(57)【要約】少なくとも１のアデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬または少なくとも１のアデノシン摂取プロモーターの有効量を必要とする対象に投与することによって、肝硬変および肝繊維症および脂肪肝を予防および治療することができる。少なくとも１のアデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬の有効量を必要とする対象に投与することからなる肝繊維症、硬変症または脂肪肝の発生を予防する方法。少なくとも１のアデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬の有効量を必要とする対象に投与することからなる肝繊維症、硬変症または脂肪肝を治療する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１のアデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬の有効量を必要とする対象に投与することからなる肝繊維症、硬変症または脂肪肝の発生を予防する方法。
【請求項２】
アデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬がアデノシン、２−フェニルアミノアデノシン、２−ｐ−２−カルボキシエチルフェニルアミノ−５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン、５−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン、５’−Ｎ−シクロプロピルアデノシン、５’−Ｎ−メチルカルボキサミドアデノシン、８−（３−クロロスチリル）カフェイン、ＰＤ−１２５９４４４、１，３−ジプロピルフェニルキサンチンおよび４−｛２−〔７−アミノー２−（２−フリル）［１，２，４］−トリアゾロ［２，３−ａ］［１，３，５］−トリアジンー５−イルアミノ〕エチル｝フェノール（ＺＭ ２４１３８５）、次式の１，３，７−アルキルキサンチンの８−スチリル誘導体：
【化１】
2004502640.tif 000005
式中、Ｒ１およびＲ３はメチル、エチル、プロピル、またはアリルであり；
Ｒ７はＨ、メチル、またはＣ１−Ｃ８アルキルであり；
Ｒαは水素であり；そして
次式の化合物：
【化２】
2004502640.tif 000006
式中、Ｙはｍ−Ｂｒまたはｐ−ＳＯ３Ｈ
【化３】
2004502640.tif 000007
からなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１のアデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬または少なくとも１のアデノシン摂取プロモーターの有効量を必要とする対象に投与することからなる肝繊維症、硬変症または脂肪肝を治療する方法。
【請求項４】
アデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬が、
【化４】
2004502640.tif 000008
式中、Ｒ１およびＲ３はメチル、エチル、プロピル、またはアリルであり；
Ｒ７はＨ、メチル、またはＣ１−Ｃ８アルキルであり；
Ｒαは水素であり；そして
次式の化合物：
【化５】
2004502640.tif 000009
式中、Ｙはｍ−Ｂｒまたはｐ−ＳＯ３Ｈ
【化６】
2004502640.tif 000010
からなる群から選択される請求項３記載の方法。
【請求項５】
アデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬が、８−（３−クロロスチリル）カフェインおよび４−｛２−［７−アミノ−２−（２−フリル）（１，２，４）トリアゾロ［２，３−ａ］［１，３，５］トリアジン−５−イルアミノ］エチル｝フェノール、ＺＭ ２４１３８５として既知、からなる群から選択される請求項４記載の方法。
【請求項６】
アデノシンＡ２Ａ受容体の刺激を阻害する少なくとも１の薬剤の有効量を必要とする対象に投与することからなる肝繊維症、硬変症または脂肪肝の発生を予防する方法。
【請求項７】
アデノシンＡ２Ａ受容体の刺激を阻害する少なくとも１の薬剤の有効量を必要とする対象に投与することからなる肝繊維症、硬変症または脂肪肝を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本出願は、ここに参考文献として組み込む２０００年２月１０日に出願した仮出願番号６０／１８１，５４６からの優先権を請求する。
【０００２】
本発明は、肝繊維症および硬変症ならびに脂肪肝を治療および予防する方法と組成物に関する。
【０００３】
【従来の技術】
アデノシンは身体に広範囲に分布するヌクレオシドである。アデノシンは、中枢神経系鎮静、血小板凝集の抑制および管平滑筋血管拡張を含む生理的応答の広い配列を仲介する。これらの効果は主として４つのタイプのアデノシン受容体の１つとアデノシンの相互作用によって生じる。
【０００４】
特定の細胞タイプまたは組織はその形成のために独特の応答を表さないので、したがって勿論アデノシンは一般の通例の物質を代表する。この点では、アデノシンは種々の内分泌ホルモンとは異なる。神経または他の細胞からのアデノシンを貯蔵および放出する証拠がない。したがって、アデノシンは種々の神経伝達物質とは異なる。
【０００５】
アデノシンは、プロスタグランジンのように、生理的調節剤の特徴がある。両方の場合に、代謝形成に含まれる酵素は偏在し、細胞の生理的状態における変化に応答して現れる。アデノシンに対する受容体はプロスタグランジンのように、非常に広範囲である。
【０００６】
アデンシン受容体は、アデノシンの生理的効果を媒介する細胞表面分子の群からなる。最近の概観はＳｔｉｌｅｓ， Ｇ．Ｆ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ． ７：４８５−４９０ （１９８６）； Ｒａｍｋｕｍａｒ， Ｖ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｇ． Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ． ３２：１９５−２４７ （１９８８）； Ｏｌａｈ， Ｍ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５４：２１１−２２５ （１９９２）； Ｓｔｉｌｅｓ， Ｇ．Ｌ． Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：６４５１−６４５４ （１９９２）； Ｊａｃｏｂｓｏｎ， Ｋ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３５：４０７−４２２ （１９９２）を含む。受容体のこの族は、アデノシン（Ｐ１）またはＡＴＰ（Ｐ２）との選択的相互作用によって、初めはＰ１またはＰ２プリン性受容体として分類されていた（Ｂｕｒｎｓｔｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， 薬剤とホルモンの細胞膜受容体において、Ｓｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７８， ｐｐ． １０７−１１８）。Ｐ１部位はアデノシン類似体の特異な選択性および分子構造に基づいたＡ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、およびＡ３アデノシン受容体にさらに細分された（Ｖａｎ Ｃａｌｋｅｒ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ３３：９９９−１００５ （１９７９）； Ｌｏｎｄｏｓ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：２５５２−２５５４ （１９８０）； Ｒａｌｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ５０（３）： ４１３−９２ （１９９８）； Ｐｏｕｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６（６）：６１９−４１ （１９９８）； Ｋｈａｋｈ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １９（２）： ３９−４１ （１９９８））。Ａ１アデノシン受容体、これはアデニリルシクラーゼを抑制する、は有効性順位（Ｒ）−ＰＩＡ＞ＮＥＣＡ＞（Ｓ）−ＰＩＡを示す。Ａ２アデノシン受容体、これはアデニリルシクラーゼを刺激する、は異なる有効性順位ＮＥＣＡ＞（Ｒ）−（ＰＩＡ）＞（Ｓ）−ＰＩＡをもつ。（（Ｒ）−ＰＩＡはＮ６−フェニルイソプロピルアデノシン；（Ｓ）−ＰＩＡはＮ６−（Ｓ）−フェニルイソプロピルアデノシン；ＮＥＣＡはＮ−エチルアデノシン−５’−ウロン酸である）。Ａ１およびＡ２アデノシン受容体は両者共に中枢神経系および周辺組織に広く分布している（Ｒａｍｋｕｍａｒ， Ｖ． ｅｔ ａｌ．， 上記）。
【０００７】
アデノシン受容体の追加の情報はＲａｌｅｖｉｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ５０（３）：４１３−９２， １９９８； Ｐｏｕｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６（６）： ６１９−４１，１９９８およびＫｈａｋｈ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １９（２）：３９−４１， １９９８に見出すことができる。
【０００８】
４種のアデニン受容体を請求しそれらの配列は既知である。比較的最近まで真に有用なラジオリガンドはＡ２アデノシン受容体を特徴づけるために入手できなかった。平滑筋でのアデノシン受容体の証明は官能アッセイ、例えば、培養基中の管平滑筋細胞でのＡ２受容体を介したアデニリルシクラーゼ活性のアデノシン刺激、によって初めはなされた（Ａｎａｎｄ−Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ， Ｍ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １０８： ２１３−２１９ （１９８２）； Ａｎａｎｄ−Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ， Ｍ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ３７： ８５７−８６７ （１９８５）。しかしながら、ｃＡＭＰを高めるのに必要なアデノシンの濃度はインヴィヴォの充分な脈管弛緩に要求されるよりも高かった （Ｂｅｒｎｅ， Ｒ． Ｍ．， Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ４７：８０７−８１３ （１９８０）； Ｈｅｒｌｉｈｙ， Ｊ．Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２３０：１２３９−１２４３ （１９７６））。Ａ１およびＡ２アデノシン受容体を研究する有用性を証明した１の細胞系は（Ｒａｍｋｕｍａｒ， Ｖ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３７：１４９−１５６ （１９９０） ＤＤＴ１ ＭＦ−２系、成長したシリアハムスターの輸精管のステロイド誘発ｌｅｉｍｙｏｓａｃｒｏｍａから誘導された平滑筋細胞系である（Ｎｏｒｒｉｓ， Ｊ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２４８：４２２−４２４ （１９７４））。
【０００９】
最近、２つの化合物がＡ２受容体のラジオリガンドに対し選択的高親和性をもつことが見出された：［３Ｈ］ＣＧＳ ２１６８０（Ｊａｒｖｉｓ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｉｒ ２５１：８８８−８９３および １２５Ｉ−ＰＡＰＡ−ＡＰＥＣ、その化学名は｛２−３（２（２−（４−アミノフェニル）メチルカルボニル−アミノ）エチルアミノカルボニル）エチル｝フェニル）エチルアミノ−５’−Ｎ−エチルカルボキサミンドアデノシン（Ｂａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｗ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：６５７２−６５７６ （１９８９））である。そのようなリガンドの使用は、３８ ｋＤａ Ａ２結合サブユニットからはっきりと識別できる４５ ｋＤａ 蛋白質 （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上）としてＡ２結合サブユニットを同定することができた。１２５−Ｉ−ＰＡＰＡ−ＡＰＥＣのアジド誘導体、Ａ２受容体の直接のフォトアフィニティプローブ使用は、Ａ２結合サブユニットがＡ１受容体グリコプロテインとは明らかに異なるグリコプロテインであることを示すことを可能にした（Ｂａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｗ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３８：１７７−１８３ （１９９０））。Ａ２アデノシン受容体はコンプレックスまたは高マンノースタイプのいずれかの単一炭水化物鎖をもつ。
【００１０】
有用なアデノシン受容体作用薬、特にＡ２受容体の選択性をもつものは、当該分野では良く知られている。これらは２−置換アデノシン−５’−カルボキサミド誘導体（Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ， Ｕ．Ｓ． 特許第４，９６８，６９７および５，０３４，３８１号）およびＮ９−シクロペンチル−置換アデニン誘導体（チェンら、Ｕ．Ｓ．特許第５，０６３，２３３号）を含む。これら特許はここに参照文献として全体を組み込む。
【００１１】
アデノシンとその類似体は、炎症性応答で好中球と相互作用する。好中球は種々の微生物による感染の広がりを制限するために必須であるが、刺激された好中球は傷ついた組織を損傷するが、感染または炎症の部位への途中にある。アデノシンの放出は正常細胞が活性化した好中球から自分を守る１つのメカニズムである。このようにして、１つの重要なアデノシンとその類似体の作用は、好中球のＡ２受容体との相互作用によって、Ｏ２−およびＨ２Ｏ２を含む毒性の酸素生成物の発生の阻害である（Ｃｒｏｎｓｔｅｉｎ， Ｂ．Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３５：１３６６−１３７１ （１９８５）； Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｐ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｈ． ２２７：６６９−６７４ （１９８５）； Ｓｃｈｒｉｅｒ， Ｄ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７：３２８４−３２８９ （１９８９）； Ｉａｎｎｏｎｅ， Ｍ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｆｅｄ． Ｐｒｏｃ． ４４：５８０ （ａｂｓｔｒ．） （１９８５））。アデノシンはＡ１受容体を介して好中球走化性を促進する（Ｃｒｏｎｓｔｅｉｎ， Ｂ．Ｎａｌｅｔ 上記；Ｒｏｓｅ，Ｆ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６７：１１８６−１１９４ （１９８９））。アデノシン受容体連結反応はＦｃｖ受容体によって作用する免疫コンプレックスによって引き金となる好中球の炎症性応答を制御する（Ｓａｌｍｏｎ， Ｊ．Ｅ．， Ｉｍｍｕｎｏ． １４５：２２３５−２２４０ （１９９０））。特に、Ａ２受容体の活性化はこれら炎症性応答を阻害したが、Ａ１受容体の活性化は刺激であった。これらの著者はプロモーターとしてのピコモルの濃度で、インヒビターとしてミクロモルで、免疫コンプレックスによって顕在化させた好中球応答のアデノシンの重要な役割に注目した。
【００１２】
興味の引くことには、免疫抑制剤メトトレキセートは、低い濃度で、皮膚繊維芽細胞または臍静脈内皮細胞のような連結組織細胞によりアデノシン放出を誘発する能力に少なくとも一部分起因する抗炎症剤として作用する。放出したアデノシンは好中球アデノシン受容体と相互作用した（Ｃｒｏｎｓｔｅｉｎ， Ｂ．Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：２４４１−２４４５ （１９９１））。
【００１３】
非選択的アデノシン受容体アゴニスト、２−クロロアデノシンは、内皮に刺激した好中球の付着を阻止し、したがって炎症の影響から内皮を保護する（Ｃｒｏｎｓｔｅｉｎ， Ｂ．Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７８：７６０−７７０ （１９８６））。さらに最近、本発明者の実験室の研究はＡ２受容体の使用は好中球付着と有毒代謝産物の生成を阻害、したがって抗−炎症作用に貢献することを示した（Ｃｒｏｎｓｔｅｉｎ， Ｂ．Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：２２０１−２２０６（１９９２））。
【００１４】
本発明者らはしたがってアデノシンが炎症部位で好中球の蓄積を制御することを見出した。好中球は無細胞の連結組織を横断するが、存在するアデノシンの低濃度は食作用、移動、および幾らかの、しかし別のものではない表面への付着を促進する。組織傷害の焦点ちかくは、損傷した細胞が高濃度のアデノシンを放出し、細胞および結合性の組織基層への好中球の付着を阻害し、刺激された好中球により有毒酸素代謝の生成を阻害する。このように、アデノシンは組織傷害または微生物浸入、炎症前の作用の部位で好中球の蓄積を促進できる（Ｃｒｏｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２、上記）。
【００１５】
アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬が傷回復を促進することが示された。高められた皮膚の傷回復は傷に増加した基質（コラーゲン）によって行われる。クロンシュタインらは米国特許第５，９３２，５５８号は、参考文献としてその全体の内容をここに組み込むが、傷回復を促進するためのアデノシン受容体作用薬の使用を開示する。増加したアデノシン放出はメトトレキサート治療の多くの抗−炎症効果を介在する、そして本発明者らはメトトレキサート刺激アデノシン放出がまた少数の患者に生じるメトトレキサート誘発肝繊維形成に貢献するかどうか調べた。
【００１６】
若干の疫学研究はコーヒー消費が硬変症の発現を予防することを示した：Ｌｅｐｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， 「アルコール消費と関連した硬変症のリスクにおけるコーヒーを飲むことおよびタバコの喫煙の効果」Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｕｏｒｎａｌ ｏｆ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ １０（６）：６５７−６６４， １９９４； Ｋｌａｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， 「コーヒー、茶および不死」Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ３（４）：３７５−３８１， １９９３； Ｋｌａｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， 「アルコール、喫煙、コーヒー、および硬変症」Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ １３６（１０）：１２４８−１２５７， １９９２； Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．， 「男性のアルコールドリンカーのコーヒー消費および減少した血清ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼおよびアミノトランスフェラーゼ活性」Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ２７（３）：４３８−４４３， １９９８。
【００１７】
カフェイン、コーヒ中の成分は、比較的非選択的アデノシン受容体拮抗薬である。不眠、心拍度数等のカフェインの効果はアデノシン受容体をブロックするその能力にすべてある。最近の疫学研究では、コーヒーの消費はアルコール性肝硬変の発現を抑え、コーヒーのさらに優れた製薬学的成分のは１つはカフェイン、非選択的アデノシン受容体拮抗薬であることが明らかになった（Ｌｅｐｏｒｅ Ａ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ． Ｅｐｉｃｅｍｏｌ． １０（６）：６５７−６６４ （１９９４）。
【００１８】
製薬学的に適切な濃度のメトトレキセートとエタノールおよびそれらの組み合わせは複数の実験でＨｅｐＧ２細胞（肝腫瘍細胞系）からのアデノシン放出を増加させた。本発明者らは若干の実験で、ＣＧＳ−２１６８０、比較的選択的アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬が、コラーゲン合成を促進し、投与量依存の仕方（ＥＣ５０約３００ｎＭ）で２０倍ほど（ｐ＜０．００４ ）で、培養したラットの星細胞系から放出することを認めた。ＣＳＣ、特異的アデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬は、ほぼ完全にコラーゲン合成のＣＧＳ−２１６８０−介在促進および放出をブロックする。ＤＰＣＰＸ、Ａ１受容体拮抗薬、およびエンプロフィリン、Ａ２Ｂ受容体拮抗薬、はＣＧＳ−２１６８０の能力に殆ど影響せず、コラーゲン放出および合成を刺激する。
【００１９】
リアングらは米国特許第５，８５９，０１９号に、アデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬、特に８−（３−クロロスチリル）カフェインを、虚血損傷またはそのリスクを負う患者に投与することによって心臓虚血を防ぐ方法を記載する。
【００２０】
目下、潜在する肝臓の破壊を避ける抗ウイルス治療の他には肝繊維症または硬変症または脂肪肝の発現の抑制の治療はない。
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は従来技術における上記欠点を解決することである。
【００２２】
本発明の別の目的は、肝繊維症、硬変症、または脂肪肝を治療することである。
【００２３】
さらに本発明の目的は、肝繊維症、硬変症、または脂肪肝を予防することにある。
【００２４】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、アデノシンＡ２Ａ受容体のための作用薬は星細胞によるコラーゲンの合成を促進する。これら受容体での拮抗薬はコラーゲン合成における作用薬介在の増加を防ぐ。組織損傷または壊死の間に、またはエタノールにさらした後に、肝細胞は高濃度のアデノシンを放出し、これは肝臓中のコラーゲンの生成を刺激し、肝繊維症および硬変症に導く。したがって、アデノシンＡ２受容体拮抗薬の投与はコラーゲン合成および放出の促進をブロックでき、このようにして肝繊維症、硬変症、または脂肪肝を予防および治療する。
【００２５】
最近、本発明者らはアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬が傷回復を促進することを示した、参照、米国特許第５，９３２，５５８号、ここに参考文献として組み込む。皮膚創傷回復を高めるには傷の基質（コラーゲン）を増加して達成される。アデノシン放出の増加はメトトレキサート治療の多くの抗炎症効果に介在する。
【００２６】
メトトレキサートはＨｅｐＧ２細胞でのアデノシン生成を促す
アデノシンはメトトレキサートの抗炎症作用に介在し、多様な細胞タイプから放出されるので、メトトレキサートが肝臓実質組織での細胞からアデノシン放出するかどうかを決定する研究が行われた。ＨｅｐＧ２細胞、ヒト肝癌細胞系（Ａ．Ｂ．Ｒｅｉｓｓ博士からの寄贈）は密集成長させ３時間０−１０ｍＭメトトレキサートを用いて３７℃にて５％ＣＯ２中でインキュベーションした。アデノシン抽出およびＨＰＬＣによる計量はＳｍａｉｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９２； １４８（１１）；３５８８−９５に記載された方法を用いて行った。
【００２７】
図１に示されるように、アデノシン放出の増加は１０ｎＭまでのメトトレキサート濃度の増加と共に観察され、その血清濃度はリューマチ性疾患に用いたメトトレキサートの抗炎症投与量で目的が達成される。メトトレキサートの投与量が多いと、細胞増殖を減らし、培養基中の細胞数のように、アデノシン放出が減る。１０ｎＭの濃度のメトトレキサートでは、アデノシン放出は４１±３９ ｎＭから２４２±８２ ｎＭまで６倍に増加し、コントロール、対ＭＴＸ、ｎ−６、ｐ＜０．００１。
【００２８】
エタノールはＨｅｐＧ２細胞におけるアデノシン生成を誘発する
エタノールはメトトレキサート治療での肝硬変の発現のリスクを増し、メトトレキサートでの患者は慣例上禁酒を助言される。エタノールは、それ自身で硬変症の発現のための良く認識された独立したリスクの要素であり、アルコール誘発硬変症はメトトレキサート誘発肝繊維症と比べて世界中で非常に大きい健康への影響力をもつ。したがって、肝細胞でのアデノシン放出へのエタノールの影響を調べた。
【００２９】
ＨｅｐＧ２細胞は、０−１６０ｍｇ／ｄｌの濃度で３７℃にて、５％ＣＯ２で、３時間エタノールを用いインキュベーションした。８０ｍｇ／ｄｌの血清レベルは大抵の管区でエタノールの適法運転者の限度である。アデノシンは上記のように計量した。８０ｍｇ／ｄｌまでのエタノール濃度がＨｅｐＧ２細胞からのアデノシン放出を促進することを見出した。これよりも大きいエタノール濃度は、図２に示すように、観察されたアデノシンと矛盾がなく、ＨｅｐＧ２細胞には毒である。さらにエタノールでメトトレキサート処理したＨｅｐＧ２のインキュベーションはメトトレキサートの適切な濃度でアデノシン放出を増加し、アデノシン放出でのメトトレキサートとエタノールの影響は付加的である（データーは示していない）。４０ｍｇ／ｄｌのエタノール濃度では、アデノシン放出はコントロールから４倍増加した（３７±３５ｎＭから２０６±７９ｎＭまで、コントロール、対ＭＴＸ、ｎ＝６、ｐ＜０．００１）。これらの発見はエタノールがＡＴＰ分解およびヒト対象での細胞外空間へのプリン放出を増加するという先の証明と矛盾しない、Ｐｉｕｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ １９８４； ７４（３）：９３６−４１。
【００３０】
アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬、ＣＧＳ−２１６８０、はラットおよびヒトの肝星細胞（ｒＨＳＣおよびＬＸ−１）によるコラーゲン生成を増加する
アデノシン放出の増加がコラーゲン生成を促進するかどうか決定するため、不滅にしたラットの肝星細胞（ｒＨＳＣ、Ｓ．Ｌ．Ｆｒｉｅｄｍａｎ博士から寄贈）を種々のアデノシン受容体にて作用薬および拮抗薬とインキュベーションし、その後コラーゲン生成を計量した。ラットの肝星細胞を、１４Ｃ−プロリンでパルスした後１０μＭのアデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬ＣＳＣを添加して、または添加なしで種々の濃度でＣＧＳ−１２６８０で処理した。コラーゲンはエタノール沈殿で抽出し、ホスフォ画像に露出後、計量した。図３に示すように、アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬ＣＧＳ−２１６８０は１０ｍＭの濃度でコントロールに対し３２２３±９１７％でコラーゲン生成を劇的に増加した（ｎ＝６、Ｐ＜０．００１）。
【００３１】
ＣＧＳ−２１６８０誘発したコラーゲンでの増加
生成はほぼ完全に、図３に示すように、３７℃、５％ＣＯ２にて４時間アデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬、８−（３−クロロスチリル）−カフェイン（ＣＳＣ）で予備インキュベーションして廃棄された。アデノシンＡ１拮抗薬、８−シクロペンチルジプロピルキサンチン（ＤＰＣＰＸ）、およびＡ２Ｂ受容体拮抗薬、エンプロフィリン、はコラーゲン放出の強化に阻害効果は最小であった（データーは示していない）。
【００３２】
別の実験は、図３に示すように、ＣＳＣによりブロックされた投与量依存の方法で不滅化したヒト肝星細胞（ＬＸ−１）において１００ｎＭまでの濃度でＣＧＳ−２１６８０がまたコラーゲン生成を増加したことを示した。１０ｎＭ以上のＣＧＳ−２１６８０濃度では、ＬＸ−１によるコラーゲン生成は減少した。ＣＧＳ−２１６８０のＡ２Ａ受容体選択性は濃度の増加とともに減少し、アデノシンＡ２Ｂ受容体活性の補充は１００ｎＭ以上のＣＧＳ−２１６８０濃度で観察され、高投与量のＣＧＳ−２１６８０によるＡ２Ｂ受容体の拮抗関係の影響はコラーゲン生成での減少の原因であるらしい。これはアデノシンＡ２Ｂ受容体活性化がコラーゲン合成を減らす心臓の繊維芽細胞でのＤｕｂｅｙの観察と一致する、Ｄｕｂｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ １９９８； ３１（４）：９４３−８。あるいは、コラーゲン生成でのＣＧＳ−２１６８０誘発の変化はコラーゲナーゼ／メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）またはそれらのインヒビター、メタロプロテイナーゼの組織インヒビター、ＴＩＭＰの発現での変化の結果である。その受容体の一つによって作用するアデノシン、Ａ２Ｂ受容体はメタロプロテイナーゼ発現を変えることに注目されたらしい（Ｂｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ １９９６：３９（６）：９２３−３０）。
【００３３】
ＫＴ−５７２０，蛋白質キナーゼＡインヒビターはｒＨＳＣによるコラーゲン生成での２１８６８０介在の増加を排除する 
ｃＡＭＰ／蛋白質キナーゼＡ経路はアデノシンＡ２Ａ受容体信号導入を媒介することが知られている。蛋白質キナーゼＡ阻害の効果はｒＨＳＣでのＣＧＳ−２１６８０−媒介コラーゲン生成で研究された。ラットのＨＳＣは、１０ミクロモルのＫＴ−５７２０、蛋白質キナーゼＡインヒビターを添加してまたは添加しないで、３７℃、５％ＣＯ２にて４時間１０ミクロモルのＣＧＳ−２１８６０で処理し、コラーゲン生成物はエタノール沈殿により抽出し、ホスフォ画像に露出後、計量化した。ＫＴ−５７２０は、図５に示すように、ＣＧＳ−２１６８０媒介のコラーゲン生成の増加を４７％に抑えることが見出された、コントロールコラーゲン生成の３３９±９９％からコントロールの１８１±６９％まで、ｎ＝４、Ｐ＜０．０１３）。従って、ＣＧＳ−２１６８０誘発のコラーゲン生成の増加は、ｃＡＭＰ／蛋白質キナーゼＡ経路によって少なくとも一部生じる。
【００３４】
アデノシンＡ２Ａ受容体の欠失したマウスは四塩化炭素−誘発肝繊維症から保護される
アデノシンＡ２Ａ受容体は細胞培養モデルにおいてコラーゲン生成を媒介することが見出された。アデノシンＡ２Ａ受容体の欠失したマウスが肝繊維症の四塩化炭素モデルを用いる硬変症から保護されるかどうかを決定する研究を行った。アデノシンＡ２Ａ（Ａ２Ａ−／−）またはＡ３（Ａ３−／−）受容体（Ｊ．Ｆ． Ｃｈｅｎ博士およびＭ．Ａ． Ｊａｃｏｂｓｏｎ博士の寄贈）の欠失したＣ５７ＢＬ／６マウスをオイル中０．０５ｍｌの四塩化炭素で、５０：５０ ｖ：ｖ、皮下に、週２回、ｎ＝５、各群につき、４週間処理した。次いでマウスを殺し、肝繊維の組織構造をＲｏｅｎｉｇｋスケールを用いて等級付けした。全部の５匹のＡ３−／−マウスは４週間後に肝臓のＲｏｅｎｉｇｋ等級３繊維症を発現したが、全部の５匹のＡ２Ａ−／−マウスは、図６に示すように、殆ど繊維症の兆候がなく、Ｒｏｅｎｉｇｋ等級０であった。Ａ２Ａ−／−マウスに対する野生タイプのコントロールの４匹は初期の、３ないし１０日以内に、四塩化炭素毒性に屈し、死体解剖は４匹全部に普通以上の肝壊死と脂肪症を示した。このグループの唯一の生存マウスは繊維症の著しい証拠を示した。
【００３５】
アデノシンＡ２Ａ受容体欠失マウスが肝繊維症の四塩化炭素モデルを用いる脂肪肝から保護されるかどうか研究を行った。アデノシンＡ２Ａ（Ａ２Ａ−／−）またはＡ３（Ａ３−／−）受容体（Ｊ．Ｆ． Ｃｈｅｎ博士およびＭ．Ａ． Ｊａｃｏｂｓｏｎ博士の寄贈）の欠失したＣ５７ＢＬ／６マウスをオイル中０．０５ｍｌの四塩化炭素で、５０：５０ ｖ：ｖ、皮下に、週２回、ｎ＝５、各群につき、４週間処理した。次いでマウスを殺し、脂肪肝の組織構造を等級付けした。全部の５匹のＡ３−／−マウスは４週間後に脂肪肝を発現したが、全部の５匹のＡ２Ａ−／−マウスは殆ど脂肪肝の兆候がなかった。
【００３６】
アデノシンデアミナーゼを一部欠失したマウスは肝繊維症を発現する
アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）はプリン代謝に必須の酵素であり、それぞれ、イノシンおよび２’−デオキシイノシンへのアデノシンおよび２’−デオキシアデノシンの加水分解脱アミノ化の原因となる（Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ １９６６； １１３（２）：３８３−８）。ＡＤＡの欠失は循環系および組織でのアデノシンの蓄積に導かれる、Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ， Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ １９９５； ７６（３ Ｐｔ２）：Ｓ２１９−２７。
【００３７】
ブラックバーンらが報告したように（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０００： １９２（２）：１５９−７０および Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０００）、ブラックバーン博士は、３週齢で死亡する過酷に合わさった免疫不全と肺炎症を発現するＡＤＡ欠失のマウスを生み出した。さらに最近、ブラックバーン博士の実験室は一部ＡＤＡ欠失のマウスを発現し、これは胎児致死性から救うために用いられた導入遺伝子の異所性の発現を示す。ＡＤＡを一部欠失したマウスは４ないし５ヶ月間生存するが、明らかに呼吸器の病気で死ぬ。完全なＡＤＡ欠失マウスと異なり、これらマウスは、肺機能の進行性のロスとなる過酷な肺繊維症を発現する。一部ＡＤＡを欠失したマウスはまた自然発生的に寿命の間に肝繊維症の度合いを変化させる。２．５ヶ月齢では、若干の炎症および繊維症が肝臓に見られる。４ヶ月齢では、実験した５匹全部のＡＤＡ一部欠失マウスは図７のように肝臓の炎症および繊維症の増加を示した。繊維症は血管の周囲および実質組織に発現する。肝臓被膜はまたＡＤＡ一部欠失マウスではさらに厚い。おまけに肺実質組織では繊維症を示し、肺のアデノシンレベルはコントロールマウスと比較してＡＤＡ一部欠失マウスでは非常に高いので（１１．９０４＋２．２６３ｎＭアデノシン／ｍｇ蛋白質 ｖｓ．１２週にて０．０３２４＋０．０６７ｎＭアデノシン／ｍｇ蛋白質 、ＡＤＡ一部欠失ｖｓ．コントロール、それぞれｎ＝４およびｎ＝５）、アデノシンホメオスタシスでの不安の原因は得られた表現型の原因であるらしい。
【００３８】
図７は三色およびアデノシンデアミナーゼで染色したＡＤＡ一部欠失マウスの組織構造区域を示す。図のＡおよびＢの一部欠失したマウスは、はっきりした繊維症を示すが、図のＣおよびＤのコントロールマウスでは認められない。
【００３９】
ＣＧＳ−２１６８０、比較的選択的アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬は２０倍（ｐ＜０．００４）ほどの投与量依存のやり方で（ＥＤＣ５０約３００ｎＭ）培養したラットの星細胞系からのコラーゲン合成および放出を促進する。ＣＳＣ、特異的アデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬は、ほぼ完全にコラーゲン合成および放出のＣＧＳ−２１６８０−介在プロモーションをブロックする。
【００４０】
ＤＰＣＰＸ、アデノシンＡ１受容体拮抗薬、およびエンプロフィリン、Ａ２Ｂ受容体拮抗薬は、コラーゲン放出および合成を刺激するＣＧＳ−２１６８０の能力に影響が小さい。【００４１】
メトトレキサートを用いた治療の最も心配される結果は肝繊維症である。幸運にも、これはリューマチ関節炎の患者のまれな病気である。アルコールの使用はメトトレキサートを取る患者の肝繊維症の発現の重要なリスク要素である。本発明者らは先にメトトレキサートが種々の細胞系からアデノシン放出を誘発することを示した。図１は、２つの実験を示しており、メトトレキサートがヘプタン細胞系ＨｅｐＧ２からのアデノシン放出を同じように促進することを示す。アデノシン放出のメトトレキサートの影響は細胞がまたエタノールにさらされるとき大きくなる（８０ｍｇ／ｄｌは大抵の管区での運転の法的限界である）。
【００４２】
脂肪肝は肝細胞の脂肪形質転換が多くは肝実質組織の炎症と破壊に結合している状態である。脂肪肝はアルコールを含む種々の毒物、薬剤または環境毒物、肝炎ＢおよびＣのような感染性病原体、代謝の先天性瑕疵（ヘモクロマトーシス）、糖尿症および肥満症のような他の病気にさらされた結果であり、または筋肉・末梢神経での起点での突発性にある。脂肪形質転換の機構はこれら条件の全てで完全に理解されておらず、現在入手できるこの条件での特別の治療はない。
【００４３】
アデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬、または活性化するためアデノシンＡ２Ａ受容体を阻害する化合物は、肝繊維症、肝繊維症の発現を避ける硬変症および／または脂肪肝、複雑にする合併症を伴う硬変症および／または脂肪肝を引き起こすことが知られている状態で患者に投与される。さらに、アデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬は確証された繊維症、硬変症、および／またはさらなる繊維症を避ける脂肪肝の患者に投与される。
【００４４】
従って、本発明は患者の肝繊維症、硬変症、および／または脂肪肝を治療または予防する方法であり、アデノシンＡ２Ａ受容体の刺激を阻害する少なくとも１つの薬剤を患者に投与することからなる。このようにして少なくとも１つの薬剤は好ましくはアデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬またはアデノシン摂取または代謝のプロモーターである。
【００４５】
上記方法に有用なアデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬はアデノシン、ＺＭ ２４１３８５として知られている４−｛２−［７−アミノ−２−（２−フリル）（１，２，４）トリアゾロ［２，３−ａ］［１，３，５］トリアジン−５−イルアミノ］エチル｝フェノール、２−フェニルアミノアデノシン、２−パラ−２−カルボキシエチルフェニルアミノ−５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン、５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン、５’−Ｎ−シクロプロピルアデノシン、５’−Ｎ−メチルカルボキサミドアデノシン、８−（３−クロロスチリル）カフェイン、およびＰＤ−１２５９４４（化学構造について参照、Ｂｒｕｎｓ， Ｒ．Ｆ． Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６０３：２１１−２１６， １９９０， ２１６頁）。
【００４６】
肝繊維症および／または硬変症を治療または予防するために用いられる他のアデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬は、１，３−ジプロピル−８−フェニルキサンチンおよび４−｛２−［７−アミノ−２−（２−フリル）（１，２，４）トリアゾロ［２，３−ａ］［１，３，５］トリアジン−５−イルアミノ］エチル｝フェノール（ＺＭ ２４１３８５）を含む。
【００４７】
肝繊維症および／または硬変症を治療または予防するために用いられる追加のアデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬は、次式の１，３−７−アルキルキサンチンの８−スチリル誘導体を含む。
【００４８】
【化７】
2004502640.tif 000002
式中、Ｒ１およびＲ３はメチル、エチル、プロピル、またはアリルであり；
Ｒ７はＨ、メチル、またはＣ２−Ｃ８アルキルであり；
Ｒαは水素である。
【００４９】
肝繊維症および／または硬変症を治療または予防するために用いられる他のアデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬は、次式の化合物を含む。
【００５０】
【化８】
2004502640.tif 000003
式中、Ｙはｍ−Ｂｒまたはｐ−ＳＯ３Ｈである。
【００５１】
【化９】
2004502640.tif 000004
【００５２】
さらに本発明は肝繊維症、硬変症、および／または脂肪肝を治療および／または予防するための製薬組成物に関し、
（ａ）アデノシンＡ２Ａ受容体の活性化を阻害する少なくとも１の薬剤；および（ｂ）製薬的に許容される担体または賦形剤からなる。
【００５３】
上記製薬組成物において、少なくとも１の薬剤は好ましくはアデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬である。
【００５４】
本発明の好適な動物の対象は、哺乳類、そして特にヒトである。治療および予防の期間は肝臓の硬変および／または繊維症の対象を治療するため、または硬変症または繊維症または脂肪肝の発現を避けるように肝臓の硬変および／または繊維症および／または脂肪肝を引き起こすことが知られている状態の対象を治療するため、アデノシンＡ２Ａ受容体を投与していることを意味する。
【００５５】
本発明は、肝臓の繊維症および／または硬変および／または脂肪肝を予防または治療するように有効量の少なくとも１のアデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬からなる製薬組成物を提供する。
【００５６】
少なくとも１のアデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬からなる本発明の製薬組成物は意図した目的を達成する任意の手段にとって投与することができる。製薬組成物の投与の量および期間は肝臓病を治療する分野の当業者により容易に決定される。
【００５７】
製薬剤は非経口、皮下、静脈注射、筋肉内、腹膜内、または経皮を含む任意の経路により投与される。あるいはまたは同時に、経口によって投与することができる。投与量は患者の年齢、健康状態、および体重、同時の治療の種類、あるにしても、所望する効果の性質に依存する。
【００５８】
本発明の範囲内の組成物はアデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬がその意図する目的を達成するために有効な量で含まれる全ての組成物を含む。各要求は変わるが、各成分の有功量の最適範囲の決定は当業者にある。代表的投与量は体重１キロ当り０．０１ないし１００ｍｇである。好ましい投与量は０．１ないし１００ｍｇ／ｋｇである。最も好ましい投与量は１ないし１００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００５９】
本発明の活性成分を投与するための製薬組成物は好ましくは、薬理学的に活性な化合物に加えて、製薬学的に用いられる製剤に活性化合物の処理を容易にする賦形剤および補助剤からなる適当な製薬学的に許容される担体を含む。好ましくは、製剤は、特に経口投与であり、好ましいタイプの投与、例えば錠剤、ドラジェー、およびカプセルに用いられる製剤、およびまた直腸、例えば座剤、ならびに注射または経口による投与に適当な溶液による製剤は、約０．０１ないし９９重量パーセント、好ましくは約２０ないし７５重量パーセントの活性化合物を賦形剤と共に含む。本発明に対し特に示さない限りパーセントは重量パーセントである。以下に既述する製薬組成物に加えて、本発明の化合物は含有複合体、例えばシクロデキストリン包含複合体またはリポソームを処方することができる。
【００６０】
本発明による製薬組成物に用いる製薬学的に許容される酸追加の塩の例は、鉱酸、例えば塩化水素酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸、硫酸、および有機酸、例えば酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、およびアリルスルホン酸、例えばｐ−トルエンスルホン酸、酸類から誘導されるものを含む。
【００６１】
製薬学的に許容される担体はビヒクル、アジュバント、賦形剤、または希釈剤、当業者に既知で容易に入手できるものを含む。製薬学的に許容できる担体は活性化合物に化学的に不活性であり、使用条件下で有害な副作用または毒性のないものである。
【００６２】
担体の選択は一部は特定の活性成分によって、また組成物を投与するのに用いられる特定の方法によって決定される。従って、本発明の製薬組成物の広範囲の処方がある。処方は経口、エーロゾル、非経口、皮下、静脈注射、動脈注射、筋肉内、腹膜内、気管内、直腸、膣投与のために調製される。
【００６３】
適当な賦形剤は、特に、充填剤、例えば糖類、例えば乳糖または蔗糖、マンニトールまたはソルビトール、セルロース製剤および／またはリン酸カルシウム、例えば、リン酸三カルシウムまたはカルシウム水素リン酸塩、ならびにバインダー、例えば澱粉糊、例えばトウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、ジャガイモ澱粉、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドンである。
【００６４】
非経口投与に適する処方は水溶性塩のような水溶性の活性化合物の水性溶液を含む。さらに、適当な油状注入懸濁液として活性化合物の懸濁液を投与することができる。適当な脂肪親和性溶媒またはビヒクルは脂肪油、例えば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド類を含む。水性注入懸濁液は懸濁液の粘度を増加する物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む。任意には、懸濁液はまた安定剤を含む。
【００６５】
本発明によるアデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬のための他の製薬学的に許容できる担体はリポソーム、活性成分が分散し、または脂質層に付着した水性の集中的な層からなる小体にいろいろに存在して含まれる製薬学的組成物である。活性成分は水性層および、脂質層中に、内側または外側、とにかく、リポソーム懸濁液として一般に知られている均質でない系に存在する。
【００６６】
疎水性層、または脂質層は、一般に、しかし独占的ではなく、ホスフォリピド、例えばレシチンおよびスフィンゴミエリン、ステロイド、例えばコレステロール、多少イオン性の表面活性物質、例えばジセチルホスフェート、ステアリルアミンまたはホスファチジル酸、および／または疎水性の他の物質からなる。
【００６７】
化合物はまた経皮投与のために、例えば、全身性の投与を達成するように経皮パッチの形で処方される。
【００６８】
経口投与に適する処方は、水、食塩水、またはオレンジジュースのような希釈剤に溶解した有効量の化合物のような液体溶液、カプセル、錠剤、サッシェおよびトローチ剤、固体または顆粒としてそれぞれ予定された量の活性成分を含む；粉；適当な液体の懸濁液；および適当な乳濁液からなる。液体処方は水およびアルコール、例えば、エタノール、ベンジルアルコール、およびポリエチレンアルコールを含み、製薬学的に受け入れられる界面活性剤、懸濁剤、または乳化剤を添加するかまたは添加しない。カプセルの形は通常の固さまたは軟らかさの殻のゼラチンタイプであることができ、例えば、界面活性剤、滑剤、および不活性充填剤、例えば乳糖、蔗糖、リン酸カルシウム、およびコーンスターチを含む。錠剤の形は１またはそれ以上の乳糖、蔗糖、マンニトール、コーンスターチ、ジャガイモ澱粉、アルギン酸、微結晶質セルロース、アカシア、ゼラチン、グアガム、コロイド状二酸化シリコン、クロスカラメロ−スソジウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、その他の保存料、調味料、および製薬学的に許容される崩壊剤、保湿剤、保存料、調味料、および製薬学的に相溶性の担体を含む。トローチ剤の形は担体中の活性成分、通常は蔗糖およびアカシアまたはトラガカントゴム、ならびにゼラチンまたはグリセリン、またはショトウおよびアカシアのような不活性塩基中の活性成分からなる錠剤を含むことができる。乳濁液等は活性成分のほかに、当業者に知られている担体を含むことができる。
【００６９】
非経口投与に適している処方は、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、および意図する患者の血液と等浸透性の処方にする溶質を含む水性および非水性等浸透性殺菌注射を含み、水性および非水性殺菌懸濁液は懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存料を含むことができる。化合物は殺菌液体または液体混合物のような製薬学担体中、薬理学的に受け入れられる希釈剤で投与される。これには水、食塩水、水性デキストロース、および関連した糖溶液、エタノール、イソプロパノールまたはヘキサデシルアルコールのようなアルコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコール、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノールのようなグリセロールケタール、ポリ（エチレングリコール）４００のようなエーテル、オイル、脂肪酸、脂肪酸エステルまたはグリセライド、またはアセチル化脂肪酸グリセライドを含み、製薬学的に許容される界面活性剤、例えば石鹸または洗剤、懸濁剤、例えばカーボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロース、または乳化剤および他の製薬学的補助剤を添加しない。
【００７０】
非経口処方に用いられるオイルは石油、動物油、植物油、合成油が用いられる。オイルの特別な例はピーナッツ油、ダイズ油、ゴマ油、綿実油、コーン油、オリーブ油、ワセリン、および鉱物油を含む。脂肪酸は非経口処方に用いられ、オレイン酸、ステアリン酸、およびイソステアリン酸を含む、オレイン酸エチルおよびミリスチル酸イソプロピルは適当な脂肪酸エステルの例である。非経口処方に用いる適当な石鹸は脂肪アルカリ金属、アンモニウム、およびトリエタノールアミン塩を含み、適当な洗浄剤はジメチルジアルキルアンモニウムハライド、およびアルキルピリジニウムハライドのようなカチオン洗浄剤、ジメチルオレフィンスルホネート、アルキル、オレフィン、エーテル、およびモノグリセリドサルフェートおよびスルフォスクシネートのようなアニオン洗浄剤；脂肪アミンオキサイド、脂肪酸アルカノールアミド、およびポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマーのような非イオン洗浄剤；アルキル−ベータ−アミノプロピオネートおよび２−アルキル−イミダゾリン４級アンモニウム塩のような両性洗浄剤；およびこれらの混合物を含む。
【００７１】
非経口処方は一般に約０．５ないし約２５重量％の活性成分を溶液に含む。適当な保存剤および緩衝液はこれらの処方に用いられる。注入の部位で炎症を最小にするかまたは除くために、これら組成物は約１２ないし約１７の親水性脂肪親和性バランス（ＨＬＢ）をもつ１またはそれ以上の非イオン性界面活性剤を含む。このような処方の界面活性剤の量は約５ないし約１５重量％の範囲にある。適当な界面活性剤ポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル、例えばソルビタンモノオレエートおよびエチレンオキサイドと疎水性塩基との高分子付加物、プロピレンオキサイドとプロピレングリコールとの縮合によって生成した付加物を含む。非経口処方は、アンプルおよび水薬瓶のような容器に密封された単一投与量または複数投与量で存在でき、使用直前に注射するため、殺菌液担体、例えば、水を添加するだけの凍結乾燥した状態で貯蔵される。即席の注射溶液および懸濁液は先に述べた種類の殺菌粉末、顆粒、および錠剤から調製される。
【００７２】
また、アデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬は活性成分と、乳化塩基または水溶性塩基を含む種々の塩基を混合して座薬に作られる。膣投与に適する処方は膣座薬、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、またはスプレイ処方の形であり、アデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬のほかに、当業者に知られているような担体を含む。
【００７３】
アデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬はアミドやペプチドのような他の分子に結合するため機能的にしたコンジナーとして用いられる。このようなコンジナーの使用は有効性を増加させ、作用期間を延ばし、プロドラッグを提供する。水溶解性も高まり、完全に除去しなくとも、望まない血漿蛋白への結合と脂質への分割を減らすことができる。したがって、薬物動力学を改善することができる。
【００７４】
対象にアデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬を投与する適当な方法がある。１以上の経路を用いて特定の化合物を投与できるが、他の経路よりも特定の経路はさらに直接にさらに有効な反応を与えることができる。従って、上記方法は単に例示であり制限されるものではない。
【００７５】
当該分野で既知の多くのリガンド結合アッセイのいくつかを用いて、アデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬であると推測される特定の薬剤が本当に受容体に結合し、アデニリルシクラーゼ活性の刺激のような、期待される生化学または生物学の活性を仲介するかどうか試験することができる。ラジオリガンド結合および生化学変化を誘発するアゴニストの測定のようなアッセイは多くの参考文献に開示されている。たとえば、Ｖａｎ Ｃａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ３３：９９９−１００５， １９７９およびＳｔｉｌｅｓ， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ． ７：４８６−４９０， １９８６。また、トランスフェクションまたは発現したアデノシンＡ２Ａ受容体作用薬を用いる結合または機能的アッセイはまた特定の薬剤が本当に受容体に結合しているかどうか試験するために用いられる。
【００７６】
既知のアッセイ方法はリガンド、またはアデノシン受容体のＡ２ＡおよびＡ２Ｂサブタイプの両方に結合し活性化することができる作用薬の使用に基づく。このアプローチでは、任意のアデノシンＡ２Ｂ受容体を占める排除化合物が用いられ、結合および活性化ができるＡ２Ａ受容体を残す。この技術はブルンの米国特許第４，７０５，６５８に記載され、これをここに参考文献としてその全体を組み込む。
【００７７】
アデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬またはアデノシン摂取プロモーターの似た量を用い、肝繊維症または硬変症または脂肪肝を予防または治療した。患者の状態および治療への応答に基づいて治療を継続し、これらは過度の実験を行わずに当業者は容易に決定することができる。
【００７８】
アデノシンＡ２Ａ受容体拮抗薬またはアデノシン摂取プロモーターの投与は、四塩化炭素のような毒物の被害者、ならびにビールス感染、自己免疫病、および第一期の胆汁性肝硬変症の患者の治療に特に有用である。
【００７９】
本発明を完全に記載したが、当業者には同じ物を広範囲の同等のパラメーター、濃度、および本発明の精神および範囲から逸脱することのない条件で過度の実験を行うことなく実施することができることを正しく認識するであろう。
【００８０】
本発明はその特定例に関連して記載したが、さらに改変を行うことができることは理解されるであろう。この出願は任意の変更、用途、または、一般に、意図の基本に従い本発明を応用することを含むことを意図するものであり、本発明からのこの種の逸脱、請求の範囲および発明の詳細な説明に記載された基本的特徴に応用されるようなものは当該分野の既知または通常の実施の範囲にある。
【００８１】
参考文献
Ａｎａｎｄ−Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ， Ｍ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １０８：２１３−２１９ （１９８２）．
Ａｎａｎｄ−Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ， Ｍ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ３７：８５７−８６７ （１９８５）．
Ｂａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｗ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ３８：１７７−１８３ （１９９０）．
Ｂａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｗ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：６５７２−７５７６ （１９８９）．
Ｂｅｒｎｅ， Ｒ．Ｍ．， Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ．， ４７：８０７−８１３ （１９８０）．
Ｂｒｕｎｓ， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４，７０５，６５８．
Ｂｕｒｎｓｔｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ．
Ｃｒｏｎｓｔｅｉｎ， Ｂ．Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３５：１３６６−１３７１ （１９８５）．
Ｃｒｏｎｓｔｅｉｎ， Ｂ．Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４８：２２０１−２２０６ （１９８５）．
Ｃｒｏｎｓｔｅｉｎ， Ｂ．Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ７８：７６０−７７０ （１９８６）．
Ｃｒｏｎｓｔｅｉｎ， Ｂ．Ｎ． ｅｔ ａｌ．， 上記
Ｃｒｏｎｓｔｅｉｎ， Ｂ．Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ ＵＳＡ， ８８：２４４１−２４４５ （１９９１）．
Ｃｒｏｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，９３２，５５８．
Ｈｅｒｌｉｈｙ， Ｊ．Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ２３０：１２３９−１２４３ （１９７６）．
Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４，９６８，６９７．
Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５．０６３，２３３．
Ｉａｎｎｏｎｅ， Ｍ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｆｅｄ． Ｐｒｏｃ．， ４４：５８０ （ａｂｔｒ．）（１９８５）．
Ｊａｃｏｂｓｏｎ， Ｋ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ３５：４０７−４２２ （１９９２）．
Ｊａｒｖｉｓ， Ｍ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｉｒ， ２５１：８８８−８９３（１９８９）．
Ｋｈａｋｈ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １９（２）：３９−４１ （１９９８）．
Ｋｌａｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， 「飲酒、喫煙、コーヒー、および肝硬変」Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ １３６（１０）：１２４８−１２５７ （１９９２）．
Ｋｌａｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， 「コーヒー、茶および不死」Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ， ３（４）：３７５−３８１ （１９９３）．
Ｌｅｐｏｒｅ， Ａ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．， 「アルコール消費に関連した肝硬変のリスクでのコーヒー飲料および喫煙の影響」、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ， １０（６）：６５７−６６４ （１９９４）．
Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ ５，８５９，０１９．
Ｌｏｎｄｏｓ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７：２５５２−２５５４ （１９８０）．
Ｎｏｒｉｓ， Ｊ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２４８：４２２−４２４ （１９７４）．
Ｐｏｕｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ６（６）：６１９−４１ （１９９８）．
Ｒａｌｅｖｉｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ５０３（３）：４１３−９２ （１９９８）．
Ｒａｍｋｕｍａｒ， Ｖ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ５４：２１１−２２５ （１９９２）．
Ｒａｍｋｕｒ， Ｖ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３７：１４９−１５６ （１９９０）．
Ｒａｍｋｕｒ， Ｖ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｕｐｒａ．
Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｐ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｈ．， ２２７６６９−６７４ （１９８５）．
Ｒｏｓｅ， Ｆ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６７：１１８６−１１９４ （１９８９）．
Ｓａｌｍｏｎ， Ｊ．Ｅ．， Ｉｍｍｕｎｏ， １４５：２２３５−２２４０ （１９９０）．
Ｓｃｈｒｉｅｒ， Ｄ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３７：３２８４−３２８９ （１９８９）．
Ｓｔｉｌｅｓ Ｇ．Ｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ， ２６７：６４５１−６４５４ （１９９２９．
Ｓｔｉｌｅｓ Ｇ．Ｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ． ７：４８６−４９０ （１９８６）．
Ｓｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． １０７−１１８ （１９７８）．
Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．， 「男性飲酒者のコーヒー消費と減少した血清ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼおよびアミノトランスフェラーゼ活性」Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ， ２７（３）：４３８−４４３ （１９９８）．
Ｖａｎ Ｃａｌｋｅｒ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ， ３３：９９９−１００５ （１９７９）．
Ｓｍａｌｌ， Ｅ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， 「インヴィトロでカンヂダアルビカンは免疫制御アデノシンおよび好中球殺傷をブロックする第二の高分子量薬剤を放出する」Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８（１１）：３５８８−３５９５ （１９９２）．
Ｐｕｉｇ， Ｊ．Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， 「アデニンヌクレオチド反転のエタノール誘発活性化。アセテートの役割の証拠」Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７４（３）：９３６−９４１ （１９８４）．
Ｄｕｂｅｙ， Ｒ．Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， 「アデノシンは心臓繊維芽細胞でのコラーゲンと蛋白質合成を阻害する、Ａ２Ｂ受容体の役割」Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ３１（４）：９４３−９４８ （１９９８）．
Ｂｏｙｌｅ， Ｄ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， 「アデノシン受容体刺激による滑液細胞コラーゲナーゼ遺伝子発現の阻害」Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ３９（６）：９２３−９３０ （１９９６）．
Ｃｈｅｎ Ｊ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ．，「アデノシン受容体欠失はマウスの一時の焦点虚血によって生じる脳損傷を少なくする。」Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ， １９（２１）：９１９２−９２００ （１９９９）．
Ｓａｌｖａｔｏｒｅ， Ｃ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， マウスのＡ（３）アデノシン受容体遺伝子の破壊と刺激した炎症細胞への影響」Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５（６）：４４２９−４４３４ （２０００）．
Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎ， Ｓ．，「アデノシンおよび２’−デオキシアデノシン類似体へのアデノシンデアミナーゼの特異性」Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ １１３（２）：３８３−３８８ （１９９６）．
Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ， Ｒ．， 「アデノシンデアミナーゼ欠失：分子基準および最近の発展。」Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ． ７６（３ Ｐｔ ２）：Ｓ２１９−２２７ （１９９５）．
Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ， Ｍ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， 「マウスでのアデノシンデアミナーゼ欠失の代謝結果は肺胞発生、肺炎症および気道閉鎖と結合する。」Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９２（２）：１５９−１７０ （２０００）．
Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ， Ｍ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．，「マウスでのアデノシンデアミナーゼ欠失の代謝および表現型の結果を制御するための酵素治療の応用：肺および免疫学異常への欠失の影響。」Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ （２０００）．
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨｅｐＧ２細胞からの増加したアデノシン放出を引き起こすメトトレキサートおよびエタノールの濃度を示す図。
【図２】エタノールによるＨｅｐＧ２細胞におけるアデノシン生成を示す図。
【図３】アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬、ＣＧＳ−２１６８０、がｒＨＳＣによりコラーゲン生成を増加することを示す図。
【図４】アデノシンＡ２Ａ受容体作用薬、ＣＧＳ−２１６８０、がヒト星細胞（ＬＸ−１細胞系）によりコラーゲン生成を変えることを示す図。
【図５】ＫＴ−５７２０、蛋白質キナーゼＡインヒビター、がｒＨＳＣによってコラーゲン生成でのＣＧＳ−２１６８０−介在の増加を排除することを示す図。
【図６】四塩化炭素−誘発の肝繊維症に対し保護されたアデノシンＡ２Ａ受容体−欠失マウスの顕微鏡写真。
【図７】アデノシンデアミナーゼを一部欠失したマウスが肝繊維症を発現することを顕微鏡写真で示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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