(57)【要約】本発明は、ＲＵ４１７４０又はＲＵ４１７４０に類似する化合物に樹状細胞を接触させることによって樹状細胞を成熟化させる方法に関する。ＲＵ４１７４０と接触させられた樹状細胞の成熟化は、その機能の性質とその表現型の性質によって証明され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単球、単球前駆体又は造血幹細胞から成熟樹状細胞又は活性化マクロファージを取得する方法において、上記単球、前駆体又は幹細胞をＲＵ４１７４０又はその類似物に接触させることを特徴とし、該化合物が、未成熟樹状細胞を該化合物に接触させることにより、
−  Ｔリンパ球を伴ったその培養の前及び／又は培養中に樹状細胞に接触せしめられた感染性又は腫瘍抗原に対してインビトロで一次応答を惹起し；
−  混合自己又は同種培養においてＴリンパ球の増殖を誘導する、
その能力によって証明される樹状細胞の機能成熟化を可能にするように選択される方法。
【請求項２】
単球、単球前駆体又は造血幹細胞から成熟樹状細胞又は活性化マクロファージを取得する方法において、上記単球、前駆体又は幹細胞をＲＵ４１７４０又はその類似物に接触させることを特徴とし、該化合物が、未成熟樹状細胞を該化合物に接触させることにより、上記樹状細胞による分子ＣＤ１４及びＣＤ１ａの発現の非常に顕著な減少と分子ＣＤ４０、ＣＤ８３、ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲの発現の有意な増加によって証明される、樹状細胞の表現型の成熟化を可能にするように選択される方法。
【請求項３】
単球、前駆体又は幹細胞が、肺炎桿菌の株Ｏ１Ｋ２ＮＣＴＣ５０５５から得られたＲＵ４１７４０の類似物に接触せしめられることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
単球、単球前駆体又は造血幹細胞から、選択された抗原を提示する成熟樹状細胞を取得する方法において、上記前駆体を、上記抗原を含む分子に結合させられたＲＵ４１７４０又はその類似物に接触させることを特徴とする方法。
【請求項５】
ＲＵ４１７４０又はその類似物と抗原との結合が非共有結合性であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
単球、単球前駆体又は造血幹細胞に接触せしめられる化合物が、抗原分子に結合した又は結合していないＲＵ４１７４０である、請求項１、２、４及び５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
ＲＵ４１７４０が１ｎｇ／ｍｌと１ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌと１０μｇ／ｍｌの間の最終濃度で単球、単球前駆体又は造血幹細胞の培地に添加される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＲＵ４１７４０の類似物がＬＣＯＳ１０１３又はＬＣＯＳ１０１４であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
ＬＣＯＳ１０１３又はＬＣＯＳ１０１４が１ｎｇ／ｍｌと１ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌと５０μｇ／ｍｌの間の最終濃度で単球、単球前駆体又は造血幹細胞の培地に添加される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
樹状細胞が、癌、感染病、アレルギー疾患又は自己免疫疾患の予防、緩和又は治療を目的とする医薬の調製のためにエキソビボで処理される、請求項１ないし９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
成熟樹状細胞及び／又は活性化マクロファージを含む組成物の調製のための、ＲＵ４１７４０又はその類似物の使用。
【請求項１２】
皮膚のランゲルハンス細胞の成熟化を促進するための、局所投与用医薬組成物の調製における、ＲＵ４１７４０又はその類似物の使用。
【請求項１３】
ＲＵ４１７４０又はその類似物と一又は複数の抗原の結合産物の、該抗原を提示する成熟樹状細胞又は活性化マクロファージの生産を誘導可能な組成物の調製のための使用。
【請求項１４】
抗腫瘍免疫反応を促進可能な組成物の製造における、請求項１ないし１０の何れか１項に記載の方法によって取得された樹状細胞の使用。
【請求項１５】
微生物による感染に対する免疫反応を促進可能な組成物の製造における、請求項１ないし１０の何れか１項に記載の方法によって取得された樹状細胞の使用。
【請求項１６】
寛容の点から免疫反応を調節可能な組成物の製造における、請求項１ないし１０の何れか１項に記載の方法によって取得され、免疫抑制剤の存在下でインキュベートされた樹状細胞の使用。
【請求項１７】
組織適合抗原の検出及び／又は特徴付けのための、請求項１ないし１０の何れか１項に記載の方法によって取得された樹状細胞の使用。
【請求項１８】
樹状細胞の成熟化又はマクロファージの活性化を誘導するための、ＲＵ４１７４０又はその類似物と抗原分子の結合産物。
【請求項１９】
ＲＵ４１７４０又はその類似物が非共有結合によって抗原分子に結合していることを特徴とする、請求項１８に記載の結合産物。
【請求項２０】
抗原分子が非タンパク質性であることを特徴とする、請求項１８又は１９に記載の結合産物。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は細胞治療の分野に属する。本発明は、単球、単球前駆体又は造血幹細胞から成熟樹状細胞及び／又は活性化マクロファージを産生することができる方法に関する。
【０００２】
樹状細胞は抗腫瘍、抗感染及び自己免疫反応の発生に重要な役割を担っている。実際、樹状細胞はＴリンパ球から一次応答を誘導可能な唯一の細胞である。よって、それらは免疫反応の開始に重要な役割を持っている。そのような機能は樹状細胞の多くの形態学的性質及び表面分子に関連している。実際、その細胞膜のサイズが大きく増加するため、樹状細胞はその環境と特に大きな接触面を持っている。更に、それらはその表面に抗原提示を可能にするクラスＩ及びクラスＩＩの非常に多くの組織適合抗原を保有している。
【０００３】
樹状細胞によって取り上げられた後、抗原はＴリンパ球に提示される前に「プロセシング」を受ける。活発な細胞代謝を必要とする再構築は４段階を含む：抗原の獲得、細胞内区画内での小ペプチド断片へのその酵素的分解、ＭＨＣのクラスＩＩ分子とのこれら断片の結合及びヘルパーＴリンパ球（Ｔｈ）のＴ細胞レセプタ（ＴｃＲ）への提示のための抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面へのペプチド−クラスＩＩ分子複合体の遊走である。第１の段階（獲得）は、温度依存性であり、非特異的なレセプターの媒介を通して、あるいはまだあまり分かっていない他のメカニズムの結果として実施される。第２の段階は、温度依存性であり（４度で阻止される）、ファゴソーム中での抗原の内部移行であり、それがついでリソソーム（プロテアーゼに富む細胞質内オルガネラ）と融合し、酸性ｐＨでエンドソームを生じる。ペプチド断片への抗原のタンパク分解が、特にカテプシンＢ、ついでＤの作用の結果、これら小胞中で生じる。この段階は、ファゴソーム−リソソーム結合を阻害するアンモニウムイオンによって、あるいはリソソームのｐＨを高めるクロロキンによって阻止され得る。第３段階はまだあまり分かっていない複雑なプロセスであり、ＭＨＣのクラスＩＩ分子と通常９個から２５個のアミノ酸からなる分解抗原のある特定の断片の結合を生じる。第４段階はＡＰＣの表面へのクラスＩＩ分子−ペプチド複合体（Ｃ３型と呼ばれる）の遊走である。ついで、このようにして形成された複合体は、リンパ球の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子が提示細胞のものと同じハプロタイプに属するならばＴｈリンパ球の表面の適当なＴｃＲと相互作用することができる（同種拘束）。
【０００４】
更に、樹状細胞は、免疫反応を開始させることによって、Ｔリンパ球の分子ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４及びＣＤ４０Ｌをそれぞれ活性化させる分子ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０のような、免疫反応の同時刺激分子に非常に富んでいる。それらはまた分子ＣＤ５４又は分子ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８のような非常に多くの接着分子を有しており、これが樹状細胞とＴ細胞の連携を容易にする。樹状細胞の他の特別な特徴はその分化段階に応じて異なった機能を果たすことである。しかして、抗原の獲得とその変化は未成熟樹状細胞の２つの主要な機能である一方、Ｔ細胞を刺激するために抗原を提示するその能力は樹状細胞が組織及びリンパ神経節中に遊走するにつれて増大する。この機能性の変化は樹状細胞の成熟化に対応する。よって、未成熟樹状細胞の成熟樹状細胞への移行が免疫反応の開始の基本的な段階である。この成熟化はこのプロセスの間に表面マーカーが変化するため容易に追跡することができる。樹状細胞の成熟化の様々な段階の表面マーカーの特徴を以下の表に纏める。
【表１】
2004527230.tif 000002
【０００５】
末梢血からの樹状細胞の分離は、白血球の１％未満がこのカテゴリーに属するに過ぎないので、非常に難しい。同じように、組織からの抽出はヒトでは不可能であり、また動物では非常に複雑である。従って、様々なサイトカインの存在下で造血前駆体及び単球から樹状細胞を産生することが可能になったことは重要な進歩であった。未成熟樹状細胞はＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下で単球から生産することができ、得られた未成熟樹状細胞はＴＮＦ−α又は他の薬剤、例えばＣＤ４０リガンド、マクロファージで馴化された培地又はＬＰＳとの接触後に成熟する。これらの最後の薬剤は複雑な又は毒性の物質である。同様に、インビボでのマクロファージの活性化は複雑で制御が困難である。このため、エキソビボでの活性化が実験研究及び治療用途への妥当な手段となっている。
【０００６】
活性化されたマクロファージは特異的又は非特異的インデューサによる炎症性活性化過程後に組織中で見出される細胞である。これらの細胞は毒性又は病原物質あるいは癌もしくは変性細胞の除去に関連している。
Cassenne Laboratories（フランス）によってBiostimの商品名で販売されているＲＵ４１７４０は、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）の株Ｋ２Ｏ１（株Ｏ１Ｋ２ＮＣＴＣ５０５５）から得られた糖タンパク抽出物からなる医薬である。これは細菌細胞壁の溶解、有機抽出、遠心分離及び限外濾過の後に得られる。
これは、
−  ８０％の糖タンパク質
−  アミノ酸、脂質及び核酸
からなる。
糖タンパク質部分は３つのフラクション：Ｐ１、Ｆ１、Ｆ２に分けられる。
Ｐ１は、莢膜（capsular）由来で、ＲＵ４１７４０の約５０％を占め、９５ｋＤの平均分子量を有する。
Ｆ１は、膜由来で、ＲＵ４１７４０の約２０％を占め、３５０ｋＤの平均分子量を有する。
Ｆ２はＰ１の一部であると思われる。
ＲＵ４１７４０は、この化合物で実施された陰性のリムルステストによって証明されるように発熱効果を生じない。
【０００７】
本発明は、成熟化の誘導剤としてＲＵ４１７４０又は以下に定義するその類似物を使用することによって樹状細胞の成熟化の新規な方法を記載する。
樹状細胞の成熟化を可能にする薬剤として、ＴＮＦ−αはその活性が最も特徴付けられているものである。残念ながら、このリンホカインは非常に毒性があり、インビボで極めて激しい反応を惹起する恐れがあり、それが細胞治療でこれを使用することに対して大きな障害となっている。ＬＰＳは樹状細胞の成熟化を誘導可能な他の化合物である。これもまた強い毒性を示し、強い発熱効果を誘導するもので、このことはＬＰＳで実施された陽性のリムルステストによって証明される。ＬＰＳはまた使用されたバッチに応じて変動する結果をもたらす。最後に、ＬＰＳは非常に迅速に分解するという欠点を持っている。ＣＤ４０のリガンド（ＣＤ４０Ｌ）については、インキュベーション時間と濃度に応じて変動する形で樹状細胞の分化を導くが、このためこれを細胞治療において使用するのは困難になっている。
【０００８】
以下の実施例において例証しているように、ＲＵ４１７４０により、上述の基準薬剤と同様か又はそれより良好な効力で樹状細胞の成熟化を誘導することができる。またこれはこれら薬剤と比較して幾つかの重要な利点を持っている。特に、Biostimという商品名で販売されているＲＵ４１７４０は、１９８２年以来、慢性感染症（慢性気管支炎、耳炎、鼻炎、．．．）において免疫系を刺激する医薬として、治療又は予防のために使用されてきた。生物体によるその完全な耐性は証明されている。更に、ＲＵ４１７４０は極めて安定な化合物であり、発明者は、それが非常に再現性があり用量依存的に樹状細胞の成熟化を誘導することを証明した。
成熟樹状細胞を必要とする細胞治療の将来において、ＲＵ４１７４０はこのようにその毒性がないこと、その安定性に関連して使用が容易であること、また得られる結果に再現性があることから、特に貴重である。
【０００９】
以下に記載するもののようなプロセスでＲＵ４１７４０と類似の性質を示すＲＵ４１７４０の任意の類似物を使用することは明らかに本発明の枠内に含まれる。しかして、６０から９０％の糖タンパク質を含有し、１ｍｇ／ｍｌ以下の濃度で未成熟樹状細胞に接触せしめられたときに分子ＣＤ４０、ＣＤ８３、ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲの発現の顕著な増加と分子ＣＤ１４及びＣＤ１ａの発現のかなりの程度の減少を誘導可能な化合物は「ＲＵ４１７４０類似物」と呼ぶ。ＲＵ４１７４０類似物の例はＬＣＯＳ１０１３及びＬＣＯＳ１０１４であり、その製造方法を実施例１０に記載する。以降、本明細書において、特に他の定義を示さない限り、「ＲＵ４１７４０」という用語はBiostimの活性成分を構成するＲＵ４１７４０そのものとその類似物の双方を意味する。
【００１０】
「ＲＵ４１７４０類似物」はここでは少なくとも次の工程の結果としてクレブシエラ属菌株（例えば、肺炎桿菌の株Ｏ１Ｋ２ＮＣＴＣ５０５５）から得られた糖タンパク抽出物からなる化合物として定義される：
・菌株の培養
・細菌細胞壁の溶解
・有機抽出
・遠心分離
・限外濾過
・乾燥
以下の実施例１０は照会名ＬＣＯＳ１０１３及びＬＣＯＳ１０１４で標記されたＲＵ４１７４０類似物の製造方法を提供する。
【００１１】
ＲＵ４１７４０類似物の化学構造は主として
・炭化水素＝７０％±１２
・タンパク質＝２０％±６
からなる。
脂質、ヌクレオシド及びアミノ酸が微量存在する。
ＲＵ４１７４０又はその類似物は検出不可能なレベルの細菌内毒素（１０ｐｇ／ｍｌ以下）を有する。
ＲＵ４１７４０は人間と動物の単球、単球の前駆体又は造血幹細胞を使用するあらゆるプロセスにおいて活性である。更に、ＲＵ４１７４０は同じ出発細胞から活性化マクロファージを同時に取得することを可能にする。
【００１２】
ＲＵ４１７４０の存在下に樹状細胞を配することにより達成される樹状細胞の成熟化はその表現型の性質又はその機能の性質によって証明することができる。
しかして、本発明は、単球、単球前駆体又は造血幹細胞から、成熟樹状細胞（単球樹状細胞、つまりＭＯＤＣ）又は活性化マクロファージを取得する方法において、上記単球、前駆体又は幹細胞をＲＵ４１７４０又はその類似物に接触させることを特徴とし、該化合物が、未成熟樹状細胞を該化合物に接触させることにより、
−  Ｔリンパ球と共になされるその培養の前及び／又はその培養中に樹状細胞に接触せしめられる感染性又は腫瘍抗原に対してインビトロで一次応答を惹起し；
−  混合自己又は同種培養においてＴリンパ球の増殖を誘導する、
その能力によって証明される樹状細胞の機能成熟化を可能にするように選択される方法に関する。
実施例６、７、９、１１及び１２がこの方法を例証する。
【００１３】
本発明は、また、単球、単球前駆体又は造血幹細胞から、成熟樹状細胞又は活性化マクロファージを取得する方法において、上記単球、前駆体又は幹細胞をＲＵ４１７４０又はその類似物に接触させることを特徴とし、該化合物が、未成熟樹状細胞を該化合物に接触させることにより、上記樹状細胞による分子ＣＤ１４及びＣＤ１ａの発現の非常に顕著な減少と分子ＣＤ４０、ＣＤ８３、ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲの発現の有意な増加によって証明される、樹状細胞の表現型の成熟化を可能にするように選択される方法に関する。
実施例１から３がこの方法を例証する。
【００１４】
更に、ＲＵ４１７４０の本来の物理化学的性質により、それに分子、特に抗原分子を吸着させることができる。よって、これにより、ＲＵ４１７４０と抗原分子の間に非共有的結合を簡単に生じさせることができる。そして、ＲＵ４１７４０又はその類似物と選択された抗原分子の間に形成された結合産物と共に未成熟樹状細胞をインキュベートすることによって、ＲＵ４１７４０又はその類似物に吸着された抗原に特異的な成熟樹状細胞を得ることが可能になる。ＲＵ４１７４０又はその類似物と抗原分子の間の結合は当業者に知られている任意の方法によって実施することができる。好適な態様では、抗原はＲＵ４１７４０又はその類似物に吸着されるが、他の結合手段（共有結合、親和性等々．．．）もまた考えられる。ＲＵ４１７４０又はその類似物の表面への吸着による最も単純な結合方法は、本質的に非タンパク性の抗原分子との結合を可能にするという利点をまた有している。
【００１５】
樹状細胞の成熟化又はマクロファージの活性化を誘導するためのＲＵ４１７４０又はその類似物と抗原分子の間の結合産物は本発明の一部を構成する。本発明の結合産物の好適な実施態様では、結合は非共有結合によって確保される。特定の結合産物はＲＵ４１７４０又はその類似物と本質的に非タンパク性の抗原分子とのものである。
本発明はまた単球、単球前駆体又は造血幹細胞から、選択された抗原を提示する成熟樹状細胞を取得する方法において、上記単球、単球前駆体又は造血幹細胞を、上記抗原を含む分子に結合させられたＲＵ４１７４０又はその類似物に接触させることを特徴とする方法に関する。
【００１６】
本発明の好適な実施態様では、上述の方法により、単球、単球前駆体又は造血幹細胞を、抗原分子に結合された又は結合されていないＲＵ４１７４０と接触させることにより成熟樹状細胞又は活性化マクロファージを取得することが可能になる。
本発明の方法の好適な実施態様では、ＲＵ４１７４０又はその類似物は、１ｎｇ／ｍｌと１ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌと１０μｇ／ｍｌの間の最終濃度で細胞の培地に添加される。
本発明の方法の他の好適な実施態様では、単球、単球前駆体又は幹細胞は、肺炎桿菌の株Ｏ１Ｋ２ＮＣＴＣ５０５５から得られたＲＵ４１７４０類似物に接触せしめられる。このような類似物の例はＬＣＯＳ１０１３又はＬＣＯＳ１０１４であり、これは好ましくは１ｎｇ／ｍｌと１ｍｇ／ｍｌの間、更により好ましくは１００ｎｇ／ｍｌと５０μｇ／ｍｌの間の最終濃度で細胞の培地に添加される。本発明の方法において、ＲＵ４１７４０又はその類似物の存在下での単球、単球前駆体又は造血幹細胞のインキュベーション時間は好ましくは１から１５日である。
【００１７】
細胞治療は患者に有益と思われる性質が付与されるようにエキソビボで改変された細胞を患者に投与することからなる最近のアプローチ法である。樹状細胞の本来の性質により、樹状細胞は、Ｔリンパ球から一次免疫反応を誘導するその能力のため、幾つかの病理分野における細胞治療へのアプローチのための優れた候補となる。特に、一又は複数の腫瘍抗原を提示する樹状細胞の投与による抗腫瘍免疫療法は特に有望な細胞治療アプローチ法である。このアプローチ法の原理は抗原を提示する細胞に対する応答を刺激するために特に効果的な形で腫瘍抗原を免疫系に提示することである。このアプローチ法は以下の実施例６で例証される。
以下に付与する実施例７は、微生物の抗原を提示する樹状細胞の投与により、これらの微生物に対する一次免疫を得ることが可能になり、よって感染に抗するために使用することができることを証明している。
【００１８】
樹状細胞を用いる他の細胞治療アプローチ法は特定の抗原に対して宿主の寛容反応を発現させるように樹状細胞を導くことからなる。これは、例えば同種移植時の同種抗原、自己免疫疾患時の自己抗原、又はアレルギー性疾患時のアレルゲンへの寛容を誘導するために有用である。
確かに、ある培養条件下で、樹状細胞はアネルギー反応、つまり活性化ではなくＴリンパ球の機能不活化を引き起こし得る。シクロスポリン又はヒスタミンのような免疫抑制剤の存在下での樹状細胞の培養により、細胞傷害性反応ではなく寛容反応を誘発する膜抗原が改変される。この知見は、一方では臓器移植に、他方ではリウマチ性多発関節炎、筋無力症、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、湿疹、乾癬等々のような自己免疫疾患及びアレルギー性疾患の治療に重要な意味を持つ可能性がある。実施例８は、ＲＵ４１７４０の存在下でのシクロスポリンＡの樹状細胞の成熟化への影響を証明することにより、このアプローチ法を例証している。
対象としている症状タイプが如何なるものであろうと、細胞治療は、ヒト又は動物の患者に自己、同種又は異種細胞を、そのエキソビボでの改変後に投与することによって実施することができる。
【００１９】
よって、本発明は、樹状細胞がエキソビボで処理され、成熟化後に、癌、感染病、アレルギー疾患又は自己免疫疾患の予防、緩和又は治療のためにヒト又は動物の患者に自系、同系又は異系的に投与される、上述のもののような方法に関する。
成熟樹状細胞及び／又は活性化マクロファージ及び／又は皮膚ランゲルハンス細胞を含む組成物の調製のための、ＲＵ４１７４０又はその類似物の使用もまた本発明の範囲に含まれる。
本発明者等は、ＲＵ４１７４０がランゲルハンス細胞の成熟化をインビトロで誘導することを可能にすることを示した（実施例４）。よって、この性質はＲＵ４１７４０を含む組成物の局所投与により皮膚又は粘膜のレベルでの免疫反応を促進するために好適に使用されうる。このような組成物の適応症の例は特に歯肉炎（gingivites）及び歯周炎（parodontites）である。よって、局所又は全身投与のための医薬組成物の調製のためのＲＵ４１７４０又はその類似物の使用もまた本発明の一部を形成する。
【００２０】
本発明の他の側面では、ＲＵ４１７４０又はその類似物は一又は複数の対象抗原に結合させられた後、上記抗原を提示する活性化マクロファージ又は成熟樹状細胞の生物体による生産を誘発するためにインビボで直接投与される。本発明のこの態様では、ＲＵ４１７４０又はその類似物は実際には対象抗原のベクターとなり、上記抗原を提示する活性化マクロファージ又は成熟樹状細胞の生産を誘発するように免疫系にこれらの抗原を提示することができる。
よって、本発明は、成熟樹状細胞又は活性化マクロファージがインビボで直接生産される上述したもののような方法に関する。
【００２１】
ＲＵ４１７４０又はその類似物と一又は複数の抗原の結合産物の、該抗原を提示する成熟樹状細胞又は活性化マクロファージの生産を誘導可能な組成物の調製のための使用もまた本発明の範囲に含まれる。
上述したもののような方法によって取得される成熟樹状細胞は様々なタイプの病理状態の処置、特に抗腫瘍免疫療法、感染に抗する努力又はある種の特定の抗原に対する生物体の寛容を増加させるために使用することができる。本発明の好適な実施態様では、上述したような方法によって取得された樹状細胞は抗腫瘍免疫反応を促進可能な組成物の製造に使用される。
【００２２】
同様に、微生物による感染に対する免疫反応を促進することができる組成物の製造における本発明の方法によって取得された樹状細胞の使用は本発明の一体部分である。
本発明の他の好適な態様では、上述したような方法によって取得される樹状細胞は免疫抑制剤の存在下でインキュベートされ、寛容の点から免疫反応を調節可能な組成物の製造に使用される。
【００２３】
本発明の方法によって製造された成熟樹状細胞はまたマイナー組織適合抗原を同定するために使用することもできる。この方法は、単球を成熟樹状細胞に分化させ、ついで同じ適合ＨＬＡファミリーの個々の間の混合リンパ球培養反応において刺激細胞としてそれらを使用することによって、単球を回収することからなる。このシステムにより、マイナー組織適合抗原に関する相違を検出することができ、同じ家族の人間の間での適合性又は不適合性を深く調べることができ、これは家族内又は家族外組織及び臓器移植の分野で確かな利点を提供する。組織適合抗原の検出及び／又は特徴付けのための本発明の方法によって取得された樹状細胞の使用もまた本発明の一部を構成する。
非限定的なものとして以下に記載する実施例と図面は、本発明の所定の利点と特徴を実証する。
【００２４】
次の実施例に記載された実験で使用された細胞培養、細胞標識、蛍光定量法による表現型決定等々の方法並びに試薬（抗体、破傷風毒素、．．．）の全てはKarine Duperrier等の文献、Journal of Immunological Methods 238 (2000), p.119-131に詳細に記載されている。
実施例１：ＲＵ４１７４０を用いたヒト単球からの樹状細胞の製造方法
末梢血を対象の患者から採取する。ついで、この血液を２００ｇにて２０分間遠心分離にかけ、末梢血細胞の血小板による汚染を消失させる。殆どの血小板と血漿を含む上方部分を、Ficoll分離勾配で遠心分離することによって精製する。その密度は１．０７７である。一核性細胞の層を回収した後、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、単球を分離するために、Percollの４の不連続な密度を含む勾配に配する。この勾配は、５％のヒト血清を含み、マグネシウムもカルシウムも含まないダルベッコ培地中、７５％（６．５ｍｌ）、５０．５％（１５ｍｌ）、４０％（３．５ｍｌ）及び３０％（３ｍｌ）の等張液中のPercoll濃度によって構成されている。このようにして７５００万から１億の細胞が各チューブ中に配され、４℃にて２５分、１０００ｇで遠心分離される。低密度の細胞、主に単球が、濃度４０％と５０．５％の間の界面で収集され、ＰＢＳで２回洗浄される。ついで、それらは培養培地中に懸濁させられた後、３ｍｌの最終容積のウェル当たり５ｘ１０６細胞の密度で６ウェルを含む培養皿に配され、３７℃で１時間放置されて付着させられる。この付着工程は、Macs型マイクロビーズシステム（Miltenyi Biotec）の補助の下、抗ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ４５Ａ、ＣＤ５６及び抗ＩｇＧを組み合わせたモノクローナル抗体混合物を用いて陰性のものを選ぶ精製システムによる更なる単球の精製に置き換えることが可能である。この更なる精製により、９０％を越える純度を持つ単球濃度を得ることが可能になる。
ついで、細胞は５％ＣＯ２の下、３７℃で培養ウェル中での培養に供せられる。ＲＰＭＩからなる培地は最終容積６ｍｌ中に２００ＩＵ／ｍｌの組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ及び５００ＩＵ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−４を含む。３日と５日に、３ｍｌを除去しサイトカインを含む新鮮培地を３ｍｌ添加して培養物を新しくする。６日に細胞をテフロンポットに移し、異なった濃度のＲＵ４１７４０又は２００ＩＵ／ｍｌの組換えヒトＴＮＦ−αの存在下で２日間、３ｍｌのポット当たり５ｘ１０５細胞の密度になるまで培養する。細胞を８日に収集し、洗浄し、更に３日の間、刺激剤なしで培養する。
【００２５】
培養期間の終わりに、成熟化の質を、細胞の表面における分子ＣＤ８０、８３、８６、１４、１ａ、ＨＬＡ−ＤＲの発現を測定することによって評価する。標識化により、生存している単球の８０％以上が、細胞を高度に分化した組織樹状細胞のグループと判別せしめる次の表現型：ＣＤ８３＋、ＣＤ８６＋＋、ＣＤ８０＋＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋＋＋、ＣＤ１ａ−、ＣＤ１４−、ＣＤ４０＋＋＋、ＣＤ５４＋＋によって特徴付けられる樹状細胞に成熟したことが明らかになった。
実際、図１は、２５μｇ／ｍｌのＲＵ４１７４０の添加後に、分子ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８０及びＣＤ８６がＤ８の時点で大部分の細胞に存在している一方、分子ＣＤ１４は本質的にもはや発現されないことを示している。
樹状細胞（ＤＣ）の成熟化に対するＲＵ４１７４０の作用を研究するために、異なった濃度の分子を試験して、ＴＮＦの作用と比較した。
次の３つの実験（ａ、ｂ、ｃ）は同じドナーの単球を用いて実施した。
【００２６】
ａ）ここで試験されたＲＵ４１７４０の濃度は０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌである。表２は、標識された細胞の割合と平均蛍光強度（ＭＦＩ）について得られた結果を示す。
【表２】
2004527230.tif 000003
これらの結果は誤差幅±２．５％で表されている。
【００２７】
８日間の培養後、ＣＤ１４分子の発現は、如何なる培養条件でも消失した（１．５％未満の割合）。
分子ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ５４及びＣＤ８６の標識化の平均蛍光強度（ＭＦＩ）はＴＮＦ−αの存在下よりも使用された用量のＲＵ４１７４０の存在下で弱いようである。
他方、分子ＣＤ８３及びＨＬＡ−ＤＱは、ＴＮＦ−αよりも１０μｇ／ｍｌの濃度のＲＵ４１７４０の存在下で僅かに強く発現される。
更に、ＣＤ８０分子のＭＦＩはＲＵ４１７４０の存在下では常に高いようである。
これらの結果から、ＲＵ４１７４０はたとえ低濃度でも樹状細胞の成熟化を誘導することが分かる。しかし、異なったマーカーのＭＦＩは試験したＲＵ４１７４０の最も高い濃度の場合に増加するようであり、ＴＮＦ−αの存在下で得られる結果に近づく。
よって、更に高い濃度での樹状細胞に対するＲＵ４１７４０の作用を第２の一連の実験で調べた。
【００２８】
ｂ）この場合に試験したＲＵ４１７４０の濃度は５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ及び５０μｇ／ｍｌである。
結果は表３に示す。
異なった接着分子、同時刺激分子及びクラスＩＩのＨＬＡ分子のＭＦＩは、培地に添加されるＲＵ４１７４０の濃度に依存した形で増加するように思われる。ＣＤ４０分子は、ＴＮＦ−αの存在下で得られた濃度と比較してＲＵ４１７４０の存在下でより低いＭＦＩを常に示している。
ＣＤ８３は、成熟化の特異的マーカーであり、ＲＵ４１７４０の量の関数としてまた増加する蛍光強度と割合を有している。
分子ＨＬＡ−ＤＱは１０μｇ／ｍｌのＲＵ４１７４０で最大の発現を示す。
【表３】
2004527230.tif 000004
これらの結果は誤差幅±２．５％で表されている。
表２の実験と比較してＲＵ４１７４０の濃度が高くなると（５０ｐｇ／ｍｌ）、分子ＣＤ４０及びＣＤ５４のＭＦＩが増加する一方、他の分子のＭＦＩは減少した（分子ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＱ）。ＣＤ８０及びＣＤ５４のような幾つかのマーカーは、５０μｇ／ｍｌのＲＵ４１７４０又はＴＮＦ−αでの成熟化後に同じ強さで発現される。
ついで、５０μｇ／ｍｌより高い濃度と低い濃度の双方のＲＵ４１７４０を第３の一連の実験で試験した。
【００２９】
ｃ）試験したＲＵ４１７４０の濃度は２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌである。
結果は表４に示す。
【表４】
2004527230.tif 000005
これらの結果は誤差幅±２．５％を含んでいる。
【００３０】
分子ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲは３種のＲＵ４１７４０の濃度で９７％を越える細胞に存在している。そのＭＦＩは２５μｇ／ｍｌのＲＵ４１７４０濃度についてＴＮＦ−αで得られたものに匹敵している。しかし、この実験では、ＲＵ４１７４０の濃度が高くなるとそれは継続して増加する。
ＣＤ８３は、１００μｇ／ｍｌ及び５０μｇ／ｍｌでは、ＴＮＦ−αで得られた結果よりも高い、非常に高い割合の細胞に存在している。そのＭＦＩは５０μｇ／ｍｌではより高いようである。
１００μｇ／ｍｌのＲＵ４１７４０では、クラスＩＩのＨＬＡ分子の蛍光強度は減少する傾向にあり、これは、この濃度がＲＵ４１７４０の限界濃度であることを示唆している。
全ての実験は、ＲＵ４１７４０の至適用量が１０から５０ｐｇ／ｍｌの間にあることを示唆している。
【００３１】
実施例２：ＲＵ４１７４０を用いたヒト造血ＣＤ３４＋幹細胞からの樹状細胞の産生方法
＊実験条件：
精製：Ficoll後、ＣＤ３４＋は４．２％の一核性細胞（ＭＮＣ）を示した。
抗ＣＤ３４抗体で被覆したビーズを用いたＭＡＣシステム法（Miltenyi Biotec）での陽性選択による精製後、９０％の細胞はＣＤ３４＋である。
培養：
−  培地：１０％のＦＣＳ、２％のペニシリン／ストレプトマイシン、１％のグルタミン及び１％の重炭酸ナトリウムを含むＲＰＭＩ。
ウェル当たり５ｘ１０５細胞で２ｍｌのウェルで培養する。
−  培地中に存在するサイトカイン：
Ｄ０からＤ５：２５ｎｇ／ｍｌのＦＣＳ、１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ及び２．５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αか６．２５ｎｇ／ｍｌのＲＵ４１７４０
Ｄ５からＤ１４：１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ
【００３２】
培養物の複製：−  細胞をウェルでホモジェナイズした後、１ｍｌのサンプルを取り、新しいウェルに配した。ついで１ｍｌの培地を新しいウェルと古いウェルに添加し、また培地に応じてＧＭ−ＣＳＦを添加した。
マーカー：ＣＤ３４−ＣＤ４５−ＣＤ１４−ＨＬＡ-ＤＲ−ＣＤ４０−ＣＤ５４−ＣＤ８３−ＣＤ８６−ＣＤ１ａ。
蛍光標識抗ＫＬＨ一次抗体を、得られたシグナルの非特異的蛍光を減じることができるようにするために対照として使用した。
＊結果：
【表５】
2004527230.tif 000006
ＣＤ１ａは、細胞表面にＴＮＦ−αの場合により多く発現されるＣＤ１４と異なり、ＴＮＦ−αでよりもＲＵ４１７４０でより多く発現する（Ｄ１２で細胞の１７．５％）。
ＲＵ４１７４０、ＣＤ４０、ＣＤ５４又はＨＬＡ−ＤＲの存在下での発現のレベルはＴＮＦ−αの存在下での発現のレベルと本質的に同一である。
ＣＤ８３は如何なる条件ででも発現されない。
【００３３】
実施例３：ＲＵ４１７４０でのヒト臍帯血のＣＤ３４＋細胞からの樹状細胞の産生方法
＊実験条件は、細胞が臍帯血から取られたことを除いて実施例２と同じである：
精製：Ficoll後、ＣＤ３４＋は０．８３％の一核性細胞（ＭＮＣ）を示した。
陽性選択による精製後、１８．１％のＣＤ３４＋が得られる。
２ｘ１０６細胞が得られた。
複製：Ｄ６、Ｄ７、Ｄ８、Ｄ１０及びＤ１２の時点
＊結果：結果を表６に示す。
【表６】
2004527230.tif 000007
二つの培養プロトコールにおいて、表面分子の発現の変化は同じ傾向を示す：
−  Ｄ１２までのＣＤ１４の増加、次に減少
−  分子ＣＤ３４の減少後、Ｄ１２で消失
−  安定を維持するＣＤ８３及びＣＤ１６の非常に弱い発現。
ＣＤ１ａはＲＵ４１７４０で処理された細胞にＤ７と早期に発現された後、Ｄ１４に約２３％で安定化し、よってＴＮＦ−αよりもＲＵ４１７４０を用いるとより速い速度になることが明らかである。
Ｄ１２以後に、分子ＣＤ４０、ＣＤ５４及びＨＬＡ−ＤＲが、ＴＮＦ−αの存在下よりもＲＵ４１７４０の存在下の方が少ない量で発現される。
【００３４】
実施例４：ランゲルハンス細胞の分化方法
幹細胞は臍帯血をFicoll勾配に通した後に得られる。一核性ＣＤ３４＋細胞は抗ＣＤ３４モノクローナル抗体（Immu 133.3, Immunotech Marseille,フランス）での陽性選択によって精製される。精製後、９０％を越える細胞がＣＤ３４＋である。
ついで、これらのＣＤ３４＋細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＴＮＦ−α（２．５ｎｇ／ｍｌ）又はＲＵ４１７４０（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で培地：ＲＰＭＩ−ＦＣＳ１０％−ペニシリン・ストレプトマイシン２％、グルタミン１％−重炭酸ナトリウム１％及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳ中で１２日培養する。Ｄ１２の培養期間の終わりに、細胞を抗ＣＤ１ａ、ＣＤ１４、Ｌａｇ、Ｅ−カドヘリン、ＤＲ及びＤＱ抗体で標識し、Ｌａｇ＋、ＣＤ１ａ＋、ＣＤ１４−、ＤＲ＋及びＤＱ＋であるランゲルハンス細胞を同定する。
表７に示された結果は、ランゲルハンス細胞の分化においてＴＮＦ−αよりもＲＵ４１７４０がより良好な効果を持つことを示している。
【表７】
2004527230.tif 000008
【００３５】
実施例５：ＲＵ４１７４０を用いたイヌの一核性細胞からの成熟樹状細胞の産生方法
エルトリエータは、液体培地中で細胞を、一方は遠心、他方は求心の二つの対向する力にかけることを可能にする装置である。これにより、細胞を、生理学的な培地中に維持しながら、そのサイズ及びその密度に応じて分離することが可能になる。この方法は、Ficollタイプの勾配では凝集を生じるイヌの細胞（単球／リンパ球）を分離するのに特に好適である。
エルトリエーション培地：
ＰＢＳ １Ｘ−ＦＣＳ２％−ＥＤＴＡ０．０１％
一核性細胞の調製：
血液袋をＣＰＤ（シトレート・ホスフェート・デキストロース）に集め、血液を塩化ナトリウムで希釈し、できるだけ多くの血小板を除去するためにブレーキなしで１５分間８００回転／分で遠心分離する。
Ficollをブレーキなしで２５分間１６００回転／分で実施する。
ＭＮＣを回収し、ＰＢＳで２回洗浄する（最初に血小板を除去）。
細胞濃度はＰＢＳ中又はエルトリエーション培地中５ｘ１０６細胞／ｍｌである。
【００３６】
単球を得るためのプロトコール
流量：２５ｍｌ／分（校正曲線に従ってポンプ制御）
遠心分離速度を変更：
次の条件で細胞を投入
３００ｍｌ中に３２００回転／分
２５０ｍｌ中に３０００回転／分
２００ｍｌ中に２７００回転／分
２００ｍｌ中に２５００回転／分
２００ｍｌ中に２３００回転／分
２００ｍｌ中に２１００回転／分
２００ｍｌ中でロータ停止
結果
２７００回転／分で得られた画分は８０％よりも高い純度で単球を含んでいる。
培養
イヌの単球を、ヒトの単球と同じようにして、同じヒト分化因子：ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ又はＲＵ４１７４０と共に培養する。他方、ＩＬ４はイヌ種に特異的である。このようにして得られた樹状細胞は樹状突起と同じ形態を有するが、表面マーカーは、ＣＤ１４−、ＤＲ＋及びＤＱ＋であるがヒトのものには匹敵しない。これはこの種において入手できる特異的抗体がないからである。ＲＵ４１７４０はＴＮＦ−αと同じ効果を有する。
【００３７】
実施例６：抗腫瘍活性の出現における成熟樹状細胞の使用
サイロカルシトニンは甲状腺の髄様癌に強く発現される非常に弱い免疫原性腫瘍抗原である。使用した系では、本発明者等はサイロカルシトニンに対するＴリンパ球クローンを複製することができた。それらはサイロカルシトニンによって引き起こされる癌において抗腫瘍活性を有し得る細胞傷害性クローンである。
図２はサイロカルシトニンペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞系の産生を例証する。  ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４及びＲＵ４１７４０の存在下での培養後に単球から得られた樹状細胞をサイロカルシトニンペプチドと共にインキュベートした後、そのペプチドに特異的なＴリンパ球の活性化を誘導するために自己Ｔリンパ球の存在下で培養した。
樹状細胞の後ペプチドと共にインキュベートしたＥＢＶ細胞の助けを借りてＴリンパ球を数回刺激した後、サイロカルシトニンペプチドと共にインキュベートされた標的ＥＢＶ細胞を特異的に溶解可能な細胞傷害性Ｔ細胞の株（Ｈ１０及びＢ７）を産生することができた。
【００３８】
実施例７：抗感染活性における成熟ＤＣの使用
ＭＯＤＣ（単球樹状細胞）によって提示される抗原として破傷風抗毒素を使用することによって、抗破傷風抗毒素株を産生させることができたが、これはこの系により感染タイプの抗原に対して一次免疫を持ちうることをかなり明瞭に証明している。
図３はＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４及びＲＵ４１７４０の存在下で培養されたヒト単球から誘導された樹状細胞による抗破傷風抗毒素株の二次応答を示している。
【００３９】
実施例８：寛容反応の誘導における成熟樹状細胞の使用
樹状細胞はある培養条件でアネルギー反応を引き起こす。シクロスポリン又はヒスタミンのような免疫抑制剤の存在下でのこれらの細胞の培養は膜抗原の改変を生じ、これが寛容反応を誘導し、細胞傷害性反応は誘導しない。従って、このようにして、寛容反応に樹状細胞を導くために樹状細胞を教育することが可能である。
我々は樹状細胞の成熟化に対するシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の影響を実施例として付与する。
精製した単球を、１０％ＡＢ型ヒト血清を含む培地中で、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下で６日間、ＲＵ４１７４０の存在下で更に２日間、培養した。培養開始直後に１μｇ／ｍｌ又は５μｇ／ｍｌのＣｓＡを加えたか加えなかった。分子ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ４０及びＣＤ１ａの発現をフローサイトメトリーによって分析した（表８）。
【００４０】
【表８】
2004527230.tif 000009
この研究は、シクロスポリンが分子ＣＤ８３及びＣＤ８０の発現を顕著に低減させる一方、ＣＤ１ａの発現を増大させることを証明している。グラフによる解析（図４）により、一方のＣＤ８３＋と免疫調節性を有する他方のＣＤ８３−の２つの細胞集団の存在が実際に明らかになっている。
確かに、ＣｓＡの存在下での樹状細胞（ＣｓＡ−ＭＯＤＣ）は一般的な抑制反応を促進するＴＨ２型応答に向けてＴリンパ球の応答を導くことができる。
図５は単球から得られ、シクロスポリンＡで処理された樹状細胞によるＴｈ２型の応答に向けての免疫反応のこの分極化を示している。
ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４及びＲＵ４１７４０の存在下で培養された単球から誘導され、シクロスポリンＡで処理された樹状細胞は未処理の樹状細胞よりもＩＬ−１２の分泌は少ない（図５Ａ）。
更に、Ｔ細胞によるサイトカインＩＦＮ−γ／Ｉ−１０（Ｔｈ１／Ｔｈ２）の分泌比は、Ｔ細胞がシクロスポリンで処理された樹状細胞によって刺激されると減少する（図５Ｂ）。
【００４１】
実施例９：混合同種又は自己リンパ球培養を誘導するための成熟ＤＣの使用
成熟ＭＯＤＣの存在下で、同種Ｔリンパ球は６日及び８日でさえ、同種Ｔリンパ球及び同種単球を用いた場合に観察されるよりかなり高い、極めて広範な増殖能を持っている。混合自己培養についても同じである。
よって、混合自己リンパ球培養は、ＧＭ−ＣＳＦ（２００ＩＵ／ｍｌ）、ＩＬ−４（５００ＩＵ／ｍｌ）及びＲＵ４１７４０（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で産生される単球（ＭＯＤＣｓ）から誘導された細胞によって誘導された。
３０Graysで放射線を当てた一万のＭＯＤＣｓを、Dynal磁気ビーズによるか（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋）ＦＡＣＳ Caliburの選択モジュール（ＣＤ８bright、ＣＤ２８−及びＣＤ８bright、ＣＤ２８＋autos)の何れかによって選択された異なったリンパ球亜集団と共に培養する。表８において、示された値は、（**）以外は、混合自己培養後のトリチウム化チミジンの取り込みを表す。実験は、２組の（*）を除いては、３組で実施された。
【表９】
2004527230.tif 000010
【００４２】
実施例１０：ＬＣＯＳ１０１３及びＬＣＯＳ１０１４の製造方法
Ａ．ＬＣＯＳ１０１３の一般的提示
ＬＣＯＳ１０１３は肺炎桿菌の培養ライセートから抽出された物質の集合からなるＲＵ４１７４０の類似物である。その生産態様は一続きの工程又は段階に基づいており、その一般的なスキームを以下に示す。
培養に使用可能な培地並びに如何にして各工程が進行するかの概要の説明を、この工程図の後により詳細に記載する。
純粋に指針として以下に記載する製造方法は６００リットルの発酵槽で得られた細菌培養に基づく操作ユニットに対応する。
【表１０】
2004527230.tif 000011
【００４３】
Ｂ．細菌の培養に使用可能な異なった培地の説明
上に特定した一連の工程に従ってＬＣＯＳ１０１３を製造するための細菌の培養は次の成分を含む培地を使用して実施することができる：
栄養培養液
パパイン大豆ペプトン                              ４±２ｇ／ｌ
酵母自己分解物質                                  ４±２ｇ／ｌ
塩化ナトリウム                                    ５±２ｇ／ｌ
水酸化ナトリウム                      ｐＨ７．４±０．２にする量
Ｒｏｕｘ皿
塩化ナトリウム                                    ５±２ｇ／ｌ
無水グルコース                                    ５±２ｇ／ｌ
酵母自己分解物質                                  １２±３ｇ／ｌ
パパイン大豆ペプトン                              ５±２ｇ／ｌ
ゲロース（gelose）                                ３０±４ｇ／ｌ
水酸化ナトリウム                      ｐＨ７．５±０．２にする量
リン酸二カリウム                                  ４±２ｇ／ｌ
リン酸一カリウム                                  ０．５±０．９ｇ／ｌ
前培養培地
パパイン大豆ペプトン                              ２０±３ｇ／ｌ
酵母自己分解物質                                  １０±２ｇ／ｌ
塩化ナトリウム                                    ５±２ｇ／ｌ
リン酸二カリウム                                  ３．５±１ｇ／ｌ
リン酸一カリウム                                  １〜２ｇ／ｌ
発酵槽用培地
パン酵母自己分解物質                              １０±２ｇ／ｌ
塩化ナトリウム                                    ５±２ｇ／ｌ
パパイン大豆ペプトン                              ２０±３ｇ／ｌ
リン酸二カリウム                                  ３．５±１ｇ／ｌ
リン酸一カリウム                                  １〜２ｇ／ｌ
【００４４】
Ｃ．ＬＣＯＳ１０１３の様々な製造段階の詳細な説明
第１段階：種菌の準備
この段階の目的は、作業バンクから得た凍結乾燥物又は凝固チューブ（cryotube）から出発して、液体培地中での前培養物の播種に必要な肺炎桿菌の培養を、Roux皿中のゲロース化培地で実施することである。作業バンクは例えばパスツール研究所の参照ＣＩＰ５２．１４５の肺炎桿菌の株を原料として実施される。
そのために、株を、栄養培養液中で細菌懸濁液を調製することによって再生し、それからRoux皿に播種し、ついで２０から２４時間、３７℃±０．５℃でインキュベートする。
第２段階：前培養
第１段階で調製された種菌から出発して、前培養物が３リットルのボトル中で調製され、３５ｌの発酵槽に播種するために使用され、それがついで第２段階で６００ｌの発酵槽に播種するために使用される。
第一の前培養物は上述の前培養培地で調製され、それに３リットルに対して３０ｇのグルコースを含むグルコースの滅菌液が添加される。３５リットルの第二の前培養物は上述の培養培地で調製され、それに４００ｇのグルコースが加えられる。
それぞれ１０Ｎの水酸化ナトリウムの滅菌液、１／２に希釈されたオルトリン酸の滅菌液及び滅菌消泡液を含む付随樽が、前培養物全体にわたって特にｐＨをおよそ６．５に維持するために、発酵槽において、第二の前培養物のために使用でき、振盪しながら、約３７℃にて約５時間続ける。
【００４５】
第３段階：発酵槽での培養
この段階の目的は満足できる品質の生成物の次工程の抽出を可能にするために１ｍｌ当たり１．７ｘ１０１０又はそれ以上の細菌を含む細菌培養物を発酵槽中で決まった条件下で産生することである。
そのために、３５ｌの発酵槽に含まれる細菌懸濁液が、上述の発酵槽用の培地を含む６００リットルの発酵槽に移され、５ｋｇのグルコースが添加された。
３５リットルの前培養の場合と同様に、それぞれ１０Ｎの水酸化ナトリウムの滅菌液と１／２に希釈されたオルトリン酸の滅菌液を含む付随樽がｐＨをおよそ６．５に調節するために使用され、また滅菌消泡液を含む付随樽が使用された。培養物は振盪しながら３７℃±１℃で約７時間成長させる。
第４段階：培養の終了と溶解剤の添加
この段階の目的は、溶解剤の作用と４０分に等しいかそれを越える時間、５５から７５℃に加熱することによって培養物を不活化させることである。そのために、次の溶解剤が使用される：
ポリソルベート８０の滅菌液、
ＥＤＴＡの滅菌液、
リゾチーム塩酸塩の滅菌液。
培養の終わりに、オルトリン酸滅菌液によってｐＨが５．８±０．３に調整された後、上記の溶解剤が培養物に移される。
ついで、発酵槽の内容物の温度が６５℃±１０℃にされ、少なくとも４０分間振盪しながらこの温度に維持される。
得られた生物分解物はついで工業用溶解樽（前もって６５℃±１０℃に加熱）に移され少なくとも２０分この温度に維持された後、３７℃±２℃にされる。
第５段階：溶解
溶解工程は細菌の細胞壁を酵素的に破壊することからなり、これにより微生物細胞の細胞質内成分が放出される。溶解工程は、前の段階の溶解前懸濁液を少なくとも６日間溶解樽中に３７℃±２℃で維持することによって実施される。
【００４６】
第６段階：モレキュラーシーブ及び濃縮
この工程では、粗ライセートの容積を、次の段階で処理すべき量を減らすために半分まで低減させる。濃縮は例えばａ≦１００ＫＤカットオフ閾値のCARBOSEP型フィルターカートリッジを装備した限外濾過装置で実施し、未結合の小分子を除去する。
第７段階：ライセートの凍結乾燥
第６段階で得られた粗ライセートを、次の溶剤抽出を可能にする固形形態で得るために、濃縮段階の直後に凍結乾燥操作を実施する。このようにして、触れると粘着性のある褐色粉末が得られる。
第８段階：アセトン抽出：
第７段階で得られたＬＣＯＳ１０１３の凍結乾燥ライセートは、室温でアセトンを用いて固液抽出によって部分的に除去される脂質を含む。使用されるアセトンの容積は凍結乾燥物(lyophilisate)の質量に比例する。
この容積は次の計算に従って得られる：
１０ｘ抽出されるべき質量≦Ｖ溶剤≦２０ｘ抽出されるべき質量で、好ましくは（Ｖ溶剤／抽出されるべき質量）＝１５
生成物は遠心分離によって回収された後、乾燥される。
【００４７】
第９段階：メタノール抽出
アセトンでの抽出後に、第８段階で得られた生成物は残留脂質及び顔料を尚も含んでおり、これが室温でメタノールを用いる固液抽出によって除去される。
使用されるメタノールの容積は凍結乾燥物の質量に比例する。
この容積は次の計算に従って得られる：
１０ｘ抽出されるべき質量≦Ｖ溶剤≦２０ｘ抽出されるべき質量で、好ましくは（Ｖ溶剤／抽出されるべき質量）＝１５
生成物は遠心分離によって回収された後、乾燥される。
第１０段階：再溶解
第９段階で得られた「メタノール抽出物」を水溶液に再溶解して、次工程の遠心分離と限外濾過による生成物の分離を可能にする。
第１１段階：遠心分離
第１０段階で得られた懸濁した粗抽出物は水に不溶性の物質及び変性タンパク質を含み、これが１４０００から１８０００ｇの範囲の遠心分離によって除去される。
遠心分離産物は僅かにコロイド状の外観を持ち、ベージュがかった褐色をしている。
【００４８】
第１２段階：限外濾過
この段階は生成物の分離の本質的な工程である。
第１１段階で得られた生成物は異なった分子サイズの物質を含んでいる：鉱物塩、タンパク質、糖タンパク質等々．．．
生成物を構成するＭＷ≧３０００００の巨大分子は３００ＫＤのカットオフ閾値を持つメンブレンを通しての限外濾過によって分離される。
生成物は、ひとたび装置の内部に導入されると、限外濾過装置を具備する閉回路中にポンプによって連続的に循環される。培地は振盪によって均質に維持される。メンブレンフィルターにポンプによってつくり出された圧力により、溶質の一部がこのメンブレンを強制的に通過させられる（透過液）。
保持された部分（保留液）は循環状態のままである。操作は一定容積で進行するので、容積の喪失は同じ容積の水の供給によって連続的に補償される。
操作の終わりに液は限外濾過される。
得られた限外濾過液は僅かに黄色の半透明な液体溶液である。
【００４９】
第１３段階：濾過
第１１段階で得られた遠心分離の上清の清澄化は１．２μｍのノミナルな保持率を持つメンブレンを通す濾過によって改善される。
このようにして、淡いベージュないしはクリーム色の乳白色の「糖タンパク質液」が得られる。
第１４段階：凍結乾燥
生成物が良好に保存されるようにするために、第１３段階から得られた液を、ついで、凍結工程を含み、よって正しくは凍結乾燥と呼ばれる方法によって凍結乾燥する。
凍結乾燥された糖タンパク質は綿状でクリーミーな白色の吸湿性粉末の外観を持つ。
第１５段階：混合
この最後の工程の目的は第１４段階から得られた凍結乾燥糖タンパク質をホモジナイズすることである。
有利にはスプレー法を凍結乾燥と混合に代えてもよい（ＬＣＯＳ１０１４）。
【００５０】
実施例１１：ヒト単球から誘導された樹状細胞の成熟化に対する分子ＬＣＯＳ１０１３の効果の研究
ヒト単球から産生された樹状細胞の成熟化に対するＬＣＯＳ１０１３の効果を、ＴＮＦ−αと比較して、３つの異なったドナーから誘導した細胞について研究した。
Ａ．プロトコール
−  未成熟樹状細胞への単球の分化を誘導するために、精製した単球（９０％以上）を、成長因子ＧＭ−ＣＳＦ（２００Ｕ／ｍｌ）及びＩＬ−４（５００Ｕ／ｍｌ）の存在下で１０％ＡＢヒト血清を含むＲＰＭＩ培地で６日間培養した。細胞の成熟化を、ＴＮＦ−α（２００Ｕ／ｍｌ）又は化合物ＬＣＯＳ１０１３（２５μｇ／ｍｌ）を４８時間かけて添加することによって誘導した。
−  このようにして産生された細胞の表現型（８日の培養後）をフローサイトメトリーによって調べた。樹状細胞の成熟化に特異的なマーカー（ＣＤ８３）、同時刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、接着分子ＣＤ５４、主要組織適合複合体のクラスＩＩのＨＬＡ−ＤＲ分子の発現を分析した。ランゲルハンス細胞、未成熟樹状細胞の特異的マーカー、ＣＤ１ａ分子の発現もまた試験した。
−  細胞の機能的性質を混合リンパ球反応（ＭＬＲ）によって研究した。これを行うために、ある範囲の濃度の樹状細胞を、ある決まった濃度の同種Ｔリンパ球（混合同種反応）又は自己Ｔリンパ球（混合自己反応）の存在下にそれぞれ４日及び５日、配した。Ｔリンパ球の増殖をトリチウム化チミジンの取り込みによって測定した。混合リンパ球反応の実験プロトコールは上で引用したK. Duperrier等の文献中により詳細に記載されている。
【００５１】
Ｂ．結果
樹状細胞の表現型
以下の表１０から１２は異なったマーカーの発現の割合並びに各マーカーの平均蛍光強度（ＭＦＩ）（括弧内）を纏めている。
【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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分子ＬＣＯＳ１０１３の存在下で産生された樹状細胞は、ＣＤ８３分子、同時刺激及び接着分子の発現、並びにＣＤ１ａの弱い発現の結果、成熟樹状細胞の表現型の特性を示している。
しかしながら、発現の割合、並びに分子ＣＤ８０のＭＦＩは、分子ＣＤ４０及びＣＤ５４のＭＦＩの場合のように、ＴＮＦ−αと比較して、分子ＬＣＯＳ１０１３の存在下で増加するようである。
これらの結果は、樹状細胞の成熟化に関して、ＴＮＦ−αと比較した場合の分子ＬＣＯＳ１０１３の格差のある効果を示唆している。
【００５２】
樹状細胞の機能
混合同種リンパ球反応の結果を図６に示す。その結果は、ＬＣＯＳ１０１３の存在下で培養した樹状細胞は、ＴＮＦ−αの存在下で産生された細胞のものに匹敵する高いアロ刺激能を示すことを示している。
混合自己リンパ球反応の結果は図７に示す。顕著なことに、ＬＣＯＳ１０１３の存在下で培養された樹状細胞は、ＴＮＦ−αの存在下で産生された細胞よりも更に大きく（少なくとも５倍以上）自己Ｔリンパ球を刺激する能力を示している。
【００５３】
Ｃ．結論
上記の結果は、分子ＬＣＯＳ１０１３が表現型及び機能のレベルで、ヒト単球から産生された樹状細胞の成熟化を効果的な形で誘導することを示している。
しかしながら、分子ＣＤ８０の発現がＬＣＯＳ１０１３の存在下で大きく増大し、細胞がＴＮＦ−αと比較して強い自己反応を誘導し、これは試験した３のドナーにおいて同じであることは興味深い。
これは、ＣＤ８０が混合自己反応の開始に本質的な役割を果たしているかも知れないことを示唆しているScheinecker等（Journal of Immunology, 1998, 161: 3966-3973）によって示された結果と一致している。
【００５４】
実施例１２：樹状細胞の成熟化に対する異なった濃度のＬＣＯＳ１０１３の効果の研究
単一のドナーのヒト単球から産生された樹状細胞の成熟化に対する異なった濃度のＬＣＯＳ１０１３の効果をＴＮＦ−αと比較して研究した。
ＬＣＯＳ１０１３に対して試験した濃度は５、１０及び２５μｇ／ｍｌであり、ＴＮＦ−αは２００Ｕ／ｍｌである。
【００５５】
表現型決定実験の結果は次表に纏める：
【表１３】
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得られた細胞の機能性が混合同種及び自己リンパ球反応によって実験され、その結果が図８に示される。
試験された３通りの濃度でのＬＣＯＳ１０１３の存在下で培養された樹状細胞は、ＴＮＦ−αの存在下で産生された細胞のものに匹敵する高いアロ刺激能を示す。
ここでもまた使用されたＬＣＯＳ１０１３の濃度に関係なく、ＬＣＯＳ１０１３の存在下で培養された樹状細胞が、ＴＮＦ−αの存在下で産生された細胞よりも更に大きく自己Ｔリンパ球を刺激する能力を示していることが観察される。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は樹状細胞への単球の分化の間におけるＤ０（破線の曲線＝処理前の単球マーカー）、Ｄ６（細線の曲線＝未成熟樹状細胞）及びＤ８（太線の曲線＝成熟樹状細胞）での細胞マーカーの変化を示し、Ｄ６以降は２５μｇ／ｍｌのＲＵ４１７４０の添加後である。
【図２】図２はサイロカルシトニンペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔ系統の生産を示している。使用されたエフェクター／標的比は横軸に示され、標的細胞の溶解割合は縦軸に示される。
【図３】図３はＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４及びＲＵ４１７４０の存在下で培養されたヒト単球から誘導された樹状細胞による破傷風毒素の提示を証明している。分当たりカウント（ｃｐｍ）で測定されたトリチウム化チミジンの取り込みは縦軸に示されている。
【図４】図４はＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４及びＲＵ４１７４０の存在下で培養された単球から誘導された樹状細胞の成熟化に対するシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の影響を示している。フローサイトメトリーで得られた曲線はＣｓＡを伴わない場合（４Ａ）及び５μｇ／ｍｌのＣｓＡを伴う場合（４Ｂ）のＣＤ８３の発現を示している。図４Ｃ及び４Ｄは樹状細胞の他のマーカー、ＤＣＬａｍｐ抗原に対しての同様の曲線を示している。破線の曲線は、樹状細胞には関連しない抗ＫＬＨ一次抗体を用いて得られた。
【図５】図５は単球から誘導されシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）で処理された樹状細胞によるＴｈ２タイプ免疫反応に対する免疫反応の方向性を示している。縦軸はそれぞれＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４及びＲＵ４１７４０の存在下で培養され、５μｇ／ｍｌのシクロスポリンＡで処理された（黒の棒）又はシクロスポリンＡで処理されていない（白の棒）単球から誘導された樹状細胞によるＩＬ−１２の分泌（図５Ａ）及びサイトカインＩＦＮ−γ／ＩＬ−１０（Ｔｈ１／Ｔｈ２）の分泌の比（図５Ｂ）を表している。３つの実験は各条件について示されている。結果は、その測定値が１００に調整されたシクロスポリンで未処理の単球に対する割合で表されている。
【図６】３の異なったドナーの精製単球から得られた樹状細胞で実施された混合同種リンパ球反応の結果を示す。２つのタイプの樹状細胞が比較され、その成熟化は４８時間のＴＮＦ−α（２００Ｕ／ｍｌ）かＬＣＯＳ１０１３（２５μｇ／ｍｌ）（「ＬＣＯＳ」と標識した曲線）の何れかによって誘導された。横軸は、ウェル当たり１０５のＴリンパ球という一定量に対して、各ウェルに沈着した照射樹状細胞の数に対応する。樹状細胞によって刺激されたＴリンパ球の増殖はトリチウム化チミジンの取り込み（縦軸）によって４日の培養後に測定されている。
【図７】３の異なったドナーの精製単球から得られた樹状細胞で実施された混合自己リンパ球反応の結果を示す。２つのタイプの樹状細胞が比較され、その成熟化は４８時間のＴＮＦ−α（２００Ｕ／ｍｌ）かＬＣＯＳ１０１３（２５μｇ／ｍｌ）（「ＬＣＯＳ」と標識した曲線）の何れかによって誘導された。横軸は、ウェル当たり１０５のＴリンパ球の一定量に対して、各ウェルに沈着した照射樹状細胞の数に対応する。樹状細胞によって刺激されたＴリンパ球の増殖はトリチウム化チミジンの取り込み（縦軸）によって５日の培養後に測定されている。
【図８】樹状細胞で実施された混合同種及び自己リンパ球反応の結果を示し、その成熟化は４８時間のＴＮＦ−α（２００Ｕ／ｍｌ）か、５、１０もしくは２５μｇ／ｍｌのＬＣＯＳ１０１３（「ＬＣＯ」と標識した曲線）の何れかによって誘導された。グラフは図６及び図７にそれぞれ示されたグラフと同じようにして得られた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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