(57)【要約】本発明は、コンドロイチンシンターゼ遺伝子及びその生成方法及び使用方法に関する。限定するものではないが、更に具体的に言うと、本発明はパスツレラマルトシダのコンドロイチンシンターゼ遺伝子及びその単離方法及び使用方法に関する。更に、本発明は硫酸化されていないコンドロイチンの使用及びその調製法、並びにデルマタン硫酸及びコンドロイチン硫酸ポリマーなどの変更種への変換に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素的に活性なコンドロイチンシンターゼをエンコードするコード領域を含む精製核酸セグメント。
【請求項２】
前記精製核酸セグメントが、パスツレラマルトシダから単離されたコンドロイチンシンターゼをエンコードする請求項１に記載の精製核酸セグメント。
【請求項３】
前記精製核酸セグメントが、配列番号２又は４のパスツレラマルトシダのコンドロイチンシンターゼをエンコードする請求項２に記載の精製核酸セグメント。
【請求項４】
前記精製核酸セグメントが、配列番号１又は３と一致したヌクレオチド配列を含む請求項２に記載の精製核酸セグメント。
【請求項５】
酵素的に活性なコンドロイチンシンターゼをエンコードするコード領域を有する精製核酸セグメントであって、配列番号１又は３のヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能な精製核酸セグメント。
【請求項６】
酵素的に活性なコンドロイチンシンターゼをエンコードするコード領域を有する精製核酸セグメントであって、半保存的又は保存的アミノ酸変更を有し、又は、配列番号１又は３のヌクレオチド配列と比較して、トランケートセグメントである精製核酸セグメント。
【請求項７】
プラスミド、コスミド、ファージ、組込みカセット又はウイルスベクターからなる群から選択された組換えベクターであって、酵素的に活性なコンドロイチンシンターゼをエンコードするコード領域を有する精製核酸セグメントを更に含む組換えベクター。
【請求項８】
前記精製核酸セグメントが、配列番号２又は４のパスツレラマルトシダコンドロイチンシンターゼをエンコードする請求項７に記載の組換えベクター。
【請求項９】
前記精製核酸セグメントが、配列番号１又は３と一致したヌクレオチド配列を含む請求項７に記載の組換えベクター。
【請求項１０】
前記プラスミドが更に発現ベクターを含む請求項７に記載の組換えベクター。
【請求項１１】
前記発現ベクターが、酵素的に活性なパスツレラマルトシダコンドロイチンシンターゼコード領域に操作可能に結合したプロモーターを含む請求項１０に記載の組換えベクター。
【請求項１２】
組換え宿主細胞であって、前記組換え宿主細胞が、酵素的に活性なコンドロイチンシンターゼをエンコードするコード領域を有する精製核酸セグメントを含む組換えベクターによって形質転換された原核細胞であるところの組換え宿主細胞。
【請求項１３】
前記精製核酸セグメントが、配列番号２又は４のパスツレラマルトシダコンドロイチンシンターゼをエンコードする請求項１２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１４】
前記精製核酸セグメントが、配列番号１又は３に一致したヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１５】
前記宿主細胞がコンドロイチンを産生する請求項１３又は１４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１６】
前記酵素的に活性なコンドロイチンシンターゼが、変更された構造を有するコンドロイチン重合体を産生可能である請求項１２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１７】
前記酵素的に活性なコンドロイチンシンターゼが、大きさ分布の変更されたコンドロイチン重合体を産生可能である請求項１２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１８】
組換え宿主細胞であって、前記組換え宿主細胞が、酵素的に活性なコンドロイチンシンターゼをエンコードするコード領域を有する精製核酸セグメントを含む組換えベクターによってトランスフェクトされた原核細胞であるところの組換え宿主細胞。
【請求項１９】
前記精製核酸セグメントが、配列番号２又は４のパスツレラマルトシダコンドロイチンシンターゼをエンコードする請求項１８に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２０】
前記精製核酸セグメントが、配列番号１又は３に一致したヌクレオチド配列を含む請求項１８に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２１】
前記宿主細胞が、コンドロイチンを産生する請求項１９又は２０に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２２】
前記酵素的に活性なコンドロイチンシンターゼが、変更された構造を有するコンドロイチン重合体を産生可能である請求項１８に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２３】
前記酵素的に活性なコンドロイチンシンターゼが、大きさ分布の変更されたコンドロイチン重合体を産生可能である請求項１８に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２４】
組換え宿主細胞であり、前記組換え宿主細胞が、エレクトロポレーション又は形質転換されて、組換えベクターを導入した組換え宿主細胞であって、前記組換えベクターが、酵素的に活性なコンドロイチンシンターゼをエンコードするコード領域を有する精製核酸セグメントを含むところの組換え宿主細胞。
【請求項２５】
前記精製核酸セグメントが、配列番号２又は４のパスツレラマルトシダコンドロイチンシンターゼをエンコードする請求項２４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２６】
前記精製核酸セグメントが、配列番号１又は３に一致したヌクレオチド配列を含む、請求項２４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２７】
前記宿主細胞が、コンドロイチンを産生する請求項２５又は２６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２８】
前記酵素的に活性なコンドロイチンシンターゼが、変更された構造を有するコンドロイチン重合体を産生可能である請求項２４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２９】
前記酵素的に活性なパスツレラマルトシダコンドロイチンシンターゼが、変更された大きさ分布を有するコンドロイチン重合体を産生可能である請求項２４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３０】
組換え宿主細胞であって、前記組換え宿主細胞が、酵素的に活性なパスツレラマルトシダコンドロイチンシンターゼをエンコードするコード領域を有する精製核酸セグメントを含む組換えベクターによって形質導入されているところの組換え宿主細胞。
【請求項３１】
前記精製核酸セグメントが、配列番号２又は４のパスツレラマルトシダコンドロイチンシンターゼをエンコードする請求項３０に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３２】
前記精製核酸セグメントが、配列番号１又は３に一致したヌクレオチド配列を含む、請求項３０に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３３】
前記宿主細胞が、コンドロイチンを産生する請求項３１又は３２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３４】
前記酵素的に活性なコンドロイチンシンターゼが、変更された構造を有するコンドロイチン重合体を産生可能である請求項３０に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３５】
前記酵素的に活性なコンドロイチンシンターゼが、変更された大きさ分布を有するコンドロイチン重合体を産生可能である請求項３０に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３６】
精製組成物であって、酵素的に活性なコンドロイチンシンターゼポリペプチドを含むところの精製組成物。
【請求項３７】
精製組成物であって、組換え方法によって形成されたコンドロイチン重合体を含むところの精製組成物。
【請求項３８】
精製組成物であって、コンドロイチンシンターゼによって形成されたコンドロイチン重合体を含むところの精製組成物。
【請求項３９】
精製組成物であって、パスツレラマルトシダコンドロイチンシンターゼによって形成されたコンドロイチン重合体を含むところの精製組成物。
【請求項４０】
精製組成物であって、配列番号２又は４のパスツレラマルトシダコンドロイチンシンターゼによって形成されたコンドロイチン重合体を含むところの精製組成物。
【請求項４１】
精製組成物であって、配列番号１又は３に一致したヌクレオチド配列を含むパスツレラマルトシダコンドロイチンシンターゼによって形成されたコンドロイチン重合体を含むところの精製組成物。
【請求項４２】
コンドロイチン重合体が、構造、（ベータ−１，４−ＧｌｃＵＡ−ベータ−１，３−ＧａｌＮＡｃ）ｎであって、ｎが１以上の正の整数である構造によって表される、請求項３６、３７、３８、３９、４０、４１及び４２の何れか１つに記載の精製組成物。
【請求項４３】
精製組成物であって、変更された大きさ分布を有するコンドロイチン重合体を含むところの精製組成物。
【請求項４４】
精製組成物であって、変更された構造を有するコンドロイチン重合体を含むところの精製組成物。
【請求項４５】
前記コンドロイチン重合体が硫酸化されていない請求項４２に記載の精製組成物。
【請求項４６】
コンドロイチン重合体をインビトロで産生する方法であって、
コンドロイチンシンターゼを提供するステップ、
コンドロイチン重合体の発現に適した培地中に前記コンドロイチンシンターゼを入れるステップ、及び
前記コンドロイチン重合体を前記培地から抽出するステップ
を含む方法。
【請求項４７】
コンドロイチンシンターゼを提供する前記ステップにおいて、前記コンドロイチンシンターゼがパスツレラマルトシダから得られる請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
コンドロイチンシンターゼを提供する前記ステップにおいて、前記コンドロイチンシンターゼが、パスツレラマルトシダから得られ、そして、配列番号２又は４に一致したアミノ酸配列を有する請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
コンドロイチンシンターゼを提供する前記ステップにおいて、パスツレラマルトシダから得られた前記コンドロイチンシンターゼが、配列番号１又は３に一致したヌクレオチド配列である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
コンドロイチン重合体をインビボで産生する方法であって、
コンドロイチンシンターゼを提供するステップ、
前記コンドロイチンシンターゼを天然又は組換え生物に入れ、かくして、コンドロイチンシンターゼを有する天然又は組換え生物を提供するステップ、
コンドロイチンシンターゼを有する天然又は組換え生物を、コンドロイチン重合体を発現するのに適した培地中に入れるステップ、及び
前記コンドロイチン重合体を抽出するステップ
を含む方法。
【請求項５１】
コンドロイチンシンターゼを提供する前記ステップにおいて、前記コンドロイチンシンターゼがパスツレラマルトシダから得られる請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
コンドロイチンシンターゼを提供する前記ステップにおいて、前記コンドロイチンシンターゼが、パスツレラマルトシダから得られ、そして、配列番号２又は４に一致したアミノ酸配列を有する請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
コンドロイチンシンターゼを提供する前記ステップにおいて、パスツレラマルトシダから得られた前記コンドロイチンシンターゼが、配列番号１又は３に一致したヌクレオチド配列である請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記コンドロイチン重合体が、インビトロで硫酸化されている請求項４２に記載の精製組成物。
【請求項５５】
前記コンドロイチン重合体が、インビトロでエピマー化されている請求項４２に記載の精製組成物。
【請求項５６】
コンドロイチンシンターゼ及びエピメラーゼを含む組換え宿主細胞。
【請求項５７】
コンドロイチンシンターゼ及びスルホトランスフェラーゼを含む組換え宿主細胞。
【請求項５８】
コンドロイチンシンターゼ、エピメラーゼ、及びスルホトランスフェラーゼを含む組換え宿主細胞。
【請求項５９】
前記コンドロイチン重合体がインビボで硫酸化されている請求項４２に記載の精製組成物。
【請求項６０】
前記コンドロイチン重合体がインビボでエピマー化されている請求項４２に記載の精製組成物。
【請求項６１】
前記コンドロイチンシンターゼがＰ．マルトシダコンドロイチンシンターゼである請求項５６、５７、又は５８に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６２】
前記Ｐ．マルトシダコンドロイチンシンターゼが、配列番号２に一致している請求項６１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６３】
精製組成物であって、酵素的に活性なコンドロイチンシンターゼポリペプチドを含むところの精製組成物。
【請求項６４】
ＤＮＡ種を検出する方法であって、
ＤＮＡ試料を得るステップ、
ＤＮＡ試料を、配列番号１又は３と一致した精製核酸セグメントと接触させるステップ、
前記ＤＮＡ試料及び前記精製核酸セグメントをハイブリダイズさせ、かくして、ハイブリダイズされた複合体を形成するステップ、及び
前記複合体を検出するステップ
を含む方法。
【請求項６５】
パスツレラマルトシダコンドロイチンシンターゼをエンコードするｍＲＮＡを発現する細菌細胞を検出する方法であって、
細菌細胞試料を得るステップ、
前記細菌細胞試料の少なくとも１種の核酸を、配列番号１又は３と一致した精製核酸セグメントと接触させるステップ、
前記少なくとも１種の核酸と前記精製核酸セグメントとをハイブリダイズさせ、もって、ハイブリダイズされた複合体を形成するステップ、及び
前記ハイブリダイズされた複合体を検出するステップであって、前記ハイブリダイズされた複合体の存在によって、パスツレラマルトシダコンドロイチンシンターゼをエンコードするｍＲＮＡを発現する細菌株を示すところのステップ
を含む方法。
【請求項６６】
コンドロイチン重合体を産生する方法であって、
酵素的に活性なコンドロイチンシンターゼをエンコードするコード領域を有する精製核酸セグメントを、宿主生物に導入するステップであって、前記宿主生物が、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ及びＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを産生する酵素をエンコードする核酸セグメントを含むところのステップ、
前記宿主生物を培地中で増殖させて、コンドロイチン重合体を分泌させるステップ、及び
分泌された前記コンドロイチン重合体を回収するステップ
を含む方法。
【請求項６７】
コンドロイチン重合体を回収する前記ステップにおいて、前記コンドロイチン重合体を前記培地又は細胞又はそれらの組合せから抽出する請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
抽出したされた前記コンドロイチン重合体を精製するステップを更に含む請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記コンドロイチン重合体を硫酸化するステップを更に含む請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
前記コンドロイチン重合体をエピマー化するステップを更に含む請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
前記宿主生物を増殖させる前記ステップにおいて、前記宿主生物が、構造的に変更されたコンドロイチン重合体を分泌する請求項６６に記載の方法。
【請求項７２】
前記宿主生物を増殖させる前記ステップにおいて、前記宿主生物が、変更された大きさのコンドロイチン重合体を分泌する請求項６６に記載の方法。
【請求項７３】
予め選択された医薬品と、そして、コンドロイチンシンターゼによって直接的に産生され、又は、硫酸化又はエピマー化又はそれらの組合せによって重合体を変更した後に産生された、有効量のコンドロイチン重合体とを含む医薬組成物。
【請求項７４】
前記コンドロイチンシンターゼをパスツレラマルトシダから得る請求項７３に記載の医薬組成物。
【請求項７５】
前記コンドロイチン重合体が、配列番号２又は４のパスツレラマルトシダコンドロイチンシンターゼによって産生される請求項７４に記載の医薬組成物。
【請求項７６】
前記コンドロイチン重合体の分子量を変更し、かくして、変更された分子量の医薬組成物を産生するところの請求項７３に記載の医薬組成物。
【請求項７７】
前記コンドロイチン重合体の分子量を変更し、かくして、変更された分子量の医薬品組成物に親和性を有する患者内の特定の組織又は細胞種を標的とすることが可能な、変更された分子量の医薬品組成物を産生するところの請求項７３に記載の医薬組成物。
【請求項７８】
酵素的に活性なコンドロイチンシンターゼをエンコードする精製及び単離された核酸配列であって、
配列番号１又は３と一致した核酸配列、
配列番号１又は３と一致した核酸配列と相補的な核酸配列、
配列番号１又は３と一致した核酸配列にハイブリダイズする核酸配列、及び
配列番号１又は３と一致した相補的核酸配列にハイブリダイズする核酸配列
から成る群から選択されるところの核酸配列。
【請求項７９】
酵素的に活性なコンドロイチンシンターゼをエンコードする核酸セグメントから本質的に構成される精製及び単離された核酸セグメント。
【請求項８０】
宿主細胞にコンドロイチン重合体を発現させることを可能にする方法によって、請求項１、２又は３による単離された核酸セグメントで形質転換又はトランスフェクトされた原核又は真核宿主細胞。
【請求項８１】
パスツレラマルトシダコンドロイチンシンターゼをエンコードするための生物学的特性の保有を可能にするために、配列番号１又は３と一致した核酸セグメントを十分に複製する、少なくとも１種の核酸セグメントを有するコンドロイチンシンターゼをエンコードする核酸セグメントから本質的に構成された単離核酸セグメント。
【請求項８２】
請求項８１に記載のｃＤＮＡ配列。
【請求項８３】
宿主細胞にコンドロイチン重合体を発現させることを可能にする方法で、請求項８１に記載の核酸セグメントで形質転換又はトランスフェクトされた原核宿主細胞又は真核宿主細胞。
【請求項８４】
酵素的に活性なコンドロイチンシンターゼをエンコードするコード領域を有する精製核酸セグメントであって、配列番号１又は３に一致したヌクレオチド配列にハイブリダイズすることが可能な精製核酸セグメント。
【請求項８５】
組換え宿主細胞であって、
（ａ）宿主細胞に内在するコンドロイチンシンターゼプロモーター及びコンドロイチンシンターゼプロモーターの転写制御下にあるコンドロイチンシンターゼ遺伝子を含む宿主細胞からなる培養物を提供するステップ、
（ｂ）（１）２種類の遺伝子要素であり、両要素のコード領域が同一方向にトランスレートされるように組み合わされた２種類の遺伝子要素であって、下流の遺伝子要素が、選択マーカー遺伝子と、前記選択マーカー遺伝子の転写を制御するプロモーターと、転写終止配列とを含み、前記上流の遺伝子要素が、転写終止配列の前の少なくとも１つの所定のポリペプチドをエンコードする１又は複数のプロモーターレスコード領域を有するところの２種類の遺伝子要素と、
（２）前記遺伝子要素に隣接し、そして、トランスレーションの方向が２種の異種遺伝子要素の方向と同じになるように方向付けられた配列と、そして、
（３）前記遺伝子要素に隣接し、そして、相同組換えによる組み込みが可能なコンドロイチンシンターゼ遺伝子と十分な相同性を有する配列と
を含む異種ＤＮＡ分子で前記培養物中の前Ｋ宿主細胞を形質転換するステップであって、相同組換えの結果、前記遺伝子要素を前記コンドロイチンシンターゼ遺伝子に組み込むところのステップ、
（ｃ）前記選択マーカーポリペプチドを発現するステップ（ｂ）で作製された宿主細胞を選択するステップ、及び
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られた前記宿主細胞をスクリーニング及び抽出して、コンドロイチンシンターゼを産生する宿主細胞を得るステップ
を含む方法の産物であるところの組換え宿主細胞。
【請求項８６】
前記組換え宿主細胞がベクターであるところの請求項８５に記載の組換え宿主細胞。
【請求項８７】
前記コンドロイチンシンターゼ遺伝子が、パスツレラマルトシダから得られるところの請求項８５に記載の組換え宿主細胞。
【請求項８８】
パスツレラマルトシダから得られた前記コンドロイチンシンターゼ遺伝子が、配列番号１又は３と一致する請求項８７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項８９】
前記組換え宿主細胞が、コンドロイチンシンターゼを発現するところの請求項８５に記載の組換え宿主細胞。
【請求項９０】
前記組換え宿主細胞が、配列番号２又は４と一致するコンドロイチンシンターゼを発現するところの請求項８９に記載の組換え宿主細胞。
【請求項９１】
請求項８５に記載の組換え宿主細胞であって、（ｅ）ステップ（ｄ）で同定された前記宿主細胞を、変異が前記コンドロイチンシンターゼ遺伝子内に発生するような条件下で、変異原に曝露するステップ、及び（ｆ）ステップ（ｄ）又は（ｅ）で作製した前記宿主細胞を、初期レベルよりも高レベルのマーカーポリペプチドを産生する宿主細胞について試験して、前記上流遺伝子要素の発現増加を引き起こし、前記異種ＤＮＡ分子によってエンコードされた全ポリペプチド類の宿主細胞による産生を異種ＤＮＡによってエンコードされた全ポリペプチド類の変異のない前記宿主細胞による産生と比較して増加させる変異であって、発現の増加した細胞を選択する条件がなくなっても前記発現増加が維持されるところの変異を有する組換え宿主細胞を得るステップを更に含む組換え宿主細胞。
【請求項９２】
異種ポリペプチドを宿主細胞で産生する組換え方法であって、
（ａ）プロモーターと、所望する異種ポリペプチドをエンコードする核酸配列を含む核酸構造物とを含むベクターで、前記宿主細胞を形質転換するステップであって、前記プロモーターが、配列番号１又は３で記載した核酸配列の転写活性化領域を含み、そして、前記核酸構造物が前記プロモーターと作動可能な位置に結合しているところのステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）の形質転換された宿主細胞を培養するステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）の形質転換された宿主細胞から異種ポリペプチドを回収するステップ
を含む方法。
【請求項９３】
配列番号２又は４に一致するアミノ酸配列を有するコンドロイチンシンターゼを発現する細胞を培養することによってコンドロイチン重合体を産生する方法。
【請求項９４】
コンドロイチン重合体のインビトロにおける硫酸化方法であって、前記コンドロイチン重合体をコンドロイチンシンターゼによって産生し、前記コンドロイチン重合体を化学的方法又は酵素的方法のいずれかで硫酸化するところの方法。
【請求項９５】
前記コンドロイチンシンターゼがパスツレラマルトシダコンドロイチンシンターゼである請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記パスツレラマルトシダコンドロイチンシンターゼが配列番号２又は４と一致する請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
コンドロイチン重合体のエピマー化方法によって得られるデルマタン重合体であって、前記コンドロイチン重合体がコンドロイチンシンターゼによって産生されるところのデルマタン重合体。
【請求項９８】
前記コンドロイチンシンターゼがパスツレラマルトシダコンドロイチンシンターゼである請求項９７に記載のデルマタン重合体。
【請求項９９】
前記パスツレラマルトシダコンドロイチンシンターゼが配列番号２又は４と一致した請求項９８に記載のデルマタン重合体。
【請求項１００】
組換えによって産生した、硫酸化されていないコンドロイチン多糖。
【請求項１０１】
コンドロイチンシンターゼによって産生された、請求項１００に記載の組換えによって産生した硫酸化されていないコンドロイチン多糖。
【請求項１０２】
前記コンドロイチンシンターゼが、配列番号２又は４と一致した、請求項１０１に記載の組換えによって産生した硫酸化されていないコンドロイチン多糖。
【請求項１０３】
ベータ１，４−結合ＧａｌＮＡｃ及びベータ１，３−結合ＧｌｃＵＡを１：１の多糖比で交互に含む多糖であって、（１）性質：白色非晶質粉末、（２）溶解性：アルコール、アセトン、クロロホルムに不溶で、水及びジメチルスルホキシドに可溶、（３）構成糖類：グルクロン酸及びＮ−アセチル−ガラクトサミンのみ、（４）分子量：１０００〜２５００００、（５）Ｈ−ＮＭＲスペクトル：硫酸化されていないコンドロイチンのシグナル特性を示す、（６）酵素感受性：コンドロイチナーゼＡＢＣには感受性であるが、ヒアルロン酸リアーゼには感受性ではない、及び（７）呈色反応：フェノール硫酸反応及びカルバゾール反応に陽性、という特性を更に有するところの多糖。
【請求項１０４】
パスツレラ類に属する微生物を培養した培地から抽出され、そして、単離された請求項１０３に記載の多糖。
【請求項１０５】
前記培地が、組織、酵母又は牛乳抽出物又はビタミン、アミノ酸及び塩、又はそれらの組合せから成る化学合成培地から成る群から選択された請求項１０４に記載の多糖。
【請求項１０６】
溶媒沈殿法、脂肪族四級アミン沈殿法、イオン交換クロマトグラフィ、選択的抽出法、又は選択的限外濾過／透析、及びそれらの組合せから成る群から選択された方法によって前記培地から精製された請求項１０５に記載の多糖。
【請求項１０７】
酵素的に活性なコンドロイチンシンターゼをエンコードするコード領域を有する精製核酸セグメントであって、配列番号１又は３の残基４５から７０４に対応する精製核酸セグメント。
【請求項１０８】
酵素的に活性なコンドロイチンシンターゼをエンコードするコード領域を有する精製核酸セグメントであって、配列番号１又は３の残基７５から７０４に対応する精製核酸セグメント。
【請求項１０９】
酵素的に活性なコンドロイチンシンターゼをエンコードするコード領域を有する精製核酸セグメントであって、配列番号１又は３の残基１から７０４に対応する精製核酸セグメント。
【請求項１１０】
請求項１０６に記載の多糖であって、硫酸化、エピマー化、断片形成、又は架橋及びそれらの組合せから成る群から選択された処理によって変更された多糖。
【請求項１１１】
コンドロイチンシンターゼをエンコードするコード領域を含む精製核酸セグメント。
【請求項１１２】
コンドロイチンシンターゼをエンコードするコード領域を含む精製核酸セグメントであって、配列番号１又は３のヌクレオチド配列と場合によってはハイブリダイズすることが可能な精製核酸セグメント。
【請求項１１３】
コンドロイチンシンターゼをエンコードするコード領域を有する精製核酸セグメントであって、半保存的又は保存的アミノ酸変更を有し、又は、配列番号１又は３のヌクレオチド配列と比較して、トランケートセグメントである精製核酸セグメント。
【請求項１１４】
プラスミド、コスミド、ファージ、組込みカセット又はウイルスベクターからなる群から選択された組換えベクターであって、更に酵素的に活性なコンドロイチンシンターゼをエンコードするコード領域を有する精製核酸セグメントを含む組換えベクター。
【請求項１１５】
組換え宿主細胞であって、前記組換え宿主細胞が、コンドロイチンシンターゼをエンコードするコード領域を有する精製核酸セグメントを含む組換えベクターで形質転換された細胞であるところの組換え宿主細胞。
【請求項１１６】
組換え宿主細胞であって、前記組換え宿主細胞が、コンドロイチンシンターゼをエンコードするコード領域を有する精製核酸セグメントを含む組換えベクターでトランスフェクトされた細胞であるところの組換え宿主細胞。
【請求項１１７】
組換えベクターを導入するためにエレクトロポレーション又は形質転換された組換え宿主細胞であって、組換えベクターがコンドロイチンシンターゼをエンコードするコード領域を有する精製核酸セグメントを含む組換え宿主細胞。
【請求項１１８】
組換え宿主細胞であって、前記組換え宿主細胞が、パスツレラマルトシダコンドロイチンシンターゼをエンコードするコード領域を有する精製核酸セグメントを含む組換えベクターで形質導入されるところの組換え宿主細胞。
【請求項１１９】
コンドロイチンシンターゼポリペプチドを含む精製組成物。
【請求項１２０】
組換え方法によって任意的に産生されるコンドロイチン重合体を含む精製組成物。
【請求項１２１】
コンドロイチンシンターゼによって任意的に産生されるコンドロイチン重合体を含む精製組成物。
【請求項１２２】
パスツレラマルトシダコンドロイチンシンターゼによって任意的に産生されるコンドロイチン重合体を含む精製組成物。
【請求項１２３】
配列番号２又は４のパスツレラマルトシダコンドロイチンシンターゼによって任意的に産生されるコンドロイチン重合体を含む精製組成物。
【請求項１２４】
配列番号１又は３と一致したヌクレオチド配列を含むパスツレラマルトシダコンドロイチンシンターゼによって任意的に産生されるコンドロイチン重合体を含む精製組成物。
【請求項１２５】
変更された大きさ分布を任意的に有するコンドロイチン重合体を含む精製組成物。
【請求項１２６】
変更された構造を任意的に有するコンドロイチン重合体を含む精製組成物。
【請求項１２７】
コンドロイチンシンターゼを任意的に提供するステップ、
コンドロイチン重合体の発現に適した培地中にコンドロイチンシンターゼを任意的に入れるステップ、及び
培地中に出たコンドロイチン重合体を任意的に抽出するステップ
を含むインビトロにおけるコンドロイチン重合体の産生方法。
【請求項１２８】
コンドロイチンシンターゼを任意的に提供するステップ、
コンドロイチンシンターゼを天然又は組み合え生物に任意的に入れ、かくして、コンドロイチンシンターゼを有する天然又は組換え生物をそこで提供するステップ、
コンドロイチンシンターゼを有する天然又は組換え生物を、コンドロイチン重合体を発現するのに適した培地中に任意的に入れるステップ、及び
コンドロイチン重合体を任意的に抽出するステップ
を含むインビボにおけるコンドロイチン重合体の産生方法。
【請求項１２９】
コンドロイチンシンターゼ又はスルホトランスフェラーゼを含む組換え宿主細胞。
【請求項１３０】
コンドロイチンシンターゼ、エピメラーゼ、及び／又はスルホトランスフェラーゼを含む組換え宿主細胞。
【請求項１３１】
コンドロイチンシンターゼポリペプチドを含む精製組成物。
【請求項１３２】
ＤＮＡ種を検出する方法であって、
ＤＮＡ試料を任意的に得るステップ、
前記ＤＮＡ試料を、配列番号１又は３と一致した精製核酸セグメントと任意的に接触させるステップ、
前記ＤＮＡ試料及び前記精製核酸セグメントを任意的にハイブリダイズさせ、かくして、ハイブリダイズされた複合体を形成するステップ、及び
前記複合体を任意的に検出するステップ
を含む方法。
【請求項１３３】
パスツレラマルトシダコンドロイチンシンターゼをエンコードするｍＲＮＡを発現する細胞株を検出する方法であって、
細胞試料を任意的に得るステップ、
細菌細胞試料の少なくとも１種の核酸を、配列番号１又は３と一致した精製核酸セグメントと任意的に接触させるステップ、
前記少なくとも１種の核酸及び前記精製核酸セグメントを任意的にハイブリダイズさせ、かくして、ハイブリダイズされた複合体を形成するステップ、及び
前記ハイブリダイズされた複合体を任意的に検出するステップであって、前記ハイブリダイズされた複合体の存在によって、パスツレラマルトシダコンドロイチンシンターゼをエンコードするｍＲＮＡを発現する細胞株を示すところのステップ
を含む方法。
【請求項１３４】
コンドロイチン重合体を産生する方法であって、
酵素的に活性なコンドロイチンシンターゼをエンコードするコード領域を有する精製核酸セグメントを、宿主生物に任意的に導入するステップであって、前記宿主生物がＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ及びＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを産生する酵素をエンコードする核酸セグメントを含むところのステップ、
宿主生物を培地中で任意的に増殖させて、コンドロイチン重合体を分泌させるステップ、及び
分泌されたコンドロイチン重合体を任意的に回収するステップ
を含む方法。
【請求項１３５】
任意的な医薬品及びコンドロイチン重合体を含む医薬組成物。
【請求項１３６】
コンドロイチンシンターゼをエンコードする精製又は単離された核酸配列であって、
配列番号１又は３と一致した核酸配列、
配列番号１又は３と一致した核酸配列と相補的な核酸配列、
配列番号１又は３と一致した核酸配列にハイブリダイズする核酸配列、及び
配列番号１又は３と一致した相補的核酸配列にハイブリダイズする核酸配列から成る群から選択されるところの核酸配列。
【請求項１３７】
酵素的に活性なコンドロイチンシンターゼをエンコードする核酸セグメントを含む精製又は単離された核酸セグメント。
【請求項１３８】
パスツレラマルトシダコンドロイチンシンターゼをエンコードするための生物学的特性の所有を可能にするために、配列番号１又は３と一致した核酸セグメントを十分に複製する、少なくとも１種の核酸セグメントを有するコンドロイチンシンターゼをエンコードする核酸セグメントを含む単離核酸セグメント。
【請求項１３９】
コンドロイチンシンターゼをエンコードするコード領域を有する精製核酸セグメントであって、配列番号１又は３と一致したヌクレオチド配列にハイブリダイズできる精製核酸セグメント。
【請求項１４０】
組換え宿主細胞であって、
（ａ）宿主細胞に内在するコンドロイチンシンターゼプロモーター及びコンドロイチンシンターゼプロモーターの転写制御下にあるコンドロイチンシンターゼ遺伝子を含む宿主細胞からなる培養物を任意的に提供するステップ、
（ｂ）（１）２種類の遺伝子要素であり、両要素のコード領域が同一方向にトランスレートされるように組み合わされた２種類の遺伝子要素であって、下流の遺伝子要素が、選択マーカー遺伝子と、前記選択マーカー遺伝子の転写を制御するプロモーターと、転写終止配列とを含み、前記上流の遺伝子要素が、転写終止配列の前の少なくとも１つの所定のポリペプチドをエンコードする１又は複数のプロモーターレスコード領域を有するところの２種類の遺伝子要素と、
（２）前記遺伝子要素に隣接し、そして、トランスレーションの方向が２種の異種遺伝子要素の方向と同じになるように方向付けられた配列と、そして、
（３）前記遺伝子要素に隣接し、そして、相同組換えによる組み込みが可能なコンドロイチンシンターゼ遺伝子と十分な相同性を有する配列と
を含む異種ＤＮＡ分子で前記培養物中の前Ｋ宿主細胞を任意的に形質転換するステップであって、相同組換えの結果、前記遺伝子要素を前記コンドロイチンシンターゼ遺伝子に組み込むところのステップ、
（ｃ）前記選択マーカーポリペプチドを発現するステップ（ｂ）で作製された宿主細胞を任意的に選択するステップ、及び
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られた前記宿主細胞を任意的にスクリーニング及び抽出して、コンドロイチンシンターゼを産生する宿主細胞を得るステップ
を含む方法の産物であるところの組換え宿主細胞。
【請求項１４１】
異種ポリペプチドを宿主細胞で産生する組換え方法であって、
（ａ）プロモーターと、所望する異種ポリペプチドをエンコードする核酸配列を含む核酸構造物とを含むベクターで、前記宿主細胞を任意的に形質転換するステップであって、前記プロモーターが、配列番号１又は３で記載した核酸配列の転写活性化領域を任意的に含み、そして、前記核酸構造物が前記プロモーターと作動可能な位置に任意的に結合しているところのステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）の形質転換された宿主細胞を任意的に培養するステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）の形質転換された宿主細胞から異種ポリペプチドを任意的に回収するステップ
を含む方法。
【請求項１４２】
配列番号２又は４と一致するアミノ酸配列を任意的に有するコンドロイチンシンターゼを発現する細胞の培養によってコンドロイチン重合体を産生する方法。
【請求項１４３】
コンドロイチン重合体をコンドロイチンシンターゼによって任意的に産生し、コンドロイチン重合体を化学的方法又は酵素的方法のいずれかで任意的に硫酸化する、コンドロイチン重合体のインビトロにおける硫酸化方法。
【請求項１４４】
コンドロイチン重合体のエピマー化方法によって得られたデルマタン重合体であって、コンドロイチン重合体がコンドロイチンシンターゼによって任意的に産生されたデルマタン重合体。
【請求項１４５】
組換えによって産生したコンドロイチン多糖。
【請求項１４６】
ベータ１，４−結合ＧａｌＮＡｃ及びベータ１，３−結合ＧｌｃＵＡを１：１の多糖比で交互に含む多糖であって、（１）性質、白色アモルフェス粉末、（２）溶解性、アルコール、アセトン、クロロホルムに不溶性で、水及びジメチルスルホキシドに溶解性、（３）構成糖類、グルクロン酸及びＮ−アセチル−ガラクトサミンのみ、（４）分子量、１０００〜２５００００、（５）Ｈ−ＮＭＲスペクトル、硫酸化されていないコンドロイチンのシグナル特性を示す、（６）酵素感受性、コンドロイチナーゼＡＢＣには感受性であるが、ヒアルロン酸リアーゼには感受性ではない、及び（７）呈色反応、フェノール硫酸反応及びカルバゾール反応に陽性、という特性を任意的に更に有する多糖。
【請求項１４７】
コンドロイチンシンターゼをエンコードするコード領域をする精製核酸セグメントであって、配列番号１又は３の残基４５から７０４に任意的に対応する精製核酸セグメント。
【請求項１４８】
コンドロイチンシンターゼをエンコードするコード領域をする精製核酸セグメントであって、配列番号１又は３の残基７５から７０４に任意的に対応する精製核酸セグメント。
【請求項１４９】
コンドロイチンシンターゼをエンコードするコード領域をする精製核酸セグメントであって、配列番号１又は３の残基１から７０４に任意的に対応する精製核酸セグメント。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（連邦政府資金援助研究であることの声明）
本発明は米国国立衛生研究所（ＧＭ５６４９７）及び米国国立科学財団（ＭＣＢ−９８７６１９３）の助成金により行われたので、米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【０００２】
（関連出願の参照）
本出願は、米国特許仮出願第６０／１９９５３８号（２０００年４月２５日出願）表題「ＰＯＬＹＭＥＲ　ＦＯＲＭＡＴＩＯＮ　ＡＮＤ　ＲＥＣＯＧＮＩＴＩＯＮ　ＭＥＣＨＡＮＩＳＭＳ　ＡＮＤ　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＯＦ　ＭＡＫＩＮＧ　ＡＮＤ　ＵＳＩＮＧ　ＳＡＭＥ」に関し、かつその特典を請求し、係属中の米国特許出願番号第０９／２８３４０２号（１９９９年４月４日出願）表題「ＤＮＡ　ＥＮＣＯＤＩＮＧ　ＨＹＡＬＵＲＯＮＡＮ　ＳＹＮＴＨＡＳＥ　ＦＲＯＭ　ＰＡＳＴＥＵＲＥＬＬＡ　ＭＵＬＴＯＣＩＤＡ　ＡＮＤ　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＯＦ　ＵＳＥ」の一部係属出願であり、係属中の米国特許出願番号第０９／４３７２７７号（１９９９年１１月１０日出願）「ＰＯＬＹＭＥＲ　ＧＲＡＦＴＩＮＧ　ＢＹ　ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥ　ＳＹＮＴＨＡＳＥＳ」の一部係属出願である。
【０００３】
（発明の背景）
１．発明の分野
本発明はコンドロイチンシンターゼ遺伝子及びその生成方法及び使用方法に関する。限定するものではないが、更に具体的には、本発明はパスツレラマルトシダ（パスツレラマルトシダ）のコンドロイチンシンターゼ遺伝子及びその単離方法及び使用方法に関する。更に、本発明は硫酸化されていないコンドロイチンの使用及びその調製法、並びにデルマタン硫酸及びコンドロイチン硫酸重合体などの変更種への変換に関する。
【０００４】
２．発明に関する背景情報
グルコサミノグリカン（ＧＡＧ）はアミノ糖を含有する二糖の反復単位から成る長鎖の直線状多糖類で、ほとんどの動物に発見されている。コンドロイチン［β（１，４）ＧｌｃＵＡ−β（１，３）ＧａｌＮＡｃ］ｎ、ヘパリン／ヘパラン［α１，４）ＧｌｃＵＡ−［β（１，４）ＧｌｃＮＡｃ］ｎ及びヒアルロナン［β（１，４）ＧｌｃＵＡ−β（１，３）ＧｌｃＮＡｃ］ｎの３種はヒトで発見された最も一般的なＧＡＧである。コンドロイチン及びヘパリンは一般に、ｎ＝２０から１００であるが、ヒアルロナンは一般的にｎ＝１０３である。コンドロイチン及びヘパリンは糖蛋白質として合成され、脊椎動物では様々な位置が硫酸化される。ヒアルロナンは脊椎動物では硫酸化されない。ヘパリン及びコンドロイチンのＧｌｃＵＡを実質的に含む画分はエピマー化されてイズロン酸を形成する。
【０００５】
多くの下等動物は、これらと同じＧＡＧ又は非常に類似した分子を有する。ＧＡＧは、細胞表面上及び細胞外マトリックスにおいて、構造及び認識両面における役割を担っている。それらの物理学的特性、すなわち負の荷電密度が高く、多数の極性水酸基があることによって、ＧＡＧは組織を水和し、膨張させる。数多くのタンパク質が１個又は複数のＧＡＧに選択的に結合する。したがって、異なる細胞種の細胞表面又は関連する細胞外マトリックスに結合した蛋白質（たとえば、ＣＤ４４、コラーゲン、フィブロネクチン）は、ＧＡＧの媒介によって接着又は相互作用する。ＧＡＧはまた、ある種の蛋白質（たとえば、成長因子又は凝固因子）を隔離したり、細胞表面に結合させたりすることが可能である。
【０００６】
ある種の病原性細菌は、ビルレンス因子として作用する莢膜と呼ばれる細胞外コーティング多糖を産生する。この莢膜がＧＡＧ又はＧＡＧ様重合体から構成されている場合がいくつかある。微生物多糖は宿主ＧＡＧと同一であるか、又は非常に類似しているので、その抗体反応は非常に限定されているか、又は存在しない。この莢膜は、食作用及び補体などの宿主防御から回避するのに役立つものと考えられている。分子偽装というこのような賢い戦略の例としては、グラム陰性Ａ型のパスツレラマルトシダ及びグラム陽性Ａ及びＣ群　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ由来のＨＡ多糖がある。これらの微生物のＨＡ莢膜は菌力を増加させ、ＬＤ５０（細菌チャレンジ後の試験動物の５０％が致死するコロニー形成単位数）の測定値は１０２から１０３倍になる。
【０００７】
ある種のＥ．ｃｏｌｉ株の侵襲性及び病原性はまた、その莢膜多糖に起因する。２種類のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ莢膜、Ｋ４及びＫ５はＧＡＧ様重合体から成る重合体を形成する。このＥ．ｃｏｌｉ　Ｋ４重合体は、硫酸化されていないコンドロイチン主鎖のＧｌｃＵＡ残基のＣ３位にフルクトース側鎖が結合したものである。Ｋ５莢膜の要素は、ヘパロザン（ｈｅｐａｒｏｓａｎ）と呼ばれる多糖で、細菌性重合体では硫酸化されておらずＧｌｃＵＡからイズロン酸へのエピマー化が起こっていないこと以外はほ乳類のヘパリンと同じである。
【０００８】
ＧＡＧ生合成に関する研究は、一般的に多糖産生を理解する上で役立ってきた。ＨＡシンターゼ類は、分子レベルで同定された最初のＧＡＧグリコシルトランスフェラーゼである。これらの酵素類は、ＵＤＰ−糖ヌクレオチド基質を使用して何千もの二糖反復単位を含有する大きな重合体を生成する。細菌、脊椎動物、及びウイルスのＨＡＳ酵素をエンコードする遺伝子がクローニングされた。いずれの場合においても、単一のＨＡＳポリペプチドをエンコードするＤＮＡが外来宿主にＨＡ合成能力をもたらすことが発現研究によって示された。最近同定されたＨＡＳ、Ｐ．マルトシダ　ｐｍＨＡＳを除いて、これらの蛋白質はアミノ酸配列及び膜における予測トポロジーが同じである。これらの構造的な違い及び反応機構が異なる可能性によって、２種類のＨＡＳが存在するものと考えられた。
【０００９】
脊椎動物におけるコンドロイチン生合成に関する生化学的な研究は１９６０年代に始まった。最近になってようやくコンドロイチンの多糖主鎖を伸長するほ乳類酵素が生化学的手段によって試験的に同定された。脊椎動物の軟骨及び肝臓で発見された８０−ｋＤａのＧｌｃＵＡトランスフェラーゼは、アジドＵＤＰ−ＧｌｃＵＡプローブで光学的親和性標識することによってコンドロイチンの主鎖の生合成に関連していることが示された。ウシ血清から通常のクロマトグラフィによって、インビトロで適切なＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ及びＧｌｃＵＡトランスフェラーゼ活性を有する調製物が得られたが、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでは（約８０ｋＤａに移動する少数のバンドを含めた）いくつかのバンドが認められた。
【００１０】
コンドロイチン多糖［（ベータ−１，３−ＧａｌＮＡｃ−ベータ−１，４−ＧｌｃＵＡ）ｎ；ｎ＝約１０〜２０００）は、医薬品用又は化粧品用のヒアルロナン（ＨＡ）多糖基質として使用されている。コンドロイチン及びヒアルロナンはいずれも（眼科用又は関節用に適した）粘弾性ゲル又は（保湿剤又は創傷用包帯に適した）親水性、吸湿性材料に形成される。変更されていない、又は誘導体化されていないコンドロイチンは存在が知られていないか、又は存在するとしても人体では非常に少量である。主な利点は、（剪断、酵素、ラジカル又は酸化的プロセスによる）天然ＨＡの分解副産物は、血管新生、脈管形成、癌、組織変調に対してある種の生体学的活性を有するが、（先に述べたような硫酸化されていない、変更されていない状態の）コンドロイチンの同様の副産物は同様の生物学的活性を有さない可能性があることである。コンドロイチン重合体は類似のＨＡ分子よりも不活性で、漠然としている。Ｐ．マルトシダ　Ｆ型又はＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ由来又はＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ様のシンターゼ遺伝子を含有する組換え宿主から得られたコンドロイチンは、特有の特性を有する代わりの生体物質として役立つであろう。
【００１１】
ＨＡＳ類以外の関連微生物ＧＡＧシンターゼに関しては、ヘパロザンを合成するＥ．ｃｏｌｉ　Ｋ５グリコシルトランスフェラーゼのみが遺伝子的及び生化学的手段によって同定されている。ＨＡＳ類とは対照的に、二糖反復単位の糖を伸長する重合鎖に移すためには２種類の蛋白質、ＫｆｉＡ及びＫｆｉＣが必要なようである。Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ４のコンドロイチン主鎖シンターゼは酵素的な特徴が明らかになっているが、関連するグリコシルトランスフェラーゼ類をエンコードする遺伝子は未だ同定されていない。
【００１２】
多くのＰ．マルトシダ単離物を酵素的分解及び生細菌細胞の莢膜の除去によって調べたところ、ＧＡＧ又はＧＡＧ様分子が生じた。主要な家禽コレラ病原体であるＡ型のＰ．マルトシダは、ヒアルロニダーゼに感受性のある莢膜を形成する。その後莢膜抽出物の構造をＮＭＲで調べたところ、ＨＡは主要な多糖として存在することが確かめられた。ＨＡ特異的結合蛋白質、アグレカンはまたＡ型のＰ．マルトシダのＨＡと相互作用する。その他の異なる２種のＰ．マルトシダ、ブタの病原体であるＤ型及び少数派の家禽コレラ病原体であるＦ型は、それらの莢膜をＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍコンドロイチンＡＣリアーゼで分解して観察したところ、コンドロイチン又はコンドロイチン様重合体を産生する。莢膜を酵素的に除去した後、いずれの型もインビトロで好中球によって速やかに食菌された。Ｄ型細胞の莢膜はまた、へパリナーゼＩＩＩによって分解されることが報告されており、ヘパリン型分子が存在することも示されているが、Ｆ型細胞では報告されていない。
【００１３】
本発明では、Ｐ．マルトシダＦ型多糖の単糖成分を分析し、Ａ型のＨＡ生合成遺伝子座のＤＮＡ配列情報を使用して、Ｆ型染色体から相同な領域を得た。これらの研究から、ｐｍＣＳ（Ｐ．マルトシダコンドロイチンシンターゼ）と称するコンドロイチンシンターゼを同定した。これは、あらゆる原料から初めて同定され分子的にクローニングされたコンドロイチンシンターゼである。興味深いことに、単一のポリペプチドがＧｌｃＵＡ及びＧａｌＮＡｃ糖類の共重合化に関わっている。我々はまた、硫酸化されていないコンドロイチン重合体としてＦ型の莢膜重合体を同定した。我々はまた、硫酸化されていないコンドロイチン重合体の新規原料としてコンドロイチンシンターゼ遺伝子を有する微生物（Ｆ型　Ｐ．マルトシダ）を同定した。
【００１４】
（発明の概要）
本発明はコンドロイチンシンターゼ遺伝子及びその生成方法及び使用方法に関する。限定するものではないが、更に具体的には、本発明はパスツレラマルトシダのコンドロイチンシンターゼ遺伝子及びその単離方法及び使用方法に関する。更に、本発明は硫酸化されていないコンドロイチンの使用及びその調製法、並びにデルマタン硫酸及びコンドロイチン硫酸重合体などの変更種への変換に関する。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明はその使用を以下の記載又は図の説明において述べた詳細な構成要素の構成及び配置に限定するものではないことを理解されたい。本発明はその他の実施形態が可能であり、様々な方法で実践又は実施することが可能である。また、本明細書で使用した用語及び述語は説明するためのものであり、限定するものではないことを理解されたい。
【００１６】
本明細書では、「核酸セグメント」及び「ＤＮＡ部分」という用語は交換して使用することが可能で、特定の種の全ゲノムＤＮＡから単離されたＤＮＡ分子を意味する。したがって、本明細書では「精製」ＤＮＡ又は核酸セグメントとは、無関係なゲノムＤＮＡ、たとえば全パスツレラマルトシダ又は、たとえばほ乳類宿主ゲノムＤＮＡから既に単離又は精製された、コンドロイチンシンターゼ（「ＣＳ」）をエンコードする配列を含有するＤＮＡ部分のことである。「ＤＮＡ部分」という用語に含まれるのは、ＤＮＡ部分及びこのような部分の小さな断片、組換えベクター、たとえばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどである。
【００１７】
同様に、単離又は精製されたｐｍＣＳ（パスツレラマルトシダのコンドロイチンシンターゼ）遺伝子を含むＤＮＡ部分とは、その他の天然に生じる遺伝子又は蛋白質コード配列から実質的に単離された、コンドロイチンシンターゼをエンコードする配列を含むＤＮＡ部分のことである。この点において、「遺伝子」という用語は、機能的蛋白質、ポリペプチド又はペプチドをエンコードする単位を簡単に意味するために使用されている。当業者が理解するように、この機能的用語には、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列又はそれらの組合せが含まれる。「その他のコーディング配列から実質的に単離した」とは、このｐｍＣＳの場合、関心のある遺伝子がＤＮＡ部分のコード領域の重要な部分を形成し、このＤＮＡ部分が天然に生じるコーディングＤＮＡの大部分、たとえば大きな染色体断片又はその他の機能的遺伝子又はＤＮＡコード領域を含まないことを意味している。もちろん、これは元の遺伝子から単離されたＤＮＡ部分であり、人為的に後から追加されたり、又は故意に残されたりした遺伝子又はコード領域を除去していない。
【００１８】
原核細胞源の使用に関連した利点によっておそらく、パスツレラマルトシダからＣＳ遺伝子を単離する最大の利点が認識されるだろう。このような１利点とは、一般的に、真核細胞の酵素では真核細胞宿主でのみ実現可能なトランスレーション後の重要な変更が必要とされる可能性があることである。このため、入手した真核細胞のＣＳ遺伝子の適用が限定される傾向がある。更に当業者等は、原核細胞の酵素遺伝子を用いようとすれば、遺伝子操作にかかる時間及び簡便さの点で更に有利であることに気が付くであろう。これらのさらなる利点には、（ａ）原核細胞の遺伝子はゲノムの大きさが比較的小さいために単離が容易であること、したがって対応するゲノムライブラリのスクリーニング量を減じることができること、及び（ｂ）原核細胞遺伝子のコード領域全体の大きさはイントロンが欠如しているため著しく小さいので、操作が容易であることが含まれる。更に、コンドロイチンシンターゼ遺伝子の産生（すなわち、酵素）にトランスレーション後の変更又は補因子が必要であれば、該遺伝子を取り出した原核細胞と同様の細胞環境（宿主）においてこれらを最良に実現することができるであろう。
【００１９】
本発明と一致するＤＮＡ配列には更に、選択した組換え宿主において該配列の発現を可能にする遺伝子制御領域が含まれることが好ましい。もちろん、使用した制御領域の性質は一般に、想定する特定の用途（たとえば、クローニング宿主）に応じて変化するだろう。
【００２０】
特定の実施形態では、本発明はｐｍＣＳなどコンドロイチンシンターゼ遺伝子をエンコードするＤＮＡ配列を組み入れた単離されたＤＮＡ部分及び組換えベクターに関する。ｐｍＣＳの場合、単離されたＤＮＡ部分及びＤＮＡ配列を組み入れた組換えベクターにはそのアミノ酸配列内に配列番号２又は４に一致したアミノ酸配列が含まれる。更に、その他の特定の実施形態では、本発明は、アミノ酸配列内にコンドロイチンシンターゼ遺伝子又はＤＮＡ、とりわけパスツレラマルトシダコンドロイチンシンターゼ−ｐｍＣＳに対応するコンドロイチンシンターゼ遺伝子又はｃＤＮＡのアミノ酸配列を含む遺伝子をエンコードするＤＮＡ配列を組み込んだ単離ＤＮＡ部分及び組換えベクターに関する。たとえば、ＤＮＡ部分又はベクターが完全長のコンドロイチンシンターゼ蛋白質をエンコードするか、コンドロイチンシンターゼ蛋白質を発現させるために使用する目的の場合、好ましい配列とは本質的に配列番号２又は４に記載されたものである。
【００２１】
元の配列（配列番号１及び２）が修正された配列（配列番号２及び４）と異なるのは、元の機能的ｐｍＣＳ遺伝子をエンコードするプラスミド鋳型を広範囲に配列決定した後、元のＤＮＡ配列に配列決定を行った技師によるいくつかの間違いを発見したからである。元来、ｐｍＣＳ遺伝子のある部分は正確に配列決定することが非常に困難である。一般的に、問題のない配列で読み取ることのできる配列の長さは２００〜７００塩基である。しかし、ｐｍＣＳ遺伝子の場合、２０から５０塩基しか読み取れず、更に読み取りが困難な箇所がいくつかある。配列決定問題には通常２つの理由がある。その理由とは、（１）鋳型が反応中１本鎖のままで、問題の鋳型の中で２本鎖領域又はループを形成し、配列決定用のポリメラーゼが鋳型から早期に離脱する原因となること、及び（２）配列決定産物が電気泳動用ゲルを泳動している間にループ構造又はねじれた構造を形成し、所望する１本鎖構造で泳動されないこと、である。そこで、ｐｍＣＳの実際のＤＮＡ及び蛋白質配列を反映させるために配列を修正した。
【００２２】
配列番号１及び２は、ジーンバンク登録番号ＡＦ１９５５１７に登録した。
【００２３】
コンドロイチンシンターゼ活性を有する核酸セグメントは、本明細書で説明した方法によって単離することが可能である。「本質的に配列番号２又は４で記載した通りの配列」という用語は、その配列が配列番号２又は４の一部と実質的に対応しており、配列番号２又は４のアミノ酸と同じでないアミノ酸配列が比較的少なく、又は生体機能が等価であることを意味する。「生体機能が等価である」という用語は、当業界ではよく理解されており、本明細書では、本質的に配列番号２又は４で記載した通りの配列を有し、コンドロイチン又は「コンドロイチン様」重合体又はコンドロイチンシンターゼポリペプチドを産生する原核細胞の能力に関連した遺伝子として更に詳細に定義する。
【００２４】
当業者は、酵素的に活性のあるコンドロイチンシンターゼをエンコードする核酸セグメントが、配列番号１、２、３又は４で記載した配列に対して保存された、又は半保存された置換を含むことが可能で、まだ本発明の範囲内であることを理解するであろう。
【００２５】
特に当業界では、核酸セグメントに構造的な変化を起こしても（すなわち、保存的に、又は半保存的にアミノ酸置換をコードしても）酵素的又は機能的活性を維持させることができる技術能力の例が豊富である。たとえば、（１）Ｒｉｓｌｅｒ他「Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ　Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａ　Ｐａｔｔｅｒｎ　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　Ａｐｐｒｏａｃｈ．」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０４：１０１９〜１０２９（１９８８）［「．．．確認されたアミノ酸側鎖の交換能によれば、４群、（ｉ）Ｉｌｅ及びＶａｌ、（ｉｉ）Ｌｅｕ及びＭｅｔ、（ｉｉｉ）Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＧｌｎ、及び（ｉｖ）Ｔｙｒ及びＰｈｅのみについて説明することができる。」］、（２）Ｎｉｅｆｉｎｄ他。「Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ　Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ　Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍｏｄｅｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｍａｉｎ−Ｃｈａｉｎ　Ｆｏｌｄｉｎｇ　Ａｎｏｌｅｓ．」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：４８１〜４９７。（１９９１）［類似性パラメータによってアミノ酸置換を設計することが可能である］及び（３）Ｏｖｅｒｉｎｇｔｏｎ他「Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ　Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　Ｔａｂｌｅｓ：Ｔｅｒｔｉａｒｙ　Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｆｏｌｄｓ」Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　１：２１６〜２２６（１９９２）［「局所的な環境と相関して観察された置換のパターンを分析することによって、異なるパターンが存在することが示される．．．」適合性の変化を起こすことができる。］を参照のこと。
【００２６】
これらの参考文献及び当業者に有用なその他無数の文献では、核酸配列を仮定すれば、当業者等はその機能を変化させることなく該核酸配列を置換及び変更できることを示している。また、置換された核酸セグメントは同一性が高く、純粋な親では酵素活性を維持することが可能であるが、ハイブリダイズすることができない。
【００２７】
当業者等はまた、本発明の範囲及びクレームを逸脱することなく、配列番号１又は３に挙げたｐｍＣＳ核酸セグメントを置換できることを理解するであろう。標準的アミノ酸置換及び許容される機能的に等価なアミノ酸置換を表Ｉに挙げる。
【００２８】
【表１】
2004512013.tif 000002
【００２９】
本発明の他の好ましい実施形態は、更に組換えベクターとして定義した配列番号２又は４と一致した蛋白質をエンコードする精製核酸配列である。本明細書では、「組換えベクター」という用語は、コンドロイチンシンターゼ蛋白質をエンコードする核酸セグメント又はその断片を含有するように変更されたベクターを意味する。該組換えベクターは更に、前記コンドロイチンシンターゼをエンコードする核酸セグメントに操作可能に結合したプロモーターを含む発現ベクターとして定義することが可能である。
【００３０】
本発明の更に好ましい実施形態は、コンドロイチンシンターゼ遺伝子を含む組換えベクターで組換えられた宿主細胞である。好ましい組換え宿主細胞は原核細胞であることが可能である。他の実施形態では、組換え宿主細胞は真核細胞である。本明細書では、「操作した」又は「組換え」細胞と言う用語は、コンドロイチンシンターゼをエンコードする遺伝子などの組換え遺伝子を導入した細胞を意味するものである。したがって、操作した細胞は、組換えによって導入した遺伝子を含有しない天然に生じる細胞から区別することができる。したがって、操作した細胞は人為的に導入された遺伝子又は複数の遺伝子を有する細胞である。組換えによって導入された遺伝子は、ｃＤＮＡ遺伝子、ゲノム遺伝子のコピーの形態であるか、又は特定の導入遺伝子に天然では関連しないプロモーターに隣接するように配置された遺伝子が含まれる。
【００３１】
組換えコンドロイチンシンターゼの産生にＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ以外の宿主を使用することを所望する場合、原核細胞系、たとえばＥ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．を使用することが有利で、更に真核細胞系、たとえば酵母又はチャイニーズハムスター卵巣細胞、アフリカミドリザル腎細胞、ＶＥＲＯ細胞なども使用することが有利である。もちろん、実施に当たって一般的に、選択したそれらの代替宿主において配列が機能するような制御条件下にコンドロイチンシンターゼ遺伝子を置くことが望ましい。適切なＤＮＡ制御配列及びその構成及び用途は、一般に当業界でよく知られており、以下に更に詳細に説明する。
【００３２】
好ましい実施形態では、コンドロイチンシンターゼをエンコードするＤＮＡ部分には更に、複製起点として、又は特定の宿主によって隣接した配列の複製を可能にする「レプリコン」として機能することが当業界で知られているＤＮＡ配列が含まれる。このような起点は、染色体外に位置するコンドロイチンシンターゼＤＮＡ配列が連結されたキメラ部分又はプラスミドの調製及び複製を可能にする。より好ましい場合では、生物工学的使用に適した細菌宿主において複製を可能にする起点を使用する。しかし、クローニングしたＤＮＡ部分がより多機能であるためには、（シャトルベクターにおけるように）用途を考慮したその他の宿主系によって認識される起点を代わりに又は追加して使用することが望ましいかもしれない。
【００３３】
いくつかの高等生物におけるクローニング又は発現のために使用可能なＳＶ４０、ポリオーマ又はウシパピローマウイルスの起点などのその他の複製起点の単離及び使用は、当業者等にはよく知られている。したがって、ある実施形態では、選択した制御領域の制御下にコンドロイチンシンターゼコーディング遺伝子配列と共に適切な複製起点を含む組換え形質転換ベクターによって本発明を定義することが可能である。
【００３４】
したがって、当業者等は本開示を知るに当たり、コンドロイチンシンターゼ遺伝子又はｃＤＮＡを得るためにその他の手段を使用できることを理解するであろう。たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応又はＲＴ−ＰＣＲによって、その他のＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ株又はその他の真核細胞源を含めたいくつかの原料、たとえばｃＤＮＡライブラリから、完全な相補的遺伝子又はｃＤＮＡを含有するＤＮＡ断片を生成して得ることが可能である。本発明では、ＤＮＡ断片を生成するために、ほとんどあらゆる分子クローニング法を使用することが可能である。したがって、一般的にＤＮＡ単離に使用する特定方法において唯一制限となるのは、単離した核酸が生体学的に機能が等価なコンドロイチンシンターゼをコードしなければならないことである。
【００３５】
ＤＮＡを単離したら、選択したベクターと連結する。本発明による利点を実現するために、ほとんどあらゆるクローニングベクターを使用することができる。一般的に有用なベクターには、原核生物用のプラスミド及びファージ、更には真核生物用のウイルスベクターも含まれる。例として、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＡ３、組換えラムダウイルス、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス及びレトロウイルスが含まれる。しかし、最終的にＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ又はＢａｃｉｌｌｕｓ株及びＥ．ｃｏｌｉ又はＰ．マルトシダの両方で複製可能なベクターを使用する場合が特に有利であるものと考えられる。
【００３６】
Ｄａｏ及びＦｅｒｒｅｔｔｉのｐＳＡ３ベクター又はＴｒｉｅｕ−Ｃｕｏｔ他のｐＡＴ１９ベクターによって例示されるこれらのベクターによって、Ｅ．ｃｏｌｉなど操作の容易な宿主においてクローニングコロニーの選択を実施し、その後コンドロイチン産生のために食品グレードのＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ又はＢａｃｉｌｌｕｓ株に戻すことが可能になる。これらは良性で、ある種の食品及び生物工学製品の生産に使用され、よく研究がなされている生物で、当業界では他の場合においてＧＲＡＳ（一般的に安全）として公知である。遺伝子投与によってＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ又はＢａｃｉｌｌｕｓ株のコンドロイチン合成能を増大させることができ（すなわち、増幅によってＨＡシンターゼ遺伝子を更にコピーする）、及び／又はコンドロイチン前駆体であるＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ及びＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの利用性を増大させるために遺伝子を更に含めることができるので、ＧＲＡＳ生物は有利である。これらの前駆体はＵＤＰ−グルコース脱水素酵素及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ／ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃエピメラーゼそれぞれの作用によって形成される。コンドロイチンシンターゼ遺伝子を有するプラスミドのコピーを更に形成したり、又は増幅したりすることによって、微生物がコンドロイチンを合成する本来の能力を増大することもまた可能である。この増幅によって、プラスミドコピー数、したがってコンドロイチンシンターゼ遺伝子コピー数を１０倍まで増加させることができる。
【００３７】
コンドロイチンシンターゼ遺伝子コピー数を更に増加させる他の方法は、遺伝子の複数コピーをプラスミドに挿入することである。他の方法には、コンドロイチンシンターゼ遺伝子の染色体ＤＮＡへの組み込みが含まれる。このような他の増幅方法は、コンドロイチンシンターゼ遺伝子の大きさが小さいので特に実施に適している。手法によっては、選択された宿主内で挿入したＤＮＡを発現できるベクターを使用すれば、染色体ＤＮＡ連結ベクターを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ又はＢａｃｉｌｌｕｓなどクローンスクリーニング用に選択された宿主をトランスフェクトできる。場合によっては、特に安定性を付与するために、コンドロイチンシンターゼ遺伝子などの遺伝子を操作可能な様式で染色体の様々な位置に組み込むことが可能である。プラスミドとは異なり、組み込まれた遺伝子は組み換え遺伝子を維持するために淘汰圧を必要としない。
【００３８】
皮膚又は滑膜の繊維芽細胞又は鶏冠細胞などの真核生物源を使用する場合、最初にｃＤＮＡライブラリの調製に着手することが望ましい。これにはまず、前記細胞からｍＲＮＡを単離して、次に逆転写酵素活性を有する酵素を使用して２本鎖ｃＤＮＡを調製し、選択したベクターに連結することによって実施する。２本鎖ｃＤＮＡを調製する数多くの可能性が当業界では公知かつ利用可能で、このような技法は全て使用できるものと考えられる。好ましい技法には逆転写法が含まれる。２本鎖ｃＤＮＡの集団が獲得できたら、許容される技法、たとえば適切なベクターへの連結及び適切な宿主での増幅などによって、ｃＤＮＡライブラリを選択した宿主内に調製する。得られるクローン数が多く、前述した技法による大量クローンのスクリーニング法が比較的容易なので、ファージ発現ベクター、たとえばλｇｔ１１、λｇｔ１２、λＧｅｍ１１、及び／又はλＺＡＰをｃＤＮＡクローンのクローニング及び発現スクリーニングに使用することが望ましいかもしれない。
【００３９】
その他のある実施形態では、本発明は本質的に配列番号１で記載した核酸配列を配列内に含む単離ＤＮＡ部分及び組換えベクターに関する。「本質的に配列番号１で記載した」という用語は、前述したものと同様の意味で使用されており、核酸配列が実質的に配列番号１の部分に対応し、配列番号１のコドンと同一でないか、又は機能的に等価ではないコドンが比較的少ないことを意味する。本明細書では「機能的に等価なコドン」とは、同じアミノ酸をエンコードするコドン、たとえば表Ｉに記載したようなアルギニン又はセリンの６個のコドンを意味し、生物学的に等価なアミノ酸をエンコードするコドンもまた意味する。
【００４０】
アミノ酸及び核酸配列には更に、他のＮ末端又はＣ末端アミノ酸又は５’又は３’核酸配列などの他の残基を含めることが可能で、蛋白質発現及び酵素活性に関与する生物学的な蛋白質の活性の維持を含めて配列が前述の基準に合う限り、まだ本質的に本明細書で開示した配列の１つに記載したものと同じであることがまた、理解されるだろう。末端配列の添加は特に、たとえばコード領域の５’又は３’部分のいずれかに隣接する様々な非コーディング配列を含むか、又は遺伝子内で生じることが知られている様々な内部配列を含むことが可能な核酸配列に適用される。
【００４１】
同様に、ポリペプチドのある部分を削除することが望ましい場合がある。たとえば、カルボキシル末端を欠失したｐｍＨＡＳ又はｐｍＣＳの機能的短縮型は、インビトロで使用する場合の利用性が高まっている。（図２、表３）ｐｍＨＡＳ１〜７０３及びｐｍＣＳ１〜７０４（それぞれ、９７２残基及び９６５残基）は完全長蛋白質とは対照的に精製が容易な溶解性蛋白質である。また、膜への過剰な負担がないので、発現レベルは非常に増加する。ｐｍＣＳの短縮型には残基４５〜７０４及び残基７５〜７０４が含まれることもまた意図される。これらの短縮型もまた、溶解性が高く、発現量が増加している。天然の膜蛋白質は低濃度でしか見いだされず、界面活性剤で特別な処理をしないと溶解性にはならない。
【００４２】
遺伝子コードの縮重並びに保存及び半保存された置換基を見込んでも、約４０％と約８０％との間、より好ましくは約８０％と約９０％との間、更により好ましくは約９０％と約９９％との間の配列が配列番号１のヌクレオチドと同一な配列は、「本質的に配列番号１で記載された通り」である配列であろう。配列番号１で記載された配列と本質的に同じ配列はまた、標準又は厳密性の低いハイブリダイズ条件下で、配列番号１の相補体を含有する核酸セグメントとハイブリダイズすることができる配列として機能的に定義することができる。適切な標準的ハイブリダイゼーション条件は当業者には周知で、本明細書で明記してある。ある種のドメイン及び活性部位は全ポリペプチドの比較的小さな部分から形成されているので、これらの領域の配列同一性又は類似性は遺伝子の一部においてのみ存在することが可能である。
【００４３】
当業界で周知の通り、蛋白質のアミノ酸の大部分は蛋白質の「足場材料（ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ）」又は一般的な環境を形成するために存在している。特定の所望する触媒作用を担う実際の役割部分は通常、一連の小さなドメイン又はモチーフである。したがって、同一の又は同様のモチーフを有する一対の酵素は、同一又は同様の触媒活性を有することが予測され、従って機能的に等価であろう。このことが予測される一組の酵素は、組合せの片方の酵素が有用ではあるが異なった一連の特性を持たなければ、相互交換して使用することが可能であるものと考えられる。同じような趣旨で、ある種の重要ではないモチーフ又はドメインを元の天然に生じる蛋白質から除去しても機能に影響を与えないことが可能である。重要ではない残基の除去は、残された重要なモチーフ又はドメインの重要な作用を攪乱しない。十分な計画及び知識から類推して、１酵素から他のポリペプチドへモチーフ又はドメインを転位して、新しい酵素にそのドメイン又はモチーフに本来備わっている所望する特性を付与することが可能である。
【００４４】
本明細書では「標準的ハイブリダイゼーション条件」という用語は、実質的に相補的な核酸セグメントが標準的なワトソン−クリック塩基対を形成するような条件を説明するために使用されている。結合又はハイブリダイゼーションの特異性を決定するには、いくつかの要素、たとえばｐＨ、温度、塩濃度、薬剤、たとえばホルムアミド及びジメチルスルホキシドの存在、ハイブリダイズする部分の長さなどが知られている。短い核酸セグメント、たとえばヌクレオチド約１４個から約１００個の間のヌクレオチド断片をハイブリダイゼーションに使用しようとするとき、一晩ハイブリダイゼーションするために好ましい塩及び温度の条件は、１．２〜１．８×ＨＰＢ、４０〜５０℃又は５×ＳＳＣ、５０℃である。厳密性のために低い塩濃度（塩１０ｍＭ又は０．１×ＳＳＣ）での洗浄を使用し、インキュベーション時間は室温で１０〜６０分にする。
【００４５】
もちろん、本発明はまた、配列番号１、２、３又は４に記載された配列に相補的、又は本質的に相補的なＤＮＡ部分を包含する。「相補的」な核酸配列とは、標準的ワトソン−クリック相補性規則による塩基対を形成できる配列である。本明細書では、「相補的配列」という用語は、前述のヌクレオチド比較によって評価して、又は配列番号１の核酸セグメントとハイブリダイズできると定義して、実質的に相補的な核酸配列を意味する。
【００４６】
本発明の核酸セグメントは、コーディング配列自体の長さに関係なく、その他のＤＮＡ配列、たとえばプロモーター、ポリアデニル化シグナル、他の制限酵素部位、マルチクローニングサイト、エピトープタグ、ポリヒスチジン領域、その他のコーディング部分などを一緒にすることが可能で、その結果全体の長さをかなり変更することが可能である。したがって、調製が容易で、目的とする組換えＤＮＡ方法での使用に好ましいように全体の長さを限定すれば、ほとんどどんな長さの核酸断片でも使用することが可能であると考えられる。
【００４７】
もちろん、本発明は配列番号１、２、３又は４の特定の核酸配列及びアミノ酸配列に限定されるものではないことがまた理解されよう。したがって、組換えベクター及び単離ＤＮＡ部分は、それぞれコンドロイチンシンターゼコード領域自体、基本のコード領域を選択的に改変又は変更したコード領域を含むことが可能で、又はそれらはコンドロイチンシンターゼコード領域を含むけれども大きいポリペプチドをエンコードすることが可能であり、又は変種のアミノ酸配列を有する生体学的機能が等価な蛋白質又はペプチドをエンコードすることが可能である。
【００４８】
本発明のＤＮＡ部分は、生体学的機能が等価なコンドロイチンシンターゼ蛋白質及びペプチドを包含する。このような配列は、核酸配列内、したがってコードされた蛋白質内に天然に生じることが知られているコドン重複性及び機能的等価性の結果として生じることが可能である。又は、機能的に等価な蛋白質又はペプチドは、交換するアミノ酸の特性を考慮して、蛋白質構造の変化を操作可能にする組換えＤＮＡ技術を適用して作り出すことが可能である。部位特異的突然変異技術を使用して人為的に考案された変更を導入して、たとえばコンドロイチンシンターゼ蛋白質の酵素活性又は抗原性の改善を導入したり、又はコンドロイチンシンターゼ活性を調べるために分子レベルでコンドロイチンシンターゼ変異体を試験したりすることが可能である。
【００４９】
また、コンドロイチンシンターゼコーディング配列を特異的に変更した結果、大きさの分布又は立体的配置が変更したコンドロイチンを産生することができる。当業者は、改変コンドロイチンシンターゼを産生して、次に重合体の大きさ及び／又は機能的能力が異なるコンドロイチンを産生することができるような方法で、コンドロイチンシンターゼコーディング配列を操作できることを理解するであろう。たとえば、コンドロイチンシンターゼが、今まで取り込まれたことのない糖又は糖誘導体を含めることによって異なる構造をとる新規のコンドロイチン様重合体を産生するように、コンドロイチンシンターゼの糖基質特異性を変更する様な方法でコンドロイチンシンターゼコーディング配列を変更することが可能である。この新たに取り込まれた糖によって、機能特性の異なる変更コンドロイチンを得ることが可能である。コンドロイチンシンターゼコーディング配列の場合当業者が理解するように、これらの所望する特性及び／又は大きさの変更を実現できるように、コンドロイチンシンターゼコーディング配列に変更及び／又は置換を施すことが可能である。
【００５０】
ｐｍＣＳの基質結合部位（たとえば、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ部位又はＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ部位又はオリゴ糖受容体部位）に関する基本的な知識によって、結合部位の触媒特性を変化させる変異を起こさせる残基を絞り込むことが可能になる。ｐｍＨＡＳの重要な触媒残基の正体、ｐｍＣＳに類似した相同体は近年解明された（Ｊｉｎｇ　＆　ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ、２０００、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ　１０；ｐｐ．８８３〜８８９）。これらの残基又はその近隣を適切に変更することによって、基準のコンドロイチン糖前駆体の代わりにその他のＵＤＰ−糖を結合させることが可能である。したがって、新規に変更された重合体が合成される。重合体の大きさの違いは、シンターゼの触媒効率の違い、又は受容体部位の親和性の変化によって引き起こされる。重合体の大きさの違いは、様々な残基を変異させることによって、ｓｅＨＡＳ及びｓｐＨＡＳ（Ｗｅｉｇｅｌ他、ＨＡの発案者）並びに脊椎動物のＨＡＳ、ｘｌＨＡＳ１（ＤＧ４２）（Ｐｕｍｍｉｌｌ　＆　ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ、未発表データ）において生じた（図６及び図７）。ｐｍＣＳはより適応性があるので、これらその他の酵素よりも頑丈で、変更された重合体を合成するｐｍＣＳ変異体と同様か、又はそれよりも優れた酵素もまた可能である。
【００５１】
本明細書では、「変更された構造」という用語は、天然で生じるコンドロイチンポリペプチドにおいて通常認められない糖又は誘導体を含むコンドロイチン重合体のことである。「変更された大きさ分布」という用語は、天然の酵素では通常認められない大きさ分布のコンドロイチン分子を合成することである。操作された大きさは、通常よりも小さい、又は大きいことが可能である。
【００５２】
大きさの異なる様々なコンドロイチン産物は、薬剤送達の分野に応用でき、構造が改変された酵素の生成は、大きさの異なるコンドロイチンと組み合わせることができる。単糖数が約１０〜２０個のコンドロイチン重合体を大量に形成することができれば、脈管形成及び創傷治癒において使用できる可能性は広い。小さなコンドロイチンオリゴ糖はその他に、医療用に使用する組換えヒト蛋白質を安定化する場合に特定して使用される。このような蛋白質の主な問題点は、血液からの除去され、生物学的半減期が短いことである。この問題の当面の解決法は、蛋白質が迅速すぎる循環によって除去されるの防ぐように小さな分子防御物を結合させることである。非常に小さな分子量のコンドロイチンは、この役割に適しており、免疫原性がなく、生体適合性である。薬剤又は蛋白質に結合した分子の大きなコンドロイチンは、コンドロイチンをエンドサイトーシスする受容体を有する網膜内細胞系を標的として使用することが可能である。大きな重合体を高濃度で使用して、関節潤滑剤、眼科的処置用品及び化粧品とすることが可能なゲル又は粘稠溶液を形成することが可能である。
【００５３】
当業者は、この開示があればコンドロイチンシンターゼによって生成されるコンドロイチン重合体の大きさ分布を制御して異なる大きさにするいくつかの方法があることを理解するであろう。まず、産物の大きさの速度論的制御は、温度を下げ、酵素作用時間を減少させ、１種又は両方の糖ヌクレオチド基質の濃度を減少させることによって変化させることができる。これらの変動要因のいくつか又は全てを減少させることによって、コンドロイチン産物の量及び大きさを減少させるだろう。これらの取り組みの欠点は、産物の収率もまた減少し、日によって、又はバッチ毎に再現性を実現することが困難な可能性があることである。
【００５４】
第２に、この酵素が大きなコンドロイチン産物を合成する本来の能力を変化させる。蛋白質の変化は、特異的なアミノ酸の置換、欠失及び添加を含めた組換えＤＮＡ技術によって（又は代謝プロセシングによる置換基の導入によっても）操作することができる。次に、本来反応速度の遅い酵素にもたすこのような変化によって、速度論的手段によってコンドロイチンの大きさを再現性よく制御することが可能になる。最終的なコンドロイチンの大きさ分布は、配列中の特定のアミノ酸に依拠する酵素のある特性によって測定される。連鎖球菌のヒアルロン酸シンターゼ、真核生物のヒアルロン酸シンターゼ及びｐｍＣＳの間で完全に保存されている残基の１０〜２０％の中には、該酵素が生成する重合体（ヒアルロナン又はコンドロイチン）の大きさを制御するか、又は非常に大きな影響を及ぼすことが可能な特有の位置に一組のアミノ酸が存在する。
【００５５】
ｘｌＨＡＳ１−Ｓｅｒ７７変異体のＨＡ産物の大きさの分析は図６及び７で示した通りである。様々な酵素について５分又は３０分間アッセイして、ＨＡ重合体産物を高速ゲル濾過によって分離した。７７位で置換したアミノ酸残基の性質に応じて、野生型酵素によって重合化したＨＡ産物と比較してより大きな、又はより小さなＨＡ産物が形成された。２種の変異体においてのみ、Ｓｅｒ７７Ｉｌｅ（大きなＨＡ）及びＳｅｒ７７Ｔｈｒ（小さなＨＡ）及び野生型シンターゼが示された。図Ａ：ＰｏｌｙＳｅｐ−４０００カラムで分離された５分後の産物。図Ｂ：ＰｏｌｙＳｅｐ−６０００カラムで分離された３０分後の産物。対照として、５８０−ｋＤａデキストラン標準物は、４０００又は６０００カラムにおいてそれぞれ１２．５分又は１６．８分に溶出した。
【００５６】
これらの残基のいずれかにおいて特異的な変化を起こすと、変更された大きさ分布を有するヒアルロナン又はコンドロイチン産物を産生する変更されたヒアルロナン又はコンドロイチンを産生することができる。ヒアルロナン、又はコンドロイチンが遊離する前に酵素が形成することができるヒアルロナン又はコンドロイチン重合体の本来の大きさを減少させるようにｓｅＨＡＳ、ｓｐＨＡＳ、ｐｍＨＡＳ、ｃｖＨＡＳ、ｐｍＣＳを操作して変化を加えることは、天然の酵素よりも小さい、又は大きいことが可能なヒアルロナン又はコンドロイチン重合体のいずれかを産生する強力な手段となるだろう。
【００５７】
最後に、生成した分子量の大きいコンドロイチンを特異的なコンドロイチナーゼによって分解して、分子量の小さいコンドロイチンにした。しかし、この操作は再現性を実現することが非常に困難で、細心の注意を払ってコンドロイチンを再精製してコンドロイチナーゼ及び所望しない消化産物を除去しなければならない。
【００５８】
構造的に変更したコンドロイチンは、所望するコンドロイチンシンターゼ及び／又は、限定はしないがより具体的にはｐｍＣＳの特定のアミノ酸を変更することによってコンドロイチン産物の大きさ分布を変更することと概念的に違いはない。アミドからアセチル基を除去するか（ＵＤＰ−ＧａｌＮ）、又は他の化学的に有用な基で置換した（たとえば、フェニルによってＵＤＰ−ＧａｌＮＰｈｅを形成する）ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの誘導体は、特に有用であることが期待される。ＧａｌＮを取り入れた前記の場合において、コンドロイチンを誘導体化する化学反応では、遊離のアミノ基が使用されるであろう。後者の場合、ＧａｌＮＰｈｅはより疎水性な、又はエマルジョンを形成する傾向がある重合体を形成するだろう。高い基質特異性は、保存された１０〜２０％の中の特定のアミノ酸群に依る可能性がある。これらの残基の１個又は複数を特異的に変更することによって、１個又は複数の基質との相互作用する特異性が天然の酵素よりも少ない機能的コンドロイチンシンターゼが作り出される。このように改変された酵素は、次に他の天然又は特定の糖ヌクレオチドを使用して、以下の目的のために使用する様々な化学物質を形成するよう考えられた糖誘導体を作り上げることができる。その目的とは、（ｉ）一般的な、又は標的への薬物送達、放射線による方法などのために特定の薬剤、蛋白質、又は毒素を構造的に変更したコンドロイチンに共有結合させること、（ｉｉ）強力な物理特性を備えたゲル、又はその他の３次元的生体物質を実現するために、ヒアルロン酸自身を他の支持体に共有架橋結合させること、及び（ｉｉｉ）生体適合フィルム又は単層を作製するためにヒアルロン酸を表面に共有結合させることである。
【００５９】
実験方法
材料及びＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ株−特に記載がなければ、化学物質は全てＳｉｇｍａ又はＦｉｓｈｅｒから入手し、分子生物学的試薬は全てＰｒｏｍｅｇａから入手した。野生型の莢膜を有するＦ型Ｐ．マルトシダ株、Ｐ−４６７９及びＰ−３６９５は、Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｒｉｍｌｅｒ博士（ＵＳＤＡ、Ａｍｅｓ、ＩＡ）から恵与された。これらの株は家禽コレラに罹ったシチメンチョウから単離された。光学顕微鏡及びインドインク莢膜染色によって判断したところ、Ｐ−４６７９はＰ−３６９５より少し大きい莢膜を持っていた。後者の株にはまた、特性の判明していないプラスミドが内在していた。
【００６０】
Ｆ型莢膜物質の炭化水素分析−Ｆ型細菌の莢膜にある陰イオン重合体は、尿素抽出法及び塩化セチルピリジニウム沈殿法によって精製した。Ｐ−４６７９は、完全合成培地（１５０ｍｌ）中でゆっくり振盪しながら３７℃で一晩増殖させた。細胞を遠心（３０００ｘｇ、１０分）によって収集し、遠心及び再懸濁を繰り返してＮａＣｌ　０．１Ｍで２回洗浄した。８Ｍ尿素３ｍｌで９８℃で８分抽出することによって、莢膜を除去した。高速で遠心して（１５０００ｘｇ、１０分）細胞を除去し、該尿素溶液を１体積のクロロホルムで２２℃で３回抽出した。水性抽出物中のＧＡＧを、塩化セチルピリジニウムを添加することによって（最終濃度１％　ｗ／ｖ）沈殿させた。実質的な多糖はまた、同様の方法で使用した培養液から沈殿させることが可能である。１０分間静置して、沈殿物を高速遠心によって収集し、ＮａＣｌ　２．５Ｍに再溶解した。高速遠心によって該混合物を透明化し、上清を３体積のエタノールで沈殿させた。該沈殿物を７０％エタノールで洗浄し、少し乾燥させ、ＮａＣｌ　２．５Ｍに再懸濁した。エタノール沈殿方法を繰り返し、ペレットを水に再溶解した。エタノール沈殿（２体積）をもう１回実施した。最終的なＧＡＧペレットを水に溶解した。収率（全抽出物についてウロン酸０．６ｍｇ）は、グルクロノラクトン標準物を使用したウロン酸のカルバゾール測定法によって決定した。
【００６１】
ＧＡＧ抽出物の単糖組成を酸加水分解（２Ｍ　ＨＣｌ、４時間、１００℃）及び高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィによって決定した。加水分解物を繰り返し水で希釈して、真空下で乾燥させてＨＣｌを除去し、次いでラムノース標準物と混合し、０．２μｍスピンフィルタを使用して透明化した。加水分解物の一部（ウロン酸約５ｎｍｏｌｅ）をＮａＯＨ　１２ｍＭで平衡化したＰＡ−１カラム（Ｄｉｏｎｅｘ）に注入した。イソクラティック溶出（２５分）によって中性糖類を分離した後、酢酸ナトリウムの勾配（３０分で０Ｍから０．１８Ｍ）を使用して酸性糖類を分離した。溶出した成分をパルス電流測定検出によって検出した。並行して、公知の単糖標準物である（サメ軟骨由来の）基準コンドロイチン硫酸Ｃ加水分解物をＦ型試料に添加して実施した。ＨＡ及びヘパリン加水分解標準物もまた実施した。ラムノース内部標準物に対する滞留時間を算出した。
【００６２】
Ｆ型ゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析−ｐｍＨＡＳハイブリダイゼーションプローブを使用したサザンブロット分析の予備実験データから、Ａ型及びＦ型微生物は莢膜遺伝子座が非常に相同であることが示唆された。これらの所見を確認するためにＰＣＲを利用した。Ａ型莢膜遺伝子座の様々な領域に対応したオリゴヌクレオチドプライマーを使用したＰＣＲ反応（２０μｌ）において、Ｆ型染色体ＤＮＡ（０．１μｇ）を鋳型として使用した。製品に付属の緩衝液に溶かしたＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｓｈｅｒ）でＰＣＲ（９４℃、３０　５、４２℃３０　５、７２℃４分）を４０サイクル行った後、試料をアガロースゲルによる電気泳動法によって分離した。全部ではないが、多くのプライマー対がＦ型ＤＮＡを増幅して予測された大きさの産物を生じたので、Ａ型及びＦ型の遺伝子座が相同であると推定された。２個のプライマー（Ｐｍ１０、５’−ＣＡＣＴＧＴＣＴＡＡＣＴＴＴＡＴＴＧＴＴＡＧＣＣ−３’配列番号５、Ｐｍ２１、５’−ＴＴＴＴＴＡＡＣＧＡＡＴＡＧＧＣＴＧＴＣ−３’配列番号６）を選択して、ＫｆａＡ相同体のカルボキシル末端半分及び予測多糖シンターゼのアミノ末端部分をエンコードするＤＮＡを含有することが予測されるＦ型遺伝子座の３．６ｋｂ部分を増幅した。ＰＣＲ反応（２６サイクル）の産物を製造元の指針に従ってＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。該プラスミドをＰｍ１０又はＰｍ２１プライマーを用いたサイクルシークエンシング（３３Ｐ−ターミネータによるＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）システム、Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって分析した。Ｆ型ＤＮＡから得られたＰＣＲ産物の予備実験による配列データは、Ａ型遺伝子座の配列と高い相同性（約８０％）を示した。したがって、３．６−ｋｂの挿入部分をプラスミドから切り出し、ゲルによって精製して、ジゴキシゲニン（Ｈｉｇｈ　Ｐｒｉｍｅ　ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で標識して、ハイブリダイゼーションプローブとして使用した。
【００６３】
莢膜を生合成遺伝子座ＤＮＡの単離−ＢａｍＨＩで切断したＺａｐ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　ＴＭベクター系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、Ｓａｕ３Ａで部分消化したＰ−４６７９　ＤＮＡ（挿入物の平均長４〜９ｋｂ）のラムダライブラリを作製した。採取したプラークをジゴキシゲニン標識プローブとハイブリダイゼーションさせ、製造元の指針を使用して呈色させて（５ｘＳＳＣ、５０℃、１６時間）スクリーニングした。Ｅ．ｃｏｌｉのＸＬＩ−Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ’に精製した個々の陽性ラムダクローン及びＥｘＡｓｓｉｓｔヘルパーファージと共に感染させて、ファージミドを作製した。得られたファージミドをＥ．ｃｏｌｉ　ＸＬＯＬＲ細胞にトランスフェクトして、プラスミドを回収した。該プラスミドの配列分析によって、ｐｍＨＡＳと相同性が高い（８７％）新規のオープンリーディングフレーム、すなわちｐｍＣＳが明らかになった。
【００６４】
組換えＰ．マルトシダコンドロイチンシンターゼの発現−ｐｍＨＡＳの今までの研究では、分子遺伝学的手段によってカルボキシル末端部分を短縮すると機能を備えた溶解性の酵素が生成された。したがって、取り出されたラムダクローンの１種、ｐＰｍＦ４Ａの挿入部分のｐｍＣＳ　ＯＲＦ（１〜７０４残基）の部分をＴａｑポリメラーゼによるＰＣＲを２０サイクル行って増幅した。センスプライマーはＯＲＦの推定アミノ末端の配列に対応し、アンチセンスプライマーは新規のカルボキシル末端、それに続く人工的な終止コドンをコードした。得られたＰＣＲ産物を精製して、ＧｅｎｅＣｌｅａｎを使用して濃縮した。この挿入物をｐＥＴＢｌｕｅ−１　Ａｃｃｅｐｔｏｒ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して、製造元の指示書に従ってクローニングした。Ｔａｑによって生じた１個のＡのオーバーハングを使用して、Ｔ７プロモーター下流のオープンリーディングフレーム及びこのベクターのリボソーム結合部位のクローニングが容易である。連結した産物をＥ．ｃｏｌｉ　ＮｏｖａＢｌｕｅに形質転換し、ブルー／ホワイトスクリーニングの条件下でＬＢカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）及びテトラサイクリン（１５μｇ／ｍｌ）上に蒔いた。
【００６５】
白色又は明るい青色のコロニーを制限酵素消化によって分析した。所望する短縮ＯＲＦ、ｐＰｍ−ＣＳ１〜７０４を備えたプラスミドを含有するクローンをＥ．ｃｏｌｉ　Ｔｕｎｅｒ、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを含む発現宿主に形質転換し、カルベニシリン及びクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地に３０℃で維持した。対数増殖期の培養物を１３−イソプロピルチオガラクトシド（最終濃度０．２ｍＭ）で５時間誘導した。細胞を遠心して収集し、凍結して、広範囲なプロテアーゼ阻害剤カクテルの存在下において弱い界面活性剤（ｂＰｅｒＩＩ試薬、Ｐｉｅｒｃｅ）で７℃で２０分間抽出した。該細胞を遠心によって除去し、溶解性抽出物をインビトロアッセイ用のコンドロイチンシンターゼ材料として使用した。
【００６６】
組換えＰ．マルトシダコンドロイチンシンターゼのウェスタンブロット分析−ｐｍＨＡＳ蛋白質の５２６から５４４残基に対応する合成ペプチド（アセチル−ＬＤＳＤＤＹＬＥＰＤＡＶＥＬＣＬＫＥＦ−アミド　配列番号７）に対して、単一特異的なポリクローナル抗体を作製した。様々な組換えＥ．ｃｏｌｉ株のｂＰｅｒ抽出物をローディングする前に同緩衝液中において４２℃で１０分間加熱した。電気泳動後、半乾燥してニトロセルロース膜へ移した。ウェスタンブロットをウシ血清アルブミンでブロックし、アフィニティ精製した抗体でインキュベートしてからプロテインＡ−アルカリホスファターゼ複合体で検出しブロモクロロインドリルホスフェート及びニトロブルーテトラゾリウムによって呈色させた。
【００６７】
コンドロイチンシンターゼ活性のアッセイ−ＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＵＡ及び／又はＵＤＰ−［３Ｈ］ＧａｌＮＡｃ前駆体（ＮＥＮ）からの放射標識単糖類の取り込み使用して、コンドロイチンシンターゼ活性をモニターした。試料は通常、コンドロイチン−６−硫酸塩受容体オリゴ糖、［ＧａｌＮＡｃ−６−ＳＯ４ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃ−６−ＳＯ４］ｎ（ｎ＝１又は２、Ｇｅｅｔｈａ　Ｓｕｇｕｍａｒａｎ博士より恵与された）の存在下で、５０ｍＭ　トリス、ｐＨ７．２、ＭｎＣｌ２　２０ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４　０．１Ｍ、エチレングリコール　１Ｍ、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ　０〜０．６ｍＭ、及びＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ　０〜０．６ｍＭを含有する緩衝液中で３０℃でアッセイした。下行性ペーパークロマトグラフィ（ワットマン　３Ｍ）で展開溶媒としてエタノール／１Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ５．５（６５：３５）を使用して、反応産物を基質から分離した。濾紙切片の原点を切断して、水で溶出して、ＨＡポリマーへの放射性糖の組み込みをＢｉｏＳａｆｅ　ＩＩカクテル（ＲＰＩ）を使用した液体シンチレーションカウンターによって検出した。ｐｍＣＳ１〜７０４の転移特異性を試験するために、様々なＵＤＰ−糖（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−ＧａｌＵＡ、ＵＤＰ−Ｇｌｃ）を基準のコンドロイチン前駆体と置換した。
【００６８】
標識重合体の大きさの分析及び酵素分解−ゲル濾過クロマトグラフィを使用して標識重合体の大きさの分布を分析した。Ｐｏｌｙｓｅｐ−ＧＦＣ−Ｐ　５０００カラム（３００×７．８ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）において０．２Ｍ　硝酸ナトリウムで０．６ｍｌ／分で溶出して分離を実施した。放射性をインラインＲａｄｉｏｆｌｏｗ　ＬＢ５０８検出器（ＥＧ　＆　Ｇ　Ｂｅｒｔｈｏｏｌｄ）でＵｎｉｓａｆｅ　Ｉカクテル（１．８ｍｌ／分、Ｚｉｎｓｓｅｒ）を使用してモニターした。カラムは様々な大きさの蛍光標識デキストランで標準化した。放射標識重合体を同定するために、いくつかの反応部分を水に対して透析し（カットオフ３ｋＤａ）、高分子量産物を様々な糖分解酵素で３７℃で７時間消化した。酵素濃度及び消化緩衝液は次の通りである。Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　コンドロイチンＡＣリアーゼ、１ミリ単位／μｌ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−酢酸塩、ｐＨ７．５、Ｐｒｏｔｅｕｓ　コンドロイチンＡＣリアーゼ、１ミリ単位／μｌ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−酢酸、ｐＨ８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ＨＡリアーゼ、２６６ミリ単位／μｌ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．４。
【００６９】
頑丈な細胞膜バリアのない細胞を宿主細胞として使用するならば、トランスフェクションは当業者等によく知られているリン酸カルシウム沈殿法によって実施できる。しかし、核注入、カチオニック脂質法、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合又はデュポンによって開発された（１９８９）バイオリスティック（商標）バイオパーティクル送達システムなど他の方法もまた、ＤＮＡを細胞に導入するために使用することが可能である。デュポンシステムを使用する利点は形質転換効率が高いことである。原核細胞又は実質的な細胞壁構造を含む細胞を使用する場合、好ましいトランスフェクションの方法は、受容能力を導入する塩化カルシウムを使用したカルシウム処理法又はエレクトロポレーション法である。
【００７０】
所望するコーディング配列及び対照配列を含む適切なベクターの構築には、標準的な連結方法が使用される。単離したプラスミド又はＤＮＡ断片を切断して調製し、必要とするプラスミドを構築するために望ましい形態で再度連結させる。切断は適切な緩衝液中で制限酵素（又は酵素類）で処理することによって実施する。一般に、プラスミド又はＤＮＡ断片約１μｇを緩衝液溶液約２０μｌに溶かした酵素約１単位と共に使用する。特定の制限酵素に適切な緩衝液及び基質量は、製造者によって指定されている。インキュベーション時間は、３７℃で約１時間とする。
【００７１】
インキュベーション後、蛋白質をフェノール及びクロロホルムで抽出することによって除去し、核酸をエタノールで沈殿させることによって水性画分から回収する。平滑末端が必要であれば、沈殿物をポリメラーゼＩ（クレノウ）１０単位で１５℃で１５分間処理し、フェノール−クロロホルムで抽出して、エタノールで沈殿させる。ほぼ等モル量の所望する成分を連結するために、正確に合致させるために適切に仕上げた末端をＤＮＡ０．５μｇ当たり約１０単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼで処理した。切断したベクターを成分として使用する場合、細菌性アルカリホスファターゼによって予め処理することによって切断したベクターの再連結を防ぐことが有用かもしれない。
【００７２】
構築したプラスミドにおける機能的配列を確認するための分析では、第１ステップとして３０〜３２℃で形質転換を実施して特異的なコンピテントＥ．ｃｏｌｉ　ＳＵＲＥ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングすることによってプラスミドＤＮＡを増幅した。第２に、組換えプラスミドを使用してＵＤＰ−ＧｌｃＡ前駆体を産生することができるＥ．ｃｏｌｉ　Ｋ５株Ｂｉ８３３７−４１を形質転換して、適切ならば抗生物質耐性によって形質転換体を首尾良く選択する。次に組換え体ライブラリーのプラスミドを、ＨＡ産生を示す細菌コロニーについてスクリーニングした。これらのコロニーを採取して、増殖させ、プラスミドを精製して、制限地図によって分析する。次に、機能的コンドロイチンシンターゼ遺伝子の存在を示すプラスミドを、当業者等に公知のいくつかの配列分析技術によって更に特徴付ける。
【００７３】
一般に、ＤＮＡ配列の最初のクローニング及び本発明に有用なベクターの構築には原核細胞を使用する。原料に適切なのは、細菌細胞、特に精製の簡単な単純最小培地で存在可能な株から得られた細菌であると考えられている。単層膜であるが、厚い細胞壁を有する細菌、たとえばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉはグラム陽性菌である。Ｅ．ｃｏｌｉなどのグラム陰性菌は、細胞を取り巻くのは１種類ではなく２種類の別個の膜を備えている。グラム陰性菌の細胞壁は薄い傾向がある。グラム陽性菌の単層膜は、グラム陰性菌の内側の細胞質膜に類似している。更に、多くの細菌が莢膜重合体を細胞から分泌する働きをする輸送システムを備えている。
【００７４】
コンドロイチンシンターゼの合成におそらく適応している形態でコンドロイチンシンターゼを発現するために、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ株、たとえばＳ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ又はＳ．ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ及び／又はＰ．マルトシダ及び／又はＢａｃｉｌｌｕｓ株を使用することが望ましいだろう。前述の株、並びにＥ．ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０（Ｆ−、ラムダ−、原栄養菌、ＡＴＣＣ第２７３３２５番）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓなどの桿菌、又はＳｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓなどのその他の腸内細菌を使用して、「優れた」コンドロイチンシンターゼを含有する宿主を作製することができた。
【００７５】
一般に、宿主細胞に適合した株から得られた複製起点及び制御配列を含有するプラスミドベクターをこれらの宿主と一緒に使用する。ベクターは通常複製起点、並びに形質転換細胞において表現型の選択を可能にするマーキング配列を有する。たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉは一般に、Ｅ．ｃｏｌｉ株から得られたプラスミド、ｐＢＲ３２２を使用して形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含むので、形質転換された細胞を同定する容易な手段を提供する。ｐＢＲプラスミド又はｐＵＣプラスミド、又はその他の微生物プラスミド又はファージはまた、微生物体が自身の蛋白質を発現するため使用可能なプロモーターを含有するか、又は含有するように変更されていなければならない。
【００７６】
組換えＤＮＡ構築に最もよく使用されるプロモーターには、ｌａｃＺプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７バクテリオファージプロモーター、及びトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系が含まれる。これらが最もよく使用されるが、その他の微生物プロモーターが発見され、使用されており、ヌクレオチド配列に関する詳細が報告されており、当業者はプラスミドベクターと機能的に連結することができる。本発明で使用するためにまた、組込型ベクターを使用することが可能である。
【００７７】
原核生物に加えて、酵母培養物など真核微生物もまた使用することができる。真核微生物の中でもＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又は通常のパン酵母が最もよく使用されるが、その他のいくつかの株も通常使用される。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓでの発現では、たとえばプラスミドＹＲｐ７が通常使用される。このプラスミドは既に、トリプトファン無しで増殖する能力を欠損している酵母の変異株、たとえばＡＴＣＣ第４４０７６号又はＰＥＰ４−１の選択マーカーとなるｔｒｐ１遺伝子を含有している。次に、酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてｔｒｐ１に異常が存在すると、トリプトファン非存在下で増殖することによって形質転換を検出できる効果的な環境がもたらされる。酵母ベクターの適切なプロモーター配列には、ガラクトース利用遺伝子、３−ホスホグリセレートキナーゼ又はその他の糖分解酵素、たとえばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸脱炭酸酵素、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、及びグルコキナーゼのプロモーターが含まれる。
【００７８】
適切な発現プラスミドを構築する際、これらの遺伝子に関連した終止配列もまた、ｍＲＮＡのポリアデニル化及び終止をもたらすために発現することが望ましい発現ベクターの３’の配列に連結する。生育条件によって転写制御が可能な利点を更に有する他のプロモーターは、アルコール脱水素酵素２、チトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連した分解酵素、及び前述のグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、及びマルトース及びガラクトース利用を担う酵素のプロモーター領域である。酵母に適合したプロモーター、複製起点及び終止配列を含むプラスミドベクターであれば適している。
【００７９】
微生物に加えて、多細胞生物由来の培養細胞もまた宿主として使用することが可能である。概ね、この様な培養細胞は脊椎動物のものでも無脊椎動物のものでも有用である。しかし、脊椎動物の細胞が最も興味深く、近年脊椎動物の細胞を培養によって増殖させることが通常の方法になってきた。このように有用な宿主細胞株の例は、ＶＥＲＯ及びＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、及びＷＩ３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ、及びＭＤＣＫ細胞株である。
【００８０】
ほ乳類細胞において使用する場合、発現ベクターの制御機能はウイルス物質によってもたらされることが多い。たとえば、通常使用されるプロモーターはポリオーマ、アデノウイルス２、ウシパピローマウイルスで、最もよく使用されるのはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）である。ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点もまた含む断片としてウイルスから容易に入手できるので、特に有用である。ウイルスの複製起点に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩ部位に渡る約２５０ｂｐの配列が含まれていれば、より小さい、又は大きいＳＶ４０断片もまた使用することが可能である。
【００８１】
更に、所望する遺伝子配列に通常関連したプロモーター又は制御配列は、このような制御配列が宿主細胞系に適合するならば、利用することもまた可能であり、望ましいことが多い。ＳＶ４０又はその他のウイルス源（たとえば、ポリオーマ、アデノ、ＢＰＶ）由来の外因性起点を含むようにベクターを構築することによって、又は宿主細胞染色体複製機構によって、複製起点がもたらされることが可能である。該ベクターを宿主細胞の染色体に組み入れるならば、後者の機構で十分なことが多い。
【００８２】
コンドロイチン硫酸及びデルマタン硫酸は、いずれも同じ重合体、すなわちＤ−グルクロン酸ベータ（１−３）Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミンベータ（１−４）から得られる。コンドロイチン硫酸及びデルマタン硫酸はいずれも、Ｎ−アセチルガラクトサミンの４位又は６位、及びウロン酸の２位で硫酸化されることができる。天然では、いずれにおいてもＮ−硫酸化は認められていない。コンドロイチン硫酸とデルマタン硫酸の違いは、グルクロン酸のイズロン酸へのエピマー化である。しかし、多糖をコンドロイチン硫酸か、又はデルマタン硫酸かに分類し命名することには問題がある。特に、デルマタン硫酸鎖と呼ばれる鎖については、グルクロン酸よりもイズロン酸の出現頻度の方が分析しやすい。したがって、コンドロイチン硫酸鎖の中にはデルマタン硫酸の配列が散在しており、逆もまた起こることが可能である。しかし、当業者であれば、グルクロン酸からイズロン酸へのエピマー化が１０％から５０％の間の重合体は、デルマタン硫酸多糖と呼ぶのにふさわしいことを理解するであろう。
【００８３】
コンドロイチン重合体は、コンドロイチンシンターゼ、限定はしないが、特に本発明のｐｍＣＳによって産生される。たとえば、コンドロイチン重合体は、コンドロイチン自体よりも更に価値のある産物である可能性を秘めたデルマタン分子に変換することができる。該コンドロイチン重合体は、精製形態で、又はインビボにおいて（すなわち、宿主自体の中で）デルマタンに変換することができる。たとえば、Ｃｈａｎｇ他は、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉの合成Ｄ−グルクロナンに対するポリ−ベータ−Ｄ−マンヌロン酸Ｃ−５−エピメラーゼの反応を確認し、詳述している。デルマタン分子は、ｐｍＣＳなどのコンドロイチンシンターゼによって生成されたコンドロイチン重合体と反応するＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉのポリ−ベータ−（１−＞４）−Ｄ−マンヌロン酸Ｃ−５−エピメラーゼを使用して生成することができる。（Ｃｈａｎｇ他、「Ａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ　ｐｏｌｙ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｍａｎｎｕｒｏｎｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｃ−５−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ　ｏｎ　Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｄ−Ｇｌｕｃｕｒｏｎａｎｓ」Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄｅｃ．１、２０００、３２９（４）：９１３〜２２、全体を本明細書に参考として明白に援用した）。本明細書に参考として明白に援用した、Ｅｒｔｅｓｖａｇ他によって発表された米国特許第５９３９２８９号はまた、Ｐ．マルトシダコンドロイチンシンターゼによって産生されたコンドロイチン分子を硫酸化されていないデルマタン分子に変換するために使用することが可能なＣ−５エピメラーゼを開示している。Ｃｈａｎｇ他の論文が、酸化デンプン及びキチンを含むウロン酸を含有する様々な多糖類のエピマー化について記載しているように、該ｃ−５エピメラーゼは、コンドロイチン重合体に作用することが予測される。
【００８４】
又は、コンドロイチンシンターゼの次にエピマー化反応を行う順番の代わりに、インビボで一緒に行う方法が可能であろう。ｐｍＣＳ／Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒエピメラーゼの場合では、反応がいずれも適合しており、両遺伝子がグラム陰性菌由来であるので、この方法が非常に適している。両酵素はＥ−ｃｏｌｉで機能することが示された。１細胞に両遺伝子を入れるとコンドロイチンとエピメラーゼの接触が可能になり、所望する産物が生じる。
【００８５】
更に、ポリウロン酸Ｃ−５エピメラーゼによって触媒される反応を測定するアッセイ方法を使用することが可能である（Ｃｈａｎｇ他、「Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｕｒｏｎｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｃ−５　Ｅｐｉｍｅｒａｓｅｓ」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、Ａｐｒｉｌ　１０、１９９８、２５８（１）：５９〜６２、（全体を本明細書に参考として明白に援用する）を参照のこと）。Ｃ−５エピメラーゼの作用は、ポリウロン酸のＣ−６カルボキシル基を転位させ、したがってベータ結合残基をアルファ結合残基に、又はその逆に変換する。前記で確認されたアッセイ法は、ベータ−グリコシド結合よりもアルファ−グリコシド結合の酸加水分解に対して感受性が高いという利点を有する。したがって、実験的重合体（産物）は酸処理によって色が生じるが、親である出発物質は実質的に色を生じない。この特定のアッセイ方法には、Ｃ−５エピメラーゼの反応の前後にポリウロン酸の部分的酸加水分解を必要とする。Ｃ−５エピメラーゼの反応前後に放出される（溶出される）ウロン酸の量が多いか又は少ないかによって、形成されたアルファ−又はベータ−グリコシド結合の量が測定され、酵素によって触媒される量が測定される。この方法では、コンドロイチン重合体のデルマタンへの変換は触媒可能で、反応及び効率をモニターすることが可能である。
【００８６】
ｐｍＣＳ酵素によって生成したコンドロイチン分子は、デルマタン硫酸分子を生成するための理想的な出発重合物質である。ある種のほ乳類エピメラーゼは、硫酸化されていない重合体分子だけをエピマー化する。たとえば、コンドロイチン分子をデルマタン分子に変換することができるＣ−５ウロノシルエピメラーゼは、硫酸化されていないコンドロイチン分子のみをエピマー化する。硫酸化されていないコンドロイチン分子は天然には見いだされておらず、コンドロイチン硫酸を脱硫酸化するか、又は硫酸化されていないコンドロイチン分子を組換えによって生成しなければならない。ｐｍＣＳ酵素が発見される前、又は発見されてからも、コンドロイチンシンターゼのことはわかっていないので、当業者は硫酸化コンドロイチンを硫酸化されていない、又は脱硫酸化したコンドロイチンに変換するために更に時間、金、資金を費やさなければならないだろう。一旦コンドロイチンが脱硫酸化されれば、ほ乳類のエピメラーゼを使用してコンドロイチン分子をデルマタン分子に変換することが可能である。ｐｍＣＳなどのコンドロイチンシンターゼを使用して、当業者はほ乳類エピメラーゼによるエピマー化の理想的な出発物質である硫酸化されていないコンドロイチン分子を産生することができる。このような１ほ乳類エピメラーゼ及びその使用方法は、たとえば、全体を本明細書に参考として明白に援用したＭａｌｍｓｔｒｏｍ　Ａ．、「Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｄｅｒｍａｔａｎ　Ｓｕｌｆａｔｅ−Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃ−５　Ｕｒｏｎｏｓｙｌ　Ｅｐｉｍｅｒａｓｅ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、Ｊａｎ．１０、１９８４、２５９（１）：１６１〜５を参照のこと。
【００８７】
酵素による硫酸化を利用して、コンドロイチン重合体を変換したデルマタン分子を硫酸化することができ、それによって血液凝固阻止、装置コーティング、及び／又はその他の生体物質用に更に価値があり、適用しやすい重合体が生成できる。本明細書に参考として明白に援用した、Ｅｋｌｕｎｄ他の表題「Ｄｅｒｍａｔａｎ　ｉｓ　ａ　Ｂｅｔｔｅｒ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｆｏｒ　４−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｉｏｎ　ｔｈａｎ　Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　４−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅｄ、Ｌ−ｉｄｕｒｏｎｉｃ−ｒｉｃｈ　Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ」Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、Ｎｏｖ．１５、２０００、３８３（２）：１７１〜７で指摘されたように、デルマタンはコンドロイチンよりも酵素的に硫酸化しやすいだけでなく、硫酸化デルマタンはコンドロイチンよりも価値があり、適用しやすく有用な産物である。したがって、ｐｍＣＳなどコンドロイチンシンターゼを利用して、本発明の開示があれば、当業者は天然及び非天然のコンドロイチン並びにデルマタン及びデルマタン硫酸を産生することができるだろう。全体を本明細書に参考として明白に援用したその他の文献は、デルマタンを酵素的に硫酸するその他の方法論を概略している。Ｂｈａｋｔａ他、「Ｓｕｌｆａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ　ｂｙ　Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ　６−Ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　２（ＧＳＴ−５）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、Ｄｅｃ．２２、２０００、２７５（５１）：４０２２６〜３４、Ｉｔｏ他、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ　４−ｓｕｌｆａｔｅ　６−Ｏ−Ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｓｑｕｉｄ　Ｃａｒｔｉｌａｇｅ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、Ｎｏｖ．３、２０００、２７５（４４）：３４７２８〜３６。
【００８８】
デルマタン重合体は、酵素的な硫酸化の他に化学的に硫酸化することができる。化学的硫酸化の１方法は、全体を本明細書に参考として明白に援用したＧａｒｇ他の表題「Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｆｕｌｌｙ　Ｓｕｌｆａｔｅｄ　Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ　ｏｎ　Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　Ａｒｔｅｒｙ　Ｓｍｏｏｔｈ　Ｍｕｓｃｌｅ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．」Ｎｏｖ．１５、１９９９、３７１（２）：２２８〜３３に概略が記載されている。一般に、無水溶媒に溶かした多糖を三酸化硫黄又はクロロスルホン酸で処理する。いずれにしても当業者は、本発明のコンドロイチンシンターゼ（ｐｍＣＳ）及びｐｍＣＳ酵素によってコンドロイチン重合体を産生する方法があれば、エピマー化反応を使用してデルマタン分子を形成し、その後の公知の酵素的、又は化学的硫酸化技術によってデルマタン分子を硫酸化することができる。一方、エピマー化していないコンドロイチンはどんな手段によっても硫酸化することができた。
【００８９】
全体を本明細書に参考として明白に援用した、Ｓｋｊａｋ−Ｂｒａｅｋ他によって発表された米国特許第４９９０６０１号はまた、超臨界ＣＯ２を使用して化合物中のウロン酸をエピマー化する化学的方法を開示している。本発明のｐｍＣＳ酵素を使用した、又はＳｋｊａｋ−Ｂｒａｅｋ他のＣＯ２エピマー化方法を使用したコンドロイチンポリペプチドを利用すると、当業者は容易に硫酸化していないデルマタン分子を生成することができる。
【００９０】
Ｆ型Ｐ．マルトシダ重合体の構造分析−Ｆ型莢膜はコンドロイチンＡＣリアーゼで処理するによって細菌の細胞から除去されることが他の研究者によって既に示されている。特異的なＨＡ−結合蛋白質、アグレカンの断片は、ＨＡ−ＴＥＳＴアッセイ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）においてＦ型重合体の抽出物と交叉反応しないが、並行して行ったＡ型細菌の抽出物においてＨＡを容易に検出した。Ｆ型重合体を酸加水分解して単糖を分析することによって、糖ガラクトサミン及びＧｌｃＵＡを含むことが示された（表２及び図５）。
【００９１】
【表２】
2004512013.tif 000003
【００９２】
Ｆ型重合体及び種々のＧＡＧの単糖成分。酸加水分解及び高ｐＨイオン交換クロマトグラフィを使用して、Ｆ型重合体（Ｆ）の糖成分を測定した。多糖コンドロイチン硫酸Ｃ（Ｃ）、ヒアルロナン（ＨＡ）、及びヘパリン（ＨＥＰ）及び純粋な単糖類を標準物として使用した。これらの加水分解条件下では、脱アセチル化及び脱硫酸化並びにグリコシル結合の所望する分断が生じる。関連するヘキソサミンの内部標準ラムノース溶出時間（１０．７分、１に設定）に対する滞留時間を表した。酸性糖類は酢酸ナトリウム勾配で溶出した。勾配を開始してからの主要なウロン酸ピークの滞留時間を表してある。Ｆ型多糖及びコンドロイチン硫酸は、同一の単糖成分、ガラクトサミン及びグルクロン酸を有する。
【００９３】
コンドロイチン硫酸加水分解物のイオン交換プロフィールは、Ｆ型加水分解物と区別がつかなかった。混合実験では、成分ピークの移動は全く同一であることが示された。Ｆ型重合体ではグルコサミン、マンノース、ガラクトース、グルコース及びフコースを含めたその他の糖は検出されなかった。ＨＡの加水分解物及びヘパリン標準物は明らかにグルコサミンを含むが、ガラクトサミンは含んでいなかった。ＮＭＲ予備実験は、Ｆ型重合体のアミノ糖がアセチル化された形態で存在しているという仮説と一致した（ＮＡｃ　ＣＨ３ケミカルシフトはＤ２Ｏにおいて２．０２ｐｐｍである。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｇｅｏｒｇｉａ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ）（図８）。Ｆ型のコンドロイチンの二糖分析では、硫酸化されていないコンドロイチンから予測される正確な質量及び電荷がわかる（図９及び図１０）。この方法には、重合体のコンドロイチナーゼによる切断、キャピラリー電気泳動による産物の分離が必要である。滞留時間を基準の標準物と比較する。質量を質量分析によって測定した。この大きさの範囲では、１Ｄａ以内の正確な質量が測定できる。
【００９４】
Ｆ型Ｐ．マルトシダ莢膜遺伝子座の分子クローニング−鋳型としてＦ型染色体ＤＮＡ及びＡ型莢膜遺伝子座に対応する種々のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＰＣＲ産物を得た。Ｆ型ｋｆａＡ相同体（Ｅ．ｃｏｌｉの推定多糖輸送体）の大部分及び推定ｐｍＣＳ遺伝子を含有する３．６ｋｂＰＣＲ産物をハイブリダイゼーションプローブとして使用して、ラムダライブラリから完全なＰ．マルトシダ莢膜遺伝子座を得た。約１０４個のプラークをスクリーニングした後、確実にハイブリダイズするプラークが２個発見され、これらのファージをプラスミドに改造した。両プラスミドが、Ａ型ＨＡシンターゼ、ｐｍＨＡＳと相同性の高いｐｍＣＳと称した９６５残基の新規オープンリーディングフレームを含有することを発見した（図１）。同一性のレベルはＤＮＡ及び蛋白質レベルいずれも約８７％であった。アミノ酸配列の違いは主に分子のアミノ末端側の半分にあるポリペプチドのいくつかの領域に局在していた。ｐｍＣＳ配列の残基５３に対応する位置において、ｐｍＨＡＳ配列では７個の残基が挿入されていること以外は、酵素類のアラインメントは全体的に精度が優れている。
【００９５】
ｐｍＣＳ及びｐｍＨＡＳポリペプチド両者の中央部分（残基４３０〜５３０）は、細胞外多糖類又はリポ多糖類の炭化水素部分を形成するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｃ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓを含めた広範な種類の細菌性グリコシルトランスフェラーゼと最も相同性が高い。最も注目すべき配列類似点のいくつかは、ＤＧＳＴＤ及びＤｘＤＤモチーフである。ｐｍＣＳ遺伝子のすぐ下流に推定ＵＤＰ−グルコース脱水素酵素遺伝子を確認した。したがって、ＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａＦ型莢膜オペロンのこの部分における関連遺伝子の順番［ＫｆａＡ相同体−多糖合成遺伝子−ＵＤＰ−グルコース脱水素酵素遺伝子］は、Ａ型において発見されたものと同じである。
【００９６】
機能的Ｐ．マルトシダコンドロイチンシンターゼの異種細菌での発現−単一特異的抗ペプチド抗体を使用したウェスタンブロット分析を使用して、ｐｍＣＳ１〜７０４又はｐｍＨＡＳ１〜７０３ポリペプチドの産生を検出した（図２）。両酵素は抗体を作製するために使用した合成ペプチドにちょうど対応する配列を含む。ｐｍＣＳ１〜７０４プラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ　Ｔｕｎｅｒ細胞由来の抽出物は、適切な大きさの（すなわち、８０ｋＤａと予測される）免疫反応バンドを含むが、このバンドはベクターだけを有する対照細胞の試料には存在しなかった。溶解性ｐｍＣＳ１〜７０４蛋白質を使用すると、天然の長さの膜蛋白質を使用した場合に比べて酵素の発現レベルが増加し、調製が容易になった。
【００９７】
ｐｍＣＳ１〜７０４プラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ　Ｔｕｎｅｒ細胞の抽出物は、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ及びＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ両者を同時に与えるとインビトロで重合体を合成するが、ベクターのみを有する細胞試料は合成しなかった（表３）。
【００９８】
【表３】
2004512013.tif 000004
【００９９】
糖ヌクレオチドに対する組換えｐｍＣＳ１〜７０４のトランスフェラーゼ特異性。粗ｂＰｅｒ抽出物（総タンパク量１５０μｇ）を、コンドロイチンオリゴ糖受容体０．５μｇを含有するアッセイ緩衝液５０μｌ及びＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＵＡ又はＵＤＰ−［３Ｈ］ＧａｌＮＡｃのいずれかと共に２０分間インキュベートした。放射標識した糖（３００μＭ、０．０４μＣｉ）を指示した標識していない第２の糖ヌクレオチド（６００μＭ）の存在下で使用した。重合体への取り込みは、ペーパークロマトグラフィによって評価した。基準の前駆体を含有するアッセイ（１００％に設定）に対する相対的な取り込みパーセントを括弧内に示した。代表的な実験結果を示してある。組換えｐｍＣＳ１〜７０４は、基準コンドロイチン前駆体のみを多糖に取り込んだ。
【０１００】
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを除外するか、又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃと置換した場合、放射標識した［１４Ｃ］ＧｌｃＵＡの重合体への取り込みは観察されなかった。逆に、ＵＤＰ−［３Ｈ］ＧａｌＮＡｃを使用した実験では、重合体への放射標識の実質的な取り込みはＵＤＰ−ＧｌｃＵＡが存在するときにのみ示された。ＵＤＰ−ＧａｌＵＡ又はＵＤＰ−ＧｌｃはＵＤＰ−ＧｌｃＵＡの代わりにはならなかった。２価金属イオンをＥＤＴＡでキレートすると、重合化活性又はトランスフェラーゼ活性は検出されなかった。ｐｍＨＡＳでの観察と類似して、コンドロイチンオリゴ糖受容体を添加すると、ｐｍＣＳ１〜７０４によって触媒される糖取り込みは受容体を添加しない同様の反応と比較して少なくとも５０倍から１００倍増加した。
【０１０１】
ゲル濾過クロマトグラフィによる分析によって、組換えｐｍＣＳはインビトロで単糖１０３（１０００）個の長い重合鎖（１００ｋＤａから４００ｋＤａ）を産生することが示された。標識ＧｌｃＵＡ及びＧａｌＮＡｃの両糖類の放射性は、１個のピークとして一緒に移動した（図３Ａ）。ＵＤＰ−糖がアッセイ中に存在していなければ、放射標識は高分子量重合体に取り込まれなかった。この重合体がコンドロイチンであることは、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ又はＰｒｏｔｅｕｓコンドロイチンＡＣリアーゼに対する感受性（図３Ｂ）及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓＨＡリアーゼの作用に対する耐性（図３Ｃ）によって確認された。
【０１０２】
天然のＦ型重合体をアガロースゲル電気泳動法によって分析するとまた、高分子量重合体が細菌によってインビボで産生されることが示された（図４）。Ｆ型重合体を染色によって視覚化した。０．８％アガロースゲルの染色は全て、１ｘＴＡＥシステムで実施した。ＨＡ及びＦ型はいずれも青白色のＤＮＡを染色し、コンドロイチン硫酸は紫色に、ヘパリンは黄色に染色した。Ｆ型重合体はＨＡよりも小さいが、それでも約５０ｋＤａから約１５０ｋＤａの非常に大きな鎖を形成している。
【０１０３】
Ｐ．マルトシダ　Ｆ型はコンドロイチン莢膜を生成する。莢膜多糖のコンドロイチン主鎖成分の重合化を担うグルコシルトランスフェラーゼもまた、クローニングされた。ｐｍＣＳ酵素は、ｐｍＨＡＳ酵素に近い相同体であるようである。近年、ｐｍＨＡＳ酵素は、ＧｌｃＵＡのみ、又はＧｌｃＮＡｃのみを転移する変異体を作製することによって、１本のポリペプチドに２個の活性部位が含まれることが測定された。２種の異なる変異体蛋白質を混合すると、ＨＡシンターゼ活性が再構成された。Ａ１と称する１個のドメインがＧｌｃＮＡｃ転移に関わり、Ａ２と称するもう１個のドメインがＧｌｃＵＡ転移に関わるようである。ｐｍＨＡＳ及びｐｍＣＳの配列を比較して、配列の違いのほとんどがＡ１ドメインに存在することが明らかになった。ｐｍＣＳ酵素は異なるヘキソサミン、ＧａｌＮＡｃを転移し、したがって提案されたｐｍＨＡＳの２個のドメイン構造と一致している。
【０１０４】
ｐｍＨＡＳ蛋白質はまた、天然の長さの酵素の７０４から９７２の残基を欠失すると溶解性酵素が形成されるので、カルボキシル末端を介して推定多糖輸送系、又は膜結合要素と相互作用するという仮説が立てられている。しかし、実質的に膜に関連した、又は疎水性の領域がこの配列に存在することは予測されていない。ｐｍＨＡＳ及びｐｍＣＳは、それらのグリコシルトランスフェラーゼ活性に必要ではないこの領域において相同性が高いので、カルボキシル末端がインビボにおける多糖輸送機構又は膜結合要素と相互作用するために必要なドメイン又はモチーフを含むことは間違いないだろう。Ａ型及びＦ型Ｐ．マルトシダ株の進化論的関係はまだ詳細にわかっていない。両生物は、広く蔓延している家禽コレラの原因微生物であるが、北アメリカにおいて罹患したトリから多く単離されたのはＨＡ莢膜を有するＡ型微生物である。２種の異なる莢膜型の原種は、コンドロイチンシンターゼ様又はＨＡＳ様遺伝子のいずれかを有するようである。この祖先酵素の特異的がいくつかの変異によって変化して、他の莢膜型が出現した可能性がある。組換えｐｍＣＳだけれなくｐｍＨＡＳはインビトロで不適切なヘキソサミンを重合体に間違って組み込むことはないので、糖転移特異性は明らかにかなり選択的である。グラム陰性菌の中には（たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ／ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃエピメラーゼを有するものもあり、したがって補助となる代謝酵素を同時に動員する必要なくＨＡ又はコンドロイチンのいずれのヘキソサミン前駆体も多糖生合成のために使用できる。一般的にＵＤＰ−グルコース脱水素酵素、すなわちＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ前駆体を形成する酵素は、グラム陰性菌では微生物がＧｌｃＵＡを含有する重合体又は複合多糖を有する場合のみ見いだされる。Ａ型及びＦ型のいずれのＰ．マルトシダにおいても、ＵＤＰ−グルコース脱水素酵素遺伝子はＧＡＧシンターゼのすぐ下流にある。
【０１０５】
細菌のコンドロイチンシンターゼとほ乳類の推定同等酵素の関係ははっきりしていない。脊椎動物における同様の蛋白質はまだデータベースに蓄積されていない。細菌のｐｍＣＳ及び脊椎動物のコンドロイチンシンターゼのいずれも、インビトロにおいてＵＤＰ−糖類を利用して受容体炭化水素を伸長する。しかし、ほとんどの場合、ほ乳類酵素は無細胞抽出液において長いコンドロイチン鎖を生成せず、インビトロで容易に認められるのは反応の半分のみである（たとえば、１個のＧｌｃＵＡをＧａｌＮＡｃ−末端オリゴ糖に添加するか、又はその逆である）。脊椎動物の組織では、その他の酵素は硫酸化及び／又はエピマー化によってコンドロイチンを大きく変更する。ｐｍＣＳの発見及び特徴付けは、扱いにくいほ乳類のコンドロイチンシンターゼの研究に更に役立つだろう。
【０１０６】
したがって、本発明によって、酵素的に活性を有するコンドロイチンシンターゼをエンコードするコード領域を有する精製核酸セグメント、ｐｍＣＳ遺伝子からコンドロイチンを生成する方法、及び前述の目的及び利点を完全に満たすｐｍＣＳ遺伝子によってエンコードされたコンドロイチンシンターゼから生成したコンドロイチンの使用が提供されることが明らかであろう。本発明をその特定の実施形態と相まって説明したが、代替、修正及び変更ができることは当業者にとって明らかであろう。したがって、添付したクレームの精神及び範囲内の代替、修正及び変更は全て含まれるものとする。
【０１０７】
本明細書に記載された測定数値及び定量的測定は（実施例及びクレームを含めて）全て近似値である。
【０１０８】
本明細書で例示的に開示又はクレームした本発明は、本明細書で具体的に開示又はクレームしていない要素がなくても実施することが可能である。したがって、本発明は本明細書で開示又はクレームした要素を包含し、この要素から構成され、又は本質的に構成されることが可能である。
【０１０９】
以下のクレームは本明細書と一致することが可能な最も広い範囲に与えられる。このクレームは、必ずしも好ましい実施形態又は実施例で示された実施形態に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ｐｍＣＳ及びｐｍＨＡＳの配列アラインメントの図である。２種のＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ＧＡＧシンターゼは相同性が高い。同一の残基はハイフンで示してある。番号付けは少し長いｐｍＨＡＳ配列に対応している。推定Ａ１（残基１６１〜２６７）及びＡ２（残基４４３〜５４７）ドメインはそれぞれ、ヘキサミントランスフェラーゼ又はグルクロン酸トランスフェラーゼ活性の重要な領域と対応する。最も大きな配列の違いは、ポリペプチドのアミノ末端側半分に見いだされる。ｐｍＣＳとｐｍＨＡＳとの間の「コンセンサス配列」は同一残基及び同様の残基であることを示している（コンセンサスの印は次の通りである。！はＩＶのいずれかである。＄はＬＭのいずれかである。％はＦＹのいずれかである。＃はＮＤＱＥＢＺのいずれかである）。Ｍｕｌｔａｌｉｎ　ｖｅｒｓｉｏｎ　５．４．１「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ　ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ」Ｆ．ＣＯＲＰＥＴ、１９８８、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、１６（２２）、１０８８１〜１０８９０　シンボル比較表：ｂｌｏｓｕｍ６２　Ｇａｐ　ｗｅｉｇｈｔ：１２　Ｇａｐ　ｌｅｎｇｔｈ　ｗｅｉｇｈｔ：２　Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ　ｌｅｖｅｌｓ：高＝９０％、低＝５０％。
【図２】
短縮された組換えＰＡＳＴＥＵＲＥＬＬＡ　ＧＡＧシンターゼのウェスタンブロット分析を表した図である。大きさが８０ｋＤａであると予測された免疫反応バンドは、ｐｍＣＳ１〜７０４（ＣＳ）又はｐｍＨＡＳ１〜７０３（ＨＡＳ）に対応する。ベクター対照（Ｖ）では同様のバンドは認められない。予め染色した標準物（Ｓｔｄ）は、大きさを比較するために示してある。
【図３】
インビトロで合成された放射標識重合体のゲル濾過分析を示した図である。ｐｍＣＳ１〜７０４抽出物（総蛋白質量１ｍｇ）をコンドロイチン受容体オリゴ糖（５μｇ）、ＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＵＡ及びＵＤＰ−［３Ｈ］ＧａｌＮＡｃ（それぞれ５８０μＭ、０．１６μＣｉ）と共に、反応量２００μｌで３０分間インキュベートした。反応生成物を５部分に分け、実験方法で説明したように様々なＧＡＧグリコシダーゼで処理した。その後該試料の一部（６０％）をｐｏｌｙＳｅｐカラム（基準溶出時間（分）：ボイド容量、１２．７；５８０ｋＤａ　デキストラン、１５．４ｋＤａ、デキストラン、１６．０、全体量、１９．３分）で分析した。インライン検出器によって測定された放射性（１４Ｃ、実線；３Ｈ、点線）は、壊変毎秒（ｄｐｓ）で表してある。両矢印は、２０ｄｐｓの応答に対応する。Ａ、未処理重合体、ピーク１５．９分。Ｂ、ＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍコンドロイチナーゼＡＣリアーゼ処理重合体、ピーク１９．２分、Ｃ、ＨＡリアーゼ処理重合体、ピーク１５．９分。大きさが約−１００ｋＤａから４００ｋＤａの重合体のピークは、放射標識した両糖を１：１の割合で含有しており、適切な酵素、コンドロイチンＡＣリアーゼによってのみ分解された。
【図４】
多糖類のゲル電気泳動分析を表した図である。様々な重合体を０．８％アガロースゲルで、１ＸＴＡＥ（トリス酢酸ＥＤＴＡ）緩衝液系で質量／電荷比によって分離した。レーン当たり重合体約９μｇを添加し、電場０．８ボルト／ｃｍを用いて分離した。レーン：パスツレラマルトシダ　Ｆ型のＦ型天然重合体。ＨＡ、ヒアルロン酸。ＩＩＩ型、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ３型莢膜重合体。Ｃｈｏｎ　ＳＯ４、左から右へコンドロイチン硫酸Ｃ、Ｂ、Ａ（注意：白い点線の円で示してある）。ヘパリン、ブタのヘパリン。ｋｂラダー、キロベースＤＮＡラダー標準物。ラムダＨ、ラムダウイルスＤＮＡ標準物のＨｉｎｄＩＩＩ消化物。選択したＤＮＡ標準物の大きさをキロベース（ｋｂ）で示してある。電気泳動後、ゲルを色素Ｓｔａｉｎｓ−Ａｌｌ（Ｓｉｇｍａ；５０％エタノール中０．０５％、ｗ／ｖ）で２時間染色し、次いで水で脱色した。Ｆ型重合体はコンドロイチン硫酸重合体よりも大きく（硫酸によって追加される電荷がないため）強く荷電していないので、ゆっくり泳動する。ＨＡ、ＩＩＩ型及びＦ型重合体は青に染色するが、コンドロイチン硫酸は紫に染色する。Ｆ型多糖は新規の硫酸化されていない大きなコンドロイチン鎖で、この重合体は初めて報告されたものである。
【図５】
Ｆ型ポリマーの単糖分析を示した図である。表２で糖成分データを作製するために使用した実際のクロマトグラムの例をここに示した。溶出時間（ｘ軸は異なる単糖を表す。単位＝分）に対する電流応答（ｙ軸はカラムから溶出した糖の相対量を示す。単位ｎＡ＝ナノアンペア）のプロフィールグラフ。回収率及びカラムの性能を評価するために（各糖成分約５ナノモルを含有する）注入された試料全てに内部標準、ラムノース（Ｒｈａ）が加えられた。「ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ標準物」には、加水分解されたＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ、及びＧｌｃＵＡの混合物が含まれる。「試料Ｆ」は、Ｆ型重合体の加水分解物である。この分析によって、Ｆ型重合体は単糖ＧａｌＮ（加水分解によってアセチル基を除去しＧａｌＮＡｃをＧａｌＮに変換した）及びＧｌｃＵＡのみから成ることが示される。
【図６】
ｘＩＨＡＳ１−Ｓｅｒ７７変異体のＨＡ産物の大きさを分析した図である。様々な酵素を５分間アッセイして、ＨＡポリマー産物を高速ゲル濾過法によって分離した。７７位の置換されたアミノ酸残基の性質によって、野生型酵素によって重合化したＨＡ産物と比較してより大きな、又はより小さなＨＡ産物が形成された。２種類の変異体においてのみ、Ｓｅｒ７７Ｉｌｅ（大きなＨＡ）及びＳｅｒ７７Ｔｈｒ（小さなＨＡ）及び野生型シンターゼが示された。５分後の産物はＰｏｌｙＳｅｐ−４０００カラムで分離した。対照としての５８０ｋＤａのデキストラン標準物は４０００又は６０００カラムそれぞれにおいて１２．５分又は１６．８分に溶出した。
【図７】
ｘＩＨＡＳ１−Ｓｅｒ７７変異体のＨＡ産物の大きさを分析した図である。様々な酵素を３０分間反応させて、ＨＡポリマー産物を高速ゲル濾過によって分離した。７７位の置換されたアミノ酸残基の性質によって、野生型酵素によって重合化したＨＡ産物と比較してより大きな、又はより小さなＨＡ産物が形成された。２種類の変異体においてのみ、Ｓｅｒ７７Ｉｌｅ（大きなＨＡ）及びＳｅｒ７７Ｔｈｒ（小さなＨＡ）及び野生型シンターゼが示された。３０分後の産物はＰｏｌｙＳｅｐ−６０００カラムで分離した。対照としての５８０ｋＤａのデキストラン標準物は４０００又は６０００カラムそれぞれにおいて１２．５分又は１６．８分に溶出した。
【図８】
ＮＭＲ分析を示した図である。Ｆ型多糖（カルバゾール反応に基づくとウロン酸は１７０μｇである）を重水（Ｄ２Ｏ）で置換し、プロトンスペクトル（Ｈ−ＮＭＲ）を４５℃で５００ＭＨｚで入手した。ピークの化学シフト（ｐｐｍ）は硫酸化されていないコンドロイチン重合体と一致した。
【図９】
二糖組成分析を表した図である。試料を５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及び６０ｍＭ　酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８、１０μｌに溶解し、コンドロイチナーゼＡＢＣ　２０ｍＵをそれぞれに添加した。３７℃の水浴内で一晩消化を続けた。２分間煮沸して酵素を失活させた。この実験はキャピラリー電気泳動Ｐ／ＡＣＥ　５５００システム（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）で、キャピラリー温度を一定に１８℃にして、電位は−２２ｋＶで、２３２ｎｍでのＵＶ吸収によって実施した。電気泳動図は、Ｇｏｌｄソフトウェアパッケージシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を使用して得た。分離及び分析は、融合シリカ（管が検出器を通過するところ以外は外面をコーティングしてある）キャピラリー管（内径５０μｍ、外径３６０μｍ、長さ５７ｃｍ、有効長４９ｃｍ）を使用して陰陽逆転電極モードで実施した。それぞれを泳動する前に、キャピラリーを０．５Ｍ　ＮａＯＨ（１分、２０ｐｓｉ）で調整し、分離緩衝液（飽和リン酸水素ナトリウムでｐＨ３．５に調節した２０ｍＭ　Ｈ３ＰＯ４）で洗浄した（１分、２０ｐｓｉ）。試料を圧力注入によって２５秒間０．５ｐｓｉで添加した。コンドロイチンオリゴ糖候補全ての標準物を使用してキャピラリーを検量した。硫酸化されていない二糖、ΔＤｉＯＳがＦ型重合体の消化物に認められた。したがって、Ｆ型の天然重合体は硫酸化されていないコンドロイチンである。
【図１０】
二糖組成分析を表した図である。試料を５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及び６０ｍＭ　酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８、１０μｌに溶解し、コンドロイチナーゼＡＣ　２０ｍＵをそれぞれに添加した。３７℃の水浴内で一晩消化を続けた。２分間煮沸して酵素を失活させた。この実験はキャピラリー電気泳動Ｐ／ＡＣＥ　５５００システム（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）で、キャピラリー温度を一定に１８℃にして、電位は−２２ｋＶで、２３２ｎｍでのＵＶ吸収によって実施した。電気泳動図は、Ｇｏｌｄソフトウェアパッケージシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を使用して得た。分離及び分析は、融合シリカ（管が検出器を通過するところ以外は外面をコーティングしてある）キャピラリー管（内径５０μｍ、外径３６０μｍ、長さ５７ｃｍ、有効長４９ｃｍ）を使用して陰陽逆転電極モードで実施した。それぞれを泳動する前に、キャピラリーを０．５Ｍ　ＮａＯＨ（１分、２０ｐｓｉ）で調整し、分離緩衝液（飽和リン酸水素ナトリウムでｐＨ３．５に調節した２０ｍＭ　Ｈ３ＰＯ４）で洗浄した（１分、２０ｐｓｉ）。試料を圧力注入によって２５秒間０．５ｐｓｉで添加した。コンドロイチンオリゴ糖候補全ての標準物を使用してキャピラリーを検量した。硫酸化されていない二糖、ΔＤｉＯＳがＦ型重合体の消化物に認められた。したがって、Ｆ型の天然重合体は硫酸化されていないコンドロイチンである。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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