(57)【要約】【課題】  胃癌組織で特異的に発現される遺伝子の発現程度の測定を用いた胃癌診断方法および診断キット、並びに転移性胃癌組織で特異的に発現される遺伝子の発現程度の測定を用いた転移性胃癌診断方法および診断キットを提供する。【解決手段】  本発明は、胃癌および転移性胃癌診断キットに関し、さらに詳しくは、胃癌に対する高発現遺伝子と低発現遺伝子の発現程度を測定して胃癌を診断する胃癌診断キットと、転移性胃癌に対する高発現遺伝子と低発現遺伝子の発現程度を測定して癌転移を通じての癌の悪性診断に非常に有効に使用できるように開発された転移性胃癌診断キットに関する。
2006526998.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）手術によって除去された試験胃組織において、ＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ，ＨＳＰＢ１およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の胃癌高発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、
（ｂ）手術によって除去された正常の胃組織において、ＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ， ＨＳＰＢ１およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の胃癌高発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、
（ｃ）手術によって除去された試験胃組織において、ＩＧＫＣ，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の胃癌高発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、
（ｄ）手術によって除去された正常の胃組織において、ＩＧＫＣ，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の胃癌高発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、および
（ｅ）前記（ａ）によって得られた測定値を前記（ｂ）で得られた測定値と比較し、前記（ｃ）によって得られた測定値を前記（ｄ）で得られた測定値と比較して胃癌であるかどうかを判定する段階を含むことを特徴とする胃癌診断方法。
【請求項２】
前記遺伝子の発現量を実時間ＲＴ−ＰＣＲまたは競争的ＲＴ−ＰＣＲを通じて特定することを特徴とする請求項１記載の胃癌診断方法。
【請求項３】
（ａ）手術によって除去された試験転移性胃癌組織において、ＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる一つ以上の転移性胃癌高発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、
（ｂ）手術によって除去された原発癌性胃組織において、ＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる一つ以上の転移性胃癌高発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、
（ｃ）手術によって除去された試験転移性胃癌組織において、ＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の転移性胃癌低発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、
（ｄ）手術によって除去された原発癌性胃組織において、ＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の転移性胃癌低発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、および
（ｅ）前記（ａ）によって得られた測定値を前記（ｂ）で得られた測定値と比較し、前記（ｃ）によって得られた測定値を前記（ｄ）で得られた測定値と比較して胃癌が転移されたかどうかを判定する段階を含むことを特徴とする転移性胃癌診断方法。
【請求項４】
前記遺伝子の発現量を実時間ＲＴ−ＰＣＲまたは競争的ＲＴ−ＰＣＲを通じて測定することを特徴とする請求項３記載の転移性胃癌診断方法。
【請求項５】
胃癌特異的高発現遺伝子であるＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ， ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ，ＨＳＰＢ１およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子のセンスおよびアンチセンスプライマー、および胃癌特異的低発現遺伝子であるＩＧＫＣ，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを含むことを特徴とする胃癌診断キット。
【請求項６】
前記プライマーが１５ｂｐ以上のＤＮＡであることを特徴とする請求項５記載の胃癌診断キット。
【請求項７】
胃癌特異的高発現遺伝子であるＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ，ＨＳＰＢ１およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子に相補的なプローブ、および胃癌特異的低発現遺伝子であるＩＧＫＣ，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子に相補的なプローブを含むことを特徴とする胃癌診断キット。
【請求項８】
前記プローブを用いたハイブリダイゼーション反応を通じて前記遺伝子の発現量を測定することを特徴とする請求項７記載の胃癌診断キット。
【請求項９】
前記プローブが２００〜１０００ｂｐであることを特徴とする請求項７または８記載の胃癌診断キット。
【請求項１０】
胃癌特異的高発現遺伝子であるＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ，ＨＳＰＢ１およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する抗体、および胃癌特異的低発現遺伝子であるＩＧＫＣ，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する抗体を含むことを特徴とする胃癌診断キット。
【請求項１１】
抗原−抗体結合反応を通じて前記タンパク質の発現程度を測定することを特徴とする請求項１０記載の胃癌診断キット。
【請求項１２】
転移性胃癌特異的高発現遺伝子であるＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーと、転移性胃癌特異的低発現遺伝子であるＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子のセンスおよびアンチセンスプライマーを含むことを特徴とする転移性胃癌診断キット。
【請求項１３】
前記プライマーが１５ｂｐ以上のＤＮＡであることを特徴とする請求項１２記載の転移性胃癌診断キット。
【請求項１４】
転移性胃癌特異的高発現遺伝子であるＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子に相補的なプローブと、転移性胃癌特異的低発現遺伝子であるＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子に相補的なプローブを含むことを特徴とする転移性胃癌診断キット。
【請求項１５】
前記プローブを用いたハイブリダイゼーション反応を通じて前記遺伝子の発現量を測定することを特徴とする請求項１４記載の転移性胃癌診断キット。
【請求項１６】
前記プローブが２００〜１０００ｂｐであることを特徴とする請求項１４または１５記載の転移性胃癌診断キット。
【請求項１７】
転移性胃癌特異的高発現遺伝子であるＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する抗体と転移性胃癌特異的低発現遺伝子であるＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する抗体を含むことを特徴とする転移性胃癌診断キット。
【請求項１８】
抗原−抗体結合反応を通じて前記タンパク質の発現程度を測定することを特徴とする請求項１７記載の転移性胃癌診断キット。
【請求項１９】
転移性胃癌特異的高発現遺伝子であるＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する抗体と、転移性胃癌特異的低発現遺伝子であるＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する抗体を含むことを特徴とする転移性胃癌診断キット。
【請求項２０】
胃癌特異的高発現遺伝子であるＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ， ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ，ＨＳＰＢ１およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質、および胃癌特異的低発現遺伝子であるＩＧＫＣ，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質に試験化合物を結合させ、試験化合物が前記タンパク質の作用を促進または抑制するかを確認することを特徴とする胃癌抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項２１】
転移性胃癌特異的高発現遺伝子であるＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質と、転移性胃癌特異的低発現遺伝子であるＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質に試験化合物を結合させ、試験化合物が前記タンパク質の作用を促進または抑制するかを確認することを特徴とする転移性胃癌抑制剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胃癌および転移性胃癌診断キットに関し、さらに詳しくは、胃癌に対する高発現遺伝子と低発現遺伝子の発現程度を測定して胃癌を診断する胃癌診断キットと、転移性胃癌に対する高発現遺伝子と低発現遺伝子の発現程度を測定して癌転移を通じての癌の悪性診断に非常に有効に使用できるように開発された転移性胃癌診断キットに関する。
胃癌は、韓国および日本などのアジアにおいて最も頻繁に発生する癌であって、死亡率１位を占める癌である［Parkinら、Int. J. Cancer 80: 827-841, 1999; Neugutら、Semin. Oncol. 23: 281-291, 1996］。しかし、現在まで胃癌関連遺伝子についてはさほど多くの報告がされていない。既存の研究によれば、癌の発生および癌の転移（metastasis）は、いくつかの特定遺伝子の役割によって行われるのではなく、癌の悪性化が進行するにつれて発生する細胞中の様々な信号伝達と調節機構に関与する多くの遺伝子の複合的な相互作用によるものであることが分かる［Fang, Chin. Med. J., 81: 193-194, 2001］。したがって、いくつかの特定な遺伝子に重点を置いて胃癌発生機構および胃癌転移機構を研究するよりは、正常の胃組織と胃癌細胞株／胃癌組織との間または原発癌性胃癌と転移性胃癌細胞株との間の多量の遺伝子発現程度を比較分析して胃癌発生および胃癌転移に係わる新しい遺伝子を発見する研究は非常に重要な意味があるであろう。このように癌の発生および癌の転移は様々な遺伝子とこれらの遺伝子の発現および調節機構が複合的に係わって進行され、現在まで胃癌機構および胃癌転移機構については明確に明らかにされていない。
【０００２】
最近の分子生物学的分析方法によれば、ｐ５３［Ｙｏｋｏｚａｋｉら、Ｉｎｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃｙｔｏｌ．  ２０４: 49-95, 2001］、β−カテニン［Parkら、Cancer Res. 59: 4257-4260, 1999］、Ｅ−カドヘリン［Ｂｅｒｘら、Hum. Mutat. 12: 226-237, 1998］、トレフォイル（三つ葉状）因子１（trefoil factor 1）［Parkら、Gastroenterology 119: 691-698, 2000］、ｃ−ｍｅｔ［李ら、Oncogene 19: 4947-4953, 2000］のような遺伝子の遺伝的変異が胃癌において多発すると報告されている。そして、ＣＡ１１［Yoshikawaら、Jpn. J. Cancer Res. 91: 459-463, 2000; Shiozakiら、Int. J. Oncol. 19: 701-707, 2001］と胃腸粘膜で合成されるトレフォイル因子であるＴＦＦ１とＴＦＦ２［Shiozakiら、Int. J. Oncol. 19: 701-707, 2001; KirikoshiとKatohKirikoshi、Int. J. Oncol. 21: 655-659, 2002］のような遺伝子が胃癌で低発現されると報告されている。また、Hasegawaらは、消火器癌で発現される２３，０４０個の遺伝子からなるｃＤＮＡマイクロアレイーを用いてＲＰＬ１０，ＨＳＰＣＢ，ＬＯＣ５６２８７，ＩＧＨＭ，ＰＧＣ，ＲＥＧＩＡ，ＲＮＡＳＥ１，ＴＦＦ１，ＴＦＦ２遺伝子の発現が胃癌の転移に関与すると報告している［Hasegawaら、Cancer Res. 62: 7012-7017, 2002］。しかし、このような遺伝子のみで胃癌を診断するのにはまだ不十分である。
【０００３】
なお、実際の癌患者のうち、約９０％程度の患者は原発癌（primary tumor）状態で死亡するよりも転移癌に悪化した後死亡に至っている。しかし、胃漿膜まで浸潤が起こった転移性胃癌の診断に関する研究はまだ不十分である［Yamazakiら、Cancer 63: 613-617, 1989; Shimadaら、Cancer 1: 1657-1668, 1999］。近来、原発癌性胃癌から転移されて悪性腫瘍に進行する一連の過程に関与する遺伝子を発見するため、多量の遺伝子を含むｃＤＮＡマイクロアレイーや遺伝子チップを用いて転移に係わる遺伝子の発現率を比較し、これから胃癌転移の新しい診断や治療のマーカーを発見するための研究が行われている［Sakakuraら、Br. J. Cancer 87: 1153-1161, 2002; Wangら、J. Cancer Res. Clin. Oncol. 128: 547-553, 2002］。既存の報告によれば、癌細胞の移動（migration）、浸潤（invasion）、そして転移（metastasis）に重要な役割を果す付着レセプター（adhesion receptor）であるＥ−カドヘリン（cadherin）レセプターとα−カテニン（catenin）タンパク質の減少が胃癌の脱分化とリンパ節転移に関与するという報告があり［Streitら、J. Mol. Med. 74: 253-268, 1996］、ＣＤ４４レセプターの様々な変異体のうちＣＤ４４−６ｖ変異体の過発現は胃癌細胞がリンパ節へ転移されるのに重要な役割を果すと報告されている［Streitら、Recent Results Cancer Res. 142: 19-50, 1996］。細胞の成長因子として知られているＥＧＦ（epidermal growth factor）とＥＧＦ−レセプター（ＥＧＦＲ）、そしてｃ−ｅｒｂＢ−２の過発現は、胃癌組織において病理学的に胃癌細胞の胃壁浸潤とリンパ節転移に関与すると報告されている［Tokunagaら、Cancer 75: 1418-1425, 1995］。また、Sakakuraらは、２１，１６８個の遺伝子からなる高密度のｃＤＮＡマイクロアレイーを用いて原発癌性胃癌細胞と転移がなされた複数の細胞に由来する細胞株との間の発現形態を比較、分析した後、ＣＤ４４、ケラチン７、ケラチン８、ケラチン１４、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（aldehyde dehydrogenase）、ＣＤ９、ＩＰ３レセプタータイプ３、ＩＬ−２レセプター、ＩＬ−４  Ｓｔａｔ、ｐ２７、そしてインテグリン４遺伝子の発現が胃癌転移に関与すると報告している［Sakakuraら、Br. J. Cancer 87: 1153-1161, 2002］。しかし、既存の研究の大部分は単一遺伝子或いはいくつかの転移に係わる遺伝子の機能のみを研究したものであり、近来、癌の転移過程に係わる細胞内信号伝達（signal transduction）、アポトーシス（apoptosis）、細胞付着（cell adhesion）などに関与する数多くの遺伝子の比較、分析が行われている［Sakakuraら、Br. J. Cancer 87: 1153-1161, 2002；Wangら、J. Cancer Res. Clin. Oncol. 128: 547-553, 2002；Weissら、Oncogene 22: 1872-1879, 2003］。したがって、正確な遺伝子を用いた診断にはさらに多くの新しい遺伝子の検索と確認が行われなければならない。
【０００４】
本発明で用いた胃癌細胞株は、Ｐａｒｋらが製造した１１種の細胞株（ＳＮＵ−１，ＳＮＵ−５，ＳＮＵ−１６，ＳＮＵ−２１６，ＳＮＵ−４８４，ＳＮＵ−５２０，ＳＮＵ−６０１，ＳＮＵ−６２０，ＳＮＵ−６３８，ＳＮＵ−６６８，ＳＮＵ−７１９）と、韓国生命工学研究院で製造した１種（ＫＭＳ５）の細胞株である。これらのうち、原発癌性胃癌（primary gastric cancer）から作製した細胞株はＳＮＵ−１，ＳＮＵ−４８４，ＳＮＵ−７１９，ＳＮＵ−５２０細胞株であり、胃癌が悪性化された後の複数の細胞から作製した転移性胃癌細胞株はＳＮＵ−５，ＳＮＵ−１６，ＳＮＵ−６０１，ＳＮＵ−６２０，ＳＮＵ−６３８，ＳＮＵ−６６８の細胞株である［Parkら、Cancer Res. 50: 2773-2780, 1990; Parkら、Int. J. Cancer 70: 443-449, 1997］。また、本発明で用いた胃癌臨床組織は、忠南大学（韓国）の医学部が提供した総３０個の胃組織（４個の正常の胃組織、１個の胃癌組織、４対の胃の正常／癌組織、１０個の原発性胃癌組織、７個の転移性胃癌組織）である。現在までＳＮＵ細胞株を用いてＳＮＵ細胞株間の特異的な発現を示す遺伝子に関しては多くの研究が行われている実情である。たとえば、ＳＮＵ−１６細胞ではｃ−ｍｅｔ発癌遺伝子の発現が増加され、ＳＮＵ−１，ＳＮＵ−５、そしてＳＮＵ−１６細胞ではＴＧＦ−型ＩＩレセプター、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９およびｃ−ｅｒｂＢ  ２遺伝子が過発現されると報告されている［Haraら、Lab. Invest. 78: 1143-1153, 1998; Parkら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8772-8776, 1994；Baeら、J Korean Med. Sci. 8: 153-159, 1993］。しかし、これらの細胞株において同一に遺伝子発現の変化を示す遺伝子についてはまだ糾明されていない。したがって、胃癌細胞株と正常の胃組織において類似する発現変化を示す胃癌関連遺伝子の発見、または種々の種類の原発癌性胃癌細胞株と悪性化された転移性胃癌細胞株において類似する発現変化を示す転移性胃癌関連遺伝子を選定して胃癌または転移性胃癌マーカーとしての可能性を確認した。
【背景技術】
【０００５】
ヒトゲノムプロジェクトの研究分野の一つとして行われてきた「ＥＳＴ(expressed sequence tag) 収集」は、特定の組織や細胞株でｃＤＮＡライブラリーを製造し、これらから任意的に選別したｃＤＮＡクローンの塩基配列を分析することによって特定の組織や細胞株で発現される遺伝子を収集するプロジェクトである。このようなＥＳＴ収集方法を通じて新しい遺伝子の発見[Adamsら、Science 252: 1651-1656, 1991;Adamsら、Nature 377:(Suppl.) 3-174, 1995; Hillierら、Genome Res. 6: 807-828, 1996; Marraら、Nat. Genet. 21:191-194,1999］、特定の組織や細胞株で発現される遺伝子の発現パターンの分析、遺伝子の量的分析［Okuboら、Nat. Genet. 2: 173-179, 1992; Adamsら、Science 252: 1651-1656, 1991; Adamsら、Nature 377:(Suppl.) 3-174, 1995; Liewら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10645-10649, 1994; Maoら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8175-8180, 1998; Ryoら、Nucleic Acids Res. 26: 2586-2592, 1998; Sterkyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13330-13335, 1998］が可能であると報告されている。したがって、特定の細胞中で特定の遺伝子の発現頻度を分析することによって胃癌に係わる遺伝子の発見が可能であり、これを通じて胃癌進行による分子的メカニズムを理解でき、さらに胃癌の診断が可能となるであろう。
【０００６】
本発明では、24種の胃癌高発現遺伝子と６種の胃癌低発現遺伝子が発見され、これらは胃癌との関連性が全く報告されていないものであって、現在これらの遺伝子について知られている内容は次の通りである。
ＴＵＢＡ６（tubulin-alpha 6 chain）は微小管の重要要素であり、ＦＫＢＰ１Ａ（FK506 binding protein 1A）は骨格筋筋小胞体のカルシウム分泌経路の構成要素であって、リアノジン（ryanodine）レセプター同形−１（isoform-1）の調節機能を有する。ＲＰＬ４（ribosomal protein L4)はまだ正確な機能が明らかにされておらず、ＡＲＦ１（ADP-ribosylation factor 1)はＧＴＰ−結合タンパク質であって、クロレラトキシン触媒サブユニットのヘテロトロピックなアロステリック(allosteric)活性酵素として作用する。ＦＴＨ１（ferritin, heavy polypeptide 1）は鉄分を貯蔵する細胞内の分子物質であり、ＳＨ３ＧＬＢ２（SH3-domain GRB2-like endophilin B2）はリング３タンパク質と類似し、ＨＳＰＣＡ（heat shock 90kDa protein 1, alpha）はＡＴＰａｓｅの活性を有する。ＴＭＳＢ４Ｘ（thymosin, beta 4, X chromosome）は細胞骨格の構成に重要な役割を果たし、ＰＹＣＲ１（pyrroline-5-carboxylate reductase 1）は触媒の活性に関与するもので、前立腺癌と関わりがあると報告されている［Ernstら、Am. J. Pathol. 160: 2169-2180, 2002］。ＡＴＦ４（activating transcription factor 4）はｔａｘ反応増幅子要素（enhancer element）であり、ＳＵＲＦ４（surfeit 4）は膜タンパク質である。ＡＣＴＢ（actin, beta）、Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１、ＫＲＴ８（keratin 8）は細胞構造形成に関与し、ＬＤＨＡ（lactate dehydrogenase A）、ＧＡＰＤ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）、ＰＫＭ２（pyruvate kinase, muscle）、ＰＧＫ１（phosphoglycerate kinase 1）は糖分解経路、ＨＭＧＩＹ（high mobility group AT-hook 1）、ＪＵＮ（v-jun sarcoma virus 17 oncogene homolog (avian)）、ＣＤ４４（CD44 antigen (homing function and Indian blood group system）は信号伝達経路、ＨＳＰＡ８（heat shock 70kDa protein 8）、ＨＳＰＣＢ（heat shock 90kDa protein 1, beta）、ＨＳＰＢ１（heat shock 27kDa protein 1）は熱衝撃関連タンパク質、ＥＥＦ１Ａ１（eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1）は真核タンパク質合成の補助因子として知られている。 一方、正常の胃組織で多く発現される遺伝子であるＣＤ７４（invariant polypeptide of major histocompatibility complex）、ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ）、ＡＧＲ２（anterior gradient 2 homolog, Xenopus laevis）、ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）、 およびＩＧＫＣ（immunoglobulin kappa constant）についてはあまり知られていない。
【０００７】
さらに、本発明では、９種の転移性胃癌高発現遺伝子と９種の転移性胃癌低発現遺伝子が発見され、これらのうちＣＤ４４の過発現は既に胃癌細胞のリンパ節転移と悪性化に重要な役割を果すと知られている［Streitら、J. Mol. Med. 74: 253-268, 1996; Jooら、Anticancer Res. 23: 1581-1588, 2003］。反面、細胞付着物質であって、細胞の浸潤と関わりがあると知られているケラチン８は、本発明の結果では発現が減少する遺伝子として糾明されたが、Sakakuraらは発現が増加する遺伝子として分類した［Sakakuraら、Br. J. Cancer 87: 1153-1161, 2002］。これは、本発明で用いた原発癌性胃癌細胞株の種類が多様であるため異なる結果を示すこともあるが、実際Sakakuraらの研究結果のように、本発明の実験においても原発癌性胃癌細胞株よりもＳＮＵ−１６細胞株でケラチン８遺伝子の発現が高く現れていることを示している。それ以外の遺伝子は胃癌の転移との関連性が報告されていないもので、現在これらの遺伝子について知られている内容は次の通りである。
【０００８】
まず、転移性胃癌細胞株で発現が増加する遺伝子のうち、ＧＡＤＤ４５ｂ（growth arrest and DNA-damage-inducible gene 45beta）は細胞死滅の際に過発現される信号伝達物質であって、最近肝癌細胞株で正常な肝細胞に比べてＧＡＤＤ４５ｂ遺伝子の発現が著しく低いことが報告され、既存に報告されていない癌抑制との関連性を示唆している［Abdollahiら、Oncogene 6: 165-167, 1991; Qiuら、Am. J. Pathol. 162:1961-1974, 2003］。ＪＵＮ（v-jun sarcoma virus 17 oncogene homolog (avian)）は原癌遺伝子（proto-oncogene）中の一つで、細胞内信号伝達物質であり、ＡＰ−１という転写活性因子を調節して細胞増殖に関与する［Shaulianら、Nat. Cell. Biol. 4: E131-136, 2002］。この遺伝子の発現は種々の種類の癌細胞において増加されており、特に乳房癌、卵巣癌、血液癌、骨肉腫などの悪性腫瘍に関わりがあると報告されている［Selvamuruganら、Mol. Cell. Biol. Res. Commun. 3: 218-223, 2000; Volmら、Clin. Exp. Metastasis 14: 209-214, 1996; Rossiら、Int. J. Cancer 57: 86-89, 1994; Honokiら、Mol. Carcinog. 7: 111-115, 1993］。しかし、胃癌転移機構と関連性があるという報告はまだされていない。ＨＭＧＩＹ（high mobility group protein isoforms I and Y）はＤＮＡ結合転写調節因子であって、良性間葉系腫瘍においてこの遺伝子が位置する染色体６ｐ２１．３地域の非正常（abnomality）が報告されている［Kazmierczakら、Genes Chromosomes Cancer 23: 279-285, 1998］。
【０００９】
しかし、これまでＨＭＧＩＹ遺伝子の発現が他の腫瘍や腫瘍の悪性化に関連するという報告はされていない。ＧＳＴＰ１（Glutathione S-transferase P1）は種々の種類の発癌性（carcinogen）の解毒（detoxification）に関与するＧＳＴ（Glutathione S-transferase）酵素中の一つで、肺癌、胃癌、乳房癌などの種々の癌において発現量が増加する酵素として知られており、特にこの遺伝子のメチル化（methylation）が胃癌の癌化機構と密接な関わりがあるということが最近報告されている［Howieら、Carcinogenesis 11: 451-458, 1990; Kangら、Lab. Investigation 83: 635-641, 2003］。ＬＭＮＡ（Lamin A/C）遺伝子は核膜タンパク質の一つで、癌化機構における機能はほとんど明らかにされていない［Wydnerら、Genomics 32: 474-478, 1996］。ＥＳＲＲＡ（Estrogen-related receptor alpha）遺伝子はヒトの生殖と骨形成に重要なホルモンであるエストロゲンの膜レセプターであって、エストロゲン信号伝達機構に必ず必要なタンパク質でる［Giguere, Trends Endocrinol. Metab. 13: 220-225, 2002］。そして、最近は悪性化された乳房癌患者の治療ターゲット物質としてＥＳＲＲＡの可能性を報告した研究もある［Ariaziら、Cancer Res. 62: 6510-6518, 2002］。ＰＬＫ（Polo-like kinase）はセリン−トレオニンリン酸化酵素であって、有糸分裂（mitosis）の正確な調節に必要な酵素であり、ヒトの肺癌、頭および首癌、そして大腸癌においてこの遺伝子およびタンパク質の発現が増加すると報告されている［Wolfら、Oncogene 14: 543-549, 1997; Knechtら、Cancer Res. 59: 2794-2797, 1999; Takahashiら、Cancer Sci. 94: 148-152, 2003］。ＩＧＦＢＰ３（insulin-like growth factor binding protein 3）は有糸分裂と細胞の死滅を調節するＩＧＦ（Insulin-like growth factor）信号伝達システムにおいて重要なタンパク質であり、種々の癌患者の血清中にＩＧＦＢＰ３タンパク質の増加は実際癌の進行を診断するのに重要なタンパク質である［Dealら、J. Clin. Endoclinol. Metab. 86: 1274-1280, 2001; Furstenbergerら、Lancet Oncol. 3: 298-302, 2002］。
【００１０】
前述した遺伝子は、原発癌性胃癌細胞株よりも胃癌の転移がなされた複数の細胞に由来する細胞株で発現が増加した遺伝子である。これらのうち、大部分の遺伝子が癌と関わりのある遺伝子であることを証明する研究が行われてきたが、胃癌または胃癌の転移過程における機能的関連性に関する研究はほとんど行われていない実情である。
【００１１】
以外にも、本発明では、胃癌転移が進行するにつれて発現が減少する遺伝子を選別して胃癌転移の診断マーカーとして使用しようとした。低発現遺伝子としては、実際胃癌細胞株と胃癌組織でその発現が増加する遺伝子として既に報告されたＦＫＢＰ１Ａ（FK506 binding protein 1A）とＴＭＳＢ４Ｘ（thymosin, beta 4, X chromosome）は細胞骨格の構成に重要な役割を果たし、ＰＫＭ２（pyruvate kinase, muscle）とＧＡＰＤ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）は糖分解経路の酵素として知られているが、胃癌が悪性化されるにつれてその発現が減少する現象を示した。ＫＲＴ８（Keratin 8）は、既存の報告によれば、細胞移動（cell migration）と細胞浸潤（cell invasiveness）に関わりのある結合タンパク質である［Martensら、Cancer 87: 87-92, 1999; Sakakuraら、Bri. J. Cancer 87: 1153-1161, 2002］。しかし、本発明では低発現遺伝子として確認された。ＰＴＭＡ（prothymosin-alpha）は有糸分裂に関与する核タンパク質であって、ｃ−ｍｙｃ転写調節因子によって発現が調節される遺伝子として胃癌や胃癌の転移に係わる研究は報告されていない［Szaboら、Hum. Genet. 90: 629-634, 1993; Haggertyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 5313-5318, 2003］。ＡＴＰ５Ａ１（ATP synthase alpha subunit）はミトコンドリアに位置する酵素としてエネルギー代謝に関与し、ＣＡＬＭ２（calmodulin 2）はカルシウム信号伝達に重要な役割を果すタンパク質であって、特定癌との関連性があるかどうかは報告されていない。ＮＥＴ１（neuroepithelial cell transforming gene 1）は１９９６年にChanらが糾明した新しい原癌遺伝子（proto-oncogene）であって、これまで多くの研究が行われていない状態であり、最近子宮頚部癌細胞の分裂にＮＥＴ１遺伝子の発現が係わっていると報告されている［Chanら、Oncogene 12: 1259-1266, 1996; Wollscheidら、Int. J. Cancer 99: 771-775, 2002］。
【００１２】
そこで、本発明者らは、胃癌細胞株、胃癌組織および正常の胃組織と、胃癌の転移がなされた複数の細胞株から製造したｃＤＮＡライブラリーの遺伝子塩基配列を分析し、これらの遺伝子の発見頻度に基づいて胃癌および転移性胃癌高発現または低発現される遺伝子を見出し、実時間（real-time）ＲＴ−ＰＣＲおよび競争的ＲＴ−ＰＣＲ方法によって胃癌および転移性胃癌の高発現遺伝子と低発現遺伝子を確認し、胃癌および転移性胃癌を検出できる新しい胃癌および転移性胃癌遺伝子マーカーを確立することによって本発明を完成した。
【００１３】
【非特許文献１】Parkinら著、Int. J. Cancer 80: 827-841, 1999年発行
【非特許文献２】Neugutら著、Semin. Oncol. 23: 281-291, 1996年発行
【非特許文献３】Fang, Chin. Med. J., 81: 193-194, 2001年発行
【非特許文献４】Yokozakiら著、Int. Rev. Cytol. 204: 49-95, 2001年発行
【非特許文献５】Parkら著、Cancer Res. 59: 4257-4260, 1999年発行
【非特許文献６】Berxら著、Hum. Mutat. 12: 226-237, 1998年発行
【非特許文献７】Parkら著、Gastroenterology 119: 691-698, 2000年発行
【非特許文献８】李ら著、Oncogene 19: 4947-4953, 2000年発行
【非特許文献９】Yoshikawaら著、Jpn. J. Cancer Res. 91: 459-463, 2000年発行
【非特許文献１０】Shiozakiら著、Int. J. Oncol. 19: 701-707, 2001年発行
【非特許文献１１】KirikoshiとKatohKirikoshi、Int. J. Oncol. 21: 655-659, 2002年発行
【非特許文献１２】Hasegawaら著、Cancer Res. 62: 7012-7017, 2002年発行
【非特許文献１３】Yamazakiら著、Cancer 63: 613-617, 1989年発行
【非特許文献１４】Shimadaら著、Cancer 1: 1657-1668, 1999年発行
【非特許文献１５】Sakakuraら著、Br. J. Cancer 87: 1153-1161, 2002年発行
【非特許文献１６】Wangら著、J. Cancer Res. Clin. Oncol. 128: 547-553, 2002年発行
【非特許文献１７】Streitら著、J. Mol. Med. 74: 253-268, 1996年発行
【非特許文献１８】Streitら著、Recent Results Cancer Res. 142: 19-50, 1996年発行
【非特許文献１９】Tokunagaら著、Cancer 75: 1418-1425, 1995年発行
【非特許文献２０】Sakakuraら著、Br. J. Cancer 87: 1153-1161, 2002年発行
【非特許文献２１】Weissら著、Oncogene 22: 1872-1879, 2003年発行
【非特許文献２２】Parkら著、Cancer Res. 50: 2773-2780, 1990年発行
【非特許文献２３】Parkら著、Int. J. Cancer 70: 443-449, 1997年発行
【非特許文献２４】Haraら著、Lab. Invest. 78: 1143-1153, 1998年発行
【非特許文献２５】Parkら著、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8772-8776, 1994年発行
【非特許文献２６】Baeら著、J Korean Med. Sci. 8: 153-159, 1993年発行
【非特許文献２７】Adamsら著、Science 252: 1651-1656, 1991年発行
【非特許文献２８】Adamsら著、Nature 377:(Suppl.) 3-174, 1995年発行
【非特許文献２９】Hillierら著、Genome Res. 6: 807-828, 1996年発行
【非特許文献３０】Marraら著、Nat. Genet. 21:191-194,1999年発行
【非特許文献３１】Okuboら著、Nat. Genet. 2: 173-179, 1992年発行
【非特許文献３２】Liewら著、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10645-10649, 1994年発行
【非特許文献３３】Maoら著、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8175-8180, 1998年発行
【非特許文献３４】Ryoら著、Nucleic Acids Res. 26: 2586-2592, 1998年発行
【非特許文献３５】Sterkyら著、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13330-13335,1998年発行
【非特許文献３６】Ernstら著、Am. J. Pathol. 160: 2169-2180, 2002年発行
【非特許文献３７】Mastumotoら著、Int. J. Cancer 74: 482-91, 1997年発行
【非特許文献３８】Inkiら著、Br. J. Cancer 70: 319-323, 1994年発行
【非特許文献３９】Dayら著、Virchows Arch. 434: 121-125, 1999年発行
【非特許文献４０】Jooら著、Anticancer Res. 23: 1581-1588, 2003年発行
【非特許文献４１】Abdollahiら著、Oncogene 6: 165-167, 1991年発行
【非特許文献４２】Qiuら著、Am. J. Pathol. 162:1961-1974, 2003年発行
【非特許文献４３】Shaulianら著、Nat. Cell. Biol. 4: E131-136, 2002年発行
【非特許文献４４】Selvamuruganら著、Mol. Cell. Biol. Res. Commun. 3: 218-223, 2000年発行
【非特許文献４５】Volmら著、Clin. Exp. Metastasis 14: 209-214, 1996年発行
【非特許文献４６】Rossiら著、Int. J. Cancer 57: 86-89, 1994年発行
【非特許文献４７】Honokiら著、Mol. Carcinog. 7: 111-115, 1993年発行
【非特許文献４８】Kazmierczakら著、Genes Chromosomes Cancer 23: 279-285, 1998年発行
【非特許文献４９】Howieら著、Carcinogenesis 11: 451-458, 1990年発行
【非特許文献５０】Kangら著、Lab. Investigation 83: 635-641, 2003年発行
【非特許文献５１】Wydnerら著、Genomics 32: 474-478, 1996年発行
【非特許文献５２】Giguere, Trends Endocrinol. Metab. 13: 220-225, 2002年発行
【非特許文献５３】Ariaziら著、Cancer Res. 62: 6510-6518, 2002年発行
【非特許文献５４】Wolfら著、Oncogene 14: 543-549, 1997年発行
【非特許文献５５】Knechtら著、Cancer Res. 59: 2794-2797, 1999年発行
【非特許文献５６】Takahashiら著、Cancer Sci. 94: 148-152, 2003年発行
【非特許文献５７】Dealら著、J. Clin. Endoclinol. Metab. 86: 1274-1280, 2001年発行
【非特許文献５８】Furstenbergerら著、Lancet Oncol. 3: 298-302, 2002年発行
【非特許文献５９】Martensら著、Cancer 87: 87-92, 1999年発行
【非特許文献６０】Szaboら著、Hum. Genet. 90: 629-634, 1993年発行
【非特許文献６１】Haggertyら著、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 5313-5318, 2003年発行
【非特許文献６２】Chanら著、Oncogene 12: 1259-1266, 1996年発行
【非特許文献６３】Wollscheidら著、Int. J. Cancer 99: 771-775, 2002年発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、本発明は、胃癌組織で特異的に発現される遺伝子の発現程度の測定を用いた胃癌診断方法および診断キットを提供することにその目的がある。
また、本発明は、転移性胃癌組織で特異的に発現される遺伝子の発現程度の測定を用いた転移性胃癌診断方法および診断キットを提供することに他の目的がある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、胃癌特異的遺伝子であるＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ， ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ， ＨＳＰＢ１，ＩＧＫＣ，ＳＮＣ７３，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２およびＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子に対する発現程度の測定を通じて胃癌を診断する胃癌診断方法および診断キットをその特徴とする。
【００１６】
また、本発明は、転移性胃癌特異的遺伝子であるＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４，ＩＧＦＢＰ３，ＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子に対する発現程度の測定を通じて悪性化された胃癌転移を診断する転移性胃癌診断方法および診断キットを他の特徴とする。
【００１７】
さらに、本発明に係る胃癌診断キットは、胃癌特異的高発現遺伝子であるＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ， ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ， ＨＳＰＢ１およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーと、胃癌特異的低発現遺伝子であるＩＧＫＣ，ＳＮＣ７３，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを含む。
【００１８】
さらに、本発明に係る胃癌診断キットは、胃癌特異的高発現遺伝子であるＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ， ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ， ＨＳＰＢ１およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子に相補的なプローブと、胃癌特異的低発現遺伝子であるＩＧＫＣ，ＳＮＣ７３，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子に相補的なプローブを含む。
【００１９】
また、本発明に係る胃癌診断キットは、胃癌特異的高発現遺伝子であるＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ， ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ， ＨＳＰＢ１およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する抗体と、胃癌特異的低発現遺伝子であるＩＧＫＣ，ＳＮＣ７３，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する抗体を含む。
【００２０】
さらに、本発明に係る転移性胃癌診断キットは、転移性胃癌特異的高発現遺伝子であるＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる少なくとも一つ以上の遺伝子のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーと、転移性胃癌特異的低発現遺伝子であるＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを含む。
さらに、本発明に係る転移性胃癌診断キットは、転移性胃癌特異的高発現遺伝子であるＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子に相補的なプローブと、転移性胃癌特異的低発現遺伝子であるＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子に相補的なプローブを含む。
【００２１】
さらに、本発明に係る転移性胃癌診断キットは、転移性胃癌特異的高発現遺伝子であるＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する抗体と、転移性胃癌特異的低発現遺伝子であるＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する抗体を含む。
【発明の効果】
【００２２】
本発明では、胃癌の診断に有用な腫瘍マーカーとして正常の胃組織で測定された６種の胃癌低発現遺伝子と胃癌細胞株および胃癌組織で測定された24種の胃癌高発現遺伝子が提供され、前記腫瘍マーカーは患者組織で迅速かつ敏感に定量できるため、胃癌の診断に非常に有効に利用できる。
さらに、本発明は、悪性化された胃癌転移の診断に有用なマーカーとして原発癌性胃癌細胞株で測定された９種の転移性胃癌低発現遺伝子と、転移性胃癌細胞株で測定された９種の転移関連高発現遺伝子が提供され、これらの腫瘍転移マーカー遺伝子は患者組織で迅速かつ敏感に定量して胃癌をはじめとする様々な癌患者の腫瘍の悪性化による転移癌を効果的に診断するのに使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明は、30種の胃癌マーカー遺伝子、具体的に24種の胃癌特異的高発現遺伝子および６種の胃癌特異的低発現遺伝子の胃癌診断用途を提供する。
また、本発明は、１８種の転移性胃癌マーカー遺伝子、具体的に９種の転移性胃癌高発現遺伝子および９種の転移性胃癌特異的低発現遺伝子の転移性胃癌診断用途を提供する。
本発明の胃癌マーカー遺伝子は胃癌組織で高発現できるか、又は低発現できる遺伝子の全長およびその断片を含む。
本発明の転移性胃癌マーカー遺伝子は転移性胃癌組織で高発現できるか、又は低発現できる遺伝子の全長およびその断片を含む。
本発明で確認された胃癌マーカー遺伝子の配列情報を下記表１に示し、転移性胃癌マーカー遺伝子の配列情報を下記表２に示す。
【００２４】
【表１】
2006526998.tif 000003
【００２５】
【表２】
2006526998.tif 000004
【００２６】
本発明では、１４種の胃癌細胞株（ＳＮＵ５，ＳＮＵ６６８，ＳＮＵ１６，ＳＮＵ４８４，ＳＮＵ１［３種］、ＳＮＵ６２０，ＳＮＵ７１９，ＳＮＵ６３８，ＳＮＵ６０１，ＳＮＵ２１６，ＳＮＵ５２０，ＫＭＳ５）、１種の胃癌組織標本（Ｔ６６５３０７）および４種の正常の胃組織標本（Ｋ４０２，Ｎ２５８２１５，Ｎ６６９７６１，Ｎ６６５３０７）を用いて総１９種のｃＤＮＡライブラリーを製造し、これらから約６５，２０９個のＥＳＴ塩基配列を決定し、胃癌試料（胃癌細胞株＋胃癌組織）と正常の胃試料（正常の胃組織）で各遺伝子の発見頻度を分析し、胃癌試料で発見頻度が高い24種の胃癌高発現遺伝子、すなわち、発癌候補遺伝子（ＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ， ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ， ＨＳＰＢ１）と発見頻度が低い６種の胃癌低発現遺伝子、すなわち、胃癌抑制候補遺伝子（ＩＧＫＣ，ＳＮＣ７３，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A））をそれぞれ選別して胃癌マーカー遺伝子を発見した。
【００２７】
また、本発明では、前記で製造した総１９種のｃＤＮＡライブラリーのうち６種の原発癌性胃癌細胞株（ＳＮＵ−１［３種］，ＳＮＵ−４８４，ＳＮＵ−７１９，ＳＮＵ−５２０）と６種の悪性化された胃癌細胞株から転移された複数の細胞株（ＳＮＵ−５，ＳＮＵ−６６８，ＳＮＵ−１６，ＳＮＵ−６２０，ＳＮＵ−６３８，ＳＮＵ−６０１）から製造された総１２種のｃＤＮＡライブラリーを選別し、これらから約３９，３１５個のＥＳＴ塩基配列を決定し、原発癌性胃癌細胞株試料と悪性化された胃癌細胞から転移された複数の細胞株試料において各遺伝子の発見頻度を分析し、転移性胃癌細胞株試料で発見頻度の高い９種の転移性胃癌高発現遺伝子（ＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４，ＩＧＦＢＰ３）と発見頻度の低い９種の転移性胃癌低発現遺伝子（ＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２，ＮＥＴ１）をそれぞれ選別して転移性胃癌マーカー遺伝子を発見した。
【００２８】
遺伝子発見頻度分析に用いられた胃癌試料および正常の胃試料で本発明の24種の胃癌発癌候補遺伝子と６種の胃癌抑制候補遺伝子の発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲ方法によって比較した結果、胃癌発癌候補遺伝子は胃癌試料で高発現されることが観察され、胃癌抑制候補遺伝子は胃癌試料で低発現されることが観察されることによって、本発明の胃癌マーカー遺伝子と胃癌との関連性が確認された。
また、遺伝子発見頻度分析に用いられた原発癌性胃癌細胞株試料および転移性胃癌細胞株試料で本発明の９種の転移性胃癌高発現遺伝子と９種の転移性胃癌低発現遺伝子の発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲ方法によって比較した結果、転移性胃癌高発現遺伝子は転移性胃癌細胞株試料で高発現されることが観察され、転移性胃癌低発現遺伝子は転移性胃癌細胞株試料で低発現されることが観察されることによって、本発明の転移性胃癌マーカー遺伝子と胃癌転移との関連性が確認された。
【００２９】
したがって、胃癌特異的遺伝子であるＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ， ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ， ＨＳＰＢ１，ＩＧＫＣ，ＳＮＣ７３，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）の遺伝子の発現程度を測定することによって胃癌を診断でき、転移性胃癌特異的遺伝子であるＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４，ＩＧＦＢＰ３，ＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２，ＮＥＴ１の遺伝子の発現程度を測定することによって胃癌転移を診断できる。
なお、本発明はまた下記の段階を含む胃癌特異的遺伝子の発現程度を測定して胃癌を診断する方法を提供する：
【００３０】
（ａ）試験胃組織において、ＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ， ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ， ＨＳＰＢ１およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の胃癌高発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、
（ｂ）正常の胃組織において、ＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ， ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ， ＨＳＰＢ１およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の胃癌高発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、
（ｃ）試験胃組織において、ＩＧＫＣ，ＳＮＣ７３，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の胃癌高発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、
（ｄ）正常の胃組織において、ＩＧＫＣ，ＳＮＣ７３，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の胃癌高発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、および
（ｅ）前記（ａ）によって得られた測定値を前記（ｂ）で得られた測定値と比較し、前記（ｃ）によって得られた測定値を前記（ｄ）で得られた測定値と比較して胃癌であるかどうかを判定する段階。
【００３１】
さらに、本発明に係る転移性胃癌特異的遺伝子の発現程度を測定して転移性胃癌を診断する方法を提供する：
（ａ）試験転移性胃癌組織において、ＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる一つ以上の転移性胃癌高発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、
（ｂ）原発癌性胃組織においてＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる一つ以上の転移性胃癌高発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、
（ｃ）試験転移性胃癌組織において、ＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の転移性胃癌低発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、
（ｄ）原発癌性胃組織において、ＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の転移性胃癌低発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、および
（ｅ）前記（ａ）によって得られた測定値を前記（ｂ）で得られた測定値と比較し、前記（ｃ）によって得られた測定値を前記（ｄ）で得られた測定値と比較して胃癌が転移されたかどうかを判定する段階。
【００３２】
本発明の胃癌および転移性胃癌マーカー遺伝子の発現量はマーカー遺伝子またはその断片に対して相補的な塩基配列を有するセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用いた公知の方法を通じて測定できる。たとえば、実時間ＲＴ−ＰＣＲ、または競争的ＲＴ−ＰＣＲなどの方法で測定できる。このようなプライマーは、前記マーカー遺伝子のＤＮＡ領域中でタンパク質をコーディングするＤＮＡ領域の一部または全部の配列が含有され、少なくとも１５ｂｐ長さのＤＮＡでなければならない。たとえば、下記実施例上の表５〜表７に記載されたプライマーを使用してもよい。本発明において「相補的」とは、少なくとも１５個の連続塩基配列において完全に相補的な配列の場合に制限されず、塩基配列上で７０％、好ましくは８０％以上の相同性があればよい。
【００３３】
さらに、本発明の胃癌および転移性胃癌マーカー遺伝子の発現量はマーカー遺伝子またはその断片をプローブとして用いた公知のハイブリダイゼーション反応を通じて測定できる。たとえば、ノーザンハイブリダイゼーション［“Molecular Cloning - A Laboratory Manual”Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al., 1982, section 7.37-7.52］、In situハイブリダイゼーション［Jacquemierら、Bull Cancer 90: 31-8, 2003］またはマイクロアレイー［Macgregor, Expert Rev Mol Diagn 3: 185-200, 2003］などの方法によって測定できる。プローブは３２種の遺伝子の塩基配列を含有する通常２００〜１０００ｂｐであり、好ましくは４００〜８００ｂｐの長さを有する。塩基配列は胃癌および転移性胃癌マーカー遺伝子の塩基配列と７０％以上の類似性を有していればよい。本発明の胃癌および転移性胃癌マーカー遺伝子のプローブは前記で製造された胃癌および転移性胃癌マーカー遺伝子のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用いた遺伝子増幅法（ＰＣＲ）などの通常の方法によって製造できる。
【００３４】
また、前記胃癌および転移性胃癌マーカー遺伝子の発現量は各遺伝子によってコードされるタンパク質の量を測定することによって測定できる。前記方法においてタンパク質は胃癌および転移性胃癌マーカータンパク質に特異的に結合する抗体を用いて通常のＥＬＩＳＡおよび免疫沈降法などによって定量化できる。
【００３５】
本発明の胃癌および転移性胃癌高発現遺伝子または胃癌および転移性胃癌低発現遺伝子のそれぞれに対する抗体は、各遺伝子を通常の方法に従って発現ベクターにクローニングして前記マーカー遺伝子によってコーディングされるタンパク質を得た後、得られたタンパク質から通常の方法によって製造できる。これには前記タンパク質から誘導されたペプチド断片も含まれ、本発明のペプチド断片としては、少なくとも７個のアミノ酸、好ましくは少なくとも９個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２個以上のアミノ酸を含む。本発明の抗体の形態は特に制限されず、ポリクロナール抗体［Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 11.12-11.13］、モノクロナール抗体［Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 11.4-11.11］または抗原結合性を有するものであればそれの一部も本発明の抗体に含まれ、すべての免疫グロブリン抗体が含まれる。さらに、本発明の抗体にはヒト化抗体［Methods in Enzymology 203, 99-121 (1991)］などの特殊抗体も含まれる。
【００３６】
本発明の30種の胃癌マーカー遺伝子またはタンパク質は単独または組合せて胃癌診断に使用してもよく、１８種の転移性胃癌マーカー遺伝子またはタンパク質は単独または組合せて転移性胃癌診断に使用してもよい。
また、本発明の胃癌および転移性胃癌診断キットは、前記胃癌および転移性胃癌特異的マーカー遺伝子のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーまたはプローブ以外にＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ＲＮＡ分離試薬をさらに含んでもよく、マイクロアレイーを通じて発現量を調査する場合は前記マーカー遺伝子の固形支持体を含む。
さらに、30種の胃癌マーカー遺伝子は胃癌発癌遺伝子または抑制遺伝子である可能性が高いので、このような標的遺伝子がコーディングするタンパク質に結合する小さい分子の化合物は標的タンパク質を阻害または促進する化合物の候補となり得、これは抗癌剤、治療剤などの医薬品として使用できる。
【００３７】
なお、１８種の転移性胃癌マーカー遺伝子は転移遺伝子または転移抑制遺伝子である可能性が高いので、このような標的遺伝子がコーディングするタンパク質に結合する小さい分子の化合物は標的タンパク質を阻害または促進する化合物の候補となり得、これは抗癌剤、治療剤などの医薬品として使用できる。
このような化合物をスクリーニングする方法としては、３２種の胃癌マーカー遺伝子または１８種の転移性胃癌マーカー遺伝子がコーディングするタンパク質をアフィニティー・カラムに固定し、これを被検試料と接触させて精製する方法［Pandyaら、Virus Res 87: 135-143, 2002］、ツーハイブリッド法を用いる方法［Fields, S and Song, O., Nature 340: 245 -246, 1989］、ウェスタンブロッティング法［“Molecular Cloning - A Laboratory Manual”Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. et al. (1982) section 18.30-18.74］、ハイスループットスクリーニング（HTS）法［Aviezerら、J Biomol Screen  6: 171-7, 2001］など多数の公知の方法を使用してもよい。スクリーニングに用いる被検試料としては細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などがあるが、これに制限されない。
【００３８】
（実施例）
以下、本発明を下記実施例によってさらに詳細に説明する。ただし、これらは本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を制限しない。
【実施例１】
【００３９】
胃癌細胞株、胃癌組織および正常の胃組織からの総ＲＮＡ分離
胃癌細胞株であるＳＮＵ５，ＳＮＵ６６８，ＳＮＵ１６，ＳＮＵ１，ＳＮＵ４８４，ＳＮＵ６２０，ＳＮＵ７１９，ＳＮＵ６３８，ＳＮＵ６０１，ＳＮＵ２１６，ＳＮＵ５２０（韓国細胞株銀行、http://cellbank.snu.ac.kr/）、ＫＭＳ５（韓国生命工学研究院）は１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培養液で培養し、１種の胃癌組織標本であるＴ６６５３０７および４種の正常の胃組織標本であるＫ４０２，Ｎ２５８２１５，Ｎ６６９７６１，Ｎ６６５３０７（忠南大学の医学部）は外科的に除去された組織から得、分析するまでこれを液体窒素に保管した。
細胞および組織の総ＲＮＡはＱＩＡＧＥＮキット（RNeasy Maxiキット：ｃａｔ＃７５１６２）を用いて分離した。まず、付着細胞はＥＤＴＡとトリプシンを用いて回収した後、１５０μｌのβ−メルカプトエタノール（Mercaptoethanol）を添加した１５ｍｌのキット内分解緩衝液に溶解した。一方、組織を約１ｇ取ってβ−メルカプトエタノールを添加した１５ｍｌのキット中のＲＬＴ緩衝液に溶解し、ホモゲナイザーで粉砕した。試料溶液を３０００ｇで１０分間遠心分離して上澄液を分離し、これに１５ｍｌの７０％ＥｔＯＨを添加してよく混合した後、３０００ｇで５分間遠心分離して総ＲＮＡを膜に付着した。２回の洗浄過程を行った後、１．２ｍｌのＲＮａｓｅが除去された水を添加して総ＲＮＡを溶出、分離した。
【実施例２】
【００４０】
ＥＳＴ発見頻度による胃癌および転移性胃癌高発現遺伝子と低発現遺伝子の選別
本発明者は、胃癌および悪性化された転移性胃癌で発現される遺伝子を分析するために、原発癌性胃癌細胞株と転移性胃癌細胞株を含む胃癌細胞株、胃癌組織と正常の胃組織で各種のｃＤＮＡライブラリーを構築し、これから無作為にクローンを選別、分析することによってＥＳＴ発見頻度に基づく胃癌および転移性胃癌高発現遺伝子と低発現遺伝子を選別しようとした。
【００４１】
１）ｃＤＮＡライブラリーの製造
前記実施例１で得られた各試料の総ＲＮＡ各１００μｇをＢＡＰ酵素反応液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ＰＨ７．０）、ＲＮＡ  ２ｍＭ  ＤＴＴ、８０Ｕ  Ｒｎａｓｉｎ（promega社））で３ＵのＢＡＰ（Bacterial alkaline Phosphatase, TakaRa）酵素で処理し、次いでＴＡＰ（Ｗａｃｏ）酵素反応液（50mM sodium acetate (PH5.5)、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ、８０Ｕ  Ｒｎａｓｉｎ（promega））で１００ＵのＴＡＰ（Tabbaco acid pyrophosphatase）酵素を反応させた。その後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ７．５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＡＴＰ、２６％  ＰＥＧ、１００Ｕ  Rnasin、配列番号１のオリゴリボヌクレオチド４０ｐｍｏｌｅ、２５０Ｕ  ＲＮＡ  ligase（TakaRa社）の反応を行い、リン酸基を有する未分解のｍＲＮＡにのみオリゴマーが添加できるように反応させた。
【００４２】
以上の反応で処理した総ＲＮＡからオリゴテックス（oligotex）ｍＲＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてｍＲＮＡを分離し、ｄＴ17を含有する配列番号２のオリゴマーをプライマーとして用いて１ｓｔ  ｃＤＮＡを合成した。 その後、 ＸＬ  ＰＣＲキット（Perkin Elmer）およびＤＮＡ挿入体の５’−プライマー（配列番号３）と３’−プライマー（配列番号４）を含有するＰＣＲ反応槽で１ｓｔｃＤＮＡを 少量増幅させた。ＰＣＲ産物をSfiIの酵素で処理した後、アガロースゲル電気泳動を行って１．３ｋｂ以上のｃＤＮＡ断片を分離した。分離されたｃＤＮＡ断片はＴａＫａＲａ連結キットを用いてDraIII酵素で処理したｐＣＮＳ−Ｄ２ベクターに連結した後、電気穿孔法（electroporation）によって大腸菌Ｔｏｐ１０Ｆ’（Invitrogen）菌株に形質転換させてｃＤＮＡライブラリーを製造した。
前記方法によって１４種の胃癌細胞株ｃＤＮＡライブラリー、１種の胃癌組織ｃＤＮＡライブラリーと４種の正常の胃組織ｃＤＮＡライブラリーを製造した（表３）。
【００４３】
各種のｃＤＮＡライブラリーの製造およびＥＳＴ分析
【表３】
2006526998.tif 000005
【００４４】
また、本発明の方法によって製造されたライブラリーのうち、６種の原発癌性胃癌細胞株ｃＤＮＡライブラリーと６種の転移性胃癌細胞株ｃＤＮＡライブラリーは表４の通りである。
【００４５】
各種のｃＤＮＡライブラリーの製造およびＥＳＴ分析
【表４】
2006526998.tif 000006
【００４６】
２）ｃＤＮＡ塩基配列の決定およびデータ分析
製作したｃＤＮＡライブラリーを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ寒天培地に塗抹して多数のｃＤＮＡクローンを培養した。培養されたクローンの塩基配列を分析するためにＭＷＧ  96 well plasmid prep systemでプラスミドＤＮＡを分離し、自動化塩基配列決定機であるＡＢＩ  ３７００で塩基配列分析を行った。決定されたＤＮＡデータの類似性検索はＢＬＡＳＴＮを用いてUni Geneデータベース（Hs. seq. all, build #151）で行った。
前記表３の１９種の胃癌関連ｃＤＮＡライブラリーにおいて約６５，２０９個のＥＳＴ塩基配列を決定し、ＵｎｉＧｅｎｅデータベースで分析を行った結果、総１９，７６２種の遺伝子が発見された。各ライブラリー別の決定されたＥＳＴ数と発見された遺伝子の種類は前記表３に示した通りである。
製造されたライブラリーのうち、原発癌性胃癌細胞株ライブラリーと転移性胃癌細胞株ライブラリーを含む前記表４の総１２種のｃＤＮＡライブラリーにおいて約３９，３１５個のＥＳＴ塩基配列を決定し、ＵｎｉＧｅｎｅデータベースで分析を行った結果、総１５，２４２種の遺伝子が発見された。各ライブラリー別の決定されたＥＳＴ数と発見された遺伝子の種類は前記表４に示した通りである。
【００４７】
３）遺伝子発見頻度分析
１４種の胃癌細胞株ｃＤＮＡライブラリーと１種の胃癌組織ｃＤＮＡライブラリーは胃癌試料（cancer pool）に、３種の正常の胃組織ｃＤＮＡライブラリーは正常の胃試料（normal pool）に大きく２つに分類した。
また、６種の原発癌性胃癌細胞株ｃＤＮＡライブラリーを原発癌性胃癌試料に、６種の転移性胃癌細胞株ｃＤＮＡライブラリーは転移性胃癌試料に大きく２つに分類した。
各遺伝子の発見頻度は各々の試料で発見された特定の遺伝子の数を発見された総遺伝子数の比として示した。また、各ライブラリーにおける各遺伝子の発見頻度は各ライブラリーで発見された特定の遺伝子の数を発見された総遺伝子数の比で計算し、これを色として示した。
前記のような分析によって、胃癌試料で発見頻度が増加する24種の高発現遺伝子と発見頻度が減少する低発現遺伝子６種が各々選別された（図１）。
また、前記のような分析によって、転移性胃癌細胞株試料における発見頻度が増加する９種の高発現遺伝子と発見頻度が減少する低発現遺伝子９種が各々選別された（図２）。
【実施例３】
【００４８】
ＲＴ−ＰＣＲ反応による選別された標的遺伝子の発現量の分析
前記で選別された胃癌高発現遺伝子と胃癌低発現遺伝子の発現量および転移性胃癌高発現遺伝子と転移性胃癌低発現遺伝子の発現量をＲＴ−ＰＣＲ方法を通じて定量的に分析した。
１）逆転写酵素反応
前記実施例１で分離した総１７種の総ＲＮＡ各々５μｇを用いて下記の逆転写反応緩衝液で４２℃、６０分間反応させて総１７種の１ｓｔ  ｃＤＮＡを合成した。その後、７０℃加熱ブロック（heating block）で１５分間反応させることによってｃＤＮＡ合成を終了した。
poly dT(12-18)プライマー(0.4μg/μl)          １μｌ
5X first-strand buffer                        ４μｌ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物                      １μｌ
０．１Ｍ  ＤＴＴ                              ２μｌ
ＲＮａｓｅＯＵＴ（４０Ｕ／μｌ）              １μｌ
逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ）                  １μｌ
総ＲＮＡ（５μｇ）                            Ｘμｌ
蒸留水                                （１０−Ｘ）μｌ  
合計                                        ２０μｌ
【００４９】
２）実時間ＰＣＲ反応によるｃＤＮＡの増幅および発現量の確認
ａ）実時間ＰＣＲ反応によるｃＤＮＡの増幅
実時間ＰＣＲは、FastStart-DNA Master SYBR Green Iキット（Roche社、スイス）を用いて行い、全反応量を総２０μｌとした。すなわち、各遺伝子のセンスおよびアンチセンスプライマーを含有する次の実時間ＰＣＲ反応液に前記１）の逆転写酵素反応で合成したｃＤＮＡを１／５００に希釈して２μｌずつ添加した。下記表５に記載された１４種の胃癌高発現遺伝子と３種の胃癌低発現遺伝子のＰＣＲプライマーはタンパク質コーディング領域内部でデザインし、各プライマーの長さは１７〜２０ｂｐ、ＧＣ含量は５０〜７０％程度である（ジェノテック、韓国）。ＰＣＲ反応は９５℃（１５秒）、５５℃（５秒）、７２℃（３０秒）の条件で４５回行った。
ｃＤＮＡ（０．５ｎｇ／μｌ）                      ２μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2                           ０．８μｌ
センスプライマー（５ｐｍｏｌｅ／μｌ）            ２μｌ
アンチセンスプライマー（５ｐｍｏｌｅ／μｌ）      ２μｌ
SYBR Green I重合酵素混合物                        ２μｌ
蒸留水                                      １１．２μｌ
総                                              ２０μｌ
【００５０】
実時間ＰＣＲに用いた各胃癌マーカー遺伝子のプライマー
【表５】
2006526998.tif 000007
【００５１】
マーカー遺伝子を定量するための標準遺伝子としてβ２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）を用いた。すなわち、１．２μｇのＢ２Ｍ  ＤＮＡを原液および１／１０，１／１００，１／１０００，１／１００００に希釈し、これを各々２μｌずつ用いて前記のような実時間ＰＣＲを行い、増幅されたＰＣＲ産物からＢ２Ｍ量の標準化グラフを作成した。これを用いてマーカー遺伝子のＰＣＲ産物からマーカー遺伝子の量を定量化した。Ｂ２ＭのＰＣＲ反応の際に各々５’−プライマー（配列番号３９）および３’−プライマー（配列番号４０）を用いた。このプライマーは、Ｂ２Ｍ遺伝子塩基配列のうちタンパク質コーディング領域内のＤＮＡ塩基配列部でデザインした。
【００５２】
ｂ）実時間ＰＣＲ反応による発現量の確認
実時間ＲＴ−ＰＣＲによって増幅されたマーカー遺伝子のＰＣＲ産物の量は、標準遺伝子のＰＣＲ産物の量（３回行って得られたＢ２Ｍの平均量）で割った。その後、高発現遺伝子の発現量は、胃癌組織で発現される標的遺伝子の量を正常の胃組織で発現される標的遺伝子の発現量の平均量に対する比率として示し、低発現遺伝子の発現量は、正常の胃組織で発現される標的遺伝子の量を胃癌細胞株および胃癌組織で発現される標的遺伝子の発現量の平均量に対する比率として図３に示す（Ｓ１４，Ｓ１７，Ｓ１８，Ｓ１９：正常の胃組織，Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３，Ｓ５，Ｓ６，Ｓ７，Ｓ８，Ｓ９，Ｓ１０，Ｓ１２，Ｓ１３，Ｓ２１：胃癌細胞株、Ｓ２０：胃癌組織）。
その結果、胃癌で発見頻度が高い胃癌高発現遺伝子（実施例２の３）データ）の実時間ＲＴ−ＰＣＲ産物の量は胃癌試料で高く、胃癌で発見頻度が低い胃癌低発現遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ産物の量は胃癌試料で低く現れた。すなわち、ＥＥＦＡ１Ａ，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＨＳＰＢ１遺伝子は胃癌発癌マーカーとしての有用性が明らかになり、これとともにＩＧＫＣ，ＳＮＣ７３，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）遺伝子は胃癌抑制マーカーとして使用可能であることが明らかになった。
【００５３】
３）競争的（Competitive）ＲＴ−ＰＣＲを用いたｃＤＮＡの増幅および発現量確認
ａ）競争的ＲＴ−ＰＣＲのための鋳型の濃度補正
本実験では、マーカー遺伝子を定量するための標準遺伝子としてＢ２Ｍ遺伝子を用いた。
標準遺伝子とプライマーのプライミング部分は同じであるが、ＰＣＲ産物のサイズが異なる競争ＤＮＡ（competitor）を標準遺伝子とともにＰＣＲ反応を行って、試料間の標準遺伝子の発現量と競争ＤＮＡの発現量が同一な濃度を見出し、ＰＣＲに用いられる各鋳型の濃度が同一になるように試料の濃度を補正した。
Ｂ２Ｍ競争ＤＮＡは３μｌのｐＣＮＳベクターＤＮＡ（２ｎｇ）、１０μｌの５ｘ  PCR premix（バイオニア社）、１μｌの５’−プライマー（２０pmole：配列番号４１）、１μｌの３’−プライマー（２０pmole：配列番号４２）、３５μｌの蒸留水を含有する５０μｌの反応液でＰＣＲ反応を行って製造した。この際、ＰＣＲ反応は９４℃（３０秒）、５０℃（３０秒）、７２℃（３０秒）の条件で３０回行い、Ｂ２Ｍ競争ＤＮＡであるＰＣＲ産物の長さは３２２ｂｐであった。
【００５４】
調製したＢ２Ｍ競争ＤＮＡを７／１０８，１／１０７，３／１０７，７／１０７，１／１０６，３／１０６の６段階に希釈した後、２μｌを前記実施例３の１）逆転写酵素反応液（逆転写反応に用いられたＲＮＡの１０ｎｇに該当する量）と各々混合した後、４μｌの５Ｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素混合液、２μｌのＢ２Ｍプライマー（５pmole/μl）（配列番号３９および４０）、８μｌの蒸留水を含有する総２０μｌの６個のＰＣＲ反応液を用いて競争的ＰＣＲを行った。この際、ＰＣＲ反応は９４℃（４０秒）、５５℃（１分）、７２℃（１分）の条件で２５回ずつ行った。
ＰＣＲ産物を３％アガロースゲルに３μｌずつローディングして１００Ｖで３０分間電気泳動させた後、Ｆｒｏｇ（商標）機械（ゲルイメージ分析システム）[Core Bio社]を用いてゲル写真を撮影した。最終的に得られたゲルバンドイメージファイル(.tif)をToltalLab v1.0プログラム（NonLinear Dynamix Ltd.）を用いて、二つのバンド（Ｂ２Ｍ競争ＤＮＡでは３２２ｂｐ、本来Ｂ２Ｍ遺伝子では３９０ｂｐ）の同様な感度が同様な濃度を選別、定量化した後、各試料の濃度を補正した。
【００５５】
ｂ）ＲＴ−ＰＣＲを用いたｃＤＮＡの増幅
前記ａ）で補正した試料のｃＤＮＡを胃癌マーカー遺伝子のセンスおよびアンチセンスプライマーを含有する表６のＰＣＲ反応液と転移性胃癌マーカー遺伝子のセンスおよびアンチセンスプライマーを含有する表７のＰＣＲ反応液で増幅させた。この際、ＰＣＲ反応は９４℃（１分）、５５℃（３０秒）、７２℃（１分）の条件で２５回ずつ行った。
下記表６の遺伝子と表７の遺伝子のプライマーは、タンパク質コーディング領域内部でデザインし、各プライマーの長さは１７〜２０ｂｐ、ＧＣ含量は５０〜７０％程度である（コアバイオシステム、韓国）。以下にＰＣＲ反応液の組成を示す。
Ｃｄｎａ                                        ５μｌ
５Ｘ  ＰＣＲ反応ｍｉｘ（バイオニア、韓国）      ３μｌ
センスプライマー（１０ｐｍｏｌｅ／μｌ）        １μｌ
アンチセンスプライマー（１０ｐｍｏｌｅ／μｌ）  １μｌ
蒸留水                                          ５μｌ  
総                                            １５μｌ
【００５６】
競争的ＰＣＲに用いた各胃癌マーカー遺伝子のプライマー
【表６】
2006526998.tif 000008
【００５７】
競争的ＰＣＲに用いた各転移性胃癌マーカー遺伝子のプライマー
【表７】
2006526998.tif 000009
【００５８】
ｃ）競争的ＰＣＲを用いた発現量の確認
ＰＣＲ反応によって増幅されたＰＣＲ産物を確認するために、ＰＣＲ反応液を２％のアガロースゲルに１００Ｖで３０分間電気泳動させた後、ＰＣＲ産物を前記実施例３−３）−ａ）と同様にToltalLab v1.0プログラム（NonLinear Dynamix Ltd.）を用いて定量化した。
その結果、図４に示すように、胃癌で発見頻度が高い胃癌高発現遺伝子（実施例２の３）データ）の競争的ＲＴ−ＰＣＲ産物の量は胃癌試料で高く、胃癌で発見頻度が低い胃癌低発現遺伝子の競争的ＲＴ−ＰＣＲ産物の量は胃癌試料で低く現れた。すなわち、10種の胃癌発癌候補遺伝子であるＴＭＳＢ４Ｘ，ＲＰＬ４，ＴＵＢＡ６，ＨＭＧＩＹ，ＡＴＦ４，ＪＵＮ， ＡＲＦ１，ＰＹＣＲ１，ＳＵＲＦ４，ＳＨ３ＧＬＢ２ は胃癌発癌マーカーとして有用であることが明らかになり、これとともに３個の非腫瘍遺伝子ＣＤ７４，ＡＧＲ２，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ）は胃癌抑制マーカーとして使用可能であることが確認された。
また、図５に示すように、転移性胃癌細胞株で発見頻度が高い高発現遺伝子の競争的ＲＴ−ＰＣＲ産物の量は転移性胃癌細胞株試料で高く、転移性胃癌細胞株で発見頻度が低い低発現遺伝子の競争的ＲＴ−ＰＣＲ産物の量は転移性胃癌細胞株試料で低く現れた。すなわち、９種の転移性胃癌高発現遺伝子であるＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４，ＩＧＦＢＰ３および転移性胃癌低発現遺伝子ＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２，ＮＥＴ１は転移性胃癌マーカーとして使用可能であることが確認された。
【実施例４】
【００５９】
臨床試料における胃癌高発現遺伝子と低発現遺伝子の発現量および転移性胃癌高発現遺伝子と低発現遺伝子の発現量の確認を通じての胃癌および転移性胃癌診断
本実験では、忠南大学の医学部で提供した４名の胃癌疑い患者から直接採取した試験組織／正常の組織（各々Ｔ１〜Ｔ４およびＮ１〜Ｎ４）の対となっている４種の臨床試料（３７６４５４，６６３５９３，６６８２１７，６７０５００）において、胃癌高発現遺伝子と低発現遺伝子の発現量を確認した。胃癌高発現遺伝子のうちＦＫＢＰ１Ａ，ＬＤＨＡ，ＨＳＰＣＢ，ＴＵＢＡ６遺伝子を、胃癌低発現遺伝子のうちＳＮＣ７３，ＩＧＫＣ，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＣＤ７４遺伝子を任意的に選別して競争的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて行った。
また、忠南大学の医学部で提供した１０名の原発癌性胃癌患者（Ｅ１〜Ｅ１０）と７名の転移性胃癌患者（Ａ１〜Ａ７）から直接採取した臨床試料において、転移性胃癌高発現遺伝子のうちＪＵＮ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＣＤ４４遺伝子を、転移性胃癌低発現遺伝子のうちＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１遺伝子を任意的に選別して各遺伝子の発現量を競争的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて確認した。
【００６０】
１）総ＲＮＡ分離および逆転写酵素反応
前記実施例１と同様な方法で総ＲＮＡを分離し、前記実施例３の１）と同様に各試料の総ＲＮＡ５μｇを用いて４２℃で６０分間逆転写反応を行うことによって、胃癌臨床試料からは総８種の１ｓｔ  ｃＤＮＡを合成し、転移性胃癌臨床試料からは総１７種の１ｓｔ  ｃＤＮＡを合成した。その後、７０℃heating blockで１５分間反応させることによってｃＤＮＡ合成を終了した。
【００６１】
２）競争的ＰＣＲを用いた各胃癌遺伝子の発現量の確認
前記実施例３−３）−ａ）と同様な方法でＰＣＲに用いられる各鋳型の濃度が同一になるように試料の濃度を補正した。すなわち、最も低い濃度で定量されたＴ１、Ｎ４およびＴ４の４／１０７の濃度を基準として、残りの５個の試料の濃度を蒸留水で希釈して補正した。補正した試料の逆転写反応液を１０μｌずつ鋳型として用いて各遺伝子のセンスおよびアンチセンスプライマーを含有する総１５μｌのＰＣＲ反応液で増幅させた。この際、ＰＣＲ反応は９４℃（１分）、５５℃（３０秒）、７２℃（１分）の条件で３０回ずつ行った。用いられたプライマーは前記表５と表６の通りである。増幅されたＰＣＲ産物を確認するために、ＰＣＲ反応液の全てを２％のアガロースゲルに１００Ｖで３０分間電気泳動させた後、ＰＣＲ産物を前記実施例３−３）−ａ）と同様にToltalLab v1.0プログラム（NonLinear Dynamix Ltd.）を用いて定量化した。
その結果、図６に示すように、胃癌高発現遺伝子であるＦＫＢＰ１Ａ，ＬＤＨＡ，ＨＳＰＣＢ，ＴＵＢＡ６遺伝子の競争的ＲＴ−ＰＣＲ産物の量は、同一患者から採取した正常の胃組織よりも大部分の試験癌組織でさらに高く、胃癌低発現遺伝子であるＳＮＣ７３，ＩＧＫＣ，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ）、ＣＤ７４遺伝子の競争的ＲＴ−ＰＣＲ産物の量は試験組織よりも大部分の正常の胃組織でさらに低く現れた。すなわち、４つの（Ｔ１〜Ｔ４）試験組織はいずれも胃癌として判定され、これは従来の臨床学的胃癌検査結果（Ｔ１：胃癌段階ＩＶ、Ｔ２：胃癌段階ＩＩＩＡ、Ｔ３とＴ４：胃癌段階ＩＩ）と一致した。
【００６２】
３）競争的ＰＣＲを用いた各転移性胃癌遺伝子の発現量の確認
前記実施例３−３）−ａ）と同様な方法でＰＣＲに用いられる各鋳型の濃度が同一になるように試料の濃度を補正した。すなわち、最も低い濃度の試料を基準として残りの１３個の試料の濃度を希釈した。遺伝子の種類によって鋳型として用いられた試料の濃度が異なるが、少なくとも１ｓｔ  ｃＤＮＡの１／５０希釈した濃度の試料を用いた。補正した試料の逆転写反応液を２μｌずつ鋳型として用いて各遺伝子のセンスおよびアンチセンスプライマーを含有する総１５μｌのＰＣＲ反応液で増幅させた。この際、ＰＣＲ反応は９４℃（３０秒）、５５℃（１分）、７２℃（１分）の条件で２５回ずつ行った。用いられたプライマーは前記表７に示した通りである。増幅されたＰＣＲ産物を確認するために、ＰＣＲ反応液の全てを２％のアガロースゲルに１００Ｖで３０分間電気泳動させた後、ＰＣＲ産物を前記実施例３−３）−ａ）と同様にToltalLab v1.0プログラム（NonLinear Dynamix Ltd.）を用いて定量化した。その結果は、図７に示すように、転移性胃癌高発現遺伝子であるＪＵＮ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ、そしてＣＤ４４の発現量は原発癌性胃癌組織よりも転移性胃癌組織で平均的にさらに高く、転移性胃癌低発現遺伝子であるＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１の発現量は原発癌性胃癌組織よりも転移性胃癌組織で平均的に低く現れた。すなわち、１７個（Ｅ１〜Ｅ１０およびＡ１〜Ａ７）の試験組織はいずれも胃癌組織であり、１０個の原発癌性胃癌組織は胃癌段階ＩＡであり、７個の転移性胃癌組織は胃癌段階ＩＶに該当する。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】胃癌遺伝子の発見頻度を分析した結果を示す。
【図２】転移性胃癌遺伝子の発見頻度を分析結果を示す。
【図３】各種の試料における胃癌高発現遺伝子と低発現遺伝子の発現程度を実時間ＲＴ−ＰＣＲ方法を行って示したものである［（ａ）〜（ｎ）は高発現遺伝子を、（ｏ）〜（ｑ）は低発現遺伝子を示す。Ｘ軸は各種の試料を示したものであって、Ｓ１４，Ｓ１７，Ｓ１８，Ｓ１９は正常の胃組織、Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３，Ｓ５，Ｓ６，Ｓ７，Ｓ８，Ｓ９，Ｓ１０，Ｓ１２，Ｓ１３，Ｓ２１は胃癌細胞株であり、Ｓ２０は胃癌組織である。Ｙ軸は各種の試料における標的遺伝子の発現量を示したものであって、高発現遺伝子の発現量は正常の胃組織で発現される発現量の平均量に対する比率として示し、低発現遺伝子の発現量は胃癌細胞株および胃癌組織で発現される発現量の平均量に対する比率として示したものである。各遺伝子の発現量は各種の試料で発現されるＢ２Ｍの発現量で割った値である］。
【図４】各種の試料における胃癌高発現遺伝子と低発現遺伝子の発現程度を競争的（competitive）ＲＴ−ＰＣＲ方法を行って示したものである［（ａ）〜（ｌ）は高発現遺伝子を、（ｍ）〜（ｏ）は低発現遺伝子を示す。Ｘ軸は各種の試料を示したものであって、Ｓ１４，Ｓ１８，Ｓ１９は正常の胃組織、Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３，Ｓ５，Ｓ６，Ｓ７，Ｓ８，Ｓ９，Ｓ１０，Ｓ１２，Ｓ１３，Ｓ２１は胃癌細胞株であり、Ｓ２０は胃癌組織である。Ｙ軸は各種の試料における標的遺伝子の発現量を示したものであって、高発現遺伝子の発現量は正常の胃組織で発現される発現量の平均量に対する比率として示し、低発現遺伝子の発現量は胃癌細胞株および胃癌組織で発現される発現量の平均量に対する比率として示したものである。各遺伝子の発現量は各種の試料で発現されるＢ２Ｍの発現量で割った値である］。
【図５】各種の試料における転移性胃癌高発現遺伝子と低発現遺伝子の発現程度を競争的（competitive）ＲＴ−ＰＣＲ法を行って示したものである［（ａ）〜（ｉ）は高発現遺伝子、（ｊ）〜（ｒ）低発現遺伝子、Ｘ軸は各種の試料を示したものであって、Ｓ１０，Ｓ５，Ｓ７，Ｓ２１は原発癌性胃癌細胞株であり、Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３，Ｓ６，Ｓ８，Ｓ９は転移性胃癌細胞株である。Ｙ軸は各種の試料における標的遺伝子の発現量を示したものであって、高発現遺伝子の発現量は原発癌性胃癌細胞株で発現される発現量の平均量に対する比率として示し、低発現遺伝子の発現量は転移性胃癌細胞株で発現される発現量の平均量に対する比率として示したものである。各遺伝子の発現量は各種の試料で発現されるＢ２Ｍの発現量で割った値である］。
【図６】胃癌臨床試料における胃癌高発現遺伝子と低発現遺伝子の発現程度を競争的（competitive）ＲＴ−ＰＣＲ方法を行って示したものである［（ａ）〜（ｄ）は高発現遺伝子を、（ｅ）〜（ｈ）は低発現遺伝子を示す。Ｘ軸は４名の胃癌患者から採取した臨床試料を示すものであって、Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３，Ｎ４は正常の胃組織、Ｔ１，Ｔ２，Ｔ３，Ｔ４は胃癌組織である。Ｙ軸は臨床試料における標的遺伝子の発現量を示すものであって、各遺伝子の発現量を臨床試料で発現されるＢ２Ｍの発現量で割った値である］。
【図７】転移性胃癌臨床試料における転移性胃癌高発現遺伝子と低発現遺伝子の発現程度を競争的ＲＴ−ＰＣＲ方法で確認した結果である［（ａ）〜（ｄ）は高発現遺伝子を、（ｅ）〜（ｈ）は低発現遺伝子を示す。Ｘ軸は１０名の原発癌性胃癌患者と７名の転移性胃癌患者から採取した臨床試料を示すものであって、Ｅ１，Ｅ２，Ｅ３，Ｅ４，Ｅ５，Ｅ６，Ｅ７，Ｅ８，Ｅ８，Ｅ９，Ｅ１０は原発癌性胃癌組織であり、Ａ１，Ａ２，Ａ３，Ａ４，Ａ５，Ａ６，Ａ７は転移性胃癌組織である。Ｙ軸は臨床試料における標的遺伝子の発現量を示すものであって、各遺伝子の発現量を臨床試料で発現されるＢ２Ｍの発現量で割った値である］。
【図１】
2006526998.tif 000010
2006526998.tif 000011
【図２】
2006526998.tif 000012
【図３】
2006526998.tif 000013
【図４】
2006526998.tif 000014
【図５】
2006526998.tif 000015
【図６】
2006526998.tif 000016
【図７】
2006526998.tif 000017
【配列表】
2006526998000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年4月7日(2006.4.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃癌特異的高発現遺伝子であるＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ， ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ，ＨＳＰＢ１およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子のセンスおよびアンチセンスプライマー、および胃癌特異的低発現遺伝子であるＩＧＫＣ，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを含むことを特徴とする胃癌診断キット。
【請求項２】
前記プライマーが１５ｂｐ以上のＤＮＡであることを特徴とする請求項１記載の胃癌診断キット。
【請求項３】
胃癌特異的高発現遺伝子であるＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ，ＨＳＰＢ１およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子に相補的なプローブ、および胃癌特異的低発現遺伝子であるＩＧＫＣ，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子に相補的なプローブを含むことを特徴とする胃癌診断キット。
【請求項４】
前記プローブを用いたハイブリダイゼーション反応を通じて前記遺伝子の発現量を測定することを特徴とする請求項３記載の胃癌診断キット。
【請求項５】
前記プローブが２００〜１０００ｂｐであることを特徴とする請求項３または４記載の胃癌診断キット。
【請求項６】
胃癌特異的高発現遺伝子であるＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ，ＨＳＰＢ１およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する抗体、および胃癌特異的低発現遺伝子であるＩＧＫＣ，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する抗体を含むことを特徴とする胃癌診断キット。
【請求項７】
抗原−抗体結合反応を通じて前記タンパク質の発現程度を測定することを特徴とする請求項６記載の胃癌診断キット。
【請求項８】
転移性胃癌特異的高発現遺伝子であるＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーと、転移性胃癌特異的低発現遺伝子であるＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子のセンスおよびアンチセンスプライマーを含むことを特徴とする転移性胃癌診断キット。
【請求項９】
前記プライマーが１５ｂｐ以上のＤＮＡであることを特徴とする請求項８記載の転移性胃癌診断キット。
【請求項１０】
転移性胃癌特異的高発現遺伝子であるＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子に相補的なプローブと、転移性胃癌特異的低発現遺伝子であるＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子に相補的なプローブを含むことを特徴とする転移性胃癌診断キット。
【請求項１１】
前記プローブを用いたハイブリダイゼーション反応を通じて前記遺伝子の発現量を測定することを特徴とする請求項１０記載の転移性胃癌診断キット。
【請求項１２】
前記プローブが２００〜１０００ｂｐであることを特徴とする請求項１０または１１記載の転移性胃癌診断キット。
【請求項１３】
転移性胃癌特異的高発現遺伝子であるＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する抗体と転移性胃癌特異的低発現遺伝子であるＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する抗体を含むことを特徴とする転移性胃癌診断キット。
【請求項１４】
抗原−抗体結合反応を通じて前記タンパク質の発現程度を測定することを特徴とする請求項１３記載の転移性胃癌診断キット。
【請求項１５】
転移性胃癌特異的高発現遺伝子であるＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する抗体と、転移性胃癌特異的低発現遺伝子であるＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する抗体を含むことを特徴とする転移性胃癌診断キット。
【請求項１６】
胃癌特異的高発現遺伝子であるＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ， ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ，ＨＳＰＢ１およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質、および胃癌特異的低発現遺伝子であるＩＧＫＣ，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質に試験化合物を結合させ、試験化合物が前記タンパク質の作用を促進または抑制するかを確認することを特徴とする胃癌抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項１７】
転移性胃癌特異的高発現遺伝子であるＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質と、転移性胃癌特異的低発現遺伝子であるＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質に試験化合物を結合させ、試験化合物が前記タンパク質の作用を促進または抑制するかを確認することを特徴とする転移性胃癌抑制剤のスクリーニング方法。
【国際調査報告】
2006526998.tif 000018
2006526998.tif 000019