(57)【要約】本発明は、炎症プロセスに関与するタンパク質及び炎症性疾患に陽性の影響を与えるための該タンパク質の機能の調節に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質が、タンパク質の機能の活性剤であるか又は阻害剤であるか測定するための方法であって、
該タンパク質が、ＭＩＦ、ＤＡＤ１、ＡＲＬ４、ＧＮＳ２、トランスグルタミナーゼ２、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素及びＵＤＰ−グルコースセラミドグリコシルトランスフェラーゼからなる群から選ばれるか、又は該タンパク質の機能的同等体、誘導体、変異体、突然変異体またはフラグメントであることを特徴とし、及び
該方法が、該タンパク質又はその機能的同等体、誘導体、変異体、突然変異体またはフラグメントと、該タンパク質の所望の機能の活性剤であるか又は阻害剤であるかを試験するための物質とを接触させ、及びその所望の機能が活性化されているか阻害されているかを測定することを特徴とする前記方法。
【請求項２】
所望の機能が阻害されているかまたは活性化されているかを直接測定する請求項１記載の方法。
【請求項３】
所望の機能が阻害されているかまたは活性化されているかを間接的に測定する請求項１記載の方法。
【請求項４】
該タンパク質が哺乳類タンパク質である請求項１記載の方法。
【請求項５】
該タンパク質がヒトタンパク質である請求項４記載の方法。
【請求項６】
分析を、細胞系を使用して行う請求項１記載の方法。
【請求項７】
分析を、無細胞系を使用して行う請求項１記載の方法。
【請求項８】
マクロファージ中で発現するタンパク質のレベルを測定することを含む、タンパク質の発現レベルを測定するための方法であって、
該タンパク質が、ＭＩＦ、ＤＡＤ１、ＡＲＬ４、ＧＮＳ２、トランスグルタミナーゼ２、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素及びＵＤＰ−グルコースセラミドグリコシルトランスフェラーゼからなる群から選ばれる、前記方法。
【請求項９】
該マクロファージが哺乳類マクロファージである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該マクロファージがヒトマクロファージである請求項９記載の方法。
【請求項１１】
慢性炎症性気道疾患を診断又は監視するための請求項８記載の方法。
【請求項１２】
慢性炎症性気道疾患が慢性気管支炎及びＣＯＰＤからなる群から選ばれる請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
物質が、あるタンパク質の機能の活性剤であるかまたは阻害剤であるか測定するための試験系であって、該タンパク質が、ＭＩＦ、ＤＡＤ１、ＡＲＬ４、ＧＮＳ２、トランスグルタミナーゼ２、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素及びＵＤＰ−グルコースセラミドグリコシルトランスフェラーゼからなる群から選ばれるか、又は該タンパク質の機能的同等体、変異体、突然変異体またはフラグメントである前記試験系。
【請求項１４】
ＭＩＦ、ＤＡＤ１、ＡＲＬ４、ＧＮＳ２、トランスグルタミナーゼ２、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素及びＵＤＰ−グルコースセラミドグリコシルトランスフェラーゼからなる群から選ばれるタンパク質、又はその機能的同等体、変異体、突然変異体またはフラグメントの細胞発現を含む請求項１３記載の試験系。
【請求項１５】
ＭＩＦ、ＤＡＤ１、ＡＲＬ４、ＧＮＳ２、トランスグルタミナーゼ２、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素及びＵＤＰ−グルコースセラミドグリコシルトランスフェラーゼからなる群から選ばれるタンパク質の活性剤または阻害剤であると測定された物質。
【請求項１６】
ＭＩＦ、ＤＡＤ１、ＡＲＬ４、ＧＮＳ２、トランスグルタミナーゼ２、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素及びＵＤＰ−グルコースセラミドグリコシルトランスフェラーゼからなる群から選ばれるタンパク質の活性剤または阻害剤である、ある疾患を治療するための物質。
【請求項１７】
前記疾患が慢性炎症性気道疾患である請求項１６記載の物質。
【請求項１８】
前記慢性炎症性気道疾患が慢性気管支炎及びＣＯＰＤからなる群から選ばれる請求項１７記載の物質。
【請求項１９】
ＭＩＦ、ＤＡＤ１、ＡＲＬ４、ＧＮＳ２、トランスグルタミナーゼ２、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素及びＵＤＰ−グルコースセラミドグリコシルトランスフェラーゼからなる群から選ばれるタンパク質の活性剤または阻害剤であると測定された少なくとも１種の物質を含む医薬組成物。
【請求項２０】
慢性炎症性気道疾患を治療するための医薬組成物を製造するための、ＭＩＦ、ＤＡＤ１、ＡＲＬ４、ＧＮＳ２、トランスグルタミナーゼ２、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素及びＵＤＰ−グルコースセラミドグリコシルトランスフェラーゼからなる群から選ばれるタンパク質の活性剤または阻害剤であると測定された物質の使用。
【請求項２１】
慢性炎症性気道疾患が慢性気管支炎及びＣＯＰＤからなる群から選ばれる請求項２０記載の物質の使用。
【請求項２２】
ＭＩＦ、ＤＡＤ１、ＡＲＬ４、ＧＮＳ２、トランスグルタミナーゼ２、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素及びＵＤＰ−グルコースセラミドグリコシルトランスフェラーゼからなる群から選ばれるタンパク質の活性剤または阻害剤であると測定された少なくとも１種の物質を含む医薬組成物を、慢性炎症性気道疾患の治療が必要な生物に適当量投与することを含む慢性炎症性気道疾患を治療するための方法。
【請求項２３】
哺乳類を治療するための請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ヒトを治療するための請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
慢性気管支炎及びＣＯＰＤからなる群から選ばれる慢性炎症性気道疾患を治療するための請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
ＭＩＦ、ＤＡＤ１、ＡＲＬ４、ＧＮＳ２、トランスグルタミナーゼ２、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素及びＵＤＰ−グルコースセラミドグリコシルトランスフェラーゼからなる群から選ばれるタンパク質の活性剤または阻害剤であると測定された物質を投与することを含む、マクロファージ中でＭＩＦ、ＤＡＤ１、ＡＲＬ４、ＧＮＳ２、トランスグルタミナーゼ２、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素及びＵＤＰ−グルコースセラミドグリコシルトランスフェラーゼからなる群から選ばれるタンパク質を選択的に調整するための方法。
【請求項２７】
マクロファージが、慢性炎症性気道疾患に含まれる請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
慢性炎症性気道疾患が、慢性気管支炎及びＣＯＰＤからなる群から選ばれる請求項２７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
序論
本発明は、炎症過程、特に、マクロファージが重要な役割を果たす慢性炎症性気道疾患の調節の分野に関する。炎症過程は、本発明により炎症過程に関与することが確認されているタンパク質の生物活性に影響を及ぼすことにより調節することができる。
マクロファージが重要な役割を果たす慢性炎症性気道疾患の例は、慢性気管支炎（ＣＢ）である。ＣＢは、気流が制限されているか否かに関わらずに起こり得、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む。ＣＢは、以下のいくつかの疾患の症状を含む複雑な疾患である：咳及び粘質過分泌を特徴とする慢性気管支炎、炎症及び気管支周囲線維症を含む末梢気道病変、気腫及び気流制限。ＣＢは、肺機能が加速度的かつ不可逆的に減退することを特徴とする。ＣＢ発症の主要危険因子は、連続的にタバコを喫煙することである。全ての喫煙者の約２０％だけがＣＢに苦しめられるので、遺伝的素因もまた疾患の一因となっていると思われる。
【０００２】
ＣＢの初期段階において最初に起こるのは炎症であり、小気道及び大気道に影響を与える。タバコを喫煙することに引き起こされる刺激が、マクロファージ及び好中球を誘引する。喫煙者の痰ではこれらの数が増加している。絶え間なく喫煙すると、傷害部位に炎症細胞を補充するマクロファージ、好中球及び上皮細胞から媒介物が放出されることにより、肺における進行性炎症性反応となる。これまで、ＣＢの経過を戻すのに利用できる治療がなかった。禁煙により、肺機能の減退を減らすことができる。
現在までに、患者の症状を幾分軽減する薬剤がわずかに知られている。持続性β２−アゴニスト及び抗コリン作用剤を適用すると、一時的に気管支が拡張する。ＬＴＢ４−阻害剤のような炎症性現象に用いるための様々なアンタゴニストが研究されている。
慢性炎症性気道疾患を治療するための薬剤を提供することが常に必要とされている。慢性炎症性気道疾患の原因は、活性化された炎症性免疫細胞、例えばマクロファージにあると考えることができる。それ故、炎症過程の原因を除くよう、マクロファージの機能を調節する薬剤が必要である。
【０００３】
発明の説明
本発明において、炎症過程に関与するマクロファージ、特に慢性炎症性気道疾患に関与するマクロファージ、更に特に慢性気管支炎またはＣＯＰＤに関与するマクロファージが、差別的に発現した核酸配列及びタンパク質発現のパターンを示すことが分かり、これは、健康なドナーまたは炎症を起こしたドナー由来のマクロファージの遺伝子発現のパターンとは異なるものであり、ここで、後者は、活性化状態のマクロファージを含有する。それ故、マクロファージは種々の炎症状態において種々の活性レベルを示す。例えば、本発明において、ＣＯＰＤ喫煙者の炎症過程に含まれるマクロファージは、健康な喫煙者由来のマクロファージとは異なる遺伝子発現パターンを示すことが、つまり、ＣＯＰＤ喫煙者におけるマクロファージが、以下に「活性化過剰」状態と称した、異なる状態を示すことが分かった。本発明は、ＭＩＦ、ＤＡＤ１、ＡＲＬ４、ＧＮＳ２、トランスグルタミナーゼ２、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素及びＵＤＰ−グルコースセラミドグリコシルトランスフェラーゼからなる群から選ばれるタンパク質を調節する物質を同定することにより、マクロファージの活性化過剰を阻害するか又はマクロファージの活性化過剰状態を軽減する可能性を提供する。これらのタンパク質は全て以下の配列表に示されており、マクロファージの活性化過剰状態を維持するか又は活性化過剰に関与する。
【０００４】
本明細書において、用語「慢性炎症性気道疾患」は、例えば、慢性気管支炎（ＣＢ）及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む。用語「慢性炎症性気道疾患」がＣＢ及びＣＯＰＤを意味するのが好ましく、ＣＢまたはＣＯＰＤを意味するのがより好ましい。
【０００５】
本発明は、活性化過剰でないマクロファージと比べて活性化過剰マクロファージにおいて差別的に発現する核酸配列の同定に基づく。そのような核酸配列は、ＭＩＦ、ＤＡＤ１、ＡＲＬ４、ＧＮＳ２、トランスグルタミナーゼ２、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素及びＵＤＰ−グルコースセラミドグリコシルトランスフェラーゼからなる群から選ばれるタンパク質であって、炎症過程、好ましくは慢性炎症性気道疾患に関与するマクロファージの活性化過剰状態を維持するか又はマクロファージの活性化過剰に関与するタンパク質をコードする。そのような差別的に発現する核酸配列又は該核酸配列にコードされるタンパク質はまた、以下に、それぞれ本発明の差別的に発現する核酸配列又はタンパク質と命名した。特に、本発明は、差別的に発現する核酸配列及びタンパク質発現パターンに起因する、マクロファージにおける表現型の変化と、炎症過程にマクロファージが関与することとの関連を教示するものであり、従って、種々の用途の根拠（ｂａｓｉｓ）を提供する。例えば、本発明は、本発明のマクロファージタンパク質又は本発明の差別的に発現する核酸配列の発現レベルを測定するための方法及び試験系を提供し、それにより、例えば、哺乳類、好ましくはヒト、特に好ましくは炎症過程に罹っているヒト、特に慢性炎症性気道疾患に罹っているヒトにおいて活性化過剰マクロファージに関連することによる炎症過程の診断又は監視方法を提供する。本発明はまた、本発明の差別的に発現する核酸配列又はタンパク質により物質を同定する方法であって、該物質が調節をする前記方法に関する。ここで、該物質が調節をするとは、該物質が、本発明の差別的に発現する核酸配列又はタンパク質に阻害剤又は活性剤として作用し、それによりマクロファージの活性化過剰を阻害するかマクロファージの活性化過剰状態を軽減して慢性炎症過程に陽性の影響を与えることを言う。それにより哺乳類、好ましくは前記疾患に罹っているヒトの治療をすることができる。本発明はまた、マクロファージにおいて本発明の差別的に発現する核酸配列又はタンパク質を選択的に調節する方法であって、該タンパク質又は差別的に発現する核酸配列のモジュレータであると測定された物質を投与することを含む前記方法に関する。本発明は、炎症過程、好ましくは慢性炎症性気道疾患の治療が必要な患者を治療するために前記物質を使用することを含む。
【０００６】
本発明の第一段階において、本発明の差別的に発現する核酸配列は、活性化過剰でないマクロファージと比べて活性化過剰マクロファージにおいて異なる発現パターンを有するものと確認された。簡単のため、特にＣＯＰＤに関与するマクロファージの調査について説明するが、他の慢性炎症性気道疾患、例えば、他の慢性気管支炎症状に罹っている被験者由来のサンプルから同等の結果を得ることができる。異なる発現パターンを調査することにより、以下の実施例で例証するように、炎症過程に関与すマクロファージの活性化状態に応じて発現する、一連の差別的に発現する核酸配列を同定することになる。
【０００７】
簡単に言えば、そのような本発明の差別的に発現する核酸配列は、活性化過剰マクロファージ由来の細胞抽出物又は細胞を使用する、比較発現プロファイリング実験により同定する。すなわち、例えば、ＣＯＰＤにおける炎症部位由来のものと、該疾患に罹っていないが、タバコの煙にさらされているような同様の炎症を起こしている状態にあるコントロールの対応する部位とを比較する。
【０００８】
第二段階において、本発明のタンパク質は、差別的に発現する核酸配列によりコードされるものと確認される。すなわち、活性化過剰を媒介する役割を果たすか又は活性化過剰状態を維持する役割を果たすタンパク質である。本発明の差別的に発現する核酸配列群は、ＭＩＦ、ＤＡＤ１、ＡＲＬ４、ＧＮＳ２、トランスグルタミナーゼ２、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素及びＵＤＰ−グルコースセラミドグリコシルトランスフェラーゼからなる群から選ばれるタンパク質をコードするものと同定することができる。該タンパク質は、活性化過剰でないマクロファージのコントロールレベルよりも低いか又は高いレベルで、本発明により活性化過剰にされているマクロファージにおいて発現することを特徴とする、活性化過剰状態を維持するか又は活性化過剰に関与する。
従って、本発明は、ＭＩＦ、ＤＡＤ１、ＡＲＬ４、ＧＮＳ２、トランスグルタミナーゼ２、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素及びＵＤＰ−グルコースセラミドグリコシルトランスフェラーゼからなる群から選ばれるタンパク質に関する。前記群から選ばれるタンパク質を、以下、本発明のタンパク質と称する。本発明のタンパク質を以下の配列表に示す。
本発明のＭＩＦ（配列番号１，２）の生物学的活性、すなわち本発明の炎症過程におけるマクロファージの関与を、例えばマクロファージの遊走を阻害することにより媒介するかは、例えば糖質コルチコイドの反作用する抑制効果及び／又は細菌の湿潤に対する炎症応答を誘発するといった別のＭＩＦの機能又は本発明のＭＩＦの生物学的活性に関連する他のＭＩＦの機能に依存する。
【０００９】
本発明はまた、ＭＩＦの機能的同等物、誘導体、変異体（ｖａｒｉａｎｔ）、突然変異体（ｍｕｔａｎｔ）及びフラグメントに関する。本明細書において、「機能的（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）」とは、本発明のＭＩＦの生物学的活性に関与する機能を有することを意味する。
【００１０】
本発明のＤＡＤ１（配列番号３，４）の生物学的活性、すなわち本発明の炎症過程におけるマクロファージの関与を媒介するかは、例えば、オリゴサッカリールトランスフェラーゼ複合体への結合及び／又は本発明のＤＡＤ１の生物学的活性に関連する他のＤＡＤ１の機能に依存する。
本発明はまた、ＤＡＤ１の機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体及びフラグメントに関する。本明細書において、「機能的」とは、本発明のＤＡＤ１の生物学的活性に関与するＤＡＤ１の機能を有することを意味する。
【００１１】
本発明のＡＲＬ４（配列番号５，６）の生物学的活性、すなわち本発明の炎症過程におけるマクロファージの関与を媒介するかは、例えば、小胞及び膜輸送に関連するタンパク質との相互作用及び／又は本発明のＡＲＬ４の生物学的活性に関連する他のＡＲＬ４の機能に依存する。
本発明はまた、ＡＲＬ４の機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体及びフラグメントに関する。本明細書において、「機能的」とは、本発明のＡＲＬ４の生物学的活性に関与するＡＲＬ４の機能を有することを意味する。
本発明のＧＮＳ（配列番号７，８）の生物学的活性、すなわち本発明の炎症過程におけるマクロファージの関与を媒介するかは、例えば、ヘパラン等の基質の結合及び／又は認識、及び／又は本発明のＧＮＳの生物学的活性に関連する他のＧＮＳの機能に依存する。
【００１２】
本発明はまた、ＧＮＳの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体及びフラグメントに関する。本明細書において、「機能的」とは、本発明のＧＮＳの生物学的活性に関与するＧＮＳの機能を有することを意味する。
本発明のトランスグルタミナーゼ２（配列番号９，１０）の生物学的活性、すなわち本発明の炎症過程におけるマクロファージの関与を媒介するかは、例えば、（γ−グルタミル）リシンイソペプチド結合の形成及び／又は本発明のトランスグルタミナーゼ２の生物学的活性に関連する基質認識等の他のトランスグルタミナーゼ２の機能に依存する。
本発明はまた、トランスグルタミナーゼ２の機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体及びフラグメントに関する。本明細書において、「機能的」とは、本発明のトランスグルタミナーゼ２の生物学的活性に関与するトランスグルタミナーゼ２の機能を有することを意味する。
【００１３】
本発明のステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素（配列番号１１，１２）の生物学的活性、すなわち本発明の炎症過程におけるマクロファージの関与を媒介するかは、例えば、パルミトイル−ＣｏＡ及び／又はステアリル−ＣｏＡ等の基質への結合及び／又はその酸化活性及び／又は本発明のステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素の生物学的活性に関連する基質認識等の他のステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素の機能に依存する。
本発明はまた、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素の機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体及びフラグメントに関する。本明細書において、「機能的」とは、本発明のステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素の生物学的活性に関与するステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素の機能を有することを意味する。
【００１４】
本発明のＵＤＰ−グルコースセラミドトランスフェラーゼ（配列番号１３，１４）の生物学的活性、すなわち本発明の炎症過程におけるマクロファージの関与を媒介するかは、例えば、ＵＤＰ−グルコース及び／又はセラミド等の基質への結合及び／又は移行活性及び／又は本発明のＵＤＰ−グルコースセラミドトランスフェラーゼの生物学的活性に関連する基質認識等の他のＵＤＰ−グルコースセラミドトランスフェラーゼの機能に依存する。
本発明はまた、ＵＤＰ−グルコースセラミドトランスフェラーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体及びフラグメントに関する。本明細書において、「機能的」とは、本発明のＵＤＰ−グルコースセラミドトランスフェラーゼの生物学的活性に関与するＵＤＰ−グルコースセラミドトランスフェラーゼの機能を有することを意味する。
【００１５】
本発明により、ＭＩＦ、ＤＡＤ１、ＡＲＬ４、ＧＮＳ２、トランスグルタミナーゼ２、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素及びＵＤＰ−グルコースセラミドトランスフェラーゼからなる群から選ばれるタンパク質の生物学的活性は、コントロールレベルよりも低いレベルで発現する場合、マクロファージの活性化過剰状態を軽減するか又はマクロファージの活性化過剰を阻害するよう活性化するのが好ましく、コントロールレベルよりも高いレベルで発現する場合、マクロファージの活性化過剰状態を軽減するか又はマクロファージの活性化過剰を阻害するよう阻害するのが好ましい。
【００１６】
本発明の一態様において、本発明は、物質が、ＭＩＦ、ＤＡＤ１、ＡＲＬ４、ＧＮＳ２、トランスグルタミナーゼ２、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素及びＵＤＰ−グルコースセラミドトランスフェラーゼからなる群から選ばれるタンパク質の活性剤であるか又は阻害剤であるかを測定する試験方法に関する。該タンパク質は慢性炎症性気道疾患に関与しており、炎症を媒介する役割を果たすので、該タンパク質の生物学的活性を調節する物質は、慢性炎症性気道疾患を治療するのに使用することもできるし、物質の機能を最適化し、最適化された物質が慢性炎症性気道疾患を治療するのに適当であるようにするためのリード化合物として使用することもできる。本発明の方法を行うために、本発明の試験系を使用することができる。
【００１７】
本発明はまた、物質が、ＭＩＦ、ＤＡＤ１、ＡＲＬ４、ＧＮＳ２、トランスグルタミナーゼ２、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素及びＵＤＰ−グルコースセラミドトランスフェラーゼからなる群から選ばれるタンパク質の活性剤であるか又は阻害剤であるかを測定するための試験系に関する。本発明の方法を行うのに有用な試験系は、細胞系又は無細胞系を含む。例えば、本発明の一態様は、例えば、測定可能な読み出し（ｒｅａｄｏｕｔ）として、レポーター遺伝子、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子等の発現を使用する、差別的に発現する核酸配列の発現レベルに作用する物質を試験できるように設計された試験系に関する。本発明の別の態様は、ＭＩＦ、ＤＡＤ１、ＡＲＬ４、ＧＮＳ２、トランスグルタミナーゼ２、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素及びＵＤＰ−グルコースセラミドトランスフェラーゼからなる群から選ばれる各タンパク質の、天然の活性剤又は人工的なものであるが適当な活性剤により、例えば適当なキナーゼ等により、本発明のタンパク質の機能の各活性化を干渉する物質、又は、本発明のタンパク質の各機能と直接相互作用する物質を試験できるように設計された試験系に関する。
【００１８】
本発明の試験系は、ＭＩＦ、ＤＡＤ１、ＡＲＬ４、ＧＮＳ２、トランスグルタミナーゼ２、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素及びＵＤＰ−グルコースセラミドトランスフェラーゼからなる群から選ばれるタンパク質、又は本発明のタンパク質の機能的同等体、誘導体、変異体、突然変異体またはフラグメント、本発明のタンパク質をコードする核酸又は本発明のタンパク質の機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメントをコードする核酸及び／又は制御要素を含み、ここで本発明のタンパク質の機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメント、又は本発明のタンパク質をコードする核酸若しくは本発明のタンパク質の機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメントをコードする核酸は、試験する物質と相互作用することができ、直接相互作用することにより、測定可能な読み出しが本発明のタンパク質のそれぞれの生物学的活性の変化を示すか、及び／又は本発明のタンパク質の発現の変化を示す。
【００１９】
本発明の試験系は、例えば、当業界で周知の要素を含む。例えば、無細胞系は、例えば、本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質の機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメント、本発明のタンパク質をコードする核酸又は本発明のタンパク質の機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメントをコードする核酸を、溶解形態又は結合形態で、又は細胞区画又は小胞内に含むことができる。適当な細胞系としては、例えば、適当な原核細胞又は真核細胞、例えば、本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質の機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメント、本発明のタンパク質をコードする核酸又は本発明のタンパク質の機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメントをコードする核酸を含む原核細胞又は真核細胞があげられる。本発明の前記試験系に使用するのに適当な細胞は、組換え技術により、例えば、所望の本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質の機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメントを発現するのに適当な組換えベクターで形質転換するか又は形質移入した後に得ることができる。或いは、そのような適当な細胞は、所望の本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質の機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメントを発現する天然原料から単離される細胞又は細胞系であり得る。本発明の試験系は、対象の物質が本発明のタンパク質の活性剤であるか又は阻害剤であるかを試験するのが望まれているか又は必要であるとき、本発明のタンパク質の天然又は人工のリガンドを含むことができる。
【００２０】
本発明の試験方法は、例えば、細胞系を細胞系の表現型を監視するのに使用するとき、読み出しを測定すること、例えば試験系における表現型の変化を測定することを含む。そのような変化は、例えば以下の実施例に詳細に説明したように、天然に起こるか又は人工的な応答における変化、例えば、ＭＩＦ、ＤＡＤ１、ＡＲＬ４、ＧＮＳ２、トランスグルタミナーゼ２、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素及びＵＤＰ−グルコースセラミドトランスフェラーゼからなる群から選ばれるタンパク質の細胞のレポーター遺伝子発現であり得る。
本発明の試験方法は、一方では物質が本発明の活性剤であるか又は阻害剤であるかを測定するのに適当な高速処理（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）試験に有用であり得る。また、例えば、高速処理試験において確認されたヒット化合物又はリード化合物の二次試験又は確認にも有用であり得る。
【００２１】
本発明はまた、本発明の方法において、本発明のＭＩＦ、ＤＡＤ１、ＡＲＬ４、ＧＮＳ２、トランスグルタミナーゼ２、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素及びＵＤＰ−グルコースセラミドトランスフェラーゼからなる群から選ばれるタンパク質の活性剤又は阻害剤であると確認された物質に関する。本発明の物質は、本発明のＭＩＦ、ＤＡＤ１、ＡＲＬ４、ＧＮＳ２、トランスグルタミナーゼ２、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素及びＵＤＰ−グルコースセラミドトランスフェラーゼからなる群から選ばれるタンパク質の機能を活性化又は阻害することができる、好ましくは阻害することができる、あらゆる化合物である。ＭＩＦ、ＤＡＤ１、ＡＲＬ４、ＧＮＳ２、トランスグルタミナーゼ２、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素及びＵＤＰ−グルコースセラミドトランスフェラーゼからなる群から選ばれるタンパク質の機能を活性化又は阻害する方法の例としては、ＭＩＦ、ＤＡＤ１、ＡＲＬ４、ＧＮＳ２、トランスグルタミナーゼ２、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素及びＵＤＰ−グルコースセラミドトランスフェラーゼからなる群から選ばれるタンパク質の発現レベルに影響を与えることである。ＭＩＦ、ＤＡＤ１、ＡＲＬ４、ＧＮＳ２、トランスグルタミナーゼ２、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素及びＵＤＰ−グルコースセラミドトランスフェラーゼからなる群から選ばれるタンパク質の機能を活性化又は阻害する方法の別の例としては、適用した物質の性質に応じて可逆的又は不可逆的に行うことができる物質を、ＭＩＦ、ＤＡＤ１、ＡＲＬ４、ＧＮＳ２、トランスグルタミナーゼ２、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素及びＵＤＰ−グルコースセラミドトランスフェラーゼからなる群から選ばれるタンパク質に直接結合させ、それによって本発明のタンパク質の機能的ドメインを活性化するか又は阻止することである。
【００２２】
従って、ＭＩＦ、ＤＡＤ１、ＡＲＬ４、ＧＮＳ２、トランスグルタミナーゼ２、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素及びＵＤＰ−グルコースセラミドトランスフェラーゼからなる群から選ばれるタンパク質の生物学的活性を活性化するか又は阻害するのに有用な物質としては、差別的に発現する核酸配列の発現に作用する物質、例えば、対応する遺伝子又は調節配列とハイブリダイズし、それにより遺伝子発現に影響する核酸フラグメント、又はＭＩＦ、ＤＡＤ１、ＡＲＬ４、ＧＮＳ２、トランスグルタミナーゼ２、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素及びＵＤＰ−グルコースセラミドトランスフェラーゼからなる群から選ばれるタンパク質自体又は他の天然に発生する細胞成分により活性化又は阻害するのに作用する物質、例えば、本発明のタンパク質に酵素学的に作用する他のタンパク質、例えば、タンパク質キナーゼがあげられる。
【００２３】
それ故、本発明は、例えば、本発明のタンパク質の遺伝子をコードする核酸配列、又は該核酸配列のフラグメント、誘導体、突然変異体又は変異体である物質であって、該核酸配列又はそのフラグメント、誘導体、突然変異体又は変異体が、遺伝子発現レベルに影響を与えることができる前記物質、例えば、アンチセンス核酸、リボザイムとして適当な核酸分子、又は三重らせん形成に適当な核酸分子に関する。
本発明はまた、例えば、ＭＩＦ、ＤＡＤ１、ＡＲＬ４、ＧＮＳ２、トランスグルタミナーゼ２、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素及びＵＤＰ−グルコースセラミドトランスフェラーゼからなる群から選ばれるタンパク質に直接結合しているか又はその活性化と相互作用し、それによりその生物学的活性に影響を与える有機若しくは無機化合物又は抗体である物質に関する。
【００２４】
更なる観点において、本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸、好ましくはメッセンジャーＲＮＡ、又は細胞、好ましくはマクロファージ、より好ましくは炎症部位から単離したマクロファージ、さらにより好ましくは慢性炎症性気道疾患に罹っている被験者の炎症部位から単離したマクロファージにおける本発明のタンパク質自身の発現レベルを測定するための方法に関する。そのような方法は、例えば、物質が本発明の活性剤であるか又は阻害剤であるか測定するための上に概要を示した方法において、差別的に発現する核酸配列発現レベルに物質が影響を与えることができるかどうか試験するのに使用することができる。しかしながら、本発明の発現レベルを測定するための方法はまた、マクロファージの活性化状態を試験するのに、例えば、活性化過剰マクロファージにより引き起こされる疾患の治療の結果を調査するか又は診断するために使用することができる。前記マクロファージは、哺乳類であるのが好ましく、ヒト細胞であるのがより好ましい。従って、本発明のマクロファージは、哺乳類の炎症部位、より好ましくはヒトの炎症部位から得るのが好ましい。従って、本発明はまた、慢性炎症性疾患の診断方法、又は該疾患の監視方法、例えば、マクロファージにおいて本発明のタンパク質をコードする核酸、好ましくはメッセンジャーＲＮＡ、又は本発明のタンパク質自身の発現レベルを測定することを含む、慢性炎症性疾患の治療が必要な患者の治療結果を監視する方法に関する。
【００２５】
本発明のタンパク質をコードする核酸、好ましくはメッセンジャーＲＮＡ、又は本発明のタンパク質自身の発現レベルを測定する方法は、発現レベルの測定目的に応じ、ルシフェラーゼアッセイ等のレポーター遺伝子駆動アッセイを介するか又はハイブリダイゼーション技術を介する各ＲＮＡ転写物の濃度を測定するといった公知の方法により、又はそれぞれの抗体を使用する本発明のタンパク質のタンパク質濃度を測定することにより行うことができる。
本発明はまた、慢性炎症性気道疾患を治療するための本発明の物質の使用に関する。本発明の別の態様は、活性剤又は阻害剤であると測定された本発明の物質の少なくとも１種を含有する医薬組成物に関する。本発明の組成物は、それ自体公知の方法により、例えば、慣用の混合、溶解、粉砕、ドラジェ製造、微粒子化（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、粉末化、乳化、カプセル化、包括化（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）又は凍結乾燥方法により製造することができる。
【００２６】
本発明の活性化するか又は阻害する物質を慢性炎症性気道疾患を治療するための薬剤として使用するために、該物質を動物モデルで、例えば、炎症性気道疾患に罹っている動物又は本発明のタンパク質を発現するトランスジェニック動物で試験することができる。
本発明の物質の毒性及び治療効果は、細胞培養及び動物実験をしてＩＣ５０、ＬＤ５０及びＥＤ５０を測定することを含む、標準的な医薬的方法により測定することができる。得られたデータは、動物、より好ましくはヒトの投与量範囲を見積もるのに使用する。投与量範囲はまた投与形態（錠剤、カプセル、エアゾールスプレー、アンプル等）及び投与ルート（例えば、経皮、経口、口内（ｂｕｃｃａｌ）、点鼻、非経口、吸入、気管内又は直腸）にもまた依存する。
【００２７】
有効成分として本発明の物質の少なくとも１種を含有する医薬組成物は、慣用の方法により処方することができる。そのような組成物の製造方法は、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ”に記載されている。本発明の物質の少なくとも１種を処方するのに有用な成分の例は、国際公開公報第９９／１８１９３号パンフレットに記載されている。この文献は本明細書に含まれるものとする。
更なる観点において、本発明は、慢性炎症性気道疾患を治療する方法に関する。該方法は、慢性炎症性気道疾患の治療が必要な生物、好ましくはヒトに、物質が本発明のタンパク質の活性剤であるか又は阻害剤であるかを測定するための本発明の方法により活性剤であるか又は阻害剤であると測定された少なくとも１種の物質を含有する医薬組成物の適当な量を投与することを含む。
【００２８】
他の態様において、本発明は、本発明のタンパク質の活性剤であるか又は阻害剤であると測定された物質を投与することを含む、マクロファージにおける本発明のタンパク質の濃度を選択的に調節する方法に関する。
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、限定的に解釈すべきではない。しかしながら、以下の実施例は本発明の最も好ましい態様を示すものである。
【００２９】
実施例
実施例１：比較発現プロファイリング
以下は、本発明のタンパク質を同定するために、どのようにしたら比較発現プロファイリングを行うことが出来るかを具体的に示すものである。
１．１．  被験者の選択
３群の被験者について研究した：健康な非喫煙者、健康な喫煙者及びＣＯＰＤ患者。
肺機能を評価するために、被験者は肺活量を測定しなければならない。年齢及び身長に基づく簡単な計算を使用して結果を特徴付けた。ＣＯＰＤ患者については、その予測ＦＥＶ１％が＜７０％の者について研究した。健康な喫煙者は、ＣＯＰＤ患者と年齢及び喫煙暦を合わせたが正常な肺機能を有する者である。健康な非喫煙者は、正常な肺機能を有し、これまで喫煙したことがない。健康な非喫煙者の群は、喘息を除外するためメタコリン挑戦（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）を有する。この方法は、各投与間で肺活量を測定することによる、被験者に投与するメタコリン量を増やすことを必要とする。ＦＥＶ１が２０％低下したとき、試験を中止し、ＰＣ２０を計算する。これがＦＥＶ１を２０％低下させるメタコリンの投与量に相当する。喘息が存在しない証拠として、３２より大きい値を必要とする。全被験者は通常のアレルゲンに対する皮膚プリックテストをし、陰性の結果を有することを必要とする。これによりアトピー性の個体を除く。被験者の病歴を監視し、付随する（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ）疾患を除外した。
【００３０】
１．２． ＢＡＬ（気管支肺胞洗浄（ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ ｌａｖａｇｅ））方法
ＢＡＬ前にミダゾラムを投与して被験者を落ち着かせた。局所麻酔スプレーを使用して咽頭の裏に麻酔をした。７ｍｍ オリンパス気管支鏡を使用した。洗浄領域は右側中央部の突出部（ｌｏｂｅ）である。２５０ｍｌの滅菌生理食塩水を点滴（ｉｎｓｔｉｌｌ）し、直ぐに吸引した。得られた吸引液はマクロファージを含有した。
１．３． ＢＡＬ処理
滅菌ガーゼを通してＢＡＬを濾過し、細片を除去した。該細胞をＨＢＳＳ中で２回洗浄し、１ｍｌ ＨＢＳＳ （Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に再懸濁し、計測した。マクロファージを引き出して、１５ ｍｌ Ｆａｌｃｏｎ ｂｌｕｅ−ｃａｐ ポリプロピレンを使用してペレットにし、１０，０００，０００細胞当たり１ ｍｌ Ｔｒｉｚｏｌ試薬濃度においてＴｒｉｚｏｌ 試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁し、次いで、−７０℃において凍結した。
【００３１】
１．４．  差別的（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）遺伝子発現分析
全ＲＮＡを、実施例１．３により得たマクロファージサンプルから抽出した。ピペットを通してＴｒｉｚｏｌ中細胞懸濁液をホモジナイズし、室温で５分間インキュベートした。Ｔｒｉｚｏｌ １ｍＬ当たり２００μＬのクロロホルムを添加し、該混合物を注意深く１５秒間混合し、室温で３分以上インキュベートした。サンプルを４℃において、１５分間１００００ｇでスピンした。上相を新しい反応チューブに移し、室温で１０分間、Ｔｒｉｚｏｌ １ｍＬ当たり０．５ ｍｌのイソプロパノールを添加することによりＲＮＡを沈殿させた。次いで、４℃において１００００ｇで１０分間ミクロ遠心分離器を使用することにより該沈殿物をペレット状にし、該ペレットを７５％エタノールで２回洗浄し、風乾し、及びＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏに再懸濁した。
Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）によりＲＮＡの洗浄を行い、ＲＮＡの純度を上げた。ＲＮＡの純度は、アガロースゲル電気泳動により測定し、濃度は２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収により測定した。
【００３２】
５μｇの各ＲＮＡをｃＤＮＡ合成に使用した。第一及び第二ストランド合成は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｃｈｏｉｃｅ ｓｙｓｔｅｍ （Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により行った。総体積１１μＬのＲＮＡ及び１μＬの１００μＭ Ｔ７−（ｄｔ）２４プライマー中で、配列番号１に記載の配列を７０℃まで１０分間加熱し、氷上で２分間冷却した。最終濃度の１倍（１×）にするための第一ストランド溶液、濃度１０ ｍＭにするためのＤＴＴ及び最終濃度０．５ｍＭにするためのｄＮＴＰ混合物を、総体積１８μＬに添加した。該反応混合物を４２℃において２分間インキュベートし、２μＬのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ 逆転写酵素（２００ Ｕ／μＬ）を添加した。第二ストランドを合成するため、１．１５ｘ第二ストランド溶液、２３０μＭ ｄＮＴＰｓ、１０Ｕ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ リガーゼ（１０Ｕ／μＬ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ ポリメラーゼ（１０ Ｕ／μＬ）， ＲＮａｓｅ Ｈ （２Ｕ／μＬ）を含有する１３０μＬの混合物を、第一ストランド合成の反応に加え、ピペットで注意深く混合した。１６℃において２時間第二ストランド合成を行い、次いで２μＬのＴ４ ＤＮＡ ポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）を添加し、１６℃で５分間インキュベートし、１０μＬの０．５ Ｍ ＥＤＴＡを添加することにより、反応を停止した。
【００３３】
ｃＲＮＡ合成の前に、二本鎖ｃＤＮＡを精製した。該ｃＤＮＡを等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）と混合し、未結合のヌクレオチドからｃＤＮＡを分離するために、ミクロ遠心分離中で相ロック（ｌｏｃｋ）ゲル（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）のゲルマトリックスによりスピンした。水相を酢酸アンモニウム及びエタノールで沈殿させた。続いて、ｃＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に使用した。製造業者（ＥＮＺＯ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）の手順に従いＥＮＺＯ ＢｉｏＡｒｒａｙ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔを使用してｃＲＮＡ合成を行った。簡単に説明すると、ｃＤＮＡを、総体積４０μＬの１ｘ ＨＹ 反応溶液、１×ビオチンラベルしたリボヌクレオチド、１ｘ ＤＴＴ、１ｘ Ｒｎａｓｅ阻害剤混合物及び１ｘ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと共に３７℃で５時間インキュベートした。次いで、該反応混合物をＲｎｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を通して精製し、酢酸アンモニウム及びエタノールでｃＲＮＡを沈殿させ、最後にＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。２６０ｎｍにおいてＵＶ分光器により濃度を測定した。残りのｃＤＮＡを１ｘ 断片化緩衝液（５ｘ断片化緩衝液：２００ｍＭ 酢酸トリス、ｐＨ ８．１、 ５００ ｍＭ ＫＯＡｃ、１５０ ｍＭ ＭｇＯＡｃ）と共に９４℃において３５分間インキュベートした。
【００３４】
ＤＮＡチップをハイブリダイズするために、１５μｇのｃＲＮＡを使用し、総体積３００μＬの５０ｐＭビオチンラベルしたコントロールＢ２ オリゴヌクレオチド、配列番号１６に示した配列、１ｘ ｃＲＮＡカクテル、０．１ｍｇ／ｍｌ ｈｅｒｒｉｎｇ 精子ＤＮＡ、０．５ｍｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ、１ｘ ＭＥＳ （２−［Ｎ−モルホリノ］−エタンスルホン酸）ハイブリダイゼーション溶液と混合した。該ハイブリダイゼーション混合物を９９℃まで５分間加熱し、４５℃に１０分間で冷却し、２００μＬの混合物を使用してプローブ配列に満たした。４５℃において６０ｒｐｍで１６時間ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後、チップ上のハイブリダイゼーション混合物を、３００μＬの非ストリンジェント洗浄液（１００ｍＭ ＭＥＳ， １００ｍＭ ＮａＣｌ， ０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）と置換した。このチップをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｆｌｕｉｄｉｃｓステーションに挿入し、ＥｕｋＧＥ−ＷＳ２手順により洗浄及び染色した。チップ当たりの染色溶液は、６００μＬの１ｘ染色液（１００ｍＭ ＭＥＳ， １Ｍ ＮａＣｌ， ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）、２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌ ＳＡＰＥ（ストレプトアビジンフィコエリトリン）（Ｄｉａｎｏｖａ）を含有し、抗体溶液は、１ｘ染色液、２ ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．１ ｍｇ／ｍｌ ヤギＩｇＧ， ３μｇ／ｍｌ ビオチニル化抗体を含有した。洗浄及び染色処理後、チップをＨＰ Ｇｅｎｅ Ａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ （Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）でスキャンした。
【００３５】
データ分析は、ＣＯＰＤ喫煙者から単離したＲＮＡでハイブリダイズしたチップと健康な喫煙者から単離したＲＮＡでハイブリダイズしたチップとの比較により行った。
以下に、差別的に発現した遺伝子及び本発明の方法により確認したその機能を具体的に示す。
【００３６】
実施例２： ＭＩＦ
ＣＯＰＤ患者において一貫して上方制御していると確認された遺伝子は、ＭＩＦ （配列番号３， ４）をコードする。ＭＩＦは、下垂体細胞、マクロファージ及びＴ細胞により分泌され、その合成は、ＬＰＳ、ＴＮＦα、ＩＦＮ−γ等の炎症誘発性刺激により誘発される。ＭＩＦ自身は、糖質コルチコイドの反作用する抑制効果による炎症誘発性活性及び細菌の湿潤に対する炎症を誘発することによる炎症誘発性活性を有する。ＭＩＦを中和することにより、ある種のマウスモデルにおいて敗血症ショックを予防することができる（Ｃａｌａｎｄｒａ ｅｔ ａｌ． １９９４， Ｂｅｒｎｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ． １９９８， Ｃａｌａｎｄｒａ ｅｔ ａｌ． ２０００）。
ＭＩＦは、健康な喫煙者と比較してＣＯＰＤ喫煙者では、一貫して上方制御されていることが分かった（４２％）。これを、“倍（ｆｏｌｄ）変化”値（表１）に示した。ＣＯＰＤ喫煙者と健康な喫煙者とを比較するためのｐ値は０．０３であった。
【００３７】
【表１】
2004516038.tif 000002
【００３８】
２．１． ＭＩＦのクローニング
ヒトＴＨＰ−１細胞から抽出した全ＲＮＡから、ＭＩＦをクローン化した。５μｇ ＲＮＡを、オリゴ（ｄｔ）１８プライマー、１ｘ第一ストランド緩衝液、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ及び２Ｕ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ （Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）により４２℃において５０分間ｃＤＮＡに逆転写した。次いで、７０℃、１５分間で該反応を終了し、ｃＤＮＡ濃度をＵＶ分光光度計で測定した。ＭＩＦを増幅させるために、ＭＩＦ用の配列特異性プライマー（配列番号１７の前（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及び配列番号１８の逆（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマー）１０ｐｍｏｌｅｓ及びｃＤＮＡ１００ｎｇをＰＣＲに使用した。反応条件は以下の通りである：９４℃で２分間、９４℃で３０秒間を３５サイクル、５３℃で３０秒、７２℃で９０秒、次いでＴａｑ ＤＮＡ−ポリメラーゼにより７２℃で７分間。反応混合物を２％アガロースゲルで分離し、約３６０ｂｐのバンドを切断し、ＱＩＡＥＸ ＩＩ 抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。精製したバンドの濃度を測定し、約１２０ｎｇを、３００ｎｇのｐＤＯＮＲ２０１、Ｇａｔｅｗａｙ ｓｙｓｔｅｍ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のドナーベクター、１ｘ ＢＰクローナーゼ（ｃｌｏｎａｓｅ）反応緩衝液、Ｂｐクローナーゼ酵素混合物（総体積２０μＬ）と共に、２５℃で６０分間インキュベートした。次いで、反応物を２μＬのプロテイナーゼＫと共にインキュベートし、３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、該反応混合物をコンピテントＤＢ３．１細胞に電気穿孔し、カナマイシン含有プレートで培養した。配列決定によりクローンを確認した。データベースに入れた配列と同じ配列（ａｃｃ． Ｌ１９６８６）を有する、ｐＤＯＮＲ−ＭＩＦと命名したクローンを次の実験に使用した。
【００３９】
２．２ ＭＩＦ用形質移入ベクターの生成
１．１に記載したＭＩＦ含有ベクターを使用して、ＭＩＦがＣＭＶプロモータの制御下で発現するＧａｔｅｗａｙ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の“ａｔｔＲ１”及び“ａｔｔＲ２”組換え部位を含有する発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ａｔｔＲにＭＩＦ用ｃＤＮＡを移行させた。１５０ｎｇの“エントリー（ｅｎｔｒｙ）ベクター”ｐＤＯＮＲ−ＭＩＦを、ＴＥ （Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ）で２０μＬにした、１５０ｎｇの“目的（ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ）ベクター”ｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ａｔｔＲ、４μＬのＬＲ クローナーゼ酵素混合物、４μＬ ＬＲ クローナーゼ反応緩衝液と混合し、２５℃で６０分間インキュベートした。次いで、２μＬのプロテイナーゼＫ溶液を添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。氷上で３０分間ＤＮＡと共に細胞をインキュベートした後、４２℃で３０秒間熱ショックを与えることにより、１μＬの反応混合物を５０μＬ ＤＨ５αに形質転換した。細胞に熱ショックを与えた後、４５０μＬのＳ．Ｏ．Ｃ．を添加し、細胞を３７℃で６０分間インキュベートした。１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢプレートに細胞（１００μＬ）を塗抹し、一晩インキュベートした。
挿入物としてＭＩＦと共にｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ａｔｔＲを含有するコロニーをｐｃＤＮＡ／ＭＩＦとし、形質移入研究に使用した。
【００４０】
２．３．  組換えＭＩＦの発現
１．１に記載したＭＩＦ含有ベクターを使用して、Ｇａｔｅｗａｙ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ） の“ａｔｔＲ１”及び“ａｔｔＲ２”組換え部位を有する発現ベクターｇｐＥＴ２８ａｂｃ／ａｔｔＲにＭＩＦ用ｃＤＮＡを移行させた。これらのベクターにより、Ｔ７プロモータの制御下、細菌中で、ｈｉｇで標識した組換えＭＩＦを発現させた。１５０ｎｇの“エントリーベクター”ｐＤＯＮＲ−ＭＩＦを、ＴＥ （Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ）で２０μＬにした、１５０ｎｇの“目的ベクター”ｇｐＥＴ２８ａｂｃ／ａｔｔＲ、４μＬのＬＲクローナーゼ酵素混合物、４μＬ ＬＲ クローナーゼ反応緩衝液と混合し、２５℃で６０分間インキュベートした。次いで、２μＬのプロテイナーゼＫ 溶液を添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。氷上で３０分間ＤＮＡと共に細胞をインキュベートした後、４２℃で３０秒間熱ショックを与えることにより、１μＬの反応混合物を５０μＬ ＤＨ５αに形質転換した。細胞に熱ショックを与えた後、４５０μＬのＳ．Ｏ．Ｃ．を添加し、細胞を３７℃で６０分間インキュベートした。１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢプレートに細胞（１００μＬ）を塗抹し、一晩インキュベートした。
正確な読み枠内にｈｉｇ標識に融合したＭＩＦと共にｇｐＥＴ２８ａｂｃ／ａｔｔＲを含有するコロニーをｐｇＰＥＴ／ＭＩＦとし、細菌内でＭＩＦを発現させるのに用いた。
【００４１】
２．４．  組換えＭＩＦの精製
１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む１ＬのブロスにｐＱＥ／ＭＩＦを含有するＥ． ｃｏｌｉ Ｍ１５（ｐＲＥＰ４）の０．５ｍＬを一晩培養したものを接種した。培養物を、ＯＤ６００が０．６になるまで激しく撹拌しながら３７℃においてインキュベートした。１ｍＭ ＩＰＴＧを添加することにより発現を誘発し、培養物をさらに４時間成長させた。４℃で２０分間４０００×ｇで遠心分離することにより細胞を捕集した。ペレットを−２０℃で凍らせた。
氷上で細胞を解凍し、溶解緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ ８．０、３００ ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール）の２ｍｌ／ｇ細胞ペレット中に再懸濁した。次いで、リゾチームを添加して１ｍｇ／ｍｌにし、氷上で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を超音波処理した（３００Ｗにおいて１０秒間６回破砕）。１０μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａ及び５μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ Ｉを添加し、氷上で１０分間インキュベートした。次いで、４℃で２０分間１００００×ｇにおいて細片を引き出すことにより溶菌液を透明にした。次いで、プロテアーゼ阻害剤（４０μｇ／ｍｌバシトラシン、４μｇ／ｍｌロイペプチン、４μｇ／ｍｌキモトリプシン、１０μｇ／ｍｌ ｐｅｆａｂｌｏｃ、１００μＭ ＰＭＳＦ）を添加した。３ ｍｌのＮｉ−ＮＴＡレジン（Ｑｉａｇｅｎ）を溶菌液に添加し、カラムに充填した。穏やかに撹拌しながら４℃で６０分間レジンに結合させた。次いで、カラム出口を開け、レジンを１２ｍＬの洗浄液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ ８．０、３００ ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール）で２回洗浄し、３ｍＬの溶離液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ ８．０、３００ ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ イミダゾール）で４回溶出した。組換えタンパク質を含有する溶出画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定し、精製したタンパク質をＢｒａｄｆｏｒｄ法により測定した。
【００４２】
２．５．  末梢血由来の単核細胞及びＣＤ４＋ Ｔ細胞の精製
健康なボランティアの血液１０ｍｌを２５ ｍｌ ＰＢＳで希釈し、５０ｍＬファルコンチューブ中１５ｍＬフィコールの上で注意深く重ねた。該チューブを室温で４０分間４００×ｇでスピンした。パスツールピペットで細胞を除き、室温で１０分間５００×ｇにおいて５０ｍＬ ＰＢＳ中で洗浄した。
磁気ビーズを使用してＣＤ４＋ リンパ球を単離した。細胞画分（前段落に記載のもの）を１ｘ１０７ 細胞当たり、８０μＬ ＭＡＣＳ液（ＰＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＢＳＡ）に再懸濁した。２０μＬのＣＤ４＋ 分離ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を１ｘ１０７細胞に添加し、４℃で１５分間インキュベートした。次いで、２０体積のＭＡＣＳ緩衝液を添加し、１０００ｒｐｍで１０分間スピンした。ペレットを、１ｘ１０８ 細胞当たり５００μＬ ＭＡＣＳ液に再懸濁し、３ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液で平衡にした Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎ ＬＳ＋ に加えた。磁気ビーズを３０秒間磁場にさらし、ラベルしたＣＤ４＋ 細胞を保持した。その後、カラムを磁場から離し、ＣＤ４＋細胞を５ｍＬのＭＡＣＳ液で流した。細胞をスピンダウンし、ＲＰＭＩ１６４０， １０％ ＦＣＳに再懸濁した。
同様に、フィコール密度遠心分離により全血からヒト単核細胞を単離した。接種後、非粘着細胞を除くために、細胞を２４時間に２回ＲＰＭＩ １６４０、１０％ ＦＣＳで洗浄した。
【００４３】
２．６． ＭＩＦによる表現型効果／細胞効果
以下のアッセイは、ＭＩＦで過渡的に又は安定的に形質移入されている細胞系ＴＨＰ−１ （Ｔｓｕｃｈｉｙａ ｅｔ ａｌ．， １９８０）又はＭｏｎｏＭａｃ ６ （Ｚｉｅｇｌｅｒ−Ｈｅｉｔｂｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９８８）で行い、読出した情報を、形質移入したようにみせかけた細胞と比較した。また、ＭＩＦの活性を刺激する本発明の物質を添加した。
【００４４】
サイトカインの製造及び放出
単球／マクロファージ細胞系を、２．５〜５ｘ１０５細胞／ｍｌの細胞密度で、ＭＩＦ（１μｇ／ｍＬ）で刺激した。０、１、３、６、１２、２４、４８及び７２時間後に細胞を捕集し、更に研究するために上澄みを凍結し、細胞をＰＢＳで洗浄し、１４３ｍＭβ−メルカプトエタノールを含む４００μＬのＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）中に再懸濁し、ＤＮＡを２０ｇの針で少なくとも５回切断し、−７０℃で保存した。
【００４５】
煙リッチ培地により、タバコの煙による細胞刺激を行った。サプリメント無含有１００ｍＬ ＲＰＭＩ培地を、２本のタバコの煙で灌流した。タバコの煙を５０ｍＬシリンジ中に引き（タバコ１本当たり５０ｍＬ体積の約２０体積）、次いで培地中に灌流した。その後、培地のｐＨを７．４に調整し、０．２μｍフィルタを通して培地を濾過滅菌（ｆｉｌｔｅｒｓｔｅｒｉｌｉｚｅ）した。細胞を煙リッチ培地に再懸濁し、１ｘ１０６細胞／ｍｌの細胞密度で、３７℃で１０分間インキュベートした。次いで細胞をＲＰＭＩ １６４０で２回洗浄し、上述した時間でフラスコ又は２４ウェルプレート（ＭｏｎｏＭａｃ６）に播種した。
全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）により、製造業者の手順に従い単離した。精製したＲＮＡをＴａｑＭａｎ分析に使用した。サイトカインＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−８及びＩＬ−６の発現レベルを測定した。
【００４６】
分泌したサイトカインの検出
培養及び刺激した細胞の上澄み中のタンパク質を、最終濃度が１０％になるまで三塩素酸（ＴＣＡ）を添加することにより沈殿させた。沈殿物を８０％エタノールで２回洗浄し、ペレットを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ ７．４、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ中に再懸濁した。ブラッドフォード法によりタンパク質濃度を測定し、各サンプル５０μｇを１２％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにかけた。ゲルをＰＶＤＦ膜上にブロットし、ＴＢＳＴ中５％ＢＳＡ中で１時間ブロックし、商業的に入手可能な、ヒトＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−８及びＩＬ−６に対する抗体と共に１時間インキュベートした。ＴＢＳＴで洗浄後、セイヨウワサビパーオキシダーゼに結合している抗ヒトＩｇＧと共にブロットをインキュベートし、再度洗浄し、ＥＣＬ化学ルミネッセンスキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で展開した。バンドの強度をＢｉｏＭａｘ Ｘ線フィルム（コダック）で可視化し、濃度計で定量した。
【００４７】
ＣＤ４＋細胞（２．０に記載したもの）を、ＲＰＭＩ １６４０、１０％ ＦＣＳ中９６ウェルプレート（５ｘ１０４細胞／２００μＬ）に接種し、１０ｎｇ／ｍＬ ＭＩＦの存在下又は不存在下、デキサメタゾン（１０ｎＭ）と共にインキュベートした。５％ＣＯ２で加湿した雰囲気中、３７℃において２４時間インキュベートした後、サイトカイン放出（例えばＩＬ−２又はＩＦＮ−γ（インターフェロン−ガンマ）をＥＬＩＳＡにより測定した。ＭＩＦはデキサメタゾンの阻害活性を超え、サイトカインの放出を引き起こした。デキサメタゾンに与えるＭＩＦの反作用する効果を、本発明の物質（０．１−１００ｎｇ／ｍｌ）を反応混合物に添加することにより調節し、ＭＩＦ−媒介効果の阻害％として計算した。
単核におけるサイトカイン放出（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α）を測定するために、デキサメタゾン及びＭＩＦ（前段落に記載したもの）と共に１時間予備インキュベートした後、細胞を１μｇ／ｍＬ ＬＰＳで処理することが必要である。
【００４８】
分泌したマトリックス金属プロテアーゼ及び他のプロテアーゼの検出
サイトカインについて使用した方法と同じ方法を使用した。ウエスタンブロットに使用した抗体は、ヒトＭＭＰ−１、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９及びＭＭＰ−１２にあわない。
分泌したマトリックス金属プロテアーゼの活性
蛍光物質を使用してプロテアーゼ活性を測定した。刺激した細胞と未刺激の細胞とから単離した上澄み（既述のもの）を、総体積５０μＬで、１μＭの基質（Ｄａｂｃｙｌ−Ｇａｂａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ （ＥＤＡＮＳ）−Ａｌａ−Ｌｙｓ−ＮＨ２ （Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ））と共に５分間室温でインキュベートした。反応当たり１２５ｎｇの精製したＭＭＰ−１２で陽性コントロールを行った。励起３２０ｎｍ及び発光４０５ｎｍにおいて蛍光光度分析によりプロテアーゼ活性を測定した。
【００４９】
タンパク質分解活性及び細胞遊走を測定するための別のアッセイにおいて、走化性（Ｂｏｙｄｅｎ）チャンバを使用した。チャンバの上方部分のウェルにおいて、細胞（ウェル当たり１０５細胞）を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の８μｍ層で被覆したフィルター上に置いた。区画の下方部分で、ＭＩＦ（１μｇ／ｍＬ）、ＭＣＰ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）、ロイコトリエンＢ４ （１０ｎｇ／ｍｌ）等の化学遊走物質を培地に添加した。５日後フィルターを除き、Ｍａｔｒｉｇｅｌを通り抜けてきた、下面の細胞を、メタノールで固定し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ染色キット（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）で染色し、光学顕微鏡により高性能視野（４００ｘ）で３回（ｉｎ ｔｈｒｅｅ）カウントした。
【００５０】
走化性アッセイ
走化性を測定するために、４８ウェルの走化性（Ｂｏｙｄｅｎ）チャンバ（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ）を使用した。細胞を、２４時間、ＦＣＳ無含有ＲＰＭＩ培地中で飢えさせた。１００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ、１０ｎｇ／ｍＬ ロイコトリエンＢ４又はＭＣＰ−１で刺激することにより走化性を刺激した。ＭＩＦ（１／ｍＬ）を添加して走化性を阻止した。ＭＩＦ活性を妨げるよう、本発明の物質を、ＦＣＳ無含有ＲＰＭＩ培地中で希釈し、３０μＬを下方区画のウェルと置換した。ポリカーボネートフィルター（孔径８μｍ）で上方区画を下方区画から離した。５０μＬの細胞懸濁液（５ ｘ１０４）を上方区画のウェルに置いた。該チャンバを、５％ＣＯ２で加湿した雰囲気中、３７℃で５時間インキュベートした。次いで、フィルターを除き、上面の細胞をこすり落とし、下面の細胞をメタノール中で５分間固定し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ染色セット（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）で染色した。遊走した細胞を光学顕微鏡により高性能視野（４００ｘ）で３回カウントした。
【００５１】
粘着アッセイ
細胞を捕集し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ及び１μＭ ＢＣＥＣＦ（（２’−７’−ビス−（カルボキシエチル）−５（６’）−カルボキシフルオレセインアセトキシメチル）エステル、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）中に再懸濁し（４ｘ１０６／ｍｌ）、３７℃で２０分間インキュベートした。ＰＢＳ中で細胞を洗浄し、０．１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ中に再懸濁した（３．３ｘ １０６／ｍｌ）。３ｘ１０５細胞（９０μＬ）を、ラミニン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で被覆した９６ウェルの平底プレートの各ウェルに添加し、１０分間放置した。ＭＩＦ（１μｇ／ｍＬ）の存在又は不存在下、本発明の物質を添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで細胞を洗浄し、３７℃で２０分間プレートをインキュベートした。０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで細胞を洗浄し、粘着細胞を１００μＬの０．０２５Ｍ ＮａＯＨ及び０．１％ ＳＤＳで可溶化した。蛍光測定により定量した。
【００５２】
食作用
細胞懸濁液（２．５ｘ１０４ 細胞／ｍｌ）を、５ｍｌのＵ９３７又はＴＨＰ−１と共に６ウェルプレートに播種するか、又は２ｍｌのＭｏｎｏＭａｃ６と共に２４ウェルプレートに播種し、本発明の物質の存在下、５％ＣＯ２で加湿した雰囲気中、３７℃で１時間インキュベートした。ＭＩＦの存在下、本発明の物質を添加し、ＭＩＦの活性を阻害した。熱により不活性化したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ （２０酵母／細胞）の分散懸濁溶液４０μＬを各ウェルに添加した。細胞を３時間より長くインキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、細胞遠心分離した（ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）。サイトスピン調製物をＭａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａで染色し、食菌した粒子を光学顕微鏡によりカウントした。
【００５３】
実施例３：ＤＡＤ１
健康な喫煙者と比較してＣＯＰＤ喫煙者において一貫して下方制御すると確認された遺伝子は、ＤＡＤ１（アポトーシス細胞死に対するディフェンダー１（ｄｅｆｅｎｄｅｒ ａｇａｉｎｓｔ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ １））である。元々、ＤＡＤ１はアポトーシスの陰性レギュレータとして発見された（Ｎａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ． １９９３）。Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅにおけるＯｓｔ２タンパク質に対する相同性により、発生期のポリペプチドにおいてアスパラギン残基上に高マンノースオリゴサッカライドを触媒する、オリゴサッカアリールトランスフェラーゼ複合体の１６ｋＤａサブユットであることが分かった。ＤＡＤ１は、内在性膜タンパク質であり、いたるところに発現する（Ｋｅｌｌｅｈｅｒ ａｎｄ Ｇｉｌｍｏｒｅ １９９７）。
ＤＡＤ１は、健康な喫煙者と比較してＣＯＰＤ喫煙者では、一貫して上方制御されていることが分かった（４２％）。これを、“倍変化”値（表２）に示した。
【００５４】
【表２】
2004516038.tif 000003
【００５５】
該タンパク質をクローン化して、既述のクローニング及びアッセイ法と同様にして設計及びアッセイを行った。
実施例４：ＡＲＬ４
健康な喫煙者と比較してＣＯＰＤの喫煙者において一貫して上方制御すると確認された遺伝子は、ＡＲＬ４（ＡＤＰ−リボシル化ファクター様タンパク質４（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４））である。ＡＲＬは、ＡＤＰ−リボシル化ファクター（ＡＲＦ）のファミリーに属する。ＡＲＦは、小胞及び膜輸送に関連する。ＡＲＬ４は核の中でも外でも検出され、細胞分化に関連する（Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ． １９９９）。
ＡＲＬ４は、健康な喫煙者と比較してＣＯＰＤ喫煙者では、一貫して上方制御されていることが分かっている（４５％）。これを、“倍変化”値（表３）に示した。ＣＯＰＤ喫煙者と健康な喫煙者とを比較する２つの別々の群のｐ値は０．１０及び０．０６であった。
【００５６】
【表３】
2004516038.tif 000004
【００５７】
４．１． ＡＲＬ４のクローニング
ヒト３Ｔ３−Ｌ１から抽出した全ＲＮＡから、ＡＲＬ４をクローン化した。５μｇ ＲＮＡを、オリゴ（ｄｔ）１８プライマー、１ｘ第一ストランド緩衝液、１０ ｍＭ ＤＴＴ、０．５ ｍＭ ｄＮＴＰｓ及び２Ｕ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ （Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）により４２℃において５０分間ｃＤＮＡに逆転写した。次いで、７０℃、１５分間で該反応を終了し、ｃＤＮＡ濃度をＵＶ分光光度計で測定した。ＡＲＬ４を増幅させるために、ＡＲＬ４用の配列特異性プライマー１０ｐｍｏｌｅｓ（配列番号１９の前プライマー及び配列番号２０の逆プライマー）及びｃＤＮＡ１００ｎｇをＰＣＲに使用した。反応条件は以下の通りである：９４℃で２分間、９４℃で３０秒間を３５サイクル、５３℃で３０秒、７２℃で９０秒、次いでＴａｑ ＤＮＡ−ポリメラーゼにより７２℃で７分間。反応混合物を２％アガロースゲルで分離し、約６００ｂｐのバンドを切断し、ＱＩＡＥＸ ＩＩ 抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。この生成物をＢａｍＨ１及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＢａｍＨ１及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したｑＱＥ−３０（Ｑｉａｇｅｎ）にクローン化した。データベースに入れた配列と同じ配列（ａｃｃ． Ｕ７３９６０）を有するｐＱＥ／ＡＲＬ４と命名したクローンを次の実験に使用した。
【００５８】
４．２． ＡＲＬ４の発現
１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む１ＬのブロスにｐＱＥ／ＡＲＬ４を含有するＥ． ｃｏｌｉ Ｍ１５（ｐＲＥＰ４）の０．５ｍＬを一晩培養したものを接種した。培養物を、ＯＤ６００が０．６になるまで激しく撹拌しながら３７℃においてインキュベートした。１ｍＭ ＩＰＴＧを添加することにより発現を誘発し、培養物をさらに４時間成長させた。４℃で２０分間４０００×ｇで遠心分離することにより細胞を捕集した。ペレットを−２０℃で凍らせた。
【００５９】
氷上で細胞を解凍し、溶解緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ ８．０、３００ ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール）の２ｍｌ／ｇ 細胞ペレット中に再懸濁した。次いで、リゾチームを添加して１ｍｇ／ｍｌにし、氷上で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を超音波処理した（３００Ｗにおいて１０秒間６回破砕）。１０μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａ及び５μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ Ｉを添加し、氷上で１０分間インキュベートした。次いで、４℃で２０分間１００００×ｇにおいて細片を引き出すことにより溶菌液を透明にした。次いで、プロテアーゼ阻害剤（４０μｇ／ｍｌバシトラシン、４μｇ／ｍｌロイペプチン、４μｇ／ｍｌキモトリプシン、１０μｇ／ｍｌ ｐｅｆａｂｌｏｃ、１００μＭ ＰＭＳＦ）を添加した。３ ｍｌのＮｉ−ＮＴＡレジン（Ｑｉａｇｅｎ）を溶菌液に添加し、カラムに充填した。穏やかに撹拌しながら４℃で６０分間レジンに結合させた。次いで、カラム出口を開け、レジンを１２ｍＬの洗浄液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ ８．０、３００ ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール）で２回洗浄し、３ｍＬの溶離液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ ８．０、３００ ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ イミダゾール）で４回溶出した。組換えタンパク質を含有する溶出画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定し、精製したタンパク質をＢｒａｄｆｏｒｄ法により測定した。
【００６０】
４．３ ＧＴＰγＳ結合アッセイ
組換えＡＲＬ４（１μＭ）を、３７℃で、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ （ｐＨ７．５）、１ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＭｇＣｌ２存在下又は不存在下（図の凡例に示した通り）、２ｍＭ ＥＤＴＡ （Ｍｇ２＋無含有１ｍＭ又は１μＭ）、１００ｍＭ ＫＣｌ中、［３５Ｓ］ＧＴＰＳ又は［３Ｈ］ＧＤＰ （１０μＭ，〜１０００ ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）とともにインキュベートした。ＧＴＰγＳ結合反応を始める前に、本発明の物質を、ＡＲＬ４と共に５分間４℃において０．５〜３００ｎＭの濃度範囲で予備インキュベートした。様々な時間において（１０秒から３０分）、２５μＬのサンプル（ＡＲＦ ２５ｐｍｏｌ）を除去し、氷冷した２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２中に希釈し、２５ｍｍ Ｂａ ８５ニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｌｌ）で濾過した。２ｍＬの同じ緩衝液でフィルターを２回洗浄し、乾燥し、シンチレーションカウンターで定量した。
【００６１】
実施例５：ＧＮＳ
健康な喫煙者と比較してＣＯＰＤの喫煙者において一貫して下方制御すると確認された遺伝子は、ＧＮＳ（グルコサミン−６−サルファターゼ（ＧＮＳ））である。ＧＮＳは、ヘパランのＮ−アセチル−ｄ−グルコサミン−６−サルフェートユニットの６−サルフェート基を加水分解する（Ｋｒｅｓｓｅ ｅｔ ａｔ． １９８０）。ＧＮＳは、健康な喫煙者と比較してＣＯＰＤ喫煙者では、一貫して下方制御されていることが分かった（４４％）。これを、“倍変化”値（表４）に示した。ＣＯＰＤ喫煙者と健康な喫煙者とを比較する２つの別々の群のｐ値は０．０５及び０．００６であった。
【００６２】
【表４】
2004516038.tif 000005
【００６３】
該タンパク質をクローン化して、既述のクローニング及びアッセイ法と同様にして設計及びアッセイを行った。
実施例６：トランスグルタミナーゼ２
健康な喫煙者と比較してＣＯＰＤの喫煙者において一貫して下方制御する確認された遺伝子は、トランスグルタミナーゼ２である。この酵素は、（γ−グルタミル）リシン結合の形成及びポリアミンのタンパク質への連結による特異的なタンパク質の共有結合架橋を触媒するカルシウム依存トランスグルタミナーゼのファミリーに属する（Ｆｏｌｋ １９８０）。トランスグルタミナーゼを分泌することもできる。生理学的機能はよく知られていないが、骨形成、傷の治療、及び他の再生過程において起こるマトリックスの専門的な過程に関連すると思われる（Ｌｕ ｅｔ ａｌ． １９８５）。
トランスグルタミナーゼ２は、健康な喫煙者と比較してＣＯＰＤ喫煙者では、一貫して下方制御されていることが分かった（５５％）。これを、“倍変化”値（表５）に示した。ＣＯＰＤ喫煙者と健康な喫煙者とを比較する２つの別々の群のｐ値は０．０４及び０．１６であった。
【００６４】
【表５】
2004516038.tif 000006
【００６５】
該タンパク質をクローン化して、既述のクローニング及びアッセイ法と同様にして設計及びアッセイを行った。
実施例７：ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素
健康な喫煙者と比較してＣＯＰＤの喫煙者において一貫して下方制御すると確認された遺伝子は、ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素である。ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素は、△９においてパルミトイル−ＣｏＡ及びステアロイル−ＣｏＡの酸化を触媒し、それぞれ、モノ不飽和脂肪アシル−ＣｏＡエステル、パルミトイル−ＣｏＡ及びアオレオイル−ＣｏＡ形成をする（Ｅｎｏｃｈ ｅｔ ａｌ． １９７６）。
ステアリル−ＣｏＡ−不飽和化酵素は、健康な喫煙者と比較してＣＯＰＤ喫煙者では、一貫して下方制御されていることが分かった（４８％）。これを、“倍変化”値（表６）に示した。ＣＯＰＤ喫煙者と健康な喫煙者とを比較する２つの別々の群のｐ値は０．０３及び０．１５であった。
【００６６】
【表６】
2004516038.tif 000007
【００６７】
該タンパク質をクローン化して、既述のクローニング及びアッセイ法と同様にして設計及びアッセイを行った。
実施例８：ＵＤＰ−グルコースセラミドトランスフェラーゼ
健康な喫煙者と比較してＣＯＰＤの喫煙者において一貫して下方制御すると確認された遺伝子は、ＵＤＰ−グルコースセラミドトランスフェラーゼである。この酵素は、ＵＤＰ−グルコースからセラミドへのグルコースの移行を触媒する。生成物グルコシル−セラミドは、分化、粘着、増殖、及び細胞−細胞認識等の多くの細胞過程に関連する、３００より多いグリコシンゴリピッドのコア構造として機能する（Ｂａｓｕ ｅｔ ａｌ． １９６８， Ｉｃｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．１９９６）。
セラミドトランスフェラーゼは、健康な喫煙者と比較してＣＯＰＤ喫煙者では、一貫して下方制御されていることが分かった（４８％）。これを、“倍変化”値（表７）に示した。
【００６８】
【表７】
2004516038.tif 000008
【００６９】
該タンパク質をクローン化して、既述のクローニング及びアッセイ法と同様にして設計及びアッセイを行った。
Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ：
ＭＩＦ
Ｃａｌａｎｄｒａ， Ｔ．， Ｂｅｒｎｈａｇｅｎ， Ｊ．， Ｍｉｔｃｈｅｌｌ， Ｒ．Ａ．， ａｎｄ Ｂｕｃａｌａ， Ｒ． （１９９４）． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７９， １９８５−１９０２．
Ｂｅｒｎｈａｇｅｎ， Ｊ．， Ｃａｌａｎｄｒａ， Ｔ．， ａｎｄ Ｂｕｃａｌａ， Ｒ． （１９９８）． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ７６， １５１−１６１．
Ｃａｌａｎｄｒａ， Ｔ．， Ｅｃｈｔｅｎａｃｈｅｒ， Ｂ．， Ｌｅ Ｒｏｙ， Ｄ． Ｐｕｇｉｎ， Ｊ．， Ｍｅｔｚ， Ｃ．Ｎ．， Ｈｕｌｔｎｅｒ， Ｌ．， Ｈｅｕｍａｎｎ， Ｄ．， Ｍａｎｎｅｌ， Ｄ．， Ｂｕｃａｌａ， Ｒ．， ａｎｄ Ｇｌａｕｓｅｒ， Ｍ．Ｐ． （２０００）． Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ６， １６４−１７０．
ＤＡＤ１
Ｎａｋａｓｈｉｍａ， Ｔ．， Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ， Ｔ．， Ｋｕｒａｏｋａ， Ａ．， Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ， Ｋ．， Ｓｈｉｂａｔａ， Ｙ．， Ｋｏｍｉｙａｍａ， Ｓ．， Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ， Ｔ． （１９９３）． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １３， ６３６７−６３７４．
Ｋｅｌｌｅｈｅｒ， Ｄ．， ａｎｄ Ｇｉｌｍｏｒｅ， Ｒ． （１９９７）． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４， ４９９４−４９９９．
ＡＲＬ４
Ｊａｃｏｂｓ， Ｓ．， Ｓｃｈｉｌｆ， Ｃ．， Ｆｌｉｅｇｅｒｔ， Ｆ．， Ｋｏｌｉｎｇ， Ｓ．， Ｗｅｂｅｒ， Ｙ．， Ｓｃｈｕｒｍａｎｎ， Ａ．， ａｎｄ Ｊｏｏｓｔ， Ｈ．−Ｇ． （１９９９）． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４５６， ３８４−３８８．
ＧＮＳ
Ｋｒｅｓｓｅ， Ｈ．， Ｐａｓｃｈｋｅ， Ｅ．， ｖｏｎ Ｆｉｇｕｒａ， Ｋ．， Ｇｉｌｂｅｒｇ， Ｗ．， ａｎｄ Ｆｕｃｈｓ， Ｗ． （１９８０）． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７７， ６８２２−６８２６．
Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ２
Ｆｏｌｋ， Ｊ．Ｅ． （１９８０）． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４９， ５１７−５３１
Ｌｕ， Ｓ．， Ｓａｙｄａｋ， Ｍ．， Ｇｅｎｔｉｌｅ， Ｖ．， Ｓｔｅｉｎ， Ｊ．Ｐ．， ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ， Ｐ．Ｊ．Ａ． （１９９５）． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０， ９７４８−９７５６．
Ｓｔｅａｒｏｙｌ−ＣｏＡ−Ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ
Ｅｎｏｃｈ， Ｈ．Ｇ．， Ｃａｔａｌａ， Ａ．， ａｎｄ Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｅｒ， Ｐ． （１９７６）． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５１， ５０９５−５１０３．
ＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ Ｃｅｒａｍｉｄｅ Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ
Ｂａｓｕ， Ｓ．， Ｋａｕｆｍａｎｎ， Ｂ．， ａｎｄ Ｒｏｓｅｍａｎｎ， Ｓ． （１９６８）． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４３， ５８０２−５８０７．
Ｉｃｈｉｋａｗａ， Ｓ．， Ｓａｋｉｙａｍａ， Ｈ．， Ｓｕｚｕｋｉ， Ｇ．， Ｊｗａ Ｈｉｄａｒｉ， Ｋ．Ｉ．−Ｐ．， ａｎｄ Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ， Ｙ． （１９９６）． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９３， ４６３８−４６４３．
Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ
Ｔｓｕｃｈｉｙａ， Ｓ．， Ｙａｍａｂｅ， Ｍ．， Ｙａｍａｇｕｃｈｉ， Ｙ．， Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｙ．， Ｋｏｎｎｏ， Ｔ．， ａｎｄ Ｔａｄａ， Ｋ． （１９８０）． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ２６， １７１−１７６．
Ｚｉｅｇｌｅｒ−Ｈｅｉｔｂｒｏｃｋ， Ｈ．Ｗ．， Ｔｈｉｅｌ， Ｅ．， Ｆｕｔｔｅｒｅｒ， Ａ．， Ｈｅｒｚｏｇ， Ｖ．， Ｗｉｒｔｚ， Ａ．， ａｎｄ Ｒｉｅｔｈｍｕｌｌｅｒ， Ｇ． （１９８８）． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ４１， ４５６−４６１．
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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