(57)【要約】本発明は、以下の主成分を適切な割合で含有するワクチン抗原製剤に関するものである：ａ）免疫した個体中の１種類以上の蛋白質を発現する１種類以上のＤＮＡおよびｂ）ウイルス抗原。本発明の新規性は、少なくとも１種類の構成成分が他方に対して及ぼす免疫反応の増強作用という点である。本発明ではまた、各種の病原体に対する多様な免疫反応を増幅かつ増強し得る構成成分の数を最小限に抑え、病原体に対する混合ワクチンを作成するために新しい製剤を開発した。当該製剤は、ヒトにおける予防かつ／または治療の目的で製薬業界が利用するのに適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
構成成分として蛋白質を発現するＤＮＡおよび蛋白質抗原を含有するワクチン製剤であって、この製剤のうち最低１種類の構成成分はもう一方に対するアジュバントとして作用するワクチン製剤。
【請求項２】
構成成分としてＣ型肝炎ウイルスのＥ１抗原の領域を含む蛋白質変種を発現するＤＮＡおよびウイルス蛋白質を含有する、請求項１に記載のワクチン製剤。
【請求項３】
構成成分としてＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３に明記するＤＮＡおよびＣ型肝炎ウイルスのカプシド蛋白質を含有する、請求項１および２に記載のワクチン製剤。
【請求項４】
構成成分としてＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３に明記するＤＮＡおよびＢ型肝炎ウイルスのカプシド蛋白質を含有する、請求項１および２に記載のワクチン製剤。
【請求項５】
構成成分としてＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２から４に明記するＤＮＡおよびＢ型肝炎ウイルスの表面抗原を含有する、請求項１および２に記載のワクチン製剤。
【請求項６】
Ｃ型肝炎ウイルスに対する治療薬かつ／または予防薬として使用される、請求項１から５に記載のワクチン製剤。
【請求項７】
Ｂ型肝炎ウイルスに対する治療薬かつ／または予防薬として使用される、請求項４および５に記載のワクチン製剤。
【請求項８】
Ｃ型肝炎ウイルスおよびＢ型肝炎ウイルスの両方に対する治療薬かつ／または予防薬として使用される、請求項４および５に記載のワクチン製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は医学の分野、特にワクチン抗原の新しい製剤に関するものである。本発明の技術的目標は、構成成分の数を最小限に抑え、成分間での相互作用を通じて増強された多様な免疫反応を誘発することのできる新しいワクチン製剤を開発することである。さらに、同時に投与した抗原に対して誘発される免疫反応を増強するためにも、混合ワクチン製剤の開発を目標とする。
【０００２】
（過去の技術）
ＨＣＶに対して有効なワクチンを作成するにあたって、いくつかの障害が存在する。ＨＣＶは、そのＲＮＡの特徴により、環境に適応して速やかに突然変異を起こすことができる。このため、世界中で特定されている複数のウイルス分離株の配列は非常に多様性が高い。最も異種性が高いのは、ＨＣＶ  Ｅ２蛋白質の超可変部であり、中和可能なエピトープが報告されている。ＨＣＶは、能動免疫反応が存在するにもかかわらず、持続的な感染症を引き起こす（Ｌｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｅｍｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ  ２０００、２０、２１１−２２６）。動物モデルにおいても、効率の良いウイルス複製のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系においても、中和抗体の発生に関する研究は行われていない。［訳者注：２０行目の「ａｎｄ」は不要、代わりに「，」が必要と思われます。］疾患の進行あるいは防御に関連する免疫のパターンは、まだ特定されていない。感染の解消のためには、おそらく強力、多種特異性かつ長期作動性の体液性免疫および細胞性免疫の両方が必要であろう（Ｌｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｅｍｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ  ２０００、２０、２１１−２２６）。
【０００３】
ＨＣＶに対するワクチンを開発するために、いくつかの取り組みがなされている。最も幅広く評価されているのは、組み換え型蛋白質、合成ペプチド類、ウイルス様粒子、ＤＮＡワクチンおよび生ウイルスベクターである。
【０００４】
いくつかのフラビウイルスは、表面蛋白質に対する抗体によって防御することが可能であるため、蛋白質サブユニットに基づくワクチンの開発はＨＣＶに関して評価された最初の戦略のうちの１つであった。ＨＣＶの構造的抗原に基づく数種類のワクチンは、動物モデルにおけるウイルスの防御に関して、限られてはいるが有効性を示した。その例として、Ｅ１−Ｅ２ヘテロダイマーによって免疫したチンパンジーが挙げられる。７匹のチンパンジーにワクチンを接種したところ、５匹では防御され、２匹では限定性の疾患が発生した（Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＲＯＣ  ＮＡＴＬ  ＡＣＡＤ  ＳＣＩ  ＵＳＥＳ  １９９４、９１、１２９４−１２９８）。この防御反応は、Ｅ２のヒト細胞への結合を阻害することのできる抗体（Ａｂｓ）の存在と相関していた（Ｒｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＲＯＣ  ＮＡＴＬ  ＡＣＡＤ  ＳＣＩ  ＵＳＥＳ  １９９６、９３、１７５９−１７６３）。
【０００５】
遺伝子型１ｂの分離株からの組み換え型Ｅ１蛋白質を、直径約９ｎｍの粒子中に自己会合するホモダイマーとして精製した（Ｍａｅｒｔｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｒｅｃｏｒｄｓ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｂｅｌｇ  ２０００、６３、２０３）。ＨＣＶを慢性的に感染させた２匹のチンパンジーに対し、組み換え型Ｅ１蛋白質５０μｇを９回投与した。ワクチン接種によって、肝臓の組織学的状態が改善し、肝臓のウイルス抗原の消失が確認された。また、組み換え型Ｅ１蛋白質と共にワクチン接種を行うことにより、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の量も低下した。投与期間中、血清中のウイルスＲＮＡの量は変化しなかったが、肝臓の炎症およびウイルス抗原の量は投与後に増加した。Ｅ１に対する抗体量の多さと疾患の改善との間には関連が認められた（Ｍａｅｒｔｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｒｅｃｏｒｄｓ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｂｅｌｇ  ２０００、６３、２０３）。
【０００６】
特に、組み換え型蛋白質からウイルス様粒子が産生されること、そしてそれらがワクチンとして利用可能であることは、非常に魅力的である。何故なら、これらの構造はウイルスの特性と類似することが多いからである。この種の粒子は、ＨＣＶの構造抗原配列を含有する組み換え型バキュロウイルスに感染させた昆虫細胞から得られ、これらの抗原に対する体液性免疫および細胞性免疫の両方の反応を誘発することができる（Ｂａｕｍｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １９９９、１１７、１３９７−４０７；Ｌｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １９９９、３０、４２３−４２９）。蛋白質サブユニットに基づくワクチンによって得られた結果は有望ではあるが、これら変種により誘発される免疫反応は主に体液性、短期間、かつ分離株特異的なものである。
【０００７】
一方、ＨＣＶに対する組み換え型ワクチンの開発の中で、異なる種類の組み換え型ウイルスベクターの評価が行われている。特に、組み換え型アデノウイルスベクターは肝臓親和性が高く、体液性免疫および細胞性免疫の両方を誘発する作用をもち、経口あるいは全身投与での送達が容易であるため、有力な候補となっている。ＨＣＶの構造蛋白質の配列をコードするＤＮＡを含有するアデノウイルスは、これら蛋白質のそれぞれ１つに対する抗体反応を誘発する（Ｍａｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９６、１４、２８−３６）。さらに、マウスをＣおよびＥ１の組み換え型アデノウイルスで免疫した後には、これらの抗原に対する特異的なＣＴＬ反応が検出される（Ｂｒｕｎａ−Ｒｏｍｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １９９７、２５、４７０−４７７）。これらの結果は有望であるが、遺伝子療法における組み換え型アデノウイルスの使用に関する最近の問題点として、ヒトでの有用性についての疑問が生じている。各種のＨＣＶ遺伝子を含有するワクシニアウイルス、カナリア痘ウイルスおよび鶏痘ウイルスのような他の組み換え型ウイルスは、マウスにおいて強力なＣＴＬおよびＴ−ヘルパー免疫反応を誘発した（Ｓｈｉｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９４、６８、３３３４−３３４２；Ｌａｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９、１６２、９３１−９３８）。しかし、これらの組み換え型ウイルスは、Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔウイルスのようなアルファウイルスの他の変種と同様、応用に際して制御問題や安全性に関する懸念を考慮する必要がある。
【０００８】
ＨＣＶのポリプロテイン中にＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のエピトープがいくつかあり、ウイルスの消失のために重要な役割を果たす可能性が確認されたことから、この病原体に対するワクチン候補としての合成ペプチドの評価が裏付けられる。Ｃ、ＮＳ４およびＮＳ５のエピトープを含有する各種ペプチドは、脂質付加の有無を問わず、マウスにおいて強力なＣＴＬ反応を誘発した（Ｓｈｉｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９９６、１７３、２４−３１；Ｈｉｒａｎｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｖｉｒｏｌ  １９９９、８０、１８７−１９３；Ｏｓｅｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９８、１６、８２３−８３３）。
【０００９】
ＨＣＶに対するワクチンを開発する上で用いる別の戦略は、直線状エピトープに対する抗体を作成する可能性に基づくものである。この代替戦略は、主としてＨＣＶのＨＶＲ−１に対する抗体を作成するために評価されており、ウサギおよびチンパンジーにおいてある程度有望な結果が得られている（Ｅｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  １９９９、１４４、９７３−９８０；Ｓｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９９、２５８、３９６−４０５）。ＨＣＶに対するワクチンの標的としてのＨＶＲ−１を選択する上での主な問題点は、準種に関するものである。
【００１０】
ペプチドワクチンの重大な障害は、ヘルパーＴ細胞のエピトープを持たないこれらのペプチドの免疫原性が低い可能性があるという点である。さらに、ワクチンの有効性は、多岐にわたる各種抗原に対して特異的な免疫反応を誘発し得るかどうかによって決まることが多い。これらの制限は、この戦略の重大な弱点である。
【００１１】
ＤＮＡ免疫は、ワクチン開発における最新の戦略の１つである。ＤＮＡワクチンは、有核細胞中の機能的転写ユニットの制御の下で対象となる抗原をコードする配列を含む精製プラスミドから構成される。このプラスミドを筋肉あるいは皮膚中に注射すると、宿主細胞に取り込まれ、細胞内で抗原が発現する。コードされた抗原が宿主細胞中で発現するということは、自然発生するウイルス感染と類似しているため、この方法の大きな利点である。ＤＮＡの操作が簡便であることや、ＤＮＡが安定しているため比較的安価でＤＮＡを大量生産できることも、ＤＮＡワクチン接種の利点である。
【００１２】
この種のワクチンによって誘発される免疫反応は、サイトカイン類のような共刺激分子群をコードする遺伝子あるいはそれらの分子と共に免疫することによって調節することが可能である。遺伝子の構造は、膜貫通領域、分泌のためのシグナル配列、あるいは抗原の細胞内輸送および加工に関与するその他の残基を挿入もしくは切断することによって調節できる。
【００１３】
特に、ＨＣＶに対するワクチンの開発において、ＤＮＡ免疫が幅広く研究されている。完全長のＨＣＶカプシド蛋白質あるいはその切断領域をコードする各種の発現ベクターが作成された（Ｌａｇｇｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９５、６９、５８５９−５８６３；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｒｅｓ  １９９５、４、１３５−１４４）。その他の構成成分として、ＨＣＶの５’非翻訳領域も含まれる（Ｔｏｋｕｓｈｉｇｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １９９６、２４、１４−２０）。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の表面抗原あるいはＨＢＶのその他のエンベロープ抗原に対する融合変種を発現するプラスミドの評価が行われている（Ｍａｊｏｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９５、６９、５７９８−５８０５）。これらのプラスミドで免疫することによって、一般に陽性のＣＴＬおよびリンパ球増殖反応が誘発された。
【００１４】
ＨＣＶのエンベロープ蛋白質もまた、この種の技術の標的となる。ＨＣＶ  Ｅ２の場合、体液性免疫反応は主としてＨＶＲ−１に向けられているようである（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌｓ  １９９８、８、４４４−４５１）。Ｅ１およびＥ２蛋白質の細胞内あるいは分泌型変種を発現するプラスミドによって免疫した場合にも、同様の免疫反応が認められる（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９８、７２、８４３０−８４３６）。ＧＭ−ＣＳＦおよびＨＣＶのＥ１あるいはＥ２蛋白質を発現するバイシストロン性プラスミドを接種した結果、体液性免疫および細胞性免疫の両方が増大した。最近、Ｅ１およびＥ２蛋白質を発現するバイシストロン性プラスミドが作成され、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるこれらの蛋白質の間でのヘテロダイマー形成がＤＮＡ免疫後に誘発される免疫反応に対して及ぼす影響についての研究が行われた。ヘテロダイマーが形成されると、ＨＣＶのＥ１およびＥ２蛋白質に対する抗体反応が得られなかった。これとは非常に対照的に、Ｅ１およびＥ２の切断変種を発現するプラスミドで免疫した後には、直線状および構造的エピトープの両方に向けられた抗体の力価が上昇した。このように、これらの抗原を含有する構成物を評価する際には、強力な抗体反応を誘発するためにヘテロダイマーの形成を阻害する必要があると考えられる（Ｆｏｕｒｎｉｌｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９９、７３、４９７−５０４）。
【００１５】
この技術によって、非構造蛋白質の評価も行われている。ＮＳ３蛋白質のＣ末端領域をコードする領域を、この領域とＩＬ−２とを同時にかつ独立して発現させることのできるベクター中に含めた場合に、良好な結果が得られた（Ｐａｐａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｒｅｓ  Ｖｉｒｏｌ  １９９８、１４９、３１５−３１９）。この免疫戦略によって、ＮＳ４およびＮＳ５の蛋白質も抗体およびＣＴＬ反応を誘発する（Ｅｎｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、ＪＩＭＭＵＮＯＬ  １９９８、１６１、４９１７−４９２３）。最近、ＧＭ−ＣＳＦおよびビリオンの非構造蛋白質（ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５）をコードする構築物を用いて、それぞれの非構造蛋白質に対する強力な抗体反応が誘発され、リンパ球増殖反応が増強された（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９９、１７、１１３６−１１４４）。
【００１６】
一般に、各種のＤＮＡ構築物に関して、本研究における併用により種々のＨＣＶ抗原が有効に発現することおよび１：１００から１：１０００００の範囲の力価で抗ＨＣＶ抗体が産生されることが報告されている（Ｉｎｃｈａｕｓｐｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９７、１５、８５３−８５６）。また、特異的なＣＴＬおよびリンパ球増殖反応を誘発することも確認された（Ｉｎｃｈａｕｓｐｅ  ｅｔ  ａｌ．、ＤＮＡ  ＡＮＤ  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ  １９９７、１６、１８５−１９５）。しかし、ＨＣＶの各種蛋白質に対する体液性反応および細胞性反応の両方をより強力なものとするために、この方法を改善する努力が必要である。したがって、ＤＮＡワクチン接種後に誘発される免疫反応を増強するために、リポソーム（Ｇｒａｍｚｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９９８、４、１０９−１１８）およびサポニンＱＳ−２１（Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ｔｏ  ｔｈｅ．、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９８、７２、４９３１−４９３９）といったいくつかの変種に関する評価が行われている。ＤＮＡ免疫においては、生物学的アジュバントとしての樹状細胞も検討されている。ウイルスベクター（Ｓｐｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９７、１８６、１２１３−１２２１；Ｂｒｏｓｓａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９７、１５８、３２７０−３２７６；Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９７、１８６、１２４７−１２５６）あるいはＲＮＡ（Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ｔｏ  ｔｈｅ．、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９６、１８４、４６５−４７２）の使用によって腫瘍抗原を発現するよう遺伝子調節したマウスの骨髄に由来する樹状細胞（ＣＤ）は、マウスにおいて腫瘍抗原に特異的なＴ細胞反応、および細胞により媒介される腫瘍に対する予防免疫を促進する作用を有することが確認された。
【００１７】
現時点では、この技術の限界を克服するために、発現された抗原に対する免疫反応を増強するためのＣｐＧモチーフの挿入（Ｈａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  １９９９、２２９、１−２２）を含めたＤＮＡ免疫のベクターの改善、およびＤＮＡ送達システムの改善が必須である。ＨＣＶ感染の特徴である困難な問題のため、またこの病原体に対する防御に相関する免疫学的パラメータについての明確な定義がなされていないため、ＨＣＶに対して有効なワクチンを作成するためには複数の免疫反応を刺激する多面的なアプローチが必要であると考えられる。おそらくこの問題の解決法は、現時点までに探索されている数種類のワクチン接種戦略を併用することにあるであろう。特に、ＤＮＡワクチンによる初回免疫と組み換え型蛋白質もしくはウイルスベクターによるブースター免疫とを併用する免疫スケジュール（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９９、１７、３１６０−３１７０；Ｐａｎｃｈｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２０００、１８２、１８−２７）についての評価が行われており、結果は有望であったが、初回−ブースター戦略によって本当にＨＣＶに対する防御免疫が誘発されるのかどうか確認するためにさらなる研究が必要である。
【００１８】
また、Ｂ型肝炎モデルに関しては、Ｂ型肝炎表面抗原、この抗原に特異的な抗体、およびこの抗原を発現するＤＮＡワクチンとによって形成される複合体を含有するワクチン製剤の評価が行われた（Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＵＳ６２２１６６４、１９９８）。この製剤は、複数の手段によって抗原を呈示させ、免疫反応を迅速に誘発するため、個々の変種によって誘発される反応よりも優れていた。
【００１９】
本発明では、構成成分として蛋白質抗原のみと１種類もしくは数種類の蛋白質を発現するプラスミドを含有し、それらのうちの少なくとも１つがもう一方のアジュバントとして作用するワクチン製剤について記載する。特に、Ｃ型あるいはＢ型肝炎ウイルスのカプシド抗原、およびＨＣＶ  Ｅ１蛋白質の個々もしくはポリプロテイン変種を発現するプラスミドについて評価する。Ｂ型肝炎モデルに関して以前に発表された組成とは異なり、免疫反応を増強するために製剤中に抗体が存在する必要がないため、必要な構成要素の数を減らすことができる。さらに、ワクチン組成の自由度が高いことから、異なる抗原に対して同時に強力な免疫反応を誘発させることも可能である。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＨＣＶおよびＨＢＶ、またはその両方に対する予防的もしくは治療的手段として個体を免疫するための組成および方法を提供するものである。最初に、構成要素として以下の成分を含有するワクチン製剤について報告する：（ａ）ＨＣＶエンベロープのＥ１抗原領域を含む蛋白質変種を発現するＤＮＡおよび（ｂ）ＨＣＶあるいはＨＢＶの蛋白質抗原を適切な割合で含有するもの。本発明の新規性は、少なくとも１種類の構成要素がもう一方に対して誘発される免疫反応に及ぼすアジュバント効果にある。遺伝子構築物によってコードされ宿主細胞によって発現される抗原や、ワクチン製剤を構成する蛋白質抗原は、ＨＣＶおよびＨＢＶに対する免疫反応を誘発するための興味深い標的である。すなわち、様々な種類の重要抗原に対して免疫反応を誘発することができる。
【００２１】
本ワクチン製剤には、混合した蛋白質抗原に対して誘発される免疫反応を促進するＤＮＡが含まれる；この効果は、当該ＤＮＡによってコードされる１種類もしくは数種類の蛋白質が免疫された宿主内で発現するかどうかに依存する。ＤＮＡは細菌菌株を原料とし、典型的な方法に従って精製する（Ｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １９９５、６、５６５−５７３）。
【００２２】
望ましい態様として、ワクチン製剤は以下のプラスミドのうちの少なくとも１種類を含有する：ｐＩＤＫＥ１Ｓ、ｐＩＤＫＥ２およびｐＡＥＣ−ＭＥであり、発現される蛋白質変種をコードするこれらプラスミドのＤＮＡ配列は、それぞれ２−４配列の数によって特定される。
【００２３】
ｐＩＤＫＥ１Ｓプラスミドは、ＨＣＶ  Ｅ１（Ｓｅｃ．Ｉｄ．Ｎｏ．２）の１７６番目から３６３番目までのアミノ酸で構成される蛋白質を発現した。一方、ｐＩＤＫＥ２プラスミドは、ウイルスポリプロテイン（Ｃ、Ｅ１およびＥ２の一部）（Ｓｅｃ．Ｉｄ．Ｎｏ．３）の最初の６５０個のアミノ酸を含む蛋白質を発現した。ＰＡＥＣ−ＭＥプラスミドは、各種ＨＣＶ抗原のＢ細胞およびＴ細胞エピトープから構成されるキメラ蛋白質を発現する（Ｓｅｃ．Ｉｄ．Ｎｏ．４）。これらのプラスミドでは、ＨＣＶキューバ分離株のｃＤＮＡからウイルス抗原をコードする配列を入手した（Ｍｏｒａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８、ＷＯ  ９８／２５９６０）。ＰＡＥＣ−ＭＥ、ｐＩＤＫＥ１ＳおよびｐＩＤＫＥ２の各プラスミドは、ｐＡＥＣ−Ｋ６プラスミドのマルチクローニングサイト中に挿入したＨＣＶ抗原コード配列を含有する（Ｈｅｒｒｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０００、２７９、５４８−５５１）。本発明に包含されるプラスミドは、ヒト細胞中で発現する抗原に対応することのできる調節要素を持つ。これらの調節要素には哺乳類において機能する転写ユニットが含まれ、例としてヒトサイトメガロウイルスのプロモーターやシミアンウイルス４０のポリアデニル化シグナルによって組み込まれる。これらのプラスミドは、細菌における複製開始点およびカナマイシンに対する耐性に関する選別マーカーも含有する。
【００２４】
本製剤の蛋白質成分は、９０％以上の純度で粒子を形成することのできる可溶性ウイルス抗原であることができる。望ましい態様として、ＨＣＶおよびＨＢＶのカプシド抗原がワクチン製剤の構成成分であり、これらと混合したＤＮＡにより発現する蛋白質に対して誘発される免疫反応を増強した。
【００２５】
本発明はまた、ＤＮＡと抗原とを混合する手順についても検討している。混合物は、ＤＮＡおよび抗原を構成成分に添加し、適切な緩衝液中に溶解することによって調製する。望ましい態様として、両成分を１０／１（ｗ／ｗ）の割合でリン酸緩衝液中に混合することにより製剤を調製する。この混合物を２６℃から３０℃の間で振盪しながら最低２時間インキュベートした後、個体に投与する。この製剤は、筋肉内、皮下、腹腔内、粘膜内、静脈内、舌下、あるいはその他の経路で投与可能である。免疫は、注射器、遺伝子銃、スプレーあるいはその他の送達器具によって行うことができる。各成分０．００１〜１０  ｍｇの範囲の用量を動物種に基づいて算出した容積で各個体に投与し、免疫法を実行する。
【００２６】
構成成分として蛋白質抗原と混合したＤＮＡを含有するワクチン製剤の場合、次のような理由から個々の構成成分のうち１種類だけを含む製剤よりも優れている：
【００２７】
−より幅広い範囲のエピトープに向けられた、体液性免疫および細胞性免疫のより強力かつより多様な反応を誘発することができる。
【００２８】
−抗原２が同時にアジュバントであるため、アジュバントの注射によって発生する毒性作用を消失させることができる。
【００２９】
−これらの製剤を混合ワクチンの中核として使用することができる。
【００３０】
−ワクチン製剤の製造過程で、抗原の吸着を必要としない。
【００３１】
ＨＣＶのＥ１蛋白質およびＨＣＶのカプシド蛋白質の領域を含む蛋白質変種を発現したＤＮＡを含有する製剤の場合、次のような理由から個々の構成成分のうち１種類だけを含む製剤よりも優れている：
【００３２】
−より幅広い範囲のエピトープに向けられた、体液性免疫および細胞性免疫のより強力かつより多様な反応を誘発することができる。
【００３３】
−抗原２が同時にアジュバントであるため、アジュバントの注射によって発生する毒性作用を消失させることができる。
【００３４】
−ＤＮＡプラスカプシドを混合ワクチンあるいは多価ワクチンの中核として使用することができる。
【００３５】
一方、ＨＣＶのＥ１蛋白質領域を含有する蛋白質変種を発現するＤＮＡによって免疫することで、本製剤中に存在するＨＢＶ蛋白質抗原の免疫性が増大した。特に、ＨＢｓＡｇまたはＨｂｃＡｇとの混合物は、次のような理由からこの抗原によって得られる結果よりも優れた結果を示す：
【００３６】
ａ）ＨＢｓＡｇに対して産生されるＩｇＧの量は、水酸化アルミニウムと共にＨＢｓＡｇを接種した場合よりも多い。
【００３７】
ｂ）強力な混合ワクチンＨＢＶ−ＨＣＶの構成要素となる。
【００３８】
ｃ）製剤の製造過程で抗原の吸着を必要としない。
【００３９】
（発明の例）
例１：ＨＣＶのポリプロテインであるカプシド−Ｅ１−Ｅ２を発現するＤＮＡとＨＣＶカプシドの蛋白質抗原とを構成成分として含有する製剤の免疫原性。
プラスミドｐＩＤＫＥ２（図１）と組み換え型ＨＣＶカプシド粒子（図２Ａ）との混合物を投与した後、ＨＣＶ構造抗原に対して誘発される免疫反応が増強されることを確認する目的で、１群当たり１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、８週齢）に筋肉内接種した。第０日における単回接種の影響について検討した１群を除き、第０日および第２１日に２回接種するスケジュールであった。初回免疫から１４週間後に、血液試料を採取した。免疫原はリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に溶解して投与した。第１群に対しては、ｐＩＤＫＥ２プラスミド  ５０μｇ（図１、このプラスミドはウイルスポリプロテインの最初の６５０個のアミノ酸をコードする配列を含む、Ｓｅｃ．Ｉｄ．Ｎｏ．３）を接種した。第２群に対しては、コア蛋白質５μｇ（ＨＣＶカプシド蛋白質の最初の１７３個のアミノ酸を含む）を接種した。第３群に対しては、最初にコア蛋白質５μｇを投与し、次にｐＩＤＫＥ２  ５０μｇを投与した（コア／ｐＩＤＫＥ２）。第４群に対しては、第３群と同様の条件で順序を逆にして投与した（ｐＩＤＫＥ２／コア）。第５群に対しては、第０日および第２１日にｐＩＤＫＥ２  ５０μｇおよびコア蛋白質５μｇの混合物を接種した（コア−ｐＩＤＫＥ２）。第６群に対しては、第５群と同様の内容を第０日にのみ接種した（コア−ｐＩＤＫＥ２（１））。また、陰性対照として７番目の群に対し、プラスミドｐＡＥＣ−Ｋ６（ＨＣＶ抗原をコードする配列を含まない）５０μｇで免疫した。
【００４０】
ＨＣＶ構造蛋白質に対する抗体反応を検出するために、抗体反応をＥＬＩＳＡによって測定した。結果の分析に際してはスチューデントのＴ検定を利用し、ｐ＜０．０５であった場合に統計学的に差があると判定した。
【００４１】
図３から、ｐＩＤＫＥ２とコア蛋白質の混合物を２回投与することにより、それぞれの構成成分に関してＨＣＶ構造抗原に対する免疫反応の増強が可能であることが示される。この製剤（２回投与）によって産生されたＨＣＶのＥ１およびＥ２エンベロープ蛋白質に対する抗体の力価は、他の群における力価よりも統計学的に高かった（図３Ａ）。また、これらの抗体力価は、単回投与したｐＩＤＫＥ２−コア混合物によって産生されたＨＣＶカプシド蛋白質に対する抗体の量よりも統計学的に高かった（図３Ａ）。免疫した群の中で、混合物を単回接種した群の抗体量は常に低かった。
【００４２】
ＨＣＶ構造抗原に対するリンパ球増殖反応の評価から（図３Ｂ）、ｐＩＤＫＥ２−コアによって２回免疫した動物群におけるカプシドに対する反応は、残りの群と比較して有意に優れていることが示された。結果は、免疫した動物から採取した脾臓細胞の刺激指数として表す。刺激指数は、（Ｈ3）チミジンの取り込みによって算出した。結論として、ｐＩＤＫＥ２およびコア蛋白質の混合物で免疫することにより、ＨＣＶ構造抗原に対して誘発される免疫反応が相乗的に促進される、ということができる。
【００４３】
例２：ＨＣＶのポリプロテインであるカプシド−Ｅ１−Ｅ２を発現するＤＮＡとＨＣＶカプシドの蛋白質抗原とを構成成分として含有する製剤の免疫原性。
ｐＩＤＫＥ２プラスミドと他の病原体の蛋白質抗原との混合物によって誘発される免疫反応の挙動について研究することを目的として、１群当たり１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、８週齢）に対し上述のプラスミドとＨＢＶカプシドの組み換え型粒子との混合物を筋肉内接種した（ＨＢｃＡｇ、図２Ｃ）。第０日および第２１日に２回接種するスケジュールであった。初回免疫から９および１４週間後に、血液試料を採取した。免疫原はリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で調製した。プラスミドは５０μｇの用量で、ＨＢＶカプシド蛋白質は５μｇの用量で投与した。第１群に対しては、プラスミドｐＡＥＣ−Ｋ６を接種した（陰性対照）。第２群に対しては、ＨＢｃＡｇ蛋白質を投与した。第３群に対しては、ｐＩＤＫＥ２を用いてワクチン接種した。第４群および第５群に対しては、ＨＢｃＡｇとプラスミドｐＩＤＫＥ２あるいはｐＡＥＣ−Ｋ６のいずれか一方との混合物を用いてワクチン接種した。結果の統計学的分析に際してはスチューデントのＴ検定を利用し、ｐ＜０．０５であった場合に有意な差があると判定した。
【００４４】
図４によると、初回免疫から１９週間後に、マウスにおいて抗体反応が誘発されたことが示される。図４Ａは、ｐＩＤＫＥ２プラスミドとＨＢｃＡｇとの混合物によって、他のワクチン接種動物よりも統計学的に高いＨＢｃＡｇに対する抗体力価が得られたことを示す。ＨＢｃＡｇ単独あるいはｐＡＥＣ−Ｋ６との混合物により免疫した群の間では、統計学的な差は認められなかった。このように、プラスミドｐＩＤＫＥ２はＨＢｃＡｇに対する免疫反応を促進する、と結論することができる。
【００４５】
一方、図４Ｂに示すように、ｐＩＤＫＥ２プラスミドとＨＢｃＡｇとの混合物は、ｐＩＤＫＥ２単独で免疫した動物よりも高い力価のＨＣＶ構造抗原に対する抗体を誘発する。したがって、ＨＢｃＡｇもまた、ｐＩＤＫＥ２の投与後に誘発されるＨＣＶ構造抗原に対する免疫反応を促進することができる。
【００４６】
例３：ＨＣＶおよびＨＢＶの変種を発現するプラスミドとＨＢＶ表面抗原の蛋白質変種とを構成成分として含有する製剤の免疫原性。
ｐＩＤＫＥ２プラスミドと共に投与した後に観察される、他の蛋白質抗原に対して産生される免疫反応の促進を確認すること、および同様のアジュバント特性を持つ他のプラスミドについて検討することを目的として、１群当たり１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、８週齢）に対しプラスミドとＨＢｓＡｇの組み換え型粒子との混合物を筋肉内接種した（図２Ｂ）。第０日、第２１日および第５０日に３回接種するスケジュールであった。初回免疫から１６週間後に、血液試料を採取した。水酸化アルミニウムで製剤を作成した群を除いて、すべての免疫原をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で調製した。第１群に対しては、ＨＣＶカプシド蛋白質の最初の１７６個のアミノ酸をコードする配列を含むプラスミドｐＩＤＫＣｏ（Ｄｕｅｎｅｓ−Ｃａｒｒｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０００；１９（７）：９９２−９９７）５０μｇと、ＨＢｓＡｇ  ５μｇとの混合物を接種した（ｐＩＤＫＣｏ−ＨＢｓＡｇ）。第２〜第７群に対しては、第１群と同一量のＤＮＡおよびＨＢｓＡｇ混合物を接種したが、使用したプラスミドは以下のとおりであった：第２群（ｐＩＤＫＥ１Ｓ−ＨＢｓＡｇ）、プラスミドｐＩＤＫＥ１Ｓ（図１、ＨＣＶポリプロテインの１７６番目から３６３番目のアミノ酸をコードする配列を含む、Ｓｅｃ．Ｉｄ．Ｎｏ．２）；第３群（ｐＡＥＣ−ＭＥ−ＨＢｓＡｇ）、プラスミドｐＡＥＣ−ＭＥ（図１、ＨＣＶ抗原の異なるエピトープを含む蛋白質をコードする配列を含む、Ｓｅｃ．Ｉｄ．Ｎｏ．４）；第４群（ｐＩＤＫＥ２−ＨＢｓＡｇ）、プラスミドｐＩＤＫＥ２（図１）ＨＣＶポリプロテインの１番目から６５０番目までのアミノ酸をコードする配列を含む、Ｓｅｃ．Ｉｄ．Ｎｏ．３；第５群（ｐＩＤＫＥ１Ｓｍ−ＨＢｓＡｇ）、プラスミドｐＩＤＫＥ１ＳｍはｐＩＤＫＥ１Ｓと同一であるが、ＨＣＶ  Ｅ１をコードする領域中に２個の挿入ヌクレオチドを含むところが異なっており、これによってオープン読み取り枠が変化しこの蛋白質の発現が妨害される（Ｓｅｃ．Ｉｄ．Ｎｏ．５）；第６群（ｐＡＥＣ−ｄ２−ＨＢｓＡｇ−ＨＢｓＡｇ）、プラスミドｐＡＥＣ−ｄ２−ＨＢｓＡｇはＨＢＶのＨＢｓＡｇをコードする配列を含む（Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２００１、２８２、４４２−４４６）；第７群（ｐＡＥＣ−Ｋ６−ＨＢｓＡｇ）、プラスミドｐＡＥＣ−Ｋ６（陰性対照、転写ユニットの制御下でのコード配列を含まない）。最後に、第８群および第９群に対しては、水酸化アルミニウム中で製剤化した、もしくは単独のＨＢｓＡｇ  ５μｇをそれぞれ接種した。結果の統計学的分析に際してはスチューデントのＴ検定を利用し、ｐ＜０．０５であった場合に有意な差があると判定した。
【００４７】
図５に示すのは、初回免疫から１６週間後に産生されたＨＢｓＡｇに対する抗体の力価である。ＰＢＳ中のＨＢｓＡｇ単独によって誘発された抗体の量は、ＨＢｓＡｇとｐＡＥＣ−Ｋ６との混合物の場合を除いて、評価した残りの変種よりも統計学的に低かった。これに対して、ＨＢｓＡｇとプラスミドｐＩＤＫＣｏ、ｐＩＤＫＥ１Ｓ、ｐＡＥＣ−ＭＥおよびｐＩＤＫＥ２との混合物によりＨＢｓＡｇに対して誘発された抗体力価は、水酸化アルミニウム中で製剤化したＨＢｓＡｇもしくはｐＡＥＣ−Ｋ６との混合物による免疫によって誘発された力価よりも統計学的に高かった。水酸化アルミニウム中で製剤化したＨＢｓＡｇもしくはｐＡＥＣ−Ｋ６、ｐＩＤＫＥ１ＳｍおよびｐＡＥＣ−ｄ２−ＨＢｓＡｇとの混合物による免疫では、ＨＢｓＡｇに対する抗体の力価が同程度であった。投与したプラスミドからの、ＨＣＶ  Ｅ１抗原のアミノ酸領域を含む蛋白質変種が宿主細胞中で発現することによって、ＤＮＡ構築物と混合した蛋白質抗原に対して起る免疫反応が増強される、と結論することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】プラスミドｐＡＥＣ−ＭＥ、ｐＩＤＫＥ１ＳおよびｐＩＤＫＥ２の構成模式図。
【図２】Ｃ型肝炎ウイルスのカプシド（Ａ）、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原（Ｂ）およびＢ型肝炎ウイルスのカプシド（Ｃ）の粒子の電子顕微鏡写真。
【図３】ｐＩＤＫＥ２プラスミドおよびコア蛋白質による免疫のスケジュール。ＤＮＡ  ５０μｇおよび蛋白質５μｇを筋肉内投与することにより動物を免疫した。
【図４】各種プラスミドおよび蛋白質ＨＢｃＡｇによる免疫スケジュール。ＤＮＡ  ５０μｇおよび蛋白質５μｇを筋肉内投与することにより動物を免疫した。
【図５】各種プラスミドおよび蛋白質ＨＢｓＡｇによる免疫スケジュール。ＤＮＡ  ５０μｇおよび蛋白質５μｇを筋肉内投与することにより動物を免疫した。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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