(57)【要約】本発明は、β−セクレターゼ　ＢＡＣＥのホモログであるＢＡＣＥ２が、非アミロイド形成性経路におけるＡＰＰのプロセシングを刺激する能力があり、それゆえＡβのレベルを抑制するということの発見に基づいている。従って、本発明は、Ａβ産生を抑制するＢＡＣＥ２のこの特有な活性のモジュレーターを同定するための方法および手段ならびにこのようなモジュレーターの使用を提供する。本明細書中に提供される方法および手段を用いて同定される化合物は、アルツハイマー病および他の神経学的疾患の処置のための潜在的な候補として使用され得る。
2004501652.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）またはそのフラグメント由来のβ−アミロイドペプチド（Ａβ）の酵素的産生を調節する方法であって、該ＡＰＰまたは該ＡＰＰフラグメントとＢＡＣＥ２ポリペプチドまたはそのアゴニストもしくはアンタゴニストを接触させる行程を包含する、方法。
【請求項２】
前記ＡＰＰがネイティブ配列ヒトＡＰＰである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＡＰＰが６９５アミノ酸アイソタイプである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＡＰＰがＳｗｅｄｉｓｈ変異を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＡＰＰフラグメントがβ−ＣＴＦである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＢＡＣＥ２がネイティブ配列ＢＡＣＥ２ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）またはそのフラグメント由来のβ−アミロイドペプチド（Ａβ）の形成を阻害する方法であって、該ＡＰＰまたは該ＡＰＰフラグメントとＢＡＣＥ２ポリペプチドまたはそのアゴニストを接触させる行程を包含する、方法。
【請求項８】
前記ＡＰＰがネイティブ配列ヒトＡＰＰである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＡＰＰが６９５アミノ酸アイソタイプである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＡＰＰがＳｗｅｄｉｓｈ変異を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＡＰＰフラグメントがβ−ＣＴＦである、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＢＡＣＥ２がネイティブ配列ＢＡＣＥ２ポリペプチドである、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
α−セクレターゼ活性の存在下において実施される、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
γ−セクレターゼ活性の存在下において実施される、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
ＢＡＣＥ２以外のβ−セクレターゼ活性の存在下において実施される、請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記β−セクレターゼ活性は、候補化合物とともに、約ｐＨ６．５〜７．０で最適ｐＨ、ＨＥＫ２９３細胞の膜抽出物の放射線不活化分析から計算された約３２〜３９ｋＤａ、またはヒト脳サンプルの放射線不活化分析から計算された約２０〜２６ｋＤａの推定分子量を有する酵素の存在に起因する、方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法であって、前記β−セクレターゼ活性が、約ｐＨ４．５〜５．０で最適ｐＨ、ＨＥＫ２９３細胞の膜抽出物またはヒト脳サンプル（ＢＡＣＥ１）の放射線不活化分析から計算された約５０〜６０ｋＤａの推定分子量を有するβ−セクレターゼ酵素の存在に起因する、方法。
【請求項１８】
前記ＢＡＣＥ２が単離形式である、請求項７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＢＡＣＥ２が、固定化または細胞結合形式である、請求項７に記載の方法。
【請求項２０】
前記処置がＢＡＣＥ２のアゴニストとともに実施される、請求項７に記載の方法。
【請求項２１】
前記アゴニストがＢＡＣＥ２の産生を刺激する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記アゴニストがＢＡＣＥ２の活性を増強する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記アゴニストがＢＡＣＥ２の活性を模倣する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記アゴニストが低分子である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）またはそのフラグメント由来の全長β−アミロイド（Ａβ）ポリペプチドの放出を阻害する方法であって、ＢＡＣＥ２ポリペプチドまたはそのアゴニストにより、該ＡＰＰまたは該ＡＰＰフラグメントを、該ＡＰＰまたは該ＡＰＰフラグメントのβ−セクレターゼプロセシングを妨害する部位で切断する工程を包含する、方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、前記部位がネイティブ配列ＡＰＰまたはそのフラグメントのα−セクレターゼ切断部位またはその周囲である、方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、前記部位が前記α−セクレターゼ切断部位のいずれかの側の約１０アミノ酸以内である、方法。
【請求項２８】
β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）またはそのフラグメント由来のβ−アミロイドペプチド（Ａβ）の酵素的産生のモジュレーターを同定する方法であって、ＡＰＰまたはＡＰＰフラグメントおよびＢＡＣＥ２と候補化合物を接触させる工程、ならびにＡβ産生に対する該候補化合物の効果をモニターする工程を包含する、方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、前記モジュレーターがＡβ産生のインヒビターである、方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、Ａβ産生に対する前記候補化合物の効果が、形成されるＡβの量を測定することによってモニターされる、方法。
【請求項３１】
α−セクレターゼ活性の存在下において実施される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
γ−セクレターゼ活性の存在下において実施される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
ＢＡＣＥ２以外のβ−セクレターゼ活性の存在下において実施される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、前記β−セクレターゼ活性は、候補化合物とともに、約ｐＨ６．５〜７．０で最適ｐＨ、ＨＥＫ２９３細胞の膜抽出物の放射線不活化分析から計算された約３２〜３９ｋＤａ、またはヒト脳サンプルの放射線不活化分析から計算された約２０〜２６ｋＤａの推定分子量を有する酵素の存在に起因する、方法。
【請求項３５】
請求項３３に記載の方法であって、前記β−セクレターゼ活性が、約ｐＨ４．５〜５．０で最適ｐＨ、ＨＥＫ２９３細胞の膜抽出物またはヒト脳サンプル（ＢＡＣＥ１）の放射線不活化分析から計算された約５０〜６０ｋＤａの推定分子量を有するβ−セクレターゼ酵素の存在に起因する、方法。
【請求項３６】
前記形成されるＡβの量が少なくとも約５０％減少される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記形成されるＡβの量が少なくとも約７５％減少される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
前記形成されるＡβの量が少なくとも約９０％減少される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
請求項２９に記載の方法であって、Ａβ産生に対する試験化合物の効果と該試験化合物の非存在下におけるＢＡＣＥ２の効果とを比較する工程をさらに包含する、方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法であって、前記試験化合物が、該試験化合物の非存在下でのＢＡＣＥ２の効果に対して、Ａβの量において少なくとも約１５％の減少を引き起こす、方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法であって、前記減少が少なくとも約２５％である、方法。
【請求項４２】
請求項４０に記載の方法であって、前記減少が少なくとも約５０％である、方法。
【請求項４３】
請求項４０に記載の方法であって、前記減少が少なくとも約７５％である、方法。
【請求項４４】
請求項２９に記載の方法であって、Ａβ産生に対する試験化合物の効果とＢＡＣＥ２の非存在下におけるＡβ産生とを比較する工程をさらに包含する、方法。
【請求項４５】
無細胞形式で実施される、請求項２８に記載の方法。
【請求項４６】
β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）またはそのフラグメント由来のβ−アミロイドペプチド（Ａβ）の酵素的産生のモジュレーターであって、請求項２９に記載の方法によって同定される、モジュレーター。
【請求項４７】
前記モジュレーターがインヒビターである、請求項４６に記載のモジュレーター。
【請求項４８】
前記モジュレーターがＢＡＣＥ２アゴニストである、請求項４６に記載のモジュレーター。
【請求項４９】
前記モジュレーターがペプチドまたはポリペプチドである、請求項４６に記載のモジュレーター。
【請求項５０】
前記モジュレーターが低分子である、請求項４６に記載のモジュレーター。
【請求項５１】
哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）におけるβ−アミロイド沈着の量を減少させる方法であって、ＢＡＣＥ２またはそのアゴニストの有効量を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項５２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記沈着が脳に存在する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
哺乳動物の患者におけるアルツハイマー病（ＡＤ）、ＡＤ型病状または大脳アミロイド血管症の処置のための方法であって、ＢＡＣＥ２またはそのアゴニストの有効量を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項５５】
前記患者がヒトである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
請求項５４に記載の方法であって、前記患者が、アルツハイマー病（ＡＤ）、ＡＤ型病状または大脳アミロイド血管症を発症する危険性を有し、そして前記処置が予防である、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、β−アミロイド前駆体タンパク質、ＡＰＰのタンパク質分解プロセシングによって得られるβ−アミロイド（Ａβ）レベルの、モジュレーターの同定および使用のための方法および手段に関連する。
【０００２】
（関連する技術の説明）
アルツハイマー病（ＡＤ）、脳のアミロイドアンギオパチー（ＣＡＡ）、およびプリオン媒介疾患を含む、多くの重要な神経学的疾患が、中枢神経系（ＣＮＳ）における、アミロイドと呼ばれる凝集タンパク質の沈着によって特徴付けられる（概説のためには、Ｇｌｅｎｎｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．９４：１−２８（１９８９）；Ｈａａｎら、Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．９２（４）：３０５−３１０（１９９０）を参照のこと）。これらの高度に不溶性の凝集物は、βシートコンフォメーションの共通の特徴を有する、非分岐、小繊維性タンパク質で構成されている。ＣＮＳにおいて、アミロイドは脳および髄膜血管（脳血管沈着）および脳実質（プラーク）に存在し得る。ヒトおよび動物モデルにおける神経病理学的研究は、アミロイド沈着に近接する細胞が、その正常機能を阻害されていることを示す（Ｍａｎｄｙｂｕｒ、Ａｃｔａ　Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．７８：３２９−３３１（１９８９）；Ｋａｗａｉら、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．６２３：１４２−１４６（１９９３）；Ｍａｒｔｉｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４５：１３４８−１３８１（１９９４）；Ｋａｌａｒｉａら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ　６：４７７−４８０（１９９５）；Ｍａｓｌｉａｈら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：５７９５−５８１１（１９９６）；Ｓｅｌｋｏｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１８２９５−１８２９８（１９９６）；Ｈａｒｄｙ、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０：１５４−１５９（１９９７））。
【０００３】
ＡＤおよびＣＡＡは、生化学的および神経病理学的マーカーを共有するが、アミロイド沈着の程度および位置、および罹患した個体によって示される症状においていくらか異なる。世界で最もよくみられる神経変性疾患、ＡＤの神経変性過程は、神経炎性プラークおよびもつれの形成を伴う、辺縁系、関連新皮質、および前脳基底部の進行性および不可逆性の求心路遮断によって特徴付けられる（概説のためには、Ｔｅｒｒｙら、「Ｓｔｒｕｃｔｕａｌ　ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ」Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ、Ｔｅｒｒｙら編、１９９４、１７９−１９６頁、Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋを参照のこと）。ジストロフィーの神経突起、および反応性星状細胞および小グリア細胞が、これらのアミロイド−関連神経炎性プラークに関連している。いかなる所定のプラークにおける神経炎の集団は混合しているが、一般的にプラークはシナプスのタンパク質、ＡＰＰ（Ｉ型）を含む球状の神経突起、および細胞骨格タンパク質および対らせんフィラメント（ＰＨＦ、ＩＩ型）を含む融合形態（ｆｕｓｉｆｏｒｍ）神経突起から構成されている。
【０００４】
ＣＡＡ患者は様々な血管性症候群を示し、そのうち最も実証されているのは脳実質の出血である。脳実質の出血は、脳血管内における広範なアミロイド沈着の結果である（Ｈａｒｄｙ、Ｔｅｒｎｄｓ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　２０：１５４−１５９（１９９７）；Ｈａａｎら、Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．９２：３０５−３１０（１９９０）；Ｔｅｒｒｙら、（１９９４）前出；Ｖｉｎｔｅｒｓ、Ｓｔｒｏｋｅ　１８：２１１−２２４（１９８７）；Ｉｔｏｈら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｉｃａｌ　Ｓｃｉ．１１６：１３５−１４１（１９９３）；Ｙａｍａｄａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ　５６：５４３−５４７（１９９３）；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ　４３：２０７３−２０７９（１９９３）；Ｌｅｖｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４８：１１２４−１１２６（１９９０））。いくつかの家族性ＣＡＡの場合、出血が起こる前に痴呆が注目され、脳血管のアミロイド沈着も認識機能を妨げ得ることを示唆する。
【０００５】
ＡＤおよびＣＡＡはどちらも、罹患した個体の脳における老人斑の蓄積によって特徴付けられる。主要なアミロイド構成成分は、βアミロイド前駆体タンパク質、β−ＡＰＰ、または単にＡＰＰのタンパク質分解プロセシングから得られる、アミロイドβまたはβ−アミロイドペプチドとも呼ばれるアミロイドβタンパク質（Ａβ）である。ＡＤに関する概説のためには、Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ　３９９：Ａ２３−Ａ３１（１９９９）を参照のこと。Ａβは、β−アミロイド前駆体タンパク質（βＡＰＰ）と呼ばれる内在性膜タンパク質のタンパク質分解的切断によって産生される。
【０００６】
２つの推定セクレターゼによってＡＰＰから産生されるＡβペプチドは、正常ＣＮＳおよび血液に低いレベルで存在する。２つの主要な改変体、Ａβ１−４０およびＡβ１−４２が、ＡＰＰの選択的カルボキシ末端切断によって産生される（Ｓｅｌｋｏｅら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：７３４１−７３４５；Ｓｅｌｋｏｅ（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　１６：４０３−４０９）。ＡＤおよびＣＡＡの両方のアミロイド沈着において、２つのペプチドのうちＡβ１−４２がより小繊維発生性であり、そしてより豊富に存在する。上記のＡＤの場合におけるアミロイド沈着に加えて、ほとんどのＡＤの場合は血管壁のアミロイド沈着とも関連している（Ｈａｒｄｙ（１９９７）前出；Ｈａａｎら（１９９０）前出；Ｔｅｒｒｙら（１９９４）前出；Ｖｉｎｔｅｒｓ（１９８７）前出；Ｉｔｏｈら（１９９３）前出；Ｙａｍａｄａら（１９８３）前出；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら（１９９３）前出；Ｌｅｖｙら（１９９０）前出）。これらの血管性損傷はＣＡＡの特徴であり、それはＡＤの非存在下で存在し得る。
【０００７】
神経炎性プラークが形成される正確なメカニズムおよび、プラーク形成とＡＤ−関連およびＣＡＡ−関連神経変性過程との関係は、よく明らかではない。しかし、証拠が、ＡＰＰ遺伝子産物またはこれら遺伝子産物の誘導体の、異常な（ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｅｄ）発現および／またはプロセシングが、神経変性およびプラーク形成にいたる病態生理学的過程に関与していることを示す。例えば、ＡＰＰのミスセンス変異は、ＡＤの常染色体優性形式に強く関連している（Ｈａｒｄｙ（１９９４）Ｃｌｉｎ．Ｇｅｒｉａｔｒ．Ｍｅｄ．１０：２３９−２４７；Ｍｅｎｎら（１９９２）Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　１：２０１−２１５）。神経変性疾患におけるＡＰＰの役割は、３番目の第２１番染色体上にヒトＡＰＰ（ｈＡＰＰ）遺伝子のさらなるコピーを有するダウン症候群の個人は、ｈＡＰＰの過剰発現（Ｇｏｏｄｉｓｏｎら（１９９３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５２：１９２−１９８；Ｏｙａｍａら（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６２：１０６２−１０６６）、および人生の初期にＡＤ型の病状を発現する顕著な傾向（Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉら（１９８５）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１７：２７８−２８２）を示すという観察によってさらに関係している。Ａβの変異は、アミロイドーシスを有する遺伝的脳出血（Ｄｕｔｃｈ　ＨＣＨＷＡ）に関連するＣＡＡと関連している（Ｌｅｖｙら（１９９０）前出）。ここでアミロイド沈着は、いくらかの散開したプラークの形成と共に脳血管に優先的に起こる（Ｍａａｔ−Ｓｃｈｉｅｍａｎら（１９９４）Ａｃｔａ　Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．８８：３７１−８；Ｗａｒｔｅｎｄｏｒｆｆら（１９９５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ　５８：６９９−７０５）。家族性ＡＤの発症に強く関連する多くのｈＡＰＰの点変異が、Ａβペプチドのいずれかの端に近いアミノ酸変化をコードしている（概説のためには、例えばＬａｎｎｆｅｌｔら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２２：１７６−１７９；Ｃｌａｒｋら（１９９３）Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．５０：１１６４−１１７２を参照のこと）。最後に、インビトロでの研究が、凝集Ａβは神経変性を誘導し得ることを示す（例えばＰｉｋｅら（１９９５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６４：２５３−２６５を参照のこと）。
【０００８】
ＡＰＰは、多くの哺乳動物組織の広く様々な細胞において発現している、糖鎖付加、１回膜貫通型タンパク質である。現在ヒトにおいて存在することが知られている特定のＡＰＰアイソタイプの例は、Ｋａｎｇら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ　３２５：７３３−７３６によって記載された６９５−アミノ酸ポリペプチド（ＡＰＰ６９５）であり、それは「正常」ＡＰＰと呼ばれる。７５１−アミノ酸ポリペプチド（ＡＰＰ７５１）がＰｏｎｔｅら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ　３３１：５２５−５２７およびＴａｎｚｉら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ　３３１：５２８−５３０によって記載されている。ＡＰＰの７７０−アミノ酸アイソタイプ（ＡＰＰ７７０）がＫｉｔａｇｕｃｈｉら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ　３３１：５３０−５３２において記載されている。位置および表現型のいずれにおいても異なり得る変異を有する、ＡＰＰの多くの特定の改変体も記載された。そのような変異の一般的な概説は、Ｈａｒｄｙ（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．１：２３３−２３５において記載される（ｐｉｖｏｔｅｄ）。特に興味のある変異は、「スウェーデン」変異と呼ばれ、ここでは位置５９５および５９６の正常Ｌｙｓ−Ｍｅｔ残基がＡｓｎ−Ｌｅｕで置換されている。この変異は、６９５アイソタイプの残基５９６および５９７の間で起こる、ＡＰＰの正常β−セクレターゼ切断部位のすぐ上流に位置している。
【０００９】
ＡＰＰはいくつかのタンパク質分解経路によって翻訳後プロセシングされ、様々な断片の分泌または細胞内断片化および分解を引き起こす。Ｆ．Ｃｈｅｃｌｅｒ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６５：１４３１−１４４４（１９９５）。ＡＰＰに対するβ−セクレターゼおよびγ−セクレターゼをあわせた活性は、アミロイドプラークの主要な構成成分である、インタクトなβ−アミロイドペプチド（Ａβ）を放出する。　−セクレターゼによるＡＰＰの最初の切断は、可溶性のＡＰＰおよび膜結合　−ＣＴＦを産生し、それはさらに　−セクレターゼによってプロセシングされて４０または４２アミノ酸ペプチドを産生し得る（Ａβ４０またはＡβ４２）。あるいは、　−セクレターゼによるＡＰＰプロセシングは、可溶性ＡＰＰおよび膜結合　−ＣＴＦの形成を引き起こし、後者は非アミロイド生成性のｐ３を産生する　−セクレターゼの基質である。Ａβは、約４３アミノ酸のペプチドであり、それはＡＰＰの６９５アミノ酸アイソタイプの残基５９７−６４０を含む。α−セクレターゼによるＡβの内部切断は、全長Ａβペプチドの放出を阻害する。ＡＤの進行におけるセクレターゼの発病に関与する程度は完全に解明されていないが、これらのタンパク質分解事象は、Ａβの形成を促進または阻害することが知られており、そして従ってＡＤのよい治療的候補であると考えられる。
【００１０】
多エピトープ性（ｐｏｌｙｔｏｐｉｃ）膜貫通タンパク質プレセニリンは、　−セクレターゼ活性に強く関係していた（概説のためには、ＨａａｓｓおよびＤｅ　Ｓｔｒｏｏｐｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８６：９１６−９１９（１９９９）を参照のこと）。プレセニリンの２つの膜貫通アスパラギン酸の突然変異誘発が、細胞アッセイにおいて　−セクレターゼ活性の不活性化を引き起こす（Ｗｏｌｆｅら、Ｎａｔｕｒｅ　３９８：５１３−５１７（１９９９））。結果として、蓄積した　−および　−ＣＴＦおよびＡβの形成は有意に減少した。基質アナログを用いた　−セクレターゼの阻害時に同様の効果が見られた（Ｗｏｌｆｅら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１：６−９（１９９８））。プレセニリンが　−セクレターゼとして十分であるかどうか、またはその機能を発揮するのに今まで未知の性質を有する別の独特の補助因子を必要とするのかどうかはまだ決定されていないが、プレセニリン１および　−セクレターゼ活性は、最近膜抽出物から共沈することが示された（Ｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９７（１１）：６１３８−４３（２０００））。
【００１１】
上記で議論されたように、β−およびγ−セクレターゼと呼ばれる、Ａβの産生に関与する少なくとも２つのプロテアーゼが存在する（Ｃｉｔｒｏｎら、Ｎｅｕｒｏｎ　１７：１７１−１７９（１９９６）；Ｓｅｕｂｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ　３６１：２６０−２６３（１９９３）；Ｃａｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５９：５１４−５１６（１９９３）；およびＣｉｔｒｏｎら、Ｎｅｕｒｏｎ　１４：６６１−６７０（１９９５））。最近これらの酵素を同定および特徴付けるために、非常な努力がなされた。最近５つの独立したグループが、β−セクレターゼに対応する遺伝子のクローニングおよび特徴付けを報告した（Ｖａｓｓａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８６：７３５−７４１（１９９９）；Ｙａｎら、Ｎａｔｕｒｅ　４０２：５３３−５３７（１９９９）；Ｓｉｎｈａら、Ｎａｔｕｒｅ　４０２：５３７−５４０（１９９９）；Ｈｕｓｓａｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４：４１９−４２７（１９９９）；Ｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９７：１４５６−１４６０（２０００））。膜結合アスパルチルプロテアーゼは、β−部位ＡＰＰ切断酵素（ＢＡＣＥ）、アスパルチルプロテアーゼ−２（Ａｓｐ２）、ｍｅｍａｐｓｉｎ２または単にβ−セクレターゼと、様々に呼ばれてきた。しかし、５つのグループ全てによって報告されたポリペプチド鎖の推定アミノ酸配列は同じである。クローニングされた酵素は、真正β−セクレターゼに期待される特徴の多くを有している。特に、ＢＡＣＥの過剰発現は、　−ＮＴＦおよびＡβレベル両方の増加を引き起こし、一方アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＢＡＣＥの抑制はこれらの切断産物の有意な減少を引き起こす。真正　−セクレターゼで予期されるように、ＡＰＰのスウェーデン２重変異（ＡＰＰｓｗ、Ｍｕｌｌａｎら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１：３４５−３４７（１９９２）；Ｃｉｔｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３６０：６７２−６７４（１９９２）；Ｃａｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５９：５１４−５１６（１９９３））は、ＢＡＣＥによってより効率的に切断された。考え合わせると、これらの結果は、ＢＡＣＥが主要な　−セクレターゼ活性であるという考えを導いた。
【００１２】
ＤＲＡＰまたはＢＡＣＥ２と命名されたＢＡＣＥの近いホモログが最近記載された（Ａｃｑｕａｔｉら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．４６８：５９−６４（２０００）、ヒトおよびマウスｃＤＮＡ配列のＧｅｎＢａｎｋ登録番号は、それぞれＡＦ０５０１７１およびＡＦ０５１１５０である；Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３７７１２−７（２０００））。ＢＡＣＥおよびＢＡＣＥ２は、６４％のアミノ酸配列類似性を共有するが、ＡＰＰプロセシングにおけるＢＡＣＥ２の役割はまだ明らかではない。驚くべきことに、脳内におけるＢＡＣＥ２の発現は非常に低いようであり、そしてこの観察が、ＢＡＣＥ２の　−セクレターゼ切断における役割は小さいものであり得るという推定に寄与している（Ｂｅｎｎｅｔｔら、同書）。
【００１３】
（発明の概要）
本明細書中で開示された実験データは、基質としてＡＰＰ７５１の野生型（ｗｔ）またはスウェーデン変異形態を用いた無細胞アッセイにおいて　−セクレターゼ切断を再構築した場合に、ＢＡＣＥ２は確かに　−セクレターゼ活性を有することを確認する。しかし、この活性はＢＡＣＥのβ−セクレターゼ活性よりも弱い。本発明はさらにＨＥＫ２９３細胞におけるＢＡＣＥ２の過剰発現は　−ＮＴＦ形成に中程度の効果を有するが、さらなるＢＡＣＥの外来性コピーの存在下または非存在下でＡβの産生を著しく抑制したという、予期しない発見に基づく。ＢＡＣＥ２はまた、ニューロン性ＳＫＮ細胞においてもＡβレベルを調節し、そして従ってその効果は非ニューロン性ＨＥＫ２９３細胞に限定されなかった。ＢＡＣＥ２によるＡβの産生の抑制は、その　−セクレターゼ部位において切断する能力を必要としないようであった。　−セクレターゼ切断を模倣するために切断された、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のＣ末端１００アミノ酸断片を有する細胞において、Ａβレベルは同様に抑制された。ＢＡＣＥ２は、α−セクレターゼ活性によって媒介されるような、代替非アミロイド形成性ＡＰＰプロセシング経路を促進することによって、Ａβ産生のモジュレーターとして機能することが示唆される。
【００１４】
１つの局面では、本発明は、当該ＡＰＰまたはＡＰＰ断片をＢＡＣＥ２ポリペプチドまたはそのアゴニストまたはアンタゴニストと接触させることによって、β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）またはその断片からの、β−アミロイドペプチド（Ａβ）の酵素的産生を調節する方法に関連する。特定の実施態様では、その方法はＢＡＣＥ２またはＢＡＣＥ２のアゴニストを用いることによる、ＡＰＰまたはＡＰＰ断片からのＡβ産生の阻害に関連する。
【００１５】
別の局面では、本発明は、ＡＰＰまたはＡＰＰ断片をＢＡＣＥ２ポリペプチドまたはそのアゴニストと接触させることによる、β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）またはその断片からのβ−アミロイドペプチド（Ａβ）の形成を阻害する方法に関連する。
【００１６】
また別の局面では、本発明は、ＡＰＰまたはＡＰＰ断片のβ−セクレターゼプロセシングを阻害する部位で、当該ＡＰＰまたはＡＰＰ断片をＢＡＣＥ２ポリペプチドまたはそのアゴニストによって切断することを含む、β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）またはその断片からの全長β−アミロイド（Ａβ）ポリペプチドの放出を阻害する方法に関連する。
【００１７】
すべての局面において、ＡＰＰは、例えば、６９５アミノ酸アイソタイプおよびいわゆるスウェーデン変異を含むアイソタイプを含む、ネイティブ配列ヒトＡＰＰであり得る。ＡＰＰ断片は、制限なしに、β−ＣＴＦを特に含む。その方法を、α−セクレターゼ活性および／またはγ−セクレターゼ活性および／またはＢＡＣＥ２以外のβ−セクレターゼ活性の存在下で実施し得る。さらなるβ−セクレターゼ活性は、候補化合物とともに、例えば、約ｐＨ６．５−７．０の最適ｐＨ、およびＨＥＫ２９３細胞膜抽出物の放射線不活性化分析から計算される約３２−３９ｋＤａ、またはヒト脳試料の放射線不活性化分析から計算される２０−２６ｋＤａの推定分子量を有する酵素の存在のためであり得る。あるいは、またはそれに加えて、さらなるβ−セクレターゼ活性は、約ｐＨ４．５−５．０の最適ｐＨ、およびＨＥＫ２９３細胞膜抽出物またはヒト脳試料の放射線不活性化分析から計算される約５０−６０ｋＤａの推定分子量を有するβ−セクレターゼ酵素の存在のためであり得る（ＢＡＣＥ１）。これらのβ−セクレターゼ活性は、新規β−セクレターゼおよびβ−セクレターゼ活性の調節に関して、２０００年５月９日に出願された同時係属出願番号０９／５６６，７４６号（代理人ドケット（ｄｏｃｋｅｔ）番号：ＳＣＩＤＳ．０２０Ａ）においてさらに開示および特徴付けられる。その開示全体は、本明細書中に参考として明確に援用される。
【００１８】
さらなる局面では、本発明は、ＡＰＰまたはＡＰＰ断片およびＢＡＣＥ２を候補化合物と接触させ、そしてＡβの産生に対する候補化合物の効果をモニターすることを含む、β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）またはその断片からの、β−アミロイドペプチド（Ａβ）の酵素的産生のモジュレーターを同定する方法に関連する。好ましい実施態様では、その方法をＡＰＰまたはその断片からのＡβの酵素的産生のインヒビターを同定するために使用する。Ａβの産生に対する候補化合物の効果は、例えば，形成されたＡβの量を測定することによってモニターし得るが、他のモニタリング方法も本発明の範囲内である。好ましい実施態様では、その方法を、形成されるＡβの量を少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８５％、最も好ましくは少なくとも約９０％減少させるインヒビターを同定するために使用する。
【００１９】
前の局面と同様に、ＡＰＰは、例えば６９５−アミノ酸アイソタイプおよびいわゆるスウェーデン変異を含むアイソタイプを含む、ネイティブ配列ヒトＡＰＰであり得る。ＡＰＰ断片は、制限なしに、β−ＣＴＦを特に含む。その方法を、α−セクレターゼ活性および／またはγ−セクレターゼ活性および／またはＢＡＣＥ２以外のβ−セクレターゼ活性の存在下で実施し得る。さらなるβ−セクレターゼ活性は、候補化合物とともに、例えば、約ｐＨ６．５−７．０の最適ｐＨ、およびＨＥＫ２９３細胞膜抽出物の放射線不活性化分析から計算される約３２−３９ｋＤａ、またはヒト脳試料の放射線不活性化分析から計算される２０−２６ｋＤａの推定分子量を有する酵素の存在のためであり得る。あるいは、またはそれに加えて、さらなるβ−セクレターゼ活性は、約ｐＨ４．５−５．０の最適ｐＨ、およびＨＥＫ２９３細胞膜抽出物またはヒト脳試料の放射線不活性化分析から計算される約５０−６０ｋＤａの推定分子量を有するβ−セクレターゼ酵素の存在のためであり得る（ＢＡＣＥ１）。
【００２０】
さらに別の局面では、本発明は、前述の方法によって同定された、β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）またはその断片からの、β−アミロイドペプチド（Ａβ）の酵素的産生のモジュレーターに関連する。モジュレーターは、好ましくはインヒビターであり、そして例えばポリペプチド、ペプチド、または小分子であり得る。
【００２１】
さらなる局面では、本発明は、哺乳動物に有効な量のＢＡＣＥ２またはそのアゴニストを投与する工程を包含する、哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）におけるβ−アミロイド沈着の量を減少させる方法に関連する。
【００２２】
別の局面では、本発明は、患者に有効な量のＢＡＣＥ２またはそのアゴニストを投与する工程を包含する、哺乳動物患者においてアルツハイマー病（ＡＤ）、ＡＤ型の病状、または脳のアミロイドアンギオパチーを治療する方法に関連する。
【００２３】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
広く様々なタンパク質が、β−アミロイド（Ａβ）ペプチドを産生するためのβＡＰＰのプロセシングまたはプロセシングの調節に関わり得る。Ａβの脳における凝集および細胞外沈着は、アルツハイマー病病理の特徴である。従って、アルツハイマー病患者においてこれらのプラークの沈着を阻害、遅延（ｄｅｌａｙ）、遅延（ｓｌｏｗ　ｄｏｗｎ）または停止させるために考えられた治療的戦略は、様々なセクレターゼの活性のみでなく、そのような酵素の制御または調節に関わる様々なタンパク質も考慮に入れなくてはならない。本明細書中で開示されるようなＢＡＣＥ２の新規活性は、アルツハイマー病および他の神経変性疾患の治療（予防を含む）の、可能性のある薬剤候補を同定するための、化合物のスクリーニングのさらに別の標的を提供する。本発明は、ＡβペプチドのＢＡＣＥ２に媒介される抑制のアゴニストまたは活性化剤のスクリーニング方法、およびアルツハイマー病の可能性のある薬物を同定する方法を提供する。
【００２４】
（Ｉ．定義）
本発明を記載する前に、本発明は記載される特定の方法論に限定されないことが理解される。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるので、本明細書中で使用される用語は特定の実施態様を記載する目的のみのためであり、そして制限することを意図しないことも理解される。
【００２５】
他に定義しなければ、本明細書中で使用される技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中で記載されるものと同様の、または同等のあらゆる方法および材料を、本発明の実施または試験で使用しうるが、好ましい方法および材料をここで記載する。本明細書中で述べられた全ての出版物は、出版物が引用されたものに関して方法および／または材料を開示および記載するために、本明細書中で参考として援用される。
【００２６】
本明細書中で議論される刊行物は、本願の出願日より前の、その開示に対してのみ提供される。本明細書中の何も、本発明が先行発明によってこのような刊行物に先立つように権利を与えられていないという承認として解釈されない。さらに、提供される公開日は、実際の公開日と異なり得、独立に確認する必要があり得る。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「β−アミロイド前駆体タンパク質」（ＡＰＰまたはβＡＰＰ）は、ヒトにおいて第２１番染色体のロングアームに位置する同名の遺伝子によってコードされ、そしてそのカルボキシ末端領域にβ−アミロイドタンパク質領域を含むポリペプチドをさす。
【００２８】
「ＢＡＣＥ２」という用語は、本明細書中であらゆる動物、例えばヒトを含む哺乳動物由来のネイティブ配列ＢＡＣＥ２、およびＢＡＣＥ２改変体（これは下記でさらに定義される）をさすために使用される。ＢＡＣＥ２ポリペプチドは、ヒト組織型を含む様々な供給源から単離、または組換えおよび／または合成方法によって調製し得る。
【００２９】
「ネイティブ配列ＢＡＣＥ２」は、その調製方法に関係なく、天然に存在するＢＡＣＥ２ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをさす。ネイティブ配列ＢＡＣＥ２を、天然から単離、または組換えおよび／または合成方法によって調製し得る。「ネイティブ配列ＢＡＣＥ２」という用語は特に、公知のまたは将来発見されるものいずれにせよ、ＢＡＣＥ２の、天然に存在する短縮形態、または分泌形態、天然に存在する改変体形態（例えば選択的スプライシングされた形態）および天然に存在する対立遺伝子改変体を含む。
【００３０】
「ＢＡＣＥ２改変体」という用語は、ネイティブ配列中に１つまたはそれ以上のアミノ酸置換および／または欠失および／または挿入を含む、ネイティブ配列ＢＡＣＥ２のアミノ酸配列改変体をさす。アミノ酸配列改変体は、ネイティブ配列ＢＡＣＥ２のアミノ酸配列と、一般的に少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する。
【００３１】
「配列同一性」は、配列を並べて、そして必要ならギャップを導入し、最大パーセント配列同一性を達成した後、そして保存的置換を配列同一性の一部として考えずに、ネイティブ配列ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。％配列同一性の値は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２において定義されたように、ＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴ２．０ソフトウェアによって産生される。好ましい実施態様では、ネイティブ配列ＢＡＣＥ２のアミノ酸配列改変体は、ストリンジェントな条件下で図７（配列番号１）に示す核酸の相補体にハイブリダイズする核酸によってコードされ、そしてネイティブ配列ＢＡＣＥ２の生物学的活性を保持する。
【００３２】
「ストリンジェントな」ハイブリダイゼーション条件は、配列依存性であり、そして異なる環境パラメーター（例えば塩濃度、および有機物の存在）によって異なる。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおける特異的核酸配列の熱融点（Ｔｍ）より約５℃から２０℃低いように選択される。好ましくは、ストリンジェントな条件は相補的な核酸に結合した特異的核酸の熱融点より約５℃から１０℃低い。Ｔｍは５０％の核酸（例えばタグ核酸）が完全にマッチするプローブにハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度およびｐＨ下で）である。
【００３３】
「ストリンジェントな」洗浄条件は通常、タグの各セットの対応するプローブアレイに対するハイブリダイゼーションに関して経験的に決定される。アレイは最初にハイブリダイズさせて（典型的にはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）、そして次いで特異的対非特異的ハイブリダイゼーションのシグナル対ノイズ比が、特異的ハイブリダイゼーションの検出を促進するのに十分高くなるまで、連続的に低い塩濃度、または高い界面活性剤濃度を含む緩衝液で、または温度を上げて洗浄する。ストリンジェントな温度条件は通常、約３０℃を超す、より通常には約３７℃を超す、そして時々約４５℃を超す温度を含む。ストリンジェントな塩条件は通常約１０００ｍＭより低い、通常約５００ｍＭより低い、より通常には約４００ｍＭより低い、典型的には約３００ｍＭより低い、好ましくは約２００ｍＭより低い、そしてより好ましくは約１５０ｍＭより低い。しかし、パラメーターの組み合わせが、いかなる単一のパラメーターより重要である。例えばＷｅｔｍｕｒら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３１：３４９−７０（１９６６）、およびＷｅｔｍｕｒ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　２６（３４）：２２７−５９（１９９１）を参照のこと。好ましい実施態様では、本明細書中で定義されたような「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、４２℃で５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％の硫酸デキストラン中でのハイブリダイゼーションと、４２℃で０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、および５５℃で５０％のホルムアミドでの洗浄、続いて５５℃でＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄であり得る。
【００３４】
細胞、動物、またはウイルスに関して使用された場合「組換え」という用語は、その細胞、動物またはウイルスが外来性ＤＮＡまたはＲＮＡをコードすることを示す。例えば、組換え細胞は、細胞のネイティブ（非組換え）形態では見られない核酸（例えばＲＮＡ）を必要に応じて発現する。
【００３５】
本発明のための「哺乳動物」は、ヒト、家畜、および農場動物、および動物園、スポーツ、またはペット動物（例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ等）を含む、哺乳動物として分類されるあらゆる動物をさす。好ましくは本明細書中における哺乳動物はヒトである。
【００３６】
ＢＡＣＥ２に関して「生物学的活性」という用語は、調節（抑制）が起こるメカニズムとは関係なく、ＢＡＣＥ２分子（ネイティブ配列ＢＡＣＥ２の改変体を含む）の、β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）またはその断片からのβ−アミロイドペプチド（Ａβ）の酵素的産生を調節、好ましくは抑制する能力をさすために使用される。好ましい実施態様では、ＢＡＣＥ２「生物学的活性」は、β−セクレターゼプロセシングによって得られた断片、例えばβ−ＣＴＦ（ＣＴ１００）を含む、ネイティブ配列ＡＰＰまたはその断片からのβ−アミロイド形成を阻害する能力である。別の好ましい実施態様では、ＢＡＣＥ２「生物学的活性」は、ＡＰＰまたはその断片（β−ＣＴＦを含むがこれに限らない）を切断して、さらなる酵素的プロセシングによる全長Ａβペプチドの放出を阻害する能力である。
【００３７】
「ＢＡＣＥ２アゴニスト」または「ＢＡＣＥ２（生物学的）活性のアゴニスト」という用語は、最も広い意味で使用され、そしてネイティブ配列ＢＡＣＥ２の産生を刺激する、ネイティブ配列ＢＡＣＥ２の生物学的活性を増強する、および／またはネイティブ配列ＢＡＣＥ２の生物学的活性を模倣する分子をさす。従って、ＢＡＣＥ２アゴニストは、ネイティブ配列ＢＡＣＥ２ポリペプチドの機能および／または発現、またはネイティブ配列ＢＡＣＥ２ポリペプチドを含む経路を通るシグナルの効率を特異的に変化させ得る。
【００３８】
同様に、「ＢＡＣＥ２アンタゴニスト」または「ＢＡＣＥ２活性のアンタゴニスト」という用語は、最も広い意味で使用され、そしてネイティブ配列ＢＡＣＥ２ポリペプチドの生物学的活性を部分的にまたは完全にブロックする、阻害する、または中和するあらゆる分子を含む。
【００３９】
「β−アミロイドタンパク質」、「アミロイドβタンパク質」、「β−アミロイドペプチド」、「アミロイドβペプチド」、および「Ａβ」という用語は交換可能に使用され、６９５アミノ酸アイソタイプヒトＡＰＰの約３８から約４４アミノ酸、そして好ましくは残基５９７−６４０を含むあらゆるペプチドまたはポリペプチドを含む、ＡＰＰのＮ末端タンパク質分解、続いてカルボキシ末端の短縮によって産生される全てのβ−アミロイドペプチドまたはポリペプチドをさす。これは、制限無しに、２つの主要な改変体、Ａβ１−４０およびＡβ１−４２、ならびにヒトＡＰＰの他のアイソタイプおよびＡＰＰの非ヒト哺乳動物ホモログの対応する領域を含む。この開示の後、おそらく他者が他のβ−アミロイドタンパク質を発見し、それらは全て本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【００４０】
ｐ３ペプチドという用語は、一般的に６９５ＡＰＰアイソフォームの残基６１２および６１３の間で起こるα−セクレターゼ活性、および６９５アミノ酸アイソタイプヒトＡＰＰの残基６３８から６４０の領域におけるＡＰＰの異種γ−セクレターゼ切断の結果できる約２６アミノ酸の部分をさす。
【００４１】
「ＡＰＰセクレターゼ」、「セクレターゼ」、および「セクレターゼ活性」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、ＡＰＰの様々な断片の分泌、または細胞内断片化、および分解を引き起こすあらゆるタンパク質分解酵素および／または活性をさす。これはα−セクレターゼ、β−セクレターゼ、γ−セクレターゼ、およびＡＰＰまたはＡβのタンパク質分解を引き起こす、あらゆる同様のしかし現在同定されていない酵素を含む。
【００４２】
「β−セクレターゼ」および「β−セクレターゼ活性」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、ＡＰＰの６９５アイソタイプの残基５９６および５９７の間（Ｋａｎｇら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ　３２５：７３３−７３６）およびＡＰＰの７５１アイソタイプの残基６５２および６５３の間（Ｐｏｎｔｅら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ　３３１：５２５−５２７）で起こる、ＡＰＰのＮ末端切断部位におけるＡＰＰのタンパク質分解を担う酵素をさす。β−セクレターゼによる２番目の切断が、６９５ＡＰＰアイソフォームの残基６０５および６０６の間で、そして７５１ＡＰＰアイソフォームの残基６６１および６６２の間で起こる（Ｈｉｇａｋｉら（１９９６）Ｎｅｕｒｏｎ　１４：６５１−６５９）。その用語は最も広い意味で使用され、そして単離された、部分的にまたは完全に精製された、組換え産生酵素、β−セクレターゼ酵素を含む細胞または細胞調製物（膜調製物を含む）、およびβ−セクレターゼ酵素を含むあらゆる溶液または混合物を含む。
【００４３】
「ＡＰＰ／β−セクレターゼ混合物」という用語は、本明細書中で使用される場合、２つの物質の複合体および／または混合物としての単離ＡＰＰおよびβ−セクレターゼをさす。
【００４４】
「α−セクレターゼ」および「α−セクレターゼ活性」という用語は、交換可能に使用され、そしてＡＰＰのβ−アミロイドドメインまたはβ−セクレターゼ処理によってできたＡＰＰのＣ末端フラグメント内で切断を産生し得る酵素または複数の酵素をさす。α−セクレターゼ活性による処理は、一般的に６９５ＡＰＰアイソフォームの残基６１２および６１３の間で、またはβ−セクレターゼ処理によってできたＡＰＰのＣ末端フラグメントの残基１６および１７の間で起こる。その用語は最も広い意味で使用され、そして単離された、部分的にまたは完全に精製された、組換え産生酵素、α−セクレターゼ酵素を含む細胞または細胞調製物（膜調製物を含む）、およびα−セクレターゼ酵素を含む任意の溶液または混合物を含む。
【００４５】
「γ−セクレターゼ」および「γ−セクレターゼ活性」という用語は、交換可能に使用され、そしてＡＰＰの膜貫通領域内で切断することによって、β−アミロイドペプチドのＣ末端およびｐ３ペプチドの産生を司る酵素または複数の酵素をさす。その用語は最も広い意味で使用され、そして単離された、部分的にまたは完全に精製された、組換え産生酵素、γ−セクレターゼ酵素を含む細胞または細胞調製物（膜調製物を含む）、およびγ−セクレターゼ酵素を含むあらゆる溶液または混合物を含む。
【００４６】
「アルツハイマー病」（本明細書中で「ＡＤ」と省略される）という用語は、本明細書中で使用される場合、主に海馬および大脳皮質におけるβ−アミロイドタンパク質を含む神経炎性プラークの形成、ならびに学習および記憶両方の障害と関連する状態をさす。本明細書中で使用される場合、「ＡＤ」はＡＤおよびＡＤ型病状の両方を含むことを意味する。
【００４７】
「ＡＤ型病状」という用語は、本明細書中で使用される場合、海馬および大脳皮質におけるβ−アミロイドタンパク質を含む神経炎性プラークの形成を含むがこれに限らないＣＮＳの変化の組み合わせをさす。そのようなＡＤ型病状は、ＡＰＰの異所性発現および／または沈着、ＡＰＰの過剰発現、異所性ＡＰＰ遺伝子産物の発現、およびＡＤに関連する他の現象に関連する疾患を含み得るが、これに限る必要はない。典型的なＡＤ型病状は、ＡＰＰの過剰発現と関連するダウン症候群と関連するＡＤ型病状を含むがこれに限る必要はない。
【００４８】
「アルツハイマー病と関連する現象」という用語は、本明細書中で使用される場合、ＡＤと関連する構造的、分子的、または機能的発生、特に動物モデルにおいて簡単に評価し得る発生をさす。そのような発生は、アミロイド沈着、神経病理学的発展、学習および記憶障害、および他のＡＤに関連する特徴を含むがこれに限らない。
【００４９】
「脳のアミロイドアンギオパチー」（本明細書中でＣＡＡと省略される）という用語は、本明細書中で使用される場合、脳実質の出血を合併し得る脳血管内のアミロイド沈着の形成に関連する状態をさす。ＣＡＡはまた、卒中の危険性の増加、および小脳およびクモ膜下出血の発現と関連する（Ｖｉｎｔｅｒｓ（１９８７）Ｓｔｒｏｋｅ　１８：３１１−３２４；Ｈａａｎら（１９９４）Ｄｅｍｅｎｔｉａ　５：２１０−２１３；Ｉｔｏｈら（１９９３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１１６：１３５−４１４）。ＣＡＡはまた、出血の発生の前に痴呆と関連し得る。ＣＡＡに関連する血管アミロイド沈着は、ＡＤの非存在下で存在し得るが、より頻繁にＡＤと関連する。
【００５０】
「脳のアミロイドアンギオパチーに関連する現象」という用語は、本明細書中で使用される場合、ＣＡＡに関連する分子的、構造的、または機能的事象、特に動物モデルにおいて容易に評価し得る発生をさす。そのような発生は、アミロイド沈着、脳実質の出血、および他のＣＡＡに関連する特徴を含むがこれに限らない。
【００５１】
「β−アミロイド沈着」という用語は、本明細書中で使用される場合、Ａβおよび他の物質からなる脳の沈着をさす。
【００５２】
「非アミロイド形成性」という用語は、β−アミロイドの産生を抑制またはなくす過程をさす。
【００５３】
「抗体」とは、抗原に結合し得る免疫グロブリンタンパク質を意味する。抗体とは、本明細書中で使用された場合、エピトープ、抗原または目的の抗原性断片に結合し得る、抗体全体およびあらゆる抗体フラグメント（例えばＦ（Ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｗ）を含むことを意味する。
【００５４】
本発明の抗体は、ＡＰＰタンパク質の特定のタンパク質溶解産物に免疫反応性または免疫特異的であり、そして従って特異的および選択的に結合する。各タンパク質溶解産物に対する抗体は、好ましくは免疫特異的である、すなわちＡＰＰの他のタンパク質溶解産物と本質的に交差反応しない。「抗体」という用語は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方、および適当な例えばペプチド抗原を用いて産生された、全ての型の抗体を含む。
【００５５】
「精製抗体」とは、それが天然に関連する他のタンパク質、炭水化物、および脂質を十分含まないものを意味する。そのような抗体は、タンパク質溶解ＡＰＰタンパク質産物（またはその抗原性フラグメント）に「選択的に結合する」、すなわち他の抗原性に無関係の分子を本質的に認識および結合しない。本発明の精製抗体は、好ましくは特定のＡＰＰタンパク質産物（例えばβＮＴＦ）に免疫反応性および免疫特異的であり、そしてより好ましくは他のＡＰＰタンパク質産物と反応しない。
【００５６】
ＡＰＰタンパク質溶解産物の「抗原性フラグメント」とは、本発明のアッセイで使用される抗体に結合し得る、そのようなタンパク質の一部分を意味する。
【００５７】
「特異的に結合する」とは、抗体の特異的ポリペプチド、すなわちＡＰＰタンパク質産物のエピトープに対する高い結合活性および／または高アフィニティー結合を意味する。この特異的ポリペプチド上のエピトープに対する抗体結合は、好ましくは同じ抗体のいかなる他のエピトープ、特に目的の特異的ポリペプチドと関連する、または同じサンプル中にある分子に存在し得るものに対する結合よりも強い。例えば他のエピトープよりＡＰＰタンパク質産物に強く結合し、結合条件を調節することによって抗体はほとんどＡＰＰタンパク質産物のみに結合する。目的のポリペプチドに特異的に結合する抗体は、他のポリペプチドと弱いが検出可能なレベル（例えば目的のポリペプチドに対して示す結合の１０％またはそれより低い）で結合し得る。そのような弱い結合、またはバックグラウンド結合は、例えば適当なコントロールを用いることによって、目的のポリペプチド上の化合物に対する特異的抗体結合と容易に識別できる。一般的に、本発明の抗体は、特定のＡＰＰタンパク質産物と、１０７モル／リットルまたはそれより高い、好ましくは１０８モル／リットルまたはそれより高い結合親和性で結合する。一般的に、１０６モル／リットルまたはそれより低い結合親和性を有する抗体は、現在使用されている従来の方法論を用いて検出可能なレベルで抗原に結合せず、有用でない。
【００５８】
「検出可能標識抗体」または「検出可能標識抗−βＮＴＦ」とは、検出可能な標識を結合した抗体（または結合特異性を保持する抗体フラグメント）を意味する。検出可能標識は、通常化学的結合によって結合させるが、標識がポリペプチドである場合、あるいは遺伝工学的技術によって結合させ得る。検出可能標識タンパク質の産生方法は、当該分野で周知である。検出可能標識を、当該分野で公知の様々なそのような標識から選択し得るが、これは普通、放射性同位体、フルオロフォア、常磁性標識、酵素（たとえば西洋ワサビペルオキシダーゼ）、または検出可能なシグナル（例えば放射活性、蛍光、色素）を放出するか、標識のその基質への暴露後に検出可能なシグナルを放出する、他の分子または化合物である。様々な検出可能な標識／基質ペア（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ／ジアミノベンジジン、アビジン／ストレプトアビジン、ルシフェラーゼ／ルシフェリン）、抗体の標識方法、および標識抗体の使用方法が、当該分野で周知である（例えばＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（１９８８）Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹを参照のこと）。
【００５９】
「化合物」という用語は、本明細書中で使用される場合、セクレターゼ活性に影響を及ぼし得るあらゆる分子、例えばタンパク質、天然に存在する物質、合成タンパク質または小分子医薬品を説明する。そのような化合物を、アミロイドに関連する疾患、および特にＡＤ、ＣＡＡおよびプリオン媒介性障害に関連する分子的および臨床的現象を治療するために使用し得る。
【００６０】
「有効な投与量」、「有効な量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ａｍｏｕｎｔ）」および「有効な量（ａｍｏｕｎｔ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」という用語は、交換可能に使用され、そして望ましい生理学的および／または心理学的変化を提供するのに十分な化合物の投与をさす。これは、患者、疾患および治療によって変化する。投与量は、治療的投与量、この場合被験体におけるアミロイドプラークレベルを十分に変化させて、障害または状態の症状を緩和または改善する、または予防的投与量、これはアミロイドプラークの望ましくないレベルまでの蓄積を予防するのに十分である、のいずれかであり得る。「治療」、「治療する」等という用語は、本明細書中で、一般的に望ましい薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味するために使用される。その効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防するという観点で予防的であり得、および／または疾患および／または疾患による副作用を部分的にまたは完全に治療するという観点で治療的であり得る。本明細書中で使用される「治療」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患のあらゆる治療を含み、以下のものを含む：
（ａ）その疾患に罹患しやすいかもしれないが、まだそれを有していると診断されていない被験体で疾患が起こるのを防ぐ；
（ｂ）疾患を阻害する、すなわちその発展を停止する；または
（ｃ）疾患を軽減する、すなわち、疾患の退縮を引き起こす。
本発明のアッセイを用いて同定し得る治療的薬剤は、ＡＤ、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血、およびプリオン媒介性障害等を含む、β−アミロイドの蓄積に関連するあらゆる疾患の治療に特に有用である。
【００６１】
「調節」、「変化」という用語およびその文法的変形は、本発明の方法に関して使用された場合、β−セクレターゼ活性の阻害または増強のような、あらゆるそして全ての修飾を含む。
【００６２】
（ＩＩ．好ましい実施態様の説明）
（１．ＢＡＣＥ２またはＢＡＣＥ２活性の刺激剤によるβ−アミロイド産生の阻害）
１つの局面では、本発明は、ＡＰＰを有効な量のＢＡＣＥ２またはＢＡＣＥ２活性の刺激剤で処理することによって、ＡＰＰまたはβ−セクレターゼ産物またはＡＰＰの産物からのβ−アミロイドの形成を阻害する方法に関連する。この方法において、ＢＡＣＥ２は、天然のヒトまたは非ヒト哺乳動物ＢＡＣＥ２ポリペプチドの全てのアイソフォームおよび対立遺伝子異型を含む、公知のまたは下に同定される任意の天然ＢＡＣＥ２ポリペプチド、ならびに上に定義されたその生物学的に活性な任意の改変体であり得る。処理をインビトロまたはインビボで実施し得る。ＢＡＣＥ２活性の刺激剤は、下に記載されるように同定し得る。
【００６３】
処理をインビボで行う場合、その目的は中枢神経系におけるβ−アミロイドの沈着によって特徴付けられる神経性疾患の治療（予防を含む）である。そのような疾患は、制限なしに、アルツハイマー病（ＡＤ）および、ダウン症候群に関連する病状、およびアルツハイマー病と関連するかまたはその非存在下で存在するかいずれにせよ、脳のアミロイドアンギオパチーを含むがこれに限らない、ＡＤ型病状を含む。
【００６４】
一般的に、ＢＡＣＥ２または下に記載されるアッセイで同定された化合物は、ヒトを含む哺乳動物宿主の脳組織においてβ−アミロイドプラークのレベルを抑制する。一般的に、ＢＡＣＥ２の能力を増強してＡＰＰの非アミロイド形成性切断を促進する化合物は、Ａβ産生のＢＡＣＥ２媒介性抑制のインビボレベルを増強することによって、脳組織のβ−アミロイドプラークのレベルを抑制する。治療的効果は、例えばＢＡＣＥ２タンパク質の発現レベルを増加させる、またはＢＡＣＥ２媒介性ＡＰＰまたはＡＰＰフラグメントの非アミロイド形成性α−セクレターゼ様処理を増強または活性化して、Ａβ産生の抑制を引き起こす化合物によって見られ得る。アルツハイマー病（ＡＤ）、ＡＤ型病状および／または脳のアミロイドアンギオパチーを発現するリスクのある個人、例えば老人および／またはＡＤに関連する公知の突然変異を有する個人に関して、予防的使用も意図される。
【００６５】
インビボの治療方法では、ＢＡＣＥ２または本発明の他の化合物を、望ましい標的タンパク質活性の調節を引き起こし得る任意の便利な手段を用いて、宿主に投与し得る。従って、化合物を治療的投与のために様々な処方に組み込み得る。より具体的には、本発明の化合物を、適当な薬剤学的に許容できるキャリア（担体）または希釈剤と組み合せて医薬品組成物へ処方し得、そして錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、経皮パッチ、坐剤、注射、吸入剤、およびエアロゾルのような、固体、半固体、液体または気体形式の調製物へ処方し得る。
【００６６】
そうであるので、化合物の投与を、経口、バッカル、直腸内、非経口、腹腔内、膣内、皮内、経皮、気管内、等の投与を含む様々な方法で達成し得る。
【００６７】
医薬品投与量形式で、化合物をその薬剤学的に許容できる塩の形式で投与し得る、またはそれらを単独で、または他の薬剤学的に活性な化合物と適当に結合して、および組み合せても使用し得る。以下の方法および賦形剤は単に例であり、そして決して制限しない。
【００６８】
経口調製物のために、化合物を単独でまたは適当な添加剤と組み合せて使用して、錠剤、粉末、顆粒またはカプセルを作成し得る。添加剤の例は、ラクトース、マンニトール、コーンスターチまたはジャガイモデンプンのような従来の添加剤；結晶性セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチンのような結合剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプンまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムのような崩壊剤；タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；そしてもし望ましいなら、希釈剤、緩衝化剤、湿潤剤、保存剤および香料である、
本発明の化合物を、植物油または他の同様の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステルまたはプロピレングリコールのような、水性または非水性溶媒に溶解、懸濁、または乳化することによって、注射のための調製物に処方し得る。もし望ましいなら、可溶化剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、および保存料のような従来の添加剤も加え得る。処方中の治療的に活性な化合物の濃度は、約０．５−１００ｗｔ％まで多様であり得る。
【００６９】
化合物を、吸入によって投与するために、エアロゾル処方で利用し得る。本発明の化合物を、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等のような、加圧された許容できる高圧ガスへ処方し得る。
【００７０】
さらに、化合物を、乳化基材または水溶性基材のような様々な基材と混合することによって、坐剤を作成し得る。本発明の化合物を坐剤によって直腸内に投与し得る。坐剤は、体温で溶解するが室温で固体化する、ココアバター、カーボワックス（登録商標）、およびポリエチレングリコールのような媒体を含み得る。
【００７１】
シロップ、エリキシル、および懸濁液のような、経口または直腸内投与のための単位投与量形式を提供し得る、ここで各投与量単位（例えばティースプーン一杯、テーブルスプーン一杯、錠剤、または坐剤）は、前もって決めた量の、１つまたはそれ以上のインヒビターを含む組成物を含む。同様に、注射または静脈内投与のために単位投与量形式は、滅菌水、正常生理食塩水、または他の薬剤学的に許容できるキャリア中の溶液として、組成物中にインヒビターを含み得る。
【００７２】
媒体、アジュバント、キャリアまたは希釈剤のような薬剤学的に許容できる賦形剤は、容易に公共で入手可能である。さらに、ｐＨ調節および緩衝化剤、緊張度モジュレーター、安定化剤、湿潤剤等のような薬剤学的に許容できる補助的物質は、容易に公共で入手可能である。
【００７３】
化合物を、生理学的に許容できるキャリア中で、０．５から２０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量のために、５ｍｇから１４００ｍｇ、より通常には１００ｍｇから１０００ｍｇ、好ましくは５００ｍｇから７００ｍｇの投与量で宿主に投与する。ＢＡＣＥ２活性を変化させる（調節する、例えば増強または阻害）化合物の投与量は、ＢＡＣＥ２活性が１０から８０％、より好ましくは２０から７０％、そしてさらにより好ましくは２５−５０％変化するように選択される。
【００７４】
（２．スクリーニングアッセイ）
別の局面では、本発明は、Ａβ産生の調節（例えば抑制）を引き起こす、ＢＡＣＥ２のＡＰＰアミロイド形成性処理を阻害する能力のモジュレーター（刺激剤およびインヒビターを含む）を同定するスクリーニングアッセイを提供する。ＢＡＣＥ２、ＡＰＰおよび処理セクレターゼ（これらのいずれかまたは全ては単離、固定化、または細胞結合形式で、または膜−酵素混合物の形式で存在し得る）を候補化合物、または複数の候補化合物と接触させて、そしてＢＡＣＥ２媒介性Ａβ産生の抑制を変化させる、好ましくは増強する候補を選択する。ＢＡＣＥ２活性に対する候補化合物の効果は、好ましくは産生されたＡβの量を変化させる（例えば抑制する）能力をモニターすることによって検出されるが、α、β、またはγ−セクレターゼ切断部位におけるＡＰＰまたはＡＰＰフラグメント切断の情報が同様に適当である。細胞膜−酵素調製物を用いて行うアッセイを含む、細胞を含まない、および細胞に基づいたアッセイはいずれも、特に本発明の範囲内である。
【００７５】
ＢＡＣＥ２の発現または能力を有意に増強して、α−セクレターゼ切断部位またはその周辺でのＡＰＰ切断を促進する候補化合物が好ましい。そのような化合物は、好ましくはＢＡＣＥ２の発現または能力を増強して、産生されるＡβの量、またはα−セクレターゼ媒介性のＡＰＰの切断を示す他のあらゆる情報を、少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％、そして多くの場合少なくとも約９５％抑制する。同定した化合物を、ＡＤ、ＡＤ型病状、脳のアミロイドアンギオパチー、または脳のようなＣＮＳにおけるβ−アミロイド沈着（プラーク）形成に関連するあらゆる他の病状を発現するリスクのある、またはそうと診断された患者、特にヒトの治療に使用し得る。
【００７６】
１つの特定の実施態様では、そのアッセイは、ＡＰＰまたはβ−セクレターゼ処理のＡＰＰフラグメントまたはＡＰＰ／ＢＡＣＥ２のＣ末端１００残基を、個々の成分として、または混合物または複合体として、試験化合物と接触させて、そしてその後ＡＰＰタンパク質溶解の可溶性産物、特にＡβおよび／またはβ−ＮＴＦおよび／またはｐ３および／またはα−ＣＴＦのレベルを検出することを含む。膜調製物を使用するアッセイを含む、細胞に基づくアッセイでは、細胞膜（細胞溶解によって得る）をさらに、ＡＰＰタンパク質溶解の細胞関連産物、すなわちＣＴＦ（α−ＣＴＦおよび／またはβ−ＣＴＦ）に関してアッセイし得る。化合物に接触させたＡＰＰおよびＢＡＣＥ２を、両方ともＡＰＰおよびＢＡＣＥ２を両方発現する細胞から得た細胞膜から単離し得る、またはＡＰＰまたはβ−セクレターゼのいずれかを発現する細胞から単離し、そして次いで一緒に合わせ得る。あるいは、ＡＰＰおよび／またはＢＡＣＥ２を、伝統的な化学的合成および／または組換えＤＮＡ技術によって、部分的にまたは完全に合成し得る。
【００７７】
特別な実施態様では、ＡＰＰまたはβ−セクレターゼ処理のＡＰＰフラグメントまたはＡＰＰおよび／またはＢＡＣＥ２のＣ末端１００残基を組換え的に発現するように作った細胞を使用し得る。例えば、ＢＡＣＥ２／ＡＰＰを過剰発現する細胞と試験化合物のインキュベーション後、上清をＡＰＰタンパク質溶解の可溶性産物、すなわちＡβおよび／またはβ−ＮＴＦおよび／またはｐ３のレベルに関してアッセイし、一方細胞溶解によって得た細胞膜を、ＡＰＰタンパク質溶解の細胞関連産物、すなわちＣＴＦ（α−ＣＴＦまたはβ−ＣＴＦ）に関してアッセイする。ＡＰＰタンパク質溶解産物の検出を、試験サンプル中で異なって（示差的に）発現されるポリペプチドの非存在または存在または変化した量を決定する多くの方法のいずれかを用いて達成し得る。一般的に、本発明の異なって発現したポリペプチドに特異的に結合する抗体をサンプルに加え、そしてエピトープに結合するのに十分な時間、通常少なくとも約３０分間インキュベートする。抗体を、直接検出のために検出可能に標識し得る（例えば放射性同位体、酵素、蛍光剤、化学発光剤等を用いて）、または結合を検出する２次抗体または試薬と組み合わせて使用し得る（例えばビオチンと西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アビジン、蛍光化合物、例えばフルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド等と結合した２次抗体）。異なって発現したポリペプチドのレベルまたは量を定性的にまたは定量的に検出する、あらゆる適当な代替方法、例えばウェスタンブロット、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ等を使用し得る。好ましい実施態様では、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、ＡＰＰタンパク質溶解産物、Ａβ、ｐ３、β−ＮＴＦ、およびＣＴＦの存在を検出する。分光測光または比色定量検出による迅速な定量のために、ＥＬＩＳＡ形式におけるアッセイを実行することによって、複数のサンプルの定量をより時間効率的にし得る。
【００７８】
ＢＡＣＥ２／ＡＰＰまたはβ−セクレターゼ処理ＡＰＰフラグメントまたはＡＰＰのＣ末端１００残基を過剰発現する細胞を、様々な可能性のある化合物に異なる濃度でおよび／または異なる時間曝露して、９６穴組織培養プレート中で増殖させ得、そして細胞から放出されたＡＰＰタンパク質溶解産物、すなわちＡβ、ｐ３および／またはβ−ＮＴＦをＥＬＩＳＡによって推定するために、培養上清のアリコートを取る。細胞結合結合ＡＰＰタンパク質溶解産物（ＣＴＦ、すなわちα−ＣＴＦまたはβ−ＣＴＦ）を、細胞を洗浄し、細胞を弱い界面活性剤で溶解し、全ての細胞質内容物を洗浄して除去し、そして同じプレートでＥＬＩＳＡを行うことによって膜結合ＣＴＦの量を推定することによって、簡便に推定し得る。もし化合物が、例えば以前に公知のスタンダードと比較して、Ａβのレベルを抑制し、そしてＣＴＦ（α−ＣＴＦおよび／またはβ−ＣＴＦ）産物のレベルを増加させたら、その化合物はアミロイド関連疾患を有する患者の治療の候補である。
【００７９】
好ましい実施態様では、本発明は、膜−酵素混合物を用いて、α−セクレターゼ様切断を促進することによって、ＢＡＣＥ２媒介性Ａβの抑制に影響を与える（好ましくは増強する）化合物を同定するアッセイ方法論を提供する。細胞膜を使用するアッセイでは、膜をアッセイで使用する前に、ＡＰＰタンパク質溶解産物のバックグラウンドレベルを除去し得る。ＡＰＰを発現する細胞の公知の細胞培養におけるＡＰＰタンパク質溶解産物のレベルを正確に決定することによって、この工程を省略し得る。その後、公知のレベルをアッセイにおいて調節し得る、すなわち、公知のバックグラウンドレベルと比較した増加または減少を、公知のバックグラウンドレベルを引くことによって決定し得る。この方法でアッセイを実施するために、もちろん統計学的に有意な数の、公知のＡＰＰレベルを発現する組換え細胞から細胞膜を得て、そしてその後これらの細胞膜に存在するＡＰＰタンパク質溶解産物のバックグラウンドレベルを決定することが必要である。
【００８０】
アッセイをＢＡＣＥ１および／または他のβ−セクレターゼの存在または非存在下で実施し得る。
【００８１】
好ましい実施態様では、本発明は、ＡＰＰのα−セクレターゼ部位を含む残基にまたがる合成基質を用いて、α−セクレターゼ様の切断を促進することによって、ＢＡＣＥ２媒介性Ａβの抑制に影響を与える（好ましくは増強する）化合物を同定するアッセイ方法論を提供する。そのような基質は、例えば合成ペプチドまたは蛍光発生的な合成基質を含み得る。そのようなアッセイの情報は、より小さいペプチドフラグメントの産生、または切断された蛍光標識基質の蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）によるものを含む。
【００８２】
（３．トランスジェニック動物モデル）
ＢＡＣＥ２媒介性Ａβ産生の抑制を増強または刺激することが発見された化合物を、トランスジェニック哺乳動物でさらにアッセイし得る。トランスジェニック動物モデルは当該分野で周知であり、そして例えばＭｏｒａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９２：５３４１−５３４５（１９９５）；Ｇａｍｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ　３７３：５２３−５２７（１９９５）；Ｈａｉｓｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７４：９９−１０２（１９９６）、および米国特許第５，３８７，７４２号および第５，９１２，４１０号において記載されている。これらの開示全体は、これによって明白に参考文献に組み込まれる。簡単には、引用された特許で開示された方法によって、アルツハイマー病の病因に関係する、クローニングした組換え体または合成のＤＮＡ配列を、哺乳動物受精卵（好ましくはマウス卵）へ注入する。注入した卵を、偽妊娠メスに移植し、そして分娩日まで成長させ、細胞がアルツハイマー病の病因に関係するタンパク質を発現するトランスジェニックマウスを提供する。トランスジェニック哺乳動物の特定の組織で望ましいタンパク質が発現するように（神経組織で最も著しく）、注入配列が、結合したプロモーター配列を有するように構築する。好ましくは普遍的に発現するタンパク質は、（１）β−アミロイドコア前駆体タンパク質；（２）β−アミロイド関連前駆体タンパク質；および（３）セリンプロテアーゼインヒビターを含む。トランスジェニックマウスは、試験化合物を、アルツハイマー病および関連する状態の治療における有用性に関して研究するために有用なモデルを提供する。
【００８３】
（４．本発明の化合物）
本発明の化合物は、公知の機能を有する本明細書中で記載された化合物を含むがこれに限らない、多くの化学的種類を包含する。ＢＡＣＥ２媒介性Ａβ産生の抑制または阻害を増強または活性化するのに有効な化合物を採用する新規方法を提供する。
【００８４】
候補化合物を、合成または天然化合物のライブラリーを含む、広く様々な種類の供給源から得ることができる。例えば、無作為なオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、広く様々な有機化合物および生物分子を無作為および管理合成する多くの手段が利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形式の天然化合物のライブラリーが入手可能または容易に産生される。さらに、天然または合成的に産生されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的手段で容易に修飾され、そしてコンビナトリアルライブラリーを産生するのに使用し得る。公知の医薬品化合物に、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等のような管理または無作為化学的修飾を行い、構造的アナログを産生し得る。
【００８５】
本発明の方法で使用する化合物は、５０より大きく約２，５００ダルトンより小さい分子量を有する小有機分子であり得る。候補化合物は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、そして典型的には少なくともアミノ基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つの化学官能基を含む。候補化合物は多くの場合、１つまたはそれ以上の上記の官能基で置換された、環状炭素またはヘテロ環構造および／または芳香族またはポリ芳香族（ｐｏｌｙａｒｏｍａｔｉｃ）構造を有する。候補化合物はまた、ペプチド、サッカライド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的アナログまたはその組み合わせを含むがこれに限らない生物分子中に見出される。
【００８６】
本発明のさらなる詳細を、以下の制限しない実施例で説明する。
【００８７】
（実施例）
以下の実施例は、当業者に本発明の作成および使用方法の完全な開示および説明を提供するために記述しており、そしてこれは、発明者がその発明と考えるものの範囲を制限することを意図せず、下記の実験が全てのまたは唯一の実施された実験であると述べることを意図しない。使用される数字（例えば量、温度等）に関して正確さを保証するために努力がなされたが、いくらかの実験誤差およびずれが説明される。他に示さなければ、割合は重量による割合、分子量は重量平均分子量、温度は摂氏、そして気圧は環境またはその付近である。
【００８８】
（実施例１　ＢＡＣＥ２アッセイで使用される材料および方法）
（１．ＢＡＣＥおよびＢＡＣＥ２のクローニングおよび同時発現）
ＰＣＴ公開ＷＯ９９／３４００４−Ａ２からの配列情報を用いたＴａｑポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ＢＡＣＥ２をヒト脳ｃＤＮＡから増幅した。増幅ＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ　ＴＡクローニング技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏ．、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。制限酵素消化の後、ＢＡＣＥ２　ＤＮＡフラグメントを、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）のＮｏｔＩおよびＢａｍＨ　Ｉ部位にサブクローニングした。制限酵素消化パターンおよび配列データによって、ｐＣＤＮＡ３．１（−）／ＢＡＣＥ２における挿入の存在および方向を確認した。Ｖａｓｓａｒら（１９９９）同書、から入手可能な配列情報を用いて、ヒト脳ｃＤＮＡからＢＡＣＥを同様にクローニングして、哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（−）／ＢＡＣＥを産生した。
【００８９】
ＢＡＣＥおよびＢＡＣＥ２　ｃＤＮＡを含む発現ベクターを、ＡＰＰ７５１ｓｗまたはＣＴ１００の存在下でＨＥＫ２９３Ｔ細胞へトランスフェクトした（Ｓｈｏｊｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５８：１２６−１２９（１９９２）；Ｌｉｃｈｔｅｎｔｈａｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９６：３０５３−３０５８（１９９９））。リポフェクタミンプラス（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を用いて２４穴プレートでトランスフェクションを行い、そしてＤＮＡ濃度を、非特異的ＤＮＡを含むことによって一定に保った。発現プラスミドを、ウェスタンブロッティングによってＢＡＣＥおよびＢＡＣＥ２発現に関して試験した。細胞培養上清をトランスフェクションの４８時間および７２時間後に回収し、そしてα−ＮＴＦ、　−ＮＴＦおよびＡβの形成に関してアッセイした。−ＮＴＦ測定を下記で記載するように行った。α−ＮＴＦをβ−ＮＴＦと同様に捕捉したが、ビオチン化２Ｈ３を用いて検出した（Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９４：１５５０−１５５５（１９９７））。Ａβレベルを、捕捉のためにモノクローナル抗体２６６を、そして検出のためにビオチン化３Ｄ６を用いてＥＬＩＳＡによって決定した（抗体エピトープの説明はＪｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄら（１９９７）同書を参照のこと）。対照的に、Ａβ４２を、２１Ｆ１２を用いて捕捉し、そしてビオチン化３Ｄ６を用いて検出した。トランスフェクションの７２時間後に調製した細胞抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ）によって分離し、そしてＡＰＰおよびＣＴＦに関してＣＴ６９５（Ｚｙｍｅｄ）によって、およびＡβ特異的モノクローナル抗体Ｗ０２（Ｋ．Ｂｅｙｒｅｕｔｈｅｒの厚意によって提供された；Ｉｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２９０８−２２９１４（１９９６））でプローブ化した。あるいは、ＡＰＰ７５１ｓｗおよびＢＡＣＥまたはＢＡＣＥ２を用いた同時発現実験を、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な、ヒト神経芽腫細胞系統、ＳＫ−Ｎ−ＭＣで行った。
【００９０】
（２．膜調製物）
両方とも膜貫通型タンパク質として発現するので、膜の調製は、β−セクレターゼ（ＢＡＣＥまたはＢＡＣＥ２）および基質（ＡＰＰ）の単離および精製または濃縮の最初の工程である。膜調製物を、「スウェーデン」ＡＤ突然変異（２９３／７５１ｓｗ）を有するＡＰＰの７５１形式を発現する、ヒト胎児腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３）から産生した。しかし、下記で記載するプロトコールを、わずかな修飾のみであらゆる細胞型のために使用し得る。細胞を、調製のために使用するまで、細胞ペレットとして−８０℃で保存した。
【００９１】
約７０−１００グラムの細胞（湿重量）を、膜抽出物から５０−１００ｍｌの酵素基質複合体／混合物を産生するために日常的に使用した。細胞を解凍し、そして全容量１２−１５×ｖｏｌ／ｇ湿重量のＴＥ／１Ｘプロテアーゼインヒビターカクテル（ＰＩＣ）緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ／５ｍＭのＥＤＴＡ　ｐＨ８．５（ＴＥ））と１×ＰＩＣ（１×ＰＩＣ：１０μＭのロイペプチン、１μＭのアプロチニン、および１μＭのペプスタチン、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に、異なる反復で再懸濁した。最初、ペレットを約６−９×ｖｏｌ／ｇ湿重量に再懸濁し、そしてｔｉｓｓｕｍｉｚｅｒ（ＩＫＡ　Ｌａｂｏｔｅｃｈｎｉｋ、Ｓｔａｕｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、中程度のセッティングで３回、１分間、氷上で間欠的に冷却してホモジナイズした。ホモジネートを次いで異なる５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブへ分配し、そして卓上遠心機（Ｓｏｒｖａｌｌ）で、４℃、１５００ｒｐｍで１０分間遠心した。遠心後、ＰＮＳ（ｐｏｓｔ−ｎｕｃｌｅａｒ上清）に対応する上清を注意深く除去し、そして新しいチューブへプールした。比較的ゆるいペレットをかき乱すのを避けるために、約１０ｍｌの物質を、未破壊の細胞および核を含むペレットを含む各チューブに残した。ペレットおよび残った上清をプールし、そしてホモジネーション緩衝液の残りで再懸濁した。次いで懸濁液を、ｔｉｓｓｕｍｉｚｅｒを用いてもう１度ホモジナイズし、続いて上記で記載したように遠心し、そして上清を回収した。得られたＰＮＳを前に保存しておいた物質とあわせてプールした。必要な場合は、さらなるホモジネーションを含んで、または前に遠心した物質をもう一度回転させて、全ての上清を効率的に回収した。次いでプールしたＰＮＳをＴｉ４５ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）中で、４℃で３０−４０分間、２８，０００ｒｐｍ（約６５，０００×ｇ）で遠心することによって、膜をペレットとして回収した。
【００９２】
上記で調製した膜調製物を、弱い界面活性剤で処理して、バックグラウンドＡＰＰタンパク質溶解産物を、好ましくは検出できないレベルまで抑制した。膜ペレットを、全部で１２×ｖｏｌ／ｇ湿重量のＴＥ／１×ＰＩＣ中で、最終濃度０．０２％のサポニン（蒸留水で作成した０．５％サポニンストック溶液から加えた）の存在下で、連続的に再懸濁した。ペレットを氷上で、Ｋｏｎｔｅｓガラス組織ホモジナイザーで、きつい乳棒（０．０１３−０．１４ｍｍのクリアランス）で、１３−１８ストロークでホモジナイズした。弱い界面活性剤サポニンによる処理は、膜を透過性にし、そして従って、可溶性タンパク質を放出する。特に、これは好ましくは、β−ＮＴＦのようなあらゆるバックグラウンドＡＰＰタンパク質溶解産物を、検出できないレベルまで抑制する。氷上で膜をホモジナイズした後、懸濁液をＴｉ４５ローター中２８，０００ｒｐｍ（約６５，０００×ｇ）で３０−４０分間遠心分離する。−ＮＴＦを含むサポニン抽出物を、Ｑ−ＨＰカラムでさらに精製するまで−８０℃で保存し（下記で記載する膜抽出物と同様に）、そして得られた−ＮＴＦを含む画分をアリコートに分けてそしてＥＬＩＳＡにおけるスタンダードとして使用するために−８０℃で保存した。サポニン抽出後のペレットを、ＴＥ／１×ＰＩＣ、０．０２％サポニンに再懸濁し、そして記載されたように処理し、そしてこの工程を、膜を全体で１２×ｖｏｌ／ｇ細胞ペーストで洗浄するまで繰り返した。
【００９３】
サポニン抽出の後、最終膜ペレット（Ｐ２ペレット）を、さらに使用するまで−８０℃で日常的に凍結した。必要な時に、凍結Ｐ２ペレットを解凍し、そしてＴＥ／１×ＰＩＣに再懸濁した。ＴｒｉｔｏｎＸ１００−Ｒを、最終濃度０．３％まで加え、そして懸濁液を、きつい乳棒（０．０１３−０．１４ｍｍのクリアランス）を有するＫｏｎｔｅｓガラス組織ホモジナイザーで、少なくとも１２回氷上でホモジナイズした。物質をよく懸濁した後、溶液を３２，０００ｒｐｍ（約１００，０００×ｇ）で、４℃で４５−６０分間遠心した。可溶化膜上清を回収し、そしてペレットを廃棄した。可溶化ＴｒｉｔｏｎＸ１００抽出物を次いで０．４５μｍのボトルトップフィルターを通して濾過し、不溶性の物質を除去し（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　Ｓｃｈｉｌｌ）、そして２５ｍｌのＱ−ＨＰセファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｔａｎｆｏｒｄ、ＣＴ）で、以下の方式で部分的に精製した。
【００９４】
上記工程からの界面活性剤処理膜調製物を、Ｑ−ＨＰセファロースクロマトグラフィーカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｔａｎｆｏｒｄ、ＣＴ）を用いて部分的に精製した。Ｑ−ＨＰカラムを５−１０カラム容量（ＣＶ）の平衡化緩衝液（２０ｍＭのトリス／ＥＤＴＡ　ｐＨ８．５、０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ１００−Ｒ）で平衡化し、そして抽出物を５ｍｌ／分で負荷した。次いでカラムを５ＣＶの平衡化緩衝液で洗浄し、非特異的に結合したタンパク質を除去した。ＡＰＰおよび　−セクレターゼを含むタンパク質を、５ＣＶかけて平衡化緩衝液（ＴＥ、０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ１００−Ｒ）中０−１ＭのＮａＣｌの直線的勾配でカラムから溶出し、そして−８ｍｌの画分を回収した。流す前に１×ＰＩＣを回収チューブに加えた。
【００９５】
各サンプルの全タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質テスト（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて決定し、そして洗浄液および溶出液に関してタンパク質プロファイルも決定した。あるいは、タンパク質を、ＵＶモニターでフォローした。ウェスタンブロット分析のために、サンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに流し、そしてＡＰＰのＣ末端を認識する抗体であるｐＡｂ３６９でブロットした（Ｇｏｕｒａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９７：１２０２−１２０５（２０００））。ＡＦ−２０シリーズの抗体または等価物を使用して、洗浄液のサポニン抽出物もブロットし、βＮＴＦを分析した。βＮＴＦ特異的抗体を、ＡＰＰのβ−セクレターゼ切断によって産生されたネオエピトープ（ｎｅｏｅｐｉｔｏｐｅ）に対して産生した。抗体を、合成ペプチド、スウェーデンアイソフォームの場合にはＩＳＥＶＮＬ、またはｗｔ基質の場合にはＩＳＥＶＫＭに対して産生した。ペプチドを、ペプチドのＮ末端システインによってタンパク質キャリアに結合させ、そして標準的な手順によってウサギを免疫するのに使用した。できた抗血清を、ペプチド免疫原を用いてアフィニティー精製した。
【００９６】
次いで個々の画分を、ＥＬＩＳＡを用いてＡＰＰの存在に関して、および下記で記載するような天然基質アッセイを用いて−セクレターゼの存在に関してアッセイした。ＡＰＰおよび−セクレターゼを含む画分をＡＰＰ／β−セクレターゼ複合体／混合物としてプールし、アリコートにして、そして将来使用するために−８０℃で保存した。
【００９７】
（３．ＡＰＰ基質の部分的精製）
内因性　−セクレターゼ活性が欠けているＡＰＰ７５１ｓｗまたはＡＰＰ７５１ｗｔ基質を得るための部分的精製アプローチを下記に示す。ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販で入手可能）中にＡＰＰ７５１ｓｗ　ｃＤＮＡまたはＡＰＰ７５１ｗｔ　ｃＤＮＡを含む発現ベクターを、標準的な手順によってＨＥＫ２９３細胞へ一過性にトランスフェクトした。ＡＰＰ７５１ｓｗの一過性トランスフェクションは、有意に高い基質対酵素比を得ることができたので、分離を改善した。細胞をローラーボトル中で、製造会社によって推奨されるトランスフェクション方法によって、ＦｕＧｅｎｅ６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いてトランスフェクトした。細胞を回収し、そして約５〜１０グラムの細胞ペーストの同等物を、上記で記載したプロトコールを用いて界面活性剤抽出に供した。上記で記載したように、１ｍｌのＱ−ＨＰセファロースカラムで分離した界面活性剤抽出物は、　−セクレターゼおよびＡＰＰ７５１ｓｗを両方含む。次いでＡＰＰ７５１ｓｗを含む画分をプールし、そのプールを平衡化緩衝液（２０ｍＭのトリス／ＥＤＴＡ　ｐＨ８．５、０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ　１００−Ｒ）で約８〜１０倍に希釈し、前のクロマトグラフィー工程からの塩を少なくした。次いでその物質を平衡化したＭｏｎｏＱカラムに充填した。非特異的に結合したタンパク質を１０ＣＶの平衡化緩衝液で洗浄し、そしてタンパク質を平衡化緩衝液中０〜１ＭのＮａＣｌの直線的勾配で、１５ＣＶで溶出した。再度、画分を前に記載したようにＡＰＰ７５１ｓｗの存在に関して分析した。　−セクレターゼ活性を、外来性に加えたＡＰＰ７５１ｓｗ基質と共にアッセイした。そうでなければ　−セクレターゼはＡＰＰ７５１ｓｗ基質が非常に限られた画分中では検出できないので、これは必要であった。ｍｏｎｏＱ工程はＡＰＰ７５１ｓｗ基質の、内因性　−セクレターゼの大部分からの分離を可能にした。この手順に基づいて、本発明者らは慣用的にＡＰＰ７５１ｓｗを約４〜６μｇ／ｍｌの濃度で得、そして基質を反応混合物に加える必要があるときには、　−セクレターゼ活性を決定するために１反応あたり約３〜８μｌを使用する。このカラムからの、基質を欠く　−セクレターゼ活性も、さらなる実験のためにプールした。
【００９８】
ＡＰＰのＣ末端１００アミノ酸も、ＢＡＣＥ２活性の基質として調製し得る。この断片は、精製を促進するためにＣ末端にエピトープタグを有して、細菌中でう好首尾に発現された（Ｈｉｇａｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３１８８５−３１８９３（１９９６））。
【００９９】
（４．ＢＡＣＥ２　Ａｓｐ変異の産生）
単一Ｄ１１０Ａ　ＢＡＣＥ２変異を、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位指向型変異誘発キットを用いて、親ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）／ＢＡＣＥ２中で産生した。変化を導入するために以下のプライマーを用い、そして変異を続いてＤＮＡ配列決定によって確認した。
５’−ＧＣＴＡＣＡＧＡＴＴＣＴＣＧＴＴＧＣＣＡＣＴＧＧＡＡＧＣＡＧＴＡＡＣＴＴＴＧ−３’（配列番号３）
５’−ＣＡＡＡＧＴＴＡＣＴＧＣＴＴＣＣＡＧＴＧＧＣＡＡＣＧＡＧＡＡＴＣＴＧＴＡＧＣ−３’（配列番号４）
（５．ＢＡＣＥおよびＢＡＣＥ２特異的抗体の調製）
ＢＡＣＥおよびＢＡＣＥ２に特異的なポリクローナル抗血清を、ＢＡＣＥのＣ末端ペプチド（ＣＬＲＱＱＨＤＤＦＡＤＤＩＳＬＬ、配列番号５）およびＢＡＣＥ２のＣ末端ペプチド（ＣＱＲＲＰＲＤＰＥＶＶＮＤＥＳＳ、配列番号６）に対してウサギで産生した。ペプチドをＫＨＬに結合し、そして抗体を標準的な手順によって産生した（Ｓｉｇｍａ　Ｇｅｎｏｓｙｓ）。
【０１００】
（６．パルス標識および免疫沈降）
トランスフェクションの４８時間後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２００μＣｉのＰｒｏｍｉｘ　Ｌ［３５Ｓ］インビトロ細胞標識ミックス（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で１５分間標識し、そして標準的な手順によって９０分まで追跡した。ＡＰＰ　ＣＴＦを、抗体３６９（Ｃａｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５９：５１４−５１６（１９９３））で免疫沈降した。馴化培地からのＡβおよびｐ３の免疫沈降に関しては、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの４８時間後、３００μＣｉのＰｒｏｍｉｘ　Ｌ［３５Ｓ］インビトロ細胞標識ミックス（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で５時間標識した。Ａβ４０およびＡβ４２および対応するｐ３種を、モノクローナル抗体１７０２．１および１０８．１でそれぞれ免疫沈降した（Ｈｉｇａｋｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２：３８８９−３８９８（１９９９））。　【０１０１】
（７．　−セクレターゼ活性のアッセイおよびＥＬＩＳＡによるβＮＴＦおよびＡＰＰの評価）
β−セクレターゼアッセイは、２つの異なる部分、　−ＮＴＦを産生するインキュベーションまたは反応期および　−セクレターゼによって産生された　−ＮＴＦを捕捉および測定するＥＬＩＳＡ部分からなる。β−セクレターゼＥＬＩＳＡを以下のように行った。平底９６穴プレート（高タンパク質結合、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）の各ウェルを、１００μｌのモノクローナル捕捉抗体８Ｅ５（約８〜１０μｇ／ｍｌで）でコーティングした（Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９４：１５５０−１５５５（１９９７））。次いでプレートをパラフィルムで覆い、そして４℃で一晩、あるいは３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、あらゆる過剰な液体を除去し、ウェルを吸い取って乾かし、そしてウェルあたり１５０μｌのブロッキング緩衝液（０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳ）で、３７℃または室温で１〜２時間インキュベートした。
【０１０２】
そのままのＨＥＫ２９３細胞またはＢＡＣＥまたはＢＡＣＥ２を発現するＨＥＫ２９３細胞の膜抽出物を、１００μｌの最終容量で、アッセイ緩衝液（５０ｍＭのＫＰｉ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、１０μＭのカルジオリピン、ｐＨ４．５）中、部分的に精製したＡＰＰ７５１ｓｗまたはＡＰＰ７５１ｗｔの存在下でインキュベートした。反応試料を３７℃で６〜１８時間インキュベートし、そして次いで試料を−２０℃に置くことによって停止させた。
【０１０３】
ブロッキング緩衝液を除去した後、コートしたプレート吸い取って乾かした。１セットのウェルに、異なる容量（例えば０、０．５、１、２、４、８、および１０μｌ）の、膜調製物由来のサポニン洗浄液を加えた。これらを、希釈緩衝液で最終容量１００μｌまで希釈し、そしてアッセイの直線性を確立するために使用した（典型的にはＯＤ４５０ｎｍで０．０６から１．２までの範囲）。
【０１０４】
別のセットの残ったウェルに、上記で記載したように行ったβ−セクレターゼ反応の５０μｌを加え、続いて希釈緩衝液（５０μｌ）を加えて容量を１００μｌ／ウェルにした。ＥＬＩＳＡプレートを、室温で１〜２時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを２００μｌの洗浄緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄し、そして吸い取って乾かした。あるいは、ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を洗浄緩衝液として使用し得る。次いで抗体／結合物緩衝液（ＰＢＳ、２％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）中１：５０００希釈のアフィニティー精製抗−ＮＴＦ　ＡＦ＃２０抗体を１００μｌ、各ウェルに加え、そしてプレートを室温で１時間インキュベートした。ＡＦ＃２０はＡＰＰのβ−セクレターゼ切断時に産生されるネオエピトープ（ｎｅｏｅｐｉｔｏｐｅ）を特異的に認識する。プレートを再び洗浄緩衝液で３回洗浄し、そして過剰な液体を洗浄の間に除去した。
【０１０５】
次いで抗体−結合物緩衝液中、１：５０００希釈のヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰを１００μｌ、各ウェルに加え、そしてプレートを室温で１時間インキュベートした。２次抗体インキュベーションの後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。前のインキュベーション中に室温にしておいた１００μｌのＴＭＢ／Ｈ２Ｏ２（Ｓｉｇｍａ）を次いで各ウェルに加えた。５〜２０分の展開中、プレートをアルミホイルで覆い、そして暗所に保存した。十分に青色が展開した後、各ウェルに１００μｌの５Ｎ　Ｈ２ＳＯ４を加えることによって反応を停止させ、そしてＳｏｆｔｍａｘ分光光度計で、４５０ｎｍでプレートを読むことによって、ＮＴＦの量を決定した。
【０１０６】
これらの画分中の基質（ＡＰＰ）レベルを決定するために、１０μｌの−２０℃反応混合物を、または画分から１０μｌのいずれかを直接、８Ｅ５抗体でコートし、そして上記で記載したようにブロックしたＥＬＩＳＡウェルに加えた。試料を９０μｌの希釈緩衝液で希釈し、そして基本的には検出システムがわずかに異なる以外は上記で記載したようにＥＬＩＳＡを行った。１次ビオチン化モノクローナル２Ｈ３抗体を１：２０００の希釈で用いて（Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄら（１９９７）同書）、続いてストレプトアビジン−ＨＲＰ結合物（Ｚｙｍｅｄ）を１：５０００で用いてＡＰＰを検出した。
【０１０７】
（実施例２　ＢＡＣＥ２はインビトロでβ−セクレターゼ活性を有する）
ＢＡＣＥ２がβ−セクレターゼ活性を有するかどうかを決定するために、本発明者らは、無細胞アッセイにおいてβ−セクレターゼ部位におけるＡＰＰ７５１ｓｗおよびＡＰＰ７５１ｗｔの切断を再構築した。偽、ＢＡＣＥ、またはＢＡＣＥ２トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞のいずれか由来の膜抽出物を等量、部分的に精製した全長ＡＰＰ７５１ｓｗまたはＡＰＰ７５１ｗｔと、示した時間インキュベートした。次いで　−ＮＴＦの形成を、一般的な方法論で記載したように、それぞれの　−ＮＴＦ特異的ＥＬＩＳＡを用いて決定した。
【０１０８】
ＢＡＣＥおよびＢＡＣＥ２トランスフェクト細胞由来の抽出物はどちらも、基質としてＡＰＰ７５１ｓｗを用いて、時間依存的な　−ＮＴＦ形成の増加を示した（図１ａ）。この活性は、２時間のトインキュベーション時間内の偽トランスフェクト抽出物には欠けていた。偽処理抽出物に存在するような内因性セクレターゼレベルは、このアッセイで十分な　−ＮＴＦレベルを検出するためには１２から１６時間の間のインキュベーション時間が必要であった（データは示していない）。結果として、それぞれの抽出物中の検出可能なβ−セクレターゼ活性は全て、過剰発現したタンパク質（それぞれＢＡＣＥおよびＢＡＣＥ２）に起因した。それに加えて、アッセイ中で異なる量のＢＡＣＥおよびＢＡＣＥ２抽出物を組み合わせると、　−ＮＴＦ形成に対する効果は相加的であった（データは示していない）。
【０１０９】
ＢＡＣＥ２も、ＢＡＣＥと同程度ＡＰＰ７５１ｗｔを切断した（図１ｂ）。ＡＰＰ７５１ｗｔはＡＰＰ７５１ｓｗより有意に弱い基質であることから予期されるように（Ｃｉｔｒｏｎら（１９９２）同書；Ｃａｉら（１９９３）同書）、インキュベーション時間を８時間まで延長した。ＢＡＣＥが主要なβ−セクレターゼであるという以前の認識と対照的に（Ｖａｓｓａｒら（１９９９）同書；Ｓｉｎｈａら（１９９９）同書；Ｈｕｓｓａｉｎら（１９９９）同書；Ｙａｎら（１９９９）同書；Ｌｉｎら（２０００）同書；Ｂｅｎｎｅｔら（２０００）同書）、ＢＡＣＥ２は、無細胞環境で、β−セクレターゼ部位においてＡＰＰのプロセシングにかなり有効なようである。従って、ＢＡＣＥ２は確かにＢＡＣＥの機能的ホモログであり得る。
【０１１０】
（実施例３　ＢＡＣＥ２の過剰発現はＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＡβ形成の抑制を引き起こす）
インビトロで　−セクレターゼ部位でＡＰＰを切断するＢＡＣＥ２の能力を考えて、本発明者らはＢＡＣＥと比較したＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＢＡＣＥ２の役割を調査した。様々な量のＢＡＣＥ２またはＢＡＣＥ発現プラスミドを、ＡＰＰ７５１ｓｗ基質ｃＤＮＡをコードする一定量のＤＮＡとコトランスフェクトした。細胞上清をトランスフェクションの４８時間または７２時間後に回収し、そして一般的な方法論で記載したように、α−ＮＴＦ、β−ＮＴＦ、全ＡβおよびＡβ４２に関して分析した。ＡＰＰ７５１ｓｗのみの発現は、偽トランスフェクト細胞と比較して、β−ＮＴＦ、α−ＮＴＦ、全ＡβおよびＡβ４２の有意な増加を引き起こした（図２ａ〜ｄ）。これは、内因性セクレターゼは、これらの状況下ではβ−ＮＴＦ形成もＡβ形成も制限しないことを示唆した。ＡＰＰ７５１ｓｗに加えてＢＡＣＥが発現した場合、前の報告から予期されたように（Ｖａｓｓａｒら（１９９９）同書；Ｓｉｎｈａら（１９９９）同書；Ｙａｎら（１９９９）同書）、β−ＮＴＦレベル（図２ａ）はさらに増加した。結果として、α−ＮＴＦレベルは比例して減少した（図２ｂ）。これらの条件下では、Ａβの産生は有意に刺激されなかった。これはおそらく、過剰発現ＡＰＰ７５１ｓｗは過剰であり、そして既に内因性ＢＡＣＥによって非常に効率的に切断されていたという事実のためであろう（偽対ＡＰＰ７５１ｓｗ単独を比較）。Ａβ形成に対するＢＡＣＥの効果は様々であると報告されており（Ｖａｓｓａｒら（１９９９）同書；Ｓｉｎｈａら（１９９９）同書；Ｈｕｓｓａｉｎら（１９９９）同書；Ｙａｎら（１９９９）同書；Ｌｉｎら（２０００）同書）、従ってγ−セクレターゼのようなさらなる因子が制限になり得るようである。
【０１１１】
ＢＡＣＥ２をＡＰＰ７５１ｓｗとコトランスフェクトした場合、β−ＮＴＦレベルに対する効果はＢＡＣＥのものと非常に似ており、ＢＡＣＥ２はインビボでいくらか　−セクレターゼ活性を有することを示唆する。実際、ＢＡＣＥ２およびＢＡＣＥによって産生されたα−ＮＴＦおよび　−ＮＴＦのレベルはお互いに反比例し、そしてＡＰＰ７５１ｓｗ単独でトランスフェクトした細胞と基本的に同じ全ＯＤ値に加算される（全ＯＤはＡＰＰ７５１ｓｗ単独で約２．５９、ＢＡＣＥ２で約２．５、およびＢＡＣＥで約２．３）。ＢＡＣＥに関して　−および　−ＮＴＦを合わせた値は、　−ＮＴＦアッセイが飽和に達したためにわずかに低かった。異なるトランスフェクション条件における異なる　−および　−ＮＴＦ値の比は、同じ基質に関する　−セクレターゼおよび　−セクレターゼの競合と矛盾しない（Ｓｋｏｖｒｏｎｓｋｙら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２５６８−２５７５）。ＢＡＣＥトランスフェクト細胞に対してＢＡＣＥ２由来の馴化培地中でわずかに高いレベルの　−ＮＴＦは、部分的に、ＢＡＣＥ２はより弱い　−セクレターゼであるという事実を反映する（図２ｂ、図４を参照のこと）。ＢＡＣＥと対照的に、ＢＡＣＥ２の発現は、全ＡβおよびＡβ４２の、偽トランスフェクト細胞で見られるレベルまでの著しい抑制を引き起こす（図２ｃ、ｄ）。従って、ＢＡＣＥ２は、　−または　−ＮＴＦのいずれかの形成のに有意な影響を与えることなく、Ａβの産生を抑制した。
【０１１２】
ＢＡＣＥまたはＢＡＣＥ２過剰発現の結果としてのＡＰＰの代謝を分析するために、本発明者らは並行パルスチェイス実験を行った（図２ｅ）。上記のようにトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞をパルス標識し、そして９０分まで追跡して、そしてＡＰＰおよびＣＴＦを免疫沈降した。ＢＡＣＥおよびＢＡＣＥ２はどちらも、偽トランスフェクト細胞のものとは有意に異なるＣＴＦの代謝回転を示した。予期されたように、ＢＡＣＥの発現は　−ＣＴＦの蓄積を引き起こした。以前の報告と一致して（Ｖａｓｓａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）同書；Ｈｉｇａｋｉら、Ｎｅｕｒｏｎ　１４：６５１−６５９（１９９５））、代替　−セクレターゼ関連切断産物（　’−ＣＴＦ）も形成された。その　−セクレターゼ活性と一致して、ＢＡＣＥ２の過剰発現は、偽トランスフェクト細胞と比較して、　−ＣＴＦレベルの有意な初期増加を引き起こした。ＢＡＣＥと対照的に、　−ＣＴＦの形成はより中程度であり、そして　−ＣＴＦは時間とともに蓄積せず、　’−ＣＴＦも形成されなかった。その代わり、本発明者らは、大きさおよびゲル移動に基づいて　−ＣＴＦに対応する切断産物の強い蓄積を観察した。従って、ＢＡＣＥ２は、最初　−セクレターゼ切断を増強し、そしてＡβへプロセスされる代わりに、できた　−ＣＴＦのほとんどはさらに　−ＣＴＦへと変換されたようであった。一般的に、ＢＡＣＥ２は増加したＡＰＰ全体の代謝回転を有し得る。ＢＡＣＥが　−セクレターゼ活性に影響するかどうかを決定するために、本発明者らはｐ３が形成され得るかどうかを決定した。本発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞を図２ｅのようにトランスフェクトし、そしてそれらをＰｒｏｍｉｘ　Ｌ［３５Ｓ］で５時間標識した。次いで馴化培地由来のＡβを、ｐ３も認識するそれぞれＡβ４０およびＡβ４２のＣ末端残基に対して産生された抗体で沈降した（図２ｆ）。ＥＬＩＳＡ結果と一致して、ＢＡＣＥ２の発現は、Ａβ４０およびＡβ４２両方の形成を阻害した。興味深いことに、ｐ３の形成は偽トランスフェクト細胞と非常に似ており、そして従ってｐ３レベルはＢＡＣＥ２によって有意に影響されなかった。考え合わせると、ＢＡＣＥ２の発現は、Ａβの形成を防止するＡＰＰの代替プロセシングを引き起こす。
【０１１３】
独立した実験で、本発明者らは、ＢＡＣＥ２が　−セクレターゼ部位でＡＰＰを切断するＢＡＣＥの能力と競合するかどうかに注意を向けた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、一定量のＡＰＰ７５１ｓｗおよびＢＡＣＥ、および漸増するレベルのＢＡＣＥ２でコトランスフェクトした。次いでβ−ＮＴＦおよびＡβレベルを培養上清において測定した（図３）。前に見られたように、ＢＡＣＥ２の発現は、Ａβレベルの劇的な用量依存性減少を引き起こした（図３ｂ）。興味深いことに、最も低いＢＡＣＥ２濃度でさえ、Ａβの抑制は非常に明白であった。これは、この効果が比較的少量しかＢＡＣＥ２を必要としないことを示唆し、酵素的メカニズムを意味する。ＢＡＣＥ２は、ＢＡＣＥのβ−ＮＴＦを形成する能力を用量依存的な様式で抑制したが、その効果はＡβの抑制と比較すると、それほど有意に明白ではなかった（図３ａ）。ＢＡＣＥおよびＢＡＣＥ２は、基質に関して競合するようであり、そして　−ＮＴＦに対する効果は、どちらかといえば立体的であり得る。特に、ＢＡＣＥ２が、基質に関するＢＡＣＥとの競合においてあまり効率的でない　−セクレターゼである場合、それは全体の　−セクレターゼ切断の効率を減少する（図４も参照のこと）。しかし、この減少は、ＢＡＣＥ２によるＡβの減少を説明するには不十分である。
【０１１４】
（実施例４　ＢＡＣＥ２は、ニューロン性ＳＫＮ細胞においてＡβレベルを調節する）
本発明者らは、ヒト神経芽腫細胞株、ＳＫ−Ｎ−ＭＣを用いて、ＢＡＣＥ２のＡβ形成に対する調節効果をさらに評価した。ＨＥＫ２９３細胞と対照的に、ＡＰＰ７５１ｓｗ単独の発現は、Ａβまたはβ−ＮＴＦいずれの形成の有意な増加も引き起こさず、これらの条件下では内因性セクレターゼまたは外来性基質のいずれかがより制限することを示唆する（図４）。結果として、本発明者らは、ＢＡＣＥ発現時にβ−ＮＴＦおよびＡβ両方の非常に明白な増加を見ることができた（図４ａ、ｂ）。ＢＡＣＥ２はまた、インビボで　−セクレターゼ活性も示し、ＡＰＰ７５１ｓｗが単独でトランスフェクトされた場合に存在するより低いβ−ＮＴＦレベルに起因して、それはニューロン性細胞においてより容易に評価された。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で見られたように、ＢＡＣＥ２はＢＡＣＥのβ−ＮＴＦ形成を刺激する能力と競合した（図４ａ）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞と一致して、ＢＡＣＥ２の発現はまた、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞においてＡβの有意な減少を引き起こし、ＢＡＣＥ２は、ニューロン性細胞を含む、異なる細胞型でＡβレベルを抑制することを確認する（図４ｂ、ｃ）。
【０１１５】
従って、その結果は、ＢＡＣＥ２は、ニューロン性細胞を含む様々な細胞型でＡβレベルを調節することを確認する。さらに、ＢＡＣＥ２の弱い　−セクレターゼ活性は、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞でより明らかであった。本研究はさらに、ＢＡＣＥ２は、ＢＡＣＥの　−ＮＴＦを形成する能力と競合することを確認する。これらの発見に基づいて、ＢＡＣＥ２は、効率的にＡＰＰをプロセシングすることなく、ＡＰＰ基質に関してＢＡＣＥと競合するようである。
【０１１６】
（実施例５　Ａβに対するＢＡＣＥ２の調節効果には、前もっての　−セクレターゼ切断は必要ない）
上記で記載したように、ＢＡＣＥ２発現は、Ａβレベルの減少と同時にＡＰＰ　ＣＴＦの蓄積を引き起こした。この効果に基づき、　−セクレターゼ切断がＡβの抑制に必要かどうかを調査した。前もっての　−セクレターゼ切断を模倣する構築物（Ｓｈｏｊｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５８：１２６−１２９（１９９２））であるＡＰＰのＣ末端１００アミノ酸（ＣＴ１００）の代謝に対するＢＡＣＥ２の効果を分析した。ＣＴ１００をＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現した場合、Ａβレベルは偽トランスフェクト細胞より有意に増加した（図５Ａ）。予期されたように、さらなるＢＡＣＥコピーは、ＣＴ１００過剰発現条件下ではＡβのレベルに影響を与えなかった。ＢＡＣＥ２およびＣＴ１００の共発現は、全ＡβおよびＡβ４２レベルの劇的な抑制を引き起こした（図５ａ、ｂ）。従って、Ａβ形成を抑制するＢＡＣＥ２の能力は、前もっての　−セクレターゼ切断を必要としない。Ａβ形成の劇的な抑制は、馴化培地および溶解物中のＣＴＦのウェスタンブロッティングによって確認した（図５ｃ）。ＢＡＣＥ２はまた、大きさがα−ＣＴＦに対応する断片の蓄積を引き起こした。定常状態で、これはβ−ＣＴＦに対応するＣＴ１００の部分的な抑制を伴い、これらのＢＡＣＥ２条件下でβ−ＣＴＦがα−ＣＴＦに変換され得ることを確認した。β−ＣＴＦ（すなわちＣＴ１００）とＢＡＣＥ２の過剰発現時に蓄積するα−様ＣＴＦの間に前駆体−産物関係が存在することを確認するために、パルス−チェイス分析を行なった。ＨＥＫ２９３細胞を、ＣＴ１００単独またはＣＴ１００をＢＡＣＥ２とトランスフェクトした。細胞を３５Ｓ−メチオニン／システインで１５分間放射性標識し、その後放射性標識を含む培地を除去して、そして標準培地で置換した。次いで細胞を９０分間インキュベートした。この９０分間の間に、試料を取ってそして免疫沈降によってＣＴＦに関して評価した。これらのＣＴ１００トランスフェクション条件下で、ＣＴＦの形成において内因性ＡＰＰは無視できた。ＣＴ１００は、偽トランスフェクト細胞でかなり安定であったが、ＢＡＣＥ２発現は、ＡＰＰをコトランスフェクトした場合に観察されるものと同じＣＴＦのパターンを産生した（図５ｄ）。さらに、ＢＡＣＥ２はα−様ＣＴＦの蓄積を引き起こし、それはＣＴ１００由来であることを明らかに示した。この効果は、ＢＡＣＥ２で重要なアスパラギン酸残基を変異させた場合にレスキューされた（図５ｄにおけるＤ１１０Ａ、下記も参照のこと）。これは、ＢＡＣＥ２はα−セクレターゼ様活性を有することを示す。考え合わせると、これらのデータは、ＢＡＣＥ２のＡβ産生を抑制する能力は、前もっての　−セクレターゼ切断とは独立の、α−セクレターゼ様活性の増強を反映することを示す。このＢＡＣＥ２のα−セクレターゼ様活性は、ＡＰＰまたはＡＰＰ断片の非アミロイド形成性プロセシングを促進し、そしてＡβの産生を減少する。
【０１１７】
（実施例６　ＢＡＣＥ２における重要なアスパラギン酸残基の変異）
ＢＡＣＥ２によるＡβ形成の抑制が、そのアスパルチルプロテアーゼ活性を必要とするかどうかを決定することに関心があった。ＢＡＣＥ２において１つの重要なアスパラギン酸残基を変異させ（Ｄ１１０Ａ）、そしてこの変異ＢＡＣＥ２およびＡＰＰ７５１ｓｗを細胞にコトランスフェクトさせることによって、この問題に取り組んだ。ＢＡＣＥとの相同性から予期されるように（Ｙａｎら（１９９９）同書；Ｌｉｎら（２０００）同書；Ａｃｑｕａｔｉら（２０００）同書；Ｂｅｎｎｅｔｔら（２０００）同書）、ＢＡＣＥ２　Ｄ１１０Ａトランスフェクト細胞由来の抽出物は、インビトロでβ−セクレターゼ部位で切断する能力を失った（図６ａ）。それに加えて、本発明者らは、インビボのＡβおよびβ−ＮＴＦレベルに対するＢＡＣＥ２　Ｄ１１０Ａ変異体の効果を評価した。興味深いことに、ＢＡＣＥ２　Ｄ１１０Ａは、Ａβ産生の抑制を明らかに逆転させた（図６ｂ、ｃ）。結果として、α−様ＣＴＦは蓄積しなかった（図５ｄに示すように）。これは、ＢＡＣＥ２の効果は、上記で示唆されたように、酵素的メカニズムに基づくことを示す。対照的に、ＢＡＣＥ２　Ｄ１１０Ａは、　−ＮＴＦを形成するのにＢＡＣＥとわずかにより効率的に競合するようであり、さらに　−セクレターゼ部位における効果はアロステリックであり得ることを示唆する（図６ｄ）。ＢＡＣＥ２　Ｄ１１０Ａ変異体はまた、ＡＰＰ　ＣＴ１００をα−ＣＴＦ様断片へ変換できないことが示され、ＢＡＣＥ２の酵素的活性が、そのα−セクレターゼ様切断に必要であることを示した。
【０１１８】
まとめると、本明細書中で開示された結果は、ＢＡＣＥ２はＢＡＣＥより弱い　−セクレターゼ活性を有し、そしてＢＡＣＥとアロステリックな様式で競合することを示す。この競合は、ＢＡＣＥ２の重要なアスパラギン酸を変異させ、それによってその　−セクレターゼ活性を除いたときさらに増強される。本発明者らはまた、ＢＡＣＥ２は、そのタンパク質溶解活性に依存する酵素的メカニズムによって、Ａβの産生を阻害することを示した。ＢＡＣＥ２は、Ａβ産生の減少を引き起こすα−セクレターゼ様切断を促進することによって、非アミロイド形成性経路へのＡＰＰプロセシングに、決定的に関わっているようである。
【０１１９】
ＢＡＣＥ２がどのようにＡβ産生へ影響を与え得るか、４つの主な可能性が存在する。最初に、ＢＡＣＥ２は　−セクレターゼ活性を阻害し得る。ＢＡＣＥ２は　−セクレターゼ部位における切断に関して外来性ＢＡＣＥといくらか競合するようであるが、このシナリオはどちらかといえばありそうにない。ＢＡＣＥ２は明らかに　−セクレターゼ部位でＡＰＰをプロセシングし得、そして実際偽トランスフェクト細胞と比較して　−ＮＴＦおよび　−ＣＴＦ形成を増加させる。２番目に、ＢＡＣＥ２は　−セクレターゼまたは　−セクレターゼ活性に欠くことのできないプレセニリンタンパク質を負に調節、または不活性化し得る（Ｓｅｌｋｏｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９７：５６９０−５６９２（２０００））。ＢＡＣＥ２過剰発現におけるＣＴＦの蓄積は、インヒビターまたはプレセニリンにおける重要なアスパラギン酸の変異による　−セクレターゼの阻害をいくらか暗示する（Ｈｉｇａｋｉら（１９９５）同書；Ｗｏｌｆｅら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１：６−９（１９９８）；Ｗｏｌｆｅら、Ｎａｔｕｒｅ　３９８：５１３−５１７（１９９９））。しかし、単純な　−セクレターゼ阻害と対照的に、ＢＡＣＥ２発現は、主に　−ＣＴＦ様切断産物の異常な蓄積を引き起こす。さらに、ｐ３のレベルはＢＡＣＥ２によって有意に影響されず、正常な　−セクレターゼ活性を示唆した。あるいは、ＢＡＣＥ２は、　−セクレターゼが存在する細胞下の区画へＡＰＰが達するのを防ぐことが考えられるが、これがどのようにタンパク質溶解事象に関与するかは不明のままである。３番目に、ＢＡＣＥ２過剰発現は、ＡＰＰプロセシングを変化させ得る。４番目に、ＢＡＣＥ２はα−セクレターゼ活性を有するかまたは増強する。本発明者らは、ＢＡＣＥ２トランスフェクト細胞におけるＡＰＰのプロセシングは、最初　−部位切断によって進行し、そして最終的に大きさおよびゲル移動で　−ＣＴＦに対応する断片の蓄積を引き起こすことを観察した。ＣＴ１００を基質として用いて示された、　−ＣＴＦと　−ＣＴＦ様断片との間の直接的な前駆体−産物関係が存在する。
【０１２０】
ＢＡＣＥ２はＡβ産生の調節に決定的に関与しているようであるので、異なる組織におけるそのレベルは、Ａβ沈着の調節において重要な因子を構成し得る。これに関して、ＢＡＣＥ２　ｍＲＮＡは、ＢＡＣＥがよく発現している（Ｖａｓｓａｒら（１９９９）同書）脳においてそれほど豊富ではない（Ｂｅｎｎｅｔｔら（２０００）同書）ことは注目すべきである。
【０１２１】
本開示中で引用された全ての参考文献、およびその中で引用された全ての参考文献は、本明細書によって明白に参考として援用される。本発明は、本発明の特定の実施形態を参照して記載してきたが、発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更がなされ得、同等物が置換され得ることが、当業者によって理解されるべきである。それに加えて、特定の状況、材料、組成物、処理、工程の処理工程を、本発明の目的、精神、および範囲に適応させるため、多くの改変がなされ得る。そのような改変は全て、本明細書中で添付された特許請求の範囲の範囲内であると意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＢＡＣＥ２が、インビトロでβ−セクレターゼ活性を有することを示す。ＢＡＣＥおよびＢＡＣＥ２および擬似トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の抽出物を用いて、ｐＨ４．５でβ−セクレターゼ切断を再構築した。基質として部分的に精製したネイティブＡＰＰ７５１ｓｗ（ａ）およびＡＰＰ７５１（ｂ）を用いたβ−ＮＴＦ形成の動態を示す。
【図２】
図２は、ＢＡＣＥ２が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＡＰＰの選択的プロセシングを引き起こし、そしてＡβの形成を抑制することを示す。異なる量のＢＡＣＥおよびＢＡＣＥ２　ｃＤＮＡを、一定レベルのＡＰＰ７５１ｓｗプラスミドと同時トランスフェクトし、そして馴化培地をトランスフェクションの７２時間後にβ−ＮＴＦ（ａ）、α−ＮＴＦ（ｂ）、全Ａβ（ｃ）およびＡβ４２（ｄ）に関して分析した。ＢＡＣＥ２は、インビボでいくらかβ−セクレターゼ活性を示し、一方Ａβ４０およびＡβ４２の産生を劇的に抑制した。ＡＰＰ　ＣＴＦの代謝を、並行パルス−チェイス実験で分析した（ｅ）。トランスフェクトした細胞を２００ＣｉのＰｒｏｍｉｘ　Ｌ［３５Ｓ］（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で１５分間標識し、そして９０分までチェイスした。ＡＰＰおよびＣＴＦを、記載したように免疫沈降した。全長の成熟および未成熟ＡＰＰ（ＡＰＰ）ならびにβ−ＣＴＦ、選択的に切断されたβ’−ＣＴＦおよびα−ＣＴＦに対応するバンドを示す。Ａβおよびｐ３の形成を、パルス−標識実験で分析した（ｆ）。トランスフェクトした細胞を、３００ＣｉのＰｒｏｍｉｘ　Ｌ［３５Ｓ］（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で５時間標識し、そして馴化培地を、対応するｐ３形態も認識する、それぞれＡβ４０およびＡβ４２のＣ末端残基に対して産生した抗体で沈降した。矢印は、ＢＡＣＥトランスフェクト細胞において　’−ＣＴＦの切断から誘導された、さらなるＡβの種を示す。
【図３】
図３は、ＢＡＣＥ２の漸増用量が、β−セクレターゼ部位における切断およびＡβ形成に示差的に影響することを示す。一定量のＢＡＣＥおよび漸増量のＢＡＣＥ２を、ＡＰＰ７５１ｓｗと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞へ同時トランスフェクトした。馴化培地を、記載されたようにβ−ＮＴＦ（ａ）およびＡβ（ｂ）の形成に関して分析した。
【図４】
図４は、ＢＡＣＥ２が、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞においてβ−セクレターゼ活性を示し、そしてＡβの形成を抑制することを示す。異なる量のＢＡＣＥおよびＢＡＣＥ２　ｃＤＮＡを、一定レベルのＡＰＰ７５１ｓｗプラスミドと共に同時トランスフェクトし、そして馴化培地をトランスフェクションの７２時間後に　−ＮＴＦ（ａ）、全Ａβ（ｂ）およびＡβ４２（ｃ）に関して分析した。
【図５】
図５は、ＢＡＣＥ２によるＡβの抑制に、前もってのβ−セクレターゼ切断は必要でないことを示す。ＢＡＣＥおよびＢＡＣＥ２をＣＴ１００、前もってのβ−セクレターゼ切断を模倣するＡＰＰ構築物と同時トランスフェクトして、そして馴化培地中の全Ａβ（ａ）およびＡβ４２（ｂ）をＥＬＩＳＡによって測定した。馴化培地でさらに、記載されたように、ＡβおよびＣＴＦ（ｃ）の検出のためにウェスタンブロットに供した。ＣＴ１００の代謝を、並行パルス−チェイス実験で分析した（ｄ）。細胞を２００μＣｉのＰｒｏｍｉｘ　Ｌ［３５Ｓ］（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で１５分間標識し、そして９０分までチェイスした。ＣＴＦを記載されたように免疫沈降した。ＣＴ１００およびα−ＣＴＦ様のバンドを示す。
【図６】
図６は、ＢＡＣＥ２における保存されたアスパラギン酸残基の変異が、インビトロでβ−セクレターゼ活性をなくし、そしてインビボでＡβ形成に対する効果を逆転させることを示す。ＢＡＣＥ２、ＢＡＣＥ２　Ｄ１１０Ａ、または擬似トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの膜抽出物を、Ｑ−ＨＰ−セファロースで分離し、そして画分をＡＰＰ７５１ｓｗ基質で、３７℃で２時間再構築した。β−ＮＴＦの形成を、記載されたようにモニターした（ａ）。ＢＡＣＥ２　Ｄ１１０Ａおよび野生型ＢＡＣＥ２を、ＡＰＰ７５１ｓｗまたはＣＴ１００と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で同時トランスフェクトした。馴化培地中の全Ａβ（ｂ）、Ａβ４２（ｃ）、およびβ−ＮＴＦ（ｄ）を記載されたように決定した。
【図７】
図７は、ヒトＢＡＣＥ２のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図８】
図８は、ヒトＢＡＣＥ２の推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図１】
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【図２】
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2004501652.tif 000005
【図３】
2004501652.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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