(57)【要約】本発明はRNAi技術のための構築物を目的とする。本発明は、標的遺伝子のサイレンシングのために遺伝子サイレンシング技術で干渉性RNAとして使用するリボ核酸（RNA）及びこのようなRNAをコードする核酸構築物を提供する。前記リボ核酸は、5'から3'方向に少なくとも第一のエフェクター配列、第二のエフェクター配列、前記第二のエフェクター配列と実質的に相補的な配列、及び前記第一のエフェクター配列と実質的に相補的な配列を含み、前記相補的な配列はそれらの対応するエフェクター配列と二本鎖領域を形成することができ、さらにこれら配列の少なくとも1つは、前記標的遺伝子のある領域の予想される転写物と実質的に同一である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子サイレンシング技術において標的遺伝子をサイレンシングするために干渉性RNAとして使用するためのリボ核酸（RNA）であって、5'から3'方向に少なくとも、第１のエフェクター配列、第２のエフェクター配列、前記第２のエフェクター配列に実質的に相補的な配列、および前記第１のエフェクター配列に実質的に相補的な配列を含み、前記相補的な配列がそれぞれ対応するエフェクター配列と二本鎖領域を形成することができ、前記配列の少なくとも一つは前記標的遺伝子の領域の予想される転写物と実質的に同一である、前記リボ核酸（RNA）。
【請求項２】
更に１以上のヌクレオチドからなるスペーシング配列を含み、配列のいずれの２つも前記スペーシング配列によって隔てられている、請求項１記載のRNA。
【請求項３】
第１のエフェクター配列が第２のエフェクター配列とスペーシング配列によって隔てられている、請求項２記載のRNA。
【請求項４】
第２のエフェクター配列に実質的に相補的な配列が第１のエフェクター配列に実質的に相補的な配列とスペーシング配列によって隔てられている、請求項２記載のRNA。
【請求項５】
更に１以上のヌクレオチドからなる追加的スペーシング配列を含み、少なくとも第１のエフェクター配列が第２のエフェクター配列と前記追加的スペーシング配列によって隔てられている、請求項４記載のRNA。
【請求項６】
更に１以上のヌクレオチドからなる追加的スペーシング配列を含み、第２のエフェクター配列に実質的に相補的な配列が第１のエフェクター配列に実質的に相補的な配列と前記追加的スペーシング配列によって隔てられている、請求項３記載のRNA。
【請求項７】
スペーシング配列がアニーリング可能でない、請求項５または６記載のRNA。
【請求項８】
第２のエフェクター配列と前記第２のエフェクター配列に実質的に相補的な配列との間でループを形成する１以上のヌクレオチドからなるスペーシング配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項記載のRNA。
【請求項９】
３つのエフェクター配列および前記エフェクター配列に実質的に相補的な３つの配列を含み、前記エフェクター配列に実質的に相補的な配列が前記エフェクター配列と二本鎖領域を形成することができる配列である、請求項１〜８のいずれか１項記載のRNA。
【請求項１０】
４つのエフェクター配列および前記エフェクター配列に実質的に相補的な４つの配列を含み、前記エフェクター配列に実質的に相補的な配列が前記エフェクター配列と二本鎖領域を形成することができる配列である、請求項１〜８のいずれか１項記載のRNA。
【請求項１１】
５つのエフェクター配列および前記エフェクター配列に実質的に相補的な５つの配列を含み、前記エフェクター配列に実質的に相補的な配列が前記エフェクター配列と二本鎖領域を形成することができる配列である、請求項１〜８のいずれか１項記載のRNA。
【請求項１２】
６つ以上のエフェクター配列および前記エフェクター配列に実質的に相補的な前記と同数の配列を含み、前記エフェクター配列に実質的に相補的な配列が前記エフェクター配列と二本鎖領域を形成することができる配列である、請求項１〜８のいずれか１項記載のRNA。
【請求項１３】
エフェクター配列が長さ10〜200ヌクレオチドである、請求項１〜12のいずれか１項記載のRNA。
【請求項１４】
エフェクター配列が長さ17〜30ヌクレオチドである、請求項１〜12のいずれか１項記載のRNA。
【請求項１５】
エフェクター配列が長さ21〜23ヌクレオチドである、請求項１〜12のいずれか１項記載のRNA。
【請求項１６】
スペーシング配列がAA、UU、UUA、UUAG、UUACAAおよびN1AAN2（式中、N1およびN2は同一でも異なっていてもよく、C、G、UまたはAのいずれかである）からなる群より選ばれる配列を含む、請求項２〜15のいずれか１項記載のRNA。
【請求項１７】
追加的スペーシング配列がAA、UU、UUA、UUAG、UUACAAおよびN1AAN2（式中、N1およびN2は同一でも異なっていてもよく、C、G、UまたはAのいずれかである）からなる群より選ばれる配列を含む、請求項５〜７のいずれか１項記載のRNA。
【請求項１８】
請求項１〜17のいずれか１項記載のRNAをコードする核酸構築物。
【請求項１９】
遺伝子サイレンシング技術において標的遺伝子をサイレンシングするために干渉性RNAとして使用するためのリボ核酸（RNA）をコードする配列を含む核酸構築物であって、5'から3'方向に少なくとも、第１のエフェクターコード配列、第２のエフェクターコード配列、前記第２のエフェクターコード配列に実質的に相補的な配列、および前記第１のエフェクターコード配列に実質的に相補的な配列を含み、前記相補的な配列の転写物はそれぞれ対応するエフェクターコード配列の転写物と二本鎖領域を形成することができ、前記配列の少なくとも一つは前記標的遺伝子の領域と実質的に同一である、前記核酸構築物。
【請求項２０】
更に１以上のヌクレオチドからなるスペーシング配列を含み、配列のいずれの２つのコード配列も前記スペーシング配列によって隔てられている、請求項19記載の核酸構築物。
【請求項２１】
第１のエフェクターコード配列が第２のエフェクターコード配列とスペーシング配列によって隔てられている、請求項２０記載の核酸構築物。
【請求項２２】
第２のエフェクターコード配列に実質的に相補的な配列が第１のエフェクターコード配列に実質的に相補的な配列とスペーシング配列によって隔てられている、請求項２０記載の核酸構築物。
【請求項２３】
第１のエフェクターコード配列が第２のエフェクターコード配列と、１以上のヌクレオチドからなる追加的スペーシング配列によって隔てられている、請求項２２記載の核酸構築物。
【請求項２４】
第２のエフェクターコード配列に実質的に相補的な配列が少なくとも第１のエフェクターコード配列に実質的に相補的な配列と１以上のヌクレオチドからなる追加的スペーシング配列によって隔てられている、請求項２１記載の核酸構築物。
【請求項２５】
スペーシング配列の転写物が追加的スペーシング配列の転写物とアニーリング可能でない、請求項２３または２４記載の核酸構築物。
【請求項２６】
第２のエフェクターコード配列と前記第２のエフェクターコード配列に実質的に相補的な配列との間に、１以上のヌクレオチドからなるスペーシング配列を含む、請求項１９〜２５のいずれか１項記載の核酸構築物。
【請求項２７】
３つのエフェクターコード配列および前記エフェクターコード配列に実質的に相補的な３つの配列を含み、前記エフェクターコード配列の１次転写物が前記エフェクターコード配列に実質的に相補的である配列と二本鎖領域を形成することができる、請求項１９〜２６のいずれか１項記載の核酸構築物。
【請求項２８】
４つのエフェクターコード配列および前記エフェクターコード配列に実質的に相補的な４つの配列を含み、前記エフェクターコード配列の１次転写物が前記エフェクターコード配列に実質的に相補的である配列と二本鎖領域を形成することができる、請求項１９〜２６のいずれか１項記載の核酸構築物。
【請求項２９】
５つのエフェクターコード配列および前記エフェクターコード配列に実質的に相補的な５つの配列を含み、前記エフェクターコード配列の１次転写物が前記エフェクターコード配列に実質的に相補的である配列と二本鎖領域を形成することができる、請求項１９〜２６のいずれか１項記載の核酸構築物。
【請求項３０】
エフェクターコード配列が長さ10〜200ヌクレオチドである、請求項１９〜２９のいずれか１項記載の核酸構築物。
【請求項３１】
エフェクターコード配列が長さ17〜30ヌクレオチドである、請求項１９〜２９のいずれか１項記載の核酸構築物。
【請求項３２】
エフェクターコード配列が長さ21〜23ヌクレオチドである、請求項１９〜２９のいずれか１項記載の核酸構築物。
【請求項３３】
請求項１〜１８のいずれか１項記載のRNAを細胞に導入することにより標的遺伝子の発現を阻害する方法。
【請求項３４】
請求項１９〜３２のいずれか１項記載の核酸構築物を細胞に導入することにより標的遺伝子の発現を阻害する方法。
【請求項３５】
請求項１〜１８のいずれか１項記載のRNAを標的遺伝子へ導入することによって前記標的遺伝子の発現を阻害する方法。
【請求項３６】
エフェクターコード配列および実質的に相補的はない列に機能可能に連結したプロモーターおよびターミネーターを更に含む、請求項１９〜３２のいずれか１項記載の核酸構築物。
【請求項３７】
請求項１９〜３０のいずれか１項記載の核酸構築物をポリメラーゼ連鎖反応によって構築する方法であって、ポリヌクレオチドに所定のオリゴヌクレオチドを加えることを含み、前記オリゴヌクレオチドは第１の部分配列および第２の部分配列に分けられており、前記ポリメラーゼ連鎖反応が以下を含む、前記方法：
3'端にポリメラーゼ連鎖反応条件下で前記ポリヌクレオチドの少なくとも第１の部分とハイブリダイズし得る固定化部を有し、5'端に前記第１の部分配列と同一のエフェクター部を有する第１のプライマー、および、3'端に前記ポリヌクレオチドの前記第１の部分に隣接する少なくとも前記ポリヌクレオチドの第２の部分とハイブリダイズし得る固定化部を有し、5'端に前記第２の部分配列と同一のエフェクター部を有する第２のプライマー、を提供する工程；
前記プライマーをポリメラーゼ連鎖反応条件下で各プライマーの前記固定化部が前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズするように前記ポリヌクレオチドに導入する工程；
ポリメラーゼ連鎖反応を行い、プライマーのエフェクターを二本鎖配列の末端に含む増幅産物を生成させる工程；および、
エフェクター部の末端を連結して結合したポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド配列を形成させる工程。
【請求項３８】
請求項３７記載の方法に適した割合でポリヌクレオチド、ポリメラーゼ、第１のプライマー、第２のプライマー、および連結酵素を含む、請求項３７記載の方法によって核酸構築物を構築するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多数の二本鎖領域を形成することができる相補性配列を含む核酸に関する。本発明はまた、このような核酸をコードする配列及び構築物、並びにこのような核酸又は構築物の遺伝子発現の改変のための（特に遺伝子発現の低下または阻害するための）使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ある種の一本鎖核酸分子は自己相補性二本鎖領域を形成することができる。このような領域では、前記ヌクレオチド配列の一部分が、前記配列の逆方向反復間でのワトソン-クリック塩基対形成によって前記配列のまた別の部分と相互作用することができる。前記反復領域が互いに隣接しているか、又は極めて近位にある場合は、前記二本鎖領域はヘアピン構造として知られる構造を形成することができる。ヘアピン構造は、アニールした逆方向反復配列とともに、ヘアピン構造の一方の端にヌクレオチドの対を形成していない“ループ”を形成する。前記ループはまた核酸鎖の折り畳みを促進することができる。
ヘアピンRNA配列は基礎研究及び応用研究で強力なツールとなった。特にこれら配列はRNA干渉技術及び遺伝子サイレンシング技術で用いられてきた。このような技術は下記特許出願の明細書に記載されている：PCT/AU99/00195（米国特許出願09/646,807号及び米国特許6,573,099号）及びPCT/AU01/00297号（前記特許の内容は参照により本明細書に含まれる）。要約すれば、RNA干渉（RNAi）ヘアピンRNA配列は、これら配列をコードするDNA構築物（以下では“ヘアピンDNA構築物”と称する）から細胞内で合成することができる。
多くのヘアピンDNA構築物が遺伝子サイレンシングで有効であることが立証されているが、他のDNA構築物は部分的な遺伝子サイレンシング活性を示しただけである。RNAiヘアピンRNAによってもたらされる遺伝子不活化度を高めることは、例えば遺伝子治療で有益であろう。さらにまた、多くの状況で、2つ又は3つ以上の別個の遺伝子又は遺伝子領域を同時にサイレンシングすることができるということは、特に遺伝子治療の応用という観点から有益であろう。
本明細書における従来技術の引用は、前記従来技術が当業者の共通の一般的知識の一部分であることを認める又は示唆することを意味するものではなく、またそのように理解されるべきではない。
【発明の開示】
【０００３】
RNA干渉技術及び遺伝子サイレンシング技術で用いることができる改良RNAヘアピン配列が求められている。さらにまた、遺伝子サイレンシング活性が改良されたヘアピンRNA転写物を生成することができるDNA構築物が求められており、さらに2つ又は3つ以上の別個の遺伝子を不活化することができるヘアピンRNA をコードするDNA構築物が求められている。さらにまた、このようなDNA構築物を合成する改良方法が求められている。本発明の目的は、従来技術を考慮してこれら要求の1つ又は2つ以上を克服、又は少なくとも緩和することである。
ある特徴では、本発明は、遺伝子サイレンシング技術で干渉性RNAとして使用するために適したリボ核酸（RNA）を提供する。前記リボ核酸は、5'から3'方向に少なくとも第一のエフェクター配列、第二のエフェクター配列、前記第二のエフェクター配列と実質的に相補的な配列、及び前記第一のエフェクター配列と実質的に相補的な配列を含み、前記相補的な配列はそれらの対応するエフェクター配列と二本鎖領域を形成することができ、さらに1つ又は2つ以上のヌクレオチドで構成される1つ又は2つ以上のスペーシング配列（間隔形成配列）を含む。
ある実施態様では、第一のエフェクター配列は、第一のスペーシング配列によって第二のエフェクター配列から隔てられている。別の実施態様では、第二のエフェクター配列と実質的に相補的な配列は、第二のスペーシング配列によって第一のエフェクター配列と実質的に相補的な配列から隔てられている。したがって、本発明のこの特徴のRNAは、スペーシング配列によって少なくとも二本鎖RNA領域は隣接する二本鎖RNA領域から隔てられるように折り畳まれることができ、スペーシング配列はアニーリングすることなくいわゆるバブルを形成する。“ハイブリダイズする”及び“アニールする”という用語は、下記で考察するように、相補的塩基の間でワトソン-クリック塩基対を形成することができるヌクレオチド配列を指す。
【０００４】
さらに別の特徴では、本発明は、遺伝子サイレンシング技術で干渉性RNAとして使用するために適したリボ核酸（RNA）を提供する。前記リボ核酸は、少なくとも第一のエフェクター配列、第二のエフェクター配列、前記第二のエフェクター配列と実質的に相補的な配列、及び前記第一のエフェクター配列と実質的に相補的な配列を含み、前記相補的な配列はそれらの対応するエフェクター配列と二本鎖領域を形成することができる。したがって、少なくとも1つの二本鎖RNA領域は、少なくとも1つの他の二本鎖RNA領域と直に隣接し、それによってスペーシング配列を介在させることなく、遺伝子サイレンシング技術で干渉性RNAの生成で使用するために適した少なくとも2つのエフェクター領域を生じる。ある好ましい実施態様では、前記RNAは、さらに、第二のエフェクター配列と前記エフェクター配列と実質的に相補的な配列との間にスペーシング配列を含み、前記スペーシング配列はループを形成することができ、このループの付近で前記RNAは折り畳まれ、二本鎖領域を形成する。
また別の特徴では、本発明は、標的遺伝子のサイレンシングのために遺伝子サイレンシング技術で干渉性RNAとして使用するために適したリボ核酸（RNA）を提供する。前記リボ核酸は、5'から3'方向に少なくとも第一のエフェクター配列、第二のエフェクター配列、前記第二のエフェクター配列と実質的に相補的な配列、及び前記第一のエフェクター配列と実質的に相補的な配列を含み、ここで前記相補的な配列はそれらの対応するエフェクター配列と二本鎖領域を形成することができ、さらにこれら配列の少なくとも1つは、標的遺伝子のある領域の予想される転写物と実質的に同一である。好ましくは、前記RNAはさらに1つ又は2つ以上のヌクレオチドのスペーサー配列を含み、ここで前記配列の任意の2つは前記スペーシング配列によって隔てられる。より好ましくは、前記RNAはさらに、1つ又は2つ以上のヌクレオチドで構成される、追加されたスペーサー配列を含む。
【０００５】
また別の特徴では、本発明は、遺伝子サイレンシング技術で干渉性RNAとして使用するために適したリボ核酸（RNA）を提供する。前記リボ核酸は、5'から3'方向に少なくとも第一のエフェクター配列、第二のエフェクター配列、前記第二のエフェクター配列と実質的に相補的な配列、及び前記第一のエフェクター配列と実質的に相補的な配列を含み、前記相補的な配列はそれらの対応するエフェクター配列と二本鎖領域を形成することができ、第二のエフェクター配列と実質的に相補的な配列は、1つ又は2つ以上のヌクレオチドで構成されるスペーシング配列によって第一のエフェクター配列と実質的に相補的な配列から隔てられ、さらに第一のエフェクター配列は、1つ又は2つ以上のヌクレオチドで構成される、別のスペーシング配列によって第二のエフェクター配列から隔てられる。本発明のこの特徴のある実施態様では、両方のスペーシング配列が含まれ、これらはアニールしない。
さらに別の特徴では、本発明は、遺伝子サイレンシング技術で干渉性RNAとして使用するために適したリボ核酸（RNA）を提供する。前記リボ核酸は、5'から3'方向に少なくとも第一のエフェクター配列、第二のエフェクター配列、前記第二のエフェクター配列と実質的に相補的な配列、及び前記第一のエフェクター配列と実質的に相補的な配列を含み、前記相補的な配列はそれらの対応するエフェクター配列と二本鎖領域を形成することができ、前記第一のエフェクター配列は、1つ又は2つ以上のヌクレオチドで構成される第一のスペーシング配列によって前記第二のエフェクター配列から隔てられる。ある実施態様では、第二のエフェクター配列と実質的に相補的な配列は、1つ又は2つ以上のヌクレオチドの第二のスペーシング配列によって第一のエフェクター配列と実質的に相補的な配列から隔てられ、第二のスペーシング配列は第一のスペーシング配列とハイブリダイズする能力をもたない。したがって、本発明のこの特徴のRNAは、少なくとも1つの二本鎖RNA領域の少なくとも一方の鎖が、スペーシング（非対形成）配列によって隣接する二本鎖RNA領域から隔ててられるように折り畳まれることができ、前記スペーシング配列はいわゆるバブルを形成する。
【０００６】
“干渉性RNAとして使用するために適した”RNAとは、干渉性RNAとして直接作用することができるRNA、又はプロセッシングされてRNAの干渉において活性を有するRNA分子を生成することができるRNAを意味する。このようなRNAは遺伝子サイレンシング技術に適している。
また別の実施態様では、少なくとも第一のエフェクター配列、前記第一のエフェクター配列と実質的に相補的な第一の相補性配列、第二のエフェクター配列及び前記第二のエフェクター配列と実質的に相補的な第二の相補性配列を含む核酸構築物が提供される。ここで第一及び第二の両エフェクター配列はそれらの対応する相補性配列と二本鎖部分を形成し、前記二本鎖領域はスペーサー配列（通常は第一のエフェクター配列よりも短い配列）によって隔てられる。
好ましい実施態様では、1つの二本鎖部分は、その2つの鎖が湾曲部を形成するループ配列によって連結され、いわゆるヘアピン構造を形成する。この実施態様では、前記二本鎖部分は1つの末端にこのループを有する。すなわち、ループは、エフェクター配列の1つとその実質的に相補的な配列との間のスペーシング配列によって形成される。好ましくは、前記核酸はまた二本鎖部分の間に一対のスペーシング配列を有し、“バブル”を形成する。
好ましくは、前記スペーサー配列はどちらかのエフェクター配列よりも短い。スペーサー配列は好ましくは1から20ヌクレオチド、より好ましくは1から10、さらに好ましくは1から7、もっとも好ましくは2から7ヌクレオチドの長さである。さらに好ましくは、ある実施態様では、1つのスペーサー配列は2ヌクレオチドの長さで、別のスペーサー配列は4ヌクレオチドの長さである。
【０００７】
前記リボ核酸又は核酸構築物は少なくとも2つのエフェクター配列を含むので、本発明は、3つ又は4つ以上のエフェクター配列（各々が対応する相補的な配列を有する）を含むような構築物にも及ぶ。前記エフェクター配列及び対応する相補的な配列は互いにスペーシング（非対形成）配列によって隔てられ、スペーシング配列はエフェクター配列が相補性配列と塩基対を形成するときバブルを形成する。好ましい実施態様では、前記リボ核酸又は核酸構築物は、3つのエフェクター配列及び3つの相補的配列を含み、各々はバブルを形成するスペーシング配列によって分離されるか；4つのエフェクター配列及び4つの相補的配列を含み、各々はバブルを形成するスペーシング配列によって分離されるか；又は5つのエフェクター配列及び5つの相補的配列を含み、各々はバブルを形成するスペーシング配列によって分離される。さらに好ましい実施態様では、前記リボ核酸又は核酸構築物は、3つのエフェクター配列及び3つの相補性配列を含むか；4つのエフェクター配列及び4つの相補性配列を含むか；又は5つのエフェクター配列及び5つの相補性配列を含み、隣接するエフェクターと相補性配列との間にスペーシング配列は介在しない。同様に6つ、7つ、8つ、9つ、10個又はそれ以上のエフェクター配列及び相補性配列が本発明のRNA及び核酸構築物中に存在することができる。前記エフェクター配列は同じでも異なっていてもよく、さらに、前記配列を同じ又は異なる標的遺伝子、同じ標的遺伝子の異なる領域、又はそれらの組合せに向けることができる。
【０００８】
また別の実施態様では、遺伝子サイレンシング技術で干渉性RNAとして使用するために適したリボ核酸（RNA）が提供される。前記リボ核酸は、5'から3'方向に少なくとも第一のエフェクター配列、第二のエフェクター配列、前記第二のエフェクター配列と実質的に相補的な配列、及び前記第一の配列と実質的に相補的な配列を含み、前記相補的な配列はそれらの対応するエフェクター配列と二本鎖領域を形成することができ、前記第二のエフェクター配列は、1つ又は2つ以上のヌクレオチドで構成されるスペーシング配列によって前記第二のエフェクター配列と実質的に相補的な配列から隔てられる。
本発明では、“標的遺伝子”は、RNA干渉技術によるサイレンシングのために標的とされる遺伝子を指す。前記遺伝子のRNA生成物は、翻訳されてアミノ酸配列を形成することができるメッセンジャーRNA（mRNA）でもよいし、又は翻訳されないRNA（例えばリボソームRNA、小型のウラシル富裕RNA又はリボザイム）でもよい。
本明細書で“遺伝子”という場合、それは最も広い意味と理解され、天然に存在するか又は合成されるかにかかわらず以下が含まれる：
（i）転写及び／又は翻訳調節配列及び／又はコード領域及び／又は非翻訳配列（すなわちイントロン、5'-及び3'-非翻訳配列）から成る古典的なゲノム遺伝子；及び／又は
（ii）DNA及びRNAウイルスの遺伝子；及び／又は
（iii）コード領域（すなわちエクソン）及び／又は5'-及び3'-非翻訳配列に対応するcDNA。
さらにまた、“遺伝子”の範囲内にはアミノ酸をコードするRNA（すなわちmRNA）をコードする核酸とともにアミノ酸をコードしないRNAをコードする核酸の両者が含まれる。
【０００９】
“実質的に同一”とは、標的遺伝子の部分と約70％同一であることを意味する。好ましくは、少なくとも80−90％、より好ましくは少なくとも95−100％同一であり、100％同一が含まれる。したがって、標的遺伝子の領域と実質的に同一である配列は、前記程度の配列類似性を有する。一般的には、本発明の二本鎖RNA領域を変異導入に付し、遺伝子発現を改変するその能力に実質的に影響を与えることなく、1つ若しくは数個のヌクレオチド置換、欠失又は付加をもたらすことができる。
RNAiは、一般的には標的とRNAi構築物との間で同一である配列によって最適化されるが、RNA干渉現象は100％に満たない相同性で認められることが知られている。当業者には理解されているように、二本鎖領域を構成する鎖は、特異的な二本鎖領域を形成するために互いに十分に相同でなければならない。RNA干渉を生じるために有効な二本鎖領域を達成することができる正確な構造上の規則はまだ完全には特定されていないが、一般的にはほぼ70％の同一性で十分である。下記で説明するように、末端部分とは対照的にエフェクター配列の中央部分におけるより高い同一性が要求される。また別に考慮されるべきことは、RNA二重鎖では）GがUと対を形成するという点で（Cと対を形成するほど強くはないが、RNAにおける塩基対形成はDNAとは微妙に異なるということである。
“実質的に相補的”とは、配列がハイブリダイズすることができる又はアニールすることができることを意味する。さらにまた、ハイブリダイゼーションは溶液の条件によって影響されることが知られている。一般的には、実質的に相補的な配列は少なくとも70％のワトソン-クリック塩基対形成を示すであろう。
【００１０】
RNAデュープレックスすなわち二本鎖領域の2つの配列は、それらが1つのポリヌクレオチドの別個の部分であったとしても（例えば前記がヘアピンを形成する場合）、“センス”鎖及び“アンチセンス”鎖と称される。“センス”鎖は、その配列が標的遺伝子の関連領域に対して広範囲に合致する場合の鎖（すなわち実質的に予想される転写生成物である鎖）であり、前記センス鎖とアニールする配列は“アンチセンス”と称される。RNAiの有効性のためには、アンチセンス鎖が標的配列と相同であること（すなわち正確に相補的であること）がより重要である。いくつかの状況下では、RNAiの開始に21ヌクレオチドのうち17で十分であるが、他の状況下では21個のうち19又は20ヌクレオチドの同一性が要求されることが知られている。一般的な水準では、二本鎖領域（すなわちデュープレックス）の中央部分ではその末端よりも高い相同性が要求されると考えられる。一定程度のサイレンシングのみが求められる状況下では、標的遺伝子生成物の部分的サイレンシング又は抑制をもたらすであろうRNAi活性の低下のために、完全な相同性からの所定の程度の欠落を個々の構築物に対して設計することができる。このような事例では、RNA構築物のアンチセンス鎖のたった1つ又は2つの塩基の変更が考えられる。他方、RNA構築物のほう一方であるセンス鎖は変異導入に対してより耐性を有する。これは、触媒的に活性を有するのはアンチセンス鎖であることによるものと考えられる。したがって、センス鎖と標的遺伝子のある領域の転写物との間の同一性の低下は、特にアンチセンス鎖が完全に前記転写物とハイブリダイズする場合は、RNAi活性を必ずしも低下させないであろう。センス鎖の変異（標的遺伝子の前記領域の転写物と同一ではない変異）は、ヘアピン構築物の配列決定の促進に有用で、さらにおそらくは他の目的、例えばヘアピン転写物のダイサープロセッシング（dicer processing）又はRNAi経路の他の局面の調節に有用であろう。
【００１１】
“ハイブリダイズする”及び“アニールする”という用語は、ヌクレオチド配列に関して本明細書では互換的に用いられ、その相補性のためにワトソン-クリック塩基対を形成することができるヌクレオチドを指す。非ワトソン-クリック塩基対形成もまた、特にRNA配列の場合は可能であることは当業者には理解されよう。例えば、いわゆる“ゆらぎペア”がRNAのグアノシンとウラシル残基との間で形成され得る。“相補的”という用語は、ワトソン-クリック塩基対形成を表示するために本明細書ではその通常の態様で用いられ、さらに“非相補的”という用語は、たとえそのような非相補性配列がゆらぎペア又は他の相互作用を生じることができるとしても、非ワトソン-クリック塩基対形成を指すために用いられる。しかしながら、本発明では、“非対形成”配列は、ワトソン-クリック塩基対を形成しない配列を特に指す。したがって、本発明のスペーシング配列又はバブル配列の具体例は、非ワトソン-クリック塩基対形成が理論的に又は実際に生じるか否かに関係なく、本明細書では非対形成配列として記載され例示される。
本明細書では“エフェクター配列”及び“エフェクター”という用語は、文脈に依存してDNA又はRNAのどちらかに関し、前記用語は、アニールされる領域内の塩基の相補性のためにアニーリングして二本鎖領域を形成する配列を指す。前記二本鎖領域は前記構築物が向けられた標的遺伝子の領域（そこでは前記エフェクター配列又はエフェクター配列と実質的に相補的な配列が標的遺伝子の領域と実質的に同一である）を決定し得る。
【００１２】
いくつかの好ましい実施態様では、前記二本鎖領域は干渉性RNA（RNAi）配列である。好ましくは、エフェクター配列の少なくとも１つは、RNA遺伝子の場合には標的遺伝子の少なくとも1つの領域と実質的に同一であり、又、DNA遺伝子の場合には標的遺伝子の少なくとも1つの領域の予想される転写物と実質的に同一である。好ましくは、第一のエフェクター配列は前記の特徴を有する。別の好ましい実施態様では、エフェクター配列はそれぞれ別個に、事情に応じて、単一の標的遺伝子の種々の領域又はそれらの予想される転写物と実質的に同一である。別の好ましい実施態様では、エフェクター配列はそれぞれ別個に、異なる標的遺伝子の領域と実質的に同一である。この文脈では、“転写物”には理論的にDNA配列によってコードされ得るRNAが含まれる（前記RNAは、その配列が実際に生成される方法に関係なく“予想される転写物”とも呼ばれる）。下記の実施態様で述べるDNAでは、エフェクター配列の少なくとも1つは標的遺伝子のある領域と実質的に同一又は相補的である（標的遺伝子がDNAである場合）。このような配列は“ターゲッティング配列”と呼ぶことができ、前記配列はサイレンシングを受ける遺伝子の領域に向けられる。このような配列はまた、構造的に“分子内自己相補性ターゲッティング配列”とも称される。
【００１３】
あるいは、二本鎖領域はいわゆる“ステム（stem）”配列を形成することができる。いくつかの実施態様では、1つ又は2つ以上のエフェクター配列は、それに対して実質的に相補的な配列と異なる長さを有するであろう。このような場合、対を形成しなかった部分はスペーサー配列として機能し得る。例えば、エフェクター配列が標的遺伝子のある領域に対する同一性（又は実質的同一性）によって作製され、さらに前記に対して実質的に相補的な配列がより短いか若しくは長い場合、対を形成しない配列は標的遺伝子の対応する領域となお実質的に同一であるが、RNA中ではエフェクター配列の部分としてではなくスペーサー（例えばループ又はバブル）として機能するであろう。ある実施態様では、エフェクター配列及びこれと実質的に相補的な配列はポリヌクレオチド上で隣接し、そのような事例では、これら2つの間の領域は下記のどちらかを含むループを形成する：（i）エフェクター配列の3'末端及び相補的な配列の5'末端；又は（ii）非対合配列。
同様に、エフェクター及び相補性配列が隣接していないが、1つ又は2つ以上の他の二本鎖領域によって分離されている場合、非対合配列はバブルを形成することができる。
【００１４】
（複数の）エフェクター配列は同じ長さでも異なる長さでもよい。好ましくは、エフェクター配列は長さが少なくとも10ヌクレオチド、好ましくは長さが10−200ヌクレオチドである。より好ましくは、それらは長さが17から30、もっとも好ましくは21から23ヌクレオチドである。種々の実施態様では、エフェクター配列は長さが、それぞれ17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30ヌクレオチドであるか、又はこれらの長さの2つ又は3つ以上の任意の組合せである。
さらにまた、本明細書で用いられる“含む（comprise）” という用語（又はその文法上の変化形）は、“含有する（include）”という用語と等価であり、他の成分又は特徴の存在を排除すると解されるべきではないことは理解されよう。
第一のエフェクター配列が第二のエフェクター配列よりも長い場合、二本鎖配列の活性は強化され得ることが判明した。このような状況では、前記第二のエフェクター配列（前記は通常はいずれの特定の標的とも実質的に同一であるようには設計されない）は“ステム”と呼ぶことができる。好ましくは、前記ステム配列は長さが1から50ヌクレオチドである。適切なステム配列GACUGAA及びその相補物である。
【００１５】
バブルは、2つの非対合又は部分的非対合鎖（前記はまたスペーシング配列であろう）によって形成される。前記非対合鎖は、核酸上の二本鎖領域を架橋又は連結する少なくとも1つの非対合塩基を含む。さらに、バブルは、核酸の一方の鎖が1つ又は2つ以上のスペーサーヌクレオチドを二本鎖領域の間に含み、さらに他方の鎖がそのようなスペーサーヌクレオチドを含まない場合に形成されるであろう。この場合、二本鎖領域の結合部近くの前記他方の鎖上の末端ヌクレオチドが1つ又は2つ以上のスペーサーヌクレオチドとともにバブルを形成する。好ましくは、本発明のこの特徴のRNAは1つのループ領域及び1つ又は2つ以上のバブル領域を含む。好ましくは、バブル領域は、RNA鎖当たり1から20個の非対合ヌクレオチドを含む。より好ましくは、バブル領域は2から10個の非対合ヌクレオチドを含む。好ましい実施態様では、バブル領域は、ヌクレオチド配列AA、UU、UUA、UUAG、UUACAA又はN1AAN2を含み、ここでN1及びN2はC、G、U又はAのいずれかで、同じでも異なっていてもよい。さらに好ましい実施態様では、バブルを形成するためのこれらの各々の対抗配列は、それぞれAA、UU、UUG、UUGA、UUGUUG及びN1AAN2であり、ここでN1及びN2はC、G、U又はAのいずれかで、同じでも異なっていてもよい。
【００１６】
好ましい実施態様では、本発明の核酸は、二本鎖RNA領域の一端でバブル領域及びループによって分離された2つの二本鎖RNA領域を含む。別の好ましい実施態様では、本発明の核酸は5つの二本鎖領域を含み、前記第一及び第二、第二及び第三、第三及び第四、並びに第四及び第五の二本鎖領域はそれぞれバブル領域によって分離され、第五の二本鎖RNA領域の一端にループを有する。
別の好ましい実施態様では、配列-X-A-Y-L-Y'-B-X'-を含む構築物が提供され、式中、
Xは、標的遺伝子の第一の領域、又は領域の転写物と実質的に同一のヌクレオチド配列であり；
Yは、1つ又は2つ以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列であり；
Aは、Xよりも短いヌクレオチド配列であり；
Bは、Xよりも短いヌクレオチド配列であり、さらにAとは非相補的であり；
Lはループ配列であり；
X'はXと実質的に相補的であり；さらに
Y'はYと実質的に相補的である。
追加されたエフェクター配列を、デュープレックスを形成するための相補的配列とともに、さらにこの実施態様のAのようなスペーサー配列とともに、又はそのようなスペーサー配列を含まずに、付加することができる。
【００１７】
別の好ましい実施態様では、配列-X-A-Y-L-Y'-X'-を含む構築物が提供され、式中、
Xは、標的遺伝子の第一の領域、又は領域の転写物と実質的に同一のヌクレオチド配列であり；
Yは、1つ又は2つ以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列であり；
Aは、Xよりも短いヌクレオチド配列であり；
Lはループ配列であり；
X'はXと実質的に相補的であり；さらに
Y'はYと実質的に相補的である。
別の好ましい実施態様では、配列-X-Y-L-Y'-X'-を含む構築物が提供され、式中、
Xは、標的遺伝子の第一の領域、又は領域の転写物と実質的に同一のヌクレオチド配列であり；
Yは、1つ又は2つ以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列であり；
Lはループ配列であり；
X'はXと実質的に相補的であり；さらに
Y'はYと実質的に相補的である。
さらに別の実施態様では、Lは-P-Q-R-S-T-を含み、式中、P、Q、R、S及びTは各々1つ又は2つ以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列を表し、さらにQ及びSは互いにハイブリダイズすることができ、P及びTはハイブリダイズしないでバブルを形成し、Rは非対合ループ領域である。Pは好ましくはUU、UUA、UUAG又はUUACAAの1つである。好ましくは、バブルを形成するためこれらの各々と対抗する配列はそれぞれUU、UUG、UUGA及びUUGUUGであり、逆の場合も又同様である。ある好ましい実施態様ではRはUUCAAGAGAである。
ある実施態様では、Yは標的遺伝子の第二の領域、又は領域の転写物と実質的に同一であり、前記標的遺伝子は、Xの定義中で参照された遺伝子と同じでも異なっていてもよい。前記標的遺伝子が同じ場合、典型的には異なる領域がX及びYの標的となるであろう。
【００１８】
別の好ましい実施態様では、さらに配列C及びDを形態-C-X-A-Y-L-Y'-B-X'-D-に含む構築物が提供され、式中、
Cは、Xよりも短いヌクレオチド配列であり；
Dは、Cと非相補的なXよりも短いヌクレオチド配列である。
また別の好ましい実施態様では、配列-S-A-T-A-U-A-V-A-W-L-W'-B-V'-B-U'-B-T'-B-S'-を含む構築物が提供され、式中、
S、T、U、V及びWは各々、標的遺伝子の領域又は領域の転写物と実質的に同一のヌクレオチド配列であり；
Aは、S、T、U、V及びW よりも短いヌクレオチド配列であり（各Aは同じでも異なっていてもよい）；
Bは、S、T、U、V及びWよりも短いヌクレオチド配列であり、さらにAとは非相補的であり（各Bは同じでも異なっていてもよいが、S、T、U、V及びWがそれらの対応する相補物とアニールすることによって二本鎖構築物が配列Lの周辺で形成されるときは、各Bはその対抗するA配列と非相補的である）；
Lはループ配列であり；
S'、T'、U'、V'及びW'は、S、T、U、V及びWと実質的に相補的なヌクレオチド配列である。
当業者には理解されるところであるが、構築物全体が１つの配列として生成される必要はない。例えば、本発明のある実施態様では、少なくとも第一及び第二のエフェクター配列が任意のスペーシング配列と一緒に生成され（例えば1つのDNA配列によって転写される）、さらに前記エフェクターに実質的に相補的な配列が任意のスペーシング配列と一緒に生成される（例えば別個のDNA配列から転写される）。2つ又は3つ以上のDNA配列が別個のプロモーターの制御下に存在することができる。いずれのループ配列もどちらかの転写物に結合させることができるが、又、ループの一部を一方の転写物の3'末端及び他方の転写物の5'末端に結合させてさらに連結を実施することもできる。前記RNA構築物をDNA構築物によって細胞にデリバリーする場合は、この実施態様では、前記2つの転写物は別個に生成され、続いて少なくとも第一及び第二のエフェクター配列とそれらの相補物との間のアニーリングによりハイブリダイズされる。
【００１９】
本発明のさらに別の特徴では、上記に記載のリボ核酸のいずれかをコードする核酸構築物が提供される。好ましい実施態様では、この構築物はデオキシリボ核酸（DNA）構築物である。ある実施態様では、DNA構築物は、遺伝子サイレンシング技術で干渉性RNAとして使用するために適したリボ核酸（RNA）をコードする配列を含み、前記構築物は、5'から3'方向に少なくとも第一のエフェクター-コード配列、第二のエフェクター-コード配列、前記第二のエフェクター-コード配列と実質的に相補的な配列、及び前記第一のエフェクター-コード配列と実質的に相補的な配列を含み、前記相補的な配列の転写物は対応するエフェクター-コード配列の転写物と二本鎖領域を形成することができる。本発明のこの特徴の実施態様では、第一のエフェクター-コード配列は、1つ又は2つ以上のヌクレオチドの第一のスペーシング配列によって第二のエフェクター-コード配列から隔てられる。好ましくは、前記第二のエフェクター-コード配列と実質的に相補的な配列は、1つまたは2つ以上のヌクレオチドの第二のスペーシング配列によって第一のエフェクター-コード配列と実質的に相補的な配列から隔てられる。好ましくは、前記第二のスペーシング配列は前記第一のスペーシング配列とアニーリングしない。したがって、この実施態様の核酸構築物のRNA（又は前記核酸構築物によってコードされるRNA）は、少なくとも1つの二本鎖RNA領域がスペーシング（非対形成）配列によって隣接する二本鎖RNA領域から隔てられるように折り畳まれることができ、前記スペーシング配列はいわゆるバブルを形成する。好ましくは、前記核酸構築物はさらに、第二のエフェクター配列と前記エフェクター配列と実質的に相補的な配列との間にスペーシング配列を含み、この場合、この実施態様の核酸構築物のRNA（又は前記核酸構築物によってコードされるRNA）は、ループを形成し、前記ループ付近で前記RNAは折り畳まれ、前記第二のエフェクター配列と前記第二のエフェクター配列と実質的に相補的な配列との間に二本鎖領域を形成する。
【００２０】
さらに別の特徴では、本発明は、標的遺伝子のサイレンシングのために遺伝子サイレンシング技術で干渉性RNAとして使用するために適したリボ核酸（RNA）をコードする配列を含む核酸構築物を提供する。前記構築物は、5'から3'方向に少なくとも第一のエフェクター-コード配列、第二のエフェクター-コード配列、前記第二のエフェクター-コード配列と実質的に相補的な配列、及び前記第一のエフェクター-コード配列と実質的に相補的な配列を含み、前記相補的な配列の転写物はそれらの対応するエフェクター-コード配列と二本鎖領域を形成することができ、さらにこれら配列の少なくとも1つは、標的遺伝子のある領域と実質的に同一である。
好ましくは、前記核酸構築物はさらに1つ又は2つ以上のヌクレオチドのスペーシング配列を含み、前記コード配列のいずれの2つもスペーシング配列によって隔てられる。より好ましい実施態様では、前記第一のエフェクター-コード配列は前記スペーシング配列によって前記第二のエフェクター-コード配列から隔てられ、及び／又は前記第一のエフェクター-コード配列と実質的に相補的な配列は前記スペーシング配列によって前記第一のエフェクター-コード配列から隔てられる。
さらに好ましい実施態様では、前記核酸構築物はさらに追加のスペーシング配列を含む。好ましい実施態様では、前記追加のスペーシング配列によって、第一のエフェクター-コード配列は、第二のエフェクター-コード配列から隔てられるか、第二のエフェクター-コード配列と実質的に相補的な配列は、第一のエフェクター-コード配列と実質的に相補的な配列から隔てられ、前記第一のスペーシング配列の転写物は前記追加のスペーシング配列の転写物とアニールしない。
【００２１】
本発明の核酸構築物又はRNAは通常は組換え分子又は単離分子であろう。
さらに好ましい実施態様では、前記核酸構築物は、第二のエフェクター-コード配列と前記第二のエフェクター-コード配列に実質的に相補的な配列との間に1つ又は2つ以上のヌクレオチドのスペーシング配列を含む。
好ましくは、前記核酸構築物はさらに、第二のエフェクター-コード配列と前記第二のエフェクター-コード配列に実質的に相補的な配列との間にループコード配列を含む。前記ループはヘアピンの“ヒンジ”を形成する。ある実施態様では、前記ループの配列は5'TTCAAGAGA3'である。さらに別に実施態様では、前記ループ配列は5'TTTGTGTAG3'である。
好ましくは、前記構築物は、プラスミド、バクテリオファージ及びウイルスを基礎にしたベクターからなる群から選択されるDNAベクターに由来する。好ましくは、前記DNA構築物は遺伝子サイレンシング技術で干渉性RNAとして使用するために適したRNAの製造に適切である。より好ましくは、前記構築物は遺伝子サイレンシングが惹起される細胞内に導入され、干渉性RNAをこの細胞内で転写することができる。
好ましくは、前記第一のエフェクター配列又はその相補性配列は、標的遺伝子のある領域と実質的に同一であるか、又は実質的に相補的である。ある実施態様では、前記第二のエフェクター配列又はその相補性配列は、同じ又は異なる標的遺伝子の同じ又は異なる領域と実質的に同一である。別の実施態様では、前記第二のエフェクター配列又はその相補性配列は、異なる標的遺伝子のある領域と実質的に同一である。
【００２２】
別の実施態様では、前記DNA構築物は5個までのエフェクター-コード配列を含む。コードされたエフェクター配列又はそれらの相補性配列の各々は標的遺伝子のある領域と実質的に同一である。前記コードされたエフェクター配列又はそれらの相補性配列は、異なる標的遺伝子の領域と実質的に同一であるか、又は同じ標的遺伝子の異なる領域と実質的に同一である。
本発明の構築物はさらに、RNAの転写を惹起させる1つ又は2つ以上の調節エレメント含むことができる。好ましくは、前記調節エレメントの少なくとも1つはプロモーターであり、前記は本発明の核酸をコードする構築物の一部分に機能的に連結される。多様なプロモーターがポリヌクレオチドベクターに含有されるであろう。プロモーター選択に影響を与える因子には、オリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド配列の誘導性転写を所望するか否か、プロモーターの強さ、及び転写が惹起されるin vivo又はin vitro環境下で発現を誘導するプロモーターの適切性が含まれる。好ましい実施態様では、プロモーターはRNAポリメラーゼIII（pol III）プロモーター、例えばU6又はH1プロモーターである。
本発明の構築物の1つ又は2つ以上の調節エレメントはターミネーター配列であろう。このようなターミネーター配列は本発明の核酸をコードする構築物の一部分に機能的に連結し、転写される核酸の3'末端の配列を決定することができる。種々のクラスのRNAポリメラーゼのためのターミネーターが当業者に知られている。ある実施態様では、前記ターミネーターはpol IIターミネーターである。別の実施態様では、前記ターミネーターはpol IIIターミネーターである。好ましくは、pol IIIターミネーターには配列TTTTT又はTTTTTTが含まれる。
【００２３】
さらにまた、このような構築物はしばしば選別マーカー又は配列（例えばアンピシリン耐性）及び／又は制限酵素部位を含むことは理解されよう。
好ましい実施態様では、本核酸構築物は、プロモーター；少なくとも第一のエフェクター-コード配列；第二のエフェクター-コード配列；第二のエフェクター-コード配列と実質的に相補的な配列；第一のエフェクター-コード配列と実質的に相補的な配列、及びターミネーター配列を含む転写単位を含み、前記プロモーター、エフェクター配列、エフェクター配列に相補的な配列及びターミネーターは機能的に連結されている。前記核酸構築物は、上記に記載した転写単位の他にさらに少なくとももう1つの転写単位を含むことができ、前記転写単位は遺伝子サイレンシング技術で使用される干渉性RNAとしての使用に適したRNAをコードする。本発明との関連において“機能的に連結される”とは、核酸の転写が、前記核酸が連結されている調節エレメントによって調節されることを意味する。好ましくは、これらはベクター内に取り込まれている。
前記DNA構築物に調節エレメント及び他のエレメントを当業界で公知の方法によって挿入し、遺伝子サイレンシング技術で干渉性RNAとして使用するために適したRNAの転写を最適化することができる。
デオキシリボ核酸（DNA）及びリボ核酸（RNA）に改変ヌクレオチドを含ませることができることは当業者には明白であろう。したがって、本発明のRNAには主としてウラシル（U）、グアノシン（G）、シトシン（C）及びアデノシン（A）のいずれか又は全てを含む核酸が含まれるが、しかしながら改変又は変異ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体もまたRNA配列内に含有されるであろう。同様に、DNAは主としてデオキシリボヌクレオチドであるチミジン（T）、グアノシン（G）、シトシン（C）及びアデノシン（A）のいずれか又は全てを含むが、しかしながら改変又は変異ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体もまたDNA配列内に含有されるであろう。
【００２４】
本発明の別の特徴では、本発明の構築物からRNAを製造する方法が提供される。前記RNAは好ましくは遺伝子サイレンシング技術で使用されるRNAiである。前記RNAは、本発明の構築物を細胞内に導入した後で前記構築物からin vitro又はin vivo技術によって製造することができる。本明細書では、“サイレンシング”とは発現の低下を意味するが、発現の妨害に限定されない。
本発明のまた別の特徴では、標的遺伝子の発現を許容し、RNAi技術によってサイレンシングされるべき標的遺伝子を含む細胞又は他の系もしくは環境（例えば細胞溶解物、組織、in vitro系などを含む）に本発明の核酸又は構築物を導入することによって標的遺伝子の発現を阻害する方法が提供される。好ましい実施態様では、多数の標的遺伝子又は遺伝子の多数の標的がサイレンシングされる。
多様なベクターを用いて本発明の核酸又は核酸をコードする構築物を細胞に導入することができる。ウイルスを基礎としたベクター、例えばアデノウイルス、レンチウイルス又はレトロウイルスに関連するものを用いることができる。本発明の核酸の発現はin vitro、ex vivo又はin vivoで生じるであろう。本発明の構築物の細胞内への導入後の核酸の発現は安定的（すなわち長期的）又は一過性であろう。アデノ付随ウイルスは好ましいベクターである。他の好ましいベクターはレトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクターである。
【００２５】
本発明のこの特徴の方法を用いて、多数の遺伝子の不活化及び／又はある遺伝子（例えばオンコジーン）の完全な不活化が有益である遺伝子療法に応用できる。例えば、ウイルスゲノムの2つ又は3つ以上の領域又はウイルスの2つ又は3つ以上の遺伝子を標的とすることによってウイルスを制御し、それによってウイルスが変異して特定のDNA構築物の作用に対して耐性を獲得する可能性を減少させることができる。さらにまた、本発明の核酸又は構築物を用いて、単一のウイルス遺伝子内の複数の部位を標的とすることができる。ウイルス制御における又別の潜在的使用可能性は、ウイルス遺伝子及びウイルス複製に必要な宿主遺伝子の両方を不活化する単一の構築物設計であろう。このような使用及び方法は本発明の範囲内に包含される。したがって、本発明の方法を用いて、ヒトの免疫不全ウイルス（HIV）の2つまたは3つ以上の遺伝子を不活化するか、又は1つまたは2つ以上のHIVの遺伝子、及び宿主細胞上の1つ又は2つ以上のHIVレセプター（例えばCCR4レセプター）を不活化することができる。
癌では、しばしば変異が多数の遺伝子に発生する。遺伝子療法によるアプローチのためには、腫瘍の発育に必要な2つ又は3つ以上の重要な遺伝子の不活化が、ただ1つの遺伝子を不活化するDNA構築物よりも癌細胞増殖の制御においてより有効であることをおそらく証明できるだろう。例えば、特定の腫瘍タイプの発達は、2つの異なる遺伝子によって制御される2つのシグナリング経路の累積的作用によって促進されるであろう。2つの遺伝子の同時不活化は腫瘍増殖のより迅速な制御をもたらすであろう。さらにまた、腫瘍の発達は異なる遺伝子によって制御される2つのまた別の経路を必要とする可能性があり、したがって両経路の阻害は腫瘍発達の効果的な阻害の要件であろう。
【００２６】
本発明のこの特徴の方法は、植物及び動物（ヒトを含む）の疾患の治療及び／又は予防に有用であろう。本方法は、遺伝子を高い特異性で標的化することができ、副作用の可能性を減少させることができるという点で他の多くの治療より有利である。
マルチ遺伝子不活化戦略はまた標的同定及び遺伝子機能の研究でおそらく有用であろう。例えば、本発明のDNA構築物は、前記構築物が単一の遺伝子Aを前記遺伝子に対する1つの標的配列を保有することによって不活化できるように設計することができる。遺伝子Aが発現されない環境下で特定の遺伝子の発現を阻害することによる表現型の作用を確立するために、他の配列をマルチ標的構築物に含めることができる。例えば、ランダムショットガンライブラリーの配列を、遺伝子Aのための標的配列を既に保有するDNA構築物にクローニングすることができる。したがって、このようなライブラリーを用い、第一の遺伝子もまた不活化されるバックグラウンドの中で、未知の機能をもつ遺伝子をスクリーニングすることができる。
RNAi技術によって標的化される標的遺伝子の領域は、経験的又は種々のアルゴリズムを含む手段によって予想できる。2つ以上の最適な標的配列が存在する場合は、そのような標的配列の全てを1つの構築物に含めることができる。
本発明の構築物又は核酸中の種々の非相補性バブル形成配列又はバブルコード配列は、遺伝子サイレンシングに関して種々の活性を有することができる。したがって、バブル配列のランダムライブラリーを作製し、任意の与えられた用途又はシステムのための遺伝子サイレンシング活性に必要な最適な配列を決定することができる。このような方法は、DNA構築物のバブル配列に沿って特定の位置に1つ又は2つ以上のランダム化したヌクレオチドを挿入し、隣接する二本鎖形成領域によってコードされる干渉性RNAの活性をテストする工程を含むことができる。このようなバブル配列は長さが10ヌクレオチドまで又はそれ以上でもよい。好ましくは、前記バブル配列は長さが4又は6ヌクレオチドである。
【００２７】
多数の標的遺伝子を不活化する構築物をまたトランスジェニック系で用い、2つの公知の遺伝子を不活化する作用について直接スクリーニングすることができる。このようなアプローチによって、複雑な育種プログラムの要求を回避し、マルチ遺伝子不活化を保有する個々の動物を作出することができる。
本発明の核酸又は構築物を適切な環境で細胞に導入することができる。前記対象核酸又は構築物を宿主細胞にデリバリーする際に用いられる担体、賦形剤及び／又は希釈剤はヒト又は獣医領域の用途に許容できなければならない。このような担体、賦形剤及び／又は希釈剤は当業者には周知である。獣医領域の使用に適した担体及び／又は希釈剤には任意の及び全ての溶媒、分散媒体、水溶液、コーティング、抗菌及び抗カビ剤、等張剤並びに吸収遅延剤などが含まれる。活性成分に不適合である全ての通常の媒体又は薬剤を除いて、組成物における前記の使用は意図されている。補充的活性成分もまた前記組成物に取り込むことができる。
本発明の又別の特徴では、RNAi技術を用いてサイレンシングされるべき標的遺伝子を含む細胞に、本発明の構築物から生成されるRNAを導入することによって、標的遺伝子の発現を阻害する方法が提供される。
【００２８】
任意の適切なウイルスによるウイルスデリバリー系を用いて本発明のRNA又は核酸構築物をデリバリーすることができる。さらに、ハイブリッドウイルス系も有用であろう。ウイルスデリバリー系の選択は種々のパラメータ、例えばデリバリーの標的となる組織、系の形質導入効率、病原性、免疫学的及び毒性の懸念などによって左右される。本発明のRNA及び本発明の核酸構築物によってコードされるRNAによる干渉にとって扱いやすい多様な感染、疾患及び他の症状を考慮すると、全ての用途に適切なただ1つのウイルス系は存在しないことは明白である。本発明で使用するウイルスデリバリー系を選択するとき、干渉性RNA含有ウイルス粒子が好ましくは以下の性状を示す系を選択することが重要である：1）再現性及び安定性のある増殖；2）高力価で精製できる；3）標的に集中するデリバリーを媒介できる（広範囲に撒き散らすことなく問題の組織又は器官に干渉性RNAをデリバリーする）。
一般的に、遺伝子療法で用いられるウイルス系でもっとも一般的に使用される5つのクラスは、それらのゲノムが宿主細胞クロマチンに組み込まれるか（オンコレトロウイルス及びレンチウイルス）、又はもっぱら染色体外エピソームとして細胞核内に存在するか（アデノ付随ウイルス、アデノウイルス及びヘルペスウイルス）によって2つのグループに分類することができる。この相違は具体的な用途に対する各ベクターの適切性の重要な決定因子であり、非組み込みベクターはある種の条件下で非増殖細胞で持続的な遺伝子発現を媒介するが、組み込みベクターは、安定的な遺伝子の変異が分裂細胞で維持されることを必要とする場合、例えば標的細胞が迅速に増殖する癌細胞である場合には選択ツールである。
【００２９】
例えば、本発明のある実施態様では、パルボウイルス科由来のウイルスが利用される。パルボウイルス科は、小型の一本鎖でエンベロープをもたないDNAウイルス科であり約5000ヌクレオチドの長さのゲノムを有する。この科のメンバーに含まれるものは、アデノ付随ウイルス（AAV）（定義によれば生産的感染サイクルの開始及び維持に別のウイルス（典型的にアデノウイルス又はヘルペスウイルス）を必要とする非独立性パルボウイルス）である。前記のようなヘルパーウイルスが存在しなくても、AAVはなお、非分裂細胞及び分裂細胞の両方において、レセプター媒介結合及び内在化、核内侵入によって標的細胞に感染し、これに形質導入する能力を有する。
いったん核内に侵入すれば、前記ウイルスは脱殻し、トランスジーンが多数の形態（もっとも永続的な形態は環状モノマーである）から発現される。AAVは、安定的に形質導入された細胞の1−5％のゲノムに組み込まれる（Nakai et al., J. Virol. 76:11343-349(2002)）。トランスジーンの発現は非常に安定で、第IX因子のAAVデリバリーに関するある研究では、イヌのモデルで前記ウイルスのただ1回の直接輸液後4.5年間、治療レベルの前記タンパク質が発現され続けている。ヘルパーウイルスが存在しないとき子孫ウイルスはAAV感染から産生されないので、形質導入の範囲はウイルスが感染した最初の細胞にだけ限定される。しかしながら、レトロウイルス、アデノウイルス及び単純ヘルペスウイルスとは異なり、AAVはヒトへの病原性及び毒性を欠くようである（Kay et al., Nature 424:251(2003)及びThomas et al., Nature Reviews Genetics 4:346-58(2003)）。
【００３０】
典型的には、AAVのゲノムは2つの遺伝子しか含まない。“rep”遺伝子は、DNA複製で使用される少なくとも4つの別々の遺伝子をコードする。“cap”遺伝子生成物は弁別的にスプライシングされて、ウイルスのキャプシドを構成する3つのタンパク質を生成する。ゲノムが新生ウイルスにパッケージングされる際、逆方向末端反復配列（ITR）のみが必須配列である。rep及びcapをゲノムから欠落させ、選択された異種配列で置換することができる。しかしながら、AAV-系異種構築物の複製及び初期ビリオンへのパーケージに必要なタンパク質の産生のために、rep及びcapタンパク質はin transで提供されねばならない。ヘルパーウイルス（例えば上記で述べたようにアデノウイルス又はヘルペスウイルス）との同時感染で通常提供されるヘルパー機能は1つ又は2つ以上のDNA発現プラスミドの形態でtransに提供することもできる。前記ゲノムは通常は2つの遺伝子のみをコードするので、デリバリービヒクルとしてAAVのパッケージング能力は4.5キロベース（kb）の一本鎖に制限されることは驚くにあたらない。しかしながら、このサイズの制限は置換遺伝子療法のためにデリバリーすることができる遺伝子を制限するかもしれないが、それはより短い配列（例えばRNAi核酸）のパッケージング及び発現に悪影響を及ぼすことはない。
しかしながら、核酸構築物のためのビヒクルとしてAAVを用いるときは、技術的ハードルに対処する必要がある。例えば、多様な割合でヒトの集団はある種のAAV血清型に対して中和抗体を有する。しかしながら、いくつかのAAV活性型が存在し、そのうちのいくつかでは中和抗体を保有する個体の百分率は非常に低下するので、他の血清型を用いるか、又は偽型を利用してもよい。性状が決定された少なくとも8つの異なる血清型が存在し、詳細には報告されていない他の単離されたものも何十と存在する。別の制限は、AAVに対する可能な免疫反応の結果として、AAVによる療法は一度だけ実施することができるが、しかしながら非ヒト由来の血清型を交互に使用することによって反復投与が可能になるかもしれない。投与経路、血清型及びデリバリーされるゲノムの構成はいずれも組織特異性に影響を及ぼす。
【００３１】
核酸構築物を含む未改変AAVを使用する際のまた別の制限は、形質導入が非効率的であるということである。in vivoでの安定な形質導入は5−10％の細胞に限られるであろう。とはいえ、安定な形質導入レベルを高めるために当分野では種々の方法が知られている。あるアプローチは偽型の使用であり、この場合AAV-2ゲノムが他の血清型に由来するcapタンパク質を用いてパッケージされる。ある研究グループは、組織培養研究のためにAAV-1、AAV-3B、AAV-4、AAV-5及びAAV-6を用いてAAV-2の偽型を網羅的に作製した。トランスジーンの最高発現レベルは、AAV-6を用いて作製された偽型ビリオンによって誘導され、AAV-2よりもほぼ2000％高いトランスジーン発現が得られた。したがって、本発明は高い形質導入レベルを（対応する干渉性RNAの発現レベルの増加とともに）達成するために偽型化されたAAVウイルスの使用を意図する。
本発明の核酸構築物で有用なまた別のウイルスデリバリー系は、レトロウイルス科由来のウイルスによる系である。レトロウイルスは、2つの固有の特色を特徴とする一本鎖RNAの動物ウイルスである。第一に、レトロウイルスのゲノムは二倍体であり、2つのRNAコピーから成る。第二に、このRNAはビリオン付随酵素である逆転写酵素によって二本鎖DNAに転写される。続いて、この二本鎖DNA又はプロウイルスは宿主のゲノムに組み込まれ、親の細胞から子孫細胞へ安定的に組み込まれた宿主ゲノムの構成部分として受け継がれていくことができる。
【００３２】
いくつかの実施態様では、レンチウイルスは、本発明で使用されるレトロウイルス科の好ましいメンバーである。レンチウイルスベクターは、濾胞性口内炎ウイルスの糖タンパク質（VSV-G）との偽型をしばしば形成し、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）（ヒト後天的免疫不全症候群（AIDS）の病因体）；ビスナ-マエディ（ヒツジの脳炎（ビスナ）又は肺炎を引き起こす）；ウマ伝染性貧血ウイルス（EIAV）（ウマで自己免疫性溶血性貧血及び脳症を引き起こす）；ネコ免疫不全ウイルス（FIV）（ネコで免疫不全を引き起こす）；ウシ免疫不全ウイルス（BIV）（ウシでリンパ節腫脹症及びリンパ球増加症を引き起こす）；及びサル免疫不全ウイルス（SIV）（非ヒト霊長類で免疫不全及び脳症を引き起こす）から誘導された。HIVによるベクターは一般的に5％未満の親ゲノムを保持し、ゲノムの25%未満がパッケージング構築物に取り込まれ、これによって先祖帰りした複製能力を有するHIVの生成の可能性が最小限にされる。生体安全性はさらに、下流の長い末端反復（long-terminal-repeat）配列中の調節エレメントが欠失し、ベクターの可動化に必要なパッケージングシグナルの転写が排除された自己不活化ベクターの開発によって高められた。
レトロウイルスRNAゲノムの逆転写は細胞質で生じる。C-型レトロウイルスと異なり、他のウイルス因子と複合体を形成したレンチウイルスcDNA（開始前複合体（pre-initiation complex）として知られている）は核膜を通過して移動し、非分裂細胞に形質導入することができる。ウイルスcDNAの構造的特色（DNAフラップ）は効率的な核内移入に寄与しているようである。このフラップは、ウイルスのポリメラーゼ遺伝子に位置する中央のポリウリン索（cPPT）の完全性に依存し、したがって大半のレンチウイルス由来ベクターはこの配列を保持する。レンチウイルスは広範な親和性、低炎症性を有し、ベクターの組み込みをもたらす。主要な制限は、組み込みがいくつかの適用で腫瘍発生を誘発する可能性である。レンチウイルスベクターを使用する主要な利点は、遺伝子導入がほとんどの組織又は細胞タイプで永続的であるということである。
【００３３】
本発明のRNAの発現に用いることができるレンチウイルスを基礎にした構築物は、好ましくはレンチウイルスの5'及び3'LTR由来の配列を含む。より好ましくは、前記ウイルス構築物は、レンチウイルス由来の不活化された又は自己不活化3'LTRを含む。前記3'LTRは当業界で公知の任意の方法によって自己不活化することができる。好ましい実施態様では、3'LTRのU3エレメントは、そのエンハンサー配列（好ましくはTATAボックス）、Sp1及びNF-カッパB部位の欠失を含む。自己不活化3'LTRの結果として、宿主細胞ゲノムに組み込まれるプロウイルスは不活化された5'LTRを含むであろう。前記LTR配列は任意の種に由来する任意のレンチウイルス由来のLTR配列であろう。前記レンチウイルス系構築物は又MMLV若しくはMSCV、RSV又は哺乳類遺伝子のための配列を取り込むことができる。さらに、レンチウイルスの5'LTR由来のU3配列は前記ウイルス構築物のプロモーター配列で置き換えることができる。これによってパッケージング用細胞株から回収されるウイルス力価を増加させることができる。エンハンサー配列もまた含めることができる。
【００３４】
アデノウイルスはエンベロープを持たないウイルスで、直鎖状の二本鎖DNAゲノムを含む。アデノウイルスには40を超える血清型の株（それらの大半はヒトで両性の気道感染を引き起こす）が存在するが、ベクターとしてはサブグループCの血清型2又は5がもっぱら用いられる。アデノウイルスのライフサイクルは通常は宿主細胞ゲノムへの組み込みを必要とせず、むしろ宿主細胞の核内でエピソームエレメントとして複製し、結果として挿入による変異誘発の危険性は無い。野生型のアデノウイルスゲノムは約35kbであり、そのうちの30kbまでを外来DNAで置換することができる。4つの初期転写単位（E1、E2、E3及びE4）（それらは調節機能を有する）及び後期転写物（前記は構造タンパク質をコードする）が存在する。原始ベクターはE1又はE3遺伝子のどちらかが不活化されており、失われている遺伝子は、ヘルパーウイルス、プラスミドによるか又はヘルパー細胞ゲノムに組み込まれた遺伝子によってtransに供給される。第二世代ベクターはさらにE2a温度感受性変異体又はE4欠失を用いる。もっとも最近の“ガットレス”ベクターは倒置末端リピート（ITR）及びトランスジーン周辺のパッケージング配列のみを含み、必要なウイルス遺伝子は全てヘルパーウイルスによってtransに提供される。
【００３５】
アデノウイルスベクターは、in vitro及びin vivoの標的細胞の形質導入に非常に効率がよく、高力価（＞1011/mL）で産生することができる。E1欠失ベクターを用いてラットの脳での長期間のトランスジーン発現を示した一実験を除けば、原ベクターからのトランスジーンのin vivo発現は一過性の傾向がある。静脈内注射をすると、投与されたベクターの90％が非免疫媒介メカニズムによって肝臓で分解される。その後、MHCクラスI拘束免疫応答がCD8+のCTLにより発生し、ウイルス感染細胞を排除し、さらにCD4+細胞がIFN-アルファを分泌し、これによって抗アデノウイルス抗体が生じる。アデノウイルスの改変によっていくつかのCTLエピトープを除去することができるが、しかしながら認識されるエピトープは宿主のMHCハロタイプにより相違する。破壊されない細胞では、残留するベクターはそれらのプロモーターが不活化され、持続的抗体がその後のベクター投与を妨げる。
一時的な免疫抑制療法を含む免疫応答を回避するためのアプローチは、長期のトランスジーン発現及び二次的遺伝子導入の達成に有効であった。干渉性の低い方法は、宿主にUV不活化ベクターを補給することによって経口寛容性を誘導することであった。しかしながら、免疫抑制を通して宿主を操作するよりもベクターを操作するほうが望ましい。複製欠損ベクターだけが用いられるが、ウイルスタンパク質が非常に低いレベルで発現され、続いて前記タンパク質は免疫系に提示される。より少ない遺伝子を含むベクター（ウイルスコード配列を全く含まない“ガットレス”ベクターがその極みであるが）の開発によって、肝組織でのトランスジーンのin vivo発現の長期化がもたらされた。しかしながら、アデノウイルスのタンパク質（その大半は分解され、免疫系に提示される）にパッケージされたDNAの初期のデリバリーは、なお臨床試験で問題を引き起こすであろう。
【００３６】
最近までアデノウイルスが宿主細胞を標的化するメカニズムはほとんど理解されてなかった。組織特異的発現はしたがって、細胞性プロモーター/エンハンサー（例えばミオシン軽鎖1プロモーター又は平滑筋細胞SM22aプロモーター）を用いるか、又は局所領域へ直接デリバリーすることによってのみ可能であった。アデノウイルスの取り込みは二段階プロセスであることが示された。前記プロセスは、アデノウイルスの線維コートタンパク質と細胞レセプター（MHCクラスI分子及びコクサッキーウイルス-アデノウイルスレセプターを含む）との最初の相互反応を含む。続いて、アデノウイルス粒子のペントンベースタンパク質が細胞表面のヘテロダイマーのインテグリンファミリーと結合し、レセプター媒介エンドサイトーシスによる内在化が可能になる。ほとんどの細胞が、アデノウイルスフィバーコートタンパク質のための主要なレセプターを発現するが、内在化はより選択的である。ウイルスの取り込みを増加させる方法には、適切なインテグリンの発現のために細胞を刺激すること、及び標的細胞タイプに特異性を有する抗体をアデノウイルスに結合させることが含まれる。しかしながら、抗体の使用は、ベクターの製造の困難さ、及び補体系活性化の潜在的リスクを増加させる。
【００３７】
本発明のウイルスデリバリーベクターのための基礎として用いることができるまた別のウイルスは1型単純ヘルペスウイルスである。HSV-1は二本鎖のDNAウイルスであり、40kb又は150kbまで（ヘルパー依存性）のパッケージング能力を有する。HSV-1はニューロンに対し強い親和性を有するが、また高い炎症性も有する。HSV-1はエピソームとして維持される。複製欠損HSV-1ベクターは、一般的には、5つの前初期遺伝子（ICP0、ICP4、ICP22、ICP27及びICP47）の全て又は組合せを欠失させることによって生成される（前初期遺伝子は溶解性感染及び他の全てのウイルスタンパク質の発現に必要である）。残念ながら、ICP0遺伝子生成物は細胞毒性を有しさらに高レベルで持続的なトランスジーンの発現ためにも必要である。したがって、毒性の無い前初期5成分変異ベクターの作成は、効率的で持続的トランスジーンの発現とは相反する。潜伏期に活性化されるHSV-1タンパク質はICP0の変異を補足し、ICP0が存在しないことにより生じるトランスジーンの発現抑制を克服することが最近になって示された。ICP0に代わってこのタンパク質を代用することによって、非神経細胞で細胞毒性を示すことなくトランスジーンの効率的な発現が促進されるかもしれない。HSV-1ニューロン特異的、潜伏期活性化プロモーターの1つをトランスジーンの発現を駆動するために用いることによって、長期発現を達成することができる。
【００３８】
当業者に公知の他のウイルス系又は非ウイルス系を用いて、本発明のRNA又は核酸構築物を問題の細胞にデリバリーすることができる。前記系には以下が含まれるが、ただしこれらに限定されない：宿主細胞への組み込みを介しウイルスによってコードされるトランスジーンをin vivoで安定的に維持する、遺伝子欠損アデノウイルス-トランスポゾンベクター（Yant et al., Nature Biotech. 20:999-1004 (2002)）；シンドビスウイルス又はセムリキ森林ウイルスに由来する系（Perri et al., J. Virol. 74(20):9802-07 (2002)）；ニューカッスル病ウイルス又はセンダイウイルスに由来する系；又は最近のDNA配列を除いたミニ環状DNAベクター（Chen et al., Molecular Therapy 8（3）：495-500 （2003））。さらにまた、ハイブリッドウイルス系も、2つまたは3つ以上のウイルス系の有用な特性を組み合わせるために用いることができる。
ウイルスを基礎にした核酸構築物を標的細胞にデリバリーするために、先ず初めに核酸構築物をウイルス粒子にパッケージする必要がある。当業界で公知の任意の方法を用いて感染性ウイルス粒子（そのゲノムはウイルス構築物コピーを含む）を生成することができる。例えば、ある方法は、核酸構築物のウイルス粒子内への取り込みに必要なウイルスタンパク質をtransで安定的に発現するパッケージング細胞、および、具体的なウイルスデリバリー系に必要な若しくは好ましい他の配列（例えば複製、構造タンパク質及びウイルスアッセンブリーに必要な配列）及び組織への進入のためのウイルス由来若しくは人工的リガンドを利用する。このような方法では、核酸構築物はウイルスデリバリーベクターに連結され、得られたウイルス核酸構築物を用いて、パッケージング細胞にトランスフェクションする。続いて前記パッケージング細胞はウイルス配列を複製し、ウイルスタンパク質を発現し、ウイルス核酸構築物を感染性ウイルス粒子にパッケージングする。パッケージング細胞株は、ウイルスタンパク質を発現することができる任意の細胞株であろう。前記には293、HeLa、A549、PerC6、D17、MDCK、BHK、ビングチェリー（bing cherry）、フェニックス、Cf2Th、又は当業者に公知であるか若しくは当業者によって開発された他の任意の株が含まれるが、ただしこれらに限定されない。例えば米国特許6,218,181号にパッケージング細胞が記載されている。
【００３９】
あるいは、必要なウイルスタンパク質を安定的に発現しない細胞株を2つ又は3つ以上の構築物で同時トランスフェクションして、効率的な機能性粒子の生成を達成することができる。前記構築物の1つは本発明の核酸構築物を含み、他のプラスミドは、細胞に機能的ウイルス（複製及びパッケージング構築物）とともに他のヘルパー機能を生成させるために必要なタンパク質をコードする核酸を含む。この方法は、ウイルス複製及びパッケージング遺伝子を安定的に発現しないパッケージング用細胞を利用する。この場合には、核酸構築物はウイルスデリバリーベクターに連結され、続いて1つ又は2つ以上のベクター（感染性ウイルス粒子の複製及び生成に必要なウイルス配列を発現する）とともに同時トランスフェクションされる。前記細胞はウイルスの配列を複製し、ウイルスタンパク質を発現し、さらにウイルス核酸構築物を感染性ウイルス粒子にパッケージする。
パッケージング細胞株又は複製及びパッケージング構築物はエンベロープ遺伝子生成物を発現しなくてもよい。これらの実施態様では、エンベロープ遺伝子をコードする遺伝子は別個の構築物で提供することができ、前記別個の構築物はウイルス核酸構築物とともに同時トランスフェクションされる。部分的には、エンベロープタンパク質は、ウイルス粒子の宿主域のために必須であるので、前記ウイルスは偽型化することができる。上記に記載したように、“偽型”ウイルスは、そのゲノムが由来するウイルス以外のウイルス由来のエンベロープタンパク質をもつウイルス粒子である。当業者は、使用されるウイルスデリバリー系に適した偽型及び標的とされる細胞を選択することができる。特異的な宿主域を付与する他に、選択された偽型は非常に高い力価でのウイルスの濃縮を可能にすることができる。あるいは、ウイルスは、特定の種に感染が限定されるエコトロピックエンベロープタンパク質で偽型化することができる（例えばエコトロピックエンベロープは、例えばネズミ細胞のみへの感染を許容し、この場合両親和性（アンホトロピック）エンベロープは例えばヒトとネズミの両細胞への感染を許容する）。さらにまた、遺伝的に改変されたリガンドを細胞特異的ターゲッティングに用いることができる。
パッケージング細胞株で産生された後、核酸構築物を含有するウイルス粒子を精製し定量する（力価を測定する）。精製方法には、密度勾配遠心沈殿、又は好ましくはカラムクロマトグラフィー法が含まれる。
【００４０】
本発明のまた別の特徴では、RNAiでの有効性について核酸配列をテストする方法が提供される。前記方法は以下の工程を含む：テストされるべきRNAi領域をコードするDNAを本発明の構築物に挿入する工程；前記構築物を前記RNAi領域に対応する標的遺伝子を含む細胞に導入する工程；前記構築物からRNAを生成させ、さらに前記標的遺伝子の発現に対する影響を評価する工程。
本発明のさらに別の特徴では、ロングレンジPCR技術を用いて本発明の構築物を製造する方法が提供される。ある実施態様では、予め定めたオリゴヌクレオチド（前記は第一の部分配列と第二の部分配列に分割される）をポリメラーゼ連鎖反応プロセスによってポリヌクレオチドに付加する方法が提供され、前記方法は以下の工程を含む：
第一のプライマー及び第二のプライマーを提供する工程であって、前記第一のプライマーが、その3'末端にポリメラーゼ連鎖反応条件下で前記ポリヌクレオチドの少なくとも第一の部分とハイブリダイズすることができる固定化部を有し、その5'末端に前記第一の部分配列と同一のエフェクター部を有し、前記第二のプライマーが、その3'末端に前記ポリヌクレオチドの第一の部分に隣接する前記ポリヌクレオチドの少なくとも第二の部分とハイブリダイズすることができる固定化部を有し、さらにその5'末端に前記第二の部分配列と同一のエフェクター部を有する、前記工程；
各プライマーの前記固定化部が前記ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるように、前記プライマーをポリメラーゼ連鎖反応条件下で前記ヌクレオチドに導入する工程；
マルチポリメラーゼ連鎖反応を実施して、二本鎖配列の末端に前記プライマーのエフェクター部を含む増幅生成物を製造する工程；および、
前記エフェクター部の末端を一緒に連結して、一体化したポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド配列を形成する工程。
【００４１】
さらに明瞭にするために、構築物の作製を目的とする本発明のこの実施態様のこの説明では、“エフェクター”という用語は、簡便のため及び適切な用語として用いられるが、しかしながら、上記のRNA及びDNA構築物自体を述べるためにこの用語が用いられている文脈とは異なる文脈で用いられている。したがって、この用語は、前出の「本明細書では“エフェクター配列”及び“エフェクター”という用語は」で始まる上記のパラグラフでこの用語が記載されている態様とは異なる文脈で用いられている。この実施態様及び関連する特許請求の範囲の“エフェクター”という用語は、上述した“エフェクター”の意味の限定を持ち込まない文脈内で解釈されるべきである。前記はまた“可変”配列とも称することができる。なぜならば、前記は構築物間で変動する配列を広く含むからである。
この方法における“オリゴヌクレオチド”とは、長さが40から100、好ましくは100未満のヌクレオチドの核酸配列を意味する。前記オリゴヌクレオチドは一本鎖でも又は二本鎖でもよい。好ましくは、前記オリゴヌクレオチドはDNAである。
この方法における“ポリヌクレオチド”とは、長さが少なくとも約1000ヌクレオチドの核酸配列を意味する。前記ポリヌクレオチドは、本発明の方法の段階に応じて一本鎖又は二本鎖であり得る。前記ポリヌクレオチドは、二本鎖環状構造又は直鎖形を有するか、又は先に環状二本鎖配列であったものの直鎖化された形態でもよい。好ましくは、前記ポリヌクレオチドはDNAである。本発明の好ましい実施態様では、前記ポリヌクレオチドは、プラスミド、バクテリオファージ及びウイルス系ベクターからなる群から選択されるDNAベクターである。
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の効率は、例えば変性、アニーリング及びポリマー形成時間、サイクルのタイミング並びに反応混合物の塩濃度によって変化させることができることは、当業者には理解されよう。PCR反応を起こさせるこれらの条件及び他の条件の変化型は、“ポリメラーゼ連鎖反応条件”という用語に包含されている。さらにまた、一連の生成物が与えられたPCR反応から生成されることは当業者には理解されるところである。これらの生成物は、当業界で公知の方法（例えばゲル電気泳動）によってサイズ又は重量によって分離することができる。本発明の好ましい実施態様では、所望のPCR生成物は溶液から単離される。
【００４２】
本発明のこの特徴のロングレンジPCR法を用いて、ベクターであるDNAポリヌクレオチドにDNAオリゴヌクレオチドを挿入し、前記オリゴヌクレオチドをリボ核酸配列（RNA）に転写させることができる構築物を形成することができる。転写はオリゴヌクレオチドのみから生じてもよいし、又はRNA転写はオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド配列の組合せの転写の結果であってもよい。転写されたRNAはさらにタンパク質に翻訳されてもよいし、又は非翻訳RNAとして保持されてもよい。本発明のこの特徴の好ましい実施態様では、前記プライマーは前記ポリヌクレオチド配列中の制限酵素部位と相同性を有する。本発明のこの特徴のさらに好ましい実施態様では、前記プライマーはリン酸化され、増幅生成物の連結はT4DNAリガーゼによって触媒される。
このロングレンジPCR法の方法で用いられるポリヌクレオチドは、1つ又は2つ以上の調節エレメントを含み、転写を起こさせることができる。好ましくは、前記調節エレメントの少なくとも1つはプロモーターである。多様なプロモーターを前記ポリヌクレオチドベクターに含ませることができる。プロモーターの選択に影響を及ぼす因子には、前記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列の誘導転写を所望するか否か、プロモーターの強さ、及び転写が惹起されるin vivo若しくはin vitro環境での発現誘導のためのプロモーターの適切性が含まれる。好ましい実施態様では、前記プロモーターはRNAポリメラーゼIII（pol III）プロモーター、例えばU6又はH1プロモーターである。
この方法の特徴における好ましい実施態様では、前記オリゴヌクレオチドは、逆方向反復配列の存在のために二本鎖ヘアピン構造を形成することができるRNA配列をコードする。好ましくは、第一のプライマーは、逆方向反復配列のほぼ1/2をそのエフェクター部に含み、第二のプライマーはそのエフェクター部に前記逆方向反復配列のほぼもう片方含む。より好ましくは、前記第一及び第二のプライマーはさらに、前記ヘアピンループRNA構造のループ領域を形成する、少なくとも1つのヌクレオチドをそれらの5'末端に含む。
【００４３】
本発明のこの特徴のまた別の実施態様では、エフェクター部は少なくとも部分的に相補的であり、したがって転写されると（上記のようにポリヌクレオチドを取り込んだベクターによる細胞のトランスフェクションの後）、それらの対応するRNA転写物はそれらの配列の相補性のために互いにハイブリダイズすることができる。
さらに好ましい実施態様では、本発明のこの特徴の方法で用いられるオリゴヌクレオチドは、遺伝子サイレンシング技術で干渉性RNAとして用いるために適したRNAをコードすることができる。このような技術はPCT/AU99/00195の明細書に開示されている。好ましくは、前記RNAはヘアピンループ構造を有する。
別の実施態様では、前記オリゴヌクレオチドは制限部位をコードし、前記オリゴヌクレオチドのポリヌクレオチドへの付加によって、一体化されたオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド配列中への制限部位の挿入がもたらされる。前記ポリヌクレオチドがベクター（例えばプラスミド）である場合、制限部位の挿入はその後のプラスミドの使用（特にサブクローニングの目的での使用）において多くの利点を有することを当業者には理解されよう。
さらに別の実施態様では、前記オリゴヌクレオチドは、遺伝子のイントロン（又は非コード）配列を含む。前記ポリヌクレオチドは遺伝子のコード配列を含むことができる。したがって、本発明の方法を用いるオリゴヌクレオチドのポリヌクレオチドへの付加は、遺伝子のコード配列中の適切な部位にイントロンの挿入を可能にすることができる。遺伝子のコード配列へのイントロンの挿入は多くの実際的な用途を有する。例えば、DNA構築物へのイントロンの挿入はトランスジーンの発現を高めることが示された。別の可能な応用は、遺伝子のサイレンシング誘導のために二本鎖RNAをデリバリーする手段としてイントロンを使用することである。
【００４４】
本発明のこの特徴のまた別の特徴では、本発明の方法にしたがってポリヌクレオチドへオリゴヌクレオチドを付加することによって生成されるDNA構築物が提供される。このDNA構築物は更なるサブクローニングのために有用で、それによって問題の第二のオリゴヌクレオチドを例えば公知のサブクローニング技術によって導入することができる。前記DNA構築物はまた、RNA及び／又はタンパク質の更なる製造のための発現構築物であってもよい。好ましくは、前記DNA構築物は、遺伝子サイレンシング技術で干渉性RNAとして使用するために適切なRNAを製造するために適している。より好ましくは、前記構築物は遺伝子サイレンシングが惹起される細胞内に導入され、干渉性RNAをこの細胞内で転写することができる。
本発明のまた別の特徴では、本発明の方法で使用するために適したプライマーが提供される。本発明のさらに別の特徴では、さらに別に付加されるオリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを製造するためのポリヌクレオチド及びプライマー対を含むキットが提供される。
本発明のこの特徴のさらに別の実施態様では、本発明のロングレンジPCR法を自動化工程で用いて多数のヘアピンDNAプラスミドを大規模に製造する方法が提供される。ロングレンジPCR法の単純さは、DNA鋳型を増幅し、これらを連結してDNAベクターを製造するロボットシステムを用いる自動化を可能にする。また、このようなベクターを用いて細菌を形質転換して、前記ベクターの実質的コピー数を増大させることができる。このようにして、例えば単一の遺伝子の種々の領域を標的とする多数のプラスミドを迅速に製造することができるであろう。
【００４５】
本発明のさらに別の特徴では、ロングレンジPCR技術を用いて配列ライブラリーを製造する方法が提供される。この事例では、フォワード及びリバースプライマーの一方又は両方の部分がリダンダントオリゴヌクレオチドを用いて合成される。増幅、連結及び細菌の形質転換後、個々のコロニーは、個々のプラスミドに個々の増幅プライマーによって取り込まれた特定のリダンダンシーを示す固有のヘアピン構築物を含む。このようにして、例えばランダムなループ配列を有するライブラリーを調製し、前記ライブラリーの個々のプラスミドをジーンサイレンシング活性について分析し、ヘアピンDNA構築物の活性を強化するループ配列を明らかにする。
本発明のまた別の特徴では、本発明のロングレンジPCRの方法を用いて核酸構築物を構築するキットが提供される。前記キットは、本発明のロングレンジPCRに適した割合でポリヌクレオチド、ポリメラーゼ、第一のプライマー、第二のプライマー及び連結酵素を含む。
本発明のまた別の特徴では、本発明の構築物の製造で使用するために適したベクターを含む、標的遺伝子の発現を阻害するキットが提供される。このようなベクターは、調節エレメント及び本発明にしたがって設計された核酸をコードするカセットの挿入のための能力を有する。
いずれの理論又は作用態様にも拘束されないが、本発明はダイサー（Dicer）及びドローシャ（Drosha）を含む酵素によって媒介されると考えられる。少なくともこれら2つのリボヌクレアーゼ（両者ともRNase IIIクラスのメンバーである）は二本鎖RNAをsiRNAに処理する過程で中心的な役割を果たす。
【００４６】
ダイサーは性状がもっとも明らかにされた成分である。ダイサーは細胞質タンパク質であると考えられている。ダイサーは二本鎖RNAを切断して、2ヌクレオチドの3'オーバーハングを有する約21ヌクレオチド（nt）のdsRNAを生成する。このオーバーハングはRNAase III型の酵素の特徴である。dsRNAをダイサーのための効率的な基質として機能させる正確な要件は不明である。miRNA前駆体はそのような基質の1つであり、天然にhpRNA構造を形成するが、発現構築物からsiRNAを生成するために設計されたhpRNAとは対照的に、それらは典型的にはミスマッチ領域を含む（すなわち、それらは完全な二本鎖構造を形成しない）。ダイサーは、通常はヘアピンの基部からhpRNAをプロセッシングしないようであるが、このことの絶対的な証明はまだ得られていない。ダイサーはおそらくRNAiの過程で他の役割を果たしているのであろう。この酵素がRISCで役割を果たすことが最近示された（すなわち、Dicerは標的mRNAの切断で役割を果たす可能性がある）。
ドローシャは、RNA干渉に関係を有するまた別のRNaseIII酵素である。ダイサーと比較してその機能はほとんど分かっていない。この酵素は核に存在し、核小体に存在するかもしれない。なぜならば、ドローシャはrRNAの成熟で役割を果たすことが知られており、rRNAの成熟は核小体性の過程だからである。RNAiにおけるドローシャの正確な役割は不明である。ドローシャはmiRNAのプロセッシングで役割を果たすことが判明しており、RNAiにおいて長いdsRNAのプロセッシングで役割を果たすかもしれない。これまでのモデルは、ドローシャはRNAのループ構造を認識し、これらと結合し、続いてhpRNAをループの約19−21nt下流で切断する可能性がある。ほとんどのRNaseIIIは、ループ構造を認識することによって機能するが、ダイサープロセッシングについて上述したモデルはこの考えと矛盾することが知られている。
【００４７】
したがってPol IIIプロモーターから発現されたhp RNAがRISCに取り込まれる可能性がある2つの可能な経路を有する、すなわち：
（i）核から細胞質へ直接出て、そこでhpRNAはおそらくダイサーによってヘアピンの基部からプロセッシングを受けてRISCに取り込まれる。これは、19ntという短いhpRNAから発現されるhpRNAについて作用する少なくとも主要な経路であろう。
（ii）ドローシャによる核（おそらく核小体）内でのプロセッシング、続いて細胞質への輸送。このプロセッシングはループの認識を含む可能性があり、2ヌクレオチドの3'オーバーハングを有するステム配列の形成をもたらすであろう。いったん輸送されれば、このドローシャによってプロセッシングされたRNAは上記のようにおそらくダイサーによってプロセッシングされる。
これらのモデルは現在のところ不完全であり、おそらく相互に排他的ではない。すなわちより長いhpRNAは両方の経路でプロセッシングされる可能性があり、いくつかはドローシャによってプロセッシングされ、続いてダイサーによってプロセッシングされ、いくらかはダイサーによってのみプロセッシングされる。さらにまた、いくらかのhpRNAは5'リーダー配列（“U6＋27”）とともに発現され、前記リーダー配列は核へ向けて前記hpRNAを標的として狙い撃ちすることができる。すなわち、前記はもっぱらダイサーの前にドローシャによってプロセッシングされる。
いずれの理論又は作用態様に拘束されないが、RNAiの治療効率及び安全性の改善はエフェクター配列の長さを最適化することによって達成できると考えられる。これは、切断酵素（例えばダイサー及びドローシャ）が予想可能な同じ位置で切断するのを補助し、それによって結果の予測性、並びに副作用及び／又は患者内若しくは患者間での効率の多様性の減少が提供されるであろう。
本発明は、付随の実施例及び図面を参照しながらこれからより完全に開示されるであろう。しかしながら、以下の記述は単なる例示であり、どのような態様においても上記に記載した本発明の普遍性に関する制限として介されるべきではないことは理解されよう。
【００４８】
実施例
１．テスト構築物
多数の遺伝子、単純で迅速なアッセイ（下記参照）が利用できるので主としてレニラルシフェラーゼ（Renilla luciferase）遺伝子を不活化するために標的化するDNA構築物を調製した。全ての構築物のための基礎となるプラスミドは、図1に示されるpU6.csaaである。全ての構築物の調製に用いられるクローニングの方法は当業者に周知である。pU6.csaaの調製のために、ヒトゲノムDNAを以下のプライマーを用いPfuポリメラーゼでPCR増幅した：
U6FR1
GAATTCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGG
U6T5H3
AAGCTTAGATCTCGTCTCACGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG
得られたフラグメントにTaqポリメラーゼを用いてA-テールを付加し、製造元（Invitrogen）のプロトコルを用いてベクターpZero Blunt（pZB）にクローニングした。ヒトU6プロモーター領域をこのプラスミドからEcoRI/HindIIIフラグメントとして切り出し、さらに、このフラグメントに上記のオリゴヌクレオチドによって導入された制限部位を用いてベクターpBluescript IISK+（Stratagene）にクローニングした。生成されたプラスミドpU6.cass（図1）は、その後の操作のために選択された個々のクローンがU6フラグメントで2つの塩基対（GA）の欠失を含んでいたので、予想された配列とはわずかに異なっていた。実際にクローニングされたフラグメントはEcoRI/HindIIIフラグメントで、前記フラグメントではEcoRI部位はpZBベクターに由来している。したがって、pU6.cassは、ヒトU6遺伝子の5'末端に10bpの挿入物を保有している。ヘアピンRNAがヘアピンDNA挿入物から発現されるような態様で前記ヘアピンDNA挿入物のBsmBI/HindIIIフラグメントとしてのクローニングを可能にするために、前記ベクターを設計した。
プラスミドpU6.ACTB-A hp（図2）を以下の4つのオリゴヌクレオチドのアニーリングを用いて調製した、すなわち：
ACTB-A-hp-U6-5
ACCGTGTGCACCGGCACAGACATTCAAGAGA
ACTB-A-hp-U6-5-6
GCAATGATCTTGATCTTCA
ACTB-A-hp-H1-3
GCAATGATCTTGATCTTCATTTTTGGAAA
ACTB-A-hp-H1-4
AGCTTTTCCAAAAATGAAGATCAAGATCATTGCTCTCTTGAA
【００４９】
部分的に相補的なオリゴヌクレオチド対、ACTB-A-hp-U6-5及びACTB-A-hp-U6-6及びACTB-A-hp-H1-3及びACTB-A-hp-H1-4をアニールし、それらアニールした対自身を続いてアニールさせ、BsmB1/HindIIIで消化したpU6.cassでのクローニングに適合する二本鎖DNA構造を作製した。前記アニールさせたオリゴヌクレオチドをT4ポリヌクレオチドキナーゼで製造元（Promega）のプロトコルによりリン酸化し、続いて前記の切断したベクターでクローニングした（前記ベクターは既にエビアルカリ性ホスファターゼ（SAP）を用い製造元（Promega）のプロトコルにより脱リン酸化されていた）。このプラスミドは、図2Cに示されているように、ヒトU6プロモーターで開始し、前記アニールした配列の3'領域のポリT列で終了する転写物によりヘアピンRNAを発現すると予想された。
【００５０】
２．ロングレンジPCR方法
ロングレンジPCR方法の一般的な戦略は図3に示されている。この方法の工程は以下のとおりである：
Ａ．
工程１：ロングレンジPCR（LPCR）プライマーを用いて、環状又は直鎖状鋳型を伸長及び増殖させる。DNA鋳型は2本の線（二本鎖DNAを示す）として示されているが、一本鎖DNAも鋳型として用いることができる。LPCRプライマーは、鋳型の上下に折れ曲がった線として示されている（細い領域はプライマーの3'固定領域を表し、太い線はプライマーの5'エフェクター部を表す）。
Ｂ．
工程２：DNA分子の増幅。Aの鋳型のどちらかのPCR増幅によって直鎖状のDNA分子が生成され、2つのLPCRオリゴヌクレオチドのエフェクター部（太い線として表示）は前記直鎖状DNA分子の両末端に取り込まれる。
Ｃ．
工程３：DNA分子の環状化。前記直鎖状DNAは、T4DNAリガーゼ又は類似の酵素を用いて容易に再環状化することができる。前記DNA分子の少なくとも一方の末端の5'リン酸化が前記の実施に要求されることに注目されたい。前記リン酸化は、5'リン酸化オリゴヌクレオチドを合成するか、又は直鎖状DNA分子をT4ポリヌクレオチドキナーゼのような酵素で処理することによって実施できるが、前者の方法がもっとも簡単である。
【００５１】
２−１．プラスミドへ制限部位の挿入
AscI制限部位を図４に示すようにプラスミドに導入した。予め存在するDNA分子に別の新たな制限部位を付加することは広く用いられている技術であり、この事例では前記部位は更なる操作のために用いられた。
この反応で用いられたフォワード及びリバースプライマーは以下のとおりである：
TATAGGCGCGCCAGAGAGCAATGATCTTGATCTTCATTT  及び
CTTGAAGCAATGATCTTGATCTTCACGGT
上記のように、前記基質プラスミドを増幅及び連結し、細菌コロニーを入手してこれを分析した。このようにしてAscI制限部位を単一工程で導入した。
図４に示した工程は以下のとおりである：
環状プラスミドは最上段に示されている。２本の線は、フォワード及びリバースプライマーが配列挿入点で前記鋳型にアニールすることができる位置を示している。この事例では、一方のプライマーは3'固定化部のみを含み、他方のプライマーは5'エフェクター部および3'固定化部を含む。挿入点周辺のプラスミドの二本鎖配列はこの図の下に示されている。上方にフォワードプライマーの配列が示され、3'固定化部は前記配列のすぐ上に示され、プライマー結合部位は矢印で表示されている。5'エフェクター領域の配列（この事例ではAscI制限部位を含む）は、文字を傾斜させて表示されている。リバースプライマーの配列は下方に示され、そのプライマー結合部位もまた矢印で表示されている。
【００５２】
２−２．U6発現カセット中にヘアピンDNA構築物を作製するためのロングレンジPCR法
この実施例では、図５に概略されているように、ロングレンジPCRを用いてヘアピンDNA構築物を作製する最適化アプローチを述べる。本アプローチは、2つのプライマーを使用して発現カセットの完全なコピーを生成することを含む。前記プライマーの各々は、ヘアピン及びループ配列のほぼ半分を含むが、配列中にオーバーラップは含まない。一方のプライマーはU6プロモーター領域に、他方はpolIIIターミネーション配列に繋ぎとめられ、さらに両プライマーはリン酸化される。増幅に用いられる基質は、ヒトU6プロモーター及びpolIIIターミネーション配列の両方を含むヘアピンDNA構築物（pU6.ACTB-A hp）であった。この鋳型プラスミドは、上記に記載した方法と同様な通常のオリゴヌクレオチドクローニング法を用いて調製された。ロングレンジ増幅に続いて、PCR生成物を再環状化し、得られたコロニーをスクリーニングして適切な挿入物を有するプラスミドを入手した。
リバース及びフォワードプライマーは、3'U6固定化部及び3'ターミネーター固定化部をそれぞれ含むように設計される。各プライマーの5'配列はヘアピン及びループ配列のほぼ半分を含み、この事例では、9ヌクレオチドループによって分離されたネズミGLUT4遺伝子の領域と相同な30ヌクレオチドである。
前記プライマーの一般的な設計は下記に示す。U6及びターミネーター固定化部には下線を付した。
リバースプライマー：
5'(NNN)ループ(a/s)(NNN)ヘアピン(a/s)GGTGTTTCGTCCTTTCCACA3'
フォワードプライマー：
5'(NNN)ループ(s)(NNN)ヘアピン(s)TTTTTGGAAAAGCTTATCGATACCGTC3'
この実施例では、リバース及びフォワードプライマーの配列は以下のとおりであった：
G U6-A
CTCTTGAACGCTCTCTCTCCAACTTCCGTTTCTCATCCGGTGTTTCGTCCTTTCCACA
G term-A
ACGCTCTCTCTCCAACTTCCGTTTCTCATCCTTTTTGGAAAAGCTTATCGATACCGTC
【００５３】
ロングレンジPCR：直鎖状増幅生成物を製造するために、PCR反応物は以下のように組み合わされる。
1μL鋳型                   10ngのpU6.ACTB-A hp
5μLの10X緩衝液            10X緩衝液(Stratagene)a又は
Pfu Ultra(登録商標)（Stratagen）
2μLの10mM dNTP            10mMの各dNTP
1μLのU6プライマー         10μM
1μLのtermプライマー       10μM
40μLのDDW
1μLのPfu Turbob又は
Pfu Ultra(登録商標)   （Stratagene）2.5U/μLb 
50μL（総量）
a10Xのクローン化PfuDNAポリメラーゼ反応緩衝液（Stratagene）：200mMトリス-塩酸（pH8.8）、20mMのMgSO4、100mMのKCl、100mMの(NH4)2SO4、1％トリトンX-100、1mg/mLのBSA（ヌクレアーゼ非含有）。
bPfuは、プライマーの分解を最小限にするために、最後に添加、好ましくは反応実施の直前に添加する。
反応は、以下のように“タッチダウン”プロトコルを用いて実施する：
最初の変性は95℃で2分
タッチダウンPCR反応は以下のとおりで30サイクルから成る：
95℃          30秒、
60℃／55℃    1分、    最初の5サイクルについては1℃づつ降下
74℃          5分
最終サイクル
74℃          10分
反応を4℃で維持
反応の最適化：これらの反応条件は大雑把なものである。必要な場合には個々の反応は以下のよって最適化することができる：
−タッチダウン及びアニーリング条件の変更、例えば65℃／60℃、60℃／55℃及び55℃／50℃の範囲の温度を使用する。
−MgCl2の添加。例えば余分な0.5mMのMgCl2の添加はPCR収量に劇的な影響を及ぼす。
連結及び形質転換：PCR生成物はT4DNAリガーゼ（迅速連結キットを用いる）を製造元（New England Biolabs）の指示にしたがって用いて環状化する。
迅速連結：
10μLの緩衝液                    2Xのクィックライゲーション緩衝液
10μLのDNA                       ほぼ100ngのDNA I
1μLのリガーゼ                   クィックT4DNAリガーゼ
21μL（総量）
室温で5分インキュベートする。
続いて標準的なプロトコルを用いて細菌を形質転換し、pU6.EGFP-A hp構築物はアンピシリン耐性をコードするので形質転換細胞をアンピシリンにより選別する。
形質転換コロニーを標準的な“コロニークラッキング”方法を用いて分析した。前記方法では、個々のコロニーのプラスミドはM13フォワード及びリバースプライマーを用いて増幅された。アガロースゲル電気泳動を用いて得られた反応物を分析した。本事例では、正確な挿入物を含むプラスミドは、GLUT4ヘアピンは基質プラスミド中のヘアピン配列より長いためにより大きな生成物を生じた。本実施例では、8つのコロニーをコロニークラッキングによって分析し、6つのコロニーが正しいサイズのバンドを生じた。3つのコロニーに由来するプラスミドの配列を決定し、1つのコロニーが正確な生成物を生じ、これをpU6.GAと命名した。
この態様で共有結合閉環状又は直鎖状鋳型の両者を用いてヘアピンプラスミドを構築することができる。直鎖状鋳型が用いられるときはバックグラウンドのレベルはより低くなる。U6構築物のためには、好ましい鋳型は、BsmBIで切断されたpU6.GA hpである（BsmBIは前記構築物のループ領域内で直鎖化する。エビのアルカリ性ホスファターゼ（SAP）による処理はバックグラウンドをさらに低下させる。
【００５４】
２−３．プラスミド中の逆方向反復の長さを増加させる
プラスミド中の逆方向反復配列の長さを図６に示したように以下のように増加させた。
フォワード及びリバースプライマーの相対的な位置並びに配列は図４に表示されている。本事例では、フォワードプライマー及びリバースプライマーは同一である。プライマー結合部位は、EGFPを標的とするように設計されたヘアピンDNA構築物のどちらかのアームとハイブリダイズするように設計され、一方、5'エフェクター配列はさらにEGFPと相同な配列を含む。ヘアピンDNA構築物の長さはこの方法を用いて連続的に大きくすることができる。
２−４．クローン化配列へのイントロンの挿入
マウスのIgE3イントロンをEGFP遺伝子のクローン化配列に挿入した。
前記EGFP遺伝子内に存在する連続配列と相同な3'固定化部を含むように、リバース及びフォワードプライマーを設計した。各プライマーの5'エフェクター配列は前記マウスのIgE3遺伝子のイントロン3の配列のほぼ半分を含んでいた。
この反応に使用したフォワード及びリバースプライマーは以下のとおりであった：
GAGAACATGGTTAACTGGTTAAGTCATGTCGTCCCACAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGA、及び
TGAACATGAGAAGGGCTGGCCACTCTCCACCTCCTGTACTCACCTGGACGTAGCCTTCGGGCATGG
上記に記したように、基質プラスミドを増幅及び連結し、細菌コロニーを得てこれを分析した。このようにした、機能的イントロン（マウスIgE遺伝子のイントロン3）を単一工程でEGFP遺伝子のコード配列に挿入した。
本方法は図7に示され以下のとおりであった：
フォワード及びリバースプライマーの相対的な位置及び配列は図4のように表示されている。本事例では、フォワード及びリバースプライマーの結合部位は、EGFPのコード配列と結合する。各プライマーのフォワード及びリバース5'エフェクター配列は、マウスIgE3遺伝子のイントロン3のほぼ半分をコードする。
【００５５】
３．ヘアピン構築物の調製
本出願で開示するほとんどの構築物は、上記に記したロングレンジPCR法を用いて調製した。プラスミドpU6.cass lin（図8）を前駆体構築物として用いて下記に開示する構築物の多くを作製することができる。本構築物は前駆体構築物pU6.GAを用いて調製した。前記前駆体構築物は、この目的のためにはプラスミドpU6.ACTB-A hp（図2）と本質的に同一であるが、ただしそのヘアピン配列は別の遺伝子を標的とする。pU6.GAはpU6.ACTB-A hpと同一のU6プロモーター及びpol IIIターミネーター配列を含むが、その新しい挿入配列によってBsmBI制限部位が挿入され、前記部位はロングレンジPCR増幅前にベクターの直鎖化を可能にする。
pU6.cass linの調製のために、BsmBIで直鎖化したpU6.GAを以下のプライマーを用いて増幅した：
U6mcs
TCTTGGACGTGGGTGTTTCGTCCTTTC
termmcs
TCTTGGAATGCTTTTTTGGAAAAGCTTATCG
予想される配列のクローンを単離した。このクローンは、3つの固有の制限部位（BmgBI、BglII及びBsmI）を含み、これらを用いてロングレンジPCR増幅の前に前記ベクターを直鎖化しバックグラウンドを減少させることができる（図8A）。このプラスミドを用いて構築物を作製するために、前記プラスミド（図8B）を増幅前にBglIIで直鎖化した。
これらの実験で用いられた構築物は表1に記載されている。通常の一重hpDNA構築物をコントロールとして用いた。二重ヘアピン構築物を調製し、それらの活性を前記コントロール構築物と比較した。前記コントロール構築物は単一の遺伝子を標的とし、テスト構築物（“二重ヘアピン”構築物）は2つの遺伝子を標的とした（ヘアピン配列の“基部” （ループからもっとも遠い）の1つの配列及びヘアピン構造のループの近く（ヘアピンの“頂上部”）の第二の配列が用いられる）。この述語の用い方は、3つ、4つ等のデュープレックス配列をもつ三重、四重等のヘアピンにも拡大することができる。レニラ（Renilla）ルシフェラーゼ遺伝子を標的とする配列が二重ヘアピンRNAの基部又は頂上部に存在する構築物の活性を、レニラルシフェラーゼのみを標的とする一重構築物の活性と比較した。この方法を用いて、2つの遺伝子を標的とする構築物の能力を容易に推論することができる。これは、場合によって両標的遺伝子に対する一重構築物の活性を決定することによって確認することができる。
【００５６】
表1：これらの実験で用いられたコントロール及び“二重ヘアピン”構築物
2006526394.tif 000002
a不活化の標的とされるmRNA
-ACTB-Aは、Genbankアクセッション番号NM_001101の1047−1065位に対応する。
-Rluc部位は、Genbankアクセッション番号U47298の1543−1561位に対応する。
-ADAR1部位は、GenBank配列NM_001111の1477−1497位に対応する。
【００５７】
前記テスト構築物は以下のように調製した。
pU6.Rluc hp：
本構築物は、レニラルシフェラーゼのmRNA（レニラルシフェラーゼを発現するように設計された構築物で安定的に形質転換させたHeLa細胞に存在する）を標的とするように設計された。前記構築物は、基質としてBglIIで直鎖化したpU6.cass linを用いて上記に記したようにロングレンジPCR法により調製した。前記基質を下記のプライマーを用いPfu Turboポリメラーゼ（Stratagene）で増幅した：
U6lucb
ACACAAAGTAGGAGTAGTGAAAGGCCGGTGTTTCGTCCTTTC
termlucb
AGGTAGGAGTAGTGAAAGGCCTTTTTTGGAAAAGCTTATCG
本構築物のマップは図9Aに示されている。さらに前記構築物によって生成されるRNAの配列及び予想される構造は図9Bに示されている。
pU6.RLuc/ACTB TTA：
本構築物によって、UUAバブル配列を保持する構築物が2つのmRNA（すなわちレニラルシフェラーゼトランスジーン及びβアクチン）を不活化することができるか否かをテストした。前記構築物は、基質としてpU6.cass lin（図8）を用い下記の2つのプライマーで増幅することによって調製された：
U6lucACTB-TTA
ACACAAAGCAATGATCTTGATCTTCATAAGTAGGAGTAGTGAAAGGCCGGTGTTTCGTCCTTTC
termluc-ACTB-TTG
AGGCAATGATCTTGATCTTCATTGGTAGGAGTAGTGAAAGGCCTTTTTTGGAAAAGCTTATCG
本構築物のマップは図10Aに示されている。さらに前記構築物によって生成されるRNAの配列及び予想される構造は図10Bに示されている。
pU6.RLuc/ACTB TTAG hp：
本構築物によって、UUAGバブル配列を保持する構築物が2つのmRNA（すなわちレニラルシフェラーゼトランスジーン及びβアクチン）を不活化することができるか否かをテストした。前記構築物は、以下のヌクレオチドをアニールさせることによって調製した：
Rluc/ACTB-1
ACCGGCCTTTCACTACTCCTACTTAGTGAAGATCAAGATCATTGC
Rluc/ACTB-2
TTGATCTTCACTAAGTAGGAGTAGTGAAAGGC
Rluc/ACTB-3
TTTGTGTAGGCAATGATCTTGATCTTCAT
Rluc/ACTB-4
GATCATTGCCTACACAAAGCAATGATC
Rluc/ACTB-5
TGAGTAGGAGTAGTGAAAGGCCTTTTTTGGAAA
Rluc/actb-6
AGCTTTTCCAAAAAAGGCCTTTCACTACTCCTACTCAATGAAGATCAA
本構築物を調製するために、オリゴアッセンブリー法を用いた。各オリゴヌクレオチドを1μg/mLで水に再懸濁し、各々の1μLを一緒に加え、0.5Xの濃度の緩衝液M（ロシュ（Roche）；10Xの緩衝液Mは100mMトリス塩酸（pH7.5）である）、100mMのMgCl2、500mMのNaCl、10mMのDTEを含む最終容積100μLを作製した。前記混合物を95℃に加熱し、続いて毎分1℃で30℃に冷却することによってオリゴヌクレオチドをアニールさせた。これらの操作はコルベットパームサイクラー（Corbett Palm-Cycler）PCR装置（Corbett Research）で実施した。続いてアニールしたオリゴヌクレオチドの20μL/をT4ポリヌクレオチドキナーゼで製造元（Promega）のプロトコルにしたがって処理した。続いて前記アニールしたオリゴヌクレオチドをキアゲン（Qiagen）PCR精製カラムを用い製造元（Qiagen）のプロトコルにしたがって精製した。続いて、溶出したオリゴヌクレオチド（溶出物質の28μLから）の2μLを、BsnBI/HindIIIエビアルカリ性ホスファターゼ（SAP：Promega）処理pU6.cass（当業者に周知の方法で調製）の100ngと連結した。続いて適切な配列を含むコロニーを単離し、構築物の配列を周知の連続プロトコルを用いて確認した。
本構築物のマップは図11Aに示されている。さらに前記構築物によって生成されるRNAの配列及び予想される構造は図11Bに示されている。
pU6.ACTB/Rluc TTA：
本構築物によって、UUAバブル配列を保持する構築物が2つのmRNA（すなわちβアクチン及びレニラルシフェラーゼトランスジーン）を不活化するか否かをテストした。前記構築物は、基質としてpU6.cass linを用い下記の2つのプライマーで増幅することによって調製された：
U6ACTB-luc-TTA
ACACAAAGTAGGAGTAGTGAAAGGCCTAAGCAATGATCTTGATCTTCACGGTGTTTCGTCCTTTC
termACTB-luc-TTG
AGGTAGGAGTAGTGAAAGGCCTTGGCAATGATCTTGATCTTCATTTTTTGGAAAAGCTTATCG
この構築物のマップは図12Aに示されている。さらに前記構築物によって生成されるRNAの配列及び予想される構造は図12Bに示されている。
pU6.ACTB/Rluc TTAG：
本構築物によって、UUAGバブル配列を保持する構築物が2つのmRNA（すなわちβアクチン及びレニラルシフェラーゼトランスジーン）を不活化することができるか否かをテストした。前記構築物は、基質としてpU6.cass linを用い下記の2つのプライマーで増幅することによって調製された：
U6ACTB-luc-TTAG
ACACAAAGTAGGAGTAGTGAAAGGCCCTAAGCAATGATCTTGATCTTCAGGTGTTTCGTCCTTTC
termACTB-luc-TTGA
AGGTAGGAGTAGTGAAAGGCCTTGAGCAATGATCTTGATCTTCATTTTTTGGAAAAGCTTATCG
この構築物のマップは図13Aに示されている。さらに前記構築物によって生成されるRNAの配列及び予想される構造は図13Bに示されている。
【００５８】
４．3つの遺伝子を標的にする構築物
レニラルシフェラーゼ及び多様な他の遺伝子を標的にする4つの構築物を調製した。3つの構築物は、レニラルシフェラーゼを標的にする配列をヘアピンRNA内のそれぞれ異なる3つの位置、すなわちヘアピンRNAの基部、中央部及び頂上部に含み、さらにUUAGバブル配列を含んでいる。前記構築物は表2に概略されている。五番目の構築物は陰性コントロールとして機能する。
表2：3つの遺伝子を標的にするヘアピン構築物
2006526394.tif 000003
a不活化の標的とされるmRNA
-EGFP標的は、pEGFPN1-MCS（Invitrogen）の924−942位に対応する。
これらの構築物は主として上記に記したロングレンジPCR法を用いて調製した。
【００５９】
pU6.Rluc/ACTB/AD1
本構築物によって、レニラルシフェラーゼトランスジーンを標的とする配列を予想されるヘアピンRNAの基部に保持する構築物がレニラルシフェラーゼを不活化するか否かをテストした。前記構築物は、基質として直線化プラスミドpU6.cass linを用い下記の2つのプライマーで増幅することによって調製された：
U6LBA
ACAAATGAACAGGTGGTTTCAGTCCTAAGCAATGATCTTGATCTTCACTAAGTAGGAGTAGTGAAAGGCCGGTGTTTCGTCCTTTC
termLBA
GTAGTGAACAGGTGGTTTCAGTCTTGAGCAATGATCTTGATCTTCATTGAGTAGGAGTAGTGAAAGGCCTTTTTTGGAAAAGCTTATCG
本構築物のマップは図15Aに示されている。さらに前記構築物によって生成されるRNAの配列及び予想される構造は図15Bに示されている。
pU6.ACTB/RLuc/AD1 hp：
本構築物によって、レニラルシフェラーゼトランスジーンを標的とする配列を予想されるヘアピンRNAの中央に保持する構築物がレニラルシフェラーゼを不活化するか否かをテストした。前記構築物は、基質として直線化プラスミドpU6.cass linを用い下記の2つのプライマーで増幅することによって調製された：
U6BLA
CACAAATGAACAGGTGGTTTCAGTCCTAAGTAGGAGTAGTGAAAGGCCCTAAGCAATGATCTTGATCTTCACCGGTGTTTCGTCCTTTC
termBLA
TAGTGAACAGGTGGTTTCAGTCTTGAGTAGGAGTAGTGAAAGGCCTTGAGCAATGATCTTGATCTTCATTTTTTGGAAAAGCTTATCG
本構築物のマップは図16Aに示されている。さらに前記構築物によって生成されるRNAの配列及び予想される構造は図16Bに示されている。
pU6.ACTB/AD1/Rluc hp：
本構築物によって、レニラルシフェラーゼトランスジーンを標的とする配列を予想されるヘアピンRNAの頂上部に保持する構築物がレニラルシフェラーゼを不活化するか否かをテストした。前記構築物は、基質としてプラスミドpU6.cass linを用い下記の2つのプライマーで増幅することによって調製された：
U6BAL
CACAAAGTAGGAGTAGTGAAAGGCCCTAATGAACAGGTGGTTTCAGTCCTAAGCAATGATCTTGATCTTCACGGTGTTTCGTCCTTTC
termBAL
TAGGTAGGAGTAGTGAAAGGCCTTGATGAACAGGTGGTTTCAGTCTTGAGCAATGATCTTGATCTTCATTTTTTGGAAAAGCTTATCG
本構築物のマップは図17Aに示されている。さらに前記構築物によって生成されるRNAの配列及び予想される構造は図17Bに示されている。
pU6.ACTB/AD1/GFP hp：
本構築物は先の3つの構築物のための陰性コントロールとして機能する。本構築物は、基質として直鎖化プラスミドpU6.cass linを用い下記の2つのプライマーで増幅することによって調製された：
U6BAG
CACAAAGATGAACTTCAGGGTCAGCCTAATGAACAGGTGGTTTCAGTCCTAAGCAATGATCTTGATCTTCACGGTGTTTCGTCCTTTC
termBAG
TAGGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGATGAACAGGTGGTTTCAGTCTTGAGCAATGATCTTGATCTTCATTTTTTGGAAAAGCTTATCG
本構築物のマップは図18Aに示されている。さらに前記構築物によって生成されるRNAの配列及び予想される構造は図18Bに示されている。
【００６０】
５．4つの遺伝子を標的にする構築物
別々の4つの標的遺伝子を標的とする構築物をテストするために、レニラルシフェラーゼ及び種々の他の遺伝子を標的にする5つの構築物を調製することができる。4つの構築物の各々が、レニラルシフェラーゼを標的にする配列を予想されるヘアピンRNA内の4つの可能な位置の1つに、すなわちヘアピンRNAの基部、前記基部の次、頂上部の隣、及び頂上部に含む。前記ヘアピンRNAはさらに前記種々の成分を分離するUUAGバブル配列を含む。前記構築物は表3に概略されている。
表3：4つの遺伝子を標的にするヘアピン構築物
2006526394.tif 000004
a不活化の標的とされるmRNA
-HER2標的は、GenBankアクセッションHUMHER2Aの223−241位に対応する。
これらの構築物は上記に記したロングレンジPCR法を用いて調製することができる。
【００６１】
pU6.Rluc/ACTB/AD1/GFP hp
本構築物によって、レニラルシフェラーゼトランスジーンを標的とする配列を予想されるヘアピンRNAの基部に保持する構築物がレニラルシフェラーゼを不活化するか否かをテストする。前記構築物は、基質としてプラスミドpU6.Rluc/ACTB/AD1hpを用い下記の2つのプライマーで増幅することによって調製される：
U6AGG4
GTTCATCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCCTACACAAAGATGAACTTCAGGGTCAGCCTAATGAACAGGTGGTTTCAGTCCTAA
ABL4
AGGTGGTTTCAGTCTTGAGCAATGATCTTGATCTTCATTGAGTAGGAGTAGTGAAAGGCCTTTTTTGGAAAAGCTTATCG
本構築物のマップは図19Aに示されている。さらに前記構築物によって生成されるRNAの配列及び予想される構造は図19Bに示されている。
pU6.ACTB/RLuc/AD1/GFP hp：
本構築物によって、レニラルシフェラーゼトランスジーンを標的とする配列を予想されるヘアピンRNAの基部から二番目の位置に保持する構築物がレニラルシフェラーゼを不活化するか否かをテストする。前記構築物は、基質としてプラスミドpU6.ACTB/Rluc/AD1 hpを用い下記の2つのプライマーで増幅することによって調製される：
U6AGG4
GTTCATCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCCTACACAAAGATGAACTTCAGGGTCAGCCTAATGAACAGGTGGTTTCAGTCCTAA
termALB4
AGGTGGTTTCAGTCTTGAGTAGGAGTAGTGAAAGGCCTTGAGCAATGATCTTGATCTTCATTTTTTGGAAAAGCTTATCG
本構築物のマップは図20Aに示されている。さらに前記構築物によって生成されるRNAの配列及び予想される構造は図20Bに示されている。
pU6.ACTB/AD1/Rluc/GFP hp：
本構築物によって、レニラルシフェラーゼトランスジーンを標的とする配列を予想されるヘアピンRNAの基部から三番目の位置に保持する構築物がレニラルシフェラーゼを不活化するか否かをテストする。前記構築物は、基質としてプラスミドpU6.ACTB/AD1/Rluc hpを用い下記の2つのプライマーで増幅することによって調製される：
U6LGG4
CTACTCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCCTACACAAAGATGAACTTCAGGGTCAGCCTAAGTAGGAGTAGTGAAAGGCCCTAA
termLAB4
GAGTAGTGAAAGGCCTTGATGAACAGGTGGTTTCAGTCTTGAGCAATGATCTTGATCTTCATTTTTTGGAAAAGCTTATCG
本構築物のマップは図21Aに示されている。さらに前記構築物によって生成されるRNAの配列及び予想される構造は図21Bに示されている。
pU6.ACTB/AD1/GFP/Rluc hp：
本構築物によって、レニラルシフェラーゼトランスジーンを標的とする配列を予想されるヘアピンRNAのループの隣に保持する構築物がレニラルシフェラーゼを不活化するか否かをテストした。前記構築物は、以下のオリゴヌクレオチドをアニールすることによって調製された：
BAGR1
ACCGTGAAGATCAAGATCATTGCTTAGGACTGAAACCA
BAGR2
ATGAACAGGTGGTTTCAGTCCTAAGCAATGATCTTGATCTTCA
BAGR3
CCTGTTCATTAGGCTGACCCTGAAGTTCATCTTAG
BAGR4
TGAAAGGCCCTAAGATGAACTTCAGGGTCAGCCTA
BAGR5
GGCCTTTCACTACTCCTACTTTGTGTAGGTAGGAGTAGTGAAAGGCC
BAGR6
TCATCTCAAGGCCTTTCACTACTCCTACCTACACAAAGTAGGAGTAG
BAGR7
TTGAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGATGAACAGGTGGTTTCAGTC
BAGR8
CACCTGTTCATCAAGCTGACCCTGAAGT
BAGR9
TTGAGCAATGATCTTGATCTTCATTTTTTGGAAA
BAGR10
AGCTTTTCCAAAAAATGAAGATCAAGATCATTGCTCAAGACTGAAAC
上記に記したように、前記オリゴヌクレオチドを一緒にアニールさせ、T4 PNKを用いて製造元（Promega）のプロトコルにしたがって処理し、生成された混合物をSAPで処理したBsmBI/HindIII切断pU6.cassにクローニングした。
本構築物のマップは図22Aに示されている。さらに前記構築物によって生成されるRNAの配列及び予想される構造は図22Bに示されている。
pU6.ACTB/AD1/GFP/HER2 hp：
本構築物は先の4つの構築物のための陰性コントロールとして機能する。本構築物は、基質としてプラスミドpU6.ACTB/AD1/GFP hpを用い下記の2つのプライマーで増幅することによって調製される：
U6GHH4
CATCTCAAGTGTGCACCGGCACAGACACTACACAAATGTCTGTGCCGGTGCACACCTAAGATGAACTTCAGGGTCAGCCTAA
termGAB4
AACTTCAGGGTCAGCTTGATGAACAGGTGGTTTCAGTCTTGAGCAATGATCTTGATCTTCATTTTTTGGAAAAGCTTATCG
本構築物のマップは図23Aに示されている。さらに前記構築物によって生成されるRNAの配列及び予想される構造は図23Bに示されている。
【００６２】
６．5つの遺伝子を標的にする構築物
別々の5つの遺伝子を標的とする構築物をテストするために、レニラルシフェラーゼ及び種々の他の遺伝子を標的にする6つの構築物を調製することができる。5つの構築物の各々は、レニラルシフェラーゼを標的にする配列を予想されるヘアピンRNA内の5つの可能な位置の1つに、すなわちヘアピンRNAの基部、前記基部の隣から頂上部の手前までの全ての位置、及び頂上部に含む。前記ヘアピンRNAはさらに前記種々の構成部分を分離するUUAGバブル配列を含む。前記構築物は表4に概略されている。
表4：5つの遺伝子を標的にするヘアピン構築物
2006526394.tif 000005
a不活化の標的とされるmRNA
-LAM標的は、GenBankアクセッションNM_005572の820−838位に対応する。
これらの構築物は上記に記したロングレンジPCR法を用いて調製することができる。
【００６３】
pU6.Rluc/ACTB/AD1/GFP/HER2 hp
本構築物によって、レニラルシフェラーゼトランスジーンを標的とする配列を予想されるヘアピンRNAの基部に保持する構築物がレニラルシフェラーゼを不活化するか否かをテストする。前記構築物は、基質としてプラスミドpU6.Rluc/ACTB/AD1/GFPhpを用い下記の2つのプライマーで増幅することによって調製される：
U6GHH5
TCAAGTGTGCACCGGCACAGACACTACACAAATGTCTGTGCCGGTGCACACCTAAGATGAACTTCAGGGTCAGCCTAA
termGABL5
GATGAACTTCAGGGTCAGCTTGATGAACAGGTGGTTTCAGTCTTGAGCAATGATCTTGATCTTCATTGAGTAGGAGTAGTGAAAGGCCTTTTTTGGAAAAGCTTATCG
本構築物のマップは図24Aに示されている。さらに前記構築物によって生成されるRNAの配列及び予想される構造は図24Bに示されている。
pU6.ACTB/RLuc/AD1/GFP/HER2 hp：
本構築物によって、レニラルシフェラーゼトランスジーンを標的とする配列を位置2（予想されるヘアピンRNAの基部から１つ位置が上）に保持する構築物がレニラルシフェラーゼを不活化するか否かをテストする。前記構築物は、基質としてプラスミドpU6.ACTB/Rluc/AD1/GFP hpを用い下記の2つのプライマーで増幅することによって調製される：
U6GHH5
TCAAGTGTGCACCGGCACAGACACTACACAAATGTCTGTGCCGGTGCACACCTAAGATGAACTTCAGGGTCAGCCTAA
termGALB5
GATGAACTTCAGGGTCAGCTTGATGAACAGGTGGTTTCAGTCTTGAGTAGGAGTAGTGAAAGGCCTTGAGCAATGATCTTGATCTTCATTTTTTGGAAAAGCTTATCG
本構築物のマップは図25Aに示されている。さらに前記構築物によって生成されるRNAの配列及び予想される構造は図25Bに示されている。
pU6.ACTB/AD1/Rluc/GFP/HER2 hp：
本構築物によって、レニラルシフェラーゼトランスジーンを標的とする配列を位置3（予想されるヘアピンRNAの中央部）に保持する構築物がレニラルシフェラーゼを不活化するか否かをテストする。前記構築物は、基質としてプラスミドpU6.ACTB/AD1/Rluc/GFP hpを用い下記の2つのプライマーで増幅することによって調製される：
U6GHH5
TCAAGTGTGCACCGGCACAGACACTACACAAATGTCTGTGCCGGTGCACACCTAAGATGAACTTCAGGGTCAGCCTAA
termGLAB5
GATGAACTTCAGGGTCAGCTTGAGTAGGAGTAGTGAAAGGCCTTGATGAACAGGTGGTTTCAGTCTTGAGCAATGATCTTGATCTTCATTTTTTGGAAAAGCTTATCG
本構築物のマップは図26Aに示されている。さらに前記構築物によって生成されるRNAの配列及び予想される構造は図26Bに示されている。
pU6.ACTB/AD1/GFP/Rluc/HER2 hp：
本構築物によって、レニラルシフェラーゼトランスジーンを標的とする配列を位置4（予想されるヘアピンRNAのループ配列から１つだけ後ろ）に保持する構築物がレニラルシフェラーゼを不活化するか否かをテストした。前記構築物は、基質としてプラスミドpU6.ACTB/AD1/GFP/Rluc hpを用い下記の2つのプライマーで増幅することによって調製される：
U6LHH5
TCAAGTGTGCACCGGCACAGACACTACACAAATGTCTGTGCCGGTGCACACCTAAGTAGGAGTAGTGAAAGGCCCTAA
termLGAB5
GTAGGAGTAGTGAAAGGCCTTGAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGATGAACAGGTGGTTTCAGTCTTGAGCAATGATCTTGATCTTCATTTTTTGGAAAAGCTTATCG
本構築物のマップは図27Aに示されている。さらに前記構築物によって生成されるRNAの配列及び予想される構造は図27Bに示されている。
pU6.ACTB/AD1/GFP/HER2/Rluc hp：
本構築物によって、レニラルシフェラーゼトランスジーンを標的とする配列を位置5（予想されるヘアピンRNAのループ配列に隣接する）に保持する構築物がレニラルシフェラーゼを不活化するか否かをテストした。前記構築物は以下のオリゴヌクレオチドをアニールすることによって調製された：
BAGR1
ACCGTGAAGATCAAGATCATTGCTTAGGACTGAAACCA
BAGR2
ATGAACAGGTGGTTTCAGTCCTAAGCAATGATCTTGATCTTCA
BAGR3
CCTGTTCATTAGGCTGACCCTGAAGTTCATCTTAG
BAGHR4
GGTGCACACCTAAGATGAACTTCAGGGTCAGCCTA
BAGHR5
GTGTGCACCGGCACAGACATTAGGGCCTTTCACTACTCCTACTTTGT
BAGHR6
CCTACCTACACAAAGTAGGAGTAGTGAAAGGCCCTAATGTCTGTGCC
BAGHR7
GTAGGTAGGAGTAGTGAAAGGCCTTGATGTCTGTGCCGGTGCACAC
BAGHR8
TCATCTCAAGTGTGCACCGGCACAGACATCAAGGCCTTTCACTACT
BAGR7
TTGAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGATGAACAGGTGGTTTCAGTC
BAGHR10
CACCTGTTCATCAAGCTGACCCTGAAGT
BAGR9
TTGAGCAATGATCTTGATCTTCATTTTTTGGAAA
BAGR10
AGCTTTTCCAAAAAATGAAGATCAAGATCATTGCTCAAGACTGAAAC
上記に記したように、前記オリゴヌクレオチドを一緒にアニールし、T4P NKを用いて製造元（Promega）のプロトコルにしたがって処理し、生成された混合物をSAPで処理しておいたBsmBI/HindIII切断pU6.cassにクローニングした。
本構築物のマップは図28Aに示されている。さらに前記構築物によって生成されるRNAの配列及び予想される構造は図28Bに示されている。
pU6.ACTB/AD1/GFP/HER2/Lam hp：
本構築物は先の5つの構築物のための陰性コントロールとして機能する。本構築物は、基質としてプラスミドpU6.ACTB/AD1/GFP/HER2 hpを用い下記の2つのプライマーで増幅することによって調製される：
U6HMM5
TCAACTGGACTTCCAGAAGAACACTACACAAATGTTCTTCTGGAAGTCCAGCTAATGTCTGTGCCGGTGCACACCTAA
termHGAB5
TGTCTGTGCCGGTGCACACTTGAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGATGAACAGGTGGTTTCAGTCTTGAGCAATGATCTTGATCTTCATTTTTTGGAAAAGCTTATCG
本構築物のマップは図29Aに示されている。さらに前記構築物によって生成されるRNAの配列及び予想される構造は図29Bに示されている。
【００６４】
７．構築物の活性の検査
レニラルシフェラーゼを標的とする構築物の活性をテストするために、キアゲン（Qiagen）カラムを製造元のプロトコルにしたがって用いてプラスミドを調製した。続いてプラスミドDNAを先に構築物pHRLSV40（Promega）で安定的に形質転換しておいたHeLa細胞にトランスフェクトした。これは、ハイグロマイシン耐性をコードする選別可能マーカープラスミドとのpHRLSV40の同時トランスフェクションによって行った（このような安定的に形質転換された細胞を得る技術は当業者に周知である）。
3,000細胞（血球計算板での計測によって決定）を96ウェルの組織培養プレート（Costar）の各ウェルに播種し、熱不活化した10％FBS（Gibco）を補充したDMEM培養液（Gibco）の100μL中で一晩インキュベートした。細胞をトランスフェクションするために、各ウェルを以下のように処理した：
−0.2μL又は0.3μLのLT1トランスフェクション試薬（Mirus Corp.）を25μLの血清非含有培養液（DMEM）に添加し、室温で10分インキュベートした。
−100ngのDNAを前記混合物に添加し、室温でさらに10分間複合体を生成させた。続いて全混合物をトランスジェニックHeLa細胞のウェルに添加した。
−細胞を37℃で一晩インキュベートし、続いて培養液を取り除き、さらに100μLの新しいDMEM10％FBSを添加し、インキュベーションを継続した。
レニラルシフェラーゼ活性を決定するために、培養液を取り除き、エンデューレン（EnduRen）を含む新しい培養液を製造元（Promega）のプロトコルにしたがって添加した。続いて細胞を5時間インキュベートした。レニラルシフェラーゼ活性は、ヴェリタス（Veritas）マイクロプレートルミノメーターを用い製造元（Turner Biosystems）のプロトコルにしたがって測定した。続いてこれらの値を相対的細胞数（セルタイターグロ（CellTiter-Glo）試薬を用い製造元（Promega）のプロトコルにしたがって測定した）について、ヴェリタス（Veritas）マイクロプレートルミノメーターを用い製造元（Turner Biosystems）のプロトコルにしたがって修正した。
【００６５】
このようにして個々の構築物の相対活性を容易にかつ正確に決定することが可能であり、さらにまたこれらの活性を適切な陰性コントロール（典型的にはpU6.cass）を用いて修正し、構築物の相対活性を決定した。
図30は、レニラルシフェラーゼを標的とする二重ヘアピン構築物の活性を示す。これらのデータは、二重ヘアピン構築物の基部又は頂上部の配列は両方とも顕著にレニラルシフェラーゼ活性を低下させ、Rluc配列が予想される転写物の基部に存在するとき構築物はもっとも強い活性を示すが、Rlucターゲッティング配列が予想される転写物の頂上部（ループの近傍）に存在する構築物では顕著な活性が保持されることを示している。これは、このような二重ヘアピン構築物は2つの活性なsiRNAを生成できることを示し、したがって、必然的に2つの遺伝子を不活化するか、又は個々のmRNAの別々の領域を標的とする2つの別々のsiRNAの生成による累積作用を介して単一の遺伝子をより効果的に不活化するために、構築物を設計することができることになる。
図31は、レニラルシフェラーゼを標的とする三重ヘアピン構築物の活性を示す。これらのデータは、三重ヘアピン構築物の基部、中央部又は頂上部に存在する配列は顕著にレニラルシフェラーゼ活性を低下させることを示している。これは、このような三重ヘアピン構築物は3つの活性なsiRNAを生成できることを示し、したがって、3つの遺伝子を不活化するために構築物を設計することができることは当然であろう。さらにまた、このような構築物を用いて、個々のmRNAの別々の領域を標的とする3つの別々のsiRNAの生成による累積作用を介して単一の遺伝子をより効果的に不活化することができるであろう。
図32は、レニラルシフェラーゼを標的とする4X及び5X構築物の活性を示している。これらのデータは4X又は5X構築物の頂上部の配列が顕著にレニラルシフェラーゼの活性を低下させることを示している。これは、このような構築物が4つ又は5つの活性なsiRNAを生成することができることを示し、したがって、4つ又は5つの遺伝子を不活化するために構築物を設計できることは当然であろう。さらにまた、このような構築物を用いて、個々のmRNAの別々の領域を標的とする4つ又は5つの別々のsiRNAの生成による累積作用を介して単一の遺伝子をより効果的に不活化することができる。
【００６６】
８．単一構築物により2つの遺伝子を不活化する
上記の方法を用いて2つの内在性遺伝子を不活化することができることを示すために、Akt1（部位a）及びAkt2（部位a及びb）遺伝子を標的とする単一の構築物を調製した。この構築物（pU6.GF-2）は、2つの遺伝子Akt1及びAkt2を不活化するように設計された。配列は以下の文献のデータを基にして設計した：Z.Y. Jiang, Q.L.Zhou, K.A. Coleman, M. Chouinard, Q. Boese, M.P. Czech (2003); Insulin signaling through Akt/protein kinase B analyzed bay small interfering RNA-mediated gene silencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(13):7569-74。pU6.GF-2は、上記に記載したようにロングレンジPCR法により、BglIIで直鎖化したpU6.cass linを基質として用いて調製した。前記基質を下記のプライマーを用いPfu Turboポリメラーゼにより増幅した：
G U6F-2
CACAAAGAGGCGCTCGTGGTCCTGGCTAACAGCTTCTCGTGGTCCTGGCGGTGTTTCGTCCTTTC  及び
G termF-2
TAGGAGGCGCTCGTGGTCCTGGTTGACAGCTTCTCGTGGTCCTGGTTTTTTGGAAAAGCTTATCG
本構築物のマップは図33Aに示されている。さらに前記構築物によって生成される予想されるRNAの配列は図33Bに示されている。
この構築物の活性をアッセイするために、リポフェクタミン2000を製造元（Invitrogen）のプロトコルにしたがって用い前記プラスミドでC2C12細胞をトランスフェクトした。48時間後に、全タンパク質を単離し、Akt1及びAkt2タンパク質レベルをウェスタンブロットを用いて測定した。さらにまたコントロール抗体をプローブとして用いてブロットを調べ、装荷量が均等であることを確認した。これらの実験の方法は当業者には周知である。
図34は、pU6.GF-2をトランスフェクトした細胞ではAkt1及びAkt2の両方のレベルが減少することを示している。
【００６７】
９．単一の遺伝子の2つの領域を標的とすることによって構築物の活性を高める
このアプローチを用いて構築物の活性を高めることができることを示すために、プラスミドpU6.GG-4を調製した。この構築物はAkt2遺伝子を標的とする。標的部位の選別は上記に引用したJiangら（2003）のデータを基にした。Akt2遺伝子内の2つの部位（“a”及び“b”）を標的にし、各部位を標的とする2つの一重hp構築物の活性を比較した。これら一重hp構築物をpU6.GG-2及びpU6.GG-3と命名した。
構築物pU6.GG-2は、上記に記載したロングレンジPCR法により、BglIIで直鎖化したpU6.cass linを基質として用いて調製した。前記基質を下記のプライマーを用いPfu Turboポリメラーゼ（Stratagene）により増幅した：
G U6-G2
CACAAAGGTGCCCTTGCCGAGGAGTCGGTGTTTCGTCCTTTC 及び
G term-G2
TAGGAGGCGCTCGTGGTCCTGGTTTTTTGGAAAAGCTTATCG
本構築物のマップは図35Aに示されている。さらに前記構築物によって生成される予想されるRNAの配列は図35Bに示されている。
構築物pU6.GG-3は、上記に記載したロングレンジPCR法により、BglIIで直鎖化したpU6.cass linを基質として用いて調製した。前記基質を下記のプライマーを用いPfu Turboポリメラーゼ（Stratagene）により増幅した：
G U6-G3
CACAAAGAGGCGCTCGTGGTCCTGGCGGTGTTTCGTCCTTTC  及び
G term-G3
TAGGGTGCCCTTGCCGAGGAGTTTTTTGGAAAAGCTTATCG
本構築物のマップは図36Aに示されている。さらに前記構築物によって生成される予想されるRNAの配列は図36Bに示されている。
構築物pU6.GG-4は、上記に記載したようにロングレンジPCR法により、BglIIで直鎖化したpU6.cass linを基質として用いて調製した。前記基質を下記のプライマーを用いPfu Turboポリメラーゼ（Stratagene）により増幅した：
GU6-G4
CACAAAGAGGCGCTCGTGGTCCTGGCTAAGGTGCCCTTGCCGAGGAGTCGGTGTTTCGTCCTTTC  及び
G term-G4
TAGGAGGCGCTCGGTGGTCCTGGTTGAGGTGCCCTTGCCGAGGAGTTTTTTGGAAAAGCTTATCG
本構築物のマップは図37Aに示されている。さらに前記構築物によって生成される予想されるRNAの配列は図37Bに示されている。
これらの構築物の活性をアッセイするために、C2C12筋原細胞を前記構築物でトランスフェクションし、上記に記載したようにAkt2タンパク質レベルを定量的ウェスタンブロットを用いて測定した。
これらの実験結果は図38に示されている。図では、pU6.GG-4はpU6.GG-2又はpU6.GG-3と比較して活性の増加を示すことが明らかである。
【００６８】
１０．ADAR及びβアクチンを標的とする二重ヘアピン構築物
10−1．テスト構築物：
本実施例では、ADAR1及びADAR2遺伝子（これらは時にそれぞれADARA及びADARBとしてもまた知られている）を不活化するためにこれらの遺伝子を標的とするDNA構築物を調製した。
2つのプラスミド、pU6.ACTB-A hp（図2）及びpU6.ACTB-A48 hp（図39）を用いた。これらの構築物は、βアクチンmRNAを不活化するように設計され、本実験では下記に記載するようにコントロールとして用いた。さらに、pＵ6.ACTB-A hpは、下記で設計されるように多くの構築物を作製するための前駆体として用いた。
pU6.ACTB-Ahpについて上記に記載した方法と類似の方法を用いて構築物pＵ6.ACTB-A48ｈｐを調製した。本事例では、8つのオリゴヌクレオチドをアニールさせた。すなわち、
ACTB48-9    ACCGTGAAGATCAAGATCATTGCTCCTCCTGA
ACTB48-10   CAATGATCTTGATCTTCA
ACTB48-3    GCGCAAGTACTCCGTGTGGTTCAAGAGA
ACTB48-4    CCACACGGAGTACTTGCGCTCAGGAGGAG
ACTB48-5    CCACACGGAGTACTTGCGCTCAGGAGGAGCA
ACTB48-6    TGAGCGCAAGTACTCCGTGTGGTCTCTTGAA
ACTB48-11   AATGATCTTGATCTTCATTTTTGGAAA
ACTB48-12   AGCTTTTCCAAAAATGAAGATCAAGATCATTGCTCCTCC
4つの部分的に相補的なオリゴヌクレオチド対（ACTB48-9及びACTB48-10、ACTB48-3及びACTB48-4、ACTB48-5及びACTB48-6、並びにACTB48-11及びACTB48-12）をアニールさせ、アニールした対自体をさらに2サイクルのアニーリングによりアニールさせて、図39に模式的に示したように、BsmBI/HindIII消化pU6.cassへのクローニングに適合する二本鎖DNA構造を作製した。前記アニールしたオリゴヌクレオチドを上記のようにpU6.cassでクローニングした。このプラスミドは、転写がヒトU6プロモーターで開始しアニールした配列の3'領域のポリT索で終了する、48ntのヘアピンRNAを発現すると予想された。
これらの実験で用いられた構築物は表5に記載されている。通常の一重hpDNA構築物をコントロールとして用いた。二重ヘアピン構築物を調製し、それらの活性を前記コントロール構築物と比較した。前記コントロール構築物は単一の遺伝子を標的とし、テスト構築物（“二重ヘアピン”構築物）は2つの遺伝子を標的とする（1つの遺伝子はヘアピン配列の基部によって標的とされ、二番目のものはヘアピン構造のループ近くの配列によって標的とされる）。
【００６９】
表5：本実験で用いられるコントロール及び“二重ヘアピン構築物”
2006526394.tif 000006
a不活化の標的とされるmRNA 
−ADAR1部位Aは、GenBank配列NM_001111の1477から1497位に対応する。
−ADAR2部位Cは、GenBank配列HSU82121の22から42位に対応する。
−ADAR2部位Aは、GenBank配列HSU82121の2134から2154位に対応する。
−ADAR1部位A及びADAR2部位Aは完全に異なる配列である。
−ADAR1部位B及びADAR2部位Bは、ADAR1及びADAR2遺伝子の両方に存在する同一の配列であり、ADAR1部位BはGenBank配列NM_00111の2906から2927位に対応する。ADAR2部位Bは、GenBank配列HSU82121の1174から1192位に対応する。
【００７０】
前記テスト構築物は以下のようにして調製した。
pU6.AD1-A：
この構築物はADAR1 mRNAを標的とし前記をADAR1 A部位で不活化するように設計され、二重ヘアピン構築物（全てヘアピンの基部に存在する配列によりA部位でADAR1 mRNAを標的とする）のためのコントロールとして機能した。本構築物は上記で述べたようにロングレンジPCR法を用いて調製した。プラスミドpU6.ACTB-A hpを基質として用い、これを下記のプライマーを用いPfu Turboポリメラーゼ（Stratagene）で増幅した：
pU6ADAR-Aフォワード
AGAGATGAACAGGTGGTTTCAGTCTTTTTGGAAAAGCTTATCGATACC
pU6ADAR-Aリバース
TGAATGAACAGGTGGTTTCAGTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG
この構築物のマップは図40に示されている。
pU6.AD2-C：
この構築物はADAR1 mRNAを標的とし前記をADAR2 C部位で不活化するように設計され、二重ヘアピン構築物（全て異なる部位でADAR2 mRNAを標的とする）のためのコントロールとして機能した。本構築物は上記で述べたようにロングレンジPCR法を用いて調製した。プラスミドpU6.ACTB-A hpを基質として用い、これを下記のプライマーを用いPfu Turboポリメラーゼ（Stratagene）で増幅した：
pU6ADARB1-Aフォワード
AGAGAGGCTGTGAACAGACGCGCCTTTTTGGAAAAGCTTATCGATACC
pU6ADARB1-Aリバース
TGAAGGCTGTGAACAGACGCGCCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG
この構築物のマップは図41に示されている。
pU6.AD2-A：
この構築物はADAR2 mRNAを標的とし前記をADAR2 A部位で不活化するように設計され、二重ヘアピン構築物（全てヘアピン構造のループ近くに存在する配列によりA部位でADAR2 mRNAを標的とする）のためのコントロールとして機能した。本構築物は上記で述べたようにロングレンジPCR法を用いて調製した。プラスミドpU6.ACTB-A hpを基質として用い、これを下記のプライマーを用いPfu Turboポリメラーゼ（Stratagene）で増幅した：
pU6ADARB1-Cフォワード
3AGAGAAGTGCTGCTGGAACTCATGCTTTTTGGAAAAGCTTATCGATACCG
pU6ADARB1-Cリバース
3TGAAAGTGCTGCTGGAACTCATGCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG
この構築物のマップは図42に示されている。
pU6.AD1/2-B：
この構築物はADAR1 B部位及びADAR2 B部位での不活化のためにADAR1及びADAR2 mRNAの両方を標的とするように設計された。ADAR1 mRNA及びADAR2 mRNAはともにこの部位を含み、したがって両mRNAは強力に前記構築物内の単一のヘアピンエレメントによって不活化された。この構築物は二重ヘアピン構築物（全て異なる部位でADAR1及び／又はADAR2 mRNAを標的とする）のためのコントロールとして機能した。本構築物は上記で述べたようにロングレンジPCR法を用いて調製した。プラスミドpU6.ACTB-A hpを基質として用い、これを下記のプライマーを用いPfu Turboポリメラーゼ（Stratagene）で増幅した：
pU6ADAR1/2-Bフォワード
AGAGATTATTTXTGCATGGCAGTCATTTTTGGAAAAGCTTATCGATACCG
pU6ADAR1/2-Bリバース
3TGAATTATTTCTGCATGGCAGTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG
この構築物のマップは図43に示されている。
pU6.AD1&2-A/UU：
この二重ヘアピン構築物は、前記ヘアピン構築物の基部の配列によりADAR1 mRNAをADAR1 A部位で、さらに前記二重ヘアピン構造のループ近くの配列によりADAR2 mRNAをADAR2 A部位で不活化するように設計された。前記2つの構造エレメントは2ヌクレオチドの“バブル”配列UUによって分離されている（図44）。本構築物は上記で述べたようにロングレンジPCR法を用いて調製した。プラスミドpU6.AD1-Aを基質として用い、これを下記のプライマーを用いPfu Turboポリメラーゼ（Stratagene）で増幅した：
pU6ADAR1/2-AAフォワード
AGAGAGGCTGTGAACAGACGCGCCTTTGAACAGGTGGTTTCAGTCTTTTTGGAAAAGC
pU6ADAR1/2-AAリバース
TGAAGGCTGTGAACAGACGCGCCAATGAACAGGTGGTTTCAGTCGGTGTTTCGT
この構築物のマップは図44に示されている。
pU6.AD1&2-A/UUA：
この二重ヘアピン構築物は、前記ヘアピンDNA構築物の基部の配列によりADAR1 mRNAをADAR1 A部位で、さらに前記二重ヘアピン構造のループ近くの配列によりADAR2 mRNAをADAR2 A部位で不活化するように設計された。前記2つの構造エレメントは3ヌクレオチドの“バブル”配列UUAによって分離されている（図45）。本構築物は上記で述べたようにロングレンジPCR法を用いて調製した。プラスミドpU6.AD1-Aを基質として用い、これを下記のプライマーを用いPfu Turboポリメラーゼ（Stratagene）で増幅した：
pU6ADAR1/2-AA(+1)F
AGAGAGGCTGTGAACAGACGCGCCTTGTGAACAGGTGGTTTCAGTCTTTTTGGAAAAGC
pU6ADAR1/2-AA(+1)R
TGAAGGCTGTGAACAGACGCGCCTAATGAACAGGTGGTTTCAGTCGGTGTTTCGT
この構築物のマップは図45に示されている。
pU6.AD1&2-A/UUACAA：
この二重ヘアピン構築物は、前記ヘアピンDNA構築物の基部の配列によりADAR1 mRNAをADAR1 A部位で、さらに前記二重ヘアピン構造のループ近くの配列によりADAR2 mRNAをADAR2 A部位で不活化するように設計された。前記2つの構造エレメントは6ヌクレオチドの“バブル”配列UUACAAによって分離されている（図46）。本構築物は上記で述べたようにロングレンジPCR法を用いて調製した。プラスミドpU6.AD1-Aを基質として用い、これを下記のプライマーを用いPfx Turboポリメラーゼ（Invitrogen）で増幅した：
pU6ADAR1/2-AA ButF
AGAGAGGCTGTGAACAGACGCGCCTTGTAATGAACAGGTGGTTTCAGTCTTTTTGGAAAAGC
pU6ADAR1/2-AA ButR
TGAAGGCTGTGAACAGACGCGCCTTGTAATGAACAGGTGGTTTCAGTCGGTGTTTCG
この構築物のマップは図46に示されている。
【００７１】
10−2．コントロール構築物
2つのヘアピンDNA構築物、pU6.ACTB-A hp（図2）及びpU6.ACTB-A48 hp（図39）をヘアピンRNAを発現させることの非特異的作用についてのコントロールとして用いた。前記構築物、pU6.ACTB-A48 hpは、二重ヘアピン構築物によって発現されるサイズと非常に類似するサイズのヘアピンRNAを発現するのでもっとも適切なコントロールであった。pU6.ACTB-A hpが標的とするACTB-A配列は、GenBank配列NM_0011101の1045−1065位と対応する。pU6.ACTB-A48 hpが標的とするACTB-A配列は、GenBank配列NM_0011101の1045−1094位と対応する。さらに別のコントロールとして、ADAR1 B及びADAR2 B部位を標的とするsiRNAの作用をT7プロモーターから転写したRNAを用いて検査した。このsiRNAをsiAD1/2-Bと命名し、以下のオリゴヌクレオチドを用いて調製した：
ADAR1/2-B T7S
AATGACTGCCATGCAGAAATACCTGTCTC
ADAR1/2-B T7AS
AATATTTCTGCATGGCAGTCACCTGTCTC
さらに別のコントロールとして、ACTB-A部位を標的として狙い撃ちするsiRNAの作用をT7プロモーターから転写したRNAを用いて検査した。このsiRNAをsiACTB-Aと命名し、このsiRNAをコードするDNAを以下のオリゴヌクレオチドを用いて調製した：
ACTB-A T7S
AATGAAGATCAAGATCATTGCCCTGTCTC
ACTB-A T7AS
AAGCAATGATCTTGATCTTCACCTGTCTC
【００７２】
10−3．βアクチン及びADAR1を標的とする二重ヘアピン構築物
βアクチン及びADAR1の両方を標的とする、さらに5つの構築物を表6に概説したように調製した（表6は本発明の他の実施態様を示している）
表6：二重ヘアピン構築物
2006526394.tif 000007
aACTB-A部位はNM_001101の1045−1065に対応する。
本構築物は上記で述べたようにロングレンジPCR法を用いて調製した。
pU6.ACTB-A/UUA：
この構築物は、ACTB-A（βアクチン）の配列を有する一重ヘアピンDNAの活性をUUAバブル配列が強化するか否かをテストするために設計した。この構築物は、プラスミドpU6.ACTB-A hpを基質として用い、これを下記の2つのプライマーにより増幅して調製されている： 
ACTADdelR
CTGAAATCTCTTGAATTTCAGTCTAAGCAATGATCTTGATCTTCACGGTG
ACTADdelF
TCTTGGCAATGATCTTGATCTTCATTTTTGGAAAAGCTTATCGATACCGTC
この構築物のマップは図48に示されている。
pU6.AD1-A&ACTB-A/UU：
この構築物は、UUバブル配列をもつ構築物が2つのmRNA（すなわちADAR1及びβアクチン）を不活化することができるか否かをテストするために設計された。この構築物は、プラスミドpU6.AD1&2-A/UUを基質として用い、下記の2つのプライマーで増幅して調製されている： 
AAR
TCATTGCTCTCTTGAAGCAATGATCTTGATCTTCAAATGAACAGGTGGTTTCAGTCGGTG
AAF
TCTTGATCTTCATTTGAACAGGTGGTTTCAGTCTTTTTGGAAAAGCTTATCGATACCGTC
この構築物のマップは図49に示されている。
pU6.AD1-A&ACTB-A/UUA：
この構築物は、UUAバブル配列をもつ構築物が2つのmRNA（すなわちADAR1及びβアクチン）を不活化することができるか否かをテストするために設計された。この構築物は、プラスミドpU6.AD1&2-A/UUを基質として用い、下記の2つのプライマーで増幅して調製した： 
AA+1R
TCATTGCTCTCTTGAAGCAATGATCTTGATCTTCATAATGAACAGGTGGTTTCAGTCGGTG
AA+1F
TCTTGATCTTCATTGTGAACAGGTGGTTTCAGTCTTTTTGGAAAAGCTTATCGATACCGTC
この構築物のマップは図50に示されている。
pU6.AD1-A&ACTB-A/UUAG：
この構築物は、UUAGバブル配列をもつ構築物が2つのmRNA（すなわちADAR1及びβアクチン）を不活化することができるか否かをテストするために設計された。この構築物は、プラスミドpU6.AD1&2-A/UUを基質として用い、下記の2つのプライマーで増幅して調製した： 
AA+2R
CATTGCTCTCTTGAAGCAATGATCTTGATCTTCACTAATGAACAGGTGGTTTCAGTCGGTG
AA+2F
ATCTTGATCTTCATTGATGAACAGGTGGTTTCAGTCTTTTTGGAAAAGCTTATCGATACCGTC
この構築物のマップは図51に示されている。
pU6.AD1-A&ACTB-A/UUACAA：
この構築物は、UUACAAバブル配列をもつ構築物が2つのmRNA（すなわちADAR1及びβアクチン）を不活化することができるか否かをテストするために設計された。この構築物は、プラスミドpU6.AD1&2-A/UUを基質として用い、下記の2つのプライマーで増幅して調製した： 
AABR
CATTGCTCTCTTGAAGCAATGATCTTGATCTTCATTGTAATGAACAGGTGGTTTCAGTCGGTG
AABF
ATCTTGATCTTCATTGTAATGAACAGGTGGTTTCAGTCTTTTTGGAAAAGCTTATCGATACCGTC
この構築物のマップは図52に示されている。
pU6.ACTB-A&AD1-A/UUA：
この構築物は、UUAバブル配列をもつ構築物が2つのmRNA（すなわちβアクチン及びADAR1）を不活化することができるか否かをテストするために設計された。この構築物は、AD1-A及びACTB-Aの相対的な位置が異なるという点で構築物pU6.AD1-A&ACTB-A/UUとは異なっていた。この構築物は、プラスミドpU6.ACTB-A hpを基質として用い、下記の2つのプライマーで増幅して調製した： 
ACTADR
TGTTCATCTCTTGAATGAACAGGTGGTTTCAGTCTAAGCAATGATCTTGATCTTCACGGTG
ACTADF
GGTGGTTTCAGTCTTGGCAATGATCTTGATCTTCATTTTTGGAAAAGCTTATCGATACCGTC
この構築物のマップは図53に示されている。図54は、ADAR1及びβアクチンを標的とする前記二重ヘアピン構築物によって生成されるヘアピンRNAの予想される構造を示している。
【００７３】
10−4．組織培養
公知の方法を用いてHeLa細胞を組織培養で増殖させ維持した。HeLa細胞をトランスフェクションするために、200,000細胞を6ウェルの組織培養プレートの各ウェルに播種し、一晩インキュベートした。その後、細胞をsiRNA又はプラスミドDNAでトランスフェクションした。siRNAをオリゴフェクタミンを製造元（Invitrogen）のプロトコルにしたがって使用してトランスフェクションした。プラスミドDNAをポリフェクト（PolyFect）を製造元（Qiagen）のプロトコルにしたがって使用して、細胞をトランスフェクションした。細胞をトランスフェクションの後48時間インキュベートし、ADAR1、ADAR2及び／又はβアクチンのmRNAレベルの分析のために全RNAを単離した。
【００７４】
10−5．RNAの調製及び即時定量PCR及びノザンブロットアッセイを用いた分析
キアゲン(QIAGEN)RNeasyミニカラムを製造元のプロトコルにしたがって使用し全RNAを調製した。DNaseの混入を除去するため、サンプルを製造元（Qiagen）のプロトコルにしたがってDNaseで処理した。、ダイナルダイナビーズ（DYNAL Dynabeads(登録商標)）mRNAダイレクト（mRNA DIRECT(登録商標)）マイクロキットを製造元（DYNAL）のプロトコルにしたがって用いポリA+RNAを調製した。ADAR1及びADAR2のmRNAレベルは、即時定量PCRアッセイを用いて決定した。各RNAサンプルについて、SYBRグリーン取り込みを用いて３つのデュープリケートアッセイを実施し、相対的なmRNAレベルを決定した。当業者に周知の方法を用いて前記反応及び分析を実施した。
定量的ノザンブロット分析を用いてβアクチンmRNAレベルを決定し、それによってβアクチンの不活化を定量した。細胞から単離した全RNAのノザンブロットをβアクチンmRNAに特異的な3'UTRに特異的なフラグメント（全HeLa細胞RNAのPCRを用いて調製）で探査し、ハイブリダイゼーションの度合いはホスホイメージャーを用いて定量した。等しくない装荷量を較正するために、ノザンフィルターを分割し、続いてヒトGAPDHに対応するPCRフラグメントで再探査し、ホスホイメージャーを用いてハイブリダイゼーションの度合いを再度定量した。続いて、個々のRNAサンプルのβアクチンmRNAレベルをGAPDHレベルに対して正規化し、実験処置間におけるβアクチンの相対的レベルを決定した。これらの分析に用いた方法及び工程は当業者によく知られたものである。
【００７５】
10-6.二重ヘアピン構築物は２つの遺伝子を同時に不活性化することができ増強された活性を示し得る
図55のグラフは、種々のDNA構築物及びsiRNAをトランスフェクトした細胞における相対的ADAR1mRNAレベルを示している。全てのデータはpU6.ACTB-A48 hpをトランスフェクションした細胞で決定したADAR1のmRNAレベルに対して正規化した（前記構築物は二重hp構築物と極めて類似するヘアピンRNAを生成するからである）。白棒線は、HeLa細胞及び種々の非特異的コントロールでトランスフェクションしたHeLa細胞におけるADAR1mRNAレベルを表している。構築物、pU6.ACTB-A hp及びpU6.AD2-CはADAR1mRNAに対して相対的に極めてわずかな作用しか与えなかった。構築物pU6.AD2-A（斜線付棒線）（ADAR2を標的とする）はADAR1mRNAレベルを低下させた。この結果は人工産物かもしれないが、ADAR2-A部位の17／21ヌクレオチドはADAR1配列と共通であるので真性のADAR1mRNA減少を反映しているかもしれない。横線の入った棒線は、siRNAコントロールでトランスフェクションしたHeLa細胞の相対的ADAR1 mRNAレベルを表している。ACTB-A siRNAは、ADAR1mRNAに対して中等度の非特異的作用を示したが、一方、siAD1/2-BはADAR1 mRNAを劇的に減少させた。灰色の棒線は、DNA構築物pU6.AD1-A及びpU6.AD1/2-BをトランスフェクトしたHeLa細胞のADAR1 mRNAレベルを表している。前記両構築物は分解のためにADAR1 mRNAを標的とし、両者ともにADAR1 mRNAレベルを劇的に減少させた。黒棒線は、二重ヘアピンDNA構築物pU6.AD1&2/UU、pU6.AD1&2/UUACAA及びpU6.AD1&2/UUAをトランスフェクトしたHeLa細胞の相対的なADAR1 mRNAレベルを表している。pU6.AD1&2/UUACAA及びpU6.AD1&2/UUAは両者ともADAR1 mRNAレベルを顕著に減少させた。極めて重大なことには、pU6.AD1&2/UUAはコントロールpU6.AD1-Aと比較して活性の増加を示した。構築物pU6.AD1&2/UUはADAR1 mRNAに対して活性を示さなかった。これらのデータはヘアピンDNA構築物内に小さなバブル配列を組み入れることによって、DNA構築物（一重構築物又は二重ヘアピン構築物のいずれの関連でも）の活性が強化されることを示している。
【００７６】
図56のグラフは、種々のDNA構築物及びsiRNAでトランスフェクションした細胞における相対的なADAR2のmRNAレベルを示している。全てのデータはpU6.ACTB-A48 hpでトランスフェクションした細胞で決定したADAR2のmRNAレベルに対して正規化されている（前記構築物は二重hp構築物と極めて類似するヘアピンRNAを生成するからである）。白棒線は、HeLa細胞及び種々の非特異的コントロールをトランスフェクトされたHeLa細胞におけるADAR2 mRNAレベルを表している。構築物、pU6.ACTB-A hp及びpU6.AD1-AはADAR2 mRNAレベルに対して相対的に極めてわずかな作用しか与えなかった。横線の入った棒線は、siRNAコントロールをトランスフェクトしたHeLa細胞の相対的ADAR1 mRNAレベルを表している。ACTB-A siRNAは、ADAR1 mRNAに対して中等度の非特異的作用を示したが、一方、siAD1/2-BはADAR1mRNAを劇的に減少させた。灰色の棒線は、DNA構築物pU6.AD2-C、pU6.AD2-A及びpU6.AD1/2-BでトランスフェクションしたHeLa細胞のADAR2mRNAレベルを表している。構築物pU6.AD2-CはADAR2のmRNAレベルに対して影響を与えなかったが、一方、pU6.AD2-A及びpU6.ACT1/2-Bは中等度にADAR2 ｍＲＮＡを減少させた。黒棒線は、二重ヘアピンDNA構築物でトランスフェクションしたHeLa細胞の相対的なADAR1 mRNAレベルを表している。構築物pU6.AD1&2/UUはADAR2 mRNAに対して活性を示さず、ADAR1 mRNAの場合と同じであった。構築物pU6.AD1&2/UUACAA及びpU6.AD1&2/UUAは両者ともに、pU6.AD2-A及びpU6.AD1/2-Bについて観察されたものと同様にADAR2 mRNAレベルを中等度に減少させた。これらのデータは、我々がテストした少なくとも2つのバブル配列の状況下ではループ配列に隣接する短いヘアピン配列は第二の遺伝子を不活化することができることを示している。
【００７７】
図57は、種々のDNA構築物でトランスフェクションした細胞における相対的なADAR1のmRNAレベルを示している。全てのデータはpU6.ACTB-A hpでトランスフェクションした細胞に対して正規化されている（前記構築物は本実験では非特異的コントロールとして用いられた）。灰色の棒線は、構築物pU6.AD1-AはADAR1 mRNAレベルに対して中等度の作用を有することを示し、これは図55で観察されたレベルと同様であった。構築物pU6.AD1-A&ACTB-A/UU、pU6.AD1-A&ACTB-A/UUA、pU6.AD1-A&ACTB-A/UUAG、pU6.AD1-A&ACTB-A/UUACA及びpU6.ACTB-A&AD1/UUAは全て、ADAR1 mRNAレベルの低下をもたらし、構築物pU6.AD1-A&ACTB-A/UUAGは最高の活性を示した。これらの結果は、二重ヘアピンの状況下のADAR1配列はADAR1 mRNAを不活化することができることを示している。
【００７８】
図58は、種々のDNA構築物でトランスフェクションした細胞における、定量的ノザンブロット分析で測定されたβアクチンmRNAの相対的レベルを示している。本事例では、全てのデータは構築物pU6.AD1&2-A/UUAに対して正規化されている。種々の非特異的コントロール（pU6.AD1-A、pU6.AD1&2-A/UU、pU6.AD1&2-A/UUA及びpU6.AD1&2-A/UUACAA）はβアクチンmRNAレベルに大して本質的に影響を与えなかった。構築物pU6.ACTB-A hpでトランスフェクションした細胞は、βアクチンmRNAレベルで約30％の低下を示した。構築物pU6.AD1-A&ACTB-A/UU、pU6.AD1-A&ACTB-A/UUA、pU6.AD1-A&ACTB-A/UUAG、pU6.AD1-A&ACTB-A/UUACAA及びpU6.ACTB-A&AD1/UUAをトランスフェクトした細胞は全てβアクチンmRNAのレベルで低下を示し、構築物pU6.AD1-A&ACTB-A/UUAGは最高の活性を示した。これらのデータは、二重ヘアピンという状況下でβアクチン配列はβアクチンのmRNAを不活化することができることを示している。図57で示された前記結果と合わせてこれらの結果は、二重ヘアピン構築物は2つの遺伝子を同時に不活化することができることを示している。
【００７９】
11．“バブル”配列のランダムライブラリーのスクリーニングによる二重ヘアピン構築物の活性の増強
二重ヘアピン構築物又はそれより高次の他のヘアピン構築物の活性を増強することができる配列を特定するために、ダイサープロセッシングのための部位であると予想し得るhpRNAの領域に任意抽出配列を含む、一連のライブラリーを調製した。
これらの実験のための基礎となる構築物は構築物pU6.GR-21である。前記は上記に記載したオリゴヌクレオチドアニーリング法により以下のプライマーを用いて調製した：
LGR-1    ACCGCTGACCCTGAAGTTCATCCTGGCCTTTC
LGR-2    GGAGTAGTGAAAGGCCAGGATGAACTTCAGGGTCAG
LGR-3    ACTACTCCTACTTTGTGTAGGT
LGR-4    ACTACTCCTACCTACACAAAGTA
LGR-5    AGGAGTAGTGAAAGGCCAGGATGAACTTC
LGR-6    CTGACCCTGAAGTTCATCCTGGCCTTTC
LGR-7    AGGGTCAGCTTTTTTGGAAA
LGR-8    AGCTTTTCCAAAAAAG
本構築物のマップは図59Aに示されている。さらに前記構築物によって生成される予想されるRNAの配列は図59Bに示されている。
下記に記載するライブラリー構築物は全て、前記二重ヘアピン構築物の頂上部の位置にレニラルシフェラーゼを標的とする同一の配列を含んでいる。前記ライブラリーの個々のクローンの活性を上記に述べたようにpU6.GR-21配列と比較することによって、活性の強化を示すバブルの配列を決定することができるかもしれない。そのようなデータを基にして、二重ヘアピン構築物またはそれより高次のヘアピン構築物の活性を強化するための一般化された設計規則を開発することができるであろう。
【００８０】
pU6.GR-21-1-2N：
本構築物シリーズは、上記に記載したオリゴヌクレオチドアッセンブリー法を用いて調製した。ライブラリーは以下のオリゴヌクレオチドを用いて調製した：
LGR-1-2-N      ACCGCTGACCCTGAAGTTCATCCNNGCCTTTC
LGR-2-2N       GGAGTAGTGAAAGGCNNGGATGAACTTCAGGGTCAG
LGR-3          ACTACTCCTACTTTCAGTAGGT
LGR-4          ACTACTCCTACCTACACAAAGTA
LGR-5          AGGAGTAGTGAAAGGCCAGGATGAACTTC
LGR-6          CTGACCCTGAAGTTCATCCTGGCCTTTC
LGR-7          AGGGTCAGCTTTTTTGGAAA
LGR-8          AGCTTTTCCAAAAAAG
本事例で、Nは任意のヌクレオチドを指す。本構築物のマップは図60Aに示されている。さらに前記構築物によって生成される予想されるRNAの配列は図60Bに示されている。
pU6.GR-21-4-2N：
本構築物シリーズは、上記に記載したオリゴヌクレオチドアッセンブリー法を用いて調製した。ライブラリーは以下のオリゴヌクレオチドを用いて調製した：
LGR-1          ACCGCTGACCCTGAAGTTCATCCTGGCCTTTC
LGR-2          GGAGTAGTGAAAGGCNNGGATGAACTTCAGGGTCAG
LGR-3          ACTACTCCTACTTTGTGTAGGT
LGR-4          ACTACTCCTACCTACACAAAGTA
LGR-5-2N       AGGAGTAGTGAAAGGCCANNATGAACTTC
LGR-6-2N       CTGACCCTGAAGTTCATNNTGGCCTTTC
LGR-7          AGGGTCAGCTTTTTTGGAAA
LGR-8          AGCTTTTCCAAAAAAG
本事例で、Nは任意のヌクレオチドを指す。このような構築物のマップは図61Aに示されている。さらに前記構築物によって生成される予想されるRNAの配列は図61Bに示されている。
pU6.GR-21-1&4-2N：
本構築物シリーズは、上記に記載したオリゴヌクレオチドアッセンブリー法を用いて調製した。ライブラリーは以下のオリゴヌクレオチドを用いて調製した：
LGR-1-2N        ACCGCTGACCCTGAAGTTCATCCNNGCCTTTC
LGR-2-2N        GGAGTAGTGAAAGGCNNGGATGAACTTCAGGGTCAG
LGR-3           ACTACTCCTACTTTGTGTAGGT
LGR-4           ACTACTCCTACCTACACAAAGTA
LGR-5-2N        AGGAGTAGTGAAAGGCCANNATGAACTTC
LGR-6-2N        CTGACCCTGAAGTTCATNNTGGCCTTTC
LGR-7           AGGGTCAGCTTTTTTGGAAA
LGR-8           AGCTTTTCCAAAAAAG
本事例で、Nは任意のヌクレオチドを指す。このような構築物のマップは図62Aに示されている。さらに前記構築物によって生成される予想されるRNAの配列は図62Bに示されている。
pU6.GR-22-1-4N：
本構築物シリーズは、上記に記載したオリゴヌクレオチドアッセンブリー法を用いて調製することができる。本事例ではランダムなオリゴヌクレオチドを使用せず、予想されるhpRNAで塩基対を形成できない3つのヌクレオチドが合成により取り込まれる。前記構築物を作製するために、オリゴヌクレオチドGR5-22、GR6-22、GR7及びGR8を以下のものと一緒にアニールさせる： 
GR22-1-4N-1        ACCGCTGACCCTGAAGT
GR22-1-4N-2        AGTGAAAGGDDBHAGATGAACTTCAGGGTCAG
GR22-1-4N-3        TCATCTDVHHCCTTTCACTACTCCTACTTTGTG
GR22-1-4N-4        CTCCTACCTACACAAAGTAGGAGT
本事例では、DはA、G又はTを示し、BはC、G又はTを示し、HはA、C又はTを示し、さらにVはA、C又はGを示す。このような構築物のマップは図63Aに示されている。さらにこのような構築物から生成されるhpRNAの予想される配列および構造は図63Bに示されている。
pU6.GR-22-1-4N：
本構築物シリーズは、上記に記載したオリゴヌクレオチドアッセンブリー法を用いて調製することができる。本事例ではランダムオリゴヌクレオチドを使用せず、予想されるhpRNAで塩基対を形成できない3つのヌクレオチドが合成により取り込まれる。前記構築物を作製するために、オリゴヌクレオチドGR1、GR2-22、GR3-22、GR4、GR7及びGR8を以下のものと一緒にアニールさせる： 
GR22-4-4N-5        TAGGTAGGAGTAGTGAAAGGDDBHAGATGAA
GR22-4-4N-6        ACCCTGAAGTTCATCTDVHHCCTTTCACTA
本事例では、DはA、G又はTを示し、BはC、G又はTを示し、HはA、C又はTを示し、さらにVはA、C又はGを示す。このような構築物のマップは図63Cに示されている。さらにこのような構築物から生成されるhpRNAの予想される配列および構造は図63Dに示されている。
pU6.GR-22-1-NAAN：
本構築物シリーズは、上記に記載したオリゴヌクレオチドアッセンブリー法を用いて調製することができる。本事例では、ランダムオリゴヌクレオチドを取り込み、先に特定された最適なAA配列を増強させることができる配列についてスクリーニングすることができる。前記構築物を作製するために、オリゴヌクレオチドGR22-1-4N-1、GR2-1-4N-4、GR5-22、GR6-22、GR7及びGR8を以下のものと一緒にアニールさせる： 
GR22-1-NAAN-2        AGTGAAAGGNTTNAGATGAACTTCAGGGTCAG
GR22-1-NAAN-3        TCATCTNAANCCTTTCACTACTCCTACTTTGTG
本事例では、Nは任意のヌクレオチドを指す。このような構築物のマップは図64Aに示されている。さらにこのような構築物から生成されるhpRNAの予想される配列および構造は図64Bに示されている。
pU6.GR-22-4-NAAN：
本構築物シリーズは、上記に記載したオリゴヌクレオチドアッセンブリー法を用いて調製することができる。本事例では、ランダムオリゴヌクレオチドを取り込み、先に特定された最適なAA配列を潜在的に増強させることができる配列についてスクリーニングすることができる。
前記構築物を作製するために、オリゴヌクレオチドGR1、GR2-22、GR3-22、GR4、GR7及びGR8を以下のものと一緒にアニールさせる：
GR22-4-NAAN-5          TAGGTAGGAGTAGTGAAAGGNAANAGATGAA
GR22-4-NAAN-6          ACCCTGAAGTTCATCTNTTNCCTTTCACTA
本事例では、Nは任意のヌクレオチドを指す。このような構築物のマップは図64Cに示されている。さらにこのような構築物から生成されるhpRNAの予想される配列および構造は図64Dに示されている。
pU6.GR-21-1＆4-4N：
本構築物シリーズは、上記に記載したロングレンジPCR法を用いて調製することができる。本事例では、ランダムなオリゴヌクレオチドを使用せず、予想されるhpRNAで通常の塩基対を形成できない3つのヌクレオチドが取り込まれる。これらの実験で使用するために適切なオリゴヌクレオチドは以下のとおりである： 
LU6GR-21-4N
CACAAAGTAGGAGTAGTGAAAGGDDBHGATGAACTTCAGGGTCAGCGGTGTTTCGTCCTTTC    及び
LtermGR-21-4N
TAGGTAGGAGTAGTGAAAGGCCBHHBTGAACTTCAGGGTCAGCTTTTTTGGAAAAGCTTATCG
本事例では、DはA、G又はTを示し、BはC、G又はTを示し、HはA、C又はTを示し、さらにVはA、C又はGを示す。このような構築物のマップは図635に示されている。さらにこの構築物から生成される予想されるRNAの配列は図65Bに示されている。
【００８１】
12．構築物のフェージング
ダイサーが発現されたhpRNAの基部からプロセッシングしていくというモデルを基にすれば、ダイサーによる切断間の（ヌクレオチドで表した）実際の距離は、最大活性を得るためにマルチ構築物を設計する際に決定的な因子となる。なぜならばダイサープロセッシングのこの“フェージング（phasing）”は、hpRNAから生成されるエフェクターsiRNAの配列の正確な同定に極めて重要であるためである。最適なフェージングを決定するために、一連の構築物を調製した。前記構築物は、Rlucを標的として、二重ヘアピン構築物の基部で種々の長さのEFGPエフェクター配列及び頂部で定常配列を発現するように設計した。
前記構築物は、上記に記載したようにオリゴヌクレオチドアッセンブリー法を用いて調製し、BsmBI／HindIII消化pU6.cassでクローニングした。この構築物の調製に用いた構築物及びオリゴヌクレオチドは以下のとおりであった：
pU.GR-17 hp：
GR1          ACCGCTGACCCTGAAGTTC
GR2-17       GAAAGGCCAGAACTTCAGGGTCAG
GR3-17       TGGCCTTTCACTACTCCTACTTTGTG
GR4          CTCCTACCTACACAAAGTAGGAGTAGT
GR5-17       TAGGTAGGAGTAGTGAAAGGCCAGAA
GR6-17       ACCCTGAAGTTCTGGCCTTTCACT
GR7          CTTCAGGGTCAGCTTTTTTGGAAA
GR8          AGCTTTTCCAAAAAAGCTG
pU.GR-18 hp：
GR1、GR4、GR7、GR8及び：
GR2-18       GAAAGGCCATGAACTTCAGGGTCAG
GR3-18       ATGGCCTTTCACTACTCCTACTTTGTG
GR5-18-2     TAGGTAGGAGTAGTGAAAGGCCATGAA
GR6-18-2     ACCCTGAAGTTCATGGCCTTTCACTA
pU6.GR-19 hp：
GR1、GR4、GR7、GR8及び：
GR2-19        GAAAGGCCAATGAACTTCAGGGTCAG
GR3-19        ATTGGCCTTTCACTACTCCTACTTTGTG
GR5-19        TAGGTAGGAGTAGTGAAAGGCCAGTGAA
GR6-19        ACCCTGAAGTTCACTGGCCTTTCACTA
pU6.GR-20 hp：
GR1、GR4、GR7、GR8及び：
GR2-20        GAAAGGCCAGATGAACTTCAGGGTCAG
GR3-20        ATCTGGCCTTTCACTACTCCTACTTTGTG
GR5-20        TAGGTAGGAGTAGTGAAAGGCCAGATGAA
GR6-20        ACCCTGAAGTTCATCTGGCCTTTCACTA
pU6.GR-21 hp：
GR1、GR4、GR7、GR8及び：
GR2-21        GAAAGGCCAGGATGAACTTCAGGGTCAG
GR3-21        ATCCTGGCCTTTCACTACTCCTACTTTGTG
GR5-21        TAGGTAGGAGTAGTGAAAGGCCAGGATGAA
GR6-21        ACCCTGAAGTTCATCCTGGCCTTTCACTA
pU6.GR-22 hp：
GR1、GR4、GR7、GR8及び：
GR2-22        GAAAGGCCAGAGATGAACTTCAGGGTCAG
GR3-22        ATCTCTGGCCTTTCACTACTCCTACTTTGTG
GR5-22        TAGGTAGGAGTAGTGAAAGGCCAGAGATGAA
GR6-22        ACCCTGAAGTTCATCTGCTGGCCTTTCACTA
pU6.GR-23 hp：
GR1、GR4、GR7、GR8及び：
GR2-23        GAAAGGCCAGCAGATGAACTTCAGGGTCAG
GR3-23        ATCTGCTGGCCTTTCACTACTCCTACTTTGTG
GR5-23        TAGGTAGGAGTAGTGAAAGGCCAGCAGATGAA
GR6-23        ACCCTGAAGTTCATCTGCTGGCCTTTCACTA
pU6.GR-24 hp：
GR1、GR4、GR7、GR8及び：
GR2-24      GAAAGGCCAGGCAGATGAACTTCAGGGTCAG
GR3-24      ATCTGCCTGGCCTTTCACTACTCCTACTTTGTG
GR5-24      TAGGTAGGAGTAGTGAAAGGCCAGGCAGATGAA
GR6-24      ACCCTGAAGTTCATCTGCCTGGCCTTTCACTA
pU6.GR-25 hp：
GR1、GR4、GR7、GR8及び：
GR2-25      GAAAGGCCAGTGCAGATGAACTTCAGGGTCAG
GR3-25      ATCTGCACTGGCCTTTCACTACTCCTACTTTGTG
GR5-25      TAGGTAGGAGTAGTGAAAGGCCAGTGCAGATGAA
GR6-25      ACCCTGAAGTTCATCTGCACTGGCCTTTCACTA
pU6.GR-26 hp：
GR1、GR4、GR7、GR8及び：
GR2-26      GAAAGGCCAGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCAG
GR3-26      ATCTGCACCTGGCCTTTCACTACTCCTACTTTGTG
GR5-26      TAGGTAGGAGTAGTGAAAGGCCAGGTGCAGATGAA
GR6-26      ACCCTGAAGTTCATCTGCACCTGGCCTTTCACTA
構築物のフェージングの例は図66に示されている。これらの構築物によって生成されるhpRNAの配列及び予想される構造は図67に示されている。
これらの構築物でトランスジェニックなRluc発現HeLa細胞を形質転換し、上記のようにRluc活性を決定した。これらの実験結果は図68に示されている。構築物pU6.GR-21 hpは最高の活性を示すことに注目されたい。21又は好ましくは22ntというフェージングはしたがって多くのhpRNAにとって最適である。
【００８２】
13．2Nライブラリーのスクリーニング
pU6.GR-21-1-2N及びpU6.GR-21-4-2Nライブラリーから任意に釣り上げたコロニーからプラスミドDNAを上記に記載したように調製し、トランスジェニックHeLa細胞におけるRlucに対する活性を上述したようにスクリーニングした。
pU6.GR-21-4-2Nライブラリーから得た合計22のクローンをこのようにしてスクリーニングした。前記クローンのいずれも活性の増加を示さなかった(データは提示していない)。
pU6.GR-21-1-2Nライブラリーから得た合計38のクローンをこのようにしてスクリーニングした。22クローンのデータを図69Aに示す。本実験では、これらのクローンの活性をコントロールpU6.ACTB Rluc TTAと比較したが、このクローンの活性はこの特定の実験で異常に高いと考えられた。結果的に、3つの最高のクローンの活性を再度テストし、結果は図69Bに示されている。これらのデータによって、クローンpU6.GR-21-1-2N-18は、もっとも適切なコントロールpU6.GR-21hpと比較して活性の強化を示すことが明示された。これらのデータは図69Bで確認されている。
配列決定して、pU6.GR-21-1-2N-18は予想されるhpRNAの21位と22位の間に配列AAを有することが示された。
【００８３】
14．多数の転写単位を含む構築物を用いた多数の遺伝子の不活化
多数の遺伝子を不活化するまた別のアプローチは、ただ1つの構築物から多数の転写物を発現させることである。そのような構築物の例は図71に示されている。
構築物pＵ6.GF-3（図71D）は2つの前駆体、pU6.GL（図71A）及びpU6.GG-4（図33及び図71C）から調製できる。pU6.GLは、図33に示した二重構築物pU6.GF-2と同じAkt1の領域でネズミのAkt1を標的とする。pU6.GLは上記に記載したロングレンジPCR法を用いて作製される。BglII、SAP処理pU6.casslinを以下のプライマーを用いて増幅する：
U6GL     CACAAACAGCTTCTCGTGGTCCTGGCGGTGTTTCGTCCTTTC
termGL   TAGCAGCTTCTCGTGGTCCTGGTTTTTTGGAAAAGCTTATCG
pU6.GLの一部分のマップは図71Aに示されている。プラスミド内のSmaI及びKpnIクローニング部位の位置もまた表示されている。このプラスミドから生成される予想される転写物は図71Bに示されている。pU6.GF-3は、pU6.GLから得られるU6転写単位を、SmaI/KpnIフラグメントとしてHincII/KpnI消化pU6.GG-4にクローニングし、pU6.GF-3を生成することによって調製することができる。pU6.GF-3は、図71Dに示すように2つのU6転写単位を含み、2つの別々のヘアピンRNA（一方はAkt1を、他方はAkt2を標的とする）を発現するように設計されている。この構築物の活性は上記に記載したように測定することができる（実施例8）。
【００８４】
15．HCVを標的とする構築物
多数の本発明の標的干渉性RNA核酸構築物で処置できるひとつの疾患はC型肝炎ウイルス（HCV）感染である。疾患予防センター（Centers for Disease Control and Prevention）がまとめた統計によれば、アメリカの人口のほぼ2％（ほぼ4百万人）が現在HCVに感染している。HCV感染個体の大半は最初は症状を示さないが、80％を超える人々が慢性及び進行性肝疾患を発し、最終的には肝硬変又は肝癌に至る。HCVは米国内では肝臓移植の主要な適用であり、毎年8,000から10,000人のアメリカ人が死亡している。世界的レベルでは、WHOの概算によれば、1億7千万人以上が罹患し、感染率はいくつかの国々では全人口の10−30％と高い。
HCVはフラビウイルス科に属するエンベロープをもつプラスセンスの一本鎖のRNAウイルスである。HCVの感染サイクルは、レセプター媒介結合及び内在化によるウイルス粒子の細胞内への侵入で開始する。細胞質で脱殻した後、ゲノムを構成するRNAのプラス鎖は宿主細胞の翻訳機構と直接相互作用することができる。5'キャップメチル化を欠くので、前記RNAは5'非翻訳領域（UTR）内に広範囲の二次構造を形成し、これは内部リボソームエントリーサイト（IRES）として機能し、翻訳プロセスの開始工程として40Sサブユニットの直接結合を可能にする。
HCVゲノム（長さはほぼ9600ヌクレオチド）は、ポリプロテインと称されるただ1つの長いオープンリーディングフレームをコードする。ウイルスタンパク質は、連結された前駆体として前記ポリプロテインから生成され、続いてこの前駆体は、多様なウイルス性及び細胞性酵素によって成熟生成物に切断される。遺伝子の中でコードされるものは、コア及びエンベロープ糖タンパク質を含む構造タンパク質（子孫ビリオンの必須の構造的成分であるのでこのように呼ばれる）である。非構造タンパク質（必要不可欠の機能（例えばRNA依存RNAポリメラーゼ）を提供する）もまた生成される。ウイルス複製機構（プラスセンスRNAをマイナス鎖の中間体に転写する）は、感染細胞の細胞質内で確立される。したがって、HCVゲノムRNAはそれ自身の複製のための鋳型とウイルスコードタンパク質の翻訳のためのメッセンジャーRNAの両方として機能する。マイナス鎖はRNAのプラス鎖に再び転写され、それによって細胞内でプラス鎖の数を増幅させる。この段階では、プラス鎖は宿主細胞の翻訳機構ともう一度相互作用するか、又は、十分な構造タンパク質が蓄積されている場合はプラス鎖をビリオンにパッケージすることができる。細胞からの脱出の後、ウイルスはその感染サイクルを繰り返す。
HCV複製の個々の工程の多くは理解されているが、最近までウイルスのライフサイクルを複製させる組織培養系が存在せず、このことは本ウイルスの研究を困難にしていた。しかしながら、in vitroのレプリコン系が開発された（例えば以下を参照されたい：Riceらの米国特許第5,585,258号、6,472,180号、6,127,116号）。レプリコンはHCVゲノムRNAの自律的複製部分であり、選別及び複製確認のためのマーカー遺伝子を含んでいる。HCV-RNA構築物を、持続的増殖の支持を許容する細胞株にトランスフェクションする。感染サイクルの工程に続いて、前記RNAは細胞機構によって翻訳され、選別マーカーがそうであるように、ゲノムの複製に必要な適切なウイルスタンパク質が生成される。完全長レプリコン及びサブゲノムレプリコンが作製され、機能を有することが示されたが、非構造タンパク質だけは必須である。前記RNAの自律的複製特性は構造遺伝子の発現とは独立に維持される。完全長のHCVゲノムを発現するレプリコンに存在するときでさえ、コア及びエンベロープタンパク質は効果的にゲノムを感染性粒子にパッケージすることができず、その結果ウイルスのパッケージ、脱出及び再侵入工程の研究におけるモデル系の損失を生じる。それにもかかわらず、レプリコンは、HCVが利用する生物学及び機構の一部分を再生成することができる。
【００８５】
本発明の干渉性RNAのin vivoデリバリーのためのAAV-2発現ベクターの開発
本発明の干渉性RNA核酸構築物の感染性粒子によるデリバリーをテストする前に、適切な発現プラスミドを構築し、有効性を確かめる。rep及びcapを除去したAAV-2ベクターは、ウイルス性の干渉性RNA核酸構築物のための骨格（以下ではrAAVベクターと称する）を提供することができる。このベクターはAAV実験で広く用いられており、効率的パッケージングの要件はよく知られている。U6及びH1プロモーターを本発明の干渉性RNAの発現のために用いることができる。ただし各プロモーターによって別個に駆動される同一の干渉性RNAの阻害レベルは大きく相違することが報告されている。しかしながら、ベクター構築物は、このような変動が見られる場合はプロモーターが容易に交換され得るようなものである。
実質的にはいずれのウイルスデリバリー系に関しても、rAAVベクターは、効率的にパッケージされるように一定のサイズ基準を満たす必要がある。一般的には、rAAVベクターは長さが4300−4900ヌクレオチドでなければならない（McCarty et al. Gene Ther. 8:1248-1254 (2001)）。rAAVベクターが制限未満になるときは、“スタッファー”フラグメントを付加する必要がある（Muzyczka et al. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158：970129 (1992））。ここで述べるAAVベクターの実施態様では、1つ又は2つ以上の選別可能マーカー遺伝子を操作してrAAV干渉性RNA核酸構築物に挿入し、rAAV干渉性RNA核酸構築物のトランスフェクション効率を判定するとともに、感染性粒子を介してデリバリーされるrAAV干渉性RNA核酸構築物による標的細胞の形質導入効率を定量することができる。
初期のテスト発現構築物は、レポーター構築物起源のルシフェラーゼ活性阻害について明らかにされている能力をもつ配列から設計された干渉性RNAの発現を駆動する（以下を参照されたい：Elbashir et al. Embo. J. 20(23):6877-6888 (2001)）。レポーターとしてルシフェラーゼ機能の生成をコードする市販の発現プラスミドは、標的配列をダウンレギュレートする種々の干渉性RNAの能力を確認するために用いられる。
ルシフェラーゼに対する干渉性RNAは以前に有効性を確認されているが、rAAVによってデリバリーされるRNAの有効性をin vivoで前記構築物をテストする前にin vitroで判定する。テスト構築物及びレポーター構築物を許容性細胞に標準的技術を用いてトランスフェクションする。ルシフェラーゼ特異的RNAi因子が無関係のRNA配列と置き換えられたrAAV発現構築物を本実験の陰性コントロールとして利用する。トランスフェクション効率の相対的百分率を、蛍光顕微鏡を用いて選択性マーカーレベルを判定することによって直接概算する。種々のRNAi因子の各々の阻害活性を判定するために、ルシフェラーゼ活性を標準的な市販キットを利用して測定する。又別には即時定量PCR分析（Q-PCR）を並行して実施した実験プレートから採集し精製したRNAについて実施する。無関係のRNA種で処理した細胞の溶解物で回収された活性と比較して、活性は約70％よりも低下し、前記RNAi因子は機能を有することが示される。
【００８６】
続いて、McCaffreyら（Nature 418:38-39 (2002)）の研究と同様にマウスの肝臓にトランスフェクションされたルシフェラーゼレポーター系に対する干渉性RNAの作用を評価するために実験を行う。流体力学トランスフェクション法（hydrodynamic transfection method）（高圧尾静脈注射）によってマウスにデリバリーされた核酸は主として肝臓に局在した。細胞培養における同時トランスフェクションを左右する原理に極めて類似しているが、混合物に由来する多数のプラスミドの同時注射ではしばしば発現構築物の全てが同じ細胞に侵入することを可能にする。したがって、尾静脈注射では肝臓内の5−40％の肝細胞しかトランスフェクトされないと言われているとしても（McCaffrey et al. Nature Biotech. 21(6):639-644 (2003)）、同時注射によってレポーター系及び発現構築物の同じ細胞へのデリバリーが可能になる。
ルシフェラーゼを標的とする干渉性RNAを保持するrAAV核酸構築物をルシフェラーゼ遺伝子をコードするレポーター構築物とともに同時注射する。陰性コントロールを投与される動物では、無関係のRNAを保持する発現構築物がレポーター構築物と同時注射される。7日後に、マウスを犠牲にし、肝臓を採集する。ルシフェラーゼ活性は肝臓の一部分から作製した溶解物で測定される。前記肝臓の残余部分はQ-PCR測定とともに組織学的分析に利用し、データの標準化のためにマーカータンパク質の発現を測定した。トランスフェクション効率を判定するためのまた別の方法は、分泌タンパク質（例えばヒトα1-アンチトリプシン（hAAT））のための第三のマーカープラスミドを同時注射したマウスから得た血清のELISA測定を含むことができる（Yant et al. Nature Genetics 25:35-41 (2000)；さらにまた以下を参照されたい：McCaffrey et al. Nature Biotech. 21(6):639-644 (2003)）。
核酸構築物が、裸のDNAプラスミドの同時トランスフェクションを利用することによってin vitro細胞培養系とともにin vivoマウスモデル系でも機能を有することがはっきりしたら、感染粒子にパッケージされたrAAV発現構築物でテストを開始する。感染性粒子は市販のAAVヘルパー非含有系から生成される。この系は以下を含む3つの別個の発現構築物の同時トランスフェクションを必要とする：１）ルシフェラーゼに対する干渉性RNAを発現するrAAV核酸構築物（前記RNAはAAV ITRによってフランキングされる）；２）AAV rep及びcap遺伝子をコードする構築物；及び３）高力価ウイルスの生成に必要なヘルパーアデノウイルス遺伝子を含む発現構築物。標準的な精製工程後に、ウイルス粒子を実験で使用する準備は完了する。
マウスにrAAV粒子を輸液する前に、マウスの肝臓でレポーター系を確立する。流体力学的トランスフェクションを用いてルシフェラーゼレポーター構築物とともにhAATのための発現プラスミドを動物間のトランスフェクション効率の相違の管理のためにデリバリーした。前記マウスを数日間回復させて十分なレベルのレポーター活性を確立させる。ルシフェラーゼレポーター活性を肝臓で確立させた後、AAV粒子を正常なC57B1/6マウスに門脈又は尾静脈注射により輸液する。無関係のRNAの発現構築物を保有するAAV粒子を陰性コントロールとして用いる。最初、比較的高い用量（2X1012ベクターゲノム（vg））をマウスに輸液する（前記用量はドースレスポンス曲線を作成するために実施される後続の実験では減少させる）。7から10日後に、マウスを犠牲にし、肝臓を採集し、さらに血清サンプルを収集する。肝臓のルシフェラーゼ活性及びRNAの相対的レベルを、単離した肝臓から先に述べたルシフェラーゼアッセイ及びQPCR工程を利用して決定する。さらにまた、形質導入効率を肝臓の連続切片でマーカータンパク質を測定することによって判定する。
流体力学的トランスフェクションによる方法は5-40％の肝細胞のトランスフェクションをもたらすことができると見積もられている。AAV-2デリバリー方法による肝細胞の形質導入は5-10％の形質導入効率をもたらすことが示された。AAVは、最初の尾静脈による方法でトランスフェクションされた同じ集団の肝細胞に優先的に形質導入され得るが、各々の技術が影響を及ぼす細胞のサブセットは重複していない可能性がある。前者が起これば、無関係の干渉性RNAが形質導入されたマウスと比較してルシフェラーゼ活性の低下が観察される。後者が起これば、ルシフェラーゼ活性の低下は観察されない。
【００８７】
肝臓組織のAAV形質導入の効率を高める改変
AAV系ベクターは所望の配列を肝細胞にデリバリーできることが示されたが、これらの組織内で生じる形質導入の相対的レベルはかなり低かった。AAV-2を用いて第IX血液因子をデリバリーしこれを発現させる現行の血友病研究のためには、前記は重大な問題ではない。血友病の治療のためには、分泌されたタンパク質のレベルを治療的レベルに補充することだけが重大である。そのような補充は、顕著なレベルの所望タンパク質を発現することができる少数の形質導入細胞からもたらされるであろう。しかしながら、干渉性RNAの作用機構は細胞内にあり、その作用は細胞から細胞へ直接伝達されないので、干渉性RNAを発現するAAVが治療として利用されるためには形質導入効率を高める必要がある。
McCartyらは、同じ発現カセットのプラス鎖及びマイナス鎖の両方をそのキャプシド内に有する自己相補性AAVベクター（scAAV）を作製することができた（Gene Ther. 8:1248-1254 (2001)）。前記は、5'ITRを変異させ、3'ITRを無傷のままにすることによって達成された。末端の分離部位他の非必須AAV配列を欠失又は変異させる、したがって野生型AAV及び本構築物による可能な組換えを排除することによって、複製が3'ITRで開始するDNA鋳型が作出される。複製機構がいったん5'ITRに到達したら、分離が起こらず、複製が3'ITRまで継続する。生じた生成物はプラス鎖及び相補的なマイナス鎖の両方を有し、しかも効率的にパッケージされる。このscAAVベクターを用い、肝臓細胞の形質導入は全肝細胞の30％に高められた（Fu et al. Molec. Therapy. doi:10.1016/j.ymthe.2003.08.021:1-7 (2003)）。大槽内にデリバリーしたとき、小脳内の50％を越えるプルキンエ細胞がscAAV粒子によって形質導入された。Thomasらは、自己相補性ベクターは、等しい用量でマウスの肝臓に輸液したとき、前記ベクターの対応する一本鎖AAVの対応物よりも50倍高いルシフェラーゼトランスジーン発現レベルをマウスの肝臓で達成できることを示した（Thomas et al. J. Virol.印刷中）。わずかに低下するとはいえ、前記ベクター間の相対的発現の相違は、注射ほぼ1年後に20倍を維持した。
形質導入効率の劇的な強化のためにAAVデリバリー系の他の改変もまた用いることができる。それらには、他の血清型由来のCapタンパク質でrAAV-2ベクターゲノムをパッケージすることによる偽型化ウイルス粒子の生成が含まれる。それらウイルスは全ての血清型のうちでもっとも性状が明らかであるので、AAV-1からAAV-6由来のCapタンパク質はもっとも一般的にAAV-2ベクターの偽型化に用いられる。これら偽型化戦略を利用して得られる利点をもってしても、肝細胞の形質導入効率の閾値は全集団の15％までしか増加させることはできない。しかしながら、何十もの他のAAV血清型が単離され同定されているが、評価できる程度には性状は調べられていない。例えば、これらのうちの1つはAAV-8で、最初アカゲザルの心臓組織から単離された。形質導入に対する新規なcapタンパク質の影響を明らかにしようと、一本鎖AAV-2ゲノムをAAV-8のcapで偽型化した偽型ウイルスを作出した。このベクターは、感染性粒子の用量を増加させて輸液した後でマウス肝臓の相対的形質導入効率を判定するためにLacZ遺伝子を含んでいた。この結果のまとめは下記の表1に示されている。
【００８８】
表1：AAV-2/2及びAAV-2/8ドースレスポンス（β-gal陽性肝細胞の％）
2006526394.tif 000008
【００８９】
輸液されたコントロールのAAV-2/2粒子の用量を増加させると、肝細胞の形質導入には軽度の増加があるが、形質導入の上限は10％の限界近くに固定されたままである。驚くべきことには、偽型AAV-2/8粒子は、最低の投与粒子用量で8％の肝細胞を形質導入した。この用量はAAV-2/2の対応物よりも30-80倍低い用量であった。さらにまた、AAV-2/8の形質導入効率における用量依存性は、AAV-2/2の形質導入効率より高く最高用量で97％を超えた。この範囲内の形質導入効率は組織内の細胞に干渉性RNAを効率的にデリバリーすることを可能とする。
AAVと同様な改変がrAAV干渉性RNA核酸構築物に施される。これらの単純な改変を導入した後、ウイルスストックをマウスモデル系におけるテストのために作る。以下のrAAV RNAi実験ウイルスストックをテストする：一本鎖AAV-2/2；一本鎖AAV-2/8；自己相補性AAV-2/2；及び自己相補性AAV-2/8。
無関係のRNA配列を発現するrAAVベクターを保有する対応するウイルス粒子を製造し、陰性コントロールとして用いた。ルシフェラーゼ活性の相対レベルにおける大きな低下は形質導入効率の増加と相関性を示す。
【００９０】
AAV干渉性RNA核酸構築物の開発
本発明の核酸構築物は単一のプロモーターの影響下にある2つまたは3つ以上の干渉性RNAを含む。最初に、ルシフェラーゼ活性の機能的阻害を示す同一の干渉性RNAの発現を駆動する単一の個々のプロモーターを含むベクターで種々のプロモーター配列のプロモーター強度の評価を行う（Elbashir et al. Nature 411：494-498 （2001a））。干渉性RNAの発現のためにU6を利用することができることを示す豊富なデータが存在するので、U6を他のプロモータの相対的強度を評価するための標準物として使用する。被検プロモーターの大半は極めて短く、ほとんどが200−300ヌクレオチドの範囲の長さである。オーバーラップのある長いオリゴヌクレオチドを用いてプロモーター及びターミネーターをde novoでアッセンブリングし、干渉性RNAをコードする配列にフランキングするマルチクローニング部位にクローニングすることができる。前記プロモーターは、これが取り込まれている遺伝子の下流に通常出現する終結シグナルと一組になっている。
各プロモーターの相対的強度は、同時トランスフェクションしたルシフェラーゼレポーターの活性低下によってin vitroで評価される。テスト構築物及びレポーター構築物は許容性細胞に標準技術を用いてトランスフェクションされる。コントロールは、ルシフェラーゼに対して機能的な干渉性RNAをコードする配列が無関係のRNA配列と置き換えられているテストプロモーター構築物から成る。トランスフェクション効率の変動を評価するために、分泌タンパク質（ヒトα1-アンチトリプシン（hAAT））をコードする第三のマーカー構築物を細胞に同時トランスフェクションする。干渉性RNAの阻害活性を判定するために、標準的な市販のキットを用いてルシフェラーゼ活性を測定する。干渉性RNA媒介ルシフェラーゼ発現低下（hAATレベルで正規化されている）は、プロモーター強度の間接的測定値である。また別に、又は前記に加えて、ルシフェラーゼRNAレベルについての即時定量PCR分析（Q-PCR）を、並行して実施した実験プレートから採集及び単離したRNAで実施される。
【００９１】
HCVに対して高度に機能的な干渉性RNAのin vivoテスト
本発明の干渉性RNA核酸構築物によってデリバリーされたAAV粒子がルシフェラーゼ-HCV融合レポーターをin vitroで阻害することを確認しなければならない。許容性組織培養細胞を上記記載のレポーター構築物の１つでトランスフェクションする。さらにまた、同時トランスフェクション混合物の各々にhAATをコードするプラスミドを補充する。48時間インキュベートした後、細胞にHCVに対する干渉性RNA核酸構築物を含む感染性粒子を投与する。無関係の3つのRNAを発現する三重プロモーター構築物を含むAAV粒子は陰性コントロールとして機能する。ルシフェラーゼ活性の測定を用いて、AAVによってデリバリーされる干渉性RNAが高度に機能を有することを確認する。
流体力学的トランスフェクションによる方法（高圧尾静脈注射）でマウスにデリバリーされた核酸は主として肝臓に局在し、したがってルシフェラーゼ-HCV融合物をマウスの肝臓にデリバリーするためにこの技術を用いることができる。動物間におけるトランスフェクションの差異を評価するために、hAAT発現プラスミドを本トランスフェクション混合物に含ませる。
HCV配列を標的とする干渉性RNAを発現する構築物を含む感染性AAV粒子は正常なC57B1/6マウスに尾静脈又は肝門脈注射によってデリバリーされる。3つの無関係のRNAを発現する感染性AAV粒子は陰性コントロールとして機能する。最初に、相当高用量のウイルス（例えば2 X 1012ベクター/ゲノム）を用いるが、その後の実験はドースレスポンス曲線を樹立するために実施される。48−72時間後にマウスを犠牲にし、肝臓を採集し、血清サンプルを収集する。ルシフェラーゼ活性は、AAV-デリバリーRNA因子の効能を評価するためにベンチマークとして用いられる。hAATレベルのモニタリングの他に、肝臓の酵素（アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ）及び腫瘍壊死因子アルファの血清レベルをELISAで測定し、一般的な肝臓毒性が本処置によって誘導されないことを確認する。
【００９２】
16．HCVの3つの別個の領域を標的とする構築物
C型肝炎ウイルス（HCV）は高い配列変動性を示す小型の一本鎖RNAウイルスである。HCV及び他の変動性ウイルス（例えばHIV）を標的とする多数の構築物の使用は顕著な利点を提供する。特に、多数の構築物の使用はddRNAi耐性HCV株の発達を大きく減少又は排除するために機能するかもしれない。さらにまた、上記の実施例で示したように、より活性の高い構築物を得ることができる。
構築物pU6.HCVx3 hp（図72）は、HCVゲノムの3つの別個の領域、すなわちアクセッション番号NC_004102の130-151，148-169及び318-340位を標的として狙い撃ちするように設計される。
pU6.HCVx3 hpはオリゴヌクレオチドアッセンブリー法により下記のオリゴヌクレオチドを用いて調製することができる：
HCV-3x-1        ACCGGAGAGCCATAGTGGTCTGGAAA
HCV-3x-2        ACCGGTTCCGTTTCCAGACCACTATGGCTCTC
HCV-3x-3        CGGAACCGGTGAGTACACGAAAAGG
HCV-3x-4        GCACGGTCTACGAGACCTTTTCGTGTACTC
HCV-3x-5        TCTCGTAGACCGTGCATTTGTGTA
HCV-3x-6        AGACCGTGCACTACACAAAT
HCV-3x-7        GTGCACGGTCTACGAGACCTCAAGGTG
HCV-3x-8        GGTGAGTACACCTTGAGGTCTCGT
HCV-3x-9        TACTCACCGGTTCCGCAAGCAGACCAC
HCV-3x-10       AGAGCCATAGTGGTCTGCTTGCGGAACC 
HCV-3x-11       TATGGCTCTCCTTTTTTGGAAA
HCV-3x-12       AGCTTTTCCAAAAAAGG
HCVに対する前記構築物の活性は上記に記載したアッセイを用いて測定することができる。
【００９３】
17．センス及びアンチセンスRNAのin vivo生成
本発明の干渉性RNA2つの構築物によってin vivoで作製することができる。図73はこのアプローチの一例を示している。2つのddRNAi構築物、pU6.GR22-センス（A）及びpU6.GR22-アンチセンス（B）は、上記で述べたロングレンジPCR法を用いて調製することができる。pU6.GR22-センスは以下のオリゴヌクレオチドを用いて調製できる：
U6 GR22-s
TGAGATGAACTTCAGGGTCAGCGGTGTTTCGTCCTTTC
term GR22-s
AGCCTTTCACTACTCCTACTTTTTTTTGGAAAAGCTTATCG
pU6.GR22-アンチセンスは以下のオリゴヌクレオチドを用いて調製できる：
U6 GR22-as
CTGGCCTTTCACTACTCCTACCTGGTGTTTCGTCCTTTC
term GR22-as
AGATGAACTTCAGGGTCAGCTTTTTTGGAAAAGCTTATCG
これらの構築物は、互いの逆方向相補物であるRNAを生成するように設計されている。それらは図73Cに示されているように（自発的に）二本鎖RNAを形成し、それによってEGFP及びhRluc mRNAの分解の引き金となることが予想される。hRluc mRNAの分解は上記で述べたように容易にアッセイすることができる。EGFPの分解は、同時トランスフェクション実験でEGFPの発現の低下をモニターすることによって容易にアッセイすることができる。前記のための方法は当業者には周知である。
前記構築物は、2つのプラスミドをhRlucを発現しているHeLa細胞に同時トランスフェクトし、上記に記載したようにhRlucの不活化をアッセイすることによってテストすることができる。あるいは、2つの転写単位を図71に示すようにただ1つの構築物に合体させ、この構築物をアッセイしてもよい。同様な実験をHeLa細胞で実施して、同時トランスフェクトしたEGFP発現プラスミドの不活化についてモニターしてもよい。
【００９４】
18．センス及びアンチセンスRNAのin vitro生成
本発明の干渉性RNA2つの構築物によってin vitroで作製することができる。図74はこのアプローチの一例を示している。in vitroで転写されたRNAは、市販のキット（Ambion siRNA構築キット）を製造元のプロトコルにしたがって用いて これらのフラグメントから調製することができる。2つのDNAフラグメント、すなわちT7 GR22-センス（A）及びT7 GR22-アンチセンス（B）の転写物は上記のキットを用いて調製できる。T7 GR22-センスは以下のオリゴヌクレオチドを用いて調製できる：
T7 GR22-s
GCTGACCCTGAAGTTCATCTCAAGCCTTTCACTACTCCTACTTCCTGTCTC
T7 GR22-アンチセンスは以下のオリゴヌクレオチドを用いて調製できる：
T7 GR22-as
AAAGTAGGAGTAGTGAAAGGCCAGAGATGAACTTCAGGGTCAGCCTGTCTC
前記2つの転写物はアニールすると予想され、適切なRNase処理に続いてそれらは図74Cに示されるdsRNAを生成するであろう。前記構築物の活性は上記に記載したように測定することができる。
本明細書で開示し特定した発明は、本文又は図面に記載された又は前記から明らかな個々の特徴の2つ又は3つ以上のまた別の組合せの全てに及ぶことは理解されよう。これら種々の組合せのいずれも本発明の種々のまた別の特徴を構成する。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】構築物pU6.cassのマップを示す。Aは前記構築物の一領域のマップを示す。ヒトU6プロモーターは灰色の矢印として示され、U6FR1の結合部位及びU6 R T5Xbaプライマーはその下に示されている。EcoRI、BsmBI及びHindIII制限部位も示されている。Bは、Aに示したEcoRI/HundIIIフラグメントをベクターpBluescript II SK+（Stratagene）に挿入することによって構築されたプラスミドの全体のマップを示す。
【図２】構築物pＵ6.ACTB-A hpのマップを示す。前記構築物は、いくつかの実験で陰性構築物として用いられた。Aでは前記プラスミドのマップが図1Bのように示されている。ヘアピンDNA転写物ユニット内のエレメント（すなわち転写開始部位、ACTB-Aセンス、ループ、ACTB-Aアンチセンス及びpolIIIターミネーター配列）の相対的位置が、EcoRI及びHindIII制限部位の位置とともに示されている。Bは、U6転写単位の一部分のマップである。ヘアピンDNA転写単位内のエレメントが示されている。前記ヘアピンのセンス及びアンチセンス領域は矢印として示され、ループ配列は斜線入り矢印として、さらにターミネーターはマップの下に一本の線として表されている。Cは、βアクチンのmRNAのACTB-A部位を標的とする本構築物から生成される予想されるヘアピンRNAを示す。予想される転写物の5'GリボヌクレオチドはU6プロモーター活性のために要求される。polIIIターミネーターはヘアピン転写物中で塩基対を形成しない3'配列UUを取り込むことが予想される。転写物は、βアクチンmRNAと相同な19ヌクレオチドの二本鎖RNA構造を形成すると予想される（垂直方向に沿ってアラインメントされた配列は潜在的な塩基対形成を示している）。ループ配列は9塩基であり。最初と二番目の塩基は8番目と9番目の塩基と潜在的に対を形成するが、簡明にするためにこれは図示されていない。さらにまた、5'Gは最後から2番目の3'Uと潜在的に塩基対を形成する可能性があるが、これもまた簡明にするために図示されていない。全ての対を形成しない配列をこのようにして図示するという取り決めは本明細書全体で用いられる。
【図３】ロングレンジPCRを用いてプラスミドを改変する一般的アプローチを示す。A：環状又は直鎖状DNAを増幅鋳型として用いることができるが、後者が好ましい。DNAは、オリゴヌクレオチドプライマー（LRPCRプライマー）により増幅される（前記LRPCRプライマーは、鋳型（細線）とハイブリダイズすることができる“クランプ”配列、及び所望の挿入物のほぼ半分と一致する配列（太線）を含む）。これらを一緒にしたとき、それらは挿入物、典型的には挿入物をコードするhpRNAを形成するであろう。B：鋳型DNAをロングレンジPCR反応に適した条件を用いて増幅する。好ましいポリメラーゼは、エラー率が低いのでPfuUltra（Stratagene）であるが、他のポリメラーゼ又は混合物も用いることができる。C：続いて増幅されたDNAフラグメントをT4DNAリガーゼを用いて分子内連結により環状化する。この工程のために、少なくとも一方の末端の5'リン酸化が要求されるが、これは増幅のためにリン酸化オリゴヌクレオチドを用いるか、又はT4ポリヌクレオチドキナーゼによる増幅後処理によって達成することができる。平滑端もまた効率的な環状化のために必要であるが（Pfuポリメラーゼは平滑端を生成する）、T4 DNAポリメラーゼによる増幅後処理によって末端をポリッシュしてもよい。
【図４】AscI制限部位のプラスミドへの挿入を示す。一番上の楕円型の線は挿入に用いられるプラスミドを表す。LRPCRプライマーの結合場所及び向きもまた示されている（模式的に示され縮尺率は異なる）。配列の挿入点の周辺もまた示されている。プラスミドの一領域の配列が、LRPCRプライマーの配列と同様にその下に示されている。AscI制限部位は太字下線として示されている。
【図５】図4に示したようなプラスミドへのhpDNA配列（逆方向反復配列及びループ配列を含む）の挿入を示す。図4のように挿入物の部分配列及びプライマーもまた示されている。アンチセンス及びセンスhp配列は太字下線として示されている。
【図６】プラスミドで逆方向反復配列の長さを増加させる方法を示す。図は図4のように示されているが、ただし１つのプライマーのみが用いられている。挿入物の部分配列及びプライマーもまた図4のように示されている。
【図７】図4のように、クローン化挿入物へのマウスIgE3イントロンの挿入を示す。
【図８】プラスミドpU6.cass linのマップを示す。Aは、U6プロモーター及びpolIIIターミネーター配列に対応する領域のマップを示す。BmgBI、BglII及びBsmI制限部位が示されている。Bは、プラスミド全体のマップを示す。
【図９】構築物pU6.Rluc hpのマップを示す。この構築物はヒト化されたレニラルシフェラーゼmRNA（アクセッション番号U47298）を分解のために標的とする。Aは、U6転写単位の一部分のマップを示す。ヘアピンDNA転写単位内のエレメントは図2Bのように示されている。Bは、図2Cのように、本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図１０】pＵ6.Rluc/ACTB TTAのマップを示す。Aは、ヘアピンDNA転写単位のマップを示す。前記転写単位内の“バブル”及び“ループ”配列の位置は斜線入り矢印として示されている。本事例では、“ステム”配列（βアクチン（ACTB）及びレニラルシフェラーゼ（Rluc）に由来する）が前記構築物に取り込まれている。Bは、図2Cに示されているように、本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。本実施例及び他の実施例では、バブル配列（通常の塩基対を形成することができない）は、転写物で潜在的に塩基対を形成する配列の上下に示される。バブル中の配列内の塩基がワトソン-クリック又は非ワトソン-クリック塩基対を形成する潜在的能力に関係なくバブル中のこれらの配列間で塩基対形成を表示しないという取り決めは本明細書全体で用いられる。ヘアピン基部の配列はレニラルシフェラーゼmRNAを標的とし、ループ近くの配列はβアクチンmRNAを標的とする。
【図１１】pU6.Rluc/ACTB TTAGのマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10Bのように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図１２】pU6.Rluc/ACTB TTAのマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10Bのように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図１３】pU6.ACTB/Rluc TTAGのマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10Bのように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図１４】pU6.ACTB/AD1 hpのマップを示す。本構築物はいくつかの実験のために陰性コントロールとして用いられた。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10Bのように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図１５】pU6.Rluc/ACTB/AD1 hpのマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。本事例では、レニラルシフェラーゼを標的とする配列（Rluc）、βアクチンを標的とする配列（ACTB）及びADAR-1を標的とする配列（AD-1）が構築物に取り込まれている。Bは、図10Bのように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図１６】pU6.ACTB/Rluc/AD1のマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10Bのように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図１７】pU6.ACTB/ADAR/Rluc hpのマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10Bのように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図１８】pU6.ACTB/ADAR/GFP hpのマップを示す。本構築物はいくつかの実験のために陰性コントロールとして用いられた。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10Bのように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図１９】pU6.Rluc/ACTB/AD1/GFP hpのマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10Bのように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図２０】pU6ACTB/.Rluc/AD1/GFP hpのマップを示す。この実施例及びこの後の例では、βアクチンに由来する配列（ACTB）、レニラルシフェラーゼに由来する配列（Rluc）、ADAR-1に由来する配列（AD-1）及びGFPが構築物に取り込まれている。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10Bのように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図２１】pU6.ACTB/AD1/Rluc/GFP hpのマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10Bのように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図２２】pU6.ACTB/AD1/GFP/Rluc hpのマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10Bのように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図２３】pU6.ACTB/AD1/GFP/HER2 hpのマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10Bのように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図２４】pU6.Rluc/ACTB/AD1/GFP/HER2 hpのマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。本事例では、βアクチンに由来する配列（ACTB）、ADAR-1に由来する配列（AD-1）、レニラルシフェラーゼに由来する配列（Rluc）、HER2及びGFPが構築物に取り込まれている。Bは、図10Bのように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図２５】pU6.ACTB/Rluc/AD1/GFP/HER2 hpのマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10Bのように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図２６】pU6.ACTB/AD1/Rluc/GFP/HER2 hpのマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10Bのように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図２７】pU6.ACTB/AD1/GFP/Rluc/HER2 hpのマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10Bのように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図２８】pU6.ACTB/AD1/GFP/HER2/Rluc hpのマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10Bのように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図２９】pU6.ACTB/AD1/GFP/HER2/LAM hpのマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。本事例では、ラミンA/Cに由来する配列（LAM）が構築物に取り込まれれている。Bは、図10Bのように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図３０】レニラルシフェラーゼを標的とする二重ヘアピン構築物の活性を示すグラフである。表示のデータは、構築物pＵ6.cassをトランスフェクトしたトランスジェニック細胞における相対的レニラルシフェラーゼに対して修正されている（n=5、±SD）。白棒線は陰性コントロール構築物、すなわちpＵ6.cass、pU6.ACTB-A hp及びpU6.ACTB/AD1 hpの活性を示す。黒棒線は、Rlucを標的とする構築物、すなわちpU6.Rluc hp及び二重ヘアピン構築物（pU6.Rluc/ACTB TTA、pU6.Rluc/ACTB TTAG、pU6.ACTB/Rluc TTA及びpU6.ACTB/Rluc TTAG）の活性を示す。
【図３１】図30のように、レニラルシフェラーゼを標的とする三重ヘアピン構築物の活性を示す。この実験では、陰性コントロール（白棒線として表示）はpU6.cass、pU6.ACTB-A hp及びpU6.ACTB/AD1/GFP hpであり、テスト構築物（黒棒線として表示）はpU6.Rluc hp及び三重ヘアピン構築物（pU6.Rluc/ACTB/AD1 hp、pU6.ACTB/Rluc/AD1 hp及びpU6.ACTB/AD1/Rluc hp）であった。
【図３２】レニラルシフェラーゼとともに4つ及び5つの遺伝子を、図30のようにループに隣接する位置4又は5で標的とする構築物の活性を示す。この実験では、陰性コントロール（白棒線として表示）はpU6.cass、pU6.ACTB-A hp及びpU6.ACTB/AD1/GFP hpであり、テスト構築物（黒棒線として表示）はpU6.Rluc hp、pU6.ACTB/AD1/GFP/Rluc及びpU6.ACTB/AD1/GFP/HER2/Rlucであった。
【図３３】Akt1及びAkt2遺伝子の両方を不活化のために標的とするpU6.GF-2のマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10Bのように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図３４】二重ヘアピン構築物pU6.GF-2をトランスフェクションした細胞におけるAkt1及びAkt2タンパク質の減少を表すウェスタンブロットを示す。ウェスタンブロットはSec5に特異的な抗体（ローディングコントロールとして機能する）、及び標的（Akt1又はAkt2）に特異的な抗体をプローブとして用いて調べた。調べたプローブ（左から右へ）は、コントロールの非トランスフェクトC2C12細胞、及びpU6.GF-2トランスフェクト細胞（両レーンともSec5及びAkt1抗体で探索された）であり、さらに非トランスフェクトC2C12細胞及びpU6.GF-2トランスフェクト細胞（両レーンともSec5及びAkt1抗体でプロービングされた）である。
【図３５】Akt2a部位を標的とするpU6.GG-2のマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10Bのように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図３６】pU6.GG-3のマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10Bのように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図３７】Akt2a及びAkt2b部位の両方を標的とするpU6.GG-4のマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10Bのように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図３８】pU6.GF-2をトランスフェクトした細胞におけるタンパク質減少の強化を示すウェスタンブロットである。ウェスタンブロットは、Sec5に特異的な抗体（ローディングコントロールとして機能する）及び標的Akt2に特異的な抗体をプローブとして調べた。プロービングしたレーン（左から右へ）は、コントロール非トランスフェクトC2C12細胞、並びに構築物pU6.GG-2、pＵ6.ＧＧ-3及びｐU6.GG-4をトランスフェクトした細胞である。
【図３９】構築物pU6.ACTB-A48 hpのマップを示す。Aは、図2BのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図2Cのように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。このヘアピンRNAは潜在的にβアクチンmRNAのACTB-A部位とともに前記mRNAの次の29ntを標的とする。転写物は48ntの二本鎖RNAを生成すると予想される。
【図４０】プラスミドpU6.AD1-Aのマップを示す。Aは、図2BのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図2C のように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。この転写物は潜在的にADAR1 mRNAのADAR1-A部位を標的とする。
【図４１】プラスミドpU6.AD2-Cのマップを示す。Aは、図2BのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図2C のように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。この転写物は潜在的にADAR2 mRNAのADAR2-C部位を標的とする。
【図４２】プラスミドpU6.AD2-Aのマップを示す。Aは、図2BのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図2C のように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。この転写物は潜在的にADAR2 mRNAのADAR2-A部位を標的とする。
【図４３】プラスミドpU6.AD1/2-Bのマップを示す。Aは、図2BのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図2C のように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。この転写物は潜在的にADAR1 mRNAのADAR1-B部位及びADAR2 mRNAのADAR2-B部位を標的とする。
【図４４】プラスミドpU6.AD1＆2-A/UUのマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。前記転写単位内の“バブル”配列及びループ配列の位置は斜線入り矢印として示されている。Bは、図10B のように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。前記ヘアピン基部の配列はADAR1 mRNAのADAR1-A部位を標的とし、ループに近い配列はADAR2 mRNAのADAR2-A部位を標的とする。
【図４５】プラスミドpU6.AD1＆2-A/UUAのマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10B のように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図４６】プラスミドpU6.AD1＆2-A/UUACAAのマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10B のように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図４７】構築物pU6.AD1＆2-A/UU（A）、pU6.AD1＆2-A/UUA（B）及びpU6.AD1＆2-A/UUACAA（C）によって生成される予想転写物の比較を示す。予想される構造は図10Bのように示される。
【図４８】プラスミドpU6.ACTB-A/UUAのマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。本事例では、ADAR1-A標的の最初の7つのヌクレオチドに由来する“ステム”配列が前記構築物に取り込まれている。いずれの理論又は作用態様にも拘束されないが、この配列は短すぎてADAR1 mRNAを標的とすることはできないと考えられるが、構築物内でバブル配列の構造を維持することによって機能することができると考えられる。Bは、図10Bのように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図４９】プラスミドpU6.AD1-A&ACTB-A/UUのマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10B のように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図５０】プラスミドpU6.AD1-A&ACTB-A/UUAのマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10B のように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図５１】プラスミドpU6.AD1-A&ACTB-A/UUAGのマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10B のように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図５２】プラスミドpU6.AD1-A&ACTB-A/UUACAAのマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10B のように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図５３】プラスミドpU6.ACTB-A&AD1-A/UUAのマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10B のように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図５４】図10Bのように、構築物pU6.ACTB-A/UU（A）、pU6.AD1-A＆ACTB-A/UUA（B）、pU6.AD1-A&ACTB-A/UUA（C）、pU6.AD1-A&ACTB-A/UUAG（D）、pU6.AD1-A&ACTB-A/UUACAA（E）、pU6.ACTB-A＆AD1-A/UUA（F）によって生成されるコード転写物の比較を示す。
【図５５】ADAR1を標的とする二重ヘアピン構築物の活性、及び一重ヘアピン構築物と比較したいくつかのバブル構築物の強化された活性を示す。
【図５６】ADAR2を標的とする二重ヘアピン構築物の活性を示す。
【図５７】ADAR1を標的とする二重ヘアピン構築物の活性を示す。
【図５８】βアクチンを標的とする二重ヘアピン構築物の活性を示す。
【図５９】GFP及びRlucを不活化のための標的とするpU6.GR-21 hpのマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10B のように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図６０】ライブラリー構築物pU6.GR-21-1-2Nのマップを示す。この構築物はGFP及びRlucを不活化のための標的とする。前記構築物内のランダム化配列の位置は前記マップの下に斜線入り矢印として示されている。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10B のように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。本事例ではNは任意のヌクレオチド（すなわちA、C、U又はG）を表す。
【図６１】ライブラリー構築物pU6.GR-21-4-2Nのマップを示す。この構築物はGFP及びRlucを不活化のための標的とする。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10B のように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図６２】ライブラリー構築物pU6.GR-21-1＆4-2Nのマップを示す。この構築物はGFP及びRlucを不活化のための標的とする。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10B のように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図６３】ライブラリー構築物シリーズpU6.GR-22-1-4N及びpU6.GR-22-4-4N（両者ともGFP及びRlucを不活化のための標的とする）のマップ及び配列を示す。Aは、図10AのようにpU6.Gr-22-1-4NのヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10B のようにこの構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。本事例では、DはリボヌクレオチドA、G又はUを表し、VはリボヌクレオチドA、C又はGを表し、さらにHはリボヌクレオチドA、C又はUを表す。Cは、図60AのようにpU6.Gr-22-4-4NのヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Dは、図10B のようにこの構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。本事例では、HはリボヌクレオチドA、C又はUを表し、BはリボヌクレオチドC、G又はUを表し、さらにDはリボヌクレオチドA、G又はUを表す。
【図６４】ライブラリー構築物pU6.GR-22-1-NAAN及びpU6.GR-22-4-NAAN（両者ともGFP及びRlucを不活化のための標的とする）のマップ及び配列を示す。Aは、図10AのようにpU6.GR-22-1-NAANのヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10B のようにこの構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。本事例では、Nは任意のリボヌクレオチドを表す。Cは、図60AのようにpU6.GR-22-4-NAANのヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Dは、図10B のようにこの構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。本事例では、Nは任意のリボヌクレオチドを表す。
【図６５】ライブラリー構築物pU6.GR-21-1&4-4N（前記はGFP及びRlucを不活化のための標的とする）のマップを示す。Aは、図63のようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図63及び64のようにこの構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図６６】選択された3つのフェージング構築物の例、すなわちpU6.GR-17 hp（A）、pU6.GR-21 hp（B）及びpU6.GR-26 hp（C）を示す。これらの例では、灰色の棒線はヒトU6プロモーターの小さな領域を表し、白い矢印はEGFP-Aエフェクター配列（17から26ntの範囲）を表し、黒い矢印はRlucを標的とする配列（これらの構築物においては一定である）を表す。
【図６７】pU6.GR-17 hp（A）、pU6.GR-18 hp（B）、pU6.GR-19 hp（C）、pU6.GR-20 hp（D）、pU6.GR-21 hp（E）、pU6.GR-22 hp（F）、pU6.GR-23 hp（G）、pU6.GR-24 hp（H）、pU6.GR-25 hp（I）及びpU6.GR-26 hp（J）によって生成される予想転写物を示す。前記予想転写物は図2Cのように示されているが、ただしGFPを標的とする変動可能な長さの配列は太字で示されている。
【図６８】フェージング構築物のRlucに対する相対的活性を示す（n=5；±SD）。pＵ6.GR21 hp及びpＵ6.GR-22 hpが最高の活性を示すことに注目されたい。
【図６９】2Nライブラリーのスクリーニングによるより高活性の構築物の同定。Aは、pU6.GR-22-1-2Nライブラリーから単離した22のクローンのRlucに対する活性の一次スクリーニングを示す（n=5；±SD）。Bは、最高活性を有するクローンのAからの再スクリーニングを示す。クローンpU6.GR-21-1-2N-18 hpはコントロールpＵ6.GR-21 hpよりも高い活性を示した。
【図７０】マルチ標的法の模式図を示す。Aは3つの遺伝子（この例ではtarg.1、targ.2及びtarg.3）を標的とする構築物の模式図を示す。本構築物はプロモーター（polII、polIII又は任意の他のタイプのプロモーター）及びターミネーター（polII若しくはpolIIIターミネーター又は転写物の3'末端を生成することができる任意の配列）を含む。この構築物はまた、センス方向（targ.1、targ.2及びtarg.3）又はアンチセンス方向（3.grat、2.grat及び1.grat1）で転写されるエフェクター配列（方向は矢印で示される）；ループ配列（四角）及びバブル（黒丸で表示）を含む。B：一時転写物は図70Aに示すように生成される。この転写物は、バブルによって分離され、ループによって分離されるループ配列を有する、センス及びアンチセンスのエフェクター配列からなる。C：続いてこの転写物はおそらく自発的にhpRNA構造を形成する。D：続いて前記hpRNA転写物はダイサーによってプロセッシングされて3つの異なるエフェクターsiRNAを生成する。本事例では、前記エフェクターは3つの異なるRNA（水平棒線）を標的とすることができ、それらを切断（垂直棒線）することができる。
【図７１】プラスミドpU6.GF-3の構築を示す。このプラスミドは単一プラスミド上に2つの転写単位（1つはAkt1を不活化するために設計され、第二のAkt2を不活化するために設計されている）を含む。Aは、図2のようにプラスミドpU6.GLのマップを示す。SmaI及びKpnI制限部位もまた示されている。図2Cのように予想されるヘアピンRNAがこの構築物から生成される。Bは、プラスミドpU6.GG-4（図37）全体のマップを示す。HincII及びKpnI制限部位の位置が示されている。CはpU6.GL由来のU6転写単位をSnaI/HindIIIフラグメントとしてHincII/KpnI制限処理されたpU6.GG-4にクローニングすることによって調製されるであろう構築物pU6.GF-3の一領域のマップを示す。このマップは2つのU6転写単位を含むpU6.GF-3の領域を示している。得られたプラスミドは2つのヘアピンRNAを生成すると予想される。前記2つのヘアピンRNAは、図37Bに示されように1つがAKt2を標的とし、第二のものが図71BのようにAkt1を標的とする。
【図７２】構築物pU6.HCVx3 hpのマップを示す。Aは、図10AのようにヘアピンDNA転写単位のマップを示す。Bは、図10B のように本構築物から生成される予想ヘアピンRNAを示す。
【図７３】2つのプラスミド、すなわちpU6.GR22-センス（A）及びpU6.GR22-アンチセンス（B）の領域のマップを示す。これらの構築物からin vivoで生成される予想転写物はそれぞれのマップの下に示されている。これらの転写物はCに示すようにアニールして、EGFP及びhRluc mRNAの両者を不活化するように設計された二本鎖RNAを生成すると予想される。
【図７４】2つのDNAフラグメント、すなわちT7 GR22-センス鋳型rc（A）及びT7 GR22-アンチセンス鋳型rc（B）の部分的マップを示す。これらの構築物からin vitroで生成される予想転写物はそれぞれのマップの下に示されている。前記転写物はCに示すようにアニールして、EGFP及びhRluc mRNAの両者を不活化するように設計された二本鎖RNAを生成すると予想される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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