）においてよりも、約１００倍〜１００００倍良好に複製した。注目すべきは、 ＳＷ７８０細胞におけるＣＶ８７６の複製は、ＣＶ８０２の約１／１００であり、これはこのウイルスの有効性の限界を示唆している。
【０２９４】
ＣＶ８７６の増殖曲線実験
５×１０５個のＲＴ−４細胞、ＰＡ−１細胞、平滑筋細胞および繊維芽細胞を、６ウェルプレートの各ウェルに播種した。２４時間後、培地を吸引して、ＭＯＩ ２ｐｆｕ／細胞でＣＶ８０２（１３３を有する野生型Ａｄ５）またはＣＶ８７６を含有する１ｍＬの血清非含有ＲＰＭＩ １６４０で置換した。３７℃で４時間インキュベーションした後、細胞を予め温めたＰＢＳで洗浄し、２ｍＬの完全ＲＰＭＩ １６４０を各ウェルに添加した。０時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間および１２０時間の様々な時点で、細胞を培地にスクラップして、３回の凍結融解サイクルにより溶解させた。溶解物を、ウイルス産生について、８日間〜１０日間、２９３細胞に対し半固形アガロース下での３つ組のプラークアッセイ法で試験した。
【０２９５】
ウイルス収量アッセイ法の時と非常に類似して、ＣＶ８７６は、ＲＴ−４細胞においてのみ良好に複製したが、初代細胞およびＰＡ−１細胞においては１２０時間を超えても良好に複製しなかった。しかし、ＣＶ８７６は、ＲＴ−４細胞において、ＣＶ８０２と比べて複製の遅延を示さなかった。
【０２９６】
ＣＶ８７６についての細胞変性効果
５×１０５個の２９３細胞、ＲＴ−４細胞、ＳＷ７８０細胞、ＰＡ−１細胞、ＭＫＮ１細胞およびＬＮＣａｐ細胞を、６ウェルプレートの各ウェルに播種した。２４時間後、培地を吸引して、０．００１から１０まで漸増するＭＯＩにおいてＣＶ８０２（Ｅ３を有する野生型Ａｄ５）またはＣＶ８７６を含有する１ｍＬの血清非含有ＲＰＭＩ １６４０で置換した（ＭＯＩ １でのデータは示さず）。３７℃で４時間インキュベーションした後、培地を完全ＲＰＭＩ １６４０ ３ｍＬで置換し、細胞変性作用がＣＶ８０２についてＭＯＩ ０．０１において認められた場合には、３７℃で６日間〜８日間インキュベーションした。
【０２９７】
ＣＶ８０２は、全ての被験細胞において効力を示したのに対し、ＣＶ８７６は、許容細胞（２９３細胞、ＲＴ−４細胞およびＳＷ７８０細胞）のみを殺傷し、非許容細胞（ＰＡ−１細胞、ＭＫＮ−１およびＬＮＣａｐ細胞）は殺傷しなかった。
【０２９８】
ＣＶ８７６についてのＭＴＴアッセイ法
２×１０４個の２９３細胞、ＲＴ−４細胞、ＳＷ７８０細胞、ＭＫＮ１細胞、ＰＡ−１細胞、ＨＢＬ−１００細胞、平滑筋細胞（膀胱由来）および繊維芽細胞（肺由来）を、９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。２４時間後、これらの細胞を、ＣＶ８０２およびＣＶ８７６を含む完全ＲＰＭＩ １６４０中で、０．００１から１０まで漸増するＭＯＩにおいて感染させた。細胞増殖および生存に関する迅速比色アッセイ法を、１日目、３日目、５日目、７日目および１０日目の各時点で行った。培地をＭＴＴの１ｍｇ／ｍｌ溶液５０μｌで置換したが、これは肝細胞の活性ミトコンドリア内に存在する脱水素酵素により不溶性の紫色のホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）に転換される。３７℃で３時間〜４時間インキュベーションした後、溶液をイソプロパノールで置換して、プレートを、３０℃で１時間インキュベーションして、５６０ｎｍ試験波長および６９０ｎｍ参照波長で測定した。
【０２９９】
ＣＰＥアッセイ法の結果と同様に、ＣＶ８７６は、許容細胞においてのみ効力を示し、非許容細胞においては示さなかった。また、ＲＴ−４細胞およびＳＷ７８０細胞において、ＣＶ８７６は、ＣＶ８０２よりもはるかにゆっくりと細胞を殺傷した。
【０３００】
ＣＶ８８２のインビトロ特徴決定
ＣＶ８８２についてのウイルス収量アッセイ法
５×１０５個の２９３細胞、ＲＴ−４細胞、ＳＷ７８０細胞、Ｇ３６１細胞、ＬＮＣａｐ細胞、ＨＢＬ−１００細胞、ＭＫＮ１細胞、ＰＡ−１細胞、繊維芽細胞および平滑筋細胞を、６ウェルプレートの各ウェルに播種した。２４時間後、培地を吸引して、ＭＯＩ ２ｐｆｕ／細胞でＣＶ８０２（Ｅ３を有する野生型Ａｄ５）またはＣＶ８８２を含有する１ｍＬの血清非含有ＲＰＭＩ １６４０で置換した。３７℃で４時間インキュベーションした後、細胞を予め温めたＰＢＳで洗浄し、２ｍＬの完全ＲＰＭＩ １６４０を各ウェルに添加した。３７℃で更に７２時間放置後、細胞を培地にスクラップして、３回の凍結融解サイクルにより溶解させた。溶解物を、ウイルス産生について、８日間〜１０日間、２９３細胞に対し半固形アガロース下での３つ組のプラークアッセイ法で試験した。
【０３０１】
許容細胞（２９３細胞、ＲＴ４細胞およびＳＷ７８０細胞）におけるＣＶ８８２の複製は、ＣＶ８０２と同等であったが（差は１００倍未満であった）、非許容細胞（Ｇ３６１細胞、ＬＮＣａｐ細胞、ＨＢＬ−１００細胞、ＭＫＮ１細胞、ＰＡ−１細胞および初代細胞）においては、１０００〜１００００００倍を上回る差を示した。
【０３０２】
ＣＶ８８２の増殖曲線実験
５×１０５個のＲＴ４細胞、ＰＡ−１細胞、および繊維芽細胞を、６ウェルプレートの各ウェルに播種した。２４時間後、培地を吸引して、ＭＯＩ ２ｐｆｕ／細胞でＣＶ８０２（Ｅ３を有する野生型Ａｄ５）またはＣＶ８８２を含有する１ｍＬの血清非含有ＲＰＭＩ １６４０で置換した。３７℃で４時間インキュベーションした後、細胞を予め温めたＰＢＳで洗浄し、２ｍＬの完全ＲＰＭＩ １６４０を各ウェルに添加した。０時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間および１２０時間の様々な時点で、細胞を培地にスクラップして、３回の凍結融解サイクルにより溶解させた。溶解物を、ウイルス産生について、８日間〜１０日間、２９３細胞に対し半固形アガロース下での３つ組のプラークアッセイ法で試験した。
【０３０３】
ウイルス収量アッセイ法の時と非常に類似して、ＣＶ８８２は、ＲＴ−４細胞においてのみ良好に複製したが、初代細胞およびＰＡ−１細胞においては１２０時間を超えても良好に複製しなかった。加えて、ＣＶ８８２は、ＲＴ−４細胞において、ＣＶ８７６と比べてより良好な複製を示した。
【０３０４】
ＣＶ８８２についての細胞変性効果
５×１０５個の２９３細胞、ＲＴ−４細胞、ＳＷ７８０細胞、ＨＢＬ−１００細胞、Ｇ３６１細胞、ＰＡ−１細胞および繊維芽細胞を、６ウェルプレートの各ウェルに播種した。２４時間後、培地を吸引して、０．００１から１０まで漸増するＭＯＩにおいてＣＶ８０２（Ｅ３を有する野生型Ａｄ５）またはＣＶ８８２を含有する１ｍＬの血清非含有ＲＰＭＩ １６４０で置換した（ＭＯＩ １でのデータは示さず）。３７℃で４時間インキュベーションした後、培地を、完全ＲＰＭＩ １６４０ ３ｍＬで置換し、細胞変性作用がＣＶ８０２についてＭＯＩ ０．０１において認められた場合には、３７℃で６日間〜８日間インキュベーションした。
【０３０５】
ＣＶ８０２が全ての被験細胞において効力を示したのに対し、ＣＶ８８２は、許容細胞（２９３細胞、ＲＴ−４細胞およびＳＷ７８０細胞）のみを殺傷し、非許容細胞（ＨＢＬ−１００、Ｇ３６１細胞、ＰＡ−１細胞および繊維芽細胞）を殺傷しなかった。
【０３０６】
ＣＶ８８２についてのＭＴＴアッセイ法
２×１０４個のＲＴ−４細胞、ＳＷ７８０細胞、ＰＡ−１細胞、ＨＢＬ−１００細胞、Ｕ１１８細胞および繊維芽細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。２４時間後、細胞を、ＣＶ８０２およびＣＶ８８２で、完全ＲＰＭＩ １６４０中で、０．００１から１０まで漸増するＭＯＩにおいて感染させた。細胞増殖および生存に関する迅速な比色アッセイ法を、１日目、３日目、５日目、７日目および１０日目の各時点で行った。培地を、ＭＴＴの１ｍｇ／ｍｌ溶液５０μｌで置換したが、これは肝細胞の活性ミトコンドリア内に存在する脱水素酵素により不溶性の紫色のホルマザンに転換される。３７℃で３時間〜４時間インキュベーションした後、溶液をイソプロパノールで置換して、プレートを、３０℃で１時間インキュベーションして、５６０ｎｍ試験波長および６９０ｎｍ参照波長で測定した。
【０３０７】
ＣＰＥアッセイ法の結果と同様に、ＣＶ８８２は、許容細胞においてのみ効力を示し、非許容細胞においては示さなかった。
【０３０８】
ＣＶ８８４のインビトロ特徴決定
ＣＶ８８４についてのウイルス収量アッセイ法
５×１０５個の２９３細胞、ＲＴ−４細胞、ＳＷ７８０細胞、Ｇ３６１細胞、ＬＮＣａｐ細胞、ＨＢＬ−１００細胞、ＭＫＮ１細胞、ＰＡ−１細胞、繊維芽細胞および平滑筋細胞を、６ウェルプレートの各ウェルに播種した。２４時間後、培地を吸引して、ＭＯＩ ２ｐｆｕ／細胞でＣＶ８０２（Ｅ３を有する野生型Ａｄ５）またはＣＶ９８４を含有する１ｍＬの血清非含有ＲＰＭＩ １６４０で置換した。３７℃で４時間インキュベーションした後、細胞を予め温めたＰＢＳで洗浄し、２ｍＬの完全ＲＰＭＩ １６４０を各ウェルに添加した。３７℃で更に７２時間放置後、これらの細胞を培地にスクラップして、３回の凍結融解サイクルにより溶解させた。溶解物を、ウイルス産生について、８日間〜１０日間、２９３細胞に対し半固形アガロース下での３つ組のプラークアッセイ法で試験した。
【０３０９】
ＣＶ８８４の複製は、許容細胞（２９３細胞、ＲＴ−４細胞およびＳＷ７８０細胞）においてはＣＶ８０２と非常に類似しているが、非許容細胞（Ｇ３６１細胞、ＬＮＣａｐ細胞、ＨＢＬ−１００細胞、ＭＫＮ１細胞、ＰＡ−１細胞および初代細胞）においては、ＣＶ８０２との１０００倍を上回る違いを示した。ＣＶ８８４は、多くの特異性を失うことなく、ＣＶ８７６およびＣＶ８８２よりもより良好な効力を示している。
【０３１０】
ＣＶ８８４の増殖曲線実験
５×１０５個のＲＴ−４細胞、ＰＡ−１細胞、平滑筋細胞および繊維芽細胞を、６ウェルプレートの各ウェルに播種した。２４時間後、培地を吸引して、ＭＯＩ ２ｐｆｕ／細胞でＣＶ８０２（Ｅ３を有する野生型Ａｄ５）またはＣＶ８８４を含有する１ｍＬの血清非含有ＲＰＭＩ １６４０で置換した。３７℃で４時間インキュベーションした後、細胞を予め温めたＰＢＳで洗浄し、２ｍＬの完全ＲＰＭＩ １６４０を各ウェルに添加した。０時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間および１２０時間の様々な時点で、細胞を培地にスクラップして、３回の凍結融解サイクルにより溶解させた。溶解物を、ウイルス産生について、８日間〜１０日間、２９３細胞に対し半固形アガロース下での３つ組のプラークアッセイ法で試験した。
【０３１１】
ウイルス収量アッセイ法の時と非常に類似して、ＣＶ８８４は、ＲＴ−４細胞においてのみ良好に複製した（ＣＶ８０２と同様）が、初代細胞およびＰＡ−１細胞においては良好に複製しなかった。また、ＣＶ８８４の複製は、ＣＶ８８２およびＣＶ８７６よりも優れていた。
【０３１２】
ＣＶ８８４についての細胞変性効果
５×１０５個の２９３細胞、ＲＴ−４細胞、ＳＷ７８０細胞、Ｇ３６１細胞、ＰＡ−１細胞および繊維芽細胞を、６ウェルプレートの各ウェルに播種した。２４時間後、培地を吸引して、０．００１から１０まで漸増するＭＯＩにおいてＣＶ８０２（Ｅ３を有する野生型Ａｄ５）またはＣＶ８８４を含有する１ｍＬの血清非含有ＲＰＭＩ １６４０で置換した（ＭＯＩ １でのデータは示さず）。３７℃で４時間インキュベーションした後、培地を、完全ＲＰＭＩ １６４０ ３ｍＬで置換し、細胞変性作用がＣＶ８０２についてＭＯＩ ０．０１において認められた場合には、３７℃で６日〜８日間インキュベーションした。
【０３１３】
ＣＶ８０２は、全ての被験細胞において効力を示したのに対し、ＣＶ８８４は、許容細胞（２９３細胞、ＲＴ−４細胞およびＳＷ７８０細胞）のみを殺傷し、非許容細胞（Ｇ３６１細胞、ＰＡ−１細胞および繊維芽細胞）は殺傷しなかった。
【０３１４】
ＣＶ８８４についてのＭＴＴアッセイ法
２×１０４個の２９３細胞、Ｔ−４細胞、ＳＷ７８０細胞、Ｕ１１８細胞、繊維芽細胞および平滑筋細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。２４時間後、これらの細胞を、ＣＶ８０２およびＣＶ８８４で、完全ＲＰＭＩ １６４０中で、０．００１から１０まで漸増するＭＯＩにおいて感染させた。細胞増殖および生存に関する迅速な比色アッセイ法を、１日目、３日目、５日目、７日目および１０日目の各時点で行った。培地を、ＭＴＴの１ｍｇ／ｍｌ溶液５０μｌで置換したが、これは肝細胞の活性ミトコンドリア内に存在する脱水素酵素により不溶性の紫色のホルマザンに転換される。３７℃で３時間〜４時間インキュベーションした後、溶液をイソプロパノールで置換して、プレートを、３０℃で１時間インキュベーションして、５６０ｎｍ試験波長および６９０ｎｍ参照波長で測定した。
【０３１５】
ＣＰＥアッセイ法の結果と同様に、ＣＶ８８４は、許容細胞においてのみ強力な効力を示し（野生型Ａｄ５同様）、非許容細胞においては示さなかった。
【０３１６】
ＣＶ８０８のインビトロ活性
マウスに、１×１０６個のＳＷ７８Ｏ細胞を皮下注射（ＳＣ）した。腫瘍が約５００ｍｍ３に成長した時点で、ＣＶ８０８をマウスに腫瘍内導入した（ＰＢＳおよび１０％グリセロール０．１ｍｌ中ウイルス５×１０７ＰＦＵ）。対照マウスにはビヒクル単独を導入した。腫瘍サイズを毎週測定した。結果を図１１に示す。このデータは、ＣＶ８０８は腫瘍増殖の抑制に効果があることを示している。
【０３１７】
本明細書に記載されたウイルスに基づく治療は、病巣内投与（すなわち、直接注射）される可能性が高いにもかかわらず、アデノウイルスベクターの静脈内（ＩＶ）投与が腫瘍の成長に影響を及ぼすかどうかを決定することも望ましい。そうであるならば、その後、ウイルスを、直接注射では接近不可能な転移性腫瘍沈着を治療するために使用することができると考えられる。この実験のために、膀胱上皮腫瘍を有するマウス群に、アデノウイルスベクター１Ｏ８〜１０１０ ＰＦＵ、または陰性対照としてのウイルスを運搬するために使用した緩衝液を、尾静脈注射により接種した。腫瘍サイズに対するアデノウイルスベクターのＩＶ注射の作用を、ビヒクル処置と比較した。
【０３１８】
実施例１５：ＣＶ８９０と化学療法剤の相乗作用
材料および方法
細胞
肝細胞癌細胞株であるＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ＳＮＵ４４９およびＳｋ−Ｈｅｐ−１、Ｃｈａｎｇ肝細胞（ヒト正常肝細胞）に加え、他の腫瘍細胞株であるＰＡ−１（卵巣癌）、ＵＭ−ＵＣ−３（膀胱癌）、ＳＷ７８０（膀胱癌）、ＨＢＬ１００（乳房上皮細胞）、Ｃｏｌｏ２０１（結腸腺癌）、Ｕ１１８ＭＧ（グリア芽細胞腫）およびＬＮＣａＰ（前立腺癌）を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＣＣ）から入手した。ＨｕＨ−７（肝臓癌）は、パトリシア・マリオン博士（Ｄｒ． Ｐａｔｒｉｃｉａ Ｍａｒｉｏｎ）（スタンフォード大学）のご厚意により得た。２９３細胞（アデノウイルスＥ１領域を含むヒト胚性腎）を、ミクロビクス（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）社（Ｔｒｏｎｔｏ、Ｃａｎａｄａ）から購入した。初代細胞ｎＢｄＳＭＣ（正常ヒト膀胱平滑筋細胞）、ｎＨＬＦＣ（正常ヒト肺繊維芽細胞）、およびｎＨＭＥＣ正常ヒト乳房上皮細胞）を、クロンティクス（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）社（ＳａｎＤｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入した。全ての腫瘍細胞株を、１０％ウシ胎仔血清（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ １６４０（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社）において維持した。初代細胞を、供給元（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社、ＳａｎＤｉｅｇｏ）の指示に従い維持した。細胞を、イムノアッセイ法（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、ＳａｎＣａｒｌｏｓ、ＣＡ）により、ＡＦＰ発現について試験した。
【０３１９】
ウイルス収量および一段階（ｏｎｅ−ｓｔｅｐ）増殖曲線
６ウェル皿（Ｆａｌｃｏｎ社）に、ウェル１個あたり５×１０５個の関心対象の細胞を感染の２４時間前に播種した。細胞を、血清非含有培地において、感染多重度（ＭＯＩ）２ ＰＦＵ／細胞で３時間感染させた。３時間後、ウイルス含有培地を除去し、単層を、３回ＰＢＳで洗浄して、完全培地（ＲＰＭＩ１６４Ｏ＋１０％ＦＢＳ）４ｍｌを各ウェルに添加した。感染後７２時間で、細胞を培養培地にスクラップして、３回の凍結融解サイクルにより溶解させた。
【０３２０】
一段階増殖曲線時点を、感染後様々な時点で収集した。各ウイルス細胞の組合せの２回の独立した感染を、２９３細胞に対し２つ組で力価決定した。（Ｙｕら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５９：１４９８−１５０４）。
【０３２１】
ノーザンブロット分析
Ｈｅｐ３Ｂ細胞またはＨＢＬ１００細胞を、ＣＶ８０２またはＣＶ８９０のいずれかを用いて、ＭＯＩ ２０ＰＦＵ／細胞（細胞当りプラーク形成単位）で感染させて、感染後２４時間で収集した。細胞全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。ノーザンブロットは、ＮｏｒｔｈｅｒｎＭａｘ Ｐｌｕｓ試薬（Ａｍｂｉｏｎ社、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）を用いて行った。ＲＮＡ ５μｇを、１％アガロースの、ホルムアルデヒドに基づく変性ゲル上で分画して、ＢｒｉｇｈｔＳｔａｒ−Ｐｌｕｓ（Ａｍｂｉｏｎ社）正帯電した膜にキャピラリートランスファー（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）により転写した。Ｅ１Ａ（アデノウイルスゲノム５０１ｂｐから１１４１ｂｐ）またはＥ１Ｂ（１５４０ｂｐから３９１０ｂｐ）のアンチセンスＲＮＡプローブは、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にクローニングされ、かつ［α３２Ｐ］ＵＴＰで転写標識されたＰＣＲ産物であった。ブロットを、ＺｉｐＨｙｂ溶液により６８℃で１４時間ハイブリダイズさせ、標準法（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて洗浄した。膜を、ＢｉｏＭａｘフィルム（Ｋｏｄａｋ社）に曝露した。
【０３２２】
ウェスタンブロット分析
Ｈｅｐ３Ｂ細胞またはＨＢＬ１００細胞を、ＣＶ８０２またはＣＶ８９０のいずれかを用いて、ＭＯＩ ２０ＰＦＵ／細胞で感染させて、感染の２４時間後に収集した。細胞を、冷ＰＢＳで洗浄して、氷上で、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ３６０ ａ ＮＰ４Ｏ同等物（Ｓｉｇｍａ社）、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ社、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）中で、３０分間溶解させた。３０分後、４℃で遠心し、上清を収集して、タンパク質アッセイＥＳＬキット（Ｒｏｃｈｅ社）によりタンパク質濃度を決定した。１レーンあたりタンパク質５０μｇを、８１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離して、Ｈｙｂｏｎｄ ＥＣＬ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｎｎａｃｉａ社、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）上に電気ブロットした。膜を、５％無脂肪乾燥ミルクを補充したＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ）中で一晩ブロックした。一次抗体のインキュベーションを、ＰＢＳＴ／１％ミルクで希釈した抗体により室温で２〜３時間行い、その後洗浄して、希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ＳａｎｔａＣｒｕｚ、ＣＡ）と共に１時間インキュベーションした。増強した化学発光体（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を検出に用いた。Ｅ１Ａ抗体（クローンＭ５８）はＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ社（Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から、Ｅ１Ｂ−２１ｋＤ抗体はオンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）社（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から入手した。全ての抗体を、製造業者の指示に従い使用した。
【０３２３】
細胞生存率アッセイ法および統計解析
ウイルスおよび化学療法剤の併用療法における細胞殺傷作用を判定するために、細胞生存率アッセイ法を、先に記載されたものに変更を加え行った（Ｄｅｎｉｚｏｔ（１９８６）Ｊｏｕｒｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、８９：２７１−２７７）。９６ウェルプレート上、関心対象の細胞を、感染の４８時間前に、ウェル１個あたり細胞１０，０００個で播種した。その後細胞を、ウイルス単独、薬物単独、または併用で処理した。細胞生存率は、培地を除去する段階、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド）（Ｓｉｇｍａ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の１ｍｇ／ｍｌ溶液５０μｌを添加する段階、および３７℃で３時間インキュベーションする段階ごとに、様々な時点で測定した。ＭＴＴ溶液を除去した後、ウェル内に残存する結晶を、イソプロパノール５０μｌの添加により溶解化させ、３０℃で０．５時間インキュベーションした。吸光度を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ社）において５６０ｎｍ（試験波長）および６９０ｎｍ（参照波長）で測定した。生存細胞の割合を、ウイルスまたは薬物で処理した細胞の０Ｄ５５０−０Ｄ６５０値を、対照細胞の０Ｄ５５０−０Ｄ６５０値で除算することにより概算した。６個の複製（ｒｅｐｌｉｃａ）試料を各時点で採取して、各実験を少なくとも３回反復して行った。
【０３２４】
統計解析のために、ＣｕｒｖｅＥｘｐｅｒｔ（Ｄａｎｉｅｌ Ｈｙａｍｓのシェアウェア、バージョン１．３４）を用い、ウイルスおよび薬物に関する用量反応曲線をプロットした。この用量反応曲線を基に、アイソボログラムを、スチール（Ｓｔｅｅｌ）およびペッカム（Ｐｅｃｋｈａｍ）の原理（１９９３、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｒａｄ． Ｏｎｃ． Ｂｉｏｌ． Ｐｈｙｓ．、５：８５）ならびにアオエ（Ａｏｅ）らが記載した方法（１９９９、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９：２９１−２９９）に従い作製した。
【０３２５】
動物実験
６週齢〜８週齢のＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕ無胸腺マウスを、シモンソンラボラトリーズ（Ｓｉｍｏｎｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（Ｇｉｌｒｏｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から入手して、腫瘍移植前の１週間実験室条件に馴化した。異種移植片を、１００μｌのＲＰＭＩ １６４０培地中に懸濁した１×１０６個のＨｅｐ３Ｂ細胞、ＨｅｐＧ２細胞またはＬＮＣａＰ細胞の皮下注入により確立した。腫瘍が２００ｍｍ３から３００ｍｍ３の間に達したら、マウスを無作為化して、被験物質１００μｌを腫瘍内注射または尾静脈注射により投薬した。腫瘍を、外径より２次元寸法を測定して、体積を式［長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）２］／２により概算した。動物は、腫瘍負荷が過剰になった時点で人道的に屠殺した。血清を眼窩後方の出血（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ ｂｌｅｅｄ）から毎週採取した。血清中のＡＦＰレベルを、ＡＦＰイムノアッセイキット（Ｇｅａｚｙｍｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、ＳａｎＣａｒｌｏｓ、ＣＡ）により決定した。処置群間の平均腫瘍体積および平均血清ＡＦＰ濃度の差異を、対のない両側ｔ検定を用いて統計学的有意性について比較した。
【０３２６】
様々な細胞におけるＣＶ８９０のＥ１Ａ／Ｅ１Ｂバイシストロニックカセットの転写および翻訳
野生型アデノウイルス感染において、Ｅ１Ａ遺伝子およびＥ１Ｂ遺伝子は、交互にスプライシングされた産物のファミリーを形成する。５個のＥ１Ａ ｍＲＮＡ、中でもとりわけ１２Ｓ（８８０ヌクレオチド、ｎｔ）および１３Ｓ（１０１８ｎｔ）のｍＲＮＡが、感染後初期および後期の両方において発現される主なものであることが見いだされている。１２Ｓおよび１３ＳのｍＲＮＡは、それぞれ、２４３アミノ酸（２４３Ｒ）および２８９アミノ酸（２８９Ｒ）の遺伝子産物をコードしている（Ｓｈｅｎｋ、１９９６に概説）。１９ｋＤおよび５５ｋＤのタンパク質をコードしている２種の主要なＥ１Ｂ転写産物は、１２Ｓ（１０３１ｎｔ）および２２Ｓ（２２８７ｎｔ）のｍＲＮＡである。Ｅ１Ｂ １２Ｓ ｍＲＮＡは１９ｋＤ産物のみをコードしているのに対し、２２Ｓ ｍＲＮＡは、翻訳時の異なる開始部位のために、１９ｋＤおよび５５ｋＤの両産物をコードしている。現在の研究において、Ｅ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂバイシストロニックカセットの作製は、ウイルス感染におけるＥ１ＡおよびＥ１Ｂ転写産物のパターンを変化させると予想された。従って、ノーザンブロット分析を行い、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ転写産物の定常状態レベルを評価した。最初に、ＣＶ８０２またはＣＶ８９０を、Ｈｅｐ３Ｂ（ＡＦＰ）細胞またはＨＢＬ１００（ＡＦＰ）細胞に２４時間感染させた。総ＲＮＡ試料を、アガロースゲル上で分離して、アンチセンスＲＮＡプローブとハイブリダイズすることによりノーザンブロットのために処理した。Ｅ１Ａプローブによるノーザンブロットにより、両方の野生型ＣＶ８０２感染細胞において１２Ｓおよび１３ＳのｍＲＮＡを可視化した。ＣＶ８９０について、Ｅ１Ａ転写産物は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞においてのみ認められ、これはＥ１Ａの条件付き転写を示している。ＣＶ８９０にただひとつの巨大な転写産物（約３．５１Ｋｂ）が存在し、１２Ｓおよび１３ＳのｍＲＮＡは最早存在しないことがわかったことは興味深い。この巨大な転写産物は、Ｅ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂバイシストロニックカセットの連続転写を示し、このことはＣＶ８９０におけるウイルスのＥ１Ａスプライシングパターンの変更を示唆している。ＣＶ８９０からのＥ１Ｂの転写も、ＡＦＰ依存型のように見える。Ｅ１Ｂの１２Ｓおよび２２Ｓの両ｍＲＮＡが、野生型ＣＶ８０２試料中に存在するのに対し、１２Ｓ ｍＲＮＡおよび巨大化した２２Ｓ ｍＲＮＡ（３．５Ｋｂ）は、ＣＶ８９０感染細胞に出現したことが示される。明らかに、この巨大化されたｍＲＮＡの正体は、Ｅ１Ａブロットにおいて可視化されたのと同じ３．５Ｋｂ転写産物であり、これはＥ１Ａ／Ｅ１Ｂバイシストロニックカセットの転写に由来している。従ってＥ１Ｂ ｍＲＮＡは、この巨大な転写産物においてＥ１Ａ ｍＲＮＡの後にタグ付けされている。この巨大な転写産物は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ １９ｋＤおよびＥ１Ｂ ５５ｋＤの全てのコード情報を含む。ＣＶ８０２に出現するｍＲＮＡスプライシングパターンは、ＣＶ８９０にはあてはまらず、Ｅ１Ｂプローブによる１２Ｓ ｍＲＮＡは消失している。一方、Ｅ１Ｂノーザンブロットにおいては、本発明者らのＥ１Ｂプローブ（１５４０ｂｐ−３９１０ｂｐ）の選択により、ヘキソン会合したタンパク質���あるアデノウイルス遺伝子ＩＸ（３５８０ｂｐ−４０７０ｂｐ）のｍＲＮＡも検出された。ＣＶ８９０感染したＨｅｐ３Ｂ細胞において、ＩＸ遺伝子の発現はＣＶ８０２のものと同等であるのに対し、ＣＶ８９０感染ＨＢＬ１００においては、その発現は同様に完全に停止された。この結果は更に、ＡＦＰ制御されたＥ１Ａ／Ｅ１Ｂ発現が、後期遺伝子発現同様、ウイルス複製にとって重要であることを明らかにしている。
【０３２７】
ウェスタンブロットにおける同じ試料の結果も、ＣＶ８９０がＥ１ＡおよびＥ１ＢのＡＦＰ依存型発現を有することを示している。本発明者らの実験条件下において、Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるＣＶ８９０のＥ１Ａ発現レベルは、ＣＶ８０２と類似している。しかし、Ｅ１Ｂ １９ｋＤタンパク質が検出された場合、その発現レベルはＣＶ８０２ Ｅ１Ａよりもはるかに低いことがわかった。これまでに、ＩＲＥＳ媒介性の第二遺伝子が、より少なく発現することが考察されている（Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉら、２０００、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．、１：３７６−３８２）。要約すると、許容Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるＣＶ８９０感染は、正常産生性感染を開始することができる、正常量のＥ１Ａタンパク質およびより少ない量のＥ１Ｂタンパク質を産出することができる。しかしＡＦＰ−細胞において、この過程は、Ｅ１Ａ遺伝子およびＥ１Ｂ遺伝子の転写および翻訳の欠如により減弱された。これらのデータは、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂの両遺伝子の発現が、ＡＦＰ ＴＲＥの制御下にあり、人工的Ｅ１Ａ／Ｅ１ＢバイシストロニックカセットはＣＶ８９０において適切に機能することを明らかにしている。
【０３２８】
ＣＶ８９０の腫瘍細胞および初代細胞におけるインビトロ複製特異性
ウイルス収量のインビトロ比較から、ＣＶ８９０は、ＣＶ７３２よりもより良好な特異性プロフィールを有する（ＣＶ７３２は、Ｅ１Ａ遺伝子がＡＦＰ−ＴＲＥの制御下にあるような、ＡＦＰ産生性細胞特異的アデノウイルス変種である。）。ＣＶ８９０の肝臓癌治療における使用に関する更なる洞察を得るために、より多くの腫瘍細胞株および初代細胞を、インビトロウイルス複製について特徴付けるために試験した。最初に、本試験における全ての細胞を、それらのＡＦＰ状態について、ＡＦＰイムノアッセイ法により分析した。これらの細胞および培地において産生されたＡＦＰを基に、全ての細胞を、高（＞２．５μｇ／１０６細胞／１０日）、低（＜０．６μｇ／１０６細胞／１０日）および無（本研究においては検出不能）の３群に分けた（表７）。異なる細胞株におけるＣＶ８９０の複製は、宿主細胞のＡＦＰ状態によく相関していることを確認した。肝細胞株群において、ＣＶ８９０のみが、ＡＦＰ＋細胞を良好に複製しており、これはＨｅｐ３Ｂ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｈ７、ＳＮＵ４４９およびＰＬＣ／ＰＲＦ／５を含む。先に報告されたＡＦＰ−細胞（Ｐａｒｋら（１９９５）Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ、６２：２７６−２８２）の肝細胞癌細胞株のひとつであるＳＮＵ４４９は、他の細胞と比較して非常に低いＡＦＰ（約６０ｎｇ／１０６細胞／１０日）を産生するので、プロモーター活性に必要とされるＡＦＰ量は、非常に低いように見える。しかし例え非常に少量のＡＦＰを用いてさえ、ＳＮＵ４４９細胞は、ＨｅｐＧ２細胞のような有意に高いレベルのＡＦＰを産生する細胞と同程度まで、依然としてＣＶ８９０の複製を支持することができる。ＣＶ８０２と比べ、ＣＶ８９０は、肝細胞癌細胞Ｓｋ−ＨｅｐｌおよびＣｈａｎｇ肝細胞、他の腫瘍細胞ならびに初代細胞を含む、ＡＦＰを産生しない細胞において１／５，０００〜１／１００，０００まで減弱される。これらの結果をまとめると、ＣＶ８９０は、腫瘍細胞の広範なスペクトルから良好な特異性プロフィールを示すことが指摘された。その中で、ＡＦＰ産生レベル高〜低までのＡＦＰ＋肝細胞だけが、ＣＶ８９０許容性である。
【０３２９】
別の実験において、ＣＶ８９０を、様々な細胞におけるそれらの一段階増殖曲線について、ＣＶ８０２と比較した。結果は、ＣＶ８９０は、ＡＦＰ低産生細胞においてウイルス収量がわずかに低い（２倍〜８倍）ことを除いて、ＡＦＰ＋細胞における野生型ＣＶ８０２と類似した増殖速度論を有することを明らかにしている。実験誤差を考慮しても、ＡＦＰ＋肝細胞癌細胞におけるＣＶ８９０およびＣＶ８０２の複製には劇的な差異はない。しかし、ＡＦＰ−細胞におけるＣＶ８９０の増殖曲線は、明確な減弱を示した。５日間の実験では、ＣＶ８９０は、肝細胞癌細胞（Ｃｈａｎｇｅ肝）および初代細胞（ｎＨＬＦＣ）を含むＡＦＰ−細胞における複製に失敗した。これら全てのインビトロウイルス複製試験から、ＣＶ８９０の複製は、ＡＦＰ−ＴＲＥの厳密な制御下にあって、アデノウイルス変種は、ＡＦＰ産生肝細胞癌細胞を優先的に標的化する優れた特異性プロフィールを有することは明らかである。
【０３３０】
ＣＶ８９０のインビボ特異性および効力
更にＣＶ８９０の特異性を、前立腺癌ＬＮＣａＰ異種移植片を持つ動物において評価した。このインビボ試験において、前立腺異種移植片を有するヌードマウスに、ＣＶ８９０またはＣＶ７８７のいずれかと共に、前立腺癌特異的アデノウイルス変種（Ｙｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５９：４２００−４２０３（１９９９））を静脈内注射した。腫瘍体積を記録して、ＬＮＣａＰ異種移植片においてＣＶ７８７のみが有意な抗腫瘍効力を有するが、ＣＶ８９０で処置した動物の腫瘍は、ビヒクル処置群同様、６週間で４００ｍｍ３からおよそ１２００ｍｍ３まで増大したことが示された。この試験は、ＣＶ８９０は、ＬＮＣａＰ異種移植片を攻撃せず、インビボ条件下において良好な特異性プロフィールを有することを示している。
【０３３１】
ＣＶ８９０のインビボ抗腫瘍効力を評価するために、ヒト肝細胞癌異種移植片を宿すヌードマウスモデルにおいて様々な試験を行った。最初に、ＨｅｐＧ２細胞またはＨｅｐ３Ｂ細胞の異種移植片を有するＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスを確立し、動物を更に、ＣＶ８９０の腫瘍塊への（腫瘍内投与、ＩＴ）またはそれらの尾静脈への（静脈内投与、ＩＶ）、単回投与または反復投与に供した。腫瘍体積および血清ＡＦＰレベルを、処置開始後毎週モニターして、その結果処置の効力を決定した。このインビトロ細胞毒性試験は、ＣＶ８９０がＣＶ７３２よりもより良好な細胞溶解作用を有することを明らかにしている。それらの抗腫瘍活性を更に試験するために、本発明者らは最初に、ＣＶ８９０をＣＶ７３２と比較する動物実験を行った。Ｈｅｐ３Ｂ異種移植片３００ｍｍ３を宿している動物を群別して（ｎ＝６）、ビヒクル単独（対照群）、ＣＶ８９０（１×１０１１粒子／投与、ＣＶ８９０群）、またはＣＶ７３２（１×１０１１粒子／投与、ＣＶ７３２群）を注射した。Ｈｅｐ３Ｂ異種移植片は、非常に侵襲性の腫瘍モデルであり、腫瘍増殖は非常に早い。ほとんどの動物が、過剰な腫瘍負荷のために、長期間生存することができない。６週間の試験期間中に、ＣＶ８９０の静脈内単回投与が有意な腫瘍増殖の阻害を示したのに対し、対照マウスは５週目に１０倍以上の腫瘍増殖を示した。ＣＶ７３２処置群において、ＩＶ注射の単回投与も、対照群と比較して腫瘍増殖を低下させたが、これはＣＶ８９０と比較して非常に小さい効果であった。例えば、ＣＶ８９０処置群の平均腫瘍体積は、３１２ｍｍ３から２１９ｍｍ３へと低下したのに対し、対照群において処置後５週目に腫瘍体積は３０８ｍｍ３から１５４２ｍｍ３へ増加した。対照群およびＣＶ７３２群の両群とも、過剰な腫瘍サイズのために、５週目に終了した。以前、５投与量の静脈内投与後から、ＣＶ７３２が肝細胞癌腫瘍の増殖を制限することが明らかにされている。同様の効力を、ＣＶ８９０のわずか１回の静脈内投与により達成することができ、これはインビボ条件下において、肝細胞癌異種移植片に対し、ＣＶ８９０がＣＶ７３２よりもより良好な効力を有することを示している。この実験において、ＣＶ８９０処置マウス５匹中４匹が、処置の３週間後に腫瘍を有さなかった。しかしＣＶ７３２群においては、６週間の実験を通じて、２匹のマウスの異種移植片が増殖を停止したが、腫瘍を有さない処置動物はなかった。動物のこの群または対照群において腫瘍の退縮はなかった。統計解析によると、ＣＶ８９０処置腫瘍と、ＣＶ７３２処置腫瘍、またはビヒクル処置腫瘍の間の平均相対腫瘍体積および血清ＡＦＰ濃度の差異は、有意であった（ｐ＜０．０１））。要約すると、これらの試験は、ＣＶ８９０が有意な抗腫瘍活性を有し、その腫瘍崩壊（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ）作用は、ＡｖＥ１ａ０４Ｉに類似したアデノウイルス変種であるＣＶ７３２よりも優れており、ここでＡＦＰ ＴＲＥはＥ１Ａのみを制御するために適用される（Ｈａｌｌｅｎｂａｃｋら（１９９９）Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ． Ｔｈｅｒ．、１０：１７２１−１７３３）ことを示唆している。
【０３３２】
化学療法剤と併用したＣＶ８９０の相乗的抗腫瘍効力
この実施例において、様々な化学療法剤をＣＶ８９０と組合せて、Ｈｅｐ３Ｂ細胞またはＨｅｐＧ２細胞におけるそれらのインビトロ殺傷作用について試験した。薬物濃度を、それら自身に対して広範な細胞毒性作用を示さない程度に最適化した。このような条件下で、一部の薬物は、ＣＶ８９０との併用においてより高い細胞殺傷作用を示した。これらの中で、現在ＨＣＣの治療に使用されている薬物であるドキソルビシンが、ＣＶ８９０と相乗的細胞毒性を示した。ドキソルビシンをＣＶ８９０と共にＨｅｐ３Ｂ細胞に対し使用する実験において、ドキソルビシン１０ｎｇ／ｍｌは細胞毒性を示さないが、ＭＯＩわずか０．０１（ｐｆｕ／細胞）においてＣＶ８９０は９日目に細胞の約３５％を殺傷した。しかし、両方を一緒に適用した場合、処置後９日目に、９０％の細胞が殺傷された。併用療法からの可能性のある相乗作用を決定するために、ＭＴＴ細胞生存率データを、更に統計解析した。図１０は、５日目のドキソルビシンおよびＣＶ８９０のＨｅｐ３Ｂ細胞に対する代表的ＩＣ５０アイソボログラムを示している。最初に、ドキソルビシン単独またはＣＶ８９０単独の用量反応曲線を作製した。スチール（Ｓｔｅｅｌ）およびペッカム（Ｐｅｃｋｈａｍ）の原理（１９９３）ならびにアオエ（Ａｏｅ）らの方法（１９９９）に基づき、３種の等効果曲線（方式１および方式２ａ、２ｂ）が構築された。このアイソボログラムから、いくつかのデータ点が、相乗領域または相加領域にあり、このことは、ＣＶ８９０およびドキソルビシンの組合せが、Ｈｅｐ３Ｂ細胞の殺傷に対し相乗作用を提供することを示している。
【０３３３】
ＣＶ８９０単独でも良好な抗腫瘍活性を有するが、本発明者らは、相乗性のインビボ評価にドキソルビシンとの併用療法を適用した。３００ｍｍ３のＨｅｐ３Ｂ異種移植片を有する動物を群別して（ｎ＝６）、ビヒクル単独（対照群）、ＣＶ８９０単独（１×１０１１粒子／一回投与量、ＣＶ８９０群）、ドキソルビシン単独（１０ｍｇ／ｋｇ、ドキソルビシン群）、またはドキソルビシンと組合わせたＣＶ８９０（併用群）を注射した。図１１は、１日目を１００％として標準化した相対腫瘍サイズの毎週の変化を示している。本実験において、６週目までに、対照群の全ての動物は基準線の７００％まで増大した過剰な腫瘍を有していたのに対し、ＣＶ８９０群および併用群の動物においては、腫瘍がないか、または腫瘍が退縮したかのいずれかであった。ＣＶ８９０で処置したＨｅｐ３Ｂ異種移植片を有する８匹のうち、３匹の動物（３７．５％）は、５週目に触知可能な（ｐａｌｐａｂｌｅ）腫瘍を有さず、別の３匹の動物では、６０％を上回る腫瘍の退縮が起こった。併用群において、８匹中４匹の動物が、５週目から腫瘍を有さず、別の４匹の動物は、約９０％腫瘍が退縮した。ＣＶ８９０群および併用群の全ての動物は生存しており、腫瘍は処置後１０週目においても抑制されたのに対し、対照動物は、６週後に過剰な腫瘍負荷のために屠殺された。更に、ＣＶ８９０は、これらのマウスにおいて、血清ＡＦＰ濃度の低下も引き起した。統計解析は、ＣＶ８９０とビヒクル処置群または併用とドキソルビシン処置群の間の、平均相対腫瘍体積および血清ＡＦＰ濃度における差異は、異なる時点で有意であった（ｐ＜０．００５）ことを示した。
【０３３４】
併用療法における強力な効力は、ドキソルビシンと組合わせたＣＶ８９０の単回ＩＶ注射が、ほとんどの動物において侵襲性Ｈｅｐ３Ｂ異種移植片を根絶し得ることを示している。
【０３３５】
【表７】様々な腫瘍細胞におけるＡＦＰ産生
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【０３３６】
【表１】ＩＲＥＳ配列
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【０３３７】
【表２】ＩＲＥＳに関する論文参照
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【０３３８】
【表３】ＴＲＥ配列
ヒトウロプラキンＩＩ５’隣接領域のヌクレオチド配列。位置＋１（翻訳開始部位）に星印をつけた。配列番号：６（配列番号：６の第一位は、翻訳開始部位を基準とした−２２３９位に対応している）。
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マウスウロプラキンＩＩ５’隣接領域のヌクレオチド配列。翻訳開始部位に星印をつけた。配列番号：７（配列番号：７の第一位は、翻訳開始部位を基準とした−３５９２位に対応している）。
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で記載されたプラスミド構築物ＣＰ６２７の概略図である。
【図２】本明細書に記載される様々なアデノウイルスの一連の概略図である。
【図３】実施例４で記載された様々なウイルスの複製効率を示す。
【図４】異なる細胞型における、様々な肝臓特異的ベクターについてのウイルス収量を示す。
【図５】ＩＲＥＳを有する、または有さない、ＡＦＰ−ＴＲＥを含むアデノウイルスベクターの概略図である。
【図６】Ｅ３領域を示す。
【図７】本明細書に記載されたアデノウイルスベクターの概略図である。
【図８】ＩＲＥＳを含むＣＶ８９０のインビボの抗腫瘍活性を示す。この図は、ＣＶ７９０またはＣＶ８９０で処理したＨｅｐＧ２ Ｘｅｎｏｇｒａｐｈの結果を示す。
【図９】ＡＤＰヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１０】第５日目における、Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるドキソルビシンおよびＣＶ８９０のＩＣ５０アイソボログラムを示す。
【図１１】ドキソルビシンを加えたＣＶ８９０のインビボにおける有効性を示す。Ｈｅｐ３Ｂヌードマウスの異種移植片を群別し（ｎ＝６）、ＣＶ８９０単独で（１×１０１１粒子／用量、静脈内）、ドキソルビシン単独で（１０ ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）、ＣＶ８９０およびドキソルビシン併用で（ＣＶ８９０ １×１０１１粒子、尾静脈内、およびドキソルビシン１０ ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）処理した、または、溶剤対照とした。腫瘍のサイズを毎週測定し、処理日における腫瘍体積を１００％として標準化した。エラーバーは平均値の標準偏差を示す。
【図１２】細胞系におけるＣＶ８０２、ＣＶ８８２およびＣＶ８８４のウイルス収量を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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