(57)【要約】１つのアッセイにおいて、複数の遺伝子座で、複数のサンプルを遺伝子タイピングするための方法を提供する。別個の遺伝子座を示すゲノムセグメントのマイクロアレイを形成し、そしてこのゲノムセグメントに相補的な合成オリゴヌクレオチドの混合物とハイブリダイズさせる。遺伝子タイピング情報は、マイクロアレイシグナルを読み取ることによって獲得される。この方法を用いて、多様な生物学的供給源由来のサンプルを特徴付けることができ、そしてこの方法は、種々の用途に使用され得る。
2004502441.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のサンプルを同時に遺伝子タイピングする方法であって、該方法が、以下の工程：
複数のポリメラーゼ連鎖反応プライマーを用いて、複数のサンプルから複数のゲノムセグメントを増幅する工程であって、各々のゲノムセグメントが、別個の遺伝子座を含む、工程；
該増幅されたゲノムセグメントから、表面上にマイクロアレイを形成する工程であって、ここで、該表面上の各々の位置は、１つのサンプルに由来し、そして本質的に１つのゲノムセグメントからなる増幅された物質を含む、工程；
該マイクロアレイを標識された合成オリゴヌクレオチドの混合物とハイブリダイズする工程であって、ここで、該混合物が、該ゲノムセグメントに相補的なオリゴヌクレオチドを含む、工程；および
該ハイブリダイズしたマイクロアレイ由来のシグナルを検出することによって、該複数の遺伝子座で、該複数のサンプルについての遺伝子タイピング情報を同時に獲得し、それによって、該複数のサンプルを遺伝子タイピングする、工程、を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記複数のサンプルが、少なくとも１０個の別個のサンプルを含む、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、ここで、前記複数のサンプルが、少なくとも５，０００個の別個のサンプルを含む、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記ゲノムセグメントが、ヒト疾患遺伝子座を含む、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、ここで、前記サンプルが、新生児血液サンプルである、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、ここで、前記遺伝子座が、β−グロビン、ＣＦＴＲおよびＧＡＬＴからなる群より選択されるヒト遺伝子に関連した遺伝子座を含む、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記表面上のマイクロアレイの密度が、１平方センチメートル当たり少なくとも１０００スポットである、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記標識された合成オリゴヌクレオチドの混合物が、１０個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含む、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記標識された合成オリゴヌクレオチドが、およそ１０ヌクレオチド長とおよそ３０ヌクレオチド長との間である、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記ゲノムセグメントが、各々およそ４０とおよそ１０００との間の塩基対を含む、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記ハイブリダイズ工程が、塩および界面活性剤を含む水溶液中にて実施される、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記ハイブリダイズ工程が、前記標識された合成オリゴヌクレオチドの融解温度のおよそ１０℃下の温度で行われる、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記標識された合成オリゴヌクレオチドが、蛍光標識を含む、方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記標識された合成オリゴヌクレオチドが、非蛍光標識を含む、方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記遺伝子タイピング情報が、特定の遺伝子座において、ホモ接合体由来のサンプルおよびヘテロ接合体由来のサンプルを識別する、方法。
【請求項１６】
請求項１３に記載の方法であって、ここで、前記シグナルが、前記標識された合成オリゴヌクレオチド由来の蛍光放射によって生成される、方法。
【請求項１７】
請求項１３に記載の方法であって、ここで、前記シグナルが、１を超える波長の光での蛍光放射によって生成される、方法。
【請求項１８】
請求項１４に記載の方法であって、ここで、前記シグナルが、抗体染色後の蛍光放射によって生成される、方法。
【請求項１９】
請求項１４に記載の方法であって、ここで、前記シグナルが、抗体染色後の１を超える波長の光での蛍光放射によって生成される、方法。
【請求項２０】
請求項１３に記載の方法であって、ここで、前記蛍光標識が、デンドリマー標識を含む、方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記表面が、ガラスを含む、方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記増幅されたゲノムセグメントが、アミノリンカーを含む、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、ここで、前記表面が、反応性アルデヒド基を含む、方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記マイクロアレイが、機械的なマイクロスポッティングによって形成される、方法。
【請求項２５】
複数のサンプルを同時に遺伝子タイピングする方法であって、該方法は、以下の工程：
ポリメラーゼ連鎖反応プライマーを用いて、複数のサンプル由来の遺伝子座を含むゲノムセグメントを増幅する工程；
該増幅されたゲノムセグメントから、表面上にマイクロアレイを形成する工程であって、ここで、該表面上の各々の位置が、１つのサンプル由来の物質を含む、工程；
該マイクロアレイを標識された合成オリゴヌクレオチドの混合物とハイブリダイズする工程であって、ここで、該混合物が、該ゲノムセグメントに相補的なオリゴヌクレオチドを含む、工程；および
該ハイブリダイズしたマイクロアレイ由来のシグナルを検出することによって、複数のサンプルの遺伝子タイピング情報を同時に獲得し、それによって、該複数のサンプルを遺伝子タイピングする、工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般的に、遺伝子タイピング（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）に関し、そしてより詳細には、疾患の診断のための遺伝子タイピングに関する。
【０００２】
（背景）
ヒト、動物および植物における多数の病理学的状態は、現在、遺伝子レベルで理解される。ヒトゲノムのマッピングの完了が発表され、より多くのヒト疾患の遺伝学的基礎が、近い将来に同定されることが期待される。従って、個体由来のＤＮＡ分析は、原則として、表だった症状がない状態で、遺伝子に基づく状態を診断または同定することを可能にする。これは、多くの状態（例えば、代謝障害）について有利であり、これにより、初期の診断が、晩年の重篤な医学的合併症を妨げ得る。
【０００３】
ＤＮＡ配列を分析する方法（これは、一般的に遺伝子タイピングとしばしばいわれる）は、当該分野で公知である。非常に一般的な用語において、サンプル中のＤＮＡが、その遺伝子配列が既知である特定の疾患状態に対応するか否かを決定するために、サンプルは、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、この疾患に関連する核酸プローブに曝露される。この核酸プローブは標識され、それによって、このプローブが、ＤＮＡサンプルにハイブリダイズしたか否かを検出することを可能にする。１つの技術において、このプローブは、チップ上でアレイに配置され、各々のプローブは、特定の位置に割り当てられる。標識されたＤＮＡサンプルへのアレイの曝露後、スキャンデバイスが、このアレイにおける各々の位置を試験し得、そして標的分子が、その位置でプローブと相互作用したか否かを決定し得る。アレイチップは、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒａ、ＣＡ）から市販されており、そしてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘに譲渡された特許に記載される（例えば、米国特許第６，０４５，９９６号、同第５，８５８，６５９号および同第５，９２５，５２５号ならびにその中の参考文献を参照のこと）。アレイはまた、ＤＮＡ配列決定用途（例えば、米国特許第６，０２５，１３６号、同第６，０１８，０４１号、同第５，５２５，４６４号および同第５，２０２，２３１号において記載されるハイブリダイゼーションアプローチによる配列決定法のような）に使用されている。
【０００４】
疾患診断についての遺伝子タイピング方法は、この方法が公共の健康生活環境において有用であるために利用可能である一方、手頃な値段である必要がある。例えば、関連した遺伝子アッセイが公知であるが、新生児スクリーニングは、現在、主にコストを考慮して、質量分析方法によって行われる。第二に、公共の健康生活環境におけるＤＮＡ診断は、質量分析方法が困難であるか、または扱いにくい複数のサンプルおよび遺伝学的状態に対する適用について実用的である必要がある。複数のサンプルの必要性には、同時に処理される複数のアレイチップの使用によって取り組まれ得る。Ｒａｖａらに対する米国特許第５，５４５，５３１号において記載されるように、各々のウェルの底にアレイチップを含む、標準的な９６ウェルマイクロタイタープレートを含むフォーマットが使用され得る。多くの患者サンプルに対して同じ試験を行うために、溶液中の各々の患者サンプルが標識され、そして異なるウェルに導入される（各々のウェルは、同一のアレイチップを有する）。従って、この方法において、別々のアレイチップを、各々のサンプルについて使用する。これは、アレイ、試薬、サンプル処理などの一定の患者当たりの費用のために、広範な用途にとって高価であり得る。
【０００５】
Ｂｒｏｗｎらに対する米国特許第５，８０７，５２２号は、疾患遺伝子における既知の変異に対する複数の患者のスクリーニングの方法を記載し、これは、患者のゲノムＤＮＡの複数のマイクロアレイおよび所定の遺伝子のすべての既知の変異を表すプローブＤＮＡフラグメントを使用する。このマイクロアレイは、交差汚染を妨げるために、個々のアレイ間にシリコンゴムの障壁成分を用い、プラスチックで裏打ちされたニトロセルロースのシート上に作製される。すべてのマイクロアレイは、単一シートの物質として処理される。しかし、Ｂｒｏｗｎらの方法は、各々の変異した対立遺伝子またはスクリーニングされた遺伝子マーカーについて、別々のマイクロアレイを用いる。
【０００６】
従って、手頃であり、そして大規模使用について十分なスループットを提供する、診断用途について十分な正確さを有する遺伝子タイピング方法についての必要性が存在する。理想的には、このような方法は、１つのアッセイにおいて、複数の患者を複数の疾患についてスクリーニングすることを可能にする。より一般には、この方法は、１つのアッセイにおいて、ヒト物質、動物物質、植物物質または微生物物質の任意の供給源由来の複数のサンプルを、複数の遺伝子座における対立遺伝子についてスクリーニングすることを可能にする。
【０００７】
（要旨）
本発明は、１つのアッセイにおいて、複数の遺伝子座で複数のサンプルを遺伝子タイピングする方法を提供する。この方法に従って、複数のサンプル由来のゲノムセグメントが、ポリメラーゼ連鎖反応プライマーを使用して増幅され、ここで、各々のゲノムセグメントは、遺伝子座、すなわち目的のＤＮＡマーカーを含む。このゲノムセグメントは、表面上でマイクロアレイに形成され、ここで、この表面の各々の位置における物質は、本質的に、１つのサンプル由来の１つのゲノムセグメントに対応する。このマイクロアレイは、マイクロアレイ上のゲノムセグメントに相補的な合成オリゴヌクレオチドの混合物とハイブリダイズされる。次いで、複数のサンプルについての遺伝子タイピング情報は、マイクロアレイシグナルを読みとることによって同時に獲得される。この方法は、疾患診断について使用され得るか、あるいは任意の植物種または動物種由来の対立遺伝子についてスクリーニングするために使用され得る。従って、この方法は、広範な種々の用途に使用され得る。
【０００８】
（詳細な説明）
遺伝子タイピング方法は、同時に複数の疾患遺伝子座において、複数の個体についての情報を獲得する。本明細書中において使用される場合、遺伝子タイピングは、特に、１つのヌクレオチド分解（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）で、所定の遺伝子座において対立遺伝子を区別することと規定される。遺伝子座（複数の遺伝子座）は、遺伝子マーカーまたはＤＮＡマーカーの染色体位置として規定される。従って、本発明に従う方法は、医学的解決のための基礎として使用され得る、個体についてのスクリーニングおよび診断情報を提供するのに必要とされる正確さを有する。
【０００９】
この方法の概観を、図１に概略的に例示する。第一に、工程１０において、ゲノムＤＮＡのサンプルが、生物学的標本から単離される。この標本は、細菌、酵母、植物または動物を含む任意の起源であり得る。ＤＮＡを含む任意の生物は、この方法に受け入れ得る。ヒト疾患の診断に対する適用について、生物学的標本は、例えば、血液、羊水、新生児血液カード（ｃａｒｄ）、唾液、精液、上皮切屑および針生検から得られる。特定の生物について、この生物学的標本は、ＤＮＡではなくＲＮＡを含み得る。このサンプルは、標準的な手順を用いて、単離および精製される。
【００１０】
次いで、サンプルＤＮＡが、工程１２において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用によって、遺伝子特異的プライマーを用いて増幅されて、いわゆるアンプリコンを産生する。このＰＣＲ工程は、広く使用され、そして当該分野において広範に記載されている（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号および同第４，６８３，１９５号および同第４，８００，１５９号および同第４，９６５，１８８号および同第５，３３３，６７５号ならびにその中の参考文献を参照のこと）。特定の対のプライマーが、目的の各々のゲノムセグメント、すなわち、目的の既知の潜在的な変異または他のＤＮＡ変更を含む各々のゲノムセグメントについて使用される。従って、この方法は、ＤＮＡマーカーを用いて同定される任意の疾患に適用可能である。このような疾患は、例えば、ほんの少数の例を挙げれば、嚢胞性線維症、チロシン血症、カエデシロップ病、α−１−アンチトリプシン欠損症、グリコール酸尿症Ｉ型、遺伝性難聴、β−サラセミア、長鎖３−ヒドロキシルアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症、中鎖（ｍｅｄｉｕｍ　ｃｈａｉｎ）アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症を含む。この方法は、鎌状赤血球貧血およびガラクトース血症のような疾患に特に有用であり、ここで、十分に研究された１つの遺伝子における１つの変異は、この疾患表現型を産生し得る。このＤＮＡマーカーは、変異、単一ヌクレオチド多型、小欠失などを含む既知の型のＤＮＡ変更のいずれかを表し得る。唯一の必要条件は、目的のＤＮＡ変更が、アンプリコンを作製するために用いられるプライマー対の内部に存在しなければならないことである。これは、ホモ接合体、ヘテロ接合体および正常な個体由来の標本を含む所定の遺伝子座における標本のすべてから作製されるアンプリコンが、ほぼ等しい効率で増幅することを確実にする。
【００１１】
各々の生物学的サンプルが、複数のプライマー対と別々に処理されて、各々の個体についての複数のアンプリコンを産生し、各々のアンプリコンは、特定の個体由来の特定のゲノムセグメントに関連し、各々のゲノムセグメントは、目的の遺伝子座を含む。この方法が現在行われているような各々のアンプリコンの長さは、およそ６０塩基対であるが、この方法は、およそ４０塩基対と１０００塩基対との間の範囲におけるアンプリコンに適用され得る。現在代表的に行われているような各々のＰＣＲ反応の総量は、およそ５０μｌである。さらなる最適化により、最小容量が５〜１０μｌに減少されることが予想され、これは、この方法が、サンプル調製について使用されるＰＣＲ増幅試薬および精製試薬の量を最小化することによって、さらなるコスト節約を提供することを可能にする。
【００１２】
このゲノムセグメントを精製して、汚染物質（例えば、ヌクレオチド、酵素、プライマー、およびマイクロアレイプリンティング、付着またはハイブリダイゼーションを妨げ得る他の物質）を除去する。ＰＣＲアンプリコンを精製するための方法は、ＴｅｌｅＣｈｅｍ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）およびＱｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を含む多数の販売元から入手可能である。この精製されたアンプリコンは、緩衝液（例えば、塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）溶液、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムおよびエチレンジアミン四酢酸（ＳＳＰＥ）溶液、または他の標準的試薬）中に懸濁される。この緩衝化アンプリコンは、工程１４において、１ウェル当たり１つのアンプリコン溶液で、標準的な９６ウェルまたは３８４ウェルマイクロプレートに配列される。精製産物の代表的な量は、配列工程について、１ウェル当たりおよそ３〜４μｌであるが、２〜２０μｌの範囲の産物量が、マイクロアレイの形成に十分である。
【００１３】
ＤＮＡ単離およびＰＣＲ工程は、９６ウェル配置または３８４ウェル配置のいずれかにおいて容易に大規模化可能（ｓｃａｌｅａｂｌｅ）であり得、その結果、１日当たり、１０，０００を超えるサンプルが、自動実験環境において容易に達成される。このスループットは、一年に２４０，０００人の患者由来の１０の遺伝子座の増幅を可能にする。従って、この方法は、集団の広範なスクリーニング、ならびに農業における作物育種、法医学、軍事適用などについて必要とされるような他のハイスループット適用を可能にする。
【００１４】
工程１６において、マイクロプレートにおけるゲノムセグメントの高密度マイクロアレイが、基板上に形成され、このマイクロアレイの現在の大きさは、基板上のおよそ１．０ｃｍ２を占有し、この基板は、代表的には、標準的な２５ｍｍ×７６ｍｍの顕微鏡スライドの大きさである。中心から中心までおよそ１４０μｍの間隔で配置された代表的なスポットの直径は、およそ１００μｍであり、各々のスポットの、基板上の別個または別々の位置での形成を可能にする。以下の実施例に記載される実験におけるスポットの総数は、１．０ｃｍ２のプリント領域において５７６スポットであるが、マイクロスポッティング技術の現在の能力と結び付いたサンプルのスケールアップは、１ｃｍ２当たり１，０００を超えるスポット、すなわち１ｃｍ２当たり推定５，１８４のスポットを可能にし、その結果、形成された１８ｍｍ×７２ｍｍのマイクロアレイは、２５ｍｍ×７６ｍｍのマイクロアレイスライド当たりおよそ８２，９４４のスポットを含む。従って、本発明の方法は、遺伝子タイピング情報が、同時に複数の個体から、すなわち、同時に少なくとも１０、少なくとも６０または少なくとも５，０００の個体から得られることを可能にする。原則として、あらゆる人民のマイクロアレイは、集団におけるあらゆる人間の永久的な遺伝子記録を提供し得る。
【００１５】
マイクロアレイにおける各々のスポットは、本質的に、ＰＣＲ工程の正確さの範囲内で、１つの個体由来の１つのアンプリコンに対応する。このサンプルは、現在、１４０μｍ間隔で三連にてプリントされる。三連のスポッティングは、結果の信頼度を増大し、そしてこれは、例えば図２において概略的に示される。左から右への第一の列２６は、ＰＣＲプライマー対Ａを用いて処理される個体番号１由来のアンプリコン（１Ａと表示）に対応する３つのスポットを含み、その後に、ＰＣＲプライマー対Ｂを用いて処理される個体１由来の３つのスポットなどが続く。図２において、列２８は、ＰＣＲプライマー対Ａ、ＢおよびＣを用いて処理された個体２由来のアンプリコンを示す。しかし、異なるサンプル由来のスポットが、異なる列に配置される必要はないが、異なるアンプリコン溶液由来のスポットが、別個の位置に配置される必要性がある。また、三連スポッティング配置それ自体についての必要性は存在せず、そして一連、二連または四連あるいは他のパターンが、信頼性のある遺伝子タイピング情報を作製するために用いられ得る。
【００１６】
マイクロアレイの形成についての現在利用可能な技術は、密着プリント（ｃｏｎｔａｃｔ　ｐｒｉｎｔｉｎｇ）技術および非密着プリント技術の両方を含む。１つの例は、ＴｅｌｅＣｈｅｍ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）のＳｔｅａｌｔｈ　Ｍｉｃｒｏ−ｓｐｏｔｔｉｎｇプリントヘッドを備えたＣａｒｔｅｓｉａｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）のＰｉｘＳｙｓ　５５００運動制御システムである。密着プリント技術は、中実のピン、スプリットピン、ピンセット、マイクロスポッティングピンならびにピンおよびリングを用いた機械的デバイスを含む。密着プリント技術は、多くの販売元（ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）、Ｇｅｎｅｔｉｘ（Ｃｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ、Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ）、Ｉｎｃｙｔｅ（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）、Ｇｅｎｅｔｉｃ　ＭｉｃｒｏＳｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒａ、ＣＡ）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒａ、ＣＡ）、Ｓｙｎｔｅｎｉ（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）、Ｃａｒｔｅｓｉａｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）などを含む）から市販されている。非密着プリント技術は、圧電性物質、バブルジェット（登録商標）、マイクロソレノイド弁、シリンジポンプなどを利用するような「インクジェット」型デバイスを含む。非密着プリント技術の販売元は、Ｐａｃｋａｒｄ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）、Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）、Ｒｏｓｅｔｔａ（Ｋｉｒｋｌａｎｄ、ＷＡ）、Ｃａｒｔｅｓｉａｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）、Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）などを含む。密着デバイスおよび非密着デバイスの両方は、３次元移動可能な手製のデバイスまたは市販のデバイスのいずれかにおいて使用され得る。Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｃａｎａｄａ）、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ　Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅｓ（Ｓａｎ　Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）、Ｃａｒｔｅｓｉａｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）、Ｇｅｎｅｔｉｘ（Ｃｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ、Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ）などからの運動制御デバイスもまた、本発明に従ったマイクロアレイの製造に適切である。
【００１７】
本方法におけるＰＣＲ反応において使用されるプライマー対は、代表的には、反応性基（例えば、アルキルアミン基）を含み、これは、マイクロアレイ基板（例えば、ガラス基板）へのアンプリコンの特異的付着を可能にし、この基板は、化学処理され得る。例えば、基板は、反応性のアルデヒド基を含み得、これは、反応産物として産生される、シッフ塩基を介してアミノ結合したＰＣＲ産物の末端付着を可能にする。この付着反応は、脱水反応によって進行する。疎水性プリント表面（例えば、反応性アルデヒド基を含む表面）は、サンプルの拡散を妨げるのに有用であり、従って、より小さいスポットの大きさおよびより高いマイクロアレイ密度を可能にする。反応性アルデヒド基を有するマイクロアレイ基板は、多くの販売元（ＴｅｌｅＣｈｅｍ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）およびＣＥＬ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）を含む）から入手可能である。しかし、任意の多くのさらなるマイクロアレイ表面の化学的性質および付着の化学的性質（ポリリジン、有機シラン、エポキシシラン、反応性カルボキシル基、ゲルパッド材料、ニトロセルロースでコーティングされたガラスおよび他の物質のコーティングまたは処理を含む）もまた利用され得ることが明らかである。末端付着スキームに加えて、紫外線または熱を用いた基板への架橋、静電相互作用、疎水性相互作用および他の手段を含む多くの非特異的スキームが、代わりに使用され得ることがまた明らかである。
【００１８】
工程１８において、マイクロアレイが処理され、そして標識された合成オリゴヌクレオチドの混合物とハイブリダイズされる。このマイクロアレイを処理して、マイクロアレイハイブリダイゼーションの前に、従来のプロトコル（例えば、Ｓｃｈｅｎａら、ＰＮＡＳ　９３、１０６１４〜１０６１９、１９９６を参照のこと）を用いて、未結合のＤＮＡ物質を除去し、未反応のアルデヒド基を不活化し、そしてプリントされたＰＣＲセグメントを変性する。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、合成オリゴヌクレオチドの融解温度Ｔｍのおよそ１０℃下の温度で、塩および界面活性剤を含む水溶液中で行われる。このハイブリダイゼーション混合物は、マイクロアレイ上のアンプリコンに存在する対立遺伝子に相補的な合成オリゴヌクレオチドからなる。すなわち、この混合物における各々の合成オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲプライマー対によって選択された遺伝子座に対応する。この方法に従って、実質的に無限の数の異なるハイブリダイゼーション混合物が調製されて、任意の核酸含有生物から、目的のアンプリコンにおける対立遺伝子を検出し得る。この工程が、大規模化可能であり（ｓｃａｌｅａｂｌｅ）、その結果、数十、数百あるいは数千の異なるオリゴヌクレオチドを含む混合物が用いられて、目的の多くの異なる対立遺伝子を試験し得、従って多くの異なる疾患を同時に試験し得ることがまた明らかである。唯一の必要条件は、野生型対立遺伝子および変更された対立遺伝子について利用可能な配列情報、ならびに各々のＰＣＲプライマー対に相補的な境界の遺伝子配列を有することである。合成オリゴヌクレオチドは、多くの販売元（ＥＯＳ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｏｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）およびＯｐｅｒｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を含む）から広範に入手可能である。
【００１９】
混合物中のオリゴヌクレオチドは、代表的には、およそ１０〜３０ヌクレオチド長であり、アンプリコン内部の１ヌクレオチド変異を区別する能力を最大化する。例えば、このオリゴヌクレオチドは、１５ヌクレオチド長（１５マー）であり得、ここで、目的の対立遺伝子は、１５マーに関して、中央の位置（位置８）に位置する。混合物中の合成オリゴヌクレオチドは、標識され、そして標識は、例えば各々のオリゴヌクレオチドの５’末端に存在し得るが、５’末端または３’末端のいずれか、あるいはおそらく両方での標識が、記載される方法の範囲内において作動することが期待される。直接的標識方法および間接的標識方法の両方が、当該分野で公知である。直接的標識において使用される一般的な蛍光タグは、Ｃｙ３およびＣｙ５と示される色素を含み、これらは、それぞれおよそ５５０ｎｍおよび６５０ｎｍで蛍光を発する。このオリゴヌクレオチド混合物は、複数の波長で蛍光を発する複数の蛍光タグを含み得る。任意の数の異なる型の蛍光タグが、Ｃｙ３タグおよびＣｙ５タグの代わりに使用されて、１つ以上の異なる色の検出を可能にし得る。多色アプローチは、例えば、野生型対立遺伝子のある色における最大の効率での検出、および変異体対立遺伝子の別の色における最大の効率での検出を可能にすることによって有用であることが予想される。他の型の標識は、種々の市販の色素および色素誘導体（例えば、Ａｌｅｘａ、フルオレセイン、ローダミン、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、Ｊｏｅ、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ、ＢＯＤＩＰＹ、ＦＩＴＣ、Ｏｒｅｇｏｎ　Ｇｒｅｅｎ、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅなどと示される色素および色素誘導体）を含む。これらの色素および誘導体の多くは、商業的供給者（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｂｕｃｋｓ、Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ）およびＧｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＴ））から得られ得る。
【００２０】
間接的標識方法は、例えば、ビオチンまたはジニトロフェノールでの標識を含み、これらは、それ自身は蛍光性ではないが、それらに結合した蛍光基を含む抗体結合体と反応性である有機分子である。従って、標識、ハプテンまたはエピトープ（例えば、ビオチンおよびジニトロフェノール）は、いわゆる間接的手段によって蛍光検出を可能にする。なぜなら、各々のスポットにおける蛍光は、抗体結合体によって寄与されるからである。この抗体結合体は、非蛍光標識との相互作用を介して、マイクロアレイと相互作用する。特定の抗体結合体は、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）を含み、これは、マイクロアレイ表面に結合したタンパク質のチロシン部分への短命のチラミド（Ｔｙｒａｍｉｄｅ）遊離基の結合を触媒する。種々の蛍光部分へのチラミドの結合によって、ビオチンおよびジニトロフェノール標識、抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体、ならびにチラミド−Ｃｙ３誘導体およびチラミド−Ｃｙ５誘導体を含む間接的手段によるハイブリダイズされた産物の検出が可能である。しかし、当業者は、任意の数の直接的標識スキームおよび間接的標識スキームが、蛍光アプローチおよび非蛍光アプローチの両方を含む検出のために使用され得ることを認識する。１つの代替の蛍光アプローチは、Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ（Ｏａｋｌａｎｄ、ＮＪ）によって記載されるデンドリマー（Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）技術を用いる。１つの代替の非蛍光アプローチは、ビーズおよび粒子（例えば、Ｇｅｎｉｃｏｎ（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって共鳴光散乱（ＲＬＳ）粒子とともに記載される）を用いる。
【００２１】
標識された合成オリゴヌクレオチド混合物とのハイブリダイゼーション後、このマイクロアレイは、工程２０において、既知の方法によって、スキャンされるかまたは読みとられて、遺伝子タイピング情報を検出する。検出は、例えば、レーザー励起および光電子増倍管検出を備えた共焦点スキャニング器具（例えば、ＧＳＩ　Ｌｕｍｏｎｉｃｓ（Ｂｅｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）によって提供されるＳｃａｎＡｒｒａｙ　３０００）を用いて行われ得る。あるいは、Ａｘｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、Ｇｅｎｅｔｉｃ　ＭｉｃｒｏＳｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒａ、ＣＡ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）およびＶｉｒｔｅｋ（Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）によって提供されるような多くの異なる型の共焦点蛍光検出システムおよび非共焦点蛍光検出システムが用いられて、この方法を実行し得る。代替の検出システムは、気体、ダイオードおよび固体状態のレーザーを使用するスキャニングシステム、ならびに種々の他の型の照明供給源（例えば、キセノンバルブおよびハロゲンバルブ）を使用するスキャニングシステムを含む。光電子増倍管に加えて、検出器は、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）および相補型金属酸化物シリコン（ＣＭＯＳ）チップを使用するカメラを含み得る。
【００２２】
直接的に標識されたオリゴヌクレオチドまたは間接的に標識されたオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションに使用されるにせよされないにせよ、所定のマイクロアレイスポットから検出されるシグナルの強度は、所定のスポットにおけるゲノムセグメントへの混合物中のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの程度に直接比例する。このオリゴヌクレオチド混合物は、野生型対立遺伝子または変異体対立遺伝子のいずれかに相補的なヌクレオチドを含み得るので、野生型のゲノムセグメントまたは変異体のゲノムセグメントのいずれかが、ハイブリダイズする混合物が調製された方法に依存して検出され得る。同一のマイクロアレイスポット由来のシグナル（例えば、図２において１Ａと標識された３つのスポット由来のシグナル）が、正確さの増大のために平均化され、従って、小さな変異係数（ＣＶ）を提供する。
【００２３】
種々の手段が用いられて、遺伝子タイピング情報を獲得および評価し得る。上記のように、絶対的な蛍光シグナルが用いられて、所定のアンプリコンの対立遺伝子組成を決定し得る。あるいは、２つ以上の色を有するオリゴヌクレオチド混合物もまた使用し得、所定の色は、所定の対立遺伝子に専用である（例えば、緑色蛍光として野生型、および赤色蛍光として変異体対立遺伝子）。種々のさらなるスキームがまた、直接的標識（例えば、蛍光染色）とともに使用されて、各々のスポットのＤＮＡ含量を評価し得る。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）から入手可能なＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ色素は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）色素の波長範囲において、染色されたＤＮＡの検出を可能にする。
【００２４】
本発明の特徴および利益は、以下の実施例によってさらに例示されるが、この実施例によって限定されない。この実施例において、新生児血液サンプルを、鎌状赤血球貧血およびガラクトース血症の種々の対立遺伝子についてスクリーニングした。
【００２５】
（実施例）
７２人の異なる新生児由来の新生児血液サンプルを単離し、そして以下の表１においてＡＲＤＣ１００〜１０９と示された遺伝子特異的プライマーを用いて増幅した。これらの５つのプライマー対は、Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＴ）からのＣ６アミノ修飾に対応する反応性アミン基を含み、これは、マイクロアレイ基板へのアンプリコンの特異的結合を可能にする。以下の表１における各々のオリゴヌクレオチド配列における「Ｎ」位置は、Ｃ６アミノ修飾を示す。これらのプライマー対は、以下の３つのヒト遺伝子の合計に対応する５つの別個のゲノムセグメントを包含する：β−グロビン、ＣＦＴＲおよびＧＡＬＴ。ヒトにおいてβ−グロビン遺伝子、ＣＦＴＲ遺伝子およびＧＡＬＴ遺伝子に関連した疾患は、それぞれ鎌状赤血球貧血、嚢胞性線維症およびガラクトース血症である。これらのゲノムセグメントは、３つの遺伝子において５つの疾患遺伝子座を包含し、そして各々のアンプリコンのおよその大きさは、６０塩基対であった。各々のＰＣＲ反応物の総量は、５０μｌであった。
【００２６】
このゲノムセグメントを増幅し、次いで、精製して、汚染物質を除去した。ＴｅｌｅＣｈｅｍ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）による３８４ウェルのＰＣＲ精製キットを、製造業者の指示書に従って用いた。この精製された産物を、１０μｌの滅菌蒸留水に再懸濁し、そしてこの１０μｌのうちの２μｌを、ＴｅｌｅＣｈｅｍ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）によって提供される２×Ｍｉｃｒｏ−Ｓｐｏｔｔｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２μｌと混合して、プリンティングについて、合計４μｌのサンプルを提供した。サンプルプレートにおける各々のＰＣＲアンプリコンの濃度は、１００μｇ／μｌであった。それぞれ４μｌの７２のサンプルの各々を、プリント緩衝液単独または合成オリゴヌクレオチドのいずれかを含む合計２４のコントロールサンプルと共に、３８４ウェルプレートの隣接ウェルに配置した。この２４のコントロールサンプルは、この実験におけるポジティブハイブリダイゼーションコントロールおよびネガティブハイブリダイゼーションコントロールの両方を提供した。合計９６のサンプル（７２の新生児アンプリコンおよび２４のコントロール）を、３８４ウェルマイクロプレートに配置し、その結果、第一の４列（Ａ１〜２４からＤ１〜２４）における全てのウェルは、それぞれ４μｌのサンプルを含んだ。Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｃｏｓｔａｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）からのポリプロピレン３８４ウェルマイクロプレートを用いたが、他の製造供給源（例えば、Ｗｈａｔｍａｎ　Ｐｏｌｙｆｉｌｔｒｏｎｉｃｓ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＡ））からのプレートが、代わりに使用され得る。疎水性材料は、凸状のサンプル小滴を生じ、これは、ポリスチレンのような材料のマイクロプレートにおいて含まれるサンプルと比較して、わずかに改善されたローディング効率およびプリント効率を有する傾向があるが、多くの異なる型のマイクロプレートが、サンプル保持について十分である。
【００２７】
【表１】
2004502441.tif 000003
７２の新生児サンプルおよび２４のコントロールサンプルのマイクロアレイを、ＴｅｌｅＣｈｅｍ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）からのＳｔｅａｌｔｈ　Ｍｉｃｒｏ−Ｓｐｏｔｔｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを備えたＣａｒｔｅｓｉａｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）からのＰｉｘＳｙｓ　５５００運動制御システムを用いて、マイクロアレイに形成した。このＳｔｅａｌｔｈプリントヘッドは、４．５ｍｍの中心から中心までの間隔で、２×２配置で配列された合計４つのプリントピンを含んだ。４つのピンのセットを用いて、３８４ウェルマイクロプレートから、同時に４サンプルをロードおよびプリントした。合計２４のプリントサイクル（９６のサンプルを４つのピンで割る）を用いて、７２の新生児サンプルおよび２４のコントロールをプリントした。合計のプリント時間は、およそ４８分であった。
【００２８】
９６全てのサンプルを、１４０μｍのスポット間隔で、１００μｍスポットとして三つ組（２８８の合計スポット）でプリントし、その結果、４つのピンの各々は、７２の個々のマイクロアレイスポット（２８８の合計スポットを４つのピンで割る）を含むマイクロアレイのサブグリッドを生成した。次いで、９６全てのサンプルを、第一のマイクロアレイに関して、２ミリメートルのオフセットで、三つ組で再プリントして、９６全てのサンプルについて、スポットの複製セット（２８８のさらなるスポット）を提供した。この最終のマイクロアレイは、およそ１．０ｃｍ２の合計領域において、合計５７６のマイクロアレイスポット（２８８＋２８８）を各々含んだ。合計３０のマイクロアレイを、製造業者の指示書に従って、ＴｅｌｅＣｈｅｍ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）からの３０のＳｕｐｅｒＡｌｄｅｈｙｄｅ　Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ上にプリントして、種々の異なるハイブリダイゼーション混合物を可能にし、そして最適化の実行を可能にした。３０のマイクロアレイ基板が、本実施例においてプリントされたが、ＥＳＩ（Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｃａｎａｄａ）からの技術を含むいくつかの市販のプリントシステムが、１２０までの基板が、１回のランにおいてプリントされることを可能にすることに注意し得る。１つのマイクロアレイは、１つのハイブリダイゼーション混合物を用いた遺伝子タイピング情報の生成に十分であり、そして複数のマイクロアレイは、異なるハイブリダイゼーション混合物を用いた所定のセットのサンプルの分析を可能にする。
【００２９】
プリント工程後、このマイクロアレイを、マイクロアレイデバイスのプラテン（ｐｌａｔｔｅｎ）上で、室温で一晩乾燥させ、次いで、マイクロアレイハイブリダイゼーションの前に、処理して、未結合のＤＮＡ物質を除去し、未反応のアルデヒド基を不活化し、そしてプリントされたＰＣＲセグメントを変性させた。この処理段階は、以下の通りであった：激しく撹拌しながら、室温で２分間０．２％　ＳＤＳに２回浸す、激しく撹拌しながら、室温で２分間蒸留水に２回浸す、基板を１００℃で蒸留水において２分間処理して、ＤＮＡを変性させる、基板を、室温で５分間風乾させる、基板を、１．２ｇのＮａＢＨ４を３３０ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解することによって調製される水素化ホウ素ナトリウム溶液において５分間処理する、１２０ｍｌの１００％エタノールを加えて、バブリングを減少させる、基板を、各々室温で１分間、０．２％　ＳＤＳ中で３回リンスする、基板を、室温で１分間蒸留水中で１回リンスする、５秒間１００℃で蒸留水中にスライドを浸漬させる、スライドを風乾させる、そして室温で暗室に保管する。水素化ホウ素ナトリウム溶液が、非常に反応性の還元剤であるので、使用直前に新たに調製して、表面上の未反応のアルデヒド基が、高効率で還元されることを確実にすることに注意するべきである。
【００３０】
ハイブリダイゼーション混合物を、商業供給者であるＥＯＳ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｏｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）によって製造される合成オリゴヌクレオチドを用いて調製した。各々の合成オリゴヌクレオチドは、特定のアンプリコンに存在する対立遺伝子に相補的であった。新生児標本についての対立遺伝子は、目的の疾患遺伝子座に対応した。直接的検出を実証するために、以下の表２において混合物１として示される、Ｃｙ３標識またはＣｙ５標識を含む１５マーの混合物を用いた。表２の混合物１におけるＣｙ３標識およびＣｙ５標識は、各々のオリゴヌクレオチド配列において、それぞれ数「３」および「５」によって示される。間接的検出を実証するために、表２において混合物２として示される、ビオチン標識またはジニトロフェノール標識を含む１５マーの混合物を用いた。表２の混合物２におけるビオチン標識およびジニトロフェノール標識は、各々のオリゴヌクレオチド配列において、それぞれ文字「Ｂ」および「Ｄ」によって示される。この合成スケールは、表２に列挙される全てのオリゴヌクレオチドについて１０ナノモルであり、そして各々のオリゴヌクレオチドを、使用の直前に、１００μＭの濃度で蒸留水に懸濁した。混合物１を、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ　塩化ナトリウム、０．０７５Ｍ　クエン酸ナトリウム）および０．２％　ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液において、２μＭ濃度の１０のオリゴヌクレオチド（表２、ＡＲＤＣ１１０〜１１９）の各々を含む５０μｌ溶液の作製によって調製した。混合物２を、１０のオリゴヌクレオチドが、ＡＲＤＣ１２５〜１２９およびＡＲＤＣ１３５〜１３９（表２）であった以外は、混合物１と同じ様式で調製した。
【００３１】
ハイブリダイゼーション反応を、マイクロアレイ当たり、１０μｌの混合物１または混合物２を用いて行った。この１０μｌの混合物を、１８ｍｍ×１８ｍｍ×０．２ｍｍの寸法のカバースリップの下で、マイクロアレイに適用した。ハイブリダイゼーションを、製造業者ＴｅｌｅＣｈｅｍ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）の指示書に従って、ハイブリダイゼーションカセットにおいて、４２℃で５．５時間行った。５．５時間のハイブリダイゼーション後、以下の通りに、このマイクロアレイを洗浄して、ハイブリダイズしていない物質を除去した：２×ＳＳＣ（０．３Ｍ　塩化ナトリウム、０．０３０Ｍ　クエン酸ナトリウム）および０．２％　ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）において、２５℃で５分間を２回、そして２×ＳＳＣ（０．３Ｍ　塩化ナトリウム、０．０３０Ｍ　クエン酸ナトリウム）において、２５℃で１分間を１回。
【００３２】
【表２】
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＊示される全ての配列は、左から右に５’から３’である。３は、Ｃｙ３を示す；５は、Ｃｙ５を示す；Ｂは、ビオチンを示す；Ｄは、ジニトロフェノールを示す。
【００３３】
ハイブリダイゼーション工程および洗浄工程の後、マイクロアレイを、遺伝子タイピング情報について検出した。混合物１を含む直接的標識実験について、この検出工程を、洗浄段階直後に、蛍光放射についてマイクロアレイをスキャンすることによって行った。検出を、光電子増倍管（ＰＭＴ）について１００％の設定、およびレーザー設定について８０％で、ＧＳＩ　Ｌｕｍｏｎｉｃｓ（Ｂｅｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）からのＳｃａｎＡｒｒａｙ　３０００共焦点スキャニング器具を用いて行った。スキャナの二色性能を使用して、混合物１オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに対応するＣｙ３チャネルおよびＣｙ５チャネルの両方で蛍光性のマイクロアレイシグナルを検出した。結果を、図３Ａおよび３Ｂに示し、ここで、図３Ａは、Ｃｙ３由来の蛍光の検出に対応し、そして図３Ｂは、Ｃｙ５由来の蛍光の検出に対応する。これらのデータを、従来のレインボースケールで示し、赤が、最も強度が強く、そして黒が、最も強度が弱い；余白の横棒は、１．０ｍｍに対応する。図３Ａにおけるマイクロアレイの一部の拡大図を、図４Ａに示す。マイクロアレイシグナルは、三つ組で現れる。なぜなら、各々の増幅された新生児患者サンプルまたはコントロールサンプルは、隣接マイクロアレイ位置で３回プリントされたからである。マイクロアレイにおけるサンプル位置を、ｙ軸（垂直方向）に沿った文字およびｘ軸（水平方向）に沿った数によって示す。蛍光性のマイクロアレイシグナルの定量を、ＧＳＩ　Ｌｕｍｏｎｉｃｓ（Ｂｅｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）からのＳｃａｎＡｒｒａｙ　Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて行った。マイクロアレイシグナルに対応する値を、図５にプロットする。このデータは、野生型、ヘテロ接合体およびホモ接合体が、鎌状赤血球およびガラクトース血症の遺伝子座の両方から、試験されるサンプルの全てにおいて容易に識別されることを明らかにする。変異係数（ＣＶ）は、全ての三つ組測定について、１０％未満であった。
【００３４】
β−グロビンの遺伝子座２３２において異なる３人の個体の３つのサンプル由来のゲノムセグメントは、例えば、それぞれ、マイクロアレイ位置ｂ１〜３；ｂ４〜６；およびｂ７〜９に存在する。３人の個体を、それぞれＥ／Ｅ、Ａ／ＥおよびＡ／Ａの遺伝子型によって示す。Ｅ／Ｅ新生児は、β−グロビン配列における２３２位でのＧからＡへの１ヌクレオチド変化である変異体対立遺伝子についてホモ接合体であり、Ａ／Ｅ新生児は、２３２位で、１つの変異体対立遺伝子および１つの正常対立遺伝子を有し、それ故、ヘテロ接合体であり、そしてＡ／Ａ新生児は、２３２位で、２つの正常対立遺伝子（すなわち、両方の対立遺伝子が、β−グロビンにおける２３２位で、Ｇ残基を含む）を有する。ハイブリダイゼーション混合物における対応する合成オリゴヌクレオチド（ＡＲＤＣ１１３、表１）は、Ｅ／Ｅ新生児の両方の対立遺伝子に完全に相補的であり、Ａ／Ｅ新生児の１つの対立遺伝子に完全に相補的であり、かつＡ／Ｅ新生児における他方の対立遺伝子に対する１つのヌクレオチドミスマッチを含み、そしてＡ／Ａ新生児における両方の対立遺伝子に対する１つのヌクレオチドミスマッチを含む。期待されるように、位置ｂ１〜３；ｂ４〜６およびｂ７〜９でのマイクロアレイシグナル強度は、各々のマイクロアレイ位置での新生児サンプルの遺伝子型と一致するシグナル強度の減少を示す。残りのサンプルについての結果は、類似の結果を明らかにし、そして図５で表にされる。
【００３５】
第二の実験において、間接的標識アプローチを、混合物２オリゴヌクレオチドを用いて実証した。このマイクロアレイを、このマイクロアレイを製造業者ＮＥＮ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）の指示書に従って、ＭＩＣＲＯＭＡＸ染色キットを用いて染色したことを除いて、混合物１を含む直接的標識実験に関してと同様に正確に、ハイブリダイズおよび洗浄した。この染色キットは、ビオチンエピトープおよびジニトロフェノールエピトープを別々に認識する抗体結合体を使用し、そして西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を使用して、マイクロアレイ表面上のチラミドＣｙ３およびチラミドＣｙ５の付着を触媒する。検出を、Ｃｙ３チャネルおよびＣｙ５チャネルの両方において、ＧＳＩ　Ｌｕｍｏｎｉｃｓ（Ｂｅｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）によるＳｃａｎＡｒｒａｙ　３０００を用いて、直接的標識アプローチに関してと同様に行った。直接的標識アプローチを用いた結果と類似して、間接的標識によって可能にされる方法は、正確な遺伝子タイピング情報が図６Ａ、６Ｂおよび４Ｂにおいて例示されるように誘導されたマイクロアレイシグナルを明らかにした。
【００３６】
本発明の方法が、現行の方法を超える有意な改善である遺伝子タイピングの新規の手段を提供することが、上述から明らかである。この方法は、初めて、１つのアッセイにおいて、複数の患者および複数の遺伝子座の遺伝子タイピングを可能にする。この方法の重要な特徴は、各々のマイクロアレイスポットが、１人の患者由来の１つのゲノムセグメントまたは遺伝子座を示し、それによって、ハイブリダイゼーション混合物において、増幅された配列と合成オリゴヌクレオチドとの間の高い特異性を可能にすることである。１つのマイクロアレイ工程において、複数の疾患について幾千または幾万の患者を試験する能力が、新生児スクリーニングのための方法の即時の使用を提供し、これは、例えば、時間および支出の有意な節約に相当する。この方法は、新生児スクリーニングを、疾患遺伝子座当たり１０ドル（１０米ドル）未満の費用で可能にするはずであり、それ故、広い商業適用に直ちになじみやすい。初期段階で先天性の遺伝性疾患についてスクリーニングする能力は、人類の健康に対して即座の有益な影響力を有する。
【００３７】
本発明を、特定の実施例に関して記載してきたが、この記載は、本発明の適用の例のみであり、そして限定としてとられるべきではない。開示される実施例の特徴の種々の適応および組み合わせは、上記の特許請求の範囲によって規定されるような本発明の範囲内である。
【００３８】
本特許出願は、少なくとも１つのカラー図面を含む。カラー図面を含む本特許出願の複写は、請求のあり次第、そして必要な手数料を支払い次第、特許商標庁によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明の実施形態に従った、同時の複数の遺伝子座での複数のサンプルの遺伝子タイピング方法のフローチャートである。
【図２】
図２は、本発明の実施形態に従った、マイクロアレイのごく一部の概略図である。
【図３】
図３Ａおよび図３Ｂは、上記の実施例に記載されるように、本発明の実施形態に従った、７２の異なる患者サンプルから調製された５７６の特徴（ｆｅａｕｔｕｒｅ）のマイクロアレイ由来のそれぞれＣｙ３放射およびＣｙ５放射から検出された直接の蛍光シグナルを示す。このマイクロアレイシグナルを、１００％の光電子増倍管（ＰＭＴ）および８０％のレーザーセッティングで、共焦点スキャナを用いて読みとった。赤が最も強く黒が最も弱い、通常型のレインボーコードを用いる。
【図４】
図４Ａおよび４Ｂは、それぞれ図３Ａおよび図３Ｂにおけるデータの拡大部分である。文字（ａ〜ｃ）および数（１〜２８）は、以下のような異なる患者サンプルの各々の位置を区別する：ａ１０〜１２、サンプル１（Ｓ／Ｓ）；ａ１３〜１５、サンプル２（Ａ／Ｓ）；ａ１６〜１８、サンプル３（Ｓ／Ｃ）；ａ１９〜２１、サンプル４（Ｃ／Ｃ）；ａ２２〜２４、サンプル５（Ａ／Ｃ）；ａ２５〜２７、サンプル６（Ａ／Ａ）；ｂ１〜３、サンプル７（Ｅ／Ｅ）；ｂ４〜６、サンプル８（Ａ／Ｅ）；ｂ７〜９、サンプル９（Ａ／Ａ）；ｂ１０〜１２、サンプル１０（野生型）；ｂ１３〜１５、サンプル１１（ヘテロ接合体）；ｂ１６〜１８、サンプル１２（ホモ接合体）；ｂ１９〜２１、サンプル１３（野生型）；ｂ２２〜２４、サンプル１４（ヘテロ接合体）；ｂ２５〜２７、サンプル１５（ホモ接合体）。バックグラウンドの除去を、ネガティブコントロールのプリント緩衝液由来のシグナルを用いて行った（ａ２８〜３０）。ポジティブハイブリダイゼーションコントロール（ｂ２８〜３０、ｃ１〜３、ｃ４〜６、ｃ７〜９およびｃ１０〜１２）をまた示す。スペースバーは、１．０ｍｍに対応する。
【図５】
図５は、図４Ａのレインボーコードによって示されるシグナルの定量値を示す。三連の測定を、バックグラウンドの除去後に平均化した。各々の患者サンプルの遺伝子型を、グラフの上および下に与える。
【図６】
図６Ａおよび６Ｂは、上記の実施例において記載されるように、本発明の実施形態に従った、図３Ａおよび３Ｂと同じセットの患者サンプルから、間接的標識方法を用いて調製されたマイクロアレイ由来のそれぞれＣｙ３放射およびＣｙ５放射から検出されたシグナルを示す。このシグナルを、図３Ａおよび図３Ｂについて記載されるように検出した。
【図１】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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