(57)【要約】病原性プリオンタンパク質を濃縮および検出ならびに定量するための方法およびツール、ならびにプリオン病の検出および／または予防もしくは治療において用いられる物質が開示される。この物質は、血清および血漿中に見出されるプリオン結合活性を有する因子である。
2004501626.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰｒＰＳｃと選択的に相互作用するが、ＰｒＰＣと相互作用しない因子。
【請求項２】
プラスミノゲン、プラスミノゲン断片、およびその誘導体から選択される、請求項１記載の因子。
【請求項３】
ＰｒＰＳｃのカルボキシル末端と相互作用することを特徴とする、請求項１または２記載の因子。
【請求項４】
異なる種のＰｒＰＳｃと相互作用可能であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の因子。
【請求項５】
ＰｒＰＳｃおよび請求項１〜４のいずれか一項に記載の因子を含む組成物。
【請求項６】
ＰｒＰＳｃが因子に結合している、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
ＰｒＰＳｃが因子に非共有結合している、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の因子および／または請求項５〜７のいずれか一項に記載の組成物を含む担体。
【請求項９】
磁気ビーズ、フィルター細片、マイクロタイタープレート、非磁気ビーズ、プラズモン表面共鳴プレート、マイクロアレイプレート、固体への相転移を受ける液体担体、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項８記載の担体。
【請求項１０】
請求項５〜７のいずれか一項に記載の組成物と特異的に相互作用するリガンド。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の因子、ならびに／または請求項５〜７のいずれか一項に記載の組成物、ならびに／または請求項８もしくは９に記載の担体、ならびに／または請求項１０記載のリガンドを含み、任意で、緩衝液、検出用試薬、および作業説明書のようなさらなる構成要素を含む、診断キット。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の因子および／または請求項１０記載のリガンドを含む、薬学的組成物。
【請求項１３】
試料と、請求項１〜４のいずれか一項に記載の因子、および／または請求項８もしくは９記載の担体、および／または請求項１０記載のリガンドとを接触させることを特徴とする、試料中のＰｒＰＳｃを検出する方法。
【請求項１４】
以下の段階を含む、生物学的材料からＰｒＰＳｃを除去する方法：
該材料と、請求項１〜４のいずれか一項に記載の因子、および／または請求項８もしくは９に記載の担体、および／または請求項１０記載のリガンドとを接触させる段階。
【請求項１５】
試験しようとする生物の材料と、請求項１〜４のいずれか一項に記載の因子、および／または請求項８もしくは９に記載の担体、および／または請求項１０記載のリガンドとを接触させることを特徴とする、ヒト伝達性海綿状脳症および動物のプリオン脳症を診断する方法。
【請求項１６】
ヒト伝達性海綿状脳症または動物のプリオン脳症を診断するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の因子、および／または請求項５〜７のいずれか一項に記載の組成物、および／または請求項８もしくは９に記載の担体、および／または請求項１０記載のリガンドの使用。
【請求項１７】
生物学的材料からＰｒＰＳｃを除去するための、および／または生物学的材料中のＰｒＰｃを不活化するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の因子、および／または請求項５〜７のいずれか一項に記載の組成物、および／または請求項８もしくは９に記載の担体、および／または請求項１０記載のリガンドの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、伝達性海綿状脳症を検出するための方法および因子ならびに個々の感染を予防および治療するための因子に関する。
【０００２】
背景技術
入手可能な全ての証拠によると、プリオンと呼ばれる伝達性海綿状脳症を引き起こす因子は情報である核酸を欠き、正常な宿主タンパク質（ＰｒＰＣと呼ばれる）をそれに似たものに変換することができる「感染」タンパク質（ＰｒＰＳｃと呼ばれる）を含む。プリオン感染の結果として組織病理学的損傷およびその臨床後遺症が証明される唯一の器官系が神経系である（ブランダー（Ｂｒａｎｄｅｒ）ら，１９９６）。この考えは、ヒト伝達性海綿状脳症（例えば、クロイツフェルト−ヤコブ病、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー症候群、クールー、および致死性家族性不眠症）と動物の全ての既知のプリオン脳症の両方に当てはまる（ウェバー（Ｗｅｂｅｒ）およびアグジ（Ａｇｕｚｚｉ），１９９７）。後者は、ヒツジのスクレイピー、ウシ海綿状脳症、ならびにラバ、シカ、および外来有蹄類の慢性消耗病を含む（ウェイスマン（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ）およびアグジ，１９９７）。
【０００３】
しかしながら、伝達性海綿状脳症を引き起こす感染因子として、このように作戦的に特定されたプリオンが中枢神経系および末梢神経系以外の器官に集落形成することができ、脳外区画において証明することができることは間違いない（アグジら，１９９７）。器官系が感染力を有する問題は、複数のプリオン株の存在によってさらに複雑になる。従来のウイルスの株と同様に、プリオンには様々な異なる特色があり、これらのそれぞれには感染宿主域に関して特定の好みがあり、プリオンが複製する細胞タイプに関しても特定の好みがある（アグジ，１９９８）。血液安全性の問題に直接関連する矛盾した状況の１つが、ウシおよびヒトのＢＳＥ因子の根本的に異なる臓器親和性によって例示される。ＢＳＥプリオンは大部分が経口暴露後でさえもウシの神経区画に限定されるように見られる（ウェルズ（Ｗｅｌｌｓ）ら，１９９８）。感染した脳１００グラムを与えた時のウシにおける実験ＢＳＥの病理発生の非常に正確な研究によって、感染力を回腸末端部において証明できる期間は短くかつ一時的であることが明らかになっている（ウェルズら，１９９８）。もっと後の時点では、ＢＳＥプリオンは、脳、脊髄、および後根神経節だけにしか示されない。回腸末端部におけるＢＳＥのはっきりした局在は知られていない。感染力がパイエル板に、または粘膜下神経叢および筋層間神経叢を含む神経区画に存在するかどうかが議論されている。ＢＳＥプリオンが、新変異型クロイツフェルト−ヤコブ病（ｎｖＣＪＤ）を引き起こすことができるという多くの状況証拠があるが（ブルース（Ｂｒｕｃｅ）ら，１９９７；チャゾト（Ｃｈａｚｏｔ）ら，１９９６；ヒル（Ｈｉｌｌ）ら，１９９７；ウィル（Ｗｉｌｌ）ら，１９９６）、完全に最終的な証拠は得られていない。以下の議論のために、本発明者らは、ＢＳＥおよび新変異型クロイツフェルト−ヤコブ病が同じ因子によって引き起こされる証拠を十分に実証されているものとみなす（アグジおよびウェイスマン（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ），１９９６）。ｎｖＣＪＤを発現させるためにヒトに継代し、連続的に進行させると、プリオンは臓器親和性の劇的な変化を経験する。プリオンは、主として神経構造に限定されたままにならず、最も顕著には扁桃腺、脾臓、最近証明されたように虫垂を含む、免疫系に属する多くの器官において検出することができる（ヒルトン（Ｈｉｌｔｏｎ）ら，１９９８）。従って、様々な構造に対する感染因子の親和性が、問題になっているプリオン株と（従って、ある程度、そのキャリアとは独立している）、プリオン病それ自体が発現する種の両方によって決まると結論を下すことは避けられない（アグジおよびワイズマン（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ），１９９８）。
【０００４】
これらの考えは学問的な関心事であるだけではない。実際に、医師による操作（すなわち、輸血、臓器移植など）による因子の伝播性は、このようなパラメータの影響を決定的に受ける。
【０００５】
ヒトプリオンの水平伝播性：
ヒトのプリオン病は間違いなく伝播性である。しかしながら、伝播は特定の状況でのみ達成される。この点で、プリオン病は、産褥熱についてゼンメルワイス（Ｓｅｍｍｅｌｗｅｉｓｓ）によって述べられた伝播性の特徴を満たしていると言うことができる。すなわち、これらの病気は感染性であるが、接触伝染性でない。クロイツフェルト−ヤコブ病に罹患した患者から他の人間への脳由来材料の直接伝播が疾患伝播をもたらしたことが記録に残っている。特に悲惨な症例が１７世紀初期、チューリヒで起こり、この時、クロイツフェルト−ヤコブ患者からの皮質記録に用いられた電極が（ホルムアルデヒドおよびアルコール）滅菌され、さらなる患者に用いられた。疾患は非常に若いレシピエントに伝播した（ベルノウリ（Ｂｅｒｎｏｕｌｌｉ）ら，１９７７）。また、角膜移植が疾患伝播をもたらしたことはほぼ間違いない（ダフィー（Ｄｕｆｆｙ）ら，１９７４）。
【０００６】
これらの悲惨な局面にもかかわらず、神経外科手術を介したＣＪＤ医原性伝播の症例は相当に稀なままであった。不顕性ＣＪＤの頻度が顕性疾患の頻度よりかなり高くなければならず、プリオンを確実に不活化するように大部分の神経外科機器が滅菌されないことを考えると、このことは完全に理解されていない。従って、医原性伝播の非常に稀な性質は、プリオン毒性に加えて宿主要因が、感染が起こる可能性に影響を及ぼし得ることを示している可能性が高い。この考えは、汚染硬膜伝播の際の医原性ＣＪＤ（ｉＣＪＤ）の疫学によって強められた。数千人の患者（大部分が日本の患者）が、プリオンに感染された死体硬膜製剤を介してＣＪＤ因子に暴露された可能性があると見積もられている。しかしながら、暴露された患者の２％未満がこれまでに発症しているように見られる。感染力の「結果（ｔａｋｅ）」のこの低い効率は喜ばしいが、その一方で、ＣＪＤプリオンに暴露された大部分の被験者が経験した見かけ上の防御についての生物学的な基礎は完全に理解されていない。医原性伝播に関する最も大きな問題は、死体由来の脳下垂体ホルモンの投与の結果として起こった（ギブス（Ｇｉｂｂｓ）ら，１９８５）。ヒトプリオンに汚染された成長ホルモンおよびゴナドトロピンの製剤は、８０人を超えるヒト（大部分が子供）の死を招いた。この因子が（例えば、筋肉内注射を介して）脳外部位に導入された時に予想される長い潜伏期間のために、１０年以上前に止められたこの処置によるさらなる症例が将来現れると想定しなければならない。
【０００７】
この悲惨なヒトでの局面ならびに患者および医師に犠牲を与えた損害の他に、脳下垂体ホルモンの惨事を詳細に理解する必要がある。なぜなら、脳下垂体前葉は中枢神経系の一部でないからである。従って、これらの事象は、プリオン複製の標準的な部位に属さない汚染脳外組織を介したプリオン伝播の代表例として役立つ可能性がある。脳内汚染後の潜伏期間が末梢感染後の潜伏期間よりかなり短いという観察は様々な動物モデルからの実験データとよく一致し、相当に長い脳外事象段階（因子の複製および特定の神経外系の侵入を含み得る）がプリオン神経侵入の前提条件であり得ることを示唆している（アグジ，１９９７）。
【０００８】
プリオンの神経親和性に影響を及ぼす因子：
プリオン感染間の神経侵入工程が非常に厳重に制御されていることを推測するもっともな理由がある。恐らく、これに関する最良の議論は、スクレイピープリオンが腹腔内接種された実験動物の潜伏時間が極端に再現可能であるという観察から出ている。既知量の標準接種物を接種した際の、様々な研究室における経験内容は、接種と最初の臨床症状との間の潜伏期間がおよそ数パーセントポイントの標準偏差を示すことであった（クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら，１９９７）。プリオン神経侵入が完全にランダムな工程であれば、潜伏時間には大きなばらつきが予想され、潜伏時間は偶然によって支配される工程に左右されるであろう。しかしながら、いくつかの律速工程が神経侵入を制御するのであれば、これらは、潜伏時間の著しい正確さの原因である可能性がある。もっとはっきり言ってしまえば、本発明者らはこの解釈が正しいことを強く望んでいる。なぜなら、このような工程が存在すれば、この工程を操作できる可能性があり、その結果として、顕性プリオン病を阻止するための暴露後のストラテジーになる可能性があるからである。実際に、神経侵入を達成する可能性のある様々な機構が探索されてきた。
【０００９】
第一段階すなわち神経侵入は免疫系の広範な集落形成であるように見える。この集落形成は、脾臓、リンパ節、扁桃腺、および虫垂もホモジナイズし、ホモジネートを適切な実験動物に注射することによって視覚化することができる。実験動物の５０％が発病するホモジネートの希釈液が、各接種物にＩＤ５０感染因子を含んでいる。
【００１０】
神経侵入の第二段階は、養子骨髄移入によって交換することができず（ブラットラー（Ｂｌａｔｔｌｅｒ）ら，１９９７）、末梢神経系および／または二次リンパ器官の胚中心に耐性の濾胞性樹状細胞によって示すことができる区画に依存しているように見える。この第２の区画は、神経侵入を支持するために正常プリオンタンパク質の発現を必要とするように思われる（ブラットラー，１９９７）。
【００１１】
神経侵入は機能的な免疫系に依存しており、免疫不全マウスは中用量の因子を接種した後に疾患を発症しない（フラセル（Ｆｒａｓｅｒ）ら，１９９６；キタモト（Ｋｉｔａｍｏｔｏ）ら，１９９１；ラスメザス（Ｌａｓｍｅｚａｓ）ら，１９９６；オロウルケ（Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ）ら，１９９４）。神経侵入に必要な免疫系の重要な一成分を追跡して、終末成熟したＢリンパ球の物理的存在を突き止めた。現在まで、プリオンを物理的に結合し、プリオンを神経侵入部位に運ぶためにＢ細胞が必要とされるかどうか、またはＢ細胞が、神経侵入の促進を間接的に担っている因子を産生するか、もしくは工程を誘導するかどうかは、はっきりしていない（クレイン（Ｋｌｅｉｎ）ら，１９９７）。濾胞性樹状細胞の成熟に必要とされるＢリンパ球分泌リンホトキシンの条件、および実験の状況で濾胞性樹状細胞が多量のスクレイピープリオンを蓄積するということを考えると、前記工程におけるＢリンパ球の主な機能がＦＤＣの成熟にあると推測することは魅力的である。
【００１２】
プリオン神経侵入の細胞的および分子的な基礎：
マウスの末梢部位にプリオンを実験的に接種した後、一般的に、リンパ細網系（ＬＲＳ）内で長期間で臨床的に無症状の感染因子複製段階がある。これは、プリオンによる検出可能な神経侵入およびその後の神経学的症状の出現の前に起こる。この症状発現前の潜伏期間の間、プリオンは、リンパ細網組織内で高力価になるまで複製することができる。末梢リンパ組織内でプリオンが複製する細胞タイプおよびプリオンが中枢神経系（ＣＮＳ）に輸送される方法（これは重要である）を解明することは非常に興味深く、臨床的に重要である。末梢プリオン病理発生における免疫系の役割を意味する多数の証拠にもかかわらず、この工程に関与する細胞の正体に関する研究はほとんどなかった。何年も前に、γ線によるマウスの全身照射がプリオン病理発生またはスクレイピーの潜伏時間に影響を及ぼさないことが明らかになった。これは、プリオン増殖のリンパ細網段階における増殖細胞のかなりの関与に反対する議論と考えられている。実際に、ＰｒＰＳｃがスクレイピーに感染した野生型マウスおよびヌードマウスの濾胞性樹状細胞網において蓄積するので、濾胞性樹状細胞（ＦＤＣ）はリンパ組織内でプリオンが複製するための最も重要な細胞タイプと考えられている（キタモト（Ｋｉｔａｍｏｔｏ）ら，１９９１）。さらに、成熟したＢ細胞およびＴ細胞が無く、機能的ＦＤＣを有するように思われない重症複合免疫不全症マウス（ＳＣＩＤ）は、腹腔内接種後のスクレイピーに対して非常に耐性があり、脾臓においてプリオンを複製しない（フラセルら，１９９６；キタモトら，１９９１；ラスメザス（Ｌａｓｍｅｚａｓ）ら，１９９６；オロウルケ（Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ）ら，１９９４）。興味深いことに、野生型脾細胞を用いたＳＣＩＤマウスの骨髄再構成は、末梢感染後のスクレイピーに対する十分な感受性を回復させる（フラセルら，１９９６；クレインら，１９９８）。これらの発見は、インタクトな、または少なくとも部分的に機能的な免疫系（リンパ球およびＦＤＣを含む）が、末梢感染部位からＣＮＳへのプリオンの効率的な移動に必要とされることを示唆している。
【００１３】
脳内接種または腹腔内接種後のスクレイピー病発症の時間経過は高度に再現可能であり、主として接種物の用量に依存している。従って、末梢リンパ組織から移動するプリオンによる神経侵入は、厳密に制御された律速反応に依存しているのかもしれない。プリオン神経侵入間のこのような律速段階を特定するために、ＰｒＰを過剰発現する脳ニューログラフトを有するＰｒＰＣ欠損マウスを腹腔内（ｉ．ｐ．）感染させた。移植片には疾患は観察されず、これは、神経侵入が脳外部位でのＰｒＰ発現に依存することを示唆している。これは、リンパ組織における感染力を回復させるが、依然としてプリオンを神経系に運ばないＰｒＰＣ発現細胞を用いたリンパ系の再構成によってさらに強められた。
【００１４】
プリオンはリンパ細網組織において検出することができるので、末梢病理発生の理解は、症状発現前症例からの、ことによると汚染された外科用機器からの血液もしくは組織への暴露または血液および血液製剤の暴露を介したヒトＢＳＥの医原性伝播の危険性の評価において非常に重要である。さらに、このような進歩は、感度の高い診断試験およびプリオン神経侵入をブロックするための手段の開発への道を開くかもしれない。プリオンによる血液供給の汚染がなぜ重要な問題であるのか。主な問題は新変異型ＣＪＤである。一つの理由としては、この新しい疾患の疫学および医原性伝播性は、散発性ＣＪＤ（ｓＣＪＤ）と同じくらいに圧倒的に理解されていない。最も心を乱すことには、英国、ことによると他の国における症状発現前疾患の分布がはっきりせず、集められているわずかな情報が楽観から程遠い（ウィル（Ｗｉｌｌ）ら，１９９９）。さらに、ｎｖＣＪＤがその散発性ＣＪＤより「リンパ侵入性」であり得ると考えることは道理に合っている。特に、ｎｖＣＪＤプリオンは扁桃腺および虫垂などのリンパ器官において容易に検出することができる（ヒル（Ｈｉｌｌ）ら，１９９９；ヒルら，１９９７；ヒルトン（Ｈｉｌｔｏｎ）ら，１９９８）。このことは、スクレイピーに当てはまるが（シュレウダー（Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ）ら，１９９７；シュレウダーら，１９９８；バンケウウレン（Ｖａｎｋｅｕｌｅｎ）ら，１９９６）、ｓＣＪＤプリオンには当てはまらないことが以前に証明された。入手可能な全ての証拠が、リンパ器官におけるプリオン貯蔵庫として濾胞性樹状細胞を指摘しているが、実験的に接種されたマウスの脾臓リンパ球はプリオンに感染することができる（ラエバー（Ｒａｅｂｅｒ）ら，１９９９）。循環リンパ球のプリオン感染力は、脾臓リンパ球において検出されるものより少なくとも２対数少ないように見えるが（ラエバー（Ｒａｅｂｅｒ）ら，１９９９）、循環リンパ球がその脾臓同胞と平衡状態にあり得る可能性は警告措置（ｃａｕｔｉｏｎａｒｙ ｍｅａｓｕｒｅ）を要する。後者は、依然として論争および議論を呼ぶところである。すなわち、白血球除去が主張されているが、現在、その効力について確実なものはなく、白血球除去に現在利用可能な技術が、ｎｖＣＪＤから得た血液供給への脅威を少なくするのに必要および／または十分であるかどうかでさえ確実なものはない。さらに、血液プリオン感染力がインビボでリンパ球に元々含まれていたとしても、細胞溶解が、適切な除去手段の非存在下、安定な血液製剤の非存在下で非粒状画分の汚染につながる可能性があることを考慮に入れなければならない。
【００１５】
第二の考えが二次予防に適用される。ヒトの食物連鎖に入った非常に多くの感染性ＢＳＥ材料を考えると、多くの個体が症状発現前ｎｖＣＪＤにかかっている可能性がある。この因子の蔓延を制限するのを助け、願わくば、これらの人間における症状の臨床的大発生を予防するためのストラテジーを開発することは絶対必要であり、急を要する。神経侵入を妨げるための可能性のある標的は、感染個体内でのプリオン複製を制御する律速工程である。前記の知識を考えると、プリオン複製および神経侵入の神経−免疫境界面を標的とした治療（アグジおよびコリンゲ（Ｃｏｌｌｉｎｇｅ），１９９７）は、暴露後予防を対象とした研究の将来有望な分野のように思われる。
【００１６】
プリオンを検出するための方法およびその限界：
リアルタイムキネティックポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の時代、本発明者らが血液中のウイルス汚染物質の検出に適合されたアッセイ法から必要とした検出閾値には役立たなかった。ＨＩＶの場合を考える。ここで、定量的ＰＣＲ技術の導入は、血液および血液製剤における検出限界を、ある程度完全なものに押し下げた。ＰＣＲ技法が有用であると判明しなかった、またはこのような幅広い支持をまだ受けていなかった時でさえ、時間分解蛍光ＥＬＩＳＡなどの超高感度免疫化学法が、ほとんどのスクリーニング用途に非常に申し分のない洗練された程度まで進歩していた。そうすると、なぜ、依然として血液中のプリオン検出に関して問題があるのか。
【００１７】
最も手に余る問題は、プリオンの独特の生物学的性質から生じている。ある程度一般に認められている知識によれば、感染性プリオンは、正常細胞タンパク質ＰｒＰＣと正確に同じアミノ酸構造を有するＰｒＰＳｃタンパク質のみからなっている可能性が高い。このことを言葉で表現する当たり障りのない方法は、ＰｒＰＳｃがプリオン感染力の唯一知られている代用マーカーであると述べることである。この後者の言い方は、タンパク質のみ（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｏｎｌｙ）仮説の支持者と感染因子がウイルスであると依然として考えている人の両方が賛成する可能性が高い。
【００１８】
プリオン検出について前記で述べられた事実の結果は明らかである。プリオンに特異的な核酸が存在しない場合、その核酸を検出するための、どのＰＣＲに基づくスクリーニングアッセイ法も選択肢でない。従って、免疫化学的アッセイ法が残った。これらはまた、ＰＣＲより数桁感度が低い上に、一連のプリオンに特有の問題をはらんでいる。最大の問題は、ＴＳＥ因子の独特の生物学的性質から再度生じている。前記で説明したように、ＰｒＰＳｃはＰｒＰＣと同じ化学組成を有し、後者は、健常個体の多くの細胞タイプ（白血球を含む）において通常見出される膜結合タンパク質である（アグジおよびワイスマン（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ），１９９７）。ＰｒＰＣおよびＰｒＰＳｃは多くの物理的性質の点で異なるが、これらの２つのアイソフォームを確実に区別する免疫学的試薬を開発することは非常に難しいように見える。ＰｒＰＳｃと反応するが、ＰｒＰＣとは反応しないモノクローナル抗体は１つしか述べられておらず、その発表の１４ヵ月後、追跡調査が現れておらず、この試薬を初めて開発した会社でさえＢＳＥプリオンに対する会社内でのスクリーニングアッセイ法に使用したように見えないので、その実際の有用性は依然として証明されていない。
【００１９】
今までで最良のプリオン検出法は、プロテイナーゼＫ（ＰＫ）を用いて消化されたホモジネート脳組織を用いてウエスタンブロット分析を行うことによる方法である。ウエスタンブロット分析のために、細胞プリオン（ＰｒＰＣ）と病原性プリオン（ＰｒＰＳｃ）との差がこれ以上見出されないように二次構造を破壊するので、消化は必要である。しかしながら、ＰｒＰＣは、特定の条件下でのＰＫによって容易に消化されるのに対して、ＰｒＰＳｃは、ＰｒＰ２７−３０と呼ばれる比較的大きな断片にしか分解されない。
【００２０】
タンパク質をいわゆる磁気ビーズ（ＭＢ）（これには特異的抗体が結合している）に吸着させることによって、タンパク質を濃縮することも既に知られている。しかしながら、このような濃縮方法をＰｒＰに適用することは、プリオンの特殊な性質のために不可能であると考えられていた。
【００２１】
従って、疾患を診断するだけではなく、さらに研究もするために、少量のＰｒＰＳｃコンフォメーションプリオンを検出するための感度の高い方法または試験、ならびにこのような試験を行うための因子を有する大きな必要性が依然として存在する。
【００２２】
発明の簡単な説明
従って、本発明の１つの目的は、それぞれＰｒＰＳｃまたはＰｒＰ２７−３０として病原性プリオンタンパク質を検出する方法を提供することである。
【００２３】
本発明の別の目的は、プリオン、特に、ＰｒＰＳｃと相互作用する物質を探索するための方法を提供することである。
【００２４】
本発明のさらに別の目的は、ＰｒＰＳｃおよび／またはＰｒＰ２７−３０を特異的に認識する物質である。
【００２５】
本発明のさらに別の目的は、例えば、このような物質を有する磁気ビーズなどの固相材料およびそれを含む組成物である。
【００２６】
本発明のさらに別の目的は、体液の精製ならびに外科用機器および診断機器の滅菌のための、このような物質を含む組成物である。
【００２７】
さらに別の目的は、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）を診断するための改善した方法およびそのための手段を提供することである。
【００２８】
ＰｒＰＳｃは「感染タンパク質」とも呼ばれる。ＰｒＰＳｃは、如何なるＴＳＥ兆候も示さず、発症もしていない健常な生物におけるＰｒＰＣの「正常な」コンフォメーションとは異なるコンフォメーションを有するプリオンタンパク質を意味する。
【００２９】
「ＰｒＰＳｃと選択的に相互作用するが、ＰｒＰＣと相互作用しないプリオン結合部位」とは、ＰｒＰＳｃに結合することができるが、ＰｒＰＣに結合しない分子または分子の一部を意味する。このような結合部位は、例えば、低分子有機化合物、ペプチドまたはタンパク質によって、ならびに抗体の抗原結合部位によって得ることができる。本明細書において、「抗体」という用語は、とりわけ、従来の抗体、ｓｃＦｖ断片（Ｆａｂ）、および（Ｆａｂ２）断片を含む。このような文脈での「選択的に」という用語は、結合部位を有する化合物が、ＰｒＰＣコンフォメーションのプリオンタンパク質より、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍強くＰｒＰＳｃコンフォメーションのプリオンタンパク質と相互作用することを意味する。最も好ましくは、結合部位は、プラスミノゲンによって示されるように、少なくともＰｒＰＳｃに対して選択性を示す。
【００３０】
「プリオン結合活性を有する因子」とは、プリオンタンパク質に結合することができ、本発明の選択的プリオン結合部位を有する化合物を意味する。この因子は低分子化合物でもよいが、好ましくは、少なくとも１０アミノ酸長のペプチドまたはタンパク質である。しかしながら、これらのペプチドまたはタンパク質は、炭水化物残基または脂質残基などのさらなる非タンパク質残基を有してもよい。この因子は、例えば、動物またはヒトに由来してもよく、合成したものでもよい。
【００３１】
「プラスミノゲンに含まれる選択的プリオン結合部位」とは、ＰｒＰＳｃと選択的に相互作用するがＰｒＰＣと相互作用しない、動物由来またはヒト由来プラスミノゲンに含まれるアミノ酸配列の全てまたは一部を有するペプチドまたはタンパク質によって得られる結合部位を意味する。
【００３２】
「プラスミノゲンの誘導体」は、天然に生じるプラスミノゲンまたはその断片と比較して少なくとも１つのアミノ酸付加、置換、または欠失を有するが、依然として、ＰｒＰＳｃと選択的に相互作用することができ、ＰｒＰＣと相互作用しないペプチドまたはタンパク質を意味する。このような誘導体は、例えば、天然に生じるプラスミノゲンをコードする核酸の部位特異的変異誘発によって、またはペプチド合成によって容易に調製することができる。
【００３３】
「プラスミノゲンの断片」とは、ＰｒＰＳｃと選択的に相互作用できるが、ＰｒＰＣと相互作用しない、天然に生じるプラスミノゲンの一部を意味する。
【００３４】
「ＰｒＰＳｃのカルボキシル末端」とは、プリオンタンパク質のカルボキシル末端からの最初のアミノ酸を意味する。
【００３５】
「リガンド」とは、ＰｒＰＳｃと本発明による結合因子との複合体に選択的に結合するが、遊離ＰｒＰＳｃのみまたは遊離因子のみと相互作用しない化合物を意味する。このようなリガンドは、例えば、抗体でもよく別の受容体型タンパク質でもよい。
【００３６】
本発明は、とりわけ、ＰｒＰＳｃまたはその消化産物を濃縮するための方法に関する。ここで、体液または流動化された器官が、ＰｒＰＳｃと選択的に相互作用するがＰｒＰＣと相互作用しないプリオン結合部位を少なくとも部分的に有する固相材料で処理される。ある特定の結合部位の選択性は、本明細書以下でさらに説明するように容易に決定することができる。十分な選択性が、例えば、プラスミノゲンによって示される。
【００３７】
このような文脈での「流動化された器官」という用語は、器官に由来し、器官の構成要素のかなりの割合を溶液または懸濁液にするために機械的手順、超音波処理、または他の手順によって可溶化された組織を意味する。
【００３８】
さらに好ましい態様において、流動化された器官は、ホモジナイズされた組織（好ましくは中枢神経系組織）、好ましくはホモジナイズされた脳組織である。
【００３９】
さらに好ましい方法において、血液、血漿、血清、尿、またはリンパなどの体液が、プロテイナーゼ（好ましくは、プロテイナーゼＫ（ＰＫ））で処理される。さらに好ましい方法において、選択的プリオン結合部位は、プリオン結合活性（ＰｒＰＢ）を有する因子に含まれる。このような因子は、好ましくは、ペプチドまたはタンパク質である。ペプチドまたはタンパク質の場合、これは、ＰｒＰＳｃまたはその消化産物への安定な結合を可能にするのに十分な長さである。十分な結合安定性（または親和性）が、例えば、プラスミノゲンによって示される。
【００４０】
さらに好ましい方法において、固相材料は、血清または血漿中に見出されるような、好ましくは、血清または血漿の硫安沈殿の画分ＩＩに含まれるようなＰｒＰＢを有する。
【００４１】
さらに好ましい方法において、固相材料は、プラスミノゲン、フィブリノゲン、または血漿の硫安沈殿の画分Ｉに見出されるＰｒＰＢを有する。
【００４２】
さらに好ましい方法において、ＰｒＰＢは、プラスミノゲン、フィブリノゲン、ｓＰｒＰＢＩＩおよびｐＰｒＰＢＩＩまたはその断片（この断片は完全なタンパク質と同じ選択性を示す）から選択される。
【００４３】
本発明は、さらに、ＰｒＰＳｃまたはその消化産物を検出し、選択的に定量するための方法に関する。この方法は、ＰｒＰＳｃまたはその消化産物を前記のようなプリオン結合部位に選択的に結合させる段階を含む。
【００４４】
好ましい態様において、プリオン結合部位は、プリオン結合活性を有する因子に含まれる。
【００４５】
好ましい態様において、因子は、血清、血漿、血清もしくは血漿の硫安沈殿の画分ＩＩ、血漿の硫安沈殿の画分Ｉに含まれる因子、またはプラスミノゲン、フィブリノゲン、ｓＰｒＰＢＩＩ、およびｐＰｒＰＢＩＩまたはその断片（これは完全なタンパク質と同様の選択性を示す）によって得られる因子から選択される。
【００４６】
ＰｒＰＳｃとプリオン結合部位との間で生成された複合体の検出は、このようなタンパク質複合体の検出に現在適用可能な任意の方法によって、例えば、任意のタイプの親和性アッセイ法によって、または特に、例えば、デビット・ワイルド（Ｄａｖｉｄ Ｗｉｌｄ）の「イムノアッセイハンドブック（Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）」，第２版 ＩＳＰＮＯ−３３−７２３０６−６，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐに記載のようなイムノアッセイ法において行うことができる。高い選択性を達成するために、蛍光検出法が好ましい。
【００４７】
さらに、本発明は、ＰｒＰＳｃまたはその消化産物と、ＰｒＰＳｃと選択的に相互作用するが、ＰｒＰＣと相互作用しないプリオン結合部位を有する材料を含む組成物を初めて提供する。好ましい態様によれば、プリオン結合部位は、プリオン結合活性を有する因子（好ましくは、血清、血漿、血清もしくは血漿の硫安沈殿の画分ＩＩ、血漿の硫安沈殿の画分Ｉに含まれる因子、またはプラスミノゲン、フィブリノゲン、ｓＰｒＰＢＩＩ、およびｐＰｒＰＢＩＩに含まれる因子から選択される）に含まれる。
【００４８】
本発明は、さらに、本発明のプリオン結合部位を有する固相材料を提供する。この結合部位は、好ましくは、プリオン結合活性を有する因子に含まれる。この因子は、好ましくは、血清、血漿、血清もしくは血漿の硫安沈殿の画分ＩＩ、血漿の硫安沈殿の画分Ｉに含まれる因子、またはプラスミノゲン、フィブリノゲン、ｓＰｒＰＢＩＩ、およびｐＰｒＰＢＩＩに含まれる因子から選択される。
【００４９】
本発明は、さらに、ＰｒＰＳｃと、ＰｒＰＳｃと選択的に相互作用するがＰｒＰＣと相互作用しないプリオン結合部位（好ましくは、プラスミノゲンに含まれる選択的ＰｒＰＳｃ結合部位）を有する因子を含むタンパク質複合体を提供する。
【００５０】
本発明は、さらに、血液、尿、脳脊髄液、脳組織、リンパ節、扁桃腺などの体液または器官における病原性プリオンタンパク質（例えば、ＰｒＰＳｃ）を検出するための試験キットを提供する。このキットは、本発明によるプリオン結合部位を有する因子を含み、この因子は、好ましくは、血清、血漿、血清もしくは血漿の硫安沈殿の画分ＩＩ、血漿の硫安沈殿の画分Ｉに含まれる因子、またはプラスミノゲン、フィブリノゲン、ｓＰｒＰＢＩＩ、およびｐＰｒＰＢＩＩに含まれる因子から選択される。
【００５１】
本発明は、さらに、ヒト伝達性ヒト海綿状脳症または動物のプリオン脳症を診断するためのアッセイ法を提供する。このアッセイ法は、試験しようとする試料と、ＰｒＰＳｃと選択的に相互作用するがＰｒＰＣと相互作用しないプリオン結合部位を接触させる段階を含む。好ましい態様において、試料は血液から得られる。試験される動物またはヒトは、ＰｒＰＳｃが試験試料中に検出された場合、陽性（すなわち、伝達性海綿状脳症を発症する現行の危険性が陽性）と診断される。
【００５２】
本発明は、本発明による選択的プリオン結合部位を含む、ＰｒＰＣに対する結合因子を使用することによって、正常ＰｒＰＣも含む可能性がある試料におけるＰｒＰＳｃの検出を初めて可能にする。
【００５３】
本発明のさらなる局面において、ＰｒＰＳｃのカルボキシル末端部分は選択的結合部位の標的である。驚くべきことに、ＰｒＰＳｃのカルボキシル末端は、ＰｒＰＳｃとＰｒＰＣとの区別を可能にする結合部位をもたらすことが発見された。この結合部位は、本発明による結合部位の好ましい標的である。
【００５４】
さらに驚くべきことに、異なる種に由来するプリオンタンパク質間に配列変化が存在することが知られているが、本発明による結合部位は異なる種のＰｒＰＳｃとＰｒＰＣを強力に区別することが見出された。従って、本発明による１つのプリオン結合部位を用いることで、異なる種のＰｒＰＳｃを検出することができる。非常に好ましい結合部位は、ヒトプラスミノゲンに含まれる結合部位である。驚くべきことに、プラスミノゲン結合部位は、複数の種に由来する疾患関連プリオンタンパク質と相互作用することが見出された。本発明によるこの発見は、さらに、個々のＰｒＰＳｃ分子の特定のタンパク質構造に特有の特性ではなく様々な種のＰｒＰＳｃに共通する性質が、プラスミノゲンにおける結合部位への結合を担っていることを示唆している。
【００５５】
本発明による使用のための担体として、生物学的試料中のある特定の化合物を検出するための生物学的アッセイ法を行うのに現在適用可能な本質的に全ての材料を考慮に入れることができる。このような担体として、磁気ビーズ、フィルター細片、マイクロタイタープレートの壁が挙げられる。
【００５６】
本発明の１つの局面によれば、ＰｒＰＳｃの検出は、まず最初に、ＰｒＰＳｃと本発明による結合部位との間で複合体が形成され、次いで、このように形成された複合体がリガンド（例えば、抗体）によって選択的に検出される点で「間接的に」行うことができる。ＰｒＰＳｃとその結合因子との相互作用によって形成されたエピトープと選択的に相互作用する、このようなリガンドもまた高度に選択的であり、このような複合体だけを検出するが、遊離ＰｒＰＳｃも本発明による遊離因子も検出しない。
【００５７】
本発明による生成物は、ＰｒＰＳｃを検出するためにアッセイ法を行うための全ての成分を含む新たな診断キットを提供するのに有用である。このようなキットは、本発明による生成物に加えて、緩衝液、試料中のＰｒＰＳｃの存在の結果である生成物を検出するための試薬、アッセイ法を確実に行う方法に関する作業説明書を含んでもよい。
【００５８】
ＰｒＰＳｃそれ自体はＴＳＥの発症において必須の要素であるので、遊離ＰｒＰＳｃを利用しにくくすることは、ＢＳＥ発症を回避するのに、および／またはＢＳＥ発症の速度を遅らせるのに有用な手段であるかもしれない。遊離ＰｒＰＳｃを減らすための手段は、本発明による結合部位へのＰｒＰＳｃの結合である。従って、この結合部位は、薬学的組成物の一部をなすことができる。
【００５９】
または、本発明による結合部位は、例えば、透析の形で、生物学的細菌からＰｒＰＳｃを除去するために使用することができる。ここで、試験しようとする動物の血液を、本発明の結合部位を含む担体と連続的に接触させる。
【００６０】
従って、本発明は、ヒト伝達性海綿状脳症および動物のプリオン脳症を診断するための信頼性の高い方法を始めて可能にする。この方法では、試験しようとする動物の材料を本発明の結合部位と接触させる。
【００６１】
ＰｒＰＳｃまたはその消化産物を濃縮するための本発明の好ましい方法において、例えば、血液、尿、脳脊髄液などの体液、または脳組織、リンパ節、扁桃腺などの流動化された器官が、磁気ビーズ（ＭＢ）などの固相材料で処理される。ここで、材料またはビーズそれぞれの少なくとも一部はプリオン結合部位を有する。好ましいプリオン結合部位は、プリオン結合活性（ＰｒＰＢ）を有する因子である。
【００６２】
前記の方法は、流動化された器官、特に、ホモジナイズされた中枢神経系組織、好ましくは、ホモジナイズされた脳組織を用いて非常にうまくいく。
【００６３】
プリオン結合部位が消化された形のＰｒＰＣとＰｒＰＳｃしか区別できない場合、実際の濃縮段階前に、体液または流動化された器官を消化することが必要である。適切な消化はプロテイナーゼＫ（ＰＫ）を用いた消化によって得られる。ここで、固相（例えば、ＭＢ）の添加前にプロテイナーゼＫを不活化することが重要である。
【００６４】
しかしながら、ＰｒＰＳｃに対する選択性を得るために出発材料の消化を必要としない方法が好ましい。
【００６５】
ＰｒＰＢを有する好ましい固相材料は、このような材料と血清または血漿（例えば、哺乳動物の新鮮な凍結血漿）をカップリングすることによって調製することができる。ここで、過剰なタンパク質がカップリング手順の間に存在する。このような因子は、ｓｐＰｒＰＢ（ｓ＝血清およびｐ＝血漿）（以下を参照のこと）と呼ばれる。さらにより好ましい、ＰｒＰＢを有する固体材料は、精製されたプラスミノゲンもしくはフィブリノゲンまたはその断片を固相（例えば、ビーズ）にカップリングすることによって調製される（以下を参照のこと）。
【００６６】
非常に適した固体材料は磁気ビーズである。なぜなら、磁気ビーズは、対象となる特定の成分で容易に処理することができ、磁場を加えることで容易に収集することができるからである。
【００６７】
本発明のさらに好ましい方法は、ＰｒＰＳｃまたはその消化産物の検出（任意で、定量）に関する。ここで、まず最初に、ＰｒＰＳｃは前記のように濃縮され（任意で、体液または流動化された器官を前もって消化することも行われ）、次いで、検出され、任意で標準と比較される。適切な検出法はウエスタンブロット分析である。このような試験は、さらに、マイクロタイタープレートフォーマットイムノアッセイ法（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ法）、免疫沈降アッセイ法、ＢＩＡＣＯＲＥアッセイ法、免疫細胞化学アッセイ法、ヒストブロットアッセイ法などの他の検出法によって具体化されてもよい。
【００６８】
前記方法に加えて、本発明はまた、プリオン結合活性を有する因子（例えば、血清の硫安沈殿の画分ＩＩにあるプリオン結合活性であるｓＰｒＰＢＩＩ、または正常もしくは新鮮な凍結血漿の硫安沈殿の画分ＩＩにあるプリオン結合活性を有する因子であるｐＰｒＰＢＩＩ）に関する。これらの因子は、もちろん、どのような形態（例えば、単離された形態または組成物（例えば、硫安沈殿画分）中の成分として）でも本発明の主題である。
【００６９】
前記の因子はＰｒＰＢの濃縮および／または単離によって得ることができる。ここで、血清または血漿は、対象となるＰｒＰＢが好ましくは一画分のみに沈殿するように分画硫安沈殿にかけられる。さらなるタンパク質単離法の適用によって、さらなる精製を得ることができる。
【００７０】
本発明の因子はプリオン、特に、ＰｒＰＳｃの検出に適するだけでなく、病原性プリオンタンパク質に対するＰｒＰＢの親和性に基づいて、血液、尿、脳脊髄液、脳組織、リンパ節、扁桃腺などの体液および器官から病原性プリオンタンパク質を精製および除去するための方法、または外科用ツールおよび／もしくは診断用ツールを滅菌するための方法においてさらなる用途を有する。これらは、さらに、体内のプリオンの蔓延を妨げるための、ＰｒＰＢ産生の調節に基づいた治療レジメのためのツールである。これに関してプラスミノゲンが特に適しており、プラスミノゲンは、体液（例えば、血液ユニット（ｂｌｏｏｄ ｕｎｉｔ））の精製にも特に適している。このような精製は、例えば、体液をＰｒＰＢＩｐ（特に、固定化されたプラスミノゲンまたはそれを含む血漿画分）で処理することによって行ってもよい。
【００７１】
本発明の一部はまた、血液、尿、脳脊髄液、脳組織、リンパ節、扁桃腺などの体液または器官における病原性プリオンタンパク質（例えば、ＰｒＰＳｃ）を検出するための試験であり、この試験は、病原性プリオンタンパク質へのＰｒＰＢの特異的な結合性質を利用している。このような試験は、マイクロタイタープレートフォーマットイムノアッセイ法（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ法）、免疫沈降アッセイ法、ＢＩＡＣＯＲＥアッセイ法、免疫細胞化学アッセイ法、ヒストブロットアッセイ法などとして具体化することができる。
【００７２】
ＰｒＰＢ生合成に特有のＤＮＡ配列ならびに適切な宿主においてこのようなＤＮＡ配列を発現することができるベクターも本発明に含まれる。
【００７３】
さらに、本発明は、ベイトとしてＰｒＰ２７−３０を用いてＰｒＰＢを精製するための方法；マウス、ウサギ、ニワトリなどの動物において産生された、ＰｒＰＢに対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体；組換えファージまたは他の組換え系で産生された、ＰｒＰＢに対する単鎖Ｆｖ断片および他のタイプの抗体断片；ＰｒＰＢの多型またはＰｒＰＢ産生の強さおよびパターンの変化に基づいてプリオン病に対する感受性を予測する試験；プリオンのバイオアッセイ法において用いられるトランスジェニック動物（例えば、脳、リンパ節、または他の器官においてＰｒＰＢを過剰産生するマウス）；プリオンのバイオアッセイ法において用いられるノックアウト動物（特に、ＰｒＰＢが無いマウス）；適切な宿主細胞（例えば、細菌、酵母、菌類、もしくは真核細胞）においてＰｒＰＢ生合成に特有のＤＮＡ配列を発現させることによる、および前記生物からＰｒＰＢを精製することによるＰｒＰＢの産生方法；ヒトおよび動物における治療用途のための医薬品としての天然または合成の（好ましくは、精製された）ＰｒＰＢの使用；天然または合成のＰｒＰＢ（特に、プラスミノゲン）を用いた生物のワクチン接種；ＰｒＰＢの異常な産生および／または代謝から生じたヒトおよび／または動物の疾患についての診断アッセイ法を含む。
【００７４】
発明の詳細な説明
既に前述したように、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）の診断試験として使用することができる低濃度ＰｒＰＳｃの検出法が大いに必要とされている。
【００７５】
ＴＳＥについて基本的に３つの診断原理がある：ＣＮＳにおける一般的な海綿状変化の組織病理学的検出、プリオンタンパク質のスクレイピー特異的アイソフォームの検出、および感染力を検出するバイオアッセイ法。これらの全ての方法には限界がある。すなわち、組織病理学は、構造変化が潜伏期の後期に現れるので前臨床診断に有用でない。プリオンタンパク質のスクレイピー特異的アイソフォームの検出はより感度が高いが、バイオアッセイ法よりかなり感度が低い。バイオアッセイ法は、原理上は、１感染単位という低さで検出することができるが、数ヶ月または数年も待つことがある。
【００７６】
今まで用いられたウエスタンブロット法は、ＰｒＰＣとＰｒＰＳｃとの区別を可能にするＰｒＰＳｃの部分的なプロテアーゼ耐性に基づいている。プロテアーゼ処理後、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性コアであるＰｒＰ２７−３０を検出することができるが、完全に消化されたＰｒＰＣを検出することができない。
【００７７】
プリオンの「粘着性」のために、一般的に、イムノアフィニティ精製（ＩＡＰ）は適用できないと思われていたが、今や、プリオン結合部位（好ましくは、プリオンタンパク質結合活性（ＰｒＰＢ）を有する因子）を有する磁気ビーズ（ＭＢ）を適用することで濃縮を達成できることが見出されている。
【００７８】
従って、絶対量のＰｒＰ２７−３０の検出感度は抗体親和性の関数であり、本発明の範囲内で、ある特定の各抗体について容易に高めることができないので、今までに考えられた問題にもかかわらず、固相材料（例えば、磁気ビーズ）に共有結合によって架橋された抗体を用いて「イムノアフィニティ精製」（ＩＡＰ）アッセイ法が初めて開発された。ＩＡＰの開発のために初め使用されたモノクローナル抗体（プリオニクス（Ｐｒｉｏｎｉｃｓ），Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄで購入した６Ｈ４，コース（Ｋｏｒｔｈ）ら，１９９７に記載）はＰｒＰＣとＰｒＰＳｃを区別することができないので（６Ｈ４は未消化形態および消化されたＰｒＰＳｃ （すなわち、ＰｒＰ２７−３０）の両方に結合する）、ＩＡＰ（図１を参照のこと）前にプロテイナーゼＫ消化を行うことが必要である。
【００７９】
本発明のＩＡＰ法の開発のために、以下のモデル系を使用した。この方法の効率を確かめるために、２種類の試験を行った。一方では、少量のスクレイピー感染マウスの脳ホモジネートを水で希釈し、次いで、ＰｒＰＳｃ濃縮法に供した。他方では、実際の状況をシミュレートするために、少量のスクレイピー感染脳ホモジネートを非感染マウスの脳ホモジネートで希釈した（実際の状況では、脳ホモジネートは少量のＰｒＰＳｃを含んでいる）（図２を参照のこと）。
【００８０】
図２において、レーン１〜６および１０は通常のウエスタンブロットを示し、レーン７〜９および１１〜１３はイムノアフィニティ精製（ＩＡＰ）を示す。ＰｒｎＰ％は、ＰｒＰ欠損マウスに由来する材料である。ＭＢは、もちろんＩＡＰだけに用いられ、ここで、６Ｈ４は、６Ｈ４抗体とカップリングされたＭＢを指し、−は、カップリングされていないＭＢを指す。ＰＲＰＣは非感染マウスの脳ホモジネートを指し、ＰｒＰＳｃはスクレイピー感染マウスの脳ホモジネートを指す。ＰＫはプロテイナーゼＫ消化を指し、ここで、−は未消化を指し、＋は消化されたホモジネートを指す。同じ略語が以下の図に用いられる。
【００８１】
ホモジネート（特に、脳組織のホモジネート）におけるプリオン分析のために、最初のホモジネーション段階において、低濃度のイオン界面活性剤を使用し、その後、低速遠心分離（好ましくは、５００ｇ、３０分、４℃を２回適用）を行うことが重要である。後の段階のために、高濃度の非イオン界面活性剤を使用し、ホモジネートのタンパク質濃度は多くて５ｍｇ／ｍｌである。
【００８２】
プロテイナーゼＫ消化のための条件は、好ましくは、５０μｇ／ｍｌのＰＫ、３７℃、少なくとも３０分である。
【００８３】
ビーズとホモジネートとの適切なインキュベーション条件は、例えば、室温で約１．５時間である。低濃度の場合、それより長いインキュベーション時間が好ましいことがある。
【００８４】
最初の試みでの濃縮段階は、消化されたホモジネートに６Ｈ４を有する磁気ビーズ（ＭＢ）を添加することで行われた。
【００８５】
消化段階が必要な場合、濃縮段階前に行わなければならない。ここで、消化（通常、プロテイナーゼＫによる消化）は、例えば、フェニルメチルスルホニルフッ化物または当業者に周知の別の薬剤を用いてプロテイナーゼを不活化することで濃縮段階前に止めなければならない。
【００８６】
例えば、脳組織ホモジネートに本発明の方法を適用することで、今まで知られている試験に必要とされる量より非常にわずかしか病原性プリオンタンパク質を含まない組織から、ウエスタンブロット分析によって検出可能な量まで、ＰｒＰ２７−３０を濃縮することができる。
【００８７】
主として同じ手順を用いて、例えば、ＰｒＰＳｃの結合パートナーを発見するために、モノクローナル抗体６Ｈ４を、調べようとする他の物質に換えることで、前記の方法をプリオン親和性アッセイ法（ＰＡＡ）として適用することもできる（図３を参照のこと）。
【００８８】
このアッセイ法の陽性対照として、６Ｈ４（図４，レーン１−３を参照のこと）が用いられ、陰性対照として、マウスＩｇＧまたはマウスアルブミン（図４，レーン４−９を参照のこと）が用いられる。
【００８９】
ある特定のマウス血清が、ＰｒＰＳｃを特異的に認識するＩｇＧを含むかどうかを調べるために、ダイナル（ＤＹＮＡＬ）社によってマウスＩｇＧに対するヒツジ抗体で既にコーティングされている磁気ビーズを、マウス血清とのプレインキュベーション後に使用した。プレインキュベーションなしで使用したこれらのビーズは、第１の陰性対照であった（図５，レーン１−２を参照のこと）。第２の陰性対照として、正常マウス血清からのＩｇＧがＰｒＰのどの形態にも結合しないことを示すために、正常マウス血清とプレインキュベーションした、これらのビーズを使用した（図５，レーン３−４を参照のこと）。驚くべきことに、ビーズのみではＰｒＰＳｃに対する親和性を示したが、ＰｒＰ２７−３０に対する親和性を示さなかった。正常マウス血清とプレインキュベーションすると、ＰｒＰ２７−３０も結合した。従って、ダイナルからのヒツジ抗体は、ＰｒＰＳｃに関連しているが、ＰＫ処理後に消化された分子を認識すると仮説を立てた。正常マウス血清とプレインキュベーションするとＰｒＰ２７−３０が結合するので、この血清は、ＰｒＰＳｃに対して親和性を有する分子を含んでいる可能性がある。
【００９０】
総マウス血清タンパク質にカップリングされたビーズは、ＰｒＰのどの形態に対しても親和性を示さなかった。しかしながら、総血清のカップリングが過剰タンパク質の存在下で行われた場合、ビーズは、モノクローナル抗体６Ｈ４と同じ、ＰｒＰ２７−３０に対する結合を示したが（図６，レーン４−６を参照のこと）、過剰のアルブミンの存在下でカップリングされたビーズは、依然として、ＰｒＰのどの形態に対しても親和性を示さなかった（図６，レーン１−３を参照のこと）。２つの条件のカップリング効率の差を測定することはできなかったが、過剰タンパク質の提供が、ＰｒＰ２７−３０に結合するビーズの表面上にスポンジ（ｓｐｏｎｇｅ）を引き起こしたのかもしれない。本発明者らまた、ＰＫ処理された総脳ホモジネートが存在する時にＰｒＰ２７−３０が結合した場合のように、ＰＫ処理された脳ホモジネートが結合を促進し得るかどうかを調べた。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＰｒｎｐ％マウスからのＰＫで消化された脳ホモジネートの添加が、ＰｒＰ２７−３０に加えてＰｒＰＳｃの結合を可能にした（図７，レーン１−３を参照のこと）。不活性ＰＫの添加は結合活性に影響を及ぼさなかった（図７，レーン７−９を参照のこと）。過剰量の存在下でカップリングした場合、ＰｒＰ２７−３０を結合する活性は、ヒト、ヒツジ、ウシの血清中に、および末期スクレイピー罹患Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血清中にも見出された（データ示さず）。
【００９１】
いくつかの種の血清は、人為構造の他に、プリオンタンパク質の病原性アイソフォームと特異的に相互作用し、ビーズへの結合に速度論的に好ましい活性（総称してＰｒＰＢと呼ぶ）を含むだろう。罹患マウスに存在する天然のＰｒＰＳｃが、タンパク質分解消化の際に放出され得るＰｒＰＢで飽和しているとすると、ＰｒＰ２７−３０に対する親和性を理解することができる。または、部分的なタンパク質分解が、ＰｒＰＳｃ上にＰｒＰＢ結合部位を暴露するのかもしれない。しかしながら、ＰＫで処理された脳ホモジネートの添加がＰｒＰＳｃの結合を可能にすることは、本発明者らの観察につながる、いくつかの異なる相互作用がある可能性があることを示している。
【００９２】
テンプレート指向性リフォールディング仮説によって、ＰｒＰＣおよびＰｒＰＳｃが変換工程間にヘテロ２量体を形成することが予測される。従って、本発明者らは、ＰｒＰＢがＰｒＰＣと同一であるかどうかを調べた。しかしながら、過剰量でカップリングした場合、ＰｒＰＢ活性は、野生型マウスの血清と同様のレベルでＰｒｎｐ％マウスの血清中に存在した。このことは、ＰｒＰＣが結合活性に寄与しないことを意味している（図８を参照のこと）。
【００９３】
ＰｒＰＢ活性が特別なカップリング条件のみで引き起こされないのであれば、ディファレンシャル硫安沈殿（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）によるマウス血清の分画によって、ＰｒＰＢ活性を「精製」することが可能なはずである。実際に、５０％より低い硫安飽和でＰｒＰＢを沈殿させることが可能であった。ここで、各画分のカップリングは過剰タンパク質の存在下で行われた（図９を参照のこと）。総マウス血清に対する精製されたウサギ免疫グロブリンはＰｒＰＢを含まないが（データ示さず）、総マウス血清（図１０，レーン１−３を参照のこと）または２５％〜５０％硫安飽和で沈殿したタンパク質（図１０，レーン４−６を参照のこと）とプレインキュベーションするとＰｒＰ２７−３０を効率的に結合した。７５％〜１００％硫安飽和で沈殿したタンパク質とのプレインキュベーションはＰｒＰＢ活性につながらなかった（図１０，レーン７−９を参照のこと）。この発見は、ＰｒＰＢ活性がビーズ表面との共有結合架橋とは無関係の、１つまたはそれ以上の血清タンパク質の性質であることを示すので重要である。
【００９４】
硫安分画はヒト血清を用いても可能であったことから（データ示さず）、ヒト血漿の５８の画分をクロマトグラフィーおよびディファレンシャル沈殿によって得て、ＰｒＰＢの正体の考えをまとめるため結合活性について試験した。全ての画分では過剰タンパク質の存在下でカップリングしなかった。従って、結果は、６Ｈ４またはマウスＩｇＧと直接比較することができる。２０の画分：プラスミノゲン、フィブリノゲン、抗トロンビンＩＩＩ、抗トロンビンＩＩＩヘパリン複合体、Ｃ１エラスターゼ阻害剤、第ＩＸ因子、およびタンパク質混合物を含むいくつかの画分の結果が陽性であった（図１１を参照のこと）。精製されたプラスミノゲンはＰｒＰ２７−３０に加えてＰｒＰＳｃを結合し、精製されたフィブリノゲンも同様であった （図１２を参照のこと）。結果が陰性であった３８の画分のうち、６つが精製タンパク質：プロトロンビン複合体濃縮物、アルブミン、活性化プロトロンビン複合体濃縮物、第ＸＩＩＩ因子、およびトロンビンを含んでいた。
【００９５】
前記のように、ＰｒＰ２７−３０の結合が異なる作用によって引き起こされるという、いくつかの示唆がある。ＰｒＰ２７−３０を結合する活性は、血清および血漿に存在するのでｓｐＰｒＰＢ（ｓ＝血清およびｐ＝血漿）と呼ばれる。この活性は、プラスミノゲンおよびフィブリノゲンで見出された活性と共通点がある。プラスミノゲンおよびフィブリノゲンは両方ともＰｒＰＳｃも結合するとさらに特徴付けられた。
【００９６】
カルシウムは凝固カスケードにおける重要な補因子であるので、カルシウム複合体を形成することによって凝固が阻害された場合に、ＰｒＰＢ活性が完全なままであるかどうかを調べた。１０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下で、プラスミノゲンには病原性ＰｒＰＳｃおよびＰｒＰ２７−３０が依然として結合したが（図１３，レーン１−３を参照のこと）、フィブリノゲンにはＰｒＰ２７−３０のみが結合した（図１３，レーン４−６を参照のこと）。少なくともプラスミノゲンの場合では、この発見は、ＰｒＰＢ活性が非特異的凝固によるものである可能性を否定している。ＰｒＰＢは病原性ＰｒＰと選択的に相互作用するが、ＰｒＰＣと相互作用しないので、相互作用はコンフォメーション特異的であるかもしれない。アッセイ法が６Ｍ尿素の存在下で行われた時に、精製プラスミノゲンを含む画分はＰｒＰＳｃもＰｒＰ２７−３０も結合しなかった（図１４，レーン８−９を参照のこと）。これらの条件下では、ＰｒＰＳｃはプロテアーゼ感受性になっている（図１４，レーン１４−１５を参照のこと）。ＰｒＰＳｃのコンフォメーションはＰＫ耐性を担っていると考えられているので、本発明者らは、この実験から、プラスミノゲンとＰｒＰＳｃとの相互作用がコンフォメーション依存的であると結論を下している。
【００９７】
さらに、プラスミノゲンのＰｒＰＢ活性は、プラスミノゲンに対する抗体でコーティングされ、プラスミノゲンとプレインキュベートされた磁気ビーズを使用することによって、ビーズへの共有結合架橋に依存しないことが明らかになった（図１５，レーン３−４を参照のこと）。２つの陰性対照がある。１．プラスミノゲンに対する抗体でコーティングされたビーズを全くプレインキュベーションしない場合（図１５，レーン１−２を参照のこと）、またはアルブミンとプレインキュベーションした場合（図１５，レーン５−６を参照のこと）、ＰｒＰの病原性アイソフォームは結合しない。２．アルブミンでコーティングされたビーズをプラスミノゲンとプレインキュベーションした場合、これもＰｒＰの病原性アイソフォームへの結合はない（図１５，レーン７−８を参照のこと）。
【００９８】
さらに、少なくともｓｐＰｒＰＢは病原性ＰｒＰを結合するだけでなく、感染力を結合することも分かった。このために、本発明者らは、ビーズの９９％を溶出し、ウエスタンブロットを行う前に、指標ｔｇａ２０マウスに常磁気ビーズの０．２％を皮内接種した（図１６を参照のこと）。病原性ＰｒＰを結合したビーズが接種された動物は全て疾患を発症した（図１７，レーン４、５、および７を参照のこと）。
【００９９】
プラスミノゲンと疾患関連プリオンタンパク質との相互作用が海綿状脳症の普遍的な特徴であるかどうかも確かめられた。ヒトプラスミノゲン（１００μｇ）を、トシル活性化された常磁性Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０（ダイナル，Ｏｓｌｏ，１ｍｌ）に結合させた。健常マウス（図１８，レーン１）、スクレイピー罹患マウス（レーン２−３）、スイス非罹患ウシのプールされていた脳（レーン４）、および様々な品種のＢＳＥ罹患ウシの脳（レーン５−１０）からの脳組織を記載のようにホモジネートし、ＰｒＰＳｃの存在について試験した。このために、５０μｇ（マウス）または１ｍｇ（ウシ）のホモジネートを、抗ＰｒＰモノクローナル抗体６Ｈ４（データ示さず）、ＢＳＡ（陰性対照；データ示さず）、またはプラスミノゲンとカップリングされた常磁気ビーズとインキュベートした。ビーズ溶出液（２４μｌ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５％濃縮用ゲル−１２％分離用ゲル）上で移動させ、ニトロセルロース膜（シュレイチャーアンドシュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ），Ｄａｓｓｅｌ）上にブロットした。疾患関連ＰｒＰを検出するために、膜を、一次抗体として６Ｈ４（プリオニクス，Ｚｕｒｉｃｈ）と、二次抗体としてウサギ−α−マウスＩｇＧ１−ＨＲＰ（ザイメッド（Ｚｙｍｅｄ），Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）とインキュベートした。次いで、膜をＥＣＬ検出試薬を用いて発色させた。シグナルをフィルムに記録し、および／またはＫｏｄａｋ ＩｍａｇｅＳｔａｔｉｏｎを用いて定量した。全ての場合で、磁気ビーズに固定化されたプラスミノゲンは、沈殿アッセイ法にかけられた時に各種からのＰｒＰＳｃを捕獲した。スクレイピーに対する様々なヒツジ品種の感受性にばらつきがあることが報告されている。感受性は、ヒツジＰｒｎｐ遺伝子内のコドン１３６、１５４、１７１での多型に位置づけられている。これらの多型はタンパク質のカルボキシル末端で生じ、塩基性アミノ酸に影響を及ぼし、間接的な証拠が、ＰｒＰＳｃのカルボキシル末端がプラスミノゲンへの結合に関与し得ることを示唆しているので、本発明者らは、ヒツジにおけるスクレイピーに対する遺伝的感受性が、ＰｒＰＳｃがプラスミノゲンに結合する能力と相関し得るかどうかを調べた。コドン１３６、１５４、１７１でＶＨＱ／ＡＲＱ（図１８，レーン１１−１３）、ＶＲＱ／ＡＲＱ（レーン１４−１６）、およびＶＲＱ／ＡＲＲ（レーン１７−１９）のＰｒｎｐ遺伝型を有する非罹患ヒツジおよびスクレイピー罹患ヒツジからの脳組織をホモジナイズし、プリオン親和性アッセイ法にかけた。プラスミノゲンは、調べられた全てのヒツジ遺伝子型からのＰｒＰＳｃを沈殿させた。図１８は、脳ホモジネートとインキュベートされたプラスミノゲンビーズからの溶出液がウエスタンブロット分析にかけられたことを示す。種および品種を各レーンの上に示す。スクレイピー感染またはＢＳＥ感染およびプロテイナーゼＫによる試料の消化を「＋」および「−」の印で示す。各レーンの下に示した数字は、様々な品種およびＰｒｎｐ遺伝子型の個々のウシおよびヒツジを示す。プラスミノゲンビーズは、試験した全ての試料においてＰｒＰＳｃを固定した。
【０１００】
さらに、本発明者らは、プリオン親和性アッセイ法を用いて、散発性クロイツフェルト−ヤコブ病、アルツハイマー病（図１９）、およびビンスヴァンガー病（データ示さず）で死亡した数人の患者からの脳組織（５００μｇ）を試験した。ＣＪＤ患者のホモジネートを用いて行った全てのアッセイ法において、プラスミノゲンはＰｒＰＳｃを沈殿できたのに対して、非ＣＪＤ患者のホモジネートではシグナルを検出することができなかった。ＰｒＰ沈着の斑様の斑−周囲空胞（ｐａｔｃｈｙ−ｐｅｒｉｖａｃｕｏｌａｒ）パターンおよびシナプスパターンを有する症例から、明白な陽性シグナルが得られた。沈殿アッセイ法におけるＰｒｐＣＪＤシグナルの強度は組織病理学的所見と密接に関連していた（図１９）。図１９において、プラスミノゲンは、ＰｒＰＣＪＤの広範囲の斑様蓄積（ａ）またはわずかなシナプス蓄積（ｂ，ｃ）を示す３人のスイス人ｓＣＪＤ患者（ａ，ｂ，ｃ）の脳ホモジネートからＰｒＰＣＪＤを沈殿させた。対照のために、本発明者らは、アルツハイマー病に罹患した患者（ｄ）からの脳ホモジネートを使用した。プロテイナーゼＫ消化は、対応するレーンの上に「＋」の印で示したように行った。ＰｒＰに対する抗体３Ｆ４（リチャード・カスクサク（Ｒｉｃｈａｒｄ Ｋａｓｃｋｓａｋ）博士から入手した，アルバート・アインシュタイン大学（Ａｌｂｅｒｔ Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ），Ｔｈｅ Ｂｒｏｎｘ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ ｏｒ Ｄｒａｃｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ，Ｂｏｔｒｕｐ）で免疫染色された対応する脳切片を右側に示す。いずれの場合でも、プラスミノゲンに基づくアッセイ法およびウエスタンブロットは一致した結果を示す。アルツハイマー病では、ＰｒＰＣは検出できたが（−）、ＰｒＰＳｃは検出できなかった（＋）。スケールバーは５０μｍである。
【０１０１】
実施例：
実施例１：ＩＡＰ法
ＩＡＰプロトコールは以下である。脳組織を１５ｍｌファルコン（ＦＡＬＣＯＮ）チューブに入れ、チューブを氷上に置き、全ての段階について氷上に放置しておく。１０％（ｗ／ｖ）ホモジネートを得るために、ホモジネート緩衝液（ＰＢＳに溶解した０．５％ ＤＯＣ／０．５％ ＮＰ−４０）を添加する。組織を１８ゲージ針および２２ゲージ針に、それぞれ１５分間吸い込んだり吸い出したりすることで通過させる。ホモジネートを４℃で３０分間、５００ｇで遠心分離する。上清を保存する。タンパク質濃度を決定する。ホモジネートを４℃で３０分間、５００ｇで遠心分離する。上清を保存する。タンパク質濃度が１０ｍｇ／ｍｌより高ければ、ホモジネート緩衝液を用いて、ホモジネートのタンパク質濃度を１０ｍｇ／ｍｌにする。ホモジネートのタンパク質濃度を５ｍｇ／ｍｌにし、３％Ｔｗｅｅｎ２０／３％ＮＰ−４０を全てＰＢＳに溶解する。組織ホモジネートにプロテイナーゼＫを、５０μｇ／ｍの最終濃度になるように添加する。３７℃で６０分間インキュベートする。５ｍＭの最終濃度を得るためにＰＭＳＦを添加する。０．２５体積のＩＡＰ緩衝液（ＰＢＳに溶解した３％Ｔｗｅｅｎ２０／３％ＮＰ−４０）を添加する。以下に記載のプロトコールによる磁気ビーズ（６Ｈ４でコーティングされている）を完全に再懸濁する。１００μｌをピペットで出す。緩衝液を除去する。ホモジネートをビーズに添加し、室温で１．５時間、連続混合しながらビーズ−試料混合物をインキュベートする。ＭＰＣ（強力磁石）を用いてビーズを集める。室温で１５秒ボルテックスし、ＭＰＣを用いることで、１ｍｌの洗浄緩衝液（ＰＢＳに溶解した２％Ｔｗｅｅｎ２０／２％ＮＰ−４０）で３回、１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄する。ビーズを沈降させ、再度ＭＰＣを用いて残りの上清を捨てる。２４μｌ×ローディング緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）；２％ＳＤＳ；０．０１％ブロモフェノールブルー；１０％グリセロール）を添加する。５分間９５℃に加熱する。試料を−２０℃で保存したら、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その後のウエスタンブロットを行う前に、再度９５℃で３０秒間加熱する。ガラスプレートを製造業者の説明書に従って組み立てる。ファルコンチューブ中に適量の分離用ゲル（Ｈ２Ｏ ２．１ｍｌ，４０％アクリルアミド１．５ｍｌ，１．５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．８）１．３ｍｌ，１０％ＳＤＳ ５０μｌ，１０％過硫酸アンモニウム５０μｌ，ＴＥＭＥＤ ２μｌ）を調製する。示した順番で成分を混合する。ＴＥＭＥＤを添加するとすぐに重合が始まる。アクリルアミド溶液をガラスプレート間の隙間に注ぐ。濃縮用ゲルのために十分な空間を残す（コームの長さ＋１ｃｍ）。パスツールピペットを用いて、水と一緒にアクリルアミドを注意深く重層する。ゲルを室温で垂直に置く。重合が完了した後（３０分）、重層したものを除去し、重合しなかったアクリルアミドを除去するために、ゲルの上部を脱イオン水で数回洗浄する。ファルコンチューブ中に適量の濃縮用ゲル（Ｈ２Ｏ １．４８ｍｌ，４０％アクリルアミド０．２５ｍｌ，１．０Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）０．２５ｍｌ，１０％ＳＤＳ ２０μｌ，１０％過硫酸アンモニウム２０μｌ，ＴＥＭＥＤ ２μｌ）を調製する。示した順番で��分を混合する。ＴＥＭＥＤを添加するとすぐに重合が始まる。濃縮用ゲル溶液を重合した分離用ゲルの表面に直接注ぐ。気泡を閉じ込めないように注意しながら、すぐに、清潔なテフロンコームを濃縮用ゲル溶液に挿入する。ゲルを室温で垂直に置く。重合が完了した後（３０分）、テフロンコームを注意深く取り除く。ゲルを電気泳動装置に取り付ける。ランニング緩衝液を上部リザーバおよび下部リザーバに添加する。ゲル底部、ガラスプレート間に閉じ込められた気泡（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，２５０ｍＭグリシン，０．１％ＳＤＳ）を取り除く。各試料２４μｌを予め決められた順番でウェル底部にロードする（１．ウェル：低分子量マーカー）。等量の１×ゲルローディング緩衝液を、使われていない任意のウェルにロードする。電気泳動装置を電源に取り付ける（陽極を下部リザーバに接続しなければならない）。１０Ｖ／ｃｍをゲルに印加する。染料の先端が分離用ゲルに移動した後（３０分）、電圧を１４Ｖ／ｃｍに上げ、ブロモフェノールブルーが分離用ゲルの底部に達するまでゲルに電圧を印加する（１時間）。次いで、電源を切る。６枚の吸い取り紙（ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）３ＭＭまたは同等品）および１枚のニトロセルロースをゲルの大きさ（６ｃｍ×８ｃｍ）に切断する。紙がゲルの端に重なっている場合、電流が転写装置を短絡させ、ゲルを飛び越え、これによって効率的な転写が妨げられる。吸い取り紙、ニトロセルロース、およびゲルを、転写緩衝液（３９ｍＭグリシン，４８ｍＭ Ｔｒｉｓ，０．０３７％ＳＤＳ，２０％メタノール）に浸けることで湿らす。装置の底板（陽極）の上に、下記の順番で、ゲル、ニトロセルロース、および紙を組み立てる。
下部電極、
転写緩衝液に浸けた３層の吸い取り紙、
転写緩衝液に浸けた１枚のニトロセルロース膜、
転写緩衝液でわずかに湿らしたポリアクリルアミドゲル、
転写緩衝液に浸けた３層の吸い取り紙。
【０１０２】
気泡を注意深く調べ、手袋をはめた手を用いるか、サンドイッチしたものの上でピペットを左右に動かすことで気泡を穏やかに除去する。ゲルと紙のサンドイッチしたものの周囲にある緩衝液を乾燥させる。上部電極（陰極）を重ねたものの上に注意深く置く。その上に、おもしを置く。電極を接続し、転写を始める。実行時間は１ｍＡ／ｃｍ２の電流で１時間である。転写後、電源を切り離す。装置を注意深く分解する。方向を追跡するために（通常、左下隅、１番レーンを切り取ることで）膜に印をつける。膜をＴＢＳ−Ｔで３回洗浄する。ブロッキング緩衝液（ＴＢＳ−Ｔに溶解した５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳）を添加する。３０分間攪拌しながら室温でインキュベートする。膜をＴＢＳ−Ｔで３回洗浄する。ｍＡＢ ６Ｈ４（２ｍｇ／ｍｌ）２．５μｌに、ＴＢＳ−Ｔに溶解した１％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳１２．５ｍｌを添加する。１時間攪拌しながら室温で、または４℃で一晩インキュベートする。膜を抗体溶液から取り出し、ＴＢＳ−Ｔで３回（各１０分）洗浄する。関連する抗マウスＩｇＧ１−ＨＲＰ １．２５μｌに、ＴＢＳ−Ｔに溶解した１％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳１２．５ｍｌを添加する。１時間攪拌しながら室温でインキュベートする。膜を抗体溶液から取り出し、ＴＢＳ−Ｔで３回（各１５分）洗浄する。ＥＣＬウエスタンブロット検出試薬（アマシャムファルマシアバイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ））からの検出溶液１ １ｍｌと検出溶液２ １ｍｌを混合する。攪拌することなく正確に１分間、室温でインキュベートする。膜を吸い取り紙の上に置くことで、過剰な検出試薬を取り除く。膜を、タンパク質側を下にしてサランラップの上に穏やかに置く。膜に力を加えないようにしながら、覆いを作るようにサランラップをくっつける。膜をタンパク質側を上にしてフィルムカセットに入れる。できるだけ速やかに作業を行う。明かりを消し、１枚のオートラジオグラフィーフィルム（例えば、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ）を膜の上に注意深く置き、カセットを閉じ、数秒間（１５秒，３０秒）暴露させる。
【０１０３】
実施例２：ＰＡＡ法
対象となるタンパク質を磁気ビーズにカップリングさせる。タンパク質１００μｇを、約１ｍｌのカップリング緩衝液（０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．５）：Ｈ３ＢＯ３ ６．１８３ｇを蒸留水８００ｍｌに溶解し、５Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨを９．５に調節し、体積を蒸留水で１０００ｍｌに調節する；必要に応じて、透析によって緩衝液を交換する）に入れる。（カップリングを過剰量の存在下で行う場合、カップリング緩衝液１ｍｌに対して１ｍｇを用いた）。ピペットを使用し、約１分間ボルテックスすることで、ダイナルによってトシル活性化されたＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０の均一な懸濁液を作成する。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ １ｍｌをピペットで取り、以下のように洗浄する：チューブをＤＹＮＡＬ ＭＰＣに入れる。分離するために２分間放置する。Ｄｙｎａｂｅａｄｓを乱さないように注意しながら上清を除去する。ＤＹＮＡＬ ＭＰＣからチューブを取り出し、ＰＢＳにＤｙｎａｂｅａｄｓを再懸濁する。これらの段階を繰り返し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを、抗体を含むカップリング緩衝液に再懸濁する。ティルトローテーションを行いながら３７℃で２４時間インキュベートする。チューブを磁石の中に３分間入れ、上清を除去する。コーティングされたＤｙｎａｂｅａｄｓを６回洗浄する：室温で５分間、ＰＢＳ／ＢＳＡ（０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（最終濃度）をＰＢＳに添加）（ｐＨ７．４）で２回；３７℃で４時間、ブロッキング緩衝液（０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む０．２Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）：Ｔｒｉｓ ２．４２ｇを蒸留水８０ｍｌに溶解し、１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨを８．５に調節し、０．１％ＢＳＡを添加し、体積を蒸留水で１００ｍｌに調節する）で１回；室温で５分間、ＰＢＳ／ＢＳＡ（ｐＨ７．４）で１回；１０分間、１％Ｔｗｅｅｎ２０で１回；室温で５分間、ＰＢＳ／ＢＳＡ（ｐＨ７．４）で１回。コーティングされたＤｙｎａｂｅａｄｓをＰＢＳ／ＢＳＡ（ｐＨ７．４），０．０２％アジ化ナトリウムに溶解して保存する。次いで、試料Ｉを調製する。ＰＡＡ緩衝液（ＰＢＳに溶解した３％ＮＰ−４０／３％Ｔｗｅｅｎ２０）１ｍｌを、悲感染脳ホモジネート（タンパク質濃度５ｍｇ／ｍｌ；０．５％ＤＯＣ／０．５ ＮＰ−４０）１０μｌに添加する。次いで、試料ＩＩおよびＩＩＩを調製する。ＰＡＡ緩衝液（ＰＢＳに溶解した３％ＮＰ−４０／３％Ｔｗｅｅｎ２０）１ｍｌを、感染脳ホモジネート（タンパク質濃度５ｍｇ／ｍｌ；０．５％ ＤＯＣ／０．５ ＮＰ−４０）１０μｌに添加する。ＰＫを添加せずに試料Ｉおよび試料ＩＩを３７℃で３０分間インキュベートする。最終濃度５０μｇ／ｍｌのＰＫ（１ｍｇ／ｍｌのＰＫ ５０μｌを添加）を添加して試料ＩＩＩを３７℃で３０分間インキュベートする。最終濃度が５ｍＭ（１００ｍＭ ＰＭＳＦ ５０μｌを添加）になるように、ＰＭＳＦを全ての試料に添加する。磁気ビーズを完全に再懸濁する。１００μｌをピペットで取る。ビーズを試料に添加し、室温で１．５時間、連続混合しながらビーズ−試料混合物をインキュベートする。ＭＰＣを用いてビーズを集める。室温で１５秒間ボルテックスし、ＭＰＣを用いることで、洗浄緩衝液１ｍｌで３回、ＰＢＳ １ｍｌで１回洗浄する。ビーズを沈降させ、再びＭＰＣを用いて残りの上清を捨てる。１×ローディング緩衝液２４μｌを添加する。５分間、９５℃に加熱する。試料を−２０℃で保存した場合、ゲルにローディングする前に、再度、９５℃で３０秒間加熱する。
【０１０４】
このアッセイ法の陽性対照として６Ｈ４を使用し、陰性対照としてマウスＩｇＧまたはマウスアルブミンを使用する（図４を参照のこと）。
【０１０５】
実施例３
ある特定のマウス血清が、ＰｒＰＳｃを特異的に認識するＩｇＧを含むかどうかを調べるために、ダイナル社によってマウスＩｇＧに対するヒツジ抗体で既にコーティングされている磁気ビーズを、マウス血清とのプレインキュベーション後に使用した。これらのビーズは、第１の陰性対照であった。第２の陰性対照として、正常マウス血清からのＩｇＧがＰｒＰのどの形態にも結合しないことを示すために、正常マウス血清とプレインキュベーションされた、これらのビーズを使用した。驚くべきことに、ビーズのみではＰｒＰＳｃに対する親和性を示したが、ＰｒＰ２７−３０に対して親和性を示さなかった。正常マウス血清とプレインキュベーションすると、ＰｒＰ２７−３０も結合した（図５を参照のこと）。従って、ダイナルからのヒツジ抗体は、ＰｒＰＳｃに関連しているが、ＰＫ処理後に消化して切り取られた分子を認識すると仮説を立てた。正常マウス血清とプレインキュベーションするとＰｒＰ２７−３０が結合するので、この血清は、ＰｒＰＳｃに対して親和性を有する分子を含んでいる可能性がある。
【０１０６】
実施例４
総マウス血清タンパク質にカップリングされたビーズは、ＰｒＰの如何なる形態に対しても親和性を示さなかった。しかしながら、総血清のカップリングが過剰タンパク質の存在下で行われた場合、ビーズは、モノクローナル抗体６Ｈ４と同じ、ＰｒＰ２７−３０に対する結合を示したが、過剰のアルブミンの存在下でカップリングされたビーズは、依然として、ＰｒＰのどの形態に対しても親和性を示さなかった（図６を参照のこと）。２つの条件のカップリング効率の差を測定することはできなかったが、過剰タンパク質の提供が、ＰｒＰ２７−３０を結合するビーズの表面上にスポンジを引き起こした可能性がある。
【０１０７】
実施例５
本発明者らまた、ＰＫ処理された総脳ホモジネートが存在する時にＰｒＰ２７−３０が結合した場合のように、ＰＫ処理された脳ホモジネートが結合を促進し得るかどうかを調べた。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＰｒｎｐ％マウスからのＰＫで消化された脳ホモジネートの添加は、ＰｒＰ２７−３０に加えてＰｒＰＳｃの結合を可能にした。不活性ＰＫの添加は結合活性に影響を及ぼさなかった（図７を参照のこと）。
【０１０８】
実施例６
過剰量の存在下でカップリングした場合、ＰｒＰ２７−３０を結合する活性が、ヒト、ヒツジ、ウシの血清中、および末期スクレイピー罹患Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血清中に見出された（データ示さず）。
【０１０９】
実施例７
テンプレート指向性リフォールディング仮説によって、ＰｒＰＣおよびＰｒＰＳｃが変換工程間にヘテロ２量体を形成することが予測される。従って、本発明者らは、ＰｒＰＢがＰｒＰＣと同一であるかどうかを調べた。しかしながら、過剰量でカップリングした場合、ＰｒＰＢ活性は、野生型マウスの血清と同様のレベルでＰｒｎｐ％マウスの血清中に存在した。このことは、ＰｒＰＣが結合活性に寄与しないことを意味している（図８を参照のこと）。
【０１１０】
実施例８
ＰｒＰＢ活性が特別なカップリング条件のみで引き起こされないのであれば、ディファレンシャル硫安沈殿によるマウス血清の分画によってＰｒＰＢ活性を「精製」することが可能なはずである。実際に、５０％より低い硫安飽和でＰｒＰＢを沈殿させることが可能であった。ここで、各画分のカップリングは過剰タンパク質の存在下で行われた（図９を参照のこと）。総マウス血清に対する精製されたウサギ免疫グロブリンはＰｒＰＢを含まないが（データ示さず）、総マウス血清または２５％〜５０％硫安飽和で沈殿したタンパク質とプレインキュベーションするとＰｒＰ２７−３０を効率的に結合した。７５％〜１００％硫安飽和で沈殿したタンパク質とのプレインキュベーションはＰｒＰＢ活性につながらなかった（図１０を参照のこと）。この発見は、ＰｒＰＢ活性が、ビーズ表面との共有結合架橋とは無関係の、１つまたはそれ以上の血清タンパク質の性質であることを示すので重要である。
【０１１１】
実施例９
硫安分画はヒト血清を用いても可能であったことから（データ示さず）、ヒト血漿の５８の画分をクロマトグラフィーおよびディファレンシャル沈殿によって得て、ＰｒＰＢの正体の考えをまとめるため結合活性について試験した。全ての画分では過剰タンパク質の存在下でカップリングしなかった。従って、結果は、６Ｈ４またはマウスＩｇＧと直接比較することができる。２０の画分の結果が陽性であった：プラスミノゲン、フィブリノゲン、抗トロンビンＩＩＩ、抗トロンビンＩＩＩヘパリン複合体、Ｃ１エラスターゼ阻害剤、第ＩＸ因子、およびタンパク質混合物を含むいくつかの画分 （図１１を参照のこと）。精製されたプラスミノゲンはＰｒＰ２７−３０に加えてＰｒＰＳｃを結合し、精製されたフィブリノゲンも同様であった（図１２を参照のこと）。結果が陰性であった３８の画分のうち、６つが精製タンパク質を含んでいた：プロトロンビン複合体濃縮物、アルブミン、活性化プロトロンビン複合体濃縮物、第ＸＩＩＩ因子、およびトロンビン。
【０１１２】
実施例１０
カルシウムは凝固カスケードにおける重要な補因子であるので、カルシウム複合体を形成することによって凝固が阻害された場合に、ＰｒＰＢ活性が完全なままであるかどうかを調べた。１０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下で、プラスミノゲンでは病原性ＰｒＰＳｃおよびＰｒＰ２７−３０が依然として結合したが、フィブリノゲンではＰｒＰ２７−３０のみが結合した（図１３）。少なくともプラスミノゲンの場合では、この発見は、ＰｒＰＢ活性が非特異的凝固によるものである可能性を否定している。
【０１１３】
実施例１１
ＰｒＰＢは病原性ＰｒＰと選択的に相互作用するが、ＰｒＰＣと相互作用しないので、相互作用はコンフォメーション特異的である可能性がある。アッセイ法が６Ｍ尿素の存在下で行われた時に、精製プラスミノゲンを含む画分はＰｒＰＳｃもＰｒＰ２７−３０も結合しなかった。これらの条件下では、ＰｒＰＳｃはプロテアーゼ感受性になっている（図１４）。ＰｒＰＳｃのコンフォメーションはＰＫ耐性を担っていると考えられているので、本発明者らは、この実験から、プラスミノゲンとＰｒＰＳｃとの相互作用がコンフォメーション依存的であると結論を下している。
【０１１４】
実施例１２
さらに、プラスミノゲンのＰｒＰＢ活性は、プラスミノゲンに対する抗体でコーティングされ、プラスミノゲンとプレインキュベーションされた磁気ビーズを使用することによって、ビーズへの共有結合架橋に依存しないことが明らかになった（図１５）。
【０１１５】
実施例１３
さらに、少なくともｓｐＰｒＰＢは病原性ＰｒＰを結合するだけでなく、感染力を結合することも分かった。このために、本発明者らは、溶出およびウエスタンブロットを行う前に、指標ｔｇａ２０マウスに常磁気ビーズの０．２％を皮内接種した。病原性ＰｒＰを結合したビーズが接種された動物は全て疾患を発症する（図１６、図１７）。
【０１１６】
実施例１４
特定の標的に対する所与のペプチドまたはタンパク質の結合特性を決定し、特徴付けるための多くの選択肢が先行技術によって提供される。固相結合技術を用いてＰｒＰＳｃ特異的結合パートナーの選択性を決定するための結合アッセイ法として、例えば、マイクロタイタープレートフォーマット、常磁気ビーズ、非磁気ビーズ、プラズモン表面共鳴、インターフェロメトリー、コインシデンス検出、質量分析法（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ／ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、エレクトロスプレー分析、およびそれらの組み合わせが挙げられる。本発明において使用するためには、以下の２つのアプローチが好ましい。
【０１１７】
１．試験しようとするペプチドもしくはタンパク質またはその断片を固相材料とカップリングさせる：
ａ．固相として磁気ビーズなどの微粒子を使用し、免疫沈降を行う。
ペプチドを磁気ビーズにカップリングさせる。ビーズをＰｒＰＳｃ、ＰｒＰ２７−３０、またはＰｒＰＣとインキュベートする。プリオンタンパク質がペプチドに結合したかどうかを、ウエスタンブロット分析または微粒子イムノアッセイ法によって検出する。
ｂ．固相としてマイクロタイタープレートの表面を使用し、ＥＬＩＳＡを行う。
マイクロタイタープレートのウェルの表面をペプチドでコーティングする。ＰｒＰＳｃ、ＰｒＰ２７−３０、またはＰｒＰＣをウェルに添加する。プリオンタンパク質がペプチドに結合したかどうかをＥＬＩＳＡによって検出する。
【０１１８】
２． ＰｒＰＳｃ（またはＰｒＰ２７−３０）およびＰｒＰＣを固相材料とカップリングさせる：
ａ．固相として磁気ビーズなどの微粒子を使用し、免疫沈降を行う。
ＰｒＰＳｃ （またはＰｒＰ２７−３０）およびＰｒＰＣをそれぞれ磁気ビーズにカップリングさせる。ビーズと、試験しようとするペプチドまたはタンパク質断片とインキュベートする。ペプチドがＰｒＰＳｃに結合したが、ＰｒＰＣに結合しなかったどうかをウエスタンブロット分析または微粒子イムノアッセイ法によって検出する。
ｂ．固相としてマイクロタイタープレートの表面を使用し、ＥＬＩＳＡを行う。
マイクロタイタープレートのウェルの表面をＰｒＰＳｃ （またはＰｒＰ２７−３０）およびＰｒＰＣでそれぞれコーティングする。試験しようとするペプチドまたはタンパク質断片をウェルに添加する。ペプチドがＰｒＰＳｃに結合したが、ＰｒＰＣに結合しなかったどうかをＥＬＩＳＡによって検出する。
【０１１９】
実施例１５
特定の標的に対するタンパク質の特異的結合に関与するタンパク質の特定の部分を決定および検出するための多くの可能性が先行技術によってもたらされる。
【０１２０】
ＰｒＰＳｃ特異的結合パートナーとして適切なプラスミノゲン断片を同定するための方法として、例えば、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイを用いた正の遺伝的選択、細菌タンパク質断片の親和性アッセイ法、およびそれらの組み合わせまたは変形が挙げられる。従って、ＰｒＰＳｃへの特異的結合に関与するプラスミノゲンの部分は、以下のように決定することができる。
【０１２１】
１．ファージ上にディスプレイされたプラスミノゲン断片および／または変異体のペプチドライブラリーを作成し、それらを、病原性プリオンタンパク質でコーティングされた固相に暴露し、ＰｒＰＳｃに対して最大結合親和性を有するが、ＰｒＰＣに対して最小親和性を有するクローンを選択する。
【０１２２】
２．細菌、酵母、菌類、または真核細胞などの宿主細胞においてプラスミノゲンの断片および／または変異体を発現させ、ペプチドを精製し、標識し、結合活性について試験する。
【０１２３】
３．宿主細胞においてプラスミノゲン断片および／または変異体との融合タンパク質を発現させ、結合アッセイ法においてＰｒＰＳｃ親和性について試験する。
【０１２４】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＩＡＰ法を示す図である。
【図２】希釈実験のウエスタンブロットおよびＩＡＰ実験を示す。ここで、レーン１〜６および１０は通常のウエスタンブロットを示し、レーン７〜９および１１〜１３はイムノアフィニティ精製（ＩＡＰ）を示す。
【図３】プリオン親和性アッセイ法（ＰＡＡ）法を示す図である。
【図４】ＰＡＡの陽性対照および陰性対照を示すウエスタンブロットである。
【図５】ダイナルによってヒツジ抗マウスＩｇＧ ＡｂでコーティングされたビーズはＰｒＰＳｃに結合するが、ＰｒＰ２７−３０に結合しないという観察を示す。正常マウス血清とプレインキュベーションすると、ＰｒＰ２７−３０も結合する。
【図６】ビーズにカップリングされた血清タンパク質を用いた結果を示すウエスタンブロットである。＊は、過剰タンパク質の存在下でカップリングが行われたことを意味する。
【図７】ＰＫ処理された脳ホモジネートをアッセイ法に添加した影響を示す。
【図８】ＰｒＰ欠損材料を用いた結果を示すウエスタンブロットである。
【図９】硫安沈殿物のＰＡＡを示すウエスタンブロットである。
【図１０】ビーズに共有結合によって架橋されていない硫安沈殿物のＰＡＡを示すウエスタンブロットである。
【図１１】クロマトグラフィーおよびディファレンシャル沈殿によって得られ、結合活性について試験された、ヒト血漿の５８画分のＰＡＡ結果を示す。
【図１２】精製されたプラスミノゲンおよびフィブリノゲンを用いた結果を示すウエスタンブロットである。
【図１３】プラスミノゲンおよびフィブリノゲンの結合活性のカルシウム依存性を示すウエスタンブロットである。
【図１４】プラスミノゲンの結合活性がタンパク質の天然の状態に依存することを示すウエスタンブロットである。
【図１５】ビーズに共有結合によって架橋されていないプラスミノゲンのＰＡＡを示すウエスタンブロットである。
【図１６】バイオアッセイ法の概念を示す。
【図１７】バイオアッセイ法の結果を示す。
【図１８】異なる種に対するプラスミノゲンのＰｒＰＳｃ結合活性を示す。
【図１９】プラスミノゲンによるヒトＰｒＰＣＪＤの沈殿を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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