(57)【要約】本発明は、アルカリハロゲン化物およびアルコールの存在下で、核酸をＳｉＯ２を含む表面上へ吸着させる、溶液からの核酸の単離方法に関する。本発明はまた、ＳｉＯ２を含む担体上で核酸を単離するための、アルカリハロゲン化物を含むバッファー溶液の使用、さらに、溶液からの核酸の単離方法を実施するためのキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液からの核酸の単離方法であって、
ａ）　アルカリ金属および／またはアルカリ土類金属塩類の存在下で、溶液中に含まれる核酸を、ＳｉＯ２を含む表面上へ吸着させ、
ｂ）　ＳｉＯ２を含む表面上に吸着された核酸を、アルコール含有洗浄バッファーによって任意に洗浄し、そして
ｃ）　水性溶液によって核酸を溶出し、任意に核酸を単離する
段階を含み、
段階ａ）において、ＳｉＯ２を含む表面上への核酸の吸着が、０．１−３Ｍのアルカリ金属および／またはアルカリ土類金属塩類ならびに３７−７０ｖｏｌ％の脂肪族アルコールの存在下で行われることを特徴とする方法。
【請求項２】
核酸がプラスミドＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＳｉＯ２を含む表面が、シリカゲル、ガラス繊維、または石英繊維からなることを特徴とする請求項１または２の１項に記載の方法。
【請求項４】
ＳｉＯ２を含む表面が、膜またはフィルターであることを特徴とする請求項１〜３の１項に記載の方法。
【請求項５】
溶液中に含まれるアルカリ金属塩類が、ハロゲン化物、好ましくはＮａＣｌおよび／またはＫＣｌであることを特徴とする請求項１〜４の１項に記載の方法。
【請求項６】
段階ａ）において、ＮａＣｌが、０．２５−１．５Ｍ、好ましくは０．５−１．２５Ｍ、最も好ましくは０．５−１．０Ｍの濃度で溶液中に存在することを特徴とする請求項１〜５の１項に記載の方法。
【請求項７】
溶液中に含まれるアルコールが、１−５個の炭素原子の鎖長を有する低級脂肪族の分岐または未分岐アルコールであることを特徴とする請求項１〜６の１項に記載の方法。
【請求項８】
溶液中に含まれるアルコールがエタノールおよび／またはイソプロパノールであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
段階ｃ）において使用される溶出溶液が、０．００１−０．５ｍｏｌ／リットル、好ましくは０．００１−０．２ｍｏｌ／リットル、最も好ましくは０．０１−０．０５ｍｏｌ／リットルの濃度のモルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、または２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジノ］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）であることを特徴とする請求項１〜８の１項に記載の方法。
【請求項１０】
ＳｉＯ２を含む表面上への核酸の吸着のための、０．２５−１．５ＭのＮａＣｌ、ＫＣｌ、またはそれらの混合物、および３７−７０ｖｏｌ％の濃度のエタノールまたはイソプロパノールを含む溶液の使用。
【請求項１１】
ａ）　請求項１０に記載の溶液、および
ｂ）　ＳｉＯ２を含む表面
を含む、請求項１〜９の１項に記載の方法を実施するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＳｉＯ２を含む表面上に核酸を吸着させる、溶液からの核酸の単離方法に関する。
【０００２】
本発明は更に、ＳｉＯ２を含む担体上での核酸の単離のためのバッファー溶液の使用、および溶液からの核酸の単離方法を実施するためのキットに関する。
【０００３】
カオトロピック塩類の存在下での無機担体上での核酸の精製および単離は、文献において周知である。
マルコ（Ｍａｒｋｏ）ら［Ａｎａｌｙｔ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １２１ （１９８２） ３８２］ およびボゲルスタイン（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ）ら［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７６ （１９７９） ６１５］は、核酸を含む抽出物からのＤＮＡが、高濃度のヨウ化ナトリウムまたは過塩素酸ナトリウムにさらされると、ＤＮＡのみが、機械的に細かく分けられたガラスシンチレーション管および粉砕されたガラス繊維またはガラス繊維板に結合するのに対し、ＲＮＡおよび蛋白質は結合しないことを確認した。このように結合したＤＮＡは、必要であれば水によって溶出され得る。
【０００４】
ＥＰ　０３８９０６３　Ｂ１は、生物学的供給源からの核酸の単離方法に関する。この方法によれば、血液、細胞、血漿等のようなＤＮＡを含む生物学的供給源は、高濃度のカオトロピック塩類の存在下で溶解され、次いで、核酸が、シリカ表面に結合される。次いで、それらは洗浄されて、そして溶出される。
【０００５】
米国特許第５，１５５，０１８号に記載の方法には、ＲＮＡのほかにＤＮＡおよび他の成分を含む生物学的供給源からのＲＮＡの単離が記載されている。
【０００６】
生物学的試料は、酸性化され、グアニジニウム塩のようなカオトロピック剤と混合される。珪酸塩粒子が試料に添加され、それら条件下で、特定のＲＮＡが珪酸塩粒子に結合する。次いで、再度、ＲＮＡも粒子から分離される。
【０００７】
ＷＯ　９５／０１３５９において、コルパン（Ｃｏｌｐａｎ）らは、高イオン強度のアルコール含有溶液から核酸を吸着させることにより、核酸混合物を精製および分離するための方法を開示している。吸着溶液は、１−５０ｖｏｌ％の濃度のアルコールのほかに、１−１０Ｍの濃度の塩類、中でも好ましくはチオシアン酸グアニジニウム、過塩素酸ナトリウムまたは塩酸グアニジニウムを含む。
【０００８】
ＷＯ　９５／２１８４９は、二本鎖および／または一本鎖核酸を、これら核酸を含む供給源から分離するための方法に関する。この方法でも、核酸は、所望のタイプの核酸の結合をもたらす条件下で無機担体上に吸着されるのに対し、望ましくないタイプの核酸は、この無機担体には結合しない。
【０００９】
無機担体へ主に一本鎖核酸を結合させ、それにより、それを二本鎖核酸から分離するために、２つのタイプの核酸を含む試料に従って、塩類、特に、カオトロピック塩類とアルコールとの水性混合物によって、処理条件を調整する。次いで、吸着していない二本鎖核酸は、既知の方法によって更に精製または単離され得る。
【００１０】
ＰＣＲ、配列決定および遺伝子導入のような分子生物学的用途のために、特に、トランスフェクションおよびワクチン接種のために用いられる核酸は、純度および完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）に関する極めて厳しい要求を受ける。分子診断法または分子医学における核酸の使用は、それらが、例えば、治療されるべき生物において病原となる効果を引き起こし得る毒性物質を含まないことを前提とする。
【００１１】
従来技術から知られている方法に共通する１つの要素は、シリカ表面上での核酸の単離のために、カオトロピック塩類が高濃度で使用されることである。塩酸グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、または過塩素酸ナトリウムのようなカオトロピック物質は、毒性の高い物質である。これら物質の存在下で単離された核酸がそれらによって汚染され、それにより分子生物学的用途において使用できなくなるか、または大部分が使用できなくなる可能性を除くことはできない。
【００１２】
カオトロピック物質の取り扱いもまた、使用者の健康に重大な危険を引き起こし、このことは、これら物質を取り扱う場合には、特定の安全な予防措置を取らなければならないことを意味する。
【００１３】
本発明の基礎となる技術的な課題は、従来技術から知られていた欠点を克服する改良された方法を提供することである。核酸を結合させるために本方法において用いられる物質は、無毒であるべきである。同時に、その方法は、例えば、安価な化学物質を使用することにより、できる限り低コストであるべきであり、そして、単離される核酸は、量的および質的に純粋な状態で単離されるべきである。
【００１４】
驚くべきことに、本発明は、溶液から核酸を単離するための方法を提供し、それによりこの課題を解決する。本発明は、第一段階において、０．１−３Ｍ、好ましくは０．２５−１．５Ｍのアルカリ金属ハロゲン化物、および３７−７０ｖｏｌ％の濃度のアルコールの存在下で、ＳｉＯ２を含む表面への核酸の結合を行う。次いで、ＳｉＯ２を含む表面上へ吸着された核酸は、アルコール含有洗浄バッファーによって任意に洗浄され、水性塩溶液または水によって核酸が溶出される。
【００１５】
ＳｉＯ２を含む表面上へ核酸を結合させるために、０．１−３Ｍ、好ましくは０．２５−１．５Ｍ、より好ましくは０．５−１．２５Ｍ、特に０．５−１．０Ｍの濃度でＮａＣｌ、ＫＣｌ、およびＬｉＣｌのようなアルカリ金属ハロゲン化物を含む水性吸着溶液が使用される。アルカリ金属ハロゲン化物は無毒物質であり、使用される濃度でのその塩溶液の取り扱いは、健康の点で完全に安全である。
【００１６】
水性吸着溶液は、上記塩類のほかに、１−５個の炭素原子の鎖長を有する低級脂肪族の分岐または未分岐アルコールを含む。溶液中に含まれる脂肪族アルコールは、３７−７０ｖｏｌ％、好ましくは３７−５０ｖｏｌ％の濃度のメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールおよびブタノールであることが好ましい。上記アルコールの中で、３７−７０ｖｏｌ％の濃度のエタノールおよび／またはイソプロパノールが特に好ましい。
【００１７】
ＳｉＯ２を含む表面は、例えば、多孔性または非多孔性の酸化珪素もしくは金属−珪素混合酸化物、シリカゲル、ガラスに基づく材料、例えば、改質もしくは非改質ガラス粒子、またはすりガラス、石英、ゼオライト、または上記物質の１つもしくはそれ以上の混合物であり得る。
【００１８】
本発明の目的のためには、表面とは、何らかの微細孔性境界層を意味する。
【００１９】
本発明による方法の特に好ましい態様において、ＳｉＯ２を含む表面は、多孔性膜またはシリカゲル、ガラス繊維もしくは石英繊維製フィルターである。
【００２０】
本発明による方法の別の態様において、より広い意味で、表面という語は、粒子または顆粒（ｇｒａｎｕｌｅｓ）、または、例えばシリカゲルフリースのような繊維の層をも含む。
【００２１】
結合した核酸は、溶離液として水または食塩水溶液を用いて、本発明により溶出され得る。使用される食塩溶液は、濃度０．００１−０．５ｍｏｌ／リットル、好ましくは０．０１−０．２ｍｏｌ／リットル、最も好ましくは０．０１−０．０５モル濃度の、例えば、モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジノ］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）溶液のような、従来技術から知られているバッファー溶液である。
【００２２】
本発明による方法の別の態様において、溶離液に含まれる核酸は、好ましくは、アルコール沈殿によって単離され得る。
【００２３】
この方法によって単離される核酸は、毒性物質を含まないので、分子生物学における使用に適している。
【００２４】
以下で、“核酸”という語は、最も広い意味で、即ち、二本鎖、一本鎖、環状および直鎖、分岐等のような、全ての長さおよび構造のリボ核酸（ＲＮＡ）、更にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ならびに、例えば単量体ヌクレオチド、オリゴマー、プラスミド、ウイルスおよびバクテリアＤＮＡおよびＲＮＡのような、それらの全ての考えられ得るサブユニット、ならびに動物および植物細胞、または他の真核生物からのゲノムおよび非ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡ、処理型および未処理型のｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｈｎ−ＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ならびに全ての他の考えられる核酸を含むことが理解されるべきである。
【００２５】
本発明による方法によって、あらゆる起源の核酸を溶液から単離することが可能になる。核酸を含む試料は、例えば、動物または植物組織、組織または細胞培養物、骨髄、血液、血清、血漿、尿、精液、脳脊髄液、痰、および塗抹標本のようなヒトおよび動物体液、植物、植物の一部、および、植物抽出物、例えばジュース、真菌、バクテリアまたは酵母のような原核微生物または真核微生物、化石化またはミイラ化試料、土壌試料、不純物を除去した泥、排水、および食品（特に、加工済み、即ち、工業的に調製された食品）から得られる。化学反応によって形成された核酸、例えば、ポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ）によって得られたもの、またはプラスミド−ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびに／または微生物由来の核酸も、本発明によって単離され得る。
【００２６】
本発明による方法は、その後のクローニング、トランスフェクションまたは配列決定のために、例えば大腸菌のようなバクテリアから、プラスミドＤＮＡを単離するために特に適している。
【００２７】
バクテリアの溶解は、例えば、ビムボイム（Ｂｉｍｂｏｉｍ）およびドリー（Ｄｏｌｙ）（１９７９）によるアルカリ溶解、またはホルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ）およびキグレー（Ｑｕｉｇｌｅｙ）による加熱による溶解のような、既知の溶解方法を用いて行われる。
【００２８】
細胞デブリならびに沈殿した蛋白質およびゲノムＤＮＡは、遠心分離または濾過によって、粘性のある溶菌液から除去され、プラスミドＤＮＡを含む、不純物を取り除いた溶菌液が得られる。プラスミドＤＮＡは、例えば、イオン交換クロマトグラフィーによって精製することができ、そして、このように予備精製されたプラスミドＤＮＡは、次いで、本発明による方法を用いて単離され得る。
【００２９】
本発明は更に、
ａ）　０．２５−１．５ＭのＮａＣｌ、ＫＣｌ、またはそれらの混合物、および３７−７０ｖｏｌ％の濃度のエタノールまたはイソプロパノールを含む吸着溶液、ならびに、
ｂ）　ＳｉＯ２を含む表面
を含む、溶液から核酸を単離するためのキットに関する。
【００３０】
ＳｉＯ２を含む表面は、シリカゲル、ガラス繊維または石英繊維製の多孔性膜またはフィルターであることができ、かつ、適当な装置中に配置することができる。そのキットは、溶解に適した溶液、ならびに上記の洗浄および溶出バッファーを更に含むことが好ましい。
【００３１】
本発明によって単離された核酸は、核酸を破壊する酵素を含まないので、それを、様々な方法で直ちに更に処理および加工し得るのに十分なほど純粋である。
【００３２】
本発明によって生成された核酸は、クローニングのために使用することができ、かつ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ制限酵素、ＤＮＡリガーゼ、および逆転写酵素のような、全ての種類の酵素のための基質として作用し得る。
【００３３】
本発明による方法によって調製された核酸は、増幅、特にＰＣＲ、鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ローリングサークル法（Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ ｐｒｏｃｅｓｓ）、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）および類似の方法のために特に適している。
【００３４】
本発明による方法はまた、診断における使用のための、特に、本発明による方法によって精製された核酸が、その後の段階において増幅され、次いで、および／または同時に、そのように増幅された核酸が検出されることを特徴とする診断方法のための、核酸の調製に特に適している（例えば、ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）， Ｐ．Ｍ．ら， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８８， ７２７６−７２８０、リバク（Ｌｉｖａｋ）， Ｋ．Ｊ．ら， １９９５． ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． ４， ３５７−３６２； キービッツ（Ｋｉｅｖｉｔｓ）， Ｔ．ら， １９９１． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈ． ３５， ２７３−２８６； ユッテンダーレ（Ｕｙｔｔｅｎｄａｅｌｅ）， Ｍ．ら， １９９４． Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ７７， ６９４−７０１）。
【００３５】
【実施例】
実施例１：
様々な濃度のＮａＣｌおよびアルコールの存在下でのプラスミドＤＮＡの単離
個々のバッファー（０．２５−１．５Ｍ ＮａＣｌ； ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ８．５； １５％（ｗ／ｖ）イソプロパノール）の３９０μｌのアリコートを、１μｇのプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶβ；クロンテック社（Ｍｅｓｓｒｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ） ＃６１７７−１） （ｃ ＝１μｇ／μｌ）と混合し、問題の結合バッファー中のイソプロパノールの総量が２８．９−４９．８ｖｏｌ％になるように、様々な量のイソプロパノールと組み合わせた。室温（ａｍｂｉｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）（２０−２５℃）で５分間インキュベーションした後、シリカ膜を含むカラム中へ混合物を移し、真空内でシリカ膜へ通した（約６００ ｍｂａｒ； キアゲン社（Ｍｅｓｓｒｓ ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ）のＱＩＡｖａｃ ６Ｓを使用）。その後、それを７５０μｌのＰＥバッファー（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ７．５； ８０％エタノール）で洗浄し、それが乾燥するまで膜に空気を通した。１００μｌのＥＢバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ８．５）を添加することにより溶出を行い、２６０ｎｍでの光度測定によって収率を決定した。結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
2004502458.tif 000002
【００３７】
実施例２：
異なるアルコール濃度でのプラスミドＤＮＡの単離
５００μｇ（ｃ＝１μｇ／μｌ）のプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶβ； クロンテック社（Ｍｅｓｓｒｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ） ＃６１７７−１）を、５ｍｌのＱ１バッファー（１．２５ Ｍ ＮａＣｌ； ５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ８．５； １５ ｖｏｌ ％ イソプロパノール）に溶解した。次いで、結合バッファー中のイソプロパノールの総含有量２２．７−４３．３ｖｏｌ％に相当する量のイソプロパノールを添加し、注意深く混合し、室温（２０−２５℃）で５分間インキュベートした。ＤＮＡ／Ｑ１／イソプロパノール混合物をガラス繊維フィルター（サルトリウス社（Ｍｅｓｓｒｓ Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）， ミニサルト・シリーズ（Ｍｉｎｉｓａｒｔ Ｓｅｒｉｅｓ））に押し付け、膜に風を吹きつけ乾燥させた。１ｍｌのＴＥバッファー（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ７．５； １ ｍＭ ＥＤＴＡ）によって溶出を行った。２６０ｎｍでの光度測定によって収率を決定した。結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】
2004502458.tif 000003
【００３９】
実施例３：
様々な濃度のＫＣｌおよびアルコールの存在下でのプラスミドＤＮＡの単離
個々のバッファー（０．２５−１．０ Ｍ ＫＣｌ； ５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ８．５； １５％ （ｗ／ｖ） イソプロパノール）の３９０μｌのアリコートを、１０μｇのプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶβ；クロンテック社（Ｍｅｓｓｒｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ） ＃６１７７−１）（ｃ＝１μｇ／μｌ）と混合し、問題の結合バッファー中のイソプロパノールの量が５７．３ｖｏｌ％までになるか（表３参照）、またはイソプロパノールとエタノールを合わせた量が７１．４ｖｏｌ％までになるように、様々な量のイソプロパノールと組み合わせた。室温（２０−２５℃）での５分間のインキュベーション後、シリカ膜を含むカラム（キアゲン社（Ｍｅｓｓｒｓ ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ）製ＱＩＡｑｕｉｃｋ， ＃２８１０４）に混合物を移し、真空内でシリカ膜へ通した（約６００ ｍｂａｒ； キアゲン社（Ｍｅｓｓｒｓ ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ）のＱＩＡｖａｃ ６Ｓを使用）。その後、それを７５０μｌのＰＥバッファー（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ７．５； ８０％エタノール）で洗浄し、それが乾燥するまで膜に空気を通した。１００μｌのＥＢバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ８．５）を添加することにより混合物を溶出し、２６０ｎｍでの光度測定によって収率を決定した。
【００４０】
【表３】
2004502458.tif 000004
【００４１】
実施例４：
様々な濃度のＬｉＣｌ；ＮａＣｌまたはＫＣｌおよびアルコールの存在下でのプラスミドＤＮＡの単離
個々のバッファー（０．２５−１．０ Ｍ 塩； ５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ８．５； １５％ （ｗ／ｖ） イソプロパノール）の３９０μｌのアリコートを、１０μｌ（およそ１０μｇ）のプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶβ；クロンテック社（Ｍｅｓｓｒｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ） ＃６１７７−１）（ｃ＝１μｇ／μｌ）と混合し、問題の結合バッファー中のエタノールの量が７１．４ｖｏｌ％までになるように（下記表４参照）、様々な量のエタノールと組み合わせた。室温（２０−２５℃）での５分間のインキュベーション後、シリカ膜を含むカラム中へ混合物を移し、真空内でシリカ膜へ通した（約６００ ｍｂａｒ； キアゲン社（Ｍｅｓｓｒｓ ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ）のＱＩＡｖａｃ ６Ｓを使用）。その後、それを７５０μｌのＰＥバッファー（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ７．５； ８０％エタノール）で洗浄し、それが乾燥するまで膜に空気を通した。１００μｌのＥＢバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ８．５）を添加することにより混合物を溶出し、２６０ｎｍでの光度測定によって収率を決定した。
【００４２】
【表４】
2004502458.tif 000005
【００４３】
実施例５
より多量のＤＮＡの単離
多量の（Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ）プラスミドＤＮＡ（ｃ＝１μｇ／μｌ；ｐＣＭＶβ；クロンテック社（Ｍｅｓｓｒｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ） ＃６１７７−１）を、１５ｍｌのＱ１バッファー（１．２５ Ｍ ＮａＣｌ；５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ８．５； １５ ｖｏｌ ％ イソプロパノール）に溶解した。次いで、最終濃度が４９．８ｖｏｌ％になるように、イソプロパノールを添加し、成分を注意深く混合し、実験室の台の上で５分間インキュベートした。
ＤＮＡ／Ｑ１／イソプロパノール混合物を、２０ｍｌシリンジ中に移し、シリカ膜を含むシリンジ・プレフィルター（サルトリウス社（Ｍｅｓｓｒｓ Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）， ミニサルト・シリーズ（Ｍｉｎｉｓａｒｔ Ｓｅｒｉｅｓ））に供給した。混合物を、定圧下でフィルターに押し込み（ｆｏｒｃｅｄ）、フィルターを除去し、膜に再度空気を通し、残留アルコールを除去した。新しい５ｍｌシリンジを用いて、シリンジ・プレフィルターに５ｍｌのＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ７．５； １ ｍＭ ＥＤＴＡ）を押し込むことにより、溶出を行った。２６０ｎｍでの光度測定によって収率を決定した。結果を表５に示す。
【００４４】
【表５】
2004502458.tif 000006
【００４５】
結果：
より多量のプラスミドＤＮＡを用いたとしても、ＤＮＡの回収率は、８０−９０％の間である。
【００４６】
実施例６
様々な濃度のＮａＣｌおよびアルコールの存在下でのプラスミドＤＮＡの単離
ＮａＣｌ溶液（０ Ｍ； ０．１ Ｍ； ０．２５Ｍ； ０．５ Ｍ； １Ｍ； ２．５ Ｍ； ５ Ｍ； 飽和溶液； ５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ８．５）の３４０μｌのアリコートを、１μｇ／μｌのプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶβ；クロンテック社（Ｍｅｓｓｒｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ） ＃６１７７−１）を含む溶液１０μｌと混合した。３５０μｌのイソプロパノールを各試料に添加し、各混合物の濃度を５０ｖｏｌ％とした。室温（２０−２５℃）での５分間のインキュベーション後、混合物を、ガラス繊維／シリカ膜（ＱＩＡｐｒｅｐ ８−ウェルストリップス（ｗｅｌｌ ｓｔｒｉｐｓ）；キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ））を含むカラム（ＱＩＡｖａｃ ６Ｓ；キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ））中に移した。ＤＮＡ含有溶液を、真空内（約６００ｍｂａｒ）で膜に通し、次いで、２００μｌのＥＢバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５）によって溶出した。各塩濃度での四回の（ｑｕａｄｒｕｐｌｅ）測定におけるＤＮＡの収率（添加量の百分率として）、ならびに平均を下記表６に示す。
【００４７】
【表６】
2004502458.tif 000007
【００４８】
この試験の結果は、ＤＮＡの回収では、０．１−２．５Ｍの間のより低い塩濃度と比較すると、非常に高い塩濃度（５Ｍ、飽和）において、収率が減少することを示す。
【００４９】
実施例７
様々な塩類または様々な濃度のアルコールの存在下でのプラスミドＤＮＡの単離
プラスミドＤＮＡの５００μｇのアリコートを、５ｍｌのＴＥバッファー（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ； ｐＨ ８．０； １ ｍＭ ＥＤＴＡ；キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ））に溶解し、個々の混合物中の最終的なアルコール濃度が４１．２、５０、６６．７および７５ｖｏｌ％になるまで、イソプロパノールを添加した。ＤＮＡ単離のための全ての測定を、ＱＩＡｖｅｃ ６Ｓ カラム（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ））中のＱＩＡプレシピテーター・マキシ（ＱＩＡｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｏｒ Ｍａｘｉ） （キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ））によって行った。表７は、試験の結果を示し、そこでは、異なる混合物中での塩濃度は、１．２５Ｍ　ＮａＣｌであった。試験をそれぞれ数回行い、表７に、個々の試料の結果およびそれらから算出した標準偏差の平均を示す。
【００５０】
【表７】
2004502458.tif 000008
【００５１】
その後、使用する塩の種類を変えることにより、上記実験を変更した：１．２５ＭのＮａＣｌ溶液を、１．２５ＭのＫＣｌ溶液に取り替えた。ＫＣｌ溶液による実験の結果を、表８に示す。
【００５２】
【表８】
2004502458.tif 000009
【００５３】
最後に、プラスミドＤＮＡのバッファーの影響も調べた。上記の方法を使用し、そして１．２５ＭのＮａＣｌ溶液を含む混合物において、ＴＥバッファーをＱＦバッファー（５０ ｍＭ ＭＯＰＳ； ｐＨ ７．０； １５％ イソプロパノール）に取り替えた。多数の測定の結果を、平均および標準偏差と共に表９に示す。表７および８のものからの個々の混合物におけるアルコール濃度の違いは、ＱＦバッファーのイソプロパノール含有量が１５％であるためである。
【００５４】
【表９】
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【００５５】
それらの結果は、使用する塩の種類（ＮａＣｌ／ＫＣｌ）は、ＤＮＡの単離における収率に対して、わずかな影響しか有さないことを示す。同様に、バッファーを取り替えることも、ＤＮＡの収率に対して、ほとんど何の影響も有さない（１．２５ＭのＮａＣｌおよびＴＥバッファーの場合に７７．４％、１．２５ＭのＮａＣｌおよびＱＦバッファーの場合に７５．０％）。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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