(57)【要約】本発明は、血管及び心臓弁のような内皮表面を必要とする構造物の新規で低侵襲性の改良された組織工学法に関する。本発明の構造物は長期開存性を有する。本発明の方法は、詰まった又は損傷された冠状血管を置換するための小口径血管の製造に、損傷された又は奇形の肺動脈弁及び大動脈弁を置換するための三葉型心臓弁導管の製造に、そして内皮表面を必要とする他の血管構造物に、特に適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織工学的血管構造物であって、前記構造物を形成するように構築され、血管組織を形成し得る内皮前駆細胞及び／又はＳＭＡ＋紡錘形細胞を播種されたスキャフォールド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）を含み、前記スキャフォールドは生分解性材料を含む、前記構造物。
【請求項２】
前記スキャフォールドが管を形成するように構築される、請求項１に記載の組織工学的血管構造物。
【請求項３】
前記スキャフォールドが三葉型（ｔｒｉｌｅａｆｌｅｔ）心臓弁を形成するように構築される、請求項１に記載の組織工学的血管構造物。
【請求項４】
組織工学的血管構造物の製造法であって、
（ａ）血管構造物を形成するように成形された基質（前記基質は生分解性材料を含む）を用意するステップ；
（ｂ）前記基質を、それに接着し血管組織を形成し得る内皮前駆細胞及び／又はＳＭＡ＋紡錘形細胞と接触させることによって、初代細胞を播種した構造物を形成するステップ；
（ｃ）前記初代細胞を播種した構造物を、第一成長期間中、前記細胞の成長に適した流動性培地中に維持し、前記第一成長相の間に該構造物にストレスを付与して、血管構造物を形成するために移植された該構造物が遭遇する生理的条件を刺激するステップ；
を含む製造法。
【請求項５】
前記ストレスを付与するステップが、前記構造物内での圧力と流れの周期的増加を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ストレスを付与するステップが、剪断応力の漸増を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記生分解性材料がポリマーである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
請求項４、５又は６の方法によって製造される組織工学的三葉型心臓弁。
【請求項９】
請求項４、５又は６の方法によって製造される組織工学的管状構造物。
【請求項１０】
請求項４、５又は６の方法によって製造される組織工学的２次元構造物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本願は、２０００年１０月３０日出願の仮出願第６０／２４４，２７７号に基づくものであり、３５　Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づいて優先権を主張する。また、本願は前記仮出願の内容に依り、その全体を引用によって本明細書に援用する。
【０００２】
政府の資金提供
本研究は、米国立心肺血液研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｒｔ Ｌｕｎｇ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のＲ０１　ＨＬ　６０４９０−０３及びＲ０１　ＨＬ　６０４６３−０３による支援を受けた。
【０００３】
発明の属する技術分野
本発明は、一般的には組織工学に関し、特に、小口径血管、三葉型心臓弁導管及び他の血管構造のような内皮表面を必要とする構造体の組織工学に関する。
【０００４】
発明の背景
冠状動脈疾患及び末梢血管疾患を含む心血管疾患は、米国における死因の第１位である１。冠状動脈及び末梢血管のアテローム性硬化症に対しては外科的置換又はバイパス手術が最も一般的な介入であり、年間５５０，０００例のバイパス手術が実施されている１。直径５ｍｍ未満の患部には自己血管が好適な置換移植片であるが、しかしながら、それには動脈又は静脈の侵襲的生検が必要であり、また多くの患者は切除又は以前の血管採取のために適切な血管を持たない２。さらに、壁の薄い自己血管は移植時に損傷を受けることが多い。小口径血管及び他の血管構造物を得るための代替のアプローチは、生分解性又は脱細胞化マトリックスのいずれかを基礎とするスキャフォールド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）を使用する組織工学的血管である。
【０００５】
これまで、ヒトにおける長期開存性を増大させるために内皮化ｅＰＴＦＥ移植片に多大な努力が傾注されてきた３９。従来、移植片に播種するための内皮源は現存の血管から生検材料を得ることに頼っていたため、自己の血管内皮細胞の採取には健康な血管が犠牲になっていた。生分解性又は生物学的スキャフォールド材料に播種した平滑筋細胞及び内皮細胞をインビトロで培養すると、強力な機械的性質を有する細胞化血管が生成するが、これらの移植片はインビボへの移植後まもなく血栓を形成することも示されている３−５。小口径血管用に採用されている別のアプローチは、インビボで宿主細胞による組織工学的移植片の再増殖をさせることである。腸コラーゲン又は天然血管のいずれかを基にした脱細胞化マトリックスを、宿主平滑筋細胞又は内皮細胞をマトリックスに浸潤させてインビボで再モデル化すると、インビボで良好な開存性を示した６−８。これらのアプローチの一つの限界は、再増殖した内皮細胞が、外植した移植片で実施した内皮依存性弛緩アッセイで機能しなかったことである。これは長期開存率に影響を及ぼし得る。その上、血管移植片の内皮化は研究で使用したイヌ及びウサギモデルではより容易に起こるので、これらの結果をヒトに外挿するのは難しい９。
【０００６】
血管構造物の組織工学における現行技術には多くの問題が付随しているため、信頼できる細胞源と長期開存性を提供し、自己細胞採取のために現時点では必要とされる動脈又は静脈の侵襲的生検を回避するような、改良された組織工学法に対する需要は依然としてある。
【０００７】
発明の要旨
本発明は、血管及び心臓弁のような内皮表面を必要とする構造物の新規で低侵襲性の改良された組織工学法に関する。本発明の構造物は長期開存性を有する。本発明の方法は、詰まった又は損傷された冠状血管を置換するための小口径血管の製造に、損傷された又は奇形の肺動脈弁及び大動脈弁を置換するための三葉型心臓弁導管の製造に、そして内皮表面を必要とする他の血管構造物に、特に適している。
【０００８】
本発明の方法は、小口径血管、心臓弁、及び弁葉又は支持体のような心臓弁の部品など、内皮表面を必要とする組織工学的構造物の製造に特に適している。
本発明の方法は、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）及び／又は紡錘形をしたα−平滑筋アクチン（ＳＭＡ）陽性細胞（本明細書中では「ＳＭＡ＋紡錘形細胞」と呼ぶ）を単離し、該細胞をインビトロで増殖させ、該細胞を適当なスキャフォールドに播種し、そして播種されたスキャフォールドを、インビボで経験するのと類似した条件下でプレコンディショニングし、血管、心臓弁、又は血管移植片のような組織工学による構造物を形成する各ステップを含む。重要なことは、本発明のＥＰＣ移植片は、天然の頸動脈には類似しているが組織工学による小口径移植片ではこれまで報告されていない収縮活性と一酸化窒素による血管弛緩とを示す。これらの結果は、ＥＰＣが動脈内皮細胞のように機能でき、従って血管移植片の長期生存に寄与することを示す。
【０００９】
理想的には、本発明で使用する細胞は自己由来で非免疫原性である。最も好ましくは、該細胞は非侵襲的に患者の末梢血から単離される。しかしながら、骨髄及び臍帯血のような他の細胞源も本発明で使用可能である。単離された細胞はインビトロで増殖させ、その後、血管移植片のような適切なスキャフォールドに播種される。ＥＰＣ及びＳＭＡ＋紡錘形細胞は、移植片に単独で播種しても又は組み合わせて播種してもよい。好適な態様において、播種されたスキャフォールドはインビボでの移植前に、例えばバイオリアクタ内で剪断応力に曝すことによってプレコンディショニングし、スキャフォールド上に最大のＥＰＣ保持を達成できるようにする。適切なバイオリアクタは、播種されたスキャフォールドをインビボで経験するような条件、すなわち流れ及び圧力の変化に曝すことが可能なものであろう。装置内の液流は、好ましくは数日間かけて低圧から高圧へ漸増するように設定される。拍動性のバイオリアクタが好適である（ＷＯ００／０７８９０）。
【００１０】
本発明の組織工学的構造体は任意の適切な形状に製造することができる。例えば、球、楕円体、ディスク・パッチ・シート・フィルムのような２次元構造体などの固体多孔質スキャフォールド、並びに中空の球又は楕円体及び開放管のような中空多孔質基質などであるが、これらに限定されない。管状の組織工学的構造物の好適な態様において、スキャフォールドは実質的に管形又は円筒形、例えばスキャフォールドの長さに応じて変化する直径を有する管形を含む。このように、本発明のスキャフォールドは、例えば適当な直径（好ましくは内径５ｍｍ未満）の管状スキャフォールド、心臓弁又は弁葉もしくは支持体のような心臓弁の部品の形状をした非円筒形スキャフォールドであり得る。
【００１１】
必要な機械的性質及び生体吸収性を有するスキャフォールドは、任意の生分解性、生体適合性の合成ポリマー材料（例えばポリエステル類又はポリ無水物類、場合により塩基性アミノ酸のような有機塩基と共重合している）、又はタンパク質性ポリマー（例えばコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン）から製造できる。本発明で使用するスキャフォールドは、細胞播種を促進する親水性表面を有する合成又はタンパク質性ポリマーである。このような親水性表面は、基質材料の表面を加水分解して該表面に遊離親水基を創出することによって、又はそうでなければ該表面をアシル化、スルホン化、グリコシル化、又は他の共役基で改質して親水性を増大させる及び／又はよりよい細胞接着性を提供することによって作られる。各種のスキャフォールド材料がＷＯ９９／０１５３８に開示されており、その開示内容は引用によって本明細書に援用する。さらに、本発明のスキャフォールドは、動物の動脈血管由来の脱細胞化材料から製造することもできる。播種されたスキャフォールドは、内皮の成長及び分化における特定のステップを刺激するために、成長因子及びサイトカインを適時に添加してもよい。
【００１２】
「構造物」、「播種された構造物」、「播種されたスキャフォールド」、「移植片」及び「播種された移植片」という用語は本明細書においては互換的に使用され、増殖したＥＰＣが適切なスキャフォールド又は移植片に播種されていることをいう。
【００１３】
「血管内皮前駆細胞」、ＥＰＣという用語は、米国仮出願第６０／２４４，２７７号に開示されている「循環内皮細胞」（ＣＥＣ）と呼ばれる細胞も含む。前記仮出願の開示内容は引用によって本明細書に援用する。
【００１４】
本発明を好適な特定の態様と結びつけて説明してきたが、当然のことながら、前述の説明並びに以下の実施例は説明を目的とするものであって、本発明の範囲を制限することを意図していない。本発明の範囲内に含まれる他の側面、利点及び変形は、本発明に関連する技術分野の専門家には明らかであろう。
【００１５】
発明の説明
本発明者らは、驚くべきことに、ＥＰＣが、内皮表面を必要とする構造体の組織工学にとって自己内皮細胞の理想的供給源となることを見出した。該細胞を得るのに天然の血管を犠牲にする必要がないからである。さらに、本発明者らは、ＥＰＣを播種したスキャフォールドをインビボでの移植前にプレコンディショニングすることによって、非血栓形成性バリアを作り出せることも見出した。このことは、得られた構造物のインビボにおける開存率を劇的に改善する。重要なことは、本発明のＥＰＣ移植片は、天然の頸動脈には類似しているが組織工学による小口径移植片ではこれまで報告されていない収縮活性と一酸化窒素による血管弛緩とを示す。これらの結果は、ＥＰＣが動脈内皮細胞のように機能でき、従って血管移植片の長期生存に寄与することを示す。
【００１６】
内皮細胞は正常血管壁の極めて重要な構成要素であり、血流と血管壁の周辺組織との間の界面を提供している。内皮細胞はまた、血管形成、炎症、及び血栓防止を含む生理的事象に重要な役割も果たす。血管構造を構成する内皮細胞のほかに、血液中を循環している非血液学的な血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）についての証拠がある１０−１４。ＥＰＣは、外傷及び虚血傷害を含む傷害された内皮に影響を及ぼす病的条件を有する循環領域に移動してくる１５−２３。正常成人では、末梢血中のＥＰＣ濃度は１ミリリットルあたり２〜３個の細胞であるが、臍帯血中濃度は３．５倍高い１４，２３−２４。従って、臍帯血がＥＰＣの一つの好適な供給源である。
【００１７】
本発明の好適な方法は、ＥＰＣを患者から単離し、それらをインビトロで増殖させ、該細胞を適当なスキャフォールドに播種し、得られた構造物を、該構造物のインビボへの移植前に様々な程度の剪断応力の印加下でプレコンディショニングすることを含む。インビボに移植すると、ＥＰＣは、相当期間、例えば少なくとも１３０日間、開存性を維持できる自己由来の非血栓形成性の管腔表面を提供する。さらに、本発明の組織工学的構造物は１３０日までにインビボで新血管を伸張し、生理的刺激に対して血管運動活性を示すようになる。
【００１８】
好適な態様において、ＥＰＣは、比較的少量、例えば約１５ｃｃ〜４５０ｃｃの患者の末梢血、特に末梢血の白血球画分から非侵襲的に得られる。しかしながら、骨髄及び異種又は自己臍帯血を含む他のＥＰＣ源も本発明での使用に適している。末梢血中のＥＰＣ数は、患者に集積（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）成長因子、例えばＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−３を投与することによって増加させることができる。ＥＰＣは、ＡＣ１３３及びＣＤ３４のようなＥＰＣ特異的抗原、並びにＫＤＲ／Ｆｌｋ−１及びＶＥＧＦ　Ｒ−２のような血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）の受容体を認識する抗体を用いて単離することもできる。
【００１９】
好ましくは、ＥＰＣは静脈穿刺などの任意の血液採取法によって得る。好ましくは、ＥＰＣは、任意の公知法、又は例えばヒストパック密度勾配法を用いて部分精製し、それから増殖させる。本発明の方法では、ＥＰＣは当該技術分野で公知の任意の方法によってインビトロで増殖させることができる。細胞培養の適切な成長条件及び培地は当該技術分野で周知である。細胞培養の培地は典型的には必須栄養素を含むが、必要に応じて追加の成分（例えば、成長因子、塩及びミネラル）も含む。これらは特定の細胞種の成長及び分化に応じて特別に調整されうる。例えば、「標準細胞成長培地」は、１１０ｍｇ／Ｌのピルビン酸塩とグルタミンを含むダルベッコ変性イーグル培地、低グルコース（ＤＭＥＭ）に、１０〜２０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）又は１０〜２０％の子ウシ血清（ＣＳ）及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリンを補給したものである。その他の標準培地は、イーグルの基本培地、最少必須培地、マッコイ（ＭｃＣｏｙ’ｓ）の５Ａ培地などで、好ましくは上記のように補給される（例えば、ＪＲＨ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カンザス州Ｌｅｎｅｘａ；ＧＩＢＣＯ，ＢＲＬ、ニューヨーク州グランドアイランド；Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．、ミズーリ州セントルイスから市販されている）。例えば、ＥＰＣをインビトロで増殖させるには、ＥＰＣを含有する白血球画分を、前述のようにフィブロネクチン被覆プレート上で平板培養する１２。細胞懸濁液を新しいフィブロネクチン被覆プレートに連続継代して接着造血細胞を迅速に取り除くのが望ましい。約２１〜２８日間の培養後、増生したコロニーの数は典型的には１×１０７総投入細胞あたり２〜３個である。成長を続けさせると、増生細胞は指数的に増殖し、３週間までに１．６×１０９細胞に達する。さらに、ＥＰＣ前駆細胞は、患者から前駆細胞を取り出す前に集積成長因子、例えばＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−３の投与によってインビボで動員できる。
【００２０】
増生した細胞は敷石状の形態を呈する。これは内皮細胞の特徴で、その様子を図１Ａに示す。内皮表現型は、内皮マーカーに対する特異的抗体で免疫染色することによって確認できる。代表的なＥＰＣ標本は、細胞−細胞膜境界に均一的にＣＤ３１（図１Ｂ）を、細胞質顆粒にワイベルパラーデ（Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ）小体に似たフォンビルブランド因子（ｖＷＦ）（図１Ｃ）を発現している。さらに、ＥＰＣはアセチル化低密度リポタンパク質（ａＬＤＬ）も組み込んでいる（図１Ｄ）。しかしながら、Ｅ−セレクチンは非刺激細胞ではほとんど発現していないが（図１Ｅ）、リポ多糖（ＬＰＳ）で刺激すると、ＥＰＣ中で著しく無秩序化する（図１Ｆ）。
【００２１】
内皮表現型を確認するもう一つの方法は、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）受容体−２であるＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、及びアンジオポエチン受容体であるＴｉｅ−２に対する特異的抗体を用いたイムノブロット法によって全細胞抽出物を分析することである（図１Ｇ及びＨ）。ＥＰＣは、ヒト真皮微小血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）と比べると、等量のＴｉｅ−２とＫＤＲを発現する傾向にある。ＶＥＧＦ及び塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）に対するＥＰＣの反応は細胞増殖アッセイによって測定することができる（図１Ｉ及びＪ）。ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦが０から９ｎｇ／ｍｌに増加すると、細胞数はそれぞれ約４倍及び８倍誘導される。ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦの増殖効果は、同じ実験的アッセイを用いた場合にＨＤＭＥＣで見られるのと比較的類似している２６。内皮表現型と一致して、ＥＰＣはマトリゲル上で培養すると６〜１２時間以内に毛細管も形成する。組織工学にとって重要なことは、内皮表現型が少なくとも２０継代不変であることである。
【００２２】
我々は、本発明の組織工学的構造物の製造に有用な第二の細胞種も同定した。培養すると、これらの細胞は紡錘形を呈し、平滑筋αアクチン（「ＳＭＡ紡錘形細胞」と呼ぶ）を発現する。これらの細胞は実施例２に記載の方法を用いて得ることができる。免疫蛍光染色法を用いれば該細胞を特徴付けできる。
【００２３】
末梢血からＥＰＣを培養したら、それらをスキャフォールドに播種できる。好ましくは、該スキャフォールドは、生理的条件下で徐々に加水分解されるような生分解性又は生体腐食性材料を含む。本発明の組織工学的構造体は任意の適切な形状に製造することができる。例えば、球、楕円体、ディスク・パッチ・シート・フィルムのような２次元構造体などの固体多孔質スキャフォールド、並びに中空の球又は楕円体及び開放管のような中空多孔質基質などであるが、これらに限定されない。管状の組織工学的構造物の好適な態様において、スキャフォールドは実質的に管形又は円筒形、例えばスキャフォールドの長さに応じて変化する直径を有する管形を含む。このように、本発明のスキャフォールドは、例えば適当な直径（好ましくは内径５ｍｍ未満）の管状スキャフォールドであり得る。例えば、直径４ｍｍ、長さ４〜５ｃｍのブタ腸骨動脈から製造される脱細胞化血管も使用できる。
【００２４】
一般的に、任意の生体適合性の徐々に加水分解されるポリマーが使用できる。好適なスキャフォールド材料は、ポリエステル類、ポリオルトエステル類、又はポリ無水物類のようなポリマー材料で、例えばグリコール酸、乳酸、又はセバシン酸の種々のポリマー又はコポリマーなどである。より一般的には、好適なスキャフォールド材料は、直鎖又は分枝、置換又は非置換、飽和又は不飽和、線状又は架橋のアルカニル、ハロアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、アリール、アラルキル、アルケニル、アラルケニル、ヘテロアリール、又はアルコキシヒドロキシ酸（例えば、（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｎ（ＯＨ）又は（ＣＯＯＨ）（ＣＲｉＲｊ）ｎ（ＯＨ）、式中、ｎは約１〜２０の整数、そして各Ｒｉ及びＲｊは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、ハロゲン、天然アミノ酸の側鎖、及び任意の直鎖又は分枝、置換又は非置換、飽和又は不飽和、低分子量（例えばＣ１−Ｃ１４）のアルカニル、ハロアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、アリール、アラルキル、アルケニル、アラルケニル、ヘテロアリール、又はアルコキシ基、又はそのような基で置換されている第二級もしくは第三級アミンからなる群から独立して選ばれる）のポリエステル類、あるいは、直鎖又は分枝、置換又は非置換、飽和又は不飽和、線状又は架橋のアルカニル、ハロアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、アリール、アラルキル、アルケニル、アラルケニル、ヘテロアリール、又はアルコキシジカルボン酸（例えば、（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｎ（ＣＯＯＨ）又は（ＣＯＯＨ）（ＣＲｉＲｊ）ｎ（ＣＯＯＨ）、式中、ｎは約１〜２０の整数、そして各Ｒｉ及びＲｊは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、ハロゲン、天然アミノ酸の側鎖、及び任意の直鎖又は分枝、置換又は非置換、飽和又は不飽和、低分子量（例えばＣ１−Ｃ１４）のアルカニル、ハロアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、アリール、アラルキル、アルケニル、アラルケニル、ヘテロアリール、又はアルコキシ基、又はそのような基で置換されている第二級もしくは第三級アミンからなる群から独立して選ばれる）のポリ無水物類などである。エステルと無水物結合の混合物を含むポリマー（例えばグリコール酸とセバシン酸のコポリマー）も使用できる。従って、例えば好適なスキャフォールド材料は、ポリグリコール酸ポリマー（ＰＧＡ）、ポリ乳酸ポリマー（ＰＬＡ）、ポリセバシン酸ポリマー（ＰＳＡ）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）コポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリ（乳酸−コ−セバシン酸）コポリマー（ＰＬＳＡ）、ポリ（グリコール酸−コ−セバシン酸）コポリマー（ＰＧＳＡ）などである。
【００２５】
本発明に有用な他の生体適合性の生分解性ポリマーは、カプロラクトン類、カーボネート類、アミド類、アミノ酸類、オルトエステル類、アセタール類、シアノアクリレート類及び分解性ウレタン類のポリマー又はコポリマー、並びに、これらと直鎖又は分枝、置換又は非置換のアルカニル、ハロアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、アルケニル、又は芳香族ヒロドキシもしくはジカルボン酸とのコポリマーなどである。さらに、反応性側鎖基を有する生物学的に重要なアミノ酸類、例えば、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、チロシン及びシステイン、又はそれらの鏡像異性体も、前述の任意の材料とのコポリマーに含めることができる。現在好適な生分解性材料は、ＰＬＡ、ＰＧＡ、及びＰＬＧＡポリマーである。一般的には、米国特許第１，９９５，９７０号、第２，７０３，３６１号、第２，７５８，９８７号、第２，９５１，８２８号、第２，６７６，９４５号、第２，６８３，１３６号及び第３，５３１，５６１号を参照。
【００２６】
合成ポリマーのスキャフォールドの代替として、タンパク質性ポリマーを含む多孔質スキャフォールドも使用できる。そうしたスキャフォールドは当該技術分野で公知であり、組織工学的構造物の製造に使用されてきた。例えば、コラーゲンゲルは血管組織構造物の製造に使用されており４３、コラーゲンのスポンジとメッシュは現在市販されている（例えば、Ｏｒｔｅｃ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク州ニューヨーク）。そのようなコラーゲン性基質、並びにエラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、又は他の細胞外マトリックスもしくは原線維タンパク質を基にした同様に構築された基質も、本発明の方法及び構造物に使用できる。そのようなタンパク質性ポリマーのスキャフォールドは、前述のように繊維性メッシュの形態、又はシート、パッチ、フィルム、もしくはスポンジのような非繊維性基質の形態であり得る。さらに、これらの基質は、例えばアシル化、スルホン化、グリコシル化、又はそうでなければアミノ酸側鎖の反応性基と他の部分との共役によって改質されて親水性の増大した及び／又は良好な細胞接着を提供するタンパク質性ポリマーを含むことができる。例えば、タンパク質をジカルボン酸無水物でアシル化して親水性を増大させることができる。又は細胞接着ペプチドと共役させて細胞播種の密度又は結合力（アビディティ）を増大させることができる。このようなタンパク質性ポリマーは、完全に生物学的性質を有するので、宿主に対して同系であれば免疫原性を低減するという利点を持つ。
【００２７】
本発明の好適な態様では、ＥＰＣのコンフルエントな単層をスキャフォールドの内腔に播種した後、インビボでの移植片移植の前に、播種スキャフォールドに様々な剪断応力を負荷してプレコンディショニングし、最大のＥＰＣ保持を達成する。プレコンディショニングしていないｅＰＴＦＥ移植片上の内皮細胞の最大８０％が、インビトロで又はビトロ後（ａｆｔｅｒ　ｖｉｔｒｏ）又はインビボでの移植後に剪断応力に曝露されると脱落することがこれまでに示されており、血管移植片上の内皮細胞のプレコンディショニングの重要性が強調されている２７−２８。
【００２８】
好ましくは、播種構造物に高剪断応力（２５ダイン／ｃｍ２）を負荷することによってインビボにおける動脈の条件をシミュレートする。好適な実施の態様では、剪断応力を２日間かけて低（１ダイン／ｃｍ２）から高（２５ダイン／ｃｍ２）に漸増し（図２Ｃ、右側の白いバー）、その後高剪断応力をさらに２日間負荷すると、約３２細胞／ｍｍという構造物の最適細胞密度が得られる（図２Ｃ、右側の黒いバー）。走査型電子顕微鏡により内皮細胞のコンフルエントな単層が明らかであろう（図２Ｄ）。これに対し、構造物を低剪断応力（１ダイン／ｃｍ２）の条件下で２日間前処理すると、３０細胞／ｍｍという細胞密度が得られる（図２Ｃ、左側の白いバー）。その後、該構造物に高剪断応力（２５ダイン／ｃｍ２）をさらに２日間負荷すると、細胞密度は１３細胞／ｍｍとなり、ほぼ５０％減少する（図２Ｃ、左側の黒いバー）。
【００２９】
播種構造物のプレコンディショニングが最適化されたら、ＥＰＣの機能は、正常の血管組織恒常性に中心的役割を果たす一酸化窒素（ＮＯ）の産生能力を試験することによって査定できる２９−３５。ＮＯは強力な血管拡張剤というだけでなく、血小板凝集、血管平滑筋増殖、及び白血球接着の阻害剤でもあり、これらのいずれもが強力な抗血栓及び抗アテローム性である２９−３５。ＥＰＣによるＮＯの産生は臓器チェンバ（ｏｒｇａｎ　ｃｈａｍｂｅｒ）法を用いるバイオアッセイで試験できる（図２Ｅ）。そこで、モルモット大動脈の内皮剥奪セグメントをトロンボキサンの類似体であるＵ４６６１９で収縮させ、次いで同じ臓器チェンバでＥＰＣ播種移植片を通って灌流させているカルシウムイオノホアＡ２３１８７に、その濃度を増加させながら暴露する。大動脈セグメントの量依存性の弛緩が観察できる（図２Ｅ、黒三角）。この量依存性の弛緩は、１０−３Ｍの内皮ＮＯシンターゼ阻害薬、Ｌ−ＮＡＭＥを添加すると著しく弱まる（７７．５％対５８．５％、Ｐ＜．００１、図２Ｅ、黒四角）。Ａ２３１８７をＥＰＣを播種してない移植片を通って灌流させた場合、大動脈セグメントは完全に収縮したままであろう。大動脈セグメントを内皮と無関係のＮＯ供与体であるナトリウムニトロプルシド（ＳＮＰ）に暴露すると、量依存性の弛緩がみられ、モルモットの大動脈セグメントに正常の平滑筋機能があることを示す（図２Ｅ、黒丸）。これらの結果から、本発明に従ってプレコンディショニングの後、移植片上のＥＰＣはＮＯを産生していることが確認される。
【００３０】
本発明を以下の実施例によってさらに特徴化するが、これらは本発明を例示するためのものである。
実施例１
末梢血からＥＰＣの単離
ＥＰＣは、１〜２週齢のヒツジの内頸静脈から採取した１。最初の５ｃｃの血液は廃棄し、１５ｃｃの血液を１００単位のヘパリンと混合した。Ａｃｃｕｓｐｉｎ管（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を用い、ヒストパック密度勾配（Ｓｉｇｍａ）上、１０００×ｇで３０分間遠心分離して白血球画分を得た。細胞ペレットを、２０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）を含むがヒドロコルチゾンを含まないＥＢＭ−２培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、カリフォルニア州サンジエゴ）中に再懸濁し、フィブロネクチン被覆プレート上で平板培養した。以後３日間は２４時間ごとに培地を新しいフィブロネクチン被覆プレートに移し、その後は３日ごとに培地を交換した。第３日目に培地中の細胞の一部をカウントし、最終培養のための投入細胞を決定した。
【００３１】
間接免疫蛍光法
間接免疫蛍光法を、前述のようにＣＤ３１に対する抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カリフォルニア州サンタクルーズ）、ｖＷＦに対する抗体（Ｄａｋｏ、カリフォルニア州カーペンテリア）、及びＥ−セレクチンに対する抗体を用いて実施し２６、蛍光ａＬＤＬ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ストートン）の組込みを画像化した。Ｚｅｉｓｓ　Ａｘｉｐｈｏｔ　ＩＩ　蛍光顕微鏡を用いて細胞を分析し、Ｅｃｋｔａｃｈｒｏｍｅ　ｐ１６００　カラースライドフィルムを用いて写真撮影した。
【００３２】
ウェスタンブロット分析
細胞溶解物を記載のように調製し４１、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜に移した。抗ＫＤＲ及び抗Ｔｉｅ−２抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カリフォルニア州サンタクルーズ）を用いてこれらの内皮特異タンパク質を検出した。
【００３３】
脱細胞化移植片の調製
採取したばかりのブタ腸骨血管を蒸留水に１時間浸け、血液成分を除去した。採取後、該腸骨血管をトリプシンを添加してインキュベートし、次いで１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）及び０．１％水酸化アンモニウム（Ｓｉｇｍａ）で処理し、４℃で７２時間振盪（１２０−ＲＰＭ）した。溶液は２４時間ごとに交換した。洗浄後、該血管を凍結乾燥し、冷ガス滅菌した。得られた血管移植片は、組織学的分析から（図２Ａ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応アッセイで検出されるＲＮＡの欠如から（データ示さず）、及び３ｍｍ２の脱細胞化マトリックス片をマウスの腹腔内に移植し反応を観察することによって測定できる免疫反応の欠如から分かるように、細胞内容を欠いているように見えるはずである。さらに、Ｍｏｖａｔ染色を用いれば、移植片が、内部及び外部弾性層板（図２Ｂ）を含むよく保存された細胞外マトリックス構造を有していることが確認できる。
【００３４】
等尺性（ｉｓｏｍｅｔｒｉｃ）試験
すべての等尺性張力試験は前述のように実施した３７。モルモットの大動脈輪を臓器チェンバの３７℃の酸素化クレブス溶液浴中で２個のタングステンあぶみ間に吊した。血管を、０．１ｇずつ段階的に増加させながら８０ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌに対して最大の反応を生じた最適静止張力まで引っ張り、１時間弛緩させた。ＥＰＣ播種移植片を該大動脈輪に直接取り付けた。Ｕ４６６１９による大動脈輪の収縮後、Ｃａ＋２イオノホアＡ２３１８７の濃度を増加させてＥＰＣのＮＯ産生を刺激することによって大動脈輪の弛緩を誘導した。さらに、Ａ２３１８７及び１０−３ＭのＬ−ＮＡＭＥに対する移植片の反応を評価し、またＳＮＰ濃度を増加させながらの評価も行った。ＥＰＣを播種した１３０日目の外植片も、血管運動活性について、外植移植片を５ｍｍの輪に分割することによって同じ実験計画を用いて試験した。４個の１３０日外植片のそれぞれから３個の輪を試験した。移植片におけるノルエピネフリン及びセロトニンの濃度増加に対する反応を評価した。１０−４Ｍのセロトニンによる最大収縮後、移植片におけるアセチルコリン及びＳＮＰの濃度増加に対する弛緩反応を測定した。ヒツジの頸動脈と伏在静脈のマッチさせたセグメントを対照として用いた。
【００３５】
ＥＰＣの標識
ＥＰＣを１μｇ／ｍｌの細胞トラッカー、ＣＭ−ＤｉＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）すなわち蛍光カルボシアニン色素で、２０分間３７℃で標識し、次にＰＢＳで３回洗浄した。次いで標識したＥＰＣを移植片に播種した。
【００３６】
移植片上のＥＰＣのプレコンディショニング
回転ダイナミックシーダー（ｓｅｅｄｅｒ）中で６時間１２ｒｐｍで、移植片に１×１０５細胞／ｃｍ２の密度で播種した。次に、ＥＰＣを播種した非細胞性移植片を層流バイオリアクタに入れ、剪断応力をポアズイユの等式：τ＝４ηＱ／πｒ３（式中、τ＝剪断応力、η＝液粘度、Ｑ＝培地流速、そしてｒ＝血管半径）を用いて計算した。剪断応力は、２日間１ダイン／ｃｍ２、又は１ダイン／ｃｍ２から２５ダイン／ｃｍ２に４時間ごとに３ダイン／ｃｍ２ずつ２日間かけて漸増させる、のいずれかで開始した。次に、すべての移植片にさらに２日間２５ダイン／ｃｍ２を負荷した。各移植片の３個の中心部セグメントをコンフルエント性に関して分析した。つまり、５μｍの組織学的切片を検査し、管腔表面周囲１ｍｍあたりの核数を数えた４２。
【００３７】
統計分析
ＮＯの全結果は平均±標準誤差（ＳＥＭ）で表す。統計的有意性は二つの平均を比較するための対応のないスチューデントｔ−検定を用いて評価した。
【００３８】
移植片の外科的移植
麻酔をかけたヒツジ（３０±３ｋｇ）の頸部中央を縦切開して総頸動脈を露出した。ヘパリン（１００ＩＵ／ｋｇ；Ｅｌｋｉｎｓ−Ｓｉｎｎ、ニュージャージー州チェリーヒル）を静脈内投与してから動脈を鉗子止めし、移植片を６．０ｐｒｏｌｅｎｅ縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ、ニュージャージー州サマービル）を用いて総頸動脈に対して端々吻合として配置した。動脈流を再確立し、層縫合によって閉じた。動物の世話と取扱いは、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ出版のＧｕｉｄｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｃａｒｅ　ａｎｄ　Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｎｉｍａｌｓに従った。
【００３９】
外植片の特徴付け
近位及び遠位吻合部と移植片中央部から採取した組織片をヘマトキシリン及びエオジンで染色した。平滑筋細胞と内皮細胞を、それぞれ平滑筋α−アクチンに対する抗体（Ｓｉｇｍａ）及びｖＷＦに対する抗体（Ｄａｋｏ、カリフォルニア州カーペンテリア）を用いた免疫化学分析によって確認した。
【００４０】
ＥＰＣを播種した血管移植片とＥＰＣを持たない対照血管移植片の長期開存性
インビボにおけるＥＰＣ播種移植片の有効性を査定するために、ヒツジで移植試験を実施した。自己ＥＰＣを１〜２週齢の子ヒツジから単離し、培養して増殖させ、脱細胞化移植片上に播種した。次に、該移植片を２日間かけて剪断応力を低から高に漸増させてプレコンディショニングした。４〜５ｃｍの長さの播種移植片（ｎ＝７）及び非播種移植片（ｎ＝４）を、頸動脈セグメントを置換するために二つの端々吻合を用いて移植した。投与した唯一の抗凝固薬は、術後７日間の毎日のアスピリン（８１ｍｇ）だけであった。すべての移植片は移植時には閉塞のない流れを示していた。我々は、毎日の超音波ドップラー血流検査と術後２週間の頸動脈二重走査試験（ｃａｒｏｔｉｄ ｄｕｐｌｅｘ ｓｔｕｄｙ）を実施し、開存性、流れ、及び血栓形成について評価した。４個の対照のうち３個の非播種移植片が移植５日以内に血栓形成により閉塞した（図３）。１個の対照移植片は１５日の採取時点ではまだ開存していたが、頸動脈二重イメージング及び組織学的分析によれば５０％の管腔は血栓によって閉塞していた。ＥＰＣを播種した全移植片は、移植後１５日又は１３０日のいずれの採取時点でも完全に開存していた（図３）。１３０日時点のＥＰＣ播種外植片の代表的動脈造影図は、血栓、閉塞、又は動脈瘤性拡張の徴候のない滑らかな管腔面を示していた（図４Ａ）。図４Ｅに示した１３０日の時点のＥＰＣ播種外植片の肉眼像は、血管内腔の滑らかな表面を立証している。
【００４１】
血管移植片の移植後試験
１５日の時点における播種移植片の組織検査によれば、内皮細胞のコンフルエントな単層が明らかになったが（データは示さず）、軽度の血栓を有するわずかな管腔領域があり、細胞が血栓−移植片の界面に集中していた（図４Ｂ）。移植片の培地は非細胞性であった。１３０日の時点で外植した播種移植片の全長の組織検査によれば、細胞内膜の肥厚を示し、隣接する動脈セグメントからのパンヌス、移植片媒体（ｍｅｄｉａ）への細胞浸潤、わずかな外膜炎症反応、及び移植片の管腔面を内張りしているコンフルエントな扁平化細胞単層と考えられた（図４Ｃ）。Ｍｏｖａｔで染色すると、細胞外マトリックス、特にエラスチンの元の解剖学的特徴を保存していることが示された（図４Ｄ）。内膜層内の細胞は、平滑筋細胞の特徴である平滑筋α−アクチンについて陽性に着色し（図４Ｆ）、一方、管腔面を内張りしている細胞は、内皮細胞の特徴であるｖＷＦについて着色した（図４Ｇ）。
【００４２】
１３０日の時点でＥＰＣがまだ移植片上に存在するかどうかを判定するために、播種前に、細胞膜に組み込まれる蛍光親油性カルボシアニントレーサーでＥＰＣを標識する。移植前に移植組織片を検査すると、標識されたコンフルエントな内皮細胞層が示された（図４Ｈ）。外植した移植片を検査すると、１５日及び１３０日の時点で、それぞれ約８０％及び１０％の管腔を覆った蛍光ＥＰＣ細胞の存在が示された（図４Ｉ及び４Ｊ）。膜に取り込まれた色素は細胞分裂ごとに希釈されるので、この結果は移植片上でのＥＰＣの高い増殖速度を示唆する。あるいは、一部の播種ＥＰＣがインビボで移植片から剥がれたか、又はトレーサー色素が１３０日の時点ではインビボで蛍光が減衰したのかもしれない。
【００４３】
１３０日時点における外植移植片の血管運動反応性
移植片には平滑筋細胞が存在するので、外植した移植片を収縮及び弛緩の反応性について評価した（図５）。１３０日時点の外植移植片の中心部セグメントを臓器チェンバに吊し、ノルエピネフリン及びセロトニンに反応する収縮性を測定した。１３０日の外植移植片はノルエピネフリンとセロトニンに対して量依存性の様式で収縮した。最大の反応を図５Ａに示す。外植移植片と比べて、マッチさせた天然頸動脈セグメントは、セロトニンに反応して２倍、ノルエピネフリンに反応して８倍の力の収縮を生じた。これらの結果は、移植片に観察された血管平滑筋細胞が確かに機能しており、二つの生理学的に重要な血管収縮薬に反応していることを示す。
【００４４】
内皮のＮＯ産生増加は、冠状動脈バイバスの動脈導管、例えば橈骨動脈又は内乳動脈の高い開存率と関連する。前のいくつかの実験で、我々はＥＰＣ播種移植片のインビトロにおけるＮＯ産生能力を示した（図２Ｅ）。ＥＰＣ播種移植片の長期開存性を評価する目的でその内皮機能をさらに査定するため、１３０日時点の外植ＥＰＣ播種移植片（黒菱形）の内皮依存性弛緩を、天然ヒツジ頸動脈（黒四角）及び伏在静脈（黒三角）のそれに対して比較した。各血管のセグメントをセロトニンで予め収縮させ、そして受容体介在型のＮＯ産生を誘導するアセチルコリンに、その量を増加させながら暴露した。アセチルコリンは３個の血管すべてに量依存性の弛緩を誘導した（図５Ｂ）。アセチルコリンに対するＥＰＣ播種移植片の最大弛緩は伏在静脈セグメントより顕著に大きかったが（６８％±１０％対２２±６％、Ｐ＜．００１）、頸動脈とは同様であった（６８％±１０％対８１±８％、Ｐ＝．０８８）（図５Ｂ）。アセチルコリンの誘導する外植移植片の量依存性弛緩は、内皮ＮＯシンターゼ阻害薬Ｌ−ＮＡＭＥの存在下では弱められた（６８％±１０％対２２±６％、Ｐ＜．００１）（図５Ｂ、ｘ）。３個の血管は、内皮と無関係のＮＯ供与体であるＳＮＰには等しく反応し（Ｐ＝ＮＳ）、最大の弛緩を達成した。これは、外植した１３０日時点のＥＰＣ播種移植片が正常の血管平滑筋細胞機能を有することを示す（図５Ｃ）。総合すると、これらの結果は、ＥＰＣ播種移植片の内皮依存性及び内皮非依存性の血管運動性が天然の頸動脈と非常に類似していることを示唆し、従って長期開存率を有する可能性も高いであろう。
【００４５】
実施例２
方法
実験計画
紡錘形を有するα−平滑筋アクチン（ＳＭＡ）陽性細胞をヒツジ新生児の末梢血から単離した。該細胞を、十分な数を達成するまで細胞培養プレート上で増殖させた。次に、該細胞を懸濁状態で、回転条件下にある半月弁の形態の生分解性スキャフォールドに移した。該細胞−ポリマースキャフォールドを回転中で２週間コンディショニングしてから拍動流シミュレーターに移し、さらに２週間置いた。インビトロでのコンディショニング期間の後、組織を採取して、細胞及び細胞外マトリックスのタンパク質含有を、組織学的染色、走査型電子顕微鏡、及び生化学アッセイを用いて分析した。１個の弁に対しては生化学的たわみ試験も実施した。
【００４６】
末梢血からの単離、特徴付け及び増殖
１５ミリリットルの血液をヒツジ新生児の頸静脈からヘパリン添加注射器に採取した。白血球画分をＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離法を用いて単離し、直径６０ｍｍのフィブロネクチン被覆ポリスチレン組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリンレイクス）上、細胞培養培地（ＤＭＥＭ、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド）中で平板培養した。この培地には、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド）、１％Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド）、２ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（Ｓｃｉｏｓ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カリフォルニア州）が補給されていた。オリジナルプレートからの細胞懸濁液を、新しいフィブロネクチン被覆プレートに２４時間ごとに連続的に移し、合計３枚のプレートを作った。第一と第二のプレートに、紡錘形を有する細胞の孤立したコロニーが見られた。細胞集団に対し、平滑筋細胞タンパク質α−ＳＭＡ（Ｓｉｇｍａ）、デスミン、カルポニン（ｃａｌｐｏｎｉｎ）、ミオシンＨ鎖、及び内皮細胞表面受容体ＣＤ３１に対する抗体を用いて免疫蛍光染色を実施した。細胞は、５％ＣＯ２の加湿インキュベータ中で増殖させ、培養で７０％のコンフルエントな状態に達した。７０％のコンフルエントな状態で、細胞を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド）を用いてトリプシン処理し、オリジナルの直径６０ｍｍプレートから取り出して直径１５０ｍｍプレートに継代した。その後、細胞を直径１５０ｍｍのプレートで増殖させ、７０％のコンフルエントな状態で１枚の皿から３枚の皿への割合で継代した。培地は３日ごとに、又は細胞を継代するときに交換した。
【００４７】
スキャフォールド
生分解性スキャフォールドは、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）（Ａｌｂａｎｙ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏ．Ｉｎｃ．，マサチューセッツ州マンスフィールド）とポリ−４−ヒドロキシブテレート（Ｐ４ＨＢ）（Ｔｅｐｈａ　Ｉｎｃ．，マサチューセッツ州Ｃａｍｈｒｉｄｇｅ）の複合材料から製造した。長さ３ｃｍ、直径１９ｍｍの半月弁を、熱処理技術を用いてサイジングモールドの周りを使って加工した（１４）。
【００４８】
細胞のスキャフォールドへの投入とスキャフォールドのコンディショニング
細胞を細胞培養プレートから０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて単離し、１０％ウシ胎仔血清、１％Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及び２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを補給した１００ｍｌの細胞培養培地（ＤＭＥＭ）の懸濁液中に、スキャフォールド１ｃｍ２あたり２百万個の細胞濃度で入れた。細胞−培地−スキャフォールドの組合せを標準の密封ハイブリダイゼーションフラスコに入れ、ハイブリダイゼーションオーブン中で３７℃の温度、４ｒｐｍの速度で回転させた。２週間の間、２４時間ごとにアスコルビン酸２００μｇ／ｍｌを含有する新鮮な細胞培養培地と交換した。次に、細胞−ポリマー構造物を開放系の拍動流シミュレーターにさらに２週間置いた。アスコルビン酸２００μｇ／ｍｌを該フローシミュレーターに２日ごとに補給した。
【００４９】
４週間のコンディショニング期間直後、組織工学的な弁をフローシミュレーターから取り出し、分析のために処理した。該弁の構造上の完全性は、組織学的に及び走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて評価した。細胞の及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の組成を定量するために生化学アッセイを実施した。弁葉に対する生化学的たわみ試験も実施した。
【００５０】
結果
細胞は、α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、カルポニン及びデスミンについては陽性に着色したが、血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ−１）については着色しなかった。組織学的染色及びＳＥＭから、構造物（ｎ＝３）の厚さ全体にわたって細胞及びＥＣＭ物質が確認された。生化学的分析によれば、構造物（ｎ＝３）の乾燥重量あたり、１４．７４μｇのＤＮＡ／乾燥重量（ＳＤ±３．６６）、４．４７μｇのコラーゲン／乾燥重量（ＳＤ±２．０）及び３４．４６μｇのエラスチン／乾燥重量（ＳＤ±３．９４）が示された。弁葉の予備的生化学的たわみ試験は、正常の弁組織に匹敵する有効な組織の剛性を示した。結論：末梢血から採取した細胞は、弁のスキャフォールドで増殖し、正常の心臓弁と機械的に似た「組織」を形成するＥＣＭタンパク質を産生できる。
【００５１】
当業者には本発明の範囲内で多様な変形が可能なことは明らかであろう。従って、本発明の変形が添付のクレーム及びそれらの均等物の範囲内に含まれる限り、それらも本発明に包含されるのは言うまでもない。
【００５２】
参考文献
以下に引用した参考文献及び本明細書中に出てくる参考文献は、引用によって本明細書に援用する。
１．Ｈｅａｒｔ　ａｎｄ　Ｓｔｒｏｋｅ　Ｆａｃｔｓ：Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｈｅａｒｔ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｅｒｉｃａｎｈｅａｒｔ．ｏｒｇ／ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ（２０００）。
２．Ｊ．Ｖ．Ｔｕら　米国及びカナダにおける高齢筋梗塞患者の心臓処置の利用及び転帰（Ｕｓｅ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ａｎｄ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｉｎ ｅｌｄｅｒｌｙ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ａｎｄ Ｃａｎａｄａ）。Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ　３３６，１５００（１９９７）。
３．Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｃ．Ｂ．＆　Ｂｅｌｌ，Ｅ．コラーゲン及び培養血管細胞から構築した血管モデル（Ａ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌ ｍｏｄｅｌ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌｓ）。Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１３，３９７（１９８６）。
４．Ｌ’Ｈｅｕｒｅｕｘ，Ｎ．，Ｐａｑｕｅｔ，Ｓ．，Ｌａｂｂｅ，Ｒ．，Ｇｅｒｍａｉｎ，Ｌ．＆　Ａｕｇｅｒ，Ｆ．Ａ．組織工学による完全に生物学的なヒト血管（Ａ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌ）。ＦＡＳＥＢ　Ｊ．１２，４７（１９９８）。
５．Ｎｉｋｌａｓｏｎ，Ｌ．Ｅ．ら　インビトロで成長させた機能的動脈（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｒｔｅｒｉｅｓ ｇｒｏｗｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ）。Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８４，４８９（１９９９）。
６．Ｔ．Ｈｕｙｎｈら、非細胞性コラーゲン移植片を生理学的に反応する新血管に改造（Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ａｎ ａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｇｒａｆｔ ｉｎｔｏ ａ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｎｅｏｖｅｓｓｅｌ）。Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔ．１７，１０８３（１９９９）。
７．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｃ．Ｅ．＆　Ｂａｉｅｒ，Ｊ．Ｅ．非細胞性血管組織：組織修復及び組織工学用の天然生体用材料（Ａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖａｓｃｕｌａｒ ｔｉｓｓｕｅｓ： ｎａｔｕｒａｌ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）。Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　２１，２２１５（２０００）。
８．Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｓ．Ｊ．＆　Ｂｒｏｃｋｂａｎｋ，Ｋ．Ｇ．Ｍ．　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｔｉｓｓｕｅ−Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇの中の４４７−４５４（Ｌａｎｇｅｒ，Ｂ．＆　Ｖａｃａｎｔｉ，Ｊ．編）（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、２０００）。
９．Ｄａｖｉｄ，Ｌ．，Ｄｏｗｅｒ，Ｔ．＆　Ｚｉｌｌａ，Ｐ．　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ　Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｇｒａｆｔｓの中の３−４５（Ｚｉｌｌａ，Ｐ．＆　Ｇｒｉｅｓｌｅｒ，Ｈ．Ｐ．編）（Ｒ．Ｇ．Ｌａｎｄｅｓ　Ｃｏ，テキサス州オースチン；１９９９）。
１０．Ａｓａｈａｒａ，Ｔ．ら　血管新生のための推定血管内皮前駆細胞の単離（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｕｔａｔｉｖｅ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）。Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７５，９６４（１９９７）。
１１．Ｙｉｎ．Ａ．ら　ＡＣ１３３，ヒト造血幹細胞及び前駆細胞に対する新規マーカー（ＡＣ１３３， ａ ｎｏｖｅｌ ｍａｋｅｒ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）。Ｂｌｏｏｄ　９０，５００２（１９９７）。
１２．Ｓｈｉ，Ｑ．ら　循環骨髄由来内皮細胞の証拠（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）。Ｂｌｏｏｄ　９２，３６２（１９９８）。
１３．Ｇｅｈｌｉｎｇ，Ｕ．Ｍ．ら　ＡＣ１３３陽性前駆細胞からの内皮細胞のインビトロでの分化（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ＡＣ１３３−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）。Ｂｌｏｏｄ　９５，３１０６（２０００）。
１４．Ｌｉｎ，Ｙ．，Ｗｅｉｓｄｏｒｆ，Ｄ．Ｊ．，Ｓｏｌｏｖｅｙ，Ａ．＆　Ｈｅｂｂｅｌ，Ｒ．Ｒ．循環内皮細胞の起源及び血液からの内皮成長（Ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ｆｒｏｍ ｂｌｏｏｄ）。Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　１０５，７１（２０００）。
１５．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔ．ら　血管新生のための骨髄由来血管内皮前駆細胞の虚血及びサイトカイン誘導性動員（Ｉｓｃｈｅｍｉａ− ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ， ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）。Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５，４３４（１９９９）。
１６．Ａｓａｈａｒａ，Ｔ．ら　生理的及び病理的血管新生における生後の脈管形成に役割を果たす骨髄由来の血管内皮前駆細胞（Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｐｏｓｔｎａｔａｌ ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）。Ｃｉｒｃｕｌ．Ｒｅｓ．８５，２２１（１９９９）。
１７．Ａｓａｈａｒａ，Ｔ．ら　骨髄由来の血管内皮前駆細胞の動員により生後の血管新生に寄与するＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｐｏｓｔｎａｔａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）。ＥＭＢＯ　Ｊ．１８，３９６４（１９９９）。
１８．Ｋａｌｋａ，Ｃ．ら　治療的血管新生のためにエクスビボ（体外）で増殖させた血管内皮前駆細胞の移植（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘ ｖｉｖｏ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）。ＰＮＡＳ　９７，３４２２（２０００）。
１９．Ｋａｌｋａ，Ｃ．ら　血管内皮細胞成長因子ｒ６５の遺伝子導入によるヒト被験者における循環血管内皮前駆細胞の増加（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒ６５ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｕｇｍｅｎｔｓ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｕｂｊｅｃｔｓ）。Ｃｉｒｃｕｌ．Ｒｅｓ．８６，１１９８（２０００）。
２０．Ｋａｌｋａ，Ｃ．ら　手術不能の冠状動脈疾患を有する患者におけるＶＥＧＦ遺伝子導入による血管内皮前駆細胞の動員（ＶＥＧＦ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｏｂｉｌｉｚｅｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｎｏｐｅｒａｂｌｅ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）。Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．７０，８２９（２０００）。
２１．Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，Ｖ．ら　ＣＤ３４＋骨髄細胞を播種したポリエステル移植片における内皮化及び微小血管形成の増強（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｏｌｙｅｓｔｅｒ ｇｒａｆｔｓ ｓｅｅｄｅｄ ｗｉｔｈ ＣＤ３４＋ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌｓ）。Ｂｌｏｏｄ　９５，５８１（２０００）。
２２．Ｃｒｏｓｂｙ，Ｊ．Ｒ．ら　造血由来の血管内皮細胞の成人血管形成における多大な寄与（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｏｒｉｇｉｎ ｍａｋｅ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｔｏ ａｄｕｌｔ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）。Ｃｉｒｃｕｌ．Ｒｅｓ．８７，７２８（２０００）。
２３．Ｍｕｒｏｈａｒａら　移植した臍帯血由来血管内皮前駆細胞による生後の血管新生の増強（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｕｇｍｅｎｔ ｐｏｓｔｎａｔａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）。Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５，１５２７（２０００）。
２４．Ｐｅｉｃｈｅｖ，Ｍ．ら　循環ヒトＣＤ３４＋細胞によるＶＥＧＦＲ−２及びＡＣ１３３の発現で確認される機能性血管内皮前駆細胞集団（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＶＥＧＦＲ−２ ａｎｄ ＡＣ１３３ ｂｙ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ＣＤ３４＋ ｃｅｌｌｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）。Ｂｌｏｏｄ　９５，９５２（２０００）。
２５．Ｏｒｔｅｎｗａｌｌ，Ｐ．，Ｂｙｌｏｃｋ，Ａ．，Ｋｊｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｂ．Ｔ．＆　Ｒｉｓｂｅｒｇ，Ｂ．ヒツジ及びイヌにおけるｅＰＴＦＥ製頸動脈間置移植片の播種：種依存性の結果（Ｓｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｅＰＴＦＥ ｃａｒｏｔｉｄ ｉｎｔｅｒｐｏｓｉｔｉｏｎ ｇｒａｆｔｓ ｉｎ ｓｈｅｅｐ ａｎｄ ｄｏｇｓ： Ｓｐｅｃｉｅｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｓｕｌｔｓ）。Ｓｕｒｇｅｒｙ　１０３，１９９（１９８７）。
２６．Ｋｒａｌｉｎｇ，Ｂ．Ｍ．＆　Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，Ｊ．簡易ヒト微小血管内皮細胞成長法によってもたらされる老化の低減とサイトカイン及び成長因子に対する反応性の持続（Ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｔｏ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ）。Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３３，３０８（１９９８）。
２７．Ｒｏｓｅｎｍａｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｋｅｍｐｃｚｉｎｓｋｉ，Ｒ．Ｆ．，Ｐｅａｒｃｅ，Ｗ．Ｈ．＆　Ｓｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎ，Ｅ．Ｂ．血管内皮細胞播種の動態（Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｓｅｅｄｉｎｇ）。Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．２，７７８（１９９５）。
２８．Ｍｉｙａｔａ，Ｔら　拍動性剪断応力への遅延暴露で改善されるヒト伏在静脈内皮細胞の播種ｅＰＴＦＥ移植片上での保持（Ｄｅｌａｙｅｄ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｐｕｌｓａｔｉｌｅ ｓｈｅａｒ ｓｔｒｅｓｓ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓａｐｈｅｎｏｕｓ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｎ ｓｅｅｄｅｄ ｅＰＴＦＥ ｇｒａｆｔｓ）。Ｊ　Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．５０，４８５（１９９１）。
２９．Ｋｅａｎｅｙ　Ｊｒ．，Ｊ．Ｆ．＆　Ｖｉｔａ，Ｊ．Ａ．内皮由来弛緩因子の作用におけるアテローム性動脈硬化、酸化的ストレス、及び抗酸化剤保護（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ， ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ， ａｎｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｒｅｌａｘｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ａｃｔｉｏｎ）。Ｐｒｏｇ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｄｉｓ．３８，１２９（１９９５）。
３０．Ｑｕｙｙｕｍｉ，Ａ．Ａ．ら　ヒト冠状動脈循環における一酸化窒素活性。冠状動脈アテローム性硬化症に対するリスク因子の影響（Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）。Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５，１７４７（１９９５）。
３１．Ａｚｕｍａ，Ｈ．，Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｍ．＆　Ｓｅｋｉｚａｋｉ，Ｓ．血小板凝集の内皮依存性阻害（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）。Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８８，４１１（１９８６）。
３２．Ｒａｄｏｍｓｋｉ，Ｍ．Ｗ．，Ｐａｌｍｅｒ，Ｒ．Ｍ．＆　Ｍｏｎｃａｄａ，Ｓ．血管内皮への血小板接着における一酸化窒素とｃＧＭＰの役割（Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ａｎｄ ｃＧＭＰ ｉｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｔｏ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）。Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４８，１４８２（１９８７）。
３３．Ｋｕｂｅｓ，Ｐ．，Ｋｕｒｏｓｅ，Ｉ．＆　Ｇｒａｎｇｅｒ，Ｄ．Ｎ．虚血後の小静脈においてＮＯ供与体はインテグリン誘導性の白血球接着を防止するが、Ｐ−セレクチン依存性のローリング現象は防止しない（ＮＯ ｄｏｎｏｒｓ ｐｒｅｖｅｎｔ ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｂｕｔ ｎｏｔ Ｐ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｏｌｌｉｎｇ ｉｎ ｐｏｓｔｉｓｃｈｅｍｉｃ ｖｅｎｕｌｅｓ）。Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６７，Ｈ９３１（１９９４）。
３４．Ｍａｒｋｓ，Ｄ．Ｓ．ら　一酸化窒素のタンパク質付加物を用いた１回治療による血管傷害後のウサギにおける新内膜増殖阻害（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｂｂｉｔｓ ａｆｔｅｒ ｖａｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｕｒｙ ｂｙ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｄｄｕｃｔ ｏｆ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ）。Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６，２６３０（１９９５）。
３５．Ｌｕｓｃｈｅｒ，Ｔ．Ｆ．ら　動脈及び静脈の冠状バイパス移植片における内皮依存性弛緩の差（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ｉｎ ａｒｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ｉｎ ｖｅｎｏｕｓ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｂｙｐａｓｓ ｇｒａｆｔｓ）。Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１９，４６２（１９８８）。
３６．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．，Ｅｖｏｒａ，Ｐ．Ｒ．Ｂ．＆　Ｓｃｈａｆｆ，Ｈ．Ｖ．内乳動脈からのＥＤＲＦのバイオアッセイ：早期及び後期のバイパス移植片開存性に関する示唆（Ｂｉｏａｓｓａｙ ｏｆ ＥＤＲＦ ｆｒｏｍ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｍａｍｍａｒｙ ａｒｔｅｒｉｅｓ： Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ａｎｄ ｌａｔｅ ｂｙｐａｓｓ ｇｒａｆｔ ｐａｔｅｎｃｙ）。Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．５４，１０７８（１９９２）。
３７．Ｓｈａｐｉｒａ，Ｏ．Ｍ．ら　内乳動脈又は伏在静脈と比較した橈骨動脈における一酸化窒素による血管弛緩の増強（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｄｉａｌ ａｒｔｅｒｙ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｍａｍｍａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｏｒ ｓａｐｈｅｎｏｕｓ ｖｅｉｎ）。Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　１００，１１−３２２（１９９９）。
３８．Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｋ．ら　マウスの大動脈移植動脈症においてドナーの内膜平滑筋様細胞の供給源となる宿主骨髄細胞（Ｈｏｓｔ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ａ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｄｏｎｏｒ ｉｎｔｉｍａｌ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ａｏｒｔｉｃ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ａｒｔｅｒｉｏｐａｔｈｙ）。Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　１０２，１１−２２１（２０００）。
３９．Ｍ．Ｄｅｕｔｓｃｈ，Ｊ．Ｍｅｉｎｈａｒｔ，Ｐ．Ｚｉｌｌａ，Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ　Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｇｒａｆｔｓ，Ｐ．Ｚｉｌｌａ，Ｈ．Ｐ．Ｇｒｉｅｓｌｅｒ，編（Ｒ．Ｇ．Ｌａｎｄｅｓ　Ｃｏ．，テキサス州オースチン，１９９９），ｐｐ．１８０−１８７。
４０．Ｂ．Ｓｈｅｎ，ら　インビトロにおける血管内皮細胞成長因子によるＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体発現の同種アップレギュレーション（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ）。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２９９７９（１９９８）。
４１．Ｓｈｅｎ，Ｂ．Ｑ．ら　インビトロにおける肝細胞成長因子によるヒト気管上皮分化の刺激（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｒａｃｈｅａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａ ｉｎ ｖｉｔｒｏ）。Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．２７２，Ｌ１１１５（１９９７）。
４２．Ｄａｒｄｉｋ，Ａ．，Ｌｉｕ，Ａ．，Ｂａｌｌｅｒｍａｎｎ，Ｂ．Ｊ．長期インビボ剪断応力による人工血管移植片上への内皮細胞保持の刺激と、その後のインビボにおける新内膜肥厚の低減（Ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｈｅａｒ ｓｔｒｅｓｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｏｎ ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ ｖａｓｃｕｌａｒ ｇｒａｆｔｓ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｉｎ ｖｉｖｏ ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）。Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２９，１５５７（１９９９）。
４３．Ｗｅｉｎｂｅｒｇ及びＢｅｌｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３１，３９７−４００（１９８６）。
【００５３】
添付の図面は、本明細書中に組み込まれ、またその一部を形成するものであるが、本発明の態様を図示し、明細書中の説明と合わせて、本発明の目的、利点、及び原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａ〜１Ｈは、末梢血から採取したＥＰＣの形態学的及び表現型的特性を示す。図１Ａは、ＥＰＣが典型的な敷石状の内皮の形態を示す図である。図１Ｂは、ＥＰＣがＣＤ３１を発現していることを示す図である。図１Ｃは、ＥＰＣがフォンビルブランド因子を発現していることを示す図である。図１Ｄは、ＥＰＣがａＬＤＬを組み込んでいることを示す図である。図１Ｅは、刺激されないＥＰＣはＥ−セレクチンの発現に対して陰性であることを示す図である。図１Ｆは、ＬＰＳでＥ−セレクチンの発現が刺激されたことを示す図である。図１Ｇ及び１Ｈは、抗体（各パネルの左側に示す）でイムノブロットした２つの異なるＥＰＣ集団、ＥＰＣ９−１９とＥＰＣ９−９Ｂ、ＨＤＭＥＣ、及びヒト線維芽細胞の全細胞抽出物を示す図である。ヒト線維芽細胞抽出物は陰性対照として、ＨＤＭＥＣは陽性対照として働き、α−チューブリンはタンパク質負荷に関する対照として働く。３本の矢（図１Ｈ）は、ＫＤＲの完全にグリコシル化された成熟形（２３０ｋＤａ）、ＫＤＲの部分グリコシル化形（２００ｋＤａ）、及びＫＤＲの非グリコシル化形（１５０ｋＤａ）を示す４０。図１Ｉは、ＶＥＧＦとの７２時間のインキュベーション後、該成長因子の濃度増加に反応してのＥＰＣの増殖を示す図である。図１Ｊは、ＢＦＧＦとの７２時間のインキュベーション後、該成長因子の濃度増加に反応してのＥＰＣの増殖を示す図である。
【図２】図２Ａ〜２Ｅは、脱細胞化したブタ腸骨血管マトリックスに播種したＥＰＣに関する移植前試験の結果を示す。図２Ａは、ヘマトキシリン及びエオジン染色による脱細胞化移植片の組織学的所見を示す図である（倍率２０×）。図２Ｂは、Ｍｏｖａｔ染色による内外のエラスチン層を示す図である（暗褐色）（倍率２０×）。図２Ｃは、４８時間低い（１ダイン／ｃｍ２）又は漸増する（１から２５ダイン／ｃｍ２）剪断応力で処理し（白いバー）、その後４８時間高い（２５ダイン／ｃｍ２）剪断応力で処理した（黒いバー）脱細胞化移植片の管腔表面におけるＥＰＣ密度を示す図である。図２Ｄは、漸増する剪断応力で４８時間、次いで高剪断応力でさらに４８時間処理したＥＰＣ播種移植片は、内皮細胞が集密層になっていることを示す走査型電子顕微鏡の図である（倍率８８０×、バー＝１０μ）。図２Ｅは、ＥＰＣ播種移植片によるＮＯ産生を示す図である。臓器チェンバシステムにおいて、内皮を剥奪したモルモットの大動脈輪をＵ４６６１９の存在下で最大限収縮させた。次いで同じ臓器チェンバ内でＥＰＣ播種脱細胞化移植片内に直接灌流させているカルシウムイオノホアＡ２３１８７の濃度を増加させながら弛緩を測定した（黒三角）。Ａ２３１８７による弛緩効果を、１０−３Ｍの内皮ＮＯシンターゼ阻害薬、Ｌ−ＮＡＭＥの存在下でも測定した（黒四角）。内皮と無関係のＮＯ供与体であるＳＮＰの濃度を増加させながらの弛緩も記録した（黒丸）。データは、収縮の削減率（パーセント）で示し、４個の移植片から導かれた平均±ＳＥＭで表した。＊Ａ２３１８７対Ａ２３１８７とＬ−ＮＡＭＥの量反応に関するＰ＜０．００１。
【図３】ＥＰＣを播種した血管移植片（破線）及び内皮細胞を持たない対照の血管移植片（実線）の長期開存性を示す図である。開存性はドップラー血流検査で定義し、頸動脈二重走査試験で確認した。ＥＰＣ播種移植片は１５日（ｎ＝３）又は１３０日（ｎ＝４）の時点で採取した。非播種移植片（対照）は１５日の時点で採取した（ｎ＝４）。
【図４】図４Ａ〜４Ｉは血管移植片の移植後試験を示す図である。図４Ａは、移植後１３０日の時点におけるＥＰＣ播種血管移植片の動脈造影図である。動脈造影図上の移植片の位置は、吻合部位のステープルによって判定され、２本の矢印で示す。図４Ｂは、１５日の時点で外植された播種移植片を示す図である。非細胞性の移植片培地の上に重なって、まとまりの悪い血栓性沈着物が見られる（星印）。図４Ｃ〜Ｆは、１３０日の時点で外植された播種移植片を示す図である。図４Ｃは、細胞内膜肥厚を示す図であり、隣接する動脈セグメントからのパンヌス、移植片培地への細胞浸潤、及び移植片の管腔面を内張りしている集密的扁平化細胞単層とみなされる（矢印）。図４Ｄは、細胞外マトリックスについて染色した切片が元の解剖学的特徴、特にエラスチンを保存していることを示す図である（黒）。内弾性膜を白の矢印で示す。図４Ｅは、外植された１３０日時点のＥＰＣ播種血管の肉眼図である。スケールは１ｍｍ。図４Ｆは、内膜層内の細胞が平滑筋α−アクチンについて着色したことを示す図である（ｉ及び差し込み）。内側層（ｍ）はα−アクチンについて染色されていない。図４Ｇは、内膜層の上に重なる細胞がｖＷＦについて着色したことを示す図で、矢印で示す。倍率は、図４Ｂ、Ｃ及びＦの差し込み＝２００×、図４Ｄ及び４Ｆ＝１００×、そして図４Ｇ＝４００×。図４Ｈは、蛍光トレーサーで標識された内皮細胞を播種された移植前の移植片を示す図である。図４Ｉは、移植片の管腔面にＣＭ−ＤｉＩ標識内皮細胞の存在を示す１５日時点の外植移植片を示す図である。図４Ｊは、移植片の管腔面にＣＭ−ＤｉＩ標識内皮細胞の存在を示す１３０日時点の外植移植片を示す図である。図４Ｇ〜Ｉは管腔を左側に配置している。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、１３０日の時点で外植された移植片の血管運動反応性を示す図である。図５Ａは、１３０日時点の各外植移植片の３個の中心部セグメントの収縮活性を、臓器チェンバで試験した結果を示す図である。ノルエピネフリンとセロトニンの量を１０−９Ｍから１０−４Ｍに増加させると移植片が収縮し、１０−４Ｍの濃度で最大の反応が見られる。図５Ｂは、ＥＰＣ播種移植片（黒菱形）、頸動脈（黒四角）、及び伏在静脈（黒三角）のマッチさせたセグメントを１０−４Ｍのセロトニンで収縮させ、アセチルコリンの増加する濃度に反応した弛緩について評価した図である。ＥＰＣ播種移植片は、アセチルコリン及び１０−３ＭのＬ−ＮＡＭＥ（ｘ）の存在下で弛緩した。＊ＥＰＣ播種移植片対Ｌ−ＮＡＭＥで減衰された反応及び伏在静脈に関するＰ＜．００１、ＥＰＣ播種移植片対頸動脈に関するＰ＝０．０８８。図５Ｃは、図５Ｂと同様のマッチさせたセグメントを、ＳＮＰの存在下での弛緩について評価した図である。データは、収縮の削減率（パーセント）で示し、平均±ＳＥＭで表してある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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