(57)【要約】細菌細胞壁トランスグリコシラーゼのための基質を製造する方法を記述する。その化学合成は細菌細胞壁生合成の工程を混乱させることのできる新規な治療剤の同定に使用しうる、そのアナログを含むリピドＩＩの供給の持続可能な、そして実質的に純粋な源を利用可能にする。
2004501085.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式
【化１】
2004501085.tif 000065
（式中、
Ａは水素またはカルボキシル基であり；
Ａｃは−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり；
Ｗ＋はそれぞれ独立に、プロトンまたはアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、アルキルアンモニウム、およびジアルキルアンモニウムよりなる群から選択されるカチオンである）
の非放射性の、単離されたリピドＩＩ化合物。
【請求項２】
５０％より大きいかまたは等しい純度を有する、次の式：
【化２】
2004501085.tif 000066
（式中、
Ａは水素またはカルボキシル基であり；
Ａｃは−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり；
Ｗ＋はそれぞれ独立に、プロトンまたはアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、アルキルアンモニウム、およびジアルキルアンモニウムよりなる群から選択されるカチオンである）
の単離されたリピドＩＩ化合物。
【請求項３】
リピドＩＩ化合物が６０％以上の純度を有する請求項１または２に記載の単離されたリピドＩＩ化合物。
【請求項４】
リピドＩＩ化合物が７０％以上の純度を有する請求項１または２に記載の単離されたリピドＩＩ化合物。
【請求項５】
リピドＩＩ化合物が８０％以上の純度を有する請求項１または２に記載の単離されたリピドＩＩ化合物。
【請求項６】
リピドＩＩ化合物が９０％以上の純度を有する請求項１または２に記載の単離されたリピドＩＩ化合物。
【請求項７】
リピドＩＩ化合物が９５％以上の純度を有する請求項１または２に記載の単離されたリピドＩＩ化合物。
【請求項８】
リピドＩＩ化合物が９８％以上の純度を有する請求項１または２に記載の単離されたリピドＩＩ化合物。
【請求項９】
リピドＩＩ化合物が９９％以上の純度を有する請求項１または２に記載の単離されたリピドＩＩ化合物。
【請求項１０】
リピドＩＩ化合物が９９．５％以上の純度を有する請求項１または２に記載の単離されたリピドＩＩ化合物。
【請求項１１】
以下の工程を含むリピドＩＩ化合物の製造方法：
（１）式１４
【化３】
2004501085.tif 000067
の保護されたニ糖のコアを提供し
（２）アノマーホスフェートを導入して、式１２
【化４】
2004501085.tif 000068
の化合物を形成し、
（３）ポリペプチド結合を導入して、式７ａ
【化５】
2004501085.tif 000069
の化合物を形成し、
（４）ウンデカプレニルジホスフェート結合を導入して、式８ａ
【化６】
2004501085.tif 000070
の化合物を形成し、
（５）Ｐｇ０、Ｐｇ３，Ｐｇ７およびＰｇ８を除去して該リピドＩＩ化合物を形成する。
（式中、
Ａは、水素またはカルボキシル基であり；
Ｒ２は、メチル基であり；
Ｐｇ０は、アシルヒドロキシ保護基であり；
Ｐｇ３は，アシルヒドロキシ保護基であり；
Ｐｇ４は，カルボキシ保護基であり；
Ｐｇ５は，ヒドロキシ保護基であり；
Ｐｇ６は，ホスフェート保護基であり、
Ｐｇ７は、アミン保護基であり；そして
Ｐｇ８は、カルボキシ保護基である。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法で製造したリピドＩＩ化合物。
【請求項１３】
６より大きいｐＨでリピドＩＩを単離することを含むリピドＩＩの単離方法。
【請求項１４】
ｐＨが６〜１２の間である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ｐＨが７〜１０の間である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ｐＨが７〜９の間である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
リピドＩＩが５０％以上の純度を有する請求項１３、１４、１５、または１６に記載の方法。
【請求項１８】
リピドＩＩが６０％以上の純度を有する請求項１３、１４、１５、または１６に記載の方法。
【請求項１９】
リピドＩＩが７０％以上の純度を有する請求項１３、１４、１５、または１６に記載の方法。
【請求項２０】
リピドＩＩが８０％以上の純度を有する請求項１３、１４、１５、または１６に記載の方法。
【請求項２１】
リピドＩＩが９０％以上の純度を有する請求項１３、１４、１５、または１６に記載の方法。
【請求項２２】
リピドＩＩが９５％以上の純度を有する請求項１３、１４、１５、または１６に記載の方法。
【請求項２３】
リピドＩＩが９８％以上の純度を有する請求項１３、１４、１５、または１６に記載の方法
【請求項２４】
リピドＩＩが９９％以上の純度を有する請求項１３、１４、１５、または１６に記載の方法
【請求項２５】
以下の工程を含むリピド基質の製造方法：
（１）式１４
【化７】
2004501085.tif 000071
の保護されたニ糖を提供し
（２）アノマーホスフェートを導入して、式１２
【化８】
2004501085.tif 000072
の化合物を形成し、
（３）ポリペプチド結合を導入して、式７
【化９】
2004501085.tif 000073
の化合物を形成し、
（４）脂質キャリアジホスフェート結合を導入して、式２
【化１０】
2004501085.tif 000074
の化合物を形成し、
（５）Ｐｇ０、Ｐｇ３基を除去して、Ｐ基を脱保護して、式１
【化１１】
2004501085.tif 000075
の脂質基質を形成する。
（式中、
Ａｃは、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり；
Ｐｇ０は、アシルヒドロキシ保護基であり；
Ｐｇ３は，アシルヒドロキシ保護基であり；
Ｐｇ４は，カルボキシ保護基であり；
Ｐｇ５は，ヒドロキシ保護基であり；
Ｐｇ６は，ホスフェート保護基であり、
Ｐｇ７は、アミン保護基であり；そして
Ｒ２は、水素、（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、または（Ｃ１−Ｃ３）アルキルフェニルであり；
Ｘは脂質キャリアであり；
カルボニルに結合したＰはアミノ酸の残基またはペプチドの残基であり（Ｐは保護された末端カルボキシ基を含む）；そして
Ｐ’はアミノ酸の残基またはペプチドである）
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法により製造されたリピドアナログ。
【請求項２７】
式１のリピドアナログ。
【化１２】
2004501085.tif 000076
（式中、
Ａｃは、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり；
Ｐｇ０は、アシルヒドロキシ保護基であり；
Ｐｇ３は，アシルヒドロキシ保護基であり；
Ｐｇ４は，カルボキシ保護基であり；
Ｐｇ５は，ヒドロキシ保護基であり；
Ｐｇ６は，ホスフェート保護基であり、
Ｐｇ７は、アミン保護基であり；そして
Ｒ２は、水素、（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、または（Ｃ１−Ｃ３）アルキルフェニルであり；
Ｘは脂質キャリアであり；
カルボニルに結合したＰはアミノ酸の残基またはペプチドの残基であり（Ｐは保護された末端カルボキシ基を含む）；そして
Ｐ’はアミノ酸の残基またはペプチドである）
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の領域）
本発明はバクテリア細胞壁の生合成を有するトランスグリコシラーゼ酵素に対する基質を製造する方法、並びにそれらから製造される基質、特別なリピドＩＩおよびそれらのアナログの化学合成に関するものである。
【０００２】
（発明の背景）
強力でとりわけ非毒性の細胞壁生合成抑制剤は、院内および院外患者セッティングの両方におけるバクテリア感染の管理に対する処置レジメを５０年以上の間支配している。しかしながら最近、これらの抗生物質に対するバクテリアの抵抗性は恐るべきレベルに達し、それらのかっての信頼すべき臨床的効能を侵し始めてきている。その結果、細胞壁に活性な薬物類に関する新たな薬剤の発見が急速に必要とされている。
【０００３】
細胞壁（ペプチドグリカン）生合成酵素およびそれらの天然基質は、分子レベルにおける抵抗メカニズムの理解を、またはより新規なおよびより効果的な薬剤の研究を指向する研究にとって非常に有効なツールとなり得るものである。トランスペプチターゼ酵素がβ−ラクタム抗生物質のターゲットであることはよく知られているが、グルコシル転移の過程に関する研究は天然のグルコシル転移基質、リピドＩＩおよびそのアナログが入手しにくいことが主因となり限定されてきた。バクテリアの培養液からリピドＩＩを単離することはいくつかの恐ろしい大きな課題を提供し、最も顕著なものは規模である。リピドＩＩのレベルは、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ において細胞当りわずか１，０００−２，０００の分子であると見積もられている。細胞当り１５００個の分子は濃厚な（１０９ｃｆｕ／ｍｌ）培地中でほぼ２．５ｎＭに相当する。５０μｇのＣ１４−リピドＩＩがマイクロコッカスルテウスから単離されたが、その単離量は非常に少なく不純および放射性のものである。（Ｂｒｏｔｚ， Ｈ．， ら， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ， ４２巻、１５４頁、（１９９８）参照）。第二に、比較的大量の細胞の脂質および膜成分からの非常に少量のリピドＩＩの完全な単離は非常に困難である。それ故にグリコシル転移方法についてのいずれかの意味深い研究を支援するためにリピドＩＩの大量の持続的供給に対する必要性が存在する。
【０００４】
リピドＩＩが分子レベルにおける抵抗性メカニズムの研究並びにより新規でより効果的な薬剤の研究にあって有用なツールである一方、それはまた別の用途も有する。例えばリピドＩＩは、例としてミクロコッカスリソディクチカスのような微生物のムコペプチド細胞壁構造中に生じるＮ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチルグルコサミンの間にあるβ−１，４−グルコシド結合を好ましく加水分解する酵素であるリゾチームの定量化にも有用である。加えるに、ある種のランチバイオティクスは固定化したリピドＩＩを含む樹脂上でアフィニティクロマトグラフィーによって精製することができる。
【０００５】
（発明の要旨）
本発明はバクテリア細胞壁生合成のトランスグルコシラーゼ酵素に対する基質として有用な脂質基質（例えばリピドＩＩアナログ）を製造するための方法を提供するものである。その方法は：
（１）化学式１４
【化１３】
2004501085.tif 000003
の保護された二糖類を提供する
（２）化学式１２
【化１４】
2004501085.tif 000004
の化合物を形成するためアノマーのホスフェートを導入する
（３）化学式７
【化１５】
2004501085.tif 000005
の化合物を形成するためペプチド結合を導入する
（４）化学式２
【化１６】
2004501085.tif 000006
の化合物を形成するため脂質−担体二燐酸塩結合を導入する
（５）化学式１
【化１７】
2004501085.tif 000007
の脂質基質を製造するためＰｇ０およびＰｇ３基を除去し、並びにＰ基を脱保護化する
（式中：
ＡｃがＣ（Ｏ）ＣＨ３であり；
Ｐｇ０がアシルヒドロキシ保護基であり；
Ｐｇ３がアシルヒドロキシ保護基であり；
Ｐｇ４がカルボキシ保護基であり；
Ｐｇ５がヒドロキシ保護基であり；
Ｐｇ６がホスフェート保護基であり；
Ｒ２が水素、（Ｃ１−Ｃ５）アルキルまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルフェニルであり；
Ｘが脂質担体であり；
カルボニルに結合しているＰがアミノ酸またはペプチドの残基であり、ここでＰは保護された末端カルボキシ基を含む；および
Ｐ’がアミノ酸またはペプチドの残基である）
工程を含む。
【０００６】
本発明はまた５０％以上（好ましくは６０％、７０％または８０％以上、さらに好ましくは９０％または９５％以上、よりさらに好ましくは９８％または９９％以上、よりさらに好ましくは９９．５％以上）の単離された純度を有する非放射性の、持続性のある供給を与えるリピドＩＩの化学的な合成を提供するものである。リピドＩＩの製造に関するその方法は：
（１）化学式１４
【化１８】
2004501085.tif 000008
の保護された二糖類を提供する
（２）化学式１２
【化１９】
2004501085.tif 000009
の化合物を形成するためアノマーホスフェートを導入する
（３）化学式７ａ
【化２０】
2004501085.tif 000010
の化合物を形成するためペプチド結合を導入する
（４）化学式２ａ
【化２１】
2004501085.tif 000011
の化合物を形成するためウンデカプレニルジホスフェート結合を導入する
（５）リピドＩＩを形成するためＰｇ０，Ｐｇ３，Ｐｇ７およびＰｇ８を除去する（式中：
Ａが水素またはカルボキシル基であり；
Ｒ２がメチルであり；
Ａｃが−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり；
Ｐｇ０がアシルヒドロキシ保護基であり；
Ｐｇ３がアシルヒドロキシ保護基であり；
Ｐｇ４がカルボキシ保護基であり；
Ｐｇ５がヒドロキシ保護基であり；
Ｐｇ６がホスフェート保護基であり；
Ｐｇ７がアミン保護基であり；および
Ｐｇ８がカルボキシ保護基である）
の工程を含む。
【０００７】
本発明はさらにリピドＩＩの実質的に純粋な生成を与えるものである。リピドＩＩ基質は上述した方法を用い合成的に製造し、クロマトグラフィーの手段により精製される。
【０００８】
最後に、本発明はリピドＩＩが６以上（好ましくは６−１２、より好ましくは７−１０、さらにより好ましくは７−９）のｐＨで単離されるリピドＩＩの単離方法を与えるものである。
【０００９】
（詳細な記述）
定義
上に用いたように、および本発明の記述を通し特記しない限り以下の略語は次の省略を含むものとして理解されるべきである。
名称　　　　　　　　薬剤またはフラグメント
Ａｃ                  −Ｃ（Ｏ）ＣＨ３
ＡｃＯＨ              酢酸
Ａｃ２Ｏ　　　　　　　 無水酢酸
ＢｏＣ                ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＢＵ               １，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデシ−７−エン
ＴｓＯＨ              ｐ−トルエンスルホン酸
ＮＭＭ               Ｎ−メチルモルフォリン
ＴＨＦ               テトラヒドロフラン
Ｂｎ                  ベンジル（即ち、−ＣＨ２Ｐｈ）
ＴＦＡ               トリフルオロ酢酸
Ｔｒｏｃ                ２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル
Ｃｂｚ                 ベンジルオキシカルボニル
ＴＬＣ               薄層クロマトグラフィー
ＮＭＲ               核磁気共鳴
ＥＳＩ−ＭＳ         電子線照射イオン化質量分析法
ＥｔＯＡｃ             酢酸エチル
ＩＲ                 赤外線分光学
ＭｅＯＨ              メタノール
ＮｄＯＭｅ             メトキシナトリウム
ＮＨＳ               Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド
ＥＤＣｌ              １−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカ
ルボイミド塩酸
Ｐｈ                  フェニル
ＣＤＩ               １，１−カルボキシジイミダゾール
ｈ                   時間
ｍｉｎ                  分
【００１０】
先に用いられたように、また本発明の記載を通じて特記しない限り次の用語は以下の意味を有するものとして理解されるべきである：
【００１１】
「アミノ酸」は本明細書中で定義されたような天然のおよび天然でないアミノ酸から成るグループから選択されたアミノ酸を意味する。アミノ酸はまたはα−炭素におけるＬまたはＤの立体化学を有する−アミノ酸を含むことを意味する。好ましいアミノ酸はα−アミノ基を有するものである。それらのアミノ酸は側鎖における置換基によって中性、陽性または陰性となり得る。「中性のアミノ酸」は電荷のない側鎖の置換基を含むアミノ酸と意味する。典型的な中性のアミノ酸はアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニンおよびシスチンを含む。「陽性のアミノ酸」はその中の側鎖置換基が生理学的ｐＨにおいて陽性に電荷しているアミノ酸を意味する。典型的な陽性のアミノ酸はリシン、アルギニンおよびヒスチジンを含む。「陰性のアミノ酸」はその中の側鎖置換基が生理学的ｐＨにおいて正味、負に荷電しているアミノ酸を意味する。典型的な陰性のアミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。好ましいアミノ酸はα−アミノ酸である。典型的な天然のアミノ酸はイソロイシン、プロリン、フェニル、アラニン、トリプトファン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニン、システン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸である。「非天然のアミノ酸」は核酸コドンのないアミノ酸を意味する。非天然のアミノ酸の例は、例えば上に示したような天然のα−アミノ酸のＤ−異性体；Ａｉｂ（アミノ酪酸）、βＡｉｂ（３−アミノ−イソ酪酸）、Ｎｖａ（ノルバリン）、β−Ａｌａ、Ａａｄ（２−アミノアジピン酸）、βＡａｄ（３−アミノアジピン酸）、Ａｂｕ（２−アミノ酪酸）、Ｇａｂａ（γ−アミノ酪酸）、Ａｃｐ（６−アミノカプロン酸）、Ｄｂｕ（２，４−ジアミノ酪酸）、α−アミノピメリン酸、ＴＭＳＡ（トリルメチルシリル−Ａｌａ）、ａＩｌｅ（アローイソロイシン）、Ｎｌｅ（ノルロイシン）、ｔｅｒｔ−Ｌｅｕ、Ｃｉｔ（シトルリン）、Ｏｒｎ、Ｄｐｍ（２，２’− ジアミノピメリン酸）、Ｄｐｒ（２，３−ジアミノプロピオン酸）、α−もしくはβ−Ｎａｌ、Ｃｈａ（シクロヘキシル−Ａｌａ）、ヒドロキシプロリン、Ｓａｒ（サルコシン）またはそれらと同様なもの；環状アミノ酸；ＭｅＧｌｙ（Ｎａ−メチルグリシン）、ＥｔＧｌｙ（Ｎａ−エチルグリシン）およびＥｔＡｓｎ（Ｎａ−エチルアスパラギン）のようなＮａ−アルキル化アミノ酸；並びにα−炭素が２個の側鎖置換基を有するアミノ酸を含む。本明細書中で用いられている天然および天然でないアミノ酸並びにその残基の名称は、「Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ ａ−Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｒｅｃｃｍｍｅｎｄａｔｉｏｎ， １９７４）」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １４（２）， （１９７５） に記載されているように有機化学の学名命名法に関するＩＵＰＡＣコミッションおよび生物化学学名命名法に関するＩＵＰＡＣコミッションによって提案された命名国際協定に従っている。本明細書および請求の範囲に用いているアミノ酸およびそれらの残基の名称並びに略語がこれらに述べられているものと異なる範囲については、異なった名称およ���略語を明らかにするだろう。
【００１２】
「アミノ酸保護基」および「ペプチド保護基」はアミノ酸／ペプチドの酸もしくはアミンの部分またはアミノ酸／アミノ酸残基の側鎖上の他の反応性のある部分を保護する基、例えばヒドロキシもしくはチオールを意味する。アミノ酸側鎖の「対応する保護された誘導体」の例については「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」 Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， １９９１ 中の Ｔ． Ｗ． Ｇｒｅｅｎ およびＰ． Ｇ． Ｍ． Ｗｕｔｓ を参照のこと。アミノ酸中の酸基に対する保護基は本明細書の「カルボキシ−保護基」の項に記載する。アミノ酸中のアミン基に対する保護基は本明細書の「アミン保護基」の項に記載する。
【００１３】
「アミノ酸残基」は、アミド結合を通してペプチドまたは分子中のペプチド部分に組み込まれている個々のアミノ酸単位を意味する。
【００１４】
「アミン保護基」は、合成の過程中における望ましくない反応に対してアミノ基を保護し、そして選択的に除去し得ることが当業界の公知である容易に除去し得る基を意味する。アミン−保護基の使用は、合成の過程中における望ましくない反応に対して基を保護するために当業界では周知のものであり、多くのそのような保護基が例えば Ｔ． Ｈ． Ｇｒｅｅｎｅ およびＰ． Ｇ． Ｍ． Ｗｕｔｓ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， 第２版， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９１） で知られており、それらは本明細書の一部を構成する。アミン保護基はまた酸に不安定なアミン保護基（例えばＢＯＣ）および水素添加に不安定なアミン保護基（例えばＣｂｚ）を含む。好ましいＰｇ７アミン−保護基はトリフルオロアセチルである。本発明では、Ｐｇ２は望ましくないオキサゾリン副生成物の発生を生じない基である（即ち、Ｐｇ２はアシル基ではあり得ない）。適切なＰｇ２アミン−保護基はカルバメートおよびイミド基を含む。特別なイミド基はフタールイミド、テトラクロロフタールイミドおよび（Ａｃ）２Ｎ−を含む。特別な、カルバメート基はメトキシ−カルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、２，２，２−トリフルオロエトキシカルボニル、２−トリメチルシリルエトキシカルボニル、ビニルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、１，１−ジメチル−プロピニルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、２，４−ジクロロベンジルオキシカルボニル、トリメチルシリルオキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、１，１−ジメチル−２，２，２−トリクロロエトキシカルボニルまたはそれに類するものを含む。好ましいＰｇ２アミン−保護基は２，２，２−トリクロロエトキシカルボニルである。
【００１５】
「カルボキシ保護基」は合成過程の間、望ましくない反応に対してカルボキシル基の酸性水素を保護するため、例えばその化合物の他の官能部位を含む反応が行われている間酸の官能基をブロックまたは保護して、そして選択的に除去されることが当業界で公知である容易に除去し得る基を意味する。そのような酸保護基は、米国特許第３，８４０，５５６および３，７１９，６６７号に記述されているように（それらの開示は本明細書の一部を構成する）、カルボキシル基の保護に広く用いられてきたものであり、当業者において周知のものである。適切な酸保護基に関しては、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， １９９１ 中のＴ． Ｗ Ｇｒｅｅｎ およびＰ． Ｇ． Ｍ． Ｗｕｔｓ を参照のこと。酸保護基はベンジルのような水素添加に不安定な酸保護基を含む。酸保護基の例は、置換されたおよび置換されていないＣ１−Ｃ８アルキル、例えばメチル、エチル、ｔ−ブチル、メトキシメチル、メチルチオメチル、２，２，２−トリクロロエチルまたはそれらに類するもの、テトラヒドロピラニル、ベンジルのような置換されたまたは置換されていないフェニルアルキルおよびアルコキシベンジルもしくはニトロベンジル基のようなそれらの置換された誘導体、またはそれらに類するもの、シンナミル、例えばジメチルアミノエチルのようなジアルキルアミノアルキルまたはそれらに類するもの、トリメチルシリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンのアミドおよびヒドラジッド、７−ニトロインドール、ヒドラジン、Ｎ−フェニルヒドラジンもしくはそれらに類するものなどの置換されたかおよび置換されていないアミドおよびヒドラジッド、ピバロイルオキシメチルもしくはプロピオニルオキシメチルまたはそれに類するもののようなアシルオキシアルキル基、ベンゾイルオキシエチルもしくはそれに類するもののようなアロイルオキシアルキル、メトキシカルボニルメチル、シクロヘキシルオキシカルボニルメチルもしくはそれに類するようなアルコキシカルボニルアルキル、ｔ−ブチルオキシカルボニルオキシもしくはそれに類するようなものの、アルコキシカルボニルオキシアルキル、ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノメチルもしくはそれに類するもののようなアルコキシカルボニルアミノアルキル、メチルアミノカルボニルアミノメチルもしくはそれに類するもののようなアルキルアミノカルボニルアミノアルキル、アセチルアミノメチルもしくはそれに類するもののようなアシルアミノアルキル、４−メチルピペラジニルカルボニルオキシメチルもしくはそれに類するようなもののようなヘテロシクリルカルボニルオキシアルキル、ジメチルアミノカルボニル−メチルもしくはそれに類するもののようなジアルキルアミノカルボニルアルキル、（５−ｔ−ブチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチルもしくはそれに類するもののような（５−（低級アルキル）−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）アルキル、並びに（５−フェニル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチルもしくはそれに類するもののような（５−フェニル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）アルキルの��うなエステルを含む。特別なカルボキシ−保護基はメチル、９−フルオレニルメチル、２−（トリメチルシリル）エチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル、２−メチルチオエチル、１，３−ジチアニル−２−メチル、２−（ｐ−トルエンスルホニル）エチル、２−（ｐ−ニトロフェニルスルフェニル）エチル、２−（２’−ピリジル）エチル、２−（ジフェニルホスフィノ）エチル、ｐ−（メチルメルカプト）フェニル、ニトロエチル、アリルまたはそれらに類するものを含む。好ましいＰｇ４カルボキシ−保護基は−ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈである。好ましいＰｇ８カルボキシ−保護基はメチルである。
【００１６】
「ヒドロキシ保護基」は合成過程の間、望ましくない反応に対しヒドロキシ基を保護し選択的に基に除去されることが当業界の公知になっている容易に除去し得る基を意味する。ヒドロキシ−保護基の使用は合成過程の間、望ましくない反応に対して基を保護するとして当業者では周知のものであり、多くのそのような保護基は、Ｔ． Ｈ． Ｇｒｅｅｎｅ および Ｐ． Ｇ． Ｍ． Ｗｕｔｓ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， 第２版， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９１） で公知であり、本明細書の一部を構成するものである。本発明においてＰｇ０，Ｐｇ１およびＰｇ５ヒドロキシ保護基は本明細書中に記載するように相互にオーソゴナルの位置にある。そのような基が化学式１８のムラミルアミド化合物と化学式１７のグルコソピラノシル化合物間のカップリング反応を不活性化させるがため、Ｐｇ１は電子吸引基ではあり得ない。適切なＰｇ１基はアラルキル、アラルケニルおよびシリル基を含む。特別なアラルキルおよびアラケニル基はベンジルおよびアリルを各々に含む。特別な、シリル基はトリメチルシリルおよび（ｔ−ブチル）ジメチルシリルのようなトリアルキルシリル基を含む。好ましいＰｇ１基はアリルおよびベンジルであり；より好ましい基はベンジルである。適切なＰｇ５基はアラルキルおよびアルケニルを含む。好ましいＰｇ５基はアリル、ｎ−ペンテニルおよびベンジルを含み；より好ましい基はベンジルである。さらにＰｇ０およびＰｇ３はケン化により除去可能でなければならない（即ち、Ｐｇ０およびＰｇ３はアシル基でなければならない）。特別な、アシル基はホルミル、アセチル、クロロアセチル、トリクロロアセチル、ｏ−ニトロフェニルアセチル、ｏ−ニトロフェニルオキシ−アセチル、トリフルオロアセチル、アセトアセチル、４−クロロブチリル、イソブチリル、ｏ−ニトロシンナモイル、ピコリノイル、アシルイソチオシアネート、アミノカプロイル、ベンゾイルまたはそれに類するものを含む。好ましいＰｇ０およびＰｇ３基はクロロアセチルおよびアセチルであり；より好ましい基はアセチルである。
【００１７】
「ホスフェート保護基」は、合成過程の間、望ましくない反応に対してホスフェート基を保護し、選択的にに除去し得ることが当業界で公知なる容易に除去し得る基を意味する。ホスフェート−保護基の使用は、合成過程の間、望ましくない反応に対し基を保護するとして当業者に周知であり、例えばＴ． Ｈ． Ｇｒｅｅｎｅ Ｐ． Ｇ． Ｍ． Ｗｕｔｓ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， 第２版， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９１） で多くのそのような保護基は公知であり、それらは本明細書の一部を構成する。好ましいＰｇ６ホスフェート−保護基はベンジルである。
【００１８】
活性化したエステルの「脱離基」は良好な求核試薬（例えばペプチド単位のアミノ基）により置換されうるような十分な不安定性を持つ置換基を意味する。個々の置換基の不安定性は同一のおよび／または隣接炭素原子についた置換基並びに離脱基の性質によって変わるであろう。当業者はアミノ求核試薬によって置換し得る脱離基のタイプを認識している。適切な脱離基に関しては「Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ” Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， １９８４ Ｍ． Ｂｏｄａｎｓｋｙ および Ａ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ 並びに“Ｐｒｉｎｃｌｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， １９８４ の Ｍ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ 」を参照のこと。本発明においては、例えば、末端のアミノ酸基が二糖類をペプチド単位と結合するためのリンカーとして働くよう脱離基が結合しているカルボニルを活性化する。特別な脱離基にペンタフルオロフェノキシ、Ｎ−オキシサクシミド、Ｎ−オキシフタールイミドおよびＮ−オキシベンゾトリアゾールを含む。好ましい脱離基はＮ−オキシサクシンイミドである。
【００１９】
「オーソゴナル保護基」は基の一つを他の基を除去することなしに除去し得る一組の状態が存在する保護基を意味する。その用語は同じ部分（例えばオーソゴナルヒドロキシ保護基）と同様に異なった部分（例えばオーソゴナルアミンおよびヒドロキシ保護基）に対する保護基を包含する。オーソゴナル保護基は必ず異なっていることは必要でない。例えば、その用語が同じ部分に対する保護基を記述するために用いられる場合、その基は異なっていてもよいし（例えばオーソゴナルアセチルおよびベンジルヒドロキシ−保護基）または同じであってもよい（例えばオーソゴナルベンジル保護基）。
【００２０】
「電子吸引基」は水素よりより強力な電子吸引因子である基を意味する。電子吸引基は負の誘導効果を示すが、一方、水素より弱い電子吸引因子である基は陽性誘導効果を示す（例えば、本明細書の一部を構成する Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ Ｏｒｇｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｈｏｌｔ， Ｒｅｉｎｅｈａｒｔ ａｎｄ Ｗｉｎｓｔｏｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９５９） の Ｅ． Ｓ． Ｇｏｕｌｄ を参照）。
【００２１】
「アシル」はＲ−Ｃ（Ｏ）−基を意味し、ここでＲは炭素−炭素結合を通してＣＯ基に結合している。
【００２２】
「アルキル」は約１−約２０個の炭素原子を分子鎖中に有する直鎖のまたは分岐の脂肪族の炭化水素を意味する。好ましいアルキル基は分子鎖中に１−約１２個の炭素原子を有し、より好ましくは本明細書で定義した低級のアルキルである。「分岐の」とはメチル、エチルもしくはプロピルのような１個またはそれ以上の低級のアルキル基が線状アルキル鎖に結合していることを意味する。「低級アルキル」は直鎖のまたは分岐鎖の鎖中にある約１−約４個の炭素原子を意味する。
【００２３】
「アルケニル」は炭素−炭素の二重結合を含み、鎖中に約２−約１５個の炭素原子を有する直鎖または分岐した脂肪族の炭化水素基を意味する。好ましいアルケニル基は鎖中に２−約１２個の炭素原子を有し；そしてより好ましくは鎖中に約２−約４個の炭素原子を有する。「分岐の」とはメチル、エチルもしくはプロピルのような１またはそれ以上の低級アルキル基が線状アルケニル鎖に結合していることを意味する。「低級アルケニル」は直鎖のまたは分岐した鎖中の約２−約４個の炭素原子を意味する。典型的なアルケニル基はエチニル、プロペニル、ｎ−ブテニル、ｉ−ブニニル、３−メチルブト−２−エニル、ｎ−ペンテニル、ヘプテニル、オクテニル、シクロヘキシブテニルおよびデセニルを含む。
「アリール」は約６−約１４個の炭素原子、好ましくは約６−約１０個の炭素原子からなる芳香属の単環式または多環式の環状系を意味する。典型的なアリール基はフェニルもしくはナフチルまたは置換されたフェニルもしくは置換されたナフチルを含む。
【００２４】
「化学式Ｂの塩基」並びに「化学式Ｂ２の塩基」はプロトン化ができる非結合電子対を有するＳＰ２およびＳＰ３が混成された窒素を含む化合物を意味する。化学式ＢまたはＢ１の塩基の例は場合により置換されたイミノ、場合により置換されたアミノおよび場合により置換されたアミジノ基を含む。
【００２５】
「カルボキシ」はＨＯ（Ｏ）Ｃ−（カルボン酸またはそれらの塩）基を意味する。
【００２６】
「Ｎ−オキシサクシンイミド」は次の構造
【化２２】
2004501085.tif 000012
の部分を意味する。
【００２７】
「脂質担体」は１より多い炭素を有する飽和および不飽和の炭化水素鎖を意味する。鎖は直鎖でも分岐でもよい。炭化水素はまた置換でも（例えば過フッ素化されて）非置換であってもよい。好ましくは炭化水素鎖は５−５５個の炭素および１−１１個のプレニル単位を、より好ましくは２５−５５個の炭素および５−１１個のプレニル単位を、最も好ましくは４０−５５個の炭素および８−１１個のプレニル単位を含む。
【００２８】
「ペプチド」はアミド結合によりともにつながったアミノ酸残基を含む高分子を意味する。適切なペプチドおよびポリペプチド単位は２またはそれ以上、好ましくは２−４個のアミノ酸残基を有するペプチドを含む。Ｐはまた１個のアミノ酸残基であり得る。Ｐは好ましくは４個のアミノ酸残基を含むポリペプチドである。特別な有用なポリペプチド単位はＤ−ｉＧｌｎ−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＡｌａまたはＤ−ｉＧｌｎ−Ｄａｐ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａである。他のアミノ酸の組合せおよびアミノ酸またはペプチド単位に含まれるアミノ酸の数は、脂質基質と相互作用を行うために選択した酵素によって用いられる。適切なアミノ酸残基は、天然のアミノ酸、変わったアミノ酸および改変したアミノ酸を含み、Ａｐｐｅｎｄｉｘ ２の中の表１から６を含む ｔｈｅ Ｗｏｌｄ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ （ＷＩＰＯ） Ｈａｎｄ ｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ， Ｓｔａｍｄａｒｄ ＳＴ． ２５： Ｓｔａｎｄａｒｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇｓ ｉｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ （１９９８） に定義されている（それらは本明細書の一部を構成する）。
【００２９】
「リピドＩＩ」は次の構造：
【化２３】
2004501085.tif 000013
の化合物を意味し、式中Ａは水素またはカルボキシル基（−ＣＯ２Ｈまたはそれらの塩）であり；Ａｃは−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であって、Ｗ＋はアルカリ金属（例えば、ナトリウムもしくはカリウム）、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウムもしくはカルシウム）、アンモニウム、アルキルアンモニウム（例えば、メチルアンモニウムもしくはエチルアンモニウム）、およびジアルキルアンモニウム（例えば、ジメチルアンモニウム、メチルエチルアンモニウムもしくはジエチルアンモニウム）より成る基から選択された各々独立したプロトンまたはカチオンである。好ましくはピロホスフェート基がプロトン化されない。グラム−陽性リピドＩＩに対しては、Ａは一般的には水素であり、一方、グラム−陰性リピドＩＩに対しては、Ａは一般的にカルボキシ基である。
【００３０】
「実質的に純粋な」は、単離した純度が純度９９％より優れているか等しいことを意味する。
【００３１】
リピドＩＩおよびそれらのアナログの有用性
Ｉ．リピドＩＩを用いたリゾチームの定量
例えば、ミクロコッカスリソデイクティカスのような微生物のムコペプチド細胞壁構造中に存在するＮ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチルグルコサミン間のβ−１，４−グルコシド結合を優先的に加水分解する酵素リゾチームの定量にリピドＩＩは有用である。
【００３２】
リゾチームは、すでに示されているが、この酵素を分泌するマクロファージ（Ｏｓｓｅｒｍａｎ ら （１９７３） Ｎａｔｕｒｅ ２４３：３３１）の抗腫瘍機能の媒介物質であるかもしれない（Ｇｏｒｄｏｎ ら （１９７４） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １３９：１２２８）。軟骨組織のリゾチームは軟骨組織の石灰化にある役割を果しているかもしれない（Ｋｕｅｔｔｎｅｒ ら （１９７４） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔｄ ３７２：３３５）。「天然の」抗生物質としてのおよび疾病の診断における補助としてのリゾチームに興味が持たれてきた（Ｇｌｙｎｎ （１９６８） Ｓｃｉ． Ｂａｓｉｓ Ｍｅｄ． Ａｎｎ， Ｒｅｖ． ３１； Ｐｒｕｚａｎｓｋｉ ら （１９６９） Ａｍｅｒ． Ｔ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ． ２５８：４０５）。高レベルの血清および尿のリゾチームが単核細胞および骨髄球の白血病に存在する（Ｏｓｓｅｒｍａｎ  （１９６６） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １２４：９２１； Ｂｒｉｅｒｒｅ ら （１９７４） Ｃｌｉｎ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ ５０： ２６５）。脳骨髄液中にこの酵素が存在することは中枢神経系の腫瘍を示す（Ｎｅｗｍａｎ ら （１９７４） Ｌａｎｃｅｔ ＩＩ ７５６）。通常ではリゾチーム活性は尿、胆汁および脊髄液には実質的にない（Ｈａｎｋｉｅｗｉｃｚ ら （１９７４） Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ａｃｔｄ ５７：２０５）。その酵素、また、群特異的な抗原の抽出等の抽出目的のためにも、大腸菌やストレプトマイセーテスを溶解するために（Ｈａａｓ ら （１９７５） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ＸＬＩＩＩ （Ｈａｓｈ， Ｊ．， ｅｅｌ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ＩＶ． Ｙ． Ｐ６２１）用いられている（Ｗａｔｓｏｎ ら （１９７５） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １：２７４）。
【００３３】
かくの如くリゾチームは数多くの重要な医学的及び研究的意味と用途を有し、それ故にそれらの正確な定量化はこれらの応用に重要である。
【００３４】
最初はリゾチームの活性は基質としてミクロコッカスルテウスを用い細胞濁度検定によって評価された。リゾチームによる細胞の溶解速度は分光光度計的に細胞液の濁り度の減少を測定することによって決定される。しかしながら、この方法はＭ．ルテウスの細胞粉末の均一性の欠如のため再現性が乏しい。その結果は緩衝剤のイオン強度の相違によっても大きく変化する。
【００３５】
最近リゾチーム活性の比色的評価をするため商業的に入手し得る基質を Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ （ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ Ｍｏ） から購入することができた。その基質は合成された三量体の糖、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−Ｎ，Ｎ，Ｎ”−トリアセチルチトトリオーゼ（ＰＮＰ−（ＧｌｃＮＡｃ）３）（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔａｌｏｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ ｎｏ． Ｎ−８６３８） 。より長いおよびより短いアセチルチトオリゴ−サッカライドがやはりリゾチーム検定に用いられた。すなわち、ＰＮＰ−（ＧｌｃＮＡｃ）ｎ、但しｎ＝２−５であった。いずれの場合もリゾチームに対し容易な解裂部位がＰＮＰ−ＧｌａＮＡｃの形成をもたらす。この検定で測定された活性は遊離したｐ−ニトロフェノールの４０５ｎｍにおける吸収の増加である。しかしながら、リゾチームによってこの基質がＰＮＰ−ＧｌｃＮＡｃへの解裂は直接にはｐ−ニトロフェノールの遊離をもたらさない。リゾチームの活性について信頼し得る比色的測定を得るためには第二の酵素β−Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼ（ＮＡＨａｓｅ）に対する検定を結び付けなければならない。ＮＡＨａｓｅはＰＮＰ−ＧｌｃＮＡｃを解裂し、ｐ−ニトロフェノールを遊離させ、その後、それが定量される（Ｎａｎｊｏ ら （１９８８） Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０４： ２５５−２５８）。この検定は、以前の検定よりもより正確なものであったが、ＰＮＰ−ＧｌｃＮＡｃ以外の解裂生成物を作り出す基質のリゾチーム解裂のため高レベルの誤差をもたらす。また、２つの酵素の系は関心のある活性を直接測定する一つの系よりも好ましくない。高度に正確であり、容易に用いることができる新しく改良された検定は、医薬的な／診断上の製品および生物学的な物質の中でリゾチームのルーチンな測定のために研究所セッティングにおいて価値があるであろう。そのような検定は、白血病および中枢神経系の腫瘍の診断に対する正確な診断の道具として利用され得るものである。ヒトの血清、尿、脳脊髄液におけるリゾチーム活性の検出は、上述の如く、ある種の癌の診断において急速にして正確に支援することになるであろうし、また癌診断の道具の集積に対し、価値のある追加物ともなるであろう。リピドＩＩは次の如くリゾチーム検定に用いることができる。
【００３６】
製造業者の使用説明書 （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ） に従ってペンタペプチドのリシンアミノ酸のε−アミンをＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ で識別したリピドＩＩは蛍光性の分子である。この標識を行ったリピドＩＩ誘導体はスタフィロコッカスアウレウス単官能性のトランスグリコシラーゼＡ （ＭｔｇＡ： 米国特許番号６，１４３，８６８ および５，９２２，５４０号） を用いて非蛍光性であるペプチドグリカン鎖へと重合することができる。重合は１００μＭ  Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎで標識した  ＬｉｐｉｄＩＩ ， ５μＭ ＭｔｇＡ． ５０ｍＭ ＭＥＳ （ｐＨ５．９） 、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１６．７ｍＭ  ＮａＣｌ および０．２７ｍＭ  ＣＨＡＰＳを用いて達成される。重合は２５℃でほぼ５時間後に完了する。
【００３７】
その高分子の隣接するフルオロホレス（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ）（隣接の染料または離れた４個の繰返し二糖類ユニット）は極めて近接している場合相互に作用し、自己クエンチングをもたらす。標識されたペプチドグリカン原料にリゾチームを加えると、その重合反応中にＭｔｇＡによって形成された同じ結合の解裂が生じる。これらの結合が解裂すると染料は物理的に分離し、染料分子間の相互作用が減少して、自己クエンチングの減少により続いて蛍光が増加する。リゾチーム触媒反応の蛍光に続き（励起：４９５ｎｍ；放射：５２１ｎｍ）、標準曲線のそれと比較するオーバタイムによって目的とする製品中に存在するリゾチームの活性を定量化することができる。
【００３８】
かくの如くリゾチーム検定キットは、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ で標識されたペプチドグリカンの予め重合された鎖を含み、それに対してリピドＩＩは必須の出発物質であり、初期のリゾチーム解裂と同時に直ちに蛍光性が増加する長さに分画される。例えば、解裂した時、二量体は必ず蛍光が増加することになる。あるいはペプチドグリカンポリマーを、識別した部分が完全なクエンチをもたらす十分密接した、しかし、初期の解裂がクエンチを直ちに除去させるに十分離れた位置をとるようＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎで標識することができる。ポリマー中に導入するＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ標識の量は、重合反応に用いられる標識されたリピドＩＩと標識されていないものの比率を変えることによって制御することができる。標識されたペプチドグリカンはキット中に水溶液として、または固体粉としてもどちらでも存在することができる。そのようなＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎで標識されたペプチドグリカンの水溶液は選択された緩衝剤中で調製することができ、定量されるべきリゾチーム試料のアリコートはその後に加えることができる。時間とともに蛍光強度の増加（励起４９５ｎ；放射：５２１ｎｍ）を追跡すること、及び標準曲線から得られたものの結果の比較によって酵素試料中おけるリゾチームの活性を定量的に測定することができる。
【００３９】
ＩＩ．リピドＩＩを用いるランチバイオティクスの精製
ランチバイオティクスは、分子の中に稀チオエーテルアミノ酸ランチオニンおよび／または３−メチルランチオニンの形成をもたらす特殊な翻訳後修飾によって特徴付けられるペプチド抗生物質の一種であり、それ故に「ランチバイオティクス」（ランチオニン含有抗生物質）という名称である。ランチバイオティクスエピデルミン、ガーディマイシン（アクタガーディン）、メルサシジンおよびニシンはグラム陽性の微生物に対し抗微生物活性を有する。
【００４０】
商業的には、ニシンＺは食品保存剤として数十年間、特別な酪農業において使用されてきた。それは人間に対し非毒性であり、この抗生物質に対する耐性の発現はその長い使用期間にも拘らず観測されていない。ニシンＺは現在、ヒトに使用するための薬品候補、並びに医療用具および微生物の発生を防ぐための食料品製造機械の表面に含まれるものに対する薬品候補としても考えられている。エピデルミン、ガルジマイシンおよびメルサシジンはヒトにおけるバクテリア感染処置に対する抗菌性の薬品として潜在的に有用である。
【００４１】
エピデルミン、メルサシジンおよびニシンは、リピドＩＩと特異的に相互作用を行う （Ｂｒｏｅｔｚ ら （２０００） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ４６：１−６； Ｂｒｅｕｋｉｎｋ ら （１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６： ２３６１−２３６４； Ｂｒｏｅｔｚ ら （１９９８） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ４２（１）： １５４−１６０） 。リピドＩＩに対するガルジマイシンの結合に対して直接な証拠はないが、そのような結合はガルジマイシンとメルサシジンの間の構造的な類似性から見て生じることが期待される。それ故に、これらすべてのランチバイオティクスは、ランチバイオティクス−製造の微生物株からの培養上清のような化合物の混合物から、固定化したリピドＩＩを含む樹脂上でアフィニティクロマトグラフィーによって精製できることが完全に期待されるであろう。ランチバイオティクス−製造株の例はラクトコッカスラクティスｓｓｐ．ラクティス（ニシン）；スタフィルコッカスエピデルミジス（エピデルミン）；バシルスｓｐ．ストレインＨＩＬ  Ｙ−８５，５４７２８（メルサシジン）；およびアクティノプラネスリグリエ（ガルジマイシン）を含む。この目的のためにリピドＩＩを活性化した樹脂、例えば Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ． のような供給者から商業的に入手し得る樹脂に結合させる。結合は製造業者の取扱説明書に従って行う。一般的には、望ましいリガンドの溶液を（この場合リピドＩＩである）適切な溶媒または緩衝液（そのリガンドの溶解度によっておよび用いるカップリング剤によって決定される）中で活性化した樹脂の懸濁質と単純に混合し、インキュベートして過剰のリピドＩＩを流し去る。
【００４２】
もしこの結合法によってランチバイオティクスの結合が生じない樹脂の表面に対しリピドＩＩの配向が生じるならば、次に、リピドＩＩは疎水性のビーズに結合し、この問題は解決する。この方法においてリピドＩＩはその天然の膜環境の中で見出されたものと同様な方法で提供される。リピドＩＩの単分子層は Ｒｅｔｚｉｎｇｅｒ ら ［（１９８５） Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １５０： １３５−１４０） または Ｋｉｍ ら （（１９９７） Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５０： １０９−１１６）］によるリン脂質の単分子層について記載されているように疎水性のビーズ上に形成される。例えば、ポリスチレンジビニルベンゼンビーズをヘキサン／エタノール中（ほぼ１−１，ｖ／ｖ）中でリピドＩＩと共に超音波処理を行って乾燥する。そのビーズを水中に再度分散し、水で洗浄し、疎水性のビーズの表面上に脂質の単分子層が得られる。もし、リピドＩＩの分子の形がビーズの表面上にあるリピドＩＩのみの単分子層の形成と相いれないならば、そのビーズはリン脂質とリピドＩＩの混合物で被覆される。
【００４３】
その後ランチバイオティクスを、固定化したリピドＩＩに結合する条件下で、ランチバイオティクスを含む混合物をリピドＩＩ樹脂を含むカラムに通す。例えば、リピドＩＩにメルサシジンおよび多分ガルジマイシンを結合すると示される条件 （Ｂｒｏｅｔｚ ら （１９９８） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ４２（１）： １５４−１６０） は：
ａ）５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２３℃；または　ｂ）半濃縮されたＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ流体ブロス
を含む。
エピデルミンおよびニシンがリピドＩＩに結合する条件 （Ｂｒｏｅｔｚ ら （１９９８） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３０（２）： ３１７−３２７） は：
ａ）６９ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．８、５８ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１１．６ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ，５．８ｍＭ  ＳＤＳ：または
ｂ）１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２，０．８５％ＮａＣｌ
を含む。
【００４４】
ニシンがリピドＩＩに対して結合する更なる条件 （Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ ら （２００１） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７６（１）： １７７２−１７７９） は２５ｍＭ  ＭＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ６．０，５０ｍＭ  Ｋ２ＳＯ４または５０ｍＭ  ＭＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ６．０，１００ｍＭ  Ｋ２ＳＯ４を含む。
【００４５】
結合していない非ランチバイオティクス物質は、樹脂固定化リピドＩＩに結合したランチバイオティクスのものに用いると同じ緩衝液でカラムを溶出することにより除去する。
【００４６】
メルサシジンおよびガルジマイシンは、二価のカチオンを除去するための緩衝液、例えばＥＤＴＡを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８を用いてその樹脂を洗浄することによってそのカラムから溶出することが完全に期待できる。別法として結合したリピドＩＩは、ＭｕｒＮＡｃとホスフェート間の結合を切断し、もはやメルサシジンまたはガルジマイシンとの相互作用がないフラグメントを発生させるための酸−加水分解を行うことができる。
【００４７】
樹脂と共有結合を行っているリピドＩＩに対するニシンおよび／またはエピデルミンの相互作用は、例えば１００％アセトニトリルのような有機溶媒または洗剤で壊れることも十分期待される。極端なｐＨ、高い塩濃度またはＥＤＴＡを含む緩衝剤の水溶液もまた採用することができる。
【００４８】
合成アプローチの概説
リピドＩＩの中にある構造要素の多様性は全体の合成に対し幾つかの重要なチャレンジを提供する。リピドＩＩの中心コアはＮ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）およびＮ−アセチルムラミン酸（ＮＡＭ）のサブユニットを含むβ−［１，４］−結合二糖類からなる。ムラミル残基はさらに、化学的に敏感なウンデカプレニル結合のα−グリコシルジホスフェート部分そしてまたラクチル結合によって３の位置に結合したペンタペプチド鎖（例えば、Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｉＧｌｎ−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＡｌａまたはＬ−Ａｌａ−Ｄ−ｉＧｌｎ−メソ−ＤＡＰ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌあ）で飾られている。
【００４９】
オルソゴナルな保護の形にある中心の二糖類のコアフラグメント自体の合成は意味深い合成のチャレンジを提出した。例えば、３つのオルソゴナルを有する保護スキームの同定は、ペンダントの水酸基の３種のタイプ（すなわち、アノマーのＯＨ、周囲のＯＨおよびカルボキシルのＯＨ）を選択的に脱保護することが非常に望まれる。加えるにβ−［１，４］グリコシド結合の立体選択的構築は反応性のあるグリコシルカチオン供与体を発生するために用いられる方法に関係なく困難であると予期された。例えば、グリコシルカチオンに関しては、次の固有な特性が各々がグリコシルカチオン受容体の反応性の喪失に寄与する；（ｉ）グルコピラノースをベースとする受容体のＣ（４）−水酸基の求核性が本来ないこと、（ｉｉ）ムラミン酸をベースとする受容体のＣ（４）−水酸基の周りの更なる立体的な群り、および（ｉｉｉ）グルコピラノーズをベースとする対応物に比較して２−デオキシ−２−アシルアミノグルコピラーノーズ受容体の更なる電子的脱活性化。グリコシルカチオン供与体に関しては、β−［１，４］グリコシディク結合の形成に向けた素地を持つ活性化方法が必要であった。グリコシルカチオンの発生のための反応条件は、また供与体と受容体の両方に内在する機能性と両立することが必要である。ＮＡＧ−ＮＡＭ二糖類の前駆体の立体選択的構築に関する合成の問題（下記のスキームＩＩを参照）の各々はを扱われ、完全に異なった形体での数グラム規模でのその合成のプロトコールが開発された。ＮＡＧ−ＮＡＭ二糖類の前駆体の製造のための合成方法は実施例に例示する。二糖類のコアは別法として Ｋａｎｔｏｃｉ， Ｄ． ら Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６２巻、２２７頁（１９８７）中に記載された一般的な方法を用いて製造することができる。
【００５０】
二糖類のコア合成に加えて、本出願者はまたリピドＩＩの全合成の以下のものを含む他のチャレンジを成功裡に処理をした：（１）αの選択的方法において適切な保護をした二糖類の前駆体中にアノマーホスフェートを導入する方法、（２）化学的に敏感なアンデカプレニル結合のジホスフェートを導入する穏やかな方法、（３）ムラミルフラグメントのアノマー中心にある反応性の官能基を一次的にマスクするために用いられるこれらを有するペンタペプチドの側鎖および炭水素化物の末端に用いる保護基のオリゴナリティ、（４）合成の最終段階のように穏やかな反応条件下で完全に脱保護を行うための保護基の全体スキームの調整、および（５）最終生成物の精製のための高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の開発。以下に記述するリピドＩＩの合成は上で概説した各々の結果を成功的に取扱う。
【００５１】
合成の後半の段階でウンデカプレニル結合のジホスフェート部分の導入は、卓越した利点を与えた。例えば、ウンデカプレニル結合の基質の強められた親脂的特性から生じた続く反応における潜在的な溶解性の複雑さが避けられた。加うるに、脂質結合のジホスフェートを後半の段階で導入することも化学的に敏感なアリル化ジホスフェート結合が耐えなければならない。続いての合成操作の数を最少にした。
【００５２】
本出願者は、また、それらを組込んだ後に脱マスクする全ての官能基に対して、塩基で解裂する保護基の使用がアノマージホスフェートのいかなる潜在的な酸鋭敏性をも避けさせることを発見した。
【００５３】
ピロホスフェート基の酸鋭敏性によるリピドＩＩの中間体の分解は当業界内で完全に認められてきていない。本出願者は一度ピロホスフェート部分が化合物中に存在すれば、分解による副生成物はｐＨを約６以上に保てば最少にすることを発見した。好ましくはｐＨを６−１２に、より好ましくは７−１０に、最も好ましくは７−９に保つ。ｐＨを４．２とする単離方法において６Ｍピリジニウムアセテートを用いる現在の慣用的な手段ではなく、もしｐＨを６以上のｐＨに保つならば天然の生成物ですらもより高い収率および純度で単離することができると信じられる。天然の生成物に対する単離方法についての詳細な記述に関しては以下を参照のこと：Ｖａｎ Ｈｅｕｅｎｏｏｒｔ， Ｙ． ら「Ｍｅｍｂａｎｅ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｇｌｙｃａｎ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ： Ｐｏｓｓｉｂｌｅ Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＰＢＰ １ｂ ａｎｄ ＰＢＰ ３」Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４巻（１１）， ３５４９−３５５７頁 （１９９２）； および Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｊ． Ｓ．， ら「Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌｓ」Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２４２（１３）， ３１８０−３１９０ （１９６７）。
【００５４】
リピドＩＩは当業者にとってよく知られた通常のクロマトグラフィー方法を用いて精製することができる。クロマトグラフィー条件の特別有用な設定を実施例にて説明する。リピドＩＩは現今で入手し得るものよりより高い純度で単離される。５０％以上の純度でリピドＩＩを単離することができる。一般的には、リピドＩＩは６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９８％以上または同等の純度で、そして最適条件下では実質的に純粋な形体（＞９９％）で単離することができる。
【００５５】
本発明が特別および好ましいグループの適切なすべての組合せ並びに本明細書で云うような個々のプロセス工程またはその組合せを含むものであることを理解すべきである。
【００５６】
リピドＩＩアナログの一般的な製造方法
変数を本明細書に記述した化学式Ｉの化合物は、適切な条件下で脱保護剤の存在の下で変数を本明細書に記述した化学式２の
【化２４】
2004501085.tif 000014
化合物からＰｇ０およびＰｇ３基を除去し、並びにＰ基を脱保護することによって製造することができる。特別なＰｇ０およびＰｇ３基はアセチルまたは類似のものである。特別な脱保護剤は水酸化ナトリウム水溶液またはそれに類するものである。特別な脱保護の条件は２時間撹拌しながら１，４−ジオキサン：水の約１：１溶液中で脱保護を行うことを含む。
【００５７】
変数を本明細書に記述した化学式２の化合物は、Ｌ１が脱離基であり、他の変数が本明細書に記述した化学式４の活性化したホスフェートを、Ｂ２が塩基であってＸが本明細書に記述した化学式３のモノホスフェートで適切なカップリングの条件の下にて処理することによって製造することができる。
【化２５】
2004501085.tif 000015
特別なＬ１はイミダゾリルまたはそれに類するものである。特別な条件は、活性化したホスフェートを、モノホスフェート（Ｅｔ３ＮＨ＋塩）に、１Ｈ−テトラゾールの存在下で（１当量）に、ＤＭＦ／ＴＨＦ中で約４日間にわたりほぼアルゴンの雰囲気下さらすことを含む。
【００５８】
変数が本明細書中に記述された化学式３の化合物は、（１）Ｐｇ９がホスフェート保護基であり、Ｘが本明細書中に記述された化学式２２の化合物を適切な条件下で脱保護剤の存在のもとで脱保護を行うこと、並びに（２）Ｂ２が本明細書中に記述された化学式Ｂ２の塩基で得られた化合物を処理することによって製造することができる。
【化２６】
2004501085.tif 000016
特別なＰｇ０ホスフェート−保護基は２，２，２−トリクロロエチルまたはそれに類するものである。化学式Ｂ２の特別な塩基はトリエチルアミンまたはそれに類するものである。特別な脱保護剤はプロトン源（例えば、ＨＣｌ）またはそれに類するものの存在下にあるＺｎ粉またはそれら類するものである。特別な条件は、ＴＨＦ（２−５ｍＬ）中０．１Ｍ  ＨＣｌまたは同様なものを０℃にて化学式２２（約１当量）および亜鉛粉（約１２当量）またはそれらに類するものを含むＴＨＦ中の撹拌せる溶液または懸濁液またはそれらに類するものに約１時間に亘り２回にわけて滴下しながら加えることを含む。反応混合物を約０℃で撹拌して、ＴＬＣによる完了へと続く。完了後、反応混合物をＥ２Ｏまたはそれに類するものと１ＮＨＣまたはそれに類するものとの間に分配し、亜鉛粉またはそれに類するものが完全に溶けるまで撹拌する。相分離し、水相をＥｔ２Ｏで（Ｘ３）またはそれに類するもので抽出する。集めたＥｔ２Ｏの層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し濾過する。トリエチルアミンまたはそれに類するもの（１−３ｍＬ）を加え、その有機相を真空中で濃縮し、化合物３を得る（８０−９５％）。
【００５９】
変数が本明細書中に記載された化学式２２の化合物は、Ｌ３が脱離基であり、Ｐｇ９が本明細書中に記載された化学式２３の化合物を、Ｘが本明細書中に記載された化学式２４のリピドアルコールと適当な条件下でカップリングさせることにより製造することができる。
【化２７】
2004501085.tif 000017
特別なＬ３はＣｌまたはそれに類するものである。特別な条件は、化学式２３の化合物（約１．５当量）およびＮ，Ｎ−ジメチルアミノ−ピリジン（約０．２当量）またはそれに類するものを無水ＣＨ２Ｃｌ２（約０．１Ｍ）またはそれに類するものに含まれるリピドアルコール（約１当量）の溶液に加えることを含む。トリエチルアミン（３当量）またはそれに類するものを滴下し、その反応を室温で撹拌する。ＴＬＣで明示される反応の完了後、反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２またはそれに類するものと１Ｎ　ＨＣｌまたはそれに類するものの間に分配する。水層をＣＨ２Ｃｌ２で（Ｘ３）またはそれに類するもので抽出する。有機層を続いてＨ２Ｏおよびブラインまたはそれらに類するもので洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）またはそれに類するもので乾燥し、真空中で濃縮する。残渣をヘキサン中の約１０％ＥｔＯＡｃまでのヘキサングラジエントで溶出するシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーで精製する。関連する画分を濃縮することによって化学式２２の化合物（約８０−約９０％）を無色の油状のものとして得る。
【００６０】
変数が本明細書中に記載されている化学式４の化合物は、Ｂが塩基であり、他の変数が本明細書に記載されている化学式６の化合物を適切な条件下で化学式５の活性化剤とカップリングすることにより製造することができる。
【化２８】
2004501085.tif 000018
【００６１】
カップリング反応は、最初ホスフェートジエステル中間体を生成し、ＣＯ２を発生させて活性化した化学式４のホスフェートを生成する。特別な活性化剤はＣＤ１またはそれに類するものである。特別な塩基のカウンターイオンＢＨ＋はＣ５Ｈ５ＮＨ＋またはそれに類するものである。特別な条件は無水ＤＭＦ／ＴＨＦまたはそれに類するものの中で約２時間かけて行われることを含む。相当するホスフォイミダゾレート誘導体への転化によるアノマーホスフェートの求電子活性化Ｆａｎｇ、ｘ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｏｔｔ．， ５巻， ２７０１頁 （１９９５） に記述されている。
【００６２】
変数が本明細書中に記述されている化学式６の化合物は（１）適切な条件のもとで水素添加剤の存在下にて、変数が本明細書中に記述されている化学式７の化合物のＰｇ６基を除去することにより、および（２）リン酸塩を形成するために得られる化合物を化学式Ｂの塩基で処理することにより製造することができる。
【化２９】
2004501085.tif 000019
特別なＰｇ６基はベンジルまたはそれに類するものである。特別な水素添加剤はＰｄ／Ｃまたはそれに類するものである。特別な水素添加条件は、化合物７を、反応液の脱ガスを促進するため氷槽中に冷却したアルコール（好ましくはメタノール）またはそれに類するもの中の約１０％Ｐｄ／Ｃの懸濁質に加えることを含む。この溶液はその後、室温に温めて大気圧下で１．５時間水素添加を行う。化学式Ｂの特別な塩基はピリジンおよびそれに類するものである。
【００６３】
変数が本明細書中に記載された化学式７の化合物は、適切な条件の下で−ＯＬが脱離基であり、他の変数が本明細書中に記載された化学式９の活性化したエステルを、Ｐが本明細書中に記載された化学式８のアミノ酸／ペプチドとカップリングすることによって製造することができる。
【化３０】
2004501085.tif 000020
特別な−ＯＬはＮ−オキシサクシンイミドまたはそれに類するものである。特別な条件はｉＰｒ２ＮＥｔおよびそれに類するものと一緒に化学式８および９の化合物をＤＭＦまたはそれに類するものの中に溶解し、アルゴンまたはそれに類するものの下で室温で約８時間撹拌することを含む。
【００６４】
変数が本明細書中に記載されている化学式８の化合物は、当業界で公知な普通のペプチド合成方法によって製造される。
【００６５】
変数が本明細書中に記載されている化学式９の活性化されたエステルは、変数が本明細書中に記載された化学式１１の酸を適切な条件下で化学式１０の化合物でエステル化することによって製造することができる。
【化３１】
2004501085.tif 000021
特別なＬＯＨはヒドロキシサクシンイミドまたはそれに類するものである。特別な条件は無水のＤＭＦまたはそれに類するものの中に化学式１１の化合物、ＥＤＣＩまたはそれに類するものおよびＮ−ヒドロキシサクシンイミドまたはそれに類するものを溶解すること並びに１８時間撹拌することを含む。
【００６６】
変数が本明細書中に記載されている化学式１１の酸は、変数が本明細書中に記載された化学式１２の化合物のＰｇ４基を適切な条件の下でカルボキシ−脱保護剤の存在下で除去することによって製造することができる。
【化３２】
2004501085.tif 000022
カルボキシ脱保護は、カルボキシ保護基の性質、すなわちそれが酸、塩基または水素添加条件の下で除去しうる（不安定な）かどうかおよび脱保護を受ける化合物中の他の反応性がある部分の性質に依存する適切な脱保護剤を用いて行われる。すなわち、脱保護剤は、もし付随の反応が望まれないならば、他の反応部分に影響を与えることなしに行われるよう選択される。特別なＰｇ４基は−ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈまたはそれに類するものである。特別な脱保護剤はＤＢＵまたはそれに類するものである。特別なその条件は化合物１２をＣＨ２Ｃｌ２またはそれに類するものに溶解することおよびＤＢＵまたはそれに類するものをアルゴン雰囲気下またはそれに類するものの下で滴下することを含む。
【００６７】
変数が本明細書中に記載されている化学式１２のホスポトリエステルは、（１）変数が本明細書中に記載されている化学式１３のラクトールを、Ｌ２が遊離基であって、その他の変数が本明細書中に記載されている化学式Ｌ２Ｐ（ＯＰｇ６）２の化合物と適切な亜リン酸塩化条件のもとでカップリングすることにより、及び（２）得られた亜リン酸塩を適切な酸化条件のもとで酸化剤の存在下でリン酸塩に酸化することにより製造することができる。
【化３３】
2004501085.tif 000023
特別な化学式Ｌ２Ｐ（ＯＰｇ６）２の化合物はＥｔ２ＮＰ（ＯＢｎ）２またはそれに類するものである。特別な亜リン酸塩化の条件は、無水のＣＨ２Ｃｌ２またはそれに類するものに含まれているラクトンを２５℃でアルゴンまたはそれに類するもののもとで無水のＣＨ２Ｃｌ２またはそれに類するものに含まれているテトラゾールまたはそれに類するものおよびＥｔ２ＮＰ（ＯＢｎ）２またはそれに類するものの激しく撹拌した懸濁液に急速に加えることを含む。特別な酸化剤はＨ２Ｏ２またはそれに類するものである。特別な酸化条件はホスフェートをＴＨＦ中に溶解することおよび−８０℃に冷却することを含む。その後、Ｈ２Ｏ２を激しく撹拌した溶液に滴下する。添加が終った後、氷浴を除き混合物を約２時間にわたりほぼ室温にまで温める。亜リン酸塩化／カップリングの一連は、例えばＷｏｎｇ，Ｃ．−Ｈ，ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１５巻、２２６０頁（１９９３）；Ｈｉｔｃｈｃｏｃｋ，Ｓ．Ａ．，ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２０巻、１９１６頁（１９９８）；およびＷａｌｋｅｒ，ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２０巻、２４８４頁（１９９８），に記述されており、これらはすべて本明細書の一部を構成する。
【００６８】
変数が本明細書中に記載されている化学式１３のラクトールは、適当な条件のもとでヒドロキシ−脱保護剤の存在下で、変数が本明細書中に記載されている化学式１４のアノマーベンジルエーテルのＰｇ５基を除去することによって製造することができる。
【化３４】
2004501085.tif 000024
特別なＰｇ５基はベンジルまたはそれに類するものである。特別なヒドロキシ脱保護基はＨ２／Ｐｄ／Ｃまたはそれに類するものである。特別な条件はベンジルエーテルを、ＨＣｌ／酢酸またはそれに類するものに溶解すること、および得られた溶液を、ＨＣｌ／酢酸またはそれに類するものに含まれる約１０％Ｐｄ／Ｃの懸濁質に添加することを含む。その反応混合物を約１．５時間約２５℃でほぼ水素の雰囲気中で撹拌する。
【００６９】
リピドＩＩの一般的な製造例
Ａが本明細書中に記載されているリピドＩＩは、変数が本明細書中に記載されている化学式２ａの化合物のＰｇ０、Ｐｇ３、Ｐｇ７およびＰｇ８基を適切な条件のもとで脱保護剤の存在下で除去することによって製造することができる。
【化３５】
2004501085.tif 000025
特別なＰｇ０およびＰｇ３基はアセチルまたはそれに類するものである。特別なＰｇ７基はトリフルオロアセチルまたはそれに類するものである。特別なＰｇ８基はメチルまたはそれに類するものである。特別な脱保護剤は水酸化ナトリウムの水溶液またはそれに類するものである。特別な条件は、約２時間の撹拌を行いながら１，４−ジオキサン：水の約１：１の溶液中で脱保護を行うことを含む。ペプチドグリカンに関係する構造にあるグルタミンへイソ−グルタミンが塩基触媒によって転移することが観察された故に、実質的により長時間にわたってペンタペプチドを水酸化イオンに媒介される脱保護条件にさらす場合注意しなければならない（例えば、本明細書の一部を構成するＫｅｇｌｅｖｉｃ，Ｄ．およびＡ．Ｅ．Ｄｅｒｏｍｅ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．，１８６巻、６３頁（１９８９）：並びにＫｅｇｌｅｖｉｃ，Ｄ．およびＪ．Ｋｉｄｒｉｃ，Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．，１１巻、１１９頁（１９９２）を参照のこと）。
【００７０】
変数を本明細書中に記載する化学式２ａの化合物は、変数を本明細書中に記載する化学式４ａの活性化ホスフェートを適切な条件下で、Ｂ２を本明細書中に記載する化学式３ａのウンデカプレニルモノホスフェートとカップリングすることによって製造することができる。
【化３６】
2004501085.tif 000026
特別なＬ１はイミダゾリルまたはそれに類するものである。特別な化学式３ａの化合物はウンデカプレニルモノホスフェート（ビス−ＮＨ４＋塩）である。特別な条件は、アルゴンまたはそれに類する雰囲気下で、ＤＭＦ／ＴＨＦまたはそれに類するものの中で約４日間にわたり、１Ｈ−テトラゾールの存在下にて活性化したホスフェートをウンデカプレニルモノホスフェート（ビス−ＮＨ４＋塩）にさらすことを含む。
【００７１】
変数を本明細書中に記載する化学式４ａの化合物は、適切な条件のもとで変数を本明細書中に記載する化学式６ａの化合物を、化学式５の活性剤とカップリングすることによって製造することができる。
【化３７】
2004501085.tif 000027
そのカップリング反応は最初ホスフェートジエステル中間体を形成し、ＣＯ２を発生させて化学式４ａの活性化したホスフェートを生成する。特別な活性化剤はＣＤＩまたはそれに類するものである。特別な塩基の対イオンＢＨ＋はＣ５Ｈ５ＮＨ＋またはそれに類するものである。特別な条件は約２時間無水のＤＭＦ／ＴＨＦまたはそれに類するものの中で反応させることを含む。それに相当するホスフォイミダゾレート誘導体への変換によるアノマーホスフェートの求電子的活性化がＦａｎｇ，Ｘ．ら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，５巻、２７０１頁（１９９５）に記載されている。
【００７２】
変数を本明細書中に記載する化学式６ａの化合物は、（１）適切な条件のもとで水素添加剤の存在下にて、変数を本明細書中に記載する化学式７ａの化合物のＰｇ６基を化合物から除去すること、および（２）ホスフェート塩を生成するために得られた化合物を化学式Ｂの塩基で処理することによって製造することができる。
【化３８】
2004501085.tif 000028
特別なＰｇ６基はベンジルまたはそれに類するものである。特別な水素添加剤はＰｄ／Ｃまたはそれに類するものである。特別な水素添加条件は、溶液の脱ガスを助けるために氷浴で冷却したアルコール（好ましくはメタノール）またはそれに類するものに含まれる約１０％のＰｄ／Ｃまたはそれに類するものの懸濁液に化学式７ａの化合物を加えることを含む。その後、その溶液を約室温まで温めて約１．５時間ほぼ大気圧中で水素添加を行う。特別な化学式Ｂの塩基はピリジンまたはそれに類するものである。
【００７３】
変数を本明細書中に記載する化学式７ａの化合物は、適切な条件のものとで変数を本明細書中に記載する化学式９ａの活性化エステルを、変数が本明細書中に記載されている化学式８ａのペプチドとカップリングすることによって製造することができる。
【化３９】
2004501085.tif 000029
特別なＯＬ基はＮ−オキシサクシンイミドまたはそれに類するものである。特別な条件はＤＭＦまたはそれに類するものの中にｉＰｒｇＮＥｔまたはそれに類するものと一緒に化学式８ａと９ａの化合物を溶解すること、そしてアルゴンまたはそれに類するものの下でおよそ室温にて約１８時間撹拌することを含む。カルボキシル活性化ペプチドカップリング反応中にＬ−Ａｌａ α−ステレオ中心にエピメリ化が行っていることに対する証拠はない。
【００７４】
変数を本明細書中に記載する化学式８ａの化合物は、当業界に公知なる通常のペプチド合成方法によって製造される。
【００７５】
ＮＡＧ−ＮＡＭ二糖類出発物質の一般的な製造例
変数を本明細書中に記載する化学式１４の化合物は、適切な条件のもとでアミン脱保護剤およびアシル化剤の存在下で、変数が本明細書中に記載されている化学式１５の化合物のＰｇ２基をアセチル基と交換することによって製造することができる。
【化４０】
2004501085.tif 000030
アミン脱保護は、アミン脱保護基の性質、すなわちそれが酸、塩基または水素添加条件により除去されうる（不安定な）かどうか、および脱保護を受ける化合物中の他の反応性部分に依存する適切な脱保護剤を用いて行うものであり、すなわち、もし付随の反応が好ましいものでなければ脱保護剤は他の反応性の部分に影響を与えることなしに脱保護を行うように脱保護剤の選択を行う。特別なアミン保護基は２，２，２−トリクロロエトキシカルボニルまたはそれに類するものである。特別な脱保護剤はプロトン源（例えば酢酸）またはそれに類するものの存在下におけるＺｎ粉またはそれに類するものである。特別なアシル化剤は無水酢酸またはそれに類するものである。特別な反応条件は、Ａｃ２Ｏ：ＡｃＯＨの２：１混合物またはそれに類するものに含まれる化学式８の化合物の溶液に対して、Ｚｎ粉またはそれに類するもの並びにＴＨＦ：Ａｃ２Ｏ：ＡｃＯＨの３：２：１混合物を加えることを含む。
【００７６】
変数を本明細書中に記載する化学式１５の化合物は、適切な条件のもとで加溶媒分解剤およびアシル化剤の存在下で、変数が本明細書中に記載される化学式１６の化合物のＰｇ１基をＰｇ３基に置き換えることによって製造することができる。
【化４１】
2004501085.tif 000031
加溶媒分解反応は、ヒドロキシ保護基の性質に依存する適切な加溶媒分解剤を用いて行い、すなわち、加溶媒分解剤はもし付随する反応が望ましいものでないならば、他の反応部分に影響を与えることのない加溶媒分解が行われるよう選択する。特別なヒドロキシ保護基はベンジルまたはそれに類するものである。特別な加溶媒分解剤はＺｎＣｌ２またはそれに類するものである。特別なアシル化剤は無水酢酸またはそれに類するものである。特別な反応条件はＡｃ２Ｏ：ＡｃＯＨの約２：１混合物中またはそれに類するものの中で加溶媒分解／アシル化を行うことを含む。
【００７７】
オルソゴナルな保護の形にある化学式１６の化合物、中心の二糖類のコアの合成は意義のある合成についての挑戦を呈する。例えば、３つの直交性を有する保護スキームの同定はペンダントなヒドロキシ基の３タイプ（即ち、アノマーＯＨ、末端ＯＨおよびカルボキシルＯＨ）を選択的に脱マスクをなすために非常に望まれるものである。加えるにβ−［１，４−］グルコシド結合の立体選択性の構築は反応性のグリコシルカチオン供与体を発生させるために用いられる方法とは無関係に困難なものと思われる。例えば、グリコシルカチオンに関しては、次の固有の特性の各々がグリコシルカチオン受容体の反応性喪失に寄与している：（ｉ）グリコピラノースに基づく受容体のＣ（４）−ヒドロキシ基の本来的な求核性の欠如、（ｉｉ）ムラミン酸に基づく受容体のＣ（４）−ヒドロキシの周囲への更なる立体的群りおよび（ｉｉｉ）それらのグルコピラノーズに基づく対応物２−デオキシ２−アシルアミノグルコピラノース受容体に比べて更なる電子的脱活性化。グリコシルカチオン供与体に関しては、β−［１，４−］グルコシド結合の形成の傾向をもつ活性化方法が必要である。グリコシルカチオンの発生のための反応条件は、また供与体と受容体の両者にある官能基と相入れるものでなければならない。
【００７８】
変数を本明細書中に記載する化学式１６の化合物は、Ａ１がＢｒまたはＣｌ（好ましくはＢｒ）でありおよび他の変数が本明細書中に記載されている化学式１７のムラミルアミド化合物を、適切な条件下で変数が本明細書中に記載されている化学式１７のグルコピラノシル化合物とカップリングすることによって製造することができる。
【化４２】
2004501085.tif 000032
特別な条件は、綿密な無水のＫｏｎｉｇｓ−Ｋｎｏｎ条件（例えば、モレキュラーシーブを含む銀トリフレート／ジクロロメタン溶液中）またはそれに類するもののもとで行うことを含む。
【００７９】
化学式１７の化合物はＩｍｏｔｏ，Ｍ．Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，６０巻、２２０５頁（１９８７）に記載されている方法に従って行う。
【００８０】
変数を本明細書中に記載する化学式１８の化合物は、変数が本明細書中に記載される化学式２０の酸を、適切な条件のもとで変数が本明細書中に記載される化学式１９の保護されたアミノ酸／ペプチド化合物とカップリングすることによって製造することができる。特別な条件は、化学式１９の化合物がトシレート塩またはそれに類するものとして加えられるＣＨ２Ｃｌ２またはそれに類するものの中に含まれるＮＭＭまたはそれに類するものおよび２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジンおよびそれに類するものの溶液中でカップリング反応を行うことを含む。
【００８１】
Ｐｇ１がベンジルであり、その他の変数が本明細書中に記載する化学式１８ａの化合物は、変数を本明細書中に記載する化学式２１の化合物を適切な条件のもとで還元剤で処理することによって製造
【化４３】
2004501085.tif 000033
することができる。特別な還元剤はトリエチルシランおよびそれに類するものである。特別な条件はＣＨ２Ｃｌ２またはそれに類するものおよびＴＦＡまたはそれに類するものの中で約０℃にて還元することを含む。この反応はムラミン酸誘導体のＣ（６）ＯＨにおけるベンジル保護／活性化のレジオ選択的な導入のための有効な手段を提供する。
【００８２】
ＤｅＮｉｎｎｏ，Ｍ．Ｐ．，ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３６巻、６６９頁（１９９５）に記載されているように、化学式２１の化合物のエステル誘導体をトリフルオロ酢酸およびトリエチルシランで処理する時、ほんの少量の化学式１８ａのアナログ化合物が観測されることが知られている。形成される大部分の生成物はスキームＩに示すようにラクトンである。
【化４４】
2004501085.tif 000034
酸触媒のラクトン化は還元的なリングの開環と競う速度で進行し、従って望まないラクトンヘとなる。本発明においては、しかしながら、エステル結合の代わりにアミド結合を導入することによりラクトンへの転換を排し、かくして所望の生成物（化合物１８ａ）が非常に高い収率で単離される。
【００８３】
変数を本明細書中に記載する化学式２１の化合物は、変数が本明細書中に記載さる化学式２０ａの酸を、適切な条件のもとで変数が本明細書中に記載されている化学式１９の保護されたアミノ酸とカップリングすることによって製造することができる。
【化４５】
2004501085.tif 000035
特別な条件は、保護さているアミノ酸がトシレート塩またはそれに類するものとして加えられるＣＨ２Ｃｌ２またはそれに類するものの中に含まれるＮＭＭまたはそれに類するおよび２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジンの溶液中でカップリング反応を行うことを含む。
【００８４】
一般的な実施例
記述する場合を除けば、窒素の陽圧下で連続的に撹拌を行って反応を進める。試薬と溶媒は買い求めて精製することなしに用いる。ＴＬＣはＥ．Ｍｅｒｃｋからの２５４ｎｍ蛍光指示計をもった０．２５ｎｍシリカゲルの６０枚プレートを用いて実施する。プレートをカバーの付いたチャンバー内に広げ紫外線で可視化し、またはエタノール中にある５％リンモリブデン酸（または別法としてＣＡＭ）で処理し加熱することにより発色させる。フラッシュクロマトグラフィーはＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅから購入したシリカゲル６０、２３０−４００メッシュ（０．００４−０．０６３ｍｍ粒子サイズ）を用いて実施する。ＨＰＬＣ分析と精製はＤｙｎａｍａｘ  Ｃ８カラムを用いて明細書に記した溶媒系と流速で実施する。ＮＭＲスペクトルはテトラメチルシラン内部標準からのダウンフィールトの１００万分の１（ｐｐｍ）化学シフトとして報告されている。１Ｈ　ＮＭＲスペクトルは５００．１８ＭＨｚのＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅスペクトロメーター、４００．２１ＭＨｚのＶａｒｉａｎ  Ｍｅｒｅｕｒｙスペクトロメーターまたは３００．１５ＭＨｚのＧＥ  ＱＥ−３００スペクトロメーターのいずれかで、示されている溶媒内で記録される。１３Ｃ　ＮＭＲスペクトルは各々１２５．７８ＭＨｚ、１００．１５ＭＨｚおよび７５．４８ＭＨｚの前述のスペクトロメーターで示されている溶媒中で記録される。ＩＲスペクトルはＮｉｃｏｌｅｔ  ５１０Ｐ  ＦＴ−ＩＲスペクトロメーターで記録する。電子線照射イオン化質量分析、（ＥＳＩ−ＭＳ）はＭｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｐｌｏｔｆｏｏｍ  ＬＣＺスペクトロメーターで記録される。高分解質量分析はＭｉｃｒｏｍａｓｓ  ＱＴＯＦ質量スペクトロメーターで記録される。
【００８５】
ＮＡＧ−ＮＡＭ二糖類出発物質の製造例
ＮＡＧ−ＮＡＭ二糖類出発物質を製造するための合成法をスキームＩＩにそのあらましを述べ下に例示する。
【化４６】
2004501085.tif 000036
【００８６】
Ｉ．ベンジル保護の位置選択的結合およびペプチドリンカーの結合
【化４７】
2004501085.tif 000037
【００８７】
ベンゼン（７５０ｍＬ）中の（Ｌ）−アラニン（１５．０ｇ、１６８ｍｍｏｌ）、フェニルスルフォニルエタノール（３７．６ｇ、２０２ｍｍｏｌ）およびＴｓＯＨ・Ｈ２Ｏ（３５．２ｇ、１８５ｍｍｏｌ）をＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋ装置を用い還流する。１６時間後に付加的なフェニルスルフォニルエタノール（２５ｇ、１３５ｍｍｏｌ）およびＴｓＯＨ・Ｈ２Ｏ（２５ｇ、１３４ｍｍｏｌ）をベンゼン（１８０ｍＬ）と一緒に加えて、その反応混合物を一晩還流する。真空中で濃縮し生成物、化合物１を白色固体として定量的な収率で得た。
【数１】
2004501085.tif 000038
【００８８】
０℃にてＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）中のベンジルＮ−アセチル−４，６−ベンジリジンムラミン酸（２０．０ｇ、４２．５ｍｍｏｌ）のスラリーにＮ−メチルモルフォリン（ＮＭＭ）（４．６７ｍＬ、４２．５ｍｍｏｌ）および２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（８．９４ｇ、５１．０ｍｍｏｌ）を加える、０℃で４５分間撹拌した後、ＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍｍｏｌ）、次いでＮＭＭ（９．３４ｍＬ、８３．０ｍｍｏｌ）およびＬ−アラニン（フェニルスルフォニルエチルエステル、トシレート塩）（１５．４ｇ、５１．０ｍｍｏｌ）（即ち、化合物ｉ）を上の反応混合物に加える。得られた溶液を室温までゆっくりと温めて３日間撹拌する。反応混合物をその後濾過する。濾液を最初１Ｎ  ＨＣｌ、その後ブラインで洗浄し、乾燥する（ＭｇＳＯ４）。その後濾液は減圧下で濃縮し、トルエンで蒸発して一晩真空乾燥を行って生成物、化合物ｉｉ（２３．５ｇ、９５％）を白色の固体として得る。
【数２】
2004501085.tif 000039
【００８９】
トリエチルアミン（１６．４ｍＬ、１０３ｍｍｏｌ）を０℃にてＣＨ２Ｃｌ２（１５０ｍＬ）中の化合物ｉｉ（１２．０ｇ、２０．６ｍｍｏｌ）の溶液に加え、次いでＴＦＡ（８．１ｍＬ、１０３ｍｍｏｌ）を滴下する。その混合物を５時間撹拌し、その後ＴＦＡ（５．０ｍＬ）の付加的な３当量を加え０℃で一晩撹拌した。ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ）で確証される反応の完了と共に、その反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、その後ＮａＨＣＯ３をゆっくりと加え、ＴＦＡを中性とする。水層をＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。有機層をブラインで洗浄し（Ｘ２）、その後乾燥（ＭｇＳＯ４）して真空で濃縮する。Ｐｒｅｐ−ＬＣ（ＥｔＯＡｃに対し７０：３０  ＥｔＯＡｃ：ヘキサンで溶出）による精製の後、ＣＨ２Ｃｌ２およびイソプロピルエーテルからの再結晶化により生成物、化合物ｉｉｉ（７．４ｇ、６１％）を白色の固体として得る。
【数３】
2004501085.tif 000040
【００９０】
ＩＩ．グリコシド化
【化４８】
2004501085.tif 000041
化合物ｉｖはＩｍｏｔｏ，Ｍ，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，６０巻、２２０５頁（１９８７）に記載されている方法を用いて製造する。
【００９１】
ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）なかの化合物ｉｉｉ（４．５９ｇ、６．４３ｍｍｏｌ）の溶液に対し４Åモレキュラーシーブ（１０ｇ）および銀トリフレート（５．１２ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）を加える。この混合物に対しＣＨ２Ｃｌ２（９．５ｍＬ）中の新たに製造した化合物ｉｖ（１０．８ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）の溶液を１時間にわたり４部で加える。出発物質の各々は使用に先立って乾燥し、その反応は無水状態に制御されて実行する。室温で２４時間撹拌した後、その反応混合物をセライトを通して濾過しＣＨ２Ｃｌ２で洗浄する。有機層をＮａＨＣＯ３、ブラインで洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）、真空中で濃縮する。ＥｔＯＡｃ中の５０％ヘキサン、ＥｔＯＡｃ中の１５％ヘキサン、ＥｔＯＡｃ、およびＥｔＯＡｃ中の５％ＭｅＯＨの溶媒溶出を用いるシリカゲル（フラッシュ溶出系）のカラムクロマトグラフィーによる精製により生成物、化合物ｖ（５．７３ｇ、７６％）を白色の固体とし、未反応の出発物質、化合物ｉｉｉ（６３０ｍｇ、１４％）と同じに得る。
【数４】
2004501085.tif 000042
【００９２】
ＩＩＩ．保護基の交換
【化４９】
2004501085.tif 000043
Ａｃ２Ｏ：ＡｃＯＨ（２：１、１１ｍＬ）中の化合物ｖ（１．９ｇ、１．５７ｍｍｏｌ）の溶液に対し、Ａｃ２Ｏ：ＡｃＯＨ（２：１、５ｍＬ）中のＺｎＣｌ２（２．１ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）の溶液を一度に加える。ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ）で判断される反応の完了（２４時間）と共にＺｎ粉（４．１ｇ、６２．８ｍｍｏｌ）およびＴＨＦ：Ａｃ２Ｏ：ＡｃＯＨ（３：２：１、２５ｍＬ）の混合物を上述の反応混合物に加え、並びに出発物質がＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ）により明示されなくなるまで撹拌することによってＴｒｏｃを除去する。反応混合物をセライトを通して濾過し、ＥｔＯＡｃで洗浄した後、減圧下で濃縮する。その残渣を繰返しトルエンと共に蒸発し、少量残っているＡｃ２ＯおよびＡｃＯＨを除した後、ＥｔＯＡｃで希釈する。有機層をＮａＨＣＯ２（Ｘ２）、Ｈ２Ｏ（Ｘ２）およびブラインで洗浄する。有機の層をその後乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、真空中で濃縮する。ＥｔＯＡｃ中の２％ＭｅＯＨで溶出するシリカ（フラッシュ溶出系）でカラムクロマトグラフィーにて精製することにより生成物、化合物ｖｉ（１．０ｇ、６７％）を白色固体として得た。
【数５】
2004501085.tif 000044
【００９３】
テトラペプチド出発物質の製造
Ｉ．Ｃｂｚ−Ｄ−ｉＧｌｎ（化合物ｉｘ）の製造
【化５０】
2004501085.tif 000045
１，４−ジオキサン（６０ｍＬ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）なかのＺ−Ｄ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ（５．００ｇ、１４．８２ｍｍｏｌの化合物ｖｉｉ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（１．７１ｇ、１４．８６ｍｍｏｌ）の溶液をＮ２下で６時間撹拌する。水酸化アンモニウム（０．７ｍＬ、１７．７８ｍｍｏｌ）を加えた後、その溶液６時間撹拌して真空中で濃縮する。得られる油状のものを酢酸エチル（２００ｍＬ）とブライン（２００ｍＬ）中に分配する。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過して真空中で濃縮し固体とする。その固体をフラッシュシリカゲル（酢酸エチル：ヘキサン−１：１）上でクロマトグラフィーにかけＣｂｚ−Ｄ−ｉＧｌｎ（ＯｔＢｕ）（３．２ｇ、６４％、化合物ｖｉｉｉの収率）を白色固体として得た。
【数６】
2004501085.tif 000046
【００９４】
トリフルオロ酢酸（２５ｍＬ）を塩化メチレン（２５ｍＬ）中のＣｂｚ−Ｄ−ｉＧｌｎ（ＯｔＢｕ）（３．２０ｇ、９．５２ｍｍｏｌの化合物ｖｉｉｉ）溶液に加え、その混合物をＮ２下で３時間撹拌する。その溶液を蒸発し白色の固体を得てエチルエーテルの助けにより濾過し、高度の真空下で乾燥し、均一なＣｂｚ−ｉＧｌｎ（２．２ｇ、８２％収率の化合物ｉｘ）を得る。
【数７】
2004501085.tif 000047
【００９５】
ＩＩ．Ｎα−Ｂｏｃ−Ｎγ−（ＴＦＡ）−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＭｅ（化合物ｘｖｉ）の製造
【化５１】
2004501085.tif 000048
【００９６】
Ｃｂｚ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ（１．２０ｇ、３．９ｍＭの化合物ｘ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹから入手することができる）を１０ｍＬのメタノール中に溶解し、０．３ｍＬ  ＴＦＡ（３．９ｍＭ）を含む１５ｍＬのメタノール中の５００ｍｇＰｄ（ＯＨ）２の懸濁液に加える。その混合物を２時間、水素の１気圧（バルーン圧力）下で激しく撹拌し、タルクを通して濾過し、真空中で濃縮して、得られた化合物ｘｉ（Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ）のＴＦＡ塩は真空下で保存する。Ｎα−ＢＯＣ−Ｎγ−（ＴＦＡ）−Ｌ−リジン（１．４０ｇ、４ｍＭの化合物ｘｉｉ、Ｂａｃｈｅｍ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡから入手し得る）および８３０ｍｇＤＣＣ（４．０ｍＭ）を別々に１５ｍＬの乾燥したＴＨＦ中に溶解し、０℃にて３時間撹拌する。その後、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（４６０ｍｇ、４．０ｍＭ）を加え、その後、そのフラスコを室温にまで温めてさらに１時間撹拌し化合物ｘｉｉｉ、化合物ｘｉｉのＮＨＳ−活性化エステルを得る。その後、その反応混合物を化合物ｘｉを含むフラスコへ直接に濾過し、１．４ｍＬのジイソプロピルエチルアミン（０．８ｍＭ）を添加する。３０分後にその反応混合物を真空中で濃縮し、酢酸エチルに溶解し、ＮａＨＣＯ３の飽和水溶液および水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した後、真空下で濃縮し、白色の泡状のもの（１．４ｇ、２．８ｍＭ、７２％収率の化合物ｘｉｖ）を得る。単離した物質は更なる精製を行わず、次の工程に使用した。
【数８】
2004501085.tif 000049
【００９７】
ＩＩＩ．化合物ｘｖｉｉｉの製造
【化５２】
2004501085.tif 000050
トリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）を塩化メチレン（１０ｍＬ）中の化合物ｘｉｖ（２．５ｇ、５．０ｍｍｏｌ）の溶液に加え、その混合物を２．５時間撹拌する。その溶液を真空中で濃縮し、高い真空度のもとで乾燥し、化合物ｘｖ、化合物ｘｉｖのトリフルオロ酢酸塩を油状のものとして得る。１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（１．８８ｇ、９．８１ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシサクシンイミド（１．１３ｇ、９．８１ｍｍｏｌ）を別々にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２５ｍＬ）中のＣｂｚ−Ｄ−ｉＧｌｎ（２．２０ｇ、７．８５ｍｍｏｌの化合物ｘｖｉ）の溶液に加える。その混合物を３時間撹拌し、水で１００ｍＬに希釈し、酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出する。その酢酸エチル溶液を飽和のＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）で、続いてブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥する。有機層を蒸発しＣｂｚ−Ｄ−ｉＧｌｎ（ＮＨＳ）（化合物ｘｖｉｉの１．９６ｇ、５．１９ｍｍｏｌ）、化合物ｘｖｉのＮＨＳ−活性化エステルを白色の固体として得る。かくの如くして得られる固体を無水ＤＭＦ（２５ｍＬ）中の先に製造した化合物ｘｖ（２．６０ｇ、５．０７ｍｍｏｌ）の溶液に加え、その後、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．００ｍＬ、１１．４０ｍｍｏｌ）を加える。その混合物を７２時間Ｎ２下で撹拌する。水（２００ｍＬ）を加えてその混合物を２時間撹拌する。得られる固体を濾過し、水（５０ｍＬ）で洗浄し、高度の真空下で乾燥し、化合物ｘｖｉｉｉ（２．２０ｇ、６６％収率）を得る。
【数９】
2004501085.tif 000051
【００９８】
ＩＶ．化合物ｘｉｘの製造
【化５３】
2004501085.tif 000052
塩化メチレン：エタノール１：１（１００ｍＬ）中の化合物ｘｖｉｉｉ（２．１５ｇ、３．２５ｍｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルフォン酸（６６２ｍｇ、３．２５ｍｍｏｌ）および５％Ｐｄ／Ｃ（５００ｍｇ）の混合物を室温で１．５時間６０ｐｓｉにて水素添加をする。触媒を濾過し、その溶液を泡状に蒸発する。その泡状のものを高度の真空下で乾燥し、均一な化合物ｘｉｘ（２．２０ｇ、９７％収率）を得る。
【数１０】
2004501085.tif 000053
【００９９】
ウンデカプレニルホスフェートジアンモニウム塩出発物質（化合物ｘｘ）の製造
【化５４】
2004501085.tif 000054
【０１００】
化合物ｘｘ、ウンデカプレノール（Ｃ５５）モノホスフェート、ジアンモニウム塩をＰｏｌｉｏｈ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｒｓａｗ，Ｐｏｌａｎｄから購入する。
【０１０１】
リピドＩＩの製造
先に論議した出発物質からのリピドＩＩおよび鍵となる中間体の製造に関する合成方法はスキームＩＩＩに概説し、下記に例示する。
【化５５】
2004501085.tif 000055
【０１０２】
Ｉ．ラクトール中間体（化合物ｘｘｉ）の製造
【化５６】
2004501085.tif 000056
化合物ｖｉ（１．０ｇ、１．０ｍｍｏｌ）を酢酸（５ｍＬ）中の０．２３Ｍ  ＨＣｌに溶解し、０．２３Ｍ  ＨＣｌ中に含まれる１０％Ｐｄ／Ｃ（０．５０ｇ）の酢酸（５ｍＬ）の懸濁液に加える。反応混合物を２５℃で１．５時間水素の大気圧（バルーン、１５ｐｓｉ）の下で撹拌する。薄層クロマトグラフィー（５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）による反応混合物の分析は出発物質を完全に消費していることを示す。その反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、触媒をセライドのパッドを通し濾過して集める。その濾液を注意深くＮａＨＣＯ３の水溶液（Ｘ３）および水（Ｘ２）で洗浄する。水に富んだ抽出物を集めＥｔＯＡｃで抽出する。一緒にした有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、真空内で濃縮し、ラクトール生成物を白色の固体として得る（８０８ｍｇ、８９％の化合物ｘｘｉの収率）
【数１１】
2004501085.tif 000057
【０１０３】
ＩＩ．モノホスフェートトリエステル中間体（化合物ｘｘｉｉ）の製造
【化５７】
2004501085.tif 000058
無水のジクロロエタン（１０ｍＬ）中の化合物ｘｘｉ（１．４ｇ、１．５５ｍｍｏｌ）を、２５℃でアルゴン下にて無水のジクロロメタン中のテトラゾール（５１７ｍｇ、７．３１ｍｍｏｌ）およびジベンジルＮ，Ｎ−ジエチルホスファーアミデト（１．４ｍＬ、４．７０ｍｍｏｌ）の激しく撹拌した懸濁液に対しシリンジにより急速に加える。反応混合物は数分以内に均一となる。２時間後薄層クロマトグラフィー（１０％  ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）は反応が完了したことを示す。その混合物をジクロロメタン（１０ｍＬ）で希釈した後、飽和ＮａＨＣＯ３（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）およびブライン（５ｍＬ）で洗浄した。その有機溶液をＮａ２ＳＯ４上で乾燥して、真空中で無色の油状のものになるまで濃縮し、１：１ジエチルエーテル／ヘキサンで結晶化と粉末にする。その固体を濾過し、ＴＨＦ（３０ｍＬ）に溶解し、−７８℃に冷却する。過酸化水素（３０％、２．８ｍＬ）をシリンジによって激しく撹拌する溶液に滴下する。添加が完了した後、氷浴を除き、その混合物を２時間にわたって室温まで温める。ＴＬＣ（４：１ＥｔＯＡｃ／アセトン）が反応の完了を示す。混合物を氷で冷やした飽和のＮａ２Ｓ２Ｏ３（５ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（１０ｍＬ）を加え５時間撹拌を行う。その有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥し、無色の油状のものが得られるまで真空下で濃縮し、１：１Ｅｔ２Ｏ／ヘキサンで処理をし、粉末状の白色固体を得る。白色固体を４０℃で高度の真空下で乾燥し、モノホスフェートトリエステル生成物を得る（１．４ｇ、９０％の化合物ｘｘｉｉ）。
【数１２】
2004501085.tif 000059
【０１０４】
ＩＩＩ．ジサッカイルペンタペプチド中間体の製造（ｘｘｉｉｉ）
【化５８】
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ＤＢＵ（１０２μＬ、０．６８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）中のモノホスフェートトリエステル（７９３ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌの化合物ｘｘｉｉ）にアルゴン雰囲気下で滴下する。１５分後、薄層クロマトグラフィー分析（１５％  ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）が出発物質の完全な消費を示す。その反応溶液をジクロロメタン（２０ｍＬ）で希釈し、１Ｎ  ＨＣＬ（３０ｍＬ）で洗浄する。有機層を濃縮し、その後、得られる泡状のものをＥｔ２Ｏで粉末にし、約２時間室温で静置する。濾過後、酸生成物をそのまま２時間４０℃で乾燥する（４６５ｍｇ、６８％収率）。
【０１０５】
その酸（４６５ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（８１ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）およびＥＤＣＴ（１３４ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（４ｍＬ）に溶解し、１８時間撹拌を行う。薄層クロマトグラフィー（１５％  ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）による反応混合物の分析は出発物質の完全な消費を示している。反応混合物の真空内で濃縮し、酢酸エチル（１０ｍＬ）中に溶解した後、水（１０ｍＬ）およびブライン（１０ｍＬ）で洗浄する。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、泡状のものになるまで濃縮して、ジエチルエーテル（５ｍＬ）で粉末に下後、ＮＨＳ−エステルを得た（３９８ｍｇ、７８％収率）。
【０１０６】
ＮＨＳ−エステル（３９８ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）、テトラペプチド（２５４ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌの化合物ｘｉｘ）およびｉＰｒ２ＮＥｔ（１９２μＬ、１．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３ｍＬ）中に溶解し、１８時間アルゴン下の室温で撹拌する。その反応混合物をその後、濃縮し、イソプロパノール／クロロホルム（１：９、１０ｍＬ）中に溶解し、ブラインで洗浄し（３×５ｍＬ）、ＭｇＳＯ４で乾燥し真空下で濃縮する。得られる油状のものをジエチルエーテルで粉末にし、ジサッカイル　ペンタペプチド化合物ｘｘｉｉｉ（４７４ｍｇ、化合物ｘｘｉｉからの全収率４６％）を白色固体として得た。
【数１３】
2004501085.tif 000061
【０１０７】
化合物ｘｘｉｉｉはまた別の方法によっても製造することができる。ＣＨＣｌ３（１．３ｍＬ）中のテトラペプチド化合物ｘｘ（０．０６８ｇ、０．１２９ｍｍｏｌ）の遊離アミンの溶液に対し、順次Ｈ２Ｏ（１．３ｍＬ）、二糖類の酸（０．１２８ｇ，０．１２９ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（０．０１７ｇ，０．１２９ｍｍｏｌ）を加える。その後、その混合物を０℃に冷却し、Ｎ−エチル−Ｎ’−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド（ＥＤＣＴ）（０．０２７ｇ、０．１４２ｍｍｏｌ）を加える。反応を４℃で２日間激しく撹拌する。１Ｎ  ＨＣｌを加えて層を分配する。有機層を１Ｎ  ＨＣｌ、Ｈ２Ｏ、飽和ＮａＨＣＯ３、Ｈ２Ｏおよびブラインで洗浄する。一緒に水の層をＣＨＣｌ３で抽出する（Ｘ３）。一緒にした有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、油状になるまで真空中で濃縮する。その残渣をシリカ上のノーマルフェースクロマトグラフィーにより精製し、無色の固体として化合物ｘｘｉｉｉ（５７％）を得る。この別法はＨｏ，Ｇ−Ｊ：Ｅｍｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｍ．；Ｍａｔｈｒｅ，Ｄ．Ｊ．；Ｓｈｕｍａｎ，Ｒ．Ｆ．；Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ，Ｄ．Ｊ．“Ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｉｄｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｔｗｏ−Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｏｔｅｍ．Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｙｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｌｏｗ−Ｒａｃｅｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｅｐｔｉｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９５，６０，３５６９−３５７０に記載されており、これらは本明細書の一部を構成している。
【０１０８】
ＩＶ．保護されたリピドＩＩ中間体（化合物ｘｘｉｖ）の製造
【化５９】
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ジサッカイルペンタペプチド（５３ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌの化合物ｘｘｉｉｉ）を、反応溶液の脱ガスを助けるため氷浴に冷却したメタノール（６．０ｍＬ）中の１０％Ｐｄ／Ｃ（１００ｍｇ）の懸濁液に加える。その後、その溶液を室温に温め、大気圧下で１．５時間水素添加を行う。触媒を濾過により集めて、得られる溶液をピリジン（１．０ｍＬ）で処理する。得られた混合物を灰色がかった白色固体になるまで真空下で濃縮し集め、１６時間高度の真空下（ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ１３２２，［Ｍ−Ｈ］）で乾燥する。
【０１０９】
白色がかった固体を、無色ＤＭＦ（２．５ｍＬ）および無水ＴＨＦ（２．０ｍＬ）中の１，１’−カルボニルジイミダゾール（２６．０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）混合物に加える。２時間撹拌した後、その反応が完了していることを質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ１３７２．４［Ｍ＋Ｈ］）で決定する。メタノール（０．６ｍＬ）を加えて、得られる溶液を１５分間撹拌する。その混合物をその後に真空中で濃縮し、ピリジン（１．０ｍＬ）から蒸発させる。得られた固体の物質は高度の真空下で２時間乾燥する。
【０１１０】
残渣をＤＭＦ（０．４ｍＬ）および乾燥したＴＨＦ（１．６ｍＬ）中に溶解し、それに対してＴＨＦ（０．５ｍＬ）およびＤＭＦ（０．１ｍＬ）中に含まれるウンデカプレニルホスフェートジアンモニウム塩（２１．４ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌの化合物ｘｘｘ）の溶液を加える。１Ｈテトラゾール（１．８ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を加え、その混合物をアルゴン雰囲気下で４日間撹拌する。その後にその溶液を真空下で濃縮し化合物ｘｘｖｉを得る。
【０１１１】
Ｖ．リピドＩＩの製造
【化６０】
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前の工程からの残渣（化合物ｘｘｉｖ）を１，４−ヂオキサン：水（１：１；２ｍｌ）に溶解する。１Ｎ水酸化ナトリウム（０．３ｍＬ）を加え、生じた混合物を２時間攪拌する。反応溶液を水性フィルターディスクを通して濾過し、Ｄｙｎａｍａｘ  Ｃ８  １００Å、５μ、２１．４ｍｍ  Ｘ  ２５ｃｍカラムで逆相ＨＰＬＣにより精製する。流速２１．６ｍｌ／分で３０分かけて１５：８５のＡ：Ｂ〜０：１００のＡ：Ｂのグラジエント溶出を用いる（Ａ＝０．０５Ｍ  炭酸水素アンモニウムそしてＢ＝メタノール）。生成物の保持時間は１８分である（２１４ｎｍで検出）。純粋な画分の凍結乾燥により１３．８ｍｇのリピドＩＩを得る（化合物ｘｘｉｉｉからの全体収率２４％）。Ｃ９４Ｈ１５７Ｎ９Ｏ２５Ｐ２についての超高分解ＭＳ　計算値１８７４．０７６５９；測定値１８７４．０８０２３。
【０１１２】
リピドＩＩの構造の確認
Ｉ．生化学的検定
リピドＩＩの構造的同一性はＬ−リシン残基のεアミノ基にダンシルタグを有するリピドＩＩの改変した型を用いる生化学的試験により実証される。その基質はＷｅｐｐｎｅｒ， Ｗ． Ａ． ａｎｄ Ｆ． Ｃ． Ｎｅｕｈａｕｓ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５２（７）， ２２９６ （１９７７）に開示された条件に類似するリピドＩＩの直接ダンシル化により製造する。
Ｗｅｐｐｎｅｒおよび Ｎｅｕｈａｕｓは、Ｇａｆｆｋｙａ ｈｏｍｏｒｉから調製した膜分画とインキュベートすることにより、グリカン鎖へのＬ−リシン残基にダンシルタグを有するＰａｒｋヌクレオチドを導入することによってリピドＩＩのｉｎ ｓｉｔｕ 生成を以前証明していた。これらの実験において、グリカン鎖は下降ペーパークロマトグラフィー、それに続く紫外光へのクロマトグラムの曝露により容易に検出された。リピドＩ（ＮＡＧ炭水化物サブユニットを欠くリピドＩＩへの直前の前駆体）のダンシルタグ型とＥ．ｃｏｌｉからの膜微粒子画分を用いる類似の実験も報告されている。Ａｕｇｅｒ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｔｔ． Ｐｅｐｔ． Ｓｃｉ．， ４， ３７１（１９９７）参照。
【０１１３】
同様の方法で、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ （米国特許第５９２２５４０号、本明細書の一部を構成する）由来の一官能性トランスグリコシラーゼ（ＭｔｇＡ）と我々のダンシルタグリピドＩＩ誘導体のインキュベート、およびＷｅｐｐｎｅｒおよび Ｎｅｕｈａｕｓにより報告された条件下での薄層クロマトグラフィーによる反応混合物のその後の分析により、上に引用した前例と全く同様に紫外光に曝露することによるグリカン鎖の可視化をもたらす。（図を参照）
ンシルタグを上記実験で用いたが、当業者に周知の他のタグを用いることができる。本明細書で用いる「タグ」という用語は物理的手段（例えば、放射活性検定、質量分析、又は蛍光）によりそれらの正常な対応物と区別でき、正常な物質の代謝を追跡できる元素又は化合物をいう。
【０１１４】
ＩＩ．生化学的グリコシル転移のプロトコール
図中、次のプロトコールを薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）片に示される対応するレーンに用いた。
レーン１：５ｍｌ基質ストック溶液（ｐＨ６．１の７５ｍＭ　ＰＩＰＥＳ中の３００ｍＭダ　　　　　ンシルリピドＩＩ、３７．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２）
レーン２および３：レーン１　プラス　５ｍＬ　ＭｔｇＡ酵素溶液（ｐＨ７．５の２５ｍＭ　　　　　ＨＥＰＥＳ中の１０ｍＭストック、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．５％
ＣＨＡＰＳ）；２５℃で２０分インキュベート
レーン４：１ｍＬのリゾチームを添加（１ｍｇ／ｍＬめんどり卵白リゾチーム、ＨＥＷＬ）
反応生成物の位置はＴＬＣをＵＶ光（３６６ｎｍ）に曝露することにより可視化する
【０１１５】
ＩＩＩ．ダンシル化リピドＩＩの製造
【化６１】
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アセトン（２５０μｌ）中のダンシルクロライド（１３．８ｍｇ、５．１μｍｏｌ）の溶液を一度に０．２５Ｍ　ＮａＨＣＯ３（２５０μｌ）中のリピドＩＩ（２．４ｍｇ、１．３μｍｏｌ）の溶液に添加した。直ちに濁ったその混合物を室温で９０分攪拌する。エレクトロスプレーＭＳおよびＨＰＬＣは生成物への完全な変換を示す。混合物を真空下で濃度し、１：１水／アセトニトリルに再溶解し、２０分にわたる８５：１５〜１００：０メタノール／５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムのグラジエントを用いて、Ｄｙｎａｍａｘ  Ｃ８カラム（１００Å、５μ、２１．４ｍｍ  ｘ  ２５ｃｍ）での製造クロマトグラフィーにより精製する。適当な画分を凍結乾燥し、ダンシルかリピドＩＩ（１．７ｍｇ、収率６３％）を得る。超高分離ＭＳ  Ｃ１０６Ｈ１６８Ｎ１０Ｏ２７Ｐ２Ｓについての計算値２１０７．１２７６４、測定値２１０７．１２７２５
【図面の簡単な説明】
【図１】基質としてリピドＩＩを用いグルコシル転移の方法を模式的に説明するものである。
【図２】合成したダンシルで標識したリピドＩＩの誘導体をスタフイロコッカスアウレウスからの単官能性トラングリコシラーゼと共にインキュベートすることによって生成したグリカン鎖の蛍光検出を説明するものである
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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2004501085.tif 000181
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004501085.tif 000182
【国際調査報告】
2004501085.tif 000183
2004501085.tif 000184
2004501085.tif 000185
2004501085.tif 000186