(57)【要約】中枢神経系内の構造及び細胞を結合するの能力を特徴とするヒトモノクローナル自己抗体を使用して、哺乳類の髄鞘脱落疾患、例えば、ヒトの多発性硬化症、並びにヒト及び家畜動物の中枢神経系のウイルス性疾患、例えば、後感染性脳脊髄炎を治療し、又はこれらの症状における髄鞘脱落の開始もしくは進行を予防抑制するための方法が記載される。特に、これらの方法はｓＨＩｇＭ２２ （ＬＩＭ ２２）、ｓＨＩｇＭ４６ ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０、ＣＢ２ｂＧ８、ＡＫＪＲ４、ＣＢ２ｉＥ１２、ＣＢ２ｉＥ７及びＭＳＩ １９Ｅ５、これらのモノマー、これらの活性フラグメント並びに上記の特性を有する単離された、又は合成のヒト又はヒト化自己抗体からなる群から選ばれるヒトモノクローナル抗体を利用する。ヒトモノクローナル抗体、又はこれらの部分をコードする核酸及びＤＮＡ分子が提供される。また、本発明はヒトポリクローナル自己抗体及びモノクローナル自己抗体、これらのモノマー、活性フラグメント、ペプチド誘導体及びフラグメント、並びに類似体、同族体、アゴニスト等の相当する物質の調製及び使用、並びに診断適用及び治療適用におけるそれらの使用に及ぶ。例えば、自己抗体、モノマー、フラグメント、ハプテン、及びペプチド均等物は神経再生及び神経保護の促進に有益であり、またペプチド又は抗体を含む治療組成物及びワクチンが含まれ、提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
髄鞘再形成治療を要する哺乳類に、有効量の、中枢神経内の構造及び細胞を結合する能力を特徴とするヒトモノクローナル自己抗体、又はその混合物、モノマー、及び／又は活性フラグメント、並びにこれらの特性を有する天然又は合成の自己抗体を投与することを含む、このような治療を要する哺乳類の中枢神経系軸索の髄鞘再形成の刺激方法。
【請求項２】
前記ヒトモノクローナル抗体がＩｇＭサブタイプの抗体である請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】
ｓＨＩｇＭ２２ （ＬＹＭ ２２）、ｓＨＩｇＭ４６、ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０、ｅｂｖ ＨＩｇＭ ＣＢ２ｂＧ８、これらの混合物、これらのモノマー、これらの活性フラグメント、これらの結合パートナー、及びこれらの特性を有する天然又は合成の自己抗体からなる群から選ばれるモノクローナル抗体を投与することを含む請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項４】
ＡＫＪＲ４、ＣＢ２ｉＥ１２、ＣＢ２ｉＥ７及びＭＳＩ１９Ｅ５、これらの混合物、これらの活性フラグメント、これらのモノマー、これらの結合パートナー、並びにこれらの特性を有する天然又は合成の自己抗体からなる群から選ばれるモノクローナル抗体を投与することを含む請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項５】
投与の方法が静脈内又は腹腔内投与である請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項６】
投与されるモノクローナル抗体の量が約０．５ｍｇ／ｋｇから約４００ｍｇ／ｋｇである請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項７】
中枢神経系軸索中のグリア細胞の増殖を要する哺乳類に、有効量の、中枢神経内の構造及び細胞に結合する能力を特徴とするヒトモノクローナル自己抗体、又はその混合物、モノマー、及び／又は活性フラグメント、並びにこれらの特性を有する天然又は合成の自己抗体を投与することを含む、このような治療を要する哺乳類の中枢神経系軸索中のグリア細胞の増殖を刺激する方法。
【請求項８】
その方法がｓＨＩｇＭ２２ （ＬＹＭ ２２）、ｓＨＩｇＭ４６、ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０、ＣＢ２ｂＧ８、これらの混合物、これらの活性フラグメント、これらのモノマー、及びこれらの特性を有する天然又は合成の自己抗体からなる群から選ばれるモノクローナル自己抗体を投与することを含む請求の範囲第７項記載の方法。
【請求項９】
投与の方法が静脈内又は腹腔内投与である請求の範囲第７項記載の方法。
【請求項１０】
投与されるモノクローナル抗体の量が約０．５ｍｇ／ｋｇから約４００ｍｇ／ｋｇである請求の範囲第７項記載の方法。
【請求項１１】
髄鞘脱落疾患の治療を要する哺乳類に、有効量の、中枢神経内の構造及び細胞に結合するそれらの能力を特徴とするヒトモノクローナル自己抗体、又はその混合物、モノマー、及び／又は活性フラグメント、並びにこれらの特性を有する天然又は合成の自己抗体を投与することを含むこのような治療を要する哺乳類の中枢神経系の髄鞘脱落疾患を治療する方法。
【請求項１２】
哺乳類が多発性硬化症を有するヒト、又はウイルス性髄鞘脱落疾患、もしくは中枢神経系の後神経疾患を有するヒトもしくは家畜動物である請求の範囲第１１項記載の方法。
【請求項１３】
ｍＡｂ ｓＨＩｇＭ２２ （ＬＹＭ ２２）、ｓＨＩｇＭ４６、ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０、ＣＢ２ｂＧ８、これらの混合物、これらの活性フラグメント、これらのモノマー、これらの結合パートナー、及びこれらの特性を有する天然又は合成の自己抗体からなる群から選ばれるモノクローナル抗体を投与することを含む請求の範囲第１１項記載の方法。
【請求項１４】
ＡＫＪＲ４、ＣＢ２ｉＥ１２、ＣＢ２ｉＥ７及びＭＳＩ１９Ｅ５、これらの混合物、これらの活性フラグメント、これらのモノマー、これらの結合パートナー、並びにこれらの特性を有する天然又は合成の自己抗体からなる群から選ばれるモノクローナル抗体を投与することを含む請求の範囲第１１項記載の方法。
【請求項１５】
投与の方法が静脈内又は腹腔内投与である請求の範囲第１１項記載の方法。
【請求項１６】
投与されるモノクローナル抗体の量が約０．５ｍｇ／ｋｇから約４００ｍｇ／ｋｇである請求の範囲第１１項記載の方法。
【請求項１７】
前記哺乳類がマウス脳脊髄炎サイラーウイルスのＤＡ株に感染されたマウスである請求の範囲第１１項記載の方法。
【請求項１８】
ａ）  グリア細胞を含む混合細胞培養物を細胞増殖に充分な条件下で培養すること、
ｂ）  前記混合培養物に、有効量の、中枢神経内の構造及び細胞に結合するそれらの能力を特徴とするヒトモノクローナル自己抗体、その結合パートナー、その混合物、その活性フラグメント、及びそのモノマー、並びにこれらの特性を有する天然又は合成の自己抗体を導入し、それによりモノクローナル抗体処理混合培養物を作製すること、
ｃ）  工程ｂ）の培養物をモノクローナル抗体処理細胞の増殖に充分な条件下に維持し、それにより混合培養物中のグリア細胞の増殖を生じさせること、および
ｄ）  前記グリア細胞を混合培養物から回収すること、
を含む、混合細胞培養物からグリア細胞の増殖を刺激するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項１９】
モノクローナル抗体がｍＡｂ ｓＨＩｇＭ２２ （ＬＹＭ ２２）、ｓＨＩｇＭ４６、ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０、ＣＢ２ｂＧ８、これらの混合物、これらのモノマー、これらの活性フラグメント、これらの結合パートナー、及びこれらの特性を有する天然又は合成の自己抗体からなる群から選ばれる請求の範囲第１７項記載の方法。
【請求項２０】
モノクローナル抗体がＡＫＪＲ４、ＣＢ２ｉＥ１２、ＣＢ２ｉＥ７及びＭＳＩ１９Ｅ５、これらの混合物、これらの活性フラグメント、これらのモノマー、これらの結合パートナー、並びにこれらの特性を有する天然又は合成の自己抗体からなる群から選ばれる請求の範囲第１７項記載の方法。
【請求項２１】
混合培養物がラット視神経又はラット脳から得られる請求の範囲第１７項記載の方法。
【請求項２２】
Ａ）  グリア細胞を細胞増殖に充分な条件下で培養し、それによりグリア細胞培養物を生産すること、
Ｂ）  前記グリア細胞培養物にグリア細胞を刺激してカルシウム（Ｃａ＋＋）ピークを示すことができる有効量の薬剤を導入し、それにより処理されたグリア細胞培養物を生産すること（前記薬剤はヒト自己抗体、ペプチド類似体、ハプテン、これらの混合物、これらの活性フラグメント、及びこれらのモノマー、並びにこれらの特性を有する天然又は合成の自己抗体から選ばれ、前記抗体は中枢神経系の構造及び細胞に結合することができることを特徴とする）、
Ｃ）  工程Ｂ）の処理されたグリア細胞培養物を処理された細胞の増殖に充分な条件下に維持すること、
Ｄ）  処理された細胞を培養物から回収し、それによりグリア細胞を得ること、そして
Ｅ）  工程Ｄ）で得られたグリア細胞を哺乳類の中枢神経系に導入し、それにより中枢神経系軸索の髄鞘再形成を刺激することを特徴とする、中枢神経系軸索の髄鞘再形成を要する哺乳類の中枢神経軸索の髄鞘再形成を刺激する方法。
【請求項２３】
前記モノクローナル抗体が図１７（配列番号１、４９）、図１８（配列番号５、５０）、図１９（配列番号９）、図２０（配列番号１１）、図２７（配列番号１３）、図２８（配列番号１５）、及びこれらの活性フラグメントからなる群から選ばれるアミノ酸配列に少なくとも一部相当するアミノ酸配列を有する請求の範囲第３項、第８項、第１３項又は第１９項のいずれか記載の方法。
【請求項２４】
前記モノクローナル抗体が図３７（配列番号２３）、図３８（配列番号２５）、図３９（配列番号２７）、図４０（配列番号２９）、図４１（配列番号３１）、図４２（配列番号３３）、図４３（配列番号３５）、及びこれらの活性フラグメントからなる群から選ばれるアミノ酸配列に少なくとも一部相当するアミノ酸配列を有する請求の範囲第４項、第１４項又は第２０項のいずれか記載の方法。
【請求項２５】
活性薬剤として、中枢神経系内の構造及び細胞に結合するそれらの能力を特徴とする一種以上のヒト抗体、それと反応性のペプチド、これらの混合物、これらの活性フラグメント、これらのモノマー及びこれらの結合パートナー、並びにこれらの特性を有する天然又は合成の自己抗体を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２６】
抗体が、ｓＨＩｇＭ２２ （ＬＹＭ ２２）、ｓＨＩｇＭ４６、ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０、ＣＢ２ｂＧ８、ＡＫＪＲ４、ＣＢ２ｉＥ１２、ＣＢ２ｉＥ７及びＭＳＩ１９Ｅ５、これらの混合物、これらの活性フラグメント、及びこれらの混合物並びに抗体ｓＨＩｇＭ２２ （ＬＹＭ ２２）、ｓＨＩｇＭ４６、ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０、ＣＢ２ｂＧ８、ＡＫＪＲ４、ＣＢ２ｉＥ１２、ＣＢ２ｉＥ７又はＭＳＩ１９Ｅ５の特性を有する天然又は合成の自己抗体からなる群から選ばれる請求の範囲第２５項記載の組成物。
【請求項２７】
神経突起外殖、再生、髄鞘再形成及び神経保護を特別な有効性をもってＣＮＳ中で促進することができる神経調節因子であって、前記薬剤がヒト抗体、ペプチド類似体、ハプテン、これらの活性フラグメント、これらのモノマー、これらのアゴニスト、これらの擬態、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれた物質を含み、前記薬剤が下記の特性：
ａ）  髄鞘再形成を誘導すること、
ｂ）  グリア細胞の細胞増殖を促進すること、および、
ｃ）  オリゴデンドロサイトとのＣａ＋＋シグナリングを促進すること
を有することを特徴とする前記神経調節因子。
【請求項２８】
抗体のＩｇＭファミリーのメンバーである請求の範囲第２７項記載の薬剤。
【請求項２９】
抗体がｍＡｂ ｓＨＩｇＭ２２ （ＬＹＭ ２２）、ｓＨＩｇＭ４６、ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０、ＣＢ２ｂＧ８、これらの混合物、及びこれらの活性フラグメント、並びにｍＡｂ ｓＨＩｇＭ２２ （ＬＹＭ ２２）、ｓＨＩｇＭ４６、ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０及びＣＢ２ｂＧ８の特性を有する天然又は合成の自己抗体からなる群から選ばれる請求の範囲第２８項記載の薬剤。
【請求項３０】
図１７（配列番号１、４９）、図１８（配列番号５、５０）、図１９（配列番号９）、図２０（配列番号１１）及びこれらの活性フラグメントからなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求の範囲第２７項記載の薬剤。
【請求項３１】
抗体がｍＡｂ ＡＫＪＲ４、ＣＢ２ｉＥ１２、ＣＢ２ｉＥ７、ＭＳＩ１９Ｅ５、これらの混合物、及びこれらの活性フラグメント、並びにｍＡｂ ＡＫＪＲ４、ＣＢ２ｉＥ１２、ＣＢ２ｉＥ７及びＭＳＩ１９Ｅ５の特性を有する天然又は合成の自己抗体からなる群から選ばれる請求の範囲第２８項記載の薬剤。
【請求項３２】
図２７（配列番号１３）、図２８（配列番号１５）、図３７（配列番号２３）、図３８（配列番号２５）、図３９（配列番号２７）、図４０（配列番号２９）、図４１（配列番号３１）、図４２（配列番号３３）、図４３（配列番号３５）及びこれらの活性フラグメントからなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求の範囲第２７項記載の薬剤。
【請求項３３】
ヒト細胞に由来する請求の範囲第２７項記載の薬剤。
【請求項３４】
検出可能な標識で標識された請求の範囲第２７項記載の薬剤。
【請求項３５】
標識が酵素、発光する薬品及び放射性元素から選ばれる請求の範囲第３４項記載の薬剤。
【請求項３６】
神経調節因子のヒト抗体又はヒト化抗体であって、前記抗体が産生される薬剤が下記の特性：
ａ）  髄鞘再形成を誘導すること、
ｂ）  グリア細胞の細胞増殖を促進すること、かつ
ｃ）  オリゴデンドロサイトとのＣａ＋＋シグナリングを促進すること
を有することを特徴とするヒト抗体又はヒト化抗体。
【請求項３７】
ポリクローナル抗体である請求の範囲第３６項記載の抗体。
【請求項３８】
モノクローナル抗体である請求の範囲第３６項記載の抗体。
【請求項３９】
キメラ（二重特異性）抗体である請求の範囲第３６項記載の抗体。
【請求項４０】
請求の範囲第３８項記載のモノクローナル抗体を産生する不死化細胞株。
【請求項４１】
検出可能な標識で標識された請求の範囲第３６項記載の抗体。
【請求項４２】
標識が酵素、発光する薬品及び放射性元素から選ばれる請求の範囲第４１項記載の抗体。
【請求項４３】
（Ａ）  図１７（配列番号１、４９）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｂ）  図１８（配列番号５、５０）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｃ）  図１９（配列番号９）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｄ）  図２０（配列番号１１）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｅ）  図２７（配列番号１３）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｆ）  図２８（配列番号１５）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｇ）  図３７（配列番号２３）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｈ）  図３８（配列番号２５）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｉ）  図３９（配列番号２７）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｊ）  図４０（配列番号２９）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｋ）  図４１（配列番号３１）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｌ）  図４２（配列番号３３）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｍ）  図４３（配列番号３５）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｎ）  通常のハイブリダイゼーション条件下で以上のＤＮＡ配列のいずれかにハイブリダイズするＤＮＡ配列、及び
（Ｏ）  上記ＤＮＡ配列のいずれかによりコードされたアミノ酸配列を発現時にコードするＤＮＡ配列
からなる群から選ばれる、抗体、そのペプチド類似体、これに相当するハプテン、又はこれらの活性フラグメントをコードする、ＤＮＡ配列又はその縮重変異体。
【請求項４４】
（Ａ）  図１７（配列番号１、４９）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｂ）  図１８（配列番号５、５０）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｃ）  図１９（配列番号９）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｄ）  図２０（配列番号１１）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｅ）  図２７（配列番号１３）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｆ）  図２８（配列番号１５）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｇ）  図３７（配列番号２３）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｈ）  図３８（配列番号２５）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｉ）  図３９（配列番号２７）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｊ）  図４０（配列番号２９）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｋ）  図４１（配列番号３１）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｌ）  図４２（配列番号３３）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｍ）  図４３（配列番号３５）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｎ）  通常のハイブリダイゼーション条件下で以上のＤＮＡ配列のいずれかにハイブリダイズするＤＮＡ配列、及び
（Ｏ）  以上のＤＮＡ配列のいずれかによりコードされたアミノ酸配列を発現時にコードするＤＮＡ配列、
からなる群から選ばれる、抗体、そのペプチド類似体、これに相当するハプテン、又はこれらの活性フラグメントをコードする、ＤＮＡ配列又はその縮重変異体を含む組換えＤＮＡ分子。
【請求項４５】
前記ＤＮＡ配列が発現調節配列に機能し得る形で連結されている請求の範囲第４４項記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項４６】
前記発現調節配列がＳＶ４０又はアデノウイルスの初期又は後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ファージλの主要オペレーター領域及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の調節領域、３−ホスホグリセレートキナーゼのプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター及び酵母α交配因子のプロモーターからなる群から選ばれる請求の範囲第４５項記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項４７】
請求の範囲第４３項記載のＤＮＡ配列から調製される、別の種における抗体、そのペプチド類似体、それに対応するハプテン、又はその活性フラグメントについてスクリーニングすることができるプローブ。
【請求項４８】
抗体、そのペプチド類似体、それに対応するハプテン、又はその活性フラグメントをコードする、ＤＮＡ配列又はその縮重変異体を含む組換えＤＮＡ分子で形質転換された単細胞宿主であって、前記ＤＮＡ配列が
（Ａ）  図１７（配列番号１、４９）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｂ）  図１８（配列番号５、５０）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｃ）  図１９（配列番号９）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｄ）  図２０（配列番号１１）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｅ）  図２７（配列番号１３）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｆ）  図２８（配列番号１５）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｇ）  図３７（配列番号２３）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｈ）  図３８（配列番号２５）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｉ）  図３９（配列番号２７）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｊ）  図４０（配列番号２９）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｋ）  図４１（配列番号３１）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｌ）  図４２（配列番号３３）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｍ）  図４３（配列番号３５）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｎ）  通常のハイブリダイゼーション条件下で以上のＤＮＡ配列のいずれかにハイブリダイズするＤＮＡ配列、及び
（Ｏ）  以上のＤＮＡ配列のいずれかによりコードされたアミノ酸配列を発現時にコードするＤＮＡ配列
からなる群から選ばれることを特徴とする前記単細胞宿主。
【請求項４９】
単細胞宿主が大腸菌、シュードモナス、バチルス、ストレプトミセス、酵母、ＣＨＯ細胞、Ｒ１．１細胞、Ｂ−Ｗ細胞、Ｌ−Ｍ細胞、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＢＳＣ１細胞、ＢＳＣ４０細胞、及びＢＴＭ１０細胞、植物細胞、昆虫細胞、及び組織培養ヒト細胞からなる群から選ばれる請求の範囲第４８項記載の単細胞宿主。
【請求項５０】
神経調節因子の存在又は活性を検出する方法であって、前記神経調節因子が、髄鞘再形成を誘導する、グリア細胞の細胞増殖を促進する、および、オリゴデンドロサイトとのＣａ＋＋シグナリングを促進する、という特性を有し、
Ａ）  前記神経調節因子の存在又は活性が疑われている哺乳類からの生物学的サンプルを、結合パートナーへの前記神経調節因子の結合を生じさせる条件下で、前記神経調節因子の結合パートナーと接触させること、および、
Ｂ）  前記サンプル中の前記神経調節因子と前記結合パートナーの間に結合が生じたか否かを検出すること、
によって前記神経調節因子が測定され、前記結合の検出が前記サンプル中の前記神経調節因子の存在又は活性を示すことを特徴とする検出方法。
【請求項５１】
神経調節因子の存在又は活性を検出することを含む哺乳類中の所定の侵襲性刺激と関連するポリペプチドリガンドの存在及び活性を検出する方法であって、請求の範囲第５０項記載の方法に従って神経調節因子の存在又は活性を検出することを含み、神経調節因子が検出されることが哺乳類中に所定の侵入性刺激と関連するポリペプチドリガンドが存在すること及び前記ポリペプチドリガンドの活性を表すことを特徴とする検出方法。
【請求項５２】
前記侵襲性刺激が感染である請求の範囲第５１項記載の方法。
【請求項５３】
前記侵襲性刺激がウイルス感染、原虫感染、腫瘍性哺乳類細胞、及び毒素からなる群から選ばれる請求の範囲第５１項記載の方法。
【請求項５４】
神経調節因子（前記神経調節因子は下記の特性：髄鞘再形成を誘導し、グリア細胞の細胞増殖を促進し、かつオリゴデンドロサイトとのＣａ＋＋シグナリングを促進することを有する）の結合部位の検出方法であって、前記方法が
Ａ．  標識神経調節因子サンプルを前記神経調節因子の結合部位が疑われている哺乳類からの生物学的サンプルと接触させること、
Ｂ．  前記生物学的サンプルを結合実験において前記標識神経調節因子の存在について試験することを含み、
前記標識神経調節因子の存在が神経調節因子の結合部位を示すことを特徴とする前記検出方法。
【請求項５５】
Ａ．  神経調節因子の受容体を有する試験細胞のコロニーを神経調節因子を含む増殖培地中で培養すること、
Ｂ．  試験薬物を添加すること、および、
Ｃ．  試験細胞の前記コロニーについて受容体との前記神経調節因子の反応性を測定することを含む、
神経調節因子の活性を調節する薬物又はその他の実体の能力の試験方法であって、
前記神経調節因子が下記の特性：
ａ）  髄鞘再形成を誘導する、
ｂ）  グリア細胞の細胞増殖を促進する、および、
ｃ）  オリゴデンドロサイトとのＣａ＋＋シグナリングを促進する
を有することを特徴とする前記試験方法。
【請求項５６】
Ａ．  薬物又は作用物質で接種された観察可能な細胞試験コロニーを培養すること、
Ｂ．  上清を前記細胞試験コロニーから回収すること、および、
Ｃ．  前記上清を前記神経調節因子の存在について試験することを含む、
神経調節因子の生成を調節し、又は神経調節因子の活性を模倣する能力についての薬物及びその他の作用物質をスクリーニングするためのアッセイ系であって、前記神経調節因子のレベルの増加又は減少が前記神経調節因子の活性を調節する薬物の能力を表し、前記神経調節因子が下記の特性：
ｉ）  髄鞘再形成を誘導する、
ｉｉ）  グリア細胞の細胞増殖を促進する、および、
ｉｉｉ）  オリゴデンドロサイトとのＣａ＋＋シグナリングを促進する、
を有することを特徴とする前記アッセイ系。
【請求項５７】
Ａ．  前もって決めた量の神経調節因子の検出可能に標識された特異性結合パートナー（前記神経調節因子は下記の特性：髄鞘再形成を誘導し、グリア細胞の細胞増殖を促進し、かつオリゴデンドロサイトとのＣａ＋＋シグナリングを促進することを有する）、
Ｂ．  その他の試薬、及び
Ｃ．  キットの使用のための指示書
を含むことを特徴とする真核生物細胞サンプル中の神経調節因子の実証用試験キット。
【請求項５８】
Ａ．  所定量の神経調節因子であって、髄鞘再形成を誘導し、グリア細胞の細胞増殖を促進し、かつオリゴデンドロサイトとのＣａ＋＋シグナリングを促進する特性を有する前記神経調節因子、
Ｂ．  所定量の、前記神経調節因子の特異性結合パートナー、、
Ｃ．  その他の試薬、及び
Ｄ．  キットの使用のための指示書
を含み、
前記神経調節因子又は前記特異性結合パートナーが検出可能に標識されていることを特徴とする、真核生物細胞サンプル中の神経調節因子の存在を証明するための試験キット。
【請求項５９】
標識された免疫化学反応性成分が、神経調節因子のポリクローナル抗体、神経調節因子のモノクローナル抗体、これらのフラグメント、及びこれらの混合物からなる群から選ばれる、請求の範囲第５０項又は第５１項記載の試験キット。
【請求項６０】
哺乳類に治療有効量の神経調節因子、前記神経調節因子の生成及び／又は活性を促進することができる薬剤、前記神経調節因子の活性を模倣することができる薬剤、前記神経調節因子の生成を抑制することができる薬剤、及びこれらの混合物からなる群から選ばれる物質、又はそれに特異的な結合パートナーを投与することを含む、ヒトを含む哺乳類の細胞衰弱、障害及び／又は機能不全及び／又はその他の疾病状態、およびＣＮＳ中のこのような状態を含む疾病状態の予防及び／又は治療方法であって、前記神経調節因子が下記の特性：
ａ）  髄鞘再形成を誘導する、
ｂ）  グリア細胞の細胞増殖を促進する、および、
ｃ）  オリゴデンドロサイトとのＣａ＋＋シグナリングを促進する
を有することを特徴とする前記予防及び／又は治療方法。
【請求項６１】
疾病状態が多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、ウイルス性髄鞘脱落症、中枢神経系の疾患、及び神経がトラウマによるように損傷される場合の中枢神経系中のその他の状態を含む請求の範囲第６０項記載の方法。
【請求項６２】
Ａ．  治療有効量の、神経調節因子、前記神経調節因子の生成及び／又は活性を促進することができる薬剤、前記神経調節因子の活性を模倣することができる薬剤、前記神経調節因子の生成を抑制することができる薬剤、及びこれらの混合物からなる群から選ばれる物質、又はそれに特異性の結合パートナー（前記神経調節因子は下記の特性：
ａ）  髄鞘再形成を誘導し、
ｂ）  グリア細胞の細胞増殖を促進し、かつ
ｃ）  オリゴデンドロサイトとのＣａ＋＋シグナリングを促進することを有する）、及び
Ｂ．  医薬上許される担体
を含むことを特徴とする、ヒトを含む哺乳類の細胞衰弱、障害及び／又は機能不全及び／又はその他の疾病状態（ＣＮＳ中のこのような疾病状態を含む）の治療用の医薬組成物。
【請求項６３】
実質的に免疫適格である宿主に抗体産生有効量の抗体ペプチドを注射し、前記抗体を回収することにより産生された抗体であって、前記抗体ポリペプチドが下記の特性：
ａ）  図１７（配列番号１、４９）、図１８（配列番号５、５０）、図１９（配列番号９）、図２０（配列番号１１）、図２７（配列番号１３）、図２８（配列番号１５）、図３７（配列番号２３）、図３８（配列番号２５）、図３９（配列番号２７）、図４０（配列番号２９）、図４１（配列番号３１）、図４２（配列番号３３）及び図４３（配列番号３５）からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有し、
ｂ）  髄鞘再形成を誘導する、
ｃ）  グリア細胞の細胞増殖を促進する、および、
ｄ）  オリゴデンドロサイトとのＣａ＋＋シグナリングを促進する
を有することを特徴とする前記抗体。
【請求項６４】
単クローン性である請求の範囲第６３項記載の抗体。
【請求項６５】
ポリクローン性である請求の範囲第６３項記載の抗体。
【請求項６６】
キメラ（二重特異性）である請求の範囲第６３項記載の抗体。
【請求項６７】
請求の範囲第４４項記載のＤＮＡ分子、又はその誘導体もしくはフラグメントで形質転換された組換えウイルス。
【請求項６８】
請求の範囲第４３項記載のＤＮＡ配列（そのフラグメント、突然変異体、変異体、類似体、又は誘導体を含む）を含むことを特徴とする単離された核酸。
【請求項６９】
核酸がＤＮＡである請求の範囲第６８項記載の単離された核酸。
【請求項７０】
核酸がｃＤＮＡである請求の範囲第６８項記載の単離された核酸。
【請求項７１】
核酸がゲノムＤＮＡである請求の範囲第６８項記載の単離された核酸。
【請求項７２】
核酸がＲＮＡである請求の範囲第６８項記載の単離された核酸。
【請求項７３】
ＲＮＡ転写のプロモーターに機能し得る形で連結された請求の範囲第６８項記載の単離された核酸。
【請求項７４】
請求の範囲第７３項記載の核酸分子を含むことを特徴とするベクター。
【請求項７５】
プロモーターが細菌プロモーター、酵母プロモーター、昆虫プロモーター、ウイルスプロモーター又は哺乳類プロモーターを含む請求の範囲第７４項記載のベクター。
【請求項７６】
ベクターがプラスミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、バクテリオファージ又は真核ウイルスＤＮＡである請求の範囲第７５項記載のベクター。
【請求項７７】
好適な宿主細胞中に請求の範囲第７３項記載のベクターを含むことを特徴とするポリペプチドの生産用の宿主ベクター系。
【請求項７８】
好適な宿主細胞が原核生物細胞又は真核生物細胞を含む請求の範囲第７７項記載の宿主ベクター系。
【請求項７９】
請求の範囲第６８項記載の核酸を含むことを特徴とする細胞株。
【請求項８０】
（ａ）  請求の範囲第７４項記載のベクターを好適な宿主細胞に導入すること、
（ｂ）  ポリペプチドを生産するように得られる宿主細胞を培養すること、
（ｃ）  工程（ｂ）で生産されたポリペプチドを回収すること、および、
（ｄ）  工程（ｃ）で回収されたポリペプチドを精製すること、
を特徴とする精製形態のポリペプチドを得る方法。
【請求項８１】
請求の範囲第８０項記載のポリペプチドに特異的に結合することができる抗体。
【請求項８２】
抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第８１項記載の抗体。
【請求項８３】
抗体がポリクローナル抗体である請求の範囲第８１項記載の抗体。
【請求項８４】
或る量の請求の範囲第８０項記載のポリペプチド及び医薬上許される担体又は希釈剤を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項８５】
請求の範囲第７４項記載のベクター及び医薬上許されるアジュバント又は担体を含むことを特徴とするワクチン。
【請求項８６】
患者に或る量の請求の範囲第８４項記載の医薬組成物を投与し、それにより免疫応答を誘導することを特徴とする、髄鞘脱落又はその他の神経変性疾病状態を生じさせる細菌、ウイルス等の病原体に暴露され、又は感染された患者の免疫応答を誘導する方法。
【請求項８７】
患者に細菌付着を防止するのに有効な量の請求の範囲第８４項記載の医薬組成物を投与し、それにより細菌、ウイルス等の病原体による感染を予防することを特徴とする、患者に髄鞘脱落又はその他の神経変性疾病状態を生じさせる細菌、ウイルス等の病原体による感染を予防する方法。
【請求項８８】
医薬組成物が静脈内送出、くも膜下送出、筋肉内送出、舌下送出、直腸送出、及び呼吸道又は鼻咽頭への送出からなる群から選ばれた経路により投与される請求の範囲第８７項記載の方法。
【請求項８９】
患者に請求の範囲第３６項記載の抗体及び医薬上許される担体又は希釈剤を含む或る量の医薬組成物を投与し、それにより細菌、ウイルス又は病原体による感染を予防することを特徴とする、患者に髄鞘脱落又はその他の神経変性疾病状態を生じさせる細菌、ウイルス等の病原体による感染を予防する方法。
【請求項９０】
患者に治療有効量の請求の範囲第８５項記載のワクチンを投与し、それにより患者を治療することを特徴とする、髄鞘脱落又はその他の神経変性疾病状態を生じさせる細菌、ウイルス等の病原体に感染し、又は暴露された患者の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本明細書に記載された発明は国立健康協会、援助金ＮＳ−２４１８０及び国立多発性硬化症協会援助金ＲＧ−１８７８−Ｂ−２により全部又は一部支持された。米国政府は本発明に或る種の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は一般に神経生物学の分野、更に特別には中枢神経系機能及び治療に役割を果たす自己抗体の同定に関する。また、本発明は、例として、医薬組成物、神経損傷と関連する疾患の治療方法、神経機能の再生方法及び回復方法、スクリーニングアッセイ並びにワクチンを含む、診断及び治療の物質及び方法に関する。
【０００３】
発明の背景
多発性硬化症（ＭＳ）は、初期の軸索損傷を通常生じない、原発性髄鞘脱落を病理学上特徴とする慢性の、頻繁に進行性の、炎症性中枢神経系（ＣＮＳ）疾患である。ＭＳの病因及び病原は知られていない。ＭＳの幾つかの免疫学的特徴、及び或る種の主要組織適合性複合体対立遺伝子とのその適度の関連は、ＭＳが免疫介在性疾患であるという推論を促していた。
自己免疫仮説は実験自己免疫（アレルギー性）脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルにより支持され、この場合、遺伝的感受性動物への或る種のミエリン成分の注射がＴ細胞介在性ＣＮＳ髄鞘脱落をもたらす。しかしながら、特異性自己抗原及び病的ミエリン反応性Ｔ細胞はＭＳ患者のＣＮＳ中で明確には同定されておらず、又はＭＳはその他の自己免疫疾患を伴っていない。疫学的データに基づく、別の仮説は、環境因子、おそらく未同定ウイルスがＣＮＳ中の炎症反応に関与し、これが、おそらくは誘導された自己免疫成分と共に、直接又は間接の（“バイスタンダー”）ミエリン破壊をもたらす。この仮説はヒト及び動物の両方における幾つかの天然に生じるウイルス感染症が髄鞘脱落を生じ得るという証拠により支持される。一つの普通に利用される実験ウイルスモデルがマウス脳脊髄炎サイラーウイルス（ＴＭＥＶ）により誘導される（Ｄａｌ Ｃａｎｔｏ， Ｍ．Ｃ．及びＬｉｐｔｏｎ， Ｈ．Ｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈ．， ８８：４９７−５００ （１９７７））。
【０００４】
ＭＳ及びその他の髄鞘脱落疾患の現行の治療効力に限界があることがこれらの疾患を改善するための新規治療の関心を刺激した。しかしながら、おそらくは環境因子及び自己免疫因子の両方を伴う、これらの疾患の明らかに複雑な病因のために、これらの髄鞘脱落障害の有効な治療に対する要望が依然として存する。
上記の先の関連特許出願において、中枢神経系中で活性を示すことが判明され、また髄鞘再形成の刺激と特に関連した自己抗体のグループが同定された。出願人らの目的の一つは抗体の活性の全範囲を研究すると同時に、このような活性を示すクラスのその他のメンバーを同定することであった。それ故、本発明が誘導されるのは以上の目的及びその他の目的の達成に関連する。
本明細書中の文献の引用はこれらの文献が本件出願の“従来技術”として利用し得ることを認めたものと見なされるべきではない。
【０００５】
発明の概要
本発明の第一局面において、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む、ヒト自己抗体が同定され、単離され、これらは中枢神経系中の神経細胞の促進、刺激、再生及び／又は髄鞘再形成に活性を示す。具体的な抗体が同定され、本明細書中で試験され、それ故、本発明はヒト自己抗体に及び、これらのヒト自己抗体はｓＨＩｇＭ２２ （ＬＩＭ ２２）、ｓＨＩｇＭ４６、ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０及びＣＢ２ｂＧ８により例示される。加えて、ヒト抗体は更にＡＫＪＲ４、ＣＢ２ｉＥ１２、ＣＢ２ｉＥ７及びＭＳＩ１９Ｅ５により例示される。また、本発明は別の局面において、同様の治療活性を示し得るその他の抗体及び関連結合パートナー（ハプテン及びペプチド類似体を含む）のスクリーニングのためのアッセイを提供する。このような活性は神経損傷又は機能不全、例えば、多発性硬化症、ＡＬＳ、卒中、パーキンソン病及びアルツハイマー病の治療又は予防を含むであろう。
【０００６】
本発明は別の局面において哺乳類の中枢神経系軸索の再生又は髄鞘再形成の促進又は刺激に関する。詳しくは、本発明はＩｇＭサブタイプの抗体及びこれらのモノマー、特にヒト自己抗体、又はこれらの混合物及び／又は活性フラグメントを含む、自己抗体を使用する中枢神経系（ＣＮＳ）軸索の髄鞘再形成の刺激方法に関するものであり、それらが中枢神経系中の構造及び細胞に結合することができることを特徴とする。また、本発明はヒト自己抗体の調製及び使用に及び、これらのヒト自己抗体はｓＨＩｇＭ２２ （ＬＩＭ ２２）、ｓＨＩｇＭ４６、ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０及びＣＢ２ｂＧ８により例示される。また、本発明はＡＫＪＲ４、ＣＢ２ｉＥ１２、ＣＢ２ｉＥ７及びＭＳＩ１９Ｅ５により例示されるヒト自己抗体の調製及び使用に及ぶ。例示抗体のＨ鎖及びＬ鎖可変領域配列が以下のように図面に示される。ＬＹＭ２２が図１７及び１８（配列番号１、５、４９及び５０）に示され、ＭＳＩ１９Ｄ１０が図１９及び２０（配列番号９及び１１）に示され、ＣＢ２ｂＧ８が図２７及び２８（配列番号１３及び１５）に示され、ＡＫＪＲ４が図３７及び３８（配列番号２３及び２５）に示され、ＣＢ２ｉＥ１２が図３９及び４０（配列番号２７及び２９）に示され、ＣＢ２ｉＥ７が図４１及び４２（配列番号３１及び３３）に示され、またＭＳＩ１９Ｅ５のＬ鎖が図４３（配列番号３５）に示される。本発明は抗体及び相当する抗体タンパク質、並びに注目された図面に示された配列を有し、又は少なくともその一部に相当する小分子、例えば、ハプテンに及ぶ。
【０００７】
本発明はＩｇ可変領域ｃＤＮＡ及び本明細書に記載された方法におけるそれらの実用性を確かめるためのこれらのｍＡｂの、中枢神経系中の構造及び細胞（オリゴデンドロサイトを含むが、これらに限定されない）を結合する能力の分析を利用する。更に、この研究は自己抗体のこのグループが中枢神経系の髄鞘再形成を生じるのに有効であるとしてその一般的な有用性を確認するものである。
本発明の更なる実施態様によれば、また上記のように、抗体の広いクラスが同定され、本明細書に開示される。詳しくは、神経組織に関する一層大きいアフィニティー並びに診断能力及び治療能力の両方を与える、ヒトポリクローナル自己抗体及びモノクローナル自己抗体がまた開示され、それに従って調製される。更に、本発明は新たに同定された抗体が種々の目的、例えば、髄鞘再形成の促進、損傷された神経細胞の再生、神経細胞の保護、神経細胞外殖等に使用し得ることに及ぶ。
【０００８】
本発明の有意な特徴及び利点は抗体の起源にある。何とならば、それらが宿主又は患者から直接得て、一層安全な自己治療を促進するのに使用し得るからである。更に広範には、これらの内因性物質に基づいた合成抗体、組換え抗体、ペプチド、小分子等の開発の開発は、自己免疫反応のようなあり得る病因又は機能不全を、ｉｎ ｖｉｖｏ導入及び外来性物質の使用の結果として、排除しないとしても軽減するであろう。また、抗体が内因性起原であることは患者又は宿主中の修復プロセスを研究し、疾病の治療における作用の基礎となるメカニズムを潜在的に同定することが可能であり得ること、それ自体が更なる治療識見及び戦略を生じ得ることの点で更なる利点を与える。
【０００９】
更に、オリゴデンドロサイ（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）における、Ｃａ＋＋ピークの誘導によるような、カルシウムシグナリングを促進する薬剤と注目された治療活性の開始及び／又は促進との間の関係の同定は、例えば、オリゴデンドロサイトにおけるカルシウムシグナリングの実証により治療薬剤の同定方法を与えるために意図されている。それ故、本発明はこの使用及び活性に同様に及ぶ。
本明細書に記載された抗体はペプチドライブラリー又はハプテンをスクリーニングするのに使用されてもよく、次にそれにより反応性ペプチド又はハプテンが単離され、髄鞘再形成、細胞増殖、分化、神経外殖、神経突起新芽形成及び／又はＣａ＋＋シグナリングを誘導するそれらの能力について試験し得る。一旦単離され精製されると、このようなペプチドは髄鞘再形成、細胞増殖又は分化、神経外殖、神経突起新芽形成及び／又はＣａ＋＋シグナリングを誘導し得るその他のポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体又はその他の分子についてスクリーニングするのにその後に使用でき、本明細書で注目される最後に挙げられたものはグリア細胞の増殖及び相当する活性に関係がある。特に、本発明の抗体に相当するペプチド、ハプテン、及びその他の分子はオリゴデンドロサイトに結合し、それにより神経リハビリテーション、例えば、髄鞘再形成、再生及び神経保護を誘導するそれらの能力により同定し得る。
【００１０】
また、本発明は広範には本明細書に記載された自己抗体に結合するペプチドに関するものであり、それによりこれらのペプチドはそれらの配列、三次元構造、又は抗体結合から生じるコンホメーションの変化のために、ペプチドワクチン中に使用でき、またそれ自体でペプチドワクチンとして使用し得る。本発明の更なる局面において、これらのペプチドは神経調節性及び／又は免疫調節性を有することがあり、神経細胞増殖応答、及び／又は神経保護、神経再生及び／又は髄鞘再形成の役割をこのような治療を要する哺乳類に誘導する方法を提供し得る。
同様に、本発明はペプチド、抗体及び／又はその他の関連基質に結合することがあり、かつ免疫性を有し得るハプテンを含み、その結果、それらはまた治療製剤（ワクチンをまた含む）中の活性成分として機能し得る。具体的な実施態様において、一種以上のハプテンがワクチン製剤中で、本発明のその他のペプチドと合わされてもよい。
【００１１】
本発明の更に別の局面において、これらのペプチドはタンパク質分解を防止するための安定剤とともに医薬組成物として製剤化でき、こうしてそれらの半減期を延長してこのような治療を要する哺乳類に経口、皮下、静脈内、鼻内、くも膜下投与され、又はリポソーム製剤として投与し得る。
また、本発明は本発明のモノクローナル抗体、又はその活性フラグメントを使用して、哺乳類の髄鞘脱落疾患、例えば、ヒトの多発性硬化症、並びにヒト及び家畜動物の中枢神経系のウイルス性疾患、例えば、感染後の脳脊髄炎を治療する方法、又はこれらの疾病における髄鞘脱落の開始又は進行を予防抑制する方法に関する。更に、本発明はグリア細胞、例えば、オリゴデンドロサイトの増殖を生じ、また刺激するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法、及び髄鞘脱落疾患を治療するためのこれらのグリア細胞の使用に関する。
【００１２】
更なる局面において、本発明は本明細書中で神経調節因子と称され、かつＣＮＳ中のそれらの治療活性に注目し得る分子のグループに及ぶ。それ故、本発明はＣＮＳ中に特別な有効性を有する神経調節因子に関するものであり、これらの薬剤は本発明の抗体からナル群から選ばれる物質を含み、それらには、ＩｇＭサブタイプの抗体、これらのモノマー、ペプチド類似体、ハプテン、これらの活性フラグメント、これらのアゴニスト、これらの模倣物、及びこれらの組み合わせが含まれる。神経調節因子は下記の特性を有する：それらは髄鞘再形成及び／又はグリア細胞の細胞増殖を誘導し、かつ／又はオリゴデンドロサイトにＣａ＋＋シグナリングを誘発する。
【００１３】
更に特別には、本発明の神経調節因子の範囲内に含まれる抗体はｍＡｂ ｓＨＩｇＭ２２ （ＬＹＭ ２２）、ｓＨＩｇＭ４６、ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０、ＣＢ２ｂＧ８、これらの混合物、これらのモノマー、これらの活性フラグメント、並びにｍＡｂ ｓＨＩｇＭ２２ （ＬＹＭ ２２）、ｓＨＩｇＭ４６、ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０及びＣＢ２ｂＧ８の特性を有する天然又は合成の自己抗体、特にヒト抗体からなる群から選ばれてもよい。本発明の神経調節因子は哺乳類細胞に由来してもよく、特別にはヒト細胞に由来してもよい。更に、神経調節因子は図１７（配列番号１及び４９）、図１８（配列番号５及び５０）、図１９（配列番号９）、図２０（配列番号１１）、図２７（配列番号１３）、図２８（配列番号１５）及びこれらの活性フラグメントからなる群から選ばれたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。
加えて、本発明の神経調節因子の範囲内の抗体はｍＡｂ、その混合物、そのモノマー、その活性フラグメント、並びにｍＡｂ ＡＫＪＲ４、ＣＢ２ｉＥ１２、ＣＢ２ｉＥ７、及びＭＳＩ１９Ｅ５の特性を有する天然又は合成の自己抗体、特にヒト抗体からなる群から選ばれてもよい。本発明の神経調節因子は哺乳類細胞に由来してもよく、具体的にはヒト細胞に由来してもよい。更に、神経調節因子は図３７（配列番号２３）、図３８（配列番号２５）、図３９（配列番号２７）、図４０（配列番号２９）、図４１（配列番号３１）、図４２（配列番号３３）、図４３（配列番号３５）及びこれらの活性フラグメントからなる群から選ばれたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。
【００１４】
また、本発明は組換えＤＮＡ分子もしくはクローン化遺伝子、又はその縮重変異体に関するものであり、これは本明細書中で神経調節因子と称され、かつ本発明の抗体、特に図１７−２０、２７、２８及び３７−４３に示された配列に少なくとも一部相当する配列を有する抗体及びペプチド（これらは本発明の抗体に少なくとも一部相当してもよく、本明細書中で抗体ペプチドとも称される）、例えば、図１７−２０、２７、２８及び３７−４３に少なくとも一部相当する一つ以上の配列を有するペプチド並びにハプテンの如き小分子を含み、またこれらから選ばれてもよい分子のクラスをコードし、同じ配列又は相補配列を有する組換えＤＮＡ分子又はクローン化遺伝子を含む。
【００１５】
更に特別には、組換えＤＮＡ分子はＤＮＡ配列又はその縮重変異体を含み、これは抗体、そのペプチド類似体、それに相当するハプテン、又はその活性フラグメントをコードし、これは
（Ａ）  図１７（配列番号１、４９）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｂ）  図１８（配列番号５、５０）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｃ）  図１９（配列番号９）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｄ）  図２０（配列番号１１）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｅ）  図２７（配列番号１３）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｆ）  図２８（配列番号１５）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
【００１６】
（Ｇ）  図３７（配列番号２３）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｈ）  図３８（配列番号２５）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｉ）  図３９（配列番号２７）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｊ）  図４０（配列番号２９）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｋ）  図４１（配列番号３１）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｌ）  図４２（配列番号３３）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｍ）  図４３（配列番号３５）の少なくとも一部に相当する配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
（Ｎ）  通常のハイブリダイゼーション条件下で以上のＤＮＡ配列のいずれかにハイブリダイズするＤＮＡ配列、及び
（Ｏ）  以上のＤＮＡ配列のいずれかによりコードされたアミノ酸配列を発現時にコードするＤＮＡ配列
からなる群から選ばれてもよい。
【００１７】
本発明はまた、本明細書で注目された活性を有するタンパク質に由来又は対応するタンパク質、またはそれらの断片若しくは誘導体であって、先に示され、記載され、図１７−２０、２７、２８及び３７−４３から選ばれたアミノ酸配列を示すタンパク質を含む。同様に、本発明はそれらのタンパク質又は抗体ペプチドと同じ活性を示し、治療組成物又はワクチン中の製剤化によるような、同様の様式で治療目的のために投与し得るハプテンに及ぶ。一実施態様において、ペプチド及びハプテンの両方を含む治療組成物又はワクチンを調製し得る。
本発明の更なる実施態様において、こうして決定された組換えＤＮＡ分子又はクローン化遺伝子の完全ＤＮＡ配列は適当な宿主に導入し得る発現調節配列に機能し得る形で連結されてもよい。それ故、本発明は本発明の抗体ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むクローン化遺伝子又は組換えＤＮＡ分子で形質転換された単細胞宿主に及ぶ。
特定の実施態様において、本発明の抗体の可変領域ＤＮＡ配列は一種以上の合成抗体を生じるのに利用し得る。特に、可変領域配列はその天然の、又は遺伝的に与えられた定常領域配列と合わされて合成抗体を与え得る。本発明は本発明の抗体のＤＮＡ配列、特に可変領域配列に由来し、それらの配列を含む合成抗体を生じるためのベクターを提供する。
【００１８】
本発明の或る好ましい実施態様のその他の好ましい特徴によれば、組換え発現系が提供されて生物学的に活性な動物又は特にヒトの抗体ペプチドが生産される。
本発明は本明細書に説明されたように既知の組換え技術を含む、自己抗体、ペプチド、相当するハプテン、又はこれらのその他の小分子類似体のクローンの調製のための幾つかの手段を含み、それ故、本発明はその範囲内にこのような合成調製物を含むことが意図されている。本明細書に開示されたｃＤＮＡ及びアミノ酸配列の単離はこのような組換え技術による本発明の抗体又はそれらの類似体の再生を促進し、それ故、本発明は組換えＤＮＡ技術により宿主系中の発現のための開示されたＤＮＡ配列から調製された発現ベクター、及び得られる形質転換された宿主に及ぶ。
本発明は本発明の自己抗体又はそれらの類似体の活性を強化することにより標的哺乳類神経細胞の神経活性を調節するのに有効な潜在的薬物のスクリーニングのためのアッセイ系を含む。一例において、試験薬物が自己抗体の活性を抑制するリガンド、又は抑制された抗体を含む抽出物にとともに細胞サンプル投与されて、対照と比較することにより、化学サンプル（ＤＮＡを含む）又は試験薬物に対する自己抗体の結合活性に関するその効果を測定し得る。
【００１９】
より重要なことに、アッセイ系はペプチド、ハプテン、その他の因子又はタンパク質（細胞質、核その他に見られるかを問わない）を含む、自己抗体及び／又はそれらの標的に結合することができ、それにより、例えば、免疫応答、神経成長、神経保護及び髄鞘再形成を含む、抗体活性、並びに本明細書で注目された相当する治療活性を強化することができる薬物又はその他の実体を同定するのに適合させることができる。このようなアッセイはペプチド及びその他の小分子ライブラリー、血清、及びその他の関係のある体液の中からの薬物候補の同定、並びに特定の細胞活性の促進もしくは抑制に特異性であり、又は経時的もしくは活性レベルにおいてこのような活性を強化する薬物の開発に有益であろう。例えば、このような薬物は髄鞘再形成を促進し、又は、その他の病気又は損傷を治療する、例えば、再成長もしくは再生に携わることができ、もしくは更に良好に携わることができるＣＮＳ神経細胞をつくる際に使用し得る。
【００２０】
同様に、本発明は天然に生じた抗体及び組換え的に調製された抗体を含む、本発明の神経調節因子に相当する抗体の開発に及ぶ。例えば、本抗体は発現ライブラリーをスクリーニングして神経調節因子として機能し得るペプチド、また、例えば、ワクチン中で機能し得るペプチドをコードする一種以上の遺伝子を得るのに使用し得る。このような抗体として、既知の遺伝子技術により調製されたポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方、および、二重特異性（キメラ）抗体、および、その他の機能を持つ抗体であって、そのために本発明の神経調節因子の一部であるヒト自己抗体の活性をエミュレートできる、又はそれを調節することができるそれらの能力と関連した更なる診断用途に適切である抗体が挙げられる。
こうして、神経調節因子、それらの類似体、及びそれに対して生じられるアンタゴニスト又は抗体は、例えば、放射性付加、又は放射性ヨウ素化により標識された神経調節因子の抗体を使用して、イムノアッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイを含む、種々の診断技術に関連して使用することができる。
【００２１】
イムノアッセイにおいて、調節量のアンタゴニスト又はその抗体等が調製され、酵素、特異性結合パートナー及び／又は放射性元素で標識され、次いで細胞サンプルに導入し得る。標識された物質又はその一種以上の結合パートナーがサンプル内の部位と反応する機会を有した後、得られる物質は既知の技術（これらは付着された標識の性質により変化し得る）により調べることができる。
放射性標識、例えば、放射性同位元素３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、及び１８６Ｒｅが使用される場合、既知の現在利用できるカウンティング操作が利用し得る。標識が酵素である場合、検出は当業界で知られている現在利用される比色技術、分光光度技術、蛍光分光光度技術、電流滴定技術又は気体定量技術のいずれかにより行ない得る。
【００２２】
本発明は神経調節因子の存在の程度の定量分析のために、又はそれらの活性を模倣もしくはブロックし得る薬物もしくはその他の薬剤を同定するために試験キットの形態で調製し得るアッセイ系を含む。その系又は試験キットは標識を神経調節因子、それらのアゴニスト及び／又はアンタゴニストに結合して、本明細書に説明された放射性技術及び／又は酵素技術の一つにより調製された標識された成分、及び一種以上の付加的な免疫化学試薬（これらの少なくとも一つは標識された成分、その結合パートナー、測定すべき成分の一種、又はそれらの一種以上の結合パートナーと結合することができる、遊離リガンド又は固定リガンドである）を含んでもよい。
更なる実施態様において、本発明は神経調節因子、それらのサブユニット、もしくはそれらの活性フラグメント、それらのペプチド均等物、それらの類似体の活性、又は同じ活性を有することが測定された薬剤もしくはその他の薬物に基づく或る種の治療方法に関する。第一の治療方法は抗体又はそれらのサブユニットの結合活性に原因的に関連し、又はそれからその後に生じる症状の発現の予防と関連し、神経調節因子、相当する自己抗体、抗体ペプチド、これらの活性フラグメント又はサブユニットの生成及び／又は活性を刺激することができる薬剤を宿主のこれらの症状の発生を予防又は治療するのに有効な量で個々に、又は互いに混合して投与することを含む。例えば、薬物又は抗体もしくはそれらのフラグメント等のその他の結合パートナーが投与されて神経再生活性及び／又は神経保護活性を強化し、又は多発性硬化症の治療のように髄鞘再形成を刺激し得る。
【００２３】
更に詳しくは、本明細書に一般に言及される治療方法は、神経調節因子の活性化の有効なインヒビターもしくはエンハンサー、又は、例えば、先に説明した本発明の側面に従って用意されて使用される薬物スクリーニングアッセイにより開発されたその他の同等に有効な薬物、を含み得る医薬組成物を投与することによる種々の病気又はその他の細胞機能不全及び障害の治療方法を含み得る。例えば、図１７（配列番号１、４９）、図１８（配列番号５、５０）、図１９（配列番号９）、図２０（配列番号１１）、図２７（配列番号１３）、図２８（配列番号１５）、図３７（配列番号２３）、図３８（配列番号２５）、図３９（配列番号２７）、図４０（配列番号２９）、図４１（配列番号３１）、図４２（配列番号３３）、図４３（配列番号３５）により示された配列に少なくとも一部相当する配列を有する、薬物、又は神経調節因子若しくはその類似タンパク質に対する他の結合パートナーがパーキンソン病又は多発性硬化症の治療のように神経再生、神経保護、又は髄鞘再形成を抑制又は強化するのに投与し得る。特に、配列が図１７及び１８に示されるｓＨＩｇＭ４６ （ＬＹＭ２２）のタンパク質、及び／又は図１９及び２０に示されるＭＳＩ１９Ｄ１０のタンパク質、及び／又は図２７及び２８に示されるＣＢ２ｂＧ８のタンパク質、及び／又は図３７及び３８に示されるＡＫＪＲ４のタンパク質、及び／又は図３９及び４０に示されるＣＢ２ｉＥ１２のタンパク質、及び／又は図４１及び４２に示されるＣＢ２ｉＥ７のタンパク質、及び／又は図４３に示されるＭＳＩ１９Ｅ５のタンパク質、それらの抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、又はこれらの活性フラグメントは、神経再生及び／又は神経保護療法又は髄鞘再形成が、例えば、アルツハイマー病、ＡＬＳ、ＭＳ、パーキンソン病、又は脊髄損傷を治療するのに適当である場合の投与のために、ワクチンを含む医薬製剤として調製し得る。
【００２４】
本発明は本明細書に提供された抗体の組み合わせ又は混合物を含み、この場合、一種より多い抗体、特にヒト抗体、最も特にｓＨＩｇＭ２２、ｓＨＩｇＭ４６、ＭＳＩ１９Ｅ１０、ＣＢ２ｂＧ８、ＡＫＪＲ４、ＣＢ２ｉＥ１２、ＣＢ２ｉＥ７及びＭＳＩ１９Ｅ５から選ばれる抗体が、医薬及び治療の組成物又は製剤中で調製し得る。加えて、本発明は更にこのような神経再生及び／又は神経保護療法又は髄鞘再形成に有益な治療化合物、薬物又は薬剤との一種以上の抗体の組み合わせを提供する。例えば、本発明の抗体製剤又は組成物はβインターフェロン製剤（ベータセロン等）及びコプロイマー１（コパキソン）を含む多発性硬化症の治療用の治療化合物と組み合わされてもよいが、これらに限定されない。
【００２５】
それ故、本発明の主たる目的は、神経再生及び／又は神経保護活性の促進と関連する或る種の特性及び活性を示す精製形態のヒト自己抗体及び相当する抗体ペプチド、ハプテン、類似体及びこれらの活性フラグメントを含む、神経調節因子を提供することである。
本発明の更なる目的は、侵襲性、自発性、又は突発性の症状が存在すると疑われている哺乳類の自己抗体の存在、量及び活性の検出方法を提供することである。
本発明の更なる目的は、哺乳類の自己抗体及び／又はそれらのフラグメント、サブユニット等の活性を模倣し、又はその副作用を治療するのに潜在的に有効な、薬物、薬剤等の如き物質のスクリーニング方法及び関連アッセイ系を提供することである。
こうして、本発明の目的は、記載されたモノクローナル自己抗体、これらの活性フラグメント、又はｓＨＩｇＭ２２ （ＬＩＭ２２）、ｓＨＩｇＭ４６、ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０及びＣＢ２ｂＧ８により例示されるヒト抗体の特性を有するその他の天然もしくは合成の自己抗体を使用する、哺乳類の髄鞘脱落疾患、例えば、ヒトの多発性硬化症、及びヒト及び家畜動物の中枢神経系のウイルス性疾患、例えば、後感染性脳脊髄炎を治療する方法、又はこれらの疾病において髄鞘脱落の開始又は進行を予防抑制する方法を提供することである。加えて、自己抗体、これらの活性フラグメント、又はＡＫＪＲ４、ＣＢ２ｉＥ１２、ＣＢ２ｉＥ７及びＭＳＩ１９Ｅ５により例示されるヒト抗体の特性を有するその他の天然もしくは合成の自己抗体を使用するこのような方法が提供される。
【００２６】
更に、本発明の目的は、オリゴデンドロサイトの如きグリア細胞の増殖を生じさせ、刺激するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法、及び髄鞘脱落疾患を治療するためのこれらグリア細胞の使用を提供することである。
本発明の更に別の目的は、本発明の神経調節因子、特にヒト自己抗体、フラグメント（ペプチドフラグメントを含む）、ハプテン、サブユニット、アゴニスト、一種以上の結合パートナーを含み、もしくはこれらをベースとし、或いは神経調節因子の生成を調節し、又はその活性を模倣もしくは拮抗作用する薬剤又は薬物をベースとする治療方法に使用するための、本発明の神経調節因子、及びそれを含む医薬組成物（ワクチンを含む）を提供することである。
本発明の更に別の目的は本発明の神経調節因子を模倣又は拮抗作用し、従って治療薬としての使用について考えられる薬物及びその他の分子の同定のためのアッセイ方法（スクリーニングアッセイを含む）を提供することである。
その他の目的及び利点は下記の例示の図面を言及して進行する下記の記載に鑑みて当業者に明らかになるであろう。
【００２７】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明は哺乳類の中枢神経系軸索の促進、刺激、再生、保護、及び／又は髄鞘再形成に関する。具体的には、本発明は中枢神経系内の構造及び細胞を結合する能力を特徴とする、ＩｇＭサブタイプの抗体及びこれらのモノマー、又はこれらの活性フラグメントを含む、自己抗体、特にヒト自己抗体、又はこれらの天然もしくは合成の類似体を使用する中枢神経系（ＣＮＳ）軸索の髄鞘再形成の刺激方法に関する。特定の実施態様において、本明細書で提供され、本発明の方法に利用される抗体はそれらがオリゴデンドロサイトに結合することができることを特徴とし、更に、特に、グリア細胞の増殖を刺激することができる。
本発明によれば、当業者に通常の分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡ技術が使用し得る。このような技術は文献に充分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（１９８９）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｉ−ＩＩＩ巻〔Ａｕｓｂｅｌ， Ｒ．Ｍ．編集（１９９４）〕；“Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”Ｉ−ＩＩＩ巻〔Ｊ．Ｅ． Ｃｅｌｉｓ編集（１９９４）〕；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”Ｉ−ＩＩＩ巻〔Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ．編集（１９９４）〕；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ． Ｇａｉｔ編集１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”〔Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編集（１９８５）〕；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”〔Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編集（１９８４）〕；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”〔Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編集（１９８６）〕；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ”〔ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， （１９８６）〕；Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”（１９８４）を参照のこと。
【００２８】
それ故、本明細書に現れる場合、下記の用語は以下に示される定義を有するべきである。
本件出願及び特許請求の範囲中に単独で本明細書に使用される“神経調節因子”という用語は、神経突起の伸長、再生及び髄鞘再形成を促進するように機能し、ＣＮＳ中で特別な利益及び効果を有する物質の広いクラスを表すことが意図され、それ故、ＩｇＭサブタイプの抗体及びこれらのモノマーを含む、本発明の抗体、特に表２及び３中を含む、本明細書に示され、最も特に本明細書中でｓＨＩｇＭ２２ （ＬＩＭ ２２）、ｓＨＩｇＭ４６、ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０、ＣＢ２ｂＧ８、ＡＫＪＲ４、ＣＢ２ｉＥ１２、ＣＢ２ｉＥ７、及びＭＳＩ１９Ｅ５と称されるヒト自己抗体、ペプチド類似体、ハプテン、モノマー、これらの活性フラグメント、アゴニスト、模倣物その他を含み、図１７−２０、２７、２８及び３７−４３に示されたペプチド配列に少なくとも部分類似性を有し得るような物質を含む。
【００２９】
また、神経調節因子とは、本明細書に示された抗体（これらのモノマー又は活性フラグメントを含む）の一種より多くの組み合わせ又は混合物を含み、包含する。
また、“神経調節因子”、“自己抗体”、“抗体ペプチド”、“ペプチド”、“ハプテン”という用語及び具体的に列挙しないあらゆる別形は、それらが単一又は多種タンパク質を含むタンパク質様物質を全て表し、含み得るという程度で、本明細書中で互換可能に使用されてもよく、本明細書に示され、図１７−２０、２７、２８及び３７−４３（配列番号１、４９、５、５０、９、１１、１３、１５、２３、２５、２７、２９、３１、３３及び３５）に示されるアミノ酸配列と、本明細書及び特許請求の範囲に示される活性のプロフィールを含むタンパク質に及ぶ。それ故、実質的に均等な活性又は改変された活性を示すタンパク質（特に抗体、合成抗体、これらのモノマー及びこれらの活性フラグメント）が同様に意図されている。これらの改変は随意であってもよく、例えば、改変が部位誘導突然変異誘発により得られてもよく、又は偶発であってもよく、例えば、改変は複合体又はその指定されたサブユニットの生産体である宿主中の突然変異により得られてもよい。また、“神経調節因子”、“自己抗体”、“抗体ペプチド”、“ペプチド”、“ハプテン”という用語は、適当な場合に、本明細書中に具体的に言及されたタンパク質、および、全ての実質的に相同の類似体及び対立変化をそれらの範囲内に含むことが意図されている。
【００３０】
本明細書に記載されたアミノ酸残基は“Ｌ”異性体形態であることが好ましい。しかしながら、“Ｄ”異性体形態の残基は、免疫グロブリン結合の所望の機能性がポリペプチドにより保持される限り、あらゆるＬアミノ酸残基に代えて使用し得る。ＮＨ２はポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を表す。ＣＯＯＨはポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基を表す。通常のポリペプチド命名法、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２４３：３５５２−５９ （１９６９）に遵守して、アミノ酸残基の略号が下記の対応表に示される。
【００３１】
【表１】
2004516807.tif 000002
【００３２】
全てのアミノ酸残基配列は左右方向がアミノ末端からカルボキシ末端への通常の方向である式により本明細書中で表されることを述べておかなければならない。更に、アミノ酸残基配列の最初又は最後にあるダッシュは一つ以上のアミノ酸残基の更なる配列へのペプチド結合を示すことを述べておかなければならない。上記表は本明細書中に二者択一的に現れ得る３文字表記法及び１文字表記法を相関関係付けるために示してある。
“レプリコン”はｉｎ ｖｉｖｏのＤＮＡ複製の自律単位として機能し、即ち、それ自体の制御のもとに複製することができるあらゆる遺伝子要素（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。
“ベクター”は別のＤＮＡセグメントを付加することができ、そのセグメントの複製を生じさせるようなレプリコン、例えば、プラスミド、ファージ又はコスミドである。
“ＤＮＡ分子”はその一本鎖形態、又は二本鎖らせんのデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、又はシトシン）のポリマー形態を表す。この用語はその分子の一次構造及び二次構造のみを表し、それを特別な三次形態に限定しない。こうして、この用語は、とりわけ、線状ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、ウイルス、プラスミド、及び染色体に見られる二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を説明する際に、配列はＤＮＡの非転写ストランド（即ち、ｍＲＮＡに相同の配列を有するストランド）に沿って５’から３’方向の配列のみを示すという慣習に従って本明細書に記載されるであろう。
“複製起点”はＤＮＡ合成に関与するＤＮＡ配列を表す。
【００３３】
ＤＮＡ“コーディング配列”は適当な調節配列の制御のもとに置かれた場合にｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドに転写され、翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コーディング配列の境界は５’（アミノ）末端にある開始コドン及び３’（カルボキシ）末端にある翻訳停止コドンにより決められる。コーディング配列として、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳類）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、更には合成ＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されない。ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列は通常コーディング配列の３’に配置されるであろう。
転写調節配列及び翻訳調節配列は宿主細胞中でコーディング配列の発現を与えるＤＮＡ調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター等である。
“プロモーター配列”は細胞中でＲＮＡポリメラーゼを結合し、下流（３’方向）のコーディング配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本発明を特定する目的のために、プロモーター配列は転写開始部位によりその３’末端で境界づけれられ、上流（５’方向）に延びてバックグラウンドより上で検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基又は要素を含む。プロモーター配列内に、転写開始部位（通常ヌクレアーゼＳ１でマッピングにより特定される）、および、ＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見られるであろう。真核生物プロモーターは常にではないがしばしば“ＴＡＴＡ”ボックス及び“ＣＡＴ”ボックスを含むであろう。原核生物プロモーターは−１０及び−３５コンセンサス配列に加えてシャイン−ダルガーノ配列を含む。
【００３４】
“発現調節配列”は別のＤＮＡ配列の転写及び翻訳を制御し、調節するＤＮＡ配列である。コーディング配列はＲＮＡポリメラーゼがコーディング配列をｍＲＮＡ（これは次いでコーディング配列によりコードされたタンパク質に翻訳される）に転写する場合に細胞中で転写調節配列及び翻訳調節配列の“制御下”にある。
“シグナル配列”はコーディング配列の前に含まれることがある。この配列は宿主細胞と相互作用してポリペプチドを細胞表面に誘導し、又はポリペプチドを培地に分泌する、ポリペプチドのＮ末端側あるシグナルペプチドをコードし、このシグナルペプチドはタンパク質が細胞から離れる前に宿主細胞により切り取られる。シグナル配列は原核生物及び真核生物の天然の種々のタンパク質と関連して見られる。
【００３５】
本発明のプローブを表すのに本明細書に使用される“オリゴヌクレオチド”という用語は、２種以上、好ましくは３種より多いリボヌクレオチドを含む分子と定義される。その正確なサイズは多くの因子に依存し、これらは次にはオリゴヌクレオチドの最終の機能及び用途に依存するであろう。
本明細書に使用される“プライマー”という用語は、プライマー伸長産物（これは核酸ストランドに相補性である）の合成が誘導される条件下、即ち、ヌクレオチド及び誘導剤、例えば、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で好適な温度及びｐＨで置かれた場合に合成の開始の位置として作用することができるオリゴヌクレオチド（精製された制限消化産物のような天然に生じるものであるか、又は合成により生成されるかを問わない）を表す。プライマーは一本鎖又は二本鎖であってもよく、誘導剤の存在下で所望の伸長産物の合成を開始するのに充分に長い必要がある。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの源及びその方法の使用を含む、多くの因子に依存するであろう。例えば、診断適用について、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは典型的には１５−２５又はそれ以上のヌクレオチドを含むが、それより少ないヌクレオチドを含んでもよい。
【００３６】
本明細書のプライマーは特別な標的ＤＮＡ配列の異なるストランドに“実質的に”相補性であるように選ばれる。これはプライマーがそれらの夫々のストランドとハイブリダイズするのに充分に相補性である必要があることを意味する。それ故、プライマー配列は鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補性ヌクレオチドフラグメントがプライマーの５’末端に付着され、プライマー配列の残部はそのストランドに相補性であってもよい。また、非相補性塩基又は更に長い配列は、プライマー配列がそのストランドの配列と充分な相補性を有してそれとハイブリダイズし、それにより伸長産物の合成のための鋳型を形成することを条件として、プライマー中に散在してもよい。
本明細書に使用される“制限エンドヌクレアーゼ”及び“制限酵素”という用語は、特定のヌクレオチド配列の付近で二本鎖ＤＮＡを切断する、細菌の酵素を表す。
【００３７】
細胞は外因性又は異種のＤＮＡが細胞内に導入された場合にこのようなＤＮＡにより“形質転換”されたという。形質転換ＤＮＡは細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組み込まれて（共有結合されて）もよく、また組み込まれなくてもよい。例えば、原核生物、酵母、及び哺乳類において、形質転換ＤＮＡはプラスミドの如きエピソーム要素で維持されてもよい。真核生物細胞に関して、安定に形質転換された細胞とは、形質転換ＤＮＡが染色体に組み込まれるようになった細胞であり、その結果、それは染色体複製により娘細胞により遺伝される。この安定性は真核生物細胞が形質転換ＤＮＡを含む娘細胞の集団を含む細胞株又はクローンを樹立することができることによって実証される。“クローン”は有糸分裂により単細胞又は共通の祖先から誘導された細胞の集団である。“細胞株”は多くの世代にわたってｉｎ ｖｉｔｒｏで安定に成長することができる一次細胞のクローンである。
【００３８】
２種のＤＮＡ配列はヌクレオチドの少なくとも約７５％（好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％又は９５％）がＤＮＡ配列の特定長さにわたってマッチする場合に“実質的に相同”であるという。実質的に相同である配列は配列データバンク中で利用できる通常のソフトウェアを使用して、又は、例えば、その特別な系について特定されたストリンジェント条件下のサザンハイブリダイゼーション実験で配列を比較することにより同定し得る。適当なハイブリダイゼーション条件を特定することは当業者の能力範囲内にある。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓらの上記文献；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｉ巻及びＩＩ巻、上記文献；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、上記文献を参照のこと。特に、本発明の抗体の重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列は相当する生殖系列遺伝子配列に対して少なくとも約９０％の相同性を有し、相当する生殖系列遺伝子配列に対し実質的に相同である。
【００３９】
また、本発明の抗体、又はそのペプチド類似体、ハプテン、もしくは活性フラグメントをコードするＤＮＡ配列は本発明の範囲内にあることが理解されるべきであり、これらはその少なくとも一部を規定するペプチド、又は図１７−２０、２７、２８及び３７−４３（配列番号１、４９、５、５０、９、１１、１３、１５、２３、２５、２７、２９、３１、３３及び３５）に示されたのと同じ配列を有するペプチドをコードするが、同じ配列番号に縮重したものである。“縮重している”は異なる３文字コドンが特定のアミノ酸を規定するのに使用されることを意味する。下記のコドンが夫々の特定アミノ酸をコードするのに互換可能に使用し得ることはこの技術分野で公知である。
【００４０】
2004516807.tif 000003
【００４１】
上記コドンはＲＮＡ配列に関するものであることは言うまでもない。ＤＮＡに関する相当するコドンはＵに代えて置換されたＴを有する。
特定のコドンが異なるアミノ酸をコードするコドンに変化するような突然変異を特定のＤＮＡ配列又は分子中で行なうことができる。一般にこのような突然変異は、可能な最も少ないヌクレオチド変化をつくることにより行なわれる。この種の置換突然変異は、生じるタンパク質において非保存様式（即ち、特定のサイズ又は特性を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸からのコドンを別のグループに属するアミノ酸に変化することにより）又は保存様式（即ち、特定のサイズ又は特性を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸からのコドンを同じグループに属するアミノ酸に変化することにより）でアミノ酸を変化するのに行ない得る。このような保存的変化は一般に得られるタンパク質の構造及び機能をあまり変化させない。非保存的変化はおそらく得られるタンパク質の構造、活性又は機能を変えるであろう。本発明は得られるタンパク質の活性又は結合特性を有意に変えない保存的変化を含む配列を含むと考えられるべきである。
下記の分類はアミノ酸の種々のグループの一例である。
【００４２】
非極性Ｒ基を有するアミノ酸
アラニン
バリン
ロイシン
イソロイシン
プロリン
フェニルアラニン
トリプトファン
メチオニン
電荷を持たない極性Ｒ基を有するアミノ酸
グリシン
セリン
スレオニン
システイン
チロシン
アスパラギン
グルタミン
電荷を持った極性Ｒ基を有するアミノ酸（ｐＨ ６．０で負に荷電される）
アスパラギン酸
グルタミン酸
塩基性アミノ酸（ｐＨ ６．０で正に荷電される）
リジン
アルギニン
ヒスチジン（ｐＨ ６．０で）
【００４３】
別のグループはフェニル基を有するアミノ酸であろう。
フェニルアラニン
トリプトファン
チロシン
別のグループ分けは分子量（即ち、Ｒ基のサイズ）に従ってもよい。
グリシン                  ７５
アラニン                  ８９
セリン                    １０５
プロリン                  １１５
バリン                    １１７
スレオニン                １１９
システイン                １２１
ロイシン                  １３１
イソロイシン              １３１
アスパラギン              １３２
アスパラギン酸            １３３
グルタミン                １４６
リジン                    １４６
グルタミン酸              １４７
メチオニン                １４９
ヒスチジン（ｐＨ ６．０で）    １５５
フェニルアラニン          １６５
アルギニン                １７４
チロシン                  １８１
トリプトファン            ２０４
【００４４】
特に好ましい置換は
−正の電荷が維持し得るようにＡｒｇに代えてＬｙｓ及びその逆；
−負の電荷が維持し得るようにＡｓｐに代えてＧｌｕ及びその逆；
−遊離−ＯＨが維持し得るようにＴｈｒに代えてＳｅｒ；並びに
−遊離ＮＨ２が維持し得るようにＡｓｎに代えてＧｌｎ
である。
アミノ酸置換はまた、特に好ましい性質を有するアミノ酸を置換するのに導入されてもよい。例えば、Ｃｙｓは別のＣｙｓとのジスルフィド架橋のための潜在的な部位を導入するであろう。Ｈｉｓが特定の“触媒”部位として導入されてもよい（即ち、Ｈｉｓは酸又は塩基として作用することができ、生化学的触媒作用に最も普通のアミノ酸である）。Ｐｒｏがは、特にその平面状構造のために導入されてもよく、これはタンパク質の構造中にβ−ターンを誘導する。
２種のアミノ酸はアミノ酸残基の少なくとも約７０％（好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０又は９５％）が同じであり、又は保存置換に相当する場合に“実質的に相同”である。特に、本発明の抗体の重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列は相当する生殖系列遺伝子アミノ酸配列に対し少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有して、相当する生殖系列遺伝子アミノ酸配列に実質的に相同である。
【００４５】
ＤＮＡ構築物の“異種”領域はとは、より大きな分子内部にある識別可能名ＤＮＡ要素であって、その大きな分子と関連して見いだされない要素である。従って、異種領域が哺乳類遺伝子をコードする場合、通常、その遺伝子は起原生物のゲノム中で哺乳類ゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡにより隣接されるであろう。異種コーディング配列の別の例はコーディング配列それ自体が自然に見られない構築物（例えば、ゲノムコーディング配列が天然遺伝子とは異なるコドンを有するイントロン、又は合成配列を含むｃＤＮＡ）である。対立遺伝子変化又は天然に生じる突然変異イベントは本明細書に特定されたＤＮＡの異種領域を生じない。
【００４６】
本明細書に使用される“抗体”という用語は特異的エピトープを結合する、抗体及びこれらのフラグメントを含む、あらゆる免疫グロブリンである。この用語はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びキメラ抗体を含むことが意図されており、最後に挙げられた抗体は米国特許第４，８１６，３９７号及び同第４，８１６，５６７号に更に詳しく記載されている。このような抗体として、既知の一般的技術により調製されたポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方だけでなく、二重特異性（キメラ）抗体、並びに活性を調節するそれらの能力と関係する付加的な診断使用にそれらを好適にするその他の機能性を含む抗体、例えば、髄鞘再形成及び／又はＣＮＳ軸索の再生を刺激し、又は神経保護を与える抗体が挙げられる。“抗体結合部位”は抗原を特異的に結合する重鎖及び軽鎖の可変領域及び超可変領域を含む抗体分子のその構造部分である。本明細書に使用される種々の文法形態の“抗体分子”という表現は無傷の免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫活性部分を意図している。例示の抗体分子は無傷の免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子並びにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦ（ｖ）として当業界で知られている部分を含む、パラトープを含む免疫グロブリン分子のこれらの部分である。
【００４７】
抗体分子のＦａｂ部分及びＦ（ａｂ’）２部分は公知である方法により実質的に無傷の抗体分子のパパイン及びペプシンタンパク質分解反応によりそれぞれ調製し得る。例えば、Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｕｓらの米国特許第４，３４２，５６６号を参照のこと。Ｆａｂ’抗体分子部分もまた公知であり、Ｆ（ａｂ’）２部分から続いてメルカプトエタノールによるように二つの重鎖部分を結合するジスルフィド結合の還元、続いてヨードアセトアミドの如き試薬による得られるタンパク質メルカプタンのアルキル化により生成し得る。
種々の文法形態の“モノクローナル抗体”という表現は特定の抗原と免疫反応することができる抗体結合部位の唯一種を有する抗体を表す。従って、モノクローナル抗体は典型的にはそれが免疫反応する抗原に対する単一の結合アフィニティーを示す。それ故、モノクローナル抗体は、それぞれが異なる抗原に対して異なる免疫特異な複数の抗体結合部位を有する抗体分子、例えば、二重特異性（キメラ）モノクローナル抗体を含んでもよい。
【００４８】
ハイブリドーマによりモノクローナル抗体をつくるための一般方法は公知である。また、不死の抗体産生細胞株が融合以外の技術、例えば、オンコジーンＤＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換、又はエプスタイン−バールウイルスによるトランスフェクションによりつくられる。例えば、Ｍ． Ｓｃｈｒｅｉｅｒら， “Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”（１９８０）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら， “Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ”（１９８１）；Ｋｅｎｎｅｔｔら， “Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”（１９８０）を参照のこと。また、米国特許第４，３４１，７６１号；同第４，３９９，１２１号；同第４，４２７，７８３号；同第４，４４４，８８７号；同第４，４５１，５７０号；同第４，４６６，９１７号；同第４，４７２，５００号；同第４，４９１，６３２号；同第４，４９３，８９０号を参照のこと。
神経調節因子ペプチド又は自己抗体ペプチドに対して産生されたモノクローナル抗体のパネルを種々の性質、即ち、イソタイプ、エピトープ、アフィニティー等についてスクリーニングすることができる。中枢神経系中の構造及び細胞に結合することができ、神経調節因子、特に本発明の自己抗体と同じ活性を示すモノクローナル抗体が特に興味深い。このような抗体は本明細書に示されかつ説明される結合アッセイ、染色アッセイ及び免疫細胞化学方法を含むアッセイで容易にスクリーニングされ、特性決定し得る。このようなモノクローナル抗体は活性アッセイ、例えば、本明細書に示され、説明されるサイラーウイルスモデル、ＥＡＥモデル及びリゾレシチンモデルで容易に同定し得る。高アフィニティー抗体も天然又は組換え自己抗体のイムノアフィニティー精製が可能である場合に有益である。
【００４９】
本発明の治療方法及び診断方法に使用される抗ペプチド抗体は好ましくはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であり、最も好ましくはヒト抗体又はヒト化抗体である。抗体はまた合成抗体であることが好ましい。加えて、本明細書に使用される抗ペプチド抗体分子は全抗体分子のＦａｂ部分、Ｆａｂ’部分、Ｆ（ａｂ’）２部分又はＦ（ｖ）部分の形態であることが好ましい。
先に示唆されたように、本発明の診断方法は有効量の抗体ペプチド／タンパク質のアンタゴニスト、例えば、抗ペプチド抗体、好ましくはアフィニティー精製ポリクローナル抗体、更に好ましくはｍＡｂを含むアッセイにより細胞サンプル又は培地を試験することを含む。加えて、本明細書に使用される抗ペプチド抗体分子はＦａｂ部分、Ｆａｂ’部分、Ｆ（ａｂ’）２部分もしくはＦ（ｖ）部分又は全抗体分子の形態であることが好ましい。既に説明されたように、この方法から恩恵を受けることができる患者として、神経疾病状態、例えば、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ウイルス性感染その他の神経病的障害（肉体的トラウマから生じる損傷を含む）を患っている患者が挙げられる。ペプチドを単離し、抗ペプチド抗体を誘導する方法及び標的細胞の試験を助ける抗ペプチド抗体の能力を測定し、最適化する方法は全てこの技術分野で公知である。
【００５０】
ポリクローナル抗ポリペプチド抗体の産生方法はこの技術分野で公知である。Ｎｅｓｔｏｒらの米国特許第４，４９３，７９５号を参照のこと。典型的には有益な抗体分子のＦａｂ部分及び／又はＦ（ａｂ’）２部分を含む、モノクローナル抗体はＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ− Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ編集， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）（これは参考として本明細書に含まれる）に記載されたハイブリドーマ技術を使用して調製し得る。簡単に言えば、モノクローナル抗体組成物が産生されるハイブリドーマを生成するために、ミエローマ又はその他の自己永続化細胞株を、抗体ペプチド結合部分、又は抗体ペプチドもしくはフラグメント、或いはその起源特異的ＤＮＡ結合部分で超免疫化された哺乳類の脾臓から得られたリンパ球と融合する。
【００５１】
脾臓細胞は典型的にはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００を使用してミエローマ細胞と融合される。融合したハイブリッドはＨＡＴに対するそれらの感受性により選択される。本発明を実施するのに有益なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは本発明の自己抗体と同じ様式で免疫反応するそれらの能力並びに標的細胞及び組織中で特定の活性を抑制又は促進するそれらの能力により同定される。
本発明を実施するのに有益なモノクローナル抗体は適当な抗原特異性の抗体分子を分泌するハイブリドーマを含む栄養培地を含むモノクローナルハイブリドーマ培養を開始することにより産生し得る。培養物はハイブリドーマが抗体分子を培地に分泌するのに充分な条件下で充分な時間の期間にわたって維持される。次いで抗体を含む培地が回収される。次いで抗体分子を公知の技術により更に単離することができる。
これらの組成物の調製に有益な培地はこの技術分野で公知であり、市販されており、合成培地、同系交配マウス等を含む。例示の合成培地は４．５ｇ／ｌのグルコース、２０ｍＭのグルタミン、及び２０％の胎児ウシ血清を補給したダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ；Ｄｕｌｂｅｃｃｏら， Ｖｉｒｏｌ． ８：３９６ （１９５９））である。例示の同系交配マウス株はＢａｌｂ／ｃである。
【００５２】
モノクローナル抗ペプチド抗体の産生方法はまたこの技術分野で公知である。Ｎｉｍａｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８０：４９４９−４９５３ （１９８３）を参照のこと。典型的には、本発明の抗体ペプチド、又はペプチド類似体もしくはフラグメントが、抗ペプチドモノクローナル抗体を産生するための前記操作で免疫原として、単独で、又は免疫原性キャリヤーにつながれて使用される。ハイブリドーマが抗体ペプチド類似体と免疫反応し、それにより本発明の抗体と同様に反応する抗体を産生する能力についてスクリーニングされる。
本発明はまたヒト抗体ｓＨＩｇＭ２２、ｓＨＩｇＭ４６、ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０、ＣＢ２ｂＧ８、ＡＫＪＲ４、ＣＢ２ｉＥ１２、ＣＢ２ｉＥ７、ＭＳＩ１９Ｅ５、これらのモノマー、ハプテンを含むこれらの類似体、これらの活性フラグメント、又はこれらの特性を有する単離され、もしくは合成の自己抗体を使用する、哺乳類の髄鞘脱落疾患、例えば、ヒトの多発性硬化症、並びにヒト及び家畜動物の中枢神経系のウイルス性疾患、例えば、後感染性脳脊髄炎の治療方法に関する。髄鞘脱落疾患の開始又は進行を抑制することを含む、これらのｍＡｂ、これらのモノマー、これらの活性フラグメント、又は同じ活性を有するその他の単離もしくは合成された自己抗体を使用する予防治療方法がまた本発明により含まれる。
【００５３】
中枢神経系（ＣＮＳ）のミエリン形成細胞であるオリゴデンドロサイト（ＯＬ）は脳室下のゾーンの神経外胚葉細胞として生じ、次いで移動し、成熟してミエリンを生じる。ＯＬの連続発生は良く特性決定された分化段階特異的マーカーにより同定される。オリゴデンドロサイト／３型星状細胞（Ｏ−２Ａ）先祖と称される、増殖性かつ移動性の双極性前駆体はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）抗ＧＤ３及びＡ２Ｂ５により同定される〔Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７６（１９７９）， ４９１３−４９１７〕。多極性、後移動性かつ増殖性細胞を特徴とする次の発育段階はｍＡｂ Ｏ４により認識される〔Ｇａｒｄら， Ｎｅｕｒｏｎ， ５（１９９０）， ６１５−６２５； Ｓｏｍｍｅｒら， Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．， ８３（１９８１）， ３１１−３２７〕。更なる発育はｍＡｂ Ｏ１により認識される、ガラクトセレブロシドの細胞表面発現〔Ｓｃｈａｃｈｎｅｒ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．， ３９（１９８２）， １−８； Ｓｏｍｍｅｒらの上記文献〕、及び２’，３’−環状ヌクレオチド３’−ホスホヒドロラーゼの発現により特定される。最も成熟した細胞はミエリン塩基性タンパク質及びプロテオリピドタンパク質の如き末端分化マーカーを発現する。
【００５４】
ＯＬ発生の段階を特徴づけるのに使用されたｍＡｂ （Ａ２Ｂ５、Ｏ１、及びＯ４）はＢＡＬＢ／ｃマウスをニワトリ胚網膜細胞又はウシ脳梁のホモジネートで免疫することによりつくられた〔Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈらの上記文献；Ｓｏｍｍｅｒらの上記文献〕。Ａ２Ｂ５はＯ−２Ａ前駆体だけでなく神経細胞も認識し、細胞表面ガングリオシドＧＱ１ｃ〔Ｋａｓａｉら， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．， ２７７（１９８３）， １５５−１５８〕及びその他のガングリオシド〔Ｆｒｅｄｍａｎら， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ２３３（１９８４）， ６６１−６６６〕と反応する。Ｏ４はスルファチド、セミノリピド及びコレステロールと反応し〔Ｂａｎｓａｌら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｒｅｓ．， ２４（１９８９）， ５４８−５５７〕、一方、Ｏ１はガラクトセレブロシド、モノガラクトシル−ジグリセリド及びサイコシンと反応する〔Ｂａｎｓａｌらの上記文献〕。これらのｍＡｂはＩｇＭ免疫グロブリン（Ｉｇ）サブクラスに属し、細胞質構造だけでなくＯＬの表面抗原を認識する〔Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈらの上記文献；Ｓｏｍｍｅｒらの上記文献〕。ＢＡＬＢ／ｃマウスをＨＳＢ−２Ｔリンパ芽球様細胞の膜懸濁液で免疫することによりつくられたマウスｍＡｂ ＨＮＫ−１ （抗Ｌｅｕ−７）は、最初、ナチュラルキラー細胞のマーカーとして報告された〔Ａｂｏら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １２７（１９８１）， １０２４−１０２９〕。その後、ＨＮＫ−１は神経系と抗原決定基を共有することが示された〔Ｓｃｈｕｌｌｅｒ−Ｐｅｔｒｏｖｉｃら， Ｎａｔｕｒｅ， ３０６（１９８３）， １７９−１８１〕。中枢及び末梢の髄鞘の両方中に見られる、ミエリン関連糖タンパク質の炭水化物エピトープはＨＮＫ−１と反応する神経組織の主要抗原であることが示された〔ＭｃＧａｒｒｙら， Ｎａｔｕｒｅ， ３０６（１９８３）， ３７６−３７８〕。しかしながら、神経組織中のその他の糖タンパク質がこのｍＡｂと反応し、これらの幾つかは胚形成、分化、及びミエリン形成に重要である〔Ｋｅｉｌｈａｕｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ， ３１６（１９８５）， ７２８−７３０； Ｋｒｕｓｅら， Ｎａｔｕｒｅ， ３１１（１９８４）， １５３−１５５； Ｋｒｕｓｅら， Ｎａｔｕｒｅ， ３１６（１９８５）， １４６−１４８； ＭｃＧａｒｒｙら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｎｏｌ．， １０（１９８５）， １０１−１１４〕。興味深いことに、ＨＮＫ−１はまた細胞質構造と反応し、ＩｇＭ Ｉｇサブクラスに属する。
【００５５】
１９９７年１月７日に発行された米国特許第５，５９１，６２９号に開示され、特許請求され、ＳＣＨ９４．０３と称されるモノクローナル抗体はマウス脳脊髄炎サイラーウイルス（ＴＭＥＶ）で慢性感染されたマウスでＣＮＳ髄鞘再形成を促進することがわかった〔Ｍｉｌｌｅｒら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．， １４（１９９４）， ６２３０−６２３８〕。ＳＣＨ９４．０３はＩｇＭ（κ）Ｉｇサブクラスに属し、ＯＬの未知の表面抗原を認識するが、あらゆる細胞中の細胞質抗原を認識する（Ａｓａｋｕｒａら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， 印刷中）。ＥＬＩＳＡによるＳＣＨ９４．０３の多反応性、及び未突然変異Ｉｇ可変領域生殖系列配列はＳＣＨ９４．０３が天然自己抗体であることを示した〔Ｍｉｌｌｅｒら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．， １４（１９９４）， ６２３０−６２３８〕。ＳＣＨ９４．０３の精密な研究、及び公知のＯＬ反応性ｍＡｂ Ａ２Ｂ５、Ｏ１、Ｏ４、及びＨＮＫ−１とのその比較はこれらが天然自己抗体である可能性を提起した。ＥＬＩＳＡによるＩｇ可変領域ｃＤＮＡ配列及びこれらのｍＡｂの多反応性のその後の分析により、これらが同様の実用性を有する天然自己抗体の包括的グループであることが確認された。
【００５６】
モノクローナル抗体、ＩｇＭモノクローナル抗体ＳＣＨ９４．０３（またＳＣＨ９４．３２と称される）及びＳＣＨ７９．０８（両方とも正常な哺乳類（即ち、髄鞘脱落疾患で感染されていない）からの脊髄ホモジネートで免疫された哺乳類から調製された）の抗原反応性が、免疫組織化学、免疫細胞化学、ウェスタンブロッティング、固相酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、及びＩｇ可変領域配列決定を含む、幾つかの生化学的アッセイ及び分子アッセイを使用して特性決定され、前記の１９９７年１月７日に発行された米国特許第５，５９１，６２９号（その教示が参考として本明細書に含まれる）に記載されていた。
【００５７】
天然又は生理的自己抗体は通常血清中に存在し、自己構造、抗原又は細胞と反応性であり、又はそれらに結合することができることにより特性決定される。それらはしばしば多反応性であり、頻度高くＩｇＭサブタイプのものであり、突然変異していない生殖系列遺伝子によりコードされ、又は生殖系列遺伝子に実質的に相同で配列相違をほとんど有しない。オリゴデンドロサイト反応性Ｏ１、Ｏ４、Ａ２Ｂ５、及びＨＮＫ−１ ＩｇＭκモノクローナル抗体の免疫グロブリン（Ｉｇ） ｃＤＮＡを配列決定し、これらを公表された生殖系列配列と比較することにより、これらが天然自己抗体であることが決定された。Ｏ１ ＶＨは未再配列ＶＨセグメント転写産物Ａ１及びＡ４と同じであり、Ｏ４ ＶＨはＶＨコーディング領域中の生殖系列ＶＨ１０１からの三つのヌクレオチド相違を有し、ＨＮＫ−１ ＶＨは六つのヌクレオチド相違を有していた。Ｏ１のＤセグメントは生殖系列ＳＰ２遺伝子ファミリー、ＪＨ４に由来し、一方、Ｏ１ ＪＨは有生殖系列ＪＨ１によりコードされ一つのサイレントヌクレオチド変化を有していた。Ｏ１及びＯ４軽鎖は一つのサイレントヌクレオチド変化以外はミエローマＭＯＰＣ２１と同じであった。ＨＮＫ−１ Ｖκは二つのサイレントヌクレオチド変化以外は生殖系列Ｖκ４１と同じであった。Ｏ１ Ｊκ、Ｏ４Ｊκ及びＨＮＫＪκは未突然変異生殖系列Ｊκ２によりコードされた。対照的に、Ａ２Ｂ５ ＶＨは生殖系列Ｖ１からの７ヌクレオチド相違を示し、一方、Ａ２Ｂ５ Ｖκをコードする生殖系列配列は同定されなかった。Ａ２Ｂ５ではなく、Ｏ１及びＯ４が直接ＥＬＩＳＡにより多重抗原に対し多反応性であった。それ故、Ｏ１、Ｏ４及びＨＮＫ−１ Ｉｇは生殖系列遺伝子によりコードされ、天然自己抗体の遺伝子型及び表現型を有する。
【００５８】
“天然”自己抗体又は“生理的”自己抗体と称される、自己抗体の全ファミリーの同定及び特性決定は、自己免疫及び自己反応性についての従来の観点に影響を与えた。広範に研究された自己抗体は、他のイソタイプが同定されてはいるものの、典型的にはＩｇＭであり、細胞骨格タンパク質、表面タンパク質、核酸、リン脂質、細菌抗原、例えば、リポ多糖、及び種々の化学ハプテンを含む、広範囲の自己構造又は抗原に対し反応性である（Ａｖｒａｍｅａｓ及びＴｅｒｎｙｎｃｋ， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ３０：１１３３−１１４２ （１９９３）により総説される）。天然自己抗体は、類似のイディオタイプ（これらの幾つは病原性自己抗体により発現される）発現を含む広範なイディオタイプ交差反応性又は“結合性（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ）”を共有し、同様に他の抗体以上で発現されている共通のイディオタイプに対する反応性を共有する。分子分析により天然自己抗体が典型的には未突然変異生殖系列免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子又は体細胞突然変異がほとんど無い実質的にそれら相同な遺伝子によりコードされ、それ故、特に、徹底的な外因性抗原暴露を受けなかった新生児動物では、Ｉｇレパートリーのかなりの画分を代表することが示された。
【００５９】
天然自己抗体の機能はなぞのままである。幾つかの仮説がそれらの生化学的特性及び分子特性に基づいて提案されていた。これらは、（１）老化又は損傷組織の排除、（２）病原体暴露とＡｇ特異的免疫応答の間のラグ期間に最初の免疫防御線を提供すること、（３）潜在的に病原性の自己免疫応答から自己抗原をマスクすること、（４）イディオタイプネットワークによる新生児免疫レパートリーの造形を含む、免疫調節、及び（５）胸腺中のＴ細胞について提案されたプロセスと同様の、骨髄中のＢ細胞の陽性選択における関与を含む。
自己抗原を認識する抗体として広く特性決定され、天然自己抗体を含む、その或る種の自己抗体は、中枢神経系の髄鞘再形成を刺激することができ、自己抗体の重要な生理機能を示唆する。正常な生理機能中、又は組織損傷及びその後の隔絶抗原の放出に応答して産生される自己抗体は、損傷された組織の修復を促進するのに積極的に関与し得る。自己抗体の既に提案された機能に従って、この積極的な関与は損傷された組織の除去を促進し、自己抗原をマスクし、それにより激しい病原性自己免疫応答を防止し、組織破壊を実際にもたらした免疫応答を調節し、それにより正常な内因性組織修復が生じることを可能にし、又は修復プロセスに関係する細胞を直接刺激することであり得る。
【００６０】
ここで、本明細書に示された結果及び実施例は、作製され、それらの自己抗原結合能力についてスクリーニングされた、特に中枢神経系中の構造及び細胞を結合することができる、ヒト自己抗体の単離を明らかにする。また、ＣＮＳ髄鞘再形成を促進するこれらの抗体の能力が実証される。ＴＭＥＶで慢性感染され、、ヒトハイブリドーマからのＩｇＭ ｍＡｂ、特にｓＨＩｇＭ２２ （ＬＩＭ ２２）、ｓＨＩｇＭ４６、ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０、ＣＢ２ｂＧ８により例示されるひとＩｇＭ Ａｂで治療されたマウスは、ＣＮＳ髄鞘再形成の詳細な定量的形態評価によって測定したところ、対照マウスよりも有意に大きいＣＮＳ修復を有していた。
【００６１】
髄鞘脱落疾患の治療
本明細書に記載された実験の結果は多発性硬化症（ＭＳ）、ＥＡＥ、及びその他の関連中枢神経系髄鞘脱落障害に対する実用的応用性を有する。自発性ＣＮＳ型髄鞘再形成の稀な例（“シャドープラーク”）がＭＳに見られ、時折の末梢神経系（ＰＮＳ）型髄鞘再形成が根部侵入ゾーン付近の髄鞘脱落した脊髄プラーク中に見られる。オリゴデンドロサイトはＭＳの慢性プラークの中央に稀に見られるが、それらはプラークの周辺で増殖するこようであり、そこでそれらは不完全な（ａｂｏｒｔｉｖｅ）髄鞘再形成と関連している。髄鞘再形成のプロセスはＭＳ中に臨床的に上観察される自発性寛解及び改善と相関関係がありかもしれない。これらの臨床的観察は新しいミエリン形成がＭＳで可能であることを示す。ｍＡｂを使用することによりＴＭＥＶ誘導髄鞘脱落を有するマウスにおいて髄鞘再形成が刺激されたことは多発性硬化症における治療応用の見込みを与えるものである。
薄いミエリン鞘の形態再生が機能回復に寄与するか否かの問題は臨床上重要である。コンピュータシミレーションは不適当に薄い鞘による新しいミエリン形成でさえインパルス伝導を改善することを示す。正常に髄鞘形成された繊維の軸索膜は高度に分化しているので、跳躍伝導を伝播するためにナトリウムチャンネルがランビエ節に高密度で存在することが必要である。実験的証拠により、新たに形成された節は、サキシトキシン結合により実証されるように、必要とされる高ナトリウムチャンネル密度を発生することが示唆される。現在までのデータは不適当に薄いミエリンによる髄鞘再形成でさえもが既に髄鞘脱落した軸索中の伝導を改善することを示唆している。それ故、この形態現象を促進するためのあらゆる戦略が機能回復を生じる可能性を有する。
【００６２】
本明細書に示されたヒト自己抗体の単離及び試験はヒト用に特に適し、かつ望ましいヒト抗体を与える。重要なことに、ヒト抗体の使用は治療抗体に対するヒト免疫応答の可能性を回避する。非ヒト動物に由来する治療抗体は免疫応答を生じることが示されており、これは個体にとって重大かつ有害であり得る。ポリクローナルヒトＩｇＭ及びポリクローナルヒトＩｇＧがｉｎ ｖｉｖｏ脊髄髄鞘脱落の二つのモデルで試験された：慢性ウイルス感染モデル、及び急性毒性モデル。両方のモデルにおいて、ポリクローナルヒトＩｇＭ治療動物はポリクローナルヒトＩｇＧで治療された動物よりも新たに髄鞘形成された軸索の密度が有意に高かった。ヒトモノクローナル抗体のパネルがまた中枢神経系に特異性の表面抗原とのそれらの反応性に基づいて同定された。これらのヒト抗体は髄鞘脱落疾患を有する哺乳類に与えられた場合にポリクローナルヒトＩｇＧよりも有意に大きい中枢神経系髄鞘再形成を促進する。ヒトモノクローナル抗体は抗原多反応性であり、オリゴデンドロサイト及び神経細胞の特定集団の表面上の決定基を認識する。髄鞘再形成を促進する或る種のヒト抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が部分配列決定された。この抗体は培養中のオリゴデンドロサイト中のカルシウムフラックスを誘導することができ、直接結合及びグリア細胞を通じたシグナリングを示唆する。これらのヒト抗体はヒト白質に結合し、ヒトの髄鞘再形成を促進するのに有効であり得る。治療薬としての使用についてのモノクローナル抗体の利益は１）抗体が可能な宿主感染なしに増殖でき、かつ２）抗体がその有効性を変化するためにｉｎ ｖｉｔｒｏで遺伝的に改変し得ることである。
【００６３】
こうして、本明細書に記載された実験の結果として、本発明の方法は髄鞘脱落障害で冒された、ヒト及び家畜動物を含む、哺乳類を治療し、髄鞘再形成及びＣＮＳ軸索の再生を刺激するだけでなく、神経保護を与えるのに使用し得る。本明細書に記載されたように、有効量のモノクローナル抗体又はペプチドフラグメント、ハプテン、もしくは均等物は、投与の通常の経路、特に静脈内（ｉｖ）又は腹腔内（ｉｐ）注射により投与し得る。本明細書に記載されたように、治療組成物及びワクチンが意図されており、調製され、投与し得る。抗体の有効量は治療される哺乳類のサイズ、疾患の重度、投与の経路、及び治療の過程に応じて変化し得る。例えば、投与されるｍＡｂの夫々の用量は約０．５ｍｇ／ｋｇから約４００ｍｇ／ｋｇまでの範囲であってもよく、好ましい範囲は約０．５ｍｇ／ｋｇから約２５０ｍｇ／ｋｇまでである。１０μｇと低い容量（０．５ｍｇ／ｋｇ）がマウスでＣＮＳ軸索の髄鞘再形成を促進するのに有効であったことに注目することは重要である。ｍＡｂの用量はまた投与の経路に依存するであろう。例えば、マウスに投与されるｉｖ用量は０．５ｍｇ／ｋｇであり、ｉｐ用量は５．０ｍｇ／ｋｇであった。治療の過程はｍＡｂの投与の頻度（例えば、毎日、毎週、又は２週毎）及び治療の期間（例えば、４週〜４ヶ月）を含む。こうして、例えば、４ヶ月にわたって与えられる少量のｍＡｂとは反対に、多量のｍＡｂを４〜５週にわたって毎日与えることができる。
【００６４】
投与されるモノクローナル抗体の量の有効性は、例えば、本明細書に記載されたように、哺乳類の総合の外観、哺乳類の活動及び哺乳類の麻痺の程度を含む、幾つかの数の臨床基準を使用して評価し得る。ヒトに髄鞘再形成を誘導するのに必要なモノクローナル抗体の量の有効性はまた二重盲検制御試験で評価し得る。髄鞘脱落疾患からの一定の神経欠陥を有する患者をモノクローナル抗体又は対照で処置することができる。定量的生体力学筋肉試験により検出される等尺性収縮筋肉強度（ｉｓｏｍｅｔｒｉｃ ｍｕｓｃｌｅ ｓｔｒｅｎｇｈｔ）の改善が一次治療終点として使用し得る。
髄鞘再形成を促進するｉｎ ｖｉｖｏ方法に加えて、ＣＮＳ軸索中の髄鞘再形成を刺激するｅｘ ｖｉｖｏ方法がまた本発明に含まれる。例えば、モノクローナル抗体をオリゴデンドロサイトの如きグリア細胞の増殖及び／又は分化を刺激するのにｉｎ ｖｉｔｒｏで使用することができる。次いでこれらの外因性グリア細胞を既知の技術を使用して哺乳類のＣＮＳに導入することができる。ＣＮＳ軸索の髄鞘再形成は存在する内因性グリア細胞の数を増加することにより増大されるであろう（オリゴデンドロサイトの如きグリア細胞がミエリンの生産に重要な役割を果たす）。
【００６５】
グリア細胞を生産し、又は混合培養物（例えば、ラット視神経細胞、又はラット脳細胞培養物）からのグリア細胞の増殖を刺激するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法も本発明に含まれる。例えば、グリア細胞を含む、ラット視神経、又は脳から得られた細胞を、細胞の増殖を促進するのに充分な条件下で混合培養物として培養する。その後に、ＣＮＳ軸索の髄鞘再形成を促進することができる有効量のｍＡｂ、例えば、ｓＨＩｇＭ２２ （ＬＩＭ ２２）、ｓＨＩｇＭ４６、ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０、及びＣＢ２ｂＧ８を細胞の混合培養物に添加し、細胞の成長及び増殖に充分な条件下で維持する。加えて、有効量のｍＡｂ、例えば、ＡＫＪＲ４、ＣＢ２ｉＥ１２、ＣＢ２ｉＥ７、又はＭＳＩ１９Ｅ５を添加してもよい。特に、本明細書に提供された一種より多い抗体の混合物又は組み合わせがこれらの方法における使用について意図されており、提供される。ｍＡｂは、ｍＡｂの非在下で増殖したグリア細胞の増殖に比べて、ｍＡｂの存在下で培養されたグリア細胞の増殖を刺激する。
【００６６】
上記のように、本発明の方法における使用のためのヒトモノクローナル抗体は薬剤、即ち、医薬組成物として投与でき、また投与されることが好ましい。こうして、有効量のモノクローナル抗体が適当な医薬上許されるキャリヤー、例えば、生理緩衝液、又は食塩溶液と合わされ、又はそれで希釈し得る。特に、本明細書に示されたモノクローナル抗体の一種より多くの組み合わせ又は混合物が適当な医薬上許されるキャリヤー、例えば、生理緩衝液、又は食塩溶液と合わされ、又はそれで希釈し得る。ワクチンが調製される場合、本発明のモノクローナル抗体又は活性な均等物が医薬上有効かつ好適なキャリヤー又はアジュバントと一緒に調製され、当業者に知られている免疫のための通常の操作に従って投与プロトコルを遂行することができる。
【００６７】
動物及びヒトへの投与のための本発明の方法に使用される医薬組成物は医薬キャリヤー又は、賦形剤と組み合わせたモノクローナル抗体を含む。好ましい実施態様において、医薬組成物は一種、好ましくは二種より多い本発明のモノクローナル自己抗体を含んでもよい。このような組成物は一種より多いモノクローナル自己抗体の存在は、同じ治療組成物又は方法中で他のものの活性を強化する点で有利である。
薬剤は本発明の化合物を含む錠剤（ロゼンジ及び顆粒を含む）、糖剤、カプセル、ピル、アンプル又は座薬の形態であってもよい。
有利には、組成物は投薬単位として製剤化され、夫々の単位は一定用量の活性成分を供給するのに適している。錠剤、被覆錠剤、カプセル、アンプル及び座薬が本発明の好ましい投薬形態の例である。活性成分が有効量を構成すること、即ち、好適な有効投薬量が単一単位投薬又は多重単位投薬で使用される投薬形態と合致することのみが必要である。正確な個々の用量だけでなく、毎日の用量が、勿論、医師又は獣医の指示のもとに通常の医療原理に従って決められるであろう。
【００６８】
モノクローナル抗体はまた水性又は非水性の希釈剤中の活性化合物の懸濁液、溶液及びエマルション、シロップ、顆粒又は粉末として投与することができる。
錠剤、糖剤、カプセル及びピルに形成されるのに適した活性化合物を含む医薬組成物（例えば、顆粒）中に使用し得る希釈剤は下記の成分：（ａ）充填剤及び増量剤、例えば、澱粉、糖、マンニトール及びケイ酸；（ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース及びその他のセルロース誘導体、アルギネート、ゼラチン及びポリビニルピロリドン；（ｃ）保湿剤、例えば、グリセロール；（ｄ）崩壊剤、例えば、アガー−アガー、炭酸カルシウム及び重炭酸ナトリウム；（ｅ）溶解を遅延するための薬剤、例えば、パラフィン；（ｆ）吸収促進剤、例えば、四級アンモニウム化合物；（ｇ）表面活性剤、例えば、セチルアルコール、グリセロールモノステアレート；（ｇ）吸着性キャリヤー、例えば、カオリン及びベントナイト；（ｉ）滑剤、例えば、ステアリン酸カルシウム及びステアリン酸マグネシウム並びに固体ポリエチレングリコールを含む。
【００６９】
活性化合物を含む錠剤、糖剤、カプセル及びピルは通例の被覆物、エンベロープ及び保護マトリックスを有することができ、これらは不透明剤を含んでもよい。それらはまたそれらがおそらく或る時間の期間にわたって活性成分のみを放出し、又は腸道の特別な部分中で放出するように構成し得る。被覆物、エンベロープ及び保護マトリックスは、例えば、ポリマー物質又はワックスからつくられてもよい。
座薬に形成されるのに適した医薬組成物中に使用される希釈剤は、例えば、通常の水溶性希釈剤、例えば、ポリエチレングリコール及び脂肪（例えば、ココア油及びハイエステル〔例えば、Ｃ１６−脂肪酸とのＣ１４−アルコール〕）又はこれらの希釈剤の混合物であってもよい。
溶液及びエマルションである医薬組成物は、例えば、通例の希釈剤（勿論、表面活性剤存在下を除いて、上述したように２００未満の分子量を有する溶媒を除く）、例えば、溶媒、溶解剤及び乳化剤を含んでもよい。このような希釈剤の具体的な非限定例は水、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカーボネート、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（例えば、落花生油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビトールの脂肪酸エステル又はこれらの混合物である。
【００７０】
非経口投与について、溶液及び懸濁液は無菌、例えば、アンプル中に含まれた水又は落花生油であるべきであり、適当な場合には、血液等張性である。
懸濁液である医薬組成物は通常の希釈剤、例えば、液体希釈剤、例えば、水、エチルアルコール、プロピレングリコール、表面活性剤（例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル）、微結晶性セルロース、メタ水酸化アンモニウム、ベントナイト、アガー−アガー及びトラガカント、又はこれらの混合物を含んでもよい。
医薬組成物はまた着色剤及び防腐剤、および、香料及び風味添加剤（例えば、ペパーミント油及びユーカリ油）、及び甘味料（例えば、サッカリン及びアスパルテーム）を含んでもよい。
【００７１】
医薬組成物は一般に全組成物の０．５〜９０質量％の活性成分を含むであろう。
モノクローナル抗体に加えて、医薬組成物及び薬剤はまたその他の医薬上活性な化合物、例えば、ステロイド、抗炎症剤等を含んでもよい。
本発明の薬剤中の希釈剤は医薬組成物に関して上記されたもののいれれかであってもよい。このような薬剤は唯一の希釈剤として２００未満の分子量の溶媒を含んでもよい。
モノクローナル抗体は経口、非経口（例えば、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮又は静脈内）、直腸又は局所、好ましくは経口もしくは非経口、特に経舌、又は静脈内に投与されることが考えられる。
投与される投薬速度は治療を受けるヒト又は動物の性質及び体重、治療に対するこの被験者の個々の反応、活性成分が投与される製剤の型、投与が行なわれる様式及び疾患の進行の時点又はそれが投与される間隔の関数であろう。こうして、或る場合には最小投与速度より小さいものを使用することが充分であるかもしれず、一方、その他の場合には所望の結果を得るために上限を超えなければならないかもしれない。より多くの量が投与される場合、これらを日の経過にわたって幾つかの個々の投与にわけることが望ましいかもしれない。
【００７２】
本発明の神経調節因子はまたワクチンの形態で投与するために調製してもよく、これは活性成分として、本明細書に記載された自己抗体、ペプチド類似体、もしくはハプテン、又はおそらくこれらの組み合わせを含んでもよい。こうして、ワクチンの調製は既知の操作に従って行うことができ、１価ワクチンだけでなく、多価ワクチンが意図されている。また、本発明のＤＮＡ分子をベースとする、ＤＮＡサブユニットワクチンを調製してもよい。全てのワクチンは医師又は臨床医の通常の慣例に従って投与することができ、そのパラメーターは本発明の範囲内にあると考えられる。
【００７３】
更に、本発明は遺伝子治療による治療を意図しており、この場合、適当な神経調節因子が治療のために対応した標的細胞に導入されて、対応する薬剤の発現を生じ、又は増大する。こうして、一実施態様において、神経調節因子、自己抗体、抗体ペプチド等、又はこれらのタンパク質もしくはポリペプチドドメインフラグメントをコードするＤＮＡ又は遺伝子がウイルスベクターを使用して、又はＤＮＡの直接導入によりｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｔｒｏで導入される。標的組織中の発現は、例えば、ウイルスベクターもしくは受容体リガンドを用いて、トランスジェニックベクターを特定細胞にターゲッティングすることにより、又は組織特異性プロモーターを使用することにより、或いはその両方で行ない得る。
ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏターゲッティング及び治療操作に普通使用されるウイルスベクターはＤＮＡをベースとするベクター及びレトロウイルスベクターである。ウイルスベクターを構築し、使用する方法はこの技術分野で知られている〔例えば、Ｍｉｌｌｅｒ及びＲｏｓｍａｎ， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０ （１９９２）を参照のこと〕。
【００７４】
ＤＮＡウイルスベクターとして、弱毒化ＤＮＡウイルス又は欠損ＤＮＡウイルス、例えば、ヘルペス単純ウイルス（ＨＳＶ）、パピローマウイルス、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）等が挙げられるが、これらに限定されない。欠損ウイルス（これらはウイルス遺伝子を完全に、又は殆ど完全に欠いている）が好ましい。欠損ウイルスは細胞への導入後に感染性ではない。欠損ウイルスベクターの使用は、ベクターがその他の細胞を感染し得ることを気にしないで、特定の局所領域における細胞への投与を可能にする。こうして、脂肪組織を特異的に標的とすることができる。具体的なベクターの例として、欠損ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）ベクター〔Ｋａｐｌｉｔｔら， Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２：３２０−３３０ （１９９１）〕、糖タンパク質Ｌ遺伝子を欠いている欠損ヘルペスウイルスベクター〔特許公開ＲＤ３７１００５Ａ〕、又はその他の欠損ヘルペスウイルスベクター〔１９９４年９月２９日に公開された国際特許公開番号ＷＯ ９４／２１８０７；１９９４年４月２日に公開された国際特許公開番号ＷＯ ９２／０５２６３〕；弱毒化アデノウイルスベクター、例えば、Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら〔Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９０：６２６−６３０ （１９９２）； またＬａ Ｓａｌｌｅら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９８８−９９０ （１９９３）を参照のこと〕により記載されたベクター；及び欠損アデノ関連ウイルスベクター〔Ｓａｍｕｌｓｋｉら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：３０９６−３１０１ （１９８７）； Ｓａｍｕｌｓｋｉら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３：３８２２−３８２８ （１９８９）； Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：３９８８−３９９６ （１９８８）〕が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
ｉｎ ｖｉｖｏ投与について、適当な免疫抑制治療がウイルスベクター、例えば、アデノウイルスと連係して使用されてウイルスベクター及びトランスフェクトされた細胞の免疫不活化を避けることが好ましい。例えば、免疫抑制サイトカイン、例えば、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、又は抗ＣＤ４抗体をウイルスベクターに対する液性免疫応答又は細胞性免疫応答をブロックするために投与することができる〔例えば、Ｗｉｌｓｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ （１９９５）を参照のこと〕。加えて、最少数の抗原を発現するように操作されたウイルスベクターを使用することが有利である。
別の実施態様において、ＤＮＡ又は遺伝子を、例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎらの米国特許第５，３９９，３４６号；Ｍａｎｎら， １９８３， Ｃｅｌｌ ３３：１５３；Ｔｅｍｉｎらの米国特許第４，６５０，７６４号；Ｔｅｍｉｎらの米国特許第４，９８０，２８９号；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら， １９８８， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：１１２０；Ｔｅｍｉｎらの米国特許第５，１２４，２６３号；１９９５年３月１６日に公開されたＤｏｕｇｈｅｒｔｙらの国際特許公開番号ＷＯ ９５／０７３５８；及びＫｕｏら， １９９３， Ｂｌｏｏｄ ８２：８４５に記載されたようなレトロウイルスベクターに導入することができる。レトロウイルスベクターは感染性粒子として機能するように、又は単一ラウンドのトランスフェクションを受けるように構築し得る。前者の場合、ウイルスはオンコジーン形質転換特性を担う遺伝子以外のその遺伝子の全てを保持し、異種遺伝子を発現するように改変される。非感染性ウイルスベクターはウイルスパッケージングシグナルを破壊するように調製されるが、異種遺伝子を含むように操作された同時導入ウイルスをパッケージするのに必要とされる構造遺伝子及びパッケージングシグナルを保持するように調製される。こうして、生産されるウイルス粒子は更なるウイルスを生産することができない。
【００７６】
標的化遺伝子デリバリーが１９９５年１０月に公開された国際特許公開ＷＯ ９５／２８４９４に記載されている。
あるいは、ベクターはリポフェクションによりｉｎ ｖｉｖｏ導入することができる。過去１０年にわたって、ｉｎ ｖｉｔｒｏの核酸被包及びトランスフェクションのためのリポソームの使用が増大している。リポソーム媒介トランスフェクションで見られる難点及び危険を制限するように設計された合成陽イオン脂質をマーカーをコードする遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクション用リポソームを調製するために使用することができる〔Ｆｅｌｇｎｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８４：７４１３−７４１７ （１９８７）； Ｍａｃｋｅｙら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：８０２７−８０３１ （１９８８）； Ｕｌｍｅｒら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−１７４８ （１９９３）を参照のこと〕。陽イオン脂質の使用は負に荷電した核酸の被包を促進することができ、したがって、負に荷電した細胞膜との融合も促進することができる〔Ｆｅｌｇｎｅｒ及びＲｉｎｇｏｌｄ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：３８７−３８８ （１９８９）〕。外因性遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで特定器官に導入するためのリポフェクションの使用は或る種の実用的な利点を有する。特定細胞へのリポソームの分子ターゲッティングは利益の一つの領域に相当する。特別な細胞型へトランスフェクションを指向させることは細胞不均一性を有する組織、例えば、膵臓、肝臓、腎臓、及び脳中で特に有利であることが明らかである。脂質はターゲッティングの目的のためにその他の分子に化学カップリングされてもよい〔Ｍａｃｋｅｙらの上記文献を参照のこと〕。標的化ペプチド、例えば、ホルモン又は神経伝達物質、及びタンパク質、例えば、抗体、又は非ペプチド分子をリポソームに化学的にカップリングさせることができる。
【００７７】
ベクターを裸のＤＮＡプラスミドとしてｉｎ ｖｉｖｏ導入することも可能である。遺伝子治療のための裸のＤＮＡベクターはこの技術分野で知られている方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用、又はＤＮＡベクタートランスポーターの使用により所望の宿主細胞に導入し得る〔例えば、Ｗｕら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：９６３−９６７ （１９９２）； Ｗｕ及びＷｕ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：１４６２１−１４６２４ （１９８８）； １９９０年３月１５日に出願されたＨａｒｔｍｕｔらのカナダ特許出願第２，０１２，３１１号；Ｗｉｌｌｉａｍｓら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：２７２６−２７３０ （１９９１）を参照のこと〕。受容体媒介ＤＮＡデリバリアプローチも使用することができる〔Ｃｕｒｉｅｌら， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ３：１４７−１５４ （１９９２）； Ｗｕ及びＷｕ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：４４２９−４４３２ （１９８７）〕。
本発明の好ましい実施態様において、上記の遺伝子治療ベクターは、例えば、本発明の自己抗体により認識されるＤＮＡコンセンサス配列、即ち抗体結合部位、を含む転写調節配列（ベクター中に挿入された治療異種遺伝子と機能し得る形で結合している）を使用する。、抗体結合部位を使用する。即ち、本発明の特異的発現ベクターは遺伝子治療に使用することができる。
【００７８】
本発明は下記の非限定実施例の考慮により更に良く理解され、これらの実施例には物質、化合物及び組成物の調製並びに本発明の例示の方法の開発及び実施が記載される。物質及び方法のいずれについても、多くの改良がこの開示の目的及び意図から逸脱しないで実施し得ることが当業者に明らかであろう。下記の実施例は本発明の好ましい実施態様を更に充分に説明するために示され、また本発明の実施について知られているベストモードを提示するという出願人の義務の履行するために供されるものであり、決して本発明の広い範囲を限定するものと見なすべきではない。
【００７９】
（実施例）
以下の実施例は、ヒトポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の調製及び試験を示す。特に、ヒトポリクローナルＩｇＭ抗体を調製し、試験し、それによりＣＮＳ内の構造体及び細胞（例えば、オリゴデンドロサイトを含む）に神経組織に対する高い特異性をもって高アフィニティーで結合するそれらの能力、及び髄鞘再形成を増進する付随的能力を実証した。本明細書に以下に示されるように、サイラーウイルスモデル及びリゾレシチン誘導髄鞘脱落モデルにおいて髄鞘再形成を確かめた。
序論
髄鞘再形成の増進はＣＮＳの炎症性髄鞘脱落障害、例えば、多発性硬化症（ＭＳ）における重要な治療目標である。急性ＭＳのため死亡した何人かの患者、及び脳バイオプシーからの出願人の最近のデータにおいて広範囲に髄鞘再形成されたＣＮＳ病変が明らかにされたことは、疾患の早期段階で完全修復が可能かもしれないことを示唆する（Ｐｒｉｎｅａｓ及びＣｏｎｎｅｌｌ １９７９； Ｐｒｉｎｅａｓら， １９９３； Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ及びＳｃｈｅｉｔｈａｕｅｒ １９９４）。しかしながら、疾患が進行するにつれて、髄鞘再形成が制限され、主として病変の周辺で生じる。ＭＳ病変中で完全な髄鞘再形成ができないことについて多数の理由が提案されてきた（Ｌｕｄｗｉｎ １９８１）。二つの重要な考察として、髄鞘再形成することができる細胞の枯渇、及び因子（これらはそれらの成長及び分化を持続する）の枯渇が挙げられる。このように、修復細胞を刺激し、又はミエリン修復を妨げる抑制因子を除去するための早期の介入が治療戦略の鍵であろう。
【００８０】
実験動物で髄鞘再形成を促進するための治療戦略として多数のアプローチが試験されてきた。予め髄鞘脱落した病巣へのオリゴデンドロサイト又は前駆グリア細胞の移植はＣＮＳ軸索の髄鞘再形成、及びより程度は低いが、髄鞘形成前駆体細胞の移動をもたらすことができる。中枢の髄鞘再形成が伝導を回復することが示されている。出願人により提案された別の戦略は内因性髄鞘再形成を増進することである（Ｍｉｌｌｅｒ， Ｄ．Ｊ．ら １９９５ｂ）。このアプローチは、髄鞘再形成することができる細胞及びそれらの成長又は分化を持続する因子が髄鞘脱落した病変中に存在するが、この応答を抑制し、従って完全な髄鞘再形成を防止するメカニズムがあることを暗示する。
【００８１】
内因性ＣＮＳ髄鞘再形成の増進の最初の記載の一つは自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ） 実験モデルから生じた。ビヒクルとして不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）及び抗原としてミエリン成分を使用して、疾患誘導後に免疫するとＥＡＥを有するモルモットにおいて構造及び機能の回復を促進した（Ｔｒａｕｔｇｏｔｔら， １９８２）。ＥＡＥにおける内因性髄鞘再形成の促進に基づいて、同様の実験がマウス脳脊髄炎サイラーウイルス（ＴＭＥＶ）で慢性感染されたマウスで行なわれた（Ｌａｎｇ， Ｗ．ら， １９８４）。マウスの感受性系統のＴＭＥＶ感染は、ウイルス存続という状況でＭＳの優れたモデルとして利用できる慢性炎症性髄鞘脱落をもたらす。ＩＦＡ中の脊髄ホモジネート（ＳＣＨ）で処置された慢性感染マウスはアジュバント単独を与えられた対照動物と較べてかなりのＣＮＳ髄鞘再形成を示した。この観察に続いて、ＳＣＨ／ＩＦＡで免疫された未感染同系動物からの抗血清又は精製Ｉｇの受身伝達がＴＭＥＶで慢性感染させたマウスにおいて髄鞘再形成を促進することを実証する実験が行なわれた（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら， １９８７ａ； Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ及びＬｅｎｎｏｎ １９９０； Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ １９９１）。これらの実験は新規であり、液性免疫応答がＣＮＳ髄鞘脱落疾患に病因役割を果たすという古典的な考えとは対照的であった。これらの実験はＩｇ、特に自己抗体がＣＮＳ髄鞘再形成を促進するのに有益な役割を果たし得ることを初めて実証したものである。
【００８２】
これらの観察に基づいて、生成が髄鞘脱落のサイラーモデルでＣＮＳ髄鞘再形成を促進するｍＡｂから始められた。ＳＣＨ／ＩＦＡを注射したＳＪＬマウスからの脾臓を融合ハイブリドーマ生成のためのＢ細胞の供給源として使用した。これらのマウスの血清は慢性髄鞘脱落マウスで髄鞘再形成を促進することが既に示されていた。ハイブリドーマを作製し、抗原としてＳＣＨを使用してＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。最初の融合後、９５の生存ハイブリドーマのうちの二つがＳＣＨに有意に結合する抗体を分泌した。これらのウェルからのハイブリドーマ細胞（ＳＣＨ７９及びＳＣＨ９４と命名した）をサブクローニングし、ＳＣＨ免疫反応性についてスクリーニングした。ＳＣＨ７９シリーズ中で、４９クローンのうちの１４のクローンが陽性であり、ＳＣＨ９４シリーズについて、３２のうちの１７が陽性であった。次いでこれらのハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体をサイラーモデル系において髄鞘再形成を促進する能力についてｉｎ ｖｉｖｏ試験した。６〜８ヶ月慢性感染されたＳＪＬマウスに４〜５週にわたって週に２回のｍＡｂの腹腔内又は静脈内注射を０．５ｍｇ〜５．０ｍｇの合計用量で施した。２種のｍＡｂ、ＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２はＣＮＳ髄鞘再形成の最大の増進を示した（Ｍｉｌｌｅｒら， １９９４）。可変重鎖及び軽鎖の配列はこれらの２種の抗体が同じであることを明らかにした。従って、その後にＳＣＨ９４．０３と称することにした（Ｍｉｌｌｅｒ及びＲｏｄｒｉｇｕｅｚ， １９９５ｃ）。
【００８３】
慢性ＴＭＥＶ誘導髄鞘脱落を有するＳＪＬマウスのＳＨ９４．０３治療は、一般にＰＢＳ治療対照動物においては５％未満であること較べて全髄鞘脱落領域の２０−３０％の髄鞘再形成をもたらす。これは対照に対して髄鞘再形成の４−６倍の増大に相当し、これがＳＣＨ９４．０３治療動物中の平均１００，０００の髄鞘再形成された軸索に相当することが軸索のカウントから推定される。完全髄鞘再形成された病変の電子顕微鏡分析は髄鞘再形成されていない軸索が残っていないことを明らかにし、これらの病変中の利用できる軸索の髄鞘再形成が１００％に近いことを示唆する。
ＳＣＨ９４．０３はＩｇＭサブクラスに属し、細胞骨格タンパク質を含む既知及び未知のタンパク質抗原に対し高度に多反応性である。興味深いことに、それは変異していないＩｇ生殖系列遺伝子によりコードされ、ＳＣＨ９４．０３が天然自己抗体であることを確認する。重要なことに、ＳＣＨ９４．０３はオリゴデンドロサイト上の未同定表面抗原を認識し、このことはこの抗体の作用のメカニズムの潜在的な標的を提供する。
【００８４】
ＳＣＨ９４．０３とＣＨ１２の間の生物学における相違がこの仮説の中心である。ＳＣＨ９４．０３のＩｇ遺伝子配列の同定の時点で、同じ生殖系列配列及び遺伝子組み合わせを有する別のマウスＩｇＭｋ抗体があることが発見された。このＩｇＭ抗体（ＣＨ１２と称する）はＣＤ５＋Ｂ細胞リンパ腫からのものであり、ホスファチジルコリン特異性である。ＳＣＨ９４．０３及びＣＨ１２はＶＬ領域で９９．１％のアミノ酸同一性を有し、同じＶＨ配列を有する。ＳＣＨ９４．０３とＣＨ１２のわずかな相違はＣＤＲ３領域にあるＮ領域挿入のためである。ＣＨ１２はオリゴデンドロサイトの表面を標識せず、サイラーモデル系で髄鞘再形成を促進せず、したがって髄鞘再形成の促進のメカニズムを説明するわずかな分子相違はＣＤＲ３領域内にあることが明白になる。この結論は、おそらくは髄鞘脱落した病変内の特異的抗原へのこれらのｍＡｂの結合が髄鞘再形成の誘導に重要であるという仮説を支持する。
現在までに、髄鞘脱落疾患のＴＭＥＶモデルで髄鞘再形成を促進する６種の異なるマウスモノクローナル抗体が同定されている（Ａｓａｋｕｒａら， １９９８）。６種の抗体の全てがＩｇＭイソタイプのものであり、自己抗体のレミニセントである生殖系列配列を保持する（Ｍｉｌｌｅｒ及びＲｏｄｒｉｇｕｅｚ， １９９５； Ａｓａｋｕｒａら， １９９６）。夫々が広い抗原結合特異性を示すが、最も重要なことに、夫々がオリゴデンドロサイトの表面で発現されている抗原に結合する。これまでの研究でオリゴデンドロサイトに結合しなかったＩｇＭ抗体は髄鞘再形成を促進しなかった。このグループのプロトタイプメンバー、ｍＡｂ ＳＣＨ９４．０３は髄鞘脱落疾患の幾つかのマウスモデルで髄鞘再形成を促進することが示されていた。慢性ウイルス誘導（ＴＭＥＶ）髄鞘脱落を有するマウスでは、ＳＣＨ９４．０３による治療は髄鞘再形成の４−６倍の増大をもたらす。ＳＣＨ９４．０３治療はまたリゾレシチン注射後の化学誘導髄鞘脱落後に生じる自発性髄鞘再形成の速度を有意に増大することが示されている。
【００８５】
髄鞘再形成促進マウス抗体の単離及び特性決定に成功したので、マウスモノクローナルのヒト対応物の同定を抗原非依存性ストラテジーを使用して開始した。その原理はＥＬＩＳＡアッセイによりマウス脊髄ホモジネートと反応し、ＣＮＳ内の構造体及び細胞に高アフィニティーで結合するヒト抗体を同定することであった。次いでこれらの抗体をミエリン修復を促進する能力についてマウス髄鞘脱落モデルにおいて試験した。プールされたヒトＩｇＭ及びＩｇＧ、Ｍａｙｏ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙクリニックの患者からの血清、並びにＥＢＶ不死化ヒトＢ細胞（結果に記載されたような種々の源から）からのモノクローナル抗体を特性決定し、マウスモデルで試験した。これらの実験の結果を以下に示す。
【００８６】
結果
ヒトポリクローナルＩｇＭが培養中にラット脳切片及びオリゴデンドロサイトに結合するがＩｇＧは結合しない
免疫組織化学により、ポリクローナルヒトＩｇＭはオリゴデンドロサイトの亜集団の表面を染色し（図６）、ラット脳の切片中の構造及び細胞に高度に反応性である（図１Ｂ）。オリゴデンドロサイト表面抗原（図６）又はラット脳の切片（図１Ａ）に対する反応性はポリクローナルヒトＩｇＧでは観察されなかった。固定され、透過性にした混合グリア細胞についてポリクローナルヒトＩｇＭ又はＩｇＧを利用する免疫組織化学は細胞内構造のごくわずかな染色を示した（データは示されていない）。
ＣＮＳ構造及び細胞に対するポリクローナルヒトＩｇＭの特異性及びオリゴデンドロサイトへの結合が顕著な髄鞘再形成潜在性を誘導するのかもしれない。対照的に、ポリクローナルヒトＩｇＧは、対照レベルより高く髄鞘再形成を促進するが（表１を参照のこと）、ＣＮＳに結合せず、ポリクローナルヒトＩｇＭとは異なるメカニズムにより機能するのであろう。
【００８７】
ヒトポリクローナルＩｇＧ及びＩｇＭはＴＭＥＶ感染マウスにおいてＣＮＳ髄鞘再形成を促進する
ＭＳの原因は分かっていないが、疫学研究はその疾患が感染性病原因子により誘起されることがあることを示唆するが（Ｆｒａｎｋｌｉｎら， １９９１）、現在まで決定的な証拠がこの理論を証明してはいない。最近、６型ヘルペスウイルスが患者のサブセットで可能な病原因子として関心を集めていた（Ｇｒｏｖｅｓら， １９９３）。再発と関連づけて研究された多種の疫学因子のうち、最近のウイルス感染のみが矛盾無く関連していた（Ｓｍｉｔｈら， １９８１）。加えて、ＭＳの主要な確立された治療、ＩＦＮ−βはウイルス複製の制御に重要なサイトカインである（１４）
【００８８】
ＭＳの研究のための一つの重要なマウスモデルはマウス脳脊髄炎サイラーウイルス（ＴＭＥＶ）である。ポジチブ鎖ピコルナウイルスは幾つかの利点を有する：（１）このウイルスはマウスの天然病原体であり、マウスはその免疫学及び遺伝学に関して広く知られている種である；（２）原発性髄鞘脱落（髄鞘の破壊）が慢性感染の主な肉体的症状である（Ｔｒａｕｔｇｏｔｔら， １９８２）；（３）宿主遺伝学が慢性のウイルス存続性、髄鞘脱落及び神経疾患に対する感受性又は耐性を決めるのに重要な役割を果たす（Ｌａｎｇら， １９９６； Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら， １９８７ａ， １９８７ｂ）；（４）ＭＳのように、病因が免疫媒介されるものである（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ及びＬｅｎｎｏｎ， １９９０； Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ １９９１； Ｍｉｌｌｅｒら， １９９４； Ｍｉｌｌｅｒ及びＲｏｄｒｉｇｕｅｚ １９９５ｃ）；（５）ウイルス複製及びウイルス集合の詳細を含む、分子ウイルス学に関する完全な情報がある；（６）慢性ＴＭＥＶ感染を有する感受性マウスの大半がＭＳと同様の神経疾患−肢の弱さ、痙性、失禁、低下された瞬時の活動及び最終的には麻痺を発生する（Ａｓａｋｕｒａら， １９９６ａ； Ａｓａｋｕｒａら， １９９８）。
【００８９】
ＭＳと同様に、ＴＭＥＶ感染マウスは疾患表現型の広いスペクトルを示す（髄鞘脱落及び神経欠陥の両方として特定される）（Ｌｕｄｗｉｎ， １９９７）。極端な一例では、ウイルスがＣＮＳ神経細胞中で複製する動物があり、ウイルスが免疫系により除かれず、ひどい脳脊髄炎及び死亡をもたらす（Ａｓａｋｕｒａら， １９９６）。このパターンの病理学が新生児マウス又はひどい免疫不全を有するマウスで観察される。この激症疾患は、ウイルスをＣＮＳから除くクラスＩ拘束Ｔ細胞により主として媒介される保護免疫応答を備えたマウスと対照的である。これらの動物は急性脳脊髄炎を発生し、その後にウイルスがその後の髄鞘脱落を生じさせずにＣＮＳから除かれる（Ｂｌａｋｅｍｏｒｅら， １９９７； Ｊｅｆｆｒｅｙ及びＢｌａｋｅｍｏｒｅ， １９９５）。これらの極端な例の間に、急性疾患を発生し消炎するが、進行性髄鞘脱落並びにオリゴデンドロサイト、星状細胞、及びミクログリア中のウイルス存続を特徴とする慢性期に入る動物がいる（Ｒｉｖｅｒａ−Ｑｕｉｎｏｎｅｓら， １９９８； Ｍｉｌｌｅｒら， １９９５ａ）。これらのマウスは死亡及び抗しがたい脳脊髄炎を防止する免疫応答を備えているが、白質からウイルスを除くことができないことが慢性の持続性炎症及び免疫媒介髄鞘脱落をもたらす。
【００９０】
抗ヒト免疫応答を避けるために、慢性感染マウス（ＴＭＥＶ感染の５〜６ヶ月後）を腹腔内の１ｍｇのＩｇの単一ボーラス注射で治療した。Ｉｇの総用量は体重１ｋｇ当り約０．０５ｇであり、これはヒトＩＶ Ｉｇ治療に使用される総用量の１／８に相当する。治療グループ間にミエリン病態の領域に有意差はなかった（表１）。しかしながら、ポリクローナルヒトＩｇＭで治療したマウスは顕著な髄鞘再形成を示した。ミエリン病態の全領域の約１／４がポリクローナルヒトＩｇＭで治療されたマウスで修復された。髄鞘再形成の程度は、ＰＢＳ治療した対照グループで観察された自発性髄鞘再形成よりも有意に高かったが（ｐ＜０．０１）、またポリクローナルヒトＩｇＧで治療されたマウスで観察されたものよりも高かった（ｐ＝０．０５）。ポリクローナルヒトＩｇＧで治療されたマウスはＰＢＳで治療されたマウスよりも大きい髄鞘再形成を示した。髄鞘再形成された個々の病変は炎症性細胞又はマクロファージを殆ど伴わずに完全な修復を示した（図１２Ａ、Ｂ）。頻繁に５００〜１０００の髄鞘再形成された軸索がこの型の病変の夫々で観察された。対照的に、ＰＢＳで治療されたマウスの殆どの病変は髄鞘再形成された軸索をほとんど有せず、病変が活性ミエリン破壊の徴候である多くの炎症性細胞及びマクロファージを含んでいた。
【００９１】
ポリクローナルヒトＩｇＭはリゾレシチン誘導髄鞘脱落において髄鞘再形成を増進する
脊髄へのリゾレシチン注射は化学誘導された脊髄損傷及び髄鞘脱落のために良く確立された方法である。注射により５−６週までに再現可能な髄鞘脱落病変が生じ、その病変は完全な自発性髄鞘再形成を受ける。本件出願人による先の研究は髄鞘再形成促進抗体による治療が内因性髄鞘再形成の速度を増大し、その結果、病変が３週までに実質的に修復されることを示した。リゾレシチン病変の単相性質、それらの迅速な自発性修復、及び病変動物における臨床欠陥の欠如は慢性ＴＭＥＶ誘導髄鞘脱落とは対照的であり、ＭＳよりも良好な脊髄損傷の性質のモデルとなり得る。
リゾレシチン誘導脊髄病変を有する動物をポリクローナルヒトＩｇＭ及びＩｇＧで治療した。病変領域の顕微鏡写真はポリクローナルヒトＩｇＭを受けた動物が多くの髄鞘再形成された軸索を含み、一方、ポリクローナルヒトＩｇＧ又はＰＢＳで治療された動物が髄鞘再形成された軸索をほとんど含まないことを示した（データは示されていない）。病変の面積当りの髄鞘再形成された軸索の数を定量するために、髄鞘再形成された軸索を３種の治療グループの病変から高倍率下でカウントした。ポリクローナルヒトＩｇＧで治療された動物よりもポリクローナルヒトＩｇＭで治療されたリゾレシチン病変中に有意に多くの髄鞘再形成された軸索があった（ｐ＜０．０５）。
【００９２】
ポリクローナルヒト免疫グロブリンは多重自己抗原及び化学ハプテンと反応する
この研究に使用したＩｇの抗原特異性をＥＬＩＳＡにより研究した。先の研究は髄鞘再形成を促進する抗体が多数のタンパク質及びハプテン抗原に対し広い反応性を示すことを示している（Ｍｉｌｌｅｒら， １９９５ｃ）。ポリクローナルヒトＩｇＧ及びＩｇＭの両方とも多数のタンパク質抗原及び化学ハプテンに結合した（図１５及び１６）。
ポリクローナルヒトＩｇＧ及びＩｇＭはＴＭＥＶ抗原と反応しない
プールされたヒトＩｇＭによる髄鞘再形成増強がＴＭＥＶ抗原に対する特異性の結果であるという可能性を排除するため、精製ＴＭＥＶを使用するウェスタンブロッティングを行なった。この研究に使用したＡｂのいずれもが既知のＴＭＥＶキャプシドタンパク質のいずれとも反応しなかった（データは示されていない）。対照的に、ＴＭＥＶに対して産生されたウサギポリクローナル抗体はウイルスのＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３キャプシド抗原に対し強い反応性を示した。
【００９３】
ＣＮＳ反応性モノクローナル抗体がヒト血清から同定し得る
天然自己抗体は正常なヒト集団中に存在するので、多数のヒトモノクローナルＩｇＭクローンをスクリーニングすることによりヒト天然モノクローナル自己抗体を同定することが可能であるに違いない。未固定脳切片結合アッセイ系を利用する血清由来ヒトモノクローナル抗体の多反応性について最初のスクリーニングを設計した。陽性クローンは蛍光複合二次抗体単独のバックグラウンドレベルより有意に高い特定の脳構造体もしくは解剖学的層又は細胞集団に結合したサンプルである。
Ｒｏｂｅｒｔ Ａ Ｋｙｌｅ博士の指示のもとにＭａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ血液学部門から得られた患者の血清から精製されたヒトＩｇＭの５２のサンプルを脳切片結合アッセイでＣＮＳ特異性について試験した。３２の抗体がバックグラウンドより高く結合することが測定された。種々の反応性を図１及び２に示す。また、５０のヒト血清由来ＩｇＧを脳切片結合アッセイでＣＮＳ特異性について試験したが、バックグラウンドより高い特有の結合パターンは明らかにされなかった（データは示されていない）。このように、直ちに、ヒトモノクローナルＩｇＭとＩｇＧの間の主要な相違が明らかにされた。
【００９４】
更に、３２の陽性抗体を脊髄ホモジネートＥＬＩＳＡ系によって結合に関して試験し（図１０）、生きた及び固定した両方のラット混合一次グリア細胞培養物への結合（図７）について試験した。これらの抗体（ＨＩｇｍ＃抗体）の反応性の表を表２に示した。生物学的活性に関して抗体をｉｎ ｖｉｖｏで試験するための基準は、ＣＮＳ特異性、培養中の固定されないオリゴデンドロサイトへの結合及びＥＬＩＳＡによるＳＣＨに対する有意な反応性とした。こうして、ＳＨＩｇＭ ２２及びｓＨＩｇＭ４６が髄鞘再形成を促進すると同定された。幾つかのその他のｓＨＩｇＭ候補は慎重に研究すべく残っている。試験されたｓＨＩｇＭ抗体のオリゴデンドロサイトへ結合する能力を表３に示してある。
【００９５】
ＣＮＳ反応性モノクローナル抗体がＥＢＶ不死化ヒトＢ細胞クローンの上清から同定された
３μｇ／ｍｌより高い総ＩｇＭ濃度を有する細胞クローンの上清を、ＣＮＳ構造に結合するそれらの能力について脳切片アッセイ系において試験した。１４０のクローン上清を脳切片結合について試験した。１５の抗体がバックグラウンドより高く結合することを測定した。これらの抗体（ＭＳＩ＃）の反応性の表を表２に示してある。ｅｂｖＨＩｇＭ反応性の代表例を図４及び５に示してある。これらの抗体の或るもののオリゴデンドロサイトへの結合能を試験した。これらの結果を表３に表示する。
ｓＨＩｇＭはヒト皮質白質に結合する。
ｓＨＩｇＭがヒトＣＮＳに結合することを確かめるために、ヒト皮質白質をラット脳切片アッセイと同様の系中で免疫標識した。図３はｓＨＩｇＭのＣＮＳ特異性の幾つかを示す。４種の抗体がヒトＣＮＳに良く結合し（図３Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）、一方、図３Ａはバックグラウンドレベルよりわずかに高く結合するｓＨＩｇＭを示す。
【００９６】
ヒトモノクローナル抗体は混合一次グリア培養物中で細胞の表面抗原に結合する
ｓＨＩｇＭの幾つかがラット一次混合グリア細胞培養物中の細胞に結合する。ｓＨＩｇＭ １２がＯ４陽性オリゴデンドロサイト領域でオリゴデンドロサイト前駆体と推定されるクラスターに結合する（図７Ａ）。４種のその他のｓＨＩｇＭ（図７Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ）は形態的に成熟したオリゴデンドロサイトに結合する。ｓＨＩｇＭ ３０は培養物中の殆どの細胞（オリゴデンドロサイト、星状細胞、ミクログリア）に結合する（図７Ｅ）。
【００９７】
ｓＨＩｇＭ及びｅｂｖＨＩｇＭはＴＭＥＶ感染マウスのＣＮＳ髄鞘再形成を促進する
抗ヒト免疫応答を避けるために、慢性感染マウス（ＴＭＥＶ感染の５〜６ヶ月後）をヒトモノクローナル抗体０．５ｍｇの単一腹腔内ボーラス注射で治療した。現在までｉｎ ｖｉｖｏ試験したヒトモノクローナル抗体のうち、ｓＨＩｇＭ ２２、ｓＨＩｇＭ４６及びｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１９がその他の試験したヒトモノクローナルＩｇＭ（ｓＨＩｇＭ １、２、及び１４）に対し髄鞘再形成を有意に促進した。治療グループ間でミエリン病理状態面積に相違はない（表１）。ｓＨＩｇＭ ２２及びｓＨＩｇＭ４６で治療されたマウスは顕著な髄鞘再形成を示した。ミエリン病理状態の全面積の約１／５がｓＨＩｇＭ ２２で治療されたマウスで修復された（表１）。髄鞘再形成の程度はＰＢＳ治療対照グループで観察された自発性髄鞘再形成よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５、表１）。個々の髄鞘再形成された病変は炎症性細胞又はマクロファージをほとんど伴わずに完全な修復を示した（図１２）。頻繁に５００〜１０００の髄鞘再形成された軸索がこの型の病変の夫々中で観察された。対照的に、ＰＢＳで治療されたマウスの殆どの病変は髄鞘再形成された軸索をほとんど有せず、病変が多くの炎症性細胞及びマクロファージ（活性ミエリン破壊の兆候）を含んでいた。オリゴデンドロサイト反応性マウスモノクローナル抗体がｉｎ ｖｉｖｏで髄鞘再形成を促進し得ることを実証する先の研究（Ａｓｕｋａｒａら， １９９８）と一致して、マウス対応物に対し同様の反応性を有するオリゴデンドロサイト反応性ヒト抗体が同様にｉｎ ｖｉｖｏで髄鞘再形成を促進し得る。
【００９８】
【表２】
2004516807.tif 000004
【００９９】
【表３】
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【０１００】
【表４】
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【０１０１】
【表５】
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【０１０２】
【表６】
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【０１０３】
【表７】
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【０１０４】
髄鞘再形成を促進するモノクローナル抗体は培養中のグリア細胞中でＣａ２＋フラックスを生じる。
髄鞘再形成促進抗体の生理濃度に対する培養グリア細胞の応答はこれらの抗体が細胞カルシウムフラックスの調節によりグリア細胞の生化学に直接の効果を有し得ることを示唆する。この効果は抗体誘導髄鞘再形成の分子メカニズムの重要な側面を表しているのかも知れない。図２１は４種の異なる抗体に対するグリアのＣａ２＋応答を示す。これらの抗体の２種、ｓＨＩｇＭ ２２及びＳＣＨ９４．０３はｉｎ ｖｉｖｏの髄鞘再形成を促進し、２種、ｓＨＩｇＭ １４及びＣＨ１２が髄鞘再形成を促進しない。抗体に応答した細胞は、二つの異なる型のカルシウムスパイクの一つを示した。幾つかの細胞はパネルＡ及びＢ中の赤色のトレースにより示されるように持続時間の短い迅速な開始スパイクで応答した（速い応答）。細胞の別のサブセットはパネルＡ及びＢ中の黒色のトレースにより示されるようにより開始が遅く、より持続時間の長いスパイクで応答した（遅い応答）。抗体ｓＨＩｇＭ ２２及びＳＣＨ９４．０３は夫々両方の型の応答を誘発したが、常に異なる個々のグリア細胞からの応答であった。これらの定性的に異なる応答は細胞の異なるサブセットに対する作用の二つの異なる分子様式を明らかに示唆する。抗体に対する応答（速い応答又は遅い応答）はｓＨＭａｂ２２による治療後に２５１のうちの３０の細胞で観察され、またＳＣＨ９４．０３で処置した２５１の細胞のうちの３６で観察された。ｉｎ ｖｉｖｏの髄鞘再形成を促進しない抗体（ｓＨＩｇＭ １４＆ＣＨ１２）は培養グリア中でカルシウムフラックスを生じないことが観察された（パネルＣ）。合計２０３の細胞をこれらの抗体の夫々について試験した。
【０１０５】
ヒトモノクローナル抗体が一次神経細胞に結合する。
ｓＨＩｇＭ及びｅｂｖＨＩｇＭの多くが脳切片中の神経細胞集団に結合する。しかしながら、結合された神経細胞の多くは切片の表面にあり、抗体が損傷された神経細胞内の内部エピトープを結合し得る可能性を示す。陽性結合ＨＩｇＭを培養中の生きたラット顆粒細胞への結合について試験した。図２２は生きた神経細胞への２種のｓＨＩｇＭの結合を示す。ｓＨＩｇＭ １２は神経細胞の軸索伸長及び樹脂状伸長の両方に結合し（図２２Ａ）、一方、ｅｂｖＨＩｇｍ ＣＢ２ｉＥ１２は顆粒細胞膜の外部及び近位の軸索伸長に専ら結合する（図２２Ｂ）。これらの反応性を抗神経フィラメント抗体および抗微小管関連タンパク質２抗体でヒト抗体陽性神経細胞をｃ−標識することにより二重標識免疫細胞化学により確かめた（データは示されていない）。
【０１０６】
本発明者らの研究所にとって特に興味深いことは、髄鞘脱落が軸索を免疫媒介損傷及び相当する神経欠陥に受けやすくする可能性である。β２ミクログロブリン欠乏マウス（β２ｍ−／−）の本発明者らの最近の分析では、本発明者らはクラスＩＭＨＣの不在下でＴＭＥＶ感染マウスが大きい髄鞘脱落病変を発生するが、臨床的欠陥を発生することができないことが明らかにされた。マウスはナトリウムチャンネル密度の増加した軸索の相対的保存及び脊髄白質の髄鞘再形成を示した。軸索の保存は神経機能の維持に必須であることが明らかである。ヒト抗体が神経細胞に特異的に結合し得るという観察はＣＮＳの抗体媒介修復に別の潜在的な手段に相当する。或る種の抗体は神経細胞に対する作用により髄鞘再形成を強化し得る。ＣＮＳ病変の修復は多くの可能なシナリオ：１）神経細胞とオリゴデンドロサイトの間の接着結合の増大、２）栄養因子をアップレギュレートし、オリゴデンドロサイト先祖を裸の軸索の領域に吸引するための神経細胞の直接の細胞刺激、３）裸の軸索における漏出イオンチャンネルの抗体遮断による軸索の神経保護、４）活性化された破壊性免疫細胞による認識からの裸の軸索の保護によりモノクローナル抗体により強化し得る。
【０１０７】
材料及び方法
Ａ．モノクローナル抗体産生、特性決定、スクリーニング及び精製：
Ａｂの供給源及びＡｂ精製
正常なヒトＩｇＭを既に記載されたように（Ｈｕｒｅｚら， １９９７）改良ドイチュ−キストラー−ニシュマンのエタノール分別操作、続いてオクタン酸沈殿及び二つの連続のイオン交換クロマトグラフィー工程により２，５００以上の健康なドナーのプールされた血漿から精製した。ＩｇＭの純度はＥＬＩＳＡ及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により確認して９０％以上であった。ＩＶＩｇとして臨床使用された健康なドナーからのプールされたヒトＩｇＧをミルズ社（エルクハート、ＩＮ）から購入した。サンプルをＭａｙｏ ＣｌｉｎｉｃのＲｏｂｅｒｔ Ａ．博士の指示のもとにディスプロテイナーゼ診療所から得た。血清のサンプルはワルデンストロームマクログロブリン血症、多発性ミエローマ、リンパ腫、良性モノクローナルガンモパシーを含む、血清中のモノクローナルＩｇＧ又はＩｇＭスパイクを特徴とする多種の症状を有する患者から得られた。
【０１０８】
エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）不死化Ｂ細胞株の作製
マーモセット細胞株Ｂ９５−８をＥＢＶの増殖及び単離のためにＡＴＣＣ（＃ＣＲＬ １６１２）から得た。細胞を完全ＲＰＭＩ−１０培地中に１ｘ１０６細胞／ｍｌで播き、続いて保湿された３７℃の５％のＣＯ２のインキュベーター中で３日インキュベートした。細胞を回収し、上澄みを１０分間にわたって３００ｘｇで４℃で遠心分離によりきれいにする。ＥＢＶを含む上清を０．４５μｍのフィルターに通し、フロースルーを集め、−１３０℃で貯蔵する（液体窒素）。このＥＢＶを含む上清は一般に１０２−１０３の形質転換単位／ｍｌを含む。
【０１０９】
不死化のための末梢Ｂ細胞を正常な成人（ＮＡ）、慢性関節リウマチを有する成人（ＡＫＪＲ）、多発性硬化症を有する成人（ＭＳ）の血液、及び胎児臍帯血（ＣＢ）から集めた。ヘパリン処理した血液（１５ｍｌ）をリン酸緩衝生理食塩水 （ＰＢＳ）中で１：２に希釈し、この希釈液１２ｍｌを５０ｍｌの遠心分離管中でフィコール−ハイペーク１２ｍｌに上層する。管を室温で８分間にわたって１５００ｘｇで遠心分離し、バフィーコート界面を取り出し、新しい５０ｍｌの遠心分離管に移す。細胞をＰＢＳ中で１回、次いでハンクス平衡生理食塩水（ＨＢＳＳ）中で２回遠心分離（１５分間、３００ｘｇ、室温）により洗浄した。次いで細胞を完全ＲＰＭＩ−１０培地２−５ｍｌ中に再度懸濁させ、カウントする。
細胞を完全ＲＰＭＩ−１０培地中で４ｘ１０６の細胞／ｍｌに希釈し、２．５ｍｌ（１ｘ１０７の細胞）を５０ｍｌの遠心分離管に移し、ＥＢＶ−上清２．５ｍｌを添加する。管を３７℃の水浴中で２時間インキュベートし、続いて１μｇ／ｍｌのシクロスポリンＡを含む完全ＲＰＭＩ−１０培地５ｍｌを添加する。次いで細胞懸濁液１０ｍｌを２５ｃｍ２の組織培養フラスコに移し、保湿された３７℃の５％のＣＯ２のインキュベーター中で３週間培養する。３週後に、培養物のアリコートを低温保存し、残部を拡張し、クローナル細胞株を制限希釈により単離する。
【０１１０】
ＩｇＭ抗体の精製
研究に使用したヒト血清サンプルは、Ｉｇクロマトグラム中の高いＩｇＭピークの存在のみにより選択した。サンプルはＭａｙｏ ＣｌｉｎｉｃのＲｏｂｅｒｔ Ａ．博士の指示のもとにディスプロテイナーゼ診療所から得た。血清のサンプルはワルデンストロームマクログロブリン血症、多発性ミエローマ、リンパ腫、良性モノクローナルガンモパシーを含む、血清中のモノクローナルＩｇＧ又はＩｇＭスパイクを特徴とする多種の症状を有する患者から得た。患者血清を３日間脱イオン水に対し透析した。オイグロブリン沈殿を遠心分離（１４０００ｒｐｍ／３０分）により集め、ＰＢＳに溶解した。溶液を遠心分離（１４０００ｒｐｍ／３０分）により透明化し、ＰＢＳで平衡化したスペロース６カラム（ファーマシア、ウプサラ）でクロマトグラフィーにかけた。ＩｇＭに相当するフラクションをプールし、還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ（１２％のゲル）により分析した。ＳＤＳゲルをシプロ・オレンジ（モレキュラー・プローブス、オイゲン）で染色し、続いてストーム８４０（モレキュラー・ダイナミクス）で走査することによりＩｇＭ濃度を測定した。モノクローナルＩｇＭ（シグマ、セントルイス）を濃度測定のための標準物質として使用した。ＩｇＭ溶液を０．２２μｍのフィルターによる濾過により滅菌した。
【０１１１】
抗原結合特異性の特性決定
髄鞘再形成を促進する能力に関するｉｎ ｖｉｖｏ試験に先立ち、抗体の予備スクリーニングのためのアッセイとしてマウス脊髄ホモジネート（ＳＣＨ）に対するＥＬＩＳＡを使用した。選択された抗体の多反応性及び抗原特異性を更に特性決定するために、タンパク質及び化学抗原の標準パネルに対するＥＬＩＳＡ、および、切片化した神経組織中及び培養オリゴデンドロサイトにおける抗体染色パターンの分析を使用する。
ＥＬＩＳＡアッセイ
抗体をマウス脊髄ホモジネート（ＳＣＨ）に対する反応性についてスクリーニングした。ＳＣＨを０．１Ｍの炭酸塩緩衝液、ｐＨ ９．５中でポリスチレンミクロタイタプレートに１８時間にわたって４℃で０．０１ｍｇ／ｍｌで被覆し、次いでＰＢＳで３回洗浄した。被覆プレートを１時間にわたって室温で１％のＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でブロックし、次いで２−２４時間にわたって室温でブロッキング緩衝液中１０μｇ／ｍｌに希釈した抗体とともにインキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％トウィーン２０で３回洗浄し、次いで結合された抗体をビオチン化ヤギ抗ＩｇＭ又はＩｇＧ、続いてストレプトアビジンに結合されたアルカリホスファターゼ、色素原の基質としてのｐ−ニトロフェニルホスフェートで検出する。反応の吸収を４０５ｎｍで測定する。
【０１１２】
また、抗体をタンパク質抗原（ヒト赤血球スペクトリン、ウシミオシンＨ鎖、マウスヘモグロビン、ウシトランスフェリン、ウシビメンチン、ニワトリ卵リゾチーム、ウサギアクチン、ウサギミエリン塩基性タンパク質、キーホールリンペットヘモシアニン）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）結合化学ハプテン（４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニルアセチル（ＮＰ）、フェニルオキサゾロン（ＰｈｏＸ）、アキソフェニルトリメチルアンモニウム（ＴＭＡ）、フルオレセイン（ＦＬ）、アゾフェニルホスホリル−コリン（ＰＣ）、アゾフェニルアルソネート（Ａｒｓ）、トリニトロアセチル（ＴＮＰ））のパネルに対する反応性についても試験する。タンパク質を５μｇ／ｍｌで使用し、ＢＳＡ結合ハプテンを２μＭのハプテン濃度で使用する。抗原をポリスチレンミクロタイタプレートに被覆し、抗体と反応させ、結合された抗体をＳＣＨ ＥＬＩＳＡについて記載されたようにして検出する。
組織切片染色
ラットの子の小脳を抗体染色パターンの比較のための神経組織の源として使用する。新鮮な固定されていない組織を２％の低融点アガロースに埋め込み、ＭｃＩｌｗａｉｎ組織チョッパーで３００μＭの矢状切片に切断する。切片を固定せず、残りの操作の間４℃又は氷で保つ。切片をＨＥＰＥＳ緩衝アール平衡塩（Ｅ／Ｈ）中で４８ウェル組織培養プレートに移し、５％のＢＳＡを含むＥ／Ｈ中で３０分間ブロックする。切片を２−１２時間にわたって４℃で１％のＢＳＡを含むＥ／Ｈ中で１０μｇ／ｍｌの一次抗体で染色する。切片をＥ／Ｈ中で３回洗浄し、２時間にわたって１％のＢＳＡを含むＥ／Ｈ中で適当な蛍光二次抗体とともにインキュベートする。切片をＥ／Ｈ中で３回、ＰＢＳ中で１回洗浄し、次いで３０分間にわたって４％のパラホルムアルデヒドで後固定する。切片をＰＢＳで３回洗浄し、２．５％の１，４−ジアザビシクロ〔２．２．２〕オクタンを含む９０％のグリセリンに取り付けて光漂白を防止する。
【０１１３】
培養オリゴデンドロサイト染色
脳半球をＰ０−Ｐ３ ＳＤラットから切開し、髄膜及び血管を除去する。組織を細断し、カルシウム及びマグネシウムを含まないＨＥＰＥＳ緩衝アール塩（Ｅ／Ｈ）中、脳当り最終容積１０ｍｌの０．２５％トリプシン溶液に移す。組織を低ｒｐｍで３７℃で３０分間振とうし、次いで熱不活化ウシ胎仔血清を１０％の最終濃度で添加してトリプシンを不活化する。ＭｇＳＯ４及びＤＮＡｓｅ Ｉを添加し（夫々０．１％及び２０μｇ／ｍｌまで）、組織を更に５分間振とうする。細胞を遠心分離により洗浄し、ＤＮａｓｅ Ｉを含むＥ／Ｈ中で再度懸濁させ、ガラスピペットにより破砕して解離させる。大きい細胞残渣を沈降させ、上にある細胞上清をＥ／Ｈ中の４％のＢＳＡクッションを通過させて洗浄する。細胞ペレットを培地中で再度懸濁させ、細胞をポリ−Ｄ−リジン培養プレートに１ｃｍ２当り２．５ｘ１０５の細胞でプレーティングする。プレートを振とうして９−１２日にオリゴデンドロサイト前駆体を単離する。この時点で培養物中にオリゴデンドロサイトの完全な表現型の広がりが存在し、最近分裂した細胞のクラスターとなって前駆細胞が上層に存在する。培養物を穏やかに振とうすることによりオリゴデンドロサイト前駆体を単離し、ポリ−リジン被覆カバースリップに再度プレーティングし、培地から成長因子を除去することにより刺激して分化させる。
【０１１４】
ＰＢＳ及び５％のＢＳＡでブロッキングした後、生きた表面染色を固定されない細胞について４℃で１５分間行なう。細胞内染色を４％のパラホルムアルデヒドによる固定及び０．１％のトリトンＸ−１００による透過後に行なう。一次抗体をフルオレセイン結合二次抗体で検出する。カバースリップを２．５％の１，４−ジアザビシクロ〔２．２．２〕オクタンを含む９０％のグリセリン中で取り付けて光漂白を防止し、エピ蛍光顕微鏡で見る。
ウェスタンブロッティング
精製ＴＭＥＶ（Ｎｊｅｎｇａら， １９９６）を１５％のアクリルアミドゲルによるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。タンパク質をエレクトロブロッティングによりニトロセルロース膜に移した。膜を２時間にわたって室温で５％の無脂肪乾燥ミルク及び０．０５％のトウィーン２０を含むトリス緩衝生理食塩水でブロックした。膜をプールしたヒトＩｇＭ、プールしたヒトＩｇＧ、ワルデンストロームのマクロブロブリン血症を有する２人の患者からのＩｇＭ、及びウサギポリクローナル抗ＴＭＥＶ Ａｂ （１：２０００） （Ｎｊｅｎｇａら， １９９６）とともに４時間にわたって室温でインキュベートした。全てのヒトＩｇを同じ濃度（１０μｇ／ｍｌ）で使用した。結合したＩｇを５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート及びニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）を使用してビオチン化ヤギ抗ヒトａｂｓ又はビオチン化ヤギ抗ウサギａｂｓ（両方ともジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリィズ社、ウェスト・グルーブ、ＰＡから）及びアルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジンで検出した。
【０１１５】
Ｂ．ヒトモノクローナル抗体を使用する髄鞘再形成の促進
ＴＭＥＶ誘導髄鞘脱落−ＴＭＥＶ誘導髄鞘脱落の生成のために、脳内ウイルス注射をメトファンで軽く麻酔した生後４−６週の動物について行なう。ＴＭＥＶのダニエル株の２ｘ１０５ ＰＦＵを含む１０μｌ容積を送出するハミルトンシリンジで２７ゲージのニードルを使用してウイルスを注射する。脳内注射は髄鞘脱落を伴う慢性ウイルス感染の９８％より大きい発生率をもたらす。髄鞘再形成実験のための慢性感染した動物は一般に感染後６−８ヶ月である。
抗体治療プロトコル
慢性髄鞘脱落を有する動物にリン酸緩衝生理食塩水中の精製抗体の腹腔内（ＩＰ）注射をする。ＴＭＥＶ感染動物について、注射スケジュールは１００ｍｌ中の５０μｇの週２回の注射からなる。抗体治療の期間は５週（合計用量５００μｇ）である。次いで動物を犠牲にし、脊髄組織を以下に記載されるような形態学的評価のために処理する。夫々の異なる抗体治療について、９匹の慢性感染した雌のＳＪＬ／Ｊマウスに抗体を注射する。治療期間の終了時に、６匹の動物を潅流し、髄鞘脱落／髄鞘再形成の形態計測定量のために処理し、３匹を軸索保全の評価に使用する凍結組織のために犠牲にする。所定の抗体について再現性のある一致した結果を伴う三つの別々の治療試験が、データを有意と考える前に必要とされる。ＰＢＳ及びイソタイプ対照グループが夫々の新しい抗体治療実験のための陰性対照として含まれる。
【０１１６】
髄鞘脱落／髄鞘再形成の形態学的評価
夫々の実験の終了時に、夫々の動物の脊髄が組織学的に評価されるであろう。マウスをペントバルビタールで麻酔し、固定剤（１％のグルタルアルデヒドを含むリン酸塩緩衝４％のホルムアルデヒド、ｐＨ ７．４）の心臓内投与により潅流する。脊髄を取り出し、１ｍｍのブロックに冠状切開し、オスミウムで後定着し、アラルダイトに埋め込む。厚さ１ミクロンの断面を夫々のブロックから切断し、４％のパラフェニルジアミンで染色する。
この技術は再現性があり、脊髄白質中の髄鞘の一致した視覚化を可能にする。
ツァイスデジタル分析システム（ＺＩＤＡＳ）及びカメラルシダを使用して、髄鞘脱落及び髄鞘再形成を定量する。夫々のマウスについて、索全体を頸部から近位尾骨脊柱領域までスパンする１０の脊髄断片を試験する。白質の全領域、髄鞘脱落の面積、及び髄鞘再形成の面積を夫々の切片について測定し、特定マウスについて分析される全ての１０の切片からの面積を加えて夫々のマウスについて全面積を得る。髄鞘脱落の領域は多量のミエリンデブリ、マクロファージを吸込んだデブリ、細胞浸潤及び裸の軸索によって特徴づけられる。オリゴデンドロサイト髄鞘再形成は異常に薄い髄鞘を有する軸索の領域及びシュバン細胞の不在によって形成の程度の統計的比較を行なう。
【０１１７】
リゾレシチン誘導髄鞘脱落
これらの実験のため、生後１２週のＳＪＬ／Ｊマウスをナトリウムペントバルビトールで麻酔し、背側ラミネクトミーを脊髄の上部胸領域で行なう。ハミルトンシリンジに取り付けられた３４ゲージのニードルを使用してリゾレシチンの１％溶液１μｍｌを索の背外側面に直接注射する。動物を注射後の２１日に殺し、脊髄の注射領域を除去し、形態学的評価のために処理する。
髄鞘脱落の第二モデルとして、リゾレシチンの脊髄内注射を使用した。生後１２週のＳＪＬ／Ｊマウスをナトリウムペントバルビトール（０．０８ｍｇ／ｇ）の腹腔内注射により麻酔した。背側ラミネクトミーを脊髄の上部胸領域で行ない、リゾレシチン（Ｌ−ａ−リゾホスファチジルコリン）（シグマ、セントルイス、ＭＯ）を既に記載されたようにして注射した（Ｐａｖｅｌｋｏら， １９９８）。簡単に言えば、ステレオタクチック（ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ）ミクロマヌピュレーターに取り付けられたハミルトンシリンジに取り付けられた３４ゲージのニードルを使用してマーカーとして添加されたエバンスブルーを含む無菌ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）中のリゾレシチンの１％溶液を注射した。ニードルを脊髄の背外側部分に挿入し、リゾレシチン溶液１μｌを注射し、次いでニードルを徐々に抜き取った。傷を二つの層中で縫合し、マウスを回復させた。リゾレシチン注射の日を０日と称した。
【０１１８】
リゾレシチン注射の７日後に、マウスをヒトＩｇＭ又はヒトＩｇＧ（１ｍｇ／注射毎）のボーラス腹腔内注射で治療した。対照マウスをＰＢＳのボーラス腹腔内注射で処置した。リゾレシチン注射の３週後及び５週後に、マウスを犠牲にし、厚さ１（ｍの切片を前節に記載されたようにして調製した。最大のリゾレシチン誘導髄鞘脱落病変を示すアラルダイトブロックを定量分析に使用した。ツァイスインターラクティブデジタル分析システムを使用して病変の全面積を定量した。ニコン顕微鏡／コンピュータ分析システムを使用して髄鞘再形成した繊維の合計数を定量した。データを髄鞘再形成された軸索の数／病変１ｍｍ２として表した。
リゾレシチン処理マウスにリゾレシチン注射後０日、３日、７日、１０日、１４日、及び１７日に抗体の５０μｇのＩＰ注射を施す。動物をリゾレシチン注射後の２１日に殺す。本発明者らは１０匹の動物の実験治療グループで統計上有意な治療効果をルーチンで見出す。ＰＢＳ対照グループ及びイソタイプ対照グループが陰性対照として利用できる。
【０１１９】
Ｃ．髄鞘再形成促進ヒトモノクローナル抗体の作用機序
Ｃａ２＋放射蛍光分析
生後２−４日のラットの子からの混合一次グリア培養物をポリ−Ｄ−リジン被覆カバースリップに播き、分析の前に５−７日培養する。Ｆｕｒａ−２−ＡＭ及びプルロニックＦ−１２７を１：１で混合し、ＤＭＥＭ（無血清）に添加して溶液中４ｍＭのＦｕｒａ−２（Ｆｕｒａ−２ローディング培地）を生じる。
細胞を含むカバースリップをＤＭＥＭで１回洗浄し、次いで６０分間にわたって３７℃でＦｕｒａ−２ローディング培地中でインキュベートする。次いで細胞をＤＭＥＭ中で４回洗浄する。コンピュータ制御データ取得システムに連結された、二つの異なる励起波長：３４０ｎｍ及び３８０ｎｍにおける５１０ｎｍの蛍光放出のデジタル像を捕捉する倒立蛍光顕微鏡上の記録チャンバー内にカバースリップを取り付ける。夫々の記録について、デジタル像を１０秒間隔で６００−８００秒にわたって個々の細胞から捕捉する。相対的内部Ｃａ２＋濃度を３４０ｎｍ／３８０ｎｍの蛍光の比として計算する。全ての記録はＤＭＥＭ １ｍｌ中で３７℃で行なう。
濃縮した（ＰＢＳ中６０ｍｇ／ｍｌ）抗体原液５０ｍｌを記録チャンバーに添加することにより試験抗体を導入し、３ｍｇ／ｍｌの最終濃度とする。試験抗体の添加の効果を記録した後、カルシウムイオノホア原液（ＰＢＳ中２００ｍＭのＢｒ−Ａ２３１８７）５０ｍｌをチャンバーに添加して１０ｍＭの最終濃度を生じる。
【０１２０】
考察
静脈内投与された正常なヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）、特にＩｇＧ（ＩＶＩｇ）はギラン−バレー症候群（ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｃｈら， １９９２）、慢性イディオパシー髄鞘脱落神経障害（ｖａｎ Ｄｏｏｒｎら， １９９１）、多病巣運動神経障害（Ｃｈａｕｄｈｒｙら， １９９３）、多発性筋炎（Ｃｈｅｒｉｎら， １９９１）、及び重症筋無力症（Ｅｄａｎ及びＬａｎｄｇｒａｆ， １９９４）を含む種々の自己免疫神経疾患を治療するのに有効であることが示されていた。投与されたＩｇの作用機序は明らかではない。幾人かの研究者らはこの治療がＴ細胞媒介自己免疫ＣＮＳ疾患、例えば、多発性硬化症（ＭＳ）に有効であり得ることを示唆していた（ｖａｎ Ｅｎｇｅｌｅｎら， １９９２； Ａｃｈｉｒｏｎら， １９９２； Ｆａｚｅｋａｓら， １９９７； Ａｃｈｉｒｏｎら， １９９８； Ｓｏｒｅｎｓｅｎら， １９９８）。
【０１２１】
本発明者らはＭＳの新規治療を開発するためのモデルとしてマウス脳脊髄炎サイラーウイルス（ＴＭＥＶ）誘導髄鞘脱落を使用した。このピコルナウイルスをマウスの感受性系統の脳内に接種する場合、ＴＭＥＶはＭＳに臨床上かつ病理学上類似する免疫媒介進行性ＣＮＳ髄鞘脱落を誘導する。本発明者らは正常なＣＮＳ抗原に対し誘導されるマウスＩｇＭ（モノクローナル抗体（ｍＡｂ）がＴＭＥＶ誘導髄鞘脱落後にＣＮＳ髄鞘再形成を促進することを既に示した（Ｍｉｌｌｅｒら， １９９４； Ａｓａｋｕｒａら， １９９８）。またＳＣＨ９４．０３と称されるプロトタイプ抗体がリゾレシチン誘導髄鞘脱落後に自発性ＣＮＳ髄鞘再形成の速度を増進することが示され（Ｐａｖｅｌｋｏら， １９９８）、実験自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）の再発モデルで重篤度及び再発の頻度を減少することが示された。これらの髄鞘再形成促進ＩｇＭ ｍＡｂの共通の特徴はそれらがオリゴデンドロサイトの表面抗原に反応し、天然自己抗体の表現型の特徴及び遺伝子型の特徴を有することである（Ｍｉｌｌｅｒ及びＲｏｄｒｉｇｕｅｚ， １９９５； Ａｓａｋｕｒａら， １９９８）。天然自己抗体は自己抗原及び非自己抗原との広い反応性スペクトルを有する。これらの抗体は正常な循環ＩｇＭレパートリーの主要なフラクションを代表する。それらの生理機能は知られていないが、天然自己抗体の有益な効果が重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、及び非肥満糖尿病を含む種々の自己免疫疾患モデルで報告されていた（Ｓｕｎｄｂｌａｄら， １９８９； Ｈｅｎｔａｔｉら， １９９４； Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら， １９９１， １９９４）。
【０１２２】
ＩＶＩｇは３０００〜１００００の健康なドナーのヒト血漿プールから精製され、９５％より多いＩｇＧ及び無視できる量のＩｇＭを含む（Ｄａｌａｋａｓ， １９９７）。本発明者らの先の観察に基づいて、本発明者らは健康なドナーからのヒトＩｇＭ（これは天然自己抗体中に濃縮される）が通常のＩＶＩｇよりも髄鞘脱落疾患の有効な治療であろうと仮定した。この仮説を試験するために、本発明者らは慢性ＴＭＥＶ感染マウスを２，５００以上の健康なドナーから得られたプールされたヒトＩｇＭで治療し、ＣＮＳ髄鞘再形成について調べた。
この研究において、本発明者らは健康なドナーからプールされたヒトＩｇＭによる治療がプールされたヒトＩｇＧ、又はＰＢＳによる治療と較べてＴＭＥＶ感染マウスでオリゴデンドロサイトによる有意に増進された髄鞘再形成をもたらすことを実証した。本発明者らはプールされたヒトＩｇＭがタンパク質及びハプテンに対する多反応性天然自己抗体の集団を含むことをＥＬＩＳＡ及び免疫組織化学により確認した。これはポリクローナルヒトＩｇＭが髄鞘脱落疾患のモデルでＣＮＳ髄鞘再形成を促進し、従って健康なドナーからのＩｇＭが通常のプールされたヒトＩｇＧよりもヒト炎症性髄鞘脱落疾患を治療するのに有効であり得る可能性を生じることの最初の実証である。
【０１２３】
本発明者らが知る限り、プールされたヒトＩｇＭは、それが安全であり、ひどい感染症及び免疫不全に有効であることが示されていにもかかわらず、ＭＳには試験されていなかった。
天然自己抗体はＩｇＭレパートリーの主要な画分である。マウスでは天然自己抗体は専らＩｇＭであるが、ヒトでは天然抗体はまた頻度は少ないがＩｇＧイソタイプのものもある。現在まで、髄鞘再形成を増進することが示された唯一のｍＡｂはオリゴデンドロサイト反応性ＩｇＭ（天然自己抗体の遺伝子型及び表現型の特徴を有する、ｍＡｂ）であった（Ａｓａｋｕｒａら， １９９８）。
結論すると、本発明者らは論理的スクリーニング技術が髄鞘脱落のモデル系において髄鞘再形成を促進する可能性を有するヒトモノクローナル抗体を同定するのに使用し得ることを実証した。抗体の性質、例えば、ＣＮＳ特異性、オリゴデンドロサイトに存在する抗原を認識する能力及び脊髄ホモジネートへの強い結合は、それらを組み合わせて、どの抗体がｉｎ ｖｉｖｏの髄鞘再形成について試験するのに最良の候補であるのかを予測することができる。これらのモノクローナル抗体の多くがヒトＣＮＳに良く結合し、このことは幾つかがヒト疾患を成功裏に治療するための療法として有益であり得ると希望する理由を与える。
以下はこの実施例に引用された文献のアルファベット順のリストである。
【０１２４】
参考文献
2004516807.tif 000010
【０１２５】
2004516807.tif 000011
【０１２６】
2004516807.tif 000012
【０１２７】
2004516807.tif 000013
【０１２８】
2004516807.tif 000014
【０１２９】
実施例２
自己抗体によるエピトープ模倣ペプチドのスクリーニング
この実施例において、本発明の自己抗体に相当する、認識された抗原、又はこれらの部分を模倣するペプチドの同定及び調製が記載される。本明細書に先に記載されたように、このようなペプチドは、増大された循環レベルの抗体に有利に応答性であることが示された疾病状態に対する増進された免疫応答を誘発するためのワクチンとして利用し得る。
ペプチド模倣物の同定のための例示的戦略は、髄鞘再形成を誘導することができると実証されたマウス自己抗体、例えば、ＨＮＫ−１抗体、に特異的に結合するペプチドについて検索することであろう。ＨＮＫ−１エピトープ抗原は炭水化物である。ＨＮＫ−１エピトープは神経組織からの糖脂質及び糖タンパク質上に主として発現される（ＭｃＧａｒｒｙら （１９８３） Ｎａｔｕｒｅ ３０６：３７６−３７８； Ｉｌｙａｓら （１９８４） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １２２：１２０６−１２１１； Ｋｒｕｓｅら （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１１：１５３−１５５； Ｙｕｅｎら （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：８９２４−８９３１）。ＨＮＫ−１抗体と反応する構造がヒト末梢神経中に存在する主要抗原糖脂質についてＣｈｏｕ及びＪｕｎｇａｌｗａｌａにより最初に記載された。その組成、糖連鎖、立体配置及びスルフェート基の位置は、ＳＧＧＬ−１についてスルフェート−３ ＧｌｃＡβ （１−３） Ｇａｌβ （１−４） ＧｌｃＮＡｃβ（１−３） ＧａｌＮＡｃβ（１−３） Ｇａｌβ （１−４） Ｇｌｃβ（１−１）−セラミドとして、またＳＧＧＬ−２についてスルフェート−３ ＧｌｃＡβ （１−３） Ｇａｌβ （１−４） ＧｌｃＮＡｃβ （１−３） Ｇａｌβ （１−４） ＧｌｃＮＡｃβ （１−３） Ｇａｌβ （１−４） Ｇｌｃβ （１−１）−セラミドとして特性決定された（Ｃｈｏｕら， １９８６）。
【０１３０】
ファージディスプレイされたランダムペプチドライブラリーのスクリーニングは分子多様性の豊富な源を与え、注目する受容体分子に結合するペプチドリガンドを同定する強力な手段に相当する。結合ペプチドを発現するファージは注目する標的を用いてアフィニティー精製により選択される。この系は多数のファージを一度にスクリーニングすることを可能にする。夫々の感染性ファージはその表面で発現されたランダム配列をコードするので、特定のファージをアフィニティーマトリックスから回収して、感染の別のラウンドにより増幅することができる。こうして、固体担体に固定された選択分子をそれらに結合するペプチドを選択するのに使用し得る。この操作は、選択分子に結合し、しばしば共通のコンセンサスアミノ酸配列を提示する幾つかのペプチドを明らかにする。選択したライブラリーメンバーの生物学的増幅及び配列決定により、一種以上のペプチドの一次構造決定が可能になる。
【０１３１】
ファージディスプレイにより同定されたペプチドリガンドは頻度高く標的分子の一つ以上の天然結合部位と反応示し、しばしば一つ以上の標的の天然リガンドに似ている。この系は抗体により認識されるペプチドエピトープを同定するのにしばしば使用されてきたが、それはまた炭水化物分子のペプチド模倣物を見出すのに成功裏に使用されてきた。炭水化物抗原に代えてペプチド模倣物を使用することに関する研究がＫｉｅｂｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓら， １９９８により総説されていた。炭水化物決定基を模倣するペプチドの実証された能力は、この模倣が糖に代えてアミノ酸を使用して行なわれてはいても、特異性パターンを再現できることを示している。
【０１３２】
１５ｍｅｒペプチドの増幅された開始ライブラリーを用いて、第一スクリーニングを行なった。ＨＮＫ−１抗体への結合に関して陽性の幾つかのクローンを見出した。ＨＮＫ−１を用いる初期スクリーニングにおいて、結合されたファージをｐＨシフトにより遊離させたが、その結果、特異的に結合されたファージと非特異的に結合されたファージの間に差別がなかった。それ故、ＨＮＫ−１抗体がジスルフィドブリッジを含むカップリング剤でビオチン化されているスクリーニングを行なった。ビオチン化抗体をストレプトアビジン被覆チューブと前もって反応させ、結合しなかった抗体を洗浄して除き、免疫チューブをスクリーニングに使用する。あるいは、ファージを溶液中でビオチン化抗体と反応させ、次いでビオチン化複合体をストレプトアビジンで被覆された免疫チューブと反応させる。いずれの場合にも、結合しなかったファージを洗浄して除いた後、結合したファージをジチオスレイトール（これは抗体及び付着されたファージを放出する）（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら， １９９４））の添加により溶離する。更に、これらのスクリーニングをマウス血清（１２．５％）の存在下で行なった。これはＨＮＫ−１抗体に対し大過剰のマウスＩｇＭを供給し、その結果、ＨＮＫ−１抗体への非特異的結合が抑制されるはずである。
【０１３３】
或る例では、溶液中のファージを“前もって固定された”抗体と反応させる場合、選択の第三又は第四ラウンド後に結合するファージの数の上昇が得られた。試験したクローンは全マウスＩｇＭに同様に結合した。最後の実験において、種々の操作を並行して比較した：ファージをマウス血清の存在下又は不在下でＨＮＫ−１被覆免疫チューブ又は溶液中のビオチン化ＨＮＫ−１に結合させた。前もって被覆された抗体を使用して濃縮が観察されたが、選択されたクローンはＨＮＫ−１に結合したが、やはり全マウスＩｇＭにも結合した。選択されたファージはまたＬ２−４１２抗体（これはＨＮＫ−１と同じ炭水化物を認識する）に反応性であったが、ＨＮＫ−１は末端硫酸基を必要としるが、一方、Ｌ２−４１２抗体は硫酸基を有する、又は有しない炭水化物を認識することは興味深い。
【０１３４】
材料及び方法
材料
１５−ｍｅｒペプチドライブラリー及び大腸菌 Ｋ９１ Ｋａｎ細胞を使用することができる。１５−ｍｅｒライブラリーを繊維状ファージｆｄ−ｔｅｔ（Ｓｃｏｔｔら， １９９０）の誘導体であるベクターｆＵＳＥ５中で構築した。このベクターは選択を可能にするテトラサイクリン耐性遺伝子を有する。繊維状ファージはそれらの宿主を殺さない。こうして、感染細胞はテトラサイクリン耐性になり、増殖し続け、子孫粒子を分泌する。大腸菌株Ｋ９１ＫａｎはＫ３８（Ｌｙｏｎｓら， １９７２）のλ−誘導体であり、染色体遺伝子型ｔｈｉを有し、カナマイシン耐性遺伝子（ｍｋｈ）（Ｓｍｉｔｈら， １９９３； Ｙｕら， １９９６）を有する。ペプチド及びＣ末端システインを介してＳＰＤＰ活性化ＢＳＡ（６０ｍｇ）を結合させたペプチド（１０ｍｇ）が、例えば、ＡＮＡＷＡ ＡＧ（８６０２ Ｗａｎｇｅｎ、スイス）から得られる。テトラサイクリン及びカナマイシンはシグマから購入し得る。Ｌ２／ＨＮＫ−１糖脂質を本発明者らの研究所でウシ馬尾からＢ． Ｂｅｃｋｅｒにより精製した。硫酸化糖、ＳＯ３−ＧｌｃＡ−Ｇａｌ−アリルは有機化学のゼリンスキー協会（ロシア科学アカデミィ、モスクワ）のＮ． Ｎｉｆａｎｔ’ｅｖにより親切に提供された。
【０１３５】
抗体
ラット中で生じさせた、ＨＮＫ−１炭水化物を認識するモノクローナル抗体（ｍＡｂ Ｌ２−４１２）の特性決定及び精製がＮｏｒｏｎｈａ， Ａ．ら， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ３８５， ２３７−２４４ （１９８６）により記載されていた。Ｌ２−４１２抗体はブダペスト条約のもとにＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ Ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ （Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ， Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， ドイツ）に寄託され、 と称される。ＨＮＫ−１抗体はＡＴＣＣからＴＩＢ２００として入手し得る。ポリクローナルラットＩｇＧ及びＨＲＰ−ストレプトアビジンをシグマ（米国）から得た。ＨＲＰ／抗Ｍ１３ポリクローナル抗体をファーマシア・バイオテクから購入した。ラットＩｇＧに対し誘導されたホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体をジャクソン・イムノリサーチから得た。
【０１３６】
開始ライブラリーの増幅
１５ｍｅｒペプチドをコードする一次ライブラリーを以下のようにスミス操作（Ｓｍｉｔｈら， １９９２）に基づいて増幅した。
細胞が必要となる前の夜に、１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む、ＬＢ培地（ｇ／Ｌ バクト−トリプトン、５ｇ／Ｌ ＮＡｃｌ、５ｇ／Ｌ 酵母エキス）２ｍｌにＫ９１Ｋａｎ細胞を接種し、３７℃で一夜振とうした。テリフィック・ブロース１００ｍｌを含む１Ｌのフラスコを調製した（バクト−トリプトン１２ｇ、酵母エキス２４ｇ、グリセロール（４ｍｌ）５．０４ｇを水９００ｍｌに添加し、９０ｍｌづつオートクレーブ処理した；リン酸カリウム緩衝液（０．１７Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、０．７２Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４、ｐＨ調節を必要としない）を使用前に夫々に９０ｍｌに添加した）。
【０１３７】
テリフィック・ブロース１００ｍｌにＫ９１ｋａｎ細胞の一夜培養液１ｍｌを接種し、１：１０希釈液のＯＤ６００が０．２に達するまで激しく振とうした。次いで振とうを１０分間にわたって遅くしてＦ−ピリを再生させ、開始ライブラリー１０μｌをフラスコに添加した。遅い振とうを続けて吸着を可能にした。次いで培養液を０．２２μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ１Ｌに移し、３５分間にわたって３７℃で激しく振とうした。テトラサイクリン濃度を２０μｇ／ｍｌに調節し、アリコートを力価の測定のために採取した。感染細胞をテトラサイクリン培地に塗布し、テトラサイクリン耐性コロニーの数をカウントすることによりファージを力価測定した（回収力価）。この方法で定義した感染性単位を形質転換単位（ＴＵ）と称し、感染性は物理的粒子の数に対するＴＵの数の比である。典型的には、培養液５０μｌのアリコートを除去し、０．２μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢで希釈した（希釈範囲は１０３−１０５であった）。夫々の希釈液２００μｌのアリコートを４０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン及び１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む寒天プレートに塗布し、３７℃で一夜インキュベートした。コロニーを翌日にカウントした。この段階で、テトラサイクリン耐性コロニーの力価は約１０７／ｍｌであるべきである。培養液の残部を一夜激しく振とうした。
【０１３８】
翌朝、遠心分離の２工程（４０００ｘｇ、１０分間、４℃及び１０，５００ｘｇ、ＧＳＡ、１０分間、４℃）の後に得られた二重にきれいにされた上清を０．１５倍容のＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液（３．３Ｍ ＮａＣｌ溶液中１６．７％のポリエチレングリコール）を添加することにより４℃にて一晩沈殿させた。遠心分離（１０，５００ｘｇ、ＧＳＡ、４０分間、４℃）後に集められた沈殿したファージをＴＢＳ（５０ ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ）１０ｍｌに溶解し、０．１５倍容のＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液をファージ懸濁液に添加し、氷の上で１時間インキュベートすることにより第二の沈殿を行なった。この段階で、大きな沈殿が明らかな筈である。
【０１３９】
遠心分離（１４，５００ｘｇ、ＳＡ６００、１０分間、４℃）後に得られたペレットをＴＢＳ１０ｍｌに再度溶解し、ＣｓＣｌ ４．８３ｇを含む、風袋を量っておいた容器に移した。容器の風袋を再度量り、ＴＢＳを１０．７５ｇの正味の重量まで添加した。これはＣｓＣｌの３１％ｗ／ｖの溶液（密度１．３０ｇ／ｍｌ）１２ｍｌを生じる筈ある。その溶液を１５０，０００ｘｇで５℃にてＳＷ４１ローター（ベックマン）中で４８時間遠心分離した。強い可視光源の助けにより、淡青色の非綿状バンド（増幅したファージを含む）が狭い綿状の不透明な白色バンド（おそらくＰＥＧに由来する）の上に見えた。最初にファージバンドの上にある液体を徐々に吸引し、次いでピペットを使用して、下の綿状バンドをできるだけ多く回避しつつファージバンドを抜き取ることによりファージバンドを回収した。次いでファージバンドを２６ｍｌのポリカーボネート遠心分離ボトル（これはショルダーまでＴＢＳで満たされていた）に送出し、Ｔｉ７０ローター（２７９，０００ｘｇ、４時間、５℃）中で遠心分離し、培養液１Ｌ当り２ｍｌのＴＢＳ中に再度懸濁させた。ファージはこの形態で冷蔵庫中に安定に貯蔵することができる。
【０１４０】
次いで増幅されたライブラリーを以下のようにして力価測定した（最終力価）。１０７から１０１０までの希釈範囲をカバーするファージの幾つかの希釈液をＴＢＳ／ゼラチン（ＴＢＳ１００ｍｌ中ゼラチン０．１ｇ）中で調製した。次いでこれらの希釈液の夫々１０μｌを使用してこの節の最初に記載されたようにして調製されたＫ９１ｋａｎ細胞１０μｌを感染させ、夫々の希釈混合物を室温（ＲＴ）で１５分間インキュベートしてファージを濃縮した細胞に感染させた。０．２μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ １ｍｌを添加し、振盪−インキュベーター中で３７℃で３０分間インキュベートした。次いで感染細胞を上記のように４０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン及び１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む寒天プレートにプレーティングした（２００μｌ）（回収力価）。
【０１４１】
スクリーニング操作
Ａ．直接結合
ｍＡｂＬ２−４１２で被覆された免疫チューブ（ヌンク、マキシソーブ）を使用してファージライブラリーをパンニングした。チューブを一夜にわたって４℃にて、スクリーニングの第一ラウンドについてはＰＢＳ（合計容積１ｍｌ）中１０μｇ／ｍｌのタンパク質とインキュベーションし、そしてスクリーニングの第２および第３ラウンドについては１μｇ／ｍｌの抗体Ｌ２−４１２とともにインキュベートすることにより被覆した。ブロット（ＰＢＳ中５％の無脂肪乾燥ミルク、０．０５％（ｖ／ｖ）のトゥイーン２０）で４℃にて２時間ブロックした後、免疫チューブ当りファージライブラリーの１０１１の形質転換単位（２５０μｌの容積中）を回転チャンバー中で３７℃で１時間結合させた。第二ラウンド及び第三ラウンドについて、非特異的結合物の数を減少するために、ファージを免疫チューブに添加する前に１００μｇ／ｍｌのラットＩｇＧとともに１時間プレインキュベートした。未結合ファージ（それから陰性対照ファージが選ばれた）の回収後に、チューブをＰＢＳ−０．０５％（ｖ／ｖ）トゥイーン２０で１０回洗浄し、４℃で０．１ＭのグリシンｐＨ ２．２（合計容積０．５−１ｍｌ）で１０分間溶離した。溶離したファージを１．５ＭのトリスｐＨ ９で中和し、次いで室温で１５分間にわたって対数期大腸菌 Ｋ９１ Ｋａｎ細胞０．５−１ｍｌを感染するのに使用した。
【０１４２】
感染させた細菌を０．２μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ２０ｍｌに移し、力価（回収力価）の測定のためのアリコートを除去した後、前節に記載されたようにして一夜増殖させた。次いで増幅された溶離物を２回遠心分離し（１０分間、３６００ｘｇそして１０分間、１４，５００ｘｇ、ＳＡ６００）、最終上清を一夜にわたって４℃で０．１５倍容のＰＥＧ／ＮａＣｌで沈殿させた。ファージをペレットにし（１５分間、１４，５００ｘｇ、ＳＡ６００）、ピペット操作及び撹拌によりＰＢＳ １ｍｌに溶解し、１分間微量遠心分離して不溶物をペレットにし、再度少なくとも１時間にわたって４℃でＰＥＧにより沈殿させた。大きな沈殿がこの段階で見えるべきである。１０分間の微量遠心分離後に得られたペレットを最後に０．０２％のアジドを含むＰＢＳ ２００μｌに溶解した。この増幅された溶離物は４℃で保存および維持することができる。ライブラリーを３回増幅及び選択した。
１００倍過剰のマウスＩｇＭを入れて非特異的結合を減少させた以外は同じ操作をＨＮＫ−１抗体を用いるＨＮＫ−１スクリーニングに使用した。
ファージを記載されたようにして力価測定した（最終力価）。コロニーを翌日にカウントし、回収力価を先のラウンドの力価（インプット）で割ることによりスクリーニングの収率を計算した。
【０１４３】
Ｂ．ビオチン化抗体を用いるスクリーニング
二つの操作を使用してこのスクリーニングを行なった。両方ともＧ． Ｓｍｉｔｈのプロトコル（未公表のプロトコル）に従った。ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチンを使用してＨＮＫ−１抗体を以下に記載されるようにしてビオチン化した。ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチンは、ビオチン基が続いてジチオスレイトール（ＤＴＴ）と一緒のインキュベーションにより除去されることを可能にするために、ビオチンをジスルフィドブリッジを介してタンパク質に連結してある。Ｌ２−４１２抗体を以下に記載されるようにして同様にビオチン化した。操作Ａでは、ビオチン化抗体を最初にストレプトアビジン被覆免疫チューブに結合させ、続いてこれを使用してファージインプットをパンニングする。操作Ｂにおいては、ビオチン化抗体を溶液中でファージとともにプレインキュベートし、その反応混合物をストレプトアビジン被覆免疫チューブに結合させる（数分間）。
【０１４４】
操作Ａにおいて、免疫チューブを一夜にわたって４℃でローターにて、合計容積１ｍｌ（チューブの全表面を湿潤させる）の、ＰＢＳ中の１０μｇ／ｍｌのストレプトアビジンで被覆した。ストレプトアビジンを捨て、チューブにブロッキング溶液、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳで４℃にて２時間にわたって満たした。ＰＢＳ−０．０５％（ｖ／ｖ）のトゥイーン２０（ＰＢＳ−Ｔ）で６回洗浄した後、ビオチン化抗体を添加した。典型的には、ブロッキング溶液４００μｌ中のビオチン化ＨＮＫ−１ ３μｇ、又はビオチン化Ｌ２−４１２抗体５μｇを添加した。抗体を少なくとも２時間（又は一夜）にわたって４℃にてローター上で結合させた。ＰＢＳ−Ｔで６回洗浄した後、ブロッキング溶液４００μｌ中の、１５−ｍｅｒ開始ライブラリーからの１０１０のファアージを４時間にわたって４℃にてローター上で夫々の抗体被覆免疫チューブに結合させた。操作Ｂにおいて、免疫チューブの被覆の際に、１０１０のファージを一夜にわたって夫々ビオチン化ＨＮＫ−１又はＬ２−４１２ ３又は５μｇとともにプレインキュベートした。次いでビオチン化抗体を１０分間にわたって４℃にてローター上で被覆免疫チューブに結合させた。どちらの操作においても、チューブをその後に１０回洗浄し、次いでファージ−抗体複合体を１−５分間、室温にてＰＢＳ中の２０ ｍＭ ＤＴＴ（容積０．５ｍｌ）で溶離した。増幅及び力価測定を上記のようにして行なった。ライブラリーを４回の増幅及び選択にかけた。
【０１４５】
ＥＬＩＳＡスクリーニング
Ａ．陽性クローンの検出のための直接結合
テトラサイクリン及びカナマイシン耐性の個々のコロニーを９６ウェルプレート（ヌンク）中で２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ中で一夜にわたって３７℃にて増殖させ（３００μｌ／ウェル）、次いでジュアン遠心分離機中で１０分間にわたって３０００ｒｐｍで遠心分離し、上清（１００μｌ）を既にｍＡｂＬ−２−４１２ （１００μｌ、μｇ／ｍｌ、一夜、４℃）で被覆された別の９６ウェルプレート中で２時間インキュベートし、ＰＢＳ−０．５％（ｗ／ｖ） ＢＳＡと一緒のインキュベーションにより２時間にわたってブロックした。５回洗浄した後、ファージの結合を１時間にわたって１：２０００の希釈でＨＲＰ結合抗Ｍ１３抗体（ファーマシア、バイオテク）と一緒のインキュベーションにより検出した。ペルオキシダーゼ反応をＨＲＰ緩衝液（０．１Ｍの酢酸ナトリウム、０．０５ＭのＮａＨ２ＰＯ４、酢酸で４．２に調節されたｐＨ）中に０．０１％の過酸化水素及び０．１％（ｗ／ｖ）の２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）−ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ、ベーリンガー・マンハイム）を含む現像剤１００μｌの添加により開始した。着色反応生成物の吸収をマルチスキャン・タイターテクプラス（フロー、スイス）中で４０５ｎｍで測定した。並行して、夫々のクローンをまたラットＩｇＧ（１００μｌ、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌ；同じく２時間にわたってブロックした）で被覆された９６ウェルプレートで試験した。選択された結合クローン（陽性ファージという）（これらはｍＡｂＬ−２−４１２の陽性結合物であったが、ラットＩｇＧに結合しなかった）を生じる細菌を４０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン及び１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地を含む寒天プレートに線状に塗った。二つの独立コロニーを採取し、ｍＡｂ Ｌ２−４１２に対する陽性について再度アッセイした。陽性の単一コロニーを４０％のグリセロール中で−８０℃にて貯蔵した。
【０１４６】
Ｂ．競合結合
ミクロタイタープレート（ヌンク）をＬ２／ＨＮＫ−１糖脂質（５０μｌ、１μｇ／ｍｌ、ＥｔＯＨに溶解した）で被覆し、一夜乾燥させた。ウェルを２時間にわたってＰＢＳ中の０．５％（ｗ／ｖ）の脂肪酸を含まないＢＳＡでブロックしながら、予め測定した限界濃度のＬ−２−４１２を、遊離ペプチドについては２．２ ｍＭの濃度、ＳＯ３糖について５ｍＭの濃度で開始する、インヒビターの連続２倍希釈列並びに１０１２の陽性ファージ及び陰性ファージ（陰性ファージはスクリーニングの第一ラウンドの未結合フラクションからクローン化された）とともにプレインキュベートした。次いでプレインキュベートした混合物を１００μｌでウェルに添加し、ＲＴで１時間インキュベートした。ＰＢＳ−０／０５％（ｖ／ｖ）トゥイーン２０で５回洗浄した後、ｍＡｂ Ｌ２−４１２の結合を１時間のＨＲＰ−結合ヤギ抗ラットＩｇＧと一緒のインキュベーション、続いて先に記載された着色反応により検出した。インヒビター存在下の基質へのｍＡｂ Ｌ２−４１２の結合の抑制のパーセンテージをインヒビター非存在下で得られた対照値（抑制の０％）を基準にして計算した。
【０１４７】
Ｃ．結合の抑制
ミクロタイタープレートを一夜にわたって４℃でＰＢＳ中のラミニン（ギブコ／ＢＲＬ）（１０μｇ／ｍｌ、１００μｌ）、又はｍＡｂＬ−２−４１２（１μｇ／ｍｌ、１００μｌ）で被覆した。全ての以下の反応工程を室温で行なった。ＰＢＳ＋０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡでブロックした後、３０μＭの濃度で開始してＢＳＡにカップリングされたペプチド（ＡＮＡＷＡ Ａｇ、スイス）の連続２倍希釈系列５０μｌを１−２時間にわたってＲＴで添加した。次いで既に測定された、関係するペプチドを有する限界数のファージを添加し、更に１時間インキュベートした。結合しれたファージをＥＬＩＳＡスクリーニング節に記載されたようにしてＨＲＰ／抗Ｍ１３抗体で検出した。ラミニンに代えて、固定化Ｌ２−４１２、抗体Ｌ２−４１２への陽性ファージの結合と競合する、ＢＳＡにカップリングしたペプチド、を用いて類似の実験を行った。
【０１４８】
Ｄ．ラミニンへの直接結合
ミクロタイタープレートを上記のようにして１００μｌのｍＡｂ Ｌ２−４１２又はラミニンで被覆し、ＢＳＡにカップリングさせたビオチン化ペプチド１００μｌを３０μＭの濃度で開始して添加し、室温で２時間インキュベートし、ＨＲＰ−ストレプトアビジンで検出した。
ＤＮＡ配列決定
凍結されたグリセロール原液から爪楊枝で陽性クローンを採取して２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ中で一夜にわたって３７℃で増殖させた。ダブルスピン法を使用して、一本鎖ＤＮＡをＧ． Ｓｍｉｔｈ （１９９２）により記載されたようにして精製し、サーモ・シーケナーゼ・サイクルシーケンシングキット（アマシャム）で配列決定し、自動化シーケンサー（Ｂ１０ゼネティック・アナライザー、アプライド・バイオシステムズ社）にかけた。
ビオチン化
製造業者の指示に従ってスルホ−ＮＨＳ−ビオチン（ピアス）を使用してＨＮＫ−１抗体、ＢＳＡ及びＢＳＡにカップリングさせたペプチドのビオチン化を行なった。抗体については１０：１のモル比を使用し、ＢＳＡ又はＢＳＡにカップリングさせたペプチドについてはモル比５：１を使用した。ビオチン化生成物を一夜にわたってＰＢＳに対し４℃で透析した。
【０１４９】
神経突起外殖実験及び培養
運動神経細胞の調製
カバースリップを１６０℃で一夜ベーキングすることによりそれらを滅菌し、４℃でポリオルニチン（シグマ、水中１．５μｇ／ｍｌ）と一緒に一晩インキュベーションして被覆した。次いでカバースリップを３回水洗し、更に以下のように試験物質で被覆した。１）ＢＳＡ−ペプチドコンジュゲートをＰＢＳに１００μｇ／ｍｌで溶解し、卓上ソニケーターで１分間音波処理し、最高速度で微量遠心分離機中で２０分間遠心分離した。上清のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄの方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄら， １９７６）により毎回測定した。次いで複合体１２０μｌをコラーゲン溶液（ＰＢＳ中２０μｇ／ｍｌのコラーゲン）２８０μｌと混合し、１００μｌを一夜にわたって４℃にて夫々のカバースリップ上に塗布した。２）陰性対照として、未処理のＢＳＡをペプチド−ＢＳＡ結合体に代えて使用した。３）Ｌ２／ＨＮＫ−１炭水化物を有する糖脂質を１０μｇ／ｍｌの濃度でエタノールに溶解し、８０μｌを上記コラーゲン溶液１ｍｌに添加した。１００μｌの容積を被覆のために使用した。カバースリップを四重に２４ウェルプレート（ヌンク）に入れ、最後に３回洗浄し、その後に細胞を塗布した（カバースリップは決して乾燥させなかった）。
【０１５０】
運動神経細胞をＡｒａｋａｗａ（１９９０）により記載されたようにＬ−１５培地（ライフ・テクノロジィズ）中に０．０５％のＤＮＡｓｅ １（シグマ）、０．１％のＢＳＡを含む氷冷溶液１ｍｌ中で生後６日のニワトリ胚の脊髄を解離させて調製した。細胞をＬ−１５中の６．８％のメトリザミド（フルカ）２ｍｌに上層し、５００ｘｇ、４℃で１５分間遠心分離した。メトリザミド／培地界面から回収した細胞をＬ−１５ ５ｍｌ中で希釈し、ＢＳＡ（Ｌ−１５中４％のＢＳＡ）の４ｍｌのクッションの上に乗せ、３００ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離した。ペレットを１％のＮ２補充物（ギブコ）及び１５μｇ／ｍｌのニワトリ筋肉抽出物（３．５ｍｇ／ｍｌ）を補充した完全培地（Ｌ−１５中の２２ ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２２ ｍＭ グルコース、１％のペニシリン及びストレプトマイシン（ギブコ））０．５−１ｍｌ中に再度懸濁させた。３０，０００の細胞をＢＳＡにカップリングさせたペプチドの存在下又は不在下でポリ−オルニチン／コラーゲン被覆カバースリップにプレーティングし、保湿されたチャンバー中で３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートした。神経突起の長さ及び数を測定し、その他の細胞と接触しておらず、２４時間培養後の細胞体の直径と同じ長さである少なくとも一工程離れた、単離された神経細胞についてカウントした。
【０１５１】
背根神経節神経細胞の調製及び培養
運動神経細胞を用いた実験と同じようにカバースリップを調製した。背根神経節神経細胞を胚の１１日のニワトリ卵から単離した。神経節を消化溶液（ＨＢＳＳ培地中０．０５％のトリプシン、０．０１％のＤＮＡｓｅ １）１ｍｌに移し、２−５分毎に再度懸濁しながら３７℃で１５分間インキュベートした。次いで神経節を氷冷解離溶液（Ｌ１５培地中０．０５％のＤＮＡｓｅ １、０．１％のＢＳＡ）１ｍｌ中で解離し、１５ｍｌのファルコンチューブ中の４％のＢＳＡクッション３ｍｌの上に装荷し、４℃で６００ｘｇで２０分間遠心分離した。細胞を先の節中に記載された完全培地０．５ｍｌ中で再度懸濁させた。２０，０００の細胞を一つのカバースリップを含むウェルに添加し、保湿されたチャンバー中で３７℃にて５％のＣＯ２で１８時間増殖させた。神経突起外殖の固定及び分析を先の節に記載されたようにして行なった。
【０１５２】
免疫組織学及び免疫細胞学
免疫組織学
生後４ヶ月のマウスからの大腿神経の凍結切片を使用してペプチド−ＢＳＡ複合体の結合を調べた。内因性ペルオキシダーゼ活性を低下させるために、切片を１時間にわたってＰＢＳ中の１％のＨ２Ｏ２、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及び１０％のヤギ血清で処理した。次いで切片を一晩４℃にてペプチド−ＢＳＡ複合体又はＢＳＡ（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ、１５０μｌ／カバースリップ）とともにインキュベーションし、次いでＰＢＳ−０．０１％トゥイーン２０で４回洗浄した。検出のために、抗ＢＳＡ抗体（シグマ、１：１６希釈、１５０μｌ／カバースリップ）を添加し、４℃にて一晩インキュベーションした。ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ血清を１時間にわたって１５０μｌ／カバースリップの容積で添加した（１：２０００）。０．１％のＨ２Ｏ２を含む、０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ４．８中のＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド中の９−アミノ−３−エチルカルバゾール（ＡＥＣ、フルカ）の４ｍｇ／ｍｌ原液の５％の希釈液を使用して着色反応を発生させた。Ｌ２−４１２抗体及びＨＲＰ結合ヤギ抗ラット抗体を陽性対照に使用した。ビオチン化ＢＳＡ−ペプチドコンジュゲートを使用して同様の実験を行なった。５０μｇ／ｍｌの濃度を一晩のインキュベーションに使用し、ＨＲＰ結合ストレプトアビジン（１：２０００）を１時間添加した。着色反応を上記のようにして発生させた。
【０１５３】
免疫細胞学
カバースリップをポリオルニチン（１．５μｇ／ｍｌ）、次いでコラーゲン（２０μｇ／ｍｌ）で被覆し、４０，０００の細胞を上記のようにして５％のＣＯ２の下で３７℃で４０時間増殖させた。次いで固定カバースリップを２時間にわたってＰＢＳ中５％の無脂肪乾燥ミルク中でブロックした。ＰＢＳ−０．０５％トゥイーン２０で徹底的に洗浄した後、ビオチン化ＢＳＡ−ペプチドコンジュゲートを４時間にわたって５０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。別の６回の洗浄工程後に、１時間にわたってＨＲＰ結合ストレプトアビジン、１：５００を使用して検出を行なった。色検出は免疫組織学について上記されたとおりにした。固定神経細胞を４０倍の倍率で写真撮影した。アドビ フォトショップを使用して、現れた画像をエンハストカラーレンダリング処理した。
以下はこの実施例で言及された文献のアルファベット順のリストである。
【０１５４】
2004516807.tif 000015
【０１５５】
実施例３
オリゴデンドロサイトに反応性のヒトモノクローナル抗体は多発性硬化症モデルにおいて髄鞘再形成を促進する
髄鞘脱落疾患に有効な治療の主要な目標である、髄鞘再形成を促進することは、脆弱な軸索を保護し、伝導速度を増大し、かつ神経欠陥を改善する可能性を有する。髄鞘再形成を促進する戦略は、オリゴデンドロサイト（ＯＬ）を移植すること、又は内因性髄鞘形成細胞を栄養因子で救済することに集中していた。種々の神経疾患及び自己免疫疾患を治療するのに常套的に使用される、免疫グロブリン（Ｉｇ）をベースとする治療は、髄鞘再形成を増進する本発明者らのアプローチの根底にある。本発明者らは多発性硬化症（ＭＳ）のウイルス媒介モデルにおいて有意な髄鞘再形成を促進する、ＯＬ表面抗原に対し誘導される２種のヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を単離した。４種の更なるＯＬ結合ヒトｍＡｂは髄鞘再形成を促進しなかった。どちらのヒトｍＡｂも、ＭＳに効力を有することが示された治療であるヒト静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）と同じくらい有効であり、ヒトＯＬの表面に結合し、髄鞘形成を担う細胞に対するｍＡｂの直接効果を示唆した。また、ヒトｍＡｂを中枢神経系（ＣＮＳ）病変の領域にターゲッティングすることはミエリンデブリのオプソニン作用を促進して修復を進行し得る。ヒトｍＡｂを単クローン性免疫グロブリン異常症の様相を有する個体の血清から単離した。これらの個体は障害を生じることなく血液中に高レベルのモノクローナルタンパク質を有し、治療としてのこれらのｍＡｂ投与が安全であるという考えに支持を与える。本発明者らの結果は１）ヒトの正常なＩｇレパートリーの一部であるＣＮＳ反応性ｍＡｂが病原性免疫障害からＣＮＳを修復し、保護することを助けるかもしれないという仮説に一致し、２）更にＯＬに結合するＡｂは必然的に病原性であるという前提に異議を唱えるものである。
【０１５６】
序論
髄鞘再形成の増進及び軸索の障害からの保護はＭＳの如き炎症性髄鞘脱落ＣＮＳ障害の治療に重要な治療目標である。ＭＳプラーク中の髄鞘再形成は起こり得るが、たとえＯＬ前駆体が成人に存在するとしても（３，４）限定的なものである（１，２）。髄鞘再形成を促進するための幾つかの戦略が実験動物で試験されていた。髄鞘脱落した組織へのＯＬ（５）又はそれらの前駆体（６）の移植は新しいミエリンを生じる。移植されたＯＬ前駆体はまた成人ＣＮＳ中で髄鞘脱落した病変を髄鞘再形成することができ（７）、病変に接近して置かれた場合に損傷の領域に向かって移動する（８）。無傷の成人ＣＮＳ中の移植されたＯＬ前駆体の生存及びミエリン病変の領域を標的とするそれらの能力に関して未解決の問題が残っている（９）。しかしながら、ＣＮＳ病変が手術アプローチ可能であり、軸索が依然として無傷である場合、グリア細胞の移植は機能的性能を改善するのに実行できる治療であり得る（１０）。
成長因子又は栄養因子のｉｎ ｖｉｔｒｏ投与はＯＬ前駆体の拡張を誘導し（１１，１２）、又は成熟ＯＬが脱分化し、続いて髄鞘形成のプログラムを再開することを促進する（１３，１４）。損傷されたＣＮＳへの遺伝子操作された繊維芽細胞による栄養因子のｉｎ ｖｉｖｏ投与は軸索の新芽形成及びＯＬ増殖を促進する（１５）。ｉｎ ｖｉｖｏ栄養因子治療の障害として、具体的には生理学上妥当な局所因子濃度及び高濃度で投与される殆どの栄養因子の潜在的な多面作用の役割を測定することが残されている。
【０１５７】
別法として、本発明者らの研究所はＣＮＳ結合Ｉｇ（１６）を使用して、既に髄鞘脱落後にアップレギュレートされているかもしれない自然の回復応答をあてにすることによりＣＮＳ病変を修復し、内因性髄鞘再形成を促進することを提案する。Ｉｇ治療はヒト髄鞘脱落疾患の治療として迅速に採用され、試験し得る（１７，１８）。本発明者らのアプローチの前提は髄鞘再形成することができる細胞及びそれらの成長及び分化に必要な因子が髄鞘脱落されたＣＮＳ中に存在することであるが、ミエリンを生じるそれらの能力は限定的なものである。ＭＳ集団（１９）内に現れる病変の不均一性及びＯＬ節約 （ｓｐａｒｉｎｇ）は、実際に、ヒト髄鞘脱落疾患の治療が個体の要求に基づいた幾つかの治療アプローチの組み合わせを必要とするかもしれないことを示唆する。
【０１５８】
本発明者らはＩｇをベースとする治療を開発するために髄鞘脱落のウイルス媒介モデルを使用した。マウス脳脊髄炎サイラーウイルス（ＴＭＥＶ）がマウスの感受性系統に脳内接種された場合、ＴＭＥＶはＭＳと臨床上かつ病理学上同様の免疫媒介進行性ＣＮＳ髄鞘脱落を誘導する（２０）。ヒトＭＳの治療の効力はＴＭＥＶモデル（２１）で観察されたものと密接に対応するので、このモデルは臨床試験の設計に重要なプラットフォームになる。ＳＣＨ９４．０３と称される、脊髄ホモジネートに対し産生されたマウスｍＡｂは、ＴＭＥＶモデルにおいて髄鞘再形成を増進する（２２）。ＳＣＨ９４．０３はＯＬの表面に結合する多反応性の、マウスＩｇＭｋ ｍＡｂである（２３）。また、ＳＣＨ９４．０３はリゾレシチン誘導髄鞘脱落後に自発ＣＮＳ髄鞘再形成の速度を増進し（２４）、実験自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）で再発を減少させる（２５）。更なるＯＬ結合マウスＩｇＭｋ ｍＡｂ（これらの幾つかはＯＬ系列の通常のマーカーである）もまたＣＮＳ髄鞘再形成を促進する（２６）。
マウスＩｇＭ ｍＡｂが髄鞘再形成を促進するので、本発明者らはポリクローナルヒトＩｇＭが、免疫媒介障害の証明された治療であるＩＶＩｇ（２７）よりも髄鞘脱落疾患の有効な治療であると仮定した。ポリクローナルヒトＩｇＭによるＴＭＥＶ慢性感染マウスの治療はＩＶＩｇと比較した場合に、増進された髄鞘再形成をもたらした。抗原非依存性戦略を使用して、２種のヒトＩｇＭ ｍＡｂも明らかにされ、これらはポリクローナルヒトＩｇＭよりも同等又は大きく髄鞘再形成を促進する。本発明者らはヒト髄鞘再形成促進ｍＡｂが、ヒト髄鞘脱落疾患に容易に実施できる、有効な治療であり得ることを示唆する。ヒトｍＡｂは臨床試験に直ぐに適用可能であり、感染性物質を含まないで生成でき、ＩＶＩｇの国内の不足を解し、高コストを軽減し得る。髄鞘再形成を促進する有効なヒトｍＡｂはまた免疫調節治療の作用メカニズムの研究を簡素化し得る。
【０１５９】
物質及び方法
ヒト抗体及びそれらの単離
２５００を越える健康なドナーのプールされた血漿から精製された正常なヒトＩｇＭをＳ．Ｖ． Ｋａｖｅｒｉ （２８）から得た。ＩｇＭの純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる確認では９０％より大きかった。臨床上ＩＶＩｇと称される健康なドナーからプールされたヒトＩｇＧはマイルズ社（エルクハート、ＩＮ）からのものである。
ヒト血清サンプルをＭａｙｏ ＣｌｉｎｉｃのＲｏｂｅｒｔ Ａ． Ｋｙｌｅ博士の指示のもとにディスプロテイン血症診療所から得、単に２０ｍｇ／ｍｌより大きいＩｇクローナルピークが存在することにより選抜した。血清はワルデンストロームマクログロブリン血症、多発性ミエローマ、リンパ腫、及び測定されていない有意のモノクローナルガンモパシーを含む、血清中のモノクローナルＩｇＧ又はＩｇＭスパイクを特徴とする多種の疾病状態を有する１０２の患者からのものであった。血清を水に対して透析し、沈殿を遠心分離（１４，０００ｒｐｍ／３０分）により集め、ＰＢＳに溶解した。溶液を遠心分離し、スペロース−６カラム（ファーマシア、アップサラ、スウェーデン）でクロマトグラフィーにかけた。ＩｇＭフラクションをプールし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。濃度をシプロ・オレンジ（モレキュラー・プローブス、オイゲン、ＯＲ）デンシトメトリーによるゲル染色により測定した。ＩｇＭ溶液を無菌濾過し、低温保存した。
【０１６０】
ＯＬ細胞培養及び免疫細胞化学
Ｐ０−Ｐ２ホルツマンＳＤラットからの脳半球を記載されたようにして（２９）混合一次グリア細胞培養のために調製し、９日にわたってｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた。ラットＯＬ前駆体を記載されたようにして単離した（３０）。難治性癲癇のための治療切除を受ける患者から得られた一時的葉バイオプシーから成人ヒトＯＬを調製した。組織は外科病理学当局により調べられた時には癲癇病巣を含まず、正常な細胞構造のものであった。成人グリア細胞を記載されたようにして単離し（３１）、ビオチン（０．０１ｍｇ／ｍｌ）、トリ−ヨードチロニン（１５ｎＭ）、０．５％のＢＳＡ（全てシグマから）、Ｎ２、１％のｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（両方ともライフ・テクノロジィズから）及び組換えヒトＰＤＧＦ ＡＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ＭＮ）で補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２の特定培地中でポリ−オルニチン（シグマ）及びラミニン（ライフ・テクノロジィズ）被覆プラスチック・マルチウェル（ベクトン・ディケンソン）又はガラスカバースリップ（フィッシャー・サイエンティフィック）に播いた。細胞表面染色を５％のＢＳＡを含むＨＥＰＥＳ−緩衝ＥＢＳＳ（Ｅ／Ｈ）でブロックした後に未固定細胞について４℃で１２分間行なった。全てのヒトＡｂは１０ｍｇ／ｍｌで使用した。ポリクローナルマウス抗血清（ベーリンガー・マンハイム）を使用して、ミエリン塩基性タンパク質についての細胞内染色を４％のパラホルムアルデヒドによる固定及び０．０５％のサポニンによる５分間の透過後に室温で行なった。蛍光結合二次抗体Ａｂ（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリィズ、ウェスト・グルーブ、ＰＡ）を使用して一次Ａｂを検出した。細胞単層を退色を防止するための２．５％の１，４−ジアザビシクロ〔２．２．２〕オクタン（３７）及び０．１μｇ／ｍｌのビスベンゾイミド（両方ともシグマから）を含む９０％グリセリン／ＰＢＳに載せ、ＳＰＯＴデジタルカメラ（ダイアグノスチック・インストルメンツ社、スターリング・ハイツ、ＭＩ）を備えたオリンパス・プロビスエピ蛍光顕微鏡で見た。
【０１６１】
ウイルス及び動物
ＴＭＥＶのダニエル株をこれらの実験に使用し、記載されたようにして調製した（３２）。ジャクソン・ラボラトリィズからの雌のＳＪＬ／Ｊマウスを１週間の順化後に使用した。４−６週齢のマウスに、容積１０ｍｌ中のＴＭＥＶの２ｘ１０５プラーク形成単位を脳内注射し、９８％を越える慢性ウイルス感染発生率をもたらした。この研究に使用した動物は感染後５〜８ヶ月のものであり、Ｉｇ又はＰＢＳの単一腹腔内注射をした動物である。用量は１．０ｍｇのＩＶＩｇ又はヒトポリクローナルＩｇＭ或いは０．５ｍｇのヒトｍＡｂとした。動物を形態評価のためにＡｂ治療の５週後に殺した；これを選択したのは、髄鞘脱落の毒性モデルの研究により、ＣＮＳ髄鞘再形成がこの時点までに殆ど完全であることが示されているからである（３３）。プラスチックに埋め込んだ脊髄切片は集中顕微鏡施設により切断され、数字コードでマークして研究所に戻された。この方法では、スライドは盲検様式で髄鞘再形成について等級が付けられる。
【０１６２】
ウェスタン・ブロッティング
精製ＴＭＥＶ（３４）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、タンパク質をニトロセルロースに移した。５％の無脂肪乾燥ミルク及び０．０５％トゥイーン２０を含むトリス緩衝生理食塩水で室温で２時間にわたってブロックした後、膜を４時間にわたってヒトＩｇ（１０μｇ／ｍｌ）又はウサギポリクローナル抗ＴＭＥＶ Ａｂ （１：２０００）とともにインキュベートした。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート及びニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ＫＰＬ、ガイザーズブルグ、ＭＤ）を使用して、結合したＩｇをビオチン化ヤギ抗ヒトｍＡｂ又はビオチン化ヤギ抗ウサギｍＡｂ（両方ともジャクソン・イムノリサーチから）及びアルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジンで検出した。
【０１６３】
脊髄髄鞘脱落／髄鞘再形成の定量
本発明者らは、ミエリンを視覚化するために、４％のパラフェニレンジアミン（ＰＰＤ）で染色されたプラスチックに埋め込まれた断片を使用して、感受性マウス中の脊髄髄鞘脱落、髄鞘再形成及び萎縮の量を定量する方法を開発した（３５、図２４Ａ）。全脊髄の代表的なサンプリングを得るために、厚さ１ｍｍの断片を２つおきの連続の１ｍｍブロックから切り出し、全脊髄に相当する１０〜１２の断片を作製した。ツァイス光学顕微鏡（カール・ツァイス社、ソーンウッド、ＮＹ）に取り付けられたツァイス相互作用デジタル分析系（ＺＩＤＡＳ）及びカメラルシダを使用して、夫々の断片から、白質、白質病変、ＯＬ髄鞘再形成、及びシュワン細胞（ＳＣ）髄鞘再形成の面積を計算した。４０倍の倍率で白質の輪郭を描いた。白質病変の領域は髄鞘脱落又は髄鞘再形成を有する白質の領域として定義され、次にこの領域を１００倍の倍率でトレースした。白質病変領域はしばしばマクロファージ浸潤、炎症を含み、ＰＰＤ染色を殆ど又は全く含まなかった（図２５Ｃ、Ｄ、Ｈ）。髄鞘再形成を伴う、又は伴わない一次髄鞘脱落を含む病変の面積の合計を全髄鞘脱落の目安として測定した。
【０１６４】
髄鞘再形成、ＯＬ又はＳＣの領域を２５０倍の倍率でトレースした。ＯＬは多重軸索繊維を髄鞘再形成することができ、従って、ＯＬ髄鞘再形成は残った正常に髄鞘形成された軸索と較べて稠密に充填された、しかし薄い髄鞘をもたらす。ＳＣは単一軸索繊維のみを髄鞘再形成することができ、ＯＬ髄鞘再形成と較べて一層厚い髄鞘を生じさせ、かつ軸索繊維間の増大されたスペースをもたらす。ＳＣ体及び核はそれらが髄鞘再形成した軸索に隣接して観察し得る。マウス当り１０〜１２の脊髄切片の夫々からトレースされた全ての面積を合計することにより、全面積を夫々のマウスについて計算した。
白質病変の全面積をサンプリングされた白質の全面積で割ることによりマウス当りの脊髄白質病変の面積％を得た。ＯＬ又はＳＣ髄鞘再形成の面積を白質病変の全面積で割ることによりマウス当りの髄鞘再形成の面積％を得た。白質病変及び広範なミエリン修復を繰り返して測定し、１．５％しか相違しない、同等な値が明らかにされた。脊髄中の髄鞘再形成の代表として１０の断片を使用することの正当性を決定するために、単一の慢性感染マウスの１０の断片対３２全部の断片を使用して比較を行なった。１０の断片のアッセイは４７．７％という髄鞘再形成面積％値を生じ、一方、全３２の断片からのデータは４０．０％という値を生じた。いずれの値も本発明者らのアッセイで有意な髄鞘再形成を示したであろう。
【０１６５】
結果
ヒトＩＶＩｇ及びポリクローナルヒトＩｇＭはＴＭＥＶ感染マウスでＣＮＳ髄鞘再形成を促進する
ＭＳの臨床研究はＩＶＩｇが疾患進行を安定化するのに部分的に有効であり得ることを示す（１８，３６，３７）。ヒトＩＶＩｇがＭＳのＴＭＥＶモデルにおいて髄鞘再形成を促進し得るかどうかを測定するために、慢性感染マウスを１ｍｇのＩＶＩｇの単一回腹腔内注射で処置した。外来Ｉｇに対する免疫応答を誘発することを避けるため単一用量を投与した。ヒトＩｇの合計用量はヒトＩＶＩｇ治療（１８）に使用された合計用量の１／４である体重１ｋｇ当り約０．０５ｇであった。追加のマウスをポリクローナルヒトＩｇＭの単一の１ｍｇのボーラスで処置した。脊髄を試験したところ、ＩＶＩｇ又はポリクローナルヒトＩｇＭを与えたマウスのＯＬ髄鞘再形成の面積％（表４、夫々１４．１５％及び２３．１９％）はＰＢＳ治療グループで観察された自発ＯＬ髄鞘再形成よりも有意に高かった（６．７４％、ＩｇＧについてｐ＜０．０５、ＩｇＭについてｐ＜０．０１）。処置グループ又はＰＢＳ対照グループ間の白質の面積或いは白質病変の面積に統計上の有意差はなかった。データは、ＩＶＩｇで処置したマウス７匹及び９匹のグループ、及び、ポリクローナルヒトＩｇＭで処置したマウスの７匹及び１０匹のグループの二つの独立の実験を記載したものである。表４中の最終値は、少なくとも５％の白質病変を有するこれらの動物のみを含む。
【０１６６】
【表８】
2004516807.tif 000016
【０１６７】
値は平均±ＳＥＭを表す。一方向ＡＮＯＶＡ及びｔ−検定を使用してＰＢＳで処置したマウスに対するヒト抗体で処置されたマウスのＣＮＳ型髄鞘再形成の面積％を比較した。このような分析により、＊Ｐ＜０．０５；†Ｐ＜０．０１、‡Ｐ＜０．００１であることが明らかされた。その他の処置方法で処置されたマウスの比較はポリクローナルヒトＩｇＭ ｐ＝０．０５、ｓＨＩｇｍ ４６ Ｐ＜０．０５を明らかにした。全てのその他の比較は統計上有意ではなかった。ポリクローナルヒトＩｇＭ、ｓＨＩｇＭ ２２及びｓＨＩｇＭ ４６の間にＣＮＳ型髄鞘再形成に関する相違はなかった。末梢神経型ＳＣ髄鞘再形成の面積は０〜０．０８ｍｍ２の範囲であった。これはミエリン病変の関数として末梢神経系型ＳＣ髄鞘再形成の０．０〜６．９２面積％に相当する。種々の処置グループ、もしくはＰＢＳと比較して、又はその他の末梢神経系型ＳＣ髄鞘再形成において、グループ間におけるミエリン病変の面積に統計上の差がなかった。
ポリクローナルヒトＩｇＭによる処置はＩＶＩｇで処置されたマウスで観察されたものよりも多いＯＬ髄鞘再形成をもたらした（ｐ＝０．０５、図２５Ａ、Ｂ）。ミエリン病変の全面積の約１／４がポリクローナルヒトＩｇＭで処置されたマウスで髄鞘再形成され、これは数千の髄鞘形成された軸索に相当した。平均で、病変の集密に髄鞘再形成された面積内の１ｍｍ２は４６，０００〜１２５，０００の髄鞘再形成された軸索に相当した。それ故、ヒトＩｇ処置後のＣＮＳ髄鞘再形成は広範なものであった。炎症性細胞又はマクロファージはほとんど存在しなかった。対照的に、ＰＢＳで処置したマウスでは、ミエリン病変の領域は髄鞘再形成された軸索をほとんど含んでいなかった（図２５Ｈ）。活性ミエリン破壊の兆候、例えば、ミエリン旋回（ｗｈｉｒｌ）、炎症性細胞及びマクロファージが存在した。
【０１６８】
髄鞘再形成を促進するための治療の有効性を判断するための更なる一層速い方法として、動物の代表的な１０の脊髄切片について、ほぼ完全な修復を示す白質病変の領域が存在するかを試験した。本発明者らは、自発髄鞘再形成における非常に稀な事象である、ほぼ集密の髄鞘再形成された軸索を含み、炎症性細胞又はマクロファージが存在しない白質病変の領域として完全修復を定義した（図２５Ｂ、Ｆ、Ｇのように）。完全修復の少なくとも一つの領域がＩＶＩｇで処置した１０匹の動物のうちの４匹及びポリクローナルヒトＩｇＭで処置した１４匹の動物のうちの１０匹で観察された。本発明者らは、ＩＶＩｇ及びポリクローナルヒトＩｇＭのどちらもＰＢＳ処置と較べて髄鞘再形成を促進し、またポリクローナルヒトＩｇＭはＣＮＳ髄鞘再形成を促進する能力においてＩＶＩｇより優れていると結論した。
ＯＬに結合するヒトｍＡｂはＴＭＥＶ感染マウスでＣＮＳ髄鞘再形成を促進する。ＣＮＳ髄鞘再形成を促進するこれまでに同定されたマウスｍＡｂの全てがＯＬに結合する（２３，２６）。ＴＭＥＶモデルにおいて試験するためのヒトｍＡｂをスクリーニングするために、ヒトｍＡｂを未固定混合一次グリア培養物中でラットＯＬの表面に結合する能力について試験した。新生仔ラット脳から樹立された一次培養物はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて９日間で分化の種々の段階のＯＬを含む（３８）。ヒトｍＡｂの本発明者らの供給源は血清由来ヒトモノクローナルＩｇＭ（ｓＨＩｇＭ）及び血清由来ヒトモノクローナルＩｇＧ（ｓＨＩｇＧ）であった。５０のｓＨＩｇＧのいずれもが未固定ラットＯＬに結合しなかったが、５２のｓＨＩｇＭのうちの６種が抗スルファチドｍＡｂ， Ｏ４（３９）で同時標識されるラットＯＬの表面に結合した。
【０１６９】
この６種のＯＬ結合ｓＨＩｇＭを使用してＴＭＥＶ感染マウスを処置した。５匹の動物からなるグループに０．５ｍｇのヒトｍＡｂの単一注射をした。ｓＨＩｇＭ２２及びｓＨＩｇＭ４６による処置後のＯＬ髄鞘再形成の平均面積％（図２５Ｆ、Ｇ）は両方とも自発髄鞘再形成に起因するバックグラウンドレベルより有意に上であった。その他の４種のＯＬ結合ｓＨＩｇＭはＰＢＳによる治療後に観察されたレベルと同等又はそれより下のレベルで髄鞘再形成を促進した。動物の第二組をｓＨＩｇＭ２２、ｓＨＩｇＭ４６又はＰＢＳで処置して初期の観察を確認した。ｓＨＩｇＭ１４はまたＯＬに結合するヒトｍＡｂの例として繰り返されるが、髄鞘再形成を促進しなかった。組み合わされたデータが表１に示される。少なくとも５％の合計の白質病変を含む動物のみが統計分析に入れられた。
ＯＬ髄鞘再形成の最高の面積％はｓＨＩｇＭ４６で治療された動物で観察され（２７．１％）、ｓＨＩｇＭ２２で治療された動物がそれに続く（１７．１％）。ｓＨＩｇＭ１４による治療後の髄鞘再形成の面積％（８．４１％）はＰＢＳによる処置後に観察された面積％（６．７４％）と同様であった。抗原特異性にかかわらず、どのｓＨＩｇＭも髄鞘再形成を促進し得るかを試験するために、本発明者らは混合一次培養物中でＯＬに免疫反応性を示さない２種のｍＡｂ、ｓＨＩｇＭ１及びｓＨＩｇＭ２をｉｎ ｖｉｖｏで研究した（図２５Ｃ、Ｄ）。ｓＨＩｇＭ１ （８．３％）、ｓＨＩｇＭ２ （１１．４％）による治療後の髄鞘再形成の面積％はｓＨＩｇＭ１４治療グループ又はＰＢＳ処置グループと有意に異ならなかった。全てのグループで、白質の面積及び白質病変の面積は統計上異ならなかった。ＰＢＳ処置グループで観察された髄鞘再形成と較べて、ｓＨＩｇＭ４６又はｓＨＩｇＭ２２による治療後の髄鞘再形成の面積％は夫々＜０．００１及び＜０．０５のｐ値を生じた。末梢神経系型ＳＣ髄鞘再形成の面積は治療グループ内で０から０．０８ｍｍ２までの範囲であった。これは白質病変の関数としてＳＣ髄鞘再形成の０．０から６．９２面積％までの値に相当した。治療グループ間でＳＣ髄鞘再形成の面積％に統計上の差がなかった。
【０１７０】
ヒトポリクローナル又はモノクローナル製剤による治療後に観察されたＯＬ髄鞘再形成の面積％の比較はｓＨＩｇＭ４６がＩＶＩｇよりも統計上優れているが（ｐ＜０．０５）、ポリクローナルヒトＩｇＭより優れていないことを明らかにした。ｓＨＩｇＭ２２による治療後に観察されたＯＬ髄鞘再形成の面積％はＩＶＩｇ、ポリクローナルヒトＩｇＭ又はｓＨＩｇＭ４６による治療後のそれとは異ならなかった。
完全修復した白質病変の面積について調べたところ、少なくとも一つの領域がｓＨＩｇＭ２２で治療された８匹の動物のうちの４匹及びｓＨＩｇＭ４６で治療された５匹の動物のうちの５匹で観察された。対照的に、ｓＨＩｇＭ１、ｓＨＩｇＭ２、ｓＨＩｇＭ１４又はＰＢＳで処置した動物のいずれもが完全修復の領域を一つも含んでいなかった。
【０１７１】
ポリクローナルヒトＩｇはラットヒトＯＬに結合するがヒトｍＡｂは結合しない
ヒトｍＡｂがヒトの髄鞘再形成を促進するのに潜在的な治療であるとすれば、ヒトＯＬの表面抗原に対する反応性はヒトＣＮＳ病変の領域にターゲッティングするのに重要であることが重要であることが分かるであろう。それ故、本発明者らはヒト髄鞘再形成促進ｍＡｂが成人の脳から得られたＯＬに結合し得るか否かを測定した。ヒトグリア細胞培養物を成人の一時的葉バイオプシーから樹立し、培養中の幾つかの時点でヒトｍＡｂで免疫標識した。
本発明者らの初期スクリーンでＯＬの表面に結合した６種のｓＨＩｇＭのうちの３種がヒトＯＬにも結合した。培養１週間で、形態的に未成熟のスルファチド陽性ヒトＯＬはｓＨＩｇＭ１４及びｓＨＩｇＭ４６で標識されたが、ｓＨＩｇＭ２２で標識されなかった。培養３週までに、形態的に複雑なスルファチド陽性ヒトＯＬはｓＨＩｇＭ１４、ｓＨＩｇＭ２２及びｓＨＩｇＭ４６で同時標識された（図２６Ａ、Ｂ、Ｃ）。培養４週までに、実質的に全てのＭＢＰ陽性ヒトＯＬがまたｓＨＩｇＭ２２及びｓＨＩｇＭ４６を結合したが、ｓＨＩｇＭ１４の結合は大いに減少された（データは示されていない）。
ＩＶＩｇ又はポリクローナルヒトＩｇＭのいずれも試験したいずれの時点でも培養中のヒトＯＬの表面に結合しなかった。しかしながら、ポリクローナルヒトＩｇＭはげっ歯類ＣＮＳの新しい未固定切片とともにインキュベートされた場合に白質道及び種々の神経細胞集団に強く結合した。ＩＶＩｇはこの結合アッセイで完全に陰性であった（データは示されていない）。ｓＨＩｇＭ２２及びｓＨＩｇＭ４６（これらの両方とも髄鞘再形成を促進する）、並びにｓＨＩｇＭ１４（これは髄鞘再形成を促進しない）も精製されたミエリン塩基性タンパク質陽性ラットＯＬの表面に結合した（データは示されていない）。
【０１７２】
本発明者らは、ＯＬ抗原に対するアフィニティーが必要であるかもしれないが、ヒトｍＡｂは髄鞘再形成を促進するのに充分ではないと結論した。有意な髄鞘再形成を促進する両方のヒトｍＡｂが成熟分化したヒトＯＬに結合するという事実はｉｎ ｖｉｖｏ機能のために生存する成人ＯＬに対し誘導されるｍＡｂの可能な要件を強調する。
ヒトＩｇ又はｍＡｂがウイルスを中和することにより髄鞘再形成を促進した可能性を排除するために、夫々の調製物をウェスタンブロッティング（３４）により精製ＴＭＥＶ抗原に対する反応性について試験した。ヒトＡｂ調製物のいずれもＴＭＥＶタンパク質と反応しなかった。しかしながら、ＴＭＥＶに対し産生されたウサギポリクローナルＩｇは４種のウイルスキャプシドタンパク質に強く反応した（データは示されていない）。
末梢Ｂ細胞を個体から得、これからｓＨＩｇＭ２２を同定した。ｓＨＩｇＭ２２の軽鎖及び重鎖可変ドメイン配列を決定した。ｓＨＩｇＭ２２軽鎖可変領域（ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＡＦ２１２９９２）はヒト軽鎖可変領域のλサブグループＩに属する。ｓＨＩｇＭ２２Ｈ鎖可変領域（ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＡＦ２１２９９３）はヒトＨ鎖可変領域のサブグループＩＩＩに属する。ｓＨＩｇＭ２２可変ドメインと最も密接な既知のヒト生殖系列可変ドメイン配列（４０）の間に有意な相違があった。
【０１７３】
考察
この一連の実験において、本発明者らはヒトＡｂがＣＮＳ髄鞘再形成を促進し得ることを実証した。更に広範な髄鞘再形成は、ヒトＩＶＩｇによる治療よりもポリクローナルヒトＩｇＭによる治療後にＴＭＥＶ感染マウスの脊髄で観察された。加えて、本発明者らは髄鞘再形成を一致して増進する２種のヒトモノクローナルＩｇＭを同定した。どちらのｍＡｂも、モノクローナルＩｇＭを含む血清を多量流出する成熟の最後の段階における単一Ｂ細胞の悪性のクローン性増殖を特徴とするリンパ腫のクラスであるワルデンストロームマクログロブリン血症（ＷＭ）（４１）を有する患者の血清から単離されたものである。高レベルのこれらのｍＡｂは有害ではないようである。ＷＭを有する患者において支配的ＩｇＭは健康な個体中に存在するＩｇＭレパートリーにより認識される抗原を正常に認識する（４２）。本発明者らがＯＬ抗原結合性の髄鞘再形成促進ｍＡｂをヒト集団から容易に同定し、単離することができたことは、これらのＡｂがＢ細胞レパートリーの中で一般的であり、ＣＮＳ損傷に応答する修飾因子として機能し得るという考えを支持するものである。
【０１７４】
髄鞘再形成促進ｍＡｂはＣＮＳ損傷に直面した場合に個体の血清中に産生し得る
ＩＶＩｇ及びポリクローナルヒトＩｇＭのどちらも髄鞘再形成を促進したが、どちらも培養中のラットＯＬ又はヒトＯＬに結合しなかった。対照的に、髄鞘再形成を促進するどちらのヒトｍＡｂもラット及びヒトの両方のＯＬ表面抗原に結合した。髄鞘再形成を促進するヒトｍＡｂの増大された効力は損傷の領域の成人ＯＬへの有効なターゲッティングのためであるかもしれない。ＳｔａｎｇｅｌはＩＶＩｇが培養中のＯＬ前駆体の分化、移動又は増殖に効果を有しないことを報告した。しかしながら、ＯＬ前駆体へのＩＶＩｇの結合は評価されなかった（４３）。ＯＬに対するＩＶＩｇのアフィニティーの欠如は、ＯＬ前駆体に対して認識できる作用を欠くことを説明するであろう。しかしながら、ＩＶＩｇがＯＬに結合しないという事実は、髄鞘再形成を促進する作用機序がヒトｍＡｂのそれと異なるかもしれないことを示す。
【０１７５】
この研究に使用したポリクローナルヒトＩｇＭのまさに同じ調製物が自己抗体を中和し（２８）、ＥＡＥ中のサイトカイン発現を変化させ（４４）、重症筋無力症のマウスモデルに有益であることが実証されていた（４５）。ポリクローナルヒトＩｇＭはげっ歯類の脳の未固定切片中で髄鞘形成された道に結合するが、ＩＶＩｇは結合しない。いずれのポリクローナル調製物も新しいヒト白質に結合しなかった。ポリクローナルヒトＩｇＭは全般の免疫調節、病原性抗体への結合及びミエリンデブリのオプソニン作用の組み合わせによりマウスの有意な髄鞘再形成を促進し得る。
Ｉｇによって髄鞘再形成が促進されるメカニズムは解明されるべく残っている。髄鞘再形成促進ｍＡｂの多くがＯＬ及び／又はミエリンに結合するので、認識された細胞に対する直接効果を仮定することは妥当である。培養中のＯＬに結合し、その生物学を変化するｍＡｂの例がある（４６−４８）。しかしながら、髄鞘再形成を促進するｍＡｂは種々の特異性を有するので（２３，２６）、夫々のｍＡｂが共通の抗原又は受容体により直接機能することはありそうにない。ＩｇＭのような多価分子は、通常は離れているシグナリング分子を原形質膜内部で接近させ、続いて活性化することができるであろう（４９）。髄鞘再形成促進ｍＡｂの殆どが脂質に結合するようなので（２６）、細胞表面へのこれらのＩｇＭの結合は原形質膜を再編し、シグナリング経路を促進することができるであろう。ＳＣＨ９４．０３が混合初代グリア培養物に添加される場合、トリチウム標識されたチミジンとり込みの２−３倍の増加が観察される（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ， 未公表の観察）。
【０１７６】
髄鞘再形成促進ｍＡｂが機能し得る別の潜在的なメカニズムはミエリンデブリ又は損傷されたＯＬへのターゲッティングによる。ＯＬ又はミエリンへの結合は損傷の領域からの細胞残渣の排除を増進し、自発ＣＮＳ修復の正常なプロセスが進行することを可能にし得る。おそらくポリクローナルヒトＩｇの作用のメカニズムは、主として、Ｂ細胞分化又はサイトカイン発現の変化及び抗イディオタイプのネットワークによる免疫調節によるものであり（２７，５０）、一方、ヒトｍＡｂの作用はＯＬ抗原及び／又はミエリンへの直接ターゲッティングによるものであろう。髄鞘再形成を促進するＡｂの能力を完全には予測する特徴はなかった。実際に、慢性ＴＭＥＶ感染マウスで試験した一種のヒトｍＡｂは髄鞘再形成を自発髄鞘再形成のレベルより下に抑制するようであり、或る種のＯＬ結合ヒトｍＡｂがｉｎ ｖｉｖｏで髄鞘再形成を抑制でき、又は髄鞘脱落を悪化し得ることを示唆する。これはＯＬ抗原（即ち、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、５１）に反応性の特異的ｍＡｂがＥＡＥで髄鞘脱落を増進するという観察（５２）と一致する。結局のところ、Ａｂの髄鞘再形成潜能力及び病原性の欠如の証明はｉｎ ｖｉｖｏ試験を必要とする。
【０１７７】
ヒトＩＶＩｇを用いる幾つかの二重盲検の偽薬対照試験がＭＳにおける若干の効力を示していた（１８，３６，３７）。ポリクローナルヒトＩｇＭ、ｓＨＩｇＭ２２及びｓＨＩｇＭ４６の全てだけでなくＩＶＩｇがＴＭＥＶにおけるＣＮＳ髄鞘再形成を増進し、これらのＡｂがＭＳに有効であり得ることを示唆した。ＯＬに結合するヒトｍＡｂは直接のＯＬ刺激という付加的な利益を有し得る。ヒトｍＡｂは病原体感染の可能性なしに産生でき、それらの有効性及び免疫原性を強化するように構造変化し得る。マウスｍＡｂ又は“ヒト化”マウスｍＡｂとは対照的に、ヒトｍＡｂは最小の免疫応答を生じるはずであり、ヒト臨床試験に容易に適用し得る。ヒトｍＡｂが慢性麻痺した動物で髄鞘再形成を促進したことを考慮すると、長年疾病に苦しんでいる患者について好結果を与える治療を開発し得るという希望が与えられる。
【０１７８】
参考文献
2004516807.tif 000017
【０１７９】
2004516807.tif 000018
【０１８０】
2004516807.tif 000019
【０１８１】
2004516807.tif 000020
【０１８２】
2004516807.tif 000021
【０１８３】
2004516807.tif 000022
【０１８４】
実施例４
先の実施例に記載されたように、本発明者らは髄鞘脱落疾患のサイラーウイルスモデルにおける髄鞘再形成と類似するパターンを誘導するヒトモノクローナル抗体を同定するために二つのアプローチを使用した。最初のアプローチはヒトＢ細胞をエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）で形質転換して免疫グロブリン分泌Ｂ細胞クローンを作製することであった。得られた細胞株をスクリーニングして高レベルで抗体を発現する培養物を同定し、および、産生された抗体のＣＮＳ抗原に結合する能力をスクリーニングした（特にオリゴデンドロサイトを結合したものが強調される）。第二のアプローチはモノクローナルガンモパシー、例えば、ＭＵＧＵＳ、リンパ腫、又はワルデンストローム症候群と診断された患者からの血清の同様のスクリーンＣＮＳ結合を行なうことであった。ＥＢＶ形質転換細胞の場合、細胞それら自体が臨床試験に充分な量のＧＭＰグレードの抗体を生じるための抗体の源を与え得る。加えて、どちらの供給源から同定された抗体も、注目の抗体をコードする合成抗体遺伝子を使用した人工抗体産生系において一層最適に産生し得る。本発明者らは、注目の抗体をコードする抗体発現カセットでトランスフェクトされたハイブリドーマ細胞株がｉｎ ｖｉｖｏ分析及び臨床試験に充分な抗体を与えると予見する。
【０１８５】
スクリーニング研究の過程で、髄鞘脱落疾患の本発明者らのｉｎ ｖｉｖｏサイラーウイルスモデルにおいて統計上有意な髄鞘再形成を誘導するヒトモノクローナルＩｇＭ抗体の組が同定された（表５）。これらの抗体の夫々がプロトタイプのマウスモノクローナル抗体ＳＣＨ９４．０３について初期に記載された髄鞘再形成応答を模倣した。これらのヒト抗体の中に、ＭＳＩ １９Ｄ１０及びＣＢ２ｂＧ８と称される、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系に由来する２種、並びに高レベルのモノクローナルＩｇＭを血清中で発現する５０人以上の患者からの抗体のパネルの中で同定された、ｓＨＩｇＭ ２２及びｓＨＩｇＭ ４６と称される、２種の抗体がある。
【０１８６】
【表９】
2004516807.tif 000023
動物は９ヶ月以上にわたってサイラーウイルスのＤＡ株で慢性感染させ、その後、患者血清（ｓＨＩｇＭ２２及びｓＨＩｇＭ ４６）又はＥＢＶ形質転換細胞系（ＭＳＩ １９Ｄ１０又はＣＢ２ｂ−Ｇ８）から単離されたＩｇＭ抗体０．５ｍｇの単一回ｉｐ注射による処置をした。５週間後に、マウスを固定液で潅流し、脊髄を組織分析のために単離した。髄鞘脱落及び髄鞘再形成の面積を顕微鏡により直接評価した。髄鞘再形成面積％を、式 ［髄鞘再形成された面積／髄鞘脱落した面積］ｘ１００ により測定した。抗体の代わりにＰＢＳ注射を与えた動物グループに対する統計上の比較により治療効果を評価した。
【０１８７】
ＥＢＶ形質転換体に由来する両方の抗体に関するＩｇＭ重鎖及び軽鎖の構造を、細胞から単離した免疫グロブリンｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡの分析により決定した。ＭＳＩ １９Ｄ１０及びｓＨＩｇＭ ２２の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列を夫々図１９及び２０（配列番号９及び１１）並びに図１７及び１８（配列番号１、４９、５及び５０）に示す。ＣＢ２ｂＧ８のＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域の配列を図２７及び２８（配列番号１３及び１５）に示す。配列自体は、それらが既知の生殖系列免疫グロブリン配列とは若干異なる以外は注目に値しない。従って、それらは未同定抗原に対する免疫応答過程中の体細胞多様化の産物であるかもしれない。これらの配列の価値は、それらが制御された条件下の免疫グロブリン生成のための発現ベクター構築のための青写真を与えることである。
【０１８８】
同様に、ＩｇＭを生じる患者の一人の血清からの重鎖及び軽鎖の構造をタンパク質配列分析、続いて患者から単離された末梢血単核細胞からのｃＤＮＡのクローニング及び配列分析により決定した。２種の密接に関連する重鎖及び軽鎖が患者の血清中に同定され、これをｓＨＩｇＭ２２と命名した（図１７及び１８）。この２種の重鎖及びＬ鎖は両方とも６０：４０の比で単離されたｃＤＮＡ集団中に存在した。両方の抗体は共通のμ−ＶＤＪ再配列及びλ−ＶＪ再配列を有し、それらが共通のＢ細胞前駆体に由来することを示す。それらは続いてそれらの可変領域の構造を変化させる突然変異の累積の結果として分岐した。本発明者らは両方の抗体とも患者の血清中で発現されていると結論する。なぜなら、どちらの抗体からのペプチドも血清から単離されたタンパク質から特性決定されたからである。しかしながら、可変鎖及び軽鎖の二つの明確な組み合わせが直接観察されず、同定された重鎖及び軽鎖のその他の組み合わせが実際に存在し得るという可能性が残っている。観察されたアミノ酸置換の位置に基づいて、本発明者らはこれらの抗体が非常に類似した反応性パターンを有することを推測する。
【０１８９】
実施例５
細胞培養における抗体遺伝子の発現のためのトランスフェクション系の開発
ヒト抗体からの高力価抗体の継続的な供給を行うために、本発明者らはトランスフェクションをベースとする発現系を開発した。内因性免疫グロブリンｍＲＮＡ生成の欠如について選択されたハイブリドーマ細胞を組換え抗体遺伝子でトランスフェクションして注目する抗体を発現する細胞を作製することができる。
本発明者らは細胞培養物中でクローン化抗体遺伝子を発現するためにゲノム及びｃＤＮＡをベースとする一連のベクター系の使用を検討した。本発明者らはゲノム遺伝子又はｃＤＮＡをベースとする遺伝子を使用して軽鎖タンパク質を成功裡に発現させた。本発明者らはゲノムをベースとする重鎖ベクターＰＡＧ４０２６（ＵＣＬＡのＳｈｅｒｉｅ Ｍｏｒｉｓｏｎ博士により親切に提供された）を使用してＨ鎖発現を得た。しかしながら、このベクター系による抗体の収量は実用的なｉｎ ｖｉｖｏ使用にはあまりにも低い。本発明者らの焦点は、高力価抗体を産生するトランスフェクトされたハイブリドーマクローンを日常的に生じさせる新規ベクターを開発することであった。本発明者らの現在の戦略は、良く機能することが本発明者らの手によって個々に示された構成部分からベクターを構築することである。
【０１９０】
本発明者らは、ｄＨｆＲ及びＣＭＶプロモーター制御下で免疫グロブリン軽鎖ｃＤＮＡを発現するベクターが軽鎖を発現すること、及びこの発現がメトトレキセート濃度を増加させつつトランスフェクションした免疫グロブリン生産細胞を増殖させることにより増幅し得ることを示した（図２９）。次いで本発明者らは、免疫グロブリン軽鎖及びｄＨｆＲを発現する、この機能性単位を相補μ鎖をコードするゲノム重鎖遺伝子を発現するベクターにクローン化する。本発明者らがこの方針に沿ってつくった最初のベクターはマウス／ヒトキメラ９４．０３をコードし、図３０の上部パネルに示される。このベクターを抗体陰性ハイブリドーマ細胞に導入し、少量の機能性抗体を発現するクローンが単離された。抗体は天然マウス抗体９４．０３と同じ様式でＣＮＳ組織を染色する（図３１）。これらの抗体産生細胞は、産生される量の抗体を拡張させるために、メトトレキセートを増加させることによる選択を受ける。ヒト血清ｓＨＩｇＭ ２２中で２種の重鎖及び２種の軽鎖が同定されたので、重鎖及び軽鎖の全ての４つの順列を評価する必要がある。本発明者らの配列研究により同定されたｓＨＩｇＭ ２２の４つの可能な組み合わせのうちの三つを発現するベクターを調製し、今、免疫グロブリン陰性ハイブリドーマ細胞に導入されている。プロトタイプベクターを図３０の下部パネルに示す。
【０１９１】
方法
マウス／ヒトキメラ９４．０３（Ｍ１）及びｓＨＩｇＭ−２２抗体を発現するための発現ベクターの構築
マウス／ヒトキメラ９４．０３のための発現系の構築
構築されたベクターは二つの単位からなる。最初の単位はゲノムＤＮＡ由来免疫グロブリン遺伝子によりコードされる免疫グロブリンの重鎖をコードする。ベクターは一部ＵＣＬＡからＳｈｅｒｒｉｅ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ博士の研究室から得られた骨格ベクター（ＰＡＧ４０２６）の誘導体である。ＰＡＧ４０２６ベクターは無関係の可変領域を発現するＩｇＭ重鎖をコードする。注目する可変領域の置換に利用できる便利なクローニング部位がなかった。それ故、本発明者らは無関係の重鎖配列を欠失させ、固有の制限部位（５’末端にＲｓｒ ＩＩ及び３’末端にＰａｃ Ｉ）でその可変領域を挟む領域を再構築することにより部位を操作した。ＰＡＧベクターの配列は知られていなかったので、本発明者らは、哺乳類ＤＮＡ中には滅多に存在しない配列を認識する酵素を使用してどの制限酵素部位が唯一であるのかを試行錯誤により決定した。
【０１９２】
マウスＩｇＭモノクローナル抗体９４．０３のＨ鎖可変領域を、ＲｓｒＩＩプライマー
ＡＣＴＣＣＣＡＡＧＴＣＧＧＣＴＣＧＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＡＧＴＧＡＣＡＡＡＣＡＣＡＧＡＣＡＴＡＧＡＡＣＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＴＣＡＣＴ（配列番号３９）
を使用してＲｓｒＩＩ部位をリーダー配列の上流に導入し、ＰａｃＩプライマー
ＡＣＴＧＡＣＴＣＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＣＴＣＡＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＧＴＧＧＴ（配列番号４０）
を使用してＰａｃＩ部位を導入するとともに正確なスプライス結合を可変領域コーディングブロックの３’末端で維持して、ＰＣＲによりｃＤＮＡから単離した。
発現ベクターの第二部分は複数のプラスミドに由来する。最終構築物は両末端にＥａｇＩ、ＳＶ４０プロモーターの調節制御下のＤＨＦＲ（ジヒドロホレート還元酵素）コーディング配列及びＣＭＶプロモーターの調節制御下のキメラマウス／ヒトκＬ鎖ｃＤＮＡコーディングブロックを含む。ベクターのこの部分は、適当なクローニング部位、プロモーター領域、ポリアデニル化シグナル、及びＤＨＦＲコーディングブロックを提供する３種のプラスミド（ｐＣＩｎｅｏ（プロメガ・コーポレーション）、ｐＵＣ１８（ニュー・イングランド・バイオラブズ）、及びｐＦＲ４００（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ及びＬｅｖｉｎｓｏｎ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０：２４９５： １９８３）から開始して段階的に構築した。合成リンカー領域の導入及び望ましくない制限エンドヌクレアーゼ認識部位の欠失を含む一連の修飾後に、メトトレキセート選択可能な軽鎖カセットをアセンブルした。このカセットは軽鎖遺伝子のｃＤＮＡコーディングブロックに隣接する固有の制限エンドヌクレアーゼ部位（Ｎｈｅ Ｉ及びＸｈｏ Ｉ）を含む。
【０１９３】
キメラ軽鎖遺伝子を２種のｃＤＮＡ配列からオーバーラップ伸長技術（Ｈｏｒｔｏｎら， Ｇｅｎｅ ７７：６１： １９８９）によりＰＣＲスプライシングを使用して構築した。キメラｃＤＮＡの融合領域に隣接するプライマーはエンドヌクレアーゼＸｈｏ Ｉ及びＮｈｅ Ｉのための酵素認識配列を含んでいた。融合遺伝子産物を増幅するのに使用した５’プライマーは
ＴＴＧＧＣＧＣＧＣＣＡＡＡＧＡＣＴＣＡＧＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＡＴＧＴＣＣＴＣＴＧＣＴＣＡＧＴＴＣ（配列番号４１）であり、３’プライマーは
ＡＴＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＴＣＴＴＡＴＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧ（配列番号４２）であった。これらの部位を使用してｃＤＮＡコーディングブロックを軽鎖カセットベクターに挿入した。
アッセンブルされたならば、エンドヌクレアーゼＥａｇ Ｉを使用してカセットを切り出し、重鎖遺伝子を含むベクター中の唯一のＥａｇ Ｉ部位に挿入した。得られる構築物は“ヒト化”９４．０３のためのマウス／ヒトキメラ抗体の重鎖構成部分及び軽鎖構成部分の両方のためのコーディング配列を含む。重鎖はヒトＩｇＨプロモーターにより発現され、軽鎖はＣＭＶプロモーターにより発現される。ｄＨＦＲ遺伝子は増幅マーカーを与え、ＳＶ４０プロモーターにより発現される。これらの遺伝子の夫々は３’末端にポリアデニル化シグナルを含む。ベクターのその他の重要な特徴には、細菌の複製起点及びアンピシリンに対する耐性をコードする細菌中で発現された遺伝子が含まれる。重鎖可変鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをコードするブロックは、抗体産生細胞のｍＲＮＡから単離される新規な免疫グロブリン配列又は合成免疫グロブリン遺伝子の配列を置換するのに使用し得る固有の制限エンドヌクレアーゼ部位により隣接される。
【０１９４】
発現ベクター系へのｓＨＩｇＭ ２２配列の挿入
重鎖及び軽鎖それぞれのアミノ酸情報並びに定常領域の配列から推定される５’プライマーを使用して、末梢血ＲＮＡのＰＣＲ増幅によりｓＨＩｇＭ ２２の重鎖及び軽鎖をコードするｍＲＮＡのｃＤＮＡを調製した。重鎖可変領域コーディングブロック、リーダー配列並びに隣接ＲｓｒＩＩ部位及びＰａｃＩ部位と一緒のドナースプライシング結合部を、ＰＣＲを使用して５’領域
ＧＡＣＴＣＧＧＴＣＣＧＣＣＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＡＡＧＴＣＧＣＣＧＧＴＧＴＴＴＣＣＡＴＴＣＧＧＴＧＡＴＣＡＴＣＡＣＴＧＡＡＣＡＣＡＧＡＧＧＡＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＴＧＣＴＣＴＴＴＴＡＡＧＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧ（配列番号４３）及び３’配列
ＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＣＣＴＧＧＡＧＡＧＧＣＣＡＴＴＣＴＴＡＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣ（配列番号４４）を加えることにより構築した。得られたＤＮＡ分子をＲｓｒ ＩＩ及びＰａｃ Ｉで消化し、続いて発現ベクターにクローン化し、ベクター中の無関係の配列に代えて所望の可変領域配列を置換した。
【０１９５】
軽鎖配列を２工程でアッセンブルした。λ定常領域を、５’プライマー
ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＧＴＣＣＴＡＧＧＴＣＡＧＣＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣＣＣＣＣ（配列番号４５）及び３’プライマーＡＴＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＴＡＴＧＡＡＣＡＴＴＣＴＧＴＡＧＧ（配列番号４６）を使用してＲＴ−ＰＣＲによりｍＲＮＡから単離した。唯一のＡｖｒＩＩ部位及び３’Ｎｏｔ Ｉ部位を使用してこのフラグメントをｐＣＩｎｅｏベクターにクローン化した。
必要とされるＮｈｅ Ｉ部位及びリーダー配列をｃＤＮＡに導入するために５’プライマー
ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＣＧＡＡＴＴＴＣＧＧＧＡＣＡＡＴＣＴＴＣＡＴＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＴＣＣＣＣＴＣＴＣＣＴＣＣＴＣＡＣＣＣＴＴＣＴＣＡＴＴＣＡＣＴＧＣＡＣＡＧＧＧＴＣＣＴＧＧＧＣＣＣＡＧＴＣＴＧＴＧＴＴＧＡＣＧＣＡＧＣＣＧ（配列番号４７）を使用してｓＨＩｇＭ ２２の可変領域を生成した。３’プライマー
ＧＧＧＣＡＧＣＣＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＡＧＧＡＣＧＧＴＣＡＧＣ（配列番号４８）を使用してＡｖｒＩＩ部位を導入し、このフラグメントを定常領域片と結合できるようにした。得られたコーディングブロックは機能性リーダーシグナルを含み、ｄＨＦＲ／軽鎖カセットにクローニングするのに必要なＮｈｅＩ部位及びＸｈｏ Ｉ部位により隣接され、そのカセットを続いて重鎖プラスミドとアッセンブルして重鎖コーディング配列及び軽鎖コーディング配列の両方並びに哺乳類細胞中の発現に必要とされるプロモーターを含む最終生成物を作製した。
【０１９６】
実施例６
９４．０３ＩｇＧイソタイプ抗体
髄鞘再形成を誘導するマウス抗体９４．０３の能力におけるイソタイプの重要性を決定するための一つの戦略はＩｇＧイソタイプを有する９４．０３の可変領域を発現する組換え抗体を生成することである。別の戦略として、本発明者らは培養中に９４．０３産生細胞の集団内の天然イソタイプスイッチ変異体を同定しようと探求した。自発スイッチ変異体はこの型の培養物中に時折現れることが知られていた。細胞表面ＩｇＧについて染色された細胞の連続ＦＡＣＳ選別後に、本発明者らはＩｇＧ１イソタイプを有する９４．０３を分泌するクローナル細胞系を単離することができた（図３２）。これらの細胞により産生された抗体の構造をＥＬＩＳＡ、ＳＤＳゲルによる生成されたタンパク質の特性決定、及びｃＤＮＡクローニングにより確認した。図３３に概説された直接配列分析により本発明者らが９４．０３抗体のＩｇＧ１変異体を単離したことを示す明確なデータが得られた。
【０１９７】
実施例７
ＩｇＧ３イソタイプ抗オリゴデンドロサイトマウス抗体Ｏ９
マウスＯ９抗体は抗オリゴデンドロサイト抗体として単離され、ＩｇＧ３サブタイプのものである（Ｋｕｈｌｍａｎｎ−Ｋｒｉｅｇ， Ｓ．， Ｓａｍｍｅｒ， Ｉ．及びＳｈａｃｈｎｅｒ Ｍ． （１９８８） Ｄｅｖｅｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ３９：２６９−２８０）。Ｏ９抗体はＣＮＳ中の白質に強くかつ特異的に結合する。本発明者らはＴＭＥＶモデルで髄鞘再形成を刺激するＯ９抗体の能力を試験し、実証した（データは示されていない）。Ｏ９抗体重鎖可変領域配列が図３４（配列番号７）に示される。Ｏ９のκ軽鎖１可変領域の配列が図３５（配列番号１９）に示される。Ｏ９のκ軽鎖１可変領域の配列が図３６（配列番号２１）に示される。
【０１９８】
実施例８
ＩｇＭモノマーは髄鞘再形成を誘導する
髄鞘再形成の誘導に関するＩｇＭ抗体の構造上の特徴の重要性を把握するための別のアプローチは、抗体を生化学的に分別し、髄鞘再形成を誘導する抗体フラグメントの能力をｉｎ ｖｉｖｏで評価することである。一つの可能性は、同定された抗体がＣＮＳ構造に対する低いアフィニティーを有することであり、それ故、ＩｇＭのデカバレンシー（ｄｅｃａｖａｌｅｎｃｙ）が髄鞘再形成活性に重要であり得ることである。なぜなら、複数の結合部位は抗体がＣＮＳ中の標的構造と相互作用するのに充分な結合活性を与えるからである。この問題に取り組むために、本発明者らは５量体の免疫グロブリン分子を一緒に維持しているジスルフィド結合の還元によりＩｇＭモノマーを作製した。得られるモノマーは２価である。このモノマーはｉｎ ｖｉｔｒｏでオリゴデンドロサイトを結合することができず、無傷の未変性抗体で観察されたパターンで脳切片を染色しない。しかしながら、このモノマーの抗体はｉｎ ｖｉｖｏの髄鞘再形成を誘導する能力を保持する（表６）。これは本発明者らのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでは観察される染色が存在しないことに鑑みて驚くべき結果であった。一つの可能性は結合を監視するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイが髄鞘再形成に関するバイオアッセイと同じ位に良い感度ではないことである。結合と髄鞘再形成の誘導の間にこのような強い相関関係があるので、本発明者らは、モノマーとの結合を観察することはできなかったが、ＣＮＳ構造に対するこれらの抗体の特異性は重要であると考える。
【０１９９】
【表１０】
2004516807.tif 000024
ＩｇＭ抗体を温和な条件下で還元し、アルキル化した。この処理により抗体の５量体構造が破壊され、２価のモノマーをカラムクロマトグラフィーにより単離することが可能になった。慢性感染ＳＪＬ／Ｊマウスに５週の治療期間にわたって週に２回ｉｐ投与される合計０．５ｍｇの抗体を与えた。５週後に、動物を固定液で潅流し、それらの脊髄を組織分析のために除去した。表５に示されたように髄鞘再形成された病変の面積を合計の髄鞘脱落した面積と比較することにより髄鞘再形成％を顕微鏡で測定した。個々の治療グループを抗体に代えてＰＢＳ注射をした動物と比較した。
【０２００】
本発明者らは抗体の（Ｆａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、及びＦｖフラグメントを作製することにより抗体を更に分別した。サイラーウイルスで慢性感染されたＳＪＬマウスをこれらの抗体フラグメントで処置し、抗体のＦｃ部分を欠いている２価のフラグメントと単一抗原結合部位を主として含む１価の抗体フラグメントのどちらが髄鞘再形成を誘導し得るか否かを測定した。
ヒトモノクローナル抗体ｓＨＩｇＭ ２２を並行して分析し、ヒトＩｇＭの抗体フラグメントが同様の様式で挙動するか否かを測定する。単一の小さい結合ドメインが髄鞘再形成を誘導し得ることが測定される場合、この情報は修復のメカニズムを測定するのに重要と判明し得るだけでなく、薬理学的類似体の開発の手がかりを与えるであろう。
【０２０１】
実施例９
ｓＨＩｇＭ ４６抗体はミエリン修復を誘導する
本発明者らの初期の研究は、ｓＨＩｇＭ ４６によるミエリン修復の誘導がｓＨＩｇＭ ２２で観察された修復よりも定性的に優れているかもしれないことを示唆する。ＴＭＥＶで慢性感染されたＳＪＬマウスの切片の組織試験をすると、髄鞘脱落の一層小さい領域がその他のモノクローナル抗体によるよりもｓＨＩｇＭ ４６による治療後に観察された（表７）。この観察は高度に統計上有意であった。この結果は注目に値する。なぜなら、抗体による治療は髄鞘脱落した病変が良く樹立され、慢性感染した動物中で最大のサイズに達するまで始まらないからである。この結果の本発明者らの解釈は、ミエリン修復が脊髄の或る領域で完全であり、その結果、それらが本発明者らの通常の組織試験の際には脊髄の正常な領域と区別されないことである。ｓＨＩｇＭ ４６治療マウスの病変を電子顕微鏡により調べ、修復された病変がその他の治療グループよりも多数のミエリンラップを含むか否かを確かめる。
【０２０２】
【表１１】
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９ヶ月以上にわたってサイラーウイルスで慢性感染させたＳＪＬ／Ｊマウスをグループに分け、個々のグループにこの一群のモノクローナル抗体の一つを単一回０．５ｍｇ ｉｐ注射をした。５週後に、動物を固定液で潅流し、それらの脊髄を組織分析のために単離した。２５倍の光学レンズを使用して光学顕微鏡により視覚化された、白質により占有された脊髄の合計面積及び髄鞘脱落の面積を測定することにより、髄鞘脱落の面積を測定した。データは３回の独立実験からのマウスについてのものを含む。プールされた治療グループ動物を治療するのに使用された抗体（“全てのその他の抗体”）はヒトモノクローナルＩｇＭ ｓＨＩｇＭ １２、１４、２２、４７、５０、ＡＫＪＲ８、ＭＳＩ １０Ｅ１０、２Ｂ２ＧＥ７、ＮＡ８ＦＥ４、及びマウス抗体０６、０９、ＲＩＰ、及びＭＯＧであった。データ組は正規性試験に合格し、ＡＮＯＶＡにより分析した。
【０２０３】
実施例１０
ヒト抗体ＡＫＪＲ４、ＣＢ２ｉＥ１２及びＣＢ２ｉＥ７の重鎖及び軽鎖可変領域、並びにＭＳＩ１９Ｅ５の軽鎖可変領域の配列を決定した。ＡＫＪＲ４の重鎖及び軽鎖可変領域の配列を夫々図３７及び３８（配列番号２３及び２５）に示した。ＣＢ２ｉＥ１２の重鎖及び軽鎖可変領域の配列を夫々図３９及び４０（配列番号２７及び２９）に示した。ＣＢ２ｉＥ７の重鎖及び軽鎖可変領域の配列を夫々図４１及び４２（配列番号３１及び３３）に示した。ＭＳＩ１９Ｅ５の軽鎖可変領域の配列を図４３（配列番号３５）に示した。
【０２０４】
実施例のこの節に示されたリストされた文献の開示だけでなく、本明細書に引用されたその他の刊行物、特許開示又は文書は、引用として本明細書にそのまま含まれる。
本発明はその他の形態で具体化することもでき、本発明の精神もしくは必須の特徴から逸脱せずにその他の方法で行うこともできる。それ故、本開示はあらゆる意味で例示的であり、限定的ではないと考えるべきであり、本発明の範囲は特許請求の範囲により示され、均等物の意味及び範囲内に入る全ての変化はその中に含まれることが意図されている。当業者は本明細書に記載された本発明の具体的な実施態様の多くの均等物を認め、又は、日常的な実験以上のものを使用せずに確かめることができるであろう。そのような均等物は特許請求の範囲により含まれることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ポリクローナルヒト抗体及び血清由来ヒトモノクローナルＩｇＭ抗体（ｓＨＩｇＭ）が小脳の切片中の細胞の表面抗原に高い特異性で結合することを示す写真を含む。新生仔ラット小脳の未固定切片の間接の免疫蛍光標識。ｓＨＩｇＭは未固定脳切片内の細胞集団及び構造に種々の特異性を示す。この性質が髄鞘再形成を促進する能力についてｉｎ ｖｉｖｏ試験するための候補抗体を選択する基準の一つとして使用された（表１及び図１２を参照のこと）。ポリクローナルヒトＩｇＧは白質及びプルキニエ細胞を含む、小脳内の多くの構造に非常に弱く結合し（Ａ）、一方、ポリクローナルヒトＩｇＭは葉の中枢の白質内のミエリン及び推定のオリゴデンドロサイト、プルキニエ細胞体並びに顆粒層及び分子層内の多くの小さい細胞に強く結合する（Ｂ）。ｓＨＩｇＭ ２２ （Ｃ）は葉の中枢の白質の上にある損傷された星状細胞、プルキニエ細胞及びそれらの樹状分枝細胞骨格、並びに分子層中の小さい丸形細胞に良く結合する。ｓＨＩｇＭ ２２は顆粒細胞の表面を、弱く、しかし一様に標識する。ｓＨＩｇＭ １４ （Ｄ）は顆粒層の細胞及び切片の表面に位置するプルキニエ細胞に良く結合し、一方、葉の中枢の白質は標識を殆ど含まない。ｓＨＩｇＭ １ （Ｅ）は葉の中枢の白質の上にある星状細胞の細胞骨格を標識する。全てのその他の構造がバックグラウンドレベルのすぐ上で同定される。ｓＨＩｇＭ ２ （Ｆ）は顆粒層の細胞及び葉の中枢の白質を横切る繊維に結合する。倍率ｘ。
【図２】
付加的なｓＨＩｇＭが小脳の切片中の細胞に高い特異性で結合することを示す写真を含む。新生仔ラット小脳の未固定切片の間接の免疫蛍光標識。ｓＨＩｇＭは未固定脳切片内の細胞集団及び構造に種々の特異性を示す。ｓＨＩｇＭ １２ （Ａ）は葉の中枢の白質に結合してスポンジ状外観を与え、細胞外基質分子を連想させる、分子層の上に一様の標識を与える。上にある星状細胞がまた良く特定される。ｓＨＩｇＭ ２９ （Ｂ）は、顆粒層及び分子層中の神経細胞の小集団を除いて、バックグラウンドのすぐ上の強さで小脳中の多くの構造に弱く結合する。１００（ｍを越える長さの軸索延長が明瞭に形どられている。ｓＨＩｇＭ ３１ （Ｃ）及びｓＨＩｇＭ ５０ （Ｆ）は夫々顆粒層に主として結合し、白質、プルキニエ細胞又は星状細胞に殆ど結合しない。ｓＨＩｇＭ ５０の結合パターンはまた細胞外基質分子を連想させる。ｓＨＩｇＭ ４２ （Ｄ）は全葉、分子層及び顆粒層並びに白質に繊維状パターンで結合する。ｓＨＩｇＭ ４６ （Ｅ）は顆粒層及び白質に繊維状パターンで結合する。プルキニエ細胞体が良く特定される。
【図３】
ｓＨＩｇＭが成人皮質白質の未固定切片に高い特異性で結合することを示す写真を含む。成人皮質白質の未固定切片の間接の免疫蛍光標識。皮質ヒト白質はＣＮＳ感染又はトラウマを有しない個体から解剖で得られた。死亡の原因はＣＮＳ関連以外であった。組織を氷上で得て、抗体標識操作中は低温に維持した。ｓＨＩｇＭ ２ （Ａ）は視野内の二三の細胞のみに結合する。対照的に、その他のｓＨＩｇＭはヒト白質を非常に良く、しかも高度の特異性で結合する。ｓＨＩｇＭ ３２は型２星状細胞の外観の細胞に結合し（Ｃ）、一方、ｓＨＩｇＭ ３１は多くの未同定丸形細胞体に結合する（Ｂ）。ｓＨＩｇＭ ２６はオリゴデンドロサイトの外観の細胞及び繊維状白質に結合する（Ｅ）。ｓＨＩｇＭ ２２は細胞外基質結合分子を示唆する様式でヒト皮質白質に結合する（Ｄ）。倍率ｘ。
【図４】
ＥＢＶ不死化ヒトＢ細胞クローン由来モノクローナルＩｇＭ抗体（ｅｂｖＨＩｇＭ）が小脳中の細胞の表面抗原に高い特性で結合することを示す写真を含む。新生仔ラット小脳の未固定切片の間接の免疫蛍光標識。ｅｂｖＨＩｇＭは未固定ラット脳切片内の細胞集団及び構造に種々の特異性を示す。ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｅ１５ （Ａ）は白質内の繊維状構造並びに顆粒層及び分子層に集密に近いパターンで結合する。ｅｂｖＨＩｇＭ ＡＫＪＲ４ （Ｂ）は顆粒層に殆ど専ら結合する。分子層内の小さい細胞がまた同定される。ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１７Ａ２ （Ｃ）及びＭＳＩ２０Ｈ１０ （Ｅ）は種々の強さの程度で中枢白質、顆粒層及び分子層並びにプルキニエ細胞に結合する。ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１６Ｅ６ （Ｄ）はプルキニエ細胞及びそれらの樹脂状樹に対し非常に強いアフィニティーを示し、一方、顆粒層ははるかに明確ではなく標識される。ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ７Ｅ１１ （Ｆ）は脳切片の表面で二三のグリア外観の細胞のみに点状様式で結合する。倍率ｘ。
【図５】
小脳の切片中の細胞の表面抗原に高い特異性で結合する付加的なｅｂｖＨＩｇＭを示す。新生仔ラット小脳の未固定切片の間接の免疫蛍光標識。ｅｂｖＨＩｇＭは未固定脳切片内の細胞集団及び構造に対し種々の特異性を示す。夫々のパネルは中枢の白質、並びに顆粒層、プルキニエ層及び分子層を含む、単一小脳葉の端部を示す。脳の切片を、ｅｂｖＨＩｇＭを含む上清：緩衝培地１：１でインキュベートした。多くのｅｂｖＨＩｇＭが白質、プルキニエ細胞体、及び分子層内の小さい細胞に結合するが、アフィニティーは様々である。ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０ （Ａ）は顆粒層の細胞並びにプルキニエ細胞及びそれらの樹状分枝に強く結合し、加えて白質及び星状細胞を弱く同定する。ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０をｉｎ ｖｉｖｏで髄鞘再形成を促進する能力について試験した（表１及び図１３を参照のこと）。その他の脳結合性ｅｂｖＨＩｇＭ、ＣＢ２ｂＧ８（Ｂ）、ＣＢ２ｅＣ２（Ｃ）、ＣＢ２ｉＥ１２（Ｄ）、及びＭＳＩ１０Ｅ１０（Ｆ）が単離され、更なる研究を保証するが、ｉｎ ｖｉｖｏで試験されなかった。ＣＢ２ｅＣ２（Ｅ）は非反応性上清の典型的な強さである。倍率ｘ。
【図６】
ポリクローナルヒトＩｇＭが培養中のオリゴデンドロサイトに結合することを示す。免疫細胞化学により、ポリクローナルヒトＩｇＭはオリゴデンドロサイトの亜集団の表面を染色する。オリゴデンドロサイト表面抗原に対する反応性がポリクローナルヒトＩｇＧ、又はｓＨＩｇＭ １もしくはｓＨＩｇＭ ２からの血清で観察されなかった。固定され、透過された細胞中のプールされたヒトＩｇＭ又はＩｇＧによる免疫細胞化学は細胞内構造のわずかな染色を示した。
【図７】
ｓＨＩｇＭが培養中のグリア細胞の表面抗原に高い特異性で結合することを示す。接種後９日目の生ラット一次混合グリア細胞培養物の間接の免疫蛍光標識。ｓＨＩｇＭは結合する細胞型だけでなく、混合グリア培養物中で同定される細胞分化段階について種々の特異性を示す。ｓＨＩｇＭ １２は一層成熟したＯ４＋オリゴデンドロサイト（Ａ、赤色標識）の中央で推定のオリゴデンドロサイト前駆細胞（Ａ、緑色標識）のクラスターに結合する。ｓＨＩｇＭ ２２はグリア培養物の表面に付着する成熟段階のオリゴデンドロサイト（Ｂ）に結合する。ｓＨＩｇＭ ４６は成熟段階のオリゴデンドロサイト（Ｃ、図の中央）及び一層かすかな点状標識を有する未成熟段階のオリゴデンドロサイト（Ｃ、図の左側）の両方に強く結合する。ｓＨＩｇＭ ４２ （Ｄ）及びｓＨＩｇＭ ５１ （Ｆ）の両方が成熟段階のオリゴデンドロサイトそしてかすかに、下にある星状細胞に結合する。ｓＨＩｇＭ ３０は培養中の殆どの細胞の細胞体に結合するが、突起延長は描かれない（Ｅ）。倍率ｘ。
【図８】
ｓＨＩｇＭが小脳の切片及び混合一次グリア細胞の培養物中のオリゴデンドロサイト系列の細胞に結合することを示す。オリゴデンドロサイト系列のマーカーとのｓＨＩｇＭ同時標識により同定された細胞。新生仔ラット小脳の未固定切片中でｓＨＩｇＭ ２２を結合する細胞は成熟段階のオリゴデンドロサイトの細胞質マーカーであるＲｉｐ抗体を同時標識する。二重標識共焦像はＲｉｐ陽性でもある（Ｃ）ｓＨＩｇＭ２２陽性細胞（Ａ）を示している。ｓＨＩｇＭ ２２陽性細胞（Ａ）を示す。像（Ａ）及び（Ｃ）は（Ｅ）中に合併されている。混合一次ラットグリア細胞培養物（Ｂ）中でｓＨＩｇＭ ５１を結合する細胞はまたＯ４陽性である（Ｄ）。抗スルファチドであるＯ４は増殖の停止の前に現れ、成人髄鞘中に維持されるオリゴデンドロサイト系列の良く確立されたマーカーである。像（Ｂ）及び（Ｄ）は（Ｆ）中で合併される。倍率ｘ。
【図９】
ｅｂｖＨＩｇＭが小脳の切片中でオリゴデンドロサイト系列の細胞に結合することを示す。新生仔ラット小脳の未固定切片中でｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｅ５により同定される細胞は抗スルファチドかつオリゴデンドロサイトの細胞表面マーカーであるＯ４抗体と同時標識される。葉の白質内の細胞の二重標識共焦像はまたＯ４陽性（Ｂ）でもあるｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｅ５陽性細胞（Ａ）を示す。像（Ａ）及び（Ｂ）は（Ｃ）中で合併されている。
【図１０】
脊髄ホモジネート中に見られるＣＮＳ抗原への結合についてのｓＨＩｇＭのスクリーニングの結果を示す。ポリスチレンプレートに結合された脊髄ホモジネートへの結合についてｓＨＩｇＭをスクリーニングした。プレートに結合する抗原の殆どが脊髄の白質からの脂質及びタンパク質である。従って、ＳＣＨホモジネートへの強い抗体結合は白質成分への結合と解される。１種のｓＨＩｇＭのみが１より大きいＯＤでＳＣＨに結合する、ｓＨＩｇＭ ２２。この抗体はまた培養中の脳切片、オリゴデンドロサイトに良く結合し、ｉｎ ｖｉｖｏの髄鞘再形成を促進する能力について試験されたものである（表１を参照のこと）。この簡単なアッセイはｉｎ ｖｉｖｏの髄鞘再形成を促進する抗体の能力を予測する際に強力な手段であることが判明した。ＳＣＨに良く結合するその他のｓＨＩｇＭ（例えば、３８及び４９）は研究中である。
【図１１】
脊髄ホモジネート中に見られるＣＮＳ抗原への結合についてのｅｂｖＨＩｇＭのスクリーニングの結果を示す。ポリスチレンに結合された脊髄ホモジネートへの結合についてｅｂｖＨＩｇＭをスクリーニングした。４種のｅｂｖＨＩｇＭが１より大きいＯＤでＳＣＨホモジネートに結合した。これらの一種、ＭＳＩ１９Ｄ１０はｉｎ ｖｉｖｏの髄鞘再形成を促進する能力について試験されたものである（表１を参照のこと）。低結合性抗体、ＡＫＪＲ４もｉｎ ｖｉｖｏで試験したものである（表１を参照のこと）。一種のその他の強い結合性の抗体、ＡＫＪＲ８は研究中である。クローンＣＢ２ｉＨ１及びＣＢ１ｂＤ２は培養中に非常にわずかな抗体しか産生しない。ここでもまた、この簡単なアッセイは抗体をスクリーニングし、どの抗体がｉｎ ｖｉｖｏの髄鞘再形成を促進することができるのかを予測する際に非常に強力な手段であることが判明した。
【図１２】
ポリクローナルヒト抗体及びｓＨＩｇＭがＴＭＥＶ感染マウスで髄鞘再形成を促進することを示す。ＴＭＥＶで慢性感染されたＳＪＬ／Ｊマウスの脊髄中のミエリン病変の領域の光学顕微鏡写真。軸索直径に関する薄い髄鞘を特徴とする、広範なＣＮＳ髄鞘再形成が、ポリクローナルヒトＩｇＧ（Ａ）、ポリクローナルヒトＩｇＭ（Ｂ）、及びｓＨＩｇＭ ２２（Ｃ）による治療後にマウス中で観察される。有意な髄鞘再形成のない髄鞘脱落がｓＨＩｇＭ １４（Ｄ）、ｓＨＩｇＭ １（Ｅ）及びｓＨＩｇＭ ２で治療されたマウス中で観察された。アラルダイトに埋め込まれた切片を１％のｐ−フェニレンジアミンで染色した。倍率ｘ。ポリクローナルヒトＩｇＭはポリクローナルヒトＩｇＧよりもｉｎ ｖｉｖｏの髄鞘再形成を促進する能力が優れていることが判明した（表１）。強いＣＮＳ特異性は抗体がｉｎ ｖｉｖｏの髄鞘再形成を促進するための要件の一つであるようだが、単独では髄鞘再形成を促進する抗体の能力を予測するのに充分ではない。
【図１３】
ｅｂｖＨＩｇＭがＴＭＥＶ感染マウスで髄鞘再形成を促進し得ることを示す。ＴＭＥＶで慢性感染されたＳＪＬ／Ｊマウスの脊髄中のミエリン病変の領域の光学顕微鏡写真。軸索直径に関する薄い髄鞘を特徴とする、広範なＣＮＳ髄鞘再形成が、ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０（Ａ）による治療後にマウス中で観察される。有意な髄鞘再形成のない髄鞘脱落がｅｂｖＨＩｇＭ ＡＫＪＲ４（Ｂ）で治療されたマウス中で観察された。アラルダイトに埋め込まれた切片を１％のｐ−フェニレンジアミンで染色した。再度、強いＣＮＳ特異性は抗体がｉｎ ｖｉｖｏの髄鞘再形成を促進するための要件の一つのようだが、単独では髄鞘再形成を促進する抗体の能力を予測するのに充分ではない。
【図１４】
ヒトポリクローナルＩｇＭで治療されたリゾレシチン病変中の髄鞘形成された軸索の定量を示す。治療されたリゾレシチン病変ｖｓ未治療のリゾレシチン病変中の髄鞘再形成された軸索／ｍｍ２。ポリクローナルヒトＩｇＧで治療された動物よりもポリクローナルヒトＩｇＭで治療されたリゾレシチン病変中に有意に多い髄鞘再形成された軸索があった（ｐ＜０．０５）。ＰＢＳ対照グループ中の１匹の動物が自発的に髄鞘再形成し、したがって、ヒト抗体治療グループと対照グループの間の差は統計上有意ではない（ｐ＞０．０５）。
【図１５】
ヒト抗体が化学ハプテンに多反応性であることをＥＬＩＳＡにより示す。直接ＥＬＩＳＡにより評価された免疫グロブリンの抗原結合特異性。ポリクローナルヒトＩｇＭ、ポリクローナルヒトＩｇＧの化学ハプテン反応性。これらの図中に使用される略号：ＮＰ、（４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニル）アセチル；ＰｈｏＸ、フェニルオキサゾロン；ＴＭＡ、アゾフェニルトリメチルアンモニウム；ＦＩＴＣ、フルオレセイン；ＰＣ、アゾフェニルホスホリル−コリン；ＡＲＳ、アゾフェニルアルソネート；ＴＮＰ、トリニトロフェニルアセチル。
【図１６】
ヒト抗体が自己タンパク質に多反応性であることをＥＬＩＳＡにより示す。直接ＥＬＩＳＡにより評価された免疫グロブリンのタンパク質抗原結合特異性。これらの図中に使用される略号：ＭＢＰ、ミエリン塩基性タンパク質；ＫＬＨ、キーホールリンペットヘモシアニン；ＨＥＬ、ニワトリ卵リゾチーム；ＢＳＡ、ウシ血清アルブミン；Ｒｂｔ、ウサギ；Ｂｏ、ウシ；Ｍｏ Ｈｂ、マウスヘモグロビン。
【図１７】
ｓＨＩｇＭ ２２重鎖可変領域配列を示す。配列は刊行物：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｉ巻， 第５編（１９９１）， Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．， Ｗｕ， Ｔ．Ｔ．， Ｐｅｒｒｙ， Ｈ．Ｍ． Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ， Ｋ．Ｓ．及びＦｏｅｌｌｅｒ， Ｃ．， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ中のヒトＶＨ配列のナンバリングシステムに従って整列される。ｓＨＩｇＭ ２２ ＶＨはＶＨサブグループＩＩＩの員である。下線を施されたアミノ酸はタンパク質配列決定により確認された。アミノ酸配列はｓＨＩｇＭ ２２ヌクレオチド配列に相当する。ｓＨＩｇＭ ２２ ＶＨ型Ａ配列及びＢ配列はＩＧＨＶ３−３０／３−３０−０５＊０１、ＩＧＨＪ４＊０２及びＩＧＨＤ２−２１＊０２生殖系列配列とは異なるヌクレオチドのみで表される。ｓＨＩｇＭ ２２ ＶＨ型Ｂのタンパク質配列中の二つのアミノ酸置換がボールド体で印刷される。ｓＨＩｇＭ ２２ ＶＨ型Ａ及びＢの両方の配列はＩＧＨＶ３−３０／３−３０−５＊０１生殖系列配列に最も密接にマッチした（９６％の相同性）。生殖系列配列に関する文献：ＩＭＧＴ、国内ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース〔ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｎｕｓｃ．ｆｒ：８１０４〕（イニシエーター及びコーディネーター：Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ， Ｆｒａｎｃｅ）
【図１８】
ｓＨＩｇＭ ２２軽鎖可変領域配列を示す。配列は刊行物：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｉ巻， 第５編（１９９１）， Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．， Ｗｕ， Ｔ．Ｔ．， Ｐｅｒｒｙ， Ｈ．Ｍ． Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ， Ｋ．Ｓ．及びＦｏｅｌｌｅｒ， Ｃ．， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ中のヒトＶＨ配列のナンバリングシステムに従って整列される。ＶλｓＨＩｇＭ ２２はλサブグループＩの員である。下線を施されたアミノ酸はタンパク質配列決定により確認された。アミノ酸配列はｓＨＩｇＭ ２２ヌクレオチド配列に相当する。ｓＨＩｇＭ ２２ Ｖλ型Ｉ配列及びＩＩ配列はＩＧＬＶ１−５１＊０１及びＩＧＬＪ３＊０１生殖系列配列とは異なるヌクレオチドのみで表される。ｓＨＩｇＭ ２２ Ｖλ型ＩＩのタンパク質配列中の二つのアミノ酸置換がボールド体で印刷される。ｓＨＩｇＭ ２２からのＶλ配列はＩＧＬＶ−５１＊０１生殖系列配列に最も密接にマッチした（９７％の相同性）。二つの遺伝子は単一ヌクレオチド変化によりそれらの共通の祖先とは異なる。生殖系列配列に関する文献：ＩＭＧＴ、国内ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース〔ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｎｕｓｃ．ｆｒ：８１０４〕（イニシエーター及びコーディネーター：Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ， Ｆｒａｎｃｅ）
【図１９】
ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０重鎖可変領域配列を示す。
【図２０】
ｅｂｖＨＩｇＭ ＭＳＩ１９Ｄ１０軽鎖可変領域配列を示す。
【図２１】
髄鞘再形成を促進するモノクローナル抗体が培養中のグリア細胞中でＣａ２＋フラックスを生じることを示す。三つのパネルは４種の異なる抗体に対するグリアのＣａ２＋応答を示す：ｉｎ ｖｉｖｏの髄鞘再形成を促進する２種、ｓＨＩｇＭ ２２（Ａ）及びＳＣＨ９４．０３（Ｂ）、並びに髄鞘再形成を促進しない２種、ｓＨＩｇＭ １４（パネルＣ）及びＣＨ１２（Ｃ）。応答した細胞はカルシウムスパイクの２種の異なる型、抗体の添加直後の速いスパイク（Ａ＆Ｂ、赤色トレース）、又は抗体の添加後に短い遅延で現れる一層広いスパイク（Ａ＆Ｂ、黒色トレース）の一つを示した。時間軸の小さい着色された三角形は抗体（又はイオノホア）が添加された瞬間を表す。抗体ｓＨＩｇＭ ２２及びＳＣＨ９４．０３は両方の型の応答を誘発したが、グリア細胞の異なるサブセットから誘発した（パネルＡ＆Ｂ）。ｉｎ ｖｉｖｏの髄鞘再形成を促進しない、抗体ｓＨＩｇＭ１４及びＣＨ１２は培養グリア中でカルシウムフラックスを生じないことが観察された（パネルＣ）。夫々の実験の終了時に、カルシウムイオノホアＢｒ−Ａ２３１８７を細胞保全性についての対照として夫々の培養物に添加した。生存細胞へのイオノホアの添加は大きいＣａ２＋内向きフラックスを生じる。このことは示した実験の夫々で明らかである。
【図２２】
ｓＨＩｇＭ及びｅｂｖＨＩｇＭが培養中の一次神経細胞に結合することを示す。培養６日の生存一次ラット顆粒細胞の間接の免疫蛍光標識。ｓＨＩｇＭ １２は培養中の小脳顆粒細胞の実際に全ての軸索及び樹脂状延長に結合する（Ａ）。結合パターンは抗ガングリオシド抗体、例えば、マウス抗体Ａ２Ｂ５で観察されたパターンと同様である。Ａ２Ｂ５はｉｎ ｖｉｖｏの髄鞘再形成を促進することが示されていた（Ａｓａｋａｒａら， １９９８）。ｅｂｖＨＩｇＭ ＣＢ２ｉＥ１２は顆粒細胞体及びそれらの近位の軸索延長のみに結合する（Ｂ）。ＣＢ２ｉＥ１２により認識される抗原は発生的に調節される。なぜなら、プレーティング後、４−５日まで培養中の顆粒細胞についてＣＢ２ｉＥ１２染色に対し陰性だからである。倍率ｘ。
【図２３】
マウスモノクローナル抗体ＳＣＨ９４．０３が培養中の顆粒細胞の表面に結合することを示す。間接の免疫蛍光標識及び共焦連続イメージングはマウスモノクローナル抗体ＳＣＨ９４．０３が培養中の顆粒細胞神経細胞の表面にのみ結合することを示す。一連の像を１μｍ離して撮影し、突起延長を有する外部標識された球形細胞体について予想される同心の円形環が明瞭に示されている。
【図２４】
ＴＭＥＶ感染マウスの脊髄中の白質、白質病変及び髄鞘再形成を定量するのに使用された方法を示す。ＴＭＥＶで慢性感染され、ポリクローナルヒトＩｇＭで治療されたＳＪＬ／Ｊマウスからの胸レベル脊髄切片の光学顕微鏡写真（Ａ）。周辺の白質が一層明るい中枢の灰質よりも暗く染色される。全白質の領域が４０倍の倍率でトレースされている（赤色アウトラインにより示される）。次いで１００倍の倍率で、白質病変の領域がトレースされている（緑色アウトラインにより示される）。この例では、白質病変の領域が切片の周辺と同じ位明るい領域として見える。最後に、２５０倍の倍率で、ＯＬ髄鞘再形成の領域（青色アウトラインにより示される）及びＳＣ髄鞘再形成の領域（黄色アウトラインにより示される）がトレースされている。ＯＬ髄鞘再形成は軸索直径に関して薄い髄鞘を特徴とする。白質病変の面積％は緑色の面積を赤色の面積で割り、１００を掛けることにより計算される。ＯＬ髄鞘再形成の面積％は青色の面積を緑色の面積で割り、１００を掛けることにより計算される。１０の脊髄断片を考慮した夫々の動物についてトレースし、面積を合計して動物に関するスコアーを計算する。一般に、各実験グループにおいて７−８匹の動物を処置し、死亡及び少なくとも５％の全白質病変を含まない動物を許す。通常４−５匹の動物が最終データ組に含まれるための基準を満たす。背側柱白質（Ａ中のアステリスクにより示された領域からのＢ）の高倍率視野により有意なＯＬ髄鞘再形成が示される（矢印）。スケールバーはＡで２５０μｍであり、Ｂで２０μｍである。
【図２５】
ヒトＡｂによる治療後に、ＴＭＥＶ慢性感染マウスは有意なＯＬ髄鞘再形成を示す。異なる治療グループの脊髄白質病変の代表的な領域の光学顕微鏡写真。ＩＶＩｇによる治療は有意なＯＬ髄鞘再形成をもたらした（Ａ）。軸索直径に関する稠密に充填された薄い髄鞘を特徴とする、殆ど完全なＯＬ髄鞘再形成（Ｂ、矢印）が、ポリクローナルヒトＩｇＭ（Ｂ）並びにヒトｍＡｂ ｓＨＩｇＭ ２２（Ｆ）及びｓＨＩｇＭ４６（Ｇ）による治療後にマウスの脊髄からの切片中に観察された。対照的に、ヒトｍＡｂ ｓＨＩｇＭ１（Ｃ）、ｓＨＩｇＭ２（Ｄ）、ｓＨＩｇＭ１４（Ｅ）又はＰＢＳ（Ｈ）による治療後に、マウスは有意なＯＬ髄鞘再形成のない白質病変を示した。活性ミエリン破壊の兆候である、浸潤性炎症性細胞及びマクロファージ摂取ミエリンデブリ（Ａ、矢印）がまた明らかであった。ｓＨＩｇＭ２２で治療された８匹の動物のうちの４匹及びｓＨＩｇＭ４６で治療された５匹の動物のうちの５匹の脊髄断片が有意な組織修復を示す稀なイベントである、少なくとも一つのほぼ集密のＯＬ髄鞘再形成領域を含んでいた。対照的に、ｓＨＩｇＭ１、ｓＨＩｇＭ２、ｓＨＩｇＭ１４、又はＰＢＳで治療された夫々のマウスからの１０の脊髄断片は何も含んでいなかった。スケールバーは２０ｍｍである。
【図２６】
ラットＯＬに結合する能力ゆえに単離されたヒトｍＡｂはまた培養中のヒトＯＬの表面にも結合する。ｓＨＩｇＭ１４（Ａ）（これは髄鞘再形成を促進しなかった）、並びにｓＨＩｇＭ２２（Ｂ）及びｓＨＩｇＭ４６（Ｃ）（これらは髄鞘再形成を促進した）は３週間にわたって培養物中に維持されたスルファチド陽性ヒトＯＬの神経細胞形質及び複雑な突起並びに膜延長に結合した。ｓＨＩｇＭ２（Ｄ、緑色のチャンネル）はスルファチド陽性（Ｄ、赤色チャンネル）ヒトＯＬに結合しなかったヒトｍＡｂの例である。核が青色に標識されている。ＩＶＩｇ、ポリクローナルヒトＩｇＭ、並びにヒトｍＡｂ ｓＨＩｇＭ１及びｓＨＩｇＭ２は試験したあらゆる時点でヒトＯＬの表面に結合しなかった。スケールバーは２５ｍｍである。
【図２７】
ＥＢＶ形質転換体抗体ＣＢ２ｂ−Ｇ８の重鎖可変領域配列を示す。
【図２８】
ＥＢＶ形質転換体抗体ＣＢ２ｂ−Ｇ８の軽鎖可変領域配列を示す。
【図２９】
ｄＨｆＲを含む発現プラスミドのメトトレキセート増幅による軽鎖ＲＮＡの増幅及びトランスフェクトされたハイブリドーマ細胞中のタンパク質発現。ＳＶ４０プロモーターの制御下に連結されたｄＨｆＲ遺伝子と一緒のＣＭＶプロモーターの制御下のヒト化９４．０３κ軽鎖のコーディング配列を含む発現プラスミドをエレクトロポレーションにより免疫グロブリン陰性Ｆ３Ｂ６ヒト／マウスハイブリドーマ細胞系に導入した。最小メトトレキセート選択下の細胞（０．５μｇ／ｍｌ）及び更にストリンジェントな選択を受けた細胞（５１．２μｇ／ｍｌ）を培養して上清を回収して軽鎖分泌を評価し、ＲＮＡを回収して軽鎖遺伝子発現を評価した。ノーザンブロット分析は一つのクローン（＃５）中のＲＮＡ発現の実質的な増幅を示す。タンパク質発現がクローン４中のメトトレキセート選択後に増大されたが、クローン５では増大されなかった。これらの知見はメトトレキセート増幅が密接に連関した遺伝子によるｍＲＮＡの増幅及びタンパク質発現を時にはもたらすが、その他の場合には転写の増幅及びタンパク質合成を生じさせないことを示す。
【図３０】
ヒト化９４．０３及びｓＨＩｇＭ ２２をコードする増幅可能なベクター。上部パネルはヒト化９４．０３軽鎖（κ）のコーディング配列及びヒト化９４．０３重鎖（μ）をコードするハイブリッドゲノム構築物を含むプロトタイプベクターである。下部パネルはｓＨＩｇＭ ２２配列に由来するコーディング配列を含む同様の構築物である。
【図３１】
マウス及びヒト化９４．０３で染色された新生仔ラット小脳。小脳切片をマウス及びヒト化９４．０３で染色した。結合した抗体を夫々マウス又はヒトＩｇＭに特異性の蛍光二次抗体を使用して位置を明らかにした。どちらの抗体も小脳中の白質道及び星状細胞に対し同様の染色パターンを示した。
【図３２】
９４．０３のＩｇＧ変異体の単離。表面でＩｇＧを発現する細胞についてのソーティングにより９４．０３の天然スイッチ変異体が培養物から単離された。細胞培養物のソーティング前プロフィール及びソーティング後プロフィールを示してある。ＩｇＧ細胞が制限希釈クローニングにより後選別集団から単離された。ＩｇＧイソタイプ特異性抗体を使用して産生された抗体がＩｇＧ１であると同定された。
【図３３】
ＩｇＧ１産生細胞が実際に９４．０３の変異体であったことの実証。ＲＮＡをＩｇＧ１発現クローナル細胞から単離した。ｃＤＮＡを９４．０３の可変領域及びγ１イソタイプの定常領域に特異性のプライマーを用いるＲＴＰＣＲを使用して作製した。得られたＤＮＡを配列決定して自発スイッチ変異体について予想される正確なスプライシング結合を明らかにした。
【図３４】
マウス０９抗体の重鎖可変領域配列を示す。
【図３５】
マウス０９抗体のマウス０９可変領域配列のκ軽鎖１可変領域配列を示す。
【図３６】
マウス０９抗体のκ軽鎖２可変領域配列を示す。
【図３７】
ＡＫＪＲ４重鎖可変領域配列を示す。
【図３８】
ＡＫＪＲ４κ軽鎖可変領域配列を示す。
【図３９】
ＣＢ２ｉＥ１２重鎖可変領域配列を示す。
【図４０】
ＣＢ２ｉＥ１２κ軽鎖可変領域配列を示す。
【図４１】
ＣＢ２ｉＥ７重鎖可変領域配列を示す。
【図４２】
ＣＢ２ｉＥ７κ軽鎖可変領域配列を示す。
【図４３】
ＭＳＩ １９Ｅ５軽鎖可変領域配列を示す。
【図４４】
マウス０４抗体のκ軽鎖２を示す。
【図１】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５ＡＢ】
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【図１５ＣＤ】
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【図１５ＥＦ】
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【図１６ＡＢ】
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【図１６ＣＤ】
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【図１６ＥＦ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３Ｂ】
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【図４４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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2004516807.tif 000287
2004516807.tif 000288