(57)【要約】新規ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が本明細書中で開示される。これらの核酸配列によってコードされるポリペプチド、このポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体、ならびに前述のポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体の誘導体、改変体、変異体がまた、開示される。本発明は、これらの新規ヒト核酸およびタンパク質のいずれか１つに関連する障害の、治療剤、診断方法ならびに、診断、処置および予防のための研究方法を、さらに開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態の改変体であって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、該成熟形態のアミノ酸配列と、そのアミノ酸残基のうちの１５％以下において異なる、改変体；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７からなる群より選択されるアミノ酸配列；ならびに
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７からなる群より選択されるアミノ酸配列の改変体であって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、該アミノ酸配列と、そのアミノ酸残基のうちの１５％以下において異なる、改変体；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７からなる群より選択されるアミノ酸配列の天然に存在する対立遺伝子改変体のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリペプチドであって、ここで、前記対立遺伝子改変体が、配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６からなる群から選択される核酸配列と単一ヌクレオチドで異なる核酸配列の翻訳であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項４】
前記改変体のアミノ酸配列が、保存的アミノ酸置換含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７からなる群から選択されるアミノ酸配列の成熟形態；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態の改変体であって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、該成熟形態のアミノ酸配列と、そのアミノ酸残基のうちの１５％以下において異なる、改変体；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７からなる群より選択されるアミノ酸配列の改変体であって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、該アミノ酸配列と、そのアミノ酸残基のうちの１５％以下において異なる、改変体；
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドの改変体の、少なくとも一部をコードする核酸フラグメントであって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、該アミノ酸配列と、そのアミノ酸残基のうちの１５％以下において異なる、核酸フラグメント；ならびに
（ｆ）  （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）の相補体を含む、核酸分子、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が天然に存在する対立遺伝子核酸改変体のヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項７】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が、天然に存在するポリペプチド改変体のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項８】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が、配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６からなる群から選択される核酸配列と単一ヌクレオチドで異なる、核酸分子。
【請求項９】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が以下：
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６からなる群より選択されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６からなる群より選択されるヌクレオチド配列と１つ以上のヌクレオチドで異なる、ヌクレオチド配列であって、ただし、そのヌクレオチドの２０％以下が、該ヌクレオチド配列と異なる、ヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）の核酸フラグメント；ならびに
（ｄ）（ｂ）の核酸フラグメント；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項１０】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が、配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６からなる群より選択されるヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、核酸分子。
【請求項１１】
請求項５に記載の核酸分子であって、該核酸分子は、以下：
（ａ）第１ヌクレオチド配列であって、前記アミノ酸配列をコードするコード配列と１以上のヌクレオチド配列で異なるコード配列を含み、ただし、該第１ヌクレオチド配列中のコード配列におけるヌクレオチドの２０％以下が、該コード配列と異なる、第１ヌクレオチド配列；
（ｂ）該第１ポリヌクレオチドの相補体である、単離された第２ポリヌクレオチド；ならびに
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸フラグメント；
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１３】
前記核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１５】
請求項１に記載のポリペプチドに免疫特異的に結合する、抗体。
【請求項１６】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１８】
サンプル中の請求項１に記載のポリペプチドの存在または量を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該サンプルを提供する工程；
（ｂ）該サンプルを、該ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体と接触させる工程；および
（ｃ）該ポリペプチドに結合した抗体の存在または量を決定して、それによって該サンプル中のポリペプチドの存在または量を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
サンプル中の請求項５に記載の核酸分子の存在または量を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該サンプルを提供する工程；
（ｂ）該サンプルを、該核酸分子に結合するプローブと接触させる工程；および
（ｃ）該核酸分子に結合した該プローブの存在または量を決定して、それによって該サンプル中の該核酸分子の存在または量を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記核酸分子の存在または量が、細胞型または組織型についてのマーカーとして使用される、方法。
【請求項２１】
前記細胞型または組織型が癌性である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１に記載のポリペプチドに結合する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該ポリペプチドを該因子と接触させる工程；および
（ｂ）該因子が該ポリペプチドに結合するか否かを決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項２３】
前記因子が、細胞レセプターまたは下流エフェクターである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載のポリペプチドの発現または活性を調節する因子を同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該ポリペプチドを発現する細胞を提供する工程；
（ｂ）該因子と該細胞とを接触させる工程；および
（ｃ）該因子が、該ポリペプチドの発現または活性を調節するか否かを決定する工程、
を包含し、それによって、該ペプチドの発現または活性における変化が、外因子の該ポリペプチドの発現または活性の調節を示す、方法。
【請求項２５】
請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節するための方法であって、該方法は、請求項１に記載のポリペプチドを発現する細胞サンプルを、該ポリペプチドの活性を調節するのに十分な量で、該ポリペプチドに結合する化合物とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２６】
ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防する方法であって、該方法は、そのような処置または予防が所望される被験体に、該被験体における該ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防するに十分な量で、請求項１に記載のポリペプチドを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２７】
前記障害が、心筋症およびアテローム硬化症からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記障害が、細胞シグナルのプロセシングおよび代謝経路の調節に関連する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記被験体がヒトである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防する方法であって、該方法は、そのような処置または予防が所望される被験体に、該被験体における該ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防するに十分な量で、請求項５に記載の核酸を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３１】
前記障害が、心筋症およびアテローム硬化症からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記障害が、細胞シグナルのプロセシングおよび代謝経路の調節に関連する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記被験体がヒトである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防する方法であって、該方法は、そのような処置または予防が所望される被験体に、該被験体における該ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防するに十分な量で、請求項１５に記載の抗体を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３５】
前記障害が糖尿病である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記障害が、細胞シグナルのプロセシングおよび代謝経路の調節に関連する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記被験体がヒトである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項３９】
請求項５に記載の核酸分子および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項４０】
請求項１５に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項４１】
請求項３８に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
【請求項４２】
請求項３９に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
【請求項４３】
請求項４０に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
【請求項４４】
第１の哺乳動物被験体における請求項１に記載のポリペプチドの変化したレベルと関連する疾患の存在または該疾患に対する素因を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該第１の哺乳動物被験体由来のサンプル中の該ポリペプチドの発現レベルを測定する工程；および
（ｂ）工程（ａ）のサンプル中の該ポリペプチドの量を、該疾患を有さないことが既知であるか、または該疾患にかかりにくいことが既知の、第２の哺乳動物被験体由来のコントロールサンプル中に存在する該ポリペプチドの量と、比較する工程、
を包含し、ここで、該コントロールサンプルと比較した場合の該第１の被験体における該ポリペプチドの発現レベルにおける変化が、該疾患の存在または該疾患に対する素因を示す、方法。
【請求項４５】
前記素因が癌に対するものである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
第１の哺乳動物被験体における請求項５に記載の核酸分子の変化したレベルと関連する疾患の存在または該疾患に対する素因を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該第１の哺乳動物被験体由来のサンプル中の該核酸の量を測定する工程；および
（ｂ）工程（ａ）のサンプル中の該核酸の量を、該疾患を有さないことが既知であるかまたは該疾患にかかりにくいことが既知の、第２の哺乳動物被験体由来のコントロールサンプル中に存在する該核酸の量と比較する工程、
を包含し、ここで、該コントロールサンプルと比較した場合の、該第１の被験体における該核酸のレベルにおける変化が、該疾患の存在または該疾患に対する素因を示す、方法。
【請求項４７】
前記素因が癌に対するものである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
哺乳動物において病理学的状態を処置する方法であって、該方法は、該病理状態を緩和するに十分な量でポリペプチドを該哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、該ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性なフラグメントと、少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドである、方法。
【請求項４９】
哺乳動物において病理学的状態を処置する方法であって、該方法は、該病理学的状態を緩和するに十分な量で請求項１５に記載の抗体を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、概して、核酸およびそれによってコードされるポリペプチドに関する。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、概して、核酸およびそれによってコードされるポリペプチドに関する。より詳細には、本発明は、細胞質ポリペプチド、核ポリペプチド、膜結合ポリペプチド、および分泌ポリペプチドをコードする核酸、ならびにこれらの核酸およびポリペプチドを産生するためのベクター、宿主細胞、抗体および組換え方法に関する。
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は、新規なポリペプチドをコードする核酸配列の発見に一部は基づく。この新規な核酸およびポリペプチドを、本明細書において、ＮＯＶＸ、またはＮＯＶ１、ＮＯＶ２、ＮＯＶ３、ＮＯＶ４、ＮＯＶ５、ＮＯＶ６、ＮＯＶ７およびＮＯＶ８の核酸およびポリペプチドと称する。これらの核酸およびポリペプチド、ならびにその誘導体、相同体（ホモログ）、類似体（アナログ）、およびフラグメントを、本明細書において以降は、総称して「ＮＯＶＸ」核酸配列または「ＮＯＶＸ」ポリペプチド配列と称する。
【０００４】
１つの局面において、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドをコードする単離されたＮＯＶＸ核酸分子を提供し、これは、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６に開示される核酸に対して同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、このＮＯＶＸ核酸分子は、ＮＯＶＸ核酸配列のタンパク質コード配列を含む核酸分子に相補的な核酸配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。本発明はまた、ＮＯＶＸポリペプチド、あるいはそのフラグメント、ホモログ、アナログまたは誘導体をコードする、単離された核酸を包含する。例えば、この核酸は、配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５および３７のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して少なくとも８０％同一であるポリペプチドをコードし得る。この核酸は、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６のいずれかの核酸配列を含む、ゲノムＤＮＡフラグメントまたはｃＤＮＡ分子であり得る。
【０００５】
オリゴヌクレオチド（例えば、ＮＯＶＸ核酸（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６）の少なくとも６個連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドまたはそのオリゴヌクレオチドの相補体）もまた、本発明に含まれる。
【０００６】
実質的に精製されたＮＯＶＸポリペプチド（配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５および３７）もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態において、このＮＯＶＸポリペプチドは、ヒトＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列に実質的に同一であるアミノ酸配列を含む。
【０００７】
本発明はまた、ＮＯＶＸポリペプチド、あるいはそれらのフラグメント、ホモログ、アナログまたは誘導体に免疫選択的に結合する抗体を特徴とする。
【０００８】
別の局面において、本発明は、治療有効量または予防有効量の治療剤および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物を包含する。この治療剤は、例えば、ＮＯＶＸ核酸、ＮＯＶＸポリペプチド、またはＮＯＶＸポリペプチドに特異的な抗体であり得る。さらなる局面において、本発明は、１以上の容器に、この薬学的組成物の治療有効量または予防有効量を含む。
【０００９】
さらなる局面において、本発明は、ポリペプチドを産生する方法を包含し、この方法は、ＮＯＶＸ核酸を含む細胞を、このＤＮＡによってコードされるＮＯＶＸポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養することによる。所望の場合、次いで、このＮＯＶＸポリペプチドを回収し得る。
【００１０】
別の局面において、本発明は、サンプル中のＮＯＶＸポリペプチドの存在を検出する方法を包含する。この方法において、サンプルを、このポリペプチドに選択的に結合する化合物と、このポリペプチドとこの化合物との間での複合体の形成を可能にする条件下で接触させる。この複合体は、存在するならば、検出され、それによって、このサンプル中のＮＯＶＸポリペプチドを同定する。
【００１１】
本発明はまた、ＮＯＶＸの発現に基づいて特定の細胞型または組織型を同定するための方法を包含する。
【００１２】
サンプル中のＮＯＶＸ核酸分子の存在を検出する方法もまた本発明に包含され、この方法は、このサンプルに、ＮＯＶＸ核酸プローブまたはプライマーを接触させ、そしてこの核酸プローブまたはプライマーが、このサンプル中のＮＯＶＸ核酸分子に結合したか否かを検出することによる。
【００１３】
さらなる局面において、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドの活性を調節するための方法を提供し、この方法は、このＮＯＶＸポリペプチドを含む細胞サンプルに、このＮＯＶＸポリペプチドに結合する化合物を、このポリペプチドの活性を調節するに十分な量で接触させることによる。この化合物は、例えば、本明細書中にさらに記載されるような、低分子（例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、糖質、脂質または他の有機分子（炭素含有）または無機分子）であり得る。
【００１４】
以下を含む障害または症候群を処置または予防するための医薬の製造における治療薬の使用はまた、本発明の範囲に包含される：例えば、炎症、自己免疫性障害、強皮症、移植、自己免疫疾患、アレルギー、免疫不全、全身性エリテマトーデス、リンパ水腫、血友病、凝固能亢進、特発性血小板減少性紫斑病、対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）、子宮内膜症、嚢胞性線維症、脾臓、胸腺、肺、および腹膜のマクロファージに関連する病理的障害、加齢、アルツハイマー病、発作、癌、癌ような異常新脈管形成、ならびにより具体的には攻撃性、転移性の癌、より詳細には、肺、腎臓、脳、肝臓および結腸の腫瘍、肥満細胞腫、前立腺癌、アポトーシスの調節、腫瘍形成（例えば、肺癌、肝臓癌および卵巣癌）；細胞増殖およびおそらく分化（ｐｏｓｓｉｂｌｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、非ホジキンリンパ腫（ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）、フォン・ヒッペル−リンダウ症候群（ＶＨＬ）症候群、レッシュ−ナイハン症候群、歯周炎、膵炎、筋骨格障害、高カルシウム血、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性麻痺、てんかん、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化症、毛細血管拡張性運動失調、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、神経変性、家族性アミロイド多発性神経障害（ａｍｙｌｏｉｄｏｔｉｃ  ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、神経変性障害および神経精神医学的障害、白質萎縮、異βリポ蛋白血症、ＩＩＩ型高リポ蛋白血症、黄色腫症、冠状血管および／または末梢血管の疾患、血管筋障害、アテローム性動脈硬化症、高血圧、先天性心臓欠陥、大動脈狭窄症、心房中隔欠損（ＡＳＤ）、房室管（Ａ−Ｖ）欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患（ｖａｌｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）、急性（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ）脈管疾患、新脈管形成および創傷治癒、白血病誘発、腎動脈狭窄症、間質性腎炎、糸球体腎炎、多嚢胞腎疾患、尿細管性アシドーシス、ＩｇＡ腎症、受胎能、内分泌機能不全、糖尿病、糖尿病性アシドーシス、高コレステロール血症、平面（ｐｌａｎａｒ）および腱の黄色腫、肥満症、成長異常および生殖異常、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下不全症、２型糖尿病、慢性肺疾患、ぜん息、結節硬化症ならびに／または他の病理状態およびこのような障害。
【００１５】
治療剤は、例えば、ＮＯＶＸ核酸、ＮＯＶＸポリペプチド、またはＮＯＶＸ特異的抗体、あるいはそれらの生物学的に活性な誘導体またはフラグメントであり得る。
【００１６】
例えば、本発明の組成物は、上に開示される疾患および障害ならびに／またはこのような他の病理状態および障害に罹患する患者の処置のために効力を有する。このポリペプチドは、本発明に特異的な抗体を産生するための免疫原として、およびワクチンとして使用され得る。これらはまた、潜在的なアゴニストおよびアンタゴニスト化合物についてスクリーニングするために使用され得る。例えば、ＮＯＶＸをコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり得、そしてＮＯＶＸは、それを必要とする被験体に投与された場合に有用であり得る。非限定的な例として、本発明の組成物は、上に開示される疾患および障害ならびに／またはこのような他の病理状態および障害に罹患する患者の処置に対する効力を有する。
【００１７】
本発明はさらに、例えば、上で開示した疾患および障害ならびに／またはこのような他の病理状態および障害を含む、障害または症候群のモジュレーター（調節因子）についてスクリーニングするための方法を包含する。この方法は、試験化合物をＮＯＶＸポリペプチドと接触させる工程、およびこの試験化合物が上記ＮＯＶＸポリペプチドに結合したか否かを決定する工程を包含する。ＮＯＶＸポペプチドペプチドに対するこの試験化合物の結合によって、この試験化合物が、活性のモジュレーター、あるいは上述の障害または症候群の潜伏または素因のモジュレーターであることが示される。
【００１８】
また、本発明の範囲には、前述の障害または症候群についての危険性の増大した試験動物に対して、試験化合物を投与することによって、活性のモジュレーター、あるいは上で開示した疾患および障害ならびに／またはこのような他の病理状態および障害を含む、障害もしくは症候群の潜伏もしくは素因のモジュレーターについてスクリーニングする方法が含まれる。試験動物は、ＮＯＶＸ核酸によってコードされる組換えポリペプチドを発現する。次いで、ＮＯＶＸポリペプチドの発現または活性を、この試験動物において測定し、同様に、コントロール動物（これは、ＮＯＶＸポリペプチドを組換え的に発現し、かつ上記の障害についての危険性も上記の症候群についての危険性も増大していない）におけるこのタンパク質の発現または活性を測定する。次いで、試験動物およびコントロール動物の両方におけるＮＯＶＸポリペプチドの発現を比較する。コントロール動物と比較した、試験動物におけるＮＯＶＸポリペプチドの活性の変化は、この試験化合物が、上記の障害または症候群の潜伏のモジュレーターであることを示す。
【００１９】
なお別の局面では、本発明は、被験体（例えば、ヒト被験体）におけるＮＯＶＸポリペプチド、ＮＯＶＸ核酸またはその両方のレベルの変化に関連した疾患の存在または素因を決定する方法を含む。この方法は、この被験体由来の試験サンプル中におけるＮＯＶＸポリペプチドの量を測定する工程、およびコントロールサンプル中において存在するＮＯＶＸポリペプチドの量に対して、この試験サンプル中におけるこのポリペプチドの量を比較する工程、を包含する。コントロールサンプルと比較した場合の試験サンプルにおけるＮＯＶＸポリペプチドレベルの変化は、この被験体における疾患の存在または素因を示す。好ましくは、この素因としては、上で開示された疾患および障害ならびに／または他のこのような病理状態および障害の素因が挙げられる。また、本発明の新規なポリペプチドの発現レベルは、種々の癌についてスクリーニングするための方法および癌の病期を決定するための方法において使用され得る。
【００２０】
さらなる局面では、本発明は、病理学的状態を緩和または予防するに十分な量で、被験体（例えば、ヒト被験体）にＮＯＶＸポリペプチド、ＮＯＶＸ核酸、またはＮＯＶＸ特異的抗体を投与することにより、哺乳動物における障害に関連した病理学的状態を処置または予防する方法を包含する。好ましい実施形態では、この障害としては、例えば、上で開示された疾患および障害ならびに／または他のこのような病理状態および障害が挙げられる。
【００２１】
なお別の局面において、本発明は、当該分野において一般的に使用される多数の技術のうちのいずれか１つによって、本発明の細胞性レセプターおよび下流エフェクターを同定する方法において使用され得る。これらの技術としては、ツーハイブリッド系、アフィニティ精製、抗体または他の特異的な相互作用分子を用いる共沈が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
他に規定されない限り、本明細書中において使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載された方法および物質と類似または等価な方法および物質が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および物質を以下に記載する。本明細書中で引用された全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献が、それらの全体において、参考として援用される。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が支配する。さらに、物質、方法および例は、例示にすぎず、限定されることは意図されない。
【００２３】
本発明の他の特徴および利点が、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、新規なヌクレオチドおよびそれによってコードされるポリペプチドを提供する。新規な核酸配列およびそれらのポリペプチドが本発明に含まれる。それらの配列は、集合的に「ＮＯＶＸ核酸」または「ＮＯＶＸポリヌクレオチド」と呼ばれ、そして対応するコードされるポリペプチドは、「ＮＯＶＸポリペプチド」または「ＮＯＶＸタンパク質」と呼ばれる。他に示されない場合、「ＮＯＶＸ」は、本明細書中に開示された新規な配列のいずれかをいうことを意味する。表Ａは、ＮＯＶＸ核酸およびそれらがコードするポリペプチドの要約を提供する。
【００２５】
【数１】
2004516820.tif 000002
ＮＯＶＸ核酸およびそれらがコードするポリペプチドは、種々の適用および状況において有用である。本発明に従う種々のＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドは、以前に記載されたタンパク質に対するドメインおよび配列の関連性の存在に従って、タンパク質ファミリーの新規なメンバーとして有用である。さらに、ＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドはまた、ＮＯＶＸポリペプチドが属するファミリーのメンバーであるタンパク質を同定するために使用され得る。
【００２６】
ＮＯＶ１は、チオレドキシン様ファミリーのタンパク質に対して相同である。従って、本発明のＮＯＶ１核酸、ポリペプチド、抗体および他の関連する化合物は、例えば、以下に関連する治療適用および診断適用において有用である：炎症、自己免疫障害、加齢および癌、および／または他の病状／障害。
【００２７】
ＮＯＶ２ａおよび２ｂは、レチノイン酸応答性／ＳＴＲＡ−６様ファミリーのタンパク質に対して相同である。従って、本発明のＮＯＶ２核酸、ポリペプチド、抗体および他の関連する化合物は、例えば、以下に関連する治療適用および診断適用において有用である：フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、アルツハイマー病、発作、結節硬化症、高カルシウム血症、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性麻痺、てんかん、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化症、毛細血管拡張性運動失調、白質萎縮症、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、神経変性、心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、先天性心欠損症、大動脈狭窄症、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損症、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、強皮症、移植、自己免疫疾患、アレルギー、免疫不全、腎動脈狭窄症、間質性腎炎、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎、全身性エリテマトーデス、尿細管性アシドーシス、ＩｇＡ腎症、レッシュ−ナイハン症候群、リンパ水腫、血友病、凝固能亢進、特発性血小板減少性紫斑病、対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）、子宮内膜症、受胎能、内分泌機能不全、糖尿病、肥満、増殖および生殖障害、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下性、および／または他の病状／障害。
【００２８】
ＮＯＶ３ａおよび３ｂは、ＬＲＲ／ＧＰＣＲ様タンパク質のファミリーに対して相同である。従って、本発明のＮＯＶ３核酸、ポリペプチド、抗体および他の関連する化合物は、例えば、以下に関連する治療適用および診断適用において有用である：異常な脈管形成（癌、およびより詳細には、攻撃的な転移性の癌、より詳細には、肺、腎臓、能、肝臓および結腸の腫瘍のような）および／または他の病状／障害。
【００２９】
ＮＯＶ４は、トリプシンインヒビター様ファミリーのタンパク質に対して相同である。従って、本発明のＮＯＶ４核酸、ポリペプチド、抗体および他の関連する化合物は、例えば、以下に関連する治療適用および診断適用において有用である：慢性肺疾患、歯周炎、膵炎および／または他の病状／障害。
【００３０】
ＮＯＶ５ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈおよびｉは、アポリポタンパク質ｅ様ファミリーのタンパク質に対して相同である。従って、本発明のＮＯＶ５核酸、ポリペプチド、抗体および他の関連する化合物は、例えば、以下に関連する治療適用および診断適用において有用である：アテローム性動脈硬化症、異βリポ蛋白血症、ＩＩＩ型高リポ蛋白血症、黄色腫症、冠状血管疾患および／または末梢血管疾患、甲状腺機能低下症、全身性エリテマトーデス、糖尿病性アシドーシス、高コレステロール血症、平面および腱（ｐｌａｎａｒ  ａｎｄ  ｔｅｎｄｏｎ）の黄色腫、異βリポ蛋白血症、高コレステロール血症、急性血管疾患、アルツハイマー病、家族性アミロイド多発性ニューロパシーおよび／または他の病状／障害。
【００３１】
ＮＯＶ６は、肥満細胞腫プロテアーゼ前駆体様ファミリーのタンパク質に対して相同である。従って、本発明のＮＯＶ６核酸、ポリペプチド、抗体および他の関連する化合物は、例えば、以下に関連する治療適用および診断適用において有用である：アレルギー、ぜん息および嚢胞性線維症、癌（例えば、肥満細胞腫）、血管疾患および／または他の病状／障害。
【００３２】
ＮＯＶ７は、キモシンβ−４様ファミリーのタンパク質のメンバーに対して相同である。従って、本発明のＮＯＶ７核酸、ポリペプチド、抗体および他の関連する化合物は、例えば、以下に関連する治療適用および診断適用において有用である：前立腺癌、免疫学的障害および自己免疫障害（例えば、甲状腺機能亢進症）、脈管形成および創傷治癒、アポトーシスの調節、神経変性障害および神経精神的障害、加齢関連障害、脾臓、胸腺、肺および腹膜のマクロファージに関連する病理学的障害、癌、ならびに／または他の病状／障害。
【００３３】
ＮＯＶ８は、タンパク質チロシンフォスファターゼ様ファミリーのタンパク質に対して相同である。従って、本発明のＮＯＶ８核酸、ポリペプチド、抗体および他の関連する化合物は、例えば、以下に関連する治療適用および診断適用において有用である：造血障害；白血病誘発；多発性嚢胞腎疾患；発癌（例えば、肺癌、肝臓癌および卵巣癌）；アポトーシス；２型糖尿病および肥満症；細胞増殖および分化；非ホジキンリンパ腫；筋骨格障害；およびＣＮＳ発達障害、ならびに／または他の病状／障害。
【００３４】
ＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドはまた、ＮＯＶＸの活性または機能を阻害または増強する分子についてスクリーニングするために使用され得る。詳細には、本発明に従う核酸およびポリペプチドは、例えば、神経発生、細胞分化、細胞運動性、細胞増殖、造血、創傷治癒および脈管形成を調節または阻害する小分子の同定のための標的として使用され得る。
【００３５】
本発明に従うＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドについてのさらなる有用性は、本明細書中に開示される。
【００３６】
（ＮＯＶ１）
新規チオレドキシン様タンパク質をコードする６２０ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ１核酸（ＡＣ０１３５５４＿ｄａ１とも呼ばれる）を、表１Ａに示す。ヌクレオチド２８２〜２８４のＡＴＧ開始コドンから始まり、ヌクレオチド６１８〜６２０のＴＡＡコドンで終結する、オープンリーディングフレームが同定された。開始コドンの上流および終止コドンの下流の推定非翻訳領域を、表１Ａに下線で示す。開始コドンおよび終止コドンを、太字で示す。
【００３７】
【表１Ａ】
2004516820.tif 000003
公の配列データベースの検索において、ＮＯＶ１核酸配列は、第９染色体のｐ３１領域に存在し、これは、３３１塩基中２３２塩基（７０％）が、Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ由来のチオレドキシン  ｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＯＡＴＨＩＯＲＤ｜ａｃｃ：Ｚ２５８６４）に同一である。公のヌクレオチドデータベースとしては、全てのＧｅｎＢａｎｋデータベースおよびＧｅｎｅＳｅｑ特許データベースが挙げられる。
【００３８】
本明細書における全てのＢＬＡＳＴアライメントにおいて、「Ｅ値（Ｅ−ｖａｌｕｅ）」または「期待値（Ｅｘｐｅｃｔ）」とは、その整列された配列が、検索したデータベース内で、単なる偶然によって、ＢＬＡＳＴ問い合わせ配列に対してその類似性を達成し得た確率（可能性）の数的な指標である。例えば、ＮＯＶ１  ＢＬＡＳＴ分析から検索された対象（「Ｓｂｊｃｔ」）（例えば、Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ由来のチオレドキシン  ｍＲＮＡ）が、偶然にのみで、問い合わせ（Ｑｕｅｒｙ）（クエリ）ＮＯＶ１配列にマッチした確率（可能性）は、６０８ｅ−２７である。期待値（Ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ）（Ｅ）は、特定のサイズのデータベースを検索する場合に、全く偶然に見出すことを「期待」し得る、ヒット数を示すパラメーターである。これは、２つの配列の間のマッチに割り当てられるスコア（Ｓｃｏｒｅ）（Ｓ）に伴い、指数関数的に減少する。本質的に、このＥ値は、配列の間のマッチに存在するランダムなバックグラウンドノイズを示す。
【００３９】
期待値（Ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ）は、結果を報告するための有意な閾値を作成するための都合のよい手段として使用される。ＢＬＡＳＴを行うために使用されるデフォルト値は、代表的には、０．０００１に設定される。ＢＬＡＳＴ２．０において、この期待値をまた、Ｐ値（確率）の代わりに用いて、マッチの有意性を報告する。例えば、１ヒットに割り当てられる１であるＥ値は、現在のサイズのデータベースにおいて、類似のスコアを有する１つのマッチを単なる偶然によって見出すことを期待し得ることを意味すると解釈され得る。ゼロであるＥ値は、類似のスコアを有するいかなるマッチも単なる偶然では見出すことが期待されないことを意味する。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／を参照のこと。時には、文字列Ｘおよび文字列Ｎが、ＢＬＡＳＴ検索から生じる。これは、人為的なヒットを妨げるように実施される、低い複雑性の配列の問い合わせ（クエリ）の自動的フィルタリングの結果である。このフィルターは、ヌクレオチド配列において文字「Ｎ」（例えば、「ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ」）またはタンパク質配列において文字「Ｘ」（例えば、「ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ」）によって、見出される任意の低い複雑性の配列を置換する。低い複雑性の領域は、有意な位置ごとのアラインメントではなく、組成の偏りを反映する、高いスコアを生じ得る。ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２６６：５５４〜５７１、１９９６。
【００４０】
配列番号１によってコードされる開示されたＮＯＶ１ポリペプチド（配列番号２）は、１１２アミノ酸残基を有し、１文字コードを使用して表１Ｂに表す。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ１が、シグナルペプチドを有し、そして０．６５００の確実性でおそらく細胞質中に局在するであろうことを予測する。他の実施形態において、ＮＯＶ１はまた、０．１０００の確実性でミトコンドリアマトリクス空間に、または０．１０００の確実性でリソソーム（管腔）に局在されているかもしれない。ＮＯＶ１ペプチドは、おそらく、シグナルペプチドを有さない。
【００４１】
【表１Ｂ】
2004516820.tif 000004
公の配列データベースの検索は、ＮＯＶ１アミノ酸配列が、Ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ由来の１０５アミノ酸残基のチオレドキシンタンパク質（ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ９７５０８）に、１０３アミノ酸残基中６５アミノ酸残基（６３％）同一であり、１０３アミノ酸残基中８０アミノ酸残基（７７％）が類似することを示す（Ｅ＝３．２ｅ−３２）。公のアミノ酸データベースとしては、ＧｅｎＢａｎｋデータベース、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＤＢ、およびＰＩＲが挙げられる。
【００４２】
開示されたＮＯＶ１ポリペプチドは、表１Ｃに列挙されたＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対する相同性を有する。
【００４３】
【表１Ｃ】
2004516820.tif 000005
これらの配列と他の配列との間の相同性は、表１Ｄに示されるＣｌｕｓｔａｌＷに図示される。ＮＯＶ１タンパク質のＣｌｕｓｔａｌＷアライメント、および本明細書中の全ての他のＣｌｕｓｔａｌＷ分析において、黒地に白抜きで示されるアミノ酸残基は、保存配列の領域（すなわち、構造的特性または機能的特性を保存するために必要とされ得る領域）を示し、強調していないアミノ酸残基は、それほど保存されておらず、そして潜在的に、タンパク質の構造または機能を変化することなく、非常に広範な程度に変更され得る。
【００４４】
【表１Ｄ】
2004516820.tif 000006
ＮＯＶ１ならびに他の全てのＮＯＶＸタンパク質における同定可能なドメインの存在は、ソフトウェアアルゴリズム（例えば、ＰＲＯＳＩＴＥ、ＤＯＭＡＩＮ、Ｂｌｏｃｋｓ、Ｐｆａｍ、ＰｒｏＤｏｍａｉｎ、およびＰｒｉｎｔｓ）を用いる検索によって、続いて、Ｉｎｔｅｒｐｒｏウエブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ）を用いてドメインマッチ（または数）をクロスすることによってＩｎｔｅｒｐｒｏ数を決定することによって、決定した。表１Ｅに開示されるようにＮＯＶ１についてのＤＯＭＡＩＮ結果を、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＢＬＡＳＴ分析を用いて、Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＤＤ）から収集した。このＢＬＡＳＴ分析ソフトウェアは、ＳｍａｒｔおよびＰｆａｍコレクションに見出されるドメインをサンプリングする。表１Ｅおよびその後の全てのＤＯＭＡＩＮ配列アライメントについて、完全に保存された単一の残基を、黒色影付きまたは印（｜）によって示し、そして「強い」半保存残基は、灰色影付きまたは印（＋）によって示す。この保存アミノ酸残基の「強い」グループは、以下のアミノ酸のグループのいずれか１つであり得る：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷ。
【００４５】
表１Ｅは、ＮＯＶ１に対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメイン表示を列挙する。これは、ＮＯＶ１配列が、このドメインを含むことが公知の他の端ｐ買う質の特性と類似する特性を有することを示す。
【００４６】
【表１Ｅ】
2004516820.tif 000007
ＮＯＶ１は、表１Ｆに示されるｐａｔｐデータベースのメンバーに対して高い相同性を有する。
【００４７】
【表１Ｆ】
2004516820.tif 000008
チオレドキシンは、ジチオールジスルフィド活性部位を含む、１２，０００ダルトンのオキシドレダクターゼ酵素である。これは、遍在性であり、植物および細菌から哺乳動物までの多くの生物に見出される。チオレドキシンに対する複数のインビトロ基質が同定されており、これらには、リボヌクレアーゼ、絨毛性ゴナドトロピン、凝固因子、グルココルチコイドレセプター、およびインスリンが挙げられる。インスリンの還元は、活性試験として古典的に使用される。Ｗｏｌｌｍａｎら（１９８８）は、ヒトチオレドキシンをコードする全長ｃＤＮＡクローンを同定した。このオープンリーディングフレームは、１０４アミノ酸（開始メチオニンを除く）のタンパク質をコードした。このタンパク質は、植物および細菌のチオレドキシンに共通の高度に保存された酵素活性部位：ｔｒｐ−ｃｙｓ−ｇｌｙ−ｐｒｏ−ｃｙｓ（アミノ酸３０〜３４）を保持した。ＴｏｎｉｓｓｅｎおよびＷｅｌｌｓ（１９９１）は、ＴＲＸ遺伝子が、１３ｋｂにわたって伸長し、そして１２ｋＤタンパク質をコードする５つのエキソンからなることを決定した。サザン分析は、ヒトゲノム中のいくつかのＴＸＮ遺伝子の存在を実証した。これらのうちの少なくとも１つは、不活性（すなわち、偽遺伝子）である。Ｋａｇｈａｄら（１９９４）はまた、ＴＸＮ遺伝子をクローニングし、そしてこれらの５つのエキソンが４つのイントロンによって分離されていることを実証した。彼らは、プライマー伸長によって、＋１転写開始点を決定した。この＋１部位は、ＴＡＴＡＡボックスの２２ｂｐ下流に位置し、７４ｂｐの５非翻訳領域を規定する。いくつかのドナー由来のゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションは、１つのみの活性なＴＸＮ遺伝子を検出した。
【００４８】
ヒトＴＸＮ  ｃＤＮＡプローブを用いたインサイチュ染色体ハイブリダイゼーションを使用して、Ｌａｆａｇｅ−Ｐｏｃｈｉｔａｌｏｆｆ−Ｈｕｖａｌｅら（１９８９）は、この遺伝子を３ｐ１２−ｐ１１に位置付けた。Ｔａｋｅｔｏら（１９９４）は、マウス中の相同遺伝子が第４染色体上に位置すること、およびマウス第１染色体の近位領域にプロセシングされたＴｘｎ偽遺伝子が存在することを見出した。
【００４９】
Ｈｅｐｐｅｌｌ−Ｐａｒｔｏｎら（１９９５）は、転写されるチオレドキシン遺伝子の正確な染色体局在が９ｑ３１であると結論付けた。彼らは、このことを、体細胞ハイブリッドパネルの分析および転写される遺伝子をコードするＹＡＣの蛍光インサイチュハイブリダイゼーションの両方によって発見した。第９染色体への局在は、そのヒト染色体のみとして、第９染色体を含むヒト／ハムスター体細胞ハイブリッドからのＰＣＲ増幅によって、確かめた。他の１染色体ハイブリッド細胞のいずれにおいても、増幅シグナルは検出されなかった。第４染色体上のマウスチオレドキシン遺伝子の位置は、注目すべきである。なぜなら、この染色体の部分は、ヒト第９染色体と相同性を共有するからである。
【００５０】
エンドサイトシス経路へインターナライズされたタンパク質は、通常、分解される。効率的なタンパク質分解は、変性（リソソーム中の酸性条件によって誘導される）ならびに鎖間および鎖内のジスルフィド結合の還元を必要とする。サイトゾルでの還元は、チオレドキシン（ＴＸＮ；１８７７００）によって酵素的に媒介される。Ａｒｕｎａｃｈａｌａｍら（Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：７４５−７５０，２０００）は、リソソームチオールレダクターゼ（彼らは、ＧＩＬＴと呼んでいる）を記載し、これは、低いｐＨで最適に活性であり、そしてインビボおよびインビトロの両方でジスルフィド結合還元を触媒し得た。彼らは、このＧＩＬＴ遺伝子が、推定２６１アミノ酸のタンパク質をコードし、このタンパク質が、３７アミノ酸のシグナルペプチドおよび２２４アミノ酸の前形態からなることを見出した。この酵素は、抗原提示細胞において構成的に発現され、そして他の細胞型においてγ−インターフェロン（１４７５７０）によって誘導され、これは、抗原プロセシングにおける潜在的に重要な役割を示唆する。
【００５１】
セレンは、長年にわたる免疫学的機能研究および多くの栄養学的研究において間接的に関連付けられた。さらに、ＨＩＶに感染したヒトにおいて、血漿中のセレンおよびセレン含有グルタチオンペルオキシダーゼ（例えば、１３８３２１）のレベルが減少されることが報告されている。この理由のために、Ｇｌａｄｙｓｈｅｖら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：６１４６−６１５１、１９９６）は、ヒトＴ細胞におけるセレン代謝についての研究を開始した。著者らは、チオレドキシンレダクターゼとしてＴ細胞中に検出されたセレン含有タンパク質の１つを同定し、そしてこのタンパク質のセレノシスチンの位置が、そのクローニングされた胎盤遺伝子中のＴＧＡコドンに対応することを実証した。Ｔ細胞チオレドキシンレダクターゼが、保存されたＣ末端領域中にセレンを含むセレノ酵素であるという知見は、公知のグルタチオンペルオキシダーゼ酵素系に加えて、主要な抗酸化剤酵素系（例えば、チオレドキシン−チオレドキシンレダクターゼ）におけるセレンの役割の別の例を提供する。
【００５２】
ＧｏｒｌａｔｏｘおよびＳｔａｄｔｍａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：８５２０−８５２５、１９９８）は、アルキル化研究によってＨｅＬａ細胞から単離されたチオレドキシンレダクターゼにおける、セレノシスチンの本質的な役割を実証した。このタンパク質におけるセレノシスチンの選択的アルキル化は、酵素活性を阻害し、そしてＮＡＤＰＨでの還元は、ヘパリンに対する親和性に影響を及ぼした。
【００５３】
チオレダクターゼ様タンパク質をコードする本発明の開示されたＮＯＶ１核酸は、表１Ａに提供される核酸配列、またはそのフラグメントを包含する。本発明はまた、任意の塩基が、表１Ａに示される対応する塩基から変化され得るが、そのチオレダクターゼ様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおコードする、変異体核酸または改変体核酸、あるいはそのような核酸のフラグメントを包含する。本発明はさらに、その記載される配列に相補的である配列の核酸（その記載される核酸のいずれかに相補的である、核酸フラグメントを含む）を包含する。本発明はさらに、その構造が化学修飾を含む、核酸または核酸フラグメント、あるいはその相補体を包含する。このような修飾としては、非限定的な例として、修飾塩基、およびその糖リン酸骨格が修飾または誘導体化された核酸が挙げられる。これらの修飾は、その修飾された核酸の化学安定性を増強するために、少なくとも部分的に行われ、その結果、これらは、例えば、被験体中の治療適用におけるアンチセンス結合核酸として使用され得る。変異体核酸または改変体核酸、ならいにそれらの相補体において、これらの塩基の約３０％までが、このように変化され得る。
【００５４】
本発明の開示されたＮＯＶ１タンパク質は、表１Ｂに提供される配列のチオレダクターゼ様タンパク質を包含する。本発明はまた、その残基のいずれかが、表２に示される対応する残基から変化され得るが、そのチオレダクターゼ様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおコードする、変異体タンパク質または改変体タンパク質、あるいはそれらの機能的フラグメントを包含する。これらの変異体タンパク質または改変体タンパク質において、それらの残基の約３８％までが、そのように変化され得る。
【００５５】
本発明はさらに、本発明のタンパク質のいずれかに免疫特異的に決尾具する抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２）を包含する。
【００５６】
本発明についての上記に定義された情報は、このチオレダクターゼ様タンパク質（ＮＯＶ１）が、「チオレドキシンファミリー」のメンバーとして機能し得ることを示唆する。従って、ここで同定されたＮＯＶ１核酸およびＮＯＶ１タンパク質は、以下に示されるような種々の病状および障害（しかし、これらに限定されない）に関連する、潜在的治療適用において有用であり得る。本発明のこれらの潜在的治療適用としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：タンパク質治療、小分子薬物標的、抗体標的（治療抗体、寸断抗体、薬物標的化／細胞傷害性抗体）、診断および／または予後マーカー、遺伝子治療（遺伝子治療／遺伝子除去（ａｂｌａｔｉｏｎ））、研究ツール、全ての組織および細胞型（本明細書中に定義されるものを含む（しかし、限定されない））のインビボおよびインビトロでの組織再生。
【００５７】
本発明のＮＯＶ１の核酸およびタンパク質は、炎症、自己免疫障害、加齢および癌を含むがこれらに限定されない疾患に関連する、潜在的な治療適用において有用である。例えば、チオレダクターゼ様タンパク質（ＮＯＶ１）をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり得、そしてチオレダクターゼ様タンパク質（ＮＯＶ１）は、それを必要とする被験体に投与される場合に、有用である。非限定的な例として、本発明の組成物は、炎症、自己免疫障害、加齢および癌に罹患している患者の処置に対する効力を有する。本発明のチオレダクターゼ様タンパク質をコードするＮＯＶ１核酸、およびチオレダクターゼ様タンパク質は、診断適用においてさらに有用であり得、ここで、その核酸またはタンパク質の存在および量が、評価される。
【００５８】
ＮＯＶ１核酸およびＮＯＶ１ポリペプチドはさらに、治療方法または診断方法において使用するための新規ＮＯＶ１物質に免疫特異的に結合する抗体の生成において有用である。これらの抗体は、以下のセクション「抗ＮＯＶＸ抗体」に記載されるような、疎水性チャートからの予測を使用して、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。開示されるＮＯＶ１タンパク質は、複数の疎水性領域を有し、これらの各々は、免疫原として使用され得る。１つの実施形態において、企図されるＮＯＶ１エピトープは、およそアミノ酸１〜１０である。別の実施形態において、ＮＯＶ１エピトープは、およそアミノ酸２０〜３５である。さらなる実施形態において、ＮＯＶ１エピトープは、およそアミノ酸４５〜５０、およそアミノ酸５５〜６０、およそアミノ酸６５〜７５、およびおよそアミノ酸９０〜１１５である。これらの新規タンパク質は、種々のヒト障害の機能的分析のためのアッセイ系において使用され得、これらは、疾患の病理の理解および種々の障害の新規薬物標的の開発を補助する。
【００５９】
（ＮＯＶ２）
ＮＯＶ２は、以下に開示される、２つの新規レチノイン酸／ＳＲＡ６様タンパク質を包含する。これらの開示されたタンパク質を、ＮＯＶ２ａおよびＮＯＶ２ｂと命名した。
【００６０】
（ＮＯＶ２ａ）
新規レチノイン酸応答性／ＳＴＲＡ−６様タンパク質をコードする２６３２ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ２ａ核酸（３２７７７８９．０．８３＿ｄａ１）を、表２Ａに示す。ヌクレオチド３１〜３３のＡＴＧ開始コドンから始まり、ヌクレオチド２０１１〜２０１３のＴＧＡコドンで終結する、オープンリーディングフレームが同定された。開始コドンの上流および終止コドンの下流の推定非翻訳領域を、表２Ａに下線で示す。開始コドンおよび終止コドンを、太字で示す。
【００６１】
【表２Ａ】
2004516820.tif 000009
ＧｅｎＢａｎｋによって利用可能になったＧｅｎｏｍｉｃ  Ｄａｉｌｙ  Ｆｉｌｅｓまたは個々の配列決定センターからダウンロードしたファイルに対して実行する、レチノイン酸応答性／ＳＴＲＡ−６またはホモログに関するＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの配列ファイルを使用するＴｂｌａｓｔＮによって、ＮＯＶ２ａ核酸を同定した。核酸配列を、公知のレチノイン酸応答性／ＳＴＲＡ−６またはホモログに対する相同性によってゲノムファイルＧｅｎｂａｎｋから予測した。エキソンを、相同性によって予測し、そしてイントロン／エキソン境界を、標準的な遺伝子学的法則を使用して決定した。複数のＢＬＡＳＴ（例えば、ｔＢｌａｓｔＮ、ＢｌａｓｔＸ、およびＢｌａｓｔＮ）検索、そしてある場合には、ＧｅｎｅＳｃａｎおよびＧｒａｉｌを用いる、類似性決定によって、エキソンをさらに選択しそして洗練した。利用可能な場合に、公のデータベースおよび独自のデータベースの両方からの発現された配列を加えて、その遺伝子配列をさらに洗練しそして完全にした。次いで、ＤＮＡ配列を、明らかな不一致について手動で補正し、それによって、全長タンパク質をコードする配列を得た。
【００６２】
開示されたＮＯＶ２ａ核酸配列は、第１５染色体に局在し、これは、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ由来のレチノイン酸応答性タンパク質（Ｓｔｒａ６）  ｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ０６２４７６｜ａｃｃ：ＡＦ０６２４７６（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：Ｍ７７６６８）に、２２０７塩基中１５１１塩基（６８％）に同一である（Ｅ＝１．２ｅ−１８９）。
【００６３】
配列番号３によってコードされるＮＯＶ２ａポリペプチド（配列番号４）は、６６０アミノ酸残基を有し、表２Ｂに一文字コードを使用して表す。ＳｉｇｎａｌＰ、ＰｓｏｒｔおよびＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ２Ａが、シグナルペプチドを有し、そして０．６０００の確実性でおそらく形質膜中に局在するであろうことを予測する。他の実施形態において、ＮＯＶ２ａはまた、０．４０００の確実性でゴルジ体に、０．３０００の確実性で小胞体（膜）に、または０．３０００の確実性でミクロボディ（ペルオキシソーム）に局在されているかもしれない。ＮＯＶ２Ａペプチドの最も可能性のある切断部位は、アミノ酸８と９との間（ＡＧＮ−ＱＴ）である。
【００６４】
【表２Ｂ】
2004516820.tif 000010
開示されたＮＯＶ２ａアミノ酸配列は、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ由来の６７０アミノ酸残基のレチノイン酸応答性タンパク質（ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ７０４９１）に対して、６７０アミノ酸残基中４９７アミノ酸残基（７４％）の同一性、および６７０アミノ酸残基中５５６アミノ酸残基（８２％）の類似性を有する（Ｅ＝７．１ｅ−２５７）。
【００６５】
ＮＯＶ２ａはまた、表２Ｃに示されるｐａｔｐデータベースのメンバーに対する高い相同性を有する。
【００６６】
【表２Ｃ】
2004516820.tif 000011
（ＮＯＶ２ｂ）
新規ＳＴＲＡ−６様タンパク質をコードする２６６３ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ２ｂ核酸（ＣＧ５２２７６−０７とも呼ばれる）を、表２Ｄに示す。ヌクレオチド１〜３のＡＴＧ開始コドンから始まり、ヌクレオチド２０６８〜２０７０のＴＧＡコドンで終結する、オープンリーディングフレームが同定された。開始コドンの上流および終止コドンの下流の推定非翻訳領域を、表２Ｄに下線で示す。開始コドンおよび終止コドンを、太字で示す。
【００６７】
【表２Ｄ】
2004516820.tif 000012
開示されたＮＯＶ２ｂ核酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ３５２７２８｜ａｃｃ：ＡＦ３５２７２８．１  ｍＲＮＡ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＳＴＲＡ６アイソフォーム１ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ、選択的スプライシングされた）に、２４４４塩基中２３９５塩基（９７％）同一である（Ｅ＝０．０）。
【００６８】
配列番号５によってコードされる開示されたＮＯＶ２ｂポリペプチド（配列番号６）は、６８９アミノ酸残基を有し、表２Ｅに一文字コードを使用して表す。ＳｉｇｎａｌＰ、ＰｓｏｒｔおよびＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ２ｂが、シグナルペプチドを有し、そして０．６０００の確実性でおそらく形質膜中に局在するであろうことを予測する。他の実施形態において、ＮＯＶ２ｂはまた、０．４０００の確実性でゴルジ体に、０．３０００の確実性で小胞体（膜）に、または０．３０００の確実性でミクロボディ（ペルオキシソーム）に局在され得る。ＮＯＶ２ｂペプチドの最も可能性のある切断部位は、アミノ酸８と９との間（ＡＧＮ−ＱＴ）である。
【００６９】
【表２Ｅ】
2004516820.tif 000013
開示されたＮＯＶ２ｂアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来の６６７アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９ＢＸ７９タンパク質（ＳＴＲＡ６  ＩＳＯＦＯＲＭ１）に対して、５７９アミノ酸残基中５７８アミノ酸残基（９９％）の同一性、および５７９アミノ酸残基中５７８アミノ酸残基（９９％）の類似性を有する（Ｅ＝０．０）。
【００７０】
ＮＯＶ２ｂは、第１５染色体にマップする。この割り当ては、ゲノムクローンに関連するマッピング情報、開示された配列との公の遺伝子およびＥＳＴ共有配列同一性、およびＣｕｒａＧｅｎ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎバイオインフォマティックツールを使用して作成された。
【００７１】
ＮＯＶ２ｂは、少なくとも以下の組織で発現される：脳、頸部、心臓、腎臓、リンパ節、リンパ組織、卵巣、下垂体、胎盤、網膜、側頭葉、甲状腺、子宮。発現情報は、ＮＯＶ２ｂの配列の導出に含まれた、これらの配列の組織供給源に由来した。
【００７２】
ＮＯＶ２ａはまた、表２Ｆに列挙されたＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対する相同性を有する。
【００７３】
【表２Ｆ】
2004516820.tif 000014
これらの配列の相同性を、表２Ｇに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図示する
【００７４】
【表２Ｇ】
2004516820.tif 000015
2004516820.tif 000016
2004516820.tif 000017
発癌は、増殖、分化およびアポトーシスの正常な制御の不活性化または破壊を含む（Ｈｕｒｓｔ  ＲＥら；Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  １９９９；４６２：４４９−６７）。しかし、これらの制御は、強力であり、重複性であり、かつ遺伝子発現レベル、ｍＲＮＡ寿命の調節、転写およびタンパク質の再循環において関連する。増殖、分化およびアポトーシスの制御の中心的な系の１つは、レチノイドシグナル伝達である。ｈＲＡＲα核レセプターは、適切なレチノイドリガンドに結合した場合、そのホモダイマーおよびｈＲＸＲαとのヘテロダイマーが多数のレチノイド応答性遺伝子の転写を調節するという点で、遺伝子転写の誘導に関する中心的な位置を占める。これらは他のシグナル伝達経路における遺伝子を含み、その結果、その全体が複雑なネットワークを形成する。この研究において、著者らは、中心的な調節事象であるというｈＲＡＲα遺伝子転写に関する簡単な原因−効果の解釈は、レチノイド応答性遺伝子ネットワークを説明しないことを示した。異なる段階の膀胱腫瘍形成を示す培養された膀胱由来細胞のセットは、モデル系を形成した。これは、種々の段階およびグレードの、２種の不死化膀胱細胞株（ＨＵＣ−ＢＣおよびＨＵＣ−ＰＣ）、１種の扁平上皮癌細胞株（ＳＣａＢＥＲ）、１種の乳頭腫下部（ＲＴ４）、および４種の移行上皮癌（ＴＣＣ−Ｓｕｐ、５６３７、Ｔ２４、Ｊ８２）から構成された。この細胞のセットを使用して、膀胱癌の挙動の範囲をモデル化した。１０μＭのオール−トランス−レチノイン酸（ａＴＲＡ）で処置する前（構成的）および後の相対的な遺伝子発現を、アンドロゲンレセプターおよびエストロゲンレセプター（レチノイドの代謝および作用に関与する遺伝子のセットである、ｈＲＡＲαおよびβ、ｈＲＸＲαおよびβ、ＣＲＢＰ、ＣＲＡＢＰＩおよびＩＩ）について；ならびにレチン酸に対して感受性であることが知られているシグナル伝達遺伝子である、ＥＧＦＲ、サイトカインＭＫ、ＩＣＡＭ  Ｉおよびトランスグルタミナーゼについて測定した。増殖の阻害、ならびにａＴＲＡおよび合成レチノイド４−ＨＰＲの両方に対するアポトーシス応答についての表現型を測定した。ａＴＲＡ感受性プロモーターを含むＣＡＴ含有プラスミドでのトランスフェクションを使用して、遺伝子発現のレチノイド調節のための共通のレチン酸感受性エレメント（ＲＡＲＥ）依存性経路が活性化されたか否かを決定した。選択された遺伝子の各々は、メッセージおよびタンパク質の上方調節または下方調節のいずれかによって、特定の様式でＴＲＡと反応することが、以前の研究から公知である。単純な因果によって容易に解釈可能でない複雑なデータセットが、観察された。全ての細胞株が、ｈＲＸＲαおよびβの高レベルのｍＲＮＡ（これは、外因性ａＴＲＡでの処理によって変更されなかった）を発現するが、他の遺伝子の構成的応答および刺激された応答は、細胞株間で広範に変化した。例えば、ＣＲＡＢＰ  Ｉは、Ｊ８２、Ｔ２４、５６３７およびＲＴ４で発現されないが、ＳＣａＢＥＲ中で低いレベル（これは、変化しなかった）で発現され、そしてＨＵＣ−ＢＣ、ＴＣＣ−ＳｕｐおよびＨＵＣ−ＰＣで中程度で発現され、これらは、それぞれ、急激に減少、増加また��減少された。多くのレチノイド感受性遺伝子の発現を支配するｈＲＡＲαの発現は、全ての細胞株で中程度〜高レベルで発現されたが、いくつかの場合、急激に上方調節されるか（ＴＣＣ−Ｓｕｐ、ＨＵＣ−ＰＣおよびＪ８２）、一定のままであるか（５６３７およびＨＵＣ−ＢＣ）、または下方調節された（ＳＣａＢＥＲ、Ｔ２４およびＲＴ４）。増殖の阻害についての表現型は、任意の単一の遺伝子の発現に対する明らかな関連性を示さなかったが、ａＴＲＡによって阻害された細胞株（ＨＵＣ−ＢＣおよびＴＣＣ−Ｓｕｐ）は、４−ＨＰＲに対して感受性でなく、また逆も同じであった。１つの株（ＲＴ４）は、レチノイドに対して感受性でなかった。トランスフェクションは、ＲＴ４またはＨＵＣ−ＰＣでのＣＡＴレポーター遺伝子のレチノイド刺激性トランスフェクションをほとんど示さなかった。トランス活性化の約２倍の増強が、ＳＣａＢＥＲ細胞、ＨＵＣ−ＢＣ細胞、Ｊ８２細胞およびＴ２４細胞で観察され、３〜８倍の活性化が、５６３７細胞、ＴＣＣ−Ｓｕｐ細胞で観察された。ＨＵＣ−ＢＣにおいて、ＧからＴへの点変異が、ｈＲＡＲα遺伝子の第６０６位に見出された。この変異は、高度に保存されたドメインのアスパラギンをチロシンに置換した。これらのデータは、レチノイドシグナル伝達が、おそらく、膀胱の発癌における不活性化の頻繁な標的であることを示す。
【００７５】
Ｗａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ  Ｐら（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １９９９  Ｆｅｂ  ２５；１４８（１−２）：５５〜６５）は、ヒト膀胱癌細胞株およびＳＶ４０不朽化尿路上皮細胞株におけるレチノイドシグナル伝達経路の存在および機能性を調査した。８つの細胞株のうち２つだけが、すべてｔｒａｎｓのレチノイン酸または１３−ｃｉｓ−レチノイン酸のいずれか１０μＭによって、増殖阻害された。レチノイド応答性エレメントの制御下にあるＣＡＴ遺伝子のトランス活性化は、感受性細胞株の両方および６つのうち４つの抵抗性細胞株におけるシグナル伝達経路の機能性を示した。一群のレチノイド応答性遺伝子およびレチノイド誘導性遺伝子の相対的ＲＴ−ＰＣＲ分析は、多数の異常調節不全とともに、レチノイン酸処置に応じてこれらの遺伝子すべての発現レベルの変化を示した。レチノイドシグナル伝達は、遺伝子発現、遺伝子増殖、および遺伝子分化を分離することによる、腫瘍形成の間の不活化のための標的であり得ると、Ｗａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ  Ｐらは結論付けた。従って、レチノイドは、膀胱癌の処置のためよりも膀胱癌の化学的予防のために効果的である可能性が高い。
【００７６】
レチノイドの増殖効果は、ＭＣ−２６結腸腺癌細胞株およびＬｏＶｏ結腸腺癌細胞株において試験された（Ｓｔｅｗａｒｔ  ＬＶら；Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １９９７  Ｊｕｎ  １５；２３３（２）：３２１〜９）。このＬｏＶｏ細胞株の増殖は、レチノイド（すべてｔｒａｎｓのレチノイン酸（ａｔＲＡ）および９−ｃｉｓ−レチノイン酸（９−ｃｉｓ−ＲＡ））の存在下で変化しなかった。しかし、両方のレチノイドが、細胞増殖により測定される、ＭＣ−２６細胞の増殖を刺激した。ａｔＲＡおよび９−ｃｉｓ−ＲＡは、ＭＣ−２６細胞増殖を増加させることにおいて等しい効力であり、このことは、この増殖刺激が、１つ以上のレチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）により媒介されることを示唆する。この増殖刺激効果を担いうるＲＡＲを決定するために、著者らは、両方の細胞株中に存在するＲＡＲサブタイプを特徴付けた。ＲＡＲαのｍＲＮＡ、ＲＡＲβのｍＲＮＡ、およびＲＡＲγのｍＲＮＡが、ＭＣ−２６細胞において検出された。ＭＣ−２６細胞中に存在するＲＡＲのうち、ＲＡＲαは、レチノイドの増殖刺激効果を媒介しない。なぜならば、選択的ＲＡＲαアンタゴニストは、ＭＣ−２６細胞増殖におけるレチノイド誘導性増殖を妨げることができなかったからである。ＲＡＲα  ｍＲＮＡ、ＲＡＲβ  ｍＲＮＡ、およびＲＡＲγ  ｍＲＮＡはまた、ＬｏＶｏ細胞株において発現される；従って、ＬｏＶｏ細胞におけるレチノイドによる増殖刺激の欠如は、ＲＡＲの不在に起因するのではないようである。これらの実験において得られた結果は、レチノイドにより惹起される増殖応答は結腸癌細胞間で変化し得ること、および結腸癌細胞株において発現されるＲＡＲサブタイプによってのみ応答の差異は決定されないかもしれないことを、示す。
【００７７】
レチノイン酸（ＲＡ）（増殖および分化の十分に特徴付けられた調節因子）は、小胞甲状腺癌細胞株（ＦＴＣ−１３３、ＦＴＣ−２３８、およびＨＴＣ−ＴＳＨｒ）ならびにＳＶ４０でトランスフェクトされた不朽化甲状腺細胞株（ｏｒｉ３および７７５１）を部分的に再分化する（Ｓｃｈｍｕｔｚｌｅｒ  Ｃら、Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １９９６；１０４  Ｓｕｐｐｌ  ４：１６〜９）。このことは、Ｉ型５’−デヨージナーゼおよび他の分化マーカーの刺激によって、示される。ＲＴ−ＰＣＲ、電気泳動移動度シフト、および［３Ｈ］−レチノイン酸結合アッセイにより示されるように、甲状腺癌細胞株は、ＲＡレセプターｍＲＮＡと、ＲＡ依存性シグナル伝達を媒介することができる、機能性リガンド結合レセプタータンパク質および機能性ＤＮＡ結合レセプタータンパク質とを発現する。まとめると、これらの特性により、これらの甲状腺由来細胞株は、甲状腺癌のＲＡ再分化の効果を研究するための有用なインビトロモデルになる。
【００７８】
この化学療法剤レチノイン酸（ＲＡ）は、多くの腫瘍型の増殖および浸潤を阻害する（Ｖｏ  ＨＰら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９８  Ｊａｎ−Ｆｅｂ；１８（１Ａ）：２１７〜２４）。頭部および頸部の扁平上皮癌（ＳＣＣ）患者におけるＲＡ化学療法は、前悪性病巣の再発を減少しそして前悪性病巣の後退を誘導する。ＲＡの効果は、細胞質タンパク質および核タンパク質の両方により媒介される。核において、リガンド依存性転写因子のファミリー（レチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）およびレチノイドＸレセプター（ＲＸＲ））が、ＲＡに対する標的遺伝子応答を調節する。細胞質において、細胞レチノイン酸結合タンパク質ＩおよびＩＩ（ＣＲＡＢＰ）が、細胞内ＲＡの濃度、輸送、および代謝を調節する。ＣＲＡＢＰ発現の変化は、標的遺伝子応答および癌細胞の表現型に影響することが示されている。このＲＡ応答を媒介する際のこれらのタンパク質の役割を解明するために、本発明者らは、アンチセンスＣＲＡＢＰ  ＩＩ構築物を発現するＳＣＣ２５細胞において、標的遺伝子発現および悪性表現型を調べた。ＲＡは、転写のアップレギュレーションによって、ＳＣＣ２５細胞において２倍のＣＲＡＢＰ  ＩＩ  ｍＲＮＡレベルを誘導した。このアンチセンス構築物の発現は、ＣＲＡＢＰ  ＩＩ発現を、検出不能なレベルまで減少させた。ＣＡＲＢＰ  ＩＩ発現の阻害は、ＲＡ応答性遺伝子の有意なダウンレギュレーションを生じた。これらの減少は、ＲＡ応答性プロモーターからの転写の減少の結果であった。驚くべきことに、このアンチセンスＣＲＡＢＰ構築物を発現するクローンは、増殖のＲＡ媒介性阻害に対して感受性がより弱かった。これらのクローンはまた、インビトロ浸潤アッセイにおいてより浸潤性でなかった。これはおそらく、マトリックスメタロチオネイナーゼ活性のダウンレギュレーションに起因した。本発明者らは、ＣＲＡＢＰ  ＩＩは、頭部および頸部のＳＣＣの浸潤を調節するＲＡ応答性遺伝子の転写に影響すると、結論付ける。
【００７９】
すべてがｔｒａｎｓのレチノイン酸（ｔｒａｎｓ−ＲＡ）および他のレチノイドは、２つの型のレチノイドレセプター（ＲＡレセプター（ＲＡＲ）およびレチノイドＸレセプター（ＲＸＲ））を介して、抗癌効果を発揮する（Ｗｕ  Ｑら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９９７  Ｎｏｖ；１７（１１）：６５９８〜６０８）。以前の研究は、ｔｒａｎｓ−ＲＡおよび関連レチノイドの増殖阻害効果は、ＲＡＲαおよびＲＡＲβのより低いレベルに起因して、特定のエストロゲン非依存性乳癌細胞株で損なわることを、示した。本研究において、本発明者らは、ｔｒａｎｓ−ＲＡ感受性乳癌細胞株およびｔｒａｎｓ−ＲＡ抵抗性乳癌細胞株の両方においていくつかの合成レチノイドが増殖阻害およびアポトーシスを誘導する能力について、そのいくつかの合成レチノイドを評価した。ＲＸＲ選択的レチノイドは、特にＲＡＲ選択的レチノイドと組み合わせると、ＲＡＲβを有意に誘導し得、そしてｔｒａｎｓ−ＲＡ抵抗株（ＲＡＲα欠損ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）のアポトーシスを誘導し得たが、高レベルのＲＡＲαを発現するｔｒａｎｓ−ＲＡ感受性ＺＲ−７５−１細胞に対して低い活性を有したことを、本発明者らの結果は示す。ゲルシフトアッセイおよび一過性トランスフェクションアッセイを使用して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するＲＸＲ選択的レチノイドの効果は、ＲＡＲβプロモーター中のＲＡ応答エレメントに結合してそしてＲＸＲ選択的レチノイドに応答してＲＡＲβを活性化した、ＲＸＲ−ｎｕｒ７７ヘテロダイマーにより多分媒介されたことを、本発明者らは見出した。対照的に、ｔｒａｎｓ−ＲＡ感受性のＲＡＲα発現細胞におけるＲＡＲ選択的レチノイドによる増殖阻害は多分、これもまたＲＡＲβプロモーターに結合しそしてＲＡＲβプロモーターを活性化した、ＲＸＲ−ＲＡＲαヘテロダイマーを介して生じた。ＲＸＲαを安定して発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１クローンにおいて、ＲＸＲ選択的レチノイドによる、ＲＡＲβ誘導および増殖阻害の両方が抑制され、一方、ＲＡＲ選択的レチノイドの効果は、増強された。まとめると、ＲＸＲの活性化は、ｔｒａｎｓ−ＲＡ抵抗性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞の増殖を阻害し得ることを、本発明者らの結果は示す。そして乳癌細胞株におけるＲＡＲ媒介性増殖阻害からＲＸＲ媒介性増殖阻害へのシグナル伝達変換を調節し得る。
【００８０】
レチノイン酸は、標的遺伝子の発現を調節することによって、発生、増殖、および分化において重要な役割を果す。Ｂｏｕｉｌｌｅｔおよび共同研究者による差引きハイブリダイゼーションｃＤＮＡクローニング技術（Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  １９９７；６３：１７３〜８６）を使用して、新規なレチノイン酸誘導性遺伝子であるＳｔｒａ６が、Ｐ１９胚生期癌細胞において同定された。Ｓｔｒａ６は、新規な型の非常に疎水的な膜タンパク質をコードし、このタンパク質は、以前に特徴付けられた内在性膜タンパク質と類似性を示さない。Ｓｔｒａ６は、発生の間および成体において特定の発現パターンを示し、このＳｔｒａ６は、血液器官関門のレベルで強力に発現された。興味深いことに、精巣セルトーリ細胞において、Ｓｔｒａ６は、精子形成周期依存性発現を有し、この発現は、Ｓｔｒａ６がすべての細管において発現されるＲＡＲαヌル変異体の精巣において失われる。この知見は、このＳｔｒａ６タンパク質が、今なお同定されていない輸送機構の構成成分であり得ることを、示唆する。
【００８１】
本発明のＮＯＶ２核酸およびＮＯＶ２タンパク質は、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、アルツハイマー病、発作、結節硬化症、高カルシウム血症、パーキンソン病、ハンチントン病、脳性小児麻痺、てんかん、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化症、毛細血管拡張性運動失調、白質萎縮症、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、神経変性、心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、先天性心欠損、大動脈狭窄症、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損、動脈管、肺狭窄、大動脈弁下部狭窄症、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、強皮症、移植、自己免疫疾患、アレルギー、免疫不全、腎動脈狭窄、間質性腎炎、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎疾患、全身性エリテマトーデス、尿細管性アシドーシス、ＩｇＡ腎症、レッシュ−ナイハン症候群、リンパ水腫、血友病、凝固能亢進（ｈｙｐｅｒｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）、特発性血小板減少性紫斑病、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、子宮内膜症、不妊症、内分泌機能不全、糖尿病、肥満、成長障害および生殖障害、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、ならびに他の疾患、障害、および状態などに関与する可能な治療適用において、有用である。例えば、レチノイン酸応答性／ＳＴＲＡ−６様タンパク質（ＮＯＶ２）をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり得、そしてレチノイン酸応答性／ＳＴＲＡ−６様タンパク質（ＮＯＶ２）は、投与される必要がある被験体に投与される場合に、有用であり得る。非限定的例として、本発明の組成物は、炎症、自己免疫障害、加齢、または癌に罹患している患者の処置のために、効力を有する。本発明のレチノイン酸／ＳＴＲＡ−６様タンパク質をコードするＮＯＶ２Ａ核酸、ならびにレチノイン酸応答性／ＳＴＲＡ−６様タンパク質、またはそれらのフラグメントは、本発明の核酸またはタンパク質の存在または適用が評価され得る、診断適用において有用であり得る。
【００８２】
ＮＯＶ２核酸およびポリペプチドはさらに、治療法または診断法における使用のための、本発明の新規な物質に免疫特異的に結合する抗体の生成において有用である。これらの抗体は、下記「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるような、疎水性表からの予測を使用して、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。開示されるＮＯＶ２タンパク質は、複数の親水性領域を有し、その親水性領域の各々は、免疫原として使用され得る。１つの実施形態において、企図されるＮＯＶ２ａエピトープは、およそアミノ酸２０〜３０である。別の実施形態において、ＮＯＶ２ａエピトープは、およそアミノ酸４０〜６０である。さらなる実施形態において、ＮＯＶ２ａエピトープは、およそアミノ酸７５〜８０、およそアミノ酸１００〜１１０、およそアミノ酸１８０〜１９０、およそアミノ酸２２０〜２６０、およそアミノ酸３１０〜３３０、およそアミノ酸３５０〜３７０、およそアミノ酸３８０〜４００、およそアミノ酸４７０〜５１０、およそアミノ酸５５０〜５７０、およびおよそアミノ酸５９０〜６５０である。これらの新規なタンパク質は、種々のヒト障害の機能的分析のためのアッセイ系において使用され得、このことは、その疾患の病理を理解すること、および種々の障害のための新規な薬物標的の開発において、有用である。
【００８３】
別の実施形態において、企図されるＮＯＶ２ｂエピトープは、およそアミノ酸５〜５０である。別の実施形態において、ＮＯＶ２ｂエピトープは、およそアミノ酸８０〜９０である。さらなる実施形態において、ＮＯＶ２ｂエピトープは、およそアミノ酸１４０〜１６０、およそアミノ酸１９０〜２１０、およそアミノ酸２３０〜２９０、およそアミノ酸３６０〜３６５、およそアミノ酸３９０〜４４０、およそアミノ酸５５０〜５９０、およびおよそアミノ酸６１０〜６７０である。これらの新規なタンパク質は、種々のヒト障害の機能的分析のためのアッセイ系において使用され得、このことは、その疾患の病理を理解すること、および種々の障害のための新規な薬物標的の開発において、有用である。
【００８４】
（ＮＯＶ３）
ＮＯＶ３は、下記に開示される新規な２つのＬＲＲ／ＧＰＣＲ様タンパク質を含む。開示されるタンパク質は、ＮＯＶ３ａおよびＮＯＶ３ｂと名付けられた。
【００８５】
（ＮＯＶ３ａ）
新規なＬＲＲ／ＧＰＣＲ様タンパク質をコードする７８９２ヌクレオチドの、開示されるＮＯＶ３ａ核酸（１２８９００８６１ｅｘｔよも呼ばれる）が、表３Ａに示される。ヌクレオチド１〜３のＡＴＧ開始コドンで始まりヌクレオチド５７２８〜５７３０のＴＡＡコドンで終了する、オープンリーディングフレームが、同定された。終止コドンから下流の推定非翻訳領域は、表３Ａにおいて下線を付してあり、そして開始コドンおよび終止コドンは、太字になっている。
【００８６】
【表３Ａ】
2004516820.tif 000018
2004516820.tif 000019
2004516820.tif 000020
本発明の開示されるＮＯＶ３ａ核酸は、第８染色体のｐ１１．２領域に位置決めされており、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のＫＩＡＡ１５３１  ｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＢ０４０９６４）と、同一な２８９４塩基を２９０８塩基中に有する（９９％）（Ｅ＝０．０）。
【００８７】
さらなるＢＬＡＳＴＮの結果が、表３Ｂに示される。
【００８８】
【表３Ｂ】
2004516820.tif 000021
配列番号７によりコードされるＮＯＶ３ａポリペプチド（配列番号８）は、１５４２アミノ酸残基であり、そして表３Ｃにおいて１文字コードを使用して示されている。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ３ａが、シグナルペプチドを含み、そして確実度０．６４００で形質膜に局在する可能性があることを、予測する。他の実施形態において、ＮＯＶ３ａはまた、確実度０．４０００でゴルジ体にか、確実度０．３７００で小胞体（膜）にか、または確実度０．１０００で小胞体（内腔）に、局在し得る。ＮＯＶ３ａペプチドについて最も可能性が高い切断部位は、アミノ酸２６とアミノ酸２７との間（ＡＲＧ−ＡＰ）である。
【００８９】
【表３Ｃ】
2004516820.tif 000022
本発明の開示されるＮＯＶ３ａアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓに由来する１０６０アミノ酸残基のＬＲＲ／ＧＰＣＲ様タンパク質であるＫＩＡＡ１５３１  ＰＲＯＴＥＩＮ（ＢＡＡ９６０５５）と、同一である６３８残基を６４７アミノ酸残基中に有し（９８％）、そして類似する６４３残基を６４７アミノ酸残基中に有する（９９％）（Ｅ＝０．０）。
【００９０】
ＮＯＶ３ａについてのさらなるＢＬＡＳＴＰの結果が、表３Ｄに示される。
【００９１】
【表３Ｄ】
2004516820.tif 000023
ＮＯＶ３ａはまた、表３Ｅに示されるｐａｔｐデータベースのメンバーに対して高い相同性を有する。
【００９２】
【表３Ｅ】
2004516820.tif 000024
ＮＯＶ３ａは、少なくとも以下の組織において発現される：脳、血液、乳房、結腸、耳、生殖細胞、心臓、腎臓、肺、筋肉、膵臓、胎盤、前立腺、皮膚、胃、精巣、子宮、胚全体、結晶、肺、卵巣、子宮、眼、前立腺、扁桃、胎盤、および胸腺。
【００９３】
さらに、この配列は、そのホモログであるＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリ１２８９００８６１の発現パターンに基づいて、以下の組織において発現されると予測される：胎児心臓、胎児肺、胎児網膜、胎児肝臓、脾臓、胎児組織全体、および結腸からの多発性腫瘍、肺からの多発性腫瘍、生殖細胞（ｇｅｅｒｍ  ｃｅｌｌ）からの多発性腫瘍、腎臓からの多発性腫瘍、前立腺からの多発性腫瘍。
【００９４】
２つのＵｎｉｇｅｎｅクラスターのＳＡＧＥ分析（実施例４）は、いくつかの脳腫瘍、卵巣腫瘍、および前立腺腫瘍における発現を示す。
【００９５】
（ＮＯＶ３ｂ）
ＮＯＶ３ａの残基４４４〜９３７のドメインをコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲによる「インフレーム」クローニングのための標的とした。このＰＣＲテンプレートは、ヒトｃＤＮＡに基づく。
【００９６】
以下のオリゴヌクレオチドプライマーを、この標的ｃＤＮＡ配列をクローニングするために使用した：
【００９７】
【数２】
2004516820.tif 000025
下流をクローニングするために、この順方向プライマーは、インフレームでＢａｍＨＩ制限部位を含み、そしてこの逆方向プライマーは、インフレームでＸｈｏＩ制限部位を含む。
【００９８】
２つの並列ＰＣＲ反応を、各反応のためのテンプレートとしてプールしたヒトｃＤＮＡの合計０．５〜１．０ｎｇを使用して、設定した。このプールは、以下のヒト組織のｃＤＮＡ各々５μｇから構成されている：副腎、脳全体、扁桃、小脳、視床、骨髄、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、肝臓、リンパ腫、バーキットラージ細胞株、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脾臓、胃、甲状腺、気管、子宮。
【００９９】
発現組織が既知でありかつ入手可能である場合、上記プライマーと、以下のヒト組織のｃＤＮＡのうちの１つの０．５ｎｇ〜１．０ｎｇとを使用して、第２のＰＣＲを実施した：骨格筋、精巣、乳腺、副腎、卵巣、結腸、正常小脳、正常脂肪、正常皮膚、骨髄、小脳扁桃、脳海馬、脳黒質、脳視床、甲状腺、胎児肺、胎児肝臓、胎児脳、腎臓、心臓、脾臓、子宮、下垂体、リンパ節、唾液腺、小腸、前立腺、胎盤、脊髄、末梢血、気管、胃、膵臓、視床下部。
【０１００】
この反応混合物は、２μｌの各プライマー（元の濃度５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）および１μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＨＦ  ２ポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、５０μｌ反応体積中に含んだ。以下の反応条件を使用した：
ＰＣＲ条件１：
ａ）９６℃  ３分
ｂ）９６℃  ３０秒変性
ｃ）６０℃  ３０秒、プライマーアニーリング
ｄ）７２℃  ６分伸長
工程ｂ〜ｄを１５回反復する
ｅ）９６℃  １５秒変性
ｆ）６０℃  ３０秒、プライマーアニーリング
ｇ）７２℃  ６分伸長
工程ｅ〜ｇを２９回反復する
ｈ）７２℃  １０分最終伸長。
ＰＣＲ条件２：
ａ）９６℃  ３分
ｂ）９６℃  １５秒変性
ｃ）７６℃  ３０秒、プライマーアニーリング、１サイクルあたり１℃ずつ温度を減少させる
ｄ）７２℃  ４分伸長
工程ｂ〜ｄを３４回反復する
ｅ）７２℃  １０分最終伸長。
【０１０１】
増幅産物を、アガロースゲル電気泳動により検出した。このフラグメントを、ゲル精製し、そして製造業者の推奨に従ってｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中に連結した。ＰＣＲ反応１回あたり１２クローンを選び、そして配列決定した。それらのインサートを、ベクター特異的Ｍ１３  ＦｏｒｗａｒｄプライマーおよびＭ１３  Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーと、以下の遺伝子特異的プライマーとを使用して、配列決定した：
【０１０２】
【数３】
2004516820.tif 000026
そのインサートアセンブリＮＯＶ３ｂは、標的配列ＮＯＶ３ａの残基４４４と９３７との間のオープンリーディングフレームをコードすることが見出された。クローン化されたインサートは、元の配列と８つのヌクレオチド位置および４つのアミノ酸位置で異なる。このクローン化されたインサートはまた、元の配列のアミノ酸残基４９１と５４６との間の５５アミノ酸の欠失分異なる。ＮＯＶ３ａとのアライメントが、下記のＣｌｕｓｔａｌＷにおいて示される。異なるアミノ酸が白または灰色の背景を有すること、および欠失アミノ酸／挿入アミノ酸は、その位置をコードしない配列中の破線により検出され得ることに、注意されたい。
【０１０３】
新規なＬＲＲ／ＧＰＣＲ様タンパク質をコードする１３２９ヌクレオチドの、開示されるＮＯＶ３ｂ核酸（１８８８２２７７８）が、表３Ｆに示される。ヌクレオチド１〜３のＧＧＡ開始コドンで始まりそしてヌクレオチド１３２７〜１３２９のＧＡＧコドンで終了する、オープンリーディングフレームが、同定された。開始コドンから上流の推定非翻訳領域が、表３Ｆにおいて下線を付してあり、そして開始コドンおよび終止コドンが、太字である。このリーディングフレームは、より大きなリーディングフレームの一部であり得る。なぜなら、このリーディングフレームは、伝統的開始コドンおよび終止コドンを保有しないからである。この核酸のコード領域は、５’方向および３’方向の両方に広がり、そしてその発現されるタンパク質の配列は、Ｎ末端方向またはＣ末端方向で広がり得る。
【０１０４】
【表３Ｆ】
2004516820.tif 000027
ＮＯＶ３ｂ核酸の逆相補鎖が、表３Ｇに示される。
【０１０５】
【表３Ｇ】
2004516820.tif 000028
配列番号９によりコードされるＮＯＶ３ｂポリペプチド（配列番号１１）は、４４３アミノ酸残基であり、そして表３Ｈにて１文字コードを使用して示される。
【０１０６】
【表３Ｈ】
2004516820.tif 000029
ＮＯＶ３はまた、表３Ｉに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対して相同性を有する。
【０１０７】
【表３Ｉ】
2004516820.tif 000030
これらの配列の相同性は、表３Ｊに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析にて図示される。
【０１０８】
【表３Ｊ】
2004516820.tif 000031
2004516820.tif 000032
2004516820.tif 000033
2004516820.tif 000034
表３Ｋ〜３Ｑは、ＮＯＶ３に対するＤＯＭＡＩＮ分析の結果からのドメインの説明を列挙する。このことは、これらのドメインを含むことが公知である他のタンパク質と類似した特性を、このＮＯＶ３ａ配列が有することを、示す。
【０１０９】
【表３Ｋ】
2004516820.tif 000035
【０１１０】
【表３Ｌ】
2004516820.tif 000036
【０１１１】
【表３Ｍ】
2004516820.tif 000037
【０１１２】
【表３Ｎ】
2004516820.tif 000038
【０１１３】
【表３Ｏ】
2004516820.tif 000039
【０１１４】
【表３Ｐ】
2004516820.tif 000040
【０１１５】
【表３Ｑ】
2004516820.tif 000041
多くの研究が実施され、ＮＯＶ３に対して種々の様式で相同な配列の機能を示した。腫瘍脈管形成の分子的理解を得るために、正常な結腸直腸組織の血管および悪性結腸直腸組織の血管に由来する、内皮細胞の遺伝子発現パターンを比較した（Ｓｔ．Ｃｒｏｉｘら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００  Ａｕｇｕｓｔ  １８；２８９：１１９７〜１２０２）。内皮において優先的に発現される１７０個を超える転写物のうち、７９個が、差次発現された。この７９個は、腫瘍関連内皮において特に増加した４６個を含む。これらの遺伝子のうちのいくつかは、細胞外マトリックスタンパク質をコードしたが、ほとんどの遺伝子は、機能が未知であった。これらの腫瘍内皮マーカーのほとんどが、広範な腫瘍型、および創傷治癒および黄体形成に関連する正常な血管において、発現された。これらの研究は、腫瘍内皮および正常内皮は、分子レベルで異なること（抗脈管形成治療の開発に有意な関連を有し得る、知見）を示す。
【０１１６】
未同定の遺伝子のコード配列に関する情報を提供するために、大きなタンパク質をコードするヒトｃＤＮＡの配列決定プロジェクトに関する研究が、行われた（Ｎａｇａｓｅ  Ｔら、ＤＮＡ  Ｒｅｓ  ２０００  Ａｐｒ  ２８；７（２）：１４３〜５０）。その研究において、研究者らは、２組のサイズ分画されたヒト成体ｃＤＮＡライブラリーおよび胎児脳ｃＤＮＡライブラリー由来の、未知のヒト遺伝子（ＫＩＡＡ１４４４〜ＫＩＡＡ１５４３と名付けた）の１００個のｃＤＮＡクローンの全配列を示す。分析したｃＤＮＡクローンのインサートの平均サイズおよび対応するオープンリーディングフレームの平均サイズは、それぞれ、４．４ｋｂおよび２．６ｋｂ（８５６アミノ酸残基）であった。推定アミノ酸配列のデータベース検索により、５３個の推定遺伝子産物を以下の５つの機能カテゴリーに分類した：細胞のシグナル伝達／連絡、核酸管理、細胞の構造／移動性、タンパク質管理、および代謝。３２個のＫＩＡＡ遺伝子産物のホモログが、このデータベースにて検出されたこともまた、明らかになった。これらのホモログは、ほぼその領域全体を通じて、配列が類似していた。さらに、これらの遺伝子の染色体遺伝子座を、公開データベースにてその染色体遺伝子座がすでに割当てられていない場合は、ヒト−齧歯類ハイブリッドパネルによって決定した。これらの遺伝子の発現レベルを、脊髄、胎児脳、および胎児肝臓、ならびに１０個のヒト組織および８個の脳領域において、逆転写カップル系（ｃｏｕｐｌｅｄ）ポリメラーゼ連鎖反応によりモニターした。この逆転写カップル系（ｃｏｕｐｌｅｄ）ポリメラーゼ連鎖反応の生成物を、酵素免疫測定法により定量した。
【０１１７】
ロイシンリッチな小さいプロテオグリカンは、その特有の特徴が、多様な生物学的特性を有する漸増数の細胞内タンパク質および細胞外タンパク質にて見出される構造モチーフである、拡大している遺伝子クラス（トリプシンインヒビターと呼ばれる）に属する（Ｉｏｚｚｏ  ＲＶ、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９９７；３２（２）：１４１〜７４）。それらのプロトタイプタンパク質コアの３次元モデリングは、リガンドタンパク質との強力かつ特有の相互作用に適した、可撓性で弧状の結合表面を提案する。個々のプロテオグリカンの特性の変化は、保存されていない方の表面残基におけるアミノ酸置換、トリプシンインヒビターの数および／または長さ、ならびに／あるいはグリコシル化の変化に、由来する。これらのプロテオグリカンは、組織形成体であり、個体発生の間および病理学的プロセス（例えば、創傷治癒、組織修復、および腫瘍支質形成）において、膠原原線維を方向付けそして順序付ける。これらの特性は、その二機能性特徴（その戦略的位置にあるタンパク質部分結合コラーゲン原線維、ずれた原線維の間の微視的ギャップ、および線維間の距離を調節しそれにより組織中の線維状コラーゲンの正確なトポロジーを確立するように外に延びる高荷電グリコサミノグリカン）に根付いている。これらのプロテオグリカンはまた、可溶性増殖因子と相互作用し、その機能的活性を調節し、そして細胞表面レセプターに結合する。後者の相互作用は、種々の細胞系における細胞周期の進行に影響し、そして浸潤性新形成細胞の周囲および再生中の組織において、これらの遺伝子産物の発現の変化と呼ばれているものを説明し得る。
【０１１８】
トリプシンインヒビターは、様々な機能および細胞位置を有する多数のタンパク質に存在する短い配列モチーフである（Ｋｏｂｅ  Ｂら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １９９４年１０月；１９（１０）：４１５−２１）。これらの反復を含む全てのタンパク質は、タンパク質−タンパク質相互作用に関与すると考えられる。リボヌクレアーゼインヒビタータンパク質の結晶構造は、チロシンインヒビターが、β−α構造ユニットに対応することを示している。これらのユニットは、これらが、溶媒に対して暴露された１つの表面を有する並行（パラレル）のβシートを形成し、その結果、このタンパク質は、独特の、非球形状を獲得するように配置される。これらの２つの特徴は、トリプシンインヒビターを含むタンパク質のタンパク質結合機能の原因である。
【０１１９】
ラトロフィリン（ｌａｔｒｏｐｈｉｌｉｎ）は、αラトロトキシンの脳特異的Ｃａ２＋非依存レセプター（強力なシナプス前性神経毒）である。Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  Ｈ．らは、２つの新規のラトロフィリンホモログの知見を報告している（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  Ｈ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  １９９９年１月２９日；４４３（３）：３４８−５２）。３つ全てのラトロフィリンは、独特なＧタンパク質結合レセプターである。これらは、それらのレクチンドメイン、オルファクトメジン（ｏｌｆａｃｔｏｍｅｄｉｎ）ドメイン、および膜貫通ドメインと強い類似性を示すが、種々のＣ末端を有する。ラトロフィリンは、選択的スプライシングの部位を７つまで有し；いくつかのスプライス改変体は、変化した３番目の細胞質ループまたは短縮型細胞質テールを含む。ラトロフィリン−１のみが、α−ラトロトキシンに結合する；これは脳に豊富にあり、そして内分泌細胞に存在する。ラトロフィリン−３もまた、脳特異的であり、一方で、ラトロフィリン−２は遍在する。互いに、ラトロフィリンは、別々の組織分布と機能を有する、異種Ｇタンパク質結合レセプターの新規のファミリーを形成する。
【０１２０】
本明細書中に開示されるＬＲＲ／ＧＰＣＲ様タンパク質および核酸（ＮＯＶ３）についての、タンパク質類似性情報、発現パターン、およびマップ位置は、このＬＲＲ／ＧＰＣＲ様タンパク質が一過性レセプターに潜在的に関係するタンパク質ファミリーに特徴的な、重要な構造および／または生理学的機能を有し得ることを示唆する。従って、本発明のＮＯＶ３核酸およびタンパク質は、潜在的な診断適用および治療適用に有用である。これらは、特異的もしくは選択的な、核酸もしくはタンパク質の診断および／または予後判定マーカーとして作用する（ここで、この核酸もしくはタンパク質の存在もしくは量が見積もられる）こと、ならびに以下：（ｉ）タンパク質治療、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療用抗体、診断用抗体、薬物標的化／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療に有用な核酸（遺伝子送達／遺伝子切除）および、（ｖ）インビトロおよびインビボでの組織再生を促進する組成物、のような潜在的治療適用を含む。
【０１２１】
ＮＯＶ３核酸およびタンパク質は、以下および／または他の病理学に記載される、種々の疾患および障害に関係している、潜在的診断適用および治療適用において有用である。例えば、本発明の組成物は、癌のような異常な新脈管形成に関連した障害（より詳細には、攻撃的な転移性の癌（より詳細には、肺、腎臓、脳、肝臓、および結腸の腫瘍））に罹患した患者の処置についての効力を有する。
【０１２２】
これらの材料は、治療方法または診断方法における使用のための（詳細には、腫瘍（より詳細には、肺、腎臓、脳、肝臓、および結腸の腫瘍））の処置のための）本発明の新規の物質に、免疫特異的に結合する抗体の産生においてさらに有用である。
【０１２３】
ＮＯＶ３核酸およびポリペプチドは、治療方法または診断方法における使用のための本発明の新規の物質に免疫特異的結合する抗体の産生にさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗−ＮＯＶＸ抗体」節に記載される、疎水性チャートからの予測を用いる当該分野で公知の方法に従って産生され得る。開示されるＮＯＶ３タンパク質は、複数の親水性領域を有し、この疎水性領域の各々は、免疫原として用いられ得る。開示されるＮＯＶ３タンパク質は、複数の親水性領域を有し、この疎水性領域の各々は、免疫原として用いられ得る。１つの実施形態では、意図されるＮＯＶ３エピトープは、アミノ酸約１〜アミノ酸約３００である。別の実施形態では、ＮＯＶ３エピトープは、アミノ酸約４２０〜アミノ酸約４５０である。さらなる実施形態では、ＮＯＶ３エピトープは、アミノ酸約６５０〜アミノ酸約８００、アミノ酸約７００〜アミノ酸約８００、アミノ酸約８２０〜アミノ酸約９００、アミノ酸約１０５０〜アミノ酸約１１５０、アミノ酸約１２００〜アミノ酸約１２５０、およびアミノ酸約１３００〜アミノ酸約１５５０である。これらのＮＯＶ３タンパク質は、種々のヒト障害の機能的分析のためのアッセイ系に用いられ得、これは、疾患の病理学の理解、および種々の障害に対する新規の薬物標的の開発を助ける。
【０１２４】
（ＮＯＶ４）
新規のトリプシン様タンパク質をコードする１１２３のヌクレオチドの、開示されるＮＯＶ４核酸（ＡＬ０３１７１１＿ｄａ１とも呼ばれる）は、表４Ａに示される。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１〜３のＡＴＧ開始個ドンで始まり、そしてヌクレオチド１１１７〜１１１９のＴＧＡコドンで終わる。終止コドンから下流の推定の非翻訳領域を、表４Ａにおいて下線を付し、そして開始コドンおよび終止コドンを太字にする。
【０１２５】
【表４Ａ】
2004516820.tif 000042
開示されるＮＯＶ４核酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓに由来するα−１−ミクログロブリンｍＲＮＡに（９５％）（１１２３塩基のうち１０６３塩基）同一な塩基を有する（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＨＣＲ｜ａｃｃ：Ｘ０４２２５）（Ｅ＝３．３ｅ−２２７）。
【０１２６】
配列番号１２によりコードされるＮＯＶ４ポリペプチド（配列番号１３）は、３７２アミノ酸残基であり、そして表４Ｂにおける１文字アミノ酸コードを用いて示される。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ４がシグナルペプチドであり、そして０．８２００の確実度で細胞外に局在するようであることを予想する。他の実施形態では、ＮＯＶ４はまた、０．１９００の精度でリソソーム（内腔）に局在し得るか、０．１４５６の確実度で微小体（ペルオキシソーム）に局在し得るか、または０．１０００の確実度で小胞体（膜）に局在し得る。ＮＯＶ４について最も可能性の高い切断部位は、ＶＳＡ−ＧＰのアミノ酸１９と２０との間である。
【０１２７】
【表４Ｂ】
2004516820.tif 000043
開示されるＮＯＶ４アミノ酸配列は、｜ａｃｃ：Ｘ０４２２５）を有する（図３Ａ）。本発明のタンパク質の完全なアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来の３５２アミノ酸残基のＡＭＢＰ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＲＥＣＵＲＳＯＲタンパク質（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｐ０２７６０）（Ｅ＝１．３ｅ−１９１）に（９２％）（３７２アミノ酸残基のうち３４３アミノ酸残基）同一、かつこのタンパク質にポジティブなアミノ酸残基を有することが見出された。
【０１２８】
開示されるＮＯＶ４タンパク質を、第１６染色体に対してマップし、そして少なくとも以下の組織で発現させた：ＨＥＰＧ２未処理（ｕｎｔｒｅａｔｅｄ）（肝細胞癌腫細胞株）；胎児肝臓；下垂体；以下のプール：視床下部（Ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ）、胎児肝臓（Ｆｅｔａｌ  Ｌｉｖｅｒ）、胎児肺（ｆｅｔａｌ＿ｌｕｎｇ）。
【０１２９】
ＮＯＶ４はまた、表４Ｃに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対して相同性を有する。
【０１３０】
【表４Ｃ】
2004516820.tif 000044
2004516820.tif 000045
これらの配列のホモロジーは、表４Ｄに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析に図示される。
【０１３１】
【表４Ｄ】
2004516820.tif 000046
2004516820.tif 000047
表４Ｅ〜４Ｉは、ＮＯＶ４に対するＤＯＭＡＩＮ分析の結果に由来するドメインの記述を列挙する。このことは、ＮＯＶ４配列が、このドメインを含むことが公知である他のタンパク質の特性に類似する特性を有することを示す。
【０１３２】
【表４Ｅ】
2004516820.tif 000048
【０１３３】
【表４Ｆ】
2004516820.tif 000049
【０１３４】
【表４Ｇ】
2004516820.tif 000050
【０１３５】
【表４Ｈ】
2004516820.tif 000051
【０１３６】
【表４Ｉ】
2004516820.tif 000052
ＮＯＶ４はまた、表４Ｊに示されるｐａｔｐデータベースのメンバーに対して高い相同性を有する。
【０１３７】
【表４Ｊ】
2004516820.tif 000053
ＮＯＶ４は、以下の分子に対して様々方法で相同であり、これらの分子の機能は、以下に記載される。増加した好中球エラスターゼと減少した抗プロテアーゼシールド（ｓｈｉｅｌｄ）との間の不均衡は、慢性肺疾患（ＣＬＤ）の発症に寄与する因子として示唆されている。Ｓｔｉｓｋａｌ  ＪＡらは、α１−プロテイナーゼインヒビター（Ａ１ＰＩ）（α−１アンチトリプシンとしても知られている）の早産児に対する投与は、ＣＬＤを予防するだろうと仮定した。Ｄｅｓｉｇｎ（Ｓｔｉｓｋａｌ  ＪＡら、Ｐｅｄｉａｔｒｃｓ  １９９８年１月１日；１０１（１）：８９−９４）。この研究において、無作為化され、プラシーボ調節された、Ａ１ＰＩ補充の予期研究（ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，  ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ａ１ＰＩ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を行った。呼吸支持されている出生時体重６００〜１０００ｇの２４時間齢未満の新生児、および呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）を有する１００１〜１２５０ｇの２４時間齢未満の新生児が、好適であった。Ａ１ＰＩ（６０ｍｇ／ｋｇ）またはプラシーボを、０日目、４日目、７日目、および１４日目に静脈内注入した。主な結果は、２８日目での補充酸素の要求をとして規定される、生存者におけるＣＬＤであった。結果。総計１０６の患者が採用された。出生時体重またはＲＤＳの発症率における群の間に有意な差異はなかった。生存者におけるＣＬＤの発症は、処置群においてより低かったが、この差異は、統計学的に有意には達しなかった（相対危険度［ＲＲ］、０．７９；信頼区間［ＣＩ］、０．６０〜１．０２）。この有益な傾向は、３６週の修正した在胎齢（ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ  ａｇｅ）で維持された（ＲＲ、０．４８；ＣＩ、０．２３〜１．００）。肺出血の発症は、処置した群においてより低かった（ＲＲ、０．２２；ＣＩ、０．０５〜０．９８）。他の合併症は、群の間で有意な差異ではなかった。このこと（早産児におけるＣＬＤの防止のためのプロテアーゼインヒビターの第１の臨床試験）において、注入は、十分に許容的であった。Ａ１ＰＩ治療は、ＣＬＤの発症を妨げ得、そしていくつかの早産の新生児における肺出血の発症を減少するようである。
【０１３８】
血清タンパク質であるα１−プロテイナーゼインヒビター（α１−ＰＩ）は、セリンプロテアーゼ（例えば、ＰＭＮエラスターゼ）を防御する。ヒトα１−ＰＩに対するウサギ抗血清を用いて、ＧＣＦにおけるこのタンパク質は、ドット−ブロット（ｄｏｔ−ｂｌｏｔ）分析から構築された標準曲線から定量された（Ｌｅｅ  ＨＭら、Ｊ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  Ｒｅｓ  １９９７年１月；３２（１  Ｐｔ  １）：９−１９）。ＧＣＦを健常な（Ｈ）患者、歯肉炎（Ｇ）の患者、および歯周病（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ）（ＡＰ）の患者から濾紙のストリップ上に収集し、次いで、Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌ／ＣａＣｌ２緩衝液（ｐＨ７．６）で抽出した。α１−ＰＩ濃度は、Ｇで増加し、そしてＡＰ被験体で最も高かった。Ｈ部位のみが、インタクトなα１−ＰＩ（５２ｋＤａ）を示し；分解フラグメント（４８ｋＤａ）は検出されなかった。ＧおよびＡＰ被験体において、α１−ＰＩ分解フラグメントは、ＧＣＦサンプルの、それぞれ、１７％および７１％に示された。ＧＣＦのコラゲナーゼおよびα１−ＰＩ−分解活性の両方は、炎症（ＧＦＣフロー（ｆｌｏｗ））の重篤度と共に増加した。さらに、α１−ＰＩ分解（またはセルピン分解（ｓｅｒｐｉｎｏｌｙｔｉｃ））活性は、ドキシサイクリンを含む異なるプロテイナーゼインヒビターのパネルに対するインビトロでの応答に基づいて、マトリクスメタロプロテイナーゼ（恐らく、コラゲナーゼ）として特徴付けされた。Ｌｅｅらは、以下を提唱している：（１）コラゲナーゼは、コラゲナーゼが分解することによってのみならず、エラスターゼおよび他のセリンプロテイナーゼのα１−ＰＩ調節の低下によっても、歯周部の崩壊を促進し、それにより細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分に対するより広範な攻撃に有利となり、そして（２）α１−ＰＩ分析について上記した技術を用いる、最近の縦断的二重盲検試験（ｒｅｃｅｎｔ  ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ  ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ  ｓｔｕｄｙ）に基づいて、成人性歯周炎を有するヒトに対する低用量のデオキシサイクリン投与は、ＥＣＭ分解のこの広範なカスケードを阻害し得る。
【０１３９】
重篤な急性膵炎を有する患者に対して腹腔内に与えられた高用量のアプロチニンは、腹腔内で活性化トリプシンを阻害するようであるが、この処置は、プロテアーゼと抗プロテアーゼとの間の均衡に対してあまり効果がない。（Ｂｅｒｌｉｎｇ  Ｒら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐａｎｃｒｅａｔｏｌ  １９９８年８月；２４（１）：９−１７）。白血球プロテアーゼの血漿レベルは、全ての患者において高く、このことは、重篤な急性膵炎の病態生理学の重要な特徴であることを示している。患者が、洗浄手順の後に、すい臓分泌性トリプシンインヒビター（ＰＳＴＩ）のより高い腹腔内レベルを有したということは驚くべき知見である。ほとんどの研究は、プロテアーゼインヒビター治療が、急性膵炎に対してほとんど影響がないかまたは影響がないことを示しているが、Ｂｅｒｌｉｎｇらの初期の研究は、重篤な急性膵炎を有する患者に対して腹腔内で与えられた非常に高用量のプロテアーゼインヒビターアプロチニンが、膵臓壊死に対する外科的処置の必要性を減少させると考えられることを見出した。現在の研究では、彼らは、同じ患者由来の血漿および腹膜サンプルをさらに分析して、アプロチニン処置が、プロテアーゼと内因性抗プロテアーゼとの間の均衡に影響するか否かを確かめている。Ｂｅｒｌｉｎｇらによる、前向き二重盲検の無作為化された多施設治験（ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  ｔｒｉａｌ）において、重篤な急性膵炎を有する４８の患者を、腹腔内洗浄で処置した。１つの群（アプロチニン群、ｎ＝２２）をまた、アプロチニンの高用量（２０００万ＫＩＵが、３０時間にわたって与えられた）を用いて腹腔内処理された。残った２６の患者を、コントロール群にした。プロテアーゼ−抗プロテアーゼ均衡を、以下を測定することにより研究した：免疫反応性のアニオン性トリプシン（ｉｒＡＴ）、カチオン性トリプシン（ｉｒＣＴ）、カチオン性トリプシンとα１−プロテアーゼインヒビターとの間の複合体（ｉｒＣＴ−α１ＰＴ）、白血球エラスターゼおよびプロテイナーゼ４（ＮＰ４）、ならびに内因性プロテアーゼインヒビター、膵臓分泌性トリプシンインヒビター（ＰＳＴＩ）、α２−マクログロブリン（α２Ｍ）、α１−プロテアーゼインヒビター（α１  ＰＩ）、抗キモトリプシン（ＡＣＨＹ）、および分泌性白血球プロテアーゼインヒビター（ＳＬＰＩ）。腹腔内レベルは、洗浄手順の前および後に研究され、そして血漿レベルを、２１日間追跡した。コントロール群は、より低い血漿レベルのＳＬＰＩを有し、そして腹水の分析は、ｉｒＣＴ−α１ＰＩの減少を示して、アプロチニン群をより目立たせた。２つの群の間で有意に異なった、他の測定された変動はなかった。全ての患者は、非常に高レベルの白血球エラスターゼおよびＮＰ４を、腹腔滲出液および血漿の両方の中に有した。ＰＳＴＩの腹腔内レベルは、他の測定された変動（これらの全ては、洗浄後により低い腹腔内レベルを示した）とは対照的に、洗浄手順の後により高かった。
【０１４０】
本明細書中に開示されるトリプシンインヒビター様タンパク質および核酸（ＮＯＶ４）についての、タンパク質類似性情報、発現パターン、およびマップ位置は、このＮＯＶ４タンパク質が、トリプシンインヒビターファミリーに特徴的な、重要な構造的および／または生理学的な機能を有し得ることを示唆する。従って、本発明のＮＯＶ４核酸およびタンパク質は、潜在的な診断適用および治療適用において有用である。これらは、特異的または選択的な、核酸またはタンパク質の診断マーカーおよび／または予後判定マーカーとして作用することを含み、ここで、核酸またはタンパク質の存在または量、ならびに以下のような潜在的治療適用が、評価される：（ｉ）タンパク質治療剤、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療用抗体、診断用抗体、薬物標的化／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療に有用な核酸（遺伝子送達／遺伝子切除）および、（ｖ）インビトロおよびインビボでの組織再生を促進する組成物。
【０１４１】
本発明のＮＯＶ４核酸およびタンパク質は、以下および／または他の病理学に記載される、種々の疾患および障害に関係している、潜在的診断適用および治療適用において有用である。例えば、本発明の組成物は、慢性肺疾患、歯周炎、膵炎に罹患した患者についての処置に効力を有する。ＮＯＶ４核酸、またはそのフラグメントは、診断適用（ここで、核酸またはタンパク質の存在または量が、評価される）においてさらに有用であり得る。
【０１４２】
ＮＯＶ４核酸およびポリペプチドは、治療方法または診断方法における使用のための本発明の新規の物質に免疫特異的結合する抗体の産生にさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗−ＮＯＶＸ抗体」節に記載される、疎水性チャートからの予測を用いる当該分野で公知の方法に従って産生され得る。例えば、開示されるＮＯＶ４タンパク質は、複数の親水性領域を有し、この親水性領域の各々は、免疫原として用いられ得る。１つの実施形態では、企図されるＮＯＶ４エピトープは、アミノ酸約２０〜アミノ酸約５０である。別の実施形態では、ＮＯＶ４エピトープは、アミノ酸約７５〜アミノ酸約１７０である。さらなる実施形態では、ＮＯＶ４エピトープは、アミノ酸約１８０〜アミノ酸約２７０、およびアミノ酸約３２０〜アミノ酸約３７０である。これらの新規のタンパク質は、種々のヒト障害の機能的分析のためのアッセイ系に用いられ得、これは、疾患の病理学の理解、および種々の障害に対する新規の薬物標的の開発を助ける。
【０１４３】
（ＮＯＶ５）
ＮＯＶ５は、以下に記載される、３つの新規のアポリポタンパク質ｅ様タンパク質を含む。開示されるタンパク質は、ＮＯＶ５ａ、ＮＯＶ５ｂ、ＮＯＶ５ｃ、ＮＯＶ５ｄ、ＮＯＶ５ｅ、ＮＯＶ５ｆ、ＮＯＶ５ｇ、ＮＯＶ５ｈ、およびＮＯＶ５ｉと命名された。
【０１４４】
（ＮＯＶ５ａ）
新規のアポリポタンパク質ｅ様タンパク質をコードする２２４９ヌクレオチドの、開示されるＮＯＶ５ａ核酸（ｓｇｇｃ＿ｄｒａｆｔ＿ｄｊ７８４ａ１６＿２００００７２３＿ｄａ１ともいわれる）を、表５Ａに示す。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド３０〜３２のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド２２１７〜２２１９のＴＧＡコドンで終わることが確認された。開始コドンから上流の推定の非翻訳領域および終止コドンから下流の推定の非翻訳領域を、表５Ａにおいて下線を付し、そして開始コドンおよび終止コドンを太字にする。
【０１４５】
【表５Ａ】
2004516820.tif 000054
ＮＯＶ５ａ配列を、登録番号ＲＰ４−７８４Ａ１６をエキソン連結プロセスに供することにより同定した。ＰＣＲプライマーを、登録番号ＲＰ４−７８４Ａ１６に対して、順方向プライマーに利用可能な最も上流の配列、および逆方向プライマーに利用可能な最も下流の配列で開始させることによって設計した。各々の場合において、固有かまたは高い選択性かのいずれかである適切な配列に遭遇するまでか、または、逆方向プライマーの場合、終止コドンに到達するまで、配列をコード配列に対するそれぞれの末端から内側に進めて（ｗａｌｋｉｎｇ）試験した。次いで、このような適切な配列を、広範囲のｃＤＮＡ種を含むライブラリーに基づいたＰＣＲ増幅における、順方向プライマーおよび逆方向プライマーとして用いた。得られたアンプリコンを、ゲル精製し、クローン化し、そして高度な重複性に対して配列決定して、ＮＯＶ５ａ配列を得た。
【０１４６】
ＮＯＶ５ａ核酸は、第１染色体上で同定され、そしてＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来の２５４９ｂｐのアポリポタンパク質Ｅレセプター２  ｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＺ７５１９０｜ａｃｃ：Ｚ７５１９０）に対して、２１１８塩基のうち２０９９塩基（９９％）同一である塩基を有する（Ｅ＝０．０）。
【０１４７】
開示されるＮＯＶ５ａポリペプチド（配列番号１５）（配列番号１４によりコードされる）は、７２９のアミノ酸残基であり、そして表５Ｂにおいて一文字コードを用いて表される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ５ａが、シグナルペプチドであり、そして０．６０００の確実度で原形質膜に局在するようであることを予想する。他の実施形態では、ＮＯＶ５ａはまた、０．４０００の確実度でゴルジ体に局在し得るか、０．３０００の確実度で小胞体（膜）に局在し得るか、または０．３０００の確実度で微小体（ペルオキシソーム）に局在し得る。ＮＯＶ５ａペプチドについての最も可能性の高い切断部位は、アミノ酸５９とアミノ酸６０との間（ＡＡＡ−ＡＡ）である。
【０１４８】
【表５Ｂ】
2004516820.tif 000055
開示されるＮＯＶ５ａアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（Ｈｕｍａｎ）由来の６９９アミノ酸残基のＡＰＯＬＩＰＯＰＲＯＴＥＩＮ  Ｅ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ２  ９０６タンパク質（ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９９８７６）に対して、６９５アミノ酸残基のうち６７６アミノ酸残基（９７％）同一であり、かつ６９５アミノ酸残基のうち６８１アミノ酸残基（９８％）類似する、アミノ酸残基を有する（Ｅ＝０．０）。
【０１４９】
（ＮＯＶ５ｂ）
新規のアポリポタンパク質ｅ様タンパク質をコードする２３４８ヌクレオチドの開示されるＮＯＶ５ｂ核酸（ｓｇｇｃ＿ｄｒａｆｔ＿ｄｊ７８４ａ１６＿２００００７２３＿ｄａ２とも呼ばれる）を表５Ｃに示す。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド３０〜３２のＡＴＧ開始コドンで始まり、ヌクレオチド２３１６〜２３１８のＴＧＡコドンで終わることが確認された。開始コドンの上流の推定非翻訳領域および終止コドンの下流の推定非翻訳領域は、表５Ｃにおいて下線を付しており、そして開始コドンおよび終止コドンを太字にしている。
【０１５０】
【表５Ｃ】
2004516820.tif 000056
ＮＯＶ５ｂ配列を、エキソン連結プロセスを通じて同定した。ＰＣＲプライマーを、順方向プライマーに利用可能な最も上流の配列、および逆方向プライマーに利用可能な最も下流の配列で開始させることによって設計した。各々の場合において、固有かまたは高い選択性かのいずれかである適切な配列に遭遇するまでか、または、逆方向プライマーの場合、終止コドンに到達するまで、配列をコード配列に対するそれぞれの末端から内側に進めて（ｗａｌｋｉｎｇ）試験した。次いで、このような適切な配列を、広範囲のｃＤＮＡ種を含むライブラリーに基づいたＰＣＲ増幅における、順方向プライマーおよび逆方向プライマーとして用いた。得られたアンプリコンを、ゲル精製し、クローン化し、そして高い重複性に対して配列決定して、ＮＯＶ５ｂ配列を得た。
【０１５１】
ＮＯＶ５ｂ核酸は、第１染色体上で同定され、そしてＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来の２５４９ｂｐのアポリポタンパク質Ｅレセプター２  ｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＺ７５１９０｜ａｃｃ：Ｚ７５１９０）に対して、１２０６塩基のうち１１５１塩基（９５％）同一である塩基を有する（Ｅ＝０．０）。
【０１５２】
開示されるＮＯＶ５ｂポリペプチド（配列番号１７）（配列番号１６によりコードされる）は、７６２のアミノ酸残基であり、そして表５Ｄにおいて一文字コードを用いて表される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ５ｂが、シグナルペプチドであり、そして０．６０００の確実度で原形質膜に局在するようであることを予想する。他の実施形態では、ＮＯＶ５ｂはまた、０．４０００の確実度でゴルジ体に局在し得るか、０．３０００の確実度で小胞体（膜）に局在し得るか、または０．３０００の確実度で微小体（ペルオキシソーム）に局在し得る。ＮＯＶ５ｂペプチドについての最も可能性の高い切断部位は、アミノ酸５９とアミノ酸６０との間（ＡＡＡ−ＡＡ）である。
【０１５３】
【表５Ｄ】
2004516820.tif 000057
開示されるＮＯＶ５ｂアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（Ｈｕｍａｎ）由来の６９９アミノ酸残基のＡＰＯＬＩＰＯＰＲＯＴＥＩＮ  Ｅ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ２  ９０６タンパク質（ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９９８７６）に対して、３４９アミノ酸残基のうち３４５アミノ酸残基（９８％）同一であり、かつ３４９アミノ酸残基のうち３４７アミノ酸残基（９９％）類似する、アミノ酸残基を有する（Ｅ＝０．０）。
【０１５４】
（ＮＯＶ５ｃ）
新規のアポリポタンパク質ｅ様タンパク質をコードする２５３７ヌクレオチドの開示されるＮＯＶ５ｃ核酸（ｓｇｇｃ＿ｄｒａｆｔ＿ｄｊ７８４ａ１６＿２００００７２３＿ｄａ３とも呼ばれる）を表５Ｅに示す。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド３０〜３２のＡＴＧ開始コドンで始まり、ヌクレオチド２５０５〜２５０７のＴＧＡコドンで終わることが確認された。開始コドンの上流の推定非翻訳領域および終止コドンの下流の推定非翻訳領域は、表５Ｅにおいて下線を付しており、そして開始コドンおよび終止コドンを太字にしている。
【０１５５】
【表５Ｅ】
2004516820.tif 000058
ＮＯＶ５ｃ配列を、エキソン連結プロセスを通じて同定した。ＰＣＲプライマーを、順方向プライマーに利用可能な最も上流の配列、および逆方向プライマーに利用可能な最も下流の配列で開始させることによって設計した。各々の場合において、固有かまたは高い選択性かのいずれかである適切な配列に遭遇するまでか、または、逆方向プライマーの場合、終止コドンに到達するまで、配列をコード配列に対するそれぞれの末端から内側に進めて（ｗａｌｋｉｎｇ）試験した。次いで、このような適切な配列を、広範囲のｃＤＮＡ種を含むライブラリーに基づいたＰＣＲ増幅における、順方向プライマーおよび逆方向プライマーとして用いた。得られたアンプリコンを、ゲル精製し、クローン化し、そして高い重複性に対して配列決定して、ＮＯＶ５ｃ配列を得た。
【０１５６】
ＮＯＶ５ｃ核酸は、第１染色体上で同定され、そしてＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来の４４６８ｂｐのアポリポタンパク質Ｅレセプター２  ｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：Ｄ５０６７８｜ａｃｃ：Ｄ５０６７８（Ｅ＝１．１ｅ−１２７））に対して、１９２２塩基のうち１６２６塩基（８４％）同一である塩基を有する。
【０１５７】
開示されるＮＯＶ５ｂポリペプチド（配列番号１９）（配列番号１８によりコードされる）は、８２５のアミノ酸残基であり、そして表５Ｆにおいて一文字コードを用いて表される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ５ｃが、シグナルペプチドであり、そして０．６０００の確実度で原形質膜に局在するようであることを予想する。他の実施形態では、ＮＯＶ５ｃはまた、０．４０００の確実度でゴルジ体に局在し得るか、０．３０００の確実度で小胞体（膜）に局在し得るか、または０．３０００の確実度で微小体（ペルオキシソーム）に局在し得る。ＮＯＶ５ｃペプチドについての最も可能性の高い切断部位は、アミノ酸４４とアミノ酸４５との間（ＡＡＡ−ＤＰ）である。
【０１５８】
【表５Ｆ】
2004516820.tif 000059
開示されるＮＯＶ５ｃアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来の７９３アミノ酸残基のＡＰＯＥＲ２ＤＥＬＴＡ４−７タンパク質（ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ１４９６８）に対して、６５９アミノ酸残基のうち５８６アミノ酸残基（８８％）同一であり、かつ６５９アミノ酸残基のうち６０１アミノ酸残基（９１％）類似する、アミノ酸残基を有する（Ｅ＝０．０）。
【０１５９】
（ＮＯＶ５ｄ）
開示されるＮＯＶ５ｄ核酸を、ＮＯＶ５ｃをエキソン連結プロセスに供することにより単離して、この配列を確認した。ＰＣＲプライマーを、順方向プライマーに利用可能な最も上流の配列、および逆方向プライマーに利用可能な最も下流の配列で開始させることによって設計した。各々の場合において、固有かまたは高い選択性かのいずれかである適切な配列に遭遇するまでか、または、逆方向プライマーの場合、終止コドンに到達するまで、配列をコード配列に対するそれぞれの末端から内側に進めて（ｗａｌｋｉｎｇ）試験した。このようなプライマーを、全長ｃＤＮＡ、ＤＮＡの部分（１つ以上のエキソン）、もしくは標的配列のタンパク質配列についてのインシリコ予測に基づいて、または他の種由来の配列に密接に関連したヒト配列に対して予測されたエキソンの翻訳された相同性によって設計した。次いでこれらのプライマーをヒトｃＤＮＡの以下のプールに基づいてＰＣＲ増幅中で使用した：副腎、骨髄、脳−扁桃体、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ（Ｒａｊｉ）、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮。通常、得られたアンプリコンをゲル精製し、クローニングし、そして高い重複性に対して配列決定した。全てのクローンから得た配列を、それ自体と、ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのデータベースにおける他のフラグメントと、および公的なＥＳＴと、アセンブルした。フラグメントおよびＥＳＴが、アセンブリについての成分として含まれるのは、このアセンブリの別の成分とのそれらの同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％であったときである。さらに、配列トレースを手動で評価し、そして適切な場合、補正のために編集した。新規のアポリポタンパク質ｅ様タンパク質をコードする３０３９ヌクレオチドの新規のＮＯＶ５ｄ配列（ＣＧ５５２５６−０２ともいわれる）は、表５Ｇに示される。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１〜３のＡＴＧ開始コドンで始まり、ヌクレオチド３０３７〜３０３９のＴＧＡコドンで終わることが確認された。開始コドンおよび終止コドンは、表５Ｇにおける太字である。
【０１６０】
【表５Ｇ】
2004516820.tif 000060
ＮＯＶ５ｄ配列を、エキソン連結プロセスを通じて同定した。ＰＣＲプライマーを、順方向プライマーに利用可能な最も上流の配列および逆方向プライマーに利用可能な最も下流の配列で開始させることによって設計した。各々の場合において、固有かまたは高い選択性かのいずれかである適切な配列に遭遇するまでか、または、逆方向プライマーの場合、終止コドンに到達するまで、配列をコード配列に対するそれぞれの末端から内側に進めて（ｗａｌｋｉｎｇ）試験した。次いで、このような適切な配列を、広範囲のｃＤＮＡ種を含むライブラリーに基づいたＰＣＲ増幅における、順方向プライマーおよび逆方向プライマーとして用いた。得られたアンプリコンを、ゲル精製し、クローン化し、そして高い重複性に対して配列決定して、ＮＯＶ５ｄ配列を得た。
【０１６１】
ＮＯＶ５ｄ核酸は、ヒト第１染色体のｐ３４領域で同定され、そしてＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：Ｄ５０６７８｜ａｃｃ：Ｄ５０６７８．１  ｍＲＮＡ（アポリポタンパク質Ｅレセプター２についてのヒトｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ）に対して、２９９５塩基のうち２５０８塩基（８３％）同一である塩基を有する（Ｅ＝０．０）。
【０１６２】
開示されるＮＯＶ５ｄポリペプチド（配列番号２１）（配列番号２０によりコードされる）は、１０１２のアミノ酸残基であり、そして表５Ｈにおいて一文字コードを用いて表される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ５ｄが、シグナルペプチドであり、そして０．６７６０の確実度で原形質膜に局在するようであることを予想する。他の実施形態では、ＮＯＶ５ｄはまた、０．１０００の確実度で小胞体（膜）に局在し得るか、または０．１０００の確実度で微小体（ペルオキシソーム）に局在し得るか、または０．１０００の確実度で細胞外に局在し得る。ＮＯＶ５ｄペプチドについての最も可能性の高い切断部位は、アミノ酸３２とアミノ酸３３との間（ＡＡＡ−ＡＡ）である。
【０１６３】
【表５Ｈ】
2004516820.tif 000061
開示されるＮＯＶ５ｄアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（Ｈｕｍａｎ）由来の９６３アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ１４１１４タンパク質（ＡＰＯＬＩＰＯＰＲＯＴＥＩＮ  Ｅ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ２  ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ）に対して、９３１アミノ酸残基のうち７４２アミノ酸残基（７９％）同一であり、かつ９３１アミノ酸残基のうち７７７アミノ酸残基（８３％）類似する、アミノ酸残基を有する（Ｅ＝０．０）。
【０１６４】
ＮＯＶ５ｄは、少なくとも以下の組織において発現される：副腎、骨髄、脳−扁桃体、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ（Ｒａｊｉ）、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮。この情報は、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ情報源、Ｐｕｂｌｉｃ（公的）ＥＳＴ情報源、Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ（文献）情報源、および／またはＲＡＣＥ情報源を含むがこれに限定されない、本発明に含まれる配列の組織情報源を決定することによって導かれた。
【０１６５】
さらに、この配列は、（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：Ｄ５０６７８｜ａｃｃ：Ｄ５０６７８．１）（アポリポタンパク質Ｅレセプター２、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ種における完全ｃｄｓホモログに密接に関係のあるヒトｍＲＮＡ）の発現パターンに起因して、脳の組織において発現されると予想される。
【０１６６】
（ＮＯＶ５ｅ）
開示されたＮＯＶ５ｅ核酸は、配列確認のためのエキソン連結プロセス（ｅｘｏｎ  ｌｉｎｋｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓ）にＮＯＶ５ｃを供することによって単離された。ＰＣＲプライマーを、順方向プライマーについては、利用可能な最も上流の配列で開始し、そして逆方向プライマーについては、利用可能な最も下流の配列で開始させることによって設計した。各々の場合で、適切な配列（固有または高度に選択性のいずれかである）に遭遇するまで、または逆方向プライマーの場合には、終止コドンに到達するまで、それぞれの末端からコード配列に向かって内向きにウォーキングさせて、この配列を試験した。このようなプライマーを、全長ｃＤＮＡ、ＤＮＡの部分（１つ以上のエキソン）、もしくは標的配列のタンパク質配列についてのインシリコ予測に基づいて、または他種由来の密接に関連したヒト配列に対して予測されたエキソンの翻訳された相同性によって設計した。次いでこれらのプライマーを、ヒトｃＤＮＡの以下のプールに基づくＰＣＲ増幅において使用した：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮。通常、得られたアンプリコンをゲル精製し、クローニングし、そして高い冗長性に対して配列決定した。全てのクローンから得られた配列を、それ自体と、ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのデータベースにおける他のフラグメントと、そして公的なＥＳＴとアセンブルした。フラグメントおよびＥＳＴが、アセンブリについての成分として含まれるのは、このアセンブリの別の成分とのそれらの同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％であった場合である。さらに、配列トレースを手動で評価し、そして必要に応じて、補正のために編集した。新規なアポリポタンパク質ｅ様タンパク質をコードする２５３７ヌクレオチドの新規なＮＯＶ５ｅ配列（ＣＧ５５２５６−０３ともいう）を、表５Ｉに示す。ヌクレオチド１〜３のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド２０８６〜２０８８のＴＧＡコドンで終結するオープンリーディングフレームが同定された。表５Ｉでは、終止コドンより下流の推定非翻訳領域に下線を付し、そして開始コドンおよび終止コドンを、太字とする。
【０１６７】
【表５Ｉ】
2004516820.tif 000062
ＮＯＶ５ｅ配列は、エキソン連結プロセスを通して同定された。ＰＣＲプライマーを、順方向プライマーについては、利用可能な最も上流の配列で開始し、そして逆方向プライマーについては、利用可能な最も下流の配列で開始させることによって設計した。各々の場合で、適切な配列（固有または高度に選択性のいずれかである）に遭遇するまで、または逆方向プライマーの場合には、終止コドンに到達するまで、それぞれの末端からコード配列に向かって内向きにウォーキングさせて、この配列を試験した。次いで、このような適切な配列を、広範なｃＤＮＡ種を含むライブラリーに基づくＰＣＲ増幅において、順方向プライマーおよび逆方向プライマーとして使用した。得られたアンプリコンをゲル精製し、クローニングし、そして高い冗長性に対して配列決定して、ＮＯＶ５ｅ配列を提供した。
【０１６８】
ＮＯＶ５ｅ核酸は、ヒト第１染色体のｐ３４領域に同定され、そしてＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＺ７５１９０｜ａｃｃ：Ｚ７５１９０．１  ｍＲＮＡ（アポリポタンパク質Ｅレセプター２についてのＨ．ｓａｐｉｅｎｓ  ｍＲＮＡ）と同一な、１３５９塩基のうちの１３５９塩基（１００％）を有する。
【０１６９】
配列番号２２によってコードされる開示されたＮＯＶ５ｅポリペプチド（配列番号２３）は、６９５アミノ酸残基であり、そして表５Ｊにおいて、一文字コードを用いて表される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔ、および／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果によって、ＮＯＶ５ｅが、シグナルペプチドを有し、そして０．６７６０の確実性で形質膜に局在化される可能性があることが予測されている。他の実施形態では、ＮＯＶ５ｅはまた、０．１０００の確実性で小胞体（膜）に局在化し得るか、０．１０００の確実性で小胞体（内腔）に局在化し得るか、または０．１０００の確実性で細胞外であり得る。ＮＯＶ５ｅペプチドについて最も可能性が高い切断部位は、アミノ酸３２と３３との間（ＡＡＡ−ＡＡ）である。
【０１７０】
【表５Ｊ】
2004516820.tif 000063
開示されたＮＯＶ５ｅアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来の６９９アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９９８７６タンパク質（アポリポタンパク質Ｅレセプター２  ９０６）と同一である、６９９アミノ酸残基のうちの６８３アミノ酸残基（９７％）、および類似である、６９９アミノ酸残基のうちの６８５アミノ酸残基（９７％）を有する（Ｅ＝０．０）。
【０１７１】
ＮＯＶ５ｅは、少なくとも以下の組織において発現される：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮。この情報は、本発明に含まれた配列の組織供給源（ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ供給源、公的なＥＳＴ供給源、および／またはＲＡＣＥ供給源を含むが、これらに限定されない）を決定することによって導き出された。
【０１７２】
さらに、この配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ種におけるアポリポタンパク質Ｅレセプター２ホモログについての密接に関連したＨ．ｓａｐｉｅｎｓ  ｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＺ７５１９０｜ａｃｃ：Ｚ７５１９０．１）の発現パターンに基づき、以下の組織で発現されることが予測される：臍静脈内皮細胞。
【０１７３】
ＮＯＶ５ｅにおける同定可能なドメインの存在は、アルゴリズム（例えば、ＰＲＯＳＩＴＥ、Ｂｌｏｃｋｓ、Ｐｆａｍ、ＰｒｏＤｏｍａｉｎ、Ｐｒｉｎｔｓ）を用いる検索によって、続いて、Ｉｎｔｅｒｐｒｏウェブサイト（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／）を用いてドメインのマッチ（または数）をクロス（ｃｒｏｓｓｉｎｇ）することによりＩｎｔｅｒｐｒｏ数を決定することによって、決定された。この結果によって、このタンパク質は、以下に示される位置に以下のタンパク質ドメインを含む（Ｉｎｔｅｒｐｒｏにより規定される場合）ことが示される：アミノ酸４５〜８３位、８４〜１６５位、１６８〜２０６位に低密度リポタンパク質レセプタードメイン；アミノ酸３３３〜３７８位、３８０〜４１６位、４１８〜４６０位、４６２〜５４６位に低密度レセプター反復；アミノ酸８６〜１２２位、１７０〜２０４位、２１１〜２４５位、２５１〜２８５位、５５６〜６００位、７３９〜７８５位にＥＧＦ様ドメイン；およびアミノ酸１９５〜２５１位にトリプシンインヒビター様システインリッチドメイン。これにより、本発明の配列は、この／これらのドメインを含むことが公知の他のタンパク質の特性と類似した特性、およびこれらのドメインの特性と類似した特性を有することが示される。
【０１７４】
（ＮＯＶ５ｆ）
開示されたＮＯＶ５ｆ核酸は、配列確認のためのエキソン連結プロセスにＮＯＶ５ｃを供することによって単離された。ＰＣＲプライマーを、順方向プライマーについては、利用可能な最も上流の配列で開始し、そして逆方向プライマーについては、利用可能な最も下流の配列で開始させることによって設計した。各々の場合で、適切な配列（固有または高度に選択性のいずれかである）に遭遇するまで、または逆方向プライマーの場合には、終止コドンに到達するまで、それぞれの末端からコード配列に向かって内向きにウォーキングさせて、この配列を試験した。このようなプライマーを、全長ｃＤＮＡ、ＤＮＡの部分（１つ以上のエキソン）、もしくは標的配列のタンパク質配列についてのインシリコ予測に基づいて、または他種由来の密接に関連したヒト配列に対して予測されたエキソンの翻訳された相同性によって設計した。次いでこれらのプライマーを、ヒトｃＤＮＡの以下のプールに基づくＰＣＲ増幅において使用した：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮。通常、得られたアンプリコンをゲル精製し、クローニングし、そして高い冗長性に対して配列決定した。全てのクローンから得られた配列を、それ自体と、ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのデータベースにおける他のフラグメントと、そして公的なＥＳＴとアセンブルした。フラグメントおよびＥＳＴが、アセンブリについての成分として含まれるのは、このアセンブリの別の成分とのそれらの同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％であった場合である。さらに、配列トレースを手動で評価し、そして必要に応じて、補正のために編集した。新規なアポリポタンパク質ｅ様タンパク質をコードする２４７４ヌクレオチドの新規なＮＯＶ５ｆ配列（ＣＧ５５２５６−０４ともいう）を、表５Ｋに示す。ヌクレオチド３０〜３２のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド２４４２〜２４４４のＴＧＡコドンで終結するオープンリーディングフレームが同定された。表５Ｋでは、開始コドンより上流の推定非翻訳領域および終止コドンより下流の推定非翻訳領域に下線を付し、そして開始コドンおよび終止コドンを、太字とする。
【０１７５】
【表５Ｋ】
2004516820.tif 000064
ＮＯＶ５ｆ配列は、エキソン連結プロセスを通して同定された。ＰＣＲプライマーを、順方向プライマーについては、利用可能な最も上流の配列で開始し、そして逆方向プライマーについては、利用可能な最も下流の配列で開始させることによって設計した。各々の場合で、適切な配列（固有または高度に選択性のいずれかである）に遭遇するまで、または逆方向プライマーの場合には、終止コドンに到達するまで、それぞれの末端からコード配列に向かって内向きにウォーキングさせて、この配列を試験した。次いで、このような適切な配列を、広範なｃＤＮＡ種を含むライブラリーに基づくＰＣＲ増幅において、順方向プライマーおよび逆方向プライマーとして使用した。得られたアンプリコンをゲル精製し、クローニングし、そして高い冗長性に対して配列決定して、ＮＯＶ５ｆ配列を提供した。
【０１７６】
ＮＯＶ５ｆ核酸は、ヒト第１染色体のｐ３４領域に同定され、そしてＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：Ｄ５０６７８｜ａｃｃ：Ｄ５０６７８．１  ｍＲＮＡ（アポリポタンパク質Ｅレセプター２についてのヒトｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ）と同一な、２３４１塩基のうちの２０４７塩基（８７％）を有する（Ｅ＝０．０）。
【０１７７】
配列番号２４によってコードされる開示されたＮＯＶ５ｆポリペプチド（配列番号２５）は、８０４アミノ酸残基であり、そして表５Ｌにおいて、一文字コードを用いて表される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔ、および／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果によって、ＮＯＶ５ｆが、シグナルペプチドを有し、そして０．６０００の確実性で形質膜に局在化される可能性があることが予測されている。他の実施形態では、ＮＯＶ５ｆはまた、０．４０００の確実性でゴルジ体に局在化し得るか、０．３０００の確実性で小胞体（膜）に局在化し得るか、または０．３０００の確実性でマイクロボディ（ペルオキシソーム）に局在化し得る。ＮＯＶ５ｆペプチドについて最も可能性が高い切断部位は、アミノ酸４４と４５との間（ＡＡＡ−ＤＰ）である。
【０１７８】
【表５Ｌ】
2004516820.tif 000065
開示されたＮＯＶ５ｆアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来の７９３アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ１４９６８タンパク質（ＡＰＯＥＲ２ＤＥＬＴＡ４−７）と同一である、７８９アミノ酸残基のうちの７１６アミノ酸残基（９０％）、および類似である、７８９アミノ酸残基のうちの７３１ミノ酸残基（９２％）を有する（Ｅ＝０．０）。
【０１７９】
ＮＯＶ５ｆは、少なくとも以下の組織において発現される：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮。この情報は、本発明に含まれた配列の組織供給源（ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ供給源、公的なＥＳＴ供給源、文献（Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ）情報源および／またはＲＡＣＥ供給源を含むが、これらに限定されない）を決定することによって導き出された。
【０１８０】
さらに、この配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ種におけるアポリポタンパク質Ｅレセプター２、完全ｃｄｓホモログについての密接に関連したヒトｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：Ｄ５０６７８｜ａｃｃ：Ｄ５０６７８．１）の発現パターンに基づき、以下の組織で発現されることが予測される：脳。
【０１８１】
ＮＯＶ５ｆにおける同定可能なドメインの存在は、アルゴリズム（例えば、ＰＲＯＳＩＴＥ、Ｂｌｏｃｋｓ、Ｐｆａｍ、ＰｒｏＤｏｍａｉｎ、Ｐｒｉｎｔｓ）を用いる検索によって、続いて、Ｉｎｔｅｒｐｒｏウェブサイト（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／）を用いてドメインのマッチ（または数）をクロス（ｃｒｏｓｓｉｎｇ）することによりＩｎｔｅｒｐｒｏ数を決定することによって、決定された。この結果によって、このタンパク質は、以下に示される位置に以下のタンパク質ドメインを含む（Ｉｎｔｅｒｐｒｏにより規定される場合）ことが示される：アミノ酸５５〜９３位、９６〜１７７位、１８０〜２１８位に、ドメイン名称低密度リポタンパク質レセプタードメイン；アミノ酸３０３〜３４８位、３５０〜３９１位、３９３〜４３５位、４３７〜５２１位に低密度レセプター反復ドメイン；アミノ酸１８２〜２１６位、２２３〜２５７位、５３１〜５７５位にＥＧＦ様ドメイン；およびアミノ酸６５０〜６８３位に融合糖タンパク質ＦＯドメイン。これにより、本発明の配列は、この／これらのドメインを含むことが公知の他のタンパク質の特性と類似した特性、およびこれらのドメインの特性と類似した特性を有することが示される。
【０１８２】
（ＮＯＶ５ｇ）
開示されたＮＯＶ５ｇ核酸は、ＮＯＶ５ｇの配列が、研究室でのｃＤＮＡフラグメントのクローニングによって、その配列のインシリコ予測によって導き出されたことによって単離された。ＤＮＡ配列の全長、もしくはその配列の部分、またはその両方のいずれかを網羅するｃＤＮＡフラグメントをクローニングした。インシリコ予測は、ＣｕｒａＧｅｎの独自の配列データベースまたは公的なヒト配列データベースにおいて利用可能な配列に基づき、そして全長ＤＮＡ配列またはそのいくつかの部分のいずれかを提供した。新規なアポリポタンパク質ｅ様タンパク質をコードする４１５０ヌクレオチドの新規なＮＯＶ５ｇ配列（ＣＧ５５２５６−０５ともいう）を、表５Ｍに示す。ヌクレオチド１０３〜１０５のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド２６７４〜２６７６のＴＧＡコドンで終結するオープンリーディングフレームが同定された。表５Ｍでは、開始コドンよりも上流の推定非翻訳領域および終止コドンより下流の推定非翻訳領域に下線を付し、そして開始コドンおよび終止コドンを、太字とする。
【０１８３】
【表５Ｍ】
2004516820.tif 000066
2004516820.tif 000067
ＮＯＶ５ｇ配列は、エキソン連結プロセスを通して同定された。ＰＣＲプライマーを、順方向プライマーについては、利用可能な最も上流の配列で開始し、そして逆方向プライマーについては、利用可能な最も下流の配列で開始させることによって設計した。各々の場合で、適切な配列（固有または高度に選択性のいずれかである）に遭遇するまで、または逆方向プライマーの場合には、終止コドンに到達するまで、それぞれの末端からコード配列に向かって内向きにウォーキングさせて、この配列を試験した。次いで、このような適切な配列を、広範なｃＤＮＡ種を含むライブラリーに基づくＰＣＲ増幅において、順方向プライマーおよび逆方向プライマーとして使用した。得られたアンプリコンをゲル精製し、クローニングし、そして高い冗長性に対して配列決定して、ＮＯＶ５ｇ配列を提供した。
【０１８４】
ＮＯＶ５ｇ核酸は、ヒト第１染色体のｐ３４領域に同定され、そしてＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：Ｄ５０６７８｜ａｃｃ：Ｄ５０６７８．１  ｍＲＮＡ（アポリポタンパク質Ｅレセプター２、完全ｃｄｓについてのヒトｍＲＮＡ）と同一な、３３６１塩基のうちの３３５８塩基（９９％）を有する（Ｅ＝０．０）。
【０１８５】
配列番号２６によってコードされる開示されたＮＯＶ５ｇポリペプチド（配列番号２７）は、８５７アミノ酸残基であり、そして表５Ｎにおいて、一文字コードを用いて表される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔ、および／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果によって、ＮＯＶ５ｇが、シグナルペプチドを有し、そして０．６７６０の確実性で形質膜に局在化される可能性があることが予測されている。他の実施形態では、ＮＯＶ５ｇはまた、０．１０００の確実性で小胞体（膜）に局在化し得るか、０．１０００の確実性で小胞体（内腔）に局在化し得るか、または０．１０００の確実性で細胞外であり得る。ＮＯＶ５ｇペプチドについて最も可能性が高い切断部位は、アミノ酸３２と３３との間（ＡＡＡ−ＤＰ）である。
【０１８６】
【表５Ｎ】
2004516820.tif 000068
開示されたＮＯＶ５ｇアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来の９６３アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ１４１１４タンパク質（アポリポタンパク質Ｅレセプター２前駆体）と同一である、８１６アミノ酸残基のうちの６８４アミノ酸残基（８３％）、および類似である、８１６アミノ酸残基のうちの７０３アミノ酸残基（８６％）を有する（Ｅ＝０．０）。
【０１８７】
ＮＯＶ５ｇは、少なくとも以下の組織において発現される：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮、大脳髄質／大脳白質、結腸、肺、リンパ組織、頭頂葉、扁桃、全生物体。発現情報は、ＮＯＶ５ｇの配列の誘導体に含まれた配列の組織供給源から導き出された。
【０１８８】
ＮＯＶ５ｇにおける同定可能なドメインの存在は、Ｐｆａｍ、ＰＲＯＳＩＴＥ、ＰｒｏＤｏｍ、Ｂｌｏｃｋｓ、またはＰｒｉｎｔｓのようなドメインデータベースに対する検索によって決定され、次いで、Ｉｎｔｅｒｐｒｏドメイン登録番号によって同定された。重要なドメインを、以下にまとめる。
【０１８９】
ＩＰＲ００００３３、ＹＷＴＤ反復は、アミノ酸３５６〜アミノ酸４０１、アミノ酸４０３〜アミノ酸４４４、アミノ酸４４６〜アミノ酸４８８、アミノ酸４９０〜アミノ酸５３３、アミノ酸５３４〜アミノ酸５７４である。このドメインはまた、この反復の最も保存された領域の後ろにあるＹＷＴＤモチーフとしても公知である。ＹＷＴＤ反復は、複数の縦列反復配列において見出され、そしてβプロペラ構造を形成することが予期された。これは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来のビテロゲニンレセプター、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプター、プレプロ上皮増殖因子（ｐｒｅｐｒｏｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ニドジェン（エンタクチン）などを含む種々のタンパク質において見出される。
【０１９０】
ＩＰＲ００２１７２、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプタークラスＡ（ＬＤＬＲＡ）ドメインは、アミノ酸４５〜アミノ酸８３、アミノ酸８４〜アミノ酸１２４、アミノ酸１２５〜アミノ酸１６３、アミノ酸１６５〜アミノ酸２０７である。低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）は、血漿の主要なコレステロール運搬リポタンパク質である。レセプタータンパク質はＬＤＬに結合し、そしてエンドサイトーシスによってＬＤＬを細胞中に輸送する。内部移行されるために、レセプター−リガンド複合体は、まず、クラスリンで覆われた穴（ｐｉｔ）にクラスター形成されなければならない。約４０アミノ酸の７個連続したシステインリッチ反復が、この多重ドメイン膜タンパク質のＮ末端に存在する。ＬＤＬレセプタークラスＡドメインは、６個のジスルフィド結合システインおよび高度に保存された負荷電アミノ酸のクラスターを含み、これらのうちの多くは、モジュールの一つの面にクラスター形成される。ＬＤＬレセプターにおいて、クラスＡドメインは、ＬＤＬおよびカルシウムについての結合部位を形成する。第４番目のシステインと第６番目のシステインとの間の酸性残基が、ＬＤＬＲのリガンドにおける正荷電配列の高親和性結合のために重要である。この反復は、βヘアピン構造と、それに続く一連のβターンとから構成されることが示された。カルシウムの結合は、何ら重要なコンフォメーション変化を誘導しないようである。これらの反復に続くのは、上皮増殖因子（ＥＧＦ）前駆体の部分に類似する３５０残基のドメインである。類似のドメインは、いくつかの細胞外タンパク質および膜タンパク質において見出された。
【０１９１】
ＩＰＲ０００５６１、ＥＧＦ様ドメインは、アミノ酸２３４〜アミノ酸２６８、アミノ酸２７４〜アミノ酸３０８である。上皮増殖因子（ＥＧＦ）の配列において見出される約３０〜４０アミノ酸残基長の配列は、多少保存された形態において、多数の他の（主に動物の）タンパク質において存在することが示された。ＥＧＦ様パターンの１以上のコピーを含むことが現在知られているタンパク質のリストは、大規模かつ多様である。関連のないタンパク質であると思われるタンパク質におけるＥＧＦドメインの機能的重要性は、未だ明らかではない。しかし、共通の特徴は、これらの反復が、膜結合タンパク質の細胞外ドメインまたは分泌されることが公知のタンパク質において見出されるという点である（例外：プロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ）。ＥＧＦドメインは、ジスルフィド結合に関与することが示されている（ＥＧＦにおいて）６個のシステイン残基を含む。この主要な構造は、二本鎖のβシートと、それに続く、Ｃ末端の短い二本鎖シートへのループである。保存されたシステインの間のサブドメインは、長さにおいて変動する。
【０１９２】
（ＮＯＶ５ｈ）
開示されたＮＯＶ５ｈ核酸は、ＮＯＶ５ｈの配列が、研究室でのｃＤＮＡフラグメントのクローニングによって、その配列のインシリコ予測によって導き出されたことによって単離された。ＤＮＡ配列の全長、もしくはその配列の部分、またはその両方のいずれかを網羅するｃＤＮＡフラグメントをクローニングした。インシリコ予測は、ＣｕｒａＧｅｎの独自の配列データベースまたは公的なヒト配列データベースにおいて利用可能な配列に基づき、そして全長ＤＮＡ配列またはそのいくつかの部分のいずれかを提供した。新規なアポリポタンパク質ｅ様タンパク質をコードする４１８０ヌクレオチドの新規なＮＯＶ５ｈ配列（ＣＧ５５２５６−０６ともいう）を、表５Ｏに示す。ヌクレオチド１６３〜１６５のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド２７０４〜２７０６のＴＧＡコドンで終結するオープンリーディングフレームが同定された。表５Ｏでは、開始コドンよりも上流の推定非翻訳領域および終止コドンより下流の推定非翻訳領域に下線を付し、そして開始コドンおよび終止コドンを、太字とする。
【０１９３】
【表５Ｏ】
2004516820.tif 000069
2004516820.tif 000070
ＮＯＶ５ｈ配列は、エキソン連結プロセスを通して同定された。ＰＣＲプライマーを、順方向プライマーについては、利用可能な最も上流の配列で開始し、そして逆方向プライマーについては、利用可能な最も下流の配列で開始させることによって設計した。各々の場合で、適切な配列（固有または高度に選択性のいずれかである）に遭遇するまで、または逆方向プライマーの場合には、終止コドンに到達するまで、それぞれの末端からコード配列に向かって内向きにウォーキングさせて、この配列を試験した。次いで、このような適切な配列を、広範なｃＤＮＡ種を含むライブラリーに基づくＰＣＲ増幅において、順方向プライマーおよび逆方向プライマーとして使用した。得られたアンプリコンをゲル精製し、クローニングし、そして高い冗長性に対して配列決定して、ＮＯＶ５ｈ配列を提供した。
【０１９４】
ＮＯＶ５ｈ核酸は、ヒト第１染色体のｐ３４領域に同定され、そしてＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：Ｄ５０６７８｜ａｃｃ：Ｄ５０６７８．１  ｍＲＮＡ（アポリポタンパク質Ｅレセプター２、完全ｃｄｓについてのヒトｍＲＮＡ）と同一な、３８５１塩基のうちの３６３４塩基（９４％）を有する（Ｅ＝０．０）。
【０１９５】
配列番号２８によってコードされる開示されたＮＯＶ５ｈポリペプチド（配列番号２９）は、８４７アミノ酸残基であり、そして表５Ｐにおいて、一文字コードを用いて表される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔ、および／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果によって、ＮＯＶ５ｈが、シグナルペプチドを有し、そして０．６７６０の確実性で形質膜に局在化される可能性があることが予測されている。他の実施形態では、ＮＯＶ５ｈはまた、０．１０００の確実性で小胞体（膜）に局在化し得るか、０．１０００の確実性で小胞体（内腔）に局在化し得るか、または０．１０００の確実性で細胞外であり得る。ＮＯＶ５ｈペプチドについて最も可能性が高い切断部位は、アミノ酸３２と３３との間（ＡＡＡ−ＡＡ）である。
【０１９６】
【表５Ｐ】
2004516820.tif 000071
開示されたＮＯＶ５ｈアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来の９６３アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ１４１１４タンパク質（アポリポタンパク質Ｅレセプター２前駆体）と同一である、８０６アミノ酸残基のうちの７１９アミノ酸残基（８９％）、および類似である、８０６アミノ酸残基のうちの７３５アミノ酸残基（９１％）を有する（Ｅ＝０．０）。
【０１９７】
ＮＯＶ５ｈは、少なくとも以下の組織において発現される：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮、大脳髄質／大脳白質、結腸、肺、リンパ組織、頭頂葉、扁桃、全生物体。発現情報は、ＮＯＶ５ｈの配列の誘導体に含まれた配列の組織供給源から導き出された。
【０１９８】
この配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ種におけるアポリポタンパク質Ｅレセプター２、完全ｃｄｓホモログについての密接に関連したヒトｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：Ｄ５０６７８｜ａｃｃ：Ｄ５０６７８．１）の発現パターンに基づき、胎盤において発現されることが予測される。
【０１９９】
ＮＯＶ５ｈにおける同定可能なドメインの存在は、Ｐｆａｍ、ＰＲＯＳＩＴＥ、ＰｒｏＤｏｍ、Ｂｌｏｃｋｓ、またはＰｒｉｎｔｓのようなドメインデータベースに対する検索によって決定され、次いで、Ｉｎｔｅｒｐｒｏドメイン登録番号によって同定された。重要なドメインを、以下にまとめる。
【０２００】
ＩＰＲ００２１７２、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプタークラスＡ（ＬＤＬＲＡ）ドメインは、アミノ酸４５〜アミノ酸８３、アミノ酸８４〜アミノ酸１２４、アミノ酸１２５〜アミノ酸１６５、アミノ酸１６８〜アミノ酸２０６である。低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）は、血漿の主要なコレステロール運搬リポタンパク質である。レセプタータンパク質はＬＤＬに結合し、そしてエンドサイトーシスによってＬＤＬを細胞中に輸送する。内部移行されるために、レセプター−リガンド複合体は、まず、クラスリンで覆われた穴にクラスター形成されなければならない。約４０アミノ酸の７個連続したシステインリッチ反復が、この多重ドメイン膜タンパク質のＮ末端に存在する。ＬＤＬレセプタークラスＡドメインは、６個のジスルフィド結合システインおよび高度に保存された負荷電アミノ酸のクラスターを含み、これらのうちの多くは、モジュールの一つの面にクラスター形成される。ＬＤＬレセプターにおいて、クラスＡドメインは、ＬＤＬおよびカルシウムについての結合部位を形成する。第４番目のシステインと第６番目のシステインとの間の酸性残基が、ＬＤＬＲのリガンドにおける正荷電配列の高親和性結合のために重要である。この反復は、βヘアピン構造と、それに続く一連のβターンとから構成されることが示された。カルシウムの結合は、何ら重要なコンフォメーション変化を誘導しないようである。これらの反復に続くのは、上皮増殖因子（ＥＧＦ）前駆体の部分に類似する３５０残基のドメインである。類似のドメインは、いくつかの細胞外タンパク質および膜タンパク質において見出された。
【０２０１】
ＩＰＲ００００３３、ＹＷＴＤ反復は、アミノ酸３４６〜アミノ酸３９１、アミノ酸３９３〜アミノ酸４３４、アミノ酸４３６〜アミノ酸４７８、アミノ酸４８０〜アミノ酸５２３、アミノ酸５２４〜アミノ酸５６４である。このドメインはまた、この反復の最も保存された領域の後ろにあるＹＷＴＤモチーフとしても公知である。ＹＷＴＤ反復は、複数の縦列反復配列において見出され、そしてβプロペラ構造を形成することが予期された。これは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来のビテロゲニンレセプター、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプター、プレプロ上皮増殖因子、ニドジェン（エンタクチン）などを含む種々のタンパク質において見出される。
【０２０２】
ＩＰＲ０００５６１、ＥＧＦ様ドメインは、アミノ酸２２４〜アミノ酸２５８、アミノ酸２６４〜アミノ酸２９８、アミノ酸５７４〜アミノ酸６１８である。上皮増殖因子（ＥＧＦ）の配列において見出される約３０〜４０アミノ酸残基長の配列は、多少保存された形態において、多数の他の（主に動物の）タンパク質において存在することが示された。ＥＧＦ様パターンの１以上のコピーを含むことが現在知られているタンパク質のリストは、大規模かつ多様である。関連のないタンパク質であると思われるタンパク質におけるＥＧＦドメインの機能的重要性は、未だ明らかではない。しかし、共通の特徴は、これらの反復が、膜結合タンパク質の細胞外ドメインまたは分泌されることが公知のタンパク質において見出されるという点である（例外：プロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ）。ＥＧＦドメインは、ジスルフィド結合に関与することが示されている（ＥＧＦにおいて）６個のシステイン残基を含む。この主要な構造は、二本鎖のβシートと、それに続く、Ｃ末端の短い二本鎖シートへのループである。保存されたシステインの間のサブドメインは、長さにおいて変動する。
【０２０３】
これにより、本発明の配列は、この／これらのドメインを含むことが公知の他のタンパク質の特性と類似した特性、およびこれらのドメインの特性と類似した特性を有することが示される。
【０２０４】
（ＮＯＶ５ｉ）
開示されたＮＯＶ５ｉ核酸は、ＮＯＶ５ｉの配列が、研究室でのｃＤＮＡフラグメントのクローニングによって、その配列のインシリコ予測によって導き出されたことによって単離された。ＤＮＡ配列の全長、もしくはその配列の部分、またはその両方のいずれかを網羅するｃＤＮＡフラグメントをクローニングした。インシリコ予測は、ＣｕｒａＧｅｎの独自の配列データベースまたは公的なヒト配列データベースにおいて利用可能な配列に基づき、そして全長ＤＮＡ配列またはそのいくつかの部分のいずれかを提供した。新規なアポリポタンパク質ｅ様タンパク質をコードする４２９４ヌクレオチドの新規なＮＯＶ５ｉ配列（ＣＧ５５２５６−０７ともいう）を、表５Ｑに示す。ヌクレオチド１０３〜１０５のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド２８１８〜２８２０のＴＧＡコドンで終結するオープンリーディングフレームが同定された。表５Ｑでは、開始コドンよりも上流の推定非翻訳領域および終止コドンより下流の推定非翻訳領域に下線を付し、そして開始コドンおよび終止コドンを、太字とする。
【０２０５】
【表５Ｑ】
2004516820.tif 000072
2004516820.tif 000073
ＮＯＶ５ｉ配列は、エキソン連結プロセスを通して同定された。ＰＣＲプライマーを、順方向プライマーについては、利用可能な最も上流の配列で開始し、そして逆方向プライマーについては、利用可能な最も下流の配列で開始させることによって設計した。各々の場合で、適切な配列（固有または高度に選択性のいずれかである）に遭遇するまで、または逆方向プライマーの場合には、終止コドンに到達するまで、それぞれの末端からコード配列に向かって内向きにウォーキングさせて、この配列を試験した。次いで、このような適切な配列を、広範なｃＤＮＡ種を含むライブラリーに基づくＰＣＲ増幅において、順方向プライマーおよび逆方向プライマーとして使用した。得られたアンプリコンをゲル精製し、クローニングし、そして高い冗長性に対して配列決定して、ＮＯＶ５ｉ配列を提供した。
【０２０６】
ＮＯＶ５ｉ核酸は、ヒト第１染色体のｐ３４領域に同定され、そしてＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：Ｄ５０６７８｜ａｃｃ：Ｄ５０６７８．１  ｍＲＮＡ（アポリポタンパク質Ｅレセプター２、完全ｃｄｓについてのヒトｍＲＮＡ）と同一な、３３８９塩基のうちの３３７５塩基（９９％）を有する（Ｅ＝０．０）。
【０２０７】
配列番号３０によってコードされる開示されたＮＯＶ５ｉポリペプチド（配列番号３１）は、９０５アミノ酸残基であり、そして表５Ｒにおいて、一文字コードを用いて表される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔ、および／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果によって、ＮＯＶ５ｉが、シグナルペプチドを有し、そして０．６７６０の確実性で形質膜に局在化される可能性があることが予測されている。他の実施形態では、ＮＯＶ５ｉはまた、０．１０００の確実性で小胞体（膜）に局在化し得るか、０．１０００の確実性で小胞体（内腔）に局在化し得るか、または０．１０００の確実性で細胞外であり得る。ＮＯＶ５ｉペプチドについて最も可能性が高い切断部位は、アミノ酸３２と３３との間（ＡＡＡ−ＡＡ）である。
【０２０８】
【表５Ｒ】
2004516820.tif 000074
開示されたＮＯＶ５ｉアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来の９６３アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ１４１１４タンパク質（アポリポタンパク質Ｅレセプター２前駆体）と同一である、６２７アミノ酸残基のうちの６２５アミノ酸残基（９９％）、および類似である、６２７アミノ酸残基のうちの６２６アミノ酸残基（９９％）を有する（Ｅ＝０．０）。
【０２０９】
ＮＯＶ５ｉは、少なくとも以下の組織において発現される：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮、大脳髄質／大脳白質、結腸、肺、リンパ組織、頭頂葉、扁桃、全生物体。発現情報は、ＮＯＶ５ｉの配列の誘導体に含まれた配列の組織供給源から導き出された。
【０２１０】
この配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ種におけるアポリポタンパク質Ｅレセプター２、完全ｃｄｓホモログについての密接に関連したヒトｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：Ｄ５０６７８｜ａｃｃ：Ｄ５０６７８．１）の発現パターンに基づき、胎盤において発現されることが予測される。
【０２１１】
ＮＯＶ５ｉにおける同定可能なドメインの存在は、Ｐｆａｍ、ＰＲＯＳＩＴＥ、ＰｒｏＤｏｍ、Ｂｌｏｃｋｓ、またはＰｒｉｎｔｓのようなドメインデータベースに対する検索によって決定され、次いで、Ｉｎｔｅｒｐｒｏドメイン登録番号によって同定された。重要なドメインを、以下にまとめる。
【０２１２】
ＩＰＲ００２１７２、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプタークラスＡ（ＬＤＬＲＡ）ドメインは、アミノ酸４５〜アミノ酸８３、アミノ酸８４〜アミノ酸１２４、アミノ酸１２５〜アミノ酸１６３、アミノ酸１６５〜アミノ酸２０７である。低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）は、血漿の主要なコレステロール運搬リポタンパク質である。レセプタータンパク質はＬＤＬに結合し、そしてエンドサイトーシスによってＬＤＬを細胞中に輸送する。内部移行されるために、レセプター−リガンド複合体は、まず、クラスリンで覆われた穴にクラスター形成されなければならない。約４０アミノ酸の７個連続したシステインリッチ反復が、この多重ドメイン膜タンパク質のＮ末端に存在する。ＬＤＬレセプタークラスＡドメインは、６個のジスルフィド結合システインおよび高度に保存された負荷電アミノ酸のクラスターを含み、これらのうちの多くは、モジュールの一つの面にクラスター形成される。ＬＤＬレセプターにおいて、クラスＡドメインは、ＬＤＬおよびカルシウムについての結合部位を形成する。第４番目のシステインと第６番目のシステインとの間の酸性残基が、ＬＤＬＲのリガンドにおける正荷電配列の高親和性結合のために重要である。この反復は、βヘアピン構造と、それに続く一連のβターンとから構成されることが示された。カルシウムの結合は、何ら重要なコンフォメーション変化を誘導しないようである。これらの反復に続くのは、上皮増殖因子（ＥＧＦ）前駆体の部分に類似する３５０残基のドメインである。類似のドメインは、いくつかの細胞外タンパク質および膜タンパク質において見出された。
【０２１３】
ＩＰＲ００００３３、ＹＷＴＤ反復は、アミノ酸４０４〜アミノ酸４４９、アミノ酸４５１〜アミノ酸４９２、アミノ酸４９４〜アミノ酸５３６、アミノ酸５３８〜アミノ酸５８１、アミノ酸５８２〜アミノ酸６２２である。このドメインはまた、この反復の最も保存された領域の後ろにあるＹＷＴＤモチーフとしても公知である。ＹＷＴＤ反復は、複数の縦列反復配列において見出され、そしてβプロペラ構造を形成することが予期された。これは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来のビテロゲニンレセプター、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプター、プレプロ上皮増殖因子、ニドジェン（エンタクチン）などを含む種々のタンパク質において見出される。
【０２１４】
ＩＰＲ０００５６１、ＥＧＦ様ドメインは、アミノ酸３２２〜アミノ酸３５６、アミノ酸６３２〜アミノ酸６７６である。上皮増殖因子（ＥＧＦ）の配列において見出される約３０〜４０アミノ酸残基長の配列は、多少保存された形態において、多数の他の（主に動物の）タンパク質において存在することが示された。ＥＧＦ様パターンの１以上のコピーを含むことが現在知られているタンパク質のリストは、大規模かつ多様である。関連のないタンパク質であると思われるタンパク質におけるＥＧＦドメインの機能的重要性は、未だ明らかではない。しかし、共通の特徴は、これらの反復が、膜結合タンパク質の細胞外ドメインまたは分泌されることが公知のタンパク質において見出されるという点である（例外：プロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ）。ＥＧＦドメインは、ジスルフィド結合に関与することが示されている（ＥＧＦにおいて）６個のシステイン残基を含む。この主要な構造は、二本鎖のβシートと、それに続く、Ｃ末端の短い二本鎖シートへのループである。保存されたシステインの間のサブドメインは、長さにおいて変動する。
【０２１５】
このことは、本発明の配列が、この／これらのドメインを含むことが公知である他のタンパク質の配列に類似する特性を有し、そしてこれらのドメインの特性に類似する特性を有することを示す。
【０２１６】
ＮＯＶ５ａはまた、表５Ｓに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対する相同性を有する。
【０２１７】
【表５Ｓ】
2004516820.tif 000075
これらの配列の相同性は、表５Ｔに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析中に図解的に示される。
【０２１８】
【表５Ｔ】
2004516820.tif 000076
2004516820.tif 000077
2004516820.tif 000078
2004516820.tif 000079
2004516820.tif 000080
2004516820.tif 000081
表５Ｕ〜Ｙは、ＮＯＶ５ａに対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの記載を列挙する。これは、ＮＯＶ５ａ配列がこのドメインを含むことが公知である他のタンパク質の配列に類似する特性を有することを示す。
【０２１９】
【表５Ｕ】
2004516820.tif 000082
【０２２０】
【表５Ｖ】
2004516820.tif 000083
【０２２１】
【表５Ｗ】
2004516820.tif 000084
【０２２２】
【表５Ｘ】
2004516820.tif 000085
【０２２３】
【表５Ｙ】
2004516820.tif 000086
ＮＯＶ５ａはまた、表５Ｚに示されるｐａｔｐデータベースのメンバーに対して高い相同性を有する。
【０２２４】
【表５Ｚ】
2004516820.tif 000087
ＮＯＶ５ｃはまた、表５ＡＡに示されるｐａｔｐデータベースのメンバーに対して高い相同性を有する。
【０２２５】
【数４】
2004516820.tif 000088
アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）は、カイロミクロンレムナント、中程度の密度のリポタンパク質、非常に低密度のリポタンパク質（ＶＬＤＬ）、β−移動性（ｍｉｇｒａｔｉｎｇ）ＶＬＤＬ（β−ＶＬＤＬ）および高密度リポタンパク質（ａｐｏＥを有する）を含む種々のリポタンパク質の主要成分として、主に血漿中を循環する、３４ｋＤａの親油性タンパク質である。ａｐｏＥは、これらのリポタンパク質の細胞認識および内部移行を担う重要な分子である。生化学的研究および遺伝学的研究は、ａｐｏＥが、カイロミクロンレムナントおよびＶＬＤＬレムナントの血漿からの肝クリアランスに関することを示した。アポリポタンパク質Ｅレセプター２は、高親和性を有するａｐｏＥリッチなβ−ＶＬＤＬを結合し、そしてこのβ−ＶＬＤＬを細胞内に内部移行させる。
【０２２６】
アポリポタンパク質Ｅレセプター２は、低密度および非常に低密度のリポタンパク質レセプター（ＬＤＬ−Ｒ）のファミリーに属するレセプターである。このファミリーは、リソソームによる分解に関して細胞外リガンドを認識しかつ細胞外リガンドを内部移行させる細胞表面レセプターからなる。このファミリーメンバーは、４つの主要な構造モジュールを含む：システインリッチな相補型リピート、上皮増殖因子前駆体様リピート、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメイン。各構造的モジュールは、異なりかつ重要な機能を供給する。これらのレセプターは、いくつかの構造的に異なるリガンドを結合する。一次配列の代わりに、異なるリガンドにおける陽性の静電ポテンシャルがレセプター結合ドメインを構成することを提唱する。このファミリーのレセプターは、種々の生理学的機能において重要な役割を担う。ＬＤＬ−Ｒは、コレステロールホメオスタシスにおいて重要な役割を果たす。変異は、家族性高コレステロール症および早発性冠動脈疾患を生じる。ＬＤＬ−Ｒ関連タンパク質は、血漿活性化α−２−マクログロブリンおよびアポリポタンパク質Ｅリッチなリポタンパク質のクリアランスにおいて重要な役割を果たす。ＬＤＬ−Ｒ関連タンパク質は、胎児発生に必須であり、そしてアルツハイマー病に関連する。これらのレセプターの発現の調節は、転写レベルで生じる。ＬＤＬ−Ｒの発現は、新規膜結合転写因子を含む細胞内ステロールのレベルによって調節される。しかし、全ての膜が、ホルモンおよび増殖因子によって調節されるが、ホルモンによる調節の機構は解明されていない。
【０２２７】
本発明のＮＯＶ５核酸およびタンパク質は、以下に関連する潜在的な治療適用に有用である：アテローム硬化症、異βリポ蛋白血症、高リポ蛋白血症ＩＩＩ型、黄色腫症、冠状および／または末梢の脈管疾患、甲状腺機能低下症、全身性エリテマトーデス、糖尿病性アシドーシス、高コレステロール血症、平面（ｐｌａｎａｒ）および腱の黄色腫、異βリポ蛋白血症、高コレステロール血症、急性脈管疾患、アルツハイマー病、家族性アミロイドーシス多発性神経障害、ならびに他の疾患、障害および状態。ＬＤＬレセプター関連タンパク質、アポリポタンパク質Ｅレセプター２および非常に低密度なリポタンパク質（ＶＬＤＬ）レセプターは、脳で優先的に発現され、そしてこれらは、種々のレベルでアルツハイマー病（Ｍｉｃｒｏｓｃ  Ｒｅｓ  Ｔｅｃｈ  ２０００  Ａｕｇ  １５；５０（４）：２７３−７）ならびに／または他の病理学および障害に関連することが推測されている。例えば、アポリポタンパク質ｅ様タンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に有用であり、そしてアポリポタンパク質ｅ様タンパク質は、その必要性のある被験体に投与される場合に有用であり得る。非限定的例示の目的で、本発明の組成物は、以下を罹患する患者の処置に対する効力を有する：アテローム硬化症、異βリポ蛋白血症、高リポ蛋白血症ＩＩＩ型、黄色腫症、冠状および／または末梢の脈管疾患、甲状腺機能低下症、全身性エリテマトーデス、糖尿病性アシドーシス、高コレステロール血症、平面（ｐｌａｎａｒ）および腱の黄色腫、異βリポ蛋白血症、高コレステロール血症、加速性の脈管疾患、アルツハイマー病、家族性アミロイドーシス多発性神経障害、ならびに他の疾患、障害および状態。ＮＯＶ５核酸またはそのフラグメントはさらに、診断適用に有用であり得、ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が、評価される。
【０２２８】
ＮＯＶ５核酸およびポリペプチドはまた、治療法または診断法における使用のための本発明の新規物質を免疫特異的に結合する抗体の生成に有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の項に記載されるような疎水性チャートからの予想を使用する、当該分野において公知の方法に従って生成され得る。例えば、開示されるＮＯＶ５ａタンパク質、ＮＯＶ５ｅタンパク質およびＮＯＶ５ｆタンパク質は、複数の疎水性領域を有し、これらの各々は、免疫原として使用され得る。１つの実施形態において、企図されるＮＯＶ５ａエピトープ、ＮＯＶ５ｅエピトープおよびＮＯＶ５ｆエピトープは、およそのアミノ酸８０〜２２０である。他の実施形態において、ＮＯＶ５ａエピトープ、ＮＯＶ５ｅエピトープおよびＮＯＶ５ｆエピトープは、およそのアミノ酸２５０〜３４０、およそのアミノ酸３７０〜５４０、およそのアミノ酸５９０〜６５０、またはおよそのアミノ酸６８０〜７２０である。この新規タンパク質はまた、種々のヒト障害の機能的分析のための強力なアッセイ系の開発において価値を有し、これは、疾患の病理学の理解および種々の障害に対する新たな薬物標的の開発の助けとなる。
【０２２９】
開示したＮＯＶ５ｂタンパク質は、複数の疎水性領域を有し、これらの各々は、免疫原として使用され得る。１つの実施形態において、企図されるＮＯＶ５ｂエピトープは、およそのアミノ酸８０〜２８０である。他の実施形態において、ＮＯＶ５ｂエピトープは、およそのアミノ酸２９０〜３５０、およそのアミノ酸３９０〜５６０、およそのアミノ酸６００〜６７０、またはおよそのアミノ酸６９０〜７５０である。この新規タンパク質はまた、種々のヒト障害の機能的分析のための強力なアッセイ系の開発において価値を有し、これは、疾患の病理学の理解および種々の障害に対する新たな薬物標的の開発の助けとなる。
【０２３０】
開示したＮＯＶ５ｃタンパク質は、複数の疎水性領域を有し、これらの各々は、免疫原として使用され得る。１つの実施形態において、企図されるＮＯＶ５ｃエピトープは、およそのアミノ酸５０〜２２０である。他の実施形態において、ＮＯＶ５ｃエピトープは、およそのアミノ酸２５０〜２８０、およそのアミノ酸３００〜４８０、およそのアミノ酸５５０〜６３０、およそのアミノ酸６５０〜６７０、およそのアミノ酸６９０〜７６０、またはおよそのアミノ酸７７０〜８００である。この新規タンパク質はまた、種々のヒト障害の機能的分析のための強力なアッセイ系の開発において価値を有し、これは、疾患の病理学の理解および種々の障害に対する新たな薬物標的の開発の助けとなる。
【０２３１】
開示したＮＯＶ５ｄタンパク質は、複数の疎水性領域を有し、これらの各々は、免疫原として使用され得る。１つの実施形態において、企図されるＮＯＶ５ｄエピトープは、およそのアミノ酸５０〜１８０である。他の実施形態において、ＮＯＶ５ｄエピトープは、およそのアミノ酸１９０〜２３０、およそのアミノ酸２５０〜３９０、およそのアミノ酸４２０〜５５０、およそのアミノ酸４７０〜６５０、およそのアミノ酸７８０〜８５０、およそのアミノ酸８７０〜９００、およそのアミノ酸９２０〜９８０、またはおよそのアミノ酸９９０〜１０５０である。この新規タンパク質はまた、種々のヒト障害の機能的分析のための強力なアッセイ系の開発において価値を有し、これは、疾患の病理学の理解および種々の障害に対する新たな薬物標的の開発の助けとなる。
【０２３２】
開示したＮＯＶ５ｇタンパク質およびＮＯＶ５ｈタンパク質は、複数の疎水性領域を有し、これらの各々は、免疫原として使用され得る。１つの実施形態において、企図されるＮＯＶ５ｇエピトープおよびＮＯＶ５ｈエピトープは、およそのアミノ酸３０〜２２０である。他の実施形態において、ＮＯＶ５ｇエピトープおよびＮＯＶ５ｈエピトープは、およそのアミノ酸２５０〜３３０、およそのアミノ酸３５０〜５４０、およそのアミノ酸５５０〜６８０、およそのアミノ酸６９０〜７２０、およそのアミノ酸７５０〜７８０、またはおよそのアミノ酸７９０〜８５０である。この新規タンパク質はまた、種々のヒト障害の機能的分析のための強力なアッセイ系の開発において価値を有し、これは、疾患の病理学の理解および種々の障害に対する新たな薬物標的の開発の助けとなる。
【０２３３】
開示したＮＯＶ５ｉタンパク質は、複数の疎水性領域を有し、これらの各々は、免疫原として使用され得る。１つの実施形態において、企図されるＮＯＶ５ｉエピトープは、およそのアミノ酸５〜１５０である。他の実施形態において、ＮＯＶ５ｉエピトープは、およそのアミノ酸１９０〜２３０、およそのアミノ酸１７０〜３２０、またはおよそのアミノ酸３６０〜４５０である。この新規タンパク質はまた、種々のヒト障害の機能的分析のための強力なアッセイ系の開発において価値を有し、これは、疾患の病理学の理解および種々の障害に対する新たな薬物標的の開発の助けとなる。
【０２３４】
（ＮＯＶ６）
新規肥満細胞腫プロテアーゼ前駆体様タンパク質をコードする８４３ヌクレオチドである、開示したＮＯＶ６核酸（ＳＣ＿１２９２９６１１９−Ａともいわれる）は、表６Ａに示される。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド２６〜２８でのＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド８３６〜８３８でのＴＡＧコドンで終止することが同定された。開始コドンから上流でありかつ終止コドンから下流の推定の非翻訳領域に、表６Ａ中で下線を付し、そして開始コドンおよび終止コドンは、太字である。
【０２３５】
【表６Ａ】
2004516820.tif 000089
開示したＮＯＶ６核酸配列は、Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（Ｄｏｇ）  ＭＡＳＴＯＣＹＴＯＭＡ  ＰＲＯＴＥＡＳＥ  ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ  ｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＤＯＧＭＣＴＲＰＢ）に対して、７６３塩基のうち５７０同一（７４％）な塩基を有する（Ｅ＝１．１ｅ−８０）。
【０２３６】
配列番号３２によってコードされる開示したＮＯＶ６ポリペプチド（配列番号３３）は、２７０アミノ酸残基であり、そして表６Ｂ中で一文字アミノ酸コードを使用して示される。シグナルＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ６がシグナルペプチドを含み、そして０．４５００の確実性でサイトゾルに局在するようであることを、予想する。ＮＯＶ６ペプチドについて最も確からしい切断部位は、アミノ酸２０と２１との間（ＫＶＧ−ＩＴ）である。
【０２３７】
【表６Ｂ】
2004516820.tif 000090
開示したＮＯＶ６アミノ酸配列は、Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（Ｄｏｇ）由来の２６９アミノ酸残基のＭＡＳＴＯＣＹＴＯＭＡ  ＰＲＯＴＥＡＳＥ  ＰＲＥＣＵＲＳＯＲタンパク質（ｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｐ１９２３６）に対して、２６８アミノ酸残基のうち同一な１６５のアミノ酸残基（６１％）、および２６８アミノ酸残基のうち陽性な１８６のアミノ酸残基（６９％）を有する（Ｅ＝３．０ｅ−８１）。一般的配列相同性（ＮＯＶ６の全長配列とＦＡＳＴＡアラインメントによって規定されるような）は、６６．１７１％アミノ酸相同性および６１．３３８％アミノ酸同一性である。さらに、このタンパク質は、示されたヌクレオチド位で（Ｉｎｔｅｒｐｒｏによって規定されるような）以下のタンパク質ドメインを含む：アミノ酸位２１〜２６０でのトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）ドメイン（ＩＰＲ００１２５４）。
【０２３８】
ＮＯＶ６はまた、表６Ｆ中に列挙されるＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対する相同性を有する。
【０２３９】
【表６Ｆ】
2004516820.tif 000091
これらの配列の相同性は、表６Ｇに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析中に図解的に示される。
【０２４０】
【表６Ｇ】
2004516820.tif 000092
2004516820.tif 000093
表６Ｈは、ＮＯＶ６に対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメイン記載を列挙する。これは、ＮＯＶ６配列がこのドメインを含むことが公知の他のタンパク質の配列に類似する特性を有することを示す。
【０２４１】
【表６Ｈ】
2004516820.tif 000094
【０２４２】
【表６Ｉ】
2004516820.tif 000095
肥満細胞トリプターゼは、肥満細胞の脱顆粒の間に細胞外に放出される、トリプシン様の特異性を有するセリンプロテアーゼ関連の分泌顆粒である。このトリプターゼ配列は、触媒の三つ組（ｔｒｉａｄ）の必須残基、ならびにトリプシン作用性セリンプロテアーゼにＰ１  ＡｒｇおよびＬｙｓの特異性を付与する推定の基質結合ポケットの基部のアスパラギン酸を含む。明白なＮ末端シグナル／活性化ペプチドは、グリシンで終止する。この位置のグリシンは、これまでにセリンプロテアーゼには観察されなく、そして新規な活性様式を示唆する。
【０２４３】
インビボでの肥満細胞活性化は、浮腫の領域および結合組織分解にしばしば関連する。トリプターゼおよびカイメースは、肥満細胞によって放出される主要なセリンプロテイナーゼであるが、これらは、細胞外マトリクスの主要成分に対してほとんど活性を有さない。マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、結合組織要素のほとんど全てを分解することが意図され、そして不活性な前駆体の形態で細胞によって分泌される。インビボでのＭＭＰ活性化の機構がほとんど理解されていないので、本発明者らは、ヒトコラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）、ストロメリシン（ＭＭＰ−３）、ゼラチナーゼＡ（ＭＭＰ−２）およびゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ−９）の前駆体型を活性化する、肥満細胞プロテイナーゼの潜在能力を試験した。精製したイヌ肥満細胞腫細胞から調製した肥満細胞プロテイナーゼは、ＭＭＰ−１およびＭＭＰ−３の両方の精製した前駆体形態を処理および活性化することを示された。アンチパインおよびキモスタチン（それぞれ、トリプターゼおよびカイメースのインヒビター）を使用して、ｐＭＭＰ−１およびｐＭＭＰ−３の両方がカイメース成分によって効果的に処理および活性化されたことを示した。対照的に、トリプターゼはｐＭＭＰ−３のみを活性化した。肥満細胞プロテイナーゼは、精製した前駆体形態のＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９を処理も活性化もし得なかった。しかし、肥満細胞プロテイナーゼによって予め活性化されたＭＭＰ−３が、ｐＭＭＰ−９を活性化したがｐＭＭＰ−２を活性化しなかったことが示された。本発明者らは、肥満細胞がこれら４つのメタロ酵素を発現する証拠を有さないので、肥満細胞セリンプロテイナーゼの放出、その後の活性化／脱顆粒化は、局所的メタロプロテイナーゼ活性化，その後のマトリクス分解を構成し得た。
【０２４４】
肥満細胞プロテアーゼトリプターゼおよびカイメースは、肥満細胞中の総タンパク質の５分の１を構成することが長く知られていた。しかし、これらの生物学的機能は、これらの生物学的機能を研究するために十分量の酵素を得る際の困難性に起因して、研究するに容易ではなかった。近年、本発明者らは、両方の酵素を均一に精製するためのイヌ肥満細胞腫細胞の不変株が、幸運にも利用可能になった。そして本発明者らは、これらの精製した酵素を２つの方法で使用した。第１に、一連の生物学的研究において、本発明者らは、喘息および嚢胞性線維症のような疾患の病理学に重要な知見を提供し得る、酵素の独特かつ有力な作用を見出した。重要な生物学的活性はまた、他の組織においても存在するようである。これらの構造のために、肥満細胞プロテアーゼは、その放出部位の近くで作用するようである。よって、特定の部位でのトリプターゼおよびカイメースの存在および量は、組織応答において重要な役割を果たし得る。喘息および嚢胞性線維症のような疾患において、これらの肥満細胞酵素の発現が変化し、そしてこれらの変化が病理学的関連に重要であるという証拠が存在する。第２に、本発明者らは、酵素の構造的研究の実施を始めた。本発明者らのグループによる最近のトリプターゼのクローニングは、その機能のよりよい理解を補助すべきである。純粋なタンパク質の結晶学は、さらなる知見を提供すべきであり、そしてこれらの作用を阻害する、強力かつ選択的薬物の合理的開発の基礎であり得る。
【０２４５】
上記で規定した本発明についての情報は、電圧依存的アニオンチャネル様タンパク質（ＮＯＶ６）が「電圧依存的アニオンチャネルファミリー」のメンバーとして機能し得ることを示唆する。従って、本明細書中で同定されたＮＯＶ６核酸およびタンパク質は、以下で示されるような種々の病理学および障害に関連した（しかし、これらに限定されない）潜在的治療適用に有用である。本発明についての潜在的治療適用としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：タンパク質治療、低分子薬物標的、抗体標的（治療的、診断的、薬物標的化／細胞傷害性抗体）、診断マーカーおよび／または予後マーカー、遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子切除）、研究ツール、（本明細書中で規定されるものを含むがこれらに限定されない）全ての組織および細胞型のインビボおよびインビトロでの組織再生。
【０２４６】
ＮＯＶ６の核酸およびタンパク質は、免疫障害および気道病理学（例えば、アレルギー、喘息および嚢胞性線維症）、癌（例えば、肥満細胞腫）、脈管疾患ならびに／または他の病理学および障害に関連する、潜在的治療適用に有用である。例えば、ＮＯＶ６をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に有用であり得、ＮＯＶ６は、その必要のある被験体に投与される場合、有用であり得る。非限定的例示の目的で、ＮＯＶ６は、免疫障害および気道病理学（例えば、アレルギー、喘息および嚢胞性線維症）、癌（例えば、肥満細胞腫）、および脈管疾患を罹患する患者の処置に対して効力を有する。ＮＯＶ６タンパク質をコードする新規ＮＯＶ６核酸、またはそのフラグメントは、さらに診断適用において有用であり得る。ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価される。これらの物質はさらに、治療法または診断法における使用のための、本発明の新規物質に対して免疫特異的に結合する抗体の生成に有用である。
【０２４７】
ＮＯＶ６核酸およびポリペプチドは、治療法または診断法における使用のための、新規ＮＯＶ６物質に免疫特異的に結合する抗体の生成にさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の項に記載されるような疎水性チャートからの予想を使用する、当該分野において公知の方法に従って生成され得る。この新規タンパク質はまた、種々のヒト障害の機能的分析のための強力なアッセイ系の開発において価値を有し、これは、疾患の病理学の理解および種々の障害に対する新たな薬物標的の開発の助けとなる。
【０２４８】
（ＮＯＶ７）
新規なサイモシンβ−４様レセプタータンパク質をコードする、開示された２３９ヌクレオチドのＮＯＶ７核酸（ＧＭ１０ｄ７＿Ａ）を、表７Ａに示す。オープンリーディングフレームを、ヌクレオチド４０〜４２のＴＣＡ開始コドンで始まり、ヌクレオチド１９０〜０９２のＴＧＡで終わると同定した。表７Ａにおいて、開始コドンと終止コドンを太字にしている。
【０２４９】
【表７Ａ】
2004516820.tif 000096
この開示されたＮＯＶ７核酸配列を、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＴＨＹＭＯＳＩＮ  ＢＥＴＡ−４  ｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：Ｍ１７７３３）に同一な、２４５塩基のうち２０５塩基を有する（Ｅ＝１．４ｅ−３０）。
【０２５０】
配列番号３４によりコードされる開示されたＮＯＶ７ポリペプチド（配列番号３５）は、５０アミノ酸残基であり、表７Ｂに１文字アミノ酸記号を用いて示される。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはヒドロパシーの結果により、ＮＯＶ７は、シグナルペプチドがなく、０．４５００の確実性で細胞質に局在していることが予測された。
【０２５１】
【表７Ｂ】
2004516820.tif 000097
ＮＯＶ７は、染色体５ｐ３５にマッピングされ、少なくとも以下の組織：乳腺、小腸、結腸、精巣および白血球において発現されることが見出された。
【０２５２】
開示されたＮＯＶ７アミノ酸配列は、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ由来のＴＨＹＭＯＳＩＮ  ＢＥＴＡ−４タンパク質（ｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｐ２００６５）の５０アミノ酸残基に対して、４３アミノ酸残基のうち同一な２６アミノ酸残基（８３％）を有し、この５０アミノ酸残基と、４３残基のうち陽性な３７残基（８６％）を有する（２．２ｅ−１２）。全体的な配列相同性（このタンパク質の全長配列とのＦＡＳＴＡアラインメントにより規定される）は、７２．０００％アミノ酸相同性であり、７２．０００％アミノ酸同一性である。
【０２５３】
さらに、ＮＯＶ７は、示されたヌクレオチド位置で以下のタンパク質ドメイン（Ｉｎｔｅｒｐｒｏにより規定される）を含む：アミノ酸８位〜４８位のサイモシンドメイン（ＩＰＲ００１１５２）。
【０２５４】
ＮＯＶ７は、表７Ｃに挙げられるＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対して相同性を有する。
【０２５５】
【表７Ｃ】
2004516820.tif 000098
これらの配列の相同性を、表７Ｄに示すＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図示する。
【０２５６】
【表７Ｄ】
2004516820.tif 000099
ＮＯＶ７はまた、表７Ｅに示されるｐａｔｐデータベースのメンバーに対して高い相同性を有する。
【０２５７】
【表７Ｅ】
2004516820.tif 000100
サイモシンβ−４は、正確な生理学的役割が未だ分かっていない小さなポリペプチドである。これは、末端のデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを誘導する胸腺ホルモンとして始めて単離された。これは、胸腺および脾臓で多量に見出されるが、多くの組織において広く分布している。これはまた、アクチンモノマーに結合し、従って、アクチン重合を阻害することが示されている。これは、造血性多能性幹細胞の増殖に対して阻害活性を有し、そして細胞のサイトゾルに局在する。これは、αインターフェロン、神経増殖因子および線維芽細胞増殖因子により誘導される。これは、サイモシンβファミリーに属する。
【０２５８】
Ａｔｋｉｎｓｏｎ  ＭＪらは、サイモシンβ４が、調節された様式でＲＯＳ  １７／２．８骨肉腫細胞において発現されることを報告した。密接に関連したラット骨肉腫細胞株ＲＯＳ  １７／２．８とＲＯＳ  ２５／１との間のｍＲＮＡの差示的発現を用いて、発現が骨芽細胞表現型と関連する遺伝子を同定した。サイモシンβ４ｃＤＮＡを、ＲＯＳ  １７／２．８およびＲＯＳ  ２５／１細胞から調製した放射性標識ｃＤＮＡとのその差示的ハイブリダイゼーションに基づいて、ＲＯＳ  １７／２．８相補的ＤＡＮライブラリーからクローニングした。ノーザンブロット分析により、サイモシンβ４（今までのところは、推定免疫調節ホルモンである）が実際に差示的に発現されることを確認した。定常状態のｍＲＮＡレベルは、あまり骨芽細胞様ではないＲＯＳ  ２５／１と比較して、骨芽細胞様表現型を示すＲＯＳ  １７／２．８細胞において数倍高かった。サイモシンβ４転写物はまた、ラットＵＭＲ  １０６骨肉腫細胞において、ならびにインタクトな新生仔ラットおよび胎仔ラットの頭蓋冠において検出された。ｃＤＮＡの配列分析により、サイモシンβ４転写物が、より末端にポリアデニル化シグナルでプロセシングされることにより生じ得ることが示された。ＲＯＳ  １７／２．８細胞のデキサメタゾンでの処理により、サイモシンβ４  ｍＲＮＡは増加したが、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の添加により減少した。ＲＯＳ細胞における表現型依存性発現およびステロイドホルモンに対する応答は、サイモシンβ４発現が、骨芽細胞表現型に寄与することを示唆する。
【０２５９】
サイモシンβ（４）（Ｔｂｅｔａ（４））は、化学量論的にアクチンモノマーを結合し、後生動物の細胞におけるアクチンモノマープールの大部分を維持する。Ｔｂｅｔａ（４）結合は、アクチンモノマーのＣｙｓ（３７４）に結合体化したＮ−ヨードアセチル−Ｎ’−（５−スルホ−１−ナフチル）エチレンジアミン（ＡＥＤＡＮＳ）の蛍光をクエンチする。アクチン−Ｔｂｅｔａ（４）複合体のＫ（ｄ）は、アクチンに結合したカチオンおよびヌクレオチドに依存するが、ＡＥＤＡＮＳプローブによっては影響を受けない。異なる安定性は、主に解離速度により決定される。２５℃において、ＭｇＡＴＰ−アクチンを結合するＴｂｅｔａ（４）の自由エネルギーは、本来、主にエンタルピー的であるが、ＣａＡＴＰ−アクチンに関しては、エントロピー的である。結合は、結合した水分子の解離とカップルしており、このことは、ＭｇＡＴＰ−アクチンモノマーよりＣａＡＴＰ−アクチンに関してより大きい。サブドメイン２上のＧｌｙ（４６）におけるＭｇＡＴＰ−アクチン（ＣａＡＴＰ−アクチンではない）のタンパク質分解は、Ｔｂｅｔａ（４）が結合した場合、１２倍より速い。Ｔｂｅｔａ（４）のＣ末端は、Ｈｉｓ（４０）のこの切断部位の近くでアクチンと接触する。トリチウム交換により、Ｔｂｅｔａ（４）は、アクチン上の約８個の迅速に交換されるアミドプロトンの交換速度が遅くなる。本発明者らは、Ｔｂｅｔａ（４）がアクチンモノマーのコンホメーションおよび構造的動力学（「運動（ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）」）を変化させると結論付ける。このコンホメーション変化は、Ｔｂｅｔａ（４）が、アクチンモノマーを封鎖し、ヌクレオチド交換を阻害する能力を反映し得る。
【０２６０】
グルココルチコイドが抗炎症性メディエーターの発現をアップレギュレートさせるという事実は、炎症性疾患における治療に関して刺激的な期待である。なぜなら、これらの分子は、毒性の副作用なしにステロイドの治療的利益を与え得るからである。グルココルチコイドの存在下で培養した単球およびマクロファージの培地は、キャピラリーチューブ移動アッセイにおいて細胞ペレットからの好中球の分散を増加させる。この上清因子は、他の好中球アゴニストとは異なり、均一な濃度で好中球の分散的な移動を促進し、内皮細胞へのこれらの接着を低下させ、ｆＭＬＰへのそれらの走化性応答を阻害し、そして特有の形態学的変化を誘導する。ここで、本発明者らは、サイモシンβ４スルホキシドが、グルココルチコイドの存在下で単球により生成され、炎症性応答を阻害するためのシグナルとして作用することを示す。インビトロでは、サイモシンβ４スルホキシドは、好中球遊走性を阻害し、インビボでは、ネイティブな形態ではなく、酸化型ペプチドがマウスの足におけるカラギーナン誘導性水腫の強力なインヒビターであった。サイモシンβ４は、酸化により、その細胞内Ｇ−アクチン封鎖活性が緩和されるので独特であるが、その細胞外シグナル伝達特性が非常に増強される。サイトゾルタンパク質に細胞外機能を付与するメチオニン酸化という説明は、抗炎症性治療の将来的なストラテジーについての大きく広がる潜在的重要性を有し得る。
【０２６１】
新脈管形成は、障害後に生じる修復プロセスにおいて必須の工程である。この研究において、本発明者らは、脈管形成性胸腺ペプチドサイモシンβ４（Ｔｂｅｔａ４）が、ラットの完全厚創傷モデル（ｆｕｌｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｗｏｕｎｄ  ｍｏｄｅｌ）における創傷治癒を増強するか否かを調査した。Ｔｂｅｔａ４の添加により、局所的にまたは腹腔内で、創傷後４日目に生理食塩水コントロールに対して再上皮形成が４２％、創傷後７日目に６１％程度まで増加した。処置した創傷はまた、７日目までにコントロールより少なくとも１１％縮小した。増強したコラーゲン沈着および新脈管形成が処置した創傷において認められた。本発明者らはまた、Ｔｂｅｔａ４がＢｏｙｄｅｎチャンバアッセイにおいてケラチノサイト移動を刺激したことを見出した。４〜５時間後、１０ｐｇ程度のＴｂｅｔａ４をアッセイ系に添加した場合に、培地単独での移動に対して２〜３倍、移動が刺激された。これらの結果により、Ｔｂｅｔａ４が複数の活性を有する強力な創傷治癒因子であることが示唆される。
【０２６２】
本明細書中に開示されるサイモシンβ４様タンパク質および核酸（ＮＯＶ７）のタンパク質類似性情報、発現パターン、およびマップ位置は、ＮＯＶ７がサイモシンβ４様ファミリーに特徴的な重要な構造的機能および／または生理学的機能を有し得ることを示唆する。従って、本発明のＮＯＶ７核酸およびタンパク質は、潜在的な診断適用および治療的適用において有用である。これらとしては、特異的または選択的な、核酸またはタンパク質の診断および／または予後マーカーとして働くこと（ここで、この核酸またはタンパク質の存在もしくは量が、アッセイされるべきである）、ならびに以下のような潜在的な治療的適用が挙げられる：（ｉ）タンパク質治療剤、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療的抗体、診断的抗体、薬物標的化抗体／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療において有用な核酸（遺伝子送達／遺伝子除去）、および（ｖ）インビトロおよびインビボで組織再生を促進する組成物。
【０２６３】
本発明のＮＯＶ７核酸およびタンパク質は、以下に記載された種々の疾患および傷害ならびに／または他の病理状態に関与する潜在的な診断的適用および治療的適用において有用である。例えば、本発明の組成物は、前立腺癌、免疫学的障害および自己免疫障害（すなわち、甲状腺機能亢進）、脈管形成および創傷治癒、アポトーシスの調節、神経変性障害および神経精神性障害、加齢関連障害、脾臓、胸腺、肺および腹腔内マクロファージに関連する病理学的障害ならびに／または他の病理的状態および障害に離間する患者の処置について効力を有し得る。このＮＯＶ７核酸またはそのフラグメントは、診断的適用においてさらに有用であり得る。ここでこの核酸またはタンパク質の存在または量がアッセイされるべきである。
【０２６４】
ＮＯＶ７核酸およびポリペプチドは、治療方法または診断方法において使用するための本発明の新規な物質に免疫特異的に結合する抗体の生成においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるように、疎水性チャートの推定を用いて、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。例えば、開示されたＮＯＶ７タンパク質は、複数の疎水性領域を有し、その各々は、免疫原として用いられ得る。この新規なタンパク質はまた、種々のヒトの障害の機能的分析のための強力なアッセイ系の開発において価値を有する。これは、疾患の病理の理解および種々の障害のために新たな薬物標的の開発において助けになる。
【０２６５】
（ＮＯＶ８）
新規なタンパク質−チロシン−ホスファターゼ様タンパク質をコードする１３４８ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ８核酸（ＧＭｂａ５５０ｐ２３＿Ａとも呼ばれる）を、表８Ａに示す。オープンリデーリングフレームは、ヌクレオチド５７〜５９のＡＴＧ開始コドンで始まり、ヌクレオチド１３０２〜１３０４のＴＡＡコドンで終わると同定された。開始コドンから上流にある推定非翻訳領域、および終止コドンから下流にある推定非翻訳領域を表８Ａにおいて下線を付し、開始コドンおよび終止コドンを太字の文字にしている。
【０２６６】
【表８Ａ】
2004516820.tif 000101
開示されたＮＯＶ８核酸配列は、第１３染色体にマッピングされ、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  プロテイン−チロシンホスファターゼｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＵＭＰＴＰＡＳＥ）に同一な（９５％）１２９９塩基のうちの１２３７塩基を有する（Ｅ＝６．８ｅ−２６２）。
【０２６７】
配列番号３６によりコードされる、開示されたＮＯＶ８タンパク質（配列番号３７）は、４１５アミノ酸残基を有し、表８Ｂにおいて１文字コードを用いて示される。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果により、ＮＯＶ８が、０．８５００の確実性で小胞体（膜）に局在するようであることが推定される。
【０２６８】
【表８Ｂ】
2004516820.tif 000102
開示されたＮＯＶ８アミノ酸は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来の４１５アミノ酸残基のプロテイン−チロシンホスファターゼ、非レセプター型２タンパク質（ｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ａ３３８９９）と同一な、４１５アミノ酸残基のうちの３８１残基（９１％）、およびこのタンパク質とポジティブな、４１５残基のうちの３９１残基（９４％）を有する（Ｅ＝４．９ｅ−２０７）。
【０２６９】
ＮＯＶ８はまた、表８Ｃに挙げられるＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対して相同性を有する。
【０２７０】
【表８Ｃ】
2004516820.tif 000103
これらの配列の相同性は、表８Ｄに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析においてに図示される。
【０２７１】
【表８Ｄ】
2004516820.tif 000104
2004516820.tif 000105
表８Ｅ〜８Ｇは、ＮＯＶ８に対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメイン説明を列挙する。これは、ＮＯＶ８配列が、このドメインを含むことが既知の他のタンパク質の特性に類似の特性を有することを示す。
【０２７２】
【表８Ｅ】
2004516820.tif 000106
【０２７３】
【表８Ｆ】
2004516820.tif 000107
【０２７４】
【表８Ｇ】
2004516820.tif 000108
ＮＯＶ８は、表８Ｈに示されるｐａｔｐデータベースのメンバーに対して高い相同性を有する。
【０２７５】
【表８Ｈ】
2004516820.tif 000109
ポリペプチド増殖因子および癌遺伝子についての多くの膜貫通型レセプターは、チロシン残基上でのタンパク質のリン酸化を触媒し、このことは、細胞増殖およびおそらく分化における調節役割を示唆する。多くのチロシンキナーゼが特徴付けられている一方で、チロシン残基から特異的にリン酸を除去する酵素については、比較的あまり知られていない。キナーゼおよびホスファターゼはともに、チロシン上でのタンパク質のリン酸化に関与する。酵素活性を調節する際のチロシン脱リン酸化の重要性は、例えば、ＳＲＣ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９００９０）に関して示され、ここで、カルボキシ末端におけるチロシン２１７での脱リン酸化は、活性の増加と関連する。遺伝子がクローニングされ、かつマッピングされているタンパク質−チロシンホスファターゼとしては、胎盤ＰＴＰａｓｅ  １Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ；１７６８８５）、ＣＤ４５（１５１４６０）、およびＬＡＲ（１７９５９０）が挙げられる。Ｔ細胞ＰＴＰａｓｅは、Ｃｏｏｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）によりクローニングされ、彼らは、Ｔ細胞ＰＴＰａｓｅが、すべてのＰＴＰａｓｅに存在する２３６アミノ酸コア領域中のＰＴＰ１Ｂと７２％のアミノ酸同一性を共有することを示した。Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１，１９９２）は、ヒトＰＴＰＴ  ｃＤＮＡを用いて、ヒト／マウスおよびマウス／チャイニーズハムスター体細胞ハイブリッドのそれぞれのサザン分析により、ヒト第１８染色体およびマウス第１８染色体にこの遺伝子を割り当てた。Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）は、ＰＴＰＮ２遺伝子を、蛍光インサイチュハイブリダイゼーションにより１８ｐ１１．３−ｐ１１．２にマッピングした。これらは、１ｑ２２−ｑ２４および１３ｑ１２−ｑ１３上の偽遺伝子と同定された。ゲノムプローブおよびｃＤＮＡプローブの特性の直接的な比較により、同一の条件下で、ゲノムプローブ（エキソンおよびイントロン配列の両方を含む）が、ハイブリダイゼーションの単一特異的部位を容易に同定するのに対し、ｃＤＮＡは、遺伝子およびその偽遺伝子の両方の部位を同定することが示された。これらのことは、高度に関連した配列がゲノム中に存在する場合に遺伝子マッピング研究において繰り返される問題に対処するためのストラテジーであることを示唆した。
【０２７６】
プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）は、細胞レベルのチロシンリン酸化を調節する酵素のファミリーである。細胞位置に基づいて、この酵素は、レセプター様ＰＴＰまたは細胞内ＰＴＰとして分類される。構造および機能の研究は、このクラスの酵素の酵素機構の理解をもたらした。ＰＴＰの適切な標的化は、Ｂ細胞およびＴ細胞の抗原により誘導された増殖性応答を含む多くの細胞シグナル伝達事象に必須である。ＰＴＰの生理学的重要性は、マウスの遺伝子ノックアウト研究、ならびにヒトゲノム配列決定およびマッピングプロジェクトによってさらに明かされる。いくつかのＰＴＰは、ヒト疾患の病理状態において重要であることが示されている。ＰＭＩＤ：１０７２３８００，ＵＩ：２０１８８８７５。
【０２７７】
ニューロン発生の間、細胞は、細胞表面レセプターを介して種々の環境的な合図に応答し、このレセプターは、タンパク質チロシンのリン酸化および脱リン酸化に基づいてシグナル伝達機構に関連する。レセプターおよび非レセプターのチロシンキナーゼは、多くの注目を浴びたが、最近数年間では、レセプター（細胞質膜結合型）および非レセプターのプロテイン−チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）はまた、神経系の発生において重要な役割を果たすことが示されてきた。多くの場合、ＰＴＰは、刺激的な分布パターンを有するか、または特定の細胞接着レセプターおよび増殖因子レセプターと関連することが示されてきた。さらに、ＰＴＰ発現レベルまたは活性を改変することにより、ニューロンの挙動が損なわれる。この検討において、本発明者らは、何が発生、分化およびニューロン生理学におけるＰＴＰの役割について現在知られているかを概説する。
【０２７８】
本明細書中に開示されるプロテイン−チロシンホスファターゼ様タンパク質および核酸（ＮＯＶ８）のタンパク質類似性情報、発現パターン、およびマップ位置は、ＮＯＶ８タンパク質がプロテイン−チロシンホスファターゼＦファミリーに特徴的な、重要な構造的機能および／または生理学的機能を有することを示唆する。従って、本発明のＮＯＶ８核酸およびＮＯＶ８タンパク質は、潜在的な診断適用および治療適用において有用である。これらは、特異的核酸もしくは選択的核酸または特異的タンパク質もしくは選択的タンパク質の診断マーカーおよび／または予後マーカーとして働くことを含み、ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量がアッセイされる。ならびに潜在的な治療適用は、例えば、以下が挙げられる：（ｉ）タンパク質治療剤、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療標的化抗体、診断標的化抗体、薬物標的化抗体／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子除去）において有用な核酸、および（ｖ）インビトロおよびインビボで組織再生を促進する組成物。
【０２７９】
本発明のＮＯＶ８核酸およびＮＯＶ８タンパク質は、以下の種々の疾患および障害ならびに／または他の病理状態に影響を与える潜在的な診断適用および治療適用において有用である。例えば、本発明の組成物は、造血障害；白血病誘発；多発性嚢胞腎疾患；癌発生（例えば、肺癌、肝臓癌および卵巣癌）；アポトーシス；２型糖尿病および肥満症；細胞増殖およびおそらく分化；非ホジキンリンパ腫；筋骨格障害；およびＣＮＳ発生障害に罹患している患者の処置に効力を有する。ＮＯＶ８核酸またはそのフラグメントは、さらに診断適用において有用であり得、ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量がアッセイされるべきである。
【０２８０】
ＮＯＶ８核酸およびＮＯＶ８ポリペプチドは、治療方法または診断方法における視葉のために本発明の新規な物質に免疫特異的に結合する抗体の生成にさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるように、疎水性チャートからの推定を用いて、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。例えば、開示されたＮＯＶ８タンパク質は、複数の親水性領域を有し、これらの各々は、免疫原として使用され得る。この新規なタンパク質はまた、種々のヒト障害のさらなる分析のために強力なアッセイ系の開発において価値がある。これは、疾患の病理状態の理解および種々の障害の新たな薬物の開発の助けになる。
【０２８１】
（ＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチド）
本発明の１つの局面は、ＮＯＶＸポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分をコードする単離された核酸に関する。ＮＯＶＸコード核酸（例えば、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するに十分な核酸フラグメント、およびＮＯＶＸ核酸分子の増幅および／または変異のためのＰＣＲプライマーとして使用するためのフラグメントもまた含まれる。本明細書中で使用される場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを用いて生成されたＤＮＡもしくはＲＮＡのアナログ、これらのフラグメントおよびホモログを含むことが意図される。この核酸分子は、１本鎖または２本鎖であり得るが、好ましくは、２本鎖ＤＮＡである。
【０２８２】
ＮＯＶＸ核酸は、成熟ＮＯＶＸポリペプチドをコードし得る。本明細書中で用いられる場合、本発明において開示されるポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態は、天然に存在するポリペプチドまたは前駆体形態もしくはプロタンパク質の産物である。この天然に存在するポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質としては、限定的な例ではなく、対応する遺伝子によりコードされる全長遺伝子産物が挙げられる。あるいは、これは、本明細書中に記載されるＯＲＦによりコードされるポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質として規定され得る。生成物の「成熟」形態は、この遺伝子産物が生じる細胞、または宿主細胞内で生じ得る場合に、１以上の天然に存在するプロセシング工程の結果として生じ得る。ポリペプチドまたはタンパク質の成熟形態をもたらすこのようなプロセシング工程の例としては、ＯＲＦの開始コドンによりコードされるＮ末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドもしくはリーダー配列のタンパク質分解切断が挙げられる。従って、残基１〜Ｎを有する（ここで、１は、Ｎ末端メチオニンである）前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態は、Ｎ末端メチオニンの除去後に残っている残基２〜Ｎを有する。あるいは、残基１〜Ｎ（ここで、残基１〜残基ＭからのＮ末端シグナル配列が除去される）を有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態は、残っている残基Ｍ＋１〜残基Ｎからの残基を有する。さらに、本明細書中で使用される場合、ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態は、タンパク質分解切断事象以外の翻訳後修飾の工程から生じ得る。このようなさらなるプロセスとしては、限定的な例ではなく、グリコシル化、ミリストイル化またはリン酸化が挙げられる。一般に、成熟ポリペプチドまたはタンパク質は、これらのプロセスのわずか１つの操作またはこれらのプロセスのいずれかの組み合わせから生じ得る。
【０２８３】
本明細書中で用いられる場合、用語「プローブ」は、特定の用途に依存して、種々の長さ（好ましくは、少なくとも約１０ヌクレオチド（ｎｔ）、１００ｎｔ、または例えば、ほぼ６，０００ｎｔ程度）の核酸配列をいう。プローブは、同一の、類似の、または相補的な核酸配列の検出に用いられる。より長い長さのプローブは、一般に、天然供給源または組換え供給源から得られ、より短い長さのオリゴマープローブより高度に特異的かつよりゆっくりとハイブリダイズする。プローブは、１本鎖または２本鎖であり得、そしてＰＣＲ、膜ベースのハイブリダイゼーション技術、またはＥＬＩＳＡ様技術において特異性を有するように設計され得る。
【０２８４】
本明細書中で用いられる場合、用語「単離された」核酸分子は、核酸の天然の供給源に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、「単離された」核酸分子は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中の核酸（すなわち、核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）に天然に隣接する配列がない。例えば、種々の実施形態において、この単離されたＮＯＶＸ核酸分子は、核酸が由来する細胞／組織（例えば、脳、心臓、肝臓、脾臓など）のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に天然に隣接するヌクレオチド配列の約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満を含む。さらに、ｃＤＮＡのような「単離された」核酸分子は、組換え技術により生成された場合、他の細胞物質もしくは培養培地を実質的に含まず、またはこの核酸分子が化学的に合成された場合、化学的前駆体または多の化学物質を実質的に含まない。
【０２８５】
本発明の核酸分子（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６、またはこの前述のヌクレオチド配列の相補体）は、標準的な分子生物学技術および本明細書中に提供される配列情報を用いて単離され得る。ハイブリダイゼーションプローブとして配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６の核酸配列の全部または一部を用いて、ＮＯＶＸ分子は、標準的なハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術を用いて単離され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９３に記載される）。
【０２８６】
本発明の核酸は、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って、テンプレートおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーとして、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、または代わりにゲノムＤＮＡを用いて増幅され得る。このように増幅された核酸は、適切なベクターにクローニングされ得、ＤＮＡ配列分析により特徴付けられる。さらに、ＮＯＶＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術により、例えば、自動化ＤＮＡ合成機を用いて、調製され得る。
【０２８７】
本明細書中で用いられる場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、一連の連結されたヌクレオチド残基をいい、このオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応において使用されるヌクレオチド塩基の十分な数を有する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列に基づき得るか、またはこれらの配列から設計され得、特定の細胞もしくは組織中の同一の、類似の、または相補的なＤＮＡもしくはＲＮＡを増幅、確認またはこれらの存在を明らかにするために用いられ得る。オリゴヌクレオチドは、約１０ｎｔ長、５０ｎｔ長、または１００ｎｔ長、好ましくは、約１５ｎｔ〜３０ｎｔ長を有する、核酸配列の一部を含む。本発明の１つの実施形態において、１００ｎｔ長未満の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６、またはその相補体のさらに少なくとも６つの連続するヌクレオチドをさらに含む。オリゴヌクレオチドは、化学的に合成され得、プローブとしても用いられ得る。
【０２８８】
別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６、またはこのヌクレオチド配列の一部（例えば、プローブもしくはプライマーとして用いられ得るフラグメント、またはＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードするフラグメント）に示されるヌクレオチド配列の相補体である核酸分子を含む。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９に示されるヌクレオチド配列の相補体である核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９に示されるヌクレオチド配列に十分相補的なものであり、これは、配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６に示されるヌクレオチド配列に対してほとんどまたは全くミスマッチなく水素結合して、安定な二重鎖を形成する。
【０２８９】
本明細書中で用いられる場合、用語「相補的」は、核酸分子のヌクレオチドユニット間のワトソンクリック塩基対形成またはフーグスティーン塩基対形成をいい、用語「結合」は、２つのポリペプチドもしくは化合物、または関連ポリペプチドもしくは化合物、またはそれらの組み合わせの間の物理的または化学的な相互作用を意味する。結合としては、イオン結合、非イオン結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが挙げられる。物理的相互作用は、直接的または間接的のいずれかであり得る。間接的相互作用とは、別のポリペプチドまたは化合物の効果を通じて生じ得るか、またはこの効果に起因し得る。直接的結合とは、別のポリペプチドまたは化合物の効果を通じて、またはこの効果に起因して生じない相互作用をいうが、代わりに、他の実質的な化学的中間体がない。
【０２９０】
本明細書中で提供されるフラグメントは、核酸の場合は、特異的ハイブリダイゼーションを可能にするに十分な長さ、またはアミノ酸の場合には、エピトープの特異的認識を可能にするに十分な長さの、少なくとも６つの（連続する）核酸または少なくとも４つの（連続する）アミノ酸の配列としてそれぞれ規定され、このフラグメントは、全長配列より短い、多くていくつかの部分である。フラグメントは、選択された核酸またはアミノ酸の任意の連続する一部分から得られ得る。誘導体は、直接的に、または改変もしくは部分的置換のいずれかによりネイティブの化合物から形成された核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、特定の成分または側鎖に関してネイティブの化合物とは異なる以外は、ネイティブの化合物に類似であるが、同一ではない構造を有する核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、合成であり得るか、または異なる進化起源に由来し得、野生型と比較して、類似もしくは逆の代謝活性を有し得る。ホモログは、異なる種に由来する特定の遺伝子の核酸配列またはアミノ酸配列である。
【０２９１】
誘導体およびアナログは、以下に記載されるように、誘導体またはアナログが、改変された核酸またはアミノ酸を含む場合、全長であってもよいし、全長以外のものでもよい。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体またはアナログとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：種々の実施形態において、同一のサイズの核酸配列またはアミノ酸配列に対して、または整列された配列と比較した場合（ここでこのアラインメントは、当該分野で公知のコンピューター相同性プログラムにより行われ、またはそのコード核酸は、ストリンジェントな、中程度にストリンジェントな、または低いストリンジェントな条件下で前述のタンパク質をコードする配列の相補体とハイブリダイズし得る）、少なくとも約７０％、８０％、または９５％同一（好ましくは８０〜９５％同一）の本発明の核酸またはタンパク質に実質的に相同な領域を含む分子。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９３、および以下を参照のこと。
【０２９２】
「相同な核酸配列」または「相同なアミノ酸配列」あるいはそのバリエーションとは、上記で議論したように、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルで相同性により特徴付けられる配列をいう。相同なヌクレオチド配列は、ＮＯＶＸポリペプチドのアイソフォームをコードするこれらの配列をコードする。アイソフォームは、例えば、ＲＮＡの選択的スプライシングの結果として同じ生物の異なる組織において発現され得る。あるいは、アイソフォームは、異なる遺伝子によりコードされ得る。本発明において、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の種（脊椎動物が挙げられるが、これらに限定されず、従って、例えば、カエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、および他の生物種が挙げられ得る）のＮＯＶＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。相同なヌクレオチド配列としてはまた、天然に存在する対立遺伝子バリエーション、および本明細書中に記載されるヌクレオチド配列の変異が挙げられるが、これらに限定されない。しかし、相同なヌクレオチド配列は、ヒトＮＯＶＸタンパク質をコードする正確なヌクレオチド配列を含む。相同な核酸配列は、配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、および３６における保存的アミノ酸置換（以下を参照のこと）ならびにＮＯＶＸの生物学的活性を有するポリペプチドをコードするそれらの核酸配列を含む。ＮＯＶＸタンパク質の種々の生物学的活性が以下に記載される。
【０２９３】
ＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸ核酸のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によりコードされる。ＯＲＦは、ポリペプチドに潜在的に翻訳され得るヌクレオチド配列に対応する。ＯＲＦを含む核酸のストレッチは、終止コドンにより途切れない。完全タンパク質のコード配列を示すＯＲＦは、ＡＴＧ開始コドンで始まり、３つの「終止」コドン（すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）の１つで終わる。本発明の目的に関して、ＯＲＦは、開始コドン、終止コドンまたはその両方があるか、またはこれらがないコード配列の任意の部分であり得る。ｂｏｎａ  ｆｉｄｅ細胞タンパク質をコードするための良好な候補と考えられるＯＲＦについては、最小のサイズ要件は、しばしば、例えば、５０以上のアミノ酸のタンパク質をコードするＤＮＡのストレッチとして設定される。
【０２９４】
ヒトＮＯＶＸ遺伝子のクローニングから決定されるヌクレオチド配列は、他の細胞型における（例えば、他の組織から）ＮＯＶＸホモログ、ならびに他の脊椎動物からのＮＯＶＸホモログの同定および／またはクローニングにおける使用のために設計されたプローブおよびプライマーの生成を可能にする。プローブ／プライマーは、代表的に、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチドは、代表的には、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９の少なくとも約１２、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００の連続するセンス鎖ヌクレオチド配列；あるいは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；あるいは配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６の天然に存在する変異体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチドの領域を含む。
【０２９５】
ヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に基づくプローブは、同じタンパク質または相同なタンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出するために用いられ得る。種々の実施形態において、このプローブは、これらに結合する標識基をさらに含み得る（例えば、標識基は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る）。このようなプローブは、ＮＯＶＸタンパク質を間違って発現する細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として、例えば、被験体からの細胞のサンプルにおけるＮＯＶＸコード核酸のレベルを測定する（例えば、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡレベルを検出するか、ゲノムＮＯＶＸ遺伝子が変異しているか、または欠失しているか否かを決定する）ことにより用いられ得る。
【０２９６】
「ＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」とは、用量依存性であってもそうでなくても、特定の生物学的アッセイにおいて測定される、本発明のポリペプチドの活性に類似するが、この活性に必ずしも同一ではない活性を示すポリペプチド（成熟形態を含む）をいう。「ＮＯＶＸの生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントは、ＮＯＶＸ生物学的活性（ＮＯＶＸタンパク質の生物学的活性は以下に記載される）を有するポリペプチドをコードする配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９の一部分を単離し、ＮＯＶＸタンパク質のコードされた部分を（例えば、インビトロでの組換え発現により）発現し、ＮＯＶＸのコードされた部分の活性を評価するすることにより、調製され得る。
【０２９７】
（ＮＯＶＸの核酸およびポリペプチドの改変体）
本発明はさらに、遺伝コードの縮重に起因して、配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６に示されるヌクレオチド配列とは異なり、従って、配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６に示されるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質と同じＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子を包含する。別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、または３７に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【０２９８】
配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６に示されるヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に加えて、このＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列における変化を導くＤＮＡ配列多型が、集団（例えば、ヒト集団）内に存在し得ることが、当業者によって理解される。ＮＯＶＸ遺伝子中のこのような遺伝的多型は、天然の対立遺伝子のバリエーションに起因して、集団内の個体間に存在し得る。本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＮＯＶＸタンパク質、好ましくは脊椎動物のＮＯＶＸタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子をいう。このような天然の対立遺伝子のバリエーションは、代表的には、ＮＯＶＸ遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％の分散を生じ得る。天然の対立遺伝子バリエーションの結果であり、かつこのＮＯＶＸポリペプチドの機能的活性を変化させない、ＮＯＶＸポリペプチド内の任意および全てのこのようなヌクレオチドのバリエーションならびに得られるアミノ酸多型は、本発明の範囲内であると意図される。
【０２９９】
さらに、他の種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードし、従って、ヒトの配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあることが意図される。本発明のＮＯＶＸのｃＤＮＡの天然の対立遺伝子改変体およびホモログに対応する核酸分子は、本明細書中に開示されるヒトＮＯＶＸ核酸に対するその相同性に基づいて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標準的なハイブリダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡまたはその一部を用いて単離され得る。
【０３００】
従って、別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも６ヌクレオチド長であり、そしてストリンジェント条件下で配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズする。別の実施形態では、この核酸は、少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、または２０００以上のヌクレオチド長である。なお別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、コード領域にハイブリダイズする。本明細書中で用いられる場合、用語「ストリンジェント条件下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄に関して、互いに少なくとも６０％相同なヌクレオチド配列が代表的には互いにハイブリダイズしたまま残る条件を記載することを意図する。
【０３０１】
ホモログ（すなわち、ヒト以外の種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸）または他の関連配列（例えば、パラログ）は、特定のヒト配列の全てまたは一部をプローブとし、核酸ハイブリダイゼーションおよびクローニングに関して当該分野で周知の方法を使用して、低い、中程度の、または高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションによって入手され得る。
【０３０２】
本明細書で用いられる場合、語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、その条件下で、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが、その標的配列にハイブリダイズするが、その他の配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる状況で異なる。より長い配列は、より短い配列より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで、特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。このＴｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下）温度である。標的配列は一般に過剰で存在するので、Ｔｍでは、５０％のプローブが平衡状態で占有されている。代表的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオンより低く、代表的には約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン（またはその他の塩）であり、そして温度が、短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ）については、少なくとも約３０℃、そしてより長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドについては、少なくとも約６０℃であるような条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような、不安定化剤の添加で達成され得る。
【０３０３】
ストリンジェント条件は、当業者に公知であり、そしてＡｕｓｕｂｅｌら（編），ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出され得る。好ましくは、この条件は、互いに少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％または約９９％相同な配列が、代表的には互いにハイブリダイズしたまま残るような条件である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％  ＢＳＡ、および５００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中での６５℃でのハイブリダイゼーションであり、これは続いて、０．２×ＳＳＣ、０．０１％  ＢＳＡ中での５０℃での１回以上の洗浄を行う。ストリンジェント条件下で配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６の配列にハイブリダイズする、本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書中で使用される場合、「天然に存在する」核酸分子とは、天然に存在する（例えば、天然のタンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有する、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子をいう。
【０３０４】
第２の実施形態では、配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６のヌクレオチド配列、またはそれらのフラグメント、アナログもしくは誘導体を含む核酸分子に、中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列が提供される。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、５５℃での６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％  ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中でのハイブリダイゼーション、続いて１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中での３７℃での１回以上の洗浄である。用いられ得る中程度のストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹおよびＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照のこと。
【０３０５】
第３の実施形態では、配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６のヌクレオチド配列、またはそれらのフラグメント、アナログもしくは誘導体を含む核酸分子に、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る核酸が提供される。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％  ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（重量／容量）デキストラン硫酸中での４０℃でのハイブリダイゼーション、続いて２×ＳＳＣ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１％  ＳＤＳ中での５０℃での１回以上の洗浄である。用いられ得る低ストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である（例えば、種交差ハイブリダイゼーションについて用いられるような条件）。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹならびにＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：６７８９−６７９２を参照のこと。
【０３０６】
（保存的変異）
集団中に存在し得る、ＮＯＶＸ配列の天然に存在する対立遺伝子改変体に加えて、配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６のヌクレオチド配列への変異によって変化が導入され得、それによって、このＮＯＶＸタンパク質の機能的能力を変更することなく、コードされるＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列に変化がもたらされることを、当業者はさらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基にてアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換は、配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、または３７の配列において行われ得る。「非必須」アミノ酸残基は、その生物学的活性を変更することなく、このＮＯＶＸタンパク質の野生型配列から変更され得る残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、このような生物学的活性に必要とされる。例えば、本発明のＮＯＶＸタンパク質の間で保存されているアミノ酸残基は、特に変更を受け入れ難いと予測される。保存的置換がなされ得るアミノ酸は、当該分野で周知である。
【０３０７】
本発明の別の局面は、活性に必須ではないアミノ酸残基における変化を含む、ＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなＮＯＶＸタンパク質は、配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６のアミノ酸配列とは異なるが、生物学的活性をなお保持する。１つの実施形態では、単離された核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、このタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７のアミノ酸配列に少なくとも約４５％相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、この核酸分子によってコードされるタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７に対して少なくとも約６０％相同であり；より好ましくは配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、または３７に対して少なくとも約７０％相同であり；なおより好ましくは、配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、または３７に対してして少なくとも約８０％相同であり；なおより好ましくは、配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、または３７に対して少なくとも約９０％相同であり；そして最も好ましくは、配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、または３７に対して少なくとも約９５％相同である。
【０３０８】
配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、または３７のタンパク質に相同なＮＯＶＸタンパク質をコードする単離された核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６のヌクレオチド配列に１以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより作製され得、その結果、１以上のアミノ酸の置換、付加または欠失が、このコードされるタンパク質に導入される。
【０３０９】
変異は、標準技術（例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）によって配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６に導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、１以上の推定非必須アミノ酸残基にて作製される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される、アミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーとしては、以下が挙げられる：塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アルパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）。従って、ＮＯＶＸタンパク質中の推定非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖のファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形態では、変異は、ＮＯＶＸコード配列の全てまたは一部に沿って（例えば、飽和変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって）ランダムに導入され得、そして得られる変異体は、ＮＯＶＸの生物学的活性についてスクリーニングされて、活性を維持する変異体を同定し得る。配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６の変異誘発に続いて、コードされるタンパク質は、当該分野で公知の任意の組換え技術によって発現され得、そしてこのタンパク質の活性が決定され得る。
【０３１０】
アミノ酸ファミリーの関連性はまた、側鎖の相互作用に基づいて決定され得る。置換されたアミノ酸は、完全に保存された「強い」残基または完全に保存された「弱い」残基であり得る。保存されたアミノ酸残基の「強い」群は、以下の群のいずれかであり得る：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷ（ここで、一文字アミノ酸コードは、互いに置換され得るこれらのアミノ酸残基によりグループ化される）。同様に、保存された残基の「弱い」群は、以下のいずれか１つであり得る：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＶＬＩＭ、ＨＦＹ（ここで、各群内の文字は、一文字アミノ酸コードを表す）。
【０３１１】
１つの実施形態では、変異体ＮＯＶＸタンパク質は、以下についてアッセイされ得る：（ｉ）他のＮＯＶＸタンパク質、他の細胞表面タンパク質、または生物学的に活性なそれらの部分と、タンパク質：タンパク質相互作用を形成する能力、（ｉｉ）変異体ＮＯＶＸタンパク質と、ＮＯＶＸのリガンドとの間の複合体形成；または（ｉｉｉ）変異体ＮＯＶＸタンパク質が細胞内標的タンパク質またはその生物学的に活性な部分に結合する能力；（例えば、アビジンタンパク質）。
【０３１２】
なお別の実施形態において、変異体ＮＯＶＸタンパク質は、特定の生物学的機能を調節する能力（例えば、インスリン放出の調節）についてアッセイされ得る。
【０３１３】
（アンチセンス核酸）
本発明の別の局面は、配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６またはそのフラグメント、アナログもしくは誘導体のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズし得るかまたは相補的である、単離されたアンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的である（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるかまたはｍＲＮＡ配列に相補的である）ヌクレオチド配列を含む。特定の局面では、少なくとも約１０、約２５、約５０、約１００、約２５０もしくは約５００ヌクレオチドまたはＮＯＶＸコード鎖の全体、またはそれらの一部のみに相補的な配列を含む、アンチセンス核酸分子が提供される。配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５もしくは３７のＮＯＶＸタンパク質のフラグメント、ホモログ、誘導体およびアナログをコードする核酸分子、または配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６のＮＯＶＸ核酸配列に相補的なアンチセンス核酸がさらに提供される。
【０３１４】
１つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。用語「コード領域」とは、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含む、ヌクレオチド配列の領域をいう。別の実施形態では、このアンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。用語「非コード領域」とは、コード領域に隣接する、アミノ酸に翻訳されない、５’配列および３’配列をいう（すなわち、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域ともいわれる）。
【０３１５】
本明細書中に開示されるＮＯＶＸタンパク質をコードするコード鎖配列を考慮すれば、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎの塩基対形成の規則に従って設計され得る。アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡのコード領域全体に相補的であり得るが、より好ましくは、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部にのみアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡの翻訳開始部位を取り囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５または約５０ヌクレオチドの長さであり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用いて、化学的合成または酵素連結反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、またはこの分子の生物学的安定性を増大させるように、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計された種々に改変されたヌクレオチドを用いて化学的に合成され得る（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが用いられ得る）。
【０３１６】
アンチセンス核酸を作製するために用いられ得る改変されたヌクレオチドの例としては以下が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイド（シュード）ウラシル、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。あるいは、このアンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされた発現ベクターを用いて生物学的に生成され得る（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、以下の小節にさらに記載されるように、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である）。
【０３１７】
本発明のアンチセンス核酸分子は、代表的には被験体に投与されるか、またはインサイチュで生成され、その結果それらは、ＮＯＶＸタンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、またはそれに結合し、それによってこのタンパク質の発現を阻害する（例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって）。このハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によってか、または例えばＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの主溝における特異的相互作用を介してであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位での直接的注射が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的化するように改変され得、次いで全身に投与され得る。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子は、選択された細胞表面上に発現されたレセプターまたは抗原にそれらが特異的に結合するように改変され得る（例えば、そのアンチセンス核酸分子を細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結することによって）。このアンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に記載されるベクターを用いて細胞に送達され得る。十分な核酸分子を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ  ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれているベクター構築物が、好ましい。
【０３１８】
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、ここで、通常のβ−ユニットとは対照的に、これらの鎖は、互いに平行に延びる（例えば、Ｇａｕｌｔｉｅｒら，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１を参照のこと）。このアンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（例えば、Ｉｎｏｕｅら，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１〜６１４８を参照のこと）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（例えば、Ｉｎｏｕｅら，１９８７，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７〜３３０を参照のこと）を含み得る。
【０３１９】
（リボザイムおよびＰＮＡ部分）
核酸の改変としては、非制限的な例として、改変塩基、および糖リン酸骨格が改変または誘導体化された核酸が挙げられる。これらの改変は、少なくとも一部は、改変された核酸の化学的安定性を増強するために実施され、その結果、それらは、例えば、被験体での治療的適用におけるアンチセンス結合核酸として使用され得る。
【０３２０】
１つの実施形態において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を切断し得るリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子であり、これらは、その一本鎖核酸に対して相補領域を有する。従って、リボザイム（例えば、ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ  １９８８．Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１に記載されるハンマーヘッド型リボザイム）を使用して、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによってＮＯＶＸ  ｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＮＯＶＸをコードする核酸に特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示されるＮＯＶＸ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６）に基づいて設計され得る。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、ＮＯＶＸをコードするｍＲＮＡ内で切断されるヌクレオチド配列に相補的である、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）Ｌ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体が構築され得る。例えば、Ｃｅｃｈらの米国特許第４，９８７，０７１号およびＣｅｃｈらの米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡをまた使用して、ＲＮＡ分子のプールから、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択し得る。例えば、Ｂａｒｔｅｌら、（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１〜１４１８を参照のこと。
【０３２１】
あるいは、ＮＯＶＸ遺伝子発現は、ＮＯＶＸ核酸の調節領域（例えば、ＮＯＶＸのプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化し、標的細胞中でＮＯＶＸ遺伝子の転写を妨害する三重らせん構造を形成することによって阻害され得る。例えば、Ｈｅｌｅｎｅ，１９９１．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．６：５６９〜８４；Ｈｅｌｅｎｅら．１９９２．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６；Ｍａｈｅｒ，１９９２．Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １４：８０７−１５を参照のこと。
【０３２２】
種々の実施形態において、ＮＯＶＸ核酸は、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格で改変され、例えば、その分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは可溶性を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を改変して、ペプチド核酸を生成し得る（例えば、Ｈｙｒｕｐら，１９９６．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４：５−２３を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格が偽ペプチド骨格によって置換され、そして４つの天然の核酸塩基のみが保持されている核酸模倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）をいう。ＰＮＡの中性の骨格は、低いイオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐら，１９９６．前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら，１９９６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１４６７０−１４６７５において記載されるような標準的固相ペプチド合成プロトコルを用いて行われ得る。
【０３２３】
ＮＯＶＸのＰＮＡは、治療的適用および診断的適用において使用され得る。例えば、ＰＮＡは、例えば転写または翻訳の停止を誘導することまたは複製を阻害することによる、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンスまたは抗遺伝子（ａｎｔｉｇｅｎｅ）剤として使用され得る。ＮＯＶＸのＰＮＡはまた、例えばＰＮＡ指向性ＰＣＲクランピング（ｃｌａｍｐｉｎｇ）による遺伝子における一塩基対変異の分析において；他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）と組み合わせて使用される場合の人工制限酵素として（Ｈｙｒｕｐら，１９９６．前出を参照のこと）；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのプローブもしくはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐら，１９９６，前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら，１９９６，前出を参照のこと）、使用され得る。
【０３２４】
別の実施形態において、ＮＯＶＸのＰＮＡは、例えば、それらの安定性または細胞性取り込みを増強するために、ＰＮＡに親油基または他のヘルパー基を結合することによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、またはリポソームもしくは当該分野において公知の薬物送達の他の技術の使用によって改変され得る。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組合せ得る、ＮＯＶＸのＰＮＡ−ＤＮＡキメラが生成され得る。ＰＮＡ部分が高い結合親和性および特異性を提供する一方で、そのようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮａｓｅ  ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用するのを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基のスタッキング、核酸塩基間の結合数および方向を考慮して選択される適切な長さのリンカーを使用して連結され得る（Ｈｙｒｕｐら，１９９６，前出を参照のこと）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐら，１９９６，前出およびＦｉｎｎら，１９９６，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２４：３３５７−３３６３において記載されるように行われ得る。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホルアミダイトカップリング化学を用いて固体支持体上で合成され得、そして改変されたヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイト）が、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間に使用され得る（例えば、Ｍａｇら，１９８９，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １７：５９７３〜５９８８を参照のこと）。次いで、ＰＮＡモノマーが段階様式でカップリングされ、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する（例えば、Ｆｉｎｎら，１９９６，前出を参照のこと）。あるいは、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを用いて、キメラ分子が合成され得る。例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅｎら，１９７５、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９〜１１１２４を参照のこと。
【０３２５】
他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、以下のような他の付属の基を含み得る：ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的化するため）、または細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８〜６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）、もしくは血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）を横切る輸送を容易にする因子。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８〜９７６を参照のこと）、またはインターカレート剤（例えば、Ｚｏｎ，１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９を参照のこと）で改変され得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤など）に結合され得る。
【０３２６】
（ＮＯＶＸポリペプチド）
本発明に従うポリペプチドは、配列が配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、または３７に提供されるＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明はまた、なおそのＮＯＶＸ活性および生理学的機能を維持するタンパク質、またはその機能的フラグメントをコードするが、その任意の残基が配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、もしくは３７に示される対応する残基から変化し得る、変異体または改変体タンパク質を含む。
【０３２７】
一般に、ＮＯＶＸ様機能を保持するＮＯＶＸ改変体は、配列中の特定位置の残基が他のアミノ酸により置換されている任意の改変体を含み、そしてさらに、親タンパク質の２つの残基間にさらなる残基を挿入する可能性、および親配列から１つ以上の残基を欠失する可能性を含む。任意のアミノ酸置換、挿入または欠失が、本発明に包含される。好適な状況では、この置換は、上記で規定されるような保存的置換である。
【０３２８】
本発明の１つの局面は、単離されたＮＯＶＸタンパク質、およびその生物学的に活性な部分、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに関する。抗ＮＯＶＸ抗体を惹起するための免疫原としての使用のために適切なポリペプチドフラグメントもまた提供される。１つの実施形態において、ネイティブなＮＯＶＸタンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を用いる適切な精製スキームによって、細胞または組織供給源から単離され得る。別の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって産生される。組換え発現に代わるものとして、ＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を用いて化学合成され得る。
【０３２９】
「単離された」または「精製された」ポリペプチドまたはタンパク質あるいはその生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質の由来する細胞または組織供給源由来の細胞性物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学合成される場合に化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、ＮＯＶＸタンパク質の調製物を含み、この調製物において、ＮＯＶＸタンパク質が単離または組換え産生される細胞の細胞性成分から、ＮＯＶＸタンパク質は分離されている。１つの実施形態において、用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、非ＮＯＶＸタンパク質（本明細書中において「夾雑タンパク質」とも呼ばれる）を（乾燥重量にて）約３０％未満、より好ましくは非ＮＯＶＸタンパク質を約２０％未満、なおより好ましくは非ＮＯＶＸタンパク質を約１０％未満、そして最も好ましくは非ＮＯＶＸタンパク質を約５％未満有する、ＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え産生される場合、好ましくは、調製物はまた培養培地を実質的に含まない。すなわち、培養培地は、そのＮＯＶＸタンパク質調製物の容量の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは約５％未満を示す。
【０３３０】
用語「化学前駆体も他の化学物質も実質的に含まない」は、タンパク質が、そのタンパク質の合成に関与する化学前駆体からも他の化学物質から分も離されているＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態において、用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、化学前駆体または非ＮＯＶＸの化学物質を約３０％未満（乾燥重量にて）、より好ましくは化学前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を約２０％未満、なおより好ましくは化学前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を約１０％未満、そして最も好ましくは化学前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を約５％未満有する、ＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。
【０３３１】
ＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＮＯＶＸタンパク質より少ないアミノ酸を含み、そしてＮＯＶＸタンパク質の少なくとも１つの活性を示す、ＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、または３７に示されるアミノ酸配列）に十分に相同なアミノ酸配列、またはＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。代表的には、生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。ＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、長さが１０、２５、５０、１００またはそれより多いアミノ酸残基であるポリペプチドであり得る。
【０３３２】
さらに、タンパク質の他の領域が欠失している他の生物学的に活性な部分は、組換え技術によって調製され得、そしてネイティブなＮＯＶＸタンパク質の機能的活性のうちの１つ以上について評価され得る。
【０３３３】
１つの実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、または３７に示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、または３７に実質的に相同であり、そして以下に詳細に議論されるように、天然の対立遺伝子バリエーションまたは変異誘発に起因してアミノ酸配列が異なるが、配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、または３７のタンパク質の機能的活性を保持する。従って、別の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、または３７のアミノ酸配列に少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列を含み、そして、配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、または３７のＮＯＶＸタンパク質の機能的活性を保持するタンパク質である。
【０３３４】
（２つ以上の配列間の相同性の決定）
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の相同性の百分率を決定するために、配列は、至適な比較の目的のために整列される（例えば、ギャップが、第２のアミノ酸または核酸配列との最適な整列のために、第１のアミノ酸配列または核酸配列の配列中に導入され得る）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められる場合、その分子は、その位置で相同である（すなわち、本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性」と等価である）。
【０３３５】
核酸配列の相同性は、２つの配列間の同一性の程度として決定され得る。相同性は、当該分野において公知のコンピュータープログラム（例えば、ＧＣＧプログラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰソフトウェア）を用いて決定され得る。ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８：４４３〜４５３を参照のこと。核酸配列比較のための以下の設定（ＧＡＰ生成ペナルティー、５．０、およびＧＡＰ伸長ペナルティー、０．３）を用いてＧＣＧ  ＧＡＰソフトウェアを使用すると、上記で言及される類似の核酸配列のコード領域は、配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６に示されるＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード）部分と、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性の程度を示す。
【０３３６】
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が、特定の比較領域にわたって、残基毎を基準として同一である程度をいう。用語「配列同一性のパーセンテージ」は、以下により算出される：この比較領域にわたって最適に整列された２つの配列を比較すること、両方の配列において同一の核酸塩基（例えば、核酸の場合にはＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を導くこと、この一致した位置の数を、比較領域の内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算すること、およびその結果を１００で乗算して、配列同一性のパーセンテージを導くこと。用語「実質的な同一性」は、本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、ここでこのポリヌクレオチドは、比較領域にわたり参照配列と比較して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、そして頻繁には９０〜９５％の配列同一性、より通常には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【０３３７】
（キメラタンパク質および融合タンパク質）
本発明はまた、ＮＯＶＸキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書中で使用される場合、ＮＯＶＸ「キメラタンパク質」またはＮＯＶＸ「融合タンパク質」は、非ＮＯＶＸポリペプチドに作動可能に連結された、ＮＯＶＸポリペプチドを含む。「ＮＯＶＸポリペプチド」は、ＮＯＶＸタンパク質（配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、または３７）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいうが、「非ＮＯＶＸポリペプチド」は、ＮＯＶＸタンパク質に対して実質的に相同ではないタンパク質（例えば、ＮＯＶＸタンパク質とは異なり、かつ同一かまたは異なる生物体に由来するタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。ＮＯＶＸ融合タンパク質において、このＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸタンパク質の全てまたは一部分に対応し得る。１つの実施形態では、ＮＯＶＸ融合タンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。別の実施形態では、ＮＯＶＸ融合タンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。なお別の実施形態においてＮＯＶＸ融合タンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも３つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結された」は、ＮＯＶＸポリペプチドおよび非ＮＯＶＸポリペプチドが、インフレームで互いに融合されていることを示すことが意図される。非ＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【０３３８】
１つの実施形態においては、この融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質であり、ここではＮＯＶＸ配列が、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合される。このような融合タンパク質は、組換えＮＯＶＸポリペプチドの精製を容易にし得る。
【０３３９】
別の実施形態において、この融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含むＮＯＶＸタンパク質である。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、ＮＯＶＸの発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用を介して増加され得る。
【０３４０】
なお別の実施形態において、この融合タンパク質は、ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質であり、ここで、ＮＯＶＸ配列が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合される。本発明のこのＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、薬学的組成物中に取り込まれ、そして被験体に投与されて、細胞の表面上でＮＯＶＸリガントとＮＯＶＸタンパク質との間の相互作用を阻害し、それによってインビボのＮＯＶＸ媒介シグナル伝達を抑制し得る。このＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を用い、ＮＯＶＸ同族リガンドのバイオアベイラビリティに影響を与え得る。ＮＯＶＸリガンド／ＮＯＶＸ相互作用の阻害は、増殖障害および分化障害の両方の処置、および細胞生存を調節（例えば、促進または阻害）することに、治療的に有用であり得る。さらに、本発明のこのＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、被験体中で抗ＮＯＶＸ抗体を産生するための免疫原として用いられ得、ＮＯＶＸリガンドを精製するらめに用いられ得、そしてＮＯＶＸリガンドとのＮＯＶＸの相互作用を阻害する分子を同定するスクリーニングアッセイで用いられ得る。
【０３４１】
本発明のＮＯＶＸキメラまたは融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術により産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、従来の技術に従って、例えば、連結のための平滑末端または付着（ｓｔａｇｇｅｒ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じて粘着（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）末端のフィルイン、所望しない連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を採用することにより、インフレームで一緒に連結する。別の実施形態では、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来技術により合成し得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、２つの連続する遺伝子フラグメント間の相補的オーバハングを生じるアンカープライマーを用いて実施し得、このフラグメントは、次いで、キメラ遺伝子配列を生成するためにアニールおよび再増幅され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）。さらに、融合成分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をすでにコードした多くの発現ベクターが市販されている。ＮＯＶＸをコードする核酸は、この融合成分がＮＯＶＸタンパク質にインフレーム連結されるように、このような発現ベクター中にクローン化され得る。
【０３４２】
（ＮＯＶＸのアゴニストおよびアンタゴニスト）
本発明はまた、ＮＯＶＸアゴニスト（すなわち、模倣物）として、またはＮＯＶＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の改変体に関する。ＮＯＶＸタンパク質の改変体（例えば、ＮＯＶＸタンパク質の離散した点変異または短縮型）が、変異誘発により生成され得る。ＮＯＶＸタンパク質のアゴニストは、天然に存在する形態のＮＯＶＸタンパク質と実質的に同じ生物学的活性、またはその生物学的活性のサブセットを保持し得る。ＮＯＶＸタンパク質のアンタゴニストは、天然に存在する形態のＮＯＶＸタンパク質の活性の１つ以上を、例えば、ＮＯＶＸタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流または上流メンバーに競合的に結合することにより阻害し得る。従って、特定の生物学的効果が、限られた機能の改変体を用いた処理により惹起され得る。１つの実施形態では、このタンパク質の天然に存在する形態の生物学活性のサブセットを有する改変体を用いた被験体の処置は、ＮＯＶＸタンパク質の天然に存在する形態を用いた処置に対して被験体における副作用がさらに少ない。
【０３４３】
ＮＯＶＸアゴニスト（すなわち、模倣物）、またはＮＯＶＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の改変体は、ＮＯＶＸタンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト活性についてＮＯＶＸタンパク質の変異体（例えば短縮型変異体）のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより同定され得る。１つの実施形態では、ＮＯＶＸ改変体の多彩なライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発により生成され、そして多彩な遺伝子ライブラリーによりコードされる。ＮＯＶＸ改変体の多彩なライブラリーは、例えば、潜在的なＮＯＶＸ配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、あるいは、その中にＮＯＶＸ配列のセットを含む（例えば、ファージディスプレイのための）より大きな融合タンパク質のセットとして発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、遺伝子配列に酵素的に連結することによって、産生され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なＮＯＶＸ改変体のライブラリーを産生するために用いられ得る種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学的合成は、自動化ＤＮＡ合成機中で実施され得、次いでこの合成遺伝子は、適切な発現ベクター中に連結される。遺伝子の縮重セットの使用は、１つの混合物において、潜在的なＮＯＶＸ配列の所望のセットをコードする全ての配列の供給を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当該分野で周知である。例えば、Ｎａｒａｎｇ，１９８３．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら，１９８４．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら，１９８４．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅら，１９８３．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと。
【０３４４】
（ポリペプチドライブラリー）
さらに、ＮＯＶＸタンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーを用いて、ＮＯＶＸタンパク質の改変体のスクリーニングおよび引き続く選択のためのＮＯＶＸフラグメントの多彩な集団を生成し得る。１つの実施形態では、コード配列フラグメントのライブラリーは、ＮＯＶＸコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを、１分子あたり約１つのみのニックが生じる条件下で、ヌクレアーゼで処理すること、二本鎖ＤＮＡを変性させること、異なるニック産物からのセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成するためにこのＤＮＡを再生すること、Ｓ１ヌクレアーゼを用いた処理により再形成された二重鎖から一本鎖部分を除去すること、および得られるフラグメントライブラリーを発現ベクター中に連結することにより生成し得る。この方法によって、ＮＯＶＸタンパク質の種々のサイズのＮ末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリーが派生し得る。
【０３４５】
点変異または短縮化により作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された性質を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための種々の技術が当該分野で公知である。このような技術を、ＮＯＶＸタンパク質のコンビナトリアル変異誘発により生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、ハイスループット分析に適した最も広く用いられる技術は、代表的には、複製可能な発現ベクター中に遺伝子ライブラリーをクローニングすること、得られるベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、およびこのコンビナトリアル遺伝子を、所望の活性の検出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下で発現することを含む。ライブラリー中の機能的変異体の頻度を増大する新規技術であるリクルーシブアンサンブル変異誘発（Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）を、スクリーニングアッセイと組み合わせて用い、ＮＯＶＸ改変体を同定し得る。例えば、ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ，１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら，１９９３．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６：３２７−３３１を参照のこと。
【０３４６】
（抗ＮＯＶＸ抗体）
ＮＯＶＸタンパク質、またはＮＯＶＸタンパク質のフラグメントに対する抗体もまた本発明に含まれる。用語「抗体」とは、本明細書において用いる場合、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原に特異的に結合（抗原と免疫反応）する抗原結合部位を含む分子）をいう。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げられるがこれらに限定されない。一般に、ヒトから得た抗体分子は、この分子に存在する重鎖の性質が互いに異なるクラスであるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤのいずれかに関する。特定のクラスは、同様にサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２等）を有する。さらに、ヒトにおいては、軽鎖は、κ鎖またはλ鎖であり得る。抗体に関する本明細書における言及は、ヒト抗体種のこのようなクラス、サブクラス、およびタイプの全てに関する言及を包含する。
【０３４７】
本発明の単離されたＮＯＶＸ関連タンパク質は、抗原またはその一部もしくはフラグメントとして機能することが意図され得、そしてさらに、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体調製のための標準的な技術を用いて、抗原に免疫特異的に結合する抗体を生成するための免疫原として用いられ得る。全長のタンパク質が用いられ得るか、あるいは、本発明は、免疫原としての使用のための抗原の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。抗原性ペプチドフラグメントは、全長タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも６つのアミノ酸残基を含み、そしてこのペプチドに対して惹起された抗体が、全長タンパク質と、またはこのエピトープを含む任意のフラグメントと特異的な免疫複合体を形成するように、そのエピトープを包含する。好ましくは、この抗原性ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基、または少なくとも１５アミノ酸残基、または少なくとも２０アミノ酸残基、または少なくとも３０アミノ酸残基を含む。抗原性ペプチドに包含される好ましいエピトープは、その表面上に位置するタンパク質の領域である；通常これらは親水性領域である。
【０３４８】
本発明の特定の実施形態では、抗原性ペプチドに含まれる少なくとも１つのエピトープは、ＮＯＶＸ関連タンパク質の表面上に位置するＮＯＶＸ関連タンパク質の領域、例えば、親水性領域である。ヒトＮＯＶＸ関連タンパク質配列の疎水性分析によって、ＮＯＶＸ関連タンパク質のどの領域が特に親水性であり、従って抗体産生を標的するのに有用な表面残基をコードする可能性が高いかが示される。抗体産生を標的するための手段として、親水性領域および疎水性領域を示すハイドロパシープロットを、例えば、フーリエ変換を伴うかまたは伴わないかのいずれかである、Ｋｙｔｅ  ＤｏｏｌｉｔｔｌｅまたはＨｏｐｐ  Ｗｏｏｄｓ法を含む、当該分野で周知の任意の方法により生成し得る。例えば、その各々がその全体において本明細書に参考として援用される、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：３８２４−３８２８；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ  １９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１４２を参照のこと。抗原性タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログ内の１つ以上のドメインに対して特異的な抗体もまた、本明細書中で提供される。
【０３４９】
本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオルソログは、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の産生における免疫原として利用され得る。
【０３５０】
当該分野において公知の種々の手順が、本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオルソログに対して指向されるポリクロナール抗体またはモノクロナール抗体の産生のために使用され得る（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。これらの抗体のうちのいくつかは、以下で考察される。
【０３５１】
（ポリクロナール抗体）
ポリクロナール抗体の産生のために、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の動物）は、ネイティブなタンパク質、その合成改変体、または前記の誘導体を用いる１以上の注射によって免疫され得る。適切な免疫原性調製物は、例えば、天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質を提示する化学的に合成されたポリペプチド、または組換え的に発現される免疫原性タンパク質を含み得る。さらに、このタンパク質は、免役されている哺乳動物において免疫原性であることが知られている第２のタンパク質に結合体化され得る。このような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、および大豆トリプシンインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。この調製物はさらに、アジュバントを含み得る。種々のアジュバントが免疫学的応答を増加させるために使用され、このようなアジュバントとしては、フロイントのアジュバント（完全および不完全）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、ジニトロフェノールなど）、ヒトにおいて使用可能なアジュバント（例えば、Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−ＧｕｅｒｉｎおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）または類似の免疫刺激剤が挙げられるが、これらに限定されない。使用され得るアジュバントのさらなる例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコレート）が挙げられる。
【０３５２】
免疫原性タンパク質に対して指向されるポリクロナール抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離され得、そして周知の技術（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧを用いるアフィニティクロマトグラフィー（これは、主に免疫血清のＩｇＧ画分を提供する））によってさらに精製され得る。続いて、または代替的に、求められている免疫グロブリンの標的である特定の抗原またはその抗原のエピトープがカラムに固定され、免疫アフィニティクロマトグラフィーによって免疫特異的抗体を精製し得る。免疫グロブリンの精製は、例えば、Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ＰＡより発行）、第１４巻、第８号（２０００年４月１７日）、２５〜２８頁）によって考察される。
【０３５３】
（モノクローナル抗体）
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」は、独特の軽鎖遺伝子産物および独特の重鎖遺伝子産物からなる抗体分子の唯一の分子種を含む抗体分子の集団をいう。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、この集団の全ての分子に同一である。従って、ＭＡｂは、抗原への独特の結合親和性によって特徴付けられる抗原の特定のエピトープと免疫反応可能な抗原結合部位を含む。
【０３５４】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ方法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載されるような方法）を使用して調製され得る。ハイブリドーマ方法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物は、免疫因子で代表的に免疫され、免疫因子に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生し得るリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。
【０３５５】
免疫因子としては、代表的に、タンパク質抗原、そのフラグメントまたはその融合タンパク質が挙げられる。一般的には、ヒト起源の細胞が所望される場合に末梢血リンパ球が使用されるか、または、非ヒト哺乳動物供給源が望まれる場合に脾臓細胞またはリンパ節細胞が使用されるかのいずれかである。次いで、適切な融合因子（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して、リンパ球を不死化細胞株に融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）第５９−１０３頁）。不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、１以上の物質（融合されていない不死化細胞の増殖または生存を阻害する）を含む適切な培養培地中で培養され得る。例えば、親の細胞が酵素、ヒポキサンチングアニンンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマからの培養培地は、代表的にヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、それらの物質はＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を阻害する。
【０３５６】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定な高レベルの抗体の発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に敏感な細胞株である。より好ましい不死化細胞株はマウス骨髄腫細胞株であり、それらは、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａおよびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから得ることが可能である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒト異種骨髄腫（ｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍａ）細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載される（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８７）第５１−６３頁）。
【０３５７】
次いで、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって決定されるか、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ））によって決定される。このような技術およびアッセイは、当該分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード分析によって決定され得る。好ましくは、標的抗原に対する高い程度の特異性および高結合親和性を有する抗体が、単離される。
【０３５８】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、限界希釈手順によって、クローンをサブクローニングし得、そして標準的な方法によって増殖し得る。例えば、この目的のために適切な培養培地としては、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物内の腹水としてインビボで増殖され得る。
【０３５９】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、タンパク質Ａセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィー）によって、培養培地または腹水から、単離または精製され得る。
【０３６０】
モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される方法）によって作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され得、そして配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに配置され得、次いでそれらは、宿主細胞（例えば、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞）にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞内でのモノクローナル抗体の合成を得る。このＤＮＡはまた、例えば、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインをコードする配列の置換（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８１２−１３（１９９４））によってか、または非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列の全てまたは一部の配列をコードする免疫グロブリンへの共有結合的な連結によって改変され得る。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常領域の代りに用いられ得るか、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインの代りに用いられ得、キメラの二価抗体を作製する。
【０３６１】
（ヒト化抗体）
本発明のタンパク質抗原に対する抗体は、さらにヒト化抗体またはヒト抗体を含み得る。これらの抗体は、投与された免疫グロブリンに対するヒトによる免疫応答を引き起こすことなく、ヒトへの投与に適切である。抗体のヒト化形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または他の抗体の抗原結合配列）であり、それらは主にヒト免疫グロブリンの配列から構成され、そして非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含む。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列の代わりにげっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列を用いることによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って達成され得る。（米国特許第５，２２５，５３９号もまた参照のこと。）いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエントの抗体においても、移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列においても見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、および代表的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含む。これらの内で、全てのまたは実質的に全てのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンの領域に対応し、そして全てまたは実質的に全てのフレームワーク領域はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、代表的には、ヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含む（Ｊｏｎｅｓら、１９８６；Ｒｉｅｃｈａｍａｎｎら、１９８８；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２））。
【０３６２】
（ヒト抗体）
完全ヒト抗体は、ＣＤＲを含む軽鎖および重鎖の両方の、本質的に全体配列がヒト遺伝子から生じる抗体分子に関する。このような抗体を、「ヒト抗体」、または「完全ヒト抗体」と本明細書中で呼ぶ。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術によって調製され得る；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２を参照のこと）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，第７７−９６頁を参照のこと）。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実行において使用され得、そしてヒトハイブリドーマの使用（Ｃｏｔｅら、１９８３．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：２０２６−２０３０を参照のこと）によってか、またはインビトロでのエプスタイン−バー−ウイルスを用いたヒトＢ細胞の形質転換（Ｃｏｌｅら、１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，第７７−９６頁を参照のこと）によって産生され得る。
【０３６３】
さらに、ヒト抗体はまた、さらなる技術（ファージディスプレイライブラリー（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））を含む）を使用して産生され得る。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が、部分的または完全に不活化されているマウス）に導入することによって、ヒト抗体は作製され得る。チャレンジの際にヒト抗体の産生が観察され、このことは全ての点（遺伝子再配列、アセンブリ、および抗体レパートリーを含む）でヒトにおいて観察されたものに密接に類似する。このアプローチは、例えば、以下に記載される：米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、およびＭａｒｋｓら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０、７７９−７８３（１９９２））；Ｌｏｎｂｅｒｇら（Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８５６−８５９（１９９４））；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ３６８、８１２−１３（１９９４））；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４、８４５−５１（１９９６））；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４、８２６（１９９６））；ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３  ６５−９３（１９９５））。
【０３６４】
ヒト抗体は、抗原によるチャレンジに応答する動物の内因性抗体ではなく完全ヒト抗体を産生するように改変されたトランスジェニック非ヒト動物を使用して、さらに産生され得る。（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０２６０２を参照のこと）。非ヒト宿主における重免疫グロブリン鎖および軽免疫グロブリン鎖をコードする内因性遺伝子は、耐えられなくなっており、そしてヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードする活性な位置は、宿主のゲノムに挿入される。例えば、不可欠なヒトＤＮＡセグメントを含む酵母人工染色体を使用して、ヒト遺伝子は組み込まれる。次いで、全ての所望の改変を提供する動物を、完全な改変の相補体よりもより少ない改変の相補体を含む中間トランスジェニック動物を交配することによって子孫として得る。このような非ヒト動物の好ましい実施形態は、マウスであり、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０９６に開示されるようにＸｅｎｏｍｏｕｓｅＴＭと呼ばれる。この動物は、ヒト免疫グロブリンを十分に分泌するＢ細胞を産生する。目的の免疫原での免疫後の動物から（例えば、ポリクローナル抗体の調製物として）、あるいは動物由来の不死化されたＢ細胞（例えば、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ）から、抗体を直接得ることが可能である。さらに、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子は、抗体を直接得るために回収され、そして発現され得るか、または抗体のアナログ（例えば、単鎖Ｆｖ分子）を得るために、さらに改変され得る。
【０３６５】
内因性免疫グロブリン重鎖の発現を欠く非ヒト宿主（マウスとして例証される）を作製するための方法の例は、米国特許第５，９３９，５９８号に開示される。それは、以下の工程を包含する方法によって得ることが可能である：胚性幹細胞において少なくとも１つの内因性重鎖遺伝子座からこのＪセグメント遺伝子を欠失し、この遺伝子座の再構成を防止し、かつ、再構成された免疫重鎖遺伝子座の転写物の形成を防止する工程であって、ここでこの欠失は、選択マーカーをコードする遺伝子を含むベクターを標的化することによってもたらされる、工程；ならびに胚性幹細胞から、その体細胞および生殖細胞が選択可能なマーカーをコードする遺伝子を含む、トランスジェニックマウスを作製する工程。
【０３６６】
目的の抗体（例えば、ヒト抗体）を産生する方法は、米国特許第５，９１６，７７１号に開示される。それは以下の工程を包含する：重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、培養中の１つの哺乳動物宿主細胞に導入する工程、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、別の哺乳動物宿主細胞に導入する工程、およびハイブリッド細胞を形成するために２つの細胞を融合する工程。ハイブリッド細胞は、重鎖および軽鎖を含む抗体を発現する。
【０３６７】
この手順のさらなる改善において、免疫原上の臨床的に関連するエピトープを同定する方法、および関連するエピトープに高い親和性で免疫特異的に結合する抗体を選択するための関連する方法は、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５３０４９に開示される。
【０３６８】
（Ｆａｂフラグメントおよび単鎖抗体）
本発明に従って、本発明の抗原性タンパク質に特異的な単鎖抗体の産生のために技術が適応され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。さらに、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築のために方法が適応され得（例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１を参照のこと）、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログについての所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ効果的な同定を可能にする。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含む抗体フラグメントは、以下に挙げられるがこれらに限定されない当該分野で公知の技術によって、産生され得る：（ｉ）抗体分子のペプシン消化によって産生されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって産生されたＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤を用いた抗体分子の処理によって産生されたＦａｂフラグメント、および（ｉｖ）Ｆｖフラグメントを含むが、これらに限定ない）は、当該分野で公知の技術によって産生され得る。
【０３６９】
（二重特異的抗体）
二重特異的抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体（好ましくはヒトモノクローナル抗体またはヒト化されたモノクローナル抗体）である。この場合において、結合特異性の１つは、本発明の抗原性タンパク質に対してである。第２の結合標的は、任意の他の抗原であり、そして、この第２の結合標的は、有利に、細胞表面タンパク質あるいはレセプターまたはレセプターサブユニットである。
【０３７０】
二重特異的抗体を作製する方法は、当該分野で公知である。伝統的には、二重特異的抗体の組換え生成は、２つの免疫グロブリンの重鎖／軽鎖の対の同時発現に基づき、ここで、この２つの重鎖は、異なる特異性を有する（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０の異なる抗体分子の潜在的混合物を作製し、このうち１つのみが正確な二重特異的構造を有する。この正確な分子の精製は、通常アフィニティークロマトグラフィー工程によって達成される。同様の手順は、１９９３年５月１３日公開のＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９１  ＥＭＢＯ  Ｊ．、１０：３６５５−３６５９において開示される。
【０３７１】
所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインは、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合され得る。この融合物は、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常ドメインを有し、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも部分を含む。この融合物の少なくとも１つに存在する軽鎖結合のために必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物および所望される場合、この免疫グロブリンの軽鎖をコードするＤＮＡは、別々の発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主生物体に同時トランスフェクトされる。二重特異的抗体の作製のさらなる詳細は、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
【０３７２】
ＷＯ９６／２７０１１に記載される別のアプローチに従って、抗体分子の対の間の界面は、組換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーのパーセンテージを最大化するように操作され得る。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子の界面からの１つ以上の小さなアミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換される。大きな側鎖と同一または同様のサイズの補完的な「空洞（キャビティ）」は、大きなアミノ酸側鎖を小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置換することによって、第２の抗体分子の界面上に生成される。このことは、ホモダイマーのような他の不必要な最終生成物よりも、ヘテロダイマーの収量を増加するための機構を提供する。
【０３７３】
二重特異的抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異的抗体）として調製され得る。抗体フラグメントから二重特異的抗体を作製するための技術は、文献において記載される。例えば、二重特異的抗体は、化学結合を使用して調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体がタンパク分解的に切断されてＦ（ａｂ’）２フラグメントを作製する手順を記載する。これらのフラグメントは、ビシナルジチオールを安定化し、そして分子間ジスルフィド形成を阻止するために、ジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元される。次いで、この作製されたＦａｂ’フラグメントは、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つは、メルカプトエチルアミンでの還元によってＦａｂ’−チオールに再変換され、そしてこれは等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合されて二重特異的抗体を形成する。生成された二重特異的抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用され得る。
【０３７４】
さらに、Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され得、そして化学的にカップリングされて二重特異的抗体を形成する。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全にヒト化された二重特異的抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の生成を記載する。各Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから別々に分泌され、そしてインビトロの指向性化学的カップリングに供され、二重特異的抗体を形成する。このように、形成されたこの二重特異的抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合し得、そしてヒト胸部腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘因し得る。
【０３７５】
組換え細胞培養物から直接二重特異的抗体フラグメントを作製し、そして単離するための種々の技術がまた、記載されてきた。例えば、二重特異的抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生される。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合された。この抗体ホモダイマーは、ヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、次いで再酸化されて抗体ヘテロダイマーを形成した。この方法はまた、抗体ホモダイマーの産生のために使用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）に記載されるこの「ディアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）」技術は、二重特異的抗体フラグメントを作製するための代替的な機構を提供した。このフラグメントは、短すぎて同じ鎖上の２つのドメインの間で対形成できないリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、１つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的なＶＬおよびＶＨドメインと対になるように強制され、これによって２つの抗原結合部位が形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用によって二重特異的抗体フラグメントを作製するための別のストラテジーもまた、報告されてきた。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。
【０３７６】
２より多くの結合価を有する抗体が企図される。例えば、三重特異的抗体が調製され得る。Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０３７７】
例示的な二重特異的抗体は、２つの異なるエピトープに結合し得、このうち少なくとも１つは、本発明のタンパク質抗原に起源を有する。あるいは、免疫グロブリン分子の抗抗原性アームは、Ｔ細胞レセプター分子のような白血球上の誘引分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、またはＢ７）、あるいはＩｇＧに対するＦｃレセプター（ＦｃγＲ）（例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６））と結合するアームと結合し得、細胞性防御機構を、この特定の抗原を発現する細胞に集中させる。二重特異的抗体はまた、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞傷害性因子に指向するために使用され得る。これらの抗体は、抗原結合アーム、および細胞傷害性因子または放射性核種キレート剤（例えば、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、またはＴＥＴＡ）に結合するアームを保有する。目的の別の二重特異的抗体は、本明細書中に記載のタンパク質抗原に結合し、そしてさらに組織因子（ＴＦ）に結合する。
【０３７８】
（ヘテロ結合体抗体）
ヘテロ接合体抗体もまた、本発明の範囲内である。ヘテロ接合体抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不必要な細胞に標的化するために（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置のために（ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９）提案されてきた。この抗体は、インビトロで、合成タンパク質化学において公知の方法（架橋剤に関与する方法を含む）を使用して調製され得ることが企図される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応の使用またはチオエーテル結合の形成によって構築され得る。この目的のための適切な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデート、ならびに例えば米国特許第４，６７６，９８０号において開示される試薬が挙げられる。
【０３７９】
（エフェクター機能操作）
本発明の抗体を、エフェクター機能について、例えば癌の処置における抗体の効力を増大するように改変することが望ましくあり得る。例えば、システイン残基は、Ｆｃ領域に導入され得、これによってこの領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にする。従って、作製されるこのホモダイマー抗体は、改良されたインターナリゼーションの能力および／または増加した補体媒介細胞死滅、ならびに抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照のこと。増大した抗腫瘍活性を有するホモダイマー抗体はまた、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されるヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製され得る。あるいは、抗体は操作され得、これは二重のＦｃ領域を有し、そしてこれによって増大した補体溶解およびＡＤＣＣの能力を有し得る。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，３：２１９−２３０（１９８９）を参照のこと。
【０３８０】
（免疫結合体）
本発明はまた、細胞傷害性の薬剤（例えば、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素学的に活性な毒素、あるいはそれらのフラグメント）、または放射性同位体（すなわち、放射性結合体））に結合体化した抗体を含む免疫結合体に関する。
【０３８１】
このような免疫結合体の作製において有用な化学療法剤は、上記に記載される。使用され得る酵素学的に活性な毒素およびそれらのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａインヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、およびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎ）が挙げられる。種々の放射性核種は、放射性結合した抗体の作製のために利用可能である。その例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅが挙げられる。
【０３８２】
抗体および細胞傷害性因子の結合体は、種々の二官能性タンパク質結合因子（例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデート  ＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ））、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン））を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製され得る。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への結合のための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。
【０３８３】
別の実施形態において、腫瘍の前標的化における利用のために、この抗体は、「レセプター」（例えば、ストレプトアビジン）に結合され得、ここで抗体−レセプター結合体は患者に投与され、続いて除去剤を使用して結合していない結合体が循環から除去され、次いで細胞傷害性因子に次々に結合する「リガンド」（例えば、アビジン）が投与される。
【０３８４】
１つの実施形態において、所望の特異性を保有する抗体のスクリーニングのための方法としては、当該分野内で公知の酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）および他の免疫学的に媒介された技術が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質の特定のドメインに対して特異的である抗体の選択は、このようなドメインを所有しているＮＯＶＸタンパク質のフラグメントに結合するハイブリドーマの生成により容易にされる。従って、ＮＯＶＸタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログ内の所望のドメインについて特異的である抗体がまた、本明細書において提供される。
【０３８５】
抗ＮＯＶＸ抗体は、ＮＯＶＸタンパク質の局在化および／または定量化に関する当該分野で公知の方法において用いられ得る（例えば、適切な生理学的サンプル中のＮＯＶＸタンパク質のレベルを測定する使用のために、診断的方法における使用のために、タンパク質の画像化における使用のために、など）。所定の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログについての抗体（抗体由来の結合ドメインを含む）は、薬理学的に活性な化合物（本明細書中、以降において「治療剤」）として利用される。
【０３８６】
抗ＮＯＶＸ抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、標準的技術（例えばアフィニティークロマトグラフィまたは免疫沈降）によって、ＮＯＶＸポリペプチドを単離するために用いられ得る。抗ＮＯＶＸ抗体は、細胞からの天然のＮＯＶＸポリペプチドの精製、および宿主細胞において発現される組換え的に産生されたＮＯＶＸポリペプチドの精製を容易にし得る。さらに、抗ＮＯＶＸ抗体が、（例えば、細胞の溶解産物または細胞上清における）ＮＯＶＸタンパク質を検出するために用いられて、ＮＯＶＸタンパク質の発現の量およびパターンを評価し得る。抗ＮＯＶＸ抗体は、例えば、所定の治療レジメンの有効性を決定するために、臨床試験の手順の一部として、組織におけるタンパク質レベルをモニターするために診断的に用いられ得る。検出は、抗体を検出可能物質に結合する（すなわち、物理的に連結する）ことにより容易にされ得る。検出可能物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌａｍｉｎｅ）フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられる；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられる；そして、適切な放射性物質の例としては１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０３８７】
（ＮＯＶＸ組換え発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明の別の局面は、ＮＯＶＸタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログをコードする核酸を含む、ベクター、好ましくは、発現ベクターに関する。本明細書において使用する場合、用語「ベクター」は、連結された別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。１つの型のベクターは、「プラスミド」である。これはさらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、ウイルス性ベクターであり、ここでは、さらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノムに連結され得る。特定のベクターは、ベクター（例えば、細菌性の複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム性哺乳動物ベクター）が導入される宿主細胞中で自律複製し得る。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、そして、これにより宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指示し得る。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に用いられる形態のベクターであるので、交換可能に使用され得る。しかし、本発明は、等価の機能を果たす、ウイルス性ベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）のような、このような他の形態の発現ベクターを含むことを意図する。
【０３８８】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態の本発明の核酸を含む。これは、組換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結されている、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択された１つ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結する」とは、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロの転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入される場合は、宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で調節配列に連結されることを意味することを意図する。
【０３８９】
用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節配列は、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示する配列、および特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を指示する配列（例えば、組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターの設計が形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどのような因子に依存し得ることが当業者に理解される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され得、それにより、本明細書に記載される核酸によってコードされるタンパク質またはペプチド（融合タンパク質またはペプチドを含む）（例えば、ＮＯＶＸタンパク質、ＮＯＶＸタンパク質の変異形態、融合タンパク質など）を産生し得る。
【０３９０】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞における、ＮＯＶＸタンパク質発現のために設計され得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）にさらに考察されている。あるいは、組換え型発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写および翻訳され得る。
【０３９１】
原核生物におけるタンパク質の発現は、最も頻繁には、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを有する、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて実施される。融合ベクターは、そこにコードされるタンパク質に、通常、組換えタンパク質のアミノ末端に、多数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、代表的には、以下の３つの目的のために役立つ：（ｉ）組換えタンパク質の発現を増加させるため；（ｉｉ）組換えタンパク質の可溶性を増加させるため；および（ｉｉｉ）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製の際に補助するため。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解の切断部位が、融合部分と組換えタンパク質との結合部に導入されて、融合タンパク質の精製の後に融合部分から組換えタンパク質を分離することを可能とする。このような酵素、およびその同族（ｃｏｇｎａｔｅ）の認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクターとしては、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的の組換えタンパク質に融合する、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
【０３９２】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ  １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。
【０３９３】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大化するための１つのストラテジーは、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力を欠損した宿主細菌中でタンパク質を発現させることである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８を参照のこと。別のストラテジーは、各アミノ酸についての個々のコドンが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用されるコドンであるように、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変更することである（例えば、Ｗａｄａら、１９９２、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８を参照のこと）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的なＤＮＡ合成技術によって実行され得る。
【０３９４】
別の実施形態において、ＮＯＶＸ発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【０３９５】
あるいは、ＮＯＶＸは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞中で発現され得る。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）中でのタンパク質の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）が挙げられる。
【０３９６】
なお別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルスの調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０に由来する。原核生物細胞および真核生物細胞の両方のために適切な他の発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章および第１７章を参照のこと。
【０３９７】
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型中で優先的に核酸の発現を指向し得る（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現する）。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的なプロモーターの非限定的な例には、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）（特に、Ｔ細胞レセプターのプロモーター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９−７３３）および免疫グロブリンのプロモーター（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８））、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）、ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発達的に調節されるプロモーターもまた含まれる（例えば、マウスｈｏｘプロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７−５４６））。
【０３９８】
本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発明のＤＮＡ分子を含む、組換え発現ベクターを提供する。すなわち、そのＤＮＡ分子は、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写によって）を可能にする様式で調節配列に作動可能に連結される。種々の細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の持続的な発現を指向する、アンチセンス方向でクローニングされた核酸に作動可能に連結された調節配列（例えば、ウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサー）が選択され得るか、または、アンチセンスＲＮＡの構成的発現、組織特異的発現、または細胞特異的発現を指示する調節配列が、選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化されたウイルスの形態であり得、ここではアンチセンス核酸は、高効率調節領域の制御下で産生され、その活性は、ベクターが導入される細胞型によって決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の考察については、例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１巻（１）１９８６を参照のこと。
【０３９９】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現べクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で、交換可能に使用される。このような用語は、特定の被験細胞をいうのみでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫をもいうことが理解される。変異または環境の影響のいずれかに起因して、特定の改変はその後の世代において生じ得るので、このような子孫は、実際には、親の細胞と同一でないかもしれないが、なお、本明細書中で使用される場合のこの用語の範囲内に含まれる。
【０４００】
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）において発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０４０１】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術を介して原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来性の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するために当該分野で容認されている種々の技術をいうことを意図し、これらには、リン酸カルシウム共沈または塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）および他の実験室マニュアルに見出され得る。
【０４０２】
安定な哺乳動物細胞のトランスフェクションのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞のほんの一部のみが外来ＤＮＡをそのゲノムに組み込み得ることが知られている。これらの要素を同定および選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が、一般的には目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。種々の選択マーカーには、薬物（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキサート）に対する耐性を付与するものが含まれる。選択マーカーをコードする核酸は、ＮＯＶＸをコードするベクターと同じベクター上で宿主細胞に導入され得るか、あるいは別々のベクター上で導入され得る。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定され得る（例えば、選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）。
【０４０３】
本発明の宿主細胞（例えば、培養中の原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞）は、ＮＯＶＸタンパク質を産生（すなわち、発現）するために使用され得る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して、ＮＯＶＸタンパク質を産生するための方法を提供する。１つの実施形態において、本発明の方法は、ＮＯＶＸタンパク質が産生されるような適切な培地中で、本発明の宿主細胞（ここに、ＮＯＶＸタンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を培養する工程を包含する。別の実施形態において、本発明はさらに、培地または宿主細胞からＮＯＶＸタンパク質を単離する工程を包含する。
【０４０４】
（トランスジェニックＮＯＶＸ動物）
本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。例えば、１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＮＯＶＸタンパク質コード配列が導入された、受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、このような宿主細胞は、外因性のＮＯＶＸ配列がゲノムに導入された非ヒトトランスジェニック動物、または内因性のＮＯＶＸ配列が変更された相同組換え動物を作製するために使用され得る。このような動物は、ＮＯＶＸタンパク質の機能および／または活性を研究するため、ならびにＮＯＶＸタンパク質活性のモジュレーターを同定および／または評価するために有用である。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」とは、非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは、ラットまたはマウスのような齧歯類であり、ここで、その動物の１つ以上の細胞が、導入遺伝子を含む。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。導入遺伝子は、細胞のゲノムに組み込まれ、この細胞からトランスジェニック動物が発生し、かつ成熟動物のゲノムに残存し、それによって、トランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織においてコードされた遺伝子産物の発現を指示する、外因性のＤＮＡである。本明細書中で使用される場合、「相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）組換え動物」とは、非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはマウスであり、ここで、内因性のＮＯＶＸ遺伝子は、内因性の遺伝子と、その動物の発生の前にその動物の細胞（例えば、その動物の胚細胞）に導入された外因性のＤＮＡ分子との間の相同組換えによって変更されている。
【０４０５】
本発明のトランスジェニック動物は、ＮＯＶＸをコードする核酸を、（例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって）受精卵母細胞の雄性前核に導入すること、およびその卵母細胞を偽妊娠雌性養育動物（ｆｏｓｔｅｒ  ａｎｉｍａｌ）中で発達させることを可能にすることによって作製され得る。配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６のヒトのＮＯＶＸ  ｃＤＮＡ配列は、非ヒト動物のゲノムに導入遺伝子として導入され得る。あるいは、ヒトのＮＯＶＸ遺伝子の非ヒトホモログ（例えば、マウスのＮＯＶＸ遺伝子）は、ヒトのＮＯＶＸ  ｃＤＮＡ（上記にさらに記載された）に対するハイブリダイゼーションに基づいて単離され得、そして導入遺伝子として使用され得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた導入遺伝子中に含まれ得、その導入遺伝子の発現の効率を増大させ得る。組織特異的調節配列は、特定の細胞に対して、ＮＯＶＸタンパク質の発現を指示するように、ＮＯＶＸ導入遺伝子に作動可能に連結され得る。胚の操作およびマイクロインジェクションを介するトランスジェニック動物（特に、マウスのような動物）を作製するための方法は、当該分野で慣習的になっており、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号；同第４，８７０，００９号；および同第４，８７３，１９１号；ならびにＨｏｇａｎ  １９８６、ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ  ＴＨＥ  ＭＯＵＳＥ  ＥＭＢＲＹＯ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。同様の方法が、他のトランスジェニック動物の作製のために使用される。トランスジェニック創始（ｆｏｕｎｄｅｒ）動物は、そのゲノムにおけるＮＯＶＸ導入遺伝子の存在および／またはその動物の組織もしくは細胞中のＮＯＶＸ  ｍＲＮＡの発現に基づいて同定され得る。次いで、トランスジェニック創始動物は、導入遺伝子を有するさらなる動物を育種するために使用され得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質をコードする導入遺伝子を有するトランスジェニック動物は、さらに、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物に交雑され得る。
【０４０６】
相同組換え動物を作製するために、ＮＯＶＸ遺伝子の少なくとも一部を含むベクターを調製する。ここで、この遺伝子は、欠失、付加、または置換が導入され、それによってそのＮＯＶＸ遺伝子が変更されている（例えば、機能的に破壊されている）。ＮＯＶＸ遺伝子は、ヒト遺伝子（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６のｃＤＮＡ）であり得るが、より好ましくは、ヒトのＮＯＶＸ遺伝子の非ヒトホモログである。例えば、配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６のヒトのＮＯＶＸ遺伝子のマウスホモログは、マウスゲノムにおける内因性のＮＯＶＸ遺伝子を変更するのに適切な相同組換えベクターを構築するために使用され得る。１つの実施形態において、そのベクターは、相同組換えに際して、その内因性のＮＯＶＸ遺伝子が、機能的に破壊されるように設計される（すなわち、機能的タンパク質をもはやコードしない；「ノックアウト」ベクターともいわれる）。
【０４０７】
あるいは、このベクターは、相同組換えに際して、内因性ＮＯＶＸ遺伝子が変異されるか、あるいはさもなければ、変更されるが、なお機能性タンパク質をコードするように、設計され得る（例えば、上流の調節領域が変更され、それによって内因性ＮＯＶＸタンパク質の発現を変更し得る）。相同組換えベクターにおいて、ＮＯＶＸ遺伝子の変更された部分は、ＮＯＶＸ遺伝子のさらなる核酸によって、その５’末端および３’末端で隣接されることにより、相同組換えが、ベクターによって保有される外因性ＮＯＶＸ遺伝子と胚性幹細胞中の内因性ＮＯＶＸ遺伝子との間で起こることを可能にする。さらなる隣接するＮＯＶＸ核酸は、内因性遺伝子との首尾よい相同組換えのために十分な長さである。典型的に、数キロベースの隣接ＤＮＡ（５’末端および３’末端の両方における）が、ベクターに含まれる。例えば、相同組換えベクターの説明について、Ｔｈｏｍａｓら（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：５０３を参照のこと。次いで、このベクターは、（例えば、エレクトロポレーションによって）胚性幹細胞株に導入され、そして導入されたＮＯＶＸ遺伝子が内因性ＮＯＶＸ遺伝子と相同組換えした細胞が、選択される（例えば、Ｌｉら（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６９：９１５を参照のこと）。
【０４０８】
次いで、選択された細胞が、動物（例えば、マウス）の未分化胚芽細胞へ注入され、凝集キメラを形成する。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ（１９８７）のＴＥＲＡＴＯＣＡＲＣＩＮＯＭＡＳ  ＡＮＤ  ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ、１１３頁〜１５２頁を参照のこと。次いで、キメラ胚が、適切な偽妊娠雌性養育動物に移植され得、そしてその胚は分娩に到る。その生殖細胞中に相同組換えされたＤＮＡを保有する子孫が、動物を育種するために使用され得、ここでこの動物の全ての細胞は、導入遺伝子の生殖系列伝達によって、相同組換えされたＤＮＡを含む。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築するための方法が、さらに以下に記載される；Ｂｒａｄｌｅｙ（１９９１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：８２３−８２９；ＰＣＴ国際公開番号：ＷＯ９０／１１３５４；ＷＯ９１／０１１４０；ＷＯ９２／０９６８；およびＷＯ９３／０４１６９。
【０４０９】
別の実施形態において、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択された系を含むトランスジェニック非ヒト動物が産生され得る。このような系の１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の説明については、例えば、Ｌａｋｓｏら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６２３２−６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１−１３５５を参照のこと）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が導入遺伝子の発現を調節するために使用される場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要となる。このような動物は、例えば、２つのトランスジェニック動物（一方は選択されたタンパク質をコードした導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコードした導入遺伝子を含む）を交配することによる「二重の」トランスジェニック動物の構築によって提供され得る。
【０４１０】
本明細書中に記載される非ヒトトランスジェニック動物のクローンがまた、Ｗｉｌｍｕｔら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０−８１３に記載される方法に従って、産生され得る。簡単には、トランスジェニック動物からの細胞（例えば、体細胞）が単離され得、そして増殖サイクル（ｇｒｏｗｔｈ  ｃｙｃｌｅ）から出て、Ｇ０期に入るように誘導され得る。次いで、静止性細胞が、例えば、電気パルスの使用により、その静止性細胞が単離されたのと同種の動物由由来の除核された卵母細胞へ融合され得る。次いで、この再構築された卵母細胞は培養され、これにより、これは桑実胚または未分化胚芽細胞に発達し、次いで、偽妊娠雌性養育動物に移される。この雌性養育動物から産まれた子孫は、その細胞（例えば、その体細胞）が単離された動物のクローンである。
【０４１１】
（薬学的組成物）
本発明のＮＯＶＸ核酸分子、ＮＯＶＸタンパク質、および抗ＮＯＶＸ抗体（これはまた、本明細書中で、「活性化合物」とも呼ばれる）、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、アナログ、およびホモログが、投与に適した薬学的組成物に組み込まれ得る。このような組成物は、典型的に、核酸分子、タンパク質または抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的な投与に適合性の、任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤（ｄｅｌａｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）などを含むことが意図される。適切なキャリアは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（当該分野の標準的参考文献であって、本明細書中に参考として援用される）の最新版に記載される。このようなキャリアまたは希釈剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、リンゲル（ｆｉｎｇｅｒ）溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油）もまた、使用され得る。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性化合物もまた、組成物へ組み込まれ得る。
【０４１２】
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように処方される。投与経路の例には、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下）投与、経口（例えば、吸入）投与、経皮（すなわち、局所的）投与、経粘膜（ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ）投与、および直腸投与が挙げられる。非経口適用、皮内適用または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような、滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような、抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムのような、抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような、キレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような、張度の調整のための薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調整され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または多用量のバイアル中に入れられ得る。
【０４１３】
注入用途に適した薬学的組成物は、滅菌水溶液（ここでは、水溶性）または分散物、および滅菌注入可能溶液または分散物の即座の調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与において、適切なキャリアには、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、無菌でなければならず、そして容易な注入性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性であるべきである。これは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして、細菌および真菌のような微生物の汚染行為に対して保護されなければならない。このキャリアは、例えば、以下を含む溶媒または分散媒体であり得る：水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）ならびにそれらの適切な混合物。適切な流動性が、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、要求される粒子サイズを維持することによって（分散物の場合）および界面活性剤を使用することによって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトール）、塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注入可能組成物の吸収期間の延長は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を組成物に含ませることによってもたらされ得る。
【０４１４】
滅菌注射可能溶液は、必要量のこの活性化合物（例えば、ＮＯＶＸタンパク質または抗ＮＯＶＸ抗体）を、適切な溶媒中で、上記で列挙される成分の１つまたは組み合わせと共に組み込み、必要な場合、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般的に、分散物は、活性化合物を、基本（ｂａｓｉｃ）の分散媒体および上記で列挙される成分からの必要とされる他の成分とを含む滅菌ビヒクル中へ組み込むことによって調製される。滅菌注射可能液剤の調製のための滅菌粉末の場合において、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、予め滅菌濾過されたその溶液から活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を得る。
【０４１５】
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤へと圧縮され得る。経口治療投与の目的のために、この活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得、そして錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、うがい薬としての使用のために流体キャリアを使用して調製され得、ここで、この流体キャリア中のこの化合物は、経口的に適用され、そして音を立てられ（ｓｗｉｓｈ）、そして吐き出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント物質が、この組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などが、任意の以下の成分または同様の性質を有する化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶セルロース、ガムトラガントまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、またはコーンスターチ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステロテス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ））；潤滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；あるいは香味剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバー）。
【０４１６】
吸入による投与について、この化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のような気体）を含む圧縮容器またはディスペンサー、あるいは噴霧器から、エアロゾル噴霧の形態で送達される。
【０４１７】
全身的投与はまた、経粘膜手段または経皮手段により得る。経粘膜投与または経皮投与について、浸透される障壁に適切な浸透剤が、処方物において使用される。このような浸透剤は、一般的に、当該分野で公知であり、そして、例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻噴霧または坐剤の使用によって達成され得る。経皮投与については、この活性化合物は、当該分野で一般的に公知である軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリーム剤へ処方される。
【０４１８】
この化合物はまた、直腸送達のための坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤基剤と共に）または貯留（ｒｅｎｔｅｎｔｉｏｎ）浣腸の形態で調製され得る。
【０４１９】
１つの実施形態において、この活性化合物は、身体からの迅速な排出に対してこの化合物を保護するキャリアを用いて調製され（例えば、制御放出処方物）、これには、移植片およびマイクロカプセル化された送達系が挙げられる。酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような、生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。このような処方物の調製のための方法は、当業者には明らかである。これらの物質はまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手され得る。リポソーム懸濁物（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を感染させた細胞へ標的化されるリポソームを含む）もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０４２０】
投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態で、経口組成物または非経口組成物を処方することが、特に有益である。本明細書で使用される投薬単位形態は、処置される被験体に対する単位投薬量として適切な物理的に個々の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと関連して所望の治療的効果を生じるように計算された、所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態についての詳細は、この活性化合物の固有の特徴、および達成される特定の治療効果、ならびに個体の処置のためのこのような活性化合物を調合する分野に固有の制限によって決定され、そして、これらに直接依存する。
【０４２１】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、被験体へ、例えば静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）によって、または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）によって送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物には、受容可能な希釈剤中の遺伝子治療ベクターを含み、または遺伝子送達ビヒクルが組み込まれる徐放性マトリックスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞からインタクトで産生され得（例えば、レトロウイルスベクター）、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１以上の細胞を含み得る。
【０４２２】
薬学的組成物は、投与のための使用説明書と共に、容器、包装、またはディスペンサーに含まれ得る。
【０４２３】
（スクリーニングおよび検出の方法）
本発明の単離された核酸分子は、以下にさらに説明されるように、ＮＯＶＸタンパク質（例えば、遺伝子治療適用における宿主細胞中の組換え発現ベクターを介する）を発現するため、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡ（例えば、生物学的サンプルにおいて）またはＮＯＶＸ遺伝子における遺伝子損傷を検出するため、ならびにＮＯＶＸ活性を調節するために使用され得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の活性または発現を調節する薬物または化合物をスクリーニングするために、ならびにＮＯＶＸタンパク質の不十分もしくは過剰な産生によって、あるいはＮＯＶＸ野生型タンパク質と比較して減少した活性もしくは異常な活性を有するＮＯＶＸタンパク質形態の産生によって特徴付けられる障害（例えば；糖尿病（インスリン放出を調節する）；肥満（脂質を結合および輸送する）；肥満に関連した代謝障害、代謝症候群Ｘ、ならびに拒食症および慢性疾患および種々の癌に関連する消耗性障害、および感染性疾患（抗菌活性を有する）、および種々の異脂肪血症）を処置するために使用され得る。さらに、本発明の抗ＮＯＶＸ抗体は、ＮＯＶＸタンパク質を検出および単離するため、ならびにＮＯＶＸ活性を調節するために使用され得る。なおさらなる局面において、本発明は、正の様式および負の様式の両方での、食欲、栄養の吸収、および代謝基質の処理に影響する方法において用いられ得る。
【０４２４】
本発明は、さらに、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイによって同定される新規の薬剤、および上記で本明細書中で記載されるような処置のためのそれらの使用に関する。
【０４２５】
（スクリーニングアッセイ）
本発明は、調節因子、すなわち、ＮＯＶＸタンパク質に結合するか、あるいは例えば、ＮＯＶＸタンパク質の発現またはＮＯＶＸタンパク質の活性に対して刺激効果または阻害効果を有する、候補または試験化合物または薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または他の薬物）を同定するための方法（本明細書中において「スクリーニングアッセイ」とも称される）を提供する。本発明はまた、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイにおいて同定された化合物を含む。
【０４２６】
１実施形態において、本発明は、ＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチド、あるいはその生物学的に活性な部分の膜結合形態に結合するか、またはその膜結合形態の活性を調節する、候補化合物もしくは試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを使用して得られ得、これには、以下が挙げられる：生物学的ライブラリー；空間的に位置付け可能な並行固相もしくは溶液相ライブラリー；逆重畳を要する合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である（例えば、Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １２：１４５を参照のこと）。
【０４２７】
本明細書中で使用される場合、「低分子」とは、約５ｋＤ未満の分子量、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物をいうように意味される。低分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、炭水化物、脂質または他の有機分子もしくは無機分子であり得る。化学的および／または生物学的混合物（例えば、真菌、細菌または藻類抽出物）のライブラリーは、当該分野で公知であり、そして本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングされ得る。
【０４２８】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば以下に見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３。
【０４２９】
化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２〜４２１）、あるいはビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５〜５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第５，２３３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８〜６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１〜３１０；Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２３３，４０９号）において提示され得る。
【０４３０】
１つの実施形態において、アッセイは細胞ベースのアッセイであり、ここで、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上に発現する細胞が、試験化合物と接触され、そしてこの試験化合物がＮＯＶＸタンパク質に結合する能力が、決定される。例えば、細胞は、哺乳動物起源または酵母細胞であり得る。この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質に結合する能力の決定は、例えば、その試験化合物を放射性同位体または酵素標識とカップリングさせて、その結果、この試験化合物のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に対する結合が、複合体におけるその標識化合物を検出することによって決定され得ることによって達成され得る。例えば、試験化合物は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで直接的または間接的のいずれかで標識され得、そしてその放射性同位体が、放射線放射の直接の計数により、またはシンチレーション計数により、検出され得る。あるいは、試験化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識され得、そしてこの酵素的標識が、適切な基質の生成物への転換を決定することにより、検出され得る。１つの実施形態において、このアッセイは、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質、またはその生物学的に活性な部分をその細胞表面上に発現する細胞を、ＮＯＶＸと結合する既知の化合物と接触させる工程、このアッセイ混合物に試験化合物を接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、この試験化合物が、既知の化合物と比較して、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を決定する工程を包含する。
【０４３１】
別の実施形態において、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、これは、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上で発現する細胞を、試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物が、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物が、ＮＯＶＸまたはその生物学的に活性な部分の活性を調節する能力の決定は、例えば、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子に結合またはこれら標的分子と相互作用する能力を決定することによって、達成され得る。本明細書中において使用する場合には、「標的分子」とは、ＮＯＶＸタンパク質が天然に結合または相互作用する分子であり、例えば、ＮＯＶＸ相互作用タンパク質を発現する細胞表面上の分子、第二の細胞表面上の分子、細胞外環境中の分子、細胞膜の内面と会合する分子、または細胞質分子である。ＮＯＶＸ標的分子は、非ＮＯＶＸ分子あるいは本発明のＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドであり得る。１つの実施形態において、ＮＯＶＸ標的分子は、シグナル伝達経路の構成要素であり、これは、細胞膜を通る細胞内への細胞外シグナル（例えば、化合物が膜結合ＮＯＶＸ分子に結合することにより発生するシグナル）の伝達を促進する。その標的は、例えば、触媒活性を有する第二の細胞内タンパク質、または下流シグナル伝達分子のＮＯＶＸとの会合を容易にするタンパク質であり得る。
【０４３２】
ＮＯＶＸタンパク質がＮＯＶＸ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相互作用する能力の決定は、直接的結合を決定するための上記方法の１つにより、達成され得る。１つの実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質がＮＯＶＸ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相互作用する能力の決定は、その標的分子の活性を決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の活性は、その標的の細胞性セカンドメッセンジャー（すなわち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など）の誘導を検出すること、適切な基質への標的の触媒活性／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする核酸に作動可能に連結されたＮＯＶＸ応答性調節エレメントを含む）の誘導を検出すること、または細胞応答（例えば、細胞生存度、細胞分化、または細胞増殖）を検出することにより、決定され得る。
【０４３３】
なお別の実施形態において、本発明のアッセイは、無細胞（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）アッセイであり、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物に接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物の、ＮＯＶＸタンパク質への結合は、上記のように、直接的または間接的にのいずれかで決定され得る。１つのこのような実施形態において、このアッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＮＯＶＸを結合する既知の化合物に接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物に接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、この試験化合物が、既知の化合物と比較して、ＮＯＶＸ、またはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を決定する工程を包含する。
【０４３４】
なお別の実施形態において、アッセイは、無細胞アッセイであり、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物がＮＯＶＸの活性を調節する能力の決定は、例えば、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子に結合する能力を、直接的結合の決定のための上記方法の１つによって決定することにより、達成され得る。代替の実施形態において、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質の活性を調節する能力の決定は、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子をさらに調節する能力を決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の適切な基質に対する触媒活性／酵素活性は、上記のように決定され得る。
【０４３５】
さらに別の実施形態において、無細胞アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＮＯＶＸタンパク質を結合する既知の化合物に接触させてアッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力の決定は、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子と優先的に結合するか、またはその標的分子の活性を優先的に調節する能力を決定する工程を包含する。
【０４３６】
本発明の無細胞アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質の、可溶性の形態または膜結合形態の両方の使用に受け入れられる。膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質を含む無細胞アッセイの場合には、ＮＯＶＸタンパク質の膜結合形態が溶液中に維持されるように、可溶化剤を利用することが所望され得る。このような可溶化剤の例には、非イオン性界面活性剤が挙げられ、例えば、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ（（Ｉｓｏｔｒｉｄｅｃｙｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｅｔｈｅｒ）ｎ）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンミニオール−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−１−ｐｒｏｐａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳ）、または３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンミニオール−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳＯ）である。
【０４３７】
本発明の上記アッセイ方法の１つより多い実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質またはその標的分子のいずれかを固定して、そのタンパク質の一方または両方の非複合形態からの複合形態の分離を促進し、そしてそのアッセイの自動化に適合させることが、所望され得る。試験化合物の、ＮＯＶＸタンパク質への結合、または候補化合物の存在下および非存在下での、ＮＯＶＸタンパク質の標的分子との相互作用は、これらの反応物を収容するために適切な任意の容器内で、達成され得る。このような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。１実施形態において、そのタンパク質の一方または両方がマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質が、提供され得る。例えば、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質またはＧＳＴ標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され得、次いでこれらは、試験化合物と合わせられるか、あるいは試験化合物および未吸着標的タンパク質またはＮＯＶＸタンパク質のいずれかと合わせられ、そしてこの混合物が、複合体形成を誘導する条件下（例えば、塩およびｐＨに関して生理学的条件）でインキュベートされる。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、結合していないあらゆる成分を除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定し、例えば上記のように、複合体を直接的または間接的のいずれかで決定する。あるいは、複合体がマトリックスから解離され得、そしてＮＯＶＸタンパク質の結合レベルまたは活性レベルを、標準的な技術を使用して決定し得る。
【０４３８】
タンパク質をマトリックスに固定するための他の技術もまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質、またはその標的分子のいずれかが、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を利用して、固定され得る。ビオチン化ＮＯＶＸタンパク質、または標的分子は、当該分野において周知の技術を使用して、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製され得（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）、そしてストレプトアビジンでコーティングした９６ウェルのプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定され得る。あるいは、ＮＯＶＸタンパク質、または標的分子と反応性であるがＮＯＶＸタンパク質のその標的分子への結合を妨害しない抗体が、そのプレートのウェルに誘導体化され得、そして結合していない標的またはＮＯＶＸタンパク質が、抗体の結合によってウェル内に捕捉され得る。このような複合体を検出するための方法には、ＧＳＴ固定複合体に関しての上記で述べた方法に加えて、ＮＯＶＸタンパク質または標的分子と反応性の抗体を使用する、複合体の免疫検出、ならびにＮＯＶＸタンパク質、または標的分子に関する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが挙げられる。
【０４３９】
別の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質発現のモジュレーターは、細胞を候補化合物と接触させ、そして細胞中のＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を決定する方法において同定される。候補化合物の存在下でのＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、候補化合物の非存在下でのＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較される。次いで、候補化合物は、この比較に基づいて、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のモジュレーターとして同定され得る。例えば、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の非存在下よりもその存在下における方が大きい（すなわち、統計的に有意に大きい）場合、この候補化合物は、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の刺激物質として同定される。あるいは、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の非存在下よりその存在下の方が少ない（統計的に有意に少ない）場合、この候補化合物は、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のインヒビターとして同定される。細胞中のＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するために本明細書中に記載の方法によって決定され得る。
【０４４０】
本発明のなお別の局面において、ＮＯＶＸタンパク質は、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおいて「餌（ベイト）（ｂａｉｔ）タンパク質」として使用されて（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら、１９９３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら、１９９３  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら、１９９３  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ  ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）、ＮＯＶＸ（「ＮＯＶＸ結合タンパク質」または「ＮＯＶＸ−ｂｐ」）に結合するか、またはこれと相互作用し、そしてＮＯＶＸ活性を調節する他のタンパク質を同定し得る。このようなＮＯＶＸ結合タンパク質はまた、例えば、ＮＯＶＸ経路の上流または下流エレメントとしてＮＯＶＸタンパク質によるシグナル伝達に関与する可能性がある。
【０４４１】
ツーハイブリッド系は、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインからなる、大部分の転写因子のモジュール的性質に基づく。簡潔には、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。一方の構築物においては、ＮＯＶＸをコードする遺伝子が既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他方の構築物においては、ＤＮＡ配列のライブラリー由来の、未同定タンパク質（「餌食（ｐｒｅｙ）」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列が、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「餌」および「餌食」タンパク質がインビボで相互作用して、ＮＯＶＸ依存性複合体を形成し得る場合、この転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、非常に近くにある。近位にあることにより、転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写が可能となる。レポーター遺伝子の発現が検出され得、そして機能的転写因子を含む細胞コロニーが、単離され得、そしてＮＯＶＸと相互作用するタンパク質をコードするクローニングされた遺伝子を得るために使用され得る。
【０４４２】
本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイにより同定される新規な因子および本明細書中に記載されるような処置のためのこの因子の使用に関する。
【０４４３】
（検出アッセイ）
本明細書中で同定されるｃＤＮＡ配列の一部またはフラグメント（および対応する完全な遺伝子配列）は、ポリヌクレオチド試薬として多くの方法で使用され得る。例えば、これらの配列を使用して、（ｉ）染色体上にそれぞれの遺伝子をマッピングし得；従って遺伝病と関連する遺伝子領域を位置決定し得る；（ｉｉ）微量の生物学的サンプルから個体を同定し得る（組織型決定）；および（ｉｉｉ）生物学的サンプルの法医学的識別を助け得るが、これに限定されない。これらの適用のいくつかは、以下の節において記載される。
【０４４４】
（染色体マッピング）
一旦、遺伝子の配列（または配列の一部分）が単離されると、この配列を用いて染色体上に遺伝子の位置をマッピングし得る。このプロセスは、染色体マッピングとよばれる。従って、ＮＯＶＸ配列の一部またはフラグメント、配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６、またはそのフラグメントもしくは誘導体を用いて、それぞれ、ＮＯＶＸ遺伝子の位置を染色体上にマッピングし得る。ＮＯＶＸ配列を染色体にマッピングすることは、これらの配列と、疾患と関連する遺伝子とを相関付ける際の重要な第一歩である。
【０４４５】
要するに、ＮＯＶＸ遺伝子は、ＮＯＶＸ配列からＰＣＲプライマー（好ましくは、１５〜２５ｂｐの長さ）を調製することにより染色体にマッピングし得る。ＮＯＶＸ配列のコンピューター分析を用いて、ゲノムＤＮＡにおける１つを超えるエキソンにまたがらないプライマーを迅速に選択し得、従って、増幅プロセスを複雑にし得る。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用され得る。ＮＯＶＸ配列に対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅されたフラグメントを生じる。
【０４４６】
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳動物由来の体細胞（例えば、ヒトおよびマウス細胞）を融合することにより調製される。ヒトおよびマウスの細胞のハイブリッドが増殖および分裂するにつれ、それらは、無作為な順序で徐々にヒト染色体を失うが、マウス染色体を維持する。マウス細胞は増殖できないが、ヒト細胞は増殖できる培地を使用することにより、それらは特定の酵素を失うので、必要な酵素をコードする遺伝子を含む１つのヒト染色体が維持される。種々の培地を使用することによって、ハイブリッド細胞株のパネルが確立され得る。パネルにおける各細胞株は、単一のヒト染色体または少数のヒト染色体いずれかおよびマウス染色体の完全なセットを含み、これにより、個々の遺伝子を特定のヒト染色体にマッピングすることが容易に可能になる（例えば、Ｄ’Ｅｕｓｔａｃｈｉｏら（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２０：９１９−９２４を参照のこと）。ヒト染色体のフラグメントのみを含む体細胞ハイブリッドはまた、転座および欠失を伴うヒト染色体を使用することにより生成され得る。
【０４４７】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に特定の配列を割り当てるための迅速な手順である。単一のサーマルサイクラーを用いて一日に３つ以上の配列が割り当てられ得る。ＮＯＶＸ配列を使用して、オリゴヌクレオチドプライマーを設計すると、下位位置決定（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、特定の染色体由来のフラグメントのパネルを用いて達成され得る。
【０４４８】
中期染色体スプレッドに対するＤＮＡ配列の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）をさらに使用して、一工程で正確な染色体位置を提供し得る。染色体スプレッドは、（紡錘体を破壊する）コルセミドのような化学物質により分裂が中期においてブロックされた細胞を使用して行われ得る。この染色体は、トリプシンで短時間処理され得、次いで、ギムザ染色され得る。薄いバンドおよび濃いバンドのパターンが各染色体で発生し、その結果、この染色体は、個々に同定され得る。ＦＩＳＨ技術は、５００または６００塩基ほどの短さのＤＮＡ配列と共に使用され得る。しかし、１，０００塩基より大きなクローンは、簡単な検出に十分なシグナル強度で、独特の染色体位置に結合する可能性がより高い。好ましくは、１，０００塩基、そしてより好ましくは、２，０００塩基が妥当な時間量で良好な結果を得るために十分である。この技術の総説については、Ｖｅｒｍａら、ＨＵＭＡＮ  ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥＳ：Ａ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  ＢＡＳＩＣ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８８）を参照のこと。
【０４４９】
染色体マッピングの試薬は、単一の染色体またはその染色体上の単一部位をマークするために個々に使用され得るか、または試薬のパネルは複数部位および／または複数染色体をマークするために使用され得る。遺伝子の非コード領域に対応する試薬は、実際に、マッピング目的のために好ましい。コード配列は、遺伝子ファミリー内に保存されており、従って、染色体マッピングの間に交叉ハイブリダイゼーションの機会が増大する可能性が高い。
【０４５０】
一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、その配列の染色体上の物理的位置は、遺伝子マップデータと相関し得る。このようなデータは、例えば、ＭｃＫｕｓｉｃｋ，ＭＥＮＤＥＬＩＡＮ  ＩＮＨＥＲＩＴＡＮＣＥ  ＩＮ  ＭＡＮ（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｗｅｌｃｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙを通じてオンラインで入手可能）において見いだされる。次いで、同じ染色体領域にマッピングされる遺伝子と疾患との間の関係は、例えば、Ｅｇｅｌａｎｄら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２５：７８３−７８７に記載される連鎖分析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）によって同定され得る。
【０４５１】
さらに、ＮＯＶＸ遺伝子と関連する疾患に罹患した個体と、この疾患に罹患していない個体との間のＤＮＡ配列における差異が決定され得る。罹患した個体のいくらかまたは全てにおいて変異が認められるが、非罹患個体のいずれにおいても認められない場合、この変異は特定の疾患の候補因子である可能性が高い。罹患個体と非罹患個体の比較は、一般に、染色体における構造的変化（例えば、染色体スプレッドから可視であるか、またはそのＤＮＡ配列に基づいたＰＣＲを用いて検出可能な欠失または転座）を最初に探すことを包含する。最終的に、いくらかの個体に由来する遺伝子の完全な配列決定を行って、変異の存在を確認し、かつ多型に由来する変異を区別し得る。
【０４５２】
（組織型決定（ｔｉｓｓｕｅ  ｔｙｐｉｎｇ））
本発明のＮＯＶＸ配列はまた、わずかな生物学的サンプルから個体を識別するために使用され得る。この技術において、個体のゲノムＤＮＡは、１つ以上の制限酵素で消化され、そして同定のために独特のバンドを生成するためにサザンブロット上でプローブされる。本発明の配列は、ＲＦＬＰ（米国特許第５，２７２，０５７号に記載の「制限酵素断片長多型」）のためのさらなるＤＮＡマーカーとして有用である。
【０４５３】
さらに、本発明の配列を用いて、個体のゲノムの選択された部分について実際の塩基ごとにＤＮＡ配列を決定する代替的技術を提供し得る。従って、本明細書中に記載のＮＯＶＸ配列を用いて、配列の５’末端および３’末端から２つのＰＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これらのプライマーを使用して、個体のＤＮＡを増幅し得、引き続いて、配列決定し得る。
【０４５４】
この様式で調製された個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、各個体が、対立遺伝子差異に起因するこのようなＤＮＡ配列の独特のセットを有するので、唯一の個体識別を提供し得る。本発明の配列は、個体由来および組織由来の配列のこのような識別を得るために使用され得る。本発明のＮＯＶＸ配列は、ヒトゲノムの部分を独特に表す。対立遺伝子変異は、これらの配列のコード領域においてある程度生じ、そして非コード領域においてより大きな程度に生じる。個々のヒト間での対立遺伝子変異は、各５００塩基につき約１回の頻度で生じると見積もられる。対立遺伝子変異の多さは、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）を含む一塩基多型（ＳＮＰ）に起因する。
【０４５５】
本明細書中で記載の配列の各々は、ある程度、標準物質（これに対して個体からのＤＮＡが識別の目的で比較され得る）として使用され得る。より多くの多型が非コード領域で生じるので、個体を区別するために、それほど多くの配列が必要であるわけではない。非コード配列は、おそらく１０〜１，０００プライマーのパネルを用いてポジティブな個体識別を不自由なく提供し得る。これらのプライマーは、各々が１００塩基の増幅された非コード配列を生じる。推定コード配列（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６における配列）が使用される場合、ポジティブな個体識別に関するプライマーのより適切な数は、５００〜２，０００である。
【０４５６】
（予測医療）
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬物ゲノム（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）およびモニタリング臨床試験が、予後（予測）の目的に使用され、これによって個体を予防的に処置する、予測医療の分野に関する。従って、本発明の１つの局面は、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織）の場合においては、ＮＯＶＸタンパク質および／または核酸の発現、ならびにＮＯＶＸの活性を決定するための診断アッセイに関し、これによって、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連して、個体が疾患または障害に罹患するかどうか、あるいは障害を発症するリスクがあるかどうかを決定する。この障害としては、代謝障害、糖尿病、肥満症、感染症、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、ならびに種々の異常脂肪性浮腫（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａｓ）、肥満に関連する代謝障害、Ｘ代謝症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｘ）、ならびに慢性疾患および種々のガンと関連する消耗疾患が挙げられる。本発明はまた、個体が、ＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または活性と関連した障害を発症するリスクがあるかどうかを決定するための予後的（または予測的）アッセイを提供する。例えば、ＮＯＶＸの遺伝子における変異が、生物学的サンプルにおいてアッセイされ得る。このようなアッセイは、予後的または予測的な目的に使用され、これによってＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または生物学的活性によって特徴付けられるかまたは関連した障害の発病の前に個体を予防的に処置し得る。
【０４５７】
本発明の別の局面は、個体におけるＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または活性を決定するための方法を提供し、これによって、その個体についての適切な治療的または予防的試薬（本明細書において「薬物ゲノム」とよばれる）を選択する。薬物ゲノムは、個体の遺伝型（例えば、特定の試薬に対して応答する個体の能力を決定するために試験された個体の遺伝型）に基づいて個体の治療的または予防的処置のための試薬（例えば、薬物）の選択を可能にする。
【０４５８】
本発明のなお別の局面は、臨床試験におけるＮＯＶＸの発現または活性に対する試薬（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることに関する。
【０４５９】
これらおよび他の試薬は、以下の節でさらに詳細に記載される。
【０４６０】
（診断アッセイ）
生物学的サンプルにおけるＮＯＶＸの存在または非存在を検出するための例示的な方法は、試験被験体から生物学的サンプルを得る工程、およびその生物学的サンプルをＮＯＶＸのタンパク質またはＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出し得る化合物もしくは薬剤とを接触させ、その結果、ＮＯＶＸの存在が、その生物学的サンプルにおいて検出される、工程を包含する。ＮＯＶＸのｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡを検出するための薬剤は、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る、標識された核酸プローブである。この核酸プローブは、例えば、全長のＮＯＶＸの核酸（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６の核酸またはそれらの一部）（例えば、少なくとも、１５、３０、５０、１００、２５０もしくは５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件下でＮＯＶＸのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするに十分である核酸）であり得る。本発明の診断アッセイにおける使用のための他の適切なプローブは本明細書において記載されている。
【０４６１】
ＮＯＶＸのタンパク質を検出するための薬剤は、ＮＯＶＸのタンパク質に結合し得る抗体であり、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナルであり得るか、またはより好ましくはモノクローナル抗体であり得る。インタクトな抗体またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が使用され得る。用語「標識（された）」とは、プローブまたは抗体に関して、検出可能な物質をそのプローブもしくは抗体にカップリングさせる（すなわち、物理的に連結する）ことによってそのプローブまたは抗体を直接標識すること、ならびに、直接標識された別の試薬との反応性によってそのプローブもしくは抗体の間接的な標識をすることを包含することが意図される。間接的な標識の例としては、蛍光標識された二次抗体を用いた一次抗体の検出、および蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて検出され得るようにＤＮＡプローブのビオチンを用いた末端標識が挙げられる。用語「生物学的サンプル」とは、被験体から単離された、組織、細胞および生物学的流体ならびに被験体に存在する組織、細胞および流体を含むことが意図される。すなわち、本発明の検出方法を用いて、ＮＯＶＸのｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを、生物学的サンプル中で、インビトロおよびインビボで検出し得る。例えば、ＮＯＶＸのｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。ＮＯＶＸのタンパク質の検出のためのインビトロ技術としては、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光が挙げられる。ＮＯＶＸのゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、ＮＯＶＸのタンパク質の検出のためのインビボ技術としては、標識された抗ＮＯＶＸ抗体を被験体に導入することが挙げられる。例えば、その抗体は、放射性マーカーを用いて標識され得る。被験体における放射性マーカーの存在および位置は、標準的な画像化技術によって検出され得る。
【０４６２】
１つの実施形態において、この生物学的サンプルは、その試験被験体からのタンパク質分子を含む。あるいは、その生物学的サンプルは、その試験被験体からのｍＲＮＡ分子またはその試験被験体からのゲノムＤＮＡ分子を含み得る。好ましい生物学的サンプルは、被験体から従来の手段によって単離された末梢血白血球サンプルである。
【０４６３】
別の実施形態において、本発明の方法はさらに、コントロール被験体からコントロール生物学的サンプルを得る工程、そのコントロールサンプルを、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡを検出し得る化合物もしくは薬剤と接触させ、その結果、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在がその生物学的サンプルにおいて検出される、工程、およびそのコントロールサンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在と、その試験サンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在とを比較する工程を包含する。
【０４６４】
本発明はまた、生物学的サンプルにおけるＮＯＶＸの存在を検出するためのキットを包含する。例えば、このキットは、以下を備え得る：生物学的サンプルにおいてＮＯＶＸのタンパク質またはｍＲＮＡを検出し得る、標識された化合物もしくは薬剤；そのサンプルにおいてＮＯＶＸの量を決定するための手段；およびそのサンプルにおいて、標準と、ＮＯＶＸの量とを比較するための手段。この化合物または薬剤は、適切な容器内に包装され得る。このキットは、さらに、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸を検出するためにキットを用いるための指示書を備え得る。
【０４６５】
（予後アッセイ）
本明細書において記載された診断方法をさらに利用して、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連した疾患もしくは障害を有するか、またはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。例えば、本明細書に記載されるアッセイ（例えば、上述の診断アッセイまたは下記のアッセイ）を利用して、ＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または活性に関連する障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。あるいは、この予後アッセイを利用して、疾患または障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。従って、本発明は、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する疾患もしくは障害を同定するための方法を提供する。ここで、試験サンプルは、被験体から得られ、そしてＮＯＶＸのタンパク質または核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）が検出され、ここで、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸の存在は、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する疾患または障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体についての診断指標である。本明細書において使用される場合「試験サンプル」とは、目的の被験体から得られた生物学的サンプルをいう。例えば、試験サンプルは、生物学的流体（例えば、血清）、細胞サンプル、または組織であり得る。
【０４６６】
さらに、本明細書に記載される予後アッセイを使用して、被験体に薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の薬物候補）を投与してＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する疾患または障害を処置し得るか否かを、決定し得る。例えば、このような方法を使用して、被験体が障害のための薬剤で有効に処置され得るか否かを決定し得る。従って、本発明は、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する障害のための薬剤を用いて、被験体が有効に処置され得るか否かを決定するための方法を提供する。ここで、試験サンプルが得られ、そしてＮＯＶＸのタンパク質または核酸が検出される（例えば、ここで、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸の存在は、この薬剤が投与されてＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する障害が処置され得る被験体についての、診断指標である）。
【０４６７】
本発明の方法はまた、ＮＯＶＸ遺伝子における遺伝的損傷を検出し、それによって、その損傷遺伝子を有する被験体が異常な細胞増殖および／または分化によって特徴付けられる障害についての危険性を有するか否かを決定するためにも使用され得る。種々の実施形態において、この方法は、その被験体からの細胞のサンプルにおいて、ＮＯＶＸタンパク質をコードする遺伝子の統合性に影響を与える少なくとも１つの変更によって特徴付けられる遺伝的損傷の存在または非存在、あるいはＮＯＶＸ遺伝子の誤発現を検出する工程を包含する。例えば、そのような遺伝的損傷は、以下の少なくとも１つの存在を確認することによって検出され得る：（ｉ）ＮＯＶＸ遺伝子からの１つ以上のヌクレオチドの欠失；（ｉｉ）ＮＯＶＸ遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの付加；（ｉｉｉ）ＮＯＶＸ遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの置換、（ｉｖ）ＮＯＶＸ遺伝子の染色体再配置；（ｖ）ＮＯＶＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルにおける変更、（ｖｉ）ＮＯＶＸ遺伝子の異常改変（例えば、ゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常改変）、（ｖｉｉ）ＮＯＶＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、（ｖｉｉｉ）ＮＯＶＸタンパク質の非野生型レベル、（ｉｘ）ＮＯＶＸ遺伝子の対立遺伝子の欠失、ならびに（ｘ）ＮＯＶＸタンパク質の不適切な翻訳後修飾。本明細書において記載されるように、当該分野において、ＮＯＶＸ遺伝子における損傷を検出するために使用され得る、多数の公知のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的サンプルは、従来手段によって被験体から単離された末梢血白血球サンプルである。しかし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプルが使用され得、これには、例えば、頬粘膜細胞が挙げられる。
【０４６８】
特定の実施形態において、損傷の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を参照のこと）（例えば、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ  ＰＣＲ）、あるいは、連結連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３６０−３６４を参照のこと）におけるプローブ／プライマーの使用を包含する。後者は、ＮＯＶＸ遺伝子における点変異を検出するために特に有用であり得る（Ａｂｒａｖａｙａら，１９９５  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：６７５−６８２を参照のこと）。この方法は、患者から細胞のサンプルを収集する工程、核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたはその両方）をそのサンプルの細胞から単離する工程、ＮＯＶＸの遺伝子に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーとその核酸サンプルとを、ＮＯＶＸ遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で接触させる工程、ならびに増幅産物の存在もしくは非存在を検出する工程、またはその増幅産物のサイズを検出する工程およびその長さをコントロールサンプルと比較する工程を包含し得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書中に記載される変異を検出するために使用される技術のいずれかとともに予備的増幅工程として使用されることが望ましくあり得ることが予想される。
【０４６９】
代替的な増幅方法としては、以下が挙げられる：当業者に周知な技術を用いた、その増幅された分子の検出の前の、自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８を参照のこと）、転写増幅系（Ｋｗｏｈら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７を参照のこと）、Ｑβレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７を参照のこと）、または他の任意の核酸増幅方法。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に極少数で存在する場合に、そのような核酸分子の検出のために特に有用である。
【０４７０】
代替の実施形態において、サンプル細胞からのＮＯＶＸ遺伝子における変異は、制限酵素切断パターンにおける変更によって同定され得る。例えば、サンプルおよびコントロールのＤＮＡが単離され、増幅され（必要に応じて）、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて消化され、そしてフラグメント長の大きさがゲル電気泳動によって決定され、そして比較される。サンプルＤＮＡとコントロールＤＮＡとの間のフラグメント長の大きさにおける差異は、そのサンプルＤＮＡにおける変異を示す。さらに、配列特異的なリボザイムの使用（例えば、米国特許第５，４９３，５３１号を参照のこと）を使用して、リボザイム切断部位の発生または喪失によって、特異的な変異の存在についてスコア付けし得る。
【０４７１】
他の実施形態において、ＮＯＶＸにおける遺伝子変異は、サンプル核酸およびコントロール核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイに対してハイブリダイズさせることによって同定され得る（例えば、Ｃｒｏｎｉｎら（１９９６）Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｌら（１９９６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：７５３−７５９を参照のこと）。例えば、ＮＯＶＸにおける遺伝子変異は、Ｃｒｏｎｉｎら（前出）に記載されるように光生成ＤＮＡプローブを含む二次元アレイにおいて同定され得る。手短には、プローブの第一ハイブリダイゼーションアレイを用いて、サンプルおよびコントロールにおける長いストレッチのＤＮＡにわたって走査し、連続的に重複するプローブの線形アレイを作成することによって、その配列間の塩基変化を同定し得る。この工程は、点変異の同定を可能にする。この工程に第二のハイブリダイゼーションアレイが続き、これは、検出される全ての改変体または変異体に相補的な、より小さな特化されたプローブアレイを用いることによる特定の変異の特徴付けを可能にする。各変異アレイは、一方が野生型遺伝子に対して相補的であり、そして他方が変異遺伝子に対して相補である並行プローブセットから構成される。
【０４７２】
なお別の実施形態において、当該分野で公知の種々の配列決定反応のいずれかを使用して、ＮＯＶＸ遺伝子を直接配列決定し得、そしてサンプルＮＯＶＸ配列と対応する野生型（コントロール）配列とを比較することによって、変異を検出し得る。配列決定反応の例としては、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ  ７４：５６０またはＳａｎｇｅｒ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ  ７４：５４６３によって開発された技術に基づくものが挙げられる。診断アッセイを実施する場合、種々の自動化配列決定手順のいずれかを利用し得ることもまた企図される（例えば、Ｎａｅｖｅら（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９：４４８を参照のこと）。これらには、質量分析法による配列決定法（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ  ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら（１９９６）Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎら（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７−１５９を参照のこと）が含まれる。
【０４７３】
ＮＯＶＸ遺伝子における変異を検出するための他の方法としては、切断剤からの保護を使用して、ＲＮＡ／ＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡのヘテロ二重鎖におけるミスマッチ塩基を検出する方法が挙げられる（例えば、Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２を参照のこと）。一般に、「ミスマッチ切断」の当該分野の技術は、野生型のＮＯＶＸ配列を含む（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織サンプルから得られた潜在的な変異体ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることによって形成されるヘテロ二重鎖を提供する工程によって始まる。この二本鎖の二重鎖を、二重鎖の一本鎖領域（例えば、そのコントロールとサンプルの鎖との間の塩基対ミスマッチに起因して存在するもの）を切断する薬剤を用いて処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を、ＲＮａｓｅを用いて処理し得、そしてＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、そのミスマッチ領域を酵素的に消化するために、Ｓ１ヌクレアーゼを用いて処理し得る。他の実施形態において、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡのいずれかの二重鎖を、ミスマッチ領域を消化するために、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム、およびピペリジンを用いて処理し得る。そのミスマッチ領域の消化後、次いで、得られた物質を変性ポリアクリルアミドゲル上で、大きさにより分離して、変異の部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａら（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５を参照のこと。１つの実施形態において、コントロールのＤＮＡまたはＲＮＡは、検出のために標識され得る。
【０４７４】
なお別の実施形態において、ミスマッチ切断反応は、二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチ塩基対を認識する１つ以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を、細胞のサンプルから得られたＮＯＶＸ  ｃＤＮＡにおける点変異を検出およびマッピングするために規定された系において使用する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチでＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチでＴを切断する（例えば、Ｈｓｕら（１９９４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １５：１６５７〜１６６２を参照のこと）。例示的な実施形態に従って、ＮＯＶＸ配列（例えば、野生型ＮＯＶＸ配列）に基づくプローブは、試験細胞由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物にハイブリダイズされる。二重鎖は、ＤＮＡミスマッチ修復酵素を用いて処理され、そしてその切断産物（もしあれば）は、電気泳動プロトコルなどから検出され得る。例えば、米国特許第５，４５９，０３９号を参照のこと。
【０４７５】
他の実施形態において、電気泳動の移動度における変化は、ＮＯＶＸ遺伝子における変異を同定するために使用される。例えば、一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）は、変異体と野生型核酸との間の電気泳動の移動度における差異を検出するために使用され得る（例えば、Ｏｒｉｔａら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：８６：２７６６；Ｃｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５〜１４４；Ｈａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３〜７９を参照のこと）。サンプルおよびコントロールＮＯＶＸ核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントは、変性され、そして再生される。一本鎖核酸の二次構造は、配列に従って変化し、電気泳動の移動度において得られる変化は、１つの塩基変化の検出さえも可能にする。ＤＮＡフラグメントは、標識され得るか、または標識されたプローブを用いて検出され得る。アッセイの感度は、ＤＮＡよりもむしろ、二次構造が配列中の変化に対してより敏感であるＲＮＡを使用することによって増強され得る。１つの実施形態において、本発明の方法は、ヘテロ二重鎖分析を利用して、電気泳動の移動度における変化に基づいて二本鎖のヘテロ二重鎖分子を分離する。例えば、Ｋｅｅｎら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．７：５を参照のこと。
【０４７６】
なお別の実施形態において、一定勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミドゲルにおける変異体または野生型フラグメントの移動は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使用してアッセイされる。例えば、Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：４９５を参照のこと。ＤＧＧＥが分析の方法として使用される場合、ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲにより約４０ｂｐの高融点ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプを付加することによって、完全には変性されないことを確実するように改変される。さらなる実施形態において、温度勾配は、コントロールおよびサンプルＤＮＡの移動度における差異を同定するために、変性剤勾配の代わりに使用される。例えば、ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２７５３を参照のこと。
【０４７７】
点変異を検出するための他の技術の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、既知の変異が中心に配置されるように調製され得、次いで、完全なマッチが見出される場合にのみ、ハイブリダイゼーションを許容する条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズされる。例えば、Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３；Ｓａｉｋｉら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６２３０を参照のこと。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ膜に付着され、そして標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズされる場合に、ＰＣＲ増幅された標的ＤＮＡまたは多数の異なる変異にハイブリダイズされる。
【０４７８】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術は、本発明と合わせて使用され得る。特異的増幅についてのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中心（その結果、増幅は、差次的ハイブリダイゼーションに依存する）（例えば、Ｇｉｂｂｓら（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２４３７〜２４４８を参照のこと）か、あるいは適切な条件下でミスマッチが妨げられ得るかまたはポリメラーゼ伸長を減少し得る、１つのプライマーの３’の最末端に、目的の変異を保有し得る（例えば、Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ  １１：２３８を参照のこと）。さらに、切断に基づく検出を行うために、変異領域に新規な制限部位を導入することは、望ましくあり得る。例えば、Ｇａｓｐａｒｉｎｉら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ６：１を参照のこと。特定の実施形態において、増幅はまた、増幅用Ｔａｑリガーゼを使用して実施され得ることが予測される。例えば、Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８９を参照のこと。このような場合において、連結は、５’配列の３’末端での完全なマッチが存在する場合にのみ生じ、増幅の存在または非存在を探索することによって、特定の部位における既知の変異の存在を検出することを可能にする。
【０４７９】
本明細書中に記載される方法は、例えば、本明細書中に記載れる少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含む、予めパッケージングされた診断キットを利用することによって実施され得、これは、例えば、ＮＯＶＸ遺伝子を含む疾患または疾病の症状または家族病歴を示す患者を診断するための臨床的設定において好都合に使用され得る。
【０４８０】
さらに、ＮＯＶＸが発現される任意の細胞型または組織（好ましくは、末梢血白血球）は、本明細書中に記載される予後アッセイにおいて利用され得る。しかし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプル（例えば、頬粘膜細胞を含む）が、使用され得る。
【０４８１】
（薬理ゲノム学（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ））
ＮＯＶＸ活性（例えば、ＮＯＶＸ遺伝子発現）に対する刺激性または阻害性の影響を有する因子、すなわちモジュレーターは、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定されるように、（予防的または治療的に）処置されるべき個体に投与され得る（この障害としては、代謝障害、糖尿病、肥満症、感染症、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、ならびに種々の異常脂肪性浮腫（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａｓ）、肥満に関連する代謝障害、Ｘ代謝症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｘ）、ならびに慢性疾患および種々の癌と関連する消耗疾患が挙げられる）。このような処置と合わせて、個体の薬理ゲノム学（すなわち、個体の遺伝子型と外来化合物または薬物に対するその個体の応答との間の関係についての研究）が、考慮され得る。治療剤の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血中濃度との間の関係を変更することによって、重篤な毒性または治療の失敗を導き得る。従って、個体の薬理ゲノム学は、個体の遺伝子型の考慮に基づく予防的または治療的処置のために有効な因子（例えば、薬物）の選択を可能にする。このような薬理ゲノム学は、さらに、適切な投薬量および治療剤レジメンを決定するために使用され得る。従って、ＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、あるいは個体におけるＮＯＶＸ遺伝子の変異含量が決定されて、それによって個体の治療的または予防的処置のために適切な因子を選択し得る。
【０４８２】
薬理ゲノム学は、罹患した人おける変更された薬物の性質および異常な作用に起因して、薬物に応答する臨床的に有意な遺伝性変更を扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ、１９９６、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，２３：９８３〜９８５；Ｌｉｎｄｅｒ、１９９７、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ，４３：２５４〜２６６を参照のこと。一般に、２つの型の薬理ゲノム学状態が、区別され得る。薬物が身体に作用する方法を変更する１つの因子として伝達される遺伝的状態（変更された薬物作用）、または身体が薬物に作用する方法を変更する１つの因子として伝達される遺伝的状態（変更された薬物代謝）。これらの薬理ゲノム学状態は、稀な欠損としてか、または多型としてのいずれかで生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）欠損は、一般的な遺伝性酵素病であり、この主な臨床的合併症は、酸化剤薬物（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取およびソラマメの摂食後の溶血である。
【０４８３】
例示的な実施形態として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および持続期間の両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびシトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多型の発見は、幾人かの患者が予期される薬物効果を得ないか、または標準的かつ安全な用量の薬物を摂取した後に過大な薬物応答および深刻な毒性を示すことに関しての説明を提供した。これらの多型は、集団において２つの表現型（高い代謝能を持つ人（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＥＭ）および低い代謝能を持つ人（ｐｏｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＰＭ））で表現される。ＰＭの有病率は、異なる集団の間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型であり、そしていくらかの変異がＰＭにおいて同定されており、この全ては機能的ＣＹＰ２Ｄ６の非存在に至る。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低い代謝能を持つ人は、彼らが標準的な用量を受ける場合に、かなり頻繁に過大な薬物応答および副作用を経験する。代謝産物が活性な治療的部分である場合、そのＣＹＰ２Ｄ６形成代謝産物モルヒネによって媒介されるコデインの鎮痛効果について実証されるように、ＰＭは治療的応答を示さない。他の極端なものは、標準的な用量に応答しない、いわゆる超迅速な代謝能を持つ人である。最近、超迅速な代謝の基準となる分子は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に起因していることが同定されている。
【０４８４】
従って、ＮＯＶＸのタンパク質の活性、ＮＯＶＸの核酸の発現、あるいは個体におけるＮＯＶＸの遺伝子の変異内容を決定して、それによって、その個体の治療的または予防的処置のために適切な因子を選択し得る。さらに、薬理ゲノム学の研究を使用して、個体の薬物応答性の表現型の同定に対して薬物代謝酵素をコードする多型対立遺伝子の遺伝子型を適用し得る。この知見は、用量または薬物選択に適用される場合、有害な反応または治療の失敗を回避し得、従って、被験体をＮＯＶＸの調節因子（例えば、本明細書中に記載される例示的なスクリーニングアッセイの１つによって同定される調節因子）を用いて処置する場合に治療的または予防的効率を増強し得る。
【０４８５】
（臨床試験中の効果のモニタリング）
ＮＯＶＸの発現または活性（例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調節する能力）に対する因子（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることは、基本的な薬物スクリーニングだけでなく臨床試験に適用され得る。例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイによって、ＮＯＶＸの遺伝子発現、タンパク質レベルを増加するか、またはＮＯＶＸ活性をアップレギュレートすることが決定される、因子の効力は、減少したＮＯＶＸの遺伝子発現、減少したタンパク質レベル、またはダウンレギュレートしたＮＯＶＸの活性を示す被験体の臨床試験においてモニターされ得る。あるいは、スクリーニングアッセイによって、減少したＮＯＶＸの遺伝子発現、減少したタンパク質レベル、またはＮＯＶＸの活性をダウンレギュレートすることが決定される、因子の効力は、増加したＮＯＶＸの遺伝子発現、減少したタンパク質レベル、またはアップレギュレートしたＮＯＶＸの活性を示す被験体の臨床試験においてモニターされ得る。このような臨床試験において、ＮＯＶＸの発現または活性、および好ましくは、例えば、細胞増殖または免疫障害に関与する他の遺伝子が、「リードアウト（読み出し）（ｒｅａｄ  ｏｕｔ）」、すなわち、特定の細胞の免疫応答性のマーカーとして使用され得る。
【０４８６】
例えば、ＮＯＶＸを含む遺伝子（これは、ＮＯＶＸ活性（例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイにおいて同定される）を調節する因子（例えば、化合物、薬物または低分子）を用いる処置によって、細胞内で調節される）が同定され得るが、これらに限定されない。従って、細胞性増殖障害に対する因子の効果を研究するために、例えば、臨床試験において、細胞が単離され得、そしてＲＮＡが調製され得、そしてＮＯＶＸおよびこの障害に関与する他の遺伝子の発現のレベルについて分析され得る。遺伝子発現のレベル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、本明細書中に記載されるように、ノーザンブロット分析もしくはＲＴ−ＰＣＲによるか、あるいは産生されるタンパク質の量を測定することによるか、本明細書中に記載されるような方法の１つによるか、あるいはＮＯＶＸまたは他の遺伝子の活性のレベルを測定することによって、定量され得る。この様式で、この遺伝子発現パターンは、この因子に対する細胞の生理学的応答の指標であるマーカーとして作用し得る。従って、この応答状態は、この因子を用いる個体の処置の前、および処置の間の種々の時点で、決定され得る。
【０４８７】
１つの実施形態において、本発明は、因子（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、低分子、または本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される他の薬物候補物）を用いる、被験体の処置の効力をモニタリングするための方法を提供し、これは、以下の工程を包含する：（ｉ）因子の投与の前に、被験体から投与前サンプルを得る工程；（ｉｉ）この投与前サンプルにおける、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出する工程；（ｉｉｉ）この被験体から１つ以上の投与後サンプルを得る工程；（ｉｖ）この投与後サンプルにおいて、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出する工程；（ｖ）この投与前サンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを、この投与後サンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルと比較する工程；ならびに（ｖｉ）従って、この被験体に対する因子の投与を変更する工程。例えば、この因子の増加した投与は、検出されるよりも高いレベルにＮＯＶＸの発現または活性を増加すること（すなわち、この因子の効力を増加すること）が望ましくあり得る。あるいは、この因子の減少した投与は、検出されるよりも低いレベルにＮＯＶＸの発現または活性を減少すること（すなわち、この因子の効力を減少すること）が望ましくあり得る。
【０４８８】
（処置方法）
本発明は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連する障害の危険性のある（または感受性）か、またはこの障害を有する被験体を処置する予防的および治療的の両方の方法を提供する。この障害としては、心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、先天性心欠損症、大動脈狭窄症、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損症、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満症、移植、副腎脳白質ジストロフィー、先天性副腎過形成、前立腺癌、新形成；腺癌、リンパ腫、子宮癌、受胎能、血友病、凝固能亢進、特発性血小板減少性紫斑病、免疫不全症、対宿主性移植片病、ＡＩＤＳ、気管支炎ぜん息、クーロン病；多発性硬化症、オールブライト遺伝性骨形成異常症の処置、ならびに他の疾患、障害および状態などが挙げられる。
【０４８９】
これらの処置方法は、以下により詳細に記載される。
【０４９０】
（疾患および障害）
（その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）増加したレベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を拮抗する（すなわち、低減または阻害する）治療剤を用いて処置され得る。活性を拮抗する治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）上記ペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；（ｉｉ）上記ペプチドに対する抗体；（ｉｉｉ）上記ペプチドをコードする核酸；（ｉｖ）相同組換えによって上記ペプチドの内因性機能を「ノックアウトする」ために利用される、アンチセンス核酸および「機能不全性」である（すなわち、上記ペプチドに対するコード配列のコード配列内の異種挿入に起因する）核酸の投与、（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８〜１２９２を参照のこと）；または（ｖ）上記ペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を変化させる、調節因子（すなわち、インヒビター、アゴニストおよびアンタゴニスト（本発明のさらなるペプチド模倣物または本発明のペプチドに対して特異的な抗体を含む））。
【０４９１】
（その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）減少したレベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を増加させる（すなわち、活性に対するアゴニストである）治療剤を用いて処置され得る。活性をアップレギュレートする治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：上記ペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；あるいはバイオアベイラビリティーを増加させるアゴニスト。
【０４９２】
増加したレベルまたは減少したレベルは、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することによって、容易に検出され得る。この定量は、患者の組織サンプルを（例えば、生検組織から）入手し、そしてそのサンプルを、その発現したペプチド（または上記ペプチドのｍＲＮＡ）のＲＮＡレベルまたはペプチドレベル、構造および／または活性をインビトロでアッセイすることによる。当該分野において周知の方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：イムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット分析、免疫沈降、次いで、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学などによる）および／またはｍＲＮＡの発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼーションなど）。
【０４９３】
（予防的方法）
１つの局面において、本発明は、被験体において異常なＮＯＶＸの発現または活性と関連する疾患または状態を、ＮＯＶＸの発現または少なくとも１つのＮＯＶＸ活性を調節する因子をこの被験体に投与することによって予防するための方法を提供する。異常なＮＯＶＸの発現または活性によって引き起こされるかまたはこれらに起因する、疾患にかかる危険性がある被験体は、例えば、本明細書中に記載の診断アッセイまたは予後アッセイのいずれか、またはそれらの組み合わせによって、同定され得る。予防因子の投与は、疾患または障害が予防されるか、あるいはその進行を遅らせられるように、このＮＯＶＸ異常の特徴である症状の発現の前に行い得る。このＮＯＶＸ異常の型に依存して、例えば、ＮＯＶＸアゴニスト因子またはＮＯＶＸアンタゴニスト因子が、その被験体を処置するために使用され得る。その適切な因子は、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイに基づいて決定され得る。本発明の予防方法は、以下の小節において、さらに議論される。
【０４９４】
（治療方法）
本発明の別の局面は、治療目的のためにＮＯＶＸの発現または活性を調節する方法に関する。本発明の調節方法は、細胞を、その細胞に関するＮＯＶＸタンパク質活性の活性のうちの１つ以上を調節する因子と接触させる工程を包含する。ＮＯＶＸタンパク質活性を調節する因子は、核酸またはタンパク質、ＮＯＶＸタンパク質の天然に存在する同族リガンド、ペプチド、ＮＯＶＸペプチド模倣物、または他の低分子のような、本明細書中に記載されるような因子であり得る。１つの実施形態において、この因子は、ＮＯＶＸタンパク質活性のうちの１つ以上を刺激する。このような刺激因子の例としては、活性なＮＯＶＸタンパク質、およびその細胞に導入されたＮＯＶＸをコードする核酸分子が挙げられる。別の実施形態において、この因子は、ＮＯＶＸタンパク質活性のうちの１つ以上を阻害する。このような阻害因子の例としては、アンチセンスＮＯＶＸ核酸分子、および抗ＮＯＶＸ抗体が挙げられる。これらの調節方法は、インビトロで（例えば、その因子とともにその細胞を培養することによって）、あるいはインビボで（例えば、被験体にその因子を投与することによって）実施され得る。このように、本発明は、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸分子の、異常な発現または異常な活性によって特徴付けられる、疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ＮＯＶＸの発現または活性を調節する（例えば、アップレギュレートまたはダウンレギュレートする）因子（例えば、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイによって同定される因子）あるいはそのような因子の組み合わせを投与する工程を包含する。別の実施形態において、この方法は、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸分子を、低下したかまたは異常な、ＮＯＶＸの発現または活性を補完するための治療として、投与する工程を包含する。
【０４９５】
ＮＯＶＸ活性の刺激は、ＮＯＶＸが異常にダウンレギュレートされている状況、および／またはＮＯＶＸ活性の増加が有益な効果を有するようである状況において、望ましい。このような状況の１つの例は、被験体が、異常な細胞増殖および／または細胞分化によって特徴付けられる障害（例えば、癌または免疫関連障害）を有する場合である。このような状況の別の例は、被験体が妊娠性疾患（例えば、子癇前症（ｐｒｅｃｌａｍｐｓｉａ））を有する場合である。
【０４９６】
（治療剤の生物学的効果の決定）
本発明の種々の実施形態において、適切なインビトロまたはインビボアッセイを行って、特定の治療剤の効果およびその投与が罹患組織の処置を示すか否かを決定する。
【０４９７】
種々の特定の実施形態において、インビトロアッセイが患者の障害に関与する代表的な細胞型で行われ、所定の治療剤がこの細胞型に対して所望の効果を発揮するか否かを決定し得る。治療において使用する化合物は、ヒト被験体において試験する前に、適切な動物モデル系において試験され得る。これらの動物モデル系としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなど。同様に、インビボ試験については、当該分野で公知の任意の動物モデル系が、ヒト被験体に対する投与の前に使用され得る。
【０４９８】
（本発明の組成物の予防的用途および治療的用途）
本発明のＮＯＶＸ核酸およびタンパク質は、以下を含むが、これらに限定されない種々の障害に関連する潜在的予防的適用および治療的適用に有用である：代謝障害、糖尿病、肥満症、感染症、食欲不振、癌関連癌、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、造血障害、および種々の異常脂肪性浮腫（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａｓ）、肥満に関連する代謝障害、Ｘ代謝症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｘ）、ならびに慢性疾患および種々の癌と関連する消耗疾患。
【０４９９】
例えば、本発明のＮＯＶＸタンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に有用であり、そしてこのタンパク質は、遺伝子治療を必要とする被験体に投与される場合、有用であり得る。非制限的例示として、本発明の組成物は、以下に罹患した患者の処置についての効力を有する：代謝障害、糖尿病、肥満症、感染性疾患、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、造血障害、および種々の異脂肪血症。
【０５００】
本発明のＮＯＶＸタンパク質をコードする新規の核酸、およびＮＯＶＸタンパク質の両方、またはそれらのフラグメントは、診断適用にも有用であり得、ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価される。さらなる用途は、抗菌分子としての用途である（すなわち、いくつかのペプチドは、抗菌特性を有することが見出されている）。これらの材料は、治療的または診断的な方法における用途に関する本発明の新規の物質に免疫特異的に結合する抗体の産生においてさらに有用である。
【０５０１】
本発明を以下の実施例においてさらに詳細に記載する、この実施例は、特許請求の範囲に記載した本発明の範囲を限定しない。
【０５０２】
（実施例）
（実施例１．ＮＯＶＸクローンの同定）
本発明で同定した新規のＮＯＶＸ標的配列を、配列を確認するためにエキソン連結プロセスに供した。ＰＣＲプライマーを、順方向プライマーについては入手可能な最も上流の配列で、そして逆方向プライマーについては入手可能な最も下流の配列で開始するように設計した。表１７Ａは、種々のクローンを得るために使用したＰＣＲプライマーの配列を示す。それぞれの場合について、適切な配列（すなわち、特有であるかまたは高度に選択的であるかのいずれか）に遭遇するまで、または逆方向プライマーの場合には終止コドンに達するまで、コード配列に向ってそれぞれの末端から内側に歩行することによって、配列を試験した。このようなプライマーを、標的配列の全長のｃＤＮＡ，ＤＮＡの一部（１つ以上のエキソン）、もしくはタンパク質配列についてのインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）予測に基づいて、または他の種からの密接に関連するヒト配列に対して推定したエキソンの翻訳された相同性によって、設計した。次いで、これらのプライマーを、以下のヒトｃＤＮＡのプールに基づいてＰＣＲ増幅において使用した：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児の脳、胎児の腎臓、胎児の肝臓、胎児の肺、心臓、腎臓、リンパ腫−Ｒａｊｉ、乳腺、膵臓、脳下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮。通常は、得られたアンプリコンをゲル精製し、クローン化し、そして高い重複性について配列決定した。エキソンの連結によって導いたＰＣＲ産物を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによるｐＣＲ２．１ベクター中にクローン化した。得られた細菌クローンは、ｐＣＲ２．１ベクター中にクローン化した完全なオープンリーディングフレームを包含している挿入物を有する。表１７Ｂは、これらの細菌クローンのリストを示す。全てのクローンから得られた配列を、それ自体とともに、ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのデータベース中の他のフラグメントとともに、そして公のＥＳＴとともにまとめた。集合の別の成分とのそれらの同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％である場合には、集合の構成要素としてフラグメントおよびＥＳＴを含んだ。さらに、少数の配列を手作業によって評価し、そして適切である場合には修正を施した。これらの手順によって本明細書中に報告する配列を提供する。
【０５０３】
【表１０Ａ】
2004516820.tif 000110
物理的なクローン：エキソンを相同性によって推定し、そしてイントロン／エキソンの境界を標準的な遺伝子規則を使用して決定した。エキソンを複数のＢＬＡＳＴ（例えば、ｔＢｌａｓｔＮ、ＢｌａｓｔＸ、およびＢｌａｓｔＮ）検索、およびいくつかの場合には、ＧｅｎｅＳｃａｎおよびＧｒａｉｌを使用する類似性の決定手段によって、さらに選択し、そして精緻化した。利用可能な場合、公のデータベースおよび独自データベースの両方からの発現配列をもまた加え、こらの遺伝子配列をさらに定義しそして完全なものとした。
【０５０４】
【表１０Ｂ】
2004516820.tif 000111
（実施例２．種々の細胞および組織中でのクローンの定量的発現分析）
種々のクローンの定量的な発現を、種々の正常細胞および病理から導いた細胞、細胞株、および組織由来のＲＮＡサンプルを含有しているマイクロタイタープレートを使用し、実時間定量ＰＣＲ（ＲＴＱ  ＰＣＲ）を使用して評価した。ＲＴＱ  ＰＣＲを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍによって実施した。サンプルの種々のコレクションをプレート上に組立て、そしてパネル１（正常な供給源および癌の供給源に由来する細胞および細胞株を含む）、パネル２（特に、正常な供給源および癌の供給源由来の外科手術のサンプルに由来する、組織由来のサンプルを含む）、パネル３（広範囲の種々の癌の供給源に由来するサンプルを含む）、パネル４（正常細胞および炎症状態に関係している細胞由来の細胞および細胞株を含む）、およびパネルＣＮＳＤ．０１（正常な脳および疾患の脳由来のサンプルを含む）と呼んだ。
【０５０５】
最初に、ＲＮＡサンプルを、構成的に発現される遺伝子（例えば、β−アクチンおよびＧＡＰＤＨ）のような参照核酸について標準化した。標準化したＲＮＡ（５μｌ）をｃＤＮＡに転換させ、そしてＯｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３０９１６９）および遺伝子特異的プライマーを使用し、製造業者の説明書に従って、ＲＴＱ−ＰＣＲによって分析した。プローブおよびプライマーを、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍのＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｐｐｌｅ  ＣｏｍｐｕｔｅｒのＭａｃｈｉｎｔｏｓｈ  Ｐｏｗｅｒ  ＰＣ用バージョンＩ）または入力として標的配列を使用する同様のアルゴリズムに従って、それぞれのアッセイについて設計した。デフォルト設定を反応条件について使用し、そして以下のパラメーターを、プライマーの選択の前に設定した：プライマー濃度＝２５０ｎＭ、プライマーの融点（Ｔｍ）範囲＝５８〜６０℃、プライマーの最適Ｔｍ＝５９℃、最大のプライマー差分＝２℃、プローブは５’にＧを有さない、プローブのＴｍはプライマーのＴｍよりも１０℃高くなければならない、アンプリコンの大きさは７５ｂｐから１００ｂｐである。選択したプローブおよびプライマー（下記を参照のこと）を、Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）によって合成した。プローブを、カップリングしていない色素を除去するためにＨＰＬＣによって二重精製し、そしてプローブの５’および３’末端へのレポーターおよび失活剤色素のカップリングをそれぞれ確認するために質量スペクトル分析によって評価した。それらの最終濃度は：順方向および逆方向プライマーについてはそれぞれ９００ｎＭ、そしてプローブは２００ｎＭであった。
【０５０６】
ＰＣＲ条件：各組織および各細胞株由来の標準化したＲＮＡを、９６ウェルＰＣＲプレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の各ウェルにスポットした。２つのプローブ（標的クローンに特異的なプローブ、および標的プローブと多重合する（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ）別の遺伝子特異的プローブ）を含有しているＰＣＲ混合物を、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７７００のための１×ＴａｑＭａｎＴＭＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用して、５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｃＮＴＰ（ｄＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕを１：１：１：２の比で）、０．２５Ｕ／ｍｌのＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、および０．４Ｕ／μｌのＲＮａｓｅインヒビター、ならびに０．２５Ｕ／μｌの逆転写酵素とともに準備した。逆転写を、４８℃で３０分間行い、続いて以下のような増幅／ＰＣＲサイクルを行った。：９５℃で１０分間、次いで４０サイクルの、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間。結果をＣＴ値（所定のサンプルが蛍光の限界値と交差するサイクル）として対数目盛を使用して、所定のサンプルとΔＣＴの仕事率に対して２と示される最も低いＣＴ値を有するサンプルとの間でのＲＮＡ濃度の差分とともに記録した。次いで、相対的な発現の割合を、このＲＮＡ差分の逆数をとり、そして１００を掛け算することによって得た。
【０５０７】
パネル１の結果においては、以下の略号を使用した：
ｃａ．＝癌腫
＊＝転移によって確立された
ｍｅｔ＝転移
ｓ  ｃｅｌｌ  ｖａｒ＝小細胞変異株
ｎｏｎ−ｓ＝ｎｏｎ−ｓｍ＝小さくない
ｓｑｕａｍ＝扁平上皮細胞
ｐｌ．ｅｆｆ＝ｐｌ  ｅｆｆｕｓｉｏｎ＝胸水
ｇｌｉｏ＝神経膠腫
ａｓｔｒｏ＝神経膠星状細胞腫、および
ｎｅｕｒｏ＝神経芽細胞腫。
【０５０８】
（パネル２）
パネル２のプレートは、一般的には、２つのコントロールのウェルと９４個の試験サンプルを含む。これは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）またはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＮＤＲＩ）との緊密な共同研究において、外科医の仕事によって入手したヒト組織から単離したＲＮＡまたはｃＤＮＡを含む。組織は、ヒトの悪性腫瘍に由来し、そして示した多くの悪性腫瘍組織が「揃った境界（ｍａｔｃｈｅｄ  ｍａｒｇｉｎ）」を有する場合には、腫瘍にすぐ隣接している非癌性組織から得た。これらを、正常な隣接組織と呼び、そして以下の結果には「ＮＡＴ」と記載する。腫瘍組織および「揃った境界」を、２つの別々の病理学者によって評価する（外科の病理学者、およびＮＤＲＩまたはＣＨＴＮの病理学者によって再び）。この分析は、腫瘍の分化の段階の全体的な組織病理学的評価を提供する。さらに、ほとんどのサンプルは、もともとの外科の病理報告を含む。これは、患者の臨床段階に関する情報を提供する。これらの揃った境界を、外科手術領域の周辺（すなわち、すぐ隣接している）組織（表ＲＲにおいては正常な隣接組織を「ＮＡＴ」と明示する）から採取する。さらに、ＲＮＡおよびｃＤＮＡサンプルを、高齢者または突然死の被害者（事故など）について行った検死による種々のヒト組織から得た。これらの組織が疾患を有さないことを確認し、そしてこれを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのような種々の商業的な供給源から購入した。
【０５０９】
全てのサンプルに由来するＲＮＡの完全性を、指針として２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡの染色強度（２：１〜２．５：１の２８ｓ：１８ｓ）、および分解産物の指標である低分子量のＲＮＡが存在しないことを使用して、アガロースゲル電気泳動の視覚的な評価によって質を管理した。サンプルを、単一のエキソンの範囲全体を増幅するように設計したプローブおよびプライマーのセットを使用して、逆転写酵素の非存在下でのＲＴＱ  ＰＣＲ反応の実行によるゲノムＤＮＡの混入について、管理した。
【０５１０】
（パネル３Ｄ）
パネル３Ｄのプレートは、９４個のｃＤＮＡサンプルおよび２個のコントロールサンプルを含む。詳細には、これらのうちの９２個は培養されたヒトの癌細胞株に由来し、２個のサンプルはヒトの初代小脳組織であり、そして２つはコントロールである。ヒトの細胞株は、一般的には、ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション）、ＮＣＩ、またはＧｅｒｍａｎ腫瘍細胞バンクから入手し、そして以下の組織グループに分ける：舌の扁平上皮細胞癌、乳癌、前立腺癌、黒色腫、類表皮腫、肉腫、膀胱癌、膵臓癌、腎臓癌、白血病／リンパ腫、卵巣／子宮／子宮頚癌、胃癌、結腸癌、肺癌、およびＣＮＳ癌細胞株。さらに、小脳の２つの異なるサンプルが存在する。これらの細胞の全てを、標準的な推奨される条件下で培養し、そして標準的な手順を使用してＲＮＡを抽出した。パネル３Ｄおよび１．３Ｄの細胞株は、学術文献において使用される最も一般的な細胞株である。
【０５１１】
全てのサンプルに由来するＲＮＡの完全性を、指針として２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡの染色強度（２：１〜２．５：１の２８ｓ：１８ｓ）、および分解産物の指標である低分子量のＲＮＡが存在しないことを使用して、アガロースゲル電気泳動の視覚的な評価によって質を管理した。サンプルを、単一のエキソンの範囲全体を増幅するように設計したプローブおよびプライマーのセットを使用して、逆転写酵素の非存在下でのＲＴＱ  ＰＣＲ反応の実行によるゲノムＤＮＡの混入について、管理した。
【０５１２】
（パネル４）
パネル４は、９６ウェルプレート（２個のコントロールのウェル、９４個の試験サンプル）上にサンプルを含む。これは、炎症状態に関係している種々のヒトの細胞株または組織から単離したＲＮＡ（パネル４ｒ）またはｃＤＮＡ（パネル４ｄ）を含む。結腸および肺（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）ならびに胸腺および腎臓（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のようなコントロールの正常組織に由来する全ＲＮＡを使用した。肝硬変患者の肝臓組織および狼瘡患者の腎臓に由来する全ＲＮＡを、ＢｉｏＣｈａｉｎ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）から入手した。クローン病および潰瘍性大腸炎を有すると診断された患者からのＲＮＡの調製のための腸組織を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ）（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）から入手した。
【０５１３】
星状細胞、肺繊維芽細胞、皮膚繊維芽細胞、冠状動脈平滑筋細胞、小気道上皮細胞、気管支上皮細胞、微小血管皮膚内皮細胞、微小血管肺内皮細胞、ヒトの肺大動脈の血管内皮細胞、ヒトの臍帯静脈の血管内皮細胞を、全て、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入し、そしてＣｌｏｎｅｔｉｃｓによってこれらの細胞型について提供される培地中で増殖させた。これらの初代細胞型を、示すように、種々のサイトカインまたはサイトカインの組合せを用いて６時間および／または１２〜１４時間の間、活性化した。以下のサイトカインを使用した：約１〜５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα、約２０〜５０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγ、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−９、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１３。内皮細胞を、時折、０．１％の血清を有するＣｌｏｎｅｔｉｃｓによる基底培地中での培養によって種々の時間枯渇させた。
【０５１４】
単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌを使用して、ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの従業員の血液から調製した。ＬＡＫ細胞を、ＤＭＥＭ、５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの必須ではないアミノ酸（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、およびインターロイキン２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２）中での４〜６日間の培養によってこれらの細胞から調製した。次いで、細胞を、１０〜２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ、および１〜２μｇ／ｍｌのイオノマイシン、５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２、２０〜５０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγ、および５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１８のいずれかで、６時間活性化した。いくつかの場合には、単核細胞を、約５μｇ／ｍｌのＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）またはＰＷＮ（アメリカヤマゴボウ有糸分裂促進物質）を含有する、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの必須ではないアミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中で、４〜５日間培養した。ＲＮＡの調製のための、サンプルを２４、４８、および７２時間で採取した。ＭＬＲ（混合したリンパ球反応物）サンプルを、２人のドナーからの採血、Ｆｉｃｏｌｌを使用する単核細胞の単離、および単離した単核細胞の、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの必須ではないアミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール（５．５×１０−５Ｍ）（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中の約２×１０６個の細胞／ｍｌの最終濃度での１：１での混合によって得た。このＭＬＲを培養し、そしてＲＮＡの調製のために１〜７日までの範囲の種々の時点でサンプルを採取した。
【０５１５】
単球を、製造業者の説明書に従って、ＣＤ１４  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｅａｄｓ、＋ｖｅＶＳ選択カラムおよびＶａｒｉｏ  Ｍａｇｎｅｔを使用して単核細胞から単離した。単球を、ＤＭＥＭ  ５％のウシの胎児の血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、１００μＭの必須ではないアミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭＣＳＦ、および５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４中での５〜７日間の培養によって樹状細胞に分化させた。マクロファージを、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの必須ではないアミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０％のＡＢヒト血清、または約５０ｎｇ／ｍｌのＭＣＳＦ中で５〜７日間の単球の培養によって調製した。単球、マクロファージ、および樹状細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのリポポリサッカライド（ＬＰＳ）で６時間および１２〜１４時間刺激した。樹状細胞をまた、１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で６時間および１２〜１４時間刺激した。
【０５１６】
ＣＤ４リンパ球、ＣＤ８リンパ球、およびＮＫ細胞をまた、製造業者の説明書に従って、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ５６のＭｉｌｔｅｎｙｉビーズ、ポジティブＶＳ選択カラム、およびＶａｒｉｏ  Ｍａｇｎｅｔを使用して単核細胞から単離した。ＣＤ４５ＲＡリンパ球およびＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ４リンパ球を、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１４、およびＣＤ１９のＭｉｌｔｅｎｙｉビーズおよびポジティブ選択を使用してＣＤ８細胞、ＣＤ５６細胞、ＣＤ１４細胞、およびＣＤ１９細胞の単核細胞を除去することによって単離した。次いで、ＣＤ４５ＲＯビーズを、ＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ４リンパ球である残りの細胞とともに、ＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ４リンパ球を単離するために使用した。ＣＤ４５ＲＡ  ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ４、およびＣＤ８のリンパ球を、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの必須ではないアミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中に入れ、そしてＰＢＳ中の０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および３μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、ＡＴＣＣ）で一晩コーティングしたＦａｌｃｏｎ  ６ウェル組織培養プレート上に１０６細胞／ｍｌでプレートした。６時間および２４時間後、細胞をＲＮＡの調製のために回収した。慢性的に活性化されたＣＤ８リンパ球を調製するために、本発明者らは、抗ＣＤ２８および抗ＣＤ３で一晩コーティングしたプレート上で４日間、単離したＣＤ８リンパ球を活性化し、次いで細胞を回収して、それらをＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの必須ではないアミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、ならびにＩＬ−２中で拡大させた。次いで再び、拡大させたＣＤ８細胞を、プレートに結合させた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で４日間活性化し、そして先のように拡大させた。ＲＮＡを２回目の活性化の６時間および２４時間後、ならびに２回目の培養物の拡大の４日後に単離した。単離したＮＫ細胞を、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの必須ではないアミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、ならびにＩＬ−２中でＲＮＡを調製する前に４〜６日間培養した。
【０５１７】
Ｂ細胞を得るために、扁桃をＮＤＲＩによって獲得した。扁桃を、滅菌した解剖用の鋏で切断し、次いで篩を通過させた。次いで、扁桃体の細胞をスピンダウンさせ、そしてＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの必須ではないアミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中に１０６個の細胞／ｍｌで再懸濁した。細胞を活性化するために、本発明者らは、５μｇ／ｍｌでＰＷＭ、または約１０μｇ／ｍｌで抗ＣＤ４０（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および５〜１０ｎｇ／ｍｌでＩＬ−４を使用した。細胞をＲＮＡの調製のために、２４、４８、および７２時間で回収した。
【０５１８】
初代細胞ならびに２次Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞および２次Ｔｒ１細胞を調製するために、６ウェルのＦａｌｃｏｎプレートを、１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および２μｇ／ｍｌのＯＫＴ３（ＡＴＣＣ）で一晩コーティングし、次いでＰＢＳで２回洗浄した。臍帯血ＣＤ４リンパ球（Ｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｅｒｍａｎ  Ｔｏｗｎ，ＭＤ）を、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの必須ではないアミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、およびＩＬ−２（４ｎｇ／ｍｌ）中で１０５〜１０６個の細胞／ｍｌで培養した。ＩＬ−１２（５ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＬ−４（１  ｇ／ｍｌ）を、Ｔｈ１に指向させるために使用し、一方で、ＩＬ−４（５ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＦＭγ（１  ｇ／ｍｌ）をＴｈ２に指向させるために使用し、そして５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１０をＴｒ１に指向させるために使用した。４〜５日後、活性化させたＴｈ１リンパ球、Ｔｈ２リンパ球、およびＴｒ１リンパ球をＤＭＥＭ中で１回洗浄し、そしてＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの必須ではないアミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、およびＩＬ−２（１ｎｇ／ｍｌ）中で４〜７日間拡大させた。この後、活性化させたＴｈ１リンパ球、Ｔｈ２リンパ球、およびＴｒ１リンパ球を、抗ＣＤ２８／ＯＫＴ３および上記のようなサイトカインを用いて、しかしアポトーシスを防ぐために抗ＣＤ９５Ｌ（１□ｇ／ｍｌ）の添加を用いて５日間再刺激した。４〜５日後、Ｔｈ１リンパ球、Ｔｈ２リンパ球、およびＴｒ１リンパ球を洗浄し、次いで再びＩＬ−２を用いて４〜７日間拡大させた。活性化させたＴｈ１リンパ球およびＴｈ２リンパ球を最大３回のサイクルまで、この方法で維持した。ＲＮＡを、プレートに結合させた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８  ｍＡｂでの２回目および３回目の活性化の６時間および２４時間後、ならびにＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２中での２回目および３回目の拡大培養の４日目に、初代および２次Ｔｈ１、Ｔｈ２、およびＴｒ１から調製した。
【０５１９】
以下の白血球株をＡＴＣＣから入手した：Ｒａｍｏｓ、ＥＯＬ−１、ＫＵ−８１２。ＥＯＬ細胞を、５×１０５個の細胞／ｍｌの０．１ｍＭのｄｂｃＡＭＰ中での８日間の培養、３日毎の培地の交換、および５×１０５個の細胞／ｍｌの細胞濃度への調節によってさらに分化させた。これらの細胞の培養のために、本発明者らは、５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの必須ではないアミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）の添加とともなって、（ＡＴＣＣによって推奨されるように）ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩを使用した。ＲＮＡを、休止細胞または１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび１μｇ／ｍｌのイオノマイシンで６時間および１４時間活性化した細胞のいずれかから調製した。角質細胞株ＣＣＤ１０６および気道上皮腫瘍株ＮＣＩ−Ｈ２９２をまたＡＴＣＣから入手した。両方を、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの必須ではないアミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。ＣＣＤ１１０６細胞を、約５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαおよび１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βで６時間および１４時間活性化し、一方、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を、以下のサイトカインを用いて６時間および１４時間活性化した：５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−９、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１３、および２５ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγ。
【０５２０】
これらの細胞株および血液細胞について、約１０７個の細胞／ｍｌをＴｒｉｓｏｌ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用して溶解させることによってＲＮＡを調製した。簡潔には、１／１０容量のブロモクロロプロパン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をＲＮＡサンプルに添加し、ボルテックスし、そして室温で１０分後、チューブをＳｏｒｖａｌｌ  ＳＳ３４回転装置で１４，０００ｒｐｍで回転させた。水相を採取し、そして１５ｍｌのＦａｌｃｏｎ  Ｔｕｂｅに入れた。等量のイソプロパノールを添加し、そして−２０℃で一晩静置した。沈殿させたＲＮＡをＳｏｒｖａｌｌ  ＳＳ３４回転装置中で９，０００ｒｐｍで１５分間スピンダウンさせ、そして７０％のエタノール中で洗浄した。このペレットを３００μｌのＲＮＡｓｅを含まない水中に再度溶解させ、そして３５μｌの緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）、５μｌのＤＴＴ、７μｌのＲＮＡｓｉｎ、および８μｌのＤＮＡｓｅを添加した。チューブを、混入しているゲノムＤＮＡを除去するために３７℃で３０分間インキュベートし、フェノールクロロホルムで１回抽出し、そして１／１０容量の３Ｍの酢酸ナトリウムおよび２倍容量の１００％エタノールで再度沈殿させた。ＲＮＡをスピンダウンさせ、そしてＲＮＡｓｅを含まない水中に入れた。ＲＮＡを−８０℃で保存した。
【０５２１】
（パネルＣＮＳＤ．０１）
パネルＣＮＳＤ．０１のプレートは、２個のコントロールのウェルおよび９４個の試験サンプルを含む。これは、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒから入手した死後のヒトの脳組織から単離されたｃＤＮＡを含む。脳を、死後４時間から２４時間の間にドナーの頭蓋冠から切り出し、神経解剖学者によって断片化し、そして液体窒素蒸気中で−８０℃で凍結させた。全ての脳を断片化し、そして明確な関連する神経病理学の診断を確認するために神経病理学者によって試験した。
【０５２２】
疾患の診断を患者の記録から入手する。パネルは、以下の診断のそれぞれに由来する２つの脳、および「正常なコントロール」を含む：アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、進行性核上性麻痺、欝状態。これらの脳のそれぞれの中で以下の領域を示す：帯状回、大脳側頭極、淡蒼球（ｇｌｏｂｕｓ  ｐａｌｌａｄｕｓ）、黒質、Ｂｒｏｄｍａｎ  Ａｒｅａ  ４（主要な運動ストリップ（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｏｔｏｒ  ｓｔｒｉｐ））、Ｂｒｏｄｍａｎ  Ａｒｅａ  ７（頭頂皮質）、Ｂｒｏｄｍａｎ  Ａｒｅａ  ９（前前頭皮質）、およびＢｒｏｄｍａｎ  Ａｒｅａ  １７（後頭の皮質）。全てではない脳の領域を全ての症例において示す；例えば、ハンチントン病は、淡蒼球の神経変性によって一部特徴付けられ、従ってこの領域は確立されたハンチントン病の症例からは得ることができない。同様に、パーキンソン病は黒質の退化によって特徴付けられ、この領域を得ることをさらに困難にする。正常なコントロールの脳を神経病理学について試験し、そして神経変性に関係しているあらゆる病理学を含まないことを見出した。
【０５２３】
全てのサンプルに由来するＲＮＡの完全性を、指針として２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡの染色強度（２：１から２．５：１の２８ｓ：１８ｓ）、および分解産物の指標である低分子量のＲＮＡが存在しないことを使用して、アガロースゲル電気泳動の視覚的な評価によって質を管理した。サンプルを、単一のエキソンの範囲全体を増幅するように設計したプローブおよびプライマーのセットを使用して、逆転写酵素の非存在下でのＲＴＱ  ＰＣＲ反応の実行によるゲノムＤＮＡの混入について、管理した。
【０５２４】
ＣＮＳパネル中の組織を同定するために使用した標識には、以下の略号を使用した：
ＰＳＰ＝進行性核上性麻痺
Ｓｕｂ  Ｎｉｇｒａ＝黒質
Ｇｌｏｂ  Ｐａｌｌａｄｕｓ＝淡蒼球
Ｔｅｍｐ  Ｐｏｌｅ＝大脳側頭極
Ｃｉｎｇ  Ｇｙｒ＝帯状回
ＢＡ  ４＝Ｂｒｏｄｍａｎ  Ａｒｅａ  ４。
【０５２５】
ＡＣ０６８３３９＿Ａ遺伝子は、シグナル伝達に関係している細胞表面レセプターの１つの型であるＧタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）をコードする。ＡＣ０６８３３９  Ａ遺伝子産物は、ＧＰＣＲの臭気物質レセプターのサブファミリーのメンバーとほぼ同様である。他の臭気物質レセプター遺伝子に対する相似性に基づいて、本発明者らは、ＡＣ０６８３３９＿Ａ遺伝子の発現が鼻の上皮細胞中で最も高くなり得ると予想した。サンプルはこれらのパネル上にには示されていない。
【０５２６】
（ＮＯＶ１）
遺伝子ＡＣ０１３５５４＿ｄａ１の発現を、表１１に記載するプライマー−プローブのセットＡｇ２０２５を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲの実行による結果を、表１２に示す。
【０５２７】
【表１１】
2004516820.tif 000112
【０５２８】
【表１２】
2004516820.tif 000113
2004516820.tif 000114
パネル１．３Ｄの要約：Ａｇ２０２５。ＮＯＶ１遺伝子の発現は、このパネル上のサンプルの中で精巣中でのみ検出され、そして転写は中程度のレベル（ＣＴ＝２９．６）で存在した。従って、この遺伝子は、このパネル上の他の組織から精巣を区別するために使用することができた。このＮＯＶ１遺伝子は、酸化還元によって媒介される反応による種々の細胞性プロセスに関係している小さな遍在性のタンパク質であるチオレドキシンに対して相同性を有しているタンパク質をコードする。精子中でのみ発現されるチオレドキシンの例は、最近報告されている（参考文献１）。従って、ＮＯＶ１遺伝子産物もまた、精子形成および／または受精において役割を果たし得る。
【０５２９】
パネル２．２の要約：Ａｇ２０２５。ＮＯＶ１遺伝子の発現は、このパネル上のサンプルの全体について低かった／検出不可能であった（ＣＴ値＞３５）（データは示さない）。
【０５３０】
パネル４Ｄの要約：Ａｇ２０２５。ＮＯＶ１遺伝子の発現は、このパネル上のサンプルの全体について低かった／検出不可能であった（ＣＴ値＞３５）（データは示さない）。
【０５３１】
（参考文献：）
１．Ｍｉｒａｎｄａ−Ｖｉｚｕｅｔｅ  Ａ．，Ｌｊｕｎｇ  Ｊ．，Ｄａｍｄｉｍｏｐｏｕｌｏｓ  Ａ．Ｅ．，Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ  Ｊ．Ａ．，Ｏｋｏ  Ｒ．，Ｐｅｌｔｏ−Ｈｕｉｋｋｏ  Ｍ．，Ｓｐｙｒｏｕ  Ｇ．（２００１）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｐｔｒｘ、ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ  ｆａｍｉｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．６月８日（ｅｐｕｂａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ）。
【０５３２】
チオレドキシン（Ｔｒｘ）は、酸化還元によって媒介される反応による種々の細胞性プロセスに関係している小さな遍在性タンパク質である。本発明者らは、本明細書において、最初に精子中でのみ存在する組織特異的分布を用いて、Ｓｐｔｒｘ（精子特異的ｔｒｘ）と命名したヒトのチオレドキシンファミリーの新規のメンバーの同定および特徴付けを報告する。ＳｐｔｒｘのＯＲＦは、２つの明らかなドメインから構成される４８６個のアミノ酸のタンパク質をコードする：１５残基のモチーフの２３回の高度に保存されている繰り返しからなるＮ末端ドメイン、およびチオレドキシンに典型的なＣ末端ドメイン。ノーザン分析およびインサイチュハイブリダイゼーションは、Ｓｐｔｒｘ  ｍＲＮＡがヒトの精巣（特に、丸型および伸張型の精子細胞）中でのみ発現されることを示した。ヒトの精巣の切片の免疫染色によって、精子細胞中のＳｐｔｒｘタンパク質を同定し、一方で、免疫蛍光および免疫金（ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ）電子顕微鏡での分析によって、射出された精子の細胞質の液滴中でのＳｐｔｒｘの局在を示した。Ｓｐｔｒｘは、天然の状態で多量体構造を有するようであり、そしてＮＡＤＰＨおよびチオレドキシンレダクターゼの存在下でインシュリンジスルフィド結合を還元することが可能である。哺乳動物の精巣の輸精管での精子形成およびその後の精巣上体での成熟の間の大量のジスルフィド結合の再形成が、細胞骨格による精子構造を安定化させるために必要である。しかし、これらのプロセスを制御する分子機構は知られていない。精子の尾が構成される精子形成の有糸分裂期後に制限される発現パターンを有するＳｐｔｒｘの同定は、Ｓｐｔｒｘがヒトの精子形成の重要な工程を調節する有力な因子であり得ることを示唆する。
【０５３３】
（ＮＯＶ２ａ）
ＮＯＶ２ａ遺伝子の発現を、表１３に記載するプライマー−プローブのセットＡｇ８５０を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲの実行による結果を、表１４および１５に示す。
【０５３４】
【表１３】
2004516820.tif 000115
【０５３５】
【表１４】
2004516820.tif 000116
2004516820.tif 000117
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【０５３６】
【表１５】
2004516820.tif 000119
2004516820.tif 000120
2004516820.tif 000121
パネル２．２の要約：Ａｇ８５０。ＮＯＶ２ａ遺伝子は、このパネル上のサンプルの中で、腎臓癌に隣接している正常な腎臓組織に由来するサンプル中で最も高く発現された（ＣＴ＝２８．４）。さらに、９個の例のこの遺伝子のうちの７個が、腎臓癌に隣接している正常な腎臓組織中でより高度に発現された。さらに、それらの正常な隣接組織と比較した場合には、肺癌中でのＮＯＶ２ａ遺伝子の発現を上回るようであった。従って、ＮＯＶ２ａ遺伝子の発現は、腎臓癌から正常な腎臓組織を、または正常な肺組織から肺癌組織を区別するために使用することが可能である。さらに、この遺伝子によってコードされるタンパク質の治療による調節が、腎臓癌または肺癌の処置における用途であり得る。
【０５３７】
パネル４．１Ｄの要約：Ａｇ８５０。ＮＯＶ２ａ遺伝子は、このパネル上のサンプルの中で、正常な腎臓繊維芽細胞株、胸腺繊維芽細胞株、皮膚繊維芽細胞株（ＣＣＤ１０７０）および星状細胞中で発現された。この遺伝子の発現は腎臓中で最も高く（ＣＴ＝２８．１）、パネル２．２で観察した発現と一致した。ＮＯＶ２ａ遺伝子は、血液器官関門で発現されそして輸送において機能し得ることが既知のレチノイン酸応答性タンパク質に対して相同性を有するタンパク質をコードする（参考文献１）。従って、Ｓｔｒａ６に対するこの遺伝子の相同性および星状細胞中でのその発現に基づくと、星状細胞は血液脳関門に関係し（参考文献２）、ＮＯＶ２ａ遺伝子産物は、血液脳関門の維持において重要であり得、そしておそらく、この関門を通過する低分子の輸送において重要であり得る。従って、低分子治療を用いるＮＯＶ２ａ遺伝子産物の調節は、緊密な接合部によって通常ブロックされる脳中への特異的な治療用分子の通過を可能にすることができる。さらに、このタンパク質の機能の調節は、自閉症の処置においてもまた重要である。なぜなら、自閉症が感染に伴う病理学と連関し得、そしてこの特定の遺伝子が自閉症に関係している染色体の遺伝子座に見出されることが最近示されているからである（参考文献３）。
【０５３８】
（参考文献：）
１．Ｂｏｕｉｌｌｅｔ  Ｐ．，Ｓａｐｉｎ  Ｖ、Ｃｈａｚａｕｄ  Ｃ．，Ｍｅｓｓａｄｄｅｑ  Ｎ．，Ｄｅｃｉｍｏ  Ｄ．，Ｄｏｌｌｅ  Ｐ．，Ｃｈａｍｂｏｎ  Ｐ．（１９９７）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  Ｓｔｒａ６、ａ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｎｅｗ  ｔｙｐｅ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．６３：１７３−１８６。
【０５３９】
レチノイン酸は、標的遺伝子の発現の調節によって、発達、増殖、および分化において重要な役割を果たす。新規のレチノイン酸誘導性遺伝子であるＳｔｒａ６は、サブトラクティブハイブリダイゼーションｃＤＮＡクローニング技術を使用して、Ｐ１９胚性癌腫細胞中で同定されている。Ｓｔｒａ６は、新規の型の極めて疎水性の膜タンパク質をコードする。これは、以前に特徴付けられている組込み型の膜タンパク質とは類似性を示さない。Ｓｔｒａ６は、発育の間の特異的な発現パターンを示し、そして成体においては、血液−器官関門のレベルで強力に発現される。興味深いことに、精巣のセルトリ細胞中において、Ｓｔｒａ６は、ＲＡＲαヌル変異体（ここでは、Ｓｔｒａ６は全ての管中で発現される）の精巣中での欠失である精子形成周期依存性の発現を有する。本発明者らは、Ｓｔｒａ６タンパク質がまだ同定されていない輸送機構の構成要素であり得ることを示唆する。
【０５４０】
ＰＭＩＤ：９２０３１４０
２．Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  Ｗ．Ｍ．（１９９９）Ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．５：５５６−６９。
【０５４１】
血液−脳関門（ＢＢＢ）は、脊椎動物の脳の中を通る毛細血管の内皮内の上皮様の高抵抗性の緊密な接合部によって形成される。ＢＢＢの存在に起因して、循環している分子は２つのプロセスのうちの１つのみを通じて脳細胞への通路を獲得する：（ｉ）自由な拡散によるＢＢＢを通じる、低分子の脂質によって媒介される輸送、または（ｉｉ）触媒される輸送。後者は、低分子量の栄養素および水溶性ビタミンについてのキャリアによって媒介される輸送プロセス、または循環しているペプチド（例えば、インシュリン）、血漿タンパク質（例えば、トランスフェリン）、もしくはウイルスについてのレセプターによって媒介される輸送を含む。ＢＢＢの透過性自体は、毛細血管の内皮細胞の血漿膜の生化学的特性によって制御されるが、脳全体の微小血管の生物学は、毛細血管の内皮と脳の微小循環を含む他の２つの主要な細胞（すなわち、毛細血管の周細胞（これは、内皮細胞および星状細胞の最下部のプロセスと基膜を共有し、脳の毛細血管の基膜のアルブミン（ａｂｌｕｍｉｎａｌ）の表面の９９％を提供する））との間でのパラ分泌相互作用の機能である。しばしば毛細血管の内皮のものとされる微小血管の機能は、実際には、毛細血管の周細胞または毛細血管の星状細胞の最下部のプロセスのいずれかによって実行される。ＢＢＢ方法論に関して、この重要な膜を通過する生物学的な輸送を研究するための種々のインビボでの方法が存在している。伝統的な生理学的技術は、現在は、新たに単離された動物またはヒトの脳の毛細血管を使用する最新の生化学および分子生物学的アプローチと関係し得る。単離された脳の毛細血管の内皮細胞または、「インビトロのＢＢＢ」モデルを形成するように組織培養物中で増殖させられ得る。しかし、ＢＢＢの研究は、インビトロのＢＢＢモデルだけを使用して行うことはできず、むしろインビボでの研究とインビトロのＢＢＢモデルを用いて行われた観察とを相関させることが必要である。
【０５４２】
ＰＭＩＤ：１０６０２３９７
３．Ｈｏｒｎｉｇ  Ｍ．，Ｗｅｉｓｓｅｎｂｏｃｋ  Ｈ．，Ｈｏｒｓｃｒｏｆｔ．，Ｌｉｐｋｉｎ  Ｗ．Ｉ．（１９９９）Ａｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｄａｍａｇｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１２１０２−１２１０７。
【０５４３】
感染因子および毒素に対する周産期での曝露は、神経精神医学的障害の病理に関連するが、環境的誘因が、発達途中の、免疫エレメントおよび神経エレメントと相互作用して神経発達障害を生じる機構は、ほとんど理解されていない。本発明者らは、神経向性非細胞溶解性ＲＮＡウイルスであるボルナ病ウイルスでの新生児ラットの感染に基づく中枢神経系の発達の障害を研究するためのモデルを記載する。感染は、立ち直り（ｒｉｇｈｔｉｎｇ）反射、活動過剰、明るい場所（ｏｐｅｎ−ｆｉｅｌｄ）での診査の阻害、および常同症的行動（Ｓｔｅｒｅｏｔｙｐｉｃ  ｂｅｈａｖｉｏｒ）の行動を生じる。構造は海馬および小脳で顕著に破壊され、顆粒球およびＰｕｒｋｉｎｊｅ細胞の数の減少を伴う。ニューロンは、アポトーシス後の産物のｍＲＮＡレベルの増大（Ｆａｓ、カスパーゼ−１）、抗アポトーシス性ｂｃｌ−ｘのｍＲＮＡレベルの減少、および断片化されたＤＮＡのインサイチュ標識によって支持されるようにアポトーシスによって主に失われる。炎症による浸潤が、前頭部皮質において一時的に観察されるが、神経膠の活性化（微小神経膠細胞増加＞星状細胞増加）は脳全体で顕著であり、そしてプロ炎症性サイトカインのｍＲＮＡ（インターロイキン１α、１β、および６、ならびに腫瘍壊死因子α）のレベルの増大、ならびに進行性の海馬および小脳の損傷と同調して数週間維持される。これらの機能と神経病理学的な異常のヒトの神経発達性障害に対する類似性は、中枢神経系と環境の影響との相互の関係の、細胞性、生化学的、組織学的、および機能的な結果を明確に定義するためのこのモデルの有用性を示唆する。
【０５４４】
ＰＭＩＤ：１０５１８５８３
ＮＯＶ３ａ
ＮＯＶ３ａ遺伝子の発現を、表１６に記載するプライマー−プローブのセットＡｇ１４２０を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲの実行による結果を、表１７、１８、１９、および２０に示す。
【０５４５】
【表１６】
2004516820.tif 000122
【０５４６】
【表１７】
2004516820.tif 000123
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2004516820.tif 000125
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【０５４７】
【表１８】
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2004516820.tif 000128
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【０５４８】
【表１９】
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2004516820.tif 000132
【０５４９】
【表２０】
2004516820.tif 000133
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2004516820.tif 000135
2004516820.tif 000136
パネル１．２の要約：Ａｇ１４０２。同じプローブ／プライマーを使用する２つの実験による結果は、良好に一致した。ＮＯＶ３ａ遺伝子は、心臓（ＣＴ＝２２〜２３）、前立腺、および卵巣組織中で最も高く発現され、そしてパネル１．２中の多数のサンプルの全体にわたって低い程度で発現される。この遺伝子が、培養された細胞株と比較して正常組織中では大きく発現されるという観察は注目する。従って、ＮＯＶ３ａ遺伝子の発現は、他の組織から心臓、前立腺、および卵巣を区別するために使用することができる。
【０５５０】
他の代謝関連組織の中では、ＮＯＶ３ａ遺伝子は、甲状腺、脳下垂体、および膵臓中で適度に発現され、そして副腎、骨格筋、および胎児／生体の肝臓中で高く発現された。インシュリン応答性組織（例えば、骨格筋およひ肝臓）中でのこの遺伝子の高い発現は、ＮＯＶ３ａ遺伝子産物が、２型糖尿病の処置のための有効な薬物標的であり得ることを示唆する。副腎および心臓中での高い発現もまた、この遺伝子がこれらの２つの組織に関係している疾患の処置のための抗体標的であり得ることを示唆する。
【０５５１】
ＮＯＶ３ａ遺伝子は、推定されるロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）のＧＰＣＲ様タンパク質をコードする。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉａ中では、軸索誘導タンパク質のＬＲＲ領域は、機能に（特に、軸索の斥力において）重要であることが示されている（参考文献１）。ＮＯＶ３ａ遺伝子によってコードされるロイシンを多く含む反復タンパク質は、脳の全体の領域にわたって高い発現を示し、扁桃体、小脳、海馬、視床、大脳皮質、および脊髄で発現が検出され、これによってこれを軸索、樹状突起について、および／または一般的には錐体（ｃｏｎｅ）の成長のための優れた候補のニューロン誘導タンパク質とする。このタンパク質のレベルで、またはこのタンパク質を通じる可能なシグナル伝達の治療的な調節は、代償性のシナプス形成、およびニューロンの死（発作、頭部の外傷）、軸索の損傷（脊髄の損傷）、または神経変性（アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、血管性痴呆、または任意の神経変性疾患）に応答するＣＮＳの繊維増殖の増強／指示に有用であり得る。さらに、ＮＯＶ３遺伝子は、黒質において最も高い発現を示す。ここでは、ドーパミン作動性のニューロンの減失が、パーキンソン病および進行性核上性麻痺の特徴である；従って、この遺伝子に基づく治療は、これらの疾患の処置に特に有用であり得る。この遺伝子はまた、脳腫瘍に由来する細胞株のような細胞株中で過剰発現を示す（Ｃｕｒａ  ４３８）。
【０５５２】
ＮＯＶ３ａタンパク質はまた、レセプターのＧＰＣＲファミリーに対する相同性を含む。いくつかの神経伝達物質レセプターはＧＰＣＲであり、これには、ドーパミンレセプターファミリー、セロトニンレセプターファミリー、ＧＡＢＡＢレセプター、ムスカリンアセチルコリンレセプターなどが含まれる；従って、このＧＰＣＲは、新規の神経伝達物質レセプターを示し得る。種々の神経伝達物質レセプター（ドーパミン、セロトニン）の標的化は、精神分裂病、二極性障害、および欝状態のような精神医学的疾病について有効な治療であることが証明されている。さらに、大脳皮質および海馬は、アルツハイマー病、心因性発作（ｓｅｉｚｕｒｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、および記憶形成の通常のプロセスにおいて重要な役割を果たすことが既知である脳の領域である。この遺伝子またはそのタンパク質産物の治療的な調節は、１つ以上のこれらの疾患において有用であり得、遺伝子によってコードされるレセプターを刺激および／または遮断し得る。しかし、中枢神経系の外側の領域（例えば、心臓、卵巣、および前立腺）でのこの遺伝子のレベルは高く、このことは、細胞間シグナル伝達における広範囲の役割の可能性を示唆している。
【０５５３】
パネル２．２の要約：Ａｇ１４０２。このパネルのサンプルの中では、ＮＯＶ３ａ遺伝子の発現は、卵巣癌に隣接している正常な卵巣組織のサンプル中で最も高かった（ＣＴ＝２８．５）。肺、結腸、および腎臓を含む多数の他の適合する正常組織サンプルについても、この発現パターンは卓越している。さらに、適合していない正常組織のサンプル（例えば、乳房、子宮、卵巣、および前立腺）もまた、ＮＯＶ３ａ遺伝子のかなりの発現を示した。この遺伝子はまた、特定の乳房、肝臓、および胃の腫瘍によっても発現を示した（Ｃｕｒａ４３８）。従って、一般的には、この遺伝子は、上記に列挙した組織型中の対応している悪性腫瘍組織から、隣接している正常組織を区別するために使用され得る。さらに、ＮＯＶ３遺伝子によってコードされるタンパク質の治療的な調節が、上記に列挙した悪性腫瘍の処置において有用であり得る。
【０５５４】
パネル３Ｄの要約：Ａｇ１４０２。ＮＯＶ３ａ遺伝子の発現は、組織細胞性（ｈｙｓｔｉｏｃｙｔｉｃ）リンパ腫細胞株に由来するサンプル中で最も高かった（ＣＴ＝２８．２）。さらに、この遺伝子はまた、いくつかのＣＮＳ癌細胞株、および種々の肉腫由来の細胞株中でも高度に発現された。従って、ＮＯＶ３ａ遺伝子の発現は、肉腫およびＣＮＳ癌に由来する細胞株と他の細胞株とを区別するために使用することができる。さらに、この発現パターンは、この遺伝子産物の治療的な調節が、肉腫またはＣＮＳ癌の処置において治療滴に有用であり得ることを示す。
【０５５５】
パネル４Ｄの要約：Ａｇ１４０２。同じプローブ／プライマーを使用する２つの実験による結果は、良好に一致した。ＮＯＶ３ａ遺伝子は、内皮細胞および繊維芽細胞中で高く発現され、そしてＩＬ−１βおよびＴＮＦαでの処置によってこれらの組織中で選択的にダウンレギュレートされる。従って、ＮＯＶ３ａ遺伝子は、推定されるＬＲＲを含有しているＧＰＣＲをコードし、これは、内皮細胞および繊維芽細胞中でプロ炎症性サイトカインＩＬ−１βおよびＴＮＦαに応答してダウンレギュレートされ得る。１つの仮説は、このＧＰＣＲについての天然のリガンドが、ＴＮＦおよびＩＬ−１での処理によって誘導され得、そして続くこの推定のＧＰＣＲへのリガンドの結合がフィードバック阻害を生じ得ることである。あるいは、ＴＮＦおよびＩＬ−１によって誘導される他のシグナル伝達経路は、ＮＯＶ３ａ遺伝子の転写レベルを減少させ得る。従って、この推定のＧＰＣＲを介するシグナル伝達を妨げる抗体、低分子、またはタンパク質治療が、喘息、肺気腫、乾癬、および関節炎のような疾患の処置において重要であり得る。
【０５５６】
（参考文献：）
１．Ｂａｔｔｙｅ  Ｒ．，Ｓｔｅｖｅｎｓ  Ａ．，Ｐｅｒｒｙ  Ｒ．Ｌ．，Ｊａｃｏｂｓ  Ｊ．Ｒ．（２００１）Ｒｅｐｅｌｌｅｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｌｉｔ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｔｈｅ  ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：４２９０−４２９８。
【０５５７】
Ｓｌｉｔは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの中線神経膠によって産生される忌避物質である軸索の誘導装置である。これは、反対側の隆起の形成および縦方向の管の横向きの位置を調節するために必要である。以下の４個の配列モチーフが、Ｓｌｉｔの構造を含む：トリプシンインヒビター（ＬＲＲ）、上皮成長因子様（ＥＧＦ）反復、ラミニン様球形（Ｇ）ドメイン、およびシステインドメイン。本明細書中で本発明者らは、ＬＲＲが忌避物質のシグナル伝達、およびＲｏｂｏへのインビトロでの結合に必要であることを実証する。ｓｌｉｔによる忌避物質のシグナル伝達は、ＬＲＲドメイン中の単一のアミノ酸変化をコードする点変異によって減少させられる。ＥＧＦまたはＧドメインとは対照的に、ＬＲＲドメインは、軸索の誘導を達成するために導入遺伝子を必要とする。最終的には、本発明者らは、中線忌避物質レセプター（ｍｉｄｌｉｎｅ  ｒｅｐｅｌｌｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）であるＲｏｂｏが、内部欠失を有するＳｌｉｔタンパク質には結合し、ここで、このＳｌｉｔタンパク質もまた忌避物質活性を保持することを示す。しかし、Ｒｏｂｏは、ＬＲＲを欠失しているＳｌｉｔタンパク質には結合しない。まとめると、本発明者らのデータは、ＳｌｉｔによるＲｏｂｏの結合および忌避物質のシグナル伝達がＬＲＲ領域を必要とすることを示す。
【０５５８】
（ＮＯＶ７）
遺伝子ＮＯＶ７の発現を、表２１および２２に記載するプライマー−プローブのセットＡｇ１６３１およびＡｇ２４４８を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲの実行による結果を、表２３および２４に示す。
【０５５９】
【表２１】
2004516820.tif 000137
【０５６０】
【表２２】
2004516820.tif 000138
【０５６１】
【表２３】
2004516820.tif 000139
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【０５６２】
【表２４】
2004516820.tif 000142
2004516820.tif 000143
2004516820.tif 000144
パネル１．３Ｄの要約：Ａｇ１６３１／Ａｇ２４８８。ＮＯＶ７遺伝子の発現は、このパネル上のサンプル全体にわたって低かった／検出不可能であった（データは示さない）（ＣＴ値＞３５）。
【０５６３】
パネル２Ｄの要約：Ａｇ２４４８。ＮＯＶ７遺伝子の発現は、眼球の黒色腫の転移に由来するサンプルにおいて最も高かった（ＣＴ＝３４．３）。このパネル上で観察されたこの遺伝子の他の発現は、信頼できる検出レベルより低かった。眼球の黒色腫は黒色腫の特有の形態であり、従って、この遺伝子の発現は、他の黒色腫、およびまた一般的な他の組織から眼球の黒色腫の転移を区別することができる。さらに、抗体または低分子の薬物の使用によるＮＯＶ７遺伝子産物の治療的な調節が、眼球の黒色腫の処置における用途であり得る。
【０５６４】
パネル２．２の要約：Ａｇ１６３１。ＮＯＶ７遺伝子の発現は、このパネル上のサンプル全体にわたって低かった／検出不可能であった（ＣＴ値＞３５）（データは示さない）。
【０５６５】
パネル４Ｄの要約：Ａｇ１６３１。ＮＯＶ７遺伝子は、アメリカヤマゴボウ有糸分裂促進物質で、またはＣＤ４０ＬおよびＩＬ−４で処理したＢ細胞中で発現された（ＣＴ＝３４）。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、Ｂ細胞の活性化の間にもまたアップレギュレートされるチモシン−β４に対して相同性を有した（参考文献１）。従って、ＮＯＶ７タンパク質は、メタロプロテイナーゼ、走化性、血管形成の誘導、および炎症の阻害、ならびに骨髄幹細胞の増殖の阻害を含む、他のチモシン−β４ホモログの機能と同様の機能を有し得る（参考文献２）。従って、ＮＯＶ７遺伝子によってコードされるタンパク質を用いて設計されたタンパク質治療は、関節炎、喘息、糖尿病、狼瘡、乾癬、およびアレルギーのような炎症性疾患の処置に有用であり得る。Ａｇ２４４８。ＮＯＶ７遺伝子の発現は、このパネル上のサンプル全体にわたって低かった／検出不可能であった（ＣＴ値＞３５）（データは示さない）。
【０５６６】
（参考文献：）
１．Ｇｏｎｄｏ  Ｈ．，Ｋｕｄｏ  Ｊ．，Ｗｈｉｔｅ  Ｊ．Ｗ．，Ｂａｒｒ  Ｃ．，Ｓｅｌｖａｎａｙａｇａｍ  Ｐ．，Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｇ．Ｆ．（１９８７）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｈｙｍｏｓｉｎ−ｂｅｔａ  ４  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，ａｎｄ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３８４０−３８４８。
【０５６７】
ヒトのチモシン−β４をコードするｃＤＮＡクローンを、急性リンパ球性白血病の患者の末梢血白血球から調製したｃＤＮＡライブラリーから単離した。このクローンは、チモシン−β４の４３個のアミノ酸残基のコード配列全体を含み、そして開始コドンおよび２つの終止コドンを有した。コード領域のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、ラットとヒトとの間で十分に保存されていた。１３２個のヌクレオチドのうちの９個が、コード配列中で異なった（９３％の相同性）が、推定アミノ酸配列は同一であった。シグナルペプチドは推定アミノ酸配列中には見られなかった。ヒトのチモシン−β４  ｍＲＮＡ（約８３０ヌクレオチドの長さ）は、ラットのチモシン−β４  ｍＲＮＡよりも約３０ヌクレオチド長かった。種々の初代骨髄様悪性腫瘍細胞およびリンパ腫悪性腫瘍細胞中、ならびに少数のヒト造血性細胞株でのヒトのチモシン−β４遺伝子の発現を研究した。種々の新生物性Ｂリンパ球のノーザンブロット分析は、分化の段階の関数として変化したチモシン−β４  ｍＲＮＡの定常状態のレベルを明らかにした。チモシン−β４  ｍＲＮＡのレベルは、クラスＩＩヒトリンパ球抗原、Ｆｃレセプター、および補体レセプターと同様に骨髄腫細胞中で減少し、このことは、チモシン−β４と免疫応答との間での関係を示唆している。チモシン−β４  ｍＲＮＡは、未熟な芽細胞中よりも成熟した顆粒球中でより高く発現された。ＴＨＰ−１細胞、ヒトの単球細胞株の、組換えのヒトインターフェロンλでの処理は、チモシン−β４  ｍＲＮＡのレベルを減少させた。そのレベルはＴＨＰ−１細胞のＩａ＋マクロファージへの分化後に減少したが、ＨＬ−６０細胞のＩａ−マクロファージへの分化の後には増大した。チモシン−β４遺伝子の発現パターンは、これが宿主の防御機構において基本的な役割を果たし得ることを示唆する。
【０５６８】
ＰＭＩＤ：３５００２３０
２．Ｈｕｆｆ  Ｔ．，Ｍｕｌｌｅｒ  Ｃ．Ｓ．，Ｏｔｔｏ  Ａ．Ｍ．，Ｎｅｔｚｋｅｒ  Ｒ．，Ｈａｎｎａｐｐｅｌ  Ｅ．（２００１）β−Ｔｈｙｍｏｓｉｎｓ，ｓｍａｌｌ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｉｎｔ．  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３３：２０５−２２０。
【０５６９】
β−チモシンは、胸腺ホルモンであると最初に考えられた、極めて保存された極性の５ｋＤａのペプチドのファミリーである。約１０年前、チモシンβ（４）ならびにこの遍在性ペプチドファミリーの他のメンバーが、主要な細胞内Ｇ−アクチン隔離（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｉｎｇ）ペプチドとして同定され、ほぼ全ての細胞中に高濃度で存在する。β−チモシンは、単量体のアクチンに１：１の複合体で結合し、そしてアクチン緩衝液として作用し、アクチン繊維への重合を妨げるが、細胞が繊維を必要とする時には、アクチン単量体のプールを供給する。β−チモシンの発現の変化は、細胞の分化に関係しているようである。β−チモシンの発現の増大、なおまたは通常は発現されないβ−チモシンの合成は、細胞の運動性を増大させることによって転移の可能性を促進し得る。チモシンβ（４）は、血漿または創傷液中で細胞の外側で検出される。いくつかの生物学的作用が、チモシンβ（４）、酸化型チモシンβ（４）、またはチモシンβ（４）からおそらく作成されたフラグメントであるａｃＳＤＫＰのものであると考えられている。特に、作用は、メタロプロテイナーゼ、化学走査性、血管形成の誘導、および炎症の阻害、ならびに骨髄幹細胞の増殖の阻害である。しかし、細胞外β−チモシンのものと考えられる作用を媒介する分子機構については知られていない。
【０５７０】
ＰＭＩＤ：１１３１１８５２。
【０５７１】
（ＮＯＶ８）
遺伝子ＮＯＶ８の発現を、表２５に記載するプライマー−プローブのセットＡｇ２４４７を使用して評価した。
【０５７２】
【表２５】
2004516820.tif 000145
この遺伝子の発現は、パネル１．３Ｄ、２Ｄ、および４Ｄ上のサンプル全体にわたって低かった／検出不可能であった（ＣＴ値＞３５）（データは示さない）。
【０５７３】
（実施例３．ＮＯＶＸクローンのＳＮＰ分析）
ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇＴＭ技術：ｃＤＮＡを、種々のドナーに由来する複数の組織型、正常、および疾患状態、生理学的状態、および発達段階を示す種々のヒトサンプルから導いた。サンプルを、組織全体、細胞株、初代細胞、または組織培養した初代細胞および細胞株として得た。細胞および細胞株を、遺伝子発現を調節する生物学的または化学的な試薬（例えば、成長因子、ケモカイン、ステロイド）で処理した。次いで、このように誘導したｃＤＮＡを、ＣｕｒａＧｅｎに所有権のあるＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ技術を使用して配列決定した。配列トレースを手作業によって評価し、そして適切である場合には修正を施した。全てのサンプルに由来するｃＤＮＡ配列を、それ自体および公のＥＳＴを用いて、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリのＣｕｒａＧｅｎのヒトＳｅｑＣａｌｌｉｎｇデータベースを作成するためのバイオインフォーマティックプログラムを使用してまとめた。それぞれの集合には、１つ以上のヒトのサンプルに由来する１つ以上の重複しているｃＤＮＡ配列を含んだ。集合の別の成分との同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％である場合には、集合の構成要素としてフラグメントおよびＥＳＴを含んだ。それぞれの集合は、遺伝子、ならびに／あるいはスプライシング形態および／または一塩基多型（ＳＮＰ）、およびそれらの組合せのような変異体を示し得る。
【０５７４】
変異体配列が、本出願に含まれる。変異体配列は、一塩基多型（ＳＮＰ）を含み得る。変異体配列は、一塩基多型（ＳＮＰ）を含み得る。ＳＮＰは、一部の例においては、ＳＮＰを含有しているヌクレオチド配列がｃＤＮＡに起源することを示す、「ｃＳＮＰ」と呼ばれる。ＳＮＰは、いくつかの方法で生じ得る。例えば、ＳＮＰは、多形現象の部位で別のヌクレオチドへの１つのヌクレオチドの置換に起因し得る。このような置換は、トランジションまたはトランスバージョンのいずれかであり得る。ＳＮＰはまた、参照対立遺伝子と比較して、ヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの挿入によっても生じ得る。この場合には、多型の部位は、１つの対立遺伝子が、別の対立遺伝子中の特定のヌクレオチドに関してギャップを保有している部位である。遺伝子中に存在しているＳＮＰは、ＳＮＰの位置で遺伝子によってコードされるアミノ酸の変化を生じ得る。しかし、ＳＮＰを含むコドンが遺伝子コードの縮重の結果として同じアミノ酸をコードする場合には、遺伝子内ＳＮＰはまた、サイレントでもあり得る。遺伝子の領域の外側に存在している、または遺伝子内のイントロンに存在しているＳＮＰは、タンパク質のアミノ酸配列には全く変化を生じないが、発現パターンの調節の変更（例えば、一過性発現、生理学的応答の調節、細胞型による発現調節、発現の強度、転写されたメッセージの安定性における変更）を生じ得る。
【０５７５】
新規のＳＮＰの同定方法：ＳＮＰは、ＣｕｒａＧｅｎに所有権があるＳＮＰＴｏｏｌアルゴリズムを使用して配列の集合を分析することによって同定される。ＳＮＰＴｏｏｌは、以下の基準で集合の中の変化を同定する：ＳＮＰは、アラインメントの両方の末端上の１０塩基対は分析しない；ウィンドウの大きさ（視野（ビュー）（ｖｉｅｗ）の中の塩基数）は１０である；ウィンドウ内の許容される不適合の数は２である；最少のＳＮＰ塩基量（ＰＨＲＥＤスコア）は２３である；ＳＮＰをスコアするための変化の最少の数は２／アセンブリの位置である。ＳＮＰＴｏｏｌは、集合を分析し、そしてＳＮＰの位置、集合中の関連する個々の変異体配列の部位、その所定の位置での集合の深さ、推定される集合の対立遺伝子の頻度、およびＳＮＰ配列のバリエーションを示す。次いで、配列トレースが選択され、そして手作業による確認のためにビュー内に入れられる。一致する集合配列は、ＳＮＰの配列のバリエーションによって生じる可能性のあるアミノ酸変化を同定するために、変異体配列の変化の変化とともにＣｕｒａＴｏｏｌにインポートされる。次いで、広範囲のＳＮＰデータ分析が、ＳＮＰＣａｌｌｉｎｇデータベースに送られる。
【０５７６】
新規のＳＮＰの確認方法：ＳＮＰを、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）として公知の有効であると認められた方法を使用して確認した。Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇのための詳細なプロトコルは、Ａｌｄｅｒｂｏｒｎら、Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｂｙ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（２０００）．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１０、８月８日発光、１２４９−１２６５に見出される。簡潔には、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇは、遺伝子型分類の実時間プライマーエクステンションプロセスである。このプロトコルは、ゲノムＤＮＡサンプルに由来する二本鎖のビオチニル化ＰＣＲ産物を使用し、そしてそれらをストレプトアビジンビーズに結合させる。次いで、これらのビーズは、一本鎖のＤＮＡを生じるように変性させられる。ＳＮＰは、ＤＮＡ鎖の伸張の際にそれぞれのｄＮＴＰから放出されるピロリン酸（ＰＰｉ）の間接的な生体照度アッセイ（ｂｉｏｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）に基づく技術を利用して特徴付けられる。Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼによって媒介される塩基の取り込み後、ＰＰｉは放出され、そしてＡＴＰスルフリラーゼ（これは、ＡＴＰの形成を生じる）についての基質として、アデノシン５’−ホスホスルフェート（ＡＰＳ）とともに使用される。続いて、ＡＴＰは、ルシフェラーゼの作用によって、そのオキシ誘導体へのルシフェリンの転換を達成する。続いて生じる確かめられた発光は、約４個の塩基までは付加された塩基の数に比例する。この方法のプロセッシビティーを可能にするために、過剰のｄＮＴＰはアピラーゼによって分解させられる。アピラーゼもまた、最初の反応混合物中に存在し、その結果、配列決定の間にのみｄＮＴＰが鋳型に付加される。このプロセスは、完全に自動化されており、そして９６ウェル形式に適応させられている。これによって、大きなＳＮＰパネルの迅速なスクリーニングが可能である。新規の一塩基多型による変異体のＤＮＡおよびタンパク質配列を、報告する。変異体を個別に報告するが、全ての任意の組合せまたは変異体の選択したサブセットもまた含む。さらに、変異体の塩基の位置および変異体のアミノ酸残基には、下線を付ける。
【０５７７】
（結果）
改変体を個別に報告するが、全てのあらゆる組合せまたは変異体の選択したサブセットもまた、本発明の企図されるＮＯＶＸ実施形態として含む。
【０５７８】
（ＮＯＶ１のＳＮＰデータ：）
ＮＯＶ１は、７個のＳＮＰ変異体を有する。そのヌクレオチドおよびアミノ酸配列についてのそれらの変異位置に、それぞれ、配列番号１および２に従って番号を付ける。ＮＯＶ１変異体のヌクレオチド配列は、表２６に示すように異なる。
【０５７９】
【表２６】
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（ＮＯＶ４のＳＮＰデータ：）
以下の局面においては、ヌクレオチド配列の１つ以上の一致する位置（Ｃｏｎｓ．Ｐｏｓ．）を、ＳＮＰとして同定する。「Ｄｅｐｔｈ」は、ＳＮＰの領域を含むクローンの数を示す。推定される対立遺伝子の頻度（Ｐｕｔａｔｉｖｅ  Ａｌｌｅｌｅ  Ｆｒｅｑ．）は、ＳＮＰを含有している全てのクローンの部分（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）である。ダッシュ（「−」）は、示される場合には、塩基が存在しないことを意味する。記号「＞」は「それに変化させられている」ことを意味する。
【０５８０】
【数５】
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（ＮＯＶ５ａのＳＮＰデータ：）
ＮＯＶ５ａは４個のＳＮＰ変異体を有する。そのヌクレオチドおよびアミノ酸配列についてのそれらの変異位置に、それぞれ、配列番号ＸおよびＹに従って番号を付ける。ＮＯＶ５ａ変異体のヌクレオチド配列は、表２７に示すように異なる。
【０５８１】
【表２７】
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（ＮＯＶ５ｂのＳＮＰデータ：）
ＮＯＶ５ｂは３個のＳＮＰ変異体を有する。そのヌクレオチドおよびアミノ酸配列についてのそれらの変異位置に、それぞれ、配列番号ＸおよびＹに従って番号を付ける。ＮＯＶ５ｂ変異体のヌクレオチド配列は、表２８に示すように異なる。
【０５８２】
【表２８】
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（ＮＯＶ５ｇのＳＮＰデータ：）
以下の位置においては、ヌクレオチド配列の１つ以上の一致する位置（Ｃｏｎ．Ｐｏｓ．）を、ＳＮＰとして同定する。「Ｄｅｐｔｈ」は、ＳＮＰの領域を含むクローンの数を示す。推定される対立遺伝子の頻度（Ｐｕｔａｔｉｖｅ  Ａｌｌｅｌｅ  Ｆｒｅｑ．）は、ＳＮＰを含有している全てのクローンの部分である。ダッシュ（「−」）は、示される場合には、塩基が存在しないことを意味する。記号「＞」は「それに変化させられている」ことを意味する。
【０５８３】
Ｃｏｎｓ．Ｐｏｓ．：８１４  Ｄｅｐｔｈ：１３  変化：Ｃ＞Ａ  Ｐｕｔａｔｉｖｅ  Ａｌｌｅｌｅ  Ｆｒｅｑ．：０．２３１。
【０５８４】
（ＮＯＶ５ｈのＳＮＰデータ）
以下の局面においては、ヌクレオチド配列の１つ以上の一致する位置（Ｃｏｎ．Ｐｏｓ．）を、ＳＮＰとして同定する。「Ｄｅｐｔｈ」は、ＳＮＰの領域を含むクローンの数を示す。推定される対立遺伝子の頻度（Ｐｕｔａｔｉｖｅ  Ａｌｌｅｌｅ  Ｆｒｅｑ．）は、ＳＮＰを含有している全てのクローンの部分である。ダッシュ（「−」）は、示される場合には、塩基が存在しないことを意味する。記号「＞」は「それに変化させられている」ことを意味する。
【０５８５】
Ｃｏｎｓ．Ｐｏｓ．：８２０  Ｄｅｐｔｈ：８  変化：Ｇ＞−  Ｐｕｔａｔｉｖｅ  Ａｌｌｅｌｅ  Ｆｒｅｑ．：０．２５０。
【０５８６】
（ＮＯＶ８のＳＮＰデータ：）
ＮＯＶ８は１個のＳＮＰ変異体を有する。そのヌクレオチドおよびアミノ酸配列についてのそれらの変異位置に、それぞれ、配列番号ＸおよびＹに従って番号を付ける。ＮＯＶ８変異体のヌクレオチド配列は、表２９に示すように異なる。
【０５８７】
【表２９】
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（実施例４：ＮＯＶ３のＳＡＧＥ分析）
【０５８８】
【表３０】
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【０５８９】
【表３１】
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（他の実施形態）
特定の実施形態が本明細書中で詳細に開示されているが、これは説明の目的だけのために例示の方法によって行われており、そして添付される特許請求の範囲に関して限定するようには意図されない。詳細には、種々の置換、変更、および改変が、特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲を逸脱することなく本発明に対して行われ得ることが、本発明者らによって企図される。核酸の出発物質、目的のクローン、ライブラリーの型の選択は、本明細書中に記載されている実施形態の知見を考慮すると、当業者にとって日常的な事項であると考えられる。他の局面、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内にあると考えられる。
【国際公開パンフレット】
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2004516820.tif 000397
2004516820.tif 000398
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004516820.tif 000399
2004516820.tif 000400
【国際調査報告】
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