(57)【要約】増殖因子阻害物質及び細胞内情報伝達モジュレーター（「増殖因子制癌剤」）による癌治療の効果をモニターする方法で、この増殖因子制癌剤は、正常な増殖因子受容体若しくは突然変異型の増殖因子受容体の過剰発現、増殖因子の過剰産出、活性化した増殖因子受容体の下流での情報伝達カスケードの欠陥に干渉することによって作用する。該方法は、癌と診断され増殖因子制癌剤で治療を行った個体から得たサンプル中のテロメラーゼ活性のレベルを求め、テロメラーゼ活性の減少と制癌剤による好ましい治療上の介入を関連づけることに基づく方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）癌と診断され増殖因子制癌剤で治療を行った個体から癌細胞を回収し癌細胞を含むサンプルを調製すること、
ｂ）該サンプルにおけるテロメラーゼ活性のレベルを求めること、
ｃ）該サンプルのテロメラーゼ活性のレベルを、治療前の個体中のサンプルにおいて求めたレベル又はテロメラーゼ活性の標準レベルと比較すること、及び
ｄ）テロメラーゼ活性レベルと増殖因子制癌剤の治療効果を互いに関連づけることを含む治療における増殖因子制癌剤の効力をモニターし評価する方法。
【請求項２】
ステップｂ）において、テロメラーゼレベルが、サンプルから得られる核酸基質のテロメラーゼによる伸長とプライマー伸長反応における伸びた核酸基質の複製により求められる請求項１記載の方法。
【請求項３】
プライマー伸長反応が、ポリメラーゼ連鎖反応である請求項２記載の方法。
【請求項４】
増殖因子制癌剤が、表皮成長因子受容体群から選ばれた受容体の阻害物質であるか、又は、表皮成長因子受容体群から選ばれた受容体の活性化によって誘発される情報伝達経路の阻害物質である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
増殖因子制癌剤が、表皮成長因子の阻害物質である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
増殖因子制癌剤が、インスリン様増殖因子受容体群から選ばれた受容体の阻害物質であるか、又は、インスリン様増殖因子受容体群から選ばれた受容体の活性化によって誘発される情報伝達経路の阻害物質である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
増殖因子制癌剤が、インスリン様増殖因子の阻害物質である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
増殖因子制癌剤が、血小板由来増殖因子受容体群から選ばれた受容体の阻害物質であるか、又は、血小板由来増殖因子受容体群から選ばれた受容体の活性化によって誘発される情報伝達経路の阻害物質である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
増殖因子制癌剤が、血小板由来増殖因子の阻害物質である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
増殖因子制癌剤が、神経栄養因子群から選ばれた受容体の阻害物質であるか、又は、神経栄養因子群から選ばれた受容体の活性化によって誘発される情報伝達経路の阻害物質である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
増殖因子制癌剤が、ＭＡＰキナーゼ経路の成分の阻害物質である請求項４、６、８又は１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
増殖因子制癌剤が、ＭＥＫインヒビターである請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
増殖因子制癌剤が、ｓｒｃインヒビターである請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
治療における増殖因子制癌剤の効力をモニターし評価するための、テロメラーゼ活性検出方法の使用。
【請求項１５】
テロメラーゼ活性検出方法が、テロメラーゼ伸長方法である請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
テロメラーゼ活性検出方法をキットの形で行う請求項１４又は１５のいずれか１項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の属する技術分野）
本発明は一般に癌治療の分野に関するものである。より詳細には、本発明は特定の癌治療における効果をモニターする方法に関するものである。
（発明の背景）
正常な哺乳動物の細胞における増殖や分化は、増殖因子や増殖因子阻害物質、及びそれらに対応した受容体をコードする遺伝子を含む多数の遺伝子の協調的発現によって調節された複雑なプロセスである。
これらの遺伝子の協調的発現の調節の欠如、例えば遺伝子増幅、転座、欠失又は一個以上の遺伝子の発現抑制、及び／又は遺伝子転写の増加による上記の調節の欠如が、特定のタイプの癌を発現させるうえで重要な役割を果たしているという証拠が癌生物学の研究から増え続けている。例えば、特定の形質転換細胞系又は悪性細胞系は、培養において最適成長するための血清（即ち、外因性増殖因子）を正常な細胞系に比べて必要としないという所見から、ヒトの腫瘍細胞はそれ自体の増殖因子を産出することによって細胞の運命を決定する能力があるという結論が導かれる。
多くの癌においては、原型癌遺伝子が増幅され癌遺伝子に変わり、結果として増殖因子又はその受容体の過剰発現及び／又は突然変異につながることも観察されてきた。さらには、活性化した増殖因子受容体下流の細胞内情報伝達経路、例えばＲａｓ経路又はＭＡＰキナーゼ経路の変化が腫瘍の発現に関与していた。
【０００２】
これらのすべての所見から新しいタイプの制癌剤が生み出されてきた。例えば増殖因子阻害物質や細胞内情報伝達モジュレーターである。これらは、上述の遺伝子の調整欠如の結果、即ち、正常な増殖因子受容体若しくは突然変異型の増殖因子受容体の過剰発現、増殖因子の過剰産出、活性化した増殖因子受容体の下流での情報伝達カスケードの欠陥といった結果に干渉することによって作用する。増殖因子とは多官能ポリペプチド群の成員で、胚発生、細胞増殖と分化、脈管形成、及び宿主免疫系の活性化を含む様々な生理的プロセスに関与している。
増殖因子の構造と生物学的作用に基づき、異なる増殖因子は別々の群に分類されてきた。これらには、表皮成長因子（ＥＧＦ）群、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）群、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）群、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）群、神経栄養因子（ＮＧＦ）群、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）群、及び造血増殖因子が含まれる。
【０００３】
増殖因子がそれぞれの受容体に結合すると、受容体はその細胞外ドメインから信号を伝送し、信号は原形質膜を通り細胞質ドメインに達するが、これにはチロシンキナーゼ活性が関与している。このチロシンキナーゼの活性化によって、多数の酵素による反応（Ｒａｓ経路又はＭＡＰキナーゼ経路を経由）と生物学的作用を誘発し、最終的にはＤＮＡ合成や細胞増殖に至る。
これらの特性ゆえに、チロシンキナーゼ活性を有する過剰発現した増殖因子受容体は、腫瘍治療における有望な標的として認識されてきた（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ．８２， ２４１， １９９９； Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ．８２， ２３１， １９９９； Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．９， ５６２， １９９７）。
結局、増殖因子受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物、増殖因子受容体の細胞外ドメインに対する抗体、又は増殖因子自体（若しくはその活性断片）が、異常増殖の治療に提案されてきた（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． ８２， ２４１， １９９９）。さらに、チロシンキナーゼ活性を有する受容体の下流で調節の欠如した細胞内情報伝達経路のコンポーネントに干渉する化合物、例えば、Ｒａｓ経路コンポーネントの阻害物質（即ち、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター）、又はＭＡＰキナーゼ経路コンポーネントの阻害物質（即ち、ＭＥＫインヒビター若しくはサーク（ｓｒｃ）キナーゼインヒビター）が悪性腫瘍の治療に好適である。以下、「増殖因子制癌剤」という用語は、上記に定義したメカニズムによって作用する化合物の同義語として使用する。
【０００４】
多くの制癌治療における主要な問題は、治療効果が一般的に予測できないということである。従来の化学療法又は放射線療法の治療効果は、通常、腫瘍の大きさ、つまり客観的応答によって評価する。治療の有効性についてのハードデータは、治療を受けた患者の生存を分析することによって得られる。しかしながら、生存の研究は、多数の患者グループと長い観察時間を意味する。そのため、癌治療の効力のマーカーを見つけようと多くの試みがなされてきた（Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９２， ２０５， ２０００）。
非常に多数のヒトの腫瘍や不死化した細胞に見られる典型的な特徴は、活性テロメラーゼが存在するということである（ＰＮＡＳ９９２， ９０８２， １９９５； Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８７， ８９５， １９９５； Ａｎｎ． Ｍｅｄ．３０， ４１９， １９９８）。テロメラーゼはリボ核たんぱく質酵素で、それ自体のＲＮＡを鋳型として利用し細胞分裂後のテロメアのＤＮＡの損失を補う複製染色体末端にヘクサヌクレオチドを付加する（Ｎａｔ． Ｍｅｄ．１， ２４９， １９９５； Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５， ２７３４， １９９５； Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１， １１３， １９９２）。テロメラーゼはテロメア長を保持し染色体構造を維持させるが、この二つが、細胞の不死化とその後に続く悪性形質転換には必要なのである。このようにテロメラーゼ活性は非常に多数のヒト腫瘍において検出されてきた。テロメラーゼ活性は、わずかではあるが造血系の特定の幹細胞や活性化した細胞で検出されうるが、テロメラーゼは、正常な生後のヒト体細胞によって発現されることはない。これらの知見をもとに、テロメラーゼ活性の検出は、ある種の癌細胞を含む不死細胞が正常な組織中に存在することを示す診断用のマーカーとして提案されてきた（Ｓｃｉｅｎｃｅ２６６， ２０１１， １９９４）。
【０００５】
治療上介入するものがいくつかあり、それらがテロメラーゼ活性に影響を及ぼすことが明らかにされてきた。まず第一に、例えばドキソルビシンやシスプラチンのような化学療法薬による薬剤起因性の腫瘍細胞の根絶は、検出可能なテロメラーゼ活性の減少に関与することがわかった。テロメラーゼレベルの低下が細胞増殖の減衰と一致していたのである。化学療法薬で治療した後に観察されたテロメラーゼ活性は、残存する生存能力のある細胞の活性をおおかた反映しているようである。化学療法薬に耐性のある腫瘍細胞を化学療法薬で治療した際、テロメラーゼ活性の低下や細胞増殖の衰えは見られなかった。同様に、線量２０Ｇｙの放射線治療を行った腫瘍組織におけるテロメラーゼの高い活性は、口腔や口腔咽頭の進行癌にとっては、放射線治療の効果が低く患者にとって芳しくない結果を予知していた（Ｉｎｔ． Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｍｅｄ．２， ３０１， １９９８）。このように、これらの知見によって、化学療法又は放射線治療の最中および治療後に、それらの治療が成功か失敗かを見極めるマーカーとしてテロメラーゼ活性レベルを規定することへの理論的根拠が与えられてきた（Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ．３， ５７９， １９９７； Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｎｃｏｌ．１３， ４８９， １９９８； Ｊｐｎ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８９， １０７４， １９９８； Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ７９， ８， １９９８）。
さらに、不死性細胞が老化へ導入されるか分化されることによって、テロメラーゼ活性が抑えられることも明らかになった（ＰＮＡＳ９２， １２３４３， １９９５； Ｌｅｕｋｅｍｉａ１０， １３５４， １９９６）。例えば、ヒトの急性前骨髄球性白血病（ＮＢ−４）やヒトの胎児性癌（ＮＴＥＲＡ−２）細胞を分化誘導性のオールトランス型レチノイン酸又はヘキサメチレンビスアセトアミドに曝すと、これらの細胞の分化しやすいクローンではテロメラーゼ活性が衰えるが、分化に耐性のあるクローンではテロメラーゼの活性の衰えは起こらなかった（Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ．５６， １５０３， １９９６）。これらの知見は、白血性細胞におけるテロメラーゼ活性を測定することが、以後の癌の進行と癌の早期再発を予知するうえで有用性があることを示唆するものである（Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ．２， ７９９， １９９６）。
【０００６】
また、特定の腫瘍細胞系においては、ホルモン剤もテロメラーゼ活性に直接又は間接的に影響を及ぼすことが示唆されてきた。成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨ−ＲＨ）拮抗薬ＭＺ−５−１５６が、生体外で培養されたＵ−８７ＭＧ膠芽腫のテロメラーゼ活性を抑制した記載がある（ＰＮＡＳ９６， ２２６，１９９９）。しかしながら、これらの物質が影響を及ぼす経路はこれから同定しなければならない。抗エストロゲンのタモキシフェンもまた腫瘍細胞におけるテロメラーゼ活性に影響を及ぼすことが明らかになった。しかし、タモキシフェンの濃度が１０−８Ｍの時のみ、乳癌細胞系ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ２３１におけるテロメラーゼへの抑圧的効果が及んだが、タモキシフェンの濃度がより高い場合（１０−７と１０−６Ｍ）又は低い場合（１０−９Ｍ）は、テロメラーゼ活性に何の影響も及ぼさなかった（Ｃａｎｃｅｒ８５， １５２３， １９９９）。濃度が１０−８Ｍのタモキシフェンがテロメラーゼ活性に影響を及ぼすメカニズムもこれから明らかにしなければならない。結局、ホルモン剤が特定の腫瘍細胞においてテロメラーゼ活性に影響を及ぼすことは明らかになったが、そのメカニズムは未知である。
従来からの化学療法や放射線治療に対して、増殖因子制癌剤での癌治療では、治療の最中又は治療後の客観的応答（腫瘍の大きさの退行又は癌細胞の根絶によって定義する）は短期間では患者のなかに見出すことができない。なぜなら、このような増殖因子制癌剤には細胞を即座に殺す作用がないからである。これらの制癌剤に関しては、客観的応答が長期間の治療の後に観察できさえすればよいと思われているのである。化合物の増殖抑制特性による治療効果は、腫瘍の成長を遅らせることであり、その結果、癌の進行に時間をかけさせるか或いは病状が安定した状態にさせるが、このような場合、客観的なパラメーターに依存することはますます難しい（Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９１， １２８１， １９９９）。さらに、テロメラーゼ活性は、化学療法及び／又は放射線治療をモニターするためのマーカーとして提案されているが、この場合、テロメラーゼのレベルは残存する腫瘍細胞の数に比例するようである。一方、増殖因子制癌剤の治療効果をモニターするのには何もマーカーとなるものがなかった。
【０００７】
（発明が解決しようとする課題）
本発明の目的は、増殖因子制癌剤の投与によって達成された治療の介入効果をモニターする方法を提供することである。
（課題を解決するための手段）
本発明の根底にある問題に対する解決策は、以下の予期せぬ発見に基づくものである。即ち、ＥＧＦのような増殖因子に誘発された信号を増殖因子制癌剤が抑制すると、腫瘍細胞の増殖を抑えるだけでなく、テロメラーゼ活性にも影響を与えるという発見に基づくものである。観察結果は非常に驚くべきもので、なぜなら、化学療法や放射線治療とは対照的に、増殖因子制癌剤は、単に腫瘍細胞を殺すのではなく、テロメラー（ｔｅｌｏｍｅｒｅ）長と染色体の安定性を担っているメカニズムに明確にはリンクしない様々なシグナル経路を実行する（ｅｆｆｅｃｔ）ことによって作用する。
本発明では、この制癌剤によって呼び覚まされた癌組織／癌細胞におけるテロメラーゼ活性の変化を求めることで、増殖因子制癌剤が有する腫瘍細胞の増殖調節効果をモニターすることができることを発見した。こうして、このような制癌剤の抗癌性効果に関する所謂「代理マーカー」としてテロメラーゼ活性を利用することができる。
【０００８】
本発明は、治療における増殖因子制癌剤の効力をモニターし評価する方法に関するものであり、この方法は、
ａ）癌と診断され増殖因子制癌剤で治療を行った個体から癌細胞を回収し、癌細胞を含むサンプルを調製すること、
ｂ）該サンプルにおけるテロメラーゼ活性のレベルを求めること、
ｃ）該サンプルのテロメラーゼ活性のレベルを、治療前の個体中のサンプルで求めたレベル又はテロメラーゼ活性の標準レベルと比較すること、及び
ｄ）テロメラーゼ活性のレベルと増殖因子制癌剤の治療効果を互いに関連づけることを含む。
【０００９】
（発明の実施の形態）
本発明の方法は、以下の増殖因子制癌剤の効力をモニターする際に適用できる。即ち、チロシンキナーゼ活性及び／又はチロシンキナーゼ活性の下流の調整が欠如した細胞内情報伝達経路のコンポーネントに干渉するすべての増殖因子制癌剤である。チロシンキナーゼの例としては、表皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）群、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦ−Ｒ）群、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦ−Ｒ）群、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ−Ｒ）群、神経栄養因子受容体（ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３，４，５，６）群、トランスフォーミング成長因子β受容体（ＴＧＦβ）群、及び造血増殖因子受容体に属するものが挙げられる。これらの受容体群の成員としては、例えば、ＥｒｂＢ−１（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ−２（ｎｅｕ／ＨＥＲ２）、Ｅｒｂ−３（ＨＥＲ３）、Ｅｒｂ−４（ＨＥＲ４）、ＰＤＧＦα及びＰＤＧＦβ、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＴＧＦα及びＴＧＦβ、ＩＧＦＲ１、ＩＧＦＲ２、サイトカン受容体（インターフェロン、ＴＮＦα、インターロイキン）、ｔｒｋＡ，ｔｒｋＢ及びｔｒｋＣ（神経栄養因子の受容体）が挙げられる。さらに、本発明の方法は、上記の増殖因子受容体への本来のリガンドの結合を阻害する物質、即ち、ＥＧＦ、ＩＧＦ又はＰＤＧＦのような増殖因子の阻害物質に適用できる。
増殖因子制癌剤の例としては、例えばＨＥＲ２に対する抗体、トラスツヅマブ（商品名ハーセプテン）のような抗体を結合する増殖因子受容体が挙げられる。
【００１０】
さらに別の例としては、チロシンキナーゼ受容体に関連したチロシンキナーゼ活性の阻害物質として知られている化合物が挙げられる（Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｏｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ １９９８，７（４）， ５５３−５７３）。チロシンキナーゼ阻害物質の例についての記載があるが、なかでもＥＰ ６８２０２７、ＷＯ ９５／１９９７０、ＷＯ ９６／０７６５７、ＷＯ ９６／３３９８０に記載されている物質、例えば、Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−［３−（４−モルホリニル）プロポキシ］−４−キナゾリンアミン（ＺＤ−１８３９）；ＷＯ ９６／３０３４７記載の例えばＮ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナゾリンアミン（ＣＰ３５８７７４）；ＷＯ ９７／３８９８３記載の例えばＮ−（４−（３−（クロロ−４−フルオロ−フェニルアミノ−７−（３−モルホリン−４−イル−プロポキシ）−キナゾリン−６−イル）−アクリルアミドジヒドロクロライド（ＣＩ１０３３、ＰＤ１８３８０５）；ＷＯ ９７／０２２６６記載の例えば（フェニルアミノピロロピリミジン；ＰＫＩ−１６６）；プロテインキナーゼ阻害物質の例もＣｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １９９８ １（２）：１３１−１４６に挙げられている。
【００１１】
チロシンキナーゼ活性の下流の調整が欠如した細胞内情報伝達経路コンポーネントを阻害する薬物の例としては、Ｒａｓ経路の阻害物質が挙げられ、例えば、ＰＮＡＳ １９９４，９１（１９）， ９１４１−９１４５）に例示されているファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、又はＭＡＰキナーゼ経路の阻害物質（即ち、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９５，２７０（４６）， ２７４８９−２７４９４に記載されているようなＭＥＫインヒビター、又は、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９９，５９， ６１４５−６１５２に記載されているようなはｓｒｃインヒビター）である。
【００１２】
ステップａ）では、外科手術又は生検で得た組織から細胞を回収して癌細胞を含んだサンプルを調製する。或いは、体液（例えば胸水、尿、血液）又は洗浄液（例えば、肺、腹腔内又は膀胱）から細胞を回収してサンプルを調製する。細胞は従来の方法で回収できる。例えば、遠心沈殿法又は蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）や磁性ビーズのような他の細胞分離技術を用いて回収し、特定の抗体を使っても使わなくてもよい。組織のサンプルは通常の方法で調製する。つまり、細かく切断し適切な緩衝液に溶解させ均質化させる方法、液体窒素を添加して溶解緩衝液に再懸濁させてから粉砕する方法、又は溶解緩衝液に溶解させ機械的ホモジェナイザーで均質化させる方法で抽出物を調製することができる。サンプル調製方法として、ＷＯ ９５／１３３８１に記載されているような洗浄剤を使った抽出法も好適な方法である。
【００１３】
ステップｂ）でテロメラーゼ活性を求める際、分析方法には何ら制限はない。この分野で公知のいかなる方法で分析することもできるし、またテロメラーゼ活性の測定に合うように開発した方法で分析することもできる。
一般に使用される方法は、これが本発明では好ましいのであるが、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６６， ２０１１， １９９４及びＷＯ ９５／１３３８１に記載されているようなテロメラーゼ伸長分析であり、これらの文献は引用により本願明細書の記載に含まれるものとする。この方法はＴＲＡＰ法（Ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ Ｒｅｐｅａｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）として一般的に知られている方法で分析キットとして市販されている。この方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のように、テロメラーゼによる核酸基質の伸長とプライマーの伸長反応における伸びた核酸基質の複製を伴う。この方法には、サンプル中のテロメラーゼの量を測る手段が種々提供されている。市販の検出キット（「ＴＲＡＰ−ｅｚｅ（商標）ＥＬＩＳＡ」テロメラーゼ活性検出キット、Ｏｎｃｏｒ社製）では、第一段階で、テロメラーゼが多数のテロメア配列（ＧＧＴＴＡＧ）をビオチン化したテロメラーゼオリゴヌクレチド基質上の３´末端に付加していく。第二段階として、伸長した産物をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅させるが、Ｔａｑポリメラーゼ、テロメラーゼオリゴヌクレオチド基質、リバースプライマー、及びジニトロフェニル（ＤＮＰ）でラベルされたｄＣＴＰを含有する核酸混合物を用いる。こうしてラベル化された産物は、ストレプトアビジンを塗布したマイクロタイタープレート上でビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって固定され、ホースラディッシュペルオキシターゼ結合抗ＤＮＰ抗体によって検出される。ＴＲＡＰ産物は、３，３´，５，５´−テトラメチルベンジジンを基質としたホースラディッシュ活性と、その後の呈色を利用して求められる。
或いは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び適当な試薬（例えば、「ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ」又は臭化エチジウム）で着色することによって、ＴＲＡＰラダーを直接視覚化することも容易に行うことができる。
【００１４】
本発明において有用なテロメラーゼ活性を検出する別の方法が、ＷＯ ９８／３７２４１に記載されている。この方法は、核酸基質、好ましくはヘアピン構造を持つ核酸基質をサンプルと接触させ、核酸の伸長を測定するステップを有し、ＰＣＲのような複製ステップを通常用いない。
細胞サンプル中のテロメラーゼ活性を検出する方法として、本発明において有用な他の方法は、放射能でラベル化したヌクレオチドをテロメラーゼ基質に取り込むことに依拠した方法である（Ｃｅｌｌ５９， ５２１， １９８９）。この従来の検出には、オリゴヌクレオチド基質、ラベル化するための放射性デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、及びゲル電気泳動が使用される。テロメア配列のオリゴヌクレオチドは試験管内では有効な基質であるが、テロメラーゼも非テロメアＤＮＡ配列を有する基質を使って反復配列を合成する。
【００１５】
通常、ステップｃ）によると、治療前と治療中、及び／又は治療後にサンプル中のテロメラーゼ活性を測定することができる。さらに、治療中及び／又は治療後に測定したテロメラーゼ活性をテロメラーゼ活性の標準レベルと比較することができる（歴史的対照）。テロメラーゼ活性の標準レベルは、通常、特定の腫瘍タイプに対応づけて確認されているテロメラーゼ活性レベルの範囲から、また異なる臨床病期に関連又は対応づけて確認されているテロメラーゼ活性レベルの範囲から求める。歴史対照群からの測定が、ある特定の癌とその臨床病期のテロメラーゼ活性の標準レベルを定義する役目を果たした。
ステップｄ）では、制癌性化合物を単独で、又は化学療法若しくは放射線治療と組み合わせて治療した癌患者の細胞サンプルにおけるテロメラーゼ活性レベルを、治療前のテロメラーゼ活性レベルと比較するか、或いは特定の腫瘍タイプに対応づけられ、異なる臨床病期に関連又は対応づけられているテロメラーゼ活性の標準レベルと比較する。テロメラーゼ活性レベルの減少は、増殖因子制癌剤の好ましい治療的介入を示す。患者にとっての最大限の治療効果を目的とした制癌剤での治療スケジュールの最適化を図るために、テロメラーゼ活性レベルが治療を調整するうえでの根拠として働く。
【００１６】
本発明の方法は、癌治療に関して以下の主要な利点を有する。
テロメラーゼ活性の測定は、個々の患者における治療効果をモニターするうえでの基準を提供するものであり、この基準は、短期間の治療の後でも利用できる。さらに、テロメラーゼ活性の測定によって治療効果をモニターすることは、様々な種類の癌、例えば肺癌、乳癌、頭部及び頚部の癌、胃腸系例えば結腸癌、膵臓癌、膀胱癌、前立腺癌、卵巣癌等に適用できる。こうして、テロメラーゼ活性の低下を、生体内での増殖因子制癌剤による治療学上重要な制癌効果の代理マーカーとして使用することができる。
また別の態様では、本発明は、治療における増殖因子制癌剤の効果をモニターし評価することを目的としたテロメラーゼ活性検出方法の使用に関するものである。
推奨実施態様においては、テロメラーゼ活性検出方法がテロメラーゼ伸長方法である。
好ましくは、テロメラーゼ活性検出方法が検出キットの形で利用されるとよいが、例えば、ＴＲＡＰ法の形態で使用されるのがよい。
【００１７】
実施例
ヒトの腫瘍細胞ＫＢ（ＣＣＬ−１７）とＡ４３１（ＣＲＬ−１５５５）をＡＴＣＣから入手し、１０％ウシ胎児血清、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０μｍｏｌ／リットルのβ−メルカプトエタノール、及び通常用いられる量の抗生物質を添加したＤＭＥＭ媒体で培養した。
ヌードマウス（５〜６週齢の雌でオランダのＨａｒｌａｎ社から入手）に皮下腫瘍を着床させるために、細胞をトリプシン化し、洗浄し、リン酸緩衝生理溶液に１０％ウシ胎児血清を加えたものに１０７ｃｅｌｌ／ｍｌの割合で懸濁させた。１０６個の細胞を含む１００μｌの細胞懸濁液をマウスの右側腹部に皮下注射で投与（一匹につき一箇所）した。腫瘍がうまく着床し、その直径が５〜９ｍｍを超えたところで、マウスを治療群と溶媒だけを投与する対照群とに無作為にわけた（細胞注入から７〜１０日後）。試験用化合物を溶解させ（１ｍｇ／ｍｌ及び５ｍｇ／ｍｌ）、胃管栄養法により直接胃の中へ投与した。体重１ｋｇにつき１０ｍｌの投与量で一日一回経口投与した。腫瘍の直径を毎週三回キャリパーで測った。腫瘍の体積（ｍｍ３）は、腫瘍体積＝長さ＊直径２＊π／６の式に従って算出した。
テロメラーゼ活性の測定には、Ｏｎｃｏｒ（登録商標）社製の「ＴＲＡＰ−ｅｚｅ（商標）ＥＬＩＳＡ」テロメラーゼ活性検出キットを使用した。マウスから外科的に取り出した腫瘍物質を清浄にし−７０℃で凍結させた。組織抽出物の作製とテロメラーゼ活性の測定は、キット供給業者により提供された説明書通りに行った。
【００１８】
増殖制癌剤として、「インヒビター１」及び「インヒビター２」と称する化合物を投与したが、これらはピリミド−ピリミジン類の分類に属し、ＥＧＦチロシンキナーゼ受容体に選択的に働く。「インヒビター１」は、４−（（３−クロロ−４−フルオロ−フェニル）アミノ）−６−（１−メチル−４−ピペリジニル−アミノ）−ピリミド（５，４ｄ）ピリミジンで、「インヒビター２」は、４−（（３−クロロ−４−フルオロ−フェニル）アミノ）−６−（４−アミノ−４−メチル−１−ピペリジニル）−ピリミド（５，４ｄ）ピリミジンである。
Ａ４３１又はＫＢ腫瘍細胞を異種移植したヌードマウスに経口投与をおこなった後、インヒビター１と２は生体内での腫瘍の増殖を阻止した（表）。意外なことに、増殖因子制癌剤による治療の後、生体内異種移植においてテロメラーゼ活性の大幅な減少が観察された。とりわけ、非常に強力な（＞６０％）、治療学的に重要性のある増殖抑制が現れた時にテロメラーゼ活性の大幅な減少が観察された。従って、テロメラーゼ活性の減少は、生体内での増殖因子制癌剤の治療学上重要な抗腫瘍効果の代理マーカーとして使用することができるのである。
【００１９】
【表１】生体内のＥＧＦＲ抑制
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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