(57)【要約】メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ゲノムにおいて多様な代謝および増殖条件に応答する遺伝子を同定した。これらの遺伝子の同定された応答性は、Ｃ１代謝細菌の調節された遺伝子発現におけるそれらのプロモーターの使用を可能にする。特に、生来の状態で３−ヘキスロース−６−リン酸シンターゼ（ＨＰＳ）を駆動するｈｐｓプロモーターが、絶対メタノトロフメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａにおける異種コーディング領域（例えば、ｃｒｔＺ）の発現を指令するのに有用であることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）１）ｎｒｔＡ遺伝子およびｇｌｎＢ遺伝子よりなる群から選択される遺伝子のプロモーター領域、および
２）Ｃ１代謝細菌において発現可能な目的のコーディング領域
を含んでなるキメラ遺伝子を有する形質転換されたＣ１代謝細菌細胞を提供し、ここで、プロモーター領域は目的のコーディング領域に操作可能に連結され、そして
ｂ）硝酸塩の存在下で工程（ａ）の形質転換されたＣ１代謝細菌細胞を増殖させ、ここで、キメラ遺伝子が発現される
ことを含んでなるＣ１代謝細菌における目的のコーディング領域の発現のための方法。
【請求項２】
ａ）１）ｇｌｙｏｘＩＩ遺伝子のプロモーター領域、および
２）Ｃ１代謝細菌において発現可能な目的のコーディング領域
を含んでなるキメラ遺伝子を有する形質転換されたＣ１代謝細菌細胞を提供し、ここで、プロモーター領域は目的のコーディング領域に操作可能に連結され、そして
ｂ）約ｐＨ５．５で工程（ａ）の形質転換されたＣ１代謝細菌細胞を増殖させ、ここで、キメラ遺伝子が発現される
ことを含んでなるＣ１代謝細菌における目的のコーディング領域の発現のための方法。
【請求項３】
ａ）１）ｈｔｐＧ遺伝子のプロモーター領域、および
２）Ｃ１代謝細菌において発現可能な目的のコーディング領域
を含んでなるキメラ遺伝子を有する形質転換されたＣ１代謝細菌細胞を提供し、ここで、プロモーター領域は目的のコーディング領域に操作可能に連結され、そして
ｂ）プロモーター領域の誘導に適切な温度で工程（ａ）の形質転換されたＣ１代謝細菌細胞を増殖させ、ここで、キメラ遺伝子が発現される
ことを含んでなるＣ１代謝細菌における目的のコーディング領域の発現のための方法。
【請求項４】
ａ）１）ｍｏｘＦ遺伝子およびｈｐｓ遺伝子よりなる群から選択される遺伝子のプロモーター領域、および
２）Ｃ１代謝細菌において発現可能な目的のコーディング領域
を含んでなるキメラ遺伝子を有する形質転換されたＣ１代謝細菌細胞を提供し、ここで、プロモーター領域は目的のコーディング領域に操作可能に連結され、そして
ｂ）メタンおよびメタノールよりなる群から選択されるＣ１炭素源の存在下で工程（ａ）の形質転換されたＣ１代謝細菌細胞を増殖させ、ここで、工程（ａ）のキメラ遺伝子が発現される
ことを含んでなるＣ１代謝細菌における目的のコーディング領域の発現のための方法。
【請求項５】
Ｃ１代謝細菌宿主細胞は、メタノトロフおよびメチロトロフよりなる群から選択される請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
Ｃ１代謝細菌宿主細胞は、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロシスチス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｃｔｉｓ）、メチロマイクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メタノモナス（Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ）、メチロフィラス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、メチロバチルス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ハイフォマイクロビウム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）よりなる群から選択されるメチロトロフである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
プロモーター領域は、配列番号３および配列番号６よりなる群から選択される核酸配列を有する請求項１に記載の方法。
【請求項８】
プロモーター領域は、配列番号９に記載の核酸配列を有する請求項２に記載の方法。
【請求項９】
プロモーター領域は、配列番号１２に記載の核酸配列を有する請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
プロモーター領域の誘導に適切な温度が、
ａ）４１〜４２℃であって、ここで、Ｃ１代謝細菌が中温性である、および
ｂ）４７〜５０℃であって、ここで、Ｃ１代謝細菌が好熱性である、
よりなる群から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
プロモーター領域を含んでなる核酸フラグメントは、配列番号１５、および配列番号１８よりなる群から選択される核酸配列を有する請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
硝酸塩の濃度は約５ｍＭ〜約１５ｍＭである請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
目的のコーディング領域は、トランスアルドラーゼ、フルクトース二リン酸アルドラーゼ、ケトデオキシホスホグルコン酸アルドラーゼ、ホスホグルコムターゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ、６−ホスホグルコン酸−６−リン酸−１デヒドロゲナーゼ、ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＡ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＺ、ｃｒｔＤ、ｃｒｔＯ、ｃｒｔＷをコードする遺伝子、リモネンシンターゼ、ｕｇｐ、ｇｕｍＤ、ｗｚａ、ｅｓｐＢ、ｅｓｐＭ、ｗａａＥ、ｅｓｐＶ、ｇｕｍＨをコードする遺伝子、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ａｒｏＧ、ａｒｏＢ、ａｒｏＱ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫ、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ、ａｒｏＣ、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＢ、ｐｈｅＡ、ｔｙｒＡｃ、ｐｄｓ、ｐｈａＣ、ｐｈａＥ、ｅｆｅ、ｐｄｃ、ａｄｈ、ピネンシンターゼ、ボルニルシンターゼ、フェランドレンシンターゼ、シネオールシンターゼ、サビネンシンターゼ、およびタキサジエンシンターゼをコードする遺伝子よりなる群から選択される請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）１）適切なレベルのβ−カロテン、および
２）β−カロテンヒドロキシラーゼをコードするコーディング領域に操作可能に連結されたｈｐｓ遺伝子のプロモーター領域を含んでなるキメラ遺伝子
を含んでなる形質転換さんれたＣ１代謝宿主細胞を提供し、そして
ｂ）適切な増殖条件下の工程（ａ）の宿主細胞と有効量のＣ１炭素基質とを接触させ、それにより、ゼアキサンチンが産生される、
ことを含んでなるゼアキサンチンの産生のための方法。
【請求項１５】
（ａ）配列番号２および配列番号５よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）とハイブリダイズし、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で洗浄される単離された核酸分子、または
（ａ）、もしくは（ｂ）に相補的である単離された核酸分子、
よりなる群から選択される硝酸誘導性遺伝子をコードする単離された核酸分子。
【請求項１６】
配列番号１および配列番号４よりなる群から選択される請求項１５に記載の単離された核酸分子。
【請求項１７】
請求項１５に記載の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号２および配列番号５よりなる群から選択される請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号２に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合、スミス−ウォーターマン法のアライメントに基づいて、少なくとも７０％の同一性を有する少なくとも４６４アミノ酸のｎｒｔＡ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、
または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列、
を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項２０】
配列番号５に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合、スミス−ウォーターマン法のアライメントに基づいて、少なくとも７６％の同一性を有する少なくとも１１２アミノ酸のｇｌｎＢ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、
または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列、
を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項２１】
（ａ）配列番号８に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）とハイブリダイズし、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で洗浄される単離された核酸分子、または
（ａ）、もしくは（ｂ）に相補的である単離された核酸分子、
よりなる群から選択されるｐＨ誘導性遺伝子をコードする単離された核酸分子。
【請求項２２】
配列番号７に記載されている請求項２１に記載の単離された核酸分子。
【請求項２３】
請求項２１に記載の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項２４】
配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号８に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合、スミス−ウォーターマン法のアライメントに基づいて、少なくとも７０％の同一性を有する少なくとも２３１アミノ酸のｇｌｙｏｘＩＩ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、
または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列、
を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項２６】
（ａ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）とハイブリダイズし、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で洗浄される単離された核酸分子、または
（ａ）、もしくは（ｂ）に相補的である単離された核酸分子、
よりなる群から選択される温度誘導性遺伝子をコードする単離された核酸分子。
【請求項２７】
配列番号１０に記載されている請求項２６に記載の単離された核酸分子。
【請求項２８】
請求項２６に記載の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項２９】
配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する請求項２８に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
配列番号１１に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合、スミス−ウォーターマン法のアライメントに基づいて、少なくとも７０％の同一性を有する少なくとも６４４アミノ酸のｈｔｐＧ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、
または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列、
を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項３１】
（ａ）配列番号１４、および１７よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）とハイブリダイズし、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で洗浄される単離された核酸分子、または
（ａ）、もしくは（ｂ）に相補的である単離された核酸分子、
よりなる群から選択されるメタンあるいはメタノール誘導性遺伝子をコードする単離された核酸分子。
【請求項３２】
配列番号１３、および１６よりなる群から選択される請求項３１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３３】
請求項３１に記載の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項３４】
配列番号１４、および１７よりなる群から選択される請求項３３に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
配列番号１４に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合、スミス−ウォーターマン法のアライメントに基づいて、少なくとも７０％の同一性を有する少なくとも８９アミノ酸のｍｏｘＦ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、
または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列、
を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項３６】
配列番号１７に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合、スミス−ウォーターマン法のアライメントに基づいて、少なくとも７０％の同一性を有する少なくとも２１５アミノ酸のｈｐｓ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、
または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列、
を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項３７】
配列番号３および配列番号６よりなる群から選択される核酸配列を有する硝酸塩の存在に応答するプロモーター領域。
【請求項３８】
配列番号９に記載の核酸配列を有する酸性ｐＨに応答するプロモーター領域。
【請求項３９】
配列番号１２に記載の核酸配列を有する高い温度に応答するプロモーター領域。
【請求項４０】
配列番号１５、および配列番号１８よりなる群から選択される核酸配列を有するメタンまたはメタノールの存在下で高度に発現されるプロモーター領域。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細菌の遺伝子発現および代謝工学の分野にある。より具体的には、本発明はＣ１代謝細菌における遺伝子発現のためのメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．から単離されるプロモーター領域の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
メタノトロフィック細菌は、周囲条件下でそれらの唯一の炭素およびエネルギー源としてメタンを使用するそれらの能力によって規定される。この能力は、大量のメタンとの共同で、メタンの生体変換を潜在的に独特かつ価値のあるプロセスにする。それ故に、いくらかのアプローチが、商業的応用のためのこれらの生物体の独特な天然の能力を利用する試みにおいて使用されている。
【０００３】
歴史的に、メタンの生体変換の商業的応用は、大きく分けて次の３つの範疇に当てはまる。
１）単一の細胞タンパク質の産生（非特許文献１）（非特許文献２；非特許文献３）；
２）化学物質産生のためのアルケン類のエポキシ化（特許文献１）；および
３）塩素処理された汚染物質の生物分解（非特許文献４；特許文献２；非特許文献５；非特許文献６）。
【０００４】
産生収量が低く、製品に毒性があり、製品を作製するのに大量の細胞塊が必要であるため、アルケンのエポキシ化が極わずかに商業的に成功している。
【０００５】
単一細胞タンパク質またはＳＣＰと称されるメタンからの大規模タンパク質産生は技術的に可能であり、市販されている（非特許文献２）。単一細胞タンパク質は比較的低価格の製品である。それ故に、経済的な産生は過重なバイオプロセッシングコストを認容することができない。ＳＣＰを産生するために使用されるメタノトロフィック株の収率は、プロセスの全体的な経済的実現性に極めて重要であり得る。メタノトロフィック細菌によって産生される微生物バイオマスは、典型的にタンパク質含有量（約７０〜８０重量％）が極めて高く、このタンパク質の所定のタイプの動物飼料への直接的使用を制限することができる。
【０００６】
ＳＣＰの合成に加えて、メタノトロフィック細胞は、さらに、メタンの酸化型生成物（即ち、メタノールおよびホルムアルデヒド）から炭水化物および脂質などの複雑な分子を構成することができる。例えば、所定の条件下で、メタノトロフは細胞外多糖を産生することが公知である（特許文献３；特許文献４；非特許文献７；非特許文献８）。同様に、メタノトロフは、多様な炭素長のイソプレノイド化合物およびカロテノイド色素の両方を蓄積することが公知である（特許文献５；特許文献４；非特許文献９）。
【０００７】
最も最近、メタノトロフィック生物体の天然の能力は、遺伝子操作の進歩によって拡張されている。オドム（Ｏｄｏｍ）らは、炭水化物、色素、テルペノイド化合物および芳香族化合物を含む単一細胞タンパク質以外の様々な材料の産生に好適な微生物プラットフォームとして、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｏｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａ．を調べている（特許文献４；特許文献６）。この特定のメタノトロフィック細菌株は、メタノールまたはメタンのいずれかを炭素基質として効率的に使用することが可能であり、該株がホルムアルデヒドから３炭素単位への炭素の組み入れのための複数の経路を含有し、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などの供与種を使用する細菌接合を介する遺伝子工学に従う点で代謝的に適応性に富む。従って、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｏｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａは、メタンから天然に産生される産物以外の新規のクラスの産物を産生するように操作することができる。しかし、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｏｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａなどのメタノトロフの代謝工学のさらなる進歩は、この宿主の外来および生来の遺伝子の発現を駆動するのに有用なプロモーターの詳細な理解が不足しているため、現在のところ制限されている。さらに、様々な天然の増殖および誘導条件下で個々に調節可能である一組のプロモーターをプロセスするのに有用であり得る。
【０００８】
一般に、原核生物のプロモーターは、特に、細胞の代謝を改変して、大量の天然の生産者（ｐｒｄｕｃｔｏｒ）の新規産物を産生するのためにキメラ遺伝子の発現を駆動するためのバイオテクノロジーにおいて重要な役割を果たすことができる。高レベルの特定のタンパク質を産生することもまた、産物として所望され得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での遺伝子発現のために一般に使用されるプロモーターは、特に、強力または誘導性プロモーターが要求される場合、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）においてキメラ遺伝子発現を駆動するのに適切ではないかもしれない。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において強力なプロモーターは、一般に、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）においてかなり低い発現を有する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の誘導性プロモーターと共に使用される誘導計は、一般に、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）では良好に機能しない。
【０００９】
従って、解決すべき問題は、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）において所望される条件下でキメラ遺伝子の発現に有用であるプロモーターを提供することがである。メタンおよびメタノール上で増殖中に高い発現を伴うプロモーターは、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）が産生宿主として使用される場合、価値がある。同様に、硝酸塩上での増殖ならびに温度およびｐＨ条件の変化によって誘導されるプロモーターは、産業施設において極めて適用可能であり、これらの条件のそれぞれは容易に調整することができる。本出願人らは、標示された代謝および増殖条件によって調節されるメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａゲノム内の遺伝子を同定し、これらの遺伝子からプロモーターを単離することによって、上記の問題を解決した。遺伝子の核酸配列はメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．およびＣ１代謝細菌培養物におけるバイオリアクターモニタリングのために使用することができる。具体的には、本出願らは、１）メタンおよびメタノール上での増殖、２）硝酸塩の存在下での誘導、３）増殖温度の変化による誘導、ならびに４）培地のｐＨの改変による誘導に応答する遺伝子を同定するためにマイクロアレイ技術を使用した。これらの遺伝子の相同物は、様々なＣ１代謝細菌における同様の目的に有用であるべきである。
【００１０】
【特許文献１】米国特許第４，３４８，４７６号明細書
【特許文献２】国際公開第９６３３８２１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０２／２０７９７号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０２／２０７２８号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０２／２０７３３号パンフレット
【特許文献６】国際公開第０２／１８６１７号パンフレット
【非特許文献１】シャープ  Ｄ．Ｈ．（Ｓｈａｒｐｅ  Ｄ．Ｈ．）、ＢｉｏＰｒｏｔｅｉｎ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ  １９８９、Ｅｌｌｉｓ  Ｈｏｒｗｏｏｄ  ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）：ハルステッド・プレス（Ｈａｌｓｔｅａｄ  Ｐｒｅｓｓ．）
【非特許文献２】ビランドセン・ジョン（Ｖｉｌｌａｄｓｅｎ，Ｊｏｈｎ）、Ｒｅｃｅｎｔ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｈｅｍ．Ｒｅａｃｔ．Ｅｎｇ．、［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅａｃｔ．Ｅｎｇ．Ｃｏｎｆ．］、第２回（１９８７）、第２巻、３２０〜３３頁。編者：クルカルニ  Ｂ．Ｄ．（Ｋｕｌｋａｒｎｉ，Ｂ．Ｄ．）；マシェルカー  Ｒ．Ａ．（Ｍａｓｈｅｌｋａｒ，Ｒ．Ａ．）；シャルマ  Ｍ．Ｍ．（Ｓｈａｒｍａ，Ｍ．Ｍ．）、出版社：ウィリー・イースト（Ｗｉｌｅｙ  Ｅａｓｔ．）、インド・ニュー・デリー（Ｎｅｗ  Ｄｅｌｈｉ，Ｉｎｄｉａ）
【非特許文献３】；ナギブ  Ｍ．（Ｎａｇｕｉｂ，Ｍ．）、Ｐｒｏｃ．ＯＡＰＥＣ  Ｓｙｍｐ．Ｐｅｔｒｏｐｒｏｔｅｉｎ、［Ｐａｐ．］（１９８０）、開催年１９７９年、２５３〜７７頁、出版社：オーガン・アラブ・エクスポーティング・カントリーズ（Ｏｒｇａｎ．Ａｒａｂ  Ｐｅｔ．Ｅｘｐｏｒｔｉｎｇ  Ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ）、クエート、クエート（Ｋｕｗａｉｔ，Ｋｕｗａｉｔ）
【非特許文献４】ジーエン（Ｔｓｉｅｎ）ら、Ｇａｓ，Ｏｉｌ，Ｃｏａｌ，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２、［Ｐａｐ．Ｉｎｔ．ＩＧＴ  Ｓｙｍｐ．Ｇａｓ，Ｏｉｌ，Ｃｏａｌ，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．］、第２回（１９９０）、８３〜１０４、編者：アキン・キャビット（Ａｋｉｎ，Ｃａｖｉｔ）；スミス・ジャレッド（Ｓｍｉｔｈ，Ｊａｒｅｄ）、出版社：Ｉｎｓｔ．Ｇａｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．、イリノイ州シカゴ（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）
【非特許文献５】マークレイ（Ｍｅｒｋｌｅｙ）ら、Ｂｉｏｒｅｍ．Ｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｔ  Ｏｒｇ．、［Ｐａｐ．Ｉｎｔ．Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｏｎ−Ｓｉｔｅ  Ｂｉｏｒｅｃｌａｍ．Ｓｙｍｐ．］、第３回（１９９５）、１６５〜７４、編者：ヒンチー・ロバート  Ｅ（Ｈｉｎｃｈｅｅ，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｅ）；アンダーソン・ダニエル  Ｂ．（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｄａｎｉｅｌ  Ｂ．）；ホッペル・ロナルド  Ｅ．（Ｈｏｅｐｐｅｌ，  Ｒｏｎａｌｄ  Ｅ．）、出版社：バトル・プレス（Ｂａｔｔｅｌｌｅ  Ｐｒｅｓｓ）、オハイオ州コロンブス（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）
【非特許文献６】マイヤー（Ｍｅｙｅｒ）ら、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｒｅｌｅａｓｅｓ，２（１）、１１〜２２（１９９３）
【非特許文献７】イバノバ（Ｉｖａｎｏｖａ）ら、Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｙａ  ５７（４）：６００−５（１９８８）
【非特許文献８】キルバン・ジョン  Ｊ．（Ｋｉｌｂａｎｅ，  Ｊｏｈｎ  Ｊ．）、ＩＩ  Ｇａｓ，Ｏｉｌ，Ｃｏａｌ，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３、［Ｐａｐ．ＩＧＴ’ｓ  Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］、第３回（１９９１）、開催年１９９０年、２０７〜２６頁、編者：アキン・キャビット（Ａｋｉｎ，Ｃａｖｉｔ）；スミス・ジャレッド（Ｓｍｉｔｈ，Ｊａｒｅｄ）、出版社：ＩＧＴ、イリノイ州、シカゴ（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）
【非特許文献９】ウラカミ（Ｕｒａｋａｍｉ）ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２（４）：３１７−４１（１９８６）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、本明細書においてメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａと称されるメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）の種から単離される誘導性遺伝子から単離される新規のプロモーター領域に関する。プロモーター領域は、窒素輸送遺伝子（ｎｒｔＡ）および窒素調節タンパク質（ｇｌｎＢ）（両方とも硝酸塩によって誘導可能である）；熱ショックタンパク質をコードする遺伝子（ｈｔｐＢ）（温度の上昇によって誘導可能である）；メタノールデヒドロゲナーゼ（ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａａｓｅ）遺伝子（ｍｏｘＦ）およびヘキスロース−６−リン酸シンターゼ（ｈｐｓ）（両方ともメタノールまたはメタンの存在下で高度に発現される）から誘導される。これらのプロモーター領域は、Ｃ１代謝細菌における様々なコーディング領域の発現を駆動するのに有効であることを見出した。
【００１２】
従って、本発明は、
ａ）１）ｎｒｔＡ遺伝子およびｇｌｎＢ遺伝子よりなる群から選択される遺伝子のプロモーター領域、および
２）Ｃ１代謝細菌において発現可能な目的のコーディング領域
を含んでなるキメラ遺伝子を有する形質転換されたＣ１代謝細菌細胞を提供し、ここで、プロモーター領域は目的のコーディング領域に操作可能に連結され、そして
ｂ）硝酸塩の存在下で工程（ａ）の形質転換されたＣ１代謝細菌細胞を増殖させ、ここで、キメラ遺伝子が発現される、
ことを含んでなるＣ１代謝細菌における目的のコーディング領域の発現のための方法を提供する。
【００１３】
同様に、本発明は、
ａ）１）ｇｌｙｏｘＩＩ遺伝子のプロモーター領域、および
２）Ｃ１代謝細菌において発現可能な目的のコーディング領域
を含んでなるキメラ遺伝子を有する形質転換されたＣ１代謝細菌細胞を提供し、ここで、プロモーター領域は目的のコーディング領域に操作可能に連結され、そして
ｂ）約ｐＨ５．５で工程（ａ）の形質転換されたＣ１代謝細菌細胞を増殖させ、ここで、キメラ遺伝子が発現される、
ことを含んでなるＣ１代謝細菌における目的のコーディング領域の発現のための方法を提供する。
【００１４】
代替的実施態様では、本発明は、
ａ）１）ｈｔｐＧ遺伝子のプロモーター領域、および
２）Ｃ１代謝細菌において発現可能な目的のコーディング領域、
を含んでなるキメラ遺伝子を有する形質転換されたＣ１代謝細菌細胞を提供し、ここで、プロモーター領域は目的のコーディング領域に操作可能に連結され、そして
ｂ）プロモーター領域の誘導に適切な温度で工程（ａ）の形質転換されたＣ１代謝細菌細胞を増殖させ、ここで、キメラ遺伝子が発現される、
ことを含んでなるＣ１代謝細菌における目的のコーディング領域の発現のための方法を提供する。
【００１５】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）１）ｍｏｘＦ遺伝子およびｈｐｓ遺伝子よりなる群から選択される遺伝子のプロモーター領域、および
２）Ｃ１代謝細菌において発現可能な目的のコーディング領域、
を含んでなるキメラ遺伝子を有する形質転換されたＣ１代謝細菌細胞を提供し、ここで、プロモーター領域は目的のコーディング領域に操作可能に連結され、そして
ｂ）メタンおよびメタノールよりなる群から選択されるＣ１炭素源の存在下で工程（ａ）の形質転換されたＣ１代謝細菌細胞を増殖させ、ここで、工程（ａ）のキメラ遺伝子が発現される、
ことを含んでなるＣ１代謝細菌における目的のコーディング領域の発現のための方法を提供する。
【００１６】
本発明のプロモーター領域の発現に好適な宿主は、メタノトロフおよびメチロトロフである。
【００１７】
本発明のプロモーターの制御下での発現に適切なコーディング領域は、カロテノイドの生合成に関与するコーディング領域である。
【００１８】
本発明は、
（ａ）配列番号２および配列番号５よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）とハイブリダイズし、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で洗浄される単離された核酸分子、または
（ａ）、もしくは（ｂ）に相補的である単離された核酸分子、
よりなる群から選択される硝酸誘導性遺伝子をコードする単離された核酸分子をさらに提供する。
【００１９】
同様に、本発明は、
（ａ）配列番号８に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）とハイブリダイズし、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で洗浄される単離された核酸分子、または
（ａ）、もしくは（ｂ）に相補的である単離された核酸分子、
よりなる群から選択されるｐＨ誘導性遺伝子をコードする単離された核酸分子を提供する。
【００２０】
別の実施態様では、本発明は、
（ａ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）とハイブリダイズし、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で洗浄される単離された核酸分子、または
（ａ）、もしくは（ｂ）に相補的である単離された核酸分子、
よりなる群から選択される温度誘導性遺伝子をコードする単離された核酸分子を提供する。
【００２１】
同様に、本発明は、
（ａ）配列番号１４、および１７よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）とハイブリダイズし、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で洗浄される単離された核酸分子、または
（ａ）、もしくは（ｂ）に相補的である単離された核酸分子、
よりなる群から選択されるメタンあるいはメタノール誘導性遺伝子をコードする単離された核酸分子を提供する。
【００２２】
特定の実施態様では、本発明は、配列番号３および配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、ならびに配列番号１８に記載の核酸配列を有する主体遺伝子から単離されるプロモーター領域を提供する。
【００２３】
本発明の核酸に加えて、本発明は、それらによってコードされるポリペプチド、本発明の核酸を含んでなるキメラ遺伝子、およびそれらによって形質転換された宿主細胞を提供する。
【００２４】
配列の説明、および生物学的寄託
本発明は、本出願の一部を形成する下記の詳細な説明および添付の配列の説明からさらに完全に理解することができる。
【００２５】
以下の配列は、米国特許法施行規則（３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．）第１．８２１〜１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）に従い、そして世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）、ならびに実施細則第２０８号および付属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用した記号および形式は、米国特許法施行規則（３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．）第１．８２２に記載の規則に従う。
【００２６】
配列番号１〜１８は、完全長コーディング領域（オープンリーディングフレーム、すなわちＯＲＦ）、タンパク質、またはプロモーターフラグメントであり、表１において同定される。
【００２７】
【表１】
2006515166.tif 000002
【００２８】
配列番号１９および２０はｍｏｘＦプロモーターの増幅に使用されるプライマーである。
【００２９】
配列番号２１および２２はｈｐｓプロモーターの増幅に使用されるプライマーである。
【００３０】
配列番号２３〜２６はｃｒｔＸコーディング領域の欠失に使用されるプライマーである。
【００３１】
本出願人らは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、以下の生物学的寄託を行った。
【００３２】
【表２】
2006515166.tif 000003
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明は、メタノトロフィック細菌株、高増殖メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａからの誘導性遺伝子およびそれらのプロモーターの単離ならびに特徴付けについて記載している。メタンおよびメタノール上での増殖ならびに硝酸塩の存在、増殖温度の変化、または培地ｐＨの改変による誘導に応答するこれらのプロモーターは、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａおよび他のＣ１代謝細菌のタンパク質、炭水化物および色素を含むバイオマスの産生を調節するのに有用である。従って、本発明は、
（ｉ）硝酸誘導によるＣ１代謝細菌における目的のコーディング領域の発現のための方法；
（ｉｉ）低ｐＨ（約５．５）誘導によるＣ１代謝細菌における目的のコーディング領域の発現のための方法；
（ｉｉｉ）誘導条件として増殖温度を上昇させることによって、Ｃ１代謝細菌における目的のコーディング領域の発現のための方法；および
（ｉｖ）メタンまたはメタノールにおける増殖によるＣ１代謝細菌における目的のコーディング領域の発現のための方法、
を提供することによって、当該分野を進歩させる。
【００３４】
さらに、本コーディング領域、または本発明のＯＲＦ、およびプロモーターフラグメントに相同な核酸配列は、他のＣ１代謝細菌の関連アプリケーションに同様の様式で機能することが予想される。
【００３５】
定義
本開示では、多数の用語および略語が使用される。以下の定義が提供される。
【００３６】
「オープンリーディングフレーム」はＯＲＦと略称される。
【００３７】
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと省略される。
【００３８】
用語「ゲノムＤＮＡ」は、生物体由来の全ＤＮＡを指す。
【００３９】
用語「全ＲＮＡ」は、生物体由来の非画分化されたＲＮＡを指す。
【００４０】
「ＲＮＡ転写物」は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼに触媒される転写から生じる産物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と称される。またはそれは一次転写物の転写後プロセシング由来のＲＮＡ配列であることができ、そして成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」は、イントロンを含まずかつ細胞によりタンパク質に翻訳される得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」はｍＲＮＡに相補的でありかつこれに由来する二本鎖ＤＮＡを指す。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含み、そして、従って細胞によりタンパク質に翻訳され得るＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的の一次転写物もしくはｍＲＮＡの全部または一部に相補的でありかつ標的遺伝子の発現を阻止するＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書；国際公開第９９２８５０８号パンフレット）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、すなわち５’非コーディング配列、３’非コーディング配列、またはコーディング配列における特異的な遺伝子転写物のいずれかの部分に関し得る。「機能的ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡまたは翻訳されていないがしかし細胞の過程に対する影響をなお有する他のＲＮＡを指す。
【００４１】
本明細書において使用される用語「発現」は、コーディング領域に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すことができる。
【００４２】
遺伝子発現に適用される用語「アップレギュレーションされる」とは、試験条件にある特定の遺伝子または領域のｍＲＮＡ転写レベルが、コントロール条件と比較して上昇していることを意味する。対照的に、遺伝子発現に適用される用語「ダウンレギュレーションされる」とは、試験条件にある特定の遺伝子または領域のｍＲＮＡ転写レベルが、コントロール条件と比較して減少していることを意味する。
【００４３】
細胞に適用される用語「増殖周期」は、細胞が培養条件において移行する代謝周期を指す。該周期は、指数期、指数期の終了、および定常期として知られる多様な段階に分割することができる。
【００４４】
用語「指数増殖」、「指数期増殖」、「対数期」または「対数増殖期」は、微生物が増殖し、そして分裂する速度を指す。対数期において増殖する場合、それらの遺伝子能力、培地の性質、および微生物が増殖する条件が最大限与えられると、微生物は最大速度で増殖する。指数期中の微生物の増殖速度は一定であり、微生物は規則的な間隔で分裂し、そして倍加する。「活動的に増殖する」細胞は対数期で増殖している細胞である。「指数増殖」の定義とは対照的に、用語「定常期」は、培養中の細胞増殖が遅くなるかまたは停止する増殖周期の期を指す。用語「増殖を変更する環境」は、細胞の増殖を阻害するかまたは細胞を死滅させる能力を有するエネルギー、化学物質、または生体物を指す。阻害剤としては、変異剤、抗生物質、ＵＶ光、γ線、Ｘ線、極端な温度、ファージ、マクロファージ、有機化学物質および無機化学物質を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００４５】
「細胞の状態」は、異なる条件下で増殖する場合の生物体の代謝状態を指す。
【００４６】
用語「発現プロファイル」は、所定の組の条件下における遺伝子群の発現を指す。
【００４７】
用語「遺伝子発現プロファイル」は、個々の遺伝子および個々の遺伝子の組の発現を指す。
【００４８】
用語「ＤＮＡマイクロアレイ」または「ＤＮＡチップ」とは、高密度フォーマットまたはアレイの固相表面上のゲノム内の１群の遺伝子またはすべての遺伝子のＰＣＲ産物の組立体を意味する。アレイの構築および使用のための一般的方法は、利用することが可能である（スキーナ  Ｍ．（Ｓｃｈｅｎａ  Ｍ．）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２７０（５２３５）：４６７−７０（１９９５））。ＤＮＡマイクロアレイは、遺伝子またはこれらの遺伝子のＰＣＲ産物を含んでなるＤＮＡマイクロアレイと分析しようとするサンプルから調製されるｃＤＮＡプローブとをハイブリダイズさせることによって、同時に実施しようとする多くの遺伝子の遺伝子発現パターンまたはプロファイルの分析を可能にする。ＤＮＡマイクロアレイまたは「チップ」技術は、ゲノム規模に対する遺伝子発現の調査を可能にし、多くの遺伝子の転写レベルを同時に測定することが可能である。簡単に説明すると、該技術は、規定された位置で固相表面上の目的の遺伝子またはオープンリーディングフレームに相補的な顕微鏡的量のＤＮＡを整列することを含んでなる。この固相表面は、一般にガラススライド、または膜（例えば、ナイロン）である。ＤＮＡ配列は、スポットするかまたはフォトリソグラフィによって整列してもよい。比較しようとする２つのサンプルから調製される２つの個別の蛍光標識プローブ混合物はマイクロアレイにハイブリダイズされる。走査型共焦点顕微鏡を使用して、レーザー励起後の蛍光によって結合プローブの存在および量を検出し、そしてレーザースキャナおよび適切なアレイ分析ソフトウェアパッケージを使用して定量する。Ｃｙ３（緑色）およびＣｙ５（赤色）蛍光標識が日常的に当該分野において使用されるが、しかし、他の類似の蛍光標識を用いてもよい。２つの比較されたサンプル間の遺伝子発現プロファイルまたはパターンを入手し、そして定量するために、２つのチャンネル（赤：緑）におけるシグナル間の比を、Ｃｙ５／Ｃｙ３プローブの相対的強度により算出し、これは、各サンプルにおける特異的ｍＲＮＡの相対存在量の信頼し得る測定値とみなされる。ＤＮＡマイクロアレイの構築のための材料は市販されている。アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）（カリフォルニア州サンタクララ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ））；シグマケミカルカンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ））；ゲノシス（Ｇｅｎｏｓｙｓ）（テキサス州ウッドランド（Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ））；クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  ＣＡ））；およびコーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）（ニューヨーク州コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＮＹ））。さらに、アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、およびコーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）などの業者により特注のＤＮＡマイクロアレイを調製することができる。
【００４９】
用語「Ｃ１炭素基質」は、炭素−炭素結合を欠く任意の炭素含有分子を指す。例には、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、ギ酸塩、メチル化アミン（例えば、モノ−、ジ−、およびトリ−メチルアミン）、メチル化チオール、ならびに二酸化炭素がある。
【００５０】
用語「Ｃ１代謝体」は、唯一のエネルギー源およびバイオマスとして単一炭素基質を使用する能力を有する微生物を指す。Ｃ１代謝体は、典型的にメチロトロフおよび／またはメタノトロフである。
【００５１】
用語「Ｃ１代謝細菌」は、唯一のエネルギー源およびバイオマスとして単一炭素基質を使用する能力を有する細菌を指す。Ｃ１代謝細菌、Ｃ１代謝体のサブセットは、典型的にメチロトロフおよび／またはメタノトロフである。
【００５２】
用語「メチロトロフ」は、炭素−炭素結合を含有しない有機化合物を酸化することが可能な生物体を意味する。メチロトロフがＣＨ４を酸化することができる場合、メチロトロフもまたメタノトロフである。
【００５３】
用語「メタノトロフ」または「メタノトロフィック細菌」は、炭素およびエネルギーの１次供給源としてメタンを利用することが可能な原核生物を意味する。メタンの二酸化炭素への完全な酸化は、好気的分解経路によって生じる。本発明において有用なメタノトロフの典型的な例として、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）属、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、およびメチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）属が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
用語「高増殖メタノトロフィック細菌株」は、唯一の炭素およびエネルギー源としてメタンまたはメタノールによる増殖が可能な細菌を指し、該細菌は、高い増殖速度および代謝されたＣ１基質の１グラムあたり細胞塊の高収量を生じる機能的エムデン−マイヤーホフ炭素フラックス経路を有する（国際公開第０２／２０７２８号パンフレットを参照のこと）。本明細書に記載の特定の「高増殖メタノトロフィック細菌株」を「メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ」、「１６ａ」または「メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａ」と呼び、これらの用語は交換可能に使用され、本発明において使用されるメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）株を指す。
【００５５】
「核酸」は、ヌクレオチドと呼ばれる共有結合したサブユニットからなる高分子化合物である。核酸は、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）およびポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）（両方とも一本鎖であってもまたは二本鎖であってもよい）を含む。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および半合成ＤＮＡが含まれる。
【００５６】
本明細書において使用される「単離された核酸フラグメント」は、一本鎖もしくは二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであり、場合により、合成、非天然または改変されたヌクレオチド塩基を含有する。ＤＮＡのポリマーの形態の単離された核酸フラグメントは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つもしくはそれ以上のセグメントからなり得る。
【００５７】
核酸フラグメントは、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で一本鎖形態の核酸フラグメントが他の核酸フラグメントにアニールすることができる場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどのもう１つの核酸フラグメントに「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、サンブルックＪ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッシュＥ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティスＴ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）（１９８９）、特に、第１１章および該第１１章に掲載の表１１．１（全体が参考として本明細書に援用される）において例示されている。温度およびイオン強度の条件はハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件を調整して、中等度に類似のフラグメント（遠い関係の生物体由来の相同配列など）から、高度に類似のフラグメント（近い関係の生物体由来の機能的酵素を複製する遺伝子など）をスクリーニングすることができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄はストリンジェンシー条件を決定する。１組の好適な条件は、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、室温、１５分間で開始し、次いで、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、４５℃、３０分間で反復し、次いで、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５０℃、３０分間を２回反復する一連の洗浄を使用する。より好適な組のストリンジェントな条件は、より高い温度を使用し、ここで洗浄は、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳによる最後の２回の３０分間の洗浄の温度を６０℃にまで上昇させたことを除いて、上記の洗浄と同一である。もう１つの好適な組の高度にストリンジェントな条件は、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で最後の２回の洗浄を行う。さらなる組のストリンジェントな条件は、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃でのハイブリダイゼーションを含み、例えば、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、続いて０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄される。
【００５８】
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的な配列を含有することを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間にミスマッチの可能性が存在する。核酸にハイブリダイズするのに適切なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の程度（当業者に周知の変数）に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリダイズに対するＴｍの値は大きい。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴｍに対応する）は、次の順で減少する。ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００ヌクレオチドを超えるハイブリダイズについては、Ｔｍを算出するための式が導入されている（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、上掲、９．５０−９．５１を参照のこと）。より短い核酸、即ちオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、上掲、１１．７−１１．８を参照のこと）。１つの実施態様において、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さは少なくとも約１５ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約２０ヌクレオチドであり、および最も好ましくは、長さは少なくとも３０ヌクレオチドである。さらに、当業者は、必要であれば、プローブの長さなどの因子に従って、温度および洗浄溶液の塩濃度を調整することができることを認識するであろう。
【００５９】
用語「オリゴヌクレオチド」は、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子にハイブリダイズ可能な一般に少なくとも１８ヌクレオチドの核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、例えば、３２Ｐヌクレオチドまたはビオチンなどの標識が共有結合しているヌクレオチドで標識することができる。１つの実施態様では、標識されたオリゴヌクレオチドを「プローブ」として使用し、本発明の核酸の存在を検出することができる。用語「プローブ」は、相補的な一本鎖標的核酸と塩基対を形成し、二本鎖分子を形成することができる一本鎖核酸分子を指す。用語「標識」は、ｍＲＮＡまたはＤＮＡに容易に付着することができ、そして検出可能なシグナルを生成することができる任意の従来の分子を指し、該シグナルの強度は、ＤＮＡフラグメントに対する標識されたプローブのハイブリダイゼーションの相対量を示す。好適な標識は蛍光分子または放射性分子である。様々な周知の標識を使用することができる。
【００６０】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、当業者による配列の人的評価によるかまたはＢＬＡＳＴ（基本的局所整列検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）；アルトシュールＳ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−４１０（１９９３））のようなアルゴリズムを使用するコンピュータにより自動化された配列の比較および同定のいずれかによって、ポリペプチドもしくは遺伝子を推定的に同定するのに十分であるポリペプチドのアミノ酸配列、または遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなる部分である。一般に、あるポリペプチドまたは核酸配列を、既知のタンパク質または遺伝子に対して、相同として推定で同定するためには、１０もしくはそれ以上の連続するアミノ酸または３０もしくはそれ以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、遺伝子の同定（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば、細菌コロニーもしくはバクテリオファージのプラークのインサイチュハイブリダイゼーション）の配列に依存する方法では、２０〜３０の連続するヌクレオチドを含んでなる遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用することができる。加えて、プライマーを含んでなる特定の核酸フラグメントを得るために、１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドをＰＣＲでの増幅プライマーとして、使用することができる。従って、ヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、該配列を含んでなる核酸フラグメントを特異的に同定し、および／または単離するのに十分な配列を含んでなる。本明細書は、１種またはそれ以上の特定の微生物タンパク質をコードする部分的、もしくは完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。本明細書に報告されるような配列の恩恵を有する当業者は、今や、当業者に既知の目的上、開示される配列の全部もしくは実質的な部分を使用してよい。従って本発明は、付随する配列表で報告されるような完全な配列、ならびに上で規定されたようなそれらの配列の実質的部分を含んでなる。
【００６１】
用語「相補的」は、相互にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するために使用される。例えば、ＤＮＡについて、アデノシンはチミンに相補的であり、そしてシトシンはグアニンに相補的である。従って、本発明はまた、付随する配列表で報告されるような完全な配列、ならびにそれらの実質的に類似の核酸配列に相補的である単離された核酸フラグメントを含む。
【００６２】
当該分野において公知である用語「パーセント同一性」は、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係であり、配列を比較することによって決定される。当該分野において、場合により「同一性」は、ペプチドまたはポリペプチド配列間の配列関係の程度をも意味し、そのような配列のストリング間の一致によって決定される。「同一異性」および「類似性」は、以下に記載される方法を含むがこれらに限定されない公知の方法によって容易に算出することができる。Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（レスクＡ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．）編、オックスフォード・ユニバーシティ・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（ＮＹ）、（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（スミスＤ．Ｗ．（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．）編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（ＮＹ）（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（グリフィンＡ．Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．）およびグリフィンＨ．Ｇ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．）編）、ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー（ＮＪ）（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（フォン・ヘインジＧ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．）編）、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）（１９８７）；ならびにＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（グリブスコフＭ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．）およびデベルウクスＪ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）編）、ストックトンプレス（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（ＮＹ）（１９９１）。同一性を決定するための好適な方法は、試験される配列間の最良の一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにおいてコード化される。配列のアライメントおよびパーセント同一性の計算は、レーザージーン（ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ）生物情報科学コンピュータ計算ソフトウェアパッケージ（ＤＮＡスター社（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ））のメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラムを使用して実施してもよい。配列のマルチプルアライメントは、デフォルトのパラメータ（ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝１０）を用い、クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法（ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３）のアライメントを使用して実施した。クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法を使用するペアワイズアライメントのためのデフォルトのパラメータは、Ｋタプル（ＴＵＰＬＥ）１、ギャップペナルティ＝３、ウィンドウ＝５およびダイアゴナルズ・セイブド＝５であった。
【００６３】
適切な核酸フラグメント（本発明の単離されたポリヌクレオチド）は本明細書において報告するアミノ酸配列に少なくとも約７０％同一、好ましくは、少なくとも約８０％同一であるポリペプチドをコードする。好適な核酸フラグメントは、本明細書において報告するアミノ酸配列に約８５％同一であるアミノ酸配列をコードする。より好適な核酸フラグメントは、本明細書において報告するアミノ酸配列に少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列をコードする。最も好適な核酸フラグメントは、本明細書において報告するアミノ酸配列に少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列をコードする。適切な核酸フラグメントは、上記の相同性を有するだけでなく、少なくとも５０アミノ酸、好ましくは少なくとも１００アミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２００アミノ酸、最も好ましくは少なくとも２５０アミノ酸を有するポリペプチドを典型的にコードする。
【００６４】
「コドンの縮重」は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えることなくヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝コード中の性質を指す。従って、本発明は、配列番号２、５、８、１１、１４、１７、および２０に記載の本微生物ポリペプチドをコードするアミノ酸配列の全部または実質的な部分をコードするいかなる核酸フラグメントにも関する。当業者は、ある所定のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドンの使用における特定の宿主細胞により表される「コドンの偏り」を十分認識している。従って、ある宿主細胞中での改良された発現のための遺伝子を合成する場合、コドンの使用頻度が該宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近づくような遺伝子を設計することが望ましい。
【００６５】
「遺伝子」は、コーディング配列の前（５’非コーディング配列）および後（３’非コーディング配列）に調節配列を含む特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを指す。「生来の遺伝子」は、それ自体の調節配列と共に天然に見出されるような遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然には一緒に見出されない調節およびコーディング配列を含んでなる、生来の遺伝子ではないあらゆる遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列およびコーディング配列、または同じ起源から由来するが、しかし天然に見出されるものとは異なる様式で配列される調節配列およびコーディング配列を含んでなることができる。本発明のキメラ遺伝子は、典型的に目的のコーディング領域に操作可能に連結された誘導性プロモーターを含んでなる。「内因性遺伝子」は、生物体のゲノム内の天然の位置にある生来の遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物体内に通常は見出されない遺伝子を指すが、しかしこれは遺伝子導入により宿主生物体内に導入される。外来遺伝子は、非生来の生物体内に挿入された生来の遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」は、形質転換手順によりゲノム中に導入されている遺伝子である。
【００６６】
用語「誘導性遺伝子」とは、特定のストレス、刺激または増殖条件に応答して高発現を伴う任意の遺伝子を意味する。本発明の誘導性遺伝子として、メチロモナス（Ｍｅｔｈｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａ．のｎｒｔＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｙｏｘＩＩ、ｈｔｐｇ、ｍｏｘＦ、およびｈｐｓとして同定される遺伝子が挙げられる。
【００６７】
「合成遺伝子」は、当業者に既知の手順を使用して化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成単位から集成することが可能である。これらの基礎単位は連結およびアニーリングされて、その後に遺伝子全体を構築するように酵素的に集成される遺伝子セグメントを形成する。ＤＮＡの配列に関するところの「化学的に合成される」は、成分ヌクレオチドがインビトロで集成されたことを意味する。ＤＮＡの人的な化学合成は、十分に確立された手順を使用して達成することができるか、または、多数の商業的に入手可能な機械の１つを使用して自動化学合成を実施することが可能である。従って、該遺伝子は、宿主細胞のコドンの偏りに反映するヌクレオチド配列の最適化に基づいた最適な遺伝子発現を適応させることが可能である。当業者は、コドンの使用を宿主に好まれるコドンに偏らせる場合に、成功裏の遺伝子発現の見込みを認識する。好ましいコドンの決定は、配列情報が入手可能である宿主細胞由来の遺伝子の調査に基づくことが可能である。
【００６８】
遺伝子に適用される用語「相同物」とは、同じ機能を有する同じまたは異なる微生物に由来する任意の遺伝子を意味する。相同遺伝子は、有意な配列類似性を有することができる。
【００６９】
「コーディング配列」または「目的のコーディング領域」は特定のアミノ配列をコードするＤＮＡ配列を指す。
【００７０】
「適切な調節配列」は、コーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、内、または下流（３’非コーディング配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または関連するコーディング配列の翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造を含んでもよい。
【００７１】
「転写および翻訳制御配列」は、宿主細胞におけるコーディング配列の発現を提供するプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどのＤＮＡ調節配列である。真核細胞では、ポリアデニル化シグナルは制御配列である。
【００７２】
「プロモーター」は、コーディング配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コーディング配列は、プロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、それらの全体が生来の遺伝子から誘導することができるか、または天然に見いだされる多様なプロモーターから誘導される多様なエレメントから成るか、または合成ＤＮＡセグメントを含み得る。当業者であれば、多様なプロモーターは多様な組織もしくは細胞タイプ、または多様な発生段階において、あるいは多様な環境または生理学的条件に応答して遺伝子の発現を指令することができることを理解している。ほとんどの時期におけるほとんどの細胞タイプにおいて遺伝子を発現させるプロモーターを、通常、「構成的プロモーター」と呼ぶ。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全には規定されていないため、多様な長さのＤＮＡフラグメントが同一のプロモーター活性を有することができることがさらに認識される。「誘導性プロモーター」とは、特定の刺激に応答する任意のプロモーターを意味する。本発明の誘導性プロモーターは、典型的に、「誘導性遺伝子」に由来し、そしてさまざまな代謝条件（増殖基質、栄養組成、またはｐＨおよび温度変化などの環境ストレス）に応答する。
【００７３】
用語「機能的に等価なサブフラグメント」および「機能的等価サブフラグメント」は、本明細書において交換可能に使用される。これらの用語は、遺伝子発現を付与または所定の表現型を産生する能力を保持する単離された核酸フラグメントの部分または部分列を指す。例えば、フラグメントまたはサブフラグメントは、形質転換された宿主において所望する表現型を産生させるためのキメラ遺伝子の発現のために使用することができる。サブフラグメントは、本来の完全核酸プロモーターフラグメントのプロモーター活性を保持する。
【００７４】
「３’非コーディング配列」は、コーディング配列の下流に配置されるＤＮＡ配列を指し、かつ、ポリアデニル化認識配列、およびｍＲＮＡのプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことが可能な調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’端へのポリアデニル酸領域（ｔｒａｃｔ）の付加に影響を及ぼすことを特徴とする。
【００７５】
用語「操作可能に連結している」は、一方の機能が他方により影響を受ける単一核酸フラグメント上の核酸配列の対合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を指す。例えば、プロモーターがコーディング配列の発現を影響することができる（すなわちコーディング配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、プロモーターはコーディング配列に操作可能に連結されている。コーディング配列はセンスまたはアンチセンスの配向で調節配列に操作可能に連結されることができる。
【００７６】
「成熟」タンパク質は、転写後にプロセシングされたポリペプチド（即ち、一次翻訳産物中に存在するいかなるプレ−もしくはプロペプチドが除去されている）を指す。「前駆体」タンパク質は、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物（即ち、プレ−およびプロペプチドがなお存在する）を指す。プレ−およびプロペプチドは、限定されるものでないが細胞内局在化シグナルであってもよい。
【００７７】
用語「シグナルペプチド」は、分泌される成熟タンパク質に先行するアミノ末端ポリペプチドを指す。シグナルペプチドは、成熟タンパク質から切断され、従って成熟タンパク質内には存在しない。シグナルペプチドは、細胞膜を横切って分泌されるタンパク質を指令し、輸送する機能を有する。シグナルペプチドはまた、シグナルタンパク質とも称される。
【００７８】
「形質転換」は、遺伝的に安定に遺伝する、核酸フラグメントの宿主生物体のゲノムへの伝達を指す。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物体は「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物体と称される。
【００７９】
用語「プラスミド」および「ベクター」は、しばしば細胞の中心的代謝の部分ではない遺伝子を担持する染色体外エレメントを指し、通常は、環状二本鎖ＤＮＡ分子フラグメントの形態である。そのようなエレメントは、任意の起源から誘導される一本鎖または二本鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡの自律的反復配列、ゲノム組込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列で、線状あるいは環状であってもよく、ここで、プロモーターフラグメントおよび適切な３’非翻訳配列を伴う選択された遺伝子産物に対するＤＮＡ配列を細胞に導入することが可能である独特な構築物に、多くのヌクレオチド配列が接続または組換えられている。「形質転換ベクター」は、外来遺伝子を含有し、該外来遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を容易にするエレメントを有する特定のプラスミドを指す。「発現カセット」は、コーディング領域を含有し、該コーディング領域に加えて特定の宿主における該コーディング領域の発現を可能にするエレメントを有するＤＮＡフラグメントを指す。
【００８０】
用語「改変された生物活性」は、微生物のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質に伴う活性を指し、該活性はアッセイ方法によって測定することができ、ここで、該方法は生来の微生物の配列に伴う活性よりも大きいかまたは小さい。「増強された生物活性」は、生来の配列に伴う活性よりも大きい改変された活性を指す。「低減された生物活性」は、生来の配列に伴う活性よりも小さい改変された活性である。
【００８１】
用語「配列解析ソフトウェア」は、ヌクレオチドもしくはアミノ酸配列の解析に有用なあらゆるコンピュータアルゴリズム、またはソフトウェアプログラムを指す。「配列解析ソフトウェア」は、市販されていてもよく、また独立して開発してもよい。典型的な配列解析ソフトウェアとして、ＧＣＧプログラムソフトウェアパッケージ（ウィスコンシン・パッケージ・バージョン９．０（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ９．０）、ジェネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）（ＧＣＧ）、ウィスコンシン州、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））、ブラストＰ（ＢＬＡＳＴＰ）、ブラストＮ（ＢＬＡＳＴＮ）、ブラストＸ（ＢＬＡＳＴＸ）（アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、およびＤＮＡスター（ＤＮＡＳＴＡＲ）（ＤＮＡスター社（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．）ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、およびスミス−ウォーターマンアルゴリズムを組み入れたファスタ（ＦＡＳＴＡ）プログラム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４）、開催年１９９２、１１１−２０．編者：スハイ・サンドル（Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ）、出版社：プレヌム（Ｐｌｅｎｕｍ）、ニューヨーク州ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ））が挙げられるが、これらに限定されない。本出願に従い、配列解析ソフトウェアが解析のために使用される場合、解析結果は、他に特定しない限り参照したプログラムの「デフォルト値」に基づくことが理解される。本明細書において使用される「デフォルト値」は、最初に初期化した場合に本来ソフトウェアにロードされる任意の組の値、またはパラメータを意味する。
【００８２】
ここで使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該分野において周知であり、サンブルックＪ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッシュＥ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティスＴ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９）（以後、「マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）」）ならびにシルハビーＴ．Ｊ．（Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．）、ベンナンＭ．Ｌ．（Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．）、およびエンクイストＬ．Ｗ．（Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８４）；ならびにグリーン・パブリッシング・アソシエーション・アンド・ウィレイ−インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）から出版されたたアウスベルＦ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）により記載されている。
【００８３】
本発明は、多様な代謝条件に応答するメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）のゲノム内に含有される多くの誘導性遺伝子を同定する。これらの遺伝子は、硝酸塩、ｐＨ、温度、またはメタンもしくはメタノールにおける増殖に応答して調節される。より具体的には、ｎｒｔＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｙｏｘＩＩ、ｈｔｐｇ、ｍｏｘＦ、およびｈｐｓを調節するプロモーター領域は、Ｃ１代謝細菌における目的の任意の適切なコーディング領域の発現を駆動するのに有用であることが同定されている。
【００８４】
マイクロアレイの適用
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）または他の任意の細菌におけるプロモーター活性の調査は、しばしば、ノーザン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）ブロット、酵素アッセイ、およびレポーター遺伝子を用いる。これらの方法は、限られた数の遺伝子の発現レベルを比較することにより、遺伝子発現に対する環境の変化の影響のモニタリングを可能にする。それらは、しばしば、生理学的条件の１つもしくはサブセットの調査を可能にするが、これらの方法は、典型的に、信頼できかつ有用な様式で生物体のゲノムにおける大半の個々の遺伝子の包括的応答をモニターすることができない。
【００８５】
ゲノム研究の進歩によるプロモーターを同定するための新規の強力な方法はＤＮＡマイクロアレイの使用である。ＤＮＡマイクロアレイ技術は、ゲノムの広範な規模で遺伝子発現プロファイルを探求するために使用される（デリシＪ．Ｌ．（ＤｅＲｉｓｉ，Ｊ．Ｌ．）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２７８：６８０−６８６（１９９７））。それは、異なる増殖条件または環境条件で発現される遺伝子の同定を可能にする。次いで、同定された遺伝子から単離されるプロモーターを使用して、増殖段階またはプロモーターに特徴的である環境条件下で他のコーディング領域を発現させることができる。遺伝子配列自体は、産業環境に価値のある遺伝子発現活性を追跡するためのプローブとして使用してもよく、ここで、プロモーター誘導のための条件は、簡便、経済的に有効かつ特定のバイオ製造プロセスに匹敵するものでなければならない。従って、同定された遺伝子配列を使用して、バイオリアクターにおける増殖条件に対するバイオマスおよび細胞応答の状態を分析してもよい。
【００８６】
マイクロアレイの作製
本発明は、これまで理解されていなかった多様な条件に応答する多くのメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａ遺伝子を同定する。ＤＮＡマイクロアレイ技術をメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａのゲノムに適用することによって、これらの新規の誘導条件によって調節されるこれらの遺伝子が同定された。任意のＣ１代謝細菌種を使用してもよいが、しかし、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａ株が好ましい。
【００８７】
ＤＮＡマイクロアレイの作製は一般的であり、当該分野において周知である（例えば、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら、米国特許第６，１１０，４２６号明細書）。典型的に、マイクロアレイの作製は、目的の生物体のゲノムを提示する核酸サンプルを提供することから始まる。典型的に、この核酸サンプルのＯＲＦ、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，２０２号明細書（１９８７、ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら）および米国特許第４，６８３，１９５号明細書（１９８６、ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら））；ならびにリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（タボル（Ｔａｂｏｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８２、１０７４−１０７８（１９８５））；ならびに／あるいは鎖置換増幅（ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９、３９２（１９９２））などのプライマー指向性増幅の方法によって増幅され、同じ配列のＤＮＡフラグメントを産生する。次いで、変性、増幅されたＯＲＦ  ＤＮＡフラグメントは、マイクロアレイを形成するための当該分野において周知の方法により、ガラスまたは他のいくつかの固体基盤からなるスライド上にスポットされる。最小数の合成工程で高密度のオリゴヌクレオチドのアレイを形成する方法については、公知である（例えば、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら、米国特許第６，１１０，４２６号明細書を参照のこと）。光指向性化学カップリング、および機械的指向性カップリングを含むが、これらに限定されない様々な方法によって、固体基盤上にオリゴヌクレオチド類似体アレイを合成することができる。例えば、光指向性合成技術を使用して、ペプチド、オリゴヌクレオチドおよび他の分子の巨大アレイを形成する方法を開示しているピルング（Ｐｉｒｒｕｎｇ）ら、米国特許第５，１４３，８５４号明細書（またＰＣＴ出願国際公開第９０／１５０７０号パンフレット）およびフォーダー（Ｆｏｄｏｒ）ら、ＰＣＴ出願国際公開第９２／１００９２号パンフレットおよび国際公開第９３／０９６６８号パンフレットを参照のこと。また、フォーダー（Ｆｏｄｏｒ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２５１、７６７−７７（１９９１）も参照のこと。
【００８８】
ＯＲＦ  ＤＮＡフラグメントは、少なくとも１つの顕微鏡ガラススライド上に高密度で整列される。一旦、ゲノム由来のＯＲＦのすべての遺伝子が増幅され、増幅されたＤＮＡフラグメントが単離され、そして整列されると、シグナル発生標識を有する１組のプローブが合成される。典型的に、プローブは、目的の生物体の遺伝子のｍＲＮＡ転写物、またはｍＲＮＡ転写物由来の核酸から作製される。本明細書において使用するｍＲＮＡ転写物由来の核酸は、特定のｍＲＮＡ転写物またはそのサブ配列から産生される核酸を指す（即ち、ｍＲＮＡ転写物は誘導しようとする核酸のテンプレートしての役割を果たす）。従って、ｍＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡから転写されるｍＲＮＡ、ｃＤＮＡから増幅されるＤＮＡ、増幅されたＤＮＡから転写されるＲＮＡなどは、すべてｍＲＮＡ転写物から誘導され、そのように誘導された産物を使用する検出によりサンプル内の本来の転写物の存在および／または存在量が示される。従って、適切なサンプルとしては、遺伝子のｍＲＮＡ転写物、ｍＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡ、ｃＤＮＡから転写されるｃＲＮＡ、遺伝子から増幅されるＤＮＡ、増幅されたＤＮＡから転写されるＲＮＡなどが挙げられるが、これらに限定されない。プローブは無作為に作製しても、または特定のオープンリーディングフレームの配列に基づいて合成してもよい。プローブは、典型的に、検出しようとする核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、アレイのＯＲＦ  ＤＮＡフラグメントに「ハイブリダイズ可能」である。プローブの長さは５塩基〜数万塩基に変動することができ、実施しようとする特定の試験に依存する。典型的に、約１５塩基〜約３０塩基のプローブの長さが適切である。プローブ分子のただ一部のみが検出しようとする核酸配列に相補的である必要がある。さらに、プローブと標的配列との間の相補性は完全である必要はない。ハイブリダイゼーションは不完全な相補的分子の間でも生じ、その結果、ハイブリダイズされた領域内の塩基の特定の画分は、適切な相補的塩基と対を形成しない。
【００８９】
プローブに組み入れることができるシグナル発生標識は当該分野において周知である。標識としては、例えば、蛍光部分、化学発光部分、粒子、酵素、放射性タグ、または発光部分もしくは分子が挙げられる（しかし、これらに限定されない）。蛍光部分が好適である。核酸に付着し、そして蛍光シグナルを放射することが可能な蛍光色素が最も好適である。フルオレセイン、テキサスレッド、およびローダミンなどの様々な色素が当該分野において公知である。１反応性色素Ｃｙ３およびＣｙ５は、両方とも市販されている（即ち、アマシャムファルマシアバイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）イリノイ州アーリントン・ハイツ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ））。適切な色素については、米国特許第５，８１４，４５４号明細書（本明細書において参考として援用される）において考察されている。
【００９０】
標識は、当業者に周知の多くの手段のいずれかに組み入れることができる。しかし、好適な実施態様では、標識は、プローブ核酸の調製の増幅工程中に同時に組み入れられる。従って、例えば、標識されたプライマーまたは標識されたヌクレオチドによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、標識された増幅産物を提供する。好適な実施態様では、標識されたヌクレオチド（例えば、色素標識ＵＴＰおよび／またはＣＴＰ）を使用する逆転写または複製により、転写された核酸に標識が組み入れられる。
【００９１】
あるいは、本来の核酸サンプル（例えば、ｍＲＮＡ、ポリＡｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）に直接かまたは合成完了後の増幅産物に標識を添加してもよい。核酸に標識を付着させる手段は当業者に周知であり、例えば、核酸のキナーゼ処理、それに続くサンプル核酸に接続している核酸リンカーの標識（例えば、蛍光団）への付着（連結反応）によるニックトランスレーションまたは（例えば、標識されたＲＮＡでの）末端標識化が挙げられる。
【００９２】
標識をプローブに組み入れた後、次いで、プローブは、標準的な条件を使用して、マイクロアレイにハイブリダイズされ、ここで、ハイブリダイゼーションの結果、二本鎖になった核酸が生じるが、一方の鎖はアレイ上にスポットされた核酸であり、そして一方の鎖はプローブであって、アレイ上のプローブのハイブリダイゼーション部位において標識から検出可能なシグナルを発生する。典型的に、プローブおよびアレイは、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で相互に混合されなければならない。これには、適切な濃度および温度条件下、無機または有機塩の存在下でプローブとアレイとを接触させることを要する。プローブおよびアレイ核酸は、プローブとサンプル核酸との間に可能な任意のハイブリダイゼーションが生じ得るのに十分に長い時間だけ接触させなければならない。混合物中のプローブまたはアレイの濃度は、ハイブリダイゼーションが生じるのに必要な時間を決定する。プローブまたはアレイ濃度が高いほど、ハイブリダイゼーションのインキュベーションに必要な時間は短い。必要に応じて、カオトロピック剤を添加してもよい。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性を阻害することによって核酸を安定化する。さらに、カオトロピック剤は、室温で短いオリゴヌクレオチドプローブの高感度かつストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にする。［バン・ネス（Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ）およびチェン（Ｃｈｅｎ）（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：５１４３−５１５１］。適切なカオトロピック剤としては、特に、塩化グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウム、およびトリフルオロ酢酸セシウムが挙げられる。典型的に、カオトロピック剤は、約３Ｍの最終濃度で存在する。所望であれば、ハイブリダイゼーション混合物に典型的に３０〜５０％（ｖ／ｖ）でホルムアミドを添加することができる。
【００９３】
多様なハイブリダイゼーション溶液を用いることができる。典型的に、これらは、約２０〜６０％容量、好ましくは３０％の極性有機溶媒を含む。一般的なハイブリダイゼーション溶液は、約３０〜５０％ｖ／ｖホルムアルデヒド、約０．１５〜１Ｍ塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（約６〜９のｐＨ範囲）などの約０．０５〜０．１Ｍ緩衝液、ドデシル硫酸ナトリウムなどの約０．０５〜０．２％界面活性剤、または０．５〜２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、フィコール（ＦＩＣＯＬＬ）（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．））（約３００〜５００キロダルトン）、ポリビリルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａｌ）、血清アルブミンを用いる。また、典型的なハイブリダイゼーション溶液には、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの非標識キャリア核酸（フラグメント化した核酸ＤＮＡ、例えば、ウシ胸腺もしくはサケ精子ＤＮＡ、または酵母ＲＮＡ）、および場合により約０．５〜２％ｗｔ／ｖｏｌグリシンが含まれる。また、ポリエチレングリコールなどの様々な極性水溶性または膨潤剤、ポリアクリレートまたはポリメタクリレートなどのアニオン性ポリマー、および硫酸デキストランなどのアニオン性多糖性ポリマーを含む排除体積剤などの他の添加物を含んでもよい。ハイブリダイゼーション条件を最適化する方法は当業者に周知である（例えば、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２４巻：核酸プローブによるハイブリダイゼーション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ）、Ｐ．ティッセン（Ｐ．  Ｔｉｊｓｓｅｎ）編、ニューヨーク州エルセビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．）、（１９９３）；およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、上掲を参照のこと）。
【００９４】
誘導性遺伝子の同定
マイクロアレイ技術を介する遺伝子発現プロファイリングの基礎は、遺伝子発現パターンの改変をもたらす様々な条件下で生物体に存在するｍＲＮＡを比較することに頼る。本発明の情況内で、細胞の個別の集団を、遺伝子発現パターンの改変をもたらす異なるストレスに曝露した。分析したストレスまたは誘導条件は、１）硝酸塩；２）低ｐＨ（約５．５）；３）温度の上昇（約４１〜４２℃）−−）；および４）メタンまたはメタノールにおける増殖を含んだ。ストレスをかけていない細胞を「対照」アレイデータの生成に使用し、かつ、ストレスをかけられた細胞を「実験」、「ストレスをかけられた」もしくは「誘導された」アレイデータを生成させるのに使用した。
【００９５】
上記のＤＮＡマイクロアレイ技術の方法を使用し、様々な異なる誘導条件を使用して、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａの誘導対非誘導における遺伝子発現パターンを比較し、
（ａ）遺伝子ｎｒｔＡおよびｇｌｎＢが硝酸塩の存在下での増殖によって誘導されること；
（ｂ）ｇｌｙｏｘＩＩ遺伝子が低ｐＨ（約５．５）の存在下での増殖によって誘導されること；
（ｃ）ｈｔｐＧ遺伝子が高温（例えば、中温性メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａにおいて４２℃）での増殖によって誘導されること；ならびに
（ｄ）遺伝子ｈｐｓおよびｍｏｘＦがメタノールおよび／またはメタンの存在下で増殖させる場合に構成的に発現されること、
が決定された。
【００９６】
スミス−ウォーターマンアライメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４）、開催年１９９２、１１１−２０．編者：スハイ・サンドル（Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ）、出版社：プレヌム（Ｐｌｅｎｕｍ）、ニューヨーク州ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ））を使用して、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａ窒素輸送体ｎｒｔＡコーディング領域配列によってコードされるアミノ酸配列を公的データベースと比較すると、最も類似する既知の配列は、本明細書において報告する４６４アミノ酸長のｎｒｔＡアミノ酸配列に対し３４％同一であることが示される。本発明の好適なアミノ酸フラグメントは本明細書に記載のアミノ酸配列に少なくとも約６０％〜７０％同一であるポリペプチドをコードし、ここで、約７０％〜９０％同一がより好適である。本明細書において報告するアミノ酸フラグメントに少なくとも９５％同一であるポリペプチドをコードする核酸フラグメントが最も好適である。同様に、本ＯＲＦに対応する核酸配列をコードする好適なｎｒｔＡは、機能的なタンパク質をコードする配列であり、本明細書において報告するｎｒｔＡの核酸配列に少なくとも８０％同一である。より好適なｎｒｔＡ核酸フラグメントは、本明細書に記載の配列に少なくとも９０％同一である。本明細書において報告する核酸に少なくとも９５％同一であるｎｒｔＡ核酸フラグメントが最も好適である。
【００９７】
スミス−ウォーターマンアライメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、上掲）を使用して、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａ窒素調節タンパク質ｇｌｎＢコーディング領域配列によってコードされるアミノ酸配列を公的データベースと比較すると、最も類似する既知の配列は、本明細書において報告する１１２アミノ酸長のｇｌｎＢのアミノ酸配列に対し７６％同一であることが示される。本発明の好適な核酸フラグメントは本明細書に記載の配列に少なくとも約７８％〜９０％同一なポリペプチドをコードし、ここで、約８０％〜９０％がより好適である。本明細書において報告するアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるポリペプチドをコードする核酸フラグメントが最も好適である。同様に、本ＯＲＦに対応する核酸配列をコードする好適なｇｌｎＢは、機能的なタンパク質をコードする配列であり、本明細書において報告するｇｌｎＢの核酸配列に少なくとも８０％同一である。より好適なｇｌｎＢ核酸フラグメントは、本明細書に記載の配列に少なくとも９０％同一である。本明細書において報告する核酸配列に少なくとも９５％同一であるｇｌｎＢ核酸フラグメントが最も好適である。
【００９８】
スミス−ウォーターマンアライメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、上掲）を使用して、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａ推定グリオキサラーゼＩＩ  ｇｌｙｏｘＩＩコーディング領域配列によってコードされるアミノ酸配列を公的データベースと比較すると、最も類似する既知の配列は、本明細書において報告する２３１アミノ酸長のｇｌｙｏｘＩＩのアミノ酸配列に対し５１％同一であることが示される。本発明の好適な核酸フラグメントは本明細書に記載の配列に少なくとも約７０％〜８０％同一なポリペプチドをコードし、ここで、約８０％〜９０％がより好適である。本明細書において報告するアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるポリペプチドをコードする核酸フラグメントが最も好適である。同様に、本ＯＲＦに対応する核酸配列をコードする好適なｇｌｙｏｘＩＩは、機能的なタンパク質をコードする配列であり、本明細書において報告するｇｌｙｏｘＩＩの核酸配列に少なくとも８０％同一である。より好適なｇｌｙｏｘＩＩ核酸フラグメントは、本明細書に記載の配列に少なくとも９０％同一である。本明細書において報告する核酸配列に少なくとも９５％同一であるｇｌｙｏｘＩＩ核酸フラグメントが最も好適である。
【００９９】
スミス−ウォーターマンアライメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、上掲）を使用して、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａ熱ショックタンパク質ｈｔｐＧコーディング領域配列によってコードされるアミノ酸配列を公的データベースと比較すると、最も類似する既知の配列は、本明細書において報告する６４４アミノ酸長のｈｔｐＧのアミノ酸配列に対し５７％同一であることが示される。本発明の好適な核酸フラグメントは本明細書に記載の配列に少なくとも約７０％〜８０％同一なポリペプチドをコードし、ここで、約８０％〜９０％がより好適である。本明細書において報告するアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるポリペプチドをコードする核酸フラグメントが最も好適である。同様に、本ＯＲＦに対応する核酸配列をコードする好適なｈｔｐＧは、機能的なタンパク質をコードする配列であり、本明細書において報告するｈｔｐＧの核酸配列に少なくとも８０％同一である。より好適なｈｔｐＧ核酸フラグメントは、本明細書に記載の配列に少なくとも９０％同一である。本明細書において報告する核酸配列に少なくとも９５％同一であるｈｔｐＧ核酸フラグメントが最も好適である。
【０１００】
スミス−ウォーターマンアライメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、上掲）を使用して、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａメタノールデヒドロゲナーゼサブユニットｍｏｘＦコーディング領域配列によってコードされるアミノ酸配列を公的データベースと比較すると、最も類似する既知の配列は、本明細書において報告する８９アミノ酸長のｍｏｘＦのアミノ酸配列に対し６０％同一であることが示される。本発明の好適な核酸フラグメントは本明細書に記載の配列に少なくとも約７０％〜８０％同一なポリペプチドをコードし、ここで、約８０％〜９０％がより好適である。本明細書において報告するアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるポリペプチドをコードする核酸フラグメントが最も好適である。同様に、本ＯＲＦに対応する核酸配列をコードする好適なｍｏｘＦは、機能的なタンパク質をコードする配列であり、本明細書において報告するｍｏｘＦの核酸配列に少なくとも８０％同一である。より好適なｍｏｘＦ核酸フラグメントは、本明細書に記載の配列に少なくとも９０％同一である。本明細書において報告する核酸配列に少なくとも９５％同一であるｍｏｘＦ核酸フラグメントが最も好適である。
【０１０１】
スミス−ウォーターマンアライメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、上掲）を使用して、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａヘキスロース−６−リン酸シンターゼ（ｈｐｓ）コーディング領域配列によってコードされるアミノ酸配列を公的データベースと比較すると、最も類似する既知の配列は、本明細書において報告する２１５アミノ酸長のｈｐｓのアミノ酸配列に対し５５％同一であることが示される。本発明の好適な核酸フラグメントは本明細書に記載の配列に少なくとも約７０％〜８０％同一なポリペプチドをコードし、ここで、約８０％〜９０％がより好適である。本明細書において報告するアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるポリペプチドをコードする核酸フラグメントが最も好適である。同様に、本ＯＲＦに対応する核酸配列をコードする好適なｈｐｓは、機能的なタンパク質をコードする配列であり、本明細書において報告するｈｐｓの核酸配列に少なくとも８０％同一である。より好適なｈｐｓ核酸フラグメントは、本明細書に記載の配列に少なくとも９０％同一である。本明細書において報告する核酸配列に少なくとも９５％同一であるｈｐｓ核酸フラグメントが最も好適である。
【０１０２】
相同誘導性遺伝子の単離
当業者であれば、本発明の遺伝子が様々なＣ１代謝細菌種の相同物を有し、そして異種遺伝子発現のための遺伝子プロモーターならびにバイオリアクターの健全状態および生産のモニタリングのための遺伝子またはＯＲＦ核酸配列の使用は、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａから誘導される遺伝子には限定されず、あらゆるＣ１代謝細菌種の相同物にまで及ぶことを理解するであろう。例えば、本発明は、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロシスチス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｃｔｉｓ）、メチロマイクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メタノモナス（Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ）、メチロフィラス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、メチロバチルス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ハイフォマイクロビウム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）を含むが、それらに限定されない種から誘導される相同物を包含する。
【０１０３】
当該分野において周知であるように、配列依存性プロトコルを使用する相同遺伝子の単離は、多様な技術を使用して容易に実現可能である。配列依存性プロトコルの例として、１）核酸ハイブリダイゼーション法、および２）ＤＮＡおよびＲＮＡ増幅の方法（先に記載）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、本発明において使用されるタンパク質またはポリペプチドに類似のタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、本核酸フラグメントの全部または一部を、ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして使用し、当業者に周知の方法論を使用して任意の所望される細菌由来のライブラリーをスクリーニングすることによって、直接単離し得る。本核酸配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブは、当該分野において既知の方法（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、上掲）により設計および合成することができる。さらに、本発明の核酸配列は、ランダムプライマーＤＮＡ標識、ニックトランスレーション、もしくは末端標識技術のような当業者に既知の方法によりＤＮＡプローブを、または利用可能なインビトロ転写系を使用してＲＮＡプローブを合成するのに直接使用することができる。加えて、本配列の一部または完全長を増幅するための特異的プライマーを、設計かつ使用することができる。生じる増幅産物は増幅反応の間に直接標識することができるか、または増幅反応後に標識することができ、そして適切なストリンジェンシーの条件下で、完全長のＤＮＡフラグメントを単離するためのプローブとして使用することができる。
【０１０４】
典型的に、ＰＣＲ型増幅技術において、プライマーは、異なる配列を有し、相互に相補的ではない。所望される試験条件に依存して、プライマーの配列は、標的核酸の効率的かつ正確な複製を提供するために設計するべきである。ＰＣＲプライマーの設計方法は一般的であり、当該分野において周知である。（テイン（Ｔｈｅｉｎ）およびウォレス（Ｗａｌｌａｃｅ）、「“Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ”，  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｋ．Ｅ．デイビス（Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ）編、（１９８６）３３〜５０頁、ＩＲＬプレス（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）、バージニア州ヘルンドン（Ｈｅｒｎｄｏｎ，  ＶＡ）；ホワイト，Ｂ．Ａ．（Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．）（編）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏｌｏｇｙのリキリックＷ．（Ｒｙｃｈｌｉｋ，Ｗ．）（１９９３）、第１５巻、３１〜３９頁、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ヒューマニアプレス社（Ｈｕｍａｎｉａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、ニュージャージー州トトワ（Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ））。
【０１０５】
一般に、本配列の２個の短いセグメントをポリメラーゼ連鎖反応プロトコルで使用し、ＤＮＡまたはＲＮＡからの相同遺伝子をコードするより長い核酸フラグメントを増幅することができる。ポリメラーゼ連鎖反応はまた、クローニングされた核酸フラグメントのライブラリー上で実施してもよく、ここで、一方のプライマーの配列は本核酸フラグメントから誘導され、そして他方のプライマーの配列は、微生物の遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸領域の存在を利用する。
【０１０６】
あるいは、第２のプライマー配列はクローニングベクター由来の配列に基づくことができる。例えば、当業者は、ＰＣＲを使用して転写物の単一点と３’または５’末端との間の領域のコピーを増幅することにより、ｃＤＮＡを生じさせるＲＡＣＥプロトコル（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ８５：８９９８（１９８８））に従うことが可能である。本配列から３’および５’方向に配向されたプライマーを設計することが可能である。商業的に入手可能な３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥ系（ギブコＢＲＬ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ））を使用して、特異的な３’または５’ｃＤＮＡフラグメントを単離することができる（オオハラ（Ｏｈａｒａ）ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ８６：５６７３（１９８９）；ロー（Ｌｏｈ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４３：２１７（１９８９））。
【０１０７】
場合により、本配列を、相同物の同定のためのハイブリダイゼーション試薬として用いてもよい。核酸ハイブリダイゼーション試験の塩基成分は、プローブ、目的の遺伝子または遺伝子フラグメントを含有することが疑われるサンプル、および特定のハイブリダイゼーション方法を含む。技術は、マイクロアレイハイブリダイゼーションに用いられる技術に類似する。
【０１０８】
マイクロアレイデータに基づくプロモーター領域の同定
プロモーター領域は、一般に、遺伝子のコーディング領域の５’側に位置する。細菌ゲノムのプロモーター領域は、複数のＯＲＦからなるオペロンの最も５’側のＯＲＦであるコーディング領域に対して存在する。従って、コーディング領域のゲノムの位置を分析して、プロモーター領域が該特定のコーディング領域に対して５’側にあるかどうかを決定する。具体的には、コーディング領域の周囲（５’および３’側の両方）のＤＮＡ配列を、さらなるＯＲＦの存在について調べる。一般に、目的のＯＲＦの５’側および近接にＯＲＦが認められず、または次の５’ＯＲＦが対向配向である場合、目的のＯＲＦはその５’側および近接にプロモーターを有する。同じ配向および目的のＯＲＦの３’近接にさらなるＯＲＦが存在する場合、目的のＯＲＦはオペロンの最も５’側である。目的のそのようなＯＲＦに対する上流領域は、プロモーター領域として使用することができる。典型的に、オペロン内の最も５’のコーディング領域のＡＴＧ翻訳開始部位から約１００ｂｐ下流および４００〜５００ｂｐ上流を含有するＤＮＡ領域を使用して、十分なプロモーター活性を確実にする。ＡＴＧ翻訳開始部位の５’または３’のいずれか一方ほど遠位に延在しないより小さなフラグメントも十分機能的なプロモーター活性を有することができる。従って、プロモーター活性を保持する機能的に等価なサブフラグメントである本発明のプロモーター配列のサブフラグメントもまた、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）におけるキメラ遺伝子を発現させるのに有用であり、ここで本発明の１つの態様である。
【０１０９】
Ｃ１代謝細菌におけるキメラ遺伝子発現
本明細書において同定される誘導性遺伝子由来のプロモーター領域（配列番号３、６、９、１２、１５、および１８）は、生来の宿主細胞および異種宿主細胞、特にＣ１代謝細菌宿主の細胞において発現させようとするキメラ遺伝子の構築に利用してもよい。本明細書に記載のキメラ遺伝子は、本発明のプロモーターの１つから選択されるプロモーター、および好適なコーディング領域を含んでなる。組換えＣ１代謝細菌におけるキメラ遺伝子の発現は、細菌細胞の組成を変更するのに有用であり得る。キメラ遺伝子は、細菌の形質転換系および当業者に周知であるベクターを使用して、組換え細菌宿主を作製するのに使用される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では複製することができるが、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）では複製することができず、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）に伝達することができるプラスミドは、組込みのためのベクターとして使用することができる。組込みベクターを使用すると、キメラ遺伝子の発現は、それを細菌ゲノムへに組込んだ後に生じる。あるいは、本発明のプロモーターを好適なコーディング領域に操作可能に連結し、Ｃ１代謝細菌においてそれ自体を複製することが可能であるプラスミドにクローニングしてもよい。様々な細菌において複製することが可能である広範な宿主範囲のプラスミドもメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）において使用することができる。プラスミドは、ヘルパー細菌株を使用する接合によって、Ｃ１代謝細菌に伝達される。
【０１１０】
一旦、組換えＣ１代謝細菌が樹立されたら、使用するプロモーターに適切な誘導条件を適用すること（例えば、メタンまたはメタノール上での増殖、硝酸塩の添加、および／または温度もしくはｐＨの改変）によって、キメラ遺伝子の発現を達成することができる。当業者であれば、適切な誘導条件を決定することが容易にできるであろう。例えば、ｈｔｐＧプロモーター（例えば、配列番号１２）は、中温性Ｃ１代謝細菌（最適増殖温度が約２０〜４５℃として一般に許容された範囲内にある細菌）において、約４１〜４２℃の温度範囲の間で誘導させるようである。対照的に、好熱性細菌（約４５℃を超える最適増殖温度を有する）は、約４７〜５０℃の誘導温度を必要とするようである。同様に、ｎｒｔＡおよびｇｌｎＢ遺伝子（例えば、配列番号３または配列番号６）から誘導されるプロモーターを含んでなるキメラ遺伝子で形質転換されたＣ１代謝体は、硝酸塩の存在下でこの遺伝子を発現させることが可能である。典型的に、約５ｍＭ〜約１５ｍＭのレベルが適切であり、ここで、約１０ｍＭのレベルが好適である。本発明の別の局面では、ｇｌｙｏｘＩＩ遺伝子（例えば、配列番号９）から誘導されるプロモーター領域を含んでなるキメラ遺伝子を有するＣ１代謝体は、酸性ｐＨ、例えば、約５．５のレベルでこの遺伝子を発現させることが予想される。あるいは、ｈｐｓおよびｍｏｘＦ遺伝子から誘導されるプロモーター領域を含んでなるキメラ遺伝子を有するＣ１代謝体宿主細胞は、細胞を適切なレベルのメタノールおよび／もしくはメタン上で増殖させるか、または適切なレベルのメタノールおよび／もしくはメタンに暴露させる場合、これらの遺伝子を発現させることが予想される。
【０１１１】
適切なＣ１代謝細菌宿主細胞の形質転換に有用なベクターは、当該分野において周知である。典型的にベクターは、選択マーカー、および自己複製もしくは染色体組込みを可能にする配列を含有する。宿主細胞に導入しようとするキメラ遺伝子は、形質転換ベクターにクローニングしてもよい。キメラ遺伝子は、転写開始の制御を有するコーディング領域の５’側領域および転写の終了を制御するコーディング領域の３’側領域を含んでなる。両方の制御領域が形質転換された宿主細胞に相同な遺伝子に由来する場合が最も好ましいが、そのような制御領域は、産生宿主として選択される特定種に生来である遺伝子に由来する必要はない。
【０１１２】
所望の宿主細胞において、目的のコーディング領域の発現を駆動するのに有用であるプロモーターは、配列番号３、６、９、１２、１５、および１８のような本発明に記載のｎｒｔＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｙｏｘＩＩ、ｈｔｐｇ、ｍｏｘＦ、およびｈｐｓ遺伝子（配列番号１、４、７、１０、１３、および１６）の上流部分から誘導されるプロモーターから選択される。特定のプロモーターの選択は、所望される調節の方法（硝酸塩、温度、ｐＨ条件における誘導；またはメタンもしくはメタノール上での増殖）に依存する。プロモーター領域は、誘導性遺伝子およびそれらの相同物（表５、７、９、および１１を参照のこと）の配列から同定し、一般的方法（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、上掲）に従って単離することができる。一旦、プロモーター領域を同定および単離したら、適切な形質転換ベクターでそれぞれを目的のコーディング領域に操作可能に連結してもよい。
【０１１３】
終了制御領域もまた、好適な宿主に生来の様々な遺伝子由来であり得る。場合により、終了部位は必要ではないが、しかし、含まれている場合が最も好ましい。
【０１１４】
好適なＣ１代謝細菌宿主
本遺伝子の発現およびプロモーターフラグメントに好適な異種宿主細胞は、唯一のエネルギー源として単一炭素基質を使用することが可能であるＣ１代謝細菌である。様々な単一炭素基質を使用することが可能である多くのＣ１代謝微生物は、当該分野において公知である。本発明に有用な単一炭素基質としては、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、メチル化アミン（例えば、モノ−、ジ−、およびトリ−メチルアミン）、メチル化チオール、ならびに二酸化炭素が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
すべてのＣ１代謝微生物は、一般にメチロトロフに分類される。メチロトロフは、炭素−炭素結合を含有しない有機化合物を酸化することが可能な任意の生物体として規定することができる。条件的メチロトロフは、炭素−炭素結合を含有しない有機化合物を酸化する能力を有するが、エネルギーならびにバイオマスのために糖および複雑な炭水化物などの他の炭素基質を使用してもよい。絶対メチロトロフは、エネルギーの生成のために使用される有機化合物が炭素−炭素結合を含有しない有機化合物に限定されたメチロトロフである。最終的に、絶対メタノトロフ（メチロトロフのサブセット）は、メタンを酸化する特殊な能力を有する絶対メチロトロフ生物体である。
【０１１６】
条件的メチロトロフィック細菌は多くの環境で見出されるが、土壌、ごみ埋立地およびごみ処理施設から最も一般的に単離される。多くの条件的メチロトロフは、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）のβ、およびγ亜群のメンバーである（ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ）ら、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃ１  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．、［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］、第７回（１９９３）、２８５−３０２、編者：マレルＪ．コリン（Ｍｕｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ）；ケリー・ドン  Ｐ．（Ｋｅｌｌｙ，Ｄｏｎ  Ｐ．）、出版社：インターセプト、英国アンドーバー（Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）；マジガン（Ｍａｄｉｇａｎ）ら、Ｂｒｏｃｋ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、第８版、プレンティス・ホール（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ）、ニュージャージー州アッパーサドル（ＵｐｐｅｒＳａｄｄｌｅ  Ｒｉｖｅｒ，ＮＪ）（１９９７））。本発明に適切な条件的メチロトロフィック細菌としては、メチロフィラス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、メチロバチルス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ハイフォマイクロビウム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
メタンを利用するさらなる能力を有するメチロトロフをメタノトロフと呼ぶ。メタン利用体であるが、炭素−炭素結合を有さない有機化合物を使用することが要求されている絶対メタノトロフが本発明において興味深い。Ｃ１化合物を利用する絶対メタノトロフのこの分類に含まれるこれらの生物体の例として、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）属、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、メチロコッカス（Ｍｅｈｔｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）属、メチロサイティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｃｔｉｓ）属、メチロマイクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属、およびメタノモナス（Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ）属が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
エネルギー的に好ましい炭素フラックス経路を有する高増殖絶対メタノトロフは、本発明において特に興味深い。例えば、本出願人らは、炭素フラックス操作に特に有用となるいくつかの経路特徴を有するメタノトロフの特定の株を発見した（国際公開第０２／２０７２８号パンフレット）。エネルギー的に好ましい炭素フラックス経路を有するこの特定の株は、配列番号１〜１８を単離し、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａとして公知である（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ２４０２）宿主生物体としての役割を果たした。
【０１１９】
産業的産生
目的の適切なコーディング領域の発現が、産物の商業的産生のために（配列番号３、６、９、１２、１５、および１８）本発明の誘導性プロモーターの使用が望ましい場合、様々な培養方法論を適用することができる。例えば、組換え微生物宿主におけるキメラ遺伝子発現により可能にされた特定の産物の大規模産生は、バッチおよび連続培養方法論の両方によって達成することができる。
【０１２０】
古典的なバッチ培養方法は閉鎖系であり、ここで、培地の組成は培養の開始時に設定され、培養プロセス中に人工的に変更されることはない。従って、培養プロセスの開始時に、培地に所望の生物体または複数の生物体を接種し、増殖または代謝活動を可能にして、系には何も添加しない。しかし、典型的に、「バッチ」培養は、炭素源の添加についてのバッチ処理であり、しばしばｐＨおよび酸素濃度などの因子を制御することが試みられる。バッチ系では、系の代謝物およびバイオマス組成は、培養が終了する時点まで一定に変化する。バッチ培養細胞は静的対数期を穏やかに通過して高対数増殖期に達し、最終的に、増殖速度が減少または停止する定常期に達する。処理を行わなければ、定常期の細胞は最終的に死滅する。対数期の細胞は、しばしば、最終産物産生の大部分を担うかまたはいくつかの系において中間的である。定常または指数後期産生は他の系で得ることができる。
【０１２１】
標準的なバッチ系の１つのバリエーションは流加培養系である。流加培養プロセスも本発明に適切であり、培養の進行に伴って基質を徐々に増量しながら添加することを除いて、典型的なバッチ系を含んでなる。異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害し易い場合、および培地中の基質量を制限することを所望する場合、流加培養系は有用である。流加培養系における実際の基質濃度の測定は困難であるため、ｐＨ、溶存酸素およびＣＯ２などの排気体分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて見積もられる。バッチおよび流加培養方法は当該分野において一般的かつ周知であり、その例はトーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（１９８９）シナウエル・アソシエート社（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）またはデスパンデ・ムクンドＶ．（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．）、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６、２２７（１９９２）（本明細書において参考として援用される）に見出すことができる。
【０１２２】
本発明の方法論およびプロモーターを使用するＣ１代謝細菌における目的の産物の商業的産生は、連続培養によっても達成することができる。連続培養は開放系であり、規定された培養培地を連続的にバイオリアクターに添加し、同時に等量の順化培地を処理のために取り出す。一般に、連続培養は細胞を一定の高液体相密度で維持し、ここで、細胞は主に対数増殖期にある。あるいは、連続培養を固定化された細胞によって実施してもよく、ここで、炭素および栄養物が連続的に添加され、価値のある産物、副産物および不要産物が細胞塊から連続的に取り出される。細胞の固定化は、天然および／または合成材料からなる広範な固相支持体を使用して実施することができる。
【０１２３】
連続または半連続培養によって、細胞増殖または最終産物の濃度に影響を及ぼす１つの因子またはいくつかの因子を変調することが可能である。例えば、１つの方法は、炭素源などの制限されている栄養物または窒素レベルを一定速度で維持し、他のすべてのパラメータを中位にすることが可能である。他の系では、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼす多くの因子を連続的に変更することができる。連続系は定常状態の増殖条件を維持しようとし、従って、培地を取り出すことによって失われる細胞は培養物中の細胞増殖速度に対して均衡を保たなければならない。連続培養プロセスの栄養および増殖因子を変調するための方法ならびに生成物の形成速度を最大にするための技術は、産業微生物学の分野において周知であり、様々な方法がブロック（Ｂｒｏｃｋ）、上掲によって詳述されている。
【０１２４】
目的の適切なコーディング領域の調節された発現
特定の誘導条件下で、本発明のプロモーターを使用し、多様なＣ１代謝細菌におけるキメラ遺伝子の調節された発現を生じさせることができる。有用なキメラ遺伝子は、Ｃ１代謝細菌宿主において発現させようとする目的の適切なコーディング領域に操作可能に連結された本明細書で規定された誘導性遺伝子（配列番号１、４、７、１０、１３および１６）のいずれか１つのプロモーター領域を含む。これらのプロモーター領域は、配列番号３、６、９、１２、１５、および１８として規定される。メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｈｔｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロサイティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｃｔｉｓ）、メチロマイクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、およびメタノモナス（Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ）、メチロフィラス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、メチロバチルス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ハイフォマイクロビウム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）を含むが、これらに限定されないプロモーター領域に適合することが可能である任意の宿主が適切である。
【０１２５】
組換えＣ１代謝細菌宿主においてキメラ遺伝子として発現させようとする目的のコーディング領域は、宿主に対して内因性であってもまたは異種であってもよいが、宿主生物体に適合可能でなければならない。商業的価値のあるタンパク質をコードする配列は、発現に特に適切である。例えば、目的の適切なコーディング領域としては、ウイルス、細菌、菌・カビ、植物、昆虫または哺乳動物ポリペプチドを含む目的の脊椎動物のタンパク質をコードするコーディング領域を含むがそれらに限定されない。さらに、目的のこれらのコーディング領域は、例えば、構造タンパク質、酵素、またはペプチドであってもよい。特に好適であるが限定されないリストには、
１）トランスアルドラーゼ、フルクトース二リン酸アルドラーゼ、ケトデオキシホスホグルコン酸アルドラーゼ、ホスホグルコムターゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ、６−ホスホグルコン酸−６−リン酸−１デヒドロゲナーゼなどの中心炭素経路に関与する酵素のコーディング領域；
２）１−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼ（ｄｘｓ）、１−デオキシキシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ｄｘｒ）、ゲラニルトランスフェラーゼまたはファルネシル二リン酸シンターゼ（ｉｓｐＡ）、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシチジルトランスフェラーゼ（ｉｓｐＤ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチルエリスリトールキナーゼ（ｉｓｐＥ）、２Ｃ−メチル−ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼ（ｉｓｐＦ）、およびゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ｃｒｔＥ）などのイソプレノイド分子の産生に関与する酵素のコーディング領域；
３）アンテラキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、α−カロテン、β−カロテン、ε−カロテン、γ−カロテン、ζ−カロテン、α−クリプトキサンチン、ディアトキサンチン、７，８−ジデヒドロアスタキサンチン、フコキサンチン、フコキサンチノール、ラクツカキサンチン（ｌａｃｔｕｃａｘａｎｔｈｉｎ）、ルテイン、リコペン、ネオキサンチン、ニューロスポレン、ペリジニン、フィトエン、ロドピン、ロドピングルコシド、シホナキサンチン、スフェロイデン、スフェロイデノン、スピリロキサンチン、ウリオリド（ｕｒｉｏｌｉｄｅ）、酢酸ウリオリド（ｕｒｉｏｌｉｄｅ  ａｃｅｔａｔｅ）、ビオラキサンチン、およびゼアキサンチンなどのカロテノイドの産生を可能にするゼアキサンチングルコシルトランスフェラーゼ（ｃｒｔＸ）、リコペンシクラーゼ（ｃｒｔＹ）、フィトエンデヒドロゲナーゼ（ｃｒｔＩ）、フィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ）、β−カロテンヒドロキシラーゼ（ｃｒｔＺ）、フィトエンデサチュラーゼ（ｃｒｔＤ）、β−カロテンケトラーゼ（ｃｒｔＯ、ｃｒｔＷ）などのカロテノイド経路酵素のコーディング領域；
４）テロペノイドの産生のための環状テルペノイドシンターゼ（例えば、リモネンシンターゼ）などのコーディング領域；
５）ＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（ｕｇｐ）、グリコシルトランスフェラーゼ（ｇｕｍＤ）、多糖輸送タンパク質（ｗｚａ、ｅｓｐＢ）、多糖生合成（ｅｓｐＭ）、グリコシルトランスフェラーゼ（ｗａａＥ）、糖トランスフェラーゼ（ｅｓｐＶ）、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ｇｕｍＨ）、およびグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子などの細胞外多糖の産生に関与する酵素のコーディング領域；
６）３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロソン酸−７−リン酸シンターゼ（ａｒｏＧ）、３−デヒドロキナ酸シンターゼ（ａｒｏＢ）、３−デヒドロキナーゼ（３−ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｓｅ）または３デヒドロキナ酸デヒドラターゼ（ａｒｏＱ）、５−シキミ酸デヒドロゲナーゼ（ａｒｏＥ）、シキミ酸キナーゼ（ａｒｏＫ）、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ、コリスミ酸シンターゼ（ａｒｏＣ）、アントラニル酸シンターゼ（ｔｒｐＥ）、アントラニル酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｔｒｐＤ）、インドール３−グリセロールリン酸シンターゼ（ｔｒｐＣ）、トリプトファンシンターゼ（ｔｒｐＢ）、コリスミ酸ムターゼまたはプレフェン酸デヒドラターゼ（ｐｈｅＡ）、およびプレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡｃ）などの芳香族アミノ酸の産生に関与する酵素のコーディング領域；ならびに
７）ｐｄｓ、ｐｈａＣ、ｐｈａＥ、ｅｆｅ、ｐｄｃ、およびａｄｈ遺伝子ならびにピネンシンターゼ、ボルニルシンターゼ、フェランドレンシンターゼ、シネオールシンターゼ、サビネンシンターゼ、およびタキサジエンシンターゼをコードする遺伝子のコーディング領域、
が含まれる。
【実施例】
【０１２６】
本発明を以下の実施例でさらに規定する。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示している一方で、具体的説明のみとして示されることを理解すべきである。当業者であれば、上記の考察およびこれらの実施例から本発明に不可欠の特徴を確かめることが可能であり、また、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、それを多様な用途および条件に適合させるように本発明の多様な変更および改変をなすことが可能である。
【０１２７】
一般的方法
実施例において使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該分野において周知であり、サンブルックＪ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッシュＥ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティスＴ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９）（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））ならびにＴ．Ｊ．シルハビー（Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベンナン（Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ）、およびＬ．Ｗ．エンクイスト（Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８４）ならびにグリーン・パブリッシング・アソシエーション・アンド・ウィレイ−インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）から出版されたアウスベルＦ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）により記載されている。
【０１２８】
略語の意味は次のようである。「ｈｒ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｎＬ」はナノリットルを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｍＭ」はミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌｅ）を意味し、「μＭ」はマイクロモル（ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ）を意味し、「ＯＤ」は光学密度を意味する。
【０１２９】
分子生物学技術：
アガロースゲル電気泳動技術は、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）（上掲）に記載の通りに実施した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術は、ホワイトＢ．（Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．）、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第１５巻（１９９３）、ヒューマナ・プレス・社（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．）、ニュージャージー州トトワ（Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）において見出された。
【０１３０】
培地および培養条件：
細菌培養の維持および増殖に適切な一般的な材料ならびに方法は、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ジェフェリーＨ．ミラー（Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ｈ．  Ｍｉｌｌｅｒ））、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）（１９７２）；Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（フィリップ・ゲルハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マーレイ（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスティロー（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．  Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．  Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．  Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーク（Ｎｏｅｌ  Ｒ．  Ｋｒｉｅｇ）およびＧ．ブリックス・フィリップス（Ｇ．  Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編）、２１０−２１３頁、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、ワシントンＤＣ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．）またはトーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．  Ｂｒｏｃｋ）  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（１９８９）シノイヤー・アソシエーツ社（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）において見出された。細菌細胞の増殖および維持に使用したすべての試薬および材料は、特に断りがない限り、アルドリッヒケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，  ＷＩ））、ディフコラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｏｔｉｅｓ）（ミシガン州デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ，  ＭＩ））、ギブコ／ＢＲＬライフ・テクノロジーズ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（メリーランド州ゲイサーズバーク（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ））、またはシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ））より入手した。
【０１３１】
カロテノイド含有物のＨＰＬＣ分析
１分間ボルテックス撹拌し、次の３０分間、間欠的にボルテックス撹拌することによって、１ｍｌアセトンで細胞ペレットを抽出した。１４，０００×ｇで１０分間、遠心分離によって細胞破砕物を取り出し、上清を回収し、０．４５μＭフィルターを介して通過させた。メリーランド州コロンビアベックマン・ゴールド・ヌーボー・ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｇｏｌｄ  Ｎｏｕｖｅａｕ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｃｏｌｏｍｂｉａ，ＭＤ））と共にベックマン・システム・ゴールド（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ）（登録商標）ＨＰＬＣを研究のために使用した。粗抽出液（０．１ｍＬ）を、対応する保護カラムを有する１２５×４ｍｍ  ＲＰ８（５μｍ粒子）カラム（ヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）カリフォルニア州サンフェルナンド（Ｓａｎ  Ｆｅｒｎａｎｄｏ，ＣＡ））に充填した。流速は１ｍＬ／ｍｉｎである一方、使用した溶媒プログラムは０〜１１．５ｍｉｎ４０％水／６０％メタノール；１１．５〜２０ｍｉｎ１００％メタノール；２０〜３０ｍｉｎ４０％水／６０％メタノールであった。ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）フォトダイオードアレイ検出器（モデル１６８）によりスペクトルデータを回収した。
【０１３２】
実施例１
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａの増殖
実施例１では、国際公開第０２／２０７２８号パンフレットに記載のように、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａ（ＡＴＣＣ＃  ＰＴＡ−２４０２）の増殖に使用した標準的条件の概要を説明する。
【０１３３】
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）株および培養培地
他で条件を具体的に述べない限り、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａの処置のための実験的実施例を通して、以下に記載の増殖条件を使用した。
【０１３４】
少なくとも８：１の気体／液体比（即ち、１６０ｍＬの全容積中２０ｍＬの硝酸液体「ＢＴＺ−３」培地）を使用して、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａを血清ストッパ付ウィートン（Ｗｈｅａｔｏｎ）ボトル（ウィートン・サイエンティフィック（Ｗｈｅａｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、イリノイ州ウィートン（Ｗｈｅａｔｏｎ，ＩＬ））中で培養した。培養のための標準気相は空気中２５％メタンを含有したが、メタン濃度は培養頭隙の容積によって約５〜５０％の範囲で変動し得た。これらの条件は増殖条件を含んでなり、細胞を増殖細胞と称する。あらゆる場合において、培養物は、他に示さない限り、ラブ・ライン（Ｌａｂ−Ｌｉｎｅ）回転振盪機中一定の振盪により３０℃で増殖させた。
【０１３５】
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａのための硝酸培地
鉱物塩のみからなる規定培地中でメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａを増殖させた；酵母抽出物またはビタミンなどの有機添加物は増殖を達成するのに必要ではなかった。本明細書において「硝酸液体培地」、または「ＢＴＺ−３」培地と称されるこの規定培地は、以下（表２および表３）に示す溶液１と混合された多様な塩からなるか、または特定する場合、硝酸塩を１５ｍＭ塩化アンモニウムで置き換えた。溶液１は微量の鉱物の１００倍濃縮ストック溶液の組成を提供する。
【０１３６】
【表３】
2006515166.tif 000004
【０１３７】
【表４】
2006515166.tif 000005
【０１３８】
微生物増殖の評価および細胞を回収するための条件
最大光学密度まで増殖させた細胞は約１．０のＯＤ６６０を有した。サーバル（Ｓｏｒｖａｌ）ＲＣ−５Ｂ遠心分離機中で、６０００ｒｐｍで２０分間ＳＳ−３４ローターを使用して、遠心分離により細胞を回収した。細胞ペレットを５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７中に再懸濁した。これらの細胞懸濁液を洗浄した休止細胞と呼ぶ。
【０１３９】
微生物の増殖は、１ｃｍ光路キュベットを使用し、ウルトロスペック（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ）２０００  ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計（ファルマシア・バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、英国ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ））中６６０ｎｍで光学密度を測定することによって、評価した。あるいは、上記のように遠心分離により培養培地から細胞を回収し、蒸留水中に細胞を再懸濁し、２回目の遠心分離で培地の塩を除去することによって、微生物の増殖を評価した。次いで、洗浄した細胞を、乾燥重量決定のために乾燥オーブン中、１０５℃で１晩乾燥した。
【０１４０】
実施例２
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ゲノムのＤＮＡマイクロアレイの構築
実施例２では、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ゲノムのＤＮＡマイクロアレイを作製するのに必要な複数工程手順を説明する。このアレイは、３７５０ＯＲＦを含んでなり、生物体の全ゲノムの約９３％を提示した。また、プローブを調製し、プローブをマイクロアレイにハイブリダイズさせ、生じたデータを回収する手順についても説明する。
【０１４１】
ＤＮＡマイクロアレイの構築のためのＤＮＡ領域の増幅
ＰＣＲ反応では、特異的プライマー対を使用して、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａのＯＲＦをコードする各タンパク質のＤＮＡを増幅した。プライマーは、当業者に周知の方法により各ＯＲＦの５’および３’配列に基づいて指名した。ゲノムＤＮＡ（１０〜３０ｎｇ）をテンプレートとして使用した。ファストＤＮＡキット（Ｆａｓｔ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ）（バイオ（Ｂｉｏ）１０、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を使用して、ゲノムＤＮＡを調製した。ＰＣＲ反応は、ホットスタート・タック（ＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ）ＴＭＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））およびｄＮＴＰ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ）の存在下で実施した。９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリングおよび７２℃で２分間のポリマー化の３５サイクルを行った。１％アガロースゲル上での電気泳動後、ＰＣＲ産物を可視化した。ＰＣＲ増幅ＤＮＡサンプルを、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）（カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））製高スループットＰＣＲ精製キットによって精製した。
【０１４２】
増幅されたＯＲＦの整列
整列の前に、等容量のＤＭＳＯ（１０μＬ）およびＤＮＡ（１０μＬ；約５０ｎｇ／μＬ）の各サンプルを３８４ウェルマイクロタイタープレート内で混合した。ジェネレーションＩＩ  ＤＮＡスポッター（モレキュラー・ダイナミクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）、カリフォルニア州サニーベール（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ））を使用して、コートされたガラススライド（テレケム（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ）、カリフォルニア州サニーベール（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ））上でサンプルを整列した。それぞれのＰＣＲ産物を２回繰り返してそれぞれのスライドに整列した。ＵＶ光による架橋後、使用するまでスライドを減圧下、デシケーター中、室温で貯蔵した。
【０１４３】
ＲＮＡの単離：
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａを、窒素源としてアンモニウムまたは硝酸塩（１０ｍＭ）を有する窒素液体培地中、実施例１に記載のように空気中２５％メタン下で培養した。ＯＤ６６０が０．３（指数期）に達するとき培養物のサンプル（典型的に２０ｍＬ）を回収した。細胞培養物を迅速に回収し、ビーズ−ビーター（バイオ（Ｂｉｏ）１０１、カリフォルニア州ビスタ（Ｖｉｓｔａ，ＣＡ））を伴うＲＬＴ緩衝液（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＮｅａｓｙミニ・キット（Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ）、カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））中で破砕した。破砕物を、３分間、１４，０００×ｇ、４℃での遠心分離によりペレット化した。ＲＮＡの単離は、このキットより供給されているプロトコルを使用して完了した。カラム上でのＤＮＡアーゼ処理後、５０〜１００μＬのＲＮＡアーゼ−フリー蒸留水でＲＮＡ産物を溶出させた。ＲＮＡ調製物を−２０℃または−８０℃のいずれかで貯蔵した。
【０１４４】
全ＲＮＡ由来の蛍光ｃＤＮＡの合成
ＲＮＡサンプル（７〜１５μｇ）およびランダムヘキサマープライマー（６μｇ；ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ）を混合してＲＮＡアーゼを含まない水で、容積を２５μＬとした。サンプルを７０℃で１０分間変性し、次いで、氷上で３０秒間冷却した。１４μＬの標識混合物を添加した後、室温で１０分間のインキュベーションによって、アニーリングを達成した。標識混合物は、８μＬの５×酵素緩衝液、４μＬ  ＤＴＴ（０．１Ｍ）、および２μＬの２０×色素混合物を含有した。色素混合物は、２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、１ｍＭ  ｄＣＴＰ、ならびに１ｍＭのＣｙ３−ｄＣＴＰまたはＣｙ５−ｄＣＴＰからなる。１〜１．５μＬのスーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）ＩＩ逆転写酵素（２００単位／ｍＬ、ライフ・テクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）、メリーランド州ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））を添加後、ｃＤＮＡの合成を４２℃で２時間進行させた。２μＬのＮａＯＨ（２．５Ｎ）を反応物に添加することによりＲＮＡを除去した。３７℃で１０分間のインキュベーション後、１０μＬのＨＥＰＥＳ（２Ｍ）でｐＨを調整した。次いで、標識したｃＤＮＡをＰＣＲ精製キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））で精製した。Ｃｙ３取り込みに対するＡ５５０またはＣｙ５に対するＡ６５０のいずれかを使用して、標識効率をモニターした。
【０１４５】
ゲノムＤＮＡの蛍光標識
先に記載されたように調製されたメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａゲノムＤＮＡをネブライザー処理して約２ｋｂ対のフラグメントにした。フラグメント化したゲノムＤＮＡ（０．５〜１μｇ）を１５μＬの水中で６μｇのランダムヘキサマー（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ）のプライマーと混合した。混合物を沸騰水に５分間置くことによって変性させた。次いで、室温に移す前に氷上で３０秒間アニーリングする。続いて、２μＬの５×緩衝液２（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ）および２μｌの色素混合物を添加した。色素混合物の成分および標識手順は、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント（５μｇ／μＬ、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ）を酵素として使用したことを除いて、ＲＮＡ標識について先に記載されている通りである。３７℃で２時間のインキュベーション後、標識したＤＮＡプローブをＰＣＲ精製キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））で精製した。
【０１４６】
ハイブリダイゼーションおよび洗浄
最初に、スライドを、３．５×ＳＳＣ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ）、０．１％ＳＤＳ、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、画分（Ｆｒａｃｔｉｏｎ）Ｖ、シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含有するプレハイブリダイゼーション溶液と共に、３０分間、３７℃でインキュベートした。プレハイブリダイゼーション後、以下の実施例に記載の標識したプローブを組み入れた１００ピコモルの色素（Ｃｙ３またはＣｙ５）を含有するハイブリダイゼーション溶液（モレキュラー・ダイナミクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）、カリフォルニア州サニーベール（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ））をスライドに添加し、カバースリップを被せた。スライドは、４２℃インキュベーター中の加湿チャンバ内に置いた。１晩のインキュベーション後、最初にスライドを、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含有する溶液により５分間、室温で洗浄した。次いで、同溶液で、６５℃で１０分間、３回洗浄した。洗浄後、スライドを蒸留水で迅速に濯ぎ、窒素気体のスチームで乾燥した。
【０１４７】
データの回収および分析
レーザースキャナ（モレキュラー・ダイナミクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）、カリフォルニア州サニーベール（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ））により、各スライドから発生したシグナルを定量した。画像は、アレイビジョン（ＡｒｒａｙＶｉｓｉｏｎ）４．０ソフトウェア（イメージング・リサーチ社（Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｉｎｃ．）、カナダ、オンタリオ（Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ））により分析した。各スポットの生蛍光強度は、バックグランドを差し引くことによって調整した。これらの読み取り値はさらなる分析のためにスプレッドシートにエキスポートした。
【０１４８】
実施例３
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）における硝酸誘導性ＤＮＡ領域の同定
実施例２に記載の方法に従って調製したメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ＤＮＡマイクロアレイを使用して、本出願人らは、２つの硝酸誘導性遺伝子を同定した。これらの遺伝子のプロモーターは、硝酸塩に応答して、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）および他のＣ１代謝細菌におけるキメラ遺伝子発現を指令するために用いることができる。本実施例では、これらの硝酸誘導性遺伝子およびそれらの推定プロモーター領域の同定について説明する。
【０１４９】
具体的には、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａを、３０℃で、窒素源として１０ｍＭ塩化アンモニウムまたは１０ｍＭ硝酸ナトリウムのいずれか一方を伴うＢＴＺ−３培地中で増殖させた。指数期（ＯＤ６６０＝０．３）の培養物（典型的に２０ｍｌ）をＲＮＡ単離のために回収した。全ＲＮＡを単離し、蛍光色素で標識し、実施例２に記載のようにマイクロアレイ上でプローブとして使用した。硝酸塩の存在下で特異的に誘導される遺伝子を同定するために、これら２つの増殖条件由来のＲＮＡサンプルから作製したプローブを使用するマイクロアレイハイブリダイゼーション実験を比較した。硝酸塩およびアンモニアサンプル間の各遺伝子に対するスポット強度の比を使用して、硝酸塩の存在下で誘導された２つの遺伝子を同定した（表４）。
【０１５０】
【表５】
2006515166.tif 000006
【０１５１】
表５は、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａから発見された硝酸誘導性遺伝子の説明である。より具体的には、表５は、これらの遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と当該分野において既知の配列との関係を例示する。ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（全部の非冗長ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ＣＤＳ翻訳、三次元構造ブルックヘイブンタンパク質データバンク（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）由来の配列、スイスプロット（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）タンパク質配列データベース、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪデータベースを含んでなる）中に含有される配列に対する類似性についてＢＬＡＳＴ（基本的局所アライメント整列検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）；アルトシュールＳ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９３）検索を行うことによって、すべての配列を比較した。硝酸誘導性遺伝子ＤＮＡ配列を全部のリーディングフレームで翻訳し、そして、ＮＣＢＩにより提供されるＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（ギシュＷ．（Ｇｉｓｈ，Ｗ．）およびステイツＤ．Ｊ．（Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３：２６６−２７２（１９９３））を使用して、「ｎｒ」データベース中に含有される公的に利用可能な全部のタンパク質配列に対する類似性について比較した。ＢＬＡＳＴＸ比較の結果を以下の表５に示し、これは、誘導性遺伝子によってコードされるアミノ酸配列が最も高い同一性および類似性を有する既知のタンパク質配列を表す。予想値は、このサイズのデータベースの検索において偶然に予想される一致数を所定のスコアで特定し、一致の統計的有意性を推定する。
【０１５２】
【表６】
2006515166.tif 000007
【０１５３】
これらの硝酸誘導性遺伝子の同定後、各遺伝子のコーディング領域ＡＴＧ開始部位周辺のゲノムＤＮＡ配列をＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（アルトシュールＳ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：３３８９−３４０（１９９７））により分析し、近接の他のＯＲＦを同定した。いずれか一方のコーディング領域の上流に位置する同じ配向のＯＲＦは認められないことが決定され、各コーディング領域はオペロンの内側（ｉｔｅｒｎａｌ）には存在せず、従って、各遺伝子はプロモーター領域を含むことが示された。ｎｒｔＡ遺伝子については、ＡＴＧ開始部位（ヌクレオチドのＡＴＧ＝配列番号１の１）の４０８塩基上流からＡＴＧ開始部位の１４３塩基下流に渡るヌクレオチド領域を、プロモーター領域を含有するのに十分であるとして選択した。ＤＮＡのこの領域を配列番号３として提供する。
【０１５４】
窒素調節ＰＩＩ−タンパク質（ｇｌｎＢ）遺伝子については、ＡＴＧ開始部位（ヌクレオチドのＡＴＧ＝配列番号４の１）の４４４塩基上流からＡＴＧ開始部位の１０７塩基下流に渡るヌクレオチド領域を、プロモーター領域を含有するのに十分であるとして選択した。ＤＮＡのこの領域を配列番号６として提供する。
【０１５５】
実施例４
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）におけるｐＨ誘導性ＤＮＡ領域の同定
実施例２に記載の方法に従って調製したメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ＤＮＡマイクロアレイを使用して、本出願人らは、１つのｐＨ誘導性遺伝子を同定した。この遺伝子のプロモーターは、低ｐＨに応答して、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）および他のＣ１代謝細菌におけるキメラ遺伝子発現を指令するために用いることができる。本実施例では、グリオキサラーゼＩＩをコードする遺伝子およびその推定プロモーター領域の同定について説明する。
【０１５６】
具体的には、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａを、３０℃で、硝酸塩を伴わず、５ｍＭ塩化アンモニウムを伴うＢＴＺ−３培地中で増殖させた。細胞密度が指数期（ＯＤ６６０＝０．３）に達したら、ＨＣｌで培養物のｐＨを５．５に調整した。４５分間の処置後、培養物を回収し、全ＲＮＡを単離し、蛍光色素で標識し、実施例２に記載のようにマイクロアレイ上でプローブとして使用した。ｐＨを低下させることによって誘導される遺伝子を同定するために、処置（ｐＨ５．５）および非処置（ｐＨ７．０）の培養物から調製したＲＮＡサンプルから作製したプローブを使用するマイクロアレイハイブリダイゼーション実験を比較した。処置および非処置サンプル間の各遺伝子に対するスポット強度の比を使用して、ｐＨの変化に応答して誘導された遺伝子を同定した（表６）。
【０１５７】
【表７】
2006515166.tif 000008
【０１５８】
表７は、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａから発見されたｐＨ誘導性遺伝子の説明である。より具体的には、表７は、この遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と当該分野において既知の配列との関係を例示する。実施例３に記載のように、ＢＬＡＳＴ検索を行うことによって、配列を分析した。
【０１５９】
【表８】
2006515166.tif 000009
【０１６０】
このｐＨ誘導性遺伝子の同定後、コーディング領域ＡＴＧ開始部位周辺のゲノムＤＮＡ配列をＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（アルトシュールＳ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０（１９９７））により分析し、近接の他のＯＲＦを同定した。このコーディング領域の上流に位置する同じ配向のＯＲＦは認められないことが決定され、プロモーター領域がこのＯＲＦの上流に位置することが示された。従って、ＡＴＧ開始部位（ヌクレオチドのＡＴＧ＝配列番号７の１）の−４２３塩基上流からＡＴＧ開始部位の１５６塩基下流に渡るヌクレオチド領域を、プロモーター領域を含有するのに十分であるとして選択した。ＤＮＡのこの領域を配列番号９として提供する。
【０１６１】
実施例５
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）における温度誘導性ＤＮＡ領域の同定
実施例２に記載の方法に従って調製したメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ＤＮＡマイクロアレイを使用して、本出願人らは、１つの温度誘導性遺伝子を同定した。この遺伝子のプロモーターは、誘導条件として温度が改変される場合、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）および他のＣ１代謝細菌におけるキメラ遺伝子発現を指令するために用いることができる。本実施例では、ｈｔｐｇおよびその推定プロモーター領域の同定について説明する。
【０１６２】
具体的には、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａを、３０℃で、５ｍＭ塩化アンモニウムを伴うＢＴＺ−３培地中で増殖させた。細胞密度が指数期（ＯＤ６６０＝０．３）に達したら、培養物の温度を４２℃に移行させた。４５分間の処置後、培養物を回収し、全ＲＮＡを単離し、蛍光色素で標識し、実施例２に記載のようにマイクロアレイ上でプローブとして使用した。温度を上昇させることによって誘導される遺伝子を同定するために、処置および非処置の培養物由来のＲＮＡサンプルから作製したプローブを使用するマイクロアレイハイブリダイゼーション実験を比較した。処置および非処置サンプル間の各遺伝子に対するスポット強度の比を使用して、より高い温度で誘導された遺伝子を同定した（表８）。
【０１６３】
【表９】
2006515166.tif 000010
【０１６４】
表９は、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａから発見された温度誘導性遺伝子の説明である。より具体的には、表９は、この遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と当該分野において既知の配列との関係を例示する。実施例３に記載のように、ＢＬＡＳＴＸ検索を行うことによって、配列を分析した。
【０１６５】
【表１０】
2006515166.tif 000011
【０１６６】
この温度誘導性遺伝子の同定後、コーディング領域ＡＴＧ開始部位周辺のゲノムＤＮＡ配列をＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（アルトシュールＳ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：３３８９−３４０（１９９７））により分析し、近接の他のＯＲＦを同定した。コーディング領域の上流に位置する同じ配向のＯＲＦは認められないことが決定され、コーディング領域はオペロンの内側には存在せず、従って、遺伝子はプロモーター領域を含むことが示された。ＡＴＧ開始部位（ヌクレオチドのＡＴＧ＝配列番号１０の１）の５４０塩基上流からＡＴＧ開始部位の１１０塩基下流に渡るヌクレオチド領域を、プロモーター領域を含有するのに十分であるとして選択した。ＤＮＡのこの領域を配列番号１２として提供する。
【０１６７】
実施例６
メタンおよびメタノールをメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）における炭素源として使用した場合に構成的に発現された遺伝子の同定
実施例２に記載の方法に従って調製したメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ＤＮＡマイクロアレイを使用して、本出願人らは、メタンおよびメタノール誘導性遺伝子を同定した。これらの遺伝子のプロモーターは、培養物がメタンおよび／またはメタノールの存在下で増殖される場合、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）および他のＣ１代謝細菌におけるキメラ遺伝子発現を指令するために用いることができる。本実施例では、メタンおよびメタノール上で増殖される場合に高度に発現される遺伝子ならびにその推定プロモーター領域の同定について説明する。
【０１６８】
これらの遺伝子の同定では、遺伝子発現レベルを推定するＤＮＡマイクロアレイ実験の能力を利用する。メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａを、空気中２５％メタンまたは８０ｍＭメタノールを伴うＢＴＺ−３培地中で増殖させた。指数期の培養物を回収し、ＲＮＡを単離し、各サンプルをＣｙ５蛍光色素で標識した。メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａゲノムＤＮＡを、実施例２に記載のようにＣｙ３色素で標識した。ゲノムＤＮＡプローブを、各ＲＮＡ由来のプローブと個別に組み合わせた。２つの混合したプローブサンプルを個別のスライドにハイブリダイズさせた。定量後、ＲＮＡ（Ｃｙ５）とＤＮＡプローブ（Ｃｙ３）との間の比を、２つのマイクロアレイ上の各スポットについて算出した。ウェイ  Ｙ．（Ｗｅｉ  Ｙ．）ら、（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３（２）：５４５−５６（２００１））に記載のように、すべての比の合計で割った個々の遺伝子の比に基づいて、各遺伝子に対するｍＲＮＡ存在量を推定した。続いて、各遺伝子の発現レベルを、そのｍＲＮＡ存在量に従って格付けした。メタンまたはメタノール上で増殖させた場合に高レベルの発現を伴う２つの遺伝子を同定した（表１０）。メタノール代謝に関与するｍｏｘＦ遺伝子は、メタン上で増殖した場合３番に格付けし、メタノール上で増殖した場合２２番に格付けした。ｈｐｓ遺伝子は、メタン上で増殖した場合１４番に格付けし、メタノール上で増殖した場合５７番に格付けした。
【０１６９】
【表１１】
2006515166.tif 000012
【０１７０】
表１１は、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａから発見されたこれらの２つの遺伝子のより詳細な説明である。より具体的には、表１１は、これらの遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と当該分野において既知のタンパク質配列との関係を例示する。実施例３に記載のように、ＢＬＡＳＴＸ検索を行って、すべての配列を分析した。
【０１７１】
【表１２】
2006515166.tif 000013
【０１７２】
これらの遺伝子の同定後、各遺伝子のコーディング領域ＡＴＧ開始部位周辺のゲノムＤＮＡ配列をＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（アルトシュールＳ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：３３８９−３４０（１９９７））により分析し、近接の他のＯＲＦを同定した。各コーディング領域の上流に位置する同じ配向のＯＲＦは認められないことが決定され、それらはオペロンの内側には存在せず、従って、遺伝子はプロモーター領域を含むことが示された。ｍｏｘＦ遺伝子については、ＡＴＧ開始部位（ヌクレオチドのＡＴＧ＝配列番号１３の１）の５００塩基上流からＡＴＧ開始部位の１９６塩基下流に渡るヌクレオチド領域を、プロモーター領域を含有するのに十分であるとして選択した。ＤＮＡのこの領域を配列番号１５として提供する。
【０１７３】
ｈｐｓ遺伝子については、ＡＴＧ開始部位（ヌクレオチドのＡＴＧ＝配列番号１６の１）の５２０塩基上流からＡＴＧ開始部位に渡るヌクレオチド領域を、プロモーター領域を含有するのに十分であるとして選択した。ＤＮＡのこの領域を配列番号１８として提供する。
【０１７４】
実施例７
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）においてマーカー遺伝子を発現することによるｍｏｘＦプロモーターの活性の証明
ｍｏｘＦ遺伝子に対して選択されたプロモーター配列のプロモーター活性を示すために、プロモーターを使用して、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）レポーター遺伝子を発現させた。標準的なＰＣＲ手順により、プライマー対：
［配列番号１９］５’−ＣＡＧＧＡＴＣＣＧＣＧＣＣＧＴＡＴＧＣＴＴＴＣＧＡＡＴＣＣＧＣＣ−３’
［配列番号２０］５’−ＣＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＣＴＧＴＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＴＧＴＴＣ−３’
を使用して、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａゲノムＤＮＡからプロモーターフラグメントを増幅した。
【０１７５】
増幅したプロモーターフラグメントをＢａｍＨＩで消化し、ＢａｍＨＩ消化ｐＴＪＳ７５ＬａｃＺＫａｍに連結させた。プラスミドｐＴＪＳ７５ＬａｃＺＫａｍは、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）コーディング領域を付加しているｐＴＪＳ７５ベクター（シュミットハウザー（Ｓｃｈｍｉｄｈａｕｓｅｒ）およびヘリンスキー（Ｈｅｌｉｎｓｋｉ）、第１６４巻、Ｎｏ．１、４６〜４５５頁（１９８５））である（図１）。プラスミドｐＴＪＳ７５は、ＩｎｃＰ群に属する広範な宿主範囲のプラスミドである。得られるプラスミドをメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａに伝達し、プラスミドを含有するコロニーをｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−３−インドイル−β−ｄ−ガラクトピラノシド）を含有するＬＢプレート上で増幅させた。コロニーの目視観察により、いくつかは青色を呈することが認められ、ｘ−ｇａｌ基質がβ−ガラクトシダーゼ酵素によってインジゴ誘導体に変換されたことを示した。これらのコロニー由来のプラスミドＤＮＡを制限酵素消化により分析したところ、ｍｏｘＦプロモーターフラグメントは、ｌａｃＺコーディング領域の方へ配向していることが示された。従って、β−ガラクトシダーゼ酵素が発現され、ｍｏｘＦプロモーター領域のフラグメントはメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａにおいてプロモーター活性を有することが示された。
【０１７６】
実施例８
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａおよび大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）において外来遺伝子発現を駆動するためのｈｐｓプロモーターの使用
実施例８では、ｈｐｓプロモーターがメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において外来遺伝子発現を駆動するのに有用であることを実証する。このことを、ゲノムＤＮＡからｈｍｐｓプロモーターフラグメントを増幅させ、ｃｒｔＺ遺伝子の発現がｈｐｓプロモーターによって駆動されるように、カロテノイド遺伝子クラスターｃｒｔＥＸＹＩＢＺを含有するプラスミドにプロモーターをクローニングし、このプラスミドを大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）に形質転換し、次いで、ゼアキサンチングルコシドの存在を検出することによって、試験した。細菌接合を介するプラスミドのメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａへの形質転換によっても、ゼアキサンチングルコシドが検出された。β−カロテンヒドロキシラーゼをコードするｃｒｔＺ遺伝子はβ−カロテンからゼアキサンチンへのヒドロキシル化を触媒するため、ゼアキサンチングルコシドの検出によりｃｒｔＺのキメラ遺伝子発現を駆動するｈｐｓプロモーターの能力が確認された。
【０１７７】
ｈｐｓプロモーターの増幅
ＰＣＲにおいて以下のプライマー：
［配列番号２１］５’−ＣＣＣＡＴＧＧＧＴＴＣＧＧＡＡＴＣＣＣＴＧＡ−３’
［配列番号２２］５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＡＧ−３’
を使用し、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａゲノムＤＮＡから、ｈｐｓプロモーターを含有する５００ｂｐのＤＮＡフラグメント（配列番号１８）を増幅した。
【０１７８】
熱サイクル条件は、９４℃で３０秒間、６１℃で３０秒間および７２℃で２分間の３０サイクル、続いて、７２℃で５分間の最終伸張とした。キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＰＣＲ精製キットを使用して、５００ｂｐ  ＰＣＲ産物を精製し、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで１時間、３７℃で消化し、次いで、１％（Ｗ／Ｖ）アガロース中ゲル電気泳動後に精製した。ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ消化ＰＣＲ産物をＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ消化ｐＢＨＲ１（モビテック（ＭｏＢｉＴｅｃ）ＬＬＣ、フロリダ州マルコ・アイランド（Ｍａｒｃｏ  Ｉｓｌａｎｄ，ＦＬ））に連結し、連結したＤＮＡを使用して、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＤＨ５αを形質転換した。形質転換体を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ寒天上で選択した。制限酵素消化およびゲル電気泳動による１つの形質転換体由来のプラスミドＤＮＡの分析により、ｐＨＰＳと命名されるプラスミドの存在を確認した（図２）。
【０１７９】
パントエア・ストウェルティ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｔｗｅａｒｔｉｉ）由来のｃｒｔＥＸＹＩＢＺ遺伝子クラスターを、ｐＣＲＴ１由来の６２５５ｂｐＥｃｏＲＩフラグメント上で得た（国際公開第０２／１８６１７号パンフレット）。この遺伝子クラスターでは、ｃｒｔＺコーディング領域は、クラスター内の他のコーディング領域に対して対抗する配向にあり、個別のプロモーターから転写されなければならない。ｃｒｔＥＸＹＩＢＺコーディング領域を含有する６２５５ｂｐＥｃｏＲＩフラグメントを、ＥｃｏＲＩで消化し、仔ウシ小腸由来アルカリホスファターゼで脱リン酸化したｐＨＰＳに連結した（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ）。連結したＤＮＡを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αを形質転換した。形質転換体を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ寒天上で選択した。黄色のコロニー色を実証した１つの形質転換体由来の制限酵素消化したプラスミドＤＮＡの分析により、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター（ＣＡＴプロモーター）が、ｐＣＲＴ１８と命名されたｃｒｔＥＸＹＩＢコーディング領域に隣接するように、配向したＥｃｏＲＩフラグメントを伴うプラスミドの存在を確認した（図２Ｂ）。黄色は、カロテノイドが産生されていたことを示した。ｐＣＲＴ１８では、β−カロテンヒドロキシラーゼをコードするｃｒｔＺ遺伝子の発現は、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ  ｈｐｓプロモーターから指令される（図２Ｂ）。ｃｒｔＺ遺伝子が発現される場合、ゼアキサンチングルコシドはｃｒｔＺによってコードされるβ−カロテンヒドロキシラーゼ活性によってβ−カロテンから誘導されるため、ゼアキサンチングルコシドを合成するためのｐＣＲＴ１８を含有する接合伝達体（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ）が予想される。
【０１８０】
一般的方法において記載のように、このコロニーの細胞を増殖させ、ＨＰＬＣにより分析した。ＨＰＬＣ分析は、ゼアキサンチンのモノ−およびジグルコシドについて予想されるプロファイル（約１３．５分の保持時間を有するゼアキサンチンよりも早く溶出する）と一致する１０．７６７〜１１．３００で溶出したピークを示した。従って、ｐＣＲＴ１８を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてゼアキサンチングルコシドが観察され、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ  ｈｐｓプロモーターが、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）以外の細菌宿主において異種遺伝子発現を指令したことを示した。
【０１８１】
プラスミドｐＣＲＴ１８を、三親接合交配によってメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａに伝達した。ｐＲＫ２０１３を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ヘルパー株およびｐＣＲＴ１８を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αドナー株を、それぞれカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を有するＬＢ培地中で１晩増殖させ、ＬＢ中で３回洗浄し、本来の培養容量の約６０倍濃度を示す１容量のＬＢに再懸濁した。メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａレシピエントを、２５％（ｖ／ｖ）メタンを含有する大気中硝酸液体「ＢＴＺ−３」培地中で４８時間増殖させ、ＢＴＺ−３中で３回洗浄し、本来の培養容量の１５０倍を示す１容量のＢＴＺ−３に再懸濁した。ドナー、ヘルパー、およびレシピエント細胞ペーストを、それぞれ１：１：２の割合で０．５％（ｗ／ｖ）酵母抽出物を含有するＢＴＺ−３寒天プレートの表面上に組み合わせた。プレートを、３０℃で、１６〜７２時間、２５％メタンに維持し、接合を生じさせた。細胞ペーストを回収し、ＢＴＺ−３に再懸濁した。希釈物を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＢＴＺ−３寒天上にプレート化し、３０℃で、２５％メタン中、１週間までインキュベートした。接合伝達体を、単離のためにカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＢＴＺ−３寒天上に画線した。制限酵素消化によりこれらの接合伝達体から単離されたプラスミドＤＮＡの分析により、ｐＣＲＴ１８の存在を確認した。
【０１８２】
カロテノイド組成の分析のために、接合伝達体を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含む２５ｍｌのＢＴＺ−３中で培養し、唯一の炭素源として１週間まで２５％メタン中３０℃でインキュベートした。細胞を遠心分離により回収し、−２０℃で凍結した。解凍後、ペレットを抽出し、上記の一般的方法の方法論に従ってＨＰＬＣによりカロテノイド含有物を分析した。ｐＣＲＴ１８を含有するメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ由来の抽出物のＨＰＬＣ分析により、ゼアキサンチングルコシドの合成が確認された（図２Ｃ）。具体的には、ピークは、ゼアキサンチンのモノ−およびジグルコシドについて予想されるプロファイル（約１３．５分の保持時間を有するゼアキサンチンよりも早く溶出する）と一致する１０．７６７〜１１．３００で溶出した。
【０１８３】
ｐＣＲＴ１８と同じであるが、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ  ｈｐｓプロモーターを欠くｃｒｔＥＸＹＩＢＺ遺伝子クラスターを含有するプラスミドｐＣＲＴ１は、単に、β−カロテンを産生する能力をメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａに付与しただけであるため（国際公開第０２／１８６１７号パンフレット）、ｐＣＲＴ１８を含有するメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａにおけるゼアキサンチングルコシドの出現により、ｈｐｓプロモーターからｃｒｔＺが発現されたことをが確認された。
【０１８４】
ゼアキサンチングルコシドの形成を除去するために、ゼアキサンチングルコシル−トランスフェラーゼをコードするｃｒｔＸ遺伝子をｐＣＲＴ１８から欠失させた。ｐＣＲＴ１８の５１４９ｂｐのＥｃｏＲＶ（１１０７位）／ＥｃｏＲＩ（６２５６位）フラグメントを、ｃｒｔＸ遺伝子を欠失させた３８７０ｂｐのＥｃｏＲＶ（１１０７位）／ＥｃｏＲＩ（４９７７位）フラグメントで置き換えた。ＰＣＲ−媒介重複伸張を使用して、３段階のＰＣＲ工程でｃｒｔＥＸＹＩＢＺ遺伝子クラスターからｃｒｔＸ遺伝子を欠失した。最初の２つの反応のテンプレートＤＮＡは、プロモーターを伴わない完全ｃｒｔＥＸＹＩＢＺ遺伝子クラスターを含有するｐＣＲＴ２と命名されたプラスミドであった。第１に、プライマーＴＲＣｃｒｔＥＦおよびＣｒｔＹＥＲ（配列番号２３、２４）でｃｒｔＥコーディング領域を増幅させ、逆方向プライマーに対し２３塩基のｃｒｔＹ相同物を組み入れた。
【０１８５】
５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＣＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣＴＣＡＴＣＧＣ−３’［配列番号２３］
５’ＣＣＡＧＡＡＴＧＡＧＡＴＣＡＴＡＧＴＧＣＧＧＴＴＧＣＡＴＧＣＡＧＣＡＴＣＣＴＴＡＡＣＴＧＡＣＧＧＣＡＧ−３’［配列番号２４］
【０１８６】
１３７３ｂｐのＰＣＲ産物をゲル精製し、第３のポリメラーゼ連鎖反応のテンプレートとして使用した。
【０１８７】
第２に、ｃｒｔＹＩＢコーディング領域をプライマーＣｒｔＥＹＦおよびＣｒｔＢＲ（配列番号２５、２６）と共に増幅させ、順方向プライマーに対し２６塩基のｃｒｔＥ相同物を組み入れた。
【０１８８】
５’ＣＴＧＣＣＧＴＣＡＧＴＴＡＡＧＧＡＴＧＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＣＣＧＣＡＣＴＡＴＧＡＴＣＴＣＡＴＴＣＴＧＧ［配列番号２５］
５’−ＧＣＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡＧＣＧＧＣＴＡＧＡＴＣＧＧＧＣＧＣＴＧＣＣ−３’［配列番号２６］
【０１８９】
３６０４ｂｐのＰＣＲ産物をゲル精製し、第３のポリメラーゼ連鎖反応のテンプレートとして使用した。
【０１９０】
第３のＰＣＲ工程では、最初の２つの反応の産物を組み合わせ、それらの２３塩基の完全相同物を介して相互にプライムさせ、２つの最も外側のプライマーで増幅した。ＴＲＣｃｒｔＥＦおよびＣｒｔＢＲ（配列番号２３、２６）で増幅させた。得られた４９５２ｂｐの産物は遺伝子クラスターｃｒｔＥＹＩＢを含有し、全体としてｃｒｔＸ遺伝子は含まなかった。ｃｒｔＥ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩおよびｃｒｔＢの部分を含む３８７０ｂｐのＥｃｏＲ１／ＥｃｏＲＶ消化フラグメントをＥｃｏＲＶおよびＥｃｏＲＩ消化ｐＣＲＴ１８に連結し、５１４９ｂｐのＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲ１フラグメントを置き換えた。得られたプラスミドｐＣＲＴ２４（図３Ａ）を、三親接合交配によってメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａに伝達し、一般的方法に記載のように、ＨＰＬＣによって接合伝達体をそれらのカロテノイド組成について分析した。
【０１９１】
ｐＣＲＴ２４を含有するメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａにおいて、ゼアキサンチン（保持時間１３．５００分）およびクリプトキサンチン（保持時間１４．７６７分）が産生され（図３Ｂ）、ｃｒｔＺ遺伝子産物によるβ−カロテンの変換（保持時間１６．２３３分）が実証され、従って、ｈｐｓプロモーターからｃｒｔＺコーディング領域の発現が確認された。
【図面の簡単な説明】
【０１９２】
【図１】掲載のｍｏｘＦプロモーターの挿入を伴うｐＴＪＳ７５ＬａｃＺＫａｍプラスミドマップである。
【図２Ａ】ｐＨＰＳのプラスミドマップの略図を表す。
【図２Ｂ】ｐＣＲＴ１８のプラスミドマップである。
【図２Ｃ】ｐＣＲＴ１８で形質転換したメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）細胞におけるゼアキサンチングルコシドの存在を実証するＨＰＬＣの結果を示す。
【図３Ａ】ｐＣＲＴ２４のプラスミドマップである。
【図３Ｂ】ｐＣＲＴ２４で形質転換したメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）細胞におけるゼアキサンチンの存在を確認するＨＰＬＣの結果を示す。
【配列表】
2006515166.tif 000014
2006515166.tif 000015
2006515166.tif 000016
2006515166.tif 000017
2006515166.tif 000018
2006515166.tif 000019
2006515166.tif 000020
2006515166.tif 000021
2006515166.tif 000022
2006515166.tif 000023
2006515166.tif 000024
2006515166.tif 000025
2006515166.tif 000026
2006515166.tif 000027
2006515166.tif 000028
【図１】
2006515166.tif 000029
【図２】
2006515166.tif 000030
【図３】
2006515166.tif 000031
【国際調査報告】
2006515166.tif 000032
2006515166.tif 000033