(57)【要約】少なくとも１つのＣＤ１３７由来細胞質シグナリング配列を含有するキメラ細胞質シグナリング分子をコードする核酸を記載する。この核酸は細胞内で発現し、細胞活性化プロセスを改良された効率で調節できるキメラ受容体及び他のタンパク質を産生する可能性がある。そのような調節細胞は、医療において、例えば感染症、炎症性疾患、及び自己免疫疾患の治療において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの細胞質シグナリング配列を含む細胞質シグナリング分子をコードする核酸であって、少なくとも１つの細胞質シグナリング配列がＣＤ１３７由来である核酸。
【請求項２】
少なくとも１つの細胞質シグナリング配列が、１次細胞質シグナリング配列である請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
１次シグナリング配列が、ＩＴＡＭを含有する請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
１次シグナリング配列が、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ６６ｄ由来である請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
１次シグナリング配列が、ＩＴＩＭを含有する請求項３に記載の核酸。
【請求項６】
少なくとも１つの細胞質シグナリング配列が、２次細胞質シグナリング配列である請求項１に記載の核酸。
【請求項７】
２次細胞質シグナリング配列が、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、又はＣＤ１５４由来である請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
３つの細胞質シグナリング配列をコードする請求項２〜７のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項９】
リーディング・フレームにおいてコードされる第１の細胞質シグナリング配列が、ＣＤ１３７由来である請求項２〜７のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１０】
ｉ）ＣＤ１３７由来細胞質シグナリング配列、続いてリーディング・フレームにおいてｉｉ）ＴＣＲζ由来細胞質シグナリング配列をコードする請求項９に記載の核酸。
【請求項１１】
リーディング・フレームにおいてコードされる第２の細胞質シグナリング配列が、ＣＤ１３７由来である請求項２〜７のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１２】
ｉ）ＴＣＲζ由来細胞質シグナリング領域、続いてリーディング・フレームにおいてｉｉ）ＣＤ１３７由来細胞質シグナリング領域をコードする請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
リーディング・フレームにおいてコードされる第１の細胞質シグナリング配列が、ＣＤ１３７由来であるか、又は２次細胞質シグナリング配列由来である請求項８に記載の核酸。
【請求項１４】
ｉ）ＣＤ２８由来細胞質シグナリング配列、ｉｉ）ＣＤ１３７由来細胞質シグナリング配列、及びｉｉｉ）ＴＣＲζ由来細胞質シグナリング領域をリーディング・フレームにおいてコードする請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
細胞外リガンド結合領域、膜貫通領域、及び細胞質シグナリング領域を含むキメラ受容体タンパク質をコードする核酸であって、細胞質シグナリング領域が、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の核酸によってコードされる核酸。
【請求項１６】
細胞外リガンド結合領域が、抗体、又はその抗原結合フラグメントである請求項１５に記載の核酸。
【請求項１７】
抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ’、又はｓｃＦｖである請求項１６に記載の核酸。
【請求項１８】
膜貫通領域が、Ｔ細胞受容体のα、β、又はζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、又はＣＤ１５４由来である請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１９】
膜貫通領域がＣＤ２８由来である請求項１８に記載の核酸。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２１】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の核酸、又は請求項２０に記載のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の核酸によってコードされた細胞質シグナリング分子を含むペプチド、又はポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の核酸によってコードされたキメラ受容体タンパク質。
【請求項２４】
請求項２２に記載のペプチド又はポリペプチド、あるいは請求項２３に記載のキメラ受容体タンパク質を発現する宿主細胞。
【請求項２５】
治療に用いるための請求項１〜１９のいずれか一項に記載の核酸、又は請求項２０に記載のベクター。
【請求項２６】
治療に用いるための請求項２３に記載のキメラ受容体タンパク質。
【請求項２７】
請求項２２に記載のペプチド又はポリペプチド、請求項２３に記載のキメラ受容体タンパク質、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の核酸、あるいは請求項２０に記載のベクターを、薬剤として許容される賦形剤と共に含む組成物。
【請求項２８】
ヒト又は動物において疾患を治療又は予防するための薬剤の製造における、請求項２２に記載のペプチド又はポリペプチド、請求項２３に記載のキメラ受容体タンパク質、あるいは請求項２７に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、新規な細胞質シグナリング分子、それをコードする核酸、並びに医療及び研究におけるその核酸及び細胞質シグナリング分子の使用に関する。
【０００２】
本出願書類を通して、多数の出版物を筆者及び出版年によって言及する。それらの出版物の完全な引用文献は、下記の発明の詳細な説明及び実施例に記載する。
【０００３】
４−１ＢＢ又はＩＬＡとしても知られるＣＤ１３７は、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーであり（Ｋｗｏｎ及びＷｅｉｓｓｍａｎ、１９８９）、したがってＴＮＦ受容体スーパーファミリーのいくつかの構造的特性及び機能的特性を共有する。ＣＤ１３７の細胞外領域は、システインに富む４つの特徴的なＴＮＦＲモチーフを含有し、ＣＤ１３７によるシグナル伝達は、腫瘍壊死因子受容体関連因子（ＴＲＡＦ）、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、及びＴＲＡＦ３の、ＣＤ１３７の細胞質領域との結合によって仲介される。これは、ｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）／ストレス活性化キナーゼ（ＳＡＰＫ）経路を含むいくつかの経路による下流のシグナル伝達をもたらすと考えられている。他のＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーと同様に、ＣＤ１３７はＴ細胞活性化に共刺激分子として関わることが示されているが（Ｇｏｏｄｗｉｎ等、１９９３、ＤｅＢｅｎｅｄｅｔｔｅ等、１９９５、１９９７）、これがこの分子の唯一の役割ではないことが明らかになってきており、他のＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーと同じように、Ｔ細胞活性化に次いで、免疫応答において多くの様々な役割を果たすことを示唆する一連の証拠がある（Ｋｗｏｎ等、２０００）。
【０００４】
免疫細胞シグナリングの分野の研究は、抗原受容体関与の下流に起こるシグナル伝達事象に関して相当量の情報を提供している。かなりの数の研究が受容体自体、及び抗原結合に応答して刺激される酵素を対象としてきた（Ｗｅｉｓｓ及びＬｉｔｔｍａｎにより概説、１９９４、ＤｅＦｒａｎｃｏ、１９９７）。
【０００５】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の個々の成分は充分に特徴づけられており、いくつかの場合においては、受容体サブユニット又は領域の機能が、キメラ受容体タンパク質の構造によって求められている（Ｋｕｗａｎａ等、１９８７、Ｒｏｍｅｏ等、１９９２）。特に細胞質シグナリング領域、及びＴＣＲ活性化におけるそれらの役割が、このアプローチを用いて同定された。この情報は、細胞活性化プロセスを調節することのできるキメラ受容体の開発を導いた（例えばＦｉｎｎｅｙ等、１９９８、及び公開国際特許明細書ＷＯ９７／２３６１３、ＷＯ９６／２３８１４、ＷＯ９６／２４６７１、ＷＯ９９／００４９４、ＷＯ９９／５７２６８を参照のこと）。
【０００６】
例えば細胞増殖の増加、サイトカイン発現の増加、細胞溶解活性の刺激、他のエフェクター機能の分化、抗体分泌、食作用、腫瘍浸潤、及び／又は細胞接着の増加のような細胞活性化の生物学的作用を制御するキメラ受容体の能力は、相当な治療潜在性を有する。
【０００７】
現在入手できるキメラ受容体は有効に細胞を活性化することができるが、そのようなキメラ受容体の細胞質シグナリング領域が、２次メッセンジャー経路の下流メンバー、典型的にはｓｒｃ及びｓｙｋ−チロシンキナーゼ・ファミリーに細胞外リガンド結合領域からの信号を伝達する有効性を改善する余地がある。
【０００８】
本発明は、ＣＤ１３７ポリペプチドの少なくとも一部を含み、したがって以前に記載されたキメラ受容体の細胞質シグナリング領域によって用いられるものとは別のシグナル伝達経路を用いることのできる新規の細胞質シグナリング分子を提供することによって、それらの困難に対処する。本発明はさらに、複数の２次メッセンジャー経路を経てシグナルを伝達することによって、より効果的に細胞活性化を仲介することのできる新規の細胞質シグナリング分子を提供する。
【０００９】
本出願人等は、キメラ受容体の一部としてＣＤ１３７ポリペプチドを使用することによって、その受容体への細胞外リガンドの結合に応答する細胞活性化がもたらされることを実証することができた。特に、ＣＤ１３７が少なくとも１つの他の細胞質シグナリング配列と共に用いられ、細胞質シグナリング分子を形成する場合、新規な予期しない特性をその細胞質シグナリング分子に付与することができる。例えば、別の２つの細胞質シグナリング配列と共にＣＤ１３７を含む細胞質シグナリング分子が、キメラ受容体の細胞質シグナリング領域として用いられる場合、結果として生じる細胞活性化のレベルは、予想されるレベルよりはるかに高い。もっとも驚くべきことには、認められる活性化の程度は、これまでに構築されたキメラ受容体によって生じた活性化を相当差で凌いでいる。
【００１０】
したがって、本発明によれば、各細胞質シグナリング配列が異なる２次メッセンジャー経路によるシグナル伝達を仲介する、２つの細胞質シグナリング配列を含む細胞質シグナリング分子をコードする核酸が提供される。好ましくは、本発明の細胞質シグナリング分子は、腫瘍壊死因子受容体関連因子（特に、例えばＴＲＡＦ２）によって、ｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）／ストレス活性化キナーゼ（ＳＡＰＫ）経路などの経路にシグナルを伝達する。より好ましくは、そのような細胞質シグナリング分子はさらに、ｓｒｃ又はｓｙｋ−チロシンキナーゼ経路を介して、シグナル伝達を仲介する。
【００１１】
特定の一実施形態において、本発明は、少なくとも２つの細胞質シグナリング配列を含む細胞質シグナリング分子をコードする核酸であって、少なくとも１つの細胞質シグナリング配列がＣＤ１３７由来である核酸を提供する。
【００１２】
上述のとおり、本発明の細胞質シグナリング分子は、複数の細胞質シグナリング配列を含む。本明細書では、「細胞質シグナリング配列」という用語は、より大きな領域の少なくとも相当部分を形成し、細胞内で生物学的プロセスの活性化又は抑制をもたらすシグナルを伝達できる単位として機能することが知られているアミノ酸の任意の配列を意味する。
【００１３】
ＣＤ１３７ポリペプチドは、３つのＴＮＦＲ反復を含有する細胞外領域、膜貫通領域、及び細胞内シグナル伝達に関与する細胞質領域からなる。したがって、ＣＤ１３７由来細胞質シグナリング配列は、ＣＤ１３７の細胞質領域、あるいは同じ機能を有するその誘導体又は変異体を含むことになる。「変異体」という用語は、任意の種変異体、あるいはその変異体が元の親配列と同じ機能を維持するという条件で１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、又は付加を含む任意の変異体を意味する。好ましくは、本発明の細胞質シグナリング分子は、ＣＤ１３７のアミノ酸残基２１４から２５５を含む細胞質シグナリング配列（Ａｌｄｅｒｓｏｎ等、１９９４）、あるいはその誘導体又は変異体を含有する。
【００１４】
本発明で用いられる他の細胞質シグナリング配列の好ましい例には、ＴＣＲ、及び共同で作用し、抗原受容体関与に続くシグナル伝達を開始する共働受容体（ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）の細胞質配列、並びにそれらの配列の誘導体又は変異体（上述のとおり）、並びに同じ機能を有する任意の合成配列が含まれる。
【００１５】
ＴＣＲのみを経て生じるシグナルはＴ細胞の完全な活性化には不充分であり、２次又は共刺激シグナルがさらに必要とされることが知られている。したがって、Ｔ細胞活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナリング配列、ＴＣＲを介して抗原依存性の１次活性を開始する配列（１次細胞質シグナリング配列）、及び抗原に依存せずに作用して２次又は共刺激シグナルを提供する配列（２次細胞質シグナリング配列）によって仲介されると言うことができる。
【００１６】
本発明の一態様において、細胞質シグナリング分子は、ＣＤ１３７由来細胞質シグナリング配列、及び１次細胞質シグナリング配列を含む。
【００１７】
１次細胞質シグナリング配列は、促進的方法又は抑制的方法のいずれかで、ＴＣＲ複合体の１次活性化を調節する。促進的な様式で作用する１次細胞質シグナリング配列は、免疫受容体チロシン活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナリング・モチーフを含有することができ（Ｒｅｔｈ、１９８９）、抑制的な様式で作用する配列は、免疫受容体チロシン抑制化モチーフ又はＩＴＩＭとして知られるシグナリング・モチーフを含有することができる（Ｂｕｒｓｈｔｙｎ等、１９９９）。
【００１８】
したがって、この態様、又は本明細書に記載の本発明のいずれかの態様で用いられる１次細胞質シグナリング配列は、好ましくは免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、又は免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する。
【００１９】
本発明に特に用いられるＩＴＡＭ含有１次細胞質シグナリング配列の例には、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄ由来のものが含まれる。好ましくは、これらの分子由来の細胞質シグナリング配列は、ＴＣＲζのアミノ酸残基３１〜１４２、ＦｃＲγのアミノ酸残基２７〜６８、ＦｃＲβのアミノ酸残基２０１〜２４４、ＣＤ３γのアミノ酸残基１１７〜１６０、ＣＤ３δのアミノ酸残基１０７〜１５０、ＣＤ５のアミノ酸残基３７８〜４７１、ＣＤ２２のアミノ酸残基６８８〜８２８、ＣＤ７９ａのアミノ酸残基１３４〜１９４、ＣＤ７９ｂのアミノ酸残基１５４〜２０１、又はＣＤ６６ｄの残基１４３〜２１８を含む。
【００２０】
特に好ましくは、本発明のこの態様による細胞質シグナリング分子は、ＴＣＲζ由来細胞質シグナリング配列を含む。
【００２１】
別の実施形態において、本発明の細胞質シグナリング分子は、ＣＤ１３７由来細胞質シグナリング配列、及び２次細胞質シグナリング配列を含む。
【００２２】
この態様、又は本明細書に記載の本発明のいずれかの態様で用いるのに適した２次細胞質シグナリング配列含有分子には、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、及びＣＤ１５４が含まれる。好ましくは、これらの分子由来の細胞質シグナリング配列は、ＣＤ２のアミノ酸残基２１２〜３２７、ＣＤ４アミノ酸残基３９６〜４３３、ＣＤ８αのアミノ酸残基１８６〜２１４、ＣＤ８βのアミノ酸残基１７５〜１８９、ＣＤ２８のアミノ酸残基１６２〜２０２、ＣＤ１３４のアミノ酸残基２１３〜２４９、又はＣＤ１５４のアミノ酸残基１〜２２を含む。特に好ましくは、ＣＤ２８又はＣＤ１５４由来の２次シグナリング配列が、ＣＤ１３７由来細胞質シグナリング配列と共に用いられる。
【００２３】
上述のとおり、本出願人等は、２つのさらなる細胞質シグナリング配列と共にＣＤ１３７を含む細胞質シグナリング分子をキメラ受容体の細胞質シグナリング領域として用いたとき、シグナル伝達の仲介において特に有効であることを見出した。
【００２４】
したがって、本発明の他の態様は、ＣＤ１３７由来細胞質シグナリング配列、及び少なくとも２つのさらなる細胞質シグナリング配列を含む細胞質シグナリング分子をコードする核酸を提供する。
【００２５】
少なくとも２つの追加の細胞質シグナリング配列の一方又は両方は、上述のとおり１次細胞質シグナリング配列、又は２次細胞質シグナリング配列であることができる。しかしながら、追加の細胞質シグナリング配列の少なくとも１つは１次細胞質配列であり、少なくとも１つの他の細胞質シグナリング配列は２次細胞質シグナリング配列であることが特に好ましい。本発明のこの態様によれば上述の任意の１次及び２次細胞質シグナリング配列を細胞質シグナリング分子に組み入れることができるが、ＴＣＲζ由来１次シグナリング配列とＣＤ２８由来２次シグナリング配列との組み合わせが好ましい。
【００２６】
本発明の細胞質シグナリング分子内の細胞質シグナル配列は、任意の順序、又は指定された順序で互いに結合していることができる。任意選択で、好ましくはアミノ酸長２から１０の短いオリゴペプチド又はポリペプチド・リンカーが結合を形成することができる。グリシン−セリン２重体は、特に適したリンカーを提供する。
【００２７】
細胞質ＣＤ１３７及び１つの追加の細胞質シグナリング配列を含む細胞質シグナリング分子をエンコードする核酸は、したがってｉ）ＣＤ１３７由来細胞質シグナリング配列及びｉｉ）１次細胞質シグナリング配列、ｉ）１次細胞質シグナリング配列及びｉｉ）ＣＤ１３７由来細胞質シグナリング配列、ｉ）ＣＤ１３７由来細胞質シグナリング配列及びｉｉ）２次細胞質シグナリング配列、又はｉ）２次細胞質シグナリング配列及びｉｉ）ＣＤ１３７由来細胞質シグナリング配列をリーディング・フレームにおいてコードすることができる。そのような細胞質シグナリング分子の特定の例には、アミノ末端からカルボキシル末端の順でｉ）ＣＤ１３７及びｉｉ）ＴＣＲζ、ｉ）ＴＣＲζ及びｉｉ）ＣＤ１３７、ｉ）ＣＤ１３７及びｉｉ）ＣＤ２８、並びにｉ）ＣＤ２８及びｉｉ）ＣＤ１３７由来細胞質シグナリング配列を含むものが含まれる。
【００２８】
本発明の細胞質シグナリング分子がＣＤ１３７由来細胞質シグナリング配列、及び少なくとも２つの追加の細胞質シグナリング配列を含む場合、これらも任意選択で上述のリンカーを介して、任意の順序、又は指定された順序で結合していることができる。したがって、そのような細胞質シグナリング分子をコードする核酸は、ｉ）ＣＤ１３７由来細胞質シグナリング配列、ｉｉ）１次細胞質シグナリング配列、及びｉｉｉ）２次細胞質シグナリング配列、ｉ）ＣＤ１３７由来細胞質シグナリング配列、ｉｉ）２次細胞質シグナリング配列、及びｉｉｉ）１次細胞質シグナリング配列、ｉ）１次細胞質シグナリング配列、ｉｉ）ＣＤ１３７由来細胞質シグナリング配列、及びｉｉｉ）２次細胞質シグナリング配列、ｉ）１次細胞質シグナリング配列、ｉｉ）２次細胞質シグナリング配列、及びｉｉｉ）ＣＤ１３７由来細胞質シグナリング配列、ｉ）２次細胞質シグナリング配列、ｉｉ）１次細胞質シグナリング配列、及びｉｉｉ）ＣＤ１３７由来細胞質シグナリング配列、又はｉ）２次細胞質シグナリング配列、ｉｉ）ＣＤ１３７由来細胞質シグナリング配列、及びｉｉｉ）１次細胞質シグナリング配列をコードすることができる。
【００２９】
そのような細胞質シグナリング分子の特定の例には、アミノ末端からカルボキシル末端の順でｉ）ＣＤ１３７、ｉｉ）ＴＣＲζ、及びｉｉｉ）ＣＤ２８、ｉ）ＣＤ１３７、ｉｉ）ＣＤ２８、及びｉｉｉ）ＴＣＲζ、ｉ）ＴＣＲζ、ｉｉ）ＣＤ１３７、及びｉｉｉ）ＣＤ２８、ｉ）ＴＣＲζ、ｉｉ）ＣＤ２８、及びｉｉｉ）ＣＤ１３７、ｉ）ＣＤ２８、ｉｉ）ＴＣＲζ、及びｉｉｉ）ＣＤ１３７、並びにｉ）ＣＤ２８、ｉｉ）ＣＤ１３７、及びｉｉｉ）ＴＣＲζ由来細胞質シグナリング配列を含むものが含まれる。
【００３０】
本発明の新規な細胞質シグナリング分子は、単独で、又はキメラ受容体などのより大きなタンパク質の一成分として用いることができる。その細胞内にすでに発現している免疫細胞受容体に対する置換細胞質シグナリング配列として作用させるために、個別のタンパク質分子としてそれらをエフェクター細胞に導入する、又はエフェクターに発現させることができる。このようにして、本発明の新規な細胞質シグナリング分子は、受容体を介したシグナリングの有効性を高めることができる。本発明の新規な細胞質シグナリング分子はその細胞の細胞質に可溶性ポリペプチドとして存在することができ、あるいは細胞膜に固定又は束縛され、細胞質に及ぶこともでき、そこで所与の一連の生理細胞条件下でシグナル伝達を仲介することができる。
【００３１】
しかしながら、本発明の細胞質シグナリング分子は、キメラ受容体タンパク質の細胞質シグナリング領域として用いられるとき、優先的にシグナリングを仲介するために用いられると考えられる。そのようなキメラ受容体はさらに、細胞外リガンド結合領域、及び膜貫通領域を含む。
【００３２】
したがって、本発明のこの態様によれば、細胞外リガンド結合領域、膜貫通領域、及びその細胞質シグナリング領域が少なくとも２つの異なる２次メッセンジャー経路を介してシグナル伝達を仲介する細胞質シグナリング領域を含むキメラ受容体タンパク質をコードする核酸が提供される。
【００３３】
細胞外リガンド結合領域の組み込みによって、特定のリガンド又はリガンド・クラスに対する特異性を示す能力がキメラ受容体に付与される。この特異性は、その受容体を活性化することのできる正確なリガンド又はリガンド・クラスを定義するために用いることができる。このようにして、選択されたリガンド・クラス又は個別のリガンドの結合によって、受容体が発現する細胞を活性化するようにこの受容体を設計することができる。
【００３４】
リガンドとキメラ受容体中の対応する結合領域との接触によって、細胞質シグナリング領域を介するシグナル伝達が生じる。キメラ受容体の細胞質領域として作用するように選択した、本発明の細胞質シグナリング分子内の細胞質シグナリング配列の組み合わせは、伝達されるシグナルの大きさを規定し、その結果として、細胞が活性化されるレベルを制御する。
【００３５】
したがって本発明の他の実施形態は、細胞外リガンド結合領域、膜貫通領域、及び上述の本発明のいずれかの態様による細胞質シグナリング分子をコードする核酸によってその細胞質シグナリング領域がコードされる細胞質シグナリング領域を含むキメラ受容体タンパク質をコードする核酸を提供する。
【００３６】
本明細書では、「細胞外リガンド結合領域」という用語は、リガンドを結合することのできる任意のオリゴペプチド、又はポリペプチドと定義される。したがって、その例が当分野の技術者に容易に明らかとなる抗体結合領域、抗体超可変ループ又はＣＤＲ、受容体結合領域、及び他のリガンド結合領域はこの用語によって記載される。好ましくは、この領域は、細胞表面分子との相互作用が可能である。
【００３７】
本発明において特に用いられる細胞表面分子との結合に関連するタンパク質の例には、抗体可変領域（ＶＨ又はＶＬ）、Ｔ細胞受容体可変部領域（ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ）、あるいはＣＤ８α、ＣＤ８ｂ、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ１１Ｃ、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ４９Ａ、ＣＤ４９Ｂ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９Ｅ、ＣＤ４９Ｆ、ＣＤ６１、ＣＤ４１、又はＣＤ５１の鎖が含まれる。場合によっては、完全な領域又は鎖を用いることが利益となる可能性があるが、適切である場合には、フラグメントを用いることができる。Ｆａｂ’フラグメント、特に１本鎖Ｆｖフラグメントは特に有用な結合成分である。
【００３８】
領域の選択は、標的細胞の表面を定義するリガンドの型及び数に依存する。例えば、細胞外リガンド結合領域は、特定の疾患状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択することができる。したがって、リガンドとして作用する可能性のある細胞表面マーカーの例には、ウイルス、細菌、及び寄生虫感染、自己免疫疾患、並びに癌細胞に関連するものが含まれる。癌細胞に関連する場合、細胞表面マーカーの特定の例は、肺腫瘍細胞に発現したボンベシン受容体、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、多形性上皮ムチン（ＰＥＭ）、ＣＤ３３、葉酸受容体、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、及びｅｒｂ−Ｂ２である。好まれる他のリガンドは、細胞表面接着分子、自己免疫疾患に存在する炎症性細胞、及び自己免疫の原因となるＴ細胞受容体又は抗原である。上に挙げた選択可能なリガンドは例として含まれるものである。このリストは限定的なものではなく、さらなる例は当分野の技術者には容易に明らかとなるであろう。
【００３９】
キメラ受容体は、２重特異性、又は多重特異性、すなわち複数のリガンド結合領域を含み、そのため複数のリガンドに対して特異性を示すことができるように設計することができる。そのような受容体は、細胞性免疫エフェクター細胞（例えばＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラル・キラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、又はマスト細胞）、あるいは補体カスケードの成分を補足する可能性がある。
【００４０】
キメラ受容体のさらなる成分は、膜貫通領域である。これは天然源、又は合成源に由来することができる。天然源の場合、この領域は、任意の膜結合タンパク質、又は膜貫通タンパク質に由来することができる。本発明において特に用いられる膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のα、β、又はζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４に由来する（すなわち少なくとも上記の膜貫通領域を含む）ことができる。あるいは、膜貫通領域は合成することができ、この場合、主としてロイシン及びバリンなどの疎水性残基を含むことになる。好ましくは、合成膜貫通領域の各末端に、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンの３重体が見出される。任意選択で、好ましくはアミノ酸長２から１０の短いオリゴペプチド、又はポリペプチド・リンカーが、キメラ受容体の細胞質シグナリング領域と膜貫通領域との間に結合を形成することができる。グリシン−セリン２重体は、特に適したリンカーを提供する。
【００４１】
細胞外リガンド結合領域と膜貫通領域との間、又は細胞質シグナリング領域と膜貫通領域との間に、スペーサー領域を組み込むことができる。本明細書では、「スペーサー領域」という用語は一般に、ポリペプチド鎖において膜貫通領域を細胞外リガンド結合領域、又は細胞質シグナリング領域に結合するように機能する任意のオリゴペプチド、又はポリペプチドを意味する。スペーサー領域は、３００個までのアミノ酸、好ましくは１０から１００個のアミノ酸、もっとも好ましくは２５から５０個のアミノ酸を含む。
【００４２】
スペーサー領域は、天然分子の全体又は一部、例えばＣＤ８、ＣＤ４、又はＣＤ２８の細胞外領域の全体又は一部、あるいは抗体定常領域の全体又は一部に由来することができる。あるいは、このスペーサー領域は、天然スペーサー配列に対応する合成配列であることができ、又は全体として合成スペーサー配列であることができる。
【００４３】
スペーサー領域は、キメラ受容体の構造性会合を最小にし、細胞における構造性活性化の発生を低減する、あるいはそのような会合を促進し、細胞内の構造性活性化のレベルを高めるように設計することができる。いずれの可能性も、他のポリペプチド鎖内のアミノ酸側鎖と共有的又は非共有的に相互作用することが可能な側鎖残基を有する膜貫通及び／又はスペーサー領域内のアミノ酸及び天然配列を、削除、挿入、変更、又は修飾することによって人工的に達成することができる。会合を促進することが通常予測できるアミノ酸の特定の例には、システイン残基、電荷アミノ酸、あるいは潜在的グリコシル化部位内のセリン又はトレオニンなどのアミノ酸が含まれる。
【００４４】
キメラ受容体は、スペーサー及び膜貫通成分が遊離チオール基を有し、それによって受容体に多量化性、特に２量化性を与えるように設計することができる。そのような多量受容体、特に２量体が好ましい。ＣＤ２８成分及び／又は抗体ヒンジ配列由来のスペーサー領域、及びＣＤ２８由来の膜貫通領域を有する受容体、並びに天然Ｔ細胞受容体のゼータ鎖が特に好ましい。
【００４５】
本発明は、新規な細胞質シグナリング分子、及びキメラ受容体タンパク質をコードする核酸を提供するだけでなく、そのタンパク質自体にも及ぶ。
【００４６】
本発明で用いる細胞質シグナリング配列の配列をコードする核酸は、指定されたアミノ酸配列から容易に得られる。他の核酸配列は、科学文献に広く報告されており、公共データベースにおいても入手可能である。ＤＮＡは市販により入手でき、又はｃＤＮＡライブラリーの一部であってよく、又は当分野の技術者に明らかとなる標準的な分子生物学及び／又は化学手順を用いて産生することもできる。特に適した技法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、オリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発、オリゴヌクレオチドを用いた合成技法、間隙オリゴヌクレオチドの酵素的開裂、又は酵素的充填が含まれる。そのような技法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＦｒｉｔｓｃｈ、１９８９、並びに下記の実施例に記載されている。
【００４７】
本発明の核酸は、担体と共に用いることができる。この担体は、ｅｘ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｖｏにおいて標的細胞及び／又は標的宿主細胞に核酸を導入するのに適したベクター又は他の担体であることができる。適切なベクターの例には、ウイルス・ベクター、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、及び単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）などが含まれる。非ウイルス・ベクターを用いることもでき、リポソーム・ベクター、国際特許出願ＷＯ９６／１００３８、ＷＯ９７／１８１８５、ＷＯ９７／２５３２９、ＷＯ９７／３０１７０、及びＷＯ９７／３１９３４に記載のカチオン脂質などの凝縮剤をベースとするベクターなどである。適切である場合、このベクターはさらに、プロモーター、及び調節配列、及び／又はウイルス由来の複製機能を含むことができ、例えばレトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）、ＡＡＶ反復、ＳＶ４０、及びヒト・サイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーター及び／又はエンハンサー、スプライシング及びポリアデニル化シグナル、並びにＥＢＶ及びＢＫウイルス複製機能などである。組織特異性調節配列、例えばＴＣＲ−αプロモーター、Ｅ−セレクチン・プロモーター、及びＣＤ２プロモーターなど、並びに遺伝子座調節領域も用いることができる。この担体は抗体であってよい。
【００４８】
本発明にはさらに、上述した本発明のいずれかの態様による核酸を含有するクローニング・ベクター、及び発現ベクターが含まれる。そのような発現ベクターは、適切な場合フレーム内で本発明の核酸分子と結合した、適切な転写及び翻訳制御配列、例えばエンハンサー・エレメント、プロモーター−オペレーター領域、終止配列、ｍＲＮＡ安定配列、開始及び終止コドン、又はリボソーム結合部位を組み入れる。
【００４９】
さらに、そのタンパク質配列に天然で有効なシグナル・ペプチドが存在しないとき、組換え細胞質シグナリング・タンパク質をある種の宿主から分泌させることが好都合である可能性がある。したがって、そのようなベクターのさらなる成分には、分泌シグナリング及びプロセシング配列をコードする核酸配列が含まれる。
【００５０】
本発明によるベクターには、プラスミド、並びにウイルス（バクテリオファージ、及び真核細胞ウイルスの両方を含む）が含まれる。異種タンパク質の発現に適した多くの発現系がよく知られており、当分野において文献に記載されている。例えば、異種ポリペプチド及びポリペプチド・フラグメントを発現するために、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）などの原核細胞を用いることはよく知られている（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ及びＦｒｔｓｃｈ、１９８９、Ｇｌｏｖｅｒ、１９９５ａを参照のこと）。同様に、真核細胞発現系も充分に開発されており、異種タンパク質の発現に一般に用いられている（例えばＧｌｏｖｅｒ、１９９５ｂ、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ等、１９９３を参照のこと）。真核細胞においては、酵母を除いて、好まれるベクターはウイルスをベースとしたものである。特に適したウイルス・ベクターには、バキュロウイルス、アデノウイルス、及びワクシニアウイルス・ベクターである。
【００５１】
適切な調節配列（プロモーター、終止、ポリアデニル化、及びエンハンサー配列、マーカー遺伝子を含む）を含有するベクターは、文献に記載されたものから選択するか、あるいは標準的な分子生物学の技法を用いて本発明のタンパク質を発現させるために容易に構築することができる。そのような技法、並びに、例えば核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、ＤＮＡ形質転換、及び遺伝子発現における核酸操作のプロトコル、並びにタンパク質の分析は、Ａｕｓｕｂｅｌ等、１９９２、又はＲｅｅｓ等、１９９３に詳しく記載されている。
【００５２】
本発明の細胞質シグナリング分子及びキメラ受容体タンパク質のｉｎ　ｖｉｔｒｏでの発現に適した宿主細胞には、原核細胞、例えば大腸菌、真核生物酵母、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ　ｓｐｅｃｉｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、哺乳動物細胞系、及び昆虫細胞が含まれる。あるいは、本発明のキメラ受容体は、ｉｎ　ｖｉｖｏで多様な宿主、例えば昆虫幼虫、植物細胞、より好ましくは哺乳動物組織において発現させることができる。
【００５３】
核酸は、任意の適切な技法によって宿主細胞に導入することができる。真核細胞では、これらの技法には、リン酸カルシウム・トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション、粒子衝撃法、リポソーム媒介トランスフェクション、あるいはレトロウイルス、アデノウイルス、又は他のウイルス、例えばワクシニア、又は昆虫細胞の場合、バキュロウイルスなどを用いる形質導入を含むことができる。細菌細胞の場合、適切な技法には、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、又はバクテリオファージを用いるトランスフェクションを含むことができる。この核酸は、細胞内にエピソーム形態で維持されることができ、あるいは細胞のゲノムに組み込まれてもよい。後者が望ましい場合、ゲノムとの組換えを促進する配列が核酸に含まれる。核酸の宿主細胞への導入に続いて、適切にキメラ受容体タンパク質の発現を高める、又は誘発する条件下で細胞を培養することができる。
【００５４】
したがって、本発明の他の態様は、本明細書に記載の細胞質シグナリング分子及び／又はキメラ受容体タンパク質をコードする核酸を含有する宿主細胞、及びそのようなタンパク質を発現する宿主細胞を提供する。
【００５５】
さらに他の態様によれば、本発明の核酸は、ｅｘ−ｖｉｖｏ又はｉｎ−ｖｉｖｏ治療において用いることができる。
【００５６】
ｅｘ　ｖｉｖｏで用いる場合、当分野でよく知られている方法、例えば、トランスフェクション、形質導入（ウイルス形質導入を含む）、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム媒介ＤＮＡ形質転換、エレクトロポレーション、カチオン・リポフェクション、又は標的化リポソームを用いて、核酸をエフェクター細胞（標的宿主から除去）に導入することができる。その後、標準的な技法を用いて、そのエフェクター細胞を宿主に再び導入する。本発明のアダプタ受容体の発現に適したエフェクター細胞の例には、免疫系に関連の細胞、例えばリンパ球、例えば細胞障害性Ｔリンパ球、腫瘍浸潤性リンパ球、好中球、好塩基球、又はＴヘルパー細胞、樹状細胞、Ｂ細胞、造血幹細胞、マクロファージ、単球、又はＮＫ細胞などが含まれる。細胞障害性Ｔリンパ球の使用が特に好ましい。
【００５７】
本発明の核酸は、ｉｎ　ｖｉｖｏでの投与に特に適している。これを達成するために、好ましくはＤＮＡであるこの核酸は、上述の担体が核酸を所望のエフェクター細胞に向けることのできる標的化担体系の形であることができる。適切な標的化送達系の例には、裸の（ｎａｋｅｄ）標的化ＤＮＡ、ＤＮＡを被包かつ／又はＤＮＡと複合した標的化リポソーム、標的化レトロウイルス系、並びにプロタミン及びポリリシン凝縮（ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ）ＤＮＡなどの標的化凝縮ＤＮＡが含まれる。
【００５８】
ターゲティング系は当分野においてよく知られており、例えばＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４、ＣＤ３、セレクティング（例えばＥ−セレクチン）、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２４、及び活性化抗原（例えばＣＤ６９、及びｄＩＬ−２Ｒ）など、ｉｎ　ｖｉｖｏで標的細胞に発現する細胞表面抗原に対する抗体、又はそのフラグメントを用いることが含まれる。あるいは、他の受容体−リガンド相互作用を、ターゲティングのために、例えばＣＤ４がＨＩＶｇｐ１６０発現標的細胞を標的とするために用いることができる。
【００５９】
一般に、抗体−標的化ＤＮＡの使用が好ましく、特に抗体−裸の標的化ＤＮＡ、抗体−標的化凝縮ＤＮＡ、特に抗体−標的化リポソームが好ましい。用いることのできるリポソームの型には、例えば抗体をリポソームに結合するために低いｐＨで開裂するリンカーを用いるｐＨ感受性リポソームが含まれる。本発明の核酸はまた、細胞膜に融合するカチオン・リポソームを用いて細胞質を直接標的とすることもできる。本発明に用いるリポソームは、循環半減期を増大するために、それらの表面に結合した親水性分子、例えばポリエチレングリコール・ポリマーを有することもできる。ＤＮＡをリポソーム又は他の担体に結合するのに適した基には、当分野において多くの例がある。例えば、国際特許出願ＷＯ８８／０４９２４、ＷＯ９０／０９７８２、ＷＯ９１／０５５４５、ＷＯ９１／０５５４６、ＷＯ９３／１９７３８、ＷＯ９４／２００７３、及びＷＯ９４／２２４２９を参照されたい。抗体又は他のターゲティング分子は、例えばチオール又はアミンなど抗体中の通常の結合基及び反応性官能基、あるいはＤＮＡ又はＤＮＡ含有材料中の通常の結合基及び反応性官能基を用いてＤＮＡ、凝縮ＤＮＡ、又はリポソームに結合することができる。
【００６０】
非標的化担体系も用いることができる。これらの系においては、タンパク質の標的化発現が有利である。これは、例えばＴ細胞特異プロモーター系、例えばゼータ・プロモーターなど、ＣＤ２プロモーター及び遺伝子座制御領域、ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲα、及びＴＣＲβプロモーター、サイトカイン・プロモーター系、例えばＩＬ２プロモーターなど、及びパーフォリン・プロモーターを用いて達成することができる。
【００６１】
本発明の細胞質シグナリング分子及びキメラ受容体タンパク質、又はそれらをコードする核酸は、哺乳類、特にヒトの患者の治療法において適用されることが意図される。本発明によって産生された細胞質シグナリング分子及びキメラ受容体は、いくつかの疾患又は障害の治療において特に有用である可能性がある。そのような疾患又は障害には、感染症の一般的項目に記載のもの、例えばＨＩＶ感染、炎症性疾患／自己免疫疾患、例えば喘息、湿疹、先天性疾患、例えば嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、皮膚疾患、例えば乾癬、神経疾患、例えば多発性硬化症、移植、例えば器官移植拒絶反応、対宿主性移植片病、代謝／特発性疾患、例えば糖尿病、癌が含まれる。
【００６２】
例えば、リガンド結合領域が標的細胞のリガンドに結合することによって、Ｔ細胞表面における本発明のキメラ受容体の発現は、その細胞の活性化を開始する可能性がある。続いて起こる受容体のシグナリング機能の活性化によって刺激された炎症メディエーターの放出は、標的細胞の破壊を確実なものにする。
【００６３】
本発明によるキメラ受容体が免疫系のエフェクター細胞に発現するとき、標的への結合はエフェクター細胞を活性化し、この活性化の下流の作用もまた標的細胞の破壊をもたらす可能性がある。キメラ受容体の細胞外リガンド結合領域が、免疫細胞の表面マーカーに対して特異性を示す場合、エフェクター細胞は疾患部位に集められる可能性がある。したがって、疾患細胞における本発明のキメラ受容体の発現は、その破壊を確実なものにする。
【００６４】
単一宿主細胞内での多重特異性キメラ受容体タンパク質の発現、又は複数のキメラ受容体（異なるリガンド特異性を有する）の発現は、受容体に２重の機能性を付与する可能性がある。例えば、その標的とのキメラ受容体の結合は、エフェクター細胞自体を活性化するだけでなく、さらに他の免疫エフェクターをその疾患部位に誘引する可能性がある。このようにして、免疫系の活性化によって、標的細胞が破壊される可能性がある。
【００６５】
本発明の他の態様は、上述の本発明のいずれかの態様による細胞質シグナリング分子、又はキメラ受容体タンパク質、あるいは細胞質シグナリング分子又はキメラ受容体タンパク質をコードする核酸を、薬剤として許容される賦形剤と共に含む組成物を提供する。
【００６６】
適切な賦形剤は当分野の技術者によく知られており、例えばリン酸緩衝生理食塩水（例えば０．０１Ｍのリン酸塩、０．１３８ＭのＮａＣｌ、０．００２７ＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４）、水、生理食塩水、グリセロール、又はエタノールなどの液体を含み、任意選択でさらに塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩、及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩を含む。湿潤剤、又は乳化剤などの助剤、及びｐＨ緩衝物質も存在させることができる。薬剤として許容される賦形剤の詳細な検討は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．１９９１）に見出すことができる。好ましくは、この組成物は、例えば注射又は注入、例えばボーラス注射、持続注入、又は粒子媒介注射による非経口投与に適した形態である。この組成物が注射又は注入用である場合、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、又は乳剤の形態を取ることができ、懸濁化剤、保存剤、安定化剤、及び／又は分散剤などの製剤化剤を含有することができる。あるいは、使用前に適切な滅菌液体で再構成される乾燥形態であることができる。粒子媒介投与の場合、ＤＮＡは、微細金粒子などの粒子上に被覆することができる。
【００６７】
それ自体が組成物を投与される個体に有害な抗体の産生を誘発せず、過度の毒性なしに投与することのできる担体も用いることができる。適切な担体は、典型的に緩やかに代謝される大きな高分子、例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、及び不活性ウイルス粒子などである。薬剤組成物はさらに、貯蔵中の寿命を延ばすために保存剤を含有することができる。
【００６８】
組成物が経口投与に適している場合、その製剤は有効成分に加えて、添加剤、例えばデンプン（例えばポテト、とうもろこし、又はコムギデンプン、セルロース）、微結晶性セルロースなどのデンプン誘導体、シリカ、乳糖などの種々の糖、炭酸マグネシウム、及び／又はリン酸カルシウムなどを含有することができる。経口投与に適した製剤は、患者の消化器系に充分に耐性であることが望ましい。この目的のために、粘液形成剤（ｍｕｃｕｓ　ｆｏｒｍｅｒ）、及び樹脂を含むことが望ましい可能性がある。また、胃液に不溶性であるカプセル中に組成物を製剤することによって耐性を向上させることが望ましい可能性がある。さらに、制御放出製剤に組成物を包含させることが好ましい可能性がある。
【００６９】
本発明のさらに他の態様によれば、ヒト又は動物において疾患を治療又は予防するための薬剤の製造における、新規の細胞質シグナリング分子又はキメラ受容体タンパク質をコードする核酸、そのようにコードされたポリペプチド、あるいはそのような核酸又はポリペプチドを含有する薬剤組成物の使用も提供される。
【００７０】
本発明の様々な態様及び実施形態を、実施例によってより詳しく例示する。本発明の範囲から逸脱することなく、細部を変更できることが理解されるであろう。
【００７１】
（実施例）
実施例１：受容体クローニング・カセットの構築
キメラ受容体フォーマットのシグナリング領域組み合わせの構築及び分析を促進するために、クローニング・カセットをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及びｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において考案した。このクローニング・カセットは、結合成分カセット、及びスペーサー／膜貫通カセットからなる。
【００７２】
この新しいカセット系を図１に示す。結合成分は５’（解読方向に対して）ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、並びに３’（同じく解読方向に対して）ＳｐｅＩ制限部位を有する。細胞外スペーサーは、ＳｐｒＩ部位（したがって、５’末端にＴｈｒ、Ｓｅｒをコードする）、及びＮａｒＩ部位（したがって、３’末端にＧｌｙ、Ａｌａをコードする）を両側に有する。膜貫通成分は、その５’末端のＮａｒＩ部位（したがって、Ｇｌｙ、Ａｌａをコードする）、並びに３’末端のＭｌｕＩ（したがって、エンコードＴｈｒ、Ａｒｇをコードする）及びＢａｍＨＩ部位（したがって、Ｇｌｙ、Ｓｅｒをコードする）を両側に有する。この細胞質シグナリング領域は、ＢａｍＨＩ部位にインフレームでクローン化することができる。このＢａｍＨＩ部位に続いて、転写終止のための終止コドンがあり、続く構築物全体のレスキューを促進するために下流にＥｃｏＲＩ部位がある。
【００７３】
ａ）結合成分カセット（ＨｉｎｄＩＩＩからＳｐｅＩ）　これは、短いリンカー配列によって結合した抗ＣＤ３３抗体のＶＬ及びＶＨ領域からなる。ＶＬ領域を、オリゴＡ５２６７及びＦ２２７８５を用いて、ｈＰ６７ｓｃＦｖからＰＣＲクローニングし（ＷＯ９７／２３６１３）、制限酵素で消化して、ＨｉｎｄＩＩＩからＢｇｌＩＩまでのフラグメントを産生した。ＶＨ領域を、オリゴＦ２２７８６及びＦ２２７８７を用いて、ｈＰ６７ｓｃＦｖからＰＣＲクローニングし（ＷＯ９７／２３６１３）、制限酵素で消化して、ＢｇｌＩＩからＳｐｅＩまでのフラグメントを産生した。次いで、これら２つのフラグメントを、リンカー配列と共にクローニング・ベクターに共ライゲート（ｃｏ−ｌｉｇａｔｅ）した。このリンカーは、５’リン酸基を有するオリゴＦ２２９６６及びＦ２２９６７をアニーリングすることによって形成した。これらのアニーリングされたオリゴは、ＢｇｌＩＩオーバーハングと適合性であったが、ライゲーションでＢｇｌＩＩ部位を再形成しなかった。
【００７４】
ｂ）スペーサー／膜貫通カセット（終止コドンより前にシグナリング・カセットのクローニングのための内部ＢａｍＨＩ部位を有するＳｐｅＩからＥｃｏＲＩ）　細胞外スペーサー成分ｈ．ＣＤ２８は、ヒトＩｇＧ１ヒンジの残基２３４から２４３、及びヒトＣＤ２８の残基１１８から１３４からなる。膜貫通成分は、ヒトＣＤ２８の残基１３５から１６１からなる（Ａｒｕｆｆｏ及びＳｅｅｄ、１９８７）。
【００７５】
このカセットを産生するために、２００ｂｐフラグメントを、オリゴＳ０１４６、Ａ６０８１、Ａ６０８２、及びＡ６０８３を用いてＰＣＲアセンブリングした（図３）。このフラグメントは、ＳｐｅＩ部位で開始し、細胞外スペーサーｈ．ＣＤ２８、ヒトＣＤ２８膜貫通領域、ＢａｍＨＩ部位、終止コドンからなり、ＥｃｏＲＩ部位で終わる（図２を参照のこと）。
【００７６】
実施例２：細胞質シグナリング配列の異なる組み合わせを有するキメラ受容体の構築
次いで、細胞質シグナリング配列を、上述のカセットのＢａｍＨＩ部位にクローニングした。各シグナリング配列がＢｃｌＩからＢａｍＨＩまでのフラグメント上にあるので、これらの配列の指向性クローニングは３’末端のみにＢａｍＨＩ部位を維持し、続く第２、及び第３の細胞質シグナリング配列のクローニングを可能にする。このクローニング法は、各シグナリング配列の間にアミノ酸２個のスペーサー（Ｇｌｙ、Ｓｅｒ）を生じる。
【００７７】
ａ）ゼータ・シグナリング・カセット（ＢｃｌＩからＢａｍＨＩフラグメント）　これはヒトＴＣＲζ鎖の残基３１から１４２からなるが（Ｗｅｉｓｓｍａｎ等、１９８８、Ｍｏｉｎｇｅｏｎ等、１９９０）、これをオリゴＦ３４７２９及びＦ３４７３０を用いてｐＨＭＦ９４２からＰＣＲクローニングし（国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ００／０１４５６に記載のゼータ・キメラ受容体）、制限酵素ＢｃＩＩ及びＢａｍＨＩで消化した。
【００７８】
ｂ）ＣＤ２８シグナリング・カセット（ＢｃｌＩからＢａｍＨＩフラグメント）　これはＣＤ２８の残基１６２から２０２からなるヒトＣＤ２８の細胞内成分を含む（Ａｒｕｆｆｏ及びＳｅｅｄ、１９８７）。この成分は、５’リン酸基を有するオリゴＢ０７３５及びＢ０７３６をアニーリングすることによって形成した。これらのアニール化オリゴの１本鎖オーバーハングは、５’ＢｃｌＩ半部位、及び３’ＢａｍＨＩ半部位（ｈａｌｆ　ｓｉｔｅ）を形成する。
【００７９】
ｃ）ＣＤ１３７シグナリング・カセット　（ＢｃｌＩからＢａｍＨＩフラグメント）　これは、ヒトＣＤ１３７の細胞内成分を含む残基２１４から２５５からなり（Ａｌｄｅｒｓｏｎ等、１９９４）、５’リン酸基を有するオリゴＦ２５５６８及びＦ２５５６９をアニーリングすることによって形成した。これらのアニール化オリゴの１本鎖オーバーハングは、５’ＢｃｌＩ半部位、及び３’ＢａｍＨＩ半部位を形成する。上述のシグナリング・カセットから産生されたキメラ受容体を表１に挙げる。
【００８０】
実施例３：受容体の分析
ａ）発現プラスミドの構築　キメラ受容体構築物を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ＋からＨｉｎｄＩＩＩからＥｃｏＲＩまでの制限フラグメント上の発現ベクターｐＥＥ６ｈＣＭＶ．ｎｅ（Ｃｏｃｋｅｔｔ等、１９９１）にサブクローニングした。空の発現ベクター（すなわち、キメラ受容体遺伝子が存在しないベース・ベクター）を陰性コントロールとして用いる。
【００８１】
【表１】
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【００８２】
ｂ）ＪｕｒｋａｔＥ６．１細胞へのトランスフェクション　安定な細胞系を産生するために、発現プラスミドを線状にし、ＢｉｏＲａｄ　Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒを用いて、エレクトロポレーションによってＪｕｒｋａｔＥ６．１細胞（ＥＣＡＣＣ）にトランスフェクトした。細胞（〜２．５×１０６）をＤＮＡ（１０μｇ）と混合し、１ｍｌのＰＢＳ中、１ｋＶ、３μＦ（０．４ｃｍ電極間隙キュベット）で２回パルスを与えた。細胞を非選択培地に一晩放置して回復させ、その後、抗生物質Ｇ４１８（Ｓｉｇｍａ）１．５ｍｇ／ｍｌを補充した培地で選択、培養した。約４週間後、細胞は分析の準備が完了した。
【００８３】
ｃ）表面発現の分析：ＦＡＣＳ　約５×１０５のＪｕｒｋａｔ細胞を、ＦＩＴＣ標識ＣＤ３３抗原１μｇ／ｍｌで染色した。蛍光は、ＦＡＣＳｃａｎサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。
【００８４】
ｄ）機能の分析：ＩＬ−２産生　２×１０５の細胞を、エフェクター：標的１：１及び１：２の比で標的細胞と共に、又は３００ｎｇ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌの濃度で可溶性ＣＤ３３抗原と共に、９６ウェル・プレートにおいて２０時間８％ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。次いで、細胞上清を回収し、ヒトＩＬ−２に関してアッセイした（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｄｕｏｓｅｔ　ＥＬＩＳＡ発色（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）キット）。
【００８５】
用いた標的細胞は以下の通りである。
Ｎ．ＥＥ６−コントロール発現ベクターでトランスフェクトしたマウス骨髄腫（ＮＳ０）。これらの細胞は、陰性コントロール標的細胞系として用いる。
Ｎ．ＣＤ３３−細胞表面の抗原ＣＤ３３の発現を促進する発現ベクターでトランスフェクトしたマウス骨髄腫（ＮＳ０）。
【００８６】
実施例４：結果
図４及び５は、キメラ受容体の細胞質シグナリング領域として用いられる細胞質シグナリング分子にＣＤ１３７由来細胞質シグナリング配列が組み込まれるとき、リガンドの細胞外リガンド結合領域への結合が、ＩＬ−２の産生によって示されるように細胞活性化をもたらすことを示す。ＦＩＴＣ−ＣＤ３３のデータを用いて受容体の発現レベルを補正したとき、少なくとも１つの追加の細胞質シグナリング配列と共にＣＤ１３７由来細胞質シグナリング配列を有するシグナリング領域を含むキメラ受容体が、ゼータ・キメラ受容体などの従来のキメラ受容体に比べて、ＩＬ−２産生の仲介においてより有効であることが認められる。
【００８７】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
ＣＤ１３７由来細胞質シグナリング配列を含有する細胞質シグナリング領域を含むキメラ受容体を構築するためのクローニング・カセットである。
【図２】
図１に記載のクローニング・カセットの構築に用いたｈ．ＣＤ２８細胞外スペーサー領域、及びヒトＣＤ２８膜貫通領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列である。
【図３】
ＣＤ１３７由来細胞質シグナリング配列を含む細胞質シグナリング分子の構築に用いたオリゴヌクレオチド配列である。
【図４】
ＣＤ１３７由来細胞質シグナリング配列を含む細胞質シグナリング領域を有するキメラ受容体タンパク質の抗原特異的刺激−細胞結合抗原による刺激である。
【図５】
ＣＤ１３７由来細胞質シグナリング配列を含む細胞質シグナリング領域を有するキメラ受容体タンパク質の抗原特異的刺激−可溶性抗原による刺激である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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