(57)【要約】細胞および組織を、損傷、特に細胞傷害剤または治療的処置により誘導される損傷から保護するための方法および組成物を開示する。この方法には、前駆細胞を前駆細胞保存因子であるFRILファミリーメンバーと接触させることが含まれる。動物における正常な細胞および組織を、化学療法または放射線療法などの治療的処置により誘導される細胞傷害性から保護するための方法もまた、開示する。これらの方法には、FRILファミリーメンバー分子を治療的処置を受けている動物に対して投与することが含まれ、ここでFRILファミリーメンバーを投与される動物の正常な細胞および組織は、治療的処置の細胞傷害性から保護される。組織を修復するために細胞を単離する方法もまた開示する。この方法には、細胞集団をFRILファミリーメンバー分子と接触させ、そしてFRILファミリーメンバー分子により特異的に結合される細胞を単離することが含まれ、ここでFRILファミリーメンバー分子に対して結合した細胞は、組織を修復するために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
前駆細胞をFRILファミリーのメンバー分子と細胞傷害剤とに接触させることを含む、前記細胞傷害剤から前記前駆細胞を保護するための方法であって、ここで前記接触させた前駆細胞が細胞傷害剤による細胞傷害性から保護される、前記方法。
【請求項２】
FRILファミリーメンバー分子が精製されている、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前駆細胞が組織中に存在するものである、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前駆細胞が造血前駆細胞である、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前駆細胞が、間葉性前駆細胞、造血幹細胞、毛胞前駆細胞、皮膚前駆細胞、肝臓前駆細胞、および消化管前駆細胞からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前駆細胞が動物の体内に存在するものである、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前駆細胞が、FRILファミリーメンバー分子を動物に対して投与することにより接触される、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
FRILファミリーメンバー分子が、薬剤的に許容可能なキャリアとともに動物に対して投与される、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
動物がヒトである、請求項6に記載の方法。
【請求項１０】
細胞傷害剤が、化学療法剤および放射線療法からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前駆細胞をFRILファミリーメンバー分子と接触させた後、細胞を細胞傷害剤に接触させる、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
治療的有効量のFRILファミリーメンバー分子を前駆細胞-枯渇性活性を有する治療的処置とともに患者に対して投与することを含む、患者体内の前駆細胞を、患者における前記治療的処置から保護するための方法であって、ここで患者における前駆細胞を前駆細胞-枯渇性活性を有する治療的処置から保護する、前記方法。
【請求項１３】
患者がヒトである、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
患者が癌である、請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
治療的処置が、放射線療法、化学療法、および放射線療法と化学療法との組み合わせからなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
【請求項１６】
化学療法剤が、シタラビン、ドキソルビシン、シスプラチン、ダウノルビシン、パクリタキセル、シクロフォスファミド、および5-フルオロウラシルからなる群から選択される、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
FRILファミリーメンバー分子が精製されている、請求項12に記載の方法。
【請求項１８】
FRILファミリーメンバー分子が、薬剤的に許容可能なキャリアとともに患者に対して投与される、請求項12に記載の方法。
【請求項１９】
患者に対してFRILファミリーメンバー分子を投与した後、患者に対して治療的処置を投与する、請求項12に記載の方法。
【請求項２０】
患者に対して治療的処置を投与して、その後患者に対してFRIL-ファミリー構成分子を投与する、請求項12に記載の方法。
【請求項２１】
細胞集団をFRILファミリーメンバー分子と接触させ、そしてFRILファミリーメンバー分子により特異的に結合される細胞を単離することを含む、組織を修復するための細胞を単離するための方法であって、ここでFRILファミリーメンバー分子に対して結合した細胞が組織を修復するために有用なものである、前記方法。
【請求項２２】
細胞集団に前駆細胞が含まれる、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
細胞集団がヒト由来のものである、請求項21に記載の方法。
【請求項２４】
FRILファミリーメンバー分子により結合された細胞が前駆細胞である、請求項21に記載の方法。
【請求項２５】
前駆細胞が、間葉性前駆細胞、造血幹細胞、毛胞前駆細胞、皮膚前駆細胞、肝臓前駆細胞、および消化管前駆細胞からなる群から選択される、請求項21に記載の方法。
【請求項２６】
細胞集団が、全血、臍帯血、胎児肝細胞、および骨髄細胞からなる群から選択される、請求項21に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2001年2月27日に出願した米国仮出願シリアル番号No. 60/271,666および2001年7月3日に出願した米国仮出願シリアル番号No. 60/302,716に基づく優先権を主張し、これらの仮出願の内容全体はそれぞれ参考文献として本明細書中に援用する。
【０００２】
発明の背景
本発明は、細胞および組織を損傷から保護すること、そして損傷した組織を修復することに関する。
【０００３】
組織はしばしば、脳卒中、心臓発作、脊髄損傷、急性肝不全、やけど、およびその他の急性の傷害による損傷から回復しない。組織の破壊はまた、慢性変性性疾患の結果としても生じる。組織工学の分野は、特定の器官および組織を成長させるようにデザインされたin vitroシステムを開発することによるか、または組織をin vivoで修復することができる細胞を移植することによるかのいずれかにより、組織を修復するための高価な方法に注目してきた。
【０００４】
一般的に使用された癌の治療には、化学療法剤および放射線療法剤が含まれる。放射線療法剤および化学療法剤は、新しい細胞が形成されるプロセスを破壊することにより機能する。これらの薬物は、迅速に増殖する癌細胞を選択的に標的とするのに対して、これらの薬剤はまた、骨髄、消化管、および毛胞などの活性な正常組織に対して悪影響も与える。
【０００５】
実際、化学療法剤による骨髄機能の抑制は、最も重大な副作用である。と言うのも、それは、酸素を組織に対して運ぶ血液細胞（赤血球）、感染と戦う血液細胞（白血球）、そして血液を凝固させる血液細胞（血小板）を産生するために必要とされる前駆細胞に損傷を与えるからである。ChabnerとMyersは、血球細胞数が減少することにより、生命にかかわる感染や出血に対する患者の感受性が増大すると教示している（Chabner, B. A. and Myers, C. E., “Antitumor antibiotics,”InCancer, Principles and Practice in Oncology, eds. DeVita, Jr. et aL, Lippincott, PA pp. 374-384, 1993）。したがって、化学療法剤により血液細胞の産生の回復が遅くなったりあるいは不完全であったりすれば、感染と戦う患者の能力が弱められるだけでなく、残っている腫瘍細胞の増殖に対処するための化学療法剤の次の投与を遅らせなければならない。
【０００６】
さらに、癌を撲滅する際の化学療法剤の効率は、骨髄および消化管に対する毒性を管理する能力に部分的に依存している。消化管に対する毒性は、一般的には、化学療法の経過の間の食欲減退および体重減少、吐き気および嘔吐、口およびのどの感染および糜爛、そして下痢の発作および便秘を引き起こす。
【０００７】
化学療法剤の毒性から正常な組織を特異的に保護する支援的ケア生成物を開発するための戦略は、化学療法剤のメカニズムの反対の作用をするか、もしくは正常な迅速に分裂する組織の増殖速度を減少させるかのいずれかの薬剤に注目してきた。化学防御剤（chemoprotective agent）と呼ばれる2種類のこれらの支援的ケア生成物が、現在、臨床試験の段階または市場販売の段階にある。EthyolTM（amifostine）は、最初は実験動物を致死的放射線照射から保護する能力により同定された低分子量化合物である。MirostatinTM（骨髄性前駆細胞増殖因子-1またはMPIF-1）は、化学療法の間、骨髄性（白血球）前駆細胞が積極的に分裂状態に進行していくことを防止することによりこれらの細胞を保護する、βケモカインである。
【０００８】
しかしながら、現在の支援的ケア薬剤は、化学療法剤の毒性を適切に減少させていない。EthyolTMそれ自体は、吐き気および嘔吐といった重大な副作用を誘導し、結果として広くは使用されていない。さらに、他のケモカインと同様に、MirostatinTMは、短寿命の制御因子であり、多形質発現性（すなわち、多くの異なる組織に対して作用する）様であり、そして高濃度で毒性である様である。MirostatinTMの価値は、それが成熟骨髄性（すなわち、白血球）前駆細胞にのみ対するという制限があることによりさらに減少する。現在までに、薬剤を投与された患者を悪液質から保護する化学防御剤または放射線療法剤は存在しない。
【０００９】
したがって、非毒性でそして安価な改善された試薬を、正常な細胞および組織、具体的には損傷を受けやすい組織および／または悪液質を含む化学療法剤および／または放射線療法薬剤の有害作用により損傷を受けた組織、を組織損傷から保護する際に使用するために産生する、という必要性が存在し続けている。
【００１０】
発明の概要
本発明は、健康な細胞および組織を損傷から保護するための、そして損傷を受けた組織を修復するための、組成物および方法を提供する。本発明の組成物は、少なくとも1つの前駆細胞保存因子（preservation factors）のFRILファミリー構成分子を含む。FRILファミリーの構成分子は、非毒性でそして安価に産生される。
【００１１】
したがって、第1の観点において、本発明は、前駆細胞をFRILファミリーメンバー分子と細胞傷害剤とに接触させることを含む、前記細胞傷害剤から前記前駆細胞を保護するための方法であって、ここで前記接触させた前駆細胞が細胞傷害剤による細胞傷害性から保護される、前記方法を提供する。好ましくは、FRILファミリーメンバー分子は精製されている。
【００１２】
特定の態様において、前駆細胞は組織中に存在するものである。いくつかの態様において、前駆細胞は造血前駆細胞である。特定の態様において、前駆細胞は、間葉性前駆細胞、造血幹細胞、毛胞前駆細胞、皮膚前駆細胞、肝臓前駆細胞、または消化管前駆細胞である。
【００１３】
本発明の第一の観点の特定の態様において、前駆細胞は動物の体内に存在するものであり、この動物には飼育動物またはヒトが含まれるが、これらには限定されない。前駆細胞が動物の体内に存在する特定の態様において、前駆細胞を、動物に対してFRILファミリーメンバー分子を投与することにより接触させる。いくつかの態様において、FRILファミリーメンバー分子を、薬剤的に許容可能なキャリアとともに動物に対して投与する。
【００１４】
本発明の第一の観点の様々な態様において、細胞傷害剤は、化学療法剤および放射線療法剤からなる群から選択される。いくつかの態様において、前駆細胞をFRILファミリーメンバー分子と接触させ、その後その細胞を細胞傷害剤と接触させる。いくつかの態様において、前駆細胞を細胞傷害剤と接触させて、その後FRILファミリーメンバー分子と接触させる。
【００１５】
第二の観点において、本発明は、治療的有効量のFRILファミリーメンバー分子を前駆細胞-枯渇性活性を有する治療的処置とともに患者に対して投与することを含む、患者における前記治療的処置から患者体内の前駆細胞を保護するための方法であって、ここで患者体内の前駆細胞が、前駆細胞-枯渇性活性を有する治療的処置に対して保護される、前記方法を提供する。この方法において、正常な前駆細胞が、前駆細胞-枯渇性活性を有する治療的処置から保護される。いくつかの態様において、患者は、飼育動物である。好ましくは、患者はヒトである。いくつかの態様において、患者は癌を有する。
【００１６】
第二の態様の特定の態様において、治療的処置は、放射線療法、化学療法、あるいは放射線療法と化学療法との組み合わせである。特定の態様において、化学療法は、シタラビン、ドキソルビシン、シスプラチン、ダウノルビシン、パクリタキセル、シクロフォスファミド、または5-フルオロウラシルである。特定の態様において、FRILファミリーメンバー分子は精製されている。特定の態様において、FRILファミリーメンバー分子は、薬剤的に許容可能なキャリアとともに患者に対して投与される。いくつかの態様において、患者は、FRILファミリーメンバー分子を投与された後に、治療的処置を投与される。
【００１７】
第三の観点において、本発明は、細胞集団をFRILファミリーメンバー分子に接触させ、そしてFRILファミリーメンバー分子により特異的に結合された細胞を単離することを含む、組織を修復するための細胞を単離するための方法であって、ここでFRILファミリーメンバー分子に結合した細胞は、組織を修復するために有用である、前記方法を特徴とする。特定の態様において、細胞集団はヒト由来のものであり、そして細胞集団には、前駆細胞が含まれ、そして細胞集団は全血、臍帯血、胎児肝細胞、または骨髄細胞である。
【００１８】
本発明のこの観点の特定の態様において、FRILファミリーメンバー分子により結合された細胞は、前駆細胞である。特定の態様において、前駆細胞は、間葉性前駆細胞、造血幹細胞、毛胞前駆細胞、皮膚前駆細胞、肝臓前駆細胞、または消化管前駆細胞である。
【００１９】
本発明にしたがって、FRILファミリーメンバー分子の組成物を治療剤として使用して、化学療法を受けている癌患者などの患者における健康な組織の損傷を予防することができる。例えば、FRILファミリーメンバー分子を、化学療法剤の健康な組織に損傷を与える作用を減少させることを目的として、薬剤的に許容可能なキャリア（例えば、生理学的に無菌な塩類溶液）とともに、いずれかの投与経路を介して化学療法を受けている癌患者に対して投与することができ、それにより患者がより高い用量の化学療法剤を受容することができ、そして好ましくは癌から回復することができる。薬剤的に許容可能なキャリアおよびそれらの製剤は周知のものであり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences（18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990）に一般的に記載されている。
【００２０】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、細胞および組織の損傷、特に、化学療法または放射線療法による治療の間に生じる細胞および組織の損傷を予防するための組成物および方法を提供する。本明細書中で引用される特許および刊行物のすべては、当該技術分野における知見を反映させたものであり、そしてそれにより、それぞれの文献が参考文献として援用されると具体的に言及された程度まで、全体として参考文献として援用される。これらの特許および刊行物と本開示との間のいずれかの不一致は、本開示に沿って解決されるだろう。
【００２１】
第1の観点において、本発明は、前駆細胞をFRILファミリーメンバー分子と細胞傷害剤とに接触させることを含む、前駆細胞を細胞傷害剤から保護するため方法であって、ここで接触させた細胞は、細胞傷害剤による細胞傷害性から保護される、前記方法を提供する。
【００２２】
“前駆細胞保存因子（preservation factors）のFRILファミリー”という用語は、レクチンのファミリーを意味するために使用され、ここでそれぞれのFRILファミリーメンバー分子は、前駆細胞を保護し、そしてそれぞれのFRILファミリーメンバー分子は正常にグリコシル化されたFLT3受容体に対して結合する（Moore et al, Biochim Biophys. Acta 25027: 1-9, 2000を参照）。“レクチン”により、高い親和性で糖残基に結合するタンパク質を意味する。本発明の第1の観点にしたがって、“結合する”または“結合した”という用語は、本発明のFRILファミリーメンバー分子が正常にグリコシル化されたFLT3受容体に対して、FLT3-リガンドが正常にグリコシル化されたFLT3受容体と結合する際の親和性と少なくとも同様の高い親和性で、そして好ましくはそれよりも高い親和性で、結合することを意味するために、交換可能に使用される。好ましくは、FRILファミリーメンバー分子は、正常にグリコシル化されたFLT3受容体と、抗体がその特異的リガンドに結合する際の親和性と少なくとも同様の高い親和性で結合する。さらにより好ましくは、本発明のFRILファミリーメンバー分子は、正常にグリコシル化されたFLT3受容体に対して、抗体がその特異的リガンドと結合する際の親和性よりも高い親和性で結合する。さらにより好ましくは、本発明のFRILファミリーメンバー分子は正常にグリコシル化されたFLT3受容体に対して、少なくとも10-7Mの解離定数（KD）で、より好ましくは10-8Mの解離定数（KD）で、さらにより好ましくは10-9Mの解離定数（KD）で、さらにより好ましくは少なくとも10-10Mの解離定数（KD）、そして最も好ましくは、本発明のFRILファミリーメンバー分子は、正常にグリコシル化されたFLT3受容体に対して、少なくとも10-11Mの解離定数（KD）で結合する。結合および結合親和性を決定するための標準的方法は既知である。
【００２３】
本発明にしたがって、“正常にグリコシル化されたFLT3受容体”により、正常な細胞によりグリコシル化されたFLT3受容体のグリコシル化パターンを有するFLT3受容体を意味する。本発明のすべての観点にしたがって本明細書中で使用される場合、“正常な細胞”により、新生物（neoplastic）細胞ではない生細胞を意味する。本明細書中で使用する場合、“新生物細胞”により、細胞-細胞接触阻害（contact inhibition）などの因子や可溶性制御因子（例えば、サイトカインまたはホルモン）などの因子により制御されない、異常な増殖、特に増殖の増大を示し、そしてFLT3受容体を異常にグリコシル化して新生物細胞上のFLT3受容体のグリコシル化パターンが異常になりそして正常細胞上でのFLT3受容体のグリコシル化パターンとは異なるようになる細胞を意味する。したがって、新生物細胞上のFLT3受容体は、本発明のFRILファミリーメンバー分子により結合されない。
【００２４】
“FRILファミリーメンバー”または“FRILファミリーメンバー分子”は、1または複数の前駆細胞保存因子（preservation factors）のFRILファミリーの分子を意味する。好ましくは、FRILファミリーメンバー分子はエンドウあるいはインゲンマメ（common bean）などのマメ科植物に由来するものである。マメ科植物は、根に（窒素-固定バクテリア）根粒を有する双子葉植物草本、低木（shrub）、および高木（tree）のファミリー（Leguminosae）に由来する植物である（“マメ科植物（leguminous plants）”）。好ましくは、FRILファミリーメンバー分子は、Phaseolus vulgaris、Dolichos lab lab、Sphenostylis stenocarpa、Vigna sinensis、またはVoandzeia subterraneaを含むが、それらには限定されない、Phaseoleaeの科または属に属する植物に由来する。好ましくは、FRILファミリーメンバー分子は、マンノース／グルコース-特異的マメ科植物レクチンである（Moore et al., Biochim. Biophys Acta 25027: 1-9, 2000；Colucci et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 646-650, 1999；Mo et al., Glycobiology, 9: 173-179, 1999；およびHamelryck et al., J. Molec. Biol. 299: 875-883, 2000を参照）。好ましくは、フジマメ（hyacinth bean；すなわちDolichos lab lab）から単離されたFRILファミリーメンバー分子は、以下の8アミノ酸配列：TNNVLQXTを含むアミノ酸配列を有する。本発明のFRILファミリーメンバー分子は好ましくは、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5またはSEQ ID NO: 7の配列を含むかまたはそれらの配列からなる核酸分子によりコードされる。好ましくは、本発明のFRILファミリーメンバー分子は、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、またはSEQ ID NO: 10の配列を含むか、またはそれらの配列からなるアミノ酸配列を有する。
【００２５】
FRILファミリーメンバー分子（例えば、変異体または融合タンパク質）の定義に含まれるその他の分子、および組換えFRILファミリーメンバー分子、そのようなFRILファミリーメンバー分子を作製しおよび精製する方法、およびそのようなFRILファミリーメンバー分子をコードする核酸分子を精製する方法は、U.S.特許No. 6,084,060；ColucciらのPCT出願番号PCT/US99/31307（PCT国際公開WO 01/49851）、およびColucciらのPCT出願番号PCT/US98/13046（PCT国際公開W0 98/59038)中に記載され、それらのすべての開示全体は、この記載により参考文献として援用される。
【００２６】
好ましくは、それぞれのFRILファミリーメンバー分子は、正常にグリコシル化されたFLT3受容体に対して結合し、そしてFRILファミリーの別の構成分子のアミノ酸配列と少なくとも約45％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約55％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも約65％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも約75％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも約85％の同一性、そしてより好ましくはFRILファミリーの別の構成分子のアミノ酸配列（例えば、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、またはSEQ ID NO: 10）と少なくとも約95％の同一性を有する。2つのタンパク質または2つの核酸分子の間のアミノ酸配列同一性および核酸配列同一性は、標準的な方法に従って測定することができる（例えば、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448, 1988；George, D.G. et al., inMacromolecular Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications,pps. 127-149, Alan R. Liss, Inc. 1988；Feng and Doolittle, Journal of Molecular Evolution 25: 351-360, 1987；およびHiggins and Sharp, CABIOS 5: 151-153, 1989；およびthe National Center for Biotechnolog National Library of Medicine, Bethesda, MDの様々なBLASTプログラムを参照）。
【００２７】
好ましくは、FRILファミリーメンバー分子が結合する正常にグリコシル化されたFLT3受容体は、前駆細胞上で発現される。本明細書中で使用する場合、“前駆細胞”は、分化および増殖により、完全に分化した機能性の子孫を生成する能力（capacity）を有するいずれか正常な体細胞のことをいう。好ましくは、前駆細胞は、組織中に存在するものである。前駆細胞には、血液、間葉、毛髪、胚、神経、筋肉、皮膚、消化管（すなわち、胃腸）、骨、腎臓、肝臓、膵臓、胸腺、および脳を含むが、これらには限定されない、いずれかの組織または器官系に由来する前駆細胞が含まれる。したがって、本発明のいくつかの態様において、前駆細胞は、造血前駆細胞である。特定の態様において、前駆細胞は、間葉性前駆細胞、造血幹細胞、毛胞前駆細胞、皮膚前駆細胞、筋肉前駆細胞、神経前駆細胞、脳前駆細胞、骨前駆細胞、腎臓前駆細胞、肝臓前駆細胞、または消化管前駆細胞である。
【００２８】
本発明の特定の好ましい態様において、正常にグリコシル化されたFLT3受容体（FRILファミリーメンバー分子が結合する）を発現する前駆細胞は、KIT受容体もまた発現する。FLT3受容体は、骨髄中の様々な幹細胞および前駆細胞上で発現しており、そして胚的細胞、造血細胞、間葉系細胞、内皮細胞、および脳細胞細胞を含むが、これらには限定されない、組織全体にわたって分散される。特定の好ましい態様において、正常にグリコシル化されたFLT3受容体（FRILファミリーメンバー分子が結合する）を発現する前駆細胞は、CD34細胞表面受容体を発現しない。
【００２９】
したがって、本発明に従えば、固相（例えば、マグネティックビーズ）に結合させたFRILファミリーメンバー分子は、FLT3+、Kit+、CD34-前駆細胞を捕捉するために有用である（以下の実施例を参照）。固相がマグネティックビーズである場合、マグネティックビーズに固定化されたFRILファミリーメンバー分子と接触させた細胞集団にマグネットを適用し、そして非結合細胞をすすぎ流すことにより、非結合細胞を分離する。FRILファミリーメンバー分子-被覆マグネティックビーズに結合する前駆細胞を単離する方法は、以下の実施例において記載する。マグネティックビーズは、商業的に入手可能である（例えば、Dynabeads Tosylactivated, Lake Success, NY；またはMiltenyi Biotec, Auburn, CAから入手）。FRILファミリーメンバー分子はタンパク質であるため、それをタンパク質のアミノ基またはスルフヒドリル基を介してマグネティックビーズに複合体化させることができる。
【００３０】
FRILファミリーメンバー分子が固定化される好ましいマグネティックビーズは、MACSスーパー-パラマグネティックMicroBeads（Miltenyi Biotec, Inc., Auburn, CAから商業的に入手可能）またはM-280 Dynabeads Tosylactivated（Dynal Biotech, Inc., Lake Success, NYから入手可能）である。好ましくは、マグネティックビーズは、生物分解性であり、それによりビーズに結合した前駆細胞は、生理学的機能を保持する。
【００３１】
本発明にしたがって、FRILファミリーメンバー分子は、直接的にまたは間接的に、組織培養プレートの底に結合させることができる。標準的な“パニング”プロトコル（例えば、Stengelin et al., EMBO J. 7(4):1053-1059, 1988；Aruffo and Seed, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(23): 8573-8577, 1987を参照）により、FRILファミリーメンバー-結合性前駆細胞を含有すると推測される細胞集団を、プレート上でインキュベートする。次いで、プレートは、生理学的に許容可能な溶液でやさしくすすぎ、それにより非結合細胞を取り除き、一方でFRILファミリーメンバー-被覆プレートに結合したFRILファミリーメンバー-結合性の前駆細胞集団はそのままにする。
【００３２】
前駆細胞は分化細胞とは区別され、分化細胞は、増殖する能力、すなわち、自己-増殖する能力、は有しても有さなくてもよいが、正常な生理学的条件下で、異なる細胞型へさらに分化することはできない細胞として定義される。前駆細胞には、最も分化した細胞または完全な成熟細胞の前の分化および増殖の細胞系にあるすべての細胞が含まれる。したがって、例えば、前駆細胞には、成熟個体における皮膚前駆細胞が含まれる。皮膚前駆細胞は、ただ一種の細胞に分化できるが、それ自体は完全には成熟していないかまたは完全には分化しておらず、そしてしたがって、前駆細胞の定義に含まれる。さらに、前駆細胞は、本明細書中で定義されるように、新生物などの異常細胞とはさらに区別される。前駆細胞を検出するための標準的な方法は、FRILファミリーメンバーの前駆細胞を保存（preserve）する能力を決定するために使用することができる（例えば、メチルセルロースまたはその他の半-固体培地ベースの前駆細胞アッセイ。例えばPaige et al., Eur. J. Immunol. 14(11):979-987, 1984; Iscove et al., J. Immunol. 142(7)2332-2337, 1989; U.S.特許No. 6,084,060に記載される）。
【００３３】
本明細書中で使用する場合、“前駆細胞を保存する（preserve）”により、FRILファミリーメンバー（またはその変異体、またはFRILファミリーメンバーまたはその変異体を含む融合タンパク質）が、未分化な状態で前駆細胞を維持する（retain）（すなわち、保存する（preserve））能力を意味し、これは既知のアッセイを使用して決定することができる（例えば、Kollet et al., Exp. Hematol. 28: 726-726, 2000; U.S.特許No. 6,084,060を参照）。好ましくは、FRILファミリーメンバーは、（他のサイトカインの非存在下で）不活発な状態のもと、血清-合成培地中での懸濁培養中で、1ヶ月まで前駆細胞を保存する（preserve）（例えば、Colucci et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 646-650, 1999を参照）。FRILファミリーメンバーが前駆細胞を保存する（preserve）限定的ではないメカニズムは、FLT3-発現前駆細胞（例えば、血管、血液、粘膜、肝臓、腎臓の前駆細胞）に対して作用して、それらの増殖および制御因子の分泌を阻害することによる。
【００３４】
したがって、本発明にしたがって、FRILファミリーメンバー分子は、前駆細胞を保存する（preserve）するために有用である；しかしながら、静止期にある前駆細胞を維持することにより、FRILファミリーメンバー分子は、FRILファミリーメンバーの非存在下において、結果として生じる進行のために、前駆細胞を保存する（preserve）ことができる。例えば、前駆細胞をFRILファミリーメンバー分子との培養中におき、そして培養を平穏な状態にしておけば、結局、培養物中のすべてのFRILファミリーメンバーが細胞により使用され、そして細胞は静止期から脱するだろう。FRILファミリーメンバーの存在下で培養する場合に前駆細胞により保持されるこの静止期により、静止期前駆細胞によるゆっくりとした細胞ターンオーバーが保証され、そしてそれらの静止期前駆細胞により分化が遅くなる。FRILファミリーメンバー分子が作用する限定的ではないメカニズムには、例えば、前駆細胞の生存率を維持すること、前駆細胞の分化への進行を防止すること（または遅くすること）、および／または（サイトカイン受容体ホーミング受容体を含む）前駆細胞の表面受容体を維持すること、が含まれる。
【００３５】
FRILファミリーメンバーが前駆細胞上の正常にグリコシル化されたFLT3受容体に結合することにより前駆細胞を保存する（preserve）能力は、正常にグリコシル化されたFLT3受容体がその天然のリガンドであるFLT3リガンドにより結合された場合の前駆細胞の応答とは区別可能であることに注目すべきである。例えば、FLT3-リガンドが前駆細胞上の正常にグリコシル化されたFLT3受容体に結合することにより、好ましくは、そのFLT3リガンド-結合前駆細胞の増殖および／または分化を誘導する。対照的に、FRILファミリーメンバーが前駆細胞上の正常にグリコシル化されたFLT3受容体に結合することにより、その前駆細胞が静止期に入ることを誘導し、それによりそのFRILファミリーメンバー-結合前駆細胞を保存する（preserve）。
【００３６】
本明細書中で使用する場合、“細胞傷害剤”は、細胞を殺すいずれかの化学物質である。細胞傷害剤として含まれるものには、化学療法剤がある（例えば、シクロフォスファミドやシスプラチン）。本発明の細胞傷害剤として含まれるものには、いくつかの細胞は殺すがしかしその他のものは殺さない、四塩化炭素（CCl4）やデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）などの化学物質もまた含まれる（例えば、CCl4は、肝細胞の壊死を引き起こす）。
【００３７】
本発明は、細胞傷害剤が新生物細胞および正常細胞を両方とも殺す薬剤である場合、特に有用である。FRILファミリーメンバー分子は、正常にグリコシル化されたFLT3受容体に対してのみ結合しうるため、正常なグリコシル化されたFLT3細胞を発現するそれらの細胞のみが細胞傷害剤の活性から保護される。したがって、新生物でありしたがって異常にグリコシル化されたFLT3受容体を発現する癌細胞は、FRILファミリーメンバーにより結合されず、そしてしたがって、細胞傷害剤の細胞傷害性効果から保護されない。
【００３８】
本発明の様々な態様において、細胞傷害剤は、化学療法または放射線療法である。いくつかの態様において、前駆細胞は、FRILファミリーメンバー分子と接触させ、その後細胞を細胞傷害剤に接触させる。いくつかの態様において、前駆細胞を細胞傷害剤と接触させた後、または細胞を細胞傷害剤と接触させると同時に、前駆細胞をFRILファミリーメンバー分子と接触させる。
【００３９】
好ましくは、本発明のFRIL-ファミリーメンバーは、精製される。FRILファミリーメンバー分子は、標準的な技術を使用して容易に精製される。タンパク質を精製する方法は、当該技術分野において既知であり、そしてそれにはHPLC、SDS-PAGE、免疫沈降、組換えタンパク質産生、特異的抗体を使用した親和性クロマトグラフィー、イオン-交換、サイズ-排除、そして疎水性相互作用クロマトグラフィー、またはこれらの方法のいずれかの組み合わせが含まれるが、これらのものには限定されない。これらのおよびその他の適した方法は、例えば、Marston, “The purification of eukaryotic proteins expressed in E. coli,” inDNA Cloning, Glover D.M., ed., Volume III, IRL Press Ltd., Oxford, 1987；Marston and Hartley, “Solubilization of protein aggregates,” pp. 266-267 inGuide to Protein Purification, Deutscher M.P., ed., Academic Press, San Diego, 1990；Laemmli, U.K., Nature 227:680-685, 1970；Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1999；U.S.特許No. 6,084,060；およびGowda et al., J. Biol. Chem. 269:18789-18793, 1994に記載される。FRILファミリーメンバーは、固相支持体（例えば、セファロースビーズ）上に結合させることができるマンノースに対して結合することにより、精製することもまた可能である。天然に存在するFRILファミリーメンバー分子を精製することができる非限定的な供給源には、Dolichos lab lab、Phaseolus vulgaris、Sphenostylis stenocarpa、Vigna sinensis、およびVoandzeia subterraneaが含まれる。
【００４０】
FRILファミリーメンバー分子のマメ科植物からの生成は、迅速かつ安価なものであり、そして結果として大量の精製されたFRILファミリー分子を生じる。FRILファミリーメンバーは、マメ科植物において相対的に豊富なものである。例えば、Dl-FRILは、フジマメ（hyacinth beans）の重量の約0.02％の割合を占める。“精製された”によりタンパク質（例えば、FRILファミリーメンバー分子)などの分子または不純分子とともに天然に存在する他の有機分子（例えば、炭水化物、核酸、タンパク質および脂質）をより含まない、そのような分子の組成物を意味し、そして精製プロセスの間に使用される物質もまた実質的に含まない。例えば、タンパク質は、少なくとも約60％、好ましくは少なくとも約75％、より好ましくは約少なくとも85％、最も好ましくは約少なくとも90％、そして最適にはおよそ少なくとも95％純粋である場合に、精製されたとみなされ、すなわち、天然に存在するタンパク質とともにある他の有機分子がなく、そして精製プロセスの間に使用される物質を含まない。FRILファミリーメンバー分子は、マンノース-親和性クロマトグラフィーまたはオボアルブミン親和性クロマトグラフィーにより、フジマメ（殺虫剤なしで生育するすることができる）などのマメ科植物から容易に精製することができ、そして組換えサイトカインよりも作製するために100倍以上安い（1/100以下）。
【００４１】
本発明の第1の観点の特定の態様において、前駆細胞は、家畜動物、実験動物、またはヒトを含むが、これらに限定されない、動物の体内にあるものである。“家畜動物”により、ネコ、イヌ、ゾウ、ラマ、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、およびヤギを含むが、これらには限定されない、ヒトに家畜化された動物を意味する。家畜動物として含まれるものには、非-ほ乳動物（例えば、シチメンチョウおよびニワトリ）もまた存在する。“実験動物”の限定的ではない例は、非-ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、ヒヒ）、魚、カエル、蠕虫、マウス、ラット、およびウサギである。特定の態様において、前駆細胞が動物である場合、前駆細胞は、FRILファミリーメンバー分子を動物に対して投与することにより接触させる。特定の態様において、FRILファミリーメンバー分子を、薬剤的に許容可能なキャリアとともに動物に対して投与する。“薬剤的に許容可能なキャリア”により、投与される動物に対して非-毒性でありそしてともに投与される化合物（すなわち、FRILファミリーメンバー）の治療的特性を維持する、いずれかの不活性なキャリアを意味する。薬剤的に許容可能なキャリアおよびそれらの製剤は、周知であり、そして例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences（18th Edition, Gennaro A., ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990）中に一般的に記載される。限定的ではない例示的な薬剤的に許容可能なキャリアは、Hank's平衡塩類溶液（HBSS）または生理学的な塩類溶液である。本発明の医薬製剤は、組成物の投与経路に依存して、いずれかの薬剤的に許容可能なキャリアを使用することができる。
【００４２】
FRILファミリーメンバーの組成物は、治療剤として使用するために安全でありかつ効能のあるものである、動物の消化管は、生のおよび／または調理された野菜および果物における、FRILファミリーメンバーなどのレクチンとの定常的に接触する。多数のレクチンが、生物学的に無傷な消化管を通過する（Pusztai, A., Eur. J. Clin. Nutr. 47: 691-699, 1993）。いくつかのレクチンは消化管と相互作用し、そして末梢血液循環中に輸送される。例えば、最近の研究では、200 gの生ピーナッツを接種した1時間後、ヒトの血液中において1〜5μg/mlのレベルでピーナッツ凝集素（PNA）を見出した（Wang et al., Lancet 352: 1831-1832, 1998）。食餌性レクチンに対する抗体は、約1μg/mlのレベルで、ヒトにおいて一般的に見出される（Tchernychev and Wilchek, FEBS Lett. 397: 139-142, 1996）。これらの循環抗体は、レクチンの炭水化物結合をブロックしない。
【００４３】
以下の実施例において示すように、マウスは、非常に高いレベルのFRILファミリーメンバーの組成物に対して耐えるため、化学療法剤の頻度および投与量レベルを増加させることを目的とした積極的な（aggressive）用量増強治療計画の間のそれらの補充を防止することにより、これが幹細胞および前駆細胞のより効果的な保護を可能にする可能性がある。以下で記載するように、Dl-FRIL（すなわち、Dolichos lab lab由来のFRIL）の生物学的活性は、サイトカイン（ng/mlの範囲）と同様である一方、マウスは、Dl-FRILに対してサイトカインよりも最大100〜1,000-倍まで耐えた。
【００４４】
第二の観点において、本発明は、治療的有効量のFRILファミリーメンバー分子を治療的処置とともに患者に対して投与することを含む、患者における治療的処置の前駆細胞-枯渇性活性から、患者体内の前駆細胞を保護するための方法であって、患者体内の前駆細胞を前駆細胞-枯渇性活性を有する治療的処置から保護する、前記方法を提供する。本発明の第1の観点の特定の態様において、前駆細胞は、家畜動物、実験動物、またはヒトを含むが、これらには限定されない、動物体内にある。いくつかの態様において、患者は癌を有する。
【００４５】
本発明にしたがって、“治療的有効量”により、FRILファミリーメンバーの組成物の投与量、または患者の前駆細胞が枯渇されることによる症状のいずれかを軽減するかおよび／または減少させるために効果的であるか、または治療的処置（例えば、化学療法）の前駆細胞-枯渇性活性を軽減するかおよび／または減少させるために効果的である、FRILファミリーメンバーの組成物を含む薬剤製剤の投与量を意味する。好ましくは、そのような投与は、全身性である（例えば、静脈注射による）。全身的に投与される場合、治療的有効量は、1日あたり約500 ngのFRILファミリーメンバー/kg全体重から約5 mg/kg全体重の量である。好ましくは、治療的有効量は、1日あたり約500 ng/kgから500μg/kg全体重のFRILファミリーメンバーである。さらにより好ましくは、治療的有効量は、1日あたり約5μg/kgから50μg/kg全体重のFRILファミリーメンバー分子である。最も好ましくは、治療的有効量は、1日あたり約50μg/kg全体重のFRILファミリーメンバーを送達する量である。
【００４６】
本発明にしたがって、前駆細胞枯渇性活性を有する治療的処置で処置した患者に対してFRILファミリーメンバーを投与することにより、患者の前駆細胞を治療的処置の前駆細胞枯渇性活性から保護する。本発明のFRIL-ファミリーメンバーの組成物および本発明のFRILファミリーメンバーの組成物を含む薬剤製剤を、患者の前駆細胞が枯渇されることによる症状を有するかそのような症状を発症する素因を有する患者に対して投与することができる。そのような症状は、先天的なものである可能性がある。例えば、患者は無形成性貧血を有する可能性がある。
【００４７】
患者の前駆細胞が枯渇されることによる症状は、治療的処置（例えば、化学療法を用いた治療）により誘導される場合もある。したがって、本発明の第二の態様の特定の態様においては、治療的有効量の薬剤製剤を患者に対して投与し、その後前駆細胞-枯渇性活性を有する治療的処置を用いて患者を治療することにより、患者における治療の前駆細胞-枯渇性活性を軽減する。第二の観点の特定の態様において、治療的処置は、放射線療法、化学療法、または放射線療法と化学療法の組み合わせを投与することである。例えば、癌患者はしばしば、前駆細胞-枯渇性活性を有する放射線療法剤および／または化学療法剤を用いて治療される。“前駆細胞-枯渇聖活性”という用語は、前駆細胞を殺すことにより、前駆細胞が複製する能力を減少させることにより、または不可逆的な分化を行うように前駆細胞を誘導することにより、治療的処置により治療される患者における前駆細胞が枯渇されることによる治療的処置の活性を意味する。限定的ではない前駆細胞-枯渇性活性を有する治療的処置の例は、シタラビン（Ara-C）、ドキソルビシン（Dox）、ダウノルビシン、ドセタキセル、トポテカン（topotecan）、ジェムシタビン（gemcitabine）、エトポシド、シスプラチン、シクロフォスファミド、パクリタキセル、および5-フルオロウラシル（5-FU）を含むが、これらには限定されない、化学療法剤である。追加的な限定的ではない前駆細胞-枯渇性活性を有する治療的処置の例は、レニウム-188 HEDP、コバルト-60、およびリン-32化合物を含むが、これらには限定されない、放射線療法である。
【００４８】
本発明は、FRILファミリーメンバー分子が、この前駆細胞-枯渇性活性を有する治療的処置から前駆細胞を保護することができる、いずれかのおよびすべてのメカニズムを包含する。一つの限定的ではないメカニズムにおいて、FRILファミリーメンバー分子は、前駆細胞による増殖を一時的に停止させ、それにより前駆細胞が治療的処置の毒性から逃れることを可能にする。
【００４９】
さらに、本発明の第二の観点の様々な態様において、患者に対してFRILファミリーメンバー分子を投与し、その後治療的処置を投与する。したがって、一つの限定的ではない本発明の例において、患者は、治療的有効量のFRILファミリーメンバー分子（またはFRILファミリーメンバーを含む組成物および／または薬剤製剤）を、患者が前駆細胞-枯渇性活性を有する治療的処置（例えば、化学療法）を用いた治療を受ける前約5日から、治療的処置を用いた治療の約2時間後までの間、投与され、ここで治療的有効量のFRILファミリーメンバー分子の組成物および／または薬剤製剤を毎日投与する。本発明にしたがって、好ましくは、患者は、治療的有効量のFRILファミリーメンバーを含む治療的有効量の組成物および／または薬剤製剤を、患者が前駆細胞-枯渇性活性を有する治療的処置（例えば、化学療法）を用いた治療を受ける前約2日から、治療的処置を用いた治療の前約1日までの間、投与される（ここで、治療的有効量のFRILファミリーメンバー分子組成物および／または薬剤製剤を毎日投与する）。いったん患者が前駆細胞-枯渇性活性を有する治療的処置の治療を受け始めたら、治療的有効量のFRILファミリーメンバーを含む組成物および／または薬剤製剤は、患者が治療的処置を受ける前に受ける治療的有効量のFRILファミリーメンバーを含む組成物および／または薬剤製剤とは異なる場合がある、ということは理解されるだろう。
【００５０】
いくつかの態様において、患者に対して、治療的処置の投与を行った後にFRILファミリーメンバー分子を投与するか、または患者に治療的処置を投与すると同時にFRILファミリーメンバー分子を投与する。特定の態様において、本発明のFRILファミリーメンバーを、前駆細胞-枯渇性活性を有する治療的処置を患者に投与するとともに患者に対して投与することにより、より高い用量の治療的処置により患者を治療することが可能にある。より高い容量の治療的処置は、治療的処置の用量を増加させるかおよび／または治療的処置を用いた治療の期間を増加させるかのいずれかにより達成することができる。例えば、小児期急性骨髄性白血病（AML）と診断された子供は、典型的には最初に、最初の7日間の間、Days 1〜3には45 mg/m2のダウノルビシンで治療し、それに加えて100 mg/m2のAra-Cで7日間、および100 mg/m2のGTGで7日間、治療する。本発明のこの観点にしたがう組成物を用いて事前に処置した同一の子供は、これらの化学療法のいずれかまたはすべてのより高い容量（すなわち、より高い容量および／またはより長い治療期間）に耐えられる。癌患者における、前駆細胞-枯渇性活性を有する治療的処置（例えば、化学療法）の用量耐性におけるこのような増加は、より癌性の細胞を破壊する結果を生じることができるため、好ましい。治療的処置（例えば、ダウノルビシン）のための用量は、当業者にとって既知のものであり、そして患者の体重および年齢に依存して変化しうる（例えば、Physician's Desk Reference, Medical Economics Co. 2000を参照）。
【００５１】
本発明にしたがって、FRILファミリーメンバー分子を、いずれかの適した手段により投与することができる。例えば、FRILファミリーメンバー分子を、慣習的な薬剤実務に従って、単位投与剤形において、薬剤的に許容可能な希釈剤、キャリア、または賦形剤中で、ほ乳動物に対して投与することができる。ほ乳動物が症状についての症候を呈する前に投与を開始することができ、それにより患者の前駆細胞が枯渇される。例えば、患者が放射線療法および／または化学療法を受ける前に、あるいは患者が放射線療法および／または化学療法を受けた後であって患者が放射線療法および／または化学療法による病気の徴候（例えば、脱毛、体重減少、消化に関する問題）を示す前に、癌患者に対してFRILファミリーメンバー分子の投与を開始することができる。本発明のFRILファミリーメンバー分子のいずれかの適した投与経路は、非経口、静脈内、動脈内、皮下、舌下、経皮、局所、肺内、筋肉内、腹腔内、吸入による投与、鼻腔内、エアロゾル、直腸内、膣内、または経口投与による投与を含むが、これらのものには限定されない、投与を使用することができる。FRILファミリーメンバー分子を含む薬剤製剤および／または組成物は、液体溶剤または懸濁剤の形状であってもよく；経口投与のためには、製剤は錠剤またはカプセルの形状でもよく；そして鼻腔内製剤のためには、製剤は粉剤、点鼻剤、またはエアロゾルの形状であってもよい。FRILファミリーメンバー分子を含む薬剤製剤および／または組成物を症状により影響を受けている領域に対して局所的に投与することができ、それにより患者の前駆細胞を枯渇する。例えば、患者の造血前駆細胞が影響を受けている場合（例えば、患者が貧血を発症している場合）、FRILファミリーメンバー分子を、患者の骨髄中に直接的に投与することができる。FRILファミリーメンバー分子を、全身的に投与することもまたできる。
【００５２】
第三の観点において、本発明は、細胞集団をFRILファミリーメンバー分子と接触させ、そしてFRILファミリーメンバー分子により特異的に結合される細胞を単離することを含む、組織を修復するための細胞を単離する方法を特徴としており、ここでFRILファミリーメンバー分子に対して結合する細胞は、組織を修復するために有用である。特定の態様において、FRILファミリーメンバー分子により特異的に結合される細胞は、細胞をin vitroで成長因子とともにインキュベートし、その後その細胞をレシピエント動物体内に注入することにより、特異的な細胞型への分化が誘導される。好ましくは、細胞およびレシピエント動物は、同一種に由来するものである。好ましくは、細胞は、レシピエント動物から単離されるか、またはMHCがレシピエント動物に適合する個体（例えば、レシピエントの一卵性双生児の片方）に由来する。好ましくは、細胞はヒト由来である。
【００５３】
非限定的な一例において、骨髄細胞を、肝硬変を患っている患者から採取する。FRIL-結合性細胞を、以下の実施例に記載するとおり、骨髄細胞または全血から単離する。（FRIL-結合性細胞を単離するための別の非限定的な方法は、細胞をFRILファミリーメンバーを用いて染色し、その後検出可能に標識した（例えば、FITCまたはフィコエリトリンで標識した）抗-FRIL抗体により染色し、その後検出可能な標識に結合するそれらの細胞をソートすることであることに注目すべきである。抗-FRIL抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）を、標準的な方法により作製することができる（例えば、Coligan et al.,Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons Inc., New York 1994を参照）。）単離されたFRIL-結合性細胞のあるものは、患者の肝臓中に直接注入することができ、細胞のあるものは肝臓の発生を刺激する成長因子（肝細胞成長因子（HGF）およびTGFβスーパーファミリーのメンバー分子を含むが、これらには限定されない）の存在下にてin vitroで培養することができる。さらに、FRIL-結合性細胞のあるものは、冷凍保存し、そして標準的な方法に従って液体窒素中で保存する。細胞は、その後に未分化な細胞として使用するために、単離したのち直接保存してもよく、または肝臓発生を刺激する成長因子の存在下にて、保存する前に培養してもよい。
【００５４】
本発明の第三の態様の特定の態様において、細胞集団には好ましくは、前駆細胞が含まれる。特定の態様において、細胞集団は、全血、臍帯血、胎児肝細胞、または骨髄細胞である。
【００５５】
本発明のこの態様の特定の態様において、FRILファミリーメンバー分子により結合される細胞は、前駆細胞である。特定の態様において、前駆細胞は、間葉性前駆細胞、造血幹細胞、毛胞前駆細胞、皮膚前駆細胞、肝臓前駆細胞、または消化管前駆細胞である。
【００５６】
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい態様をさらに説明することを目的としており、そしてその性質として非限定的である。当業者であれば、日常的な実験程度のものを使用して、本明細書中に記載された具体的な物質および方法と同等の多数のものを認識し、または、確かめることができるだろう。
【００５７】
実施例1
末梢血単核細胞の濃縮
以下の標準的な手順を使用して、臍帯血または末梢血のいずれかから末梢血単核細胞（PBMCs）を調製し、そして赤血球を除去した。（ヒト臍帯血（CB）サンプルを、満期分娩から得た。）この一般的なプロトコルは、文献に記載されている（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. 92:10119-10122, 1995；Clin. Lab. Haem. 20:341-343, 1998；Vox Sang. 76:237-240, 1999を参照）。
【００５８】
血液は、滅菌条件下にて採取し（100μlを細胞数カウントのために保存する）そして血液全容量をを記録した。次に、ヘタスターチ（hetastarch）（ストックは0.9％NaCl中6％であり、Abbottから商業的に入手可能、NDC 0074-7248-03, 500 ml)を最終濃度が1.2％となるように血液に対して添加し、そしてよく攪拌した。次いで血液を室温（約25℃）にて45分間静置させた。上層の色および透明度をこの時間の間記録した。
【００５９】
この45分間の“静置時間”の間、最初の細胞数カウントを行った（血球計算板を使用）。これを行うため、180μlの2％酢酸を、20μlの保存した細胞と混合し（80μlを残す）、1:10希釈し、そして細胞数をカウントした。
【００６０】
45分間の“静置時間”ののち、白血球が濃縮された上層を新しい50 mlコニカルチューブに移し、そして白血球を脱気HAEMを用いて2回洗浄した（HAEMとは、HBSS（Life Technologies, 14025-076）＋0.1％AIM V Media（Life Technologies 12055-083）＋1 mM EDTA（Sigma E-7889 Lot # 110K89271）であり、そして5分間攪拌することにより脱気する）。洗浄するため、細胞の容量を、脱気したHAEMを用いて40 mlまでにし、その後細胞を400×g、11℃にて、Beckman GS-6R遠心分離機中で10分間遠心分離をかけ、そして上清を吸引除去した。
【００６１】
洗浄した後、細胞ペレットを1 mlのHAEM中で再懸濁し、そして残存する赤血球を溶解した。赤血球を溶解するため、9 mLのNH4Cl溶液（0.72％NH4Cl、10 mM EDTA, StemCell Technologies, Inc., Vancouver, Canada）を1 mlの細胞懸濁液に添加し、チューブを混合しそして氷上で5分間静置した。
【００６２】
次に、細胞を脱気したHAEM中で2回洗浄した（容量を脱気したHAEMを用いて40 mlまで増加させ、細胞を、1300 RPM、11℃にて5分間遠心分離し、その後上清を吸引除去する）。次いで細胞ペレットを20 mlの脱気したHAEM中に再懸濁した。最終的に、残りの細胞をカウントし、そしてFRIL機能性実験か、またはFRIL結合性を使用したソートかのいずれかのためにすぐに使用した。
【００６３】
実施例2
前駆細胞を単離するためのFRIL-結合性細胞選抜
以下の標準的な手順を使用して、実施例1において記載したように調製した末梢血単核細胞から前駆細胞を単離した。
【００６４】
滅菌技術を使用して、実施例1で得た細胞を、1300 RPM、11℃にて5分間遠心分離した（細胞は実施例1で得た20 ml中に存在する）。上清を吸引除去し、そして細胞を、450μlの脱気HAEMを含む500μl中に再懸濁した（一般的には、細胞ペレット中に50μlの細胞と過剰なHAEMが存在すると考えられた）。
【００６５】
次に、50μlのビオチン化FRIL（bFRIL；1μg/mlでストック）に500μlの細胞を添加し、そして混合した（細胞容量に対して1：10希釈のbFRILを作製）。(ビオチン化FRILを作製するため、FRILを標準的な方法に従って精製し（U.S. 特許No. 6,084,060；Mo et al., Glycobiology 9: 173-179, 1999；Kollet et al., Exp. Hematol. 28: 726-726, 2000；Hamelryck et al., J. Molec. Biol. 299: 875-883, 2000を参照）、そしてPierce Chemical Co. のプロトコルにしたがってビオチン化した。）bFRIL／細胞混合物を、氷上で30分間インキュベートした。
【００６６】
次に、bFRIL／細胞混合物全体を脱気したHAEMで40 mlまで増やし、そして細胞を1300 RPM、11℃にて5分間、遠心分離した。上清を吸引除去した後、細胞を500μlの脱気したHAEM中に再懸濁した。次に、ストレプトアビジン（SA）ビーズ（Miltenyi 100-18-101）を107細胞あたり5μlのビーズ濃度で、細胞に対して添加した。ビーズ-細胞混合物を混合し、そして氷上に5分間静置した。次に、細胞の全量を1.5 mlの脱気したHAEMを用いて2 mlまで増やした。
【００６７】
そうしているあいだに、MidiMACS分離装置（Miltenyi 423）およびMACS LS+分離カラム（Miltenyi 424-01）を用意した。カラムをプレフィルター（プレ分離フィルター30 um；Miltenyi 414-07）を伴う磁石中にセットし、そのカラムの下に50 mlコニカル試験管を設置した。3 mlの脱気したHAEMをプレフィルターを介して流し、“FRIL陰性細胞”の回収を開始した。
【００６８】
カラムを用意してすぐに、カラム中にHAEMのでこぼこ（meniscus）がまだ存在しているあいだに、細胞サンプルをプレフィルターに移した。時折、プレフィルターを若干押し込んで作り出された真空部分を放出することが必要だった。
【００６９】
サンプルをカラムに流した後、2 mlの脱気したHAEMを試験管にピペットで入れ、そこで細胞を洗浄しそして過剰な細胞を回収する。2 mlを次いでプレフィルター中にピペットで入れた。
【００７０】
次に、さらに2 mlの脱気したHAEMをプレフィルターにピペットで入れ、その後カラムを最後に洗浄してから、乾燥させた（ran dry from the last wash）。プレフィルターからこれ以上の水滴が出なくなった後、プレフィルターを押し込んでそしてその後取り出した。次にカラムを一連の洗浄操作で洗浄した：2 mlの脱気したHAEMを用いて3回洗浄し、その後5 mlの脱気したHAEMを用いて2回洗浄した。カラムは、決して乾燥させない様にし、そしてカラムの先端はいつも滴っているようにした。
【００７１】
次に、カラムを磁石から取り出し、そして “FRIL陽性細胞”と表示した15 mlのコニカル試験管の上部にカラムの先端の直下に位置するように設置し、先端が試験管の内部に入るようにした。この15 mlコニカル試験管を使用して、カラムが磁石から離れてしまったときに細胞が勢いよく飛び散ってしまう場合でも、細胞を回収する。
【００７２】
カラムを取り出した直後に、2 mlの脱気したHAEAをピペットでカラムに入れ、そしてすぐにカラムに備え付けた滅菌プランジャーを用いて、HAEMをカラムを介して試験管中に強制的に押し出した。最終容量は、2〜2.5 mlのあいだであった。
【００７３】
次に、押し出した細胞を、1300 RPM、11℃にて5分間、遠心分離にかけ、そして細胞ペレットを2 mlのHAEM中に再懸濁し、そして細胞数をカウントした（トリパンブルーを使用して、死細胞に対する生細胞の数をカウントした）。生存細胞カウントに関して、生細胞の全数を生細胞および死細胞の全数で割り、その後100をかけて％とした。これらのFRIL-結合性細胞はここではすぐに使用した。
【００７４】
典型的には、臍帯血から、約0.3％の細胞がFRILに結合した。
実施例3
FRIL-結合性前駆細胞の解析
実施例2において記載したように単離したFRIL-結合性前駆細胞を、標準的な方法（例えば、Coligan et al.,Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons Inc., New York 1994を参照）にしたがって、商業的に入手可能な抗体（例えば、Becton Dickinsonから商業的に入手可能なFITC標識抗-ヒトCD34、Coulter, Miami FL USAから商業的に入手可能なフィコエリトリン（PE）-標識抗-ヒトCD38、およびBeckman Coulterから商業的に入手可能なPE-標識抗-ヒトCD135（抗-Flt3）)を使用して、細胞染色（その後Becton Dickinson FACScan上でのFACS解析）により解析した。
【００７５】
図1A〜1Dにおいて示すように、実施例2において記載されるように単離されたFRIL-結合性細胞は、FLT3受容体発現が約50％陽性（図1C）およびKit受容体発現が60％陽性（図1D）であることが分かった。さらに、図2Bにおいて示すように、FLT3陽性であったそれらの細胞の中で、36％の細胞が血液白血球およびリンパ球上で見出される活性化マーカーであるCD38に関して陽性であった。このように、FLT3陽性細胞のほとんど（64％）は、活性ではなかった。
【００７６】
（FRIL-結合性細胞の50％のみがFLT3陽性であるという事実により、抗-FLT3抗体がFRILに対するよりもFLT3受容体に対してより低い親和性しか有さないか、FLT3受容体がFRILによりブロックされておりそしてそのため抗-FLT3抗体により結合され得ないか、および／またはFLT3受容体が結合することに加えて、FRILが前駆細胞上に存在する他の受容体に対して結合することのいずれかが示唆される。）
FRIL-結合性細胞、FRILに結合しなかった細胞（すなわち、実施例2のカラムに結合することなく流れ出てきた細胞）、そして実施例1にしたがって精製した、ソートしなかった臍帯血細胞を、次に約105細胞/ウェルで24-ウェルプレート中にまき、そして内皮刺激物質（100 ng/mLの血管内皮増殖因子（Biosource International, Camarillo, California）)または造血刺激物質（寒天調整培地、StemCell Technologies）の存在下、コロニー形成解析のために、0.9％メチルセルロース培地（StemCell Technologies）中でインキュベートした。培養2週間後に、顕微鏡でコロニー数を数えた。
【００７７】
図3Aおよび3Bにおいて示したように、内皮刺激物質または造血刺激物質のいずれかの存在下でインキュベートした場合、ソートしなかった臍帯血細胞およびFRILに結合しなかった細胞（“FRIL-”）は、比較的少数のコロニーしか形成しなかった。対照的に、FRIL-結合性細胞（“FRIL+”)は、内皮刺激物質または造血刺激物質のいずれかに応答して、多数のコロニーを形成した。内皮培養における黒色棒は、均一な形態を有する細胞のクラスターを含有するコロニーを示す。造血細胞における黒色棒は、骨髄性細胞または赤血球系細胞のいずれかを含有するコロニーからなる；白色棒は、骨髄性コロニーおよび赤血球系コロニーの両方を含有する、より原始的な前駆細胞に由来する混合コロニーを示す。
【００７８】
このように、これらの結果から、FRIL-結合性細胞は、それらの細胞をインキュベートする際の刺激物質のタイプに依存して、内皮細胞および造血細胞の両方に分化する能力を残存している、非常に初期の前駆細胞であることが示された。
【００７９】
実施例4
FRIL-結合性細胞は、CD34+CD38-/low細胞と同様である
FRIL-結合性細胞を、末梢血単核細胞（PBMCs）およびCD34+細胞と比較した。
【００８０】
PBMCsは、実施例1に記載したように調製した。
CD34+細胞は、以下のとおり調製した：実施例1に記載したように調製した細胞を、MACS分離キット（Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany）を製造者の指示に従って使用して、CD34+細胞に関して濃縮した。濃縮化されたCD34+細胞の精製度は、一つのカラムを使用して60〜80％であった。
【００８１】
全RNAを、同等数のそれぞれの細胞種から調製し、そしてFlt-1受容体をコードする転写物、Flt-3受容体をコードする転写物、または同等数の細胞数を確認するために使用する対照遺伝子（GADPH）をコードする転写物の存在について、RT-PCRによりアッセイした。PCR生成物をアガロースゲル電気泳動により分離し、そして標準的な方法（例えば、Ausubel et al., supraを参照）に従って、エチジウムブロマイドを用いて可視化した。図4においても見ることができるように、試験したすべての細胞種（レーン1、PMNC；レーン2、FRIL-結合性細胞；レーン3、CD34+細胞)は、同等レベルのGAPDHを発現した。対照的に、PMNCは、FLT3受容体およびFLT1受容体の両方のを低いレベルで発現した。
【００８２】
実施例5
マウスは高レベルのDl-FRILに耐性である
以前の実験で、FRILのin vitroでの生物学的活性がケモカインおよびサイトカイン（ng/mlレンジ）から同様であることが示された（例えば、Moore et al., Biochim. Biophys. Acta 25027: 1-9, 2000；Kollet et al., Exp. Hematol. 28: 726-736, 2000；Colucci et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 646-650, 1999；Mo et al., Glycobiology 9: 173-179, 1999を参照）。ケモカインおよびサイトカインは、高レベルではしばしば毒性である。したがって、研究は、FRILが同様に高レベルで毒性であるかどうかについて調べるために行った。
【００８３】
これらの研究を行うため、Dl-FRIL（Dolichos lab lab由来のFRILファミリーメンバー）を、標準的な方法に従って、精製した（U.S. 特許No. 6,084,060；Mo et al., supra；Kollet et al., supra；Hamelryck et al., J. Molec. Biol. 299: 875-883, 2000）。Dl-FRILを、0.006〜1 mg/kg（0.32〜20μg/マウス）の3-対数用量範囲にわたって、マウスに対して静脈内に投与した。Dl-FRILについて十分に薬剤の作用に耐え、そしてこれらのマウスは、引き続いて月2回のDl-FRIL投与を受け、短期副作用または長期副作用をいずれも観察されなかった。
【００８４】
マウスにおけるサイトカイン化学的防護特性を試験するためのプロトコルは、典型的には、化学療法を開始する前に、4〜10日間の毎日の事前処置（ボーラス送達または持続的送達）処置計画が伴う。開始時点としてこの枠組みを使用して、Dl-FRILを、毎日5 mg/kg（100μg/マウス）、静脈から4日間、注入した。この容量計画により処置された150匹以上のマウスにおいて、大きな副作用は観察されなかった。
【００８５】
別の研究において、マウスに、毎日4〜8容量のFRIL（0.05〜5 mg/kg/一回投与量）を、静脈または皮下経路で、1週間以上の期間与えたが、いかなる副作用的反応も観察されなかった。
【００８６】
FRILの上限の予備的な目安を得るために設計した別の研究において、4匹のBALB/cマウス（オス2匹およびメス2匹、5ヶ月齢）に、（1 ml容量に慣れるために）500 mg/kgのFRILの単回ボーラス腹腔内注入を行い、そして生存について48時間モニターした。この用量のFRILは、典型的な高用量である5 mg/kgよりも100倍高いものであったが、4匹のマウスのうち3匹で致死的であった（LD75）。生き残ったマウスの体重は、最初の2日間で約15％減少し、そして第4日までには正常にまで戻った。生き残ったマウスの血液カウントは、FRILの注入後3日後に、正常範囲内のものであった。この結果から、Dl-FRILが非常に大用量であっても、完全に毒性と言うわけではないことを示す。
【００８７】
実施例6
FRILファミリーメンバータンパク質はCB MNCを化学療法薬の毒性から保護する
FRILファミリーメンバータンパク質が前駆細胞を化学療法薬の毒性から保護することができるか否かを調べるため、臍帯血単核細胞（CB mnc）を以前に記載されたように採取した（Kollet et al., 上記を参照）。次いで、CB mneを、0.1 mlの容量の血清合成培地（AIMV, Life Technologiesより商業的に入手可能）中、200,000 細胞/mLの濃度で、96ウェル組織培養プレート（Corning, Inc., Corning, NY）中で培養した。したがって、ウェル当たり20,000 細胞であった。
【００８８】
Dl-FRIL（Dolichos lab lab由来のFRILファミリーメンバー）を、標準的な方法に従って精製した（U.S. 特許No. 6,084,060；Mo et al., 上記；Kollet et al., 上記；Hamelryck et al., 上記を参照）。Dl-FRILを（対照を添加することなしに）10 ng/mlまたは100 ng/mlの濃度で、シタラビン（Ara-C）、ドキソルビシン（Dox）、シスプラチン、または5-フルオロウラシル（5-FU）とともに5-対数用量範囲にわたって添加した。培養物を、加湿チャンバー中で、最大29日間培養液を交換することなく、インキュベートした。生細胞を、XTT（2,3-bis［メトキシ-4-ニトロ-5スルホフェニル］-2H-テトラゾリウム-5カルボキシアニリド内部塩）（Diagnostic Chemicals Ltd, Charlottetown, Prince Edward Island, Canada）により、培養の5日後に調べた。このXTTは、活発に呼吸している細胞により切断されるテトラフォルマザン塩である（Rochm et al., J. Immunol. Methods 142: 257-265, 1991）。増殖および細胞生存は、Vmax動的プレートリーダー（Molecular Devices Corp., Mountain View, CA）を用いて、分光光度計的に定量し、そして比活性（units/mL）または特異的活性（units/mg）のいずれかとして記録した。
【００８９】
図5A〜5Cにおいて示すように、Dl-FRIL（10 ng/ml（黒三角）または100 ng/ml（白丸）のいずれか）を含有する培養物は、シタラビン（Ara-C）（図5A）、シスプラチン（図5B）、またはドキソルビシン（Dox）（図5C）に対する感受性が10倍〜10,000倍に減少したことを示した。図5Dにおいて示すように、5-FU培養物中にFRILが存在することにより、大幅な用量範囲にわたり、細胞生存率が増大する。Dl-FRILによるAra-C、Dox、およびシスプラチンの用量シフトのあいだでの5-FUと比較した場合に観察される差異は、5-FUが、DNA-特異的薬剤としてではなくむしろ、RNAメカニズムを介して作用していることを示す最近の報告により、説明することができる可能性がある（Bunz et al., J. Clin. Invest. 104:263-269, 1999）。
【００９０】
実施例7
Dl-FRILは、マウスを重要な最初の2週間における5-FU誘導死から保護する
投与計画は、FRILがマウスを5-フルオロウラシル（5-FU）の造血毒性に起因する死から防御するかどうかを決定するために確立した。このマウス5-FU化学防御モデルは、LernerとHarrison（Exp. Hematol. 18:114-118, 1990）およびde Haanたち（Blood 87:4581-4588., 1996）による研究に基づいた。図6A〜6Cに示すように、Dl-FRILを5-FUとともに投与するための3種類の異なる投与計画を行った。実際、この研究をマウスにおいて行うため、事前処置投与計画（図6A）および“最適化”投与計画（図6C）を組み合わせて修飾したものを使用した。化学療法を開始する前に1日または数日間、サイトカインにより動物を処置することの必要性に基づいて、そしてサイトカインのために使用されたものよりも10-〜100-倍である投与量（5 mg/kg）にDl-FRIL-処置マウスが容易に耐性になるため、上述したDl-FRILに関するこの投与計画（5 mg/kg×4日または5日）を選択した（実施例1を参照）。FRILおよびサイトカインは、同一の濃度範囲（ng/ml）で前駆細胞に対して作用するため、この事前処置投与計画を使用して、Dl-FRILがマウスを第1週に2回の間隔で投与した5-FUから防御できるかどうかを試験した：
Dl-FRILは、実施例1において上述したように、Dolichos lab labから精製した。
【００９１】
第一の研究において、体重をあわせた2群のBALB/cマウス（10匹マウス／群）に対して、HBSS中0.2 mLのDl-FRIL（500μg/ml、すなわち、注入当たり100μg）（Group 1）または0.2 mLのHank's 平衡塩類溶液（HBSS；Group 2）のいずれかとともに、5日間連続して日単位で静脈内で（i.v.）注入した。Dl-FRILまたはHBSSの2回目の注入後2時間後に（day 0）、マウスに対して、5-FU（150 mg/kg）を腹腔内（i.p.）に注入した。さらに、Dl-FRILまたはHBSS（day 5）の最終注入の後1日後に、マウスに150 mg/kgの5-FUで2回目のi.p.注入を行った。5-FU単回投与によって死んだマウスはいなかった。
【００９２】
図7において示すように、Dl-FRIL-処置したマウス群における10匹のマウスのうち7匹（Group 1；白丸）が、5-FUの2回投与により処置した後、2週間生存した。対照的に、HBSS-処置マウス群における10匹のマウスのうち1匹のみ（Group 2；図7における黒丸）が、1回目5-FU投薬を受けた2週間後に行った5-FUの2回投与を生き延びた。
【００９３】
第二の研究において、体重をあわせたBALB/cマウス（10匹マウス／群）を、100μgのDl-FRILを含有する0.2 mLのHBSS（Group 1）；10μgのDl-FRILを含有する0.2 mLのHBSS（Group 2）； 1.0μgのDl-FRILを含有する0.2 mlのHBSS（Group 3）；0.1μgのDl-FRILを含有する0.2 mLのHBSS（Group 4）；または0.2 mLのHBSS（Group 5）により、day -1、day 0、day 4、およびday 5に日単位で静脈内に注入した。day 0およびday 5にDl-FRILまたはHBSSを注入して2時間後、マウスに対して、5-FU（150 mg/kg）を腹腔内（i.p.）に注入した。5-FUの単回投与で死んだマウスはいなかった。
【００９４】
図8に示すように、1回目5-FU処置の2〜3週間後、1.0μgのDl-FRILをday -1、day 0、day 4、およびday 5に与えたGroup 3のマウス（白三角）は、最高の生存を示した（10匹のうち8匹が生存した）のに対して、Dl-FRILを与えなかった10匹のマウスのうち2匹のみが（Group 5；図8における黒丸）が、1回目の5-FU処置の2週間後まで生存した。0.1μgのFRILでマウスを処置することにより（Group 4；図8における黒四角）、30％のみが生存するという結果となった。図8に示すように、この実施例およびFRIL投与タイミングにおいて、10μgおよび100μgでのより高い投与量でのFRILにより、それぞれ50％および40％のマウスが保護されたが、これはおそらく、前駆細胞があまりに長いあいだ休止状態に置かれていて、結果として骨髄の回復が遅れたためである。
【００９５】
2つの異なる実験が関与する別の研究において（16週齢オスまたは8週齢メス）、体重をあわせたBALB/cマウス（10匹マウス／群）に、0.2 mlのDl-FRIL（500 mg/mL、すなわち、注入当たり100μg）または0.2 mLのHBSSのいずれかを、日単位で4日間、静脈内に注入した。Dl-FRILの最終処置の2時間後、マウスに5-FU（150 mg/kg）を静脈内に注入した。マウスのGroupは、day 3（D0/3）またはday 5（D0/5)のいずれかに2回目の5-FU投与（150 mg/kg）を受けた。以前と同様に、5-FUの単回投与で死んだマウスはいなかった。
【００９６】
以下の表Iにおいて示すように、実験1において（16週齢オス）、マウスをFRILで事前処置し、そしてday 3に2回目の5-FU投与を与えた場合、HBSS事前処置と5-FUのみを、day 0とday 3に与えた10匹のマウスすべてが死亡したことと対照的に、10匹のマウスのうち3匹が生存した。
【００９７】
【表１】
2004527495.tif 000002
【００９８】
同様に、表Iにおける実験2において、day 0およびday 3において5-FUで処置した場合に生存したマウスはいなかったが、マウスをday 0およびday 5において5-FUで処置した場合、FRIL事前処置を受けたマウス群は、HBSS事前処置した群において観察された10％の生存率と対照的に、40％の生存率を有した。
【００９９】
まとめると、これらの研究から、5-FUを投与したマウスは、FRILファミリーメンバータンパク質も投与する場合に、生存率が非常に高くなることが示され、これは投与が1回目5-FU投与量の投与の前であるか、または1回目および2回目5-FU投与量の両方の投与と同時であるかによらない。
【０１００】
実施例8
FRILは、2倍-投与量の5-フルオロウラシル化学防御モデルにおけるマウスの消耗を防止する
FRILおよび5-FUの両方を投与した実施例3におけるマウスは、一見健康で正常に見えるが、一方HBSSおよび5-FUを投与したマウスは、病的に見える。したがって、研究を行って、FRILが化学療法処置動物において典型的に見られる消耗を防止することができるかどうかを調べた。
【０１０１】
このことを行うため、BALB/cマウス（メス、週齢7〜8週、10匹マウス／群）の皮下に、0.2 mLのFRIL（100μg/mL、すなわち、全量20μg）または0.2 mLのHBSSのいずれかを、day 0およびday 5での5-FU（150 mg/kg、i.p.）を用いた処置の前日、および1時間前に注入した。すなわち、マウスに、FRILまたはHBSSをday -1、day 0、day 4、およびday 5に投与した。マウスは毎日体重測定した。
【０１０２】
図9Aおよび9B（代表的な実験）に示すように、生命を維持するFRILの化学防御的特性は、骨髄以外にも拡張し、化学療法により損傷を受けた他の組織および器官を防御する。生存するFRIL-処置マウスは、生存するHBSSのみで処置したマウスとは対照的に体重減少および嗜眠性行動という特徴的な化学療法剤毒性徴候を示さなかった。これらの結果から、血液細胞産生だけでなく、化学療法により損傷を受けた、例えば肝臓、心臓、神経システム、および消化管などの他の組織についてもまた、健康を回復するために必要とされる、骨髄-由来幹細胞および前駆細胞をFRILは保護することが示される。
【０１０３】
実施例9
FRILの最大耐用量（MTD）の確立
無胸腺ヌードマウス（Jackson Laboratory, Bar Harbor, MEから商業的に入手可能）を使用して、単回静脈内FRIL注入に関して、MTDを確立する。
【０１０４】
これを行うため、FRILを4群（240、120、60、および30 mg/kgの投与量）の2匹ずつの無胸腺メスマウスのそれぞれに投与する。マウスを日単位で生存および致死（morbundity）について観察し、そしてday 1、day 5、day 9、およびday 14に体重測定する。研究は、day 14に終了する。研究は、マウスがすべての投与量レベルに対して耐性であるかどうか、またはすべての投与量レベルでマウスが死亡したかどうか、に依存して、より高い投与量またはより低い投与量で繰り返す。このようにして、無胸腺マウスにおけるMTDを決定する。
【０１０５】
別の研究において、day 1〜day 6またはday 1、day 2、day 5、day 6、day 9、およびday 10にFRILを静脈内に（i.v.）投与する。生存または致死について、マウスを毎日観察し、そしてday 1、day 5、day 9、day 13、day 17、day 21、day 25、およびday 30に秤量した。研究は、30日で終了する。研究を、マウスが全ての用量レベルに耐性であるかどうか、または全ての用量レベルがマウスを死亡させるかどうか、に基づいて、より高い用量またはより低い用量で繰り返した。このように、無胸腺ヌードマウスにおけるMTDを決定する。
【０１０６】
実施例10
細胞傷害剤を伴う、FRILの処置スケジュール
次に、4種の臨床的に承認された剤を組み合わせるために適した処置スケジュールを使用する、FRILに関する容量範囲を見つける研究を行った。この研究は、8群のそれぞれ4匹の無胸腺メスマウスからなるグループからなる（4種の用量レベル／処置スケジュール）。FRILは、細胞傷害剤でのそれぞれの処置の1日前および1時間前に、静脈内に投与した（i.v.）。細胞傷害剤は、5日間のあいだ毎日注入（パクリタキセルに関して）するか、または4日間隔で3回の注入をするか（5-フルオロウラシル、ドキソルビシン、およびシクロフォスファミドに関して）のいずれかを用いて投与する。用量レベルは、予備的な用量範囲を見つける研究の結果により決定する。
【０１０７】
実施例11
FRILファミリーメンバーは、幅広く用いられている細胞周期に対して活性な化学療法に対して化学防御的特性を有する
FRILファミリーメンバーの最適投与計画を確立した後、FRILファミリーメンバーのシタラビン（Ara-C）およびドキソルビシンによる死亡からマウスを防御する能力を解析した。
【０１０８】
シタラビン（Ara-C）およびドキソルビシンの初回投与計画は、以下の通りである：ドキソルビシン - 4 mg/kgを単回ボーラスi.p.注入（Grzegorzewski et al., J. Exp. Med. 180:1047-1057, 1994）；Ara-C - 0時間および12時間の時点において300 mg/kgを1回でi.p.注入（Paukovits et al., Blood 77:1313-1319, 1991）。さらなる研究は、標的となる臨床的指標に基づいている。
【０１０９】
実施例12
FRILは、静止期にあるCD34+細胞を維持する
実施例2において調製したFRIL-結合性細胞がCD34+細胞に非常に似ていた（同一ではなかったが）ため、後者の細胞を使用して、FRILを用いたインキュベーションがどのような効果を細胞に対して有しているかを決定した。FRILの細胞に対する親和性が高かったため、細胞がすでにFRILを結合してしまっており、そしてそのためすでに静止期に入ってしまっていたため、実施例2において調製したFRIL-結合性細胞はこの研究では使用しなかったことに注意すべきである。
【０１１０】
CD34+細胞は、ミニMACS分離キット（Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany）を製造者の指示にしたがって使用して、実施例1において調製した細胞をCD34発現に関してソートすることにより、調製した（実施例5を参照）。濃縮されたCD34+細胞の精製度はカラムを用いて60〜80％であった。
【０１１１】
ソートした直後（すなわち、day 0において）、細胞を透水性にし（0.1％のtriton-Xと共にインキュベーションし）、ヨウ化プロピジウム（PI）で染色し、そしてFACSort（Becton Dickinson, San Jose, CA）を使用したFACscan解析に供した。細胞の細胞周期段階を、細胞が有した核酸の量（すなわち、どの程度のPIが細胞により取り込まれているか）により決定した。
【０１１２】
図10において示す通り、細胞をソートしたその日に、大多数の細胞（96.6％）が静止期にあった（すなわち、細胞周期のG0/G1期にある）。
次に、ソートした細胞を、 Dl-FRIL（40 ng/mL）、SFR6（幹細胞因子およびFlt-3リガンド、100 ng/mL（R&D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota）；rhIL-6、50 ng/mL；sIL6R、1280 ng/mL（Inter-Pharm Laboratories, Ness Ziona, Israel）；そしてFRIL、40 ng/mL（ImClone Systems Inc., New York, New York）、またはSFG36（幹細胞因子、300 ng/mL；Flt-3リガンド、300 ng/mL；G-CSF、50 ng/mL（R&D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota）；IL-3およびIL-6、10 ng/mL（R&D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota））の存在下で、24ウェルプレート中で培養し（2〜4×105細胞／ウェル）、そして分裂細胞の数は、インキュベーション開始後3、6、および10日に算定した。
【０１１３】
【表２】
2004527495.tif 000003
【０１１４】
表IIに示すように、FRIL中でのインキュベーションにより非分裂静止期状態にあるCD34+細胞が、インキュベーションの10日後でも維持されていたのに対して、SFR6またはSFG36中でのインキュベーションにより、CD34+細胞は刺激され、細胞周期に進入した。
【０１１５】
実施例13
FRILはサイトカイン刺激に勝つ
次に、FRILが単核細胞を維持する能力を、サイトカインが細胞周期への細胞の進入を刺激する能力と比較した。したがって、単核細胞（実施例1において調製したもの）をFRIL (0〜1000 ng/ml）およびサイトカイン（StemCell Technologies）を含有する寒天調整培地の両方の存在下で、5日間インキュベートした。
【０１１６】
【表３】
2004527495.tif 000004
【０１１７】
表IIIにおいて示すように、FRILは細胞を両方で刺激したサイトカイン刺激にわたって、優性的な様式で作用した。このように、1000 ng/mlのFRILのもとでインキュベーションすることにより、単核細胞が増殖することを妨害する一方で、骨髄性細胞コロニーおよび赤血球前駆細胞コロニーの頻度を最大に引き上げる。
【０１１８】
さらに、FRIL中でのインキュベーションの後、細胞は明らかに生存しており、そしてサイトカインに対して応答することができた。別の実験において、細胞をFRIL（40 ng/mL）中で6日間培養した。6日目に、細胞を外来性のFRILが存在しない条件下で回収そして洗浄し、そしてFRILまたはサイトカインカクテルのいずれかを含有する培養物中に、均等に分配した。さらに4日間の培養の後、細胞を回収し、カウントした（day 10）。FRIL-処置細胞の同様の処置を、FRILと共に10日間インキュベーションした後行い、その後、3日間、サイトカインで刺激し（day 13）、そして13日間の培養の後、7日間のサイトカイン刺激（day 20）を行った。図11Aおよび11Bにおいて示すように、FRILのみで処置した細胞（灰色の棒）は、FRILと共にインキュベーションした後に増殖しておらず、一方で生細胞および前駆細胞の両方共は、細胞をサイトカインで処理し、その後FRILと共にインキュベーションしたとき、数が増大した（黒色の棒）。
【０１１９】
実施例14
Dl-FRILは、マウスをデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）-で誘導した大腸炎から防御する
デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）の経口投与により、急性および慢性の大腸炎をまうすにおいて誘導する。DSS-誘導性大腸炎のメカニズムは、研究中である。現在の研究では、大腸上皮での毒性作用、腸管バクテリアフローラにおける変化、そしてマクロファージ炎症性反応の活性化、に焦点が当てられている（Mahler et al., Am. J. Physiol. 274: G544-G551, 1998）。
【０１２０】
FRILファミリーメンバータンパク質がマウスをDSS-誘導性大腸炎から保護するかどうかを調べるため、FRILを標準的な方法に従って精製し、そしてマウスにおけるDSS-投与の前およびその間に投与し、そして大腸炎を組織学的解析により解析した。
【０１２１】
体重をあわせたC3H/HeJBirマウスまたはNOD/SCID/B2マウス（10匹マウス／群、オスとメスを同じ数、6〜8週齢、The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME））を、皮下（subQ）に、HBSS-中0.2 mLのDl-FRIL(500μg/mL、すなわち、注入あたり100μg）と共に（Group 1）または0.2 mlのHank's-平衡塩類溶液と共に（HBSS；Group 2）のいずれかを、毎日7日間連続して注入する。Dl-FRILまたはHBSS（day 0）の2回目の注入の後2時間後に、実験的大腸炎をマウスに酸性飲用水中3.5％（wt/vol）のDSS（分子量：36,100〜45,000）（TB Consultancy, Uppsala, Sweden）を自由摂取で5日間与えることにより誘導した。いったんDSS投与を停止し、そしてマウスに酸性飲用水のみを16日間、day 21に剖検を行うまで与えた。このDSSの用量は、経験的に致死を最小限に抑えつつ中程度〜重度の大腸炎を引き起こす様に確立されたものである。
【０１２２】
マウスは、毎日体重測定し、そしてDSSに曝露している間、下痢の形跡について調べた。HBSS対照で処置したマウスは、典型的には、軟便または下痢があることが見いだされる。さらに、HBSS対照群において、血液の全体所見（gross evidence）がしばしば便中に観察される。FRILで処置されたマウスは、典型的には、HBSS対照群と比較して、ほとんど軟便または下痢を有さないことが見いだされる。
【０１２３】
全てのマウスは、day 21にCO2窒息により安楽死させる。大腸を採取し、そして盲腸を結腸から分離する。腸標本を、Feketeの酸-アルコール-ホルマリン固定液を用いて管腔内注入により、穏やかに膨張させる。直腸を含む結腸全体をインデックスカード上に置き、カード面において中心にある、楊枝（toothpick）の周りに同心円状に巻き付けることにより、腸ロールとして調製する。サンプルを固定液中に一晩浸漬し、そして次いで70％エタノールに移す。組織を処理し、パラフィン中に包埋し、5μmで薄切し、そしてヘマトキシリンおよびエオジンで染色する。
【０１２４】
それぞれの盲腸の2枚の切片およびそれぞれの結腸／直腸のそれぞれの1枚の切片にアクセッション番号をつけ、そしてそれらを病理学者が検査する。それぞれの病変を、重度、潰瘍形成、過形成、および関連する領域に基づいて、病変について得点をつけた。
【０１２５】
HBSS処置大腸炎誘導マウスと比較する場合、FRILを投与された大腸炎誘導マウスは、あまり腸損傷を示さないこと（すなわち、病変、重度、潰瘍形成、過形成が低く、影響を受けた全体領域が少ないこと)が見いだされた。
【０１２６】
実施例15
Dl-FRILは、マウスにおける四塩化炭素（CCl4）誘導性肝臓損傷から、マウスを防御する
マウスをCCl4に対して曝露することにより、活性CCl3ラジカル型に酸化される場合、肝細胞壊死が生じる。CCl3は、細胞膜脂質と反応し、膜統合性の損傷および結果として細胞死を引き起こす。
【０１２７】
FRILファミリーメンバータンパク質によりマウスをCCl4-誘導性肝臓損傷から防御できるかどうかを調べるため、FRILをマウスにおけるCCl4-投与の前およびその最中に投与し、そして肝臓損傷を、血清コリグリシンレベルの解析および組織学的解析により評価する（Biesel, KW et al., Br. J. Exp. Path., 65, 125-131, 1984）。
【０１２８】
体重をあわせたBALB/cマウス（10匹マウス／群、オスとメスを同数、週齢6〜8週、The Jackson Laboratory）の皮下に（subQ）、0.2 mLのHBSS中Dl-FRIL（500μg/mL、すなわち、注入あたり100μg）（Group 1）または0.2 mlのHank's平衡塩類溶液（HBSS；Group 2）を、日単位で7日連続して注入する。2回目のDl-FRILまたはHBSS（day 0）の2時間後、実験的肝臓損傷を、0.3 mlのオリーブオイル中CCl4（10％ v/v）を注入することにより誘導する。CCl4注入の4日後、マウスの眼窩後洞から採血し、CO2窒息により安楽死させ、そして肝臓を取り出し、リン酸緩衝化10％ホルマリン中で固定し、そして処理して5μm厚パラフィン切片にする。切片をヘマトキシリンとエオジンで染色する。ゴリグリシンレベルを、商業的に利用可能なキットを製造者の指示にしたがって使用して、ラジオイムノアッセイにより測定する（Abbott Laboratories, North Chicago, IL）。血清レベルを、CCl4注入1日前に採取したサンプルおよび注入後day 1とday 4のサンプル中のものと比較する。
【０１２９】
最後に、組織学的解析を行い、肝臓壊死領域の定量的相違を調べる。
HBSS処置肝臓損傷誘導マウスと比較する場合、FRILを投与された肝臓損傷誘導マウスは、あまり腸損傷を示さないことが見いだされる（すなわち、病変、重度、潰瘍形成、過形成が少なく、そして影響を受けた全体的な領域が小さい）。
【０１３０】
実施例16
FRIL-結合性細胞は全能性であり、組織修復に有用である
FRIL-結合性細胞が全能性であるかどうかを調べるため、近交系オスマウス（例えば、Jackson Laboratory, Bar Harbor Maineから入手するBalb/c）から採取した胎児肝臓および／または胎児血液を、上述したように、FRIL-被覆ビーズに対して特異的に結合する能力に関してソートする。ビーズから細胞を取り出すため、ビーズ-被覆された細胞を大過剰の“フリー”なFRIL（すなわち、ビーズに結合していないFRIL）を用いて流し、そしてマグネットに接着させることによりビーズを回収し、それにより結果としてビーズを含まない細胞を得る。
【０１３１】
細胞は、分割する。
細胞のいくらかは、筋肉細胞、腎臓細胞、皮膚細胞、神経組織、上皮細胞、骨細胞の発生を刺激する因子を含む、様々な成長因子中でインキュベートする。成長因子の非限定的な例としては、骨形態形成タンパク質-2、トランスフォーム成長因子-b（TGFb）、線維芽細胞成長因子-1（FGF-1）、線維芽細胞成長因子-2（FGF-2）、毛様体神経栄養性因子（CNTF）、神経成長因子（NGF）、肝細胞成長因子（HGF）、インスリン様成長因子（IGF）、表皮成長因子（EGF）およびその他のもの（例えば、van den Berg et al. (2001) Clin. Orthoped. 391S:244-50；Tomita et al. (2000) J. Atheroscler. Thromb. 7:1-7；Sleeman et al. (2000) Pharm. Acta. Helv. 74:265；およびWells (2000) Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 279:845；Zaret (2000) 92:83を参照）が含まれる。
【０１３２】
結果は、FRILで選択された細胞が、どの成長因子中でインキュベートしたかに依存して、様々な組織に発生することができることを示す。
細胞のいくらかを、FRILで選択された細胞を精製するオス胎児と同一の近交系の新生児メス中に直接注入する。言い換えれば、レシピエントは、ドナーと、レシピエントがY染色体をもっていないという点のみで異なっている。細胞を、メスマウスの様々な体の領域に（例えば、肝臓中、血流中、胸腺中に）注入する。マウスを成熟させ、そして生涯の様々なステージで（例えば、春機発動期、出産後）マウスを犠死させ、組織切片を作製し、そしてY染色体の存在について染色する。結果から示されることは、注入された細胞は、細胞が注入された場所および／または細胞が移動した場所に依存して、いずれかの組織型に分化することができるということである。
【０１３３】
これらの研究から、FRILで選択された細胞（すなわち、FRILに結合することができる細胞）は全能性であり、そして組織修復のために使用することができることが示される。
均等物
当業者は、日常的な実験程度のものを使用して、本明細書中で記載される態様の多数の均等物を認識しうるかまたは確かめることができる。そのような均等物は、以下の請求項の範囲内に包含されるものと企図している。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】図1A〜1Dは、本発明にしたがって単離されたFRIL-結合性臍帯血細胞のフローサイトメトリーのヒストグラムを示す。図1は、細胞の相対サイズを示し、ここで豊富な領域（“ゲート設定した（gated）”）は、生細胞を示す。図1Bは、3％のゲート設定した細胞のみがフィコエリトリン（PE）で標識された非-特異的IgG1抗体により陽性に染色されたことを示す。図1Cは、50％のゲート設定した細胞がPE-標識抗-FLT3抗体により陽性に染色されたことを示す。図1Dは、60％のゲート設定した細胞がPE-標識抗-KIT抗体により陽性に染色されたことを示す。
【図２】図2Aおよび2Bは、本発明にしたがって単離されたFRIL-結合性臍帯血細胞のフローサイトメトリーのヒストグラムを示す。図2Aは、PE-標識非-特異的抗体により陽性に染色されない細胞のうち、0.06％のみがFITC-標識された抗-CD38抗体に対して陽性に染色されたことを示す。図2Bは、PE-標識された抗-FLT3抗体で陽性に染色された細胞のうち、64％の細胞はCD38を発現せず、一方36％の細胞は実際にCD38を発現することを示す（すなわち、36％はFITC標識された抗-CD38抗体に対して陽性に染色された）。
【図３】図3Aおよび3Bは、本発明にしたがって単離されたFRIL-結合性臍帯血細胞の、内皮刺激または造血刺激に対する反応を示す線グラフを示す。FRIL-結合性細胞（“FRIL+”）は、内皮刺激（図3A）または造血刺激（図3B）のいずれかの存在下において、多数のコロニーを形成した。対照的に、ソートされていない臍帯血細胞（“CB”）およびFRILに特異的に結合しなかった単核臍帯血細胞（“FRIL-”）は、内皮刺激（図3A）または造血刺激（図3B）のいずれかの存在下において、少数のコロニーしか形成しなかった。
【図４】図4は、GAPDH mRNA（左側3レーン）、FLT3受容体mRNA（中3レーン）またはFLT 1受容体mRNA（右側3レーン）に対して特異的に結合するプライマーを用いて増幅した、臍帯血単核細胞（“1”と表示されたウェル）、本発明にしたがって単離されたFRIL結合性臍帯細胞（“2”と表示されたウェル）または本発明にしたがって単離されたCD34結合性臍帯血細胞（“3”と表示されたウェル）から抽出したmRNAのポリメラーゼ連鎖反応解析を示す。
【図５】図5A〜5Dは、代表的な非-限定的な本発明のFRILファミリーメンバーであるDl-FRILの存在下または非存在下における、CB mnc化学療法剤の用量反応性を示す線グラフを示す。化学療法剤は、10％Agar-SCM（StemCell Technologies）を含有するAIMV（Life Technologies）中のCB MNC（2×105細胞/0.1 mL）に関して、5-対数用量範囲にわたってアッセイした。黒丸は、Dl-FRILを含まない化学療法薬を示す；黒三角は、Dl-FRILを10 ng/mlで全てのウェルにおいて含有する培養を示す；そして白丸は、全てのウェルにおいて100 ng/mlのDl-FRILであることを示す。図5Aは、Ara-Cに対する用量反応性を示す；図5Bは、シスプラチンに対する用量反応性を示す；図5Cは、ドキソルビシンに対する用量反応性を示す；および図5Dは、5-FUに対する用量反応性を示す。
【図６】図6A〜6Cは、5-FUの投与と比較した場合の、代表的で非-限定的な本発明のFRILファミリーメンバーであるDl-FRILの投与のタイミングに関する、様々な非-限定的なプロトコルのスキーム図である。図6A（“FRILでの事前処置”）においては、5-FUを投与する最初の日の3日前から日単位で開始して、4回投与量のDl-FRILの投与を行った。図6B（“5-FU処置中のFRIL”）においては、5回投与量のDl-FRILの投与を、最初の5-FU投与の前日から開始し、そして2回目の5-FU投与まで継続する。図6C（“最適化FRIL投与”）においては、4回投与量のDl-FRILを投与し、その際、それぞれのDl-FRIL投与は、5-FU投与の前日およびその日に行う。
【図７】図7は、代表的で非-限定的な本発明のFRILファミリーメンバーである100μgのDl-FRIL（白丸）またはHank's平衡塩類溶液（HBSS；黒丸）を投与した、5-FU処置動物の生存の増加を示す生存グラフである。図7の下左は、Dl-FRILおよび5-FUの投与スケジュールである。
【図８】図8は、代表的で非-限定的な本発明のFRILファミリーメンバーであるDl-FRILを示された量投与した、5-FU処置動物の生存の増加を、HBSSを投与した動物（黒丸）と比較して示す、生存グラフである。図8の下左は、Dl-FRILおよび5-FUの投与スケジュールである。
【図９】図9Aおよび9Bは、代表的で非-限定的な本発明のFRILファミリーメンバーであるDl-FRIL（図9B）またはHank's平衡塩類溶液（HBSS）（図9A）を投与した、5-FU処置マウスの体重を示す線グラフである。図9Aおよび9Bの下左は、HBSSおよび5-FU（図9A）およびDl-FRILおよび5-FU（図9B）の投与スケジュールである。
【図１０】図10は、ソートしたその日にヨウ化プロピジウムで染色したCD34+細胞のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。この図でも分かるように、96.6％の細胞は、細胞周期の非-増殖性G0/G1期にある。
【図１１】図11Aおよび11Bは、FRILと共にインキュベートし、洗浄し、その後FRIL（灰色棒）またはサイトカインカクテル（黒棒）のいずれかと示された日数のあいだでインキュベートした細胞における、CB CD34+細胞のインキュベーション後の生細胞（図11A）および前駆細胞（図11B）の数を示す棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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