(57)【要約】本発明は、新規な脂肪酸不飽和化酵素ファミリーのメンバーをコードする単離された核酸分子を提供する。本発明は、不飽和化酵素の核酸分子を含む組換え発現ベクター、発現ベクターが導入された宿主細胞、および長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣＰＵＦＡ）、例えばＤＨＡの大規模生産のための方法も提供する。
2004516017.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群より選択される、単離された核酸分子：
（ａ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７に示したヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（ｂ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；および
（ｃ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然の対立遺伝子バリアントをコードする核酸分子。
【請求項２】
以下からなる群より選択される、単離された核酸分子：
（ａ）配列番号：１、３、５、７のヌクレオチド配列またはそれらの相補物との同一性が少なくとも７０％であるヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（ｂ）配列番号：１、３、５、７のヌクレオチド配列またはそれらの相補物を含む核酸の少なくとも３０ヌクレオチドの断片を含む核酸分子；
（ｃ）配列番号：２、４、６または８のアミノ酸配列との同一性が少なくとも約５０％であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；および
（ｄ）配列番号：２、４、６または８のアミノ酸配列の少なくとも１０個の連続したアミノ酸残基を含む断片である、配列番号：２、４、６または８のアミノ酸配列を含むポリペプチドの断片をコードする核酸分子。
【請求項３】
請求項１または２記載の核酸分子の相補物とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、単離された核酸分子。
【請求項４】
請求項１または２記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項５】
発現ベクターである、請求項４記載のベクター。
【請求項６】
請求項５記載の発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞。
【請求項７】
植物細胞、微生物細胞および動物細胞からなる群より選択される、請求項６記載の宿主細胞。
【請求項８】
植物細胞が、アマ（アマ属（Ｌｉｎｕｍ ｓｐ．））、ナタネ（アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．））、ダイズ（ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ ａｎｄ Ｓｏｊａ ｓｐ．））、ヒマワリ（ヒマワリ属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｓｐ．））、ワタ（ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｓｐ．））、トウモロコシ（ズィー・メイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ））、オリーブ（モクセイ科（Ｏｌｅａ ｓｐ．））、ベニバナ（ベニバナ属（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｓｐ．））、カカオ（テオブロマ・カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ））およびラッカセイ（ラッカセイ属（Ａｒａｃｈｉｓ ｓｐ．））からなる群より選択される脂肪種子作物から得られる細胞である、請求項７記載の宿主細胞。
【請求項９】
微生物細胞が、ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、ピティウム・イレギュラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）、スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）およびクリテコジニウム（Ｃｒｙｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）からなる群より選択される、請求項８記載の宿主細胞。
【請求項１０】
ポリペプチドを産生させるために請求項６記載の宿主細胞を培養する段階を含む、ポリペプチドの生産方法。
【請求項１１】
以下からなる群より選択される、単離されたポリペプチド：
（ａ）配列番号：２、４、６または８の少なくとも１０個の連続したアミノ酸を含む断片である、配列番号：２、４、６または８のアミノ酸配列を含むポリペプチドの断片；
（ｂ）配列番号：１、３、５または７からなる核酸分子の相補物とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドである、配列番号：２、４、６または８のアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然の対立遺伝子バリアント；
（ｃ）配列番号：１、３、５または７のヌクレオチド配列を含む核酸との同一性が少なくとも７０％であるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるポリペプチド；および
（ｄ）配列番号：２、４、６または８のアミノ酸配列との同一性が少なくとも６０％であるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号：２、４、６または８記載のアミノ酸配列を含む、請求項１１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
不飽和脂肪酸の生産方法であって、請求項１または２記載の単離された核酸分子による細胞のトランスフェクションおよび形質転換を行う段階、ならびに不飽和脂肪酸が産生される条件下で細胞を培養または栽培する段階を含む方法。
【請求項１４】
細胞が植物細胞、動物細胞および微生物細胞からなる群より選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
植物が脂肪種子作物から選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
脂肪種子作物が、アマ（アマ属）、ナタネ（アブラナ属）、ダイズ（ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ ａｎｄ Ｓｏｊａ ｓｐ．））、ヒマワリ（ヒマワリ属）、ワタ（ワタ属）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、オリーブ（モクセイ科）、ベニバナ（ベニバナ属）、カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）およびラッカセイ（ラッカセイ属）からなる群より選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
不飽和脂肪酸を回収する段階をさらに含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
不飽和脂肪酸が、ＧＬＡ １８：３（６，９，１２）、ＳＤＡ １８：４（６，９，１２，１５）、ＡＡ ２０：４（５，８，１１，１４）、ＥＰＡ ２０：５（５，８，１１，１４，１７）、ＤＰＡ ２２：５（４，７，１０，１３，１６）およびＤＨＡ ２２：６（４，７，１０，１３，１６，１９）からなる群より選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１９】
不飽和脂肪酸の生産方法であって、少なくとも１つの不飽和化酵素標的分子を含む組成物を、請求項１１または１２記載の少なくとも１つの単離されたポリペプチドと、不飽和脂肪酸が生成される条件下で接触させる段階を含む方法。
【請求項２０】
不飽和脂肪酸を回収する段階をさらに含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
不飽和脂肪酸が、ＧＬＡ １８：３（６，９，１２）、ＳＤＡ １８：４（６，９，１２，１５）、ＡＡ ２０：４（５，８，１１，１４）、ＥＰＡ ２０：５（５，８，１１，１４，１７）、ＤＰＡ ２２：５（４，７，１０，１３，１６）およびＤＨＡ ２２：６（４，７，１０，１３，１６，１９）からなる群より選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
不飽和脂肪酸を産生しうる細胞の作製方法であって、脂肪酸アシル鎖における二重結合の形成を触媒する活性を有する不飽和化酵素をコードする核酸分子である、請求項１または２記載の核酸分子を該細胞に導入する段階を含む方法。
【請求項２３】
細胞が、植物細胞、動物細胞および微生物細胞からなる群より選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
植物細胞が脂肪種子植物由来の細胞である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
脂肪種子植物が、アマ（アマ属）、ナタネ（アブラナ属）、ダイズ（ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ ａｎｄ Ｓｏｊａ ｓｐ．））、ヒマワリ（ヒマワリ属）、ワタ（ワタ属）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、オリーブ（モクセイ科）、ベニバナ（ベニバナ属）、カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）およびラッカセイ（ラッカセイ属）である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
不飽和脂肪酸が、ＧＬＡ １８：３（６，９，１２）、ＳＤＡ １８：４（６，９，１２，１５）、ＡＡ ２０：４（５，８，１１，１４）、ＥＰＡ ２０：５（５，８，１１，１４，１７）、ＤＰＡ ２２：５（４，７，１０，１３，１６）およびＤＨＡ ２２：６（４，７，１０，１３，１６，１９）からなる群より選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
不飽和脂肪酸の生産を調節するための方法であって、不飽和脂肪酸の産生の調節が起こるように請求項６記載の細胞を培養する段階を含む方法。
【請求項２８】
不飽和脂肪酸の産生が増強される、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
不飽和脂肪酸が、ＧＬＡ １８：３（６，９，１２）、ＳＤＡ １８：４（６，９，１２，１５）、ＡＡ ２０：４（５，８，１１，１４）、ＥＰＡ ２０：５（５，８，１１，１４，１７）、ＤＰＡ ２２：５（４，７，１０，１３，１６）およびＤＨＡ ２２：６（４，７，１０，１３，１６，１９）からなる群より選択される、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
産生された不飽和脂肪酸を回収する段階をさらに含む、請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
不飽和脂肪酸の大規模生産のための方法であって、不飽和脂肪酸が産生されるように請求項６記載の細胞を培養する段階を含む方法。
【請求項３２】
不飽和脂肪酸の産生が増強される、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
不飽和脂肪酸が、ＧＬＡ １８：３（６，９，１２）、ＳＤＡ １８：４（６，９，１２，１５）、ＡＡ ２０：４（５，８，１１，１４）、ＥＰＡ ２０：５（５，８，１１，１４，１７）、ＤＰＡ ２２：５（４，７，１０，１３，１６）およびＤＨＡ ２２：６（４，７，１０，１３，１６，１９）からなる群より選択される、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
産生された不飽和脂肪酸を回収する段階をさらに含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３５】
請求項１１または１２記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項３６】
請求項１３記載の方法によって生産されたポリペプチドを含む組成物。
【請求項３７】
請求項１９記載の方法によって生産されたポリペプチドを含む組成物。
【請求項３８】
請求項２２記載の方法によって作製された細胞を含む組成物。
【請求項３９】
動物飼料中に用いられる、請求項３５記載の組成物。
【請求項４０】
動物飼料中に用いられる、請求項３６記載の組成物。
【請求項４１】
栄養補助食品として用いられる、請求項３６記載の組成物。
【請求項４２】
ヒトまたは動物の食事を補うための方法であって、請求項３５記載の組成物を投与する段階を含む方法。
【請求項４３】
障害を有する患者の治療方法であって、患者が治療されるように請求項３５記載の組成物を投与する段階を含む方法。
【請求項４４】
障害が、ストレス、糖尿病、癌、炎症性疾患および心血管疾患からなる群より選択される、請求項４３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０００年９月２８日に提出された米国特許仮出願第６０／２３６，３０３号、および２００１年６月１２日に提出された米国特許仮出願第６０／２９７，５６２号に対する優先権を主張するものであり、それらのすべての内容は全体が参照として本明細書に組み入れられる。それらに引用されたすべての参考文献のすべての内容も明示的に参照として組み入れられ、本出願の一部であることを意図している。
【０００２】
発明の背景
脂肪酸は長鎖炭化水素側基を有するカルボン酸であり、多くの生物プロセスに根本的な役割を果たしている。脂肪酸は自然下で遊離していることは稀であり、実際には脂質の主成分としてエステル化されている。脂質／脂肪酸はエネルギー源であり（例えば、β酸化）、生物的または生化学的な情報を処理するために不可欠な細胞膜と一体化した構成要素でもある。
【０００３】
脂肪酸は飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸の２群に分けることができ、後者はシス配置した１つまたは複数の炭素二重結合を含む。不飽和脂肪酸は、非ヘム鉄酵素のクラスに属する末端不飽和化酵素によって生成される。これらの酵素のそれぞれは、他の２つのタンパク質、すなわちシトクロムｂ５およびＮＡＤＨシトクロムｂ５レダクターゼを含む電子伝達系の部分である。特に、この種の酵素は脂肪酸分子の炭素原子間の二重結合の形成を触媒する。ヒトおよび他の哺乳動物では、不飽和脂肪酸に特定の二重結合を形成するために必要なこれらの不飽和化酵素の範囲が限られている。このため、ヒトはある種の脂肪酸を食物から摂取する必要がある。このような必須脂肪酸には、例えば、リノール酸（Ｃ１８：２）；リノレン酸（Ｃ１８：３）、アラキドン酸（Ｃ２０：４）がある。これに対して、昆虫および植物は、はるかに広範囲にわたる不飽和脂肪酸およびその誘導体を合成することができる。
【０００４】
ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６（４，７，１０，１３，１６，１９））などの長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣＰＵＦＡ）は、哺乳動物のさまざまな組織およびオルガネラ（神経、網膜、脳および免疫細胞）の細胞膜に不可欠な成分である。例えば、脳のリン脂質では脂肪酸の３０％以上が２２：６（ｎ−３）および２０：４（ｎ−６）である（Ｃｒａｗｆｏｒｄ， Ｍ．Ａ．ら（１９９７）Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｎｕｔｒ． ６６：１０３２Ｓ〜１０４１Ｓ）。網膜では、ＤＨＡが、光受容細胞の感光部分である桿状体細胞外節の全脂肪酸の６０％以上を占めている（Ｇｉｕｓｔｏ， Ｎ．Ｍ．ら（２０００）Ｐｒｏｇ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． ３９：３１５〜３９１）。臨床試験により、ＤＨＡは乳児における脳の成長および発達、ならびに成人における正常な脳機能の維持に不可欠であることが示されている（Ｍａｒｔｉｎｅｔｚ， Ｍ．（１９９２）Ｊ． Ｐｅｄｉａｔｒ． １２０：Ｓ１２９〜Ｓ１３８）。ＤＨＡはシグナル伝達過程に関与する光受容器の機能、ロドプシン活性化、ならびに桿体および錐体の発生にも大きな影響を及ぼす（Ｇｉｕｓｔｏ， Ｎ．Ｍ．ら（２０００）Ｐｒｏｇ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． ３９：３１５〜３９１）。加えて、高血圧、関節炎、アテローム性動脈硬化、抑うつ症、血栓症および癌などの疾患に対してＤＨＡに何らかの好ましい効果があることもわかっている（Ｈｏｒｒｏｃｋｓ， Ｌ．Ａ．およびＹｅｏ， Ｙ．Ｋ．（１９９９）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｓ． ４０：２１１〜２１５）。したがって、脂肪酸が食事によって適切に供給されることが、ヒトが健康を維持するには重要である。特に乳児、若齢小児および高齢者は、これらの脂肪酸を体内で効率的に合成することができず、食物によって補う必要があるため、これらを食事から十分に摂取することが重要である（Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ａ．Ａ．（１９９９）Ｌｉｐｉｄｓ ３４：Ｓ１〜Ｓ３）。
【０００５】
ＤＨＡは、メチル末端に最も近い二重結合の位置によれば、ｎ−３系の脂肪酸である。これは、不飽和化および伸長の段階が交互に生じることによって合成される。ＤＨＡの生合成は１８：３（９，１２，１５）に始まり、Δ６不飽和化によって１８：４（６，９，１２，１５）となった後に伸長によって２０：４（８，１１，１４，１７）となり、さらにΔ５不飽和化によって２０：５（５，８，１１，１４，１７）となる。この点以降の生合成に関しては若干の議論がある。従来の見解は、２０：５（５，８，１１，１４，１７）が伸長して２２：５（７，１０，１３，１６，１９）となった後に、最終的なΔ４不飽和化によって２２：６（４，７，１０，１３，１６，１９）となるというものである（Ｈｏｒｒｏｂｉｎ， Ｄ．Ｆ．（１９９２）Ｐｒｏｇ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． ３１：１６３〜１９４）。しかし、シュプレッヒャー（Ｓｐｒｅｃｈｅｒ）らは最近、Δ４不飽和化酵素は関係せず、ペルオキシソーム内での限定的なβ酸化により２回連続して伸長し、Δ６不飽和化および二炭素短縮が伴ったＤＨＡ生合成の別経路を提唱している（Ｓｐｒｅｃｈｅｒ， Ｈ．ら（１９９５）Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． ３６：２４７１〜２４７７；Ｓｐｒｅｃｈｅｒ， Ｈ．ら（１９９９）Ｌｉｐｉｄｓ ３４：Ｓ１５３〜Ｓ１５６）。
【０００６】
ＤＨＡの生成は、それがヒトの健康に対して有益な効果を及ぼすため重要である。現在、ＤＨＡの主な源は魚類および藻類である。魚油はこの脂肪酸の主要かつ伝統的な源であるが、これは販売される時点までに通常は酸化されている。さらに、魚油の供給は変動性が大きい上にその原料が水産資源の減少に伴って危険に晒されており、一方、藻類原料は収穫量が少なく抽出コストが高いために高価である。
【０００７】
ＥＰＡおよびＡＡはいずれもΔ５必須脂肪酸である。これらはヒトおよび動物にとって独特な種類の食物および飼料成分を構成している。ＥＰＡはｎ−３系に属し、アシル鎖に５つの二重結合があり、海産物に認められるほか、北大西洋産の油分の多い魚類に豊富に存在する。ＡＡはｎ−６系に属し、４つの二重結合がある。ω−３位に二重結合がないため、ＡＡはＥＰＡにみられるものとは異なる性質を有する。ＡＡから生成されるエイコサノイドには強い炎症作用および血小板凝集作用があるが、一方、ＥＰＡに由来するものには抗炎症性および血小板凝集抑制作用がある。ＡＡは肉、魚および卵などのいくつかの食物から得られるが、その濃度は低い。
【０００８】
γ−リノレン酸（ＧＬＡ）は、哺乳動物に認められるもう１つの必須脂肪酸である。ＧＬＡは超長鎖ｎ−６脂肪酸および種々の活性分子の代謝中間体である。哺乳動物では、長鎖多価不飽和脂肪酸の形成はΔ６不飽和化が律速段階である。加齢、ストレス、糖尿病、湿疹およびいくつかの感染症などの多くの生理的および病的な状態で、Δ６不飽和化の段階が抑制されていることが示されている。加えて、ＧＬＡは酸化およびある種の疾患、例えば癌または炎症に伴う急速な細胞分裂によって容易に代謝される。このため、ＧＬＡの食事補給によってこれらの疾患のリスクを低下させることができる。臨床試験により、ＧＬＡの食事補給がアトピー性湿疹、月経前症候群、糖尿病、高コレステロール血症、ならびに炎症性疾患および心血管疾患などのいくつかの病的状態の治療に有効なことが示されている。
【０００９】
ＧＬＡの主な源は、サクラソウ（Ｏｅｎｏｔｈｅｒａ ｂｉｅｎｎｉｓ）、ルリチシャ（Ｂｏｒａｇｏ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｌ．）、クロフサスグリ（Ｒｉｂｅｓ ｎｉｇｒｕｍ）などの植物、ならびにモルティエラ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｓｐ．）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ ｓｐ．）およびシアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）などの微生物からの油である。しかし、これらのＧＬＡ源は、入手しやすさの変動の大きさおよび抽出工程に伴うコストのため、食事補給のためには理想的でない。
【００１０】
発明の概要
脂肪酸の生合成は植物および微生物の主な活動である。しかし、ヒトが必須脂肪酸、例えば、長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣＰＵＦＡ）を合成する能力は限られている。バイオテクノロジーは長い間、植物および微生物における脂肪酸産生プロセスを操作するための効率的な手法と考えられてきた。これはコスト効果が高く再生可能であり、ほとんど副作用を伴わない。そこで、特殊な脂肪酸および医薬用ポリペプチドを含むさまざまな化合物の、植物、動物および微生物細胞の操作による生産を目的として、膨大な産業的取り組みがなされている。このため、バイオテクノロジーは、不飽和脂肪酸、特にＬＣＰＵＦＡを、これらの脂肪酸から最大の治療的価値が得られるような安全でコスト効果の高い様式で生産するために興味深い経路である。
【００１１】
本発明は、少なくとも一部には、新規な不飽和化酵素をコードする核酸分子のファミリーの発見に基づく。特に、本発明者らは、長鎖多価不飽和脂肪酸ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸、２２：６、ｎ−３）およびＤＰＡ（ドコサペンタエン酸、２２：５、ｎ−６）の生合成に関与するＦａｄ４（Δ４不飽和化酵素）、Ｆａｄ５およびＦａｄ５−２（Δ５不飽和化酵素）ならびにＦａｄ６（Δ６不飽和化酵素）を同定した；より詳細には、Ｆａｄ４不飽和化酵素は２２：５（ｎ−３）および２２：４（ｎ−６）から結果的にＤＨＡおよびＤＰＡを生じさせる；Ｆａｄ５およびＦａｄ５−２不飽和化酵素は２０：４（ｎ−３）および２０：３（ｎ６）から結果的にＥＰＡおよびＡＡを生じさせる；Ｆａｄ６不飽和化酵素は１８：２（ｎ−６）および１８：３（ｎ−３）から結果的にＧＬＡ（γ−リノレン酸）およびＳＤＡ（ステアリドン酸）を生じさせる。
【００１２】
１つの態様において、本発明は、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７に示したヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を特徴とする。もう１つの態様において、本発明は、配列番号：２、４、６または８に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子を特徴とする。
【００１３】
さらに他の態様において、本発明は、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７に示したヌクレオチド配列と実質的に同一な（例えば、同一性が７０％の）ヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を特徴とする。本発明はさらに、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７に示したヌクレオチド配列の少なくとも３０個の連続したヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を特徴とする。もう１つの態様において、本発明は、配列番号：２、４、６または８に示したアミノ酸配列と実質的に同一な（例えば、同一性が５０％の）アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子を特徴とする。また、配列番号：２、４、６または８に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドの対立遺伝子バリアント（ａｌｌｅｌｉｃ ｖａｒｉａｎｔ）をコードする核酸分子も特徴とする。完全長ポリペプチドをコードする単離された核酸分子に加えて、本発明は、本発明の完全長ポリペプチドの断片、例えば生物活性断片（例えば、配列番号：２、４、６または８のアミノ酸配列の少なくとも１０個の連続したアミノ酸残基を含む断片）をコードする核酸分子も特徴とする。さらに他の態様において、本発明は、本明細書に記載の単離された核酸分子と相補的な、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、核酸分子も特徴とする。
【００１４】
１つの関連した局面において、本発明は、本明細書に記載の単離された核酸分子（例えば、不飽和化酵素をコードする核酸分子）を含むベクターを提供する。また、このようなベクターを含む宿主細胞（例えば、不飽和化酵素の核酸分子およびポリペプチドの生産に適したベクターを含む宿主細胞）も特徴とする。
【００１５】
もう１つの局面において、本発明は、単離された不飽和化酵素ポリペプチドおよび／またはその生物活性断片を特徴とする。範例となる態様は、配列番号：２、４、６または８に示したアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号：２、４、６または８に示したアミノ酸配列との同一性が少なくとも５０％であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７に示したヌクレオチド配列との同一性が少なくとも７０％であるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドを特徴とする。また、本明細書に記載の完全長ポリペプチドの断片（例えば、配列番号：２、４、６または８に示した配列の少なくとも１０個の連続したアミノ酸残基を含む断片）、さらには配列番号：２、４、６または８に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドの対立遺伝子バリアントも特徴とする。
【００１６】
１つの態様において、不飽和化酵素ポリペプチドまたはその断片は、不飽和化酵素活性を有する。もう１つの態様において、不飽和化酵素ポリペプチドまたはその断片は、Ｎ末端ヘム結合モチーフ、例えば、前端（ｆｒｏｎｔ−ｅｎｄ）不飽和化酵素に認められるシトクロムｂ５様ドメインを有する。もう１つの態様において、不飽和化酵素ポリペプチドまたはその断片は、すべてのミクロソーム不飽和化酵素に認められる保存的ヒスチジンモチーフを少なくとも２つ、好ましくは約３つ有し、選択的には不飽和化酵素活性を有する。１つの好ましい態様において、不飽和化酵素ポリペプチドまたはその断片は、約３つのヒスチジンモチーフを有する。
【００１７】
不飽和化酵素遺伝子を含む構築物は、ＤＨＡ、ＥＰＡ、ＡＡ、ＳＤＡおよびＧＬＡなどのＬＣＰＵＦＡを産生しうる細胞を作製するために、植物、動物および微生物を含む任意の発現系で用いることができる。本発明の不飽和化酵素を発現させるために用いられる植物の例には、特に、脂肪種子作物、例えばアマ（アマ属）、ナタネ（アブラナ属）、ダイズ（ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ ａｎｄ Ｓｏｊａ ｓｐ．））、ヒマワリ（ヒマワリ属）、ワタ（ワタ属）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、オリーブ（モクセイ科）、ベニバナ（ベニバナ属）、カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）およびラッカセイ（ラッカセイ属）などからの植物体および植物種子が含まれる。
【００１８】
１つの関連した局面において、本発明は、ＬＣＰＵＦＡまたは他の所要の不飽和脂肪酸化合物が産生されるように不飽和脂肪酸の生合成経路が操作された細胞、例えば、植物細胞、動物細胞および／または微生物細胞を用いて、不飽和脂肪酸、例えば、ＬＣＰＵＦＡ、および不飽和脂肪酸の生合成経路の他の重要な化合物を生産する、新たな改善された方法を提供する。
【００１９】
本発明の新たな改善された方法は、不飽和脂肪酸（例えば、ＤＨＡ）が産生される（例えば、より高いレベルで産生される）ように操作された、不飽和脂肪酸生合成経路の少なくとも１つの脂肪酸不飽和化酵素を有する細胞における、不飽和脂肪酸の生産方法を含む。例えば、本発明は、不飽和脂肪酸、例えばＬＣＰＵＦＡ、例えばＤＨＡが産生されるように、少なくとも１つの単離された不飽和化酵素の核酸分子、例えば、上記のＦａｄ４、Ｆａｄ５、Ｆａｄ５−２および／もしくはＦａｄ６またはそれらの一部を含む細胞における、不飽和脂肪酸（例えば、ＤＨＡ）の生産方法を特徴とする。このような方法はさらに、ＬＣＰＵＦＡを回収する段階を含む。
【００２０】
もう１つの態様において、本発明は、不飽和脂肪酸、例えばＬＣＰＵＦＡ、例えばＤＨＡの生産方法であって、本明細書に定義した少なくとも１つの不飽和化酵素標的分子を、少なくとも１つの単離された不飽和化酵素ポリペプチド、例えば、上記のＦａｄ４、Ｆａｄ５、Ｆａｄ５−２および／もしくはＦａｄ６またはそれらの一部と、不飽和脂肪酸、例えばＬＣＰＵＦＡ、例えばＤＨＡが産生される条件下で接触させることを含む方法を提供する。このような方法はさらに、ＬＣＰＵＦＡを回収する段階を含む。
【００２１】
上記の核酸、タンパク質およびベクターは、本発明の方法において特に有用である。特に、本発明は、不飽和脂肪酸の産生（例えば、ＤＨＡの産生）を増大させる方法であって、不飽和化酵素の核酸、例えばＦａｄ４、Ｆａｄ５、Ｆａｄ５−２および／またはＦａｄ６を含む組換え植物、動物および／または微生物を、脂肪酸の産生が増大する条件下で培養することを含む方法を特徴とする。
【００２２】
もう１つの態様において、本発明は、不飽和脂肪酸を産生しうる植物の作製方法を特徴とする。このような方法は、細胞、例えば植物細胞に、脂肪酸分子における二重結合の形成を触媒する活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸分子を導入することを含む。
【００２３】
もう１つの態様において、本発明は、脂肪酸の産生を調節するための方法であって、脂肪酸の産生の調節が起こるように、二重結合の形成を触媒する活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸分子を含む細胞を培養することを含む方法を特徴とする。
【００２４】
もう１つの態様において、本発明は、本明細書に記載の不飽和脂肪酸、核酸またはポリペプチドを含む組成物を含む。本発明の組成物は、この種の脂肪酸を産生しうる上記のような細胞、および選択的には、薬学的に許容される担体も含みうる。
【００２５】
もう１つの態様において、本発明の組成物は、栄養補助食品（ｄｉｅｔａｒｙ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）として、例えば動物飼料中に、または機能性食品（ｎｅｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）として用いられる。本発明の組成物は障害を有する患者を治療するためにも用いられ、これは患者が治療されるように組成物を投与することを含む。このような方法に含まれる障害には、例えば、ストレス、糖尿病、癌、炎症性疾患および心血管疾患が含まれる。
【００２６】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲によって明らかになると考えられる。
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも一部には、本明細書において「不飽和化酵素（ｄｅｓａｔｕｒａｓｅｓ）」または「不飽和化酵素（ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）」核酸分子およびタンパク質分子（例えば、Ｆａｄ４、Ｆａｄ５、Ｆａｄ５−２およびＦａｄ６）と互換的に称する、新規な脂肪酸不飽和化酵素ファミリーのメンバーの発見に基づく。これらの新規分子は脂肪酸不飽和化酵素ファミリーに属し、ＬＣＰＵＦＡを産生する生物、例えば、ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、ピティウム・イレギュラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）、スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）およびクリテコジニウム（Ｃｒｙｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）において発現される。
【００２８】
本明細書で用いる「脂肪酸」という用語は当技術分野で知られており、これには長鎖炭化水素を主体とするカルボン酸が含まれる。脂肪酸は、グリセリドを含む多くの脂質の構成要素である。よくみられる天然の脂肪酸の大部分は、偶数個の炭素原子（１６または１８）を有するモノカルボン酸であり、飽和型のものも不飽和型のものもある。「不飽和」脂肪酸は、炭素原子間にシス二重結合を含む。本発明に含まれる不飽和脂肪酸には、例えば、ＤＨＡ、ＧＬＡおよびＳＤＡが含まれる。「多価不飽和」脂肪酸は、複数の二重結合を含み、二重結合がメチレンで中断された系（−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−）として配置している。
【００２９】
本明細書では脂肪酸を、コロンの前の数字が脂肪酸中の炭素原子の数を示し、コロンの後の数字が、存在する二重結合の数を示す番号方式によって記載する。不飽和脂肪酸の場合には、この後の括弧内に二重結合の位置を示す数字が入る。括弧内の各数字は、二重結合によって連結した２つの炭素元素のうち番号の少ない方のことである。例えば、オレイン酸は１８：１（９）と記載でき、リノール酸は１８：２（９、１２）と記載できるが、これは１８個の炭素があって、それぞれ炭素９に二重結合が１つ、炭素９および１２の２箇所に二重結合があることを意味する。
【００３０】
不飽和脂肪酸の生成、すなわち不飽和脂肪酸の生合成経路における調節段階は、膜会合型脂肪酸不飽和化酵素、例えばＦａｄ４、Ｆａｄ５、Ｆａｄ５−２および／またはＦａｄ６によって触媒される。特に、この種の酵素は脂肪酸分子の炭素原子間の二重結合の形成を触媒する。本明細書で用いる「不飽和脂肪酸の生合成経路」という用語は、インビボまたはインビトロでの不飽和脂肪酸の合成につながる一連の化学反応のことを指す。このような経路は、不飽和脂肪酸が生成され、最終的には長鎖多価不飽和脂肪酸が生成される、一連の不飽和化および伸長の段階を含む。このような不飽和脂肪酸には、ＧＬＡ １８：３（６，９，１２）、ＳＤＡ １８：４（６，９，１２，１５）、ＡＡ ２０：４（５，８，１１，１４）、ＥＰＡ ２０：５（５，８，１１，１４，１７）、ＤＰＡ ２２：５（４，７，１０，１３，１６）およびＤＨＡ ２２：６（４，７，１０，１３，１６，１９）が含まれうる。
【００３１】
不飽和化酵素は、ヘム結合モチーフおよび／または約３つの保存的ヒスチジンモチーフを含みうるが、さらに別のドメインが存在してもよい。脂肪酸不飽和化酵素ファミリーのメンバーは、飽和脂肪酸を、不飽和脂肪酸、例えば、哺乳動物のさまざまな組織およびオルガネラ（神経、網膜、脳および免疫細胞）の細胞膜の成分である長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣＰＵＦＡ）に変換する。ＬＣＰＵＦＡの例には、例えばドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６（４，７，１０，１３，１６，１９））が含まれる。臨床試験により、ＤＨＡは乳児における脳の成長および発達、ならびに成人における正常な脳機能の維持に不可欠であることが示されている（Ｍａｒｔｉｎｅｔｚ， Ｍ．（１９９２）Ｊ． Ｐｅｄｉａｔｒ． １２０：Ｓ１２９〜Ｓ１３８）。ＤＨＡはシグナル伝達過程に関与する光受容器の機能、ロドプシン活性化、ならびに桿体および錐体の発生にも影響を及ぼす（Ｇｉｕｓｔｏ， Ｎ．Ｍ．ら（２０００）Ｐｒｏｇ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． ３９：３１５〜３９１）。加えて、高血圧、関節炎、アテローム性動脈硬化、抑うつ症、血栓症および癌などの疾患に対してＤＨＡに何らかの好ましい効果があることもわかっている（Ｈｏｒｒｏｃｋｓ， Ｌ．Ａ．およびＹｅｏ， Ｙ．Ｋ．（１９９９）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｓ． ４０：２１１〜２１５）。このため、不飽和化酵素分子を用いて、成長、増殖または分化の調節異常を特徴とする疾患の治療に有用なＬＣＰＵＦＡを生産することが可能である。このような疾患には、癌、例えば上皮癌、肉腫または白血病；腫瘍血管新生および転移；骨異形成；肝疾患；骨髄異形成症候群；ならびに造血疾患および／または骨髄増殖性疾患が含まれる。血管新生と関係し、このため不飽和化酵素と関連のある疾患である他の疾患には、遺伝性出血性末梢血管拡張症１型、進行性骨化性線維異形成症、特発性間質性肺線維症およびクリッペル・トレノネー・ウェーバー症候群が含まれる。
【００３２】
「ファミリー」という用語は、本発明のタンパク質および核酸分子を言及する場合、共通の構造ドメインまたはモチーフを有し、本明細書に定義した十分なアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の相同性を有する、２つまたはそれ以上のタンパク質または核酸分子のことを意味するものとする。このようなファミリーのメンバーは天然のものでも天然でないものでもよく、同一の種に由来するものでも異なる種に由来するものでもよい。例えば、ファミリーは、ヒト由来の第１の蛋白質のほかにヒト由来の明らかに異なる第２の蛋白質を含むことができ、または非ヒト由来の相同体を含むこともできる。ファミリーのメンバーは共通の機能的特徴も有しうる。
【００３３】
例えば、本発明の不飽和化酵素タンパク質のファミリーは、シトクロムｂ５ヘム結合モチーフを１つ含む。本明細書で用いる「ヘム結合モチーフ」とは、前端（ｆｒｏｎｔ−ｅｎｄ）不飽和化酵素に認められるシトクロムｂ５様ドメインのＮ末端に伸びた部分のことを指す。
【００３４】
もう１つの態様において、不飽和化酵素ファミリーのタンパク質のメンバーは、タンパク質中に「ヒスチジンモチーフ」、好ましくは、約３つまたは４つのヒスチジンモチーフを含む。本明細書で用いる「ヒスチジンモチーフ」という用語は、少なくとも約２つのヒスチジンアミノ酸残基、好ましくは約３つまたは４つのヒスチジンアミノ酸残基を有するタンパク質ドメインのことを指し、これはすべてのミクロソーム不飽和化酵素において第３の保存的ヒスチジンモチーフとして認められることが一般的である。
【００３５】
シトクロムｂ５ヘム結合モチーフおよびヒスチジンモチーフの例には、図３および６に示した、配列番号：２のアミノ酸残基４１〜４４、１８２〜１８６、２１６〜２２３および４５３〜４６２、配列番号：５のアミノ酸残基４０〜４３、１７１〜１７５、２０７〜２１３および３７５〜３８４、配列番号：８のアミノ酸残基４０〜４５、１７１〜１７６、２０８〜２１３および３９５〜４００、ならびに配列番号：１１のアミノ酸残基４２〜４７、１７８〜１８３、２１５〜２２０および４００〜４０５が含まれる。
【００３６】
単離された本発明の不飽和化酵素タンパク質は、配列番号：２、４、６もしくは８のアミノ酸配列と十分に相同なアミノ酸配列を有する、または配列番号：１、３、５、７もしくは９と十分に相同なヌクレオチド配列によってコードされる。本明細書で用いる「十分に相同な」という用語は、第１および第２のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列が共通の構造ドメインもしくはモチーフおよび／または共通の機能的活性を有するような形で、第２のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と十分なまたは最小限の数の同一または同等なアミノ酸残基（例えば、類似した側鎖をもつアミノ酸残基）またはヌクレオチドを含む、第１のアミノ酸またはヌクレオチド配列のことを指す。例えば、ドメインのアミノ酸配列全体にわたって少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の相同性または同一性を有する共通の構造ドメインを有し、少なくとも１つ、好ましくは２つの構造ドメインまたはモチーフを含むアミノ酸配列またはヌクレオチド配列は、本明細書において十分に相同であると定義される。さらに、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の相同性または同一性を有し、共通の機能的活性を有するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列も、本明細書において十分に相同であると定義される。
【００３７】
１つの好ましい態様において、不飽和化酵素タンパク質は、以下のドメインまたはモチーフ：ヘム結合モチーフおよび／またはヒスチジンモチーフ、の少なくとも１つまたは複数を含み、配列番号：２、４、６または８のアミノ酸配列との相同性または同一性が少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上であるアミノ酸配列を有する。さらにもう１つの好ましい態様において、不飽和化酵素タンパク質は、以下のドメイン：ヘム結合モチーフおよび／またはヒスチジンモチーフ、の少なくとも１つまたは複数を含み、配列番号：１、３、５または７のヌクレオチド配列を含む核酸分子の相補物とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる。もう１つの好ましい態様において、不飽和化酵素タンパク質は、少なくとも１つのヘム結合モチーフおよび／または少なくとも約３つのヒスチジンモチーフを含み、不飽和化酵素活性を有する。
【００３８】
本明細書で互換的に用いられる「不飽和化酵素活性」「不飽和化酵素の生物活性」または「不飽和化酵素の機能的活性」には、不飽和化酵素タンパク質、ポリペプチドまたは核酸分子により、不飽和化酵素反応性細胞または不飽和化酵素の基質に対して発揮または媒介される、標準的な技法に従ってインビボまたはインビトロで決定される活性が含まれる。１つの態様において、不飽和化酵素活性は、不飽和化酵素標的分子との会合などの直接的活性である。本明細書で用いる「標的分子」または「結合パートナー」とは、不飽和化酵素タンパク質が自然下で結合または相互作用して不飽和化酵素を介した機能が実現されるような分子、例えば、不飽和脂肪酸の合成に関与する中間体脂肪酸などの分子のことである。不飽和化酵素の直接的活性には、不飽和脂肪酸分子を生成させる、脂肪酸分子の炭素原子間の二重結合の形成も含まれる。
【００３９】
単離されたヤブレツボカビ属Δ４不飽和化酵素Ｆａｄ４のｃＤＮＡのヌクレオチド配列、およびＦａｄ４ ｃＤＮＡによってコードされる予想されるアミノ酸配列を、図１ならびにそれぞれ配列番号：１および２に示している。ヤブレツボカビ属Ｆａｄ４遺伝子（オープンリーディングフレーム）は約１５６０ヌクレオチド長であり、分子量が約５９．１ｋＤで長さが約５１９アミノ酸残基のタンパク質をコードする。
【００４０】
ヤブレツボカビ属Δ５不飽和化酵素Ｆａｄ５のｃＤＮＡヌクレオチド配列、およびＦａｄ５ ｃＤＮＡによってコードされる予想されるアミノ酸配列を、図２ならびにそれぞれ配列番号：３および４に示している。ヤブレツボカビ属Ｆａｄ５遺伝子は約１３２０ヌクレオチド長であり、分子量が約４９．８ｋＤで長さが約４３９アミノ酸残基のタンパク質をコードする。
【００４１】
ピティウム・イレギュラレΔ５不飽和化酵素Ｆａｄ５−２のｃＤＮＡのヌクレオチド配列、およびＦａｄ５−２ ｃＤＮＡによってコードされる予想されるアミノ酸配列を、図４ならびにそれぞれ配列番号５および６に示している。ピティウム・イレギュラレＦａｄ５−２遺伝子は約１３７１ヌクレオチド長であり、約４５６アミノ酸残基長のタンパク質をコードする。
【００４２】
ピティウム・イレギュラレΔ６不飽和化酵素Ｆａｄ６のｃＤＮＡのヌクレオチド配列、およびＦａｄ６ ｃＤＮＡによってコードされる予想されるアミノ酸配列を、図５ならびにそれぞれ配列番号：７および８に示している。ピティウム・イレギュラレＦａｄ６遺伝子は約１３８３ヌクレオチド長であり、約４６０アミノ酸残基長のタンパク質をコードする。
【００４３】
本発明のさまざまな局面について、以下の小節でさらに詳細に述べる。
【００４４】
Ｉ．単離された核酸分子
本発明の１つの局面は、不飽和化酵素タンパク質またはその生物活性断片をコードする単離された核酸分子、さらには不飽和化酵素をコードする核酸分子（例えば、不飽和化酵素ｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いるのに十分な核酸断片、および不飽和化酵素核酸分子の増幅または変異のためのＰＣＲプライマーとして用いられる断片に関する。本発明で用いる「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、ならびにヌクレオチド類似体を用いて作製されたＤＮＡまたはＲＮＡ類似体を含むものとする。核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００４５】
「単離された核酸分子」という用語には、その画分の天然の源に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子が含まれる。例えば、ゲノムＤＮＡに関して、「単離された」という用語は、そのゲノムＤＮＡと自然下で付随している染色体から分離された核酸分子を含む。「単離された」核酸は、その核酸分子の由来である生物のゲノムＤＮＡ中でその核酸分子と自然下で隣接している配列（すなわち、その核酸の５’および３’末端に位置する配列）を含まないことが好ましい。例えば、種々の態様において、単離された不飽和化酵素核酸分子が含みうるのは、その核酸の由来である細胞のゲノムＤＮＡ中でその核酸と自然下で隣接するヌクレオチド配列の約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満である。さらに、ｃＤＮＡ分子などの「単離された」核酸分子は、組換え法によって作製された場合にはその他の細胞材料もしくは培地を実質的に含まず、または化学合成された場合には前駆化学物質もしくはその他の化学物質を実質的に含まないと考えられる。
【００４６】
本発明の核酸分子、例えば、配列番号：１、３、５、７のヌクレオチド配列を有する核酸分子またはそれらの一部は、標準的な分子生物学の技法および本明細書で提供する配列情報を用いて単離することができる。本明細書に記載する核酸配列の全体または一部をハイブリダイゼーションプローブとして用いることにより、不飽和化酵素の核酸分子を、標準的なハイブリダイゼーション法およびクローニング法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９に記載されたもの）を用いて単離することができる。
【００４７】
さらに、配列番号：１、３、５または７のすべてまたは一部を含む核酸分子を、配列番号：１、３、５または７の配列に基づいて設計した合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単離することもできる。
【００４８】
本発明の核酸は、標準的なＰＣＲ増幅法に従い、テンプレートとしてのｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ、および適切なオリヌクレオチドプライマーを用いて増幅しうる。このようにして増幅された核酸は、適切なベクター中にクローニングして、ＤＮＡシークエンシングによって特徴を分析することが可能である。さらに、例えば自動ＤＮＡ合成装置を用いるなどの標準的な合成法により、不飽和化酵素ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成することもできる。
【００４９】
もう１つの態様において、核酸分子は、配列番号：１、３、５または７に示したヌクレオチド配列からなる。
【００５０】
さらにもう１つの態様において、本発明の単離された核酸分子には、配列番号：１、３、５もしくは７に示したヌクレオチド配列またはこれらのいずれかのヌクレオチド配列の一部の相補物が含まれる。配列番号：１、３、５もしくは７に示したヌクレオチド配列に対して相補的な核酸分子とは、配列番号：１、３、５もしくは７に示したヌクレオチド配列とハイブリダイズし、それによって安定な二重鎖を形成しうる程度に、配列番号：１、３、５もしくは７に示したヌクレオチド配列に対して十分に相補的なもののことである。
【００５１】
さらにもう１つの態様において、本発明の単離された核酸分子には、配列番号：１、３、５もしくは７に示したヌクレオチド配列（例えば、ヌクレオチド配列の全長に対する）またはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの一部もしくは相補物に対する同一性が、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上であるヌクレオチド配列が含まれる。１つの態様において、本発明の核酸分子は、少なくとも（または最大で）５０〜１００、１００〜２５０、２５０〜５００、５００〜７５０、７５０〜１０００、１０００〜１２５０、１２５０〜１５００、１５００〜１７５０、１７５０〜２０００、２０００〜２２５０、２２５０〜２５００、２５００〜２７５０、２７５０〜３０００、３２５０〜３５００、３５００〜３７５０ヌクレオチド長またはそれ以上であって、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号：１、３、５または７の核酸分子の相補物とハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含む。
【００５２】
さらに、本発明の核酸分子は、配列番号：１、３、５または７の核酸分子の一部のみ、例えば、プローブもしくはプライマーとして用いうる断片、または不飽和化酵素タンパク質の一部、例えば不飽和化酵素タンパク質の生物活性部分をコードする断片などを含みうる。不飽和化酵素遺伝子のクローニングによって決定されたヌクレオチド配列により、不飽和化酵素ファミリーの他のメンバーならびに他の種由来の不飽和化酵素相同体の同定および／またはクローニングに用いるために設計されたプローブおよびプライマーの作製が可能となる。プローブ／プライマー（例えば、オリゴヌクレオチド）は一般に、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは一般に、配列番号：１、３、４、６、７、９、１０、１２のセンス配列の、配列番号：１、３、５もしくは７のアンチセンス配列の、または配列番号：１、３、５もしくは７の天然の対立遺伝子バリアントもしくは変異体（ｍｕｔａｎｔ）の、少なくとも約１２または１５個、好ましくは約２０または２５個、より好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５または７５個の連続したヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列の領域を含む。
【００５３】
プローブまたはプライマーの例は、少なくとも（または最大で）１２または１５、２０または２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５ヌクレオチド長またはそれ以上である、および／または、本明細書に記載の単離された核酸分子の連続したヌクレオチドを含む。また、プローブまたはプライマー配列の内部に１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基の違いがある点を除き、本明細書に記載の単離された核酸分子の隣接または連続したヌクレオチドを含むプローブまたはプライマーも、本発明の範囲に含まれる。不飽和化酵素のヌクレオチド配列に基づくプライマーは、同じまたは相同なタンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出する（例えば、特異的に検出する）ために用いることができる。好ましい態様において、プローブはさらに、それに結びついた標識基を含み、例えば標識基は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素補因子などであってよい。もう１つの態様では、プライマーのセットを提供する。例えば、不飽和化酵素配列の選択した領域、例えば、本明細書に記載のドメイン、領域、部位または他の配列を増幅するために用いうる、ＰＣＲにおける使用に適したプライマーのセットを提供する。プライマーは、長さが少なくとも５、１０または５０塩基対であって、１００または２００塩基対未満であるべきである。プライマーは、本明細書に開示する配列または天然バリアントの配列と比較して同一である、または違いが１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基以下であるべきである。このようなプローブは、不飽和化酵素ｍＲＮＡレベルの検出、またはゲノムの不飽和化酵素遺伝子が変異もしくは欠失しているか否かの判定といった、対象からの細胞の試料における不飽和化酵素をコードする核酸のレベルの測定などにより、不飽和化酵素タンパク質を誤発現（ｍｉｓｅｘｐｒｅｓｓ）する細胞または組織を同定するための診断検査キットの一部として用いることができる。
【００５４】
「不飽和化酵素タンパク質の生物活性部分」をコードする核酸断片は、不飽和化酵素の生物活性（不飽和化酵素タンパク質の生物活性は本明細書で説明している）を有するポリペプチドをコードする配列番号：１、３、５または７のヌクレオチド配列の部分を単離し、不飽和化酵素タンパク質のコード部分を発現させて（例えば、インビトロでの組換え発現による）、不飽和化酵素タンパク質のコード部分の活性を評価することによって調製することができる。１つの範例となる態様において、核酸分子は少なくとも５０〜１００、１００〜２５０、２５０〜５００、５００〜７００、７５０〜１０００、１０００〜１２５０、１２５０〜１５００、１５００〜１７５０、１７５０〜２０００、２０００〜２２５０、２２５０〜２５００、２５００〜２７５０、２７５０〜３０００、３２５０〜３５００、３５００〜３７５０ヌクレオチド長またはそれ以上であり、（本明細書に記載の）不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする。
【００５５】
本発明はさらに、遺伝暗号の縮重のために配列番号：１、３、５または７に示したヌクレオチド配列とは異なり、このため配列番号：１、３、５または７に示したヌクレオチド配列によってコードされるものと同じ不飽和化酵素タンパク質をコードする核酸分子も含む。もう１つの態様において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号：２、４、６または８に示したアミノ酸配列との違いが少なくとも１アミノ酸残基であるが５、１０、２０、５０または１００アミノ酸残基は上回らないアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。さらにもう１つの態様において、核酸分子はヒトの不飽和化酵素のアミノ酸配列をコードする。この比較のために整列化が必要な場合には、最大の相同性が得られるように配列を整列化する必要がある。
【００５６】
核酸バリアントは、対立遺伝子バリアント（同じ遺伝子座）、ホモログ（異なる遺伝子）およびオルソログ（異なる生物）などの天然のものでもよく、天然でないものでもよい。非天然型バリアントは、ポリヌクレオチド、細胞または生物体に対して適用されるものを含む変異誘発法によって作製可能である。バリアントはヌクレオチドの置換、欠失、逆位および挿入を含みうる。変異はコード領域および非コード領域の一方にあってもよく、両方にあってもよい。変異によって（コードされると比較して）保存的および非保存的なアミノ酸置換のいずれが生じてもよい。
【００５７】
対立遺伝子バリアントは、例えば、不飽和化酵素タンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらす、集団（例えば、ヒト集団）内のＤＮＡ配列多型に起因する。不飽和化酵素遺伝子におけるこのような遺伝的多型性は、天然の対立遺伝子変異のために集団内の個体間にも存在しうる。
【００５８】
本明細書で用いる「遺伝子」および「組換え遺伝子」という用語は、不飽和化酵素タンパク質、例えば脂肪種子の不飽和化酵素タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、さらに非コード調節配列およびイントロンも含みうる、核酸分子のことを指す。
【００５９】
したがって、１つの態様において、本発明は、配列番号：２、４、６または８のアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然の対立遺伝子バリアントをコードする単離された核酸分子であって、配列番号：１、３、５または７を含む核酸分子の相補物と、例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子を特徴とする。
【００６０】
不飽和化酵素、例えばＦａｄ４、Ｆａｄ５、Ｆａｄ５−２またはＦａｄ６の対立遺伝子バリアントには、機能的および非機能的な不飽和化酵素タンパク質の両方が含まれる。機能的な対立遺伝子バリアントとは、例えば、（ｉ）不飽和化酵素の基質もしくは標的分子（例えば、ＤＨＡなどの脂肪酸）と相互作用する能力；および／または（ｉｉ）不飽和化酵素の基質もしくは標的分子における炭素原子間に二重結合を形成する能力を維持している、不飽和化酵素タンパク質の天然のアミノ酸配列バリアントのことである。本発明の核酸分子およびタンパク質分子によって生成される脂肪酸は、加齢、ストレス、糖尿病、癌、炎症性疾患（例えば、関節炎、湿疹）および心血管疾患などの障害の治療にも有用である。機能的な対立遺伝子バリアントは一般に、配列番号：２、４、６もしくは８の１つもしくは複数のアミノ酸の保存的置換、またはタンパク質の重大でない領域における重大でない残基の置換、欠失もしくは挿入のみを含むと考えられる。
【００６１】
非機能的な対立遺伝子バリアントとは、例えば、（ｉ）不飽和化酵素の基質もしくは標的分子（例えば、１８：４（６，９，１２，１５）などの中間体脂肪酸）と相互作用する能力；および／または（ｉｉ）不飽和化酵素の基質もしくは標的分子における炭素原子間に二重結合を形成する能力をもたない、不飽和化酵素タンパク質、例えばＦａｄ４、Ｆａｄ５、Ｆａｄ５−２またはＦａｄ６の天然のアミノ酸配列バリアントのことである。非機能的な対立遺伝子バリアントは一般に、配列番号：２、４、６もしくは８のアミノ酸配列の非保存的な置換、欠失もしくは挿入もしくは早期切断、またはタンパク質の重大残基もしくは重大領域における置換、挿入もしくは欠失を含むと考えられる。
【００６２】
本発明はさらに、オルソログ（例えば、不飽和化酵素タンパク質のヒトオルソログ）を提供する。ヤブレツボカビ属およびピティウム・イレギュラレの不飽和化酵素タンパク質のオルソログは、他の生物から単離されたタンパク質であり、非ヒト不飽和化酵素タンパク質と同じ、不飽和化酵素の基質または標的分子との結合機構、二重結合形成機構、乳児における脳の成長および発達を調節する機構、成人における正常な脳機能の維持機構、シグナル伝達過程に関与する光受容器の機能に影響を及ぼす能力、ロドプシン活性化に影響を及ぼす能力、桿体および／もしくは錐体の発生機構、ならびに／または細胞の成長および／もしくは増殖を調節する機構を有する。ヤブレツボカビ属およびピティウム・イレギュラレの不飽和化酵素タンパク質のオルソログは、配列番号：２、４、６または８と実質的に相同なアミノ酸配列を含むものとして容易に同定しうる。
【００６３】
さらに、不飽和化酵素ファミリーの他のメンバーをコードし、このため配列番号：１、３、５または７の不飽和化酵素配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子も、本発明の範囲に含まれるものとする。例えば、別の不飽和化酵素ｃＤＮＡを、Ｆａｄ４、Ｆａｄ５、Ｆａｄ５−２またはＦａｄ６のヌクレオチド配列に基づいて同定することができる。さらに、異なる種に由来する不飽和化酵素タンパク質をコードし、このため配列番号：１、３、５または７の不飽和化酵素配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子も、本発明の範囲に含まれるものとする。例えば、スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）またはクリテコジニウム（Ｃｒｙｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）の不飽和化酵素ｃＤＮＡを、Ｆａｄ４、Ｆａｄ５、Ｆａｄ５−２またはＦａｄ６のヌクレオチド配列に基づいて同定しうる。
【００６４】
本発明の不飽和化酵素ｃＤＮＡの天然の対立遺伝子バリアントおよびホモログに対応する核酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標準的なハイブリダイゼーション法に従って本明細書に開示するｃＤＮＡまたはそれらの一部をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、本明細書に開示する不飽和化酵素核酸とのそれらの相同性に基づいて単離することができる。
【００６５】
オルソログ、ホモログおよび対立遺伝子バリアントは、当技術分野で知られた方法を用いて同定可能である（例えば、本発明の単離された核酸分子に対する、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での、ハイブリダイゼーションによる）。１つの態様において、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも１５、２０、２５、３０ヌクレオチド長またはそれ以上であり、配列番号：１、３、５または７のヌクレオチド配列を含む核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。他の態様において、核酸は少なくとも５０〜１００、１００〜２５０、２５０〜５００、５００〜７００、７５０〜１０００、１０００〜１２５０、１２５０〜１５００、１５００〜１７５０、１７５０〜２０００、２０００〜２２５０、２２５０〜２５００、２５００〜２７５０、２７５０〜３０００、３２５０〜３５００、３５００〜３７５０ヌクレオチド長またはそれ以上である。
【００６６】
本明細書で用いる「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、互いに高度の同一性または相同性があるヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズした状態を保つようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する条件を説明することを意図している。好ましくは、条件は互いの同一性が少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％または９０％である配列およびイントロンが互いにハイブリダイズした状態を保つものである。このようなストリンジェントな条件は当業者に周知であり、「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、アウスユーベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．（１９９５）、第２、４および６節に記載がある。このほかのストリンジェントな条件は、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）、第７、９および１１章に記載されている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非制限的な一例は、約６５〜７０℃の４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でハイブリダイゼーション（または、約４２〜５０℃の４×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中でのハイブリダイゼーション）を行い、続いて約６５〜７０℃の１×ＳＳＣ中で１回または複数回の洗浄を行うことを含む。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非制限的な一例は、約６５〜７０℃の１×ＳＳＣ中でハイブリダイゼーション（または、約４２〜５０℃の１×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中でのハイブリダイゼーション）を行い、続いて約６５〜７０℃の０．３×ＳＳＣ中で１回または複数回の洗浄を行うことを含む。ストリンジェンシーを低くしたハイブリダイゼーション条件の好ましい非制限的な一例は、約５０〜６０℃の４×ＳＳＣ中でハイブリダイゼーション（または、約４０〜４５℃の６×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中でのハイブリダイゼーション）を行い、続いて約５０〜６０℃の２×ＳＳＣ中で１回または複数回の洗浄を行うことを含む。上に挙げた値の中間の範囲、例えば、６５〜７０℃または４２〜５０℃でのものも本発明に含まれるものとする。ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４および１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．４である）を、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）の代わりにハイブリダイゼーションバッファーおよび洗浄バッファーに用いることができる；洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後にそれぞれ１５分間行う。５０塩基対未満であると予想されるハイブリッドに関するハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低い必要があり、ここでＴｍは以下の式に従って決定される。長さが１８塩基対未満のハイブリッドに関しては、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の��）である。長さが１８〜４９塩基対のハイブリッドに関しては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、ここでＮはハイブリッド中の塩基の数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーションバッファー中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣの場合の［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。また、膜、例えばニトロセルロースまたはナイロン膜に対する核酸分子の特異的ハイブリダイゼーションを減少させるために、ブロッキング剤（例えば、ＢＳＡまたはサケもしくはニシン精子キャリアーＤＮＡ）、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、ＰＶＰなどを非制限的に含む別の試薬を、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄バッファーに添加してもよいことも当業者は認識していると考えられる。特に、ナイロン膜を用いる場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の別の好ましい非制限的な一例は、約６５℃の０．２５〜０．５Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、７％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーションに続き、６５℃の０．０２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、１％ＳＤＳ（例えば、ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：１９９１〜１９９５を参照）または０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで、１回または複数回の洗浄を行うというものである。
【００６７】
配列番号：１、３、５または７の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子は、天然の核酸分子に対応することが好ましい。本明細書で用いる「天然の」核酸分子とは、自然界にみられるヌクレオチド配列を有する（例えば、天然型タンパク質をコードする）ＲＮＡまたはＤＮＡ分子のことを指す。
【００６８】
集団内に存在する可能性のある不飽和化酵素配列の天然の対立遺伝子バリアントに加えて、当業者はさらに、配列番号：１、３、５または７のヌクレオチド配列に変異によって変化を導入し、それにより、不飽和化酵素タンパク質の生物活性を変化させることなく、コードされる不飽和化酵素タンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらしうることを理解すると考えられる。例えば、配列番号：１、３、５または７の配列中の「非必須」アミノ酸残基の箇所に保存的アミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換を作製することができる。「非必須」アミノ酸残基とは、生物活性を変化させることなく、Ｆａｄ４、Ｆａｄ５、Ｆａｄ５−２またはＦａｄ６の野生型配列（例えば、配列番号：２、５、８または１１の配列）からの変更が可能な残基のことであり、これに対して「必須」アミノ酸残基は生物活性に必要なものである。例えば、本発明の不飽和化酵素タンパク質の間で保存されているアミノ酸残基、例えばヘム結合モチーフまたはヒスチジンモチーフに存在するものは、特に変更不能であると予想される。さらに、本発明の不飽和化酵素タンパク質と脂肪酸不飽和化酵素ファミリーの他のメンバーとの間で保存されている別のアミノ酸配列も変更不能である可能性が高い。
【００６９】
したがって、本発明のもう１つの局面は、活性のために必須でないアミノ酸残基に変化を含む不飽和化酵素タンパク質をコードする核酸分子に関する。このような不飽和化酵素タンパク質は、アミノ酸配列の点で配列番号：２、４、６または８とは異なるが、生物活性は保っている。１つの態様において、単離された核酸分子は、配列番号：２、４、６または８に対する、例えば配列番号：２、５、８または１１の全長に対する相同性が、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上であるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００７０】
配列番号：２、４、６または８のタンパク質と相同な不飽和化酵素タンパク質をコードする単離された核酸分子は、コードされるタンパク質に１つまたは複数のアミノ酸置換、付加または欠失が導入されるように、配列番号：１、３、５または７のヌクレオチド配列に１つまたは複数のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することによって作製しうる。変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）は、位置指定変異誘発、ＰＣＲを介した変異誘発（ＰＣＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）などの標準的な技法により、配列番号：１、３、５または７に導入することができる。保存的アミノ酸置換を１つまたは複数の予想される非必須アミノ酸残基の箇所に作製することが好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基が類似した側鎖を有するアミノ残残基によって置換されるものをいう。類似したアミノ酸残基を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。このため、不飽和化酵素における予想される非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基によって置換することが好ましい。または、もう１つの態様においては、飽和変異誘発法（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）などによって、不飽和化酵素のコード配列の全体または一部にわたってランダムに変異を導入することもでき、その結果得られた変異体を、活性を保持している変異体を同定するために不飽和化酵素生物活性に関してスクリーニングすることもできる。配列番号：１、３、５または７の変異誘発の後には、コードされるタンパク質を組換え法によって発現させ、タンパク質の活性を決定することができる。
【００７１】
１つの好ましい態様では、変異型不飽和化酵素タンパク質を、（ｉ）不飽和化酵素の基質もしくは標的分子（例えば、ＤＨＡなどの脂肪酸）と相互作用する能力；および／または（ｉｉ）不飽和化酵素の基質もしくは標的分子における炭素原子間に二重結合を形成する能力に関してアッセイすることができる。
【００７２】
ＩＩ．単離された不飽和化酵素タンパク質
本発明の１つの局面は、単離されたまたは組換え型の不飽和化酵素タンパク質およびポリペプチド、ならびにそれらの生物活性部分に関する。１つの態様では、標準的なタンパク質精製法を用いる適切な精製方式により、細胞または組織源から天然型の不飽和化酵素タンパク質を単離することができる。もう１つの態様では、組換えＤＮＡ法によって不飽和化酵素タンパク質が産生される。組換え体の発現の代わりに、標準的なペプチド合成法を用いて不飽和化酵素タンパク質またはポリペプチドを化学合成することもできる。
【００７３】
「単離された」または「精製された」タンパク質またはその生物活性部分は、不飽和化酵素タンパク質の由来である細胞もしくは組織源からの細胞材料もしくは他の混入タンパク質を実質的に含まず、または化学合成された場合には前駆化学物質もしくはその他の化学物質を実質的に含まない。「細胞材料を実質的に含まない」という表現には、タンパク質が、それが単離または組換えによって産生された細胞の細胞成分から分離されている不飽和化酵素タンパク質の調製物が含まれる。１つの態様において、「細胞材料を実質的に含まない」という表現には、不飽和化酵素でないタンパク質（本明細書では「混入タンパク質」とも称する）が（乾燥重量で）約８０％、７０％、６０％、５０％、４０％または３０％未満である、より好ましくは不飽和化酵素でないタンパク質が約２０％未満である、さらにより好ましくは不飽和化酵素でないタンパク質が約１０％未満である、最も好ましくは不飽和化酵素でないタンパク質が約５％未満である、不飽和化酵素タンパク質の調製物が含まれる。不飽和化酵素タンパク質またはそれらの生物活性部分が組換えによって産生される場合には、それは培地も実質的に含まないこと、すなわち培地がタンパク質調製物の容積の約２０％未満である、より好ましくは約１０％未満である、最も好ましくは５％未満であることが好ましい。
【００７４】
「前駆化学物質または他の化学物質を実質的に含まない」という表現には、タンパク質が、タンパク質の合成にかかわる前駆化学物質または他の化学物質から分離されている不飽和化酵素タンパク質の調製物が含まれる。１つの態様において、「前駆化学物質または他の化学物質を実質的に含まない」という表現には、前駆化学物質または不飽和化酵素でない化学物質が（乾燥重量で）約３０％未満である、より好ましくは前駆化学物質または不飽和化酵素でない化学物質が約２０％未満である、さらにより好ましくは前駆化学物質または不飽和化酵素でない化学物質が約１０％未満である、最も好ましくは前駆化学物質または不飽和化酵素でない化学物質が約５％未満である、不飽和化酵素タンパク質の調製物が含まれる。本発明のタンパク質は、対応する天然のタンパク質とは異なる形態、および／または少なくともいくつかの細胞成分が付随したままの形態であってもよいことが理解される必要がある。例えば、タンパク質に細胞膜が付随していてもよい。
【００７５】
本明細書で用いる場合、不飽和化酵素タンパク質の「生物活性部分」には、不飽和化酵素分子と不飽和化酵素でない分子（例えば、脂肪酸などの不飽和化酵素基質）との間の相互作用に関与する、不飽和化酵素タンパク質の断片が含まれる。不飽和化酵素タンパク質の生物活性断片には、不飽和化酵素のアミノ酸配列と実質的に相同なまたはそれに由来するアミノ酸配列、例えば、不飽和化酵素タンパク質の活性の少なくとも１つを示すのに十分なアミノ酸残基を含む配列番号：２、５、８または１１に示したアミノ酸配列、を含むペプチドが含まれる。生物活性部分は、不飽和化酵素タンパク質の活性；すなわち（ｉ）不飽和化酵素の基質もしくは標的分子（例えば、ＤＨＡなどの脂肪酸）と相互作用する能力；および／または（ｉｉ）不飽和化酵素の基質もしくは標的分子における炭素原子間に二重結合を形成する能力、の少なくとも１つを有するドメインまたはモチーフを含むことが一般的である。不飽和化酵素タンパク質の生物活性部分は、例えば、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００アミノ酸長またはそれ以上であるポリペプチドでありうる。
【００７６】
１つの態様において、不飽和化酵素タンパク質の生物活性部分は、ヘム結合モチーフおよび／または少なくとも１つのヒスチジンモチーフ、好ましくは約３つのヒスチジンモチーフを含む。さらに、タンパク質の他の領域が欠失したその他の生物活性部分を組換え法によって調製し、天然型の不飽和化酵素タンパク質の機能的活性の１つまたは複数に関して評価することもできる。
【００７７】
１つの好ましい態様において、不飽和化酵素タンパク質は、配列番号：２、４、６または８に示したアミノ酸配列を有する。他の態様において、不飽和化酵素タンパク質は配列番号：２、４、６または８と実質的に同一であり、配列番号：２、４、６または８のタンパク質の機能的活性を保持しているが、上の小節Ｉで詳細に述べたように、天然の対立遺伝子変異または変異誘発のためにアミノ酸配列が異なっている。もう１つの態様において、不飽和化酵素タンパク質は、配列番号：２、４、６または８との同一性が少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上であるアミノ酸配列を含むタンパク質である。
【００７８】
もう１つの態様において、本発明は、配列番号：１、３、５もしくは７のヌクレオチド配列またはそれらの相補物との同一性が少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上であるヌクレオチド配列からなる核酸分子によってコードされる、不飽和化酵素タンパク質を特徴とする。本発明はさらに、配列番号：１、３、５もしくは７のヌクレオチド配列またはそれらの相補物を含む核酸分子の相補物とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列からなる核酸分子によってコードされる、不飽和化酵素タンパク質を特徴とする。
【００７９】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の一致率（ｐｅｒｃｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を決定するには、最適な比較がなされるように配列を整列化する（例えば、最適な整列化が得られるように、第１および第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較のために非相同配列を無視することができる）。１つの好ましい態様において、比較のために整列化する参照配列（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％であり、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％または９０％である（例えば、第２の配列を５１９個のアミノ酸残基を有する配列番号：２のＦａｄ４アミノ酸配列と整列化する場合には、少なくとも１５６個、好ましくは少なくとも２０８個、より好ましくは少なくとも２６０個、さらにより好ましくは少なくとも３１１個、さらにより好ましくは少なくとも３６３、４１５または４６７個のアミノ酸残基を整列化する；第２の配列を４３９個のアミノ酸残基を有する配列番号：４のＦａｄ５アミノ酸配列と整列化する場合には、少なくとも１３２個、好ましくは少なくとも１７６個、より好ましくは少なくとも２２０個、さらにより好ましくは少なくとも２６３個、さらにより好ましくは少なくとも３０７、３５１または３９５個のアミノ酸残基を整列化する；第２の配列を４５６個のアミノ酸残基を有する配列番号：６のＦａｄ５−２アミノ酸配列と整列化する場合には、少なくとも１３７個、好ましくは少なくとも１８２個、より好ましくは少なくとも２２８個、さらにより好ましくは少なくとも２７３個、さらにより好ましくは少なくとも３１９、３６５または４１９個のアミノ酸残基を整列化する；第２の配列を４６０個のアミノ酸残基を有する配列番号：８のＦａｄ６アミノ酸配列と整列化する場合には、少なくとも１３８個、好ましくは少なくとも１８４個、より好ましくは少なくとも２３０個、さらにより好ましくは少なくとも２７６個、さらにより好ましくは少なくとも３２２、３６８または４１４個のアミノ酸残基を整列化する）。続いて、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置でアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列のある位置を、第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドが占めている場合には、２つの分子はその位置で同一である（本明細書で用いる場合、アミノ酸または核酸の「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、アミノ酸または核酸の「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」と同義である）。２つの配列間の一致率は、２つの配列の最適な整列化を行うために導入する必要のあるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた上で２つの配列が共有する同一な位置の数の関数である。
【００８０】
配列の比較および２つの配列間の一致率の決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。１つの好ましい態様では、２つのアミノ酸配列の間の一致率を、ＧＣＧソフトウエアパッケージ中のＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）に組み込まれているニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４４〜４５３（１９７０））のアルゴリズムを用い、ブロッサム６２行列（Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２ ｍａｔｒｉｘ）またはＰＡＭ２５０行列、およびギャップ加重（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）として１６、１４、１２、１０、８、６または４、長さ加重（ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）として１、２、３、４、５または６を用いて決定する。さらにもう１つの好ましい態様では、２つのヌクレオチド配列の間の一致率を、ＧＣＧソフトウエアパッケージ中のＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）を用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列、およびギャップ加重（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）として４０、５０、６０、７０または８０、長さ加重（ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）として１、２、３、４、５または６を用いて決定する。ＧＡＰプログラムと組み合わせて用いるためのパラメーターの好ましい非制限的な一例は、ブロッサム（Ｂｌｏｓｓｕｍ）６２スコア行列、ギャップペナルティ（ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）１２、ギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｄ ｐｅｎａｌｔｙ）４およびフレームシフトギャップペナルティ（ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）５の組み合わせを含む。
【００８１】
もう１つの態様において、２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の間の一致率は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０またはバージョン２．０Ｕ）に組み込まれているマイヤーズ（Ｍｅｙｅｒｓ）およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）のアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ．、４：１１〜１７（１９８８））を用い、ＰＡＭ１２０加重残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティ（ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｐｅｎａｌｔｙ）１２およびギャップ長ペナルティ（ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）４を用いて決定することができる。
【００８２】
本発明の核酸配列およびタンパク質配列をさらに「クエリー配列（ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」として用いて、例えば、ファミリーの他のメンバーまたは関係のある配列を同定するために、公開データベースに対する検索を行うことができる。この種の検索は、アルツシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９０）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３〜１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行うことができる。本発明の不飽和化酵素核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るためには、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、スコア＝１００、ワード長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）＝１２としたＮＢＬＡＳＴプログラムを用いて実行するとよい。本発明の不飽和化酵素タンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るためには、ＢＬＡＳＴのタンパク質検索を、スコア＝５０、ワード長＝３としたＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて実行するとよい。比較用のギャップが入ったアライメントを得るためには、アルツシュールら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９〜３４０２に記載されたギャップＢＬＡＳＴ（Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ）を用いるとよい。ＢＬＡＳＴおよびギャップＢＬＡＳＴプログラムを用いる際には、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照。
【００８３】
ＩＩＩ．不飽和脂肪酸の生産方法
本発明は、不飽和脂肪酸、例えば、ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸、２２：６（ｎ−６））、ＤＰＡ（ドコサペンタエン酸、２２：５（ｎ−６））、ＡＡ（アラキドン酸、２０：４（ｎ−６））およびＥＰＡ（エイコサペンタエン酸、２０：５（ｎ−３））などのＬＣＰＵＦＡを生産する、新たな改善された方法を提供する。
【００８４】
Ａ．組換え細胞および細胞培養のための方法
本発明はさらに、本明細書に記載の遺伝子産物、好ましくはＦａｄ４、Ｆａｄ５、Ｆａｄ５−２およびＦａｄ６遺伝子産物をコードする核酸配列を含む、組換えベクターを提供する。組換えベクターという用語には、天然型のベクターまたはプラスミドに含まれるものよりも多い、少ないまたは異なる核酸配列を含むように変更、改変または操作されたベクター（例えば、プラスミド）が含まれる。１つの態様において、組換えベクターは、調節配列と機能的に結合した、少なくとも１つの脂肪酸不飽和化酵素をコードする核酸配列を含む。「調節配列と機能的に結合した」という語句は、（例えば、ベクターを宿主細胞内に導入した場合に）関心対象のヌクレオチド配列が、そのヌクレオチド配列の発現（例えば、増強した、増大した、構成的な、基礎的な、減弱した、低下した、または抑制した発現）、好ましくはヌクレオチド配列によってコードされる遺伝子産物の発現を可能とする様式で結合していることを意味する。ベクターの例は本明細書でさらに詳細に述べるほか、例えば、フラスコッティ（Ｆｒａｓｃｏｔｔｉ）ら、米国特許第５，７２１，１３７号にも記載されており、その内容は参照として本明細書に組み入れられる。
【００８５】
「調節配列」という用語には、他の（非調節性）核酸配列の発現に影響を及ぼす（例えば、修飾または調節する）核酸配列が含まれる。１つの態様において、調節配列は、調節配列および関心対象の遺伝子が自然下にある場合に観察されるのと同様もしくは同一な、関心対象の特定の遺伝子に対する位置および／または向き、例えば、天然の位置および／または向きで、組換えベクター中に含まれる。例えば、関心対象の遺伝子（例えば、Ｆａｄ４、Ｆａｄ５、Ｆａｄ５−２またはＦａｄ６遺伝子）を、天然の生物体でその遺伝子に付随または隣接している調節配列と機能的に結合させて（例えば、「天然の」Ｆａｄ４、Ｆａｄ５、Ｆａｄ５−２またはＦａｄ６調節配列と（例えば、「天然の」Ｆａｄ４、Ｆａｄ５、Ｆａｄ５−２またはＦａｄ６プロモーターと）機能的に結合させて）、組換えベクターに含めることができる。または、関心対象の遺伝子（例えば、Ｆａｄ４、Ｆａｄ５、Ｆａｄ５−２またはＦａｄ６遺伝子）を、天然の生物体において別の（例えば、異なる）遺伝子に付随または隣接している調節配列と機能的に結合させて、組換えベクターに含めることもできる。例えば、Ｆａｄ４、Ｆａｄ５、Ｆａｄ５−２またはＦａｄ６遺伝子を、Ｆａｄ４、Ｆａｄ５、Ｆａｄ５−２またはＦａｄ６のものでない調節配列と機能的に結合させてベクター中に含めることができる。または、関心対象の遺伝子（例えば、Ｆａｄ４、Ｆａｄ５、Ｆａｄ５−２またはＦａｄ６遺伝子）を、別の生物由来の調節配列と機能的に結合させてベクター中に含めることもできる。例えば、他の微生物由来の調節配列（例えば、他の細菌の調節配列、バクテリオファージの調節配列など）を、関心対象の遺伝子と機能的に結合させることができる。
【００８６】
好ましい調節配列には、プロモーター、エンハンサー、終結シグナルおよび他の発現制御因子（例えば、転写されたｍＲＮＡにおける、転写および／または翻訳調節タンパク質の結合部位）が含まれる。このような調節配列は、例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．）、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｈ， Ｅ． Ｆ．）およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．）、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９に記載されている。調節配列には、細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を指令するもの（例えば、構成性プロモーターおよび強力な構成性プロモーター）、細胞におけるヌクレオチド配列の誘導性発現を指令するもの（例えば、誘導性プロモーター、例えばキシロース誘導性プロモーター）および細胞におけるヌクレオチド配列の発現を減弱または抑制するもの（例えば、減弱シグナルまたはリプレッサー配列）が含まれる。調節配列の除去または欠失によって関心対象の遺伝子の発現を調節することも本発明の範囲に含まれる。例えば、関心対象の遺伝子の発現が増強されるように、転写の負の調節に関与する配列を除去することができる。
【００８７】
１つの態様において、本発明の組換えベクターは、プロモーターまたはプロモーター配列と機能的に結合した、少なくとも１つの遺伝子産物（例えば、Ｆａｄ４、Ｆａｄ５、Ｆａｄ５−２またはＦａｄ６）をコードする核酸分子を含む。
【００８８】
さらにもう１つの態様において、本発明の組換えベクターは、１つまたは複数の終結配列（例えば、転写終結配列）を含む。「終結配列」という用語には、ｍＲＮＡの転写を終結させる働きをする調節配列が含まれる。終結配列（または縦列転写終結配列）はさらに、例えばヌクレアーゼに対して、ｍＲＮＡを安定化する働きをすることもある（例えば、ｍＲＮＡに構造物を付加することによる）。
【００８９】
さらにもう１つの態様において、本発明の組換えベクターは、抗生物質耐性配列を含む。「抗生物質耐性配列」という用語には、宿主生物に対して抗生物質に対する耐性を向上させる、または付与する配列が含まれる。１つの態様において、抗生物質耐性配列は、ｃａｔ（クロラムフェニコール耐性）、ｔｅｔ（テトラサイクリン耐性）配列、ｅｒｍ（エリスロマイシン耐性）配列、ｎｅｏ（ネオマイシン耐性）配列およびｓｐｅｃ（スペクチノマイシン耐性）配列からなる群より選択される。本発明の組換えベクターはさらに、相同組換え配列（例えば、宿主生物の染色体への関心対象の遺伝子の組換え導入を可能とするように設計された配列）を含みうる。例えば、ａｍｙＥ配列は、宿主染色体への組換え導入のための相同標的として用いることができる。
【００９０】
「操作された細胞」という用語には、不飽和脂肪酸が産生されるように、細胞が少なくとも１つの脂肪酸不飽和化酵素、例えばＦａｄ４、Ｆａｄ５、Ｆａｄ５−２および／またはＦａｄ６を有するように操作された（例えば、遺伝的工学による操作を受けた）細胞が含まれる。このような微生物の改変または操作は、生合成経路の調節解除（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）および／または少なくとも１つの生合成酵素の過剰発現を非制限的に含む、本明細書に記載の任意の方法によるものであってよい。「操作された」酵素（例えば、「操作された」生合成酵素）には、例えば、対応する野生型または天然型の酵素と比べて、酵素の少なくとも１つの上流もしくは下流前駆物質、基質または産物が変更または改変されるように、その発現または産生が変更または改変された酵素が含まれる。
【００９１】
「過剰発現された」または「過剰発現」という用語には、細胞の操作前または操作されていない同等の細胞における発現よりも大きいレベルでの、遺伝子産物（例えば、脂肪酸不飽和化酵素）の発現が含まれる。１つの態様においては、細胞の操作前または操作されていない同等の細胞における発現よりも大きいレベルで遺伝子産物を過剰発現するように、細胞の遺伝子操作を行うこと（例えば、遺伝子工学による操作を行うこと）ができる。遺伝子操作には、特定の遺伝子の発現と関連のある調節配列もしくは部位を変更もしくは改変すること（例えば、強力なプロモーター、誘導性プロモーターまたは複数のプロモーターを付加することによる、または発現が構成的となるように調節配列を除去することによる）、特定の遺伝子の染色体位置を改変すること、特定の遺伝子に隣接するリボソーム結合部位もしくは転写終結因子などの核酸配列を変更すること、特定の遺伝子のコピー数を増やすこと、特定の遺伝子の転写および／もしくは特定の遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質（例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写活性化因子など）を改変すること、または当技術分野で慣例的な、特定の遺伝子の発現の調節解除を行う任意の他の従来の手段（例えばリプレッサータンパク質の発現を阻止するためのアンチセンス核酸分子の使用を非制限的に含む）が非制限的に含まれうる。
【００９２】
もう１つの態様において、細胞の操作前または操作されていない同等の細胞における発現よりも大きいレベルで遺伝子産物を過剰発現するように、細胞を物理的または環境的に操作することができる。例えば、転写および／または翻訳が増強または増加するように、細胞を、特定の遺伝子の転写および／または特定の遺伝子産物の翻訳を増加させることが知られたまたは疑われる作用物質（ａｇｅｎｔ）で処理する、またはその存在下で培養することができる。または、転写および／または翻訳が増強または増加するように、細胞を、特定の遺伝子の転写および／または特定の遺伝子産物の転写を増加させるように選択した温度で培養することもできる。
【００９３】
「調節解除された（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｅｄ）」または「調節解除（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）」という用語には、細胞における生合成酵素のレベルまたは活性が変更または改変されるような、細胞における生合成経路中の酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の変更または改変が含まれる。好ましくは、遺伝子産物が増強または増加するように、生合成経路中の酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子を変更または改変する。「調節解除された経路」という語句には、複数の生合成酵素のレベルまたは活性が変更または改変されるような、生合成経路中の酵素をコードする複数の遺伝子の変更または改変が含まれうる。細胞における経路を「調節解除する」（例えば、所定の生合成経路中の複数の遺伝子を同時に調節解除する）能力は、複数の酵素（例えば、２種または３種の生合成酵素）が、「オペロン」と呼ばれる連続した遺伝物質の断片上に互いに隣接して存在する遺伝子によってコードされるという細胞の特定の現象によって生じる。
【００９４】
「オペロン」という用語には、１つまたは複数の、好ましくは少なくとも２つの構造遺伝子（例えば、酵素、例えば生合成酵素をコードする遺伝子）に付随してプロモーターおよびおそらくは調節因子を含む、遺伝子発現の協調的な構成単位が含まれる。構造遺伝子の発現は、例えば、調節タンパク質の調節因子との結合により、または転写の抗転写終結により、協調的に調節されうる。複数の構造遺伝子が転写されて、構造タンパク質のすべてをコードする単一のｍＲＮＡが生じることがある。オペロンに含まれる遺伝子が協調的に調節されるため、単一のプロモーターおよび／または調節因子の変更または改変が、オペロンによってコードされる各遺伝子産物の変更または改変を引き起こしうる。調節因子の変更または改変には、内因性プロモーターおよび／もしくは調節因子の除去、強力なプロモーター、誘導性プロモーターもしくは複数のプロモーターの付加、または遺伝子産物の発現が改変されるような調節配列の除去、オペロンの染色体位置の改変、オペロンに隣接するもしくはオペロンの内部にあるリボソーム結合部位などの核酸配列の変更、オペロンのコピー数の増大、オペロンの転写および／もしくはオペロンの遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質（例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写活性化因子など）の改変、または当技術分野で慣例的な、遺伝子の発現の調節解除を行う任意の他の従来の手段（例えばリプレッサータンパク質の発現を阻止するためのアンチセンス核酸分子の使用を非制限的に含む）が非制限的に含まれうる。調節解除には、例えば、フィードバック耐性のある、または比活性がより高いもしくは低い酵素を得るために、１つまたは複数の遺伝子のコード領域を変更することも含まれうる。
【００９５】
特に好ましい本発明の「組換え」細胞は、植物由来の遺伝子もしくは遺伝子産物または微生物由来の遺伝子もしくは遺伝子産物を過剰発現するように遺伝子工学による操作を受けたものである。「植物由来の」「微生物由来の」または「に由来する」という用語には、例えば、微生物もしくは植物、例えば、脂肪種子植物に天然に認められる遺伝子、または遺伝子産物（例えば、Ｆａｄ４、Ｆａｄ５、Ｆａｄ５−２またはＦａｄ６）、または植物遺伝子もしくは微生物からの遺伝子によってコードされるもの（例えば、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７によりコードされるもの）が含まれる。
【００９６】
本発明の方法は、少なくとも１つの脂肪酸不飽和化酵素を過剰発現する組換え細胞を特徴とする。１つの態様において、本発明の組換え細胞は、ヤブレツボカビ属（Ｔｈｒａｕｓｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）の脂肪酸不飽和化酵素（例えば、ヤブレツボカビ属Δ４または５不飽和化酵素（Ｆａｄ４またはＦａｄ５遺伝子産物））を過剰発現するように遺伝子工学による操作を受けている（例えば、配列番号：２もしくは４のアミノ酸配列を有する、または配列番号：１もしくは３の核酸配列によってコードされる脂肪酸不飽和化酵素）の少なくとも１つを過剰発現するように操作されている）。
【００９７】
もう１つの態様において、本発明の組換え細胞は、ピティウム・イレギュラレＡ５またはΔ６不飽和化酵素（Ｆａｄ５−２またはＦａｄ６遺伝子産物）（例えば、配列番号：６もしくは８のアミノ酸配列を有する、または配列番号：５もしくは５のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる脂肪酸不飽和化酵素）を過剰発現するように遺伝子工学による操作を受けている。
【００９８】
もう１つの態様において、本発明は、脂肪酸不飽和化酵素の核酸配列（例えば、配列番号：１、３、５または７に示した脂肪酸不飽和化酵素の核酸配列）を含むベクターによる形質転換を受けた細胞（例えば、微生物細胞）を特徴とする。
【００９９】
本発明のもう１つの局面は、脂肪酸の生産を調節する方法であって、脂肪酸の産生の調節が起こるように（例えば、不飽和脂肪酸の産生が増強されるように）、本発明の核酸分子（例えば、不飽和化酵素）による形質転換を受けた細胞を培養することを含む方法を特徴とする。脂肪酸の産生を調節するために、本発明の核酸分子（例えば、Ｆａｄ４、Ｆａｄ５、Ｆａｄ５−２およびＦａｄ６）による形質転換を受けた細胞を培養する方法を、本明細書では「生体内変化（ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」と称する。生体内変化過程には、本明細書に記載の組換え細胞および／または不飽和化酵素を利用しうる。「生体内変化過程」という用語を、本明細書では「生物学的変換過程（ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）」とも称し、これには、脂肪酸不飽和化酵素の上流にある任意の化合物（例えば、基質、中間体または産物）の、脂肪酸不飽和化酵素の下流にある化合物（例えば、基質、中間体または産物）、特に不飽和脂肪酸への生成（例えば、転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）または変換（ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ））がもたらされる生物過程が含まれる。１つの態様において、本発明は、不飽和脂肪酸の生産のための生体内変化過程であって、少なくとも１つの脂肪酸不飽和化酵素を過剰発現する細胞を、少なくとも１つの適切な基質と、不飽和脂肪酸が生成される条件下で接触させること、および選択的には、脂肪酸を回収することを含む過程を特徴とする。１つの好ましい態様において、本発明は、不飽和脂肪酸の生産のための生体内変化過程であって、Ｆａｄ４、Ｆａｄ５、Ｆａｄ５−２またはＦａｄ６を過剰発現する細胞を、適切な基質（例えば、中間体脂肪酸）と、不飽和脂肪酸（例えば、ＤＨＡ、ＳＤＡまたはＧＬＡ）が生成される条件下で接触させること、および選択的には、不飽和脂肪酸を回収することを含む方法を特徴とする。不飽和化脂肪酸が生成される条件には、不飽和脂肪酸の望まれる生産が得られる任意の条件が含まれうる。
【０１００】
生体内変化反応に用いられる細胞および／または酵素は、意図する機能（例えば、希望する脂肪酸の生産）を遂行することを可能とする形態にある。細胞は全細胞でもよく、望まれる最終結果を得るために必要な細胞の部分のみでもよい。細胞には、懸濁化（例えば、緩衝液または培地などの適切な溶液中に）、すすぎ洗い（例えば、細胞を培養した培地をすすぎ洗いして除く）、アセトン乾燥、固定化（例えば、ポリアクリルアミドゲルもしくはｋ−カラゲナンによる、または合成支持体、例えばビーズ、マトリックスなどに対して）、固定、架橋または透過化処理（例えば、膜および／または壁を透過化し、化合物、例えば基質、中間体または産物が前記の膜または壁をより容易に通過できるようにする）を行うことが可能である。細胞の種類は、本発明の方法において用いうる任意の細胞、例えば、植物、動物または微生物の細胞であってよい。
【０１０１】
本発明の１つの重要な局面は、希望する化合物（例えば、希望する不飽和脂肪酸）が産生されるように、組換え植物を育成すること、または本明細書に記載の組換え微生物を培養することを含む。「培養すること」という用語には、本発明の生きた微生物を維持および／または成長させること（例えば、培養物または菌株を維持および／または成長させること）が含まれる。１つの態様では、本発明の微生物を液体培地中で培養する。もう１つの態様では、本発明の微生物を固形培地中または半固形培地中で培養する。１つの好ましい態様では、本発明の微生物を、微生物の維持および／または成長に必須または有益な栄養分（例えば、炭素源または炭素基質、例えば 豆類または穀類の飼料、デンプン、糖、糖アルコール、炭化水素、油、脂肪、脂肪酸、有機酸およびアルコールなどの複合糖質；窒素源、例えば、穀類、豆類および塊茎に由来する植物タンパク質、ペプトン、ペプチドおよびアミノ酸、肉、乳などの動物性源に由来するタンパク質、ペプチドおよびアミノ酸、ならびにペプトン、肉エキスおよびカゼイン加水分解物などの動物性副産物；尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムおよびリン酸アンモニウムなどの無機窒素源；リンの源、例えば、リン酸、そのナトリウム塩およびカリウム塩；微量元素、例えば、マグネシウム、鉄、マンガン、カルシウム、銅、亜鉛、ホウ素、モリブデンおよび／またはコバルトの塩；さらにはアミノ酸、ビタミン、成長促進物質などの発育因子）を含む培地（例えば、滅菌液体培地）中で培養する。
【０１０２】
本発明の微生物は、制御されたｐＨで培養することが好ましい。「制御されたｐＨ」という用語には、希望する産物（例えば、不飽和脂肪酸）の産生が起こる任意のｐＨが含まれる。１つの態様では、微生物を約ｐＨ ７で培養する。もう１つの態様では、微生物をｐＨ ６．０〜８．５で培養する。望ましいｐＨは、当業者に知られた任意のさまざまな方法によって維持しうる。
【０１０３】
また、本発明の微生物は、制御された曝気（ａｅｒａｔｉｏｎ）下で培養することが好ましい。「制御された曝気」という用語には、希望する産物（例えば、不飽和脂肪酸）の産生が起こるのに十分な曝気（例えば、酸素）が含まれる。１つの態様において、曝気は、培養物中の酸素レベルを調節することにより、例えば、培地中に溶解した酸素の量を調節することによって調整される。培養物の曝気は、培養物を攪拌することによって調整することが好ましい。攪拌はプロペラもしくは類似の機械的攪拌装置により、発育容器（例えば、発酵槽）の回転もしくは振盪により、またはさまざまなポンプ装置によって供給しうる。換気をさらに、無菌空気または酸素を培地（例えば、発酵混合物）に通すことによって調整してもよい。また、本発明の微生物は過剰な泡立ちを起こさずに培養することが好ましい（例えば、泡止め剤の添加による）。
【０１０４】
さらに、本発明の植物または微生物を、制御された温度で培養することもできる。「制御された温度」には、希望する産物（例えば、不飽和脂肪酸）の産生が起こる任意の温度が含まれる。１つの態様において、制御された温度には、１５℃〜９５℃の間の温度が含まれる。もう１つの態様において、制御された温度には、１５℃〜７０℃の間の温度が含まれる。好ましい温度は、２０℃〜５５℃の間、より好ましくは３０℃〜４５℃の間、または３０℃〜５０℃の間である。
【０１０５】
微生物は液体培地中で培養する（例えば、維持および／または成長させる）ことができ、好ましくは、静置培養、試験管培養、振盪培養（例えば、回転振盪培養、フラスコ振盪培養など）、曝気攪拌培養または発酵などの従来の培養法により、連続的または間欠的に培養する。１つの好ましい態様においては、微生物を振盪フラスコ内で培養する。より好ましい１つの態様では、微生物を発酵槽の中で培養する（例えば、発酵工程）。本発明の発酵工程には、バッチ法、流加培養法および連続発酵法が非制限的に含まれる。「バッチ工程」または「バッチ発酵」という用語は、培地、栄養分、補充性添加物などの組成物を発酵の開始時に設定し、発酵中には変更を行わない閉鎖系のことを指すが、培地の過度の酸性化および／または微生物の死滅を防ぐためにｐＨおよび酸素濃度などの因子を制御するようにしてもよい。「流加培養工程」または「流加培養」発酵という用語は、発酵の進行とともに１つまたは複数の基質または補充物を添加すること（例えば、段階的または連続的に添加する）を除いて、バッチ発酵と同じである。「連続工程」または「連続発酵」という用語は、規定の発酵培地を連続的に発酵槽に添加し、好ましくは希望する産物（例えば、不飽和脂肪酸）を回収するために、同じ量の使用済みまたは「馴化」培地を同時に除去する系のことを指す。このような工程はさまざまなものが開発されており、当技術分野で周知である。
【０１０６】
「希望する化合物（例えば、不飽和脂肪酸、例えばＤＨＡ）が産生されるような条件下で培養すること」という表現は、希望する化合物の産生を得るため、または産生される特定の化合物の所要の収量を得るために適切または十分である条件（例えば、温度、圧力、ｐＨ、継続時間など）の下で、植物または微生物を維持および／または成長させることを含む。例えば、所要の量の不飽和脂肪酸（例えば、ＤＨＡ）が産生されるのに十分な時間にわたって培養を継続する。好ましくは、不飽和脂肪酸の最大限の産生に実質的に到達するのに十分な時間にわたって培養を継続する。１つの態様では、培養を約１２〜２４時間にわたって継続する。もう１つの態様では、培養を約２４〜３６時間、３６〜４８時間、４８〜７２時間、７２〜９６時間、９６〜１２０時間、１２０〜１４４時間にわたり、または１４４時間よりも長く継続する。もう１つの態様では、不飽和脂肪酸が産生収量に到達するのに十分な時間にわたって培養を継続し、例えば、少なくとも約１５〜２０ｇ／Ｌの不飽和脂肪酸が産生されるように、少なくとも約２０〜２５ｇ／Ｌの不飽和脂肪酸が産生されるように、少なくとも約２５〜３０ｇ／Ｌの不飽和脂肪酸が産生されるように、少なくとも約３０〜３５ｇ／Ｌの不飽和脂肪酸が産生されるように、少なくとも約３５〜４０ｇ／Ｌの不飽和脂肪酸（例えば、少なくとも約３７ｇ／Ｌの不飽和脂肪酸）が産生されるように、または少なくとも約４０〜５０ｇ／Ｌの不飽和脂肪酸が産生されるように、細胞を培養する。さらにもう１つの態様においては、不飽和脂肪酸の好ましい収量、例えば上記の範囲内の収量が、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間または約９６時間で産生されるような条件下で、微生物を培養する。
【０１０７】
不飽和脂肪酸の生産においては、本発明の培養細胞を、補充性脂肪酸生合成基質の存在下で培養することがさらに望ましいと思われる。「補充性脂肪酸生合成基質」という用語には、細胞と接触させた場合または細胞の培地中に含めた場合に、不飽和脂肪酸の生合成を増強または増大させる働きをする作用物質または化合物が含まれる。本発明の補充性脂肪酸生合成基質は、濃溶液または懸濁液（例えば、水または緩衝液などの適した溶媒中にあるもの）の形態で、または固体の形態で（例えば、粉末の形態で）添加してよい。さらに、本発明の補充性脂肪酸生合成基質は、単一のアリコートとして、所定の時間にわたって連続的または間欠的に添加することができる。
【０１０８】
本発明の方法はさらに、希望する化合物（例えば、不飽和脂肪酸）を回収する段階を含みうる。希望する化合物を「回収すること」という用語には、培地から化合物を抽出、採取、単離または精製することが含まれる。化合物の回収は、従来の樹脂（例えば、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂、非イオン系吸着樹脂など）による処理、従来の吸着剤（例えば、活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルミナなど）による処理、ｐＨの変更、溶媒抽出（例えば、アルコール、酢酸エチル、ヘキサンなどの従来の溶媒による）、透析、濾過、濃縮、結晶化、再結晶化、ｐＨ調整、凍結乾燥などを非制限的に含む、当技術分野で知られた任意の従来の単離法または精製法に従って行うことができる。例えば、最初に微生物を培養物から除去することにより、化合物を培地から回収する。続いて、不要な無機陽イオンおよび関心対象の不飽和脂肪酸（例えば、ＤＨＡ）よりも酸性度の強い有機酸を除去するために、培地を陽イオン交換樹脂中またはその上に通過させる。
【０１０９】
結果として得られた調製物が他の成分を実質的に含まないように（例えば、培地の成分および／または発酵副産物を含まないように）、本発明の希望する化合物を「抽出」「単離」または「精製」することが好ましい。「他の成分を実質的に含まない」という表現には、化合物が、それが産生された培養物の培地成分または発酵副産物から分離されている（例えば、精製または部分精製された）、希望する化合物の調製物が含まれる。１つの態様において、調製物は、希望する化合物を（乾燥重量にして）約８０％よりも多く有し（例えば、他の培地成分または発酵副産物が約２０％である）、より好ましくは、希望する化合物を約９０％よりも多く有し（例えば、他の培地成分または発酵副産物が約１０％未満である）、さらにより好ましくは、希望する化合物を約９５％よりも多く有し（例えば、他の培地成分または発酵副産物が約５％未満である）、最も好ましくは希望する化合物を約９８〜９９％よりも多く有する（例えば、他の培地成分または発酵副産物が約１〜２％未満である）。希望する化合物が塩へと誘導体化された不飽和脂肪酸である場合には、化合物はさらに、塩の形成に伴う混入化学物質を含まない（例えば、実質的に含まない）ことが好ましい。希望する化合物がアルコールへと誘導体化された不飽和脂肪酸である場合には、化合物はさらに、アルコールの形成に伴う混入化学物質を含まない（例えば、実質的に含まない）ことが好ましい。
【０１１０】
１つの代替的な態様では、例えば、植物または微生物が生物的に無害（例えば、安全）な場合には、希望する不飽和脂肪酸を植物または微生物から精製しない。例えば、植物または培養物（または培養上清）の全体を産物の源として（例えば、粗産物として）用いることができる。１つの態様においては、植物または培養物（または培養上清）上清を改変せずに用いる。もう１つの態様では、植物または培養物（または培養上清）を濃縮する。さらにもう１つの態様では、植物または培養物（または培養上清）を粉砕、乾燥または凍結乾燥する。
【０１１１】
Ｂ．高収量生産法
本発明の１つの特に好ましい態様は、不飽和脂肪酸、例えばＤＨＡを生産するための高収量生産法であって、操作された植物または微生物を、不飽和脂肪酸が著しく高収量で産生される条件下で培養することを含む方法である。「高収量生産法」、例えば、希望する化合物の生産のための（例えば、不飽和脂肪酸の生産のための）高収量生産法という用語には、同等の生産法に関する通常のレベルよりも高いまたは上のレベルで希望する化合物の生産が得られる方法が含まれる。高収量生産法により、著しい高収量で希望する化合物の生産が得られることが好ましい。「著しい高収量」という用語には、同等の生産法に関する通常のレベルよりも十分に高いまたは上の、例えば、希望する産物の商業生産（例えば、商業的に実現可能なコストでの産物の生産）のために十分なレベルの高さである、生産または収量のレベルが含まれる。１つの態様において、本発明は、不飽和脂肪酸を生産するための高収量生産法であって、操作された植物または微生物を、不飽和脂肪酸が２ｇ／Ｌを上回るレベルで産生される条件下で培養することを含む方法を特徴とする。もう１つの態様において、本発明は、不飽和脂肪酸を生産するための高収量生産法であって、操作された植物または微生物を、不飽和脂肪酸が１０ｇ／Ｌを上回るレベルで産生される条件下で培養することを含む方法を特徴とする。もう１つの態様において、本発明は、不飽和脂肪酸を生産するための高収量生産法であって、操作された植物または微生物を、不飽和脂肪酸が２０ｇ／Ｌを上回るレベルで産生される条件下で培養することを含む方法を特徴とする。さらにもう１つの態様において、本発明は、不飽和脂肪酸を生産するための高収量生産法であって、操作された植物または微生物を、不飽和脂肪酸が３０ｇ／Ｌを上回るレベルで産生される条件下で培養することを含む方法を特徴とする。さらにもう１つの態様において、本発明は、不飽和脂肪酸を生産するための高収量生産法であって、操作された植物または微生物を、不飽和脂肪酸が４０ｇ／Ｌを上回るレベルで産生される条件下で培養することを含む方法を特徴とする。
【０１１２】
本発明はさらに、希望する化合物を生産するための（例えば、不飽和脂肪酸を生産するための）高収量生産法であって、操作された植物または微生物を、十分に高いレベルの化合物が商業的に望ましい期間内に産生される条件下で培養することを含む方法を特徴とする。１つの範例となる態様において、本発明は、不飽和脂肪酸を生産する高収量生産法であって、操作された植物または微生物を、不飽和脂肪酸が３６時間で１５〜２０ｇ／Ｌを上回るレベルで産生される条件下で培養することを含む方法を特徴とする。もう１つの態様において、本発明は、不飽和脂肪酸を生産する高収量生産法であって、操作された植物または微生物を、不飽和脂肪酸が４８時間で２５〜３０ｇ／Ｌを上回るレベルで産生される条件下で培養することを含む方法を特徴とする。もう１つの態様において、本発明は、不飽和脂肪酸を生産する高収量生産法であって、操作された植物または微生物を、不飽和脂肪酸が７２時間で３５〜４０ｇ／Ｌを上回るレベル、例えば、７２時間で３７ｇ／Ｌを上回るレベルで産生される条件下で培養することを含む方法を特徴とする。もう１つの態様において、本発明は、不飽和脂肪酸を生産する高収量生産法であって、操作された植物または微生物を、不飽和脂肪酸が６０時間で３０〜４０ｇ／Ｌを上回るレベル、例えば、６０時間で３０、３５または４０ｇ／Ｌを上回るレベルで産生される条件下で培養することを含む方法を特徴とする。本明細書に挙げた範囲内に含まれる、および／またはその中間にある値および範囲も、本発明の範囲に含まれるものとする。例えば、６０時間で少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８および３９ｇ／Ｌのレベルでの不飽和脂肪酸の産生は、６０時間で３０〜４０ｇ／Ｌという範囲に含まれる。もう１つの例として、３０〜３５ｇ／Ｌまたは３５〜４０ｇ／Ｌという範囲は、６０時間で３０〜４０ｇ／Ｌという範囲に含まれるものとする。さらに、当業者は、例えば「６０時間で３０〜４０ｇ／Ｌ」の産生レベルを達成するために操作された微生物を培養することには、微生物をさらに長い期間（例えば、６０時間よりも長い期間）にわたって培養し、選択的には不飽和脂肪酸のさらに高い収量での産生を得ることが含まれることを理解すると考えられる。
【０１１３】
ＩＶ．組成物
本発明の不飽和化酵素核酸分子、タンパク質およびそれらの断片は、組成物に組み入れることが可能な不飽和脂肪酸を生産するために用いることができる。本発明の組成物には、例えば、動物飼料として用いるための組成物、機能性食品（例えば、栄養補助食品）として用いるための組成物、および投与のために適した薬学的組成物が含まれる。
【０１１４】
このような薬学的組成物は一般に、不飽和脂肪酸および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で用いる「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的投与に適合しうる任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌薬および抗真菌薬、等張液および吸収遅延剤などを含むものとする。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当技術分野で周知である。従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合性である場合を除き、組成物におけるその使用が考慮される。補足的な活性化合物を組成物に組み入れることも可能である。
【０１１５】
本発明の薬学的組成物は、その意図する投与経路と適合しうるように製剤化される。投与経路の例には、静脈内、皮内、皮下、経口（吸入など）、経皮（局所）、経粘膜および直腸内投与などの避腸的なものが含まれる。避腸的、皮内または皮下適用のために用いられる溶液または懸濁液は以下の成分を含みうる：注射用水、食塩液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈液；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌薬；アスコルビン酸または重硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸鉛、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝液；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性を調整するための薬剤。ｐＨは塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基によって調整しうる。非経口製剤は、アンプル、ディスポーザルシリンジまたはガラスもしくはプラスチック製の多回投与用バイアル中に封入することができる。
【０１１６】
注射用に適した薬学的組成物には、滅菌水性溶液（水溶性の場合）または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の要時調合用製剤（ｅｘｔｅｍｐｏｒａｎｅｏｕｓ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与のために適した担体には、生理食塩水、滅菌精製水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ；Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。すべての場合において、組成物は無菌でなければならず、シリンジ注入が容易に行える程度に流動的である必要がある。それは製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の混入作用から保護される必要がある。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびその適した混合物などを含む溶媒または分散媒であってよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散液の場合には必要な粒子径の維持、および界面活性剤の使用によって維持しうる。微生物の作用の防止は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの種々の抗菌薬および抗真菌薬によって実現しうる。多くの場合には、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコ−ル、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物中に含めることが好ましいと考えられる。注射用組成物の持続的吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの、吸収を遅延させる薬剤を組成物中に含めることによって達成しうる。
【０１１７】
滅菌注射用溶液は、適切な溶媒中に、必要に応じて上記に列挙した成分の１つまたは組み合わせとともに、必要な量の活性化合物（例えば、本発明の核酸分子およびタンパク質分子によって生産されるＬＣＰＵＦＡ、またはその断片）を組み入れ、その後で滅菌濾過を行うことによって調製しうる。一般に、分散液は、基本的な分散媒、および上記に列挙したものからの必要な他の成分を含む滅菌媒体中に活性化合物を含めることによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合には、好ましい調製の方法は、活性成分の粉末に加えて、その前に滅菌濾過された溶液からの望ましい任意の付加的な成分が得られる真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１１８】
経口用組成物は一般に不活性希釈液または可食担体を含む。それらはゼラチンカプセルに封入すること、または圧縮して錠剤にすることができる。経口治療的投与の目的には、活性化合物を賦形剤とともに組み入れ、錠剤、トローチ剤またはカプセル剤の形態で用いることができる。液体担体中の化合物が経口的に適用され、咀嚼および喀出または嚥下される口内洗浄剤として用いるための液体担体を用いて経口用組成物を調製することもできる。組成物の一部として薬学的に適合性のある結合剤および／または添加材料を含めることが可能である。錠剤、丸剤、トローチ剤などは以下の成分、または同様の性状をもつ化合物の任意のものを含みうる：微結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの賦形剤；アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）またはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステローテス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）などの潤滑剤；コロイド二酸化ケイ素などのグライダント；ショ糖またはサッカリンなどの甘味料；またはペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香料などの着香料。
【０１１９】
吸入による投与のためには、化合物を、二酸化炭素などのガスなどの適した噴霧剤を含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからのエアロゾル噴霧の形態で送達させる。
【０１２０】
全身投与を経粘膜的または経皮的手段によって行うこともできる。経粘膜的または経皮的投与のためには、透過させようとする障壁に適した浸透剤が製剤中に用いられる。このような浸透剤は当技術分野で一般に知られており、例えば、経粘膜的投与のためには、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜的投与は鼻スプレーまたは坐薬の使用によって実施しうる。経皮的投与のためには、活性化合物を、当技術分野で一般的に知られた軟膏、膏薬、ゲルまたはクリーム剤の形態に製剤化する。
【０１２１】
また、直腸内送達のための坐薬（例えば、カカオ脂およびその他のグリセリド類などの従来の坐薬用基材）または停留浣腸の形態として化合物を製剤化することもできる。
【０１２２】
１つの態様では、活性化合物を、インプラントおよびマイクロカプセル化された送達系を含む放出制御型製剤などの、化合物を身体からの迅速排出から保護すると思われる担体とともに調製する。エチレンビニルアセテート、重合無水物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステルおよびポリ乳酸などの生分解性で生体適合性のある重合体を用いることもできる。このような製剤の調製のための方法は当技術分野で明らかであると思われる。アルザ社（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびノバファーマシューティカルズ社（Ｎｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）から材料を購入することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を備えた、感染細胞を標的とするリポソームを含む）を薬学的に許容される担体として用いることも可能である。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているような当業者に周知の方法に従って調製しうる。
【０１２３】
投与の簡便性および投与量の均一性のためには、経口用または非経口用組成物を単位用量剤形（ｕｎｉｔ ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍ）として製剤化することが特に有利である。本明細書で用いる単位用量剤形とは、治療しようとする対象に対する単位用量として適した物理的に離散的な単位のことを指し、各単位は必要な医薬担体とともに望ましい治療効果を生じるように計算された規定量の活性化合物を含む。本発明の単位用量剤形に関する仕様は、活性化合物に特有な特徴および達成しようとする特定の治療効果、ならびに個体の治療のためのこのような活性化合物の調合の技術分野に内在する制限によって規定されるとともに、それらに直接依存する。
【０１２４】
このような化合物の毒性および治療的有効性は、培養された細胞または実験動物のいずれかを用いる標準的な製薬学的手順によってＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）を求めることによって決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量の比が治療係数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表現しうる。大きな治療係数を示す化合物が好ましい。有害な副作用を示す化合物を用いてもよいが、このような化合物を罹患組織に指向させる送達系を設計するためには、非罹患細胞に対する障害をできるだけ少なくし、それによって副作用を軽減するように注意する必要がある。
【０１２５】
細胞培養アッセイ法および動物試験によって得られたデータを、ヒトで使用するための用量の範囲を設定するために用いることができる。このような化合物の用量は、ほとんどまたは全く毒性がなく、ＥＤ５０を含む循環血中濃度の範囲内にあることが好ましい。採用する剤形および用いる投与経路に応じて、この範囲内で用量を変更することができる。本発明の方法に用いる任意の化合物に関して、治療的有効量を細胞培養アッセイ法によってまず推定することができる。細胞培養物で決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の半値抑制が得られる被験化合物の濃度）を含む流血中血漿中濃度が達成される用量を動物モデルに処方してもよい。このような情報は、ヒトでの有用な用量をより正確に決定するために用いることができる。血漿中濃度は、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【０１２６】
本明細書に定義する、蛋白質またはポリペプチドの治療的有効量（すなわち、有効量）は、約０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、好ましくは約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、さらにより好ましくは約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２〜９ｍｇ／ｋｇ、３〜８ｍｇ／ｋｇ、４〜７ｍｇ／ｋｇまたは５〜６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。当業者は、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の全般的健康状態および／または年齢、ならびに他に存在する疾患を非制限的に含むある種の要因が、対象を有効に治療するために必要な投与量に影響を及ぼす可能性があることを理解すると考えられる。さらに、治療的有効量のタンパク質、ポリペプチドまたは抗体による対象の治療は、単一の治療を含むこともでき、または好ましくは一連の治療を含むこともできる。
【０１２７】
１つの好ましい例においては、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の抗体、タンパク質またはポリペプチドにより、週に１回、約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、より好ましくは約３〜７週、さらにより好ましくは約４、５または６週間にわたって対象をＬＣＰＵＦＡで治療する。治療に用いる抗体、タンパク質またはポリペプチドの有効量が個々の治療の経過に伴って増加または減少する可能性があることも理解されると考えられる。投与量の変化が起こる可能性もあり、それは本明細書に記載の診断アッセイ法の結果から明らかになる。
【０１２８】
薬学的組成物は、投与のための指示とともに容器、包みまたはディスペンサー中に含めることができる。
【０１２９】
以下の実施例によって本発明をさらに例示するが、これは制限的なものとみなされるべきではない。本明細書ならびに図面の全体を通じて引用されるすべての参考文献、特許および公表された特許出願の内容は、参照として本明細書に組み入れられる。
【０１３０】
実施例
材料：ヤブレツボカビ属ＡＴＣＣ ２１６８５およびピティウム・イレギュラレは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、２０８５２ ＵＳＡ）から購入し、培地中（Ｗｅｅｔｅ， Ｊ．Ｄ．ら（１９９７）Ｌｉｐｉｄｓ ３２：８３９〜８４５）にて２４℃で７日間増殖させた。これに続いて、バイオマスを遠心処理によって回収し、ＲＮＡの単離に用いた。
【０１３１】
実施例１：構築およびｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
以上の材料から、キュウ（Ｑｉｕ）およびエリクソン（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ）（Ｑｉｕ， Ｘ．およびＥｒｉｅｋｓｏｎ， Ｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒ． １２：２０９〜２１４）に従って全ＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡライブラリーを全ＲＮＡから構築した。第１鎖ｃＤＮＡはギブコ社（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）のスーパースクリプトＩＩ（ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ）逆転写酵素によって合成した。第２鎖ｃＤＮＡはストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社のＤＮＡポリメラーゼＩによって合成した。サイズ分画の後に、１ｋｂを上回るｃＤＮＡ挿入物をλ Ｕｎｉ−Ｚａｐ ＸＲベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に連結した。続いて、この組換えＤＮＡをギガパックＩＩＩゴールド（Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ ｇｏｌｄ） パッケージング抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてパッケージ化し、ＮＺＹプレートに播いた。この結果得られたライブラリーは５×１０６種の独立したクローンを示した。ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ、Ｆｒｉｔｓｅｈ， Ｅ．Ｆ．、Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．（１９８９）「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ − Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ）に従って行った。
【０１３２】
実施例２：ＲＴ−ＰＣＲ
スーパースクリプトＩＩ（ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ）逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）によって全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを合成し、２つの縮重プライマー（順方向プライマー：
2004516017.tif 000003
および逆方向プライマー：
2004516017.tif 000004
）を用いるＰＣＲ反応のためのテンプレートとして用いた。ＰＣＲ増幅は、９４℃ １分間、５５℃ １．５分間および７２℃ ２分間を３５サイクルを行った後の７２℃ １０分間の伸長段階からなる。８００ｂｐ〜１０００ｂｐの増幅産物をアガロースゲルから単離し、キット（Ｑｉａｅｘ ＩＩゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した後にＴＡクローニングベクターｐＣＲ（登録商標）２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングした。続いて、クローニングした挿入物の配列を、プリズム・ダイデオキシ・ターミネーター・サイクルシークエンシング・システム（ＰＲＩＳＭ ＤｙｅＤｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｒｎｓ）によって決定した。
【０１３３】
実施例３：ＦＡＤ４、ＦＡＤ５、ＦＡＤ５−２およびＦＡＤ６の酵母における発現
Ｆａｄ４、Ｆａｄ５、Ｆａｄ５−２およびＦａｄ６のオープンリーディングフレームを、プレシジョンプラス（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ）酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いるＰＣＲによって増幅し、ＴＡクローニングベクター（ｐＣＲ（登録商標）２．１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングした。ＰＣＲ産物が最初のｃＤＮＡと同一であることをシークエンシングによって確認した後に、断片をＢａｒｎＨＩ−ＥｃｏＲＩ二重消化によって遊離させ、酵母発現ベクターｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の誘導性プロモーターＧＡＬ１の制御下に挿入した。
【０１３４】
酢酸リチウム法を用いて、酵母Ｉｎｖｓｃ２株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をこの発現構築物によって形質転換し、ウラシルを含まない最少培地上で形質転換体を選択した（Ｇｉｅｔｚ， Ｄ．ら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：１４２５；Ｃｏｖｅｌｌｏ， Ｐ．Ｓ．およびＲｅｅｄ， Ｄ．Ｗ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １１１：２２３〜２２６）。
【０１３５】
ウラシルを含まず、グルコースを含む最少培地上で２８℃にて形質転換体をまず増殖させた。一晩培養した後に、細胞を遠心沈降させ、洗浄した上で蒸留水中に再懸濁した。２％ガラクトースを含み、さらに０．１％タージトールの存在下で０．３ｍＭの基質脂肪酸を含む最少培地または含まない最少培地を、酵母形質転換体の細胞浮遊液に接種し、２０℃で３日間インキュベートし、その後に１５℃でさらに３日間インキュベートした。
【０１３６】
実施例４：脂肪酸分析
ヤブレツボカビ、ピティウム・イレギュラレおよび酵母細胞を採取し、蒸留水で２回洗った。続いて２ｍＬメタノール性ＫＯＨ（７．５％ｗ／ｖ ＫＯＨ、９５％メタノール中）を材料に添加し、１２ｍｌガラス培養試験管に密封した混合物を８０℃に２時間加熱した。０．５ｍＬの水を添加し、非鹸化性脂質を除去するために試料を２ｍＬヘキサンで２回抽出した。続いて、残った水相を１ｍＬ ６Ｎ ＨＣｌの添加によって酸性化し、２ｍＬヘキサンで２回抽出した。ヘキサン相を一緒にして、窒素流の下で乾燥させた。２ｍＬの３Ｎメタノール性ＨＣｌ（ＳＵＰＥＬＣＯ、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｐａｒｋ、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、ＰＡ １６８２３−００４８）を添加し、混合物を８０℃で２時間加熱した。室温に冷ました後に、１ｍＬの０．９％ＮａＣｌを添加し、混合物を２ｍＬヘキサンで２回抽出した。一緒にしたヘキサンを窒素流の下で蒸発させた。その結果得られた脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を、コベロ（Ｃｏｖｅｌｌｏ）およびリード（Ｒｅｅｄ）（Ｃｏｖｅｌｌｏ， Ｐ．Ｓ．およびＲｅｅｄ， Ｄ．Ｗ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １１１：２２３〜２２６）に従って、ＧＣおよびＧＣ−ＭＳにより分析した。
【０１３７】
ＧＣ／ＭＳ分析は、マスリンクス（Ｍａｓｓｌｙｎｘ）バージョン２．０ソフトウエアにより制御され、ＧＣ ８０００シリーズのガスクロマトグラフィー装置と接続されたフィソンズ（Ｆｉｓｏｎｓ）ＶＧ ＴＲＩＯ ２０００質量分析計（ＶＧ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ、ＵＫ）を用いて、標準的なＥＩモードで行った。温度プログラム下で１８０℃に１分間おいた後に４Ｃ／分の速度で２４０℃にして１５分間保ったＤＢ−２３カラム（３０Ｍ×内径０．２５ｍｍ、膜厚０．２５Ｉｌｍ、Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆｏｌｓｏｍ、ＣＡ）を、ＦＡＭＥ分析に用いた。
【０１３８】
実施例５：カラシナおよびアマ（ＬＩＮＵＭ ＵＳＩＴＡＴＩＳＳＩＭＵＭ）の形質転換ならびに外因性脂肪酸処理
カラシナ（Ｂ． ｊｕｎｃｅａ）およびアマの５〜６日齢実生の胚軸を、種々のプロモーターの制御下にある完全長ｃＤＮＡを有するバイナリーベクターの宿主であるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を接種するための体外培養組織として用いた。２０日齢のトランスジェニック実生を外因性脂肪酸処理に用いた。実生を葉、茎および根の３つの部分に分けた。それぞれを切断して小片にし、２４ウェルタイタープレートに入れた。各ウェルに２ｍＬの０．０５％基質ナトリウム塩（ＮｕＣｈｅｃｋ Ｐｒｅｐ Ｉｎｃ．、Ｅｌｙｓｉａｎ、ＭＮ）を添加した。次にプレートをゆっくりと振盪しながら２４℃で４時間インキュベートした。インキュベーションの後に、植物組織を水で３回洗って脂肪酸分析に用いた。
【０１３９】
実施例６：ヤブレツボカビ属の脂肪酸プロファイル
ヤブレツボカビおよびピティウム・イレギュラレは、ＤＨＡ、ＡＡ、ＥＰＡおよびＤＰＡなどのＬＣＰＵＦＡを産生する能力があることから、科学界で最近関心を集めている。図１５および１６はそれぞれヤブレツボカビ属およびピティウム・イレギュラレの７日培養物から単離した脂質の脂肪酸組成を示している。表に示した通り、これらの微生物は、ｎ−３およびｎ−６系の両方の、１８炭素Δ６脂肪酸（γ−リノレン酸およびステアリドン酸）から２２炭素Δ４脂肪酸（ＤＨＡおよびＤＰＡ）までの広範囲にわたる多価不飽和脂肪酸を含む。これらの生物、特にヤブレツボカビ属は、ＤＨＡおよびＤＰＡの生合成に必要な不飽和化酵素および伸長酵素のすべてのセットを含むように思われる。この菌株には、プレチャー（Ｐｒｅｃｈｅｒ）経路におけるＤＨＡおよびＤＰＡの合成の前駆物質と提唱されている２４炭素多価不飽和脂肪酸が存在しない（Ｖｏｓｓ， Ａ．ら（１９９１）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：１９９９５〜２００００；Ｍｏｈａｍｍｅｄ， Ｂ．Ｓ．ら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３２６：４２５〜４３０）。ヤブレツボカビ属では、２４炭素脂肪酸はＤＨＡおよびＤＰＡなどの２２炭素Δ４脂肪酸のインビボ合成に関与しないと思われる。
【０１４０】
実施例７：「前端」不飽和化酵素をコードするｃＤＮＡの同定
ヤブレツボカビ属およびピティウム・イレギュラレにおいてＬＣＦＵＦＡの生合成に関与する不飽和化酵素をコードする遺伝子を同定するために、ＰＣＲを用いるクローニング法を適用した。前端不飽和化酵素中のｃｙｔ ｂ５様ドメインのＮ末端伸長部分のヘム結合モチーフ、およびすべてのミクロソーム不飽和化酵素中の第３の保存的ヒスチジンモチーフをそれぞれ標的とするように２つの縮重プライマーを設計した。この設計の背景にある根拠は、ヤブレツボカビ属およびピティウム・イレギュラレにおけるＥＰＡおよびＤＨＡの生合成に関与する不飽和化酵素に、他の前端不飽和化酵素と類似した一次構造、すなわち不飽和化酵素中のｃｙｔ ｂ５様ドメインのＮ末端伸長部分があるはずというものである。ヤブレツボカビ属およびピティウム・イレギュラレから、Ｎ末端にｃｙｔ ｂ５様ドメインを含む融合タンパク質をコードする４つのｃＤＮＡ断片が同定された。
【０１４１】
完全長ｃＤＮＡクローンを同定するために、４つの挿入物をプローブとして用いて、ヤブレツボカビ属およびピティウム・イレギュラレのｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行ったところ、各群で複数のｃＤＮＡクローンが同定された。これらの全クローンのシークエンシングにより、４つの完全長ｃＤＮＡが同定され、Ｆａｄ４、Ｆａｄ５、Ｆａｄ５−２およびＦａｄ６と命名された。Ｆａｄ４のオープンリーディングフレームは１５６０ｂｐであり、分子量が５９．１ｋＤａの５１９アミノ酸をコードする（図１）。Ｆａｄ５は１２３０ｂｐ長であり、分子量が４９．８ｋＤａの４３９アミノ酸をコードする（図２）。ヤブレツボカビ属由来のこれらの２つの配列を比較したところ、推定されるタンパク質の間のアミノ酸同一性は１６％に過ぎなかった。詳細な分析により、Ｆａｄ４がＦａｄ５よりも８０アミノ酸長く、それが第２および第３の保存的ヒスチジンモチーフの間に存在することが明らかになった（図３）。ピティウム・イレギュラレ由来のＦａｄ５−２のオープンリーディングフレームは１３７１ｂｐであり、４５６アミノ酸をコードする（図４）。ピティウム・イレギュラレ由来のＦａｄ６は１３８３ｂｐ長であり、４６０アミノ酸をコードする（図５）。ピティウム・イレギュラレ由来の２つの配列の比較により、推定されるタンパク質の間の類似性は３９％を上回ることが示された（図６）。
【０１４２】
タンパク質データベースのＢＬＡＳＴＰ（商標）検索により、４つのタンパク質、Ｆａｄ４、Ｆａｄ５、Ｆａｄ５−２およびＦａｄ６のそれぞれに関して以下のヒットが判明した：
Ｆａｄ４（５１９アミノ酸残基）
Ｂｌａｓｔｐ ｎｒ
2004516017.tif 000005
Ｆａｄ ５（４３９アミノ酸残基）
Ｂｌａｓｔｐ ｎｒ
2004516017.tif 000006
Ｆａｄ５−２（４５６アミノ酸残基）
Ｂｌａｓｔｐ ｎｒ
2004516017.tif 000007
Ｆａｄ ６（４５９アミノ酸残基）
Ｂｌａｓｔｐ ｎｒ
2004516017.tif 000008
【０１４３】
実施例８：ＦＡＤ４、ＦＡＤ５、Ｆａｄ５−２およびＦＡＤ６の酵母における発現
Ｆａｄ４の機能を確かめるために、完全長ｃＤＮＡを誘導性プロモーターの制御下で酵母Ｉｎｖｓｃ２株にて発現させた。図７は、培地に２２：５（７，１０，１３，１６，１９）を補充することにより、Ｆａｄ４ ｃＤＮＡを含む酵母細胞がベクター対照と比較して別の脂肪酸を有したことを示している。ピークの保持時間はＤＨＡ標準物質と同一であった。遊離脂肪酸のＬＣ／ＭＳ分析により、負イオンエレクトロスプレー法でＤＨＡ標準物質と同一な脱プロトン化分子イオン（ｍ／ｚ＝２７９）が生じたことが示された。さらに、ＦＡＭＥのＧＣ／ＭＳ分析により、ピークのスペクトルがＤＨＡ標準物質のものと同一であることも示された（図８）。これらの結果は、Ｆａｄ４が、２２：５（７，１０，１３，１６，１９）基質の４位に二重結合を導入してΔ４不飽和化脂肪酸ＤＨＡ（２２：６−４，７，１０，１３，１６，１９）を生成しうる、Δ４脂肪酸不飽和化酵素であることを示している。
【０１４４】
Ｆａｄ４の基質特異性をさらに調べるために、１８：２（９，１２）、１８：３（９，１２，１５）、２０：３（８，１１，１４）および２２：４（７，１０，１３，１６）を含むを含む種々の基質を別個に酵母形質転換体に与えた。その結果から、Ｆａｄ４が２２：４（７，１０，１３，１６）を基質として用いて（図９）、別のΔ４不飽和化脂肪酸であるＤＰＡ（２２：５−４，７，１０，１３，１６）も生成しうることが示された（図１０）。検討した残りの脂肪酸は有効な基質ではなかった。
【０１４５】
Ｆａｄ５およびＦａｄ５−２の機能を確かめるために、出芽酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｉｎｖｓｃ２株に対して、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下にあるＦａｄ５およびＦａｄ５−２のオープンリーディングフレームをそれぞれ含むプラスミドによる形質転換を行った。ホモ−γ−リノレン酸（ＨＧＬＡ、２０：３−８，１１，１４）を含む培地中で酵母形質転換体にガラクトースによる誘導を行ったところ、形質転換体に蓄積するＦＡＭＥのクロマトグラムに、対照と比較して別のピークが観察された（図１１）。このクロマトグラムと標準物質のものとの比較により、この脂肪酸の保持時間がアラキドン酸標準物質（ＡＡ、２０：４−５，８，１１，１４）と同一であることが判明した。この産物の位置化学をさらに確認するために、ＦＡＭＥをＧＣ／ＭＳにより分析した。図１２は、この新たな脂肪酸およびＡＡ標準物質の質量スペクトルが同一であることを示している。これらの結果は、酵母ではＦａｄ５およびＦａｄ５−２がＨＧＬＡ（２０：３−８，１１，１３）をＡＡ（２０：４−５，８，１１，１４）に変換することを示している。Ｆａｄ５−２の基質特異性をさらに調べるために、Ｆａｄ５−２を含むプラスミドを、Δ９不飽和化酵素遺伝子であるｏｌｅ１が破壊されている別の酵母株であるＡＭＹ−２αに導入した。この菌株はモノ不飽和脂肪酸を補充しなければ最少培地中で増殖することができない。この実験で、この菌株はＦａｄ５−２の基質ではない１７：１（１０Ｚ）を補充した最少培地で増殖したため、種々の基質、特に一不飽和脂肪酸に対する酵素の特異性を検討することにした。１６：１（９Ｚ）、１８：１（９Ｚ）、１８：１（１１Ｚ）、１８：１（１１Ｅ）、１８：１（１２Ｅ）、１８：１（１５Ｚ）、１８：２（９Ｚ，１２Ｚ）、１８：３（９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ）、２０：２（１１Ｚ，１４Ｚ）および２０：３（１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ）を含む、考えられるさまざまな基質を検討した。その結果、Ｆａｄ５−２がΔ９エチレン性およびΔ１１エチン性二重結合を有する不飽和脂肪酸、ならびにΔ８エチレン性二重結合（２０：３−８，１１，１４）を有する脂肪酸を不飽和化しうることが示された。図１３に示した通り、Ｆａｄ５−２は１８：１（９Ｚ）および１８：１（１１Ｚ）基質の両方を、対応するΔ５不飽和化脂肪酸である１８：２−５，９（保持時間１０．３４分）および１８：１−５，１１（保持時間１０．４４分）のそれぞれに効率的に変換した。また、Ｆａｄ５−２は１８：１（１１Ｅ）および１８：１（１２Ｅ）などのトランス型脂肪酸も不飽和化した。
【０１４６】
図２５は、酵母ＡＭＹ−２αで検討した、Ｆａｄ５−２の脂肪酸基質に対する基質選好性を比較したものである。基質および蓄積した産物の相対的割合は、酵素の基質選好性の有用な指標である。図２５に示した通り、Ｆａｄ５−２は、２０：３（８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）、２０：３（１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ）および２０：２（１１Ｚ，１４Ｚ）などの２０炭素を有する脂肪酸を基質として選好する。一方、より短鎖の脂肪酸は、酵母におけるこの酵素の基質としては相対的に弱かった。
【０１４７】
Ｆａｄ６の機能をさらに確かめるために、出芽酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）宿主Ｉｎｖｓｃ２株に対して、ガラクトース誘導性プロモーターＧＡＬ１の制御下にあるＦａｄ６のオープンリーディングフレームを含むプラスミドによる形質転換を行った。リノール酸を含む培地中で酵母形質転換体にガラクトースによる誘導を行ったところ、形質転換体に蓄積するＦＡＭＥのクロマトグラムに、対照と比較して別のピークが観察された（図１４）。このクロマトグラムと標準物質のものとの比較により、この脂肪酸の保持時間がγ−リノレン酸（ＧＬＡ、１８：３−６，９，１２）標準物質と同一であることが判明した。産物の位置選択性をさらに検討するために、発現株からの脂肪酸のジエチルアミン誘導体をＧＣ−ＭＳにより分析した。図１５は、この新たなピークが、Δ６、Δ９およびΔ１２位に３つの二重結合がある真のＧＬＡであることを示している。ｎおよびｎ＋１炭素の主断片に１２Ｄの違いがあることは、炭素ｎ＋１およびｎ＋２の間に二重結合があることの指標となる。このため、１５６および１６８、１９６および２０８、ならびに２３６および２４８の断片は、それぞれΔ６、Δ９およびΔ１２位に二重結合があることを意味する。これらの結果は、Ｆａｄ６が酵母においてリノール酸（１８：２）をＧＬＡに変換するΔ６不飽和化酵素であることを示している。
【０１４８】
実施例９：ＦＡＤ４のカラシナにおける発現
ヤブレツボカビＦａｄ４が脂肪種子作物において機能するか否かを明らかにするために、構成性プロモーターの制御下にあるＦａｄ４を含む構築物によってカラシナの形質転換を行った。８種の独立したトランスジェニック植物が得られた。カラシナには利用しうるΔ４脂肪酸不飽和化酵素基質がない。このため、この植物におけるトランスジェニック酵素の活性を検討するためには、２２：５（ｎ−３）基質を外因的に供給する必要がある。この実験では、野生型およびトランスジェニック体の両方にドコサペンタエン酸ナトリウムの水溶液を与えた。外因的に供給した基質はいずれの種類の植物の根、茎および葉によっても直ちに取り込まれるが、ＤＨＡに変換されるのはトランスジェニック体のみであることが明らかになった。葉でのＤＨＡの産生レベルは根および茎よりも高かった。葉では、外因性基質が全脂肪酸の１０〜２０％のレベルまで取り込まれ、Δ４不飽和化脂肪酸（２２：６、ｎ−３）が全脂肪酸の３〜６％の範囲として産生された（図１６）。これらの結果は、ヤブレツボカビ由来のΔ４脂肪酸不飽和化酵素が脂肪種子作物において機能することを示している。
【０１４９】
実施例１０：Ｆａｄ５−２のカラシナにおける発現
Ｆａｄ５−２が脂肪種子作物で機能するか否か、およびその発現が成長および発育に影響を及ぼすか否かを明らかにするために、カラシナに対して、構成性プロモーター（タンデム型カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）の後ろにＦａｄ５−２ ｃＤＮＡを含むバイナリーベクターによる形質転換を行った。６種の独立した一次トランスジェニック植物が得られ、異なる組織由来の脂質の脂肪酸プロファイルを決定した。図１７は、Ｔ１系統の３週齢実生植物の脂肪酸組成を示している。野生型と比べて、すべてのトランスジェニック植物組織は４つの新たなピークを含む変化した脂肪酸プロファイルを有し、これらは４種の異なるΔ５非不飽和化ポリメチレン中断型脂肪酸（Δ５−ＵＰＩＦＡ）、具体的にはタキソール（ｔａｘｏｌｅｉｃ）酸（１８：２−５，９）；エフェドレン（ｅｐｈｅｄｒｅｎｉｃ）酸（１８：２−５，１１）；ピノレン（ｐｉｎｏｌｅｎｉｃ）酸（１８：３−５，９，１２）およびコニフェロン酸（ｃｏｎｉｆｅｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（１８：４−５，９，１２，１５）と同定された。このように、カラシナは酵母と同様に、Ｐ．イレギュラレΔ５不飽和化酵素を機能的に発現し、内因性基質１８：１−９；１８：１−１１；１８：２−９，１２および１８：３−９，１２，１５を対応するΔ５不飽和化脂肪酸に変換することができる。根はΔ５−ＵＰＩＦＡの産生量が最も多く、全脂肪酸の２０％を占め、これに続いて茎では６％、葉では５％であった（図１７）。
【０１５０】
カラシナには利用しうるホモ−γ−リノレン酸（２０：３−８，１１，１４）基質はない。このため、トランスジェニック植物がＡＡを産生しうるか否かを検討するために、基質２０：３（８，１１，１４）を外因的に供給した。この実験では、野生型およびトランスジェニック体の両方にホモ−γ−リノレン酸ナトリウムの水溶液を与えた。外因的に供給した基質はトランスジェニック植物の根、茎および葉によって直ちに取り込まれる、植物内部でＡＡに変換されることが明らかになった（図１８）。
【０１５１】
Δ５−ＵＰＩＦＡは植物のすべての部分に蓄積したが、トランスジェニックカラシナの成長および発育に対する表現型効果は観察されなかった。葉、茎および根などの植物組織の成長および発育は、対応する野生型と区別できなかった。
【０１５２】
種子においてΔ５不飽和化脂肪酸を産生させるために、カラシナに対して、異種性種子特異的プロモーター（アブラナのナピンプロモーター）の後ろにＦａｄ５−２ ｃＤＮＡを含む構築物による形質転換を行った。トランスジェニック種子の脂肪酸分析により、トランスジェニック体のガスクロマトグラムには、野生型対照と比べて２つの新たな脂肪酸が生じていることが示された（図１９）。それらはタキソール酸（１８：２−５，９）およびピノレン酸（１８：３−５，９，１２）と同定された。これらの脂肪酸を合わせると種子脂肪酸の９．４％であった。非形質転換対照と比較して、Δ５−ＵＰＩＦＡの蓄積はオレイン酸含有量に有意な影響を及ぼさなかった。
【０１５３】
実施例１１：Ｆａｄ５−２のアマにおける発現
アマ種子においてΔ５不飽和化脂肪酸を産生させるために、２つの種子特異的プロモーター、すなわち異種性のアブラナナピンプロモーターおよびアマ内因性プロモーターの制御下にあるＦａｄ５−２により、アマの形質転換を行った。図２６に示す通り、ナピンプロモーターを含むトランスジェニック植物は、１種類のΔ５不飽和化脂肪酸、すなわちタキソール酸を種子において全脂肪酸の１％のレベルで産生した。一方、アマニ特異的プロモーターを含むトランスジェニック植物は３種類のΔ５不飽和化脂肪酸：タキソール酸、ピノレン酸およびコニフェロン酸を産生した。これらのうち、タキソール酸（１８：２−５，９）の存在量が最も多く、選んだ系統（ＦＮ−１０−１）における全脂肪酸の９％を占め、次いでコニフェロン酸およびピノレン酸の順であった。驚いたことに、トランスジェニック種子におけるΔ５不飽和化脂肪酸の蓄積は他の脂肪酸の組成、特にオレイン酸レベルに大きな影響を及ぼした。異なるプロモーターの制御下でＦａｄ５−２不飽和化酵素を発現する２種類のトランスジェニック植物のいずれにおいても、Δ５−ＵＰＩＦＡの蓄積に伴ってオレイン酸は著しく増加した。ナピン特異的およびアマ種子特異的プロモーターを有するトランスジェニック植物におけるオレイン酸の含有量はそれぞれ全脂肪酸の平均４４．７％および２４．３％に達し、これに対して非形質転換対照は１７．４％であった。
【０１５４】
実施例１２：ＦＡＤ６のアマにおける発現
アマ種子においてΔ６不飽和化脂肪酸を産生させるために、２つの品種のアマに対して、異種性種子特異的プロモーター（アブラナのナピンプロモーター）の制御下にあるＦａｄ６ ｃＤＮＡを含む構築物による形質転換を行った。品種Ｉのアマ（Ｎｏｒｍａｎｄｙ種）は伝統的な産業用脂肪種子作物であり、これに対して品種ＩＩ（Ｓｏｌｉｎ種）は、品種Ｉの化学的変異誘発に由来する食用脂肪種子作物である。合計１２種のトランスジェニック植物を作製した。トランスジェニック体の大半は、保持時間がＧＬＡおよびＳＤＡのものに対応する２つの新規脂肪酸を示し、それらは全脂肪酸の０．１〜４．３％を占めた（図２７）。ソリン（Ｓｏｌｉｎ）種のトランスジェニック体におけるＧＬＡレベルはＳＤＡのものよりも高かったが、ノルマンディー（Ｎｏｒｍａｎｄｙ）種のトランスジェニック体におけるＧＬＡレベルはＳＤＡのものよりも低かった。これは、ソリン種のアマニにおける主要な脂肪酸がリノール酸であり、ノルマンディー種の種子における主要な脂肪酸がリノレン酸であることから理解しうる。
【０１５５】
実施例１３：ＦＡＤ６のカラシナにおける発現
カラシナ種子においてΔ６不飽和化脂肪酸を産生させるために、カラシナに対して、アマの形質転換に用いたのと同じ構築物、すなわち、アブラナのナピンプロモーターの制御下にＦａｄ６がある構築物による形質転換を行った。１５種の独立したトランスジェニック植物が得られた。トランスジェニック種子の脂肪酸分析により、大部分のトランスジェニック体のガスクロマトグラムには、野生型対照と比べて３種の新たな脂肪酸が生じていることが示された（図２０）。この３種の脂肪酸は１８：２（６，９）および１８：３（６，９，１２）および１８：４（６，９，１２，１５）と同定された。カラシナはアマと同様に、Ｐ．イレギュラレ由来のＦａｄ６を機能的に発現し、内因性基質１８：１（９）、１８：２（９，１２）および１８：３（６，９，１２）の６位に二重結合を導入して、トランスジェニック種子において対応する３種のΔ６脂肪酸の産生をもたらすことが可能である。トランスジェニック種子で産生される３種の新たな脂肪酸のうち、最も存在量が多いのはＧＬＡであり、トランスジェニック種子におけるレベルは全脂肪酸の３０％〜３８％である。次に存在量の多い成分はＳＤＡであり、これは複数のトランスジェニックにおいて全脂肪酸の３〜１０％を占めている（図２１）。
【０１５６】
トランスジェニック種子の脂肪酸組成を図２２に示している。Δ６不飽和化脂肪酸の高レベル産生が、２つの主要な脂肪酸であるリノール酸およびリノレン酸を代償にしていることが明らかである。トランスジェニック体におけるオレイン酸およびステアリン酸の割合は野生型対照よりも幾分低いが、有意差はなかった。トランスジェニック体におけるリノール酸の含有量は著しく減少していた。形質転換されていない野生型では、リノール酸が種子内の全脂肪酸の４０％以上を占める。トランスジェニック体では、そのレベルは１０％未満に低下した。トランスジェニック体におけるリノール酸の減少と比較すると、トランスジェニック体におけるリノレン酸の減少の著しさは落ちるが、それでも有意であった。形質転換されていない野生型では、リノレン酸は種子内の全脂肪酸の１０％以上を占めるが、トランスジェニック体ではそのレベルが５％未満に低下した。トランスジェニック種子で著しく減少した２種類の脂肪酸はΔ６不飽和化酵素の基質であり、この減少は対応する２つのΔ６不飽和化脂肪酸の産生を代償としたものである。
【０１５７】
等価物
当業者は、定型的な範囲の実験により、本明細書に記載された特定の態様の等価物を認識する、または確認しうると考えられる。このような等価物は特許請求の範囲に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヤブレツボカビ属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）由来のＦａｄ４のＤＮＡ配列およびタンパク質配列を示している；（Ａ）オープンリーディングフレームのｃＤＮＡ配列（配列番号：１）；および（Ｂ）翻訳されたタンパク質配列（配列番号：２）。
【図２】ヤブレツボカビ属由来のＦａｄ５のＤＮＡ配列およびタンパク質配列を示している；（Ａ）オープンリーディングフレームのｃＤＮＡ配列（配列番号：４）；および（Ｂ）翻訳されたタンパク質配列（配列番号：５）。
【図３】ヤブレツボカビ属由来のＦａｄ４およびＦａｄ５タンパク質配列（それぞれ配列番号：２および５）の比較を示している。縦線はアミノ酸の一致を示す。シトクロムｂ５ヘム結合モチーフおよびヒスチジンリッチモチーフなどの保存的モチーフを強調している。２つの矢印は、２つの縮重プライマーの結合位置を示している。
【図４】ピチウム・イレギュラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）由来のＦａｄ５−２のＤＮＡ配列およびタンパク質配列を示している；（Ａ）オープンリーディングフレームのｃＤＮＡ配列（配列番号：７）；および（Ｂ）翻訳されたタンパク質配列（配列番号：８）。
【図５】ピチウム・イレギュラレ由来のＦａｄ６ＤＮＡ配列およびタンパク質配列を示している；（Ａ）オープンリーディングフレームのｃＤＮＡ配列（配列番号：１０）；および（Ｂ）翻訳されたタンパク質配列（配列番号：１１）。
【図６】ピチウム・イレギュラレ由来のＦａｄ５−２およびＦａｄ６タンパク質配列（それぞれ配列番号：８および１１）の比較を示している。縦線はアミノ酸の一致を示す。シトクロムｂ５ヘム結合モチーフおよびヒスチジンリッチモチーフなどの保存的モチーフを強調している。２つの矢印は、２つの縮重プライマーの結合位置を示している。
【図７】Ｆａｄ４を外因性基質２２：５（ｎ−３）とともに発現している酵母Ｉｎｖｓｃ２株由来の脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）に対するガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析を示している。
【図８】図７中の新たなピークのＦＡＭＥに対するガスクロマトグラフィー／質量分析（ＭＳ）分析を示している；（Ａ）Ｆａｄ４産物；（Ｂ）ＤＨＡ（２２：６、ｎ−３）標準物質。
【図９】Ｆａｄ４を外因性基質 ２２：４（ｎ−６）とともに発現している酵母Ｉｎｖｓｃ２株由来のＦＡＭＥに対するＧＣ分析である。
【図１０】図９中の新たなピークのＦＡＭＥに対するＧＣ／ＭＳ分析である；（Ａ）Ｆａｄ４産物；（Ｂ）ＤＰＡ（２２：５、ｎ−６）標準物質。
【図１１】Ｆａｄ５を外因性基質 ２０：３（ｎ−６）とともに発現している酵母Ｉｎｖｓｃ２株由来のＦＡＭＥに対するＧＣ分析である。
【図１２】図１１中の新たなピークのＦＡＭＥに対するＧＣ／ＭＳ分析である；（Ａ）Ｆａｄ５産物；（Ｂ）ＡＡ（２０：４−５，８，１１，１４）標準物質。
【図１３】Ｆａｄ５−２をそれぞれ外因性基質１８：１−９（上の図）および１８：１−１１（下の図）とともに発現している酵母ＡＭＹ２α株由来のＦＡＭＥに対するＧＣ分析である。
【図１４】Ｆａｄ６を外因性基質１８：２（９，１２）とともに発現している酵母Ｉｎｖｓｃ２株由来のＦＡＭＥに対するＧＣ分析である。
【図１５】図１４による新たなピークの誘導体に対するＭＳ分析である。新たな脂肪酸のジエチルアミドの構造を、このアミド部分を含むイオンに関するｍ／ｚ値とともに示している。ｍ／ｚが１５６／１６８、１９６／２０８および２３６／２４８である３対のイオンはそれぞれΔ６、Δ９およびΔ１２位に二重結合がある指標となる。
【図１６】３５Ｓプロモーターの制御下にあるＦａｄ４を、外因的に供給した基質２２：５（ｎ−３）とともに発現しているカラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）の葉由来のＦＡＭＥに対するＧＣ分析である。
【図１７】３５Ｓプロモーターの制御下にあるＦａｄ５−２を有する、１つのトランスジェニックＴ１系統の植物組織（葉、茎および根）の脂肪酸組成を示している。脂肪酸レベルは、カラシナ（Ｂ． ｊｕｎｃｅａ）の全脂肪酸に占める重量百分率として示している。
【図１８】Ｆａｄ５−２を外因性基質ホモ−γ−リノレン酸（ＨＧＬＡ、２０：３−８，１１，１４）とともに発現しているカラシナの根ＦＡＭＥに対するＧＣ分析である。
【図１９】ナピンプロモーターの制御下にあるＦａｄ５−２を発現しているカラシナの種子から調製したＦＡＭＥに対するＧＣ分析である。
【図２０】Ｆａｄ６を発現しているカラシナ由来の種子ＦＡＭＥに対するＧＣ分析である。３つの新たなピークは、トランスジェニック種子に３種のΔ６不飽和化脂肪酸があることを示している。
【図２１】カラシナのＦａｄ６トランスジェニック種子に蓄積しているＧＬＡ（γ−リノレン酸）およびＳＤＡ（ステアリドン酸）の重量百分率を示している。
【図２２】Ｆａｄ６を発現している５種のトランスジェニック系統由来の種子脂質の脂肪酸組成を示している；ＳＡ＝ステアリン酸；ＯＡ＝オレイン酸；ＬＡ＝リノール酸；ＧＬＡ＝γ−リノレン酸；ＡＬＡ＝α−リノレン酸；ＳＤＡ＝ステアリドン酸。
【図２３】ヤブレツボカビ属の脂肪酸プロファイルを示した表である。
【図２４】ピティウム・イレギュラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）の脂肪酸プロファイルを示した表である。
【図２５】酵母ＡＭＹ−２α／ｐＦａｄ５−２株における外因性脂肪酸の変換を示した表である。
【図２６】ナピン（Ｎａｐｉｎ）プロモーターおよびアマニ特異的（Ｃｌｎ）プロモーターの制御下にあるＦａｄ５−２を発現しているトランスジェニックアマニにおけるΔ５−不飽和化ポリメチレン中断型脂肪酸（Δ５−ＵＰＩＦＡ）の蓄積を示した表である。脂肪酸レベルは全脂肪酸に占める重量百分率として示している。
【図２７】ナピンプロモーターの制御下にあるＦａｄ６を発現しているトランスジェニックアマニ（ソリン（Ｓｏｌｉｎ）種およびノルマンディー（Ｎｏｒｍａｎｄｙ）種）におけるΔ６不飽和化脂肪酸の蓄積を示した表である。脂肪酸レベルは全脂肪酸に占める重量百分率として示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年9月24日(2002.9.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本発明は、少なくとも一部には、新規な不飽和化酵素をコードする核酸分子のファミリーの発見に基づく。特に、本発明者らは、長鎖多価不飽和脂肪酸ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸、２２：６、ｎ−３）およびＤＰＡ（ドコサペンタエン酸、２２：５、ｎ−６）の生合成に関与するＦａｄ４（Δ４不飽和化酵素）、Ｆａｄ５およびＦａｄ５−２（Δ５不飽和化酵素）ならびにＦａｄ６（Δ６不飽和化酵素）を同定した；より詳細には、Ｆａｄ４は２２：５（ｎ−３）および２２：４（ｎ−６）を不飽和化してＤＨＡおよびＤＰＡを生じさせる；Ｆａｄ５およびＦａｄ５−２は２０：４（ｎ−３）および２０：３（ｎ６）を不飽和化してＥＰＡおよびＡＡを生じさせる；Ｆａｄ６は１８：２（ｎ−６）および１８：３（ｎ−３）を不飽和化してＧＬＡ（γ−リノレン酸）およびＳＤＡ（ステアリドン酸）を生じさせる。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
シトクロムｂ５ヘム結合モチーフおよびヒスチジンモチーフの例には、図３および６に示した、配列番号：２のアミノ酸残基４１〜４４、１８２〜１８６、２１６〜２２３および４５３〜４６２、配列番号：４のアミノ酸残基４０〜４３、１７１〜１７５、２０７〜２１３および３７５〜３８４、配列番号：６のアミノ酸残基４０〜４５、１７１〜１７６、２０８〜２１３および３９５〜４００、ならびに配列番号：８のアミノ酸残基４２〜４７、１７８〜１８３、２１５〜２２０および４００〜４０５が含まれる。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
単離された本発明の不飽和化酵素タンパク質は、配列番号：２、４、６もしくは８のアミノ酸配列と十分に相同なアミノ酸配列を有する、または配列番号：１、３、５、もしくは７と十分に相同なヌクレオチド配列によってコードされる。本明細書で用いる「十分に相同な」という用語は、第１および第２のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列が共通の構造ドメインもしくはモチーフおよび／または共通の機能的活性を有するような形で、第２のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と十分なまたは最小限の数の同一または同等なアミノ酸残基（例えば、類似した側鎖をもつアミノ酸残基）またはヌクレオチドを含む、第１のアミノ酸またはヌクレオチド配列のことを指す。例えば、ドメインのアミノ酸配列全体にわたって少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の相同性または同一性を有する共通の構造ドメインを有し、少なくとも１つ、好ましくは２つの構造ドメインまたはモチーフを含むアミノ酸配列またはヌクレオチド配列は、本明細書において十分に相同であると定義される。さらに、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の相同性または同一性を有し、共通の機能的活性を有するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列も、本明細書において十分に相同であると定義される。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
さらに、本発明の核酸分子は、配列番号：１、３、５または７の核酸分子の一部のみ、例えば、プローブもしくはプライマーとして用いうる断片、または不飽和化酵素タンパク質の一部、例えば不飽和化酵素タンパク質の生物活性部分をコードする断片などを含みうる。不飽和化酵素遺伝子のクローニングによって決定されたヌクレオチド配列により、不飽和化酵素ファミリーの他のメンバーならびに他の種由来の不飽和化酵素相同体の同定および／またはクローニングに用いるために設計されたプローブおよびプライマーの作製が可能となる。プローブ／プライマー（例えば、オリゴヌクレオチド）は一般に、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは一般に、配列番号：１、３、５もしくは７のセンス配列の、配列番号：１、３、５もしくは７のアンチセンス配列の、または配列番号：１、３、５もしくは７の天然の対立遺伝子バリアントもしくは変異体（ｍｕｔａｎｔ）の、少なくとも約１２または１５個、好ましくは約２０または２５個、より好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５または７５個の連続したヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列の領域を含む。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
不飽和化酵素、例えばＦａｄ４、Ｆａｄ５、Ｆａｄ５−２またはＦａｄ６の対立遺伝子バリアントには、機能的および非機能的な不飽和化酵素タンパク質の両方が含まれる。機能的な対立遺伝子バリアントとは、例えば、（ｉ）不飽和化酵素の基質もしくは標的分子（例えば、２２：５（ｎ−３）などの脂肪酸）と相互作用する能力；および／または（ｉｉ）不飽和化酵素の基質もしくは標的分子における炭素原子間に二重結合を形成する能力を維持している、不飽和化酵素タンパク質の天然のアミノ酸配列バリアントのことである。本発明の核酸分子およびタンパク質分子によって生成される脂肪酸は、加齢、ストレス、糖尿病、癌、炎症性疾患（例えば、関節炎、湿疹）および心血管疾患などの障害の治療にも有用である。機能的な対立遺伝子バリアントは一般に、配列番号：２、４、６もしくは８の１つもしくは複数のアミノ酸の保存的置換、またはタンパク質の重大でない領域における重大でない残基の置換、欠失もしくは挿入のみを含むと考えられる。


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
非機能的な対立遺伝子バリアントとは、例えば、（ｉ）不飽和化酵素の基質もしくは標的分子（例えば、２２：５（ｎ−３）などの中間体脂肪酸）と相互作用する能力；および／または（ｉｉ）不飽和化酵素の基質もしくは標的分子における炭素原子間に二重結合を形成する能力をもたない、不飽和化酵素タンパク質、例えばＦａｄ４、Ｆａｄ５、Ｆａｄ５−２またはＦａｄ６の天然のアミノ酸配列バリアントのことである。非機能的な対立遺伝子バリアントは一般に、配列番号：２、４、６もしくは８のアミノ酸配列の非保存的な置換、欠失もしくは挿入もしくは早期切断、またはタンパク質の重大残基もしくは重大領域における置換、挿入もしくは欠失を含むと考えられる。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
集団内に存在する可能性のある不飽和化酵素配列の天然の対立遺伝子バリアントに加えて、当業者はさらに、配列番号：１、３、５または７のヌクレオチド配列に変異によって変化を導入し、それにより、不飽和化酵素タンパク質の生物活性を変化させることなく、コードされる不飽和化酵素タンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらしうることを理解すると考えられる。例えば、配列番号：１、３、５または７の配列中の「非必須」アミノ酸残基の箇所に保存的アミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換を作製することができる。「非必須」アミノ酸残基とは、生物活性を変化させることなく、Ｆａｄ４、Ｆａｄ５、Ｆａｄ５−２またはＦａｄ６の野生型配列（例えば、配列番号：２、４、６または８の配列）からの変更が可能な残基のことであり、これに対して「必須」アミノ酸残基は生物活性に必要なものである。例えば、本発明の不飽和化酵素タンパク質の間で保存されているアミノ酸残基、例えばヘム結合モチーフまたはヒスチジンモチーフに存在するものは、特に変更不能であると予想される。さらに、本発明の不飽和化酵素タンパク質と脂肪酸不飽和化酵素ファミリーの他のメンバーとの間で保存されている別のアミノ酸配列も変更不能である可能性が高い。


【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
したがって、本発明のもう１つの局面は、活性のために必須でないアミノ酸残基に変化を含む不飽和化酵素タンパク質をコードする核酸分子に関する。このような不飽和化酵素タンパク質は、アミノ酸配列の点で配列番号：２、４、６または８とは異なるが、生物活性は保っている。１つの態様において、単離された核酸分子は、配列番号：２、４、６または８に対する、例えば配列番号：２、４、６または８の全長に対する相同性が、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上であるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。


【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
本明細書で用いる場合、不飽和化酵素タンパク質の「生物活性部分」には、不飽和化酵素分子と不飽和化酵素でない分子（例えば、脂肪酸などの不飽和化酵素基質）との間の相互作用に関与する、不飽和化酵素タンパク質の断片が含まれる。不飽和化酵素タンパク質の生物活性断片には、不飽和化酵素のアミノ酸配列と実質的に相同なまたはそれに由来するアミノ酸配列、例えば、不飽和化酵素タンパク質の活性の少なくとも１つを示すのに十分なアミノ酸残基を含む配列番号：２、４、６または８に示したアミノ酸配列、を含むペプチドが含まれる。生物活性部分は、不飽和化酵素タンパク質の活性；すなわち（ｉ）不飽和化酵素の基質もしくは標的分子（例えば、ＤＨＡなどの脂肪酸）と相互作用する能力；および／または（ｉｉ）不飽和化酵素の基質もしくは標的分子における炭素原子間に二重結合を形成する能力、の少なくとも１つを有するドメインまたはモチーフを含むことが一般的である。不飽和化酵素タンパク質の生物活性部分は、例えば、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００アミノ酸長またはそれ以上であるポリペプチドでありうる。


【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
もう１つの態様において、本発明の組換え細胞は、ピティウム・イレギュラレＡ５またはΔ６不飽和化酵素（Ｆａｄ５−２またはＦａｄ６遺伝子産物）（例えば、配列番号：６もしくは８のアミノ酸配列を有する、または配列番号：５もしくは７のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる脂肪酸不飽和化酵素）を過剰発現するように遺伝子工学による操作を受けている。


【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
実施例６：ヤブレツボカビ属の脂肪酸プロファイル
ヤブレツボカビおよびピティウム・イレギュラレは、ＤＨＡ、ＡＡ、ＥＰＡおよびＤＰＡなどのＬＣＰＵＦＡを産生する能力があることから、科学界で最近関心を集めている。図２３および２４はそれぞれヤブレツボカビ属およびピティウム・イレギュラレの７日培養物から単離した脂質の脂肪酸組成を示している。表に示した通り、これらの微生物は、ｎ−３およびｎ−６系の両方の、１８炭素Δ６脂肪酸（γ−リノレン酸およびステアリドン酸）から２２炭素Δ４脂肪酸（ＤＨＡおよびＤＰＡ）までの広範囲にわたる多価不飽和脂肪酸を含む。これらの生物、特にヤブレツボカビ属は、ＤＨＡおよびＤＰＡの生合成に必要な不飽和化酵素および伸長酵素のすべてのセットを含むように思われる。この菌株には、プレチャー（Ｐｒｅｃｈｅｒ）経路におけるＤＨＡおよびＤＰＡの合成の前駆物質と提唱されている２４炭素多価不飽和脂肪酸が存在しない（Ｖｏｓｓ， Ａ．ら（１９９１）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：１９９９５〜２００００；Ｍｏｈａｍｍｅｄ， Ｂ．Ｓ．ら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３２６：４２５〜４３０）。ヤブレツボカビ属では、２４炭素脂肪酸はＤＨＡおよびＤＰＡなどの２２炭素Δ４脂肪酸のインビボ合成に関与しないと思われる。


【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】ヤブレツボカビ属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）由来のＦａｄ４のＤＮＡ配列およびタンパク質配列を示している；（Ａ）オープンリーディングフレームのｃＤＮＡ配列（配列番号：１）；および（Ｂ）翻訳されたタンパク質配列（配列番号：２）。
【図２】ヤブレツボカビ属由来のＦａｄ５のＤＮＡ配列およびタンパク質配列を示している；（Ａ）オープンリーディングフレームのｃＤＮＡ配列（配列番号：３）；および（Ｂ）翻訳されたタンパク質配列（配列番号：４）。
【図３】ヤブレツボカビ属由来のＦａｄ４およびＦａｄ５タンパク質配列（それぞれ配列番号：２および４）の比較を示している。縦線はアミノ酸の一致を示す。シトクロムｂ５ヘム結合モチーフおよびヒスチジンリッチモチーフなどの保存的モチーフを強調している。２つの矢印は、２つの縮重プライマーの結合位置を示している。
【図４】ピチウム・イレギュラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）由来のＦａｄ５−２のＤＮＡ配列およびタンパク質配列を示している；（Ａ）オープンリーディングフレームのｃＤＮＡ配列（配列番号：５）；および（Ｂ）翻訳されたタンパク質配列（配列番号：６）。
【図５】ピチウム・イレギュラレ由来のＦａｄ６ＤＮＡ配列およびタンパク質配列を示している；（Ａ）オープンリーディングフレームのｃＤＮＡ配列（配列番号：７）；および（Ｂ）翻訳されたタンパク質配列（配列番号：８）。
【図６】ピチウム・イレギュラレ由来のＦａｄ５−２およびＦａｄ６タンパク質配列（それぞれ配列番号：６および８）の比較を示している。縦線はアミノ酸の一致を示す。シトクロムｂ５ヘム結合モチーフおよびヒスチジンリッチモチーフなどの保存的モチーフを強調している。２つの矢印は、２つの縮重プライマーの結合位置を示している。
【図７】Ｆａｄ４を外因性基質２２：５（ｎ−３）とともに発現している酵母Ｉｎｖｓｃ２株由来の脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）に対するガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析を示している。
【図８】図７中の新たなピークのＦＡＭＥに対するガスクロマトグラフィー／質量分析（ＭＳ）分析を示している；（Ａ）Ｆａｄ４産物；（Ｂ）ＤＨＡ（２２：６、ｎ−３）標準物質。
【図９】Ｆａｄ４を外因性基質 ２２：４（ｎ−６）とともに発現している酵母Ｉｎｖｓｃ２株由来のＦＡＭＥに対するＧＣ分析である。
【図１０】図９中の新たなピークのＦＡＭＥに対するＧＣ／ＭＳ分析である；（Ａ）Ｆａｄ４産物；（Ｂ）ＤＰＡ（２２：５、ｎ−６）標準物質。
【図１１】Ｆａｄ５を外因性基質 ２０：３（ｎ−６）とともに発現している酵母Ｉｎｖｓｃ２株由来のＦＡＭＥに対するＧＣ分析である。
【図１２】図１１中の新たなピークのＦＡＭＥに対するＧＣ／ＭＳ分析である；（Ａ）Ｆａｄ５産物；（Ｂ）ＡＡ（２０：４−５，８，１１，１４）標準物質。
【図１３】Ｆａｄ５−２をそれぞれ外因性基質１８：１−９（上の図）および１８：１−１１（下の図）とともに発現している酵母ＡＭＹ２α株由来のＦＡＭＥに対するＧＣ分析である。
【図１４】Ｆａｄ６を外因性基質１８：２（９，１２）とともに発現している酵母Ｉｎｖｓｃ２株由来のＦＡＭＥに対するＧＣ分析である。
【図１５】図１４による新たなピークの誘導体に対するＭＳ分析である。新たな脂肪酸のジエチルアミドの構造を、このアミド部分を含むイオンに関するｍ／ｚ値とともに示している。ｍ／ｚが１５６／１６８、１９６／２０８および２３６／２４８である３対のイオンはそれぞれΔ６、Δ９およびΔ１２位に二重結合がある指標となる。
【図１６】３５Ｓプロモーターの制御下にあるＦａｄ４を、外因的に供給した基質２２：５（ｎ−３）とともに発現しているカラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）の葉由来のＦＡＭＥに対するＧＣ分析である。
【図１７】３５Ｓプロモーターの制御下にあるＦａｄ５−２を有する、１つのトランスジェニックＴ１系統の植物組織（葉、茎および根）の脂肪酸組成を示している。脂肪酸レベルは、カラシナ（Ｂ． ｊｕｎｃｅａ）の全脂肪酸に占める重量百分率として示している。
【図１８】Ｆａｄ５−２を外因性基質ホモ−γ−リノレン酸（ＨＧＬＡ、２０：３−８，１１，１４）とともに発現しているカラシナの根ＦＡＭＥに対するＧＣ分析である。
【図１９】ナピンプロモーターの制御下にあるＦａｄ５−２を発現しているカラシナの種子から調製したＦＡＭＥに対するＧＣ分析である。
【図２０】Ｆａｄ６を発現しているカラシナ由来の種子ＦＡＭＥに対するＧＣ分析である。３つの新たなピークは、トランスジェニック種子に３種のΔ６不飽和化脂肪酸があることを示している。
【図２１】カラシナのＦａｄ６トランスジェニック種子に蓄積しているＧＬＡ（γ−リノレン酸）およびＳＤＡ（ステアリドン酸）の重量百分率を示している。
【図２２】Ｆａｄ６を発現している５種のトランスジェニック系統由来の種子脂質の脂肪酸組成を示している；ＳＡ＝ステアリン酸；ＯＡ＝オレイン酸；ＬＡ＝リノール酸；ＧＬＡ＝γ−リノレン酸；ＡＬＡ＝α−リノレン酸；ＳＤＡ＝ステアリドン酸。
【図２３】ヤブレツボカビ属の脂肪酸プロファイルを示した表である。
【図２４】ピティウム・イレギュラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）の脂肪酸プロファイルを示した表である。
【図２５】酵母ＡＭＹ−２α／ｐＦａｄ５−２株における外因性脂肪酸の変換を示した表である。
【図２６】ナピン（Ｎａｐｉｎ）プロモーターおよびアマニ特異的（Ｃｌｎ）プロモーターの制御下にあるＦａｄ５−２を発現しているトランスジェニックアマニにおけるΔ５−不飽和化ポリメチレン中断型脂肪酸（Δ５−ＵＰＩＦＡ）の蓄積を示した表である。脂肪酸レベルは全脂肪酸に占める重量百分率として示している。
【図２７】ナピンプロモーターの制御下にあるＦａｄ６を発現しているトランスジェニックアマニ（ソリン（Ｓｏｌｉｎ）種およびノルマンディー（Ｎｏｒｍａｎｄｙ）種）におけるΔ６不飽和化脂肪酸の蓄積を示した表である。脂肪酸レベルは全脂肪酸に占める重量百分率として示している。




【国際調査報告】
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