(57)【要約】ゲノム配列データから機能領域を推定、確認および表示する方法および装置が提供される。本方法および装置はゲノム配列データ内でコード領域を推定する、その発現を実験的に確認する、また、発現データをゲノム配列と有意義な関係で関連づけて表示するのに特に有用である。従って本発明の方法および装置は新規な遺伝子の発見に有効なツールとなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体にアドレス配置された複数の核酸プローブを含んでなり、該核酸プローブの少なくとも５０％が真核生物ゲノムのただ１つのエクソン断片を含み、該断片が発現した遺伝子と高いストリンジェンシーで選択的にハイブリダイズ可能であり、該複数の核酸プローブが平均少なくとも１００ｂｐの長さであり、かつ、該真核生物ゲノムが遺伝子あたり平均少なくとも１イントロンである、単一エクソン核酸マイクロアレイ。
【請求項２】
該核酸プローブの少なくとも９５％が該真核生物ゲノムのただ１つのエクソンの選択的ハイブリダイズ部分を含む、請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項３】
該エクソン含有核酸プローブの少なくとも５０％が、該断片の第１の末端に隣接して、同様にそのゲノムの該断片に隣接する第１のイントロン配列および／または遺伝子間配列をさらに含む、請求項１に記載の単一エクソン核酸マイクロアレイ。
【請求項４】
該エクソン含有核酸プローブの少なくとも９５％が、該断片の第１の末端に隣接して、同様にそのゲノムの該断片に隣接する第１のイントロン配列および／または遺伝子間配列をさらに含む、請求項１に記載の単一エクソン核酸マイクロアレイ。
【請求項５】
該エクソン含有核酸プローブの少なくとも５０％が、該断片の第１の末端に隣接して、同様にそのヒトゲノムの該断片に隣接する第１のイントロン配列および／または遺伝子間配列を含み、該断片の第２の末端に隣接して、同様にそのヒトゲノムの該断片に隣接する第２のイントロン配列および／または遺伝子間配列をさらに含む、請求項１に記載の単一エクソン核酸マイクロアレイ。
【請求項６】
該エクソン含有核酸プローブの少なくとも９５％が、該断片の第１の末端に隣接して、同様にそのヒトゲノムの該断片に隣接する第１のイントロン配列および／または遺伝子間配列を含み、該断片の第２の末端に隣接して、同様にそのヒトゲノムの該断片に隣接する第２のイントロン配列および／または遺伝子間配列をさらに含む、請求項１に記載の単一エクソン核酸マイクロアレイ。
【請求項７】
該エクソン含有核酸プローブの少なくとも５０％が原核生物ベクター配列およびバクテリオファージベクター配列を欠く、請求項１に記載の単一エクソン核酸マイクロアレイ。
【請求項８】
該エクソン含有核酸プローブの少なくとも９５％が原核生物ベクター配列およびバクテリオファージベクター配列を欠く、請求項１に記載の単一エクソン核酸マイクロアレイ。
【請求項９】
該エクソン含有核酸プローブの少なくとも５０％がＡまたはＴのホモポリマーストレッチを欠く、請求項１に記載の単一エクソン核酸マイクロアレイ。
【請求項１０】
該エクソン含有核酸プローブの少なくとも９５％がＡまたはＴのホモポリマーストレッチを欠く、請求項１に記載の単一エクソン核酸マイクロアレイ。
【請求項１１】
該真核細胞ゲノムが遺伝子あたり少なくとも平均２イントロンである、請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項１２】
該真核細胞ゲノムが遺伝子あたり少なくとも平均３イントロンである、請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項１３】
該真核細胞ゲノムが遺伝子あたり少なくとも平均５イントロンである、請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項１４】
該ゲノムがヒトゲノムである、請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項１５】
真核細胞ゲノムにおいて遺伝子を同定する方法であって、
該真核生物のゲノム配列から該遺伝子のエクソンの少なくとも１つをアルゴリズムで推定し、次いで
ｍＲＮＡ由来の核酸と、該推定エクソンと配列が同じであるか、または配列が相補的な選択的ハイブリダイズ部分を有する核酸プローブとのハイブリダイゼーションを検出することを含み、
該プローブが請求項１から１４のいずれか一項に記載の単一エクソンマイクロアレイ内に含まれる、方法。
【請求項１６】
真核生物遺伝子の発現を測定する方法であって、請求項１から１４のいずれか一項に記載の単一エクソンマイクロアレイと、検出可能なように標識された核酸の第１のコレクションとを接触させ（なお、該第１のコレクション核酸は少なくとも１つの真核生物組織または細胞種のｍＲＮＡに由来する）、次いで
該マイクロアレイの各プローブと検出可能なように結合した標識を測定する
ことを含む、方法。
【請求項１７】
該測定値を第２の測定値（この第２の測定値は核酸の第２の対照コレクションを用いて同様に得られたものである）と比較することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
該マイクロアレイを、検出可能なように標識された核酸の第１および第２のコレクションと同時に接触させ、該第１および第２のコレクション核酸が識別可能なように標識されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
所定の生物学的機能についての情報で注釈付けされた真核生物ゲノム配列のビジュアルディスプレーであって、
第１のビジュアルエレメント（その第１のビジュアルエレメントの長辺に沿って各点が該ゲノム配列のヌクレオチドマップに対して直線的かつ独自にマッピングされる）；
第２のビジュアルエレメント（その第２のビジュアルエレメントの第１および第２の境界が該ゲノム配列の第１および第２のヌクレオチドに対して直線的にマッピングされ、該第１および第２のヌクレオチドは該所定の機能を有すると推定される該ゲノム配列の領域を特定する）；および
第３のビジュアルエレメント（その第３のビジュアルエレメントの第１および第２の境界が該ゲノム配列の第１および第２のヌクレオチドに対して直線的にマッピングされ、該第１および第２のヌクレオチドは該所定の機能を有すると実験的に確認される該ゲノム配列の領域を特定する）
を含む、ビジュアルディスプレー。
【請求項２０】
該ディスプレーが電子装置である、請求項１９に記載のビジュアルディスプレー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明はバイオインフォマティクスおよび分子生物学の分野にあり、特にゲノム配列から導き出された機能情報を推定、確認および表示する分析方法および装置に関する。本発明は特に、遺伝子をコードするゲノム配列部分を同定する方法および装置に、その発現をアッセイするためのゲノム由来の単一エクソン核酸マイクロアレイのデザイン、製造および使用に、またゲノム配列を発現情報で注釈付けして表示する方法および装置に関する。
【０００２】
（発明の背景）
核酸シーケンシングのための全般的な技術が発明（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７０（４）：１２０９−１３ （１９７３）； Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７０ （１２）：３５８１−４ （１９７３））されてからほぼ２０年間、これらの技術は主として、すでに生物学的知見の基礎が確立されているタンパク質をさらに理解する、すなわち知見を得たり予測したりするためのツールとして用いられた。多くの場合、配列同定に先立つクローニングの試みは先行する生物学的理解によって情報が与えられもし、導かれもしてきた。
【０００３】
例えば、抗原に対するＴ細胞受容体のクローニングは、その既知の、あるいはその予測される膜会合により、またＴ細胞特異的体細胞組換えによるその遺伝子の推定される構成により予測される細胞種特異的発現に基づいて推定された（Ｈｅｄｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３０８ （５９５５）：１４９−５３ （１９８４））。それに次ぐシーケンシングの試みが直ちにそのタンパク質ファミリーを確定し、理解を高めた（Ｈｅｄｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３０８（５９５５）：１５３−８ （１９８４））。
【０００４】
しかしながら最近になって、ヒトその他のゲノムを配列決定する公開・非公開の大きな事業に関してハイスループット・シーケンシング法および装置の開発はこの研究パラダイムを変え、今日、配列情報はコードされるタンパク質産物の基礎的な生物学の理解をしばしば進展させている。
【０００５】
大規模シーケンシングのアプローチの一つは、発現した配列、すなわちｍＲＮＡの単離を通して理解できるものが最初に最も重要視されるものであるという命題に基づくものである。この「発現配列タグ」（「ＥＳＴ」）のアプローチはすでに膨大な配列データをもたらしている（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１６５１ （１９９１）； Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． Ｔｏｄａｙ ４：１１５ （１９９９）； Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． １５：４１５ （１９９７）； Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３７７ （ｓｕｐｐｌ．）：３ （１９９５）； Ｍａｒｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ２１：１９１ （１９９９））。このアプローチによって配列決定された核酸については、何らかの確実性をもってアプリオリに知られる生物学的情報だけがそれ自体生物学的に表現されることがしばしばである。元々ｍＲＮＡが得られた種および組織によって、このような配列の大部分もまた、発現がおそらく見られる種および少なくとも１つの組織がその旨注釈付けされる。
【０００６】
さらに最近では、ゲノムシーケンシングのペースが劇的に加速化されてきた。ゲノムＤＮＡが配列決定の試みにとっての最初の基質となる場合には発現は推定できず、その配列についてのアプリオリな生物学的情報だけが起源の種および染色体（およびおそらく染色体マップの位置）を含むことが多い。
【０００７】
方向性をもったＥＳＴおよびゲノムシーケンシグのアプローチによる配列集積のこれまで加速化しているペースをもってすれば、また特に複数の属、属内の複数の種、また種内の複数の個体からの配列情報の集積をもってすれば、核酸配列の機能を迅速かつ効果的に解明可能とする方法がますます必要となる。そしてこのような機能情報が集積すると、配列自体との有意義かつ有用な関係においてこのような機能情報を保存する方法がさらに必要となり、すなわち、既知の、または推定される機能情報で生の配列データを注釈付けする手段および装置がますます必要となる。
【０００８】
ゲノムシーケンシングのペースの高まりは配列決定の方法論および装置の技術変化によるところが大きいが（Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０：９９５ （１９９８）； Ｐｅｎｎｉｓｉ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：１８２２−１８２３ （１９９９））、同時に重要な機能的モチベーションが存在する。
【０００９】
ＥＳＴのアプローチはゲノムの非コード部分についての配列情報が得られるのはまれであると考えられていたが、現在では、ＥＳＴのアプローチはゲノムの実際の発現の複雑性を断片的にだけではあるが捉えることができるものと思われている。
【００１０】
例えば、Ｃ．エレガンス（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）ゲノムが完全に配列決定されたとき、遺伝子推定アルゴリズムにより１９，０００を超える潜在的遺伝子が確認されているが、そのうち７，０００のみがＥＳＴシーケンシングにより見出されたものであった（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：２０１２ （１９９８））。同様に、最近完了したアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の第２染色体の配列決定では４０００を超える遺伝子が推定されているが（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４０２：７６１ （１９９９））、そのうちＥＳＴシーケンシングの試みによってこれまでに同定されているのは約６％に過ぎない。ヒトゲノムはＥＳＴ範囲の最も重要な部分を占めているが、その遺伝子の全てを解明するにはまだ甚だ短い。ある最近の評価ではヒト遺伝子は１４６，０００を超える遺伝子を含み、その時点でまだ発見されていない遺伝子は半分より多いことが示唆されている。現在のところ、多くの遺伝子、おそらく２０ないし５０％はゲノムシーケンシングによって見つけるしかないと予測される。
【００１１】
従って、ゲノム配列の機能領域、もっぱらというわけではないが最も重要なものとしては、遺伝子をコードする機能をもつ領域を同定可能とする方法が必要である。
【００１２】
ヒトゲノムのコード配列の多くは既知の遺伝子と相同でなく、オープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）の検出や遺伝子機能の推定は困難なものとなる。真核生物ゲノムにおけるコード領域を推定するにはコンピューター的方法が存在する。ＧＲＡＩＬおよびＧＲＡＩＬ ＩＩなどの遺伝子推定プログラム（Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８（２４）：１１２６１−５ （１９９１）； Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｔ． Ｅｎｇ． １６：２４１−５３ （１９９４）； Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６：２４１−５３ （１９９４）； Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６：２５９−８１ （１９９６）； ＧＥＮＥＦＩＮＤＥＲ， Ｓｏｌｏｖｙｅｖ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． ２２：５１５６−６３ （１９９４）； Ｓｏｌｏｖｙｅｖ ｅｔ ａｌ．， Ｉｓｍｂ ５：２９４−３０２ （１９９７）；およびＧＥＮＥＳＣＡＮ， Ｂｕｒｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６８：７８−９４ （１９９７））では既知の相同性または機能を持たない多くの推定遺伝子を推定する。しかしながら、このようなプログラムは高い偽陽性率を示すことが知られている（Ｂｕｒｓｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３４：３５３−３６７ （１９９６））。このようなプログラムの複数によって得られた共通配列を用いれば、ゲノム配列からエクソンを呼び起こす確実性が高まることが知られている（Ａｎｓａｒｉ−Ｌａｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ８（１）：２９−４０ （１９９８））。
【００１３】
しかし、ゲノムデータからの機能的遺伝子の同定は依然として不完全な技術である。例えば、ヒト第２１染色体の全配列の報告として、第２１染色体マッピング・シーケンシング・コンソーシアムは、ヒトの遺伝子数に関する先行のバイオインフォマティクスでの評価を実質的に下方修正する必要があると報告している（Ｎａｔｕｒｅ ４０５：３１１−１９９ （２０００）； Ｒｅｅｖｅｓ， Ｎａｔｕｒｅ ４０５：２８３−２８４ （２０００））。
【００１４】
このように、バイオインフォマティクス的に得られた領域の機能、特にタンパク質をコードすると推定される領域の発現が実験的に容易に確認可能とする方法および装置が必要である。
【００１５】
最近、核酸マイクロアレイの開発によって遺伝子発現の自動・高度平行測定が可能となってきた（その開示を出典明示により本明細書にそのまま組み入れる、Ｓｃｈｅｎａ （ｅｄ．）， ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ）， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９９） （ＩＳＢＮ： ０１９９６３７７６８）； Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ２１（１） （ｓｕｐｐｌ）：１ − ６０ （１９９９）； Ｓｃｈｅｎａ （ｅｄ．）， Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ： Ｔｏｏｌｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ／ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｂｏｏｋｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ （２０００） （ＩＳＢＮ： １８８１２９９３７６）に総説）。
【００１６】
Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ． ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ， Ｌｅｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ．， ”Ｔｈｅ Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ． Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ： ａｎ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３３（１）：１５１−２ （１９９６）などの文献にこれまでに記載されているものに由来するか、または特定の生物学的課題を狙いとした「課題特異的」ライブラリーの構築（Ｒ．Ｓ． Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． （印刷中））に由来するｃＤＮＡ／ＥＳＴライブラリーに由来することはマイクロアレイに共通することである。定義によればこのようなマイクロアレイはＥＳＴライブラリーで見出された遺伝子の発現のみを測定することができ、従ってゲノムシーケンシングによってのみ発見される遺伝子のプローブとしては有用でなかった。
【００１７】
ある生物学的課題の答えを出すために全ゲノム核酸マイクロアレイを用いる有用性は酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に関して証明されている（Ｄｅ Ｒｉｓｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：６８０ （１９９７））。しかしながら、酵母核遺伝子の大多数、約９５％は単一のエクソン遺伝子であり、すなわちイントロンを欠き（Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ．， ＲＮＡ ５：１１３５−１１３７ （１９９９）； Ｇｏｆｆｅａｕ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：５６３−６７ （１９９６））、コード領域がより容易に同定され得る。全ゲノム核酸マイクロアレイは一般にはより複雑な真核生物ゲノムからの、特に１遺伝子につき平均１を超えるイントロンのものからの遺伝子発現を探知するためには用いられてこなかった。
【００１８】
（発明の概要）
本発明はゲノム配列から導き出された機能情報を推定、確認および表示する方法および装置を提供することで当技術分野におけるこれら、またその他の課題を解決するものである。
【００１９】
ある態様では、本発明は、ゲノム配列から機能領域を推定する、かかる領域の機能活性を実験的に確認および同定し、さらに元の配列データとの有意義かつ有用な関係において、このようにして得られた情報を結びつけて表示する方法を提供する。
【００２０】
関連の態様では、本発明は、ゲノム配列内で同定された推定遺伝子の発現を確認する装置を提供する。特に本発明は、ゲノム配列内で同定された推定遺伝子の発現を確認するのに有用な、新規なるゲノム由来単一エクソン核酸マイクロアレイを提供する。
【００２１】
もう１つの態様では、本発明は、本発明のゲノム由来単一エクソン核酸マイクロアレイ上のプローブと配列が同じであるか、または配列が実質的に同じ核酸の容易な作出のための組成物およびキットを提供する。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、プローブに対応する整列された一連の増幅可能なプローブ、またはその上に１以上のサブセットのプローブとともにパッケージングされたゲノム由来単一エクソンマイクロアレイを提供する。もう１つの実施態様では、指定のセットの増幅可能なプローブはゲノム由来単一エクソンマイクロアレイとは別にパッケージングされる。
【００２３】
もう１つの態様では、本発明は、特に本発明の方法および装置に従って注釈付けされた配列を表示するための、注釈付け配列を表示する手段を提供する。さらに、かかるディスプレーはかかる注釈付け配列の電子検索、問合せ、および解析のための好ましいグラフィック・ユーザー・インターフェースとして使用できる。
【００２４】
もう１つの態様では、本発明は、遺伝子発現解析のために、特にマイクロアレイによる遺伝子発現解析のために有用なゲノム由来単一エクソン核酸プローブを提供する。本発明は特に、１以上の組織で発現することが知られるゲノム由来単一エクソンプローブを提供する。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
定義
本明細書で用いられる「マイクロアレイ」および同等の「核酸マイクロアレイ」とは、支持体に結合した複数の核酸のコレクションをさし、結合した複数の核酸の各々とのハイブリダイゼーションは個別に検出できる。支持体は固体または多孔質、平面または非平面、単一または分布していてもよい。
【００２６】
このように定義される「マイクロアレイ」および「核酸マイクロアレイ」とは、いわゆるＳｃｈｅｎａ （ｅｄ．）， ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ）， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９９） （ＩＳＢＮ： ０１９９６３７７６８）； Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ２１（１） （ｓｕｐｐｌ）：１ − ６０ （１９９９）；およびＳｃｈｅｎａ （ｅｄ．）， Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ： Ｔｏｏｌｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ／ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｂｏｏｋｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ （２０００） （ＩＳＢＮ： １８８１２９９３７６）（なお、これらの開示は出典明示によりそのまま本明細書の一部とする）の装置の全てを含む。
【００２７】
このように定義される「マイクロアレイ」および「核酸マイクロアレイ」とはまた、とりわけその開示が出典明示によりそのまま本明細書の一部とする、Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７（４）：１６６５０１６７０ （２０００）に記載される単一平面支持体よりもむしろ複数のビーズ上に核酸が分布配置される複数の核酸の支持体結合コレクションも含み、このような場合、「マイクロアレイ」および「核酸マイクロアレイ」とは凝集状態にある複数のビーズをさす。
【００２８】
核酸マイクロアレイに関して本明細書で用いられる「プローブ」とは、支持体に結合された、あるいは結合させようとする核酸をさす。液相ハイブリダイゼーションに関して本明細書で用いられる「プローブ」とは、検出可能なように標識された、あるいは標識しようとする既知配列の核酸をさす。このようないずれかのものに関して「標的」とは、ワトソン−クリックの相補性によってプローブと結合させようとする核酸をさす。
【００２９】
本明細書で用いられる「配列番号〜を含むプローブ」およびその変形は核酸プローブを意味し、そのプローブの少なくとも一部が（ｉ）参照の配列番号で直接示される配列、または（ｉｉ）参照の配列番号で示される配列に相補的な配列のいずれかを有し、直接示される配列とその相補物との間の選択は、プローブが所望の標的と相補的であるという必要条件によって指定される。
【００３０】
本明細書で用いられる「プローブの発現」およびその言語変形は、そのプローブが、ｍＲＮＡに由来する核酸と高いストリンジェンシーで検出可能なようにハイブリダイズすることを意味する。
【００３１】
本明細書で用いられる「エクソン」とは、天然タンパク質の部分をコードするとバイオインフォマティクス的に推定される核酸配列をさす。
【００３２】
本明細書で用いられる「オープンリーディングフレーム」および同等の頭文字「ＯＲＦ」はその全体が隣接するアミノ酸配列へと翻訳され得るエクソン部分をさす。このように定義されるＯＲＦはその個々のエクソン内に完全に含まれ、ヌクレオチド長で計った場合、ちょうど３分できる長さを有する。このように定義されるＯＲＦは天然タンパク質の全体を必ずしもコードする必要はない。
【００３３】
本明細書で用いられる「選択的スプライシング」およびその言語的に同等な表現は単一の遺伝子から複数のイソ型タンパク質の発現をもたらすあらゆる種類のＲＮＡプロセッシングを含み、従って、「スプライシング変異体」およびその言語的に同等な表現は、ある遺伝子から転写されたが、プロセッシングされ、複数のイソ型タンパク質を集合的にコードするｍＲＮＡを包含する。
【００３４】
例えば、例示に過ぎないが、スプライシング変異体としてはエクソンの挿入、伸張、エクソンの末端切断、エクソンの欠失、５’非翻訳領域における選択肢（「５’ＵＴ」）および３’非翻訳領域における選択肢（「３’ＵＴ」）が挙げられる。かかる３’選択肢としては、例えば、ＲＮＡ転写物の切断部位およびポリ（Ａ）付加部位の違いが挙げられる。例えば、Ｇａｕｔｈｅｒｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ８：５２４−５３０ （１９９８）参照。
【００３５】
本明細書で用いられる「特異的結合対」とは互いに高い特異性で結合する分子対を意味する。結合対は典型的には少なくとも１０７、好ましくは少なくとも１０８、より好ましくは少なくとも１０９リットル／モルの親和性または結合力を有する。限定されるものではないが、特異的結合対の例としては、抗体と抗原、ビオチンとアビジン、およびビオチンとストレプトアビジンが挙げられる。
【００３６】
注釈付けゲノム配列のビジュアルディスプレーに関して本明細書で用いられる「方形」とは、少なくとも第１および第２の境界を有し、第１および第２の境界の各々がそのディスプレーの別のビジュアルオブジェクトの点に対して独自にマッピングされ得る幾何学的形状を意味する。
【００３７】
ゲノム配列の機能領域を同定、確認および表示する方法および装置
図１は本発明の第１の態様、すなわち、ゲノム配列から機能領域を推定、また、かかる領域の機能活性を実験的に確認および同定し、次いでこのようにして得られた情報を、元のゲノム配列データとの有意義かつ有用な関係において結びつけて表示する方法を広義の概略において示すフローチャートである。
【００３８】
最初に本発明のプロセス１０へ入力したものはゲノム配列データを含む１以上のデータベース１００から抽出される。ゲノム配列は通常はサブゲノム断片から得られるので、その配列データは典型的にはこれらのサブゲノム配列決定断片に対応する一連のレコードに保存する。連鎖させてより大きな隣接配列（「コンティグ」）を形成したものもあるし、そうでないものもある。データベースの配列データの限定パーセンテージは誤りがあるのが典型で、とりわけベクター配列、異常なクローニング結果から作出された配列、人工ポリリンカーの配列、および誤って読み取られた配列からなる。
【００３９】
データベース１００の各配列レコードは最低、注釈付けとして独自の配列識別名（登録番号）を含み、さらに登録日、起源種および寄託者を識別するために注釈付けされるのが典型である。データベース１００は非ゲノム配列も含み得るので、各配列はさらにゲノム配列に関するクエリー検索を可能とするよう注釈付けされるのが典型である。染色体の起源を所望によりマップ位置を添えて示すこともできる。データは、下記のようにある部分本発明の使用を通じて追加情報でさらに注釈付け可能であり、経時的に増大する。注釈付けはデータレコード内の、データベース１００の外部の情報に存在していて、それに対するレコードと、あるいは２者の組合せによってリンクされている。
【００４０】
本発明のゲノム配列データベース１００として有用なデータベースとしては、ＧｅｎＢａｎｋが挙げられ、特にｈｔｇｓ（ドラフト）、ＮＴ（ヌクレオチド、コマンドライン）およびＮＲ（非重複）区分をはじめとするそのいくつかの区分が挙げられる。ＧｅｎＢａｎｋは国立衛生研究所によって設立され、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）によって維持されている。マウス、ラット、アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、Ｃ．エレガンス、Ｃ．ブリグシー（Ｃ． ｂｒｉｇｓｉｉ）、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、ゼブラフィッシュその他の高等真核生物など、ヒト以外の種に由来するゲノム配列のデータベースもゲノム配列データベース１００として有用であることが分かろう。
【００４１】
次ぎに、ゲノム配列データベース１００のクエリーによって得られたゲノム配列をユーザーによって指定される生体機能を有するものと推定される、領域をその中で同定するために１以上のプロセス２００へ入力する。かかる機能としては、限定されるものではないが、タンパク質のコード、転写の調節、転写後のメッセージの輸送の調節、転写後のメッセージのスプライシングの調節、転写後のメッセージの分解の調節、染色体体細胞組換えへの寄与または調節、染色体の安定性または移動への寄与、対立遺伝子の排除またはＸ染色体の不活性への寄与などが挙げられる。
【００４２】
プロセス２００へ入力する特定のゲノム配列は、それに対して関連の配列が同定される機能ならびにかかる同定のために選択されるアプローチによって異なる。プロセスステップ２００は所定のゲノム領域内で異なる機能を繰り返し同定できる。このような場合、入力は数回の繰り返しについて異なることが多い。
【００４３】
プロセス２００によって必要な機能を有すると推定された配列は次ぎに、プロセス３００へ入力され、そこで実験的確認に好適な入力配列のサブセットが同定される。実験的確認は物理的アッセイおよび／またはバイオインフォマティクス的アッセイを含み得る。次ぎに続く実験アッセイが物理的なものでなく、バイオインフォマティクス的である場合には、供試できる配列に対する制約が少なくなり、従ってこの後者の場合、プロセス３００は入力配列の全てを出力することができる。
【００４４】
プロセス３００からのサブセット配列の出力を、次ぎにプロセス２００で推定された機能の実験的確認および同定のためのプロセス４００に用いるが、この実験的確認は物理的アッセイとバイオインフォマティクス的アッセイの双方を含むことができ、そのような場合が多い。
【００４５】
プロセス５００はプロセス４００の物理的アッセイおよび／またはバイオインフォマティクス的アッセイで得られた機能情報で配列データを注釈付けする。かかる注釈付けは、例えば配列データレコード自体に機能データを組み込むことによるか、ヒエラルキーデータベースまたはリレーショナルデータベースにおいてレコードをリンクさせることによるか、外部データベースへリンクさせることによるか、それらの組合せによるか、あるいはデータベース分野で周知の他の手段によって機能情報をその配列を有効に関連付けるいずれの技術を用いて行ってもよい。データはＮＣＢＩによって維持されているＧｅｎＢａｎｋなど、他者により維持されているデータベースへの組み込むよう寄託することさえ可能である。
【００４６】
図１にさらに示されるように、外部ソース６００からプロセス５００に追加の注釈付けを入力してもよい。
【００４７】
この注釈付けデータは次ぎに、所望により、磁気ディスク、光ディスク、光磁気ディスク、フラッシュメモリーなどのような非一時的媒体における任意の保存７００の前、それと同時、またはその後にプロセス８００に表示してもよい。
【００４８】
図１はプロセス４００からの実験データ出力はプロセス１０の各々の前工程、例えば、プロセス２００における機能配列の同定の補助、プロセス３００における実験的に好適なサブセットの同定の補助、ならびにプロセス４００における機能配列に関する物理的および／または情報的基板の作出およびその後の機能配列のアッセイの実行の補助に使用できることを示す。
【００４９】
各工程からの情報は次のプロセスへそのまま送ることもできるし、あるいは次のプロセスへ送る前に常時保存または一時保存の形態で保存することもできる。データはかかるプロセスステップの各々の後、または少なくとも複数のプロセスステップの後に保存されることが多い。プロセスステップのいずれか、または全ては自動化することができる。
【００５０】
図２はプロセス２００に従うゲノム配列内の機能配列の推定をさらに詳しく示したものである。
【００５１】
ゲノム配列データベース１００はゲノム配列に関して第１のクエリー２０を受ける。
【００５２】
クエリー２０による回答を要する配列は、この第１の場合では、同定する機能によって異なる。
【００５３】
例えば、タンパク質をコードする働きをするゲノム配列はとりわけ遺伝子推定アプローチ、競合的配列解析アプローチ、または両者の組合せを用いて同定することができる。遺伝子推定解析では、あるゲノムからの配列をプロセス２００に入力し、そこで少なくとも１つ、好ましくは複数のアルゴリズム法を適用して推定コード領域を同定する。競合的配列解析では、比較により、対応する、例えば合成の、複数の供給源、典型的には複数の種に由来する配列をプロセス２００へ入力し、そこで少なくとも１つ、おそらくは複数のアルゴリズム法を適用して配列を比較し、変異性が最小の領域を同定する。
【００５４】
クエリー２０の正確な内容はまたクエリーを受けるデータベースによって異なる。例えば、そのデータベースがおそらくは複数の種に由来するゲノム配列と非ゲノム配列の双方を含み、かつ、推定する機能がヒトゲノムＤＮＡにおけるタンパク質コードである場合には、それに応じてクエリーは、回答配列がゲノム性のものであって、ヒトに由来するものであることを要求する。
【００５５】
問合せ２０にはまた、次の解析法の実行要件に見合う配列を回答するようにする基準を組み込んでもよい。あるいは、またはそれに加えて、かかる実行基準は次ぎの予備プロセスステップ２４で実施してもよい。
【００５６】
例えば、同定しようとする機能がタンパク質コードである場合、問合せ２０には、ゲノム配列データベース１００から、複数の個別配列断片の中であるいずれかのエクソンの実質的断片化が回避されるに十分長いコンティグ内に存在する配列だけが回答するような基準を組み込んでもよい。
【００５７】
かかる基準は例えば、１０ｋｂ、より典型的には２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、好ましくは５０ｋｂ以上といった要求される最小個別ゲノム配列断片長からなり、ならびにバクテリア人工染色体（「ＢＡＣ」）などのあるいずれかのクローンに由来する配列が、わずか２０の個別片、より典型的にはわずか１５断片、いっそう典型的にはわずか１０ないし１２断片といった限定最大断片数で提供されるという任意のさらなる、あるいは代わりの要件からなる。
【００５８】
発明者らの結果は、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）由来のゲノム配列が、その配列が少なくとも５０ｋｂの長さであり、かつ、加えてあるいずれかのＢＡＣ由来の配列が１５未満、好ましくは１０未満の断片で提供されるとすれば、本発明に従う遺伝子推定解析に十分であることを示した。従って、クエリー２０にはＢＡＣシーケンシングから登録したデータが１５未満、好ましくは１０未満の断片であるという要件を組み込んでもよい。
【００５９】
クエリーに組み込むことができるさらなる基準としては、配列登録の日付、または日付範囲があり得る。このプロセスは上ではゲノム配列データベース１００がスタティックなものであるかのうように記載されているが、このゲノム配列データベースはもちろん必ずしもスタティックなものである必要はないと理解され、実際には頻繁に、時間単位でも更新されるのが典型である。このように、以下の実施例１および２にさらに記載されるように、絶対日付後に新たに追加されたか、または本発明の方法および装置を用いて行われる解析の相対的前に新たに追加されたかのいずれかの新たに追加された配列についてデータベースをクエリー検索できる。このように、本明細書に記載されるプロセスは動的な一時的構成要素を組み込むことができる。
【００６０】
かかる一時的制限の有用性の一つには、新たに登録されたゲノム配列から新規な遺伝子、特にＥＳＴシーケンシグ（または同様に遺伝子発現に基づくその他のシーケンシグの試み）によってはこれまでに同定されなかったものの存在を確認できるということがある。実施例１でさらに記載されるように、かかるアプローチは新たに登録されたヒトゲノム配列が、タンパク質をコードする働きをする配列に関して解析した場合、既存のＥＳＴおよびその他の発現データベースのものよりも新規な遺伝子を容易に確認することを示した。実際に、以下で示されるように、新たに登録されたヒトゲノム配列において確認された有に２／３の遺伝子がこれまでには確認されていなかった。これにより本発明の方法は極めて有効な遺伝子発見ツールとなる。
【００６１】
また考えられることとしては、このような遺伝子発見はヒト以外の種に由来するゲノム配列を用いて行うことができる。特に有用な種としては齧歯類、特にマウスなどの創薬の際にモデル系として用いられるものである。
【００６２】
クエリー２０に上記のような複数の基準を組み込めば、クエリー言語、クエリーの複雑性、およびデータベース分野で周知のその他の考慮にある程度よるところがあるが、その複数の基準は一連の個別クエリーとして、または単独のクエリーとして実施できる。
【００６３】
クエリー２０がクエリー基準を満たすゲノム配列を回答しなければ、示されているようにプロセス２２およびプロセス２００（実際にはプロセス１０の全体）によって無しという結果が報告され、２３で終わる。最初のクエリーの報告および終了の代わりに、またそれに加えて、最初の無しという結果を考慮して新たなクエリー２０を行ってもよい。
【００６４】
クエリー２０がクエリー基準を満たす配列を回答する場合、その回答配列は次ぎに、プロセス２５で用いられるその望ましい解析アプローチおよび特定の解析方法に好適かつ特異的な任意のプレプロセッシング２４に送られる。
【００６５】
プレプロセッシング２４はその多くのアプローチおよび方法に好適なプロセス、ならびに意図される次の解析に特に適したプロセスを含み得る。
【００６６】
大部分のアプローチおよび方法に好適なプレプロセッシング２４は次の解析に不適切な配列、または次の解析を妨げるものを排除することを含む。このような配列には、ＡｌｕリピートやＬＩＮＥエレメントなどの反復配列、ベクター配列、人工ポリリンカーなどの人工配列などが含まれる。このような除去は望ましくない配列の同定とそれに次ぐそのマスキングによって容易に行うことができる。
【００６７】
同定は、クエリー２０によって回答されたゲノム配列を公知の反復配列、ベクター配列、人工配列およびその他の人為配列を含む公開・非公開のデータベースと比較することで行うことができる。このような比較は、ＣＲＯＳＳ＿ＭＡＴＣＨまたはＲＥＰＥＡＴＭＡＳＫＥＲ（後者はｈｔｔｐ：／／ｆｔｐ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ＲＭ／ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ．ｈｔｍｌでオンラインにて利用できる）など当技術分野で周知のプログラムを用いて、あるいは当業者に十分操作できる専有の配列比較プログラムによって容易に行うことができる。
【００６８】
あるいは、またはそれに加えて、人為的なものを含む望ましくない配列は外部データベースと比較せずにアルゴリズム的に同定した後に除去することもできる。例えば、合成ポリリンカー配列は既知の制限部位の平均密度より有意に高いことを識別するアルゴリズムによって同定することができる。別の例としては、ベクター配列はゲノム配列総体のものと矛盾するヌクレオチドまたはコドン利用を識別するアルゴリズムによって同定することができる。
【００６９】
ひとたび同定されれば、その望ましくない配列は除去することができる。除去は便宜には、例えば特定のヌクレオチド参照を次ぎに「Ｘ」などのバイオインフォマティック・アルゴリズムによって認識されないものに変換することによるなどして望ましくない配列をマスキングすることで行うことができる。あるいは、現在のところ好ましいとはいえないが、望ましくない配列を回答されたゲノム配列からギャップを残して切り取ることもできる。
【００７０】
プレプロセッシング２４はさらに、最も質の高い１つの配列を複写配列の中から選択することを含む。質がより高いことは、あいまいなヌクレオチド（そのゲノム配列においてあいまいさを示す記号を用いて識別されるヌクレオチドと定義される）のパーセンテージが低いこと、あいまいなヌクレオチドの数が少ないこと、またはあいまいなヌクレオチドのクラスターの存在密度が最小であることとして測定できる。質がより高いことはまた、あるいは最長のコンティグに存在するかどうかで評価することができる。
【００７１】
プレプロセッシング２４はプロセス２５の解析アルゴリズムへ送るために特に適当なデータフォーマッティングを含んでもよく、多くの場合がそうである。かかるフォーマッティングはとりわけ、ゲノム配列データベース１００における元の登録番号に由来するものであっても、新たに付けられるものであってもよいが、独自の配列識別名を付け加えることを含んでよく、そうするのが典型であり、また、さらに追加の注釈付けを含んでもよい。フォーマッティングは、次のプロセスによって期待される入力にもよるが、ＦＡＳＴＡなどへの、またはＦＡＴＳＡなどからの変換など、ある配列リストスタンダードから別のものへの変換を含んでもよい。
【００７２】
プレプロセッシング（同定しようとした機能およびかかる同定を行う方法に必要な情報によって任意であってよい）の後、プロセッシング２５を行い、そこでそのゲノム配列内で望ましい機能を有する配列を同定する。
【００７３】
上記のように、かかる機能としては、限定されるものではないが、タンパク質のコード、転写の調節、転写後のメッセージの輸送の調節、転写後のメッセージのスプライシングの調節、転写後のメッセージの分解の調節、染色体体細胞組換えへの寄与または調節、染色体の安定性または移動への寄与、対立遺伝子の排除またはＸ染色体の不活性への寄与などが挙げられる。
【００７４】
具体的に示される機能がタンパク質のコードである場合、本発明の上記プロセスはゲノム配列における個々のエクソンの同定に迅速かつ有効に使用することができる。
【００７５】
以下で議論し、また、同一所有者同時係属の米国仮出願第６０／２０７，４５６号（２０００年５月２６日出願）、同第６０／２３４，６８７号（２０００年９月２１日出願）、同第６０／２３６，３５９号（２０００年９月２７日出願）、同一所有者同時係属の英国特許出願第２４２６３．６（２０００年１０月４日出願）、および同一所有者同時係属のＰＣＴ出願（２００１年１月２９日出願）（代理人整理番号ＰＢ ０００４ ＷＯ １の「ヒト心臓における遺伝子発現の解析に有用なヒトゲノム由来単一エクソン核酸プローブ」、ＰＢ ０００４ ＷＯ ２の「ヒト脳における遺伝子発現の解析に有用なヒトゲノム由来単一エクソン核酸プローブ」、ＰＢ ０００４ ＷＯ ３の「ヒト成人肝臓における遺伝子発現の解析に有用なヒトゲノム由来単一エクソン核酸プローブ」、ＰＢ ０００４ ＷＯ ４の「ヒト胎児肝臓における遺伝子発現の解析に有用なヒトゲノム由来単一エクソン核酸プローブ」、ＰＢ ０００４ ＷＯ ５の「ヒト肺における遺伝子発現の解析に有用なヒトゲノム由来単一エクソン核酸プローブ」、ＰＢ ０００４ ＷＯ ６の「ヒト骨髄における遺伝子発現の解析に有用なヒトゲノム由来単一エクソン核酸プローブ」、ＰＢ ０００４ ＷＯ ７の「ヒト胎盤における遺伝子発現の解析に有用なヒトゲノム由来単一エクソン核酸プローブ」、ＰＢ ０００４ ＷＯ ８の「ＢＴ ４７４細胞における遺伝子発現の解析に有用なヒトゲノム由来単一エクソン核酸プローブ」、ＰＢ ０００４ ＷＯ ９の「ＨＢＬ １００細胞における遺伝子発現の解析に有用なヒトゲノム由来単一エクソン核酸プローブ」、ＰＢ ０００４ ＷＯ １０の「Ｈｅｌａ細胞における遺伝子発現の解析に有用なヒトゲノム由来単一エクソン核酸プローブ」）（なおこれらの開示は出典明示により本明細書にそのまま組み入れる）に詳細に記載されているが、発明者らは本発明の方法および装置を用いてヒトゲノム配列において１５，０００を超えるエクソンを同定し、発明者らは少なくとも１種類のヒト組織または細胞種でその発現を確認した。有に２／３のエクソンは、発明者らが発見した時点で既存の公開発現（ＥＳＴ、ｃＤＮＡ）データベースには提供されていない遺伝子に属し、これにより本発明の方法および装置は新規な遺伝子の発見に極めて有効なツールとなる。
【００７６】
以下でさらに記載し、また、その開示が出典明示により本明細書にそのまま組み入れられる同一所有者同時係属の米国特許出願第０９／６３２，３６６号（２０００年８月３日出願）で詳細に記載されているが、本発明のゲノム由来単一エクソンプローブおよびマイクロアレイは真核生物細胞および組織における多様な選択的スプライシングのハイスループット同定に極めて有用であることが分かる。
【００７７】
ゲノム配列からこのような個々のエクソンを同定するには、プロセス２５を用いて推定コード領域を同定する。推定遺伝子をコードする配列を同定するためにプロセス２５で有用な２例のアプローチとして遺伝子推定と比較配列解析がある。
【００７８】
遺伝子推定は１以上のソフトウエアプログラムに埋め込まれ、ＧＲＡＩＬ、ＤＩＣＴＩＯＮ、ＧＥＮＳＣＡＮおよびＧＥＮＥＦＩＮＤＥＲなどの種々の発見法を用いてオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定するいくつかのアルゴリズム法のいずれかを用いて行うことができる。
【００７９】
比較配列解析は同様に、配列の変異性が低い領域を識別する種々の公知のプログラムのいずれかを用いて行うことができる。
【００８０】
比較配列解析の利点は、ゲノム配列が、遺伝子推定プログラムによって必要とされるものよりも範囲が狭く、かつ／または質の低いプロセス２００へ入力できるということである。
【００８１】
発明者らは例えば最近、比較配列解析を用いてヒトとマウス間で直交する配列を同定し、このようにして同定されたマウス配列（「ｓｉｍｉｌｏｎｓ」）をプロセス３００へ出力したが、これにより発明者らは新規なマウスのエクソンと遺伝子を同定し、次いでその発現を確認することができた。医薬分野で周知であるが、モデル系で同定された遺伝子は治療介入の標的の値を評価するため、また、それらの標的と相互作用する薬剤をスクリーニングしたり評価したりするための標的となる。
【００８２】
以下の実施例１にさらに記載されるが、遺伝子推定ソフトウェアプログラムでは一定範囲の結果が得られる。実施例１において新たに登録されたヒトゲノム配列の入力では、例えばＧＲＡＩＬは推定コード領域としての最大パーセンテージ、すなわち解析されたデータの２％のゲノム配列を同定し、ＧＥＮＥＦＩＮＤＥＲはそれに次ぐ１％を呼び出し、ＤＩＮＴＩＯＮでは最低の推定コード領域を示し、コード領域として呼び出されたのはゲノムの０．８％であった。
【００８３】
このようないくつかの方法の間で一致が必要な場合には高い確実性が得られる。本明細書では特にエクソンの呼び出しに関して議論されるが、方法間の一致は通常、他の機能を推定する場合にも同様に信頼性を高める。
【００８４】
このように問合せ２６により示されるように配列プロセッシング２５は、所望によりプレプロセッシング２４とともに、プロセス２７で決定および報告されるこのような繰り返し間での一致をもって、異なる方法でも繰り返すことができる。
【００８５】
プロセス２７は与えられた入力ゲノム配列に対するいくつかの出力を比較し、個別に報告された結果間での一致を識別する。一致それ自体、ならびにその一致を満たす配列は次ぎにプロセス２９ａに保存され、プロセス２９ｂで表示され、続いてアッセイに好適なそのサブセットの同定のためにプロセス３００に出力される。
【００８６】
一致レベルの倍率はプロセス２７によって算出および報告することができる。
【００８７】
例えば、以下の実施例１でさらに記載されるが、プロセス２７は遺伝子推定方法の特定ペアの全ての間での一致、遺伝子推定方法のいずれか１以上のペア間での一致、あるいは用いた遺伝子推定アルゴリズムの全ての間での一致を報告することができる。このように実施例１、プロセス２７では、ＧＲＡＩＬとＧＥＮＥＦＩＮＤＥＲプログラムでは０．７％のゲノム配列で一致し、ＧＲＡＩＬとＤＩＣＴＩＯＮでは０．５％のゲノム配列で一致し、また、これら３プログラムを一緒にすると解析されたデータの０．２５％で一致したことが報告された。別の例では、０．２５％のゲノム配列が３プログラムの全てで推定コード領域を含むとしてみなされた。
【００８８】
別の例として、発明者らが現在用いている４種の遺伝子推定アルゴリズムのうち３種、すなわち、ＧＥＮＥＦＩＮＤＥＲ、ＧＥＮＳＣＡＮおよびＧＲＡＩＬはエクソンの位置の他、フレーム情報を推定するものである。推定されたエクソンの位置およびフレームに重複があれば、同定が完了していなくとも、推定されたエクソンをプロセス２７に合流させ、最も可能性の高い共通コード領域を見出す。このプロセスを可能性のある全ての重複が合流されるまで繰り返す。このアプローチにより各アンプリコンに存在するエクソンの平均数が少なくなり、エクソンの伸張およびエクソンの末端切断選択的スプライシングの結果を検出するために有効なエクソン特異的プローブを作製する際に好ましい。
【００８９】
さらに、選択された機能を同定する種々のアプローチ間でも一致が必要とされる可能性がある。
【００９０】
例えば、同定しようとする機能がタンパク質配列のコードであって、最初に用いるエクソン呼び出しのアプローチが遺伝子推定である場合、同じ入力配列、またはそのサブセットに対して比較配列解析などの別のアプローチでこのプロセスを繰り返すことができる。このような場合、比較配列解析の後に遺伝子推定を行うが、比較はゲノム核酸配列に対して行えるだけでなく、加えて、あるいはその代わりに遺伝子推定アプローチによって先に同定されたエクソンから翻訳された推定アミノ酸配列に対しても行うことができる。
【００９１】
繰り返しプロセスとして示されているが、一致をみる必要がある複数の解析は一連の、並行した、あるいはそのある組合せで行うことができる。
【００９２】
所望によりその決定のための複数の方法およびアプローチ間で一致を示す推定される機能配列は機能アッセイ向けのそのサブセットの同定のためにプロセス３００へ送られる。
【００９３】
同定しようとする機能がタンパク質コードである場合、プロセス３００を用いて、物理的および／またはバイオインフォマティクス的アプローチにより実験的確認のために好適なそのサブセットを同定する。
【００９４】
目的が例えば遺伝子特異的プローブを得るための遺伝子の単一エクソンのみの発現の同定および確認である場合、プロセス２００で同定された推定エクソンをバイオインフォマティクス的に分類または保存して推定遺伝子とする。この保存はとりわけ解析のために選択された種におけるエクソン／遺伝子の平均数の考慮、そのゲノム配列に対して呼び出されたエクソン密度、および他の経験的法則に基づくことができ、推定遺伝子構造もまたこれら種々の遺伝子推定プログラムによって提供される。従って、これらのエクソンのうち１以上が次ぎに遺伝子発現アッセイで用いるために選択できる。
【００９５】
その代わりに、目標が、その開示が出典明示によりそのまま本明細書に組み入れる、同一所有者同時係属の米国特許出願第９０／６３２，３６６号（２０００年８月３日出願）にさらに記載されているように、選択的スプライシング結果の検出を望む場合など、ある遺伝子のエクソンの全てまたは複数の発現の同定および確認である場合、プロセス２００で同定された推定エクソンをバイオインフォマティクス的に分類または保存して推定遺伝子とすることができる。従って、エクソン特異的エクソンの全てを次の遺伝子発現アッセイで確認するために選択することができる。
【００９６】
このような次の遺伝子発現アッセイが増幅させた核酸を用いる場合、所望のアンプリコン長、プライマー合成必要条件、推定エクソン長、配列のＧＣ含量、可能性のある二次構造の伸張などを考慮することで首尾良く増幅した可能性が最も高いと思われるエクソンを同定および選択することができる。次ぎの遺伝子発現アッセイが増幅産物を用いるものであれ用いないものであれ、核酸のハイブリダイゼーションによる場合には、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーを含めさらに考慮すれば、選択されたハイブリダイゼーションおよび洗浄ストリンジェンシーで配列特異的に最も容易に識別できる配列のサブセットを同定することができる。特にかかる考慮の一つに、反復配列にわたる推定エクソンの排除があり、このような配列は見かけ上、非特異的メッセージとハイブリダイズし得るが、ハイブリダイゼーションの特異的シグナルは低下する。
【００９７】
バイオインフォマティクスアッセイでは、実験的に試験可能な配列上の制約が少なく、従ってこのような場合、プロセス３００は入力配列全部を出力することができる。
【００９８】
プロセス３００によりアッセイに用いるのに好適であるとして同定された配列のサブセットを次ぎにプロセス４００で用いてプロセス２００で行った推定の実験的確認のための物理的および／または情報的基板を作出し、その後、その基板をアッセイする。
【００９９】
目的がゲノム配列においてタンパク質コード領域を同定することである場合、タンパク質をコードすると推定された配列の発現をプロセス４００で確認する。
【０１００】
このように、もう１つの態様では、本発明は、ゲノム配列内で同定された推定エクソンの発現を確認する方法および装置を提供する。特に本発明は、推定されたエクソンの発現が新規なタイプの核酸マイクロアレイ、すなわち本発明のゲノム由来単一エクソン核酸マイクロアレイを用いて測定および確認される、遺伝子発現の確認方法を提供する。
【０１０１】
本態様のある実施態様によれば、推定されたエクソンをゲノムＤＮＡから増幅する。
【０１０２】
増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行うことができる。ＰＣＲを使用するのが便宜であるが、ローリング・サイクル増幅法などの他の増幅アプローチも使用することができる。
【０１０３】
増幅スキームは最小の付加配列（すなわち、フランキング、イントロンまたは遺伝子間配列）しか伴わないアンプリコンにおいて各推定エクソンの全体をキャプチャーするようにデザインすることができる。本発明の方法を用いてゲノム配列から推定されたエクソンは長さが異なるので、このようなアプローチでは種々の長さ？のアンプリコンが生じる。
【０１０４】
しかし発明者らは、ヒトゲノム配列から推定されたほとんどのエクソンは５００ｂｐより短いことを見出した。少なくとも約７５ｂｐ、より好ましくは少なくとも約１００ｂｐ、いっそう好ましくは少なくとも約２００ｂｐのアンプリコンを核酸マイクロアレイ上のプローブとして固定化することができるが、本発明の方法を用いた初期の実験結果では、より長いアンプリコン、少なくとも約４００ｂｐ、より好ましくは約５００ｂｐがスライドグラスまたはその他の処理面により効率的に固定化されることが示唆された。
【０１０５】
発明者らはこのようなより長いアンプリコンにおいて推定エクソンをフランキングするイントロンおよび遺伝子間素材がマイクロアレイ実験の際にエクソン特異的ハイブリダイゼーションとの干渉を引き起こすのではないかと考えていたが、驚いたことにそうではなく、実験組織（または細胞種）と対照組織の間のいずれのプローブの発現比率も、メッセージまたはｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションに関与しない配列のプローブの存在によって有意な影響を受けることはないことを見出した。
【０１０６】
同じく驚くことにこの技術は、単一プローブエクソンが高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション解析に十分なシグナル強度をもたらさないことを示唆した。低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は重複の多いオリゴヌクレオチドを基にしたマイクロアレイとの有益なハイブリダイゼーションを可能とするようにデザインされたものであったが、ＥＳＴを基にしたマイクロアレイに典型的に用いられる高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は単一エクソンプローブとともには使用できないものと考えられていた。発明者らは驚くことに、単一エクソンプローブが高いストリンジェンシーでも適当なシグナルをもたらすことを見出した。
【０１０７】
結果として発明者らは、遺伝子間配列および／またはイントロン配列によってフランクされた単一エクソンを有するゲノム由来増幅産物を用いて容易にバイオインフォマティクス的に推定されたエクソンの発現を確認できることを見出した。
【０１０８】
化学合成法によりエクソンを包含するに十分な長さのオリゴヌクレオチドが作製できる限り、かかるオリゴヌクレオチドは増幅材料の代わりにプローブとして使用できる。しかしながら目下のところ、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの合理的な大きさの限界を超える増幅産物が作製できることから、増幅によって、イントロン配列および／または遺伝子間配列によりフランクされた単一エクソンを有するプローブがより容易に作製できる。
【０１０９】
フランキング遺伝子間配列および／またはイントロン配列を有するプローブは、エクソン配列しか含まないプローブよりも広範な選択的スプライシング結果を検出することができる。例えば、エクソンの伸張はかかるプローブによりシグナル強度の増強として検出できるが、発明者らはシグナル強度とハイブリダイズする配列の長さとの間ほぼ直線の関係を見出した。また、異核、すなわち未熟なｍＲＮＡをアッセイする場合、イントロンおよび／または遺伝子間フランキング配列を有するプローブによればより多様な事象を評価することができる。
【０１１０】
さらに、所定の大きさのアンプリコンをマイクロアレイに適用することからはある利点が得られる。
【０１１１】
従って、増幅スキームは選択的に、また、好ましくは、所定の大きさ、好ましくは推定された各エクソンを中心に少なくとも約３００ｂｐ、より好ましくは少なくとも約４００ｂｐ、最も好ましくは約５００ｂｐの領域を増幅するようデザインすることができる。このようなアプローチにより大きさの多様性が限定されたアンプリコンの集団が得られるが、それは典型的には推定エクソンに加え、それをフランクするイントロン核酸および／または遺伝子間核酸を含む。
【０１１２】
逆に、本発明の方法に従ってヒトゲノム配列から推定されたエクソンの１０％少々は５００ｂｐを超える長さである。このように長いエクソン部分、好ましくは少なくとも約３００ｂｐ、より好ましくは少なくとも約４００ｂｐ、最も好ましくは約５００ｂｐも増幅可能である。しかし、発明者らの初期の実験では、発明者らはこのようなエクソン片の増幅の成功率は低いが、より長い断片、少なくとも約１０００ｂｐ、典型的には少なくとも約１５００ｂｐ、また２０００ｂｐといった長いものまでを増幅する際には、このような推定エクソンは効果的に増幅されることを見出した。さらにＰＣＲ反応の通常の至適化で５００ｂｐの長いエクソンが増幅できよう。
【０１１３】
増幅に関しては、せいぜい約５００ｂｐであると推定されるエクソン内またはエクソン周囲を中心とする少なくとも約５００ｂｐのゲノム配列、あるいは５００ｂｐの長さを超えると推定されるエクソンについては少なくとも約１０００ないし１５００ｂｐのゲノム配列を増幅することを目的に、プロセス３００で選択された推定エクソンをＰＲＩＭＥＲ３（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ／にてオンラインで入手して使用できる）などの１以上のプライマーデザインプログラムに入力し、標準的な技術によってプライマーを合成する。必須配列を有するプライマーは市販されているか、あるいは標準的な技術によって合成することができる。
【０１１４】
便宜には、第１の所定配列は各エクソン特異的５’プライマーに通常付加することができ、また第２の、典型的には異なる、所定配列は各３’エクソン特有のプライマーに通常付加することができる。これはアンプリコンを不死化する働きをし、すなわち、共通５’配列および共通３’配列エレメントにそれぞれ相補的な単一のプライマーセットを用いてアンプリコンをさらに増幅させる働きをする。これらの「万能」プライミング配列の存在はさらに、その後の配列確認を助け、シーケンシング反応を誘導する全てのアンプリコンに共通の配列を提供する。共通５’配列および共通３’配列はさらにエクソンを証明する何らかのさらなる研究をすべくクローニング部位を付加する働きをすることができる。
【０１１５】
かかる所定配列は少なくとも約１０ｎｔ長、典型的には少なくとも約１２ｎｔ長、より典型的には約１５ｎｔ長が有用であり、通常は約２５ｎｔ長を超えない。以下に示される実施例で用いる「万能」プライミング配列は各々１６ｎｔの長さであったが、これはまた、その開示を出典明示により本明細書にそのまま組み入れる、同一所有者同時係属の米国特許出願第０９／６０８，４０８号（２０００年６月３０日出願）にも記載されている。
【０１１６】
増幅の基板として用いられるゲノムＤＮＡは、そのゲノム配列データがもともと得られた真核生物種、または近縁種からのものであり、その生物の体細胞性もしくは生殖系組織または培養細胞から周知の技術により便宜に調製することができる。例えば、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， ４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ （Ａｐｒｉｌ １９９９）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （ＩＳＢＮ： ０４７１３２９３８Ｘ）およびＭａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９８９）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （ＩＳＢＮ： ０８７９６９３０９６）参照。なお、これらの開示は出典明示により本明細書にそのまま組み入れる。このように調製されたゲノムＤＮＡの多くは市販されており、ヒトゲノムＤＮＡでは提供者のインフォームドコンセントの証明も添付されている。
【０１１７】
サイズ排除スピンカラムまたはガラス吸着などによる部分精製の後（ゲル電気泳動によるなどアンプリコンの質に確認を行っても行わなくともよい）、各アンプリコン（単一エクソンプローブ）を支持基板上にアレイとして配置する。
【０１１８】
支持基板上への核酸の配置および固定によるマイクロアレイの作製方法は当技術分野で周知である。Ｓｃｈｅｎａ （ｅｄ．）， ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ）， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９９） （ＩＳＢＮ： ０１９９６３７７６８）； Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ２１ （１） （ｓｕｐｐｌ）： １−６０ （１９９９）； Ｓｃｈｅｎａ （ｅｄ．）， Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ： Ｔｏｏｌｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ／ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｂｏｏｋｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ （２０００） （ＩＳＢＮ： １８８１２９９３７６）（なお、この開示は出典明示により本明細書にそのまま組み入れる） に総説。
【０１１９】
典型的には支持基板はガラスであってよいが、非晶質シリコーン、結晶性シリコーン、またはプラスチックなどのその他の材料であってもよい。このようなプラスチックとしては、ポリメチルアクリル系、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアセタール、ポリスルホン、セルロースアセテート、セルロースセニトレート、ニトロセルロース、またはその混合物が挙げられる。典型的にはこの支持体は方形であってよいが、他の形状、特に円形ディスク、また球状であってもある利点が得られる。Ｄｅｍｅｒｓ， ”Ｓｐａｔｉａｌｌｙ Ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｒｒａｙｓ ｉｎ ＣＤ−ＲＯＭ Ｆｏｒｍａｔ，” 国際特許出願ＷＯ ９８／１２５５９（なお、この開示は出典明示により本明細書にそのまま組み入れる）に記載のように、核酸アレイの支持基板としてスライドグラスに代わる特に有利なものとして光ディスクがある。
【０１２０】
増幅した核酸は支持基板の表面に共有結合させることができ、また、より典型的には変性および仮定される非共有結合的相互作用による結合、またはそれらの何らかの組合せを助ける攪乱剤中、誘導体化した表面に塗布してもよい。
【０１２１】
支持基板上に核酸を配列するのに有用なロボットスポット装置は公開ドメイン仕様（Ｔｈｅ ＭＧｕｉｄｅ， ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０， ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎ／ｍｇｕｉｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）、または便宜には商業ソースから購入することができる（ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ ＧｅｎＩＩ Ｓｐｏｔｔｅｒ ａｎｄ ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ ＧｅｎＩＩＩ Ｓｐｏｔｔｅｒ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｉｎｃ．， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）。スポットはまた、インクジェット技術を用いるものをはじめとする印刷法によって行ってもよい。
【０１２２】
当技術分野で周知であるように、マイクロアレイは典型的には固定化された対照核酸も含む。本発明のゲノム由来単一エクソンマイクロアレイのバックグラウンドシグナルを測定するのに有用な対照としては、複数の大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）遺伝子が容易に使用できる。実施例１にさらに記載されるが、１６または３２の大腸菌遺伝子はこのようなマイクロアレイにおける非特異的ハイブリダイゼーションの概略測定をするのに十分である。
【０１２３】
当技術分野で周知であるが、核酸マイクロアレイを作製するために支持基板上のアレイとして配置される増幅産物は全てホスホジエステル結合によって結合した天然ヌクレオチドからなってもよいし、あるいはまたハイブリダイゼーション反応で相補的結合が得られる限り、非天然ヌクレオチド、別のヌクレオチド間結合、またはその双方を含んでもよい。酵素的増幅を用いて固定化プローブを作製する場合には、増幅酵素は、作製できる核酸類似体のタイプにあるさらなる制約を課す。
【０１２４】
本明細書では特に平面基板上に構築された高密度マイクロアレイを用いる場合が記載されるが、ゲノム配列から推定されたエクソンの発現を確認するための本発明の方法は、Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７ （４）： １６６５０１６７０ （２０００）；米国特許第６，０５７，１０７号および米国特許第５，７３６，３３０号（なお、これらの開示は出典明示により本明細書にそのまま組み入れる）に記載されているような非平面、ビーズベースのマイクロアレイをはじめ、非平面上、非単位、分布型基板上のマイクロアレイを含む、本明細書で定義される公知のタイプのマイクロアレイはいずれも使用できる。理論上、パックされたこのようなビーズの集合体により、単一の平面基板に対するスポットまたはリソグラフィー技術で達成可能な高密度核酸プローブ集塊が形成される。
【０１２５】
さらに、遺伝子発現はニトロセルロース、ナイロン、および正電荷を有する誘導体化ナイロンメンブランのようなメンブラン上に構築されるものなど、低密度アレイに対するハイブリダイゼーションを用いて確認することができる。
【０１２６】
しかしながら固相基板上の平面マイクロアレイは、既存のリーダーとの適合性があることをはじめ、ある有用な利点をもたらす。例えば、標準的な顕微鏡用スライドは各々少なくとも１０００、典型的には少なくとも２０００、好ましくは５０００以上、１９，０００以上までの個々の配列の核酸プローブを含み得る。
【０１２７】
各推定遺伝子は単一の推定エクソンにより、または同じ遺伝子に属するものと推定される複数のエクソンによりアレイ上に表現することができる。また、当技術分野で周知であるが、単一の推定エクソンを表す所定の配列の各プローブは単一のマイクロアレイ上の複数の位置に配置してシグナルを重複させることもできる。
【０１２８】
上記のゲノム由来単一エクソンマイクロアレイは本発明の重要な態様であり、（１）ｍＲＮＡから誘導された核酸の付着により作製されたもの、（２）オリゴヌクレオチドプローブのｉｎ ｓｉｔｕ合成によって作製されたもの、および（３）酵母ゲノムＤＮＡから構築されたものをはじめ、遺伝子発現分野でこれまでに用いられてきたマイクロアレイとはいくつかの原理および利点で異なっている。
【０１２９】
真核生物遺伝子発現の研究に用いられている大部分の核酸マイクロアレイは、発現したメッセージに直接的または間接的に由来する固定化プローブ核酸を有する。例えば、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ． ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ， Ｌｅｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ．， ”Ｔｈｅ Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ． Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ： ａｎ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３３ （１）： １５１−２ （１９９６）のもの、または特定の生物学的課題を狙いとした「課題特異的」ライブラリーのｄｅ ｎｏｖｏ構築， Ｒ．Ｓ． Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｓｔ ５４： ６８−６９ （２０００）（出典明示により本明細書にそのまま組み入れる）のものなど、これまでに文献に記載されている、ｃＤＮＡ／ＥＳＴライブラリーに由来するマイクロアレイが一般的である。このようなマイクロアレイは本明細書ではひとまとめにして「ＥＳＴマイクロアレイ」と呼ぶ。
【０１３０】
定義によるとこのようなＥＳＴマイクロアレイはＥＳＴライブラリーで見出された遺伝子のみの発現を測定することができ、発明者らは発現した遺伝子を分数表示するためにのみ本明細書（以下を参照）で示している。このように、以下の実施例１でさらに述べるが、本発明の方法により新たに登録されたヒトゲノム配列データから同定された遺伝子（これらに関する発現は本発明の方法および装置を用いて引き続き確認された）のゆうに２／３がＥＳＴまたはその他の発現データベースでは明らかにされておらず、従って、ＥＳＴマイクロアレイにおけるプローブとして表現され得ていなかった。
【０１３１】
さらに、ＥＳＴおよびｃＤＮＡライブラリー、従ってそれに基づいたマイクロアレイも、メッセージの起源組織または細胞種によって偏りがある。
【０１３２】
さらに、ＥＳＴおよび／またはｃＤＮＡライブラリーにおけるメッセージの表示はメッセージの逆転写の成否、しかし典型的には、ある場合にはその次のクローニングの成否に依存している。このことはＥＳＴマイクロアレイにおける配列に利用できるプローブ集団へ実質的な偏りをもたらす。例えば、以下の実施例で示すが、本発明の方法によってゲノム配列から同定された遺伝子サブセットであって、ＥＳＴまたはその他の発現データベースでこれまでに登録されたものはより高い発現レベルの遺伝子に偏っている。
【０１３３】
これに対して本発明のゲノム由来単一エクソンマイクロアレイ上に配列されるプローブを作製するためには逆転写もクローニングも必要でない。本発明のゲノム由来単一エクソンマイクロアレイ上への最終的なプローブの付着はゲノム素材からの増幅の成否に依存するが、所望のアンプリコンの配列に関する先行知見によれば、ＥＳＴアプローチにおける未知のメッセージの逆転写およびクローニングの成功の要件によってもたらされるものより、増幅させにくいあるプローブ配列を取り出せる機会が多くなる。さらに、配列を増幅することができなければ、その配列は本発明で用いるために随時その全てを化学合成することができる。
【０１３４】
このように、本発明のゲノム由来単一エクソンマイクロアレイは、当技術分野でこれまでに用いられてきたＥＳＴマイクロアレイよりも遙かに偏りなく、遺伝子発現を測定する遙かに多様なプローブを提供する。
【０１３５】
発現メッセージからのそれらの最終起源に関するさらなる結果として、ＥＳＴマイクロアレイにおけるプローブは成熟ｍＲＮＡのポリ−Ａテールに由来するポリ−Ａ（または相補的なポリ−Ｔ）ストレッチを含むことがしばしばある。これらのホモポリマーストレッチはクロス・ハイブリダイゼーション、すなわち、プローブの遺伝子特異的部分に相同な配列を欠いた標識ｃＤＮＡのホモポリマーテールとハイブリダイズすることで起こる偽りのシグナルに寄与する。
【０１３６】
これに対して、本発明のゲノム由来単一エクソンマイクロアレイに配列されたプローブはメッセージのポリアデニル化から導かれるホモポリマーストレッチを欠くことからより特異的なシグナルを提供することができる。典型的には、本発明のゲノム由来単一エクソンマイクロアレイ上の少なくとも約５０％のプローブがＡまたはＴからなるホモポリマー領域を欠いている。なお、本明細書における目的では、ホモポリマー領域とは２５以上、典型的には３０以上の同一ヌクレオチドのストレッチと定義される。より典型的は、本発明のゲノム由来単一エクソンマイクロアレイ上のプローブの少なくとも６０％、いっそう典型的には少なくとも約７５％がこのようなホモポリマーのストレッチを欠いている。
【０１３７】
ハイブリダイゼーションにまた影響するさらなる違いは、ＥＳＴマイクロアレイプローブがクローニングされた材料に由来するのが典型であることによるものである。ＥＳＴマイクロアレイ上のプローブとして配置されるプローブ材料の多くはプラスミド、ファージ、またはファージミドベクターから切り取られたものであるか、それらから増幅されたものであるので、特にプローブがベクターから切り取られたのではなく増幅されたものである場合には、ＥＳＴマイクロアレイはかなりの量のベクター配列を含むのが典型である。
【０１３８】
これに対し、本発明のゲノム由来単一エクソンマイクロアレイの大多数のプローブは、ゲノムＤＮＡから直接的または間接的に増幅された原核生物またはバクテリオファージベクターの配列を含まない。従って典型的には、本発明のゲノム由来単一エクソンマイクロアレイ上に配置された個々のエクソン含有プローブの少なくとも約５０％、より典型的には少なくとも約６０％、７０％、８０％以上でさえもがベクター配列を欠き、特にプラスミドおよびバクテリオファージから抽出された配列を欠く。本発明のゲノム由来単一エクソンマイクロアレイのエクソン含有プローブの少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは９０％を超えるものがベクター配列を欠くことが好ましい。プレプロセッシング２４によるベクター配列の除去に注意すれば、ベクターフリーのエクソン含有プローブのパーセンテージは９５ないし９９％といった高いものとなり得る。本発明のゲノム由来単一エクソンマイクロアレイにはベクター配列が実質的に含まれないことで、プローブベクター配列との偽りのクロス・ハイブリダイゼーションが少なくなるので、ハイブリダイゼーションの際の特異性が高まる。
【０１３９】
ＥＳＴマイクロアレイの構築におけるベクターからのプローブの切り出しまたは増幅のさらなる結果として、その上に配列されたプローブは５’および３’の両末端に、ベクター由来の人工配列であるポリリンカー多重クローニング部位をしばしば含む。ゲノム由来単一エクソンマイクロアレイ上に配置されたプローブでは、その上に追加されるこのような人工配列は必要としない。
【０１４０】
しかし、上記のように、推定エクソンを増幅するのに用いられるエクソン特異的プライマーは、典型的にはエクソン特異的プライマー配列の５’側に、次ぎに続く増幅反応またはシーケンシング反応を誘発する「万能なもの」（すなわち、エクソン配列によらない）として有用な人工配列を含んでもよい。このような「万能」５’および／または３’プライミング配列を増幅プライマーに付加する場合には、ゲノム由来単一エクソンマイクロアレイ上に配置されるプローブはＥＳＴマイクロアレイで見られるものと同様の人工配列を含む。しかし、本発明のゲノム由来単一エクソンマイクロアレイはこのような配列を用いなくとも作製可能であり、そのようにして構築されれば、非特異的ハイブリダイゼーションに寄与する非特異的配列の量がいっそう少なくなる。
【０１４１】
ＥＳＴマイクロアレイにおけるプローブとしての典型的なクローニング材料の仕様のもう１つの結果として、このようなマイクロアレイが２つの別個の遺伝子のコード領域を含むキメラ分子のようなクローニング人工産物から生じたプローブを含むということがある。ゲノム材料に由来し、典型的にはその後クローニングされなければ、本発明のゲノム由来単一エクソンマイクロアレイのプローブはこのようなクローニング人工産物を欠き、従って、遺伝子発現の測定においてシグナルの特定性が高まる。
【０１４２】
多くのＥＳＴマイクロアレイにおいてプローブがクローニング起源であるさらなる結果として、個々のプローブの大きさがしばしば異なるということがあり、これにより最適なハイブリダイゼーションストリンジェンシーが１つのマイクロアレイ上のプローブ間で異なることとなる可能性がある。これに対し、上記のように、本発明のゲノム由来単一エクソンマイクロアレイ上に配置されるプローブは大きさのばらつきが狭いように、プローブサイズが平均サイズの約１０％を超えない、典型的には平均プローブサイズの約５％を超えない範囲でデザインすることが容易にできる。
【０１４３】
それらが完全または部分的スプライシングメッセージに起源するために、ＥＳＴアレイに配置されたプローブはしばしば複数のエクソンを含む。ＥＳＴマイクロアレイにおけるこのようなエクソンをわたるプローブのパーセンテージは、与えられた種の推定エクソン／遺伝子数と固定化されたプローブの平均長を基に平均値として算出できる。ヒト遺伝子では、ほぼ完全なヒト第２２染色体の配列（Ｄｕｎｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４０２ （６７６１）： ４８９−９５ （１９９９））によりヒト遺伝子は平均５．５エクソン／遺伝子であると推定される。２００ないし５００ｂｐのプローブをもってしても、大多数のヒトＥＳＴマイクロアレイプローブは１を超えるエクソンを含む。
【０１４４】
これに対し、本発明のゲノム由来単一エクソンマイクロアレイにおけるプローブは、ゲノム配列においてアルゴリズム的に同定されたエクソンに起源しているために個々のエクソンを含み、これにより、出典明示により本明細書にそのまま組み入れる、同一所有者同時係属の米国特許出願第０９／６３２，３６６号（２０００年８月３日）出願にさらに記載されているように、スプライシング変異体の発現を検出および同定する能力が与えられる。
【０１４５】
マルチエクソンプローブが存在しても最初のレベルのスクリーニングでは推定エクソンの発現を確認する能力が妨げられることはないが、本発明のゲノム由来マイクロアレイ上に配置されるプローブの少なくとも約５０％、典型的には少なくとも約６０％、いっそう典型的には少なくとも約７０％がエクソン１つだけからなる、またはエクソンを１つだけ含むことが好ましい。好ましい実施態様では、本発明のゲノム由来マイクロアレイのプローブの少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９９％までもがエクソン１つだけからなる、またはエクソンを１つだけ含む。
【０１４６】
最も好ましくは実施態様では、ゲノム由来マイクロアレイのプローブの少なくとも約９５％、さらには少なくとも９９％までもがエクソン１つだけからなる、またはエクソンを１つだけ含むが、発明者らは発明者らの初期のバイオインフォマティクス・パラメーターが典型的にはこの段階の解析では約１０％のプローブが潜在的に２つにエクソンを含むことを見出した。発明者らはこれらのプローブのある部分が単一のエクソンだけをコードしていることを証明できると考え、発明者らのバイオインフォマティクス的アプローチをさらに至適化することで、１を超える潜在エクソンを有するプローブのパーセンテージが下がるものと予測する。
【０１４７】
当技術分野において本発明のゲノム由来単一エクソンマイクロアレイとＥＳＴアレイとをさらに区別する点は、ＥＳＴマイクロアレイにおいて表現されるエクソンが、ＥＳＴの同定に用いられるシーケンシングの方法論がそのような偏りを持つことから、それらの個々の遺伝子の３’または５’末端にしばしば偏っている。これに対し、本発明のゲノム由来単一エクソンマイクロアレイに配置するためのエクソンの選択の際にはこのような３’または５’の偏りは必ずしも付与されていない。
【０１４８】
逆に、本発明のゲノム由来単一エクソンマイクロアレイに提供されるプローブは、必ずしもそうである必要はないが典型的には、成熟ｍＲＮＡに由来し、ＥＳＴマイクロアレイには存在しないイントロン配列および／または遺伝子間配列を含む。上記のように、このような包含は必須ではないが、特に選択的スプライシングの検出のためのプローブを用いる際には有利である。従って典型的には、本発明のゲノム由来単一エクソンマイクロアレイ上のエクソン含有プローブの少なくとも約５０％、より典型的には少なくとも約６０％、いっそう典型的には少なくとも約７０％が非コード領域から抽出された配列を含む。いくつかの実施態様では、本発明のゲノム由来単一エクソンマイクロアレイ上のエクソン含有プローブの少なくとも約８０％、より典型的には少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、また９９％以上までもが非コード領域から抽出された配列を含む。
【０１４９】
本発明のゲノム由来単一エクソンマイクロアレイはまた、フォトリソグラフィーまたはその他ｉｎ ｓｉｔｕ合成法の制限によりプローブサイズが厳しく制約されるｉｎ ｓｉｔｕ合成マイクロアレイとは全く異なっている。
【０１５０】
典型的にはｉｎ ｓｉｔｕ合成マイクロアレイ上に配列されたプローブは最大約２５ｐｂに制限される。周知の結果として、このようなチップに対するハイブリダイゼーションは低ストリンジェンシーで行わなければならない。従って、明白な配列特異的なハイブリダイゼーション結果を得るには、ｉｎ ｓｉｔｕ合成マイクロアレイでは、変異した（すなわち、誤対合した）配列を有するプローブ類似体の各プローブについてプログラムされた整列を伴った実質的な重複を必要とする。
【０１５１】
これに対し、プローブ長がより長い本発明のゲノム由来単一エクソンマイクロアレイでは遙かに高いストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションおよび洗浄が可能である。従って典型的には、本発明のゲノム由来単一エクソンマイクロアレイ上のエクソン含有プローブは平均少なくとも約１００ｂｐ、より典型的には少なくとも約２００ｂｐ、好ましくは少なくとも約２５０ｂｐ、いっそう好ましくは約３００ｂｐ、４００ｂｐ、あるいは好ましい実施態様では少なくとも約５００ｂｐの長さである。実質的なプローブ重複の必要をなくすことで、このアプローチはｉｎ ｓｉｔｕ合成マイクロアレイで達成可能な、本発明のマイクロアレイ上に配列される個々のエクソンまたは遺伝子に対するプローブを高密度とすることができる。
【０１５２】
さらなる違いとしては、ｉｎ ｓｉｔｕ合成マイクロアレイのプローブは典型的には支持基板に共有結合されることである。これに対し、本発明のゲノム由来マイクロアレイ上に配置されるプローブは必ずしも必要ではないが、典型的には、基板に非共有結合的に結合される。
【０１５３】
さらに、ｉｎ ｓｉｔｕマイクロアレイ上の短いプローブでは、それらの相補的標的配列とハイブリダイズしたプローブの融解温度において大きなパーセンテージの差が生じることから、アレイ全体としての理論上の最適ストリンジェンシーにおいても大きなパーセンテージ差が生じる。
【０１５４】
これに対し、本発明のマイクロアレイにおいてのより大きなプローブでは、配列されたプローブの範囲の融解温度におけるパーセンテージ差が小さくなる。
【０１５５】
ｉｎ ｓｉｔｕ合成アレイに優る本発明のマイクロアレイのさらなる顕著な利点は、個々の各プローブの質が配置の前に確認できるということである。これに対し、プローブの質はこれまでに用いられているｉｎ ｓｉｔｕ合成マイクロアレイではプローブごとの基準で評価することはできない。
【０１５６】
本発明のゲノム由来単一エクソンマイクロアレイはまた、酵母などの下等な真核生物からのゲノム由来マイクロアレイとも区別され、それに優る実質的利点を提供する。例えば、Ｌａｓｈｋａｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４： １３０５７−１３０６２ （１９９７）参照。
【０１５７】
サッカロミセス・セレビシエにおける６１００ほどの核遺伝子のうち約２２０ないし２５０だけ、すなわち４ないし５％だけが遺伝子推定および／または比較配列解析の先行使用を必要とせずにこのようなマイクロアレイ上の単一エクソンアンプリコンの容易な増幅および配置を可能とする標準的なスプライセオソームイントロンを有する（Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８： ８５−８６ （２０００）； Ｓｐｉｎｇｏｌａ ｅｔ ａｌ．， ＲＮＡ ５（２）： ２２１−３４ （１９９９））。
【０１５８】
本発明の重要な態様はサッカロミセス・セレビシエなどの酵母よりも高いパーセンテージのイントロン含有遺伝子を有する真核生物から抽出されたゲノム配列において、特にはタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも約１０％、典型的には少なくとも約２０％、より典型的には少なくとも約５０％がイントロンを有する真核生物から抽出されたゲノム配列において推定コード領域を同定およびその発現を確認することができることである。好ましい実施態様では、本発明の方法および装置は、遺伝子当たりのイントロンの平均数が少なくとも約１、より典型的には少なくとも約２、いっそう典型的には少なくとも約３以上である真核生物のゲノム配列に由来する新規な遺伝子のエクソンを同定およびその発現を確認するために使用される。
【０１５９】
物理的基板を製造した後、推定される機能の実験的確認を行う。
【０１６０】
ゲノム配列において同定しようとする機能がタンパク質のコードである本発明の好ましい実施態様では、実験的確認は典型的には核酸ハイブリダイゼーション実験により、特に好ましい実施態様では上記のようにして製造したゲノム由来単一エクソンマイクロアレイとのハイブリダイゼーションにより、推定エクソンの発現を測定することで行う。
【０１６１】
発現は便宜にはマイクロアレイ分野で周知の技術に従い（その開示を出典明示により本明細書にそのまま組み入れる、Ｓｃｈｅｎａ （ｅｄ．）， ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ）， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９９） （ＩＳＢＮ： ０１９９６３７７６８）； Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ２１（１） （ｓｕｐｐｌ）：１ − ６０ （１９９９）； Ｓｃｈｅｎａ （ｅｄ．）， Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ： Ｔｏｏｌｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ／ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｂｏｏｋｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ （２０００） （ＩＳＢＮ： １８８１２９９３７６）に総説）、マイクロアレイ中の各プローブについてシグナル強度として、また対照に対して測定された発現の比率としての双方で測定および報告する。以下の実施例２も参照のこと。発現率を算出するのに用いる参照（対照）のｍＲＮＡソースは、複数の組織および／または細胞種のプールに由来するもののように異種であっても、あるいは単一培養細胞種のような同種のｍＲＮＡソースから抽出してもよい。
【０１６２】
以下の実施例１および２では、発明者らは対照として１０種の組織／細胞のプールを用いる。発明者らは対照プールで発現を示すほとんど全てのプローブがＨｅＬａ細胞で発現することが容易に示せることを認めた。プールされた対照を用いると微妙な選択的スプライシングがマスクされる可能性があることから、発明者らは最近の実験では対照メッセージのソースとしてＨｅＬａ細胞を用いている。
【０１６３】
ｍＲＮＡは標準的な技術（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， ４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ （Ａｐｒｉｌ １９９９）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （ＩＳＢＮ： ０４７１３２９３８Ｘ）およびＭａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９８９）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （ＩＳＢＮ： ０８７９６９３０９６）、なお、これらの開示は出典明示により本明細書にそのまま組み入れる）により製造できるし、あるいは市販されている。次いでこのｍＲＮＡを典型的には標識ヌクレオチドの存在下で逆転写させる。すなわち、インデックスソース（その中で発現を測定しようとするもの）を第１の標識、典型的には蛍光団（同じく蛍光色素、蛍光体、蛍光染料と呼ばれる）で標識したヌクレオチドの存在下で逆転写させ、リファレンスソースは第２の標識、典型的には蛍光団、典型的には第１の標識から蛍光測定により識別できるものの存在下で逆転写させる。以下の実施例２にさらに記載されているが、Ｃｙ３およびＣｙ５染料が本方法に特に有用であることが分かっている。インデックスおよびリファレンス標的を部分精製した後、標準的な技術に従い、典型的にはカバーガラス下、または自動スライド処理装置でプローブアレイに対するハイブリダイゼーションを行う。
【０１６４】
洗浄後、マイクロアレイを便宜にはＧｅｎ３またはＡｖａｌａｎｃｈｅ Ｓｃａｎｎｅｒ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）などの市販のマイクロアレイスキャニング装置を用いてスキャンする。次いで発現についてのデータ（一次保存してもよいし、しなくともよい）をプロセス５００に送り、そこで各プローブに関する結果をもとの配列と関連づける。
【０１６５】
多くの場合、ゲノム由来単一エクソンマイクロアレイに対する標的材料のハイブリダイゼーションは特に着目するその上のプローブを確実に識別する。このように、次ぎにさらなる支持基板上にアレイ配置するために、多くはこのようにして同定された複数のプローブを有するマイクロアレイの一部として、あるいはその代わりに、またはそれに加えてさらなる使用のための単一の固相もしくは液相プローブとしてといったように、個々のプローブの十分な質をユーザーが容易に得られることがしばしば望ましい。
【０１６６】
このように、もう１つの態様では、本発明は本発明のゲノム由来単一エクソンマイクロアレイ上のプローブと配列が同じ核酸、または配列が実質的に同じ核酸を容易に製造するための組成物およびキットを提供する。
【０１６７】
ある実施態様では、本発明は実質的に単離および精製された核酸の形態の個々の単一エクソンプローブを提供する。このような実施態様の１つでは、プローブはハイブリダイゼーション反応を行うに十分な質で提供される。
【０１６８】
ハイブリダイゼーション反応を行うに十分な質で提供される場合、プローブは二本鎖ＤＮＡ、標的に相補的な一本鎖ＤＮＡ、標的に相補的な一本鎖ＲＮＡ、またはこのようなハイブリダイズ可能なキメラＤＮＡ／ＲＮＡ分子など、プローブのエクソン（またはその相補物）を含む標的に直接ハイブリダイズ可能ないずれかの形態であり得る。
【０１６９】
この核酸はその代わりに、あるいはそれに加えて、相補的結合が得られる限り、非天然ヌクレオチド、別のヌクレオチド間結合、またはその双方を含んでもよい。例えば、特に米国特許第５，１４２，０４７号；同第５，２３５，０３３号；同第５，１６６，３１５号；同第５，２１７，８６６号；同第５，１８４，４４４号；同第５，８６１，２５０号；国際特許出願ＷＯ９３／２５７０６；およびＳｃｉｅｎｃｅ ２５４： １４９７ （１９９１）； Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１４：９６７７ （１９９２）； Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １４４：１８９５ （１９９２）； Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍ． ８００ （１９９３）； Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１６６７ （１９９３）； Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ Ｌｔｄ． ３２５ （１９９２）； Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１４：９６７７ （１９９２）； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１：１９７ （１９９３）； Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ． ５１８ （１９９３）； Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ８：５３ （１９９３）； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１：２１０３ （１９９３）； Ｏｒｇ． Ｐｒｏｃ． Ｐｒｅｐ． ２５：４５７ （１９９３）； ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ３６３ （１９９２）； Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ． ９：８００ （１９９３）； Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１５：６４７７ （１９９３）； Ｎａｔｕｒｅ ３６５：５６６ （１９９３）； ＷＯ９２／２０７０２；およびＷＯ９２／２０７０３（なお、これらの開示は出典明示により本明細書に組み入れる）に記載されるように、プローブとしてはホスホロチオエート、メチルホスホネート、モルホリノ類似体、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。
【０１７０】
しかし、このようなプローブはそれよりもＰＣＲによるような増幅に好適な形態および量で提供されることが便宜である。通常はＰＣＲが用いられるが、特に米国特許第５，８５４，０３３号および同第５，７１４，３２０号ならびに国際特許出願ＷＯ９７／１９１９３およびＷＯ００／１５７７９（なお、これらの開示は出典明示により本明細書に組み入れる）に記載されるようなローリングサークル増幅など、他の増幅アプローチも同様に使用できる。十分理解されていることであるが、これらのプローブが増幅に好適な形態で提供される場合、核酸類似体の範囲および／またはヌクレオチド間結合の範囲は増幅酵素の必要条件および性質によって制約を受ける。
【０１７１】
これらのプローブが増幅に好適な形態で提供される場合、遺伝子発現解析のための直接ハイブリダイゼーションに十分であるほどの質は必要とせず、単に増幅鋳型として働くに十分であればよく、典型的には少なくとも約１ｐｇ、より典型的には少なくとも約１０ｐｇ、通常は少なくとも約１００ｐｇ以上であればよい。
【０１７２】
個別の増幅可能なプローブは各々、プローブ鋳型とプライマーを含む単一の組成物、またはそれから個別パッケージングされたこのようなプライマーを含むキットのいずれかとして、増幅プライマーともにパッケージングすることもできる。上記のように、ゲノム増幅に用いるエクソン特異的５’プライマーはそれに付加された第１の共通配列を有してもよく、ゲノム増幅に用いるエクソン特異的３’プライマーはそれに付加された第２の異なる共通配列を有してもよく、このようなものであれば、この具体例では１セットの５’および３’プライマーを用いていずれのプローブも増幅することができる。このプローブ組成物および／またはキットはまた増幅を行うのに必要なバッファー、酵素などを含んでもよい。
【０１７３】
もう１つの実施態様では、増幅プライマーのみを提供する。これらのプライマーはユーザーが準備できるゲノムＤＮＡから増幅により単一エクソンプローブを生じさせるに十分なものである。
【０１７４】
上記のように、本発明のゲノム由来単一エクソンマイクロアレイでの使用を意図する場合、本発明のゲノム由来単一エクソンプローブは、エクソンを含め（必ずというわけではないが典型的にはエクソンを中心に）典型的には平均少なくとも約７５ないし１００ｂｐ、より典型的には少なくとも約２００ｂｐ、好ましくは少なくとも約２５０ｂｐ、いっそう好ましくは約３００ｂｐ、４００ｂｐ、または好ましい実施態様では少なくとも約５００ｂｐの長さである。さらに、本発明のゲノム由来単一エクソンマイクロアレイでの使用を意図する場合、本発明のゲノム由来単一エクソンプローブは検出可能な標識を含まないのが典型である。
【０１７５】
しかし、固相ハイブリダイゼーションでの使用、すなわち、プローブが最初に支持基板に結合されていない（しかし、標的は実際には結合されていると考えられる）ハイブリダイゼーション反応での使用を意図する場合、マイクロアレイに基づくハイブリダイゼーションアプローチに課せられる長さの制約はゆるくなり、このようなプローブは標識されるのが典型である。
【０１７６】
このような場合、このようなプローブの最小サイズを指定する唯一の機能的制約は、このような各プローブがハイブリダイゼーション反応においてそれから抽出されたエクソンを特異的に同定することができねばならないということである。理論上、１７ヌクレオチドといった小さなプローブがヒトゲノムにおいてその同族配列を特異的に同定することができる。発現したメッセージ、すなわち、ゲノム配列に比べて複雑性がかなり低い標的配列のサブセットに対するハイブリダイゼーションでは、特異性のために遙かに少ないヌクレオチドしか必要としない。
【０１７７】
従って、本発明のプローブはせいぜい２０ｂｐのエクソン、典型的には少なくとも約２５ｂｐのエクソン、より典型的には少なくとも約５０ｂｐ以上のエクソンを含めばよい。液相またはマイクロアレイに基づくハイブリダイゼーションのいずれかにおいて特異的にシグナルを与えるために本発明のプローブに含める必要があるエクソンの最低量は、標準的な高いストリンジェンシー条件を用いて通常の実験で容易に決定することができる。
【０１７８】
このような高いストリンジェンシー条件は特に、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， ４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ （Ａｐｒｉｌ １９９９）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （ＩＳＢＮ： ０４７１３２９３８Ｘ）およびＭａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９８９）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （ＩＳＢＮ： ０８７９６９３０９６）（なお、これらの開示は出典明示により本明細書にそのまま組み入れる）に記載されている。
【０１７９】
マイクロアレイに基づくハイブリダイゼーションでは、標準的な高いストリンジェンシー条件とは、便宜には、５０％ホルムアミド、５Ｘ ＳＳＣ、０．２μｇ／μｌポリ（ｄＡ）、０．２μｇ／μｌヒトｃｏｔ１ ＤＮＡおよび０．５％ ＳＤＳ、加湿炉中、４２℃で一晩、引き続き、１Ｘ ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳ中、５５℃で５分、次いで、０．１Ｘ ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳ中、５５℃で２０分のマイクロアレイの連続洗浄であればよい。
【０１８０】
固相ハイブリダイゼーションでは、標準的な高いストリンジェンシー条件とは、便宜には、６Ｘ ＳＳＣ中、６５℃での水性ハイブリダイゼーションであればよい。
【０１８１】
構造関連および機能関連のタンパク質をコードするｍＲＮＡに対するクロス・ハイブリダイゼーションに好適な低いストリンジェンシー条件は、便宜には、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度を室温（およそ２５℃）に下げること以外は高いストリンジェンシー条件と同じであってよい。
【０１８２】
固相ハイブリダイゼーションでの使用を意図する場合、本発明の単一エクソンプローブの最大サイズはゲノムＤＮＡ中のその他のエクソンの近接により指定され、各単一エクソンプローブは、ヒトゲノム中のそのエクソンに隣接する遺伝子間成分および／またはイントロン成分を含み得るが、本発明の各プローブは典型的にはただ１つのエクソン部分しか含まない。
【０１８３】
このように、各単一エクソンプローブはわずか約２５ｋｂの隣接ゲノム配列、より典型的にはわずか約２０ｋｂ、より通常にはわずか約１５ｋｂ、いっそう通常にはわずか約１０ｋｂの隣接ゲノム配列しか含まない。通常、最大約５ｋｂのプローブが用いられ、わずか約３ｋｂというのがより典型的である。
【０１８４】
一本鎖プローブは標的配列に相補的でなければならないと考えられるが、このような相補的配列およびその必要条件を決定することは十分当業者の範囲内である。さらに、二本鎖プローブは適宜変性させれば、液相ハイブリダイゼーションおよびマイクロアレイに基づくハイブリダイゼーションの双方に使用できると考えられる。このように、本明細書の上記および下記で示されるものと相補的な配列を有する一本鎖核酸プローブ、およびその一方の鎖が本明細書に記載されるプローブと相補的な配列を有する二本鎖プローブを提供することが本発明の１つの態様である。
【０１８５】
上記のように、必ずしも必要ではないが、プローブは、遺伝子間成分および／またはイントロン成分がゲノムＤＮＡ中でエクソンの方へ向くようにエクソンと同一の直線関係で、片側または両側でエクソンをフランクする遺伝子間成分および／またはイントロン成分を含でもよい。しかし、これらのプローブは１を超える発現エクソンに由来する核酸は含まないのが典型である。
【０１８６】
また、溶液ハイブリダイゼーションでの使用を意図する場合、本発明のプローブは検出可能な標識を持ち得ることが便宜である。核酸標識は当技術分野で周知であり、特に３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉなどの放射活性標識；Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン、その他Ｈａｕｇｌａｎｄ， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， ７ｔｈ ｅｄ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ （２０００）に記載の標識、またはその蛍光共鳴エネルギー移動タンデムコンジュゲートなどの蛍光標識；化学発光および／または増強化学発光検出に好適な標識；ＥＳＲおよびＮＭＲ検出に好適な標識；量子ドット；およびビオチン、ジオキシゲニンなどのような特異的結合対の一方のメンバーを含む標識が挙げられる。
【０１８７】
プローブはハイブリダイゼーションに十分な、あるいは増幅に十分な質で個別のバイアルまたはコンテナで提供してもよく、また、乾燥（例えば凍結乾燥）または溶媒和形態で提供してもよい。溶媒和形態であれば、その溶液はハイブリダイゼーションおよび／または増幅に望ましいバッファーおよび塩を含み得るのが便宜である。また、マイクロアレイ上にスポットするのが望ましければ、これらのプローブは、マイクロアレイ支持基板への付着を助けるために攪乱剤溶液として提供できるのが便宜である。
【０１８８】
あるいは、これらプローブは複数のこのような個々のゲノム由来単一エクソンプローブとしてパッケージングできるのが便宜である。
【０１８９】
本態様のある実施態様では、各々少量のプローブを、典型的には基板に結合させずに、典型的にはマイクロタイターディッシュのウェルにつき１つの空間アドレス整列されたセットを配置する。９６ウェルマイクロタイタープレートを使用できるが、３８４、８６４、１５３６、３４５６、６１４４、または９６００ウェルを有するマイクロタイタープレートにより提供されるものなど、より高密度のアレイを用いるとより高い効率が得られる。また、物理的なくぼみ（ウェル）を有するマイクロタイタープレートが便宜に使用されるが、液体連絡していない領域から試薬をアドレス回収可能ないずれも装置でも使用できる。
【０１９０】
整列されたセットのプローブの各々は個々のパッケージングされたプローブに関して上記されている形態のいずれでも提供できる。
【０１９１】
上記のように、ゲノム増幅に用いるエクソン特異的５’プライマーはそれに付加された第１の共通配列を有してもよく、ゲノム増幅に用いるエクソン特異的３’プライマーはそれに付加された第２の異なる共通配列を有してもよく、このようなものであれば、特定の実施態様では１セットの５’および３’プライマーを用いて、増幅可能な整列セットからいずれのプローブも増幅することができる。
【０１９２】
このようなゲノム由来単一エクソンプローブのコレクションは、所定の組織、細胞種、発達段階、病状などにおける共通の発現など、共通の属性に関して選択された複数のプローブを含み得るのが便宜である。
【０１９３】
このような規定のサブセットでは、典型的には少なくとも５０％のプローブが規定の組織または細胞種での発現などの共通の属性を有する。より典型的には、少なくとも約６０％のプローブが規定の組織で発現し、いっそう典型的には少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、８５％、または好ましい実施態様では少なくとも約９０％、また、９５％以上までのもプローブが規定の組織または細胞種での発現などの共通の属性を有する。
【０１９４】
同様に、本発明はもう１つの態様において、所定の組織、細胞種、発達段階、病状などにおける共通の発現など、共通の属性に関して選択された複数のプローブを有するゲノム由来単一エクソン核酸マイクロアレイを提供する。
【０１９５】
これらの「サブセットにより規定される」ゲノム由来単一エクソンマイクロアレイは本発明の「第１の繰り返し」ゲノム由来単一エクソンマイクロアレイから、すなわち、推定されたエクソンの発現を確認するために使用されるものから、規定の組織または細胞種での発現などの共通の属性を有することが分かっているプローブのパーセンテージにより識別できる。このような「サブセットにより規定される」マイクロアレイでは、典型的には少なくとも５０％のプローブが共通の属性、典型的には規定の組織または細胞種での発現を有する。より典型的には少なくとも約６０％のプローブが規定の組織で発現し、いっそう典型的には少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、８５％、または好ましい実施態様では少なくとも約９０％、また９５％以上までものプローブが規定の組織または細胞種での発現などの共通の属性を有する。
【０１９６】
遺伝子発現解析に用いる場合、この「規定サブセット」のゲノム由来単一エクソンマイクロアレイは、供試組織で共通して発現することが分かっているプローブを低いパーセンテージで有するゲノム由来単一エクソンマイクロアレイよりも高い物理的常法密度を提供する。例えばプローブ密度を固定した場合では、規定サブセットのゲノム由来単一エクソンマイクロアレイの所定のマイクロアレイ表面積はより多数の発現測定値をもたらす。あるいは、所定のプローブ密度では、基板表面積のより小さいものからでも同じ数の発現測定値が得られる。あるいは、プローブ密度を固定し、かつ、表面積を固定した場合には、プローブは重複して提供できるので、あるいずれかのプローブに対するシグナル測定により高い確実性が得られる。さらに、アッセイする組織で発現することが分かっているプローブのパーセンテージが高ければ、発現のレベル間でより緻密なレベルの識別を明らかにするよう、検出手段の動的範囲を調節することができる。
【０１９７】
本発明のもう１つの態様では、ゲノム由来単一エクソンマイクロアレイは個々のプローブのアドレッサブルセットとともにパッケージングするが、この個々のプローブのセットは少なくともマイクロアレイ上に少なくとも１つのプローブのサブセットを含む。別の実施態様では、整列された増幅可能なプローブセットを、ゲノム由来単一エクソンマイクロアレイとは別にパッケージングする。
【０１９８】
ある実施態様では、このマイクロアレイおよび／または整列プローブセットをさらに、プローブの識別と情報のアドレス化を提供し、かつ、遺伝子発現データなどの注釈付け情報をさらに含む記録媒体とともにパッケージングする。このような記録媒体はマイクロアレイ、整列プローブセット、またはその両者とともにパッケージングできる。
【０１９９】
出典明示により本明細書にそのまま組み入れる、「ＣＤ−ＲＯＭ形式の空間アドレッサブル・コンビナトリアル・ケミカル・アレイ」と題された国際特許出願ＷＯ９８／１２５５９に記載されているものなど、記録媒体を組み込んだ基板にマイクロアレイを構成すれば、ゲノム由来単一エクソンマイクロアレイおよびバイオインフォマティクス情報の個々のパッケージングは必要とされない。
【０２００】
固相平面基板で高密度ゲノム由来マイクロアレイを用いることは、これまでのところタンパク質をコードすると推定される配列の発現の物理的確認および同定にとっての好ましいアプローチであるが、他のタイプのマイクロアレイ、ならびに低密度マクロアレイも使用できる。
【０２０１】
プロセス２００においてゲノム配列から推定された機能のプロセス４００での実験的確認は物理的確認よりもむしろ、あるいはそれに加えてバイオインフォマティクス的であり得る。
【０２０２】
同定しようとする機能がタンパク質のコードである場合、推定されたエクソンは発現することが分かっている、または発現するものと思われる配列とバイオインフォマティクス的に比較することができる。
【０２０３】
このようにプロセス３００（またはプロセス２００）から出力された配列はＥＳＴデータベース、ＳＮＰ（「単一ヌクレオチド多形」）データベース、既知のｃＤＮＡおよびｍＲＮＡ配列、ＳＡＧＥ（「連続的遺伝子発現解析」）データベース、および発現した配列のクエリー検索が可能なより総合的な配列データベースなどの発現データベースをクエリー検索するのに使用できる。このようなクエリー検索はＢＬＡＳＴ（「ベーシック・ローカル・アライメント・サーチ・ツール」）など、いずれの配列クエリーアルゴリズムによって行ってもよい。同一配列に関する情報、クエリー配列と相同な配列の散剤または局部領域を有する非同一配列に関する情報をはじめ、このようなクエリー検索の結果は次ぎにプロセス５００にそのまま送られ、プロセス２００、プロセス３００、またはプロセス４００で順次行われる解析を報告するために用いられる。
【０２０４】
実験データはプロセス４００で物理的アッセイによって得られたものであれ、バイオインフォマティクス的アッセイによって得られたものであれ、プロセス５００に送られ、そこで便宜に配列データ自体と関連付けられ、このプロセスを一般に注釈付けと呼ぶ。このような注釈付けは、例えば記録そのものに機能データを組み込むことにより、ヒエラルキーデータベースまたはリレーショナルデータベースに記録をリンクすることにより、外部データベースに記録をリンクすることにより、あるいはそれの組合せにより、機能情報を配列と便宜に結びつけるいずれかの技術を用いて行うことができる。このようなデータベース技術は十分当業者の範囲内にある。
【０２０５】
注釈付けされた配列データはその場所に保存することもできるし、ゲノム配列データベース１００にアップロードすることもできるし、かつ／または表示することもできる８００。
【０２０６】
本発明の方法および装置はゲノム配列からの機能情報を迅速に作製する。発明者らは例えば本発明の方法および装置を用いて、ヒトゲノム配列において１５，０００を超えるエクソンを確認し、その発現を少なくとも１種のヒト組織または細胞で確認した。これらのエクソンのゆうに２／３が既存の公開発現（ＥＳＴ、ｃＤＮＡ）データベースでは表示されなかった遺伝子に属している。発明者らはまた、これらの単一エクソンプローブを用いて新規な遺伝子における選択的スプライシングを同定した。
【０２０７】
目下、配列の蓄積が高まっているペースと結びつけると、本発明によって提供されるゲノムＤＮＡの領域の機能を容易に同定および確認することができるということは、情報を有意義に表示する方法にとって必要なものとなる。従って、注釈付けされた配列を表示する、特に本発明の方法および装置によって注釈付けされた配列を表示する手段を提供することが本発明のもう１つの態様である。さらに、このような表示はこのような注釈付け配列の電子検索、クエリー検索、および解析のための好ましいグラフィック・ユーザー・インターフェースとして使用することができる。
【０２０８】
図３は本発明に従って注釈付けされた単一ゲノム配列を表すビジュアルディスプレー８０を模式的に示す。ピーター・モンドリアンの芸術作品に少し似ていることから、ビジュアルディスプレー８０は本明細書ではあるいは「モンドリアン」とも呼ばれる。
【０２０９】
ディスプレー８０の各ビジュアルエレメントは注釈付けされたゲノム配列（「注釈付け配列」）に関して配列されている。典型的には注釈付け配列において示されるヌクレオチド数が与えられれば、個々のヌクレオチドの表示はディスプレー８０のハードコピー出力で読むようなことはめったにない。従って典型的には、注釈付け配列はディスプレー８０の左の境界線から右の境界線へと伸びる長方形８９として模式化される。本明細書では便宜に、長方形８９の左の境界線がその配列の最初のヌクレオチドを表し、長方形８９の右の境界線がその配列の最後のヌクレオチドを示す。
【０２１０】
しかし、以下でさらに論じるが、注釈付け配列のモンドリアンビジュアルディスプレーは電子保存された情報のコンピューター表示、解析およびクエリー検索のための便宜なグラフィック・ユーザー・インターフェースとして働き得る。このような使用では、個々のヌクレオチドは長方形８９のＸ軸座標とリンクさせることができれば便宜である。これにより、自動的に、すなわち、例えばカーソルその他のポインターを長方形８９の上に動かした際に時間差で小さなオーバーレイドウインドウ（「ツールチップ」）が現れることで、あるいは長方形８９内のある点でマウスその他のポインターをクリックすることなどによるユーザーの介入により、長方形８９内のどの点の注釈付け配列も容易に見ることができる。
【０２１１】
ビジュアルディスプレー８０は、ユーザーが表示するゲノム配列を列挙した後に作成される。このような列挙は単一のクローン（例えば、ＧｅｎＢａｎｋに登録された単一のＢＡＣ）の登録番号からなるか、またはそれを含み得るか（従ってこの場合には、開始および終結ヌクレオチドが確実に同定されている）、あるいは、選択された配列の範囲に関して固定されたアンカーまたは支点からなるか、またはそれを含み、従って表示される配列の相対的な終点が得られる。例えば、ユーザーは所定の染色体マップ位置、遺伝子名、またはクエリー検索により入力クエリー配列との類似もしくは一致として返ってきた配列に対してでもこのような範囲を固定することができる。ビジュアルディスプレー８０をコンピューター処理データに対するグラフィック・ユーザー・インターフェースとして用いる場合、標準的な絞り込みおよび／または選択ツールを用いることで最初と最後に表示されたヌクレオチドをさらに制御すれば能動的に選択可能となるのが典型である。
【０２１２】
プロセス２００からの出力を表す、すなわち、ゲノム配列内に所望の機能を有する配列のバイオインフォマティクス的推定を表すにはビジュアルディスプレー８０の欄８１を用いる。さらなる配列は典型的には少なくとも１つの長方形８３（８３ａ、８３ｂ、８３ｃ）によって示され、それらのＸ軸座標によりその左の境界線および右の境界線がそれぞれ機能を有すると推定される領域の開始ヌクレオチドおよび終結ヌクレオチドを示す。
【０２１３】
単一のバイオインフォマティクス的方法またはアプローチが、所望の機能を有する複数の領域を同定する場合には、欄８１に複数の長方形８３が配置される。複数の方法および／またはアプローチを用いて機能を同定する場合には、かかる方法および／またはアプローチは各々、水平に配置された独自の一連の長方形８３によって示すことができ、このように水平に配置された一連の各長方形は他の方法およびアプローチの結果を表すものから垂直に分岐する。
【０２１４】
このように、図３の長方形８３ａは機能を推定するための第１のアプローチの第１の方法の機能推定を表し、長方形８３ｂはその機能を推定するための第２の方法および／または第２のアプローチの機能推定を表し、また、長方形８３ｃは第３の方法および／またはアプローチの推定を表す。
【０２１５】
同定しようとする機能がタンパク質のコードである場合、欄８１を用いてタンパク質をコードする配列のバイオインフォマティクス的推定を示す。例えば、長方形８３ａはＧＲＡＩＬまたはＧＲＡＩＬ ＩＩの結果を表し、長方形８３ｂはＧＥＮＥＦＩＮＤＥＲの結果を表し、長方形８３ｃはＤＩＣＴＩＯＮの結果を表し得る。
【０２１６】
所望により、好ましくは、単一の方法および／またはアプローチの推定をひとまとめにして表す長方形８３は同じ色および／またはテクスチャーであり、別の方法および／またはアプローチで用いられる色および／またはテクスチャーと区別できる。
【０２１７】
その代わりに、またはそれに加えて、長方形８３の色、色合い、密度、またはテクスチャーはさらにその推定のバイオインフォマティクス的確実性の評価を報告するのにも使用できる。例えば、多くの遺伝子推定プログラムが推定の確実性の評価を報告する。このように、かかる確実性の程度が高まりは濃淡の濃さの高まりにより示すことができる。ディスプレー８０をグラフィック・ユーザー・インターフェースとして用いる場合、それに加えて、またはその代わりに、このような確実性の評価および実際にそのプログラムによって出力された他の全ての結果が、時間差ウインドウ（「ツールチップ」運動）またはポインター（例えば、マウス）による能動的リンクにより、個々の長方形８３からのリンクにより利用できるようになる。
【０２１８】
上記のように、推定の確実性の上昇は機能を調べる方法および／またはアプローチ間の一致を求めることによって達成することができる。このように、欄８１は、フレーム内で重複する個別推定されたエクソンの長さを組み合わせることをはじめ、機能の推定においてより高い一致程度を示す一連の水平の長方形８３を含み得る。
【０２１９】
図３は欄８１に水平に配置された３つの一連の長方形を示すが、ディスプレー８０は、ある機能を推定するのに用いられる方法および／またはアプローチの数にもよるが、少なくければこのような一連の長方形を１つ、多くとも識別できる状態で表示できるまでの長方形を含み得る。例えば、最初の試みで用いた３つの遺伝子推定プログラム（ＧＲＡＩＬ、ＧＥＮＥＦＩＮＤＥＲ、ＤＩＮＴＩＯＮ）へＧＥＮＳＣＡＮ（
ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｓ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＧＥＮＳＣＡＮｉｎｆｏ．ｈｔｍｌ）
などの４つ目の遺伝子推定プログラムを追加することは、欄８１に水平に配置され、長方形８１ａ、８１ｂおよび８１ｃから垂直に分岐する４番目の一連の長方形によって提供することができる。
【０２２０】
さらに、欄８１は異なる複数の機能の推定を示すために使用できる。しかし、このようなディスプレーにより時としてビジュアル的な複雑性を増すので、ディスプレーに対して単一の機能を選択するユーザーの能力がより有効なものとなる。ディスプレー８０をコンピュータークエリー検索および解析のグラフィック・ユーザー・インターフェースとして使用する場合、このような機能は一連のグラフィックボタンまたはタブ（図３では示されていない）によって便宜に示され、ユーザーが選択できる。
【０２２１】
長方形８９は図３では、長方形８４が挿入されて示されている。長方形８４は、推定された機能情報が物理的にアッセイされた注釈付け配列の部分を表し、アッセイした材料の開始および終結ヌクレオチドが長方形８４の左の境界線および右の境界線のＸ軸座標で示されている。長方形８５は、所望により円８６（８６ａ、８６ｂおよび８６ｃ）とともにこのような物理的アッセイの結果を表示する。
【０２２２】
図３には単一の長方形８４が示されているが、物理的アッセイは注釈付けゲノム配列の１領域だけに限られるものではない。プロセス２００によって機能を有する推定された領域の増加のパーセンテージが物理的にアッセイされ、従って、いずれの所定のゲノム配列に対してもディスプレー８０の長方形８４および８５の数は増え、高い密度の配列の注釈付けを表すものと思われる。例えば、選択的スプライシング検出のためのエクソン特異的プローブの生成を目的として、一般に単一の遺伝子に属する複数のエクソン、好ましくは全てのエクソンについて実験的に発現をアッセイするのが好ましい。従って、ディスプレー８０はこのようなエクソンを包含するゲノム配列にでは、アッセイしたエクソンの各々について一連の長方形８４および８５を有する。
【０２２３】
同定しようとする機能がタンパク質のコードである場合、長方形８４は発現の測定に用いるプローブの配列を同定する。本発明の実施態様において、ゲノム由来単一エクソンマイクロアレイを用いて発現を測定する場合、長方形８４はマイクロアレイの固相支持体表面に固定化されたプローブに含まれる配列を同定する。上で特に述べたように、このようなプローブは増幅中に組み込まれた少量の付加的、合成的材料を含むことがしばしばあり、プローブの再増幅を可能とするようデザインされる。なお、この配列はディスプレー８０には示されないのが典型である。
【０２２４】
長方形８７はゲノム配列のバイオインフォマティクス的アッセイの結果を表すのに用いられる。例えば、同定しようとする機能がタンパク質のコードである場合、プロセス４００にはプロセス２００でエクソンをコードすると推定された配列を用いて発現データベースをバイオインフォマティクス的にクエリー検索することが含まれる。そして上記で論じたように、バイオインフォマティクス的アッセイは物理的アッセイよりも制約が少ないので、プロセス３００によりそれをさらにサブッセットすることなくプロセス２００の全出力をかかるアッセイに用いることができる。従って、長方形８７は典型的にはバイオインフォマティクス的アッセイに提示される領域の個々の指標を含む必要はなく、すなわち、長方形８７は典型的にはその中に長方形８９中の長方形８４に類似する領域を持つ必要がない。
【０２２５】
図３で示される長方形８７は小さな長方形８８０および８８を含む。長方形８８０はバイオインフォマティクス的アッセイにおいて該当結果を回答した領域を示し、長方形８８はこのような該当結果を回答しなかった領域を表す。推定および表示しようとする機能がタンパクの質コードである場合、長方形８８０は、ＥＳＴ、ＳＮＰ、ＳＡＧＥデータベースなどの発現データベースにおいて有意な類似性を持つ配列を同定する推定エクソンの領域を示し、長方形８８は既存の発現データベースで同定されたものに対して新規な遺伝子を示す。
【０２２６】
長方形８８０はさらに色、濃淡、テクスチャーなどにより、バイオインフォマティクス的アッセイから得られたさらなる情報を示す。
【０２２７】
例えば、アッセイされ表示される機能がタンパク質のコードである場合、長方形８８０の濃淡の程度を用いて発現データベースのクエリー検索で見出された配列の類似性の程度を表すことができる。識別レベルの数はわずか２である（同一性および類似性、なお、類似性はユーザーの選択できる下限値を有する）。あるいは、視覚的に識別できる限り多くの異なる識別レベルを示すこともできる。
【０２２８】
ディスプレー８０をグラフィック・ユーザー・インターフェースとして用いる場合、長方形８８０はさらに発現データベースのクエリー検索により同定された配列および／またはその統計的概要ヘ直接リンクさせることができる。すでに論じたディスプレー８０のグラフィック・ユーザー・インターフェースとしての各使用に関して、ディスプレー８０を経由して入手した情報はかかる表示をするコンピューターに常駐させる必要はなく、多くの場合、１以上の遠隔サーバーに常駐するリンク情報をもってクライアントとしての働くことを理解すべきである。
【０２２９】
長方形８５はその左右の境界線により区切られた配列の物理的アッセイの結果を表示する。
【０２３０】
長方形８５は単一の長方形からなってもよく、そのような場合には単一のアッセイを示すが、あるいは、また、より典型的には、同じ配列の個別の物理的アッセイを示す一連の長方形（８５ａ、８５ｂ、８５Ｃ）からなる。
【０２３１】
アッセイする機能が遺伝子発現である場合、かつ、遺伝子発現が本明細書に記載のようにゲノム由来単一エクソンマイクロアレイへのハイブリダイゼーションの同時２色蛍光検出法を用いてアッセイされる場合、個々の長方形８５を彩色して対照に対する発現の程度を示すことができる。便宜には、従来それぞれその標識化に用いてきたＣｙ３およびＣｙ５染料のスペクトルに対応する、緑色の濃淡を用いて対照値を越えるサンプル中の発現を表すことができ、また、赤色の濃淡を用いて対照より低い発現を表すことができる。さらなる機能情報は円８６（８６ａ、８６ｂ、８６ｃ）の形で提供し、円の直径を用いて長方形８５で示されたものとは異なるパラメーターを示すことができる。例えば、注釈付けされた機能が１以上の推定エクソンの発現の分布である場合、長方形８５は対照に対する発現を報告することができ、円８６を用いてシグナル強度を報告することができる。以下で論じるが、かかる相対発現（発現比）および絶対発現（シグナル強度）はノーマライズした値を用いて表すことができる。
【０２３２】
ディスプレー８０をグラフィック・ユーザー・インターフェースとして用いる場合、長方形８５はアッセイについてのさらなる情報へのリンクとして用いることができる。例えば、遺伝子発現に対してアッセイが１つである場合、各長方形８５を用いてハイブリダイズしたｍＲＮＡソース、対照の特徴、マイクロアレイスキャンから得た生データあるいは加工データなどに関する情報とリンクさせるのに用いることができる。
【０２３３】
単に例示のためのものであるが、図４は仮定のゲノム配列がエクソン特異的発現データで注釈付けされる場合の典型的な彩色慣例を示すディスプレー８０の実施態様を示す。当然容易に理解されるように、色の選択は任意であり、別の色を用いてもよい。
【０２３４】
この典型的な表示では、ＢＡＣ配列（「チップ配列」）８９は赤色で表され、物理的にアッセイされたその領域（図３の長方形８４に対応）は白色で示される。アルゴリズムの遺伝子推定は欄８１に示され、ＧＲＡＩＬによる推定は緑色、ＦＥＮＥＦＩＮＧＥＲによる推定は青色、そしてＤＩＣＴＩＯＮによる推定はピンク色で示される。長方形８７の中に、クエリー発現データベースを用いた場合、一致または類似配列（「ＥＳＴヒット」）の回答は白色の長方形（図３の長方形８８０に対応）として示され、灰色は相同性の低い配列を示し、黒色は未知の配列を示す（なおここで、黒色および灰色は図３の長方形８８に対応する）。
【０２３５】
図３および４は左から右へと中断されずに単一の配列ストレッチを示すが、より長い配列は、図９および１０に示されるような個々のモンドリアンの縦方向の積み重ねにより便宜に表される。
【０２３６】
発明者らのビジュアルディスプレーツール、モンドリアンを用いて、発明者らは、個々のエクソンの発現パターンの一致が、通常単一の遺伝子に属するエクソンを同定する有効な手段であることを見出した。従って本発明の別の態様は、ビジュアルディスプレーを基にした方法を含む、通常単一の遺伝子に属するエクソンを、関連付けの基準として複数の組織および／または細胞種におけるその発現パターンの一致を用いてエクソンと関連付ける方法を提供する。
【０２３７】
実施例３でさらに論じるが、図９はカルバミルリン酸シンセターゼ遺伝子（ＡＦ１５４８３０．１）を含むＢＡＣ ＡＣ００８１７２（塩基２５，０００〜１３０，０００で示される）のモンドリアンを表し、その配列および構造はすでに報告されている。図３の欄８１に示される領域内の紫色の背景はこの遺伝子の３７の既知のエクソン全てを示す。
【０２３８】
分かるように、ＧＲＡＩＬ ＩＩは既知エクソンのうち２７（７３％）の確認に成功し、ＧＥＮＥＦＩＮＤＥＲは既知エクソンのうち３７（１００％）の確認に成功したが、ＤＩＣＴＩＯＮは既知エクソンのうち７（１９％）を確認したに過ぎない。
【０２３９】
推定されたエクソンのうち７つは物理的アッセイで選択し、そのうち５つはＰＣＲにより増幅に成功し、配列決定された。これらの５つのエクソンは全て同一の遺伝子、カルバミルリン酸シンセターゼ遺伝子（ＡＦ１５４８３０．１）に由来するものと分かった。
【０２４０】
この５つのエクソンを配列し、１０の組織で遺伝子発現を測定した。得られたモンドリアン（図５）を見ると容易に分かるように、５つの単一エクソンプローブは同一の発現比パターンを示し、すなわち、各エクソンは第４、第７、および第８の長方形（図３の長方形８５に対応）によって表される組織において対照を越えて（すなわち、緑色で）発現し、残りの組織では対照以下で発現する。
【０２４１】
当然、アッセイした組織の１つにおいて選択的スプライシングによって除去または末端切断されたエクソンは種々の発現パターンを生じるであろう。しかし、一般に単一の遺伝子に属するエクソンの関連付けを目的とするならば、アッセイした組織間で一致すれば、なお仮定に基いてそのエクソンを同一の遺伝子に属するものとみなせる。
【０２４２】
本発明のこの態様の方法は自動化可能であって、典型的には自動化される。例えば、出典明示により本明細書にそのまま組み入れる、ＷＯ９９／５８７２０では複数の多次元発現データセットの関連性を整理するためのアルゴリズムを記載している。その中に示される方法は容易にデータセットの関連性の整理に適用でき、そこでは各データセットは複数の組織および細胞種において個々のエクソンの発現比を含み、これにより、関連があるが必ずしも同一ではないエクソンの発現パターンが共通の遺伝子に属すると分類することができる。
【０２４３】
【実施例】
以下の実施例は例として示されるものであり、これに限定されるものではない。
【０２４４】
実施例１
ヒトゲノム配列において推定されるエクソンからの単一エクソンマイクロアレイの製造
バイオインフォマティクスの結果
本研究の直前５ヶ月間で登録された１０片に満たない全てのヒトＢＡＣ配列をＧｅｎＢａｎｋよりダウンロードした。これはほぼ２２００クローンに対応し、合計でほぼ３５０ＭＢの配列、すなわちヒトゲノムの約１０％となる。
【０２４５】
ＣＲＯＳＳ＿ＭＡＴＣＨプログラムを用いて繰り返しエレメントをマスキングした後、３つの個別の遺伝子検出プログラムを用いてこの配列をオープンリーディングフレームについて分析した。この３つのプログラムは、独立のトレーニングセットで開発した独立のアルゴリズム法（ＧＲＡＩＬはニューラル・ネットワークを用い、ＧＥＮＥＦＩＮＤＥＲは隠されたマーコフ（Ｍａｒｋｏｆｆ）モデルを用い、また、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ所有のプログラムＤＩＣＴＩＯＮは異なる発見方法に従って作動する）を用いて遺伝子を推定する。３つプログラム全ての結果を用いてゲノムＤＮＡのセグメントにおける推定マトリックスを作成した。
【０２４６】
この３つの遺伝子検出プログラムからはある範囲の結果が得られた。ＧＲＡＩＬは推定コード領域として最大パーセンテージである、解析データの２％を同定した。ＧＥＮＥＦＩＮＤＥＲはそれに次いで１％を呼び出し、ＤＩＣＴＩＯＮは推定コード領域が最も少なく、コード領域として呼び出されたのはゲノム配列の０．８％であった。
【０２４７】
共通データは以下の通り。ＧＲＡＩＬおよびＧＥＮＥＦＩＮＤＥＲはゲノム配列の０．７％で共通、ＧＲＡＩＬおよびＤＩＣＴＩＯＮはゲノム配列の０．５％で一致、そして３つのプログラムはともに分析データの０．２５％で一致した。すなわち、３つのプログラム全てによってゲノム配列の０．２％が推定コード領域を含むと確認された。
【０２４８】
３つのプログラムのうちいずれか２つにより推定されたエクソン（「共通エクソン」）は２つの基準：（１）２５ｋｂウィンドウ内の連続した７つのエクソンをおそらくは単一の遺伝子を与えるものとして一緒にビンに入れること、および（２）２５ｋｂウィンドウ内に７未満のエクソンが見つかった場合、全てのエクソンをおそらくは単一の遺伝子を与えるものとして一緒にビンに入れること、によって「遺伝子ビン」へ分類した。
【０２４９】
ＰＣＲ
全て５００ｂｐより長い共通エクソンであった場合、次ぎに反復配列に渡っていなかった各々の遺伝子ビンから最大のエクソンを増幅用に選択した。この方法では１遺伝子あたり１エクソンと見積もられたが、遺伝子数は複数のエレメントによって表されていることが分かった。
【０２５０】
これまでに、長さ２５０ｂｐ未満のＤＮＡ断片がマイクロアレイ構築のための支持基板として用いられているスライドのアミノ修飾したガラス面にはうまく結合しないことが分かっていたので、アンプリコンは本実験では長さ約５００ｂｐにデザインした。
【０２５１】
従って、遺伝子ビンごとに最大のエクソンを選択した後、このエクソンを中心とする５００ｂｐの配列断片をプライマーピッキングソフトＰＲＩＭＥＲ３（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ／でオンラインにて利用可能）に送った。第１の付加配列は一般に各エクソンに特有の５’プライマーに付加され、第２の、異なる付加配列は一般に各エクソンに特有の３’プライマーに付加されると、単一の「万能」５’および３’プライマーのセットを用いて、それに続くアンプリコンの再増幅が可能となり、従ってアンプリコンは不死化する。万能プライミング配列の付加はまた配列の確認を助け、これを用いてクローニング部位を付加することもでき、いくつかのエクソンがさらなる研究を保証することが分かるはずである。
【０２５２】
次いでこれらのエクソンをゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅させ、アガロースゲル上で確認し、万能プライマーを用いて配列決定し、マイクロアレイにスポットされるアンプリコンの特徴を確認する。
【０２５３】
プライマーはＯｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （Ａｌａｍｅｄａ， ＣＡ）より提供されたものであった。ＰＣＲ増幅は鋳型としてヒトゲノムＤＮＡ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を用いる準技術によって実施した。各ＰＣＲ産物は、アガロースゲルのＳＹＢＲ（登録商標）グリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）染色、続いてＦｌｕｏｒｉｍａｇｅｒ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｉｎｃ．， Ｓｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）により画像化することで確認した。単一のバンドが現れた場合、ＰＣＲ増幅は成功として分類した。
【０２５４】
ＰＣＲを用いてゲノムＤＮＡから直接、着目するエクソンを増幅させる成功率は約７５％であった。図５は推定エクソン長の分布および増幅されたＰＣＲ産物の分布を図示したもので、エクソン長を点線で、ＰＣＲ産物長を実線で示している。エクソンサイズの範囲は９００ｂｐを超えるまでに広がっていることが容易に分かるが、平均推定エクソンサイズは２２９ｂｐの過ぎず、サイズ中央値は１５０ｂｐ（ｎ＝９４９８）であった。アンプリコンの平均サイズを４７５±２５ｂｐとすると、平均のＰＣＲ増幅産物の約５０％が推定コード領域を含み、アンプリコンの残り５０％がイントロン配列、遺伝子間配列のいずれかまたは双方を含んでいた。
【０２５５】
約５００ｂｐの増幅に基づいた方法論を用いると、長いエクソンではＰＣＲの失敗率が高いことが分かった。この問題に取り組むため、バイオインフォマティクス的プロセスを５００ｂｐよりも長いエクソンから１０００、１５００または２０００ｂｐ断片を増幅するように調節した。これにより５００ｂｐを超えるエクソンの増幅成功率は向上し、遺伝子検出アルゴリズムによって推定されたエクソンの約９．２％を占めた。
【０２５６】
アレイに配置したプローブの約７５％（首尾よくＰＣＲ増幅したものの９０％）は、ＭｅｇａＢＡＣＥシーケンサー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｉｎｃ．， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）、万能プライマー、およびストランドプロトコールを用いて正逆の両方向でシーケンシングすることによって配列を確認した。
【０２５７】
ゲノムクローン（ＢＡＣ）の中にはＰＣＲおよびシーケンシング結果があまり十分に得られないものがあった。この理由は明らかではないが、初期のドラフト配列の質またはベクターの封入および提供されたいくつかの配列データのコンタミネーションに関するものである可能性がある。
【０２５８】
コード領域をフランクするイントロン成分および遺伝子間成分は理論上マイクロアレイ実験の際のハイブリダイゼーションを妨害する可能性があったが、それに続く実験結果は特異な発現比が非コード配列の存在により著しく影響を受けることはないことを示した。エクソンサイズの変動も同様に特異な発現比に著しい影響を及ぼさないことが分かったが、エクソンサイズの変動は絶対的なシグナル強度には影響を及ぼすことが観察された（データは示されていない）。
【０２５９】
３５０ＭＢのゲノムＤＮＡは上記のプロセスにより９７５０の個別のプローブへ変換され、これを市販の機器（ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ ＧｅｎＩＩ Ｓｐｏｔｔｅｒおよび／またはＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ ＧｅｎＩＩＩ Ｓｐｏｔｔｅｒ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｉｎｃ．， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）を用いてスライドグラス上に二反復でスポットした。各スライドをさらに１６または３２のいずれかの大腸菌遺伝子に含め、この平均ハイブリダイゼーションシグナルをバックグラウンド生物学的ノイズの測定値として用いた。
【０２６０】
各プローブ配列を、ヒトＥＳＴデータセット、ＮＲデータセット、およびＳｗｉｓｓＰｒｏｔ　ＧｅｎＢａｎｋ（１９９９年５月７日、リリース２．０．９）に対してＢＬＡＳＴした。
【０２６１】
プローブ配列（増幅したもの）の３分の１はＥＳＴ（配列の２０％）かまたは既知のｍＲＮＡ（配列の１３％）のいずれかと正確に合致した（ＢＬＡＳＴのＥｘｐｅｃｔ（「Ｅ」）値は１ｅ−１００未満）。さらにプローブ配列の２２％は既知のＥＳＴまたはｍＲＮＡに対していくらかの相同性を示した（ＢＬＡＳＴのＥ値は１ｅ−５〜１ｅ−９９）。プローブ配列の残る４５％は、公開データベースに存在する発現した配列または発現の可能性のある配列のいずれについても有意な配列の相同性を示さなかった。
【０２６２】
次ぎに、全てのプローブ配列（増幅したもの）をＢＬＡＳＴＸ（Ｇｉｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ３：２６６ （１９９３））を用いてＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースとのタンパク質類似性について解析した。既知配列と同一または相同であるプローブの３分の２の推定機能分類が表１に示されている。
【表１】
2004512494.tif 000002
【０２６３】
これから分かるように、最も一般的なタイプの２つの遺伝子は転写因子およびレセプターであり、配列されたエレメントのそれぞれ２．２％および１．８％を占めている。
【０２６４】
実施例２
ゲノム由来単一エクソンマイクロアレイからの遺伝子発現測定
実施例１に従って作製した２つのゲノム由来単一エクソンマイクロアレイを、各測定の対照として（１）脳、心臓、肝臓、胎児肝臓、胎盤、肺、骨髄、ＨｅＬａ、ＢＴ４７４、またはＨＢＬ１００細胞の各々から個々の引き出したメッセージより合成したＣｙ３標識ｃＤＮＡ、および（２）１０種全ての組織および細胞種からプールしたメッセージより作製したＣｙ５標識ｃＤＮＡに対して、一連の同時二色蛍光実験にてハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションおよびスキャンは標準的なプロトコールおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ装置を用いて行った。
【０２６５】
便宜にはｍＲＮＡサンプルは市販の入手先（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡおよびＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ （ＡＰＢ））より購入した。Ｃｙ３−ｄＣＴＰおよびＣｙ５−ｄＣＴＰ（ともにＡＰＢから）を、オリゴ（ｄＴ）１２〜１８プライマー１μｇおよびランダム９マープライマー２μｇを次の通り用いて実施したポリＡ＋　ｍＲＮＡ１μｇの個々の逆転写中に組み込んだ。７０℃まで加熱した後、このＲＮＡ：プライマー混合物を氷上で急冷した。氷上で急冷した後、１Ｘ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩバッファー、０．０１Ｍ ＤＴＴ、１００μＭ ｄＡＴＰ、１００μＭ ｄＧＴＰ、１００μＭ ｄＴＴＰ、５０μＭ ｄＣＴＰ、５０μＭ Ｃｙ３−ｄＣＴＰまたはＣｙ５−ｄＣＴＰ ５０μＭおよび２００Ｕ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ酵素を記載の最終濃度となるようにＲＮＡに加えた。反応物を４２℃で２時間インキュベートした。２時間後、第１鎖のｃＤＮＡを１Ｕ リボヌクレアーゼＨを添加して単離し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップカラムを用い、エタノール洗浄を５回に増やして反応物を精製した。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５を用いてプローブを溶出した。
【０２６６】
分光光度計を用いて、プローブの染料の組み込みを測定した。次いで、各染料５０ｐｍｏｌｅに相当するＣｙ３およびＣｙ５双方のｃＤＮＡ量をＳｐｅｅｄｖａｃで乾燥させ、５０％ホルムアミド、５Ｘ ＳＳＣ、０．２μｇ／μｌポリ（ｄＡ）、０．２μｇ／μｌヒトＣ。ｔｌ ＤＮＡ、および０．５％ ＳＤＳを含有するハイブリダイゼーション溶液３０μｌに再懸濁した。
【０２６７】
アレイを４２℃の湿度炉に一晩置いて、カバーガラス下でハイブリダイゼーションを行った。スキャンする前にスライドを１Ｘ ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳ中、５５℃にて５分間洗浄し、続いて、０．１Ｘ ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳ中、５５℃にて２０分間洗浄した。スライドを水にくぐらせ、弱い窒素流下で完全に乾燥させた。
【０２６８】
スライドをＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｇｅｎ３ Ｓｃａｎｎｅｒを用いて記載のようにスキャンした（Ｓｃｈｅｎａ （ｅｄ．）， Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ： Ｔｏｏｌｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ／ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｂｏｏｋｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ （２０００） （ＩＳＢＮ： １８８１２９９３７６））。
【０２６９】
プールしたｃＤＮＡを対照として用いると大量の組織が検査できるが、組織／細胞種に特異的な蛍光チャネル中で発現の高い遺伝子はいずれも対照チャネル中に少なくとも１０％のレベルで存在するため、相対的遺伝子発現の測定が不十分となる。このことから、各プローブに対するシグナルおよび発現比（後者は以下、「発現」または「相対発現」とする）は、スライド全体を測定する場合、それぞれ平均の比率または平均シグナルを用いてノーマライズした。
【０２７０】
データは、シグナルが生物学的ノイズよりも少なくとも３倍大きい場合に限って、さらなる解析を行った。なお、生物学的ノイズとは大腸菌対照遺伝子によって生じる平均シグナルと定義される。
【０２７１】
次ぎに、これらのプローブに対する相対的発現シグナルを、組織または細胞種の関数としてプロットし、これを図６に示す。
【０２７２】
図６は１０種の組織のパネル全体の発現分布を示す。このグラフは発現されなかったか（「０」）、全てではないが１以上の供試組織において発現したか（「１」〜「９」）、あるいは全ての供試組織で発現した（「１０」）か、配列により確認された産物の数を示す。
【０２７３】
２つのマイクロアレイ上に配列された９９９９のエレメントのうち（正の対照および負の対照ならびに「失敗した」産物を含む）、２３５３（５１％）が少なくとも１の組織または細胞種で発現した。有意なシグナルを示す遺伝子エレメントのうち（ノーマライズしたＣｙ３シグナルが１より大きい場合、生物学的ノイズの５倍のシグナルを示し、発現が「有意」と記録される）、３９％（９９１）が１０種全ての組織で発現した。次いで遺伝子エレメントからなる最も一般的なクラス（１５％）は１つの組織でのみ発現した。
【０２７４】
単一の組織で発現した遺伝子をさらに解析し、その解析結果が図７にまとられている。
【０２７５】
図７Ａは、少なくとも１つの組織にて３より大きなシグナル強度を示した全ての確認済み配列の発現を示したマトリックスである。各クローンはマトリックス中の列で示される。アッセイした１０種の組織の各々はマトリックス中では別個の列で表されており、この組織中のクローンの相対発現（発現比）はそれぞれの節の緑色の濃淡の強さによって示される（強さの凡例はパネルＢに示す）。マトリックスの一番上の列（「ＥＳＴヒット」）は「物理的」発現データよりも「バイオインフォマティク的」発現データを包含し、すなわち、プローブ配列を用いてＥＳＴ、ＮＲおよびＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースのクエリー検索によって回答された結果を表している。「バイオインフォマティクス的発現」（すなわち、回答された相同性の程度）の凡例をパネルＣに表す。要するに、白色が既知、黒色が新規で、灰色が有意な相同性で一致しなかったものを示す（白色：Ｅ値＜１ｅ−１００；灰色：１ｅ−５（１ｘ１０−５）〜１ｅ−９９（１ｘ１０−９９）；黒色：Ｅ値＞１ｅ−５（１ｘ１０−５））。
【０２７６】
図７から容易に分かるように、心臓および脳はそれぞれの組織に特異的に発現することを示す遺伝子数が最も多いことが証明された。脳には特異的に発現する２００の遺伝子が確認され、心臓では１５０が確認された。残りの組織も特異的発現する遺伝子に関して以下のような数値を示した：肝臓、１００；肺、７０；胎児肝臓、１５０；骨髄、７５；胎盤、１００；ＨｅＬａ、５０；ＨＢＬ、１００；およびＢＴ４７４、５０。
【０２７７】
さらに、これらの中で、ただ１つの組織中でダウンレギュレーションされるものと比較して、ただ１つの組織中でアップレギュレーションされる、より多くの「新規の」遺伝子が観察された。実際、単一の供試組織でのみ発現が測定可能なエクソンは、配列決定データベース中での割合は１１％に過ぎないことが分かり、一方、この組織のうち９種では発現が測定可能なエクソンの３６％は公開データベースにも存在する。１０種の組織全てにおいて発現するエクソンに関しては、少なくとも４５％が現存する発現配列データベースに存在する。多くの組織で発現する遺伝子はＥＳＴのアプローチによって発見される可能性が高く、従ってすでに発見されている可能性が高かいため、これらの結果は予期されなかったものではない。
【０２７８】
既知遺伝子および未知遺伝子からのシグナルの比較
ＧｅｎＢａｎｋヒトＥＳＴデータベースに存在する遺伝子と高い相同性を有することが分かった遺伝子のノーマライズしたシグナルを、ＧｅｎＢａｎｋヒトＥＳＴデータベースには見られない遺伝子のノーマライズしたシグナルと比較した。データを図８に示す。
【０２７９】
図８は、既存のＥＳＴ、ＮＲおよびＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースのクエリー１ｅ−３０（１ｘ１０−３０）よりも大きなＢＬＡＳＴ Ｅｘｐｅｃｔ（「Ｅ」）値を有する（「未知」と示される）全ての配列確認産物のノーマライズしたＣｙ３シグナル強度を点線で示し、１ｅ−３０よりも小さなＢＬＡＳＴ Ｅｘｐｅｃｔ値を有する（「既知」）全ての配列確認産物のノーマライズしたＣｙ３シグナル強度を青色で示している。生物学的バックグラウンドノイズはノーマライズした平均Ｃｙ３シグナル強度０．２を有する。
【０２８０】
予期されたように、最も高度に発現したエクソンは「既知」遺伝子であった。極めて高いシグナル強度は、ＥＳＴ配列によって発見される可能性の高い、極めて高度に発現する遺伝子と相互に関連するため、これは驚くことではない。
【０２８１】
しかし、重要な点は、高度に発現するものでさえその多くが「未知」であるということである。遺伝子を同定し、その発現を確認するのに用いるこのゲノムアプローチはエクソンを遺伝子の３’末端かまたは５’末端のいずれにも偏らせないので、これらの高度に発現する遺伝子の多くが末端を配列決定したｃＤＮＡライブラリーで検出されていないであろう。
【０２８２】
重要な点は、ＥＳＴデータベース中のこの遺伝子の存在が、ゲノム由来のマイクロアレイへの組み込みに対する必要条件ではないことで、さらに、かかる「未知」エクソンを配列すれば、まだ発見されていない遺伝子に機能を割り当てる助けとなり得るということである。
【０２８３】
遺伝子発現の確認
未処理のゲノム配列から遺伝子を同定する上記アプローチの有効性を確かめるため、プローブのうち２つの発現を逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ ＰＣＲ）およびノーザンブロット解析を用いてアッセイした。
【０２８４】
２つのマイクロアレイプローブをシーケンシグの成功の前のエクソンサイズ、およびマイクロアレイ実験により測定される組織特異的な遺伝子発現パターンに基いて選択した。ＲＴ ＰＣＲでは、もともとゲノムＤＮＡからの２つの個別のエクソンを増幅するのに用いたプライマーを組織特異的ｃＤＮＡのパネル（Ｒａｐｉｄ−Ｓｃａｎ遺伝子発現パネル２４ヒトｃＤＮＡｓ）（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）に対して用いた。
【０２８５】
配列ＡＬ０７９３００＿１が心臓の組織に存在することがマイクロアレイハイブリダイゼーションにより示され、配列ＡＬ０３１７３４＿１が胎盤の組織に存在することがマイクロアレイ実験により示された（データは示されていない）。これらの２つの配列についてのＲＴ−ＰＣＲでは、マイクロアレイにより測定され、個々の組織種ｃＤＮＡからの正確に同じ大きさのＰＣＲ生成物の存在によって確かめられるように、組織特異的遺伝子発現が確認された。
【０２８６】
明らかに、全てのマイクロアレイの結果が独立したアッセイ法によって確認できないし、また実際できるはずもなく、そうでなければ、高スループットの、高度並行マイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイの利点がなくなる。しかし、上記に示した２つのＲＴ−ＰＣＲ結果に加え、配列された遺伝子の３分の１が発現データベースに存在することを見出したことは、未加工のゲノムデータから新規の遺伝子を確認するという発明者らの方法論（バイオインフォマティクスからの推定とゲノム由来単一エクソンマイクロアレイを用いる発現確認とを組み合わせたもの）の能力の有効な確証をもたらす。
【０２８７】
このアプローチがさらに、同定した遺伝子の発現パターンの正確な特性決定を提供することを確かめるため、脳において高いシグナルを示したマイクロアレイ配列の詳細な解析を行った。
【０２８８】
この解析に関して、脳内で高いシグナル（ノーマライズしたもの）を示したが、その他の全ての組織で極めて低いシグナル（ノーマライズしたもの） （０．５未満、生物学的ノイズと判定）を示した配列をさらに研究した。これらの判断基準に合致したものは８２配列で、配列したエレメントの約２％である。マイクロアレイハイブリダイゼーションにおいて脳内で最も高いシグナルを示した１０配列を、既知であるかまたは合理的に推定される場合に、割り当てた機能とともに表２に詳細に示した。
【表２】
2004512494.tif 000003
【０２８９】
これらの後者の確認アプローチで研究される１０配列のうち、８配列が既知であった。これら８のうち、６の配列が中枢神経系または脳で重要であることがこれまでに報告されている。最高のシグナルを示したエクソン（ＡＰ００２１７−１）は、文献では中枢神経系において高度にかつ特異的に発現することが報告されている（Ｈｅｉｚｍａｎｎ， Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． ９：１０９７（１９９７））、 Ｓ１００Ｂ Ｃａ２＋結合タンパク質をコードする遺伝子であることが分かった。
【０２９０】
いくかの脳特異的プローブ配列（ＡＣ００６５４８−９、ＡＣ００９２６６−２を含む）はＧｅｎＢａｎｋの既知のヒトｃＤＮＡのいずれとも相同性を持たないが、ラットおよびマウスのｃＤＮＡとは相同性を示す。配列ＡＣ００４６８９−９およびＡＣ００４６８９−３はともにニューロンに存在するホスファターゼであることが分かった（Ｍｉｌｌｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２４（５）：１８６−１９１ （１９９９））。２のマイクロアレイ配列、ＡＰ００００４７−１およびＡＰ００００８６−１は未知の機能を有し、ＡＰ００００８６−１はＧｅｎＢａｎｋに存在していない。これら双方の遺伝子について、機能性は今や中枢神経系での役割へと絞り込むことができるが、このことはこのようにしてマイクロアレイをデザインすることの有効性を示すものである。
【０２９１】
次ぎに、他の組織での発現に関わらず、脳で最高のシグナル強度（ノーマライズしたもの）を有するチップ配列の機能を評価した。この解析では、この配列が脳だけで発現するものとは限らなかったため、発明者らはさらに多くの一般的な遺伝子の発現を見出した。例えば、脳における２０の最高シグナル強度スポットを観察すると、４つがチュービュリンに類似し（ＡＣ００８０７９０５；ＡＦ１４６１９１−２；ＡＣ００７６６４−４；ＡＦ１４１９１−２）、２つがアクチンに類似し（ＡＬ０３５７０１−２；ＡＬ０３４４０２−１）、および６つがグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）と相同であった（ＡＬ０３５６０４−１；Ｚ８６０９０−１；ＡＣ００６０６４−Ｌ；ＡＣ００６０６４−Ｋ；ＡＣ０３５６０４−３；ＡＣ００６０６４−Ｌ）。これらの遺伝子は全種類のマイクロアレイ実験において対照またはハウスキーピング遺伝子としてしばしば用いられている。
【０２９２】
脳で発現の高い他の興味深い遺伝子としてフェリチン重鎖タンパク質があり、文献では脳および肝臓に見られると報告されており（Ｊｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｌ． Ｓｃｉ． １３４（Ｓｕｐｐｌ）：５２−５６ （１９９５））、結果をアレイで確認した。別の高度に発現するチップ配列としては、翻訳伸長因子１α（ＡＣ００７５６４−４）、ＤＥＡＤ−ｂｏｘホモログ（ＡＬ０２３８０４−４）、およびＹ染色体ＲＮＡ結合モチーフ（Ｃｈａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４９８２）：２８３−８９ （１９９８））（ＡＣ００７３２０−３）が挙げられる。トリソミー２１（ダウン症候群）に関すると思われる遺伝子ＤＳＣＲ１に対して相同性の低い類似体（ＡＰ００１２３−１／２）は、脳および心臓の双方において高い発現を示し、文献と一致している（Ｆｕｅｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． ４（１０）：１９３５−４４ （１９９５））。
【０２９３】
さらにこのアプローチを検証するものとして、ＢＡＣ ＡＣ００６０６４をアレイに含めることを選択した。このＢＡＣはＧＡＰＤＨ遺伝子を含むことが知られており、従ってエクソン選択プロセスの対照として使用することができる。遺伝子検出およびエクソン選択アルゴリズムは、アレイ上にスポッティングするＢＡＣ ＡＣ００６０６４から２５のエクソンを選択し、そのうち４つはＧＡＰＤＨ遺伝子から導かれたものであった。表３はＢＡＣ００６０６４からの４つのエクソンの平均発現率を市販のＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の５種類の異なる希釈物についての平均発現率と比較したものを示す。
【表３】
2004512494.tif 000004
【０２９４】
各組織は、実験的に選択されたエクソンと対照との間で良好な一致を示し、このエクソンを掘り当てるアプローチの有効性を重ねて証明した。さらに、このデータはまた組織内でのＧＡＰＤＨ発現の変動を示し、ハウスキーピング遺伝子としての分類およびマイクロアレイ実験におけるハウスキーピング対照としての有効性に疑問を投げかけた。
【０２９５】
実施例３
「モンドリアン」としての配列および発現データの表示
上記のようにマイクロアレイ用に処理した各ゲノムクローンに関して、全長クローン配列、クローン内のプローブ配列、３つの遺伝子検出プログラムの各々の結果、このプローブ配列に関するＥＳＴ情報、ならびにマイクロアレイシグナルおよび複数組織に対する発現をはじめ過剰な情報が集積し、これは発明者らの情報表示能力を試すものであった。
【０２９６】
従って、発明者らは、注釈付け配列のビジュアルディスプレーに関する新規なツールを考案した。これを、ピーター・モンドリアンの絵画との視覚的類似を尊重して、以後「モンドリアン」と称する。図３および４はモンドリアンに示された情報の要所を示す。
【０２９７】
図９はカルバミルリン酸シンセターゼ遺伝子（ＡＦ１５４８３０．１）を含むＢＡＣ ＡＣ００８１７２（塩基２５，０００〜１３０，０００で表示）のモンドリアンを示す。図３中で８１の欄の紫色の部分はこの遺伝子の３７の既知のエクソン全てを示す。
【０２９８】
分かるように、ＧＲＡＩＬ ＩＩは既知エクソンのうち２７（７３％）の確認に成功し、ＧＥＮＥＦＩＮＤＥＲは既知エクソンのうち３７（１００％）の確認に成功したが、ＤＩＣＴＩＯＮは既知エクソンのうち７（１９％）を確認したい過ぎなかった。
【０２９９】
推定エクソンのうち７つが物理的アッセイに選択され、そのうち５つがＰＣＲにより増幅に成功し、配列決定された。これらの５つのエクソンは全て同じ遺伝子、カルバミルリン酸シンセターゼ遺伝子（ＡＦ１５４８３０．１）に由来するものであることが分かった。
【０３００】
この５つのエクソンを配列して、遺伝子発現を１０の組織にわたって測定した。モンドリアンで容易に分かるように、アレイ上の５つのチップ配列は同一の発現パターンを示し、システムの再現性を科学的に精緻に証明している。
【０３０１】
図１０はＢＡＣ ＡＬ０４９８３９のモンドリアンである。発明者らはこのＢＡＣから１２のエクソンを選択し、そのうち１０で配列決定に成功し、これらが５ないし６遺伝子を形成することが分かった。興味深いことにこのＢＡＣ上の遺伝子の４つがプロテアーゼ阻害剤である。さらに、これらのデータは同じ遺伝子から選択されたエクソンが同じ発現パターンを示すことを科学的に精緻に示し、赤い線の下に描かれている。この図から、発明者らの既知遺伝子を見出す能力が極めて優れていることは明らかである。新規の遺伝子も８６．６ｋｂ〜８８．６ｋｂに見出され、全てのエクソン検出プログラムもこれに一致する。２つのエクソンは同じ発現パターンを示し、互いに隣接しているため、発明者らは単一の遺伝子由来の２つのエクソンがあることを確信している。以下の色の背景は既知遺伝子を示す（上から下へ）：赤色＝カリスタチンプロテアーゼ阻害剤（Ｐ２９６２２）；紫色＝血漿セリンプロテアーゼ阻害剤（Ｐ０５１５４）；青緑色＝α１抗キモトリプシン（Ｐ０１０１１）；藤色＝４０Ｓリボソームタンパク質（Ｐ０８８６５）。チップ配列８および１２は配列を確認していないことに注意。
【０３０２】
実施例４
遺伝子推定および単一エクソンマイクロアレイ解析によるゲノム配列から確認された遺伝子の配列
実施例１〜３で述べたように実験でヒトゲノム配列から確認された３つのエクソンの配列をここに示すが、各エクソンはその推定コード配列によって表され、その後はその発現を評価するためにゲノム由来単一エクソンマイクロアレイで用いられるアンプリコンの配列によって表される。この３つの配列は、本方法によって得られる３つのクラス、すなわち、（１）ＥＳＴ、ＳＮＰ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースなどの発現データベースですでに確認され、かつ登録されているもの；（２）発現データベースには一致は示されていないが、かかる発現データベースにすでに存在する遺伝子と有意な相同性を示す配列を有するもの；および（３）発現データベースでは一致が存在せず、かつ、発現データベースに存在する遺伝子と有意に相同な配列も持たないもの、の各々を表すようにそれぞれ選択された。
【０３０３】
まず最初の、ＡＣ００７６８３＿４＿チップ配列１と呼ばれるものは、既存の発現データベース中の配列と同一であることが分かった。
ＡＣ００７６８３＿４＿チップ、配列１の推定エクソン：
【表４】
2004512494.tif 000005
（配列番号１）
ＡＣ００７６８３＿４＿チップ、配列１のアンプリコン：
【表５】
2004512494.tif 000006
（配列番号２）
【０３０４】
２番目の、ＡＣ００７６８２＿２＿チップ配列２と呼ばれるものは、発現データベースでは一致が見出せなかったが、かかるデータベースの１以上の配列と相同性を有することが分かった。
ＡＣ００７６８２＿２＿チップ、配列２の推定エクソン：
【表６】
2004512494.tif 000007
（配列番号３）
ＡＣ００７６８２＿２＿チップ、配列２のアンプリコン：
【表７】
2004512494.tif 000008
（配列番号４）
【０３０５】
３番目の、ＡＣ００７５５２＿４＿チップ、配列２と呼ばれるエクソンは、公開発現データベースでは一致が存在せず、配列においていずれの登録配列との有意な関連もないことが分かった。
ＡＣ００７５５２＿４＿チップ、配列２の推定エクソン：
【表８】
2004512494.tif 000009
（配列番号５）
ＡＣ００７５５２＿４＿チップ、配列２のアンプリコン：
【表９】
2004512494.tif 000010
（配列番号６）
【０３０６】
実施例５
ヒト遺伝子発現の測定に有用なゲノム由来単一エクソンプローブ
上記実施例１および２に示したプロトコールをＧｅｎＢａｎｋで新規に利用できるように追加のヒトゲノム配列にいくつかの変更を施した。これらおよび実施例２に報告される実験を合わせた努力から、発明者らは１５，０００を越える独特のヒトゲノム由来単一エクソンプローブを作製し、それらが１０種の供試組織のうち１以上で有意なレベルで発現することを示すことができた。
【０３０７】
実施例１および２で示されるバイオインフォマティクス的推定のためのプロトコールの修正は次の通り。
【０３０８】
まず第１に、発明者らは最初に用いていたＤＩＣＴＩＯＮ、ＧＥＮＥＦＩＮＤＥＲおよびＧＲＡＩＬの３つに、４番目の遺伝子推定プログラムＧＥＮＳＣＡＮを加えた。
【０３０９】
第２に、発明者らはエクソン推定の解像度を次のように向上させた。
【０３１０】
実施例１および２で報告した実験において、ゲノム配列をスキャンする際に２５ｂｐのウィンドウを用いたが、３つの遺伝子推定プログラムのうち２つがウィンドウ内のどこにおいてもエクソンを確認した場合、エクソンが呼び出される。より最近の実験では、発明者らはヌクレオチドを基準にヌクレオチドの一致を探したところ、４つのプログラムのうち２以上が、ヌクレオチドがエクソン内に収まっていると確認した場合、そのヌクレオチドはエクソンに属するものとして呼び出される。これは重複する推定エクソンをマージするというさらなる利点がある。
【０３１１】
最後に、発明者らは各一致エクソンに対して下方のサイズ限界値を隣接する７５ヌクレオチドとした。
【０３１２】
各プローブはゲノム由来単一エクソンマイクロアレイでの使用に先立ち両鎖について完全に配列決定した。なお、配列決定で各プローブの正確な化学構造が確認された。配列決定のその他の利点は、シーケンシングプライマー３’ＯＨから開始する、配列決定した核酸の単一塩基付加断片セットが得られることである。（単一エクソンプローブはまずゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅を行うことにより得られるため、発明者らは当然、単一エクソンプローブの各々の単一塩基付加断片（各断片は２つの増幅プライマーのうちの１つからの伸長産物に対応する）のかなり大きなセットをさらに得ることとなった。）
【０３１３】
ハイブリダイゼーション解析は、１点変更を加えたが、実質的には実施例１および２で示されたようにして行った。
【０３１４】
実施例１および２において、発明者らは対照として１０種の組織／細胞種のプールを用いた。以来、対照プールで発現を証明するあらゆるプローブがＨｅＬａ細胞で容易に発現されることを観察し、より最近の研究では対照メッセージのソースとしてＨｅＬａを用いている。
【０３１５】
ハイブリダイゼーション結果の解析において、生物学上有意であると考えられるに足る長さのシグナルを確認するため、実施例１および２で用いた一律の絶対シグナル強度の閾値（０．５、第１の反復チップ上の全ての大腸菌対照スポットの平均よりも大まかに１０倍大きいレベルを表す）を、以下の通り各チャネルおよび各ハイブリダイゼーションについて決められた統計的閾値へと置き換えた。
【０３１６】
典型的には３２の大腸菌配列から開始し、二反復で（左側および右側）スポットしてマイクロアレイあたり合計６４の対照スポットとし、プローブに対して左側と右側の未加工の（ノーマライズしていない）シグナル間の違いが５倍を越えて観察された場合には対照スポットを除外した。
【０３１７】
残りの対照スポットからのノーマライズしたシグナルの中間値を算出した（ノーマライズの手順については以下を参照）。
【０３１８】
対照スポットがノーマライズしたシグナルの中間値＋２．４（２．４は観察された対照スポット集団の標準偏差の大まかに１２倍）より大きいシグナル強度を持つ場合、その対照スポットをアウトライアーとして除外し、ノーマライズは以下で示す通りに行った。
【０３１９】
残りの対照スポットからノーマライズしたシグナル強度の平均および標準偏差を算出し、対照の平均＋３の標準偏差を、次に特定のハイブリダイゼーション実験の最少強度閾値として用いて、発現が有意であるという確度９９％を得た。
【０３２０】
シグナルのノーマライズは以下の通りに行った。ハイブリダイゼーションごとに（マイクロアレイごと、２色の各々について個別に）、全てのスポットの中間値を決定した。各プローブに対し、ノーマライズしたシグナル値は、プローブの２倍のシグナル強度（対照を含む各ＤＮＡプローブはスライドあたり２度スポットされる）を母集団の中央値で割った相加平均である。
【０３２１】
この閾値を用い、発明者らは１０種の供試組織／細胞種のうち１以上で有意なシグナルを生じた１５，０００を越える単一エクソンプローブを確認した。これらの単一エクソンプローブの正確な構造は、同一所有者同時係属の米国仮出願第６０／２０７，４５６号（２０００年５月２６日出願）、同第６０／２３４，６８７号（２０００年９月２１日出願）、同第６０／２３６，３５９号（２０００年９月２７日出願）、同一所有者同時係属の英国特許出願第２４２６３．６（２０００年１０月４日出願）、および同一所有者同時係属のＰＣＴ出願（２００１年１月２９日出願）（代理人整理番号ＰＢ ０００４ ＷＯ １の「ヒト心臓における遺伝子発現の解析に有用なヒトゲノム由来単一エクソン核酸プローブ」、ＰＢ ０００４ ＷＯ ２の「ヒト脳における遺伝子発現の解析に有用なヒトゲノム由来単一エクソン核酸プローブ」、ＰＢ ０００４ ＷＯ ３の「ヒト成人肝臓における遺伝子発現の解析に有用なヒトゲノム由来単一エクソン核酸プローブ」、ＰＢ ０００４ ＷＯ ４の「ヒト胎児肝臓における遺伝子発現の解析に有用なヒトゲノム由来単一エクソン核酸プローブ」、ＰＢ ０００４ ＷＯ ５の「ヒト肺における遺伝子発現の解析に有用なヒトゲノム由来単一エクソン核酸プローブ」、ＰＢ ０００４ ＷＯ ６の「ヒト骨髄における遺伝子発現の解析に有用なヒトゲノム由来単一エクソン核酸プローブ」、ＰＢ ０００４ ＷＯ ７の「ヒト胎盤における遺伝子発現の解析に有用なヒトゲノム由来単一エクソン核酸プローブ」、ＰＢ ０００４ ＷＯ ８の「ＢＴ ４７４細胞における遺伝子発現の解析に有用なヒトゲノム由来単一エクソン核酸プローブ」、ＰＢ ０００４ ＷＯ ９の「ＨＢＬ １００細胞における遺伝子発現の解析に有用なヒトゲノム由来単一エクソン核酸プローブ」、ＰＢ ０００４ ＷＯ １０の「Ｈｅｌａ細胞における遺伝子発現の解析に有用なヒトゲノム由来単一エクソン核酸プローブ」）に含まれる配列リストで明白に示されている（なお、これらの開示は出典明示によりそのまま本明細書に組み入れる）。
【０３２２】
発明者らはまた各プローブのエクソン内のＯＲＦの配列を推定した。なお、ＯＲＦとは隣接するアミノ酸配列へそのすべてを翻訳され得るエクソンの一部であると定義される。
【０３２３】
ＯＲＦを推定するため、発明者らはまず４つの遺伝子検出プログラムのうち２以上での一致を探した。一致には２つのパラメーター：（１）エクソンの推定と同様に、各ヌクレオチドは２以上のプログラムでエクソン内に収まることが確認されていなければならないこと；および、さらに（２）この一致を立証するのに用いるプログラムはフレームが一致しなければならないこと、を要した。停止コドンが存在すればＯＲＦの推定は不適格とした。また、５０ｎｔより短いＯＲＦも無視した。
【０３２４】
ヌクレオチドおよびフレームについて一致がない場合は、推定したエクソンの６つのフレームの各々を、停止コドン、およびエクソンにありがちなＯＲＦとして選択された少なくとも５１ｎｔの最も長いオープンリーディングフレームについて個々に調べた。エクソンの中にはいずれの基準セットによって定義されたＯＲＦも持たないものがある。
【０３２５】
次ぎに発明者らは標準遺伝子コードを用いて推定ＯＲＦを翻訳した。
【０３２６】
これらの単一エクソンプローブの正確な構造は、同一所有者同時係属の米国仮出願第６０／２０７，４５６号（２０００年５月２６日出願）、同第６０／２３４，６８７号（２０００年９月２１日出願）、同第６０／２３６，３５９号（２０００年９月２７日出願）、同一所有者同時係属の英国特許出願第２４２６３．６（２０００年１０月４日出願）、および同一所有者同時係属のＰＣＴ出願（２００１年１月２９日出願）（代理人整理番号ＰＢ ０００４ ＷＯ １の「ヒト心臓における遺伝子発現の解析に有用なヒトゲノム由来単一エクソン核酸プローブ」、ＰＢ ０００４ ＷＯ ２の「ヒト脳における遺伝子発現の解析に有用なヒトゲノム由来単一エクソン核酸プローブ」、ＰＢ ０００４ ＷＯ ３の「ヒト成人肝臓における遺伝子発現の解析に有用なヒトゲノム由来単一エクソン核酸プローブ」、ＰＢ ０００４ ＷＯ ４の「ヒト胎児肝臓における遺伝子発現の解析に有用なヒトゲノム由来単一エクソン核酸プローブ」、ＰＢ ０００４ ＷＯ ５の「ヒト肺における遺伝子発現の解析に有用なヒトゲノム由来単一エクソン核酸プローブ」、ＰＢ ０００４ ＷＯ ６の「ヒト骨髄における遺伝子発現の解析に有用なヒトゲノム由来単一エクソン核酸プローブ」、ＰＢ ０００４ ＷＯ ７の「ヒト胎盤における遺伝子発現の解析に有用なヒトゲノム由来単一エクソン核酸プローブ」、ＰＢ ０００４ ＷＯ ８の「ＢＴ ４７４細胞における遺伝子発現の解析に有用なヒトゲノム由来単一エクソン核酸プローブ」、ＰＢ ０００４ ＷＯ ９の「ＨＢＬ １００細胞における遺伝子発現の解析に有用なヒトゲノム由来単一エクソン核酸プローブ」、ＰＢ ０００４ ＷＯ １０の「Ｈｅｌａ細胞における遺伝子発現の解析に有用なヒトゲノム由来単一エクソン核酸プローブ」）に含まれる配列リストで明白に示されている（なお、これらの開示は出典明示によりそのまま本明細書に組み入れる）。
【０３２７】
プローブ、エクソン、およびＯＲＦにコードされるペプチドの各々の配列をクエリーとして用いて、ｄｂＥＳＴ、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＲ、およびＳＷＩＳＳＰＲＯＴの各々で最も類似した配列を確認した。使用したクエリープログラムはＢＬＡＳＴ（ｄｂＥＳＴおよびＮＲの核酸配列クエリー）、ＢＬＡＳＴＸ（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴの核酸配列クエリー）、ＴＢＬＡＳＴＸ（ｄｂＥＳＴおよびＮＲのペプチド配列クエリー）、およびＢＬＡＳＴＰ（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴのペプチド配列クエリー）である。クエリー配列はそれ自身ＧｅｎＢａｎｋ中のゲノム配列に由来するので、ＮＲからの非ゲノムヒットのみを記録した。
【０３２８】
同一所有者同時係属出願の、添付の配列リストは、各配列番号に関して、「Ｅ」値そのものに加えて、最も高い絶対期待値（「Ｅ」）値（「最高ヒット」）を出した３つのクエリーデータベースの各々から登録した登録番号を報告している。この配列リストは出典明示によりそのまま本明細書に組み入れる。
【０３２９】
本明細書中で言及した全ての特許、特許出願、および他の公開された参考文献は、あたかも各々が個々に具体的に出典明示により本明細書に組み入れられているように、出典明示によりそのまま本明細書に組み入れる。本発明の例としての好ましい実施態様を記載するが、本発明から離れずにその中で種々の変更および改変を行ってもよく、また、添付の特許請求の範囲においてかかる変更、改変および本発明の真の精神および範囲内にある同等なもののすべてを包含するものとすることは当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に従ってゲノム配列から機能領域を推定する、かかる領域の機能活性を実験的に確認する、また元の配列データとの有意義かつ有用な関係において、このようにして得られたデータを結びつけて表示する方法を示す。
【図２】本発明に従ってゲノム配列から機能領域を推定するための、図１で示された方法の一部をさらに詳しく示す。
【図３】本発明のビジュアルディスプレーを示す。ここでは、単一ゲノム配列が推定され、かつ、実験的に確認された機能情報で注釈付けされる「モンドリアン（Ｍｏｎｄｒｉａｎ）」を示す。
【図４】図９および１０のようにモンドリアンを用いてゲノム配列をエクソン特異的発現データで注釈付けする場合の典型的な色の慣例をさらに確認する仮定の注釈付けゲノム配列のモンドリアンを示す。
【図５】実施例１から得られたデータを要約するチャートであり、推定エクソン長（点線）および本発明の方法に従ってヒトゲノム配列から得られる実際のＰＣＲ産物（アンプリコン）（実線）のサイズ分布を示す。
【図６】実施例１および２から得られたデータを要約するヒストグラムであり、推定されるエクソンが本発明のゲノム由来単一エクソンマイクロアレイとの同時二色ハイブリダイゼーションを用いて発現することが示された組織の数を示す。このグラフは１０種の供試組織／細胞種のいずれにおいても発現されなかったか（「０」）、全てではないが１以上の供試組織において発現したか（「１」〜「９」）、あるいは全ての供試組織で発現した（「１０」）か、配列により確認された産物の数を示す。
【図７】実施例１および２から得られたデータの画像表示であり、少なくとも１つの組織で３より大きいシグナル強度で発現した確認配列を有するプローブの発現（対照に対する比）を示す。なお、図７Ａは測定した１０種の組織の各々においてマイクロアレイハイブリダイゼーションによって測定された発現と、ＥＳＴ、ＮＲおよびＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースのクエリーによって「バイオインフォマティクス的に」測定された発現の双方を示し、図７Ｂは図７Ａにおける物理的発現の表示（比）の凡例を示し、図７Ｃは図７Ａで示されたＥＳＴヒットをスコアリングするための凡例を示す。
【図８】実施例１および２から得られたデータのチャートであり、既存のＥＳＴ、ＮＲおよびＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおける配列と同一であった（既知）、あるいは同一ではなかった（未知）整列配列に対してＣＹ３シグナル強度をノーマライズしたものの比較を示し、ここで点線は１ｅ〜３０（１ｘ１０−３０）より大きなＢＬＡＳＴ Ｅｘｐｅｃｔ（「Ｅ」）値を有する（「未知」）全ての配列確認産物のシグナル強度を示し、実線は１ｅ〜３０（１ｘ１０−３０）より小さなＢＬＡＳＴ Ｅｘｐｅｃｔ（「Ｅ」）値を有する（「既知」）配列確認スポットを示す。
【図９】カルバミルリン酸シンセターゼ遺伝子（ＡＦ１５４８３０．１）を含むＢＡＣ ＡＣ００８１７２（塩基２５，０００〜１３０，０００）のモンドリアンを示す。
【図１０】ＢＡＣ Ａ０４９８３９のモンドリアンである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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