(57)【要約】患者における末梢動脈疾患を処置するための組成物および方法が、提供される。この組成物は、組換え線維芽細胞増殖因子−２を含む。ＦＧＦ−２のような線維芽細胞増殖因子は、跛行および重篤な肢虚血を含む末梢動脈疾患を処置または予防するための治療的有効量で投与される。ＦＧＦ−２の治療的有効量および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物もまた、提供される。末梢動脈疾患および跛行を処置するための本発明の方法は、ＦＧＦ−２のようなＦＧＦを含む薬学的組成物の少なくとも単一用量を、動脈内注入、静脈内注入、または筋肉内注入を介して、患者に投与する工程を包含する。増加した恩恵は、間欠的な投薬を含む複数回投薬に起因し得ることが認識される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において末梢動脈疾患を処置するための方法であって、該方法は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の治療的有効量を該患者に投与する工程を包含し、ここで、該ＦＧＦの治療的有効量は、２回の用量に分けられ、そして単一用量は、該患者の各々の脚に１時間以内に投与される、方法。
【請求項２】
前記ＦＧＦが、前記患者の各々の脚の少なくとも１つの動脈への動脈内注入（ＩＡ）により投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＦＧＦが、該患者の各々の脚の総大腿動脈へと投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＦＧＦが、カテーテルを使用する両側送達を介して投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＦＧＦが、該患者の各々の脚の総大腿動脈への直接ＩＡ注入を介して投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ＦＧＦが、１回以上の筋肉内（ＩＭ）注入により投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記末梢動脈疾患が、跛行により証明される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記患者が、重篤な肢虚血を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＦＧＦが、ＦＧＦ−２である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＦＧＦ−２が、組換え分子である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＦＧＦ−２が、図２（配列番号２）に示される配列、図３（配列番号４）に示される配列、図４（配列番号６）に示される配列、図５（配列番号８）に示される配列、またはその新脈管形成活性フラグメントもしくはムテインを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ムテインが、ＦＧＦ−２分子を含み、ここで、構成システイン残基の少なくとも１つが、中性アミノ酸に置換される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記中性アミノ酸が、セリンまたはトレオニンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＦＧＦ−２が、ヘパリンまたは他のプロテオグリカンからなる群より選択される別の分子と同時に投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヘパリンが、低分子量の分子である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ヘパリンが、未分画のヘパリンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＦＧＦ−２が、前記患者へのヘパリン投与またはプロテオグリカンの投与の約５分〜約６０分以内に投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＦＧＦ−２が、前記患者へのヘパリン投与またはプロテオグリカンの投与の約２０分〜約３０分以内に投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＦＧＦ−２が、ヘパリンおよび他のプロテオグリカンからなる群より選択される分子の投与なしに投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＦＧＦ−２の治療的有効量が、２４時間に１回、前記患者に投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＦＧＦ−２の治療的有効量が、１週間に１回、前記患者に投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＦＧＦ−２の治療的有効量が、１ヶ月に１回、２ヶ月ごとに１回、３ヶ月ごとに１回、４ヶ月ごとに１回、５ヶ月ごとに１回、または６ヶ月ごとに１回、前記患者に投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＦＧＦ−２の治療的有効量が、血管手術、機械的バイパス手術、血管形成術、または血管造影法の補助剤として投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＦＧＦ−２、またはその新脈管形成活性フラグメントもしくはムテインの治療的有効量が、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１μｇ／ｋｇである、請求項１１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＦＧＦ−２、またはその新脈管形成活性フラグメントもしくはムテインの治療的有効量が、約１μｇ／ｋｇ〜約３μｇ／ｋｇである、請求項１１に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＦＧＦ−２、またはその新脈管形成活性フラグメントもしくはムテインの治療的有効量が、約３μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇである、請求項１１に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＦＧＦ−２、またはその新脈管形成活性フラグメントもしくはムテインの治療的有効量が、約５μｇ／ｋｇ〜約７μｇ／ｋｇである、請求項１１に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＦＧＦ−２、またはその新脈管形成活性フラグメントもしくはムテインの治療的有効量が、約７μｇ／ｋｇ〜約９μｇ／ｋｇである、請求項１１に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＦＧＦ−２、またはその新脈管形成活性フラグメントもしくはムテインの治療的有効量が、約９μｇ／ｋｇ〜約１０μｇ／ｋｇである、請求項１１に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＦＧＦ−２、またはその新脈管形成活性フラグメントもしくはムテインの治療的有効量が、約１０μｇ／ｋｇ〜約１５μｇ／ｋｇである、請求項１１に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＦＧＦ−２、またはその新脈管形成活性フラグメントもしくはムテインの治療的有効量が、約１５μｇ／ｋｇ〜約２０μｇ／ｋｇである、請求項１１に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＦＧＦ−２、またはその新脈管形成活性フラグメントもしくはムテインの治療的有効量が、約２０μｇ／ｋｇ〜約２５μｇ／ｋｇである、請求項１１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＦＧＦ−２、またはその新脈管形成活性フラグメントもしくはムテインの治療的有効量が、約２５μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇである、請求項１１に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＦＧＦ−２、またはその新脈管形成活性フラグメントもしくはムテインの治療的有効量が、約３０μｇ／ｋｇ〜約４０μｇ／ｋｇである、請求項１１に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＦＧＦ−２、またはその新脈管形成活性フラグメントもしくはムテインの治療的有効量が、約４０μｇ／ｋｇ〜約５０μｇ／ｋｇである、請求項１１に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＦＧＦ−２、またはその新脈管形成活性フラグメントもしくはムテインの治療的有効量が、約４μｇ〜約０．３ｍｇである、請求項１１に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＦＧＦ−２、またはその新脈管形成活性フラグメントもしくはムテインの治療的有効量が、約０．３ｍｇ〜約３．５ｍｇである、請求項１１に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＦＧＦ−２、またはその新脈管形成活性フラグメントもしくはムテインの治療的有効量が、約１．０〜約２．０ｍｇである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＦＧＦ−２、またはその新脈管形成活性フラグメントもしくはムテインの治療的有効量が、約２．０〜約３．５ｍｇである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＦＧＦ−２が、動脈内（ＩＡ）注入または静脈内（ＩＶ）注入により前記患者に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＦＧＦ−２が、１回以上の筋肉内（ＩＭ）注入により前記患者に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＦＧＦ−２が、皮下（ＳＣ）注入により前記患者に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＦＧＦ−２の投与が、該ＦＧＦ−２の投与なしでの最大歩行時間（ＰＷＴ）に対して、前記患者におけるＰＷＴの改善を提供する、請求項９に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＦＧＦ−２の投与が、該ＦＧＦ−２の投与なしでの足関節上腕血圧比（ＡＢＩ）に対して、前記患者におけるＡＢＩの改善を提供する、請求項９に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＦＧＦ−２の投与が、身体の痛みの軽減をもたらす、請求項９に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＦＧＦ−２の投与が、階段昇降能力を改善する、請求項９に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＦＧＦ−２の投与が、跛行の重篤度を低下させる、請求項９に記載の方法。
【請求項４８】
患者において末梢動脈疾患を処置するための方法であって、該方法は、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）の治療的有効量を該患者に投与する工程を包含し、ここで、該治療的有効量は、約０．１μｇ／ｋｇ〜約９．９μｇ／ｋｇである、方法。
【請求項４９】
前記ＦＧＦ−２の治療的有効量が、薬学的組成物の一部として投与される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記薬学的組成物が、安定化されたＦＧＦ−２−ＤＴＴ処方物である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＦＧＦ−２が、ヘパリンおよび他のプロテオグリカンからなる群より選択される、別の分子と同時に投与される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＦＧＦ−２またはその新脈管形成活性フラグメントもしくはムテインの治療的有効量が、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１μｇ／ｋｇである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＦＧＦ−２またはその新脈管形成活性フラグメントもしくはムテインの治療的有効量が、約１μｇ／ｋｇ〜約３μｇ／ｋｇである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＦＧＦ−２またはその新脈管形成活性フラグメントもしくはムテインの治療的有効量が、約３μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＦＧＦ−２またはその新脈管形成活性フラグメントもしくはムテインの治療的有効量が、約５μｇ／ｋｇ〜約７μｇ／ｋｇである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＦＧＦ−２またはその新脈管形成活性フラグメントもしくはムテインの治療的有効量が、約７μｇ／ｋｇ〜約８μｇ／ｋｇである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＦＧＦ−２またはその新脈管形成活性フラグメントもしくはムテインの治療的有効量が、約８μｇ／ｋｇ〜約９μｇ／ｋｇである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＦＧＦ−２またはその新脈管形成活性フラグメントもしくはムテインの治療的有効量が、約９μｇ／ｋｇ〜約９．９μｇ／ｋｇである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＦＧＦ−２またはその新脈管形成活性フラグメントもしくはムテインの治療的有効量が、約７μｇ〜約０．７ｍｇである、請求項４８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＦＧＦ−２またはその新脈管形成活性フラグメントもしくはムテインの治療的有効量が、約９．０μｇ〜約０．５ｍｇである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＦＧＦ−２またはその新脈管形成活性フラグメントもしくはムテインの治療的有効量が、約０．１ｍｇ〜約０．４ｍｇである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＦＧＦ−２またはその新脈管形成活性フラグメントもしくはムテインの治療的有効量が、約０．１ｍｇ〜約０．２ｍｇである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＦＧＦ−２が、動脈内（ＩＡ）注入または静脈内（ＩＶ）注入により前記患者に投与される、請求項４８に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＦＧＦ−２が、１回以上の筋肉内（ＩＭ）注入により前記患者に投与される、請求項４８に記載の方法。
【請求項６５】
間欠性跛行を伴う患者における最大歩行時間の改善のための方法であって、該方法は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の治療的有効量を該患者に投与する工程を包含し、ここで、該ＦＧＦの治療的有効量は、２回の用量に分けられ、そして単一用量は、該患者の各々の脚に１時間以内に投与される、方法。
【請求項６６】
前記ＦＧＦが、ＦＧＦ−２である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＦＧＦ−２の治療的有効量が、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１μｇ／ｋｇである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＦＧＦ−２の治療的有効量が、約１μｇ／ｋｇ〜約３μｇ／ｋｇである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＦＧＦ−２の治療的有効量が、約３μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇである、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＦＧＦ−２の治療的有効量が、約５μｇ／ｋｇ〜約９μｇ／ｋｇである、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＦＧＦ−２の治療的有効量が、約９μｇ／ｋｇ〜約１０μｇ／ｋｇである、請求項６６に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＦＧＦ−２の治療的有効量が、約１０μｇ／ｋｇ〜約２０μｇ／ｋｇである、請求項６６に記載の方法。
【請求項７３】
前記ＦＧＦ−２の治療的有効量が、約２０μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇである、請求項６６に記載の方法。
【請求項７４】
間欠性跛行を伴う患者における足関節上腕血圧比の改善のための方法であって、該方法は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の治療的有効量を該患者に投与する工程を包含し、ここで、該ＦＧＦの治療的有効量は、２回の用量に分けられ、そして単一用量は、該患者の各々の脚に１時間以内に投与される、方法。
【請求項７５】
前記ＦＧＦが、ＦＧＦ−２である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＦＧＦ−２の治療的有効量が、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１μｇ／ｋｇである、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記ＦＧＦ−２の治療的有効量が、約１μｇ／ｋｇ〜約３μｇ／ｋｇである、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記ＦＧＦ−２の治療的有効量が、約３μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇである、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
前記ＦＧＦ−２の治療的有効量が、約５μｇ／ｋｇ〜約９μｇ／ｋｇである、請求項７５に記載の方法。
【請求項８０】
前記ＦＧＦ−２の治療的有効量が、約９μｇ／ｋｇ〜約１０μｇ／ｋｇである、請求項７５に記載の方法。
【請求項８１】
前記ＦＧＦ−２の治療的有効量が、約１０μｇ／ｋｇ〜約２０μｇ／ｋｇである、請求項７５に記載の方法。
【請求項８２】
前記ＦＧＦ−２の治療的有効量が、約２０μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇである、請求項７５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、末梢性動脈疾患を処置するための、方法および薬学的組成物、特に、組換え線維芽細胞増殖因子−２（ｒＦＧＦ−２）を含む組成物の投与に関する。
（発明の背景）
冠状動脈疾患（ＣＡＤ）および末梢性動脈疾患（ＰＡＤ）は、一般的に動脈硬化に続く、不充分な血流によって特徴付けられる状態である。虚血の症状（ＣＡＤに対する狭心症またはＰＡＤに対する間欠性跛行）は、ストレスによって引き起こされ、静止によって軽減される。ＣＡＤにおいて、症状は、心筋梗塞、不整脈、および進行性心不全に起因して生命を脅かすようになり得る。ＰＡＤにおいて、症状は、重篤な肢の虚血を発生する場合を除いて生命を脅す可能性はより小さいが、有害な心臓血管事象および死の危険性が増大する。
【０００２】
危険因子の同定および管理は、ＣＡＤおよびＰＡＤの両方における医療管理において重要である。危険因子の薬理学的管理としては、抗高血圧剤、脂質低下剤、および低血糖剤が挙げられ；禁煙、食餌療法、運動がしばしば、可変であるコンプライアンスを伴って処方される。虚血症状の低減を目的とする薬理学的管理としては、しばしば、脈管拡張薬、抗狭心症剤、および抗血小板療法が挙げられる。（ステントを用いて、またはそれを用いない）経皮脈管形成および直接的な外科的再構築による機械的な脈管再生は、血流を改善して症状を低減する。しかし、脈管形成後の再狭窄および疾患の進行は、この恩恵の持続時間を制限し得る。
【０００３】
ＰＡＤは、米国において約１１００万人の患者を冒す。これらの患者の約３分の１は、間欠性跛行（同量の筋肉活動により相次いで引き起こされ、休息によって低減される、脚の筋肉における不快感、疼痛、疲労、または重苦しさ）を経験する。跛行は、狭心症に類似しており、股関節部、臀部、大腿、またはふくらはぎに局在し得る虚血性筋肉痛を示す。これは、予想可能に同量の身体ストレスによって生じる。アテローム性動脈硬化は、全身性であるが、しばしば、一方の下肢が、他方の下肢より重く罹患される。患者は、休息痛、非回復性の潰瘍および／または壊疽を伴う重篤な肢の虚血を進展し得る。休息痛は、休息において基礎的な栄養の要求を満たすための血液供給が不充分である場合に生じ、代表的には罹患している肢の足指または足に局在する。
【０００４】
ＣＡＤおよびＰＡＤの罹患率は、国々で老年人口と共に上昇すると予測される。なぜならば、老齢化はアテローム動脈硬化についての主な危険因子であるからである。より少ない侵襲性のカテーテルに基づく処置方法およびより費用効率が高いプログラムおよび処置方法が、これらの状況を取り扱うために必要とされる。
【０００５】
（発明の要旨）
患者における、末梢性動脈疾患（ＰＡＤ）を処置するための組成物および方法が提供される。治療有効量の線維芽細胞増殖因子（例えば、ＦＧＦ−２）、および薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物が提供される。本発明の方法に関連して投与される場合のこのような組成物は、ＰＡＤ患者（この疾患に関連する間欠性跛行に罹患している患者を含む）に対して有効な治療を提供する。このような組成物はまた、切断に至る重篤な肢の虚血を阻止するためにＰＡＤ患者に投与され得る。
【０００６】
本発明の方法は、動脈内注入（ＩＡ）として、静脈内注入（ＩＶ）として、筋内注射（ＩＭ）として、または皮下注射（ＳＣ）として、治療有効量の増殖因子（例えば、ＦＧＦ−２）を含有する薬学的組成物の投与する工程を包含する。ＦＧＦ−２の単一用量の投与は、ＰＡＤの処置について有効である。治療的な利益は、安全性において妥協することなく、複数用量で獲得され得る。ＦＧＦ−２の投与は、ＦＧＦ−２投与後少なくとも９０日間で、ＰＡＤに罹患する患者のピーク歩行時間（ｐｅａｋ　ｗａｌｋｉｎｇ　ｔｉｍｅ）を改善する。ＦＧＦ−２は、重篤な肢の虚血に罹患する患者（非回復性潰瘍を伴うか、または伴わない、休息痛に罹患する患者を含む）を処置するために使用され得る。さらに、ＦＧＦ−２は、重篤な肢の虚血に罹患するＰＡＤ患者を治療するために使用され得る。本発明のＦＧＦ含有組成物は、ステントを用いるか、またはこれを用いない、機械的なバイパスおよびバルーンカテーテルを使用する経皮的経管的介入を含む、脈管外科手術についての添加物として投与され得る。
【０００７】
（発明の詳細な説明）
末梢性動脈疾患（ＰＡＤ）に起因する間欠性跛行の処置のために１つの潜在的な新規代替物は、既存の脈管から新しい脈管の形成（新脈管形成）を促進し、また内皮細胞機能を回復する脈管形成増殖因子の使用である。新脈管形成において、内皮細胞は、静止状態から離れ、そして内在する基底膜の消化を開始し、その後、増殖、移動、およびついには中空の管を形成する（Ｇｅｒｗｉｎｓら（２０００）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３４（３）：１８５−１９４）。線維芽細胞増殖因子は、リガンド刺激可能チロシンキナーゼである細胞表面レセプターに結合する。これらのレセプターに対するこれらの増殖因子の結合は、内在性のチロシンキナーゼの活性化および下流のシグナル伝達カスケードに対するシグナル伝達を生じる（Ｇｅｒｗｉｎｓら（２０００）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３４（３）：１８５−１９４）。虚血組織における新脈管形成は、脈管内注入カテーテルの使用による、脈管形成増殖因子（例えば、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦ）の経壁性送達によって促進され得る。例えば、米国特許第５，９４１，８６８号を参照のこと。
【０００８】
患者におけるＰＡＤを処置するための組成物および方法が提供される。この組成物生物および方法は、ＰＡＤに起因する跛行および重篤な肢の虚血の処置および予防において有用である。用語「重篤な肢の虚血」とは、客観的に証明された動脈性閉塞疾患に寄与し得る、慢性虚血性休息痛（ｃｈｒｏｎｉｃ　ｉｓｃｈｅｍｉｃ　ｒｅｓｔ　ｐａｉｎ）、潰瘍または壊疽に罹患する全ての患者に対して使用される。用語「重篤な肢の虚血」は、慢性の意味を含み、急性の肢の虚血とは区別されるべきである。「急性の肢の虚血」は、任意の突然の疾患であり、または四肢の存続に対する脅威を生じる肢の灌流における悪化が意図される。Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．３１：Ｓ１３５，Ｓ１６８（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。本発明の方法は、脈管形成剤（例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のファミリーの脈管形成メンバー（好ましくは、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−１８、および最も好ましくはＦＧＦ−２を含む）を使用する。本明細書中に記載の全ての脈管形成増殖因子は、組換え分子であり得ることが認識される。また、本発明の組成物は、脈管形成剤のような１つ以上の線維芽細胞増殖因子および生物学的活性であるこれらの改変体を含み得ることが認識される。ＦＧＦ配列の改変体としては、脈管形成活性の、フラグメント、アナログおよび誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。「フラグメント」によって、インタクトなＦＧＦの配列および構造の一部だけからなるポリペプチドが意図され、そして、これらは、Ｃ末端欠失、Ｎ末端欠失、および両方の欠失であり得る。「アナログ」によって、１つ以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失を有する、ネイティブなＦＧＦの配列および構造を含む脈管形成剤ＦＧＦまたはそれらのフラグメントの類似物のいずれかが意図される。１つ以上のペプトイド（ペプチド模倣物）およびムテインを有するペプチドまたは脈管形成剤の変異形態はまた、アナログという用語によって包含される。「誘導体」によって、脈管形成剤、脈管形成剤のフラグメントまたはそれらそれぞれのアナログの任意の適切な改変（例えば、脈管形成活性が保持される限りでの、グリコシル化、リン酸化、または、外来部分の他の付加）が意図される。フラグメント、アナログ、および誘導体を形成するための方法は、当該分野において利用可能である。一般的には、米国特許第４，７３８，９２１号、同第５，１５８，８７５号および同第５，０７７，２７６号；国際公開番号ＷＯ　８５／００８３１、同ＷＯ　９２／０４３６３、同ＷＯ　８７／０１０３８、および同ＷＯ　８９／０５８２２；ならびに欧州特許番号ＥＰ　１３５０９４、同ＥＰ　１２３２２８、および同ＥＰ　１２８７３３（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０００９】
このような改変体は、脈管形成活性を保持し、従って、「脈管形成的に活性である」べきである。これらの改変体は、標準的なバイオアッセイを使用して、脈管形成活性について測定され得る。代表的なアッセイとしては、胎盤膜を使用する公知のラジオレセプターアッセイが挙げられる（例えば、米国特許第５，３２４，６３９号；Ｈａｌｌら（１９７４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．ａｎｄ　Ｍｅｔａｂ．３９：９７３−９７６；およびＭａｒｓｈａｌｌら（１９７４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．ａｎｄ　Ｍｅｔａｂ．３９：２８３−２９２を参照のこと）。さらなるアッセイとしては、内皮細胞増殖のインビトロアッセイにおいて決定されるようなマイトジェン活性が挙げられる。この活性は、好ましくは、例えば、以下の刊行物のいずれかにおいて記載されるような、ヒト臍静脈内皮（ＨＵＶＥ）細胞に基づくアッセイにおいて決定される：Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ　Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：７３１１−７３１５；ＦｅｒｒａｒａおよびＨｅｎｚｅｌ（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６１：８５１−８５８；Ｃｏｎｎら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：１３２３−１３２７；Ｓｏｋｅｒら（１９９８）Ｃｅｌｌ　９２：７３５−７４５；Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２６９８８−２６９９５；Ｓｉｅｍｍｅｉｓｔｅｒら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２２：２４９−２５５；Ｆｉｅｂｉｃｈら（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１１：１９−２６；Ｃｏｈｅｎら（１９９３）Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ　７：１３１−１３８。さらなる生物学的活性が、例えば、以下のアッセイにおいて試験され得るような、新脈管形成および／または脈管再形成に関係する：Ｃｏｎｎｏｌｌｙら（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１４７０−１４７８およびＬｏｂｂら（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２４：４９６９−４９７３に記載されるような角膜嚢新脈管形成アッセイ；例えば、Ｐｅｐｐｅｒら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８９：８２４−８３１；Ｇｏｔｏら（１９９３）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６９：５０８−５１７；またはＫｏｏｌｗｉｊｋら（１９９６）Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１３２：１１７７−１１８８に記載されるような内皮細胞管形成アッセイ；例えば、Ｐｌｕｅｔら（１９８９）ＥＭＢＯ．Ｊ．８：３８０１−３８０６に記載されるような、ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）新脈管形成アッセイ；Ｂｏｈｌｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８１：５３６４−５３６８に記載されるような内皮細胞有糸分裂誘発アッセイ；Ｐｒｅｓｔａら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｂｉｏｌ．６：４０６０−４０６６；ＫｌａｇｓｂｒｕｎおよびＳｈｉｎｇ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：８０５−８０９；Ｇｏｓｏｄａｒｏｗｉｃｚら（１９８５）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２２：３２３−３３２；またはＭｏｓｃａｔｅｌｌｉら（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８３：２０９１−２０９５；ならびにＰｒｅｓｔａら（１９８６）Ｍｏｌ．ａｎｄ　Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：４０６０−４０６６に記載されるような内皮細胞移動アッセイ；（これらの全ては、本明細書中で参考として援用される）。これらのアッセイの１つ以上が使用され得ることが認識される。好ましくは、この改変体は、ネイティブ分子と少なくとも同じ活性を有する。
【００１０】
線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）（組換え的に生成された形態（ｒＦＧＦ−２）を含む）は、冠状動脈疾患（狭心症）および末梢性動脈疾患（跛行）の処置に対する有用性を有する強力なマイトジェンおよび脈管形成剤である。ＦＧＦ−２は、通常、多くの身体組織において産生され、特定の虚血状態に対する身体の応答に関連するが、身体自体のＦＧＦ−２の供給は、アテローム性動脈硬化および動脈不全／虚血の合併症を回避するのに不充分であり得る。
【００１１】
本発明の組成物および方法が、ＰＡＤ患者、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、心筋梗塞、発作、糖尿病、高脂血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａｓ）、高血圧を含むがこれらに限定されない、広範囲な関連する臨床的な病気に罹患している患者および外科的な脈管再生またはカテーテルに基づく脈管再生を有する患者さえを処置するために使用され得る。線維芽細胞増殖因子、特にＦＧＦ−２が、跛行に冒されたＰＡＤ患者（重篤な肢の虚血を有する患者を含む）を処置するために使用され得る。重篤な肢の虚血は、処置されないままだと、急性の肢の虚血へと進展し得、そして最終的には、肢の切断を余儀なくされる。従って、本発明の方法を使用して、急性の肢の虚血を予防し得る。
【００１２】
本発明のＦＧＦ含有組成物は、動脈内（ＩＡ）、静脈内（ＩＶ）、筋内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）、経壁などでそれらを必要とする患者に投与される。「経壁」投与は、特に標的部位に隣接する、新内膜、内膜、内側、外膜（ａｄｖｅｎｔｉａｌ）、および脈管周囲空間を含む、血管壁または体腔空間壁中への組成物の局所送達を意図する。「標的部位」は、四肢、例えば脚中への血液供給を取り囲むか、または直接取り囲む領域を意図する。
【００１３】
動脈内投与（ＩＡ）は、少なくとも１つの動脈中へのＦＧＦ含有組成物の送達を含む。ＩＡ注射では、この注射は、代表的には、脚中のいくつかの動脈、例えば、左および右の共通（ｃｏｍｍｏｎ）大腿動脈中に分割されるが、時々、単一の動脈中に投与される。この注射は、約１分、１〜５分、１０〜２０分、または２０〜３０分の間、両脚中の各動脈中に投与され得る。この注射は、予測された利点を達成または持続するためにときどき繰り返され得る。繰り返し投与のためのタイミングは、症状および血流力学的尺度により測定されるような患者の応答を基礎にする。注射物として与えられる、ＦＧＦ−２のようなＦＧＦの治療的に有効な投与量または量は、２つの投与量、そして処置を受ける患者の各脚中に投与される単一の投与量に分割され得る。このようにして、総投与量が、血管新生薬剤を患者の両脚に提示するように送達される。
【００１４】
従って、１つの実施形態では、本明細書の他で規定されるようなＦＧＦの治療的に有効な投与量または量が、この手順が単一の穿刺で終了され得るような両側性の送達方法を用いるＩＡ注射を経由して投与される。このように、ｒＦＧＦ−２のような、ＦＧＦの治療的に有効な量または総投与量の半分が第１脚の共通大腿動脈中に注射され、次いで、対側性の回腸動脈および共通大腿動脈への大動脈の分岐部を超えてカテーテルを案内し、そして次いで第２脚の大腿動脈中に総投与量の残りを注射する。脚の各々中への１つである各注射の速度は、第１および第２注射の間の短い中断をともなって、約１０分の期間に亘り、約１ｍＬ／分である。従って、一般に、第２の注射は、第１の注射の約１時間以内に始まるが、第１の注射の後２、３または４時間までに始まり得る。好ましくは、この第２の注射は、第１の注射の終了の、約３０分以内に、より好ましくは約２０分以内に、さらにより好ましくは約１０分以内に、なおより好ましくは約５分以内に始まる。各注射には、ＦＧＦがボーラス（ｂｏｌｕｓ）として投与されない限り、３、４または５分のような、約１０分より少ない時間を要し得る。当業者によって、ｒＦＧＦ−２のようなＦＧＦの治療的に有効な投与量または量は、患者の両脚間に、総投与量の非等分部分が各脚に送達される（例えば、１つの脚には３分の１、そして他の脚には３分の２）ように分割され得ることが認識される。対側性送達方法の利点は、各脚中への１つである２つの注射が、被験体への単一の穿孔によって達成され得ることである。この実施形態では、この穿孔の照準は、好ましくは腿の付け根のレベルである。担当医により好適であるとみなされる場合、上腕からのアプローチが用いられ得る。この手順では、血流に対する妨害が注射点に対して遠位方向のままである限り、カテーテルが、膝のすぐ上の領域中のようなより遠位方向に案内され得る。
【００１５】
あるいは、ｒＦＧＦ−２のようなＦＧＦの治療的に有効な量は、各共通大腿動脈中への直接ＩＡ穿孔により送達され得る。この様式では、ＦＧＦの投与量の半分が１つの共通大腿動脈中に投与され、その一方、ＦＧＦの投与量の他の半分が他の共通大腿動脈中に投与される。直接ＩＡ穿孔は、それが対側性送達で必要なカテーテル法手順を避けられる点で有利であり得るが、それは治療的に有効な投与量が両脚中に分割され、かつ注射されるべきである場合に２つの穿孔を必要とする。対側性送達についていえば、各注射は、第１および第２の注射間の短い中断をともなって、約１０分間の期間に亘り、約１ｍＬ／分の速度で送達される。従って、第２の注射は、一般に、第１の注射の約１時間以内に始まるが、第１の注射の後、２、３または４時間までに始まり得る。好ましくは、この第２の注射は、第１の注射の終了の、約３０分以内に、より好ましくは約２０分以内に、さらにより好ましくは約１０分以内に、なおより好ましくは約５分以内に始まる。各注射には、ＦＧＦがボーラスとして投与されない限り、３、４または５分のような、約１０分より少ない時間を要し得る。ここで再び、ｒＦＧＦ−２のようなＦＧＦの治療的に有効な投与量または量は、患者の両脚間に、総投与量の非等分部分が各脚に送達されるように分割され得ることが認識される。
【００１６】
本発明の方法に従う、ＦＧＦ含有組成物の送達は、種々の公知の血管内薬物送達システムにより達成され得る。このような送達システムは、血管内カテーテル送達システムを含む。血管中への血管新生増殖因子の直接経壁注射に有用な種々のカテーテルシステムが当該分野で周知である。本発明を実施する目的には、種々の診断または治療型カテーテルのいずれをも用い得る。血管形成術と組み合わせてＦＧＦが投与される場合、バルーンカテーテルを用い得る。血管の内壁に係合し、そしてその中に血管新生増殖因子を直接注射し得る得る膨張可能な遠位端を有するバルーンカテーテルは、特許文献中に詳細に記載されている。例えば、米国特許第５，３１８，５３１号；同第５，３０４，１２１号；同第５，２９５，９６２号；同第５，２８６，２５４号；同第５，２５４，０８９号；同第５，２１３，５７６号；同第５，１９７，９４６号；同第５，０８７，２４４号；同第５，０４９，１３２号；同第５，０２１，０４４号；同第４，９９４，０３３号；および同第４，８２４，４３６号を参照のこと。血管の管腔内の膨張のために間隔を置いて離れるかまたはらせん状のバルーン有するカテーテル、および得られる隔離された処置部位に対する治療剤の送達は、米国特許第５，２７９，５４６号；同第５，２２６，８８８号；同第５，１８１，９１１号；同第４，８２４，４３６号；および同第４，６３６，１９５号に記載されている。非バルーン薬物送達カテーテルは、米国特許第５，１８０，３６６号；同第５，１１２，３０５号；および同第５，０２１，０４４号；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９２／１１８９０に記載されている。遠位の血管アクセスのために提供されるカテーテル、およびステントもまた用いられ得る。超音波で支援される薬物送達カテーテル（フォノフォレーシス（ｐｈｏｎｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）デバイス）は、米国特許第５，３６２，３０９号；同第５，３１８，０１４号；および同第５，３１５，９９８号に記載されている。その他のイオン泳動（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）およびフォノフォレーシス薬物送達カテーテルは、米国特許第５，３０４，１２０号；同第５，２８２，７８５号；および同第５，２６７，９８５号に記載されている。従来の血管形成術バルーンカテーテルと組み合わせる使用のために意図される薬物送達管腔を有するスリーブカテーテルは、米国特許第５，３６４，３５６号および同第５，３３６，１７８号に記載されている。これらの参考文献のすべては、本明細書中に参考として援用される。
【００１７】
直接筋内（ＩＭ）注射を用いて、本発明の血管形成薬剤を投与し得る。注射のための薬剤は、ＦＧＦタンパク質またはこのタンパク質の血管新生活性フラグメント、および血管新生活性ＦＧＦタンパク質またはフラグメントをコードする遺伝子またはプラスミドを包含し得る。注射物は、罹患した四肢の、動脈および動脈様管のような側枝流血管または導管脈管近くの、存在する血管の近傍にある、太腿またはふくらはぎ中に投与される。血管新生薬剤の治療的に有効な投与量は、単回注射として投与されるか、または複数注射として分割および投与され得る。好ましくは、この治療的に有効な量または投与量は、１〜約２０の注射、１〜約１５の注射、より好ましくは１〜約１０の注射として送達される。血管新生薬剤の単回投与量は、筋内に投与され、そして症状および／または血流力学尺度に基づき必要に応じて繰り返され得る。ＩＭ注射を用いるような局所送達は、血管新生薬剤のより低い投与量を投与する付加された利点を提供し得る。本明細書の実施例４、および１９９９年８月１３日に出願された米国仮出願番号第６０／１４８，７４６号に基づく、２０００年８月１１日に出願され、「Ｄｏｓｅ　ｏｆ　ａｎ　Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ　Ｆａｃｔｏｒ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ　ｔｏ　Ｉｍｐｒｏｖｅ　Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　Ｂｌｏｏｄ　Ｆｌｏｗ」と題する同時係属中の出願および割り当てられた米国特許出願第０９／６３７，４７１号（その両方は、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。ＩＭ注射にとっての利点は、低血圧を生じる可能性がより少ないこと、虚血領域においてより長い半減期を有する可能性がより高いこと、より侵襲性でないこと、そしてそれ故、ＩＡ注射と比べてより頻繁に繰り返され得ることである。ＩＡ注射またはＩＭ注射は、臨床症状により保証されるとき、１〜２月毎のＩＭ注射により「ブースト」され得る。
【００１８】
組換えＦＧＦ−２は、潜在的な血管拡張剤である酸化窒素を放出し、注射前（先んじた）および注射の間の積極的な流体管理が患者の安全性にとって重要である。注射前の１２ｍｍＨｇの推定された楔入圧を確立するためのＩＶ流体の投与（例えば、５００〜１０００ｍＬの規定生理食塩水）、および最大血圧の低減（例えば、９０ｍｍＨｇ未満）のためのＩＶ流体のボーラス投与（例えば、２００ｍＬの規定生理食塩水）を、ヒト患者へのＩＣまたはＩＶ注射によるｒＦＧＦ−２の投与の安全性を最適化した注射と組み合わせた。
【００１９】
ｒＦＧＦ−２の突然のボーラスは、動物において、著しい低血圧症をともなうので、注射の速度は患者の安全性にとって重要である。０．５〜２ｍＬ／分、代表的には１ｍＬ／分の投与は、ヒト患者へのＩＣまたはＩＶ注射によるｒＦＧＦ−２の投与の安全性を最適化した。
【００２０】
本発明の別の実施形態では、ＦＧＦ−２を含むがこれに限定されない線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む組成物は、血管または機械的バイパス手術または血管形成術と関連する、跛行をともなうようなものを含む末梢動脈疾患をもつ患者に投与され得る。ＦＧＦ−２を含むがこれに限定されないＦＧＦは、ステントとともにまたはなしで手術の間に投与され得る。従って、ＦＧＦは、機械的バイパスおよび血管形成術を含む血管手術の付加物として投与され得る。
【００２１】
本発明の組成物は、血流を改善するために、安全かつ治療的に有効な量の線維芽細胞増殖因子を提供する。「安全かつ治療的に有効な量」は、本発明に従って投与される場合、医療的に管理され得ない主要な合併症がなく、しかもＰＡＤの症状を有する患者における客観的な改善を提供する、ＦＧＦ−２のような線維芽細胞増殖因子、または血管新生活性のあるその改変体またはフラグメントの量を意図する。この治療的に有効な量は、年齢、体重、症状の重篤度、全身の健康、体調などに依存して、患者により変動し得ることが認識される。その他の因子は、投与の様式、および薬学的組成物中に含まれるＦＧＦの個々の量を含む。代表的には、ＦＧＦ−２のような本発明の血管新生薬剤の治療的に有効な量は、実際の体重を基に、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ、好ましくは約０．２μｇ／ｋｇ〜約７５μｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．４μｇ／ｋｇ〜約５０μｇ／ｋｇ、なおより好ましくは約０．５０μｇ／ｋｇ〜約３５μｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは約１．０μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇである。従って、血管新生薬剤がＦＧＦ−２である場合、ＦＧＦ−２の治療的に有効な量は、投与の経路および様式に依存して、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１μｇ／ｋｇ、０．１μｇ／ｋｇ〜約１μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜３μｇ／ｋｇ、約３μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約５μｇ／ｋｇ〜約７μｇ／ｋｇ、約７μｇ／ｋｇ〜約８μｇ／ｋｇ、約８μｇ／ｋｇ〜約９μｇ／ｋｇ、約９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、または９．９μｇ／ｋｇのような約１０μｇ／ｋｇまでの約９μｇ／ｋｇ〜約９．９μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１５μｇ／ｋｇ、約１５μｇ／ｋｇ〜約２０μｇ／ｋｇ、約２０μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇ、約３０μｇ／ｋｇ〜約４０μｇ／ｋｇ、約４０μｇ／ｋｇ〜約６０μｇ／ｋｇ、約６０μｇ／ｋｇ〜約８０μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２である。
【００２２】
示されるように、本発明の組成物および方法は、跛行および重篤な四肢虚血を含む、ＰＡＤおよびＰＡＤにともなう症状を処置または予防するために有用である。このようにして、所望の治療的応答は、増加した運動能力、くるぶし−上腕指数における改善、体の痛みおよび跛行の減少を含む。重篤な四肢虚血をもつＰＡＤ患者の場合には、所望の治療的応答は、無感覚により制御可能でない絶え間ない休息痛の回復、潰瘍の治癒、および壊疽および切断の予防を含む。
【００２３】
ＰＡＤの処置のために、ＦＧＦ、特にＦＧＦ−２の投与の効力をモニターする方法は、当該分野で周知である。例えば、罹患した四肢中への増加した血流をモニターする方法は、制限されないで、ドップラー超音波脳波検査（Ｍａｃｄｏｎａｌｄ（１９９４）Ｊ．Ｖａｓ．Ｔｅｃｈ、１８：２４１−２４８）、および磁気共鳴スペクトル法、休息時または運動期間後のくるぶし−上腕またはつま先最大血圧指数、および血管造影法を用いる増加した側枝血管密度を含む。効力の臨床的指標は、総踏み車歩き時間（すなわち、ピークウォーキングタイム、ＰＷＴ）および跛行の発症までの時間；および患者の生活の質の質問を含む。
【００２４】
本発明のＦＧＦ含有薬学的組成物は、所望の生理学的効果、すなわち、血管新生、および／または内皮細胞機能の回復および側枝血管の促進を達成するに十分な時間送達される。この組成物は、単一のボーラス、または複数の注射として投与され得る。代表的には、この血管新生因子は、所定の時間に亘る注射として送達され得る。投与のために任意の手段が包含され、持続放出処方物、プラスミド、または遺伝子、および投与の他の経路を含む。総時間量は、送達速度および送達される組成物中の薬物濃度に依存して変動し得る。例えば、動脈内投与には、投与の時間は、１秒〜約２４時間、より通常には約１分〜約６時間、詳細には約５分〜約３０分で変動し得る。単回の動脈内投与量投与は、ＰＡＤの処置に効力がある。
【００２５】
本発明の方法に従って投与される場合、ＦＧＦ含有組成物は、患者に、少なくとも１ヶ月、２ヶ月、一般に３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、そしていくつかの場合には、さらなる処置が必要とされる前６ヶ月を超えて持続する、ＰＡＤに対する安全かつ治療的に効力のある処置を提供する。ＦＧＦ−２のような、血管新生薬剤は、ほぼ週毎、好ましくは月毎またはより好ましくは隔月毎、なおより好ましくは３ヶ月毎、さらにより好ましくは４ヶ月毎、そしてなおさらにより好ましくは６ヶ月毎に、１日あたり１回または２回投与され得る。
【００２６】
示されるように、線維芽細胞増殖因子および関連分子は、内皮細胞機能を回復し得、そして内皮および／または平滑筋細胞増殖を促進し得る。線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、ヘパリンのようなプロテオグリカンに対する高い程度の親和性によって特徴付けられる少なくとも２３種の構造的に関連した（ＦＧＦ−１〜ＦＧＦ−２３と名付けられた）ポリペプチドのファミリーである。種々のＦＧＦ分子は、サイズが１５〜少なくとも３２．５ｋＤａの範囲であり、そして神経細胞接着および分化を含む正常および悪性条件（Ｓｃｈｕｂｅｒｔら（１９８７）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０４：６３５−６４３）、創傷治癒（米国特許第５，４３９，８１８号（Ｆｉｄｄｅｓ））；において、多くの中胚葉および外胚葉細胞型に対するマイトジェンとして、栄養性因子として、分化誘導または阻害因子として（Ｃｌｅｍｅｎｔｓら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　８：１３１１−１３１６）；および血管新生因子として（Ｈａｒａｄａ（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：６２３−６３０）、広範な範囲の生物学的活性を示す。従って、このＦＧＦファミリーは、変動する程度で線維芽細胞、平滑筋細胞、上皮細胞、内皮細胞、筋細胞、および神経細胞に刺激を与える多能性増殖因子のファミリーである。ＦＧＦ様ポリペプチドもまた、本発明の組成物および方法における使用に意図される。「ＦＧＦ様」は、ＦＧＦレセプター１、特に、ヘパリン様分子に結合するレセプター１−Ｃを結合し、しかも血管新生活性を有するポリペプチドを意図する。ヘパリン様分子は、ＦＧＦを結合し、ＦＧＦをダイマー化し、しかもレセプター活性化を促進するヘパリン、プロテオグリカン、および他のポリアニオン性化合物を意図する。本発明の実施に特に目的であるものは、ＦＧＦ−２と称されるＦＧＦ、および当該分野で公知であるその改変体およびフラグメントである。例えば、米国特許第５，９８９，８６６号；同第５，９２５．５２８号；同第５，８７４，２５４号；同第５，８５２，１７７号；同第５，８１７，４８５号；同第５，７１４，４５８号；同第５，６５６，４５８号；同第５，６０４，２９３号；同第５，５７６，２８８号；同第５，５１４，５６６号；同第５，４８２，９２９号；同第５，４６４，９４３号；および同第５，４３９，８１８号を参照のこと。
【００２７】
投与されるＦＧＦ、より詳細にはＦＧＦ−２は、任意の動物種由来であり得、これには、トリ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、およびヒトを含むがこれらに限定されるわけではない。一般に、このＦＧＦは、哺乳動物種由来であり、ＦＧＦ−２の場合、好ましくはウシまたはヒト由来である。このＦＧＦは、以下に概説するように、ネイティブ、組換え生産、または化学的合成形態であり得る。ＦＧＦがＦＧＦ−２である場合、これは、組換え産生の方法に依存して、１４６アミノ酸形態、１５３〜１５５アミノ酸形態、またはそれらの混合物であり得る。本明細書に参考として援用される米国特許第５，１４３，８２９号を参照のこと。さらに、ＦＧＦ−２分子の血管新生活性のムテインが用いられ得る。例えば、本明細書に参考として援用される、米国特許第５，８５９，２０８号および５，８５２，１７７号を参照のこと。
【００２８】
目的のＦＧＦポリペプチド、より詳細にはＦＧＦ−２の生物学的に活性な改変体もまた、本発明の方法により包含される。先に注記したように、このような改変体は、フラグメント、アナログ、および誘導体を含む。このような改変体は、血管新生活性を保持すべきてあり、そしてそれ故、上記のような標準的なバイオアッセイを用いて測定したとき「血管新生活性」である。
【００２９】
本発明の組成物および方法で用いられるネイティブＦＧＦの改変体は、参照ＦＧＦ分子のアミノ酸配列に対して、一般に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは約９０％〜９５％またはそれ以上、そして最も好ましくは約９８％またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有する。「配列同一性」は、改変体のアミノ酸配列の特定された連続セグメントが、比較の基礎として供される参照ＦＧＦ分子のアミノ酸配列に整列されかつ比較される場合に、改変体および参照ＦＧＦ分子内に見出される同じアミノ酸残基を意図する。従って、例えば、参照ＦＧＦ−２分子がヒトＦＧＦ−２である場合、血管新生活性なその改変体は、一般に、図３に提示される完全長のアミノ酸配列（配列番号３）に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは約９０％〜９５％またはそれ以上，最も好ましくは約９８％またはそれ以上の配列同一性を有する。さらに、例えば、本明細書に参考として援用される、ＷＯ９８／２１２３７または１９９９年９月２８日に出願された米国出願第０９／４０７，６８７に記載のような、その他のＦＧＦレセプター結合性ペプチドが用いられ得る。
【００３０】
目的の参照ポリペプチド分子の生物学的に活性な改変体であるポリペプチドは、わずか１〜１５アミノ酸、６〜１０のようなわずか１〜１０、わずか５、わずか４、３、２、または１アミノ酸残基だけ参照分子と異なり得る。２つのアミノ酸配列間の配列同一性％は、両方の配列において同一のアミノ酸残基がある位置の数を決定し、一致した位置の数を得る工程、一致した位置の数を、参照分子に対して比較されるセグメントにある位置の総数で除する工程、およびこの結果に１００を掛け配列同一性の％を得る工程によって算出される。
【００３１】
２つの配列の最適アラインメントの目的のためには、改変体ポリペプチドのアミノ酸配列の連続セグメントは、参照ポリペプチド分子のアミノ酸配列に関して付加的なアミノ酸残基または欠失したアミノ酸残基を有し得る。参照アミノ酸配列に対する比較のために用いられる連続セグメントは、少なくとも２０連続するアミノ酸残基を含み、そして３０、４０、５０、１００またはそれ以上の残基であり得る。改変体のアミノ酸配列中のギャップの包含をともなう増加した配列同一性のための矯正は、ギャップペナルティーを割り当てることによりなされ得る。配列アラインメントの方法は、アミノ酸配列について、およびアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列についての両方が当該分野で周知である。
【００３２】
従って、任意の２つの配列間の同一性％の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。配列の比較のために利用される、１つの好適な、数学的アルゴリズムの非制限的な例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ　４：１１−１７のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部である、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中で利用されている。ＰＡＭ１２０重量残基テーブル、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーが、アミノ酸配列を比較する場合にＡＬＩＧＮプログラムとともに用いられ得る。２つの配列を比較することにおける使用のための別の好適な非制限的な例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：５８７３−５８７７で改変されたような、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：２２６４のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム中に取り込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施され、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列が得られ得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施され、目的のポリペプチドに相同なアミノ酸配列が得られ得る。比較目的のためのギャップをもつアラインメントを得るために、ギャップＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９に記載のように利用され得る。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いて、分子間の遠い関係を検出する累次積分検索を実施し得る。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）前述を参照のこと。ＢＬＡＳＴ、ギャップＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、個々のプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを用い得る。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。ＡＬＩＧＮプログラム（Ａｌｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　５：補足３（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．中のＤａｙｈｏｆｆ（１９７８））およびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎから入手可能）中のプログラム、例えば、ＧＡＰプログラムもまた参照のこと。ここでは、これらプログラムのデフォルトパラメータが利用される。
【００３３】
アミノ酸配列同一性％を考慮する場合、いくつかのアミノ酸残基位置は、タンパク質機能の性質に影響しない保存的アミノ酸置換の結果として異なり得る。これらの例では、配列同一性％は、保存的に置換されたアミノ酸における類似性を説明するために上方に調節され得る。このような調節は、当該分野で周知である。例えば、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ａｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．４：１１−１７を参照のこと。
【００３４】
当該分野は、ＦＧＦポリペプチド改変体の調製および使用に関する実質的な指針を提供する。ポリペプチド改変体を調製することにおいて、当業者は、ネイティブなヌクレオチドまたはアミノ酸配列に対するどの改変が、末梢動脈疾患を有する患者の処置に関する本発明の方法における使用に、本発明の薬学的組成物の治療的活性成分としての使用に適切である改変体を生じるかを容易に決定し得る。
【００３５】
線維芽細胞増殖因子（例えば、ＦＧＦ−２）は、本発明の方法における使用のための薬学的組成物に処方される。この様式で、薬学的に受容可能なキャリアは、薬学的組成物中で、ＦＧＦ−２のような脈管形成因子および他の成分と組み合わせて使用され得る。「薬学的に受容可能なキャリア」は、治療学的成分の貯蔵、投与、および／または所望の効果を容易にするために当該分野で従来使用されるキャリアまたは希釈剤を意図する。キャリアはまた、脈管形成因子（すなわち、ＦＧＦまたはその改変体）の任意の望ましくない副作用を減少し得る。適切なキャリアは、安定であるべきである（すなわち、処方物中で他の成分と反応し得ない）。これは、治療のために使用される投薬量および濃度で、レシピエント中に有意な局所的または全身的な有害な影響を生じるべきではない。このようなキャリアは、当該分野で一般的に公知である。本発明の適切なキャリアとしては、アルブミン、ゼラチン、コラーゲン、多糖類、単糖類、ポリビニルピロリドン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、不揮発油、オレイン酸エチル、リポソーム、グルコース、スクロース、ラクトース、マンノース、デキストロース、デキストラン、セルロース、マンニトール、ソルビトール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルギン酸ヘパリンなどのような、従来使用された大きな安定した高分子である。緩徐な放出キャリア（例えば、ヒアルロン酸）もまた、適切であり得る。安定化剤（例えば、トレハロース、チオグリセロールおよびジチオスレイトール（ＤＴＴ））もまた添加され得る。例えば、同時係属中の米国出願番号６０／２２９，２３８、表題「Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ　ＦＧＦ　Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ　Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｒｅｄｕｃｉｎｇ　Ａｇｅｎｔｓ」（これは、参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。本願において記載されるＤＴＴを含むＦＧＦ処方物は、「安定化されたＦＧＦ−ＤＴＴ処方物であり安定化されたＦＧＦ−２−ＤＴＴ形式を含む」として本明細書中に定義される。組成物中の他の受容可能な成分としては、水、生理食塩水、リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、および他の有機酸もしくはこれらの塩のような等張性を強化する緩衝剤を含むがこれらに限定されない。さらに、本発明の脈管形成因子は、緩徐な放出のための経路を使用して投与され得る。これらの処方物は、ＤＭＳＯを含み得る。
【００３６】
好ましい薬学的組成物は、注射から生じる局所的疼痛および過敏が減少した緩衝液を組み込み得る。このような緩衝液としては、低リン酸緩衝液およびコハク酸緩衝液が挙げられるがこれらに限定されない。薬学的な組成物は、脈管形成因子または改変体の可溶性を強化し得る可溶化化合物をさらに含み得る。
【００３７】
本発明の目的のために、脈管形成因子ＦＧＦまたはその脈管形成的に活性な改変体を含む薬学的組成物は、溶液、懸濁液、またはエマルジョンのような単位用量でかつ注射可能な形態または注入可能な形態で、処方されるべきである。これはまた、凍結乾燥粉末の形態であり得、これは、投与の前に、溶液、懸濁液、またはエマルジョンに変換され得る。薬学的組成物は、メンブレンろ過によって滅菌され得、これはまた、凝集物を除去し、そして密封されたバイアルまたはアンプルのような単回用量または複数用量の容器中で貯蔵され得る。
【００３８】
薬学的組成物を処方するための方法は、一般に当該分野で公知である。薬学的に受容可能なキャリア、安定化剤、およびイソモライト（ｉｓｏｍｏｌｙｔｅ）の処方および選択の徹底的な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版；Ｍａｃｋ　Ｐｕｂ．Ｃｏ．：Ｅａｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ　１９９０）（これは、参考として本明細書中に援用される）において見出され得る。
【００３９】
本発明の薬学的組成物はまた、一般に１日より長い間、処置される患者における薬学的に活性な因子の存在を延長するために、徐放性形態で処方され得る。徐放性処方物の調製の多数の方法は、当該分野で公知であり、そしてＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版；Ｍａｃｋ　Ｐｕｂ．Ｃｏ．：Ｅａｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ　１９９０）（これは、参考として本明細書中に援用される）において開示されている。一般に、因子は、固体疎水性ポリマーの半透性マトリクス中に包括され得る。このマトリクスは、フィルムまたは微小カプセルに形成され得る。このようなマトリクスの例としては、ポリエステル、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−グルタミン酸γエチルのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら（１９８３）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ　２２：５４７−５５６）、ポリ−アクチド（ｐｏｌｙ−ａｃｔｉｄｅ）（米国特許第３，７７３，９１９号およびＥＰ５８，４８１）、ポリアクテート（ｐｏｌｙａｃｔａｔｅ）ポリグリコール酸（ＰＬＧＡ）、ヒドロゲル（例えば、Ｌａｎｇｅｒら（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７；Ｌａｎｇｅｒ（１９８２）Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５を参照のこと）、非分解性エチレン−酢酸ビニル、Ｌｕｐｒｏｎ　ＤｅｐｏｔＴｍのような分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられるがこれらに限定されない。適切な微小カプセルとしてはまた、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−微小カプセル、およびコアセルベーション技術もしくは界面重合によって調製される、ポリメチルメタクリレート（ｐｏｌｙ−ｍｅｔｈｙｌｍｅｔａｃｙｌａｔｅ）微小カプセルが挙げられる。アルギン酸ヘパリンビーズのような微小粒子もまた使用され得る。さらに、リポソームおよびアルブミン微粒子のような微小エマルジョンまたはコロイド状の薬物送達系もまた使用され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版；Ｍａｃｋ　Ｐｕｂ．Ｃｏ．：Ｅａｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ　１９９０）を参照のこと。
【００４０】
詳細には、ウシ起源の哺乳動物線維芽細胞増殖因子（図２（配列番号２）のＦＧＦ−２）はまた塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）として公知であり、そして図３（配列番号４）のヒトＦＧＦ−２（あるいは、脈管形成的に活性なそのフラグメントまたはムテイン）は、本発明の実施において使用され得る。ウシＦＧＦ−２をコードするヌクレオチド配列は、図１（配列番号１）に示される。ヒトＦＧＦ−２をコードするヌクレオチド配列は、図３（配列番号３）に示される。米国特許第５，６０４，２９３号（これは、参考として本明細書中に援用される）もまた参照のこと。運動能力がＰＡＤに関連する跛行によって限定される患者に対して臨床的利点を生じると推定されるＦＧＦ−２の用量は、ＦＧＦ−２の約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ、好ましくは約０．２０μｇ／ｋｇ〜約７５μｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．４μｇ／ｋｇ〜約５０μｇ／ｋｇ、なおより好ましくは約０．５０μｇ／ｋｇ〜約３５μｇ／ｋｇ、なおより好ましくは約１．０μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇ、および最もありそうなのは標準的な用量としての０．３〜３．５ｍｇの範囲である。従って、１つの実施形態において、ＦＧＦ−２（例えば、組換えＦＧＦ−２（ｒＦＧＦ−２））の治療的有効用量は、投与の経路および様式に依存して、ＦＧＦ−２の約０．１μｇ／ｋｇ〜約１μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜３μｇ／ｋｇ、約３μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約５μｇ／ｋｇ〜約７μｇ／ｋｇ、約７μｇ／ｋｇ〜約８μｇ／ｋｇ、約８μｇ／ｋｇ〜約９μｇ／ｋｇ、約９μｇ／ｋｇ〜約９．９μｇ／ｋｇ（例えば、約９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、または９．９μｇ／ｋｇ）、約１０μｇ／ｋｇまで、約１０μｇ／ｋｇ〜約１５μｇ／ｋｇ、約１５μｇ／ｋｇ〜約２０μｇ／ｋｇ、約２０μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇ、約３０μｇ／ｋｇ〜約４０μｇ／ｋｇ、約４０μｇ／ｋｇ〜約６０μｇ／ｋｇ、約６０μｇ／ｋｇ〜約８０μｇ／ｋｇである。
【００４１】
処置される患者の体重に依存しないより絶対的な用語で、脈管形成因子の用量を規定することは、都合が良い。この実施形態において、用量は、「標準的な」用量としていわれる。そのように定義される場合、本発明の方法に従って投与される標準的な用量は、約４．０μｇ〜約７．２ｍｇ（例えば、約４．０μｇ〜約０．３ｍｇ、好ましくは約０．３ｍｇ〜約１．０ｍｇ、なおより好ましくは約１．０ｍｇ〜約２．０ｍｇ、なおより好ましくは約２．０ｍｇ〜約２．５ｍｇ、約２．５ｍｇ〜３．５ｍｇ、約３．５ｍｇ〜約４．５ｍｇ、約４．５ｍｇ〜約５．５ｍｇ、約５．５ｍｇ〜約６．５ｍｇ、約７．２ｍｇまで）の範囲である。この実施形態において、標準的な用量は、最も低い投薬量（約０．１μｇ／ｋｇ）での最も小さい患者（例えば、４０ｋｇ）からより高い投薬量（この実施形態について約４８μｇ／ｋｇ）でのより大きい患者（例えば、１５０ｋｇ）まで変化する、多数のヒトＰＡＤ患者のいずれか１人に投薬することに適用するために十分な量のＦＧＦ−２である。例えば、患者が体重７０ｋｇの場合、標準的な用量は、投与の形態および様式に依存して、約０．２ｍｇ〜約３．０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約２．５ｍｇ、好ましくは約２．１ｍｇで変化する。
【００４２】
より低い用量のＦＧＦ−２（例えば、０．１μｇ／ｋｇと約１０μｇ／ｋｇとの間）が意図される場合、本発明の方法に従って投与される標準的な用量は、７０ｋｇの患者について、約７．０μｇ〜約０．７ｍｇ、約８μｇ〜約０．６ｍｇ、約９μｇ〜約０．５ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約０．４ｍｇ、好ましくは約０．２１ｍｇで変化する。従って、いくつかの実施形態において、７０ｋｇの患者についての標準的な用量は、約７．０μｇ〜約０．７ｍｇ（８μｇ、９μｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．６ｍｇ、０．６５ｍｇ、約０．７ｍｇまでを含む）で変化する。
【００４３】
ＦＧＦ−２は、グリコサミノグリカン−（例えば、ヘパリン）結合タンパク質であり、そしてグリコサミノグリカン（「プロテオグリカン」または「ムコ多糖」として知られている）の存在は、活性および曲線下の面積（ＡＵＣ）を最適化するので、本発明のＦＧＦ−２の投薬量は、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン）の静脈内（ＩＶ）投与の２０〜３０分以内に投与され得る。種々の分画されたヘパリンおよび未分画のヘパリン、プロテオグリカン、および硫酸コンドロイチンのような硫酸化ムコ多糖は、本発明の実施において使用され得る。低分子量のハプテン（１０，０００ｄ未満）および未分画（すなわち、高分子量）ハプテン（１０，０００ｄを超える）は、本発明の実施において使用され得る。これらの分子は、ｒＦＧＦ−２と共にか、またはｒＦＧＦ−２の投与の２０〜３０分以内に投与され得る。ヘパリンは、適切には２０〜８０単位／ｋｇで、そして好ましくは４０単位／ｋｇで投薬される。
【００４４】
１つの実施形態において、単位用量は、約０．１μｇ／ｋｇ〜約８０μｇ／ｋｇで変化する十分な量のＦＧＦ−２を含む。より代表的には、全身的単位用量は、０．３ｍｇ〜３．５ｍｇの図２（配列番号２）のＦＧＦ−２もしくは図３（配列番号４）のＦＧＦ−２、または脈管形成的に活性なフラグメントもしくはそのムテインを含む。約０．０１μｇ〜約５００μｇ、約３ｍｇまでを含む、局所的送達のための投薬量が、使用され得る。ＩＭ注射を用いる場合のように局所的に投与される場合、用量は、心房内投与される用量と同じ、１０分の１、または１００分の１であり得る。単位用量は、代表的に、上記参照の量のＦＧＦ−２、および本明細書中の他の箇所に記載されるような有効量の１つ以上の薬学的に受容可能な緩衝液、安定化剤、および／または他の賦形剤を含む、溶液形態または再構築された凍結乾燥形態で提供される。
【００４５】
図２（配列番号２）のアミノ酸配列を有する組換えＦＧＦ−２は、米国特許第５，１５５，２１４号、表題「Ｂａｓｉｃ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ」（１９９２年１０月１３日発行、そしてこれは、その全体が参考として本明細書中に援用される）において記載されるように作製される。’２１４の特許において開示されるように、図１（配列番号１）のＤＮＡ（これは、図２（配列番号２）のｂＦＧＦ（以下「ＦＧＦ−２」）をコードする）は、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、Ｃｏｌ　Ｅ１、ｐＣＲＩ、ＲＰ４、またはλファージのようなクローニングベクターに挿入され、そしてこのクローニングベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞のいずれかを形質転換するために使用され、ここで、形質転換された細胞は、ＦＧＦ−２を発現する。１つの実施形態において、宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母細胞である。発現される得られた全長ＦＧＦ−２は、図２（配列番号２）に従う１４６アミノ酸を有する。図２（配列番号２）のＦＧＦ−２は、４つのシステイン（すなわち、残基２５位、６９位、８７位、および９２位）を有するが、内部ジスルフィド結合は存在しない。［’２１４の第６欄、５９〜６１行。］しかし、架橋が酸化条件下で生じる場合、これは、２５位の残基と６９位の残基との間で生じるようである。
【００４６】
図３（配列番号４）の対応する１４６残基のヒトＦＧＦ−２のように、図２（配列番号２）の１４６残基の哺乳動物ＦＧＦ−２（これは、ウシ起源である）は、１５５アミノ酸を有するポリペプチドとしてインビボで最初に合成される（Ａｂｒａｈａｍら（１９８６）ＥＭＢＯ　Ｊ．５（１０）２５２３−２５２８；ウシ起源の図４（配列番号６）；ヒト起源の図５（配列番号８））。全長の１５５残基のＦＧＦ−２分子と比較される場合、１４６残基のＦＧＦ−２分子は、対応する全長のウシおよびヒトの１５５残基のＦＧＦ−２分子（それぞれ、図４（配列番号６）および図５（配列番号８））のＮ末端において、最初の９個のアミノ酸残基（Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ（配列番号９））を欠く。ヒトまたはウシ起源の１５５残基のＦＧＦ−２、およびその生物学的に活性な改変体はまた、ウシおよびヒトの１４６残基のＦＧＦ−２分子について記載される様式で、本発明の組成物および方法において使用され得る。さらに、１５５残基の形態は、組換えタンパク質生成の方法に依存して、１５３〜１５５残基またはその混合物として存在し得ることが認識される。図２（配列番号２）の哺乳動物ＦＧＦ−２は、２つの残基の位置で、図３（配列番号４）のヒトＦＧＦ−２と異なる。詳細には、図２（配列番号２）の哺乳動物ＦＧＦ−２の残基１１２位および１２８位のアミノ酸は、それぞれＳｅｒおよびＰｒｏであり、一方で、ヒトＦＧＦ−２（図３；配列番号４）において、これらは、それぞれＴｈｒおよびＳｅｒである。１５５残基の形態については、これらの差異は、図４（配列番号６；ウシ起源のＦＧＦ−２）ならびに図５（配列番号８：ヒト起源のＦＧＦ−２）の残基１２１位および１３７位に生じる。
【００４７】
本発明の組成物および方法において使用される組換えＦＧＦ−２は、米国特許第４，９５６，４５５号、表題「Ｂｏｖｉｎｅ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ」（１９９０年９月１１日発行、そしてこれは、その全体が参考として本明細書中に援用される）において詳細に記載される技術を使用して、薬学的な純度（総タンパク質の９０重量％以上の純度、好ましくは９２重量％以上の純度、より好ましくは９５重量％以上の純度、好ましくは実質的に純粋（すなわち、総タンパク質の約９８重量％の純度））に精製された。詳細には、本発明の薬学的組成物の単位用量で使用される組換えＦＧＦ−２の精製において使用される最初の２つの工程は、「以前に記載されたような従来のイオン交換およびＨＰＬＣ工程」である。［米国特許第４，９５６，４５５号、Ｂｏｌｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８１：５３６４−５３６８を引用、これらの参考文献については確信していない。］第３の工程（’４５５特許は、「重要な精製工程」と称する［’４５５の第７欄、５〜６行］）は、ヘパリン−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）親和性クロマトグラフィーであり、ここで、ＦＧＦ−２の強力なヘパリン結合親和性は、約１．４Ｍおよび１．９５Ｍ　ＮａＣｌで溶出される場合、数千回の精製を達成するように利用される［’４５５の第９欄、２０〜２５行］。ポリペプチド同質性は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって確認され得る。緩衝液交換は、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ−２５（Ｍ）ゲルろ過クロマトグラフィーによって達成された。
【００４８】
図２（配列番号２）の１４６残基のＦＧＦ−２に加えて、本発明の単位用量の治療的活性剤はまた、図２（配列番号２）のＦＧＦ−２の「脈管形成的に活性なフラグメント」を含む。用語「図２（配列番号２）のＦＧＦ−２の脈管形成的に活性なフラグメント」は、図２（配列番号２）の１４６残基の約８０％を有し、そして図２（配列番号２）のＦＧＦ−２の脈管形成効果を保持するＦＧＦ−２のフラグメントを意味する。「脈管形成的に活性なフラグメント」のこの定義はまた、図３（配列番号４）のヒトＦＧＦ−２に適用する。図４（配列番号６）または図５（配列番号８）のＦＧＦ−２の「脈管形成的に活性なフラグメント」は、それぞれ、図４（配列番号６）または図５（配列番号８）の１５５残基の約８０％を有するＦＧＦ−２のフラグメントである。
【００４９】
脈管形成的に活性であるために、ＦＧＦ−２フラグメントは、２つの細胞結合部位、および２つのヘパリン結合部位の少なくとも１つを有するはずである。類似の１４６残基のヒトＦＧＦ−２（ｈＦＧＦ−２；配列番号４）の２つの推定細胞結合部位は、そのおよそ残基３６〜３９位およびおよそ７７〜８１に存在する。Ｙｏｓｈｉｄａら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：７３０５−７３０９の図３を参照のこと。ｈＦＧＦ−２の２つの推定ヘパリン結合部位は、そのおよそ残基１８〜２２位および１０７〜１１１位に存在する。Ｙｏｓｈｉｄａ（１９８７）の図３を参照のこと。ヒトＦＧＦ−２（ｈＦＧＦ−２）およびウシＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ−２）についてのアミノ酸配列の間の実質的な類似性を考えると、ｂＦＧＦ−２（図２（配列番号２））についての細胞結合部位がまた、そのおよそ残基３６〜３９位およびおよそ７７〜８１位に存在し、そしてヘパリン結合部位が、そのおよそ残基１８〜２２位および１０７−１１１位に存在することが予想される。１５５残基形態のさらなる９残基が、図２（配列番号２；ウシ起源のＦＧＦ−２）または図３（配列番号４；ヒト起源のＦＧＦ−２）において示される残基１〜１４６に関するこれらの結合部位の相対的な位置に影響を与えない。従って、ヒトＦＧＦ−２（図５；配列番号８）の１５５残基形態について、２つの推定細胞結合部位は、そのおよそ残基４５〜４８位およびおよそ８６〜９０位に存在し、そして２つの推定ヘパリン結合部位は、そのおよそ残基２７〜３１位およびおよそ１１６〜１２０位に存在する。さらに、１５５残基のウシタンパク質とヒトタンパク質との間の実質的な類似性を考えると、２つの推定細胞結合部位は、１５５残基のウシＦＧＦ−２（図４；配列番号６）のおよそ残基４５〜４８位およびおよそ８６〜９０位に存在し、そして２つの推定ヘパリン結合部位は、およそ残基２７〜３１位およびおよそ１１６〜１２０位に存在することが予想される。上と一貫して、図２（配列番号２）のＦＧＦ−２のＮ末端短縮は、ウシにおいて脈管形成活性を除去しないことが当該分野で周知である。詳細には、この技術は、図２（配列番号２）のＦＧＦ−２と比較してＮ末端短縮を有する、いくつかの天然に存在しかつ生物学的に活性なＦＧＦ−２のフラグメントを開示する。図２（配列番号２）の残基１２〜１４６を有する活性なかつ短縮されたｂＦＧＦ−２が、ウシ肝臓で見出され、そして図２（配列番号２）の残基１６〜１４６を有する別の活性なかつ短縮されたｂＦＧＦ−２が、ウシ腎臓、副腎、および精巣において見出された。（例えば、米国特許第５，１５５，２１４号の第６欄の４１〜４６行（Ｕｅｎｏら（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１３８：５８０−５８８を引用）を参照のこと。）同様に、ＦＧＦ活性を有することが知られている図２（配列番号２）のｂＦＧＦ−２の他のフラグメントは、ＦＧＦ−２（２４−１２０）−ＯＨおよびＦＧＦ−２（３０−１１０）−Ｎ１７１２−である［米国特許第５，１５５，２１４号の第６欄、４８〜５２行］。これらの後者のフラグメントは、ＦＧＦ−２（図２（配列番号２））の細胞結合部分およびヘパリン結合セグメント（残基１０７〜１１１）の１つの両方を保持する。従って、哺乳動物ＦＧＦの脈管形成的に活性なフラグメントは、代表的に、少なくとも図２（配列番号２）のＦＧＦ−２の残基３０〜１１０に対応する残基；より詳細には、少なくとも図２（配列番号２）のＦＧＦ−２の残基１８〜１４６に対応する残基を有するＦＧＦ−２の末端短縮フラグメントを含む。
【００５０】
ネイティブなＦＧＦ配列に基づく他の合成ペプチドがＦＧＦレセプターに結合する限り、これらのペプチドが使用され得ることが認識される。さらに、異なるネイティブな配列、ならびにネイティブおよび合成の配列の組み合わせ由来のペプチドを含む、ハイブリッドＦＧＦ分子が、構築され得る。さらに、このハイブリッド分子は、ＦＧＦレセプターと結合する能力を保持する。
【００５１】
本発明の単位用量はまた、図２（配列番号２）、図３（配列番号４）、図４（配列番号６）、または図５（配列番号８）のＦＧＦ−２の「脈管形成的に活性なムテイン」を含む。用語「脈管形成的に活性なムテイン」は、これらのそれぞれの位置において、それぞれ図２（配列番号２）に示されるＦＧＦ−２配列の１４６残基、図３（配列番号４）に示されるヒトＦＧＦ−２配列の１４６残基、図４（配列番号６）において示されるＦＧＦ−２配列の１５５残基、または図５（配列番号８）において示されるＦＧＦ−２配列の１５５残基の少なくとも８０％、好ましくは９０％を構造的に保持し、そしてＦＧＦ−２のそれぞれの非変異形態の脈管形成活性を機能的に保持する、図２（配列番号２）、図３（配列番号４）、図４（配列番号６）、または図５（配列番号８）のＦＧＦ−２の変異形態を意図する。好ましくは、変異は、Ｌ−アミノ酸を使用する「保存的置換」であり、ここで、１つのアミノ酸は、別の生物学的に類似のアミノ酸によって置換される。保存的置換の例としては、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、またはＧｌｙのような１つの疎水性残基の別の残基との置換、またはＡｒｇとＬｙｓとの間、ＧｌｕとＡｓｐとの間、またはＧｌｎとＡｓｎとの間のような１つの極性残基の別の残基との置換が挙げられる。一般には、荷電アミノ酸は、お互いに交換可能であると考えられている。しかし、置換をより保存的にするには、存在する場合、側鎖上の電荷の大きさおよび類似の両方を考慮する。適切な置換としては、セリンの、残基８７位および９２位における１つまたは両方のシステイン（これらは、ジスルフィド形成に関与しない）との置換が挙げられる。他の適切な置換としては、ムテインが酸性条件下でより大きい安定性を有するように、少なくとも１つの構成的なシステインが別のアミノ酸と置換される、任意の置換が挙げられる。例えば、米国特許第５，８５２，１７７号（これは、参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。１つのこのような置換は、例えば、システイン残基の以下のような天然のアミノ酸との置換である：グリシン、バリン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファン、セリン、トレオニン、およびメチオニン（米国特許第５，８５２，１７７号）。好ましくは、置換は、ＦＧＦ−２　Ｎ末端において導入され、これは、脈管形成活性に関連しない。しかし、上に議論されるように、保存的な置換は、分子全体の導入のために適切である。
【００５２】
当業者は、本発明の単位用量、組成物および方法での使用について脈管形成活性を有するＦＧＦ−２ポリペプチドムテイン（またはムテインのフラグメント）の発現を得るために、周知の技術を使用して、図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図４（配列番号５）、または図５（配列番号７）のＤＮＡにおいて１つ以上の点変異を作製し得る。図２（配列番号２）、図３（配列番号４）、図４（配列番号６）、または図５（配列番号８）のＦＧＦ−２の脈管形成的に活性なムテインを調製するために、それぞれ図２（配列番号２）、図３（配列番号４）、図４（配列番号６）、または図５（配列番号８）のＦＧＦ−２をコードする図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図４（配列番号５）、または図５（配列番号７）のｃＤＮＡに１つ以上の点変異を導入するために、当該分野で公知の、そして／またはＧｉｌｍａｎら（１９７９）Ｇｅｎｅ　８：８１またはＲｏｂｅｒｔｓら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ　３２８：７３　１に教示されるような、部位特異的変異誘発についての標準的な技術を使用する。
【００５３】
本発明の薬学的組成物は、図２（配列番号２）、図３（配列番号４）、図４（配列番号６）、図５（配列番号８）の哺乳類ＦＧＦ−２またはその脈管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインの脈管形成的に有効な用量、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。代表的には、本発明の薬学的組成物の安全かつ脈管形成的に有効な用量は、ヒト患者に投与するのに適した形態およびサイズであり、この用量は、（ｉ）図２（配列番号２）のＦＧＦ−２、またはその脈管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインの１．０μｇ／ｋｇ〜３０．０μｇ／ｋｇ、および（ｉｉ）薬学的に受容可能なキャリア、を含む。他の実施形態において、安全かつ脈管形成的に有効な用量は、図２（配列番号２）、図３（配列番号４）、図４（配列番号６）、図５（配列番号８）のＦＧＦ−２、またはその脈管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインの約０．１μｇ／ｋｇ〜約１μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約３μｇ／ｋｇ、約３μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約５μｇ／ｋｇ〜約７μｇ／ｋｇ、約７μｇ／ｋｇ〜約８μｇ／ｋｇ、約８μｇ／ｋｇ〜約９μｇ／ｋｇ、約９μｇ／ｋｇ〜約９．９μｇ／ｋｇ（例えば、約９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８または９．９μｇ／ｋｇ）、約１０μｇ／ｋｇまで、約１０μｇ／ｋｇ〜約１５μｇ／ｋｇ、約１５μｇ／ｋｇ〜約２０μｇ／ｋｇ、約２０μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇ、約３０μｇ／ｋｇ〜約４０μｇ／ｋｇ、約４０μｇ／ｋｇ〜約６０μｇ／ｋｇ、約６０μｇ／ｋｇ〜約８０μｇ／ｋｇ、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。
【００５４】
代表的な薬学的組成物は、図２（配列番号２）もしくは図３（配列番号４）に示される配列を有する、０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、より代表的には、０．３ｍｇ／ｍｌ〜０．５ｍｇ／ｍｌのＦＧＦ−２（より詳細には、組換えＦＧＦ−２（ｒＦＧＦ−２））、またはその脈管形成的に活性なフラグメントもしくはムテイン、１０ｍＭのチオグリセロール、１３５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、および１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ５．０）を含有する。上記組成物に適切な希釈液またはフラッシング剤（ｆｌｕｓｈｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）は、上記キャリアのいずれかである。代表的には、この希釈液は、１０ｍＭのチオグリセロール、１３５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、および１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ５．０）を含むキャリア溶液自体である。図２（配列番号２）のｒＦＧＦ−２、またはその脈管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインは、液体形態で長期間は不安定である。安定性および有効期限を最大にするために、薬学的に受容可能な水性キャリア中のｒＦＧＦ−２またはその脈管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインの有効量を含有する本発明の薬学的組成物は、−６０℃で凍結保存されるべきである。解凍された溶液は、冷蔵状態で１ヶ月間安定である。代表的な単位用量は、１．５〜８ｍｇの図２（配列番号２）または図３（配列番号４）のＦＧＦ−２を有する、約５〜１０ｍｌの上記組成物を含む。
【００５５】
別の実施形態において、薬学的組成物は、凍結乾燥（フリーズドライ）された形態において、図２（配列番号２）、図３（配列番号４）のＦＧＦ−２、またはその脈管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインの単位用量を含有する。この形態において、ＦＧＦ−２の単位用量は、治療効果を失うことなしに、室温で実質的に６ヶ月よりも長く保存され得る。凍結乾燥は、本明細書におけるＦＧＦ−２の単位用量を各々が含む複数のバイアルの減圧下で、急激に凍結乾燥することによって達成される。凍結乾燥器により上記凍結乾燥を行うが、凍結乾燥器は市販されており、当業者によって容易に作動可能である。患者に投与する前に、凍結乾燥された産物は、好ましくは、それ自体のバイアル中で、適切な滅菌水性希釈液（代表的には、０．９８％（またはそれ未満）の滅菌生理食塩水または適合性滅菌緩衝液、またはさらに滅菌脱イオン水）を用いて、既知の濃度に再構築される。例えば、同時係属中の米国特許出願６０／２２９，２３８，表題「Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ　ＦＧＦ　Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｒｅｄｕｃｉｎｇ　Ａｇｅｎｔｓ」（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。ｋｇ単位の患者体重に依存して、図２（配列番号２）のＦＧＦ、図３（配列番号４）のＦＧＦまたはその脈管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインの０．２μｇ／ｋｇ〜３６μｇ／ｋｇを含む単一用量が、患者に投与するための再構築産物としてバイアルから吸引される。例えば、２４μｇ／ｋｇで投薬された平均７０ｋｇの男性は、１６８０μｇ（すなわち、１６８０ｍｇ）の注入物（７０ｋｇ×２４μｇ／ｋｇ）を受け取るようにバイアルから吸引された再構築産物の十分な容量を有する。
【００５６】
溶液形態の薬学的組成物は、約１０〜約３０分間にわたって実質的に連続的に単位用量を注入することによって一般的には投与されるが、この組成物が長期間にわたって投与され得ることが認識される。この組成物が１つ以上の血管内に投与される場合、代表的には、単位用量の一部（例えば、２分の１）が第一の血管に投与され、続いて第二の二次血管に投与される。上記再配置手順を用いて、全ての単位用量が投与されるまで、単位用量の一部が複数の血管に投与され得る。投与後、当該分野で公知の簡便なプロトコールを使用して、カテーテルを取り除く。脈管形成の徴候および治療利点（例えば、跛行の減少、足関節上腕血圧比における改善、最大歩行時間における改善、階段を上がる能力の上昇、体の痛みの低下、臨界四肢虚血における改善または臨界四肢虚血（ｌｉｍｂ　ｉｓｃｈｅｍｉａ）の予防、および患者の生活の質の改善）は、ＦＧＦ−２投与後、２週間〜１ヶ月の早さで見られる。
【００５７】
以下の実施例は、例示の目的で提供されるものであり、制限を目的として提供されるものではない。
【００５８】
（実施例）
（実施例１：第Ｉ相の臨床試験において用いられるＦＧＦ−２の単位用量）
図２（配列番号２）に示される配列を有する、組換え産生されたＦＧＦ−２（ｒＦＧＦ−２）を、単位用量および薬学的組成物として処方した。種々の処方物が以下に記載される。
【００５９】
ｒＦＧＦ−２単位用量を、積層グレイブチルラバーストッパーおよびレッドフリップオフオーバーシール（ｒｅｄ　ｆｌｉｐ−ｏｆｆ　ｏｖｅｒｓｅａｌ）を備える３ｃｃのＩ型ガラスバイアル中に液体として提供した。このｒＦＧＦ−２単位用量は、１．２ｍｌの図２（配列番号２）の０．３ｍｇ／ｍｌ　ｒＦＧＦ−２を、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１０ｍＭのモノチオグリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物（分子量３７２．２）、１３５ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ５）中に含んだ。従って、絶対条件において、各バイアル（および単位用量）は、０．３６ｍｇのｒＦＧＦ−２を含んだ。液体形態の単位用量を含むバイアルを、２℃〜８℃で保存した。
【００６０】
希釈液を、積層グレイブチルラバーストッパーおよびレッドフリップオフオーバーシールを備える５ｃｃのＩ型ガラスバイアル中に供給した。ｒＦＧＦ−２希釈液は、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１０ｍＭのモノチオグリセロール、１３５ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ５）を含む。各バイアルは、２℃〜８℃で保存される５．２ｍｌのｒＦＧＦ−２希釈溶液を含んだ。このような因子はまた、切断術への臨界四肢虚血の進行を予防するために投与され得る。
【００６１】
注入されるｒＦＧＦ−２の薬学的組成物を、ｒＦＧＦ−２単位用量をｒＦＧＦ希釈液を用いて希釈することによって調製した。ＥＤＴＡ濃度を１００μｇ／ｍｌの限界より低く保つために、ＦＧＦ−２の比較的高い絶対量が患者に投与される場合、全注入容量を４０ｍｌまで増加させた。
【００６２】
（実施例２：第ＩＩ相のＰＡＤ臨床試験）
０．９未満の休止期足関節上腕血圧比（ＡＢＩ）の状態よって定義されるような、抹消動脈疾患（ＰＡＤ）は、５５歳を越える成人の約１５％を冒す一般的な状態である。これら個体の約３３％が跛行の微侯であり；約２５％が進行する。血流制限がさらに悪くなるにつれて、ＰＡＤのスペクトルは、穏やかな状態から中程度の跛行に進行し、続いて四肢切迫（ｌｉｍｂ−ｔｈｒｅａｔｅｎｉｎｇ）虚血を起こし、休息痛によって初期に特徴付けられ、次いで、乏しい創傷治癒、および切迫した壊疽または顕性の壊疽を起こす。
【００６３】
第ＩＩ相試験を、下鼡径部ＰＡＤに起因する間欠性跛行を伴う患者の運動能力に対するｒＦＧＦ−２の動脈内投与の効力を評価するために行った。この第ＩＩ相ＰＡＤ試験は、安全な薬物速度論、および重度の間欠性跛行を起こすように中程度のＰＡＤ被験体における２０分間にわたる動脈内（ＩＡ）注入による効力を評価するための、多施設の無作為化した、二重盲検のプラシーボコントロールの、ｒＦＧＦ−２のレジメン確認研究であった。この試験における患者の包括についての主要な選択基準は、４０歳を越えており、跛行、安静状態で０．８未満の足関節上腕血圧比（ＡＢＩ）、患者の大腿流入、４ヶ月を越えた医学的な安定およびインフォームドコンセントによって運動が制限された。この試験由来の患者の包括についての主要な選択基準は、（ＡＣＳガイドラインに従う）悪性腫瘍（２．０ｍｇ／ｄＬより高いクレアチニン、２＋より高いかもしくはそれと等しい、または３００ｍｇ／日より高い尿タンパク質、増殖性網膜症、および／または安全性またはコンプライアンスして影響を及ぼす他の状態）を示す証拠であった。１９０人の患者が、第ＩＩ相ＰＡＤ試験においに関与した。患者集団のベースライン特性を表１〜３に示す。
【００６４】
【表１】
2004501164.tif 000002
【００６５】
【表２】
2004501164.tif 000003
【００６６】
【表３】
2004501164.tif 000004
患者の約３分の２が、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）の経歴を有し、わずか３分の１未満が、心筋梗塞を経験的に示し、３分の１が糖尿病であり、約４分の３が高血圧および／または異脂肪血症であった（表２）。この標的集団の約２０〜３０％を、１回より多くの血管新生手順を受けていた（表３）。低いベースラインの生活の質のスコア（ＷＩＱおよびＳＦ−３６）は、中程度から重度の疾患を有する標的ＰＡＤ患者集団を示す。これらのスコアは、１または１００％が正常であるスケールに基づく。従って、スコアの増加は、改良を示す。スコアを、患者が自己評価を行うアンケートに基づいて作表した。
【００６７】
ｒＦＧＦ−２を、２本の脚の間に１日目および３０日目に分配された２０分間にわたる動脈内（ＩＡ）注入によって投与した。投与された用量は、３０μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２であった。この試験患者を、３つのグループに分けた；プラシーボ；単一用量（１日目にｒＦＧＦ−２）；および二倍用量（１日目および３０日目にｒＦＧＦ−２）。本研究で使用された一次終点は、Ｇａｒｄｎｅｒ段階的運動プロトコールによる９０日目での最大歩行時間（ＰＷＴ）の変化であった。第二終点を、以下を含んで測定した：１８０日目のＰＷＴ変化、跛行発病時間（ＣＯＴ；患者が跛行を示し、そして／または痛みが始まる時間として記述される）、足関節上腕血圧比（ＡＢＩ；標準的な超音波デバイスを用いて決定されるような）、ならびに９０日目および１８０日目でのＷａｉｋｉｎｇ　Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ　Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ（ＷＩＱ）およびＳｈｏｒｔ−Ｆｏｒｍ−３６（ＳＦ−３６）による健康に関連する生活の質（ＱＯＬ）。
【００６８】
組換えＦＧＦ−２（ｒＦＧＦ−２）を、０．３ｍｇ／ｍｌのｒＦＧＦ−２、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．３ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのチオグリセロール、１３５ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ５．０）を含む溶液中に処方した。各々５ｍｌのバイアルは、３．７ｍｌの明瞭な無色溶液を含んだ（１バイアル当たり１．１ｍｇのｒＦＧＦ−２）。ｒＦＧＦ−２を含むバイアルを、「ｒＦＦＧＦ−２」と標識化し、凍結で供給した。薬物製品を、用量を調製する前に室温で解凍し；薬剤師に対する詳細な取扱説明書を、研究マニュアルに提供した。解凍した未希釈の活性薬物製品を、２〜８℃にて３０日間冷蔵保存し得る。
【００６９】
薬物産物をプラシーボ（希釈液）で希釈し、投与前に濾過した。フィルターは、滅菌した非発熱性であり、かつ低タンパク質結合であった。０．２２マイクロシリンジフィルター（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ，＃ＳＬＧＶＲ２５ＬＳまたは等価物）を介する薬物製品の濾過によって、強力なまたは潜在的な結果的損失を有さない粒子を除去する。解凍した未希釈の薬物製品を、８時間以内で使用した。
【００７０】
プラシーボ（希釈液）を、薬物製品から識別不可能な明瞭な無色溶液として供給した。これは、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．３ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのチオグチセロール、１３５ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ５．０）を含んだ。希釈液を含むバイアルを、「プラシーボ」と標識表示し、液体状態で供給し、そして２〜８℃で冷蔵保存した。
【００７１】
試験の結果により、ｒＦＧＦ−２が単一用量処置グループと二倍用量処置グループとの両方について９０日目で受容可能な安全なプロフィールを有することが示された。１日目および３０日目での用量は、１日目での単一用量と類似の安全なデータを得た（データ示さず）。
【００７２】
研究から１８０日目での患者の傾向および患者に対する有害な事象を、それぞれ、表４および表５に示す。
【００７３】
【表４】
2004501164.tif 000005
【００７４】
【表５】
2004501164.tif 000006
（データ解析）
データの一次解析を、ＡＮＯＶＡによって行った。ＰＷＴのない１０人の被験体および血管再生された６人の被験体を、解析から除いた。二次解析を、ＲａｎｋのＡＮＯＶＡによって行った。一次解析から除かれた１６人の被験体を、最低ランクに設定した。これは、さらに保存的なアプローチを示す。例えば、表６を参照のこと。
【００７５】
【表６】
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（一次終点：９０日目での最大歩行時間）
組換えＦＧＦ−２は、コントロールプラシーボグループ（図６）と比較して、ｒＦＧＦ−２の単一用量を受け取る試験において患者の９０日目でのＰＷＴ（ｐ＝０．０２６）における統計学的に有意な改良によって測定されるような、ＰＡＤ処置において効果的であった。また、結果より、ｒＦＧＦ−２の二倍用量（１日および３０日）が単一用量（１日）よりも好ましくないことが示された。
【００７６】
（二次有効変数）
二次有効変数は、１８０日目でのＰＷＴ、跛行発病時間（ＣＯＴ）、ならびに９０日目および１８０日目での足関節上腕血圧比（ＡＢＩ）、ならびに９０日目および１８０日目でのＷＩおよびＳＦ−３６の生活の質アンケートを含んだ。１８０日での結果は、プラシーボ応答における多量の増加を反映する。
【００７７】
図７は、プラシーボ、単一用量ｒＦＧＦ−２、または二倍用量ｒＦＧＦ−２を受け取る患者グループについての９０日目および１８０日目でのＰＷＴの絶対的な変化を示す。各患者について、ベースラインのＰＷＴを、９０日目でのＰＷＴから差し引き、そしてこの差異を各グループについて合計し、そして平均を決定した。このデータを、分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって解析する。
【００７８】
図８は、９０日目および１８０日目で示される、３つの患者群におけるＰＷＴの絶対的な変化の割合を示す。２つのｒＦＧＦ−２群全体で平均されたＰＷＴの変更の割合もまた示される（任意のＦＧＦと表される）。
【００７９】
図９は、第ＩＩ期の臨床研究の３つの患者群について測定されたＡＢＩ（足根関節上腕指数（ａｎｋｌｅ　ｂｒａｎｃｈｉａｌ　ｉｎｄｅｘ））を示す。基準の測定、９０日目の測定、および基準の測定と９０日目の測定との間の対応する変化が示される。ＡＢＩにおける平均変化もまた、３つの患者群について示される。ＡＢＩは、Ａｎ　Ｏｆｆｉｃｅ　Ｂａｓｅｄ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　Ａｒｔｅｒｉａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ（２０００）Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　Ｍｅｄｉａ，Ｉｎｃ．、Ｗｒｉｇｈｔｓｔｏｗｎ、ＰＡ）に記載される。
【００８０】
足根関節上腕指数は、ドップラー超音波デバイスによって測定されるような、脚における収縮期の圧力と、腕における収縮期の圧力の比である。正常なＡＢＩは１である。０．９未満のＡＢＩは、ＰＡＤの診断とみなされる。試験において登録された標的集団の平均のＡＢＩは、休息時で指標の脚において０．５６であった。指標の脚は、より低いＡＢＩを有する脚である。図９は、各群について、基準での、９０日目の、および１８０日目の平均ＡＢＩ（上のパネル）を示す。下のパネルは、各群についての、９０日目および１８０日目のＡＢＩにおける平均変化を示す。プラシーボと比較して、処置群において、陽性の指導的な変化が存在する。この差異は、１８０日目の二倍用量の群において、統計的有意性を達成した（平均ΔＡＢＩ＝０．１１；プラシーボに対してｐ＝０．０３１）。ＡＢＩが血流の客観的な測定を示す場合、この変化は、ＦＧＦの提案された機構、新規の副行血管の形成に一致する。
【００８１】
図１０は、プラシーボ群と比較した、単用量群および二倍用量群についての９０日目および１８０日目の跛行のＷＩＱ重症度を示す。バーの値は、各群において改善したか、同じままか、または悪くなった、各群における患者の割合を示す。９０日目に、処置群の５０％より多い患者が改善され、一方、プラシーボ患者の４０％未満が改善された。１８０日目には、この明らかな処置の恩恵は失われた。ＷＱＩのさらなる情報については、Ｒｅｇｅｎｓｔｅｉｎｅｒら（１９９０）Ｊ．Ｖａｓｃ，Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２：１４２−１５３（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００８２】
図１１は、各群についての、距離、速さおよび階段上りに関する、基準、９０日目および１８０日目での重症度スコアを示す。変化は、ＦＧＦ処置群について、距離および速さについて指導的に陽性であるが、これらの結果は、統計的有意性を達成しなかった。階段上りについて、プラシーボ群に対して、単用量群について改善の傾向が存在した（ｐ＝０．１１）。この図は、単用量群についての結果が、ＷＩＱ距離、速さおよび階段上りに関しての、プラシーボについての結果よりも良好であったことを示す。この図は、より高いスコアがより良好である尺度で示される。
【００８３】
図１２は、簡易型−３６（ＳＦ−３６）からの身体的要約スコアを示す。ＳＦ−３６は、３６個の質問からなる、生活の一般的に有効な質の道具である。ＳＦ−３６は、１２個の領域を有し、これは２つの要約スコア（身体的および精神的）に分けられ得る。１点の変化は、２年の寿命の増加に関連する。図中の変化スコアは、９０日目に、プラシーボ群と比較して、単用量群における２点より大きい改善を示す。
【００８４】
この研究の結果を、図１３に要約する。
【００８５】
（亜群の試験）
この分析計画は、第ＩＩ期の臨床試験患者群の３つの予め特定化された亜群における処置応答の追跡を提供する：糖尿病（Ｉ型またはＩＩ型、イエス対ノー）、喫煙（現在　対　非現在（過去に喫煙した個体または喫煙経験のない個体を含む））、および中間の年齢（６８歳以下　対　６８歳より年上）。一次効力測定、ＰＷＴの変化の結果を、各亜群について以下に示す。表７〜１２のデータは、（一次効力分析と一致するように）対数形質転換結果を反映する。
【００８６】
（糖尿病）
９０日目および１８０日目でのＰＷＴの結果を、表７および８に示す。プラシーボ群とＦＧＦ処置群との間に統計的に有意な差異は存在しなかった。９０日目に、ＦＧＦ処置群における糖尿病および非糖尿病の両方において、変化はより大きかった。１８０日目に、変化は、糖尿病においてより小さく、そしてＦＧＦ処置群の非糖尿病に類似した。単用量群における糖尿病の割合は、僅かに低かった（プラシーボ群における３７％、そして二倍用量群における３６％に対して２７％）。
【００８７】
【表７】
2004501164.tif 000008
【００８８】
【表８】
2004501164.tif 000009
（喫煙）
現在の喫煙者および現在の非喫煙者についての９０日目および１８０日目のＰＷＴの変化の結果を、表９および１０に示す。現在の喫煙者について、９０日目と１８０日目で統計的に有意な差異は見られなかった。現在の非喫煙者について、９０日目に、全体的に（ｐ＝０．００７）そしてプラシーボ群と単用量群との間に（Ｐ値＝０．００２）、統計的に有意な差異が存在した；１８０日目には、統計的に有意な差異は見られなかった。回帰分析の結果は、喫煙が結果の混乱子であることを示唆した。
【００８９】
【表９】
2004501164.tif 000010
【００９０】
【表１０】
2004501164.tif 000011
（年齢）
６８歳より年上の被験体および６８歳以下の被験体についての、９０日目および１８０日目のＰＷＴの変化の結果を、表１１および１２に示す。二倍用量群において、高いＷＴＰ（８分以上）を有する被験体の頻度が、より高かった。６８歳よりも年上の被験体について、好ましくない統計的に有意な差異が、１８０日目に二倍用量群において見られた（Ｐ値＝０．０３１）。６８歳以下の被験体について、ＰＷＴの変化は、ＦＧＦ処置群においてより高かったが、９０日目でも１８０日目でも統計的に有意な差異は見られなかった。これらの結果は、６８歳以下の被験体におけるより高い改善を示唆する。
【００９１】
【表１１】
2004501164.tif 000012
【００９２】
【表１２】
2004501164.tif 000013
（ｈｏｃ後の応答子分析）
この研究において、９０日目にそのＰＷＴが２分以上増加した被験体のうち、単用量群において基準で低いＰＷＴ（４分以下）を有する被験体の頻度は、より高かった。１８０日目の応答の最も強い予測子は、９０日目での応答であった。そのＰＷＴが２分以上増加した被験体についてのＰＷＴの変化、およびそのＰＷＴが２分未満増加した被験体についてのＰＷＴの変化を、それぞれ、表１３および１４に示す。９０日目および１８０日目でのより高い割合の応答子が存在し、そして変化の大きさは、単用量群よりも大きかった。単用量処置を受ける患者の約４０％が、９０日目および１８０日目の両方で、２分より多いＰＷＴの増加を有したが、プラシーボまたはＦＧＦ−２の二倍用量を受ける患者の約２２％および約２６％のみが、この大きさの応答を経験した。さらに、この処置効果は、この分析によって、１８０日目でも持続するようである。
【００９３】
【表１３】
2004501164.tif 000014
【００９４】
【表１４】
2004501164.tif 000015
（ｈｏｃ後の足根関節上腕指数の分析）
最初の分析計画は、分析から除外される１．２より高い基準の足根関節上腕指数（ＡＢＩ）（非圧迫動脈と一致する）を有する被験体を予め特定した（図９を参照のこと）。データのｈｏｃ後の分析において、いずれの時点（すなわち、基準、９０日目および／または１８０日目）においても１．２より高いＡＢＩを有する被験体を、分析から除外した。図１４に見られるように、このｈｏｃ後の分析は、単用量群および二倍用量群の両方が、９０日目に、プラシーボ群と比較して、統計的に有意なＡＢＩの改善を有したことを示す。この有意性は、１８０日目では明らかでないが、単用量群および二倍用量群の両方について、この傾向は持続した。
【００９５】
（効力の要約）
（一次効力分析）
一次効力分析（９０日目でのＰＷＴの変化）についての全体のＰ値は、０．７５であった（ＡＮＯＶＡ）。ＲａｎｋｓのＡＮＯＶＡによる二次効力分析についての全体のＰ値は、統計的に有意であった（Ｐ値＝０．０３４）。単用量群は、９０日目に、二倍用量群における２０．３％の増加およびプラシーボ群における１３．８％の増加に対して、ＰＷＴの３３．５％の増加を実証した。単用量対プラシーボのペアの比較は、統計的に有意であった（Ｐ値＝０．０２６）。この処置効果は、対数形質転換データを使用して、１８０日目で維持されなかった。
【００９６】
（二次効力変数）
二次効力変数は、１８０日目のＰＷＴの差異のないこと、９０日目または１８０日目のＣＯＴの差異のないこと、１８０日目の二倍用量群における統計的に有意な変化を有する、ＦＧＦ処置群におけるＡＢＩの有利な傾向、および仔ウシプレチスモグラフィーにおける差異のないことを示した。ＷＩＱの変化の解釈は、基準での不均衡によって混乱した。９０日目のプラシーボと比較して、単用量群におけるＳＦ−３６のＰＣＳＳの改善へ向かう傾向が存在した；この傾向は、体痛（ｂｏｄｙ　ｐａｉｎ）スコアの統計的に有意な差異によって駆動された。
【００９７】
予め特定化された亜群において、喫煙の効果は最も興味深かった。９０日目のＰＷＴの変化についての全体のＰ値は、現在の非喫煙者については０．００７であったが、一方、現在の喫煙者については０．９３であった。プラシーボ群におけるＰＷＴの変化は、現在の非喫煙者については５．５％であり、そして喫煙者については２９．３％であった。回帰モデルは、喫煙が混乱する変数であることを示唆する（以下のｈｏｃ後の回帰分析を参照のこと）。プラシーボ群における現在の喫煙者の過剰な提示（単用量における２４％、および二倍用量群における２１％に対して３８％）は、全ての評価可能な被験体において差異を検出することを困難にした。
【００９８】
非糖尿病におけるＰＷＴの変化は、９０日目および１８０日目の全ての評価可能な被験体において見られる変化に匹敵する。糖尿病におけるＰＷＴの変化は、９０日目の全ての評価可能な被験体において見られる変化に匹敵するが、１８０日目の変化には匹敵しない。回帰モデルは、糖尿病が共変数であることを示唆しなかった。中間年齢を超えた被験体（６８歳より年上）におけるＰＷＴの変化は、９０日目および１８０日目の中間年齢より下の被験体におけるＰＷＴの変化より小さかった。回帰モデルは、年齢が共変数であることを示唆しなかった。
【００９９】
ｈｏｃ後の応答子分析は、単用量群における応答子のより高い割合、および単用量群におけるより強い大きさの効果を示す。さらに、これは、処置効果が１８０日目に持続することを示唆する。１８０日目の応答の最も強い予測子は、９０日目の応答である。
【０１００】
（ピーク歩行時間のｈｏｃ後の回帰分析）
回帰モデルは、絶対的変化スコア、相対的変化スコアおよび分析変数としての９０日目のＰＷＴ（ＰＷＴ９０）の使用の基礎を成す基準を評価するために使用された。このモデルは、以下で考察される。このｈｏｃ後の分析は、絶対的スコアおよび相対的スコアの両方が欠点を有し、そして第ＩＩ期の臨床試験においてＦＧＦ処置の効果を評価するための値をほとんど提供しないことを明らかにする。分析変数としてＰＷＴ９０を使用し、そして基準のＰＷＴに適合させることは、ＦＧＦの処置効果を評価するためのより良い基礎および値を提供するようである。
【０１０１】
（背景−分析における想定）
Ｉ．絶対変化スコアが、分析に使用される補正変数であると仮定する。各対象について、ＰＷＴにおける９０日目の絶対変化スコア＝（ＰＷＴ９０日目−ＰＷＴベースライン）または＝（ＰＷＴ９０−ＰＷＴＢ）。
【０１０２】
（ＰＷＴ９０−ＰＷＴＢ）＝ｄ、次いでＰＷＴ９０＝１．０＊ＰＷＴＢ＋ｄ、（ＰＷＴＢの全範囲にわたって）と仮定すると、ＰＷＴ９０対ＰＷＴＢの散乱プロットの想定は、以下である：
１．線形、
２．傾き＝１．０、および
３．切片は、ｄである（制限されない）。
【０１０３】
絶対変化スコアが、補正変数であると仮定される場合、図１５は、ＰＷＴ９０対ＰＷＴＢの仮想のプロットを示す。
【０１０４】
ＩＩ．相対的変化スコアが、分析に使用される補正変数であると仮定する。各対象について、ＰＷＴにおける９０日目の相対的変化スコア＝（ＰＷＴ９０／ＰＷＴＢ）。（ＰＷＴ９０／ＰＷＴＢ）＝ｌｄ、次いでＰＷＴ９０＝ｌｄ＊ＰＷＴＢ＋０．０（ＰＷＴＢの全範囲にわたって）と仮定すると、ＰＷＴ９０対ＰＷＴＢの散乱プロットは、以下である：
１．線形、
２．傾きは、ｌｄであり、そして
３．切片は、０．０である。
【０１０５】
相対的変化スコアが、想定された補正である場合、図１６は、ＰＷＴ９０対ＰＷＴＢの仮想のプロットを示す。
【０１０６】
本来の分析計画が、分析変数として絶対的変化スコアを使用した。ねぜなｒ、相対的スコアを使用するＰＩｓ／コンサルタントからの強い初期ガイダンスは、存在せず、そして絶対変化スコアを、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）の処置に指向される関連する研究の分析において使用したからである。ＣＡＤおよびＰＡＤのためのＦＧＦの合わせた指標についての可能性に興味があった。これは、同じ分析変数の一貫した使用によって容易になる。しかし、９０日目のデータを示した変化スコアの歪度および尖度の盲検化した予備評価は、対称的でないことが明らかであるので、分析計画は、Ｌｏｇ１０相対的変化スコア（Ｌｏｇ１０（ＰＷＴ９０／ＰＷＴＢ）＝Ｌｏｇ１０ＰＷＴ９０−Ｌｏｇ１０ＰＷＴＢ））を使用するために訂正される。１８０日目のＰＷＴ絶対変化スコアは、よち対称性に近いことが明らかであった（ｈｏｃ分析後において）、すなわち、絶対変化スコアは、よりよい分布特性を有することが明らかであった。
【０１０７】
（結果）
表１５および表１６に記載されるモデルを使用するｈｏｃ後の抑制分析の結果を、図１７〜１９に示す。図１７は、各処置群についてＰＷＴ９０対ＰＷＴＢの散乱プロットおよび限定されないスプライン抑制曲線を示す。図１７は、絶対変化スコアの使用のための最初の２つの基準（線形および傾き＝１）は、完全に満たされず、そして相対的変化スコアの使用のための基準（線形および傾き＝０．０）もまた、満たされない。従って、分析変数としての絶対変化スコアまたは相対的変化スコアの使用は、観察されたデータと完全な一貫性がないことが明らかである。
【０１０８】
図１８は、以下に記載される抑制モデル２を示す同じ散乱プロットおよび曲線を示す。抑制モデルは、９０日目のＰＷＴにおける変化を評価するため、およびベースラインＰＷＴを調節するためのさらに柔軟な方法を提供する。散乱プロットの曲った形は、曲線を生じる抑制モデルが、研究データをより良く示すか、または研究データに一致することを示唆する。曲った形を達成するために、抑制モデルは、分析変数のようなＰＷＴ９０ならびにＰＥＴＢおよび（ＰＷＴＢ）２を含む予測子変数を有する。喫煙状態のような他のベースライン変数が、重要な交絡因子である場合、これらはまた、抑制モデルに含まれ得る。
【０１０９】
表１５は、分析変数としてのＰＷＴ９０を用い、そしてＰＷＴＢについて調整された３つの抑制モデルを示す。全てのモデルはまた、施設（場所）について調調整される。モデル１は、任意の傾きを有し得る（すなわち、モデル１は、１．０を必要としない）ので、ＰＷＴ９０のためのモデル１は、予測子変数ＰＷＴＢのみを含むが、絶対変化スコアを使用するさらに柔軟である。モデル１は、絶対変化スコアまたは相対変化スコアのいずれよりもよくデータに適合する。
【０１１０】
ＰＷＴ９０のためのモデル２は、予測子変数としてＰＷＴＢと（ＰＷＴＢ）２の両方を含み、そして散乱プロットの曲線形状に適合する（図１８を参照のこと）。モデル２は、以下に見られるように、モデル１よりも研究データに対してより良い適合を提供することが明らかである。
【０１１１】
１）　モデルにおけるＰＷＴＢ２の組み込みのためのｐ値＝０．０２７、および
２）　モデル１と比較される増大したＲ２＝０．５２、これは、Ｒ２（ｐ＝０．０２５における統計的に有意な改善を示す。
【０１１２】
ＰＷＴ９０のためのモデル３は、喫煙状態（ベースライン）、ＰＷＴＢおよび（ＰＷＴＢ）２を含み、そして現在の喫煙状態に調節する。
【０１１３】
（表１５：ＰＷＴ９０についてに抑制モデル。全ての抑制モデルは、施設（場所）について調節される）
【０１１４】
【表１５】
2004501164.tif 000016
ＰＷＴ９０に対する３つの抑制モデルは、以下を示唆する：
・単一用量群は、９０日目でＰＷＴにおける統計的に有意な改善を有したペアワイズｐ値は、０．０３２、０．０２７および０．０１５（それぞれ、モデル１、２および３について）。
・単一用量は、６９．８、７１．７および７９．３秒間というプラセボ群に対してＰＷＴにおける平均増加を有した。
・二重用量群は、９０日目でのＰＷＴにおいて傾向または統計的に有意な改善を有したペアワイズｐ値は、０．０９６、０．０６７８および０．０３７のを有する。
・二重用量群は、５６．７、６１．８および７１．５秒間というプラセボ群に対してＰＷＴにおいて平均増加を有した；従って、二重用量群は、プラセボ群よりも増大したＰＷＴにおいて単一用量にさらに類似する。
・抑制モデルは、９０日間でＰＷＴにおいて５０％以上の改変を説明する。
【０１１５】
図１９は、各処置群についてのＰＷＴ１８０対ＰＷＴＢの散乱プロットおよび限定されていないスプライン抑制曲線を示す。データの形はまた、１の傾きまたは０．０の切片を支持しない。１８０日目のＰＷＴデータの形は、ごくわずかに曲線になっている。
【０１１６】
表１６は、分析変数としてのＰＷＴ１８０について、ＰＷＴＢおよび他のベースラインの対象特徴について調整された３つの抑制モデルを示し、全ての３つのモデルは、類似する結果を示し、単一用量群は、プラセボ群に対して２２〜２６秒の利益を有し、そして、二重用量群は、明らかに、プラセボ群とは異なっている。
【０１１７】
（表１６：ＰＷＴ１８０についてに抑制モデル。全ての抑制モデルは、施設（場所）について調節される）
【０１１８】
【表１６】
2004501164.tif 000017
要約すれば、結果変数（ｏｕｔｃｏｍｅ　ｖａｒｉａｂｌｅ）として９０日目のＰＷＴを使用すること、およびベースラインにおいてＰＷＴについて調整するｈｏｃ後抑制分析は、単一用量群においてプラセボより約７０秒間（１．１６分間）の増加および二重用量群において約５７秒間（０．９５分間）の増加を示した（それぞれ、ｐ＝０．０３２、０．０９６）。関係を非線形（すなわち、曲線）にすることは、単一用量において約７２秒間（１．１９分間）および二重用量群において６２秒間（１．０３分間）に処置の効果を増大した（それぞれ、Ｐ＝０．０２７、０．０６７）。喫煙状態のための調整は、さらに、単一用量において約７９秒間（１．３２分間）および二重用量群において約７２秒間（１．１９分間）に処置の効果の増大する（それぞれ、ｐ＝０．０１５、０．０３５）。
【０１１９】
（第ＩＩ相の臨床結果からの結果）
この研究は、ｒＦＧＦ−２でのＰＡＤの処置のための有効量、経路およびレジメンを規定した。動脈内に与えられる３０μｇ／ｋｇ　ｒＦＧＦ−２の単一用量は、ＰＡＤ患者のＰＷＴを改善した。ｒＦＧＦ−２の二重用量を投与することは、ＦＧＦ−２の単一用量を投与するより良くなかった。ＰＷＴにおける利益の程度は、３ヶ月と６ヶ月の両方に観察された利益の持続時間であり、１分間よりも大きかった。事実、単一用量処置を受けた患者の約４０％は、プラセボを受けた患者のわずか約２２％およびｒＦＧＦ−２の二重用量を受けた患者の約２６％と比較して、９０日目と１８０日目の両方で２分間より大きいＰＷＴの増大を経験した。データによりこの９０日目で応答したこれらの患者は、１８０日目でさらに応答するようであることが示された。
【０１２０】
従って、ｒＦＧＦ−２を用いた反復投薬は、患者の安全性に妥協することなく、必要である場合、可能である。複数の投薬の安全性に連関してｒＦＧＦ−２の単一用量で９０日目と１８０日目の両方で見られるＰＷＴにおける有益な効果は、ＰＡＤ患者に長期の治療的な利益を提供するための方法を提供する。これを、例えば、１日目に治療的な有効用量、続いて、治療的に必要であれば、（すなわち、症状の再発のような）治療的有効用量を患者に投与することによって達成し得る。
【０１２１】
（実施例３：第ＩＩＩ相のＰＡＤの臨床試験）
第ＩＩＩ相の、多施設の（５０の場所まで）、二重盲検、プラセボ制御用量最適化研究を実施する。この治験の第１の目的は、中程度から重度の跛行を伴う末梢性動脈疾患（ＰＡＤ）被験体における３．０μｇ／ｋｇまたは３０．０μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２対プラセボの動脈内（ＩＡ）注入の安全性および効率を評価することである。治験は、運動を制限された中程度から重度の跛行を伴う４５０人の被験体（１部門あたり１５０）を登録する。登録基準および排除基準を、表１７に示す。サンプルのサイズは、２２５人の患者を登録した後、９０日間での最大歩行時間の可変性のＤＳＭＢ評価に基づいて調整され得る。
【０１２２】
（表１７．第ＩＩＩ相の臨床試験の概要）
【０１２３】
【表１７】
2004501164.tif 000018
研究薬剤（図２に示される配列（配列番号２）を有するｒＦＧＦ−２）は、通常生理食塩水で再構成される、凍結乾燥粉末中に０．３５または３．５ｍｇ／ｍＬを含む：これは、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、４％グリシン、１％グルコース（ｐＨ６．０）中に処方される。処置は、総大腿動脈を介して、均等に２本の脚間で分割される、１ｍＬ／分のプラセボ、３．０μｇ／ｋｇまたは３０．０μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２での２０ｍＬの注入からなる。処置のための割り当てを、１：１：１、プラセボ：３．０μｇ／ｋｇ　ｒＦＧＦ−２：３０．０μｇ／ｋｇ　ｆＦＧＦ−２に無作為化する。血液を、ＦＧＦ−２の血漿濃度の分析のための注入のベースラインおよび最後に引き出す。各被験体を、研究薬物投与後６時間にわたり、病院で観察し、１８０日の特定の間隔で外来患者として追跡した。
【０１２４】
患者を、ＩＡ注入に関連する収縮期血圧をならびにアレルギー反応のいずれかの証拠、ならびに有害な現象の頻度および重篤度、実験パラメーターの変化（特に、尿タンパク質）、網膜毒性の証拠、ならびにセロコンバーション（抗体形成）の証拠についてモニタする。ＤＳＭＢは、登録の間、ＳＡＥおよび異常な臨床検査を概説する。
【０１２５】
第１の効力の変数は、ベースラインＰＷＴ、喫煙状況および施設について調整される、Ｇａｒｄｎｅｒ段階運動試験時間によって測定されるよう９０日間での最大歩行時間（ＰＷＴ）におけるベースラインからの変化である。第２の効果を、以下のパラメーターに基づいて確立する：
・ベースラインＰＷＴ、喫煙状態および施設について調節された４５日間、１３５日間および１８０日間でのＰＷＴにおけるベースラインからの変化；
・４５日間、９０日間、１３５日間および１８０日間における跛行の発症時間（ＣＯＴ）におけるベースラインの変化；
・４５日間、９０日間、１３５日間および１８０日間におけるａｎｋｌｅｂｒａｃｈｉａｌ指標圧力（ＡＢＩ）におけるベースラインからの変化；
・４５日間、９０日間、１３５日間および１８０日間でのＷＩＱの跛行の重篤度、距離、速度および階段上昇スコアにおけるベースラインからの変化；
・４５日間、９０日間、１３５日間および１８０日間でのＳＦ−３６の生理学的成分要約スコア（ＰＣＳＳ）におけるベースラインからの変化；ならびに
・９０日間および１８０日間での応答者の割合。
【０１２６】
潜在的な補助研究は、血量計、筋肉生検およびＭＲ分光法を含む。一般的なプロトコルおよび追加の来診者の情報試験を、表１８に示す。
（表１８．事象の一般的なスケジュール）
【０１２７】
【表１８】
2004501164.tif 000019
１．ＣＢＣ（差異なし）、血小板、電解質、ＢＵＮ、クレアチニン、コレステロール、肝臓酵素、グルコース、コチニン
２．特定の比重、定性的なタンパク質、タンパク質／クレアチニンについての尿比。
【０１２８】
（統計的分析）
ベースラインが、ベースライン後ＰＷＴ評価なしに、被験体について欠損データすなわち、最も低いランクを進展した後、ベースラインＰＷＴ、喫煙状態および施設について調節して、データを、最後の値に対してＲａｎｋのＡＮＯＶＡを使用して分析を処理する意図で分析する。
【０１２９】
（実施例４：末梢動脈機能不全を有するラットにおける側副血流に対するＦＧＦ−２投薬量レジメンの影響）
ＦＧＦ−２投与の３つの経路（動脈内［陽性コントロール］、筋肉内、およびヒトにおいて使用される経路）が実験的な末梢動脈機能不全を有するラットにおいて側副血流を上昇させる効力を比較する研究を行った。
【０１３０】
以前の動物モデル研究で、ｂＦＧＦは、両側の大腿動脈閉塞後、遠位のふくらはぎの筋肉に対する側副血流を改善することに効果的であることが実証された（Ｙａｎｇら（１９９６）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７９：６２〜６９；ＹａｎｇおよびＦｅｎｇ（２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７８：Ｈ８５〜Ｈ９３）。約５０ｍｌ／分／１００ｇから７０〜８０ｍｌ／分／１００ｇへの血流改善は、大腿上部の側副血管の血管抵抗における有意な減少に起因して可能であった。ふくらはぎ筋肉に対する側副血流における増加は、大腿動脈樹（ａｒｔｅｒｉａｌ　ｔｒｅｅ）のＸ線画像から得られる血管造影スコアとよく相関する。大腿上部の側副血管は、大腿動脈の閉塞後、回路における抵抗の主要な部位である（Ｙａｎｇら（１９９６）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７９：６２〜６９）。新規な毛細血管のデノボ合成（血管新生）は、大きい導管血管に発達し得ることも、そしてこれがこの血管応答の原因でもないようである。むしろ、抵抗の変化の程度および血管の発達が生じるための短い時間（１６日間）によっては多分、既存の血管の拡大が、より増大した血流に寄与する一次的変化となる。側副血流におけるｂＦＧＦを用いたこの増加はまた、年を取ったラットにおいても見出され（ＹａｎｇおよびＦｅｎｇ（２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７８：Ｈ８５〜Ｈ９３）、そして身体活動を伴って増大する（Ｙａｎｇら（１９９８）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７４：Ｈ２０５３〜Ｈ２０６１）。
【０１３１】
ｂＦＧＦ投与の種々の経路およびレジメンは、動物モデルにおいて側副血流の増加に効果的だと示されている。これらとしては、閉鎖血管の全身的経路、およびボーラスでの皮下経路、浸透圧ポンプを用いる注射または時限式注入によって達成される、短期間および比較的長期間の送達レジメンが挙げられる（ＹａｎｇおよびＦｅｎｇ（２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７８：Ｈ８５〜Ｈ９３）。これらのプロトコールは、ｂＦＧＦの効力を実証するのに有力である一方、これらのレジメンのいくつかは、治療的な血管新生における患者の管理には適切ではない。さらに、患者において時限的な間隔でｂＦＧＦを繰り返し投与する価値が期待されるが、以前の実験的研究において使用される手順の多くを用いては可能ではない。例えば、ｂＦＧＦの筋肉内注射の効力を確立することは、非常に有用である。しかし、ｂＦＧＦの直接的な筋肉内注射が、側副血流における標的化または全身化された改良に影響を与えるか否かは、現在、不明確である。従って、本試験実験の目的は、筋肉内注射を介するＦＧＦ−２投与の効力、および治療的血管新生において使用される、臨床的に適切なプロトコールを評価することであった。
【０１３２】
（実験設計）
末梢動脈機能不全を有する動物を、以下の４つの群に分けた：
群１　動脈内、１４日間の連続注入、ＦＧＦ−２（５μｇ／ｋｇ／日）　Ｎ＝６
群２　以下から構成されるビヒクル群：
群２ａ　ビヒクルの１４日間の動脈内連続注入　Ｎ＝２
群２ｂ　ビヒクルの動脈内単回注射　Ｎ＝２
群２ｃ　ビヒクルの筋肉内単一ボーラス　Ｎ＝４
群３　動脈内単回注射
群３ａ　用量１（１．５μｇ／ｋｇ総量）　Ｎ＝６
群３ｂ　用量２（１５μｇ／ｋｇ総量）　Ｎ＝６
群３ｃ　用量３（３０μｇ／ｋｇ総量）　Ｎ＝６
群４　筋肉内注射
群４ａ　用量１（０．１５μｇ／ｋｇ総量）　Ｎ＝６
群４ｂ　用量２（１．５μｇ／ｋｇ総量）　Ｎ＝６
群４ｃ　用量３（１５μｇ／ｋｇ総量）　Ｎ＝６
明確な送達経路に起因して、この研究を、完全な盲検様式（ｂｌｉｎｄｅｄ　ｍａｎｎｅｒ）では実行しなかった。しかし、１つの送達経路内の動物は、ランダムに割当てた盲検様式で用量の処置（すなわち、ビヒクル、注入、用量１、用量２、または用量３）を受けた。
【０１３３】
（一般プロトコール）
成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（約３２５ｇ）を、毎日２回ずつ、５〜１０分間、５日間歩かせることによって、トレッドミルに対して馴化させた。実験を開始するために、動物を、両側の大腿動脈閉塞に供した（方法を参照のこと）。同じ日に、動物に、上に記載の処置群に従って２週間の処置を開始した。実験の１６日目に、ラットを、電動のトレッドミル上を走らせながら側副依存性の血液を決定した。データセットの完了後、結果を処置群に従ってプールし、そしてこの結果をＡＮＯＶＡによって統計的に分析した。送達経路の各々由来のビヒクル処置動物は、１つの参照コントロール群にグループ分けされ得ることが予測された。しかし、データを評価して、筋肉内注射処置が、例えば、筋肉における炎症応答によって引き起こされる全身応答を導入したか否か、を決定した。
【０１３４】
（末梢動脈機能不全モデル）
大腿動脈の両側の結紮を設計し、残りの筋肉の血流を損なうことなしに末梢血管機能不全を確立する。筋肉の血流の高貯蔵は、著しく減少するが、残りの筋肉の血流は、残りの必要な血流を支えるのに十分である；例えば、（Ｙａｎｇら（１９９０）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ　６９：１３５３〜１３５９；ＹａｎｇおよびＴｅｒｊｕｎｇ（１９９３）Ｊ．Ａｐｐｌ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．７５（１）：４５２〜４５７；ＭａｃｋｉｅおよびＴｅｒｊｕｎｇ（１９８３）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２４５：Ｈ２６５〜Ｈ２７５）を比較のこと。従って、「休息痛」も、病理学的変化を引き起こす合併症も、組織壊死も、より近位の血管閉塞に伴って観察される壊疽も存在しない（ＣｈｌｅｂｏｕｎおよびＭａｒｔｉｎ（１９９４）Ａｕｓｔ．Ｎ．Ｚ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．６４：２０２〜２０７）。これらの外科的に処置された動物は、臨床的に見出される広範な範囲の末梢動脈機能不全を示さないことが理解される。むしろ、このモデルは、間欠性跛行の症状をそれ自体がしばしば示す、大きな血管閉塞疾患に特有である。
【０１３５】
（方法）
（動物の世話）　Ｔａｃｏｎｉｃ　Ｆａｒｍｓ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹから入手した成体Ｓｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙラット（約３２５ｇ）を、１２時間／１２時間の明／暗サイクルで、温度を調節した部屋（２０±１℃）に収容した。動物に、Ｐｕｒｉｎａ　Ｒａｔ　Ｃｈｏｗおよび水道水を自由に与えた。以前の研究は、１群あたり約１２匹の動物の完全データセットが、処置効果を決定的に評価するのに必要であることを確立した（Ｙａｎｇら（１９９０）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ　６９：１３５３〜１３５９）。従って、本研究は、研究の半分の将来の考慮のための一般応答を評価する、パイロット研究であった。供給業者から受け取ったラットの約９０％は、自ら走りまわり（処置群に無作為に割当てられる）、そしていくらかの消耗が実験の実施において起こるので、１実験群あたりｎ＝５〜６が得られることが予測された。
【０１３６】
（ＦＧＦ−２送達）　ＦＧＦ−２送達を、以下によって大腿動脈結紮の時点で以下のように開始／達成した：ａ）１４日間の連続動脈内注入；ｂ）筋肉内単回注射；またはｃ）動脈内単回注射。
【０１３７】
陽性コントロールについて、８匹のラットの群を、留置ポンプ／カテーテルから１４日間の注入を受けさせた（速度＝０．５μＬ／時間）。このカテーテルを、注入が、１つの後脚の大腿動脈における結紮点の上流に送達されるように配置した。６匹のラットが、５μｇ／ｋｇ／日で１４日間、総量７０μｇ／ｋｇの用量のＦＧＦ−２を受けた；他の２匹は、ビヒクル（ＰＢＳ）単独を受けた。デットスペースを可能にするために、ポンプを詰め込む、チュービングを詰め込む等して、各ラットについて０．４３５ｍＬのポンプ溶液の最終容積を、約３２５ｇの最初のラット重量に基づいて計算した。別々のポンプ溶液アリコートを、各ラットについて調製した。使用の直前、４３．５μＬのクエン酸ナトリウムおよび７μＬのグリセロールを各アリコートに添加し、それにより、各調製チューブにおけるＦＧＦ−２溶液またはＰＢＳの容量は、０．４３５−０．０４３５−０．００７＝０．３８５ｍＬとなった。従って、ＦＧＦアリコートについて、ＦＧＦ−２の濃度は、１５２．５μｇ／ｍＬであった。
【０１３８】
ラットの第２の群は、動脈内単回注射で、ビヒクルまたはＦＧＦ−２を受けた。この注射は、結紮点の上流で、１つの後脚の大腿動脈に、１０分間にわたって与えられた。注射される容積は、０．３５ｍＬであった。６匹のラットが、総用量１．５μｇ／ｋｇのＦＧＦ−２を受けた；６匹が、１５μｇ／ｋｇのＦＧＦ−２を受けた；６匹が、３０μｇ／ｋｇのＦＧＦ−２を受けた；そして２匹が、ビヒクル単独を受けた。
【０１３９】
ラットの第３の群は、筋肉内単回注射を受けた。この注射を、２つの部位（１つの後脚の内側の膝屈曲筋において、側副大腿の領域において）に分けて行った。注射される容量は、１部位あたり１００μＬであり、総容量は０．２ｍＬであった。６匹のラットが、総用量０．１５μｇ／ｋｇのＦＧＦ−２を受けた；６匹が、１．５μｇ／ｋｇのＦＧＦ−２を受けた；６匹が、１５μｇ／ｋｇのＦＧＦ−２を受けた；そして４匹が、ビヒクル単独を受けた。
【０１４０】
（結紮手術）　エーテル麻酔下で、各大腿動脈を、鼡径靱帯のすぐ遠位で単離した。結紮糸を、血流の全体的閉塞を確実にするように、大腿動脈の周りに密着して配置した。局所的抗生物質粉末（Ｎｅｏ−Ｐｒｅｄｅｆ，Ｕｐｊｏｈｎ）を、皮膚クリップで閉鎖する前に、創傷に配置した。この外科的手順は短時間であり、１００％の成功率で達成され、そして動物は迅速に回復した。慣習的に行なわれるように（ＹａｎｇおよびＴｅｒｊｕｎｇ（１９９３）Ｊ．Ａｐｐｌ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．７５（１）：４５２〜４５７；Ｙａｎｇら（１９９５ａ）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７６．４４８〜４５６；Ｙａｎｇら（１９９５ｂ）Ａｍ　Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６８：Ｈ１１７４〜Ｈ１１８０）、剖検時の目視検査で、手術が成功したことを確認した。
【０１４１】
（トレッドミルを走る間のインビボでの血流の決定）　筋肉の血流を、広範に使用されているように（ＹａｎｇおよびＴｅｒｊｕｎｇ（１９９３）Ｊ．Ａｐｐｌ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．７５（１）：４５２〜４５７；ＭａｃｋｉｅおよびＴｅｒｊｕｎｇ（１９８３）Ａｍ　Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２４５：Ｈ２６５〜Ｈ２７５；ＭａｔｈｉｅｎおよびＴｅｒｊｕｎｇ（１９８６）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２４５：Ｈ１０５０〜Ｈ１０５９；ＭａｔｈｉｅｎおよびＴｅｒｊｕｎｇ（１９９０）Ａｍ　Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５８：Ｈ７５９〜Ｈ７６５；Ｙａｎｇら（１９９０）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ　６９：１３５３〜１３５９；Ｙａｎｇら（１９９５）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７６．４４８〜４５６；Ｙａｎｇら（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６８：Ｈ１１７４〜Ｈ１１８０；Ｙａｎｇら（１９９６）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７９：６２〜６９）、トレッドミルを走る間、放射標識したマイクロスフェアを利用して、盲検様式で決定した。０．０５％のＴｗｅｅｎ８０を含有する１０％デキストランの懸濁液中の、８５Ｓｒまたは１４１Ｃｅ（約１０ｍＣｉ／ｇ）で標識されているマイクロスフェア（直径１５μｍ）を、商業的に（ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ）得た。十分に混合したマイクロスフェアの懸濁液を、大動脈弓に注意深く注入し、次いで、１５〜２０秒にわたって生理食塩水を流した。注射部位の直接的な比較（左心室　対　大動脈弓）で、腎臓および後脚の筋肉に対する同じ血流をもたらした。約３６０，０００個のスフェアを注入して、適切なマイクロスフェア分布を確立し、そしてデータにおける、統計学的な保証を可能にする（ＭａｃｋｉｅおよびＴｅｒｊｕｎｇ（１９８３）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２４５：Ｈ２６５〜Ｈ２７５；ＭａｔｈｉｅｎおよびＴｅｒｊｕｎｇ（１９８６）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２４５：Ｈ１０５０〜Ｈ１０５９；ＭａｔｈｉｅｎおよびＴｅｒｊｕｎｇ（１９９０）Ａｍ　Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５８：Ｈ７５９〜Ｈ７６５）。代表的に、運動の間、個々の筋肉サンプルあたり４００を十分に越えるマイクロスフェアが存在した。５００μｌ／分（Ｓａｇｅ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｍｏｄｅｌ　３５５ポンプ）で、尾部動脈から参照血液サンプルを採血することを、マイクロスフェアの注入１０秒前に開始し、そして約１００秒続けた。右側頚動脈、大腿動脈、および尾部動脈から採血した参照血液サンプルは、お互いに５〜１０％以内で一致することが見出された（ＭａｃｋｉｅおよびＴｅｒｊｕｎｇ（１９８３）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２４５：Ｈ２６５〜Ｈ２７５；未公開観察）。
【０１４２】
２つの血流の決定を、それぞれの動物において、中間トレッドミル速度およびより速いトレッドミル速度で行い、筋肉のピークの血管コンダクタンスを確立し、その結果、大腿上部における側副抵抗が、ふくらはぎの筋肉に対する下流の血流に関する律速となった。筋肉収縮（運動）が、血管拡張のための最も力強い刺激なので、このことが達成される。運動に続いて、ラットを、ペントバルビタールの過用量によって屠殺し、そして組織サンプルを以下に記載するように得て、そして参照血液サンプルを用いて１％の計数誤差で計数した（ＬＫＢ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｇａｍｍａ　Ｃｏｕｎｔｅｒ）。腎臓の両側の切片（中央の第３）をとり、マイクロスフェア混合の妥当性を検証した。適切な収集物を、バックグラウンドおよび同位体のスピルオーバーについて作製した。血流（ｍｌ／分／１００ｇ）を、以下のように計算した：
流動＝（ＣＰＭＴ×流動ＲＢＳ×１００）／（ＣＰＭＲＢＳ×ＷｔＴ）
ここで、Ｔは組織であり、そしてＲＢＳは、参照血液サンプルである。
【０１４３】
心拍数および動脈血圧を、運動の間、連続してモニタリングした。
【０１４４】
（血流決定のための外科的手順）　インビボでの血流決定のための外科的調製は、Ｌａｕｇｈｌｉｎら（１９８２）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ　５２：１６２９〜１６３５によって記載される調製の改変版であった。動物を、ケタミン／ＡＣＥ−プロマジン（１ｋｇあたり１００ｍｇ／０．５ｍｇ）で麻酔し、そしてカテーテルを右側の頚動脈に、後のマイクロスフェアの注入のために大動脈弓まで挿入した。カテーテル（ＰＥ　５０テーパー状）をまた、血液サンプルを採血するために、尾部動脈中に配置した。両方のカテーテルを、ヘパリン（１００ＩＵ／ｍｌ）を含有する生理食塩水で充填し、皮膚の下に誘導し、そして頚部の後ろで外に出した。各切開部位を縫合し、そして１％キシロカイン軟膏（Ａｓｔｒａ　Ｐｈａｒｍ．）でカバーした。他者（ＧｌｅｅｓｏｎおよびＢａｌｄｗｉｎ（１９８１）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５０：１２０５〜１２１１）の実験と一致して、カテーテルの配置の３〜４時間後に、ラットは機敏になり、走り回り、そして通常の運動抵抗を示した。
【０１４５】
（筋肉切片）　股関節窩（ｈｉｐ　ｓｏｃｋｅｔ）から遠位部まで、後脚の全ての組織を、切開し、重量を測定し、そして放射能について計数する。筋肉（Ｇｒｅｅｎｅ（１９６３）Ａｎａｔｏｍｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｒａｔ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ｈａｆｎｅｒ　Ｐｕｂ．Ｃｏ．）としては、大腿二頭筋、半腱様筋、半膜様筋、尾部大腿筋（ｃａｕｄｏｆｅｍｏｒａｌｉｓ）、内転筋群、殿筋群、大腿筋膜張筋、四頭筋群、ヒラメ筋、足底筋、腓腹筋、前脛骨筋、足の長指伸筋、深側部（ｄｅｅｐ　ｌａｔｅｒａｌ）および後部の脛筋が挙げられる。脛骨、腓骨、大腿骨および足もまた、重量を測定し、計数する。さらに、迅速に単収縮する（ｆａｓｔ−ｔｗｉｔｃｈ）赤筋線維（深側部の大腿四頭筋および深側部の腓腹筋）、迅速に単収縮する白筋線維（浅部（ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ）の四頭筋および浅部の内側腓腹筋）、ならびに緩慢に収縮する（ｓｌｏｗ−ｔｗｉｔｃｈ）赤筋線維（ヒラメ筋）から主に構成される切片が、得られる。これらの筋線維切片の詳細は生化学的特徴付け、生理学的特徴付けおよび形態学的な特徴付けが公知である（ＳａｌｔｉｎおよびＧｏｌｌａｉｃｋ（１９８３）Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｓｋｅｌｅｔａｌ　Ｍｕｓｃｌｅ，Ａｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｏｃ．５５５〜６３１頁を参照のこと）。横隔膜に対する血流をまた決定して、結紮に供していない活性な筋肉の応答を追跡する。
【０１４６】
（統計学的手順）　分散分析、Ｔｕｋｅｙの平均比較、およびＴ検定という反復観測を使用した統計学的評価を、適切に実行した（ＳｔｅｅｌおよびＴｏｒｒｉｅ（１９６０）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　＆　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　ｏｆ　Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，ＭａｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。
【０１４７】
（結果）
ｒＦＧＦ−２の筋肉内投与は、用量依存性の様式で、血流を増加させた（図２０）。動脈内に投与した場合、１５μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２用量は、３０μｇ／ｋｇ用量と、ちょうどおなじ効果があった。１４日間にわたる連続注入は、単回ＩＡ注入形態投与のまたは単一ＩＭ注射投与形態と比較して、有意に異なる効力をもたらさなかった。
【０１４８】
これらのデータは、ｒＦＧＦ−２の単回ＩＭ注射および単回ＩＡ注入の、ＰＡＤ動物モデルにおける後脚の４分の１（ｈｉｎｄｌｉｍｂ　ｑｕａｒｔｅｒ）に対する血流を増加させることにおける効力を実証する。
【０１４９】
本明細書中において言及される全ての刊行物および特許出願は、本発明が属する分野の当業者の技術水準を示す。全ての刊行物および特許出願は、本明細書中で、個々の刊行物または特許出願が具体的に、そして具体的かつ個々に本明細書中に参考として援用されると示されるのと同じ程度に、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０１５０】
前述の発明は、理解を明確にする目的で図解および例によっていくらか詳細に記載してきたが、ある種の変更および改変が、添付の実施形態の範囲内でなされ得ることが、容易に明白である。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、図２に示されるアミノ酸配列を有する線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）をコードするＤＮＡ配列（配列番号１）を示し；このＦＧＦ−２はウシ起源である。翻訳されたアミノ酸配列（配列番号２）がまた示される。
【図２】
図２は、図１に示されたＤＮＡにコードされる１４６アミノ酸残基のウシＦＧＦ−２についてのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】
図３は、ヒト起源の１４６アミノ酸残基のＦＧＦ−２に対する翻訳されたアミノ酸配列（配列番号４）をコードするＤＮＡ配列（配列番号３）を示す。
【図４】
図４は、ウシ起源の１５５アミノ酸残基ＦＧＦ−２に対する翻訳されたアミノ酸配列（配列番号６）をコードするＤＮＡ配列（配列番号５）を示す。
【図５】
図５は、ヒト起源の１５５アミノ酸残基のＦＧＦ−２に対する翻訳されたアミノ酸配列（配列番号８）をコードするＤＮＡ配列（配列番号７）を示す。
【図６】
図６は、第ＩＩ相治験にある患者における、ｒＦＧＦ−２の投与の第９０日目でのピーク歩行時間（ＰＷＴ）の相対的な変化を示す。この研究において、３つの群を評価した：第１日目と第３０日目との両方でプラシーボが投与した群；第１日目に単一用量のｒＦＧＦ−２（３０μｇ／ｋｇ）を投与し、第３０日目にプラシーボを投与した群；第１日目と第３０日目との両方に１用量のｒＦＧＦ−２（３０μｇ／ｋｇ）を投与した群。平均および標準誤差を、これらの各群において測定したＰＷＴに対して示した。ＡＮＯＶＡ分析は、欠測値を有する患者および脈管再生された患者を排除した。順位検定（Ｒａｎｋ　ｔｅｓｔ）のＡＮＯＶＡは、最も低い順位を割り当てることによって、欠側値を有する患者および脈管再生された患者を排除した。ペアワイズ比較は、単一用量群とプラシーボ群との間のｐ値が０．０２６であり、そして二倍の用量群とプラシーボ群との間のｐ値が０．４５であることを示した。この図は、臨床試験の主要な有効率分析を提供し、これは、対数変換データの使用を指定した。これは、結果が単調な試験（ｔｒｅａｄｍｉｌｌ　ｔｅｓｔ）でしばしば見られるような歪みまたはケルトシス（ｋｅｒｔｏｓｉｓ）を有する場合の、データの適切な統計的取り扱いと考えられる。
【図７】
図７は、プラシーボを受けた患者群、単一用量のｒＦＧＦ−２を受けた患者群、または二倍の用量のｒＦＧＦ−２を受けた患者群について、９０日および１８０日におけるＰＷＴの絶対変化を示す。各患者について、ベースラインにあるＰＷＴを、９０日目のＰＷＴから差し引き、この差を各群について足し合わせ、そして平均を決定した；このデータは分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって分析された。
【図８】
図８は、第９０日目および第１８０日目において示された、３つの患者群でのＰＷＴの絶対変化（％）を示す。２つのｒＦＧＦ−２群にわたって平均されたＰＷＴの変化（％）もまた示す（任意のＦＧＦと示される）。
【図９】
図９は、第ＩＩ相治験の３つの患者群について測定されたＡＢＩ（足関節上腕血圧比）を示す。ベースライン測定、第９０日目の測定、およびベースラインと第９０日目の測定との間の対応する差が示される。ＡＢＩにおける平均変化もまた、３つの患者群について示す。ＡＢＩは、本明細書中で参考として援用される、Ａ　Ｏｆｆｉｃｅ　Ｂａｓｅｄ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　Ａｒｔｅｒｉａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ（２０００）Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍｅｄｉａｃａｌ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　Ｍｅｄｉａ，Ｉｎｃ．，Ｗｒｉｇｈｓｔｏｗｎ，ＰＡ．）に記載される。ベースラインで１．２を超えるＡＢＩを有する被験体は、この分析から排除した。
【図１０】
図１０は、第ＩＩ相の治験おける３つの患者群についての９０日目および１８０日目での跛行のＷＩＱ重篤度の結果を示す。値は、この状況の改善、無変化、または悪化を示す、各群における患者のパーセンテージを示す。
【図１１】
図１１は、各群についての、距離、速度、および階段昇降について、ベースライン、第９０日目および第１８０日目での重篤度のスコアを示す。図は、単一用量群についての結果は、ＷＩＱ距離、速度および階段昇降について、プラシーボ群の結果より良好であったことを示した。図は、スケールとともに示し、ここでより高いスコアがより良好である。
【図１２】
図１２は、ショートフォーム３６（ＳＦ−３６）からの身体要約スコア（ｐｈｙｓｉｃａｌ　ｓｕｍｍａｒｙ　ｓｃｏｒｅ）を示す。１ポイントの変化は、２年の寿命の増加に関連する。この図における変化スコアは、例えば、第９０日目において、２ポイントよりも大きい、単一用量群　対　プラシーボ群における改善を示す。
【図１３】
図１３は、本研究の結果を要約する。
【図１４】
図１４は、任意の時刻（すなわち、ベースライン、第９０日目、および／または第１８０日目）で１．２を超えるＡＢＩ（足関節上腕血圧比）を有する患者をこの分析から排除したときの、第ＩＩ期の治験の３つの患者群について測定されたＡＢＩを示す。ベースライン測定、第９０日目測定、およびベースライン測定と第９０日目の測定との間の対応する変化を示す。ＡＢＩにおける平均変化はまた、３つの患者群についても示す。
【図１５】
図１５は、絶対変化スコアが正しい分析変数であると仮定される場合の、第９０日目におけるピーク歩行時間（ＰＷＴ９０）対　ベースラインにおけるピーク歩行時間（ＰＷＴＢ）の仮定のプロットを示す。仮定は：（ＰＷＴ９０−ＰＷＴＢ）＝ｄ、次いで、ＰＷＴ９０＝１．０＊ＰＷＴＢ＋ｄＰＷＴ９０、散布図は、線形であり、傾き＝１．０であり、そして切片はｄである（非制限）。
【図１６】
図１６は、相対変化スコアが正しい分析変数であると仮定された場合の、ＰＷＴ９０　対　ＰＷＴＢの仮のプロットを示す。仮定：（ＰＷＴ９０／ＰＷＴＢ）＝ｌｄ、次いで、ＰＷＴ９０＝ｌｄ＊ＰＷＴＢ＋０．０（ＰＷＴＢの全範囲にわたる）、散布図は、線形であり、傾きは、ｌｄ（非制限）であり、そして切片は、０．０である。
【図１７】
図１７は、プラシーボ群（白三角）、単一用量群（白四角）、および二倍の用量群（白丸）についての、ＰＷＲ９０　対　ＰＷＴＢの散布図と、非限定のスプライン回帰曲線。
【図１８】
図１８は、プラシーボ群（白三角）、単一用量群（白四角）、および二倍の用量（白丸）群に適用したときの、表１５に記載の回帰モデル２を表現する曲線を加えた、図１６と同じ散布図を示す。Ｐ＝プラシーボ；Ｓ＝単一用量；Ｄ＝二倍の用量。
【図１９】
図１９は、プラシーボ群（白三角）、単一用量群（白四角）、および二倍の用量群（白丸）についての、ＰＷＴ１８０　対　ＰＷＴＢの散布図、と非限定スプライン回帰曲線を示す。
【図２０】
図２０は、動脈内注入（ＩＡ）または筋内注射（ＩＭ）による単一の投与および１４日間連続動脈内注入の、ラット両側性モデル（ｒａｔ　ｂｉｌａｔｅｒａａｌ　ｍｏｄｅｌ）の総後肢血流おける効果を示す。リン酸緩衝化溶液（ＰＢＳ）を、ビヒクルコントロールとして提供した。
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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