(57)【要約】本発明は核磁気共鳴（ＮＭＲ）および残存双極性結合の測定を使用した、特定標的分子に結合するリガンドを同定するための化合物スクリーニング法を提供する。本方法は、合理的薬物デザインを支援するために、特定標的分子、例えばタンパク質、ポリペプチドおよび高分子に結合する化合物のスクリーニングおよび／または同定に特に有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）液晶溶液中に少なくとも１つのリガンドを入れること；
（ｉｉ）１−、２−または多重結合スカラー連結を観察するために、前記少なくとも１つのリガンドの第一１−、２−または多次元高解像度ＮＭＲ相関スペクトルを作製すること；
（ｉｉｉ）少なくとも１つのリガンドの溶液に特定標的分子のサンプルを加えること；
（ｉｖ）少なくとも１つのリガンドの第二１−、２−または多次元高解像度ＮＭＲ相関スペクトルを作製すること；および
（ｖ）少なくとも１つのリガンド内にある核の特定ペアに対応する共鳴線のスプリッティングの差を同定するために、前記第一および第二高解像度ＮＭＲ相関スペクトルを比較するステップを含む、特定標的分子に結合する単一または複数のリガンドを同定する方法。
【請求項２】
第一および／または第二高解像度ＮＭＲ相関スペクトルが特定標的分子内に見出される要素のＮＭＲ活性核の化学シフトに関連している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
２者間の正確な比較を保証するために、リガンドの第二高解像度ＮＭＲ相関スペクトルが、該第一スペクトルを得る時の条件と同一条件下に得られる、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
特定標的分子がタンパク質、またはポリペプチド、または高分子である、前記請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
特定標的分子が膜タンパク質である、前記請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
タンパク質が清浄液中に提供される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
核のペアが活性であり、かつ１Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎまたは３１Ｐを含む群から選択される、前記請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
液晶媒体が、
（ｉ）ジミリストイルホスファチジルコリン：ジヘキサノイルホスファチジルコリンの水溶液；
（ｉｉ）ジトリデシルホスファチジルコリン：ジヘキシルホスファチジルコリンの水溶液または；
（ｉｉｉ）塩化セチルピリジニウム：ヘキサノールのＮａＣｌ溶液、を含む群より選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
高解像度ＮＭＲ相関スペクトル作製前にＮＭＲ活性安定型同位元素を使った同位元素濃縮のステップを更に含み、そこでリガンドまたはリガンドライブラリー、特定標的分子またはその両方が濃縮される、前記請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
濃縮ＮＭＲ活性安定型同位元素が１３Ｃ、１５Ｎまたは３１Ｐまたは２Ｈ、またはそれら同位元素の混合体、あるいはその何れかの組み合わせの放射活性同位元素、もしくはリガンド内に見出されるその他ＮＭＲ活性安定型同位元素またはその非安定型同位元素から成る群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
標的分子が液晶媒体のマトリックスを含む化学種に強固に結合されるように生化学的に誘導化されるか、または本来そのような能力を有している、前記請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
誘導化が、
（ｉ）標的分子上の１またはそれ以上の部位のミリストイル化；
（ｉｉ）本来備えているか、または過剰発現タンパク質の遺伝子工学による膜貫通ドメインまたはグリコシル化ホスファチジルイノシトール膜アンカーの存在、または；
（ｉｉｉ）化学的手段による液晶媒体上官能基への標的分子の共有結合、の方法のいずれか一つを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ｉ）液晶溶液中にスクリーンされるリガンドを入れること；
（ｉｉ）１−、２−または多重結合スカラー連結を生成するために、スクリーンされるリガンドの第一１−、２−または多次元高解像度ＮＭＲ相関スペクトルを作製すること；
（ｉｉｉ）スクリーンされるリガンド溶液に特定標的分子のサンプルを加えること；
（ｉｖ）スクリーンされるリガンドの第二１−、２−または多次元高解像度ＮＭＲ相関スペクトルを作製すること；および
（ｖ）少なくとも１つのリガンド内にある核の特定ペアに対応する共鳴線のスプリッティングの差を同定するために、前記第一および第二高解像度ＮＭＲ相関スペクトルを比較するステップを含む、適当な生物学的活性を有する単一または複数のリガンドを含む治療薬候補を選択することを目的とする、リガンドライブラリースクリーニングへの使用方法。
【請求項１４】
さらに請求項２〜１２に引用される特徴の１またはそれ以上を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
さらに治療薬候補として同定された選択リガンド、またはその誘導体あるいは相同体と、医薬品として許容されるキャリアーとを混合するステップを含む、請求項１３または１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
単一または複数の作用物質リガンドを請求項１〜１５の何れかに引用の方法により同定すること、およびさらに同定された作用物質またはその誘導体あるいは相同体と医薬品として許容されるキャリアーとを混合することを含む、医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は特定標的分子に結合する化合物をスクリーニングおよび／または同定することへの核磁気共鳴（ＮＭＲ）の使用、特に、合理的薬物デザインを支援するために、リガンドライブラリーおよび標的分子へのそれらの結合のスクリーニングでの使用に関する。
【０００２】
［発明の背景］
現在驚異的速度で様々なゲノム配列解析プロジェクトが進行中である。関連遺伝子配列によりコードされた標的分子の３次元構造は、合理的な薬物デザイン、即ち、例えば天然リガンドのアゴニストまたはアンタゴニスト、阻害剤、基質または標的ベクターとして標的分子に結合する化合物のデザインの好適プラットホームである。合理的に薬物をデザインする上で、標的分子と天然リガンドの間の複合体の、原子解像において３次元構造を得ることはなお一層有益である。しかし現時点では、複雑な結合プロセスのエネルギー論はこの情報を単独で使用し合理的に薬物デザインができるほど十分解明されていない。
【０００３】
一般的には、共通の化学的課題に基づき多数の化合物（「ライブラリー」）を、あるいはその共通構造骨格が複合体の３次元構造より推論されるより小数の化合物（「フォーカスドライブラリー」）がデザインされる。これらの化合物は望ましい活性（「陽性」）を検出するためにデザインされた化学的または生物学的アッセイにより、個別または混合体としてスクリーニングされる。しかしこのようなアッセイに付随する問題として「偽陽性」および「偽陰性」が危惧される。偽陽性は、ライブラリーのメンバーが結合する部位（結合部位）以外の部位で標的分子と非特異的に結合することで生ずるが、偽陰性はライブラリーのメンバーが標的分子に対し、そのアッセイ法では検出できないほど低い親和性を有することから生ずる。誤った結果は、製薬会社に対し研究及び開発の時間と金の両方を浪費させることになる。
【０００４】
従来技術より、標的分子およびそれらのリガンドとの複合体の３次元構造を決定することへのタンパク質結晶学の使用が知られている。しかし本方法には、ライブラリーの全てのメンバーについて標的分子−リガンド複合体の結晶が必要であり、そしてこのような結晶を成長させることは当業者にとってさえ殆ど試行錯誤であるという問題が伴う。従って、結晶学は迅速スクリーニングに好適な方法ではないことは明らかであろう。
【０００５】
試みられてきた別の技術はＮＭＲである。ＮＭＲは溶液材料を必要とするが、原則として所定ライブラリーの１より多いメンバーを同時にスクリーニングできる。米国特許第５、６９８、４０１号、第５，８０４、３９０号、および米国特許第５、８９１、６４３号に開示されるように、標的分子に結合する単一または複数の化合物を同定することを目的とした推定リガンドライブラリーのスクリーニングにＮＭＲが使用できることが従来技術より分かる。各上記技術は同位元素に富むタンパク質からの第１二次元１５Ｎ／１Ｈ  ＮＭＲ相関スペクトルを、そして同位元素に富むタンパク質／リガンド複合体から、第２１５Ｎ／１Ｈ  ＮＭＲ相関スペクトルを作製することに基づいている。次にタンパク質スペクトルの変化を使用し、結合部位を同定する。換言すれば、従来技術はタンパク質上の結合部位、およびリガンドが実際にタンパク質と結合しているに関する所定情報しか使用できない。さらにこの技術は、１５Ｎを使ったタンパク質の同位元素濃縮化に制限される。
【０００６】
従来のＮＭＲ技術に伴う問題は、スクリーンされるリガンドファミリーのメンバーの方向に関する情報を得ることができないことである。従来技術は、リガンドファミリーメンバーの相対的方向に関する情報も提供できず、即ちこの技術はライブラリー／セットより最適候補を比較同定できず、またこの技術はタンパク質に関しリガンドの絶対的方向についての情報も提供できない。
【０００７】
本発明は、（ａ）その親和性が通常アッセイでは検知できないほど弱すぎるライブラリーのメンバー（複数）を検出でき、そして（ｂ）標的分子に関し同一または異なる相対方向で結合する所定ライブラリーの２またはそれ以上のメンバーを識別できる方法を提供することで、これらの問題を軽減または克服する。
【０００８】
我々は化学シフト法に基づくリガンドのＮＭＲスクリーニングに関する問題に対し、全く異なるアプローチを用いた。我々は、モーメントと、モーメントを結びつけるベクターと磁場との間に形成される角度との間の距離に依存する、適用磁場に於ける２つの磁気モーメント間の相互作用エネルギーに基づく方法を使用している。このようなモーメントを持つ原子核のＮＭＲスペクトルでは、相互作用のこのエネルギーは各核に対応する共鳴線の「スプリッティング」となって表れる。ヘルツで表されるこのスプリッティングの大きさは、双極性結合定数として知られている。溶液中で高速にタンブルし、そして正味配向度を持たない（等方性タンブリング）分子の原子核については、角項の平均値が平均して０であることから、双極性結合定数は観察されない。これに対し、応用場に関し強く整列されている、即ち固体中の分子内の原子間には、大きな双極性結合（典型的にはキロヘルツ）が観察される。
【０００９】
本発明では（１）弱く配向した標的分子の同定に特に好都合である残存双極性結合、およびそれらの複合体（２）の使用を記述する。標的分子に結合したリガンドは、標的分子と同じ程度に整合し、そして加えられた磁場にと同一配向を採るだろう。これに対し、溶液中の遊離リガンドは、それが遙かに小さい大きさであることを活かし、遙かに小さい整合度を採るだろう。
【００１０】
我々は、予想外の観察を使用して従来技術の持つ問題を克服し、リガンドスクリーニングの感受性を好都合に改良し、そして標的分子に関し「陽性」の配置に関する情報を迅速に提供することで、正確な結合部内に結合している「陽性」を検出することができるようになった。本発明により、リガンドの結合親和性と標的分子に対する配向の両方についてのデータを同時に作製することが可能になる。我々は、本発明のリガンドスクリーニング法は特に製薬産業に有益であると信じている。
【００１１】
［発明の説明］
最も広義の態様では、本発明は残存双極性結合の測定を使用した、特定標的分子に結合するリガンドを同定するための、化合物スクリーニング法を提供する。
【００１２】
本発明の第１の態様によれば、以下のステップを含む、特定標的分子に結合する単一または複数のリガンドを同定する方法が提供される。
（ｉ）少なくとも１つのリガンドを液晶溶液内に入れること；
（ｉｉ）１−、２−または多重結合スカラー連結を観察するために、前記少なくとも１つのリガンドの第一１−、２−または多次元高分解ＮＭＲ相関スペクトルを作製すること；
（ｉｉｉ）少なくとも１つのリガンドの溶液に特異的標的分子のサンプルを加えること；
（ｉｖ）少なくとも１つのリガンドの第二、１−、２−または多次元高分解ＮＭＲ相関スペクトルを作製すること；および
（ｖ）少なくとも１つのリガンド内にある核の特定の対に割り振られた共鳴線のスプリッティングの差を同定するために、第一および第二高分解ＮＭＲ相関スペクトルを比較すること。
【００１３】
好ましくは、第一および／または第二高分解ＮＭＲ相関スペクトルは、特定標的分子内に生じた、いずれかの要素のＮＭＲ活性核の化学シフトに関する。
【００１４】
好ましくは、両者の間を正確に比較できるよう、リガンドの第二高分解ＮＭＲ相関スペクトルは前記第一スペクトルを得た場合と同一条件の下に得る。
【００１５】
好ましくは、特定標的分子は、タンパク質またはポリペプチドであり、随意標的分子は例えば清浄液中の膜タンパク質であろう。
【００１６】
従って、本発明は「天然リガンド」、リガンドライブラリー、またはその選択メンバーの１−、２−または多次元高分解ＮＭＲ相関スペクトルを提供すること、そしてリガンドは希釈液晶媒体中に提供されることが認識されるだろう。高分解ＮＭＲ相関スペクトルは、１−、２−または多重結合スカラー連結の観察が可能な形で得られる。スペクトルは典型的には１Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎまたは３１ＰのようなＮＭＲ活性核の化学シフトに相関するがこれらの核に限定されるものではなく、そして特定標的分子のその他要素と相関するだろう。本発明の方法は高分子標的に応用できる。
【００１７】
液晶媒体の組成物は当業者に周知であり、そして本出願の範囲を制限するものではない。しかしながら好適例として、以下の何れか一つを含む。
（ｉ）ジミリストイルホスファチジルコリン：ジヘキサノイルホスファチジルコリン、好ましくは２．９：１（モル／モル）の濃度の水溶液（５〜１５％（ｗ／ｖ）；
（ｉｉ）ジトリデシルホスファチジルコリン：ジヘキシルホスファチジルコリン、好ましくは３．０：１（モル／モル）濃度の水溶液（５〜１５％ｗ／ｖ）または；
（ｉｉｉ）塩化セチルピリジニウム：ヘキサノールの水溶液、好ましくは１〜５％（ｗ／ｗ）の、１：１（ｗ／ｗ）の０．２Ｍ  ＮａＣｌ液。
【００１８】
特定標的分子／高分子のサンプルを希釈液晶媒体中のリガンドに加えれば、それ以外第一相関性スペクトルと同一条件の下に第二相関性スペクトルが得られる。共鳴線のスプリッティングの差は、通常の方法により単一または複数のリガンド内の特定核対に割り振られる。「陽性」であるリガンドライブラリーのメンバーは、それら共鳴線のスプリッティングの変化より同定され、そして同一結合部位に結合し、同一の比較配置を有する「陽性」は全ての核対について比較した時、スプリッティングが同一速度で変化することから同定される。
【００１９】
本発明により完全整合例と等方性例、即ち部分的に整合された例との間にある中間段階の分子を使用する。後者の状態は、分子に僅かに整合度を付与する液晶媒体中に分子を溶解することで誘導される。このようにして残存双極性結合はそれらの最大値に対し比較され、そして数十ヘルツのオーダーでスプリッティングを生じさせる。スプリッティングのスケーリングは、完全整合状態にある核が１ダースより多く存在する場合には実際的に不可能な作業であるスペクトルの解釈を大きく単純化する。
【００２０】
残存双極性結合を使用することは、標的分子へ結合するリガンドが標的分子と同程度の整合を採り、そして加えられた磁場に対し同一配向を採るだろうという実感に基づいている。このことは、その大きさが遙かに小さいことから遙かに小さい整合度を持つであろう溶液中の遊離状態リガンドと対照をなす。さらに、同一結合部位にある標的分子と「天然リガンド」に対するのと類似の様式にて結合するライブラリーのメンバーは、同一または極めて類似した残存双極性結合を示すだろう。結合現象は「天然リガンド」内の原子、または活性を有するライブラリーメンバーの共鳴線スプリッティングの大きさの変化となって表れる。典型的には共鳴ラインはスカラースピン−スピン結合相互作用によっても分割される。この結合の大きさは一定であり、整合度に依存しないことから、残存双極性結合は、整合されていない状態でのスカラースプリッティングの大きさを、部分的に整合した状態での値と比較した時の差として測定することができる。
【００２１】
本発明の実施形態の一つでは、方法はさらにリガンドまたはリガンドライブラリーと特定標的分子の両方、あるいはリガンドまたはリガンドライブラリーのみを、高解像度ＮＭＲ相関スペクトルを作製する前に、ＮＭＲ活性安定型同位元素を用いて同位元素を濃縮するステップを含む。このようなステップは、サンプル単位容積当たりの安定同位元素核数を増やし、これにより感度を向上させるという更なる利点をもたらす。しかし、この追加ステップは同等の高解像度のスペクトルを得る場合には必要なく、それは単に感度をさらに高めるための方法であることが理解されるだろう。
【００２２】
特定標的分子を単独またはリガンドあるいはリガンドライブラリーと共に、同位元素的に濃縮することには、標的分子の整合の範囲と強さに関するパラメータ（整合テンソルの成分）を通常の方法で抽出でき、そして標的分子−リガンド複合体の高解像度三次元構造の構築に役立てることができるという発明にとってさらに別の利点がある。
【００２３】
好ましくは、濃縮ＮＲＭ活性安定同位元素は１３Ｃ、１５Ｎ、３１Ｐまたは２Ｈ、あるいはそのような同位元素もしくはその放射活性同位元素のいずれかの組み合わせによる混合体、またはリガンド中に見出されるその他ＮＭＲ活性安定同位元素もしくはその非安定型同位元素より成る群から選択される。
【００２４】
本発明の別の実施形態では、標的分子は液晶媒体のマトリックスを含む化学種に強く結合されるように生化学的に誘導されるか、本来そのような能力を持っている。特定のタンパク質、例えば膜タンパク質はもともと好適な誘導体をむことが認識される。誘導化は多くの形状で起こり得るものであり、そして本出願の範囲を制限するものではない。しかし好適例には以下のいずれか一つを含まむ。
（ｉ）タンパク質の１またはそれ以上の位置のミリスイル化；
（ｉｉ）過剰発現タンパク質に遺伝子工学により備えられた膜貫通ドメインまたはグリコシルホスファチジルイノシトール膜アンカー、または；
（ｉｉｉ）化学的手段による、液晶媒体上官能基へのタンパク質の共有結合。
【００２５】
この実施形態は標的分子が高度の整合度を採用し、標的細胞と弱く結合する（解離定数＞１０−６モル）リガンドの共鳴線が、残存双極性結合による顕著なスプリッティングを示すようになる別の利点も提供する。
【００２６】
本発明の第二の態様によれば、適当な生物学的活性を有する単一または複数のリガンドを含む治療薬候補を選択するための、リガンドライブラリーのスクリーニングへの使用に関する本発明の第一態様の方法が提供される。
【００２７】
好ましくは、本方法は治療薬候補として同定され、選択された単一または複数のリガンド、またはその誘導体あるいは相同体を、医薬品として受け入れ可能なキャリアーと混合することをさらに含む。
【００２８】
好ましくは、本方法はさらに１またはそれ以上の前記好適特徴を含む。
【００２９】
本発明の第３の態様によれば、ここに記載の方法により単一または複数の作用物質リガンドを同定すること、およびさらに同定された作用物質またはその誘導体あるいは相同体と医薬品として受け入れ可能なキャリアーとを混合することを含む、医薬品組成物の製造方法が提供される。
【００３０】
以下本発明を、例示のみを目的として、図面を参照しながら説明する。
【００３１】
［実施形態の詳細な説明］
前もって秤量された、洗浄済みガラス製セプタムバイアル（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）番号１３８０４）に８４０ｍｌのジヘキサノイルホスファチジルコリン（ＤＨＰＣ）のクロロホルム溶液（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｐ４１４８）を、２５０μｌのハミルトンマイクロシリンジを使って加えた。クロロホルム乾燥窒素ガス気流中に１５分間蒸発させられ、続いて少なくとも２時間凍結乾燥された。このバイアルを再度重量測定し、正確なＤＨＰＣ量を決定した（２２ｍｇ）。この乾燥ＤＨＰＣに７８５μｌの酸化ジューテリウム（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、続いて９５．８ｍｇのジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｐ６３９２）を加え、ＤＨＰＣ：ＤＭＰＣ  １：２．９（モル／モル）の１５％溶液を得た。一度完全に溶解した後、さらに７８５μｌの酸化ジューテリウムを加えて７．５％溶液を得た。この溶液６５０μｌに、それぞれ（３）記載に従い最終濃度０．２８ｍＭおよび０．１４ｍＭに調製された１３Ｃ−濃縮グロボチリアオシルセラミドオリゴサッカライドおよび１５Ｃ−濃縮ラクトースを均等に加えた。１バンド１３Ｃ−１Ｈスプリッティングが観察できるよう、Ｆ２ディメンジョンのブロードバンド１３Ｃデカップリングなしに１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトルを、この溶液に３０８ＫおよびｐＨ７．０で記録した。関連共鳴は図１に太文字で示した。次に合計２．７ｍｇの凍結乾燥大腸菌Ｏ１５７Ｂサブユニット受容体を上記溶液に溶解し、そして第二ＨＳＱＣスペクトルをそれ以外最初と同じ条件の下に記録した。関連共鳴は図１に通常文字で示した。
【００３２】
［文献］
【表１】
2004502132.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、大腸菌Ｏ１５７毒素由来の受容体Ｂサブユニットの非存在下（太線）および存在下（細線）での、ラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）およびグロボトリアオシルセラミドオリゴ糖（Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）混合体の１３Ｃ−１Ｈ異核単一量子相関（ＨＳＱＣ）を説明している。天然リガンドであるＧａｌα１−４Ｇａｌβ−４Ｇｌｃの共鳴のみが、受容体存在下にシフトしている。タンパク質のリガンドでないＧａｌβ１−４Ｇｌｃの共鳴は変化しない。
【国際公開パンフレット】
2004502132.tif 000004
2004502132.tif 000005
2004502132.tif 000006
2004502132.tif 000007
2004502132.tif 000008
2004502132.tif 000009
2004502132.tif 000010
2004502132.tif 000011
2004502132.tif 000012
2004502132.tif 000013
2004502132.tif 000014
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2004502132.tif 000018
2004502132.tif 000019
2004502132.tif 000020
【国際調査報告】
2004502132.tif 000021
2004502132.tif 000022