(57)【要約】本発明は、ブタｗａｐ遺伝子座の５’及び３’領域からなる単離されたインシュレーターＤＮＡ分子、また、導入された異種遺伝子の発現を、その遺伝子が組み込まれたクロマチンにおける抑制と多様化効果から隔離する方法に関するものである。本発明はまた、前記インシュレーターＤＮＡ分子からなる哺乳動物の細胞と、それから得られるヒト以外の動物を目的とするものであって、そのような動物は、好ましくは乳中に有益なボリペプチドを発現することができるものである。
2004516836.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタのｗａｐ遺伝子座の５’と３’領域からなる、インシュレーターＤＮＡ分子であり、前記ＤＮＡ分子はそれぞれ、アクセッション番号Ｉ−２５９５とＩ−２５９６としてＣＮＣＭに寄託されたＢＡＣ  ９０５Ｆ９かＢＡＣ  ３４４Ｈ５から入手可能な、約１４５ｋｂと７５ｋｂのＮｏｔＩ−ＮｏｔＩ断片から単離されるものであることを特徴とする、単離されたインシュレーターＤＮＡ分子。
【請求項２】
更にそのブタｗａｐ遺伝子のシス作用性制御配列からなることを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
【請求項３】
シス作用性制御配列はエンハンサーであることを特徴とする、請求項１または２のいずれかに記載のインシュレーター分子。
【請求項４】
ベクターは以下を含むものである：
（ａ）請求項１から３のいずれか一つに記載の単離された少なくとも一つのインシュレーターＤＮＡ分子
（ｂ）プロモータードメイン
（ｃ）プロモータードメインと作用面で結びついている異種遺伝子。
【請求項５】
少なくとも一つのインシュレーターがプロモーターの５’の位置にあり、それが、遺伝子が組み込まれたクロマチン中のシス作用性制御エレメントからの遺伝子の転写と発現を作用面で隔離するためになされていることを特徴とする、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
少なくとも一つのインシュレーターが、遺伝子の３’の位置にあり、それが、遺伝子が組み込まれたクロマチン中のシス作用性制御エレメントからの遺伝子の転写と発現を作用面で隔離するためになされていることを特徴とする、請求項４または５に記載のベクター。
【請求項７】
５’から３’の方向に、転写開始領域、前記転写開始領域の下流に位置する、それと作用面で関連のある構造遺伝子、そして転写開始領域の５’に位置する、及び／あるいはその構造遺伝子の３’に位置する、請求項１から３のいずれか一つに記載のインシュレーターからなることを特徴とする、発現カセットからなるＤＮＡ構成。
【請求項８】
前記プロモーターがウサギｗａｐ遺伝子プロモーターであり、それにより、動物の乳中の構造遺伝子の効率的な発現を可能にすることを特徴とする、請求項７に記載のＤＮＡ構成または請求項４から６のいずれか一つに記載のベクター。
【請求項９】
前記構造遺伝子がコードするのは、ポリペプチド、または抗体、成長因子、日用品のようなもしくは治療的価値のあるポリペプチドから選んだタンパク質であることを特徴とする、請求項７に記載のＤＮＡ構成または請求項４から６のいずれか一つに記載のベクター。
【請求項１０】
配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ１からなる、請求項７から９のいずれか一つに記載のＤＮＡ構成または請求項４から６のいずれか一つに記載のベクター。
【請求項１１】
導入された異種遺伝子の発現を、その遺伝子が組み込まれたクロマチンにおける抑制や多様化の効果から隔離するための方法であり、前記方法は、
（ａ）請求項４から６のいずれか一つに記載のベクター、または請求項７から１０のいずれか一つに記載のＤＮＡ構成を準備し、
（ｂ）前記ベクターまたはＤＮＡ構成で哺乳類細胞にトランスフェクションを行い、
（ｃ）前記ベクターまたはＤＮＡ構成を前記細胞のクロマチンに組み込み、その結果生じる組み込まれた遺伝子の発現は、前記細胞のクロマチン中のシス作用性ＤＮＡ制御配列から隔離されるようになされることからなるものである。
【請求項１２】
異種遺伝子の発現が増大したヒト以外のトランスジェニック動物を作る方法であり、前記方法は、
（ａ）請求項４から６のいずれか一つに記載のベクターまたは請求項７から１０のいずれか一つに記載のＤＮＡ構成によって哺乳動物の細胞を形質転換し、
（ｂ）そして、前記細胞からヒト以外の動物を発生させることからなるものである。
【請求項１３】
請求項７から１０のいずれか一つに記載のＤＮＡ構成がそのクロマチンに組み込んでいることを特徴とする、哺乳類細胞。
【請求項１４】
請求項４から６のいずれか一つに記載のベクターで安定的にトランスフェクションを行うことを特徴とする、哺乳類細胞。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の細胞からなることを特徴とする、異種遺伝子の発現を増大されたヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項１６】
乳牛、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラット及びマウスの中から選ばれることを特徴とする、請求項１５に記載のヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項１７】
異種遺伝子が組み込まれたクロマチンの抑制と多様化効果を防止するためのものであることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一つに記載の単離したインシュレーターＤＮＡ分子の使用。
【発明の詳細な説明】
。
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、ブタｗａｐ遺伝子座の５’及び３’領域からなる単離されたインシュレーターＤＮＡ分子、また、導入された異種遺伝子の発現を、その遺伝子が組み込まれたクロマチンにおける抑制と多様化効果から隔離する方法に関するものである。本発明はまた、前記インシュレーターＤＮＡ分子からなる哺乳動物の細胞と、それから得られるヒト以外の動物を目的とするものであって、そのような動物は好ましくは乳の中に有益なボリペプチドを発現することができるものである。
【０００２】
薬として用いたり人が消費したりするための組換えタンパク質の潜在的な供給源として、乳は、生体液の中でも、主要なものと考えられるものの一つである。乳腺に特異的なプロモーターを含むハイブリッド遺伝子を、受精させた卵母細胞にマイクロインジェクションすることは、１９８７年以来、行われ、成功してきている。バイオリアクターとしてのトランスジェニック動物と、トランスジェニック動物の入手方法についての全般的な概説はＨｏｕｄｅｂｉｎｅ社（２０００年）にて入手可能である。
【０００３】
しかしながら、授乳期の動物の乳腺に特異的に発現しない場合には、導入遺伝子によってコードされたタンパク質は、トランスジェニック動物の健康に有害な影響を及ぼす可能性がある。一方、トランスジェニック動物の乳中に生じる外来タンパク質の量は、予測不能であり、少ないことが多い。更に、発現のレベルも系統ごとに異なり（Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４）同じ系統の動物の間でも異なることさえある（Ａｌ−Ｓｈａｗｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８；  Ｄｏｂｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）。このことは主に、宿主ゲノムへの導入遺伝子の様々な組み込み部位がに左右される。従って、導入遺伝子が抑制されたり、多様化が起きたりして、同一の個体の組織に導入遺伝子発現のモザイク現象が引き起こされることもよくある（Ｄｏｂｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７；  Ｆｅｓｔｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６  ａｎｄ  Ａｌａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。
【０００４】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
遺伝子構成の発現を高めるために様々な試みが提案されている。第一に、その導入遺伝子に連結可能なシス制御エレメントが幾つかあり、それにより、位置による影響を抑制することができる。例えば、ヒトのβ−グロビン遺伝子群やＣＤ２遺伝子の遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）は、その導入遺伝子がセントロメアの近くに組み込まれる場合であっても、位置に依存せずコピーに依存する、組織特異的な発現を生じさせることができる（Ｆｅｓｔｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６；  Ｍｉｌｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）。更に、ニワトリのβ−グロビン遺伝子座の５’末端のようなインシュレーターエレメント（Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３；  Ｔａｂｏｉｔ−Ｄａｍｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）、ヒトＴ細胞受容体のＤＮアーゼＩ高感受性部位（ＨＳ）２−６にまたがる領域（Ｚｈｏｎｇ  ａｎｄ  Ｋｒａｎｇｅｌ，  １９９９）またはケラチン−１８遺伝子のＡｌｕエレメント（Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）により、トランスジェニックマウスに、位置に依存しない発現を生じさせることが可能である。そのようなエレメントの概説については、米国特許第６，１００，４４８号明細書（インシュレーターエレメントを用いて植物細胞における導入遺伝子の発現を増大させる）、米国特許第６，０３７，５２５号明細書（植物細胞における導入遺伝子の発現の変動性を減少させる方法）そして米国特許第５，６１０，０５３号明細書（哺乳動物の細胞内において、発現した遺伝子をシス作用性の制御配列から保護するためのクロマチンインシュレーターエレメントとして作用するＤＮＡ配列）も参照されたい。第二の可能性は、導入遺伝子が適切に発現するに十分なだけのエレメント全てを含んでいることが期待される長大なゲノム断片を用いることである。実際、ヒトのＡｐｏＢ遺伝子を正確に発現させることは、（ＡｐｏＢ遺伝子の下流７０ｋｂそして上流２２ｋｂの）大きなゲノムＤＮＡ断片をマイクロインジェクションすることにより、トランスジェニックマウスの肝臓と腸において可能となったのであり、（ＡｐｏＢ遺伝子の下流１９ｋｂそして上流１７．５ｋｂの）小さな断片では実現できなかった（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。
【０００５】
今までのところ、いくつかの乳タンパク質遺伝子を、位置に依存しない形で、トランスジェニック動物で発現させることができている。ヒツジβ−ラクトグロブリン遺伝子（Ｗｈｉｔｅｌａｗ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）、ラットＷＡＰ遺伝子（Ｋｒｎａｃｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）、ＢＡＣベクターにおけるヤギα−ラクトアルブミン遺伝子（Ｓｔｉｎｎａｋｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）そしてＹＡＣベクターにおけるヒトα−ラクトアルブミン遺伝子（Ｆｕｊｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）がそれである。しかしながら、宿主ゲノムへの導入遺伝子の組み込み部位は多様であり、そのため、導入遺伝子の大部分について発現パターンが予測不可能であることが、有益な導入遺伝子を乳内に効率的に発現させることのできる動物を作り出す上での障害になっている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は導入遺伝子を位置に依存せずに発現させることを可能にするインシュレーターエレメントをもたらすことにより上記の問題を解決するものである。
【０００７】
もう一つの論点は、有益な導入遺伝子の乳内での効率的な生産を確実にすることである。乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）は齧歯類（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４；  Ｈｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎ  ａｎｄ  Ｓｉｐｐｅｌ，  １９８２）、ウサギ（Ｄｅｖｉｎｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８；  Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）そしてラクダ（Ｂｅｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６）の主要な乳清タンパク質である。それはブタの乳中で確認されている（Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。マウスやウサギのｗａｐ遺伝子プロモーターは、トランスジェニック動物の乳腺の中に組換えタンパク質を生成するために用いられている。マウスｗａｐ遺伝子の上流領域をヒトプロテインＣ（ｈＰＣ）遺伝子と共働させると、トランスジェニックブタの乳中に０．１から１．８ｇ／ｌのｈＰＣを生成することができた（Ｖａｎ  Ｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）。ウサギｗａｐ遺伝子の６．３ｋｂ上流の断片により調節されたウシ成長ホルモン遺伝子は、乳中に１から１６ｇ／ｌのレベルで発現した  （Ｔｈｅｐｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）。しかしながら、これらのレベルは組み込まれたコピーの数に関わらず系統によって異なり、発現の特異性は組み込み部位に依存した。
【０００８】
本発明は更に、有益な導入遺伝子を乳内に効率的に発現させるようにすることが可能なシス制御エレメントをもたらし、それにより、異種タンパク質を大量に生成することを目指すものである。
この点に関しては、本発明者等は、ブタｗａｐ  ｃＤＮＡをクローニングし、ブタｗａｐ遺伝子を全て含むＢＡＣ構成を調製した。ブタｗａｐ遺伝子のコード配列を、当業者に知られた齧歯類やウサギ目動物のｗａｐ配列と比較して明らかになったところによると、エクソン配列のみが部分的に保存されている。
【０００９】
ブタｗａｐ遺伝子は、１８番染色体のサブテロメア領域に位置していることが突き止められた。ブタｗａｐ遺伝子の、授乳期の動物の乳腺での発現を評価すると、その発現レベルが高度であることが明らかになった。ブタｗａｐ遺伝子の下流７０ｋｂそして上流５０ｋｂを含んだ大きなゲノム断片か、あるいは、それよりも小さな（下流１ｋｂそして上流２．４ｋｂの）断片からの、ブタｗａｐ遺伝子の発現レベルを比較するために、これら二つのゲノム断片をＨＣ１１細胞系統にトランスフェクトした。組み込んだコピーの数に関しては、ＢＡＣ構成の発現は、プラスミドの十五倍高いレベルで起きた。そのようにして本発明者等は、マウスの乳腺上皮ＨＣ１１細胞系統が乳タンパク質遺伝子の制御配列を識別する手段として役に立つことを明らかにした。
【００１０】
そこで、本発明者等は、ＨＣ１１細胞を用いて、ｗａｐ遺伝子の上流７０ｋｂそして下流５０ｋｂのこれらのＢＡＣクローンの一つにより、１ｋｂの上流領域を含む断片の十五倍の高さの発現が可能になることを明らかにした。
１４０ｋｂの上流領域と５ｋｂの下流領域とで取り囲むブタｗａｐ遺伝子を含む導入遺伝子の発現特異性をテストした。発現レベルは、異なるトランスジェニックマウス系統と、授乳期のブタの乳腺内での内因性の発現との間で比較した。
【００１１】
そのようにして、本発明は、トランスジェニック動物の乳内での導入遺伝子の発現を最適化するのに必要な制御エレメントの全てを含むブタｗａｐ遺伝子の周りで単離された、長大なゲノム断片をもたらすものである。そのような配列の中にはシス制御エレメントとインシュレーターの両方が含まれており、それにより、導入遺伝子の、乳中での、位置に依存しない、効果的で組織特異的な発現を可能にする。
【００１２】
【発明の実施の形態】
説明
本発明が目指すのは、ブタｗａｐ遺伝子座の５’と３’領域からなる、単離されたインシュレーターＤＮＡ分子であり、そこでは前記ＤＮＡ分子は、それぞれアクセッション番号Ｉ−２５９５とＩ−２５９６とで２０００年１２月１３日にＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ  （ＣＮＣＭ），Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ，２８，  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｒ  Ｒｏｕｘ，７５７２４  Ｐａｒｉｓ  ｃｅｄｅｘ  １５に寄託されたＢＡＣ  ９０５Ｆ９かＢＡＣ  ３４４Ｈ５から入手可能な約１４５ｋｂと７５ｋｂのＮｏｔＩ−ＮｏｔＩ断片から単離されるものである。キャップ部位の上流４０ヌクレオチド、下流２０４７ヌクレオチドからのブタｗａｐ遺伝子のゲノム配列全体をＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１とする。「インシュレーター」という用語は、プロモーターに作用して、遺伝子発現を強化したり、または抑制したりする、周囲のクロマチンでのエレメントの影響を防止するＤＮＡセグメントを言う；Ｖ．Ｃｏｒｃｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７６，４６２（Ａｕｇ．１０，１９９５）。二つのインシュレーターを用いる場合には、それは同じものでもよいし、異なっていてもよい。本発明によるインシュレーターは、それがインシュレーターとしての機能を保持する限りは、ｗａｐ遺伝子座から単離された、天然に発生するインシュレーターの断片を包囲することのできるものである。そのインシュレーターの長さは決定的に重要というわけではないが、一般的には１００、２００または３００塩基から２０００、３０００、５０００、１００００またはそれ以上の塩基長であってよい。本発明に関して言えば、長めの断片は、ｗａｐ遺伝子座のシス作用性エレメントを組み込むために用いてもよく、そしてそれゆえに、トランスジェニック動物の乳中に異種タンパク質を効率的に発現させることができるようになる。
【００１３】
そのようにして、本発明によるＤＮＡ分子は更に、ブタｗａｐ遺伝子のシス作用性の制御配列を含むこともできる。そのシス作用性の制御配列は「ミルク・ボックス」となりうるエンハンサーであり、ＧＲＥ、ＭＡＦまたはＳｔａｔ−５、ＭＰＢＦ、Ｃ／ＥＢＰそしてＹＹＩその他の因子のような転写因子の結合配列に対応するものである。
【００１４】
第二の実施例において、本発明は以下のようなものからなるベクターを目指す：
（ａ）上記の少なくとも一つの単離されたインシュレーターＤＮＡ分子；
（ｂ）プロモータードメイン；
（ｃ）プロモータードメインと作用面で関連する異種遺伝子。
【００１５】
そのようなベクターにおいて、少なくとも一つ（１、２またはそれ以上）のインシュレーターはプロモーターの５’に位置しており、それにより、その遺伝子が組み込まれたクロマチン中のシス作用性の制御エレメントから、その遺伝子の転写と発現を作用面で隔離するようにする。
その他に、少なくとも一つのインシュレーターは、その遺伝子の３’に位置しており、それにより、その遺伝子が組み込まれたクロマチン中のシス作用性の制御エレメントから、その遺伝子の転写と発現を作用面で隔離するようにする。異種遺伝子が二つのインシュレーターの間に区画された状態で発現することになるベクターを考えてもよい。
本文中で用いられる「作用面で関連している」という用語は、単一のＤＮＡ分子の上で、一つの機能が他のもう一つによって影響されるように関連しあっている複数のＤＮＡ配列があるということを言っている。そういうわけで、転写開始領域は、それが構造遺伝子の発現に影響を与える可能性がある場合には、構造遺伝子と作用面で関連しているということになる。
【００１６】
本発明によるベクターは、スプマウイルス；レンチウイルス、オンコウイルスの中から選択されるレトロウイルスベクターであってよい。
レトロウイルスはエンベロープのある一本鎖のＲＮＡウイルスで、動物細胞に感染するものである。レトロウイルスが細胞に感染すると、そのＲＮＡゲノムは二本鎖の線状ＤＮＡの形に変換され、それが宿主細胞ゲノムの中に組み込まれる。組換えレトロウイルスベクターを含む、ウイルスベクターは、細胞内に遺伝子を導入するための手段として、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈やＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション、核酸のマイクロインジェクションやリポフェクションなどよりも効率的なものとなる。
【００１７】
本発明の第三の実施例は発現カセットからなるＤＮＡ構成に関するものである。その構成を構成するのは、５’から３’の方向に、転写開始領域、その転写開始領域の下流に位置しており、それと作用面で関連のある構造遺伝子、そして転写開始領域の５’に位置し、または／あるいはその構造遺伝子の３’に位置する、請求項１から請求項３のうちの一つに記載のインシュレーターである。そのようなＤＮＡ構成の形状は、上記のベクターでも、プラスミド、裸のＤＮＡ、エピソームベクター、あるいは人工染色体であってもよい。二つの別々の構成にすることも可能であり、一つは本発明のインシュレーターＤＮＡ配列からなるもの、もう一つは、発現することになる異種遺伝子からなるものであり、その両方の構成を一緒に宿主細胞に注入してもよい。
有利には、上記の構成を初期胚、ＥＳ細胞、分化全能性細胞そして卵母細胞に直接マイクロインジェクションするか、あるいは精細胞に導入してもよい。
【００１８】
より好ましい実施例の中には、上記のＤＮＡ構成またはベクターで、前記プロモーターがウサギｗａｐ遺伝子プロモーターであり、それにより、動物の乳中で構造遺伝子を効率的に発現させることができるようにしたものが考えられているものがある（そのウサギｗａｐプロモーターは米国特許第５，９６５，７８８号明細書に記載されている）。言うまでもなく、本発明の範囲内で、他のどのような構成性の、あるいは組織特異的なプロモーターを活用してもよい。
【００１９】
活用可能な構造遺伝子としては、日用品または治療用の、抗体、成長因子、ポリペプチド、血液因子、酵素またはペプチドから選択されるポリペプチドまたはタンパク質をコードするものがある。
【００２０】
上記のＤＮＡ構成またはベクターで、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１からなるものも考えられている。
【００２１】
本発明のもう一つの実施例は、導入された異種遺伝子の発現を、その遺伝子が組み込まれたクロマチンの抑制や多様化の効果から隔離するための方法に関するものである。それは、以下のような手順からなるものである：
（ａ）上記のベクターまたはＤＮＡ構成を準備する；
（ｂ）そのベクターまたはＤＮＡ構成で哺乳類細胞にトランスフェクションを行い；そして
（ｃ）その細胞のクロマチンに、そのベクターまたはＤＮＡ構成を組み込み、その結果組み込まれた遺伝子の発現は、その細胞のクロマチン内でのシス作用性ＤＮＡ制御配列から隔離されているようにする。
ある特殊な実施例においては、本発明は、導入された異種遺伝子の発現を、次のようにして、抑制から隔離するための方法に関する、以下の手順からなるものである：
（ａ）上記のエピソームベクターを準備する。
（ｂ）そのベクターで哺乳動物の細胞にトランスフェクションを行う。
【００２２】
本発明はまた、異種遺伝子の発現が増大したヒト以外のトランスジェニック動物を作るための方法に関する、次の手順からなる方法であり；
（ａ）上記のベクターまたはＤＮＡ構成で哺乳動物の細胞を形質転換する；
（ｂ）そしてその細胞からヒト以外の動物を発生させる。
【００２３】
好ましい哺乳動物細胞は、配偶子形成の最終段階にまだ達しておらず、その中にレトロウイルスベクターを感染させることのできる卵母細胞であってもよい。注入された卵母細胞を次に、それに伴う減数分裂で、完全に成熟できる状態にする。減数分裂中に核膜が壊れることにより、レトロウイルスベクターのプロウイルス状態のものを卵母細胞のゲノムの中に組み込むことができる。注入された卵母細胞は、インビトロでの受精の前に成熟できるような条件の下でインビトロで培養することができる。（例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ヤギ等の）幾つもの哺乳動物種の卵母細胞を成熟させる条件は当業者には周知である。例えば、米国特許第６，０８０，９１２号明細書（トランスジェニック動物を作りだす方法）や米国特許第５，９９４，６１９号明細書（培養した内部細胞塊細胞を用いるキメラのウシやブタの生産）を参照してもよい。
【００２４】
本発明を実施するにあたり、卵母細胞の成熟をインビボで行ってもよい。ヒト以外の動物の希望通りの種に感染させることができ、成育可能で非常に高度に濃縮できるレトロウイルスベクターを、上記のように活用してもよい。力価の高いウイルスストックを用いることにより、注入した各卵母細胞の卵黄周囲間隙に所定の数のウイルス粒子を導入することができる。（例えばウシ、ハムスター、ブタ及びヤギ等の）様々な哺乳類の種の未成熟の卵母細胞を成熟させることのできるインビトロの培養条件は当業者には周知である〔Ｐａｒｒｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ２４：５３７；Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｓ  ａｎｄ  Ｆｉｒｓｔ（１９９４）Ｊ．Ａｎｉ．Ｓｃｉ．７２：４３４；Ｂａｖｉｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ（１９７７）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．１６：２２８；Ｂａｖｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２８：２３５；Ｌｅｉｂｆｒｉｅｄ  ａｎｄ  Ｂａｖｉｓｔｅｒ（１９８２）Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．６６：８７；Ｋｅｓｋｉｎｔｅｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｚｙｇｏｔｅ  ２：９７  Ｆｕｎａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．１０１：１５９  ａｎｄ  Ｆｕｎａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５０：１０７２参照〕。
【００２５】
ヒト以外のトランスジェニック動物を得るのに非常に役に立つ細胞としては他に、分化全能性細胞、分化多能性細胞そしてＥＳ細胞である。そのような細胞を培養し形質転換するための方法が記載されているのは、次のものである。国際公開第００／２７９９５号パンフレット（ＥＳ細胞）、国際公開第００／１５７６４号パンフレット（ＥＳ細胞の増殖と分化誘導）、国際公開第９９／２７０７６号パンフレット（分化多能性胚性幹細胞と、そのような細胞を得るための方法）、国際公開第９９／１０４８８号パンフレット（真核生物における部位特異的組換えとそのために有用な構成）、米国特許第５，６９０，９２６号明細書（分化多能性胚細胞と、その細胞を作る方法）、国際公開第９７／４１２０９号パンフレット（多能性ウサギ胚性幹細胞系統とキメラウサギを発生させる際の使用法）、国際公開第９７／２００３５号パンフレット（動物の胚からの分化全能性胚性幹細胞の確立と維持とトランスフェクション）、米国特許第５，１６６，０６５号明細書（胚性幹細胞のインビトロでの増殖）、国際公開第９５／２００４２号パンフレット（ＥＳ細胞の単離）、国際公開第９４／２３０４９号パンフレット（トランスジェニック動物における大型のゲノム配列の導入と発現）、国際公開第９９／０９１４１号パンフレット（ブタの分化全能性細胞とそれを長期間培養するための方法）、国際公開第９７／４９８０３号パンフレット（胚の卵割球に遺伝子を移植することによるトランスジェニック）、国際公開第９７／２００３５号パンフレット（家畜の胚からの分化全能性ＥＳ細胞の確立と維持とトランスフェクション）、国際公開第９６／０７７３２号パンフレット（核移植のための分化全能性細胞）そして豪州特許第３３９５６９５号明細書（核移植のための分化全能性細胞）。
【００２６】
それゆえ、本発明はまた哺乳類細胞を目的とするものであり、その哺乳類細胞は特に、卵母細胞、分化全能性細胞、分化多能性細胞そしてＥＳ細胞の中から選んだ哺乳類細胞であって、その細胞のクロマチンに上記のＤＮＡ構成やベクターが組み込まれている。
【００２７】
現行の技術水準においては、本発明のベクターかＤＮＡ構成で線維芽細胞のような体細胞を形質転換したものを生成し、それを受容細胞への核移植に用いて、そこで今度は胚を生成することが可能である。核移植技術が記載されているのは、国際公開第９５／１７５００号パンフレット、国際公開第９７／０７６６８号パンフレット、国際公開第９７／０７６６９号パンフレット、国際公開第９８／３０６８３号パンフレット、国際公開第９９／０１１６３号パンフレットそして国際公開第９９／３７１４３号パンフレットである。
【００２８】
その結果、もう一つの実施例は、本発明による細胞からなる異種遺伝子の発現を増大させた、ヒト以外のトランスジェニック動物を目的とする。
そのような動物は例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラットそしてマウスの中から選択できる。
【００２９】
本発明は上記の実施例のみに限定されるものではなく、以下のようなものも想定している。
【００３０】
本発明はまた、異種遺伝子が組み込まれたクロマチンの抑制効果と多様化効果を防止するために、本文中に説明した単離したインシュレーターＤＮＡの使用にも関するものである。
【００３１】
例えば、以下のような手順で本発明を実施し、二つの遺伝子の差次的発現を隔離することが可能である：
（ａ）本発明による少なくとも一つの単離されたインシュレーター分子；
（ｂ）最初に発現する遺伝子と；（ｃ）第二に発現する遺伝子と；（ｄ）第一の遺伝子と作用面で結びついている、第一の遺伝子の発現を仲介するプロモーターと；（ｅ）前記第二の遺伝子と作用面で結びついている、第二の遺伝子の発現を仲介するプロモーターと；（ｆ）前記第二の遺伝子と作用面で結びつき、それにより、第二の遺伝子の発現を増強するようにしたエンハンサーとを準備すること、
但し、そのインシュレーターのうちのその一つまたは複数は、その第一の遺伝子と作用面で結びついているプロモーターの５’構成の中に位置しており；
そのエンハンサーは、前記第一の遺伝子とは逆の転写方向に位置している第二の遺伝子と作用面で結びついているプロモーターの５’に位置しており、そして更に、そのインシュレーターのうちの一つまたは複数は、第一と第二の遺伝子の３’に位置している。
【００３２】
他の方法としては、ＤＮＡ構成を使って、以下のものから構成される二つの異なるタンパク質をコードする二つの遺伝子の差次的発現を隔離するという、以下のものからなるものがある；
（ａ）請求項２または請求項３のいずれかに記載の一つまたは複数の真核生物インシュレーター分子と；（ｂ）第一に発現可能な遺伝子と；（ｃ）第二に発現可能な遺伝子と；（ｄ）第一の遺伝子に作用面で結びついている前記第一、第二遺伝子の発現を仲介するプロモーターと；（ｅ）第二の遺伝子に作用面で結びついている前記第二遺伝子の発現を仲介するプロモーターと；（ｆ）第一の遺伝子に作用面で結びつき、第一の遺伝子の発現を増強する第一のエンハンサーと；（ｇ）第二の遺伝子に作用面で結びつき、前記第二の遺伝子の発現を増強する第二のエンハンサー。
但し、そのインシュレーターのうちの一つまたは複数はその第一と第二のエンハンサーの間に位置しており、その第一のエンハンサーはその第一の遺伝子のプロモーターの転写活性を増強するように作用させることが可能であり、そして、その第二のエンハンサーはその第二の遺伝子のプロモーターの転写活性を増強するように作用させることが可能であり、そして更に、そのインシュレーターのうちの一つまたは複数はその第一と第二の遺伝子の３’に位置している。
【００３３】
本発明を実施するために可能なもう一つの方法は、本文で説明した単離したインシュレーターＤＮＡを用いて、二つの異種遺伝子が組み込まれたクロマチンの抑制効果と多様化効果を防止することである。実際、二つの異なる構造遺伝子の少なくとも一つに少なくとも一つの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）が作用面で結びついているようにして、それら前記遺伝子が同時に発現するようにすることは可能である。
ＩＲＥＳに調節された翻訳の一般的な概説についてはＨｏｕｄｅｂｉｎｅ  ｅｔ  Ａｔｔａｌ，１９９９，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，８：１５７−１７７  ａｎｄ  ｉｎ  Ｏｈｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊａｎ  ２０００，ｍ／ｓ（ｍｅｄｅｃｉｎｅｓ／ｓｃｉｅｎｃｅｓ），ｖｏｌ  １６，７７−８６を参照されたい。更に具体的には、ＩＲＥＳを含むレトロウイルスベクターとレトロトランスポゾンを用いる遺伝子移植方法は、国際公開第９３／０３１４３号パンフレット及び国際公開第９２／０７９５０号パンフレットにそれぞれ記載されている。一つのプロモーターと一つのＩＲＥＳからなる一つのベクターにおいて二つの遺伝子を同時に発現させるための様々なＤＮＡ構成は国際公開第９６／０１３２４号パンフレットの図１に記載されている。
【００３４】
齧歯類動物のｗａｐ遺伝子とウサギｗａｐ遺伝子とでは、エクソンは、高い割合の同一性を示す。配列の相同性と大きさによって判断したところでは、イントロンは、より保存されていない。更に、共通の転写シグナルにも、保存されているものが幾つかある。実際、潜在的なＴＡＴＡボックスは、他のＷＡＰ遺伝子におけるようにＴＡＴＡコンセンサス配列を修正したものであり、ポリアデニル化シグナルは同一である。
【００３５】
ブタｗａｐ遺伝子のシス制御エレメントが乳腺内での組換えタンパク質の生成を促すのに役に立つかどうかを判断するためには、ブタにおける内因性ｗａｐ遺伝子の発現を評価しなければならない。第一に、本発明者等は、ブタｗａｐ遺伝子の発現レベルがウサギとマウスのｗａｐ遺伝子の発現と比較しうるものであるかどうかを測定した。本発明者等は、乳分泌の始めにｍＲＮＡの濃度を評価することを選択した。強いシグナルを明らかにするのに必要な曝露は三十分だけだったので、それら三種の動物の内因性ｗａｐ  ｍＲＮＡは容易に検出できた。ブタｗａｐ  ｍＲＮＡは、マウスとウサギのそれよりも僅かに乏しいようであった。マウスとウサギのｗａｐ遺伝子は授乳期の個体の乳腺に豊富に発現しているので、ブタｗａｐ遺伝子も授乳期のブタの乳腺によく発現しているようであった。
【００３６】
もっと大きなゲノムＤＮＡ断片を使えば発現も更に強くなるかどうかを測定するために、１ｋｂだけのプロモーター領域と共働したブタｗａｐ遺伝子（ｐＷＡＰｐＸｈｏＩ）と、そのブタｗａｐ遺伝子の上流７０ｋｂそして下流５０ｋｂを含んだＢＡＣクローンの一つ（ＢＡＣ  ９０５Ｆ９）とをマウスの乳腺上皮細胞（ＨＣ１１）にトランスフェクションした。ＢＡＣクローンでトランスフェクションを行った細胞から検出された組み込み済のコピーの数は、もっと小さなゲノム断片を使った場合よりも少なかった。それは、ＢＡＣクローン（１５０ｋｂ）とプラスミド（８．５ｋｂ）で大きさが異なるということから説明されうる。実際、もう一つのものよりも１６倍小さいＤＮＡ断片の方が、宿主ゲノムに組み込まれる可能性は高い。この発現はノーザンブロット分析によっては検出されず、二つの発現を比較するために用いたのはＲＴ−ＰＣＲである。次に明らかにしたのは、コピーの数に関しては、ＢＡＣ  ９０５Ｆ９クローンの発現は、もっと小さなゲノム断片で行ったときよりも十五倍高いということである。これは、長いゲノム断片にはそれだけ多くのエンハンサーとインシュレーターが存在するということから説明できる。更に、ＢＡＣクローンのｗａｐ遺伝子の発現は泌乳刺激ホルモンに、より敏感なようだったが、それは発現レベルが、インシュリン、インシュリンとプロラクチン、インシュリンとコルチコイド及びそれら三種のホルモンを用いるに従って次第に増大したからである（データは示されていない）。これらの結果は、そのゲノム断片の中に乳タンパク質遺伝子の末端制御配列があるという証拠とも一致する。しかしながら、このＢＡＣクローンが授乳期の個体の乳腺に特異的で高い発現を与えることができるかどうかを示すことを期待できるのは、トランスジェニック動物だけである（下記参照）。
【００３７】
トランスジェニックマウスの乳中にブタＷＡＰタンパク質を生じさせるために、二つの異なる技法により、ブタＷＡＰコード転写単位を含むバクテリア人工染色体インサートから、１５０ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。第一の技法は単純にフェノール・クロロホルム抽出をするものであり、もう一つの技法ではＧＥＬａｓｅ酵素と透析を用いた。マウスのトランスジェニック系統を発生させるためには、どちらも等しく効率的であった。その時、通常のフェノール・クロロホルム技法は、マウスの受精した卵母細胞にマイクロインジェクションするための長いＤＮＡ断片を調製するのに使ってよいようであった。しかしながら、この方法の欠点は、有益な遺伝子を保持するＤＮＡ断片が、他のものから分離しないことである。後に残る原核生物ＤＮＡは内因性ＤＮＡのメチル化を促進したり、導入遺伝子の正常な環境に干渉したりして、導入遺伝子の発現を妨げる恐れがある。興味深いことに、この事実は観察されなかった。この結果により、ブタｗａｐ遺伝子を保持する長いＤＮＡ断片の中にもインシュレーターがあることが確認される。
【００３８】
八頭の個体をトランスジェニックした。二頭はフェノール・クロロホルム精製ＤＮＡで得たものであり、六頭は他の方法で調製したＤＮＡで得たものである。自身の導入遺伝子を全く伝達しなかった個体が一頭あり、もう一頭は生殖能力を得る前に死んでしまった。そこで、六つの系統を分析した。これらの系統の授乳期の個体全てが乳腺中にブタｗａｐ遺伝子を発現した。それゆえ、長いゲノム断片により、組み込み部位に依存せずに発現させることが可能になった。
【００３９】
その上、この発現は乳腺においてのみ、検出された。処女個体においては、ブタｗａｐ  ｍＲＮＡも内因性マウスｗａｐ  ｍＲＮＡもノーザンブロットでは見いだされなかった。それゆえ、その発現は発達上で制御されたわけである。このＤＮＡ断片の中にあるシス作用性エレメントは、そういうわけで、ブタｗａｐ遺伝子発現の調節に係わるものである。
【００４０】
マウスの乳の組成を調べることによっても、この結論は裏付けられる。ブタＷＡＰとなることが予想されるタンパク質は、クマシーブリリアントブルー染色により、系統１６の個体の乳と乳清の中にのみ、検出された。ここで明らかなのは、個体ＢＡＣ１６はブタｗａｐ遺伝子を強く発現したということであり、それは、対応する組換えタンパク質が内因性ネズミタンパク質のそれよりもレベルが高く、そしてブタの乳清中の十倍を上回る濃度があるからである。ネズミＷＡＰタンパク質の濃度は約３から５ｍｇ／ｍｌに達するということが知られている（Ｈｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎ  ａｎｄ  Ｓｉｐｐｅｌ，１９８２）。個体ＢＡＣ１６の乳中でそれを上回ってはいないにしても、ブタＷＡＰタンパク質はこのレベルで存在していた。
【００４１】
更に明らかになっているのは、発現レベルは組み込まれたコピーの数と相関関係があるということである。導入遺伝子のコピーを２６個保持している系統１６の発現レベルは、コピーが３個しかない系統２８よりも８倍も高い。しかしながら、一つか二つのコピーしか保持していない個体では発現レベルの違いをはっきり示すことができないが、それは、系統間での多様化が、同じ系統の個体間の違いに、およそ等しいためである。
【００４２】
そのようなわけで、本発明によるｗａｐ遺伝子を含むブタＢＡＣクローンは、組み込み部位に係わらず、導入遺伝子の発現を授乳期の乳腺に生じさせることができる。今までのところ、トランスジェニックマウスに、位置に依存しない形で発現した乳タンパク質遺伝子は数える程度である。例を挙げると、ヒツジβ−ラクトグロブリン遺伝子（Ｗｈｉｔｅｌａｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、ラットｗａｐ遺伝子（Ｋｒｎａｃｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、ＹＡＣにおけるヒトα−ラクトアルブミン遺伝子（Ｆｕｊｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、そしてＢＡＣにおけるヤギα−ラクトアルブミン遺伝子（Ｓｔｉｎｎａｋｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）である。本発明のブタＢＡＣクローンは、授乳期のトランスジェニック動物の乳腺の中での組換えタンパク質をコードする遺伝子の発現をしっかりと調節する新しい手段となるものである。結論として、ここでのデータにより、ブタｗａｐ遺伝子を保持するＢＡＣ構成の中には、シス制御エレメントだけでなくインシュレーターもあることが立証される。
【００４３】
凡例
図１：ＷＡＰｐＸｈｏＩインサートの地図の一部（Ａ）と、ブタＷＡＰ遺伝子を含む二つの更に有益なＢＡＣクローン上での酵素の分布の一部（Ｂ）。（黒の□）は、ブタＷＡＰ遺伝子の四つのエクソンの位置を示す。（白の□）はブタＷＡＰ遺伝子全体の位置を示す。Ａ：ＡｓｃＩ；Ｘ：ＸｈｏＩ；Ｅ：ＥｃｏＲＩ；Ｎ：ＮｏｔＩ。
【００４４】
図２：授乳期のブタ、ウサギそしてマウスの乳腺におけるｗａｐ遺伝子転写。授乳期五日目のブタの乳腺と授乳期三日目のウサギとマウスの乳腺の全ＲＮＡ（１０及び２０μｇ）を１．５％変性アガロース／ホルムアルデヒドゲルで分画し、ブロットし、３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識したマウス（Ａ）、ブタ（Ｂ）そしてウサギ（Ｃ）のｗａｐ  ｃＤＮＡとハイブリダイズした。等しいロードのＲＮＡサンプルを２８及び１８Ｓ  ｒＲＮＡの紫外線／エチジウムブロマイド写真で示している（Ｄ）。
【００４５】
図３：マウスの上皮細胞系統（ＨＣ１１）のブタｗａｐ遺伝子発現。ＨＣ１１細胞系統にＲＳＶｎｅｏ及びｐＷＡＰｐＸｈｏＩまたはＢＡＣ  ９０５Ｆ９でコトランスフェクションを行った。クローンのプールをＧ４１８（１５０μｇ／ｍｌ）で選択した。細胞の培養は材料と方法で説明したように行い、ホルモン処理（インシュリン、デキサメタゾン、プロラクチン）の４８時間後に採取した。Ａ：特異的なブタｗａｐＲＴ−ＰＣＲを、トランスフェクションをしていないＨＣ１１細胞系統（ＮＴ）、ｐＷＡＰｐＸｈｏＩプール（ｐＷＡＰｐＸｈｏＩ）そしてＢＡＣ９０５Ｆ９プール（ＢＡＣ９０５）で行った。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで電気泳動した。Ｂ：ＰＣＲ産物をナイロン膜の上にブロットし、標識したブタｃＤＮＡｗａｐ１．４プローブとハイブリダイズした。Ｃ：ＰＣＲ増幅を正規化するために、内因性のマウスＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡをＲＴ産物で増幅し、２％アガロースゲルで電気泳動し、ブロットして、標識したマウスＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡのプローブとハイブリダイズした。
Ｄ：組み込んだコピーの数の評価を、トランスフェクションをしていないＨＣ１１細胞（ＮＴ）、ｐＷＡＰｐＸｈｏＩプール（ｐＷＡＰｐＸｈｏＩ）、ＢＡＣ９０５プール（ＢＡＣ９０５）そしてＥｃｏＲＩで４時間消化したブタのゲノムＤＮＡから取った１０μｇのゲノムＤＮＡを使ってサザンブロットを行い、ＷＡＰｐＥｃｏＲＩ−２．４ｋｂプローブでハイブリダイズした。
【００４６】
図４：ブタｗａｐ導入遺伝子の組織特異的発現
全ＲＮＡを様々なトランスジェニック系統の様々な組織から調製した。全ＲＮＡ（１０μｇ）をホルムアルデヒドゲルの各レーンに加え、ナイロン膜に移し、〔３２Ｐ〕で標識したブタｗａｐ  ｃＤＮＡプローブ及び〔３２Ｐ〕で標識したネズミｗａｐ  ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズした。ハイブリダイズしたものをＸ線フィルムで見えるようにした。
【００４７】
図５：授乳期１０−１２日目のトランスジェニックマウスの乳腺と授乳期９日目のブタの乳腺におけるブタｗａｐ  ｍＲＮＡレベルの比較
授乳期１０日目の非トランスジェニックマウス（ＮＴ）、授乳期１０−１２日目のトランスジェニック動物、トランスジェニック処女動物（Ｓ１４５）及び授乳期９日目のブタの乳腺から全ＲＮＡを調製した。トランスジェニックマウスの１０μｇの全ＲＮＡと、授乳期の非トランスジェニックマウスと授乳期のブタの、それぞれ１０．５と１μｇの全ＲＮＡを、ホルムアルデヒドゲルの各レーンに加え、ナイロン膜に移し、〔３２Ｐ〕で標識したブタｗａｐ  ｃＤＮＡプローブ（ブタｗａｐ  ｍＲＮＡ）、〔３２Ｐ〕で標識した１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブ（１８Ｓ  ｒＲＮＡ）そして〔３２Ｐ〕で標識したネズミｗａｐ  ｃＤＮＡプローブ（マウスｗａｐ  ｍＲＮＡ）とハイブリダイズした。ハイブリダイズしたものをＸ線フィルムで見えるようにした。
【００４８】
図６：授乳期１０−１２日目のトランスジェニックマウス及び授乳期９日目のブタの乳及び乳清におけるブタＷＡＰタンパク質濃度の比較
非トランスジェニックマウス（ＮＴ）、トランスジェニックマウス（Ｂａｃ１６、Ｂａｃ２８、Ｂａｃ２９）ならびに豚の乳（０．１μｌ）及びブタの乳清（０．５μｌ）（Ａ．）、あるいは非トランスジェニックマウス（ＮＴ）、トランスジェニックマウス（Ｂａｃ１６、Ｂａｃ２８、Ｂａｃ２９）の乳清（０．０５μｌ）ならびにブタの乳清（０．５μｌ）（Ｂ．）を１６％ＳＤＳ／ＰＡＧＥにロードし、９０Ｖで２時間、電気泳動した。タンパク質をクマシーブリリアントブルー染色で見えるようにした。ブタＷＡＰタンパク質（ｐＷＡＰ）とネズミＷＡＰタンパク質（ｍＷＡＰ）を矢印で示す。
【００４９】
【実施例】
実施例１：ブタｗａｐタンパク質遺伝子の単離と解析
ブタｗａｐタンパク質遺伝子の核酸配列は知られていなかったので、ＢＡＣライブラリーから大きなゲノム断片を単離するためにはブタｗａｐ  ｃＤＮＡの少なくとも一部のクローニングが必要だった。そのようなわけで、授乳期のブタの乳腺からのブタｗａｐ  ｃＤＮＡを特異的に増幅するようにプライマーを設計する必要があった。マウス（Ｈｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎ  ａｎｄ  Ｓｉｐｐｅｌ，１９８２）、ラット（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４）そしてウサギ（Ｄｅｖｉｎｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）のＷＡＰ  ｃＤＮＡ配列の比較により、二つの領域がよく保存されていることが明らかになった。シグナルペプチド配列と三番目のエクソンの始めである。その結果、これらの保存された領域で二つのプライマーが選ばれ、それにより、ＲＴ−ＰＣＲにより、ブタｗａｐ  ｃＤＮＡの５’末端を増幅した。ＲＴ−ＰＣＲにより得られた特異なバンド（２２０ｂｐ）を単離し、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）の中でクローニングし、両方の鎖をシークエンスした。考えうる三つのリーディングフレームを調べたところでは、そのうちの一つが、Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）が発表したブタＷＡＰのアミノ酸配列と９１．３％の相同性を示した。クローニングしたＤＮＡ断片の配列から導き出した更に二つのアミノ酸（ａａ３９及びａａ４０）が、ＷＡＰタンパク質のこの部分に見いだされた。これら二つのＷＡＰタンパク質配列間のこの違いが、ＰＣＲまたはシークエンシングにおける誤りにより生じるかも知れない。他の可能性として、それがブタｗａｐ遺伝子における多型性を反映することも考えられる。
【００５０】
ブタｗａｐ  ｃＤＮＡの５’末端の配列から、ブタｗａｐ遺伝子からの二つの特異的プライマーの設計を行い、その二つのプライマーの組み合わせでＰＣＲ反応によりブタＢＡＣライブラリーをスクリーニングした。ブタｗａｐ遺伝子を含む五つのクローン（２８３Ｅ５、３４４Ｈ５、８２９Ｇ１、８２９Ｇ５、９０５Ｆ９）を単離し、制限酵素地図を作成した（図１）。これらのＢＡＣベクターでクローニングされたゲノムＤＮＡ断片の長さは１２０から１５５ｋｂの範囲だった。二つのクローンが特に興味深く思われた。ＢＡＣ  ９０５Ｆ９クローンにはそのインサートの中央部にｗａｐ遺伝子を含み、そしてｗａｐ遺伝子の上流７０ｋｂと下流５０ｋｂを包囲していた。ＢＡＣ  ３４４Ｈ５クローンはｗａｐ遺伝子のキャップ部位の上流１３０ｋｂを包囲していた。これら二つのクローンの中にｗａｐ遺伝子を制御する幾つかの重要なエレメントが含まれていたかも知れない。
この制限酵素地図から本発明者等が測定したところでは、５．４ｋｂのＸｈｏＩ断片の中に少なくとも５’末端のｗａｐ遺伝子があった。このＸｈｏＩ断片をプラスミドベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ−のＸｈｏＩ部位にクローニングした。プライマーウォーキング法を選択し、ジデオキシ法で二つのＷＡＰ遺伝子ＤＮＡ鎖のシークエンシングを行った。完全なＷＡＰ遺伝子が、５．４ｋｂのＸｈｏＩ断片の中に見いだされ、その配列は、アクセッション番号ＡＦ３２０３０６でＥＭＢＬデータベースで入手可能である。
【００５１】
ブタｗａｐ遺伝子の長さは２ｋｂにまたがる。ＴＡＴＡボックスと推定されるものが、予想された位置、即ち、キャップ部位から−３０ｂｐのところに見いだされた。このＴＡＴＡボックスは典型的なＴＡＴＡコンセンサス配列（Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１）のようには見えず、修正された配列（ＴＴＴＡＡＡＡ）を示した。興味深いことに、この配列はまた、他の種のＷＡＰ遺伝子にも見いだされ（Ｄｅｖｉｎｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）、これまで研究された乳タンパク質遺伝子の大部分にも見いだされた。ブタｗａｐ遺伝子を構成するのは、それぞれ１０９、１４１、１６０、１４７個のヌクレオチドを含む四つのエクソンと、６３５、３２７、５２８個のヌクレオチドで形成された三つのイントロンである。第一のエクソンがコードしたのはｍＲＮＡの５’−Ｐ非翻訳領域の２８個のヌクレオチドと、シグナルペプチドの１９個のアミノ酸と、分泌されたＷＡＰタンパク質の最初の８個のアミノ酸である。最後のエクソンに含まれていたのは、最後の４個のアミノ酸と３’ＯＨ非翻訳領域を形成する１２９個のヌクレオチドである。
【００５２】
たとえｗａｐ遺伝子の構造的組成が種間でよく保存されていたとしても、完全なｗａｐ遺伝子の配列を比較してみて明らかになったところでは、保存されたのはエクソン配列だけだった。イントロンの配列の同一性の割合はとても低く、そしてそれらの大きさは全く変化しやすい。例えば、第三のイントロンが含むのは、マウスでは約１．１ｋｂの長さ、ラットでは約５００ｂｐ、ウサギでは３６９ｂｐそしてブタでは５１７ｂｐであった。ブタｗａｐのアミノ酸配列は、ラクダ、ウサギ、ラットそしてマウスのＷＡＰタンパク質と、それぞれ７５、５０、４０及び３５％の相同性を示した（Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。ブタｗａｐ  ｃＤＮＡ配列に見られた相同性は、ウサギ（Ｇｅｎｂａｎｋ；Ｘ０７９４３）、ラット（Ｇｅｎｂａｎｋ；Ｊ００８０１）そしてマウス（Ｇｅｎｂａｎｋ；Ｖ００８５６）のｗａｐ  ｃＤＮＡとそれぞれ、６７．２、６１．６、５９．６％である。
【００５３】
実施例２：授乳期の乳腺内の内因性ｗａｐ遺伝子の発現
材料と方法
授乳期５日目のブタ、授乳期３日目のウサギそして授乳期３日目のマウスの乳腺から得た全ＲＮＡの２０μｇと１０μｇとを、前述したように、三つの１．５％アガロース・ホルムアルデヒド変性ゲルで電気泳動させて分離した（Ｐｕｉｓｓａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。ＲＮＡを５０ｍＭのＮａＯＨで処理して断片化し、つぎに毛細管現象で５０ｍＭのリン酸ナトリウムの存在下、ｐＨ７で、Ｂｉｏｈｙｌｏｎ−Ｚ＋膜（Ｂｉｏｐｒｏｂｅ）に移した。ウサギ、マウスそしてブタのｗａｐ  ｃＤＮＡを鋳型として用い、変性ｗａｐ１／ｗａｐ４プライマーでＰＣＲ増幅を行うことにより、マウス、ウサギそしてブタの特異的なプローブを得た。その三つのプローブをランダムプライマー法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）を使って同時に標識した。６５℃で一晩、ハイブリダイゼーションを行い、その後、前述したようにオートラジオグラフィーを行った（Ｐｕｉｓｓａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。
【００５４】
結果：
ＷＡＰタンパク質をまず、齧歯類の乳、その後、ウサギ目、ラクダそしてブタの乳から単離した。様々な種の乳清中のＷＡＰタンパク質の量は異なる。実際、    では濃度が１から５ｇ／ｌであった（ＭｃＫｅｎｚｉｅａｎｄ  Ｌａｒｓｏｎ，１９７８；Ｐｉｌｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１；Ｈｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）のに対してウサギでは１５ｇ／ｌであった（Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。しかも、マウスのｗａｐ  ｍＲＮＡレベルは処女の状態と授乳期中期とでは数千倍も増大するものであるから、内因性のＷＡＰの生成は、乳腺の生理学的な状態に依存するものである（Ｐｉｔｔｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８ａ；Ｐｉｔｔｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８ｂ）。
【００５５】
ブタｗａｐ遺伝子を包囲するＢＡＣクローンのシス制御エレメントを用いることが有益なものとなりうるかどうかを知るためには、ブタｗａｐ遺伝子の発現レベルがウサギやマウスのｗａｐ遺伝子の発現レベルと比較しうるものかどうか判断する必要があった。授乳期五日目のブタ、授乳期三日目のマウスそして授乳期三日目のウサギの全乳腺ＲＮＡを抽出し、電気泳動により分離した。できるだけ同じようなプローブを得るために、既にブタｗａｐ  ｃＤＮＡのクローニングに使用し、ウサギ、マウスそしてラットのｗａｐ  ｃＤＮＡの保存に照らして設計したものと同じプライマーを用いて、乳腺ＲＮＡからのＲＴ産物で三回のＰＣＲ増幅を行った。その三つのＰＣＲ産物を精製し、つぎにランダムプライマー法により同時に３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識し、それにより、できるだけ似通った特異的な活性を得た。ノーザンブロットを同時に行った。
【００５６】
三十分間だけオートラジオグラフィーを行うとシグナルが現れるため、マウス、ウサギそしてブタの乳腺で、ｗａｐ  ｍＲＮＡは容易に検出できた（それぞれ図２Ａ、図２Ｃそして図２Ｂ）。ブタのｗａｐ  ｃＤＮＡプローブが部分的にウサギｗａｐ  ｍＲＮＡとクロスハイブリダイズしていたことを除けば、強い種特異的なシグナルがあることが各プローブにより示された（図２Ｂ）。
紫外線／エチジウムブロマイド写真（図２Ｄ）ではＲＮＡのロードが等しいことが見てとれる。そこで、本発明者等は、ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒでシグナルを定量することにより、様々なｗａｐ遺伝子のｍＲＮＡレベルを比較することができる。本発明者等が見たところ、ブタｗａｐ  ｍＲＮＡでのハイブリダイゼーションシグナルは、マウスｗａｐ  ｍＲＮＡ及びウサギｗａｐ  ｍＲＮＡで観察したものよりもそれぞれ５から８倍及び６から８倍低かった。
【００５７】
実施例３：ＨＣ１１細胞におけるブタｗａｐ遺伝子発現
材料と方法
マウスの乳腺上皮細胞系統ＨＣ１１を、既知のように（Ｂａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）、ＲＰＭＩ１６４０（Ｅｕｒｏｂｉｏ）、１０％の熱不活化されたウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｓｉｇｍａ）、インシュリン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）５μｇ／ｍｌそしてＥＧＦ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１０ｎｇ／ｍｌを含む増殖培地で培養した。メーカーの推奨により、直径６ｃｍの皿一枚につき、プラスミドまたはＢＡＣ  ＤＮＡ５μｇ及び選択プラスミドｐＲＳＶｎｅｏ０．５μｇとで、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）による細胞のトランスフェクションを５０％のコンフルエントで行った。トランスフェクションした細胞を、増殖培地の中に１５０μｇ／ｍｌのジェネティシンを加えて選択した。クローンプール（トランスフェクトするごとに少なくとも５０から１００個のクローン）を、コンフルエントで培養した。コンフルエントまで達した後、更に４日間、増殖培地で細胞の培養を行い、その後、ＦＢＳとＥＧＦは除いたがトランスフェリンと非必須アミノ酸を補った増殖培地（ＧＣ３様培地）に一日置いた。結局、ＧＣ３様培地に泌乳刺激ホルモン：インシュリン（５μｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（１０−６Ｍ）そしてプロラクチン（１μｇ／ｍｌ）を加えることにより、次の二日間に、乳タンパク質遺伝子発現が誘発された。
【００５８】
メーカーの推奨に従って、ＲＮＡｘｅｌ法（Ｅｕｒｏｂｉｏ）により、全ＲＮＡを調製した。ＡＭＶ逆転写酵素（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｙｓ  Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡのＲＴ−ＰＣＲ分析用第一鎖ｃＤＮＡ合成キット）によるＲＴ−ＰＣＲ分析を、１μｇの全ＲＮＡ、オリゴ（ｄＴ）プライマー、及び既知の（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）ｗａｐプライマーとマウスＧＡＰＤＨを組み合わせたものを用いて行った。
組み込んだコピーの数をサザンブロットで評価した。１０μｇのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで４時間消化して、１×ＴＢＥの中の１％アガロースゲルで分画し、つぎにＢｉｏｈｙｌｏｎ−Ｚ＋膜（Ｂｉｏｐｒｏｂｅ）にブロットした。標識したＷＡＰｐＥｃｏＲＩ  ２．４ｋｂプローブでハイブリダイゼーションを行った。
【００５９】
結果
ＨＣ１１細胞系統は、妊娠中期のマウスの乳腺から単離された、自然発生的に不死となったＣＯＭＭＡ  １Ｄ細胞から分化誘導される（Ｂａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。この細胞系統においては、乳タンパク質遺伝子は泌乳刺激ホルモン（インシュリン、ヒドロコルチゾンそしてプロラクチン）それに細胞間の相互作用に対して敏感である。更にその上、トランスフェクトしたラットのβ−ｃａｓｅｉｎ−ｃａｔ遺伝子発現は、既知の（Ｄｏｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）誘発の最適条件の下で相当に増強された。もっと多くの制御エレメントを含むブタｗａｐ遺伝子の大きなゲノム断片を用いれば、小さな断片を使うよりも更に高度で良好な発現が可能になるのかどうかを確かめるために、１ｋｂだけのプロモーター領域と共働するブタｗａｐ遺伝子（ｐＷＡＰｐＸｈｏＩ）またはブタｗａｐ遺伝子の上流７０ｋｂ及び下流５０ｋｂと共働するブタｗａｐ遺伝子（ＢＡＣ９０５Ｆ９）との発現レベルの比較を行った。これら二つのゲノム断片を、ＨＣ１１細胞系統に、選択プラスミド、ｐＲＳＶｎｅｏで、それぞれ別々に、トランスフェクトした。５０から１００クローンのプールをジェネティシン選択により単離した。プールは、完全培地で四日間、コンフルエントの状態で維持し、更にもう一日、血清とＥＧＦを除いた培地の中においた。つぎに、インシュリン、デキサメタゾンとプロラクチンで更に二日間、誘発を行った。各プールでの発現レベルをＲＴ−ＰＣＲで評価した（図３）。
【００６０】
トランスフェクションを行っていないＨＣ１１細胞では何のシグナルも得られなかったので、ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーはブタｗａｐ  ｃＤＮＡに特異的なものであった。紫外線／エチジウムブロマイド写真で見たところ、ｐＷＡＰｐＸｈｏＩプール細胞よりもＢＡＣ９０５Ｆ９プール細胞からのＲＮＡで大量のＲＴ−ＰＣＲ産物が得られた（図３Ａ）。これらのＲＴ−ＰＣＲ産物をナイロン膜に移して、ブタｗａｐ  ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズした。ＲＴ−ＰＣＲ増幅を正規化するために、内因性マウスＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡを既知の（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）特異的プライマーにより同じＲＴサンプルから増幅した（図３Ｃ）。Ｐｈｏｓｐｏｒｉｍａｇｅｒ（登録商標）による放射性シグナルの定量（図３Ｂ）によって明らかになったところによると、ブタｗａｐ遺伝子の発現は、ｐＷＡＰｘｈｏＩプラスミドでトランスフェクトした細胞におけるよりも、ＢＡＣ９０５Ｆ９クローンでトランスフェクトした細胞における方が三倍高く発生した。サザンブロット分析（図３Ｄ）によって明らかになったところでは、ＢＡＣ９０５Ｆ９クローンでトランスフェクトした細胞の場合にはｗａｐ遺伝子のコピー２８個がＨＣ１１細胞系統ゲノムに組み込まれたのに対して、ｐＷＡＰｘｈｏＩトランスフェクションの場合にはコピーは１４０個であった。そういうわけで、ＢＡＣクローンを用いれば、それよりも小さなゲノム断片に比べて、ｗａｐ遺伝子コピー当たりの発現が十五倍も高めることができる。
【００６１】
実施例４：授乳期のトランスジェニックマウスの乳腺での発現レベル
材料と方法
マイクロインジェクション及びトランスジェニック動物を識別するためのブタｗａｐ遺伝子ＢＡＣインサートの単離
ブタｗａｐ遺伝子ＢＡＣクローンの単離と解析を上記の実施例１で報告した。この研究のため、ＢＡＣ  ３４４Ｈ５クローンを選んだ。Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  ｋｉｔのＮｕｃｌｅｏｂｏｎｄＡＸ１００カラムで調製したＢＡＣ  ＤＮＡをＮｏｔＩで完全に消化して、受精した卵母細胞のマイクロインジェクションに用いたＤＮＡ断片を二つの異なる技法で調製した。第一の技法は要するに、ＮｏｔＩでＢＡＣを消化したあとに得られるＤＮＡ断片をフェノール・クロロホルム抽出で精製するということである。この画分を受精した卵母細胞に直接、マイクロインジェクションした。第二の技法では、ＮｏｔＩ  ＤＮＡ断片を、１％の低融点アガロースゲルを使って、電場反転ゲル電気泳動により、サイズ分画した。つぎに、ブタｗａｐ遺伝子を含むＢＡＣインサートをＧＥＬａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）で単離し、既知のように（Ｓｃｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）透析した。精製されたＤＮＡの濃度は１％アガロースミニゲルで評価した。このＢＡＣ断片を１から５ｎｇ／μｌに希釈して、Ｃ５７Ｂ１６  ＸＣＢＡの受精した卵母細胞の前核にマイクロインジェクションした。既知のように（Ａｔｔａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）尾から抽出したゲノムＤＮＡでＰＣＲ分析を行い、それにより、トランスジェニックマウスを識別した。二つの特異的プライマーセットを用いた。増幅を３０回繰り返して、ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで検出した。
【００６２】
サザンブロット分析による、トランスジェニックマウスにおける導入遺伝子コピー数の評価
各系統における導入遺伝子のコピー数の評価をするために既知のように（Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）プロテイナーゼＫ（Ｒｏｃｈｅ）で消化した後に尾からゲノムＤＮＡを抽出した。トランスジェニックのマウスとブタから採取したゲノムＤＮＡ（５μｇ）を、ＥｃｏＲＩ制限酵素で完全に消化し、１％アガロースゲルで一晩、サイズ分画した。ＤＮＡを断片化したものをナイロン膜に移した（ＮｙｔｒａｎＮ，  Ｓｃｈｌｅｉｈｅｒ  ｅｔ  ｓｈｕｅｌｌ）。図１Ａに示すように、ブロットをした標識ＷＡＰｐＥｃｏＲＩ  ２．４ｋｂプローブとハイブリダイズした。メーカーのガイドラインに従って、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  ｉｍａｇｅ−ｍａｓｔｅｒ  ＤＴＳスキャニングシステムを使って、オートラジオグラフィーにより、シグナルの定量を行った。ブタＤＮＡとのハイブリダイゼーションから派生したシグナルが二つのコピーの参照に用いられる。
【００６３】
導入遺伝子の発現
メーカーの推奨に従って、ＳＶ全ＲＮＡ分離システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）により、ＲＮＡの調製を行った。サンプルごとに１０μｇの全ＲＮＡを使ってノーザンブロット分析を行い、ホルムアルデヒド／アガロースゲルでサイズ分画を行った（Ｐｕｉｓｓａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。断片化したＲＮＡをＢｉｏｈｙｌｏｎ−Ｚ＋膜（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）に移して、適切に標識したプローブとハイブリダイズした。１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブ（Ｒａｙｎａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）で得られたハイブリダイゼーションシグナルをサンプル間のＲＮＡロードを正規化するための内部標準として用いた。ネズミのｗａｐｍＲＮＡシグナルは個体間の内因性遺伝子転写の違いを評価する上での内部標準として役立った。
乳または乳清タンパク質を９０Ｖで二時間、１６％ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルで分画した。タンパク質をクマシーブリリアントブルーＲ染色により、見えるようにした。
【００６４】
結果
トランスジェニックマウスの発生
ブタｗａｐ遺伝子を含む五つのＢＡＣクローンを以上に説明した。ｐＢｅｌｏＢａｃ１１ベクターを構成した場合には、ＮｏｔＩ制限部位をそのポリリンカーに導入し、それにより、原核生物ＤＮＡベクターからゲノム断片を分離するのは容易であった。残念ながら、その五つのブタｗａｐ遺伝子ＢＡＣクローンの中には、それらのインサートの中にＮｏｔＩ制限酵素部位が含まれており、その位置は、ブタｗａｐ遺伝子のポリアデニル化シグナル部位の僅かに５ｋｂ後である。それゆえ、ｗａｐ遺伝子の下流の長い領域を用いるのは困難と思われた。本発明者等が選んだのは、ブタｗａｐ遺伝子の上流の最も長い領域（キャップ部位からおよそ１４５ｋｂ）を含むＢＡＣ３４４Ｈ５クローンでトランスジェニックマウスを発生させることであった。
【００６５】
ＢＡＣクローンからＤＮＡ断片を抽出する様々な技法で、受精した卵母細胞にマイクロインジェクションを行うのに役立つものについて、説明を行ってきた。Ｃｈｒａｓｔ  ａｎｄ  ｃｏｌｌａｒｏｒａｔｏｒｓ（１９９９）は、１％の低融点アガロースゲルからＤＮＡを抽出する三つの方法をテストした。第一の方法は要するに、アガロースをアガラーゼで消化し、Ｑｉａｇｅｎのｔｉｐ１００カラムでＤＮＡを精製するというものである。第二の方法ではＱｉａｇｅｎカラムの代わりに、フェノール・クロロホルム精製とエタノール沈殿を用いる。第三の方法で用いるのは、アガロースからエレクトロエリューションを行うことである。エレクトロエリューションがＤＮＡの収量と完全性で最も優れていることが明らかになった。ＢＡＣ３４４Ｈ５クローンからＮｏｔＩ断片を調製するために、これら三つの技法をテストした。どの方法によっても、マイクロインジェクションに使えるようなＤＮＡ断片は得られなかった。これゆえに、本発明者等が選んだのは、二つの技法を用いて約１５０ｋｂのインサートを精製することであった。消化されたＤＮＡを精製できるのは従来のフェノール・クロロホルム抽出だけだったので、第一の方法では、他の二つの方法で得た有益なインサートを精製することにはならなかった。第二の技法は、１％低融点アガロースゲルとパルスフィールド電気泳動でサイズ分画することにより他の二つの方法で得たｗａｐ遺伝子インサートを分離することに他ならなかった。ＧＥＬａｓｅ消化によりアガロースからＤＮＡを精製したあと透析を行った。これら二つの調製物をマウスの卵にマイクロインジェクションしてトランスジェニック動物を作成した。
【００６６】
二頭のトランスジェニックマウス（系統１６と１７）を、フェノール・クロロホルムで精製したＤＮＡで得た２１頭の新生マウスからのゲノムＤＮＡを用いて、ＰＣＲ分析で識別した。ＧＥＬａｓｅ酵素を用いる方法で調製したＤＮＡで３３頭のマウスが生まれ、その内の六頭（系統２４、２６、２８、２９、３０及び１０７）がトランスジェニックマウスだった。トランスジェニックマウスの割合はどちらかのＤＮＡ調製と極めて似通っていた。個体ＢＡＣ１７はその導入遺伝子を自分の子孫に伝えることができなかった。それでもなお、この系統ではサザンブロットにより、組み込まれたコピーが３つ検出された。個体ＢＡＣ２６は生殖する前に死亡し、外来ＤＮＡはサザンブロットで検出できなかった。他の始祖動物は全て導入遺伝子を自分の子孫に伝え、第一世代の個体は導入遺伝子発現について研究対象とした。
組み込みをしたコピーの数を、系統ごとに二または三頭のマウスからの、ＥｃｏＲＩで消化したゲノムＤＮＡを用いてサザン分析で評価した。ハイブリダイゼーションに用いたプローブはブタｗａｐ遺伝子の２．４ｋｂのＥｃｏＲＩ断片であった（図１Ａ）。系統１６には導入遺伝子のコピー２６個が保持され、系統２４、２９、３０にはコピーが１個、系統１０７には２個、そして系統２８にはコピーが３個保持された。
【００６７】
導入遺伝子の特異性
各系統のトランスジェニックマウスの様々な組織のＲＮＡを用いたノーザンブロット分析によって明らかになったところでは、トランスジェニックマウスの系統全てにおいて授乳期の乳腺にブタｗａｐ遺伝子が十分に発現した（図４）。そういうわけで、短いゲノムＤＮＡ断片を含む遺伝子構成でしばしば観察されるような導入遺伝子の消失は、ブタｗａｐ遺伝子を含むＢＡＣベクターによって防止された。その六つの系統全てを研究したところでは、ブタｗａｐ  ｍＲＮＡは授乳期の個体の乳腺においてのみ検出された。他の組織（肝臓、心臓、腎臓、十二指腸、脳、唾液腺または胃）も検査したが、異所性発現は見られなかった。ノーザンブロットごとに、マウスｗａｐ  ｃＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションを行った。ブタｗａｐ遺伝子の発現パターンを内因性ｗａｐ遺伝子発現と比較した。マウスゲノムに無作ために組み込みを行ったＢＡＣ３４４Ｈ５クローンからのブタｗａｐ遺伝子の発現は、マウスの内因性ｗａｐ遺伝子と同じくらい特異的に乳腺内に発現した。
【００６８】
授乳期のトランスジェニックマウスの乳腺内での発現レベル
授乳期のトランスジェニック動物の乳腺内での導入遺伝子発現レベルを評価し、それを内因性ブタｗａｐ遺伝子の発現と比較するために、授乳期の非トランスジェニックマウス、授乳期のトランスジェニックマウス、そして授乳期のブタの、乳腺からの全ＲＮＡをノーザン法で分析した（図５）。マウスとブタからの全ＲＮＡロード（１、５または１０μｇ）を基準にして特異的ｍＲＮＡのレベルの評価を更に容易に行うことができた。ブタｗａｐ  ｃＤＮＡプローブとの最初のハイブリダイゼーションを行ったところでは、授乳期１０日目の非トランスジェニックマウスの乳腺からのＲＮＡでは何のシグナルも検出されなかったので、内因性マウスｗａｐ  ｍＲＮＡとのクロスハイブリダイゼーションは起きなかったことが明らかになった。系統ごとに二または三頭のトランスジェニック個体から得られたデータにより明らかになったところでは、発現レベルは系統ごとに全く異なっていた。系統１６では導入遺伝子が十分に発現したが、他の五つでは発現レベルは似通っていた。系統２９の一頭の処女雌もノーザンブロットでテストした。このマウスの乳腺にはブタｗａｐ  ｍＲＮＡは全く見られなかった。マウスｃＤＮＡプローブで第二のハイブリダイゼーションを行って測定した内因性ネズミｗａｐ  ｍＲＮＡについても、それは同様であった。それゆえ、発現は授乳期にあるマウスに特異的なものであった。
【００６９】
マウスｗａｐ  ｃＤＮＡプローブを内因性乳タンパク質遺伝子の発現レベルを評価する上での内部標準として用いた。処女の個体を除いて、全ての個体に比較に値するマウスｗａｐ  ｍＲＮＡ濃度が見られた（図５）。１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブをゲルへのＲＮＡロードを評価する上での内部標準として用いた。トランスジェニックマウスの中でのブタｗａｐ遺伝子の発現レベルを、授乳期９日目のブタの内因性ｗａｐ遺伝子のそれと比較した。ブタｗａｐ  ｃＤＮＡプローブハイブリダイゼーションのシグナルと１８Ｓ  ｒＲＮＡプローブハイブリダイゼーションのシグナルとの間の比率を計算した。ブタの乳腺からの比率を任意に１と定め、他はそれを基準にすることにした。その結果を表１にまとめた。系統１６だけが、ブタｗａｐ  ｍＲＮＡについて授乳期９日目のブタよりも高い値を示した。系統２８のテストした三頭の個体のうち二頭のブタｗａｐ  ｍＲＮＡ濃度が、ブタで観察されたものと似通っていた。他の個体では見られる発現レベルはもっと低かった。系統２８と１０７は別として、同じ系統でも個体間で僅かに発現レベルに違いがあった。実際、系統２８の３頭のマウスを研究したが、その内の一頭ではｗａｐ遺伝子の発現が他の二頭のマウスよりも９倍低かった。系統１０７では、ＢＡＣ１８３と名付けた個体で、個体ＢＡＣ１８１よりも四倍低いシグナルが見られた。いずれにしても、内因性ネズミｗａｐ遺伝子の発現レベルに違いは見られなかった。
【００７０】
表１：授乳期にあるトランスジェニックマウスの乳腺の中のｗａｐ遺伝子発現レベル。
発現とは、トランスジェニックマウスにおけるブタｗａｐ  ｍＲＮＡ濃度と授乳期のブタにおけるブタｗａｐ  ｍＲＮＡ濃度との間の比率である。各系統の二または三頭のトランスジェニック個体にサザンブロット分析を行い、そこからコピー数を評価した。ブタゲノムＤＮＡは２つのコピーの基準として役に立った。
【００７１】
【表１】
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【００７２】
発現レベルは、トランスジェニックマウスにおける二つの組み込まれたコピーの数に関しては、天然のゲノム環境におけるブタｗａｐ遺伝子の発現レベルと全く似通っているように見えた。前述した二つの個体（Ｂａｃ１２３とＢａｃ１８３）は別として、ブタｗａｐ遺伝子の発現に関係する２つの組み込みを行ったコピーごとの発現レベルの違いは、各個体間で１から３倍以下であった。それゆえ導入遺伝子の発現は本質的に組み込まれたコピーの数と相関関係があった。
【００７３】
ＲＮＡ分析をより確実にするために、マウスの乳のタンパク質で変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。抗ブタＷＡＰ特異的抗体は全く入手できなかったので、クマシーブリリアントブルーＲ染色を用いて、各タンパク質がマウスの乳中に存在するか否かを明らかにした（図６）。ブタｗａｐタンパク質が示されたのは、個体Ｂａｃ１６の乳または乳清の中だけだった。同様の条件で、内因性ＷＡＰタンパク質がブタの乳中には検出されなかったのは、興味深く、注目に値する。
【００７４】
実施例５：ブタにおけるＷＡＰ遺伝子座を更に解析する
ブタのＷＡＰ遺伝子座のシークエンシングを行った。本発明の配列は以下のように、
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２（アセンブル１９）、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３（アセンブル１７）、
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４（アセンブル２０）、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５（アセンブル１２）、
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６（アセンブル１８）、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７（アセンブル２１）そしてＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８（アセンブル１６）（図７及び８参照）と記述される。
それゆえ、遺伝子座の完全な配列はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２からＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８までの連続である。ヒトＲＡＭＰ３と強い相同性を有し、カルシトニン様受容体の輸送タンパク質をコードする遺伝子が、このＷＡＰ遺伝子座に見られた。
更に、約８０Ｋｂの長さのＢＡＣ９０５Ｆ９のＮｏｔＩ断片と約３０Ｋｂの長さのＢＡＣ３４４Ｈ５のＡｓｃＩ−ＮｏｔＩ断片とを含むトランスジェニックマウスが得られた。本発明者等が観察したところでは、８０Ｋｂの断片を用いれば、授乳期にあるトランスジェニックマウスの乳腺に導入遺伝子を高い率で特異的に発現させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＷＡＰｐＸｈｏＩインサートの地図の一部（Ａ）と、ブタＷＡＰ遺伝子を含む二つの更に有益なＢＡＣクローン上での酵素の分布の一部（Ｂ）を示した図。
【図２】授乳期のブタ、ウサギそしてマウスの乳腺におけるｗａｐ遺伝子転写を示した図。
【図３】マウスの上皮細胞系統（ＨＣ１１）のブタｗａｐ遺伝子発現を示した図。
【図４】ブタｗａｐ導入遺伝子の組織特異的発現を示した図。
【図５】授乳期１０−１２日目のトランスジェニックマウスの乳腺と授乳期９日目のブタの乳腺におけるブタｗａｐｍＲＮＡレベルを示した図。
【図６】授乳期１０−１２日目のトランスジェニックマウス及び授乳期９日目のブタの乳及び乳清におけるブタＷＡＰタンパク質濃度を示した図。
【図７】ブタのＷＡＰ遺伝子座を示した図。
【図８】ブタのＷＡＰ遺伝子座を示した図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004516836.tif 000096
2004516836.tif 000097
【国際調査報告】
2004516836.tif 000098
2004516836.tif 000099
2004516836.tif 000100
2004516836.tif 000101
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