(57)【要約】ニューレグリン１関連遺伝子１（ＮＲＧ１ＡＧ１）を含み、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドをコードする核酸を開示する。また、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドをコードする関連核酸；ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチド；ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドに結合する抗体；精神分裂病の罹りやすさの診断方法；ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチド活性を変化させる因子のアッセイ、もしくはＮＲＧ１ＡＧ１結合因子を同定するアッセイ、および該アッセイで同定された因子もしくは結合因子；ＮＲＧ１ＡＧ１核酸、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチド、またはＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの活性を変化させる因子を含む、ＮＲＧ１ＡＧ１治療剤；ＮＲＧ１ＡＧ１治療剤を含む医薬組成物；ならびに精神分裂病の治療方法を記載する。
2004527203.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューレグリン１関連遺伝子１またはその断片もしくはバリアントを含有してなる単離された核酸分子。
【請求項２】
ニューレグリン１関連遺伝子１が配列番号：１のヌクレオチド配列を有してなる請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８および配列番号：９からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有してなるポリペプチドをコードする核酸。
【請求項４】
配列番号：１および配列番号：１の相補体からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含有してなる単離された核酸分子。
【請求項５】
配列番号：１および配列番号：１の相補体からなる群より選ばれるヌクレオチド配列と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする単離された核酸分子。
【請求項６】
配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８および配列番号：９からなる群より選ばれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする単離された核酸分子。
【請求項７】
配列番号：１および配列番号：１の相補体からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含有してなる第２の核酸分子と試料を高ストリンジェンシー条件下で接触させる工程を含む、試料中の第１の核酸分子の存在をアッセイするための方法。
【請求項８】
調節配列に作動可能に連結された、配列番号：１、配列番号：１の相補体、配列番号：６をコードする核酸、配列番号：７をコードする核酸、配列番号：８をコードする核酸および配列番号：９をコードする核酸からなる群より選ばれる単離された核酸分子を含有してなるベクター。
【請求項９】
請求項８記載のベクターを含有してなる組換え宿主細胞。
【請求項１０】
単離された核酸分子の発現に好適な条件下で請求項９記載の組換え宿主細胞を培養する工程を含む、該核酸分子にコードされるポリペプチドの生産方法。
【請求項１１】
ニューレグリン１関連遺伝子１にコードされる単離されたポリペプチドまたは該ポリペプチドの断片もしくはバリアント。
【請求項１２】
ニューレグリン１関連遺伝子１が配列番号：１の配列または配列番号：１の相補体を有してなる請求項１１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８および配列番号：９からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有してなる請求項１１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８および配列番号：９からなる群より選ばれるアミノ酸配列との同一性が約９０％より大きいアミノ酸配列を含有してなる単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１１記載の単離されたポリペプチドを含有してなる融合タンパク質。
【請求項１６】
請求項１１記載のポリペプチドと選択的に結合する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１７】
配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８および配列番号：９からなる群より選ばれるアミノ酸配列または該アミノ酸配列の断片もしくはバリアントと選択的に結合する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１８】
試料中の請求項１記載の単離された核酸分子にコードされるポリペプチドの存在をアッセイする方法であって、該コードされるポリペプチドと特異的に結合する抗体と該試料を接触させる工程を含む、方法。
【請求項１９】
ニューレグリン１関連遺伝子１における多型を検出することを含み、ここで、該遺伝子における多型の存在が精神分裂病に罹りやすいことを示す、個体の精神分裂病に対する罹りやすさを診断する方法。
【請求項２０】
対照試料におけるニューレグリン１関連遺伝子１にコードされるポリペプチドの発現または組成と比較した、被検試料におけるニューレグリン１関連遺伝子１にコードされるポリペプチドの発現または組成の変化を検出することを含み、ここで、被検試料における該ポリペプチドの発現または組成の変化の存在が精神分裂病に罹りやすいことを示す、精神分裂病に対する罹りやすさを診断する方法。
【請求項２１】
ニューレグリン１関連遺伝子１にコードされるポリペプチドの発現または組成の変化が、対照試料において発現されたスプライシングバリアントポリペプチドとは異なるスプライシングバリアントポリペプチドの被検試料における発現を含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
請求項１１記載のポリペプチドの活性を変化させる因子の同定方法であって、
ａ）  該ポリペプチドまたはその誘導体もしくは断片を試験対象の因子と接触させる工程；
ｂ）  該ポリペプチドまたはその誘導体もしくは断片の活性レベルを評価する工程；ならびに
ｃ）  該活性レベルを、該因子の非存在下での該ポリペプチドまたはその活性誘導体もしくは断片の活性レベルと比較する工程、
を含み、ここで、該因子の存在下での該ポリペプチドまたはその誘導体もしくは断片の活性レベルが、該因子の非存在下でのレベルと統計学的に有意な量で異なる場合、該因子は該ポリペプチドの活性を変化させる因子である、方法。
【請求項２３】
請求項２２記載の方法により同定可能な、ニューレグリン１関連遺伝子１にコードされるポリペプチドの活性を変化させる因子。
【請求項２４】
ニューレグリン１関連遺伝子１レセプター、ニューレグリン１関連遺伝子１結合因子、ペプチド擬似物、融合タンパク質、プロドラッグ、抗体およびリボザイムからなる群より選ばれる、ニューレグリン１関連遺伝子１にコードされるポリペプチドの活性を変化させる因子。
【請求項２５】
ニューレグリン１関連遺伝子１にコードされるポリペプチドを請求項２４記載の因子と接触させる工程を含む、該ポリペプチドの活性を変化させる方法。
【請求項２６】
請求項１１記載のポリペプチドとニューレグリン１関連遺伝子１結合因子との相互作用を変化させる因子の同定方法であって、
ａ）  該ポリペプチドまたはその誘導体もしくは断片、該結合因子と試験対象の因子とを接触させる工程；
ｂ）  該ポリペプチドまたはその誘導体もしくは断片と該結合因子との相互作用を評価する工程；ならびに
ｃ）  該相互作用のレベルを、該因子の非存在下での該ポリペプチドまたはその誘導体もしくは断片と該結合因子との相互作用のレベルと比較する工程、
を含み、ここで、該因子の存在下での該ポリペプチドまたはその誘導体もしくは断片の相互作用のレベルが、該因子の非存在下での相互作用のレベルと統計学的に有意な量で異なる場合、該因子は該ポリペプチドと該結合因子との相互作用を変化させる因子である、方法。
【請求項２７】
請求項２６記載の方法により同定可能な、ニューレグリン１関連遺伝子１ポリペプチドとニューレグリン１関連遺伝子１結合因子との相互作用を変化させる因子。
【請求項２８】
ニューレグリン１関連遺伝子１レセプター、第２のニューレグリン１関連遺伝子１結合因子、ペプチド擬似物、融合タンパク質、プロドラッグ、抗体およびリボザイムからなる群より選ばれる第１のニューレグリン１関連遺伝子１結合因子とのニューレグリン１関連遺伝子１ポリペプチドの相互作用を変化させる因子。
【請求項２９】
ニューレグリン１関連遺伝子１ポリペプチドおよび／またはニューレグリン１関連遺伝子１結合因子を請求項２８記載の因子と接触させる工程を含む、ニューレグリン１関連遺伝子１ポリペプチドとニューレグリン１関連遺伝子１結合因子との相互作用を変化させる方法。
【請求項３０】
ａ）  請求項１記載の核酸またはその誘導体もしくは断片を含む溶液を試験対象の因子と接触させる工程；
ｂ）  該核酸、誘導体もしくは断片の発現レベルを評価する工程；ならびに
ｃ）  該発現レベルを、該因子の非存在下での該核酸、誘導体もしくは断片の発現レベルと比較する工程、
を含み、ここで、該因子の存在下での該ヌクレオチド、誘導体もしくは断片の発現レベルが、該因子の非存在下での発現と統計学的に有意な量で異なる場合、該因子はニューレグリン１関連遺伝子１の発現を変化させる因子である、方法。
【請求項３１】
請求項３０記載の方法により同定可能な、ニューレグリン１関連遺伝子１の発現を変化させる因子。
【請求項３２】
ａ）  レポーター遺伝子と作動可能に連結された、ニューレグリン１関連遺伝子１のプロモーター領域を含有してなる核酸を含む溶液を試験対象の因子と接触させる工程；
ｂ）  該レポーター遺伝子の発現レベルを評価する工程；ならびに
ｃ）  該発現レベルを、該因子の非存在下での該レポーター遺伝子の発現レベルと比較する工程、
を含み、ここで、該因子の存在下での該レポーター遺伝子の発現レベルが、該因子の非存在下での発現レベルと統計学的に有意な量で異なる場合、該因子はニューレグリン１関連遺伝子１の発現を変化させる因子である、
ニューレグリン１関連遺伝子１の発現を変化させる因子の同定方法。
【請求項３３】
請求項３２記載の方法により同定可能な、ニューレグリン１関連遺伝子１の発現を変化させる因子。
【請求項３４】
ａ）  請求項１記載の核酸またはその誘導体もしくは断片を含む溶液を試験対象の因子と接触させる工程；
ｂ）  該核酸、誘導体もしくは断片の発現を評価する工程；ならびに
ｃ）  該発現を、該因子の非存在下での該核酸、誘導体もしくは断片の発現と比較する工程、
を含み、ここで、該因子の存在下での該ヌクレオチド、誘導体もしくは断片の発現が、該因子の非存在下での発現と統計学的に有意な量で異なる場合、該因子はニューレグリン１関連遺伝子１の発現を変化させる因子である、
ニューレグリン１関連遺伝子１の発現を変化させる因子の同定方法。
【請求項３５】
該因子の存在下での該ヌクレオチド、誘導体もしくは断片の発現が、該因子の非存在下での１つまたはそれ以上のスプライシングバリアントの発現と種類または量において異なる１つまたはそれ以上のスプライシングバリアントの発現を含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
請求項３４記載の方法により同定可能な、ニューレグリン１関連遺伝子１の発現を変化させる因子。
【請求項３７】
ニューレグリン１関連遺伝子１に対するアンチセンス核酸、ニューレグリン１関連遺伝子１ポリペプチド、ニューレグリン１関連遺伝子１レセプター、ニューレグリン１関連遺伝子１結合因子、ペプチド擬似物、融合タンパク質、そのプロドラッグ、抗体およびリボザイムからなる群より選ばれる、ニューレグリン１関連遺伝子１の発現を変化させる因子。
【請求項３８】
ニューレグリン１関連遺伝子１を含む細胞を請求項３７記載の因子と接触させる工程を含む、ニューレグリン１関連遺伝子１の発現を変化させる方法。
【請求項３９】
ＤＮＡ結合ドメインおよびニューレグリン１関連遺伝子１ポリペプチド、スプライシングバリアント、またはその断片もしくは誘導体をコードする核酸を含有してなる第１のベクター、ならびに転写活性化ドメインをコードする核酸と被験ポリペプチドをコードする核酸とを含有してなる第２のベクターを用いるツー酵母ハイブリッド系を使用することを含み、転写活性化が該ツー酵母ハイブリッド系において起こる場合、該被験ポリペプチドは、ニューレグリン１関連遺伝子１ポリペプチドと相互作用するポリペプチドである、ニューレグリン１関連遺伝子１ポリペプチドと相互作用するポリペプチドの同定方法。
【請求項４０】
ニューレグリン１関連遺伝子１またはその断片もしくは誘導体、ニューレグリン１関連遺伝子１にコードされるポリペプチド、ニューレグリン１関連遺伝子１レセプター、ニューレグリン１関連遺伝子１結合因子、ペプチド擬似物、融合タンパク質、プロドラッグ、抗体、ニューレグリン１関連遺伝子１発現を変化させる因子、ニューレグリン１関連遺伝子１にコードされるポリペプチドの活性を変化させる因子、ニューレグリン１関連遺伝子１にコードされるポリペプチドの転写後プロセッシングを変化させる因子、ニューレグリン１関連遺伝子１とニューレグリン１関連遺伝子１結合因子との相互作用を変化させる因子、ニューレグリン１関連遺伝子１にコードされるスプライシングバリアントの転写を変化させる因子およびリボザイムからなる群より選ばれるニューレグリン１関連遺伝子１治療剤。
【請求項４１】
請求項４０記載のニューレグリン１関連遺伝子１治療剤を含有してなる医薬組成物。
【請求項４２】
ニューレグリン１関連遺伝子１治療剤が、ニューレグリン１関連遺伝子１またはその断片もしくは誘導体を含有してなる単離された核酸分子である請求項４１記載の医薬組成物。
【請求項４３】
ニューレグリン１関連遺伝子１治療剤が、ニューレグリン１関連遺伝子１にコードされたポリペプチドである請求項４１記載の医薬組成物。
【請求項４４】
ニューレグリン１関連遺伝子１治療剤を個体に治療有効量で投与することを含む、個体の精神分裂病の治療方法。
【請求項４５】
ニューレグリン１関連遺伝子１治療剤がニューレグリン１関連遺伝子１アゴニストである請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
ニューレグリン１関連遺伝子１治療剤がニューレグリン１関連遺伝子１アンタゴニストである請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
外因性ニューレグリン１関連遺伝子１およびニューレグリン１関連遺伝子１ポリペプチドをコードする核酸からなる群より選ばれる核酸を含有してなるトランスジェニック動物。
【請求項４８】
ａ）  試料を、ニューレグリン１関連遺伝子１核酸の配列の一部と少なくとも部分的に相補的である連続したヌクレオチド配列を含有してなる核酸と、ハイブリダイゼーションに適切な条件下で接触させる工程；ならびに
ｂ）  ニューレグリン１関連遺伝子１核酸と、前記ニューレグリン１関連遺伝子１核酸の配列の一部と少なくとも部分的に相補的である連続したヌクレオチド配列を含有してなる前記核酸との間でハイブリダイゼーションが起こったか否かを評価する工程
を含む、ニューレグリン１関連遺伝子１核酸の存在について試料をアッセイするための方法。
【請求項４９】
連続したヌクレオチド配列を含有してなる前記核酸が、前記ニューレグリン１関連遺伝子１核酸の配列の一部と完全に相補的である、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
前記ニューレグリン１関連遺伝子１核酸の少なくとも一部の増幅を含む請求項４８記載の方法。
【請求項５１】
前記連続したヌクレオチド配列が、１００個以下のヌクレオチド長であり、かつａ）配列番号：１の連続したヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一であるか；ｂ）配列番号：１の連続したヌクレオチド配列の相補体と少なくとも８０％同一であるか；またはｃ）前記ニューレグリン１関連遺伝子１核酸に選択的にハイブリダイズすることができるかのいずれかである、請求項４８記載の方法。
【請求項５２】
ニューレグリン１関連遺伝子１核酸のヌクレオチド配列の一部と少なくとも部分的に相補的である連続したヌクレオチド配列を含有してなる核酸を含有してなる、ニューレグリン１関連遺伝子１核酸の存在について試料をアッセイするための試薬。
【請求項５３】
該核酸が、前記ニューレグリン１関連遺伝子１核酸のヌクレオチド配列の一部と完全に相補的である連続したヌクレオチド配列を含有してなる、請求項５２記載の試薬。
【請求項５４】
ａ）  ニューレグリン１関連遺伝子１核酸のヌクレオチド配列の一部と少なくとも部分的に相補的である連続したヌクレオチド配列を含有してなる１つまたはそれ以上の標識核酸、および
ｂ）  該標識を検出するための試薬
を別々の容器に含有してなる、ニューレグリン１関連遺伝子１核酸の存在について試料をアッセイするための試薬キット。
【請求項５５】
該標識核酸が、前記ニューレグリン１関連遺伝子１核酸のヌクレオチド配列の一部と完全に相補的である連続したヌクレオチド配列を含有してなる、請求項５４記載の試薬キット。
【請求項５６】
ニューレグリン１関連遺伝子１核酸のヌクレオチド配列の一部と少なくとも部分的に相補的であり、かつプライマー伸長条件下に維持した時、前記ニューレグリン１関連遺伝子１核酸のプライマーとしての機能を果たしうる連続したヌクレオチド配列を含有してなる１つまたはそれ以上の核酸を含有してなる、ニューレグリン１関連遺伝子１核酸の存在について試料をアッセイするための試薬キット。
【請求項５７】
ニューレグリン１関連遺伝子１核酸の存在について試料をアッセイするための、１００個以下のヌクレオチド長であり、かつａ）配列番号：１の連続したヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一であるか；ｂ）配列番号：１の連続したヌクレオチド配列の相補体と少なくとも８０％同一であるか；またはｃ）前記ニューレグリン１関連遺伝子１核酸に選択的にハイブリダイズすることができるかのいずれかである核酸の使用。
【請求項５８】
配列番号：１とは少なくとも１塩基の違いを有するニューレグリン１関連遺伝子１核酸の存在について試料をアッセイするための、１００個以下のヌクレオチド長であり、かつａ）配列番号：１の連続したヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一であるか；ｂ）配列番号：１の連続したヌクレオチド配列の相補体と少なくとも８０％同一であるか；またはｃ）前記ニューレグリン１関連遺伝子１核酸に選択的にハイブリダイズすることができるかのいずれかである核酸の使用。
【請求項５９】
精神分裂病に対する罹りやすさを診断するための、１００個以下のヌクレオチド長であり、かつａ）配列番号：１の連続したヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一であるか；ｂ）配列番号：１の連続したヌクレオチド配列の相補体と少なくとも８０％同一であるか；またはｃ）前記ニューレグリン１関連遺伝子１核酸に選択的にハイブリダイズすることができるかのいずれかである核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０００年２月２８日に出願された米国特許出願第０９／５１５，７１６号の一部継続出願である。上記出願の全教示は参照により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
発明の背景
精神分裂病は、精神病理の破壊的な形態であり、一生のうちの有病率は世界中で０．５％〜１％である。双子と養子の研究では、遺伝的因子と環境的要因の両方が罹病性に影響することが示されている（例えば、 Ｔｓｕａｎｇ， Ｍ．Ｔ． ら、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒ． Ｒｅｓ． ４（２）：１５７−７１ （１９９１）； Ｔｉｅｎａｒｉ， Ｐ．Ｊ． および Ｗｙｎｎｅ， Ｌ．Ｃ．， Ａｎｎ． Ｍｅｄ． ２６（４）：２３３−７ （１９９４）； Ｆｒａｎｚｅｋ， Ｅ． および Ｂｅｃｋｍａｎｎ， Ｈ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １５５（１）：７６−８３ （１９９８）； Ｔｓｕａｎｇ， Ｍ． Ｔ．， Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｓｃｉ． ５（１）：２８−３０ （１９９８） を参照のこと）。１親等内では、そのリスクは、精神分裂病個体の親で６％から、兄弟姉妹で１０％、さらに子供で１３％までと様々であり、両親の一方も精神分裂病である場合、兄弟姉妹に対するリスクは１７％に上昇し、２人とも精神分裂病者の子供は、該疾患を発症するリスクが４６％であることが報告されている（ＭｃＧｕｅ， Ｍ．および Ｇｏｔｔｅｓｍａｎｎ， Ｉ．Ｉ．， Ｅｕｒ． Ａｒｃｈ． Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ Ｃｌｉｎ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２４０：１７４−１８１ （１９９１）； また、例えば、Ｌｉｍ， Ｌ．Ｃ． および Ｓｉｍ， Ｌ．Ｐ．， Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ Ｍｅｄ． Ｊ． ３３（６）：６４５−７ （１９９２）も参照のこと）。しかしながら、伝達の様式は不明なままである。
【０００３】
第３、第５、第６、第８、第１０、第１３、第２０、第２２染色体およびＸ染色体上の遺伝子座を含むいくつかの遺伝子座に対する連鎖を示す報告書が公表されている（例えば、染色体３ｐおよび８ｐについては、Ｐｕｌｖｅｒ， Ａ．Ｅ．， ら、Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｇｅｎｅｔ． ６０（４）：２５２−６０ （１９９５）；染色体５ｑ、６ｐおよび８ｐについては、Ｋｅｎｄｌｅｒ， Ｋ．Ｓ． ら、Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｇｅｎｅｔ． ８８（１）：２９−３３ （１９９９）；染色体５ｑ、６ｐ、８ｐ、２０ｐおよび２２ｐについては、Ｈｏｖａｔｔａ， Ｉ． ら、Ｍｏｌ． Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ３（５）：４５２−７ （１９９８）；染色体６ｐについては、Ｓｃｈｗａｂ， Ｓ．Ｇ． ら、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １１（３）：３２５−７ （１９９５）， Ｂｒｚｕｓｔｏｗｉｃｚ， Ｌ．Ｍ． ら、Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ６１（６）：１３８８−９６ （１９９７） および Ｃａｏ， Ｑ． ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４３（１）：１−８ （１９９７）；第６および第８染色体については、Ｓｔｒａｕｂ， Ｒ．Ｅ． ら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ ６１Ｉ：８２３−３３ （１９９６）；第８染色体については、Ｋｅｎｄｌｅｒ， ＫＳ． ら、Ａｍ． Ｊ． Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １５３（１２）：１５３４−４０ （１９９６）；第１０染色体については、Ｓｔｒａｕｂ， Ｒ．Ｅ． ら、Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｇｅｎｅｔ． ８１（４）：２９６−３０１ （１９９８） および Ｓｃｈｗａｂ， Ｓ．Ｇ． ら、Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｇｅｎｅｔ． ８１（４）：３０２−３０７ （１９９８）；第１３染色体については、Ｌｉｎ， Ｍ．Ｗ． ら、Ｐｓｙｃｉａｔｒ． Ｇｅｎｅｔ． ５（３）：１１７−２６ （１９９５）； Ｌｉｎ， Ｍ．Ｗ． ら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ９９（３）：４１７−４２０ （１９９７） および Ｂｌｏｕｉｎ， Ｊ．Ｌ． ら、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ２０（１）：７０−７３ （１９９３）（第８および第１３）；第２２染色体については、Ｇｉｌｌ， Ｍ． ら、Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｇｅｎｅｔ． ６７（１）：４０−４５ （１９９６） および Ｂａｓｓｅｔｔ， Ａ．Ｓ． ら、Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｇｅｎｅｔ． ８１（４）：３２８−３７ （１９９８）；ならびにＸ染色体については、Ｍｉｌｕｎｓｋｙ， Ｊ． ら、Ｃｌｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． ５５（６）：４５５−６０ （１９９９） を参照のこと）。
【０００４】
発明の概要
本発明は、ニューレグリン（ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ）１関連遺伝子１（ＮＲＧ１ＡＧ１）を含有してなる単離された核酸分子に関する。一態様において、該単離された核酸分子は、配列番号：１および配列番号：１の相補体からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含有してなる。本発明はさらに、配列番号：１および配列番号：１の相補体からなる群より選ばれるヌクレオチド配列と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸分子に関する。本発明はさらにまた、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドをコードする（例えば、配列番号：６、７、８もしくは９、または別のＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドのスプライシングバリアントをコードする）単離された核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）に関する。
【０００５】
本発明はさらに、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号：１または配列番号：１の相補体；配列番号：６、７、８もしくは９、またはＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの別のスプライシングバリアントをコードするヌクレオチド配列）を含有してなる第２の核酸分子、またはその断片もしくは誘導体と試料を、選択的ハイブリダイゼーションに適切な条件下で接触させる工程を含む、試料中におけるＮＲＧ１ＡＧ１の全部または一部を含有してなる核酸分子の存在について試料をアッセイするための方法を提供する。本発明はさらにまた、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチド、その断片もしくは誘導体の発現レベルを（直接または間接的に）検出する工程を含む、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチド、その断片もしくは誘導体の発現レベルについて試料をアッセイするための方法を提供する。
【０００６】
本発明はまた、調節配列に作動可能に連結された本発明の単離された核酸分子を含有してなるベクター、ならびに該ベクターを含有してなる組換え宿主細胞に関する。本発明はまた、本明細書に記載の単離された核酸分子の発現に好適な条件下で本発明の組換え宿主細胞を培養する工程を含む、該核酸分子にコードされるポリペプチド（ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチド）の作製方法を提供する。
【０００７】
本発明はさらに、本発明の単離された核酸分子にコードされる単離されたポリペプチド（例えば、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチド）、ならびにその断片または誘導体を提供する。特定の態様において、該ポリペプチドは、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８もしくは配列番号：９のアミノ酸配列を含有してなる。別の態様において、該ポリペプチドは、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの別のスプライシングバリアントである。本発明はまた、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９のアミノ酸配列との同一性が約９０％を超えるアミノ酸配列を含有してなる単離されたポリペプチドに関する。
【０００８】
本発明はまた、本発明のポリペプチドに選択的に結合する、抗体またはその抗原結合断片に関し、コードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体と試料を接触させる工程を含む、試料中の本発明の単離された核酸分子にコードされるポリペプチドの存在をアッセイするための方法に関する。
【０００９】
本発明はさらに、精神分裂病に対する素因を診断する方法に関する。個体の精神分裂病に対する素因を診断する方法は、ＮＲＧ１ＡＧ１における変異の存在を検出すること、ならびにＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの異なるスプライシングバリアントの存在などのＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの発現の変化を検出することを含む。該発現の変化は定量的、定性的または定量的および定性的の両方でありうる。
【００１０】
本発明はさらにまた、１つまたはそれ以上のＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの活性または発現を変化（例えば、増強または阻害）させる因子を同定するためのアッセイに関する。例えば、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドまたはその断片もしくは誘導体を含む細胞、細胞画分または溶液を、試験対象の因子と接触させることができ、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの発現または活性のレベルを評価することができる。１つより多いＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの活性または発現を同時に評価することができる（例えば、細胞、細胞画分または溶液が、異なるスプライシングバリアントなどの１種より多いＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドを含み得、該異なるポリペプチドまたはスプライシングバリアントのレベルを評価しうる）。
【００１１】
別の態様において、本発明は、１つまたはそれ以上のＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドと相互作用するポリペプチドを同定するためのアッセイに関する。例えば、ツー酵母ハイブリッド系において、ＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸およびＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチド、スプライシングバリアント、またはその断片もしくは誘導体をコードする核酸を含む第１のベクターを使用し、転写活性化ドメインをコードする核酸と、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチド、スプライシングバリアント、またはその断片もしくは誘導体と相互作用する可能性のあるポリペプチド（例えば、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチド結合因子またはＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチド受容体）をコードする核酸とを含む第２のベクターを使用する。第１のベクターおよび第２のベクターの両方を含む酵母を適切な条件下でインキュベーションすることにより、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドまたはその断片もしくは誘導体と相互作用するポリペプチドの同定が可能になり、したがって、それは、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの発現の活性を変化させる因子でありうる。
【００１２】
ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの発現または活性を増強または阻害する因子もまた本発明に包含され、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの発現または活性を増強または阻害する因子と、ＮＲＧ１ＡＧ１および／またはポリペプチドを含む細胞を接触させることにより、またはＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドを接触させることにより、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの発現または活性を変化（増強または阻害）させる方法も本発明に包含される。
【００１３】
さらにまた、本発明は、本発明の核酸、本発明のポリペプチド、および／またはＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの活性を変化させる因子を含有してなる医薬組成物に関する。本発明はさらに、本発明の核酸、本発明のポリペプチド、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの活性を変化させる因子、または該核酸、ポリペプチドおよび／またはＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの活性を変化させる因子を含有してなる組成物などのＮＲＧ１ＡＧ１治療剤を投与することによる精神分裂病の治療方法に関する。
【００１４】
発明の詳細な説明
本明細書に記載のように、本出願人は、染色体８ｐ１２上の１．５Ｍｂセグメントに存在する精神分裂病の疾患罹病性遺伝子を同定するために、連鎖解析およびハプロタイプ解析を用いた。この遺伝子はニューレグリン１関連遺伝子１（ＮＲＧ１ＡＧ１）である。ニューレグリン１関連遺伝子１の全配列をＡｐｐｅｎｄｉｘ Ｉに示す。該配列におけるマイクロサテライトマーカーおよび一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）をＡｐｐｅｎｄｉｘ ＩＩに示す。Ａｐｐｅｎｄｉｘ ＩＩＩは、ニューレグリン１関連遺伝子１エキソンのスプライスバリアントを示す。
【００１５】
本発明の核酸
このように、本発明は、哺乳動物（例えば、霊長類またはヒト）ニューレグリン１関連遺伝子１（ＮＲＧ１ＡＧ１）を含有してなる単離された核酸分子に関する。本明細書で用いる「ＮＲＧ１ＡＧ１」という用語は、８ｐ２１〜１１遺伝子座内の精神分裂病に対する罹りやすさに関連する単離された核酸分子をいい、またＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチド（例えば、Ａｐｐｅｎｄｉｘ Ｉに示すような配列番号：６、７、８もしくは９を有してなるポリペプチド、またはＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの別のスプライシングバリアント）をコードする単離された核酸分子（例えば、ｃＤＮＡまたは遺伝子）をいう。好ましい態様では、該単離された核酸分子は、配列番号：１（Ａｐｐｅｎｄｉｘ Ｉに示す）または配列番号：１の相補体を含有してなる。別の好ましい態様では、該単離された核酸分子は、Ａｐｐｅｎｄｉｘ ＩＩに示すような１つまたはそれ以上の一ヌクレオチド多型も存在することを除き、配列番号：１の配列または配列番号：１の相補体を含有してなる。
【００１６】
本発明の単離された核酸分子は、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡなどのＤＮＡでありうる。本明細書で用いる「ニューレグリン１関連遺伝子１核酸」（「ＮＲＧ１ＡＧ１核酸」）は、ＮＲＧ１ＡＧ１をコードする核酸分子（単鎖または二本鎖のいずれかのＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）をいう。ＤＮＡ分子は二本鎖または一本鎖であり得、一本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡは、コード鎖あるいはセンス鎖または非コード鎖あるいはアンチセンス鎖でありうる。該核酸分子は、遺伝子のコード配列の全部または一部を含みえ、イントロンならびに非コード３’および５’配列などのさらなる非コード配列（例えば、調節配列など）をさらに含み得る。さらに、該核酸分子は、マーカー配列、例えば該ポリペプチドの単離または精製を補助するポリペプチドをコードする配列と融合させうる。かかる配列には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質をコードするもの、およびインフルエンザ由来の血球凝集素Ａ（ＨＡ）ポリペプチドマーカーをコードするものが含まれるが、これらに限定されない。
【００１７】
本明細書で用いる「単離された」核酸分子は、通常、該遺伝子またはヌクレオチド配列に隣接する核酸から分離されたもの（ゲノム配列の場合ように）および／または他の転写された配列から完全に、または部分的に精製されたもの（例えば、ＲＮＡライブラリーの場合のように）である。例えば、本発明の単離された核酸は、それが天然に存在する複雑な細胞環境から、または組換え技術により作製される場合は培養培地から、または化学的前駆体から、または化学的に合成される場合は他の化学物質から実質的に単離されうる。ある場合においては、該単離された材料は、組成物（例えば、他の物質を含有してなる粗抽出物）、バッファー系または試薬混合物の一部を構成する。他の場合において、該材料は、例えばＰＡＧＥまたはＨＰＬＣなどのカラムクロマトグラフィーにより測定したとき本質的に均質となるまで精製し得る。好ましくは、単離された核酸分子は、存在する全ての高分子種の少なくとも約５０、８０または９０％（モル基準で）を含有する。ゲノムＤＮＡに関して、用語「単離された」はまた、ゲノムＤＮＡが天然に会合する染色体から分離された核酸分子に言及しうる。例えば、単離された核酸分子は、核酸分子が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満のヌクレオチドを含有しうる。
【００１８】
核酸分子は、他のコード配列または調節配列に融合されても、依然として単離されていると見なされうる。従って、ベクターに含まれる組換えＤＮＡは、本明細書中で使用される「単離された」の定義に含まれる。また、単離された核酸分子は、異種宿主細胞中の組換えＤＮＡ分子、ならびに溶液中の部分的または実質的に精製されたＤＮＡ分子を含む。「単離された」核酸分子はまた、本発明のＤＮＡ分子のインビボおよびインビトロのＲＮＡ転写産物を含む。単離された核酸分子またはヌクレオチド配列は、化学的に合成されるかまたは組換え手段によるものである核酸分子またはヌクレオチド配列を含みうる。それゆえ、ベクターに含まれる組換えＤＮＡは、本明細書中で使用される「単離された」の定義に含まれる。さらに、単離されたヌクレオチド配列は、異種生物内の組換えＤＮＡ分子、ならびに部分的または実質的に精製された溶液中のＤＮＡ分子を含む。本発明のＤＮＡ分子のインビボおよびインビトロのＲＮＡ転写産物もまた、「単離された」ヌクレオチド配列に含まれる。かかる単離されたヌクレオチド配列は、相同な配列（例えば、他の哺乳動物種から）を単離するため、遺伝子マッピング（例えば、染色体とのインサイチュハイブリダイゼーションによる）のため、またはノーザンブロット解析等により組織（例えば、ヒト組織）における遺伝子の発現を検出するためのプローブとしてコードされるポリペプチドの製造に有用である。
【００１９】
本発明はまた、天然では必ずしも見出されないが、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチド（例えば、配列番号：６、７、８もしくは９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの他のスプライシングバリアント）をコードするバリアント核酸分子に関する。従って、例えば、天然に存在するヌクレオチド配列とは異なる配列を含むが、遺伝子コードの縮重により、本発明のＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子もまた、本発明の主題である。本発明はまた、一部（断片）をコードするか、またはＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドのアナログもしくは誘導体等のバリアントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。かかるバリアントは、対立遺伝子変異または単一ヌクレオチド多型等の場合には天然に存在し得、種々の変異原および変異原性プロセスにより誘導されるもの等は天然には存在し得ない。意図される変異には、付加および欠失を含む保存的または非保存的なアミノ酸変化を生じうる１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失および置換が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、ヌクレオチド（および／または得られたアミノ酸）変化がサイレントであるかまたは保存的であり；すなわち、それらはＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの特徴または活性を変更しない。１つの好ましい態様では、ヌクレオチド配列は、１つ以上の多型マイクロサテライトマーカー（例えば、Ａｐｐｅｎｄｉｘ ＩＩに示されるような）を含有する断片である。別の好ましい態様では、ヌクレオチド配列は、ＮＲＧ１ＡＧ１遺伝子における１つ以上の単一ヌクレオチド多型（例えば、Ａｐｐｅｎｄｉｘ ＩＩに示されるような）を含む断片である。
【００２０】
本発明の核酸分子の他の変更としては、例えば、標識、メチル化、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート）、荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート）、ペンダント成分（例えば、ポリペプチド）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレン）、キレーター、アルキレーター、および修飾結合（例えば、αアノマー核酸）等のヌクレオチド間修飾が挙げられうる。水素結合および他の化学的相互作用を介して設計された配列に結合する能力において核酸分子を模倣する合成分子もまた含まれる。かかる分子には、例えば、分子の骨格においてリン酸結合の代わりにペプチド結合を用いるものが含まれる。
【００２１】
本発明はまた、選択的ハイブリダイゼーション等の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で本明細書中に記載されるヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸分子（例えば、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズし、任意にポリペプチドの活性を有する核酸分子）に関する。１つの態様では、本発明は、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件（例えば、選択的ハイブリダイゼーションのための）下で配列番号：１または配列番号：１の相補体から選択されるヌクレオチド配列を含有するヌクレオチド配列にハイブリダイズする本明細書中に記載されるバリアントを含む。別の態様では、本発明は、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件（例えば、選択的ハイブリダイゼーションのための）下で、配列番号：６、７、８または９から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズする本明細書に記載されるバリアントを含む。好ましい態様では、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション下でハイブリダイズするバリアントは、ＮＲＧ１ＡＧ１の活性（例えば、結合活性）を有する。
【００２２】
かかる核酸分子は、特異的ハイブリダイゼーション（例えば、高ストリンジェンシー条件下での）により検出および／または単離されうる。本明細書中で使用される「特異的ハイブリダイゼーション」は、第１の核酸が第２の核酸以外のいかなる核酸にもハイブリダイズしないような様式（例えば、第１の核酸が、ハイブリダイゼーションが行われる試料中のいかなる他の核酸よりも第２の核酸に対して高い類似性を有する場合）で、第２の核酸にハイブリダイズする第１の核酸の能力をいう。ハイブリダイゼーションに関して「ストリンジェンシー条件」は、第２の核酸への特定の核酸のハイブリダイゼーションを可能にするインキュベーションおよび洗浄条件、例えば、温度および緩衝液濃度の条件をいう技術用語である；第１の核酸は、第２の核酸に完全（すなわち、１００％）に相補的であり得、または第１および第２の核酸は、完全よりも低い（例えば、７０％、７５％、８５％、９５％）ある程度の相補性を共有し得る。例えば、所定の高ストリンジェンシー条件は、低い相補性を有するものから完全に相補的な核酸を区別するのに使用されうる。核酸ハイブリダイゼーションに関して「高ストリンジェンシー条件」、「中ストリンジェンシー条件」および「低ストリンジェンシー条件」は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙの２．１０．１〜２．１０．１６頁および６．３．１〜６．３．６頁（Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら、”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， （１９９８）、その教示の全体が参考として本明細書中に援用される）に説明されている。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する正確な条件は、イオン強度（例えば、０．２ＸＳＳＣ、０．１ＸＳＳＣ）、温度（例えば、室温、４２℃、６８℃）およびホルムアミド等の不安定化剤またはＳＤＳ等の変性剤の濃度だけでなく、核酸配列の長さ、塩基組成、ハイブリダイズしている配列間のミスマッチパーセントおよび他の非同一配列内の該配列のサブセットの出現の頻度等の因子にも依存する。従って、等価な条件は、２つの核酸分子間の類似した程度の同一性または類似性を維持しながらこれらのパラメーターの１つ以上を変化させることにより決定されうる。典型的には、条件は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％もしくはそれ以上、互い同一である配列が互いにハイブリダイズしたままであるように使用される。ハイブリダイゼーションが起こらないレベルのストリンジェンシーからハイブリダイゼーションが最初に観察されるレベルまでハイブリダイゼーション条件を変化させることにより、所定の配列が試料中の最も類似する配列とハイブリダイズ（例えば、選択的に）することが可能な条件が決定されうる。
【００２３】
例示的な条件は、Ｋｒａｕｓｅ，Ｍ．Ｈ．およびＳ．Ａ．Ａａｒｏｎｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２００：５４６−５５６（１９９１）に記載されている。また、Ａｕｓｕｂｅｌら、”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， （１９９８）は、中または低ストリンジェンシー条件のための洗浄条件の決定を記載している。洗浄は、ハイブリッドの相補性の最小レベルを決定するように条件が通常設定される工程である。一般に、相同性ハイブリダイゼーションのみが生じる最も低い温度から開始して、最終的な洗浄温度を低下させる（ＳＳＣ濃度を一定に保持する）ことにより各℃が、ハイブリダイズする配列間のミスマッチの最大の程度を１％増大させる。一般に、ＳＳＣの濃度を倍加することにより、約１７℃のＴｍの増大を生じる。これらのガイドラインを用いて、洗浄温度は、求められるミスマッチのレベルに応じて、高、中、または低ストリンジェンシーについて経験的に決定されうる。
【００２４】
例えば、低ストリンジェンシー洗浄は、０．２ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを含有する溶液中で室温で１０分間洗浄する工程を含みうる；中ストリンジェンシー洗浄は、０．２ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを含有する予め温められた溶液（４２℃）溶液中で４２℃で１５分間洗浄する工程を含みうる；高ストリンジェンシー洗浄は、０．１ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを含有する予め温められた（６８℃）溶液中で６８℃で１５分間洗浄する工程を含みうる。さらに、洗浄は、当該分野で公知であるように所望の結果が得られるまで繰り返してまたは連続して行われうる。等価な条件は、当該分野で公知であるように、標的核酸分子と使用されるプライマーまたはプローブとの間の類似した程度の同一性または類似性を維持しながら、例として与えられたパラメーターの１つ以上を変化させることにより測定されうる。
【００２５】
２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の同一性パーセントは、最適な比較目的のために配列を整列すること（例えば、ギャップが第１の配列の配列に導入されうる）により決定されうる。次いで、対応する位置のヌクレオチドまたはアミノ酸が比較され、２つの配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一な位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一な位置の数／位置の総数×１００）。所定の態様では、比較目的のために整列される配列の長さは、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、およびさらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％または９０％の参照配列の長さである。２つの配列の実際の比較は、周知の方法、例えば、数学的アルゴリズムを用いて達成されうる。かかる数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ９０：５８７３−５８７７ （１９９３）に記載されている。かかるアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２５：３８９−３４０２ （１９９７）に記載されるようなＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２）に組み込まれる。ＢＬＡＳＴおよびギャップＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照。１つの態様では、配列比較のためのパラメーターは、スコア＝１００、ワード長＝１２に設定されうるか、変化されうる（例えば、Ｗ＝５またはＷ＝２０）。
【００２６】
配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ、ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、ＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを使用する場合、ＰＡＭ１２０ウェイト残基テーブル、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティが使用されうる。配列解析のためのさらなるアルゴリズムが当該分野で公知であり、ＴｏｒｅｌｌｉｓおよびＲｏｂｏｔｔｉ （１９９４） Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．， １０：３−５に記載されたＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ；ならびにＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ （１９８８） ＰＮＡＳ， ８５：２４４４−８に記載されたＦＡＳＴＡを含む。
【００２７】
別の態様では、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｏｍ  ６３マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、および１２、１０、８、６、または４のギャップウェイトおよび２、３、または４の長さウェイトを用いてＣＧＣソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｇｃ．ｃｏｍで入手可能）中のＧＡＰプログラムを用いて達成されうる。さらに別の態様では、２つの核酸配列間の同一性パーセントは、ＣＧＣソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｇｃ．ｃｏｍで入手可能）中のＧＡＰプログラムを用いて、５０のギャップウェイトおよび３の長さウェイトを用いて達成されうる。
【００２８】
本発明はまた、高ストリンジェント条件下で、配列番号：１および配列番号：１の相補体から選択されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列にハイブリダイズする断片または一部を含む単離された核酸分子を提供し、さらに高ストリンジェント条件下で配列番号：６、７、８または９から選択されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズする断片または一部を含む単離された核酸分子を提供する。本発明の核酸断片は、少なくとも約１５、好ましくは少なくとも約１８、２０、２３または２５ヌクレオチドであり、３０、４０、５０、１００、２００またはそれ以上のヌクレオチド長でありうる。本明細書中に記載される抗原性ポリペプチドをコードするより長い断片、例えば、３０またはそれ以上のヌクレオチド長は、以下に記載される抗体の産生のために特に有用である。
【００２９】
関連する局面では、本発明の核酸断片は、本明細書中に記載されるようなアッセイにおいてプローブまたはプライマーとして使用される。「プローブ」または「プライマー」は、塩基特異的様式で核酸分子の相補鎖にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。かかるプローブおよびプライマーは、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５４， １４９７−１５００ （１９９１）に記載されるようにポリペプチド核酸を含む。また本明細書中で使用される用語「プライマー」は、特に、本明細書中に記載されるものを含むがそれらに限定されない周知の方法（例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ）を用いてテンプレート定方向ＤＮＡ合成の開始の点として働く一本鎖オリゴヌクレオチドをいう。
【００３０】
典型的には、プローブまたはプライマーは、配列番号：１、配列番号：１の相補体から選択される連続したヌクレオチド配列、または配列番号：６〜９から選択されるアミノ酸配列をコードする配列を含む核酸分子の連続したヌクレオチドの少なくとも約１５、典型的には約２０〜２５、およびより典型的には約４０、５０または７５にハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。好ましい態様では、プローブまたはプライマーは、１００またはそれより少ないヌクレオチド、好ましくは６〜５０ヌクレオチド、好ましくは１２〜３０ヌクレオチドを含有する。他の態様では、プローブまたはプライマーは、連続したヌクレオチド配列または連続したヌクレオチド配列の相補体に少なくとも７０％同一であり、好ましくは少なくとも８０％同一であり、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一であるか、または連続したヌクレオチド配列または連続したヌクレオチド配列の相補体に選択的にハイブリダイズしうる。しばしば、プローブまたはプライマーは、標識、例えば、ラジオアイソトープ、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子をさらに含む。
【００３１】
プローブまたはプライマーとして有用な代表的なオリゴヌクレオチドは、ＡｐｐｅｎｄｉｘＩＩに示されるマイクロサテライトマーカーを含む。
【００３２】
上記に記載のもの等の本発明の核酸分子は、標準的な分子生物学的技術および配列番号：１、６、７、８および／または９に提供される配列情報を用いて同定および単離されうる。例えば、核酸分子は、配列番号：１および／または配列番号：１の相補体に提供される配列の１つ以上に基づいて設計される、または配列番号：６、７、８および／または９に提供されるアミノ酸配列の１つ以上をコードする配列に基づくヌクレオチドに基づいて設計される、合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により増幅および単離されうる。一般的には、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （Ｈ．Ａ． Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ，ＮＹ， １９９２）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， １９９０）；Ｍａｔｔｉｌａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９：４９６７ （１９９１）；Ｅｃｋｅｒｔら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１：１７ （１９９１）； ＰＣＲ （ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ）；および米国特許第４，６８３，２０２号明細書を参照。核酸分子は、テンプレートとしてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを用いて増幅され、適切なベクターにクローン化され、ＤＮＡ配列解析によって特徴づけられうる。
【００３３】
他の適切な増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ４：５６０ （１９８９）， Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４１： １０７７ （１９８８）， 転写増幅（Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ８６：１１７３ （１９８９））、および自己配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：１８７４ （１９９０））および核酸に基づく配列増幅（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。後者の２つの増幅方法は、等温転写に基づく等温反応を含み、これは増幅産物として一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の両方を、それぞれ約３０または１００対１の比で生じる。
【００３４】
増幅ＤＮＡは、放射標識され、ヒト細胞に由来するｃＤＮＡライブラリー、ｚａｐ ｅｘｐｒｅｓｓ、ＺＩＰＬＯＸまたは他の適切なベクター中のｍＲＮＡをスクリーニングするためのプローブとして使用されうる。対応するクローンが単離され得、ＤＮＡがインビボ切除の後に得られ得、クローン化インサートが、いずれかの方向または両方向で当該分野で認識されている方法により配列決定され、適切な分子量のポリペプチドをコードする正確なリーディングフレームが同定されうる。例えば、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列の直接解析は、市販の周知の方法を用いて達成されうる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （第２版、ＣＳＨＰ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９）； Ｚｙｓｋｉｎｄら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， （Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ， １９８８））を参照。これらのまたは類似した方法を用いて、ポリペプチドおよびポリペプチドをコードするＤＮＡが単離され、配列決定され、さらに特徴づけられうる。
【００３５】
本発明のアンチセンス核酸分子は、配列番号：１および／または配列番号：１の相補体、および／または配列番号：１または配列番号：１の相補体の一部のヌクレオチド配列、および／または配列番号：６、７、８および／または９のアミノ酸配列をコードする配列、または配列番号：６、７、８および／または９の一部をコードする配列を用いて設計され、当該分野で公知の手順を用いる化学合成および酵素的連結反応を用いて構築されうる。例えば、アンチセンス核酸分子（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、分子の生物学的安定性を増大するか、またはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成される二重鎖の物理的安定性を増大するように設計された天然に存在するヌクレオチドまたは種々の修飾されたヌクレオチドを用いて化学的に合成され得、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用されうる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、核酸分子がアンチセンス方向にサブクローン化された発現ベクターを用いて生物学的に生産されうる（すなわち、挿入された核酸分子から転写されたＲＮＡは、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である）。
【００３６】
一般に、本発明の単離された核酸配列は、サザンゲルにおいて分子量マーカーとして、および関連する遺伝子位置をマッピングするために標識される染色体マーカーとして使用されうる。核酸配列はまた、患者内の内因性ＤＮＡ配列と比較して、遺伝子障害（例えば、精神分裂病の素因または罹り易さ）を同定するために使用され、およびプローブとして、関連するＤＮＡ配列にハイブリダイズし、これを発見し、または試料から既知配列を減算するために使用されうる。核酸配列はさらに、遺伝学的フィンガープリント法のためにプライマーを駆動するのに、ＤＮＡ免疫技術を用いて抗ポリペプチド抗体を惹起するのに、および抗原として抗ＤＮＡ抗体を惹起するのにまたは免疫応答を誘発するのに使用されうる。本明細書中に同定されるヌクレオチド配列（および完全な遺伝子配列に対応する）の一部または断片は、ポリヌクレオチド試薬として多数の方法で使用されうる。例えば、これらの配列は、（ｉ）それぞれの遺伝子を染色体上にマッピングする；従って、遺伝子疾患に関連する遺伝子領域を位置づける；（ｉｉ）微小な生物学的試料から個体を同定する（組織タイピング）；および（ｉｉｉ）生物学的試料の法医学的同定を補助するために使用されうる。さらに、本発明のヌクレオチド配列は、解析、特徴付けもしくは治療的使用のために、または対応するポリペプチドが発現される組織のためのマーカーとして、構成的に、組織分化の間、または疾患状態において、組換えポリペプチドを同定および発現するために使用されうる。核酸配列は、さらに、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイおよび／または診断アッセイにおける試薬として使用され得、また、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイおよび／または診断アッセイにおいて使用するためのキット（例えば、試薬キット）の成分として含まれうる。
【００３７】
本発明の別の局面は、配列番号：１および配列番号：１の相補体（またはその一部）からなる群より選択される核酸分子を含有する核酸構築物に関する。本発明のさらに別の局面は、配列番号：６、７、８または９のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含有する核酸構築物に関する。前記構築物は、本発明の配列がセンスまたはアンチセンス方向に挿入されたベクター（例えば、発現ベクター）を含有する。本明細書中に使用される用語「ベクター」は、それが連結された別の核酸を輸送しうる核酸分子をいう。１つのタイプのベクターは、「プラスミド」であり、さらなるＤＮＡセグメントが連結されうる環状二本鎖ＤＮＡループをいう。別のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、ここでさらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに連結されうる。所定のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自律増殖しうる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムとともに複製される。さらに、所定のベクター（発現ベクター）は、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を行いうる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形態である。しかし、本発明は、等価な機能で働く、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）等の発現ベクターの他の形態を含むことを意図する。
【００３８】
本発明の好ましい組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸分子の発現に適した形態で本発明の核酸分子を含む。このことは、組換え発現ベクターが発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択される１つまたはそれ以上の調節配列（発現される核酸配列に作動可能に連結されている）を含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結された」は、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入される場合、宿主細胞において）を可能にする様式で調節配列に連結されていることを意味することを意図する。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御因子（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。かかる調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ （１９９０）に記載されている。調節配列は、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を行うものおよび所定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を行うもの（例えば、組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択および所望されるポリペプチドの発現のレベル等の因子に依存しうることが当業者により認識されるであろう。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、それにより本明細書中に記載される核酸分子によりコードされる、融合ポリペプチドを含むポリペプチドを産生しうる。
【００３９】
本発明の組換え発現ベクターは、原核または真核細胞、例えば、大腸菌等の細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞における本発明のポリペプチドの発現のために設計されうる。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、上記にさらに考察されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写および翻訳されうる。
【００４０】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は本明細書中では交換可能に使用される。かかる用語は、特定の被験者細胞だけでなく、かかる細胞の子孫または潜在的な子孫をもいうことが理解される。所定の修飾が、変異または環境的影響のいずれかにより引き続く世代において生じ得るので、かかる子孫は、実際には親細胞とは同一ではないが、本明細書中で使用される用語の範囲内に依然として含まれる。
【００４１】
宿主細胞は、任意の原核または真核細胞でありうる。例えば、本発明の核酸分子は、細菌細胞（例えば、大腸菌）、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞等）において発現されうる。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【００４２】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術により原核または真核細胞に導入されうる。本明細書中で使用される用語「形質転換」または「トランスフェクション」は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む、種々の当該分野で認識されている外来核酸分子（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入する技術をいうことが意図される。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）および他の研究室マニュアル中に見出されうる。
【００４３】
哺乳動物細胞の適切なトランスフェクションのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、細胞の小画分のみでそれらのゲノムに外来ＤＮＡを組み込み得ることが知られている。これらのインテグラントを同定または選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子は、一般に、目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。好ましい選択マーカーは、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキセート等の薬物に対する耐性を付与するものを含む。選択マーカーをコードする核酸分子は、本発明の核酸分子と同じベクターで宿主細胞に導入されてもよいし、または別のベクターで導入されてもよい。導入された核酸分子で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択により同定されうる（例えば、選択マーカー遺伝子を組み込まれた細胞は生存し、一方、他の細胞は死滅する）。
【００４４】
培養中の原核または真核宿主細胞等の本発明の宿主細胞は、本発明のポリペプチドを産生（すなわち、発現）するために使用されうる。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を用いてポリペプチドを産生する方法を提供する。ある態様では、前記方法は、本発明のポリペプチドが産生されるように、本発明の宿主細胞（本発明のポリペプチドをコードする組換え発現ベクターが導入された）を適切な培地中で培養することを含む。別の態様では、前記方法はさらに、培地または宿主細胞からポリペプチドを単離することを含む。
【００４５】
本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用されうる。例えば、１つの態様において、本発明の宿主細胞は、本発明の核酸分子（例えば、外因性のＮＲＧ１ＡＧ１遺伝子、またはＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドをコードする外因性の核酸）が導入されている、受精した卵母細胞または胚性幹細胞である。かかる宿主細胞は、次に、外因性ヌクレオチド配列がゲノムに導入されている非ヒトトランスジェニック動物、または内因性ヌクレオチド配列が変化されている相同な組換え動物を作製するのに使用されうる。かかる動物は、ヌクレオチド配列、および該配列によりコードされたポリペプチドの機能および／または活性を研究するため、ならびにそれらの活性のモジュレーターを同定および／または評価するために有用である。本明細書で用いられる場合、「トランスジェニック動物」は、動物の細胞の１つ以上が導入遺伝子を含む、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはラットまたはマウス等の齧歯動物である。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリおよび両生類が挙げられる。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれ、かつ成熟動物のゲノムにとどまる外因性ＤＮＡであり、それにより、トランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織において、コードされた遺伝子産物の発現を指示する。本明細書で用いられる場合、「相同な組換え動物」は、内因性遺伝子と、動物の細胞、例えば、動物の発達前の動物の胚細胞、に導入される外因性ＤＮＡ分子との間の相同な組換えにより、内因性遺伝子が変化している、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスである。
【００４６】
胚操作およびマイクロインジェクションを介してトランスジェニック動物、特にマウス等の動物を作製する方法は、当該分野において通常のものになってきており、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号明細書、米国特許第４，８７０，００９号明細書、米国特許第４，８７３，１９１号明細書およびＨｏｇａｎ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８６） に記載されている。相同な組換えベクターおよび相同な組換え動物を構築する方法は、Ｂｒａｄｌｅｙ（１９９１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２：８２３−８２９ならびにＰＣＴ国際公開第９０／１１３５４号パンフレット、国際公開第９１／０１１４０号パンフレット、国際公開第９２／０９６８号パンフレット、および国際公開第９３／０４１６９号パンフレットにさらに記載されている。本明細書に記載されている非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Ｗｉｌｍｕｔら（１９９７） Ｎａｔｕｒｅ， ３８５：８１０−８１３およびＰＣＴ国際公開第９７／０７６６８号パンフレットおよび国際公開第９７／０７６６９号パンフレットに記載の方法により作製されうる。
【００４７】
本発明のポリペプチド
本発明はまた、ＮＲＧ１ＡＧ１によりコードされた単離されたポリペプチド（「ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチド」）およびその断片およびバリアント、ならびに本明細書に記載されたヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチド（例えば、他のスプライシングバリアント）に関する。用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーのことをいい、特定の長さをいうのではなく、したがってペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質が、ポリペプチドの定義内に含まれる。本明細書で使用される場合、組換えおよび非組換え細胞から単離される際には実質的に細胞物質を含まないとき、または化学的に合成される際には化学前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まないときポリペプチドは「単離された」または「精製された」と言われる。ポリペプチドは、しかしながら、細胞内で通常結合しない他のポリペプチドに結合されえ（例えば、「融合タンパク質」において）、それでもなお、「単離された」または「精製された」ものである。
【００４８】
本発明のポリペプチドは、均質になるまで精製されうる。しかしながら、ポリペプチドが均質になるまで精製されていない調製物も有用であることが理解される。重要な特徴は、相当な量の他の成分の存在下であってさえ、調製物がポリペプチドの所望の機能を許容するということである。したがって、本発明は、様々な精製度を包含する。１つの態様において、用語「細胞物質を実質的に含まない」は、約３０％未満（乾燥重量で）の他のタンパク質（すなわち、混入タンパク質）、約２０％未満の他のタンパク質、約１０％未満の他のタンパク質、または約５％未満の他のタンパク質を有するポリペプチドの調製物を含む。
【００４９】
ポリペプチドが組換え的に作製される場合、それはまた培養培地を実質的に含まず、すなわち、培養培地は、ポリペプチド調製物の約２０容量％未満、約１０容量％未満、または約５容量％未満に相当する。用語「化学前駆物質または他の化学物質を実質的に含まない」は、合成に伴われる化学前駆物質または他の化学物質から分離されるポリペプチドの調製物を含む。１つの態様において、用語「化学前駆物質または他の化学物質を実質的に含まない」は、約３０％未満（乾燥重量で）の化学前駆物質または他の化学物質、約２０％未満の化学前駆物質または他の化学物質、約１０％未満の化学前駆物質または他の化学物質、または約５％未満の化学前駆物質または他の化学物質を有するポリペプチドの調製物を含む。
【００５０】
１つの態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号：１およびその相補体およびその一部からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされたアミノ酸配列、例えば、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８もしくは配列番号：９、または配列番号：６、７、８または９の一部を含む。しかしながら、本発明のポリペプチドはまた、断片および配列バリアントを包含する。バリアントは、有機体の同一遺伝子座によりコードされた実質的に相同なポリペプチド、すなわち、対立遺伝子バリアント、ならびに他のスプライシングバリアントを含む。バリアントはまた、有機体の他の遺伝子座に由来するが、配列番号：１およびその相補体およびその一部からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされたポリペプチドに対して実質的に相同を有するか、または配列番号：６、７、８および９をコードするヌクレオチド配列からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされたポリペプチドに対して実質的に相同を有するポリペプチドを包含する。バリアントはまた、これらのポリペプチドに実質的に相同または同一であるが、他の有機体に由来するポリペプチド、すなわちオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）を含む。バリアントはまた、これらのポリペプチドに実質的に相同または同一であり、化学合成により作製されるポリペプチドを含む。バリアントはまた、これらのポリペプチドに実質的に相同または同一であり、組換え法により作製されるポリペプチドを含む。
【００５１】
本明細書で使用される場合、アミノ酸配列が、少なくとも約４５〜５５％、典型的には少なくとも約７０〜７５％、より典型的には少なくとも約８０〜８５％、および最も典型的には約９０％より多く相同または同一である場合、２つのポリペプチド（またはポリペプチドの領域）が実質的に相同または同一である。本発明の実質的に相同なアミノ酸配列は、より詳細に前に説明したようなストリンジェントな条件下で、配列番号：１またはその一部にハイブリダイズする核酸分子によりコードされるか、またはより詳細にそれらについて説明したようなストリンジェントな条件下で、配列番号：６、７、８もしくは９またはその一部をコードする核酸配列にハイブリダイズする核酸分子によりコードされる。
【００５２】
２つのアミノ酸配列、または２つの核酸配列の相同または同一の割合を決定するために、最適な比較目的のため配列を整列させる（例えば、他方のポリペプチドまたは核酸分子との最適な整列のために一方のポリペプチドまたは核酸分子の配列にギャップが導入されうる）。次に、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドが、比較される。一方の配列における位置が、他方の配列における対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められる場合、分子はその位置で相同である。本明細書で使用される場合、アミノ酸または核酸の「相同」は、アミノ酸または核酸の「同一」と等しい。２つの配列間の相同の割合は、配列により共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、相同の割合は、同一の位置の数／全部の位置の数の１００倍に等しい）。
【００５３】
本発明はまた、同一性の程度は低いが、本発明の核酸分子によりコードされたポリペプチドにより行なわれる１つ以上の同一機能を行なうために十分な類似性を有するポリペプチドを包含する。類似性は、保存的アミノ酸置換により決定される。かかる置換は、ポリペプチドの所定のアミノ酸を類似の特徴を有するもう１つのアミノ酸により置換するものである。保存的置換は、表現型的にサイレントでありうる。保存的置換として典型的に見られるものは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間の１つからもう１つへの置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの互換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換ならびに芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒ間の置換である。どのアミノ酸変化が表現型的にサイレントでありうるかに関するガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０） により見出される。
【００５４】
バリアントポリペプチドは、１つ以上の置換、欠失、挿入、逆位、融合、および切形またはこれらのいずれかの組み合わせによりアミノ酸配列が異なりうる。さらに、バリアントポリペプチドは、十分に機能的でありうるか、または１つ以上の活性における機能が欠如しうる。十分に機能的なバリアントは、典型的には、保存的変化または重要でない（ｎｏｎ−ｃｒｉｔｉｃａｌ）残基もしくは重要でない領域における変化のみを含む。機能的なバリアントはまた、機能において変化を生じないかまたはわずかな変化を生じる、類似アミノ酸の置換を含みうる。あるいは、かかる置換は、ポジティブにまたはネガティブに機能に多少影響しうる。非機能的バリアントは、典型的には、１つ以上の非保存的アミノ酸置換、欠失、挿入、逆位もしくは切形、または重要な残基もしくは重要な領域における置換、挿入、逆位もしくは欠失を含む。
【００５５】
機能に必須であるアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４：１０８１−１０８５（１９８９） ）等の当該技術で公知の方法により同定されうる。後者の手順は、分子中の全ての残基で単一のアラニン変異を導入する。次に、生じる変異体分子が、インビトロでの生物学的活性、またはインビトロでの増殖活性について試験される。ポリペプチド活性に対して重要な部位がまた、結晶化、核磁気共鳴または光親和性標識等の構造解析により決定されうる（Ｓｍｉｔｈ ら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２４：８９９−９０４（１９９２）；ｄｅ Ｖｏｓ ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５５：３０６−３１２（１９９２））。
【００５６】
本発明はまた、本発明のポリペプチドのポリペプチド断片を含む。断片は、配列番号：１およびその一部またはその相補体を含む核酸分子によりコードされたポリペプチドに由来しうる（例えば、配列番号：６、７、８もしくは９、または他のスプライシングバリアント）。しかしながら、本発明はまた、本明細書に記載されるポリペプチドのバリアントの断片を包含する。本明細書で使用される場合、断片は、少なくとも６個の連続したアミノ酸を含有する。有用な断片は、ポリペプチドの１以上の生物学的活性を保持するもの、ならびにポリペプチド特異的抗体を作製するための免疫源として使用されうる断片を含む。
【００５７】
生物学的に活性な断片（例えば、６、９、１２、１５、１６、２０、３０、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、１００以上のアミノ酸長さであるペプチド）は、周知の方法を用いるポリペプチド配列の解析により同定されているドメイン、セグメントまたはモチーフ、例えば、シグナルペプチド、細胞外ドメイン、１以上の膜貫通セグメントまたはループ、リガンド結合領域、ジンクフィンガードメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、アシル化部位、グリコシル化部位、またはリン酸化部位を含みうる。
【００５８】
断片は別々でありえ（他のアミノ酸またはポリペプチドと融合されていない）、またはより大きなポリペプチド内にありうる。さらに、数個の断片が単一のより大きなポリペプチド内に含まれうる。１つの態様において、宿主中で発現されるように設計された断片は、ポリペプチド断片のアミノ末端に融合された異種のプレ−およびプロ−ポリペプチド領域、および断片のカルボキシル末端に融合された追加の領域を有しうる。
【００５９】
本発明は、したがって、キメラまたは融合ポリペプチドを提供する。これらは、ポリペプチドに実質的に相同でないアミノ酸配列を有する異種のタンパク質またはポリペプチドに作動可能に連結された本発明のポリペプチドを含む。「作動可能に連結された」は、ポリペプチドおよび異種のタンパク質がインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）で融合されることを示す。異種のタンパク質は、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端で融合されうる。１つの態様において、融合ポリペプチドは、本来のポリペプチドの機能に影響を与えない。例えば、融合ポリペプチドは、ポリペプチド配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合されているＧＳＴ融合ポリペプチドでありうる。融合ポリペプチドの他の型としては、限定されないが、酵素的融合ポリペプチド；例えば、β−ガラクトシダーゼ融合、酵母ツーハイブリッドＧＡＬ融合、ポリ−Ｈｉｓ融合およびＩｇ融合が挙げられる。かかる融合ポリペプチド、特にポリ−Ｈｉｓ融合は、組換えポリペプチドの精製を促進しうる。一定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、ポリペプチドの発現および／または分泌は、異種のシグナル配列を用いることにより増加されうる。それゆえに、他の態様において、融合ポリペプチドは、そのＮ末端に異種のシグナル配列を含む。
【００６０】
ＥＰ−Ａ−Ｏ  ４６４  ５５３は、免疫グロブリンの定常部の様々な部分を含む融合タンパク質を開示する。Ｆｃは、治療および診断に有用であり、したがって、例えば、改良された薬物動態学的特性を生じる（ＥＰ−Ａ  ０２３２  ２６２）。薬物発見において、例えば、アンタゴニストを同定するための高スループットスクリーニングアッセイを目的として、ヒトタンパク質が、Ｆｃ部分と融合されている。Ｂｅｎｎｅｔｔ ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ， ８：５２−５８（１９９５） およびＪｏｈａｎｓｏｎら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２７０， １６：９４５９−９４７１（１９９５）。したがって、本発明はまた、本発明のポリペプチドを含む可溶性融合ポリペプチド、および免疫グロブリンの様々なサブクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）の重鎖または軽鎖の定常部の様々な部分を包含する。
【００６１】
キメラまたは融合ポリペプチドは、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いることにより作製されうる。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片は、通常の技術にしたがって、インフレームで互いに結合される。他の態様において、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成機を含む通常の技術により合成されうる。あるいは、核酸断片のＰＣＲ増幅は、２つの連続的な核酸断片間の相補的な突出を生じさせるアンカープライマーを用いて行なわれえ、それは続いてアニール化され、再増幅されて、キメラ核酸配列を生じうる（Ａｕｓｕｂｅｌ ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９２を参照）。さらに、すでに融合部分（例えば、ＧＳＴタンパク質）がコードされている多くの発現ベクターが、市販で入手可能である。本発明のポリペプチドをコードする核酸分子は、融合部分がポリペプチドにインフレームで連結されているようなかかる発現ベクターにクローン化されうる。
【００６２】
単離されたポリペプチドは、天然にそれを発現する細胞から精製されえ、それを発現するように改変された細胞（組換え体）から精製されえ、または既知のタンパク質合成法を用いて合成されうる。１つの態様において、ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術により作製される。例えば、ポリペプチドをコードする核酸分子は発現ベクターにクローン化され、発現ベクターは宿主細胞に導入され、ポリペプチドが宿主細胞中で発現される。次に、標準的なタンパク質精製技術を用いる適切な精製機構により、ポリペプチドが細胞から単離されうる。
【００６３】
一般に、本発明のポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルまたは当該分野で認識された方法を用いる分子ふるいゲル濾過カラムにおける分子量マーカーとして使用されうる。本発明のポリペプチドは、抗体を生じるか、または免疫応答を惹起するために使用されうる。ポリペプチドはまた、生体液における該ポリペプチド、またはそれが結合する分子（例えば、レセプターまたはリガンド）のレベルを定量的に測定するためのアッセイにおいて、試薬、例えば、標識試薬として使用されうる。ポリペプチドはまた、細胞または組織のマーカーとして使用されえ、そこで対応するポリペプチドは、優先的に、構成的に組織分化の間に、または疾患状態でのいずれかで発現される。ポリペプチドは、例えば、相互作用捕捉アッセイにおいてなどで、対応する結合試薬、例えば、レセプターまたはリガンドを単離するため、および結合相互作用のペプチドまたは小分子のアンタゴニストまたはアゴニストをスクリーニングするために使用されうる。
【００６４】
本発明の抗体
別の局面において、本発明は、例えば、配列番号：６、７、８、９によりコードされたアミノ酸配列またはその一部を有するか、または配列番号：１の全てまたは一部を含む核酸分子によりコードされたアミノ酸配列（例えば、配列番号：６、７、８、９、または別のスプライシングバリアント、またはその一部）を有する本発明のポリペプチドおよびポリペプチド断片に対する抗体を提供する。用語「抗体」は、本明細書で用いられる場合、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な一部、すなわち、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子のことをいう。本発明のポリペプチドに特異的に結合する分子は、該ポリペプチドまたはその断片に結合するが、天然に該ポリペプチドを含む試料、例えば生物学的試料中の他の分子に実質的に結合しない分子である。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な一部の例としては、ペプシン等の酵素を用いて抗体を処理することにより生じうるＦ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２ 断片が挙げられる。本発明は、本発明のポリペプチドに結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を提供する。用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成」は、本明細書で用いられる場合、本発明のポリペプチドの特定のエピト−プと免疫反応しうる抗原結合部位を１種のみ含む抗体分子の集団のことを言う。モノクローナル抗体組成は、したがって、典型的には、免疫反応する本発明の特定のポリペプチドに対して単一の結合親和性を示す。
【００６５】
ポリクローナル抗体は、所望の免疫原、例えば、本発明のポリペプチドまたはその断片で適切な被験体を免疫化させることにより、上記のように調製されうる。免疫化した被験体の抗体力価は、固定化ポリペプチドを用いる酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）等の標準的な技術により、時間を通じてモニターされうる。所望であれば、ポリペプチドに対する抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離されえ、ＩｇＧ画分を得るためのプロテインＡクロマトグラフィー等の周知の技術によりさらに精製されうる。免疫化後適切な時間に、例えば、抗体力価が最も高いとき、抗体産生細胞が、被験体から得られえ、初めにＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５−４９７ により記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，４ ：７２）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、（１９８５）、モノクローナル抗体および癌治療、Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、７７〜９６頁）またはトリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術等の標準的な技術によりモノクローナル抗体を調製するために使用されうる。ハイブリドーマを作製するための技術は、周知である（一般に、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （１９９４）Ｃｏｌｉｇａｎ ら（編）、Ｊｈｏｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ参照）。簡単には、上記免疫原で免疫化された哺乳動物由来のリンパ球（典型的には脾臓細胞）に不死細胞株（典型的には骨髄腫）が融合され、得られたハイブリドーマ細胞の培養上清が、本発明のポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定するためにスクリーニングされる。
【００６６】
リンパ球および不死細胞株を融合するために使用される多数の周知のプロトコルのいずれかが、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するために適用されうる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 、上記；Ｇａｌｆｒｅら、（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ， ２６６ ：５５０５２ ；Ｒ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔｈ， ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８０）；およびＬｅｒｎｅｒ（１９８１） Ｙａｌｅ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ．， ５４ ：３８７−４０２ を参照）。さらに、当業者は、かかる方法の多くのバリエーションが存在し、それらもまた有用であることを認識するであろう。
【００６７】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマの調製に代わり、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、ポリペプチドを用いて組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングすることにより同定および単離され、それにより該ポリペプチドに結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離しうる。ファージディスプレイライブラリーを作製し、スクリーニングするためのキットが、市販により入手できる（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ， カタログ番号２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰＴＭ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｋｉｔ， カタログ番号２４０６１２）。さらに、抗体ディスプレイライブラリーを作製し、スクリーニングするのに使用するために特に好適な方法および試薬の例は、例えば、米国特許第５， ２２３， ４０９号明細書、ＰＣＴ国際公開第９２／１８６１９号パンフレット、ＰＣＴ国際公開第９１／１７２７１号パンフレット、ＰＣＴ国際公開第９２／２０７９１号パンフレット、ＰＣＴ国際公開第９２／１５６７９号パンフレット、ＰＣＴ国際公開第９３／０１２８８号パンフレット、ＰＣＴ国際公開第９２／０１０４７号パンフレット、ＰＣＴ国際公開第９２／０９６９０号パンフレット、ＰＣＴ国際公開第９０／０２８０９号パンフレット、Ｆｕｃｈｓ ら、（１９９１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙら、（１９９２） Ｈｕｍ． Ａｎｔｉｂｏｄ． Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ， ３：８１−８５ ；Ｈｕｓｅら、（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４６：１２７５−１２８１ ；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ら、（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．， １２ ：７２５−７３４ に見出されうる。
【００６８】
さらに、ヒトおよび非ヒト部分の両方を含む、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体等の組換え抗体は、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製されえ、本発明の範囲内である。かかるキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術により産生されうる。
【００６９】
一般に、本発明の抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降等の標準的な技術により、本発明のポリペプチドを単離するために使用されうる。ポリペプチド特異的抗体は、細胞由来の天然のポリペプチドおよび宿主細胞で発現された組換え的に産生されたポリペプチドの精製を促進しうる。さらに、ポリペプチドの発現の量およびパターンを評価するために、（例えば、細胞溶解物、細胞上清、または組織試料中の）ポリペプチドを検出するのに、本発明のポリペプチドに特異的な抗体が使用されうる。抗体は、例えば、所定の治療法の有効性を決定するため、臨床試験手順の一部として、組織におけるタンパク質レベルをモニターするため診断に使用されうる。検出可能な物質に抗体を結合することにより、検出が容易になりうる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。適切な補欠分子族の複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン、およびアビジン／ビオチンが挙げられる。適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられる。発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる。生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられる。適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【００７０】
本発明の診断アッセイおよびスクリーニングアッセイ
本発明はまた、ＮＲＧ１ＡＧ１遺伝子発現を評価するため、または本発明のＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの活性を評価するための診断アッセイに関する。１つの態様において、アッセイは、生物学的試料（例えば、血液、血清、細胞、組織）に関連して使用され、それにより個体が、精神分裂病に罹患しているか、または精神分裂病を発症するおそれがある（その素因を有するまたはそれに感受性を有する）かどうかを決定する。本発明はまた、個体が精神分裂病を発症しやすいかどうかを決定するための予後（または予測）アッセイを提供する。例えば、遺伝子における変異が、生物学的試料においてアッセイされうる。かかるアッセイは、予後または予測目的に使用され、それにより、精神分裂病に関連する症状の開始前に個体を予防的に治療しうる。本発明の他の局面は、本発明のポリペプチドの遺伝子発現または活性における因子（例えば、薬物、化合物または他の因子）の影響をモニターするためのアッセイ、ならびにＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドに結合する因子を同定するためのアッセイに関する。これらおよび他のアッセイおよび因子は、以下の段落でさらに詳細に記載される。
【００７１】
診断アッセイ
本明細書中に記載される核酸、プローブ、プライマー、ポリペプチドおよび抗体は、精神分裂病に対する感受性の診断方法、ならびに精神分裂病に対する感受性を診断するために有用なキットにおいて使用することができる。
【００７２】
本発明の１つの態様において、精神分裂病に対する感受性の診断は、ＮＲＧ１ＡＧ１における多型を検出することによって行われる。多型は、フレームシフト変異を生じさせる、１つのヌクレオチドの挿入もしくは欠失または２つ以上のヌクレオチドの挿入もしくは欠失などのＮＲＧ１ＡＧ１における変異；コードされるアミノ酸の変化を生じさせる、少なくとも１つのヌクレオチドの変化；未成熟停止コドンの生成を生じさせる、少なくとも１つのヌクレオチドの変化；数個のヌクレオチドの欠失で、そのヌクレオチドによってコードされる１つ以上のアミノ酸の欠失を生じさせる欠失；遺伝子のコード配列の分断を生じさせる、例えば、不等（ｕｎｅｑｕａｌ）組換えまたは遺伝子変換などによる１つまたは数個のヌクレオチドの挿入；遺伝子の全体または一部の重複；遺伝子の全体または一部の転位；あるいは遺伝子の全体または一部の再配置であり得る。２つ以上のそのような変異が１つの遺伝子に存在し得る。そのような配列変化は、ＮＲＧ１ＡＧ１によってコードされるポリペプチドにおける変異を生じさせる。例えば、変異がフレームシフト変異である場合、そのフレームシフトは、コードされるアミノ酸の変化を生じさせ得るし、かつ／または短縮型ポリペプチドの生成をもたらす未成熟停止コドンの生成を生じさせ得る。あるいは、精神分裂病に対する感受性に関連した多型は１つ以上のヌクレオチドにおける同義変異（すなわち、ＮＲＧ１ＡＧ１によってコードされるポリペプチドにおける変化を生じさせない変異）であり得る。そのような多型は、スプライシング部位を変化させるか、ｍＲＮＡの安定性または輸送に影響を及ぼすか、あるいはそうでなければ遺伝子の転写または翻訳に影響を及ぼし得る。上記に記載される変異のいずれかを有するＮＲＧ１ＡＧ１は、本明細書中では「変異（型）遺伝子」と呼ばれる。
【００７３】
精神分裂病に対する感受性を診断する第１の方法では、サザン分析、ノーザン分析またはインサイチューハイブリダイゼーションなどの様々なハイブリダイゼーション方法を使用することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．他編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９９年までのすべての増補を含む）を参照のこと）。例えば、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡの試験対象者由来の生物学的試料（「試験試料」）が、精神分裂病を有すると思われる個体、または精神分裂病に対して感受性であると思われる個体、または精神分裂病にかかりやすいと思われる個体、または精神分裂病に関する欠陥を有すると思われる個体（「試験個体」）から得られる。そのような個体は、成人、小児または胎児であり得る。試験試料は、血液試料、羊水試料、脳脊髄液試料、あるいは皮膚、筋肉、口内粘膜または結膜粘膜、胎盤、胃腸管または他の器官からの組織試料などの、ゲノムＤＮＡを含有する任意の供給源に由来し得る。胎児の細胞または組織に由来するＤＮＡの試験試料は、羊水穿刺または絨毛膜絨毛サンプリングなどによる適切な方法によって得ることができる。その後、ＤＮＡ試料、ＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料は、ＮＲＧ１ＡＧ１における多型が存在するかどうかを明らかにするために、かつ／またはＮＲＧ１ＡＧ１によってコードされるスプライシングバリアントが存在するかどうかを明らかにするために調べられる。多型またはスプライシングバリアントの存在は、核酸プローブに対する、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡにおける遺伝子のハイブリダイゼーションによって示され得る。本明細書中で使用される「核酸プローブ」はＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブであり得る；核酸プローブは、ＮＲＧ１ＡＧ１における少なくとも１つの多型を含有し得るか、またはＮＲＧ１ＡＧ１の特定のスプライシングバリアントをコードする核酸を含有する。プローブは、上記に記載された核酸分子のいずれかであり得る（例えば、遺伝子、断片、遺伝子を含むベクター、プローブまたはプライマーなど）。
【００７４】
精神分裂病に対する感受性を診断するために、ハイブリダイゼーション試料を、ＮＲＧ１ＡＧ１を含有する試験試料を少なくとも１つの核酸プローブと接触させることによって形成する。ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するための好ましいプローブは、本明細書中に記載されるｍＲＮＡ配列またはゲノムＤＮＡ配列にハイブリダイズし得る標識された核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、完全長の核酸分子またはその一部、例えば、長さが少なくとも１５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチドまたは５００ヌクレオチドで、ストリンジェントな条件のもとで、適切なｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドなどであり得る。例えば、核酸プローブは、配列番号：１の全体もしくは一部、または配列番号：１の相補体もしくはその一部であり得るか、あるいは配列番号：６、７、８もしくは９の全体または一部をコードする核酸であり得る。本発明の診断アッセイにおいて使用される他の好適なプローブは上記に記載されている（例えば、項目「本発明の核酸」のもとで議論されたプローブおよびプライマーを参照のこと）。
【００７５】
ハイブリダイゼーション試料は、ＮＲＧ１ＡＧ１に対する核酸プローブの特異的なハイブリダイゼーションを可能にする十分な条件のもとで維持される。本明細書中で使用される「特異的なハイブリダイゼーション」は、（例えば、ミスマッチを全く有しない）正確なハイブリダイゼーションを示す。特異的なハイブリダイゼーションは、例えば、上記に記載されるように、高ストリンジェンシー条件または適度なストリンジェンシー条件のもとで行われうる。特に好ましい態様において、特異的なハイブリダイゼーションに対するハイブリダイゼーション条件は高ストリンジェンシーである。
【００７６】
その後、特異的なハイブリダイゼーションが、それが存在する場合には、標準的な方法を使用して検出される。特異的なハイブリダイゼーションが核酸プローブと試験試料中のＮＲＧ１ＡＧ１との間で生じる場合、ＮＲＧ１ＡＧ１は、多型を有するか、またはスプライシングバリアントであり、核酸プローブに存在する。２つ以上の核酸プローブもまた、この方法では同時に使用することができる。これらの核酸プローブのいずれか１つの特異的なハイブリダイゼーションは、ＮＲＧ１ＡＧ１における多型を示すか、またはＮＲＧ１ＡＧ１によってコードされる特定のスプライシングバリアントの存在を示し、従って、精神分裂病に対する感受性に関する診断となる。
【００７７】
ノーザン分析（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．他編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、上記）を参照のこと）では、上記に記載されたハイブリダイゼーション方法が、精神分裂病に対する感受性に関連した多型または特定のスプライシングバリアントの存在を確認するために使用される。ノーザン分析の場合、ＲＮＡの試験試料が、適切な手段によって個体から得られる。上記に記載されるように、個体に由来するＲＮＡに対する核酸プローブの特異的なハイブリダイゼーションは、ＮＲＧ１ＡＧ１における多型を示すか、またはＮＲＧ１ＡＧ１によってコードされる特定のスプライシングバリアントの存在を示し、従って、精神分裂病に対する感受性に関する診断となる。
【００７８】
核酸プローブの使用の代表的な例については、例えば、米国特許第５，２８８，６１１号および同第４，８５１，３３０号を参照のこと。
【００７９】
あるいは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブを、上記に記載されたハイブリダイゼーション方法において核酸プローブの代わりに使用することができる。ＰＮＡは、有機塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵ）がグリシン窒素にメチレンカルボニルリンカーを介して結合しているＮ−（２−アミノエチル）グリシンユニットなどのペプチド様の無機骨格を有するＤＮＡ模倣体である（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．他、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４、５、アメリカ化学会、１頁（１９９４）を参照のこと）。ＰＮＡプローブは、精神分裂病に対する感受性に関連した多型を有する遺伝子に特異的にハイブリダイズするように設計することができる。ＮＲＧ１ＡＧ１に対するＰＮＡプローブのハイブリダイゼーションは、精神分裂病に対する感受性に関する診断となる。
【００８０】
本発明の別の方法において、遺伝子内の変異または多型が制限部位の作出または除去を生じさせる場合、制限消化による変異分析を、変異遺伝子または多型を含有する遺伝子を検出するために使用することができる。ゲノムＤＮＡを含有する試験試料が個体から得られる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、試験個体に由来するゲノムＤＮＡの試験試料におけるＮＲＧ１ＡＧ１（および必要な場合には隣接配列）を増幅することができる。ＲＦＬＰ分析が記載されるように行われる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（上記）を参照のこと）。関連するＤＮＡ断片の消化パターンは、ＮＲＧ１ＡＧ１における変異または多型の存在または非存在を示し、従って、精神分裂病に対するこの感受性の存在または非存在を示す。
【００８１】
配列分析もまた、ＮＲＧ１ＡＧ１における特定の多型を検出するために使用することができる。ＤＮＡまたはＲＮＡの試験試料が試験個体から得られる。ＰＣＲまたは他の適切な方法を使用して、遺伝子を増幅することができ、かつ／または所望する場合にはその隣接配列を増幅することができる。ＮＲＧ１ＡＧ１もしくは該遺伝子の断片、ｃＤＮＡもしくはｃＤＮＡの断片、またはｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡの断片の配列が、標準的な方法を使用して決定される。遺伝子、遺伝子断片、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡ断片、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ断片の配列は、該遺伝子、ｃＤＮＡ（例えば、配列番号：１、または配列番号：６、７、８もしくは９をコードする核酸配列、またはその断片）、またはｍＲＮＡの既知の核酸配列と適宜比較される。多型がＮＲＧ１ＡＧ１に存在することにより、個体が精神分裂病に対する感受性を有することが示される。
【００８２】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドもまた、増幅されたオリゴヌクレオチドと対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブとのドットブロットハイブリダイゼーション（例えば、Ｓａｉｋｉ，Ｒ．他（１９８６）、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２４：１６３〜１６６を参照のこと）の使用によって、多型がＮＲＧ１ＡＧ１に存在することを検出するために使用することができる。「対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド」（これはまた本明細書中では「対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ」と呼ばれる）は、ＮＲＧ１ＡＧ１に特異的にハイブリダイゼーションし、かつ精神分裂病に対する感受性に関連した多型を含有する約１０塩基対〜５０塩基対（好ましくは、約１５塩基対〜３０塩基対）のオリゴヌクレオチドである。ＮＲＧ１ＡＧ１における特定の多型に対して特異的な対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブは、標準的な方法を使用して調製することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（上記）を参照のこと）。精神分裂病に対する感受性に関連する遺伝子内の多型を確認するために、ＤＮＡの試験試料が個体から得られる。ＰＣＲを使用して、ＮＲＧ１ＡＧ１のすべてまたは断片およびその隣接配列を増幅することができる。増幅されたＮＲＧ１ＡＧ１（または該遺伝子の断片）を含有するＤＮＡは、標準的な方法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（上記）を参照のこと）を使用してドットブロットされ、そしてブロットはオリゴヌクレオチドプローブと接触させられる。その後、増幅されたＮＲＧ１ＡＧ１に対するプローブの特異的なハイブリダイゼーションの存在が検出される。個体に由来するＤＮＡに対する対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブの特異的なハイブリダイゼーションは、ＮＲＧ１ＡＧ１における多型を示し、従って精神分裂病に対する感受性を示している。
【００８３】
別の態様において、個体に由来する標的核酸配列セグメントに相補的であるオリゴヌクレオチドプローブのアレイを、ＮＲＧ１ＡＧ１における多型を確認するために使用することができる。例えば、１つの態様において、オリゴヌクレオチドアレイを使用することができる。オリゴヌクレオチドアレイは、典型的には、異なる既知の位置において基体の表面に結合されている複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含む。これらのオリゴヌクレオチドアレイは、「ジーンチップス（Ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ）（商標）」としても記載されており、この分野では広く記載されている（例えば、米国特許第５，１４３，８５４号ならびにＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９０／１５０７０および同第ＷＯ９２／１００９２）。これらのアレイは、一般には、ホトリソグラフィー法および固相オリゴヌクレオチド合成法の組合せを組み込んだ機械的な合成方法または光誘導による合成方法を使用して作製することができる。Ｆｏｄｏｒ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：７６７〜７７７（１９９１）；Ｐｉｒｒｕｎｇ他、米国特許第５，１４３，８５４号（ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９０／１５０７０もまた参照のこと）；Ｆｏｄｏｒ他、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９２／１００９２および米国特許第５，４２４，１８６号を参照のこと（これらのそれぞれの教示は全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。機械的な合成方法を使用するこれらのアレイを合成する技術が、例えば、米国特許第５，３８４，２６１号に記載されている（その教示は全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００８４】
オリゴヌクレオチドアレイが調製されると、目的とする核酸がアレイとハイブリダイゼーションさせられ、多型について走査される。ハイブリダイゼーションおよび走査は、一般には、本明細書中に記載される方法によって、そしてまた、例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９２／１００９２および同ＷＯ９５／１１９９５ならびに米国特許第５，４２４，１８６号（これらの教示は全体が参考として本明細書中に組み込まれる）に記載される方法によって行われる。簡単に記載すると、１つ以上の以前に同定された多型マーカーを含む標的核酸配列が、周知の増幅技術（例えば、ＰＣＲ）によって増幅される。典型的には、これには、多型から上流および下流の両方で標的配列の２つの鎖に相補的であるプライマー配列の使用が含まれる。非対称的ＰＣＲ技術もまた使用することができる。増幅された標的は、一般には標識を取り込んでおり、その後、適切な条件のもとでアレイとハイブリダイゼーションさせられる。アレイのハイブリダイゼーションおよび洗浄が完了した後、アレイは、標的配列がハイブリダイゼーションしているアレイ上の位置を決定するために走査される。走査から得られたハイブリダイゼーションデータは、典型的には、アレイ上の位置を関数とする蛍光強度の形態である。
【００８５】
例えば、１つの単一多型を検出するための単一検出ブロックに関して主に記載されるが、アレイは、多数の検出ブロックを含むことができ、従って、多数の特定の多型を分析することができる。代わりの態様では、複数の検出ブロックが、アレイに対する標的のハイブリダイゼーションのときに様々な最適な条件が使用され得るように、１つのアレイ内において、または多数の別個のアレイにおいてグループ化され得ることが一般に理解される。例えば、ＡＴリッチセグメントに含まれる多型とは別に、ゲノム配列のＧＣリッチ領域に含まれる多型の検出を提供することは多くの場合望ましいと考えられる。これは、それぞれの状況についてハイブリダイゼーション条件の個別の最適化を可能にする。
【００８６】
多型を検出するためにオリゴヌクレオチドアレイを使用することのさらなる記載が、例えば、米国特許第５，８５８，６５９号および同第５，８３７，８３２号に見出すことができる（これらの教示は全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００８７】
核酸分析の他の方法を、ＮＲＧ１ＡＧ１における多型またはＮＲＧ１ＡＧ１によってコードされるスプライシングバリアントを検出するために使用することができる。代表的な方法として、例えば、直接的な手作業による配列決定（ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ，（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１９９１〜１９９５；Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．他（１９７７）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ７４：５４６３〜５４６７；Ｂｅａｖｉｓ他、米国特許第５，２８８，６４４号）；自動化された蛍光配列決定；一本鎖高次構造多型アッセイ（ＳＳＣＰ）；クランプド変性ゲル電気泳動（ＣＤＧＥ）；変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ，Ｖ．Ｃ．他（１９８９１）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２３２〜２３６）、移動度シフト分析（Ｏｒｉｔａ，Ｍ．他（１９８９）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２７６６〜２７７０）  制限酵素分析（Ｆｌａｖｅｌｌ他（１９７８）  Ｃｅｌｌ  １５：２５）；Ｇｅｅｖｅｒ他（１９８１）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：５０８１）；ヘテロ二重鎖分析；化学的ミスマッチ切断（ＣＭＣ）（Ｃｏｔｔｏｎ他（１９８５）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３９７〜４４０１）；ＲＮａｓｅ保護アッセイ（Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．Ｍ．他（１９８５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２）；ヌクレオチドミスマッチを認識するポリペプチド（大腸菌のｍｕｔＳタンパク質など）の使用；対立遺伝子特異的ＰＣＲが挙げられる。
【００８８】
本発明の別の態様において、精神分裂病に対する感受性の診断はまた、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈殿および免疫蛍光を含む様々な方法によりＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの発現および／または組成を調べることによって行うことができる。個体に由来する試験試料が、ＮＲＧ１ＡＧ１によってコードされるポリペプチドの発現の変化および／またはその組成の変化の存在について、あるいはＮＲＧ１ＡＧ１によってコードされる特定のスプライシングバリアントの存在について評価される。ＮＲＧ１ＡＧ１によってコードされるポリペプチドの発現の変化は、例えば、量的なポリペプチド発現（すなわち、産生されるポリペプチドの量）の変化であり得る；ＮＲＧ１ＡＧ１によってコードされるポリペプチドの組成の変化は、質的なポリペプチド発現の変化（例えば、変異型ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドまたは異なるスプライシングバリアントの発現）である。好ましい態様において、精神分裂病に対する感受性の診断は、ＮＲＧ１ＡＧ１によってコードされる特定のスプライシングバリアントを検出することによって、または様々なスプライシングバリアントの特定のパターンを検出することによって行われる。
【００８９】
質的および量的の両方の変化もまた存在し得る。本明細書中で使用される、ポリペプチドの発現または組成における「変化」は、対照試料におけるＮＲＧ１ＡＧ１によるポリペプチドの発現または組成と比較したときの、試験試料における発現または組成の変化をいう。対照試料は、試験試料に対応し（例えば、同じタイプの細胞に由来し）、かつ精神分裂病に罹患していない個体に由来する試料である。対照試料と比較して、試験試料においてポリペプチドの発現または組成が変化していることは、精神分裂病に対する感受性を示している。同様に、対照試料と比較して、試験試料において１つ以上の異なるスプライシングバリアントが存在すること、または試験試料において有意に異なる量の異なるスプライシングバリアントが存在することは、精神分裂病に対する感受性を示している。ＮＲＧ１ＡＧ１によってコードされるポリペプチドの発現または組成を調べる様々な手段を使用することができ、これには、分光測定法、比色測定法、電気泳動、等電点フォーカシング、および免疫ブロッティング（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、特に第１０章もまた参照のこと）などの免疫アッセイ（例えば、Ｄａｖｉｄ他、米国特許第４，３７６，１１０号）が含まれる。例えば、１つの態様において、（例えば、上記に記載されるような）ポリペプチドに結合し得る抗体、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体を使用することができる。抗体はポリクローナルであり得るか、またはより好ましくはモノクローナルであり得る。完全な抗体またはその断片（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）を使用することができる。用語「標識された」は、プローブまたは抗体に関しては、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリングする（すなわち、物理的に連結する）ことによってプローブまたは抗体を直接的に標識すること、ならびに直接標識された別の試薬との反応性によってプローブまたは抗体を間接的に標識することを包含するものとする。間接的に標識することの例には、蛍光的に標識された二次抗体を使用する一次抗体の検出、および蛍光的に標識されたストレプトアビジンを用いて検出することができるようにＤＮＡプローブをビオチンで末端標識することが含まれる。
【００９０】
変異型ＮＲＧ１ＡＧ１によってコードされるポリペプチドに特異的に結合する上記のような抗体、または非変異型遺伝子によってコードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体、またはＮＲＧ１ＡＧ１によってコードされる特定のスプライシングバリアントに特異的に結合する抗体を使用するウエスタンブロッティング分析を使用して、特定のスプライシングバリアントが試験試料に存在すること、または多型ＮＲＧ１ＡＧ１もしくは変異型ＮＲＧ１ＡＧ１によってコードされるポリペプチドが試験試料に存在すること、あるいは特定のスプライシングバリアントが試験試料に存在しないこと、または非多型遺伝子もしくは非変異型遺伝子によってコードされるポリペプチドが試験試料に存在しないことを確認することができる。多型遺伝子もしくは変異型遺伝子によってコードされるポリペプチドの存在、あるいは非多型遺伝子もしくは非変異型遺伝子によってコードされるポリペプチドの非存在は、精神分裂病に対する感受性に関する診断になり、ＮＲＧ１ＡＧ１遺伝子によってコードされる特定のスプライシングバリアントの存在（または非存在）もそうである。
【００９１】
この方法の１つの態様において、試験試料中のＮＲＧ１ＡＧ１によってコードされるポリペプチドのレベルまたは量が、対照試料中のＮＲＧ１ＡＧ１によってコードされるポリペプチドのレベルまたは量と比較される。試験試料中のポリペプチドのレベルまたは量が、違いが統計学的に有意であるように、対照試料中のポリペプチドのレベルまたは量よりも多いか、または少ないことは、ＮＲＧ１ＡＧ１によってコードされるポリペプチドの発現における変化を示しており、従って精神分裂病に対する感受性に関する診断になる。あるいは、試験試料中のＮＲＧ１ＡＧ１によってコードされるポリペプチドの組成が、対照試料中のＮＲＧ１ＡＧ１によってコードされるポリペプチドの組成と比較される。対照試料中のポリペプチドの組成と比較して、試験試料中のポリペプチドの組成が異なること（例えば、異なるスプライシングバリアントが存在すること）は、精神分裂病に対する感受性に関する診断になる。別の態様において、ポリペプチドのレベルまたは量および組成の両方が試験試料および対照試料において評価され得る。対照試料と比較して、試験試料中のポリペプチドの量またはレベルが異なること；対照試料と比較して、試験試料中の組成が異なること；あるいは量またはレベルの違いおよび組成の両方が異なることは精神分裂病に対する感受性を示している。
【００９２】
診断方法において有用なキット（例えば、試薬キット）は、本明細書中に記載される方法のいずれかにおいて有用な様々な成分を含む。そのような成分には、例えば、本明細書に記載されるようなハイブリダイゼーション用のプローブまたはプライマー（例えば、標識されたプローブまたはプライマー）、標識された分子を検出するための試薬、制限酵素（例えば、ＲＦＬＰ分析のために）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド、変異型ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドまたは非変異型（天然型）ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチド（例えば、配列番号：６、７、８、および／または９）に結合する抗体、ＮＲＧ１ＡＧ１を含む核酸を増幅するための手段、あるいはＮＲＧ１ＡＧ１の核酸配列を分析するための手段、またはＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドのアミノ酸配列を分析するための手段などが含まれる。
【００９３】
スクリーニングアッセイおよびそれによって同定される因子
本発明は、本発明の核酸にハイブリダイゼーションするヌクレオチドの存在を確認するための方法、ならびに本発明の核酸によってコードされるポリペプチドの存在を確認するための方法（これらはまた本明細書中では「スクリーニングアッセイ」と呼ばれる）を提供する。１つの態様において、試料における目的とする核酸分子（例えば、本発明の核酸と有意な相同性を有する核酸）の存在（または非存在）が、試料を、上記に記載されるような高ストリンジェンシー条件のもとで、本発明の核酸（例えば、配列番号：１の配列または配列番号：１の相補体を有する核酸、あるいは配列番号：６、７、８、もしくは９の配列を有するアミノ酸をコードする核酸、あるいはそのような核酸の断片またはバリアント）を含む核酸と接触させ、その後、試料をハイブリダイゼーションの存在（または非存在）について評価することによって評価され得る。好ましい態様において、高ストリンジェンシー条件は、選択的なハイブリダイゼーションに適切な条件である。好ましい態様において、高ストリンジェンシー条件は、選択的なハイブリダイゼーションに適切な条件である。別の態様において、目的とする核酸分子を含有する試料は、目的とする核酸分子（例えば、ニューレグリン１関連遺伝子１核酸）の一部に対して少なくとも部分的に相補的である連続したヌクレオチド配列（例えば、上記に記載されるようなプライマーまたはプローブ）を含有する核酸と接触させられ、そして接触させられた試料は、ハイブリダイゼーションの存在または非存在について評価される。好ましい態様において、連続したヌクレオチド配列を含有する核酸は、目的とする核酸分子の一部に対して完全に相補的である。
【００９４】
これらの態様のいずれにおいても、目的とする核酸の全体または一部を、ハイブリダイゼーションの実施に先立って増幅に供することができる。
【００９５】
別の態様において、試料における目的とするポリペプチド（本発明のポリペプチドあるいはその断片またはバリアントなど）の存在（または非存在）は、試料を、目的とするポリペプチドに特異的に結合する抗体（例えば、上記に記載される抗体などの抗体）と接触させ、その後、目的とするポリペプチドに対する抗体の結合の存在（または非存在）について試料を評価することによって評価することができる。
【００９６】
別の態様において、本発明は、本明細書中に記載されるポリペプチドの活性を変化させる（例えば、増大または低下させる）か、またはそうでなければ本明細書中に記載されるポリペプチドと相互作用する因子（例えば、融合タンパク質、ポリペプチド、ペプチド擬似物、プロドラッグ、受容体、結合因子、抗体、小分子または他の薬物、あるいはリボザイム）を同定する方法を提供する。例えば、そのような因子は、本明細書中に記載されるポリペプチドに結合する因子（例えば、ＮＲＧ１ＡＧ１結合因子）；例えば、本発明のポリペプチドの活性に対する刺激作用または阻害作用を有する因子；ＮＲＧ１ＡＧ１結合因子と相互作用する本発明のポリペプチドの能力を変化させる（例えば、増強または阻害する）因子（例えば、受容体または他の結合因子）；またはＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの翻訳後プロセシングを変化させる因子（例えば、正常に合成された位置から細胞表面などの細胞内の別の位置に該ポリペプチドを向かわせるタンパク質分解的プロセシングを変化させる因子；より活性なポリペプチドが細胞から放出されるようにタンパク質分解的プロセシングを変化させる因子、など）でありうる。
【００９７】
１つの態様において、本発明は、本明細書中に記載されるポリペプチド（または１つまたは複数のその生物学的に活性な部分）に結合するか、またはその活性を調節する候補因子または被験因子をスクリーニングするアッセイ、ならびにそのようなアッセイによって同定され得る因子を提供する。被験因子は、この分野で知られているコンビナトリアルライブラリー法における多数の方法のいずれかを使用して得ることができる。これらには、生物学的ライブラリー；空間的に送達可能な（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）平行した固相ライブラリーおよび液相ライブラリー；デコンボルーションを必要とする合成ライブラリー法；「一ビーズ・一化合物」ライブラリー法；ならびにアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法が含まれる。生物学的ライブラリー法はポリペプチドライブラリーに限定されるが、それ以外の４つの方法は、ポリペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．（１９９７）  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．，１２：１４５）。
【００９８】
１つの態様において、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの活性を変化させる因子を同定するために、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチド（例えば、配列番号：６、７、８または９、あるいはＮＲＧ１ＡＧ１によってコードされる別のスプライシングバリアント）あるいはその断片または誘導体（これらは上記に記載される）を含有または発現する細胞、細胞溶解物または溶液を、試験対象の因子と接触させることができる；あるいは、該ポリペプチドを試験対象の因子と直接接触させることができる。ＮＲＧ１ＡＧ１活性のレベル（量）が評価され（例えば、ＮＲＧ１ＡＧ１活性のレベル（量）が直接的または間接的のいずれかで測定され）、そして対照における活性のレベル（すなわち、試験対象の因子の非存在下でのＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドあるいはその断片または誘導体の活性のレベル）と比較される。因子の存在下での活性のレベルが、因子の非存在下での活性のレベルと、統計学的に有意な量で異なる場合、その因子は、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの活性を変化させる因子である。対照に対するＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチド活性のレベルの増大は、その因子が、ＮＲＧ１ＡＧ１活性を増強する因子（ＮＲＧ１ＡＧ１活性のアゴニスト）であることを示している。同様に、対照に対するＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチド活性のレベルの低下は、その因子が、ＮＲＧ１ＡＧ１活性を阻害する因子（ＮＲＧ１ＡＧ１活性のアンタゴニスト）であることを示している。別の態様において、試験対象の因子の存在下でのＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドあるいはその誘導体または断片の活性のレベルは、以前に明らかにされている対照のレベルと比較される。因子が存在するもとでの活性のレベルが、対照のレベルと、統計学的に有意な量で異なることは、その因子がＮＲＧ１ＡＧ１活性を変化させることを示している。
【００９９】
本発明はまた、ＮＲＧ１ＡＧ１の発現を変化させる因子（該遺伝子の発現（例えば、転写または翻訳）を変化させる（例えば、増大または低下させる）か、あるいはそうでなければ本明細書中に記載される核酸と相互作用する）（例えば、アンチセンス核酸、融合タンパク質、ポリペプチド、ペプチド擬似物、プロドラッグ、受容体、結合因子、抗体、小分子または他の薬物、あるいはリボザイム）を同定するアッセイ、ならびにそのようなアッセイによって同定され得る因子に関する。例えば、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ＮＲＧ１ＡＧ１遺伝子）を含有する溶液を、試験対象の因子と接触させることができる。溶液は、例えば、核酸を含有する細胞、または核酸を含有する細胞溶解物を含みうる；あるいは溶液は、核酸の転写／翻訳に必要なエレメントを含む別の溶液であり得る。溶液に懸濁されていない細胞もまた、所望する場合には用いることができる。ＮＲＧ１ＡＧ１発現のレベルおよび／またはパターン（例えば、種々のスプライシングバリアントのレベルおよび／またはパターンなどの、発現したｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルおよび／またはパターン）が評価され、そして対照における発現のレベルおよび／またはパターン（すなわち、試験対象の因子の非存在下でのＮＲＧ１ＡＧ１発現のレベルおよび／またはパターン）と比較される。因子の存在下でのレベルおよび／またはパターンが、因子の非存在下でのレベルおよび／またはパターンとは統計学的に有意な量または様式で異なる場合、その因子は、ＮＲＧ１ＡＧ１の発現を変化させる因子である。ＮＲＧ１ＡＧ１発現の増強は、その因子がＮＲＧ１ＡＧ１活性のアゴニストであることを示している。同様に、ＮＲＧ１ＡＧ１発現の阻害は、その因子がＮＲＧ１ＡＧ１活性のアンタゴニストであることを示している。別の態様において、試験対象の因子の存在下での１つまたは複数のＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチド（例えば、種々のスプライシングバリアント）のレベルおよび／またはパターンが、以前に明らかにされている対照のレベルおよび／またはパターンと比較される。因子が存在するもとでのレベルおよび／またはパターンが、対照のレベルおよび／またはパターンとは統計学的に有意な量または様式で異なることは、その因子がＮＲＧ１ＡＧ１の発現を変化させることを示している。
【０１００】
本発明の別の態様において、ＮＲＧ１ＡＧ１遺伝子の発現を変化させる因子、またはそうでなければ本明細書中に記載される核酸と相互作用する因子を、レポーター遺伝子に作動的に連結されたＮＲＧ１ＡＧ１遺伝子のプロモーター領域をコードする核酸を含有する細胞、細胞溶解物または溶液を使用して同定することができる。試験対象の因子と接触させた後、レポーター遺伝子の発現レベル（例えば、発現したｍＲＮＡまたはタンパク質のレベル）が評価され、そして対照における発現レベル（すなわち、試験対象の因子の非存在下でのレポーター遺伝子の発現レベル）と比較される。因子が存在するもとでのレベルが、因子が存在しないもとでのレベルと、統計学的に有意な量または様式で異なる場合、その因子は、ＮＲＧ１ＡＧ１遺伝子プロモーターに作動的に連結されている遺伝子の発現を変化させるその能力によって示されるように、ＮＲＧ１ＡＧ１の発現を変化させる因子である。レポーターの発現の増強は、その因子が、ＮＲＧ１ＡＧ１活性のアゴニストであることを示している。同様に、レポーターの発現の阻害は、その因子が、ＮＲＧ１ＡＧ１活性のアンタゴニストであることを示している。別の態様において、試験対象の因子の存在下でのレポーターの発現レベルが、以前に明らかにされている対照のレベルと比較される。因子が存在するもとでのレベルが、対照のレベルと、統計学的に有意な量または様式で異なることは、その因子がＮＲＧ１ＡＧ１の発現を変化させることを示している。
【０１０１】
ＮＲＧ１ＡＧ１によってコードされる種々のスプライシングバリアントの量を変化させる因子（例えば、第１のスプライシングバリアントの活性を増強させ、かつ第２のスプライシングバリアントの活性を阻害する因子）、ならびに第１のスプライシングバリアントの活性のアゴニストであり、第２のスプライシングバリアントの活性のアンタゴニストである因子を、上記に記載されるこれらの方法を使用して同定することができる。
【０１０２】
本発明の他の態様において、様々なアッセイを、ＮＲＧ１ＡＧ１結合因子に関連してＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの活性に対する被験因子の影響を評価するために使用することができる。例えば、ＮＲＧ１ＡＧ１と相互作用する化合物（これは本明細書中では「ＮＲＧ１ＡＧ１結合因子」と呼ばれ、受容体などの、ＮＲＧ１ＡＧ１と相互作用するポリペプチドまたは他の分子であり得る）を発現する細胞が、被験因子の存在下でＮＲＧ１ＡＧ１と接触させられ、そしてＮＲＧ１ＡＧ１とＮＲＧ１ＡＧ１結合因子との相互作用を変化させる被験因子の能力が測定される。あるいは、ＮＲＧ１ＡＧ１結合因子を含有する細胞溶解物または溶液を使用することができる。ＮＲＧ１ＡＧ１またはＮＲＧ１ＡＧ１結合因子に結合する因子は、ＮＲＧ１ＡＧ１がＮＲＧ１ＡＧ１結合因子に結合し、またはＮＲＧ１ＡＧ１結合因子と会合し、またはそうでなければＮＲＧ１ＡＧ１結合因子と相互作用する能力を妨げるか、または増強することによって相互作用を変化させることができる。被験因子がＮＲＧ１ＡＧ１またはＮＲＧ１ＡＧ１結合因子に結合する能力の測定は、例えば、被験因子を放射性同位体または酵素的標識とカップリングして、ポリペプチドに対する被験因子の結合が、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈによる標識を直接的または間接的に検出することによって測定できるようにすることによって行うことができ、放射性同位体は、放射線のダイレクトカウンティング、またはシンチレーションカウンティングによって検出されうる。あるいは、被験因子は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼで酵素的に標識することができ、酵素的標識は、適切な基質の生成物への変換を測定することによって検出されうる。被験因子がポリペプチドと相互作用する能力を、相互作用因子のいずれも標識することなく測定することもまた本発明の範囲内である。例えば、微量生理機能測定装置（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）を使用して、被験因子とＮＲＧ１ＡＧ１またはＮＲＧ１ＡＧ１結合因子との相互作用を、被験因子またはＮＲＧ１ＡＧ１またはＮＲＧ１ＡＧ１結合因子のいずれをも標識することなく検出することができる。ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｈ．Ｍ．他（１９９２）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５７：１９０６〜１９１２。本明細書中で使用される「微量生理機能測定装置」（例えば、Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ（商標））は、細胞がその環境を酸性化する速度を、光制御可能な電位差測定センサー（ＬＡＰＳ）を使用して測定する分析装置である。この酸性化速度の変化を、リガンドとポリペプチドとの相互作用の指標として使用することができる。
【０１０３】
本発明の別の態様において、本明細書中に記載されるように、１つ以上のＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドと相互作用するポリペプチドを同定するために様々なアッセイを使用することができる。例えば、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．およびＳｏｎｇ．Ｏ．、Ｎａｔｕｒｅ、３４０：２４５〜２４６（１９８９））によって記載されるシステムなどの酵母ツーハイブリッドシステムを使用して、１つ以上のＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドと相互作用するポリペプチドを同定することができる。そのような酵母ツーハイブリッドシステムでは、ベクターが、２つの機能的ドメイン（ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメイン）を有する転写因子の柔軟性に基づいて構築される。この２つのドメインが分離され、しかし互いに相互作用する２つの異なるタンパク質に融合された場合、転写活性化が達成され得、そして特異的なマーカー（例えば、ＨｉｓおよびＡｄｅなどの栄養性マーカー、またはｌａｃＺなどの色マーカー）の転写を、相互作用および転写活性化の存在を確認するために使用することができる。例えば、本発明の方法では、ＤＮＡ結合ドメインをコードし、さらにＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチド、スプライシングバリアントあるいはその断片または誘導体をコードする核酸を含む第１のベクターが使用され、そして転写活性化ドメインをコードする核酸と、さらにはＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチド、スプライシングバリアントあるいはその断片または誘導体と潜在的に相互作用し得るポリペプチド（例えば、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチド結合因子または受容体）をコードする核酸とを含む第２のベクターが使用される。第１のベクターおよび第２のベクターを含有する酵母を適切な条件（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから得られるＭａｔｃｈｍａｋｅｒ（商標）システムなどで使用されるマッチング条件）下でインキュベーションすることにより、目的とするマーカーを発現するコロニーを同定することができる。このようなコロニーは、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドあるいはその断片または誘導体と相互作用する１つまたは複数のポリペプチドを同定するために調べることができる。そのようなポリペプチドは、上記に記載されるように、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの発現活性を変化させる因子として有用であり得る。
【０１０４】
本発明の上記のアッセイ方法の１つ以上の態様では、ポリペプチドの一方または両方の複合体化形態を非複合体化形態から分離することを容易にするために、ならびにアッセイの自動化を行うために、ＮＲＧ１ＡＧ１、ＮＲＧ１ＡＧ１結合因子またはアッセイの他の成分のいずれかを固相支持体に固定化することが望ましくあり得る。ポリペプチドに対する被験因子の結合、またはポリペプチドと結合因子との相互作用が、被験因子の存在下および非存在下で、反応物を含有するのに好適な任意の容器において達成され得る。そのような容器の例として、マイクロタイタープレート、試験管および微量遠心チューブが挙げられる。１つの態様において、ＮＲＧ１ＡＧ１またはＮＲＧ１ＡＧ１結合因子がマトリックスまたは他の固相支持体に結合することを可能にするドメインが付加されている融合タンパク質（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質）が提供され得る。
【０１０５】
別の態様おいて、本発明の核酸分子の発現の調節因子が、ＮＲＧ１ＡＧ１をコードする核酸を含有する細胞、細胞溶解物または溶液を被験因子と接触させ、そして細胞、細胞溶解物または溶液における適切なｍＲＮＡまたはポリペプチド（例えば、１つまたは複数のスプライシングバリアント）の発現を測定する方法で同定される。被験因子が存在するもとでの適切なｍＲＮＡまたは１つまたは複数のポリペプチドの発現レベルが、被験因子が存在しないもとでのｍＲＮＡまたは１つまたは複数のポリペプチドの発現レベルと比較される。その後、被験因子を、この比較に基づいて発現の調節因子として同定することができる。例えば、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、被験因子の存在において、その非存在下の場合よりも大きい（統計学的に有意に大きい）とき、その被験因子は、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現の刺激因子またはエンハンサーとして同定される。あるいは、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、被験因子の存在下において、その非存在下の場合よりも小さい（統計学的に有意に小さい）とき、その被験因子は、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現の阻害剤として同定される。細胞におけるｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルは、ｍＲＮＡまたはポリペプチドを検出するための本明細書中に記載される様々な方法によって測定することができる。
【０１０６】
本発明はさらに、上記に記載されたスクリーニングアッセイによって同定される新規な因子に関する。従って、本明細書中の記載に従って同定された因子を適切な動物モデルにおいてさらに使用することは本発明の範囲内である。例えば、本明細書中の記載に従って同定された因子（例えば、調節性因子、アンチセンス核酸分子、特異的抗体、またはポリペプチド結合因子である被験因子）は、そのような因子による治療の効力、毒性または副作用を明らかにするために、動物モデルにおいて使用することができる。あるいは、本明細書中の記載に従って同定された因子は、そのような因子の作用機構を明らかにするために、動物モデルにおいて使用することができる。さらに、本発明は、本明細書に記載されるような治療のための、上記に記載されるスクリーニングアッセイによって同定された新規な因子の使用に関する。さらに、本明細書中の記載に従って同定された因子は、ポリペプチドまたは遺伝子（あるいはポリペプチドまたは遺伝子を含む細胞）を本明細書中の記載に従って同定された因子と接触させることによって、ニューレグリン１関連遺伝子１によってコードされるポリペプチドの活性を変化させるために、またはニューレグリン１関連遺伝子１の発現を変化させるために使用することができる。
【０１０７】
医薬組成物
本発明はまた、本明細書中に記載される核酸、特に、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む医薬組成物；本明細書中に記載されるポリペプチド（例えば、配列番号：６、７、８、および／または９の１つ以上、および／またはＮＲＧ１ＡＧ１によってコードされる他のスプライシングバリアント）を含む医薬組成物；および／または本明細書中に記載されるようなＮＲＧ１ＡＧ１遺伝子の発現もしくはＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの活性を変化させる（例えば、増強もしくは阻害する）因子を含む医薬組成物に関する。例えば、ポリペプチド、タンパク質（例えば、ＮＲＧ１ＡＧ１受容体）、その断片、融合タンパク質もしくはプロドラッグ、または本発明のヌクレオチドを含むヌクレオチドもしくは核酸構築物（ベクター）、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの活性を変化させる因子、ＮＲＧ１ＡＧ１遺伝子の発現を変化させる因子、あるいはＮＲＧ１ＡＧ１結合因子もしくはＮＲＧ１ＡＧ１結合パートナーは、医薬組成物を調製するために、生理学的に許容されうるキャリアまたは賦形剤とともに製剤化することができる。キャリアおよび組成物は無菌であり得る。製剤は投与様式に合わせるべきである。
【０１０８】
好適な医学的に許容されうるキャリアには、水、塩溶液（例えば、ＮａＣｌ）、生理的食塩水、緩衝化生理的食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール類、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（ラクトース、アミロースまたはデンプン、デキストロースなど）、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香料オイル、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど、ならびにそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。医薬調製物は、所望する場合には、活性な因子と有害に反応しない補助的な因子と、例えば、滑沢剤、保存剤、安定化剤、湿潤化剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩、緩衝剤、着色剤、風味剤および／または芳香物質などと混合することができる。
【０１０９】
組成物はまた、所望する場合には、微量の湿潤化剤または乳化剤またはｐＨ緩衝化剤を含有することができる。組成物は、液体溶液、懸濁物、エマルション、錠剤、ピル、カプセル、持続放出性製剤または粉末であり得る。組成物は、従来の結合剤およびキャリア（トリグリセリドなど）を用いて坐薬として製剤化することができる。経口用製剤は標準的なキャリアを含むことができ、例えば、製薬規格のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含むことができる。
【０１１０】
これらの組成物を導入する方法には、皮内、筋肉内、腹腔内、眼内、静脈内、皮下、局所的、経口的および鼻腔内が含まれるが、これらに限定されない。他の好適な導入方法としてまた、遺伝子治療（下記に記載される）、再充填可能なデバイスまたは生分解性デバイス、粒子加速デバイス（「遺伝子銃」）および徐放性ポリマーデバイスをも挙げることができる。本発明の医薬組成物はまた、他の因子との組合せ療法の一部として投与することができる。
【０１１１】
組成物は、ヒトへの投与に適合した医薬組成物として日常的な手法に従って製剤化することができる。例えば、静脈内投与される組成物は、典型的には、無菌の等張性水性緩衝液における溶液である。必要な場合には、組成物はまた、可溶化剤、および注射部位における痛みを取り除くための局所麻酔剤を含むことができる。一般に、成分は、ユニット投薬形態で、例えば、活性因子の量を示す気密容器（アンプルまたは袋など）における乾燥した凍結乾燥粉末または水非含有濃縮物として、別々に、または一緒に混合されて提供される。組成物が注入により投与され得る場合には、組成物は、無菌の医薬規格の水、生理的食塩水またはデキストロース／水を含有する注入ボトルを用いて調剤され得る。組成物が注射により投与される場合には、成分が投与前に混合され得るように、注射用無菌水または生理的食塩水のアンプルが提供され得る。
【０１１２】
局所適用の場合、局所適用と適合し得るキャリアを含み、かつ好ましくは水よりも大きい動的粘度を有する非噴霧性形態物、粘性から半固体または固体の形態物を用いることができる。好適な製剤には、限定されないが、溶液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム、軟膏、粉末剤、浣腸剤、ローション、ゾル、リニメント剤、膏薬、エアロゾル剤などが含まれ、これらは、所望する場合には、滅菌されるか、または補助的な因子、例えば、保存剤、安定化剤、湿潤化剤、緩衝剤、もしくは浸透圧に影響を及ぼす塩などと混合される。前記因子は、化粧用製剤に配合することができる。局所適用の場合、噴霧可能なエアロゾル調製物もまた好適であり、この場合、活性成分は、好ましくは固体または液体の不活性なキャリア物質との組合せで、絞り出しボトルに充填されるか、または加圧された揮発物、通常の場合にはガス状噴射剤（例えば、加圧空気）との混合で充填される。
【０１１３】
本明細書中に記載される因子は中性形態物または塩形態物として配合することができる。薬学的に受容可能な塩には、遊離アミノ基と形成される塩、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する塩、および遊離カルボキシル基と形成される塩、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプルピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する塩が含まれる。
【０１１４】
本発明の因子は治療的に効果的な量で投与される。特定の障害または状態の治療において治療的に効果的である因子の量は、障害または状態の性質に依存するが、標準的な臨床的技術によって決定することができる。さらに、インビトロアッセイまたはインビボアッセイを、最適な投薬量範囲を確認することを助けるために必要に応じて用いることができる。製剤において用いられる正確な用量はまた、投与経路、精神分裂病の症状の重篤度に依存するが、医師の判断およびそれぞれの患者の状況に従って決定すべきである。効果的な用量は、インビトロ試験システムまたは動物モデル試験システムから導かれた用量応答曲線から外挿し得る。
【０１１５】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分の１つまたはそれ以上が充填された１つまたはそれ以上の容器を含む医薬的なパックまたはキットを提供する。任意に、そのような１つまたは複数の容器には、医薬品または生物学的産物の製造、使用または販売を規制する政府当局により規定された書式で注意書きが伴い得る。そのような注意書きは、ヒトへの投与に対する、販売の製造、使用の当局による承認を示す。パックまたはキットには、投与様式、薬物投与の順序（例えば、個別、連続的、または同時）などに関する情報が表記され得る。パックまたはキットはまた、患者に治療を受けることを忘れないようにする手段を含むことができる。パックまたはキットは、併用療法の単回ユニット投薬量であり得るか、または多数のユニット投薬量であり得る。特に、本発明の因子は分割することができ、任意の組合せで混合することができ、１つのバイアルまたは錠剤で存在し得る。ブリスターパックまたは他の調剤手段で組み立てられた因子が好ましい。本発明の目的のために、ユニット投薬量は、それぞれの因子の個体の薬理学に依存し、かつ標準的な時間経過でＦＤＡ承認された投薬量で投与される投薬量を意味するものとする。
【０１１６】
治療方法
本発明はまた、ＮＲＧ１ＡＧ１治療因子を使用して、精神分裂病に対する治療方法（予防的および／または治療的）に関する。「ＮＲＧ１ＡＧ１治療因子」は、本明細書中に記載されるようにＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの活性および／またはＮＲＧ１ＡＧ１遺伝子の発現を変化させる（例えば、増強または阻害する）因子（例えば、ＮＲＧ１ＡＧ１のアゴニストまたはアンタゴニスト）である。ＮＲＧ１ＡＧ１治療因子は、様々な手段によって、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの活性または遺伝子発現を変化させることができ、例えば、さらなるＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドを提供することによって、またはＮＲＧ１ＡＧ１遺伝子の転写もしくは翻訳をアップレギュレーションすることによって；ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの翻訳後プロセシングを変化させることによって；ＮＲＧ１ＡＧ１スプライシングバリアントの転写を変化させることによって；あるいはＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの活性を（例えば、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドに結合することにより）妨げることによって、またはＮＲＧ１ＡＧ１遺伝子の転写もしくは翻訳をダウンレギュレーションすることによって変化させることができる。代表的なＮＲＧ１ＡＧ１治療因子として、下記のものが挙げられる：
【０１１７】
本明細書中に記載される核酸またはその断片もしくは誘導体、特に、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド、およびそのような核酸を含むベクター（例えば、遺伝子、ｃＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡ（ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドまたはその活性な断片もしくは誘導体をコードする核酸など）、あるいはオリゴヌクレオチド；例えば、配列番号：１、または配列番号：６、７、８、もしくは９をコードする核酸、またはその断片もしくは誘導体）；
【０１１８】
本明細書中に記載されるポリペプチド（例えば、配列番号：６、７、８および／または９の１つもしくはそれ以上、および／またはＮＲＧ１ＡＧ１によってコードされる他のスプライシングバリアント、またはその断片または誘導体）；
【０１１９】
他のポリペプチド（例えば、ＮＲＧ１ＡＧ１受容体）；ＮＲＧ１ＡＧ１結合因子；ペプチド擬似物；その融合タンパク質またはプロドラッグ；抗体（例えば、上記に記載されるように、変異型ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドに対する抗体、または非変異型ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドに対する抗体、またはＮＲＧ１ＡＧ１によってコードされる特定のスプライシングバリアントに対する抗体）；リボザイム；他の小分子；
【０１２０】
および他の因子でＮＲＧ１ＡＧ１遺伝子の発現またはポリペプチド活性を変化させる（例えば、増強または阻害する）因子、あるいはＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの翻訳後プロセシングを変化させる因子、あるいはＮＲＧ１ＡＧ１スプライシングバリアントの転写を調節する因子（例えば、どのスプライシングバリアントを発現させるかに影響を及ぼす因子、または発現するそれぞれのスプライシングバリアントの量に影響を及ぼす因子）。
【０１２１】
好ましい態様において、ＮＲＧ１ＡＧ１治療因子は、１つ以上のＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドをコードする核酸（例えば、配列番号：６、７、８および／または９、あるいはその断片または誘導体をコードする）である。別の好ましい態様において、ＮＲＧ１ＡＧ１治療因子は、ＮＲＧ１ＡＧ１遺伝子の調節領域などのＮＲＧ１ＡＧ１遺伝子の断片を含む核酸（例えば、配列番号：１の断片またはその誘導体を含む核酸）である。さらに別の好ましい態様において、ＮＲＧ１ＡＧ１治療因子は、ＮＲＧ１ＡＧ１遺伝子の調節領域と、さらに１つ以上のＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチド（またはその断片もしくは誘導体）をコードする核酸とを含む核酸である。
【０１２２】
１つより多いＮＲＧ１ＡＧ１治療因子を所望する場合には同時に使用することができる。
【０１２３】
核酸であるＮＲＧ１ＡＧ１治療因子は精神分裂病の治療において使用される。本明細書中で使用される用語「治療」は、疾患に関連した症状を改善することだけでなく、疾患の発症を防止すること、疾患の発症を遅延させること、そして疾患の症状の重篤度または頻度を低下させることをも示す。治療は、個体におけるＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの活性を変化させる（例えば、阻害もしくは増強する）ためか、置換するためか、または補充するために設計される。例えば、ＮＲＧ１ＡＧ１治療因子は、ＮＲＧ１ＡＧ１遺伝子の発現もしくは利用性またはＮＲＧ１ＡＧ１の特定のスプライシングバリアントの発現もしくは利用性をアップレギュレートまたは増大させるために、あるいは逆に、ＮＲＧ１ＡＧ１遺伝子の発現もしくは利用性またはＮＲＧ１ＡＧ１の特定のスプライシングバリアントの発現または利用性をダウンレギュレートまたは低下させるために投与することができる。天然型ＮＲＧ１ＡＧ１遺伝子もしくは特定のスプライシングバリアントの発現または利用性をアップレギュレートまたは増大させることは、欠損遺伝子または他のスプライシングバリアントの発現または活性を妨げるか、あるいはその発現または活性を補償することができ、一方、天然型ＮＲＧ１ＡＧ１遺伝子または特定のスプライシングバリアントの発現または利用性をダウンレギュレートまたは低下させることは、欠損遺伝子または特定のスプライシングバリアントの発現または活性を最小限にすることができ、それにより欠損遺伝子または特定のスプライシングバリアントの影響を最小限にすることができる。
【０１２４】
ＮＲＧ１ＡＧ１治療因子（１つまたは複数）は、治療的に効果的な量（すなわち、疾患に関連した症状を改善することによって、疾患の発症を防止もしくは遅延させることによって、および／または疾患の症状の重篤度もしくは頻度をも低下させることによって、疾患を治療するために十分である量）で投与される。特定の個体の障害または状態の治療において治療的に効果的である量は、疾患の症状および重篤度に依存し、標準的な臨床的技術によって決定することができる。さらに、インビトロアッセイまたはインビボアッセイを、最適な投薬量範囲を確認することを助けるために任意に用いることができる。製剤において用いられる正確な用量はまた、投与経路および疾患または障害の重篤度に依存し、医師の判断およびそれぞれの患者の状況に従って決定するべきである。効果的な用量は、インビトロ試験システムまたは動物モデル試験システムから導かれた用量応答曲線から外挿することができる。
【０１２５】
１つの態様において、本発明の核酸（例えば、配列番号：１などの、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドをコードする核酸、あるいはＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドまたはそのスプライシングバリアント、その誘導体もしくは断片をコードする別の核酸、例えば、配列番号：６、７、８および／または９をコードする核酸など）は、単独または上記に記載されるような医薬組成物のいずれかで使用することができる。例えば、ＮＲＧ１ＡＧ１、またはＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、それ自体で、またはベクター内に含ませて、細胞により天然型ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドが産生されるように、細胞内に（インビトロまたはインビボのいずれかで）導入することができる。必要な場合には、遺伝子、またはｃＤＮＡ、または遺伝子もしくはｃＤＮＡを含むベクターで形質転換された細胞を、疾患に冒されている個体に導入（または再導入）することができる。従って、天然型ＮＲＧ１ＡＧ１の発現および活性を現実には有しない細胞、または変異型ＮＲＧ１ＡＧ１の発現および活性を有する細胞、または疾患に関連したＮＲＧ１ＡＧ１スプライシングバリアントの発現を有する細胞を、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドまたはＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの活性な断片（またはＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの異なるバリアント）を発現させるために操作することができる。好ましい態様において、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドあるいはその活性な断片または誘導体をコードする核酸をウイルスベクターなどの発現ベクターに導入することができ、そしてこのベクターを動物内の適切な細胞に導入することができる。ウイルス移入システムおよび非ウイルス移入システムを含む他の遺伝子導入システムを使用することができる。あるいは、非ウイルス遺伝子移入法、例えば、リン酸カルシウム共沈殿、機械的な技術（例えば、マイクロインジェクション）、リポソームによる膜融合媒介移入、または直接的なＤＮＡ取り込みなどもまた使用することができる。
【０１２６】
あるいは、本発明の別の態様において、本発明の核酸、本発明の核酸に対して相補的な核酸、またはそのような核酸の一部（例えば、下記に記載されるようなオリゴヌクレオチド）は、ＮＲＧ１ＡＧ１のｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイゼイズする核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）が投与されるか、または該核酸がインサイチュで生成される「アンチセンス」治療で使用することができる。ｍＲＮＡおよび／またはＤＮＡに特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸は、例えば、翻訳および／または転写を阻害することによってＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドの発現を阻害する。アンチセンス核酸の結合は、従来の塩基対相補性によって、または例えば、ＤＮＡ二重鎖に結合する場合には、二重らせんの主溝における特異的な相互作用を介して行われ得る。
【０１２７】
本発明のアンチセンス構築物は、例えば、上記に記載されるような発現プラスミドとして送達することができる。プラスミドが細胞内で転写された場合、プラスミドは、ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡおよび／またはＤＮＡの一部分に対して相補的なＲＮＡを産生する。あるいは、アンチセンス構築物は、エクスビボで生成させられ、そして細胞内に導入されるオリゴヌクレオチドプローブであり得る。次いで、オリゴヌクレオチドプローブは、ＮＲＧ１ＡＧ１のｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズすることによって発現を阻害する。１つの態様において、オリゴヌクレオチドプローブは、内因性のヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼ）に対して耐性であり、それによりオリゴヌクレオチドプローブをインビボで安定にする修飾されたオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用される例示的な核酸分子は、ＤＮＡのホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）アナログ、ホスホチオアートアナログおよびメチルホスホナートアナログである（例えば、米国特許第５，１７６，９９６号、同第５，２６４，５６４号および同第５，２５６，７７５号を参照のこと）。さらに、アンチセンス治療において有用なオリゴマーを構築する一般的な方法はまた、例えば、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ他（（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：９５８〜９７６）およびＳｔｅｉｎ他（（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、４８：２６５９〜２６６８）によって記載される。アンチセンスＤＮＡに関して、例えば、ＮＲＧ１ＡＧ１配列の−１０領域〜＋１０領域の間の翻訳開始部位に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０１２８】
アンチセンス治療を行うために、ＮＲＧ１ＡＧ１をコードするｍＲＮＡに対して相補的なオリゴヌクレオチド（ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＤＮＡ）が設計される。アンチセンスオリゴヌクレオチドはＮＲＧ１ＡＧ１のｍＲＮＡ転写物に結合し、翻訳を妨げる。完全な相補性は、好ましいが、必要ではない。ＲＮＡの一部に対して「相補的」な配列は、本明細書中で示される場合、配列が、ＲＮＡとハイブリダイズすることができ、これにより安定な二重鎖を形成する十分な相補性を有することを示している。二本鎖のアンチセンス核酸の場合には、従って、二重鎖ＤＮＡの１つの鎖を試験することができ、または三重鎖の形成をアッセイすることができる。ハイブリダイズする能力は、上記に詳しく記載されているように、アンチセンス核酸の相補性度および長さの両方に依存する。一般に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、核酸は、ＲＮＡとのより多くの塩基ミスマッチを含むことができ、安定な二重鎖（または、場合により三重鎖）を依然として形成することができる。当業者は、標準的な手法の使用によってミスマッチの許容可能な程度を確認することができる。
【０１２９】
アンチセンス治療において使用されるオリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖の、ＤＮＡ、ＲＮＡあるいはそのキメラ混合物または誘導体または改変体であり得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善するために、塩基部分、糖部分またはリン酸エステル骨格を修飾することができる。オリゴヌクレオチドは、（例えば、宿主細胞の受容体をインビボで標的化するための）ペプチドなどの他の付加基、または細胞膜を横断する輸送を促進する因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ他（１９８９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：６５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅ他（１９８７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：６４８〜６５２；ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）、または血液脳関門を横断する輸送を促進する因子（例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）、またはハイブリダイゼーションにより誘発される切断剤（例えば、Ｋｒｏｌ他（１９８８）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：９５８〜９７６を参照のこと）、またはインターカレーション剤（例えば、Ｚｏｎ（１９８８）、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９を参照のこと）を含むことができる。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーションにより誘発される架橋剤、輸送因子、ハイブリダイゼーションにより誘発される切断剤）に結合することができる。
【０１３０】
アンチセンス分子は、ＮＲＧ１ＡＧ１をインビボで発現する細胞に送達される。多数の方法を、アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを細胞に送達するために使用することができる。例えば、アンチセンス分子を組織部位に直接注入することができ、あるいは所望する細胞を標的化するために設計された修飾型アンチセンス分子（例えば、標的細胞表面に発現する受容体または抗原に特異的に結合するペプチドまたは抗体に連結されたアンチセンス）を全身投与することができる。あるいは、好ましい態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なプロモーター（例えば、ｐｏｌＩＩＩまたはｐｏｌＩＩ）の制御下に置かれている組換えＤＮＡ構築物が利用される。患者における標的細胞をトランスフェクトするためにそのような構築物を使用することにより、内因性のＮＲＧ１ＡＧ１転写物との相補的な塩基対を形成し、それによりＮＲＧ１ＡＧ１のｍＲＮＡの翻訳を妨げる十分な量の一本鎖ＲＮＡの転写がもたらされる。例えば、ベクターを、細胞によって取り込まれ、そしてアンチセンスＲＮＡの転写が行われるようにインビボで導入することができる。そのようなベクターは、所望するアンチセンスＲＮＡが産生されるように転写され得る限り、エピソームに維持することができるか、または染色体に組み込ませることができる。そのようなベクターは、この分野において標準的で、そして上記に記載される組換えＤＮＡ技術方法によって構築することができる。例えば、プラスミド、コスミド、ＹＡＣまたはウイルスベクターを、組織部位に直接導入することができる組換えＤＮＡ構築物を調製するために使用することができる。あるいは、所望する組織に選択的に感染するウイルスベクターを使用することができる。そのような場合、投与は別の経路（例えば、全身投与）によって達成され得る。
【０１３１】
内因性ＮＲＧ１ＡＧ１の発現もまた、標的化された相同的組換えを使用してＮＲＧ１ＡＧ１またはそのプロモーターを不活性化または「ノックアウト」することによって低下させることができる（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓ他（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ、３１７：２３０〜２３４；Ｔｈｏｍａｓ＆Ｃａｐｅｃｃｈｉ（１９８７）、Ｃｅｌｌ、５１：５０３〜５１２；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ他（１９８９）、Ｃｅｌｌ、５：３１３〜３２１を参照のこと）。例えば、内因性ＮＲＧ１ＡＧ１（ＮＲＧ１ＡＧ１のコード領域または調節領域のいずれか）に対して相同的なＤＮＡが隣接する変異型の非機能的なＮＲＧ１ＡＧ１（または完全に無関係なＤＮＡ配列）を、ＮＲＧ１ＡＧ１をインビボで発現する細胞をトランスフェクトするために、選択マーカーおよび／または負の選択マーカーとともに、またはそのようなマーカーを用いることなく使用することができる。標的化された相同的組換えを介してＤＮＡ構築物を挿入することにより、ＮＲＧ１ＡＧ１の不活化がもたらされる。組換えＤＮＡ構築物は、上記に記載されるように、適切なベクターを使用して、必要とされる部位にインビボで直接投与または標的化することができる。あるいは、非変異型ＮＲＧ１ＡＧ１の発現を、類似する方法を使用して増大させることができる。すなわち、標的化された相同的組換えを、上記に記載されるように、細胞内の変異型ＮＲＧ１ＡＧ１の代わりに、非変異型の機能的なＮＲＧ１ＡＧ１（例えば、配列番号：１を有する遺伝子）を含むＤＮＡ構築物またはその一部を挿入するために使用することができる。別の態様において、標的化された相同的組換えを、細胞内に存在するＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドのバリアントとは異なるＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドのバリアントをコードする核酸を含むＤＮＡ構築物を挿入するために使用することができる。
【０１３２】
あるいは、内因性ＮＲＧ１ＡＧ１の発現は、ＮＲＧ１ＡＧ１の調節領域（すなわち、ＮＲＧ１ＡＧ１のプロモーターおよび／またはエンハンサー）に対して相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を標的化して、体内の標的細胞におけるＮＲＧ１ＡＧ１の転写を妨げる三重らせん構造を形成させることによって低下させることができる。（一般的には、Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．（１９９１）、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．、６（６）：５６９〜８４；Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．他（１９９２）、Ａｎｎ，Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、６６０：２７〜３６；およびＭａｈｅｒ，Ｌ．Ｊ．（１９９２）、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ、１４（１２）：８０７〜１５を参照のこと）。同様に、本明細書中に記載されるアンチセンス構築物は、ＮＲＧ１ＡＧ１タンパク質の１つの正常な生物学的活性を中和することによって、インビボ組織培養において、そしてエクスビボ組織培養のために、その両方で、組織の操作（例えば、組織分化）において使用することができる。さらに、アンチセンス技術（例えば、アンチセンス分子のマイクロインジェクション、あるいはＮＲＧ１ＡＧ１のｍＲＮＡまたは遺伝子配列に関してその転写物がアンチセンスであるプラスミドによるトランスフェクション）は、発達事象におけるＮＲＧ１ＡＧ１の役割、ならびに成体組織におけるＮＲＧ１ＡＧ１の正常な細胞機能を調べるために使用することができる。そのような技術は、細胞培養において利用され得るが、トランスジェニック動物の作製においてもまた使用することができる。
【０１３３】
本発明のさらに別の態様において、本明細書中に記載されるような他のＮＲＧ１ＡＧ１治療因子もまた精神分裂病の治療または防止において使用することができる。治療因子は、上記に記載されるように組成物で送達することができ、またはそれ自身で送達することができる。治療因子は全身投与することができ、または特定の組織に標的化することができる。治療因子は、例えば、化学合成、組換え製造、インビボ製造（例えば、米国特許第４，８７３，３１６号（Ｍｅａｄｅ他）などのトランスジェニック動物）を含む様々な手段によって製造することができ、そして本明細書中に記載される手段などの標準的な手段を使用して単離することができる。
【０１３４】
上記治療方法のいずれかの組合せ（例えば、変異型ＮＲＧ１ＡＧ１のｍＲＮＡを標的化するアンチセンス治療とともに非変異型ＮＲＧ１ＡＧ１ポリペプチドを投与すること；ＮＲＧ１ＡＧ１によってコードされる第１のスプライシングバリアントを、ＮＲＧ１ＡＧ１によってコードされる第２のスプライシングバリアントを標的化するアンチセンス治療とともに投与すること）もまた使用することができる。
【０１３５】
本発明を下記の非限定的な実施例によってさらに説明する。本明細書中に引用されているすべての刊行物の教示はその全体が参考として本明細書中に組み込まれる。
【０１３６】
実施例  精神分裂病に連鎖した遺伝子の同定
患者集団
アイスランドにおける精神分裂病の生涯発症率は、近隣諸国で観測されている平均余命に類似しており、男性については０．６％で、女性については０．９％である。患者を診断して、以前に診断された精神分裂病者の診断を確認し、そして試料を集める７名の精神科医からなるチームが用いられた。それぞれの精神科医は、精神分裂病および情緒障害に対する調査票（寿命版）（ＳＡＤＳ−Ｌ）（Ｅｎｄｉｃｏｔｔ，Ｊ．およびＳｐｉｔｚｅｒ，Ｒ．Ｌ．、Ａｒｃｈ．Ｇｅｎ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、３５：８３７（１９７８））を使用して面接した。その後、ＳＡＤＳ−Ｌ面接から得られた情報を使用して、すべての症例が、研究診断基準（ＲＤＣ）と精神的障害の診断および統計学マニュアル（第３版改訂）（ＤＭＳ  ＩＩＩ−Ｒ）とに従って分類された。さらに、精神病に対する運用基準ＯＰＣＲＩＴチェックリストもまた、精神病に対する多診断法を容易にするために使用された（ＭｃＧｕｆｆｉｎ，Ｐ．他、Ａｒｃｈ．Ｇｅｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、４８（８）：７６４〜７０（１９９１））。
【０１３７】
ＢＡＣコンティグの構築
目的の領域に対するＢＡＣ（細菌人工染色体）コンティグを、ＲＣＰＩ１１ヒトＢＡＣライブラリー（Ｐｉｅｔｅｒ  ｄｅＪｏｎｇ、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ）を使用して作製した。ＢＡＣを、その領域における入手可能なＳＴＳマーカーおよびマイクロサテライトマーカーを使用するハイブリダイゼーション、その後、ＢＡＣ末端配列から設計されたマーカーを使用する連続した数回のハイブリダイゼーションにより同定した。ハイブリダイゼーションの結果を確認して、ＢＡＣの順序を、その領域におけるすべての入手可能なマーカーを使用するＰＣＲによって決定した。主目的は、マイクロサテライトマーカーを高分解能で順序づけることであった。
【０１３８】
新しいマイクロサテライトマーカーの検索
ＢＡＣをショットガンクローニングして、メンブランに方眼状に配置した。マイクロサテライトの反復を含有するクローンを、マイクロサテライト反復配列からなるオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションによって同定した。陽性クローンを配列決定により分析して、プライマーを、これらのマイクロサテライトを増幅するために設計した。
【０１３９】
ＤＮＡ配列決定
目的とする領域の全体を最少数で覆う（ｃｏｖｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｍｉｎｉｍｕｍ ｔｉｌｉｎｇ ｐａｔｈ）９個のＢＡＣをショットガンクローニングおよび配列決定により分析した。色素ターミネーター（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢｉｇＤｙｅ（商標））化学を蛍光自動化ＤＮＡ配列決定のために使用した。ＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ３７７配列決定装置を使用して、データを集め、そしてＰｏｌｙｐｈｒｅｄソフトウエアと組み合わせたＰｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐ／Ｃｏｎｓｅｄソフトウエアパッケージを使用して、配列を組み立てた。
【０１４０】
配列データベースにおけるエキソンの検索
エキソン／遺伝子を、ＤＮＡデータベースおよびタンパク質データベースに対するＢＬＡＳＴアラインメントによって検索した。
【０１４１】
ｃＤＮＡライブラリーにおける新しいエキソンの検索
３’および５’の両方のＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ端の迅速な増幅）を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．から得られるＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ（商標）  ｃＤＮＡ、およびｄｅＣＯＤＥ  ｇｅｎｅｔｉｃｓで作製されたｃＤＮＡライブラリーを使用して行った。全脳、胎児脳および精巣に由来するｃＤＮＡライブラリーを使用した。
【０１４２】
エキソン予測ツールを使用する新しいエキソンの検索
遺伝子探索ソフトウエア（ｄｅＣＯＤＥ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を使用して、エキソンが本発明者らの１．５Ｍｂ配列のどこに存在するかを予測した。これらの候補エキソンをｃＤＮＡライブラリーから増幅するプライマーを設計して、タッチダウンＰＣＲを行い、生成物を配列分析によって確認した。
【０１４３】
エキソンの捕捉
エキソンを、Ｌｉｖｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得られるエキソントラッピングキットを使用することによって「捕捉」した。プライマーを、これらの候補エキソンをｃＤＮＡライブラリーから増幅するために設計して、タッチダウンＰＣＲを行い、生成物を配列分析によって確認した。
【０１４４】
全ゲノムスキャン
６以内の減数分裂事象で関連する罹患者に由来する試料、２６０名の罹患者および３３４名の関連する血縁者の遺伝子型を、９５０個のマイクロサテライトマーカーのマーカー集団を使用して決定した。１つの遺伝子座（８ｐ２１−８ｐ１１）を、１５０個のさらなる追跡マーカーを用いて再調査した。全ゲノムスキャンにおける２６０名の罹患者およびその血縁者に加えて、１３２名の罹患者および１４７名の入手可能な血縁者の遺伝子型もまた、８ｐ２１−１１遺伝子座に対する１５０個のマイクロサテライトマーカーを使用して決定した。
【０１４５】
統計学的分析
連鎖分析を、Ａｌｌｅｇｒｏソフトウエアを用いて行った。図１には、ＣＳ罹患家系（１５８名の罹患者、罹患者間における５マイオティック事象の最大距離）を使用した対立遺伝子共有モデルに対する結果が示される。
【０１４６】
確からしい精神分裂病遺伝子座（８ｐ２１−１１における遺伝子座）の物理的マッピング
最大ＬＯＤスコアが３に近い見出された最も重要な遺伝子座の物理的マッピングを、細菌人工染色体（ＢＡＣ）を使用して行った。最初、遺伝子座は約３０ｃＭと広かった。この領域の小さい一部のみが以前に配列決定されていただけであり、塩基の総累積数は約５Ｍｂであった。この領域におけるマーカーの公表された順序は正しくなく、そしてこの領域において知られている多型マーカーの大部分は放射ハイブリッドマッピングされていなかった。ＢＡＣマップを用いた主目的は、この領域におけるすべての多型マーカーを高分解能（１００〜１５０ｋｂ）で順序づけることであり、新しい多型マーカーを検索することであった。
【０１４７】
この領域に由来するプライマーを用いてＢＡＣライブラリーをスクリーニングすることによって、３０００個のＢＡＣがハイブリダイゼーション法およびＰＣＲ法によって回収された。コンティグのマッピングを行った：これらのクローンのうちの９４０個が、ＰＣＲおよびハイブリダイゼーションによってコンティグに特定された。さらに、２５２個のさらなるＢＡＣが、フィンガープリント分析に基づいてコンティグに特定された（合計で１１９２個のＢＡＣクローンがコンティグに特定された）。マーカーの順序を訂正した後、最大ｌｏｄスコアは３．１である（図１）。ＢＡＣコンティグによって含まれる３０ｃＭのＢＡＣ領域における５３４個のマーカーの順序が、今回、新しく決定された。この物理的マップにより、多型マイクロサテライトマーカーおよびＳＴＳマーカーの配置および設置が可能になった。ＢＡＣを、ＢＡＣコンティグからサブクローン化して、ハイブリダイゼーションによって新しいマイクロサテライトについて検索した。試料の遺伝子型を、平均して、遺伝子座全体で０．１７ｃＭ毎の多型マイクロサテライトマーカーを使用して決定した。マイクロサテライトはＡｐｐｅｎｄｉｘ  ＩＩに示される。
【０１４８】
物理的マッピング研究の結果、遺伝子座が約２０ｃＭに狭められた。この２０ｃＭの領域は４つの大きなコンティグ（それぞれが２〜１０Ｍｂ）によって埋められた。主ピークは７ｃＭを越えて広がり、この領域は１つのＢＡＣコンティグに存在した。４つのコンティグは、これらのコンティグにおける放射ハイブリッドマッピングされたマーカー、人工酵母染色体（ＹＡＣ）マップからのデータに基づいて、そしてハプロタイプを家族内で比較することによって正しく配置された。本明細書中に記載されるようにマーカーの順序が訂正されたので、密集してマッピングされたマーカーを使用して、より正しいハプロタイプを再構築することができ、そして家族間で実質的な重なりを示す危険性ハプロタイプについて検索することができる。
【０１４９】
危険性のあるハプロタイプの同定
遺伝子座８ｐ２１−１１
密集してマッピングされたマーカーに対する遺伝子型を使用して、罹患者のハプロタイプを構築して、個体の各家族内において３人以上の罹患者が保有する候補の危険性ハプロタイプを同定した。これらの候補ハプロタイプを家族間で比較することによって、これらのハプロタイプのいくつかが実質的な重なりを有することが見出された（図２）。罹患者において見出されたハプロタイプのコア（Ｄ８Ｓ１８１０からテロメア側の６個のマーカー、０．３Ｍｂ）が、患者の１０％（調査した７４６染色体のうちの３７個）で見出された。対照的に、対照の３％がこのハプロタイプを有していた（３７６のうちの６）。図２は、４４名の患者のハプロタイプがこの危険性ハプロタイプの一部を有することを示している。図３は、配列決定されたＢＡＣＳの順序の概略、および８ｐ１２の遺伝子座における危険性ハプロタイプの範囲を示している。
【０１５０】
連鎖分析およびハプロタイプ分析からの結果は、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）遺伝子および新しい遺伝子のニューレグリン１関連遺伝子１（ＮＲＧ１ＡＧ１）に由来するエキソンを有する、８ｐ１２における１．５Ｍｂのセグメントに存在する疾患感受性遺伝子の存在を強く示唆している。ニューレグリン１（ＮＲＧ１）に対する遺伝子は、米国特許出願第０９／５１５，７１６号（代理人文書番号：２３４５．２００４−０００、発明の名称「ヒト精神分裂病遺伝子」）にさらに記載されている。これは、本出願と同時に出願され、その全体が参考として本明細書中に組み込まれる。
【０１５１】
候補領域の配列
遺伝子座８ｐ１２
候補ハプロタイプが家族間で実質的な重なりを示した８ｐ１２におけるＢＡＣコンティグの１．５Ｍｂの配列決定。この配列は、１つのコンティグに存在し、ニューレグリン１関連遺伝子１（ＮＲＧ１ＡＧ１）を有する。この遺伝子由来の８つのエキソンを同定した。オープンリーディングフレームは他の既知の遺伝子と全く相同性を示さなかった。エキソン、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）およびエキソンを示す図がずに示される。この遺伝子はニューレグリン１内にあり、危険性ハプロタイプにより規定される１．５Ｍｂ領域内に存在するので、精神分裂病への罹りやすさについての有力な候補遺伝子である。
【０１５２】
ニューレグリン１（ＮＲＧ１）
ニューレグリン１（これはまた、ＡＲＩＡ、ＧＧＦ２およびヘレグリンとも呼ばれる）は、単一遺伝子の選択的ＲＮＡスプライシングから生じる一群のポリペプチド因子である（Ｆｉｓｃｈｂａｃｈ，Ｇ．Ｄ．およびＲｏｓｅｎ，Ｋ．Ｍ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０：４２９〜４５８（１９９７）；Ｏｒｒ−Ｕｒｔｒｅｇｅｒ，Ａ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：１７４６〜１７５０（１９９３）；そしてまた、Ｃｏｒｆａｓ，Ｇ．他、Ｎｅｕｒｏｎ、１４（１）：１０３〜１５（１９９５）、およびＭｅｙｅｒ，Ｄ．他、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２４（１８）：３５７５〜８６（１９９７）も参照のこと）。ニューレグリンは多くの組織で発現しており、中でも中枢神経系で発現している（例えば、Ｃｏｒｆａｓ，Ｇ．他、Ｎｅｕｒｏｎ、１４（１）：１０３〜１１５（１９９５）を参照のこと）。ニューレグリン１遺伝子は、ＮＭＤＡ受容体の発現におけるその役割、上皮増殖因子受容体およびＧＡＢＡ（ａ）受容体サブユニットの活性化だけでなくＡＣｈＲ遺伝子発現の活性化におけるその役割、そしてまたＧタンパク質シグナル変換カスケードにおける成分のその誘導を含む多くの理由で精神分裂病に関連していることが予想される。ニューレグリン１のこれらの活性のさらなる考察については、本願と同日に出願した米国特許出願第０９／５１５，７１６号を参照のこと。
【０１５３】
ニューレグリン１関連遺伝子１（ＮＲＧ１ＡＧ１）
ニューレグリン１関連遺伝子１はこれまでに未知の遺伝子である。８つのエキソンがこの遺伝子に見出され（図４）、４つの選択的スプライシングの形態が存在する（Ａｐｐｅｎｄｉｘ ＩＩＩ参照）。オープンリーディングフレームはいずれの既知の遺伝子とも相同性を示さなかった。この遺伝子はＮＲＧ１内に存在する。該遺伝子はＮＲＧ１よりかなり小さく、その遺伝子配列中、１１２９２９塩基を有する。この遺伝子の全てのエキソンが知られているわけではない；５’エキソンは２つのスプライシングバリアントで未だ知られていない。この遺伝子はニューレグリン１遺伝子内にあり、同じ鎖上に存在するので、ニューレグリン１と同じプロセスに関与すると予想される。
【０１５４】
この遺伝子は、危険性ハプロタイプにより規定される１．５Ｍｂ配列のどこにエキソンが存在するかを予測することにより同定された。次いで、プライマーを設計し、ｃＤＮＡライブラリー（脳）をスクリーニングした。また、ＢＬＡＳＴアラインメントを実施し、ＥＳＴデータベースに対して１．５Ｍｂ配列をＢＬＡＳＴイングした。ＥＳＴデータベースには、この遺伝子とオーバーラップする２つのＥＳＴクローンが存在した。これらのクローンのＩＭＡＧＥ番号およびアクセッション番号は：ＩＭＡＧＥ：７２７９６０ １（ＡＡ３９４３０９、ＡＡ４３５５５０）およびＩＭＡＧＥ １６４３９３８（ＡＩ０２７６３８）である。
【０１５５】
変異分析
ニューレグリン１関連遺伝子１（８ｐ１２）
８つの全てのエキソンを１８０名の罹患者および１８０名の対照者で調べた。多数のＳＮＰが見出された（図４；Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ＩＩもまた参照のこと）。ＳＮＰ、欠失および挿入がＡｐｐｅｎｄｉｘ  ＩＩに示される。
【０１５６】
細菌人工クローン（ＢＡＣ）
ＢＡＣクローンのＲ−２１７Ｎ４、Ｒ−２９Ｈ１２、Ｒ−４５０Ｋ１４、Ｒ−４７８Ｂ１４、Ｒ−４２０Ｍ９、Ｒ−２２Ｆ１９、Ｒ−７２Ｈ２２、Ｒ−２４４Ｌ２１、Ｒ−２２５Ｃ１７、Ｒ−３１７Ｊ８およびＲ−５４１Ｃ１５は、ＲＣＰ１１１ヒトＢＡＣライブラリー（Ｐｉｅｔｅｒ  ｄｅＪｏｎｇ、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ）に由来する。使用したベクターはｐＢＡＣｅ３．６であった。これらのクローンを、ＬＢ／クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）／グリセロール（７．５％）を含有する９４ウエルマイクロタイタープレートに移し、そして単一コロニーが配列決定によって確実に同定された後、−８０℃で保存した。その後、これらのクローンは、適切な抗生物質クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）／スクロース（５％）を含むＬＢ寒天平板において画線培養することができる。
【０１５７】
本発明はその好ましい態様に関して特に示され、かつ記載されているが、形態および細部における様々な変化が、添付された請求項により規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、そこで行われ得ることが当業者によって理解される。
【０１５８】
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【０１５９】
【表１】
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【０１６０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、８ｐ２１〜１１の精神分裂病遺伝子座のノンパラメトリックなマルチポイント（ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ｍｕｌｔｉｐｏｉｎｔ）ＬＯＤスコアを示すグラフである。
【図２】
図２は、精神分裂病に罹った個体において見られるハプロタイプを示す。多数のハプロタイプにおいて見られる部分を緑で示す。
【図３】
図３は、配列決定したＢＡＣＳの順番、および遺伝子座８ｐ１２における精神分裂病の危険性のあるハプロタイプの境界を示す。
【図４】
図４は、遺伝子座８ｐ１２におけるエキソン、一塩基多型（ＳＮＰ）、およびニューレグリン１関連遺伝子１のエキソンを示す。変異についてスクリーニングしたシリンダー（ｃｙｌｉｎｄｅｒ）について、Ｎは新規エキソン、白星印はＳＮＰ（コード）、黒星印はＳＮＰ（非翻訳）、白丸は５’エキソン、黒丸は３’エキソン、線はゲノムでの隣接を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004527203.tif 001119
2004527203.tif 001120
【国際調査報告】
2004527203.tif 001121
2004527203.tif 001122
2004527203.tif 001123
2004527203.tif 001124