(57)【要約】本発明は、結合を仲介するアダプターを使用して特にクローニング方法において第１核酸分子のフラグメントを第２の核酸分子に結合する方法、コード、たとえば英数字コードに対応するフラグメントを特に含む、容易に読み取れる情報を含むフラグメント鎖を生成する方法、このようにして生成した核酸分子、およびこのような方法を実施するためのキットを提供する。
2004512807.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも以下の工程を含み、第１核酸分子のフラグメントを第２核酸分子に結びつける方法：
１）該第１核酸分子をその認識部位から離れた切断部位を有するヌクレアーゼで切断し、該第１核酸分子の少なくとも１つのフラグメント（これは該フラグメントの少なくとも一つの末端で一本鎖ヌクレオチド領域（ＳＳ１ａ）を有する）を作り出す工程、
２）必要に応じて該第２核酸分子の少なくとも１つの末端で一本鎖ヌクレオチド領域（ＳＳ２）を作る工程、
３）該第１核酸分子のフラグメントの一本鎖領域（ＳＳ１ａ）に対して相補的である一本鎖領域（ＳＳＡ１）を一方の末端で含み、さらに該第２核酸分子の一末端での一本鎖領域（ＳＳ２）に相補的なもう一つの一本鎖領域（ＳＳＡ２）を他の末端で含んでいるアダプター分子を、工程１）の少なくとも１つの一本鎖領域（ＳＳ１ａ）に結合させる工程、
４）該アダプターを該第１核酸フラグメントに連結させる工程、
５）該アダプターを該第２核酸分子に結合させる工程、
６）該アダプターを該第２核酸分子に連結させる工程。
【請求項２】
上記第１核酸分子フラグメントがいずれかの末端で一本鎖ヌクレオチド領域（ＳＳ１ａおよびＳＳ１ｂ）を持ち、その各々に同一でも異なってもよいアダプターが結合し、該第１アダプターは該第２核酸分子に結合して、該第２アダプターは該第２核酸分子かまたは第３核酸分子のいずれかと結合することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記アダプターが上記第２核酸分子の末端に結合して、これにより環状核酸分子を形成することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記第２核酸分子がベクターもしくはそのフラグメントであり、一本鎖領域が工程２）でヌクレアーゼを用いる該ベクターの切断により生成されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
上記アダプター分子がさらに１以上のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
上記ヌクレアーゼが、ＩＰまたはＩＩＳクラスの酵素からの制限酵素であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
上記第１核酸分子の２以上のフラグメントが、別々の第２核酸分子、および選択により第３核酸分子に、あるいはそれらの別々の末端に結びつけることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
該第１核酸分子の１以上のフラグメントが、アダプターを介して、異なる切断事象から生じる第２核酸分子の一本鎖領域に結びつけることを特徴とする請求項４〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
該第１核酸分子の１以上のフラグメントが、アダプターを介して２以上の第２核酸分子中の一本鎖領域に、結びつけることを特徴とする請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
２以上の第１核酸分子が切断され、アダプター分子により同一反応で同時に、１以上の第２核酸分子に結合することを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
すべての工程が一緒に行われることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに定義された方法に従って生成された核酸分子。
【請求項１３】
請求項１２に定義された核酸分子を含有するクローニングベクターもしくは発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１３に定義されたベクターを含有する真核細胞または原核細胞または遺伝形質転換体。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれかに定義された方法に従って、第１核酸分子フラグメントを第２核酸分子またはそのフラグメントに結合させるためのキットであり、少なくとも（ｉ）請求項１〜９のいずれかに記載の１以上のアダプター、（ｉｉ）第２核酸分子および（ｉｉｉ）認識部位の外側を切断するヌクレアーゼを含み、該アダプターのうちの一つの末端が、該ヌクレアーゼを用いる切断の後に該第２核酸分子上に生成する一本鎖領域に相補的である一本鎖領域を有することを特徴とするキット。
【請求項１６】
少なくとも以下の工程を有する二本鎖核酸分子を合成する方法：
１）ｎ個の二本鎖核酸フラグメントを生成し、少なくともｎ−２個のフラグメントが両末端で一本鎖領域を有し、２個のフラグメントが少なくとも一方の末端で一本鎖領域を有し、ここで（ｎ−１）個の一本鎖領域は、（ｎ−１）個の他の一本鎖領域に相補的であり、これにより（ｎ−１）個の相補的対を生成する工程、
２）該ｎ個の二本鎖核酸フラグメントを接触させ、同時にもしくは連続的に一本鎖領域の相補的対の結合をもたらす工程、
３）所望により該相補的対を同時にもしくは連続的に連結させてｎ個のフラグメントからなる核酸分子を生成する工程。
【請求項１７】
該フラグメントが各々、８〜２５塩基の長さを有することを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ｎが少なくとも１０であることを特徴とする請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
該フラグメントが１以上のコード要素に対応する情報単位を表示する領域を含むことを特徴とする請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
上記コードが英数字であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
上記コードが二進（バイナリー）であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
１以上の上記コード要素の各々に、式
（Ｘ）ａ
が与えられており、ＸがヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃもしくはそれらの誘導体であって相補的結合ができ、各位置において同一でも異なってもよく、ａは４〜１０の整数であり、（Ｘ）ａが１以上のコード要素の各々に対し異なっていることを特徴とする請求項１９〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
上記コードが二進（バイナリー）であり、コード要素、“１”および“０”に、次式が与えられていることを特徴とする請求項２２に記載の方法：
“０”＝（Ｘ）ａ
“１”＝ （Ｙ）ｂ
〔ここで、（Ｘ）ａおよび（Ｙ）ｂは同一ではなく、ＸおよびＹが、各々ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃもしくはそれらの誘導体であって相補的結合ができ、各位置において同一でも異なっていてもよく、ａおよびｂは４〜１０の整数である。〕。
【請求項２４】
式（Ｘ）ａおよび（Ｙ）ｂにおいて、ＸおよびＹが各位置において同一であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも以下の工程を含む二本鎖核酸分子を合成する方法：
１）請求項１６〜２４のいずれかに定義された方法に従って、フラグメント鎖を生成する工程；
２）所望により該フラグメント鎖の終端で一本鎖領域を生成する工程（ここで、該一本鎖領域は、該フラグメント鎖上の他の一本鎖領域に対して相補的であることから、これら一本鎖領域の相補的対を形成する。）；
３）該フラグメント鎖を互いに、同時にもしくは連続的に接触させて該一本鎖領域の該相補的対の結合をもたらす工程。
【請求項２６】
請求項１６〜２５のいずれかに定義された方法に従って生成された核酸分子またはそれらの一本鎖核酸分子。
【請求項２７】
１以上のコード要素に特異的であり、シグナル伝達の手段を担持するプローブが上記核酸分子に結合し、該シグナル伝達手段により発生されたシグナルを検知し、これにより１以上のコード要素を同定することができることを特徴とする、請求項１６〜２５のいずれかに定義された方法に従って調製された核酸分子中に含まれるコード要素を同定する方法。
【請求項２８】
（ｎ）ｍ 個のフラグメントを含んでおり、目的鎖の各位置に可能なコード要素すべてに対応するフラグメントが与えられる、請求項１６〜２７のいずれかに定義されたフラグメントのライブラリー〔ここで、ｎは請求項１６〜２７のいずれかにより定義されるもので該ライブラリーが生成し得る鎖の長さに対応しており、ｍは可能なコード要素もしくはそれらの組み合わせの数に対応する整数である。〕。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、第１核酸分子と第２の核酸分子を結びつける新規の方法に関し、詳細には、第１の分子と第２の分子の間の結合をアダプター分子が仲介するクローニング方法、このようにして形成された核酸分子、容易に読み取れる情報を有するＤＮＡを生成する方法、およびこのような方法を実施するためのキットに関する。
【０００２】
現在知られているクローニング方法は一般に、制限酵素の使用を含む。この制限酵素は、インサート（挿入）フラグメントを生成し、また、ベクターを切断して対応する末端配列、したがって相補的な末端配列を生成するのに使用される。使用される制限酵素は一般に、回文（パリンドローム）配列を切断し、したがって全く同一の突出（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を生み出す。次いで、同じ制限エンドヌクレアーゼを用いて切断した異なる配列を連結して、新たな組換え核酸を形成することができる。
【０００３】
しかし、このような方法にはいくつかの限界がある。全く同じ２つの突出を形成するエンドヌクレアーゼを使用する欠点の１つは、連結するとさまざまな生成物が形成されることである。たとえば２つのフラグメントＡとＢを連結する場合、突出が共通であるため、所望のＡ＋Ｂの他に生成物Ａ＋Ａ、Ｂ＋Ｂも生成される。ＡおよびＢを形成したときに生じたその他のフラグメントに由来する他の副生物、たとえば元の位置への再会合も生じる。そのため、アガロースゲルを使用した分離プロセスを使用するのが普通である。しかしこの分離手順によってしばしば、かなりのＤＮＡが失われる。
【０００４】
このような方法は必然的に、前記の副生物の問題、およびたとえば特定の挿入フラグメントだけをクローン化する場合に所望の最終生成物を同定する必要があることなどを含め、さまざまな限界を有する。
ＰＣＲ技術、たとえばＰＣＲプライマーがＩＩＳ酵素認識部位を有するＰＣＲ技術を使用してクローニングを実行する他のクローニング技術も使用されている。しかし、ＰＣＲ技術は時間のかかる技術であり、かなりの収量損につながる精製段階も必要となるため、クローニング技術においてＰＣＲの使用は不利である。ＰＣＲ反応は、点突然変異などを導入する可能性もあり、フラグメントの長さがポリメラーゼの能力、たとえば最長約５０ｋｂに制限される。
【０００５】
意外にも、固有の一本鎖領域を有するフラグメントを生成し、次いで第１核酸分子と第２の核酸分子の間の結合を仲介することによって、これらの欠点の多くを回避することができることが分かった。この方法では、非同一の突出を形成する制限ヌクレアーゼ、たとえばＩＰまたはＩＩＳ型の制限エンドヌクレアーゼを使用する。４塩基対から成る突出（ｏｖｅｒｈａｎｇ）をつくる制限エンドヌクレアーゼを使用する場合、形成されるそれぞれのフラグメントは、それぞれ４塩基対から成る２つの突出を有するであろう。したがって理論上は、この２つの突出の組合せが異なる４８（すなわち６５，５３６）種のフラグメントを形成することが可能である。したがって切断により形成されるそれぞれのフラグメントは一般に、大きな核酸分子を切断したときでも、固有の突出ペアを有する。
【０００６】
次いでこれらの固有の突出を、２つの突出を有するアダプターを使用して適切に向けて、調整することができる。たとえば、あるクローニング技術では、アダプターの一方の突出を、インサート（挿入）フラグメントの突出に対応させ、他方の突出を、インサートを導入するベクターの突出に対応させる。この方法を図１に概示する。このケースでは、インサートを含むＤＮＡ分子を、インサートの両側に突出をつくる制限エンドヌクレアーゼを用いて切断する。形成される多くのフラグメントはそれぞれ異なる突出を有することから、インサートの両端の２つの突出は固有である。次いでリガーゼを加えて、対応する一本鎖領域を有する２つのアダプターを結合させる。これによってインサートの両方の末端に、インサートをその中にクローン化するベクターへの結合に使用できるように選択された２つの新たな突出が形成される。他の分子上に同一の突出が生み出されない限り、アダプターには所望のインサートだけが連結する。最後の段階ではこのインサートは、アダプターの突出と相補的な２つの突出を有するベクターに連結される。ベクターの突出は、インサートに対して説明した原理と同じ原理を使用して構築することができる。
【０００７】
したがってこの新規の方法では、第１核酸分子上に生成された一本鎖領域と相補的な、したがって第１核酸分子に結合するアダプター分子を使用する。ただしこのアダプター分子は、そのもう一方の末端に異なる一本鎖領域を有し、したがって、第１核酸分子フラグメントが結合のために提示した一本鎖領域を効果的に修飾する。該アダプターの遊離の一本鎖領域は、相補的な一本鎖領域を提示する第２の核酸分子への第１核酸分子フラグメントの結合を仲介することができる。
【０００８】
この仲介の方法は、第１核酸分子フラグメントを効果的に同定し、選択し、次いでそのフラグメントの第２の核酸分子への結合を仲介するという、以前には不可能であった特別の応用を有する。
他のフラグメントとは異なる一本鎖領域を両端に有し、選択されて適当なベクター中にクローン化されることができるクローニングのためのフラグメントの生成は、クローニング方法にとって特に重要である。本明細書で説明するとおり、このようなフラグメントは、認識部位の外側で切断する酵素の使用によって生成され、おそらくフラグメントごとに変化する認識部位の周囲の配列に応じた突出を生成する。
【０００９】
このような技術を使用して、単一のフラグメントだけを特定のベクターに向けることができ、あるいは適当なアダプターが構築されるならば同じ反応混合物の中でも異なる部位または異なるベクターに異なるフラグメントを導くことができる。
これらの方法は、従来技術の方法に優る特定の利点を有する。具体的には、手順全体を、１段階または２段階で実施することができる。たとえば、切断と連結を同時に実施し、または切断と連結を別々に実施することができる。手順を２段階で実施する場合でも、たとえばＴ４　ＤＮＡリガーゼは、制限エンドヌクレアーゼ用のほとんどの緩衝液中で十分に機能すること知られているため、両方の段階を同じ緩衝液中で実施することがしばしば可能である。したがって、時間および資源を消費する沈殿手順を回避することができる。さらに、０〜４塩基の突出を使用する従来のクローニングとは異なり、連結を、４〜６塩基の突出を用いて実行することができ、これによって連結の効率を著しく高めることができる。
【００１０】
さらに、ゲル分離を実施する必要性を回避することができる。最初に必要なＤＮＡの量を大幅に低減させることができる。さらに、ゲル分離の際に普通に生じることだが、ＵＶ露光によるＤＮＡ分子の突然変異も避けることができる。さらに、実験室員が発癌性のＥｔＢｒにさらされない。さらに、制限切断によって同様のサイズのフラグメントが生じるときに起こる分離の問題を回避することができる。空のベクター、過剰なインサート、インサートの方向の誤りなど望ましくない副生物の頻発も回避される。
【００１１】
インサートが切断されるかどうかは一般に問題とはならないため、小さな選択、たとえばタイプＩＩＳまたはＩｐ制限エンドヌクレアーゼについての選択は、これに対応する、従来のクローニング手順に使用される通常のタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの選択に比べてはるかに多くのクローニング可能性を提供することができる。少数のＩＩＳ、ＩＰ型制限エンドヌクレアーゼおよび高い頻度で切断する同種の制限エンドヌクレアーゼを持つことによって、多くのクローニング可能性が可能になる。
【００１２】
大きなＤＮＡ分子（たとえばゲノムＤＮＡ）、または多くの異なるＤＮＡ分子を同時に含む溶液（たとえばｃＤＮＡライブラリー）をクローン化する特殊な場合には、従来の方法を使用することが極めて難しい。たとえば大きなＤＮＡ分子をＥｃｏＲＩを用いて切断する場合には、同じ突出を有する極めて多数のフラグメントが形成され、さらに、これらのフラグメントのかなりの割合がおおよそ同じ大きさとなるであろう。ゲル分離を用いたとしても、これによって多数の望ましくない連結生成物が形成されるに違いない。さらに、インサートが大きい場合にはゲル分離が困難になる。その上、大きなインサートを切断しない制限エンドヌクレアーゼを見つけることはしばしば困難であり、不可能なこともある。本明細書に記載のクローニング手順を使用することによって、これらの問題を低減／排除することができる。
【００１３】
必要であれば、ＣｊｅＩまたは同種のエンドヌクレアーゼを使用することによって突出の塩基対の数を（たとえば）６まで増やして、より多くの可能な変異体を形成し、したがって固有の突出を生成する確率を増大させることができる。
複雑なクローニング手順において、本発明の方法の利点はいっそう大きくなる。たとえばいくつかのアダプターを使用する場合、後に詳細に説明するように、同一のベクター中の対応する数の異なる部位のところに多くの異なるインサートを同一の反応でクローン化することができる。
【００１４】
同じ基本原理を使用して、小さなフラグメントまたは大きなフラグメントの欠失を達成することもできる。このことは、とりわけゲノムＤＮＡの複雑な組換え（異物移植に使用するゲノム中の内因性ウィルスの除去、他のゲノムからの多数の遺伝子の挿入、遺伝子の新たな組合せなど）を実現する可能性を開く。この方法を、人為的な進化系に関して重要なエキソンシャフリング（ｅｘｏｎ−ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）および他の組換えに使用することもできる。
【００１５】
したがって第１の態様では、本発明が、第１核酸分子のフラグメントを第２の核酸分子に結びつける方法であって、少なくとも、
１）該第１核酸分子を、その認識部位から離れた切断部位を有するヌクレアーゼを用いて切断し、該第１核酸分子の少なくとも１つのフラグメント（これは該フラグメントの少なくとも一つの末端で一本鎖ヌクレオチド領域（ＳＳ１ａ）を有する）を作り出す工程と、
２）必要に応じて、該第２の核酸分子の少なくとも一方の末端で一本鎖ヌクレオチド領域（ＳＳ２）を作る工程と、
３）該第１核酸分子フラグメントの一本鎖領域（ＳＳ１ａ）に対して相補的である一本鎖領域（ＳＳＡ１）を一方の末端で含み、さらに、該第２核酸分子の一方の末端の一本鎖領域（ＳＳ２）に相補的なもう一つの一本鎖領域（ＳＳＡ２）を他の末端で含んでいるアダプター分子を、工程１）の少なくとも１つの一本鎖領域（ＳＳ１ａ）に結合させる工程と、
４）該アダプターを該第１核酸フラグメントに連結する工程と、
５）該アダプターを該第２核酸分子に結合する工程と、
６）該アダプターを該第２核酸分子に連結する工程
を含む方法を提供する。
【００１６】
本明細書で使用する前記第１および第２の核酸分子は、一本鎖領域を生み出すことができる二本鎖の任意の天然または合成ポリヌクレオチド分子、たとえばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡおよびそれらの類似体などのＤＮＡである。
第１核酸分子のフラグメントは、その認識部位の外側で切断するヌクレアーゼを使用することによって生成する。切断する部位に応じて１つまたは複数のフラグメントを生み出すことができる（たとえば、部位が分子の最末端である場合には、２つのフラグメントの生成ではなく２、３の塩基だけを除去することができる）。本明細書に記載された他の核酸分子フラグメントは、第１核酸分子フラグメントを生成するのに使用された技術を含む（本明細書に記載の）適当な手段によって生成することができる。フラグメントの長さは１０塩基以上であることが好ましく、たとえば１０から２００ｂｐ、好ましくは１００塩基を超える長さである。クローニング応用のためには、２００塩基を超える長さのフラグメント、たとえば２００塩基から２ｋｂのフラグメントを使用することができる。より長い一本鎖領域を生成する場合には、これよりも長い、たとえば長さ１０〜１００ｋｂ、またはそれ以上のフラグメントも企図される。
【００１７】
本明細書で「一本鎖領域」と呼ぶ領域は、第１、第２または第３の核酸分子、あるいはアダプター分子の端、すなわち末端の突出領域である。これらの領域は、相補的な一本鎖領域を有する分子間の特定の結合およびこれに続くこれらの分子間の連結を可能にするのに十分である。したがって一本鎖領域の長さは、少なくとも１塩基、好ましくは３塩基、より好ましくは少なくとも４塩基の長さ、たとえば４から１０塩基、具体的には４、５または６塩基の長さである。本発明の方法では、長さＭｂまでのフラグメントの使用を可能にする長さ２０塩基までの一本鎖領域が企図される。
【００１８】
本明細書で使用する「結合」という用語は、相補的な一本鎖領域の会合（すなわち非共有結合）段階を指す。これに続く配列の「連結」によって共有結合が達成される。
本明細書で使用する「相補的」という用語は、たとえば塩基−塩基相補性を介した特定の塩基認識を指す。しかし、本明細書で相補性と呼ぶものには、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対におけるヌクレオチド対、核酸分子中の塩基と特定のハイブリッドを形成することができるヌクレオシド類似体、たとえばデオキシイノシンの対合、ならびにこのような特定のハイブリッドを形成する他の類似体、たとえばＰＮＡ、ＤＮＡおよびそれらの類似体の対合（ｐａｉｒｉｎｇ）が含まれる。１つの一本鎖領域の他の一本鎖領域に対する相補性は、使用する条件下で特定の結合が達成されるときに十分であるとみなされる。したがって長い一本鎖領域の場合には、塩基−塩基特異性のある程度の欠落、たとえばミスマッチは許容される。たとえば、一連の１０塩基のうちの１つの塩基が相補的でない場合、これを許容することができる。一本鎖領域の最終的な結合および連結に影響を及ぼさないこのようなわずかなミスマッチは、本発明の目的上、相補的であるとみなされる。たとえば異なる大きさの突出を使用するとき、あるいは相補的部分がすべての一本鎖領域を含まないときには、一本鎖領域が、結合後も一本鎖のまま残る部分を保持することがある。このようなケースでは、先に述べたとおり、結合を達成できるのであれば一本鎖領域が相補的であるとみなされる。これらの場合には必要に応じて、たとえばクレノーフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ）または他の適当な技術を使用して連結の前に失われた塩基を埋めることができる。
【００１９】
本明細書で「アダプター」と呼ぶ分子は、第１核酸分子フラグメントを、第２または第３の核酸分子への結合のために適合させる分子である。アダプター分子は少なくとも２つの領域を含む。第１核酸分子フラグメントの一本鎖領域と相補的な一本鎖領域を含む第１の部分と、第２核酸分子の一本鎖領域と相補的な一本鎖領域を含む第２の部分である。これらの一本鎖領域は先に説明したものと同様であり、アダプター分子を構成する異なる鎖上にあることが好ましい。前述の部分は少なくとも一本鎖領域と同じ長さ、たとえば４から６塩基であるが、それよりも長くてもよく、たとえば最長２０塩基とすることができる。
【００２０】
分子の安定のためには、これらの一本鎖領域間にリンク領域が必要である。特に増幅、複製および／または翻訳を実行するクローニング方法では、該リンク領域が二本鎖核酸フラグメントを含むと好都合である。しかし、連結させた分子の最終的な用途に応じて、この部分を、適当な任意の分子によって置き換えることができる。第１核酸分子と第２核酸分子の間の連結を達成するためには、連結のための適当な接続点および部分が提供されなければならないことは明らかである。
【００２１】
リンク部分は、リンク機能以外の働きもすることができ、たとえば、それぞれ増幅または同定のためのプライマーまたはプローブ結合に適当な配列を提供することができ、あるいは可動因子、たとえばトランスポゾンなどのための組込み部位を含むことができる。この方法を実施する方法によっては、アダプターが、本発明の方法で使用する制限酵素に対する制限部位を含まないことが好ましく、これによってアダプターの添加前にそのような酵素を不活化し、または除去する必要性を回避することができる。
【００２２】
アダプター分子が核酸分子だけから成り、アダプターのさまざまな特性がアダプターの異なる領域によって提供されると好都合である。
アダプターは、それぞれ１０から１００個、たとえば２０から５０個の間の塩基を有する２つの相補的なオリゴヌクレオチドから成ると好都合である。
上述の方法では、アダプターが結合する両方の末端（ＳＳ１ａおよびＳＳ１ｂ）に一本鎖領域を有する、少なくとも１個の第１核酸分子フラグメントが生成されることが好ましい。
【００２３】
本明細書に記載の方法は、クローニングに使用することが好ましい。したがって上述の方法では、第１核酸分子フラグメントの両端にアダプターを結合し（アダプターは同じものでも、または異なるものでもよい）、第１アダプターの結合していない端を第２核酸分子に結合し、第２アダプターの結合していない端を第２の核酸分子に結合する（すなわち第１のアダプターの結合から遠位のもう一端に結合し、それによって環状分子を形成する）か、または第３の核酸分子に結合する。これらの２つの選択肢のうちの最初のものは、環状ベクターを切断することによって第２の核酸分子を得、これに［アダプター１］：［第１核酸分子フラグメント］：［アダプター２］インサートを結合させて、ベクターを再び環状にすることによって達成することができる。あるいは、線状または環状ベクターを切断して、２つ以上の別個のフラグメント（ここでは第２および第３核酸分子）を得、これらを、アダプター１：第１核酸分子：アダプター２によって接合することができる。
【００２４】
したがって好ましい特徴においては、アダプターがそれぞれ結合した一本鎖ヌクレオチド領域を両方の末端（ＳＳ１ａおよびＳＳ１ｂ）に有する第１核酸分子フラグメントを生成する。これらのアダプターは同じでも、または異なっていてもよい。前記アダプターの第１のアダプターは前記第２核酸分子に結合させ、前記アダプターの第２のアダプターは、前記第２の酸分子または第３の核酸分子に結合させる。
【００２５】
言い換えると、好ましい実施形態では本発明が、第１核酸分子のフラグメントを第２核酸分子中にクローン化する方法であって、少なくとも、
１）該第１核酸分子を、その認識部位から離れた切断部位を有するヌクレアーゼを用いて切断し、少なくとも１つのフラグメントがその両方の末端に一本鎖ヌクレオチド領域（ＳＳ１ａおよびＳＳ１ｂ）を有する該第１核酸分子の１つまたは複数のフラグメントを生み出す工程と、
２）該第２核酸分子を切断して、該切断部位のところに少なくとも２つの一本鎖領域（ＳＳ２ａおよびＳＳ２ｂ）を生み出す（たとえば環状ベクターを線状にするか、または線状または環状ベクターのフラグメントを生成する）工程と、
３）該第１核酸分子フラグメントの一本鎖領域（ＳＳ１ａ）に対して相補的である一本鎖領域（ＳＳＡ１）を一方の末端で含み、さらに、該第２核酸分子の切断によって生成された一本鎖領域（ＳＳ２）の一方と相補的な別の一本鎖領域（ＳＳＡ２）をもう一方の末端に含む第１のアダプター分子を、工程１）の一本鎖領域の１つ（ＳＳ２ａ）に結合させ、
該第１核酸分子フラグメントの第２の一本鎖領域（ＳＳ１ｂ）および該第２核酸分子の切断によって生成された第２の一本鎖領域（ＳＳ２ｂ）に結合した先に定義した第２のアダプター分子を、工程１）の第２の一本鎖領域（ＳＳ１ｂ）に結合させる工程と、
４）該アダプターを該第１核酸フラグメントに連結する工程と、
５）該アダプターを該第２核酸分子またはそのフラグメントに結合する工程と、
６）該アダプターを該第２核酸分子またはそのフラグメントに連結する工程
を含む方法を提供する。
【００２６】
第２核酸分子の切断の結果、２つ以上の別個のフラグメントが生成され、これらがアダプターを介して第１核酸分子フラグメントに連結される場合、該フラグメントが、本発明の第２および第３の核酸分子を構成する。
［アダプター：第１核酸フラグメント：アダプター］単位のコンカテミリゼーション（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ）を防ぐため、これらのアダプターに結合する第２核酸分子と第３核酸分子の一本鎖領域は相補的でないことが好ましい。したがってたとえば、ベクター中へのクローニングを実施する場合には、該ベクターが線状にされ、該ベクターの少なくとも一部分がそのベクターの１つの末端から除去される、たとえば、少なくとも２回の切断事象が起こることが好ましい。
【００２７】
このような方法、特にクローニングの方法では、第２の核酸分子、たとえば第１核酸分子フラグメントを挿入する第２の核酸分子がベクター（または、たとえば第２および第３の核酸分子が一体としてベクターを含み、このベクターの切断によって生じたものである場合にそのベクターの一部分）であると好都合である。このようなベクターには、線状または環状であってもよい任意の二本鎖核酸分子が含まれる。（しかし、アダプターに関して先に述べたとおり、一本鎖領域が存在し、あるいは一本鎖領域が、第２の核酸またはそのフラグメント（たとえばベクター）の末端に生成されている場合には、アダプターへの末端での連結が損なわれない限り、隣接する領域を任意の分子から構成することができる。）
このようなベクターが、本発明の方法またはそれに続く操作でのベクターの使用を助ける配列を含むと好都合である。したがってベクターは、使用する切断方法に対して２つだけ、または少数の制限切断部位を有するように選択すると好都合である。かくしてたとえば、制限酵素を使用する場合には、その酵素に対して最小限の認識部位しか含まない、好ましくは２つの認識部位しか含まないベクターを選択する。
【００２８】
ベクターはさらに、クローニング、選択、増幅、転写または翻訳のための部分または配列を適宜含むことができる。したがってベクターを、プローブ部位、プライマー部位、プロモーター領域、他の調節領域、たとえば発現制御配列などとともに使用することができる。周知のクローニングベクター、たとえばｐＢＲ３２２およびその誘導ベクター、ｐＵＣベクター、たとえばｐＵＣ１９、λベクター、ＢＡＣ、ＹＡＣおよびＭＡＣベクター、他の適当なプラスミドまたはウイルスベクターなどを使用すると好都合である。
【００２９】
フラグメントが挿入される分子、すなわち第１核酸分子は、本明細書に記載のヌクレアーゼを使用してその末端の少なくとも一方に一本鎖領域を生成することができる任意の分子とすることができる。ただし、その中央部分は適宜、変更することができる。しかし、このような分子が二本鎖核酸分子であり、本発明に基いて必要とされる一本鎖突出を生成するためには酵素の使用のための適当な部位を含むことが好ましい。第１核酸分子がゲノムＤＮＡから誘導され、本発明の方法を使用して、そのフラグメントを適当なベクター中に挿入するのが適当である。
【００３０】
使用することができるアダプターには、一本鎖領域を末端に有する短い二本鎖核酸分子から、たとえば後述する選択を可能にするさらに別の配列を含むより長い分子を含む。適当な一本鎖領域は、第１、第２および第３の核酸分子またはそれらのフラグメントの末端配列に基づいて選択される。適当な選択を使用してインサートの配向を定め、たとえばアンチセンス核酸分子の生成に使用できるクローンを生成することができる。
【００３１】
本発明の方法では、たとえばハイブリッド形成とともに両末端に突出を残す相補的一本鎖オリゴヌクレオチドの結合、あるいは適当な切断または消化によって、一本鎖突出がすでに生成されているアダプターを使用することができる。
あるいは、本発明の方法の間に、たとえば反応過程中において制限酵素の使用または他の適当な技術によって、一本鎖部分を提供するようにアダプターを修飾することもできる。工程の数を単純にするためには、第１、第２または第３（必要な場合）の核酸分子の一本鎖領域を生成するのに使用する酵素を用いて、アダプターの一本鎖領域を生成することができると好都合である。
【００３２】
先に述べたとおり、一本鎖領域の長さは４塩基またはそれ以上とすることができる。より長い突出を使用するとき、あるいは第１、第２または第３の核酸分子の対応する完全な一本鎖領域の配列が知られていないか、または不明確である場合には、一本鎖領域中に１つまたは複数の縮重塩基を有する一群のアダプターを、たとえばアダプターのライブラリーを生成する方法を用いて使用することができる。縮重塩基を、ミスマッチ連結をしやすい位置で使用することもできる。
【００３３】
便宜上、本発明の方法において使用するためにアダプターの汎用ライブラリーを生成することができる。したがってたとえば、２つの任意の塩基（ＮＮ）とそれぞれのアダプターに特異的な２つの塩基（たとえばＡＡ、ＣＣ、．．．、ＴＴ）から成る４塩基対突出を有する１６個の異なるアダプターを生成することができる。このようにして、１６個の異なる第１分子のフラグメント突出間で区別することができる十分なアダプターを生成することができる。この数は、多くのクローニング目的にとっては十分といえよう。同様にして、第２の分子、たとえばベクターの突出のライブラリーを生成することができる。
【００３４】
アダプターライブラリー中の置換の数を増大させるため、別個の２つのオリゴヌクレオチドライブラリーを生成することができる。すなわち、第１核酸分子フラグメントの一本鎖領域に対応する領域を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを含むライブラリーと、第２核酸分子（たとえばベクター）の一本鎖領域に対応する領域を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを含む第２のライブラリーである。しかし一般に、ライブラリーのそれぞれの構成員には相補的な領域があることから第１のライブラリーの１つの構成員を選択し、第２のライブラリーの構成員と一緒にしたときに、これらがハイブリッドを形成し、関連する一本鎖領域を一本鎖のまま残す。したがってたとえば、第１および第２の核酸分子にそれぞれ結合するＡＡ突出およびＴＣ突出を有するアダプターを生成するためには、異なるライブラリーの構成員、たとえばＧＧＣＣＣＣＣＮＮＡＡをＴＣＮＮＮＣＣＧＧＧＧと組み合わせて、適当な突出を表す
ＧＧＣＣＣＣＣＮＮＡＡ
ＴＣＮＮＮＣＣＧＧＧＧ
を形成する。それぞれ１６の構成員から成る２つのライブラリーだけを使用して、２５６個の異なるアダプターを生成することができる。
【００３５】
適当なアダプターの生成においては、第１、第２および／または第３の核酸分子の突出に結合するときに許容する必要があるミスマッチの量が低減されれば好都合である。これは、ミスマッチ連結が生じる確率に基づいてオリゴヌクレオチドを選択することによって、都合よく達成することができる。これを達成するためのコンピュータプログラムを実施例６で詳細に説明する。この方法によって、１００を超えるフラグメントを有し、ミスマッチのレベルを極めて低くした鎖を１回の連結サイクルで構築するのに使用できるオリゴヌクレオチドのセットを同定することができる。したがって本発明が他の特徴において、本発明の方法で使用するアダプター分子を同定するように適合されたコンピュータソフトウェアを提供する。
【００３６】
先に述べたとおり、前記第１核酸分子のフラグメントの生成は、その認識部位から離れた切断部位を有するヌクレアーゼを使用して達成される。そうする中で、その分子の配列を反映した固有の突出が創出される。好ましい特徴では、前記ヌクレアーゼが、ＩＰまたはＩＩＳ型の制限酵素、あるいはそれらの機能型誘導体である。このような酵素には、その認識部位から遠位の部位で切断する酵素に到達するべく適当なドメインの融合によって合成された酵素が含まれる。
【００３７】
これらの酵素は、切断される配列に対して特異性を示さず、したがってこれらの酵素は、すべてのタイプの塩基組成を有する突出を生成することができる。ＩＩＳ酵素を用いた切断によって、さまざまな長さ、たとえば長さ−５から＋６塩基の突出が得られる。本発明の方法を実行するためには、３塩基対〜６塩基対の突出、たとえば４塩基対の突出を生成する酵素を選択することが好ましい。本発明で使用する好ましい酵素には、３′末端に４塩基突出を生成する酵素としてＢｓｔＸＩ；３′末端に５塩基突出を生成する酵素としてＡｌｏＩ、ＢａｅＩ、ＢｐｌＩ、Ｂｓｐ２４Ｉ；３′末端に６塩基突出を生成する酵素としてＣｊｅＩ、ＣｊｅＰＩ、ＨａｅＩＶ；５′末端に４塩基突出を生成する酵素としてＡｃｅＩＩＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、Ａｌｗ２６Ｉ、ＡｌｗＸＩ、Ｂｂｒ７Ｉ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｂｖＩＩ、Ｂｖｂ１６ＩＩ、Ｂｌｉ７３６Ｉ、ＢｐｉＩ、ＢｐｕＡＩ、ＢｓａＩ、Ｂｓｃ９１Ｉ、ＢｓｅＫＩ、ＢｓｅＸＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、Ｂｓｏ３１Ｉ、Ｂｓｐ４２３Ｉ、ＢｓｐＢＳ３１Ｉ、ＢｓｐＩＳ４Ｉ、ＢｓｐＬＵ１１ＩＩＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＳＴ５Ｉ、ＢｓｐＴＳ５１４Ｉ、Ｂｓｔｌ２Ｉ、Ｂｓｔ７１Ｉ、ＢｓｔＢＳ３２Ｉ、ＢｓｔＧＺ５３Ｉ、ＢｓｔＴＳ５Ｉ、ＢｓｔＯＺ６１６Ｉ、ＢｓｔＰＺ４１８Ｉ、Ｅｃｏ３１Ｉ、ＥｃｏＡ４ｌ、ＥｃｏＯ４４Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦｏｋＩ、ＰｈａＩ、ＳｆａＮＩ、Ｓｔｈ１３２Ｉ、ＳｔｓＩ；５′末端に５塩基突出を生成する酵素としてＨｇａＩが含まれる。
【００３８】
１００クラスを超えるＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼが同定されており、基質特異性と切断パターンの両方に関して多様なバリエーションがある。さらに、これらの酵素が、「モジュールスワッピング（ｍｏｄｕｌｅ ｓｗａｐｐｉｎｇ）」実験によく適していることが分かっており、そのため、特定の要件に対する新たな酵素を生成することができる（Ｈｕａｎｇ−Ｂ，　ｅｔ　ａｌ．；　Ｊ−Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｈｅｍ．　１９９６，　１５（５）：４８１−９，　Ｂｉｃｋｌｅ，　Ｔ．Ａ．；　１９９３　ｉｎ　Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ　（２ｎｄ　ｅｄｎ），　Ｋｉｍ−ＹＧ　ｅｔ　ａｌ．；　ＰＮＡＳ　１９９４，　９１：８８３−８８７）。これらの実験において、転写因子Ｓｐ１の結合ドメインをＦｏｋＩの切断ドメインと合体させて、Ｓｐ１部位を有する４塩基突出を作るクラスＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼが構築された。他の実験では、転写因子Ｕｌｔｒａｂｉｔｈｏｒａｘの結合部位の外側で切断するクラスＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼが生成された。クラスＩ酵素に関しても対応する実験が実施された。ＳｔｙＲ１２４１のｈｓｄＳサブユニットのＮ末端部分（ＧＡＡＮ６ＲＴＣＧを認識する）をＳｔｙＲ１２４１のｈｓｄＳサブユニットのＣ末端部分（ＴＣＡＮ７ＲＴＴＣを認識する）と合体させることによって、配列ＧＡＡＮ６ＲＴＴＣを認識する新たな酵素が構築された。他にもいくつかの実験が実施され、同様の成功を納めた。したがって、通常のクラスＩＩ酵素の場合とは異なり、多くの新たなＩＩＳおよびＩＰ制限酵素を構築し、将来に生じる可能性があるクローニング要件に適合させることができると考えることは理にかなっている。それゆえ本明細書で記載する原理に基づいてこれらの酵素の極めて多くの組合せおよび変形体を使用することができる。
【００３９】
前記第１核酸フラグメントの一本鎖領域の生成は、本明細書に記載のヌクレアーゼを用いる前記第１核酸分子の切断によって、中間体分子を発生することなく直接に達成することができる。これは、本発明の好ましい特徴を構成する。あるいは、間接的なより精巧な技術を使用することもできる。たとえば、本明細書に記載のヌクレアーゼを使用して第１核酸分子またはそのフラグメントを「トリミング」することができる。この場合、ヌクレアーゼ認識部位を担持するリンカー分子を第１核酸分子またはそのフラグメントに結合させ、認識部位の外側で切断すると、第１核酸分子またはそのフラグメントの内部で切断される。この方法は、制限切断に使用されるほとんどの緩衝液中でＴ４　ＤＮＡリガーゼ（および他のリガーゼ）が十分に機能することを利用するため、特に有益である。したがって連結と切断とを同じ溶液中で同時に実施することができる。さらにこの方法では、最初の切断段階によって生成された突出が固有ではない場合に、固有の突出を生成することができる。
【００４０】
トリミング手順は、たとえば本明細書に記載の１つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼを用いた切断の後に、第１核酸分子またはそのフラグメント上の突出にアドレスされた「開始リンカー」を使用して、開始することができる。本明細書で使用する「リンカー」という用語は、本明細書で説明した「アダプター」に類似の分子を指すが、リンカーはトリミングされる分子への結合を可能とする一本鎖領域を１つだけ含んでいればよい点が異なる。さらに、開始リンカーは、その認識配列の外側で切断する本明細書に記載のヌクレアーゼ、たとえばＢｐｌＩに対する１つまたは複数の切断部位を含む。第１核酸分子またはそのフラグメントは、トリミング手順に使用するＩＩＳ酵素に対する切断部位を含まないことが何にもまして優先する。あるいはこのような切断部位を、トリミング手順の前に（たとえばメチル化によって）不活化してもよい。
【００４１】
伸長リンカー（使用する場合）および終結リンカー（後者を本明細書に記載のアダプターとすることができる）、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼおよびトリミングに使用するＩＩＳ酵素は、開始リンカーと一緒に加えることができる。開始リンカーを所定位置に連結すると切断が実施され、これによって第１核酸分子またはそのフラグメントの内部に突出を生成する。所望により（すなわちトリミングがさらに必要な場合）、縮重突出を含む伸長リンカーを使用して、生成された突出と連結させることに用いることができる。このリンカーは適当なヌクレアーゼ認識部位も担持するため、切断によって、第１核酸分子またはそのフラグメント中にさらに上流の別の切断部位を再び生成する。このプロセスは、突出の１つに相補的である突出が終結リンカー（または本明細書に記載のアダプター）に生成されるまで続くであろう。この最後のリンカーは、それ自体、ヌクレアーゼ認識部位を持たず、したがってトリミングを終了させる。先に述べたとおり、この終結リンカーは、次の段階で使用するアダプターに結合するための適当な一本鎖領域を有することができ、またはそれ自体がアダプターであることができる。このトリミング方法を実施する適当な技術が、実施例４および実施例９に示されている。
【００４２】
このトリミング方法は、ＢｃｇＩクラスに属するＩＩＳ酵素（たとえばＢｐｌＩ、ＢａｅＩなど）を用いて実行しないほうが好ましい。これは、これらのタンパク質が、メチラーゼとエンドヌクレアーゼが組み合わさったものであり、メチラーゼの機能が、伸長リンカー上の結合部位を不活化する可能性があるためである。したがって、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩなどを含む酵素がこの方法を実行するのに好ましい酵素である。ＢｃｇＩクラスの酵素を使用する場合には、補助因子ＡｄｏＭｅｔの代わりに、ＡｄｏＨｃｙ、Ｓｉｎｅｆｕｎｇｉｎｅまたはメチル供与体として機能しない他の補助因子を使用しなければならない。
【００４３】
したがって本発明が好ましい特徴において、少なくとも１つの一本鎖領域を有する二本鎖核酸分子の末端を除去する方法であって、少なくとも、（ｉ）その認識部位の外側で切断するヌクレアーゼの認識部位および前記二本鎖核酸分子上の一本鎖領域と相補的な一本鎖領域とを含む二本鎖リンカー分子を前記分子に結合（すなわち連結）し、次いで前記ヌクレアーゼを使用して切断し、これによって前記核酸分子の末端から１つまたは複数の塩基（たとえば３〜１０個の塩基。これは、一本鎖形、二本鎖形またはこれらの組合せとすることができる）を除去することとなる工程と、（ｉｉ）任意選択で、前述のヌクレアーゼの認識部位と最初の切断段階または後続の切断段階によって生成された突出に結合する縮重した一本鎖領域とを含む１つまたは複数の伸長リンカーを結合し、前記ヌクレアーゼを使用して切断する工程と、（ｉｉｉ）工程ｉまたはｉｉで生成された一本鎖領域に結合する終結リンカーを加える工程、を含む方法を提供する。
【００４４】
同様の技術を使用して、第１核酸分子フラグメントと第２（または第３）の核酸分子の連結の後に、不要な配列、たとえばアダプターが寄与した不要な配列を除去することができる。不要な配列は、さまざまな技術を使用して除去することができる。たとえば、不要な配列（たとえばアダプターからの領域）が植物トランスポゾン配列を含む場合には、その配列を切除するのに必要なトランスポサーゼ酵素を加えることによってこれを除去することができる。あるいはそれらの認識部位の外側で切断するヌクレアーゼを利用することによって不要な配列を除去することができる。したがって、たとえば（切断部位配列の適当な選択によって）切断した後に、２つの異なった切断部位のところに相補的な突出を生成し、したがって介在配列の切除を可能にする酵素に対する認識部位を含むアダプターを使用することができる。介在配列を除去する技術の例を実施例５に示した。使用するヌクレアーゼによっては、介在配列に隣接した位置またはその内部以外の位置で該酵素のための部位を不活化する必要が生じる可能性があることを理解されたい。
【００４５】
したがって他の好ましい特徴では、本発明で使用するアダプターが、さらに１つまたは複数のヌクレアーゼ認識および切断部位を含んでおり、これによって前記配列の配置が切断後に相補的な一本鎖領域の生成を可能にし、そこで前記一本鎖領域対は各々、異なった部位での切断によって生成される。
本発明の方法のさまざまな段階を実施する様式に応じて、後述するように、必要な場合には、第２核酸分子および／またはアダプターをも切断または消化して、適当な一本鎖領域を提供することができる。好ましい態様では、第２核酸分子および／またはアダプターを、第１核酸分子フラグメントを生成する前記のヌクレアーゼを使用して切断する。しかし、このようなヌクレアーゼを用いて切断する代わりに、第２または第３の核酸分子あるいはアダプターからの適当な一本鎖領域および／またはフラグメントを生成するのに代替技術を使用することができる。かくしてたとえば、他の制限酵素、非特異性ヌクレアーゼまたは適当なエキソヌクレアーゼ、あるいは機械的な方法、たとえば音波処理またはボルテキシング（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）を使用することもできる。酵素を使用する場合には、反応中に少容量の酵素を使用して、効率を高めることが好ましい。
【００４６】
アダプターと第１、第２および第３の核酸分子との間の連結は、当該技術分野で周知の適当な技術によって達成する（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　ｉｎ　「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ」，　２ｎｄ　Ｅｄ．，　Ｅｄｉｔｏｒ　Ｃｈｒｉｓ　Ｎｏｌａｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９を参照されたい）。たとえば連結は化学的に、あるいは適当な天然にあるリガーゼまたはその変異体の使用によって達成することができる。使用することができる適当なリガーゼには、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼおよび熱安定リガーゼ、たとえばＰｆｕ、Ｔａｑ、ＴＴＨ　ＤＮＡリガーゼが含まれる。末端塩基のリン酸化状態の制御、たとえばキナーゼまたはホスファターゼの適当な使用によって、連結を防止し、または許容することができる。大量に使用して、分子間の連結を回避することもできる。このようにして、ベクター／インサートに対するアダプターの高い比を使用して、ベクターまたはインサートがその原材料中に再連結することを回避することができる。
【００４７】
他の技術を使用して、再連結するベクターまたは切断されないベクターを回避し、または除去することができる。たとえば、インサートによって不活化されていない場合に限り宿主菌を破壊する選択マーカー中に、インサートをクローン化することができる。あるいは、連結段階の後に、ベクターから除去されるフラグメントに対して特異的な制限酵素を使用して制限切断を実行することができる。再連結したベクターおよび切断されなかったベクターは、この段階で切断されよう。したがって、理想的なクローニング部位は、インサートの連結とともに除去される多くの固有の制限部位を含む部位である。あるいは周知の技術、たとえばゲル分離を使用して、所望の生成物を同定することができる。
【００４８】
切断段階と連結段階を一緒に実施する場合、インサートおよびインサートを挿入するベクターが、使用するヌクレアーゼに対する結合部位を含まないほうが有利である。同様に、クローニングプロセス中にベクターから除去するフラグメントが、ヌクレアーゼに対する結合部位を含む場合も有利である。このケースで、そのフラグメントがベクターと再連結する場合には、該フラグメントは切断され、これによって再び除去される。
【００４９】
第１および第２の核酸分子（および任意の選択で第３の核酸分子）またはそれらのフラグメントが共有結合によって結びつけられている場合、必要ならば、いずれかの副生物から適当な生成物の選択を実施することができる。選択は、当該技術分野で周知の任意の技術によって実施することができる。しかし、標識プローブを使用して正しい生成物にしか存在しない配列を、たとえばアダプターと第１、第２または第３の核酸配列との間の接合部に向けられたプローブで、たとえば正しい配列の結合によってしか形成されない１つまたは複数の配列をプローブすることによって、同定することができると好都合である。あるいは、連結によって生成物に付与された機能的性質によって、具体的にはベクターが適当なホスト中にクローン化されたときに特定の生成物の発現をもたらす配列の完成によって正しい連結を検出することができる。あるいは、選択を、たとえば増幅および／または形質転換後に得られた生成物の配列決定によって選択を実施することもできる。
【００５０】
適当な標識には、シグナルの生成によって検出および／または定量を直接的または間接的に可能にする任意の部分が含まれる。多くの適当な例が存在するが、これにはたとえば、放射性標識、化学標識（たとえばＥｔＢｒ、ＴＯＴＯ、ＹＯＹＯおよび他の染料）、発色団または蛍光団（たとえばフルオレセイン、ローダミンなどの染料）、フェリチン、ヘモシアニンまたはコロイド金などの高電子密度試薬が挙げられる。あるいは標識を、適当な実体、たとえば基質との相互作用によってその存在が視覚化される酵素、たとえばペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼとすることができる。
【００５１】
先に述べたとおり、この方法が提供する周知の方法に優る重要な利点の１つは、必要とされる技術の単純化である。本明細書で説明した諸段階は、別個の試験管内で順番に（たとえば様々な酵素を使用され、交差反応が望ましくないとき）、または限られた数の段階で実施することができる。しかしながら、この反応を単一の段階で実施するのが理想である。これには、酵素、アダプターおよび第２／第３の核酸分子、たとえばベクターの適当な選択により達成することができる。
【００５２】
かくしてたとえば、第１核酸分子のフラグメント化を、第２核酸分子のフラグメント化にも使用される特定のヌクレアーゼを使用して実施することができる。使用される酵素は、その認識部位の外側で切断するため、第１核酸分子フラグメント上と第２の核酸分子フラグメント上で見られる生成一本鎖領域は無関係であると予想される。しかしながら、仲介アダプターを適当に選択することによって（仲介アダプターは、その酵素に対する制限部位を持たない場合、またはそれらの部位のところでの切断が適当な一本鎖領域を出現させる場合にも加えることができる）、これらの無関係な配列をアダプターの仲介によってリンクさせることができる。このようにして反応全体を単一の段階で実施することができる。
【００５３】
アダプターを使用して、第１核酸分子フラグメントを異なる第２核酸分子フラグメントまたは切断部位に向けることができることも理解されよう。したがってそうすることにより、特定のベクターまたはベクター内の部位に、異なる第１核酸分子を向けて連結させることが可能になる。これにより、複数のベクター（および対応する適切なアダプター）を同時に使用して、第１核酸分子フラグメントを１個取り込むことができる。
【００５４】
代替方法として、複数のフラグメントまたは同じフラグメントのコピーを同一ベクター内の異なる部位に挿入することもできる（後者の場合、１つの共通な端部を有するが、他端部では可変性を示すアダプターを使用することによって、それをベクター内の異なる部位に結合させることが可能である）。他の代替方法では、第１核酸分子フラグメントを逆方向で捕らえ（ここでも適切なアダプターを選択することによって）、ベクター内に挿入して、たとえばアンチセンス鎖を生成することができる。
【００５５】
したがって好ましい実施形態では、本明細書に記載される方法は単一の段階で行われる。ただし、ひとたび関連分子の会合が得られると、連結段階（つまり、第１核酸分子フラグメントへのアダプターおよび最終的な連結）は別々に行うことができる。他の好ましい実施形態では、本発明は、第１核酸分子の２個以上のフラグメントを異なる第２核酸分子（またはそれらの異なる末端）に同時に結合する方法を提供する。クローニングにおいては、これは前記第２核酸分子の異なる部位、または異なる第２核酸分子群の中に、たとえば１つのベクター内の異なる部位または異なるベクターに、２個以上のフラグメントを導入することに等しい。
【００５６】
したがって本発明は、第１核酸分子の２つ以上のフラグメントを異なる第２および任意の選択で第３の核酸分子またはそれらの異なる末端に結合する本発明の方法を提供する。好ましい態様においては、前記第１核酸分子の１つまたは複数のフラグメントをアダプターを介して、異なる切断処理の結果生じる前記第２核酸分子の一本鎖領域に結び付ける方法が提供される。他の好ましい特徴においては、前記第１核酸分子の１つまたは複数のフラグメントをアダプターを介して、２つ以上の第２核酸分子の一本鎖領域に結合する方法が提供される。
【００５７】
複数の第１核酸分子（たとえば２個以上、具体的には２〜１０個）が同じ反応中で同時に切断させられ、それらのフラグメントは、異なる第２核酸分子、たとえば異なるベクターまたはベクター中の部位にそれらのフラグメントを結合するようにし向ける適切なアダプターに結合されるといった、さらに複雑な反応も想定できることが理解されよう。
【００５８】
前記の方法は極めて単純化された方法を記載しているが、前記の効果は不連続な段階の方法を実施することによっても得ることができる。他の分子中に望ましくない生成物を生み出すような異なる酵素が使用される場合には、これは極めて適切である。したがって、たとえば異なるヌクレアーゼ、たとえば制限酵素を使用して、第１および第２の核酸分子を切断させてもよい。このような場合、これらの分子は別々に切断させられ、その後フラグメントがアダプターとともに混合される前に、酵素は取り除かれるかまたは不活性化される。同様に、同じ酵素が使用され、アダプターが酵素感受性部位を含む場合でも、たとえばメチル化によって、反応を避けるようにアダプターを適切に改質することができるか、またはアダプターを加える前に、第１および／または第２の核酸分子をフラグメント化するために使用される酵素は、不活性化されるか取り除かれる（前述のように）はずである。
【００５９】
好都合には、酵素の不活性化は少なくとも６５℃で、たとえば２０分間インキュベートすることによって達成される。その代替方法としては、反応から酵素を取り除く適切な技術、キレート剤、阻害剤などを使用して不活性化を達成することができる。
ひとたび適切なクローンが生成され選択されると、意図されるクローンの利用に応じて、標準的な増幅、形質転換、複製、発現、配列決定の方法に従ってこれらを処理することができる。したがって本発明の他の態様においては、クローニングなどの方法の核酸分子生成物（すなわち、〔第１核酸分子フラグメント〕：〔アダプター〕：〔第２の核酸分子〕の生成物である核酸分子）、ならびに核酸分子の生成物および形質転換またはトランスフェクトされた原核または真核宿主細胞または本発明の方法に従って生成される核酸分子を含む遺伝形質転換体を含む発現ベクターがある。
【００６０】
適切な発現ベクターは、たとえば本発明の核酸分子に関する読み枠の整合に関係がある、翻訳（たとえば開始および停止コドン、リボゾーム結合部位）および転写制御要素（たとえばプロモーターおよびオペレーターの領域、停止配列）などといった適切な制御配列を含む。適切な発現システム、およびそれらを原核または真核細胞または生殖細胞株または体細胞に導入し発現させて遺伝形質転換体を形成するための方法は、当該分野においてよく知られており記載されている。形質転換用に適切である発現ベクターには、バキュロウイルス、アデノウイルスおよびワクシニアウイルスなどのバクテリオファージおよびウイルスがある。
【００６１】
本明細書に記載される方法を実施するためのキットは、本発明の好ましい態様を形成する。したがってさらなる他の態様から鑑みて、本発明は第１核酸分子のフラグメントを第２核酸分子またはそれらのフラグメントに結合するためのキットを提供し、このキットは少なくとも（ｉ）１つまたは複数の前記のアダプターまたはこのようなアダプターを生成するための手段、（ｉｉ）第２核酸分子、および（ｉｉｉ）その認識部位の外側を切断するヌクレアーゼを含み、前記アダプターのうちの１つの末端は、前記ヌクレアーゼによる切断後に前記第２核酸分子上に生成される一本鎖領域に相補的である一本鎖領域を有する。
【００６２】
前記キットはたとえば本明細書、詳細には実施例３に記載されるオリゴヌクレオチドのライブラリーを含むことが好ましく、そのライブラリーから適切なアダプターを生成することができる。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドのライブラリーは、本発明のもうひとつの好ましい特徴を形成する。したがって、たとえば前記ライブラリーは、以下のものを含む複数のオリゴヌクレオチドを含んでよい。１）式ＸＮＮＮＮＮの複数のオリゴヌクレオチド、前式でＸは１つまたは複数の塩基（前記塩基は前記の塩基と同様である）であり、前記オリゴヌクレオチドのすべてにおいて不変であり、それぞれのＮは異なるオリゴヌクレオチドにおいて変化している、すなわち１０２４の変異体を生成する５’端の塩基である。２）式Ｘ’ＮＮＮＮの複数のオリゴヌクレオチド、前式でＸ’はＸと相補的であり前記オリゴヌクレオチドのすべてにおいて不変であり、それぞれのＮは前記と同様に５’端の塩基である。３）式ＹＮＮＮＮＮの複数のオリゴヌクレオチド、前式でＹ（Ｘと同一ではない）は１つまたは複数の塩基（前記塩基は前記の塩基と同様である）であり前記オリゴヌクレオチドのすべてにおいて不変であり、それぞれのＮは前に記載したのと同様に３’端の塩基である。４）式Ｙ’ＮＮＮＮＮＮの複数のオリゴヌクレオチド、前式でＹ’はＹと相補的であり前記オリゴヌクレオチドのすべてにおいて不変であり、それぞれのＮは前に記載したのと同様の３’端の塩基である。
【００６３】
このキットは、リガーゼ、制限または連結部位の不活性化および活性化のために必要な酵素、増幅および／または適切な酵素用のプライマー、緩衝液および溶液、および前記のライブラリーからオリゴヌクレオチドを選択する際に支援するためのコンピュータプログラムを含むデータキャリアを含むリストから選択される他の適切な成分を任意の選択で含んでよい。本発明の方法を実施するためのこのようなキットの使用は、本発明の他の態様を形成する。
【００６４】
前記の方法を適合させて、以下に記載するように複数の第１、第２、第３などの核酸分子を１つにすることができる。この方法では、フラグメントの末端に現れる一本鎖領域を適切に選択することによって、複数のフラグメントを１つにする。以下により詳細に記載されるように、これは生物学的目的用の特定配列の生成における利用を有するが、鎖を構成している単位各々が情報の一単位を示す、すなわちその鎖を利用して情報を蓄えることができる核酸分子鎖の生成において特に有用性がある。本明細書で使用される「鎖」とは、本明細書に記載されるフラグメントの一連の配置のことである。このような鎖は線状であることが好ましく、枝分かれのある（および枝分かれのない）フラグメント配列を含む。したがって、たとえば枝分かれしたＤＮＡフラグメントを使用して、フラグメントの枝分かれした配置を有する鎖を提供することができる。
【００６５】
異なる単位フラグメントを有する核酸分子鎖、すなわちフラグメント鎖を生成するために、以下の方法を使用することができる。第１に、いずれかの末端に突出を有するフラグメントを生成することが必要であり、これによりこれらをお互いに結合させることができる。（ただし基本的な３’および５’フラグメントは、内部フラグメントに結びつくようになる末端のみに突出を有している可能性がある。）以下により詳細に記載されるように、いくつかの応用例のために適切なオリゴヌクレオチドは、構成員が少なくともいくつかのその塩基において可変性を示しているライブラリーに由来してもよい。その構成員が二本鎖であるライブラリーが生成されるならば、このようなライブラリー中の構成員の数がかなり多くなる可能性があることが理解されよう。しかしながら、より少数のより小さな構築単位を使用することによって、この数を効果的に減少させることができる。
【００６６】
１つの方法は、従来技術を使用して２つの一本鎖オリゴヌクレオチドを作成することである。前述の例では（いずれかの末端に６塩基の二本鎖リンカーおよび３塩基の突出があり）、お互いに相補的でこのためハイブリッド形成が可能である、６塩基領域を有するオリゴヌクレオチドを使用することができる。すべての分子がハイブリダイゼ−ションに関与するわけではないため、ハイブリダイズしている領域を越えて一本鎖領域が広がり、このようにして一本鎖領域が形成される。好都合には、繰り返し配列がフラグメント鎖中に頻繁に現れる場合、必要とされるライブラリーの構成員の数をさらに減らすことができる。このことは以下にさらに詳細に記載される。
【００６７】
ひとたび適切な二本鎖単位（すなわちフラグメント）が形成されると、配列上に存在する異なる突出が固有のものである場合には、それらの単位を同じ溶液中で連結させることができる。
したがって他の態様では、本発明は二本鎖核酸分子を合成する方法を提供し、少なくとも以下の段階を含む。
【００６８】
１）ｎ個の二本鎖核酸フラグメントを生成する。少なくともｎ−２個のフラグメントが両末端で一本鎖領域を有し、２個のフラグメントが少なくとも１方の末端で一本鎖領域を有し、（ｎ−１）個の一本鎖領域が（ｎ−１）個の他の一本鎖領域と相補的であり、これにより（ｎ−１）個の相補的対（ｐａｉｒ）が生成する。
２）該ｎ個の二本鎖核酸フラグメントを接触させて、同時にまたは連続的に一本鎖領域の前記相補的対の結合をもたらし、
３）所望により該相補的対を同時にまたは連続的に連結させて、ｎ個のフラグメントからなる核酸分子を生成する。
【００６９】
「核酸分子」、「一本鎖領域」、「相補的」、「結合」および「連結」という語は前に記載されるものと同様である。
段階１）では、（ｎ−１）個の「他の」一本鎖領域と相補的である（ｎ−１）個の一本鎖領域について言及される。このことは一本鎖領域の２つのファミリーを記載し、これらは合わせて２（ｎ−１）個の構成員を含み、ｎ−１対を形成する。したがって「他の」とは、第１のファミリー中には存在しない第２のファミリー中の一本鎖領域のことである。
【００７０】
本明細書で使用される「接触」とは、相補的な一本鎖領域の会合につながる条件下で、二本鎖のフラグメントを一緒に合わせることである。使用する方法に応じて、接触によってこれらの領域を保持するフラグメントの連結が最終的に可能になるであろう。しかしながら、連結以外の方法によってフラグメントが結びつけられることを示しておかなければならない。たとえば適切なプライマー、たとえばプライマーの対を用いるＰＣＲ法を使用することができる。
【００７１】
同時的または連続的な接触および／または連結とは、伸長している鎖にフラグメントを個別にまたはグループをなして加えるか、またはｎ個のフラグメントをすべて同時に加える可能性のことであり、それぞれの付加の後またはひとたびｎ個のフラグメントすべてが１つになると、連結を行うことができる。ひとたびすべてのフラグメントが１つになった後で、連結が行われるのが好ましい。
【００７２】
ここで使用される「フラグメント」とは、本明細書で前に定義されるものと同様であるが、その長さが短いことが好ましい。したがって、長さが６塩基を超える、たとえば６と５０塩基の間、たとえば８〜２５塩基のフラグメントが好ましい（前記長さは、お互いに長さが若干異なる可能性があるフラグメントを構成する、各一本鎖オリゴヌクレオチドの長さのことである）。
【００７３】
ここで言及される「ｎ」とは、少なくとも４の整数、たとえば少なくとも１０または１００、たとえば２５と２００の間の整数のことである。
前述のように、一本鎖オリゴヌクレオチドの使用によってフラグメントを生成して、適切な二本鎖分子を生成することが好ましい。
このような方法において特に興味深いのは、容易にアクセスすることができるコードの形で情報を蓄えるために使用することができるフラグメント鎖の生成である。
【００７４】
現在ではさまざまな目的のために（たとえばコンピュータソフトウェア、音楽、フィルム、データベースなど）、情報を蓄えることに対する過大な要求がある。したがって、効率的な記憶媒体を見つけることが必須であり、結果としてＣＤ　ＲＯＭ、ＤＶＤ技術などの開発につながる。核酸分子は情報を記憶するための極めて効率の良い方法を提供し、現在使用されている記憶方法に優るいくつかの利点を有する。たとえば、核酸分子の記憶容量は莫大である。原則として、ＤＮＡ分子を含む試験管はＣＤ　ＲＯＭ数百万枚分かそれ以上の大量の情報を含むことができる。ＰＣＲ、ＬＣＲなどの開発されている技術によって大幅に増強された自然科学のシステムを使用して、核酸を即座に効率よくコピーすることができる。適切に保存されれば、核酸分子を極めて長期間にわたって保存することができる。当然ながら、核酸分子を操作するための既存のツールは、たとえばポリメラーゼ、制限酵素、転写因子、リボゾームなどの分子のプロセシング用にすでに利用可能である。核酸分子は触媒的な特性も有している可能性がある。
【００７５】
さらに、セキュリティ・システムとして核酸分子を使用することができる。なぜなら、たとえばますます普及している、たとえばＣＤなどの現在の記憶システムのコピーとは異なり、核酸分子は容易にコピーされないように作成されているからである。
しかしながら以前は、ＤＮＡのメッセージを書いたりＤＮＡのメッセージを読んだりするためのいかなる有効な方法も存在しなかったために、核酸分子によって提供される莫大な可能性を利用することは不可能であった。前記の方法は、この問題を克服し大きなＤＮＡ分子の迅速な合成を可能とし、およびこれらの分子を急速かつ効率的にスキャンして情報を検索する方法を提供する。
【００７６】
本明細書に記載される方法に従って生成される核酸分子によってコード化されている情報の効果的な検索の鍵は、分子内の情報提供単位を拡大することである。自然界および以前に使用した方法において、配列中のそれぞれの塩基は個別の情報内容を有している。実際、１つの塩基が２つ以上の情報単位を示すことができる方法が記載されている。たとえば２進（バイナリー）コードでは、塩基Ａは「００」、Ｃは「０１」、Ｇは「１０」、Ｔは「１１」である。１個の分子中に多量の情報を含むことができる点でこの方法には利点があるが、個々の塩基を結びつけて差別化する書込みおよび読取りの方法が必要であるため、このシステムには重大な欠点がある。
【００７７】
それゆえ本発明の好ましい方法では、１つの塩基ではなく短い配列である情報単位が提供される。前記の技術によって、このような鎖を早急に生成することが可能であり、情報に容易にアクセスすることができる。
このようにして、コードされている情報を示す単位を生成し読み取ることができる。したがって、それぞれの情報単位がコードの要素を表すことができ、たとえばそのコードは文字数式コードまたは２進コードなどといったより単純な表示であってよい。それぞれの場合において、コードの個々の要素、たとえば「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、「１」、「０」などが個別化された特定配列によって表されることが必要である。
【００７８】
本明細書で使用される「情報単位」とは、１つの情報、たとえば１つまたは複数の（すなわちそれらの組合せ）コードの要素を表す離散的な短い配列のことである。
前記のコードの「要素」とは、２進または文字数式コードなどのコードを構成している異なる構成要素のことである。
【００７９】
したがって、本発明の方法の好ましい実施形態では、１つに結びついているフラグメントは１つまたは複数のコードの要素に対応する情報単位を表す領域を含む。コードは文字数式であることが好ましい。コードは２進法であることが特に好ましい。それゆえたとえば、情報捕獲の２進システムを考えると、「０」、「１」フラグメントからなる鎖を生成したい場合は、適切な配列の組合せが「０」または「１」に属すると考えることができる。
【００８０】
好都合には、前記１つまたは複数のコードの要素各々は（まとめて）以下の式を有し、
（Ｘ）ａ
上式でＸはヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃまたはその誘導体であり、これは相補的な結合を可能にし、各位置において同じであるかまたは異なっていてよく、
ａは２より大きい整数、たとえば４より大きい整数、たとえば２〜２０、好ましくは４〜１０、たとえば６〜８の整数であり、
（Ｘ）ａは１つまたは複数のコード要素の各々に対し異なる。
【００８１】
２進コードの場合、コード要素「１」および「０」は以下の式を有することができることが特に好ましい。
「０」＝（Ｘ）ａおよび「１」＝（Ｙ）ｂ
上式で（Ｘ）ａと（Ｙ）ｂは同一ではなく、
ＸおよびＹは各々ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃまたはその誘導体であり、これらは相補的な結合ができ、各位置において同一でも異なっていてよく、
ａおよびｂは２より大きい整数、たとえば４より大きい整数、たとえば２〜２０、好ましくは４〜１０、たとえば６〜８の整数である。
【００８２】
本明細書で言及されるように、相補的な結合をする能力のある「誘導体」とは、相補鎖中に存在する一ヌクレオチドに結合する能力のあるヌクレオチドの類似体または変異体のことであり、詳細には天然に存在するヌクレオチドかまたはヌクレオチドの合成変異体、たとえばウラシルまたはメチル化、アミド化されたヌクレオチドなどを含む。
【００８３】
最も単純で好ましい形では、それぞれの位置において、ＸおよびＹは同じもの、たとえば「０」＝ＧＧＧＧＧＧＧＧおよび「１」＝ＡＡＡＡＡＡＡＡである。しかしながら〔ＡＣ〕６Ａまたは〔ＧＴ〕６Ａなどの繰り返し配列を使用することができる。コード配列は機能的な性質を有していてもよい。たとえば、それはＡｔｔＰ１またはＡｔｔＰ２などの組み込み要素であってよい。
【００８４】
しかしながら、前記の配列は１個より多いコード要素を示すものであってもよいことが理解されよう。したがって、たとえば情報単位は２つ以上のコード要素、具体的には２〜３２個の要素、好ましくは２〜４個のコード要素であってよい。たとえば２進コードを想定する場合、それぞれの情報単位は「０１」または「００」または「１１」または「１０」であってよい。
【００８５】
本明細書に記載する方法では、このような特徴を含む鎖を以下のようにして調製することができる。たとえば８　０／１フラグメントを有する鎖を生成するために、異なる突出を有する８個の「０」出発フラグメントおよび異なる突出を有する８個の「１」出発フラグメントが、図２に示すように生成される。この場合、「０」フラグメントは配列ＧＧＧＧＧＧＧＧからなるが、これは他の配列に置き換えることもできる。さらに、これらのフラグメントは固有の突出を有するように合成され、その結果それらを１カ所にのみ連結させることができる。したがって、位置２のフラグメント内にある突出の１つによって補われるような突出を有するように、鎖中の位置１のフラグメントが生成される。したがって、位置１のフラグメントに結合することができる位置２のフラグメントが合成される。同様に、位置３のフラグメントは位置２のフラグメントに末端の一方のみで、位置４のフラグメントはもう一方の末端などに結合することができ、以下同様である。これらのフラグメントは別々に蓄えられる。鎖を構成するために、それぞれの位置に対して２つの二者択一のうちの１つからの選択が行われ、その結果適切な２進法の鎖が生成される。
【００８６】
したがって前述のスキームでは、鎖０１００１０１１を表すフラグメント鎖を生成するために、位置１、３、４および６からの「０」フラグメントを位置２、５、７および８からの「１」フラグメントと混合させる。リガーゼの添加または前述の他の連結方法を使用することによって次いでフラグメントが１つに連結される場合、前記の鎖が生成されるであろう。情報単位が２つのコード要素で表されるそれぞれのフラグメントを保持する場合、たとえばわずか４つのフラグメントを使用することによって、この鎖を得ることもできることが理解されよう。
【００８７】
中間体フラグメント鎖（たとえば少なくとも４つのフラグメントを含む）を他のフラグメント鎖と結合させることがさらに可能であり、これらは、鎖の末端に適切な突出が存在するとして、１つに連結して複合フラグメント鎖を形成することができる。したがって、いくつかのサイクルが平行して行われ、その生成物が結合され得る。図２に示す方法において、末端フラグメントは平滑末端を有しているが、その末端に突出を同様に有する適切なフラグメントを使用することができるのは明らかである。
【００８８】
それぞれが８フラグメントを有する（次いでこれらを１つに連結することができる）、８個のフラグメント鎖を生成するための適切な技術を図３に示す。フラグメント鎖１に関しては、完成したフラグメント鎖がフラグメント鎖２などに連結することが可能であるような、末端フラグメントが使用される。次いでこれらを結びつけて、６４個のフラグメント鎖を生成することができる。同様に、８個のこのようなフラグメント鎖を結びつけて、５１２個のフラグメントを含むフラグメント鎖を生成することができる。
【００８９】
より短い鎖の生成に関しては、連結の段階が行われるとき、これはひとたびすべてのフラグメント鎖が結びついた後に好都合に行われることが理解されよう。しかしながら、結果として生じるそれぞれのフラグメント鎖を加えることによって、望むならば連結段階を順次に行うことができる。
１サイクル当たり８個の２進フラグメントを結合するためには、１６個の異なる出発フラグメントが必要であり、これらはそれぞれの位置において異なる「０」、「１」の選択対象を表す。２サイクルを使用して６４個のフラグメントの鎖を作成するためには、すなわち８個のフラグメントを有する８個の鎖（次いで結合される）を作成するためには、わずか１６＋（４×７）＝４４個の出発フラグメントが必要とされる。したがって、生成することができサイクルの数とともに指数関数的に増加するフラグメント鎖の組合せとは対照的に、必要とされる異なる出発フラグメントの数はほぼ直線的な増加を示す。その結果、比較的少数の出発フラグメントを用いて極めて長いフラグメント鎖を生成することができる。
【００９０】
当然ながら前述のように、８より長いかまたは８より短い中間体鎖を生成することができる。突出領域には多数の置換体が存在するので、より多くの出発フラグメントを使用してもよく、かくして１サイクルでより大きなフラグメントを作成することができる。したがって、長い鎖を生成するために必要なサイクルの数を減らすことができる。
【００９１】
本明細書に記載される技術の変更形態を使用することによって、本明細書に記載される方法に従って生成される小さなフラグメント鎖も１つに結合ることができる。たとえば、相補的なプライマー対を使用して、実施例８に記載されるようにさまざまな鎖を結合させることができる。この技術では、異なるプライマー対を使用して、フラグメント鎖の増幅が達成される。プライマー対１における第２のプライマーはプライマー対２における第１のプライマーと相補的であり、その対の第２のプライマーはプライマー対３における第１のプライマーと相補的である等々。したがって、プライマー対によって導入される相補的末端を介して、一本鎖の形態でお互いに結合することができる生成物を生成する、ＰＣＲ反応が行われる。次いで、これらを１つに連結させることができる。
【００９２】
代替方法として、制限部位の外側で切断するヌクレアーゼに対する制限部位を含むプライマーを用いて、本明細書に記載される方法に従って調製されるフラグメント鎖を増幅させることができる。次いでこれらの増幅生成物をこのヌクレアーゼで消化して、それぞれのフラグメント鎖末端に非パリンドローム的な突出を生成することができる。適切な配列の選択によって（たとえば使用されるプライマー中またはフラグメント中の）生成される突出は、異なるフラグメント鎖を整然と結びつけるのを可能にする。
【００９３】
したがって好ましい態様では、本発明は二本鎖核酸分子を合成する方法を提供し、少なくとも以下の段階を含む。
１）前に記載の方法に従ってフラグメント鎖を生成する。
２）所望により前記フラグメント鎖の末端に一本鎖領域を生成する。前記一本鎖領域は前記フラグメント鎖上の他の一本鎖領域に対して相補的であることから一本鎖領域の相補的対を形成する。
【００９４】
３）前記フラグメント鎖を互いに同時にもしくは連続的に接触させて、前記一本鎖領域の相補的対をもたらす。
任意の選択で前記鎖が１つに連結されるが、代替技術を使用して基本的な鎖を形成することができる。たとえば、本明細書に記載されるようにＰＣＲ法を使用することができる。
【００９５】
中間体フラグメント鎖は４と２０個の間のフラグメントの長さ、たとえば５〜１０個であることが好ましく、５と５０個の間のこのようなフラグメント鎖は１０と２０個の間に結びつけられる。
好都合には、本発明の方法において使用されるフラグメントはライブラリー中に含まれている。ライブラリーを構成するフラグメントを生成する方法は、当該分野ではよく知られている。たとえば、２つの部分を含む一連のオリゴヌクレオチドを生成することができる。第１の部分は一末端に突出を形成し、第２の部分は相補的なオリゴヌクレオチドへの結合をもたらし、その部分内に情報単位を含む。共通のハイブリダイズ部分および様々な突出を生成することによって、１つまたは複数のコード要素（該ハイブリダイズ部分の少なくとも一部によって示される）のための一連の二本鎖オリゴヌクレオチドが生成される。これによって、１つのコード要素（またはその組合せ）用のライブラリーが提供される。情報単位、すなわちハイブリダイズ部分中の配列を適切に変更することによって、異なるコード要素（またはその組合せ）用に異なるライブラリーを調製することができる。
【００９６】
好都合には、本発明において使用するために、これらの異なる二本鎖オリゴヌクレオチドは２次元アレイに配置される。その結果第１の次元では基本的なフラグメント内の連続的な部分が示され、第２の次元では考えられるコード要素（またはその組合せ）が提供される。最も単純な場合、「０」および「１」が異なる配列によって表される２進コードでは、第１の次元は提案されるフラグメントのそれぞれの位置のためのフラグメントを含み、第２の次元はわずか２つの変数（「０」および「１」）を有するはずである。これは１つのライブラリーまたは２つのライブラリー、すなわち「０」または「１」ライブラリーとしてみなすことができる。ひとたびこれらのライブラリーが生成されると、所望する任意のフラグメント順序を有するフラグメント鎖を容易に生成することができる。
【００９７】
ライブラリーの構成員をその適正な部位またはウエルに適切に向けるために、（すなわち該ライブラリーは別々の固形担体、または異なるアドレス、たとえばウエルを有する固形担体、または異なる溶液を含む異なるウエルからなっていてよい）何らかの適切な区分け技術を使用することができる。ライブラリーの構成員の生成のために使用される方法によってこの区分けを達成することができ、または適切な技術、たとえば関連のあるライブラリーの部位において相補的なオリゴヌクレオチドに結合させることによって、この区分けを達成することができる。
【００９８】
ライブラリーの構成員を結合するのに適した適切な固形担体は当該分野ではよく知られており文献に広く記載されている。一般に固形担体は、化学的または生化学的手順における固定化、分離などのために現在広く使用されているかまたは提案されている、周知の担体またはマトリックスのうちの任意のものであってよい。したがってたとえば固定化する部分は、たとえばポリマー材料、たとえばアガロース、セルロース、アルギナート、テフロン（Ｒ）、ラテックスまたはポリスチレンでできている、ビーズ、粒子、シート、ゲル、フィルタ、膜、ミクロファイバーストリップ、チューブまたはプレート、ファイバーまたは毛細管の形をとってよい。粒子状材料、たとえばビーズが一般に好ましい。好都合には、固定化する部分は超常磁性粒子などの磁性粒子を含むことができる。
【００９９】
好ましい実施形態では、プレートまたはシートを使用して分子を線状の配置に固定することが可能である。プレートはプレートに垂直な側壁を含んでもよく、プレート上に分子を結合することができる。固形担体への結合は直接的または間接的に行うことができ、使用する技術は、結合される分子がライブラリーの構成員を固定するためのオリゴヌクレオチドであるか、あるいはライブラリーの構成員自身に依存することになる。ライブラリーの構成員を直接結合するためには、すなわちオリゴヌクレオチドへの結合を介さずに、核酸分子および／または固形担体を保持している結合部分を使用することによって、好都合にも結合を間接的に行うことができる。したがって、たとえばアビジン、ストレプトアビジンまたはビオチン、ＤＮＡまたはＤＮＡ結合タンパク質（たとえばそれが結合するｌａｃＩリプレッサータンパク質またはｌａｃオペレーター配列のいずれか）、抗体（モノまたはポリクローナルであってよい）、抗体フラグメントまたは抗体のエピトープまたはハプテンなどの一対の親和性結合のパートナーを使用することができる。これらの場合、結合対の１つのパートナーが固形担体（または元来固形担体の一部である）に結合され、もう一方のパートナーは核酸分子（または元来核酸分子の一部である）に結合される。代替方法として、たとえばフィルタを使用する場合などは、直接結合する技術を使用することができ、紫外線誘導型の架橋によって結合を行うことができる。ＤＮＡフラグメントを結合するときは、ガラスに付着するＤＮＡの本来の性質も使用することができる。
【０１００】
ライブラリーの構成員の捕獲のために使用されるオリゴヌクレオチドは、固形担体上での適切な官能基の使用によって、固形担体に結合ることができる。
当該分野で周知の方法によって適切な官能基の固形担体への結合を行うことができ、これはたとえばヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒドまたはアミノ基を介した結合を含み、この結合は適切な表面コーティングを提供するように固形担体を処理することによって提供することができる。適切な官能基の本発明の核酸分子への結合は連結によって行うことができ、または合成または増幅中に、たとえばビオチンまたは捕獲用の特定配列などの適切な部位を保持しているプライマーを使用して導入することができる。
【０１０１】
したがって他の態様では、本発明は、本明細書で定義される（ｎ）ｍフラグメントを含むフラグメントのライブラリーを提供する。前式でｎは前に定義されるものであって、前記ライブラリーが生成することができる鎖の長さに対応し、ｍは可能なコード要素またはその組合せに対応する整数であり、したがって最終的な鎖中の各位置について可能なコード要素すべてに対応するフラグメントが提供される。
【０１０２】
１つの次元中の前記ライブラリーの一部分、〔すなわち、ただ１つのコード要素（またはその組合せ）用にｎ個のフラグメントを含むか、あるいはその鎖上の１つの位置に対するすべてのコード要素（またはその組合せ）を表すｍ個のフラグメントを含む〕は本発明の他の態様を形成する。
適切な混合は、自動制御によって達成することができる。たとえば「０」、「１」フラグメントの場合、これらの要素を正しく組み合わせることは、物資および時間の消費の点で重要な段階である。実施例２に、この方法をより詳細に記載する。特に適当な増幅方法（クローニングおよび／またはＰＣＲなど）が最後の段階で使用される場合には、この手順を縮小化することができる。したがって、図４Ｃに記載されるようにフローサイトメータを使用する区分けなどの技術を使用する技術を使用することができる。このような選別手順は充分に確立されており、標準的な装置では１秒当たり約５〜３００００の小滴を選別することができるが、最新型のサイトメータでは１秒当たり約３０００００までの小滴を選別することができる。
【０１０３】
前述のように、それぞれのフラグメントは２つ以上のコード要素を表すことができることが考えられる。たとえば既存の技術および３２×１００ライブラリー成分のライブラリーを使用して、それぞれのフラグメントが５つのコード要素を表す場合、３２００の容器が図４Ｃに示す区分け装置に接続されるならば、１秒当たり５００のコード要素を有する数千個の鎖を書くことが可能であるはずである。このような迅速性を以って核酸配列を生成することができる方法は、当該分野で知られている方法に優る重大な利点を提供することは明らかである。
【０１０４】
前記の方法に従って生成される核酸分子（すなわちフラグメント鎖）、およびその一本鎖分子は、本発明の他の特徴をもさらに含む。前記のように、これらの分子をベクター内に適切に含むことができる。
ひとたび生成されると、以下に記載するように、二本鎖または一本鎖の形であるフラグメント鎖をさまざまな応用例において使用することができる。特に有用な１つの応用例は、情報を記憶することである。そうした場合、このような鎖中に蓄えられている情報を読みとる適切な手段が必要とされる。いくつかの応用例では、たとえばフラグメント鎖の１つの末端上の突出に対して相補的であって固形担体上に保持されているオリゴヌクレオチドに結合させることによって、フラグメント鎖を特定部位に適切に向けることができる。代替の方法として、適切な抗体／抗原、またはＤＮＡ：タンパク質認識システムを使用することができる。したがって、分子内に記憶されている情報はこのようにして処理し、または次いで溶液中でアクセスすることができる。
【０１０５】
同時係属の出願ＰＣＴ／ＧＢ９９／０４４１７（ここにそのコピーを添付する）は、核酸分子中に含まれる情報を処理し、読みとるための適切な技術を開示している。この点において特筆すべきは、特定配列を対象としている蛍光標識を担持しているプローブの蛍光性を検出する技術である。このような技術では、前記の標識を有するプローブは特定のフラグメント領域、特にコード要素を示す領域を対象とすることができる。したがって、これらの標識によって（直接的または間接的に）発生するシグナルを検出することができ、これによってコード要素が同定される。簡単な２進システムが使用される場合は、わずか２つの別個の標識が必要とされるのみで、それらの結合パターンを決定することができる。代替方法として、より複雑なコードがフラグメント鎖中に反映されている場合は、的確な検出のためにはさらに別個の標識がそれに応じて必要とされる。
【０１０６】
かくして別の態様において本発明は、前述のようにして調製される核酸分子中に含まれるコード要素（すなわちフラグメント鎖）の同定の方法を提供し、１つまたは複数のコード要素に特異的なシグナル手段（たとえば標識）を担持しているプローブは前記核酸分子に結合させられ、前記シグナル手段によって発生するシグナルが検出され、それによって前記１つまたは複数のコード要素を同定することができる。
【０１０７】
前記シグナル手段は、前に記載したものと同様の標識であることが好ましい。
本明細書で言及される「プローブ」とは、適切な核酸分子のことである。たとえばこれはＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡの配列、またはこれらのハイブリッドからできたものであり、特異的な相互作用によって、たとえば特定配列への相補的な結合によって、標的核酸分子（一本または二本鎖であってよい）に結合することができる、すなわち特定のコード要素に特異的である。プローブは任意の好都合な長さ、特異的な結合が可能であるような、たとえば約５〜５０塩基、好ましくは８〜２０塩基の長さであってよい。
【０１０８】
本明細書において使用される「シグナル手段」とは、直接的または間接的にシグナルを発生させるための手段のことである。そのシグナルは、たとえば特定の生成物の存在、色、蛍光性、放射性、磁性、常磁性、電荷、大きさまたは体積などの検出することができる任意の物理的または化学的性質であってよい。標識はその蛍光性が検出される蛍光団であることが好ましい。このような場合、標識の検出のために蛍光スキャナを使用し、それによってコード配列を同定することができる。
【０１０９】
特定のシグナルの出現によって、個々のコード要素または要素の組合せを同定することができる。個々のシグナルの位置は、コード要素の配列を決定するために重要であることは明らかである。結果として、位置的情報（絶対的なまたは相対的な）を得ることができる方法が使用されるべきである。たとえば一端が固形担体に結びついている標的分子を使用する適切な技術が、同時係属の出願ＰＣＴ／ＧＢ９９／０４４１７に記載されている。
【０１１０】
ナノおよびピコ技術において、特にたとえば液体の流れ、電気または他の技術によってフラグメント鎖を伸長させ、その鎖をナノおよびピコ構造のための鋳型として使用することによって一度に生成される、フラグメント鎖に関するいくつかの適用例が存在する。その生成物を使用して生成物を標識することもでき、次いでそれを選別してその同一性を確定することができる。代替方法として、分子を使用してたとえば画像、テキスト、音楽などの情報を蓄えることができ、またはＤＮＡコンピュータ中のデータ貯蔵体として分子を使用することができる。迅速な生産および読みとり技術によってこのような適用例が初めて可能になる。
【０１１１】
前に記載した方法を実施するためのキットは、本発明の好ましい態様を形成する。したがってさらなる態様から鑑みると、本発明は、少なくともｎ個の二本鎖核酸フラグメントを含む二本鎖核酸分子を合成するためのキットを提供し、少なくともｎ−２個のフラグメントが両方の末端に一本鎖領域を有し、２個のフラグメントが少なくとも一方の末端に一本鎖領域を有し、（ｎ−１）個の一本鎖領域は（ｎ−１）個の他の一本鎖領域と相補的であり、かくして（ｎ−１）個の相補対が生成する。ｎ個のフラグメントの鎖を１つ生成するためにはｎ個を超えるフラグメントが供給されることが好ましく、これにより異なる位置に適切なフラグメントを選択することが可能である。したがって好ましい特徴では、前記キットは（ｎ）ｍ個のフラグメントを含み、ｎは前に定義したものと同様であり、ｍは考えられる変更の形、たとえば固有配列またはコード要素またはこれらの組合せの数に対応する整数であり、したがって、最終的な鎖中の各々の位置の可能な配列またはコード要素のすべてに対応するフラグメントが提供される。フラグメントが表すフラグメント鎖およびコード要素中の位置を基準として配置されている適切なライブラリー中において、これらのフラグメントが提供されることが好ましく、その結果所望するフラグメントをアレイから容易に選択することができる。
【０１１２】
キットは、リガーゼ、制限部位または連結部位の不活性化および活性化のために必要な酵素、増幅および／または適切な酵素用のプライマー、緩衝液および溶液を含むリストから選択される他の適切な成分を任意の選択で含んでよい。本発明の方法を実施するためのこのようなキットの使用は、本発明の他の態様を形成する。
【０１１３】
以下の実施例は単に例示によって与えられのみであり、その中で図面が参照される。
【０１１４】
【実施例１】
ベクターへのインサートのクローニング、たとえばＰＨＩＸ１７４からＰＵＣ１９へ
クローニングを達成するためにＩＩＳおよびＩＰ酵素を用いて行われる一般的手順では、下記の特徴を有するクローニングベクターの使用が必要である：
１）　遺伝子（ｌａｃＺ， ｃｃｄＢまたはこれ以外のもの）内に位置し、成功した挿入の検出を可能とするマルチクローニングサイト
２）　前記マルチクローニングサイトは、外側に位置し、突出を生じる２つのＨｇａＩサイトを含み、該突出はベクター中の他の場所で他のＨｇａＩが作り出したものとは異なる。
【０１１５】
ＨｇａＩサイトの配向によって、消化の間のベクター部分からのそのサイトの切除が確実となる。未消化のプラスミドに基づくバックグラウンドを最小限にするために、いくつかのＨｇａＩサイトおよび他の最適な制限酵素サイトがＭＣＳ中に含められる。制限酵素は、ＨｇａＩバッファー中でよく開裂し、また、ベクター中に他のサイトを持たないように選択される。
【０１１６】
ドナープラスミドは、適当な一組のＩＩＳおよび／またはＩＰ酵素を用いて切断される。ベクター中にサブクローンされるフラグメントを特定するために、アダプターが用いられる。これは、インサート上に生じた突出に対してアダプター上の適当な一本鎖領域を利用することによる。これにより、分子：ベクター−アダプター１−インサート（例：ＰｈｉＸ１７４遺伝子）−アダプターＩＩ−ベクターに帰着する。
【０１１７】
この方法は、ＰｈｉＸ１７４インサートをたとえば、ｐＵＣ１９といったベクターへ挿入するために例示される。ｐＵＣ１９プラスミド中のＨｇａＩサイトは、ランダムに選択され、我々のいう”ポリリンカー”となり、他方で、ＰｈｉＸ１７４ゲノムからの異なる遺伝子および遺伝子結合物が“インサート”として用いられる。
ゲノムは下記に示したように、ＰｈｉＸ１７４中で組織化される。遺伝子Ａ，Ｂ，ＣおよびＥ相互の相対的な位置を示す：
【０１１８】
【数１】
2004512807.tif 000003
【０１１９】
上記において、遺伝子Ｂは、遺伝子Ａ内部に位置し、他方、遺伝子Ｃは、遺伝子Ａと多少重なる（３塩基対だけ）。遺伝子ＤおよびＫは、示してはいないが、遺伝子ＣおよびＥと同じ領域に位置する。このゲノム領域は、最後の列に示したように、９個の ＢｂｖＩサイトを含み、ここで、ＢｂｖＩで切断することにより生じる突出のペアは、下記に示したとおりであり、括弧内に示した塩基対位置を有する：
【０１２０】
【数２】
2004512807.tif 000004
【０１２１】
ＰｈｉＸ１７４ゲノム部分は、示していないが、５個より多いＢｂｖＩサイトを有する：
【０１２２】
【数３】
2004512807.tif 000005
【０１２３】
これらのうち、１２個だけが異なる突出を生じ、他方で、２つは同一の突出を生じる。
ｐＵＣ１９を開裂するのにＨｇａＩを用いる場合には、４個の異なるサイトが開裂され、８つの異なる突出が生じる。これらは、下記のとおりである：
【０１２４】
【数４】
2004512807.tif 000006
【０１２５】
方法：
バクテリオファージＰｈｉＸ１７４由来の遺伝子Ｂを意図したベクターへサブクローンするためには、下記のプロトコルが用いられる：
１）２μｇのＰｈｉＸ１７４ ＤＮＡを、１Ｘバッファー２（ＮＥＢ）中の２ＵのＢｂｖＩ（ＮＥＢ）を用い、水を２０μｌの容量になるまで添加して、３７℃で１時間消化させる。その後、ＢｂｖＩを６５℃で２０分間加熱不活性化する。
２）２μｇのベクター（例：ｐＵＣ１９）を、１Ｘバッファー１（ＮＥＢ）中の２ＵのＨｇａ Ｉ（ＮＥＢ）を用いて、水を２０μｌの容量になるまで添加し、３７℃で１時間、消化させる。その後、ＨｇａＩを６５℃で２０分間加熱不活性化する。
３）アダプターは、別々の試験管中で、（所望の生成物、すなわち順／逆配向の特定の遺伝子を得るために選択された）オリゴヌクレオチドを２つずつそれぞれに混合することにより作製され、アニーリングされる。
４）６μｌのＰｈｉＸ１７４の切断反応物を、３μｌのベクターの切断反応物と混合し、５〜５０ｐｍｏｌの各アダプター、２〜１０Ｕ／μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）、１Ｘリガーゼバッファー（ＮＥＢ）および５％のポリエチレングリコール８０００の存在下で、水を３０μｌの容量になるまで添加し、２５℃で１時間連結させる。
５）通常の方法を用いてバクテリアをトランスフォームさせる。
６）その後、コロニーを数え、さらにそのうちのいくつかを採取しさらに分析する（シークェンシングなど）。
材料：
ＰｈｉＸ１７４の突出を処理するのに用いられるオリゴヌクレオチド：
【０１２６】
【数５】
2004512807.tif 000007
【０１２７】
ｐＵＣ１９の突出を処理するのに用いられるオリゴヌクレオチド：
クローニングサイト１ａ
【０１２８】
【数６】
2004512807.tif 000008
【０１２９】
クローニングサイト１ｂ
【０１３０】
【数７】
2004512807.tif 000009
【０１３１】
この組換え方法が、古典的なＣｏｈｅｎ−Ｂｏｙｅｒ法と比較して、重要な利点を２つ有することに、注目すべきである。この手順は実施するのに極めて容易である。この方法は、トランスフォーメーションの前に、混合工程とインキュベーションの工程しか必要としない。ＰＣＲ増幅もゲル分離もまた必要としない。この方法は、有意義な適応性を与え、２つの制限酵素を用いるだけで複雑な組換えを可能にする。
【０１３２】
【実施例２】
鎖合成の自動化および小型化
この方法では、適当な“０”および“１”フラグメントを適切な突出と混合し、 “０”のものと“１”のものからなる特定のストリング（ｓｔｒｉｎｇ）を製造するための迅速な工程について説明する。
【０１３３】
一つは“０”フラグメントを有し、もう一つは“１”フラグメントを有する、２つのライブラリーを作製する。詳細な説明に記載したように、これらは、隣接位置でフラグメントの対応する突出に結合し得る突出を有した状態で生じる。これらの切断した部分は、異なるウェルに存在して、ライブラリーを形成する。たとえば、位置１のフラグメントは、ウェル１に存在し、位置２のフラグメントは、ウェル２に存在し、以下同様である。したがって、２つのライブラリーは各位置について選択対象となる二者を提供する。鎖を生じるためには、したがって、位置１について適切なフラグメント“０”または“１”を、位置２についても同様に選択することだけが要求される。これらのフラグメントは唯一の突出であるため、隣接位置のフラグメントに対してのみハイブリダイズできることから、適切なフラグメントを選択し、その後に、それらのフラグメントを同時に混合し、連結することしか要求されない。この効果を達成する異なる方法を、図４に示す。図４では、混合するための３つの異なる選択肢を示す。
【０１３４】
図４Ａでは、たとえば鎖０−１−０−０−１を製造するために、この装置が、位置１，３および４で“０”ライブラリーから吸引し、また、位置２および５で“１”ライブラリーから吸引するのに用いられる。その後、吸引された液体は、リガーゼおよび適当なバッファーとともに混合することができる。選択肢Ｂでは、ライブラリー中の各ウェルを、電気的に開閉し得るチューブ／ノズルと連結する。ノズルからの液体を、リガーゼおよび適当なバッファーとともにライゲーションチャンバー（ｌｉｇａｔｉｏｎ ｃｈａｍｂｅｒ）に注ぐ。開閉するノズルのパターンを適当に変えることにより、異なる鎖が構成される。
【０１３５】
手順はたとえば、図４Ｃに示したようなフローサイトメトリー技術を用いてまた小型化されてもよい。この方法では、ライブラリー成分が、“書込機械（ｗｒｉｔｉｎｇ−ｍａｃｈｉｎｅ）”の頂部の容器内に貯蔵される。各容器からの小滴は、構成される鎖の種類に応じて廃棄物ウェルまたは生成物ウェルのいずれかのウェルに導かれる。その誘導機構は、通常のフローサイトメーターで使用されるのと同様であり、すなわち、小滴は、容器を出るときに帯電され、電気的に異なる方向に導かれ得る。
【０１３６】
【実施例３】
本発明に用いるオリゴヌクレオチドを含むライブラリー
クローニング方法は、好適には、オリゴヌクレオチドを含むライブラリーを用いて行うことができる。たとえば、ライブラリーは、下記のものを含んでいてもよい：
１．１個の共通部分、および変化して可能なすべての置換、すなわち１０２４個の変異体を与える５個の塩基を５’末端に有するオリゴヌクレオチド
２．１個の共通部分、および変化して可能なすべての置換、すなわち２５６個の変異体を提供する４塩基を５’末端に有するオリゴヌクレオチド
３．１個の共通部分、および変化して可能なすべての置換、すなわち１０２４個の変異体を提供する５塩基を３’末端に有するオリゴヌクレオチド
４．１個の共通部分、および変化して可能なすべての置換、すなわち４０９６個の変異体を提供する６塩基を３’末端に有するオリゴヌクレオチド。
【０１３７】
上記において、オリゴヌクレオチドは、不変の塩基によって全“１”オリゴヌクレオチドが“２”オリゴヌクレオチドに相補的になるように製造される。これにより異なる４／５塩基の突出を有する二本鎖分子を生じる。同様に、“３”および“４”オリゴヌクレオチドは相補的である。
このような方法で結合される（すなわち、いずれかの末端で４〜６個の塩基の突出を有する）オリゴヌクレオチドはまた、ライブラリーのある構成部分と結合することによっても生じる相補的な二本鎖オリゴヌクレオチドと結合してもよい。この方法では、長さが異なる可変的な突出が生成する分子中に創出される。具体的には、３’末端および５’末端の両方に４塩基の突出を有する分子が挙げられる。
【０１３８】
５’および３’アダプターを連結させることができるオリゴヌクレオチドもまた、ライブラリー中に供与される。したがって、たとえば、下記の形態を有するオリゴヌクレオチドが提供され得る：
【０１３９】
【数８】
2004512807.tif 000010
【０１４０】
ここで、“ｃｏｍｐｘ”は、領域“ｃｏｍｐｘ＊”に相補的な領域をいう。すなわち、“５”、“６”、“７”または“８”は、“９”に結合できる。さらに、“ｃｏｍｐ２”は上記オリゴヌクレオチド１に結合することができ、“ｃｏｍｐ２ａ”はオリゴヌクレオチド２に結合することができ、“ｃｏｍｐ３”はオリゴヌクレオチド“４”に結合することができ、さらに、“ｃｏｍｐ３＊”はオリゴヌクレオチド“３”に結合することができる。“Ａ”で示される塩基は“Ｂ”に結合する。すなわち、“７”および“１０”はこれらの末端で結合し得る。同様に、“Ｄ”は“Ｅ”に結合し、“Ｆ”は“Ｇ”に結合し、“Ｈ”は“Ｉ”に結合する。（これらの塩基は一緒にある場合、可変的な内容を有していてもよい。たとえばＡＡＡＡ＝ＧＡＧＡ、そしてＢＢＢＢ＝ＴＣＴＣ）。
【０１４１】
上述のようなリンカーの適切な利用により、５’および３’アダプターを結合してもよい。たとえば、特定の４塩基の５’突出を有するオリゴヌクレオチド“２”は、その相補的領域を通じてオリゴヌクレオチドリンカー“１１”に結合していてもよく、該リンカーはその後、“ＥＥＥＥＥ”重複（ｏｖｅｒｌａｐ）を残すであろう。これは、この重複部を通してオリゴヌクレオチド“８”に結合することができ、“８”自身その相補領域を通じてオリゴヌクレオチド“９”と結合することができる。重複“ＨＨＨＨＨＨ”は、相補的領域への結合を通じてオリゴヌクレオチド“４”に付着し得るオリゴヌクレオチド“１３”に結合してもよい。したがって、種々の置換を作ることができ、その結果、たとえば、４、５または６塩基重複の任意の組み合わせといった種々の長さの重複を生じる。この重複は、同じ鎖上でも異なる鎖上にあってもよい。
【０１４２】
【実施例４】
単一の突出を作るためのトリミング手順
ここに提示する系によれば、７個の異なるＩＩＳ酵素を用いてトリミング手順を行うことが可能となる。該酵素は４塩基の５’突出（ＦｏｋＩおよびＢｓｔ７１Ｉ）、５塩基の５’突出（ＨｇａＩ）、５塩基の３’突出（ＢｐｌＩおよびＢａｅＩ）、および６塩基の３’突出（ＣｊｅＩおよびＨａｅＩＶ）を作る。もし、ここに提示するオリゴヌクレオチド系と、実施例３に記載した基本的オリゴヌクレオチドキットとを組み合わせれば、５塩基および６塩基の３’突出の全置換および４塩基および５塩基の５’突出の全置換をトリミング手順のために準備することができる。
【０１４３】
この実施例における、開始リンカー（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｌｉｎｋｅｒ）の結合モチーフの位置を下記に示す：
【０１４４】
【数９】
2004512807.tif 000011
【０１４５】
開始リンカー：
【０１４６】
【数１０】
2004512807.tif 000012
【０１４７】
６塩基の３’突出ＰＰＰＰＰＰは非回文配列であり、相補的突出のＱＱＱＱＱＱと連結することができる。１０個の異なる開始リンカーが必要とされる理由は、ＢａｅＩが１０個の塩基をその結合部位から切り離してしまうからである。したがって、これらのリンカーは、ＢａｅＩが各トリミングサイクルにおいて１０塩基を“飛び越える（ｊｕｍｐ）”箇所で、トリミング手順を受け入れる。その際１０個の異なる開始位置が、すべての可能性をカバーするために必要とされるであろう。他方、ＨｇａＩは５塩基を切り離すだけで、５個の異なる開始位置しか要しない。このことが、ＨｇａＩの結合部位が、上記Ｘ＝０〜Ｘ＝３に存在しない理由である。
伸長リンカー（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｌｉｎｋｅｒ）：
【０１４８】
【数１１】
2004512807.tif 000013
【０１４９】
終結リンカー（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｌｉｎｋｅｒ）：
先に記載した基本的オリゴヌクレオチドを用いて作られたアダプターが、終結リンカーとして用い得る。したがって、終結リンカーの別個の組は必要とされない。
方法：
この方法では、５塩基の３’突出で始まるＢｓｔ７１Ｉを使用するトリミング反応を示す。標的ＤＮＡが下記に示され、最初に生じる突出を“＊”でマークする。
【０１５０】
【数１２】
2004512807.tif 000014
【０１５１】
標的ＤＮＡ中の最初のＢｓｔ７１Ｉ突出は、突出ＣＡＣＴＴ−３’の５〜８だけ塩基下流に位置するであろう。Ｘは、したがって、３でなければならない（下図参照）。その後、下記の方法を適用することができる：
３’ＧＴＧＡＡ突出を用意することができる一つのリンカーを、４−３’ ６塩基（ＱＱＱＱＱＱ）を一つの試験管中で３−３’ ５塩基（ＧＴＧＡＡ）とともにアニーリングすることにより調製する：
【０１５２】
【数１３】
2004512807.tif 000015
【０１５３】
その後、３’−ＧＡＧＴＧＣ突出をＸ＝３の開始リンカーと連結させ、ＧＴＧＡＡ−３’突出を標的ＤＮＡ分子上でＣＡＣＴＴ−３’突出と連結する：
【０１５４】
【数１４】
2004512807.tif 000016
【０１５５】
【実施例５】
構成体からの介在配列の除去
ある場合には、適当でない核酸配列を、たとえば前記インサート配列と前記ベクター配列との間に含む構成体を調製してもよい。次いで、前記リンカー配列を除去するための方法を適用するべきである。いくつかの可能な方法を以下に述べるが、そこでは制限酵素のための結合部位がアダプター配列中に与えられる。その後、制限酵素による切断は、再連結可能なＤＮＡ末端をもたらすであろう。ベクターＤＮＡを、ＶＶＶＶＶＶＶと表し、これに対し、インサートＤＮＡをＩＩＩＩＩＩＩと表す。
【０１５６】
方法１
２つのＩＩＳ酵素（ＢｂｓＩおよびＥｓｐ３Ｉ）で５’ 末端に４塩基の突出を生じさせる：
６５．
【０１５７】
【数１５】
2004512807.tif 000017
【０１５８】
ＢｂｓＩおよびＥｓｐ３Ｉで切断後：
【０１５９】
【数１６】
2004512807.tif 000018
【０１６０】
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結後：
【０１６１】
【数１７】
2004512807.tif 000019
【０１６２】
方法２
１つのＩＩＳ酵素（ＢｓａＸＩ）で３’ 末端に３塩基の突出を生じさせる：
【０１６３】
【数１８】
2004512807.tif 000020
【０１６４】
ＢｓａＸＩで切断後：
【０１６５】
【数１９】
2004512807.tif 000021
【０１６６】
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結後：
【０１６７】
【数２０】
2004512807.tif 000022
【０１６８】
方法３
１つのＩＩＳ酵素（ＭｌｙＩ）で平滑末端を生じさせる：
【０１６９】
【数２１】
2004512807.tif 000023
【０１７０】
ＭｌｙＩで切断後：
【０１７１】
【数２２】
2004512807.tif 000024
【０１７２】
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結後：
【０１７３】
【数２３】
2004512807.tif 000025
【０１７４】
【実施例６】
ミスマッチ連結が最少である６塩基対突出を有するオリゴヌクレオチド群の同定
お互いにミスマッチ連結を形成しそうにない６塩基対突出を有するオリゴヌクレオチド群を同定するために、以下の工程を用いることができる。
１．６塩基の突出ペア（対）２０４８個をすべて作製する。
２．回文ペア３２個を除去する。
【０１７５】
これにより、突出ペア２０１６個からなる最終的な組を生成する。
パート１
１．ペア＃１としてあるペア（対）を用い、セクション１を実施することにより、次のペアを選択する。
セクション１
アルゴリズム１
すでに選択されたｎ個のペアと、残っている（２０１６−ｎ）個のペアのすべてとの間で（２０１６−ｎ）個の非加重ミスマッチ点数の表を計算し、後者のなかから表の最低点がもっとも高くなるようなペア（群）を見出す（点数計算方法の詳細は、以下を参照）。そのようなペアが１つだけであれば、それを選択する。数ペアあった場合には、最低の非加重点数を与えた突出比較の加重ミスマッチ点数を計算し、最低の加重点数が最も高いペアを見出す。そのようなペアが１つだけであれば、それを選択する。数ペアあった場合には、ミスマッチ表の２番目に低い非加重点数のものを使用して、すべての手順を再びやり直し、その後、３番目に低いもので行なうなどする。すべてのミスマッチ点数を検討した後、数ペアが同点で残った場合には、それらをすべて保存する。
【０１７６】
突出ペアの鎖を得るために、選択された各ペアに対しアルゴリズム１を繰り返し、所望する位置数について反復する。この手順は、突出ペアを各枝上に有するツリー（ｔｒｅｅ）をつくる。各ポイントでのペアの特定の結合についての最低の非加重および加重ミスマッチ点数を計算する。（１）所望する位置数に到達した場合、または（２）ペアの結合が既に先に見出されていたものである場合、または（３）その結合の最低のミスマッチ点数が既に構築された完全な鎖の最低点数よりも低い場合には、特定の経路は止められる。ポイント（３）は、新しい完全鎖おのおのが、以前に構築されたそれらの鎖（群）よりも高いか、少なくとも同等である、最低ミスマッチ点数を常に有することを保証する。また、この方法の結果として、与えられた鎖中の全てのペアは唯一であり、前記ツリーの中のすべての完全鎖も唯一であることに注目されたい。前記の方法全体は、調査される最後の経路が止まるときに終結する。最低ミスマッチ点数が最も高い完全鎖（群）を保存する。
【０１７７】
ペア＃１として、２０１６個のペア各々を用いて、セクション１を開始して繰り返し、２０１６個の突出鎖の組をつくる。アルゴリズム２を適用して、最適な鎖（群）を見出す。
アルゴリズム２
すべての鎖に対し、鎖中に存在するすべてのペア間で非加重ミスマッチの点数表を計算し、表中での最低点が最も高い鎖（群）を見出す（詳細は以下を参照）。そのような鎖が１つだけであれば、それを選択する。いくつかの鎖があった場合には、最低の非加重点数を与えた突出比較の加重ミスマッチ点数を計算し、最低加重点数が最も高い鎖を見出す。そのような鎖が１つだけであれば、それを選択する。いくつかの鎖があった場合には、ミスマッチ表の２番目に低い非加重点数のものを使用して、すべての手順を再びやり直し、その後、３番目に低いもので行なうなどする。すべてのミスマッチ点数を検討した後、いくつかの鎖が同点で残った場合には、それらをすべて保存する。
【０１７８】
これにより１以上の突出鎖の組をつくることができる。
パート２
一つの鎖を用いて、セクション２を実施する。
セクション２
アルゴリズム３
前記鎖について、鎖中のすべてのペア間のミスマッチ点数表において最低の非加重および加重点数の原因である突出ペア（群）を見出す。その後、そのペアを、もとの鎖中には存在しない残りのすべての突出ペアで置き換えることによって新しい鎖を創出する（置換されるものが数ペアあった場合には、一回に１つのペアを置換する）。新しく生成された鎖の完全な組ともとの鎖とから、１以上の鎖をアルゴリズム２に従って選択する。ここで、もとの鎖をアルゴリズム２中に含めることは、選択された鎖が、もとの鎖の点数よりも高いか、少なくとも同等のミスマッチ点数を常に有することを保証する。改善には（もし、あれば）は、最低もしくはｎ番目に低い非加重点数、または相当する加重点数を含んでもよい。
【０１７９】
選択した鎖のそれぞれについて、アルゴリズム３を繰り返す。この手順は、鎖を各枝上に有するツリーをつくる。前記のツリーに加えられる新しい鎖はそれぞれ、以前の工程で見出された鎖の点数よりも高いか、同等のミスマッチ点数を有する。選択された鎖が、既に先に見出されていたものである場合には、特定の経路は止められる。これは、前記のツリーの中のすべての鎖が唯一であることを保証する。前記の方法全体は、調査される最後の経路が止まるときに終結する。前記のツリーの中に存在するすべての鎖を保存する。
【０１８０】
パート１の終わりで選択された各鎖を用いて開始し、セクション２（すなわち、ツリーの構築）を繰り返す。
すべてのツリーの中に存在する鎖の組全体から、１以上の鎖をアルゴリズム２に続いて選択する。
これは１以上の突出鎖の最終的な組をつくる。
ミスマッチ点数の計算方法
非加重点数
２つの６塩基突出間の連結についての前記非加重点数は、最初の３塩基および最後の３塩基のトリプレットを別々に検討して観察されたミスマッチの数である。たとえば、ＡＡＡＡＡＣ／ＴＴＴＧＣＡの連結についての点数は０−３であり、ＡＡＡＡＡＣ／ＴＣＡＧＧＧについての点数は２−２である。すべての可能な点数を最高から最低へ、以下の順に並べる。
【０１８１】
【数２４】
2004512807.tif 000026
【０１８２】
加重点数
連結についての加重点数（ＷＳ）は以下のようにして計算される。
【０１８３】
【数２５】
2004512807.tif 000027
【０１８４】
ここでＢＰＳｉは、ｉ部位における特定の塩基対についての点数であり、この点数は以下の表中に与えられる。
【０１８５】
【数２６】
2004512807.tif 000028
【０１８６】
ある突出とその相補的なものとの完璧な対合については、ＷＳ ＝ ６である。
ペア間の比較と点数表の構築
近接する突出ペアの発見
近接する突出ペアを選択するために、前回の位置で選択されたペアと残っているすべてのペアとの間のミスマッチ点数表を計算する。そのような表を構築するために、前回に選択したすべてのペアを新しいペアと比較し、またいずれの突出を自身と比較する。したがって、ｎペアを既に選択していた場合には、各表ごとに検討される連結の数は、４ｎ＋２（ｎ＋１）＝６ｎ＋２である。同じＤＮＡ鎖上にある２つの突出を比較する場合、それらの１つは逆転される。
【０１８７】
以下の例、すなわちＡＡＡＡＡＣ／ＴＴＴＴＴＧ（１Ａ／１Ｂ）およびＡＡＡＣＧＴ／ＴＴＴＧＣＡ（２Ａ／２Ｂ）ペアが前回に選択されていて、新しいＡＧＴＣＣＣ／ＴＣＡＧＧＧ（３Ａ／３Ｂ）ペアが近接位置で試行される場合を考えてみよう。
対応表を以下に示す。
【０１８８】
【表１】
2004512807.tif 000029
【０１８９】
ここで、最低点は２−２；２．４であり、突出１Ａと３Ｂ間の連結によって与えられる。
鎖についての点数表
ある鎖についてのミスマッチ点数表を計算するために、該鎖に含まれるすべての突出ペアを互いに比較し、またいずれの突出もそれ自身と比較する。したがって、ｐ個の突出ペアを有する鎖について検討される連結数は、４ｐ（ｐ−１）／２＋２ｐ＝２（ｐ２）である。上述したように、両突出が同じＤＮＡ鎖上にある場合の比較では、２つの突出の１つは逆転される。
【０１９０】
たとえば、以下の３ペア（すなわち４位置）の鎖を考えてみよう：ＡＡＡＡＡＣ／ＴＴＴＴＴＧ（１Ａ／１Ｂ）、ＡＡＡＣＧＴ／ＴＴＴＧＣＡ（２Ａ／２Ｂ）、ＡＧＴＣＣＣ／ＴＣＡＧＧＧ（３Ａ／３Ｂ）、これらのうち、１Ａはあるフラグメント上にあり、１Ｂおよび２Ａは２番目のフラグメント上にあり、２Ｂおよび３Ａは３番目のフラグメント上にあり、３Ｂは４番目のフラグメント上にある。
【０１９１】
対応表を以下に示す。
【０１９２】
【表２】
2004512807.tif 000030
【０１９３】
ここで、最低点は０−３；３．８であり、突出１Ａおよび２Ｂ間の連結によって与えられる。
得られた結果；
切断点の表
パート１
【０１９４】
【表３】
2004512807.tif 000031
【０１９５】
パート２
【０１９６】
【表４】
2004512807.tif 000032
【０１９７】
非加重のミスマッチ点数（９＝３−３、８＝３−２、７＝２−２、６＝３−１、５＝２−１、４＝１−１、３＝３−０、２＝２−０、１＝１−０）は、位置の数が増加するにつれて減少することに気付くだろう。
パート１の終わりおよびパート２の終わりで得られた鎖のサンプル
３位置（この鎖は両パートの終わりで得られた。）：
【０１９８】
【数２７】
2004512807.tif 000033
【０１９９】
４位置：
パート１
【０２００】
【数２８】
2004512807.tif 000034
【０２０１】
パート２
【０２０２】
【数２９】
2004512807.tif 000035
【０２０３】
９位置（この鎖は両パートの終わりで得られた。）：
【０２０４】
【数３０】
2004512807.tif 000036
【０２０５】
１０位置（この鎖は両パートの終わりで得られた。）：
【０２０６】
【数３１】
2004512807.tif 000037
【０２０７】
１４位置（この鎖は両パートの終わりで得られた。）：
【０２０８】
【数３２】
2004512807.tif 000038
【０２０９】
１５位置：
パート１
【０２１０】
【数３３】
2004512807.tif 000039
【０２１１】
パート２
【０２１２】
【数３４】
2004512807.tif 000040
【０２１３】
３３位置（この鎖は両パートの終わりで得られた。）：
【０２１４】
【数３５】
2004512807.tif 000041
【０２１５】
３４位置（この鎖は両パートの終わりで得られた。）：
【０２１６】
【数３６】
2004512807.tif 000042
【０２１７】
９０位置（この鎖はパート１の終わりで得られた。）：
【０２１８】
【数３７】
2004512807.tif 000043
【０２１９】
【実施例７】
バイナリー配列１−０−１−０−０をコードする５−フラグメント鎖の構築
この実験は、４つの非回文的な５’末端６塩基突出ペアの組を用いる特異的な５フラグメント鎖の構築を示す。この４つの独特な突出ペアの組は、実施例６で述べたようにコンピュータープログラムを用いて見出された。
【０２２０】
前記突出ペアに基いて、別々の試験管中で相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって５つのライブラリー成分の組が作成された。：
シグナル１：
【０２２１】
【数３８】
2004512807.tif 000044
【０２２２】
シグナル２：
【０２２３】
【数３９】
2004512807.tif 000045
【０２２４】
シグナル３：
【０２２５】
【数４０】
2004512807.tif 000046
【０２２６】
シグナル４：
【０２２７】
【数４１】
2004512807.tif 000047
【０２２８】
シグナル５：
【０２２９】
【数４２】
2004512807.tif 000048
【０２３０】
その後、前記ライブラリー成分（各４ｐｍｏｌ）を互いに混合し、１００ ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を使用して１×リガーゼバッファー中で２５℃で１５分間、連結した。次いで、このリガーゼを６５℃で２０分間、不活性化した。
連結反応液（５０μｌ）の５μｌを、１×サーモポル（Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ）バッファー（ＮＥＢ）、０．０５ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．４μＭ Ｔ７プライマー、０．４μＭ ＳＰ６プライマーおよび０．０４Ｕ／μｌ ベント（Ｖｅｎｔ）ポリメラーゼ（ＮＥＢ）を含むＰＣＲ反応液（５０μｌ）中でテンプレートとして用いた。ＰＣＲは、ホットスタートし（ポリメラーゼ添加前に９５℃で３分間）、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７６℃で３０秒、ＰＴＣ−２００サーモサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を使用して、３０サイクル行なった。１０μｌの前記ＰＣＲ産物を図５に示したように１．５％ アガロースゲル上で分析した。このゲル写真は、予想（２４３ｂｐ）されたように、およそ２４０ｂｐに相当する１つの強いバンドのみを示した。残りのＰＣＲ産物をクロロホルムで２回抽出し、７１％エタノールと０．１Ｍ 酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）を用いて沈殿させた。ＤＮＡを水に溶かし、配列決定をした。その配列から、予想されたシグナル鎖（１−０−１−０−０）が生成したことを確認した。
【０２３１】
【実施例８】
１回のライゲーションサイクルの次に１回のＰＣＲサイクルまたは２回のライゲーションサイクルを用いる、バイナリー配列をコードする５×５ フラグメント鎖の構築
この実験は、前の実施例で示された連結方法に代わるものとして、フラグメント鎖同士をつなぐための相補的なプライマーペア（対）の使用について示す。
【０２３２】
この実験では、先に示したように（実施例７）、５位置の５つのフラグメント鎖（フラグメントまたはビット）をそれぞれライゲーションサイクル１中で別々に連結する。その後、この５つのフラグメント鎖を、５つの異なるプライマーペア（ペア１を鎖１の増幅に使用し、ペア２を鎖２の増幅に使用するなど）とともに増幅する。プライマーペア１中の２番目のプライマーは、プライマーペア２中の最初のプライマーと相補的であり、プライマーペア２中の２番目のプライマーは、プライマーペア３中の最初のプライマーと相補的である、などとなっている。
【０２３３】
その後、５つのＰＣＲ反応物のそれぞれから少量のアリコートを取り、シグナル鎖１および５の末端に特異的なプライマーで新しいＰＣＲ反応を行う。本方法を図６で説明する。
材料：
フラグメント鎖と結合し、またプライマーとしても働くオリゴヌクレオチドを選択する。したがって、たとえば隣接する鎖については、たとえば下記のプライマーペアを使用して結合してもよい。：
フラグメント鎖２末端（結合したプライマーを有する）。：
【０２３４】
【数４３】
2004512807.tif 000049
【０２３５】
フラグメント鎖３末端（結合したプライマーを有する）。：
【０２３６】
【数４４】
2004512807.tif 000050
【０２３７】
上記の例示されたプライマー領域は相補的であり、したがって互いに結合することができる。
この方法の代わりに、５つのフラグメント鎖（連結によって生成された）を互いに連結する２つのライゲーションサイクルを使用しても良い。このように、数回の構築サイクルが、長いシグナル鎖をつくりあげることとなる。最初のライゲーションサイクルでの初期連結の後に、５つのフラグメント鎖がＦｏｋＩ部位を有するプライマーでもって増幅される。該プライマーは、ＦｏｋＩでの消化が各フラグメント鎖の末端に非回文の突出をつくるように適切に選択される。フラグメント鎖末端においてフラグメント鎖１中に生成されたこの突出は、フラグメント鎖２中に生成された最初の突出と連結でき、フラグメント鎖２中に生成された２番目の突出は、フラグメント鎖３中に生成された最初の突出と結合できる等々である。それによって、前記の５つのフラグメント鎖は、コントロールされた様式により互いに連結され得て、２５フラグメント（ビット）を有する最終的な鎖を生成する。
【０２３８】
１００または５００個のフラグメントを有するフラグメント鎖を構築したい場合には、この手順をもう１回または２回繰り返すことができる。しかしながら、ライゲーションサイクルを何回実施することが可能であるかに関して、ポリメラーゼの能力が、制限因子となるだろう。したがって、さらに長い鎖を構築するためには、他の方法を適用する必要があるだろう。
【０２３９】
【実施例９】
トリミングされた遺伝子ＡとともにＰＨＩＸ１７４からのインサートのＰＵＣ１へのクローニング
この実験は、望まないフランキング配列の削除のための「トリミング」方法を示す。この実験の他の重要な側面は、５’ 末端および３’ 末端の突出が、ともに一本鎖オリゴヌクレオチド単体と結合することができることを示すことである。また、インサートが２つの異なるＩＩＳ部位内にクローンされ、それによりインサートの鎖状体化に関する問題を排除することが注目される。
【０２４０】
この方法において、ＰｈｉＸ１７４からの遺伝子Ａを、ｐＵＣ−１９ベクター内にクローンする。詳細を実施例１で述べたように、ＰｈｉＸ１７４は、ＢｂｖＩを用いる切断によって調製され、異なる非回文の５’末端４塩基突出が横側に配置した１５フラグメントとなる。次いで遺伝子Ａに隣接する２つの突出は、ＢｐｌＩ部位を含む「開始リンカー」とともに用意され、一方、残りのフラグメントは再連結させることができる。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、ＢｐｌＩ、ＢｐｌＩ部位を含む「伸長リンカー」および２つの「終結アダプター」を、遺伝子Ａの最初と最後の各５塩基に対してそれぞれ用意し、使用する。該溶液を３７℃でインキュベートし、それによりトリミング反応を、遺伝子Ａ中にある最初と最後の各５塩基に到達して終結するまで続けさせることができる。
【０２４１】
前記ｐＵＣ−１９ベクターをＨｇａＩおよびＢｓａＩで切断することによって調製する。ＨｇａＩによる切断で生成した突出については実施例１に述べる。ＢｓａＩによる切断は、４つの同一でない切断片を生じ、８つの同一でない突出をもたらす。たとえば部位１−ＧＣＣＡ／ＣＧＧＴ（１６００）。
遺伝子Ａは、その最初と最後の５塩基において下記の配列を有する（下線でマークした）。
【０２４２】
【数４５】
2004512807.tif 000051
【０２４３】
下線部の配列でトリミング手順を終結させる場合には、不要のフランキング塩基対を全く有しない遺伝子Ａをクローンすることができる。ＢｐｌＩにより生成された３’末端の５塩基突出は、マークした塩基対に相当する。
ＰｈｉＸ１７４からの遺伝子Ａのクローニング部位として用いられる、ｐＵＣ１９内でＨｇａＩおよびＢｓａＩによって生成された突出ペアは、ＴＴＣＴＣ／ＣＧＧＴである。
方法：
これは、ｐＵＣ１９をＨｇａＩ（ＮＥＢ４、３７℃）およびその後ＢｓａＩ（ＮＥＢ４、５０℃）の両方で切断したことを除いて、実施例１に述べたのと同様である。
材料：
開始リンカー１（ｓ）：
【０２４４】
【数４６】
2004512807.tif 000052
【０２４５】
開始リンカー１（ａｓ）：
【０２４６】
【数４７】
2004512807.tif 000053
【０２４７】
開始リンカー２（ｓ）：
【０２４８】
【数４８】
2004512807.tif 000054
【０２４９】
開始リンカー２（ａｓ）：
【０２５０】
【数４９】
2004512807.tif 000055
【０２５１】
伸長リンカー（ｓ）：
【０２５２】
【数５０】
2004512807.tif 000056
【０２５３】
伸長リンカー（ａｓ）：
【０２５４】
【数５１】
2004512807.tif 000057
【０２５５】
標識したリンカー２（ｓ）：
【０２５６】
【数５２】
2004512807.tif 000058
【０２５７】
標識したリンカー２（ａｓ）：
【０２５８】
【数５３】
2004512807.tif 000059
【０２５９】
終結リンカー１（ｓ）：
【０２６０】
【数５４】
2004512807.tif 000060
【０２６１】
終結リンカー１／２（ａｓ）：
【０２６２】
【数５５】
2004512807.tif 000061
【０２６３】
終結リンカー１（短いバージョン）：
【０２６４】
【数５６】
2004512807.tif 000062
【０２６５】
終結リンカー２（ｓ）：
【０２６６】
【数５７】
2004512807.tif 000063
【０２６７】
終結リンカー２（短いバージョン）：
【０２６８】
【数５８】
2004512807.tif 000064
【０２６９】
トリミング反応の効率は、以下のようにして評価することができる。γ−３２Ｐ標識アダプターを有する突出６）を用意する。その後、トリミング反応を、突出１）から開始させる。規則的な時間間隔でアリコートを採取し、次いでＤＮＡフラグメントの大きさの分布をゲル上で分析する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明の方法をどのように使用して、ベクター内にインサートを導入することができるかを示す概略図である。インサートは第１核酸分子から切断され、アダプターと会合しそれに連結されて、次いでベクター内に連結される。
【図２】
異なる突出を有する８個の「０」および「１」出発フラグメントを使用する、フラグメント鎖の生成を示す図である。
【図３】
６４個のフラグメント鎖の生成を示す図である。それぞれ８個のフラグメントを含む８個の鎖が生成され、鎖１と２、２と３等々の末端は相補的であり、したがってそれらを１つに連結させることができる。
【図４】
それぞれの位置に関して整列されたフラグメントのライブラリーからの「０」、「１」フラグメントを混合する３つの技術を示す図である。Ａ）適切なウエルからの吸引によって適切なフラグメントを選択し、Ｂ）ライブラリーウエルから適切なフラグメントが放出され、Ｃ）フローサイトメーターを使用して適切な小滴を混合チャンバに向ける。
【図５】
ＳＰ６およびＴ７プライマーを使用して、シグナル鎖１−０−１−０−０のＰＣＲ増幅を示す図である。レーン１：１キロベースのＤＮＡ梯子（）（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）１マイクログラム、レーン２：ＳＰ６およびＴ７プライマーを使用してＰＣＲで増幅したフラグメント鎖ＤＮＡ１０マイクロリットル、レーン３：ＳＰ６およびＴ７−Ｃｙ５プライマーを使用した以外はレーン２と同じ。
【図６】
フラグメント鎖を１つに結合するため、増幅過程の間にプライマー対の使用を示す図である。
【図１】
2004512807.tif 000065
【図２】
2004512807.tif 000066
【図３】
2004512807.tif 000067
【図４】
2004512807.tif 000068
【図５】
2004512807.tif 000069
【図６】
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【国際公開パンフレット】
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2004512807.tif 000162
2004512807.tif 000163
2004512807.tif 000164
2004512807.tif 000165
【国際調査報告】
2004512807.tif 000166
2004512807.tif 000167
2004512807.tif 000168
2004512807.tif 000169
2004512807.tif 000170