(57)【要約】凍結乾燥した血小板を含む、脱水組成物が提供される。この血小板にはトレハロースが充填され、凍結乾燥と再水和に際して生物学的性質が保存される。トレハロースの充填は、約２５℃よりも高く約４０℃よりも低い温度、最も好ましくは３７℃において行われ、充填溶液はトレハロースを約１０ｍＭから約５０ｍＭの量で有する。こうして凍結乾燥された血小板は実質的に貯蔵安定性を有し、アゴニストに対して正常の応答を行うように再水和可能である。例えばトロンビンに対して正常の応答を行い、事実上全ての血小板が３７℃で約３分以内に凝固の生成に関与する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の治療に有用な脱水組成物であって、
治療を意図する哺乳動物の種から選択された実質的に貯蔵安定性のある血小板からなり、前記血小板が凍結乾燥及び再水和に際して生物学的性質を保存すべくトレハロースで有効に充填されており、前記血小板が少なくとも１つのアゴニストに対して正常応答を示すように再水和可能である、脱水組成物。
【請求項２】
凍結乾燥された血小板内部に充填されたトレハロースの量が約１０ｍＭから約５０ｍＭである、請求項１の脱水組成物。
【請求項３】
前記少なくとも１つのアゴニストに対する正常応答が、生理学的濃度のトロンビンに対する応答である、請求項１の脱水組成物。
【請求項４】
生物学的性質の保存が、特徴的な血小板表面のレセプタを媒介として達成される、請求項１の脱水組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１つのアゴニストが、トロンビン、コラーゲン、リストセチン、及びＡＤＰからなる群より選択される、請求項１の脱水組成物。
【請求項６】
組成物が周囲温度において実質的に貯蔵安定性である、請求項１の脱水組成物。
【請求項７】
前記有効な充填が、液相エンドサイトーシスを介して外部のトレハロースを取り込むように、血小板を約２５℃より高く約４０℃より低い温度で培養することを含む、請求項１の脱水組成物。
【請求項８】
前記血小板が人の血小板である、請求項１の脱水組成物。
【請求項９】
前記凍結乾燥された血小板が凍結乾燥前に、約２０ｍＭのトレハロースが内部に均一に分布していることによって特徴付けられる、請求項１の脱水組成物。
【請求項１０】
水分が約５重量％を越えない量である、請求項１の脱水組成物。
【請求項１１】
抗生物質、抗カビ剤、成長因子、及びこれらの混合物からなる群より選択される治療剤をさらに含む、請求項１の脱水組成物。
【請求項１２】
均一に分布したある濃度の治療剤を内部に有する血小板であって、トロンビンに対して正常応答を有することを確定可能な血小板からなる、治療用組成物。
【請求項１３】
前記確定可能なトロンビンに対する正常応答が、３７℃において約３分以内の凝固生成である、請求項１２の治療用組成物。
【請求項１４】
前記治療剤が、抗トロンビン剤、抗生物質、抗細胞分裂剤、又は抗脈管形成剤を含む、請求項１２の治療用組成物。
【請求項１５】
止血助剤であって、
治療を意図する哺乳動物の種から選択された実質的に貯蔵安定性のある血小板と、前記血小板が凍結乾燥及び再水和に際して生物学的性質を保存すべくトレハロースで有効に充填されており、前記血小板が少なくとも１つのアゴニストに対して正常応答を示すように再水和可能であること、及び
前記血小板が担持される生体適合性のある基材とからなる、止血助剤。
【請求項１６】
前記血小板がコーティングされており、又は前記基材中に含浸されている、請求項１５の止血助剤。
【請求項１７】
前記基材が織成した又は不織の包帯、傷当て、又は縫合糸である、請求項１５の止血助剤。
【請求項１８】
哺乳動物の治療に有用な脱水組成物の調製方法であって、
治療を意図する哺乳動物の種から選択された血小板を準備し、この血小板が生物学的性質を保存すべくオリゴ糖で有効に充填されており、前記充填が前記オリゴ糖の溶液を用いて血小板を約２５℃より高く約４０℃より低い温度で培養することを含み、前記溶液が前記オリゴ糖を約５０ｍＭまで含有し、前記培養が前記オリゴ糖を前記血小板の内部に約１０ｍＭから約５０ｍＭの量で充填するのに十分なものであり、
前記充填された血小板をその凝固点より低く冷却し、及び
冷却された血小板を凍結乾燥することからなる方法。
【請求項１９】
前記血小板が人の血小板である、請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記培養温度が約３７℃である、請求項１８の方法。
【請求項２１】
前記培養が少なくとも約２時間行われる、請求項１８の方法。
【請求項２２】
前記培養が少なくとも約４時間行われる、請求項１８の方法。
【請求項２３】
前記血小板が人の血小板であり、前記培養が約３０℃から約３７℃の間で行われ、前記溶液がトレハロースを約１０ｍＭから約５０ｍＭの量で含有し、前記培養が少なくとも約４時間行われる、請求項１８の方法。
【請求項２４】
前記冷却が毎分約２℃から５℃の速度で、乾燥バッファ中において行われる、請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記凍結乾燥が約−３２℃より低い温度において行われ、約９５重量％の水分が除去される、請求項１８の方法。
【請求項２６】
脱水組成物を用いる治療方法であって、
治療を意図する哺乳動物の種から選択され凍結乾燥された血小板を準備し、この血小板が生物学的性質を保存すべくトレハロースで有効に充填されていること、及び
前記凍結乾燥された血小板を前記選択された哺乳動物の種の創傷又は火傷に適用することからなる方法。
【請求項２７】
前記凍結乾燥された血小板が生体適合性のある基材上に担持されている、請求項２６の方法。
【請求項２８】
前記凍結乾燥された血小板が、創傷又は火傷への適用に先立って再水和される、請求項２６の方法。
【請求項２９】
前記凍結乾燥された血小板が、適用に先立って、水分が飽和された空気中で予備水和される、請求項２６の方法。
【請求項３０】
前記予備水和に続き、前記予備水和された凍結乾燥血小板が再水和される、請求項２９の方法。
【請求項３１】
前記予備水和が約３７℃において、約１時間から約３時間にわたって行われる、請求項２９の方法。
【請求項３２】
前記予備水和が、前記凍結乾燥された血小板の水分含量を約３５重量％から約５０重量％の間とするのに十分なものである、請求項２９の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は一般に、血小板の治療的使用に関し、より詳しくは、適用時に再水和可能であり、再水和された場合にトロンビンその他のアゴニストに対し、新鮮血小板に関するのと同様の正常応答を有する凍結乾燥組成物を調製するといったように、血小板を操作又は変性することに関する。本発明の組成物は、輸注治療、止血助剤、及び薬剤の伝達などの用途に有用である。
【０００２】
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられた許可第ＨＬ６７８１０−０３の下に政府の助成を受けてなされた。政府は本発明に対し、所定の権利を保有する。
【０００３】
【従来の技術】
血液輸注センターは、輸注のための濃縮血小板を製造するについて、相当のプレッシャーの下にある。血小板に対する需要が莫大であるため、この血液成分を保存することが必要になる。というのは、血小板は止血に対する重要な寄与因子だからである。血小板は一般に、楕円形から球形の形状を有し、２−４μｍの直径を有する。今日、富血小板血漿濃縮物は、血液バッグ中に２２℃で保存されている。しかしながら、こうした条件下での貯蔵寿命は、５日間に限定されている。貯蔵の間の血小板機能の急激な喪失、及び細菌汚染のリスクによって、濃縮血小板の分配や利用可能性は複雑なものになっている。血小板は、低温で活性化される傾向がある。活性化されると、血小板は実質的に、輸中治療のような用途には役立たなくなる。従って、血小板の寿命期間を増大させる保存方法の開発が望まれる。
【０００４】
過去数十年にわたり、幾つかの血小板保存技術が開発されてきた。凍結保護物質として種々の薬剤、例えばグリセリン（Ｖａｌｅｒｉら、Ｂｌｏｏｄ， ４３， １３１−１３６， １９７４）又はジメチルスルホキシド即ち「ＤＭＳＯ」（Ｂｏｃｋら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ， ３５， ９２１−９２４， １９９５）を用いた血小板の冷凍保存は、ある程度の成功を収めている。最良の結果は、ＤＭＳＯで得られている。しかしながら、こうした冷凍保存された細胞のかなりの部分は、解凍後に部分的に溶解し、また形状は風船形である。こうした風船形の細胞は、種々のアゴニストに対して応答せず、冷凍され解凍された血小板の各種のアゴニストに対する全体的な応答性は、新鮮血小板と比較して３５％未満に減少してしまう。−８０℃で冷凍保存されたＤＭＳＯ血小板の貯蔵寿命は１年と報告されているが、凍結保護剤を除去するために相当の洗浄と処理を必要とし、またそうしてさえも、最終製品は凝固（血餅）の生成能力が大幅に低下する。
【０００５】
凍結乾燥によって血小板を乾燥する試みが、パラホルムアルデヒドで固定した血小板について記載されている（Ｒｅａｄら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９２， ３９７−４０１， １９９５）。Ｒｅａｄらを発明者とする１９９９年５月１１日発行の米国特許第５，９０２，６０８号は、外科用助剤を記載し、特許請求している。これは基材を含み、その上に固定された乾燥血小板が担持されている。こうした乾燥血小板は、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、又は過マンガン酸塩などの固定液に対して血小板を接触させることによって、固定されている。これらの固定剤によって固定された凍結乾燥血小板が、止血に際して適切に機能するか否かは疑問である。
【０００６】
１９９８年４月７日に発行されたＳｐａｒｇｏらの米国特許第５，７３６，３１３号は、血小板が一晩かけて剤で、好ましくはグルコースで充填され、次いで凍結乾燥されることからなる方法を記述している。この血小板は予備培養バッファ中で予備培養され、次いで約１００ｍＭから約１．５Ｍの範囲の濃度を有する炭水化物、好ましくはグルコースで充填される。培養は、約１０℃から約３７℃、最も好ましくは約２５℃で行われることが教示されている。
【０００７】
１９９８年１０月２７日にＢｅａｔｔｉｅらに発行された米国特許第５，８２７，７４１号は、ジメチルスルホキシド及びトレハロースのような、人の血小板のための凍結保護物質を開示している。血小板は例えば、凍結保護物質を含有する溶液中に約２２℃の温度で懸濁され、次いで１５℃未満に冷却される。これにより、幾らかの凍結保護物質が細胞中に取り込まれる。
【０００８】
トレハロースは、ほぼ完全な脱水をも乗り切ることができる、種々多様な生物中に高濃度で見出される二糖である（Ｃｒｏｗｅら、Ａｎｈｙｄｒｏｂｉｏｓｉｓ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ５４， ５７９−５９９， １９９２）。これまでにトレハロースは、凍結及び乾燥に際してある種の細胞を安定化させることが示されている（Ｌｅｓｌｉｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １１９２， ７−１３， １９９４、Ｂｅａｔｔｉｅら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ， ４６， ５１９−５２３， １９９７）。
【０００９】
他の研究者たちは、真空下で乾燥を行う前に電気穿孔法を用いて、血小板にトレハロースを充填させることを試みている。しかしながら、電気穿孔法は細胞膜に対して非常にダメージを与え、また血小板を活性化させると考えられる。活性化された血小板は、疑わしい臨床値を有する。
【００１０】
血小板はまた、１９９８年６月２日にＧｕｒｅｗｉｃｈを発明者として発行された米国特許第５，７５９，５４２号で議論されているように、種々の疾病の治療において、薬剤を運搬する用途に用いることが示唆されている。この特許は、血小板の外側の膜に結合されたウロキナーゼ型のプラスミノーゲン活性化物質のＡ鎖を含む、融合剤から形成される複合体の調製について開示している。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
従って、血小板がその生物学的性質、特にトロンビンなどの血小板アゴニストに対する応答を維持又は保存するように、また大規模で商業的に実現可能なスケールで実施できるようにして、血小板を有効且つ効率的に保存する必要性が存在する。さらに、薬剤のカプセル化に有用で、標的部位まで薬剤を運ぶのに用いられている、現在のビヒクルの種類を拡張することもまた役に立つ。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明の１つの側面では脱水組成物が提供され、これは凍結乾燥及び再水和に際して生物学的性質を保存するために、トレハロースが有効に充填された凍結乾燥血小板からなる。こうした血小板は、トロンビンなどの少なくとも１つのアゴニストに対して正常応答を示すように再水和可能である。例えば、本発明による実質的に全ての凍結乾燥血小板は、再水和されトロンビン（１Ｕ／ｍｌ）と混合された場合に、３７℃において３分以内に凝固（血餅）を生成する。脱水組成物は、所望とする治療用途に応じて、抗生物質、抗カビ剤、成長因子その他の、１又はより多くの他の剤を含むことができる。
【００１３】
本発明の別の側面では止血助剤が提供され、そこにおいては上記の凍結乾燥血小板が、生体適合性のある表面上に、或いはそれによって担持される。この止血助剤の第３成分としては、抗生物質、抗カビ剤、又は成長因子その他の治療剤がある。生体適合性のある表面は、包帯又は凍結乾燥されたコラーゲンなどのトロンビン性表面である。こうした止血助剤は、適用時点の直前に、血小板が担持された表面を水和させることによって再水和可能である。或いは緊急時には、乾燥した止血治療助剤を創傷又は火傷に対して直接適用し、現場で水和させることができる。
【００１４】
本発明の具体例を作成し、使用する方法もまた記載される。こうした方法の１つは、脱水組成物の調製方法であり、これは血小板供給源を準備し、この血小板をトレハロースで有効に充填して生物学的性質を保存し、トレハロースが充填された血小板をその凝固点より低い温度に冷却し、冷却された血小板を凍結乾燥することからなる。トレハロースでの充填は、約５０ｍＭまでのトレハロースを含有するトレハロース溶液を用いて、約２５℃より高く約４０℃よりも低い温度で、血小板を培養することを含む。こうした脱水組成物を使用する方法は、血小板を再水和することをさらに含んでなることができる。この再水和は好ましくは予備水和ステップを含み、予備水和ステップでは凍結乾燥血小板が、温かい、水分で飽和された空気に対して、凍結乾燥血小板の水分含量を約３５重量％から約５０重量％の間とするのに十分な時間にわたって曝露される。
【００１５】
本発明のさらに別の側面では、薬剤伝達組成物が提供される。これは、均一に分布したある濃度の治療剤を内部に有する血小板を含む。この薬剤伝達組成物は特に、血小板媒介部位をカプセル化された薬剤の標的とするのに有用である。
【００１６】
本発明の実施は、血小板の操作又は変性を可能にしながらも、トロンビンに対する応答などの生物学的性質を維持又は保存させる。また、血小板の保存に対するこの方法の使用は、大規模な、商業的に実現可能なスケールで行うことができ、血小板の活性化を回避させる。本発明の凍結乾燥血小板、及びこの凍結乾燥血小板を含む止血助剤は、水分遮蔽材料で包装された場合、周囲温度で実質的に貯蔵安定である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明の組成物及び実施形態には、操作され（例えば凍結乾燥により）又は変性され（例えば薬剤が充填され）、特に血小板輸注治療などの治療的用途、傷当て材、包帯、及び縫合糸などの外科用又は止血助剤として、及び薬剤伝達用のビヒクルとして有用な、血小板が含まれる。知られているように、人の血小板は１２℃と２０℃の間で相転移を有する。本発明者らは、血小板が３０℃と３７℃の間で第２の相転移を有することを見出した。本発明者らによるこの第２の相転移の温度範囲の発見は、薬剤伝達のためのビヒクルとして血小板を使用する可能性を示唆する。なぜなら血小板に対して種々の有用な治療剤を、血小板の外側膜などの変化といった、血小板の正常応答に干渉する異常を生ずることなしに充填できるからである。
【００１８】
例えば血小板には、抗トロンビン薬剤、例えば組織プラスミノーゲン活性化物質（ＴＰＡ）を充填して、心臓発作などの場合に血小板が血栓部位に集まって、血小板によってカプセル化され標的に運ばれる「凝固破壊」薬剤の１種又は複数種を放出するようにできる。抗生物質もまた血小板によってカプセル化可能である。なぜなら細菌によって産生されるリポ多糖は、血小板を誘引するからである。抗生物質が充填された血小板は、炎症部位に対して選択された抗生物質を運搬する。充填可能な他の薬剤には、抗細胞分裂剤及び抗脈管形成剤が含まれる。血小板は、腫瘍に関連して新たに形成された血管中を循環するから、抗細胞分裂剤を局所的に伝達することができ、また同様に、腫瘍の新生血管中を循環する血小板は抗脈管形成剤を付与して、腫瘍に対する血液供給を阻止することができる。このようにして、本発明により、選択された薬剤が充填された血小板を、治療的応用のために調製し、使用することができる。薬剤が充填された血小板は特に、血小板が媒介し血栓や血管損傷を形成している部位を標的として薬剤が選択される場合など、血流搬送式の薬剤伝達を考慮したものである。かくして充填された血小板は、少なくとも１つのアゴニスト、特にトロンビンに対して正常応答を有する。凍結乾燥による保存を意図する場合には、このような血小板には付加的にトレハロースを充填することができる。
【００１９】
本発明の組成物及び装置の鍵となる構成成分は、保存を凍結乾燥により行う場合はオリゴ糖、好ましくはトレハロースである。これは、本発明者らが見出したところでは、トレハロースが有効に充填された血小板は、凍結乾燥（及び再水和）に際して生物学的性質を保存するためである。この生物学的性質の保存、例えばトロンビンと組み合わせた場合の正常凝固応答は、保存後に血小板を種々の治療的応用に成功裡に使用できるようにするために必要である。
【００２０】
正常止血は、血小板が寄与する相互作用の結果であり、損傷した血管壁に対する血小板の粘着から始まる。血小板は凝集を形成し、これが凝固を促進する。糖タンパク質（ＧＰ）１ｂ−ＩＸ−Ｖ複合体と呼ばれる複合体は、有力なアゴニストであるαトロンビンのための結合部位を血小板表面にもたらすことによって、血小板の活性化に関与する。αトロンビンは、損傷した組織から放出されるセリンプロテアーゼである。従って、本発明による操作及び変性が、血小板を活性化しないことが重要である。また、血小板が休止状態にあることが、通常は好ましい。そうでなければ、血小板は活性化される。
【００２１】
考慮している治療的応用の殆どについては、トロンビンに対する凝固応答が鍵となるが、本発明の凍結乾燥血小板は再水和の後、トロンビン以外の他のアゴニストにも応答する。こうしたものにはコラーゲン、リストセチン、及びＡＤＰ（アデノシン二リン酸）があり、これらはすべて、通常の血小板アゴニストである。こうした他のアゴニストは典型的には、血小板表面にある特異なレセプタに関連する。
【００２２】
広く言えば、本発明による保存型血小板の調製は、血小板供給源を準備するステップ、この血小板を約２５℃より高く約４０℃よりも低い温度で保護用オリゴ糖で充填するステップ、充填された血小板を−３２℃未満に冷却するステップ、及び血小板を凍結乾燥するステップからなる。
【００２３】
本発明の保存プロセスに適した血小板の供給源を提供するために、血小板は好ましくは全血から分離される。従って、本発明で用いられる血小板は好ましくは、凍結乾燥に先立って、他の血液成分（赤血球及び白血球）が除去されている。これら他の血液成分の除去は、典型的には遠心分離ステップを含む、技術的に周知の手順によって行うことができる。
【００２４】
本発明の血小板内部に充填される好ましいトレハロースの量は約１０ｍＭから約５０ｍＭであり、約５０ｍＭまでのトレハロースを含有するトレハロース溶液でもって、凍結乾燥に際して生物学的性質を保存すべく血小板を培養することによって達成される。培養中のトレハロース濃度がより高いことは、後でより詳しく説明するように好ましくない。トレハロースの有効な充填はまた、約２５℃より高く約４０℃よりも低い、好ましくは約３０℃から約４０℃より低い、最も好ましくは約３７℃の、上昇された温度を用いることによって達成される。これは、血小板の第２の相転移を発見したことに基づく。図１に見られるように、トレハロースの充填効率は、約２５℃より高く約４０℃までの培養温度において、急激な傾斜で増大を始める。外部溶液（即ち充填バッファ）中におけるトレハロースの濃度、及び培養中の温度は相俟って、基本的に液相エンドサイトーシス（即ち飲作用）を通じて生ずると思われる、トレハロースの取り込みをもたらす。飲作用による小胞は時間が経つと溶解するが、これは結果的に血小板中へのトレハロースの均一な分布を生じ、血小板を活性化せず、また大規模製造に適用可能である。図２は、培養時間の関数としての、トレハロース充填効率を例示している。
【００２５】
これらの図のさまざまの面から看取できるように、特に好ましい実施形態を調製するに当たっては、血小板にはトレハロースが、３７℃で約４時間にわたって培養することにより充填される。充填バッファ中におけるトレハロース濃度は好ましくは３５ｍＭであり、これは細胞内トレハロース濃度として大体２０ｍＭに帰着するが、何れにせよ最も好ましくは、トレハロースは約５０ｍＭを越えない。約５０ｍＭ未満のトレハロース濃度においては、血小板は正常な形態学的外観を有する。
【００２６】
人の血小板は、１２℃から２０℃の間で相転移を有する。本発明者らが見出したところでは、この相転移を経て血小板が凍結された場合、充填量は比較的劣る。従って、本発明者らのある者が共同発明者となっている米国特許第５，８２７，７４１号に記載の方法を実行する場合、血小板中には比較的穏当な量のトレハロースしか充填できない。
【００２７】
この出願では、本発明者らは血小板の相転移についてさらに研究し、３０℃と３７℃の間の第２の相転移を見出した。本発明者らが獲得した、約３７℃における優れた充填は、何らかの形でこの第２の相転移に関連していると考えられる。理論によって限定されるものではないが、本発明者らは飲作用もまた関与していると考えるが、恐らくはこの第２の相転移それ自体が、高い温度における飲作用を刺激しているのであろう。他のオリゴ糖についても、トレハロースと同様の量でこの第２の相転移において充填された場合は、類似の効果が奏されるであろう。
【００２８】
何れにせよ、血小板をゆっくりと冷却するとそれらが活性化されることが周知であるという事実に鑑みれば、充填を高い温度で行うことができるのは幸運である。こうした緩やかな冷却は、トレハロースを導入するために第１の、即ちより低温の、２０℃から１２℃の間での相転移を用いるについての条件である（Ｔａｂｌｉｎら、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １６８， ３０５−３１３， １９９６）。かくして本発明者らの相対的に高温での充填は、その機構に関わらず、充填の増大をもたらすと共に、驚くべきことに活性化の問題を回避するという両方の点で、思いも寄らない利点をもたらす。
【００２９】
図６に転ずると、本発明者らが別の、より大きな分子を血小板に充填したことが看取されよう。図６においては、例示的な大きな分子（ＦＩＴＣデキストラン）が血小板に充填された。これは、本発明者らがトレハロース及びＦＩＴＣデキストランについて行いうることを示したように、第２の相転移を用いることにより、多種多様な水溶性の治療剤を血小板に充填可能であることを示しているが、その一方で特徴的な血小板表面のレセプタは依然として維持され、また血小板の活性化は回避される。
【００３０】
本発明者らは本発明を実施することにより、４時間の培養の後に最大６１％という値で充填効率を達成した。４時間後も、まだ飽和には達しなかった。トレハロースのこの高い充填効率は、トレハロースが飲作用による小胞中に局在化されているのではなく、均一に分布していることを強く示しており、また本発明者らは、他の治療剤の充填についても同様の効果を予想している。外部濃度２５ｍＭにおける６１％という充填効率は、細胞質ゾル濃度で１５ｍＭに相当する。トレハロースが０．１マイクロメートルのエンドソーム中に局在化されているだけだとすると、小胞数は１０００を越えるであろう。このような大きな数の小胞が血小板中に、他の血小板のオルガネラに隣接して存在しているとは思われない。そこで本発明者らは、飲作用による小胞は、細胞質中に溶解するものと考える。その結果として、小さな小胞中への断続的な充填ではなく、トレハロースの均一な分布が生ずる。また、３０℃と３７℃の間の相転移に基づいて、トレハロースが膜を通過することも考えられる。
【００３１】
本発明者らが見出したところでは、エンドサイトーシス的な取り込み経路は、糖の濃度が約０．１Ｍを越えると閉鎖される。従って本発明者らは、充填バッファ中で約５０ｍＭより高い糖濃度を使用しないことを好む。なぜなら本発明者らは、この値より大きなある点において、血小板の膨潤及び形態学的な変化を見出したからである。しかして本発明者らは、７５ｍＭのトレハロース中３７℃において、約４時間の培養後に血小板が膨潤したことを見出した。また、５０ｍＭよりも高い濃度では、内部のトレハロース濃度は減少し始める。本発明とは対照的に、Ｓｐａｒｇｏらの米国特許第５，７３６，３１３号により教示された血小板方法は、炭水化物の充填を約１００ｍＭから開始し、１．５Ｍまで増加させる。上記のように、本発明者らが見出したところでは、高濃度の充填バッファは、少なくともトレハロースについて、膨潤及び形態学的な変化をもたらす。
【００３２】
トレハロースによる血小板の有効な充填は、少なくとも約２時間、好ましくは少なくとも約４時間培養することで行うのが好ましい。この充填の後、血小板はその凝固点より低く冷却され、凍結乾燥される。
【００３３】
凍結前に、血小板は休止状態に置かれねばならない。休止状態になければ、血小板は恐らく活性化する。血小板を休止状態に置くためには、種々の適当な剤、例えばカルシウムチャネル遮断剤などを用いることができる。例えば、アデニン、アデノシン又はイロプロストの溶液は、この目的のために好ましい。別の好ましい剤はＰＧＥ１である。乾燥前に、血小板が膨潤しておらず、完全に休止状態にあることが重要である。血小板が活性化されればされる程、凍結乾燥中にそれらが損傷を受ける可能性は大きくなる。
【００３４】
血小板にトレハロースが有効に充填された後、休止状態にある場合に、充填バッファは除去され、血小板に乾燥バッファが接触される。トレハロースの充填後の血小板の乾燥は、適当な水分置換分子（又は乾燥バッファ）、例えばアルブミンを含有する溶液中に血小板を懸濁することによって実行できる。アルブミンを使用する場合には、血小板と同じ種に由来するものでなければならない。乾燥バッファもまた、好ましくは約１００ｍＭまでの量で、トレハロースを含有しているべきである。乾燥バッファ中のこのトレハロースは、血小板を空間的に分離させ、外側の血小板の膜を安定化させるのに役立つ。乾燥バッファはまた好ましくは、バルキング充填剤（血小板をさらに分離させるための）を含有する。既に記述したように、アルブミンはバルキング充填剤として役立つが、他のポリマーも同様の効果を伴って使用することができる。好適な他のポリマーには、例えば、水溶性ポリマーとしてＨＥＳやデキストランがある。
【００３５】
乾燥バッファ中のトレハロースが充填された血小板は次いで、約−３２℃より低い温度に冷却される。冷却、つまり冷凍の速度は好ましくは−３０℃／分から−１℃／分の間にあるのが好ましく、より好ましくは約−２℃／分から−５℃／分の間にある。
【００３６】
凍結乾燥ステップは好ましくは、約−３２℃より低い温度、例えば約−４０℃で実行され、乾燥は血小板から水分の約９５重量％が除去されるまで継続することができる。凍結乾燥の最初の段階では、圧力は好ましくは約１×１０−６Ｔｏｒｒである。試料が乾燥するにつれて、温度は−３２℃よりも高くに上げることができる。試料の嵩、温度及び圧力に基づいて、気化する水分の喪失を最大化するために最も効率的な温度の値は何かを、実験的に求めることができる。凍結乾燥された本発明の組成物は、約５重量％よりも少ない水分を有するのが好ましい。
【００３７】
凍結乾燥された血小板はそれ自体で使用することができ、生理学的に受容可能な溶液に溶解しても用いられ、或いは凍結乾燥血小板を担持する表面を備える生物学的に適合性のある（生体適合性）構造又は基材の構成部分をなすことができる。凍結乾燥血小板は例えば、治療用途のための生体適合性構造に適した多種多様の既知で有用な材料に対してコーティングとして適用し、或いは含浸させることができる。上記した米国特許第５，９０２，６０８号は例えば、外科用助剤、傷当て材、包帯、縫合糸、補綴器具その他として有用な、数多くの材料について記述している。例えば縫合糸は、モノフィラメント又は編糸（ブライド）であり、生分解性又は非生分解性であり、ナイロン、絹、ポリエステル、綿、ガット、ホモポリマー、グリコライドとラクタイドのコポリマーなどの材料からなる。ポリマー材料はまた、薄膜として流延（キャスト）し、傷当て材として使用すべく殺菌し包装することができる。包帯は、綿その他の、傷に対して適用し又は傷を覆うのに適した繊維からなる織布又は不織布といった、何らかの適当な基材材料から作成することができる。また任意に裏当て材を含むことができ、また任意に、包帯を傷を覆って固定させるために、その表側の表面に接着領域を１つ又はより多く含むことができる。
【００３８】
凍結乾燥血小板は、それ自体の形態であろうと、生体適合性の構造又は基材の構成部材としてであろうと、また任意に他の乾燥又は凍結乾燥した成分を含んでいようと、所望の時点までは再水和を防止するように包装される。この包装は、治療目的の種々の適当な包装の何れであっても構わない。例えば包装は箔、メタライズされたプラスチック材料、及び水分遮断性プラスチック（例えば高密度ポリエチレン又はＳｉＯｘのような材料を用いて生成されたプラスチックフィルム）などから作成されたものであり、トレハロースが充填された血小板を凝固点より低く冷却し、冷却された血小板を凍結乾燥するのに用いられる。トレハロースの充填は、約５０ｍＭまでのトレハロースを含有するトレハロース溶液を用いて、約２５℃より高く約４０℃より低い温度で血小板を培養することを含む。脱水組成物を使用する方法は、血小板を再水和することを含む。再水和は好ましくは、凍結乾燥血小板の水分含量を約３５重量％から約５０重量％とするのに十分な、予備水和ステップを含む。
【００３９】
再構築が望まれる場合には、水分で飽和された空気中での凍結乾燥血小板の予備水和に続いて、再水和を行うことが好ましい。予備水和を用いると、より密な外観を示す細胞を収集でき、風船状の細胞は存在しない。以前に凍結乾燥されており、予備水和されてなる本発明の血小板は、新鮮血小板に類似する。これは例えば図７に示されている。看取されるように、以前に凍結乾燥されていた血小板は、新鮮血小板のように見える状態まで復元可能である。
【００４０】
予備水和ステップの前には、血小板を乾燥バッファ中で希釈して、予備水和と再水和に際しての凝集を防止するのが好ましい。約３×１０８セル／ｍｌ未満の濃度であれば、最終的な回復は約７０％であり、目に見える凝集は生じない。予備水和は好ましくは水分で飽和された空気中で行われ、最も好ましくは約３７℃で約１時間から約３時間にわたって行われる。この好ましい予備水和ステップは、凍結乾燥血小板の水分含量を約３５重量％から約５０重量％の間とする。
【００４１】
予備水和された血小板は次いで、完全に再水和されうる。再水和は、意図する用途に応じて、何らかの水性溶液で行うことができる。１つの好ましい再水和において、本発明者らは血漿を用いたが、これは約９０％の回復を達成した。
【００４２】
凍結乾燥血小板が再び水和される場合、血小板を希釈して凝集を防止することが多くの場合に好ましいから、特定の臨床的応用に際しては、血小板を濃縮することが所望又は必要になる。濃縮は、何らかの在来手段、例えば遠心分離によって行うことができる。一般に、再水和された血小板組成物は好ましくは１ｍｌ当たりに１０６から１０１１個の血小板を有し、より好ましくは１ｍｌ当たり１０８から１０１０個の血小板を有する。
【００４３】
血小板を凍結乾燥する従来の試みとは対照的に、本発明者らが本書で開示しているのは、非常に簡単な充填、凍結乾燥及び再水和プロトコルによって、再水和の後でも形態学的に完全で、トロンビンに対して新鮮血小板と同一の応答を有する血小板を得ることができる、ということである。さらに、この応答を与えるためのトロンビンの濃度は、生理学的濃度、つまり１Ｕ／ｍｌである。
【００４４】
例えば図８のパネル（Ａ）には新鮮血小板による凝固（血餅）生成が例示され、パネル（Ｂ）には本発明に従って保存され再水和された血小板によるそれが例示されている。トロンビンに対して３分間曝露した後に判定した細胞数は、新鮮血小板及び本発明による予め凍結乾燥された血小板の双方について、ゼロであった。
【００４５】
図９は、凝集測定器で測定した凝固（血餅）をグラフで示している。この装置を用いると、凝固（血餅）が形成された場合に透過率の変化を測定することができる。血小板の初期濃度は２５０×１０６血小板／ｍｌであり、次いでトロンビン（１Ｕ／ｍｌ）を添加して、凝集測定器を用いて凝固（血餅）の生成を監視した。吸光度は急激に降下し、細胞数は３分後に２×１０６血小板／ｍｌ未満に低下したが、これは新鮮血小板をコントロールとして行った試験の結果に匹敵するものであった。
【００４６】
本発明で使用する血小板は好ましくは、凍結乾燥に先立って他の血液成分が除去されてなるものであるが、本発明の組成物及び装置はまた、種々の追加的な治療剤を含むことができる。例えば、特に止血用途を対象としている実施形態では、血小板と混合することによって、抗カビ剤及び抗菌剤を血小板に含有させるのが有用である。こうした実施形態はまた、凍結乾燥されたコラーゲンを含む混合物又は組成物を包含するが、これは血小板に対し、トロンビン性の表面をもたらす。例えばプロテオグリカンからなる成分など、凍結乾燥された細胞外基質をもたらすことのできる他の成分も使用可能である。本発明の実施形態に含めることのできるさらに他の治療剤には、成長因子がある。実施形態においてこれらの他の成分又は混合物が含められる場合、それらは好ましくは乾燥形態であり、最も好ましくはやはり凍結乾燥されている。本発明者らはまた、本組成物の治療的な使用をも考慮しているが、その場合には追加の治療剤が血小板に対し、水和された形で取り入れられ、又は混合される。先に述べたように、血小板はまた、薬剤伝達の用途において、薬剤をカプセル化するように調製可能である。トレハロースがやはり血小板の内部に充填されているならば、そのような薬剤カプセル化された血小板は、先に述べたようにして凍結乾燥することができる。
【００４７】
血小板は、治療を意図する哺乳動物の種（例えば人、馬、犬、猫、又は絶滅危惧種）から、最も好ましくは人から選択される。
【００４８】
血小板を備えた止血助剤を適用することによって治療される怪我には、擦過傷、創傷、火傷、及び器官や皮膚組織の手術中に生ずる傷などが含まれる。本発明の血小板は、そうした怪我や傷の位置へと何らかの適当な手段によって適用又は伝達することができる。例えば本発明の実施形態を火傷に対して適用すると、かさぶたの発現、血管の成長を誘発する基質、及び最終的には火傷を覆って復元する皮膚細胞に関する走化性勾配の形成が促進される。
【００４９】
輸注治療については、本発明の組成物は薬学的処方として再構成（再水和）され、静脈注射によって人の患者に投与される。こうした薬学的処方には、血小板を再水和するのに適した何らかの水性キャリヤ（例えば、バッファや再構成処方中に含有させることのできる他の治療的に活性な剤を含む、殺菌された生理食塩水）を含めることができる。薬剤の伝達については、本発明の組成物は通常、静脈注射などによって、血流中に投与される。
【００５０】
本発明の側面について、以下では実施例によって例示的に説明するが、これらは本発明を限定することを意図したものではない。実施例その他で用いた略称は次の通りである。
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド
ＡＤＰ＝アデノシン二リン酸
ＰＧＥ１＝プロスタグランジンＥ１
ＨＥＳ＝ヒドロキシエチル澱粉
ＥＧＴＡ＝エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’四酢酸
ＴＥＳ＝Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸
ＨＥＰＥＳ＝Ｎ−（２−ヒドロキシルエチル）ピペラリン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）
ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水
ＨＳＡ＝ヒト血清アルブミン
【００５１】
【実施例】
例１
血小板の洗浄
サクラメントの血液センター又は本発明者らの研究所内のボランティアから、濃縮血小板を得た。富血小板血漿を８分間、３２０×ｇで遠心分離して、赤血球及び白血球を除去した。上清をペレット化し、バッファＡ（１００ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＥＧＴＡ，１０ｍＭイミダゾール，ｐＨ６．８）中で２回洗浄した（４８０×ｇで２２分間、４８０×ｇで１５分間）。血小板数は、ＣｏｕｌｔｅｒカウンタＴ８９０（米国フロリダ州マイアミのＣｏｕｌｔｅｒ社製）によって測定した。
血小板中へのルシファ・イエローＣＨの充填
蛍光染料であるルシファ・イエローＣＨ（ＬＹＣＨ）を、溶質による膜の浸透を示す標識として用いた。１−２×１０９血小板／ｍｌの濃度の洗浄した血小板を、１−２０ｍｇ／ｍｌのＬＹＣＨの存在下に、種々の温度で培養した。培養温度と培養時間は、指示に従って選択した。培養後、血小板懸濁液は１４０００ＲＰＭで２０秒間スピンダウンし（机上遠心器）、バッファＡに再度懸濁し、バッファＡ中で２０秒間スピンダウンし、再度懸濁させた。血小板数は、Ｃｏｕｌｔｅｒ社製のカウンタで測定し、試料はペレット化した（１４０００ＲＰＭで４５秒間遠心分離、机上遠心分離器）。ペレットは０．１％のトリトンバッファ（１０ｍＭ ＴＥＳ，５０ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ６．８）中に溶解させた。溶解物の蛍光は、パーキン・エルマー社製のＬＳ５分光蛍光測定器で、４２８ｎｍ（ＳＷ １０ｎｍ）の励起及び５３０ｎｍ（ＳＷ １０ｎｍ）の発光で測定した。各試料についての取り込みは、溶解物バッファ中におけるＬＹＣＨの標準曲線を用いて、細胞当たりのＬＹＣＨのナノグラム数として計算した。ＬＹＣＨの標準曲線は、２０００ｎｍ／ｍｌまでリニアであることが見出された。
細胞に結合されたルシファ・イエローの視覚化
ＬＹＣＨが充填された血小板を、蛍光顕微鏡分析用にセットされたフルオレセインフィルタを用いて、蛍光顕微鏡（ツァイス社製）によって観察した。血小板は、培養直後、又はバッファ中１％のパラホルムアルデヒドで固定した後に検討した。固定した細胞は、ポリＬ−リシンでコーティングしたカバースライド上に沈降させ、グリセリン中に配置した。
血小板へのトレハロース充填
１−２×１０９血小板／ｍｌの濃度の洗浄した血小板を、１−２０ｍｇ／ｍｌのトレハロースの存在下に、種々の温度で培養した。培養温度は、４℃から３７℃の間で選択した。培養時間は、０．５から４時間にわたり変化させた。培養後、血小板溶液はバッファＡ中で２回洗浄した（机上遠心分離器で１４０００ＲＰＭで２０秒間遠心分離）。血小板数はＣｏｕｌｔｅｒ社製のカウンタで測定した。血小板はペレット化し（１４０００ＲＰＭで４５秒間遠心）、８０％メタノールを用いてペレットから糖を抽出した。これらの試料を３０分間、８０℃で加熱した。メタノールを窒素で蒸発させ、試料は乾燥状態で保存し、分析前にＨ２Ｏに再度溶解した。血小板中のトレハロースの量は、アントロン反応（Ｕｍｂｒｅｉｔら、Ｍａｍｏｍｅｔｒｉｃ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９７２）を用いて定量した。即ち試料を３ｍｌのＨ２Ｏと６ｍｌのアントロン試薬（１リットルの硫酸中に溶解した２ｇのアントロン）に溶解する。渦流で混合した後、試料を沸騰水浴中に３分間置く。次いで試料を氷上で冷却し、パーキン・エルマー社製の分光光度計で吸光度を６２０ｎｍで測定した。血小板に結合されたトレハロースの量は、トレハロースの標準曲線を用いて判定した。トレハロースの標準曲線は、試験管当たり６から３００μｇのトレハロースについてリニアであることが見出された。
トレハロース及びＬＹＣＨ濃度の定量
各試料について取り込み量を、血小板当たりのトレハロース又はＬＹＣＨのマイクログラム数として計算した。内部のトレハロース濃度は、血小板の半径が１．２μｇであり、また血小板の容積の５０％が細胞質ゾルによって占められている（残りは細胞膜）と仮定して計算した。充填効率は、細胞質ゾルのトレハロース又はＬＹＣＨの濃度と、充填バッファ中の濃度から求めた。
【００５２】
図１は、人の血小板中へのトレハロースの充填効率に対する温度の影響を、４時間の培養時間と５０ｍＭの外部トレハロースの場合について示している。トレハロースの取り込みに対する温度の影響は、ＬＹＣＨの取り込みの場合に類似した挙動を示している。トレハロースの取り込みは、２２℃及びそれ未満の温度では比較的少ない（５％未満）が、３７℃ではトレハロースの充填効率は４時間後に３５％である。
【００５３】
３７℃におけるトレハロースの取り込みを時間を追って見た場合、２相の曲線が観察される（図２）。トレハロースの取り込みは最初は緩やかである（０から２時間について２．８×１０−１１モル／ｍ２ｓ）が、２時間を越えると３．３×１０−１０モル／ｍ２ｓで迅速にリニアな取り込みを行うことが観察される。４時間の培養時間後には、充填効率は６１％まで増大する。この高い充填効率は、トレハロースが飲作用による小胞中に局在化しているのではなく、血小板全体に均一に分布していることを強く示す証左である。
【００５４】
外部トレハロース濃度の関数としてのトレハロースの取り込みが、図３に示されている。トレハロースの取り込みは、外部トレハロース濃度が０から３０ｍＭの範囲についてリニアである。最も高い内部トレハロース濃度は、外部トレハロース濃度が５０ｍＭの場合に得られている。５０ｍＭよりも高い濃度では、内部トレハロース濃度は再び減少する。こうした高いトレハロース濃度では、充填バッファの塩濃度を調節して等張性を補正したとしても、充填効率は低いままである。７５ｍＭのトレハロース濃度では、４時間の培養後に血小板は膨潤した。
【００５５】
顕微鏡及びフローサイトメトリー分析を用いて、４時間の培養時間の間の血小板の安定性を調べた。２５ｍＭの外部トレハロースの存在下では、３７℃における４時間の血小板培養の後、形態学的な変化は観察されなかった。血小板のフローサイトメトリー分析により、血小板の個体群は４時間の培養時間にわたり、非常に安定であったことが示された。微小小胞によりゲートされる細胞の相対比率が安定であった（３％未満）ことにより、４時間の培養後に、微小小胞の形成の徴候が観察されなかったことが判定された。通常、微小小胞の形成は、血小板の活性化の最初の徴候であると考えられている（Ｏｗｎｅｒｓら、Ｔｒａｎｓ． Ｍｅｄ． Ｒｅｖ．， ８， ２７−４４， １９９４）。血小板の活性化に特徴的な抗原には、糖タンパク質５３（ＧＰ５３、リソソーム膜標識）、ＰＥＣＡＭ−１（血小板内皮細胞付着分子１、アルファ顆粒の成分）、及びＰ−セレクチン（アルファ顆粒膜タンパク質）などがある。
例２
血小板の洗浄
血小板は、本発明者らの研究所のボランティアから得た。富血小板血漿を８分間、３２０×ｇで遠心分離して、赤血球及び白血球を除去した。上清をペレット化し、バッファＡ（１００ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＥＧＴＡ，１０ｍＭイミダゾール，１０μｇ／ｍｌ ＰＧＥ１，ｐＨ６．８）中で２回洗浄した（４８０×ｇで２２分間、４８０×ｇで１５分間）。血小板数は、ＣｏｕｌｔｅｒカウンタＴ８９０（米国フロリダ州マイアミのＣｏｕｌｔｅｒ社製）によって測定した。
血小板へのトレハロース充填
血小板にトレハロースを、例１で記載したようにして充填した。１−２×１０９血小板／ｍｌの濃度の洗浄した血小板を、３５ｍＭのトレハロースを添加したバッファＡ中で、３７℃において培養した。培養時間は、典型的には４時間であった。試料は１時間毎に１分間、緩やかに撹拌した。培養後、血小板溶液はペレット化し（マイクロ遠心器中で２５秒間）、乾燥バッファ（９．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１４２．５ｍＭ ＮａＣｌ，４．８ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＣｌ２，３０ｍＭ トレハロース，１％ヒト血清アルブミン，１０μｇ／ｍｌ ＰＥＧ１）中に再度懸濁した。凝集の試験では、乾燥バッファ中にはＰＥＧ１は添加しなかった。トレハロースは、ファンスティール社から入手した。３０％のヒト血清アルブミンはシグマ社から入手した。
凍結及び乾燥
典型的には０．５ｍｌの血小板懸濁液を２ｍｌのＮｕｎｃ社製低温用バイアルに入れ、ＣｒｙｏＭｅｄ社の制御付き凍結装置にて冷凍する。バイアル（小瓶）は２２℃から−４０℃へと、−３０から−１℃／分の速度、通常は−５から−２℃／分の速度で冷凍した。冷凍した溶液は−８０℃のフリーザーに移し、少なくとも１時間半はそこに保管した。次いで凍結した血小板懸濁液は真空フラスコに入れ、Ｖｉｒｔｉｓ社の凍結乾燥装置に装着した。フラスコを凍結乾燥装置に装着した直後に、真空度が２０×１０−６Ｔｏｒｒに戻るまで試料が凍結したまま保持されるように液体窒素中に保持し、その後試料は昇化温度にまで温度上昇するようにされた。凝縮器の温度は−４５℃であった。こうした条件の下で、試料中の熱電対で測定した試料の温度は、一次乾燥に際して約−４０℃であった。一次乾燥中の賦形のために、試料をＴｇ未満に維持することが重要である（トレハロースについては−３２℃）。
再水和
最初に０．５ｍｌの血小板懸濁液を入れたバイアルを、１ｍｌのＰＢＳバッファ／水（１／１）中で再水和した。ＰＢＳバッファは、９．４ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４，０．６ｍＭのＫＨ２ＰＯ４，１００ｍＭのＮａＣｌからなる。幾つかの実施例ではＰＧＥ１を１０μｇ／ｍｌの濃度で再水和バッファに添加し、又は再水和を血漿／水（１／１）中で行った。
予備水和
閉じたボックス中で、水分で飽和された空気を用い、３７℃において血小板凍結乾燥物を予備水和した。予備水和時間は０から３時間であった。
回復
凍結乾燥され（予備）再水和された血小板の数的な回復を、ＣｏｕｌｔｅｒカウンタＴ８９０（米国フロリダ州マイアミのＣｏｕｌｔｅｒ社製）による細胞数を、乾燥前と再水和後で比較することによって判定した。再水和された血小板の形態は、光学顕微鏡を用いて観察した。この目的で、血小板は２％のパラホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドに固定し、ポリＬ−リシンでコーティングされたカバースライド上に、４５分間にわたり沈降させた。その後、カバースライドを顕微鏡に装着し、観察した。凍結乾燥され再水和した血小板の光学濃度は、１．０×１０８細胞／ｍｌの血小板懸濁液の吸光度を５５０ｎｍで、パーキン・エルマー社製の吸光分光計を用いて測定することによって判定した。
凝固の研究
乾燥した血小板を、水と１／１の比率で稀釈した血小板を含まない血漿（血漿を３８００×ｇで５分間遠心）の２アリコートで再水和した（２時間の予備水和の後に）。この血小板懸濁の０．５ｍｌのアリコートを、磁気スターラを備えた凝固キュベットに入れた。３７℃において、撹拌しながらこの血小板懸濁に対してトロンビン（１Ｕ／ｍｌ）を添加することにより、トロンビンに対する血小板の応答を試験した。３分後、トロンビンを添加した血小板懸濁液を、凝固（血餅）に関して観察し、ＣｏｕｌｔｅｒカウンタＴ８９０を用いて細胞数をカウントした。
【００５６】
乾燥バッファ中の細胞濃度が１０９細胞／ｍｌの場合、直接の再水和は細胞の溶解を招きやすく、予備水和は凝集を生じやすい。本発明者らはまた、予備水和され再水和される血小板の回復は、乾燥バッファ中の細胞濃度に依存していることを見出した。細胞濃度が３×１０８細胞／ｍｌより高い場合、回復率は非常に低い値に低下する。３×１０８細胞／ｍｌより低い濃度では、回復率は７０％前後であり、凝集は見られなかった。予備水和はより高い細胞密度をもたらし、また風船状の細胞は存在しない。
【００５７】
９０分よりも長い予備水和時間は、細胞密度にそれ以上の改善をもたらすことはなく、血小板を僅かに活性化する。ペレット中の水分含量は、予備水和時間の増大と共に増大し、再水和の時点で約３５％から５０％の間にあるのが好ましい。５０％よりも高い水分含量においては、凍結乾燥物中に水滴が見られる（血小板が非常な高張状態にあることを意味する）。
【００５８】
例１によって示されるように、３５ｍＭのトレハロースを含有するバッファＡ中で４時間にわたり３７℃で培養されると、血小板にはトレハロースが充填され、細胞内トレハロース濃度が１５−２５ｍＭの血小板がもたらされる。培養後、血小板は、３０ｍＭのトレハロースと主たる賦形剤として１％のＨＳＡを有する乾燥バッファに移される。
【００５９】
直接的に再水和された血小板は、数値的には高い８５％という回復率を示すが、細胞のかなりの部分（２５−５０％）が部分的に溶解しまた風船状の形態を有していた。直接的に再水和された血小板は全体的に、新鮮血小板と比較するとより密でない。
【００６０】
水分で飽和された空気中で予備水和された血小板の数値的な回復率は、乾燥バッファ中の細胞濃度が１０９細胞／ｍｌの場合、僅かに２５％である。この低い回復率は、予備水和中に形成された凝集物に起因する。しかしながら、凝集していない細胞は、直接的に再水和された血小板よりも密であり、新鮮血小板のそれに類似していた。
【００６１】
予備水和に際しての凝集を防止するために血小板の稀釈を行うことが望ましいようであるから、臨床応用については、再水和に続いて血小板の濃縮を行うことが必要になろう。本発明者らはそこで、再水和された血小板の遠心分離に遠心分離に対する安定性について試験し、直接的に再水和された血小板は遠心分離後の回復率が５０％であるのに対し、予備水和された血小板は遠心分離後の回復率が７５％であることを見出した。これより本発明者らは、本発明の血小板は、悪影響なしに濃縮可能であるとの結論を導いた。
例３
本発明者らは、トレハロースは乾燥バッファ中における主たる凍結保護物質であると考えている。しかしながら、乾燥バッファ中の他の成分、例えばアルブミンもまた、回復率を向上させうる。乾燥バッファ中の外部トレハロースがなければ、数値的な回復率は僅かに３５％である。乾燥バッファ中のトレハロースが３０ｍＭであると、回復率は６５％前後である。３０ｍＭのトレハロースと１％のアルブミンの組み合わせにより、８５％という数値的な回復率が与えられる。
例４
典型的には０．５ｍｌの血小板懸濁液を２ｍｌのＮｕｎｃ社製低温用バイアルに入れ、ＣｒｙｏＭｅｄ社の制御付き凍結装置にて冷凍した。バイアル（小瓶）は２２℃から−４０℃へと、−３０から−１℃／分の速度、通常は−５から−２℃／分の速度で冷凍した。冷凍した溶液は−８０℃のフリーザーに移し、少なくとも１時間半はそこに保管した。次いで凍結した血小板懸濁液は真空フラスコに入れ、Ｖｉｒｔｉｓ社の凍結乾燥装置に装着した。フラスコを凍結乾燥装置に装着した直後に、真空度が２０×１０−６Ｔｏｒｒに戻るまで試料が凍結したまま保持されるように液体窒素中に保持し、その後試料は昇化温度にまで温度上昇するようにされた。凝縮器の温度は−４５℃であった。こうした条件の下で、試料中の熱電対で測定した試料の温度は、一次乾燥に際して約−４０℃であった。一次乾燥中の賦形のために、試料をＴｇ未満に維持することが重要である（トレハロースについては−３２℃）。凍結速度の関数としては、回復には僅かな相違しか見られなかった。最適な凍結速度は２℃から５℃／分の間にあることが見出された。
例５
トロンビン（１Ｕ／ｍｌ）に対する凍結乾燥した血小板の応答を、新鮮血小板のそれと比較した。何れの試料中でも、血小板の濃度は０．５×１０８細胞／ｍｌであった。５００μｌの血小板溶液を凝固バイアルに入れた。トロンビンを試料に添加し、試料を３７℃で３分間撹拌した。新鮮血小板及び凍結乾燥した血小板の何れについても、３分後に測定された細胞数はゼロであった。トロンビンに対する応答は、糖タンパク質１ｂ（ＧＰ１ｂ）中での分割によって判定した。これはモノクローナル抗体と、フローサイトメトリー分析によつて検出した。しかして、トロンビンの添加後に見られたパターンでは、血小板表面のＧＰ１ｂの量は低減されていた。
【００６２】
凍結乾燥され、予備水和され、そして再水和された血小板（例１及び例２）の、トロンビン（１Ｕ／ｍｌ）に対する応答は、新鮮血小板のそれと同一であることが見出された。新鮮血小板及び再水和された血小板の何れについても、３７℃で３分以内に凝固（血餅）が形成された。これらの凝固を図８のパネル（Ａ）及び（Ｂ）によって示す。Ｃｏｕｌｔｅｒカウンタで細胞数の測定を行った結果、本発明者らは細胞が存在していないことを見出したが、これはパネル（Ｂ）に示されているように、全ての血小板が凝固形成に関与したことを示している。
例６
他のアゴニストとの反応を調べた。本発明の血小板の血小板懸濁液を、５０×１０６血小板／ｍｌで準備した。次いで種々のアゴニストを添加し、次いでＣｏｕｌｔｅｒカウンタでカウントして、視覚的に観察可能な凝固形成に関与した血小板の割合を判定した。細胞数のカウントは、２ｍｇ／ｍｌのコラーゲンとの反応では５分後に、２０μＭのＡＤＰとの反応では５分後に、また１．５ｍｇ／ｍｌのリストセチンとの反応でも５分後に、０から２×１０６血小板／ｍｌであった。
【００６３】
これは、試験した全てのアゴニストについて、凝固形成に関与した血小板の割合が９５−１００％であったことを意味している。使用したアゴニストの濃度は、全て生理学的濃度であった。全ての場合について、凝固を生じた血小板の割合は、新鮮なコントロール血小板の場合と同じであった。
【００６４】
以上においては本発明を好ましい特定の実施例に関連して説明したが、以上の説明及び実施例は、例示を行うことを意図したものであって本発明の範囲を限定するためのものではなく、本発明の範囲は特許請求の範囲によって規定されるものであることが理解されねばならない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
人の血小板について、培養温度に対してプロットしたトレハロースの充填効率をグラフ的に示す。
【図２】
培養に続いての、トレハロースが充填された人の血小板の割合を、培養時間の関数としてグラフ的に示す。
【図３】
人の血小板の内部トレハロース濃度を外部のトレハロース濃度に対して、一定の３７℃の温度における時間の関数としてグラフ的に示す。
【図４】
人の血小板中へのトレハロースの充填効率を、外部のトレハロース濃度の関数としてグラフ的に示す。
【図５】
種々のトレハロース濃度について、凍結乾燥と直接の再水和の後の、乾燥バッファ中における血小板回復の実施例を、乾燥バッファ中における３０ｍＭのトレハロース及び１％のＨＳＡと組み合わせてグラフ的に示す。
【図６】
外部濃度と比較してのＦＩＴＣデキストランの取り込みを、マーカーであるＬＹＣＨのそれと比較してグラフ的に示す（培養時間は４時間）。
【図７】
血小板の光学濃度に対する予備水和の効果をグラフ的に示す。
【図８】
凝固バイアル（小瓶）に移し替えられ、各サンプルにトロンビン（１Ｕ／ｍｌ）が添加され、サンプルを３７℃で３分間撹拌してなる、５００μｌの血小板溶液（血小板濃度は０．５×１０８セル／ｍｌ）の応答を示す。パネル（Ａ）は従来技術による血小板であり、パネル（Ｂ）は本発明による血小板である。
【図９】
凝固の生成をグラフ的に示す。吸光度はトロンビン（１Ｕ／ｍｌ）の添加に際して急激に低下し、本発明の血小板についての血小板濃度は、２５０×１０６血小板／ｍｌから３分後に２×１０６血小板／ｍｌまで低下した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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