(57)【要約】ＩＶ型アデニル酸シクラーゼタンパク質、ｃＤＮＡ、およびヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼを調節する試薬は、例えばこの酵素の異常な活性によって起こる疾患およびＩＶ型アデニリルシクラーゼの活性を刺激または阻害することによってその症状を改善することができる疾患などの機能不全または疾患の予防、回復または矯正に役立つ。そのような疾患には、例えば、高血圧；尿閉；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；再狭窄；アテローム性動脈硬化症；過剰な平滑筋細胞または平滑筋細胞増殖の減少を特徴とする疾患；動脈瘤；創傷治癒；脳卒中；虚血；潰瘍；喘息；アレルギー；良性前立腺肥大；片頭痛；嘔吐；精神障害または神経障害、例えば不安、精神分裂病、躁うつ病、鬱病、譫妄、痴呆、および重度精神遅滞、神経変性疾患およびジスキネジーなどの変性疾患などが含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードしている単離されたポリヌクレオチドであって、
ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約７０％一致するアミノ酸配列；および、
配列番号２に示すアミノ酸配列
より成る群から選ばれるアミノ酸配列を包含するＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号１に記載の配列を含むポリヌクレオチド；
ｃ）（ａ）および（ｂ）に明記したポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
ｄ）遺伝コードの縮重のため、その配列が（ａ）から（ｃ）に明記するポリヌクレオチド配列から逸脱している配列のポリヌクレオチド；および、
ｅ）（ａ）から（ｄ）に明記したポリヌクレオチド配列の断片、誘導体またはアレル変異体を表すポリヌクレオチド、
より成る群から選ばれるポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項３】
請求項２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４】
請求項１に記載のポリヌクレオチドによりコードされている、実質上精製されたＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチド。
【請求項５】
ａ）請求項３に記載の宿主細胞を、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドの発現に好適な条件下で培養し；そして、
ｂ）ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドを該宿主細胞培養から回収する工程、
を含む、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドを調製する方法。
【請求項６】
ａ）請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドを生体試料の核酸材料とハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成させ；そして、
ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程、
を含む、生体試料中のＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを検出する方法。
【請求項７】
ハイブリダイゼーションの前に、生体試料の核酸材料を増幅させる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
生体試料を、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載のＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドと特異的に相互作用する試薬と接触させる工程を含む、該ポリヌクレオチドまたは該ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドを検出する方法。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれかに記載の方法を実施するための診断キット。
【請求項１０】
被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドによりコードされる任意のＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドと接触させ；
該ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドに対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含むＩＶ型アデニル酸シクラーゼの活性を低下させる物質をスクリーニングする方法であって、該ポリペプチドに結合する被験化合物を、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼの活性を低下させる可能性のある治療物質として同定する方法。
【請求項１１】
被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドによりコードされるＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドと接触させ；そして、
該ポリペプチドのＩＶ型アデニル酸シクラーゼ活性を検出する工程、
を含むＩＶ型アデニル酸シクラーゼの活性を調節する物質をスクリーニングする方法であって、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼ活性を増大させる被験化合物を、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼの活性を増大させる可能性のある治療物質として同定し、かつ該ポリペプチドのＩＶ型アデニル酸シクラーゼ活性を低下させる被験化合物を、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼの活性を低下させる可能性のある治療物質として同定する方法。
【請求項１２】
被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドと接触させ；そして、
該ポリヌクレオチドに対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含むＩＶ型アデニル酸シクラーゼの活性を低下させる物質をスクリーニングする方法であって、該ポリヌクレオチドに結合する被験化合物を、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼの活性を低下させる可能性のある治療物質として同定する方法。
【請求項１３】
細胞を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載の任意のＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドと特異的に結合する試薬と接触させ、それによりＩＶ型アデニル酸シクラーゼの活性を低下させる工程、を含むＩＶ型アデニル酸シクラーゼの活性を低下させる方法。
【請求項１４】
請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法によって同定される、該ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドの活性を調整する試薬。
【請求項１５】
請求項２に記載の発現ベクターまたは請求項１４に記載の試薬および製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
【請求項１６】
疾患においてＩＶ型アデニル酸シクラーゼの活性を調整するための医薬を製造するための、請求項２に記載の発現ベクターまたは請求項１４に記載の試薬の使用。
【請求項１７】
該疾患が高血圧；尿閉；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；再狭窄；アテローム性動脈硬化症；過剰な平滑筋細胞または平滑筋細胞増殖の減少を特徴とする疾患；動脈瘤；創傷治癒；脳卒中；虚血；潰瘍；喘息；アレルギー；良性前立腺肥大；片頭痛；嘔吐；不安、精神分裂病、躁うつ病、鬱病、譫妄、痴呆、重度精神遅滞および変性疾患を含む精神障害または神経障害である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているｃＤＮＡ。
【請求項１９】
配列番号１を含む請求項１８に記載のｃＤＮＡ。
【請求項２０】
配列番号１より成る請求項１８に記載のｃＤＮＡ。
【請求項２１】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２２】
該ポリヌクレオチドが配列番号１より成る、請求項２１に記載の発現ベクター。
【請求項２３】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２４】
該ポリヌクレオチドが配列番号１より成る、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号２に示すアミノ酸配列より成る、請求項２５に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項２８】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている発現ベクターを含む宿主細胞を、該ポリペプチドが発現される条件下で培養し；それにより、該ポリペプチドを単離する工程、を含む該ポリペプチドを調製する方法。
【請求項２９】
該発現ベクターが配列番号１を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
配列番号１に記載の１１個の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを、生体試料の核酸材料とハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成させ；そして、該ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程、を含む配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドのコード配列を検出する方法。
【請求項３１】
ハイブリダイズさせる工程の前に、核酸材料を増幅する工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
配列番号１に記載の１１個の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；および、請求項３０に記載の方法のための使用説明書を含む、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドのコード配列を検出するためのキット。
【請求項３３】
生体試料を、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する試薬と接触させて、試薬−ポリペプチド複合体を形成させ；そして、該試薬−ポリペプチド複合体を検出する工程、を含む該ポリペプチドを検出する方法。
【請求項３４】
該試薬が抗体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する抗体；および、請求項３３に記載の方法のための使用説明書、を含む該ポリペプチドを検出するためのキット。
【請求項３６】
被験化合物を、（１）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約７０％一致するアミノ酸配列、および（２）配列番号２に示すアミノ酸配列、より成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させ；そして、
該ポリペプチドに対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含むヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼの活性を調整できる物質をスクリーニングする方法であって、該ポリペプチドに結合する被験化合物をヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼの活性を調節する可能性のある物質と同定する方法。
【請求項３７】
接触させる工程が細胞においてである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
細胞がインビトロである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
接触させる工程が無細胞系においてである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
該ポリペプチドが検出可能な標識を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
被験化合物が検出可能な標識を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
被験化合物が該ポリペプチドと結合している標識リガンドに取って代わる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
該ポリペプチドが固体支持体と結合している、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
被験化合物が固体支持体と結合している、請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
被験化合物を、（１）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約７０％一致するアミノ酸配列、および（２）配列番号２に示すアミノ酸配列、より成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させ；そして、
該ポリペプチドの活性を検出する工程、
を含むヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼの活性を調整する物質をスクリーニングする方法であって、該ポリペプチドの活性を増大させる被験化合物を、ヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼの活性を増大させる可能性のある物質として同定し、かつ該ポリペプチドの活性を低下させる被験化合物を、ヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼの活性を低下させる可能性のある物質として同定する方法。
【請求項４６】
接触させる工程が細胞においてである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
細胞がインビトロである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
接触させる工程が無細胞系においてである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
被験化合物を、配列番号１に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされている産物と接触させ；そして、
該産物に対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含むヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼの活性を調整する物質をスクリーニングする方法であって、該産物と結合する被験化合物をヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼの活性を調節する可能性のある物質として同定する方法。
【請求項５０】
該産物がポリペプチドである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
該産物がＲＮＡである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
細胞を、配列番号１に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされている産物に特異的に結合する試薬と接触させ、それによりヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼの活性を低下させる工程、を含むヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼの活性を低下させる方法。
【請求項５３】
該産物がポリペプチドである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
該試薬が抗体である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
該産物がＲＮＡである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
該試薬がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
該試薬がリボザイムである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
細胞がインビトロである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
細胞がインビボである、請求項５２に記載の方法。
【請求項６０】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する試薬；および、製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
【請求項６１】
該試薬が抗体である、請求項６０に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
配列番号１に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド産物と特異的に結合する試薬；および、製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
【請求項６３】
該試薬がリボザイムである、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
該試薬がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
該試薬が抗体である、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている発現ベクター；および、製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
【請求項６７】
該発現ベクターが配列番号１を含む、請求項６６に記載の医薬組成物。
【請求項６８】
高血圧；尿閉；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；再狭窄；アテローム性動脈硬化症；過剰な平滑筋細胞または平滑筋細胞増殖の減少を特徴とする疾患；動脈瘤；創傷治癒；脳卒中；虚血；潰瘍；喘息；アレルギー；良性前立腺肥大；片頭痛；嘔吐；不安、精神分裂病、躁うつ病、鬱病、譫妄、痴呆、重度精神遅滞および変性疾患を含む、精神障害ならびに神経障害より選択されるＩＶ型アデニル酸シクラーゼ機能障害関連疾患を処置する方法であって、それを必要とする患者に、ヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼの機能を調整する試薬の治療的有効量を投与し、それによりＩＶ型アデニル酸シクラーゼ機能障害関連疾患の症状を回復させる工程を含む方法。
【請求項６９】
該試薬が請求項３６に記載の方法によって同定される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
該試薬が請求項４５に記載の方法によって同定される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
該試薬が請求項４９に記載の方法によって同定される、請求項６８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明はヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼ（ｈＡＣ４）、それをコードしているヌクレオチド配列、およびｈＡＣ４の調節に関する。
【０００２】
（背景技術）
細胞が外部からの刺激を処理するために持っている共通の機構には、細胞表面の受容体がその刺激によって活性化される事象が含まれる。受容体の活性化により、細胞内部にシグナルが伝達され、さらにいくつかのタンパク質がそのプロセスに動員される。受容体の典型例はＧタンパク質共役膜受容体のメンバーである。これらの受容体は、アデニリルシクラーゼ、ホスホリパーゼ、およびプロテインキナーゼを含む様々なエフェクターの活性に影響を及ぼす。これらのエフェクターのそれぞれは、異なる調節特性を持つアイソフォームを含むので、複雑なシグナル統合が可能になり、このシグナル統合により、外部からの刺激に対して著しく特異的な応答をする機会が、細胞に与えられる。
【０００３】
アデニリルシクラーゼファミリーは、多くの細胞プロセス（例えば細胞成長、発生、代謝および分化）を支配するシグナル伝達系路に関与する重要な二次メッセンジャーｃＡＭＰを合成する酵素群を含んでいる。現在までに９つのＡＣが主に齧歯類動物から同定されている。アデニリルシクラーゼの構造は詳しく研究されており、順に、細胞質Ｎ末端領域、６つの膜貫通ヘリックスからなる膜アンカリング疎水性ドメイン（Ｍ１）、大細胞質ドメイン（Ｃ１）、第２膜貫通ヘリックスクラスター（Ｍ２）、および第１細胞質ドメインに相同なＣ末端の第２細胞質ドメイン（Ｃ２）という５つのドメインを持つ共通のトポロジーを示す。ＡＣ１〜ＡＣ９の予想トポロジーは、Ｐ−糖タンパク質などのＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）膜トランスポーターのトポロジーに似ているが、哺乳類ＡＣがチャネルまたはポンプとして機能することを示す証拠は、現在までのところ得られていない。９つのＡＣアイソフォームはいずれも、Ｎ結合型グリコシレーションを受けると予想される部位をＭ２内に少なくとも１つは持っている。Ｍ１およびＭ２を全く持たない組換え可溶性ＡＣがＴａｎｇとＧｉｌｍａｎによって実証された後、多くの生化学的証拠および構造上の証拠によって、相同なＣ１ドメインとＣ２ドメインとの相互作用がシクラーゼ触媒機構の核心にあることが明らかになった。全てのアイソフォームは、同一ドメインまたは相同ドメインの二量化を必要とする共通の触媒機構を持つようである。
【０００４】
９つのアデニリルシクラーゼは共通する配列と機能的類似性（例えばいずれもＧｓαタンパク質によって活性化され得る）とを持っているが、各アデニリルシクラーゼは著しく異なる調節機構の制御を受け、組織特異的に発現する（１−５）。例えばＡＣ３、ＡＣ５およびＡＣ６はＧｉタンパク質による阻害に対して感受性であることが明らかにされており、ＡＣ２はＧβγサブユニットによって刺激され得るが、ＡＣ３とＡＣ６はどちらもＧβγサブユニットによって刺激されない。膜アンカー型Ｇタンパク質のサブユニットと直接相互作用するだけでなく、アデニリルシクラーゼは、細胞内イオン組成およびキナーゼ活性またはその両者の刺激誘発性変化の結果として、間接的にも応答する。ＡＣ１、ＡＣ３およびＡＣ８はＣａ２＋／カルモジュリンによって刺激される。ＡＣ５およびＡＣ６は低レベルのＣａ２＋によって阻害される。ＡＣ２およびＡＣ７はキナーゼＣの活性化によって刺激される。一方、Ｇｓによって刺激されたＡＣ４の活性はプロテインキナーゼＣによって阻害されるが、ＡＣ４の基礎活性はプロテインキナーゼＣでは阻害されない。中枢神経系にかなりの発現量を持つＡＣ１、ＡＣ３およびＡＣ８は、Ｃａ２／ＣａＭによる強い刺激を示すが、他のアイソフォームはそうではない。ＡＣ５およびＡＣ６は主に心臓で発現する。
【０００５】
アデニリルシクラーゼアイソフォーム活性化機構の多様性および分布の相違は、ｃＡＭＰレベルの組織特異的調節の一因であるのかもしれない。構造および生化学的性質の特徴が異なることから、アイソフォーム特異的なモジュレーターを発見することが可能であり、それらは組織特異的および疾患特異的に有効であることが強く示唆される。
【０００６】
一例としてＰＤＥ４インヒビターは、上記の結論をはっきりと裏付けている。特異的ＰＤＥ（下流酵素ホスホジエステラーゼは、ｃＡＭＰを対応する不活性な５−一リン酸体に変換することによって、ｃＡＭＰレベルを調節する）インヒビター、すなわちＰＤＥ４インヒビターが、有望な喘息処置剤になるという事実は、喘息の治療においてアデニリルシクラーゼの特異的モジュレーターが同じ役割または相乗的役割を持つかもしれないという考えを裏付けている。
【０００７】
ヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼをコードしている完全なｃＤＮＡ配列は今まで同定されておらず、このタンパク質の特徴もまだ研究されていない。
【０００８】
（発明の概要）
ヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼ（ｈＡＣ４）を調節するための試薬および方法を提供することが、本発明の目的である。本発明のこの目的および他の目的は、以下に説明する態様の一つによって達成される。
【０００９】
本発明の一態様は、
配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約７０％一致するアミノ酸配列；および、
配列番号２に示すアミノ酸配列、
より成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドである。
【００１０】
本発明のさらに別の態様は、ヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼの活性を調節する物質をスクリーニングする方法である。被験化合物を、
配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約７０％一致するアミノ酸配列；および、
配列番号２に示すアミノ酸配列、
より成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドと接触させる。
【００１１】
被験化合物とＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドの間の結合を検出する。それにより、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドに結合する被験化合物を、ヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼの活性を調節する可能性のある物質であると同定する。この物質はＩＶ型アデニル酸シクラーゼの活性を低下させることによって作動することができる。
【００１２】
本発明のもう一つの態様は、ヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼの活性を調節する物質をスクリーニングする方法である。被験化合物を、
配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約７０％一致するヌクレオチド配列；および、
配列番号１に示すヌクレオチド配列、
より成る群から選ばれるヌクレオチド配列を含むＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと接触させる。
【００１３】
上記ポリヌクレオチドに対する被験化合物の結合を検出する。ポリヌクレオチドに結合する被験化合物を、ヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼの活性を調節する可能性のある物質と同定する。この物質はＩＶ型アデニル酸シクラーゼ ｍＲＮＡとの相互作用を通じてＩＶ型アデニル酸シクラーゼ量を減少させることによって作動することができる。
【００１４】
本発明の別の態様は、ヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼによって媒介される生物学的活性を調節する物質をスクリーニングする方法である。被験化合物を、
配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約７０％一致するアミノ酸配列；および、
配列番号２に示すアミノ酸配列、
より成る群から選ばれるアミノ酸配列を含む、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドと接触させる。
【００１５】
上記ポリペプチドのＩＶ型アデニル酸シクラーゼ活性を検出する。それにより、被験化合物の不在下におけるＩＶ型アデニル酸シクラーゼ活性と比較して該ポリペプチドのＩＶ型アデニル酸シクラーゼ活性を調節する被験化合物を、ヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼによって媒介される生物学的活性を調節する可能性のある物質と同定する。それにより、被験化合物の不在下におけるＩＶ型アデニル酸シクラーゼ活性と比較して該ポリペプチドのＩＶ型アデニル酸シクラーゼ活性を低下させる被験化合物を、ヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼによって媒介される生物学的活性を調節する可能性のある物質と同定する。
【００１６】
本発明のさらにもう一つの態様は、ヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼによって媒介される生物学的活性を調節する物質をスクリーニングする方法である。被験化合物を、
配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約７０％一致するヌクレオチド配列；および、
配列番号１に示すヌクレオチド配列、
より成る群から選ばれるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドのＩＶ型アデニル酸シクラーゼ産物と接触させる。
【００１７】
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼ産物への被験化合物の結合を検出する。それにより、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼ産物に結合する被験化合物を、ヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼによって媒介される生物学的活性を調節する可能性のある物質であると同定する。
【００１８】
本発明のさらにもう一つの態様は、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼの活性を増加させる方法である。細胞を、
配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約７０％一致するヌクレオチド配列；および、
配列番号１に示すヌクレオチド配列、
より成る群から選ばれるヌクレオチド配列を含む、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチドがコードしている産物に特異的に結合する試薬と接触させる。
【００１９】
それにより、細胞のＩＶ型アデニル酸シクラーゼ活性を低下させる。
【００２０】
このように本発明は、治療効果を得るために調節することができるヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼを提供する。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードしている単離されたポリヌクレオチドであって、
ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約７０％一致するアミノ酸配列；および、
配列番号２に示すアミノ酸配列
より成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号１に記載の配列を含むポリヌクレオチド；
ｃ）（ａ）および（ｂ）に明記したポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
ｄ）遺伝コードの縮重のため、その配列が（ａ）〜（ｃ）に明記するポリヌクレオチド配列から逸脱している配列のポリヌクレオチド；および、
ｅ）（ａ）〜（ｄ）に明記したポリヌクレオチド配列の断片、誘導体またはアレル変異体を表すポリヌクレオチド、
より成る群から選ばれるポリヌクレオチドに関する。
【００２２】
さらに、本出願人らは、ヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼを調節することにより、この酵素の異常な活性によって起こる疾患、およびＩＶ型アデニリルシクラーゼの活性を刺激または阻害することによってその症状を改善することができる疾患を、制御できることを見いだした。そのような疾患としては、例えば、高血圧；尿閉；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；再狭窄；アテローム性動脈硬化症；過剰な平滑筋細胞または平滑筋細胞増殖の減少を特徴とする疾患；動脈瘤；創傷治癒；脳卒中；虚血；潰瘍；喘息；アレルギー；良性前立腺肥大；片頭痛；嘔吐；精神障害または神経障害、例えば不安、精神分裂病、躁うつ病、鬱病、譫妄、痴呆、および重度精神遅滞、神経変性疾患およびジスキネジーなどの変性疾患などが挙げられる。
【００２３】
ポリペプチド
本発明に係るＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドは、配列番号：２に示すアミノ酸配列または下記定義による生物学的に活性なその変異体から選ばれる少なくとも１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、または２５０個の連続するアミノ酸を含む。したがって、本発明のＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドは、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼタンパク質の一部、完全長のＩＶ型アデニル酸シクラーゼタンパク質、またはＩＶ型アデニル酸シクラーゼタンパク質の全部または一部を含む融合タンパク質であり得る。
【００２４】
生物学的に活性な変異体
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチド変異体は生物学的に活性である、即ちＡＴＰをアデノシン３’，５’−サイクリック一リン酸（ｃＡＭＰ）に変換する触媒活性を保持している。アデニル酸シクラーゼはインビトロでモニターすることができる活性をいくつか持つことで知られている。例えばアデニル酸シクラーゼ活性は、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８，５４１（１９７４）およびＡｄｖ．Ｃｙｃｌｉｃ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｓ．，１０，３５（１９７９）に記載されているように、基質からの放射標識ｃＡＭＰの合成を測定することによって、間接的に検定される。
【００２５】
天然または非天然ＩＶ型アデニル酸シクラーゼ変異体は配列番号：２に示すアミノ酸配列またはその断片と少なくとも約７０、好ましくは約７５、９０、９６若しくは９８％一致するアミノ酸配列を有することが好ましい。推定されるＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドと配列番号：２のアミノ酸配列との一致パーセントは、Ｂｌａｓｔ２整列（アラインメント）プログラム（Ｂｌｏｓｕｍ６２， Ｅｘｐｅｃｔ １０， ｓｔａｎｄａｒｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅｓ）を用いて決定される。
【００２６】
一致パーセントの変異は例えばアミノ酸置換、挿入または欠失に起因し得る。アミノ酸置換は１対１のアミノ酸の置き換えとして定義される。置換されたアミノ酸が類似の構造的および／または化学的性質を有する場合、置換は保存的である。保存的置換の例は、イソロイシンまたはバリンによるロイシンの置換、グルタミン酸塩によるアスパラギン酸塩の置換、またはセリンによるスレオニンの置換である。
【００２７】
アミノ酸挿入または欠失はアミノ酸配列への、またはその内部での変化である。これらは典型的には約１から５アミノ酸の範囲で起こる。ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドの生物学的または免疫学的活性を破壊することなく、どのアミノ酸残基が置換、挿入または欠失できるかを決定する際の指針は、当分野で周知のコンピュータープログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを用いて見出すことができる。あるアミノ酸変化が生物学的に活性なＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドを生成するか否かは、ＡＴＰをｃＡＭＰに変換する効率を検定することにより容易に決定できる。
【００２８】
融合タンパク質
融合タンパク質は、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドアミノ酸配列に対する抗体の作製に、そして様々な検定系での使用に有用である。例えば、融合タンパク質は、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドの一部と相互作用するタンパク質の同定に使用できる。タンパク質親和クロマトグラフィーまたはタンパク質−タンパク質相互作用のためのライブラリーに基づく検定、例えば酵母２−ハイブリッドまたはファージディスプレイ系をこの目的のために使用できる。このような方法は当分野で周知であり、薬物スクリーニングとしても使用できる。
【００２９】
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチド融合タンパク質は、ペプチド結合により融合した二つのポリペプチドセグメントを含んでいる。第一のポリペプチドセグメントは配列番号２、または上記のようなそれらの配列の生物学的に活性な変異体の少なくとも１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、または２５０個の連続アミノ酸を含む。第一のポリペプチドセグメントはまた、完全長ＩＶ型アデニル酸シクラーゼを含むことができる。
【００３０】
第二のポリペプチドセグメントは完全長タンパク質またはタンパク質断片であってよい。融合タンパク質の構築に一般的に使用するタンパク質は、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、自己蛍光タンパク質（青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を包含する）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を包含する。さらに、融合タンパク質の構築には、ヒスチジン（Ｈｉｓ）標識、ＦＬＡＧ標識、インフルエンザへマグルチニン（ＨＡ）標識、Ｍｙｃ標識、ＶＳＶ−Ｇ標識、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）標識を包含するエピトープ標識を使用する。その他の融合構築は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−標識、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合物、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物を包含する。融合タンパク質はさらに、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドコード配列と非相同タンパク質配列の間に位置する開裂部位を含むよう構築することができ、その結果、このＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドは、開裂させ、非相同部分を無くすように精製できる。
【００３１】
融合タンパク質は当分野で周知のように化学合成できる。好ましくは、融合タンパク質は二つのポリペプチドセグメントを共有結合で連結することにより、または分子生物学分野で標準的な方法により調製する。例えば、当分野で知られているように、第二のポリペプチドセグメントをコードしているヌクレオチドを有する適切なリーディングフレームに配列番号１より選ばれるコード配列を含むＤＮＡ構築物を作製し、このＤＮＡ構築物を宿主細胞で発現させることによる組換えＤＮＡ法を用いて、融合タンパク質を調製できる。融合タンパク質構築用の多くのキットが、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ＣＡ）、ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ； Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ， ＭＡ）、およびＱｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ， Ｃａｎａｄａ； １−８８８−ＤＮＡ−ＫＩＴＳ）といった企業から入手できる。
【００３２】
種相同体の同定
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチド（下記）を使用して、他の種、例えばマウス、サル、または酵母由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングするために好適なプローブまたはプライマーを作製し、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドの相同体をコードしているｃＤＮＡを同定し、そして当分野で周知のようにこのｃＤＮＡを発現させて、ヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドの種相同体を得ることができる。
【００３３】
ポリヌクレオチド
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼコード化ポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であってよく、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドのコード配列またはこのコード配列の相補体を含んでいる。ヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼのコード配列を配列番号１に示す。
【００３４】
ヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードしている縮重ヌクレオチド配列、および、配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約７０、好ましくは約７５、９０、９６または９８％一致するホモローガスなヌクレオチド配列もまた、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドである。二つのポリヌクレオチド配列間の配列一致パーセントは、ＡＬＩＧＮのようなコンピュータープログラムを用いて決定するが、これは、ギャップオープンペナルティー−１２およびギャップエクステンションペナルティー−２によるアフィニティ（ａｆｆｉｎｉｔｙ）ギャップ検索を用いるＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用するものである。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子、種相同体および生物学的に活性なＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードしているＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドの変異体もやはりＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドである。
【００３５】
ポリヌクレオチド変異体および相同体の同定
上記のＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチド変異体および相同体もまたＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドである。典型的には、相同なＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチド配列は、当分野で周知のように、ストリンジェントな条件下で候補ポリヌクレオチドを既知のＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドにハイブリダイズすることにより同定できる。例えば、以下の洗浄条件 −− ２Ｘ ＳＳＣ（０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１％ＳＤＳ、室温 ２回、各々３０分間；次いで２× ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃ １回、３０分間；次いで２× ＳＳＣ、室温 ２回、各々１０分間 −− を使用して、最大約２５−３０％の塩基対ミスマッチを含む相同配列を同定できる。より好ましくは、相同核酸鎖は１５−２５％の塩基対ミスマッチを、さらに好ましくは５−１５％の塩基対ミスマッチを含む。
【００３６】
本明細書に開示するＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドの種相同体はさらに、適当なプローブまたはプライマーを作製し、他の種、例えばマウス、サル、または酵母由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることによって同定できる。ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドのヒト変異体は、例えばヒトｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることにより同定できる。二本鎖ＤＮＡのＴｍは相同性が１％低下する毎に１−１．５℃低下することがよく知られている（Ｂｏｎｎｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ８１，１２３（１９７３））。故にヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドの変異体または他の種のＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドは、推定の相同ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドを、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはその相補物とハイブリダイズさせて被験ハイブリッドを作製することによって同定できる。被験ハイブリッドの融解温度を完全に相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むハイブリッドの融解温度と比較し、被験ハイブリッドの中の塩基対ミスマッチのパーセント数を算出する。
【００３７】
ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件に従いＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドまたはその相補物とハイブリダイズするヌクレオチド配列もまたＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドである。ストリンジェントな洗浄条件は当分野で周知且つ理解されており、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， ２ｄ ｅｄ．， １９８９， ９．５０−９．５１頁に開示されている。
【００３８】
典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のためには、温度と塩濃度の組み合わせを、検討中のハイブリッドの理論的Ｔｍよりおよそ１２−２０℃低くなるよう選択すべきである。配列番号１に示すヌクレオチド配列を有するＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドまたはその相補物と、それらのヌクレオチド配列のいずれか１つと少なくとも約７３、好ましくは約７５、９０、９６、または９８％一致するポリヌクレオチド配列とのハイブリッドのＴｍは、例えばＢｏｌｔｏｎおよびＭｃＣａｒｔｈｙ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ４８，１３９０（１９６２）の式：
Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／ｌ）、
［式中、ｌ＝塩基対で表したハイブリッドの長さ］
を用いて算出できる。
【００３９】
ストリンジェントな洗浄条件としては例えば、４× ＳＳＣ（６５℃）、または５０％ホルムアミド、４× ＳＳＣ（４２℃）、または０．５× ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（６５℃）が挙げられる。高度ストリンジェントな洗浄条件は、例えば０．２× ＳＳＣ（６５℃）などである。
【００４０】
ポリヌクレオチドの調製
天然に存在するＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドは、膜構成成分、タンパク質および脂質といった他の細胞成分を含まないよう単離できる。ポリヌクレオチドは、細胞に産生させて標準的核酸精製技術を用いて単離するか、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅技術を用いて、若しくは自動合成機を用いて合成することができる。ポリヌクレオチドを単離する方法は機械的であり、当分野で知られている。ポリヌクレオチドを取得するためのこのような任意の技術を用いて、単離されたＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドを得ることができる。例えば、制限酵素およびプローブを用いてＩＶ型アデニル酸シクラーゼヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド断片を単離できる。単離したポリヌクレオチドは他の分子を含まないか、あるいは少なくとも７０、８０、または９０％含まない調製物である。
【００４１】
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼ ｃＤＮＡ分子は、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼ ｍＲＮＡを鋳型に用いて標準的分子生物学技術にて調製できる。その後ＩＶ型アデニル酸シクラーゼ ｃＤＮＡ分子は、当分野で周知でありＳａｍｂｒｏｏｋら．（１９８９）のようなマニュアルに開示される分子生物学技術を用いて複製できる。ヒトゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型に使用して本発明に係るポリヌクレオチドのさらなるコピーを得るため、ＰＣＲのような増幅技術を用いることができる。
【００４２】
別法として、合成化学技術を用いてＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドを合成することもできる。遺伝コードの縮重は、例えば配列番号２に示すアミノ酸配列を有するＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドまたはその生物学的に活性な変異体をコードしている別のヌクレオチド配列の合成を可能にする。
【００４３】
ポリヌクレオチドの伸長
ＰＣＲに基づく様々な方法を用いて、本明細書に開示された核酸配列を伸長させ、プロモーターおよび調節要素といった上流配列を検出することができる。例えば制限部位ＰＣＲは、既知の座に隣接する未知配列を検索するため、ユニバーサルプライマーを使用する（Ｓａｒｋａｒ， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． ２，３１８−３２２，１９９３）。まず、ゲノムＤＮＡを、リンカー配列に対するプライマーと既知領域に特異的なプライマーの存在下で増幅する。次に、増幅させた配列を、同じリンカープライマーと最初のものの内部にある別の特異的プライマーを用いて、二回目のＰＣＲにかける。各回のＰＣＲ産物を適当なＲＮＡポリメラーゼで転写し、逆転写を用いて配列決定する。
【００４４】
既知領域に基づく異なるプライマーを用いて配列を増幅または伸長するために、逆ＰＣＲを使用することもできる（Ｔｒｉｇｌｉａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６，８１８６，１９８８）。ＯＬＩＧＯ ４．０６ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ， Ｍｉｎｎ）のような市販ソフトウェアを用いて、長さ２２−３０ヌクレオチド長、５０％またはそれ以上のＧＣ含有量を持ち、約６８−７２℃の温度で標的配列とアニーリングするプライマーを設計できる。この方法は、幾つかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知領域に適当な断片を作り出せる。次いでこの断片を分子内ライゲーションにより環化し、ＰＣＲ鋳型として使用する。
【００４５】
使用できるもう一つの方法は、ヒトおよび酵母人工染色体ＤＮＡ中の既知配列に隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を含む、捕捉ＰＣＲである（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． １，１１１−１１９，１９９１）。この方法では、作製した二本鎖配列を、ＰＣＲの実施前に当該ＤＮＡ分子の未知断片中に入れるため、さらに複数の制限酵素消化とライゲーションを行うことができる。
【００４６】
未知配列を回収するために使用できるもう一つの方法はＰａｒｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９，３０５５−３０６０，１９９１の方法である。さらに、ＰＣＲ、ネスティド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマー、およびＰＲＯＭＯＴＥＲＦＩＮＤＥＲライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆ．）を用いてゲノムＤＮＡ歩行を行なうことができる（ＣＬＯＮＴＥＣＨ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆ．）。このプロセスはライブラリーをスクリーニングする必要性を排除し、イントロン／エクソン接合点の発見に有用である。
【００４７】
スクリーニングで完全長ｃＤＮＡを求める場合、より大きなｃＤＮＡを含むようサイズ選択したライブラリーを使用するのが望ましい。遺伝子の５’領域を含む配列をより多く含んでいるという点で、無作為プライミングしたライブラリーが好ましい。無作為プライミングしたライブラリーの使用は、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーが完全長ｃＤＮＡを産生しない状況で特に好ましいであろう。ゲノムライブラリーは、配列を５’非転写調節領域へと伸長させるのに有用な場合がある。
【００４８】
市販品が入手可能な毛細管電気泳動系を用いて、ＰＣＲまたは配列決定産物のサイズを分析、またはヌクレオチド配列を確認することができる。例えば、毛細管配列決定は、電気泳動分離用の流動性ポリマー、レーザー励起する４種の異なる蛍光色素（各ヌクレオチドにつき１種ずつ）、および電荷結合素子カメラによる放射された波長の検出を利用することができる。出力／光強度は適当なソフトウェア（例えばＧＥＮＯＴＹＰＥＲおよびＳｅｑｕｅｎｃｅ ＮＡＶＩＧＡＴＯＲ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて電気信号に変換でき、試料のロードからコンピューター分析および電子的データ表示に至る全プロセスをコンピューター管理することができる。毛細管電気泳動は、特定の試料中に限られた量で存在するかも知れないＤＮＡの小片を配列決定するのに特に好ましい。
【００４９】
ポリペプチドの取得
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドは、例えばヒト細胞からの精製によって、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドの発現によって、または直接的化学合成によって取得できる。
【００５０】
タンパク質精製
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドは、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼ発現構築物がトランスフェクトされている宿主細胞を含めて、同酵素を発現する任意のヒト細胞から精製できる。特に良いＩＶ型アデニル酸シクラーゼ源は末梢血白血球である。精製ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドは、細胞内のＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドに通常付随するその他の化合物、例えばある種のタンパク質、炭水化物または脂質から、当分野で周知の方法を用いて分離する。このような方法は、サイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム分画、イオン交換クロマトグラフィー、親和クロマトグラフィー、および調製用ゲル電気泳動を包含するが、これらに限定されない。高塩濃度洗浄液（ｈｉｇｈ ｓａｌｔ ｗａｓｈｅｓ）にアデニル酸シクラーゼ酵素が濃縮されるようである。精製ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドの調製物は少なくとも８０％純粋であり、好ましくは該調製物は９０％、９５％、または９９％純粋である。調製物の純度はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような当分野で既知の任意の手段によって評価できる。
【００５１】
ポリヌクレオチドの発現
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドを発現させるため、挿入されたコード配列の転写と発現に必要な要素を含む発現ベクター中に前記ポリヌクレオチドを挿入することができる。当業者に周知の方法を利用して、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードしている配列および適当な転写および翻訳調節要素を含む発現ベクターを構築できる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えがある。このような技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．， Ｎ．Ｙ．， １９８９に記載されている。
【００５２】
様々な発現ベクター／宿主系を利用して、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードしている配列を組込み、そして発現させることができる。これらには、微生物、例えば組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌；酵母発現ベクターにより形質転換された酵母、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）により感染を受けた昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）、もしくは細菌発現ベクター（例えばＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）により形質転換された植物細胞系、または動物細胞系が包含されるがこれらに限定される訳ではない。
【００５３】
調節要素または調節配列は、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写と翻訳を実行するベクターの非翻訳領域−エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域−である。かかる要素はその強さと特異性において異なっている。利用するベクター系および宿主に応じて、構成的および誘導的プロモーターを包含する、多数の好適な転写および翻訳要素を使用できる。例えば、細菌系でクローニングを行う場合、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等のハイブリッドｌａｃＺプロモーターのような誘導的プロモーターを使用できる。バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターは昆虫細胞に使用できる。植物細胞のゲノムから誘導したプロモーターまたはエンハンサー（例えば熱ショック、ＲＵＢＩＳＣＯ、および貯蔵タンパク質遺伝子）、または植物ウイルスから誘導したプロモーターまたはエンハンサー（例えば、ウイルスプロモーターまたはリーダー配列）を該ベクター中にクローニングすることができる。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子由来の、または哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが好ましい。ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を複数コピー含む細胞系を作製する必要がある場合は、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターを適当な選択マーカーと共に使用することができる。
【００５４】
細菌および酵母発現系
細菌系では、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドに対して意図する用途に応じて幾つかの発現ベクターを選択できる。例えば、抗体の誘導のため大量のＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドが必要である場合は、容易に精製できる融合タンパク質の高レベル発現を指令するベクターが使用できる。このようなベクターは、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のような多機能Ｅ．ｃｏｌｉクローニングおよび発現ベクターを包含するが、これに限定される訳ではない。ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴベクターにおいては、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードしている配列を、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔとこれに続く７残基の配列と共にフレーム内で該ベクター中にライゲーションすることができ、その結果ハイブリッドタンパク質が産生される。ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６４，５５０３−５５０９，１９８９）またはｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）もまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を伴う融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるのに使用できる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、その後遊離グルタチオンの存在下で溶離することにより、溶菌させた細胞から容易に精製できる。このような系で調製したタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、または第Ｘａ因子プロテアーゼ開裂部位を含むよう設計でき、その結果、目的とするクローンポリペプチドをＧＳＴ部分から随意に解放することができる。
【００５５】
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいては、α因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨのような構成的または誘導的プロモーターを含む幾つかのベクターが使用できる。総説としてＡｕｓｕｂｅｌら、（１９８９）およびＧｒａｎｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３，５１６−５４４，１９８７を参照されたい。
【００５６】
植物および昆虫発現系
植物発現ベクターを使用する場合、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードしている配列の発現は、幾つかのプロモーターのうち任意のものにより駆動できる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターのようなウイルスプロモーターを、単独で、またはＴＭＶ由来のオメガリーダー配列と組み合わせて使用できる（Ｔａｋａｍａｔｓｕ， ＥＭＢＯ Ｊ． ６，３０７−３１１，１９８７）。別法として、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットのような植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを使用することもできる（Ｃｏｒｕｚｚｉら、ＥＭＢＯ Ｊ． ３，１６７１−１６８０，１９８４；Ｂｒｏｇｌｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４，８３８−８４３，１９８４；Ｗｉｎｔｅｒら、Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． １７，８５−１０５，１９９１）。これらの構築物は、直接ＤＮＡ形質転換または病原体媒介トランスフェクションにより植物細胞中に導入できる。このような技術は幾つかの一般に入手可能な総説に記載されている（例えば、ＨｏｂｂｓまたはＭｕｒｒａｙ、ＭＣＧＲＡＷ ＨＩＬＬ ＹＥＡＲＢＯＯＫ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ， ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｐｐ１９１−１９６，１９９２）。
【００５７】
昆虫系もまたＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドの発現に使用できる。例えば、かかる系の１つでは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａの幼虫で外来遺伝子を発現させるベクターとして使用する。ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードしている配列を、ポリヘドリン遺伝子のような該ウイルスの非必須領域中にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの調節下に置くことができる。ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをうまく挿入すると、ポリヘドリン遺伝子は不活性化し、コートタンパク質を欠く組換えウイルスが生成する。次いでこの組換えウイルスをＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａの幼虫への感染に使用し、そこでＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドを発現させることができる（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ９１，３２２４−３２２７，１９９４）。
【００５８】
哺乳動物発現系
ウイルスに基づく多くの発現系を用いて哺乳動物宿主細胞でＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドを発現させることができる。例えば、発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードしている配列は、後期プロモーターおよび３部に分かれたリーダー配列を含むアデノウイルス転写／翻訳複合体中にライゲーションできる。該ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域における挿入を用いて、感染宿主細胞においてＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドを発現できる生存ウイルスを取得できる（Ｌｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８１，３６５５−３６５９，１９８４）。所望によりラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーのような転写エンハンサーを用いて哺乳動物宿主細胞での発現を増大させることができる。
【００５９】
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）もまた、プラスミドが内包し発現するＤＮＡ断片よりも大きなＤＮＡ断片の運搬に使用できる。６Ｍから１０ＭのＨＡＣを構築し、常套的送達法により細胞に到達させる（例えば、リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、または小胞）。
【００６０】
さらに、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードしている配列のより効率的な翻訳を達成するために、特異的開始シグナルを使用できる。かかるシグナルはＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を包含する。ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードしている配列、その開始コドン、および上流配列を適当な発現ベクター中に挿入した場合、さらなる転写または翻訳調節シグナルは必要ないであろう。しかしながら、コード配列またはその断片のみを挿入した場合は、外因性の翻訳調節シグナル（ＡＴＧ開始コドンを包含する）を供給すべきである。開始コドンは挿入物全体を確実に翻訳させるために、正しいリーディングフレームになければならない。外因性翻訳要素および開始コドンは天然および合成両者の様々な起源であってよい。発現の効率は、使用する特定の細胞系に対し適切なエンハンサーを存在させることにより増強できる（Ｓｃｈａｒｆら、Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０，１２５−１６２，１９９４）。
【００６１】
宿主細胞
宿主細胞菌株は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現されたＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドを所望の方法で処理できる能力を目的として選択できる。該ポリペプチドのこのような修飾には、アセチル化、カルボキシ化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が包含されるがこれらに限定されない。該ポリペプチドの「プレプロ」型を開裂する翻訳後プロセシングもまた、正しい挿入、折り畳み、および／または機能を促進するために使用できる。翻訳後活性のための特異的な細胞機構および特徴的メカニズムを持つ異なる宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、およびＷＩ３８）が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９）から入手でき、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実とするために選択できる。
【００６２】
組換えタンパク質の、長期高収量産生のために、安定な発現が好ましい。例えば、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドを安定に発現する細胞系を、ウイルス複製起点および／または内因性発現要素、および同じまたは別のベクター上にある選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて形質転換することができる。該ベクターの導入に続いて、細胞を強化培地で１−２日間生育させた後、培地を選択培地に交換することができる。選択マーカーの目的は選択に対する抵抗性を付与することであり、その存在が、導入されたＩＶ型アデニル酸シクラーゼ配列をうまく発現する細胞の生育と回収を可能にする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型にとって適当な組織培養技術を用いて増殖させることができる。例えば、ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ， Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６を参照されたい。
【００６３】
幾つかの選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収できる。これらには、それぞれｔｋ−またはａｐｒｔ−細胞で使用できる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１，２２３−３２，１９７７）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ ２２，８１７−２３，１９８０）遺伝子が包含されるがこれらに限定される訳ではない。さらに、代謝拮抗物質、抗生物質、または除草剤耐性を選択の基準に用いることができる。例えば、ｄｈｆｒはメソトレキサートに対する耐性を付与し（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ７７，３５６７−７０，１９８０）、ｎｐｔはアミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を付与し（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０，１０１４，１９８１）、そしてａｌｓおよびｐａｔはそれぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与する（Ｍｕｒｒａｙ， １９９２，上記）。さらなる選択遺伝子が記載されている。例えば、ｔｒｐＢは細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用するようにさせ、ｈｉｓＤは細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用するようにさせる（Ｈａｒｔｍａｎ ＆ Ｍｕｌｌｉｇａｎ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８５，８０４７−５１，１９８８）。アントシアニンのような可視マーカー、β−グルクロニダーゼとその基質ＧＵＳ、およびルシフェラーゼとその基質ルシフェリンは、形質転換体を同定し、特異的ベクター系に帰すことのできる一過性または安定なタンパク質発現の量を定量するために使用できる（Ｒｈｏｄｅｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ５５，１２１−１３１，１９９５）。
【００６４】
発現の検出
マーカー遺伝子発現の存在はＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドも存在することを示唆しているが、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドの存在と発現は確認する必要があるかもしれない。例えば、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードしている配列がマーカー遺伝子配列内部に挿入されている場合、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードしている配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の不在によって同定できる。これとは別に、単一のプロモーターの制御下に、マーカー遺伝子と、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドポリペプチドをコードしている配列とを、タンデムに置くこともできる。誘導または選択に応答して起こるこのマーカー遺伝子の発現は、通常、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドの発現を示す。
【００６５】
これとは別に、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドを含み、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドを発現する宿主細胞は、当業者に知られる様々な方法によって同定できる。これらの方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびタンパク質バイオアッセイまたはイムノアッセイ技術（核酸またはタンパク質の検出および／または定量のための膜、溶液、またはチップに基づく技術を包含する）が包含されるがこれらに限定されない。例えば、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列の存在は、プローブまたは断片またはＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの断片を使用するＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたは増幅によって検出できる。核酸増幅に基づく検定は、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドを含む形質転換体を検出するための、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードしている配列から選択されるオリゴヌクレオチドの使用を含む。
【００６６】
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドに対し特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかを使用して該ポリペプチドの発現を検出および測定するための様々なプロトコルが当分野で知られている。例として、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）がある。ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチド上の２個の非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる、２部位のモノクローナルに基づくイムノアッセイが使用でき、または、競合的結合検定を使用することができる。これらのおよびその他の検定はＨａｍｐｔｏｍら、ＳＥＲＯＬＯＧＩＣＡＬ ＭＥＴＨＯＤＳ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ， Ｓｔ．Ｐａｕｌ， Ｍｉｎｎ．， １９９０およびＭａｄｄｏｘら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １５８，１２１１−１２１６，１９８３に記載されている。
【００６７】
多岐にわたる標識およびコンジュゲーション技術が当業者に知られており、様々な核酸およびアミノ酸検定に使用できる。ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識化ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを調製する手段は、標識したヌクレオチドを使用する、オリゴ標識化、ニック翻訳、末端標識化、またはＰＣＲ増幅を包含する。これとは別に、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードしている配列を、ｍＲＮＡプローブの産生のためのベクター中にクローニングすることもできる。このようなベクターは当分野で既知であり、市販品が入手でき、標識化ヌクレオチドおよび適当なＲＮＡポリメラーゼ、例えばＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６を添加することによりインビトロでのＲＮＡプローブの合成に使用することができる。これらの方法は、市販の様々なキットを用いて実施できる（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、 Ｐｒｏｍｅｇａ、およびＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）。検出を容易にするために使用できる適当なリポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、および蛍光、化学ルミネセント、または色素生成物質、ならびに基質、補助因子、インヒビター、磁性粒子などが包含される。
【００６８】
ポリペプチドの発現および精製
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列で形質転換させた宿主細胞は、発現と、細胞培養からのタンパク質の回収に適した条件下で培養できる。形質転換細胞により産生されたポリペプチドは、その配列および／または使用したベクターに応じて分泌されまたは細胞内に貯留され得る。当業者には理解できるであろうが、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核または真核細胞膜を通った可溶性ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドの分泌を指令する、または膜結合ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドの、膜挿入を指令する、シグナル配列を含むよう設計できる。
【００６９】
上に論じたように、他の構築物を用いて、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードしている配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードしているヌクレオチド配列と結合させることができる。このような精製促進ドメインには、金属キレート化ペプチド、例えば固定化金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするタンパク質Ａドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／親和精製系で利用するドメインが包含されるが、これらに限定されない（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ．， Ｓｅａｔｔｌｅ， Ｗａｓｈ．）。精製ドメインとＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドとの間に開裂可能リンカー配列、例えば第Ｘａ因子またはエンテロキナーゼに特異的なリンカー配列を入れること（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）もまた、精製を促進するために利用できる。このような発現ベクターの１つは、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドと、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ開裂部位に先立つ６個のヒスチジン残基とを含む融合タンパク質の発現を提供する。このヒスチジン残基はＩＭＡＣ（Ｐｏｒａｔｈら、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ． ３，２６３−２８１，１９９２に記載の固定化金属イオン親和クロマトグラフィー）による精製を促進し、一方エンテロキナーゼ開裂部位は融合タンパク質からのＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドの精製手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターはＫｒｏｌｌら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２，４４１−４５３，１９９３に開示されている。
【００７０】
化学合成
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードしている配列は、その全体または一部を、当分野で周知の化学的方法を用いて合成できる（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ． ２１５−２２３，１９８０；Ｈｏｒｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ． ２２５−２３２，１９８０）。これとは別に、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチド自身を、そのアミノ酸配列を合成するための化学的方法、例えば固相技術を用いる直接ペプチド合成を用いて調製できる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． ８５，２１４９−２１５４，１９６３；Ｒｏｂｅｒｇｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９，２０２−２０４，１９９５）。タンパク質合成は手動技術またはオートメーションを用いて実施できる。自動化合成は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａペプチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて達成できる。所望により、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドの断片を別々に合成し、化学的方法を用いて合して完全長の分子を調製することもできる。
【００７１】
新たに合成したペプチドは、調製用高速液体クロマトグラフイー（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， ＰＲＯＴＥＩＮＳ： ＳＴＲＵＣＴＵＲＥＳ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９８３）により実質的に精製できる。合成ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドの組成はアミノ酸分析または配列決定により確認できる（例えばエドマン分解法；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、上記を参照されたい）。さらに、直接合成中にＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドのアミノ酸配列の任意の部分を改変させ、そして／または化学的方法を用いて他のタンパク質由来の配列と合して、変異体ポリペプチドまたは融合タンパク質を調製することができる。
【００７２】
改変ポリペプチドの調製
当業者には理解できるであろうが、天然に存在しないコドンを有するＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドコード化ヌクレオチド配列を調製することは有利であり得る。例えば、特定の原核または真核宿主が好むコドンを選択して、タンパク質発現の速度を増大させ、または所望の性質、例えば天然に存在する配列から産み出される転写物の半減期より長い半減期を持つＲＮＡ転写物を調製することができる。
【００７３】
本明細書に開示するヌクレオチド配列は、当分野で一般的に知られる方法を用いて、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドまたはｍＲＮＡ産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を修飾する改変を包含する（但しこれらに限定される訳ではない）様々な理由で、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドコード配列を改変させるように設計できる。無作為断片化によるＤＮＡシャフリングと遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再集合を用いてヌクレオチド配列を設計できる。例えば、位置指定突然変異誘発を用いて、新たな制限部位を挿入し、グリコシル化パターンを変え、コドンの優先性を変え、スプライス変異体を調製し、突然変異を導入する等を実施できる。
【００７４】
抗体
当分野で知られているいかなる型の抗体も、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドのエピトープと特異的に結合するよう作製できる。本明細書で使用する「抗体」とは、無処理の免疫グロブリン分子、およびその断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ＝）２、およびＦｖを包含し、これらはＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドのエピトープに結合できる。典型的には、エピトープを形成するためには少なくとも６、８、１０、または１２の連続するアミノ酸が必要である。しかしながら、非連続アミノ酸を含むエピトープはより多くの、例えば少なくとも１５、２５、または５０のアミノ酸を必要とするかも知れない。
【００７５】
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドのエピトープと特異的に結合する抗体は治療に使用でき、そして免疫化学検定、例えばウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学検定、免疫沈降、またはその他の当分野で既知の免疫化学的検定に使用できる。所望の特異性を有する抗体の同定のため、様々なイムノアッセイが使用できる。競合的結合または免疫放射検定のための多数のプロトコルが当分野でよく知られている。このようなイムノアッセイは典型的には、免疫原と、その免疫原に特異結合する抗体との間の複合体形成の測定を含んでいる。
【００７６】
典型的には、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドと特異的に結合する抗体は、免疫化学検定に使用する時、他のタンパク質が提供する検出シグナルより少なくとも５、１０、または２０倍高い検出シグナルを提供する。好ましくは、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドに特異結合する抗体は、免疫化学検定で他のタンパク質を検出せず、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドを溶液から免疫沈降させることができる。
【００７７】
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドは、哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、またはヒトを免疫してポリクローナル抗体を産生させるのに使用できる。所望により、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドは、担体タンパク質、例えば牛血清アルブミン、チログロブリン、およびスカシガイヘモシアニンとコンジュゲートさせることができる。宿主の種に応じて、免疫学的反応を増大させるために種々のアジュバントを使用できる。このようなアジュバントは、フロイントアジュバント、鉱物性ゲル（例えば水酸化アルミニウム）、および界面活性物質（例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、スカシガイヘモシアニン、およびジニトロフェノール）を包含するがこれらに限定されない。ヒトに使用するアジュバントの中ではＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｉ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍが特に有用である。
【００７８】
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体は、培養中の連続的細胞系により抗体分子の産生を提供する任意の技術を用いて調製できる。これらの技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術があるがこれらに限定されない（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７，１９８５； Ｋｏｚｂｏｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１，３１−４２，１９８５； Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８０，２０２６−２０３０，１９８３； Ｃｏｌｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６２，１０９−１２０，１９８４）。
【００７９】
さらに、マウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子にスプライシングして適当な抗原特異性と生物活性を持つ分子を得る、キメラ抗体の産生のために開発された技術が利用できる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８１，６８５１−６８５５，１９８４； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２，６０４−６０８，１９８４； Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４，４５２−４５４，１９８５）。モノクローナルおよびその他の抗体はまた、これを治療に使用した場合に患者が該抗体に対する免疫反応を起こすのを防ぐため、ヒト化することができる。このような抗体は、治療に直接使用できるほど配列が充分ヒトに類似しているかも知れず、または幾つかの重要残基の変更を必要とするかも知れない。齧歯類の抗体とヒト配列の間の配列相違は、個々の残基の位置指定突然変異誘発により、または相補性決定領域全体の格子により、ヒト配列内の残基と相違する残基を置き換えることによって最小化することができる。別法として、ヒト化抗体はＧＢ２１８８６３８Ｂに記載のように組換え法を用いて調製できる。ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドと特異的に結合する抗体は、Ｕ．Ｓ．５５６５３３２に開示のように、部分的または完全にヒト化した抗原結合部位を含むことができる。
【００８０】
これに代わり、当分野で既知の方法を用いて、一本鎖抗体の調製のために記載した技術を適合させ、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドに特異結合する一本鎖抗体を調製することができる。関連する特異性を持つが別個のイディオタイプ組成を有する抗体を、無作為組み合わせ免疫グロブリンライブラリーから鎖シャフリングによって調製することができる（Ｂｕｒｔｏｎ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８８，１１１２０−２３，１９９１）。
【００８１】
一本鎖抗体はまた、ハイブリドーマｃＤＮＡを鋳型に用いて、ＰＣＲのようなＤＮＡ増幅法を用いて構築することができる（Ｔｈｉｒｉｏｎら、１９９６， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ． ５，５０７−１１）。一本鎖抗体は単一または二重特異性であり得、また、二価または四価であり得る。四価二重特異性一本鎖抗体の構築は例えばＣｏｌｏｍａ ＆ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， １９９７， Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５，１５９−６３に教示されている。二価二重特異性一本鎖抗体の構築はＭａｌｌｅｎｄｅｒ ＆ Ｖｏｓｓ， １９９４， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６９，１９９−２０６に教示されている。
【００８２】
下記のように、一本鎖抗体をコードしているヌクレオチド配列を手動または自動ヌクレオチド合成を用いて構築し、標準的組換えＤＮＡ法を用いて発現構築物中にクローニングし、そして細胞中に導入してコード配列を発現させることができる。別法として、一本鎖抗体を、例えば繊維ファージ技術を用いて直接調製することもできる（Ｖｅｒｈａａｒら、１９９５， Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６１，４９７−５０１； Ｎｉｃｈｏｌｌａら、１９９３， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ． １６５，８１−９１）。
【００８３】
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドに特異結合する抗体はまた、リンパ球集団においてインビボ産生を誘導することによって、または、文献に開示されている極めて特異的な結合試薬のパネルまたは免疫グロブリンライブラリーをスクリーニングすることによって調製することもできる（Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８６，３８３３−３８３７，１９８９； Ｗｉｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３４９，２９３−２９９，１９９１）。
【００８４】
その他の型の抗体を、本発明方法において構築し、治療に使用することができる。例えば、ＷＯ９３／０３１５１に開示のように、キメラ抗体を構築することができる。免疫グロブリンから誘導され多価且つ多重特異的である結合タンパク質、例えばＷＯ９４／１３８０４に記載の「ジアボディイ（ｄｉａｂｏｄｙ）」もまた調製できる。
【００８５】
本発明に係る抗体は当分野で周知の方法により精製できる。例えば、抗体は、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドが結合しているカラムを通過させることにより親和精製できる。次いで、結合した抗体を、高い塩濃度の緩衝液を用いてカラムから溶出することができる。
【００８６】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に対し相補的なヌクレオチド配列である。いったん細胞中に導入されるとこの相補的ヌクレオチドは、該細胞が産生した天然配列と結合して複合体を形成し、転写または翻訳のいずれかを遮断する。好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも１１ヌクレオチド長であるが、少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０またはそれ以上のヌクレオチド長であってもよい。より長い配列もまた使用できる。アンチセンスオリゴヌクレオチド分子をＤＮＡ構築物に提供し、上記のように細胞中に導入して、その細胞におけるＩＶ型アデニル酸シクラーゼ遺伝子産物のレベルを低下させることができる。
【００８７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはこの両者の組み合わせであってよい。オリゴヌクレオチドは、１つのヌクレオチドの５’末端を、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロアミデート、燐酸エステル、カルバメート、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、カルボネート、および燐酸トリエステルといった非ホスホジエステルヌクレオチド間結合で、別のヌクレオチドの３’末端と共有結合させることにより、手動で、または自動合成機によって合成できる。Ｂｒｏｗｎ， Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０，１−８，１９９４； Ｓｏｎｖｅａｕｘ， Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２６，１−７２，１９９４； Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ． ９０，５４３−５８３，１９９０を参照されたい。
【００８８】
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼ遺伝子の制御、５’、または調節領域と二本鎖を形成するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することにより、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼ遺伝子発現の修飾が得られる。転写開始部位、例えば開始部位から−１０および＋１０位の間から誘導されるオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、「三重らせん」塩基対合法を用いて阻害を達成できる。三重らせん対合は、ポリメラーゼ、転写因子またはシャペロンが結合するのに十分なほど開く二重らせんの能力の阻害を引き起こすため、有用である。三本鎖ＤＮＡを用いる治療上の進歩が文献に記載されている（例えばＧｅｅら、Ｈｕｂｅｒ ＆ Ｃａｒｒ， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＡＮＤ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣ ＡＰＰＲＯＡＣＨＥＳ， Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｍｔ．Ｋｉｓｃｏ， Ｎ．Ｙ．， １９９４）。転写物がリボソームに結合するのを防ぐことによりｍＲＮＡの翻訳を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた設計できる。
【００８９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドの相補配列との間に好結果の複合体を形成させるためには、正確な相補性は必要ない。例えばＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドに対し正確に相補的な連続するヌクレオチドからなる２、３、４、若しくは５つまたはそれ以上の区間（ストレッチ）であって、その各々が、隣接するＩＶ型アデニル酸シクラーゼヌクレオチドとは相補的ではない連続するヌクレオチドからなる１区間（ストレッチ）によって隔てられているものを含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼ ｍＲＮＡに対する充分な標的化特異性を提供できる。好ましくは、相補的な連続ヌクレオチドの各区間（ストレッチ）は少なくとも４、５、６、７若しくは８ヌクレオチド長またはそれ以上である。非相補的な介在配列は、好ましくは１、２、３、または４ヌクレオチド長である。当業者は、アンチセンス−センスの対の算出融点を容易に使用して、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドと特定のＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチド配列間で寛容されるミスマッチの程度を決定できるであろう。
【００９０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドとハイブリダイズする能力に影響を及ぼすことなく修飾できる。これらの修飾は該アンチセンス分子の内部、または一端もしくは両端である。例えば、ヌクレオシド間の燐酸結合は、アミノ基と末端リボースの間にいろいろな数の炭素残基を有するコレステリルまたはジアミン部分を加えることによって修飾できる。修飾された塩基および／または糖、例えばリボースの代わりのアラビノース、または３’ヒドロキシ基または５’燐酸基が置換されている３’，５’−置換オリゴヌクレオチドもまた修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドに使用できる。これらの修飾オリゴヌクレオチドは当分野で周知の方法により調製できる。例えば、Ａｇｒａｗａｌら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０，１５２−１５８，１９９２； Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ． ９０，５４３−５８４，１９９０； Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ． ２１５，３５３９−３５４２，１９８７を参照されたい。
【００９１】
リボザイム
リボザイムは触媒活性を有するＲＮＡ分子である。例えば、Ｃｅｃｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６，１５３２−１５３９； １９８７； Ｃｅｃｈ， Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５９，５４３−５６８； １９９０， Ｃｅｃｈ， Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ． ２，６０５−６０９； １９９２， Ｃｏｕｔｕｒｅ ＆ Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １２，５１０−５１５， １９９６を参照されたい。当分野で知られるように、リボザイムは、ＲＮＡ配列を開裂することにより遺伝子機能を阻害するのに使用できる（例えば、Ｈａｓｅｌｏｆｆら、米国特許５６４１６７３）。リボザイムの作用機構は、相補的標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、その後の内ヌクレオチド鎖分解性の（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）開裂を含む。例には、特異的ヌクレオチド配列の内ヌクレオチド鎖分解性の開裂を特異的且つ効果的に触媒できる、設計されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子がある。
【００９２】
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドのコード配列を用いて、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドから転写されたｍＲＮＡに特異結合するリボザイムを作製できる。他のトランスのＲＮＡ分子を極めて配列特異的に開裂できるリボザイムを設計し構築する方法が開発され、当分野で記載されている（Ｈａｓｅｌｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４，５８５−５９１，１９８８）。例えば、リボザイムの開裂活性は、別個の「ハイブリダイゼーション」領域を該リボザイム中に組み入れることによって、特定のＲＮＡを標的とさせることができる。このハイブリダイゼーション領域は標的ＲＮＡに対し相補的な配列を含んでおり、したがってその標的と特異的にハイブリダイズする（例えばＧｅｒｌａｃｈら、ＥＰ３２１２０１を参照されたい）。
【００９３】
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼ ＲＮＡ標的内部の特異的リボザイム開裂部位は、この標的分子を、以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣを包含するリボザイム開裂部位についてスキャンすることにより同定できる。同定できたならば、該開裂部位を含む標的ＲＮＡの領域に対応する、１５および２０の間のリボヌクレオチドを有する短いＲＮＡ配列を、標的を非機能的にし得る二次構造の特徴について評価できる。さらに、候補のＩＶ型アデニル酸シクラーゼ ＲＮＡ標的の適合性を、リボヌクレアーゼ防護検定を用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対する利用可能性を試験することによって評価できる。より長い相補配列を用いて、標的に対するハイブリダイゼーション配列の親和性を増大させることができる。リボザイムのハイブリダイズおよび開裂する領域は、相補領域を介して標的ＲＮＡにハイブリダイズする時、リボザイムの触媒領域が標的を開裂し得るといったように、完全に相関している。
【００９４】
リボザイムはＤＮＡ構築物の一部として細胞内に導入できる。マイクロ注入、リポソーム媒介トランスフェクション、電気穿孔、または燐酸カルシウム沈殿といった機械的方法を用いて、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼ発現の低下が望まれる細胞中にリボザイム含有ＤＮＡ構築物を導入することができる。これとは別に、細胞がＤＮＡ構築物を安定的に保持することが望まれる場合は、該構築物をプラスミド上で供給し、当分野で知られるように、別個の要素として維持するか、または細胞のゲノム中に組み込むことができる。リボザイムコード化ＤＮＡ構築物は、細胞中のリボザイムの転写を調節するために、プロモーター要素、エンハンサーまたはＵＡＳ要素、および転写ターミネーターシグナルといった転写調節要素を含み得る。
【００９５】
Ｈａｓｅｌｏｆｆら、米国特許５６４１６７３に教示のように、リボザイムは、標的遺伝子の発現を誘導する因子に応答してリボザイムの発現が起こるように設計することができる。リボザイムはまた、追加レベルの調節を提供するよう設計でき、その結果、ｍＲＮＡの破壊はリボザイムと標的遺伝子の両者が細胞に誘導された時にのみ起こる。
【００９６】
スクリーニング方法
本発明は、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドまたはＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドに結合する、またはその活性を調節する、被験化合物をスクリーニングするための検定を提供する。好ましくは、被験化合物はＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する。より好ましくは、被験化合物は、ＡＴＰをｃＡＭＰに変換するというヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼの能力、またはＩＶ型アデニル酸シクラーゼ活性を、被験化合物の不在時に比較して少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％低下または増大させる。
【００９７】
被験化合物
被験化合物は当分野で既知の薬理学的物質であってよく、または薬理活性を持っていることが前もって分かっていない化合物であってよい。この化合物は天然に存在する、または実験室で設計されたものであってよい。これらは、微生物、動物、または植物から単離されたものであってよく、そして組換え的に調製され、または当分野で既知の化学的方法により合成されたものであってよい。所望により被験化合物は、生物学的ライブラリー、空間的アドレス特定可能な並行固相または液相ライブラリー、デコンボルーションを要する合成ライブラリー法、「一ビーズ一化合物」ライブラリー法、および親和クロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を包含する（但しこれらに限定される訳ではない）当分野で既知の数多くの組み合わせライブラリー法のいずれかを用いて取得できる。生物学的ライブラリーアプローチはポリペプチドライブラリーに限定されているが、他の４種のアプローチはポリペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーに適用できる。Ｌａｍ， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． １２，１４５，１９９７を参照されたい。
【００９８】
分子ライブラリーの合成法は当分野でよく知られている（例えば、ＤｅＷｉｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０，６９０９，１９９３； Ｅｒｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９１，１１４２２，１９９４； Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． ３７，２６７８，１９９４； Ｃｈｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１，１３０３，１９９３； Ｃａｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ． ３３，２０５９，１９９４； Ｃａｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ． ３３，２０６１； Ｇａｌｌｏｐら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． ３７，１２３３，１９９４を参照されたい）。化合物のライブラリーは溶液で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３，４１２−４２１，１９９２）、またはビーズ（Ｌａｍ， Ｎａｔｕｒｅ ３５４，８２−８４，１９９１）、チップ（Ｆｏｄｏｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３６４，５５５−５５６，１９９３）、細菌または胞子（Ｌａｄｎｅｒ、米国特許５２２３４０９）、プラスミド（Ｃｕｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９，１８６５−１８６９，１９９２）、またはファージ（Ｓｃｏｔｔ ＆ Ｓｍｉｔｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，３８６−３９０， １９９０； Ｄｅｖｌｉｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，４０４−４０６，１９９０）；Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７，６３７８−６３８２，１９９０； Ｆｅｌｉｃｉ， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２２２，３０１−３１０，１９９１； およびＬａｄｎｅｒ、米国特許５２２３４０９）上に提供できる。
【００９９】
ハイスループットスクリーニング
被験化合物は、高（ハイ）スループットスクリーニングを用いて、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する能力、またはＩＶ型アデニル酸シクラーゼ活性もしくはＩＶ型アデニル酸シクラーゼ遺伝子発現に影響を及ぼす能力についてスクリーニングできる。ハイスループットスクリーニングを使用して、多くの個別的化合物を並行して試験でき、その結果多数の被験化合物を迅速にスクリーニングできる。最も広範に確立されている技術は９６ウェル微量定量プレートを利用するものである。この微量定量プレートのウェルは、典型的には５０から５００μｌの範囲の検定容量を必要とする。このプレートに加えて、９６ウェルフォーマットに適合させた多くの機器、材料、ピペット、ロボット、プレート洗浄機、およびプレート読み取り機が市販されている。
【０１００】
別法として、自由フォーマット検定、すなわち試料間に物理的障壁を持たない検定が使用できる。例えば、組み合わせペプチドライブラリーのための、単純な均質検定で色素細胞（メラノサイト）を用いる検定が、Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． １９，１６１４−１８（１９９４）に記載されている。ペトリ皿中のアガロースの下にこの細胞を入れ、次いで組み合わせ化合物を伴っているビーズをアガロースの表面に載せる。組み合わせ化合物はこのビーズから化合物を部分的に放出する。化合物がゲルマトリックス中へと局所的に拡散するにつれて活性化合物が細胞の色の変化を惹起するため、活性化合物を暗色色素領域として視覚化することができる。
【０１０１】
自由フォーマット検定のもう一つの例は、生体分子スクリーニング学会第１回年次総会（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．、１９９５年１１月７−１０日）で報告されたＣｈｅｌｓｋｙ、「組み合わせライブラリーのスクリーニングのための戦略：新規な、そして伝統的なアプローチ」により記載されている。Ｃｈｅｌｓｋｙは、カルボニックアンヒドラーゼのための単純な均質酵素検定をアガロースゲルの内部に入れ、その結果ゲル中の酵素がゲル全体に色の変化を惹起するようにさせた。その後、光リンカーを介して組み合わせ化合物を持つビーズをゲル内部に入れ、すると該化合物はＵＶ光により部分的に放出された。酵素を阻害する化合物は、色の変化がより少ない局所阻害領域として観察された。
【０１０２】
さらに別の例がＳａｌｍｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ２，５７−６３（１９９６）に記載されている。この例では、組み合わせライブラリーを、寒天中で生育する癌細胞への細胞毒性効果を有する化合物についてスクリーニングした。
【０１０３】
もう一つのハイスループットスクリーニング法がＢｅｕｔｅｌら、米国特許５９７６８１３に記載されている。この方法では、被験試料を多孔性マトリックスに入れる。次に１またはそれ以上の検定成分を、マトリックス、例えばゲル、プラスチックシート、フィルター、またはその他の形の容易に操作できる固体担体の内部、上、または底に入れる。試料がこの多孔性マトリックスに導入されるとこれらは充分ゆっくりと拡散し、その結果、被験試料が混ざらずに検定が遂行できる。
【０１０４】
結合検定
結合検定について、被験化合物は好ましくは、例えば、本酵素のＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位またはＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドの活性部位に結合してこれを占有し、その結果、正常な生物活性を妨げるような小分子である。このような小分子の例は小ペプチドまたはペプチド様分子を包含するが、これらに限定される訳ではない。
【０１０５】
結合検定では、被験化合物またはＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドのいずれかが検出可能な標識、例えば蛍光、放射性同位元素、化学ルミネセント、または酵素標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼ）を含むことができる。そこで、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドに結合している被験化合物の検出は、例えば放射能の放出を直接計数することにより、またはシンチレーション計数により、または検出可能産物への適当な基質の変換を測定することにより、達成できる。
【０１０６】
別法として、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドへの被験化合物の結合を、反応体のいずれをも標識せずに測定することができる。例えば、マイクロフィジオメーターを用いて、被験化合物とＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドとの結合を検出できる。マイクロフィジオメーター（例えばサイトセンサーＴＭ）とは、細胞がその環境を酸性化する速度を光アドレッサブル電位差センサー（ＬＡＰＳ）を用いて測定する分析機器である。この酸性化速度の変化は、被験化合物とＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドの相互作用の指標として使用できる（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７，１９０６−１９１２，１９９２）。
【０１０７】
被験化合物がＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドに結合する能力の測定はまた、実時間Ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＩＡ）のような技術を用いて達成できる（Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ ＆ Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ， Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ． ６３，２３３８−２３４５，１９９１、およびＳｚａｂｏら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ． ５，６９９−７０５，１９９５）。ＢＩＡは、いかなる反応体をも標識せずに、生体特異的相互作用を実時間で研究するための技術である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））。光学的現象表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の変化を、生体分子間の実時間反応の指標に使用できる。
【０１０８】
本発明のさらに別の態様では、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドを二ハイブリッド検定または三ハイブリッド検定（例えば、米国特許５２８３３１７； Ｚｅｒｖｏｓら、Ｃｅｌｌ ７２，２２３−２３２，１９９３； Ｍａｄｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８，１２０４６−１２０５４，１９９３； Ｂａｒｔｅｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４，９２０−９２４，１９９３； Ｉｗａｂｕｃｈｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８，１６９３−１６９６，１９９３； およびＢｒｅｎｔ ＷＯ９４／１０３００）における「おとりタンパク質」として使用し、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドに結合またはこれと相互作用してその活性を調節する他のタンパク質を同定することができる。
【０１０９】
二ハイブリッド系はたいていの転写因子のモジュール的性格に基づくものであり、それは、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインから成っている。簡潔に述べると、この検定は二種の異なるＤＮＡ構築物を利用する。例えば、一方の構築物においては、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが、既知の転写因子のＤＮＡ結合ドメインをコードしているポリヌクレオチドに融合できる（例えばＧＡＬ−４）。別の構築物においては、未同定タンパク質（「餌」または「試料」）をコードしているＤＮＡ配列が、既知の転写因子の活性化ドメインをコードしているポリヌクレオチドに融合できる。もし「おとり」および「餌」タンパク質がインビボで相互作用してタンパク質依存複合体を形成できたならば、該転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインは極めて近位に招来される。この近位性が、転写因子に応答する転写調節部位と機能的に結合しているリポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写を可能にする。リポーター遺伝子の発現が検出でき、機能的転写因子を含む細胞コロニーを単離し、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドと相互作用するタンパク質をコードしているＤＮＡ配列取得に使用することができる。
【０１１０】
反応体の一方または両方の非結合型からの結合型の分離を促進するため、そして検定の自動化の便宜を図るため、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物のいずれかを固定化することが望ましいかも知れない。したがって、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物のいずれかを固体支持体に結合させることができる。好適な固体支持体は、ガラスまたはプラスチックスライド、組織培養プレート、微量定量ウェル、管、シリコンチップ、またはビーズ（ラテックス、ポリスチレン、またはガラスビーズを包含するがこれらに限定されない）のような粒子を包含するがこれらに限定されない。共有および非共有結合、受動吸収、またはそれぞれポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物に付着させた結合部分と固体支持体の対、の使用を包含する、当分野で既知の任意の方法を用いてＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物を固体支持体に付着させることができる。被験化合物は好ましくは整列して固体支持体に結合させ、その結果個々の被験化合物の位置を追跡することができる。ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチド（またはポリヌクレオチド）への被験化合物の結合は、反応体を入れるのに適した任意の容器で達成できる。かかる容器の例には微量定量プレート、試験管、および微量遠沈管がある。
【０１１１】
一つの態様において、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドは、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドを固体支持体に結合させるドメインを含む融合タンパク質である。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）上またはグルタチオン誘導体化微量定量プレート上に吸着させ、次いでこれを被験化合物または被験化合物および非吸着ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドに合し；次にこの混合物を複合体形成が行われる条件下でインキュベートする（例えば、塩およびｐＨに関して生理的条件）。インキュベーションの後、ビーズまたは微量定量プレートのウェルを洗浄して未結合成分を除去する。反応体の結合は上記のように直接的または間接的に測定できる。別法として、複合体を固体支持体から解離させた後に結合を測定することもできる。
【０１１２】
本発明に係るスクリーニング検定には、タンパク質またはポリヌクレオチドを固体支持体上に固定化するためのその他の技術を使用することもできる。例えば、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物のいずれかを、ビオチンとストレプトアビジンのコンジュゲーションを利用して固定化できる。当分野で周知の技術（例えばビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）を用いて、ビオチニル化したＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物をビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジン被覆した９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定化できる。別法として、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチド、ポリヌクレオチド、または被験化合物と特異的に結合するが、所望の結合部位、例えばＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドのＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位または活性部位に干渉しない抗体をプレートのウェルに誘導体化することができる。未結合の標的またはタンパク質が抗体コンジュゲーションによりウェル中に捕捉できる。
【０１１３】
ＧＳＴ−固定化複合体について上に記載した方法に加え、このような複合体を検出する方法には、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドまたは被験化合物に特異結合する抗体を用いる、複合体の免疫検出、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドの活性検出に依拠する酵素結合検定、および非還元条件下でのＳＤＳゲル電気泳動がある。
【０１１４】
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する被験化合物を求めるスクリーニングは、無傷の細胞で実施することもできる。ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む任意の細胞が、細胞に基づく検定系で使用できる。ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドは細胞中に天然に存在し、または上記のような技術を用いて導入できる。ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する被験化合物の結合は、上記のように測定する。
【０１１５】
酵素検定
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼ活性を増大または低下させる能力について被験化合物を試験できる。アデニル酸シクラーゼ活性は、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｌｃｈｅｍ．，５８，５４１（１９７４）およびＡｄｖ．Ｃｙｃｌｉｃ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｓ．，１０，３５（１９７９）に開示されているように、基質である標識ＡＴＰからの標識ｃＡＭＰの合成を、Ｙ．Ｓａｌｏｍｏｎらが記載しているように測定することによって、間接的に検定される。
【０１１６】
酵素検定は、精製したＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチド、細胞膜調製物、または無傷の細胞を被験化合物と接触させた後に実施できる。ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドの活性を少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％低下させる被験化合物を、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼ活性を低下させる可能性のある治療物質として同定する。ヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドの活性を少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％増大させる被験化合物を、ヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼ活性を増大させる可能性のある治療物質として同定する。
【０１１７】
遺伝子発現
別の態様では、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼ遺伝子の発現を増大または減少させる被験化合物を同定する。ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドを被験化合物と接触させ、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドのＲＮＡ産物またはポリペプチド産物の発現を測定する。被験化合物存在下での適当なｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルを、該被験化合物不在下でのｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルと比較する。すると被験化合物が、この比較に基づく発現のモジュレーターとして同定できる。例えば、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、被験化合物の不在時よりも存在時により大きい場合は、この被験化合物を、該ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現の刺激物質または増強物質と同定する。そうではなく、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、被験化合物の不在時よりも存在時により小さい場合は、この被験化合物を、該ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現のインヒビターと同定する。
【０１１８】
細胞におけるＩＶ型アデニル酸シクラーゼ ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現のレベルは、ｍＲＮＡまたはポリペプチドを検出するための当分野で周知の方法により決定できる。定性または定量的方法のいずれかが使用できる。ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドのポリペプチド産物の存在は、例えばラジオイムノアッセイのような免疫化学的方法、ウエスタンブロッティング、および免疫組織化学を包含する、当分野で周知の様々な技術を用いて決定できる。別法として、ポリペプチド合成は、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチド内への標識アミノ酸の取り込みを検出することにより、インビボで、細胞培養で、またはインビトロ翻訳系で決定できる。
【０１１９】
このようなスクリーニングは、無細胞検定系または無傷の細胞のいずれかで実施できる。ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドを発現するいかなる細胞も細胞に基づく検定系で使用できる。ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチドは細胞内に天然に存在するか、または上記のような技術を用いて導入することができる。一次培養または確立された細胞系、例えばＣＨＯまたはヒト胚性腎２９３細胞のいずれかを使用できる。
【０１２０】
医薬組成物
本発明はさらに、治療効果を達成するために患者に投与できる医薬組成物を提供する。本発明に係る医薬組成物は、例えばＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチド、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリヌクレオチド、リボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドと特異的に結合する抗体、またはＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチド活性のミメティック（模倣体）、アゴニスト、アンタゴニスト、またはインヒビターを含み得る。この組成物は単独で、または少なくとも１種類の他の物質、例えば安定化化合物と組み合わせて投与でき、これは、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、および水を包含する（但しこれらに限定されない）任意の無菌で生物学的適合性のある製薬的担体中で投与できる。この組成物は単独で、または他の物質、薬物またはホルモンと組み合わせて患者に投与できる。
【０１２１】
活性成分に加えてこれらの医薬組成物は、賦形剤および補助物質を含む適当な製薬的に許容し得る担体を含有でき、これらは、製薬的に使用できる調製物への活性化合物の処理を促進する。本発明に係る医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、非経口、局所、舌下、または直腸手段を包含する（但しこれらに限定されない）多くの経路により投与できる。経口投与用医薬組成物は、当分野で既知の製薬的に許容し得る担体を用いて経口投与に適した用量に調合できる。このような担体により、該医薬組成物を、患者が内服するための錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などに調合できる。
【０１２２】
経口使用のための医薬製剤は、活性化合物を、固体賦形剤と合し、得られた混合物を所望により粉砕し、そしてこの顆粒混合物を、所望ならば適当な補助物質を加えた後に錠剤または糖衣錠核が得られるように加工することによって得ることができる。好適な賦形剤は炭水化物またはタンパク質増量剤、例えば乳糖、シュクロース、マンニトール、またはソルビトールを包含する糖；トウモロコシ、小麦、米、馬鈴薯、またはその他の植物由来の澱粉；セルロース、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム；アラビアゴムおよびトラガカントゴムを包含するゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質である。所望により崩壊剤または可溶化剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを添加できる。
【０１２３】
糖衣剤核は、濃縮糖溶液のような適当な被覆剤と共に使用でき、これはさらに、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポル（ｃａｒｂｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含むことができる。製品の同定のためまたは活性化合物の量、即ち用量をあらわすために染料または色素を錠剤または糖衣被覆剤に添加できる。
【０１２４】
経口的に使用できる医薬調合物は、ゼラチン製の押してはめ込むカプセル剤、ならびに、ゼラチンおよび被覆剤、例えばグリセロールまたはソルビトールでできた軟封入カプセル剤を包含する。押してはめ込むカプセル剤は、活性成分を、乳糖または澱粉のような増量剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および所望により安定剤と混合して含有できる。軟カプセル剤では、活性化合物を、安定剤を加えた、または加えない適当な液体、例えば脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコールに溶解または懸濁できる。
【０１２５】
非経口投与に好適な医薬製剤は、水溶液、好ましくは生理学的適合性の緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的に緩衝化した食塩水中で調合できる。水性注射用懸濁剤は、該懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有できる。さらに、活性化合物の懸濁剤は適当な油性注射用懸濁剤として調製できる。好適な親油性溶媒または媒質は、胡麻油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを包含する。非脂質ポリカチオンアミノポリマーもまた送達に使用できる。所望により懸濁剤は、化合物の溶解性を増し高濃縮溶液の調製を可能にするような適当な安定剤または物質を含むことができる。局所または鼻腔投与のためには、透過すべき特定の障壁に対し適当な浸透剤を製剤に使用する。このような浸透剤は当分野で一般に知られている。
【０１２６】
本発明に係る医薬組成物は当分野で既知の方法で、例えば常套的混合、溶解、顆粒化、糖衣剤製造、すりつぶし、乳化、カプセル化、捕捉、または凍結乾燥プロセスによって製造できる。この医薬組成物は塩として提供でき、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、琥珀酸などを包含する（但しこれらに限定されない）多くの酸を用いて調製できる。塩は、水性または他のプロトン性溶媒において、対応する遊離塩基型よりもより可溶性の傾向がある。別の場合には、好ましい調製物は、ｐＨ範囲４．５から５．５において以下のもの：１−５０ｍＭヒスチジン、０．１％−２％シュクロース、および２−７％マンニトール、の全てまたは任意のものを含有できる凍結乾燥粉末であってよく、これを使用前に緩衝液と合する。
【０１２７】
調合と投与のための技術のさらなる詳細は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ）の最新版に見出すことができる。医薬組成物を製造した後、これらを適当な容器に入れ、適応状態の治療のためにラベルを貼る。このようなラベル表示は、投与の量、頻度、および投与方法を包含する。
【０１２８】
治療上の適応および方法
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼ活性の調整は、この酵素の異常な活性によって起こる疾患、およびＩＶ型アデニリルシクラーゼの活性を刺激または阻害することによってその症状を改善することができる疾患の処置に有用であると予想される。そのような疾患としては、例えば、高血圧；尿閉；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；再狭窄；アテローム性動脈硬化症；過剰な平滑筋細胞または平滑筋細胞増殖の減少を特徴とする疾患；動脈瘤；創傷治癒；脳卒中；虚血；潰瘍；喘息；アレルギー；良性前立腺肥大；片頭痛；嘔吐；精神障害および神経障害、例えば不安、精神分裂病、躁うつ病、鬱病、譫妄、痴呆、および重度精神遅滞、神経変性疾患およびジスキネジーなどの変性疾患などが挙げられる。
【０１２９】
本発明はさらに、上記のスクリーニング検定により同定する新規物質の使用に関するものである。したがって、本明細書に記載のように同定される被験化合物を適当な動物モデルに使用することが、本発明の範囲内にある。例えば、本明細書記載のように同定される物質（例えば、調節物質、アンチセンス核酸分子、特異抗体、リボザイム、またはＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチド結合分子）を動物モデルに使用して、かかる物質による治療の有効性、毒性、または副作用を決定することができる。これとは別に、本明細書に記載のように同定される物質は、かかる物質の作用機構を決定するための動物モデルに使用できる。さらに、本発明は、本明細書記載の治療のための上記スクリーニング検定により同定する新規物質の用途・使用に関するものである。
【０１３０】
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼ活性に影響を及ぼす試薬をインビトロまたはインビボでヒト細胞に投与し、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼ活性を低下させることができる。この試薬は好ましくはヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼ遺伝子の発現産物に結合する。発現産物がタンパク質である場合、この試薬は好ましくは抗体である。ヒト細胞をｅｘ ｖｉｖｏで治療するために、身体から取り出した幹細胞の調製物に抗体を添加できる。次いでこの細胞を、当分野で既知のクローン増幅を行って、または行わずに、同じまたは別のヒトの身体に戻すことができる。
【０１３１】
一つの態様では、この試薬はリポソームを用いて送達する。好ましくはリポソームは、投与される動物中で少なくとも約３０分間、より好ましくは少なくとも約１時間、さらに好ましくは少なくとも約２４時間安定である。リポソームは、試薬、とりわけポリヌクレオチドを動物、例えば人間の特定部位に標的化できる脂質組成物を含んでいる。好ましくはリポソームのこの脂質組成物は、動物の特定の臓器、例えば肺、肝臓、脾臓、心臓、脳、リンパ節、および皮膚を標的とすることができる。
【０１３２】
本発明において有用なリポソームは、標的細胞の細胞質膜と融合してその内容物を細胞へと運搬できる脂質組成物を含んでいる。好ましくは、リポソームのトランスフェクション効率は、約１０６細胞に送達されるリポソーム１６ｎｍｏｌｅあたりＤＮＡ約０．５μｇ、より好ましくは約１０６細胞に送達されるリポソーム１６ｎｍｏｌｅあたりＤＮＡ約１．０μｇ、さらに好ましくは約１０６細胞に送達されるリポソーム１６ｎｍｏｌｅあたりＤＮＡ約２．０μｇである。好ましくは、リポソームは直径が約１００および５００ｎｍの間、より好ましくは約１５０および４５０ｎｍの間、そしてさらに好ましくは約２００および４００ｎｍの間である。
【０１３３】
本発明での使用にとって好適なリポソームには、例えば当業者に知られる遺伝子送達法で標準的に用いるリポソームが包含される。より好ましいリポソームは、ポリカチオン脂質組成物を有するリポソームおよび／またはポリエチレングリコールとコンジュゲートしたコレステロールバックボーンを有するリポソームを包含する。所望により、リポソームはそのリポソームを特定の細胞タイプへと標的化できる化合物、例えばリポソームの外表面に露出している細胞特異的リガンドを含む。
【０１３４】
リポソームと、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムのような試薬との複合体形成が、当分野において標準的な方法を用いて達成できる（例えば米国特許５７０５１５１）。好ましくは約０．１μｇから約１０μｇのポリヌクレオチドを約８ｎｍｏｌのリポソームと、より好ましくは約０．５μｇから約５μｇのポリヌクレオチドを約８ｎｍｏｌのリポソームと、そしてさらに好ましくは約１．０μｇのポリヌクレオチドを約８ｎｍｏｌのリポソームと合する。
【０１３５】
別の態様では、受容体媒介標的化送達を用いて抗体を特異的組織にインビボ送達できる。受容体媒介ＤＮＡ送達技術は、例えばＦｉｎｄｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １１，２０２−０５（１９９３）； Ｃｈｉｏｕら、ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＤＩＲＥＣＴ ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ編）（１９９４）； Ｗｕ ＆ Ｗｕ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６３，６２１−２４（１９８８）； Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６９，５４２−４６（１９９４）； Ｚｅｎｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８７，３６５５−５９（１９９０）； Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６６，３３８−４２（１９９１）に教示されている。
【０１３６】
治療的有効量の決定
治療的有効量の決定は、充分当業者の能力の範囲内にある。治療的有効量とは、治療的有効量の不在下で起こるＩＶ型アデニル酸シクラーゼ活性に比較してＩＶ型アデニル酸シクラーゼ活性を増大させ、または低下させる活性成分の量を指す。
【０１３７】
いかなる化合物に関しても、治療的有効量は最初に細胞培養検定で、または動物モデル、通常マウス、ウサギ、イヌ、またはブタで見積もることができる。動物モデルは適当な濃度範囲および投与経路の決定にも使用できる。次にこのような情報を用いて人間での有用な用量と投与経路を決定できる。
【０１３８】
治療的有効性および毒性、例えばＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％で致死的な用量）は、細胞培養または実験動物における標準的薬学的方法により決定できる。治療効果に対する毒性効果の用量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０で表すことができる。
【０１３９】
大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養検定および動物研究から得られるデータを、人間への使用のための用量範囲を処方する際に使用する。かかる組成物に含まれる用量は、好ましくは殆どまたは全く毒性を持たないＥＤ５０を包含する循環濃度の範囲内である。この用量は、使用する剤形、患者の感受性、および投与経路に応じてこの範囲内で変わる。
【０１４０】
正確な用量は、治療を必要とする対象に関連する因子に照らして医師が決定する。用量および投与は、充分なレベルの活性成分を提供するよう、または所望の効果を保持するよう、調節する。考慮できる因子は、疾病状態の重篤度、対象の全身健康状態、年齢、体重、および対象の性別、食餌、投与の時間および頻度、薬物の組み合わせ、反応の感受性、および療法に対する寛容／応答を包含する。長時間作用性医薬組成物は、その製剤の半減期およびクリアランス率に応じて３から４日毎、毎週、または２週間に１回投与することができる。
【０１４１】
標準的な用量は投与経路に応じて０．１から１００，０００マイクログラムまで変えることができ、約１ｇまでの総用量とすることができる。特定の用量および送達方法についての指針は文献に提供されており、一般に当分野の医師が入手できる。当業者は、ヌクレオチド用にはタンパク質またはそれらのインヒビター用のものとは異なる製剤を使用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は特定の細胞、状態、場所などに特異的である。
【０１４２】
この試薬が一本鎖抗体である場合、この抗体をコードしているポリヌクレオチドを構築し、トランスフェリン−ポリカチオン−媒介ＤＮＡ転移、裸のまたはカプセル内核酸を用いるトランスフェクション、リポソームの媒介する細胞融合、ＤＮＡ被覆ラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、電気穿孔、遺伝子銃、およびＤＥＡＥ−または燐酸カルシウム−媒介トランスフェクションを包含する（但しこれらに限定される訳ではない）充分確立した技術を用いて、ｅｘ ｖｉｖｏまたはインビボで細胞内に導入できる。
【０１４３】
抗体の有効なインビボ用量は、約５μｇから約５０μｇ／ｋｇ、約５０μｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇから約５００μｇ／ｋｇ（患者の体重）、および約２００から約２５０μｇ／ｋｇ（患者の体重）の範囲である。一本鎖抗体をコードしているポリヌクレオチドの投与のためには、有効なインビボ用量は、約１００ｎｇから約２００ｎｇ、５００ｎｇから約５０ｍｇ、約１μｇから約２ｍｇ、約５μｇから約５００μｇ、および約２０μｇから約１００μｇのＤＮＡの範囲である。
【０１４４】
発現産物がｍＲＮＡである場合、試薬は好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムである。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを発現するポリヌクレオチドは、上記のように多岐にわたる方法によって細胞中に導入できる。
【０１４５】
好ましくは、試薬は、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼ遺伝子の発現またはＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドの活性を、該試薬の不在時と比較して少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％低下させる。ＩＶ型アデニル酸シクラーゼ遺伝子の発現レベルまたはＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドの活性を低下させるよう選択した機構の有効性は、当分野で周知の方法、例えばＩＶ型アデニル酸シクラーゼ特異的ｍＲＮＡへのヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドの免疫学的検出、またはＩＶ型アデニル酸シクラーゼ活性の測定を用いて評価できる。
【０１４６】
上記のいずれの態様においても、本発明に係る任意の医薬組成物は他の適当な治療薬と組み合わせて投与できる。併用療法に使用するための適当な物質の選択は、常套的製薬原理に従い、当業者により実施することができる。治療薬の組み合わせは、相乗的に働いて、上記の様々な疾患の治療または予防を奏効させる。このアプローチを用いて、より低い各物質の用量で治療効果を達成することができ、したがって有害な副作用の可能性を低減することができる。
【０１４７】
上記の治療方法のいずれも、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も好ましくはヒトといった哺乳動物を包含する、このような治療を必要とする任意の対象に適用することができる。
【０１４８】
診断方法
ヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼはさらに、この酵素をコードしている核酸配列における突然変異の存在に関連する疾病および異常、またはそれら疾病および異常に対する感受性を検出する診断検定に使用できる。例えば、疾病に罹患している個体と正常な個体とにおけるＩＶ型アデニル酸シクラーゼをコードしているｃＤＮＡまたはゲノム配列の間の相違を決定できる。もし罹患している個体の幾つかまたは全てに突然変異が観察され、正常な個体には観察されないならば、この突然変異がその疾病の原因であると思われる。
【０１４９】
レファレンス遺伝子および突然変異を有する遺伝子の間の配列相違は、直接ＤＮＡ配列決定法によって明らかにできる。加えて、クローニングしたＤＮＡセグメントを、特定のＤＮＡセグメントを検出するためのプローブとして使用できる。この方法の感受性はＰＣＲと組み合わせる時極めて増強される。例えば、二本鎖ＰＣＲ産物または修飾ＰＣＲにより調製された一本鎖鋳型分子と共に、配列決定プライマーを使用することができる。配列決定は、放射標識したヌクレオチドを用いる常套的方法によって、または蛍光標識を使用する自動配列決定法によって実施する。
【０１５０】
ＤＮＡ配列相違に基づく遺伝子試験は、変性させる物質を含むまたは含まないゲル中のＤＮＡ断片の電気泳動移動度の変化を検出することにより実施できる。小配列の欠失および挿入は、例えば高分解能ゲル電気泳動によって視覚化できる。異なる配列のＤＮＡ断片は変性させるホルムアミド勾配ゲル上で識別でき、ここでは、異なるＤＮＡ断片の移動度が、それらの特異的融解温度または部分的融解温度に従って、ゲル中の異なる位置で遅延する（例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，１２４２，１９８５を参照されたい）。特定の位置での配列改変もまたヌクレアーゼ保護検定、例えばＲＮアーゼおよびＳ１保護または化学的開裂法によって明らかにすることができる（例えば、Ｃｏｔｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，４３９７−４４０１，１９８５）。即ち特異的ＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保護、化学的開裂、直接ＤＮＡ配列決定といった方法によって、または制限酵素とゲノムＤＮＡのサザンブロッティングを使用することによって実施できる。ゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定のような直接法に加えて、突然変異はｉｎ ｓｉｔｕ分析により検出することもできる。
【０１５１】
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼレベルの変化もまた種々の組織で検出できる。血液または組織生検のように、宿主から誘導した身体試料中の受容体ポリペプチドのレベルを検出するために用いる検定は、当業者に周知であり、ラジオイムノアッセイ、競合的結合検定、ウェスタンブロット分析、およびＥＬＩＳＡ検定を包含する。
【０１５２】
本明細書に引用する全ての特許および特許出願は、引用により特に本明細書の一部とする。上記の内容は本発明を一般的に記載するものである。より完全な理解は以下の具体的実施例を参照することによって得られ、それらの実施例は例示のみの目的で提供するものであり、本発明の範囲を限定する意図は無い。
【０１５３】
実施例１
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼ活性の検出
配列番号：１に記載のポリヌクレオチドを発現ベクターｐＣＥＶ４に挿入し、得られた発現ベクターｐＣＥＶ４−ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをヒト胚の腎臓２９３細胞にトランスフェクトする。これらの細胞から抽出物を得て、以下の検定法でＩＶ型アデニル酸シクラーゼ活性を測定する。体積１．０マイクロリットルのＨ２Ｏ、ＮａＦ、グアニリル−５’−イミド二リン酸（ＧｐｐＮＨｐ）、イソプロテレノール、またはイソプロテレノール＋ＧｐｐＮＨｐを、５本の反応チューブのそれぞれに加え、０℃に保つ。次に、２５マイクロリットルの反応混合物Ａ（トリス酢酸 １００ｍＭ、ｐＨ７．４；ＫＣｌ ２０ｍＭ；ＭｇＣｌ２ １０．０ｍＭ；ホスホエノールピルビン酸 ２０ｍＭ；ＡＴＰ ２．０ｍＭ；ＧＴＰ ０．０２ｍＭ；ジチオスレイトール ２．０ｍＭ；ウシ血清アルブミン ０．０４％；ｃＡＭＰ ０．６６ｍＭ；ピルビン酸キナーゼ １．０ｍｇ／ｍｌおよびα３２Ｐ−ＡＴＰ、３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）を各反応チューブに加える。最後に、２５マイクロリットルの細胞抽出物を各チューブに加え、チューブを３７℃の水浴に入れることによって反応を開始する。３０分後に、３００マイクロリットルの停止溶液を添加することによって、反応を停止する。検定チューブを９５℃で５分間加熱する。ダウエックス−アルミナクロマトグラフィーを使って３２ｐ−ｃＡＭＰを単離する。配列番号２のポリペプチドはＩＶ型アデニル酸シクラーゼ活性を持つことが明らかになる。
【０１５４】
実施例２
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼの全配列を決定するために、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼ転写物の３’末端を増幅するためのプライマーと、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼ転写物の５’末端を増幅するためのプライマーとを用いて、ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）を行なう。ＲＡＣＥは、ヒト末梢血白血球由来のポリＡ ＲＮＡをｃＤＮＡ合成の出発物質として使用し、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， ＰａｌｏＡｌｔｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）で、製造者のプロトコールに従って行なう。うまく増幅された断片をＣｌｏｎｔｅｃｈ ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローニングし、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７ ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、製造者の標準的配列決定プロトコールに従い、各ベクター上のインサートに隣接するＳＰ６およびＴ７プロモーター領域に相補的なプライマーを使って配列決定する。配列が得られたら、コンピュータープログラムＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ， ＭＩ， ＵＳＡ）を使って各クローンから得た配列を整列して、連続した一つのＤＮＡ配列を形成させる。このコンティグのコンセンサス配列はＩＶ型アデニル酸シクラーゼ遺伝子転写物の３’または５’末端に相当すると考えられる。
【０１５５】
プライマーＡＣ４−Ｌ１：５’−ＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＣＴＴＣＡＧＣＣＣＣ（配列番号３）、ＡＣ４−Ｒ１：５’−ＴＣＡＧＣＣＴＡＧＧＧＴＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧ（配列番号４）を使って、ヒト気管支内皮細胞ｃＤＮＡライブラリーからＡＣ４遺伝子のＰＣＲ増幅を行なうと、３．３ｋｂの産物が１つ得られる。このＰＣＲ産物のクローニングと配列解析により、ＡＣ４遺伝子は配列番号１に示す配列を持つことがわかる。ＡＣ４は配列番号２に示す１１０３アミノ酸を含むポリペプチドをコードしている。
【０１５６】
ＡＣ１〜９の配列アラインメントにより、ＡＣ４配列はＡＣ２およびＡＣ７に最も近く、配列一致度はそれぞれ５６％および５３％であることがわかった（図３Ａおよび３Ｂ）。
【０１５７】
実施例３
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼｍＲＮＡの組織発現
アデニル酸シクラーゼｍＲＮＡの組織発現を調べるために、様々なヒト組織から得られるＲＮＡの定量的逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）解析を行なった。種々の組織に由来する１００μｇの全ＲＮＡ（Ｈｕｍａｎ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐａｎｅｌ Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｇ３， Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ， ＵＳＡ）をテンプレートとして使用し、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＭ ＲＴ−ＰＣＲ用第一鎖合成システム（Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌ， ＭＤ， ＵＳＡ）を使って、第一鎖ｃＤＮＡを合成した。次に、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼｍＲＮＡ転写物の有無を調べるために、１０ｎｇの第一鎖ｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応のテンプレートとして使用した。ポリメラーゼ連鎖反応は、ＤＮＡ結合性蛍光色素ＳＹＢＲグリーンＩの存在下に、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ， ＵＳＡ）で行なった。この色素は、ポリメラーゼ連鎖反応で二本鎖ＤＮＡがうまく合成された場合にのみ生成するＤＮＡ二重らせんの副溝に結合し、結合すると、ＬｉｇｔｈＣｙｃｌｅｒ装置で定量的に測定することができる光を放射する。ポリメラーゼ連鎖反応は、オリゴヌクレオチドプライマー１ ＣＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣＣＴＧＴＧ（配列番号５）およびプライマー２ ＧＧＧＡＣＴＧＡＧＧＣＧＡＡＧＡＡＧＡＣＡＣＡＡ（配列番号６）を使って行ない、反応が８６℃の温度に達したら、各反応サイクル後に、放射された光の強さを測定した。同時に反応させた既知濃度の標品と比較することにより、放射された光の強さを、テンプレートｃＤＮＡ １ナノグラムあたりの遺伝子転写物のコピー数に変換した。
【０１５８】
種々の組織タイプにおける１細胞あたりのｍＲＮＡ転写レベルの相違を補正するために、５種類のハウスキーピング遺伝子、すなわちグリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３ＰＨＤ）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、βアクチン、ポルフォビリノゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）、およびβ−２−ミクログロブリンの様々な組織における計算発現レベルを使って、標準化操作を行なった。使用したハウスキーピング遺伝子のセットがわずかに異なる点を除けば、この標準化操作はＲＮＡ Ｍａｓｔｅｒ Ｂｌｏｔ Ｕｓｅｒ Ｍａｎｕａｌ， Ａｐｅｎｄｉｘ Ｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）に記載されている操作と基本的に同じである。
【０１５９】
ｈＡＣ４のｍＲＮＡの発現は肺、脳、骨格筋、腎臓および気管に見られた。胸腺およびＰＢＬなどの免疫関連細胞では発現は見られなかった。
【０１６０】
２６種類のヒト組織におけるヒトＡＣ４遺伝子の発現プロファイリングから、これは肺で高発現することが示唆される（図４）。
【０１６１】
肺／気管支初代細胞におけるＡＣ４の詳細な発現解析から、ＡＣ４は気管支内皮細胞で特異的に発現し、気管支上皮細胞、平滑筋細胞および肺線維芽細胞ではそうでないことが示唆される（図５）。
【０１６２】
気管支内皮細胞におけるＡＣ１〜９の発現を比較するために、各アデニリルシクラーゼ用の配列特異的プライマー、すなわち
ＡＣ１−Ｌ：ＡＡＧＴＣＣＡＣＣＧＧＣＴＧＣＴＧＡＧＡＡＧＧ（配列番号７）
ＡＣ１−Ｒ：ＴＡＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＣ（配列番号８）
ＡＣ２−Ｌ：ＧＴＡＧＧＧＡＡＧＣＴＧＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡＣ（配列番号９）
ＡＣ２−Ｒ：ＧＧＡＴＧＣＣＡＣＧＴＴＧＣＴＣＴＧＧＧＡＡＡＧ（配列番号１０）
ＡＣ３−Ｌ：ＧＡＣＡＡＧＴＣＣＧＡＧＡＧＡＧＡＧＣＧＣＴＧ（配列番号１１）
ＡＣ３−Ｒ：ＣＴＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＴＧＴＧＡＣＡＧＡＧ（配列番号１２）
ＡＣ４−Ｌ：ＣＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣＣＴＧＴＧ（配列番号５）
ＡＣ４−Ｒ：ＧＧＧＡＣＴＧＡＧＧＣＧＡＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＡ（配列番号６）
ＡＣ５−Ｌ：ＡＧＣＴＧＡＴＧＧＡＣＣＡＧＡＴＧＡＡＧＴＡＣ（配列番号１３）
ＡＣ５−Ｒ：ＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＴＴＧＧＣＡＧ（配列番号１４）
ＡＣ６−Ｌ：ＡＧＣＡＣＣＴＡＣＧＡＴＣＡＧＧＴＧＧＧＣＣ（配列番号１５）
ＡＣ６−Ｒ：ＧＡＧＧＡＡＧＴＡＧＧＴＧＧＴＣＡＴＣＴＣＣＣ（配列番号１６）
ＡＣ８−Ｌ：ＡＴＴＣＡＴＣＴＴＧＣＣＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＣＴＧ（配列番号１７）
ＡＣ８−Ｒ：ＴＣＡＧＡＴＴＴＧＴＣＧＧＴＧＣＣＴＴＣＡＧＣＣ（配列番号１８）
ＡＣ９−Ｌ：ＣＴＧＴＡＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＡＣＧＧＡＴＣＡＣ（配列番号１９）
ＡＣ９−Ｒ：ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＧＡＡＡＣＧＴＴＧＡＧＣＴＴＧＧ（配列番号２０）
を設計し、ＱＲＴ−ＰＣＲ解析に使用した。図６に示す結果は、ＡＣ４が気管支内皮細胞で発現する最も有力なアデニリルシクラーゼであることを明確に実証している。この結果は、正常状態でも、疾患状態でも、ｃＡＭＰレベルの制御に、さらには内皮細胞機能の調節に、ＡＣ４が極めて重要であるかもしれないことを示唆している。例えば、肺内皮におけるｃＡＭＰレベルが体液平衡および白血球輸送を調節することは、よく研究されている。肺炎症は内皮細胞におけるＣａ２＋の増加とｃＡＭＰの低下を伴い、それが細胞間隙の増加ならびに体液、タンパク質および炎症性浸潤物の血管透過性の増大をもたらす。したがって、ＡＣ４を特異的に活性化する薬物は、内皮のｃＡＭＰレベルを効果的かつ特異的に上昇させることができ、肺内皮バリアーの強化をもたらすことができて、炎症媒介物質および酸化剤が誘発する細胞間隙を防止し、炎症促進性の刺激が誘導する接着分子発現を減少させることによって白血球輸送を阻害すると予想される。内皮細胞ｃＡＭＰを上昇させて細胞−細胞付着を促進するβ−アドレナリン作動薬が気道炎症および肺水腫を逆転させるために臨床的に利用されることから、ＡＣ４アゴニストは炎症性疾患の処置に有用である可能性が示唆される。
【０１６３】
実施例４
組換えヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼの発現
酵母で大量のヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドを生産するために、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現ベクターｐＰＩＣＺＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎｄ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を使用する。ヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼコード化ＤＮＡ配列は配列番号１に示すヌクレオチド配列である。ベクターｐＰＩＣＺＢに挿入する前に、そのＤＮＡ配列を、周知の方法により、５’末端に開始コドンを含み、３’末端にエンテロキナーゼ開裂部位、Ｈｉｓ６レポーター標識および終止コドンを含むように改変しておく。制限エンドヌクレアーゼによる開裂に用いる制限酵素認識配列を両端に付加する。ｐＰＩＣＺＢのマルチクローニングサイトを、対応する制限酵素で消化した後、改変ヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドコード化ＤＮＡ配列をｐＰＩＣＺＢ中にライゲートする。この発現ベクターはピキア・パストリスにおける誘導発現用であり、発現は酵母プロモーターによって駆動される。得られたｐＰＩＣＺ／ｍｄ−Ｈｉｓ６ベクターを使って酵母を形質転換する。酵母を通常の条件下に振とうフラスコで培養し、組換え生産されたタンパク質を、８Ｍ尿素の存在下に、アフィニティークロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡ−樹脂）で、培養物から単離する。結合したポリペプチドを緩衝液（ｐＨ３．５）で溶出し、中和する。Ｈｉｓ６レポーター標識からのヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼの分離は、エンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）により、製造者の説明書に従って行なう。精製ヒトＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドが得られる。
【０１６４】
実施例５
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドに結合する被験化合物の同定
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質を含む精製ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドを、９６穴マイクロタイタープレートのグルタチオン被覆ウェルに吸収させたものを、生理学的緩衝溶液中、ｐＨ７．０で、小分子ライブラリーの被験化合物と接触させる。ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドは配列番号２に示すアミノ酸配列を含む。被験化合物は蛍光標識を含む。試料を５分〜１時間インキュベートする。対照試料は被験化合物の不在下でインキュベートする。
【０１６５】
被験化合物を含む緩衝溶液をウェルから洗い流す。ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドへの被験化合物の結合は、ウェル内容物の蛍光測定によって検出する。被験化合物をインキュベートしていないウェルの蛍光と比較してウェル内の蛍光を少なくとも１５％増加させる被験化合物を、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドに結合する化合物であると同定する。
【０１６６】
実施例６
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼ遺伝子発現を減少させる被験化合物の同定
ＩＶ型アデニル酸シクラーゼ発現コンストラクトをトランスフェクトしたヒト細胞の培養物に被験化合物を投与し、３７℃で１０〜４５分間インキュベートする。トランスフェクトされていない同じタイプの細胞の培養物を、被験化合物を投与せずに同じ時間インキュベートし、これを陰性対照とする。
【０１６７】
これらの２つの培養物から、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８，５２９４−９９（１９７９）に記載されているように、ＲＮＡを単離する。２０〜３０μｇの全ＲＮＡを使ってノーザンブロットを作製し、Ｅｘｐｒｅｓｓ−ｈｙｂ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）中６５℃で、３２Ｐ−標識ＩＶ型アデニル酸シクラーゼ特異的プローブとハイブリダイズさせる。このプローブは、配列番号１の相補鎖から選択される少なくとも１１個の連続したヌクレオチドを含む。被験化合物の不在下で得られるシグナルと比較してＩＶ型アデニル酸シクラーゼ特異的シグナルを減少させる被験化合物を、ＩＶ型アデニル酸シクラーゼ遺伝子発現のインヒビターであると同定する。
【０１６８】
実施例７
アデニル酸シクラーゼヒト遺伝子ｍＲＮＡに特異的に結合する試薬による患者の処置
配列番号１の相補鎖から選択される少なくとも１１個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの合成を、ホスホロアミダイト法（Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０，５３４−８３，１９９０）により、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｇｅｎｅ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒシリーズ合成装置で行なう。組立てと脱保護の後、オリゴヌクレオチドを２回エタノール沈殿し、乾燥し、所望の濃度でリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に懸濁する。キャピラリーゲル電気泳動およびイオン交換ＨＰＬＣによってオリゴヌクレオチドの純度を検査する。リムルス（Ｌｉｍｕｌｕｓ）アメーバ様細胞アッセイ（Ｂａｎｇ， Ｂｉｏｌ．Ｂｕｌｌ．（Ｗｏｏｄ Ｈｏｌｅ， Ｍａｓｓ．）１０５，３６１−３６２，１９５３）を使って、オリゴヌクレオチド調製物中のエンドトキシンレベルを決定する。
【０１６９】
濃度０．１〜１００μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む水性組成物を注射により患者に直接投与する。患者の重症度が低下する。
【０１７０】
引用文献
１．Ｓｕｎａｈａｒａ， Ｒ．Ｋ．， Ｄｅｓｓａｕｅｒ， Ｃ．Ｗ．およびＧｉｌｍａｎ， Ａ．Ｇ． （１９９６） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． ３６，４６１−４８０
２．Ｘｉａ， Ｚ．Ｇ．およびＳｔｏｒｍ， Ｓ．Ｒ． （１９９７） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ７，３９１−３９６
３．Ｈａｎｏｕｎｅ， Ｊ．， Ｐｏｕｉｌｌｅ， Ｙ， Ｔｚａｖａｒａ， Ｅ．， Ｓｈｅｎ， Ｔ．Ｓ．， Ｌｉｐｓｋａｙａ， Ｌ．， Ｍｉｙａｍｏｔｏ， Ｎ．， Ｓｕｚｕｋｉ， Ｙ．およびＤｅｆｅｒ， Ｎ． （１９９７） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １２８，１７９−１９４
４．Ｃｏｏｐｅｒ， Ｄ．Ｍ．Ｆ．（ｅｄ） （１９９８） Ａｄｖ． Ｓｅｃｏｎｄ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ３２
５．Ｔａｎｇ， ＷＪおよびＨｕｒｌｅｙ， ＪＨ （１９９８） Ｍｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５４， ２３１−２４０。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号１）。
【図２】図１のＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列（配列番号２）。
【図３Ａ】アデニリルシクラーゼファミリーメンバー間の配列類似性。
【図３Ｂ】アデニリルシクラーゼファミリーの系統樹。
【図４】ＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチド（ＡＣ４）の組織分布。
【図５】気道細胞におけるＩＶ型アデニル酸シクラーゼポリペプチド（ＡＣ４）の発現。
【図６】気管支内皮細胞におけるアデニリルシクラーゼの発現。
【図３Ａ】
2004511245.tif 000002
【図４】
2004511245.tif 000003
【図５】
2004511245.tif 000004
【図６】
2004511245.tif 000005
【国際公開パンフレット】
2004511245.tif 000006
2004511245.tif 000007
2004511245.tif 000008
2004511245.tif 000009
2004511245.tif 000010
2004511245.tif 000011
2004511245.tif 000012
2004511245.tif 000013
2004511245.tif 000014
2004511245.tif 000015
2004511245.tif 000016
2004511245.tif 000017
2004511245.tif 000018
2004511245.tif 000019
2004511245.tif 000020
2004511245.tif 000021
2004511245.tif 000022
2004511245.tif 000023
2004511245.tif 000024
2004511245.tif 000025
2004511245.tif 000026
2004511245.tif 000027
2004511245.tif 000028
2004511245.tif 000029
2004511245.tif 000030
2004511245.tif 000031
2004511245.tif 000032
2004511245.tif 000033
2004511245.tif 000034
2004511245.tif 000035
2004511245.tif 000036
2004511245.tif 000037
2004511245.tif 000038
2004511245.tif 000039
2004511245.tif 000040
2004511245.tif 000041
2004511245.tif 000042
2004511245.tif 000043
2004511245.tif 000044
2004511245.tif 000045
2004511245.tif 000046
2004511245.tif 000047
2004511245.tif 000048
2004511245.tif 000049
2004511245.tif 000050
2004511245.tif 000051
2004511245.tif 000052
2004511245.tif 000053
2004511245.tif 000054
2004511245.tif 000055
2004511245.tif 000056
2004511245.tif 000057
2004511245.tif 000058
2004511245.tif 000059
2004511245.tif 000060
2004511245.tif 000061
2004511245.tif 000062
2004511245.tif 000063
2004511245.tif 000064
2004511245.tif 000065
2004511245.tif 000066
2004511245.tif 000067
2004511245.tif 000068
2004511245.tif 000069
2004511245.tif 000070
2004511245.tif 000071
2004511245.tif 000072
2004511245.tif 000073
2004511245.tif 000074
2004511245.tif 000075
2004511245.tif 000076
2004511245.tif 000077
2004511245.tif 000078
2004511245.tif 000079
2004511245.tif 000080
2004511245.tif 000081
2004511245.tif 000082
2004511245.tif 000083
2004511245.tif 000084
2004511245.tif 000085
2004511245.tif 000086
2004511245.tif 000087
2004511245.tif 000088
2004511245.tif 000089
2004511245.tif 000090
2004511245.tif 000091
2004511245.tif 000092
2004511245.tif 000093
2004511245.tif 000094
2004511245.tif 000095
2004511245.tif 000096
2004511245.tif 000097
2004511245.tif 000098
2004511245.tif 000099
2004511245.tif 000100
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004511245.tif 000101
【国際調査報告】
2004511245.tif 000102
2004511245.tif 000103
2004511245.tif 000104
2004511245.tif 000105
2004511245.tif 000106