(57)【要約】本発明の新規化合物は、一般構造式Ｉａ−ｄを有する。本発明の化合物は、８量体、７量体、６量体および５量体ペプチドであって、以下のアミノ酸配列を有するものに関し、そして「式Ｉａ−ｄ」【化１】2004516301.tif 000019またはその薬学的に許容される塩またはエステルを有するとして集合的に言及しこれらは、転写因子Ｅ２Ｆ−１のサイクリンＡへの相互作用を阻害する。Ｅ２Ｆ−１／サイクリンＡ相互作用のアンタゴニストとして、本発明の化合物を癌の処置で使用し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般構造式Ｉａ、Ｉｂ、ＩｃおよびＩｄから選択されるアミノ酸配列を含む単離ペプチドであって、
【表１】
2004516301.tif 000018
ここで
ＡＡ１は、
（ａ） Ｇｌｙ、
（ｂ） Ａｌａ、
（ｃ） Ｌｅｕ、および
（ｄ） 小脂肪族アミノ酸
から選択され、
ＡＡ２は、
（ａ） Ｐｈｅ、
（ｂ） Ｔｈａ、
（ｃ） Ｃｈａ、
（ｄ） Ｔｙｒ、
（ｅ） Ｐｙａ、
（ｆ） Ｔｒｐ、および
（ｇ） 他の芳香族アミノ酸
から選択され、
ＡＡ３は、
（ａ） Ｌｅｕ、
（ｂ） Ｃｐａ、および
（ｃ） 天然または非天然脂肪族アミノ酸
から選択され、
ＡＡ４は、
（ａ） Ｌｙｓ、
（ｂ） Ｃ１Ｃ１７アルキル、Ｃ５Ｃ２０アリールアルキルまたはＣ６Ｃ２０アリールラジカルによって置換されたＬｙｓ、
（ｃ） 所望によりＣ１Ｃ１７アルキル、Ｃ５Ｃ２０アリールアルキルまたはＣ６Ｃ２０アリールラジカルによって置換されたＯｒｎ、および
（ｄ） 所望によりＣ１Ｃ１７アルキル、Ｃ５Ｃ２０アリールアルキルまたはＣ６Ｃ２０アリールによって置換されたｈＬｙｓ
から選択され、
ＡＡ５は、
（ａ） Ａｒｇ、
（ｂ） Ｌｙｓ、
（ｃ） Ｏｒｎ、
（ｄ） ｈＬｙｓ、および
（ｅ） Ｈｉｓ
から選択され、
ＡＡ６は、
（ａ） Ｌｙｓ、
（ｂ） ｈＬｙｓ、
（ｃ） Ｏｒｎ、
（ｄ） Ｌｙｓ、ここでＮεはＣ５Ｃ２０アルキル、直線形または分枝Ｃ１Ｃ６アシル基、環形成飽和または不飽和Ｃ５Ｃ２０アルキル、Ｃ５Ｃ２０アリールアルキルおよびＣ６Ｃ２０アリールラジカルから選択される１または２ラジカルによって置換され、および
（ｅ） Ｏｒｎ、ここでＮδはＣ５Ｃ２０アルキル、直線形または分枝Ｃ１Ｃ６アシル基、環形成飽和または不飽和Ｃ５Ｃ２０アルキル、Ｃ５Ｃ２０アリールアルキルおよびＣ６Ｃ２０アリールラジカルから選択される１または２ラジカルによって置換されるもの
から選択され、
ＡＡ７は、
（ａ） Ａｌａ、
（ｂ） Ｖａｌ、および
（ｃ） 天然または非天然アミノ酸、またはその類似体（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）または等電子体（ｉｓｏｓｔｅｒｅ）、
から選択され、
ＡＡ８は、
（ａ） Ｐｒｏ、
（ｂ） 天然または非天然アミノ酸、またはその類似体または等電子体（ｉｓｏｓｔｅｒｅ）
から選択され、
該キャップは存在しないか、または
（ａ） Ｃ１Ｃ８アシル、および
（ｂ） Ｃ３Ｃ８シクロアルキルアルカノイルまたはフラニルアセチル
から選択されるペプチド、
および薬学的に許容されるその塩であって、
そのようなペプチドは所望により、核局在化ペプチド配列ＨＩＶ−１ ＴａｔまたはＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａペプチド配列（ペネトラチン，ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）に連結され、
そして該（＊）記号は、アミド、置換アミド結合またはその等電子体を介する任意的な分子内連結のための部位を示し、得られる化合物は、それぞれ環状５量体、６量体、７量体、または８量体である、単離ペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
【請求項２】
請求項１の単離ペプチドであって、
ＡＡ１は、
（ａ） Ｇｌｙ、
（ｂ） Ａｌａ、および
（ｃ） Ｌｅｕ
から選択され、
ＡＡ２は、
（ａ） Ｐｈｅ、
（ｂ） Ｔｈａ、
（ｃ） Ｃｈａ、
（ｄ） Ｔｙｒ、
（ｅ） Ｐｙａ、および
（ｆ） Ｔｒｐ
から選択され、
ＡＡ３は、
（ａ） Ｌｅｕ、
（ｂ） Ｃｐａ、および
（ｃ） 天然脂肪族アミノ酸
から選択され
ＡＡ４は、
（ａ） Ｌｙｓ、
（ｂ） Ｏｒｎ、および
（ｃ） ｈＬｙｓ
から選択され、
ＡＡ５は、
（ａ）Ａｒｇ、
（ｂ） Ｌｙｓ、
（ｃ） Ｏｒｎ、
（ｄ） ｈＬｙｓ、および
（ｅ） Ｈｉｓ
から選択され、
ＡＡ６は、
（ａ） Ｌｙｓ、
（ｂ） ｈＬｙｓ、
（ｃ） Ｏｒｎ
から選択され、
ＡＡ７は、
（ａ） Ａｌａ、
（ｂ） Ｖａｌ、および
（ｃ） 天然アミノ酸
から選択され、
ＡＡ８は、
（ａ） Ｐｒｏ、
（ｂ） 天然アミノ酸および
該キャップは存在しないか、または
（ａ）アセチル（Ａｃ）、シクロプロピルカルボニル、シクロプロピルアセチル（Ｃｐｒ）、ピバロイルイソプロピルカルボニル、イソプロピルアセチル、２，２−ジメチルブタノイル（Ｄｍｂ）、レブリノイル、シクロプロピルグリシノイル （Ｃｐｇ）、ジメチルグリシノイル（Ｄｍｇ）、および
（ｂ）シクロペンチルアセチル、シクロヘキシルアセチル、シクロヘプチルアセチル、フラニルアセチル
から選択される、単離ペプチドおよび薬学的に許容されるその塩であって、
そのようなペプチドは所望により、核局在化ペプチド配列ＨＩＶ−１ ＴａｔまたはＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａペプチド配列（ペネトラチン）に連結され、
そして該（＊）記号は、アミド、置換アミド結合またはその等電子体を介する任意的な分枝内連結のための部位を示し、得られた化合物は、それぞれ環状５量体、６量体、７量体、または８量体である、単離ペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
【請求項３】
請求項１または２の単離ペプチドであって、
環状５量体である、
Ａｃ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、または
Ａｃ−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）
環状６量体である、
Ａｃ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、
Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、
Ｃｐｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、
Ｃｐｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、
Ｃｐｒ−Ｌｙｓ−（Ｃ５−Ｃ２０）−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、
Ｃｐｒ−Ｌｙｓ−（Ｃ５−Ｃ２０）−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、
Ｃｐｒ−Ｌｙｓ−（ＣＨ（ＣＨ３）（Ｃ１３Ｈ２７））−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、
Ｄｍｂ− Ｌｙｓ−（Ｃ５−Ｃ２０）−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、または
Ｄｍｂ− Ｌｙｓ−（Ｃ５−Ｃ２０）−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）；
環状７量体である、
Ａｃ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、
Ａｃ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、
Ｃｐｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、または
Ｃｐｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）；
または
環状８量体である、
Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、
Ａｃ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、
Ａｃ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、
Ｃｐｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、または
Ｃｐｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）；
を含み、ここでカッコは、環形成残基を示す、単離ペプチド、
またはその薬学的に許容される塩。
【請求項４】
哺乳動物の治療的処置の方法における使用のための、請求項１ないし３のいずれかのペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
請求項１ないし３のいずれかのペプチドまたはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体を一緒に含む、医薬組成物。
【請求項６】
治療的有効量の、請求項１ないし３にずれかに記載のペプチド、またはその薬学的に共用される塩を、薬学的に許容される担体と一緒に含む、哺乳動物の癌の処置のための医薬組成物。
【請求項７】
癌の処置における使用のための医薬組成物の製造のための、請求項１ないし３のいずれかのペプチドまたはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項８】
癌の処置における、請求項１ないし３のいずれかのペプチドまたは薬学的に許容されるその塩の使用。
【請求項９】
癌の処置の方法であって、そのような処置の必要な哺乳動物に、治療的有効量の、請求項１ないし３のいずれかに記載のペプチドまたは薬学的に許容される塩を投与することを含む方法。
【請求項１０】
Ｅ２Ｆ−１細胞調節タンパク質の、サイクリンＡへの結合を阻害する方法であって、そのような処置の必要な哺乳動物に、治療的有効量の、請求項１ないし３のいずれかのペプチドまたはその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、概括的には、Ｅ２Ｆ−１細胞調節タンパク質の、サイクリンＡへの結合を阻害する新規ペプチド化合物に関する。本発明は、新規化合物、新規組成物、これらの使用の方法、およびこれらの製造の方法を提供し、ここでそのような化合物は、概括的には、作用の機構がＥ２Ｆ−１／サイクリンＡ相互作用の阻害に依存する治療物質として薬理学的に有用であり、そして特に、癌の処置のための治療で有用である。
【０００２】
発明の背景
最近の研究は、特にＧ１／Ｓ相転移中の、細胞成長の調節に対するＥ２Ｆ−１転写活性についての重要な役割を実証した。Ｒｂファミリーのメンバーのタンパク質は（その機能は、Ｇ１サイクリン依存性キナーゼ（ｃｄｋｓ）によって調節される）、Ｅ２Ｆファミリーのメンバーの活性を制御する。この制御経路の種々の要素の崩壊は、ヒト癌の発生の間の通常の事象である。
【０００３】
哺乳動物細胞周期を通して、進行は、ｃｄｋｓの秩序ある活性化によって駆動される。Ｃｄｋ活性は、翻訳後修飾を介して、および調節タンパク質、例えばサイクリンとの相互作用によってさらに調節される。それぞれのサイクリンは、ｃｄｋｓの好ましいサブセットに結合し、そして得られるサイクリン−ｃｄｋ複合体は典型的には、細胞周期中のある定義された期間についてのピークのキナーゼ活性を示す。
【０００４】
癌を処置するあるアプローチであって、宿主毒性を最小化するものは、細胞周期経路が変化する、細胞を優先的に殺す薬物を開発することである。インビトロキナーゼ結合阻害アッセイおよびインビボ成長抑制アッセイの使用は、癌を処置するときに有用であり、またはさらに使用して、更なる新規ペプチド性および非ペプチド性阻害剤の設計のためのスキャフォルドを提供することのできる化合物を同定できる。
【０００５】
細胞増殖におけるその役割に加えて、いくつかの最近の観察は、Ｅ２Ｆ−１がアポトーシス（プログラムされた細胞死）に関係する可能性を示唆する。特に、Ｅ２Ｆ−１  ＤＮＡ結合活性の、サイクリンＡ／ｃｄｋ２による抑制は、秩序あるＳ相進行にリンクし、このリンクの崩壊は、Ｓ相遅延および細胞周期停止、次いでアポトーシスにつながる。こうして、Ｅ２Ｆ−１／サイクリンＡ／ｃｄｋｓ複合体の崩壊は、抗癌薬物の開発のための魅力的標的を示す。
【０００６】
あるＥＬＩＳＡが、Ｅ２Ｆ−１／サイクリンＡ相互作用のアンタゴニストを同定するために開発された。この方法は、３種のタンパク質である、Ｅ２Ｆ−１、サイクリンＡおよびｃｄｋ２の間の相互作用に基づき、そして発色化学的に分析される。このアッセイを使用し、生物学的実験に使用される種々の合成ペプチドのためのおよびＳＡＲ研究のためのＩＣ５０値を決定した。
【０００７】
これらの合成ペプチドを調査手段としてまたは新しいコンジュゲート性（キメラ）ペプチドまたはさらなる修飾ペプチドを作成するための中間体として使用し、細胞周期調節をさらに調査し、そして細胞成長阻害アッセイにおいて実験すことができる。細胞成長阻害および形質転換セルラインにおける細胞死を引き起こすペプチドを、腫瘍が該化合物に応答する患者での癌治療のために使用し、そして癌患者のための治療的養生法において使用できる。
【０００８】
発明の要約
本発明の化合物は、一般構造式Ｉａ、Ｉｂ、ＩｃおよびＩｄから選択されるアミノ酸配列を含むペプチド
【表２】
2004516301.tif 000002
またはその薬学的に許容される塩であって、転写因子Ｅ２Ｆ−１の、サイクリンＡへの相互作用を阻害するものである。Ｅ２Ｆ−１／サイクリンＡ相互作用のアンタゴニストとしえ、本発明の化合物を癌の処置において使用し得る。前例は、Ｅ２Ｆ−１／サイクリンＡ総合作用の、環状ペプチドまたは非ペプチドによる阻害についての文献中にない。
【０００９】
したがって、Ｅ２Ｆ−１／サイクリンＡ相互作用を阻害する化合物を提供することが、本発明の目的である。式Ｉａ−ｄの化合物を、癌の処置のために使用する方法を提供することも本発明の追加的目的である。式Ｉａ−ｄの化合物についての医薬組成物を提供することも更なる本発明の目的である。式Ｉａ−ｄの化合物を使用するＥ２Ｆ−１／サイクリンＡ相互作用のインビトロ阻害のための方法を提供することは、本発明のなおさらなる目的である。
【００１０】
発明の詳細な記載
本発明は、一般構造式Ｉａ、Ｉｂ、ＩｃおよびＩｄから選択されるアミノ酸を含む単離ペプチドに関し、
【表３】
2004516301.tif 000003
ここで、ＡＡ１は、
（ａ）グリシン（Ｇｌｙ）、
（ｂ）アラニン（Ａｌａ）、
（ｃ）ロイシン（Ｌｅｕ）および
（ｄ）小脂肪族アミノ酸
から選択され、
【００１１】
ＡＡ２は、
（ａ）フェニルアラニン（Ｐｈｅ）
（ｂ）チエニルアラニン（Ｔｈａ）
（ｃ）シクロフェキシルアラニン（Ｃｈａ）
（ｄ）チロシン（Ｔｙｒ）
（ｅ）ピリジルアラニン（Ｐｙａ）
（ｆ）トリプトファン（Ｔｒｐ）および
（ｇ）さらなる芳香族アミノ酸
から選択され、
【００１２】
ＡＡ３は、
（ａ）Ｌｅｕ
（ｂ）シクロプロピルアラニン（Ｃｐａ）、および
（ｃ）天然または非天然脂肪族アミノ酸
から選択され、
【００１３】
ＡＡ４は、
（ａ）リジン（Ｌｙｓ）
（ｂ）Ｃ１−Ｃ１７アルキル、Ｃ５−Ｃ１７−アリールアルキルまたはＣ６−Ｃ２０アリールラジカルによって置換されるＬｙｓ
（ｃ）所望によってＣ１−Ｃ１７−アルキル、Ｃ５−Ｃ２０アリールアルキルまたはＣ６−Ｃ２０アリールラジカルによって置換されてもよいオルニチン（Ｏｒｎ）、
（ｄ）所望によってＣ１−Ｃ１７−アルキル、Ｃ５−Ｃ２０アリールアルキルイルまたはＣ６−Ｃ２０アリールラジカルによって置換されてもよいホモリジン（ｈＬｙｓ）
から選択され、
【００１４】
ＡＡ５は、
（ａ）アルギニン（Ａｒｇ）
（ｂ）Ｌｙｓ、
（ｃ）Ｏｒｎ
（ｄ）ｈＬｙｓ、および
（ｅ）ヒスチジン（Ｈｉｓ）
から選択され
【００１５】
ＡＡ６は、
（ａ）Ｌｙｓ
（ｂ）ｈＬｙｓ、
（ｃ）Ｏｒｎ
（ｄ）Ｌｙｓ、ここでＮεは、Ｃ５−Ｃ２０−アルキル、直直線形または分枝Ｃ１−Ｃ６アシル基、環形成飽和または不飽和Ｃ５−Ｃ２０−アルキル、Ｃ５−Ｃ２０アリールアルキル、例えばベンジル、およびＣ６−Ｃ２０アリールラジカル、例えばフェニルから選択される１または２ラジカルによって置換され、
および
（ｅ）Ｏｒｎ、ここでＮδは、Ｃ５−Ｃ２０−アルキル、直線形または分枝Ｃ１−Ｃ６アシル基、環形成飽和または不飽和Ｃ５−Ｃ２０−アルキル、Ｃ５−Ｃ２０アリールアルキル、例えばベンジル、およびＣ６−Ｃ２０アリールラジカル、例えばフェニルから選択される１または２ラジカルによって置換されるもの、
から選択され、
【００１６】
ＡＡ７は、
（ａ）Ａｌａ
（ｂ）バリン（Ｖａｌ）
（ｃ）天然または非天然アミノ酸、またはその類似体（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）または等電子体（ｉｓｏｓｔｅｒｅ）、
から選択され
【００１７】
ＡＡ８は、
（ａ）プロリン（Ｐｒｏ）
（ｂ）天然または非天然アミノ酸、またはその類似体または等電子体
から選択され、そして
該キャップは、存在しないかまたは好ましくは
（ａ）Ｃ１−Ｃ８アリル、および
（ｂ）Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルアルカノイルまたはフラニルアセチル
から選択されるがこれらに限定されず、
【００１８】
およびその薬学的に許容される塩、そのようなペプチドは、好ましくは、核局在化ペプチド配列、たとえば限定されないがＨＩＶ−１  ＴａｔまたはＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａペプチド配列（ペネトラチン，ｐｅｎｅｔｒａｔｏｉｎ）に連結される。該（＊）記号は、分子内連結のための部位を示す。分子内連結は、アミド、置換アミド結合またはその等電子体（ｉｓｏｓｔｅｒｅ）を介する。任意の前記ペプチドが、星を付した（＊）アミノ酸を介して連結するとき、該化合物は環状５量体、６量体、７量体、または８量体である。該環状多量体は、直線形多量体を超えて好ましい。これらのペプチドはまた、ポリアミノ酸フラグメントであることができ、これらは望まれるように他のアミノ酸に接続される。同じ態様では、それぞれのペプチド配列のＮ−末端は、「キャップ」基によってキャップされることができる。任意のアミノ酸は、それらの類似体、等電子体または類似体によって置換できる。
【００１９】
好ましくは、本発明は、一般構造式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、およびＩｄ
【表４】
2004516301.tif 000004
から選択されるアミノ酸配列を含む単離ペプチドに関し
ここで、
ＡＡ１は、
（ａ）Ｇｌｙ、
（ｂ）Ａｌａおよび
（ｃ）Ｌｅｕ
から選択され、
ＡＡ２は、
（ａ）Ｐｈｅ
（ｂ）Ｔｈａ
（ｃ）Ｃｈａ
（ｄ）Ｔｙｒ
（ｅ）Ｐｙａ、および
（ｆ）Ｔｒｐ
から選択され、
【００２０】
ＡＡ３は、
（ａ）Ｌｅｕ
（ｂ）Ｃｐａ、および
（ｃ）天然脂肪族アミノ酸
から選択され、
ＡＡ４は、
（ａ）Ｌｙｓ
（ｂ）Ｏｒｎ、および
（ｃ）ｈＬｙｓ
から選択され、
ＡＡ５は、
（ａ）Ａｒｇ
（ｂ）Ｌｙｓ
（ｃ）Ｏｒｎ
（ｄ）ｈＬｙｓ、および
（ｅ）Ｈｉｓ
から選択され、
【００２１】
ＡＡ６は
（ａ）Ｌｙｓ
（ｂ）ｈＬｙｓ
（ｃ）Ｏｒｎ
から選択され、
ＡＡ７は、
（ａ）Ａｌａ
（ｂ）Ｖａｌ、および
（ｃ）天然アミノ酸
から選択され、
【００２２】
ＡＡ８は
（ａ）Ｐｒｏ
（ｂ）天然アミノ酸、
から選択され、そして
該キャップは、存在しないか、または好ましくは
（ａ）アセチル（Ａｃ）、シクロプロピルカルボニル、シクロプロピルアセチル（Ｃｐｒ）、ピバロイル、イソプロピルカルボニル、イソプロピルアセチル、２，２−ジメチルブタノイル（Ｄｍｂ）、レブリノイル、シクロプロピグリシノイル（Ｃｐｇ）、ジメチルフリシノイル（Ｄｍｇ）、および
（ｂ）シクロペンチルアセチル、シクロヘキシルアセチル、シクロヘプチルアセチル、フラニルアセチル
から選択される単離ペプチド
および、その薬学的に許容されるその塩である。
【００２３】
そのようなペプチドは、所望により、核内局在化ペプチド配列ＨＩＶ−１  ＴａｔまたはＡｎｅｎｎａｐｅｄｉａペプチド配列（ペネトラチン）に連結されても良く、
そして（＊）記号は、アミド結合を介する所望の分子内連結のための部位を示す。
得られる化合物はそれぞれ環状５量体、６量体、７量体、または８量体である。
【００２４】
好ましい化合物の例は、以下を含むがこれらに限定されない。
環状５量体：
Ａｃ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、または
Ａｃ−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）；
環状６量体：
Ａｃ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、
Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、
Ｃｐｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、
Ｃｐｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、
Ｃｐｒ−Ｌｙｓ−（Ｃ５−Ｃ２０）−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、
Ｃｐｒ−Ｌｙｓ−（Ｃ５−Ｃ２０）−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、
Ｃｐｒ−Ｌｙｓ−（ＣＨ（ＣＨ３）（Ｃ１３Ｈ２７））−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、［実施例１参照］
Ｄｍｂ−Ｌｙｓ−（Ｃ５−Ｃ２０）−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、または
Ｄｍｂ−Ｌｙｓ−（Ｃ５−Ｃ２０）−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）；
環状７量体：
Ａｃ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、
Ａｃ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、
Ｃｐｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、または
Ｃｐｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）；
環状８量体：
Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、［実施例２参照］
Ａｃ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、
Ａｃ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、
Ｃｐｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、または
Ｃｐｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）；
ここでカッコは、環形成に関係する残基を示し、
そして薬学的に許容されるその塩を含むがこれらに限定されない。
【００２５】
本発明の化合物は、一般形式のオクタペプチドを引用して命名する。
キャップ−ＡＡ８−ＡＡ７−ＡＡ６−ＡＡ５−ＡＡ４−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１
ここで、「ＡＡＸ」は、Ｃ末端のＡＡ１から開始するオクタペプチドの「ｘｔｈ」（ｘ＝１−８）位置のアミノ酸を示す。該「キャップ」は、Ｎ末端に付着される非アミノ酸基である。ＡＡ１は、カルボキシル末端残基である。名称は、一般形式で与える。アミノ末端「キャップ」次いで３文字コードの第一残基、次いでハイフンおよび３文字コードの第二残基、次いでハイフンおよび３文字コードの第三残基、および以下同様（３文字コードは、標準的ペプチド命名法であり、Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２６０， １４−４２ およびＩＵＰＳＣ−ＩＵＢ Ｎｏｒｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ参照）。非天然アミノ酸は、受け入れられた命名法によって言及する。
【００２６】
用語「ペプチド」は、ここで使用するように、また適当な場合にポリペプチドを含むことが理解される。
ここで使用するように「アルキル」は、分枝および直鎖飽和または不飽和脂肪族炭化水素基であって、特定数の炭素原子を有するものを含むことを意図する。「アシル」は、−Ｃ（Ｏ）−架橋を介して付着された特定数の炭素原子を有するアルキル基を表す。
ここで使用するように用語「単離」は、材料が、その本来の環境、例えば、もしそれが天然存在ならば天然環境から除去されていることを意図する。
【００２７】
本発明の化合物は、配列：Ａｃ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙの直線形または環状類似体（ａｎａｌｏｇｕｅｓ）である。該直線形配列は、Ｅ２Ｆ−１のサイクリンＡへの結合を有効に阻害する、サイクリンＡへ結合するいくつかの細胞周期調節タンパク質のコンセンサス配列である。望まれるレベルの阻害活性を提供するある数の化合物を、同定した。
【００２８】
最初に同定した配列を表Ｉに示す。
表Ｉ：最初に同定された配列
【表５】
2004516301.tif 000005
【００２９】
３つの、Ｅ２Ｆ−１／サイクリンＡ相互作用の阻害に要する最小ペプチド長を決定し、そして表ＩＩに示す。
表ＩＩ：直線形および環状類似体のＩＣ５０
【表６】
2004516301.tif 000006
【００３０】
ペプチドは、Ｌｙｓ＊の側鎖アミノ基と、Ｇｌｙ＊のカルボキシル基の間で環形成されている。注：配列Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−＊Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ＊は、これ以降、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）として表し、カッコ中の残基は環に関係することを示す広く一般に受け入れられる慣行のとおりである。有効な阻害に必要な最小配列は、５−８残基である。該環状類似体は、対応する直線形類似体より、一般に５０−１００倍良好な阻害である。
【００３１】
Ｅ２Ｆ−１／サイクリンＡ相互作用の阻害に必要な、コンセンサス配列中、重要な残基である、Ｐｒｏ８−Ａｌａ７−Ｌｙｓ６−Ａｒｇ５−Ｌｙｓ４−Ｌｅｕ３−Ｐｈｅ２−Ｇｌｙ１は、Ｌｙｓ６、Ａｒｇ５、Ｌｅｕ３、およびＰｈｅ２である。最適活性ペプチドは、環形成されたコンセンサス配列であり、しかし、Ｐｒｏ８、Ａｌａ７および／またはＬｙｓ６は、他のアミノ酸、その類似体、等電子体または類似体で置換できる。Ｌｙｓ６の場合、それは他のアミノ酸およびチオール、例えばシステイン（Ｃｙｓ）、５−アミノバレリン酸、６−アミノカプロイン酸、およびレブリン酸で置換できる。それはまた、ＮεのあるｈＬｙｓ、Ｏｒｎ、またはＬｙｓ、およびＮδのあるＯｒｎによって置換でき、これらはＣ５−Ｃ２０直線形または分枝直鎖または環形成飽和または不飽和アルキルであり、またはＣ６−Ｃ２０アリールラジカル、たとえばフェニル、Ｃ５−Ｃ２０アリールアルキル、例えばベンジル、またはＡｒｇによって置換できる。Ａｌａ７はＰｒｏ、直線形または分枝アシル基によって置換できる。
【００３２】
Ａｒｇ５の場合に、置換は活性に対し有害であり、しかしペプチドはａｒｇ類似体、等電子体または類似体を受け入れることができる。Ｌｅｕ３は活性のために重要である。Ｐｈｅ２の存在は、また重要であるがしかし、他の類似体、等電子体または類似体、好ましくは芳香族または疎水性基を受け入れることができる。Ｇｌｙ１は環状ペプチドに要求される。
【００３３】
環状８量体である、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）での重要な残基の同定
環状８量体である、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）の個々のアミノ酸の、サイクリンＡヘの結合における役割を評価するために、それぞれのアミノ酸を、等電子体で置換し、そして阻害活性をインビトロＥＬＩＳＡで測定した。
【００３４】
Ａ．フェニルアラニンの置換（Ｐｈｅ，Ｆ）
環状８量体である、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）の幾つかの類似体は、種々のＰｈｅ等電子体を使用して合成し、そしてこれらの活性を決定した。データは、すべての、Ｐｈｅについて使用されたアミノ酸等電子体が、最初に導いた環状８量体である、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）の活性の増加という結果とならなかったことを指摘する。しかし、非天然アミノ酸、例えばＴｈａおよびＣｈａは、環状８量体であるＰｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）の活性の多くの喪失なく、Ｐｈｅを置換できる。
【００３５】
Ｂ．ロイシン（Ｌｅｕ，Ｌ）の置換
環状８量体である、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）のいくつかの類似体を、種々のロイシン等電子体を使用して合成し、これらの活性を決定した。結果は、すべての、Ｌｅｕを置換するために使用したアミノ酸等電子体が、最初に導いた２の活性の増加という結果とならなかったことを示す。しかし、非天然アミノ酸、例えばＣｐａは、活性の喪失なく、Ｌｅｕを置換できる。
【００３６】
Ｃ．阻害に要する最小配列の同定
環状ペプチドを、環状８量体ペプチドである、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）のＮ末端から逐次的除去、次いでアセチル基でキャップすることによって合成し、そしてこれらのペプチドを、インビトロＥＬＩＳＡでのそれらの阻害活性について分析した（表ＩＩＩ）。Ｅ２Ｆ−１／サイクリンＡ相互作用に必要な絶対最小配列は、環状６量体、４である。
表ＩＩＩ：種々のペプチドのＩＣ５０
【表７】
2004516301.tif 000007
【００３７】
４のアセチル基は、いくつかの他のアシル基によって置換し、そしてそれぞれの類似体の活性を、ＥＬＩＳＡで測定した。アセチル基のイソプロピルカルボニル、イソプロピルアセチル、ピバロイルおよびシクロプロピルカルボニル、シクロプロピルアセチル基での置換は、環状８量体である、Ｐｒｏ−ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）に均等な６量体類似体を提供した。二次的疎水性ポケット残基の操作は、阻害活性を喪失することなく、環状８量体である、Ｐｒｏ−Ａｌａ−ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）からの２アミノ酸の除去を可能とする。
【００３８】
本発明の化合物を、タンパク質合成の標準的方法を使用してそれらの構成アミノ酸から製造し得る。例えばＳｃｈｒｏｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， ”Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”， Ｖｏｌ． Ｉ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９６５， または Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ｅｔ ａｌ．， ”Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”， Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ １９６６， または ＭｃＯｍｉｅ （ｅｄ．）， ”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９７３， およびＧｅｏｒｇｅ Ｂａｒａｎｙ ａｎｄ Ｒ． Ｂ． Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄによる”Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｂｉｏｌｏｇｙ” ２， Ｃｈａｐｔｅｒ Ｉ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８０， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。
【００３９】
２アミノ酸、またはアミノ酸およびペプチド、または２ペプチドの濃縮は、通常の濃縮方法、例えば、アジド法、混合酸無水物法、カルボジイミド法、活性エステル法（ｐ−ニトロフェニルエステル法、ＢＯＰ［ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−フォスフォニウムヘキサフルオロフォスフェート］法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル法など）、Ｗｏｏｄｗａｒｄ試薬Ｋ法、またはＨＢＴＵ法にしたがって実施できる。固相法でのペプチド鎖の伸長の場合には、ペプチドは、不溶性担体に、そのＣ末端アミノ酸で付着する。不溶性担体のために、そのＣ末端アミノ酸のカルボキシル基と反応し、後に容易に切断する結合を構成するもの、例えば、ハロメチル樹脂、例えば、クロロメチル樹脂およびブロモメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、アミノメチル樹脂、ｐ−ヒドロキシメチルフェニルアセトアミド（ＰＡＭ）樹脂、ベンズヒドリルアミン、樹脂、ｔ−アルキルオキシカルボニル−ヒドラジド樹脂、またはサスリン、Ｗａｎｇまたはトリチル樹脂を使用できる。
【００４０】
ペプチドの化学的合成に普通であるのは、種々のアミノ酸部分の反応性側鎖基の、好適な保護基での、鎖が完全に組みたてられた後に該基が最終的に除去されるまでの、その位置での保護である。また普通なのは、アミノ酸またはフラグメント上のアルファアミノ基を、その部分をそのカルボキシル基で反応させつつ保護し、次いでアルファ−アミノ保護基を選択的除去し、その位置で起こるその後の反応を可能とするものである。よって、合成の処理として、ペプチド鎖中の望まれる配列中に位置するアミノ酸残基のそれぞれと、側鎖保護基を有する種々のこれらの残基とを含む化合物を生産することが普通である。これらの保護基を次いで、同時に実質的に一般的に除去し、望まれる得られる生成物を精製に続いて生産する。
【００４１】
アルファおよびオメガ側鎖アミノ基を保護するための適用可能な保護基は、例えば、ベンジルオキシカルボニル、イソニコチニルオキシカルボニル、（ｉＮＯＣ）、ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｔ−アミロキシカルボニル（Ａｏｃ）、イソボルニルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、２（４，４−ビフェニル）−２−プロピルオキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、メチルスルフォニルエトキシカルボニル（Ｍｓｃ）、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル（ＮＰＳ）、ジフェニルフォスフィンチオイル（Ｐｐｔ）、ジメチルフォスフィノチオイル（Ｍｐｔ）等である。
【００４２】
カルボキシル基の保護基として、これらを例示でき例えば、ベンジルエステル（Ｂｚｌ）、ｔ−ブチルシクロエステル（ｔ−Ｂｕ）、４−ピリジルメチルエステル（ＯＰｉｃ）などである。特異的アミノ酸、例えばアミノおよびカルボキシル基以外の官能基を修飾するＡｒｇ、Ｃｙｓ、およびセリン（Ｓｅｒ）を、好適な保護基によって機会が要求するように保護する。例えば、Ａｒｇ中のグアニジノ基を、ニトロ、ｐ−トルエンスルフォニル、ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンゼンスルフォニル、４−メトキシ−２，６−ジメチルベンゼンスルフォニル（Ｍｄｓ）、１，３，５−トリメチルフェニルスルフォニル／ｌ（Ｍｔｓ）、２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルフォニル（ＰＢＦ）、トリチルなどで保護し得る。システイン中のチオール基を、ｐ−メトキシベンジル、トリフェニルメチル、アセチルアミノメチル、エチルカルバモイル、４−メチルベンジル、２，４，６−トリメチルベンジル（Ｔｍｂ）などで保護し得、そしてＳｅｒ中のヒドロキシル基を、ベンジル、ｔ−ブチル、アセチル、テトラヒドロピラニル等で保護できる。
【００４３】
「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＩＩ．（１９８４）中のＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇは、ペプチドを調製するための手法に関する詳細な情報を提供する。アルファアミノ基の保護は、１４−１８頁に記載され、そして側鎖封鎖を、１８−２８頁に記載する。アミン、ヒドロキシルおよびスルフヒドリル官能基の保護基の表は、１４９−１５１頁に提供される。これらの記載はここに引用により含める。
【００４４】
本発明のペプチドはまた、自動ペプチド合成機、例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ， Ａａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．と製造者供給プロトコルを使用して調製し得、またはＭｉｌｌｉｇｅｎ Ｃｏ． Ａｎ Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＡＢＩ ４３３Ａペプチド合成機を標準的Ｆｍｏｃプロトコルを使用して使用した。望まれるアミノ酸誘導体および樹脂を、商業的源から購入した。逆相ＨＰＬＣを、アセトニトリル／０．１％水性ＴＦＡの直線形勾配を使用してＹＭＣ  Ｃ１８カラムに基づく商業的ＨＰＬＣシステムで実施した。溶出を、２１５、２３０、２５４および２８０ｎｍで監視した。精製ペプチドを、質量分析技法によって分析したペプチドを、ＤＭＦ中のフルオレセイン−５−マレイミドおよびＤＩＥＡ（４当量）を使用して、これらのＣｙｓ残基において標識した。
【００４５】
本発明の化合物を、容易に入手可能な出発材料、試薬および慣行的合成手法を使用して、以下の実施例またはその変法にしたがって製造できる。これらの反応では、当業者に自体公知であるがさらに詳細には述べない変形の使用をなすことがまた可能である。
【００４６】
１実施態様では、本発明は、Ｅ２Ｆ−１細胞調節タンパク質の、サイクリンＡへの結合を阻害する方法であって、そのような処置の必要の哺乳動物対象に、治療的有効量の本発明のペプチド、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法を提供する。
【００４７】
本発明のペプチド、およびそれらの対応する薬学的許容塩の、Ｅ２Ｆ−１細胞調節タンパク質のサイクリンＡへの結合を阻害する能力を、これらのタンパク質、Ｅ２Ｆ−１、サイクリンＡおよびｃｄｋ２の間の相互作用に基づくＥＬＩＳＡを使用して実証し得る。このアッセイは、生物学的実験においてまたはＳＡＲ研究のために使用された種々の合成ペプチドについてのＩＣ５０の決定を可能とする。
【００４８】
さらなる実施態様では、本発明は、癌を処置する方法であって、そのような処置の必要な哺乳動物に、治療的有効量の本発明のペプチドまたはその薬学的許容塩を投与することを含む方法を提供する。
【００４９】
本発明はまた、Ｅ２Ｆ−１細胞調節タンパク質の、サイクリンＡへの結合を阻害することにおいて有用である医薬組成物であって、薬学的に許容される担体または希釈剤および本発明のペプチドの治療的有効量、またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を含む。
【００５０】
本発明はさらに、哺乳動物の治療的処置のための方法における使用のための、本発明のペプチド、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【００５１】
さらなる実施態様では、本発明は、本発明のペプチド、またはその薬学的に許容される塩を、薬学的に許容される担体とともに含む医薬組成物を提供する。
【００５２】
なおさらなる実施態様では、本発明は、哺乳動物の癌の処置のための医薬組成物であって、治療的有効量で、本発明のペプチド、またはその薬学的許容塩を、薬学的に許容される担体をともに含む医薬組成物を提供する。
【００５３】
本発明はまた、本発明のペプチド、またはその薬学的に許容される塩の、癌の処置での使用のための、医薬組成物の製造のための使用に関する。
本発明はさらにまた、本発明のペプチド、またはその薬学的に許容される塩の、癌の処置における使用に関する。
【００５４】
本発明の化合物を、その薬学的に許容される塩の形態で投与し得る。用語「薬学的に許容される塩」は、すべての許容される塩、例えば酢酸塩、ラクトビオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、レアレート、重炭酸塩、マレイン酸塩、重硫酸塩、マンデル酸塩、二酒石酸塩、メシレート、ホウ酸塩、臭化物塩、メチル硝酸塩、エデト酸カルシウム、メチル硫酸塩、カムシレート、ムケート、炭酸塩、ナプシル酸塩、塩化物塩、硝酸塩、クラブラン酸塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、クエン酸塩、アンモニウム塩、ジヒドロ塩酸塩、オレイン酸塩、エデト酸塩、シュウ酸塩、エヂシレート、パモ酸塩（エンボン酸塩）、エストレート、パルミチン酸塩、エシレート、パントテン酸塩、フマル酸塩、リン酸／二リン酸塩、グルセプテート、ポリガラクツロン酸塩、グルコン酸塩、サリチル酸塩、グルタミン酸塩、ステアリン酸塩、グリコニルアルサニレート、硫酸塩、ヘキシルレソルシネート、塩基性酢酸塩、ヒドラバミン、コハク酸塩、臭化水素酸塩、タンニン酸塩、塩酸塩、酒石酸塩、ヒドロキシナフトエート、テオクレート、ヨウ化物塩、トシレート、イソチオネート、乳酸塩、パノエート、吉草酸塩などを含むことを意図し、これらは溶解性または加水分解特性を修飾するために投与形態として使用することができ、または持続放出性またはプロドラッグ製剤として使用できる。本発明の化合物の特定の官能性に依存して、本発明の化合物の薬学的に許容される塩は、カチオン、たとえばナトリウム、カリウム、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、亜鉛、および塩基、例えばアンモニア、エチレンジアミン、Ｎ−メチル−グルタミン、リジン、アルギニン、オルニチン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、プロカイン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、ジエチルアミン、ピペラジン、トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン、およびテトラメチルアンモニウム水酸化物から形成されるものを含む。
【００５５】
これらの塩は、標準的手法、例えば遊離酸を、好適な有機または無機塩基と反応させることによって、製造し得る。塩基性基、例えばアミノが存在する場合、酸性塩、すなわち塩酸塩、臭素酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、パモ酸塩等を、投与形態として使用することができる。
【００５６】
また、酸（−ＣＯＯＨ）またはアルコール基が存在する場合には、薬学的に許容されるエステル、例えば、アセテート、マレエート、ピバロイルオキシメチル、などおよび可溶性または加水分解特性を修飾するために、持続性放出のためまたはプロドラッグ製剤のため当業界既知のこれらのエステルを使用できる。
【００５７】
本発明の化合物またはその誘導体は、立体化学が式Ｉａ−ｄに記載されるそれらの中心の他のキラル中心を有し得、そしてしたがって、ラセミ体、ラセミ混合物および個々のエナンチオマーまたはジアステレオマーとして存在し得、すべてのそのような異性体形態、並びにそれらの混合物は本発明の範囲内である。さらに、本発明の化合物の結晶性形態のあるものまたはその誘導体は、多形として存在し得、そしてそれ自体、本発明に含むことを意図する。加えて、本発明の化合物のあるものは、水または普通の有機溶媒と溶媒和物を形成し得る。そのような溶媒和物は本発明の範囲内である。
【００５８】
用語「治療的に有効な量」は、研究者、獣医師、医学博士、または他の臨床医によって求められる、組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を誘起する薬物または薬学的物質の量を意味し、これらは処置される障害の症状の緩和を含む。本発明の処置の新規方法は、当業者に既知の障害についてのものである。
【００５９】
用語「哺乳動物」は、ヒトを含む。
本発明の化合物を利用する投与養生法は、型、種、年齢、体重、性別および患者の医学的状態；処置すべき状態の重度；投与の経路；患者の腎臓および肝臓機能；および使用されるその特定の化合物を含む種々の要因にしたがって選択される。内科医または獣医師の当業者は、該状態の予防、制御または停止に要する有効な量の薬物を決定および処方できる。毒性なく効験をもたらす範囲内の薬物の濃度を達成する最適正確性は、薬物の標的部位への利用性の動力学に基づく養生法を要する。これは、薬物の分布、平衡および排除の考察に関係する。
【００６０】
生成物の１日用量は、１日あたり成体ヒトあたり、０．０１ないし５００ｍｇの範囲にわたり変化し得る。経口投与のために、組成物を好ましくは、処置すべき患者への投与の症状調節のための活性成分の０．０１ないし５００ｍｇ、好ましくは、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、または５０．０ｍｇを含む錠剤の形態で提供する。薬物の有効量は、通常、１日あたり、約０．００１ｍｇ／ｋｇないし約５０ｍｇ／ｋｇの体重の用量レベルで、供する。該範囲は、より特に１日あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇないし１０ｍｇ／ｋｇの体重である。
【００６１】
癌の処置のために、本発明の化合物を、癌を処置するときに有用であると知られる物質と一緒に使用し得る。
活性物質が、分離投与製剤である場合に、１より多い活性物質との組み合わせ処置のために、該活性物質を同時的に投与することができ、またはこれらそれぞれを、別個に定められた時間に投与できる。
本発明の化合物を経口的に、静脈内に、包膜内に、または非経腸に、担体中でまたはシャペロン（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）担体に連結して送達でき、体の標的部位への送達を実施できる。
【００６２】
本発明はまた、本発明の処置の新規方法における使用のための好適な経口、全身、および非経腸医薬組成物を提供する目的を有する。用語「処置」は、癌に罹患すると知られまたは信じられる個体における癌の症状を緩和および／または進行の停止を含むことを意図する。化合物「の投与」または「を投与する」なる用語は、本発明の化合物または発明の化合物のプロドラッグを、処置の必要な個体へ提供することを意図すると理解されるものとする。本発明の化合物を、前記状態の処置での使用のための活性成分として含む組成物は、全身投与のための慣行の媒体中で広範囲の治療的投与形態において投与できる。例えば、化合物を、錠剤、カプセル（それぞれ設定された時の放出および持続的放出製剤を含む）、丸薬、粉末、顆粒、エリクシル、チンキ、溶液、懸濁、シロップ、および乳化液のような経口投与形態でまたは注射によって投与することができる。同様に、これらはまた閉塞を有するまたは有しない、静脈内（ボーラスおよび点滴）、腹膜内、包膜内、局所、または筋肉内形態、製薬学の当業者に周知のすべての使用形態で投与し得る。
【００６３】
本発明の方法において、ここで詳細に記載の化合物は、活性成分を形成することができ、そして典型的には、好適な薬学的希釈剤または賦形剤であって意図される投与形態について好適に選択されるものと混合して投与し、すなわち、経口錠剤、カプセル、エリクシル、シロップなどおよび慣行薬学的実務と両立するものである。
【００６４】
例えば、錠剤またはカプセルの形態で経口投与のため、活性薬物成分を、経口、非毒性薬学的に許容される不活性担体、例えばエタノール、グリセロール、水等と組み合わせることができる。さらに、望まれまたは必要なときに、好適な結合剤、滑沢剤、崩壊剤および着色料をまた、混合物に包含できる。好適な結合剤は、限定しないが、デンプン、ゼラチン、天然糖、例えばグルコースまたはβラクトース、コーン甘味料、天然および合成ガム、例えばアカシア、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセロース、ポリエチレングリコール、ワックス等を含む。これらの投与形態で使用される滑沢剤は、限定しないが、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどを含む。崩壊剤は、限定しないが、デンプン、メチルセルロース、アガー、ベントナイト、キサンタンガムなどを含む。
【００６５】
液体は、好適に香味付与された懸濁または分散剤、例えば合成または天然ガム、例えばトラガカント、アカシア、メチルセルロースなど中で形成する。使用され得る他の分散剤は、グリセリン等を含む。非経腸投与のために、滅菌懸濁および溶液剤が望ましい。一般に好適な保存料を含む等張調製品は、静脈内投与が望まれるときに使用する。
【００６６】
本発明の化合物はまた、リポソーム送達システムの形態、例えば小ユニラメラベシクル、大ユニラメラベシクルおよびマルチラメラベシクルの形態で投与できる。リポソームを、種々のリン脂質、例えばコレステロール、ステアリルアミン、またはホスファチジルコリンから形成できる。
【００６７】
本発明の化合物を、薬物の制御された放出を達成することにおいて有用なあるクラスの生物分解可能ポリマー、例えばポリ乳酸、ポリエプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリヒドロピレン、ポリシアノアクリレート、およびハイドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマーと結合し得る。
【００６８】
全般的方法
すべての温度は、以下の実施例において、セッ氏度で与える。示す場合を除き、商業的に入手可能な化合物を、さらなる精製なくして使用した、注記しない場合、天然または非天然アミノ酸は、Ｌ配置のものである。
【００６９】
ペプチド合成
ペプチドを、標準的Ｈｍｏｃプロトコルを使用するＡｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＢＩ ４３３Ａペプチド合成機において組みたてる。アミノ酸誘導体および樹脂を、Ｂａｃｈｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ およびＭｉｄｗｅｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入する。逆相ＨＰＬＣを、アセトニトリル／０．１％水性ＴＦＡの直線形勾配を使用するＹＭＣ  Ｃ１８カラムにおけるＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣシステムで実施する。溶出を、２１５、２３０、２５４および２８０ｎｍで監視する。精製されたペプチドを、質量分析（ＳＣＩＥＸ  ＡＰＩ  ＩＩＩ質量分析器）によって分析する。
【００７０】
使用した、実施例の全般に受け入れられる省略形を、表ＩＶおよびＶに示す。
表ＩＶ：本文に使用した省略形
【表８】
2004516301.tif 000008
【表９】
2004516301.tif 000009
【表１０】
2004516301.tif 000010
【表１１】
2004516301.tif 000011
【００７１】
表Ｖ：普遍的単一アミノ酸コード
【表１２】
2004516301.tif 000012
【表１３】
2004516301.tif 000013
【００７２】
生物学的アッセイ
特異的ペプチドによって腫瘍細胞中の成長阻害を決定するための材料および方法
セルライン（表ＶＩ）。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、Ｕ２ＯＳ、Ａ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１０％  ＦＣＳで補足したＤＭＥＭで維持した。ＳＷ４８０およびＨＣＴ−１１６を、１０％  ＦＣＳで補足したＲＰＭＩ１６４０中で成長させた。
【００７３】
表ＶＩ：アッセイに使用したヒトセルライン
【表１４】
2004516301.tif 000014
＊すべてのセルラインは、アメリカンタイプカルチャーコレクション、ロックビル、ＭＤから獲得した。
【００７４】
ペプチド処理および蛍光顕微鏡
４ｘ１０４細胞／ウェルを、１０％ＦＣＳで４８ウェルプレートに配置し、そして終夜培養した。培養培地を廃棄し、そして細胞を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭで１回洗浄した。細胞モノレイヤーを３７℃で種々の濃度のペプチド溶液と、２４時間インキュベートした。フルオレセイン標識ペプチドを検出するため、細胞を１回ＰＢＳ（ｐＨ＝７．３）ですすぎ、そして蛍光顕微鏡（３２０倍のＡｘｉｏｖｅｒｔ １３５）を使用して可視化した。
【００７５】
成長阻害の評価
３ｘ１０３細胞／ウェルを、１０％  ＦＣＳで９６ウェルプレートに配置した。培養培地を廃棄し、そして細胞を１回Ｏｐｔｉ−ＭＥＭで洗浄した。細胞モノレイヤーを種々の濃度のペプチド溶液と３７℃２４時間インキュベートした。成長阻害を、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム；ＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａより）およびメソ硫酸フェナジン；ＰＭＳ（Ｓｉｇｍａより）からなる溶液を使用して評価した。成長を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０）は、２４時間後に算出した。
【００７６】
ペプチド
Ｔａｔ−ペプチドを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３３Ａペプチド合成機において固相化学によって合成する。ペプチドを、フルオレセインマレイミドでそれらのシステイン残基上で標識した。ペネトラチン−ペプチドを、利用可能技法を使用して合成した。ペプチドのアミノ酸配列は、表ＶＩＩ中である。
表ＶＩＩ：種々のペプチドの配列
【表１５】
2004516301.tif 000015
【００７７】
ここでアミノ酸がそれらの普遍的単一文字アミノ酸コードによって表される場合、Ｆｌｕは、フルオレセイン、Ｍａｌは、マレイミドおよびＸはＧｌｙまたはＧｌｙ−Ｇｌｙリンカーである。
【００７８】
結果
Ｅ２Ｆ−１／サイクリンＡ結合の阻害
Ｅ２Ｆ−１に由来する８残基ペプチド（８７−９４）が、サイクリンＡ−ｃｄｋ２複合体の、Ｅ２Ｆ−１およびｐ２１への結合を崩壊させることができるので、これらのペプチドの、哺乳動物細胞ヘの導入は、Ｅ２Ｆ−１／サイクリンＡヘテロダイマーを不活性化する生理学的共通物を評価するための手段を提供し得る。ＨＩＶ−ｔａｔ４７−５６またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメインタンパク質の第三ヘリックスからとった１６アミノ酸残基に由来する内在化配列（表ＶＩＩ）は、生物学的膜を横断して移動することが示された。
Ｔａｔ配列は、Ｅ２Ｆ−１  Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ、または環形成コンセンサスＰｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）、またはスクランブル直線形８量体のいずれかに付着しＴａｔ−直線形、Ｔａｔ−環形成、またはＴａｔ−ｍｔを創出した。類似命名法を、ペネトラチンシリーズについて作成した（表ＶＩＩ）。これらの融合ペプチドの、Ｅ２Ｆ−１／サイクリンＡ結合への阻害活性を、決定した。Ｔａｔ−直線形、Ｔａｔ−環状およびペネトラチン−直線形は、Ｅ２Ｆ−１／サイクリンＡ結合アッセイにおいて、範囲０．１−１μＭの５０％阻害を示した。
【００７９】
ＩＣ５０値は、核局在化配列の融合のないものよりも約１−１００倍である。対照的に、Ｔａｔ、Ｔａｔ−スクランブルまたはペネトラチンペプチドは、１００μＭまで阻害を示さなかった。類似の結果が、インビトロ翻訳アッセイを使用してＧＳＴ−プルダウンアッセイから取得された。
【００８０】
Ｔａｔペプチドのとりこみおよび細胞内区画化
システイン残基上でフルオレセインマレイミドで標識されたＴａｔ−ｍｔペプチドの内在化を、調査した。標識したペプチドを、質量分析によって確認し、そして使用前にＨＰＬＣによって精製した。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の細胞培養最適培地に添加するときに、ペプチドを主に、３０分のインキュベーションのみ後に核内蓄積のある核から回収した。われわれはさらに、３０および１００μＭのペプチドの、２４時間のオステオサルコーマＵ２ＯＳ細胞とのインキュベーションでの実験を反復した。結果は、核への１００％貫通を示した。ペプチドを、フルオレセインマレイミドでの直接的標識後、同じ条件下で試験した。内在化ペプチドの量および局在化の変化は、Ｔａｔ−ペプチドと比較して観察されなかった。
【００８１】
成長阻害
Ｕ２ＯＳの非同時性培養物を、Ｔａｔ−直線形またはＴａｔ−環状で処理した場合、処理約３時間後開始しそしてその後継続し、細胞は丸型形態をとった。これらは、環状ペプチドの場合によりはっきりした効果を有するＭＴＳアッセイによって測定されるような用量依存性阻害を示した。量体直線形、環状（核局在化配列付加なし）で処理した細胞が何ら形態学的変化を示さないように、該効果は融合ペプチドに特異的であった。
【００８２】
同様に、Ｔａｔそれ自体またはスクランブルまたは非関連配列とのＴａｔ融合ペプチドの導入は、３００μＭまで何ら形態学的変化およびＭＴＳ読みを引き起こさなかった。他の細胞型、例えばＭＤＡ−ＭＢ４３５、ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳癌腫細胞、ＨＣＴ−１１６、ＳＷ４８０結腸癌腫細胞、Ｗ１３８／ＶＡ１３  ＳＶ４０形質転換肺維芽細胞はまた、Ｔａｔ−直線形および環状ペプチドの両方に感受性であった。ただし、Ｒａｔ１およびＨｅＣａｔ細胞はこの限りでない。類似の阻害効果が、ペネトラチン−ｗｔ配列をＡ５４９肺癌種および他の腫瘍細胞型へ導入したときに見られた。
【００８３】
種々のペプチドのＩＣ５０値を計算し、そして表ＶＩＩＩに要約する。Ｔａｔ−環状ペプチドは、細胞中でＴａｔ−直線形よりもより強力であり、これは、インビトロのそれらのＩＣ５０値と合致する。さらに、腫瘍セルラインは、不死化正常セルラインよりもより阻害された。恐らく、腫瘍細胞中のＥ２Ｆ−１の内生基本レベルは、イムノブロッティングによって以前示されたように、より高い。
【００８４】
表ＶＩＩＩ： 種々のペプチドのＩＣ５０（μＭ）
【表１６】
2004516301.tif 000016
＊ＮＴ， 試験せず
【００８５】
種々のペプチドによるＥ２Ｆ−１／サイクリンＡ／ｃｄｋ２結合の阻害
サイクリンＡへの結合に要する最小配列を評価するために、種々の長さのペプチドを作成し、そしてＥ２Ｆ−１／サイクリンＡ／ｃｄｋ２ＥＬＩＳＡにおけるそれらの阻害活性を試験した。環状８量体および環状６量体についてのＩＣ５０値は、それぞれ１ｎＭおよび２０ｎＭである。しかし、環状５量体のＩＣ５０値は、３μＭであり、または環状８量体よりも２オーダーの規模でより高い。こうして、６量体アミノ酸ペプチドは、活性ペプチドのための最小の長さであるようである。加えて、環状ペプチドは、対応する直線形配列よりもより強力である。
【００８６】
ＥＬＩＳＡ
Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｌｏｎ ＩＩ ＥＬＩＳＡプレートを、重炭酸バッファー中の４ｍｇ／ｍｌの抗ＧＳＴ抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の２５０μＬで、４℃で終夜被覆した。５０ｍＭのトリス（ｐＨ＝７．５）、０．１５ＭのＮａＣｌ、および０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）からなる洗浄バッファーで５回洗浄後、非特異的部位を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．５）、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）からなる３００μＬのアッセイバッファーで室温で２時間封鎖した。プレートを次いで、ＴＢＳＴで５回洗浄し、アスピレート乾燥し、そして１００μＬの、ＴＢＳ中のＧＳＴ−Ｅ２Ｆ−１（２５ｎＭ）で処理した。ＧＳＴ−Ｅ２Ｆ−１を、室温で少なくとも１時間、タンパク質のないアッセイバッファーを受ける非特異的結合（ＮＳＢ）コントロールウェルとインキュベートした。プレートを、ＴＢＳＴで５回洗浄し、そしてアッセイバッファーで希釈した多重濃度の試験化合物を、アッセイバッファーで希釈した、５ｎＭのサイクリンＡ／ｃｄｋ２と共インキュベートした。サイクリンＡ／ｃｄｋ２複合体を、１：１比率の２種タンパク質を、アッセイプレートへの添加前にＴＢＳ中で４℃で３０分間混合することによって新しく調製した。室温で２時間のインキュベーションに続き、プレートをＴＢＳＴで５回洗浄し、そしてウサギ抗ｃｄｋ２抗体（ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）の１：５００希釈品の１００μＬをアッセイバッファーで希釈し、そしてすべてのウェルに添加した。少なくとも１時間室温でまたは終夜４℃でのインキュベーションに続き、プレートをＴＢＳＴで５回洗浄し、そしてＨＲＰコンジュゲートした抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）の、アッセイバッファーで１：５００希釈した１００μＬを、すべてのウェルに添加した。半時間室温インキュベーションに続き、プレートをＴＢＳＴで５回洗浄し、アスピレート乾燥し、そしてクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ＝４．２）中に調製した、１００μＬのＨＲＰ基質ＡＢＴＳの添加によって展開した。１０−１５分後、吸光度を、４０５ｎｍのマイクロプレートリーダーを使用して読む。
【００８７】
本発明を記載し、ある種の特定のその実施態様を引用して例示したが、当業者は、種々の変化、修飾および置換が、そこに本発明の精神および範囲から離れることなくなすことができることを認識する。例えば、前に示した特定の投与以外の有効な投与を、前特定の本発明化合物について示したいずれかについて処置される哺乳動物の応答性における便宜な変形として適用可能であり得る。同様に、観察された特異的薬理学的応答は、選択された特定の活性化合物、または薬学的担体が存在するかいなか、並びに使用される投与の製剤および様式の型にしたがっておよび依存して変化し得、そしてそのような予測される結果の変化または違いは、本発明の目的および実施化にしたがって企図される。したがって、本発明は続く請求の範囲によって定義され、およびそのような請求項は、合理的である範囲で広く解釈されるべきであることを意図する。
【００８８】
実施例１：環状６量体；Ｃｐｒ−Ｌｙｓ−（ＣＨ（ＣＨ３）（Ｃ１３Ｈ２７））−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）の合成
環状６量体の合成は、出発点として商業的入手可能Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＳＡＳＲＩＮ樹脂を利用する。６量体の鎖は、「Ｃ」から「Ｎ」への方向に、２５％ピペリジンでの連続的脱保護、次いでＦｍｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨ、そして最後にシクロプロパンカルボン酸でのＨＢＴＵ仲介カップリングで作り上げる。ペプチドをひとたびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＢＩ４３３Ａペプチド合成機で固相上に組みたてると、保護したペプチド−樹脂（２ｍＭ）を、３０ｍＬの２％  ＤＭＦ中ＮＨ２ＮＨ２で２回処理する（３０分および９０分）。樹脂をＤＭＦ（２回）、ＣＨ２ＣＨ２（２回）、ＭｅＯＨ（１回）およびＣＨ２ＣＨ２でよく洗浄する。ペプチド樹脂をＬｙｓ−１において、ヘプタデカノンおよびＴＨＦ／ＭｅＯＨ（５０ｍＬ，１：１）中のＮａＢＨ３ＣＮ（０．７５ｇ）および触媒量のＡｃＯＨ（３滴）で還元的にアルキル化する。Ｌｙｓ−４のＭｔｔ基を、ＣＨ２ＣＨ２中の１％  ＴＦＡで選択的に除去する（３回、それぞれ６０ｍＬ）。これらの条件はまた、保護されたペプチドを樹脂から切断し、そしてペプチドを濃縮した。該粗保護直線形ペプチドを次いで、ＨＢＴＵ（１１．２５ｍＭ）／ＨＯＢｔ（１１．２５ｍＭ）／ＤＩＥＡ（１２ｍＬ）ＤＭＦ（２５ｍＬ）を使用して３０分間、Ｌｙｓ−４の側鎖アミノ基およびＧｌｙのα−カルボキシル基の間を環形成する。環状ペプチドを、冷水（２Ｌ）で沈殿させそしてろ過する。環状ペプチドを、５０％  ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）で２時間脱保護し、粗ペプチドを提供し、これを冷ジエチルエーテルで沈殿させる。粗生成物（１．２ｇ）を、Ｃ８カラムおよびＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中のＣＨ３ＣＮ（＋０．１％ＴＦＡ）の勾配を使用する逆相ＨＰＬＣによって精製する。均質材料を含有するフラクションをプールし、そして凍結乾燥し、白色綿状粉末得る。純粋６量体ペプチドは、ｍ／ｚ（ＭＨ）＋１００８．７を示し、そして２４％（４８０ｍｇ）総収率を取得する。
【００８９】
実施例２；環状８量体である、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）の合成
環状８量体である、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）の合成手法を記載する。環状８量体である、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）の合成は、出発点として商業的入手可能Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＳＡＳＲＩＮ樹脂を利用する。該環状８量体である、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）の鎖は、２５％のピペリジン次いでＦｍｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ−（ｔ−Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ、および最後にＢｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨでのＨＢＴＵ仲介カップリングでの連続的脱保護によって、「Ｃ」から「Ｎ」への方向で作り上げる。ペプチドを固相上で組みたてると、Ｌｙｓ−５のＭｔｔ基をＣＨ２Ｃｌ２によって選択的に除去する。これらの条件はまた、樹脂から保護されたペプチドを切断する。粗保護直線形ペプチド（ＦＡＢ−ＭＳ，ｍ／ｚ１１６８）を次いで、Ｌｙｓ−５の側鎖アミノ基とＧｌｙ−８のαカルボキシル基の間で、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＭＦを使用して環形成する。該環状ペプチドを、９５％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏで１時間脱保護し、粗ペプチド環状８量体であるＰｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）を提供する。粗生成物を、ＣＨ３ＣＮ（＋０．１％ＴＦＡ）のＨ２Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）中の勾配を使用する逆相ＨＰＬＣによって精製する。均質材料を含むフラクションをプールし、そして白色綿状粉末に凍結乾燥する。清浄環状８量体ペプチドＰｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）は、ｍ／ｚ（ＭＨ＋）８９９．１３を示し、環状８量体であるＰｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）の計算された分子量、Ｃ４３Ｈ７１Ｎ１３Ｏ８についてのＦＡＢ−ＭＳ、ＭＨ＋、環状８量体であるＰｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）の構造
【化１】
2004516301.tif 000017
と矛盾しない。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004516301.tif 000060
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