(57)【要約】チオコラリンおよびＢＥ−２２１７９の全合成方法が得られることによって、これらの化合物の相対的および絶対的な立体構造が確立され、関連する一連の類似体の調製および特性決定が可能となる。チオコラリン、ＢＥ−２２１７９、およびそれらの関連する類似体の生物活性の機構が説明される。チオコラリン、ＢＥ−２２１７９、およびそれらの関連する類似体は、高親和性ビスインターカレーションによってＤＮＡと結合することが開示され、非常に高い細胞毒性活性を示すことも開示される。
2004516258.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造で表される化合物。
【化１】
2004516258.tif 000025
｛式中、
Ｘ１およびＸ２は、＝ＣＨ２および−ＣＨ２ＳＭｅからなる群より選択され、
Ｒ１およびＲ２は、水素、Ｃｂｚ、ＦＭＯＣ、および以下の構造で表される基からなる群より選択される。
【化２】
2004516258.tif 000026
（式中
Ｙは、ＣおよびＮからなる群より選択され、
Ｒ３は、存在しないか、または−Ｏ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）であり、
Ｒ４は、水素およびヒドロキシル基からなる群より選択される。）
ただし、
Ｘ１が＝ＣＨ２である場合、「ａ」は二重結合を表し、Ｒ１およびＲ２はいずれも水素ではなく、
Ｘ１が−ＣＨ２ＳＭｅである場合、「ａ」は単結合を表し、
Ｘ２が＝ＣＨ２である場合、「ｂ」が二重結合であり、Ｒ１およびＲ２はいずれも水素ではなく、
Ｘ１が−ＣＨ２ＳＭｅである場合、「ｂ」は単結合を表し、
Ｒ３が存在しない場合、ＹがＮであるか、またはＲ４が水素である。｝
【請求項２】
以下のジアステレオマー構造で表される請求項１に記載の化合物。
【化３】
2004516258.tif 000027
【請求項３】
以下のジアステレオマー構造で表される請求項２に記載の化合物。
【化４】
2004516258.tif 000028
【請求項４】
以下のジアステレオマー構造で表される請求項３に記載の化合物。
【化５】
2004516258.tif 000029
【請求項５】
以下のジアステレオマー構造で表される請求項３に記載の化合物。
【化６】
2004516258.tif 000030
【請求項６】
以下のジアステレオマー構造で表される請求項２に記載の化合物。
【化７】
2004516258.tif 000031
【請求項７】
以下のジアステレオマー構造で表される請求項６に記載の化合物。
【化８】
2004516258.tif 000032
【請求項８】
以下のジアステレオマー構造で表される請求項６に記載の化合物。
【化９】
2004516258.tif 000033
【請求項９】
以下のジアステレオマー構造で表される請求項２に記載の化合物。
【化１０】
2004516258.tif 000034
【請求項１０】
以下のジアステレオマー構造で表される請求項９に記載の化合物。
【化１１】
2004516258.tif 000035
【請求項１１】
以下のジアステレオマー構造で表される請求項９に記載の化合物。
【化１２】
2004516258.tif 000036
【請求項１２】
以下のジアステレオマー構造で表される請求項２に記載の化合物。
【化１３】
2004516258.tif 000037
【請求項１３】
以下のジアステレオマー構造で表される請求項１２に記載の化合物。
【化１４】
2004516258.tif 000038
【請求項１４】
以下のジアステレオマー構造で表される請求項１２に記載の化合物。
【化１５】
2004516258.tif 000039
【請求項１５】
以下のジアステレオマー構造で表される請求項２に記載の化合物。
【化１６】
2004516258.tif 000040
【請求項１６】
以下のジアステレオマー構造で表される請求項１５に記載の化合物。
【化１７】
2004516258.tif 000041
【請求項１７】
以下のジアステレオマー構造で表される請求項１５に記載の化合物。
【化１８】
2004516258.tif 000042
【請求項１８】
以下のジアステレオマー構造で表される請求項２に記載の化合物。
【化１９】
2004516258.tif 000043
【請求項１９】
所定の濃度のチオコラリン、ＢＥ−２２１７９、または請求項１〜１８のいずれかに記載の化合物を含有する組成物を、癌細胞と接触させるステップを含み、前記濃度は、前記癌細胞に対して細胞毒性となるのに十分な濃度である、癌細胞を殺す方法。
【請求項２０】
ビスインターカレーションによって、チオコラリン、ＢＥ−２２１７９、または請求項１〜１８のいずれかに記載の化合物を、デオキシオリゴヌクレオチドまたはデオキシポリヌクレオチドに結合させるステップを含む、チオコラリン、ＢＥ−２２１７９、または請求項１〜１８のいずれかに記載の化合物を、デオキシオリゴヌクレオチドまたはデオキシポリヌクレオチドに結合させる方法。
【請求項２１】
以下の構造：
【化２０】
2004516258.tif 000044
で表される第１の中間体を環化して、以下の構造：
【化２１】
2004516258.tif 000045
で表される改良された中間体を生成するステップを含む、改良された中間体の合成方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、抗腫瘍性抗生物質を有することに関する。より詳細には、本発明は、ＤＮＡビスインターカレーション（ｂｉｓｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｏｎ）および抗腫瘍性抗生物質活性を有する、チオコラリン（ｔｈｉｏｃｏｒａｌｉｎｅ）およびＢＥ−２２１７９の類似体に関する。
【０００２】
［背景］
チオコラリン（１、図１）は、ミクロモノスポラｓｐ．Ｌ−１３−ＡＣＭ２−０９２より単離された効力のある抗腫瘍性抗生物質である（ロメオ（Ｒｏｍｅｏ），Ｆ，ら、Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ． １９９７， ５０， ７３４；ペレス・バズ（Ｐｅｒｅｚ Ｂａｚ）ら、Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ． １９９７， ５０， ７３８；ペレス・バズ，Ｊら、ＰＣＴ国際出願ＷＯ９５２７７３号（１９９５年）；Ｃｈｅｍ． Ａｂｓｔ． １９９５， １２４， １１５５６１）。これは２重の対称性二環式オクタデプシペプチド（ｔｈｅ ｔｗｏ−ｆｏｌｄ ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｂｉｃｙｃｌｉｃ ｏｃｔａｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅｓ）のグループに含まれる最も新しい物質であり、このグループには、抗腫瘍性抗生物質ＢＥ−２２１７９（オカダ（Ｏｋａｄａ），Ｈ．ら、Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ． １９９４， ４７， １２９）（２）、トリオスチンＡ（ｔｒｉｏｓｔｉｎ Ａ）（ショージ（Ｓｈｏｊｉ），Ｊ．ら、Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ． １９６１， １４， ３３５；ショージ，Ｊ．ら、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． １９６５， ３０， ２７７２；オオツカ（Ｏｔｓｕｋａ），Ｈ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９６７， ２３， １５３５；オオツカ，Ｈ．ら、Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ． １９７６， ２９， １０７）（３）、およびエキノマイシン（ｅｃｈｉｎｏｍｙｃｉｎ）（コルバス（Ｃｏｒｂａｚ），Ｒ．ら、Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ １９５７， ４０， １９９；ケラー−シーリアイン（Ｋｅｌｌｅｒ−Ｓｃｈｉｅｒｌｅｉｎ），Ｗ．ら、Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ １９５７， ４０， ２０５；ケラー−シーリアイン，Ｗ．ら、Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ １９５９， ４２， ３０５；マーチン（Ｍａｒｔｉｎ），Ｄ．Ｇ．ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ １９７５， ２８， ３３２；デル（Ｄｅｌｌ），Ａ．ら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９７５， ９７， ２４９７）（４）が含まれ、これらはビスインターカレーションによってＤＮＡと結合する（ウェアリング（Ｗａｒｉｎｇ），Ｍ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ １９７４， ２５２， ６５３；ワング（Ｗａｎｇ），Ａ．Ｈ．−Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８４， ２２５， １１１５；キグリー（Ｑｕｉｇｌｅｙ），Ｇ．Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８４， ２３２， １２５５；ヨシナリ（Ｙｏｓｈｉｎａｒｉ），Ｔ．ら、Ｊｐｎ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９４， ８５， ５５０）。ＢＥ−２２１７９とは異なり、チオコラリンはＤＮＡトポイソメラーゼＩおよびＩＩを阻害しないが、細胞周期の進行およびクローン性（ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を阻害する濃度でＤＮＡポリメラーゼαを阻害する（エルバ（Ｅｒｂａ），Ｅ．ら、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １９９９，８０，９７１；ヨシナリ，Ｔ．ら、Ｊｐｎ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９４， ８５， ５５０）。この物質は二本鎖ＤＮＡをほどくことが分かっており（エルバ，Ｅ．ら、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ １９９９， ８０， ９７１；ヨシナリ，Ｔ．ら、Ｊｐｎ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９４， ８５， ５５０）、トリオスチン、エキノマイシン、ならびにより大型の環式デカデプシペプチド、例えば、サンドラマイシン（ｓａｎｄｒａｍｙｃｉｎ）（図２）（単離：マトソ���（Ｍａｔｓｏｎ），Ｊ．Ａ．ら、Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ． １９８９， ４２， １７６３；全合成：ボーゲル（Ｂｏｇｅｒ），Ｄ．Ｌ．ら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９３， １１５， １１６２４；ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９６， １１８， １６２９；ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９９， ７， ３１５；ボーゲル，Ｄ．Ｌ．らＢｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９８， ６， ８５）、ルゾペプチン（ｌｕｚｏｐｅｐｔｉｎ）類（ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９９， ７， ３１５；ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９８， ６， ８５；単離：コニシ（Ｋｏｎｉｓｈｉ），Ｍ．ら、Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ． １９８１， ３４， １４８；構造および立体化学（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）：アーノルド（Ａｒｎｏｌｄ），Ｅ．ら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９８１， １０３， １２４３；全合成（ルゾペプチンＡ〜Ｃ）：ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９９， １２１， １０９８；ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９９， １２１， １１３７５；ルゾペプチンＥ２：チウフォリニ（Ｃｉｕｆｏｌｉｎｉ），Ｍ．Ａ．ら、Ｊ． Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ． １９９９， ３６， １４０９；チウフォリニ，Ｍ．Ａ．ら、Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ．， Ｉｎｔ． Ｅｄ． ２０００， ３９， ２４９３）、およびキノキサペプチン（ｑｕｉｎｏｘａｐｅｐｔｉｎ）類（単離：リングハム（Ｌｉｎｇｈａｍ），Ｒ．Ｂ．ら、Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ． １９９６， ４９， ２５３；全合成：ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、ジン（Ｊｉｎ），Ｑ． Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ．， Ｉｎｔ． Ｅｄ． １９９９， ３８， ２４２４）と同様にビスインターカレーションによってＤＮＡと結合する。チオコラリンおよびＢＥ−２２１７９に関する初期の研究によってそれらの２次元構造は確立されたが、相対的および絶対的な立体化学については確立されていない（ロメオ，Ｆ．ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９９７， ５０， ７３４；ペレス・バズ，Ｊら、Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ． １９９７， ５０， ７３８；ペレス・バズ，Ｊ．ら、ＰＣＴ国際出願ＷＯ９５２７７３号（１９９５年）；Ｃｈｅｍ． Ａｂｓｔ． １９９５， １２４， １１５５６１；オカダ，Ｈ．ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９９４，４７，１２９）。トリオスチンＡおよびエキノマイシンは、キノキサリン発色団へのアミド結合のα位でＤ型立体構造を有し（Ｄ−Ｓｅｒ）、残りの不斉中心ではＬ型立体構造を有する。サンドラマイシン（ｓａｎｄｒａｍｙｃｉｎ）（単離：マトソン，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９８９，４２，１７６３；全合成：ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９３，１１５，１１６２４；ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９６，１１８，１６２９）およびキノキサペプチン（ｑｕｉｎｏｘａｐｅｐｔｉｎｓ）（単離：リングハム，Ｒ．Ｂ．ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９９６，４９，２５３；全合成：ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．１９９９，３８，２４２４）の同様の中心も、ルゾペプチン（単離：コニシ，Ｍ．ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９８１，３４，１４８；構造および立体化学：アーノルド，Ｅ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８１，１０３，１２４３；全合成（ルゾペプチンＡ〜Ｃ）：ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９９，１２１，１０９８；ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９９，１２１，１１３７５；ルゾペプチンＥ２：チウフォリニ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．１９９９，３６，１４０９；チウフォリニ，Ｍ．Ａ．ら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０００，３９，２４９３）と同様にＤ−Ｓｅｒを含むことが報告されている。さらに、合成類似体３は、すべてＬ型の立体構造を有し、有意なＤＮＡ結合を示さないことが報告されている（キアルデリ（Ｃｉａｒｄｅｌｌｉ），Ｔ．Ｌら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９７８， １００， ７６８４）。
【０００３】
チオコラリンおよびＢＥ−２２１７９の全合成が必要とされている。これらの化合物の相対的および絶対的立体化学の確立（ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２０００， １２２， ２９５６）、ならびにそれらの活性の特性決定が必要とされている。類似体の設計および調製が必要とされている。
【０００４】
［要約］
チオコラリンおよびＢＥ−２２１７９（２つのペンダント３−ヒドロキシキノリン発色団を有するＣ２対称性二環式オクタデプシペプチド）の全合成の完全な詳細について説明し、それらの相対的および絶対的な立体化学の確立を行う。本発明の方法の重要な点としては、遅い段階における発色団の導入、対称性テトラペプチドのカップリング、ジスルフィド形成後に１つの第２級アミド部位で実施される２６員オクタデプシペプチドの大環化、および、実質的にラセミ化が起こらない条件下での最終カップリング反応における不安定なチオールエステル結合の導入をともなうテトラデプシペプチドの集合反応（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ ａｓｓｅｍｂｌａｇｅ）が挙げられる。合成における問題が生じるにもかかわらず、発色団を遅い段階で導入することで、本発明の方法により、ある範囲の主要発色団類似体を容易に合成することができる。チオコラリンおよびＢＥ−２２１７９は、エキノマイシンと同様に高親和性ビスインターカレーションでＤＮＡと結合するが、検出可能な配列選択性はほとんどまたは全く存在しないことが示された。１および２の両方は、エキノマイシンに匹敵する非常に大きな細胞毒性活性（Ｌ１２１０細胞系でそれぞれＩＣ５０＝２００ｐＭおよび４００ｐＭ）を示すことが分かり、ルゾペプチン発色団を有する類似体の１つは強力な細胞毒性剤であることも分かった。
【０００５】
本発明の態様の１つは、次の構造で表される化合物に関する。
【化２２】
2004516258.tif 000003
上記構造において、Ｘ１およびＸ２は、＝ＣＨ２または−ＣＨ２ＳＭｅのいずれでもよく、Ｒ１およびＲ２は、水素、Ｃｂｚ、ＦＭＯＣ、および次の構造で表される基から選択される。
【化２３】
2004516258.tif 000004
上記構造において、Ｙは、ＣおよびＮのいずれでもよく、Ｒ３は、存在しないか、または−Ｏ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）であり、Ｒ４は、水素またはヒドロキシル基のいずれかである。ただし、以下の条件が付く。すなわち、Ｘ１が＝ＣＨ２である場合、「ａ」は二重結合を表し、Ｒ１およびＲ２はいずれも水素ではなく；Ｘ１が−ＣＨ２ＳＭｅである場合、「ａ」は単結合を表し；Ｘ２が＝ＣＨ２である場合、「ｂ」が二重結合であり、Ｒ１およびＲ２はいずれも水素ではなく；Ｘ１が−ＣＨ２ＳＭｅである場合、「ｂ」は単結合を表し；Ｒ３が存在しない場合、ＹがＮであるか、またはＲ４が水素である。本発明のこの態様の好ましい実施形態は、以下のジアステレオマー構造で表される。
【化２４】
2004516258.tif 000005
【０００６】
本発明のこの態様の例（亜属）は、以下のジアステレオマー構造で表される。
【化２５】
2004516258.tif 000006
この例の好ましい具体例（種）は、以下のジアステレオマー構造で表される。
【化２６】
2004516258.tif 000007
および
【化２７】
2004516258.tif 000008
【０００７】
本発明のこの態様の第２の例（亜属）は、以下のジアステレオマー構造で表される。
【化２８】
2004516258.tif 000009
この第２の例の好ましい具体例（種）は、以下のジアステレオマー構造で表される。
【化２９】
2004516258.tif 000010
および
【化３０】
2004516258.tif 000011
【０００８】
本発明のこの態様の第３の例（亜属）は、以下のジアステレオマー構造で表される。
【化３１】
2004516258.tif 000012
この第３の例の好ましい具体例（種）は、以下のジアステレオマー構造で表される。
【化３２】
2004516258.tif 000013
および
【化３３】
2004516258.tif 000014
【０００９】
本発明のこの態様の第４の例（亜属）は、以下のジアステレオマー構造で表される。
【化３４】
2004516258.tif 000015
この第４の例の好ましい具体例（種）は、以下のジアステレオマー構造で表される。
【化３５】
2004516258.tif 000016
および
【化３６】
2004516258.tif 000017
【００１０】
本発明のこの態様の第５の例（亜属）は、以下のジアステレオマー構造で表される。
【化３７】
2004516258.tif 000018
この第５の例の好ましい具体例（種）は、以下のジアステレオマー構造で表される。
【化３８】
2004516258.tif 000019
および
【化３９】
2004516258.tif 000020
本発明のこの態様のさらに好ましい具体例（種）は、以下のジアステレオマー構造で表される。
【化４０】
2004516258.tif 000021
【００１１】
本発明のもう１つの態様は、癌細胞を殺す方法に関する。この方法は、所定の濃度のチオコラリン、ＢＥ−２２１７９、または前述のチオコラリン、ＢＥ−２２１７９の任意の類似体を含有する組成物を、前記癌細胞と接触させるステップを含み、前記濃度は、前記癌細胞に対して細胞毒性となるのに十分な濃度である。
【００１２】
本発明の別の態様は、チオコラリン、ＢＥ−２２１７９、または前述のチオコラリン、ＢＥ−２２１７９の任意の類似体を、デオキシオリゴヌクレオチドまたはデオキシポリヌクレオチドに結合させる方法に関する。この方法は、ビスインターカレーションによって、チオコラリン、ＢＥ−２２１７９、または前述のチオコラリン、ＢＥ−２２１７９の任意の類似体を、このようなデオキシオリゴヌクレオチドまたはこのようなデオキシポリヌクレオチドに結合させるステップを含む。
【００１３】
本発明の別の態様は、改良された中間体の合成方法に関する。この方法は、以下の構造：
【化４１】
2004516258.tif 000022
で表される第１の中間体を環化して、以下の構造：
【化４２】
2004516258.tif 000023
で表される改良された中間体を生成するステップを含む。
【００１４】
［詳細な説明］
本発明の方法の重要な要素としては、遅い段階における発色団の導入、対称性テトラペプチドのカップリング、ジスルフィド形成後に１つの第２級アミド部位で実施される２６員オクタデプシペプチドの大環化、および実質的にラセミ化が起こらない条件下での最終カップリング反応における不安定なチオールエステル結合の導入をともなうテトラデプシペプチドの集合反応が挙げられる。大環式チオールエステルの開裂を伴う分子内Ｓ−Ｎアシル転移が起こる可能性があるため、大環式合成における問題が生じるにもかかわらず、発色団を遅い段階で導入することで、本発明の方法により、ある範囲の主要発色団類似体を容易に合成することができる。
【００１５】
〔テトラデプシペプチド合成〕
１に見られる３つの好適な官能化Ｃｙｓ残基の調製をともなう、トリペプチド１５およびＮ−Ｃｂｚ−Ｄ−Ｃｙｓ−ＯＴｃｅ（１１）から主要テトラデプシペプチド１６の集合反応を図３にまとめる。Ｎ−Ｍｅ−Ｃｙｓ−ＯＨ（５）（ブロンドー（Ｂｌｏｎｄｅａｕ），Ｐ．ら、Ｃａｎ． Ｊ． Ｃｈｅｍ． １９６７， ４５， ４９）をアセトアミドメチル（Ａｃｍ）基（１．５当量のＮ−ヒドロキシメチルアセトアミド、Ｈ２ＳＯ４）とＢＯＣ基（ＢＯＣ２Ｏ、６２％）とで連続的にＳ保護およびＮ保護することによって、架橋ジスルフィドＣｙｓ残基の前駆物質６を得た。Ｎ−Ｍｅ−Ｃｙｓ−ＯＨ（５）（ブロンドー，Ｐ．ら、Ｃａｎ． Ｊ． Ｃｈｅｍ． １９６７， ４５， ４９）の選択的Ｓ−メチル化（Ｍｅｌ、ＮａＨＣＯ３）の後、ＢＯＣ保護（ＢＯＣ２Ｏ、ＮａＯＨ、７３％）を行うことで７を得た。７のエステル化（ＴＭＳＣＨＮ２、８９％）の後に、８のＢＯＣの脱保護（３ＭのＨＣｌ−ＥｔＯＡｃ、９１％）を行って、第２の官能化Ｌ−Ｃｙｓ残基の前駆物質である９を得た。別の方法では、塩基性条件での７のエステル化（Ｍｅｌ、ＮａＨＣＯ３、ＤＭＦ）、または８または９の第３級アミンへの曝露（Ｅｔ３Ｎ、ＣＨ２Ｃｌ２）によって、大規模なＭｅＳＨのβ脱離が起こってジヒドロアミノ酸が得られる場合もある。Ｄ−Ｃｙｓ残基を有する発色団を構成する化合物１１は、そのジスルフィド前駆物質１０の還元（Ｐｈ３Ｐ、２−メルカプトエタノール、９９％）の還元によって調製し、この前駆物質はＤ−シスチンをＣｂｚ（ＣｂｚＣｌ、ＮａＨＣＯ３）およびＴｃｅ｛トリクロロエタノール、ＤＣＣ、（ＤＣＣ＝ジシクロヘキシルカルボジイミド；ＥＤＣｌ＝１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩；ＨＯＢｔ＝１−ヒドロキシベンゾトリアゾール；ＨＯＡｔ＝１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール）ＨＯＢｔ、７６％｝で段階的に保護することによって調製した。トリクロロエタノールによるエステル化反応は、ラセミ化に対して敏感であることが分かっており、ＨＯＢｔ（３３％ｄｅ対１００％ｄｅ）の非存在下またはＤＭＡＰ（３３％ｄｅ）の存在下で、広範囲のラセミ化が起こった。６と９のカップリング（ＥＤＣｌ、ＨＯＡｔ、７８％）によって１２が得られ、ＨＯＡｔに対してＨＯＢｔの方がわずかに転化率が低かった。１２のＢＯＣの脱保護（３ＭのＨＣｌ−ＥｔＯＡｃ、１００％）を行い、Ｎ−ＢＯＣ−Ｇｌｙ−ＯＨとカップリングさせ（ＥＤＣｌ、ＨＯＡｔ、６８％）、１４のメチルエステルの加水分解（ＬｉＯＨ、１００％）を行うことによって１５を得た。
【００１６】
Ｄ−システイン誘導体１１とトリペプチド１５を結合させる主要チオールエステル化反応を、ＥＤＣｌ−ＨＯＡｔ（８３％）を使用し塩基を加えずに実質的にラセミ化が起こらない条件で実施して、デプシペプチド１６（ｄｅ９５：５）を得た。ＤＰＰＡ（ＤＰＰＡ＝ジフェニルホスホラジデート；ＤＥＰＣ＝ジエチルホスホロシアニデート；ヤマダ（Ｙａｍａｄａ），Ｓ．ら、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． １９７４， ３９， ３３０２；ヨコヤマ（Ｙｏｋｏｙａｍａ），Ｙ．ら、Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． １９７７， ２５， ２４２３）またはＤＥＰＣとＥｔ２Ｎを使用すると転化率ははるかに低くなったが、その理由の一部は競合的な塩基触媒によるジスルフィド１０の生成によるものである。前述の報告（ＤＰＰＡ＝ジフェニルホスホラジデート；ＤＥＰＣ＝ジエチルホスホロシアニデート；ヤマダ，Ｓ．ら、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． １９７４， ３９， ３３０２；ヨコヤマ，Ｙ．ら、Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． １９７７， ２５， ２４２３）と同様の方法で、非極性溶媒ＣＨ２Ｃｌ２を使用する場合に、実質的に完全なラセミ化（１６：ｅｐｉ−１６＝５８：４２）が観察された。さらに、チオールエステル１６の生成後のすべての反応に塩基を使用すると、チオールエステルの競合的なβ脱離または直接的な開裂が起こることが分かったので、これを避ける必要があった。
【００１７】
〔環状オクタデプシペプチドの生成、ならびにチオコラリンおよびＢＥ−２２１７９の全合成の完了〕
１６のアミン（３ＭのＨＣｌ−ＥｔＯＡｃ、１００％）およびカルボン酸（Ｚｎ、ＡｃＯＨの９０％水溶液、９９％）の脱保護によってそれぞれ１７および１８を生成し、塩基を加えずにこれらをカップリングさせて（ＥＤＣｌ、ＨＯＡｔ、ＣＨ２Ｃｌ２、８３％）第２級アミドを生成することによって１９を得ることで、線状オクタデプシペプチドを生成した（図４）。１つの第２級アミド部位で環を閉じる１９の環化による２６員環オクタデプシペプチド２３の生成は、Ｔｃｅエステルの脱保護（Ｚｎ，ＡｃＯＨの９０％水溶液）、ジスルフィド結合形成（カンバー（Ｋａｍｂｅｒ），Ｂ．ら、Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ １９８０， ６３， ８９９）（Ｉ２，ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ、２５℃、０．００１Ｍ、２段階で５３％）、およびＢＯＣの脱保護（３ＭのＨＣｌ−ジオキサン）を連続して行った後、ＥＤＣｌ−ＨＯＡｔ（０．００１ＭのＣＨ２Ｃｌ２、−２０℃、６時間、２段階で６１％）で処理することで実施した。この４段階のＮ−ＢＯＣの脱保護とジスフルフィド形成段階を逆にすると、転化率が低下した（全４段階で１３％）。現在までのところ、閉環の後にジスルフィド結合形成を実施するすべての試みは成功していない。ジスルフィド結合によって束縛されない２６員環の大環化反応は例外的にうまく進行するが（＞５０％）、２６員環の境界内部での後のジスルフィド結合形成（Ｉ２，ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ、２５℃）はうまくいかなかった。したがって、２３の生成を含む段階のこの順序は、制約されたジスルフィドにより大環化を改良するためではなく、ジスルフィド結合形成を可能にするためであった。ジスルフィドを不安定化させる大環状構造内部の制約によってもこのことが可能であるが、３および４で同様のことが観察されないことから、２６員大環状構造内部の遊離架橋チオールにより隣接するチオールエステルの競合的分子内開裂が起こることによって問題が生じると考えられる。
【００１８】
穏やかな条件によるＣｂｚ保護基の除去（キソ（Ｋｉｓｏ），Ｙ．ら、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ． １９８０， １０１）（ＴＦＡ−チオアニソール、２５℃、４時間）を行い、得られるアミン２４を３−ヒドロキシキノリン−２−カルボン酸〔２５｛３−ヒドロキシキノリン−２−カルボン酸メチル（ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９５，６０，７３６９）をＬｉＯＨ、ＴＨＦ−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（３／１／１）と、２５℃で２時間処理して調製した（７１％）｝、ＥＤＣｌ、ＤＭＡＰ、４３％〕と発色団フェノールを保護せずにカップリングさせると、（−）−１（［α］２５Ｄ−１８０が得られ（ｃ０．１１、ＣＨＣｌ３））［文献１［α］２５Ｄ−１９１（ｃ１．１、ＣＨＣｌ３）］、これは天然物質に報告される性質（ロメロ，Ｆ．ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９９７， ５０， ７３４；ペレス・バズ，Ｊ．ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９９７，５０，７３８；ペレス・バズ，Ｊ．らＰＣＴ国際出願ＷＯ９５２７７３号（１９９５年）；Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔ．１９９５，１２４，１１５５６１）とすべての点で同じであった。これらの条件下では、問題となる遊離アミンの分子内Ｓ−Ｎアシル転移とこれに伴うチオールエステルの開裂が最小限になった。１をＮａＩＯ４で処理すると、ジアステレオマー混合物として対応するビススルホキシドが得られ、これをＣＨ２Ｃｌ２中で加熱すると（還流、６時間、全体で６６％）脱離が促進され、（−）−ＢＥ−２２１７９（２）が得られ（［α］２５Ｄ−８９（ｃ０．０１、ＣＨＣｌ３））［文献（オカダ，Ｈ．ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９９４，４７，１２９）［α］２５Ｄ−９４（ｃ０．４４、ＣＨＣｌ３）］、これは天然物質に関して報告される性質（オカダ，Ｈ．ら、Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ． １９９４， ４７， １２９）とすべての点で同じであった。合成および天然の１および２の関連性から、二次元構造の帰属が確認され、図４に示されるようにこれらの相対的および絶対的立体構造が確立された。
【００１９】
興味深いことに、２３とチオコラリン（１）の両方、ならびに関連する天然生成物類似体２６〜２８は、十分明確なスペクトルの１Ｈ  ＮＭＲによって観察される１つの立体配座に適合する。合成された１のスペクトルは、天然の１の公開された１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（ロメオ，Ｆ．ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９９７， ５０， ７３４；ペレス・バズ，Ｊ．ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９９７，５０，７３８；ペレス・バズ，Ｊ．ら、ＰＣＴ国際出願ＷＯ９５２７７３号（１９９５年）；Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔ．１９９５，１２４，１１５５６１）と同一であることが分かった。対照的に、ＢＥ−２２１７９はより複雑であるが十分に明確な１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが得られ、これは２つの非対称または４つの対称の立体配座がほぼ等しい比率で存在することと整合性がある。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルでは、ＮＭｅシグナル（２ＮＭｅ）と２つのオレフィンシグナル（Ｃ＝ＣＨＨ）がほぼ１：１で８つのよく分離したシグナルとして現れる。重要なことは、合成した２の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが、天然の２の公開された１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（Ｏｋａｄａ，Ｈ．ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９９４，４７，１２９）と同一であることが分かったことである。
【００２０】
〔別の方法〕
成功している順序を実施する前に、２３（図５）についてＦＭＯＣ保護基とＣｂｚ保護基に対する塩基性脱保護条件とを使用する予備的研究を最初に実施した。したがって、１６および１９の合成で説明した手順によって、テトラデプシペプチド３０およびオクタデプシペプチド３１を調製した。架橋した２６員環オクタデプシペプチド３２を得るための３１の環化は、Ｔｃｅエステルの脱保護（Ｚｎ，ＡｃＯＨの９０％水溶液）、ＢＯＣの脱保護（３ＭのＨＣｌ−ジオキサン）、およびジスルフィド結合形成（Ｉ２，ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ、２５℃、０．００１Ｍ）を順次実施した後、ＥＤＣｌ−ＨＯＡｔ（０．００１ＭのＣＨ２Ｃｌ２、−２０℃、６時間、４段階で１６％）で処理することで実施した。しかし、３２をＥｔ２ＮＨまたはピペリジンに曝露すると、ＦＭＯＣの十分な脱保護が起こる代わりに大環状構造の分解が起こった。別の方法として、ジシクロヘキシルアミン、Ｅｔ３Ｎ、またはＤＭＡＰを含む他のアミンで３２を処理しても、環状アミン２４が生成しないが、これは、チオールエステルの求核体に対する感受性、Ｃｙｓ残基のα位の脱保護によって誘導される競合的β脱離、およびチオールエステルの解離を伴う遊離アミンへの分子内Ｓ−Ｎアシル転移の可能性が原因である。しかし、１を直接得るためのインサイチューの遊離アミンの捕捉（２５、ＥＤＣｌ、ＤＭＡＰ）または２４の誘導体の保護（ＢＯＣ２ＯまたはＣｂｚＣｌ、Ｅｔ３Ｎ）の試みも成功しなかった。
【００２１】
両方の第２級アミドを同時に生成することにより架橋２６員大環状構造を形成する方法も試みた。しかし、分子間ジスルフィド結合形成（Ｉ２、ＭｅＯＨ）、さらにＴｃｅ基およびＢＯＣ基の連続的脱保護と、得られる対称ジスルフィドのＥＤＣｌおよびＨＯＡｔによる処理によって、ある範囲のオリゴマーとより高次の大環状構造を含む生成物の複雑な混合物が得られ、３２の生成は観察されなかった（図５）。
【００２２】
最後に、合成の初期段階でペンダント発色団を導入する方法も調べてみた。例えば、１５と３４のカップリング反応（ＥＤＣｌ、ＨＯＡｔ、８６％）によって、置換キノリン発色団を有するテトラデプシペプチド３５を得た（図６）。しかし、チオールエステルの脱離は、ＢＯＣの脱保護（ＨＣｌまたはＴＦＡの９０％水溶液、０℃）またはＴｃｅエステルの加水分解（Ｚｎ、ＨＯＡｃの９０％水溶液、０℃）、および微量の所望の線状オクタデプシペプチドしか得られなかった後のカップリング反応の条件では問題が生じた。おそらくこれは、アミドを有する活性化Ｎ−アシル−Ｄ−Ｃｙｓ誘導体のαプロトンの酸性度がカルバメート保護基に対して増加することが原因であると思われる。
【００２３】
〔類似体の合成〕
遅い段階でアミン２４を生成した後、ペンダント発色団を導入することによって、１および２の発色団類似体について調べる機会が得られた。したがって、アミン２４を、キノリン−２−カルボン酸、キノキサリン−２−カルボン酸（これはエキノマイシンおよびトリオスチンＡに見られる発色団である）、および３−ヒドロキシ−６−メトキシキノリン−２−カルボン酸（単離：コニシ，Ｍ．ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９８１，３４，１４８；構造および立体化学：アーノルド，Ｅ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８１，１０３，１２４３；全合成（ルゾペプチンＡ〜Ｃ）：ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９９，１２１，１０９８；ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９９，１２１，１１３７５；ルゾペプチンＥ２：チウフォリニ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．１９９９，３６，１４０９．；チウフォリニ，Ｍ．Ａ．ら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０００，３９，２４９３；ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９５，６０，７３６９）（これはルゾペプチンに見られる発色団である）とカップリングさせて主要発色団類似体２６〜２８も生成した（図４）。対応する２の類似体は、１を酸化して２を生成する図４に示される方法と同様の方法で２６〜２８を酸化することによって得ることができる。
【００２４】
〔ＤＮＡ結合親和性〕
見かけの絶対結合定数および見かけの結合部位の大きさを、子ウシ胸腺（ＣＴ）ＤＮＡを使用した１および２の滴定における蛍光消光測定によって求めた。チオコラリンとＢＥ−２２１７９の励起スペクトルと発光スペクトルを、水性緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、７５ｍＭのＮａＣｌ）中で測定した。同じ発色団を有するチオコラリンとＢＥ−２２１７９はともに、励起（３８０ｎｍ）および発光（５１０ｎｍ）で最大となる強い蛍光を溶液中で示し、ＤＮＡが結合することによって消光した。さらに、この蛍光の強度のため、蛍光消光測定が非常に容易になり、化合物が溶解性である場合には１〜１０μＭの低い初期試料濃度で測定が可能となった。エキノマイシンに関する同様の測定は、蛍光発光強度が低く溶解性が低いために実施不可能であった。滴定を行う場合、少量のＣＴ−ＤＮＡ（塩基対で３２０μＭ）を、試料（２μＭ）のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）（７５ｍＭのＮａＣｌ緩衝液）溶液２ｍＬに加えた。１５分間隔で添加を行って、結合を平衡させた。式ｒｂ／ｃ＝Ｋｎ−Ｋｒｂ（式中、ｒｂはＤＮＡヌクレオチドリン酸１つ当たりに結合する分子数であり、ｃは遊離薬物濃度であり、Ｋはみかけの結合定数であり、ｎはヌクレオチドリン酸１つ当たりの薬物の結合部位数である）を使用して、滴定結果のスキャッチャード分析（スキャッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ），Ｇ．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９４９，５１，６６０）を実施した。ｒｂ／ｃ対ｒｂのプロットより、薬物の会合定数（傾き）および見かけの結合部位の大きさ（ｘ切片）が求められる（図７および図８）。
【００２５】
チオコラリンは、二重鎖ＤＮＡに対して比較的高い親和性（ＫＢ＝２．６×１０６Ｍ−１）を示し、薬物と塩基対の比率が１：６．５の時に高い結合親和性で化学量論的に飽和した。ＢＥ−２２１７９（構造的に独立した２つの環外オレフィンを有する）も、ＣＴ−ＤＮＡに対して同様の親和性と結合部位の大きさが得られた。２つの塩基対に及ぶビスインターカレーションを仮定すると、５．８〜６．５塩基対当たりに１つの分子が結合する高い親和性は、４塩基対の飽和限界に近づき、チオコラリンとＢＥ−２２１７９は結合可能な部位で制限された選択性でＤＮＡと結合すると思われる。このことは、サンドラマイシン（単離：マトソン，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９８９，４２，１７６３；全合成：ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９３，１１５，１１６２４；ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９６，１１８，１６２９）およびエキノマイシンに適用した方法を使用して、ｗ７９４  ＤＮＡ（ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９１，４７，２６６１）に対するＤＮアーゼＩ（ＤＮａｓｅ Ｉ）によるＤＮＡ結合の選択性（ガラス（Ｇａｌａｓ），Ｄ．Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９７８，５，３１５７）およびＭＴＥフットプリント（Ｔｕｌｌｉｕｓ，Ｔ．Ｄ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７，１５５，５３７）を確立する試みと整合性があり、１に対する識別可能な選択性は得られなかった（図９および１０）。より大型で対称な環状デカデプシペプチドであるサンドラマイシン、ルゾペプチン、およびキノキサペプチンに関する従来の研究では、これらがＣＴ−ＤＮＡに対してより高い親和性を示すことが分かっている（ＫＢ＝１．０〜３．４×１０７Ｍ−１）。チオコラリンとＢＥ−２２１７９はサンドラマイシン（ＫＢ＝３．４×１０７Ｍ−１）と同じ発色団を有するので、二重鎖ＤＮＡへの結合能力の差は、環状デプシペプチド、その環の大きさ、および異なるペプチド主鎖に起因し、発色団の構造には起因しないことを示している。
【００２６】
同様に、エキノマイシンとトリオスチンＡは、ビスインターカレーションによってＤＮＡと結合し、これらの種類の中では最も広範囲に研究された天然生成物である。５’−ＰｙＰｕＰｙＰｕ部位と結合し、２つの塩基対５’−ＡＴ部位にわたる５’−ＣＡＴＧに対して最も高い親和性を示すサンドラマイシンおよびルゾペプチン（ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９９，７，３１５；ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９８，６，８５；単離：コニシ，Ｍ．ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９８１，３４，１４８；構造および立体化学：アーノルド，Ｅ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８１，１０３，１２４３；全合成（ルゾペプチンＡ〜Ｃ）：ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９９，１２１，１０９８；ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９９，１２１，１１３７５；ルゾペプチンＥ２：チウフォリニ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．１９９９，３６，１４０９；チウフォリニ，Ｍ．Ａ．ら、Ａｎｇｅｗ，Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０００，３９，２４９３）とは対照的に、キノキサリンは５’−ＣＧ部位、例えば５’−ＧＣＧＴまたは５’−ＰｕＰｙＰｕＰｙで優先的にビスインターカレーションが起こり、各インターカレーションを有する２つにわたる塩基対は、ＰｕＰｙとＰｙＰｕのステップで起こる。１および２とトリオスチンＡ（３）の間の構造的相違はわずかである。発色団の違い以上に、これらは保存性側鎖ＣＨ２ＳＣＨ３とＮＭｅ−ＶａｌＣＨ（Ｍｅ）２の違いを含み、より顕著にはＧｌｙとＬ−Ａｌａ（Ｈ対Ｍｅ）の置換を含み、チオエステルとエステル（Ｓ対Ｏ）の主鎖の違いを含む。それにもかかわらず、これらの変化は後述のようにＤＮＡ結合選択性をなくし、ビスインターカレーション錯体の安定性を低下させうる。
【００２７】
〔二官能性インターカレーション〕
チオコラリンとＢＥ−２２１７９がビスインターカレーションによってＤＮＡと結合することが、負のスーパーコイルＤＮＡの巻き戻しを誘導するそれらの能力から確認された。これは、濃度増加にともなってスーパーコイル構造のφＸ１７４  ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動移動度が徐々に減少し（巻き戻し（ｕｎｗｉｎｄ））、その後さらに高濃度で正常な移動度（再巻き取り（ｒｅｗｉｎｄ））する能力によって測定した。使用される条件下では、エキノマイシンの場合、０．０４４の薬物／塩基対比でφＸ１７４  ＤＮＡの巻き戻しが起こった（図１１および図１２）。チオコラリンはより高い０．１１の薬物／塩基対比でφＸ１７４  ＤＮＡの完全な巻き戻しが起こったが、ＢＥ−２２１７９は巻き戻しが生じるためには１．１の薬物／塩基対比より高濃度が必要であった。スーパーコイルＤＮＡの完全な再巻き取りは薬物／塩基対比がチオコラリンの場合０．４４、エキノマイシンの場合０．２２で起こったが、ＢＥ−２２１７９は測定した濃度ではφＸ１７４ＤＮＡの再巻き取りは起こらなかった。エキノマイシンのキノキサリン発色団を有するチオコラリン類似体２７は、チオコラリン自体と同様の挙動を示すことが分かった。したがって、この場合観察された１および２とエキノマイシンの相違は、環状デプシペプチドの性質と関係しており、発色団の構造とは関係していないと思われる。これらの条件下ではモノインターカレーターである臭化エチジウムはスーパーコイルＤＮＡを巻き戻さないが、電気泳動中にこの結合物質の分離が防止される条件下ではスーパーコイルＤＮＡを巻き戻すことができる。したがって、ビスインターカレーションを示すチオコラリンおよび２７による負のスーパーコイルＤＮＡの巻き戻しとその後の正のスーパーコイルＤＮＡの形成とは類似しているが、エキノマイシンよりもわずかに有効性が低く、ＢＥ−２２１７９の場合には実質的に有効性が低い。このことより、エキノマイシンおよびチオコラリンと比較すると、ＢＥ−２２１７９は、小さな巻き戻し角、低い安定性、または速い分離速度で結合すると考えられる。
【００２８】
１または２が、ＤＮＡを開裂、アルキル化、または架橋する能力についても試験した。特に、ＢＥ−２２１７９に見られる求電子性不飽和は、ＤＮＡへの共有結合、特に後のビスインターカレーション結合のためのアルキル化部位として機能すると推測できる。ある範囲の条件でスーパーコイルφＸ１７４  ＤＮＡ（形態Ｉ）から緩和（形態ＩＩ）または線状（形態ＩＩＩ）のＤＮＡへの変化を監視する単純な分析で、１または２のいずれかがＤＮＡを開裂させることを示す形跡は見られなかった。同様に、アデニンＮ３またはＮ７、あるいはグアニンＮ３またはＮ７アルキル化部位の熱的な脱プリンおよび開裂を利用するｗ７９４  ＤＮＡの配列の開裂の実験では、２によるアルキル化は見られなかった。しかし、これらの実験は、熱的に不安定でない部位（例えばグアニンＣ２アミン）のアルキル化を排除していない。確立されたプロトコル（ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９１，４７，２６６１）に従ってｗ７９４  ＤＮＡについて別の分析を行うと、ＤＮＡ２本鎖の間の架橋を示す形跡はなかった。これらの実験は、熱的に不安定なおよび熱的に不安定でないアルキル化部位の両方を検出するが、検出は２本鎖の間の架橋と関与する部位のみである。２がＣ２対称性を有することから、エキノマイシンおよびトリオスチンＡと同様のビスインターカレーションでは、二重鎖ＤＮＡの相補鎖とのみ反応する（ＤＮＡ間の架橋）位置に２つの求電子性部位が配置され、ＤＮＡ内架橋は除外される。したがって、これらの実験では、熱的に不安定でない部位（例えば、Ｇ  Ｃ２アミン）の反応を含めた２によるＤＮＡ架橋は安全に排除されるが、熱的に不安定でない部位におけるモノアルキル化は除外されない。
【００２９】
〔ＤＮＡ結合選択性〕
前述の研究では、チオコラリンは高い親和性でＤＮＡと結合するが、選択性はほとんどまたは全くないことが示されている。そのため、関連するビスインターカレーターのエキノマイシン（５’−ＰｕＣＧＰｙ）（コルバス，Ｒ．ら、Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ １９５７， ４０， １９９；ケラー−シーリアイン，Ｗ．ら、Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ １９５７， ４０， ２０５；ケラー−シーリアイン，Ｗ．ら、Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ １９５９， ４２， ３０５；マーチン，Ｄ．Ｇ．ら、Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ． １９７５， ２８， ３３２；デル，Ａ．ら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９７５， ９７， ２４９７）、サンドラマイシン（５’−ＣＡＴＧ）（ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９９， ７， ３１５；ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９８， ６， ８５）、およびルゾペプチン（５’−ＣＡＴＧ）（単離：コニシ，Ｍ．ら、Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ． １９８１， ３４， １４８；構造および立体化学：アーノルド，Ｅ．ら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９８１， １０３， １２４３；全合成（ルゾペプチンＡ〜Ｃ）：ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９９， １２１， １０９８；ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９９， １２１， １１３７５；ルゾペプチンＥ２：チウフォリニ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ． Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ． １９９９， ３６， １４０９；チウフォリニ，Ｍ．Ａ．ら、Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ．， Ｉｎｔ． Ｅｄ． ２０００， ３９， ２４９３）の高親和性インターカレーション部位を含む４つの２重デオキシオリゴヌクレオチド５’−ＧＣＸＸＧＣ−３’（式中、ＸＸ＝ＴＡ、ＡＴ、ＧＣ、ＣＧ）の組を使用して、１の結合について調べた。ＤＮＡ結合時に観察される蛍光消光を使用した滴定によって結合定数を求めた。チオコラリンおよびＢＥ−２２１７９の励起スペクトルおよび発光スペクトルは、水性緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、７５ｍＭのＮａＣｌ）中で記録した。溶解または光退色による蛍光の減少を最小限にするために、読み取りに必要な励起ビームへの露出を最小限にして、溶液を４ｍＬキュベットに入れて暗黒中で撹拌した。滴定は、各デオキシオリゴヌクレオチドを加えてから１５分間の平衡時間をかけて実施した。デオキシオリゴヌクレオチドに結合するチオコラリンのスキャッチャードプロットによると下に凸の曲線が得られ、本明細書ではこの結果は、高親和性ビスインターカレーションとモノインターカレーションを含みうるより低い親和性の結合を示すものと見なされる。１つのリガンドが２つの結合部位を有すると仮定するフェルドマン（フェルドマン（Ｆｅｌｄｍａｎ），Ｈ．Ａ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７２，４８，３１７）に記載されるモデルを使用すると、この曲線は以下の式にしたがってデコンボリューション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅ）される。
【００３０】
【式１】
2004516258.tif 000024
【００３１】
（式中、Ｋ１およびＫ２は、高親和性および低親和性の場合の会合定数を表しており、ｎ１およびｎ２は、独立した結合現象において二重鎖１つ当たりに結合する薬物の数を表している）このデータのスキャッチャードプロットから、それぞれの場合の結合は１：１であることが分かった。この高親和性結合は、中央の２つの塩基対部位の周囲のビスインターカレーションをともなう１つの分子の結合と整合性がある。最も強い結合を示す５’−ＧＣＧＣＧＣおよび５’−ＧＣＣＧＧＣとのＧＣリッチ結合があまり優先されなかったが、４種類のデオキシオリゴヌクレオチドでこれらの差は３〜７×１０６Ｍ−１の小さな範囲である（図１２）。したがって、本明細書のフットプリント法およびその他の関連する研究と同様に、１のデオキシオリゴヌクレオチドとの結合の選択性はほとんどなかった。
【００３２】
〔生物学的性質〕
図１３は、エキノマイシン、チオコラリン、およびＢＥ−２２１７９、ならびに前駆体２３およびそれらの類似体の生物学的性質をまとめている。チオコラリンおよびＢＥ−２２１７９は、Ｌ１２１０アッセイで非常に高い細胞毒性活性（それぞれＩＣ５０＝２００および４００ｐＭ）を示し、エキノマイシンよりわずかに活性が低い。両方の発色団がなくＣｂｚおよびＦＭＯＣ保護基を有する化合物２３および３２は不活性であり、チオコラリンの活性の１０５分の１未満である。ルゾペプチンと同じ発色団を有する類似体２８も強い活性を示したが、キノリンＣ３フェノールのない２６、およびエキノマイシンとトリオスチンＡのキノキサリン発色団を有する２７は、より低い細胞毒性活性を示した。さらに、エキノマイシンと同様にチオコラリンはＨＩＶ−１逆転写酵素の弱い阻害剤にすぎないことが分かった。
【００３３】
これらの観察で最も注目すべきことは、チオコラリンとＢＥ−２２１７９の両方が、非常に強い細胞毒性剤を示し、ナノモル未満すなわち低いピコモル濃度（２００〜４００ｐＭ）でＩＣ５０を示す数少ない化合物の群に属することである。
【００３４】
［実施例］
〔Ｎ−ＢＯＣ−ＮＭｅ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ（６）〕
ＮＭｅ−Ｌ−Ｃｙｓ−ＯＨ塩酸塩（５、１．３５ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）およびアセトアミドメタノール（１３．４ｇ、１５ｍｍｏｌ）を水（５ｍＬ）に溶解した溶液を濃ＨＣｌ（０．６４ｍＬ）で処理し、その反応混合物を２５℃で１２時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮した。残留物を１００ｍＬのＴＨＦ−Ｈ２Ｏ（１：１）に溶解し、得られた溶液に１ＮのＮａＯＨ水溶液を加えてｐＨを８にした。ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（２．６２ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）を加え、ｐＨを８に維持しながら反応混合物を２５℃で１２時間撹拌した。反応混合物を１ＮのＨＣｌ水溶液（１５０ｍＬ）に注ぎ、ＣＨＣｌ３（３×１００ｍＬ）で抽出した。これらの有機相を合わせたものを乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、続いて減圧濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、３×１５ｃｍ、４％ＭｅＯＨ−ＣＨＣｌ３溶離液）によって、白色泡状の６（１．８９ｇ、６．２１ｍｍｏｌ、６２％）を得た。
【００３５】
〔Ｎ−ＢＯＣ−ＮＭｅ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−ＯＨ（７）〕
ＮＭｅ−Ｌ−Ｃｙｓ−ＯＨ塩酸塩（５、１．３５ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）を１００ｍＬのＴＨＦ−Ｈ２Ｏ（１：１）溶解した溶液を、ＮａＨＣＯ３（１．６８ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）、およびＭｅｌ（０．６５ｍＬ、１０．５ｍｍｏｌ）で順次処理し、その反応混合物を２５℃で３時間撹拌した。１ＮのＮａＯＨ水溶液を加えて反応混合物のｐＨを８にした。ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（２．６２ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）を加え、ｐＨを８に維持しながら反応混合物を２５℃で１２時間撹拌した。反応混合物を１ＮのＨＣｌ水溶液（１５０ｍＬ）に注ぎ、ＣＨＣｌ３（３×１００ｍＬ）で抽出した。これらの有機相を合わせたものを乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、続いて減圧濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、３×１５ｃｍ、２％ＭｅＯＨ−ＣＨＣｌ３溶離液）によって、無色油状物質の７（１．８９ｇ、７．６３ｍｍｏｌ、７６％）を得た。
【００３６】
〔Ｎ−ＢＯＣ−ＮＭｅ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−ＯＭｅ（８）〕
トリメチルシリルジアゾメタン（２．０Ｍヘキサン溶液、３．７０ｍＬ、０．７４ｍｍｏｌ）を、７（１．８６ｇ、７．４０ｍｍｏｌ）を１００ｍＬのベンゼン−ＭｅＯＨ（５：１）に溶解した０℃の溶液に滴下した。滴下後、反応混合物を減圧濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、３×１５ｃｍ、２０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン溶離液）によって、無色油状物質の８（１．７７ｇ、６．７３ｍｍｏｌ、９１％）を得た。
【００３７】
〔ＮＭｅ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−ＯＭｅ（９）〕
化合物８（１．３２ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を３ＭのＨＣｌ−ＥｔＯＡｃ５ｍＬで処理して、その混合物を２５℃で３０分間撹拌した後、揮発分を減圧除去した。Ｅｔ２Ｏ（１０ｍＬ）を塩酸塩に加えて残留ＨＣｌを除去した後、これを減圧除去した。その残留物をＣＨＣｌ３（２００ｍＬ）に溶解し、その有機層を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）と飽和ＮａＣｌ水溶液（１００ｍＬ）で洗浄した。その有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、続いて減圧濃縮すると、無色油状物質の９（７４６ｍｇ、９１％）が得られ、これをさらに精製することなく次の反応で直接使用した。
【００３８】
〔（Ｎ−Ｃｂｚ−Ｄ−Ｃｙｓ−ＯＴｃｅ）２（１０）〕
Ｄ−シスチン（５００ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ）とＮａＯＨ（３５２ｍｇ、８．４ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのＴＨＦ−Ｈ２Ｏ（１：１）に溶解した溶液を、ＣｂｚＣｌ（０．６３ｍＬ、４．４ｍｍｏｌ）で処理し、反応混合物をを２５℃で１時間撹拌した。反応混合物を水（５０ｍＬ）で希釈し、ＣＨＣｌ３（３×５０ｍＬ）で抽出した。その水相に６ＮのＨＣｌ水溶液（５０ｍＬ）を加えて酸性化し、ＣＨＣｌ３（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせたものを乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、そして減圧濃縮した。その残留物をピリジン（２０ｍＬ）に溶解し、ＨＯＢｔ（８４０ｍｇ、６．３ｍｍｏｌ）とトリクロロエタノール（０．６９ｍＬ、５．３ｍｍｏｌ）を加えた。その混合物を−２０℃に冷却し、ＤＣＣ（１．２９ｇ、６．３ｍｍｏｌ）で処理して、得られた混合物をＡｒ存在下−２０℃で２４時間撹拌した。ＤＣＵの白色沈殿物をろ過により除去し、ろ液を減圧濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、その有機相を１ＮのＨＣｌ水溶液（１００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）、および飽和ＮａＣｌ水溶液（５０ｍＬ）で洗浄した。その有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、続いて減圧濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、３×１５ｃｍ、２０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン溶離液）によって、無色油状物質の１０（１．２３ｇ、１．６ｍｍｏｌ、７６％）を得た。
【００３９】
〔Ｎ−Ｃｂｚ−Ｄ−Ｃｙｓ−ＯＴｃｅ（１１）〕
１０（７７１ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのＴＨＦに溶解した溶液を、Ｐｈ３Ｐ（２６２ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、２−メルカプトエタノール（７０μＬ、１．０ｍｍｏｌ）、および水（１８０μＬ、１０ｍｍｏｌ）で処理し、その反応混合物を５０℃で５時間撹拌した後、減圧濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、３×１５ｃｍ、２０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン溶離液）によって、無色油状物質の１１（７６４ｍｇ、１．９８ｍｍｏｌ、９９％）を得た。
【００４０】
〔Ｎ−ＢＯＣ−ＮＭｅ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＮＭｅ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−ＯＭｅ（１２）〕
６（１．７５ｇ、５．７４ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（５７ｍＬ）に溶解した溶液を、ＨＯＡｔ（７８１ｍｇ、５．７４ｍｍｏｌ）およびＥＤＣｌ（１．１０ｇ、５．７４ｍｍｏｌ）で順次処理して、その混合物を０℃で１５分間撹拌した。９の溶液（９３５ｍｇ、５．７４ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物をさらに１２時間撹拌した。反応混合物を１ＮのＨＣｌ水溶液（１００ｍＬ）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（２×１００ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせたものを、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ水溶液（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、続いて減圧濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、３×１５ｃｍ、ＥｔＯＡｃ溶離液）によって、白色泡状の１２（２．０１ｇ、４．４６ｍｍｏｌ、７８％）を得た。
【００４１】
〔Ｎ−ＢＯＣ−ＧＩｙ−ＮＭｅ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＮＭｅ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−ＯＭｅ（１４）〕
１２の試料（２．０１ｇ、４．４６ｍｍｏｌ）を３ＭのＨＣｌ−ＥｔＯＡｃ４．５ｍＬで処理し、その混合物を２５℃で３０分間撹拌した後、揮発分を減圧除去した。Ｅｔ２Ｏ（１０ｍＬ）を塩酸塩１３に加えて残留ＨＣｌを除去した後、これを減圧除去した。この手順を３回繰り返した後、１．９６ｇの１３（１００％）が得られ、これをさらに精製することなく次の反応で直接使用した。
【００４２】
Ｎ−ＢＯＣ−Ｇｌｙ−ＯＨ（７７３ｍｇ、４．４６ｍｍｏｌ）と塩酸塩１３（１．９６ｇ、４．４６ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（４５ｍＬ）に溶解した溶液を、ＨＯＡｔ（９０９ｍｇ、６．６９ｍｍｏｌ）、ＥＤＣｌ（１．２６ｇ、６．６９ｍｍｏｌ）、およびＮａＨＣＯ３（５４９ｍｇ、６．６９ｍｍｏｌ）で順次処理し、その反応混合物を０℃で１２時間撹拌した。反応混合物を１ＮのＨＣｌ水溶液（１００ｍＬ）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（２×１００ｍＬ）で抽出した。それらの有機相を合わせたものを、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ水溶液（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、続いて減圧濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、５×１４ｃｍ、２０％アセトン−ＥｔＯＡｃ溶離液）によって、白色泡状の１４（１．５４ｇ、３．０３ｍｍｏｌ、６８％）を得た。
【００４３】
〔Ｎ−ＢＯＣ−Ｇｌｙ−ＮＭｅ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＮＭｅ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−ＯＨ（１５）〕
１４（３９４ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのＴＨＦ−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（３：１：１）に溶解した０℃の溶液に、水酸化リチウム一水和物（９２ｍｇ、２．３１ｍｍｏｌ）を加え、得られた反応混合物を２５℃で１．５時間撹拌した。反応混合物を１ＮのＨＣｌ水溶液（１００ｍＬ）に注ぎ、ＣＨＣｌ３（３×５０ｍＬ）で抽出した。これらの有機相を合わせたものを乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、続いて減圧濃縮すると、白色泡状の１５（３９３ｍｇ、１００％）が得られ、これをさらに精製することなく使用した。
【００４４】
〔Ｎ−Ｃｂｚ−Ｄ−Ｃｙｓ［Ｎ−ＢＯＣ−Ｇｌｙ−ＮＭｅ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＮＭｅ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）］−ＯＴｃｅ（１６）〕
１５（３９３ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（８ｍＬ）に溶解した溶液を、ＨＯＡｔ（１５０ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ）およびＥＤＣｌ（１８３ｍｇ、０．９２ｍｎｏｌ）で順次処理し、その混合物を−２０℃で１５分間撹拌した。１１の溶液（３００ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物をさらに４時間撹拌した。反応混合物を１ＮのＨＣｌ水溶液（１００ｍＬ）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせたものを、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ水溶液（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、続いて減圧濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、３×１５ｃｍ、３３％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン溶離液）によって、白色泡状の１６（５５１ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ、８３％）と、白色泡状のｅｐｉ−１６（２８ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ、４％）を得た。
【００４５】
〔Ｎ−Ｃｂｚ−Ｄ−Ｃｙｓ［Ｎ−Ｃｂｚ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ｎ−ＢＯＣ−Ｇｌｙ−ＮＭｅ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＮＭｅ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｍｅ））−ＧＩｙ−ＮＭｅ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＮＭｅ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）］−ＯＴｃｅ（１９）〕
化合物１６（４３２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を３ＭのＨＣｌ−ＥｔＯＡｃ５．０ｍＬで処理して、その混合物を２５℃で３０分間撹拌した後、揮発分を減圧除去した。Ｅｔ２Ｏ（１０ｍＬ）を塩酸塩１７に加えて残留ＨＣｌを除去した後、これを減圧除去した。この手順を３回繰り返すと、４２９ｍｇの１７（１００％）が得られ、これをさらに精製することなく次の反応で直接使用した。
【００４６】
１６（４３２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をＡｃＯＨの９０％水溶液（１５ｍＬ）に溶解した溶液を、Ｚｎ（１．６２ｇ、２５ｍｍｏｌ）で処理し、得られた懸濁液を０℃で２時間撹拌した。ろ過によって亜鉛を除去し、ろ液を減圧濃縮した。その残留物を１ＮのＨＣｌ水溶液（５０ｍＬ）に注ぎ、ＣＨＣｌ３（３×５０ｍＬ）で抽出した。これらの有機相を合わせたものを乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、続いて減圧濃縮すると、白色泡状の１８（４３０ｍｇ、１００％）が得られ、これをさらに精製することなく次の反応で直接使用した。１７（４２９ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）と１８（４３０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（５．０ｍＬ）に溶解した溶液を、ＨＯＡｔ（９８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）およびＥＤＣｌ（１１９ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）で順次処理し、その反応混合物を０℃で６時間撹拌した。反応混合物を１ＮのＨＣｌ水溶液（５０ｍＬ）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせたものを飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）と飽和ＮａＣｌ水溶液（３０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、続いて減圧濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、３×１５ｃｍ、２０％アセトン−ＥｔＯＡｃ溶離液）によって、白色泡状の１９（６１３ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ、８３％）を得た。
【００４７】
〔Ｎ−Ｃｂｚ−Ｄ−Ｃｙｓ［Ｎ−Ｃｂｚ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ｎ−ＢＯＣ−Ｇｌｙ−ＮＭｅ−Ｌ−Ｃｙｓ−ＮＭｅ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）］−Ｇｌｙ−ＮＭｅ−Ｌ−Ｃｙｓ−ＮＭｅ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）］−ＯＨ（２１）〕
１９（５００ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）をＡｃＯＨの９０％水溶液（１５ｍＬ）に溶解した溶液を、Ｚｎ（１．０８ｇ、１７．０ｍｍｏｌ）で処理し、得られた懸濁液を０℃で２時間撹拌した。ろ過によって亜鉛を除去し、ろ液を減圧濃縮した。その残留物を１ＮのＨＣｌ水溶液（１００ｍＬ）に注ぎ、ＣＨＣｌ３（３×５０ｍＬ）で抽出した。これらの有機相を合わせたものを乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、続いて減圧濃縮した。その残留物をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）と混合したものを、ヨウ素（８６８ｍｇ、３．４ｍｍｏｌ）を３４０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（１０：１）に溶解した溶液に滴下し、その反応混合物を２５℃で２時間撹拌した。反応混合物を氷浴で冷却し、ヨウ素の色がなくなるまで５％Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液を加えた。混合物を１ＮのＨＣｌ（５０ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ水溶液（３０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、続いて減圧濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、３×１６ｃｍ、１０％ＭｅＯＨ−ＣＨＣｌ３溶離液）によって、淡黄色泡状の２１（２０１ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、４９％、通常４９〜５３％）を得た。
【００４８】
〔［Ｎ−Ｃｂｚ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＭｅ−Ｌ−Ｃｙｓ−ＮＭｅ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）］２（システインチオール）ジラクトン（２３）〕
２１の試料（１８０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を３ＭのＨＣｌ−ジオキサン１．５ｍＬで処理し、その混合物を２５℃で３０分間撹拌した後、揮発分を減圧除去した。Ｅｔ２Ｏ（５ｍＬ）を塩酸塩に加えて残留ＨＣｌを除去した後、これを減圧除去した。その残留物をＣＨ２Ｃｌ２（１５０ｍＬ）と混合したものを、ＨＯＡｔ（１２２ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）およびＥＤＣｌ（１４９ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）で順次処理し、反応混合物を０℃で６時間撹拌した。反応混合物を１ＮのＨＣｌ水溶液（５０ｍＬ）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）で抽出した。それらの有機相を合わせたものを、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ水溶液（３０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、続いて減圧濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、４×１５ｃｍ、２５％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン溶離液）によって、白色固体の２３（８４ｍｇ、７７μｍｏｌ、５２％、通常５２〜６１％）を得た。
【００４９】
〔チオコラリン（１）〕
２３の試料（１４．０ｍｇ、１２．９μｍｏｌ）を２ｍＬのＴＦＡ−チオアニソール（１０：１）で処理し、その反応混合物を２５℃で６時間撹拌した後、減圧濃縮した。その残留物を３ＭのＨＣｌ−ＥｔＯＡｃで処理し、揮発分を減圧除去して、塩酸塩を得た。
【００５０】
２５（１１．９ｍｇ、６４．５μｍｏｌ）とＤＭＡＰ（７．７ｍｇ、６４．５μｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）に溶解した溶液を、ＥＤＣｌ（１２．６ｍｇ、６４．５μｍｏｌ）で処理し、その反応混合物を２５℃で３０分間撹拌した。塩酸塩２４を加え、反応混合物を２５℃で３時間撹拌した。その反応混合物を１ＮのＨＣｌ水溶液（５ｍＬ）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（２×５ｍＬ）で抽出した。それらの有機相を合わせたものを、飽和ＮａＣｌ水溶液（３ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、続いて減圧濃縮した。ＰＴＬＣ（ＳｉＯ２、ＣＨＣｌ３：ＥｔＯＡｃ：ＨＯＡｃ＝１０：２０：０．３溶離液）によって、白色固体の１（６．５ｍｇ、５．５μｍｏｌ、４３％）が得られ、これは、信頼できる１に関して公開された１Ｈ  ＮＭＲチャート（ロメオ，Ｆ．ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９９７， ５０， ７３４；ペレス・バズ，Ｊら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９９７，５０，７３８；ペレス・バズ，Ｊ．ら、ＰＣＴ国際出願ＷＯ９５２７７３号（１９９５年）；Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔ．１９９５，１２４，１１５５６１）と同一の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示した。
【００５１】
〔ＢＥ−２２１７９（２）〕
１の試料（１．０ｍｇ、０．８５μｍｏｌ）を３０％アセトン水溶液（４００μＬ）に溶解したものを、ＮａＩＯ４（０．４ｍｇ、８．５μｍｏｌ）で処理し、その反応混合物を２５℃で１２時間撹拌した後、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３を加えて反応を停止させた。混合物を減圧濃縮して、その残留物をＥｔＯＡｃ（２×２ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせたものを、飽和ＮａＣｌ水溶液（３ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、続いて減圧濃縮して、粗スルホキシドを得た。この粗スルホキシドをＣＨ２Ｃｌ２（４００μＬ）に溶解した溶液を、６時間加熱還流し、続いて揮発分を減圧除去した。ＰＴＬＣ（ＳｉＯ２、ＣＨＣｌ３：ＥｔＯＡｃ：ＨＯＡｃ＝１０：２０：０．３溶離液）によって、淡黄色固体の２（０．６ｍｇ、０．５６μｍｏｌ、６６％）が得られ、これは、信頼できる２に関して公開された１Ｈ  ＮＭＲチャート（オカダ，Ｈ．ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９９４，４７，１２９）と同一の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示した。
【００５２】
〔［Ｎ−｛２−キノリンカルボキシ）−Ｄ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＭｅ−Ｌ−Ｃｙｓ−ＮＭｅ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）］２（システインチオール）ジラクトン（２６）〕
１の場合に記載した方法で、２３（５．０ｍｇ、４．６μｍｏｌ）を、キノリン−２−カルボン酸（４．０ｍｇ、２３．０μｍｏｌ）、ＥＤＣｌ（４．５ｍｇ、２３．０μｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（２．８ｍｇ、２３．０μｍｏｌ）と、ＣＨ２Ｃｌ２（３００μＬ）中で反応させ、ＰＴＬＣ（ＳｉＯ２、ＣＨＣｌ３：ＥｔＯＡｃ：ＨＯＡｃ＝１０：２０：０．３溶離液）で精製して、白色泡状の２６（２．８ｍｇ、２．４μｍｏｌ、５２％）を得た。
【００５３】
〔［Ｎ−（２−キノキサリンカルボキシ）−Ｄ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＭｅ−Ｌ−Ｃｙｓ−ＮＭｅ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）］２（システインチオール）ジラクトン（２７）〕
１の場合に記載した方法で、２３（５．０ｍｇ、４．６μｍｏｌ）を、キノキサリン−２−カルボン酸（４．０ｍｇ、２３．０μｍｏｌ）、ＥＤＣｌ（４．５ｍｇ、２３．０μｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（２．８ｍｇ、２３．０μｍｏｌ）と、ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）中で反応させ、ＰＴＬＣ（ＳｉＯ２、ＣＨＣｌ３：ＥｔＯＡｃ：ＨＯＡｃ＝１０：２０：０．３溶離液）で精製して、白色泡状の２７（２．０ｍｇ、２．２μｍｏｌ、４７％）を得た。
【００５４】
〔［Ｎ−（３−ヒドロキシ−６−メトキシ−２−キノリンカルボキシル）−Ｄ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＭｅ−Ｌ−Ｃｙｓ−ＮＭｅ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）］２（システインチオール）ジラクトン（２８）〕
１の場合に記載した方法で、２３（５．０ｍｇ、４．６μｍｏｌ）を、３−ヒドロキシ−６−メトキシ−キノリン−２−カルボン酸（単離：コニシ，Ｍ．ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９８１，３４，１４８：構造および立体化学：アーノルド，Ｅ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８１，１０３，１２４３；全合成（ルゾペプチンＡ〜Ｃ）：ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ：１９９９，１２１，１０９８；ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９９，１２１，１１３７５；ルゾペプチンＥ２：チウフォリニ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．１９９９，３６，１４０９；チウフォリニ，Ｍ．Ａ．ら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０００，３９，２４９３；ボーゲル，Ｄ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９５，６０，７３６９）（４．０ｍｇ、２３．０μｍｏｌ）、ＥＤＣｌ（４．５ｍｇ、２３．０μｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（２．８ｍｇ、２３．０ｍｍｏｌ）と、ＣＨ２Ｃｌ２（３００μＬ）中で反応させ、ＰＴＬＣ（ＳｉＯ２、ＣＨＣｌ３：ＥｔＯＡｃ：ＨＯＡｃ＝１０：２０：０．３溶離液）で精製して、白色泡状の２８（２．５ｍｇ、２．４μｍｏｌ、５１％）を得た。
【００５５】
［図面の詳細な説明］
図１はチオコラリン（１）、ＢＥ−２２１７９（２）、トリオスチンＡ（３）、およびエキノマイシン（４）の構造を示している。チオコラリンはミクロモノスポラｓｐ．Ｌ−１３−ＡＣＭ２−０９２から単離された強力な抗腫瘍性抗生物質である。この物質は、抗腫瘍性抗生物質ＢＥ−２２１７９（２）、トリオスチンＡ（３）、およびエキノマイシン（４）を含む２重の対称性二環式オクタデプシペプチドのグループに含まれる最も新しい物質であり、ビスインターカレーションによってＤＮＡと結合する。
【００５６】
図２は、サンドラマイシン、ルゾペプチン、およびキノキサペプチンを含むより大型の環式デカデプシペプチドのグループの構造を示している。トリオスチンＡおよびエキノマイシンは、キノキサリン発色団へのアミド結合のα位でＤ型立体構造を有し（Ｄ−Ｓｅｒ）、残りの不斉中心ではＬ型立体構造を有する。サンドラマイシンおよびキノキサペプチンの同様の中心も、ルゾペプチンと同様にＤ−Ｓｅｒを有する。
【００５７】
図３は、１に見られる３つの好適な官能化Ｃｙｓ残基の調製をともなう、トリペプチド１５およびＮ−Ｃｂｚ−Ｄ−Ｃｙｓ−ＯＴｃｅ（１１）から主要テトラデプシペプチド１６の集合反応を示す図式を示している。Ｎ−Ｍｅ−Ｃｙｓ−ＯＨ（５）をアセトアミドメチル（Ａｃｍ）基（１．５当量のＮ−ヒドロキシメチルアセトアミド、Ｈ２ＳＯ４）とＢＯＣ基（ＢＯＣ２Ｏ、６２％）で連続的にＳ保護およびＮ保護することによって、架橋ジスルフィドＣｙｓ残基の前駆物質６を得た。Ｎ−Ｍｅ−Ｃｙｓ−ＯＨ（５）の選択的Ｓ−メチル化（Ｍｅｌ、ＮａＨＣＯ３）の後、ＢＯＣ保護（ＢＯＣ２Ｏ、ＮａＯＨ、７３％）を行うことで７を得た。７のエステル化（ＴＭＳＣＨＮ２、８９％）の後に、８のＢＯＣの脱保護（３ＭのＨＣｔ−ＥｔＯＡｃ、９１％）を行って、第２の官能化Ｌ−Ｃｙｓ残基の前駆物質である９を得た。Ｄ−Ｃｙｓ残基を有する発色団を構成する化合物１１は、そのジスルフィド前駆物質１０の還元（Ｐｈ３Ｐ、２−メルカプトエタノール、９９％）によって調製し、この前駆物質はＤ−シスチンをＣｂｚ（ＣｂｚＣｌ、ＮａＨＣＯ３）およびＴｃｅ〔トリクロロエタノール、ＤＣＣ、｛ＤＣＣ＝ジシクロヘキシルカルボジイミド；ＥＤＣｌ＝１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩；ＨＯＢｔ＝１−ヒドロキシベンゾトリアゾール；ＨＯＡｔ＝１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール｝ＨＯＢｔ、７６％〕で段階的に保護することによって調製した。トリクロロエタノールによるエステル化反応は、ラセミ化に対して敏感であることが分かっており、ＨＯＢｔ（３３％ｄｅ対１００％ｄｅ）の非存在下またはＤＭＡＰ（３３％ｄｅ）の存在下で、広範囲のラセミ化が起こった。６と９のカップリング（ＥＤＣｌ、ＨＯＡｔ、７８％）によって１２が得られ、ＨＯＡｔに対してＨＯＢｔの方がわずかに転化率が低かった。１２のＢＯＣの脱保護（３ＭのＨＣｌ−ＥｔＯＡｃ、１００％）を行い、Ｎ−ＢＯＣ−Ｇｌｙ−ＯＨとカップリングさせ（ＥＤＣｌ、ＨＯＡｔ、６８％）、１４のメチルエステルの加水分解（ＬｉＯＨ、１００％）を行うことによって１５を得た。Ｄ−システイン誘導体１１とトリペプチド１５を結合させる主要チオールエステル化反応を、ＥＤＣｌ−ＨＯＡｔ（８３％）を使用し塩基を加えずに実質的にラセミ化が起こらない条件で実施して、デプシペプチド１６（ｄｅ９５：５）を得た。
【００５８】
図４は、２、２６、２７、および２８の合成図式を示している。出発アミン１７および遊離酸１８を塩基の非存在下（ＥＤＣｌ、ＨＯＡｔ、ＣＨ２Ｃｌ２、８３％）で混合して、１９を得た（図４）。１つの第２級アミド部位で環を閉じる１９の環化による２６員環オクタデプシペプチド２３の生成は、Ｔｃｅエステルの脱保護（Ｚｎ，ＡｃＯＨの９０％水溶液）、ジスルフィド結合形成（Ｉ２，ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ、２５℃、０．００１Ｍ、２段階で５３％）、およびＢＯＣの脱保護（３ＭのＨＣｌ−ジオキサン）を連続して行った後、ＥＤＣｌ−ＨＯＡｔ（０．００１ＭのＣＨ２Ｃｌ２、−２０℃、６時間、２段階で６１％）で処理することで実施した。この４段階のＮ−ＢＯＣの脱保護とジスフルフィド形成段階を逆にすると、転化率が低下した（全４段階で１３％）。現在までのところ、閉環の後ジスルフィド結合形成を実施するすべての試みは成功していない。ジスルフィド結合によって束縛されない２６員環の大環化反応は例外的にうまく進行するが（＞５０％）、２６員環の境界内部での後のジスルフィド結合形成（Ｉ２，ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ、２５℃）はうまくいかなかった。したがって、２３の生成を含む段階のこの順序は、制約されたジスルフィドにより大環化を改良するためではなく、ジスルフィド結合形成を可能にするためであった。ジスルフィドを不安定化させる大環状構造内部の制約によってもこのことが可能であるが、３および４で同様のことが観察されないことから、２６員大環状構造内部の遊離架橋チオールにより隣接するチオールエステルの競合的分子内開裂が起こることによって問題が生じると考えられる。
【００５９】
図５は、３２の好適な合成を示す図式である。１６および１９の合成で説明した手順によって、テトラデプシペプチド３０およびオクタデプシペプチド３１を調製した。架橋２６員環オクタデプシペプチド３２を得るための３１の環化は、Ｔｃｅエステルの脱保護（Ｚｎ，ＡｃＯＨの９０％水溶液）、ＢＯＣの脱保護（３ＭのＨＣｌ−ジオキサン）、およびジスルフィド結合形成（Ｉ２，ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ、２５℃、０．００１Ｍ）を順次実施した後、ＥＤＣｌ−ＨＯＡｔ（０．００１ＭのＣＨ２Ｃｌ２、−２０℃、６時間、４段階で１６％）で処理することで実施した。しかし、３２をＥｔ２ＮＨまたはピペリジンに曝露すると、ＦＭＯＣの十分な脱保護が起こる代わりに大環状構造の分解が起こった。別の方法として、ジシクロヘキシルアミン、Ｅｔ３Ｎ、またはＤＭＡＰを含む他のアミンで３２を処理しても、環状アミン２４が生成しないが、これは、チオールエステルの求核体に対する感受性、Ｃｙｓ残基のα位の脱保護によって誘導される競合的β脱離、およびチオールエステルの解離を伴う遊離アミンへの分子内Ｓ−Ｎアシル転移の可能性が原因である。しかし、１を直接得るためのインサイチューの遊離アミンの捕捉（２５、ＥＤＣｌ、ＤＭＡＰ）または２４の誘導体の保護（ＢＯＣ２ＯまたはＣｂｚＣｌ、Ｅｔ３Ｎ）の試みも成功しなかった。
【００６０】
図６は、合成の初期段階でペンダント発色団を導入する方法を示している。従って、１５と３４のカップリング反応（ＥＤＣｌ、ＨＯＡｔ、８６％）によって、置換キノリン発色団を有するテトラデプシペプチド３５を得た。
【００６１】
図７は、蛍光対ＤＮＡ／薬物比の２種類のプロットと、それぞれから得られるスキャッチャードプロットを示している。式ｒｂ／ｃ＝Ｋｎ−Ｋｒｂ（式中、ｒｂはＤＮＡヌクレオチドリン酸１つ当たりに結合する分子数であり、ｃは遊離薬物濃度であり、Ｋはみかけの結合定数であり、ｎはヌクレオチドリン酸１つ当たりの薬物の結合部位数である）を使用して、滴定結果のスキャッチャード分析（スキャッチャード，Ｇ．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９４９，５１，６６０）を実施した。ｒｂ／ｃ対ｒｂのプロットより、薬物の会合定数（傾き）および見かけの結合部位の大きさ（ｘ切片）が求められる。（ａ）ＣＴ−ＤＮＡ濃度を増加させた場合のチオコラリンの蛍光消光〔Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および７５ｍＭのＮａＣｌ緩衝溶液中で励起３８０ｎｍおよび発光５１０ｎｍ〕。（ｂ）パートａの蛍光消光のスキャッチャードプロット。（ｃ）ＣＴ−ＤＮＡ濃度を増加させた場合のＢＥ−２２１７９の蛍光消光〔Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および７５ｍＭのＮａＣｌ緩衝溶液中で励起３８０ｎｍおよび発光５１０ｎｍ〕。（ｄ）パートｃの蛍光消光のスキャッチャードプロット。
【００６２】
図８は、ＤＮＡ結合性を比較した表である。ａ：子ウシ胸腺ＤＮＡ、ＫＢ＝蛍光消光によって測定した見かけの結合定数。括弧内の値は、飽和した高親和性結合における薬物／塩基対比であり、結合の選択性の指標と見なすことができる。ｂ：負のスーパーコイルＦＸ１７４  ＤＮＡの巻き戻しに必要な薬物／塩基対比（形態Ｉから形態ＩＩへのゲル移動度、０．９％アガロースゲル）。ｃ：再巻き取りの完了すなわち正のスーパーコイルＦＸ１７４  ＤＮＡの形成に必要な薬物／塩基対比（形態ＩＩから形態Ｉへのゲル移動度、０．９％アガロースゲル）。ｄ：５’−ＣＣＧＣ部位におけるフットプリント法で求めた結合定数（図９）。
【００６３】
図９は、ｗ７９４  ＤＮＡと結合するエキノマイシンのＤＮアーゼフットプリントの電気泳動ゲルである。レーン１３、Ｇ、Ｃ、およびＡのサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）配列決定反応；レーン４、天然ＤＮＡ；レーン５、ＤＮアーゼＩ処理を行っていない対照ＤＮＡ；レーン６〜１４、０、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、および１４０ｍＭのエキノマイシンを使用しＤＮアーゼＩ処理（１分間）を実施。
【００６４】
図１０は、ｗ７９４  ＤＮＡと結合するチオコラリンのＤＮアーゼフットプリントの電気泳動ゲルである。レーン１、天然ＤＮＡ；レーン２、ＤＮアーゼＩ処理を行っていない対照ＤＮＡ；レーン３〜６、Ｇ、Ｃ、およびＡのサンガー配列決定反応；レーン７〜２６、０、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、および０ｍＭのチオコラリンを使用しＤＮアーゼＩ処理（１分間）を実施。
【００６５】
図１１は、チオコラリン、エキノマイシン、ＢＥ−２２１７９、および２７のＤＮＡをほどく能力を調べるための一連の３つの電気泳動アガロースゲルを示している。（Ａ）レーン１、未処理のスーパーコイルＦＸ１７４  ＤＮＡ、９５％が形態Ｉで５％が形態ＩＩ；レーン２〜８、チオコラリンで処理したＦＸ１７４  ＤＮＡ；レーン９〜１４、エキノマイシンで処理したＦＸ１７４  ＤＮＡ。［薬物］／［塩基対］比は、０．０２２（レーン２および９）、０．０３３（レーン３および１０）、０．０４４（レーン４および１１）、０．０６６（レーン５および１２）、０．１１（レーン６および１３）、０．２２（レーン７および１４）、０．４４（レーン８）であった。（Ｂ）レーン１、未処理のスーパーコイルＦＸ１７４  ＤＮＡ；レーン２〜１２、ＢＥ−２２１７９で処理したＦＸ１７４  ＤＮＡ。［薬物］／［塩基対］比は、０．０２２（レーン２）、０．０３３（レーン３）、０．０４４（レーン４）、０．０６６（レーン５）、０．１１（レーン６）、０．２２（レーン７）、０．３３（レーン８）、０．４４（レーン９）、０．６６（レーン１０）、１．１（レーン１１）、および２．２（レーン１２）であった。（Ｃ）レーン１、未処理のスーパーコイルＦＸ１７４  ＤＮＡ、５％が形態Ｉで５％が形態ＩＩ；レーン２〜８、チオコラリン類似体（２７）で処理したＦＸ１７４  ＤＮＡ。［薬物］／［塩基対］比は、０．０２２（レーン２）、０．０３３（レーン３）、０．０４４（レーン４）、０．０６６（レーン５）、０．１１（レーン６）、０．２２（レーン７）、および０．４４（レーン８）であった。
【００６６】
図１２は、チオコラリンが高い親和性でＤＮＡと結合するが、選択性はほとんどまたはまったくないことを示す表である。関連するビスインターカレーターのエキノマイシンの高親和性インターカレーション部位（５’−ＰｕＣＧＰｙ）、サンドラマイシン（５’−ＣＡＴＧ）、およびルゾペプチン（５’−ＣＡＴＧ）を含む４つの２重デオキシオリゴヌクレオチド５’−ＧＣＸＸＧＣ−３’（式中、ＸＸ＝ＴＡ、ＡＴ、ＧＣ、ＣＧ）の組を使用して、１の結合について調べた。最も強い結合を示す５’−ＧＣＧＣＧＣおよび５’−ＧＣＣＧＧＣとのＧＣリッチ結合があまり優先されなかったが、４種類のデオキシオリゴヌクレオチドでこれらの差は３〜７×１０６Ｍ−１の小さな範囲である。したがって、本明細書のフットプリント法およびその他の関連する研究と同様に、１のデオキシオリゴヌクレオチドとの結合の選択性はほとんどなかった。
【００６７】
図１３は、エキノマイシン、チオコラリン、およびＢＥ−２２１７９、ならびに前駆体２３およびそれらの類似体の生物学的性質をまとめている。チオコラリンおよびＢＥ−２２１７９は、Ｌ１２１０アッセイで非常に高い細胞毒性活性（それぞれＩＣ５０＝２００および４００ｐＭ）を示し、エキノマイシンよりわずかに活性が低い。両方の発色団がなくＣｂｚおよびＦＭＯＣ保護基を有する化合物２３および３２は不活性であり、チオコラリンの活性の１０５分の１未満である。ルゾペプチンと同じ発色団を有する類似体２８も強い活性を示したが、キノリンＣ３フェノールのない２６、およびエキノマイシンとトリオスチンＡのキノキサリン発色団を有する２７は、より低い細胞毒性活性を示した。さらに、エキノマイシンと同様にチオコラリンはＨＩＶ−１逆転写酵素の弱い阻害剤にすぎないことが分かった。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、チオコラリン（１）、ＢＥ−２２１７９（２）、トリオスチンＡ（３）、およびエキノマイシン（４）の構造を示している。
【図２】
図２は、サンドラマイシン、ルゾペプチン、およびキノキサペプチンを含む、より大きな環状デカデプシペプチドのグループの構造を示している。
【図３】
図３は、１に見られる３つの好適な官能化Ｃｙｓ残基の調製をともなう、トリペプチド１５およびＮ−Ｃｂｚ−Ｄ−Ｃｙｓ−ＯＴｃｅ（１１）から主要テトラデプシペプチド１６の集合反応を示す図式を示している。
【図４】
図４は、２、２６、２７、および２８の合成図式を示している。
【図５】
図５は、３１の大環化に必要な一連の段階を示す図式を示している。
【図６】
図６は、合成の初期段階でペンダント発色団が導入される方法を示している。
【図７】
図７は、蛍光対ＤＮＡ／薬物比の２種類のプロットと、それぞれから得られるスキャッチャードプロットを示している。
【図８】
図８は、ＤＮＡ結合性を比較した表を示している。
【図９】
図９は、ｗ７９４  ＤＮＡに結合するエキノマイシンのＤＮアーゼフットプリント法の電気泳動ゲルを示している。
【図１０】
図１０は、ｗ７９４  ＤＮＡに結合するチオコラリンのＤＮアーゼフットプリント法による電気泳動ゲルを示している。
【図１１】
図１１は、チオコラリン、エキノマイシン、ＢＥ−２２１７９、および２７のＤＮＡをほどく能力を試験する一連の３つの電気泳動アガロースゲルを示している。
【図１２】
図１２は、チオコラリンは高い親和性でＤＮＡと結合するが、選択性はほとんど、または全く存在しないことを示す表を示している。
【図１３】
図１３は、合成された化合物および同様の天然化合物の生物活性をまとめた表を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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2004516258.tif 000114
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004516258.tif 000115
2004516258.tif 000116
【国際調査報告】
2004516258.tif 000117