(57)【要約】少なくとも１つの抗原を含み抗原提示細胞に抗原をロードすることができるＴ細胞を含むデリバリーシステム。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの抗原を含むＴ細胞を含み、抗原をリンパ節に送達することができるデリバリーシステム。
【請求項２】
少なくとも１つの抗原を含むＴ細胞を含み、ＡＰＣによるその後の提示のためにＡＰＣに抗原を送達することができるデリバリーシステム。
【請求項３】
抗原が腫瘍抗原である請求項１又は２に記載のデリバリーシステム。
【請求項４】
抗原が細菌抗原又はウイルス抗原である請求項１〜３のいずれか記載のデリバリーシステム。
【請求項５】
Ｔ細胞がマーカーを含む請求項１〜４のいずれか記載のデリバリーシステム。
【請求項６】
マーカーがマーカー遺伝子である請求項５に記載のデリバリーシステム。
【請求項７】
マーカーが細菌性耐性遺伝子である請求項６に記載のデリバリーシステム。
【請求項８】
細菌性耐性遺伝子がネオマイシン耐性を付与する請求項７に記載のデリバリーシステム。
【請求項９】
マーカーが別の抗原である請求項６によるデリバリーシステム。
【請求項１０】
別の抗原がＨＳＶ−Ｔｋ又はＣＤ２０である請求項９に記載のデリバリーシステム。
【請求項１１】
別の抗原と細菌性耐性遺伝子の両方をさらに含む請求項５〜１０のいずれか記載のデリバリーシステム。
【請求項１２】
Ｔ細胞が次のマーカーのうち少なくとも１つを発現する請求項１〜１１のいずれか記載のデリバリーシステム：ＨＬＡ−Ｉ、ＨＬＡ−ＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ５４及びＣＤ２５。
【請求項１３】
Ｔ細胞を伴う抗原の使用であって、免疫応答を起こすことができる少なくとも１つの他の抗原をＴ細胞が有する、少なくとも１つの他の抗原に対する免疫応答をモニターするための抗原の使用。
【請求項１４】
抗原が強い免疫原性抗原である請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
抗原がＨＳＶ−Ｔｋ又はＣＤ２０である請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
少なくとも１つの他の抗原が腫瘍抗原である、請求項１３〜１５のいずれか記載の使用。
【請求項１７】
少なくとも１つの他の抗原がウイルス抗原である、請求項１３〜１６のいずれか記載の使用。
【請求項１８】
Ｔ細胞が次のマーカーのうち少なくとも１つを発現する、請求項１３〜１７のいずれか記載の使用：ＨＬＡ−Ｉ、ＨＬＡ−ＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ６２Ｌ  ＣＣＲ７、ＣＤ５４及びＣＤ２５。
【請求項１９】
免疫応答を起こすことができる抗原を含むＴ細胞に対する免疫応答をモニターする方法であって、Ｔ細胞に第２の抗原を導入することを含む方法。
【請求項２０】
抗原が腫瘍抗原である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
抗原が細菌抗原又はウイルス抗原である請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
第２の抗原が強い免疫原性抗原である請求項１９〜２１のいずれか記載の方法。
【請求項２３】
第２の抗原がＨＳＶ−Ｔｋ又はＣＤ２０である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
抗原を含むＴ細胞にＡＰＣを曝露することを含む、インビボで抗原をＡＰＣにロードする方法。
【請求項２５】
抗原が腫瘍抗原である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
抗原が細菌抗原又はウイルス抗原である請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
Ｔ細胞がマーカーを含む請求項２４〜２６のいずれか記載の方法。
【請求項２８】
マーカーがマーカー遺伝子である請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
マーカーが細菌性耐性遺伝子である請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
細菌性耐性遺伝子がネオマイシン耐性を付与する請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
マーカーが別の抗原である請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
別の抗原がＨＳＶ−Ｔｋ又はＣＤ２０である請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
Ｔ細胞が別の抗原とマーカーの両方をさらに含む請求項２７〜３２のいずれか記載の方法。
【請求項３４】
Ｔ細胞が次のマーカーのうち少なくとも１つを発現する請求項２４〜３３のいずれか記載の方法：ＨＬＡ−Ｉ、ＨＬＡ−ＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ５４及びＣＤ２５。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれかの方法で使用するＴ細胞を得る方法であって、Ｔ細胞の単離；Ｔ細胞の活性化；Ｔ細胞の培養；及びＴ細胞への抗原の導入を含む方法。
【請求項３６】
Ｔ細胞が抗原で形質導入される請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
Ｔ細胞がフィトエモアグルチニン(phytoemoagglutinine)、抗ＣＤ３モノクローナル抗体又は抗ＣＤ３／ＣＤ２８モノクローナル抗体をコーティングしたビーズで活性化される請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項３８】
Ｔ細胞を増殖因子の存在下で培養する請求項３５〜３７のいずれか記載の方法。
【請求項３９】
増殖因子がｈｕ−ｒ−ＩＬ−２を含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
５％の自己由来の血清を含む培地でＴ細胞を培養する請求項３５〜３９のいずれか記載の方法。
【請求項４１】
Ｔ細胞を１×１０６細胞／ｍｌで培養する請求項３５〜４０のいずれか記載の方法。
【請求項４２】
請求項３５〜４１のいずれか記載の方法によって得ることができるＴ細胞。
【請求項４３】
抗原がロードされているＴ細胞。
【請求項４３】
請求項１〜２０、４２又は４３のいずれかで定義されるＴ細胞を含む医薬組成物。
【請求項４４】
ワクチンの形態である請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
腫瘍又は感染の治療又は予防のための薬剤を調製するための、請求項１〜２０、４２又は４３のいずれかで定義されるＴ細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔ細胞の形態である抗原デリバリーシステム、免疫応答をモニターするためのこのようなＴ細胞の使用、及びにこのＴ細胞の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な遺伝的又は後天的なヒトの疾患を治療するために、ヒト細胞への遺伝子導入が研究されている。当初、単一遺伝子の欠陥による遺伝的疾患が、遺伝子治療の主要なターゲットとして提案された。しかし、これまでに認可された大多数のヒトの遺伝子治療の試みは、癌やＡＩＤＳなど後天的疾患の治療に関わるものである。腫瘍遺伝子治療への１つのアプローチは、遺伝子改変した腫瘍細胞（そこでは、トランスジーン（サイトカイン、アロ−ＨＬＡなど）によって免疫原性を高めることが意図されている）を患者にワクチン接種することにより、腫瘍抗原に対する宿主免疫系を刺激することに基づく。別のアプローチは、エクソビボで作製した腫瘍特異的エフェクターの養子免疫移送(adoptive transfer)に基づく。注入されたエフェクターは、通常、自己由来又はＨＬＡ適合性のリンパ球であり、インビトロで特異的並びに非特異的刺激によって増殖する。注入された細胞のエフェクター機能の増幅は、サイトカインをコードする遺伝子をそれに形質導入することによって達成されている。
【０００３】
欧州特許第０ ９０４ ７８６号では、患者内において抗原提示をなし得る自己由来細胞又はＨＬＡ関連細胞から本質的になる組成物を少なくとも２回順次投与することによる腫瘍ワクチン接種方法が開示されており、ここで、前記細胞は、外来遺伝子を形質導入した腫瘍細胞又は腫瘍抗原と外来抗原とを形質導入した抗原提示細胞のいずれかである。
【０００４】
国際公開公報ＷＯ９７／１９１６９には、細胞表面に患者の少なくとも１つのＭＨＣ−Ｉハプロタイプを少なくとも一部に有し、かつ抗原がロードされた腫瘍細胞を含む腫瘍ワクチンが開示されている。
【０００５】
したがって、従来技術では、抗原デリバリーシステムとして腫瘍細胞又はＴ細胞に抗原を直接提示するものとして理解されている抗原提示細胞を使用する方法が採られている。
【０００６】
しかし、ワクチン及びワクチン接種法を提供することが長い間必要とされてきたことについては理解されるであろう。本発明はそのようなアプローチを提供する。
【特許文献１】欧州特許第０  ９０４  ７８６号
【特許文献２】国際公開公報ＷＯ９７／１９１６９
【特許文献３】欧州特許第０  ９０５  ７８６号
【特許文献４】ＵＳ−Ａ−４６６３０５８号
【特許文献５】米国特許第５１３９９４１号
【特許文献６】米国特許第４７９７３６８号
【非特許文献１】Sambrook et al.，MOLECULAR Cloning，A Laboratory Manual(1989)。
【非特許文献２】Ausubel et al.,Short Protocols in MOLECULAR Biology(1999）4th Ed, John Wiley ＆ Sons, Inc（並びにCurrent Protocols in MOLECULAR Biology完全版）。
【非特許文献３】Coffin et al.,1997,”retroviruses”, Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds：JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus  ７５８〜７６３頁。
【非特許文献４】Mann et al.、１９８３年。
【非特許文献５】Berger and Kimmel（1987, Guide to MOLECULAR Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA）。
【非特許文献６】Introna et al. HumGene Ther 11：611,2000。
【非特許文献７】Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.（A.R.Gennaro edit. 1985）。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、患者の体内に導入されると、腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原などの抗原をプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）に接触させることができる遺伝子操作されたＴ細胞に関する。より具体的に言えば、本発明は、抗原に対する応答を刺激する抗原をコードする外因性(exogenous)の（すなわち、外来）遺伝子を含む形質導入されたＴ細胞、及び応答を刺激する抗原ポリペプチドがロードされたＴ細胞を提供する。Ｔ細胞はさらにワクチン接種の有効性をモニターするのに用いられるＨＳＶ−Ｔｋなどの抗原を含んでいてもよい。好都合に、Ｔ細胞はインビトロで調製し、注入その他の方法でインビボに導入されると、トランスジーン産物をプロフェッショナル抗原提示細胞へと運び、これによってトランスジーン産物に対する免疫応答を刺激する。本発明はまた、それによって患者の免疫学的状態をモニターすることができる方法を提供する。本発明は、さらにＴ細胞の培養方法を提供する。
【０００８】
このように、我々は、抗原を含むＴ細胞が、抗原を抗原提示細胞（ＡＰＣ）へと運ぶ（次いで、ＡＰＣが抗原を提示して免疫応答を生じる）ように作用することを見出した。したがって、本発明は、従来技術とは異なる戦略を使用する。
【０００９】
本発明の１つの態様によれば、少なくとも１つの抗原を含む、Ｔ細胞を含み、リンパ節に又はリンパ系の他の部分に抗原を送達することができるデリバリーシステムが提供される。
【００１０】
すなわち、本発明は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に抗原をロードすることができる少なくとも１つの抗原を含むＴ細胞を含むデリバリーシステムを提供する。
【００１１】
抗原は、一般にＴ細胞にとって外来である。本願で「外来」という場合、Ｔ細胞に対して通常外因性の抗原を含む。
【００１２】
抗原はＴ細胞中に、抗原をコードするポリヌクレオチドとして導入してもよい。すなわち、Ｔ細胞にポリヌクレオチドを形質移入又は形質導入してもよい。あるいは、Ｔ細胞にポリペプチドの形で抗原をロードしてもよいが、これは同様にタンパク質でもよい。参照の便宜上、ポリペプチドとタンパク質という用語は、本願を通して一般に交換可能なものとして使用される。したがって、抗原を含むＴ細胞とは、本願では、Ｔ細胞がリンパ節及び／又はＡＰＣに抗原を送達できるようにＴ細胞が抗原を伴っていることを意味する。
【００１３】
本発明の別の態様によれば、少なくとも１つの抗原を含むＴ細胞を含み、ＡＰＣによるその後の提示のためにＡＰＣに抗原を送達できるデリバリーシステムが提供される。
【００１４】
１つの実施形態では、外来の抗原は細菌又はウイルスの抗原である。好ましくは、外来抗原は腫瘍抗原である。
【００１５】
好ましくは、Ｔ細胞は少なくとも１つの別の外来のポリペプチド又はポリヌクレオチド配列をさらに含む。
【００１６】
１つの実施形態では、この別の外来遺伝子はマーカー、すなわち、マーカー又は選択遺伝子である。
【００１７】
好ましくは、マーカーは細菌性耐性遺伝子、例えば、ネオマイシン耐性を付与する細菌性耐性遺伝子である。
【００１８】
別の実施形態では、マーカーはさらに別の抗原、好ましくはＨＳＶ−Ｔｋ又はＣＤ２０である。この抗原は、いわゆる自殺システムで使用できるため特に好ましい。
【００１９】
さらに別の実施形態では、デリバリーシステムはさらに、別の抗原とマーカー遺伝子の両者を含む。
【００２０】
好ましくは、Ｔ細胞は、次のマーカーのうち少なくとも１つを発現する：ＨＬＡ−Ｉ、ＨＬＡ−ＩＩ  ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ５４及びＣＤ２５。
【００２１】
したがって、本発明の別の態様では、次のマーカーのうち少なくとも１つを発現するＴ細胞が提供される：ＨＬＡ−Ｉ、ＨＬＡ−ＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ５４及びＣＤ２５。
【００２２】
本発明の別の態様によれば、免疫応答を高めることができる少なくとも２つの抗原を含むＴ細胞の使用が提供され、ここで一方の抗原に対する応答は他方の抗原に対する免疫応答をモニターするために使用される。
【００２３】
本発明の別の態様によれば、Ｔ細胞中に第２の抗原を導入することを含む、免疫応答を高めることができる第１の抗原を含むＴ細胞への免疫応答をモニターする方法が提供される。
【００２４】
本発明の別の態様によれば、抗原を含むＴ細胞にＡＰＣを曝露することを含む、インビボでＡＰＣにロードする方法が提供される。
【００２５】
本発明のさらに別の態様では、特許請求の範囲の方法で使用されるＴ細胞を得る方法であって、Ｔ細胞を単離、Ｔ細胞を活性化、Ｔ細胞の培養及びＴ細胞への抗原の導入を含む方法が提供される。
【００２６】
好ましくは、Ｔ細胞は、抗原をコードするポリヌクレオチド配列を形質導入するか形質移入する。
【００２７】
好ましくは、Ｔ細胞は、フィトエモアグルチニン(phytoemoagglutinine）、抗ＣＤ３モノクローナル抗体又は抗ＣＤ３／ＣＤ２８モノクローナル抗体でコーティングを施したビーズで活性化する。
【００２８】
好ましくは、Ｔ細胞は、ｈｕ−ｒ−ＩＬ−２などの増殖因子の存在下で培養する。
【００２９】
好ましくは、Ｔ細胞は、５％の自己由来の血清を含む培地中で培養する。
【００３０】
好ましくは、Ｔ細胞は、１×１０６細胞／ｍｌで培養する。
【００３１】
本発明の別の態様によれば、本発明の方法によって得ることができ、本発明によるデリバリーシステムとして有用なＴ細胞が提供される。
【００３２】
以下、本発明の様々な好ましい特徴及び実施形態を非限定的な例によって説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本願で言及する技術は、一般に当技術分野においてよく知られており、参考文献としては特に、Sambrook et al., MOLECULAR Cloning,A Laboratory Manual (1989）及びAusubel et al., Short Protocols in MOLECULAR Biology (1999) 4th Ed, John Wiley ＆ Sons, Inc（並びにCurrent Protocols in MOLECULAR Biology完全版）が挙げられる。
【００３４】
一般的に言えば、本発明は、インビトロで遺伝子操作されたＴリンパ球（Ｔ細胞）であって、インビボで注入すると、抗原（例えば、腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原）をプロフェッショナル抗原提示細胞に接触させることができる遺伝子操作されたＴ細胞に関する。もっとも、本発明は、Ｔ細胞のインビボでの操作も包含する。より具体的に言えば、本発明は、ａ）腫瘍に対する免疫応答を刺激するための腫瘍抗原をコードする外因性遺伝子を含む、インビトロで形質導入されたか又は形質移入されたＴリンパ球；及びｂ）腫瘍抗原エピトープをコードするペプチドがインビトロでロードされたＴリンパ球に関する。Ｔ細胞はワクチン接種の有効性をモニターするため、別の強い抗原、例えば、ＨＳＶ−Ｔｋを含んでもよい。
【００３５】
Ｔ細胞が、例えば、レトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入の適切な標的であることは報告されている。特に、腫瘍ワクチン接種用の腫瘍抗原を発現するＴ細胞の使用が記載されている。しかし、例えば、欧州特許第０  ９０５  ７８６号には、どのような効果も、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として働くＴ細胞によって生じると報告されている。この見方とは対照的に、我々は、Ｔ細胞は、ＡＰＣをトランスジーンに曝露し、次いで、これがＡＰＣによって提示されることにより作用することを見出した。言い換えれば、Ｔ細胞は、抗原プロセッシング及び提示のためにＡＰＣにトランスジーン産物を曝露する。「曝露する」と言う場合、本願ではトランスジーン産物の結合及び／又は取り込みが生じるようにＡＰＣとトランスジーンとを接触させることを含む。ＡＰＣは抗原を内部に取り込み、提示のためにそれをプロセッシングする。
【００３６】
「抗原処理」は、本願では、抗原のより短いペプチド配列への分解、及びペプチドとＭＨＣ分子との結合を含む。ＭＨＣ分子の２つの別個のクラス、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスIIが、それぞれＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞のいずれかへの抗原の提示を調節する。抗原提示は、厳密に言えば、Ｔ細胞レセプター（それらはＡＰＣの表面上でＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスIIの分子の一方と共同して抗原ペプチドを特異的に認識する）を介したＴ細胞の活性化であるが、Ｂ細胞もある種の抗原を認識し結合することができる。
【００３７】
さらに、我々は、本発明のシステムが抗原をリンパ系、特にリンパ節に送達する効果的な方法を提供することを見出した。Ｔ細胞は局所的に投与できるが、Ｔ細胞は遠位の部位に投与しても、リンパ節へと効率的に移動することができると考えられる。リンパ節は、リンパ液として知られている体液に対して免疫学的フィルタとして機能する。リンパ節は身全体にわたって存在する。これらの節はほとんどＴ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞及びマクロファージから構成されて、我々の組織の大半から液体を排出する。抗原は循環系にリンパ液を戻す前に、リンパ節においてリンパ液からろ過される。脾臓中でも同様にして、抗原を捕捉するマクロファージ及び樹状細胞が、Ｔ細胞及びＢ細胞にこれらの外来の物質を提示し、次いで免疫応答が開始される。
【００３８】
したがって、本発明は、細胞依存の抗原デリバリーシステムをさらに提供する。このシステムでは、抗原又は抗原をコードするポリヌクレオチドを１つ又は複数の細胞にエクソビボで導入し、次いで、患者に導入する。
【００３９】
本発明のＴ細胞は単独で投与してもよいが、一般には医薬組成物として投与される。
【００４０】
ＡＰＣと免疫応答
上記のように、本発明は抗原提示細胞（ＡＰＣ）への抗原の送達に関する。ＡＰＣはマクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、及び事実上ＭＨＣ分子を発現できる他の任意の細胞タイプを含む。
【００４１】
マクロファージは組織内に存在する単球系統の食細胞で、効果的な抗原提示のために特によく装備されている。これらは一般にＭＨＣクラスII分子を発現し、その食細胞特性と共に、巨大分子又は微粒子状物質を飲み込み、広範囲なリソソームシステムでそれを消化し、抗原ペプチドの形態にそれをプロセッシングし、Ｔリンパ球による認識のため、細胞表面にそれを発現するのに非常に有効である。
【００４２】
樹状細胞は、その高度に分枝した形態からそう名づけられたものであるが、体全体にわたって多くの器官に見出され、骨髄に由来し、通常、ＭＨＣクラスII抗原を高水準で発現する。樹状細胞は活発に運動し、血流と組織の間を往来することができる。樹状細胞は一次免疫応答を引き起こすユニークな能力を備えた抗原提示細胞で、それにより、免疫学的記憶の確立を可能にする。未熟な状態の樹状細胞は高い食細胞能力を有する。抗原捕捉後、未熟な樹状細胞はリンパ節に移動し、そこで、成熟した後、循環中の抗原特異的リンパ球を活性化する。このように、これらもまた重要なＡＰＣと考えられる。ランゲルハンス細胞は皮膚内に位置する樹状細胞の例である。
【００４３】
Ｂリンパ球は、活発に食細胞性を示すものではないが、クラスII陽性で、細胞表面抗原特異的レセプター、免疫グロブリン又は抗体分子を有する。高い抗原結合親和性をもたらすその潜在的能力から、Ｂ細胞は、低濃度の抗原をその表面に集中し、それをエンドサイトーシスによって取り込み、それを処理し、その表面上のＭＨＣ抗原と共同して抗原ペプチドの情況下でそれを提示する独自の能力を有している。このように、Ｂ細胞は非常に効果的なＡＰＣになる。
【００４４】
したがって、外来の抗原への免疫応答では、Ｂ細胞又はＴ細胞と組み合わせられた抗原提示細胞（ＡＰＣ）（通常マクロファージ又は樹状細胞のいずれか）の存在が必要とされる。ＡＰＣがＢ細胞にその細胞表面上の抗原を提示すると、Ｂ細胞は増殖し、かつその抗原に特異的に結合する抗体を生産するようにシグナルが与えられる。抗体が細菌又は寄生動物上の抗原に結合する場合は、それは、多形核白血球又はマクロファージがそれらを飲み込み（貪食し）、死滅させるためのシグナルとして働く。抗体の別の重要な機能は「補体破壊カスケード（complement destruction cascade）」を開始することである。抗体が細胞又は細菌に結合すると、補体と呼ばれる血清タンパク質が不動化された抗体に結合し、細菌を穿孔することによりこれを破壊する。抗体はまた、ナチュラルキラー細胞及びマクロファージにシグナルを与えてウイルス又は細菌に感染した細胞を死滅させることができる。
【００４５】
ＡＰＣがＴ細胞に抗原を提示する場合、Ｔ細胞は活性化される。活性化されたＴ細胞は増殖し、ＣＤ４＋Ｔ細胞の場合には分泌性になり、あるいは、それがＣＤ８＋Ｔ細胞である場合には、ＡＰＣによって提示された抗原を特異的に発現する標的細胞を殺すように活性化される。抗体の生産及びＣＤ８＋キラーＴ細胞の活性は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞サブセットによって高度に調節される。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、細胞がより効率的に増殖し機能するようにシグナルを与える増殖因子又はシグナルをこれらの細胞に与える。
【００４６】
Ｔ細胞
Ｔ細胞又はＴリンパ球は、通常、機能及び表現型において（識別上）異なる２つの主なサブセットに分けられる。ＣＤ４＋Ｔ細胞とも呼ばれるヘルパーＴサブセットは、免疫調節に関連する調整者である。ヘルパーＴ細胞の主要な機能は、感染と戦ってこれを退けるために他の白血球を活性化する専門因子の分泌によって免疫応答を増大又は強化することである。
【００４７】
別の重要なＴ細胞タイプは、Ｔキラーサブセット又はＣＤ８＋Ｔ細胞と呼ばれる。これらの細胞はある種の腫瘍細胞、ウイルス感染細胞及び場合によっては寄生動物を直接死滅させるという点で重要である。それらは、しばしば活性化が生じる部位として第２のリンパ器官（リンパ節及び脾臓）に依存するが、さらに、身体の他の組織、最も顕著には、肝臓、肺、血液及び腸及び生殖腺に見出される。
【００４８】
Ｔ細胞を本発明のエクソビボ方法で使用しようとする場合、Ｔ細胞は典型的には、患者又はドナーの血液から分離されたＴリンパ球である。Ｔ細胞は適切な方法によって（例えば、ＵＳ−Ａ−４６６３０５８号に記載されているようにして）得ることができ、抗体媒介分離を含む標準的方法によって濃化及び／又は精製することができる。Ｔ細胞は同一又は異なる個体から得た他の免疫細胞と組み合わせて使用してもよい。あるいは、Ｔ細胞及び他の細胞タイプの源として全血を使用してもよいし、白血球を豊富化した血液又は精製した白血球を用いてもよい。特にヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）を使用することが好ましい。あるいは、ＣＤ８＋細胞等の他のＴ細胞を使用してもよい。Ｔ細胞ハイブリドーマ、末梢血又は胸腺起源の未熟なＴ細胞及びＮＫ−Ｔ細胞等の細胞系を使用するのも便利であろう。好ましい実施形態では、本発明の中で使用されるＴ細胞は、抗原特異的抑制を他のＴ細胞に移送することができるＴ細胞になるであろう。
【００４９】
ポリペプチド及び核酸配列のＴ細胞への導入
抗原ポリペプチド物質は、ポリペプチド自体としてＴ細胞に投与してもよいが、Ｔ細胞中でポリペプチドの発現を可能にする条件下で、ポリペプチドをコードする核酸構築物／ウイルスベクターを細胞中に導入することによりＴ細胞に投与してもよい。
【００５０】
好ましくは、本発明でベクター中に使用されるポリヌクレオチドは、宿主細胞によりコード配列の発現が得られる制御配列と動作可能に連結させる。すなわち、ベクターは発現ベクターである。「動作可能に連結」という用語は、記載された成分が意図したように機能することを可能にする関係を意味する。コード配列に「動作可能に連結される」調節配列は、コード配列の発現が制御配列と適合性を有する条件下で達成されるようにライゲートする。
【００５１】
制御配列を、例えば、別の転写調節エレメントの付加によって改変して、転写モデュレーターに対する応答性の良い制御配列によって転写レベルを指令してもよい。
【００５２】
本発明のベクターは、抗原の発現をもたらすように下記のようなＴ細胞に形質転換又は形質移入してもよい。
【００５３】
本発明はまた、抗原が、例えば、ポリペプチドの形で導入、すなわち、ロードされたＴ細胞を包含する。
【００５４】
参照の便宜上、抗原ポリペプチドとそれをコードするポリヌクレオチドの両方を「抗原」と呼ぶこともある。
【００５５】
Ｔ細胞中に遺伝子とポリペプチドの両方を導入するのに都合のよい方法（但し、これらに限定されない）を、以下に論じる。
【００５６】
Ｔ細胞を形質転換する任意の適当な方法が使用できる。送達のために現在利用可能なメカニズムの非限定的な例としては、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム形質転換又は粒子衝撃によるものがある。しかし、構築物の移送は、細胞膜を物理的に又は化学的に透過性にする、言及した方法のうちのいずれによってでも実行し得る。適当な方法については以下により詳細に記載する。
【００５７】
１．エレクトロポレーション
本発明のある好ましい実施形態では、抗原はエレクトロポレーションによって細胞に導入される。エレクトロポレーションは、細胞及びＤＮＡの懸濁液を高電圧放電に曝露することを含む。
【００５８】
Ｔ細胞に対するエレクトロポレーション条件が最適化され得ることも考えられる。特に、電圧、キャパシタンス、時間、エレクトロポレーション媒体組成物などのパラメータを最適化することが望ましいであろう。他のルーチンな調節の実行は当業者に知られている。
【００５９】
２．粒子衝撃
裸のＤＮＡを構築物を細胞中に移送する１つの方法に粒子衝撃がある。この方法は、ＤＮＡをコーティングした微小投射物（microprojectiles）が細胞膜を貫通し細胞を殺すことなく細胞に侵入できる高速度まで加速するという能力に依存する。使用される微小投射物は、タングステン、白金、金のビーズなどの生物学的に不活性な物質からなっている。
【００６０】
場合によっては、粒子衝撃を使用してレシピエント細胞にＤＮＡを送達するのに金属粒子上へのＤＮＡ堆積は必要ではないと考えられる。ＤＮＡでコーティングするのではなく、粒子がＤＮＡを含んでもよいと考えられる。したがって、ＤＮＡでコーティングを施した粒子は粒子衝撃によりＤＮＡの送達レベルを増加させる可能性があるが、本来、それ自体は必要ではない。
【００６１】
小粒子を加速するためのいくつかの装置が開発されている。そのような１つの装置は高電圧放電によって電流を生じるもので、これが原動力となる。別の方法は、バイオリスティック（Biolistic）粒子デリバリーシステム（それは、懸濁した細胞で覆われたフィルタ表面上に、ステンレス鋼やＮｙｔｅｘスクリーンなどのスクリーンを通してＤＮＡでコーティングを施した粒子を推進するために使用することができる）の使用を含む。それらが大きく凝集した状態でレシピエント細胞に送達されないように、スクリーンで粒子を分散させる。投射装置と投射対象の細胞の間に介在するスクリーンが、投射物凝集体のサイズを低減させ、大きすぎる投射物によってレシピエント細胞に与えられるダメージを低減させ、より高い頻度での形質転換に寄与し得ると信じられている。
【００６２】
粒子衝撃を行うためには、好ましくは、懸濁状態の細胞をフィルタ又は固体の培地上で濃縮する。衝撃の対象である細胞は、微小投射物停止プレートより下の適切な距離に配置する。また、所望であれば、１つ又は複数のスクリーンを、加速装置と粒子衝撃の対象である細胞の間に配置する。
【００６３】
小規模の研究によって条件を完全に最適化する様々な衝撃パラメータの調節が望ましいと考えられる。特に、ギャップ距離、飛行距離、組織距離、ヘリウム圧力などの物理的なパラメータを調節することが望ましいであろう。また、レシピエント細胞の生理学的状態に影響を及ぼし、したがって形質転換や組み込み効率に影響を及ぼす可能性がある条件を修正することによって外傷低減要因を最適化することが可能であろう。例えば、浸透の状態、組織の水和、及びレシピエントＴ細胞のサブカルチャー段階や細胞周期を、最適の形質転換のために調節してもよい。他のルーチンな調節の実施は当業者に知られている。
【００６４】
３．ウイルスの形質転換
ａ．アデノウイルスの感染
核酸構築物を送達するため１つの方法は、アデノウイルス発現ベクターの使用を含む。アデノウイルスベクターはゲノムＤＮＡへの組み込み容量が小さいことが知られているが、この特徴はこれらのベクターによってもたらされる遺伝子導入効率が高いことによって相殺される。「アデノウイルス発現ベクター」は、（ａ）構築物のパッケージングを支援し、（ｂ）その中にクローン化された構築物を最終的に発現するのに十分なアデノウイルス配列を含むそれら構築物を含むものとして意図される。
【００６５】
ベクターは、アデノウイルスの遺伝子的に操作された形式を含む。遺伝子構成又はアデノウイルス（３６ｋｂ、線状で二重らせん構造のＤＮＡウイルス）についての知識は、７ｋｂまでの外来の配列を備えた大きなピースでのアデノウイルスＤＮＡの置換を可能にする。レトロウイルスとは対照的に、アデノウイルスのＤＮＡは潜在的な遺伝毒性なしでエピソームの態様で複製され得るので、宿主細胞のアデノウイルスへの感染は染色体の統合をもたらさない。また、アデノウイルスは構造上安定しており、広範囲な増幅の後でもゲノム再編成は検出されていない。
【００６６】
アデノウイルスは、ゲノムの大きさが中程度であること、操作し易さ、高い力価、広い標的細胞範囲及び高い感染力から、遺伝子導入ベクターとしての使用に特に適している。ウイルスのゲノムの両端は、１００〜２００塩基対の逆方向反復配列（ＩＴＲ）を含むが、これはウイルスのＤＮＡ複製及びパッケージングに必要なシスエレメントである。ゲノムの初期（Ｅ）及び後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡの複製開始で分けられる異なる転写ユニットを含む。Ｅ１領域（Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノム及び少数の細胞遺伝子の転写調節を担うタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２Ａ及びＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質合成をもたらす。これらのタンパク質はＤＮＡ複製、後期遺伝子発現及び宿主細胞シャットオフに関与する。ウイルスのキャプシドタンパク質の大部分を含む後期遺伝子産物は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）によって生じる単一の初期転写物がかなりのプロセシングを受けて初めて発現される。ＭＬＰ（１６．８地図単位の位置にある）は感染の後期に特に効率がよく、このプロモーターから生じるｍＲＮＡはすべて、それらを翻訳にとって好ましいｍＲＮＡにする５’三分節リーダー（tripartite  leader；ＴＰＬ）配列を有する。
【００６７】
現在のシステムでは、組み換えアデノウイルスは、シャトルベクターとプロウイルスベクターの間の相同的組み換えから作製される。２つのプロウイルスベクター間の可能な組み換えにより、このプロセスからは野生型アデノウイルスが生成される可能性がある。したがって、個々のプラークからウイルスの単一のクローンを分離し、そのゲノム構造を検討することが極めて重要である。
【００６８】
現在のアデノウイルスベクターは増殖欠損性であり、その生成及び増殖は、ユニークなヘルパー細胞系（２９３と呼ばれる）に依存する。これはヒト胚の腎臓細胞Ａｄ５  ＤＮＡ断片によって形質転換され、構成的にＥ１タンパク質を発現する。Ｅ３領域はアデノウイルスゲノムには重要でないため、現在のアデノウイルスベクターは、２９３個の細胞の助けによって、外来ＤＮＡをＥ１、Ｄ３又はその両方の領域中で運ぶ。自然界において、アデノウイルスは、野生型のゲノムのおよそ１０５％をパッケージにすることができ、約２ｋｂの余分なＤＮＡの収容能力を有する。Ｅ１領域とＥ３領域における代替可能なＤＮＡおよそ５．５ｋｂと組み合わせて、現在のアデノウイルスベクターの最大収容能力は７．５ｋｂ、又はベクターの長さの合計の約１５％未満である。アデノウイルスのウイルスゲノムの８０％以上がベクター骨格に残る。
【００６９】
ヘルパー細胞系は、ヒト胚の腎臓細胞、筋細胞、造血細胞又は他のヒト胚の間葉細胞若しくは上皮細胞などヒト細胞に由来するものでもよい。あるいは、ヘルパー細胞は、ヒトのアデノウイルス感染を許容する他の任意の哺乳類類の細胞に由来するものでもよい。そのような細胞としては、ベロ（Vero）細胞その他のサル胚の間質又は上皮細胞が挙げられる。上述のように、好ましいヘルパー細胞系は２９３である。
【００７０】
アデノウイルスベクターが増殖欠損性、少なくとも、条件付きで欠損性であるという必要性以外の点では、本発明を成功裡に実施させる上でアデノウイルスベクターの性質は決定的なものとは考えられない。アデノウイルスは、既知の４２の異なるセロタイプ又はサブグループＡ〜Ｆのうちのいずれでもよい。本発明で用いる条件付き増殖欠損性アデノウイルスベクターを得るためには、サブグループＣの５型アデノウイルスが好ましい出発材料である。これは、５型アデノウイルスは、多くの生化学的情報及び遺伝情報が知られているヒトのアデノウイルスであり、また、それは、これまでにもベクターとしてアデノウイルスを使用するほとんどの構築例で使用されてきたからである。
【００７１】
上述のように、本発明による典型的なベクターは増殖欠損性であり、アデノウイルスＥ１領域を持たない。したがって、Ｅ１をコードする配列が取り除かれた位置に形質転換用構築物を導入するのが最も便利であろう。しかしながら、アデノウイルス配列内の構築物の挿入位置は、本発明にとって重要なことではない。目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、Ｅ３置換ベクター中の削除されたＥ３領域の代わりに、又はＥ４領域中（この場合、ヘルパー細胞系又はヘルパーウイルスがＥ４欠陥を補足する）に挿入することができる。
【００７２】
アデノウイルスの増殖及び操作は当業者に知られており、インビトロとインビボで広範な宿主範囲を示す。このグループのウイルスは高い力価、例えば、１ｍｌ当たり１０９〜１０１１のプラーク形成単位で得ることができ、しかもそれらは高度に感染性である。アデノウイルスの生活環は宿主細胞ゲノムへの統合を必要としない。アデノウイルスベクターによって運ばれる外来遺伝子はエピソームであり、したがって、宿主細胞に対して有する遺伝毒性は低い。野生型のアデノウイルスを用いたワクチン接種に関する研究で副作用は報告されておらず、インビボでの遺伝子導入ベクターとしてその安全性及び治療可能性が実証されている。
【００７３】
ｂ．ＡＡＶ感染
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、統合頻度が高く、非分裂細胞に感染可能であり、したがって、組織培養において哺乳類細胞中に遺伝子を送達するのに有用であるという点で、本発明で使用するのに魅力的なベクターシステムである。ＡＡＶは、感染力については広範な宿主範囲を有する。ｒＡＡＶベクターの生成及び使用に関する詳細は米国特許第５１３９９４１号及び米国特許第４７９７３６８号に記載されており、いずれも参照によって本願に組み込まれる。
【００７４】
組み換えＡＡＶベクターは、マーカー遺伝子及びヒトの疾病に含まれる遺伝子のインビトロ及びインビボでの形質導入に成功裡に使用されている。最近では、ＡＡＶベクターについて嚢胞性繊維症治療の第１相ヒト治験が承認されている。
【００７５】
ＡＡＶは、培養細胞中での生産的な感染を達成するために別のウイルス（アデノウイルス又はヘルペスウイルスファミリーのメンバーのいずれか）との同時伝染を必要とするという点で従属性のパルボウイルスである。ヘルパーウイルスとの同時伝染がない場合、野生型ＡＡＶのゲノムはヒト染色体１９にその端部を介して統合し、そこでプロウイルスとして潜在状態で存在する。しかし、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質も発現されない限り、ｒＡＡＶが統合されるのは染色体１９に制限されない。ＡＡＶプロウイルスを含む細胞がヘルパーウイルスに重複感染すると、ＡＡＶゲノムは染色体あるいは組み換えプラスミドから「救出され」、正常な生産的感染が確立される。
【００７６】
典型的には、２つのＡＡＶ末端反復によって前後を挟まれた目的の遺伝子を含むプラスミドと、末端反復を有しない配列をコードする野生型ＡＡＶを含む発現プラスミド、例えば、ｐＩＭ４５とで同時形質移入して組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルスを作る。また、細胞を、ＡＡＶヘルパー機能のために必要なアデノウイルス遺伝子を含むアデノウイルス又はプラスミドに感染させるか形質移入させる。このようにして作ったｒＡＡＶウイルスストックをアデノウイルス（これは、例えば、塩化セシウム密度遠心によってｒＡＡＶ粒子から物理的に分離しなければならない）で汚染する。あるいは、ＡＡＶコード領域を含むアデノウイルスベクター又はＡＡＶコード領域とアデノウイルスヘルパー遺伝子の一部又は全部を含む細胞系を使用することもできるであろう。統合プロウイルスとしてｒＡＡＶ  ＤＮＡを含む細胞系も使用できる。
【００７７】
ｃ．レトロウイルスへの感染
本発明の好ましい方法の１つは、レトロウイルスの使用を含む。本発明のレトロウイルスベクターは、任意の適当なレトロウイルスから由来するものでもよいし、又は由来し得るものでもよい。多種多様なレトロウイルスが識別された。例としては以下のものが挙げられる：マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、ウマ感染性貧血（ＥＩＡＶ）、マウス乳ガンウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、藤波肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉腫ウイルス（ＦＢＲ  ＭＳＶ）、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、Ａｂｅｌｓｏｎマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭＬＶ）、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス２９（ＭＣ２９）及びトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）。レトロウイルスの詳細なリストは、Coffin et al., 1997, ”retroviruses”, Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds：JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus  ７５８〜７６３頁に見出され得る。
【００７８】
いくつかのレトロウイルスのゲノム構造についての詳細は当技術分野で見ることができる。例として挙げれば、ＨＩＶ及びＭｏ−ＭＬＶについての詳細は、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ（それぞれゲノムアクセッション番号ＡＦ０３３８１９及びＡＦ０３３８１１）に見ることができる。
【００７９】
レトロウイルスは、広範には２つのカテゴリーに分類することができる。すなわち、「単純型」と「複雑型」である。レトロウイルスは、さらに７つのグループ分けることもできる。これらのグループのうちの５つは、腫瘍形成性の可能性を備えたレトロウイルスを表わす。残りの２つのグループはレンチウイルス類及びスプマウイルス類である。これらのレトロウイルスの概要はCoffin et al.、１９９７年（前掲書）に示されている。
【００８０】
レンチウイルスグループは、さらに「霊長類型」と「オン霊長類型」に分割できる。霊長類レンチウイルスの例としては、ヒト自己免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因体であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。非霊長類レンチウイルスグループとしては、プロトタイプである「遅発型ウイルス」ビスナ‐マエディ（ｖｉｓｎａ／ｍａｅｄｉ）ウイルス（ＶＭＶ）、並びに関連するヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）及び最近になって記載されたネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）及びウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が挙げられる。
【００８１】
レンチウイルスファミリーと他のタイプのレトロウイルスの相違は、レンチウイルスは分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染する能力があるという点である。対照的に、ＭＬＶなどの他のレトロウイルスは、例えば、筋肉、脳、肺及び肝臓組織を構築するもののような非分裂細胞に感染することができない。
【００８２】
個々のレトロウイルスゲノムは、ビリオンタンパク質及び酵素をコードするｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖと呼ばれる遺伝子を含む。プロウイルスでは、これらの遺伝子はその両端が長い末端反復配列（ＬＴＲ）と呼ばれる領域で挟まれている。ＬＴＲはプロウイルスの統合及び転写の原因となる。ＬＴＲはまた、エンハンサー−プロモーター配列として働き、ウイルス遺伝子の発現をコントロールできる。レトロウイルスＲＮＡのエンキャプシデーションは、ウイルスゲノムの５’端に位置するｐｓｉ配列によって生じる。
【００８３】
ＬＴＲはそれ自身３つの要素（それらはＵ３、Ｒ及びＵ５と呼ばれる）に分割することができる同一の配列である。Ｕ３は、ＲＮＡの３’端に特有の配列に由来する。ＲはＲＮＡの両端における繰り返し配列に由来し、Ｕ５はＲＮＡの５’端に特有の配列に由来する。３つの要素のサイズは、異なるレトロウイルス間では相当に変化し得る。
【００８４】
感染性レトロウイルスへのＲＮＡゲノムの基本的な分子構成は（５’）Ｒ−Ｕ５−ｇａｇ，ｐｏｌ，ｅｎｖ−Ｕ３−Ｒ（３’）である。欠損性レトロウイルスベクターゲノムでは、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖが存在しないか機能しない可能性がある。ＲＮＡの両端のＲ領域は繰り返し配列である。Ｕ５とＵ３は、それぞれＲＮＡゲノムの５’端及び３’端にユニークな配列を表わす。
【００８５】
レトロウイルスベクターを構築するために、目的の遺伝子をコードする核酸を、ウイルスゲノムの増殖欠損性ウイルスを産生するあるウイルスの配列の場所に挿入する。ビリオンを生じるために、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖを含むがＬＴＲとパッケージング成分を含まないパッケージング細胞系を構築する（Mann  et  al．、１９８３年）。レトロウイルスのＬＴＲ及びパッケージング配列と共に、ｃＤＮＡを含む組み換えプラスミドをこの細胞系へ導入すると（例えば、リン酸カルシウム沈殿による）、パッケージング配列によって、組み換えプラスミドのＲＮＡ転写物がウイルス粒子へとパッケージされ得るようになり、次いで、これらは培地へ分泌される。次いで、組み換えレトロウイルスを含有する培地を回収し、場合によっては濃化して遺伝子導入に使用する。レトロウイルスベクターは多種多様な細胞タイプに感染できる。しかし、統合と安定な発現には、宿主細胞の分裂が必要である。
【００８６】
欠損性レトロイルスベクターの使用に伴う懸念事項は、パッケージング細胞中には増殖能力を有する野生型ウイルスが生じる可能性があるという点である。これは、宿主細胞ゲノムの中で統合されたｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ配列の上流に組み換えウイルスからの完全な配列が挿入される組み換え事象によって起こり得る。しかし、組み換えの可能性を大幅に減少させた新しいパッケージング細胞系が今や利用可能である。
【００８７】
ｄ．他のウイルスベクター
本願に記載する方法及び組成物では構築物として、他のウイルスベクターを使用できる。牛痘やヘルペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターを使用できる。
【００８８】
４．リン酸カルシウム共沈又はＤＥＡＥ−デキストラン処理
他の好ましい実施形態においては、リン酸カルシウム共沈を用いて抗原を細胞に導入する。別の実施形態においては、発現構築物をＤＥＡＥデキストラン次いでポリエチレングリコールを使用することにより細胞内に送達する。
【００８９】
５．直接的顕微注入又は超音波ローディング
別の実施形態としては、直接的顕微注入又は超音波ローディングによる抗原の導入が挙げられる。
【００９０】
６．リポソーム媒介形質転換
別の実施形態において、抗原をリポソームに封入してもよい。リポソームはリン脂質二重層膜と内部の水性媒体を特徴とする小胞構造である。多重層リポソームは水性媒体によって隔てられた複数の脂質層を持つ。これは、リン脂質を過剰の水溶液に懸濁させたときに自発的に形成される。脂質成分は自己再配列を起こしてから閉じた構造を形成して、水と溶解した溶質とを脂質二重層の間に封入する。リポフェクタミン（Gibco  ＢＲＬ）と複合体化した核酸構築物も考えられる。
【００９１】
本発明のある実施形態では、リポソームをセンダイウイルス（ＨＶＪ）と複合体化させることができる。これは細胞膜との融合を容易にし、リポソームに封入されたＤＮＡの細胞進入を促進することが明らかにされている。別の実施形態では、リポソームを核非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と複合体化させるか、ＨＭＧ−１と一緒に使用してもよい。さらに別の実施形態として、リポソームをＨＶＪとＨＭＧ−１の両方と複合体化させるか、その両方と一緒に使用してもよい。
【００９２】
７．アデノウイルス支援されたトランスフェクション
ある実施形態中においては、アデノウイルス支援されたトランスフェクションを使用して核酸構築物を細胞に導入する。この細胞システムでは、アデノウイルス結合システムを使用した増大させたトランスフェクション効率が報告されており、発明者は、トランスフェクション効率を増加させるために同じ技術を使用することを考えている。
【００９３】
培養
本発明はさらに、本発明で使用するためのＴ細胞を培養する方法を提供する。
【００９４】
特に、末梢血から分離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、増殖するようにインビトロで活性化させることができる。細胞分裂促進性の刺激は、フィトエモアグルチニン（ＰＨＡ；２μｇ／ｍｌ）又は抗ＣＤ３  ｍＡｂ（ＯＫＴ３；３０ｎｇ／ｍｌ）などの化合物の使用によって得ることができる。
【００９５】
活性化されたＴ細胞は、ｈｕ−ｒ−ＩＬ−２（例えば、１００Ｕ／ｍｌ）などの増殖因子の存在下、５％の自己由来の血清を補足した培地中、１×１０６細胞／ｍｌで培養することができる。
【００９６】
好ましい１つの実施形態では、ＣＤ３とＣＤ２８に対する抗体でコーティングした磁気ビーズの存在下、好ましくはｈｕ−ｒ−ＩＬ２（例えば、１００Ｕ／ｍｌ）の存在下でＴ細胞を培養することができる。ビーズは、ビーズ３個／Ｔ細胞の比率で使用するのが便利である。
【００９７】
次いで、例えば、抗原（複数可）をコードするウイルスベクター（複数可）を使用して、Ｔ細胞を活性化されたＴ細胞に曝露することによって形質導入／形質移入する。トランスジーン（複数可）の発現は形質導入効率を評価するために使用できる。選択遺伝子及びマーカーについては、下により詳細に議論される。あるいは、リンパ球は、上記のようにではあるが、形質導入／形質移入しないで培養する。代わりに、患者への投与の前に、活性化されたＴ細胞に、抗原を、例えば、よく知られている腫瘍、細菌又はウイルス抗原をコードする合成ペプチドの形でロードする。
【００９８】
遺伝子操作プロセス全体は一般に５〜１５日間継続する。
【００９９】
遺伝子操作したＴ細胞は、保存のため冷凍してもよい。
【０１００】
培養の終わりに、遺伝子操作したＴ細胞は、ＨＬＡ−Ｉ  ＨＬＡ−ＩＩ  ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７、ＣＤ４０Ｌ  ＣＤ６２Ｌ  ＣＣＲ７、ＣＤ５４及びＣＤ２５の少なくとも１つを発現するはずである。したがって、我々は、Ｔ細胞の表現型が重要であることを見出した。
【０１０１】
ワクチン
本発明は、個体、特に哺乳動物、好ましくはヒトにおいて免疫学的応答を引き起こす方法であって、抗原が抗体及び／又はＴ細胞免疫応答を生じ、例えば、腫瘍又は細菌若しくはウイルス感染などの感染から個体を保護するように、本発明の抗原を含むＴ細胞を個体に接種することを含む方法に関する。また、そのような免疫学的応答が腫瘍成長又はウイルス若しくは細菌の増殖を遅らせる方法も提供される。
【０１０２】
したがって、本発明は、その中で免疫学的応答を引き起こすことができた個体、好ましくはヒトに導入された時、そのような個体内で免疫学的応答を引き起こす免疫学的組成物に関する。免疫学的応答は、治療上又は予防的に使用されてもよく、抗体免疫及び／又はＣＴＬ若しくはＣＤ４＋Ｔ細胞によって起こる細胞免疫などの細胞免疫の形式をとってもよい。
【０１０３】
活性成分（複数可）として免疫原性ポリペプチド（複数可）を含むワクチンの調製は、当業者に知られている。典型的には、そのようなワクチンは注入用液体（溶液又は懸濁液のいずれかとして）、あるいは注入に先立ち液体中に溶液又は懸濁液とするのに適した固体形状で調製することができる。調製物は乳化してもよいし、あるいは、タンパク質をリポソーム内にカプセル化してもよい。活性な免疫原の成分は、しばしば、薬学的に許容できて活性成分との適合性を有する賦形剤と混合する。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、ブドウ糖、グリセリン、エタノールなど及びこれらの組み合わせである。
【０１０４】
さらに、所望であれば、ワクチンは、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤及び／又はワクチンの有効性を増強するアジュバントなど、少量の補助物質を含んでもよい。
【０１０５】
本発明のワクチン製剤は、好ましくは製剤の免疫性増強のための補助システムに関し及び／又はそうしたシステムを含む。好ましくは、補助システムはＴＨ１タイプの応答を優先的に高める。
【０１０６】
免疫応答は、２つの極端なカテゴリーに広く分類されると考えられる。すなわち、体液性又は細胞媒介免疫応答（伝統的には、それぞれ抗体と細胞エフェクターの保護メカニズムによって特徴づけられる）である。応答のこれらのカテゴリーはＴＨ１タイプ応答（細胞媒介応答）及びＴＨ２タイプ免疫応答（体液性応答）と呼ばれている。
【０１０７】
極端なＴＨ１タイプ免疫応答は、抗原特異的、ハプロタイプ限定的な細胞傷害性Ｔリンパ球及びナチュラルキラー細胞応答の生成によって特徴づけることができる。マウスでは、ＴＨ１タイプ応答はＩｇＧ２ａサブタイプの抗体の生成によってしばしば特徴づけられ、他方、ヒトでは、これらはＩｇＧ１タイプ抗体に対応する。ＴＨ２タイプ免疫応答は、マウスＩｇＧ１、ＩｇＡ及びＩｇＭに含む、広範囲の免疫グロブリンアイソタイプの生成によって特徴づけられる。
【０１０８】
これらの２つのタイプの免疫応答の発現の元になる推進力は、サイトカインと考えることができる。高レベルのＴＨ１タイプサイトカインは、与えられた抗原に対する細胞媒介免疫応答の誘導を進める傾向があり、高レベルのＴＨ２タイプサイトカインは、抗原に対する体液性免疫応答の誘導を進める傾向がある。
【０１０９】
ワクチンなどの免疫調整剤は、本発明の１種又は複数のポリペプチド、又はヌクレオチド配列を含むＴ細胞から調製できる。活性成分（複数可）として免疫原性ポリペプチド（複数可）を含む、免疫調整剤の調製は、当業者に知られている。典型的には、そのような免疫調整剤は、注入可能液体（溶液又は懸濁液のいずれかとして）として、あるいは注入に先立ち液体中に溶液又は懸濁液とするのに適した固体形状で調製することができる。調製物は乳化してもよいし、あるいは、タンパク質をリポソーム内にカプセル化してもよい。活性な免疫原の成分は、しばしば、薬学的に許容できて活性成分との適合性を有する賦形剤と混合する。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、ブドウ糖、グリセリン、エタノールなど及びこれらの組み合わせである。
【０１１０】
さらに、所望であれば、免疫調整剤は、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤及び／又は免疫調整剤の有効性を増強するアジュバントなど、少量の補助物質を含んでもよい。有効である可能性のあるアジュバントの非限定的な例としては以下のものが挙げられる：水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ｎｏｒ−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ  １１６３７。ｎｏｒ−ＭＤＰと呼ばれる）、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ  １９８３５Ａ。ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）、細菌から抽出された３つの成分、モノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジマイコレート及び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０乳液中に含むＲＩＢＩ。
【０１１１】
アジュバント及び他の薬剤のさらなる例としては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム（ミョウバン）、硫酸ベリリウム、シリカ、カオリン、炭素、油中水型乳剤、水中油型乳剤、ムラミルジペプチド、細菌の菌体内毒素、脂質Ｘ、コリネバクテリウムパルヴム（Corynebacterium parvum）（プロピオノバクテリウムアクネス（Propionobacterium acnes））、百日咳菌（Bordetella pertussis）、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、リソレシチン、ビタミンＡ、サポニン、リポソーム、レバミソール、ＤＥＡＥデキストラン及びブロックされた共重合体又は他の合成アジュバントを含む。そのようなアジュバントは、様々な供給元、例えば、メルクアジュバント６５（Merck and company，Inc．，ニュージャージー州Rahway）、Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジュバント及び完全アジュバント（Difco Laboratories、ミシガン州Ｄｅｔｒｏｉｔ）から市販されている。
【０１１２】
典型的には、Ａｍｐｈｉｇｅｎ（水中油型）、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（水酸化アルミニウム）又はＡｍｐｈｉｇｅｎとＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌの混合物のようなアジュバントが使用される。水酸化アルミニウムだけしかヒトの使用用途に承認されていない。
【０１１３】
両者が有効な量である限り、免疫原とアジュバントの割合は広い範囲にわたって変えることができる。例えば、水酸化アルミニウムは、免疫調整剤混合物の約０．５％量（Ａ１２０３基準）存在することができる。免疫調整剤は、免疫原を最終濃度として０．２〜２００μｇ／ｍｌ、好ましくは５〜５０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは１５μｇ／ｍｌ含むように製剤するのが便利である。
【０１１４】
製剤後に、免疫調整剤を滅菌容器に組み入れ、次いで、密閉され、低温、例えば、４℃で保存してもよく、凍結乾燥してもよい。凍結乾燥では安定した形で長期保存が可能になる。
【０１１５】
免疫調整剤は、従来通りに非経口的に、注入によって、例えば、皮下又は筋肉内のいずれかで投与される。他の投与形態に適した別の製剤としては、坐薬及び場合によっては経口製剤が挙げられる。坐薬については、従来のバインダー及びキャリアーは、例えば、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドを含んでもよい。そのような坐薬は、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲の活性成分を含む混合物から形成することができる。経口製剤は、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性製剤又は粉末の形態を取り、活性成分を１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％含む。免疫調整剤組成物を凍結乾燥する場合、凍結乾燥された物質は投与の前に例えば、懸濁液として再構成してもよい。再構成は、好ましくは緩衝液を用いて行われる。
【０１１６】
本発明のポリペプチドは中性又は塩として免疫調整剤中に製剤化できる。薬学的に許容できる塩類は酸性添加塩類（ペプチドの遊離アミノ基で形成される）を含み、これは例えば塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸などの有機酸によって形成される。このような遊離カルボキシル基で形成された塩類としては、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン及びプロカインなどの有機塩基に由来するものでもよい。
【０１１７】
抗原
一般に、抗原は抗原レセプターと相互作用できるすべての物質である。抗原は特定の抗体に結合し、抗原が認識され不活性化されるメカニズムを提供する。このようにして、抗原は、特異的抗体と複合体を形成し、その結果、複合体は専門免疫細胞に結合することができる。この専門免疫細胞は複合体を内部に取り込んでそれを破壊するか、又はヒスタミンなどの生物学的媒介物質を放出して、アレルギー性／炎症性反応を生じる。免疫原はそれ自体に対する免疫応答を生成するように免疫細胞を活性化する抗原である。したがって、免疫原は抗原であるが、抗原は必ずしも免疫原ではない。参照の便宜上、本願では、抗原、免疫原という用語は一般に交換可能なものとして使用される。
【０１１８】
本発明は、一般に、免疫系に抗原を提示する新しい方法に関する。抗原の免疫原としての可能性を決定する要因のうちのいくつか、従って免疫応答を生成するその能力は、免疫細胞認識及び抗原投与経路に対する抗原エピトープの接近容易性を含む。本発明は抗原の免疫原性が最適化されるようにこれらの要因を改善するシステムを提供する。その結果、２、３回分の投与量に相当するものを１回のワクチン投与で得ることができる。したがって、ワクチンの有効性が改善されるだけでなく、患者のコンプライアンスも改善される。
【０１１９】
本発明は、抗原が免疫系、特にＡＰＣに提示されるようにＴ細胞導入できるすべての抗原に適用可能である。特に好ましい実施形態では、抗原は、Ｔ細胞中で発現可能なポリヌクレオチドの形でＴ細胞中に導入される。
【０１２０】
広範囲の適当な抗原が知られている。それらの配列は、例えば、文献中で知られているポリペプチド配列に基づいて選択できる。免疫原活性を備えたタンパク質の部分配列を有するポリペプチドについては、どのペプチドが適切な候補か配列比較によって確証することが可能である。好ましい候補はその免疫原性が既に実証されているポリペプチド、すなわち、ウイルス又は細菌のタンパク質などの既に知られている免疫原に由来するポリペプチドである。このタイプのポリペプチドは、好ましくはその免疫原性のためにＭＬＣ試験で強い反応を示す。「タンパク質」という用語は、単一鎖ポリペプチド分子だけでなく多重的なポリペプチド複合体（個々の構成ポリペプチドは、共有結合又は非共有結合手段によって連結される）をも含む。「ポリペプチド」という用語は、長さ２以上のアミノ酸のペプチド（典型的には５個、１０個又は２０個アミノ酸を超える）を含む。
【０１２１】
本発明で使用するポリペプチド配列が、特定の配列若しくはその断片又は特定のタンパク質から得られる配列に限定されず、任意の出所（例えば、関連するウイルス／細菌タンパク質、細胞の相同体、合成ペプチド、さらにその変異体や誘導体）から得られる相同配列を含むことは理解されるであろう。本発明のポリペプチド配列は、さらに本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む。
【０１２２】
したがって、本発明は、抗原のアミノ酸配列の変異体、相同体又は誘導体、さらに、本発明のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の変異体、相同体又は誘導体を同様に包含する。
【０１２３】
本発明の文脈では、相同配列は、特定の配列とアミノ酸レベルが少なくとも６０、７０、８０又は９０％、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であるアミノ酸を含ものとする。特に、相同性は、典型的には実質的でない近隣の配列ではなく抗原性にとって不可欠であることがわかっている配列のそれらの領域に関して特に考慮されるべきである。ファミリーメンバーに共通して保存される領域は、比較的高い相同性スコアを持つことを要求されるはずである。ユニークであるかファミリーメンバー間での保存度が低い領域は、ケースバイケースでより低いスコアとすることが可能で、これは新規性を確立する助けとなる。このビットごとのアプローチは、全面的な相同スコアよりも一般により有用である。相同性は類似性（すなわち、類似の化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）の点で考慮することもできるが、本発明の文脈では、配列同一性の点で相同性を表現することが好ましい。
【０１２４】
相同性比較は目分量で、あるいは、より普通には、容易に利用可能な配列比較はプログラムの支援を受けて行うことができる。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間の％相同性を計算することができる。
【０１２５】
本発明のアミノ酸配列に関して「変異体」、「誘導体」という用語は、その配列から又はその配列に対する、１つの（又は複数の）アミノ酸の任意の置換、変化、修飾、置換、欠失、又は追加を含み、得られるアミノ酸配列が、好ましくは抗原活性を有し、配列表中に示したポリペプチドの活性の好ましくは少なくとも２５〜５０％、より好ましくは少なくとも実質的に同じ活性を有する配列を含む。
【０１２６】
したがって、本発明の特定の配列は本発明で使用するために修正してもよい。典型的には、配列の抗原性を維持する修正がなされる。したがって、１つの実施形態では、もし修正した配列が少なくとも約２５〜５０％まで又は実質的に同じ活性を保持するのであれば、アミノ酸置換は、例えば、１、２又は３から１０、２０又は３０置換までなされ得る。しかし、別の実施形態では、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列への修正は、ポリペプチドの生物学的活性を故意に小さくするために行うこともできる。例えば、標的分子と結合する能力は残しているが機能的なエフェクタードメインを欠くために短縮ポリペプチドは、全長（非短縮）分子の生物学的活性の阻害剤として有用であり得る。
【０１２７】
一般に好ましくは、変異体又は誘導体のアミノ酸残基の２０％、１０％、又は５％未満が、配列表に記載する対応領域と比較して変更される。
【０１２８】
アミノ酸置換は、例えば、治療のために投与したポリペプチドの血漿半減期を増加させるために天然には存在しないアナログの使用を含んでもよい（治療に使用するためのペプチド誘導体の生産についてのその他の詳細に関しては下記を参照）。
【０１２９】
例えば下表に従って保存的な置換を行うこともできる。第２欄の同じブロックの、及び好ましくは第３欄の同じ行中のアミノ酸は、互いに置換することができる。
【０１３０】
【表１】
2006503878.tif 000002
また、本発明のポリペプチドは、その全長ポリペプチド及び変異体の断片を含む。好ましい断片は、エピトープを含むものを含む。適切な断片は、アミノ酸長が、少なくとも約５、例えば１０、１２、１５又は２０である。それらはまた、アミノ酸長が、２００、１００又は５０未満のアミノ酸であってもよい。タンパク質及び対立形質及びその種変異体のポリペプチド断片は、保存的置換を含めて、１種又は複数（例えば、２、３、５、又は１０）の置換、欠失又は挿入を含んでもよい。置換、欠失及び／又は挿入が、例えば組み換え技術によってなされる場合、配列表に記載するアミノ酸残基の好ましくは２０％、１０％又は５％未満が変更される。
【０１３１】
特に好ましい断片としては、抗原ドメインを有するものが挙げられる。
【０１３２】
本発明で使用するポリヌクレオチドは、本発明の配列をコードする核酸配列を含む。遺伝コードの縮重の結果、多数の異なるポリヌクレオチドが同じポリペプチドをコードし得るという点は当業者であれば理解されるであろう。さらに、当業者であれば、本発明のポリペプチドを発現させる何らかの特定の宿主有機体でのコドン使用法を反映するため、慣用的な技術を用いて、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響しないヌクレオチド置換をなし得ることも理解はずである。
【０１３３】
本発明のポリヌクレオチドはＤＮＡ又はＲＮＡを含んでもよい。それらは一本鎖でもよいし又は二本鎖でもよい。さらに、それらはそれらの内に合成ヌクレオチド又は修飾されたヌクレオチドを含むポリヌクレオチドでもよい。オリゴヌクレオチドに対する多種多様なタイプの修飾が当技術分野で知られている。これらはメチルホスホネート及びホスホロチオエート骨格、分子の３’及び／又は５’端へのアクリジン又はポリリシン鎖の付加を含む。本発明の目的のためには、ここに記載されたポリヌクレオチドが、当技術分野において利用可能な任意の方法によって修正されてもよいことは、理解されるはずである。そのような修正は本発明のポリヌクレオチドのインビボ活性又は寿命を増強するために行われてもよい。
【０１３４】
ヌクレオチド配列に関して「変異体」、「ホモログ」又は「誘導体」という用語は、その配列から又はその配列に対する、１つの（又は複数の）核酸の任意の置換、変化、修飾、置換、欠失又は付加を含み、得られる核酸配列が抗原活性を有するポリペプチドをコードする配列を含む。
【０１３５】
上に示したように、配列相同性に関して、本願の配列表に示す配列に好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性を有する。より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する。ヌクレオチド相同比較は上に記載するように行われ得る。好ましい配列比較プログラムは上に記載したＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムである。デフォルトのスコアリングマトリクスは、各同一のヌクレオチドに対して１０の、各ミスマッチに対して−９のマッチング値を有する。デフォルトギャップ生成ペナルティは−５０であり、デフォルトギャップ伸張ペナルティは各ヌクレオチドに対して−３である。
【０１３６】
本発明はまた、抗原配列又はその任意の変異体、断片若しくは誘導体、又は上記のいずれかの相補鎖に選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を包含する。ヌクレオチド配列は、長さが好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドであり、より好ましくは長さが少なくとも２０、３０、４０又は５０ヌクレオチドである。
【０１３７】
本願で使用する場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は、「核酸鎖が塩基対形成によって相補鎖と連結するプロセス」だけでなく、ポリメラーゼ連鎖反応技術において実行されるような増幅プロセスも同様に含むものとする。
【０１３８】
本願で示すヌクレオチド配列又はその相補鎖に選択的にハイブリダイズすることができる本発明のポリヌクレオチドは、一般に少なくとも２０、好ましくは少なくとも２５又は３０、例えば少なくとも４０、６０又は１００以上の連続するヌクレオチドからなる領域にわたって、対応するヌクレオチド配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０又は９０％、より好ましくは少なくとも９５％又は９８％相同である。
【０１３９】
「選択的にハイブリダイズすることができる」という用語は、本発明の標的ポリヌクレオチドがバックグラウンドを有意に越えるレベルでプローブとハイブリダイズすることが分かる条件下で、プローブとして使用するポリヌクレオチドを用いることを意味する。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、例えば、スクリーニングされるｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリー中に、他のポリヌクレオチドが存在するために生じ得る。この場合、バックグラウンドは、プローブとライブラリーの非特異性のＤＮＡメンバーとの間の相互作用によって生成されたシグナルのレベルを意味し、これは、標的ＤＮＡについて観察される特異的相互作用の強度の１０倍未満、好ましくは１００倍未満である。相互作用の強度は、例えば、プローブを放射性標識（例えば、３２Ｐで）することにより測定することができる。
【０１４０】
ハイブリダイゼーションの条件は、Berger  and  Kimmel(1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA)に教示されるように核酸結合複合体の融点（Ｔｍ）に基づき、下に説明されるような定義された「ストリンジェンシー」を与える。
【０１４１】
最大ストリンジェンシーは、典型的には約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い）で；高ストリンジェンシーはＴｍ以下約５℃〜１０℃で；中程度のストリンジェンシーはＴｍ以下約１０℃〜２０℃；また、低ストリンジェンシーはＴｍ以下約２０℃〜２５℃で生じる。当業者には理解されるように、最大ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、同一のポリヌクレオチド配列を識別又は検出するために使用することができ、中間の（又は低い）ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、類似又は関連するポリヌクレオチド配列を識別又は検出するために使用することができる。
【０１４２】
好ましい態様では、本発明は、ストリンジェントな条件（例えば、６５℃、０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎａ３、ｐＨ  ７．０｝）下、抗原ヌクレオチド配列にハイブリダイズできるヌクレオチド配列をカバーする。
【０１４３】
本発明のポリヌクレオチドは二本鎖であるが、両方の鎖が二重であるもの（個々に又は組み合わせにおいてのいずれか）も本発明に包含される。ポリヌクレオチドが一本鎖である場合、そのポリヌクレオチドの相補的配列も本発明の範囲内で含まれると理解すべきである。
【０１４４】
本発明の配列に１００％相同ではないが、本発明の範囲以内にあるポリヌクレオチドは多くの方法で得ることができる。本願に記載する配列の他の変異体は、例えば、個体の範囲内（例えば異なる集団からの個体）で作られるＤＮＡライブラリーをプローブすることにより得ることができる。さらに、他のウイルス／細菌細胞、細胞ホモログ、特に哺乳類細胞（例えば、ラット、マウス、ウシ及び霊長類細胞）で見出される細胞のホモログを得ることができ、また、一般に、そのようなホモログ及びその断片は、本願の配列表で示される配列に選択的にハイブリダイズできるであろう。そのような配列は、他の動物類からのゲノムのＤＮＡライブラリーから作られたｃＤＮＡライブラリーをプローブしたり、既知の配列のすべて又は一部を含むプローブによって、中程度から高ストリンジェンシー条件下にそのようなライブラリーをプローブすることにより得ることができる。同様の考察は、種ホモログ及び対立形質の変異体を得るのにも当てはまる。
【０１４５】
変異体及び株／種ホモログは、縮重ＰＣＲを使用して得ることもできる。これは、本発明の配列内で保存されたアミノ酸配列をコードする変異体及びホモログ内の標的配列に対して設計されたプライマーを使用するものである。保存された配列は、例えば、いくつかの変異体／ホモログからのアミノ酸配列をアラインすることにより予測できる。配列のアラインメントは当技術分野で既知のコンピューターソフトウエアを使用して実行することができる。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＰｉｌｅＵｐプログラムが広く使用される。
【０１４６】
縮重ＰＣＲで使用されるプライマーは、１又は複数の縮重位置を含み、既知の配列に対する単一の配列プライマーによって配列のクローンを作るために使用するものより低いストリンジェンシー条件で使用されるであろう。
【０１４７】
あるいは、そのようなポリヌクレオチドは同定された配列の部位指示的突然変異生成によって得ることができる。これは、例えば、ポリヌクレオチド配列が発現されている特定の宿主細胞に対するコドン嗜好を最適化するために、サイレントコドンの変更が配列に要求される場合に有用である可能性がある。制限酵素認識部位を導入するか又はポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドの特性若しくは機能を変更するために他の配列変更が望ましい場合もあろう。
【０１４８】
本発明によるＤＮＡポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチド及びプローブは、組み換えによって、あるいは、合成的に、又は当業者に利用可能な任意の手段によって生産することができる。それらは標準的技術によってクローン化することもできる。
【０１４９】
タンパク質又はタンパク質断片を使用する場合、プロセシングされた最終生産物の同一性は化学分析又は生物学的アッセイ（プロセシングされた断片に特異的なＴ細胞を刺激するＡＰＣの能力）によって実証することができる。
【０１５０】
ペプチド候補は、原則としてはいくつかの段階で外来ペプチドとしてその適応性に関して選択される。一般に、こうした候補は、第１には、ＭＨＣ−Ｉ分子へのその結合能力に関するペプチド結合試験によって試験される（好ましくは一連の試験による）。
【０１５１】
適当な研究方法の１つは、例えばフローサイトメトリーに基づくＦＡＣＳ分析である。ペプチドを蛍光性染料、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレスセインイソチオシアナート）でマークし、ＭＨＣ−Ｉ分子を発現する腫瘍細胞に適用する。流れの中で、個々の細胞はある波長のレーザーで励起され、放射されたた蛍光を測定する。これはペプチドの細胞への結合量に依存する。
【０１５２】
ペプチド結合量を決定する別の方法はＳｃａｔｃｈａｒｄブロットである。このためにはＩ１２５又は希土類金属イオン（例えば、ユウロピウム）で標識したペプチドを使用する。細胞を４℃で３０〜２４０分間、所定の様々なペプチド濃度でチャージする。ペプチドの細胞との非特異的相互作用を決定するため、試料のうちのいくつかに、標識が付されていない過剰量のペプチドを加えて標識が付されたペプチドの特異的相互作用を妨げる。次いで、非特異的な細胞付着物質をすべて除去するために細胞を洗う。次いで、放射された放射能を用いてシンチレーション計数器により、又は長寿命蛍光を測定するのに適した光度計で細胞結合ペプチドの量を決定する。このようにして得られたデータを、標準的方法を使用して評価する。
【０１５３】
第２ステップでは、良好な結合性を有する候補をその免疫原性に関して試験する。
【０１５４】
免疫原活性が未知のタンパク質に由来するゼノペプチド（xenopeptide）の免疫原性は、例えばＭＬＣ試験によって試験することができる。この試験（好ましくは、さらに様々なペプチドを用いた一連のものとして行う）において、免疫原活性が既知のペプチドを標準として使用し、特に激しい反応を惹起するペプチドが本発明の目的に適している。
【０１５５】
その免疫原性に関しＭＨＣ−Ｉ−結合ペプチド候補を試験する別の可能な方法は、Ｔ２細胞へのペプチドの結合を検討するものである。そのような試験の１つはＴ２細胞、又はＲＭＡ−Ｓ細胞の特有の性質に基づく。これは、ＴＡＰペプチド輸送メカニズムに欠陥があり、ＭＨＣ−Ｉの情況で提示されるペプチドに適用された場合、安定なＭＨＣ−Ｉ分子のみ提示する。
【０１５６】
ＨＬＡ遺伝子、例えば、ＨＬＡ−Ａ１及び／又はＨＬＡ−Ａ２遺伝子で安定に形質移入されたＴ２細胞又はＲＭＡ−Ｓ細胞をこの試験のために使用する。細胞が、免疫系によって外来のものとして認識されるようなＭＨＣ−Ｉ情況において提示されることによって、良好なＭＨＣ−Ｉ配位子であるペプチドにより作用される場合、これらのペプチドは著しい量のＨＬＡ分子を細胞表面に出現させる。細胞表面上のＨＬＡの検出（例えば、モノクローナル抗体による）によって適当なペプチドを識別することが可能になる。ここでもまた、良好なＨＬＡ−又はＭＨＣ結合能力を有することが知られている標準的ペプチドを使用するのが適当である。
【０１５７】
抗原は、真菌類、寄生動物、細菌及びウイルスに由来するものでもよい。したがって、本発明の１つの実施形態は、感染症の予防又は治療に関する。本発明が適用できる感染症の例としては以下のものが挙げられる：アデノウイルス、炭そ熱、コレラ、ジフテリア、破傷風、百日咳、マラリア、ヘモフィリアインフルエンザ(Haemophilus influenzae)タイプＢを含むインフルエンザ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、脳炎、麻疹、耳下腺炎、風疹、脳膜炎タイプＡ、Ｃ、Ｙ及びＷ−１３５などの脳膜炎、ペスト(plague)、肺炎双球菌、狂犬病、天然痘、サルモネラ菌、チフス、水痘、黄熱病、リフトバレー熱。しかし、本発明は利用可能となる任意の新しい免疫原と共に使用するのに適用可能であろう。実際、本発明は免疫系への抗原の提示を改善するので、ワクチン法では扱いにくいと一般に考えられている疾病及び感染病、例えば、ＨＩＶに特に適用可能であろう。
【０１５８】
特に好ましい実施形態では、本発明は癌ワクチンを提供する。したがって、本発明は、黒色腫、前立腺癌、肺癌、乳癌及び結腸癌並びにリンパ腫などの腫瘍の治療において有用である。
【０１５９】
さらに、化学療法や放射線などの従来の癌治療の欠点の１つは、癌細胞を破壊する際に、それらがある程度の健康な組織にダメージを与えるという点である。癌ワクチンはこれらの問題を軽減することを目的とする。本発明は腫瘍関連抗原と共に使用するのに特に適用可能である。たとえ免疫系が癌細胞を外来のものと認識しなくても、癌細胞はそれらの表面に特定の抗原を備えていることが見い出されている。これらは個々の腫瘍に特有な場合もあるし、又はいくつかのタイプによって共有される場合もあるし、腫瘍が発生する正常な組織によって発現される場合もある。また、本発明は、癌遺伝子や腫瘍抑圧遺伝子などの腫瘍形成に関与する遺伝子産物に付随する抗原に適用可能である。本発明はさらに、肝臓癌及びＥＢＶの進行に長期にわたり原因として関わっているＢ型肝炎ウイルスなどの癌に関係するウイルスにも適用可能である。
【０１６０】
本発明は外科又は化学療法など、疾病の以下の診断又は以下の初期治療に使用することができる。
【０１６１】
本発明で使用され得る腫瘍抗原の例（但し、これらに限定されない）を以下に論じる。
【０１６２】
ＭＡＧＥ−１（Ｔ細胞によって認識されるヒトの腫瘍抗原をコードするものとして最初に報告された遺伝子）のクローニング以来、腫瘍抗原についての分子の識別及び同定は、主として黒色腫について達成されてきた。この主な理由は、他のタイプの癌からインビトロの細胞系、すなわち、腫瘍特異的ＣＴＬ系統を生成するのに必要なそのような系統、又は分子の点から新しい癌抗原を識別することを目指した遺伝生化学的アプローチで使用されるクローンを確立するのが困難だという点にある。しかし、最近になって、新しいアプローチにより、黒色腫と異なる腫瘍においてもＴ細胞によって認識される新しい抗原の発見が可能になった。様々な抗原カテゴリーの例を以下に示す。しかし、上に議論したように、本発明では、アナログ又は人為的に修正したエピトープも使用してもよい。抗体によって識別される他の抗原も使用でき、Ｓｅｒｅｘ技術によって検出されたように、それらの大きなコレクションが癌研究(www．Licr．org／SEREX．htm)研究所のデータベース中に見出すことができる。多くの腫瘍抗原（例えば、ＭＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１ａ）が現在、同じ癌患者の中のＴ細胞と抗体の両方によって認識されるとわかったことは注目すべき点である。さらに、最近の技術（例えば、差し引きハイブリダイゼーション、表示差分析(representational−difference analysis)、マイクロアレイ）を使用して、正常な相当物と比較して新生物細胞中で優先的に発現されるか過剰発現され、又は転移では発現するが原発初期傷害では発現しない何百もの遺伝子が検出されている（例えば、黒色腫、乳癌、リンパ腫など）。適当なコンピューターアルゴリズムの使用によって、ＭＨＣ分子を結合できる多数の新しいエピトープが識別されるであろう。そのようなアプローチの適用によって、遺伝子産物の大きな配列をそれらの潜在的な抗原機能についてスクリーニングすることができる。免疫原性エピトープは適当な機能アッセイによって選択できる。これらはすべて、さらに本発明において有用である可能性がある。
【０１６３】
腫瘍抗原の分類
グループ１．クラスＩＨＬＡ限定癌／精巣抗原
腫瘍免疫学における画期的出来事は、確かにＭＡＧＥ−１のクローニング及びこれに続く１年後の最初のＴ細胞定義された抗原エピトープの同定であった。これらの発見に続き、このグループ内の新しいメンバーの識別が急速に進んだ。遺伝子ファミリーＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ及びＧＡＧＥファミリーが生まれた。このグループ（現在ではＮＹ−ＥＳＯ−１も含む）に属する抗原は、組織学的に様々なヒトの腫瘍及び正常な組織中、精巣の精母細胞／精原細胞中、場合によっては胎盤中で発現することから癌／精巣（ＣＴ）抗原と呼ばれる。これらの抗原は、今や、抗腫瘍のワクチン開発のための主要な成分のうちの１つを表わす。ＣＴ抗原は成人の組織において通常活動していないがある種の腫瘍の中で転写活性化された遺伝子の復活に起因する。ＣＴ遺伝子は恐らく最もよく特徴が明らかにされた遺伝子である。クローン化されたＣＴ抗原のグループ内の新たな遺伝子は含むであろう（ＣＴ９、ＣＴ１０、ＬＡＧＥ、ＭＡＧＥ−Ｂ５、−Ｂ６、−Ｃ２、−Ｃ３及び−Ｄ、ＨＡＧＥ、ＳＡＧＥ）。
【０１６４】
グループ２．クラスＩＨＬＡ限定分化抗原
これらの抗原は、腫瘍と、腫瘍が発生した正常な組織の間で共有される。大部分は黒色腫と正常なメラニン形成細胞で見つかる。メラニン形成細胞系統に関連するタンパク質の多くは、メラニンの生合成に関係する。ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の両者によって認識されるエピトープは、メラノソームタンパク質に由来し得る。
【０１６５】
グループ３．クラスＩＨＬＡ限定広発現抗原
広く発現する腫瘍抗原をコードする遺伝子は、多くの正常な組織とともに組織学的に様々なタイプの腫瘍（あるタイプの癌に関しての優先的発現がない）でも検出された。正常な組織上で発現した多くのエピトープはＴ細胞認識のためには閾値レベル未満であるが、腫瘍細胞でのそれらの過剰発現が以前に確立している耐性を壊すことにより抗癌性応答を引き起こし得る可能性がある。これらの広発現遺伝子産物は、遺伝子転写及び翻訳の変更を通じてＴ細胞に定義されたエピトープを生成することに関係するメカニズムの広いスペクトルを明らかにした。いくつかの例を強調すると、ＲＵ２遺伝子が逆鎖転写によってそのエピトープを作成する一方、ＣＥＡのエピトープは非−ＡＵＧ−定義された代替的ＯＲＦに由来する。
【０１６６】
グループ４．クラスＩＨＬＡ限定腫瘍特異的抗原
ユニークな腫瘍抗原が、正常遺伝子の点突発変異から発生し（カテニン様、ＣＤＫ４）、その分子変化は新生物の形質転換又は進行にしばしば伴う。これらの抗原はそれらが識別された個々の腫瘍の中でのみこのように発現される。というのも、同じ変化が２つの異なる新生物に生じるのは、変化が新生物の形質転換に不可欠なステップとなっている遺伝子（例えば、ＲＡＳ）を含んでいなければ、ありそうもないからである。マウスモデルの場合では、ユニークな抗原は、共有される抗原の他のグループより高い免疫原性を有することが示された。ユニークな抗原は、マウス中の腫瘍移植の拒絶の原因となるので、それらは腫瘍特異的移植抗原（ＴＳＴＡ）として定義された。
【０１６７】
腫瘍特異的抗原であるが共有された他の抗原が記載されている。これは、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２の場合のように、スプライシング機構の変更によって生成され、腫瘍中には存在するが、正常な細胞中では生じない。
【０１６８】
グループ５．クラスII  ＨＬＡ限定抗原
腫瘍抗原によるＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の刺激は、癌患者においては損なわれているか存在しないと考えられており、これは腫瘍への不十分な免疫応答の理由である可能性がある。したがって、そのようなリンパ球によって認識された腫瘍抗原エピトープの識別は、臨床上の効能を生じる可能性がある抗腫瘍免疫応答で長い間求められてきた重大な改良ステップである。クラスII  ＨＬＡによって提示されたＣＤ４＋Ｔ細胞応答を刺激することができる第１のエピトープは、１９９４年に黒色腫チロシナーゼ中で識別された。次いで、４年間のギャップ（その間には追加のエピトープは１つだけが同定された）を経て、クラスII限定ペプチドをコードする他の遺伝子が発見された。しかし、腫瘍抗原のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを識別するための技術的と方法論のアプローチが利用可能になるにつれ、そのようなエピトープの報告には指数関数的な増加が見られた。実際、１９９８年以来、１４の抗原から２７種もの新たなクラスII  ＨＬＡ限定エピトープが、Ｉｉ−ｃＤＮＡ融合ライブラリー、免疫化遺伝子組み換えマウス及び生化学的アプローチを使用して、分子として識別された。したがって、クラスII限定された抗原であっても、真に腫瘍特異的抗原を表わす、変異タンパク質のサブグループを含む点が注意される。
【０１６９】
グループ６．融合タンパク質。
【０１７０】
いくつかの悪性腫瘍、特に白血病のいくつかの形式では、発癌の分子的メカニズムは、離れた遺伝子が融合した結果生じた染色体の転座を含む。これは、各タイプの疾病を特徴づけ（例えば、それぞれＣＭＬ及びＡＰＬ中のｂｃｒ−ａｂｌ、ｐｍｌ−ＲＡＲ）、Ｔ細胞（それぞれクラスＩ又はクラスII  ＨＬＡ限定のＣＤ８＋又はＣＤ４＋）によって認識できる新しいエピトープを生成する融合タンパク質の合成をしばしば引き起こす。これらのエピトープは白血病患者において弱い免疫原に見えるが、それでも、これらのペプチド又はタンパク質のいくつかは、ワクチン接種用の樹状細胞をパルスするために使用できる。
【０１７１】
本発明において特に有用な腫瘍抗原の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ及びＧＡＧＥ、チロシナーゼからのＣＴＬ認識するエピトープ、ＭｅｌａｎＡＭａｒｔ１、ｇｐ１００ｍｅ１７及びｇｐ７５ＴＲＰ１。
【０１７２】
選択遺伝子又はマーカー
本発明のＴ細胞は、好ましくは、選択遺伝子又はマーカー遺伝子である別の外来遺伝子を、少なくとも１つ含む。よく知られているように、形質転換されていない細胞から形質転換された細胞を選択するために選択遺伝子を使用することができる。多種多様な選択可能なマーカーが、ベクターの中で成功裡に使用されており、これらは本発明でも同様に使用することができる。適当な、細菌抗原又は動物抗原が使用される。好ましい実施形態では、例えば、細菌抗原（例えば、β−ガラクトシダーゼ）、細菌遺伝子又は抗生物質（例えば、ｎｅｏ、ａｍｐ、Ｋａｎ及びｔｅｔ）に対する耐性を付与する他の遺伝子又は自殺遺伝子（例えば、ＨＳＶ−Ｔｋ）である。
【０１７３】
好ましい実施形態では、Ｔ細胞は外来抗原として少なくとも１つの自殺遺伝子をさらに含む。そのような自殺遺伝子の使用の利点は、シクロスポリン又は５’−フルオロシトシンなどの別の物質を全身に投与することにより、この遺伝子の活性化をコントロールすることができるという点である。１つの自殺遺伝子の例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ  Ｔｋ）が挙げられ、ガンシクロビル投与後、感染細胞及び傍観者細胞を殺すことができる。
【０１７４】
他の自殺遺伝子としては、例えば、５−フルオロシトシンへの致死感受性を付与するシトシンデアミナーゼ遺伝子が挙げられ、ヒト細胞表面分子ＣＤ２０（これは形質導入された細胞をリツキシマブ(rituximab)の投与によって殺すことを可能にする(Introna et al. HumGene Ther 11：611,2000)。ＣＤ２０の利点は、それがヒトの分子であるため、免疫原性がないという点である。
【０１７５】
自殺遺伝子の使用における特別の利点は、望ましくない副作用が生じた場合には、Ｔ細胞を殺すために使用できるという、その安全性である。
【０１７６】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、選択遺伝子又はマーカー遺伝子は、それ自体免疫原性か、又は免疫原性のタンパク質を発現する。そのようなシステムの利点は、患者の免疫学的状態を可能にし、したがって、あるワクチン接種治療の有効性のモニターを可能にする点である。このような適当な別の外来抗原としては、ＨＳＶ−Ｔｋ及びＮｅｏ（これらは両方とも、免疫能力のある患者において免疫応答を生成する）が挙げられる。例えば、以下にさらに詳細に記載するように、第１の抗原に対する患者の免疫を、抗ＨＳＶ−Ｔｋ細胞溶解活性を検出することによってモニターすることができる。
【０１７７】
安全上の理由から、例えば、放射線照射又はミトマイシン処理によって本発明のＴ細胞を成長阻止することもできる。そのような放射線は、室温で１００Ｒａｄ／分の照射量で実行することができる。そのような放射線に曝露された細胞はもはや増殖しないが、細胞の中にはそのｍＲＮＡがまだ存在しているため、タンパク質をまだ発現することができる。
【０１７８】
治療
これは、ヒト又はヒト以外の動物に有益なすべての治療的適用を含む。哺乳動物の治療は特に好ましい。ヒトの治療及び獣医的治療は両者とも本発明の範囲内である。
【０１７９】
治療は既存の症状に関してのものでもよいし、又は、それは予防的でもよい。これは、成人、年少者、幼児、胎児又はこれらのいずれかの一部（例えば、器官、組織、細胞又は核酸分子）の治療でもよい。
【０１８０】
本発明の方法によって調製されたＴ細胞は、悪性腫瘍に罹患した患者に投与できる。
【０１８１】
一般に、エクソビボアプローチでは、患者は、処理されたＴ細胞が由来する患者であると考えられる。治療され得る悪性腫瘍の例としては、胸部、頚部、大腸、直腸、子宮内膜、腎臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、膀胱、ＣＮＳ、食道、頭又は首、肝臓、精巣、胸腺又は甲状腺の癌を含む。血球、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、リンパ球の前駆体又は脊髄細胞前駆体の悪性腫瘍も治療し得る。
【０１８２】
腫瘍は固形腫瘍でも非固形腫瘍でもよいし、原発腫瘍でも播種性転移（２次）腫瘍でもよい。非固形腫瘍は骨髄腫；急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、赤白血病(erythroleukaemia)などの白血病（急性又は慢性、リンパ球性又は骨髄性）；ホジキン、非ホジキン及びバーキット(Burkitt）などのリンパ腫を含む。固形腫瘍は癌腫、大腸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、腎臓癌、腺癌、黒色腫、基底細胞癌又はへん平上皮細胞癌、中皮腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、網膜芽細胞腫、肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、繊維肉腫、骨原性肉種、肝臓癌及び精上皮腫を含む。
【０１８３】
典型的には、本発明の組成物は、腫瘍細胞の表面で過剰発現される抗原などの腫瘍特異的抗原とともに投与できる。
【０１８４】
Ｔ細胞は進行中の免疫応答（アレルギー症状又は自己免疫疾患など）を治療するために使用してもよいし、又は患者中に耐性を生成するために使用してもよい。したがって、本発明の細胞は、動物とヒトにおける不適当なリンパ球活性によって特徴づけられる疾患を治療及び予防する治療の方法で使用することができる。Ｔ細胞は単一の抗原に対する、又は多数の抗原に対する耐性を付与するために使用できる。
【０１８５】
典型的には、Ｔ細胞は患者又はドナーから得られる。また、患者（エクソビボ治療）に戻す前に上記のようにプライミングがなされる。
【０１８６】
医薬組成物
医薬組成物は治療上有効な量の薬学的に活性な薬剤を含むかそれからなる組成物である。それは、好ましくは薬学的に許容できるキャリアー、希釈剤又は賦形剤（それらの組み合わせを含む）を含む。治療用途に許容できるキャリアー又は希釈剤は製薬分野においてよく知られており、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A．R．Gennaro edit．1985)に記載されている。薬剤キャリアー、賦形剤又は希釈剤の選択は意図する投与経路及び標準的な医薬プラクティスによって選択することができる。医薬組成物は、キャリアー、賦形剤若しくは希釈剤として又はこれに加えて、任意の適当なバインダー（複数可）、滑剤（複数可）、懸濁剤（複数可）、コーティング剤（複数可）、可溶化剤（複数可）を含むことができる。
【０１８７】
「治療上有効な量」は、その意図する目的を達成するのに有効な治療剤の量を指す。個々の患者の必要が変わる可能性があるが、各一酸化窒素付加物有効量の最適範囲の決定は、当業者の技術範囲内である。一般に症状を治療するための、本発明の化合物及び／又は組成物による投薬レジメンは、患者のタイプ、年齢、体重、性別、食餌及び病状、機能障害の重篤さ、投与経路、使用する特定の化合物の活性、有効性、薬物動態学及び毒物学プロフィールなどの薬学的考察、ドラッグデリバリーシステムを使用するか否か、また、化合物が薬剤の組み合わせの一部として投与されるのかなどを含む様々な要因に従って選択され、当業者であれば調整可能である。したがって、実際に使用される投薬レジメンは広く変わり得るし、したがって、本願に述べる好ましい投薬レジメンから外れることもあり得る。
【０１８８】
薬学的に許容できるキャリアーの例としては、例えば、水、塩溶液、アルコール、シリコーン、ろう、石油ゼリー、植物油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、リポソーム、糖、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、滑石、界面活性剤、ケイ酸、粘着性パラフィン、芳香油、脂肪酸モノグリセリド及びジグリセリド、鉱物油脂肪酸エステル(petroethral fatty acid esters)、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどを含む。
【０１８９】
必要な投薬範囲は、ペプチドの選択、投与経路、製剤の性質、被験者の症状及び治療に携わっている医師の判断に依存する。しかし、適切な投薬量は、０．１〜１００μｇ／患者ｋｇの範囲にある。
【０１９０】
ワクチン組成物は、注射可能な形式が便利である。免疫応答を増強するために慣用のアジュバントを使用することができる。ワクチン接種のための適切なユニット投与量は抗原０．５〜５マイクログラム／ｋｇであり、そのような投与量を好ましくは１〜３回、１〜３週の間隔で投与する。ここに示す投与量範囲では、本発明の化合物を用いた場合、適切な個体へのそれらの投与を排除する毒物学的な副作用は観察されないであろう。
【０１９１】
しかし、利用可能な化合物の種類、及び様々な投与経路の異なる効率を考慮すれば、必要とされる投薬量は広く変化することが期待されている。例えば、経口投与は静注による投与より高用量を要求すると予想されるであろう。これらの投薬量レベルにおける変化は、当技術分野においてよく理解されているように、最適化のために標準の経験的なルーチンを使用して調節することができる。
【０１９２】
本発明の好ましい特徴及び実施形態を、以下の例及び図面を参照してさらに説明する。
【実施例１】
【０１９３】
白血病のための同種異系(allogeneic)骨髄移植(allo−BMT)を行った情況において、ドナーリンパ球の注入は、腫瘍再発及びウイルス感染をコントロールするための確立された戦略である。移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）固有のリスクを回避するため、ＢＭドナーリンパ球を自殺遺伝子によって形質転換して、薬剤への感受性を付与することができる。これにより、治療上及び安全性の点の両方から形質導入された細胞の選択的除去が可能になる。
【０１９４】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、すべてのＢＭドナー及び健常な対照の研究からＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Nycomed、オスロ、ノルウェー）密度勾配遠心分離器によって分離した。
【０１９５】
（活性化）  ２つの異なる活性化シグナルを用いてＴ細胞を活性化した（以下、Ｔブラストと呼ぶ）：フィトエモアグルチニン（ＰＨＡ）２μｇ／ｍｌ(Boehringer Mannheim)；抗ＣＤ３  ｍＡｂ（ＯＫＴ３）３０  ｎｇ  ／ｍｌ（Orthoclone、ミラノ、イタリア）；ＯＫＴ３（３０  ｎｇ  ／ｍｌ）。活性化されたＴ細胞は、ｈｕ−ｒ−ＩＬ−２  １００Ｕ／ｍｌ（EuroCetus Italia S．r．l．、ミラノ、イタリア）の存在下で５％の自己由来血清を補ったＲＰＭＩ  １６４０中、１×１０６細胞／ｍｌで培養した。培地は３〜４日ごとに交換した。
【０１９６】
（形質導入）  リンパ球形質導入の２つの方法を利用した。１−同時培養：リンパ球活性化は、ポリブレン（８μｇ／ｍｌ）存在下の組織培養フラスコ中、致死量を照射したパッケージング細胞（１００Ｇｒａｙ；GIL RAD、Gilardoni、Mandello（イタリア））のセミコンフルエント単分子層上で実行された。同時培養は７２時間実行された。２−スピンオキュレーション(spinoculation)：３〜４日間の活性化した後、リンパ球を回収し、無細胞レトロウイルス上清及びポリブレン（８μｇ／ｍｌ）の存在下、２時間遠心分離２サイクルで形質導入した。
【０１９７】
形質導入操作後、リンパ球を収穫し、新鮮な培地中に播種した（１０６／ｍｌ）。レトロウイルスで形質導入された細胞はマウス抗ヒトＬＮＧＦＲ  ｍＡｂ  ２０．４（ATCC、Rockville、メリーランド州）を用いたＦＡＣＳによって５日目にΔＬＮＧＦｒ発現について分析した。
【０１９８】
（選択）  形質導入された細胞の純粋な集団を２つの選択方法によって得た。ＨＳＶ−ＴＫ／ｎｅｏ（ＴＮ）融合タンパク質（ネオマイシン耐性及びＨＳＶ−ＴＫ活性の両方を付与する二機能性のタンパク質）をコードするＳＦＣＭＭ２ベクターで形質導入されたリンパ球を、培地へのネオマイシン（０．８μｇ／ｍｌ）添加によって選択した。新鮮なネオマイシンを、培養３日目、７日目及び１０日目に加えた。
【０１９９】
野生型ＨＳＶ−ＴＫ  とΔＬＮＧＦｒをコードするＳＦＣＭＭ３ベクターで形質導入されたリンパ球を、ｍＡｂ  ２０．４とラット抗マウス−ＩｇＧＩコーティングビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０、Ｄｙｎａｌ  Ａ．Ｓ．Ｎ０２１２オスロ（ノルウェー））を用いた磁気ソートにより免疫選択した。
【０２００】
形質導入した細胞の純粋な集団を冷凍し、次いで、患者に投与し、又は抗原特異的免疫応答をモニターするために刺激物質としてエクソビボで利用した。
【０２０１】
ＰＢＭＣの試料を、治療した７人の患者から得て、照射したそれぞれのＢＭドナーの形質導入されたＴ細胞、又は照射した同種異系Ｔブラストのいずれかに接触させた。培養２日目に１０  Ｕ／ｍｌ  ＩＬ２を加えた。この混合物を、刺激細胞の溶解について観察し、これは、形質導入されたＴ細胞によって発現されたトランスジーン産物又はアロ抗原(alloantigen)に特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が試料中に存在することを示した。使用された溶解アッセイはクロム放出アッセイであった。図１に示す結果は、形質導入された標的用特異性を備えた細胞傷害性Ｔ細胞がすべての患者から得られたことを示す。患者の免疫能力を評価するために、同種異系標的に対する特定の免疫応答を試験したところ、すべての応答者において検出された。これは、上に記載した条件下で形質転換されたＴブラストの注入が、形質導入された細胞に対する免疫応答を誘発し得ることを示唆する。
【実施例２】
【０２０２】
免疫応答の標的抗原を識別するためにさらなる研究を実行した。患者のうちの１人に由来するエフェクター細胞を、ベクターの単一成分を発現する自己由来のＴブラストに対して試験した。ＨＳＶ−ＴＫを発現するＴブラストは溶解され、一方、ΔＬＮＧＦｒを発現する標的細胞は全く認識されなかった（図２）。同様の結果が他の患者から分離されたエフェクター細胞で得られた。
【実施例３】
【０２０３】
実施例１からの結果（つまり、ＨＳＶ−ＴＫに特有の免疫の生成）を、注入の時間及び遺伝子操作し注入したＴ細胞の数に関して分析した。骨髄移植からの月数として測定した注入の時間（横座標）及び遺伝子操作し注入したＴ細胞の数（縦座標）を示す。形質導入された細胞に対する免疫応答の進行は、実施例１に記載するような自己由来の形質転換されたＴ細胞及び同種異系Ｔ細胞に対するＰＢＬのエクソビボ刺激によって評価した。陽性抗アロ免疫応答の存在下で、形質導入された細胞に対する細胞溶解活性の存在によって、患者がトランスジーンに対し免疫にならなかったか（白符号）、免疫になった（黒符号）かを考えた。データポイントは、免疫応答の誘導に対して細胞注入に原因がある（黒符号）、原因がない（白符号）を表わす。患者ＵＰＮ−１５に対しては、２つの異なる時点が表わされている。これらの結果は、インビトロで操作された細胞による免疫応答の誘導が注入される細胞の数には依存せず、注入時に機能する免疫系の存在に厳密に関連づけられることを示唆した。
【実施例４】
【０２０４】
インビボでトランスジーン特異的免疫応答を誘発する、形質導入されたＴブラストによって利用されるメカニズムを識別するためにさらなる研究を行った。ＰＢＭＣ試料を２人の健康なドナーから得て、実施例１に従い、照射した自己由来の形質導入されたＴブラスト又は照射した同種異系Ｔブラストのいずれかによって刺激した。培養２日目に１０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ２を加えた。この混合物を、刺激細胞の溶解について観察し、これは、形質導入されたＴ細胞によって発現されたトランスジーン産物又はアロ抗原（alloantigen）に特異的なＣＴＬが試料中に存在することを示した。図４に示される結果は、形質導入された標的への特異性を備えた細胞傷害性Ｔ細胞が健康な対照からは得られなかったことを示す。したがって、我々の実験条件では、形質導入されたＴブラストはプロフェッショナル抗原提示細胞として機能することはできず、それ自身で、ナイーブＴ細胞前駆体を活性化することが示唆される。常在のＡＰＣによって媒介されるインビボでの交差提示経路は、注入された患者においてはインビボでのトランスジーン特異的免疫応答誘導の原因になっているのであろう。
【実施例５】
【０２０５】
トランスジーン特異的免疫応答誘導の原因である細胞メカニズムを明確にするためにさらなる実験を行った。有効な免疫応答を生成する能力、及び形質導入されたＴブラストの循環系中での存在を、患者ＵＰＮ−１５（図５）の追跡検査の間に評価した。形質導入されたＴブラストの循環系中での存在を、新鮮な血液試料上でＨＳＶ−ＴＫ特異的プライマーを用いたＰＣＲを行うことによって分析した。実施例１に記載するように、免疫の再構築及びＨＳＶ−ＴＫ特異的免疫を評価した。患者ＵＰＮ−１５は、機能的な免疫系がない状態で、移植後早期に注入された。彼の免疫系が完全に再構築された時でさえ、注入された細胞は循環系中でＰＣＲによって長期間（図５、黒円）検出された。免疫学的再構築は、ＨＳＶ−ＴＫ特異的免疫応答（図５、白星）がない状態での活性な抗アロ免疫のレパートリーの存在によって実証された。したがって、注入時には、適切なＴ細胞応答を生成する患者の能力が、抗原提示能力と抗原応答能力の両方について深く損なわれているので、免疫は生じない。後で、免疫系が完全に再構築される場合、循環系内の形質導入されたＴブラストは活性化シグナルを提供することができず、それらはＡＰＣとして機能を果たさず、したがって、形質導入された細胞に特異的な細胞毒素のエフェクター細胞を誘発することができない。
【０２０６】
ＵＰＮ−１５免疫系が完全に再構築された時になされたＨＳＶ−ＴＫ−遺伝子操作されたＴブラストの２回目の注入は、ＨＳＶ−ＴＫ特異的免疫（図５、黒星）の誘導をもたらし、遺伝子操作された細胞の破壊に結びつく（図５、白円）。
【０２０７】
したがって、実施例１に記載するように操作されたＴ細胞が、免疫能力を有する媒体（melieu）に伝えられると免疫が生じる。特に、Ｔ細胞は免疫応答を引き起こす適所に抗原を運ぶヒビクルの役割をインビボで果たす。ここに、増殖因子（例えば、ＩＬ２）剥奪によって媒介される注入細胞の部分的な細胞死は、担持された抗原の放出に結びつく。宿主ＡＰＣによる放出された抗原物質の提示及びナイーブＨＳＶ−ＴＫ特異的Ｔ細胞前駆体の活性化がこれに続く。
【０２０８】
以上の実験は、Ｔリンパ球がインビボで標的抗原送達の媒体になるようにインビトロで修正することができる新しい方法論について記載した。
【実施例６】
【０２０９】
Ｔリンパ球はインビボで標的抗原送達の媒体になるようにインビトロで修正することができる。ＭＡＧＥ−３陽性黒色腫に罹患している患者からの自己由来のリンパ球を、腫瘍抗原ＭＡＧＥ−３及びＨＳＶ−ＴＫ／ｎｅｏ（ＴＮ）融合タンパク質（ネオマイシン耐性とＨＳＶ−ＴＫ活性の両者を付与する二機能性タンパク質）をコードするレトロウイルスベクターによって形質転換した。
【０２１０】
利用した活性化形質導入及び選択の操作は実施例１で報告したのと同様とした。操作プロセスの終わりに、形質導入された細胞の純粋な集団を冷凍し、次いで、ワクチン接種の投与量を増やしていくプロトコルで患者に投与した。形質導入された細胞は、抗原特異的免疫応答をモニターするシミュレータとしてエクソビボでも利用した。
【０２１１】
ＰＢＭＣ試料を治療前及び５回目のワクチン接種後に黒色腫患者から得た。収集した細胞は、直ちに、自己由来のＥＢＶ黒色腫細胞、及びＭＡＧＥ−３又はＨＳＶ−ＴＫのいずれかを形質導入したＥＢＶに接触させた。試験は、抗ＩＦＮｇ  ｍＡｂでコーティングしたＥＬＩＳＰＯＴプレート上で実行した。培養２４時間後に細胞を取り除き、ＩＦＮｇスポットの存在を評価するためにプレートを処理した。図６に示す結果は、トランスジーン（例えば、ＭＡＧＥ−３及びＨＳＶ−ＴＫ）への特異性を備えたＩＦＮｇを放出するＴ細胞がワクチン接種後に得られたことを示す。腫瘍特異的Ｔ細胞の出現頻度の著しい増加も検出された。これは、Ｔブラストの注入が、上に記載した条件下に形質転換されて、形質導入された細胞に対する免疫応答を誘発し得ることを示唆する。
【実施例７】
【０２１２】
ＰＢＭＣをワクチン接種後に黒色腫患者から得て、ＭＡＧＥ−３−形質導入された照射されたＴ細胞に接触させた。２日間の培養後に、１０Ｕ／ｍｌのＩＬ２を添加した。この混合物を刺激細胞の存在下にＩＦＮｇ放出について観察し、これは、形質導入されたＴ細胞によって発現されたＭＡＧＥ−３  トランスジーン産物に特異的なエフェクター細胞が試料中に存在することを示した。図７に示す結果は、ＭＡＧＥ−３及び自己由来の腫瘍に対する特異性を備えたエフェクターＴ細胞が得られたことを示す。これはさらに、Ｔブラストの注入が、上に記載した条件下に形質転換されて、トランスジーン産物に対する免疫応答を誘発することができることを確認する。
【実施例８】
【０２１３】
トランスジーン特異的免疫エフェクター生成の動力学を調べるため、注入した形質導入された細胞の投与量に関して、治療前、及びワクチン接種プロトコル数回目（すなわち、３回目、５回目及び１５回目のワクチン接種後に）の時点で黒色腫患者からＰＢＭＣを得た。収集した細胞を、ＭＡＧＥ−３−形質導入された照射されたＴ細胞又はＨＳＶ−ＴＫ−形質導入されたＴ細胞に接触させた。２日間の培養後に、１０Ｕ／ｍｌのＩＬ２を添加した。各時点で、いくつかの独立した微小培養物を平板培養した（３０〜４８の範囲）。数回の刺激後、微小培養物を刺激細胞の存在下にＩＦＮｇ放出について観察し、これは、ＭＡＧＥ−３又はＨＳＶ−ＴＫに特異的なエフェクター細胞が試料中に存在することを示した。以下の表に要約される結果は、形質導入されたＴ細胞の注入と、トランスジーンに対する免疫応答の進行との間の相関性の存在を示す。陽性微小培養物の数によって表わされるＭＡＧＥ−３反応的Ｔ細胞前駆体の量の継続的増加が観察された。
【０２１４】
【表２】
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上記の明細書中で言及したすべての刊行物は、参照によって本願に組み込まれる。本発明の記載された方法及びシステムの様々な修正及び変更は、発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者に明白である。本発明を特定の好ましい実施形態に関して説明してきたが、特許請求の範囲の発明はそのような特定の実施形態に過度に制限されるべきでないことが理解されるべきである。実際、分子生物学及び関連分野の当業者に明白な、発明を行うための記載された態様の様々な修正は、以下の特許請求の範囲内に含まれるものと意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２１５】
【図１】刺激細胞（黒符号）に対する及び無関係な標的（白符号）に対する、注入患者から分離されたエフェクター細胞を使用して実験した細胞溶解の結果を示すグラフである（エフェクター細胞は、７人の患者から分離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、自己由来の形質導入Ｔ細胞（円）及び同種異系(allogeneic)Ｔ細胞（正方形）で刺激することによって生成させた。形質導入は、ＨＳＶ−ＴＫタンパク質及び細胞表面マーカーΔＬＮＧＦｒ（削除されたヒトの低親和性神経増殖因子レセプター）をコードするベクターによって行った）。
【図２】未修飾の細胞及びＨＳＶ−ＴＫ又はΔＬＮＧＦｒを発現する細胞に対し治療された患者から分離されたエフェクター細胞を使用して行った、細胞溶解実験の結果を示すグラフである。
【図３】注入時間、注射された遺伝子操作されたＴ細胞の数及びトランスジーン特異的免疫応答の進行の関係を示すグラフである（データポイントは、免疫応答の誘導に対して細胞注入に原因がある（黒符号）、原因がない（白符号）を表わす）。
【図４】刺激細胞（黒符号）に対する及び無関係な標的（白符号）に対する、２人の健康なドナーから分離されたエフェクター細胞を使用して実験した細胞溶解の結果を示すグラフである（エフェクター細胞は、２人の健常なドナーから分離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、自己由来の形質導入Ｔ細胞（円）及び同種異系Ｔ細胞（正方形）で刺激することによって生成させた）。
【図５】患者ＵＰＮ−１５の病歴及び追跡検査の概要を表す模式図である（形質導入された循環系中Ｔ細胞の存在（黒丸）又は不在（白丸）を、ＨＳＶ−ＴＫ特異的プライマーを用いたＰＣＲによって、図示する時間ポイントでモニターした。免疫応答の進展は、自己由来の形質導入Ｔ細胞及び同種異系Ｔ細胞に対する循環系中リンパ球のエクソビボ刺激によってモニターした。患者は、抗−ＨＳＶ−ＴＫ細胞溶解活性の検出によりトランスジーンに対して免疫されなかったか（白星）、免疫された（黒星）かを検討した）。
【図６】治療した黒色腫患者から分離した新鮮なリンパ球を使用して、ＭＡＧＥ−３又はＨＳＶ−Ｔｋを発現する自己由来の細胞に対して、及び改変されなかった自己由来のＥＢＶ及び黒色腫細胞系に対して行ったＥＬＩＳＰＯＴ実験の結果を示すグラフである。
【図７】治療された黒色腫患者からインビトロで分離したエフェクター細胞を使用して、ＭＡＧＥ−３形質転換Ｔ細胞及び非形質転換Ｔ細胞（すなわち、ＰＨＡ−Ｍ３及びＰＨＡ）並びに自己由来で無関係な黒色腫細胞系に対して行ったＩＦＮｇ放出実験の結果を示すグラフである（エフェクター細胞は、治療した患者から分離したＰＢＭＣを、自己由来のＭＡＧＥ−３形質導入Ｔ細胞で刺激することによって生成させた）。
【図１】
2006503878.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年6月10日(2005.6.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの抗原を含むＴ細胞を含み、抗原をリンパ節に送達することができるデリバリーシステム。
【請求項２】
少なくとも１つの抗原を含むＴ細胞を含み、ＡＰＣによるその後の提示のためにＡＰＣに抗原を送達することができるデリバリーシステム。
【請求項３】
抗原が腫瘍抗原である請求項１又は２に記載のデリバリーシステム。
【請求項４】
抗原が細菌抗原又はウイルス抗原である請求項１〜３のいずれか記載のデリバリーシステム。
【請求項５】
Ｔ細胞がマーカーを含む請求項１〜４のいずれか記載のデリバリーシステム。
【請求項６】
マーカーがマーカー遺伝子である請求項５に記載のデリバリーシステム。
【請求項７】
マーカーが細菌性耐性遺伝子である請求項６に記載のデリバリーシステム。
【請求項８】
細菌性耐性遺伝子がネオマイシン耐性を付与する請求項７に記載のデリバリーシステム。
【請求項９】
マーカーが別の抗原である請求項６によるデリバリーシステム。
【請求項１０】
別の抗原がＨＳＶ−Ｔｋ又はＣＤ２０である請求項９に記載のデリバリーシステム。
【請求項１１】
別の抗原と細菌性耐性遺伝子の両方をさらに含む請求項５〜１０のいずれか一項に記載のデリバリーシステム。
【請求項１２】
Ｔ細胞が次のマーカーの少なくとも１つを発現する請求項１〜１１のいずれかに記載のデリバリーシステム：ＨＬＡ−Ｉ、ＨＬＡ−ＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ５４及びＣＤ２５。
【請求項１３】
Ｔ細胞を伴う第１の抗原の使用であって、免疫応答を起こすことができる抗原をＴ細胞が有する、第２の抗原に対する免疫をモニターするための第１の抗原の使用。
【請求項１４】
第１の抗原が強い免疫原性抗原である請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
第１の抗原がＨＳＶ−Ｔｋ又はＣＤ２０である請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
第２の抗原が腫瘍抗原である、請求項１３〜１５のいずれか記載の使用。
【請求項１７】
第２の他の抗原がウイルス抗原である、請求項１３〜１６のいずれか記載の使用。
【請求項１８】
Ｔ細胞が次のマーカーのうち少なくとも１つを発現する、請求項１３〜１７のいずれか記載の使用：ＨＬＡ−Ｉ、ＨＬＡ−ＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ６２Ｌ  ＣＣＲ７、ＣＤ５４及びＣＤ２５。
【請求項１９】
免疫応答を起こすことができる第１の抗原を含むＴ細胞に対する免疫応答をモニターする方法であって、Ｔ細胞に第２の抗原を導入することと、第２の抗原に対する免疫応答を第１の抗原に対する免疫応答の基準としてモニターすることとを含む方法。
【請求項２０】
第１の抗原が腫瘍抗原である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
第１の抗原が細菌抗原又はウイルス抗原である請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
第２の抗原が強い免疫原性抗原である請求項１９〜２１のいずれか記載の方法。
【請求項２３】
第２の抗原がＨＳＶ−Ｔｋ又はＣＤ２０である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
抗原を含むＴ細胞にＡＰＣを曝露することを含む、インビボで抗原をＡＰＣにロードする方法。
【請求項２５】
抗原が腫瘍抗原である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
抗原が細菌抗原又はウイルス抗原である請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
Ｔ細胞がマーカーを含む請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
マーカーがマーカー遺伝子である請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
マーカーが細菌性耐性遺伝子である請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
細菌性耐性遺伝子がネオマイシン耐性を付与する請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
マーカーが別の抗原である請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
別の抗原がＨＳＶ−Ｔｋ又はＣＤ２０である請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
Ｔ細胞が別の抗原とマーカーの両方をさらに含む請求項２７〜３２のいずれか記載の方法。
【請求項３４】
Ｔ細胞が次のマーカーのうち少なくとも１つを発現する請求項２４〜３３のいずれか記載の方法：ＨＬＡ−Ｉ、ＨＬＡ−ＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ５４及びＣＤ２５。
【請求項３５】
請求項１９〜３４のいずれかの方法で使用するＴ細胞を得る方法であって、Ｔ細胞の単離すること；Ｔ細胞の活性化；Ｔ細胞の培養；及びＴ細胞への抗原の導入を含む方法。
【請求項３６】
Ｔ細胞が抗原で形質転換される請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
Ｔ細胞がフィトエモアグルチニン(phytoemoagglutinine)、抗ＣＤ３モノクローナル抗体又は抗ＣＤ３／ＣＤ２８モノクローナル抗体をコーティングしたビーズで活性化される請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項３８】
Ｔ細胞を増殖因子の存在下で培養する請求項３５〜３７のいずれか記載の方法。
【請求項３９】
増殖因子がｈｕ−ｒ−ＩＬ−２を含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
Ｔ細胞を５％の自己由来の血清を含む培地で培養する請求項３５〜３９のいずれか記載の方法。
【請求項４１】
Ｔ細胞を１×１０６細胞／ｍｌで培養する請求項３５〜４０のいずれか記載の方法。
【請求項４２】
請求項３５〜４１のいずれか記載の方法によって得ることができるＴ細胞。
【請求項４３】
抗原がロードされているＴ細胞。
【請求項４４】
請求項１〜２０、４２又は４３のうちのいずれかで定義されるＴ細胞を含む医薬組成物。
【請求項４５】
ワクチンの形態である請求項４４に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
腫瘍又は感染の治療又は予防のための薬剤を調製するための、請求項１〜２０、４２又は４３のうちのいずれかで定義されるＴ細胞の使用。
【国際調査報告】
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