(57)【要約】四糖を生物マーカーとして使用して、リソソーム貯蔵病、好ましくは、グリコーゲン貯蔵病に関して、被験者をスクリーニングする方法を提供する。さらに好ましい実施形態では、ポンペ病（すなわち、ＩＩ型グリコーゲン貯蔵病）に関して、被験者をスクリーニングする。新生児スクリーニングアッセイも提供する。本発明は、さらに、罹患被験者における臨床状態および治療の有効性をモニタリングする方法を提供する。さらに、好ましくは、ポンペ病に関する新生児スクリーニングアッセイの一部として、四糖生物マーカーをタンデム型質量分析法で測定する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取した生物学的サンプル中のヘキソース四糖（Ｇｌｃ）４の濃度を決定するステップと、該濃度を基準値と比較するステップとを含み、
前記基準値より高い濃度で前記生物学的サンプル中に（Ｇｌｃ）４が検出されることにより、前記被験者がグリコーゲン貯蔵病に罹患していると認定することを特徴とする、グリコーゲン貯蔵病に関して被験者をスクリーニングする方法。
【請求項２】
（Ｇｌｃ）４が、α−Ｄ−Ｇｌｃ（ｌ→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃの構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（Ｇｌｃ）４濃度が、定量的方法を使用して決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
タンデム型質量分析法、質量分析法、液体クロマトグラフィ、および免疫精製からなる群から選択される方法で（Ｇｌｃ）４が定量化される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記（Ｇｌｃ）４濃度が、準定量的方法を使用して決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記グリコーゲン貯蔵病が、ポンペ病（ＩＩ型グリコーゲン貯蔵病）、ＩＩＩ型グリコーゲン貯蔵病、およびＶＩ型グリコーゲン貯蔵病からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記被験者がヒト被験者である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒト被験者が新生児被験者である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記生物学的サンプルが体液サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記体液サンプルが、血液、血漿、血清、尿、唾液、および羊水からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記体液サンプルが新生児血液サンプルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記新生児血液サンプルが乾燥した血液スポットである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記体液サンプルが乾燥した尿サンプルである、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記生物学的サンプルが細胞または組織サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記基準値が所定の値である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記基準値が、対応する被験者集団で確認される（Ｇｌｃ）４濃度に基づく、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記対応する被験者集団が、非罹患被験者集団である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
グリコーゲン貯蔵病に罹患していると認定されている被験者に対して、さらなる診断テストを実施するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
被験者から採取した生物学的サンプル中のヘキソース四糖（Ｇｌｃ４）の濃度を決定するステップと、該濃度を基準値と比較するステップとを含み、
前記基準値より高い濃度で前記生物学的サンプル中に（Ｇｌｃ）４が検出されることにより、前記被験者がポンペ病（ＩＩ型グリコーゲン貯蔵病）に罹患していると認定することを特徴とする、ポンペ病に関して被験者をスクリーニングする方法。
【請求項２０】
（Ｇｌｃ）４が、α−Ｄ−Ｇｌｃ（ｌ→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃの構造を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記（Ｇｌｃ）４の濃度が、定量的方法を使用して決定される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
（Ｇｌｃ）４がタンデム型質量分析法で定量化される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記タンデム型質量分析法による定量化前に、前記生物学的サンプル中の前記オリゴ糖類が、ブチルパラアミノ安息香酸で誘導体化される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
［Ｕ−１３Ｃ］グルコース標識されたヘキソース四量体を内部標準として使用して、前記タンデム型質量分析法による定量化が標準化される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記内部標準が、α−Ｄ−Ｇｌｃ（ｌ→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃの構造を有する［Ｕ−１３Ｃ］標識されたヘキソース四量体を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記（Ｇｌｃ）４の濃度が、準定量的方法を使用して決定される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記基準値が所定の値である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記所定の基準値が、対応する被験者集団で確認される（Ｇｌｃ）４濃度に基づく、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記対応する被験者集団が、非罹患被験者集団である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ポンペ病に罹患していると認定されている被験者に対して、さらなる診断テストを実施するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
新生児被験者から採取した生物学的サンプル中のヘキソース四糖（Ｇｌｃ）４濃度を決定するステップであって、（Ｇｌｃ）４が、α−Ｄ−Ｇｌｃ（ｌ→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃの構造を有することを特徴とするステップと、前記濃度を基準値と比較するステップとを含み、
前記基準値より高い濃度で前記生物学的サンプル中に（Ｇｌｃ）４が検出されることにより、前記新生児被験者がポンペ病（ＩＩ型グリコーゲン貯蔵病）に罹患していると認定することを特徴とする、ポンペ病に関して新生児被験者をスクリーニングする方法。
【請求項３２】
被験者から採取した生物学的サンプル中のヘキソース四糖（Ｇｌｃ）４濃度を決定するステップと、該濃度を基準値と比較するステップとを含み、
前記基準値より高い濃度で前記生物学的サンプル中に（Ｇｌｃ）４が検出されることが、前記被験者の臨床状態を示すことを特徴とする、ポンペ病（ＩＩ型グリコーゲン貯蔵病）を有する被験者の臨床状態をモニタリングする方法。
【請求項３３】
（Ｇｌｃ）４が、α−Ｄ−Ｇｌｃ（ｌ→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃの構造を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記被験者が、ポンペ病のための治療を受けている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記治療が、酵素置換療法、遺伝子療法、または食事療法からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ポンペ病のための前記被験者の治療を開始または再開始するかどうかを決定するために前記モニタリングが実施される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
被験者から採取した生物学的サンプル中のヘキソース四糖（Ｇｌｃ）４濃度を決定するステップと、該濃度を基準値と比較するステップとを含み、
前記基準値より高い濃度で前記生物学的サンプル中に（Ｇｌｃ）４が検出されることが、前記被験者における治療計画の有効性を示すことを特徴とする、ポンペ病（ＩＩ型グリコーゲン貯蔵病）を有する被験者における治療計画の有効性を評価する方法。
【請求項３８】
（Ｇｌｃ）４が、α−Ｄ−Ｇｌｃ（ｌ→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃの構造を有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
新生児被験者からの乾燥した血液スポットにおけるヘキソース四糖（Ｇｌｃ）４の濃度をタンデム型質量分析法で決定するステップと、該濃度を基準値と比較するステップとを含み、
前記基準値より高い濃度で前記生物学的サンプル中に（Ｇｌｃ）４が検出されることにより、前記新生児被験者をポンペ病（ＩＩ型グリコーゲン貯蔵病）に罹患していると認定することを特徴とする、ポンペ病に関して新生児被験者をスクリーニングする方法。
【請求項４０】
（Ｇｌｃ）４が、α−Ｄ−Ｇｌｃ（ｌ→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃの構造を有する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
［Ｕ−１３Ｃ］グルコース標識されたヘキソース四量体を内部標準として使用して、前記タンデム型質量分析法による定量化が標準化される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記内部標準が、α−Ｄ−Ｇｌｃ（ｌ→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃの構造を有する［Ｕ−１３Ｃ］グルコース標識されたヘキソース四量体を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
被験者から採取した生物学的サンプル中のヘキソース四糖（Ｇｌｃ）４の濃度を前記タンデム型質量分析法で決定するステップを含む、生物学的サンプル中のオリゴ糖の濃度を決定する方法。
【請求項４４】
（Ｇｌｃ）４が、α−Ｄ−Ｇｌｃ（ｌ→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃの構造を有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
タンデム型質量分析法による定量化の前に、前記生物学的サンプル中の前記オリゴ糖類が、ブチルパラアミノ安息香酸で誘導体化される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記定量化ステップの前に濃縮ステップをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記濃縮ステップが、免疫沈降を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記生物学的サンプルが、血液、血漿、血清、尿、唾液、および羊水からなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
前記生物学的サンプルが、血液、血漿、および血清からなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項５０】
前記生物学的サンプルが、新生児の血液サンプルである、請求項４３に記載の方法。
【請求項５１】
前記生物学的サンプルが、新生児の尿サンプルである、請求項４３に記載の方法。
【請求項５２】
前記定量化ステップの前に、前記生物学的サンプル中のグルコース濃度を低下させるステップをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項５３】
［Ｕ−１３Ｃ］グルコース標識されたヘキソース四量体を内部標準として使用して、前記タンデム型質量分析法による定量化が標準化される、請求項４３に記載の方法。
【請求項５４】
前記内部標準が、α−Ｄ−Ｇｌｃ（ｌ→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃの構造を有する［Ｕ−１３Ｃ］標識されたヘキソース四量体を含む、請求項５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願情報］
本出願は、２０００年６月７日提出の合衆国仮出願第６０／２０９，９２０号（その全部を、引用することにより本明細書の一部をなすものとする）の利益を主張するものである。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、リソソーム性貯蔵疾患に罹患した患者を診断およびモニタリングする方法に関する。特に、本発明は、体液中または組織中に生物マーカーが存在することに基づいて、ポンペ病（すなわち、ＩＩ型グリコーゲン貯蔵病）および他のグリコーゲン貯蔵病に罹患した患者を診断およびモニタリングする方法に関する。
【０００３】
［発明の背景］
ポンペ病は、ＩＩ型グリコーゲン貯蔵病（ＧＳＤ−ＩＩ）または酸性マルターゼ欠損症としても知られ、グリコーゲン分解酵素であるリソソーム酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）の活性不足に起因するグリコーゲン代謝の遺伝性疾患である（Ｔｈｅ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂａｓｅｓ　ｏｆ　Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ　Ｄｉｓｅａｓｅ、第７版、第２巻（Ｓｃｒｉｖｅｒ，Ｃ．Ｒ．，Ｂｅａｕｄｅｔ，Ａ．Ｌ．，Ｗ．Ｓ．，ａｎｄ　Ｖａｌｌｅ，Ｄ編）、２４４３〜２４６４ページ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）のＨｉｒｓｃｈｈｏｒｎ，Ｒ．（１９９５））。その最も重症の形態では、本疾患は、過度の心肥大、巨舌、進行性筋衰弱および早期幼児の著明な低血圧を特徴とする。たいていの患児は、３〜６月齢で診断され、１才以前に死亡する。
【０００４】
最近、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養（Ｖａｎ　Ｈｏｖｅ　ＪＬＫ，ｅｔ　ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．９３：６５−７０）、およびトランスジェニックマウスおよびウサギ・ミルク（Ｂｉｊｖｏｅｔ　ＡＧＡ，ｅｔ　ａｌ．（１９９８）Ｈｕｍ　Ｍｏｌ　Ｇｅｎｅｔ．７：１８１５−２４；Ｂｉｊｖｏｅｔ　ＡＧＡ，ｅｔ　ａｌ．（１９９９）Ｈｕｍ　Ｍｏｌ　Ｇｅｎｅｔ　８：２１４５−５３）で産生されるリコンビナント・ヒト前駆体、ｒｈＧＡＡが産生された。このｒｈＧＡＡは、動物モデルおよび患者細胞における欠陥を修正することが証明されており（Ｋｉｋｕｃｈｉ　Ｔ，ｅｔ　ａｌ．（１９９８）Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　１０１，８２７−８３３；Ｂｉｊｖｏｅｔ　ＡＧＡ，ｅｔ　ａｌ．（１９９９）Ｈｕｍ　Ｍｏｌ　Ｇｅｎｅｔ；８，２１４５−５３）、マウスモデルにおける全ての冒された筋肉を直すために遺伝子療法ベクターが適用されてきた（Ａｍａｌｆｉｔａｎｏ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６，８８６１−８８６６）。ヒトポンペ病患者の予備試験で、ｒｈＧＡＡは、これらの患者における心筋機能および骨格筋機能を改善できることが証明された（Ａｍａｌｆｉｔａｎｏ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｄ．３：１３２）。これらの有望な新しい治療方法は、早期診断にも治療モニタリングにも適した生物マーカーアッセイの必要性を刺激してきた。
【０００５】
今のところ、ポンペ病の診断で使用できる利用しやすい（且つ非侵襲的な）生物マーカーはない。ポンペ病向けのスクリーニングアッセイの開発は、幼児型疾患において特に有益であろう。ポンペ病に罹患した新生児または幼児の早期予後判定および治療によって、これらの患者の予後を改善することが可能である。さらに、モニタリング療法は、ポンペ病患者の治療効果および予後を改良することが可能である。
【０００６】
Ｈａｌｌｇｒｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（（１９７４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．４，４２９−４３３）は、クロマトグラフ法を使用して、推定構造であるＧｌｃα１−６Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃ（Ｇｌｃ４）を有するグルコース四量体（１０才のポンペ病患者の尿中で上昇した）を同定し、特性決定した。
【０００７】
尿性（Ｇｌｃ）４は、ＩＩＩ型およびＶＩ型グリコーゲン貯蔵病（Ｌｅｎｎａｒｔｓｏｎ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｂｉｏｍｅｄ．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．３，５１−５４；Ｏｂｅｒｈｏｌｚｅｒ，Ｋ．ａｎｄＳｅｗｅｌｌ，Ａ．Ｃ．（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３６，１３８１）、デュシェンヌ（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ）型筋ジストロフィー（Ｌｅｎｎａｒｔｓｏｎ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｂｉｏｍｅｄ．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．３，５１−５４；ＫｉｋｕｃｈｉＴ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ  ＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ  １０１，８２７−８３３）、急性膵炎（Ｋｕｍｌｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １７６：３９；Ｋｕｍｌｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｎｃｒｅａｔｏｌ．４：１３９；Ｗａｎｇ，Ｗ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８２，４８−５３）、ある種の悪性腫瘍（Ｋｕｍｌｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １７６：３９）で、また、妊娠中（Ｚｏｐｆ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ（１９８２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４８，１０９−１１９；Ｈａｌｌｇｒｅｎ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，１０３４−１０４０）に、上昇していることも証明されている。
【０００８】
Ｌｅｎｎａｒｔｓｏｎら（（１９７８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８３：３２５）は、ＩＩ型またはＩＩＩ型ＧＳＤ患児の２例が排泄した尿性オリゴ糖類を、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）／質量分析法（ＭＳ）で特性決定した。両病態で分泌された主なオリゴ糖は（Ｇｌｃ）４であった。より大きいオリゴ糖類も存在していた。同様に、Ｃｈｅｓｔｅｒら（（１９８３）Ｌａｎｃｅｔ  １：９９４）は、ＩＩ型およびＩＩＩ型ＧＳＤ患者では、尿性（Ｇｌｃ）４排泄物が４〜６０倍上昇することを記述している。これらの研究者は、臨床的に正常なヘテロ接合体では、尿性（Ｇｌｃ）４が緩やかに上昇することも報告している。ラジオイムノアッセイおよびガスクロマトグラフィ／質量分析法で、オリゴ糖の同定および定量化を実施した。Ｐｅｅｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４０：９１４、およびＫｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１１９９８）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４：２４２２も参照されたい。
【０００９】
Ｏｂｅｒｈｏｌｚｅｒら（（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３６：１３８１）は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を使用して、ＧＳＤ患者における尿性（Ｇｌｃ）４排泄物を分析した。この報告書から、ＧＳＤ患者では、尿中の（Ｇｌｃ）４排泄物は、肝臓の症状と相関関係があるが、筋症状とは全く相関関係がないことが理解される。
【００１０】
前述の研究の中で、ＧＳＤ患者における（Ｇｌｃ）４血漿濃度を評価した研究はない。さらに、これらの研究は、新生児期の間に、健常被験者と比較して、（Ｇｌｃ）４濃度が評価されるかどうかについて述べていない。さらに、たとえば、治療計画の有効性を評価するために、（Ｇｌｃ）４を、ポンペ病の診断、疾患の重症度の評価、またはポンペ病患者の臨床状態のモニタリングを行うための生物マーカーとして使用できるかどうかは、これらの参考文献では示唆されていない。
【００１１】
分画した尿性オリゴ糖類の過メチル化に続くガスクロマトグラフィー質量分析法、（Ｌｅｎｎａｒｔｓｏｎ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（１１９７６）Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．３，５１−５４．）、ラジオイムノアッセイ（Ｚｏｐｆ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ，（１１９８２）Ｊ．ＩｍｍｕｎｏＬ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４８，１０９−１１９）、酵素結合免疫吸着検定法（Ｋｕｍｌｉｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．３，８５−９４）、（Ｇｌｃ）４に対するモノクローナル抗体を使用したＨＰＬＣ（Ｗａｎｇ，Ｗ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８２，４８−５３）、および過ベンゾイル化オリゴの分析を含むＨＰＬＣ法（Ｏｂｅｒｈｏｌｚｅｒ，Ｋ．ａｎｄ    Ｓｅｗｅｌｌ，Ａ．Ｃ．（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３６，１３８１）、またはイオン交換とパルス電流測定検出またはポストカラム誘導体化の使用（Ｐｅｅｌｅｎ，Ｇ．Ｏ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４０，９１４−９２１）を含む（Ｇｌｃ）４を分析するための様々な方法が開発された。本発明者が知る限り、タンデム型質量分析法を使用した（Ｇｌｃ）４の検出および定量化はこれまでに記載されていない。さらに、ポンペ病患者における（Ｇｌｃ）４の血漿濃度は、これまでに報告されていない。さらに、（Ｇｌｃ）４を新生児期中のポンペ病に関する生物マーカーとして使用するためのプロトコールは、これまで提案されていない。
【００１２】
Ｍｅｉｋｌｅら（（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３：１３２５）およびＷＯ９７／４４６６８号には、リソソーム性貯蔵障害に関する一般的な診断用マーカーとしての、リソソーム膜タンパク質、ＬＡＭＰ−１の使用について記載されている。時間分解蛍光イムノアッセイを使用して、健常被験者ならびに２５のリソソーム性貯蔵障害の１つに罹患した被験者で、血漿サンプル中のＬＡＭＰ−１濃度を測定した。評価した２５の障害のうち１７に罹患した患者の血漿サンプルで、ＬＡＭＰ−１が上昇していた。しかし、スクリーニングしたポンペ病患者４例のうち１例が、血漿ＬＡＭＰ−１濃度の上昇を示しただけであったが、被験者４例全てが、重度の臨床症状を呈していた。ポンペ病患者から確定された線維芽細胞系細胞系におけるＬＡＭＰ−１およびリソソーム酵素活性も特性決定した。
【００１３】
Ｈｕａら（（１９９８）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４：２０９４）は、第２のリソソーム膜タンパク質、ＬＡＭＰ−２を、リソソーム貯蔵障害をスクリーニングするための生物マーカーとして使用した。蛍光−免疫定量法を使用して、健常者および罹患者からの血漿中ＬＡＭＰ−２を測定した。評価した２５例中１４例のリソソーム性貯蔵障害患者が血漿ＬＡＭＰ−２濃度の上昇を示した。しかし、ポンペ病患者４例の中で、ＬＡＭＰ−２の上昇を示したものはなかった。「未区分」の新生児集団からの新生児血液スポットで、ＬＡＭＰ−１濃度およびＬＡＭＰ−２濃度も測定した。新生児のＬＡＭＰ−１およびＬＡＭＰ−２濃度は、年長被験者のレベルと比較して、高かった。このレポートから、これらのリソソーム膜生物マーカーを用いた一次スクリーニングは、高率の擬陽性をもたらす可能性があることがわかる。これらの研究者は、新生児集団のトップ１〜５％を、第二段階の診断法でさらに検査することを提唱している。
【００１４】
従って、特に、新生児期中に、ポンペ病患者を同定する方法が、当技術分野で必要である。ポンペ病患者を同定およびモニタリングする非侵襲的方法も、当技術分野で必要である。さらに、他の遺伝性代謝障害をスクリーニングするための既存の方法論と矛盾しない、ポンペ病用の新生児スクリーニング方法が、当技術分野で必要である。
【００１５】
［発明の概要］
以下に、さらに詳しく述べる通り、本発明は、罹患者から採取した生物学的サンプル中に、（Ｇｌｃ）４と呼ばれるヘキソース四量体生物マーカーが、蓄積すること（すなわち、濃度上昇）を特徴とする障害を、スクリーニングおよびモニタリングする方法を提供する。この（Ｇｌｃ）４四量体は、グリコーゲン貯蔵病、たとえば、ＧＳＤ−１１（ポンペ病）をスクリーニングおよびモニタリングするための生物マーカーとして特に有用である。好ましい実施形態において、本発明の方法は、乾燥した血液スポット（たとえば、新生児のスクリーニング用カード上の）における（Ｇｌｃ）４濃度を分析することによって、新生児のスクリーニングに使用することができる。
【００１６】
ヘキソース四糖（Ｇｌｃ４）の推定構造は、以下の通りに決定されている。α−Ｄ−Ｇｌｃ（ｌ→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃ。
【００１７】
本発明は、高レベルの（Ｇｌｃ）４生物マーカーを分析するための迅速且つ信頼できる方法（たとえば、ＨＰＬＣまたはタンデム型質量分析法（ＴＭＳ））を使用して、客観的な様式でポンペ病を診断し、検出し、且つ／またはモニタリングできる力を提供する。本発明は、感度、再現性、高分解能、簡便性、および低経費の点で前述の方法より有利である。さらに、本明細書に開示の新生児スクリーニング分析法は、他の遺伝性代謝障害のための最新の新生児スクリーニング方法論と矛盾しない。
【００１８】
従って、第１の態様として、本発明は、グリコーゲン貯蔵病に関して被験者をスクリーニングする方法であって、被験者から採取した生物学的サンプル中のヘキソース四糖（Ｇｌｃ）４の濃度を決定するステップと、該濃度を基準値と比較するステップとを含み、基準値より高い濃度で生物学的サンプル中に（Ｇｌｃ）４が検出されることにより、被験者をグリコーゲン貯蔵病に罹患していると認定することを特徴とするスクリーニング方法を提供する。この（Ｇｌｃ）４四糖は、推定構造α−Ｄ−Ｇｌｃ（ｌ→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃを有することが好ましい。グリコーゲン貯蔵病は、ＩＩ型グリコーゲン貯蔵病（ＧＳＤ−ＩＩすなわちポンペ病）、ＧＳＤＩＩＩ、またはＧＳＤＶＩであることがさらに好ましく、さらに好ましくは、ＧＳＤ−ＩＩである。
【００１９】
さらなる態様として、本発明は、ポンペ病（ＩＩ型グリコーゲン貯蔵病）に関して新生児被験者をスクリーニングする方法であって、新生児被験者から採取した生物学的サンプル中のヘキソース四糖（Ｇｌｃ）４濃度を決定するステップと、該濃度を基準値と比較するステップとを含み、基準値より高い濃度で生物学的サンプル中に（Ｇｌｃ）４が検出されることにより、新生児被験者をポンペ病に罹患していると認定することを特徴とするスクリーニング方法を提供する。（Ｇｌｃ）４は、推定構造α−Ｄ−Ｇｌｃ（ｌ→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃを有することが好ましい。生物学的サンプルは、血液、血清、血漿または尿サンプル（さらに好ましくは、乾燥した血液、血清、血漿または尿サンプル）であることがさらに好ましい。
【００２０】
さらなる態様として、本発明は、ポンペ病（ＩＩ型グリコーゲン貯蔵病）患者の臨床状態をモニタリングする方法であって、被験者から採取した生物学的サンプル中のヘキソース四糖（Ｇｌｃ）４の濃度を決定するステップと、該濃度を基準値と比較するステップとを含み、基準値より高い濃度で生物学的サンプル中に（Ｇｌｃ）４が検出されることが、被験者の臨床状態を示すことを特徴とするモニタリング方法を提供する。この（Ｇｌｃ）４生物マーカーは、推定構造α−Ｄ−Ｇｌｃ（ｌ→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃを有することが好ましい。ある特定の実施形態では、被験者における治療計画の有効性を評価するためにこの方法が実行される。
【００２１】
もう１つのさらなる態様として、本発明は、ポンペ病（ＩＩ型グリコーゲン貯蔵病）に関して新生児被験者をスクリーニングする方法であって、新生児被験者からの乾燥血液スポットにおけるヘキソース四糖（Ｇｌｃ）４濃度をタンデム型質量分析法で決定するステップと、該濃度を基準値と比較するステップとを含み、基準値より高い濃度で生物学的サンプル中に（Ｇｌｃ）４が検出されることによって、新生児被験者をポンペ病に罹患していると認定することを特徴とするスクリーニング方法を提供する。（Ｇｌｃ）４生物マーカーは、推定構造α−Ｄ−Ｇｌｃ（ｌ→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃを有することが好ましい。
【００２２】
この（Ｇｌｃ）４四糖は、当技術分野で周知の任意の方法、たとえば、タンデム型質量分析法、質量分析法、ＨＰＬＣ、免疫精製法、液体クロマトグラフィ等々で、定量化または決定することができる。ＨＰＬＣおよびタンデム型質量分析法が好ましく、タンデム型質量分析法が最も好ましい。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、被験者から採取した生物学的サンプル中のヘキソース四糖（Ｇｌｃ）４濃度を、タンデム型質量分析法で定量化または決定するステップを含む、生物学的サンプル中のオリゴ糖濃度を定量化または決定する方法を提供する。（Ｇｌｃ）４は、推定構造α−Ｄ−Ｇｌｃ（ｌ→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃを有することが好ましい。［Ｕ−１３Ｃ］グルコース標識されたヘキソース四量体をＴＭＳプロトコール用の内部標準として使用することも好ましい。
【００２４】
本発明の方法は、ＧＳＤ−ＩＩ患者に蓄積する他のオリゴ糖類（たとえば、限界デキストリン）を生物マーカーとして使用して、実施することも可能である。
【００２５】
本発明のこれらの態様およびその他の態様を、以下の本発明の説明にさらに詳しく記載する。
【００２６】
［発明の詳細な説明］
本発明は、ＩＩ型グリコーゲン貯蔵病（ＧＳＤ−ＩＩ）を検出するスクリーニング方法のための生物マーカーとして、ヘキソース四量体｛以下、（Ｇｌｃ）４｝を使用することができるという発見に、ある程度基づく。（Ｇｌｃ）４は、推定的に、グルコース四糖と認定されていた。さらに、証拠から、（Ｇｌｃ）４オリゴ糖は、構造α−Ｄ−Ｇｌｃ（ｌ→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃを有することがわかる（Ｈａｌｌｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７４）ＥｕｒＪ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．４：４２９；図１２参照）。
【００２７】
本研究は、（Ｇｌｃ）４濃度、特に血漿（Ｇｌｃ）４濃度を使用して、ポンペ病患者をモニタリングできること（たとえば、治療計画の有効性を評価するため）、また、（Ｇｌｃ）４濃度と、罹患者における疾患の臨床経過との良好な相関関係を証明できることを発見した。
【００２８】
本明細書において、本発明の説明で使用される専門用語は、個々の実施形態を説明するためであって、本発明を限定する意図はない。本発明の説明および添付のクレームで使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上、異なることを明らかに示さない限り複数形をも含むことを意図する。
【００２９】
用語「ポンペ病」および「ＩＩ型グリコーゲン貯蔵病」（すなわち、ＧＳＤ−ＩＩ）は、本明細書では互換可能に使用されるが、「ポンペ病」は、従来、本障害の幼児型を示するために、より頻繁に使用されている。
【００３０】
本明細書で使用される用語（Ｇｌｃ）４は、ポンペ病患者の体液（たとえば、尿および血漿）中に蓄積するヘキソース四量体｛（ｈｅｘ）４｝生物マーカーを指す。（Ｇｌｃ）４は、推定的に、ＧＡＡ酵素の欠損による不完全なグリコーゲン分解の結果として蓄積するグルコース四糖（たとえば、限界デキストリン）と認定された。（Ｇｌｃ）４の推定構造は、α−Ｄ−Ｇｌｃ（ｌ→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃである。（図１２）。
【００３１】
当業者は、（Ｇｌｃ）４のアミノ安息香酸ブチル誘導体のタンデム型質量分析によって決定される（Ｇｌｃ）４の推定構造は、ヘキソース四量体のものであることを理解するであろう。ヘキソース成分およびその間の結合の同一性は、ＴＭＳ分析で決定できない。従って、当業者は、（Ｇｌｃ）４は、可能なグルコシド結合（たとえば、１→２、１→３、１→４、１→６）のいずれかによって、間が結合されたヘキソースモノマー（たとえば、グルコース、ガラクトース、マンノース）の組み合わせを含んでもよいことを理解するであろう。
【００３２】
（Ｇｌｃ）４とポンペ病との間の連関、ならびに文献に報告された今までの観察結果から、グルコース四糖は、（Ｇｌｃ）４の重要な成分であることが強く示唆される。
【００３３】
本明細書で使用される「スクリーニング」は、上述の（Ｇｌｃ）４の蓄積を特徴とする障害の存在に関して、被験者を評価するのに使用される手法を指す。このスクリーニング手法が、個体群または個体集団内の各個体のうちどれが、ある特定の障害に罹患しているかを決定する際に有用且つ有益であれば、スクリーニング手法は、擬陽性または擬陰性が皆無である必要はない。本明細書に開示のスクリーニング方法は、診断用および／または予後判定用の方法であってもよく、且つ／または患者治療効果のモニタリングに使用してもよい。
【００３４】
本明細書で使用される「診断方法」は、ある特定の障害に罹患している被験者を同定するために実行されるスクリーニング手法を指す。
【００３５】
「予後判定方法」は、疾患経過の予測を、少なくともある程度、助けるために使用される方法を指す。言い換えれば、予後判定方法を使用して、疾患の重症度を評価することが可能である。たとえば、本明細書に開示のスクリーニング手法を実行して、罹患者を同定することも、疾患の重症度を評価することもでき、且つ／またはさらに先の疾患経過を予測することもできる。このような方法は、治療処置の必要性およびどのタイプの処置を実施するか等々を評価する際に有用な可能性がある。加えて、特定の被験者について、どのように疾患が進行するかを深く洞察することが望ましいとき（たとえば、ある特定の患者が、ある特定の薬剤治療に対して好都合に応答する公算、または臨床治験を実施するために、患者を、明確な異なる小集団に分類または分割することが望ましいとき）、ある特定の障害を有すると以前に診断された被験者に対して、予後判定方法を実行してもよい。
【００３６】
本明細書で使用される用語「濃度の定量化」または「濃度の決定」は、指示されたサンプル中の被分析物の濃度またはレベルの測定を指す。一般に、定量化ステップまたは決定ステップの結果として、絶対的数値または相対的数値が、サンプル中の被分析物の濃度に割当てられる。以下にさらに詳細に説明する通り、当技術分野で既知の適当な方法を使用して、本発明による生物学的サンプル中の（Ｇｌｃ）４濃度を定量化または決定することが可能である。（Ｇｌｃ）４濃度を「定量化」または「決定」する方法は、やはり以下にさらに詳細に説明する、定量的方法論およびまたは準定量的方法論の両者を含む。
【００３７】
「定量的」方法は、絶対的数値または相対的数値を、生物学的サンプル中の被分析物の濃度に割当てる方法である。
【００３８】
「準定量的」方法は、被分析物の濃度が閾値 レベルより上であることを示すが、絶対的数値または相対的数値を割当てない方法である。「ディップスティック」法として一般に知られている分析方法は、準定量的分析法の例である。
【００３９】
以下の本発明の説明は、（Ｇｌｃ）４オリゴ糖に関する。ポンペ病を検出するための、より長いオリゴ糖（すなわち、ＧＡＡ酵素の欠損に起因する不完全なグリコーゲン分解によって生じる限界デキストリン）の使用にも、本発明の方法を適用することが可能である。
【００４０】
たとえば、ポンペ病患者の尿中の、（Ｇｌｃ）６、（Ｇｌｃ）７および（Ｇｌｃ）８について記述されている（Ｌｅｎｎａｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８３：３２５；Ｋｕｍｌｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２６９：６７８）。推定構造：α−Ｄ−Ｇｌｃ（ｌ→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃ、α−Ｄ−Ｇｌｃ（ｌ→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃおよびα−Ｄ−Ｇｌｃ（ｌ→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃを有する、少なくとも３種の（Ｇｌｃ）６異性体が存在する。（Ｇｌｃ）７異性体の推定構造は、α−Ｄ−Ｇｌｃ（ｌ→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）（α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→６））−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃ−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃおよびα−Ｄ−Ｇｌｃ（ｌ→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃ−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃであると決定されている。（Ｇｌｃ）８オリゴ糖の推定構造は、α−Ｄ−Ｇｌｃ（ｌ→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃであると決定されている。ポンペ病患者および対照の尿中および血漿中で、未知の構造を有する（ｈｅｘ）５オリゴ糖が、ＴＭＳによって検出されており、グリコーゲンの限界デキストリンである可能性が高い。ポンペ病患者の尿中で、１１までの残基を有するヘキソースオリゴマーが、飛行質量分析法のマトリックス支援レーザー脱離時間によって検出されている（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４４：２４２２）。
【００４１】
α−（１→６）グルコシド結合を非残基末端に有するオリゴ糖は、より安定で好ましいことを当業者は理解するであろう。同様に、長いオリゴ糖は、短いオリゴ糖より安定性が低い傾向がある。ポンペ病患者と比べて、健常者の生物学的サンプル中に特定のオリゴ糖が蓄積する程度をさらに考慮しなければならない。最後に、妨害物質が存在することから、本発明による生物マーカーとして使用するためのオリゴ糖の選択に関する情報が得られる。
【００４２】
一般に、（Ｇｌｃ）４の代替としては、特に、新生児被験者の場合、（Ｇｌｃ）５、（Ｇｌｃ）６、（Ｇｌｃ）７、（Ｇｌｃ）８およびそれより長鎖のヘキソースオリゴ糖類が好ましい生物マーカーである。あるいは、たとえば、（Ｇｌｃ）４アッセイを使用して擬陽性を同定するために、こうしたより長い鎖のオリゴ糖類を二次生物マーカーとして利用してもよい。類似した、（Ｇｌｃ）４を検出するためのプロトコールを使用して、より長いヘキソースオリゴマーを測定することができる。たとえば、タンデム型質量分析法に関して、同じ誘導体化およびスキャン機能を使用しても、異なる質量（ｍ／ｚ）を検出することが可能である。
【００４３】
［（Ｇｌｃ）４：ポンペ病および他の代謝障害のための生物マーカー］
（Ｇｌｃ）４四糖はグリコーゲンに由来し、ポンペ病患者における酸性リソソームのα−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）欠損の結果としての不完全なグリコーゲン分解（すなわち、限界デキストリン）の副生成物を代表すると考えられる。この限界デキストリンは、おそらく、グリコーゲンがリソソーム内に蓄積することによって引き起こされる細胞溶解の結果として、グリコーゲンが循環内に放出されるときに形成されることが、証拠から示唆される。循環中で、グリコーゲンは、αアミラーゼおよび中性のα１−４グルコシダーゼによる作用を受け、結果として限界デキストリンを生じる（Ｕｇｏｒｓｋｉ，（１９８３）Ｊ．Ｅｘｐ．ＰａｔｈｏＬ  １：２７）。（Ｇｌｃ）４は、体液（たとえば、血液、血漿、血清、尿、唾液、羊水、等々）中で、高濃度で検出される可能性がある。
【００４４】
尿中の（Ｇｌｃ）４四糖の蓄積は、その他のグリコーゲン貯蔵病および障害、たとえば、ＧＳＤ−ＩＩＩおよびＧＳＤ−ＶＩ、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、急性膵炎、およびある種の悪性腫瘍の場合と関連していた。ＧＳＤ−ＩＩ１は、グリコーゲン脱分枝酵素活性の欠損によって引き起こされる。ＧＳＤ−ＶＩは、肝ホスホリラーゼ系の欠損によって引き起こされる雑多な疾患群である。この欠損は、肝ホスホリラーゼ酵素それ自体のこともあり、ホスホリラーゼキナーゼのこともある。
【００４５】
従って、本発明は、被験者から採取した生物学的サンプル中に（Ｇｌｃ）４が蓄積すること（すなわち、濃度上昇）を特徴とする障害に関して、被験者をスクリーニングする方法を提供する。この方法に従えば、生物学的サンプルが被験者から採取され、サンプル中の（Ｇｌｃ）４の有無が決定され、（Ｇｌｃ）４がサンプル中に存在する場合、被験者は、推定的に、障害に罹患していると認定される。
【００４６】
あるいは、また、好ましくは、本方法は、本質的に定量的であってもよく、準定量的であってもよい。この実施形態に従えば、生物学的サンプルを被験者から入手し、生物学的サンプル中の（Ｇｌｃ）４濃度を定量化するかまたは決定する。基準値（すなわち、基準濃度）を上回る、生物学的サンプル中の（Ｇｌｃ）４レベルにより、被験者は、推定的に、障害に罹患していると認定される。一般に、基準値は、スクリーニングする被験者に応じた健常集団および罹患集団における既知の（Ｇｌｃ）４濃度に基づく（たとえば、新生児被験者は、一般に健常および／または罹患した新生児集団と比較する）。たとえば、被験者を、対応する任意抽出の集団と比較してもよい。あるいは、被験者を罹患していない（すなわち、健常な）被験者の対応集団および／または罹患被験者の対応集団と比較してもよい。
【００４７】
健常被験者では、年齢と共に（Ｇｌｃ）４レベルが減少する傾向があるため、被験者を、年齢対応集団と比較することが好ましい（表４および５を参照）。早発性ポンペ病患者では、遅発型疾患と比較して、（Ｇｌｃ）４レベルが高い可能性があることを、当業者は理解するであろう。
【００４８】
基準値は、当技術分野で周知の方法に従って選択することが可能である。特定の実施形態では、基準値は所定の値であってもよい。あるいは、基準値は、アッセイの過程で決定してもよい。たとえば、既知の非罹患被験者および／または罹患被験者からのサンプルを、被験サンプルと同時に分析し、それから基準値を決定してもよい。さらなる代替法として、混合集団からの被験サンプルを分析し、たとえば、当技術分野で周知の統計学的方法を使用し、結果の分布に基づいて、基準値を決定してもよい。
【００４９】
従って、この基準値は、罹患被験者を同定するための閾値を示す。基準値の選択は絶対的ではない。たとえば、比較的低い値は、擬陰性の出現率を有利に低下させることができるが、擬陽性の公算を高める可能性もある。従って、他のスクリーニング技術については、基準値は、経費、早期診断および治療の利益、擬陽性成績を有する者に対するフォローアップ診断方法の侵襲性、およびスクリーニングアッセイをデザインする際に決まって考慮される他の因子を含むがその限りではない、多数の因子を基にしてもよい。
【００５０】
当技術分野で周知の方法を使用して、推定的に、罹患していると、被験者を認定してもよい。たとえば、適切な対応する対照集団と比較して、約７０パーセンタイル以上、８０パーセンタイル、９０パーセンタイル、９５パーセンタイル、９６パーセンタイル、９７パーセンタイル、９８パーセンタイル、９９パーセンタイル、またはそれより高い（Ｇｌｃ）４値を有する被験者は、推定的に、罹患していると認定してもよい。あるいは、適切な非罹患集団の平均値（あるいは、中間値または中央値）より、約２、３、４、５、８、１０または２０倍以上高い（Ｇｌｃ）４濃度を有する被験者は、推定的に、罹患していると認定してもよい。
【００５１】
二次的な生物マーカーを任意に使用して、（Ｇｌｃ）４アッセイでありそうな擬陽性を同定することが可能である。代表的な二次生物マーカーとしては、ポンペ病患者の体液中に認められる長鎖オリゴ糖類（上述）などがある。その他のあり得る二次生物マーカーとしては、ＬＡＭＰ−１およびＬＡＭＰ−２マーカーなどがある（Ｍｅｉｋｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３：１３２５およびＷＯ９７／４４６６８号；Ｈｕａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４：２０９４）。
【００５２】
好ましい実施形態では、リソソーム貯蔵病（たとえば、グリコーゲン貯蔵病）またはデュシェンヌ型筋ジストロフィーに関して、さらに好ましくは、グリコーゲン貯蔵病（ＧＳＤ−Ｉ以外）、なおいっそう好ましくは、ＧＳＤ−ＩＩ（ポンペ病）、ＧＳＤ−ＩＩＩまたはＧＳＤ−ＶＩに関して、被験者をスクリーニングするために、前述の方法を実行する。最も好ましい実施形態では、ポンペ病（ＧＳＤ−ＩＩ）に関して被験者をスクリーニングするために、本方法が使用される。
【００５３】
当技術分野で周知のリソソーム貯蔵病は多数ある。代表的なリソソーム貯蔵病としては、ＧＭ１ガングリオシドーシス、テイ・サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）病、ＧＭ２ガングリオシドーシス（ＡＢ異形）、サンドホフ（Ｓａｎｄｈｏｆｆ）病、ファブリ（Ｆａｂｒｙ）病、ゴーシェ（Ｇａｕｃｈｅｒ）病、異染性白質萎縮症、クラッベ（Ｋｒａｂｂｅ）病、ニーマン・ピック（Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ）病（Ａ〜Ｄ型）、ファーバー（Ｆａｒｂｅｒ）病、ウォルマン（Ｗｏｌｍａｎ）病、フルラー（Ｈｕｒｌｅｒ）症候群（ＭＰＳ  ＩＩＩ）、シャイエ（Ｓｃｈｅｉｅ）症候群（ＭＰＳ  ＩＳ）、フルラー・シャイエ（Ｈｕｒｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｅ）症候群（ＭＰＳ  ＩＨ／Ｓ）、ハンター（Ｈｕｎｔｅｒ）症候群（ＭＰＳ  ＩＩ）、サンフィリポ（Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏ）Ａ症候群（ＭＰＳ  ＩＩＩＡ）、サンフィリポＢ症候群（ＭＰＳ  ＩＩＩＢ）、サンフィリポＣ症候群（ＭＰＳ  ＩＩＩＣ）、サンフィリポＤ症候群（ＭＰＳ  ＩＩＩＤ）、モルキオ（Ｍｏｒｑｕｉｏ）Ａ病（ＭＰＳＩＶＡ）、モルキオＢ病（ＭＰＳ  ＩＶＢ）、マロトー・ラミー病（ＭＰＳ  ＶＩ）、スライ（Ｓｌｙ）症候群（ＭＰＳ  ＶＩＩ）、α−マンノシドーシス、β−マンノシドーシス、フコシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、シアリドーシス（ムコリピドーシス  １）、ガラクトシアリドーシス（ゴールドバーグ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ）症候群）、シンドラー（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ）病、ムコリピドーシス  ＩＩ（Ｉ−細胞病）、ムコリピドーシス  ＩＩＩ（偽フルラー多発性ジストロフィー）、シスチン蓄積症、サラ（Ｓａｌｌａ）病、幼児シアリン酸貯蔵病、バッテン（Ｂａｔｔｅｎ）病（若年性ニューロンセロイド脂褐素症）、幼児ニューロンセロイド脂褐素症、ムコリピドーシスＩＶ、およびプロサポシンなどがあるが、その限りではない。
【００５４】
本発明に従って、リソソーム貯蔵病と関連づけられる酵素欠損としては、β−ガラクトシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼＡ、β−ヘキソサミニダーゼＢ、ＧＭ２アクティベータータンパク質、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、ガラクトシルセラミダーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、酸性セラミダーゼ、酸性リパーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、ヘパランＮ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼアセチル−ＣｏＡ、グルコサミニド  アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ、アリールスルファターゼＢ、β−グルクロニダーゼ、α−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、α−Ｌ−フコダーゼ、Ｎ−アスパルチル−β−グルコサミニダーゼ、α−ノイラミニダーゼ、リソソーム保護タンパク質、α−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ、シスチン輸送タンパク質、シアリン酸輸送タンパク質、ＣＬＮ３遺伝子産物、パルミトイル−タンパク質チオエステラーゼ、サポシンＡ、サポシンＢ、サポシンＣ、またはサポシンＤの欠損などがあるが、その限りではない。
【００５５】
既知のグリコーゲン貯蔵病は多数あり、たとえば、Ｃ．Ｒ．Ｓｃｒｉｖｅｒら（編）．Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ、第７版、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ．１９９５，ｐｐ．９３５−９６５の、Ｙ．Ｔ．Ｃｈｅｎ  ＆  Ａ．Ｂｕｒｃｈｅｌｌ，Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓを参照されたい。代表的なグリコーゲン貯蔵病としては、１ａ型ＧＳＤ（フォン・ギールケ（ｖｏｎ  Ｇｉｅｒｋｅ）病）、１ｂ型ＧＳＤ、１ｃ型ＧＳＤ、１ｄ型ＧＳＤ、ＩＩ型  ＧＳＤ（ポンペ病または幼児ＩＩ型ＧＳＤを含む）、ＩＩＩａ型ＧＳＤ、ＩＩＩｂ型ＧＳＤ、ＩＶ型ＧＳＤ、Ｖ型ＧＳＤ（マックアードル（ＭｃＡｒｄｌｅ）病）、ＶＩ型ＧＳＤ、ＶＩＩ型ＧＳＤ、グリコーゲンシンターゼ欠損症、腎ファンコーニ（Ｆａｎｃｏｎｉ）症候群を伴う肝糖原病、ホスホグルコイソメラーゼ欠損症、筋ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症、ホスホグリセリン酸ムターゼ欠損症、および乳酸脱水素酵素欠損症などがあえるが、その限りではない。
【００５６】
グリコーゲン貯蔵病と関連づけられる酵素欠損としては、グルコース６−ホスファターゼ、リソソーム酸性αグルコシダーゼ、グリコーゲン脱分枝酵素、分枝酵素、筋ホスホリラーゼ、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、筋ホスホフルクトキナーゼ、グリコーゲンシンターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、筋ホスホグリセリン酸キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、または乳酸脱水素酵素の欠損などがあるが、その限りではない。
【００５７】
本発明を使用して、リソソーム酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）欠損症（ポンペ病（すなわち、ＧＳＤ−ＩＩ）における代謝障害）を有する被験者を検出することが好ましい。
【００５８】
さらなる態様として、本発明は、ポンペ病に関して被験者をスクリーニングする方法であって、被験者から得た生物学的サンプル中の（Ｇｌｃ）４濃度を定量化または決定することを含むスクリーニング方法を提供する。被験者から採取した生物学的サンプル中の（Ｇｌｃ）４濃度を基準値（この用語については、上述の通り）と比較する。この基準値（所定の値であってもよい）より高い濃度で、生物学的サンプル中に、（Ｇｌｃ）４が検出されるとき、推定的に被験者をポンペ病に罹患していると認定する。
【００５９】
一般に、本明細書に開示の方法は、獣医学的用途および医学的用途の両者を有する。従って、被験者は、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、囓歯類、トリ等々であってもよい。しかし、一般には、本発明による被験者は、ヒト被験者、たとえば、新生児被験者（すなわち、出生時から生後約１週まで）、幼児被験者、若年被験者、青年被験者または成人被験者である。新生児被験者が好ましい。本明細書で使用される「新生児」被験者は、当技術分野で使用される早産児を含む。
【００６０】
被験者は、たとえば、ブロードベーススクリーニングアッセイのための、一般住民の一部であってもよい。あるいは、被験者は、上述した、（Ｇｌｃ）４の蓄積を特徴とする代謝障害（たとえば、グリコーゲン貯蔵病、さらに詳細には、ＧＳＤ−ＩＩ）を有する疑いのある（たとえば、被験者が臨床症状を有する）被験者であってもよい。その他の特定の実施形態では、被験者は、（Ｇｌｃ）４の蓄積を特徴とする障害を有すると既に診断されている（たとえば、患者の臨床状態、または治療の有効性をモニタリングするため）。この実施形態によれば、被験者は、グリコーゲン貯蔵障害（さらに好ましくは、ＧＳＤ−ＩＩ）を有すると診断されていることが好ましい。
【００６１】
本明細書で使用される、「生物学的サンプル」は、本明細書に記載の障害（たとえば、ＧＳＤ−ＩＩ、ＧＳＤ−ＩＩＩ、およびＧＳＤ−ＶＩ等の、グリコーゲン貯蔵障害）で（Ｇｌｃ）４蓄積が検出される可能性がある、適当な体液、細胞、または組織（培養細胞および組織を含む）を含んでもよい。生物学的サンプルは、被験者に対する外傷が少なく、ブロードベーススクリーニングアッセイにより適した、比較的非侵襲的な方法（すなわち、外科的方法または生検を含まない方法）で得られることが好ましい。生物学的サンプルが、体液サンプルであることも好ましい。代表的な体液サンプルとしては、血漿、血清、血液（臍帯血を含む）、尿、唾液、羊水等々があるが、その限りではない。血液、血漿、血清、および尿サンプルが、より好ましい。
【００６２】
あるいは、生物学的サンプルは、培養細胞（たとえば、線維芽細胞）または組織を含む細胞サンプルまたは組織サンプル、および細胞または組織から採取した条件培地または浸出液である。代表的な細胞または組織としては、筋（たとえば、骨格筋、平滑筋、心筋および横隔膜）、肝、皮膚、包皮、臍帯の細胞または組織等々がある。肝および筋の細胞および組織が好ましい。
【００６３】
さらなる代替法として、生物学的サンプルを、固体媒体、たとえば、濾紙、スワブ、コットン等々の上に提供してもよい。特に好ましい実施形態では、生物学的サンプルは、新生児被験者からの乾燥した血液サンプル、たとえば、新生児のスクリーニングカード（すなわち、「ガスリー（Ｇｕｔｈｒｉｅ）」カード）上の乾燥した血液スポットである。さらなる好ましい例として、生物学的サンプルは、乾燥した尿サンプル（たとえば、濾紙上またはおむつの内層）であってもよい。
【００６４】
本明細書に記載の本発明のスクリーニング方法によって、被験者は、推定的に、ある特定の障害（たとえば、ポンペ病）に罹患していると認定される。特定の実施形態では、これらの被験者における診断を裏付けるために、さらなる、第２段階の診断試験を実行する。一般に、このような第２段階の方法論（たとえば、組織生検に対する酵素アッセイ）は、本明細書に開示のスクリーニング方法より高価で、多くの時間を必要とし、且つ侵襲的である。たとえば、基準濃度より高い（Ｇｌｃ）４レベルを有する被験者を、推定的に、ポンペ病に罹患していると認定し、この診断を裏付けるためのさらなる診断テスト用に選択し、被験者が別の障害（たとえば、ＧＳＤ−ＩＩ１）に罹患しているか、またはスクリーニングアッセイで擬陽性成績を示す健常被験者であるかを評価することが可能である。
【００６５】
本発明は、さらに、（Ｇｌｃ）４の蓄積を特徴とする障害に罹患していると、既に陽性に診断されている被験者の臨床経過をモニタリングする方法に用途があり、これについては、上述の通りである。本研究では、罹患被験者からの生物学的サンプル（特に、血漿、血液および血清）中の高い（Ｇｌｃ）４濃度は、罹患被験者の臨床状態と相関関係があることを発見した。事実、罹患被験者では、他の症候が悪化する前に、（Ｇｌｃ）４濃度が上昇している可能性があり、軽減の早期指標として使用することが可能である。従って、（Ｇｌｃ）４を、治療有効性および患者の臨床状態の指標として使用することが可能である。
【００６６】
従って、本発明はさらに、（Ｇｌｃ）４の蓄積を特徴とする障害を有する被験者の臨床状態をモニタリングする方法を含む。被験者は、グリコーゲン貯蔵障害、さらに好ましくは、ＧＳＤ−ＩＩを有すると、既に診断されていることが好ましい。被験者の臨床状態をモニタリングして、治療計画、たとえば、酵素置換療法、遺伝子療法、および／または食事療法の有効性を決定することが可能である。たとえば、生物マーカーのレベルから、現行の治療計画が有効でないことが示唆される場合、変更した治療コースを開始することを決定してもよい。あるいは、被験者の状態をモニタリングして、被験者の治療を開始または再開始するかどうかを決定してもよい。
【００６７】
本明細書に開示の創意に富むスクリーニング方法は、（Ｇｌｃ）４の有無を検出する（好ましくは、上述の生物学的サンプル中の（Ｇｌｃ）４濃度を決定する）適当な方法論を使用して、実行することが可能である。具体的な方法としては、クロマトグラフィ法（たとえば、高速液体クロマトグラフィ）、イムノアッセイ（たとえば、免疫親和性クロマトグラフィ、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光分析法、免疫細胞化学分析法、免疫ブロット、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）等々）、液体クロマトグラフィ質量分析法、ガスクロマトグラフィ質量分析法、飛行時間質量分析法、タンデム型質量分析法、およびこれらの質量分析技術と免疫精製法との組み合わせなどがあるが、その限りではない。
【００６８】
好ましい方法は、簡単で、迅速で、正確で、比較的非侵襲的（たとえば、非外科的）で、高感度であり、且つ好ましくは、（Ｇｌｃ）４以外の、分子からの妨害シグナルを最小限に抑える。新生児のスクリーニング方法として使用するとき、この方法論が既存のスクリーニングアッセイと矛盾せず、また、自動化およびサンプルの高スループットスクリーニングに適応できることは、さらに好ましい。
【００６９】
本発明の方法は、完全に手動であってもよく、あるいは、また好ましくは、部分的に、または完全に、自動化されている。サンプルの高スループットを容易にするために、多数のサンプルを評価するためのスクリーニングプログラム（たとえば、新生児のスクリーニングプログラム）は、一般に、少なくとも部分的に自動化されている。一般に、自動システムを使用して、たとえば、データを獲得して分析する。その他の好ましい高スループット方法では、スポットした生物学的サンプル（たとえば、血液、血漿、血清、尿等々）のアレイまたはマイクロアレイを同時に分析することが可能である。このようなアレイまたはマイクロアレイは、約１０、５０、１００、２００、３００、５００、８００、１０００、２０００、５０００サンプルまたはそれより多いサンプルを含むことが可能である。
【００７０】
ＨＰＬＣ、飛行時間質量分析法、およびタンデム型質量分析法（ＴＭＳ）を使用する方法が好ましく、ＴＭＳが最も好ましい。
【００７１】
生物学的サンプル中の（Ｇｌｃ）４およびその他のグルカン類を分析するのに好ましいＨＰＬＣ法は、Ｃ１８逆相カラムを使用する。この方法によれば、パラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）の誘導体および紫外検出器を用いた波長３０４ｎｍにおけるモニタリングを使用して、単量体（グルコース）から七量体（マルトヘプタオース）までの標準物質のベースライン分離を容易に実行することができる。
【００７２】
ＴＭＳを使用して、生物学的サンプル中の（Ｇｌｃ）４およびその他のグルカン類を定量化または決定する好ましい方法を以下に、もっと詳しく説明する。
【００７３】
（Ｇｌｃ）４被分析物の濃度が、その技術の検出限界に比して低い生物学的サンプルでは、サンプル中の（Ｇｌｃ）４を検出する（あるいは、定量化する）ステップの前に、濃縮ステップを使用することが好ましい。説明に役立つ、好ましい濃縮技術の１例として、検出／定量化ステップの前に、免疫親和性法を使用して、サンプル中の（Ｇｌｃ）４濃度を上昇させることが可能である。たとえば、磁化ビーズに結合した（Ｇｌｃ）４を特異的に認識する抗体を用いて、免疫沈降を実施することが可能である。特異的抗（Ｇｌｃ）４抗体は当技術分野で周知である（たとえば、Ｚｏｐｆ    ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８：１０９；Ｌｕｎｄｂｌａｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６８：２１７；Ｌｕｎｄｂｌａｄ    ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６８：２２７を参照）。  サイズ排除クロマトグラフィを使用して、サンプル中の（Ｇｌｃ）４を濃縮することも可能である。
【００７４】
これらの濃縮方法を使用して、（Ｇｌｃ）４被分析物を汚染物質または妨害物質から分離することも可能である。
【００７５】
本発明のさらなる態様は、特異的に認識して（Ｇｌｃ）４に結合する抗体である。本明細書で使用される、用語「抗体」は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含む、あらゆるタイプの免疫グロブリンを指す。この中で、ＩｇＭおよびＩｇＧが特に好ましい。抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく、また、（たとえば）マウス、ラット、ウサギ、ウマ、またはヒトを含む、任意の種が起源であってもよく、あるいは、キメラ抗体であってもよい。たとえば、Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６，４０３−１１（１９８９）を参照されたい。抗体は、Ｒｅａｄｉｎｇに付与された米国特許第４，４７４，８９３号、またはＣａｂｉｌｌｙらに付与された米国特許第４，８１６，５６７号に開示の方法に従って作られる組換えモノクローナル抗体であってもよい。抗体はＳｅｇＡｌらに付与された米国特許第４，６７６，９８０号に開示の方法に従って作られる特異的抗体によって化学的に構築することも可能である。
【００７６】
（Ｇｌｃ）４に対する特異的結合部位を含む抗体断片を作製することも可能である。たとえば、このような断片としては、抗体分子のペプシン消化によって作ることができるＦ（ａｂ′）２断片、およびＦ（ａｂ′）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって作成することができるＦａｂ断片などがあるが、その限りではない。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片を迅速且つ容易に同定することができるように、Ｆａｂ発現ライブラリーを作成してもよい（Ｗ．Ｄ．Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４，１２７５−１２８１（１９８９））。
【００７７】
抗体を作成するために、免疫原特性を有する（Ｇｌｃ）４、たとえば、ハプテンまたはオプソニンに結合せた（Ｇｌｃ）４またはその誘導体を注射することによって、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト等々を含む様々な宿主を、免疫化することができる。宿主種に応じて、免疫学的応答を高めるために、様々なアジュバントを使用することができる。このようなアジュバントとしては、フロイント、水酸化アルミニウム等のミネラルゲル、およびリゾレシチン、プルロニックポリオール類、ポリアニオン類、ペプチド、油乳濁液、キーホールリムペット・ヘモシアニン、およびジニトロフェノール等の表面活性物質などがあるが、その限りではない。ヒトに使用されるアジュバントの中で、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｉ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｒｎ  ｐａｒｖｕｍが特に好ましい。
【００７８】
培養中の連続細胞系による抗体分子の産生をもたらす技術を使用して、（Ｇｌｃ）４に対するモノクローナル抗体を作成することが可能である。こうした技術としては、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術などがあるが、その限りではない（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７；Ｋｏｚｂｏｒ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８１：３１−４２；Ｃｏｔｅ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２０２６−２０３０；Ｃｏｌｅ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ６２：１０９−１２０）。簡単に記載すると、この方法は、以下の通りである。動物を、（Ｇｌｃ）４または免疫原性誘導体、または（たとえば、ハプテンまたはオプソニンに結合した）その複合体で、動物を免疫化する。次いで、リンパ系細胞（たとえば脾臓リンパ球）を免疫化動物から獲得し、不死化細胞（たとえば、骨髄腫またはヘテロ骨髄腫）と融合させ、ハイブリッド細胞を作る。所望の抗体を産生するものを同定するために、このハイブリッド細胞をスクリーニングする。
【００７９】
ヒト抗体を分泌するヒトハイブリドーマは、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎの技法によって作成することができる。ヒトの治療には、ヒト抗体が特に好ましいが、一般に、ヒトモノクローナル抗体の長期産生に向いた安定したヒト−ヒトハイブリドーマの作成は困難であろう。囓歯類（特にマウス）におけるハイブリドーマ産生は、十分に確立された手法であり、従って、安定したネズミハイブリドーマは、精選された特性を持つ抗体の無限のソースを提供する。ヒト抗体の代替物として、遺伝子工学技術で、マウス抗体をキメラネズミ／ヒト抗体に転換することができる。たとえば、Ｖ．Ｔ．Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４（４）：２１４−２２１（１９８６）；Ｌ．Ｋ．Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ５（１９８６）を参照されたい。
【００８０】
（Ｇｌｃ）４に特異的なモノクローナル抗体を使用して、抗−イディオタイプ（パラトープ特異的）抗体を作成することができる。たとえば、ＭｃＮａｍａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２０，１３２５−２６（１９８４），Ｒ．Ｃ．Ｋｅｎｎｅｄｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２，２２０（１９８６）を参照されたい。
【００８１】
さらに、適切な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るために、マウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子にスプライシングする、「キメラ抗体」を作成するために開発された技術を使用することができる（Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１，６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍ．Ｓ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｓ．Ｔａｋｅｄａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４（１９８５））。あるいは、当技術分野で周知の方法を使用して、単鎖抗体を作成するために記述された技術を、（Ｇｌｃ）４−特異的単鎖抗体を作成するように改変することが可能である。関連の特異性を有するが、全く異なるイディオタイプの組成物の抗体を、ランダム組み合わせイムノグロブリンライブラリーから、鎖シャッフリングによって作成することができる（Ｄ．Ｒ．Ｂｕｒｔｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８，１１１２０−３（１９９１））。
【００８２】
リンパ球集団でｉｎ  ｖｉｖｏでの産生を誘導することによって、または免疫グロブリンライブラリーまたは文献に開示されている極めて特異的な結合試薬集団をスクリーニングすることによって、抗体を産生することができる（Ｒ．Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，３８３３−３８３７（１９８９））；Ｇ．Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４９，２９３−２９９（１９９１））。
【００８３】
［新生児のスクリーニング］
本明細書に開示の方法は、早期医学的介入を可能にするために、新生児期における罹患者を同定するための、新生児スクリーニングプログラムの一部として、都合よく使用することができる。多くの新生児スクリーニングプログラムは、踵の穿刺による血液を、新生児スクリーニングカード（たとえば、綿繊維濾紙）上に吸収させる、独特の検体収集法に依存する。フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を引き起こすフェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠損、およびメープルシロップ尿症（ＭＳＵＤ）を引き起こす分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ欠損等の、アミノ酸代謝欠陥が原因で起こる死亡および罹患の防止は、これらの乾燥した新生児血液スポットにおける高いアミノ酸レベル用の簡単な生化学検査の開発に負うている。
【００８４】
本明細書に開示のスクリーニング方法は、さらに、他の新生児スクリーニングアッセイと同時に、または平行して（すなわち、同一サンプルからであるが、必ずしも同一アッセイでなくてもよい）、たとえば、新生児の血液サンプルまたは新生児スクリーニングカード上の乾燥した血液スポットを用いて、有利に実施することが可能である。
【００８５】
新生児のスクリーニングカードは、コットン、セルロース、アセテート、およびそれらの組み合わせを含む、適当な天然材料のものであってもよく、合成材料のものであってもよい。
【００８６】
あるいは、新生児スクリーニングプログラムは、上述のような、他の生物学的サンプル中の（Ｇｌｃ）４の測定に基づいてもよい。たとえば、血液（たとえば、臍帯血）、血漿、血清、または尿中の（Ｇｌｃ）４を測定してもよい。特定の実施形態では、おむつ材料から尿を抽出してもよい。
【００８７】
従って、本発明のさらなる態様は、（上述の）（Ｇｌｃ）４の蓄積を特徴とする障害に関して新生児被験者をスクリーニングする方法であって、新生児被験者から採取した生物学的サンプル中の（Ｇｌｃ）４濃度を定量化または決定するステップ  を含み、基準値より高い濃度で、生物学的サンプル中に、（Ｇｌｃ）４が検出されるとき、新生児被験者を障害に罹患していると認定する、スクリーニング方法である。
【００８８】
ポンペ病に関して、新生児被験者をスクリーニングする好ましい方法は、新生児被験者から採取した血液サンプル中の（Ｇｌｃ）４濃度を定量化または決定するステップを含み、基準値より高い濃度で、生物学的サンプル中に、（Ｇｌｃ）４が検出されるとき、新生児被験者をポンペ病に罹患していると認定する。血液サンプルは、新生児のスクリーニングカードから採取されることが好ましい。上述の通り、この方法は、ＧＳＤ−ＩＩＩおよび他のグリコーゲン貯蔵病等の、他の障害を有する新生児被験者を同定することができる。本発明の方法のこの特徴は、これらのスクリーニング方法論の用途を減じることはなく、それどころか、有益な利点であると考えられる。あるいは、新生児被験者からの他の生物学的サンプル、たとえば、尿（たとえば、おむつ材料上に回収された）を使用することが可能である。
【００８９】
以下にもっと詳しく説明する、さらなる好ましい実施形態では、（Ｇｌｃ）４を、疾患が存在する生物マーカーとして使用し、ＧＳＤ−ＩＩ（および／または他のグリコーゲン貯蔵病）に関する新生児スクリーニングプログラムの一部として、タンデム型質量分析法を含む方法論を使用する。
【００９０】
上述の通り、新生児のスクリーニング方法を少なくとも部分的に自動化することが好ましい（上述の通り）。たとえば、一度、ＨＰＬＣカラム上またはタンデム型質量分析計内にサンプルを置いたら、その後は、自動システムを使用して、データを獲得して分析することが好ましい。
【００９１】
［タンデム型質量分析法（ＴＭＳ）に基づく方法論］
ＴＭＳは、上述した本発明の方法を実行するのに好ましい方法論である。三連四重極質量分析計を使用して混合物を分析するためのＴＭＳの概念は、Ｙｏｓｔ  ａｎｄ  Ｅｎｋｅ，Ｔａｎｄｅｍ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｔｙ，Ｆ．Ｗ．ＭｃＬａｆｆｅｒｔｙ（Ｅｄ．），Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８３），ｐｐ．１７５−１９５のＴａｎｄｅｍ  ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙによって考え出された。類似した構造型の化合物を選択的に検出するために、共通のプロダクトイオンに断片化する、分子種を同定するための前駆体イオンスキャン機能、または共通の断片をなくすイオンを同定するためのコンスタント・ニュートラル・ロス・スキャン機能、または選択された前駆体およびプロダクトイオンのみを検出するマルチ反応モニタリングのいずれかを使用する。ワークアップおよび分析の前に、安定した同位元素で標識された類縁体等の適切な内部標準を生物マトリックスに加えることによって、標的被分析物の正確な定量化が容易になる。
【００９２】
三連の四重極型質量分析法および四重極型および飛行時間型質量分析計を組み合わせたハイブリッド質量分析法を含むが、その限りではない、当技術分野で周知の適当なＴＭＳ方法論を使用することが可能である。イオントラップおよびイオンサイクロトロン共鳴型質量分析計を使用することもできる。
【００９３】
ＴＭＳは、新生児スクリーニングプログラムに特に適する。アミノ酸およびアシルカルニチンのみを定量化できることにより、２０より多くの代謝障害を評価することが可能になる。ＰＫＵ（Ｃｈａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３９：６６）、ＭＳＵＤ（Ｃｈａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１：６２）、高メチオニン血症（Ｃｈａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３：２１０６）、および中鎖アシル−ｃｏＡデヒドロゲナーゼ欠損（ＭＣＡＤ）（Ｃｈａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３：２１０６）は全て、新生児期に、ＴＭＳで確実に検出されることが遡及的共同研究で確認された（Ｓｗｅｅｔｍａｎ，（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４２：３４５も参照）。サンプル混合物を流動溶媒に注入したとき、インターレーススキャン機能を使用して、ＴＭＳで同時に被分析物が定量化される。バッチ法は、９６ウェル形式でサンプルを準備して分析し、自動化コンピューターアルゴリズムを使用して結果を分析し、１日に１０００サンプルを分析できる能力を証明したと報告されている（Ｒａｓｈｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３：１１２９）。ＴＭＳを使用した新生児のスクリーニングは、様々な管轄で実施されている。
【００９４】
本発明者が知る限り、本明細書に記載のＨＰＬＣ試験およびＴＭＳ試験が、ポンペ病に罹患している被験者からの血漿（または、他の血液由来）サンプル中の、高い（Ｇｌｃ）４濃度を報告する、第１号である。さらに、（Ｇｌｃ）４を生物マーカーとして使用して、ポンペ病に関してスクリーニングするための最初のＴＭＳプロトコール、特に、最初のこのような新生児スクリーニングプログラムを、本明細書に開示する。
【００９５】
従って、本発明は、生物学的サンプル中の（Ｇｌｃ）４濃度を、ＴＭＳで定量化または決定する方法を、さらに提供する。当技術分野で周知の方法で、好ましくは、パラ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）誘導体（たとえば、ブチル−ＰＡＢＡ）または２−アミノアクリドンを用いて、分析前に、サンプル中のオリゴ糖類を誘導体化することが可能である。ＴＭＳに最も特異的で且つ高感度のスキャン機能を決定するために、誘導体の断片化を調査した。たとえば、ｍ／ｚ８６６からｍ／ｚ５０９への遷移後、エレクトロスプレーイオン化ＴＭＳ（ＥＳＩ−ＴＭＳ）と共に三連四重極質量分析計を使用したマルチ反応モニタリングによって、（Ｇｌｃ）４のブチルＰＡＢＡ誘導体を検出できることを、本研究者は確認した。他の誘導体化方法を使用できること、また、適切なスキャン機能を使用して、これらの代替（Ｇｌｃ）４誘導体を検出できることを、当業者は理解するであろう。同様に、ＥＳＩに代わるものとして、多数の代替イオン化方法が当技術分野で知られている（たとえば、マトリックス支援レーザー脱着イオン化；ＭＡＬＤＩ）。
【００９６】
特定の実施形態では、上述した通り、ＴＭＳ分析の前に、被分析物を濃縮する。（Ｇｌｃ）４を特異的に認識する抗体を結合させた常磁性ビーズを用いた免疫沈降によって、（Ｇｌｃ）４を濃縮することが特に好ましい。次いで、適切な溶媒を使用して、この（Ｇｌｃ）４をビーズから溶離することができる。一般に（しかし、必ずしもそうではないが）、濃縮ステップは、誘導体化の前に実行される。他の特に好ましい実施形態では、同一サンプルから、関心のある他の被分析物を免疫精製することが可能である。たとえば、代謝障害に特有の異なる被分析物に特異的な抗体をそれぞれ担持する、ビーズの混合集団をサンプルに加えてもよい。この方式では、同一サンプルを使用して、多種多様な遺伝性代謝障害に関してスクリーニングすることが可能である。
【００９７】
あるいは、サイズ排除に基づく方法を使用して、（Ｇｌｃ）４を濃縮してもよい。
【００９８】
さらに、妨害物質または別の望ましくない物質を減少させるために、「浄化」ステップまたは前処理ステップを使用してもよい。たとえば、生物学的サンプル中のグルコースと（Ｇｌｃ）４との比率が比較的高い（たとえば、２：１またはそれより高い）場合、ＴＭＳで分析する前に、サンプル中のグルコース濃度を下げることが好ましい。サンプル中のグルコース濃度は、当技術分野で周知の方法で下げることができる。１つの代表的且つ好ましい方法は、一般に、誘導体化前に、サンプルを酵素処理に供してグルコースを除去する方法である。たとえば、生物学的サンプルからグルコースを減少させるかまたは除去するために、サンプルをグルコースオキシダーゼで消化する。酵素処理は、（Ｇｌｃ）４四糖を分解しないか、または微々たる程度まで分解するに過ぎないことが好ましい。あるいは、一般に、誘導体化ステップ後に、分離（たとえば、クロマトグラフィ）技術を使用して、グルコースを（Ｇｌｃ）４四糖と分離してもよい。例を挙げて説明するために、誘導体化ステップ後に、液体クロマトグラフィ（たとえば、逆相）を使用して、誘導体化したグルコースを、誘導体化した（Ｇｌｃ）４と分離することができる。
【００９９】
内部標準は、被分析物と同一の条件に付すために、一般に、操作前にサンプルに加える。適当な内部標準を使用してもよい。＋６Ｄａの質量シフトを与えるために、グルコース残基の１つを［Ｕ−１３Ｃ］標識されたグルコースで置き換えた（Ｇｌｃ）４ホモログ（実施例に記載の通り）が適当であり、また好ましい。既知量の内部標準をサンプルに加える。サンプル中の（Ｇｌｃ）４および内部標準によって生成されるシグナルの比率によって、サンプル中の（Ｇｌｃ）４の出発量を、較正曲線を使用して決定することが可能になる。較正曲線は、同一定量の内部標準を使用した、異なる既知濃度のＧｌｃ４標準に対する、シグナル比（（Ｇｌｃ）４と内部標準）のプロットである。
【０１００】
好ましい代替内部標準は、重水素標識したグルコース四量体である。
【０１０１】
生物学的サンプル中の（Ｇｌｃ）４を定量化または決定するための本発明の好ましい方法は、（１）生物学的サンプルを採取するステップと、（２）既知量の、適当な安定な同位元素で標識された標準をサンプルに加えるステップと、（３）任意に、磁化ビーズで免疫沈降し、続いて適当な溶媒でビーズから溶離することにより、サンプル中の（Ｇｌｃ）４を濃縮するステップと、（４）たとえば、ブチルＰＡＢＡまたは２−アミノアクリドンでグルカン類を誘導体化するステップと、（５）ＴＭＳを使用して、（Ｇｌｃ）４を定量化するステップとを含む。上述の通り、任意に、ステップ４より前の酵素処理、またはステップ５より前のクロマトグラフィ分離によって、妨害するグルコースシグナルを減少させてもよい。
【０１０２】
［Ｕ−１３Ｃ］標識されたグルコース四量体を、ＴＭＳ分析用内部標準として使用することが好ましい。
【０１０３】
前述の方法論を、本発明のスクリーニングおよびモニタリングアッセイの好ましい実施形態で、使用することが可能である。さらに上述した通り、本発明の方法を、部分的にまたは完全に自動化することが好ましい。
【０１０４】
ＴＭＳに基づく方法論は、新生児のスクリーニングカードからの乾燥した血液スポットで、（Ｇｌｃ）４を定量化または決定するのに特に適当する。この実施形態によれば、上記の方法は、適当な溶媒（たとえば、水性溶媒または水性溶媒と有機溶媒との混合物）を使用して、乾燥した血液スポットからオリゴ糖類を抽出するステップをさらに含む。あるいは、ＴＭＳを使用して、（たとえば、濾紙またはおむつ材料上の）乾燥した尿サンプル中の（Ｇｌｃ）４の存在を、定量化または決定することが可能である。
【０１０５】
従って、特に好ましい実施形態として、本発明は、ポンペ病に関して、新生児被験者をスクリーニングする方法であって、（１）一般的に、新生児のスクリーニングカード（たとえば、濾紙）上の乾燥した血液スポットの形態の、血液サンプルを提供するステップと、（２）溶媒を使用して、この乾燥した血液スポットからオリゴ糖類を抽出するステップと、（３）既知量の、適当な安定した同位元素で標識された内部標準を、各サンプルに加えるステップと、（４）オリゴ糖類を（たとえば、ブチル−ＰＡＢＡで）誘導体化するステップと、（５）特異的スキャン機能を使用して、ＴＭＳで、（Ｇｌｃ）４誘導体を分析するステップと、（６）誘導体化された（Ｇｌｃ）４によって生成されるシグナルと、誘導体化された内部標準シグナルとを比較することによって、サンプル中の（Ｇｌｃ）４を定量化または決定するステップと、（６）（上述の通り）基準値より大きい、サンプル中の（Ｇｌｃ）４濃度に基づいて、これらの被験者を、ポンペ病に罹患していると、推定的に認定するステップとを含む方法を提供する。
【０１０６】
上述の通り、この方法は、任意に、被分析物濃縮ステップおよびグルコース除去ステップをさらに含む。
【０１０７】
これまで本発明を説明してきたが、本発明を制限するためではなく、例を挙げて説明するために限って本明細書に含まれる、実施例を参照しながら、本発明を説明する。
【０１０８】
［実施例１  材料および装置］
α−Ｄ−Ｇｌｃ（ｌ→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃ（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃ｛（Ｇｌｃ）４｝、マルトテトラオース（Ｍ４）、マルトペンタオース（Ｍ５）、マルトヘキサオース（Ｍ６）、マルトヘプタオース（Ｍ７）、セロペンタオース（Ｃ５）、シアノボロ水素化ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）、無水安息香酸、ブチル−４−アミノ安息香酸（ＢＡＢ）、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン（ＰＭＰ）、および２′−フコシルラクトースは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。２−アミノアクリドン（ＡＭＡＣ）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から購入した。メタノール、アセトニトリル（ＨＰＬＣ用等級）、酢酸および塩酸は、ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）から購入した。他の試薬は全て、分析用等級のものであり、市販されていた。
【０１０９】
全てのＨＰＬＣ溶媒を濾過し（０．２μｍ膜）、使用直前に脱気した。使用前に、ＰＭＰをメタノールから再結晶化した。Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｖａｃ  Ｃ１８カートリッジ（１００ｍｇ）およびＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８カラム（内径２５０×４．６ｍｍ、５μｍ）をＷａｔｅｒｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）から購入した。ＨＰＬＣシステムは、Ｗａｔｅｒｓ  ６２６ポンプ、４８６波長可変吸光度検知機、７１７プラス・オートサンプラー、および６００Ｓコントローラー（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を備えていた。
【０１１０】
質量スペクトル分析を実施した。Ｑｕａｔｔｒｏ−ＬＣエレクトロスプレーイオン化三連四重極タンデム質量分析計（ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）、（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））は、Ｈｅｗｌｅｔｔ−ＰａｃｋａｒｄバイナリポンプおよびＧｉｌｓｏｎ２１５液体取扱い装置を備えていた。内部標準の合成に使用した凍結乾燥した組換えＴＶＡＩＩは、Ｄｒ．Ｔａｋａｓｈｉ  Ｔｏｎｏｚｕｋａ（応用生物科学部、東京農業大学、東京）の惜しみない贈物であった。
【０１１１】
［実施例２  （Ｇｌｃ）４のＨＰＬＣアッセイ］
＜ＨＰＬＣ分析用サンプル調製＞
酵素置換療法を受けている患者から単離するサンプルの場合、治療開始前、および治療中、２週間ごとに、血漿および６時間尿サンプルを採集した。（Ｇｌｃ）４レベルの試験前に、尿サンプルおよび血漿サンプルの両者を、−２０℃で凍結した。
【０１１２】
尿サンプルを遠心分離し、５０μｌの上澄を、１０μｇの内部標準（脱イオン水１０μｌ中のセロペンタオース（Ｃ５））と混合した。脱イオン水１０μｌ中に含まれる既知量の（Ｇｌｃ）４を、１０μｇのＣ５を含有する対照尿のアリコート５０μｌに加えることによって、尿標準を調製した。
【０１１３】
ガラス製の円錐形試験管内で、血漿または血清（２００μｌ）を、１μｇの内部標準（Ｃ５）および５００μのメタノールと混合し、６，０００ｒｐｍにて４分間遠心分離し、変性タンパク質をペレット化させた。Ｎ２条件で上澄を乾燥させ、６０μｌの脱イオン水で再構成した。既知量の（Ｇｌｃ）４を、血漿対照サンプルのアリコート２００μｌに加えることによって、血漿標準を調製した。
【０１１４】
＜（Ｇｌｃ）４をＨＰＬＣ分析するためのオリゴ糖類の誘導体化＞
Ｐｏｕｌｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ（（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９３，６６１−６８９）の方法の変法を使用して、ブチル−ｐ−アミノ安息香酸（ＢＡＢ）でオリゴ糖類を誘導体化した。必要に応じて用時調製した誘導体化試薬は、ＢＡＢ（５４ｍｇ）、ＮａＢＨ３ＣＮ（４７ｍｇ）、酢酸（０．１１ｍｌ）、およびメタノール（１．７６ｍｌ）を含んでいた。上述の通りに調製した各サンプルに、試薬１４０μｌを加えた。サンプル混合物を８０℃にて４５分間インキュベートし、次いで、温度まで冷却した。１５％アセトニトリル０．９ｍｌを加え、この混合物を１０秒間、渦巻攪拌した。固相抽出を使用して、未反応の試薬を誘導体化オリゴ糖類から除去した。サンプルをＣ１８カートリッジに充填し、１ｍｌのメタノールに続いて、１ｍｌの脱イオン水で前処理し、１５％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル／水  １ｍｌで洗浄した。次いで、ＢＡＢ標識されたオリゴ糖類を３０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル／水  １ｍｌで溶離した。尿サンプルの場合、溶離液をＨＰＬＣで直接分析した。血漿サンプルの場合、溶離液をＮ２下で乾燥させ、分析前に、３０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル／水１５０μｌで再構成した。
【０１１５】
２−アミノアクリドン（ＡＭＡＣ）、ＰＭＰ、およびオリゴ糖類の過ベンゾイル（ＰＢ）誘導体を、公表されている手順に従って調製した（Ｏｋａｆｏ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８，４４２４−４４３０；Ｚｏｐｆ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｆｕ，Ｄ．，（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９，１１３−１２３；Ｄａｎｉｅｌ，Ｐ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．
Ｒｅｓ．９７，１６１−１８０）。
【０１１６】
＜ＨＰＬＣ分析および定量＞
ＢＡＢ標識されたオリゴ糖類を、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８カラムで、流量０．５ｍｌ／分にて分離し、溶出液のＵＶ吸光度を３０４ｎｍでモニタリングした。ＨＰＬＣ溶離は、３０分間、６ＮのＨＣｌを使用してｐＨ４〜６に調節したアセトニトリル３０％および０．０１ｍＭテトラブチルアンモニウムクロリド７０％を用いた定組成溶離であった。３２分にアセトニトリルを５０％に上昇させ、３８分に初期条件に戻すことによって、余分の未反応のＢＡＢおよび他の不純物を、カラムから洗い流した。総分析時間は、サンプル当たり４５分であった。適切な場合にはベースライン補正を用いて、（Ｇｌｃ）４および内部標準（Ｃ５）のピーク面積を自動的に計算し、これらの面積の比率を使用して、（Ｇｌｃ）４を定量化した。
【０１１７】
＜標準およびＨＰＬＣ分画のＥＳＩ−ＭＳＩＭＳ分析＞
サンプル全部か、またはＨＰＬＣ分離後に、分画として採集したサンプルのいずれかの、ＢＡＢオリゴ糖誘導体を、タンデム質量分析計を用いたＥＳＩ−ＭＳおよびＥＳＩＭＳ／ＭＳで分析した。アセトニトリル：水（１：１；ｖ／ｖ）の担体溶媒への注入は、２０μｌのＲｈｅｏｄｙｎｅループで、１５μｌ／分の流量にて行った。キャピラリおよびコーン環境は、それぞれ、３．５０ｋＶおよび７８〜９５Ｖであり、ソースブロック温度および脱溶媒和温度は、それぞれ、８０℃および１５０℃であった。４５〜７７ｅＶの衝突エネルギーおよび３．５×１０−３ｍＢａｒの気体セル圧を、衝突誘起解離実験に使用した。陽イオンモード、走査速度１００ａｍｕ／ｓで、質量スペクトルを入手した。
【０１１８】
［実施例３  ＨＰＬＣによる（Ｇｌｃ）４の分離および分析］
実施例２に上述した、同一の高解像度液体クロマトグラフィカラムを使用したＨＰＬＣによるオリゴ糖類の定量化における適性について、４つの誘導体を比較した。これらの誘導体は、ブチル−ｐ−アミノ安息香酸（ＢＡＢ）、２−アミノアクリドン（ＡＭＡＣ）、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン（ＰＭＰ）、および無水安息香酸であった。ＢＡＢ誘導体化は、感度、再現性、高分解能、簡便性、および低価格であるという利点に基づいて、この用途のために、最終的に選択された。この比較において、ＡＭＡＣ誘導体化は高い感度を有していたが、（Ｇｌｃ）４を、尿中に多量に認められる乳糖と分離することができず、また、ＰＭＰ誘導体化は、優れた分解能を有していたが、感度は比較的低かった。過ベンゾイル化は優れた分解能およびかなりの感度を有していたが、時間がかかりすぎた。アノマーの還元および完全な過ベンゾイル化を含む、全手順に３０時間以上を要したのに対して、ＢＡＢ方法では、わずか２時間であった。さらに、ＢＡＢ誘導体は、４０℃で数週間安定していたが、ＰＭＰ誘導体およびＡＭＡＣ誘導体は、はるかに不安定であった。
【０１１９】
ＢＡＢ標識された（Ｇｌｃ）４と、尿中および血漿中に存在する他のオリゴ糖類との分離は、溶離溶媒および流量を慎重に選択し、疾患が存在しないことが分かっている、様々な年齢の幼児（対照）からの多数のサンプルを分析することによって、達成される。選択された患者サンプルからの分画を、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳで分析することによって決定するとき、本発明の方法の特徴は、（Ｇｌｃ）４の保持時間に既知の妨害シグナルが存在しないことによって、実質的に保証される。（Ｇｌｃ）４と他のオリゴ糖類との分離を示す正常な尿クロマトグラムの１例を、図１（パネルＡ）に示す。はるかに大きい（Ｇｌｃ）４のシグナルを示すＧＳＤ−ＩＩ患者の尿を比較のために含める（図１、パネルＢ）。その他の、同定された尿性オリゴ糖類を、図１（パネルＡおよびＢ）に示す。患者の尿で、グルコースシグナルが比較的低いことがポンペ病における低血糖症という表現型と一致することは、注目に値する（（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，第７版、第２巻（Ｓｃｒｉｖｅｒ，Ｃ．Ｒ．，Ｂｅａｕｄｅｔ，Ａ．Ｌ．，Ｓｌｙ，Ｗ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｖａｌｌｅ，Ｄ．編），ｐｐ．９３５−９６５，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋの、Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｔ．ａｎｄ  Ｂｕｒｃｈｅｌｌ，Ａ．，（１９９５））。正常な対照（図２、パネルＡ）およびＧＳＤ−ＩＩ患者（図２、パネルＢ）における血漿（Ｇｌｃ）４レベルの比較も実施した。明確にするために、大きいグルコースシグナルは排除した。
【０１２０】
ＢＡＢ法は、（Ｇｌｃ）４と、マルトテトラオース（Ｍ４）とを分離できないことに留意すべきである。図３の例から分かる通り、ＰＭＰ誘導体（Ｍ４と（Ｇｌｃ）４とを完全に分離することができる）の分析によって、選択された対照および患者にＭ４が存在しないことを、本発明者は確認した。この方法に基づいて、尿中のＭ４含量は、ＢＡＢ法の検出限界より低い、＜１μｇ／ｍｌであると推定され、従って、無視できると考えられる。
【０１２１】
［実施例４  （Ｇｌｃ）４に対するＨＰＬＣ方の感度および特異性］
シグナル対ノイズ比が３より大きいと定義されている、（Ｇｌｃ）４に対する本方法の絶対感度は、１回のＨＰＬＣ注入について、３ｎｇ（４．５ｐｍｏｌ）であった。尿サンプルの場合、検出限界は、サンプル総量１ｍｌから５０μｌ注入に基づいて、１．２μｇ／ｍｌであり、血漿の場合、総量１５０μｌから１００μ注入に基づいて、検出限界は０．０２μｇ／ｍｌであった。この感度は、正常な対照値の範囲に基づいて、十分である（表１参照）。
【０１２２】
【表１】
2004501365.tif 000002
【０１２３】
［実施例５　（Ｇｌｃ）４に対するＨＰＬＣアッセイの確度および精度］
サンプル調製中および分析中に生じる損失を評価するために、内部標準（Ｃ５）を導入した。添加した（Ｇｌｃ）４濃度に対する、（Ｇｌｃ）４とＣ５のピーク面積比の尿標準曲線は、１５μｇ／ｍｌまで直線状であり、これは、尿サンプルでは、３００μｇ／ｍｌに相当する。血漿標準曲線は、１μｇ／ｍｌまで直線状であり、これは、血漿サンプルでは、７．５μｇ／ｍｌに相当する。直線回帰のｒ２値は、＞０．９９９であった。キャリブレータの反復分析によれば、本発明の方法の確度および精度は、十分に、臨床アッセイの許容範囲内であった（表２）。週１回の頻度で、同一品質の対照サンプルを分析することによって、本方法の再現性を決定した。表２に示す通り、尿対照サンプルでも、血漿対照サンプルでも、結果は１０％以内で一致した。
【０１２４】
【表２】
2004501365.tif 000003
【０１２５】
［実施例６　ＨＰＬＣ単離されたオリゴ糖類の、ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳによる同定］
ＨＰＬＣクロマトグラフ分離が適当であると考えたとき、ＥＳＩ−ＭＳを使用して、選択された患者尿サンプル中の（Ｇｌｃ）４の同一性を確認した。患者および対照サンプルのＨＰＬＣ分析中に回収された、（Ｇｌｃ）４に対応する分画を、ＥＳＩ−ＭＳで分析した。ＢＡＢ標識されたグルコース四量体のナトリウム付加物に対応する、ｍ／ｚ８６６のイオン質量の優性で決定するとき、ほとんどが、テトラグルコースに関して一様であった。ＨＰＬＣで分析するとき、多数の幼児対照尿サンプル中の（Ｇｌｃ）４の量が、予想より高いことが、方法の開発中に観察された。ＥＳＩ−ＭＳによる（Ｇｌｃ）４分画の分析で、（Ｇｌｃ）４がｍ／ｚ６８８の化合物と共溶離することが明白になった。ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析を使用して、この化合物は、デオキシヘキソース−ヘキソース−ヘキソースＰＡＢ誘導体のナトリウム付加物であることが分かった。この化合物は、ヒト母乳の成分である２′−フコシルラクテートであるという仮定（Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ，Ｐ，ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５１，８９−９７）が、確実な検体のＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析で裏付けられた。次いで、この化合物と（Ｇｌｃ）４とを分離するために、ＨＰＬＣ方法を適当に修正した。この方法は、分子的に特異的でない検出器に頼る臨床用ＨＰＬＣアッセイの開発における質量分析法の価値を強く示すものである。
【０１２６】
（Ｇｌｃ）４と異性体マルトテトラオース（Ｍ４）とを区別するために、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳも使用したが、これらの化合物は、アッセイ条件で、ＨＰＬＣによって分離しないためである。（Ｇｌｃ）４およびＭ４のＮａ＋付加物の衝突誘起解離（ＣＩＤ）は、結果として、図４に示す断片化パターンを示した。ｍ／ｚ７０４および５４２におけるイオンは、ＰＡＢ修飾グルコース残基上にナトリウムカチオンを保持して、非還元末端からグルコース残基を連続的に喪失することによって生じ、ｍ／ｚ５０９におけるイオンは、非還元末端上にナトリウムカチオンを保持して、ＰＡＢグルコース残基を喪失することによって生じる。断片ｍ／ｚ５０９と、ｍ／ｚ５４２の平均（±２標準偏差（ＳＤ））強度比は、（Ｇｌｃ）４スペクトルでは１．５７（±０．１１）（図４、パネルＡ）であり、Ｍ４スペクトルでは０．６５（±０．０５）（図４、パネルＢ）であると決定された。この比率の誤差は、３週間にわたって７回繰返した分析で、（Ｇｌｃ）４では３．６％であり、Ｍ４では４．３％であった。これらのデータから、（Ｇｌｃ）４の場合には、非還元末端からの喪失より還元末端からの残基喪失が好ましいが、Ｍ４の場合には、その逆が当てはまることが示唆される。異なる患者６例の尿中のヘキソース四量体からのｍ／ｚ５０９断片イオンとｍ／ｚ５４２断片イオンとの比率は、（Ｇｌｃ）４標準のそれと類似した１．６４±０．４４（平均値±２）であり、四量体は、確かに、主に（Ｇｌｃ）４であったことがわかる。１例を図４（パネルＣ）に示す。
【０１２７】
ＧＳＤ−ＩＩ患者の一部の尿に見られる大きいオリゴ糖類を特性決定するために、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳをさらに適用した。このような患者からの全ＢＡＢ誘導体化尿のＥＳＩ−ＭＳ分析の１例を図５に示す。ｍ／ｚ８６６、１０２８、１１９０および１３５２のイオンに割当てられる正体は、それぞれ、４、５、６および７単位を有するヘキソースオリゴマーのナトリウム付加物である。これらのイオンに関するシグナルは、対照尿サンプルでははるかに低いか存在せず、全て、グリコーゲンに由来することが推測される。ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳを使用した、これらの付加物の分析で、標準的なＭ５、Ｍ６およびＭ７に由来するものと同一質量を有するプロダクトイオンが明白になり、これらの付加物は、キソースオリゴマーであることが確認された。しかし、（Ｇｌｃ）４およびＭ４の場合と同様、ある種のイオンの強度に違いがあり、これらを表３にまとめる。尿性ヘキソースオリゴマーと、Ｍ５、Ｍ６、およびＭ７との間の主な違いは、それぞれ、ｍ／ｚ５０９とｍ／ｚ５４２、ｍ／ｚ６７１とｍ／ｚ７０４およびｍ／ｚ８３３とｍ／ｚ８６６の比率である。非還元末端に由来する生成物イオンに比べて、この断片化経路からのプロダクトイオン強度が高いことによって決定するとき、尿性ヘキソースオリゴマーでは、還元末端からの喪失が有利であることが、以上のデータからわかる。ＧＳＤ−ＩＩ患者およびＧＳＤ−ＩＩＩ患者の尿中で同定された、６〜８個の残基を含む、グルコースオリゴマーについて先に報告した通り、患者尿中のヘキソースオリゴマーは、少なくとも１つのα−１→６結合を含むことが、以上の結果から分かる。（Ｌｅｎｎａｒｔｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８３，３２５−３３４）。
【０１２８】
【表３】
2004501365.tif 000004
【０１２９】
［実施例７　尿中および血漿中の（Ｇｌｃ）４濃度］
年齢範囲で分けた正常対照の、尿中および血漿中の（Ｇｌｃ）４濃度を表１にまとめる。（Ｇｌｃ）４排泄物と年齢上昇との反比例が確認され、これは、血漿より尿で、量的に明白であった。表４および表５から分かるように、ＧＳＤ−ＩＩ患者の尿中および血漿中（Ｇｌｃ）４濃度も、年齢依存的のようであった。
【０１３０】
【表４】
2004501365.tif 000005
【０１３１】
【表５】
2004501365.tif 000006
【０１３２】
（Ｇｌｃ）４の尿中排泄物は、食事、空腹状態、および身体活性に影響されることが、以前に報告されている（Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．Ｊ．ａｎｄ  Ｗｈｅｌａｎ，Ｗ．Ｊ．（１９６０），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７６，２５７−２６３）。表１の尿（Ｇｌｃ）４レベルを、尿クレアチニン濃度に標準化した。サンプル採集中、食事および身体活性因子に関して、管理しようとしなかった。しかし、ＧＳＤ−ＩＩ患者２１例（幼児、小児、および成人型）から、血漿中および尿中の（Ｇｌｃ）４濃度は共に、年齢が対応する正常対照のものより、少なくとも係数２で、一貫して高いことが分かる。表４は、若干のＧＳＤ−Ｉ患者およびＧＳＤ−ＩＩ１患者の尿（Ｇｌｃ）４濃度も示す。ＧＳＤ−ＩＩ１患者は、グリコーゲンを蓄積し、高レベルの（Ｇｌｃ）４を排泄する。（Ｇｌｃ）４は、グリコーゲンのα−アミラーゼ分解によって生じる限界デキストリンであることが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで証明されている（Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．Ｊ．ａｎｄ  Ｗｈｅｌａｎ，Ｗ．Ｊ．（１９６０），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７６，２５７−２６３，Ｕｇｏｒｓｋｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．１，２７−３８）。アカゲザルにグリコーゲンを静脈内投与すると、（Ｇｌｃ）４排泄物が増加することが証明されている（Ｋｕｍｌｉｅｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １７６，３９−４８）。酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）は、１→４結合でも１→６結合（分枝部位）でも、グリコーゲンを分解することが報告されている（Ｂｒｏｗｎ，Ｂ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ（１９７０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．９，１４２３−１４２８）。従って、ＧＡＡ欠損（ＧＳＤ−ＩＩ）および脱分枝酵素欠損（ＧＳＤ−ＩＩＩ）によって蓄積されるグリコーゲンは、類似した立体配置を有する可能性がある。グリコーゲンの多い組織の分解およびターンオーバーによる、循環内へのグリコーゲン放出の増加によって、血漿および尿中の（Ｇｌｃ）４濃度が上昇するであろうと予測される。ＧＳＤ−Ｉ患者の尿中（Ｇｌｃ）４濃度は、対照の範囲内である。これは、ＧＳＤ−Ｉでは、主として貯蔵される物質が、グリコーゲンよりむしろ脂肪であることによる公算が高い（Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，第７版、第２巻（Ｓｃｒｉｖｅｒ，Ｃ．Ｒ．，Ｂｅａｕｄｅｔ，Ａ．Ｌ．，Ｓｌｙ，Ｗ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｖａｌｌｅ，Ｄ．編），ｐｐ．９３５−９６５，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）の、Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｔ．ａｎｄ  Ｂｕｒｃｈｅｌｌ，Ａ．（１９９５））。
【０１３３】
［実施例８  臨床診断のためのＨＰＬＣ法の利用］
ＧＳＤＩＩ患者における血漿（Ｇｌｃ）４レベルを、本明細書にはじめて報告する。幼児発症患者および若年発症患者は、全例が著明に高いレベルを有するが、成人発症ＧＳＤＩＩ患者２例は、正常範囲内であった。この研究所で、ＧＳＤＩＩ患者について測定された尿（Ｇｌｃ）４濃度は、１９〜８２１ｎｍｏｌ／ｍｇクレアチニン（２．２〜９２．８ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニン）の範囲であり、これは、Ｏｂｅｒｈｏｌｚｅｒａｎｄ  Ｓｅｗｅｌｌ（（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３６，１３８１）によって報告された、ＧＳＤ−ＩＩ患者５例の値の範囲と類似している（６．８〜９０８ｎｍｏｌ／ｍｇクレアチニン）。Ｐｅｅｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ（（１９９４）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４０，９１４−９２１）によって報告された値（７８−３２４ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニン）は、はるかに高い。Ｌｕｎｄｂｌａｄらは、（Ｇｌｃ）４濃度を、排泄速度として、ｍｇ／２４時間で報告している（（１９７６）Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．３，５１−５４）。これは、おそらく間違いなく、（Ｇｌｃ）４蓄積状態に関する最も正確なデータであるが、２４時間尿サンプル採集は、通常、臨床診断状況では実施できない。適切な対照年齢範囲を比較に使用すれば、この研究で得られる研究に基づいて、サンプルを受け取ってから２４時間以内に、推定上の診断を行うのに、ポンペ病を有する臨床的疑いまたはリスクが高い患者からのスポット尿サンプル（既知のクレアチニンレベルを有する）で十分であろう。その後、古典的酵素学で疾患診断を確認するために、筋生検または皮膚線維芽細胞が推奨される。
【０１３４】
［実施例９  生物マーカーとしての（Ｇｌｃ）４の使用］
＜試験被験者＞
皮膚線維芽細胞および／または筋において、正常の１％未満に低下したＧＡＡ活性によって実証される、幼児ＧＳＤ−ＩＩに罹患している幼児３例を、酵素置換療法のフェーズＩ／ＩＩ臨床治験のための研究に登録した。酵素ソースは、ｒｈＧＡＡ分泌ＣＨＯ細胞の培地から精製した、組換えヒトＧＡＡ（ｒｈＧＡＡ）であった。この研究は、施設内治験審査委員会によって認可された、また、親の文書によるインフォームド・コンセントを得た。詳細な患者の特徴および心機能、肺機能、神経機能および運動機能の臨床評価を、臨床結果を報告するの紙に記載した（Ａｍａｌｆｉｔａｎｏ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｄ．３：１３２）。これらの患者３例は、治療開始時の重症度に関して、異なる臨床徴候を有していた。患者１（Ｐｔｌ）は、４ヶ月齢で治療を受け、過度の心肥大、重度運動遅延、および成長障害を伴う摂食困難を呈する、疾患の最も進行したステージであった。Ｐｔ２は、３ヶ月齢で治療を開始し、重度心筋症、中等度運動遅延および摂食困難を呈していた。Ｐｔ３は、２  １／２ヶ月齢に治療を開始したとき、疾患の早期であった。この患児は、重大な運動遅延を呈したが、心筋症は認めらなかった。
【０１３５】
＜（Ｇｌｃ）４測定＞
治療開始前、および治療中、２週間ごとに、血漿および６時間尿を採集した。試験前に、尿および血漿サンプルの両者を、−２０℃で凍結した。実施例２に上述した通り、ＢＡＢを誘導体として使用して、ＨＰＬＣで尿中および血漿中の（Ｇｌｃ）４レベルを測定した。定性分析の場合、Ｃ５を各被験サンプルに内部標準として加え、および２つの対照サンプル（低（Ｇｌｃ）４含量および高（Ｇｌｃ）４含量）を毎日測定した。
【０１３６】
＜ＨＰＬＣ法を使用した、疾患進行および治療応答のモニタリング＞
患者３例に関する、治療前および治療中の、尿の（Ｇｌｃ）４レベルを図６に示す。血漿中の（Ｇｌｃ）４のレベルを図７に示す。（Ｇｌｃ）４レベルは、治療開始時の臨床重症度と良好な相関関係を示した。最も進行したステージの疾患を有していたＰｔ１は、血漿でも、尿でも、最も高い（Ｇｌｃ）４レベルを有していたが、Ｐｔ２は、中等度の疾患および中程度に上昇したレベルの（Ｇｌｃ）４含量を有していた。Ｐｔ３は、最も穏やかな疾患症状を有し、また、血漿のみで（Ｇｌｃ）４上昇を示し、尿では正常であった。ポンペ病に関する生物マーカーとして、血漿中の（Ｇｌｃ）４測定は、その尿中レベルよりも敏感なようである。これは、血漿中の（Ｇｌｃ）４上昇の大きさが、尿レベルより大きいことおよびＰｔ３における正常な尿レベルによって現れる。
【０１３７】
治療の最初の２〜３ヶ月の間に、患者３例全てで、尿中および血漿中（Ｇｌｃ）４レベルが共に低下した（図６および７）。また、低下は、尿より血漿で顕著であった。しかし、Ｐｔｓ１および２の（Ｇｌｃ）４レベルはその後上昇し、付随して、臨床的に衰退し、また、ｒｈＧＡＡに対する抗体が産生された。血漿分離法、ＩＶＩＧ、サイトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）および毎日の酵素注入を１０日間用いて、抗体を除去し、耐性を誘導しようとする試みは、一時的に臨床改善をもたらしたが、その後、再び臨床的に衰退し、Ｐｔ１では、第２の免疫寛容療法が必要であった。Ｐｔ１では、（Ｇｌｃ）４レベルと、臨床経過および免疫寛容療法に対する応答の間に、相関関係があった（図６および７）。臨床経過および免疫寛容療法に対する応答の類似した相関関係が、Ｐｔ２でみられた。抗ｒｈＧＡＡ抗体が発生していなかったＰｔ３は、引き続いて、正常な心評価、神経学的評価および運動評価を有している。Ｐｔ３の（Ｇｌｃ）４レベルは、治療の最初の２ヶ月間で正常化し、それ以来、概ね正常なままである。患者３例全てにおける臨床経過および（Ｇｌｃ）４レベルの相関関係は、また、尿より血漿で顕著であった。（Ｇｌｃ）４レベル、特にポンペ病患者の血漿（Ｇｌｃ）４レベルは、疾患の臨床状態を示すことが、上述の結果から強く示唆される。血液中の（Ｇｌｃ）４の測定は、ポンペ病における総合的疾患状態および治療に対する治療応答を評価する非侵襲的方法を提供し、その結果、筋生検を回避すると考えられる。
【０１３８】
［実施例１０  タンデム型質量分析法による（Ｇｌｃ）４分析のための、安定な同位元素で標識された内部標準の合成］
Ｔｏｎｏｚｕｋａらの方法（Ｔｏｎｏｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２６１：１５７；Ｔｏｎｏｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ａｐｐｌｉ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．４３：９５）を使用して、安定な同位元素で標識された内部標準を合成した。この方法では、［Ｕ−１３Ｃ］グルコースの存在下で、三糖類パノース（Ｇｌｃα１−６Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃ）のポリマーであるプルランを、α−アミラーゼ、ＴＶＡ  ＩＩで消化する。ＴＶＡ  ＩＩは、［Ｕ−１３Ｃ］グルコースを、α１−４およびα１−６結合で付加し、その結果として、還元末端に標識された残基を有するグルコース四量体を形成して、パノース生成物のトランスグリコシル化を触媒する。
【０１３９】
プルラン１００ｍｇおよび［Ｕ−１３Ｃ６］グルコース１００ｍｇを、２ｍｌの５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０に溶解し、１００μｌのＮａＨＰＯ４緩衝液、ｐＨ６．９中の８ｍｇのＴＶＡＩＩと混合し、４０℃で５．５時間インキュベートした。この混合物を氷で冷却し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｆｒｅｅ  ３０ｋＤａ分子量カットオフフィルターを通して、２０００ｇで２時間遠心分離した。この濾液を、３０μｍ粒子サイズのＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−４０Ｓ（Ｓｕｌｐｅｃｏ，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ）を詰めたゲル濾過カラム（１７０×１５ｃｍ）で分画し、ｄＨ２Ｏで、流量０．５ｍｌ／分にて溶離した。分画のアリコートを、６５：３５  アセトニトリル：Ｈ２Ｏ中の１５ｍＭ酢酸アンモニウムと混合し、３．５ｋＶキャピラリおよび３１Ｖコーン環境と共に、流動相としてアセトニトリル：Ｈ２Ｏ（１：１、ｖ／ｖ）を使用して、エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）で分析した。［Ｕ−１３Ｃ６］標識されたヘキソース四量体を含む分画をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｖａｐ（Ｌａｂｃｏｎｃｏ）を使用して、真空下、４０℃にて６時間乾燥した。［Ｕ−１３Ｃ６］標識されたヘキソース四量体をＨ２Ｏで再構成した。ＥＳＩ−ＭＳを使用し、ＢＡＢ誘導体化内部標準（ｍ／ｚ８７２）の［Ｍ＋Ｎａ］＋の強度を、非標識ＢＡＢ誘導体化Ｇｌｃ４標準（ｍ／ｚ８６６）のそれとを比較することによって、合併した［Ｕ−１３Ｃ６］標識されたヘキソース四量体濃度を決定した。ＨＰＬＣと共にＵＶ検出を使用したＢＡＢ誘導体の分析によって、ＩＳの純度を決定した。ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８カラム（内径２５０×４．６ｍｍ、５μｍ）と、３６分間にわる、５：２２：７３（ｖ／ｖ／ｖ）０．０５ｍｏｌ／リットルの酢酸アンモニウム：アセトニトリル：Ｈ２Ｏから５：６０：３５（ｖ／ｖ／ｖ）０．０５ｍｏｌ／リットルの酢酸アンモニウム：アセトニトリル：Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）までの勾配溶離で、誘導体化オリゴ糖類を分離した。可能な限り、保持時間を、確実な標準と比較することによって、オリゴ糖類を同定した。ＨＰＬＣ分離でも分画を回収し、Ｎ２下で乾燥させ、血漿サンプルについて後述するものと同一条件を使用して、ＥＳＩ−ＭＳおよびＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳで［Ｍ＋Ｎａ］＋イオンを分析した。
【０１４０】
反応混合物からゲル濾過で単離した、テトラヘキソース分画のＨＰＬＣ分析で、多数の成分が存在することが証明された（図８参照）。ＨＰＬＣ分析によって回収された分画を、ＥＳＩ−ＭＳおよびＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを使用して分析した。ＢＡＢ誘導体化［１３Ｃ６］テトラヘキソースに関して予想したｍ／ｚ値および断片化パターンを有する４成分を同定した（図８のピーク１〜４）。これらの成分の１つ（図８のピーク４）を、その保持時間、およびナトリウム化（ｓｏｄｉａｔｅｄ）Ｂ３およびＹ２断片イオン（それぞれ、ｍ／ｚ５０９および５４８）の比率から、［１３Ｃ６］Ｇｌｃ４と同定した。上述の通り（実施例６：Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８７：１３６も参照）、Ｇｌｃ４およびマルトテトラオース（全てα１−４結合を有する）に関する、これらの２つのプロダクトイオンの比率の差。この内部標準成分に関する、ｍ／ｚ５０９と５４８の比率（平均値±２ＳＤ）は１．３３±０．２４（ｎ＝１０）であった。Ｇｌｃ４標準の場合、ｏｆｍ／ｚ５０９と５４２（ｍ／ｚ５４８に相当する非標識物）の比率（平均値±２ＳＤ）は、１．４１±０．０９（ｎ＝５）であった。ピーク２は、存在する主な異性体であって、Ｔｏｎｏｚｕｋａらによって、トランスグリコシル化反応の主要生成物の１つであると同定された、ＩＭＩＭである公算が高い。この異性体に関する、ｍ／ｚ５０９と５４８の比率は、マルトテトラオース（０．４８±０．１６（ｎ＝５））に類似した、０．３４±０．１０（ｎ＝１０）であった。ピーク１に関するこの比率は、１．３４±０．３２（ｎ＝８）であった。ピーク１とピーク３の構造的同一性は分かっておらず、ピーク３は、四量体および五量体の混合物であった。パノース（ピーク５）およびグルコース（ピーク６）も、調製物の中に存在していた。ＨＰＬＣおよびＭＳ分析の両者で決定したとき、３つの主な異性体、ピーク１、２および４は、全部で、内部標準混合物の８４％を構成していた。ピーク１：ピーク２：ピーク４の比率は、０．２：１．７：１．０であった。
【０１４１】
［実施例１１  血漿および尿中のＧｌｃ４をタンデム型質量分析する方法］
−７０℃または−２０℃で最高１年保存した貯蔵した、対照および患者の尿サンプルおよび血漿サンプルを使用した。正常なヒト血清（＃１１０１）は、Ｂｉｏｃｅｌｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，ＣＡから入手した。尿、尿スポットおよび血漿サンプルは、上述の通りに、ＢＡＢで誘導体化した。
【０１４２】
＜尿＞  尿５０μｌを、１００μｍｏｌ／リットルの内部標準２５μｌと、１０秒間、渦巻混合し、試薬（１４９ｍｍｏｌ／リットルのＢＡＢ、４００ｍｍｏｌ／リットルのＮａＢＨ３ＣＮおよびメタノール中６％の氷酢酸を含む）１４０μｌで、８０℃にて４５分間、誘導体化した。ＧＳＤＩＩ患者からの尿サンプルの一部は、分析前に、尿２００μｌを１．８ｍｌのｄＨ２Ｏと混合することによって、希釈することが必要であった。
【０１４３】
＜尿スポット＞  尿を、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、その上澄をきれいな試験管に移した。反復した３０μｌアリコートをリンター紙（等級９０３、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ社製，ＮＨ）上にスポットし、室温で一晩乾燥させた。残りの尿は、−７０℃で保存した。２×１／４インチの尿スポットを、室温で１時間振盪することによって、３００μｌのｄＨ２Ｏ中に抽出した。抽出物１００μｌを、２μＭのＩＳ、５０μｌと混合し、Ｎ２下で乾燥させ、２０μｌのｄＨ２Ｏで再構成し、上述の通りに誘導体化した。
【０１４４】
＜血漿および血清＞  血漿または血清１００μｌおよび２μｍｏｌ／リットルの内部標準５０μｌをメタノール５００μｌと渦巻混合し、１４０００ｇで５分間遠心分離した。この上澄をＮ２下で乾燥させ、ｄＨ２Ｏ  ２０μｌで再構成し、試薬（４００ｍＭのＢＡＢ、２．０ｍｏｌ／リットルのＮａＢＨ３ＣＮおよびメタノール中７．５％の氷酢酸を含む）１００μｌを使用して、８０℃で４５分間、誘導体化した。
【０１４５】
誘導体化した尿、尿スポット抽出物および血漿サンプルを、上述のＣ１８カートリッジ（実施例２；Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８７：１３６も参照）を用いた固相抽出を使用して精製した。溶出液を、Ｎ２下、４０℃で乾燥させ、８０：２０  メタノール：Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）で再構成し、９６ウェル・マイクロタイタープレートに移した。
【０１４６】
＜キャリブレータ＞  対照成人の尿を使用し、２．５〜２００μｍｏｌ／リットルの範囲のＧｌｃ４標準を加えて、尿キャリブレータを作成した。ｄＨ２Ｏおよび０．１〜１０μｍｏｌ／リットルの範囲で、尿スポットキャリブレータを作成した。Ｂｉｏｃｅｌｌの正常なヒト血清を使用し、０．１〜１０μｍｏｌ／リットルの範囲のＧｌｃ４標準を加えて、血漿キャリブレータおよび品質管理サンプルを作成した。
【０１４７】
＜質量分析および定量＞  尿および血漿サンプルは、マルチ反応モニタリングを使用して、エレクトロスプレーイオン化−タンデム型質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）で分析し、（Ｇｌｃ）４および内部標準は、それぞれ、ｍ／ｚ８６６からｍ／ｚ５０９およびｍ／ｚ８７２からｍ／ｚ５０９への遷移を追跡することによって検出した。尿由来のオリゴ糖誘導体類を、４０μｌ／分の流量で、８０：２０  メタノール：Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）流動相に注入した。サンプルを濃縮するために、２×１００ｍｍ  Ｃ１８カラム（Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）と共に、２００μｌ／分の流量で、８０：２０  メタノール：Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）を流動相として使用した、さらなる液体クロマトグラフィステップを含む同じ方法で、血漿および尿スポットサンプルを分析した。総分析時間は、尿サンプルの場合には２．５分であり、血漿および尿スポットサンプルの場合には３．０分であった。コーン電圧９０Ｖ、キャピラリ電圧３．５ｋＶ、衝突エネルギー４０ｅＶおよびアルゴン衝突ガス圧３．１×１０−３ｍＢａｒを使用した。（Ｇｌｃ）４標準に関するＭＲＭシグナルと内部標準に関するＭＲＭシグナルの比率を、添加した（Ｇｌｃ）４濃度に対してプロッティングすることによって導いた外部較正曲線を使用して、サンプルを定量化した。
【０１４８】
クレアチニン測定。尿中および尿スポット抽出物中のＧｌｃ４濃度を、クレアチニン濃度と関連づけた。尿中のクレアチニンを、ピクリン酸法（Ｊａｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１８８６）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１０：３９１）を使用して測定し、尿サンプルと尿スポット抽出物サンプル対のクレアチニンを、他所で発表する、安定な同位元素希釈法を使用して、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳで測定した。
【０１４９】
＜ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによる、尿分析および血漿分析の検証＞
尿分析および血漿分析を、キャリブレータおよび品質管理（ＱＣ）サンプルの繰返し分析によって検証した。さらに、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳで決定した患者サンプル中および対照サンプル中のＧｌｃ４濃度を、ＨＰＬＣ−ＵＶで決定した結果と比較した。尿較正曲線およびＱＣを、４週間にわたって分析し、血漿較正曲線ｓおよびＱＣを、８週間にわたって分析した。
【０１５０】
＜尿に関する較正曲線およびＱＣの日間変動＞
Ｇｌｃ４濃度が１桁または２桁違う可能性がある対照サンプルおよび患者サンプルの両者を定量化するために、尿較正曲線を２つの濃度範囲に分けた。較正曲線勾配の日間変動は、２．５〜７０μＭの低い範囲では１．３％であり、４０〜２００μｍｏｌ／リットルの高い範囲では２．３％であった（ｎ＝５）。４週間にわたる、低い範囲および高い範囲に関する、較正曲線の決定の平均値±ＳＤ係数（ｒ２）は、それぞれ、０．９９８±０．００１および０．９９８±０．００１であった（ｎ＝５）。キャリブレータの日間精度および平均確度を表６に示す。３１．６ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニンという平均Ｇｌｃ４濃度を有する患者サンプルの繰返し分析で決定された日内のおよび日間の精度（ｃｖ）は、それぞれ、２．６％（ｎ＝５）および５．０％（ｎ＝４）であった。０．４ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニンという平均Ｇｌｃ４を有する対照サンプルの場合、日内および日間精度は、それぞれ、４．６％（ｎ＝５）および２４．２％（ｎ＝４）であった。
【０１５１】
【表６】
2004501365.tif 000007
【０１５２】
血漿に関する較正曲線およびＱＣの日間変動。０．１〜２．５μｍｏｌ／リットルおよび１．０〜１０μｍｏｌ／リットルに関して血漿を定量化したところ、８週間にわたる曲線勾配の日間変動は、それぞれ、２０．３％および２０．６％（ｎ＝７）であった。平均値±ＳＤｒ２値は、低い範囲では０．９９８±０．００１であり、高い範囲では０．９９４±０．００９（ｎ＝７）であった。キャリブレータの日間精度および平均確度を表７に示す。キャリブレータの作成に使用した、同一の正常なヒト血漿プールを使用して、血漿ＱＣを作成した。この血漿中に少量の内因性のＧｌｃ４が検出および決定され、計算の際に計上した。血漿ＱＣの日内および日間での繰返し分析に関する結果を、それぞれ、表８および表９に示す。
【０１５３】
【表７】
2004501365.tif 000008
【０１５４】
【表８】
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【０１５５】
【表９】
2004501365.tif 000010
【０１５６】
［実施例１２　ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析とＨＰＬＣ分析との比較］
ＨＰＬＣ法で分析した尿サンプル２４検体および血漿サンプル２９検体（患者および対照）の結果を、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ法による結果と比較した（図９および図１０）。尿サンプルの場合、ｙ＝０．９７ｘ−４．０、Ｓｙ／ｘ＝６．５およびｒ２＝０．８２であった。血漿サンプルの場合、ｙ＝０．６２ｘ＋０．１６、Ｓｙ／ｘ＝０．３１、ｒ２＝０．５０２であった。データのＢｌａｎｄ−Ａｌｔｍａｎ解析（Ｂｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｌａｎｃｅｔ  １：３０７）を使用したとき、尿および血漿に関する一致限界［平均差（ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）±差の２ＳＤ］は、それぞれ、３±１２．４および０．１±０．７２であった。
【０１５７】
［実施例１３  液体尿サンプルおよびスポットした尿サンプル中のＧｌｃ４分析の比較］
３７対の液体尿サンプルとスポット尿サンプルの、Ｇｌｃ４濃度を決定した。濃度の比較を図１１に示す。ｙ＝０．９９ｘ−０．３８、Ｓｙ／ｘ＝５．３６およびｒ２ ＝０．９５４であった。Ｂｌａｎｄ　Ａｌｔｍａｎ解析の一致限界［平均差（液体−スポット）±差の２ＳＤ］は、０．５５±１０．４であった。
【０１５８】
［実施例１４　起こり得る分析妨害の究明］
［Ｍ＋Ｎａ］＋イオンの強度を最適化するために、高いコーン電圧（９０Ｖが使用される。この電圧では、インソース断片化が起こり、従って、断片にしてｍ／ｚ８６６プロダクトイオンを与える、より高質量のヘキソースオリゴマーからのＧｌｃ４分析を妨害する可能性がある。これを究明するために、マルトペンタオースおよびマルトヘキサオースの異なるコーン電圧におけるインソース断片化の程度を決定した。さらに、ＧＳＤＩＩ患者サンプル中の、より高質量のヘキソースオリゴマーの、ｍ／ｚ８６６への寄与を推定した。シリンジポンプ（モデル）を１０μｌ／分の流量で使用して、８０：２０メタノール：Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）中、１２μｍｏｌ／リットルのマルトペンタオースおよびマルトヘキサオースＢＡＢ誘導体を、質量分析計に注入した。コーン電圧を、３０Ｖから１００Ｖに上げ、ｍ／ｚ８６６および［Ｍ＋Ｎａ］＋の相対強度を決定した。マルトペンタオースの場合、ｍ／ｚ８６６の相対強度は、３０Ｖでｍ／ｚ１０２８の強度の２．５％から、１００Ｖで４．６％まで、コーン電圧と共に増加した。マルトヘキサオースの場合、ｍ／ｚ８６６の相対強度は、コーン電圧と共に増加しなかった。９０Ｖで、両標準の［Ｍ＋Ｎａ］＋の相対強度は、類似していた（４％）。ｍ／ｚ８３０〜１４００を１００ａｍｕ．ｓｅｃ−１の速度で走査することによって、ＧＳＤＩＩ患者の尿サンプル１２検体のＢＡＢ−誘導体を、ＭＳ１モードで分析した。存在するヘキソース五量体、ヘキソース六量体およびヘキソース七量体の、［（Ｍ＋Ｎａ］＋のｍ／ｚ８６６に対する平均相対強度は、それぞれ、５．２、２．８および３．６％であると決定された。従って、これらのヘキソースオリゴマーオリゴ糖類の、ｍ／ｚ８６６シグナルへの複合寄与は、０．４６％であると決定された。
【０１５９】
［実施例１５  ＴＭＳを使用した新生児スクリーニングアッセイ］
ＴＭＳに基づくアッセイを使用し、（Ｇｌｃ）４を生物マーカーとして使用して、ポンペ病に関して、新生児をスクリーニングした。乾燥した血液スポット（一般に、踵穿刺による）を含む新生児スクリーニングカードを入手する。血液スポットから円板を打ち抜き、オリゴ糖類を抽出するための溶媒が入っているバイアルに入れる。内部標準を各バイアルに既知量で加える（たとえば、モノマーの１つがＵ１３Ｃ−グルコースホモログで置き換えられた（Ｇｌｃ）４四量体）。次いで、ブチル−ＰＡＢＡを使用して、サンプル中のオリゴ糖類を誘導体化する。この誘導体化されたサンプルを、実施例１１に記載の通り、ＴＭＳで分析する。データをコンピューターで得て分析し、各サンプル中の（Ｇｌｃ）４濃度を決定する（すなわち、内部標準および被分析物によって生成されたシグナルの比率を比較することによる）。基準値より高い値は、ポンペ病を示す。
【０１６０】
抗（Ｇｌｃ）４Ａｂを化学的結合させた常磁化ポリスチレン球（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標））と共にインキュベートすることによって、サンプルを誘導体化する前に、任意選択的に、被分析物を濃縮する。このビーズを磁気的に回収し、適切な溶媒を使用して、被分析物をビーズから溶離する。
【０１６１】
さらなる任意のステップとして、ＴＭＳ分析前に、サンプル中のグルコースモノマーの濃度を低下させる。１つのプロトコールでは、誘導体化の前に、グルコースオキシダーゼをサンプルに加える。代替プロトコールでは、ＴＭＳの前に、液体クロマトグラフィステップ（逆相）で誘導体化グルコースモノマーを分離する。
【０１６２】
前述の実施例は、本発明を例証するものであって、本発明を限定するものと考えてはならない。本発明は、クレームに説明されており、クレームの均等物は、その中に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】
尿サンプル中のＢＡＢ標識された（Ｇｌｃ）４のＨＰＬＣ分離のクロマトグラムを示す図である。Ｙ軸は、３０４ｎｍにおけるＵＶ吸光度である。Ｘ軸は、分で示した溶離時間である。Ｉ．Ｓ．は、１０ｍｇ／ｍｌのセロペントース（Ｃ５）の内部標準である。パネルＡは、正常者からの尿の溶離プロフィールである。パネルＢは、ＧＳＤＩＩ患者からの尿の溶離プロフィールである。
【図２】
血漿サンプル中のＢＡＢ標識された（Ｇｌｃ）４のＨＰＬＣ分離のクロマトグラムを示す図である。Ｙ軸は、３０４ｎｍにおけるＵＶ吸光度である。Ｘ軸は、分で示した溶離時間である。Ｉ．Ｓ．は、１ｍｇ／ｍｌのセロペントース（Ｃ５）の内部標準である。パネルＡは、正常者からの尿の溶離プロフィールである。パネルＢは、ＧＳＤＩＩ患者からの尿の溶離プロフィールである。
【図３】
ＰＭＰ標識されたオリゴ糖類、マルトヘキソース（Ｍ６）、マルトペントース（Ｍ５）、マルトテトラオース（Ｍ４）、（Ｇｌｃ）４、マルトトリオース（Ｍ３）、マルトース（Ｍｌｔ）、およびグルコース（Ｇｌｃ）のＨＰＬＣ分析のクロマトグラムを示す図である。Ｙ軸は、３０４ｎｍにおけるＵＶ吸光度である。Ｘ軸は、分で示した溶離時間である。パネルＡは、（Ｇｌｃ）４およびマルト−オリゴ糖標準の溶離プロフィールである。パネルＢは、ＧＳＤＩＩ患者の尿中（Ｇｌｃ）４の溶離プロフィールである。
【図４】
ＢＡＢ標識されたマルトテトラオース・ナトリウム付加物イオン（Ｍ４−ＢＡＢ）Ｎａ＋、ｍ／ｚ８６６．４（パネルＡ）；ＢＡＢ標識（Ｇｌｃ）４・ナトリウム付加物イオン（Ｇｌｃ４−ＢＡＢ）Ｎａ＋、ｍ／ｚ８６６．４（パネルＢ）；およびＧＳＤＩＩ患者の尿サンプル中に存在するヘキソース四量体、ｍ／ｚ８６６．４（パネルＣ）のプロダクトイオンスペクトルを示す図である。プロダクトイオンｍ／ｚ７０４．４、ｍ／ｚ５４２．３、およびｍ／ｚ５０９．２は、それぞれ、ヘキソース１個、ヘキソース２個、およびＢＡＢ標識されたグルコースの喪失に相当する。Ｙ軸は、断片の％強度である。Ｘ軸は、ｍ／ｚ値である。
【図５】
ＩＩ型グリコーゲン貯蔵病患者の尿中ＢＡＢ標識されたオリゴ糖類のＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳスペクトルを示す図である。Ｃ１８カートリッジ精製後、この誘導体サンプルを、ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳに直接注入した。イオンを四重極質量分析計で走査した（実験の詳細については、テキスト参照）。Ｙ軸は、断片の％強度である。Ｘ軸は、ｍ／ｚ値である。
【図６】
患者１（パネルＡ）、患者２（パネルＢ）、および患者３（パネルＣ）からの尿中（Ｇｌｃ）４レベルを示す図である。（Ｇｌｃ）４レベルは、ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニン（Ｃｒ）で示す。破線は、正常対照（＜１才）２０例における主な（Ｇｌｃ）４レベル＋標準偏差値を示す。中白の矢印は、酵素療法の開始を示す。破線が付いた中黒の矢印は、２倍量の酵素投与開始を示す。実線が付いた中黒の矢印は、免疫療法の開始を示す。
【図７】
患者 １ （パネル Ａ）、 患者 ２ （パネル Ｂ）、 および 患者 ３ （パネル Ｃ）からの血漿中（Ｇｌｃ）４レベルを示す図である。（Ｇｌｃ）４レベルは、ｍｍｏｌ／ｍｏｌで示す。破線は、正常対照（＜１才）２０例における主な（Ｇｌｃ）４レベル＋標準偏差値を示す。中白の矢印は、酵素療法の開始を示す。破線が付いた中黒の矢印は、２倍量の酵素投与開始を示す。実線が付いた中黒の矢印は、免疫療法の開始を示す。
【図８】
ＨＰＬＣで分離した内部標準反応混合物の四糖分画のＢＡＢ−誘導体を示すグラフである。
【図９】
ＨＰＬＣまたはＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳのいずれかによる、対照および患者尿サンプル中のＧｌｃ４分析の比較を示す図である。
【図１０】
ＨＰＬＣまたはＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳのいずれかによる、対照および患者血漿サンプル中のＧｌｃ４分析の比較を示す図である。
【図１１】
ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによる、液体およびスポット尿サンプル対におけるＧｌｃ４分析の比較を示す図である。
【図１２】
Ｇｌｃ４四糖の推定構造を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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2004501365.tif 000024
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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