(57)【要約】本発明は野生型ＣＴＬＡ４または非突然変異型ＣＴＬＡ４Ｉｇよりも高いアビディティーでＣＤ８０および／またはＣＤ８６抗原に結合する可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子を提供する。本可溶性ＣＴＬＡ４分子は、Ｓ２５〜Ｒ３３領域内およびＭ９７〜Ｇ１０７領域内の特定のアミノ酸残基が突然変異しているＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを含む第１のアミノ酸配列を持つ。本発明の突然変異体分子はその突然変異体分子の溶解性を増大させる第２のアミノ酸配列を含んでもよい。
2004511213.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）＋２９位のアラニンがチロシン、ロイシン、トリプトファンおよびスレオニンからなる群より選択されるアミノ酸で置換され、かつ（ｂ）＋１０４位のロイシンがグルタミン酸で置換されているＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを含む、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６を結合するＣＴＬＡ４突然変異体分子。
【請求項２】
可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子の溶解性、アフィニティーまたは結合価を変化させるアミノ酸配列をさらに含む請求項１のＣＴＬＡ４突然変異体分子。
【請求項３】
アミノ酸配列がヒト免疫グロブリン定常領域を含む請求項２のＣＴＬＡ４突然変異体分子。
【請求項４】
可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子の分泌を可能にするアミノ酸配列をさらに含む請求項２のＣＴＬＡ４突然変異体分子。
【請求項５】
アミノ酸配列がオンコスタチンＭシグナルペプチドを含む請求項４のＣＴＬＡ４突然変異体分子。
【請求項６】
図７に示すように＋１位のメチオニンおよび＋１２４位のアスパラギン酸を含む請求項１のＣＴＬＡ４突然変異体分子。
【請求項７】
図７に示すように−１位のアラニンおよび＋１２４位のアスパラギン酸を含む請求項１のＣＴＬＡ４突然変異体分子。
【請求項８】
ヒト免疫グロブリン定常領域が図７に示すように＋１３０位のシステインがセリンで置換され、＋１３６位のシステインがセリンで置換され、＋１３９位のシステインがセリンで置換され、かつ＋１４８位のプロリンがセリンで置換されるように突然変異している請求項３のＣＴＬＡ４突然変異体分子。
【請求項９】
図７に示すように＋２９位のアラニンがチロシンで置換され、かつ＋１０４位のロイシンがグルタミン酸で置換されているＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを含む、ＣＴＬＡ４より高いアビディティーでＣＤ８０および／またはＣＤ８６に結合する可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子。
【請求項１０】
可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子の溶解性、アフィニティーまたは結合価を変化させるアミノ酸配列をさらに含む請求項９のＣＴＬＡ４突然変異体分子。
【請求項１１】
アミノ酸配列がヒト免疫グロブリン定常領域を含む請求項１０のＣＴＬＡ４突然変異体分子。
【請求項１２】
可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子の分泌を可能にするアミノ酸配列をさらに含む請求項１０のＣＴＬＡ４突然変異体分子。
【請求項１３】
アミノ酸配列がオンコスタチンＭシグナルペプチドを含む請求項１２のＣＴＬＡ４突然変異体分子。
【請求項１４】
図７に示すように＋１位のメチオニンおよび＋１２４位のアスパラギン酸を含む請求項９のＣＴＬＡ４突然変異体分子。
【請求項１５】
図７に示すように−１位のアラニンおよび＋１２４位のアスパラギン酸を含む請求項９のＣＴＬＡ４突然変異体分子。
【請求項１６】
ヒト免疫グロブリン定常領域が図７に示すように＋１３０位のシステインがセリンで置換され、＋１３６位のシステインがセリンで置換され、＋１３９位のシステインがセリンで置換され、かつ＋１４８位のプロリンがセリンで置換されるように突然変異している請求項１１のＣＴＬＡ４突然変異体分子。
【請求項１７】
図８に示すように＋１０４位のロイシンがグルタミン酸で置換されているＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを含む、ＣＴＬＡ４より高いアビディティーでＣＤ８０および／またはＣＤ８６に結合する可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子。
【請求項１８】
請求項１の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子に相当するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項１９】
請求項９の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子に相当するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項２０】
図７または図８に示すようにヌクレオチド位置＋１のアデニンで始まり＋１０７１のアデニンで終わるヌクレオチド配列を持つ請求項１８の核酸分子。
【請求項２１】
図７または図８に示すようにヌクレオチド位置＋１のアデニンで始まり＋１０７１のアデニンで終わるヌクレオチド配列を持つ請求項１９の核酸分子。
【請求項２２】
図７または図８に示すように−３のグアニジンで始まり＋１０７１のアデニンで終わるヌクレオチド配列を持つ請求項１８の核酸分子。
【請求項２３】
図７または図８に示すように−３のグアニジンで始まり＋１０７１のアデニンで終わるヌクレオチド配列を持つ請求項１９の核酸分子。
【請求項２４】
請求項１８〜２３のいずれか一項のヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項２５】
ｐＤ１６Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇと名付けられ、ＡＴＣＣにＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−２１０４として寄託された、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇをコードするベクター。
【請求項２６】
適切な宿主細胞に請求項２４または２５のベクターを含んでなる宿主ベクター系。
【請求項２７】
適切な宿主細胞が細菌細胞または真核細胞である請求項２６の宿主ベクター系。
【請求項２８】
請求項２４または２５のベクターを持つ宿主細胞。
【請求項２９】
真核細胞である請求項２８の宿主細胞
【請求項３０】
真核細胞がＣＯＳ細胞である請求項２９の宿主細胞。
【請求項３１】
真核細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である請求項２９の宿主細胞。
【請求項３２】
ＣＨＯ細胞がＤＧ４４、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ１ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞株、ＥＣＡＣＣ８５０５０３０２のＣＨＯ、ＣＨＯクローン１３、ＣＨＯクローンＢ、ＣＨＯ−Ｋ１／ＳＦおよびＲＲ−ＣＨＯＫ１からなる群より選択される請求項３１の宿主細胞。
【請求項３３】
可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体タンパク質の製造方法であって、請求項２６の宿主ベクター系をＣＴＬＡ４突然変異体タンパク質が宿主細胞内で産生されるように生育すること、およびそのようにして産生されたタンパク質を回収することを含む方法。
【請求項３４】
Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの製造方法であって、請求項２８の宿主細胞をＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇが宿主細胞内で産生されるように生育すること、およびそのようにして産生されたタンパク質を回収することを含む方法。
【請求項３５】
請求項３３の方法によって製造される可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体タンパク質。
【請求項３６】
請求項３４の方法によって製造されるＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ。
【請求項３７】
Ｔ細胞とＣＤ８０陽性および／またはＣＤ８６陽性細胞との相互作用を調節する方法であって、Ｔ細胞とＣＤ８０陽性および／またはＣＤ８６陽性細胞との相互作用を妨害するＣＴＬＡ４突然変異体分子／ＣＤ８０複合体またはＣＴＬＡ４突然変異体分子／ＣＤ８６複合体が形成されるように、ＣＤ８０陽性および／またはＣＤ８６陽性細胞を請求項１の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子と接触させることを含む方法。
【請求項３８】
Ｔ細胞とＣＤ８０陽性および／またはＣＤ８６陽性細胞との相互作用を調節する方法であって、Ｔ細胞とＣＤ８０陽性および／またはＣＤ８６陽性細胞との相互作用を妨害するＣＴＬＡ４突然変異体分子／ＣＤ８０複合体またはＣＴＬＡ４突然変異体分子／ＣＤ８６複合体が形成されるように、ＣＤ８０陽性および／またはＣＤ８６陽性細胞を請求項９の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子と接触させることを含む方法。
【請求項３９】
可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子が図８に示すように＋１０４位のロイシンがグルタミン酸に置換されているＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを含む請求項３７の方法。
【請求項４０】
ＣＤ８０陽性および／またはＣＤ８６陽性細胞を可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子の断片または誘導体と接触させる請求項３７の方法。
【請求項４１】
ＣＤ８０陽性および／またはＣＤ８６陽性細胞を可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子の断片または誘導体と接触させる請求項３８の方法。
【請求項４２】
ＣＤ８０陽性および／またはＣＤ８６陽性細胞が抗原提示細胞である請求項３７の方法。
【請求項４３】
ＣＤ８０陽性および／またはＣＤ８６陽性細胞が抗原提示細胞である請求項３８の方法。
【請求項４４】
ＣＴＬＡ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８０陽性およびＣＤ８６陽性細胞との相互作用が阻害される請求項３７の方法。
【請求項４５】
ＣＴＬＡ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８０陽性およびＣＤ８６陽性細胞との相互作用が阻害される請求項３８の方法。
【請求項４６】
Ｔ細胞とＣＤ８０陽性および／またはＣＤ８６陽性細胞との相互作用によって媒介される免疫系疾患を処置する方法であって、Ｔ細胞とＣＤ８０陽性および／またはＣＤ８６陽性細胞との相互作用を調節するために請求項１の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子を対象に投与することを含む方法。
【請求項４７】
Ｔ細胞とＣＤ８０陽性および／またはＣＤ８６陽性細胞との相互作用によって媒介される免疫系疾患を処置する方法であって、Ｔ細胞とＣＤ８０陽性および／またはＣＤ８６陽性細胞との相互作用を調節するために請求項９の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子を対象に投与することを含む方法。
【請求項４８】
可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子が図８に示すように＋１０４位のロイシンがグルタミン酸で置換されているＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを含む請求項４６の方法。
【請求項４９】
前記Ｔ細胞相互作用が阻害される請求項４６の方法。
【請求項５０】
前記Ｔ細胞相互作用が阻害される請求項４７の方法。
【請求項５１】
対象における移植片対宿主疾患を抑制する方法であって、対象に請求項１の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子と、ＩＬ−４と反応するリガンドとを投与することを含む方法。
【請求項５２】
対象における移植片対宿主疾患を抑制する方法であって、対象に請求項９の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子と、ＩＬ−４と反応するリガンドとを投与することを含む方法。
【請求項５３】
可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体が図８に示すように＋１０４位のロイシンがグルタミン酸に置換されているＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを含む請求項５１の方法。
【請求項５４】
ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−２１０４の核酸分子によってコードされる可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子。
【請求項５５】
Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇをコードするＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−２１０４のＤＮＡ配列。
【請求項５６】
図７のアミノ酸配列を含む可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子。
【請求項５７】
請求項５６の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子をコードする核酸分子。
【請求項５８】
野生型ＣＴＬＡ４より高いアビディティーでＣＤ８６を結合する可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子。
【請求項５９】
結合しているＣＤ８０および／またはＣＤ８６からの解離速度が野生型ＣＴＬＡ４より遅い可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子。
【請求項６０】
ＣＤ８０および／またはＣＤ８６への結合速度ならびに結合しているＣＤ８０および／またはＣＤ８６からの解離速度が野生型ＣＴＬＡ４より遅い可溶性ＣＴＡＬ４突然変異体分子。
【請求項６１】
ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−２１０４の核酸分子によってコードされる可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子の一部であって、突然変異体ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを含む一部。
【請求項６２】
Ｉｇテールをさらに含む請求項６１の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子の一部。
【請求項６３】
可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子をコードするＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−２１０４の核酸分子の一部であって、突然変異型ＣＴＡＬ４分子の細胞外ドメインをコードする一部。
【請求項６４】
Ｉｇテールをコードする核酸分子をさらに含む請求項６３の核酸分子の一部。
【請求項６５】
医薬的に許容できる担体および請求項１の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子を含む免疫系疾患処置用医薬組成物。
【請求項６６】
医薬的に許容できる担体および請求項９の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子を含む免疫系疾患処置用の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願明細書では様々な刊行物を参照する。これらの刊行物の内容は、本発明が属する技術分野の水準をより詳しく説明するために、参照によりそのまま本明細書に組み込まれるものとする。
【０００２】
（発明の分野）
本発明はＣＤ８０および／またはＣＤ８６を結合する能力が維持されるように野生型ＣＴＬＡ４から突然変異させた可溶性ＣＴＬＡ４分子の分野に関する。
【０００３】
（発明の背景）
Ｔリンパ球と抗原提示細胞（ＡＰＣ）とが抗原非特異的に細胞間相互作用すると、抗原に対するＴ細胞応答をもたらすＴ細胞共刺激シグナルが生じる（ＪｅｎｋｉｎｓおよびＪｏｈｎｓｏｎ（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５：３６１−３６７）。共刺激シグナルは抗原に対するＴ細胞応答の強度と、その応答が抗原に対するそれ以降の応答を活性化するか不活化するかを決定する（Ｍｕｅｌｌｅｒら（１９８９）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７：４４５−４８０）。
【０００４】
共刺激の不在下でＴ細胞の活性化が起こると、Ｔ細胞応答は中止されるか、またはアネルギー状態になる（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｈ．（１９９２）Ｃｅｌｌ ７１：１０６５−１０６８）。重要な共刺激シグナルの一つはＴ細胞表面レセプターＣＤ２８と抗原提示細胞上のＢ７関連分子（例えば、それぞれＢ７−１とＢ７−２またはＣ８０とＣＤ８６と呼ばれる分子）との相互作用によって生じる（Ｐ．ＬｉｎｓｌｅｙおよびＪ．Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ（１９９３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１：１９１−２１２）。
【０００５】
現在ＣＤ８０（Ｂ７−１）と呼ばれている分子は、元々はヒトＢ細胞関連活性化抗原として記載された分子であり（Ｙｏｋｏｃｈｉ，Ｔ．ら（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２８：８２３−８２７；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．ら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４３：２７１４−２７２２）、その後、関連するＴ細胞分子ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４のカウンターレセプターであることが確認された（Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．ら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：５０３１−５０３５；Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．Ｓ．ら（１９９１ａ）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １７３：７２１−７３０；Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．Ｓ．ら（１９９１ｂ）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １７４：５６１−５７０）。
【０００６】
さらに最近になって、ＣＴＬＡ４のもう一つのカウンターレセプターが抗原提示細胞上に同定された（Ａｚｕｍａ，Ｎ．ら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６６：７６−７９；Ｆｒｅｅｍａｎ（１９９３ａ）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：９０９−９１１；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．ら（１９９３ｂ）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １７８：２１８５−２１９２；Ｈａｔｈｃｏｃｋ，Ｋ．Ｌ．Ｓ．ら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １８０：６３１−６４０；Ｌｅｎｓｃｈｏｗ，Ｄ．Ｊ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１０５４−１１０５８；Ｒａｖｉ−Ｗｏｌｆ，Ｚ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１１８２−１１１８６； Ｗｕ，Ｙ．ら（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １７８：１７８９−１７９３）。この分子は現在、ＣＤ８６（Ｃａｕｘ，Ｃ．ら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １８０：１８４１−１８４８）と呼ばれているが、Ｂ７−０（Ａｚｕｍａら（１９９３）前掲）またはＢ７−２（Ｆｒｅｅｍａｎら（１９９３ａ）前掲）とも呼ばれ、その細胞外領域は、ＣＤ８０と約２５％の配列一致度を持っている（Ａｚｕｍａら（１９９３）前掲；Ｆｒｅｅｍａｎら（１９９３ａ）前掲；同（１９９３ｂ）前掲）。ＣＤ８６トランスフェクト細胞は、Ｃ２８が媒介するＴ細胞応答をトリガーする（Ａｚｕｍａら（１９９３）前掲；Ｆｒｅｅｍａｎら（１９９３ａ）（１９９３ｂ）前掲）。
【０００７】
ＣＤ８０とＣＤ８６の発現の比較はいくつかの研究の主題になっている（Ａｚｕｍａら（１９９３）前掲；Ｈａｔｈｃｏｃｋら（１９９４）前掲；Ｌａｒｓｅｎ，Ｃ．Ｐ．ら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：５２０８−５２１９；Ｓｔａｃｋ，Ｒ．Ｍ．ら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：５７２３−５７３３）。最新のデータは、ＣＤ８０とＣＤ８６の発現が異なる調節を受けることを示しており、免疫応答に際してＣＤ８６発現はＣＤ８０発現に先だって起こる傾向があることを示唆している。
【０００８】
可溶型のＣＤ２８およびＣＴＬＡ４は、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４の可変領域（ｖ）様細胞外ドメインを免疫グロブリン（Ｉｇ）定常ドメインに融合してＣＤ２８ＩｇおよびＣＴＬＡ４Ｉｇを得ることによって構築されている。ＣＴＬＡ４ＩｇはＣＤ８０陽性細胞にもＣＤ８６陽性細胞にもＣＤ２８Ｉｇより強く結合する（Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．ら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７９３−８０）。インビトロでもインビボでも多くのＴ細胞依存性免疫応答がＣＴＬＡ４Ｉｇによって遮断される（Ｌｉｎｓｌｅｙら（１９９１ｂ）前掲；Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．Ｓ．ら（１９９２ａ）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：７９２−７９５；Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．Ｓ．ら（１９９２ｂ）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １７６：１５９５−１６０４；Ｌｅｎｓｃｈｏｗ，Ｄ．Ｊ．ら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：７８９−７９２；Ｔａｎ，Ｐ．ら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １７７：１６５−１７３；Ｔｕｒｋａ，Ｌ．Ａ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１１１０２−１１１０５）。
【０００９】
Ｐｅａｃｈら（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９４）１８０：２０４９−２０５８）は、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインのなかで、ＣＤ８０への強い結合にとって重要な領域を同定した。具体的に述べると、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）様領域中のヘキサペプチドモチーフ（ＭＹＰＰＰＹ）は、全てのＣＤ２８およびＣＴＬＡ４ファミリーメンバーで、完全に保存されていることが確認された。ＣＴＬＡ４中のＭＹＰＰＰＹモチーフおよびＣＤ２８Ｉｇ中の選択した残基にアラニンスキャニング法によって突然変異を導入すると、ＣＤ８０への結合が減少するか、または消失した。
【００１０】
ＣＴＬＡ４とＣＤ２８の相同領域を入れ替えたキメラ分子も構築された。ＨＳ４、ＨＳ４−ＡおよびＨＳ４−ＢはＣＴＬＡ４のＣＤＲ３様領域を移植することによって構築された分子である。ＣＴＬＡ４のＣＤＲ３様領域はカルボキシ末端に延長部分を持つので、ＣＤ２８Ｉｇにいくつかの非保存アミノ酸残基が導入されることになる。これらの相同突然変異体はＣＤ８０に対してＣＤ２８Ｉｇよりも高い結合アビディティーを示した。
【００１１】
もう一つのキメラ相同突然変異体群では、空間的にＣＤＲ３様領域に隣接すると予測されＣＤ２８には保存されていないＣＴＬＡ４のＣＤＲ１様領域が、ＨＳ４およびＨＳ４−Ａに移植された。これらのキメラ相同突然変異体分子（ＨＳ７およびＨＳ８と呼ばれている）は、ＣＤ８０に対してＣＤ２８Ｉｇよりもさらに高い結合アビディティーを示した。
【００１２】
ＨＳ７およびＨＳ８にＣＴＬＡ４のＣＤＲ２様領域を移植することによってさらにキメラ相同突然変異体分子が作製されたが、この組合わせではＣＤ８０に対する結合アビディティーは改善されなかった。したがって、ＣＴＬＡ４およびＣＤ２８のＭＹＰＰＰＹモチーフはＣＤ８０への結合にとって決定的な意味を持つと結論されたが、ＣＴＬＡ４のＣＤＲ１様領域中およびＣＤＲ３様領域中の非保存アミノ酸残基も、ＣＴＬＡ４のＣＤ８０との高い結合アビディティーの一因になっていた。
【００１３】
ＣＴＬＡ４ＩｇはＣＤ８０に関係するＴ細胞共刺激を効果的に遮断することが明らかにされているが、ＣＤ８６に関係する応答の遮断にはそれほど有効でない。抗原特異的活性化細胞のプライミングを遮断する能力がおそらくＣＴＬＡ４Ｉｇより高い分子として、可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子、特にＣＤ８６に対して野生型ＣＴＬＡ４より高いアビディティーを持つ分子を構築した。
【００１４】
既知の可溶型ＣＴＬＡ４より優れている免疫抑制用および癌処置用医薬組成物を得るために、改良されたＣＴＬＡ４分子が依然として必要とされている。
【００１５】
（発明の要旨）
したがって本発明は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６を結合する可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子を提供する。本発明の突然変異体分子には、ＣＤ８０もしくはＣＤ８６またはその両方を認識し結合することができるものが含まれる。一部の態様では、突然変異体分子は、ＣＴＬＡ４より高いアビディティーでＣＤ８０および／またはＣＤ８６を結合する。
【００１６】
ＣＴＬＡ４突然変異体分子の一例は本明細書に記載のＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（図７）である。ＣＴＬＡ４突然変異体分子のもう一つの例は本明細書に記載のＬ１０４ＥＩｇ（図８）である。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＬ１０４ＥＩｇはＣＴＬＡ４Ｉｇよりも強くＣＤ８０およびＣＤ８６を結合する。
【００１７】
（詳細な説明）
定義
本明細書で使用する以下の用語または表現は以下に指定する意味を持つ。
【００１８】
本明細書にいう「野生型ＣＴＬＡ４」は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６を結合しかつ／またはＣＤ８０および／またはＣＤ８６がそのリガンドと結合するのを妨害する天然の完全長ＣＴＬＡ４（米国特許第５，４３４，１３１号、第５，８４４，０９５号、第５，８５１，７９５号）またはその細胞外ドメインのアミノ酸配列を持つ。具体的態様として、野生型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは＋１位のメチオニンから始まって＋１２４位のアスパラギン酸で終わるか、または−１位のアラニンから始まって＋１２４位のアスパラギン酸で終わる。野生型ＣＴＬＡ４はＮ末端の細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよびＣ末端の細胞質ドメインを持つ細胞表面タンパク質である。細胞外ドメインはＣＤ８０やＣＤ８６などの標的抗原に結合する。細胞では、天然の野生型ＣＴＬＡ４タンパク質はＮ末端にシグナルペプチドを持つ未成熟ポリペプチドとして翻訳される。この未成熟ポリペプチドは、シグナルペプチドの切断および除去を含む翻訳後プロセシングを受けて、未成熟型のＮ末端とは異なる新たに生成したＮ末端を持つＣＴＬＡ４切断産物をもたらす。さらなる翻訳後修飾が起こって、ＣＴＬＡ４切断産物の新たに生成したＮ末端から１または複数のアミノ酸が除去される場合もありうることは、当業者には理解されるだろう。成熟型のＣＴＬＡ４分子にはＣＴＬＡ４の細胞外ドメインまたはＣＤ８０および／またはＣＤ８６に結合するその一部が含まれる。
【００１９】
「ＣＴＬＡ４Ｉｇ」は、Ｉｇテールに接合された野生型ＣＴＬＡ４またはＣＤ８０および／またはＣＤ８６を結合するその一部を含む可溶性融合タンパク質である。ある態様は、＋１位のメチオニンから始まって＋１２４位のアスパラギン酸で終わるかまたは−１位のアラニンから始まって＋１２４位のアスパラギン酸で終わる野生型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン、＋１２５位の接合部アミノ酸残基グルタミン、および＋１２６位のグルタミン酸から＋３５７位のリジンまでを包含する免疫グロブリン部分を含む（図９）。
【００２０】
本明細書にいう「融合タンパク質」は、米国特許第５，４３４，１３１号または第５，６３７，４８１号に記載されているような当技術分野周知の方法を使って一つに接合された１または複数のアミノ酸配列であると定義される。接合されたアミノ酸配列はその結果、一つの融合タンパク質を形成する。
【００２１】
本明細書にいう「ＣＴＬＡ４突然変異体分子」は、ＣＴＬＡ４（好ましくはＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン）に１または複数の突然変異を持っているため、野生型ＣＴＬＡ４分子に類似しているがもはや同一ではなく、完全長ＣＴＬＡ４であってもその一部（誘導体または断片）であってもよい分子である。ＣＴＬＡ４突然変異体分子はＣＤ８０もしくはＣＤ８６またはその両方を結合する。突然変異型ＣＴＬＡ４分子には、生物学的または化学的に活性な非ＣＴＬＡ４分子が含まれているか、または結合されていてもよい。突然変異体分子は可溶性（すなわち循環性）であってもよいし、表面に結合されていてもよい。ＣＴＬＡ４突然変異体分子はＣＴＬＡ４の全細胞外ドメインまたはその一部、例えば断片もしくは誘導体を含むことができる。ＣＴＬＡ４突然変異体分子は合成法または組換え法で製造することができる。
【００２２】
本明細書で使用する用語「突然変異」とは、野生型ポリペプチドのヌクレオチド配列中またはアミノ酸配列中の変化をいう。この場合は野生型ＣＴＬＡ４細胞外ドメイン中の変化である。この変化は置換、欠失、付加または切断を含むアミノ酸変化であることができる。突然変異体分子は１または複数の突然変異を持つことができる。当技術分野ではよく知られているように、ヌクレオチド配列中の突然変異はアミノ酸配列の突然変異をもたらす場合もあるし、アミノ酸配列の突然変異をもたらさない場合もある。これに関連して、いくつかのヌクレオチドコドンは同じアミノ酸をコードする。例えばアミノ酸の一つアルギニン（Ｒ）をコードするヌクレオチドコドンＣＧＵ、ＣＧＧ、ＣＧＣおよびＣＧＡ、またはアミノ酸の一つアスパラギン酸（Ｄ）をコードするコドンＧＡＵおよびＧＡＣが、その例である。したがってあるタンパク質は、ヌクレオチド配列の詳細は異なっているがそれでもなお同じ配列を持つタンパク質分子をコードしている１または複数の核酸分子によってコードすることができる。アミノ酸コード配列は以下の通りである。
【表１】
2004511213.tif 000003
【００２３】
本明細書にいう「ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン」は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６を認識し結合するＣＴＬＡ４の一部である。例えば、ＣＴＬＡ４のある細胞外ドメインは＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸までを含む（図９）。あるいは、ＣＴＬＡ４のある細胞外ドメインは、−１位のアラニンから＋１２４位のアスパラギン酸までを含む（図９）。細胞外ドメインにはＣＤ８０および／またはＣＤ８６を結合するＣＴＬＡ４の断片または誘導体が包含される。
【００２４】
本明細書にいう「非ＣＴＬＡ４タンパク質配列」または「非ＣＴＬＡ４分子」は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６を結合せず、ＣＴＬＡ４がその標的に結合するのを妨害しない任意の分子であると定義される。一例として免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域またはその一部が挙げられるが、これに限るわけではない。Ｉｇ定常領域は、好ましくは、ヒトまたはサルＩｇ定常領域、例えばヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含むヒトＣ（ガンマ）１である。Ｉｇ定常領域は、突然変異によってそのエフェクター機能を低下させることができる（米国特許第５，６３７，４８１号および第６，１３２，９９２号）。
【００２５】
本明細書にいう「ＣＴＬＡ４突然変異体分子の断片」は、標的（例えばＣＤ８０および／またはＣＤ８６）を認識し結合するＣＴＬＡ４突然変異体分子の一部、好ましくはＣＴＬＡ４の細胞外ドメインまたはその一部である。
【００２６】
本明細書にいう「ＣＴＬＡ４突然変異体分子の誘導体」は、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインと少なくとも７０％の配列類似性を持ち、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインのように機能する（すなわちＣＤ８０および／またはＣＤ８６を認識し結合する）分子である。
【００２７】
本明細書にいう「ＣＴＬＡ４分子の一部」には、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６を結合するＣＴＬＡ４分子の断片および誘導体が包含される。
【００２８】
本明細書に記載の発明をさらに詳しく理解することができるように、以下の説明を行う。
【００２９】
本発明の組成物
本発明はＣＤ８０および／またはＣＤ８６を認識し結合する可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子を提供する。一部の態様では、本可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体はＣＤ８０および／またはＣＤ８６に対してＣＴＬＡ４Ｉｇより高いアビディティーを持つ。
【００３０】
ＣＴＬＡ４突然変異体分子の一例としてＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇが挙げられる（図７）。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇのアミノ酸配列はアミノ酸位置−１のアラニンから始まって、アミノ酸位置＋３５７のリジンで終わることができる。もう一つの選択肢として、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇのアミノ酸配列はアミノ酸位置＋１のメチオニンから始まって、アミノ酸位置＋３５７のリジンで終わることもできる。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇのＣＴＬＡ４部分はアミノ酸位置＋１のメチオニンからアミノ酸位置＋１２４のアスパラギン酸までを包含する。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、＋１２５位にある接合部アミノ酸残基グルタミンと、＋１２６位のグルタミン酸から＋３５７位のリジンまでを包含する免疫グロブリン部分とを含む（図７）。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは野生型ＣＴＬＡ４Ｉｇ（以下ＣＴＬＡ４Ｉｇという）と比較してＣＤ８０には約２倍強く、またＣＤ８６には約４倍強く結合する。このように強く結合するため、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは免疫応答の遮断にＣＴＬＡ４Ｉｇより有効である。
【００３１】
ＣＴＬＡ４突然変異体分子は少なくともＣＴＬＡ４の細胞外ドメインまたはＣＤ８０および／またはＣＤ８６を結合するその一部を含む。ＣＴＬＡ４突然変異体分子の細胞外部分は＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を含む（図７または８）。もう一つの選択肢として、ＣＴＬＡ４の細胞外部分は、−１位のアラニンから＋１２４位のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を含んでもよい（図７または８）。
【００３２】
一態様として、可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子は、＋２５のセリンから始まって＋３３のアルギニンで終わるアミノ酸配列の一領域（Ｓ２５〜Ｒ３３）中に１または複数の突然変異を持つＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを含む融合タンパク質である。例えば野生型ＣＴＬＡ４の＋２９位のアラニンをチロシン（コドン：ＵＡＵ、ＵＡＣ）で置換することができる。あるいは、アラニンをロイシン（コドン：ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、ＣＵＧ）、フェニルアラニン（コドン：ＵＵＵ、ＵＵＣ）、トリプトファン（コドン：ＵＧＧ）またはスレオニン（コドン：ＡＣＵ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、ＡＣＧ）で置換することもできる。当業者には容易に理解できるだろうが、ＲＮＡ配列のウラシル（Ｕ）ヌクレオチドはＤＮＡ配列のチミン（Ｔ）ヌクレオチドに相当する。
【００３３】
もう一つの態様として、可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子は、＋９７のメチオニンから始まって＋１０７のグリシンで終わるアミノ酸配列の一領域（Ｍ９７〜Ｇ１０７）中またはその近傍に１または複数の突然変異を持つＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを含む融合タンパク質である。例えば野生型ＣＴＬＡ４の＋１０４位にあるロイシンをグルタミン酸（コドン：ＧＡＡ、ＧＡＧ）で置換することができる。この置換を持つＣＴＬＡ４突然変異体分子を本明細書ではＬ１０４ＥＩｇという（図８）。
【００３４】
さらにもう一つの態様として、可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子は、Ｓ２５〜Ｒ３３領域中およびＭ９７〜Ｇ１０７領域中に１または複数の突然変異を持つＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを含む融合タンパク質である。例えば一態様として、ＣＴＬＡ４突然変異体分子は＋２９位にアラニンの代わりにチロシンを含み、＋１０４位にロイシンの代わりにグルタミン酸を含む。これらの置換を持つＣＴＬＡ４突然変異体分子を本明細書ではＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇという（図７）。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇをコードする核酸分子はｐＤ１６Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇに含まれ、２０００年６月１９日にバージニア州２０１１０−２２０９マナッサス・ユニバーシティブルバード１０８０１のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託された（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−２１０４）。ｐＤ１６Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇベクターはｐｃＤＮＡ３ベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）の誘導体である。
【００３５】
さらに本発明は、図７もしくは８に示すＣＴＬＡ４突然変異体の細胞外ドメインまたはその一部と、ＣＴＬＡ４突然変異体分子の溶解性、アフィニティーおよび／または結合価を変化させる部分とを含む可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子も提供する。
【００３６】
本発明の実施態様として、上記の部分は免疫グロブリン定常領域またはその一部とすることができる。生体内用途には、前記免疫グロブリン定常領域が対象の体内で有害な免疫応答を誘発しないことが好ましい。例えば臨床プロトコールでは、突然変異体分子がヒトまたはサル免疫グロブリン定常領域を含むことが好ましいだろう。適切な免疫グロブリン領域の一例は、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含むヒトＣ（ガンマ）１である。他のアイソタイプも使用することができる。さらに他の免疫グロブリン定常領域（好ましくは免疫原性が弱いか免疫原性を持たない他の免疫グロブリン定常領域）も使用することができる。
【００３７】
上記部分の他の例として、ポリペプチドタグが挙げられる。適切なタグの例には、例えばｐ９７分子、ｅｎｖ ｇｐ１２０分子、Ｅ７分子、およびｏｖａ分子などがあるが、これらに限るわけではない（Ｄａｓｈ，Ｂ．ら（１９９４）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ７５：１３８９−９７；Ｉｋｅｄａ，Ｔ．ら（１９９４）Ｇｅｎｅ １３８：１９３−６；Ｆａｌｋ，Ｋ．ら（１９９３）Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０：４４７−５２；Ｆｕｊｉｓａｋａ，Ｋ．ら（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０４：７８９−９３）。他の分子をタグとして使用することもできる（Ｇｅｒａｒｄ，Ｃ．ら（１９９４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ６２：７２１−７３９；Ｂｙｒｎ，Ｒ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８９）６３：４３７０−４３７５；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．ら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１７０４−１７０７；Ｌａｓｋｙ，Ｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：２０９−２１２）。
【００３８】
さらに本発明は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６抗原に対して野生型ＣＴＬＡ４より反応性が高い可溶性突然変異型ＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質を提供する。その一例は図７に示すＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇである。
【００３９】
もう一つの態様として、可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子は、ＣＴＬＡ４部分と免疫グロブリン部分との間に位置する接合部アミノ酸残基を含む。接合部アミノ酸はグルタミンを含めて、どのアミノ酸であってもよい。接合部アミノ酸は当技術分野で知られる分子法または化学合成法によって導入することができる。
【００４０】
もう一つの態様として、可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子は、免疫グロブリン部分のヒンジドメイン内のシステイン残基の一部または全部、例えば＋１３０、＋１３６または＋１３９位のシステインが、セリンで置換されている免疫グロブリン部分（例えばヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）を含む（図７または８）。突然変異体分子は図７または８に示すように＋１４８位のプロリンがセリンで置換されていてもよい。
【００４１】
可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子は突然変異体分子のＣＴＬＡ４部分の細胞外ドメインのＮ末端に結合したシグナルペプチドを持っていてもよい。シグナルペプチドは、例えばオンコスタチンＭ（Ｍａｌｉｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ９：２８４７−２８５３）もしくはＣＤ５（Ｊｏｎｅｓ，Ｎ．Ｈ．ら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２３：３４６−３４９）のシグナルペプチドまたは任意の細胞外タンパク質のシグナルペプチドなど、突然変異体分子の分泌を可能にする配列であればなんでもよい。
【００４２】
突然変異体分子は、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインのＮ末端に結合したオンコスタチンＭシグナルペプチド、およびＣＴＬＡ４の細胞外ドメインのＣ末端に結合したヒト免疫グロブリン分子（例えばヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３）を含むことができる。この分子は、−２６位のメチオニンから−１位のアラニンまでのアミノ酸配列を包含するオンコスタチンＭシグナルペプチド、＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を包含するＣＴＬＡ４部分、＋１２５位の接合部アミノ酸残基グルタミンおよび＋１２６位のグルタミン酸から＋３５７位のリジンまでのアミノ酸配列を包含する免疫グロブリン部分を含む。
【００４３】
本発明の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子は分子法または化学合成法によって得ることができる。分子法には以下の工程が含まれるだろう：可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子を発現させコードする核酸分子を適切な宿主細胞に導入する工程、核酸分子が導入された前記宿主細胞を、宿主細胞による前記突然変異体分子の発現が可能な条件で培養する工程、および発現した突然変異体分子を単離する工程。突然変異体分子のシグナルペプチド部分は、タンパク質分子が細胞表面に発現され、宿主細胞によって分泌されることを可能にする。翻訳された突然変異体分子は、シグナルペプチドの切断によるＣＴＬＡ４部分および免疫グロブリン部分を持つ成熟タンパク質の生成を伴う翻訳後修飾を受けることができる。この切断が−１位のアラニンの後ろで起こると＋１位のメチオニンを第１アミノ酸とする成熟突然変異体分子が生成する（図７または８）。あるいは、この切断が−２位のメチオニンの後ろで起こると、−１位のアラニンを第１アミノ酸とする成熟突然変異体分子が生成する。
【００４４】
好ましい一態様は、ヒト免疫グロブリン分子（例えばヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３）の全部または一部に結合したヒトＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを持つ可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子である。この好ましい分子は、＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を包含する可溶性分子のＣＴＬＡ４部分、＋１２５位の接合部アミノ酸残基グルタミン、および＋１２６位のグルタミン酸から＋３５７位のリジンまでを包含する免疫グロブリン部分を含む。ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを持つ部分は、＋２９位のアラニンがチロシンで置換され、＋１０４位のロイシンがグルタミン酸で置換されるように突然変異している。この突然変異体分子の免疫グロブリン部分は、＋１３０、＋１３６および＋１３９位のシステインがセリンで置換され、＋１４８位のプロリンがセリンで置換されるように突然変異させてもよい。この突然変異体分子を本明細書ではＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（図７）と呼ぶ。
【００４５】
Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇのもう一つの態様は、−１位のアラニンから＋１２４位のアスパラギン酸までのアミノ酸配列、＋１２５位の接合部アミノ酸残基グルタミン、および＋１２６位のグルタミン酸（例えば＋１２６位から＋３５７位のリジンまで）を包含する免疫グロブリン部分を持つ突然変異体分子である。ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを持つ部分は、＋２９位のアラニンがチロシンで置換され、＋１０４位のロイシンがグルタミン酸で置換されるように突然変異している。この突然変異体分子の免疫グロブリン部分は、＋１３０、＋１３６および＋１３９位のシステインがセリンで置換され、＋１４８位のプロリンがセリンで置換されるように突然変異している。この突然変異体分子を本明細書ではＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（図７）と呼ぶ。シグナル配列が切断されると、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは＋１位のメチオニンから始まるか、または−１位のアラニンから始まることができる。
【００４６】
本発明のもう一つの突然変異体分子は、ヒト免疫グロブリン分子（例えばヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３）に結合したヒトＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを持つ可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子である。この分子は、ＣＴＬＡ４をコードするアミノ酸配列のうち＋１位のメチオニンから始まって＋１２４位のアスパラギン酸に至る部分、＋１２５位の接合部アミノ酸残基グルタミン、および＋１２６位のグルタミン酸から＋３５７位のリジンまでのアミノ酸配列を包含する免疫グロブリン部分を含む。ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを持つ部分は、＋１０４位のロイシンがグルタミン酸で置換されるように突然変異している。この突然変異体分子のヒンジ部分は、＋１３０、＋１３６および＋１３９位のシステインがセリンで置換され、＋１４８位のプロリンがセリンで置換されるように突然変異している。この突然変異分子を本明細書ではＬ１０４ＥＩｇという（図８）。
【００４７】
もう一つの選択肢として、Ｌ１０４ＥＩｇの一態様は、ヒト免疫グロブリン分子（例えばヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３）に結合したヒトＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを持つ可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子である。この好ましい分子は、−１位のアラニンから始まって＋１２４位のアスパラギン酸に至るアミノ酸配列を包含するＣＴＬＡ４部分、＋１２５位の接合部アミノ酸残基グルタミン、および＋１２６位のグルタミン酸から＋３５７位のリジンまでを包含する免疫グロブリン部分を含む。ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを持つ部分は、＋１０４位のロイシンがグルタミン酸で置換されるように突然変異している。この突然変異体分子のヒンジ部分は、＋１３０、＋１３６および＋１３９位のシステインがセリンで置換され、＋１４８位のプロリンがセリンで置換されるように突然変異している。この突然変異体分子を本明細書ではＬ１０４ＥＩｇという（図８）。
【００４８】
さらに本発明は、（ａ）第２アミノ酸配列に融合された、Ｔ細胞増殖を遮断する膜糖タンパク質（例えばＣＤ２８、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ４０およびｇｐ３９）の第１アミノ酸配列、（ｂ）Ｔ細胞増殖を遮断する突然変異型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインの断片である第２アミノ酸配列、例えば＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸までを含むアミノ酸分子（図７または８）、および（ｃ）識別タグとして働くまたは分子の溶解性を高める第３アミノ酸配列を持つ可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子を提供する。例えば第３アミノ酸配列は、基本的に、非免疫原性免疫グロブリン分子のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域のアミノ酸残基からなることができる。適切な免疫グロブリン分子の例として、ヒトまたはサル免疫グロブリン、例えばＣ（ガンマ）１が挙げられるが、これに限るわけではない。他のアイソタイプも使用することができる。
【００４９】
さらに本発明は、本発明の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子に相当するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。一態様として、本核酸分子はＤＮＡ（例えばｃＤＮＡ）またはそのハイブリッドである。もう一つの選択肢として、本核酸分子はＲＮＡまたはそのハイブリッドである。
【００５０】
さらに本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含むベクターも提供する。また宿主ベクター系も提供する。本宿主ベクター系は適切な宿主細胞に本発明のベクターを含んでなる。適切な宿主細胞の例としては原核細胞および真核細胞が挙げられるが、これらに限るわけではない。
【００５１】
本発明は、医薬有効量のＣＴＬＡ４突然変異体分子を含む免疫系疾患処置用医薬組成物を包含する。特定の態様では、免疫系疾患は、ＣＤ２８陽性および／またはＣＴＬＡ４陽性細胞がＣＤ８０陽性および／またはＣＤ８６陽性細胞と相互作用することによって媒介される。可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子は、好ましくは、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン中に１または複数の突然変異を持つＣＴＬＡ４分子である。医薬組成物は可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体タンパク質分子および／または前記分子をコードする核酸分子および／またはベクターを含むことができる。好ましい態様として、可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子は、図７または８のいずれかに示すＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン（それぞれＬ１０４ＥＡ２９ＹまたはＬ１０４Ｅ）のアミノ酸配列を持つ。さらに好ましくは、可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子は本明細書に開示するＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇである。本組成物はさらに、例えば薬物毒素、酵素、抗体またはコンジュゲートなど、他の治療薬を含んでもよい。
【００５２】
また好ましくは、本医薬組成物は、本発明の分子（例えばＬ１０４ＥＡ２９ＹまたはＬ１０４Ｅなどの可溶性ＣＴＬＡ４分子）と混合したときに本発明分子の活性を損なわず、かつ対象の免疫系と反応しない適切な担体および佐剤も含む。適切な担体および佐剤の例としてはヒト血清アルブミン、イオン交換体、アルミナ、レシチン、緩衝剤（リン酸塩、グリシンなど）、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、および塩類または電解質（硫酸プロタミンなど）が挙げられるが、これらに限らない。他の例としては通常の医薬担体、例えばリン酸緩衝食塩溶液、水、エマルション（油／水エマルションなど）、および様々なタイプの湿潤剤が挙げられる。他の担体として、滅菌溶液、コート錠などの錠剤、カプセル剤を挙げることもできる。通例、このような担体は賦形剤、例えばデンプン、ミルク、糖、ある種の粘土、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、植物性脂肪、植物油、ゴム、グリコールまたは他の既知の賦形剤を含む。このような担体には香料および着色料または他の成分を含めることもできる。このような担体を含む組成物は周知の従来法によって製剤化することができる。そのような組成物は例えばリポソームなどの様々な脂質組成物およびポリマーマイクロスフェアなどのポリマー組成物中に製剤化することもできる。
【００５３】
本発明の医薬組成物は、例えば静脈内（ｉ．ｖ．）投与、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与、筋肉内（ｉ．ｍ．）投与、皮下投与、経口投与、坐剤としての投与、または局所接触、またはミニ浸透圧ポンプなどの徐放装置の対象への植込みなど、通常の投与法を用いて投与することができる。
【００５４】
本発明の医薬組成物は、例えば溶液または懸濁液、錠剤、丸剤、散剤、坐剤、ポリマー製マイクロカプセル、リポソームおよび注射液または注入液など、様々な剤形をとることができる。好ましい剤形は投与形式および治療用途に依存する。
【００５５】
本発明組成物の最も有効な投与形式および用法は、疾患の重症度および経過、患者の健康状態および処置に対する反応ならびに処置を行う医師の判断に依存する。したがって本組成物の用量は患者毎に調整すべきである。
【００５６】
可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子は、対象の体内で内因性Ｂ７（例えばＣＤ８０および／またはＣＤ８６）分子がそれぞれのリガンドと結合するのを遮断するのに十分な量および期間（例えば時間および／または複数回）対象に投与されるだろう。内因性Ｂ７／リガンド結合の遮断により、Ｂ７陽性細胞（例えばＣＤ８０陽性および／またはＣＤ８６陽性細胞）とＣＤ２８陽性および／またはＣＴＬＡ４陽性細胞との相互作用が阻害される。治療薬の投与量は、例えば患部組織のタイプ、処置しようとする自己免疫疾患のタイプ、疾患の重症度、患者の健康状態、その薬剤による処置に対する患者の反応など、多くの因子に依存する。したがって薬剤の投与量は対象および投与形式に依存して変動しうる。可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子は０．１〜２０．０ｍｇ／ｋｇ−患者体重／日、好ましくは０．５〜１０．０ｍｇ／ｋｇ／日の量で投与することができる。本発明の医薬組成物の投与は様々な時間にわたって実施することができる。一態様として、本発明の医薬組成物は１時間以上にわたって投与することができる。また、投与は疾患の重症度および当技術分野で知られる他の因子に応じて繰り返すこともできる。
【００５７】
さらに本発明は、タンパク質を製造する方法であって、本発明の宿主ベクター系を宿主中でタンパク質が産生されるように生育することおよびそのようにして産生されたタンパク質を回収することを含む方法も提供する。
【００５８】
さらに本発明は、機能的ＣＴＬＡ４陽性およびＣＤ２８陽性Ｔ細胞とＣＤ８０陽性および／またはＣＤ８６陽性細胞との相互作用を調節する方法も提供する。この方法では、内因性ＣＴＬＡ４抗原とＣＤ８０および／またはＣＤ８６との反応を妨害しかつ／または内因性ＣＤ２８抗原とＣＤ８０および／またはＣＤ８６との反応を妨害する突然変異型ＣＴＬＡ４／ＣＤ８０複合体および／または突然変異型ＣＴＬＡ４／ＣＤ８６複合体が形成されるように、ＣＤ８０陽性および／またはＣＤ８６陽性細胞を本発明の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子と接触させる。本発明の一態様として、可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子は、突然変異型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインの少なくとも一部を含む融合タンパク質である。もう一つの態様として、可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子には、＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を有し少なくとも１つの突然変異を持つＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを含む第１アミノ酸配列、ならびにヒト免疫グロブリンガンマ１分子のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む第２アミノ酸配列が含まれる（図７または８）。
【００５９】
本発明の実施態様として、ＣＤ８０陽性またはＣＤ８６陽性細胞を、本発明の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子の断片または誘導体と接触させる。もう一つの選択肢として可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子は、ＣＴＬＡ４突然変異体レセプターの細胞外ドメインの一部に相当する第２アミノ酸配列に融合したＣＤ２８レセプターの細胞外ドメインの一部に相当する第１アミノ酸配列およびヒト免疫グロブリンＣ−ガンマ−１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域に相当する第３アミノ酸配列を持つＣＤ２８Ｉｇ／ＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質である。
【００６０】
可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子はインビボで阻害特性を示すと予想される。Ｔ細胞／ＡＰＣ細胞相互作用、例えばＴ細胞／Ｂ細胞相互作用がＴ細胞とＡＰＣ細胞の接触の結果として起こっているような状態では、導入されたＣＴＬＡ４突然変異体分子が結合してＣＤ８０陽性および／またはＣＤ８６陽性細胞、例えばＢ細胞に対する反応を起こすことにより、Ｔ細胞／ＡＰＣ細胞相互作用が妨害、すなわち阻害され、その結果、免疫応答が調節されることになるだろう。
【００６１】
本発明は免疫応答をダウンレギュレートする方法を提供する。可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子による免疫応答のダウンレギュレーションは、既に進行中の免疫応答を阻害または遮断する目的で行ってもよいし、免疫応答の誘導を予防するものであってもよい。本発明の可溶性ＣＴＬＡ４分子は、Ｔ細胞応答を抑制することによって、もしくはＴ細胞に特異的寛容を誘発することによって、またはその両方によって、例えばＴリンパ球増殖およびサイトカイン分泌などの活性化Ｔ細胞の機能を阻害するだろう。
【００６２】
さらに本発明は、免疫系疾患を処置し寛容を誘導する方法も提供する。具体的態様では、免疫系疾患はＣＤ２８陽性および／またはＣＴＬＡ４陽性細胞とＣＤ８０／ＣＤ８６陽性細胞との相互作用によって媒介される。さらなる一態様では、Ｔ細胞相互作用が阻害される。免疫系疾患の例としては自己免疫疾患、免疫細胞増殖性疾患および移植関連障害が挙げられるが、これらに限るわけではない。これらの方法では、本発明の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子を投与して、Ｔ細胞とＣＤ８０陽性および／またはＣＤ８６陽性細胞との相互作用を調節する。もう一つの選択肢として、ＣＴＬＡ４突然変異体分子に接合した膜糖タンパク質を持つＣＴＬＡ４突然変異体ハイブリッドを投与することもできる。移植関連疾患の例には、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）（例えば骨髄移植によって起こるもの、または寛容の誘導をもたらすもの）、移植拒絶、慢性拒絶および組織または細胞（例えば固形臓器、皮膚、島、筋、肝細胞、ニューロンなど）の同種移植もしくは異種移植に関係する免疫障害がある。免疫細胞増殖性疾患の例には、乾癬、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、精巣血管中心性Ｔ細胞リンパ腫、良性リンパ球性血管炎、および自己免疫疾患、例えば狼蒼（例：エリテマトーデス、ループス腎炎）、橋本甲状腺腫、原発性粘液水腫、グレーヴス病、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、糖尿病（例：インシュリン依存性糖尿病、Ｉ型糖尿病）、グッドパスチャー症候群、筋無力症、天疱瘡、クローン病、交感性眼炎、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、リウマチ性疾患（例：慢性関節リウマチ）、多発性筋炎、強皮症、および混合結合組織病などがあるが、これらに限るわけではない。
【００６３】
さらに本発明は、移植組織のレシピエントである対象による固形臓器および／または組織移植拒絶を阻害する方法も提供する。通例、組織移植の場合、移植片の拒絶はＴ細胞がそれを異物と認識することによって開始され、次いで移植片を破壊する免疫応答が起こる。本発明の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子は、Ｔリンパ球増殖および／またはサイトカイン分泌を阻害することによって組織破壊を軽減するだろう。また、抗原特異的Ｔ細胞不応答性の誘導により、全身的な免疫抑制を行わなくても、長期にわたる移植片の受容が起こるだろう。さらに、本発明の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子は、例えばコルチコステロイド、シクロスポリン、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、タクロリムス、バシリキシマブ、および／または他の生物製剤などといった他の医薬と共に投与することもできる。
【００６４】
また本発明は、対象における移植片対宿主病を抑制する方法も提供する。この方法では、本発明の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子が単独で、またはＩＬ−２、ＩＬ−４またはγ−インターフェロンと反応する他の追加リガンドと共に、対象に投与される。例えば、ドナーＴ細胞のアロ反応性を阻害するために、本発明の可溶性ＣＴＬＡ突然変異体分子を骨髄移植レシピエントに投与することができる。あるいは、骨髄移植片内のドナーＴ細胞を、移植に先立ってエクスビボで、レシピエントのアロ抗原に対して寛容化してもよい。
【００６５】
可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子によるＴ細胞応答の阻害は自己免疫障害の処置にも役立つだろう。多くの自己免疫障害は自己抗原に対して反応性を持つＴ細胞の不適切な活性化によって起こり、これは、その疾患の病理に関係するサイトカインおよび自己抗体の産生を促進する。自己免疫障害を患っているまたは自己免疫障害を起こしやすい対象に可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子を投与すれば、自己反応性Ｔ細胞の活性化が妨げられ、疾患症状が軽減または除去されるだろう。この方法では、本発明の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子を単独で、またはＩＬ−２、ＩＬ−４またはγ−インターフェロンと反応する他の追加リガンドと共に、対象に投与してもよい。
【００６６】
さらに本発明は、可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子と他の免疫抑制剤、例えばシクロスポリン（Ｍａｔｈｉｅｓｅｎ「シクロスポリンＡ処置ラットの中枢死因軽々における異種移植ヒト膠芽腫細胞の長期生存および血管新生（Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ−Ｔｒｅａｔｅｄ Ｒａｔｓ）」（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．，４４：１５１−１５６参照）、プレドニソン、アザチオプリンおよびメトトレキセート（Ｒ．Ｈａｎｄｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ「第５３章：免疫抑制に使用される薬物（Ｃｈａｐｔｅｒ ５３： Ｄｒｕｇｓ
Ｕｓｅｄ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）」１２６４〜１２７６頁）との併用も包含する。他の免疫抑制剤も使用することができる。例えば慢性関節リウマチの処置には、可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子を、例えばコルチコステロイド、非ステロイド系抗炎症薬／Ｃｏｘ−２阻害剤、メトトレキセート、ヒドロキシクロロキン、スルファサラゾピリン、金塩、エタナーセプト、インフリキシマブ、アナキンラ、アザチオプリン、および／または抗ＴＮＦのような他の生物製剤などといった医薬と共に投与することができる。全身性エリテマトーデスの処置には、可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子を、例えばコルチコステロイド、サイトキサン、アザチオプリン、ヒドロキシクロロキン、ミコフェノール酸モフェチルおよび／または他の生物製剤などといった医薬と共に投与することができる。さらに、多発性硬化症の処置には、可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子を、例えばコルチコステロイド、インターフェロンβ−１ａ、インターフェロンβ−１ｂ、酢酸グラチラマー、塩酸ミトキサントロン、および／または他の生物製剤などといった医薬と共に投与することができる。
【００６７】
可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子（好ましくはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ）は、免疫応答を調節するために、以下の薬剤の１または複数と併用することもできる：可溶性ｇｐ３９（ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ１５４、Ｔ−ＢＡＭ、ＴＲＡＰとも呼ばれる）、可溶性ＣＤ２９、可溶性ＣＤ４０、可溶性ＣＤ８０、可溶性ＣＤ８６、可溶性ＣＤ２８、可溶性ＣＤ５６、可溶性Ｔｈｙ−１、可溶性ＣＤ３、可溶性ＴＣＲ、可溶性ＶＬＡ−４、可溶性ＶＣＡＭ−１、可溶性ＬＥＣＡＭ−１、可溶性ＥＬＡＭ−１、可溶性ＣＤ４４、ｇｐ３９と反応する抗体、ＣＤ４０と反応する抗体、Ｂ７と反応する抗体、ＣＤ２８と反応する抗体、ＬＦＡ−１と反応する抗体、ＬＦＡ−２と反応する抗体、ＩＬ−２と反応する抗体、ＩＬ−１２と反応する抗体、ＩＦＮ−γと反応する抗体、ＣＤ２と反応する抗体、ＣＤ４８と反応する抗体、ＩＣＡＭ（例えばＩＣＡＭ−２）と反応する抗体、ＣＴＬＡ４と反応する抗体、Ｔｈｙ−１と反応する抗体、ＣＤ５６と反応する抗体、ＣＤ３と反応する抗体、ＣＤ２９と反応する抗体、ＴＣＲと反応する抗体、ＶＬＡ−４と反応する抗体、ＶＣＡＭ−１と反応する抗体、ＬＥＣＡＭ−１と反応する抗体、ＥＬＡＭ−１と反応する抗体、ＣＤ４４と反応する抗体。ある態様では、モノクローナル抗体が好ましい。また他の態様では抗体断片が好ましい。当業者には容易に理解されるように、併用には、本発明の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子と他の免疫抑制剤１種、可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子と他の免疫抑制剤２種、可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子と他の免疫抑制剤３種などを含めることができる。最適な組合わせおよび用量は、当技術分野で周知の方法を使って決定し、最適化することができる。
【００６８】
具体的な組合わせの例には以下の組合わせがある：Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＣＤ８０モノクローナル抗体；Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＣＤ８６モノクローナル抗体；Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、ＣＤ８０モノクローナル抗体およびＣＤ８６モノクローナル抗体；Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびｇｐ３９モノクローナル抗体；Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＣＤ４０モノクローナル抗体；Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＣＤ２８モノクローナル抗体；Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、ＣＤ８０およびＣＤ８６モノクローナル抗体、ｇｐ３９モノクローナル；Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、ＣＤ８０およびＣＤ８６モノクローナル抗体、およびＣＤ４０モノクローナル抗体；Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、抗ＬＦＡ１モノクローナル抗体、および抗ｇｐ３９モノクローナル抗体。ｇｐ３９モノクローナル抗体の具体例はＭＲ１である。当業者には他の組合わせもすぐにわかるだろう。
【００６９】
本発明の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子、例えばＬ１０４ＥＡ２９Ｙは、例えば同種または異種移植片の急性または慢性拒絶、または自己免疫障害の処置または予防のために、または寛容を誘導するために、唯一の活性物質として、または免疫調節措置に使用される他の薬物と共に、または他の抗炎症剤と共に使用することができる。例えば、本発明の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子は、以下の薬物と併用することができる：カルシニューリン阻害剤、例えばシクロスポリンＡまたはＦＫ５０６、免疫抑制性マクロライド、例えばラパマイシンまたはその誘導体、例えば４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチルラパマイシン、リンパ球ホーミング剤、例えばＦＴＹ７２０またはその類似体、コルチコステロイド、シクロホスファミド、アザチオプレン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｅｎｅ）、メトトレキセート、レフルノミドまたはその類似体、ミゾリビン、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、１５−デオキシスパガリンまたはその類似体、免疫抑制性モノクローナル抗体、例えば白血球レセプター、例えばＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８、ＣＤ７、ＣＤ２５、ＣＤ２７、Ｂ７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５８、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭ）、ＯＸ４０、４−１ＢＢまたはそれらのリガンドに対するモノクローナル抗体、または他の免疫調節化合物、例えばＣＴＬＡ４／ＣＤ２８−Ｉｇ、または他の接着分子阻害剤、例えばＬＦＡ−１アンタゴニスト、セレクチンアンタゴニストおよびＶＬＡ−４アンタゴニストなどのモノクローナル抗体もしくは低分子量阻害剤。本化合物は、ＣＤ４０およびそのリガンドを妨害する化合物、例えばＣＤ４０に対する抗体およびＣＤ４０−Ｌに対する抗体と併用すると、例えば上記の適応症（例：寛容の誘導）に、とりわけ有用である。
【００７０】
本発明の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子を、例えば上述したような他の免疫抑制／免疫調節または抗炎症療法と併用して投与する場合、同時投与される免疫抑制剤、免疫調節剤または抗炎症性化合物の用量は、もちろん、使用する併用薬のタイプ（例えばステロイドかシクロスポリンか）、実際に使用する薬物、処置しようとする状態などに依存して変動する。
【００７１】
上記の説明に従って、本発明は、さらなる一側面として、遊離型または医薬的に許容できる塩型の本発明の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇを、第２の医薬物質と同時にまたは逐次的に同時投与することを含み、前記第２の医薬物質が例えば上述の免疫抑制薬、免疫調節薬または抗炎症薬薬物であるような、上に定義した方法を提供する。さらに本発明は、免疫抑制薬、免疫調節薬または抗炎症薬を含む少なくも１つの医薬組成物と同時にまたは逐次的に使用される遊離型または医薬的に許容できる塩型のＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇを含む、上に定義した方法で使用される治療的組合わせ、例えばキットも提供する。
【００７２】
本発明分子の製造方法
ＣＴＬＡ４突然変異体分子は原核細胞で発現させることができる。原核細胞の最も一般的な代表例は種々の細菌株である。細菌はグラム陽性菌でもグラム陰性菌でもよい。典型的には大腸菌などのグラム陰性細菌が好ましい。他の微生物株も使用することができる。
【００７３】
ＣＴＬＡ４突然変異体分子をコードする配列は、大腸菌などの原核細胞で外来配列を発現させるために設計されたベクターに挿入することができる。これらのベクターは一般に使用される原核制御配列を含むことができる。この原核制御配列とは、本明細書では、リボソーム結合部位配列と共に転写開始用のプロモーターを含み、所望によりオペレーターを含んでもよいと定義され、例えばβ−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（ｌａｃ）プロモーター系（Ｃｈａｎｇら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ １９８：１０５６）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ８：４０５７）およびラムダ由来のＰＬプロモーターおよびＮ遺伝子リボソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８）などといった一般に使用されるプロモーターを含む。
【００７４】
このような発現ベクターは、ベクターが細菌中で複製することができるように、そしてアンピシリンまたはカナマイシンなどの抗生物質の存在下で生育した時に当該プラスミドを保有する細胞を選択することができるように、複製起点と、抗生物質に対する耐性を付与するβ−ラクタマーゼまたはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子などの選択マーカーも含むだろう。
【００７５】
発現プラスミドは、例えばＣａＣｌ２ショック（Ｃｏｈｅｎ（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２１１０およびＳａｍｂｒｏｏｋら編「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））およびエレクトロポレーションなど、様々な標準的方法で原核細胞に導入することができる。
【００７６】
本発明の実施態様として、真核細胞も適切な宿主細胞である。真核細胞の例には、初代または不死化動物細胞、酵母（例えばサッカロミセス・セレビシェ、シゾサッカロミセス・ポンベおよびピキア・パストリス）および植物細胞などがある。骨髄腫、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞は、宿主として使用することができる動物細胞の例である。ＣＨＯ細胞の具体例には、例えばＤＧ４４（Ｃｈａｓｉｎら，１９８６，Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ． １２：５５５−５５６；Ｋｏｌｋｅｋａｒ，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：１０９０１−１０９０９）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ−６１）、ＣＨＯ−Ｋ１ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＥＣＡＣＣ８５０５０３０２のＣＨＯ（ＣＡＭＲ（英国ウィルトシャー・ソールズベリー））、ＣＨＯクローン１３（ＧＥＩＭＧ（イタリア・ジェノバ））、ＣＨＯクローンＢ（ＧＥＩＭＧ（イタリア・ジェノバ））、ＥＣＡＣＣ９３０６１６０７のＣＨＯ−Ｋ１／ＳＦ（ＣＡＭＲ（英国ウィルトシャー・ソールズベリー））およびＥＣＡＣＣ９２０５２１２９のＲＲ−ＣＨＯＫ１（ＣＡＭＲ（英国ウィルトシャー・ソールズベリー））などがある。植物細胞の代表例としては、タバコ（全草、細胞培養またはカルス）、トウモロコシ、ダイズおよびコメ細胞などがある。トウモロコシ、ダイズおよびコメ種子も利用することができる。
【００７７】
ＣＴＬＡ４突然変異体分子をコードする核酸配列は、真核宿主で外来配列を発現させるために設計されたベクターに挿入することもできる。このベクターの調節要素は、使用する真核宿主に応じて様々である。
【００７８】
一般に使用されるベクター発現用の真核制御配列は、ほ乳類細胞に適合したプロモーターおよび制御配列、例えばＣＭＶプロモーター（ＣＤＭ８ベクター）およびトリ肉腫ウイルス（ＡＳＶ）（πＬＮベクター）などを含む。他の一般に使用されるプロモーターには、例えばシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）の初期および後期プロモーター（Ｆｉｅｒｓら（１９７３）Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３）、または他のウイルスプロモーター、例えばポリオーマ、アデノウイルス２およびウシ乳頭腫ウイルス由来のものなどがある。ｈＭＴＩＩ（Ｋａｒｉｎら（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９９：７９７−８０２）などの誘導性プロモーターも使用することができる。
【００７９】
真核生物中でＣＴＬＡ４突然変異体分子を発現させるためのベクターはエンハンサー領域と呼ばれる配列を持ってもよい。これらは遺伝子発現の最適化に重要であり、プロモーター領域の上流または下流に見いだされる。
【００８０】
真核宿主細胞用の発現ベクターの例には、ほ乳類宿主細胞用のベクター（例えばＢＰＶ−１、ｐＨｙｇ、ｐＲＳＶ、ｐＳＶ２、ｐＴＫ２（Ｍａｎｉａｔｉｓ）；ｐＩＲＥＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；ｐＲｃ／ＣＭＶ２、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＳＦＶ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ｐＶＰａｋｃベクター、ｐＣＭＶベクター、ｐＳＧ５ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、レトロウイルスベクター（例えばｐＦＢベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ｐＣＤＮＡ−３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはその修飾型、アデノウイルスベクター；アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、酵母ベクター（例えばｐＳＥＣベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））などがあるが、これらに限るわけではない。
【００８１】
ＣＴＬＡ４突然変異体分子をコードする核酸配列は、真核宿主細胞のゲノムに組み込んで、宿主ゲノムの複製と共に複製させることができる。あるいは、ＣＴＬＡ４突然変異体分子を保有するベクターに複製起点を含ませて、染色体外複製を可能にすることもできる。
【００８２】
サッカロミセス・セレビシェで核酸配列を発現させるには、内因性酵母プラスミド２μ環状ＤＮＡ由来の複製起点を使用することができる（Ｂｒｏａｃｈ（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ． １０１：３０７）。もう一つの選択肢として、自律的複製を促進する酵母ゲノム由来の配列を使用することもできる（例えばＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂら（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２８２：３９）、Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら（１９８０）Ｇｅｎｅ １０：１５７、およびＣｌａｒｋｅら（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ． １０１：３００）。
【００８３】
酵母ベクター用の転写制御配列としては例えば糖分解酵素を合成するためのプロモーターが挙げられる（Ｈｅｓｓら（１９６８）Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ． ７：１４９、Ｈｏｌｌａｎｄら（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：４９００）。当技術分野で知られる他のプロモーターには、例えばＣＤＭ８ベクターに含まれるＣＭＶプロモーター（ＴｏｙａｍａおよびＯｋａｙａｍａ（１９９０）ＦＥＢＳ ２６８：２１７−２２１）、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎら（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５５：２０７３）および他の糖分解酵素のプロモーターなどがある。
【００８４】
その他、誘導性のプロモーターもあり、これらは環境刺激または細胞の成長培地によって調節することができる。これらの誘導性プロモーターには、例えば熱ショックタンパク質、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素異化に関係する酵素、およびマルトースおよびガラクトース資化を担う酵素の遺伝子に由来するものなどがある。
【００８５】
調節配列はコード配列の３’末端にも置くことができる。これらの配列はメッセンジャーＲＮＡを安定化するように作用するだろう。そのようなターミネーターはいくつかの酵母由来遺伝子およびほ乳類遺伝子のコード配列に続く３’非翻訳領域に見いだされる。
【００８６】
植物用ベクターおよび植物細胞の代表例には、アグロバクテリウムＴｉプラスミド、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）およびトマトゴールデンモザイクウイルス（ＴＧＭＶ）などがあるが、これらに限るわけではない。
【００８７】
ほ乳類細胞宿主系形質転換の一般面は、１９８３年８月１６日発行の米国特許第４，３９９，２１６号にＡｘｅｌらが記載している。ほ乳類細胞は、例えばリン酸カルシウム存在下でのトランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどの方法、またはウイルスベクターによる形質導入によって形質転換することができる。
【００８８】
植物および酵母ゲノムに外来ＤＮＡ配列を導入する方法としては、（１）機械的方法、例えば単一細胞またはプロトプラストへのＤＮＡのマイクロインジェクション、ＤＮＡの存在下で細胞をガラスビーズと共にボルテックスする方法、またはＤＮＡで覆ったタングステンまたは金球体を細胞またはプロトプラストに撃ち込む方法など、（２）ポリエチレングリコール処理または高圧電気パルスの印加（エレクトロポレーション）によって巨大分子に対して細胞膜を透過性にすることにより、ＤＮＡを導入する方法、または（３）リポソーム（ｃＤＮＡを含むもの）を使って細胞膜に融合させる方法などが挙げられる。
【００８９】
ＣＴＬＡ４突然変異体分子の発現は当技術分野で知られた方法によって検出することができる。例えば突然変異体分子はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシー染色およびＣＴＬＡ４を結合する抗体を使った免疫ブロッティングによって検出することができる。タンパク質の回収は、標準的なタンパク質精製手段、例えばアフィニティークロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーなどを用いて実質的に純粋な産物を得ることによって行うことができる（Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」第３版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９９４））。
【００９０】
本発明はさらに、上で製造された可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子も提供する。
【００９１】
ＣＴＬＡ４Ｉｇコドンベース突然変異誘発法
一態様として、部位特異的突然変異誘発法および新規スクリーニング法を使って、ＣＤ８６に対する結合アビディティーを向上させるＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン中の突然変異をいくつか同定した。この態様では、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインのうち、セリン２５からアルギニン３３までの領域、Ｃ’鎖（アラニン４９およびスレオニン５１）、Ｆ鎖（リジン９３、グルタミン酸９５およびロイシン９６）、メチオニン９７からチロシン１０２までの領域、チロシン１０３からグリシン１０７までの領域、そしてグルタミン１１１、チロシン１１３およびイソロイシン１１５のＧ鎖中の残基に突然変異を導入した。これらの部位は、キメラＣＤ２８／ＣＴＬＡ４融合タンパク質の研究（Ｐｅａｃｈら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９４，１８０：２０４９−２０５８）、どのアミノ酸残基側鎖が溶媒露出しているかを予測するモデル、およびＣＤ２８とＣＴＬＡ４の間で一定の位置にアミノ酸残基同一性または相同性が欠けていることに基づいて選択した。また、特定した残基に空間的に近接（５〜２０オングストローム単位）している残基も本発明の一部とみなされる。
【００９２】
ＣＤ８０および／またはＣＤ８６に対するアフィニティーが変化している可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子を合成し選別するために、２段階法を採用した。これらの実験では、まず、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインの特定コドンにおける突然変異のライブラリーを作製し、次にＢＩＡｃｏｒｅ解析によってそれらをスクリーニングすることにより、ＣＤ８０またはＣＤ８６に対する反応性が変化している突然変異体を同定した。ＢＩＡｃｏｒｅアッセイシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ（ニュージャージー州ピスカタウェイ））では、検出器に配置されたデキストラン被覆センサーチップへのＣＤ８０ＩｇまたはＣＤ８６Ｉｇの共有結合が基本的に必要な表面プラズモン共鳴検出器システムを使用する。次に、センサーチップを含むチャンバーに試験分子を注入し、結合する相補的タンパク質の量を、センサーチップのデキストラン被覆側に物理的に結合している分子量の変化に基づいて評価することができ、分子量の変化は検出器システムによって測定することができる。
【００９３】
本発明の利点
ＣＤ８０およびＣＤ８６へのＣＴＬＡ４結合は迅速な「オン」速度と迅速な解離（「オフ」）速度とを特徴とすること、またＣＴＬＡ４Ｉｇ−ＣＤ８６複合体はＣＴＬＡ４Ｉｇ−ＣＤ８０複合体よりおよそ５〜８倍迅速に解離することから、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６からのＣＴＬＡ４Ｉｇの解離速度を遅くすることにより、より強力な免疫抑制特性を持つ分子が得られるだろうと考えた。したがってＣＤ８０陽性またはＣＤ８６陽性細胞に対して野生型ＣＴＬＡ４または非突然変異型ＣＴＬＡ４Ｉｇより高いアビディティーを持つ可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子は、ＣＴＬＡ４または非突然変異型ＣＴＡＬ４Ｉｇよりも高い効率で抗原特異的活性化細胞のプライミングを遮断すると予想される。
【００９４】
さらにまたＣＴＬＡ４Ｉｇの製造コストは極めて高い。より強力な免疫抑制特性を持つ高アビディティー突然変異型ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子は、臨床的に非突然変異型ＣＴＬＡ４Ｉｇよりかなり低い用量で使用しても、ほぼ同等の免疫抑制レベルを達成することができる。したがって可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子、例えばＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは費用効果が極めて高いだろう。
【００９５】
本発明を例示して、当業者がそれを製造し使用する際の助けとなるように、以下に実施例を記載する。以下の実施例は決して本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【００９６】
実施例
実施例１
この実施例では本発明の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子をコードするヌクレオチド配列を作製するために使用する方法を説明する。一部位突然変異体Ｌ１０４ＥＩｇを作製し、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６に関する結合動態を調べた。テンプレートとしてＬ１０４ＥＩｇヌクレオチド配列を使用して、二部位突然変異型ＣＴＬＡ４配列Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇを作製し、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６に関する結合動態を調べた。
【００９７】
ＣＴＬＡ４Ｉｇコドンベース突然変異誘発
ＣＤ８０および／またはＣＤ８６分子からの解離速度（「オフ」速度）が遅くなっている突然変異型ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子を同定するために、突然変異誘発およびスクリーニング方法を開発した。テンプレートとしてＣＴＬＡ４Ｉｇ（米国特許第５，８４４，０９５号、第５，８５１，７９５号および第５，８８５，７９６号、ＡＴＣＣ受託番号６８６２９）を使用して、一部位突然変異体ヌクレオチド配列を作製した。コドンの１位および２位は任意の塩基であってよいが３位はグアニンまたはチミンのみ（ＸＸＧ／Ｔ；ＮＮＧ／Ｔともいう）とすることにより、特定ｃＤＮＡコドンのランダム突然変異誘発用の変異原オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを設計した。この方法でアミノ酸をコードする特定のコドンを、２０アミノ酸のそれぞれをコードするように、ランダムに突然変異させた。このＸＸＧ／Ｔ突然変異誘発法では、２０アミノ酸のそれぞれをコードする３２種類のコドンが得られる。ＣＴＬＡ４ＩｇのＭ９７〜Ｇ１０７（図７または８参照）付近に突然変異をコードするＰＣＲ産物をＳａｃＩ／ＸｂａＩで消化し、同様に切断したＣＴＬＡ４ＩｇπＬＮ発現ベクターにサブクローニングした。この方法を使って、一部位ＣＴＬＡ４突然変異体分子Ｌ１０４ＥＩｇ（図８）を作製した。
【００９８】
ＣＴＬＡ４ＩｇのＳ２５〜Ｒ３３付近の突然変異誘発については、ＰＣＲプライマー指定突然変異誘発法によって、まず、このループの５’側にサイレントなＮｈｅＩ制限部位を導入した。ＰＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＸｂａＩで消化し、同様に切断したＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＩｇ発現ベクターにサブクローニングした。この方法を使って、二部位ＣＴＬＡ４突然変異体分子Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（図７）を作製した。具体的には、テンプレートとして一部位ＣＴＬＡ４突然変異体分子Ｌ１０４ＥＩｇをコードする核酸分子を使用して、二部位ＣＴＬＡ４突然変異体分子Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇを作製した。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇを含むｐｉＬＮベクターを図１２に示す。
【００９９】
実施例２
以下に、実施例１に記載のコンストラクトから発現された一部位および二部位突然変異型ＣＴＬＡ４ポリペプチドであって、ＣＤ８０およびＣＤ８６抗原に対して非突然変異型ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子より高い結合アビディティーを示すものを同定するために使用したスクリーニング方法を説明する。
【０１００】
最新のインビトロおよびインビボ研究により、ＣＴＬＡ４Ｉｇ単独では抗原特異的活性化Ｔ細胞のプライミングを完全には遮断できないことが示されている。ＣＴＬＡ４Ｉｇと、ＣＤ８０またはＣＤ８６に特異的なモノクローナル抗体とを用いてＴ細胞増殖の阻害を測定したインビトロ研究では、抗ＣＤ８０モノクローナル抗体がＣＴＬＡ４Ｉｇ阻害を増強しなかったことが示されている。しかし、抗ＣＤ８６モノクローナル抗体は阻害を増強したことから、ＣＴＬＡ４ＩｇはＣＤ８６相互作用の遮断にはあまり有効でないことがわかる。これらのデータは、ＣＤ８０が媒介する細胞応答の阻害に必要なＣＴＬＡ４Ｉｇ濃度はＣＤ８６が媒介する細胞応答の場合の約１／１００であることを示したＬｉｎｓｌｅｙら（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９４）１：７９３−８０１）による初期の発見を裏付けている。これらの知見に基づいて、ＣＤ８６に対して野生型ＣＴＬＡ４より高いアビディティーを持つ可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子は、抗原特異的活性化細胞のプライミングをＣＴＬＡ４Ｉｇより良く遮断することができるはずであると推測した。
【０１０１】
そこで、新しいスクリーニング法を用いて上記実施例１に記載の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異体分子をスクリーニングして、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する結合アビディティーを向上させるＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン中の突然変異をいくつか同定した。「オフ」速度の決定は濃度に依存しないので、このスクリーニング方法は、「オフ」速度が遅くなっていると思われる突然変異体を、タンパク質精製または定量を行わずに直接同定するための効果的な方法になる（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙら（１９９３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１２：４５７−４６８）。
【０１０２】
ＣＯＳ細胞に個々のミニプレップ精製プラスミドＤＮＡをトランスフェクトし、数日間増殖させた。３日調整培養培地を可溶性ＣＤ８０ＩｇまたはＣＤ８６Ｉｇで被覆したＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサーチップ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ（スウェーデン・ウプサラ）にかけた。突然変異体タンパク質の特異的結合および解離を、表面プラズモン共鳴によって測定した（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ，Ｄ．Ｊ．ら（１９９３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１２：４５７−４６８）。実験は全てＢＩＡｃｏｒｅ（商標）またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００バイオセンサーを使って２５℃で行った。リガンドは一般的なＮ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドＮ−ヒドロキシスクシンイミドカップリング法を使って研究用ＮＣＭ５センサーチップ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に固定化した（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．ら（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９８：２６８−２７７、Ｋｈｉｌｋｏ，Ｓ．Ｎ．ら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６８：５４２５−１５４３４）。
【０１０３】
スクリーニング法
２４穴組織培養プレートで生育したＣＯＳ細胞に、突然変異型ＣＴＬＡ４ＩｇをコードするＤＮＡを一過性にトランスフェクトした。分泌された可溶性突然変異型ＣＴＬＡ４Ｉｇを含む培養培地を３日後に収集した。
【０１０４】
Ｇｒｅｅｎｅら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１：２６７６２−２６７７１に記載されているようにＣＤ８６ＩｇまたはＣＤ８０Ｉｇで誘導体化したＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサーチップに、ＣＯＳ細胞調整培養培地を流し、野生型ＣＴＬＡ４Ｉｇに見られる「オフ」速度より遅い「オフ」速度を持つ突然変異体分子を同定した。選択した培地試料に対応するｃＤＮＡを配列決定した。また、ＣＯＳ細胞一過性トランスフェクションを大量に行って、そこから培養培地のプロテインＡ精製によって突然変異型ＣＴＬＡ４Ｉｇタンパク質を調製するために、ＤＮＡを調製した。
【０１０５】
ＢＩＡｃｏｒｅ解析条件および平衡結合データ解析はＪ．Ｇｒｅｅｎｅら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１：２６７６２−２６７７１および本明細書に記載されているように行った。
【０１０６】
ＢＩＡｃｏｒｅデータ解析
分析に先立ってセンサーグラムのベースラインをゼロ応答単位（ＲＵ）に標準化した。試料をモック誘導化フローセルに流して、溶液間のバルク屈折率差によるバックグラウンド応答単位（ＲＵ）値を決定した。平衡解離定数（Ｋｄ）はＲｅｑ対Ｃのプロットから計算した。ここに、Ｒｅｑは（定常状態応答）−（モック誘導化チップでの応答）であり、Ｃは分析物のモル濃度である。結合曲線は市販の非線形カーブフィッティングソフトウェア（Ｐｒｉｓｍ、ＧｒａｐｈＰＡＤ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使って解析した。
【０１０７】
実験データは、まず単一レセプターへの単一リガンド結合のモデル（１部位モデル、すなわち単純なラングミュアー系、Ａ＋Ｂ←→ＡＢ）にあてはめ、平衡結合定数（Ｋｄ＝［Ａ］［Ｂ］／［ＡＢ］）を式：Ｒ＝Ｒｍａｘ・Ｃ／（Ｋｄ＋Ｃ）から計算した。次に、データを、リガンド結合の最も簡単な二部位モデル（すなわち、式：Ｒ＝Ｒｍａｘ１・Ｃ／（Ｋｄ１＋Ｃ）＋Ｒｍａｘ２・Ｃ／（Ｋｄ２＋Ｃ）で表される２つの相互作用しない独立した結合部位を持つレセプター）にあてはめた。
【０１０８】
これら２つのモデルの適合度を、実験データとの比較によって視覚的に、また平方和のＦ検定によって統計的に解析した。二部位モデルの方が適合度が有意に高くない限り（ｐ＜０．１）、より単純な一部位モデルをベストフィットとして選択した。
【０１０９】
結合および解離解析はＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ２．１ソフトウェア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使って行った。結合速度定数ｋｏｎは均一な一部位相互作用および並行２部位相互作用の両方を仮定して２つの方法で計算した。一部位相互作用の場合は、Ｒｔ＝Ｒｅｑ（１−ｅｘｐ−ｋｓ（ｔ−ｔ０））［式中、Ｒｔは時刻ｔにおける応答、Ｒｅｑは定常状態応答、ｔ０は注入を開始した時刻、ｋｓ＝ｄＲ／ｄｔ＝ｋｏｎ・Ｃｋｏｆｆであって、Ｃはモノマー結合部位に関して計算した分析物の濃度である］に従ってｋｏｎ値を計算した。二部位相互作用の場合は、式：Ｒｔ＝Ｒｅｑ１（１−ｅｘｐ−ｋｓ１（ｔ−ｔ０））＋Ｒｅｑ２（１−ｅｘｐｋｓ２（ｔ−ｔ０））に従ってｋｏｎ値を計算した。各モデルについて、ｋｓ対Ｃのプロットの傾き（最大結合の約７０％まで）の計算値からｋｏｎの値を決定した。
【０１１０】
解離データは一部位モデル（ＡＢ＝Ａ＋Ｂ）または二部位モデル（ＡｉＢｊ＝Ａｉ＋Ｂｊ）に従って解析し、速度定数（ｋｏｆｆ）をベストフィット曲線から計算した。誤差が機械のバックグランド（機械によって２〜１０ＲＵ）より大きい場合（その場合は二結合部位モデルを使用）を除いて、上記結合部位モデルを使用した。レセプター占有の半減期はｔ１／２＝０．６９３／ｋｏｆｆの関係を使って計算した。
【０１１１】
フローサイトメトリー
マウスモノクローナル抗体Ｌ３０７．４（抗ＣＤ８０）はＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（カリフォルニア州サンホゼ）から購入し、ＩＴ２．２（抗Ｂ７−０［ＣＤ８６とも呼ばれる］）はＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。免疫染色のために、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中でインキュベートすることによって、ＣＤ８０陽性および／またはＣＤ８６陽性ＣＨＯ細胞を培養器から取り出した。ＣＨＯ細胞（１〜１０×１０５個）をまずモノクローナル抗体または免疫グロブリン融合タンパク質と共に１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ中でインキュベートした後、洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート結合ヤギ抗マウスまたは抗ヒト免疫グロブリン第２段階試薬と共にインキュベートした（Ｔａｇｏ（カリフォルニア州バーリンゲーム））。細胞に最終洗浄を施し、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で解析した。
【０１１２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィー
ＳＤＳ−ＰＡＧＥはトリス／グリシン４−２０％アクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ（カリフォルニア州サンディエゴ））で行った。分析用ゲルはクーマシーブルーで染色し、デジタルスキャニングによって湿ゲルの画像を得た。０．０２％ＮａＮ３を含むリン酸緩衝食塩水で平衡化したＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３００ ＳＷＸＬカラム（７．８×３００ｍｍ、Ｔｏｓｏｈａａｓ（ペンシルバニア州モントゴメリービル））を使用し、１．０ｍｌ／分の流量で、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（２５μｇ）およびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（２５μｇ）をサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。
【０１１３】
ＣＴＬＡ４ＸＣ１２０ＳおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＸＣ１２０Ｓ
一本鎖ＣＴＬＡ４ＸＣ１２０Ｓを先に記述されているように製造した（Ｌｉｎｓｌｅｙら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：１５４１７−１５４２４）。簡単に述べると、オンコスタチンＭ ＣＴＬＡ４（ＯＭＣＴＬＡ４）発現プラスミドをテンプレートとして使用し、ベクター中の配列に適合するようにフォワードプライマー：
ＧＡＧＧＴＧＡＴＡＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＡＡＴＧＧＧＴＧＴＡＣＴＧＣＴＣＡＣＡＣＡＧ
を選択した。またリバースプライマー：
ＧＴＧＧＴＧＴＡＴＴＧＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＴＣＡＧＡＡＴＣＴＧＧＧＣＡＣＧＧＴＴＣ
は、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインの最後の７アミノ酸（すなわちアミノ酸１１８〜１２４）に相当し、制限酵素部位および停止コドン（ＴＧＡ）を含んだ。Ｃ１２０Ｓ（１２０位におけるシステインからセリンへの）突然変異はリバースプライマーによって指定された。具体的に述べると、上記リバースプライマーのヌクレオチド配列ＧＣＡ（ヌクレオチド３４〜３６）を以下のヌクレオチドの一つで置き換える：ＡＧＡ、ＧＧＡ、ＴＧＡ、ＣＧＡ、ＡＣＴまたはＧＣＴ。当業者には理解されるであろうが、ヌクレオチド配列ＧＣＡはシステインのコドンＴＧＣの逆相補配列である。同様に、ヌクレオチド配列ＡＧＡ、ＧＧＡ、ＴＧＡ、ＣＧＡ、ＡＣＴまたはＧＣＴはセリンのコドンの逆相補配列である。ポリメラーゼ連鎖反応産物をＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩで消化し、発現ベクターπＬＮ（Ｂｒｉｓｔｒｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ（ニュージャージー州プリンストン））に特定の向きでサブクローニングした。各コンストラクトをＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１１４】
高アビディティー突然変異体の同定および生化学的特徴づけ
２４のアミノ酸を突然変異誘発用に選択し、得られた約２３００の突然変異型タンパク質を、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ；上記の方法）により、ＣＤ８６Ｉｇ結合に関してアッセイした。各部位での突然変異誘発の主な効果を表３に要約する。Ｓ２５〜Ｒ３３中のアミノ酸の一部にはランダム突然変異を施してもリガンド結合は変化しないようだった。Ｅ３１およびＲ３３ならびに残基Ｍ９７〜Ｙ１０２の突然変異誘発はリガンド結合の低下をもたらすようだった。残基Ｓ２５、Ａ２９、およびＴ３０、Ｋ９３、Ｌ９６、Ｙ１０３、Ｌ１０４、およびＧ１０５の突然変異誘発は「オン」速度の低下および／または「オフ」速度の低下をもたらした。これらの結果は、Ｓ２５〜Ｒ３３領域中の残基およびＭ９７〜Ｙ１０２中またはその近傍にある残基がリガンド結合に影響するという先の発見を裏付けている（Ｐｅａｃｈら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：２０４９−２０５８）。
【０１１５】
部位Ｓ２５、Ｔ３０、Ｋ９３、Ｌ９６、Ｙ１０３およびＧ１０５の突然変異誘発によって、「オフ」速度がＣＤ８６Ｉｇより遅い突然変異体がいくつか同定された。しかしこれらの例では、遅い「オフ」速度が遅い「オン」速度と相殺して、ＣＤ８６Ｉｇに対して野生型ＣＴＬＡ４Ｉｇで見られるアビディティーと見かけ上同じ程度の総アビディティーを持つ突然変異体が得られた。また、Ｋ９３の突然変異誘発はかなりの凝集をもたらしたが、これも観察された動態変化の原因になっていたのだろう。
【０１１６】
Ｌ１０４にランダム突然変異誘発を行った後、ＣＯＳ細胞のトランスフェクションおよび固定化ＣＤ８６Ｉｇに対する培養培地試料のＳＰＲによるスクリーニングを行ったところ、「オフ」速度が野生型ＣＴＬＡ４Ｉｇのおよそ１／２しかない突然変異体タンパク質を含む培地試料が６つ得られた。これら突然変異体の対応するｃＤＮＡを配列決定したところ、いずれもロイシンからグルタミン酸への突然変異（Ｌ１０４Ｅ）をコードすることがわかった。ロイシン１０４からアスパラギンへの置換（Ｌ１０４Ｄ）はＣＤ８６Ｉｇ結合に影響を及ぼさないようだった。
【０１１７】
次に、今度はＰＣＲテンプレートとして野生型ＣＴＬＡ４ＩｇではなくＬ１０４Ｅを使用して、表３に列挙した各部位で、上述のように突然変異誘発を繰り返した。再び固定化ＣＤ８６Ｉｇを使ってＳＰＲ解析を行ったところ、アラニン２９の突然変異誘発により、「オフ」速度が野生型ＣＴＬＡ４Ｉｇのおよそ１／４しかないタンパク質を含む培養培地試料が６つ同定された。最も遅い２つはチロシン置換（Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙ）、２つはロイシン（Ｌ１０４ＥＡ２９Ｌ）、１つはトリプトファン（Ｌ１０４ＥＡ２９Ｗ）、そして１つはスレオニン（Ｌ１０４ＥＡ２９Ｔ）だった。野生型ＣＴＬＡ４Ｉｇのアラニン２９を単独でランダムに突然変異させても遅い「オフ」速度を持つ突然変異体は同定されないようだった。
【０１１８】
精製したＬ１０４ＥおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの相対分子量および凝集状態をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって評価した。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（約１μｇ；レーン３）およびＬ１０４ＥＩｇ（約１μｇ；レーン２）は、還元条件（約５０ｋＤａ；＋βＭＥ；＋２−メルカプトエタノール）でも非還元条件（約１００ｋＤａ；−βＭＥ）でも、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（約１μｇ；レーン１）と見かけ上同じ電気泳動移動度を持っていた（図１０Ａ）。サイズ排除クロマトグラフィーにより、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（図１０Ｃ）はＣＴＬＡ４Ｉｇ二量体（図１０Ｂ）と見かけ上同じ移動度を持つことが証明された。主要ピークはタンパク質二量体に相当し、図１０Ｂで速く溶出するマイナーピークは高分子量凝集体に相当する。ＣＴＬＡ４Ｉｇの約５．０％は高分子量凝集体として存在したが、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇまたはＬ１０４ＥＩｇの凝集を示す証拠は認められなかった。したがって、Ｌ１０４ＥＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇに見られたＣＤ８６Ｉｇへの強い結合は、突然変異誘発が誘発した凝集に起因するものではないと考えられる。
【０１１９】
平衡結合解析および速度論的結合解析
プロテインＡで精製したＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＩｇ、およびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇに対し、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を使って、平衡結合解析および速度論的結合解析を行った。結果を表２に示す。観察された平衡解離定数（Ｋｄ；表２）はある濃度範囲（５．０〜２００ｎＭ）にわたって作成した結合曲線から計算した。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇはＬ１０４ＥＩｇまたはＣＴＬＡ４Ｉｇより強くＣＤ８６Ｉｇに結合する。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇのＫｄ（３．２１ｎＭ）がＬ１０４ＥＩｇ（６．０６ｎＭ）またはＣＴＬＡ４Ｉｇ（１３．９ｎＭ）より低いことは、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの方がＣＤ８６Ｉｇに対して高い結合アビディティーを持つことを示している。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇのＫｄ（３．６６ｎＭ）がＬ１０４ＥＩｇ（４．４７ｎＭ）またはＣＴＬＡ４Ｉｇ（６．５１ｎＭ）より低いことは、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの方がＣＤ８０Ｉｇに対して高い結合アビディティーを持つことを示している。
【０１２０】
速度論的結合解析により、ＣＤ８０に対するＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ結合の「オン」速度は同じぐらいであり、ＣＤ８６Ｉｇに関する「オン」速度も同様であることがわかった（表２）。しかしこれらの分子の「オフ」速度は等しくなかった（表２）。ＣＴＬＡ４Ｉｇと比較すると、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇのＣＤ８０Ｉｇからの「オフ」速度は約１／２、ＣＤ８６Ｉｇからの「オフ」速度は約１／４だった。Ｌ１０４Ｅの「オフ」速度はＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇとＣＴＬＡ４Ｉｇの中間だった。これらの突然変異の導入は「オン」速度には有意な影響を与えなかったので、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇで観察されたＣＤ８０ＩｇおよびＣＤ８６Ｉｇに対するアビディティーの増加は、主として「オフ」速度の低下によると思われた。
【０１２１】
ＣＤ８６ＩｇおよびＣＤ８０Ｉｇに対するＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇのアビディティーの増加が、各単量体の二量体としての会合の仕方に突然変異が影響を与えたためかどうか、あるいはアビディティーを増大させる構造変化が各単量体に導入されたかどうかを決定するために、ＣＴＬＡ４およびＬ１０４ＥＡ２９Ｙ細胞外ドメインの一本鎖コンストラクトを、上述のように、そしてＬｉｎｓｌｅｙら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：１５４１７−１５４２４に記載のように、システイン１２０のセリンへの突然変異誘発によって作製した。精製したタンパク質ＣＴＬＡ４ＸＣ１２０ＳおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＸＣ１２０Ｓが単量体であることをゲル透過クロマトグラフィーによって明らかにした後（Ｌｉｎｓｌｅｙら（１９９５）前掲）、それらのリガンド結合特性をＳＰＲによって解析した。その結果、ＣＤ８６Ｉｇに対する両単量体タンパク質の結合アフィニティーはそれぞれの二量体で観察される結合アフィニティーのおよそ３５〜８０分の１であることがわかった（表２）。これは、高アビディティーリガンド結合にはＣＴＬＡ４の二量化が必要であることを示す先に公表されたデータを裏付けている（Ｇｒｅｅｎｅら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：２６７６２−２６７７１）。
【０１２２】
Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＸＣ１２０ＳはＣＤ８０ＩｇにもＣＤ８６ＩｇにもＣＴＬＡ４ＸＣ１２０Ｓより約２倍高いアフィニティーで結合した。このアフィニティーの増大は、どちらのリガンドからも解離速度が約１／３に低下したためだった。したがって、Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙによる強いリガンド結合は、分子の二量化に変化があったからではなく、おそらくアビディティーを増大させる構造変化が各モノマー鎖に導入されたためだろう。
【０１２３】
アビディティを増大させる突然変異の位置および構造解析
最近、ＣＴＬＡ４の細胞外ＩｇＶ様ドメインの溶液構造がＮＭＲ分光法によって決定された（Ｍｅｔｚｌｅｒら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，４：５２７−５３１）。これにより、三次元フォールドにおけるロイシン１０４およびアラニン２９の正確な位置特定が可能になった（図１１Ａ〜Ｂ）。ロイシン１０４は高度に保存されたＭＹＰＰＰＹアミノ酸配列の近くに位置する。アラニン２９は、ＭＹＰＰＰＹ領域に空間的に隣接するＳ２５〜Ｒ３３領域のＣ末端近くに位置する。これら２つの領域の基礎をなす残基間には有意な相互作用があるが、Ｌ１０４とＡ２９の間には、どちらもタンパク質の隣接する疎水コアの一部を構成しているものの、直接的な相互作用はないようである。アビディティーを増大させる２つの突然変異が構造にもたらす結果をモデリングによって評価した。Ａ２９Ｙ突然変異はＳ２５〜Ｒ３３領域とＭＹＰＰＰＹ領域の間の溝に容易に収納され、ＭＹＰＰＰＹ領域のコンフォメーションを安定化する役割を果たしうる。野生型ＣＴＬＡ４では、Ｌ１０４はＭＹＰＰＰＹ領域に近いＬ９６およびＶ９４と強い疎水相互作用を形成する。グルタミン酸突然変異がＬ１０４に似たコンフォメーションをとることは２つの理由からまずあり得ない。第１に、Ｓ２５〜Ｒ３３領域に有意な摂動を加えずに構造上長いグルタミン酸側鎖を収容するには空間が不十分である。第２に、グルタミン酸側鎖の負電荷を疎水領域に埋め込むとエネルギー損失が大きい。むしろモデリング研究によれば、グルタミン酸側鎖は表面に飛びだし、表面ではその電荷が溶媒和によって安定化されうることが予測される。このようなコンフォメーション変化は、当該領域中の他の残基に歪みをもたらすことなく、Ｇ１０５によって容易に調節されうる。
【０１２４】
ＣＤ８０またはＣＤ８６を発現するＣＨＯ細胞への高アビディティー突然変異体の結合
安定にトランスフェクトされたＣＤ８０＋およびＣＤ８６＋ＣＨＯ細胞へのＣＴＬＡ４Ｉｇおよび突然変異体分子結合のＦＡＣＳ解析（図２）を本明細書に記載するように行った。ＣＤ８０陽性およびＣＤ８６陽性ＣＨＯ細胞を様々な濃度のＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇまたはＬ１０４ＥＩｇと共にインキュベートした後、洗浄した。結合した免疫グロブリン融合タンパク質をフルオレセインイソチオシアネート結合ヤギ抗ヒト免疫グロブリンを使って検出した。
【０１２５】
図２に示すように、ＣＤ８０陽性またはＣＤ８６陽性ＣＨＯ細胞（１．５×１０５個）を、表示した濃度のＣＴＬＡ４Ｉｇ（■）、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（○）またはＬ１０４ＥＩｇ（△）と共に２３℃で２時間インキュベートし、洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート結合ヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗体と共にインキュベートした。合計５，０００個の生細胞への結合をＦＡＣＳｃａｎで解析し（単回測定）し、ＰＣ−ＬＹＳＹＳを使ってデータヒストグラムから平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定した。データを、第２段階試薬のみと共にインキュベートした細胞で測定されたバックグラウンド蛍光（ＭＦＩ＝７）に関して補正した。対照Ｌ６モノクローナル抗体（８０μｇ／ｍｌ）は３０未満のＭＦＩを示した。これらの結果は４回の独立した実験の代表例である。
【０１２６】
ヒトＣＤ８０トランスフェクトＣＨＯ細胞へのＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、Ｌ１０４ＥＩｇおよびＣＴＬＡ４Ｉｇの結合はほぼ同等である（図２Ａ）。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＬ１０４ＥＩｇは、ヒトＣＤ８６を安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に、ＣＴＬＡ４Ｉｇより強く結合する（図２Ｂ）。
【０１２７】
機能アッセイ
ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞を免疫磁気ネガティブ選択法によって単離した（Ｌｉｎｓｌｅｙら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １７６：１５９５−１６０４）。単離したＣＤ４陽性Ｔ細胞を、滴定濃度の阻害剤の存在下にホルバール（ｐｈｏｒｂａｌ）ミリステートアセテート（ＰＭＡ）＋ＣＤ８０陽性またはＣＤ８６陽性ＣＨＯ細胞で刺激した。ＣＤ４陽性Ｔ細胞（８〜１０×１０４個／細胞）を１ｎＭ ＰＭＡの存在下で、照射ＣＨＯ細胞刺激因子と共にまたは同刺激因子なしで培養した。７２時間培養の最後の７時間にわたって１μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］チミジンを添加することにより、増殖応答を測定した。ＰＭＡ＋ＣＤ８０陽性ＣＨＯまたはＣＤ８６陽性ＣＨＯ刺激Ｔ細胞のＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＣＴＬＡ４Ｉｇによる阻害を行った。結果を図３に示す。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇはＣＤ８０陽性ＰＭＡ処理ＣＨＯ細胞の増殖をＣＴＬＡ４Ｉｇより強く阻害した（図３Ａ）。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇはＣＤ８６陽性ＰＭＡ処理ＣＨＯ細胞の増殖の阻害にもＣＴＬＡ４Ｉｇより有効だった（図３Ｂ）。したがってＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、Ｔ細胞のＣＤ８０媒介性共刺激およびＣＤ８６媒介性共刺激のどちらについても、より強力な阻害剤である。
【０１２８】
図４は、上で調製したアロ刺激ヒトＴ細胞を、ＣＤ８０およびＣＤ８６を発現させるＰＭと呼ばれるヒトＢリンパ芽球腫細胞株（ＬＣＬ）でさらにアロ刺激した細胞のＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＣＴＬＡ４Ｉｇによる阻害を示している（３．０×１０４個／ウェルのＴ細胞および８．０×１０３個／ウェルのＰＭ）。一次アロ刺激を６日間行った後、細胞に３Ｈ−チミジンを７時間パルスし、次いで放射ラベルの取込みを決定した。
【０１２９】
二次アロ刺激は以下のように行った。７日間一次アロ刺激したＴ細胞をリンパ球分離媒体（ＬＳＭ）（ＩＣＮ（オハイオ州オーロラ））上に収集し、２４時間休止させた。次に、上と同じ比率のＰＭを加えることにより、滴定量のＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの存在下で、Ｔ細胞を再び（二次）刺激した。３日間刺激した後、細胞に放射標識をパルスし、上記のように収集した。一次アロ刺激Ｔ細胞に対するＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの効果を図４Ａに示す。二次アロ刺激Ｔ細胞に対するＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの効果を図４Ｂに示す。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは一次、二次共にＴ細胞増殖応答をＣＴＬＡ４Ｉｇより強く阻害する。
【０１３０】
サイトカイン産生（図５）を測定するために、一対の二次アロ刺激プレートを用意した。３日後にＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（カリフォルニア州カマリロ））を使用し製造者の推奨する条件で培養培地をアッセイした。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、二次アロ刺激後のＴ細胞のＩＬ−２、ＩＬ−４およびγ−ＩＦＮサイトカイン産生の遮断に関して、ＣＴＬＡ４Ｉｇより強力であることがわかった（図５Ａ〜Ｃ）。
【０１３１】
サル混合リンパ球反応（ＭＬＲ）に対するＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＣＴＬＡ４Ｉｇの効果を図６に示す。２匹のサルの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ；各サルから３．５×１０４細胞／ウェル）をリンパ球分離媒体（ＬＳＭ）で精製し、２μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）と混合した。細胞を３日間刺激した後、放射標識を１６時間パルスしてから収集した。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇはサルＴ細胞増殖をＣＴＬＡ４Ｉｇより強く阻害した。
【０１３２】
平衡定数および見かけの速度定数を以下の表に示す（値は３回の異なる実験から得た平均±標準偏差である）
【表２】
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【０１３３】
以下に挙げる部位でのＣＴＬＡ４Ｉｇの突然変異誘発によるＣＤ８６Ｉｇ結合に対する効果を上述のようにＳＰＲによって決定した。主な効果を「＋」記号で示す。
【表３】
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【０１３４】
本発明が関係する分野の当業者には明らかであろうが、本発明には、本発明の精神または欠くことのできない特徴から逸脱することなく、上に詳しく開示した態様以外の態様を持たせることができる。したがって上述した本発明の具体的態様は例示であって限定ではないとみなすべきである。本発明の範囲は上記の説明に含まれる実施例に限定されるのではなく特許請求の範囲に記載されているとおりである。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＣＤ８６Ｉｇに対するＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、Ｌ１０４ＥＩｇおよび野生型ＣＴＬＡ４Ｉｇの平衡結合解析を表す図。
【図２】上記実施例２に記載するヒトＣＤ８０またはヒトＣＤ８６トランスフェクトＣＨＯ細胞へのＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、Ｌ１０４ＥＩｇおよびＣＴＬＡ４Ｉｇの結合を示すＦＡＣＳアッセイのデータを表す図。
【図３】上記実施例２に記載するＣＤ８０陽性およびＣＤ８６陽性ＣＨＯ細胞の増殖の阻害を表す図。
【図４】上記実施例２で説明するように、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇが一次および二次アロ刺激Ｔ細胞の増殖の阻害に関してＣＴＬＡ４Ｉｇより有効であることを示す図。
【図５】上記実施例２で説明するように、アロ刺激ヒトＴ細胞におけるＩＬ−２（図５Ａ）、ＩＬ−４（図５Ｂ）およびγ−インターフェロン（図５Ｃ）サイトカイン産生の阻害に関して、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇがＣＴＬＡ４Ｉｇより有効であることを示す図。
【図６】上記実施例２で説明するように、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）刺激サルＴ細胞の増殖の阻害に関して、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇがＣＴＬＡ４Ｉｇより有効であることを示す図。
【図７】上記実施例１で説明するようにシグナルペプチド、＋１位のメチオニンから始まって＋１２４位のアスパラギン酸で終わるかまたは−１位のアラニンから始まって＋１２４位のアスパラギン酸で終わるＣＴＬＡ４の突然変異型細胞外ドメイン、およびＩｇ領域を含むＣＴＬＡ４突然変異体分子（Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を表す図。
【図８】上記実施例１で説明するようにシグナルペプチド、＋１位のメチオニンから始まって＋１２４位のアスパラギン酸で終わるかまたは−１位のアラニンから始まって＋１２４位のアスパラギン酸で終わるＣＴＬＡ４の突然変異型細胞外ドメイン、およびＩｇ領域を含むＣＴＬＡ４突然変異体分子（Ｌ１０４ＥＩｇ）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を表す図。
【図９】シグナルペプチド、＋１位のメチオニンから始まって＋１２４位のアスパラギン酸で終わるかまたは−１位のアラニンから始まって＋１２４位のアスパラギン酸で終わるＣＴＬＡ４の細胞外ドメインの野生型アミノ酸配列、およびＩｇ領域を持つＣＴＬＡ４Ｉｇのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を表す図。
【図１０】ＣＴＬＡ４Ｉｇ（レーン１）、Ｌ１０４ＥＩｇ（レーン２）およびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（レーン３Ａ）のＳＤＳゲル（図１０Ａ）ならびにＣＴＬＡ４Ｉｇ（図１０Ｂ）およびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（図１０Ｃ）のサイズ排除クロマトグラフ。
【図１１】ＮＭＲ分光法によって決定された溶液構造から作成したＣＴＬＡ４細胞外Ｉｇ Ｖ様フォールドのリボン図。図１１ＢはＳ２５〜Ｒ３３領域およびＭＹＰＰＰＹ領域の拡大図であって、アビディティーを増大させる突然変異Ｌ１０４およびＡ２９の位置と側鎖の向きとを示している。
【図１２】Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇインサートを持つベクターｐｉＬＮ−ＬＥＡ２９Ｙの概略図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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