(57)【要約】本発明は、Ｋ１６ペプチドを用いることによってトランスフェクション効率を向上させる方法に関する。さらに、本発明は新規Ｋ１６ペプチド、特に下記ペプチド配列を有するＫ１６−ＣＹＣ、およびＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＧＧＧＣＮＥＷＴＬＥＬＬＥＥＬＫＮＥＡＶＲＨＦのペプチド配列を有するＫ１６ｍＶｐｒＮに関する。2004501657.tif 000007
2004501657.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の、
プラスミドＤＮＡ、
合成ペプチド、
脂質、
を含む複合体を用いる、トランスフェクション方法。
【請求項２】
合成ペプチドが、
2004501657.tif 000005
からなる群より選択される、請求項１記載のトランスフェクション方法。
【請求項３】
合成ペプチドが、環状Ｋ１６−ペプチド、好ましくは以下の配列：
2004501657.tif 000006
を有するＫ１６−ＣＹＣである、請求項１記載のトランスフェクション方法。
【請求項４】
リポフェクチンを脂質として用いる、請求項１〜３のいずれか１項記載のトランスフェクション方法。
【請求項５】
ＤＮＡに対するペプチドのチャージ比率が０．７〜１．０である、請求項１〜４のいずれか１項記載のトランスフェクション方法。
【請求項６】
脂質に対するプラスミドＤＮＡの重量比が１〜２倍である、請求項１〜５のいずれか１項記載のトランスフェクション方法。
【請求項７】
環状ペプチドである、上記のＫ１６−ＣＹＣペプチド。
【請求項８】
以下の配列、
ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＧＧＧＣＮＥＷＴＬＥＬＬＥＥＬＫＮＥＡＶＲＨＦ
を有する、Ｋ１６−ＶｐｒＮペプチド。
【請求項９】
以下の配列、
ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＧＧＧＮＥＡＴＬＥＬＬＰＥＬＫＮＰＡＶＲＨＦ
を有する、Ｋ１６−ｍＶｐｒＮペプチド。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか１項記載のペプチドとプラスミドＤＮＡとの、トランスフェクションへの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、Ｋ１６ペプチドの使用によるトランスフェクション効率の改良方法に関する。さらに、本発明は、新規Ｋ１６ペプチドを包含する。本出願は分子生物学および医科学分野に関するものである。
【０００２】
非ウイルス性遺伝子送達システムのトランスフェクション機構は、種々の生物学的バリアを通過することを含む複雑な過程である。非ウイルス性ベクターのトランスフェクション効率を制限する１つの主要な要因は、核エンベロープである。核へのベクターの移行は結果的にトランスジーンの効率的発現を可能にする。
【０００３】
プラスミドＤＮＡに核エンベロープを通過させるための手法は、細胞の核原形質輸送機序を利用することである。１つの方法としては、ＮＬＳ配列を有しかつ陽イオン性ＤＮＡ結合ドメインを含むペプチドをＤＮＡに非共有結合させることである。その結果、結合したＮＬＳ配列を核内へのＤＮＡの核輸送を容易にする核輸送機序によって認識されると考えられる。
【０００４】
非ウイルス性遺伝子送達システムでは、最もよく使用されるＮＬＳ配列の１つにシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）大型Ｔ抗原（ＳＶ４０−ＮＬＳ）の１２６〜１３２のアミノ酸配列がある。しかし、この方法によるＮＬＳ配列特異的なトランスフェクション効率の向上は、確実に証明されているわけではない。
【０００５】
本発明の目的は、プラスミドＤＮＡの核への取り込みを向上させることであった。本発明において、合成ペプチドは、オリゴリジンＤＮＡ結合ドメインとＳＶ４０−ＮＬＳとを含むように構築された。さらに、プラスミドＤＮＡ、合成ペプチドおよび脂質からなる複合体が構築され、最適化された。
【０００６】
合成ペプチドは、以下の配列を有するものを用いた：
2004501657.tif 000003
上記全てのペプチドは、プラスミドＤＮＡへのペプチドの結合用に１６残基のリジンを有している。
【０００７】
Ｋ１６−ＮＬＳペプチドは、ＳＶ４０−ＮＬＳ配列（ＰＫＫＫＲＫＶ）も含有する。Ｋ１６−ＳＬＮペプチドは、Ｋ１６−ＮＬＳと同じアミノ酸組成を有するコントロールぺプチドである。これは、同じＤＮＡ結合ドメインを有するがＳＶ４０ＮＬＳ配列を逆向きで含んでいる。Ｋ１６−Ｖｐｒペプチドは、上記オリゴリジンＤＮＡ結合ドメインを有し、かつＨＩＶ Ｉ−Ｖｐｒタンパク質のＣ末端ドメインに由来するＮＬＳ配列も有する。Ｋ１６−ＶｐｒＮペプチドは、Ｋ１６−Ｖｐｒに類似しているが、ＨＩＶ Ｉ−ＶｐｒのＮ末端ドメインに由来するＮＬＳ配列を有しいる。Ｋ１６−ｍＶｐｒＮは、上記ＤＮＡ結合ドメインと、３つの重要なアミノ酸残基を置換して構築したＰｐｒＮ−ＮＬＳ−コントロール配列とを含むコントロールペプチドである。すでに述べたように、これらの改変は、カーゴの核移入を容易にする能力を欠損したペプチドをもたらす。
【０００８】
さらに、１６残基のリジン（Ｋ１６）からなる合成ペプチドを、別のコントロールペプチドとして用いた。
【０００９】
脂質混合リポフェクチンは、脂質として利用するのが好ましかった。
【００１０】
プラスミドＤＮＡ、ペプチドおよび脂質を含む複合体を形成させ、ヒト結腸癌細胞（ＨＣＴ １１６）でのｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション実験に用いた。ルシフェラーゼリポーター遺伝子を、トランスフェクション効率を測定するために用いた。
【００１１】
上記Ｋ１６ペプチドの構築に加えて、本発明は、ＤＮＡ−ペプチド−脂質複合体の構築を含む。したがって、重要なのは、ＤＮＡに対するペプチドのチャージ比率および脂質の適量を選択することによる複合体の構成成分率である。複合体形成の方法（濃度、容量、バッファーの種類、インキュベーション時間およびさらに混合物に添加される成分の順序等、図１〜３および図４〜６を参照のこと）は、該システムのトランスフェクション効率を決定する重要な因子でもある。
【００１２】
各因子の最適化の後、適切な複合体成分率ならびに適切な複合体の形成方法が得られ、ＨＣＴ１１６細胞へのトランスフェクションにより、レポーター遺伝子発現のＮＬＳ−配列特異的な増加が得られる。
【００１３】
本発明は、チャージするＤＮＡに対するペプチドの比率を選択することにより、比較的少量の脂質を添加したペプチド／ＤＮＡ複合体に比べて不安定なペプチド／ＤＮＡ複合体を作製することを含む。
【００１４】
その結果としての配列特異的な遺伝子発現の増大は、ＤＮＡの核輸送の増加と相関関係にある。
【００１５】
本発明の他の部分は、ＮＬＳ−配列の安定化のための環状ペプチドの構築および非ウイルス性遺伝子送達システムの最適化への該環状ペプチドの利用である。
【００１６】
ＳＶ４０−ＮＬＳ配列は、塩基性残基を比較的多く含むため、生理学的条件下でかなり強い正電荷を帯びる。トランスフェクション実験並びに生化学的研究の項に示すように、ＳＶ ４０−ＮＬＳは、非ウイルス性遺伝子送達システムに用いられるプラスミドＤＮＡと強い相互作用を有するであろう。ＳＶ ４０−ＮＬＳのＤＮＡへの結合は、核移行機序との相互作用においてＮＬＳの立体構造的な妨害となり得る。さらに、ＮＬＳの二次構造もまた変化し、対応する因子によって核移行基質として認識される可能性もある。
【００１７】
本発明は、ＳＶ ４０−ＮＬＳの二次構造をペプチドの環状化により安定化させることを含む。ＳＶ ４０−ＮＬＳは、その受容体であるインポーチン（ｉｍｐｏｒｔｉｎ）αに相互作用する際βシート構造を有する。ＮＬＳ−環状化の基本は、２つのアンチパラレルなβシート配列を含む環状ペプチドの利用であった。
【００１８】
本発明は、上述の環状ペプチド内でＳＶ ４０−ＮＬＳの再構築することを含む。その結果として、環状ペプチドは、２つのアンチパラレルなβシート配列を含んで構築されるが、その一方にはＳＶ ４０−ＮＬＳが含まれている。ＤＮＡにペプチドが結合するために、１６残基のリジンは、ＳＶ ４０−ＮＬＳの反対側に位置するβシートに共有結合させた。結果として得られる構築物（Ｋ１６−ＣＹＣ）は、環状ＮＬＳ配列およびオリゴリジンＤＮＡ結合ドメインを含む合成ペプチドである。
【００１９】
Ｋ１６−ＣＹＣは以下の配列を有する：
2004501657.tif 000004
さらに、本発明は、以下の２つのＫ１６ペプチドを含む。１つは以下の３９アミノ酸配列を含むペプチドであり：
ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＧＧＧＣＮＥＷＴＬＥＬＬＥＥＬＫＮＥＡＶＲＨＦ
もう一つは、以下の３８アミノ酸配列を含むペプチドである：
ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＧＧＧＮＥＡＴＬＥＬＬＰＥＬＫＮＰＡＶＲＨＦ。
【００２０】
プラスミドＤＮＡと組み合わせること、ならびにプラスミドＤＮＡと脂質と組み合わせることにより、これらのペプチドはトランスフェクション実験に適している。
【００２１】
以下、本発明を種々の実施例により例証する。
【００２２】
非ウイルス性遺伝子送達システムにおけるＫ１６−ＣＹＣペプチドの利用
ＤＮＡ−ペプチド−脂質複合体の最適化の上述の方法に基づいて、プラスミドＤＮＡ、Ｋ１６−ＣＹＣペプチドおよびリポフェクチンを含む異種複合体を作製し、ＨＣＴ１１６細胞のトランスフェクション実験に用いた。
【００２３】
Ｋ１６−ＣＹＣペプチドを用いたトランスフェクション後のレポーター遺伝子の発現が、ＳＶ ４０−ＮＬＳ配列の直鎖型を含有するＫ１６−ＮＬＳペプチドに比べて顕著に増加したことが認められた（図７および図８参照）。
【００２４】
非ウイルス性遺伝子送達システムにおけるＫ１６−ＶｐｒＮペプチドの利用
プラスミドＤＮＡ、Ｋ１６−ＶｐｒＮペプチドおよびリポフェクチンを含む複合体を作製し、ＨＣＴ１１６細胞のトランスフェクション実験に用いた。他の適用においては、プラスミドＤＮＡおよびＫ１６−ＶｐｒＮペプチドを含む複合体も作製し、ＨＣＴ１１６細胞のトランスフェクション実験に用いた。両適用において、Ｋ１６−ｍＶｐｒＮペプチドを、Ｋ１６−ＶｐｒＮペプチドの代わりにコントロールペプチドとして用いた。結果は、コントロールペプチドを用いた実験に比べてレポーター遺伝子の発現が有意に増大していた（図９および図１０）。
【００２５】
ＮＬＳ配列特異的なトランスフェクション効率の向上は、ペプチド／ＤＮＡ複合体に脂質を添加しなかった場合により大幅に向上するということが観察された（図１０）。Ｋ１６−ＶｐｒＮペプチドは、Ｋ１６−ｍＶｐｒＮペプチドに比べて最大１０倍のレポーター遺伝子発現レベルを示した。さらに、Ｋ１６−ＶｐｒＮの場合は、Ｋ１６−ｍＶｐｒＮに比べて１２分の１の量を用いると最大の遺伝子発現が得られた。
【００２６】
観察されたトランスフェクション効率の向上が、Ｋ１６−ＶｐｒＮペプチドを用いた場合に、より優れた複合体形成が得られることに大きく関与しているという可能性を排除するために、相対的な粒子の大きさの測定（図１１）および動的光散乱を用いて相対的な粒子数の測定（図１２）を実施した。図１１に示す通り、Ｋ１６−ＶｐｒＮを使用すると、Ｋ１６−ｍＶｐｒＮに比べてＤＮＡ複合体の粒子サイズに有意な差は認められなかった。さらに、図１２に示すように、ＤＮＡに対するペプチドの比率が高くなるに従って光散乱強度は増大する。しかし、図１０と図１２とを比較すると、レポーター遺伝子発現と光散乱強度は相関していないことがわかる。無論、ＤＮＡに対するペプチドのチャージ比率が３倍の時、Ｋ１６−ＶｐｒＮペプチドは、Ｋ１６−ｍＶｐｒＮに比べて、光散乱強度の３倍の増加とレポーター遺伝子発現の少なくとも１００倍の増加をもたらす。ＤＮＡに対するペプチドのチャージ比率が９倍の時、チャージ比率が３倍の時に比べて、光散乱強度は２倍増加する。しかし、かかる条件下では、レポーター遺伝子発現は、１０倍増加するだけである。
【００２７】
測定される光散乱強度と相対的なＤＮＡ複合体の量との間の相関関係を示すために（図１３および図１４）、プラスミドＤＮＡをＫ１６−ＶｐｒＮまたはＫ１６−ｍＶｐｒＮと一緒に用いてペプチド／ＤＮＡ複合体を形成させた。続いて、複合体を１６倍まで希釈して、動的光散乱測定に供した。光散乱強度が希釈率の増大につれて減少したが、複合体の相対的なサイズは、ほぼ一定に保たれていた。この観察は、光散乱強度がＤＮＡ複合体の相対的な量の測定可能な指標となることを示している。
【００２８】
これらの結果は、観察されるＫ１６−ＶｐｒＮペプチドによって生じる、レポーター遺伝子発現の配列特異的な増加は、粒子のサイズまたは粒子の量の増加に起因するものではないことを示唆する。したがって、特異的な因子によるＶｐｒＮ配列の認識に基づいてトランスフェクション過程において細胞性の機序が起こることが予測される。Ｋ１６−ＶｐｒＮ／プラスミドＤＮＡ複合体が核への移行の基質として核移行の機構によって認識されていると考えられ得る。さらに、このことは、観察されたトランスフェクション効率をもたらす核内でのＤＮＡの蓄積の増大をもたらす。
【００２９】
新規性に関して、以上の結果は以下のことを導く：
１．ＮＬＳ配列に関与するトランスフェクション効率の配列特異的な増大をもたらす組成を有するＤＮＡ−ペプチド−脂質−複合体が作製された；
２．ＮＬＳ配列の環状化により、ＤＮＡ複合体のトランスフェクション効率がさらに増大する；
３．ＶｐｒＮ配列の使用により、ＮＬＳ配列特異的な様式で、トランスフェクションシステムの効率は劇的に増大する。
【図１】
2004501657.tif 000008
【図２】
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【図３】
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2004501657.tif 000011
【図４】
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【図５】
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【図６】
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2004501657.tif 000015
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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