(57)【要約】電荷または電荷密度を改変することにより、活性化血管部位への治療薬、診断薬、および画像化剤の選択的輸送を促進するための方法および関連組成物を開示する。
2004511426.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の群より選択される組成物を、選択的に標的化する方法：（ａ）ｐＨが約７．５の約０．０５ ｍＭ ＫＣｌ溶液中におけるζ（ゼータ）電位が約＋２５ ｍＶから＋１００ ｍＶの範囲の、リポソームを除く粒子；（ｂ）７．５を上回る等電点をもつ分子；（ｃ）約２５ ｍｏｌ％から５０ ｍｏｌ％の範囲の陽イオン性脂質を含むリポソーム；（ｄ）ｐＨが約７．５の約 ０．０５ ｍＭ ＫＣｌ溶液中におけるζ電位が約＋２５から＋１００ ｍＶの範囲の陽イオン性脂質層をもつ磁性体（ｍａｇｎｅｔｏｓｏｍｅ）；および（ｅ）外層において約２５から６０ ｍｏｌ％の範囲で陽イオン性両親媒性物質を含むか、またはｐＨが約７．５の約 ０．０５ ｍＭ ＫＣｌ溶液中におけるζ電位が約＋２５ ｍＶから＋１００ ｍＶの範囲の水中油型のエマルジョンまたはマイクロエマルジョン。
【請求項２】
活性化血管部位が（ａ）血管新生部位；（ｂ）炎症部位；（ｃ）創傷治癒部位；および（ｄ）血液脳関門からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
画像化剤および以下からなる群より選択される担体を含む、活性化血管部位に選択的に標的化する画像化用組成物：（ａ）ｐＨが約７．５の約０．０５ ｍＭ ＫＣｌ溶液中におけるζ（ゼータ）電位が約＋２５ ｍＶから＋１００ ｍＶの範囲の、リポソームを除く粒子；（ｂ）７．５を上回る等電点をもつ分子；（ｃ）約２５ ｍｏｌ％から５０ ｍｏｌ％の範囲の陽イオン性脂質を含むリポソーム；（ｄ）ｐＨが約７．５の約 ０．０５ ｍＭ ＫＣｌ溶液中におけるζ電位が約＋２５から＋１００ ｍＶの範囲の陽イオン性脂質層をもつ磁性体（ｍａｇｎｅｔｏｓｏｍｅ）；および（ｅ）外層において約２５から６０ ｍｏｌ％の範囲で陽イオン性両親媒性物質を含むか、またはｐＨが約７．５の約 ０．０５ ｍＭ ＫＣｌ溶液中におけるζ電位が約＋２５ ｍＶから＋１００ ｍＶの範囲の水中油型のエマルジョンまたはマイクロエマルジョン。
【請求項４】
画像化剤が、酸化鉄粒子、色素、蛍光色素、ＮＭＲ標識、シンチグラフィ標識、金粒子、ＰＥＴ標識、超音波造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ ｍｅｄｉａ）、およびＣＴ造影剤からなる群より選択される、請求項３記載の画像化用組成物。
【請求項５】
請求項３または４記載の組成物を動物に投与する段階、および組成物を診断的に有効なレベルまで血管新生部位の近傍に選択的に蓄積させる段階を含む、画像化剤を動物の血管新生部位に選択的に標的化する方法。
【請求項６】
経口投与、静脈内投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、動脈内投与、筋肉内投与、点眼およびエアロゾル投与からなる群より選択される経路によって組成物を投与する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
組成物が以下の群より選択される、治療的有効量の活性成分および担体を含む、活性化血管部位へ選択的に標的化するための治療用組成物：（ａ）ｐＨが約７．５の約０．０５ ｍＭ ＫＣｌ溶液中におけるζ（ゼータ）電位が約＋２５ ｍＶから＋１００ ｍＶの範囲の、リポソームを除く粒子；（ｂ）７．５を上回る等電点をもつ分子；（ｃ）約２５ ｍｏｌ％から５０ ｍｏｌ％の範囲の陽イオン性脂質を含むリポソーム；（ｄ）ｐＨが約７．５の約 ０．０５ ｍＭ ＫＣｌ溶液中におけるζ電位が約＋２５から＋１００ ｍＶの範囲の陽イオン性脂質層をもつ磁性体（ｍａｇｎｅｔｏｓｏｍｅ）；および（ｅ）外層において約２５から６０ ｍｏｌ％の範囲で陽イオン性両親媒性物質を含むか、またはｐＨが約７．５の約 ０．０５ ｍＭ ＫＣｌ溶液中におけるζ電位が約＋２５ ｍＶから＋１００ ｍＶの範囲の水中油型のエマルジョンまたはマイクロエマルジョン。
【請求項８】
活性成分が細胞成長抑制剤および細胞毒性剤からなる群より選択される、請求項７記載の治療用組成物。
【請求項９】
細胞増殖抑制剤および細胞毒性剤が、タキサン、無機錯体、有糸分裂阻害剤、ホルモン、アントラサイクリン、抗体、トポイソメラーゼ阻害剤、抗炎症薬、アルカロイド、インターロイキン、サイトカイン、成長因子、タンパク質、ペプチド、およびテトラサイクリンからなる群より選択される、請求項８記載の治療用組成物。
【請求項１０】
請求項７または８記載の組成物を動物に投与する段階、および組成物を治療的に有効なレベルまで血管新生部位の近傍に選択的に蓄積させる段階を含む、治療用組成物を動物の血管新生部位へ選択的に標的化する方法。
【請求項１１】
動物が哺乳動物である、請求項５または１０記載の方法。
【請求項１２】
経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、動脈内投与、点眼およびエアロゾル投与からなる群より選択される経路によって組成物を投与する、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
以下の群より選択される一つまたは複数の特徴をもつように組成物を修飾する段階を含む、活性化血管部位における組成物の選択的な結合を促進する方法：（ａ）ｐＨが約７．５の約０．０５ ｍＭ ＫＣｌ溶液中における約＋２５ ｍＶから＋１００ ｍＶの範囲のζ電位；および（ｂ）７．５を上回る（ｂｅｔｗｅｅｎ ａｂｏｕｔ）等電点。
【請求項１４】
活性化血管部位が血管新生関連疾患の徴候を示す、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
血管新生関連疾患が、糖尿病性網膜症、慢性炎症性疾患、慢性関節リウマチ、皮膚炎、乾癬、胃潰瘍、血液（ｈｅｍａｔｏｇｅｎｏｕｓ）腫瘍および固形腫瘍ならびにそれらの転移からなる群より選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
組成物が、ζ電位が少なくとも約＋２５ ｍＶのレベルまで上昇するように修飾される、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
組成物が、非修飾薬剤に対して薬剤の等電点を７．５を上回る値まで上昇させる陽イオン生成試薬との反応を介して修飾される、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
組成物が、エチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、トリエチレンテトラアミン、４−ジメチルアミノブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアミン、ジメチルアミノベンズアルデヒド、ポリリシン、およびキトサンからなる群より選択される陽イオン生成試薬を反応させることで修飾される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
組成物がペプチドまたはタンパク質を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
組成物が、ｐＨが約７．５の約０．０５ ｍＭ ＫＣｌ溶液中における約＋２５ ｍＶから＋１００ ｍＶの範囲のζ電位、または７．５を上回る等電点をもち、さらに組成物が、血管新生関連疾患を治療するための組成物の投与に関してラベルが表示されるまたは説明書とともに包装される、血管新生関連疾患の治療に治療的に有効な活性成分を含む治療用組成物。
【請求項２１】
組成物が、ｐＨが約７．５の約０．０５ ｍＭ ＫＣｌ溶液中における約＋２５ ｍＶから＋１００ ｍＶの範囲のζ電位、または７．５を上回る等電点をもち、さらに組成物が、炎症に対する組成物の投与に関してラベルが表示されるまたは説明書とともに包装される、炎症を抑制するために治療的に有効な活性成分を含む治療用組成物。
【請求項２２】
組成物が、ｐＨが約７．５の約０．０５ ｍＭ ＫＣｌ溶液中における約＋２５ ｍＶから＋１００ ｍＶの範囲のζ電位、または７．５を上回る等電点をもち、さらに組成物が、骨修復または創傷治癒を促進するための組成物の投与を説明したラベルが表示されるまたは説明書とともに包装される、骨修復または創傷治癒を促進するのに治療的に有効な活性成分を含む治療用組成物。
【請求項２３】
組成物が、ｐＨが約７．５の約０．０５ ｍＭ ＫＣｌ溶液中における約＋２５ ｍＶから＋１００ ｍＶの範囲のζ電位、または７．５を上回る等電点をもち、さらに組成物が、血管新生関連疾患を診断または画像化するための組成物の投与を説明したラベルが表示されるまたは説明書とともに包装される、血管新生関連疾患の診断または画像化に診断的に有効な活性成分を含む診断用組成物。
【請求項２４】
活性成分がエーテル脂質、アルキルリゾレシチン、アルキルリゾリン脂質、リゾ脂質、アルキルリン脂質からなる群より選択される、請求項７記載の治療用組成物。
【請求項２５】
エーテル脂質が、１−Ｏ−オクタデシル−２−Ｏ−メチル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−Ｏ−ヘキサデシル−２−Ｏ−メチル−ｓｎ−グリセロール、ヘキサデシルホスホコリン、オクタデシルホスホコリンからなる群より選択される、請求項２４記載の治療用組成物。
【請求項２６】
組成物が、ｐＨが約７．５の約０．０５ ｍＭ ＫＣｌ溶液中におけるζ電位が約＋２５ ｍＶから＋６０ ｍＶの範囲の粒子を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２７】
組成物が、ｐＨが約７．５の約０．０５ ｍＭ ＫＣｌ溶液中におけるζ電位が約＋３０ ｍＶから＋５０ ｍＶの範囲の粒子を含む、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
組成物が、ｐＨが約７．５の約０．０５ ｍＭ ＫＣｌ溶液中におけるζ電位が約＋２５ ｍＶから＋６０ ｍＶの範囲の粒子を含む、請求項３記載の画像化用組成物。
【請求項２９】
ｐＨが約７．５の約０．０５ ｍＭ ＫＣｌ溶液中におけるζ電位が約＋３０ ｍＶから＋５０ ｍＶの範囲の粒子を含む、請求項２８記載の組成物。
【請求項３０】
組成物が、ｐＨが約７．５の約０．０５ ｍＭ ＫＣｌ溶液中におけるζ電位が約＋２５ ｍＶから＋６０ ｍＶの範囲の粒子を含む、請求項７記載の治療用組成物。
【請求項３１】
ｐＨが約７．５の約０．０５ ｍＭ ＫＣｌ溶液中におけるζ電位が約＋３０ ｍＶから＋５０ ｍＶの範囲の粒子を含む、請求項３０記載の組成物。
【請求項３２】
組成物が修飾され、ｐＨが約７．５の約０．０５ ｍＭ ＫＣｌ溶液中におけるζ電位が約＋２５ ｍＶから＋６０ ｍＶの範囲になるように上昇または低下する、請求項１２記載の方法。
【請求項３３】
さまざまな量の陽イオン性成分に関連する組成物のζ電位を評価する段階、およびζ電位の最適範囲を同定する段階を含む、特定部位への標的化のための組成物のζ電位の最適範囲を特定する方法。
【請求項３４】
陽イオン性成分を組成物に結合させて、最適範囲のζ電位を有する組成物を作製する段階を含む、組成物を修飾してその効力を高める方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、治療薬、診断薬、および画像化剤を、活性化血管部位の近傍に蓄積させるように選択的に標的化する組成物および方法に関する。具体的には本発明は、このような薬剤を、陰イオン電荷が血管新生部位または炎症部位で曝露されたり集積されたりする血管内皮部位へ選択的に標的化する組成物および方法に関する。より具体的には本発明は、癌、糖尿病性網膜症、および後水晶体線維形成症などの血管新生関連疾患の治療に有用な組成物および方法に関する。また本発明は、血管新生関連疾患および創傷治癒過程と関連するように、活性化血管部位と関連した効率を高めるための診断薬、画像化剤、および治療薬の修飾および包装に関する。本発明はまた、毒性副作用を最小に維持しながら標的効果を最大とするように調節可能な薬剤担体系の修飾に関する。
【０００２】
背景
本発明は、活性化血管部位が、静止状態にある血管内皮細胞に対する陰電荷の増強に関係するという発見に関する。実際には、活性化血管内皮細胞、およびそれと関連する細胞外マトリックス層の、増強された表面陰電荷は、血液中の負に帯電した化合物の浸透に対する天然の障壁として機能する可能性がある。
【０００３】
１．血管の構造および透過性
循環系において血液を保持し、血液と身体の組織および血管外液を隔てる血管は、管腔層中で血管内皮細胞に沿って並んでいる。極めて細い血管である毛細血管は、単層の血管内皮細胞から構成される、壁の薄い微小な血管である。毛細血管壁は、栄養素と代謝物の交換、および血管内外の体液区画間の体液平衡の確立および維持にかかわる。親油性分子、および低分子量の親水性分子は、この壁を介して容易に拡散するが、通常は巨大分子を透過させない。血管内皮細胞は接合部で相互に結合しているので、器官が、制御不能の分子交換をしないようにする障壁となっている。
【０００４】
接合面で結合した内皮細胞からなる血管膜は不透過性である。例えば、抗体、タンパク質結合型ホルモン、サイトカインなど多くの巨大分子は間質空間にアクセス可能であり、リンパ系を介して最終的に血漿へ戻る。１９５０年代初頭にパッペンハイマー（Ｐａｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ）らは、半径が約４０Åの孔が毛細血管に存在することで小さな親水性溶質が拡散可能であることを示唆した（Ｒｉｐｐｅら、１９９４）。後にグロッテ（Ｇｒｏｔｔｅ）らは、血漿タンパク質を通過させる２５０Å〜３００Åの大きな孔が毛細血管に存在することを報告している（Ｒｉｐｐｅら、１９９４）。後年、孔の存在、および大きさに基づく毛細血管選択性の存在が多くの組織で十分確認されている（Ｒｉｐｐｅら、１９９４）。
【０００５】
脳は、関連する内皮細胞および隣接する細胞外マトリックスに比較的高い陰電荷が存在する血液脳関門で保護されている。例えばタグチ（Ｔａｇｕｃｈｉ）ら（１９９８）は、ラット脳室の脈絡叢において、毛細血管内皮の管腔面および横隔膜有窓部（ｆｅｎｅｓｔｒａｌ ｄｉａｐｈｒａｇｍ）、ならびにその基底膜および上皮が強く陰イオン性であることを報告している。タグチ（Ｔａｇｕｃｈｉ）ら（１９９８）はまた、負に帯電した内皮細胞小孔（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｆｅｎｅｓｔｒａｅ）および基底膜が、陰イオン性分子の通過を阻害する電荷障壁として作用する可能性があることも示唆している。
【０００６】
したがって、電荷、大きさ、立体配置、および極性といった分子の物理的化学的性質は、その血管壁内外の輸送に影響を及ぼすと理解されている（Ｓｅｎｏ、１９８３；Ｙｕａｎ、１９９８）。一般に分子の血管透過率は、そのサイズと逆相関する。また血管壁は、陰イオン性分子より陽イオン性分子に対する透過率が比較的大きい。これはおそらく血管壁の管腔面の基底膜および糖衣（ｇｌｙｃｏｃａｌｙｘ）が負に帯電しているためである（Ｙｕａｎ、１９９８）。このような知見と一致して、アダムソン（Ａｄａｍｓｏｎ）ら（１９８８）は、リボヌクレアーゼ（正味電荷＋４；分子量１３，６８３）の血管透過率が、大きさは同様（分子量１４，１７６）であるが負に帯電した（正味電荷−１０）α−ラクトアルブミンの血管透過率より２倍高いことを報告している。
【０００７】
陰イオン性巨大分子に対する微小血管の内皮細胞の障壁の形成に関する評価を行ったヘンリー（Ｈｅｎｒｙ）ら（１９９６）は、ニワトリの尿漿膜では時間の経過とともに内皮の陰イオン性部位が減少することを見出した。ヘンリー（Ｈｅｎｒｙ）らは、４．５日目〜１４日目の管腔内皮、接合間隙、および原形質膜小胞（ｐｌａｓｍａｌｅｍｍａ ｖｅｓｉｃｌｅ）の陽イオン性のフェリチン結合は連続しているものの、１８日目にはこの結合が不連続になったことを見いだした。カバージョ（Ｃａｖａｌｌｏ）ら（１９８０）は、セロトニンまたは軽度熱傷に曝露したラット精巣挙筋血管の小血管および血管周囲成分の表面電荷の特性を調べ、漏洩性の血管（ｌｅａｋｙ ｖｅｓｓｅｌｓ）では、管腔内皮形質膜上の陰イオン性部位の密度が高いことを発見した。
【０００８】
２．血管新生部位および活性血管部位における陰電荷の増強
血管新生とは新しい血管が形成される過程である（Ｆｏｌｋｍａｎら、１９９２）。血管新生は、生殖、発生、および創傷修復などの通常の身体活動に極めて重要である。血管新生の過程全体は完全に解明されているわけではないが、この過程には、相互に相互作用して毛細血管の初代細胞である内皮細胞の成長を調節する複雑な一連の分子群がかかわると考えられている。通常の条件下では、このような分子群は、静止状態（長くて数週間、または状況によっては数十年間の長期にわたって毛細血管の成長がみられない状態）に細胞を維持する。しかし必要であれば、創傷治癒などの場合に、このような分子群は５日間以内に細胞の速やかな増殖および代謝回転を促進する（Ｆｏｌｋｍａｎら、１９９２；Ｆｏｌｋｍａｎら、１９８７）。
【０００９】
血管新生とは、通常の条件下で高度に調節された過程であるが、多くの疾患は、持続的な制御不能な血管新生を特徴とする。例えば眼の血管新生は、失明の最も一般的な原因に関連するとされている。関節炎のような症状では、新しく形成された毛細血管が関節に浸潤して軟骨を破壊する。糖尿病では、網膜に形成された新しい毛細血管が硝子体に浸潤し、出血を促して失明を引き起す。固形腫瘍の成長および転移も血管新生の影響を受ける（Ｆｏｌｋｍａｎら、１９８６；Ｆｏｌｋｍａｎら、１９８９）。２ ｍｍ以上に大きくなった腫瘍は専用の血液供給を必要とし、新しい毛細血管の成長を誘導することによりこれを達成する。腫瘍の深部に存在するこのような新しい血管は腫瘍細胞にとって、循環系へ侵入して肝臓、肺、または骨などの遠隔部位へ転移する経路となる（Ｗｅｉｄｎｅｒら、１９９１）。
【００１０】
腫瘍の血管漏出性（ｖａｓｃｕｌａｒ ｌｅａｋｉｎｅｓｓ）は正常組織と比べて一般的に高い（Ｙｕａｎら、１９９４）。Ｙｕａｎら（１９９５）は、腫瘍血管の透過率が、その血管壁に直径が約４００ ｎｍの大きな孔が存在することから、正常血管の透過率と比べて高いことを明らかにしている。正常組織および腫瘍の血管新生時の漏出は、分裂および増殖に伴う、内皮細胞の弛緩、および接合部の緩みの結果であると考えられている。あるいは血管の漏出は血管新生の進行に必要であると示唆されている（Ｄｖｏｒａｋら、１９９５）。
【００１１】
しかし、このような漏出性に対する恒常性維持反応がどんなものであれ、活性血管部位における、血管原性内皮細胞は、血管部位において静止状態で見出されるものと比べて、高密度および／または多量の負に帯電した表面分子を発現しているようである。この知見は、漏洩性の血管では、対照と比べて管腔内皮形質膜上の陰イオン性部位の密度が上昇することを示した、カバージョ（Ｃａｖａｌｌｏ）ら（１９８０）のような研究により支持されている。陰電荷のこのような増強は、血液系に由来する負に帯電した分子の浸透に対する天然の障壁として機能する。上述したように、タグチ（Ｔａｇｕｃｈｉ）ら（１９９８）は、内皮細胞小孔（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｆｅｎｅｓｔｒａｅ）および基底膜における陰電荷の増加が、陰イオン性分子の通過を抑える電荷障壁として作用する場合があることを示している。
【００１２】
陽イオン性リポソームは、器官特異的なパターンで内皮細胞に取り込まれ、肺に最も多く蓄積されることが報告されている（ＭｃＬｅａｎら、１９９７）。しかし、腫瘍の血管原性内皮細胞、および慢性炎症では陽イオン性リポソームが優先的に取り込まれ、高い割合で内皮細胞小孔と結びついていることが明らかにされている（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、１９９８）。内皮細胞小孔は、腫瘍内皮上に極めて高頻度に存在するので（ＲｏｂｅｒｔｓおよびＰａｌａｄｅ、１９９７；Ｈｏｂｂｓら、１９９８）、陽イオン性タンパク質の血管外への溢出部位である可能性がある。
【００１３】
３．陽イオン性リポソームの血管新生内皮細胞への標的化
マクドナルド（ＭｃＤｏｎａｌｄ）ら、米国特許第５，３２２，６７８号（１９９８）は、標的細胞の成長に影響するまたは標的細胞を標識する薬剤を含む陽イオン性リポソームを用いた血管新生内皮細胞の選択的標的化を報告している。陽イオン性リポソームは、十分な時間をかけて、リポソームそのものおよび／またはリポソームの内容物が血管原性内皮細胞内に入るように血管新生内皮細胞と結びつく。したがって同細胞内に入る薬剤は、細胞の血管新生を抑制したり促進したり、または単に血管新生部位の検出可能とする標識となったりする場合がある。マクドナルド（ＭｃＤｏｎａｌｄ）らの発明は、陽イオン性リポソームが、対応する静止状態の内皮細胞と結合する程度と比べて、５倍またはそれ以上高い比で血管原性内皮細胞と結合するという発見が元となっている。
【００１４】
このマクドナルド（ＭｃＤｏｎａｌｄ）らの特許では、例えば５ ｍｏｌ％またはそれ以上の陽イオン性脂質を有する、または具体的には約４５％の中性脂質と約５５％の陽イオン性脂質を有する中性および陽イオン性の脂質の両方を含む場合がある陽イオン性リポソームの用途について説明されている。マクドナルド（ＭｃＤｏｎａｌｄ）らは、陽イオン性リポソームが０ ｍＶを上回るζ電位をもつことを示している一方で、この発明では、任意の特異的なζ電位または等電点、またはその範囲が、血管原性内皮細胞の選択的な標的として好ましいものとなることは説明していない。マクドナルド（ＭｃＤｏｎａｌｄ）らはまた、血管新生内皮細胞の選択的な標的化を目的に陽イオン性リポソーム組成物に用いる陽イオン性脂質の好ましい上限を示してもいない。
【００１５】
サーストン（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ）ら（１９９８）も、陽イオン性リポソームを用いた、マウスの腫瘍および慢性炎症における内皮細胞の標的化について説明している。サーストン（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ）は、５５ ｍｏｌ％の陽イオン性成分を有する陽イオン性リポソームを用いている。サーストン（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ）は、マウスの腫瘍または慢性炎症における内皮細胞を選択的に標的化するための具体的なζ電位または等電点、またはその範囲について説明していない。
【００１６】
４．タンパク質の薬物動態の調節
モーガン（Ｍｏｒｇａｎ）らによる米国特許第５，３２２，６７８号（１９９４）および米国特許第５，６３５，１８０号（１９９７）では、タンパク質の薬物動態を、その電荷を変えることで変化させる方法が説明されている。これらの特許では、抗体またはその断片の陽イオン性の程度が大きいほど、より容易に糸球体基底膜に蓄積し、そのため、より速やかに血清から除去されるという知見に基づき、「標的化タンパク質」の、特に抗体断片の腎クリアランスを調節する方法が説明されている。したがってモーガン（Ｍｏｒｇａｎ）らによれば、タンパク質薬剤の正味電荷を変化させて、血流からのクリアランス速度を上昇または低下させることができる。
【００１７】
モーガン（Ｍｏｒｇａｎ）らの特許では、腫瘍細胞が正味の負の表面電荷をもつこと、また正常細胞が同様に負の電荷のクラスターをもつことが観察されている。モーガン（Ｍｏｒｇａｎ）は、腫瘍細胞に陰電荷があるにもかかわらず、標的とされる治療用タンパク質の電荷を、腎クリアランスを低下させ、血清半減期を延長させ、また正常細胞との非特異的な相互作用を最小とする目的で、さらに負（すなわち、さらに陰イオン性の、また別の表現では、７未満の等電点をもつように）にすべきであると説明している。こうすることで、腫瘍などの標的部位における薬剤の局在が高まることが可能になると説明されている。モーガン（Ｍｏｒｇａｎ）らは、酸性側へのシフトが少なくともｐＨ単位の１０分の１であって４ ｐＨ単位未満、より好ましくは、等電点の酸性側へのシフトが約１ ｐＨ単位であるように、より酸性の等電点をもつように治療薬を修飾することを説明している。モーガン（Ｍｏｒｇａｎ）らは、ｐＩが４．０またはそれ未満（より酸性）であれば、本質的に全てのイオン化可能な官能基がタンパク質内でプロトン化されると説明している。これを達成する方法の一つは、標的化タンパク質の少なくとも１個のリシン残基の電荷を正味の陽電荷から正味の陰電荷へ変えることである。これについては例えば米国特許第５，６３５，１８０号のｃｏｌｓ． ６〜８および１１、ならびに米国特許第５，３２２，６７８号のｃｏｌｓ． ６〜８を参照されたい。
【００１８】
対照的に、診断用画像化製品についてモーガン（Ｍｏｒｇａｎ）らは、中性または塩基性の抗体断片が、初期時点で血清クリアランス、およびバックグラウンドに対する腫瘍比を高くさせるために必要であると説明している。しかし比較的塩基性の（陽イオン性の）断片は、短い半減期の同位元素に好ましく、比較的酸性の（陰イオン性の）断片は長目の半減期の同位元素に好ましいと説明されている。したがってモーガン（Ｍｏｒｇａｎ）らは、診断薬には、より塩基性の等電点、また治療薬には、より酸性の等電点が適していると説明している。しかしモーガン（Ｍｏｒｇａｎ）らは、標的化を最大にして毒性を最小とするための治療薬または診断薬のいずれかの電荷または等電点を調整するための手引きを提示していない。
【００１９】
モーガン（Ｍｏｒｇａｎ）らとは対照的に、カウリ（Ｋｈａｗｌｉ）らによる米国特許第５，９９０，２８６号（１９９９）では、正味の陽電荷を増加させるのではなく、正味の陽電荷を低下させた（等電点を酸性側へシフトさせた）抗体の診断目的の用途について説明されている。カウリ（Ｋｈａｗｌｉ）らによれば、これは抗原結合特異性を上昇させ、非特異的な結合を低下させ、またインビボにおけるクリアランス時間を短縮することを目的としている。開示された方法には、検出対象抗原に対する結合特異性を有する完全な抗体（配置された複数の遊離アミノ基を有する天然の抗体）を得る段階、少なくとも一種の遊離アミノ基を化学薬剤と反応させて修飾抗体を生じさせる段階（この段階で修飾抗体が完全抗体の等電点より低い等電点をもつようになる）、および修飾抗体を検出用標識で標識する段階が含まれる。この方法により、例えばγカメラなどによる免疫シンチグラフィで検出可能な標識された修飾抗体が得られると説明されている。
【００２０】
カウリ（Ｋｈａｗｌｉ）らと同様に、Ｒｅｎａｌ Ｆａｉｌｕｒｅ ２０（２）：２１１〜２１７（１９９８）におけるロック（Ｒｏｋ）らの論文は、薬剤−ＬＭＷＰ接合体の尿中排出が、担体表面上の陽電荷を低下させる（等電点を酸性側へシフトさせる）ことで増加する場合があることを示すデータを報告している。したがって、このような担体は、薬剤を膀胱へ標的化させるための魅力的な候補であると説明されている。
【００２１】
以上のような先行技術では、治療薬の正味電荷を減少させるような電荷の修飾、すなわち正に帯電した治療薬および診断薬が、不活性な血管部位と比較して、負に帯電しているか、または陰イオン性の電荷のクラスター形成を示す活性化血管部位へ選択的に標的化されるという意外な知見に部分的に基づく本発明とは異なり、標的部位への局在を増加させる目的で、対象薬剤をより陰イオン性にすることが説明されている。本発明は、治療薬および診断薬を修飾して、活性化血管部位へ選択的に標的化するために、正味のζ電位または等電点を上昇させることを説明する。本発明では、活性化血管部位へ選択的に向かわせるためのζ電位および等電点の範囲の手引きを提示する。
【００２２】
現時点では、治療薬および診断薬を標的部位、例えば血管新生部位または炎症部位へ選択的に輸送する臨床的に証明された方法がないことから、このような条件は、癌性組織を外科的に除去するといった物理的手段で直接処置されている。血管新生部位は化学的手段で処置される場合もある。例えば化学療法薬剤が癌に投与され、抗炎症薬が治療中の慢性の抗炎症条件に投与される。しかし、このような処置は、手術リスク、副作用、効力、および成功率に関して懸念がある。さらに化学療法などの処置は標的とされず、化学療法に起因する骨髄抑制、胃腸炎、嘔気、脱毛症、肝または肺の障害、および不妊症などの副作用が生じる場合がある。したがって、さまざまな血管新生関連疾患に見出されるように、治療薬および診断薬を活性化血管部位へ選択的に輸送する新しい方法を開発することが求められている。
【００２３】
活性化血管部位、すなわち血管新生が起こっている領域で陰電荷を増強することは、静止状態の内皮細胞と活性化細胞を区別する手段となる。このような負に帯電した活性化血管部位は、正味の陽電荷または後述する範囲の陽電荷をもつように修飾された治療薬および診断薬の標的となりうる。治療薬、画像化剤、および診断薬を、陽電荷をもつように、また活性化血管部位へ選択的に標的化するように修飾することができる。
【００２４】
発明の概要
本発明は、治療用組成物、診断用組成物、または他の薬学的組成物を、その電荷または電荷密度をそれぞれ修飾することで活性化血管部位へ選択的に標的化する方法を提供する。薬剤または薬剤担体の組成物の電荷の修飾に密接に相関する対象が、その耐容性の変化である。正に帯電した薬剤担体系は、耐容性が生物学的に不良であるとみなされることがある。つまり典型的には、正に帯電した成分量の増加とともに毒性が上昇する。実施例で明らかにされるように、発明者らは驚くべきことに、薬剤担体系の標的に関する挙動と、そのζ電位との間に直線関係があることを見出した。しかし、ζ電位と陽イオン性成分濃度との関係は双曲線に最適に適合する。このため、標的化がほぼ最大であるが陽イオン性成分濃度はそれほどではない領域を特定することができる。このような選択的標的化法は、好ましくは、以下からなる群より選択される組成物を投与することで実施される：（ａ）ｐＨが約７．５の約０．０５ ｍＭ ＫＣｌ溶液中におけるζ電位が約＋２５ ｍＶ〜＋１００ ｍＶの範囲の、リポソーム以外の粒子；（ｂ）７．５を上回る等電点をもつ分子；および（ｃ）約２５ ｍｏｌ％〜５０ ｍｏｌ％の範囲の陽イオン性脂質を含むリポソーム；（ｄ）ｐＨが約７．５の約０．０５ ｍＭ ＫＣｌ溶液中におけるζ電位が約＋２５ ｍＶ〜＋１００ ｍＶの範囲の陽イオン性脂質層をもつ磁性体（ｍａｇｎｅｔｏｓｏｍｅ）；（ｅ）外層に２５〜６０ ｍｏｌ％の範囲で陽イオン性両親媒性物質を含むか、またはｐＨが約７．５の約０．０５ ｍＭ ＫＣｌ溶液中におけるζ電位が約＋２５ ｍＶ〜＋１００ ｍＶである水中油型のエマルジョンまたはマイクロエマルジョン。対象となる活性化血管部位は、（ａ）血管新生部位；（ｂ）炎症部位；（ｃ）創傷治癒部位；ならびに（ｄ）血液脳関門を含む。他の同様の部位は当業者に明らかである。
【００２５】
好ましくは、活性化血管部位への選択的標的化用の画像化用組成物には画像化剤および担体が含まれる。活性化血管部位への選択的標的化用の治療用組成物には治療的有効量の活性成分および担体が含まれ、そしておそらく画像化剤も含まれる。対象となる担体には以下のような担体が含まれる：（ａ）ｐＨが約７．５の約０．０５ ｍＭ ＫＣｌ溶液中におけるζ電位が約＋２５ ｍＶ〜＋１００ ｍＶの範囲の、リポソーム以外の粒子；（ｂ）７．５を上回る等電点をもつ分子；（ｃ）約２５ ｍｏｌ％〜５０ ｍｏｌ％の範囲の陽イオン性脂質を含むリポソーム；（ｄ）ζ電位が約＋２５ ｍＶ〜＋１００ ｍＶ範囲の陽イオン性脂質層をもつ磁性体；（ｅ）外層に約２５〜６０ ｍｏｌ％の範囲で陽イオン性両親媒性物質を含むか、またはｐＨが約７．５の約０．０５ ｍＭ ＫＣｌ溶液中におけるζ電位が約＋２５ ｍＶ〜＋１００ ｍＶである、水中油型のエマルジョンまたはマイクロエマルジョン。適切な画像化剤には、酸化鉄粒子、色素、蛍光色素、ＮＭＲ標識、シンチグラフィ標識、金粒子、ＰＥＴ標識、超音波造影剤、およびＣＴ造影剤が含まれる。
【００２６】
哺乳動物、また特にヒトを含む動物を対象とした治療法、診断法、および画像化法では、血管新生部位の近傍における画像化または他の診断目的にかなう、薬剤または活性成分の有効レベルの選択的な蓄積を可能とするプロトコルで薬剤が投与される。
【００２７】
対象となる投与経路には、経口投与、静脈内投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、動脈内投与、および筋肉内投与、点眼ならびにエアロゾル投与などがある。
【００２８】
好ましい態様においては、治療用組成物の活性成分は、細胞増殖抑制剤および細胞毒性剤からなる群より選択される。細胞増殖抑制剤および細胞毒性剤の例には、タキサン、無機錯体、有糸分裂阻害剤、ホルモン、アントラサイクリン、抗体、トポイソメラーゼ阻害剤、抗炎症薬、アルカロイド、インターロイキン、サイトカイン、成長因子、タンパク質、ペプチド、テトラサイクリン、およびヌクレオシド類似体などがあるがこれらに限定されない。このような薬剤の特定の例には、パクリタキセルおよびその誘導体、ドセタキセルおよびその誘導体、エポシロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）Ａ、エポシロンＢ、エポシロンＤおよびそれらの誘導体、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｅｃｉｎ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ビンクリスチン、ナベルビン抗菌活性剤（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｉ ａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）、トロンボスポンジン、アンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、シスプラチン化合物および他の白金化合物、ゲムシタビン、ならびに５’−フルオロウラシルおよび他のヌクレオシド類似体などがあるがこれらに限定されない。
【００２９】
本発明の他の局面は、以下からなる群より選択される一つまたは複数の特徴をもたせるための、さまざまな組成物の修飾を含む：（ａ）ｐＨが約７．５の約０．０５ ｍＭ ＫＣｌ溶液中における約＋２５ ｍＶ〜＋１００ ｍＶの範囲のζ電位；および（ｂ）７．５を上回る等電点。
【００３０】
さまざまな疾患が前述の方法および組成物で治療されることが企図される。このような疾患には例えば、糖尿病性網膜症、慢性炎症性疾患、慢性関節リウマチ、炎症、皮膚炎、乾癬、胃潰瘍、血液腫瘍および固形腫瘍などが含まれる。場合によっては、活性化血管部位を同定することが血管新生関連疾患の適用となる。
【００３１】
好ましいζ電位範囲のζ電位を得るために、活性薬剤または担体のいずれかを修飾することで結合産物のζ電位を上昇または低下させる場合があることが企図される。このような修飾は、当業者に知られている化学的な方法で達成される場合があり、好ましくはエチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、トリエチレンテトラアミン、４−ジメチルアミノブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアミン、他の陽イオン性ポリアミン、ジメチルアミノベンズアルデヒド、ポリリシン、他の陽イオン性ペプチド、キトサン、および他の陽イオン性多糖類などを含むがこれらに限定されない陽イオン生成試薬、および／または陽イオン性試薬が含まれる。このような修飾は、活性薬剤を陽イオン性分子と反応させて両分子間に共有結合を生じさせることで達成されることもある。あるいは、このような修飾を、活性薬剤と陽イオン性薬剤または担体系との錯体形成（すなわち非共有結合を形成させること）により達成することができる。一部の組成物はタンパク質を含む場合があり、ζ電位を上昇または低下させるさまざまな試薬はタンパク質化学者および医薬品合成化学者に周知である。
【００３２】
本発明の好ましい態様において、診断用組成物、画像化用組成物、および治療用組成物は、血管新生関連疾患を治療するための組成物の投与を説明したラベルが表示されるまたは説明書とともに包装される、。
【００３３】
治療用組成物に含まれる活性成分が、エーテル脂質、アルキルリゾレシチン、アルキルリゾリン脂質、リゾリン脂質、アルキルリン脂質からなる群より選択されることが企図される。好ましくは、組成物中のエーテル脂質は、１−Ｏ−オクタデシル−２−Ｏ−メチル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−Ｏ−ヘキサデシル−２−Ｏ−メチル−ｓｎ−グリセロール、ヘキサデシルホスホコリン、およびオクタデシルホスホコリンを含むがこれらに限定されない。
【００３４】
好ましい態様において、治療用組成物は炎症を有効に抑制し、骨修復を促進し、または、創傷治癒を促進する。
【００３５】
好ましくは、投与される組成物のζ電位は、ｐＨが約７．５の約０．０５ ｍＭ ＫＣｌ溶液中で約＋２５ ｍＶ〜＋６０ ｍＶの範囲、より好ましくは、ｐＨが約７．５の約０．０５ ｍＭ ＫＣｌ溶液中で約＋３０ ｍＶ〜＋５０ ｍＶの範囲にある。本発明の別の態様においては、既知の診断用組成物、画像化用組成物、および治療用組成物を修飾して、組成物の有効ζ電位を上昇または低下させ、上述の好ましい範囲内、または詳細に説明すれば、ｐＨが約７．５の約０．０５ ｍＭ ＫＣｌ溶液中で約＋２５ ｍＶ〜＋６０ ｍＶの広い範囲に収まるようにする。
【００３６】
ＤＯＴＡＰに加えてさまざまな陽イオン性脂質が本発明の対象となる。例には、ＤＤＡＢ（ジオクタデシル−ジメチル−臭化アンモニウム）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β［Ｎ’−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）］コレステロール、ＤＯＳＰＥＲ（１，３−ジオレイル−２−（６−カルボキシ−スペルミル）−プロピル−アミド）などがあるがこれらに限定されない。
【００３７】
本発明は、特定部位を標的とする組成物のζ電位の最適範囲を決定する方法を提供する。本方法は以下の段階を含む：（ｉ）陽イオン性組成物の濃度を変化させながら組成物のζ電位を測定する段階；（ｉｉ）ζ電位の値をｙ軸に、陽イオン性成分の濃度をｘ軸にプロットして双曲線を得る段階；および（ｉｉｉ）双曲線が曲がった領域（双曲線が曲がった領域は組成物のζ電位の最適範囲を示す）における、陽イオン性組成物のζ電位および濃度を決定する段階。本発明は、さまざまな量の陽イオン性成分に結合する組成物のζ電位を評価する段階、およびζ電位の最適範囲を特定する段階を含む、特定部位を標的とする組成物のζ電位の最適範囲を特定する方法を提供する。本発明はまた、陽イオン性成分と上記組成物を結合させて最適範囲のζ電位を有する組成物を提供する段階を含む、組成物を修飾して、その効率を高める方法も提供する。
【００３８】
発明の詳細な説明
本発明は、特定の正味の陽電荷または電荷をもつ分子が、活性化血管部位を選択的に標的とすることができるという知見に基づいている。このような部位は、血管原性内皮細胞、炎症部位、および創傷治癒部位と関連して見出される。
【００３９】
本発明はまた、診断薬、画像化剤、および治療薬の正味の陽電荷を上昇させたり調節したりすることが、活性化血管部位におけるこのような薬剤の選択的な蓄積を招くという知見にも基づいている。また、特定の電荷範囲または電荷密度を選択することで、肺に長期的にみられるような、このような薬剤の炎症部位における蓄積は、他の組織における活性化血管部位と非活性化血管部位との間で標的化の選択性を提供しつつ最小化できる場合がある。この点について、後に示す範囲未満で正味の陽電荷をもつ薬剤が処理され、修飾され、包装されて、見かけ上の正味電荷を増加させることが企図される。後に示す好ましい範囲より正味の陽電荷を過剰にもつ薬剤が処理され、修飾され、包装されて、生物学的耐用性を改善するために、見かけ上の正味電荷を減少させることも企図される。
【００４０】
また本発明は、特定の正味の陽電荷をもつ分子が、静止状態の内皮細胞と肺などの比較的安定な活性化血管部位の内皮細胞の両方に対して、血管原性内皮細胞に選択的に結合して、それに取り込まれるという知見に基づいている。このような選択的な標的化および蓄積によって、上記薬剤と細胞外マトリックス、および血管原性内皮細胞との局所的な結合が強まる。また、薬剤のこのような選択的標的化および局所的蓄積は、腫瘍によって誘導される血管新生部位と区別される炎症と関連した活性化血管部位に存在する血管内皮細胞の近傍で生じる。このような蓄積はまた、活性化血管部位のいずれのタイプであっても、これら薬剤の高濃度の勾配を炎症部位または転移性腫瘍で生じる。血管外への溢出および他の関連する過程により、このような薬剤は、治療目的、造影目的、および診断目的で、そのような標的部位に選択的に蓄積する。
【００４１】
したがって本発明は、診断薬、画像化剤、または治療薬を、ヒト患者を含む哺乳動物の活性化血管部位へ選択的に向かわせる方法を提供する。一般に本発明では、ｐＨが約７．５で約０．０５ ｍＭ ＫＣｌ中で２５ ｍＶ以上の正味の正のζ電位、または７．５を上回る等電点を、好ましくは後述する範囲で有する薬剤の投与を行って、薬剤を一か所または複数の活性化血管部位へ選択的に蓄積させることができる。
【００４２】
そのような薬剤は、標的血管内皮細胞の近傍に薬剤が蓄積する時間および様式によって、炎症部位の血管内皮細胞、ならびに血管原性内皮細胞、およびその細胞外マトリックスを標的とすることができる。本発明は、後述される範囲において、ｐＨが約７．５で約０．０５ ｍＭ ＫＣｌ中で約２５ ｍＶ以上の特定の正味の正のζ電位を有するか、または等電点が７．５以上の担体、および活性成分を含む薬剤も提供する。また本発明の組成物および方法は、血管内皮細胞間の境界が崩れやすくなり、細胞およびその細胞外マトリックスが、静止状態部位、または非活性化血管部位に対する陰電荷の上昇を招く、創傷治癒と関連する活性化血管部位で使用することができる。
【００４３】
この点については、ζ電位が、微粒子、具体的には、リポソーム、磁性体、または大きさが約３ ｎｍ〜１０ ｎｍを上回るマイクロエマルジョンなどのコロイド粒子の電荷または電荷密度に適用可能な尺度の一つであることを、関連技術分野にかかわる者であれば理解できると思われる。同様に等電点が、タンパク質、抗体、およびデキストランなどのコロイドを含む巨大分子の電荷密度に適用可能な尺度の一つであることは明らかである。
【００４４】
１．定義
文中で特に断らない限り、本明細書で用いられる全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味をもつ。
【００４５】
「活性化血管部位」とは、活性化表現型を示し、内皮細胞間に通常見出される接合部が血管新生または炎症のために弛緩し、また、この部位の透過性が上昇して、血液、血漿、およびさまざまな薬剤の血管外への溢出が可能となる血管内皮部位を意味する。
【００４６】
「活性成分」とは、診断的または治療的に有効な薬剤を意味する。
【００４７】
「血管新生」とは新しい血管が形成されることを意味する。内皮細胞は、創傷修復時もしくは腫瘍形成時、または本明細書で血管新生関連疾患と呼ぶ他の病的な状態などで形成が誘導されるとインビボで新しい毛細血管を形成する。
【００４８】
「血管新生関連疾患」という用語は、血管新生が異常に長期化したり病理学的に誘導されるような、ヒトにおけるある種の病理学的過程を意味する。血管新生関連疾患には、糖尿病性網膜症、慢性炎症性疾患、慢性関節リウマチ、皮膚炎、乾癬、胃潰瘍、血液腫瘍、および他の型のヒト固形腫瘍などが含まれる。
【００４９】
「血管原性内皮細胞」とは、一般に血管内皮細胞が正常増殖速度より十分高い速度で増殖している、血管形成を生じている血管内皮細胞を意味する。
【００５０】
「担体」とは通常、診断薬、画像化剤、または治療薬とともに投与される希釈物、アジュバント、賦形剤、または溶媒を意味する。本明細書で用いられる担体という用語は、意図した標的部位への薬剤輸送を促進することを目的として、活性成分との複合体、または活性成分と結合しない複合体を含む薬学的に許容される成分も意味する。対象となる担体には、当技術分野で周知の担体、リポソーム、さまざまなポリマー、脂質複合体、血清アルブミン、抗体、シクロデキストリン、およびデキストラン、キレート、ならびに他の超分子集合体などが含まれる。
【００５１】
「陽イオン性」とは、生理学的ｐＨにおいて正味の陽電荷または正のζ電位（または７を上回る等電点）をもつ薬剤を意味する。
【００５２】
「コロイド」またはコロイド粒子とは、不溶性かつ１０ ｎｍ〜５０００ ｎｍの大きさをもつ、溶媒中に分散した粒子である。
【００５３】
「併用」または「供投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」とは、同時投与、連続投与、重複投与、交互投与、並行投与、または他の任意の投与計画を意味し、単回の投与、処方または指示の一部としてさまざまな薬剤が投与されたり治療が実施されたりし、通常は部分的または完全に投与されるさまざまな薬剤の投薬または治療が同時期に行われることを意味する。
【００５４】
「診断薬または画像化剤」とは、ＭＲＩ法およびシンチグラフィ法を含むさまざまな検出法による血管新生部位の局在決定または可視化に使用可能な薬学的に許容される薬剤を意味する。対象となる診断薬または画像化剤には、色素、蛍光色素、金粒子、酸化鉄粒子、ならびに常磁性分子、Ｘ腺減弱性化合物（ＣＴまたはＸ線用）、超音波、γ線放出性同位元素（シンチグラフィ）、および陽電子放出同位元素（ＰＥＴ）の造影剤を含む他の造影剤などの当技術分野で周知の薬剤が含まれる。
【００５５】
「診断的に有効である」とは、モニタリングまたは画像化する目的で、血管新生部位または血管形成部位の局在決定またはそうでなければ特定に有効な薬剤を意味する。
【００５６】
「エマルジョン」または「マイクロエマルジョン」とは、二種の非混和液を含む系を意味し、極めて小さな球状の相（内相）が、もう一方の相（外相）全体に分散する。例えば水中油型（ミルク）または油中水型（マヨネーズ）などがある。エマルジョンまたはマイクロエマルジョンは、二種の非混和液のコロイド分散の場合がある（例えば液−液分散）。
【００５７】
「内皮細胞」とは、血管、心臓、およびリンパ管の内面に並ぶ細胞の単層である内皮を構成する細胞を意味する。内皮細胞は細胞分裂能を保持するが、通常（すなわち非血管原性）の条件下で極めて緩やかに増殖する（１年に約１回の細胞分裂）。
【００５８】
「毒性が高い」または「毒性の高い薬剤」とは、標的細胞内で発現されて、タンパク質、ＤＮＡ、またはＲＮＡの合成を抑制したり、もしくは脂質表面を不安定化したりするほか、またそれ以外にはアポトーシスまたはネクローシスによる細胞死を生じるタンパク質またはペプチドを意味する。このような薬剤は、１９９９年１１月３日に出願された関連出願第６０／１６３，２５０号に記載されている。
【００５９】
「ζ電位を上昇させる」、または「等電点を上昇させる」という表現は、活性成分または担体化合物を対象に、誘導体化、共有結合の修飾、アミノ酸の置換もしくは付加、担体または他の基質との複合体化もしくは結合によって達成されるように、血管新生部位などの活性化血管部位における成分または担体の蓄積速度および蓄積量に統計学的に有意な変化を、このような変化または修飾を行う前における同成分または担体の蓄積に対して生じるように、その正味の陽電荷の量を増やして、変化させたり修飾したりすることを意味する。
【００６０】
「等電点」（ｐＩまたはＩＥＰ）とは、分子が正味電荷をもたない時のｐＨを意味する。
【００６１】
「フェロソーム（ｆｅｒｒｏｓｏｍｅｓ）」とも呼ばれる「マグネトソーム（ｍａｇｎｅｔｏｓｏｍｅ）」とは、１層または複数の脂質層に包まれた数ナノメートルの大きさの磁鉄鉱コアを意味する。
【００６２】
「水中油型エマルジョン」とは、水性溶媒中において、両親媒性脂質の層で封入された疎水性の油性コロイド滴の分散を意味する。
【００６３】
血管原性毛細血管などの活性化血管部位に関する「選択的に標的とする」、または「選択的に結合させる」という表現は、血管新生内皮細胞またはその細胞外マトリックスの近傍に薬剤が蓄積すること、または薬剤が血管新生内皮細胞またはその細胞外マトリックスに、対応する正常な（すなわち非血管原性）内皮細胞で見出されるより高レベルで結合および／または取り込まれることを意味する。
【００６４】
蛍光強度に関する「選択性」とは、周辺組織の蛍光強度に対する腫瘍内皮細胞の相対的な蛍光強度の比を意味する。したがって実施例５では選択性は、荷電性デキストラン分子が腫瘍内皮に結合する親和性の値として測定される。
【００６５】
「治療的に有効な」という表現は、炎症性疾患、または癌などの血管新生関連疾患の病態の量または程度を有効に低下させる薬剤、または血管形成または血管新生の速度を、好ましくは、既存の血管形成部位においてこのような過程の継続を実質的に妨げたり、別の望ましくない血管新生部位における血管新生の開始を実質的に妨げたりするまで低下させる薬剤を意味する。例えば、腫瘍の転移に関連する血管新生を治療する場合、治療的に活性または有効な薬剤は、有意な抗腫瘍活性、または腫瘍の縮小を、腫瘍細胞に対する直接的な作用、または血管新生の抑制のいずれかによって示すことがある。このような化合物は例えば、原発性腫瘍の増殖、好ましくは癌の転移能を低下させることがある。あるいは、このような化合物は、例えば微小血管の大きさや数の低下、または血管密度比の低下のいずれかによって腫瘍の血管分布を縮小させる可能性がある。
【００６６】
「腫瘍の縮小」とは、腫瘍の全体の大きさ、直径、断面積、重量、または生存能が低下することを意味する。つまり、腫瘍マーカーの減少、または本発明の組成物で癌患者を治療した結果として、癌細胞の減少または増殖遅延を示す、癌の診断または予後の他の一般的な指標の正の徴候を意味する。好ましくは、このような化合物を投与することで、癌患者の一か所またはそれ以上の腫瘍部位で約３０％〜５０％の腫瘍の縮小、好ましくは少なくとも約６０％〜７５％の腫瘍の縮小、さらにより好ましくは少なくとも約８０％〜９０％の腫瘍の縮小、かつ最も好ましくは少なくとも約９５％〜９９％の腫瘍の縮小が生じる。理想的には、このような投与により、癌患者の一か所または複数の部位において、生存能力のある腫瘍細胞の死滅または根絶が誘導されるか、または腫瘍細胞が完全に除かれて、臨床的に観察可能な緩解、または患者の他の健康状態の増進に至る。
【００６７】
「血管新生部位の近傍」とは、活性成分が血管新生内皮細胞と新生血管系に物理的に近接していることを意味し、血管新生関連疾患に関して診断的または治療的に有効な活性成分量の輸送を可能とする局所的濃度勾配が形成される。
【００６８】
「ζ電位」とは、特定の条件下においてレーザードプラー（Ｌａｓｅｒ Ｄｏｐｐｌｅｒ）微量電気泳動法により、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００などの機器を用いて測定される、コロイド粒子などの粒子の測定電位を意味する。ζ電位は、バルク溶液と水力学的なせん断力がかかる領域（拡散層）との間の境界における電位を意味する（図１参照）。「ζ電位」とは、外側に作用して粒子の界面動電位的な挙動にかかわる粒子の電位であるため、「界面動電位」と同義である。
【００６９】
２．詳細な説明
Ａ．荷電性デキストランでコーティングされた酸化鉄粒子のＨＵＶＥＣによる取り込み
巨大分子の内皮細胞への輸送は、分子の大きさだけでなく、その電荷にも依存している。例えばマクドナルド（ＭｃＤｏｎａｌｄ）ら（米国特許第５，８３７，２８３号）では、陽イオン性リポソームが、腫瘍に栄養を供給する、血管原性内皮細胞を選択的に標的とすることについて開示されている。またスプラッグ（Ｓｐｒａｇｇ）ら（１９９７）は、細胞毒性剤ドキソルビシンを含むＥセレクチンで標的化した免疫リポソームとインキュベートした活性化されたヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）が細胞生存率を有意に低下させた一方で、活性化されていないＨＵＶＥＣは同じ処理による影響を受けなかったことを説明している。Ｅセレクチンで標的化された免疫リポソームは、Ｅセレクチンに特異的なモノクローナル抗体を結合させた陽イオン性リポソームからなる。Ｅセレクチンは、インビボで活性化部位に発現される内皮に特異的な細胞表面分子であり、サイトカインで処理することでＨＵＶＥＣによって誘導される。腫瘍内皮の細胞表面または糖衣（ｇｌｙｃｏｃａｌｙｘ）が負に帯電していることは当業者に周知である。
【００７０】
本発明は、ヒト臍血管内皮細胞培養において、正に帯電したデキストランでコーティングされた酸化鉄の取り込みが、中性のデキストランまたは負に帯電したデキストランでコーティングされた酸化鉄の取り込みと比べて大きいという知見に部分的に基づいている。表１に示すように、ＨＵＶＥＣを、正に帯電したデキストランでコーティングされた酸化鉄とインキュベートすると、酸化鉄の５１．８％が細胞に取り込まれて細胞溶解物中に認められ、４８．２％が培地中に残った。一方ＨＵＶＥＣを、負に帯電したデキストランでコーティングされた酸化鉄とインキュベートすると、酸化鉄の２８．７％が細胞溶解物中に認められ、７１．３％が培地中に残った。またＨＵＶＥＣを、中性デキストランでコーティングされた酸化鉄とインキュベートすると、酸化鉄の１８．４％が細胞溶解物中に見出され、８１．６％が培地中に認められた。
【００７１】
Ｂ．陽イオン性電荷と標的化の相関
先行技術では、抗体およびリポソーム、磁性体（ｍａｇｎｅｔｏｓｏｍｅ）、ならびにマイクロエマルジョンなどの巨大分子の腫瘍部位への輸送が、対象分子の電荷に依存することが示唆されているが、先行技術では、血管原性内皮細胞およびその細胞外マトリックスなどの活性化血管部位への診断薬、画像化剤、および治療薬の選択的標的化を促進するζ電位または陽電荷の特定の範囲は何ら提示されていない。
【００７２】
本発明は、陽イオン性リポソーム、ならびに磁性体および水中油型マイクロエマルジョンに見出されるように、ＤＯＴＡＰ（（１，２−ジオレオイル），ｓｎ−３−グリセロトリメチルアンモニウムプロパン）、または他の任意の正に帯電した脂質（一価または多価に帯電したもの）のｍｏｌ％の上昇が、巨大分子のζ電位、および血管原性内皮細胞の近傍におけるその選択的関連性に相関するという知見に部分的に基づいている。表２および表３に示すように、４ ｍｏｌ％〜５０ ｍｏｌ％の範囲のＤＯＴＡＰ濃度では、ζ電位の比較的一定の上昇がみられる。しかし５０ ｍｏｌ％を上回るＤＯＴＡＰ濃度では、ζ電位の値は安定化し、最大値がｐＨ ７〜ｐＨ ７．５で約＋６０ ｍＶとなる。表２および表３の結果のグラフでは、異なる緩衝液系でζ電位が測定された場合でも双曲線の形状が維持されることが確認できる（図２および図３）。絶対的なζ電位は異なる緩衝液中ではわずかに変化するが、結果を示すグラフの双曲線の形状は変わらない。
【００７３】
データは、超分子集合体中における（例えばリポソーム）正味の陽電荷と陽イオン性成分との関連が線形でないことを示している（図２）。ＤＯＴＡＰ濃度が６０ ｍｏｌ％を上回るとζ電位はプラトーに達する。すなわち、陽イオン性成分濃度をさらに上昇させてもζ電位は上昇しない。電荷密度には最大値が存在するようであり、それを越えて陽イオン性成分をさらに添加しても利点はない。治療薬、画像化剤、または治療薬のζ電位を、このζ電位を越えて上昇させると、標的部位以外の組織における非特異的な結合が増大することで、毒性および他の副作用が大きくなる可能性が高い。クリアランス速度を上昇させることで、標的部位で利用可能な有効用量を低下させることもできる。
【００７４】
以上のデータから、本発明の好ましい治療薬、画像化剤、または診断薬を製剤化して、活性化血管部位における選択的な結合を最適化することができる。しかし発明者らによって驚くべきことに認められたように、粒子状態のこのような薬剤のζ電位は、好ましくは、さらにζ電位が上昇しても、血管原性内皮細胞による取り込み、または活性化血管部位における薬剤の蓄積の対応する上昇をもはや生じない点より低く留めるべきである。こうすることで、選択的蓄積による利益が得られ、このような薬剤の非特異的な結合および副作用の量は最小とすることができる。
【００７５】
したがって例えば、本発明の診断用、画像化用、および治療用組成物は、好ましくは、ｐＨが約７．５の約０．０５ ｍＭ ＫＣｌ中における約＋２５ ｍＶ〜＋１００ ｍＶの範囲の正味のζ電位を生じるか、または記載された条件において約２０〜６０ ｍｏｌ％の範囲の陽イオン性成分を含む。好ましくは、ｐＨが約７．５の約０．０５ ｍＭ ＫＣｌ中において約＋２５ ｍＶ〜＋６０ ｍＶの範囲、または約２５ ｍｏｌ％〜５０ ｍｏｌ％の陽イオン性成分が用いられる。より好ましくは、ｐＨが約７．５の約０．０５ ｍＭ ＫＣｌ中において約＋２５ ｍＶ〜＋５５ ｍＶの範囲範囲が用いられる。最も好ましくは、ｐＨが約７．５の約０．０５ ｍＭ ＫＣｌ中において約＋３０ ｍＶ〜＋５０ ｍＶの範囲が用いられる。したがって、ＤＯＴＡＰおよび中性脂質で製剤化されたリポソームについては、ＤＯＴＡＰの最適量は約２０ ｍｏｌ％〜６０ ｍｏｌ％の範囲にあり、またより好ましくは約３５ ｍｏｌ％〜５０ ｍｏｌ％である。
【００７６】
一般に、図２および図３に示した結果に基づき、少なくとも２５ ｍｏｌ％、最大でも６０ ｍｏｌ％の陽イオン性成分を含むことが好ましい。図２および図３は、０ ｍｏｌ％〜５０ ｍｏｌ％では、対応するζ電位が直線的に上昇することを示している。２５ ｍｏｌ％未満では、対応するζ電位は曲線の下半分にある。したがって、血管原性内皮細胞への標的化は、本明細書で対象となる目的には適切ではない場合がある。約６０ ｍｏｌ％以上では、それほど多くの選択的な標的化は得られない。したがって６０ ｍｏｌ％の陽イオン性成分が好ましい上限である。取り込み曲線の変曲点も、最適な剤形を得る際に考慮される場合がある。好ましくは、曲線の変曲点の最適領域は、変曲点におけるζ電位の約±１０ ｍＶか、または変曲点における陽イオン性成分の濃度の約±１０ ｍｏｌ％である。
【００７７】
ζ電位がコロイド粒子に加わるので、陽イオン性分子について同様の標的化の挙動が観察される。本出願では、好ましい等電点は７．５以上である。
【００７８】
本発明の対象となる他の陽イオン性脂質の例には、ＤＤＡＢ（ジオクタデシル−ジメチル−臭化アンモニウム）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）］コレステロール、ＤＯＳＰＥＲ（１，３−ジオレオイル−２−（６−カルボキシ−スペルミル）−プロピル−アミド）などがあるがこれらに限定されない。
【００７９】
Ｃ．インビボにおける、正に帯電した分子の血管原性内皮細胞への選択的標的化
本発明はさらに、荷電性デキストランと活性化血管部位の一種、具体的には、インビボで腫瘍部位に位置する血管原性内皮細胞との結合親和性が、同分子の正味の陽電荷とともに上昇するという知見に基づいている。図４Ａ〜図４Ｃに示すように、正味の陽電荷をもつデキストラン分子の選択性は、中性または陰電荷をもつ対応する分子群より大きい。本開示の目的では、陰性デキストランのｐＩは約３とみなされ、中性デキストランでは約７、陽性デキストランは約１０とみなされる。本明細書に記載された結果から、陽イオン性巨大分子が、細胞表面に位置する負に帯電した結合部位、または内皮の糖衣（ｇｌｙｃｏｃａｌｙｘ）に吸着することがわかる。これは、活性化血管部位における薬剤の局所濃度が、比較的漏洩性の内皮細胞壁を介して標的組織に至る構築物の血管外溢出を促す局所濃度勾配とともに上昇することを反映している。
【００８０】
Ｄ．ヒト腫瘍異種移植片における血管透過性：分子の電荷依存性
正常組織では、管腔内皮膜は負に帯電している（Ｃｕｒｒｙら、１９８７；Ｔｕｒｎｅｒら、１９８３；Ｂａｌｄｗｉｎら、１９９１）。したがって、培養内皮細胞単層を対象にインビトロで（Ｓａｈａｇｕｎら、１９９０）、またさまざまな正常組織で（Ｊａｉｎら、１９９７）示されているように、陰イオン性巨大分子の血管外への溢出は制限されている。上述したように、アダムソン（Ａｄａｍｓｏｎ）ら（１９８８）は、α−ラクトアルブミン（ＭＷ＝１４，１７６；正味電荷−１０）の微小血管透過率が、リボヌクレアーゼ（ＭＷ＝１３，６８３；正味電荷＋４）の透過率の約５０％であることを明らかにしている。この結果は、正常組織における正に帯電した分子の微小血管透過率が、負に帯電した分子の透過率より高いことを示唆している。陰イオン性巨大分子の輸送が制限されることは、浸透圧作用により、体液の恒常性の維持に極めて重要である（Ｃｕｒｒｙ、１９８４）。
【００８１】
ただし、腫瘍血管は正常血管とは大きく異なる。腫瘍血管壁内外の輸送に分子電荷が果たす役割は未だ解明されていない。本発明では、分子電荷が腫瘍血管障壁内外の輸送過程に及ぼす作用について説明する。
【００８２】
本発明は、正に帯電した分子が、中性または陰電荷をもつ同様の大きさの化合物と比較して固形腫瘍の血管の元になる血管に高濃度で蓄積する可能性があるという観察に部分的に基づいている。高濃度で蓄積することで、このような正に帯電した分子群は、腫瘍組織に対する腫瘍血管より速く血管外へ遊出する場合がある。表４（実施例５）は、陽イオン性ＢＳＡ（ｐＩの範囲：８．６〜９．１）、およびＩｇＧ（ｐＩ：８．６〜９．３）の腫瘍血管透過率が、陰イオン性ＢＳＡ
2004511426.tif 000003
およびＩｇＧ
2004511426.tif 000004
と比べて２倍以上高い（４．２５および４．６５×１０−７ ｃｍ／秒）ことを示している。したがって、分子のｐＩまたはζ電位を上昇させる陽イオン化は、診断薬または治療薬、ならびに固形腫瘍に対する遺伝子治療用ベクターおよび他の巨大分子の輸送を改善する有効な方法となる可能性がある。
【００８３】
Ｅ．中性および陽イオン性のローダミン標識リポソームのヒト内皮細胞培養物（ＨＵＶＥＣ）による取り込み
本発明はさらに、中性および陽イオン性のローダミン標識リポソームのＨＵＶＥＣによる取り込みが、ζ電位とＤＯＴＡＰのｍｏｌ％が相関することについて上述したデータと匹敵するという知見に基づいている。図５Ａに示すように、ＤＯＴＡＰが０ ｍｏｌ％〜５０ ｍｏｌ％の間は、蛍光強度は比較的一定して上昇する。ＤＯＴＡＰ濃度が５０ ｍｏｌ％を上回ると、蛍光強度の値は安定する。発明者らはこのデータを元に、生理学的ｐＨにおける内皮細胞標的化のために、本発明の方法および組成物に意図して用いられるリポソームが、約２０ ｍｏｌ％〜６０ ｍｏｌ％のＤＯＴＡＰ、または他の陽イオン性脂質の濃度、より好ましくは上述したように約５０ ｍｏｌ％の濃度を含むと考えている。ζ電位に対する蛍光強度の測定結果を示す図５Ｂは、ＨＵＶＥＣ細胞で測定された蛍光強度とζ電位との関連が比較的直線的であることを示している。したがって、標識リポソームのζ電位がさらに上昇しなければ、標識リポソームのＨＵＶＥＣによる取り込みは増えないと考えられる。
【００８４】
Ｆ．電荷（すなわち等電点またはζ電位）を高める化合物の修飾
診断薬、画像化剤、および治療薬を、誘導体化、または修飾することで等電点またはζ電位を上昇させるさまざまな手法がある。例えばモーガン（Ｍｏｒｇａｎ）らによる米国特許第５，６３５，１８０号および米国特許第５，３２２，６７８号、ならびにカウリ（Ｋｈａｗｌｉ）らによる米国特許第５，９９０，２８６号では、タンパク質組成物を修飾してその正味電荷を調節するさまざまな手法について説明されている。同様にロック（Ｒｏｋ）ら（Ｒｅｎａｌ Ｆａｉｌｕｒｅ ２０（２）：２１１〜２１７（１９９８））は、活性成分に対する担体分子が修飾されたさまざまな治療用剤形について報告している。
【００８５】
産物の修飾、誘導体化、および組換え発現の手法は、抗体、抗体断片、成長因子、ホルモン、または他のタンパク質活性薬剤に一般的に応用することができる。活性成分を結合させるさまざまな標的化部分および担体部分の電荷（等電点）を増加させる修飾および誘導体化に適した他の手法がある。このような担体には例えば、ポリビニルピロリドン、ピランピラン共重合体、ポリヒドロキシ−プロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチル−アスパルタミド−フェノール、またはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキサイド−ポリリシンを含むさまざまなポリマーがある。有用な陽イオン生成薬には、タンパク質のカルボキシ基とのＥＤＣＩ反応を介したエチレンジアミンなどがある。特定の例にヘキサメチレンジアミンがある。他の陽イオン性薬剤には、ヘキサメチレンジアミン、トリエチレンテトラアミン、４−ジメチルアミノブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアミン、およびジメチルアミノベンズアルデヒドなどが含まれるがこれらに限定されない。
【００８６】
また本発明の適切な正味の正のζ電位をもつ活性成分は、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸とポリグリコール酸の共重合体、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、ならびにヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロック共重合体などの薬剤の徐放を達成するのに有用な一連の生分解性高分子に結合させることもできる。重合体および半透性重合体マトリックスは、ステントやチューブなどの造形物に成形することができる。
【００８７】
化合物を修飾して正味電荷を調節する分野の当業者であれば、他の関連する修飾法になじみがあると思われる。例えば、薬剤の陽電荷を、その経皮輸送を促すことを第一に意図しながら増加させる組成物および方法について記載されたジョリー（Ｇｙｏｒｙ）らによる米国特許第５，９９０，１７９号（１９９９）を参照することができるが、開示された手法は、その発明の組成物および方法に関連するものである。
【００８８】
以上のような電荷を増やす修飾によって利益が得られるであろう診断薬、画像化剤、および治療薬の例には、エーテル脂質、アルキルリゾレシチン、アルキルリゾリン脂質、リゾ脂質、アルキルリン脂質などが含まれるがこれらに限定されない。これらの薬剤が、細胞増殖抑制作用をもつことと、リポソーム組成物の膜二重層の一部から構成されうることが指摘されている。このような薬剤の特定の例には、１−Ｏ−オクタデシル−２−Ｏ−メチル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−Ｏ−ヘキサデシル−２−Ｏ−メチル−ｓｎ−グリセロール、ヘキサデシルホスホコリン、オクタデシルホスホコリンが含まれるがこれらに限定されない。
【００８９】
Ｇ．診断および造影用の標識
本発明の一つの局面として、正に帯電した分子を、血管原性内皮細胞の成長を誘導した腫瘍を画像化するための診断マーカーとして使用することができる。画像を得ることを目的とした本発明の好ましい応用には、診断ツールとしての磁気共鳴の使用が含まれる。リポソーム状態での投与に適した薬剤については、上述した好ましいζ電位を有するリポソームを得る陽イオン性化合物および非陽イオン性化合物の範囲で製剤化可能なリポソームを調製するためのさまざまなプロトコルを当業者であれば理解すると思われる（Ｓｚｏｋａら、１９８０）。内皮細胞を標的とする磁性体（ｍａｇｎｅｔｏｓｏｍｅ）も、上述のリポソーム製剤に使用される同様の陽イオン性化合物および非陽イオン性化合物を用いて得られる。大きな分子、具体的にはタンパク質については、上述した手法などの他の適切な手法で、好ましい範囲の等電点をもつ薬剤を調製することができる。生体高分子、マイクロエマルジョン、酸化鉄粒子などの担体を用いて、好ましい等電点をもつ薬剤を調製することができる。あるいは、このような薬剤を陽イオン化することで修飾することが可能である。
【００９０】
磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）が現在、身体の軟組織を画像化する最も高感度で非侵襲性の方法の一つであることを当業者であれば理解すると思われる。ＣＴスキャンまたは従来のＸ線を用いる方法とは異なり、このようなスキャン装置は放射線を使用しないかわりに、あらゆる身体組織および体液に含まれる水中に存在する水素原子と相互作用する磁場を利用する。ＭＲＩによるスキャン中は、コンピュータがさまざまな水素核の上昇エネルギーを対象組織の断面像に翻訳する。スキャンの手順は極めて細かく、ＣＴスキャンでは見逃されるおそれのある腫瘍を検出できる場合が多い。脳腫瘍、乳腺腫瘍、および身体の任意の軟組織（肝臓、膵臓、卵巣などを含む）における任意の固形腫瘍を含むがこれらに限定されない多種多様なタイプの組織および腫瘍をＭＲＩで画像化することができる。
【００９１】
ＭＲＩ（およびＣＴ）スキャンの感度を上昇させるためにさまざまな造影剤が使用されている。「巨大分子ＭＲＩ造影剤（ＭＭＣＭ）」が以前から知られているが、このような造影剤は最近になって診断に用いられるようになってきた（Ｋｕｗａｔｓｕｒｕら、１９９３）。複数のクラスの化合物がＭＲＩにおける造影剤として有効である。このようなクラスには、超常磁性酸化鉄粒子、窒素酸化物、および常磁性金属キレート剤などがある（Ｍａｎｎら、１９９５）。強度の常磁性金属が一般に好ましいとされている。通常、常磁性ランタニドおよび遷移金属イオンはインビボで毒性を示す。したがって、これらの化合物を有機リガンドとともにキレートに取り込ませる必要がある。本発明の血管原性内皮細胞の近傍へのキレート化金属の標的化を高めることで、通常必要とされる画像化剤組成物の総用量を低下させることが可能となる。
【００９２】
許容されるキレート剤は当技術分野で周知であり、例えば１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）；１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸（ＤＯ３Ａ）；１，４，７−ｔｒｉｓ（カルボキシメチル）−１０−（２−ヒドロキシプロピル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（ＨＰ−ＤＯ３Ａ）；ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）；重合体（例えばポリ−Ｌ−リシンまたはポリエチレンイミン）に結合させたＤＴＰＡ；および他の化合物などがある。さまざまな常磁性金属がキレート形成に適している。適切な金属は、原子番号（２２〜２９）、４２、４４、および５８〜７０であり、かつ酸化状態が２または３である。原子番号２２〜２９、および５８〜７０の元素が好ましく、２４〜２９および６４〜６８の元素がより好ましい。このような金属の例には、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、プラセオジム（ＩＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、エルビウム（ＩＩＩ）およびイッテルビウム（ＩＩＩ）などがある。クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）およびガドリニウム（ＩＩＩ）が特に好ましく、ガドリニウム（ＩＩＩ）が最も好ましい。このような常磁性物質の他の情報については、国際公開公報第９４／２７４９８号を参照されたい。
【００９３】
典型的には、腫瘍画像化用の造影剤は、非経口的経路、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、皮内、または筋肉内に投与される。したがって造影剤は、許容される担体、通常は水性担体に溶解または懸濁した造影剤の溶液を含む組成物として投与される。ＭＭＣＭの濃度は造影剤の強度によって変わるが、典型的には約０．１ μｍｏｌ／ｋｇ〜約１００ μｍｏｌ／ｋｇの範囲にある。さまざまな水性担体、例えば水、緩衝液、０．９％ 生理食塩水、５％ グルコース、０．３％ グリシン、ヒアルロン酸などが知られている。このような組成物を、従来のよく知られた滅菌法で滅菌することができ、または無菌的にろ過することができる。
【００９４】
ブラッシュ（Ｂｒａｓｃｈ）ら（米国特許第６，００９，３４２号）は、巨大分子造影剤による画像化（ＭＣＭＩ）用の大きな骨格に結合させた造影剤の用途、腫瘍、より具体的には乳房腫瘍の微小血管透過率を推定する定量法について開示している。このような骨格は、アルブミン、ポリ−Ｌ−リシンなどのポリペプチド、多糖、デンドリマー、もしくは強固な炭化水素、または、低分子量だが有効分子量が大きい他の化合物などのタンパク質の場合がある。好ましい骨格は、ゲルろ過マトリックスを通過するときに、３０ ｋＤａのペプチドと同様の挙動を示す化合物である。
【００９５】
腫瘍を画像化する他の方法には、ＣＴスキャン、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、および放射性核種による画像化などがある。ＣＴスキャン用の造影剤にはＸ線を減弱させるあらゆる分子が含まれる。画像診断分野の当業者に知られているように、陽電子放出断層撮影および放射性核種による画像化では短命の放射性同位元素が好まれる。同様に、あらゆる陽電子放出性同位体は、陽電子放出断層撮影用の造影剤として有用であり、あらゆるγ線放出同位元素は放射性核種による画像化に有用であることが知られていると思われる。
【００９６】
超音波画像法は、診断目的で身体を画像化する別の方法である。超音波用造影剤には二つの一般的なタイプがある。一つは陽性造影剤でもう一つは陰性造影剤である。陽性造影剤は超音波エネルギーを反射するので、陽性の（明るい）像を生じる。これに対して、陰性造影剤は、伝達性または超音波透過性（ｓｏｎｏｌｕｃｅｎｃｙ）を高めるので、陰性の（暗い）像を生じる。気体、液体、固体、およびこれらの組み合わせなどのさまざまな物質が、コントラストを強める薬剤として検討されている。米国特許第５，５５８，８５４号に開示されている固体粒子造影剤には、ＩＤＥ粒子およびＳＨＵ４５４が含まれるがこれらに限定されない。欧州特許出願第０２３１０９１号では、超音波像のコントラストを強めるために高度にフッ素化された有機化合物を含む水中油型エマルジョンが開示されている。臭化パーフルオロオクチル（ＰＦＯＢ）を含むエマルジョンも、超音波造影剤として検討されている。米国特許第４，９００，５４０号では、コントラスト促進剤として気体または気体前駆体を含むリン脂質をベースとしたリポソームの用途について開示されている。
【００９７】
また標識モノクローナル抗体を用いて、罹病組織または損傷組織の局在を決定することが行われている。有用な標識には、放射性標識（放射性同位元素）、蛍光標識、およびビオチン標識などが含まれる。局在決定試験に適した抗体または抗体断片の標識に使用可能な放射性同位元素には、γ線放出性元素、陽電子放出性元素、Ｘ腺放出性元素、および蛍光放出性元素などがある。抗体標識用の適切な放射性同位元素には、ヨード−１３１、ヨード−１２３、ヨード−１２５、ヨード−１２６、ヨード−１３３、臭化物−７７、インジウム−１１１、インジウム−１１３ｍ、ガリウム−６７、ガリウム−６８、ルテニウム−９５、ルテニウム−９７、ルテニウム−１０３、ルテニウム−１０５、水銀−１０７、水銀−２０３、レニウム−９９ｍ、レニウム−１０５、レニウム−１０１、テルル−１２１ｍ、テルル−１２２ｍ、テルル−１２５ｍ、ツリウム−１６５、ツリウム−１６７、ツリウム−１６８、テクネチウム−９９ｍ、およびフッ素−１８などがある。ハロゲンを標識として多かれ少なかれ互換的に用いることができる。これはハロゲンで標識された抗体、および／または正常な免疫グロブリンが、実質的に同じ動態および分布、ならびに同様の代謝を示すと考えられているからである。γ線放出元素であるインジウム−１１１およびテクネチウム−９９ｍが好ましい理由は、このような放射性金属がγカメラで検出され、インビボにおける画像化に望ましい半減期をもつためである。抗体は、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）などの接合体金属キレート剤を介してインジウム−１１１またはテクネチウム−９９ｍで標識することができる。これについては例えばクレイサレック（Ｋｒｅｊｃａｒｅｋ）ら（１９７７）；カウ（Ｋｈａｗ）ら（１９８０）；米国特許第４，４７２，５０９号；および米国特許第４，４７９，９３０号を参照されたい。モノクローナル抗体との結合に適した蛍光化合物には、フルオレセインナトリウム、フルオレセインイソチオシアネート、およびテキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）塩化スルホニルなどがある（ＤｅＢｅｌｄｅｒら、１９７５）。
【００９８】
本発明は、非蛍光性色素、例えばパテントブルーＶなども対象とする。ヒルンレ（Ｈｉｒｎｌｅ）ら（１９８８）は、パテントブルーＶをリポソームに封入する手法について説明している。
【００９９】
Ｈ．治療用の剤形および送達系
本発明の剤形には、治療用組成物、診断用組成物、および画像化用組成物が含まれるがこれらに限定されない。対象となる組成物には、細胞増殖抑制剤または細胞毒性剤などの活性成分を含めることができる。細胞増殖抑制剤または細胞毒性剤の例には、タキサン、無機錯体、有糸分裂阻害剤、ホルモン、アントラサイクリン、抗体、トポイソメラーゼ阻害剤、抗炎症薬、血管新生阻害剤、アルカロイド、インターロイキン、サイトカイン、成長因子、タンパク質、ペプチド、テトラサイクリン、およびヌクレオシド類似体などがあるがこれらに限定されない。タキサンの特定の例にはパクリタキセルおよびドセタキセルが含まれる。無機錯体の特定の例にはシスプラチンが含まれる。アントラサイクリンの特定の例には、ダウノルビシン、ドキソルビシン、およびエピルビシンが含まれる。血管新生阻害剤の特定の例にはアンギオスタチンが含まれる。アルカロイドの特定の例にはビンブラスチン、ビンクリスチン、ナベルビン、およびビノレルビンが含まれる。ヌクレオシド類似体の特定の例には、５−フルオロウラシルおよび他の類似体が含まれる。対象となる活性薬剤には、サイトカイン、インターロイキン、成長因子、タンパク質、および抗体の治療的に有効な断片もある。
【０１００】
さまざまな送達系が知られており、正に帯電した診断薬、画像化剤、もしくは治療薬を含む治療用組成物、またはこのような薬剤群用の正に帯電した担体の投与に用いることができる。例えば、リポソーム、微粒子、およびマイクロカプセル、ならびに磁性体への封入について、数多くの診断用、画像化用、および治療用製品について説明されている。いくつかの例では、このような製剤は、受容体を介したエンドサイトーシスに至る（ＷｕおよびＷｕ、１９８７、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：４４２９〜４４３２）。一般に、このような組成物の被験者への適切な投与方法には、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、動脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および口内の経路などがあるがこれらに限定されない。別の全身性投与には、胆汁酸塩またはフシジン酸もしくは他の界面活性剤などの浸透剤を用いる経粘膜投与および経皮投与がある。また治療用組成物は、直接腫瘍内に注入することで腫瘍部位に投与することができる。
【０１０１】
本発明の組成物は、例えば、注入またはボーラス注入、上皮または皮膚粘膜の内面（例えば口腔粘膜、直腸粘膜、または腸粘膜など）からの吸収などの任意の従来の経路で投与することが可能であり、また他の生物学的に活性のある薬剤を組み合わせて投与することができる。投与は全身性または局所性とすることができる。また本発明の薬学的組成物を、脳室内注射および髄腔内注射を含む任意の適切な経路によって中枢神経系へ導入することが望ましい場合がある。脳室内注射は例えば、オマヤ槽（Ｏｍｍａｙａ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）などの槽につなげた脳室内カテーテルにより促進することができる。肺を介した投与も、例えば任意選択でエアロゾル状の薬剤とともに吸入器またはネブライザーを用いることで可能である。
【０１０２】
本発明の薬学的組成物を、治療を必要とする領域へ局所的に投与することが望ましい場合がある。これは例えば局所投与、注射、カテーテル使用、坐剤使用、または、シラスティックメンブレン（ｓｉｌａｓｔｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ）またはファイバーなどのメンブレンを含む、多孔性、非多孔性、またはゼラチン状の材料からなるインプラントの使用により達成される場合があるがこれらに限定されない。
【０１０３】
本発明の組成物は徐放系で投与することもできる。これには例えばポンプを使用することができる（Ｌａｎｇｅｒ、前掲；Ｓｅｆｔｏｎ、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｆ． Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ． １４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８： ５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２１：５７４（１９８９）を参照）。本発明の別の態様においては高分子材料を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌａ．（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ、Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ、Ｊ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｓｃｉ． Ｒｅｖ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２３：６１（１９８３）；Ｌｅｖｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら、Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． ７１：１０５（１９８９））。また徐放系を、治療標的、すなわち脳の近傍に配置することで、全身用量のわずか一部を必要とすることができる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、前掲、第２巻、ｐｐ．１１５〜１３８（１９８４）を参照）。他の徐放系は、ランガー（Ｌａｎｇｅｒ）による総説（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７〜１５３３（１９９０））で説明されている。
【０１０４】
本発明は、本明細書に記載された研究成果と矛盾しないさまざまな薬学的組成物および製剤も対象とする。このような組成物には、治療的有効量の治療用薬剤、および薬学的に許容される担体が含まれる。このような薬学的担体は、水または油（ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などの、石油、動物、植物、または合成起源のものを含む油）などの無菌性液体とすることができる。水は、薬学的組成物を静脈内に投与する場合に好ましい担体である。生理食塩水ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液も、特に注射溶液用の液体担体として用いることができる。適切な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、モルト、コメ、コムギ、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、粉末脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどがある。このような組成物には、望ましいならば微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含めることができる。このような組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、徐放性製剤などの形状をとることができる。組成物は、トリグリセリドなどの従来型の結合剤および担体を用いて坐剤として製剤化することができる。経口剤には製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含めることができる。適切な薬学的担体の例は、Ｅ．Ｗ．マーティン（Ｍａｒｔｉｎ）による「レミントン薬理学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」に記載されている。このような組成物は、治療的有効量の治療用組成物を、好ましくは純粋な状態で患者への適当な投与を可能とする形状を提供するための適量の担体とともに含む。
【０１０５】
全体的な剤形は、投与様式に適したものとすべきである。したがって本発明の組成物は、例えばヒトへの静脈内投与に適したルーチンの手法にしたがって製剤化される。典型的には、静脈内投与する組成物は、無菌性の等張性水性緩衝液の状態をした溶液である。適切であれば、このような組成物には、可溶化剤、および注射部位における痛みを和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔薬を含めることもできる。一般に構成成分は、個別の状態で、または単位剤形（例えば、活性薬剤量を示すアンプルなどの密封容器に収められた凍結乾燥粉末、または無水濃縮物）に混合した状態で提供される。組成物が注入投与される場合、無菌性の製薬グレードの水または生理食塩水を含む輸液用ボトル内で調剤することができる。組成物を注射投与する場合、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルを、内容物が投与前に混合するために提供することができる。
【０１０６】
特定の疾患または状態の診断、モニタリング、画像化、および治療に有効な、本発明の診断用、画像化用、および治療用組成物の量は、疾患または状態の性質に変動し、標準的な臨床的手法で決定することができる。また、インビボアッセイ法および／またはインビトロアッセイ法を任意選択で用いることで、最適用量範囲が特定しやすくなる。任意の特定の製剤に用いられる正確な用量も、投与経路、および疾患または障害の重症度によって変動するので、術者の判断、および患者のおかれた状況に応じて決定されるべきである。しかし一般的には、本明細書に記載された方法で既知の化合物を修飾して、その正味の正のζ電位を上昇させる場合は、活性成分の用量を非修飾化合物の用量より少なくすることができる。
【０１０７】
Ｉ．腫瘍の画像化および治療に用いる組成物の投与
本発明の活性成分は、主治医たる癌専門医または他の医師によって適切であるとみなされる投与経路で投与することができる。このような経路には、腫瘍塊への直接注射、または血管原性内皮細胞の近傍へ本発明の組成物を投与する任意の方法などが含まれる場合もある。投与量は、レシピエントの年齢、健康状態、および体重、併用治療の内容（もしあれば）、治療頻度、ならびに癌専門医に周知の望ましい作用の性質によって変わる。
【０１０８】
本発明の方法を実施する際には、本発明の化合物を単独、もしくは他の診断薬、画像化剤、および治療薬と組み合わせて使用することができる。ある好ましい態様においては、本発明の化合物は、一般的に受け入れられている医療行為、または他の抗癌治療法によって、以上の条件のために通常処方される他の化合物（アンギオスタチンまたはエンドスタチンの発現ベクターまたはタンパク質などの抗血管新生薬を含む）と同時に投与することができる。本発明の化合物は、通常は、ヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ラット、およびマウスなどの哺乳動物を対象にインビボまたはインビトロで使用することができる。
【０１０９】
治療的有効量は、インビトロまたはインビボにおける方法で決定することができる。本発明の個々の特定の化合物については、個々に判断して最適な必要用量を決定することができる。治療有効用量の範囲は、投与経路、治療目的、および患者の状態、ならびに例えば腫瘍の性質、段階、および大きさの影響を受ける。皮下針で注射する場合は、体液中へ投薬するようにする。他の投与経路については、薬理学分野で周知の方法によって各化合物について吸収効率を個別に決定しなければならない。したがって治療者にとっては、最適な治療効果を得るために、必要に応じて用量を調節して投与経路を修正することが必要となる場合がある。有効量レベル、すなわち所望の結果を達成するために必要な用量レベルの決定は、当業者であれば容易に行うことができる。典型的には化合物の適用は、低目の用量レベルから始めて、所望の作用が得られるまで用量レベルを徐々に増やしてゆく。
【０１１０】
状況によって変わることがあるが、各成分の有効量の最適範囲の決定は当技術分野の範囲内である。一般的には最適用量は、正味のζ電位を増加させるべく何らかの方法で修飾されていないか、または誘導体化されていない治療薬に対応する用量に等しいか、またはそれ未満である。選択的標的化のために正味のζ電位の増加を示すように修飾された治療薬の安全性レベルがより高く、毒性がより低く、また高用量投与が可能であることが企図される。さらに一般的には本発明の化合物は、単回、または１日２回〜４回に分けた用量、および／または持続点滴による投与法で、約０．０１ ｍｇ〜約５０ ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、約０．０５ ｍｇ〜約５ ｍｇ／ｋｇ、またより好ましくは、約０．２ ｍｇ〜約１．５ ｍｇ／ｋｇの用量範囲の有効量で静脈内または非経口的に投与することができる。
【０１１１】
Ｊ．活性化血管部位をもつさまざまな疾患の治療および画像化
ある種の活性化血管部位にみられる増殖性または血管原性内皮細胞が関与する複数の腫瘍性疾患および非腫瘍性疾患がある。デイビス−スミス（Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ）らによる米国特許第５，９５２，１９９号に記載されているように、このような疾患には、固形腫瘍および転移性腫瘍、ならびに、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム動脈硬化症、糖尿病性網膜症、後水晶体線維形成症、血管新生緑内障、加齢性黄斑変性、血管腫、移植された角膜または他の組織による免疫拒絶、および慢性炎症などの疾患が含まれる。
【０１１２】
以上の疾患に対する従来の治療法はさまざまである。例えば癌は、さまざまな化学療法で治療することができる。慢性関節リウマチは、アスピリン、もしくはイブプロフェン、コルチコステロイドなどのアスピリン代替薬、もしくは免疫抑制療法で治療される場合がある。メルクマニュアル（Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ）第１６版（１９９２）、ｐｐ．１３０５〜１２。アテローム動脈硬化症の治療は、症候性の条件、もしくは血中コレステロール値の低下または血管形成術などの危険因子が標的とされる。メルクマニュアル（Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ）第１６版（１９９２）、ｐｐ．４０９〜４１２。糖尿病は、原発性糖尿病、または血圧などの関連状態を制御することで治療可能な糖尿病性アテローム動脈硬化症、および糖尿病性網膜症を含むさまざまな状態を誘導することがある。メルクマニュアル（Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ）第１６版（１９９２）、ｐｐ．４１２〜４１３、１１０６〜１１２５、２３８３〜２３８５。乾癬は、最も一般的には局所軟膏およびステロイド投与で治療される。メルクマニュアル（Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ）第１６版（１９９２）、ｐｐ．２４３５〜２４３７。後水晶体線維形成症は、予防的酸素投与およびビタミンＥ投与で最も良好に治療されるが、寒冷療法による切除（ｃｒｙｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｂｌａｔｉｏｎ）が必要な場合もある。メルクマニュアル（Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ）第１６版（１９９２）、ｐｐ．１９７５〜１９７６。したがって、以上の血管新生関連疾患が、血管新生の関連を共有するにもかかわらず共通の治療法の適応を共有しないことは明らかである。
【０１１３】
活性化血管部位に関与する他の疾患には、腎炎などの炎症性疾患などが含まれる。最近、イルエラ−アリスぺ（Ｉｒｕｅｌａ−Ａｒｉｓｐｅ）ら（１９９５）は、糸球体腎炎に反応して誘導される毛細血管修復に糸球体内皮細胞が関与することを報告している。多くの糸球体疾患では、糸球体間質に対する重度の障害が生じて、マトリックスの溶解、および糸球体毛細血管の損傷に至る場合がある。糸球体構造の崩壊は永続的な損傷に至る場合があるが、場合によっては自然に回復することがある。イルエラ−アリスぺ（Ｉｒｕｅｌａ−Ａｒｉｓｐｅ）らは、糸球体間質に対する重度の損傷を受けてから２日〜１４日後に内皮細胞が糸球体毛細血管の修復を伴って増殖することを示した。初期の内皮細胞増殖には、塩基性繊維芽細胞成長因子が関与し、後期の糸球体内皮細胞増殖には、血管透過性因子／内皮細胞成長因子の増加、およびＶＰＦ／ＶＥＧＦ受容体ｆｌｋの増加が関与する。これは糸球体内皮細胞が、損傷に対する糸球体反応に積極的な役割を果たしていることと、本発明の治療用、画像化用、および診断用組成物が、糸球体腎炎などの炎症性疾患に関連して有用である可能性があることを意味する。
【０１１４】
また、血管新生を抑制したり予防したりすることで、さまざまな血管新生関連疾患を治療する、比較的新しくてかつ包括的な機構がもたらされる。したがって本発明の一つの局面は、血管新生または増殖性の内皮細胞の近傍などの活性化血管部位に選択的に蓄積して、このような細胞および新生血管系の血管新生を誘導する血管新生細胞や腫瘍細胞の細胞死を引き起す薬剤を標的化することである。現時点で、例えば本出願の好ましいζ電位を有するリポソーム内に適切に製剤化される、係属中の米国特許仮出願第６０／１６３，２５０号に毒性の高い薬剤が開示されている。
【０１１５】
Ｋ．併用療法または供投与療法
対象とされるように、本発明は、他の治療薬、血管新生阻害剤、および／または他の抗腫瘍性薬剤の投与を伴う、本発明に関連する方法による、本明細書に開示された化合物の併用または供投与にも関する。このような他の治療薬、血管新生阻害剤、および薬剤は、例えば眼科医および癌専門医によく知られている。本発明の構築物および方法と組み合わせて用いられるこのような他の薬剤および関連する方法には、例えばパリッシュ（Ｐａｒｉｓｈ）ら（１９９９）による米国特許第５，８７４，０８１号、およびソープ（Ｔｈｏｒｐｅ）ら（１９９９）による米国特許第５，８６３，５３８号に開示されている、または当技術分野で周知の従来の化学療法剤、放射線療法、免疫調節薬、遺伝子治療、および免疫毒素および抗血管新生製剤（アンギオスタチンまたはエンドスタチンなど）などの他のさまざまな組成物の使用などがある。上述した血管新生関連疾患に対する本発明および従来の治療法に基づく併用療法または供投与療法も特に企図される。
【０１１６】
Ｌ．創傷治癒
本発明の組成物および製剤が、活性化血管部位がかかわる病的状態の治療に対して、創傷治癒を促すことを目的として創傷または他の活性化血管部位の治療を促進するために選択的に標的化されることも明らかに企図される。
【０１１７】
繊維芽細胞成長因子、および血管内皮細胞増殖因子などの成長因子は、正常の創傷治癒過程で細胞の増殖および分化を促す。繊維芽細胞成長因子ファミリーには、内皮細胞、繊維芽細胞、平滑筋細胞、および表皮細胞を含むさまざまな細胞系列の増殖を促進することが示された少なくとも７種のポリペプチドが含まれる。このファミリーのポリペプチドには、酸性繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−１）、塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−２）、ｉｎｔ−２（ＦＧＦ−３）、カポジ肉腫増殖因子（ＦＧＦ−４）、ｈｓｔ−１（ＦＧＦ−５）、ｈｓｔ−２（ＦＧＦ−６）、およびケラチノサイト増殖因子（ＦＧＦ−７）が含まれる（ＢａｉｒｄおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ、Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６３８：ｘｉｖ、１９９１）。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、血管透過性因子（ＶＰＦ）としても知られ、血管内皮細胞に対する選択性の高い分裂促進因子である（Ｆｅｒｒａｒａら、１９９２）。ＶＰＦは、正常な創傷治癒の特性の一つである、損傷完治後であっても血漿タンパク質の持続的な微小血管透過性亢進にかかわることがわかっている。これはＶＰＦが創傷治癒に重要な役割を果たしていることを示唆している（Ｂｒｏｗｎら、１９９２）。
【０１１８】
創傷治癒では、成長因子をリポソームに封入して、リポソーム組成物を局所的に注射して標的部位に送達することができる。リポソームは、さまざまな業者から市販品を入手することができる。またリポソームは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載された当技術分野で周知の方法で調製することができる。米国特許第５，８７９，７１３号では、適切な脂質（ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイル（ａｒａｃｈａｄｏｙｌ）ホスファチジルコリン、およびコレステロールなど）を有機溶媒に溶解後に蒸発させて、乾燥状態の脂質の薄いフィルムを容器表面に作ることによるリポソーム製剤の調製法が記載されている。次に活性化合物またはその一リン酸塩、二リン酸塩、および／または、三リン酸塩誘導体の水性溶液を容器内に入れる。この容器を手で回して、容器側壁から脂質材料を引きはがし、脂質凝集物を分散させることでリポソーム懸濁物を形成させる。一般的には、生物学的に活性のある分子（ＦＧＦやＶＥＧＦなど）を、患者の標的部位で有効量を放出する濃度でリポソームと混合する。
【０１１９】
Ｍ．血管新生障害にかかわる他の条件
本発明の組成物および製剤が、血管新生障害にかかわる他の条件を治療するために選択的に標的とされる場合があることも明らかに企図される。
【０１２０】
血管新生が加齢に伴って損なわれることが最近報告されている。リード（Ｒｅｅｄ）ら（２０００）は、血管新生の遅延が、コラゲナーゼ活性が低下した結果として内皮細胞の移動が遅れることに部分的に起因すると報告している。したがってコラゲナーゼ活性を促すような変化は、微小血管内皮細胞の移動能力および血管新生能力を高める可能性がある。リバード（Ｒｉｖａｒｄ）ら（１９９９）は、高齢動物における血管新生の障害が、低い基礎ＮＯ放出、アセチルコリンに応じた血管拡張の低下、および虚血組織におけるＶＥＧＦの発現低下を含む内皮機能障害の結果であると説明している。したがってリバード（Ｒｉｖａｒｄ）ら（１９９９）は、下肢虚血の側枝発生にかかわる血管新生が、加齢関連性の内皮の機能不全およびＶＥＧＦ発現低下の結果、加齢に伴って損なわれていると結論している。しかし加齢は、側副血管の発生を増やさず、また血管新生にかかわる外因性サイトカインの影響を受ける可能性があると考えられる。
【０１２１】
ヤマナカ（Ｙａｍａｎａｋａ）ら（１９９９）は、損傷を受けた糸球体毛細血管網の再生が、糸球体病変の修復過程に重要な役割を果たしていると報告している。糸球体内皮細胞の損傷は、糸球体疾患の進行および修復過程に影響を及ぼす。糸球体病変が重度の場合、血管新生は、損傷領域で生じる硬化を後に伴う、内皮細胞損傷のために妨げられる。糸球体内皮細胞の損傷が、メサンギウム細胞および上皮細胞に影響を及ぼすことはいうまでもない。したがって腎疾患の進行が、内皮細胞の血管新生を促することで調節されうることが企図される。
【０１２２】
レイノー現象は、指動脈の痙縮に起因する、冷たさに対する手の感受性の上昇と、それによる指の蒼白としびれ感を特徴とする。これは、手および足への血液供給が不十分であることに起因する循環系障害の一種である。一連の研究から、末梢レベルまたは中枢レベルのいずれかにおける神経系の変化が、内皮細胞の機能不全に結びつくことが示唆されている。セリニック（Ｃｅｒｉｎｉｃ）ら（１９９７）は、レイノー病および全身性強皮症における血管新生欠損の治療に治療目的の血管新生（血管の再生）を利用することを提案している。
【０１２３】
Ｎ．脳の治療
本発明の組成物および製剤が、適切な正味の陽電荷を血液脳関門において内皮細胞に提示することで血液脳関門を越えるように選択的に標的とされる可能性があることも明らかに企図される。
【０１２４】
前述の一般的な記述に関しては、後述する特定の例は、説明する目的のみをもち、本発明の範囲を制限する意図はない。他の一般的および特異的な設定は当業者に明らかである。
【０１２５】
実施例
実施例１：荷電性デキストランでコーティングされた酸化鉄粒子の合成
デキストランで安定化された酸化鉄粒子は、文献に記載された手順で調製した（Ｐａｐｉｓｏｖら、１９９３）。このような粒子（例えば過ヨウ素酸塩）を酸化させると、個々のコロイドの表面にアルデヒド基が生じる。次に、このアルデヒド基をさまざまな試薬のアミン基と反応させると、正味電荷がさまざまな産物が得られる。例えば、ホスファチジルエタノールアミン（正味電荷がゼロ）、または遊離のアミン基を有する他の中性分子とカップリングさせると陰電荷をもつ産物が得られる。デンドリマー、ポリリシン、正味の陽電荷をもつタンパク質、または過剰な陽電荷をもつ他の適切な分子との適切なモル比でのカップリングでは正味の陽電荷をもつ産物が得られる。未修飾および未酸化の、デキストランで安定化された酸化鉄粒子を、代表的な非荷電性分子として使用した。
【０１２６】
１．デキストランで安定化された酸化鉄粒子（中性電荷）の調製
デキストランなどのコーティング材料の存在下における磁鉄鉱の、従来の共沈殿経路を適用した。反応は２段階で進む。最初にＦｅＣｌ２とＦｅＣｌ３をデキストランと混合し、アルカリ性溶媒中で沈殿を生じさせて、Ｆｅ（ＯＨ）２およびＦｅ２Ｏ３・ｎＨ２Ｏを得る。加熱して水分を除去し、Ｆｅ３Ｏ４の超常磁性結晶を得る。この粒子を水中に再分散させることで、さまざまなサイズ分布の粒子を得る。Ｚａｖｅｒａｇｅ（単一様相（ｍｏｎｏｍｏｄａｌ）分布に適合した粒子集団の平均粒子サイズ）が８０ ｎｍ〜１２０ ｎｍの粒子（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いた。典型的には、１ ｍｌの溶液には約０．２ ｍｍｏｌのデキストランと０．５５ ｍｍｏｌに相当する３１ ｍｇのＦｅが含まれる。このような粒子のζ電位は、０．０５ Ｍ ＫＣｌ中でｐＨ ７において０ ｍＶ〜−１５ ｍＶである。
【０１２７】
２．酸化鉄粒子の酸化
デキストランでコーティングした酸化鉄粒子の酸化は、ボグダノフ（Ｂｏｇｄａｎｏｖ）ら（Ｂｏｇｄａｎｏｖ Ｊｒ．ら、１９９４）の手順を変更して行った。デキストランでコーティングした酸化鉄粒子を過ヨウ素酸ナトリウムと、６ ｍｏｌデキストロースに対して１ ｍｏｌのＩＯ４−の近似モル比になるように水性溶液中で混合した（３０分、ｐＨ ６）。この反応を、（モル比で約３００倍またはそれ以上過剰の）エチレングリコールの添加により停止させた。次に、この溶液を０．１５ Ｍ ＮａＣｌに対して透析を行った。
【０１２８】
３．正に帯電した粒子の調製
上記の手順で得た酸化された酸化鉄粒子を用いて、正に帯電した粒子を調製した。ポリリシン（２ μｍｏｌ）の水性溶液を約２０ μｍｏｌのホウ酸ナトリウム（ｐＨ ９）と混合し、３００ μｍｏｌの鉄および１００ μｍｏｌのデキストロースを含む、段階２に由来する酸化鉄粒子を修飾した。このエマルジョンを０．１５ Ｍ ＮａＣｌに対して透析を行い、細胞培養実験に用いた。この粒子のζ電位は約＋５０ ｍＶ（ｐＨ ７．５）であった。
【０１２９】
４．負に帯電した粒子
ラウリン酸で二重層でコーティングされた負に帯電した酸化鉄粒子は、ベルリンハート社（Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅａｒｔ ＡＧ）から入手できる。この粒子のζ電位は（ｐＨ約７．０において）約−３０ ｍＶ〜−４０ ｍＶである。
【０１３０】
実施例２：荷電性デキストラン粒子の他の合成法
中性の、多価陽イオン性および多価陰イオン性のデキストランは、アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）から購入することができる。中性デキストランは、さまざまな大きさのクラス（１０，０００ダルトン〜２，０００，０００ダルトン）のものを得られるが、荷電性デキストランは一つの大きさ（５００，０００ダルトン）しか入手できない。陽イオン性デキストランはジエチルアミノエチルエーテル（ＤＥＡＥ）誘導体で、陰イオン性デキストランは硫酸塩である。後述するように、他の分子サイズを有するＤＥＡＥデキストランおよびデキストラン硫酸を、既知の手法を変更して合成した。
【０１３１】
１．一定の大きさをもつデキストラン粒子の調製
誘導体化を行う前に、デキストラン分子を、アイザックス（Ｉｓａａｃｓ）ら（１９８３）に記載された方法に似た大きさに基づく異なるクラスに分けた。したがって、次に行う特性解析（例えば電荷密度、等電点電気泳動）を用いて、デキストラン分子に対する荷電性官能基の比を決定することができる。
【０１３２】
デキストランを、各実験の出発材料として用いる３つの異なる大きさのクラス（１０，０００ダルトン、７０，０００ダルトン、および５００，０００ダルトン）をファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（Ｕｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）から購入した。次に、デキストラン分子の大きさをゲルクロマトグラフィで確認した。この操作では、１０，０００ダルトンのデキストランをセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、長さ７５ ｃｍ、内径５ ｃｍ）上に重層し、０．０５ Ｍの重炭酸アンモニウム（ｐＨ ８．２）で溶出した。次に２０ ｍｌの画分を回収し、ヘキソース量をモクラシュ（Ｍｏｋｒａｓｃｈ）ら（１９５４）に記載された方法で分析した。７０，０００ダルトンのデキストランを対象に、ＡｃＡ ２２カラム（ＬＫＢ、Ｂｒｏｍｍａ、Ｓｗｅｄｅｎ、９６×２．５ ｃｍ）を用いて同様にクロマトグラフィを行った。次に９ ｍｌの画分を回収した。５００，０００ダルトンのデキストランを対象にセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）６Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、６×２．５ ｃｍ）を用いてクロマトグラフィを行い、９ ｍｌの画分を回収して分析した。個々のデキストランの種類について、最大デキストラン量を含む画分を回収してプールし、約７０％の出発材料とした。各デキストランプールから、材料を凍結乾燥して後に使用した。
【０１３３】
デキストラン画分の等電点は、ｐＨ ３〜ｐＨ １１をカバーするファルマライト（Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ）ゲル（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた等電点電気泳動で決定し、ｐＨ ７であることがわかった。
【０１３４】
２．多価陰イオン性デキストランの調製
デキストラン硫酸は、ナガサワ（Ｎａｇａｓａｗａ）ら（１９７４）に記載された方法で調製した。１６２ ｍｇのデキストラン（１ ｍｍｏｌグルコース）、２２５ ｍｇの８硫酸キノリル（１ ｍｍｏｌ）、および６７ ｍｇのＣｕＣｌ２（０．５ ｍｍｏｌ）を、１０ ｍｌの無水ジメチルホルムアミド中に混合して４０℃で５時間攪拌した。次に反応混合物を５０ ｍｌの水で希釈し、沈殿を生じさせた。沈殿をろ過して除去し、ろ液をＤｏｗｅｘ ５０Ｗカラム（Ｘ８、Ｈ＋、２０メッシュ〜５０メッシュ）に通した。溶出液および洗浄液を混合し、２Ｎ ＮａＯＨで中和し、水で一晩透析を行った。次に透析溶液を真空中で２．５ ｍｌに濃縮し、４５ ｍｌのエタノールに滴下しながら添加し、デキストラン硫酸ナトリウムの沈殿を生じさせた。この沈殿を遠心して分離し、エタノールで洗浄し、Ｐ２Ｏ５を用いて真空中、８０℃で３時間かけて乾燥させた。
【０１３５】
各複合体の等電点（ＩＥＰ）は、ｐＨ ２．５〜ｐＨ ５をカバーするファルマライト（Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ）ゲル（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた等電点電気泳動で決定した。１０，０００ダルトンの画分に由来するデキストラン硫酸のＩＥＰはｐＨ ３で認められ、７０，０００ダルトンの画分に由来するデキストラン硫酸のＩＥＰはｐＨ ２．５未満で認められ、５００，０００ダルトンの画分に由来するデキストラン硫酸のＩＥＰはｐＨ ２．８で認められた。
【０１３６】
各産物について、硫酸は重量測定でＢａＳＯ４であると判定され、デキストランは、アンスロン（ａｎｔｈｒｏｎｅ）で定量された（Ｍｏｋｒａｓｃｈら、１９５４）。デキストラン／硫酸塩のモル比は、１０，０００ダルトンの画分では約４６であり、７０，０００ダルトンの画分では１９０であり、また５００，０００ダルトンの画分では５４であった。
【０１３７】
３．多価陽イオン性デキストランの調製
ＤＥＡＥデキストランは、マッケルナン（ＭｃＫｅｒｎａｎ）ら（１９６０）の方法で調製した。６ ｇのデキストランをＮａＯＨ溶液（４ ｇのＮａＯＨ を１７ ｍｌの水に溶解）に溶解して０℃に冷却した。塩酸２−クロロトリエチルアミン（３．５ ｇを４．５ ｍｌの水に溶解）を攪拌しながら添加し、３５分間かけて温度を８０℃まで上昇させた。冷却後、攪拌しながらエタノールを添加し、ＤＥＡＥデキストランの沈殿を生じさせた。この産物を遠心して分離し、水に溶解して再び沈殿を生じさせた。この手順を上清の色がなくなるまで繰り返し行った。産物の水性溶液をＨＣｌで最後に中和し、透析を行い、真空中で濃縮した。ＤＥＡＥデキストランを凍結乾燥して単離した。
【０１３８】
各複合体の等電点（ＩＥＰ）は、ｐＨ８〜１０．５をカバーするファルマライト（Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ）ゲル（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた等電点電気泳動で決定した。１０，０００および７０，０００ダルトンの画分に由来するＤＥＡＥデキストランはｐＨ １０．５以上でＩＥＰを示し、５００，０００ダルトンの画分はｐＨ ９．６でＩＥＰを示した。
【０１３９】
各産物について、燃焼解析で窒素量を決定した後に、ＧＣ分析を行い、デキストランをアンスロンで定量した（Ｍｏｋｒａｓｃｈら、１９５４）。デキストラン／アミンのモル比は、１０，０００ダルトンの画分では約２であり、７０，０００ダルトンの画分では４５であり、５００，０００ダルトンの画分では５９０であった。
【０１４０】
実施例３：荷電性デキストランでコーティングした酸化鉄粒子のＨＵＶＥＣによる取り込み
ヒト内皮細胞培養物（ＨＵＶＥＣ）を、細胞密度が２×１０４細胞／ｃｍ２になるように、ゼラチンコーティングされた１０ ｃｍ２培養プレートに添加し、２％ ウシ胎児血清を含む内皮成長培地中で３７℃、５％ ＣＯ２加湿雰囲気中で４８時間培養した。培地を除いて細胞をＰＢＳで洗浄し、１ ｍｌの無血清内皮用基礎培地を添加した。荷電性デキストランでコーティングした酸化鉄粒子を５０ μｇ Ｆｅ３＋／ｍｌの濃度になるように培養物に添加した。４時間の培養後、培地を除去して培養物を１ ｍｌのＰＢＳで洗浄した。除去培地および洗浄液をプールし、ジャンダー（Ｊａｎｄｅｒ）（１９９５）に記載されたチオシアナート反応を利用した方法で鉄濃度を測定した。この細胞を５００ μｌの濃ＨＣｌで溶解し、培養プレートを５００ μｌのＰＢＳで洗浄した。細胞溶解液および洗浄液をプールし、ジャンダー（Ｊａｎｄｅｒ）（１９９５）に記載されたチオシアナート反応を利用した方法で鉄濃度を測定した。
【０１４１】
前述の実験の結果を以下の表１に示す。
【０１４２】
【表１】荷電性デキストランでコーティングした酸化鉄粒子とインキュベートした後のＨＵＶＥＣ培養物の細胞溶解液および培地中の鉄濃度
2004511426.tif 000005
【０１４３】
細胞溶解液および培地中に測定された鉄濃度は、正に帯電したデキストランでコーティングされた酸化鉄粒子のＨＵＶＥＣによる取り込みが、中性荷電粒子または負に帯電した荷電粒子の取り込みと比べて著しく高いことを明らかに示している。
【０１４４】
実施例４：リポソームのζ電位の測定
１．測定原理
ζ電位は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で測定した。この実験では、電気泳動の移動度は、コロイド粒子の電荷密度によって変わるので、レーザードプラー（Ｌａｓｅｒ Ｄｏｐｐｌｅｒ）微量電気泳動で測定される。このような粒子は、その光散乱挙動を元に検出される。
【０１４５】
測定を、２５℃で数回繰り返して行った。試料の測定間に、標準溶液（一定のζ電位をもつラテックス粒子）を繰り返し測定し、システムが正しく動いていることを確認した。陽イオン性成分（ＤＯＴＡＰ）の内容量に幅のあるリポソームを調製した（総脂質量は１０ ｍＭ）。
【０１４６】
２．リポソームの合成
最初にフィルム法を行う。脂質を丸底フラスコ内のクロロホルム中に溶解し、このフラスコを、脂質が薄いフィルムを形成するまで真空中で回転させる。脂質フィルムは、３ ｍｂａｒ〜５ ｍｂａｒの真空中で約６０分間かけて４０℃で乾燥させる。次に脂質を適量の５％グルコース中に分散させて多重膜脂質ベシクルの懸濁液を得る（脂質濃度は１０ ｍＭ）。１日後、このベシクルを、適切な大きさのメンブレン（通常１００ ｎｍ〜４００ ｎｍ）を通して押し出す（加圧下でろ過する）（ζ電位の場合、すべてのリポソームは１００ ｎｍのメンブレンで押し出された）。
【０１４７】
ζ電位の測定については、以下の二種の異なる溶媒系に製剤を１：２５に希釈した：（ａ）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（それぞれｐＨ ６．８またはｐＨ ８．０）；および（ｂ）０．０５ ＭのＫＣｌ溶液、ｐＨ ７．０（試料添加後にｐＨ ７．５〜ｐＨ ７．７まで上昇）。
【０１４８】
この実験の結果を表２および表３に示す。
【０１４９】
【表２】Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中における７種のリポソーム製剤（ＤＯＴＡＰ、中性脂質ＤＯＰＣ（ジオレオイルホスファチジルコリン）、またはＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）を異なる量で含む）の測定
2004511426.tif 000006
試料の伝導率は、それぞれ約３ ｍＳ／ｃｍ２（ｐＨ ６．８）および１ ｍＳ／ｃｍ２（ｐＨ ８）である。
【０１５０】
【表３】０．０５ ＭのＫＣｌ溶液（ｐＨ ７．０〜ｐＨ ７．５）中における７種のリポソーム製剤（ＤＯＴＡＰ、共脂質ＤＯＰＣを異なる量で含む）の測定
2004511426.tif 000007
試料の伝導率は、約２．６５ ｍＳ／ｃｍ２である。
【０１５１】
以上の結果は、ＤＯＴＡＰの濃度が４ ｍｏｌ％〜約５０ ｍｏｌ％である場合は、ζ電位が一定に上昇することを示している。しかし意外なことにＤＯＴＡＰ濃度が５０ ｍｏｌ％以上の場合は、ζ電位に変化はみられなくなって＋４０ ｍＶ〜＋６２ ｍＶの値となり、全体が双曲線の形状を示す。このデータは、このような双曲線形が、ζ電位の絶対値は若干変化するものの、異なる緩衝液系で維持されることを示している。ＫＯＨ／ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）で得られた曲線は最も生理学的な状態を示しているが、ｐＨ ６．５とｐＨ ８．０における他の二つの曲線は、生理学的ｐＨからある程度の変位があっても、曲線の形状が変わらないことを示している。
【０１５２】
この実施例では、ＤＯＴＡＰは、リポソーム製剤のζ電位測定に使用される。他の陽イオン性脂質をＤＯＴＡＰと交換できること、またリポソーム製剤のζ電位を測定することができることは当業者の能力に含まれる。
【０１５３】
実施例５：正に帯電した分子の血管原性内皮細胞へのインビボにおける選択的標的化
巨大分子の腫瘍組織への輸送および特異的な相互作用は、例えば分子の大きさや電荷などのさまざまなパラメータによって変化する。この実施例では、電荷に依存した、インビボにおける血管原性内皮細胞への標的化を示す。モレキュラープローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）から入手した蛍光標識された荷電性デキストラン、または以下の手順で合成されたものを用いる。このような荷電性分子の、血管原性内皮細胞への間接的な標的化は、ハムスターチャンバーモデルで説明される（Ｅｎｄｒｉｃｈら、１９８０）。
【０１５４】
１．さまざまな正味電荷をもつ蛍光標識デキストラン
親水性多糖であるであるデキストランは、高分子量であること、水溶性が良好であること、毒性が低いこと、および比較的不活性であることを特徴とする。このような特性があるため、デキストランは、色素（例えば蛍光色素）に対する有効な水溶性担体となっている。デキストランのもつ生物学的に一般的ではないα−１，６−ポリグルコース結合は、多くの内因性の細胞グリコシダーゼによる切断に耐性を示す。
【０１５５】
ａ．モレキュラープローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）から入手した蛍光標識デキストラン
正味の陽電荷をもつデキストランの挙動を分析するために、モレキュラープローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）から入手した陽イオン性蛍光標識デキストランを用いた。このようなデキストランの例には、分子量を３，０００〜７０，０００の間で変化させたローダミングリーン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ）（商標）をカップリングさせたデキストラン、またはリシンを結合させたテトラメチルローダミンをカップリングさせたデキストラン（個々のデキストラン分子に陰イオン基がカップリングされているが、結合陽イオン性リシン残基を介して正味の陽電荷をもつ）がある。最終的に正味の陽電荷を生じるリシン残基を含む蛍光デキストランを使用することもできる。
【０１５６】
正味の陰電荷をもつ蛍光デキストランについては、モレキュラープローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）から入手した、リシン残基を含まない陰イオン性または多価陰イオン性の蛍光デキストランを用いた。陰イオン性または多価陰イオン性のデキストランの例には、分子量が３，０００〜７０，０００の、カスケードブルー（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ）（登録商標）をカップリングしたデキストラン、またはフルオレセインをカップリングさせたデキストラン、もしくは他の蛍光標識を有する負に帯電したデキストランなどがある。
【０１５７】
正味電荷がゼロの中性デキストランについては、分子量が１０，０００〜７０，０００の範囲である、ローダミンＢをカップリングさせたモレキュラープローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）のデキストラン、または他の中性の蛍光デキストランを用いた。
【０１５８】
ｂ．荷電性または中性の蛍光標識デキストランの合成
荷電性または中性の未標識デキストランを、デキストラン分子を酸化させて（例えば過ヨウ素酸を用いて）合成し、反応性アルデヒド基を得た。次にこのアルデヒド基を、さまざまな試薬のアミン官能基と反応させて正味電荷が異なる分子を得た。最後に、これらの分子を蛍光色素と結合させた。
【０１５９】
（ｉ）デキストランの酸化
未標識デキストラン分子を、最大６ ｍｏｌのデキストロースに対して１ ｍｏｌのＩＯ４−の適切なモル比で過ヨウ素酸ナトリウムと水性溶液中で混合した（３０分間、ｐＨ ６）。この反応をエチレングリコール（モル比で約３００倍過剰）を添加して停止させ、０．１５ ｍｏｌのＮａＣｌに対して透析を行った。
【０１６０】
（ｉｉ）正に帯電した蛍光標識デキストランの調製
修飾された酸化型デキストランを、ホウ酸ナトリウム緩衝液（〜ｐＨ９）中でポリリシンの水性溶液と適切な方法で混合した。結果として生じた溶液を０．１５ ＭのＮａＣｌに対して透析を行った。次に、ポリリシンの残りの一級アミノ基を、０．１ Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液中で、蛍光色素（例えばＡｍｅｒｓｈａｍ製のＣｙ−Ｄｙｅファミリーの蛍光色素、もしくはフルオレセイン誘導体または他の任意の反応性色素）のスクシニミジル（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）エステルまたは塩化スルホニルと反応させた。ポリリシン−デキストランに対するフルオロフォアの選択モル比は、結果として生じる反応産物に正味の陽電荷を付与する前に決定した。遊離の色素は試料を０．１５ ＭのＮａＣｌに対して透析を行って分離した。反応産物の等電点は、生理学的緩衝液中における等電点電気泳動により約８を上回ることが確認された。
【０１６１】
（ｉｉｉ）中性の蛍光デキストランの調製
酸化型デキストランを、二つの一級アミノ基（例えば、アラニン−アラニン−リシン）を有する適切なペプチドと、デキストランとのカップリング用のペプチド主鎖の遊離アミノ基を用いて反応させた。次に、０．１ ｍｏｌ％〜１０ ｍｏｌ％の、ポリリシンの一級アミノ基を、蛍光色素（例えばＬｉｓｓａｍｉｎｅ Ｒｈｏｄａｍｉｎ Ｂ、フルオレセイン誘導体、または他の任意の反応性蛍光色素）の塩化スルホニルまたはスクシニミジルエステルと反応させて正味電荷がゼロの分子を得た。反応産物の等電点は、生理学的緩衝液中における等電点電気泳動で７〜７．５であることを確認した。
【０１６２】
（ｉｖ）負に帯電した蛍光デキストランの調製
酸化型デキストランを、正味電荷がゼロか、またはそれ未満の電荷をもつ正負に帯電したアミノ酸を含む適切なペプチド（例えばグルタミン酸−グルタミン酸−リシン）と反応させた。上述の通り、ペプチドのＮ末端の遊離のアミノ基を、酸化型デキストランのアルデヒド基に結合させた。次にリシン残基の０．１ ｍｏｌ％〜１０ ｍｏｌ％の脂肪族アミノ基を、適切な反応性蛍光色素接合体（上述）と反応させた。反応産物の等電点は、生理学的緩衝液中で等電点電気泳動でチェックし、典型的には５未満であることがわかった。
【０１６３】
２．インビボにおける蛍光標識デキストランの血管原性内皮細胞への標的化
雄のシリアンゴールデンハムスター（体重４０ ｇ〜５０ ｇ）に、チタン製チャンバー（ｄｏｒｓａｌ ｓｋｉｎｆｏｌｄ ｃｈａｍｂｅｒ）を設置した。チャンバーの設置は、ペントバルビタールによる麻酔下で行った（腹腔内に５０ ｍｇ ｋｇ−１）。透明なアクセスチャンバーを移植し、麻酔および微小手術から２４時間の回復期間をおいた後に、微視的に完全な微小循環の基準を満たす調製物のみを、ハムスターの無色素性悪性黒色腫（Ａ−Ｍｅｌ−３）（Ｆｏｒｔｎｅｒら、１９６１）の細胞２×ｌ０５個をチャンバーへの移植に用いた。本発明の腫瘍モデルでは、血管新生の特徴が良好に決定された。この実験は、機能性の腫瘍の微小循環が確立する、腫瘍成長の６日〜７日後に行った。適量の蛍光標識された荷電性デキストランを、試料注入の２４時間前に右頚静脈に移植したポリエチレン製の細い留置カテーテルから注入した。この実験の過程で、覚醒状態のチャンバー設置ハムスターを、パースペックス（Ｐｅｒｓｐｅｘ）チューブを用いて特別に設計したステージ上に固定した。蛍光デキストランの腫瘍内皮特異的なホーミングは、血管の元となる腫瘍組織および周辺宿主組織を対象に注入後のさまざまな時点（０．５分〜３６０分）で蛍光顕微鏡を用いて分析した。両組織型における蛍光強度は、各チャンバーでみられる、標準蛍光シグナルに対する割合（％標準）として決定した。腫瘍組織に対する物質の選択性を示すものとして定義される、腫瘍および周辺組織における％標準蛍光の比は、荷電性デキストランが腫瘍内皮に結合する親和性の値であり、これを図４に示す。
【０１６４】
３．結論
一般に、血管の元となる腫瘍内皮に対する荷電性デキストランの結合親和性は、導入分子の正味の陽電荷とともに上昇する（図４Ａ〜図４Ｃを参照）。これは、陽イオン性巨大分子が、腫瘍内皮の細胞表面または糖衣に位置する負に帯電した結合部位に吸着することを意味する。
【０１６５】
実施例６．ヒト腫瘍異種移植片における血管腫瘍への標的化：分子の電荷依存性
上述した通り、分子の電荷は、血管壁内外の輸送に影響を及ぼす性質の一つである。しかし、分子電荷が固形腫瘍に含まれる血管の元となる腫瘍血管内における多量の蓄積に続く、巨大分子の微小血管透過性に及ぼす作用について述べたデータはない。したがってこの実施例では、大きさは同様なものの電荷が異なるさまざまなタンパク質の腫瘍微小血管透過率を測定した。測定は、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの透明なチャンバー（ｄｏｒｓａｌ ｓｋｉｎｆｏｌｄ ｃｈａｍｂｅｒ）に移植したヒト結腸腺癌ＬＳ１７４Ｔを対象に実施した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびＩｇＧを蛍光標識し、ヘキサメチレンジアミンとの結合によって陽イオン化、またはスクシニル化によって陰イオン化した。この分子を静脈内注入し、腫瘍組織における蛍光を生体蛍光顕微鏡で定量した。蛍光強度および薬物動態学的データを元に微小血管透過率を算出した。
【０１６６】
１．動物および腫瘍のモデル
ＬＳ１７４Ｔ腫瘍を保持するチャンバー（ｄｏｒｓａｌ ｓｋｉｎｆｏｌｄ ｃｈａｍｂｅｒ）を、文献の方法（Ｌｅｕｎｉｇら、１９９２）で雄の重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに設置した。簡単に説明すると、チタン製チャンバーを、マウス（雄、６週齢〜８週齢、２５ ｇ〜３５ ｇ）の背側皮膚に麻酔下で移植した（体重１ ｋｇあたり、７５ ｍｇの塩酸ケタミンおよび２５ ｍｇのキシラジンを皮下注）。２日後、ヒト結腸癌細胞の濃懸濁液２ μｌ（リン酸緩衝生理食塩水中に約２×１０５個の細胞）を、チャンバー内の皮下組織の横紋筋層に接種した。透過率測定実験は、腫瘍細胞を移植してから２週間後に実施した。
【０１６７】
２．荷電修飾性ＢＳＡの調製
最初にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ａ７０３０；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、カルボキシテトラメチルローダミンのスクシニミジル（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）エステル（Ｃ−１１７１；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｉｎｅ、ＯＲ）と結合させて蛍光標識した。遊離の色素は、０．００２％ アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を含む５０ ｍＭ リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ）で平衡化したゲルろ過カラム（Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ １０ＤＧ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈａｒｃｕｌａｅｓ、ＣＡ）で除いた。この処理により、１：３の色素／タンパク質のモル比となった。次にＢＳＡ溶液のアリコートをスクシニル化により陰イオン化するか、またはヘキサメチレンジアミンを結合させて陽イオン化した。スクシニル化（Ｋｌｏｔｚ、１９６７；Ｒｅｎｎｋｅ ＆ Ｖｅｎｋａｔｃｈａｌａｍ、１９７８）では、５０ ｍｌのジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ）に溶解した１０ ｍｇの無水コハク酸（Ｓｉｇｍａ）を、少しずつ増量しながら、１ ｍｌの０．２ Ｍ 重炭酸緩衝液（ｐＨ ８．０）に溶解した１０ ｍｇのタンパク質を含む溶液に滴下して添加した。インキュベート時間（３０分、室温）中、ｐＨは８．０〜８．５に維持した。陽イオン化（Ｔｒｉｇｕｅｒｏら、１９８９；Ｋｕｍａｇａｉら、１９８７；Ｈｏａｒｅ ＆ Ｋｏｓｈｌａｎｄ、１９６７）では、タンパク質（１ ｍｌの５ ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ ５．３）中に１０ ｍｇ。必要に応じて１ Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ ５．３に維持）の遊離カルボキシル基を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボキシイミド（ＣＤＩ、Ｓｉｇｍａ）で活性化した。この目的のために、ＣＤＩの二つの部分（それぞれ１００ ｍｌの水中に１０ ｍｇのＣＤＩを含む）を１０分間隔でタンパク質溶液に添加した。ＣＤＩの第二の部分を添加直後に、活性化タンパク質を、２ ｍｌの２ Ｍヘキサメチレンジアミン水溶液（Ｓｉｇｍａ）に攪拌しながら添加し、溶液のｐＨを６．８に調節し、混合液を５時間室温でインキュベートした。結合処理を行った後に、産物を一晩透析を行って精製し、高分子量の凝集体をセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ−６Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通して溶出して除去した。主要タンパク質のピークをプールし、４℃で保存した。
【０１６８】
３．荷電修飾性ＩｇＧの調製
マウスのモノクローナルＩｇＧ抗体（ＭＯＰＣ２１；Ｍ−９２６９、Ｓｉｇｍａ）の溶媒を、ゲルろ過カラム（Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ １０ＤＧ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で０．２ Ｍの重炭酸ナトリウム緩衝液に交換し、この溶液を遠心ろ過して（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＣＬ； Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）、１ ｍｇタンパク質／ｍｌに濃縮した。ｐＨを９．３に調節した。蛍光については、Ｃｙａｎｉｎｅ ３単機能性色素（Ｃｙ３−Ｍｏｎｏ−ＯＳｕ；ＰＡ１３１０４；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を用いて、少量のＩｇＧ（０．５ ｍｇ ＩｇＧ／個体）でインビボ実験を実施可能とする高い蛍光強度を得た。Ｃｙ３−Ｍｏｎｏ−ＯＳｕを、２ ｍｇ色素／１０ ｍｇタンパク質の比で添加し、この溶液を室温で６０分間攪拌した。遊離の色素を、０．００２％のアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を含む５０ ｍＭ ＰＢＳで平衡化したゲルろ過カラム（Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ １０ＤＧ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で除去し、溶液を遠心ろ過により（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＣＬ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）１．８ ｍｇタンパク質／ｍｌに濃縮した。次にＩｇＧの陰イオン性誘導体および陽イオン性誘導体を、ＢＳＡについて上述した方法で調製した。
【０１６９】
４．分子電荷および分子量の測定
タンパク質の等電点は、垂直式の電気泳動装置でポリアクリルアミドゲルスラブを用いた等電点電気泳動で決定した。クーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ）でゲルを染色後、標準タンパク質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と比較してｐＩを定量した。タンパク質の分子量は、試料緩衝液中で、還元剤β−メルカプトエタノールを必要に応じて使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で分析した。
【０１７０】
５．腫瘍の微小血管透過率の測定
さまざまなタンパク質の有効な微小血管透過率が、文献（Ｙｕａｎら、１９９３；１９９５）に記載された手順で蛍光顕微鏡を用いて測定されている。簡単に説明すると、動物を上述の手順で麻酔し、顕微鏡のステージ上のポリカーボネートチューブに固定した。蛍光標識したタンパク質をＰＢＳに溶解し、ボーラスで尾静脈に注射した（０．１ ｍｌ／２５ ｇ体重）。腫瘍組織の蛍光強度は蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｐｌａｎ、Ｚｅｉｓｓ）の２０倍の対物レンズで観察し、光電子増倍管を用いて２０分かけて定量を行った。ビデオ撮影した腫瘍領域のオフライン解析により、腫瘍の微小血管の表面積と容積を測定した。各タンパク質の挙動を評価するために３匹の動物を用いた別の実験では、血漿クリアランスの時定数を、タンパク質注入から３０分以内に動脈血標本を採取して定量した。さまざまなタンパク質のそれぞれを対象とした６個体〜７個体の腫瘍について行った実験で判定された腫瘍の微小血管透過率は、ユアン（Ｙｕａｎ）ら（Ｙｕａｎら、１９９３）の方法によって以上のデータを元に算出した。微小血管透過率の結果は、中央値±中央値の標準誤差で示す。
【０１７１】
結果を表４に示す。
【０１７２】
【表４】トレーサー分子およびその腫瘍微小血管透過率の特徴
2004511426.tif 000008
陰イオン化および陽イオン化したＢＳＡおよびＩｇＧを、「材料および方法」に記載された手順で天然タンパク質から調製した。
ａｐＩ、等電点；Ｋ、血漿中における濃度低下の時間定数；Ｐｖ、微小血管透過率。
ｂユアンら（１９９５）のデータに由来する。
【０１７３】
６．結論
蛍光顕微鏡による観察の結果、血管壁に沿ってさまざまなタンパク質が均一に血管外に遊出した。陰イオン化および陽イオン化されたＢＳＡの腫瘍微小血管透過率（Ｐｖ）を表４に示す。負に帯電したＢＳＡの透過率の値は低く（Ｐｖ＝１．１１±０．４４×１０−７ ｃｍ／秒；中央値±中央値の標準誤差）、正に帯電したＢＳＡの方がほぼ４倍の高さであった（Ｐｖ＝４．２５±０．２６×１０−７ ｃｍ／秒）。
【０１７４】
陰イオン化および陽イオン化されたＩｇＧの腫瘍微小血管透過率は、対応するＢＳＡ試料の測定値を若干上回った（表４）。電荷修飾型ＢＳＡに関するデータと同様に、陽イオン化されたＩｇＧは最高透過率を示し（Ｐｖ＝ ４．６５±０．２９×１０−７ ｃｍ／秒）、陰イオン化されたＩｇＧの透過率（Ｐｖ＝１．９３±０．４１×１０−７ ｃｍ／秒）は天然タンパク質について得られた測定値より低値であった。
【０１７５】
実施例７．中性および陽イオン性のローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）標識リポソームのヒト内皮細胞培養物（ＨＵＶＥＣ）による取り込み
ＨＵＶＥＣを、２×１０４細胞／ｃｍ２の細胞密度になるようにゼラチンコーティングされた２４穴培養プレートに添加し、２％ウシ胎児血清を含む内皮成長培地中で３７℃で４８時間、５％ ＣＯ２を含む加湿雰囲気中で培養した。培地を除いて細胞をＰＢＳで洗浄し、５００ μｌの無血清内皮基礎培地を添加した。ローダミンで標識したリポソーム（０．５ ｍＭのローダミン標識）を総脂質濃度が１００ μＭになるように培地に加えた。培養を始めてから４時間後に培地を除去し、培養物を５００ μｌのＰＢＳで２回洗浄した。細胞を、１．５ ｍｌの１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００のＰＢＳ溶液で３０分間かけて室温で溶解した。蛍光強度を、励起波長５６０ ｎｍと放出波長５８０ ｎｍで、ＳＰＥＸ ＦｌｕｏｒｏＭａｘ−２で測定した。
【０１７６】
実験の結果を表５に示す。
【０１７７】
【表５】ローダミン標識リポソームのＨＵＶＥＣによる取り込み（総脂質濃度１０ ｍＭ、リポソーム組成物はｍｏｌ％で示す）
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ζ電位は、表３に記載した条件で測定された。
【０１７８】
実施例８．リポソーム性陽イオン性画像化剤の調製
（ｉ）画像化剤の調製
細胞用画像化剤は、陽イオン性脂質（例えばＤＯＴＡＰ）からなる陽イオン性リポソームに封入する。例えば、磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）は、陽イオン性リポソームに封入されて、高熱症の造影または治療にそれぞれ用いられることが当技術分野で知られている。このような酸化鉄は、上述の一般的な方法、または例えば米国特許第５，０８８，４９９号に記載された方法で陽イオン性リポソームの内部に含めることができる。高熱症の治療では、癌患者の静脈内に酸化鉄粒子を投与する。この粒子は腫瘍内に蓄積する。患者を磁界の中に置くと酸化鉄粒子が加熱され、結果的に固体腫瘍が破壊される。
【０１７９】
特定の実施例として、Ｈ＋イオンで静電気的に安定化された超常磁性酸化鉄粒子（Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅａｔ ＡＧから購入可能）を、ＤＯＴＡＰとＤＯＰＣを５０：５０の比で含み、初期の総脂質濃度が１５ ｍＭのリポソームに封入する。このような製剤は以下の手順で調製される：ＤＯＴＡＰ（０．０７５ ｍｍｏｌ）とＤＯＰＣ（０．０７５ ｍｍｏｌ）を２０ ｍｌのクロロホルムに溶解して、５００ ｍｌの丸底フラスコ内に静置する。クロロホルムを真空中で蒸発させ、５ ｍｂａｒの減圧下で９０分間かけてフィルムを乾燥させる。次に脂質フィルムを１０ ｍｌの酸化鉄粒子の水溶液（２８６ ｍＭ）で再水和する。リポソーム懸濁物を穏やかに混合し、冷蔵庫内で保存する。２４時間後、この懸濁物を１２，０００ Ｇで１０℃で３０分間遠心する。この結果、混合物が二相に分離する。上層には、酸化鉄を封入したリポソームの大部分が含まれ、下層には、リポソームに含まれずに封入されなかった酸化鉄が含まれる。上層画分（１０ ｍｌ）を４００ ｎｍのポリカーボネートメンブレン（Ｏｓｍｏｉｃｓ Ｉｎｃ．）に５回にわたって通す（Ｌｉｐｅｘ ｅｘｔｒｕｄｅｒ、容量１０ ｍｌのバレル）。押し出された産物の脂質成分はＨＰＬＣで、また鉄は光度測定法（チオシアナート法）で分析した。
【０１８０】
（ｉｉ）画像化剤の投与
動物実験では、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１０６個のルイス肺癌（Ｌｅｗｉｓ Ｌｕｎｇ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ＬＬＣ）細胞を接種した。接種から約１０日後にマウスに触知可能な腫瘍が発生した。腫瘍が約５ ｎｍ〜８ ｎｍの大きさ（２次元測定）になったら、動物を２Ｔ ＭＲトモグラフ（Ｂｒｕｋｅｒ）に据え、麻酔（イソフルラン注入）して、解剖学的配置でスキャンする。このスキャンの間、Ｔ１緩和率およびＴ２緩和率を記録して比較した。次にマウスの体重１ ｇあたり１４ μｌの画像化剤製剤（上述の手順で調製）を尾静脈に注射した。このマウスをトモグラフに再び据え、注入後のさまざまな時点でスキャンした。上述の製剤を注入した動物の腫瘍を対象とした代表的な実験で測定した緩和率データを表６にまとめる。正常組織（例えば筋肉）のＴ２緩和率に変化は認められなかった（データは示していない）。
【０１８１】
【表６】リポソーム性陽イオン性造影剤の投与前後における腫瘍組織のＴ２値
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【０１８２】
実施例９．陽イオン性画像化剤としてのマグネトソーム（ｍａｇｎｅｔｏｓｏｍｅ）
マグネトソームは、脂質二重層に包まれたナノメートルサイズの磁鉄鉱コアからなる。陽イオン性外層を用いたマグネトソームの調製は、負に帯電したリン脂質または中性のリン脂質の用途について記載された様式（Ｄｅ Ｃｕｙｐｅｒら、１９９０）と同様の様式で生じる。マグネトソームのインビボ試験法は、１０６個のルイス肺癌細胞を接種したＣ５７ＢＬ／６マウスで実施した。画像化する際は、複数の組織のＴ２緩和率をＭＲで測定した。
【０１８３】
１．正に帯電したマグネトソームの調製
脂質二重層に包まれた磁鉄鉱コアは、例えば酸化鉄粒子のラウリン酸単層を脂質と置換することで調製することができる。層の交換は、ラウリン酸でコーティングしたマグネタイト粒子を、３０ ｍｏｌ％〜７０ ｍｏｌ％のリン脂質および７０ ｍｏｌ％〜３０ ｍｏｌ％の陽イオン性脂質からなるリポソームとインキュベートすると自然に生じる。リン脂質は、Ｆｅ３Ｏ４の酸素原子に結合することで、ラルリン酸と置き換わると想定されている。陽イオン性成分はマグネトソームの外層に選択的に蓄積し、それを電気的に安定化させる。過剰なラウリン酸は混合液から透析を行って除かれる。産物を次に精製する。
【０１８４】
特定の例として、ラウリン酸でコーティングされた超常磁性酸化鉄粒子（鉄濃度は２ Ｍ）を含む１５０ μｌの懸濁物を３７℃で、ＤＯＴＡＰおよびＤＯＰＣ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ｉｎｃ．、Ａｌａｂａｓｔｅｒ）を３０／７０ ｍｏｌ％のモル比で含む１０ ｍｌの１０ ｍＭリポソーム製剤（実施例４記載の手順で合成）とともにインキュベートした。次に、この混合物を、５％グルコース溶液に対して５日間かけて透析を行った。透析過程におけるラウリン酸の減少は、臭化フェナシル（ｐｈｅｎａｃｙｌｂｒｏｍｉｄｅ）（Ｂｏｒｃｈら、１９７５）でラウリン酸誘導体を形成させた後にＨＰＬＣでモニタリングした（ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ ＲＰ−ｓｅｌｅｃｔ Ｂ ５ μｍ ２５０−４（Ｍｅｒｃｋ）、アセトニトリル／水＝７５：２５、流速＝１ ｍｌ／分、λ＝２５４ ｎｍ、ｋ’＝３．０、ｋ’＝（ｔｒ−ｔ０）／ｔ０）。
【０１８５】
封入化されなかった酸化鉄粒子をマグネトソームから分離し、過剰の空リポソームをセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−３００ ＨＲ上でゲルクロマトグラフィーで分離した。マグネトソームは、強い永久磁石（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ）を用いて超常磁性ＭＡＣＳマイクロビーズ上で空リポソームと分離した。表７に、マグネトソームに関する分析結果をまとめる。
【０１８６】
【表７】粒子精製前後に測定したマグネトソームの分析データ
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【０１８７】
２．ルイス（Ｌｅｗｉｓ）肺癌をもつＣ５７ＢＬ／６マウスの画像化
動物実験では、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＬＬＣ細胞（リン酸緩衝生理食塩水中に約１０６個の細胞）を皮下に接種した。接種の約１０日後に触知可能な腫瘍がマウスに発生した。この腫瘍の大きさが約５ ｍｍ〜８ ｍｍ（２次元測定）となったら、マウスを麻酔し（イソフルラン吸入）、２ Ｔ ＭＲトモグラフ（Ｂｕｒｋｅｒ）のサーモスタットパッド上に据え、解剖学的配置でスキャンした。このスキャンの間、Ｔ１およびＴ２の緩和率（ｒｅｌａｘｉｖｉｔｙ）を記録して比較した。次に、マウスの体重１ ｇあたり１４ μｌの画像化剤製剤（上述の手順で調製）を尾静脈に注射した。このマウスをトモグラフに再び据え、注入後のさまざまな時点でスキャンした。表８に、上述の製剤を接種したさまざまなマウスで測定された緩和率データをまとめる。
【０１８８】
【表８】代表的な動物実験における、陽イオン性マグネトソーム投与前後における腫瘍組織のＴ２値
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【０１８９】
実施例１０．水に不溶性の薬剤の担体として脂質親和性薬剤パクリタキセルを含む陽イオン性マグネトソーム
脂質親和性薬剤（例えばパクリタキセル）の適切な担体としての安定な水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルジョンを、電気スターラーまたは超音波処理器でホモジナイズして得た（Ｔｕｃｈｉｄａら、１９９２、Ｃａｖａｌｌｉら、２０００）。複数の脂質を含む油層は、その結晶化を数か月間にわたって防ぐ薬剤の約２．１ ｍｏｌ％の可溶化剤として作用する。インビボにおける応用に関しては、疎水性マトリックスの主成分は、トリグリセリド（ＴＧ）のような生体適合性のある生分解性脂質を選択した。標的化する目的では、最大５ ｍｏｌ％のＤＯＴＡＰまたはＤＤＡＢが、陽イオン性乳化剤として必要とされるだけである。これは、外層中の陽イオン性両親媒性物質の５０％に対応する。粒子の大きさは、脂質親和性物質（ＴＧ）と両親媒性物質の重量比（ＴＧ／Ａ）の影響を受け、ＴＧの増量と相関する。
【０１９０】
パクリタキセル（１０ ｍｇ）を５６０ ｍｇのトリオクタデシルグリセリドに溶解した。次に２５ ｍｇのＤＯＴＡＰ、２５ ｍｇのＤＯＰＣ（ＴＧ／Ａ＝１１）を含む脂質混合物を、ＴＧ／パクリタキセル混合物中に室温で１０分間ホモジナイズして（ＩＫＡ Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ Ｔ８、１００００ ｒｐｍ）分散させた。次に７ ｍｌの５％グルコース溶液を、ホモジナイズを続けながら１５分かけて油層混合物に滴下して添加した。表９のデータは、陽イオン化の原理が、薬剤の添加／非添加を問わずマイクロエマルジョンに等しく適用可能で、血管新生の標的化に対して十分高いζ電位をもつ安定な製剤が結果的に得られることを示している。この方法で、高い比の薬剤−陽イオン性成分を達成して（この場合は重量％で１：２．５）、薬剤輸送系の寛容性の有意な改善がみられる。
【０１９１】
【表９】トリグリセリド（ＴＧ）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＣ、およびパクリタキセルからなる陽イオン性マイクロエマルジョンの遠心後（５００ ｇ、１０分）の分析データ
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【０１９２】
実施例１１．他の封入化画像化剤の調製
代表的な画像化剤製剤には、リポソーム性磁鉄鉱粒子（実施例８に記載）で封入された陽イオン性リポソーム、陽イオン性リポソーム（磁鉄鉱粒子が脂質二重層に共有結合されたもの）、Ｇｄ錯体を封入したＧｄ−ＤＴＰＡとの陽イオン性リポソーム、Ｇｄを脂質二重層と共有結合した陽イオン性リポソーム、内部封入、または膜結合のいずれか、またはその両方のＸ線減弱性複合体／分子（ＣＴまたはＸ線画像試験用）を含む陽イオン性リポソームが含まれる。代表的な数を以下に示す既知の手法で、また上記のζ電位の範囲を達成する製剤を調製することで、当業者であれば広範囲の画像化剤を製剤化して投与することができる。
【０１９３】
Ｇｄ−ＤＴＰＡを封入化する方法は当技術分野で周知である（Ｕｎｇｅｒ、Ｅ．Ｃ．、Ｐ． ＭａｃＤｏｕｇａｌｌ、Ｐ． ＣｕｌｌｉｓおよびＣ． Ｔｉｌｃｏｃｋ、「リポソームＧｄ−ＤＴＰＡ：ＭＲＩによるヘパトーマモデルの増強における封入化の効果（Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｇｄ−ＤＴＰＡ： ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｍａ ｍｏｄｅｌ ｂｙ ＭＲＩ）」、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ ７：４１７〜２３、（１９８９）を参照）。
【０１９４】
米国特許第６，００１，３３３号では、ＣＴによる画像化による腫瘍検出用のリポソーム性造影剤の調製法が説明されている。この方法は以下の段階を含む：（ａ）マルトースと水を約２０ ｇのマルトース：１００ ｍｌの水の比で混合して、マルトースが溶解して水溶液となるまで攪拌する段階；（ｂ）卵黄ホスファチジルコリンと９９．６％エタノールを、約４．２ ｇの卵黄ホスファチジルコリン：５ ｍｌのエタノールの比で混合して、溶解してアルコール溶液を形成するまで攪拌する段階；（ｃ）ＢＨＴをこの水溶液に、約６．２ ｍｇのＢＨＴ：２０ ｇのマルトースの比で添加する段階；（ｄ）このアルコール溶液を、各４５０ ｍｌの水に対して５ ｍｌのエタノールを含む溶液が得られるまで連続的に混合しながら水溶液に滴下して添加することで封入化溶液を形成させる段階；（ｅ）この物質を攪拌して、封入化用溶液中に封入化する段階；（ｆ）段階（ｅ）の混合物をマイクロフッ素化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｉｎｇ）装置に通して清澄溶液を形成させる段階；（ｇ）段階（ｆ）の混合物を凍結乾燥する段階。
【０１９５】
適量の卵黄ホスファチジルコリンを陽イオン性脂質と置換して、対象薬剤を含み、所望のζ電位および／または等電点をもつリポソーム成分を得てその薬剤を選択的に腫瘍に向けるように上記の方法を変更することは当業者の能力の範囲内である。
【０１９６】
リポソーム製剤の他の調製法は当技術分野で周知である。調整法には例えば、脂質フィルムの水和、溶媒注入、逆相蒸発、およびこれらの方法と凍結融解サイクルの組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。超音波処理、ｐＨ誘導によるベシクル形成、または界面活性剤による可溶化によってリポソームを調製することも当業者の能力の範囲に含まれる。また封入化分子と非封入化分子の分離にも、ゲルろ過法、超遠心法、クロスフローろ過法、密度勾配遠心法、透析法を含むがこれらに限定されないさまざまな方法を利用することができる。
【０１９７】
実施例１２：ヌードマウスにおける腫瘍の縮小
一般に実施例４によってジフテリア毒素を含むように作製されるリポソーム組成物を、腫瘍をもつ試験用ヌードマウスに注射する。腫瘍をもつ対照ヌードマウスへの平行注射を、そのζ電位を調節する目的で誘導体化されていない同様の組成物を用いて行う。２日間の間隔をおいた２ラウンドの注射の１４日後に試験マウスおよび対照マウスを殺して解剖して調べる。試験マウスで腫瘍塊の統計学的に有意な縮小が示されれば、組成物が腫瘍の縮小を引き起すのに治療上有効であることを意味する。
【０１９８】
腫瘍の縮小を引き起すのに有用な他の組成物には、パクリタキセル、ドセタキセル、または他のタキサン系、ビンクリスチン、ナベルビン、および他のビンカアルカロイド系、ゲムシタビンおよび他のヌクレオシド類似体、シスプラチンおよび他の白金系化合物を含むリポソーム組成物が含まれる。以上の組成物は、実施例４の手順で製剤化することができる。
【０１９９】
実施例１３：癌患者の膀胱腫瘍の画像化
蛍光画像化剤を実施例４に記載されたプロトコルで調製し、膀胱癌（尿路上皮癌）患者に全身投与した。投与する蛍光画像化剤は、５０ ｍｏｌ％ ＤＯＴＡＰ、４５ ｍｏｌ％ ＤＯＰＣ、および５ ｍｏｌ％ ローダミン−ＤＯＰＥ（溶媒は５％グルコース）を含むリポソーム懸濁物として製剤化した（総脂質量は１０ ｍＭ）。この製剤を、患者の体重１ ｋｇあたりの総脂質が０．５ ｍｇになる用量で、２ ｍｌ／分の速度で患者に全身投与した。
【０２００】
治療中および治療後に、蛍光性画像化剤の蓄積を、リポソーム性蛍光色素に特異的な蛍光フィルターセットに接続した膀胱手術用の従来の内視鏡を用いて検出した。腫瘍組織中の蛍光色素の蓄積は、画像化法ならびに色素の分光光度的同定法で画像化した。腫瘍縁が蛍光標識されるため、腫瘍組織を正常膀胱上皮と明瞭に識別することが可能であり、腫瘍を完全に切除することができた。
【０２０１】
実施例１４：固形腫瘍の癌患者の画像化
ＭＲＩ画像化剤は一般に、実施例４および実施例８に記載されたプロトコルで調製されて癌患者に投与される。ＭＲＩ画像化剤は、４０ ｍｏｌ％ ＤＯＴＡＰ、６０ ｍｏｌ％ ＤＯＰＣ（総脂質濃度４０ ｍＭ）、および９ ｍＭのＦｅ濃度を含むリポソーム製剤として製剤化される。１０ ｍｌの製剤を、患者１人あたり約５ ｍｇのＦｅとなるように、または約０．０６ ｍｇ Ｆｅ／ｋｇ体重（Ｆｅの現行投与量の約１０％）になるように８０ ｋｇの患者に投与する。
【０２０２】
実施例１５：固形腫瘍をもつ癌患者の治療
実施例９の手順で調製された治療薬を、腫瘍治療用に調製してヒト患者に投与する。この製剤の治療的有効量を、一種またはそれ以上の固形腫瘍の増殖がみられる患者に静脈経由で投与する。治療は、循環性腫瘍抗原の減少および／または身体再吸収を含む一種または複数の縮小マーカーで判定される腫瘍縮小がみられるまで続けられる。次に製剤を用いる連続治療または間欠治療が、予防法、または総腫瘍縮小を確実なものとする方法として任意選択で行われる。
【０２０３】
実施例１６：後水晶体線維形成症患者の治療
後水晶体線維形成症の患者は、寒冷療法による切除（ｃｒｙｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｂｌａｔｉｏｎ）で治療される。また実施例１１に記載された治療用製剤も患者に投与される。除去域の血管再生は減少または予防される。
【０２０４】
実施例１７：併用療法
一種または複数の固形腫瘍をもつ患者は実施例１１の手順で治療を受ける。初期治療後に、患者は従来の化学療法、および／または放射線療法を受ける。治療の進行は、一般的な腫瘍学プロトコルによって必要に応じてモニタリングする。併用療法を行うことで、放射線または化学療法薬に対する患者の曝露を減らすことができる。
【０２０５】
実施例１８：治療用組成物と二次活性成分の供投与
実施例１１に記載されたリポソーム製剤を、ソープ（Ｔｈｏｒｐｅ）らによる米国特許第５，９６５，１３２号に記載された免疫毒素と同時に製剤化する。治療的有効量の同時製剤化リポソームを、一種または複数の腫瘍をもつ患者に投与する。腫瘍の縮小を観察する。
【０２０６】
実施例１９：創傷治癒
ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦを含む、米国特許第５，８７９，７１３号に記載されたリポソーム組成物を、患者の創傷治癒の促進用に製剤化する。ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦの治療的有効量を、ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＣ（４０：６０）を含むリポソーム組成物に添加する。治療的有効量のリポソーム製剤を、創傷治癒を必要とする患者に投与する。創傷治癒を観察する。
【０２０７】
前述の考察および実施例が単に一つの好ましい態様の詳細な説明を示していることは明らかである。したがって、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、さまざまな変更および同等物が可能であることは当業者には明らかである。本特許出願で示されるすべての学術論文記事、他の参照、特許、特許出願は、その全体が参照として組み入れられる。
【０２０８】
参照
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【図面の簡単な説明】
【図１】粒子のζ電位の略図を示す。
【図２】さまざまなリポソーム製剤について測定されたζ電位を示す。
【図３】ζ電位がＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）の濃度（ｍｏｌ％）に依存する双曲線に適合させた陽イオン性リポソームのζ電位を示す。
【図４】周辺組織に対する腫瘍内皮細胞の相対蛍光強度に関して、中性、陰性、および陽性の荷電性デキストランに経時的な選択性があることを示す。
【図５Ａおよび図５Ｂ】ＨＵＶＥＣによる、ローダミン標識したリポソームの取り込みを示す。図５Ａは、蛍光強度（ｃｐｓ）に対するＤＯＴＡＰ（モル％）を示す。図５Ｂは、蛍光強度（ｃｐｓ）に対するζ電位（ｍＶ）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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