(57)【要約】本発明は、２以上の分子レパートリーを互いに対してスクリーニングしたり、かつ／または２以上のレパートリーを組み合わせることで組み合わせレパートリーを形成したりするのに用いることができる方法に関する。詳細には本発明は、２種類の分子レパートリーを、第１のレパートリーの実質的に全ての構成員を、機能的相互作用について第２のレパートリーの実質的に全ての構成員に対して調べるようスクリーニングすることができる方法に関する。さらに本発明は、重鎖および軽鎖の実質的に全ての組み合わせによって形成される抗体を１以上の標的リガンドに対してスクリーニングすることができるように重鎖レパートリーと軽鎖レパートリーとを組み合わせることによる、抗体レパートリーの形成およびスクリーニングに関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の分子レパートリーを第２の分子レパートリーに対してスクリーニングして、前記第２のレパートリーの構成員と相互作用する前記第１のレパートリーの構成員を確認する方法において、
（ａ）前記第１のレパートリーの実質的に全ての構成員が前記第２のレパートリーの実質的に全ての構成員と並置されるように、少なくとも一つのアレイを形成するよう、前記第１および第２のレパートリーを配置する段階；ならびに
（ｂ）前記第１のレパートリーと前記第２のレパートリーの構成員間での相互作用を検出する段階
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記第１のレパートリーおよび前記第２のレパートリーの両方の構成員を、それぞれが前記第１または前記第２のレパートリーの構成員を含む一連の線、チャンネルまたは管に配置して、前記第１のレパートリーに相当する線、チャンネルまたは管と前記第２のレパートリーに相当するものが互いに並置されて、前記第１のレパートリーの実質的に全ての構成員が前記第２のレパートリーの実質的に全ての構成員と並置されるようにする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
各線、チャンネルまたは管がそれぞれ、前記第１および前記第２のレパートリーの異なる構成員の群を含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１および第２のレパートリーの構成員が、固体材料に切り込みまたはエッチング形成されたチャンネルに沿って配置されて、前記第１のレパートリーの構成員を含む実質的に全てのチャンネルが前記第２のレパートリーの構成員を含む実質的に全てのチャンネルと交差するようになっている請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記第１および第２のレパートリーの構成員が単一の支持体に付与されている請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
（ａ）第１および第２の支持体上に前記第１および第２のレパートリーを配置する段階；
（ｂ）前記第１のレパートリーの実質的に全ての構成員が前記第２のレパートリーの実質的に全ての構成員と並置されるように、前記第１の支持体と前記第２の支持体を並置させる段階；ならびに
（ｃ）前記第１のレパートリーと前記第２のレパートリーの構成員間の相互作用を検出する段階
を有する請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記第１および第２のレパートリーが、ペプチド；ポリペプチド；核酸分子；精製タンパク質；組換えタンパク質；アミノ酸；ｃＤＮＡ；発現ｃＤＮＡ；オリゴヌクレオチド；ヌクレオチド；ヌクレオチド類縁体；関係する遺伝子のファミリーまたはそれらに相当するタンパク質；酵素；ＤＮＡ結合タンパク質；免疫グロブリンファミリー構成員；抗体；Ｔ細胞受容体；ハプテン；小有機分子；非有機化合物；金属イオン；および炭水化物のレパートリーからなる群から選択される請求項１ないし６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記第１および第２レパートリーの構成員間の前記相互作用が、結合相互作用；ＤＮＡメチル化；核酸分解；核酸開裂（１本鎖または２本鎖）；信号伝達事象；触媒反応；リン酸化事象；グリコシル化事象；タンパク質分解開裂；化学反応；および細胞感染からなる群から選択される請求項１ないし７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
第１、第２および第３の分子レパートリーを互いに対してスクリーニングして、相互作用する前記第１、第２および第３のレパートリーの構成員を確認する方法において、
（ａ）前記第１、第２および第３のレパートリーを少なくとも一つのアレイを形成するように配置して、前記第１、第２および第３のレパートリーの実質的に全ての構成員が並置されるようにする段階；ならびに
（ｂ）前記第１、第２および第３レパートリーの構成員間の相互作用を検出する段階
を有することを特徴とする方法。
【請求項１０】
それぞれが第１のレパートリーの１構成員および第２のレパートリーの１構成員を有する二本鎖ポリペプチドのコンビナトリアルライブラリーを形成およびスクリーニングする方法において、
（ａ）前記第１のレパートリーの実質的に全ての構成員が前記第２のレパートリーの実質的に全ての構成員と交差するように前記第１および第２のレパートリーを配置することで、交差部で機能的二本鎖ポリペプチドの実質的に全ての組み合わせを得る段階；ならびに場合によって
（ｂ）前記二本鎖ポリペプチドと標的分子との間の相互作用を検出する段階
を有することを特徴とする方法。
【請求項１１】
そうして得られた前記コンビナトリアルライブラリーを、複数の標的分子との相互作用についてスクリーニングする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
３本鎖（ｔｈｒｅｅ−ｃｈａｉｎ）ポリペプチドライブラリーを、第１、第２および第３の分子レパートリーを３次元で使用して形成する（そして場合によりスクリーニングする）請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１、第２（および場合により第３）のレパートリー間の相互作用のパターンを用いて、陽性相互作用、陰性相互作用、特異的相互作用または交差反応相互作用を確認し、あるいは前記第１のレパートリー（前記第２および／または場合により第３のレパートリーとの相互作用パターンを用いて）、前記第２のレパートリー（前記第１および／または場合により第３のレパートリーとの相互作用パターンを用いて）および／または前記第３のレパートリー（前記第１および／または第２のレパートリーの構成員との相互作用パターンを用いて）の構成員間の類似性を推定する系統樹を構築する請求項１ないし１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記第１、第２および場合により第３のレパートリーの１以上が、アレイにおいてそれの相当するポリペプチドをｉｎ ｓｉｔｕで産生するために発現される複数の核酸分子を有する請求項１ないし１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸分子が、それの転写を方向付けるのに十分な制御配列に機能し得る形で連結されたポリペプチドのレパートリーの構成員をコードする発現ベクターの形である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記発現ベクターがバクテリオファージである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記発現ベクターがプラスミドである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記発現ベクターが直鎖核酸分子である請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸が細胞内に含まれ、発現される請求項１４ないし１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が、細菌細胞、下等真核細胞および高等真核細胞からなる群から選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸分子が、裸または複合体形成した核酸の形で固定化されている請求項１４ないし１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記レパートリー構成員をロボット手段を用いて配列する請求項１ないし２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
第２の分子レパートリーに対して第１の分子レパートリーをスクリーニングして、前記第２のレパートリーの構成員と相互作用しない前記第１のレパートリーの構成員を確認する方法において、
（ａ）前記第１のレパートリーの実質的に全ての構成員が前記第２のレパートリーの実質的に全ての構成員と並置されるように前記第１および第２のレパートリーを配置する段階；および
（ｂ）互いに相互作用しない前記第１および第２のレパートリーの構成員を確認する段階
を有することを特徴とする方法。
【請求項２４】
第２の分子レパートリーに対して第１の分子レパートリーをスクリーニングして、互いの相互作用が第３の分子または分子群の有無によって決まる前記第１および第２のレパートリーの構成員を確認する方法において、
（ａ）前記第１のレパートリーの実質的に全ての構成員が前記第２のレパートリーの実質的に全ての構成員と並置されるように前記第１および第２のレパートリーを配置する段階；および
（ｂ）各種濃度の前記第３の分子または分子群の存在下に前記第１および第２のレパートリーの構成員間の相互作用を検出する段階
を有することを特徴とする方法。
【請求項２５】
前記第３の分子または分子群が前記第１のレパートリーのある種の構成員と相互作用することで、前記第１のレパートリーの該構成員を前記第２のレパートリーのある種の構成員と相互作用させることができる請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１および第２のレパートリーの構成員が、それらの構成員の前記第３の分子または分子群への同時結合を必要とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１および第２レパートリーの構成員間の前記相互作用が、第３の分子または分子群の存在によって促進される請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１および第２レパートリーの構成員間の前記相互作用が、第３の分子または分子群の存在によって妨害される請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１、第２および場合により第３の分子レパートリーを含む高密度の線を描出する装置。
【請求項３０】
前記第１、第２および場合により第３の分子レパートリーが進むことができる交差したチャンネルまたは管を有する装置。
【請求項３１】
調べる相互作用の数より必要な分配作業の方が少ない請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも一つであるが全てではないレパートリーの構成員が、それぞれがそのレパートリーの１構成員を含む一連の線、チャンネルまたは管で配置されて、そのレパートリーに相当する前記線、チャンネルまたは管が、どのような配置であるかは問わず、他のレパートリーの実質的に全ての構成員と交差する請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１のレパートリーおよび前記第２のレパートリーの両方の構成員が、それぞれが前記第１または第２のレパートリーの１構成員を含む一連の線、チャンネルまたは管で配置されて、前記第１のレパートリーに相当する線、チャンネルまたは管および前記第２のレパートリーに相当するものが互いに接触することで、分配作業より多くの相互作用について試験が行われる請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
生物学的相互作用に最も好ましい条件を確認する方法において、可変パラメータの２以上の異なる集合の実質的に全ての組み合わせが関与して、各パラメータ集合が交差する線、チャンネルもしくは管によって形成されるアッセイを有することを特徴とする方法。
【請求項３５】
前記変動させるパラメータが、緩衝液組成、基質濃度、ｐＨ、温度、変性剤および復元剤（これらに限定されるものではない）からなる群から取られる請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
２段階以上の酵素反応を含む酵素の２以上のレパートリーをスクリーニングして、所定の基質からの所定の産生物を共同で形成する第１のレパートリーの構成員および第２のレパートリーの構成員を確認する方法において、
（ａ）前記第１のレパートリーの実質的に全ての構成員が前記第２のレパートリーの実質的に全ての構成員に対して並置されるよう、前記第１および第２のレパートリーを配置して少なくとも一つのアレイを形成する段階；ならびに
（ｂ）前記第１および第２レパートリーの前記構成員の交差部での生成物形成を検出する段階
を有することを特徴とする方法。
【請求項３７】
各種細胞群を各種ウィルス群に対してスクリーニングして、前記細胞群に感染するウィルス群を確認する方法において、
（ａ）実質的に全ての前記各種細胞画分が実質的に全てのウィルス群と並置されるよう、前記細胞群および前記ウィルス群を配置して少なくとも一つのアレイを形成する段階；ならびに
（ｂ）前記細胞群に感染するウィルス群を検出する段階
を有することを特徴とする方法。
【請求項３８】
各種細胞画分を互いに対してスクリーニングして、他の細胞画分中の成分と相互作用する成分を含む細胞画分を確認する方法において、
（ａ）全ての前記各種細胞画分が互いに並置されるよう、前記細胞画分を配置して少なくとも一つのアレイを形成する段階；ならびに
（ｂ）前記各種細胞画分の交差部での相互作用を検出する段階
を有することを特徴とする方法。
【請求項３９】
各種細胞群を互いに対してスクリーニングして、他の細胞群と相互作用する細胞群を確認する方法において、
（ａ）実質的に全ての前記各種細胞画分が互いに対して並置されるように、前記細胞群を配置して少なくとも一つのアレイを形成する段階；ならびに
（ｂ）前記各種細胞群の交差部での相互作用を検出する段階
を有することを特徴とする方法。
【請求項４０】
ペプチドレパートリーを同じペプチドレパートリーに対してスクリーニングして、前記ペプチドレパートリーの他の構成員と相互作用するペプチドレパートリーの構成員を確認する方法において、
（ａ）前記ペプチドレパートリーの実質的に全ての構成員が互いに対して並置されるように、前記ペプチドレパートリーの前記構成員を配置して少なくとも一つのアレイを形成する段階；ならびに
（ｂ）前記ペプチドレパートリーの前記各種構成員の交差部での相互作用を検出する段階
を有することを特徴とする方法。
【請求項４１】
ポリペプチドレパートリーを同じポリペプチドレパートリーに対してスクリーニングして、前記ポリペプチドレパートリーの他の構成員と相互作用するポリペプチドレパートリーの構成員を確認する方法において、
（ａ）前記ポリペプチドレパートリーの実質的に全ての構成員が互いに対して並置されるように、前記ポリペプチドレパートリーの前記構成員を配置して少なくとも一つのアレイを形成する段階；ならびに
（ｂ）前記ポリペプチドレパートリーの前記各種構成員の交差部での相互作用を検出する段階
を有することを特徴とする方法。
【請求項４２】
酵母２−ハイブリッド系を用いて、互いに相互作用する分子レパートリーの構成員を確認する請求項１、４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
一連の交差する線、チャンネルまたは管を用いて前記アレイを形成する請求項３６ないし４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
ポリペプチドの第２レパートリーの実質的に全ての構成員とペアとなったポリペプチドの第１レパートリーの実質的に全ての構成員からなるコンビナトリアルライブラリーの形成（および場合によりスクリーニング）方法において、
（ａ）前記第１のレパートリーの実質的に全ての構成員を含む細胞が、前記第２のレパートリーの実質的に全ての構成員に相当するヌクレオチド配列と交差するように、複数のヌクレオチド配列（それぞれが前記第１のレパートリーの異なるポリペプチド構成員をコードすることができる）および複数のヌクレオチド配列（それぞれが前記第２のレパートリーの異なるポリペプチド構成員をコードすることができる）を配置してアレイを形成する段階；および
（ｂ）前記２種類のレパートリーが交差する場所で、前記第１のレパートリーの前記ヌクレオチド構成員を含む細胞を、前記第２のレパートリーの構成員をコードするヌクレオチド配列でトランスフォームする段階；および場合によって
（ｃ）前記ヌクレオチド配列を発現させて、前記第１および第２のレパートリーの相当するポリペプチドを産生させる段階；および場合によって、
（ｄ）前記第１および第２レパートリーのポリペプチド構成員間の相互作用を検出する段階
を有することを特徴とする方法。
【請求項４５】
ポリペプチドの第２レパートリーの全構成員とペアとなった、ポリペプチドの第１レパートリーの全構成員からなるコンビナトリアルライブラリーの形成（および場合によりスクリーニング）方法において、
（ａ）複数のヌクレオチド配列からなる第１のレパートリー（各配列が前記第１のレパートリーの異なるポリペプチド構成員をコードすることができる）および複数のヌクレオチド配列からなる第２のレパートリー（各配列が前記第２のレパートリーの異なるポリペプチド構成員をコードすることができる）を、前記第１のレパートリーの実質的に全ての構成員が前記第２のレパートリーの実質的に全ての構成員と交差するように配置してアレイを形成する段階；および
（ｂ）前記第１および第２レパートリーの両方の構成員でトランスフォーム可能な宿主細胞と、（ａ）で形成されたアレイとを接触させる段階；および場合によって
（ｃ）前記ヌクレオチド配列を発現させて、前記宿主内部に前記第１および第２のレパートリーの相当するポリペプチドを産生させる段階；および場合によって、
（ｄ）前記によって形成されたアレイを用いて、前記第１および第２レパートリーの構成員の存在を必要とする機能的アッセイを行う段階
を有することを特徴とする方法。
【請求項４６】
ポリペプチドの第２レパートリーの実質的に全ての構成員とペアとなったポリペプチドの第１レパートリーの実質的に全ての構成員からなるコンビナトリアルライブラリーの形成（および場合によりスクリーニング）方法において、
（ａ）前記第１のレパートリーの実質的に全てのヌクレオチド構成員を含む細胞が、前記第２のレパートリーの実質的に全てのヌクレオチド構成員を含むウィルスと交差するように、複数のヌクレオチド配列（それぞれが前記第１のレパートリーの異なるポリペプチド構成員をコードすることができる）を含む宿主細胞のレパートリーおよび複数のヌクレオチド配列（それぞれが前記第２のレパートリーの異なるポリペプチド構成員をコードすることができる）を含む複数のウィルスを配置してアレイを形成する段階；および
（ｂ）前記２種類のレパートリーが交差する場所で、前記第１のレパートリーの前記ヌクレオチド構成員を含む細胞を、前記第２のレパートリーのヌクレオチド構成員を含むウィルスに感染させる段階；および場合によって
（ｃ）前記ヌクレオチド配列を発現させて、前記第１および第２のレパートリーの相当するポリペプチドを産生させる段階；および場合によって、
（ｄ）前記第１および第２レパートリーのポリペプチド構成員間の相互作用を検出する段階
を有することを特徴とする方法。
【請求項４７】
ポリペプチドの第２レパートリーの、実質的に全ての構成員とペアとなった、ポリペプチドの第１レパートリーの、実質的に全ての構成員からなる酵母２ハイブリッドライブラリーの形成（および場合によりスクリーニング）方法において、
（ａ）前記第１のレパートリーの実質的に全てのヌクレオチド構成員を含む酵母細胞が、前記第２のレパートリーの実質的に全てのヌクレオチド構成員を含む酵母細胞と交差するように、複数のヌクレオチド配列（それぞれが前記第１のレパートリーの異なるポリペプチド構成員をコードすることができる）を含む酵母細胞および複数のヌクレオチド配列（それぞれが前記第２のレパートリーの異なるポリペプチド構成員をコードすることができる）を含む酵母細胞を配置してアレイを形成する段階；および
（ｂ）前記２種類のレパートリーが交差する場所で、前記第１のレパートリーの構成員を含む酵母細胞を、前記第２のレパートリーの構成員を含む酵母細胞と交配させる段階；および場合によって
（ｃ）前記ヌクレオチド配列を発現させて、前記第１および第２のレパートリーの相当するポリペプチドを産生させる段階；および場合によって、
（ｄ）前記第１および第２のレパートリーのポリペプチド構成員間の相互作用を検出する段階
を有することを特徴とする方法。
【請求項４８】
前駆体の２種類（またはそれ以上）のレパートリーからなるコンビナトリアルケミカルライブラリーを形成（および場合によりスクリーニング）することで、第１の化学前駆体レパートリーの実質的に全ての構成員を第２の化学前駆体レパートリーの実質的に全ての構成員とともに組み立てる方法において、
（ａ）前記第１の化学前駆体レパートリーの実質的に全ての構成員が第２の化学前駆体レパートリーの実質的に全ての構成員と並置されるように、前記第１および第２の化学前駆体レパートリーを配置してアレイを形成する段階；および
（ｂ）前記第１の化学前駆体レパートリーの構成員と前記第２の化学前駆体レパートリーの構成員とを組み立てて、新規化合物の組み合わせアレイを形成する段階；および場合によって
（ｃ）何らかの生物学的相互作用について前記新規化合物アレイをスクリーニングする段階
を有することを特徴とする方法。
【請求項４９】
一連の交差する線、チャンネルまたは管を用いて前記アレイを形成する請求項４４ないし４７のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
各線、チャンネルまたは管が前記レパートリーの特定の構成員に結合しやすくなるように、タグ付けシステムによってアレイ中での前記レパートリーの構成員の位置が方向付けされる請求項１ないし４９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、２以上の分子レパートリーを互いに対してスクリーニングしたり、かつ／または２以上のレパートリーを組み合わせることで組み合わせレパートリーを形成およびスクリーニングしたりするのに用いることができる方法に関する。詳細には本発明は、２種類の分子レパートリーをスクリーニングするのに、第１のレパートリーの実質的に全ての構成員（ｍｅｍｂｅｒ）を、機能的相互作用に関して第２のレパートリーの実質的に全ての構成員に対して調べることができる方法に関する。さらに本発明は、重鎖のレパートリーを軽鎖のレパートリーと組み合わせることで、重鎖と軽鎖の実質的に全ての組み合わせによって形成される抗体を１以上の標的リガンドに対してスクリーニングすることができるようにする抗体レパートリーの形成およびスクリーニングに関する。
【０００２】
発明の背景
各種ゲノムのマッピングおよび配列決定によって、最終的にこれらの生物が発現する全てのタンパク質のクローニングが行われる。これらのタンパク質の相互作用マップを作成するためには、２次元的スクリーニングを行って、全てのタンパク質の、全ての他のタンパク質に対する結合を調べることができるようにする必要がある。
【０００３】
２次元スクリーニングは、他の多くの利用分野でも必要とされる。例えば、モノクローナル抗体の産生と組み合わせたマウス免疫感作などの方法ならびにファージディスプレイなどのｉｎ ｖｉｔｒｏ選択方法を用いて、同時に多くの異なる標的に対して多くの異なる抗体が作製されている。どの抗体がどの標的に結合するかを確認するためには、これらの集合についてデコンボリューション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）を行う必要があり、それには複雑なスクリーニング法が必要とされる。
【０００４】
さらに、治療用に低分子の薬物をヒト標的に対し得ようとする場合、あるヒトタンパク質が推定候補薬剤に結合する度合だけでなく、その候補薬剤の他のヒトタンパク質との交差反応（それがある場合）の度合、または他の関連薬剤がより良好な結合剤であるか、および／または相対的に交差反応性が低いか否かも確認することは有用であると考えられる。
【０００５】
上記の例はいずれも、分子の第１の集合（またはレパートリー）の構成員間の相互作用を、分子の第２の集合（またはレパートリー）の全ての構成員に対して迅速に調べることができる方法を必要とする。現在のところそのようなスクリーニングは一般に、試薬の組み合わせを区画されたウェルに分配するか、あるいは膜上のスポットの形で互いの上に分配して、試験対象の全ての試薬組み合わせが別個のウェル／スポットに存在するようにすることで行われる。従って、１００種類の分子のレパートリーを、やはり１００種類の分子からなる異なるレパートリーに対して試験するとした場合、それら２種類のレパートリーの構成員の全ての組み合わせを完全に網羅するためには、１００００個のウェル／スポットが必要となると考えられる。そのような不連続に配置された組み合わせを形成するには、２成分相互作用の場合、相互作用を誘発または検出するのに必要と考えられる分配作業以外に、存在するウェルまたはスポットの２倍の分配「作業」、この場合には２００００回の作業が必要になると考えられる。各レパートリー中の構成員数が直線的に増えるに連れて、組み合わせの数とそれに伴って分配作業数は指数関数的に増える。実際に、例えば１００種類のみの抗体重鎖のレパートリー、１００種類のみの抗体軽鎖のレパートリー、および１００種類のみの抗原候補物のレパートリーが関与する３成分相互作用の場合、１００万回もの「分配」作業が必要になると考えられる。
【０００６】
発明の概要
本発明者らは、２種類の分子レパートリー中の全構成員間での、全ての可能な相互作用を調べるのに用いることができる、本発明者らがマトリクススクリーニングと称している方法であって、これらのレパートリーの構成員個々の組み合わせを区画化する必要性をなくす方法を開発した。
【０００７】
本発明の第１の態様によれば、第１の分子レパートリーを第２の分子レパートリーに対してスクリーニングして、前記第２のレパートリーの構成員と相互作用する前記第１のレパートリーの構成員を確認する方法において、
（ａ）前記第１のレパートリーの実質的に全ての構成員が前記第２のレパートリーの実質的に全ての構成員と並置されるように、少なくとも一つのアレイを形成するよう、前記第１および第２のレパートリーを配置する段階；ならびに
（ｂ）前記第１のレパートリーと前記第２のレパートリーの構成員間での相互作用を検出する段階
を有することを特徴とする方法が提供される。
【０００８】
最も広い形態において本発明は、２種類の分子レパートリーを互いに対してスクリーニングする方法を提供する。その２種類のレパートリーの個々の構成員は、両方のレパートリーの構成員の実質的に全ての組み合わせの並置が可能となるように空間配置する。本明細書で「実質的に全ての組み合わせ」（または「実質的に全ての構成員」）に言及する場合にそれは、ある種の並置が偶然や設計によって起こり得ないことを排除しないものであることは明らかである。しかしながら本発明は、２種類の分子レパートリーを互いに対して同時にスクリーニングすることを必要とし、単一のレパートリーを第２のレパートリーの個々の構成員でスクリーニングすることを除外するものである。好ましくは「実質的に全ての」とは、レパートリー構成員の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を指す。
【０００９】
本発明によれば並置は、例えば、２つのレパートリーのそれぞれについて互いに交わる一連の線を形成することで達成できる。それらの線は、直線、実質的に平行な線または曲線、あるいはそれらの組み合わせであることができる。唯一の制限は、第１のレパートリーの実質的に全ての構成員が第２のレパートリーの実質的に全ての構成員と交差できるようにしなければならないという点である。相補的構成の例としては、平行直線に対してある角度で配置された平行直線；星型の放射状線とともに使用される同心円または多角形などがある。当業者であれば、本発明に従って、レパートリー構成員を同様に空間配置させるためのその他多くのシステムを想起するであろうが、それらはいずれも、何らかの形の第１のレパートリーの各構成員に相当する連続線、流線、チャンネルまたは流れであって、そのうちの実質的に全てが第２のレパートリーの実質的に全ての構成員に相当する実質的に全ての線、流線、チャンネルまたは流れと交差することができるような配分により特徴づけられたものである。それには、第２のレパートリーの管と交差する、第１のレパートリーの各構成員に対する管、あるいは個々のレパートリー構成員が流れることができる固体材料に切り込まれたチャンネルなどがある。
【００１０】
従って本発明の第２の態様によれば、前記第１レパートリーおよび前記第２レパートリーの両方の構成員を、それぞれが前記第１または前記第２のレパートリーの構成員を含む一連の線、チャンネルまたは管に配置して、前記第１のレパートリーに相当する線、チャンネルまたは管と前記第２のレパートリーに相当するものが互いに接触して、前記第１のレパートリーの実質的に全ての構成員が前記第２のレパートリーの実質的に全ての構成員と並置されるようにする方法が提供される。
【００１１】
本発明の文脈において「一つの」構成員は、ただ一つの構成員または少なくとも一つの構成員を意味することができる。有利にはそれは、ただ一つの構成員を指す。しかしながら別の態様では本発明はさらに、各線、チャンネルまたは管における、レパートリーの複数構成員からなる群の使用をも提供するものである。好ましくはそのような群は、１０以下の構成員、有利には５以下の構成員からなるものであるが、少なくとも２個の構成員を有する。
【００１２】
先行技術における区画されたコンビナトリアルスクリーニングと比較した本発明による交差する線、チャンネル、流線または流れの使用の利点は、個々のレパートリーのサイズが直線的に大きくなるにつれ、レパートリー構成員の全ての組み合わせをスクリーニングするのに必要とされる分配段階の数も直線的に増えるという点である。例えば、ウェルを用いるスクリーニング法では１００×１００のレパートリーをスクリーニングするのに１００００回の分配段階が必要になると考えられるが、本発明によるスクリーニングでは、わずか２００回の分配段階が必要なだけである。さらに、１回の分配作業を行うことで各レパートリーの各構成員を空間的に配置することから、第１のレパートリーの個々の構成員と並置された第２のレパートリーの構成員との間の相互作用の比較がより正確になる。さらに、本発明はスポットではなく交差線を使用したり、あるいはウェルではなく交差チャンネルを使用することから、可能な相互作用の実質的に全ての組み合わせについて試験を行うのに、さほど高い位置的な正確性は要求されない。すなわち、２次元スクリーニングを行う場合であって、第１のレパートリーの１構成員に相当する１本の線が例えば１ｍｍだけずれている場合、その線は第２のレパートリーからの実質的に全ての線に対してある角度を形成して配置されていることから、その線はなおも実質的に全ての線と交差しており、従って相互作用の実質的に全ての組み合わせについて試験が良好に行われる。他方、第１のレパートリーの１構成員に相当するスポットが例えば１ｍｍだけずれている場合、それらは第２のレパートリーの構成員に相当するスポットから完全にはずれる可能性があることから、多くの組み合わせの相互作用の試験が行われなくなる。従って本発明は、自動スクリーニング方法だけでなく、位置的正確さが保証できず、分配作業の数を制限しなければならない手動法にも好適である。
【００１３】
以上説明したように、線、チャンネルまたは管は多様な形式で配置することができ、単一の支持体上または複数の支持体上に配置することができる。最も簡単な構成では、分子を単一の支持体上、例えばニトロセルロース膜上に線の形態で手動により引くことができる。それらの線は、ロボット技術を用いて好適な支持体に施すこともでき、それによってアレイの正確さおよび密度を本発明で非常に有利な程度に高めることができる。本発明の有利な態様では、複数支持システムを用いることができ、その場合には、線のアレイを別個の支持体上に設け、次にそれらの支持体を並置することで、レパートリーの構成員間における相互作用を評価することができる。
【００１４】
従って本発明の第３の態様では、第１の分子レパートリーを第２の分子レパートリーに対してスクリーニングして、第２レパートリーの１以上の構成員と相互作用する、第１レパートリーの１以上の構成員を確認する方法において、
（ａ）第１および第２の支持体上に第１および第２のレパートリーを配置する段階；
（ｂ）前記第１のレパートリーの実質的に全ての構成員が前記第２のレパートリーの実質的に全ての構成員と並置されるように、前記第１の支持体と前記第２の支持体を並置させる段階；ならびに
（ｃ）前記第１のレパートリーと前記第２のレパートリーの構成員間の相互作用を検出する段階
を有することを特徴とする方法が提供される。
【００１５】
本発明はまた、より高次のアレイ、例えば３次元アレイにも適用可能である。そこで、酵素、基質および補因子などの３成分相互作用を、３次元的に配置された線、チャンネルまたは管を用いてスクリーニングすることができる。別の形態では、３成分は抗体重鎖、抗体軽鎖および抗原であることができると考えられ、それらのレパートリーを３次元でスクリーニングすることができる。本発明による２次元、３次元またはそれより高い次元でのレパートリーのスクリーニングは、包括的なコンビナトリアルスクリーニングを行うことが必要と考えられる分配（またはピペット注入）作業の数が減ることから非常に有利である。すなわち、先行技術における従来の方法を用いる、例えば３００種類の構成員からなる２種類のレパートリーの互いに対するスクリーニングでは、少なくとも９００００回の個別の分配作業が必要になると考えられ、例えば３００種類の構成員からなる３種類のレパートリーの互いに対するスクリーニングでは、少なくとも２７０万回の分配作業が必要になると考えられる。それに対して本発明では、同じレパートリーを包括的にスクリーニングするための分配作業数がそれぞれ６００回または９００回まで減らせ、時間および労力の大幅な削減となる。
【００１６】
従って本発明の第４の態様によれば、第１、第２および第３の分子レパートリーを互いに対してスクリーニングして、相互作用する前記第１、第２および第３のレパートリーの構成員を確認する方法において、
（ａ）前記第１、第２および第３のレパートリーを少なくとも一つのアレイを形成するように配置して、前記第１、第２および第３のレパートリーの実質的に全ての構成員が並置されるようにする段階；ならびに
（ｂ）前記第１、第２および第２のレパートリーの構成員間の相互作用を検出する段階
を有することを特徴とする方法が提供される。
【００１７】
多次元アレイは、多くの方法で作製することができる。有利には、第３の次元は、フィルターやその他のそのような膜を積み重ねて分子を移動させる毛細管作用を利用することで、あるいは、電気泳動もしくは浸透などの手段によって積層物に強制的に分子を通すことで、あるいは積層物を貫通させることで、あるいは積層物を形成する浸透性フィルターを用いることにより形成される。
【００１８】
さらに第３の次元は、チャンネルの交差部に（第１および第２のレパートリーの場合）、孔を有してその孔が（ひとたび膜を積層すると）第３のレパートリーの構成員が通過できる第３次元の付加的なチャンネル集合を形成するような非透過性層を積層することにより形成することができる。
【００１９】
さらに別の実施形態では、前記第３の次元は、ゲルまたは類似のそのような物質のブロックを用いて形成することができ、それはｘ面、ｙ面およびｚ面に沿ってそれぞれ第１、第２および第３のレパートリーの構成員を注入することが可能で、そのようにして３次元空間にアレイを形成するチャンネルを形成することができる。
【００２０】
さらに、第１、第２（そして場合により第３）の分子レパートリーの構成員間の相互作用マトリクスを、互いに隣接して配置された交差管または半透過管のネットワークを用いて形成することができる。
【００２１】
第１、第２（および場合によって第３）の分子レパートリーの構成員は、同じレパートリーからの異なる構成員と置き換えて、相互作用の新たな組み合わせや集合をスクリーニングすることができる。
【００２２】
本発明を用いて多成分および多鎖の相互作用を迅速にスクリーニングすることができることから、それを、例えば、抗体もしくはＴ細胞受容体ライブラリーなどの分子のコンビナトリアルライブラリーの同時形成およびスクリーニングに適用することもできる。すなわち、重鎖および軽鎖の遺伝子を組み合わせることで抗体の広範なコンビナトリアルライブラリーを形成し、得られる対合を別個にスクリーニングする代わりに、対合自体を本発明に従って形成し、場合によって１以上の標的抗原に対してスクリーニングすることができる。そこで例えば、１０００種類の重鎖を１次元で線として引くことができると考えられ、１０００種類の軽鎖を別の次元で線として引いて、実質的に全ての重鎖線が実質的に全ての軽鎖線と交差して、その交差部において完全に機能を有し折り畳まれた抗体分子を形成することができ、それを次に並置させた抗原、例えばその交差する重鎖線および軽鎖線と接触するようになるさらに別の支持体上にコーティングされたものでスクリーニングすることができる。この実施形態によれば、１０００種類の重鎖および１０００種類の軽鎖の実質的に全ての組み合わせ、すなわち計１００万種類の異なる抗体は、先行技術のスクリーニング法に従えば使用しなければならないと考えられる１００万回ではなく、わずか２０００回の分配作業を用いてスクリーニングされる。これによって、特異的相互作用についての「単純な」スクリーニングを行う迅速な方法が提供される。そこで例えば、構成員（またはいずれかの関連する構成員）がある標的抗原（またはそれらの関連する標的抗原）と接触したことがないかそれに対して選択されたことがない重鎖のレパートリーおよび軽鎖のレパートリーを、標的抗原に対してスクリーニングして、特異的結合性重鎖および軽鎖の対合を確認することができる。
【００２３】
そこで本発明の第５の態様では、それぞれが第１のレパートリーの１構成員および第２のレパートリーの１構成員を有する二本鎖ポリペプチドのコンビナトリアルライブラリーを形成およびスクリーニングする方法において、
（ａ）第１および第２のレパートリーを配置して、前記第１のレパートリーの実質的に全ての構成員が前記第２のレパートリーの構成員に対して並置されるように少なくとも一つのアレイを形成することで、機能的な二本鎖ポリペプチドの実質的に全ての組み合わせを設ける段階；ならびに場合により
（ｂ）前記二本鎖ポリペプチドと標的分子との間の相互作用を検出する段階
を有することを特徴とする方法が提供される。
【００２４】
好ましくは、前記コンビナトリアルライブラリーは、抗体もしくはＴ細胞受容体ライブラリーであり、前記２種類のレパートリーは重鎖および軽鎖（抗体ライブラリーの場合）またはα鎖およびβ鎖（Ｔ細胞受容体ライブラリーの場合）からなる。
【００２５】
そのようにして得られるコンビナトリアルライブラリーについて、好ましくは複数の標的分子との相互作用のスクリーニングを行う。そうして、標的分子を標的分子の群またはそれのレパートリーの形で提供し、本明細書に記載の３次元アレイにおいてスクリーニングすることができる。
【００２６】
好ましくは、本発明による方法を用い、３次元で第１、第２および第３の分子レパートリーを用いて３本鎖ポリペプチドライブラリーを形成する（そして場合によりスクリーニングする）ようにすることができる。
【００２７】
第１、第２（および場合によって第３）のレパートリー間の相互作用のパターンを用いて、陽性相互作用、陰性相互作用、特異的相互作用または交差反応相互作用を確認したり、あるいは第１のレパートリー（第２および／または場合により第３のレパートリーとの相互作用パターンを用いて）、第２のレパートリー（第１および／または場合により第３のレパートリーとの相互作用パターンを用いて）および／または第３のレパートリー（構成員第１および／または第２のレパートリーの構成員との相互作用パターンを用いて）の構成員間の類似性を推定する系統樹を構築することができる。
【００２８】
本発明に従ってスクリーニングされる相互作用の多くに、核酸配列の発現によって直接または間接的に誘導されたポリペプチドが含まれることから、その核酸自体を本発明による線、チャンネルまたは管に配置し、発現させて、それらに相当するポリペプチドを産生させることが非常に有利である。そのようにして、前記２種類のレパートリーのそれぞれからの交差するポリペプチドが一緒に発現される。特に、例えば抗体の場合のように、２種類のレパートリー構成員の会合が協同的折り畳みに依存している場合に、このことはそれらの会合に役立ち得る。さらに、レパートリー構成員の相互作用に関する情報が、それらをコードする遺伝子情報と空間的に連結される。その遺伝子情報は、相互作用の座標を計算し、それの線、チャンネルまたは管上のいずれかの点からの相当するヌクレオチド配列データを取り出すか、あるいは交差部自体からのヌクレオチド配列データを取り出すことで確認することができる。
【００２９】
従って本発明の第６の態様では、第１、第２および場合によって第３のレパートリーの１以上が、アレイにおいて、相当するポリペプチドをｉｎ ｓｉｔｕで産生するために発現される複数の核酸分子を有するようにする方法が提供される。
【００３０】
本発明は２以上のレパートリーの互いに対する迅速かつ効率の良いスクリーニングに関するものであることから、現在使用されている分子相互作用を促進または妨害する方法を本発明とともに用いることができる。そこで、一方のレパートリーは遊離ハプテンの変種からなることができ、他方のレパートリーは選択抗ハプテン抗体からなることができる。両方のレパートリーを固定化型の標的ハプテン分子の近位に配置することで、スクリーニングを行って、ある種の遊離ハプテン変種に結合することで固定化標的ハプテンへの結合に対し競合する抗体を確認することができる。この場合、結合がないことが陽性の結果と見なされるものと考えられる。そのような実験に対するコントロールには、その遊離ハプテンと平行な水の線および抗ハプテン抗体と平行な非ハプテン結合抗体の線などがあり得る。別の形態として、一つの遊離ハプテンを用いて、抗ハプテン抗体のレパートリー構成員の、異なる固定化ハプテン変種のレパートリーの構成員への結合を妨害することができると考えられる。他の第３の分子には、レパートリー構成員の相互の結合を促進し、それ自体を本発明によるレパートリーの形で用いることができる物質などがあると考えられる。そのようにして、標的分子を固体支持体に固定化することができると考えられ、結合剤および結合剤促進剤の交差するレパートリーを標的分子と接触させるようにすることができると考えられる。当業者には、そのような分子およびレパートリー構成員の多くの異なる組み合わせが想到されよう。
【００３１】
従って本発明の第７の態様では、第１の分子レパートリーを第２の分子レパートリーに対してスクリーニングして、互いとの相互作用が第３の分子または分子集合の有無によって決まる第１および第２のレパートリーの構成員を確認する方法において、
（ａ）第１および第２のレパートリーを配置して、前記第１のレパートリーの実質的に全ての構成員が前記第２のレパートリーの実質的に全ての構成員と並置されるように少なくとも一つのアレイを形成する段階；ならびに
（ｂ）各種濃度の前記第３の分子または分子集合の存在下に、前記第１のレパートリーの構成員と前記第２のレパートリーの構成員との間の相互作用を検出する段階
を有することを特徴とする方法が提供される。
【００３２】
本発明の方法は、非常に大きいレパートリーからの主要な標的および分子の最初の確認と治療介入用の標的または薬剤の最終的な確認との間のギャップに橋渡しをするものである。この問題は先行技術では、可能な陽性相互作用物のＥＬＩＳＡスクリーニングを用いることで対処される。しかしながらＥＬＩＳＡのプロトコールは、自動化して高スループットとするのは容易ではない。本発明による方法の非常に高い平行性は、各レパートリーの構成員についての包括的な相互作用プロファイルを明らかにするものである。それによって例えば、あるタンパク質ファミリー全体と相互作用するリガンドを、そのファミリーの部分集合のみと反応するものと識別することができ、交差反応薬剤を開発プログラムから除外することができ、抗体の真の特異性および交差反応性を確認することができる。抗体交差反応性、従ってその特異性の確認は、免疫感作マウスから、あるいは例えばファージディスプレイによって行われるｉｎ ｖｉｔｒｏ選択から派生した異なる抗体群がある場合に極めて重要である。マトリクススクリーニングは、それによって非常に広範囲の抗原を群内の各抗体に対して調べ、下流側の研究を妨害する未知で望ましくない交差反応の機会を低減することができることから、その文脈において特に強力である。
【００３３】
別の形態として、本発明を用いて大きい包括的なコンビナトリアルライブラリーを形成およびスクリーニングすることで、わずか２０００回の分配作業を用いて、１００万のクローン抗体ライブラリーを形成およびスクリーニングすることができると考えられる。さらに、豊富な相互作用ペア情報源から、あるいは可能性としては、本発明による非常に高密度のマトリクスとともに全プロテオームを用いることで、複雑なタンパク質−タンパク質相互作用マップを形成することができる。
【００３４】
本発明はさらに、ファージディスプレイおよび他の発現−表示法の重要な利点を有するものであり、すなわち、ポリペプチドレパートリーの構成員をコードする核酸をそれの相当するポリペプチドと空間的に会合させることができ、従って個々のポリペプチドの機能特性に基づいて選択することができる。しかしながら、表面にポリペプチドを示す細菌細胞を用いて核酸およびポリペプチドを区画することでその会合を達成するファージディスプレイとは異なり、本発明は、新規なアレイ形成戦略を利用して、その会合を提供するという長所を有する。核酸およびポリペプチドを細菌細胞内またはその表面に保持する必要性を排除することで本発明は、酵素活性、立体配置または他の検出可能な特性など、ポリペプチドの機能特性に基づいてポリペプチドレパートリーを選択するための結合活性の選択を超えて展開することができる。
【００３５】
上記のスクリーニングを行う上での試薬または手段に関連して、各種の装置を提供することができる。
【００３６】
定義
本発明に従って使用される「レパートリー」という用語は、例えばアミノ酸配列が異なる多様なポリペプチド変種の群、ヌクレオチド組成および／または配列が異なるＤＮＡ変種の群、あるいは多くの異なる形態で存在し得る他の種類の分子の群を指す。一般にはレパートリーには、１０を超える異なる変種が含まれる。大きいレパートリーは、選択に供される非常に多くの数の可能な変種を含み、１０１３の大きさになる場合がある。比較的小さいレパートリーは、特にそれが予め選択されて、特に有用な小群（例えば、細胞表面マーカーに結合する抗体、ある種の反応群を触媒する酵素、他のタンパク質に結合するタンパク質など）を富化している場合、あるいは望ましくない構成員（停止コドンを有するもの、正しい折り畳みを行うことができないもの、あるいは他の形で不活性なものなど）を除去している場合に特に有用である。そのような比較的小さいレパートリーは、１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６またはそれ以上のポリペプチドを有することができる。有利には、比較的小さいレパートリーは、１０〜１０４のポリペプチドを有する。
【００３７】
本発明では、ポリペプチドの２以上のレパートリーを互いに対してスクリーニングする。有利には、構成員または各レパートリーの少なくとも５０％を各スクリーニングで互いに対してスクリーニングする。好ましくは、各レパートリーの構成員の６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％をそのようにスクリーニングする。
【００３８】
本発明の文脈において「相互作用する」とは、各種レパートリーを構成する分子（および適宜、スクリーンを構成する別の分子）間の検出可能な相互作用を指す。例えば抗体−抗原相互作用の場合、一方のレパートリーは多様な抗体群を含み、他方は多様な抗原群を含み、その相互作用は結合相互作用であるものと考えられる。別の形態として相互作用は、一方のレパートリーが酵素からなり、他方のレパートリーがそれらの基質からなる酵素触媒反応であることができる。本発明を用いて、結合相互作用、ＤＮＡメチル化、核酸分解、核酸開裂（１本鎖または２本鎖）、シグナル伝達事象、触媒反応、リン酸化事象、グリコシル化事象、タンパク質分解開裂、化学反応、細胞感染およびそれらの組み合わせなどの相互作用についてアッセイを行うことができる。そのような相互作用の検出は、当業界では公知である。
【００３９】
本発明の文脈において「分子」とは、スクリーニングに使用することができる物質を指す。そのような分子には、ペプチド、ポリペプチド、核酸分子、精製タンパク質、組換えタンパク質、アミノ酸、ｃＤＮＡ、発現ｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁物、関連する遺伝子のファミリーまたはそれの相当するタンパク質、酵素、ＤＮＡ結合タンパク質、免疫グロブリンファミリーの構成員、抗体、Ｔ細胞受容体、ハプテン、小有機分子、非有機化合物、金属イオン、炭水化物およびこれらの組み合わせなどがあり得る。そのような分子のレパートリー形成は当業界では公知である。「ポリペプチド」とは、発現ｃＤＮＡ、免疫グロブリンスーパーファミリーの構成員、抗体ポリペプチドまたはＴ細胞受容体ポリペプチドなどのポリペプチドを意味することができる。有利には抗体レパートリーは、予め組み立てられまたは組み立てられ、本発明に従ってスクリーニングされる重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の両方のポリペプチドを含むレパートリーを含むことができる。本明細書で使用される抗体ポリペプチドとは、修飾または未修飾の抗体または抗体の一部であるポリペプチドである。従って、抗体ポリペプチドという用語には、重鎖、軽鎖、重鎖−軽鎖二量体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ′）２断片、Ｄａｂ断片、軽鎖もしくは重鎖単一ドメインおよび１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）もしくはジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）などのＦｖ断片などが含まれる。そのような抗体分子およびそれをコードする核酸の構築方法は、当業界では公知である。しかしながら「ポリペプチド」は、酵素、抗原、薬物、受容体分子などの細胞シグナル伝達に関与する分子あるいは標的分子と相互作用することができる比較的大きいポリペプチドの１以上の個々のドメインなどの他のポリペプチドを指すことができる。本発明による分子は、上記のような分子を産生する細胞の形での細胞形で、あるいは細胞内に含まれない非細胞形で提供することができる。細胞は例えば、細菌細胞、下等真核細胞（例：酵母）または高等真核細胞（例：昆虫細胞、両生類細胞、鳥類細胞または哺乳類細胞）であることができる。酵母細胞の使用も想到される。
【００４０】
本発明の文脈において、「細胞群」という用語は、細胞の集合を指す。細胞群を含む細胞は、全て同一の生物種および細胞種であることができるか、あるいは混合群であることができる。細胞群の１実施形態は、例えば所定の遺伝子コード配列の変種をコードするライブラリーでトランスフォームされた哺乳動物線維芽細胞などの実質的に均一な細胞群を含む。
【００４１】
本発明の文脈において、「ウィルス群」という用語は、ウィルス粒子の集合を指す。ウィルス群を含む粒子は、全てが同一の生物種および株のものであることができるか、あるいは混合群であることができる。ウィルス群の１実施形態は、例えばレトロウィルス粒子などの組換えまたはランダム突然変異粒子の群を含む。ウィルス群は、１以上の遺伝子コード配列の変種を有する複数の個体を含むことができる。
【００４２】
本発明の文脈における「並置」には物理的接触が含まれるが、それに限定されるものではない。本発明による２以上のレパートリーを、レパートリーの構成員間の相互作用部位をその位置に関連付けることができるような形で、分子が互いに相互作用することができるよう並置することができる。別の形態として、レパートリーをお互いに、および標的分子と並置して、レパートリーの構成員が互いに相互作用し、その後一体となって標的分子と相互作用するようにすることができる。
【００４３】
本明細書で言及される「アレイ」とは、レパートリー構成員の所定の空間配置である。アレイはいかなる物理的形態を取ることもできる。アレイは、手動または自動化された手段によって作製することができ、好ましいアレイ作製法についてはさらに後述する。
【００４４】
「分配作業」は、ある物質をある個別の場所から第２の個別の場所に移動させる単一作業である。個別の場所は、ウェル、管、チャンネル、スポット、線、矩形、球形、立方体などの形態であることができる。単一分配作業の例には、
（ｉ）ある管もしくはウェルから第２の管もしくはウェルへの液体のピペット注入（この場合、同一液体の少量サンプルの、複数の管またはウェルへのピペット注入は、２以上の異なる液を同一の管またはウェルに分配する場合のように、複数の分配作業と見なされるものと考えられる）；あるいは、
（ｉｉ）ピン移動によって原液ウェルから膜に液体を移動させて、その液のスポットを形成すること（この場合、同一原液ウェルからの、膜上の異なる接種位置への第２の少量サンプルのスポット形成は、別個の分配作業と見なされると考えられる）；あるいは
（ｉｉｉ）単一の原液ウェルから液体を移動させて、膜上に１本の連続線を形成すること（この場合、同じ液体のものであっても第２の別の線を形成することは、別個の分配作業と見なされるものと考えられる）；あるいは
（ｉｖ）管またはチャンネルへの溶液の滴下分配（この場合、同一の管もしくはチャンネルへの異なる液の滴下分配、または異なる管もしくはチャンネルへの同一液の滴下分配は、別個の分配作業と見なされると考えられる）などがある。
【００４５】
本発明の文脈における「マトリクス」とは、２以上の分子レパートリーにおける実質的に全ての構成員間の実質的に全ての可能な相互作用を調べるのに用いることができる、特定の種類のアレイである。そのようなマトリクスは、それぞれがレパートリーの１以上の構成員を有する一連の交差する線、チャンネルまたは管を有することができる。一つのマトリクスは、多くの個々の線、チャンネルまたは管ならびにさらに多くの交差部または交点を有する。
【００４６】
本明細書で使用される「促進」という用語は、所定の分子または複数の分子の存在下で、その分子または複数分子が存在しない場合の相互作用と比較して、検出される相互作用が少なくとも１０％増加することを意味する。
【００４７】
本明細書で使用される「妨害」という用語は、所定の分子または複数の分子の存在下で、その分子または複数分子が存在しない場合の相互作用と比較して、検出される相互作用が少なくとも１０％低減することを意味する。
【００４８】
本明細書で使用される「細胞画分」という用語は、細胞分画工程から得られる細胞溶解物の一部を意味する。細胞分画法の非限定的な例としては、界面活性剤抽出、塩抽出、酸沈殿、脂溶性成分の抽出、膜単離、水溶性成分または水系成分の抽出、核／細胞質分画および遠心力による分離（例：Ｓ−１００画分）などがある。細胞分画法と見なされる他の分離には、核酸単離、細胞溶解物もしくは分画細胞溶解物の成分のクロマトグラフィー分離、分取電気泳動分画、イオン交換およびアフィニティ分離（例：免疫沈殿または免疫アフィニティクロマトグラフィー、Ｈｉｓ／Ｎｉ＋＋相互作用、ＧＳＴ／グルタチオン相互作用など）などがある。
【００４９】
図面の簡単な説明
図１：数百の異なる抗体を数百の異なる抗原に対して同時にスクリーニングして相互作用するペアを確認できると考えられる方法を示す、本発明による抗体レパートリーを抗原レパートリーに対してスクリーニングする１方法の概略。特異的相互作用を図示してある。
【００５０】
図２：手動で作成したマトリクスを用いるｓｃＦｖ類の分析。この図では、２１種類の抗原（横方向）を１６種類のｓｃＦｖ（縦方向）に対してスクリーニングする。４種類のｓｃＦｖが、ファージ選択によりユビキチンに対して選択されている（Ｕｂ１ｂ１、Ｕｂ１ａ１、Ｒ１３およびＲ１４）。２種類の抗原クローン（ＱおよびＴ）がユビキチンであることが知られており、５種類の他のクローン（Ａ、Ｐ、Ｒ、ＳおよびＵ）がおそらく抗ユビキチンｓｃＦｖと結合することが一次スクリーニングで確認されている。この４種類の抗ユビキチンｓｃＦｖのそれぞれが、２種類の既知ユビキチンクローンおよび前記５種類の潜在的なユビキチンクローンの各々と結合する。しかしながら、ｓｃＦｖ Ｕｂ１ｂ１およびｓｃＦｖ Ｒ１４の交差反応性が非常に高いことがわかる。
【００５１】
図３：ｘ、ｙおよびｚ次元での動きを可能とするロボットプラットホームに搭載されるよう設計された本発明によるロボット線引き用ヘッド。１列の万年筆ペン先が懸濁液中のレパートリー構成員を毛細管現象によって好適な固体支持体上に送達する。ペン先は、固体支持体に対して至適な角度で液体を送達するように取り付けられており、次いで９６ウェルマイクロタイタープレートからの液体吸い上げを停止することにより垂直に保持される。
【００５２】
図４：ロボットによって作成されたマトリクスを用いるｓｃＦｖの分析。１２種類の抗原の二重線（横方向）を、１９２種類のｓｃＦｖ（縦方向）に対してスクリーニングする。特異的ペア形成の起こる交差部で特異的相互作用を認めることができる。さらに、ニトロセルロースと交差反応するｓｃＦｖが、実質的に全ての抗原と交差反応するｓｃＦｖと同様に、連続した横線として認められる（横方向のスポット形成）。
【００５３】
図５：２本鎖抗体レパートリーの作成およびスクリーニングの例。（ａ）先行技術によるスポットアレイ。１．ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）結合性重鎖、２．ＢＳＡ結合性軽鎖、３．非結合性重鎖および軽鎖、あるいは４．ＢＳＡ結合性重鎖および軽鎖を分泌する細菌を混合し、次いで固定化ＢＳＡの近傍で培養し誘導した。１および２は結合抗体を得るために混合する必要があることが示唆されている（対照である４で認められるように）。このスクリーニングを行うには３２種類の別個の分配作業が必要であった。（ｂ）本発明によるマトリクススクリーニングによって、わずか８回の分配作業を用いて同じスクリーニングを行うことができる（２との交差の下、１に対するシグナル（ａ ｓｉｇｎａｌ ｆｏｒ １ ｄｏｗｎ ｗｉｔｈ ２ ａｃｒｏｓｓ）がないのはおそらく、誘発時にフィルター間に存在する気泡によるものである）。
【００５４】
図６：重鎖の線および軽鎖の線の密度を高くすることで、より密度の高い抗体アレイの作成およびスクリーニングが可能となる。そこで、２４種類の抗ＢＳＡ重鎖および４８種類の抗ＢＳＡ軽鎖をｘ軸およびｙ軸に垂直に描いて、ＢＳＡに対してスクリーニングされる１１５２通りのペア形成を行った。
【００５５】
図７：３８４種類の任意抽出した重鎖および３８４種類の任意抽出した軽鎖をｘ軸およびｙ軸に対して垂直に描き、ニトロセルロースフィルター上にコーティングされたＢＳＡに対してスクリーニングした（１４７，４５６通りの組み合わせ）。１組の特異的重鎖および軽鎖のペアを単離したが、それは後にニトロセルロースに対して結合性であることが確認された。
【００５６】
図８：本発明による３次元スクリーニングの模式図。この図では、レパートリーの構成員はｘ軸、ｙ軸およびｚ軸の平面に配置され、相互作用は交差面の各種頂点において生じる。
【００５７】
図９：３次元スクリーニングの概念を証明する図。抗ＢＳＡ重鎖をある平面に設け、抗ＢＳＡ軽鎖を第２の平面上に設け、ＢＳＡを第３の平面において設ける。それらの頂点での相互作用は、３成分全てが存在する場合にのみ検出される。
【００５８】
発明の詳細な説明
本発明によるマトリクスは多くの異なる方法で形成して、多くの異なる分子が関与する多くの異なる相互作用のスクリーニングを行うことができる。本発明は、２以上のレパートリーの構成員の実質的に全ての組み合わせをスクリーニングする能力を特徴とする。本発明者らは、一連の交差線を用いてそれを行うことができることを明らかにしたが、最小数の分配作業を用いて２以上のレパートリーのコンビナトリアルスクリーニングを行うことを可能とする他の手法も想到され、それには例えば交差するチャンネルまたは管の使用などがある。本発明者らの方法は、分子の連続群を並置して２次元または３次元の網目構造を形成することで、異なるレパートリーの構成員が互いに一つとなり、相互作用する可能性があるという手法に基づくものである。これは、不連続のスポットまたは区画されたウェルを用いて分子の個々の組み合わせを分離する先行技術におけるスクリーニングプロトコールとは対照的である。本発明においては、連続的な線、チャンネルまたは管が互いに交差して、分子の個々の組み合わせがその交差箇所または交点に存在するようになっている。全体として見ると、それによって形成される分子「ウェブ」または「網目構造」を用いて、特定の相互作用するペアを確認できるだけでなく、２つのレパートリー間の相互作用の全体的パターンを確認することができる。そうして得られる情報を用いて、両方のレパートリーの構成員の性能を互いに比較することができ、詳細にはその情報を用いて、マトリクス内の個々のレパートリー構成員の交差反応性を迅速に確認することができる。
【００５９】
スクリーニングを行うためのレパートリー
構築について当業者には公知である多くの異なるレパートリーを本発明とともに用いることができる。小有機分子のレパートリーは、コンビナトリアルケミストリーの手法によって構築することができる。ペプチドのレパートリーは、ＷＯ８４／０３５６４に記載のようなピンまたはロッド群の上で合成することができる。各ビーズが個々のレパートリー構成員であるペプチドレパートリーを形成するビーズ表面でのペプチド合成が関与する類似の方法が、米国特許第４６３１２１１号に記載されており、関連する方法がＷＯ９２／０００９１に記載されている。ビーズに基づく方法の大幅な改善には、各ライブラリー構成員のアミノ酸配列の確認を容易にするための、オリゴヌクレオチドなど固有の識別タグによる各ビーズのタグ付けが含まれる。これらの改良されたビーズに基づく方法はＷＯ９３／０６１２１に記載されている。
【００６０】
これらのレパートリーはアレイ形成を行ってマトリクスを形成する前に構築することができると考えられるが、上記のいずれの技術も、本発明によるマトリクス自体において、直接のレパートリー構成員のｉｎ ｓｉｔｕ合成（すなわち、レパートリー構築とレパートリースクリーニングの連携）に適用可能であることが想到される。実際、別の化学合成方法には、アレイにおける別個の所定位置に各個別のライブラリー構成員（例：固有ペプチド配列）を配置するような形での、表層でのペプチド（またはペプチド様物質）のアレイ合成が含まれる。従って、各ライブラリー構成員が何であるかは、アレイ中の空間位置によって決定される。所定の分子（例：受容体）と反応性ライブラリー構成員の間の結合相互作用が起こるアレイ中の位置を決定し、それによって空間位置に基づいて反応性ライブラリー構成員の配列を確認する。これらの方法については、米国特許第５１４３８５４号；ＷＯ９０／１５０７０およびＷＯ９２／１００９２；フォドールらの報告（Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５１： ７６７；ドワーらの報告（Ｄｏｗｅｒ ａｎｄ Ｆｏｄｏｒ （１９９１） Ａｎｎ． Ｒｅｐ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ２６： ２７１）に記載されており、本発明によるマトリクスの形成に容易に適合させることができるものと考えられる。
【００６１】
本発明は、タンパク質−タンパク質相互作用、特に抗体−抗原相互作用のスクリーニングに特に有用である。本発明で有用な適切な抗体レパートリーの調製については、ＷＯ９９／２０７４９（この開示内容は参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されている。ＷＯ９９／２０７４９には、免疫グロブリンのライブラリーを作成し、遺伝子リガンドを前選択できる方法および／またはそれを一つの主鎖配座を用いて作製する方法について記載されている。ＷＯ９９／２０７４９に記載のライブラリーを、その明細書に記載の方法に従って、あるいは当業界で公知の方法によって宿主生物で発現させて、本発明でのアレイ形成および使用に好適なポリペプチドのレパートリーを得ることができる。別法ではポリペプチドを、本発明で用いるためにｉｎ ｓｉｔｕで合成する、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏの転写／翻訳を用いて発現させることができる。
【００６２】
レパートリー構成員のアレイ形成によるマトリクススクリーンの形成
本発明によれば、分子がそれ自体アレイ形成されるか、宿主細胞に存在してもしなくても良いアレイ形成されたヌクレオチド前駆物によって発現されるか否かに応じて、手動または自動の多様な方法のいずれかによって分子のアレイ形成を行って、マトリクスを形成することができる。アレイは有利にはロボット技術によって形成する。ロボット技術は正確かつ高密度のマトリクスを形成することが可能であり、容易に複製でき、例えば本発明に従って形成されるコンビナトリアル抗体レパートリーを多くの異なる標的リガンドに対してスクリーニングすることができるためである。ロボットプラットホームは当業界では公知であり、機械は、小さな表面または広い表面に非常に正確に高速でアレイ形成することができるものが各社から入手可能である（Ｇｅｎｅｔｉｘ、Ｇｅｎｅｔｉｃ ＭｉｃｒｏＳｙｓｔｅｍｓおよびＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ社製など）。そのような機械は、精製タンパク質、上清もしくは細胞を、多孔質表層または非多孔質表層上にスポット形成して、それを後に必要に応じ固定化して安定なアレイを得るようにすることができる。ロボット操作は高密度アレイを形成する上で好ましい方法であるが、分子もしくは細胞を支持体上の所定の位置に配置する上で好適な手動法を含むいかなる方法も用いることができる。アレイ形成は規則的な、線が隣りの線から所定の距離に「描出される」ようなものであってもよく、不規則なものや、ランダムなものであってもよい。
【００６３】
分子レパートリーは、相互作用について溶液中でスクリーニングすることができるか、あるいは１以上のレパートリーを固体支持体に固定化することができる。従って、２種類の溶液を２チャンネルに流して、それらの交差箇所で、例えば比色反応、蛍光反応または発光反応によって検出可能な相互作用を生じさせるようにすることができる。別法として、レパートリーの一つを、例えば架橋によってニトロセルロース膜上に固定化することができると考えられ、第２のレパートリーに相当する溶液を、第１のレパートリーの固定化構成員を固定した支持体上に「引く」ことができると考えられる。そのような固定化は、直接的または間接的であることができる。例えば、間接固定化には、遺伝子リガンドでコーティングした固体支持体上へのポリペプチドレパートリーのアレイ形成が含まれる。
【００６４】
１態様ではレパートリーの構成員を、タグ付けシステムによってそれらの位置に指向させることで、各線、チャンネルまたは管がレパートリーの特定の構成員と結合するか、結合するような状況を作らせる。例えばレパートリーの１構成員における各ポリペプチドが、既知抗体のエピトープまたは、アフィニティペア（例：アビジン／ビオチンなど）の構成員などのタグを有することができる。線、チャンネルまたは管を、タグに結合する相当する分子（例：エピトープタグに特異的な抗体もしくは結合ペアの相当する構成員）でコーティングする。コーティングされた線、チャンネルまたは管とレパートリーのタグ付けされた構成員を含む溶液との接触によって、アレイ上でのその構成員の配置が行われる。
【００６５】
別法として、両方のレパートリーを別個の固体支持体上に固定化し、次に並置して相互作用するペアを確認することができると考えられる。本発明の好ましい態様では、ポリペプチドのマトリクスを、最初に宿主細胞中のそれら核酸前駆体のアレイ形成を行い、次にヌクレオチド配列を発現させて相当するポリペプチドを得ることで形成することができる。
【００６６】
１態様では、酵母細胞を用いて、本発明による方法で有用な分子の１以上のレパートリーを発現させることができる。酵母に外因性核酸を導入および発現する方法は当業界で公知である。酵母を用いるある好ましい手法は、酵母２−ハイブリッド法を利用するものである。この手法では、ある酵母群を、２−ハイブリッドペアの一方の構成員との融合のレパートリーをコードするライブラリーでトランスフォームし、別の群を２−ハイブリッドペアの相当する第２の構成員との融合のレパートリーをコードするライブラリーでトランスフォームする。その２種類の酵母細胞群は、異なる交配型のものである。この２群を配置してアレイを形成することで、第１のレパートリーの全ての構成員を含む酵母細胞が第２のレパートリーの全ての構成員を含む酵母細胞と交差するようにし、細胞が交配できるようにする。第１のレパートリーと第２のレパートリーの構成員間相互作用によって、２−ハイブリッド受容体構築物からの信号が発生する。
【００６７】
別の態様では、昆虫、両生類、鳥類、ほ乳類その他の高等真核細胞を用いることができる。限定的ではない例を挙げると、分子（小有機分子、ペプチド、ポリペプチドなど）のレパートリーについて、分子レパートリーの各構成員が受容体のレパートリーの各構成員と交差するアレイを形成することで修飾組換え細胞表面受容体（例：リガンド結合もしくは活性化において有用な領域に挿入された可変カセットを有する受容体）のレパートリーと相互作用する分子のスクリーニングを行うことができる。その後の細胞における受容体の活性化または阻害の検出により、どの分子がどの修飾受容体の活性に影響したかを示す。この方法によって、受容体その他のタンパク質の新たな調節剤の確認と構造／機能相関の迅速な確認の両方が可能となる。この方法はまた、相互作用について分析される両方のレパートリーの発現について高等真核細胞を用いるように調整することもできる。それは例えば、両方のレパートリーを細胞表層分子として発現させることで、あるいは例えば一方のレパートリーを分泌タンパク質として発現させ、他方を細胞表層タンパク質として発現させることで行うことができると考えられる。個々のレパートリーを発現する細胞と接触するかそれに近接並置されると、各レパートリーの構成員と他方の構成員との生産的相互作用を検出することができる。当業者であれば、所定のポリペプチドレパートリーを発現する高等真核細胞を容易に形成することができる。
【００６８】
相互作用の検出方法は、形成されるアレイの詳細な性質に応じて変わる。例えば方法は、アレイが細胞を用いるか否かに応じて変わる。検出方法の例としては、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）；蛍光消光；レポーター発現（例：ルシフェラーゼ、ＧＳＴ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、抗生物質耐性）；栄養素要求性からの救済；２次メッセンジャーレベルにおける変化、ＧＤＰ−ＧＴＰ交換、キナーゼ活性化もしくはリン酸化、ホスファターゼ活性化もしくは脱リン酸化、タンパク質分解もしくはイオン透過性変化などの信号伝達事象；酵素反応；メチル化；核酸開裂；グリコシル化；タンパク質分解；および感染（例：ウィルスまたはファージによる感染）などがあるが、これらに限定されるものではない。相互作用検出のためのこれらの手法または読み出しはそれぞれ当業界では公知であることから、当業者であれば、不必要な実験を行う必要なく、本発明の方法でそれを用いることができる。
【００６９】
本発明により選択される分子の使用
本発明の方法によって選択される分子は、実質的にあらゆる工程において用いることができる。その分子がポリペプチドである場合、ｉｎ ｖｉｖｏでの治療および予防の用途、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの診断用途、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのアッセイおよび試薬用途などの結合、または触媒作用が関与するプロセスで使用することができる。例えば抗体分子は、当業者には公知の方法に従って、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学法、アフィニティクロマトグラフィーなどの、抗体に基づくアッセイ法で用いることができる。
【００７０】
上記で示唆したように、本発明によって選択される分子は、診断法、予防法および治療法において有用である。例えばこれらの方法によって形成および選択される酵素変種について、それを基質分子候補物質とともにインキュベートし、基質の生成物への変換を分析する当業界で公知の方法をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで用いて、活性のアッセイを行うことができる。選択される細胞表層受容体または接着分子を培養細胞で発現させ、次にそれについて、生化学的刺激に対して応答する能力または未変換の接着分子が結合すると予想される細胞表層分子を発現する他の細胞種との親和性を、それぞれ調べることができると考えられる。
【００７１】
本発明によって製造されるタンパク質の治療用途および予防用途には、ヒトなど、投与を受ける哺乳動物への、本発明により選択されるポリペプチドの投与が含まれる。その点に関して特に有用なものは、抗体、他の受容体（Ｔ細胞受容体などがあるが、それに限定されるものではない）またはそれらの結合タンパク質である。
【００７２】
哺乳動物への投与には、少なくとも９０〜９５％の均質性を有する実質的に純粋な分子が好ましく、特にその哺乳動物がヒトである場合の医薬用途には、９８〜９９％またはそれ以上の均質性が最も好ましい。ひとたびある程度精製したら、あるいは所望の均質性まで精製したら、選択されたポリペプチドを診断または治療（体外の場合を含む）用に、あるいはアッセイ法、免疫蛍光染色などの開発および実施において用いることができる（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｅ ａｎｄ Ｐｅｒｎｉｓ， （１９７９ ａｎｄ １９８１） Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ）。
【００７３】
本発明の選択された抗体またはそれらの結合タンパク質は、典型的には、炎症状態、アレルギー性過敏症、癌、細菌もしくはウィルス感染および自己免疫障害（Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、全身紅斑性狼瘡、クローン病および重症筋無力症などがあるが、これらに限定されるものではない）の予防、抑制または治療において有用であろう。
【００７４】
本願において「予防」という用語には、疾患が誘発される前の保護的組成物の投与が関与する。「抑制」とは、誘発事象の後であるが、疾患が臨床的に発症する前に前記組成物を投与することを指す。「治療」には、疾患症状が認められるようになった後での保護組成物の投与が関与する。
【００７５】
疾患に対する保護または疾患治療における抗体またはそれらの結合タンパク質の有効性をスクリーニングするために用いることができる動物モデル系が使用可能である。感受性マウスでの全身紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）の試験方法は当業界で公知である（Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ． （１９７８） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １４７ ： １６５３； Ｒｅｉｎｅｒｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９７８） Ｎｅｗ Ｅｎｇ． Ｊ Ｍｅｄ．， ２９９： ５１５）。重症筋無力症（ＭＧ）は、他の動物種からの可溶性ＡｃｈＲタンパク質を用いてその疾患を誘発することで、ＳＪＬ／Ｊ雌マウスで試験が行われる（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ４２： ２３３）。関節炎は、ＩＩ型コラーゲンの注射によって、感受性系統のマウスで誘発される（Ｓｔｕａｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ４２： ２３３）。アジュバント関節炎を誘発する方法については、感受性ラットにおけるミコバクテリウム熱ショックタンパク質の注射による報告がある（Ｖａｎ Ｅｄｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ， ３３１： １７１）。甲状腺炎は、記載の方法に従ってチログロブリンを投与することでマウスで誘発される（Ｍａｒｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８０） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １５２： １１１５）。インシュリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）は自然に生じるか、あるいはカナサワら（Ｋａｎａｓａｗａ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ， ２７： １１３）が記載のものなど、ある種の系統のマウスで誘発することができる。マウスおよびラットでのＥＡＥは、ヒトにおけるＭＳのもであるとして役立つ。このモデルでは、ミエリン塩基性タンパク質の投与によって脱髄性疾患が誘発される（Ｐａｔｅｒｓｏｎ （１９８６） Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ， Ｍｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｇｒｕｎｅ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｔｏｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． １７９−２１３； ＭｃＦａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９７３） Ｓｃｉｅｎｃｅ， １７９： ４７８およびＳａｔｏｈ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３８： １７９参照）。
【００７６】
本発明の選択された抗体、受容体（Ｔ細胞受容体などがあるが、それに限定されるものではない）またはそれらの結合タンパク質を、他の抗体、特に疾患に関与するヒト細胞上の他のマーカーと反応性のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）と組み合わせて使用することもできる。例えば好適なＴ細胞マーカーには、学会（ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ； Ｂｅｒｎｈａｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， ＮＹ）によりいわゆる「分化クラスター」と称されているものに分類されたものなどがあり得る。
【００７７】
通常、本発明の選択された抗体、受容体または結合タンパク質は、薬理的に適切な担体とともに純粋な形で利用されることになろう。代表的にはその担体には、水系またはアルコール／水系の溶液、乳濁液または懸濁液などがあり、いずれも生理食塩水および／または緩衝媒体を含む。非経口媒体には、食塩水、リンゲルブドウ糖液、ブドウ糖および食塩ならびに乳酸加リンゲル液などがある。ポリペプチド複合体を懸濁状態に維持する上で必要であれば、好適な生理的に許容される補助剤を、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギン酸類などの増粘剤から選択することができる。
【００７８】
静脈内投与媒体には、リンゲルブドウ糖液をベースとする流体および栄養補給液ならびに電解質補給液などがある。抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤および不活性ガスなどの保存剤および他の添加剤も存在させることができる（Ｍａｃｋ （１９８２） Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）。
【００７９】
本発明の選択されたポリペプチドは、別個に投与される組成物として用いることができるか、あるいは他の薬剤と共に用いることができる。それらには、シクロスポリン、メトトレキセート、アドリアマイシンまたはシスプラチナムならびにイムノトキシン類などの各種免疫治療薬などがあり得る。医薬組成物には、本発明の選択された抗体、受容体またはそれらの結合タンパク質と併用した各種細胞障害剤その他の薬剤の「カクテル」などが含まれ、あるいは投与前に蓄積されるか否かを問わず、異なる標的リガンドを用いて選択されるポリペプチドなどの、異なる特異性を有する本発明に従って選択されたポリペプチドの組み合わせもあり得る。
【００８０】
本発明による医薬組成物の投与経路は、当業者には公知のいかなるものであっても良い。免疫療法（それに限定されない）などの療法の場合、本発明の選択された抗体、受容体またはそれらの結合タンパク質を、標準的な方法に従って患者に投与することができる。投与は、非経口投与、静脈内投与、筋内投与、腹腔内投与、経皮投与、肺経路を介した投与または適宜にカテーテルを用いる直接注入などの適切な形態によって行うことができる。投与の用量および回数は、患者の年齢、性別および状態、他薬剤の同時投与、禁忌ならびに臨床医が考慮すべき他のパラメータによって決まる。
【００８１】
本発明の選択されたポリペプチドは、保存用に凍結乾燥し、使用前に好適な担体で再生させることができる。この方法は、従来の免疫グロブリンを用いる場合に有効であることが明らかになっており、当業界で公知の凍結乾燥および再生法を用いることができる。凍結乾燥および再生によって、多様な程度の抗体活性損失が生じ得ること（例えば、従来の免疫グロブリンを用いる場合、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体より活性損失が大きい傾向がある）、ならびに相殺するために使用レベルを上方に調節する必要が生じる場合があることは当業者には明らかであろう。
【００８２】
本発明の選択されたポリペプチドまたはそれらのカクテルを含む組成物を投与して、予防処置および／または治療処置を行うことができる。ある種の治療用途では、選択細胞群の少なくとも部分的な阻害、抑制、調節、殺滅または何らかの他の測定可能なパラメータを達成する上で十分な量を「治療上有効な用量」と定義する。その用量を達成する上で必要な量は、疾患の重度および患者自身の免疫系の全般的状態によって決まるが、通常は体重１ｋｇ当たりの選択された抗体、受容体（例：Ｔ細胞受容体）もしくはそれの結合タンパク質は０．００５〜５．０ｍｇの範囲であり、０．０５〜２．０ｍｇ／ｋｇ／投与の用量がより一般的に用いられる。予防用途の場合、本発明の選択されたポリペプチドまたはそれのカクテルを含む組成物も、同様またはそれより若干低い用量で投与することができる。
【００８３】
本発明による選択されたポリペプチドを含む組成物を予防および治療の場面で利用して、哺乳動物における特定の標的細胞群の変化、失活、殺滅または除去に役立てることができる。さらに、本明細書に記載のポリペプチドの選択されたレパートリーを体外またはｉｎ ｖｉｔｒｏで選択的に用いて、標的細胞群を殺滅、低減その他の形で、細胞の不均一集合から効果的に除去することができる。哺乳動物から取り出した血液を、選択された抗体、細胞表面受容体またはそれの結合タンパク質と体外で組み合わせることで、標準的な方法に従って哺乳動物に戻す血液から、望ましくない細胞を殺滅その他の形で除去することができる。
【００８４】
説明のみを目的として、下記の実施例で本発明についてさらに説明する。
【００８５】
実施例
実施例１
ｓｃＦｖレパートリーのマトリクススクリーニング
本実施例の一部として使用した２フィルター捕捉システムは、発明の名称が「アレイスクリーニング方法」である本発明者らの同時係属中である英国特許出願（英国特許出願番号９９２８７８７．２）に記載のものに基づいたものである。細菌を一方のフィルター上の線で増殖させ、それによって産生されるｓｃＦｖを、第１のフィルター上のｓｃＦｖの線から９０°の方向に向いたニトロセルロースに結合した抗原の線を有する第２のフィルターに捕捉する（図１参照）。ｓｃＦｖが抗原と相互作用する交点では、抗原とｓｃＦｖが結合した場合にｓｃＦｖが捕捉される。本実施例では、結合したｓｃＦｖの検出は、ＨＲＰに結合した超抗原タンパク質Ｌを用いて行う。
【００８６】
方法
抗原ライブラリー
抗原は、オリゴ（ｄＴ）初回抗原刺激によって胎児脳ポリ（Ａ）＋ＲＮＡから得たヒト発現ライブラリーｈＥＸ１から得る（Ｂｕｓｓｏｗ ｅｔ ａｌ １９９８）。ｃＤＮＡは、修飾ｐＱＥ−３０ベクター（Ｑｉａｇｅｎ）において指向的にクローニングされる。
【００８７】
抗原フィルター
抗原クローンを、３７℃の液体培地（１００μｇ／ｍＬのＡｍｐおよび１％グルコースを含む２×ＴＹ）で終夜増殖させた。手動線描出の場合、ピペットに取り付けられていないｐ１０フィルターチップ（Ａｒｔ）を用い、金属定規でフィルターに沿って線を引くことで、該液体培養物を予め湿らせておいたＰＶＤＦフィルター（エタノールに浸漬し、ＰＢＳで洗い、２×ＴＹに浸したもの）に移した。そうしてチップの毛細管作用を利用して、該培養液を膜表面に移送した。各クローンはフィルター上で、前のものから６ｍｍ離したところに線描された。自動線描出の場合、カイビーシステムズ（Ｋａｙｂｅｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のピッカー／グリッダーシステムに取り付けられた図３に示すロボットヘッドを用いて、ＰＶＤＦフィルターに液体培養物を移送した。各クローンはフィルター上に、２５ｍｍ／秒の速度で、前のものから４．５ｍｍ離したところに線描された。
【００８８】
次に抗原フィルターを、１００μｇ／ｍＬのＡｍｐ、１％グルコースを含むＴＹＥ寒天平板上で３０℃にて終夜増殖させた。次に該フィルターを、１００μｇ／ｍＬのＡｍｐ、１ｍＭのＩＰＴＧを含む別のＴＹＥ寒天平板に移し、３７℃で３時間経過させてクローンの誘発を行った。抗原フィルターを平板からはがし、０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌを含む予め浸らせたブロッティング紙上で１０分間変性させ、１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．５Ｍ ＮａＣｌ中で５分間の中和を２回行い、次に２×ＳＳＣ中で１５分間インキュベートした。フィルターを乾燥させ、エタノールに短時間浸漬し、４％ Ｍａｒｖｅｌ ＰＢＳでブロックし、ＰＢＳで洗い、２×ＴＹに浸した。
【００８９】
ＳｃＦｖライブラリー
ｓｃＦｖ類は、ＶＨ（Ｖ３−２３／ＤＰ−４７およびＪＨ４ｂ）およびＶＫ（Ｏ１２／Ｏ２／ＤＰＫ９およびＪＫ１）に関する単一のヒトフレームワークに基づくライブラリーから得たものであり、既知構造の抗原と接触し、成熟レパートリーにおいて非常に多様性に富んだ抗原結合部位において、側鎖の多様性（ＮＮＫまたはＤＶＴコード）を有している。用いられる群（ｆｏｌｄ）はしばしばｉｎ ｖｉｖｏで発現され、ｓｃＦｖ類の捕捉または検出を促進するが抗原結合を妨害しない遺伝子リガンドタンパク質ＬおよびＡに結合する。ｓｃＦｖクローンは、タンパク質Ａおよびタンパク質Ｌへの結合についてｓｃＦｖ形式で予備スクリーニングして、それらが機能性であることを確認している。
【００９０】
ＳｃＦｖフィルター
抗体クローンを３７℃の液体培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１％グルコースを含む２×ＴＹ）で終夜増殖させた。次に、液体培養物を予めブロッキング処理したニトロセルロースフィルター（４％スキムミルク粉末のＰＢＳ溶液中、室温（ＲＴ）で１時間経過させ、ＰＢＳで洗い、２×ＴＹに浸したもの）に移した。抗原培地については手動およびロボットによる抗体のフィルターへの移動を行った。ロボット移動によって形成されるｓｃＦｖ類の線の密度については、１．１２５ｍｍごとに１本とした。
【００９１】
次にＳｃＦｖフィルターを、１００μｇ／ｍＬ Ａｍｐ、１％グルコースを含むＴＹＥ寒天平板上で３７℃にて増殖させた。終夜増殖させた後、抗原フィルターを１００μｇ／ｍＬ Ａｍｐ、１ｍＭ ＩＰＴＧの入った新鮮なＴＹＥ寒天平板に載せて乾燥し、ｓｃＦｖフィルターをその上に置いた。次に、二枚のフィルターと共に平板培地を３０℃で３時間インキュベートして、ｓｃＦｖ類の誘発を行った。
【００９２】
フィルターの精査
上側の（ｓｃＦｖ）フィルターを廃棄し、２番目の（抗原）フィルターをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、室温にて４％ ＭＰＢＳで３０分間ブロッキングした。該フィルターをＰＢＳＴで３回洗浄し、次に４％ ＭＰＢＳ中、室温で１時間にわたり、タンパク質Ｌ  ＨＲＰ結合体（Ａｃｔｉｇｅｎ、１／２０００）とともにインキュベートした。フィルターをＰＢＳＴでさらに３回洗浄し、ＥＣＬ試薬で現像した。インキュベーションはいずれも、緩く撹拌する振盪機にかけて、緩衝液５０ｍＬ中にて行った。
【００９３】
結果
モデルシステムとして本発明者らは、１６種類のｓｃＦｖに対して２１種類の抗原の手動マトリクススクリーニングを行い、わずか３７回の分配作業を用いて３３６種類の相互作用を調べた。そのｓｃＦｖレパートリーには、ファージ選択によってユビキチンに対して選択された４種類のｓｃＦｖが含まれていた（Ｕｂ１ｂ１、Ｕｂ１ａ１、Ｒ１３およびＲ１４）。抗原レパートリーには、ユビキチンであることが知られている２種類のクローン（ＱおよびＴ）ならびに一次スクリーニングで恐らく抗ユビキチンｓｃＦｖに結合すると確認されている他の５種類のクローン（Ａ、Ｐ、Ｒ、ＳおよびＵ）が含まれていた。図からわかるように（図２）、４種類の抗ユビキチンｓｃＦｖのそれぞれが、２種類のユビキチンクローンならびに５種類の可能なユビキチンクローンのそれぞれに結合していた。しかしながら、ｓｃＦｖ Ｕｂ１ｂ１とｓｃＦｖ Ｒ１４は交差反応性が非常に高いことがわかる。モデルアレイには、１２種類のｓｃＦｖクローンであるＣ２からＨ１１に対して結合剤の可能性があると一次抗原アレイスクリーニングで確認された１４種類の抗原クローンも含まれていた。マトリクスからわかる通り（図２）、抗原Ｍ（未知機能のタンパク質）は、ｓｃＦｖ Ｄ１２に特異的に結合する。抗原Ｅ（ＤＮＡ結合タンパク質）も、ｓｃＦｖ Ｈ１１に特異的に結合する。これは、抗原アレイスクリーニングで最初に確認された相互作用を確認する上でのマトリクススクリーニングの有用性を示すものである。
【００９４】
次に本発明者らは、ロボットヘッド（図３ａ−設計；図３ｂ−写真）を用いて線描出を行うより高密度のマトリクススクリーンを扱った。このシステムでは、１２種類の抗原の二重線（横方向）を１９２種類のｓｃＦｖ（縦方向）に対してスクリーニングするものである。そうして、２３０４種類の異なる可能な相互作用を、わずか２１６回の分配作業を用いて各２回試験した。やはり、特に３種類の抗原（そのうちの２種類は同じ）に対して、線の交点で多くの異なる相互作用が認められる。
【００９５】
実施例２
本発明による二本鎖抗体レパートリーの作成およびスクリーニング
本実施例の一部として用いた２フィルター捕捉システムは、発明の名称が「アレイスクリーニング方法」である本発明者らの同時係属中である英国特許出願（英国特許出願番号９９２８７８７．２）に記載のものに基づいたものである。以前に、抗体重鎖および軽鎖が溶液中で会合して、活性な抗原結合部位を有するＦｖ断片を形成し得ることが明らかになっており、そのような技術は当業界において公知である。特定の重鎖および軽鎖の非共有結合的会合が、そのような会合がアレイ上で起こるだけの強さのものであるか否かを調べるため、本発明者らはファージ選択抗ＢＳＡ ｓｃＦｖ（１３ｃｇ２）の重鎖と軽鎖を分離した。重鎖と軽鎖の間の会合がどの程度強いものであるかは不明であったが、本発明者らは、１３ｃｇ２の重鎖および軽鎖を別個に、重鎖または軽鎖のみ（単一領域）；ｓｃＦｖ（重鎖と軽鎖の間に１５アミノ酸の連結部を有する）およびジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）（重鎖と軽鎖の間にゼロアミノ酸連結部を有する）という３種類の組換え断片の形態にクローニングした。後者の２種類の形態は、軽鎖または重鎖１３ｃｇ２の多様性を用いて構築し、各場合において未変化鎖がダミーの重鎖または軽鎖であった。（ダミー鎖は、単一であるが未知の抗原結合特異性を有する）。抗原としてＢＳＡを用いたアレイ上の各種形態の試験は、ジアボディ形態がフィルター表面に最も安定な会合を与えることを示している。
【００９６】
いずれも上記のジアボディ形態でのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）結合性重鎖（１）、ＢＳＡ結合性軽鎖（２）、非結合性重鎖および軽鎖（３）またはＢＳＡ結合性重鎖および軽鎖（４）のいずれかを発現する細菌を混合し、スポットとして増殖させるか（図５ａ）、あるいは横線および縦線として描いてから増殖させた（図５ｂ）。いずれの場合も、終夜増殖させた後、増殖細菌を含有するフィルターを、ＢＳＡでコーティングされた第２のフィルターの上に乗せ、タンパク質発現の誘発を行った。結合性重鎖が結合性軽鎖と共発現される場合にのみ、陽性シグナルが認められる（すなわち、１と２が一緒になった、もしくは４を含むいずれかの組み合わせ。２との交差の下、１に対するシグナルがないのはおそらく、誘発時にフィルター間に存在する気泡によるものである。）。線を描くことで、分配作業の数が大幅に減る（この場合、３２回から８回に）。
【００９７】
重鎖の線および軽鎖の線の密度を高くすることで、より高密度の抗体アレイを形成し、スクリーニングすることができる。そこで、２４種類の抗ＢＳＡ重鎖および４８種類の抗ＢＳＡ軽鎖をｘ軸およびｙ軸に対して垂直に描いて、ＢＳＡに対してスクリーニングされる１１５２種類のペアを形成した（図６）。さらに高密度の形態では、３８４種類の未選択重鎖および３８４種類の未選択軽鎖をｘ軸およびｙ軸に対して垂直に描き、ニトロセルロースフィルター上にコーティングされたＢＳＡに対してスクリーニングした（１４７，４５６通りの組み合わせ）。一組の特異的重鎖および軽鎖のペアを単離し、それを次にニトロセルロースに対して結合性であると確認した（図７）。スクリーンを増やして１０００種類の重鎖対１０００種類の軽鎖（１００万種類の異なる抗体）を網羅しようとする場合、本発明による方法を用いることで、分配作業の数は２００万回から２０００回に低減するものと考えられる。
【００９８】
実施例３
３次元スクリーニング
本発明による３次元スクリーニングの模式図を示す（図８）。この図では、レパートリー構成員はｘ軸、ｙ軸およびｚ軸における平面に配置され、相互作用は交差する面の各種頂点で起こる。その考え方を証明するものとして、抗ＢＳＡ重鎖をある平面上に設け、抗ＢＳＡ軽鎖を第２の平面上に設け、ＢＳＡを第３の平面上に設ける。頂点での相互作用は、３種類の成分全てが存在する場合にのみ検出される（図９）。
【００９９】
上記の明細書で言及した全ての刊行物ならびにその刊行物中で引用されている参考文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。本発明の前述した方法およびシステムについての各種の変更および別形態は、本発明の範囲および精神を逸脱しない限りにおいて、当業者には明らかであろう。上記においては具体的な好ましい実施形態と関連付けて本発明について記述したが、特許請求される本発明は、そのような具体的な実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、分子生物学もしくは関連する分野における当業者には明らかな、本発明を実施する上での上記形態に対する各種の変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
数百の異なる抗体を数百の異なる抗原に対して同時にスクリーニングして相互作用するペアを確認できると考えられる方法を示す、本発明による抗体レパートリーを抗原レパートリーに対してスクリーニングする１方法の概略を示す図である。
【図２】
手動で作成したマトリクスを用いたｓｃＦｖの分析を示す図である。
【図３】
ｘ、ｙおよびｚ次元での動きを可能とするロボットプラットホームに搭載されるよう設計された本発明によるロボット線引き用ヘッドを示す図である。
【図４】
ロボットによって形成されたマトリクスを用いるｓｃＦｖの分析を示す図である。
【図５】
２本鎖抗体レパートリーの作成およびスクリーニングの例を示す図であり、（ａ）は先行技術によるスポットアレイの図であり、（ｂ）本発明によるマトリクススクリーニングによって、わずか８回の分配作業を用いて同じスクリーニングを行うことができることを示す図である。
【図６】
重鎖線および軽鎖線の密度を高くすることで、より密度の高い抗体アレイの作成およびスクリーニングができることを示す図である。
【図７】
３８４種類の未選択重鎖および３８４種類の未選択軽鎖をｘ軸およびｙ軸に対して垂直に描き、ニトロセルロース上にコーティングされたＢＳＡに対してスクリーニングした（１４７，４５６通りの組み合わせ）場合を示す図である。
【図８】
本発明による３次元スクリーニングの模式図である。
【図９】
３次元スクリーニングの考え方を証明する図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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