(57)【要約】器官（４０）又は組織をほぼ正常な代謝速度に維持するための血液を含まない代謝支持システムが開示される。このシステムは、コンテナー（３３）を含む器官室（３２）及び灌流及び／又は移送の間にコンテナー（３３）内で器官（４０）が移動するのを抑えるように適合された支持体（３６）を用いる。この器官室（３２）は灌流溶液の静脈流出を受け且つ器官（４０）の外部表面と静脈流出との接触を防止するための導管（４３）をさらに含む。器官の生産物を受けるための導管（４７）は灌流の間に機能性の器官（４０）から生ずる器官生産物の採取を可能にする。器官室（３２）を使用すれば、移植のための器官の長期維持、温阻血損傷を受けたと思われる器官の蘇生及び活発な修復のため、及び摘出された器官の輸送のために必要な構成成分の新たな合成又は継続した合成が支えられる。
2004529938.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
器官（４０）を保存するためのシステムに使用する器官室（３２）であって、該室が
コンテナ（３３）、
コンテナ（３３）内で器官（４０）を支えるためのコンテナ（３３）内に配置できる少なくとも一つの弾力性のある支持体（３６）を含むものであり、
器官（４０）が弾力性のある支持体の上に置かれたときに、器官（４０）がコンテナ（３３）内で動くのを防ぐため、支持体（３６）が器官（４０）の外部表面部分に適合するものである、器官室。
【請求項２】
支持体（３６）が流体を充填した袋を含むものである、請求項１記載の器官室（３２）。
【請求項３】
支持体（３６）がゲルを充填した袋を含むものである、請求項１記載の器官室（３２）。
【請求項４】
支持体（３６）がガスを充填した袋を含むものである、請求項１記載の器官室（３２）。
【請求項５】
支持体（３６）が器官（４０）の腎臓に適合するものである、請求項１記載の器官室（３２）。
【請求項６】
支持体（３６）が器官（４０）の心臓に適合するものである、請求項１記載の器官室（３２）。
【請求項７】
支持体（３６）が器官（４０）の肝臓に適合するものである、請求項１記載の器官室（３２）。
【請求項８】
支持体（３６）が器官（４０）の膵臓に適合するものである、請求項１記載の器官室（３２）。
【請求項９】
器官（４０）からの保存溶液の静脈流出を受け取るための、そして該流出が器官（４０）の外部表面に接触するのを防ぐための、器官（４０）に接続できる導管（４３）を更に含む、請求項１記載の器官室（３２）。
【請求項１０】
器官（４０）からの保存溶液の静脈流出を受け取るための、そして該流出が器官室（３２）の内部表面に接触するのを防ぐための、器官（４０）に接続できる導管（４３）を更に含む、請求項１記載の器官室（３２）。
【請求項１１】
導管（４３）からの静脈流出を受け取るための貯蔵槽（３８）を更に含む、請求項１０記載の器官室（３２）。
【請求項１２】
器官の生産物を受け取るための器官（４０）に接続可能な導管（４７）を更に含む、請求項１記載の器官室（３２）。
【請求項１３】
室（３２）が温保存システムに接続可能である、請求項１記載の器官室（３２）。
【請求項１４】
貯蔵槽（３８）、熱交換器（１４）、酸素供給器（２０）、及びポンプ（１２）のうちの少なくとも一つを更に含む、請求項１記載の器官室（３２）。
【請求項１５】
循環している灌流溶液の少なくとも一つのパラメータを監視するための少なくとも一つのセンサーを更に含む、請求項１記載の器官室（３２）。
【請求項１６】
該パラメータが流速、ｐＨ、ＰａＯ2、ＰａＣＯ2、温度、血管圧、及び代謝指標から選択されるものである、請求項１５記載の器官室（３２）。
【請求項１７】
該代謝指標が酸素消費、ブドウ糖消費、少なくとも一つのクエン酸回路成分の消費、及びＣＯ2生産から選択されるものである、請求項１６記載の器官室（３２）。
【請求項１８】
器官（４０）を保存するためのシステムに使用される器官室（３２）であって、
コンテナ（３３）、
コンテナ（３３）内で器官（４０）を支えるための、コンテナ（３３）内に設置可能な支持体（３６）で、コンテナ（３３）内で器官（４０）が動くのを防ぐように適合された該支持体（３６）、及び、
静脈流出が器官（４０）の外部表面に接触するのを防ぐように該流出を送達する導管（４３）、
を含む器官室。
【請求項１９】
温保存溶液を器官（４０）に送達するための灌流導管（４２）を更に含む、請求項１８記載の器官室（３２）。
【請求項２０】
保存溶液から器官生産物を分けて採取するための導管（４７）を更に含む、請求項１８記載の器官室（３２）。
【請求項２１】
器官室を温保存システムに取外し可能なように接続するためのコネクターをさらに含む、請求項１８記載の器官室（３２）。
【請求項２２】
貯蔵槽（３８）、熱交換器（１４）、酸素供給器（２０）、及びポンプ（１２）のうちの少なくとも一つを更に含む、請求項１８記載の器官室（３２）。
【請求項２３】
保存溶液のパラメータの少なくとも一つを監視するための少なくとも一つのセンサーを更に含む、請求項１９記載の器官室（３２）。
【請求項２４】
該パラメータが流速、ｐＨ、ＰａＯ2、ＰａＣＯ2、温度、血管圧、及び代謝指標から選択されるものである、請求項２３記載の器官室（３２）。
【請求項２５】
該代謝指標が酸素消費、ブドウ糖消費、少なくとも一つのクエン酸回路成分の消費、及びＣＯ2生産から選択されるものである、請求項２４記載の器官室（３２）。
【請求項２６】
支持体（３６）が成人の大きさの腎臓の輪郭に適応するよう形成された空洞を含む硬い素材を含むものである、請求項１８記載の器官室（３２）。
【請求項２７】
支持体（３６）が小児の大きさの腎臓の輪郭に適応するよう形成された空洞を含む硬い素材を含むものである、請求項１８記載の器官室（３２）。
【請求項２８】
コンテナ（３３）が器官（４０）内を循環した灌流溶液を受け取るための貯蔵槽（３８）を更に含むものである、請求項１９記載の器官室（３２）。
【請求項２９】
器官（４０）を保存する方法であって、
器官（４０）の移動を防ぐように適合された支持体（３６）の上に器官を配置する工程、及び、
温保存溶液で器官（４０）を灌流する工程
を含む方法。
【請求項３０】
器官（４０）の機能的特性を監視する工程を更に含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
器官を温保存溶液で灌流する工程、該保存溶液が器官の外部表面と接触するのを防ぐように保存溶液の静脈流出を器官から離して方向付ける工程を含む、器官の保存方法。
【請求項３２】
器官（４０）の輸送方法であって、
器官（４０）の損傷を阻害するのに十分な時間、ほぼ正常な代謝速度で器官（４０）を維持できる温保存システムの器官室（３２）内で器官（４０）を灌流する工程、
器官室（３２）を保存システムから取り出す工程、
器官（４０）を冷却する工程、及び、
器官（４０）を輸送する工程
を含む方法。
【請求項３３】
該器官室（３２）が、
コンテナ（３３）、
コンテナ（３３）内で器官（４０）を支えるためのコンテナ（３３）内に設置可能な支持体（３６）であって、コンテナ（３３）内で器官（４０）の移動を防ぐように適合された支持体（３６）、及び、
静脈流出を送達するための、そして該流出が器官（４０）の外部表面に接触するのを防止するための導管（４３）
を含むものである、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
温保存システムに器官（４０）を含む器官室（３２）を再設置する工程、及び器官（４０）を灌流する工程を更に含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
架橋されたポリヘモグロビン、複合ヘモグロビン、組換えヘモグロビン及びペルフルオロ化合物から選択される酸素運搬体を含む、温保存システムに用いられる保存溶液。
【請求項３６】
該複合ヘモグロビンがポリエチレングリコール複合ヘモグロビンである、請求項３５記載の保存溶液。
【請求項３７】
該ポリエチレングリコール修飾ヘモグロビンがヒトのヘモグロビン又は非ヒトヘモグロビンである、請求項３６記載の保存溶液。
【請求項３８】
該非ヒトヘモグロビンがウシヘモグロビンである、請求項３７記載の保存溶液。
【請求項３９】
該非ヒトヘモグロビンがウマヘモグロビンである、請求項３６記載の温保存溶液。
【請求項４０】
該ポリエチレングリコール修飾ヘモグロビンが組換えヘモグロビンである、請求項３５記載の温保存溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ほぼ生理的な条件の下で移植用の器官を維持するための溶液、方法及び装置を含む代謝支持システムに関する。より具体的には、本発明はこのシステムの器官室、及び、移植用器官の活性修復及び／又は長期間の維持、移植後の器官機能の予測、器官の一時的な冷蔵保存のための準備、及び移植を意図された器官の輸送に要求される総合的な機能を支える際における該器官室の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
移植用器官が極度に不足し続けている。現在、臨床移植における主な律速因子は器官の持続的な不足である。例えば腎臓移植は、心拍のある死亡したドナーから回収された器官の利用可能性に大きく依存する。しかしながら、まだ利用されていない移植用器官の大きな供給源がある。即ち、心拍停止した死体である。心拍停止した死体は、負傷部位のため死に至り、外傷後の生存時間が短い事故の犠牲者である。さらに、心拍停止した死体では、生命維持装置を停止させると同時に亡くなった人の器官を提供するという決心を家族が感情的にできないという結果になる。このような状況では、その器官はいったん心臓が鼓動を停止すると循環血液の供給が不足し（温阻血）、傷害カスケード（injury cascade）を生ずるため使用されない。
【０００３】
僅かだが機能上に温阻血による損傷を受けた器官は、移植用の器官を保存するために現在用いられている低体温状態により媒介される更なる損傷に耐えることができない。このような条件下では、脂質二重層は位相変化を受け、流動性を大幅に失ったゲル状になる。細胞膜内の完全に凍った脂質はＯ2張力の利用を打ち消す。その代謝の結果は解糖であるが、これは酸素欠乏の状態と類似している。１８℃より低いと低体温は腎臓の尿細管と腎糸球体の活動を阻害し、４℃では酸素の利用効率が正常体温時のそれの約５％であると記述されてきた。
【０００４】
低体温保存はまた、器官内で血管痙攣に続いて水腫を引き起こすことがある。低体温で保存された器官は腎糸球体内皮細胞の腫脹と尿細管の壊死に伴う血管完全性の喪失を受けることがある。これは採用した低体温条件に起因する現象である。低体温はまた、Ｎａ／Ｋ依存ＡＴＰアーゼを阻害でき、その結果細胞容積調節能力を失わせることができる。容積調節の喪失は細胞の腫脹及び損傷を引き起こすものである。酸素の十分な供給はこの腫脹の量を積極的に減少させない。何故なら細胞膜が完全に凍結し、酸素の効果的な利用を妨げるからである。適切な酸素の送達がないと、酸素欠乏症は数時間の灌流後にさらに小さな血管の崩壊をもたらす。酸素不足とそれに続くＡＴＰ貯蔵の枯渇は、伝統的な保存条件の下では嫌気的解糖が主要なエネルギー源であることを意味する。その後のヌクレオシドの損失は、恐らくは温阻血及び長期間の冷阻血を受けた組織が血液供給を回復させた後にＡＴＰを再生できないことにおける極めて重大な要因であろう。適切に酸素を供給できないことが器官保存のために機械的に低体温に頼る結果となった。温阻血の場合、循環停止は酸化的リン酸化反応のための分子状酸素が存在しないという酸素欠乏をもたらす。分子状酸素の欠乏はミトコンドリア内でＮＡＤＨの蓄積とＡＴＰ貯蔵の涸渇をもたらす。
【０００５】
従って、阻血（温阻血であろうと冷阻血であろうと）は前致死期（prelethal phase）、及び致死期（lethal phase）として特徴付けることができる事象の傷害カスケードである。前致死期は三通りの有害な効果、即ち低酸素症、栄養不良、及び有毒な代謝廃棄物の除去の失敗を引き起こす。循環血液の欠乏に伴い分子酸素が欠乏する。その結果生じる低酸素症は、ミトコンドリア内におけるＡＴＰ貯蔵の欠乏などのエネルギー貯蔵の欠乏を誘発する。ＡＴＰ欠乏は水腫、正常な細胞完全性の喪失、及び細胞膜極性の喪失を含む細胞変化をもたらす。この細胞変化は代謝廃棄物の蓄積、プロテアーゼの活性化、及び細胞死を招く阻血の致死期を誘発する。
【０００６】
現在の低体温器官保存における最先端技術を代表し、低体温条件における最適な器官保存を提供する灌流溶液は、移植後の器官の機能を促進する代謝産物、低体温で誘発される組織の水腫を防ぐ成分、抗酸化剤、膜安定化剤、コロイド、イオン、及び塩を含む（非特許文献１，非特許文献２を参照）。この灌流液の処方は、低体温で誘発される代謝の低下により器官を保存するように設計される。これは低体温での貯蔵中に通常直面する水腫及び血管痙攣を最小限にするが、実質的に拡大されたドナープールの利用を提供するものではない。
【０００７】
これは、温阻血により損傷を受けた器官又は組織が低体温により媒介される更なる損傷に耐えることができないという事実に起因するものである。３０分以内の阻血でさえ、器官の移植後の機能は危うくすることがある。例えば、心拍のある死体から得た器官（損傷なし）を使用すると、即時不全率（immediate nonfunction rate）は２５％と推定される。わずか３０分以内の温阻血では即時不全率は約６０％にまで上昇する。従って、心拍が停止した死体から得た腎臓の６０％は、前致死阻血傷害のため即時に機能しない。さらに、不可逆的な阻血損傷及び傷害は、ほんの数時間以内に器官の血流喪失をもたらすと考えられている（特許文献１を参照）。新たな器官供給源を開発できない限り、移植手順の数は変わらないであろう。また、温阻血で損傷を受けた器官又は組織における前致死期の阻血損傷を修復するための入手可能なプロセス／システムがないため、ドナープールは実質的に拡大できない。
【０００８】
最近、血流の停止直後に溶液を介在させることによる阻血損傷の防止への努力が重点的に行われている。例えば、米国特許第４，４１５，５５６で開示された保護溶液は、外科手術の間に用いられたり、器官の阻血損傷を防ぐために移植される器官に用いられたりする。この保護溶液は、器官の灌流中の好気的代謝を促進するための灌流液として使用される。米国特許第５，３９５，３１４は、血液供給を妨害した後に、器官代謝をより低くし、酸素を供給し、且つ遊離基損傷を阻害するように設計された低体温保存溶液（約８℃〜１０℃）を脳を通して循環させることにより、脳を蘇生させる方法を記載している。
【０００９】
このような方法及び保存溶液は、器官における阻血損傷を防ぐのに有益であるが、これらの有益な効果は実用的制限及び機能的制限のため割り引かざるを得ない。第一に、このような方法及び溶液が阻血損傷を防ぐのに有効であるためには、血液供給の妨害の直後（数分以内）に適用しなければならない。事故の犠牲者が器官ドナーになる場合のように、物流の制約がこのような方法及び溶液の使用を厳しく制限する。例えば、阻血傷害カスケードが始まる事故現場や救急車の中では、これらを用いることは非現実的である。第二に、不可逆的な阻血損傷及び傷害は、数分で（例えば、脳）又はわずか数時間以内（心臓、腎臓）に、器官に血流の喪失が起こると思われる。温阻血によりわずかだが機能的に損傷を受けた器官又は組織は、移植前の低体温保存又は移植後の血流の回復により媒介される更なる損傷に耐えることができない。阻血−再灌流後の血液循環の回復が逆説的に更なる組織の損傷をもたらす結果となりうることが一つの理由である（非特許文献３を参照）。再灌流の間、阻血損傷を受けた組織への酸素再添加は、酸素遊離基の形成、遊離基スカベンジャーの喪失、及び走化成物質の放出により、更なる組織傷害が惹起される結果となる。
【特許文献１】
クラッツらへの、米国特許  第５，３９５，３１４号公報。
【非特許文献１】
サウスアードら、Transpl. 49: 251, 1990。
【非特許文献２】
サウスアード、Transpl. Proc. 21: 1195, 1989。
【非特許文献３】
マクコードら、N Engl J Med 312: 159-163, 1985。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、最初の器官洗浄に有益であって且つ移植用器官をイン・サイチュ又はエクス・ビボ保存するための灌流液として有益な保存溶液を含むシステムが必要とされている。このシステムは温阻血に起因する損傷を最小化し、事実上修復し、且つ、ほぼ正常な代謝速度で器官を持続させる温保存技術を採用するものである。このシステムの可搬性及び自動化は、特にこのシステムが生命維持の停止前又は直後に生体内で、又は心停止が起こった事故後に外部で、器官の保存を開始するのに用いられる状況ではとりわけ重要である。
【００１１】
発明の概要
一つの側面では、本発明は器官、組織又は解剖による切除部分（section of anatomy）を、身体の循環系の外部で又は少なくとも循環系とは隔離してほぼ正常な代謝状態で維持するための血液を含まない代謝サポートシステムに関する。該システムは、灌流中に生成される器官の生産物を回収する手段を有する器官を保持する器官室、器官をほぼ正常な代謝状態に維持できる温灌流溶液を循環させ再生するための一つ以上の灌流液経路を含む灌流送達部分システム、呼吸用ガス及び灌流液のｐＨを調節するための制御されたガス発生部分システム、灌流液の温度を制御するための温度制御器、及び灌流液の様々なパラメータを監視する監視部分システムを含む。
【００１２】
関連する側面では、本発明は灌流溶液の様々なパラメータの監視がマイクロプロセッサで制御される監視部分システムに関する。このようなシステムはマイクロプロセッサ、及び灌流液の流路に配置され、マイクロプロセッサと連動して灌流溶液の温度、ｐＨ、気圧、流速、ＰａＯ2、ＰａＣＯ2及び容積モル浸透圧濃度のうち少なくとも一つを感知し、検知した情報をマイクロプロセッサに提供するセンサーを含むであろう。
【００１３】
別の側面では、本発明は器官を保存するための血液を含まない代謝サポートシステムで用いる器官室であって、一つのコンテナ、コンテナ内で器官を支えるためコンテナ内に配置可能な少なくとも一つの支持体（support member）を含む器官室に関するものであり、この支持体は、器官室内で器官が動くのを抑えるように設計されている。一つの実施態様では、本発明の支持体は、ガス袋、液体袋、又はジェルを充填した袋のような、器官の外部表面部分に適合する弾力性のある支持体である。別の実施態様では、これは器官の外部表面部分に合うように輪郭を合わして作られた空洞を含む堅い支持体である。器官は、成人ドナー又は小児ドナーから得た心臓、肝臓、腎臓、膵臓、肺又はその他の組織であり得る。
【００１４】
該器官室は、器官を通って循環する灌流溶液の静脈流出を器官から貯蔵庫に直接送る導管（conduit）、器官の生産物を灌流液から分離して回収するための導管、灌流溶液の流速、ｐＨ、ＰａＯ2、ＰａＣＯ2、温度、血管圧、及び酸素消費、ブドウ糖消費、クエン酸回路成分の少なくとも一つの消費、ＣＯ2生産などの代謝指標から選択される灌流液の少なくとも一つのパラメータを監視する少なくとも一つのセンサーを更に含む。
【００１５】
また別の側面では、本発明は少なくとも一つの温保存システムのコンポーネント、例えば貯蔵槽、熱交換器、酸素供給器、及び／又はポンプを更に含む器官室に関する。または、本発明の器官室は、器官室を外部の温保存システムに取り外しできるように接続するためのコネクターを含む。
【００１６】
また別の側面では、本発明は、コンテナ内で器官が動くのを防ぐように設計された弾力のある支持体の上にコンテナ内の器官を配置する工程を含む、器官の保存方法に関する。この器官は次に、本発明の代謝サポートシステムなどの温保存システムに接続され、ほぼ正常な代謝速度で器官を維持できる温保存溶液を用いて灌流される。
【００１７】
別の関連する側面では、本発明は本発明の血液を含まない代謝サポートシステムのような器官室を含む温保存システムに器官を固定させ維持する工程、及びこの器官の機能的完全性を監視する工程を含む、移植用の器官又は組織を維持する方法に関する。
【００１８】
別の側面では、本発明は、能動的修復過程が結果として起こるのに十分なデノボ合成の継続をサポートする温灌流システムと併用した本発明の器官室の使用に関する。
【００１９】
別の側面では、本発明は本明細書に記載されたもののような器官室に器官を固定させる工程、器官の損傷を防ぐのに十分な時間、ほぼ正常な代謝速度で器官を維持できる本明細書に記載された血液を含まない代謝サポートシステムのような器官室を含む第一の温保存システム中で器官を灌流する工程、及び温保存システムから器官室を切り離しそして器官を含む器官室を出荷及び輸送するために冷蔵又は冷却包装する工程を含む器官の輸送方法に関する。必要であれば、移植場所に着いた際に、該器官を温灌流して移植者に移植される前にこの器官の機能の完全性を監視できるように、該器官を含む器官室を第二の温保存システムに固定することができる。
【００２０】
また別の関連する側面では、本発明は器官を温保存溶液で灌流し、この保存溶液が器官の外部表面に触れないよう保存溶液の静脈流出の向きを器官から離す工程を含む器官の保存方法に関する。
【００２１】
また別の側面では、本発明はポリエチレングリコールで修飾したヘモグロビンを含む血液を含まない代謝サポートシステムで採用される温保存溶液に関する。このヘモグロビンは起源がヒトでも動物でも組換え体であってもよい。
【００２２】
発明の詳細な説明
数々の灌流装置が他で記載されている。例えば、米国特許第５，８５６，０８１号、５，７１６，３７８号、５，３６２，６２２号、５，３５６，７７１号、５，３２６，７０６号、４，１８６，５６５号及び３，９９５，４４４号に記載されている。しかしながら、温保存溶液を採用し、進行中の器官の代謝及び移植を意図される器官の発揮する機能をサポート及び制御できるものはない。そうするためには、本明細書に記載されたもののような代謝サポートシステム（ＥＭＳ）で器官の自然の営みを維持及び制御しなければならない。本発明のＥＭＳ灌流システムは、必要に応じて器官の回復するのに必要な、及び器官による酸化的代謝をサポートするのに必要な全ての構成要素を含む温灌流溶液を送達する。この灌流システムはまた、栄養素と化学エネルギー基質の連続的な供給を確実にし代謝の副産物を除去するため、灌流溶液を再処理する。さらに、このＥＭＳは温度、血管圧、灌流流速、ＯｓＭ、ｐＨ、ＰａＯ2、ＰａＣＯ2、栄養素送達及び老廃物の除去を含む様々な灌流パラメータを監視し制御する。
【００２３】
以下の記述では、用語の使用に当たって一定の慣例に従う。用語「器官、組織又は解剖による切除部分」は本発明のＥＭＳなどで維持される、身体の切除された生存能力のある部分及び全ての部分を指し、腎臓、心臓、肝臓、肺、小腸、膵臓、脳、目、皮膚、手足、又は四半部を含むがこれに限定しない無傷の器官を指す。用語「器官生産物」は器官の分泌機能の結果として形成される任意の物質、大抵は流体、例えば肝臓から出る胆汁、腎臓から出る尿を指すが、腎臓濾過や心臓ポンプ輸送などの機構的機能をも含む。
【００２４】
用語「保存溶液」、「灌流溶液」、「灌流物」は互換性をもって用いられ、摘出する前又はその間に阻血損傷を受けたであろう器官における細胞の完全性及び機能を回復させる手段を提供し、更に器官又は組織をほぼ正常な代謝速度で維持することを可能にする血液を含まない緩衝化生理的溶液を指す。用語「血液を含まない」は実質的に全血又はその個々の構成成分を含む灌流物を排除することを意図する。しかしながら本発明の灌流溶液は、最小量の全血又は血液構成成分、例えば赤血球、血清又はプラズマを含む場合がある。
【００２５】
用語「ほぼ正常な速度の代謝」及び「ほぼ正常な代謝速度」は、米国特許第５，６９９，７９３号に記載されたような器官の機能的特性がある特定の器官にとっての正常機能と言える範囲内にあるかどうかを測定及び評価して決定されたとき、ある特定の器官の正常な代謝速度の約７０〜１００％として定義する。機能的特性の例は、心電図で測定されたときの心臓の電気活動、器官産物の物理的及び化学的パラメータ、例えば灌流物濃度から確認できる酸素消費及びブドウ糖利用、膵酵素、心臓酵素、クレアチニン・クリアランスと濾過機能、及び尿の比重などを含むが、これらに限定されない。
【００２６】
用語「治療物質」は器官又は組織で機能的、合成的、代謝的、免疫原性的、又はゲノム的変化を生じさせるのに用いられる全ての分子を指す。これらには、ウイルス性ベクター、リポソーム、エピソーム、裸のＤＮＡ、センス分子かアンチセンス分子のいずれか、ＲＮＡ、化学療法薬、シオキン（cyokines）及びケモキン（chemnokines）などの生物製剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００２７】
本発明のプロセスは、所望の組織（単数又は複数）を養う血液の動脈供給源の除去又は遮断により、生理的システムの残りから器官、組織又は解剖学上の特定部位を摘出する工程を含む。同様に、器官又は解剖による切除部分からの静脈流出を遮断し、静脈廃流を回収する。もしこの組織が完全に身体から切り離されれば、組織の神経遮断（enervation）及びリンパ腺もまた切り離される。次に、血液及び血液産物を除去するため、この器官又は組織を約２５℃〜３７℃で本発明の溶液で動脈系内を通して洗い流す。続いてこの組織を本発明の血液を含まない代謝サポートシステムに入れ、本発明の溶液で灌流する、その間この溶液の様々なパラメータをこのシステムで監視し、器官及び組織の適切な代謝を維持するのに必要なように調節する。例えば、尿や胆汁などの器官の生産物を回収し、器官生産物の物理的及び化学的パラメータがその特定の器官にとっての正常機能に関する範囲内にあるかどうかを評価することにより、器官の機能も監視される。本発明は従って、器官の機能的状態を評価するための部分システムを任意選択的に含み得る。このように、器官の機能はインライン検知手段及びインラインテスト方法論を用いて監視される。
【００２８】
摘出した器官又は解剖による切除部分を本発明に従って約２５℃から３７℃のほぼ生理的な温度の溶液で灌流すると、様々な機能が働く。この灌流は細胞環境を生理的ｐＨに維持し、ほぼ正常な酸素化、温度、及び容積モル浸透圧濃度を維持する。この灌流は高分子に対する組織の正常なバリア機能を維持し、これにより安定した灌流圧と安定した脈管構造流速が結果として得られる。該灌流は脈管構造を適切に拡張して満たし、摘出された器官又は解剖による切除部分でのほぼ正常な代謝レベルを維持する適切な栄養要素を送達し、高エネルギー化合物を供給して人為的に遮断された好気的代謝を支える。この灌流はブドウ糖、ピルビン酸、ウリジン５−三リン酸（ＵＴＰ）を含む場合があるがこれらに限定されない補助的基質で進行中の酸化的代謝を支える。この進行中の酸化的代謝はアデニン化合物の貯蔵を維持することにより更に支えられる。クエン酸回路と電子伝達系は、摘出された器官と組織での代謝サポートと機能を継続させるための適切な基質の送達を提供することで支えられる。本発明の方法及び溶液で支えられる進行中の代謝は適切な代謝産物と栄養素を提供し、緊密な細胞機能と正常な膜極性で組織の完全性を維持する。
【００２９】
本発明の方法及びシステムは、器官又は解剖による切除部分の中の血液の除去し、血管及び細胞周辺（pericellular）の空間を本発明の溶液で再び満たすことを可能にする。更に、このシステムはｐＨ、ＰａＯ2、温度、容積モル浸透圧濃度及び静水圧を維持し、細胞の完全性に必要な代謝を支える適切な基質を送達する。この方法、溶液及びシステムを組み合わせて提供される進行中の代謝は、組織（単数及び複数）が身体又は循環システムから摘出される時間の間、特定の器官又は解剖による切除部分の進行中の機能を支えるのに十分なレベルである。
【００３０】
限定するためではなく説明のために、この溶液は本発明のＥＭＳ器官培養技術で維持されている組織（単数又は複数）に適切な収縮期圧で、その特定の器官又は組織の正常に近い流速に達するまで灌流する。限定するためではなく説明の手段として、ヒトの腎臓を収縮期圧＜８０ｍｍＨｇ、流速＞８０ｃｃ／分の溶液で灌流しうる。そのｐＨは酸素供給器を介してＣＯ2又はＯ2を注入することで生理的範囲に維持される。適切な酸素は酸素輸送化合物をこの溶液の成分として含めることで器官に提供される。
【００３１】
本発明の方法、溶液及びシステムは、それぞれのほぼ生理的な範囲の適切な器官代謝を支えるのに必要な酸素供給、代謝用の栄養素、コロイド浸透圧、ｐＨ、灌流圧、温度及び流速を提供する。上で定義したように、正常に近い代謝速度は正常な代謝速度の約７０〜１００％である。更に、本発明の方法、溶液及びシステムは、器官又は解剖による切除部分の正常な機能生産物を生ずるのに十分な酸化的代謝を支えるるＥＭＳ器官培養の期間の間、代謝のレベルを支える。
【００３２】
従って、本発明の血液を含まない代謝サポート（ＥＭＳ）技術は、従来の冷保存法に優る多くの利点を提供する。（１）移植用器官は、移植に至るまでの長い時間にわたって代謝的に活性な状態で維持することができ、その間にその機能の完全性を評価でき且つ移植後に機能するその能力の蓋然性を評価できる。（２）温阻血が長すぎたために移植に適さないとこれまで思われた器官を蘇生させ、活発に回復させることが出来る。（３）従来の冷保存プロトコルで冷阻血に曝される前にＥＭＳ灌流を行うと組織が保護され、器官の収穫後すぐに冷保存するのに比べて同種移植片の冷保存の期間を長くすることができるようになる。（４）ＥＭＳ灌流は、例えば化学療法や遺伝子治療で、治療物質の標的化送達の手段を提供する。（５）器官又は組織の内部の細胞を刺激し、化合物を活発にデ・ノボ合成できる。
【００３３】
灌流溶液
器官保存と灌流物溶液は、様々な定義済みの添加成分を加えられる食塩溶液などの緩衝化生理学的溶液や細胞培養のような基礎培地から成る基礎溶液を含むものとして、当分野で知られている。本発明の灌流溶液は、代謝中の器官によるタンパク質合成を支えるのに十分な量のアミノ酸、イオン、生理的食塩水、血清タンパク質、炭水化物及びｐＨを生理的レベルに維持する緩衝システムを含むこのような基礎溶液を採用する。更に、本発明の灌流溶液は移植片内の血管内皮の栄養上及び代謝上の必要を支えるように設計されており、それにより脈管構造の完全性、それに続いて器官の正常な透過性を維持する。
【００３４】
緩衝化基礎培地は、市販の食塩水または細胞培養培地（例えば、ハンクのＢＳＳ、アールのＢＳＳ、ハムのＦ１２、ＤＭＥＭ、イスコフのＭＥＭ、Ｍ１９９、ＲＰＭＩ・１６４０、ＲＳＭ−２１０）のいずれかで良い。本発明の灌流溶液の一つの実施態様では、重炭酸塩緩衝システムを採用する。重炭酸塩緩衝液はＥＭＳシステムの呼吸ガス制御部分システムと連動して機能し、自動的に灌流溶液のｐＨを７.０から７.６、より好ましくは７.３０〜７.４５の狭い範囲に維持する。これは肺による血液ｐＨの呼吸制御に近似する。
【００３５】
この基礎培地には、必須アミノ酸及び非必須アミノ酸、増殖因子、血管拡張剤、ビタミン、及び化学エネルギー基質を含むがこれらに限定されない多くの添加成分が、器官又は組織による酸化的代謝を支えるのに生理学的に有効な量で加えられる。
【００３６】
本発明の灌流溶液に含まれるべきアミノ酸は、基本的な２０種類のアミノ酸を含み、Ｄ−若しくはＬ−アミノ酸、又はその組み合わせであっても良く、シトルリン、オルニチン、ホモシステイン、ホモセリン、β−アラニン、アミノ−カプロン酸などのような修飾されたアミノ酸、またはその組み合わせであっても良い。
【００３７】
この灌流溶液に添加される化学エネルギー基質は、ピルビン酸、ブドウ糖、ＡＴＰ、ＡＭＰ、コエンザイムＡ、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、チアミンピロリン酸塩酸塩（コカルボキシラーゼ）、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＤＰＮ）、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＴＰＮ）、ウリジン５’三リン酸（ＵＴＰ）塩酸塩を含んでもよい。これらの化学エネルギー基質は、本発明の灌流溶液の調製の際に基礎溶液に添加される添加成分の組み合わせを、容量で約０.０１％から約９０％含む。
【００３８】
この基礎培地には、２’デオキシアデノシン、２’デオキシグアノシン、２’デオキシシチジン、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン及びウリジンを含むＤＮＡの修復及び合成のための核酸も添加される。本発明の溶液は、インスリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）及び、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２）、インスリン様ＧＦＩ及びII、上皮ＧＦ（epithelial GF）、上皮ＧＦ（epidermal GF）、脳由来ＦＧＦ、ソマトメジンＡ１、Ａ２、Ｂ及びＣ、神経成長因子（ＮＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、へパリン結合成長因子（ＨＢＧＦ）、内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、グルココルチコイド及びウロガストン（urogastone）などの増殖因子（ＧＦ）を更に含んでも良い。また、ＩＬ−１、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、及びエリスロポエチンなどのサイトカインも含まれる。
【００３９】
本発明の灌流溶液は、血清アルブミン及び／又はコンドロイチン硫酸Ｂ、へパリン、ペタスターチ、ヘタスターチ、及び血漿増量剤などのムコ多糖類をコロイドの供給源として含み、リノール酸、アラキドン酸、リノレン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、油などの脂質をも含む。更に、吸着因子（attachment factor）、抗酸化剤、血管拡張剤、及び不透過性物質が本発明の灌流溶液に含まれる場合がある。
【００４０】
本発明の高度の容積モル浸透圧濃度は最初の器官洗浄に使用し、過度の低体温を起こさない温保存技術（１８℃〜３５℃）を用いたＥＭＳシステムで器官を長時間維持するための灌流液として使用する。この溶液は移植片内の血管内皮の栄養上、合成上、代謝上の必要を支えるように設計されており、それにより脈管構造の完全性とそれに続いて器官の正常な透過性を維持する。本発明の溶液の成分の一部には、他の既知の組織培養培地の成分、及び過度の低体温を伴う器官移植用の他の既知の灌流溶液の成分に類似するものがあるが、本発明の溶液は特に微細血管及び大血管の内皮細胞の刺激増幅を可能にし、移植片内の血管内皮の完全性を支え、過度の低体温を伴わずに正常な透過性と代謝を支えるように設計されている。温保存技術を用いた移植用器官の保存溶液として役立つこの溶液の強化された能力は、タンパク質及びコロイドの供給源としての血清アルブミン、脈管構造の適切な膨張を確実にする血管拡張剤、生存能力及び細胞機能を可能にする微量元素、酸化的リン酸化サポートのためのピルビン酸及びアデノシン、吸着因子としてのトランスフェリン、代謝サポートのためのインスリン及び糖、及び不透過性物質の供給源としてだけでなく有毒な遊離基をも除去するグルタチオン、不透過性物質の供給源としてのシクロデキストリン、細胞吸着因子及び成長因子のスカベンジャー及び助長因子（potentiator）、微細血管代謝サポートのための高Ｍｇ濃度、成長因子の増強作用と止血のためのコンドロイチン硫酸及びヘパリン硫酸を主に含むムコ多糖体、及びコロイド、不透過性物質及び成長プロモーターの供給源としてのＥＮＤＯ  ＧＲＯ（商標）で補ったことに帰せられると思われる。結果として、本発明の保存溶液は、器官を過度の低体温を起こすことなく保存できることが分かり、冷保存で起こる共通の問題、即ち水腫、血管痙攣、ＡＴＰ貯蔵の枯渇、イオン・ポンプの停止、解糖、及び低温により誘発される有害な遊離基中間体の生成を示さない。本発明の保存溶液はより効果的な保存を提供し、それにより拡張されたドナープール、即ち、心拍停止した死亡ドナーの利用につながる可能性を提示する。
【００４１】
当業者らは、他の化合物が機能的に等価な化合物で置き換えられて同様の結果が得られる得ることを認めるはずである。限定のためではなく説明のために、表１に本発明の灌流溶液の一つの実施態様の成分を列挙する。
【００４２】
【表１】
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【００４３】
【表１−１】
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【００４４】
【表１−２】
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【００４５】
【表１−３】
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該灌流溶液は、酸化的代謝のための分子状酸素を器官に与える働きをする一つ以上の酸素運搬化合物（「酸素運搬体」）を含む。このような酸素運搬体は当業者らに良く知られており、ヘモグロビン、及びジアスピリン架橋ヘモグロビン（ＤＣＬＨｂ）、ｏ−ラフィノース架橋ヘモグロビン、及びグルタルアルデヒド架橋ヘモグロビンなどの架橋ポリヘモグロビンを含む安定化ヘモグロビン誘導体、及びポリオキシエチレン複合体（polyoxyethylene conjugates）（ＰＨＰ）、ＰＥＧ複合ヘモグロビンなどの複合ヘモグロビン（conjugated hemoglobin)、組換えヘモグロビン生産物、パーフルオロ化合物（ＰＦＣ）エマルジョン及び／又はパーフルオロ化合物超微粒気泡（集合的に「パーフルオロ化合物」と称する）を含むが、これらに限定されない。このような酸素運搬体の一つはパーフルブロン・エマルジョン（臭化ペルフルオロオクチル、ＰＦＯＢ）などのパーフルオロ化合物である。酸素運搬体として役立つと言われている他のパーフルオロ化合物・エマルジョンは、例えば米国特許第５，４０３，５７５号、４，８６８，３１８号、４，８６６，０９６号、４，８６５，８３６号、４，６８６，０２４号、４，５３４，９７８号、４，４４３，４８０号、４，４２３，０７７号、４，２５２，８２７号、４，１８７，２５２号、４，１８６，２５３号、４，１１０，４７４号、及び３，９６２，４３９号に記載されている。このような液状ＰＦＣエマルジョンには、臭化ペルフルオロオクチル、二臭化ペルフルオロオクチル（perfluorooctyl dibromide）、ブロモフルオロカーボン、ペルフルオロエーテル、フルオゾルＤＡ（商標）、Ｆ−４４Ｅ、１，２−ビスペルフルオロブチル−エチレン、Ｆ−４−メチル  オクタヒドロキノール−イジジン（F-4-methyl octahydroquinol-idizine) 、９〜１２炭素ペルフルオロアミン、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロインダン、ペルフルオロトリメチル・ビシクル［３，３，１］イナン、ペルフルオロメチル・アダマンテ（perfluoromethyl adamante) 、ペルフルオロジメチル・アダマンチン（perfluoromethyl adamantine) が含まれるが、これらに限定されない。このような酸素運搬体は、本発明の灌流溶液の調製の際に基礎溶液に添加し溶解される添加成分を容量で約０％から約５９％、又は灌流溶液全体の約０％から約２０％（ｖ／ｖ）を含む。
【００４６】
また、赤血球（ＲＢＣ）が酸素運搬体として、灌流される器官による代謝を支えるのに効果的な量で用いられる場合がある。一般的に、灌流溶液５００ｍｌにつき約５ｃｃのＲＢＣ（即ち、約１％）が効果的な量である。パーフルオロ化合物のエマルジョン又は複合ヘモグロビンと比較した場合、ＲＢＣは代謝している器官による酸素消費と同等の酸素濃度を供給する。これは一般的に０.１〜０.３ｃｃ／分／ｇｍの速度で発生する。加えて、灌流の２４から４８時間後にはＲＢＣがクレチネート（cretinate）されたという証拠はなかった。従ってこの範囲のＲＢＣ量は、血液に基づく灌流物と関連した器官への機構的損傷の問題を与えない。
【００４７】
ＲＢＣ（灌流液５００ｃｃにつき５ｃｃ）を、＞２００ｍｍＨｇのＰＯ2が得られるまで循環している灌流液に添加した。安定した灌流圧、血管流速、及び利尿が得られた（表２参照）。
【００４８】
（外１）
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（外２）
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好ましい実施態様では、化学的に修飾されたヘモグロビン、例えばポリエチレングリコール修飾ヘモグロビンは、灌流液の酸素張力（oxygen tension）を灌流されている器官による代謝を支えるのに十分なレベルに維持するために用いてもよい。一般的に、灌流溶液５００ｍｌにつき約０.０１ｇから０.５ｇ未満が効果的な量である。化学的に修飾されたヘモグロビンは、組換えられたか又はヒト若しくは他の動物から単離されたかのいずれかで、酸素を除去し、例えば架橋結合又は重合（polymeraization）により、又はポリエチレングリコールやポリオキシエチレンなどの付加物の添加により化学的に改変されたヘモグロビンを指す。ポリエチレングリコール修飾ヘモグロビンは、ポリエチレングリコール（α−ヒドロ−ω−ヒドロキシポリ−（オキシ−１，２−タンジイル）と結合するように修飾されたヘモグロビンを指し、化学的に改変されたヘモグロビンの調製法は当分野で知られており、例えば米国特許第５，２３４，９０３号、５，３８６，０１４号、６，０５４，４２７号、５，９８５，８２５号、及び５，８１４，６０１号がある。その内容は参照により本明細書にその全体がインコーポレートされる。
【００４９】
本発明の灌流溶液は更に、生理学的に有効な量で血管拡張剤を含み、これは微細血管を適切に拡張するためばかりでなく平滑筋細胞弛緩を介して大血管を適切に拡張するための手段をも提供する。脈管構造の正常な透過性が維持されていることを保証するため、この血管拡張は内皮細胞に依存した形で制御される。本発明の灌流溶液で使用する血管拡張成分には、（ｉ）アセチルコリン、ドーパミン、ブラジキニン、及びアルギニンなどの内皮細胞が媒介する血管拡張のための基質、（ii）プロスタサイクリン（及び類似体、例えばカルバサイクリン）及びＭｇ+などの微細血管の血管拡張のための基質、及び（iii)アデノシン（及び類似体、例えばシクロヘキシルアデノシン）、及びカルシウム・チャンネル遮断により媒介される血管膨張に対するこれらを組み合わせ効果のためのベラパミルが含まれる。本発明が包含する他のカルシウム・チャンネル遮断薬は、フルナリジン、ニフェジピン、ＳＮＸ−１１、クロルプロマジン、及びジルチアゼムを含む。前述の血管拡張剤の使用は脈管構造が十分拡張し、同時にその完全性と正常な障壁機能を保持することを確実にする。この血管拡張剤は、本発明の灌流溶液を調製する際に基礎溶液に添加される添加成分の組み合わせを約１％から約５０容量％（ｗ／ｖ）で含む。
【００５０】
ＥＭＳ灌流部分システム
本発明は、好ましい実施態様を参照しながら説明される。このシステムの様々な構成要素は組み合わされる場合や、設計上の選択としてシステムに導入された別々の部品として提供される場合があることを理解すべきである。
【００５１】
図１は本発明の器官灌流循環経路の一つの実施態様の図である。殆どの場合、一つの灌流経路のみが必要となる。しかしながら、代謝的に維持されるべき器官が肝臓である場合は、二つの灌流回路が必要である。この二つの灌流経路は図２に示してあり、以下で更に詳細に説明する。このシステムを通る循環に利用できる灌流液は全て、ポンプ１２により循環経路１０を通って推進される。この灌流溶液の流れの方向は流路内に矢印で示してある。本発明の灌流液を循環させるのにどんなポンプを用いても良いが、脈動ポンプ、例えばモデル番号ＭＯＸ−１００（商標）（ウォーターズ・インストルメンツ，インク．，ロチェスター，ミネソタ州）が好ましい。
【００５２】
該灌流液は、器官４０に入る前に熱交換器１４を通過して２５℃〜３７℃の範囲内の温度となる。器官による最適な代謝にとって好ましい温度はこの範囲内にある。この熱交換器１４は、灌流経路１０内に配置されている温度センサー１８からの入力を受信する温度コントローラー１６で制御される。一つの実施態様では、この温度コントローラーは、温度を所望の範囲に保つために必要な場合には、灌流液の温度を感知する熱電対と、熱電対で活性化される熱交換器を含む一つのユニットである。別の実施態様では、上記温度は温水を灌流液貯蔵槽又は酸素供給器の周囲に温水を循環させるための水加熱装置により制御しうる。さらに別の実施態様では、器官室内に配置された温度センサーが灌流液の温度を監視しそして制御するのに用いられる。
【００５３】
酸素運搬体を含む該灌流液は、器官と接触する前に、中空糸酸素供給器若しくは膜酸素供給器２０、例えばサルネスから入手できるもののような小児用サイズの酸素供給器を介して酸素化し、大抵の場合は１００〜２４０ｍｍＨｇの範囲内の酸素分圧が得られる。しかしながら、肝臓の門脈系に灌流液を供給する灌流経路に配置される場合、この分圧は大抵８０〜１４０ｍｍＨｇの範囲内に維持される。好ましい実施態様では、この酸素供給器２０は熱交換器１４とｐＨセンサー２２の間の灌流溶液流路１０に配置される。この酸素供給器は独立したユニットであっても良いが、例えば熱交換器と組み合わせたり又は器官室の一部として、本システムの別の構成単位と組み合わせて一つのユニットを形成しても良い。
【００５４】
該灌流溶液のｐＨ及びＰａＣＯ2は、ＣＯ2による灌流液の自動間欠ガス発生で制御され、７.３０〜７.４５の範囲のｐＨと３０〜６０ｍｍＨｇのＣＯ2分圧を有する循環間流液となる。最終的にこの灌流液は、器官室３２に入る直前に従来型の気泡トラップ３０で気泡が除去される。この灌流液は静脈廃液として器官から出て行き、大抵の灌流システムでは、器官を保持する器官室３２の小室の下に配置された廃液貯蔵槽３８に重力により直接排液される。好ましい実施態様では、この廃液は器官４０の静脈内に挿入された従来型の非外傷性のカニューレによるか、又は以下に更に詳しく説明するように静脈が導管４３と連結し続けるように静脈を支えるための装置４９によって静脈に接続される導管４３を用いて廃液貯蔵槽３８に向けられる。
【００５５】
器官室
用いられる器官室３２の仕様は維持されるべき器官に左右される。例えば、器官が肝臓の場合、器官室には二つ同時に作動する灌流流路を収容する二つ以上の入口がなくてはならない（図２）。器官が心臓の場合には、心臓の灌流液の入口の上部の灌流流路から上方に延びる開口した垂直な管が、鼓動している心臓による灌流液の押し出しに対抗するのに十分な圧力が維持されるように灌流液の柱を提供する。
【００５６】
しかしながら、一般的に器官室３２（図１〜４に示すとおり）は、維持すべき器官４０を収容するのに適したサイズの下部と上部を含み、覆い又は蓋３４を有するコンテナ３３を含む。室全体は医療用の品質で、無毒の、血を吸わない（non-leeching) 、殺菌可能な硬い素材でできている。一つの実施態様では、この器官室はステンレス鋼製で、１枚以上の透明若しくは半透明のパネルのような、室の内部を見るための手段を有している。灌流中に器官を観察できることは極めて望ましく、従って好ましい実施態様では、器官室全体が透明な硬い素材でできている。様々な熱可塑性物質が市販されている。例えば、ルサイト、又はＬＥＸＡＮ（登録商標）などのポリカーボネート素材である。本発明の器官室は、ふさわしい素材の組み合わせを含んでもよい。
【００５７】
本発明の器官室は、灌流の間器官の機械的制約を与えるコンテナ３３の中で器官４０を支えるための器官室コンテナ３３の上部に配置できる少なくとも一つの支持体３６を含む。これにより、例えば輸送中の器官の突発的な移動により器官又はその血管が障害を受けたり損傷するのを最小限に抑えられる。器官室３２は更に、灌流液が器官の外部表面及び器官室の内部表面に接触するのを避けて汚染の危険を最小限にするため、器官からの灌流液の静脈流出を温保存システムの貯蔵槽に直接流す一つ以上の灌流液入口４２、導管４３を含む。また、この器官室は器官４０から出る器官生産物を回収する導管４８を含む。任意選択的に、コンテナ３３の下部は灌流液貯蔵槽３８及び／又は灌流システムの他の構成要素を含む。
【００５８】
器官支持体３６は、器官がコンテナ内で移動するのを阻害するように適合される。器官支持体３６は、固形の素材若しくは半固形の素材から作りうる、又は器官を吊り下げたような状態でぶらさげるメッシュ状の布で作ってもよい。一つの実施態様では、この支持体は器官が空洞内に納まるように器官の一部の形状に形を合わせた空洞を持つ固形素材又は半固形素材である。好ましい実施態様では、この支持体は上に載せる器官の形に適合できるガス（不活性ガス）、流体（例えば、生理的食塩水又は他の適切な非毒性液体）、又はゲル（例えば、シリコン）を充填したパウチ又は袋などの弾性のある物質である。支持体の外部表面及び内部の素材は両者とも、不活性で生態適合性があり殺菌できる素材でなければならない。支持体は底面上、及び部分的に側面で器官と接触するが、灌流の間器官を観察できるように、器官室コンテナの側面又は覆いから見える部分を残している。器官の目視観察は水腫の徴候を早期に発見するため、適切に灌流されていない器官の場所又は器官の機能不全の他の徴候を発見するために必要である。
【００５９】
支持体は器官室内で器官を支え、重要なことに、室内での器官の移動を阻止し、それにより器官の損傷を防ぐ。室内で器官が滑ったり転がったりするのを防ぐことにより、特に器官の輸送中に主要な血管、例えば腎臓の腎静脈及び動脈が伸びるのも排除する。振動や衝撃による影響が減少する。さらに、このタイプの器官支持は、器官が身体内で隣接する組織に支えられそして隣接する組織と接触している正常な生理的環境により近い。さらに、成形性のある支持体により、器官の側に置くだけでなく、器官を様々な向き（生理学的なものも含む）に向けることができる。
【００６０】
図３は、器官室３２に器官４０の静脈４１から灌流液を器官室（図３に示したとおり）の一部であるか又は器官室とは別のものである（図１及び２）灌流液貯蔵槽３８に直接導く手段を有する灌流液出口４３がある実施態様を表す。静脈４１を出て行く灌流液が器官４０の側面を流れ落ち、器官室の下に配置された貯蔵槽に滴り落ちる現存する器官室とは異なり、本発明の器官室は、灌流液が器官の外部表面と接触するのを防止することにより、灌流液の汚染の可能性を実質的に減少させる。任意選択的に、この器官室は、図３及び図５に図示するように静脈支持体４８を更に含む。この実施態様のさらなる利点は、器官に隣接して配置された殺菌可能な先が分かれた小さな部品（図３及び図５に示す）のような静脈支持手段により、静脈にカニューレを挿入する必要性及びカニューレの挿入に関連する障害や損傷を避け得ることである。静脈支持体４８は静脈と器官の外壁との交差点に近い場所で静脈を支持し、静脈排液を器官から離して貯蔵槽３８に導く管の端に対して静脈の開口端を安全に保持することができる。
【００６１】
本発明の器官室は使い捨てのユニットであっても良く、又は殺菌して再使用できるステンレス鋼やポリカーボネートなどの適切な素材でできていても良い。一つの実施態様では、本発明の器官室は器官室を外部の温保存システムに取り外し可能なように接続するためのコネクターを含む。適切なコネクターは、いったん器官室をその中に設置すると流路の完全性を確実にするための、長い不活性な生物学的適合性のある管又はより複雑な機械装置を含むがこれらに限定されない。
【００６２】
任意選択的に、この器官室は酸素供給器、貯蔵槽、気泡トラップ及び流量計、これらに限定されないが、含む温灌流システムの様々なコンポーネントを含んでもよい。また、圧力、温度、ｐＨ、ＰａＯ2、ＰａＣＯ2、ブドウ糖などの代謝の指標、及びＮＯ（安定な終末生産物）ＰＣＮＡ又はＺＯ−１などの合成機能のマーカーを測定する手段が器官室に組み込まれる場合がある。更に本発明の器官室は、灌流液をサンプリングするための一つ以上の出入口、及び灌流液を再生利用するための一つ以上の出入口を含む。
【００６３】
図３は、器官室コンテナの下部に灌流液貯蔵槽を有する本発明の器官室の一実施態様を例示する。器官代謝を示す灌流液のパラメータ、例えばブドウ糖濃度、ＰａＯ2、ＰａＣＯ2などを監視するためのセンサーが、灌流液が器官に入る直前と器官から出るときの灌流液の特性を測定するために配置されている。器官の前後の灌流液の値の変化は器官代謝を示す。
【００６４】
ｐＨ及び温度などの灌流液のその他のパラメータのためのセンサーを器官室内に配置して、灌流の間、灌流液のパラメータを最適に制御させても良い。
【００６５】
大抵の保存システムでは、器官から出る静脈廃液は、支持手段３６内の穴３７のいずれかを通って重力により器官室３２の貯蔵槽３８に直接流れて回収される。本発明では、静脈流出は重力による流れによって回収されるが、静脈を例えばある長さの管４３に連結して、器官から離して運ばれる。一つの実施態様では、これは非外傷性のカニューレを用いて静脈にカニューレを挿入することで実施される。しかしながら、再移植の際の切除で利用できる静脈の長さは、カニューレ挿入の間に発生する何らかの損傷により減少する。従って、好ましい実施態様では、導管内で静脈４１を支持する静脈支持体４６は、静脈４１が器官４０の外壁と交差する点で器官に隣接した状態で静脈の下に配置される。図６及び図７に示されるように、この支持体の上部は静脈及び導管をこの２つの合流点で支持するのに十分なだけ広い。これにより、静脈４１の結紮された端を導管に、例えばある長さの管４３に、カニューレ挿入する必要なく、例えば管４３の端を静脈４１の上部で単に滑らせるだけで接続することが可能になる。または、静脈は部分的に開いた導管内に落ち着かせてもよい。静脈の更なる損傷はこれにより回避される。
【００６６】
器官生産物の回収
本発明の器官室は、器官生産物を灌流液と分けて回収するか、或いは器官生産物を灌流液の一部として再循環させることができる。器官生産物を回収する手段４８はバルブ及び／又は出入口を含み、それによって灌流中に器官が生産した器官生産物の全て又は一部を試料として採取しその器官にとっての正常な器官機能を示すパラメータについて検定することができる。
【００６７】
本発明の器官室は、器官生産物を灌流液から分けて任意選択的に回収する手段を更に含む。例えば、灌流された腎臓により生産される尿は、尿管から器官生産物流路へ出て行く。この器官生産物経路内に配置されるのは、開いたときに器官生産物経路を静脈灌流液経路と流体が流れるように連結させるバルブである。このバルブが閉じた位置にあれば、器官生産物は灌流液から迂回され、試料採取用又は回収用出入口により該システムから除去されうる。この器官の機能的特性はこの回収した器官生産物の化学的パラメータ、生産物の生産速度、又は消失速度を決定するために添加したトレーサー分子の濃度を評価することにより求めることができる。或いは、器官生産物は灌流液容量、容積モル浸透圧濃度及び化学的完全性が保持できるよう、灌流液に再混合される。このようにして、器官代謝、灌流及び機能が測定でき、保存される器官の状態が先を見越して評価できる。
【００６８】
該廃液は、ミリポア社から入手できるような０.２２ミクロンの孔径を持つフィルター４４を通して濾過し、破砕物及び細菌性汚染物を除去する。回収した廃水はこのように、空気との接触による灌流液の汚染を最小にするという別の利点ももたらす。いったん灌流溶液が廃液貯蔵槽３８に回収されると、この廃液は灌流液交換又は灌流透析部分システム５０内で透析するかのいずれかで再生され、該システムを再循環する。
【００６９】
本発明の器官室は更に、灌流溶液のパラメータを監視し制御するための適切なマイクロプロセッサ及びセンサーを含む。
【００７０】
灌流再生
当発明のシステムにおける灌流溶液の構成物の器官による連続的な代謝利用のため、灌流液は補給するか再生しなければ遂には使い果たすであろう。一つの実施態様では、代謝を支えるのに必要な成分は灌流液交換、即ち、貯蔵槽内の装置４６により消耗した灌流液の一部を除去し、新鮮な灌流液で置き換えることにより補給できる。
【００７１】
灌流交換
一つの実施態様では、灌流液は容量を調節できる二つのポンプ４７及び４９を用いて交換される。ポンプ４７は消耗した灌流液を抽出するための貯蔵槽内の装置４６に接続され、ポンプ４９は酸素供給器２０のすぐ前の灌流液経路１０に配置される。消耗した灌流溶液のポンプ４７による除去の直ぐ後にポンプ４９によりこのシステムに等量の新鮮な灌流液を導入する。この方法の交換は連続的又は断続的にできる。交換の速度は、温度及び／又は灌流される器官の代謝速度によって決まる。
【００７２】
新鮮な灌流液を酸素供給器２０およびｐＨ制御システムのすぐ前にある灌流経路に導入することにより、灌流液のＰａＯ2及びｐＨは一定に保たれる。このように代謝の副産物は除去され、アシドーシスを進行させずに器官による進行中の代謝を維持するため、新鮮な溶液が投与される。灌流液の量は一定のままであり、容積モル浸透圧濃度も一定のままである。
【００７３】
灌流液透析
しかしながら、代謝速度に追いつくためには器官の代謝を維持するのに必要な栄養分を灌流液交換で補充するのが不適切な場合もある。従って別の実施態様では、灌流液は単独で又は灌流液交換と組み合わせて連続的に透析により再生される。
【００７４】
本発明の透析部分システムでは、代謝の継続に必要な栄養分及び化学エネルギー基質は一つ以上の透析ユニットにより灌流液中に再導入される。このようなユニットは、一つで又はいくつか繋いで、灌流液から異化代謝産物を除去する透析に類似した方法で、補給対象の灌流液中に栄養分を供給することができる。
【００７５】
該ＥＭＳの灌流透析部分システムは、図１に示すように、灌流流路１０と流体が流れるように連結している廃液貯蔵層５０及び一つ以上の栄養分貯蔵槽Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄｎを含む。栄養分貯蔵槽Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄｎは分子量カットオフが１，０００〜８０，０００ダルトンの範囲で変わる半透水性膜Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍｎを経て廃液貯蔵槽５０と繋がっている。これらの栄養分貯蔵槽には灌流溶液を再生するのに必要な濃縮した量の構成成分が入れてあり、これらは廃液貯蔵槽５０の灌流液中に拡散させられる。
【００７６】
一つの実施態様では、二つ以上で使用する場合には、灌流液の流れはまず最大サイズの分子量を持つ栄養素と接し、それに続いて接する栄養分の分子量が小さくなるよう、栄養分貯蔵槽を分子量が大きいものから順に配置する。これにより、最初の透析ユニットで失われたかもしれない如何なる構成成分も、灌流液透析システムを出る前に、次のユニットを通ることにより確実に補給される。このシステムは、廃液貯蔵槽と栄養分貯蔵槽の間の平衡が維持されるように灌流液溶液の容量を調節する装置を更に含む。
【００７７】
監視システム及び制御システム
灌流溶液監視部分システムは、灌流溶液の様々なパラメータを監視するための標準的な構成要素とハードウェアを用いて複数の機能を実行する。一つの実施態様では、熱交換器に連結された熱電対又は温度センサー１８で温度を検知し制御する。例えば気泡トラップ３０の構成部品として、灌流溶液流路に配置された一つ以上の圧力計３１は、灌流液に対する血管抵抗及び呼吸ガスの部分圧を監視するのに用いられる。流量計５２、例えば、トラソニック社から入手可能なものなどの、灌流液を運搬する管の上に留めてあるセンサー５４が付いた流速を検知するための超音波装置が、灌流液の流速を監視するのに用いられる。好ましい実施態様では、この流量計は気泡トラップと器官室の動脈入口の間の流路に配置される。灌流液の容積モル浸透圧濃度は従来の氷点降下法を用いて測定する。または、容積モル浸透圧濃度は灌流溶液の主成分の濃度を評価するインライン検出手段を用いて監視しても良い。灌流液の試料は気泡トラップ３０又はこの測定のために灌流液流路に配置された他の何らかの手段により除去してもよい。
【００７８】
別の実施態様では、灌流溶液のパラメータを監視及び制御は器官室内に組み込まれたセンサー及びマイクロプロセッサを用いて行われる。これらは全て、通常の技術者の技術範囲内にある。制御部分システムの構成要素は、設計上の選択の問題としてシステムに組み込まれる別個の部品として組み合わされ又は提供されてもよい。
【００７９】
ｐＨと呼吸ガスの維持
灌流溶液は、１００〜２５０ｍｍＨｇのＯ2の部分圧（ＰａＯ2）を維持するため、１００％の酸素２８を膜若しくは中空糸の酸素供給器２０を介して導入することにより連続的に酸素が供給される。本発明のこのシステムは、灌流液のｐＨを７.３２と７.３８の間に、そして灌流液中のＣＯ2レベルを３０〜６０ｍｍＨｇの部分圧に維持する新規なメカニズムを含む。灌流液のｐＨレベル及びＣＯ2レベルの調節は、ＣＯ2での灌流液の制御された断続的なガス発生により達成される。このシステムは、例えば灌流経路１０にあるｐＨ電極又はセンサー２２でｐＨを連続的に監視する。このｐＨセンサー２２は、ｐＨの厳格な制御を維持するために必要なＣＯ2２６ガス発生を調節するためのコントローラー２４及びソレノイド２５に機能しうるように接続される。
【００８０】
一つの実施態様では、例えばハンナ・インストルメント製のモデルＨＩ８７１１などの一つ以上のｐＨメーター２１が、灌流流路１０に配置されたセンサー又は電極２２により循環している灌流液のｐＨを監視する。ブレオニクス社製のデータロジャーなどのインライン・コントローラー２４は、コントローラー２４に接続されたｐＨメーター２１を介してｐＨセンサー２２からの入力を受信し、ソレノイド２５を用いてＣＯ2２６を灌流溶液中に放出するようバルブ接点２３を操作する。ｐＨが７.３５を超え、それによりコントローラー２４の設定値を超えると、ガス発生システムがバルブ接点２３及びソレノイド２５により稼動して、ｐＨが再び７．３５に達するまでＣＯ2２６が灌流溶液中に注入され、その点でこのシステムは動作を停止し、このガスは停止する。重炭酸塩緩衝液システムを有する灌流溶液と組み合わせて用いる場合、このようにしてＣＯ2を用いて灌流溶液の間欠的なガス発生を行なうことは、呼吸系による血液ｐＨの厳格な生理的制御を模倣する際に特に有効である。灌流溶液の他のパラメータと同様に、ｐＨ及び呼吸ガスはこの用途で当業者に知られているセンサー及びマイクロプロセッサーを用いて監視し制御しうる。
【００８１】
ＥＭＳ内での器官の固定
本発明に従って、いったん器官が摘出されると、カニューレを通して主要な動脈血液供給中に十分な量の灌流溶液をゆっくりと導入して、特定の器官の廃液から血液がなくなるまでその器官を灌流する。器官を洗い流すのに十分な灌流溶液の量が特定の器官のタイプ及びサイズ、並びにその器官が血流を失った時間に左右されるということは、当業者らに理解されるであろう。例えば、１〜３時間の間に血流を失ったヒトの腎臓を流すのには、灌流溶液は２００〜６００ｍｌで十分であろう。このようにして血管内に蓄積された全ての阻血血液及びアシドーシス産物は除去される。さらにｐＨが復元され、新鮮な基質が供給されて、嫌気的代謝及び細胞の完全性及び機能の維持に必要な他の細胞経路がサポートされる。
【００８２】
洗い流した後、器官は例えば器官室内に設置できる支持体の上に器官を置くことで器官室の内部空間内に固定され、器官の移動防止が図られる。例えばこの支持体は、特に輸送中に器官が器官室内を動き回らないよう、流体、ガス、又はゲルを充填した袋などの器官の外部表面の形になじむ弾力性のある支持体であっても良く、また器官の外部表面に概ね形を合わせた空洞を含む固体又は半固体の支持体であっても良い。器官は次いでカニューレを挿入した動脈を器官室の入口孔と繋ぐ短い管により灌流溶液に接続される。本発明で使用する管はすべて不活性で殺菌可能な素材、例えば、シリコンやＴｙｇｏｎ（登録商標）製の管であることが望ましい。
【００８３】
器官は、灌流溶液の温度を２５℃から３７℃の範囲に維持しながら灌流する。同時に、該システムは灌流液のＰａＯ2、ＰａＣＯ2、及びｐＨをガス発生部分システムで調節し、流速、血管圧及び容積モル浸透圧濃度を監視する。
【００８４】
灌流期間中、器官の機能の完全性も監視される。様々な生理学的パラメータ及び代謝パラメーが機能完全性の指標として使用できる。例えば、表１に示したような既知の処方で作る灌流液を使用すると、代謝機能の一定の側面の測定を容易にすることができる。時間に対して、器官を通って循環する間に灌流液内のブドウ糖濃度が失われる割合は、器官機能の一つの尺度となる。選択された時点に関して、ブドウ糖利用の正常レベルの範囲より低いブドウ糖濃度は器官の損傷又は代謝の阻害の指標になり得る。器官機能の尺度の別の一例は、灌流液が器官内を循環している間の酸素消費である。不適切な酸素消費、即ち、正常範囲に比べて低い酸素消費は、組織の低酸素症を表す場合がある。器官機能の尺度のまた別の一例は、標準的な灌流圧を使用して器官を通って循環している灌流液の血管流速である。正常範囲に比べて低い流速は、血管収縮、水腫、血管内皮細胞の膨張、及び損傷を受けた器官における血管完全性の喪失を表しうる。
【００８５】
これらの器官機能の特徴は、ＥＭＳ温保存システムの灌流経路に配置されたセンサーによって容易に監視される。センサーの最適な配置は、器官室自体の中で、保存溶液が器官に入る直前で且つ器官を出て行く溶液の静脈流出の近くである。センサーを器官のすぐ前及びすぐ後に配置すると、どんな差異も器官自体に帰することができるという点で、テストの精度が上がる。センサーを他の配置にすることも可能ではあるが、センサーを器官に対して遠くに配置するとエラーの可能性がはいってくる。これは、ブドウ糖などの代謝マーカーでは大した問題ではないが、酸素に対しては大きな懸念となる。
【００８６】
本発明のシステムはまた、器官の機能的完全性の他の指標を評価するための二つめの監視用部分システムをも備える。例えば、灌流期間中に器官から器官生産物を抽出する器官室の導管は、器官の産出物を追跡し、灌流された器官の生産物の物理的若しくは化学的パラメータを正常な器官機能を表す範囲と比較して評価することで、器官機能の監視を可能にする。当業者は、保存対象の器官に応じてどの特性を監視するかを簡単に決定することができる。例えば器官が腎臓であれば、利尿速度、尿浸透圧、比重、クレアチニン・クリアランスなどを含むパラメータを計測することにより腎臓生理学の個々の側面だけでなく腎機能全体が測定できる。監視部分システムの性質は灌流される器官に依存し、胆汁酵素、心臓酵素、心電計の動きなどを測定する手段を含むことがある。
【００８７】
本発明を実施するため、器官生産物の化学的若しくは物理的パラメータについての正常な値及び範囲、及び器官の正常な機能を表す他の計測値は、生理学及び臨床化学上の医療分野の当業者らに知られる教科書で参照される値のプラスマイナス２０％である。「臨床化学のＣＲＣハンドブック」マリオワーナー編，ＣＲＣプレス、スチュアート・アイラ・フォックス著「ヒト生理学」第６版，ウィリアム・シー・ブラウン、パブリッシャーを参照。
【００８８】
様々な器官及び組織の器官培養を支える場合の本発明の有効性を評価した。本発明を使用し、イヌの腎臓、ウシの腎臓、ラットの心臓、ヒトの胎盤及びウシの肢で効果を立証した。
【実施例１】
【００８９】
イヌの腎臓を摘出し、腎動脈にカニューレを挿入し、本発明のプロセス及びシステムを用いて溶液を適用した。全ての血液を腎臓から除去し、これらの腎臓を溶液で灌流した。該腎臓をＥＭＳ器官培養技術で支えて３２℃で３日間維持した。同様に、ＥＭＳ器官培養の期間中、生理学的ｐＨ、容積モル浸透圧濃度、圧力、流速及び酸素消費を維持した。該腎臓は、器官培養の間、無傷のままであり、代謝し続けた。腎臓内で進行する代謝は、機能の継続という結果を得るのに十分であった。即ち、該腎臓は器官培養の期間中、尿を生産し続けたのである。無傷の全腎臓の培養の結果を表２に列挙する。このＥＭＳ器官培養の期間中、どのパラメータ範疇においても代謝又は機能の低下はなかった。同様に、進行した水腫もなく、組織学的な評価の後に観察された壊死もなかった。
【００９０】
【表２】
2004529938.tif 000009
【実施例２】
【００９１】
種による差異を評価するため、ウシの腎臓もテストした。ウシの腎臓は、実施例１に記載したのと同じ技術を用いて、ＥＭＳ器官培養の中に３日間置いた。イヌの腎臓を使用したときの結果と同様に、ウシの腎臓はＥＭＳ器官培養で、進行中の代謝や得られる機能を損失することなく、３日間無傷で維持できた。イヌの腎臓で得られた結果と同様に、ウシの腎臓は器官培養の期間中、安定した灌流圧、流速及び水腫の欠如を示した。組織学的評価に基づき、このウシの腎臓は正常であり、腎臓構造の全構成要素が優れた状態に保たれているように見えた。
【実施例３】
【００９２】
ラット（複数）から心臓を摘出し、その大動脈にカニューレを挿入した。これらの心臓を本発明のＥＭＳ器官培養内に置いて２４時間維持した。ラットの心臓を用いたこのテストの結果を表３に列挙する。
【００９３】
【表３】
2004529938.tif 000010
ＥＭＳ器官培養期間の後、これらの心臓が生命を維持するのに十分な完全性を持つか否かを評価するため、複数の心臓のうちの三つを移植した。この三つの心臓は全て、補助なしに自発的に鼓動し、生命を維持することができた。
【実施例４】
【００９４】
臍帯がまだ付いたままのヒトの胎盤を摘出した。臍帯の血管にカニューレを挿入し、本発明の溶液でその血液を臍帯から洗い出した。該器官の血液を洗い流し、血管内部を該溶液で満たした直後に、該器官をＥＭＳ器官培養の中に置いた。該器官はＥＭＳ器官培養技術を用いて約２２時間、無傷で維持された。この器官培養期間中、胎盤を通る溶液の流速は９２ｃｃ／分で最大血圧は８０ｍｍＨｇであった。ＥＭＳ器官培養の終わりに、この無傷の胎盤を組織学的に評価した。次いで臍帯と胎盤自体の両方から単離細胞を採取した。その結果を表４に示す。
【００９５】
【表４】
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２２時間のＥＭＳ器官培養後に器官全体から生存能力のある細胞を採取することができた。臍帯血管及び無傷の胎盤の双方からコラゲナーゼ消化により組織を単離した。無傷の器官から単離された細胞は、培養フラスコの表面に付着する能力、及び標準的な組織培養で複製する能力を保持していた。この単離された細胞は標準的な組織培養で複製を続け、遂には３回継代した。従って、この無傷の器官はＥＭＳ器官培養での維持が成功し、そのため代謝的に活性であったのである。器官培養期間後に器官全体から単離された細胞のその後の生存能力と機能は、この解釈を支持する。
【実施例５】
【００９６】
無傷のウシの肢を入手した。大腿動脈にカニューレを挿入し、この無傷の肢からその血液を洗い出した。本発明の溶液を用いて血管内部を満たし、該肢をＥＭＳ器官培養で２日間維持した。器官培養の完了時点で、該肢を組織学的に評価した。これらの評価の結果から、該肢の構成要素は、壊死を観察することなく、完全に保存されたことが示された。２日のＥＭＳ器官培養後の無傷の肢から単離した細胞は、同様に生存能力があった。この無傷の肢から単離した細胞は標準的な細胞培養でフラスコの表面に付着した。これらの細胞は増殖し続け、３回継代された。器官全体で得られた結果と同様に、無傷の肢などの解剖による切除部分も本発明のＥＭＳ器官培養技術で維持することができた。
【実施例６】
【００９７】
本発明のＥＭＳ器官培養技術を用いて、長さが約２〜２.５フィートに達するヒトの臍帯を維持した。このヒトの臍帯はＥＭＳ器官培養内で少なくとも７日間無傷で維持された。該臍帯の血管は一方の端にカニューレを挿入した。もう一方の端で、血管と２本の動脈をｙコネクターに繋がったシリコン管で接続し閉回路を形成した。ＥＭＳ器官培養の完了時点で、該臍帯血管の内腔表面をコラゲナーゼで消化した。単離された内皮細胞は生存能力があり、標準的な組織培養でフラスコ表面に付着した。単離された細胞は組織培養で内皮細胞の正常な特性を示した。即ち、単離された細胞は付着し、複製し、抗血友病因子抗原を発現した。これらの結果は、本発明のＥＭＳ器官培養技術が２〜２.５フィートの長さのヒトの組織をＥＭＳ器官培養で７日間、組織内の細胞の生存能力を損なうことなく、無傷で維持するのに使用できることを実証する。これらの研究は、ＥＭＳ器官培養技術が無傷の器官又は解剖による大きな切除部分を長期間維持する上で有効であることを証明する。
【００９８】
本発明のＥＭＳ全器官培養技術はイン・ビボ適用にも使用できる。特定の器官は、器官に栄養分を供給する主動脈源の摘出、及び静脈流出を同時に摘出・回収することにより摘出できる。器官培養技術のイン・ビボ適用は、イナベーション（enervation）系及びリンパ系の生理学的な維持を含む。標的化された器官又は解剖による切除部分に栄養分を供給する動脈にカニューレを挿入し、器官廃液を受け取る静脈も同様にカニューレを挿入し、血液を組織内から流し出す。血管内腔を本発明の溶液で再び満たす。器官又は解剖による切除部分はイン・ビボで維持されるが、生理学的システムからは「切断」されており、ＥＭＳ器官培養技術により維持される。
【実施例７】
【００９９】
イヌの腎臓は、腎の動脈と静脈にカニューレを挿入し、腎臓から血液を洗い流し、本発明の溶液で再び満たすことにより単離した。この腎臓は、ＥＭＳ器官培養技術を用いて３７℃で８時間そのままで維持した。この分離の間、該腎臓は酸素消費及びブドウ糖消費により測定すると、イン・ビボＥＭＳ器官培養で代謝を続けた。同様に、代謝は継続的な利尿が生ずる程に十分なレベルのものであった。該腎臓は、残りの静脈系から切り離されＥＭＳ器官培養技術で維持されている間、尿を製造し続け接続された膀胱を満たし続けた。ＥＭＳ器官培養が終わるとカニューレを除去し、該器官を血液で再灌流した。該腎臓は正常に機能し続けた。１０頭のイヌ全てが、腎臓をＥＭＳ器官培養後に正常な血清の化学的性質を示した。
【実施例８】
【０１００】
摘出された器官又は局所化された組織の灌流は、全身毒性を減少させながら高用量化学療法を実施するのに極めて適している。最近いくつかの癌研究所における、化学療法剤を送達するのに単離器官の灌流を行なおうとする試みは、標的外の組織の損傷を惹起する危険性が高かった。標的の器官は、本発明の器官培養技術を用いれば、如何なる損傷をも惹起することなく維持できる。化学療法剤を送達するために器官培養技術を用いる利点は、通常の全身性副作用を減少させ又は排除さえしながら同時に遙かに高用量を送達するという機会である。
【０１０１】
薬物送達技術としてのＥＭＳ器官培養の有効性は、移植が不可能なヒトの腎臓で確立された。この腎臓は、腎細胞癌と同定された腎腫瘍のため移植不可能であった。このヒトの腎臓は、ＥＭＳ灌流の間、安定した灌流圧、血管流速及び酸化的代謝を示した。同様に、ヒトの腎臓はまた、酸素及びブドウ糖を消費し、尿を生産し、そしてクレアチニンを浄化した。腎臓の生検は、組織学的評価のためＥＭＳ全器官培養灌流の前後の両方で行った。１８時間のＥＭＳ器官培養後に観察された組織学的変化はなかった。従って、ＥＭＳ器官培養は、腎細胞癌を持つ腎臓を、損傷を惹起することなく維持し、それにより標的化された薬物療法のための送達システムを提供できる。
【実施例９】
【０１０２】
心臓発作や脳梗塞などの閉塞性疾病に続く阻血性発作は、ＥＭＳ器官培養技術の別のイン・ビボ適用を表す。最近開発された血栓溶解剤は、脳梗塞や心臓発作を患う患者に大きな展望を与える。このような療法の有効性は、まだ閉塞現象後の短い時間内に薬物を投与できるかどうかにかかっている。閉塞箇所の下流の組織が血液を奪われ、その結果阻血性損傷が起きる。ＥＭＳ器官培養技術は、閉塞箇所から下流の組織を再灌流しそして維持するのに使用でき、それにより血栓溶解療法を実施する機会の時間枠を拡大する。
【０１０３】
大きな損傷後の蘇生で主に問題となるのは、適切な栄養素の送達と容量交換である。事後の敗血症を伴う出血及び多器官不全は、外科集中治療室での死亡の約６０％の原因となる。本発明のＥＭＳ器官培養技術は、ショックからの蘇生においてイン・ビボで組織の完全性と機能を維持するために使用できる。正常血液量は生理的温度の本発明の無細胞溶液で回復でき、これにより、生命に関わる失血をしている患者での二次的な再灌流傷害の進行は最小限になる。ＥＭＳ器官培養技術は摘出した器官を維持する。又は患者の全体を維持するのに用いてもよい。
【実施例１０】
【０１０４】
本発明の灌流溶液に適切な増殖因子及びホルモンを加えると、損傷を受けた器官における細胞修復工程が支えられれる。６０〜１２０分の温阻血を経験している腎臓を、本発明のＥＭＳ全器官培養技術で維持した。本発明の器官培養技術で６〜８時間器官培養した後、ヘンレ係蹄のシック・アセンディング・リム（thick ascending limb）の遠位尿細管で有糸分裂像が観察された。見掛けの損傷のない腎臓内の領域、即ち、近位尿細管および糸球体では修復プロセスの証拠はなかった。これらの研究は、損傷を受けた組織の修復及び再生におけるＥＭＳ器官培養技術の実質的な可能性を実証する。
【０１０５】
死後２時間で取り出した腎臓は、次のようにＥＭＳ灌流の間、蘇生及び修復がなされた。最初の灌流圧及び血管流速は極めて異常であり、平均灌流圧が２４／２０ｍｍＨｇ、平均血管流速が４ｃｃ／分／ｍｇであった。同様に、最初の酸素消費も損なわれ、平均値は０.０８ｃｃ／分／ｇｍであった。これらの器官の最初の査定は、一次機能なし（ＰＮＦ）又は生存能力なしと予測した。
【０１０６】
本明細書に記載のプロセス及び溶液を用いて８時間ＥＭＳ灌流する間に、この腎臓は修復された。灌流圧及び血管流速は正常になり、酸素消費は平均値０.２２ｃｃ／分／ｇｍまで増え、尿流量が元に戻った。これらのパラメータの正常化は、ＰＮＦから軽度の急性腎尿細血管壊死を伴う生存可能な器官に結果を変化させるのに十分な程この腎臓が蘇生し、回復したことを示す。これらの腎臓のうちの二つは８時間のＥＭＳ灌流後の生存可能性を測定し、その後移植した。三つ目の腎臓は１８時間のＥＭＳ灌流の後、再移植した。下の表５に挙げた結果は器官の生存可能性を示すだけでなく、死後２時間の温阻血からの蘇生及び損傷の修復におけるＥＭＳ技術の役割をも証明する。
【０１０７】
【表５】
2004529938.tif 000012
ＥＭＳ技術は、現在臨床的移植における修復不可能な損傷であると考えられている阻血傷害から器官を蘇生させ修復することができる。ＥＭＳ灌流の期間は、修復の程度に直接相関し、腎臓を長く灌流させればそれだけ良く修復する。８時間のＥＭＳ灌流では、移植後第４日目でピーク値の血清クレアチニンを持ち移植可能になり、第１２日と１３日目で正常化する程にＰＮＦの腎臓を十分に修復した。１８時間のＥＭＳ灌流では更なる修復が見られ、血清クレアチニン値がわずかに上昇し、２日でピークとなり、移植後３日目で正常値になった。これは再移植前に８時間灌流した腎臓よりも１週間早い。
【実施例１１】
【０１０８】
ＥＭＳ器官培養技術の、肝臓をほぼ生理学的な温度で保存する効果、及び死後６０分の温阻血（ＷＩ）後に肝機能を蘇生する能力を検討した。酸素消費、及び急性の損傷を表す標準的な肝臓酵素を含む、肝臓の生存能力及び代謝機能を表す選択されたパラメータの測定を行った。代謝機能の評価には、胆汁生産の測定及び胆汁中の酵素とビリルビンの濃度の評価が含まれた。
【０１０９】
図２に記載の肝臓灌流システムは、動脈及び静脈血管系の双方を支える必要があるため、腎臓システム及び肝臓システムとは異なる。本発明で記載するシステムは、より低い血管流速（＜２５０ｃｃ／分）で肝臓動脈を経て高いＰａＯ2（１００〜２４０ｍｍＨｇ）を送達し、同時に門脈系を経て低いＰａＯ2（＜１４０ｍｍＨｇ）とそれに対応する高い血管流速（＞２４０ｃｃ／分）を供給する点で独特である。正味の効果は、胆管系が保護され、灌流中の胆汁生産が最大になるよう、より生理学的な灌流を供給することである。
【０１１０】
図２に示したように、廃液貯蔵槽３８は、ポンプ６４で灌流液を肝臓の門脈６６に運搬する二つ目の灌流経路６０に排出させる二つ目の廃液排出口６２を有する。腎臓と同様に、該ＥＭＳシステムは灌流液の温度、灌流圧、血管流速、容積モル浸透圧濃度、ｐＨ、ＰａＯ2、ＰａＣＯ2、栄養分送達および老廃副産物の除去を制御する。これは二つの流路で灌流液をそれぞれ別に監視、制御することにより、又は肝臓動脈を供給する灌流経路のみを調節することにより行われる。従って、一つの実施態様では、門脈系用の流路はそれ自体の温度制御器、酸素供給器及び呼吸ガス制御器、ｐＨ制御器、気泡トラップ、及び流速、血管抵抗、ＯｓＭ、ＰａＯ2、及びＰａＣＯ2を検知する手段を更に含む。
【０１１１】
肝動脈流路と同様に、門脈流路の灌流温度は２５℃〜３７℃の範囲で維持される。一つ以上のインライン酸素供給器と酸素運搬体が、肝動脈と門脈供給について上で述べた酸素張力を与える。一つ以上のｐＨ電極、制御器及びソレノイドのシステムがＣＯ2の流入を制御し、両方の流路で灌流液のｐＨを７.３０〜７.４５の範囲に維持する。
【０１１２】
他の器官と同様に、長期間の肝臓の保存は、灌流液交換、透析、又はその組み合わせにより灌流液中の枯渇した栄養分を補充することにより、そして蓄積した代謝老廃物を透析で除去することにより行われる。肝臓に特有の合成的特性は、タンパク質合成と新たな細胞増殖を生み出すことにより再生の機会を与える。
【０１１３】
死後３０分（ｎ＝５）又は６０分（ｎ＝５）の温阻血（ＷＩ）のいずれかの後、子ウシの肝臓を摘出した。肝上の大静脈を横隔膜で切り離した。左上側から始め、リンパ組織、胃動脈及び総胆管を切って肝臓を解剖した。門脈と肝動脈を切り離し、それぞれ１２ｍｍと５ｍｍのカニューレでカニューレ挿入した。この肝臓を約４時間、３４℃で灌流した。灌流の間、ビリルビン、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ及び血液ガス（blood gases）を測定するため、灌流液の試料を２時間と４時間の時点で採取した。水腫又は変色はなく、ＥＭＳ器官培養技術の肝臓修復能力を証明した。
【０１１４】
死後３０分のＷＩを受けた肝臓は、ＥＭＳで蘇生させた後、全て高い酸素消費速度を示した。ＷＩ傷害が６０分に及んでも、酸素消費速度には有意義な違いは検出されなかった。死後３０分のＷＩに付された肝臓は、代謝の回復後、３１ｍｍＨｇの平均動脈血圧（ＭＡＰ）（肝動脈と門脈を合わせて）とこれに対応する３２０ｃｃ／分の合併流速を示した。血管抵抗は０.１であった。ＷＩに曝される時間が死後６０分に増えると、ＭＡＰは２０ｍｍＨｇまで下がり、流速は平均４２０ｃｃ／分まで増加した。この結果得られた血管抵抗は０.０６であった。
【０１１５】
標準的な肝機能スクリーニングを実施して、ＡＬＴ、ＡＳＴ、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）及び総ビリルビン／直接型ビリルビンをテストした。ＥＭＳ器官培養技術で蘇生させた後、死後３０分のＷＩで傷害を受けた肝臓は、２時間で一つの肝臓を除き、テストした両方の時点でＡＬＴ、ＡＬＰ及びビリルビンの正常値を示した（表４）。同様に、ＷＩ傷害が死後６０分に増加した場合、２時間及び４時間のＥＭＳ灌流後のＡＬＴ、ＡＬＰ及びビリルビンの値は正常であった。
【０１１６】
胆汁生産
死後３０分のＷＩの後にＥＭＳで蘇生させた肝臓は、温灌流の期間中胆汁を生産した。胆汁流速の変化を観察すると、１.５〜６ｃｃ／時の範囲であった。胆汁の色は暗緑色または緑黄色であった。摘出時点で胆嚢から取り出した胆汁から成る正常な対照は、３１５ｍｇ／ｄＬの総ビリルビン量、１８ＩＵ／ＬのＡＬＰを示し、ＡＳＴ及びＡＬＴについては陰性であった。死後３０分のＷＩで傷害を受けた肝臓は広範囲のビリルビン濃度、１.１〜４１８ｍｇ／ｄＬを持つ胆汁を生産した（表５）。しかしながら、平均値は正常な胆汁のビリルビン濃度に近かった。上述のＥＭＳ灌流液での肝臓酵素の濃度について観察された結果と同様に、胆汁ＡＳＴレベルは３０分のＷＩを受けた肝臓を２から４時間灌流する間に半減し、一方６０分のＷＩで損傷を受けた肝臓では胆汁ＡＳＴレベルは一定のままであった。ＡＬＴは３０分のＷＩ後に２時間灌流した肝臓のうち２つから得た胆汁で見出された。死後６０分のＷＩを受けた肝臓で生産された胆汁は、２時間と４時間のＥＭＳ灌流の両方でＡＬＴをも含んでいた。同様に、回復した肝機能は、胆汁生産の継続を支えるのに十分であった。
【０１１７】
これらの結果は、ＥＭＳ器官培養技術が実質的な死後のＷＩ傷害後の肝機能を蘇生させ修復させる能力を与えることを示唆する。３０分及び６０分のＷＩを受けた肝臓では、代謝はＥＭＳ灌流でほぼ生理学的な酸素消費を復旧するのに十分回復した。肝機能のテストの結果は肝臓が６０分程度のＷＩ損傷から蘇生できるという更なる証拠を示す。
【０１１８】
冷阻血損傷を予防するためのＥＭＳ技術の使用
冷虚血に曝す前のＥＭＳ灌流は組織を保護し、同種移植片の冷保存期間の延長を可能にする。現在、同種移植片は日常的に冷保存で２４時間しか臨床的に保存されない。冷保存の期間を延長すると、高率で機能の遅延をもたらし、多くの場合、腎臓が機能を回復できるまで透析により患者を支えることが必要である。冷阻血に曝す前に無傷の器官を無細胞の灌流に適合させることで、冷損傷から細胞を保護することができる。
【０１１９】
従って、本発明はまた、組織、移植片又は移植用の器官を貯蔵する方法であって、血液及び血液産物を除去するために組織、移植片又は器官を血液を含まない緩衝化生理学的溶液で洗い流す工程、組織、移植片又は器官への損傷を阻害するのに十分な時間ほぼ正常な代謝速度で組織、移植片又は器官を維持できる、本明細書に記載したものなどの温保存システム中で組織、移植片又は器官を灌流する工程、及びこの器官を４℃〜８℃で貯蔵する工程を含む方法を提供する。損傷を抑制するのに十分な時間とは、摘出された器官が灌流パラメータ、例えば流速や血管抵抗を正常化する機会を得た時間である。一般的に、３０分から２４時間の灌流期間で十分である。
【０１２０】
本発明の器官室は器官がコンテナ内で動くのを抑えるので、これは器官の輸送にも特に適している。器官は上で述べたように貯蔵のために調製できる。続いて、温保存システムから器官室を単に取り出し、出荷用に冷蔵又は冷包装することにより器官は輸送される。必要に応じて、移植場所に到着した際、器官を含む器官室を互換性のある温灌流システムに再固定でき、移植者に移植される前にこの器官を温灌流できる。更に、温灌流の期間を利用して移植前に該器官の機能的特性を監視することができる。
【０１２１】
温保存システムのコンポーネントが該器官室に組み込まれている実施態様では、適切な電源を用いて器官の灌流を輸送中に続けることができる。
【０１２２】
イヌの腎臓の対照グループ（ｎ＝３）を摘出し、ＶｉａＳｐａｎ（商標）ですぐに冷洗し、次いで２重に袋に入れ、氷の中に静的に包装して４８時間保存する。テストグループの腎臓は切除後、冷保存の前にＥＭＳ灌流に置いた。このグループ（ｎ＝２）では、切除した腎臓はＥＭＳ灌流溶液で血液を洗い出し、３２℃〜３４℃でＥＭＳ灌流に６時間置いた。ＥＭＳ灌流期間の後、該腎臓を４℃の２重の袋で約２００ｃｃのＶｉａＳｐａｎ（商標）で再度洗い流し、静的に包装して氷の中で４８時間保存した。
【０１２３】
冷蔵した腎臓を再移植する直前に、反対側の腎臓を腎摘出した。テスト腎臓と対照腎臓は次いで、腎動脈と大動脈の間と腎動脈から大静脈の間に作った末端−側面吻合を用いて自家移植した。移植後、該イヌを縫合し回復させた。毎朝、該イヌの前足から採血し、臨床経過を測定するため化学検査を実施した。
【０１２４】
結果
冷蔵前のＥＭＳ灌流は、静的な冷蔵４８時間後に正常な機能が回復するまでの時間が半減するという、より良い結果をもたらした。対照グループの腎臓をゆっくりと再灌流したが、手術台上(on the table)では尿は生産されなかった。ごく少量の尿が移植後の第一夜の間に生産された。対照グループのイヌは、可逆的な急性尿細管壊死（ＡＴＮ）の期間を経験した。移植後２４時間の血清クレアチニン値は、全て正常値を上回っており、それぞれ５.３、２.６、及び２.８ｍｇ／ｄＬであった。血清クレアチニン値は上昇し続け、頂点に達し、その後徐々に降下し、それぞれ７、９、及び１２日に正常化した。
【０１２５】
テストグループでは、腎臓は再灌流の数分以内に手術台上で尿を生産した。これらの腎臓は移植後の期間中、尿を生産し続けた。移植後２４時間の血清の化学は上昇し、血清クレアチニン値は２.２及び２.５ｍｇ／ｄＬであった。対照のイヌとは対照的に、上昇した血清化学が頂点に達したのは移植後２日目であった。血清クレアチニン値はそれぞれ５日と６日に正常化した。安楽死直後、該腎臓は巨視的に正常であった。組織学的研究もまた、正常な腎病理学を明らかにした。
【０１２６】
再移植前のＥＭＳ灌流は、従って、温灌流されたテスト腎臓はより軽度で期間がより短いＡＴＮを経験するという点で、冷阻血に誘発される損傷に対する保護を与える。ＥＭＳ灌流されたテストグループの腎臓はまた、ＥＭＳ灌流を受けていない対照グループの腎臓と比べると、移植後２４時間後の血清クレアチニン値がより低かった。ＥＭＳ灌流された腎臓はまた、すぐに冷蔵された対照グループの腎臓よりもより早く（５.５日対９.３日）血清クレアチニン値が正常化した。
【０１２７】
標的化された薬物の送達システムとしてのＥＭＳの使用
ＥＭＳ灌流は、器官、解剖による切除部分及び又は組織に標的化された方法で薬物を送達するのに用いることができる。さらに、どの手順においても、ＥＭＳで支えられた進行中の代謝及び機能を監視することができ、薬物の影響及びそれに対応する如何なる細胞の応答をも定量化するメカニズム提供することができる。例えば、熱ショックタンパク質の高レベル調節を惹起することで知られる化合物、ヘムオキシゲナーゼ−１を、本発明の技術に従って灌流されている摘出腎臓に投与した。該ＥＭＳ技術はエクス・ビボ灌流の間の腎臓の代謝と機能を適切に支え、６時間以内にヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）酵素の発現を増加させた。
【０１２８】
テストグループ（ｎ＝３）のイヌの腎臓を摘出し、カニューレ挿入し、ＥＭＳ灌流溶液で血液を洗い流し、コバルト・プロトポルフィリン（ＣｏＰＰ）を５、２５又は５０ｕＭのいずれかを灌流液に添加して３２℃〜３４℃でＥＭＳ灌流に６時間置いた。代謝と機能の評価は、ＨＯ−１誘導期間の間のエクス・ビボの腎機能の定量化から成るものであった。ＥＭＳ技術を使用することで、腎臓はほぼ生理学的な温度での灌流により代謝的に活性状態に維持された。約７０〜９０ｇｍの重さの腎臓が、脳死とそれに付随する僅か１５分の温阻血の後に得られた。これらの腎臓を、次いで３２℃から３４℃のＥＭＳ灌流に移した。該腎臓は、酸化的代謝、血管動力学及び器官機能について評価した。器官パラメータは、機能の評価の前に１時間安定化させた。動脈系及び静脈系からの試料を灌流中に生産された尿とともに採取した。動脈及び静脈の試料についてのＰＯ2測定にはラジオメータＡＢＬ５を用いた。
【０１２９】
酸素消費は、
ｍｌ／分／ｇｍ＝（ＰＯ2動脈−ＰＯ2静脈）×（流速）
として計算し、
血管抵抗は、
血管抵抗＝平均動脈圧／平均流速
として計算した。
【０１３０】
（外３）
2004529938.tif 000013
クレアチニンをトレーサーとして灌流液に添加した。３２℃〜３４℃でのＥＭＳ灌流の間に作られた尿を採取してテストした。クレアチニン濃度をＩＤＥＸＸヴェットラブ化学アナライザー上で測定し、糸球体濾過速度（ＧＦＲ）を
ＧＦＲ＝  （尿中クレアチニン）×（尿流量）／（灌流液中クレアチニン）×（時間）
として計算した。
【０１３１】
これらの腎臓のエクス・ビボの酸化的代謝は、三つ全てのＣｏＰＰ濃度と匹敵しており、６時間のＥＭＳ灌流の間中安定したままであった。回復した酸化的代謝は、酸素消費で測定したとき、０.１７から０.２３ｃｃ／分／ｇｍの範囲であった。しかしながら、この酸素消費は２５μＭのＣｏＰＰで灌流した腎臓では全ての時点で最高であった。灌流圧、血管流速及び血管抵抗もまた三つのＣｏＰＰ濃度グループで匹敵していた。従って、ＥＭＳ灌流中のＣｏＰＰの処置は血管動力学又は細胞酸化的代謝に悪影響を与えなかった。しかしながら、ＣｏＰＰ誘導の濃度の増加に従い、尿流量、クレアチニン清浄化、及びタンパク尿の発生における差異が観察された。
【０１３２】
器官機能に対するＣｏＰＰ濃度の効果
ＣｏＰＰ濃度が増加するに従い、尿流量は抑制された。ＣｏＰＰ濃度が５から２５μＭに増加した場合は尿流量は６６％だけ低下し、ＣｏＰＰが５０μＭに増加した場合は９０％を越えて低下した。糸球体濾過速度（ＧＦＲ）は、ＧＦＲの計算が尿流量と尿中クレアチニン濃度の両方に依存するため、それに応じて低かった。ＣｏＰＰ濃度を５μＭから２５μＭに増やすとＧＦＲが７１％低下した。同様に、５０μＭのＣｏＰＰ濃度はＧＦＲの９１％抑制をもたらした。ＣｏＰＰの濃度の増加はタンパク尿で示されるような「漏出性内皮（leaky endothelium）」の発生とも関連付けられた。
【０１３３】
（外４）
2004529938.tif 000014
（外５）
2004529938.tif 000015
ＥＭＳ灌流は、ＣｏＰＰに対する細胞が応答してヘムオキシゲナーゼ−１の発現を増加させるのに十分な程、進行中の代謝と機能を効果的に支えた。更に、ＥＭＳ灌流の間、ＣｏＰＰの投与は灌流の特性又は細胞代謝に悪影響を与えなかった。しかしながら、器官機能は、ＣｏＰＰ濃度が増加するにつれ投与量に依存する形で、尿流量の低下、糸球体濾過速度の低下及びタンパク尿の発生という面で、影響を受けることが見出された。従って、薬物に誘発される毒性はＥＭＳ灌流を通した投与の間に検知できる。治療用量で、ＥＭＳ灌流はＣｏＰＰによるＨＯ−１発現の誘発を支えるのに効果的であった。
【０１３４】
遺伝子治療でのＥＭＳ技術の使用
ＥＭＳ技術の関連のある使用は、標的化された遺伝子の送達システムとしてである。遺伝子治療の長期にわたる利益は、所望の遺伝子をある特定の場所に送達するという問題によって妨げられている。器官培養技術は、所望の場所に遺伝子を送達する一つの機構を提供する。遺伝子治療は、外因性遺伝子を移植に先立って導入できるので、移植された器官に関しては特に魅力的である。医薬品が遺伝子治療ベクターである場合は、その構築物は内因性タンパク質又は外因性タンパク質を機能的にコードしてもよく、これらは次いで移植後に標的中で発現することができる。このような遺伝子導入は標的組織によるさまざまなタンパク質の発現を可能にする。
【０１３５】
灌流システムは、標的の器官が適切な血液循環システムを有する、例えば腎臓、肝臓、心臓などである限り、数々の器官への遺伝子導入と医薬品投与に特に適している。灌流システムを経由する遺伝子送達の最も明白な利点は、有効性の向上、遺伝子導入の標的の特異性、及びごく少量のベクター物質の使用である。更に、体外の灌流システムは被験者の全身循環に大量の外来性遺伝子物質を投与することの危険性を減少する。これは免疫適格性の個体には特に重要である。
【０１３６】
低体温灌流を用いて無傷の腎臓に遺伝子産物を送達しようとする最近の試みは、標的細胞におけるトランスフェクション効率及び遺伝子発現の双方の低減という結果に終わった（ツァイグラー  ＳＴ、カービー  ＪＤ、キュリエル  ＤＴ、ディーセルム  ＡＧ、トンプソン  ＪＡ：Transpl 61:812，1996）。より重要なことに、この遺伝子導入は近位尿細管上皮細胞に局在化することが見出された。血管壁に沿っての透過性の変化は、低体温を含む様々な要因によって仲介されることが知られている。透過性が改変された結果、通常は静電荷によって血管壁で撃退される粒子又は粒子サイズが基層への透過性を増加させるという障壁機能の損傷である。
【０１３７】
長時間器官保存への本発明の貢献に加え、本発明のＥＭＳ技術は、生体外又は正常の場所のいずれかで、標的化された遺伝子の導入を達成するために用いることができる。該ＥＭＳは、トランスフェクション期間の前、間及び後に、トランスフェクトされる器官又は組織を代謝的に活性な状態に維持する。標的外の組織と接触することなく、長期間に渡ってほぼ生理学的な条件の下で標的化された組織と直接作用する能力は、ウイルス性ベクターの必要性の排除を含む代替的トランスフェクションの手順を使用する機会を提供する。例えば、ＥＭＳ器官培養灌流中に、より高い組み込み率を容易にするために、リポソーム複合体又はウイルス性ベクター及び血管内皮細胞特異的プロモーターを、治療用ＤＮＡをほぼ生理学的な温度で導入するために、灌流システムに導入することができる。
【０１３８】
ＥＭＳの間に代謝を保存するもう一つの利点は、代謝を抑制し細胞膜電位を変える低体温を使用するのとは対照的に、トランスフェクトの前に器官又は組織の機能状態を確定することの実現可能性である。これは器官が心拍のあるドナー以外のドナーから得られたものであり、何らかの阻血傷害を受けたかもしれない場合には特に重要である。更に、トランスフェクションの間に器官の代謝を監視することができ、無傷の器官の場合には最終的な器官の機能、即ち利尿などを定量化できる。細胞膜は正常な流体状態にあるので、正常な障壁機能が維持され、治療用の遺伝子（単数又は複数）を血管細胞に直接標的化する能力を持つ。
【０１３９】
ＥＭＳ灌流が腎臓内で血管壁の完全性と正常な障壁機能を保存する能力は、血管細胞に限定したトランスフェクションを達成する機構を提供する。器官内の血管細胞に治療用遺伝子（単数又は複数）を標的化させる能力はいくつかの重要な利点をもたらす。例えば、レポーター遺伝子産物は直接血流と接触し、それにより効果的な遺伝子治療送達システムを提供する。血管内皮は器官内で免疫性の接触面となるため、遺伝子治療は移植疾患及び自己免疫疾患の両方で、器官特異的な免疫調節療法の機会を与える。
【０１４０】
更なる利点は、ＥＭＳが無細胞であること、そしてＥＭＳが初期の免疫応答を誘発することなく、治療用遺伝子（単数又は複数）の核への最適なトランスフェクションのための環境を提供することである。従って、該ＥＭＳは、正常の場所または生体外で適用される場合、標的遺伝子送達用の高効率の送達ビークルを表し、そして代謝と機能を同時に監視することを可能にする。
【０１４１】
本発明の方法に従って、目的の遺伝子を現在知られているビークルの宿主を介して標的の組織に送達しうる。外因性ＤＮＡと標的組織のゲノムの間の相同組換えによる遺伝子治療は、ゲノム内の特定の遺伝子座の修飾という結果をもたらす。トランスフェクションのいくつかの方法には、遺伝子、リポソーム、プラスミドＤＮＡなどを含むウイルスベクターによる送達が含まれる。更に、本発明の方法によるエピソームＤＮＡの送達が実施可能であり、ゲノムとは無関係の標的遺伝子ベクターのエピソーム反復に起因する送達遺伝子のゲノム組み込みの必要性を回避する。
【０１４２】
器官又は組織について、本発明の標的送達方法を実施する際は、標的の組織を含む器官を生体から摘出し、温ＥＭＳ溶液で血液を洗い流し、ＥＭＳ灌流の上に置く。該灌流は機能の基準線が確立するのに十分な時間行う。外因性分子、例えばウイルス性ベクターを灌流内に注入し、そして薬学的に有効な量の外因性分子を送達するのに十分な時間灌流を継続する。器官の機能は、該器官を受容体に戻す前に、送達後の一定期間監視する。
【実施例１２】
【０１４３】
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子をコードする複製障害性のアデノウイルス（Adeno CMV5-GFP）を用いて、３４℃でエクス・ビボ灌流する間、無傷のウシ腎臓への遺伝子導入を支えるＥＭＳ灌流システムの有効性を評価した。ウシの腎臓は温ＥＭＳ溶液で血液を洗い流し、ＥＭＳ灌流に置いた。この灌流は約６０分実施し、機能の基準線を確立した。ウイルスベクター（１×１０9ＰＦＵ）をシステム中に注入し、灌流を２時間続けた。ＥＭＳ灌流中のウイルスベクターの投与とその結果の感染力は器官代謝又は器官機能に悪影響を与えなかった。
【０１４４】
対照腎臓は、ビアスパンをベースとした冷灌流液を用いて洗浄し４℃で灌流した腎臓から成る。代謝及び機能は４℃では阻害されるため、対照腎臓の代謝または機能に対するウイルスベクターの如何なる効果も測定できなかった。
【０１４５】
遺伝子導入に続き、これらの腎臓は、ウイルス粒子を循環させるあらゆる残留物を除去するため、腎動脈を経由して十分に洗い流した。次いで脈間構造の内腔をコラゲナーゼ溶液で満たして各腎臓内の血管細胞を単離し、これらの細胞を形態学的に確認した。消化され単離された血管内皮細胞を腎臓から洗い流し、これらを洗浄し１×１０6／ｍｌの濃度で一次培養中に置いた。緑色蛍光タンパク質をコードするトランスフェクトされた遺伝子の発現は表７に記載する。
【０１４６】
該ＥＭＳ灌流は感染率の上昇をもたらし、ＧＦＰを発現する培養では１８時間までに血管細胞の４０％が感染したのに対し、冷灌流された対照の腎臓では１７％であった。組織培養で４８時間で、ＥＭＳ灌流した腎臓から単離された内皮細胞は細胞の６０％でＧＦＰの強い発現を示した。対照的に、トランスフェクションが冷温で実施された対照の腎臓では、発現レベルの上昇は検出されなかった。
【０１４７】
コラゲナーゼ消化により血管内皮細胞を単離した後、実質性の細胞をＥＭＳ灌流された腎臓から分離した。分離された実質細胞は、組織培養で２４時間及び４８時間の時点ではＧＦＰ発現が陰性であることが見出された。これらの結果は、ＥＭＳ灌流の間にＧＦＰをコードする遺伝子の感染力及び導入が腎臓の血管内部の血管細胞に限定されたことを示唆する。従って、ＥＭＳで灌流されたテスト腎臓ではより良いトランスフェクション率とより高いレポーター遺伝子発現が両方の時点で観察され、トランスフェクションの証拠は血管細胞でしか見つからなかった。
【０１４８】
【表６】
2004529938.tif 000016
【０１４９】
【表７】
2004529938.tif 000017
本発明のＥＭＳ温保存技術は、損傷を負わせることなく器官を保存し、（エクス・ビボ器官灌流後の）器官の再移植又は（正常場所灌流後の）再灌流の際、直ちに正常機能を得るのに十分なレベルで代謝を支える。これらの理由で、ＥＭＳ灌流は治療薬、例えばヌクレオチドの送達が望まれる遺伝子治療における治療薬の送達に特に良く適している。更に、本発明のＥＭＳ温保存技術は現在の方法論より優れた遺伝子送達／トランスフェクションシステムを提供する。
【０１５０】
例えば、トリグヴァソンらに対する米国特許第５，８７１，４６４号は医薬品送達用の灌流装置及び方法を開示し、正常場所及びエクス・ビボの両方で成功した遺伝子トランスフェクションを記載している。しかしながら、この結果は過剰な利尿（灌流の最初の１時間で８００ｃｃ）で証明された実質的な腎臓損傷が発生したことを示唆する。また、利尿は２時間を越えて１，２００ｃｃ／時まで劇的に増加している。これは該腎臓が灌流中に損傷を受けたことの別の示唆である。更に、正常場所での灌流は２時間に及ばず、その後の時点では尿生産の記載はなく、エクス・ビボ灌流の場合には該腎臓は再移植されなかった。従って処置後の腎機能は記載されていない。
【０１５１】
トリグヴァソンに記載されたクレブス・リンガー液を用いた摘出腎臓の灌流が、再移植すると機能しない損傷器官を生ずる結果となることが証明された。当業者は摘出した腎臓がほぼ生理学的な温度で灌流された場合には数時間生存可能であるに過ぎないことを認めるはずである。
【０１５２】
以前に報告された研究を超えるＥＭＳ灌流の改良は、器官がほぼ生理学的な温度に維持され、損傷を与えられずに、器官代謝が支えられ、エクス・ビボの灌流後の再移植又は正常場所での灌流後の再灌流された場合、すぐに正常機能が得られるというものである。更に、ＥＭＳ灌流は数日間行うことができ、損傷を与えずに効果的な遺伝子トランスフェクションを可能にするだけでなく、ＥＭＳは遺伝子産物を完全に発現するのに十分長く器官を支えることができる。ほぼ生理学的な代謝で数日間器官を支える能力は、再移植又は再灌流の前にトランスフェクトされた遺伝子によりコードされるタンパク質産物を合成するという独特の能力を示し、これは既存の技術では不可能だったものである。
【０１５３】
次の例は、遺伝子送達及び遺伝子導入の間の器官の完全性を保つというＥＭＳ技術の優れた能力を証明する。対になった腎臓を子ウシから摘出した。この切除された腎臓から血液を洗い出し、対のうちの一方をＥＭＳ灌流上に置き、他方をトリグヴァソンにより記載されたシステムと溶液を用いた灌流の上に置いた。灌流の間、酸化的代謝は毎分毎グラム消費されるＯ2、利尿と対応する器官機能により酸素消費を計算して評価した。器官の機能は、その正常な障壁機能を保持し、血管内部に大きな分子を保持する糸球体の能力として測定した。ＥＭＳ灌流の場合、器官機能はコロイド、血清アルブミンのタンパク質漏出なしに尿を生産する能力、及びトリグヴァソン特許がコロイドを含まないため、血管内腔に赤血球を保持する能力、即ち赤血球について陰性の尿を生産する能力である。
【０１５４】
（外６）
2004529938.tif 000018
米国特許第５，８７１，４６４号に記載された方法に基づく灌流、即ち、インライン酸素供給器を持つガンブロ機器上で、１７％のヘマトクリットを得るために赤血球を補給されたクレブス・リンガー液を用いた灌流は、器官の水腫、マノメーターで測定したとき灌流圧の上昇、低い酸素消費、及び灌流液と同等のヘマトクリットを含む尿を生ずる障壁機能の低下という結果をもたらす。組織学は器官損傷の進行を支える更なるデータを示した。対照的に、ＥＭＳ灌流は水腫を防ぎ、安定した灌流圧と酸素消費を維持し、タンパク質を濾過した尿生産をもたらす。組織学はＥＭＳ灌流中の腎臓の完全性が保存されたことを確証した。
【０１５５】
（外７）
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長期間保存
ＥＭＳ技術を用いて、器官をエクス・ビボで長期間、代謝的に活発な状態で且つほぼ生理学的な温度で保存することができる。ＥＭＳ技術を用いて、１０個のイヌの腎臓をエクス・ビボで２４時間、４８時間及び７２時間保存した。エクス・ビボ灌流の期間中、灌流圧、血管流速、血管抵抗、酸素消費、ブドウ糖消費、及び利尿は安定したままであった。更に、これらの腎臓は組織学的な評価で正常であるように見えた。灌流期間中の様々な時点でＥＭＳ灌流溶液を交換することにより、適切な代謝サポートが達成された。これらの器官のうち三つが、その後の生存可能性と機能を測定するために再移植された。
【０１５６】
（外８）
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ＥＭＳ技術で２４時間を越えて灌流した該腎臓のうち三つを再移植した。この三つの腎臓は全て再灌流すると直ちに良い膨張を示し、再灌流して数分以内で尿を生産した。この三つの腎臓は全て直ぐに正常な機能を示し、終了時間までに膀胱がいっぱいになった。この３匹のイヌは全て、長期間ＥＭＳ灌流された腎臓のみで生存し、正常な血清化学値及び尿分析値示した。
【０１５７】
輸送用の器官を調製するためのＥＭＳシステムの使用
器官の維持と修復に加え、本発明は移植場所まで輸送するための器官の保存と器官の調製に役立つ方法を提供する。移植用の組織、移植片及び器官の貯蔵法は上に記載されている。同様に、本発明の器官室と温保存システムは移植場所への輸送するための器官を調製するためにも有利である。基本的に、器官は器官室に固定され、器官の損傷を修復し冷蔵又は出荷から生じうる更なる損傷から保護するために温保存システムで灌流する。この方法は（ａ）組織、移植片又は器官を血液を含まない緩衝化生理学的溶液で洗浄して血液及び血液産物を除去する工程、（ｂ）組織、移植片又は器官を、器官、組織又は移植片を支えることができる支持体を持ち、輸送中の器官、組織又は組織片が器官室内で動くのを阻止する器官室内で灌流する工程であって、該器官室が組織、移植片又は器官を保護するのに十分な期間ほぼ正常な代謝速度で組織、移植片又は器官を維持できる温保存システムの一部である工程、（ｃ）組織、移植片又は器官を冷灌流溶液を、例えば、４〜８℃の範囲の温度で灌流する工程、（ｄ）器官を含む器官室全体を温保存システムから取り出し、該器官を含む器官室を冷包装する工程、及び（ｅ）移植場所へ器官を含む器官室を輸送する工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】図１は、灌流液を循環させる閉ループ灌流部分システム及びそれを再処理する透析部分システムを有する血液を含まない代謝サポートシステムの実施態様を示す。
【図２】図２は、灌流交換部分システム及び肝臓の保存に適する二つの灌流経路を有する実施態様を示す。
【図３】図３は本発明の器官室の実施態様の一つの透視図である。
【図４】図４は本発明の器官室であって、該器官質がさらに貯蔵庫を含むものの実施態様の一つの透視図ある。
【図５】図５は本発明の器官室の一つの実施態様の断面図である。
【図６】図６は器官の血管を支持し、灌流液を器官から直接貯蔵庫に導く導管と接触して血管をしっかりと保持する血管支持体の断面図である。
【図７】図７は血管支持体の透視図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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