(57)【要約】本発明は、新規のヒトＡＢＣＡ１２遺伝子、および、新規の完全長および短鎖ＡＢＣＡ１２タンパク質をコードするｃＤＮＡに関する。また、本発明は、このような核酸を含むベクターおよび組換え宿主細胞、ヌクレオチドプローブならびにプライマー、そして、ＡＢＣＡ１２遺伝子、または、対応するＡＢＣＡ１２遺伝子の対立遺伝子形態により生産される、対応するタンパク質における多型および変異を検出する手段に関する。
2004527237.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜４のいずれか一つまたはその相補ヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項２】
配列番号１〜４のいずれか一つのヌクレオチド配列またはその相補ヌクレオチド配列の、少なくとも８個の連続したヌクレオチドを含む単離された核酸。
【請求項３】
配列番号１〜４のいずれか一つまたはその相補ヌクレオチド配列を含む核酸と少なくとも８０％のヌクレオチド同一性を有する単離された核酸。
【請求項４】
配列番号１〜４のいずれか一つまたはその相補ヌクレオチド配列を含む核酸と、８５％、９０％、９５％または９８％のヌクレオチド同一性を有する、請求項３に記載の単離された核酸。
【請求項５】
高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１〜４のいずれか一つまたはその相補ヌクレオチド配列を含む核酸とハイブリダイズする、単離された核酸。
【請求項６】
配列番号１〜４のいずれか一つで示されたヌクレオチド配列またはその相補ヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項７】
配列番号１〜４のいずれか一つのヌクレオチド配列またはその相補ヌクレオチド配列の、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む、ＡＢＣＡ１２遺伝子に特異的なヌクレオチドプローブまたはプライマー。
【請求項８】
配列番号７〜３８のいずれか一つのヌクレオチド配列またはその相補ヌクレオチド配列を含む、ＡＢＣＡ１２遺伝子に特異的なヌクレオチドプローブまたはプライマー。
【請求項９】
マーカー化合物を含む、請求項７または８に記載のヌクレオチドプローブまたはプライマー。
【請求項１０】
ａ）核酸と、２種のヌクレオチドプライマーとを接触させること、ここで、増幅反応に必要な試薬の存在下で、第一のヌクレオチドプライマーは核酸領域の５’位でハイブリダイズし、第二のヌクレオチドプライマーは核酸領域の３’位でハイブリダイズすること；および、
ｂ）増幅された核酸領域を検出すること、
を含む、請求項１に記載の核酸の領域を増幅する方法。
【請求項１１】
２種のヌクレオチドプライマーが、
ａ）配列番号１〜４のいずれか一つのヌクレオチド配列または相補ヌクレオチド配列の、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチドプライマー、
ｂ）配列番号７〜３８のいずれか一つのヌクレオチド配列またはその相補配列を含むヌクレオチドプライマー、
からなる群より選択される、請求項１０に記載の核酸領域を増幅する方法。
【請求項１２】
ａ）ハイブリダイゼーション位置がそれぞれ核酸領域の５’および３’に位置する２種のヌクレオチドプライマー；および、必要に応じて、
ｂ）増幅反応に必要な試薬、
を含む、請求項１に記載の核酸を増幅するためのキット。
【請求項１３】
２種のヌクレオチドプライマーが、
ａ）配列番号１〜４のいずれか一つのヌクレオチド配列または相補ヌクレオチド配列の、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチドプライマー、
ｂ）配列番号７〜３８のいずれか一つのヌクレオチド配列またはその相補配列を含むヌクレオチドプライマー、
からなる群より選択される、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
請求項１に記載の核酸の検出方法であって、
ａ）核酸と、ヌクレオチドプローブとを接触させること、ここで該ヌクレオチドプローブは、
１）配列番号１〜４のいずれか一つのヌクレオチド配列またはその相補ヌクレオチド配列の、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチドプローブ、
２）請求項７〜９のいずれか一項に記載のヌクレオチドプローブ、
３）配列番号７〜３８のいずれか一つのヌクレオチド配列またはその相補ヌクレオチド配列を含むヌクレオチドプローブ、
からなる群より選択され、および、
ｂ）核酸とプローブとの間で形成された複合体を検出すること、
を含む、請求項１に記載の核酸の検出方法。
【請求項１５】
プローブが支持体に固定されている、請求項１４に記載の検出方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の核酸を検出するキットであって、
ａ）１）配列番号１〜４のいずれか一つのヌクレオチド配列またはその相補ヌクレオチド配列の、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチドプローブ、
２）請求項７または９に記載のヌクレオチドプライマー、
３）配列番号７〜３８のいずれか一つのヌクレオチド配列またはその相補ヌクレオチド配列を含むヌクレオチドプローブ、
からなる群より選択されるヌクレオチドプローブ、および、必要に応じて、
ｂ）ハイブリダイゼーション反応に必要な試薬、
を含む、上記キット。
【請求項１７】
プローブが支持体に固定されている、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
請求項１に記載の核酸を含む組換えベクター。
【請求項１９】
ベクターがアデノウイルスである、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載の組換えベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１に記載の核酸を含む組換え宿主細胞。
【請求項２２】
配列番号５または６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項２３】
請求項２２に記載の核酸を含む組換えベクター。
【請求項２４】
請求項２２に記載の核酸を含む組換え宿主細胞。
【請求項２５】
請求項２３に記載の組換えベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項２６】
ａ）配列番号５または６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｂ）配列番号５または６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むポリペプチドのポリペプチド断片または変異体、および、
ｃ）配列番号５または６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むポリペプチドに相同なポリペプチド、
からなる群より選択される、単離されたポリペプチド。
【請求項２７】
請求項２６に記載の単離されたポリペプチドに対する抗体。
【請求項２８】
検出可能な化合物を含む、請求項２７に記載の抗体。
【請求項２９】
ａ）ポリペプチドと請求項２８に記載の抗体とを接触させること；および、
ｂ）ポリペプチドと抗体との間で形成された抗原／抗体複合体を検出すること、
を含む、ポリペプチドを検出する方法。
【請求項３０】
ａ）請求項２８に記載の抗体；および、
ｂ）ポリペプチドと抗体との間で形成された抗原／抗体複合体を検出できる試薬、
を含む、ポリペプチドを検出する診断キット。
【請求項３１】
請求項１に記載の核酸と、生理学的に適合可能な添加剤とを含む医薬組成物。
【請求項３２】
請求項２３に記載の組換えベクターと、生理学的に適合可能な添加剤とを含む医薬組成物。
【請求項３３】
親油性物質輸送における機能障害に罹った患者の予防および／または治療用薬剤を製造するための、請求項１８に記載の組換えベクターの使用。
【請求項３４】
親油性物質輸送における機能障害、または、染色体遺伝子座２ｑ３４に位置する病状（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、またはインスリン依存性糖尿病）に罹った患者の予防および／または治療を目的とした薬剤を製造するための、配列番号５または６のアミノ酸配列を含む単離されたＡＢＣＡ１２ポリペプチドの使用。
【請求項３５】
配列番号５または６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むポリペプチドと、生理学的に適合可能な添加剤とを含む医薬組成物。
【請求項３６】
親油性物質輸送における機能障害により起こる疾病、または、染色体遺伝子座２ｑ３４に位置する病状（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、またはインスリン依存性糖尿病）の予防または治療に関する活性成分をスクリーニングするための、配列番号５または６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むＡＢＣＡ１２ポリペプチドの使用。
【請求項３７】
親油性物質輸送における機能障害により起こる疾病の予防または治療に関する活性成分をスクリーニングするための、配列番号５または６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むＡＢＣＡ１２ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞の使用。
【請求項３８】
ａ）配列番号４または５を有するＡＢＣＡ１２ポリペプチドを含む膜小胞、および、検出可能なマーカーを含む脂質基質を調製すること；
ｂ）アゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物と共に、工程ａ）で得られた小胞をインキュベートすること；
ｃ）検出可能なマーカーを含む脂質基質の放出を、定性的および／または定量的に測定すること；および、
ｄ）工程ｂ）で測定された脂質基質の放出と、アゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物で前もってインキュベートしていない膜小胞で測定された、標識された脂質基質の放出とを比較すること、
を含む、脂質物質輸送において活性な化合物、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法。
【請求項３９】
ａ）少なくとも配列番号４または５を含むＡＢＣＡ１２ポリペプチドを発現する細胞と、検出可能なマーカーで標識されたアニオンとをインキュベートすること；
ｂ）工程ａ）に記載の細胞を洗浄し、それにより細胞に浸透しなかった過量の標識されたアニオンを除去すること；
ｃ）工程ｂ）で得られた細胞と、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物とをインキュベートすること；
ｄ）標識されたアニオンの細胞からの流出を測定すること；および、
ｅ）工程ｄ）で測定された標識されたアニオンの流出と、アゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物で前もってインキュベートしていない細胞で測定された標識されたアニオンの流出を比較すること、
を含む、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法。
【請求項４０】
請求項２４に記載の組換え宿主細胞を含むインプラント。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＡＢＣＡ１２で示される新規のＡＢＣＡ遺伝子、新規のＡＢＣＡ１２タンパク質をコードする核酸およびｃＤＮＡに関する。また、本発明は、ベクターおよび組換え宿主細胞、ヌクレオチドプローブおよびプライマー、同様に、特にＡＢＣＡ１２遺伝子、または、ＡＢＣＡ１２遺伝子の対立遺伝子形態により生産される対応するタンパク質における一般的多型、および変異を検出する手段に関する。
【０００２】
ＡＢＣ（ＡＴＰ結合カセット輸送体）遺伝子スーパーファミリーは、活性な輸送体タンパク質をコードしており、細菌からヒトに至るまで進化中に非常によく保存されたタンパク質ファミリーを構成する（Ａｍｅｓ ａｎｄ Ｌｅｃａｒ， ＦＡＳＥＢ Ｊ．， １９９２， ６， ２６６０−２６６６）。ＡＢＣタンパク質は、細胞外および細胞内の様々な物質（例えばイオン、金属アミノ酸、ペプチド、糖類、ビタミンまたはステロイドホルモン）の膜輸送に関与する。より正確には、哺乳動物で同定されたいくつかのＡＢＣ輸送体は、塩素チャンネル、多剤耐性、胆汁酸塩輸送体、グルタチオン抱合体輸送体、ＨＬＡクラスＩ抗原輸送体、スルホニル尿素受容体、オリゴＡ結合タンパク質、または脂質誘導体（コレステロール、ホスファチジルセリン、．．．）輸送体の機能を有する。ヒトで特徴付けられた４０種のなかでも１１種がヒトの病気に関連することが説明されており、例えば、特にＡＢＣＡ１、ＡＢＣＡ４（ＡＢＣＲ）およびＡＢＣＣ７（ＣＦＴＲ）であり、これらはそれぞれ、タンジール病（Ｂｏｄｚｉｏｃｈ Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．， １９９９， ２２（４）；３４７−３５１； Ｂｒｏｏｋｓ−Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，１９９９， ２２（４）， ３３６−３４５ ； Ｒｕｓｔ Ｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．， １９９９， ２２， ３５２−３５５； Ｒｅｍａｌｅｙ Ａ Ｔ ｅｔ ａｌ．）、シュタルガルト病（Ｌｅｗｉｓ Ｒ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．， １９９９， ６４， ４２２− ４３４）、および嚢胞性線維症（Ｒｉｏｒｄａｎ ＪＭ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８９， ２４５， １０６６−１０７３）に関連すると考えられている。これらの密接な関係は、ＡＢＣ遺伝子ファミリーの機能的役割の重要性を明らかにし、新しいファミリー遺伝子メンバーの発見は、ヒトの病気の生理病理学に対する新しい識見を提供するはずである。
【０００３】
プロトタイプのＡＢＣタンパク質は、ＡＴＰと結合し、ＡＴＰ加水分解からのエネルギーを用いて様々な分子を細胞膜を越えて輸送する。機能タンパク質は、２つのＡＴＰ結合ドメイン（ヌクレオチド結合フォールド、ＮＢＦ）と、２つの膜貫通（ＴＭ）ドメインとを含む。その遺伝子は、一般的に、各ドメインの２つを含む完全な輸送体、または、各ドメインの１つだけを有する半分の輸送体として構成されている。完全な輸送体の多くは、ＴＭ−ＮＢＦ−ＴＭ−ＮＢＦ様式のように配置されている（Ｄｅａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ， １９９５， ５， ７９−７８５）。
【０００４】
ＡＴＰ結合ドメインのアミノ酸配列アライメント分析により、ＡＢＣ遺伝子がサブファミリーに分類されている（Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ， １９９６， ５， １６４９−１６５５）。現在、近年のＨＵＧＯ分類に従って、ＡＢＣ（Ａ〜Ｇ）と呼ばれる７種のＡＢＣ遺伝子サブファミリー（ＡＢＣ１、ＣＦＴＲ／ＭＲＰ、ＭＤＲ、ＡＢＣ８、ＡＬＤ、ＧＣＮ２０、ＯＡＢＰ）がヒトゲノムにおいて説明されており、１種（ＯＡＢＰ）を除いて、全てが、複数のメンバーを含む。ほとんどの場合、これらのサブファミリーは、膜貫通ドメイン配列でも顕著な保存を示す遺伝子を含み、類似した遺伝子構成を有する。しかしながら、ＡＢＣタンパク質は非常に多様な基質を輸送し、異なるサブファミリーのいくつかのメンバーは、基質認識において、同じサブファミリーのタンパク質よりも、高い類似性を有することが示されている。また、５種のサブファミリーが酵母ゲノムで示されており、これは、これらのグループが、真核生物の進化において初期から保存されていることを示している（Ｄｅｃｏｔｔｉｇｎｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ， １９９７， １３７−４５； Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。
【０００５】
ヒトで同定された数種のＡＢＣ輸送タンパク質は、様々な病気に関連する。例えば、嚢胞性線維症はＡＢＣＣ７遺伝子またはＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通性伝達制御因子）遺伝子における変異により発症する（Ｒｉｏｒｄａｎ ＪＭ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８９， ２４５， １０６６−１０７３）。また、ＡＢＣ遺伝子サブファミリー「Ｃ」に属する他の遺伝子（ＡＢＣＣ６遺伝子）のコーディング配列における変異が、弾性線維性偽性黄色腫の表現型に関与するとして近年同定された（Ｌｅ Ｓａｕｘ ｅｔ ａｌ．， （２０００）， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ ２５（２）， ２２３−７； Ｂｅｒｇｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ， ２５（２）：２２８−３１）。弾性線維性偽性黄色腫は、結合組織の遺伝的障害であり、これは、皮膚、動脈および網膜における弾性線維の石灰化を特徴とし、それにより皮膚および眼の病変や、動脈の機能不全を発症させる。同様に、スルホニル尿素、ＡＢＣＣ８またはＳＵＲ１の受容体は、インスリン依存性のＩ型糖尿病（ＩＤＤＭ）に関与するようである。その上、腫瘍細胞におけるいくつかの多剤耐性表現型は、ＭＤＲ（多剤耐性）タンパク質をコードする遺伝子に関連しており、これはまた、ＡＢＣ輸送体構造も有する（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． １９９９ Ａｐｒ； １４（２）： １１５−３１）。他のＡＢＣ輸送体は、神経性の病状および腫瘍の病状に関与し（米国特許第５，８５８，７１９号）、または、金属の恒常性の欠陥により発症する病気に関与する可能性があり、例えばＡＢＣ−３タンパク質が挙げられる。同様に、ＰＦＩＣ２と示される他の輸送ＡＢＣは、進行性家族性肝内胆汁うっ滞の形態に関与するようであり、このタンパク質は、ヒトにおいて、胆汁酸塩の搬出に関与する可能性がある。
【０００６】
ＡＢＣサブファミリーのなかでも、ＡＢＣＡ遺伝子サブファミリーが、おそらく最も進化的に複雑である。ＡＢＣＡ遺伝子およびＯＡＢＰは、わずか２種の、酵母ゲノムにおける同定可能なオーソログを有さないＡＢＣ遺伝子のサブファミリーを示す。しかしながら、Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓにおいて少なくとも１つのＡＢＣＡ関連遺伝子が存在し（ｃｅｄ−７）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおいては数種が存在する。従って、ＡＢＣＡ遺伝子は、真核生物が多細胞性になり、より洗練された輸送の必要性が生じた後に、分岐したものと考えられる。これまで、ヒトＡＢＣＡサブファミリーの１１種のメンバーが説明されており、当該グループを最大にしている。
【０００７】
ＡＢＣＡサブファミリーの４つの遺伝子の全長配列が説明されており、複雑なエキソン−イントロン構造が明らかになった。最も特徴付けられたＡＢＣＡ遺伝子は、ＡＢＣＡ４およびＡＢＣＡ１である。哺乳動物において、ＡＢＣＡ１遺伝子は、マクロファージおよび単核細胞で高度に発現され、アポトーシス細胞の取り込みに関連する（Ｌｕｃｉａｎｉ ｅｔ ａｌ， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ （１９９４）２１， １５０−９； Ｍｏｙｎａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ （１９９８）２６， ６２９−３５； Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ （１９９８）９３， ９５１−６０）。Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓにおいて、ｃｅｄ−７遺伝子、ＡＢＣＡ１オーソログは、アポトーシス細胞の認識と取り込みとにおいて役割を有し、保存された機能を示す。近年、ＡＢＣＡ１は、タンジール病、末梢組織における高レベルのコレステロールを特徴とする病気および超低レベルのＨＤＬ、ならびに、家族性低αリポタンパク血症（ＦＨＤ）に関与する遺伝子であることが示された（Ｂｏｄｚｉｏｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ （１９９９）２２， ３４７−５１； Ｂｒｏｏｋｓ−Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ （１９９９）３３６−４５； Ｒｕｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ （１９９９）２２， ３５２−５； Ｍａｒｃｉｌ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ （１９９９）３５４， １３４１−４６）。ＡＢＣＡ１タンパク質は、ＨＤＬ組織のアポリポタンパク質１（アポＡ−１）との相互作用を介して、末梢組織からのコレステロール逆輸送において機能することが提唱されている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＪＢＣ （２０００））。ＡＢＣＡ２遺伝子は脳で高度に発現され、ＡＢＣＡ３は肺で高度に発現されるが、どの機能もそれらそれぞれの染色体遺伝子座に起因しない。ＡＢＣＡ４遺伝子は、もっぱら網膜の杆状光受容体で発現され、それらの変異は、ヒトの目の数種の病状、例えば網膜変性疾患レチノイドに関与する（Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９７）２７７， １８０５− １８０７； Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ （１９９７）１５， ２３６−２４６； Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ （１９９９）８２６９−８１； Ｗｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ （１９９９）９８， １３−２３； Ｃｒｅｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ （１９９８）７， ３５５−３６２； Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｍｉｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ （１９９７）４０， １４２−１４６）。ＡＢＣＡ４は、杆状光受容体外側の区域のディスクから、網膜および／または網膜リン脂質複合体を細胞質へ輸送し、それにより光エネルギー変換を容易にすると考えられている。
【０００８】
それゆえに、ＡＢＣＡサブファミリーからの新規の遺伝子を特徴づけることによって、膜脂質輸送に関するトランスロカーゼ活性を有し、ヒトの病状において主要な役割を行い得る生物学的に重要な輸送体が得られる可能性がある。
【０００９】
脂質は、水不溶性の有機生体分子であり、様々な生物学的機能、例えばエネルギーの貯蔵、輸送および代謝、ならびに、膜構造および流動性の主要な要素である。脂質は、ヒトおよび他の動物における２種の源から誘導される：いくつかの脂質は、食事脂肪や油として摂取され、他の脂質はヒトまたは動物により生合成される。哺乳動物において、体重の少なくとも１０％は脂質であり、その大部分はトリアシルグリセロールの形態である。
【００１０】
また、トリアシルグリセロールは、トリグリセリドおよびトリアシルグリセリドとして知られており、グリセロールにエステル化した３つの脂肪酸からなる。食事性のトリアシルグリセロールは、エネルギー源として脂肪組識中に貯蔵されるか、または、消化管でトリアシルグリセロールリパーゼにより加水分解され、最も重要なトリアシルグリセロールリパーゼは膵臓のリパーゼである。トリアシルグリセロールは、リポタンパク質の形態で組織間で輸送される。
【００１１】
リポタンパク質は、血漿で見出されたミセル様の集合体であり、割合が変化する、異なるタイプの脂質およびタンパク質（アポタンパク質と呼ばれる）を含む。血漿リポタンパク質には５個の主要なクラスがあり、その主要な機能は脂質輸送である。これらのクラスは、密度の増加の順に、カイロミクロン、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、および、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）である。多くのタイプの脂質がそれぞれリポタンパク質クラスと関連していることがわかっているが、それぞれのクラスは、主に１タイプの脂質を輸送し：トリアシルグリセロールは、カイロミクロン、ＶＬＤＬおよびＩＤＬで輸送され；その一方で、リン脂質およびコレステロールエステルは、それぞれＨＤＬおよびＬＤＬで輸送される。
【００１２】
リン脂質は、グリセロールホスフェートのジ脂肪酸エステルであり、また、ホスフェートに結合した極性基も含む。リン脂質は、重要な細胞膜の構造的要素である。リン脂質は、ホスホリパーゼという酵素により加水分解される。代表的なリン脂質であるホスファチジルコリンは、多くの真核細胞膜の主要な要素である。
コレステロールは、ステロイドホルモンおよび胆汁酸の代謝前駆体であり、同様に、細胞膜の主成分である。ヒトおよび他の動物において、コレステロールは食事で摂取され、また、肝臓や他の組織でも合成される。コレステロールは、ＬＤＬおよび他のリポタンパク質におけるコレステロールエステルの形態で、組織間で輸送される。
【００１３】
膜は、あらゆる生細胞を取り囲んでおり、細胞内および細胞外の仕切りの間のバリアとして働く。また、膜は、真核性の核を取り囲み、小胞体を構成し、例えば軸索を取り巻くミエリン鞘で特殊化した機能を発揮する。典型的な膜は、約４０％の脂質と、６０％のタンパク質とを含むが、これは顕著に変動する。主要な脂質成分は、リン脂質であり、特に、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミン、ならびに、コレステロールである。膜の物理化学的な特性、例えば流動性は、リン脂質の脂肪酸のプロファイルまたはコレステロール含量のいずれかを改変することによって変化しうる。また、組成や膜脂質の構成を調節をすることによっても、膜依存性の細胞の機能、例えば受容体活性、エンドサイトーシス、およびコレステロールの流れは調節される。
【００１４】
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、血漿中で循環するリポタンパク質の５種の主要なクラスのうちの一つである。これらリポタンパク質は、様々な代謝経路、例えば脂質輸送、胆汁酸の形成、ステロイド生成、細胞増殖に関与し、加えて、血漿  プロテイナーゼ系への干渉にも関与する。
【００１５】
ＨＤＬは、完全な遊離コレステロール受容体であり、酵素活性（例えばコレステロールエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、肝性リパーゼ（ＨＬ）およびレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の酵素活性）と協力して、コレステロール逆輸送（すなわち末梢細胞中で過剰のコレステロールを胆汁酸の形態で体から排出するために肝臓に輸送すること）において主要な役割を果たす。末梢組織から肝臓へのコレステロール輸送にＨＤＬが中心的な役割を果たすことが示されている。
【００１６】
例えばタンジール病、ＦＨＤ病、およびＬＣＡＴ欠損症などのＨＤＬ欠損症に関連する様々な病気が説明されており、加えて、ＨＤＬ−コレステロール欠損症がマラリアおよび糖尿病に罹った患者で観察されている（Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｊ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ．， ２２７：１５１−５； Ｄｊｏｕｍｅｓｓｉ、１９８９， Ｐａｔｈｏｌ Ｂｉｏｌ， ３７ ：９０９−１１； Ｍｏｈａｎｔｙ ｅｔ ａｌ．， １９９２． Ａｎｎ Ｔｒｏｐ ＭｅｄＰａｒａｓｉｔｏｌ， ８６ ：６０１−６； Ｍａｕｒｏｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， ６７ ：２２７−３９； Ｇｒｅｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｖｏｘ Ｓａｎｇ， ７２ ：２１１−２０； Ａｇｂｅｄａｎａ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ａｎｎ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．， ８４ ：５２９−３０； Ｃｕｉｓｉｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｍｅｄ Ｔｒｏｐ， ５０ ：９１−５； Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． ２６ ：２７９−８５； Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． ３１：１８１−８； Ｐｉｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ．， １９：１３８−４３； Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒａｐｅｒ， １９９６， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １４：７１７−２１；ＨａｇｅｒａｎｄＨａｊｄｕｋ， １９９７， Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８２３−６； Ｋｗｉｔｅｒｏｖｉｃｈ， １９９５， Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．， ７４８ ：３１３−３０； Ｓｙｖａｎｎｅ ｅｔ ａｌ． １９９５， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ９２：３６４−７０； ａｎｄ Ｓｙｖａｎｎｅ ｅｔ ａＬ， １９９５， Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．， ３６：５７３−８２）。タンジール病および／またはＦＨＤ病に関与する欠損症は、細胞コレステロールの移動における細胞欠陥に関連し、それによりＨＤＬの分解が起こり、リポタンパク質代謝の混乱を導く。
【００１７】
アテローム性動脈硬化症は、組織学的用語において、血管壁中、特に大血管（大動脈、冠状動脈、頚動脈）中での脂質や他の血液誘導体の堆積（脂質または線状脂質）プラークにより定義されている。これらのプラークは、アテローム性動脈硬化症の経過の進行の度合いに従って多かれ少なかれ石灰化され、このようなプラークは病変に結合する可能性があり、主にコレステロールエステルからなる脂肪性沈着物のの血管内への蓄積に関連する。これらプラークは、血管壁の肥厚、平滑筋の肥大、泡沫細胞（増加したマクロファージによるコレステロールの無制御な摂取により生じる脂質含有細胞）の出現、および、線維組織の蓄積を伴う。アテロームプラークは壁から著しく突出し、それにアテローム、血栓症または塞栓症による血管閉塞の原因となる狭窄性特徴が与えられ、これは、重症の患者において起こる。これらの病変は、深刻な心臓血管の病状、例えば心筋梗塞、突然死、心不全および卒中を起こす可能性がある。
【００１８】
リポタンパク質代謝で役割を有する遺伝子内の変異が同定されている。特定には、アポリポタンパク質のアポＡ−Ｉ遺伝子における数種の変異が特徴付けられている。これら変異はまれであり、アポＡ−Ｉ生産の欠如を起こすことがある。ＬＰＬまたはその活性化剤のアポＣ−ＩＩをコードする遺伝子における変異は、深刻な高トリグリセリド血症に関連しており、実質的にＨＤＬ−Ｃレベルを減少させる。また、酵素のＬＣＡＴをコードする遺伝子における変異も、深刻なＨＤＬ欠損症に関連する。
【００１９】
加えて、コレステロール逆輸送における機能障害は、細胞内小胞から膜表面への貯蔵コレステロール輸送（そこでＨＤＬにより受容される）における１またはそれ以上の工程に影響を与える生理学的な欠陥によって誘発される可能性がある。
【００２０】
糖尿病は、インスリンの欠如または欠乏、インスリン耐性、もしくはその両方により起こる炭水化物代謝障害として定義され、最終的には高血糖症になる。糖尿病は、一般的に、２つの主要なサブタイプ：Ｉ型またはインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、および、ＩＩ型またはインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）に分類される。この２つを区別するより正確な方法は、インスリン依存性糖尿病をケトアシドーシス傾向にあるものとして、および、インスリン非依存性糖尿病をケトアシドーシス耐性として分類することである。Ｉ型およびＩＩ型は免疫学的−病因学的な根拠で、Ｉ型は免疫が仲介する状態、それに対して、ＩＩ型は免疫が仲介しない状態を言及することで区別される（Ｆｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ． Ｉｎ： Ｂｒａｕｎｗａｌｄ Ｅ， Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ ＫＪ， Ｐｅｔｅｒｓｄｏｒｆ ＲＧ， ｅｔ ａｌ， ｅｄｓ． Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， １１ｔｈ ｅｄ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ； １９８８：１７７８−１７８１）。糖尿病は、死の危険や、アテローム性動脈硬化症の様々な合併症からの障害を著しく増加させる。実際には、約８０％の成人の糖尿病患者が、虚血性心疾患（ＣＨＤ）、脳血管障害、および／または末梢血管疾患により死亡している。上昇したＬＤＬコレステロール、減少したＨＤＬコレステロール、および、高トリグリセリド血症が、しばしば、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）やインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）で見出される。より高い血液トリグリセリドや、より低いＨＤＬコレステロールは、本質的に、随伴性の代謝障害を伴うインスリン耐性または不適切なインスリン作用により生じる異常な生理に関連する可能性がある、という明らかな証拠がある。Ｉ型糖尿病は、発症の感受性に関して存在しなければならない遺伝的要素を有し、このようなＩＤＤＭ感受性遺伝子は染色体２ｑ３４にマッピングされていると考えられている。
【００２１】
層状魚鱗癬は、角質化の遺伝性の常染色体劣性障害である。新生児の皮膚は厚いコロジオン様膜で覆われており、乳児は敗血症や激しい脱水症にさらされるため、層状魚鱗癬は生後間もなく生命を脅かす。また、層状魚鱗癬は、掌蹠角皮症、脱毛症および紅斑を様々に併発する。タイプ１の層状魚鱗癬は、染色体１４ｑ１１に対してマッピングされており、近年、トランスグルタミナーゼ１（ＴＧＭ１）遺伝子における有害な変異により生じることが示された（Ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ （１９９５）４： １３９１−１３９５； Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９５）２６７： ５２５−５３８； Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ （１９９５）９： ２７９−２８３； Ｌａｉｈｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ （１９９７）６１： ５２９−５３８； Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ （１９９７）２７２： ２１０１８−２１０２６； Ｐｅｔｉｔ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ （１９９７）５： ２１８−２２８）。この遺伝子は、角質化した外皮、その最終分化の後期に形成されるケラチノサイトの細胞質膜下のタンパク質構造のっ構築を指示している。タイプ２の層状魚鱗癬と示される他の形態が、染色体２ｑ３３〜ｑ３５にマッピングされているが（ＩＣＲ２Ｂ遺伝子座；Ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ Ｍｏｌｅｃ Ｇｅｎｅｔ （１９９６）５： ５５５−５５９）、原因となる遺伝子は未だ知られていない。この領域は、Ｄ２Ｓ１４３およびＤ２Ｓ１３７マーカーで挟まれたほぼ２Ｍｂの領域に絞られている（Ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ， ＥｕｒＪＨｕｍ Ｇｅｎｅｔ （１９９９）７： ７７−８７）。
【００２２】
白内障は、ヒトが失明する主要な原因の一つである。多形先天性白内障を有する家族で行われた遺伝子連鎖分析によれば、染色体２ｑ３３〜３５に関する連鎖、より正確にはＤ２Ｓ７２とＴＮＰ１との付近での連鎖が証明された（Ｒｏｇａｅｖ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ （１９９６）５： ６９９−７０３）。遺伝性の先天性ヒト白内障の多くの形態が、単独の異常（ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ）として説明されている。白内障において広範な変動性を生じさせるレンズの不透明度は、異なるメカニズムにより生じる可能性がある。従って、クリスタリン遺伝子、または、クリスタリンタンパク質を改変する酵素をコードする遺伝子が候補となる。クリスタリン遺伝子および偽遺伝子が、ゲノムの様々な領域、なかでも、ガンマクリスタリンに関する２ｑ３３〜ｑ３６領域にマッピングされた（Ｓｈｉｌｏｈ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ （１９８６）７３： １７−１９）。
【００２３】
本出願人は、ＡＢＣ輸送体スーパーファミリー、より正確にはＡＢＣＡタンパク質サブファミリーに属する新規の遺伝子を発見し、特徴づけ、さらに、それをＡＢＣＡ１２と指定した。ＡＢＣＡ１２遺伝子が、２つの異なるポリアデニル化部位、および、２つのスプライシング形態を有することから、異なる転写アイソフォームが同定された。従って、４つの異なるｍＲＮＡ  ＡＢＣＡ１２がヒトで発現されることが見出された。オルタナティブスプライシングの結果として生じる２つのメッセンジャーは、異なる長さの２種の推定ＡＢＣＡ１２タンパク質、完全長ＡＢＣＡ１２タンパク質、同様に、より短いアイソフォームをコードする。完全長ＡＢＣＡ１２タンパク質の双方において、特に膜貫通領域（ＴＭ）ならびにＡＴＰ結合領域１および２（ＮＢＤ１およびＮＢＤ２）に、顕著なアミノ酸配列の保存が示され、類似した遺伝子構成を有する。
【００２４】
さらに、本出願人らは、ヒト第二染色体の２ｑ３４遺伝子座に位置する領域において、新規のＡＢＣＡ１２遺伝子をマッピングし、当該遺伝子は、統計的に、魚鱗癬（Ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒｏｐ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ （１９９９）７：７７−８７； Ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ （１９９６）５（４）５５５−９）、多形先天性白内障、およびインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ１３）（Ｍｏｒａｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９６）２７２ （５２６９）１８１１−１８１３）などの病状と関連している。この結果は、ＡＢＣＡ１２が、これら３つの障害（新規のＡＢＣＡ１２遺伝子がこれら病状の表現型の原因遺伝子の一つであり得る）に対する位置的な候補である、という仮説を指示している。
【００２５】
その上、組織分布の電子的分析が行われ、ＡＢＣＡ１２転写物の配列は、皮膚／上皮細胞のｃＤＮＡライブラリー配列解析により生み出される様々なＥＳＴと適合することが示され、これは、皮膚／上皮で優先的に組織発現されていることを示す。これは、実際に、ゲノムマッピングや組織分布データに基いた位置的、領域的な候補であることから、例えば魚鱗癬において、ＡＢＣＡ１２が関与しているという仮説を強化している。
【００２６】
【発明の要約】
本発明は、糖類、金属、アミノ酸、またはビタミンを含む様々な基質の輸送に関与する可能性がある、ヒトＡＢＣＡ１２遺伝子に対応する核酸、ｃＤＮＡｓおよびタンパク質アイソフォームに関する。より正確には、それらは、哺乳動物において、塩素チャンネル、多剤耐性、胆汁酸塩輸送体、グルタチオン抱合体輸送体、ＨＬＡクラスＩ抗原輸送体、スルホニル尿素受容体、または脂質誘導体（特にコレステロール、ホスファチジルセリン（ｐｈｏｓｐｈａｄｉｔｙｌｓｅｒｉｎｅ）のような物質）の輸送体として機能し、または、候補の染色体領域が第二染色体上、より正確には２ｑアーム上、さらにより正確には２ｑ３４遺伝子座に位置するいずれかの病状において機能する。
従って、本発明の第一の主題は、配列番号１〜４のいずれか一つのヌクレオチド配列、または、その相補ヌクレオチド配列を含む核酸である。
【００２７】
また、本発明は、配列番号１〜４のいずれか一つのヌクレオチド配列またはその相補ヌクレオチド配列の、少なくとも８個の連続したヌクレオチドを含む核酸に関する。
また、本発明は、配列番号１〜４のいずれか一つのヌクレオチド配列またはその相補ヌクレオチド配列を含む核酸と、少なくとも８０％のヌクレオチド同一性を有する核酸に関する。
【００２８】
また、本発明は、配列番号１〜４のいずれか一つのヌクレオチド配列またはその相補ヌクレオチド配列を含む核酸と、少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、および、さらにより好ましくは９８％のヌクレオチド同一性を有する核酸に関する。
また、本発明は、高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１〜４のいずれか一つのヌクレオチド配列またはその相補ヌクレオチド配列とハイブリダイズする核酸に関する。
【００２９】
また、本発明は、完全長ヒトＡＢＣＡ１２タンパク質アイソフォームをコードする核酸、特にｃＤＮＡ分子に関する。従って、本発明は、配列番号１〜４のいずれか一つのヌクレオチド配列または相補ヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
また、本発明は、配列番号１〜４で示されたヌクレオチド配列または相補ヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
【００３０】
本発明によれば、配列番号１または３のヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号５のアミノ酸配列を含む２５９５個のアミノ酸の完全長ＡＢＣＡ１２ポリペプチドをコードする。
本発明によれば、配列番号２または４のヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号６のアミノ酸配列を含む２５１６個のアミノ酸の完全長ＡＢＣＡ１２ポリペプチドをコードする。
【００３１】
従って、また、本発明は、配列番号５または６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸に関する。
従って、また、本発明は、配列番号５または６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。
また、本発明は、配列番号５または６のいずれか一つで示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。
【００３２】
さらに本発明は、ＡＢＣＡ１２遺伝子、または、この遺伝子の対立遺伝子形態により生産された対応するタンパク質において、一般的な多型、特に変異を検出するための手段に関する。
他の観点によれば、本発明はまた、少なくとも１つの二対立遺伝子多型（例えば１またはそれ以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失）を含むＡＢＣＡ１２遺伝子のヌクレオチド配列に関する。
ヌクレオチドプローブおよびプライマーは、ＡＢＣＡ１２核酸（ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、ｃＤＮＡ）の領域に存在する核酸配列、特に、変異または多型のいずれか一つを含む核酸配列と、ハイブリダイズする。
【００３３】
本発明に係るヌクレオチドプローブまたはプライマーは、配列番号１〜４のいずれか一つまたはその相補ヌクレオチド配列を含む核酸の、少なくとも８個の連続したヌクレオチドを含む。
好ましくは、本発明に係るヌクレオチドプローブまたはプライマーは、本発明に係る核酸の、特に、配列番号１〜４のいずれか一つまたはその相補ヌクレオチド配列を含む核酸の、１０、１２、１５、１８または２０〜２５、３５、４０、５０、７０、８０、１００、２００、５００、１０００、１５００個の連続したヌクレオチドの長さを有する。
【００３４】
あるいは、本発明に係るヌクレオチドプローブまたはプライマーは、本発明に係る核酸の、より特定には、配列番号１〜４のいずれか一つまたはその相補ヌクレオチド配列を含む核酸の、１２、１５、１８、２０、２５、３５、４０、５０、１００、２００、５００、１０００、１５００個の連続したヌクレオチドの長さを有する断片からなる、および／または含む。
それゆえに、本発明に係るヌクレオチドプローブまたはプライマーの定義は、上記で定義した高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１〜４のいずれか一つまたはその相補ヌクレオチド配列を含む核酸とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含める。
【００３５】
好ましい本発明に係るプローブおよびプライマーは、配列番号７〜３８のいずれか一つを含むヌクレオチド配列またはその相補ヌクレオチド配列の全部または一部を含む。
本発明に係るヌクレオチドプライマーは、本発明に係る核酸、より特定には配列番号１〜４のいずれか一つのヌクレオチド配列またはその相補ヌクレオチド配列を含む核酸のいずれか一つを増幅するのに用いることができる。
【００３６】
本発明によれば、ＡＢＣＡ１２遺伝子に特異的なヌクレオチドプライマーのいくつかは、配列番号１〜４を含む核酸を増幅するのに用いることができ、当該ヌクレオチドプライマーは、配列番号７〜３８のいずれか一つのヌクレオチド配列またはその相補ヌクレオチド配列を含む。
【００３７】
本発明の他の主題は、サンプル中に含まれた、本発明に係る核酸、より特定には、
ａ）配列番号１〜４のいずれか一つ、その相補ヌクレオチド配列を含む核酸、または、
ｂ）配列番号１〜４のいずれか一つで示された、もしくはその相補ヌクレオチド配列を含む核酸、
を増幅する方法に関し、前記方法は、工程：
ａ）増幅反応に必要な試薬の存在下で、標的核酸の存在が疑われるサンプルと、１対のヌクレオチドプライマーとを接触させること、ここで該１対のヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーション位置が、それぞれ増幅が求められる標的核酸の領域の５’側と３’側とに位置する；および、
ｂ）増幅された核酸を検出すること、
を含む。
【００３８】
また、本発明は、サンプル中で、配列番号１〜４のいずれか一つのヌクレオチド配列を含む核酸、または、相補ヌクレオチド配列、または、配列番号１〜４のいずれか一つもしくは相補ヌクレオチド配列の核酸断片または変異体の存在を検出する方法に関し、前記方法は、以下の工程を含む：
１）１またはそれ以上の本発明に係るヌクレオチドプローブと、試験しようとするサンプルとを接触させること；
２）プローブとサンプル中に存在する核酸との間で形成され得る複合体を検出すること。
【００３９】
本発明に係る検出方法の特定の実施形態によれば、オリゴヌクレオチドプローブが、支持体に固定される。
他の観点によれば、オリゴヌクレオチドプローブが、検出可能なマーカーを含む。
【００４０】
本発明の他の主題は、
ａ）配列番号１〜４のいずれか一つもしくはその相補ヌクレオチド配列、または
ｂ）配列番号１〜４のいずれか一つで示された、もしくはその相補ヌクレオチド配列を含む核酸の全部または一部を増幅するためのボックスまたはキットであり、前記ボックスまたはキットは、以下を含む：
１）本発明に係る１対のヌクレオチドプライマー、ここで該１対のヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーション位置は、それぞれ増幅が求められる標的核酸の５’側および３’側に位置する；および、必要に応じて、
２）増幅反応に必要な試薬。
このような増幅ボックスまたはキットは、好ましくは、少なくとも１つの、上述した１対のヌクレオチドプライマーを含む。
【００４１】
また、本発明は、サンプル中で、本発明に係る核酸の存在を検出するためのボックスまたはキットに関し、前記ボックスまたはキットは、以下を含む：
ａ）１またはそれ以上の本発明に係るヌクレオチドプローブ；
ｂ）ハイブリダイゼーション反応に必要な適切な試薬。
【００４２】
第一の観点によれば、当該検出ボックスまたはキットは、ヌクレオチドプローブおよびプライマーが、支持体に固定されていることを特徴とする。
第二の観点によれば、当該検出ボックスまたはキットは、ヌクレオチドプローブおよびプライマーが検出可能なマーカーを含むことを特徴とする。
【００４３】
上述の検出キットの特定の実施形態によれば、このようなキットは、本発明に係る複数のオリゴヌクレオチドプローブおよび／またはプライマーを含み、これらは、所定の標的核酸を検出するのに用いることができ、またあるいは、本発明に係る核酸のコーディング領域または非コーディング領域における変異を検出する野に用いることができる。本発明の好ましい実施形態によれば、標的核酸は、配列番号１〜４のいずれか一つまたは相補核酸配列のヌクレオチド配列を含む。あるいは、当該標的核酸は、核酸断片または変異体である。
他の好ましい実施形態によれば、本発明に係るプライマーは、一般的に、配列番号１〜４のいずれか一つまたは相補配列の全部または一部を含む。
【００４４】
また、本発明は、本発明に係る核酸を含む組換えベクターに関する。好ましくは、このような組換えベクターは、
ａ）配列番号１〜４のいずれか一つのヌクレオチド配列またはその相補ヌクレオチド配列を含む核酸、
ｂ）配列番号１〜４のいずれか一つで示されたヌクレオチド配列またはその相補ヌクレオチド配列を含む核酸、
ｃ）配列番号１〜４のいずれか一つのヌクレオチド配列またはその相補ヌクレオチド配列を含む核酸の、少なくとも８個の連続したヌクレオチドを含む核酸を有する核酸；
ｄ）配列番号１〜４のいずれか一つのヌクレオチド配列またはその相補ヌクレオチド配列とを含む核酸と、少なくとも８０％のヌクレオチド同一性を有する核酸；
ｅ）配列番号１〜４のいずれか一つのヌクレオチド配列またはその相補ヌクレオチド配列とを含む核酸と、８５％、９０％、９５％または９８％のヌクレオチド同一性を有する核酸；
ｆ）高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１〜４のいずれか一つのヌクレオチド配列または相補ヌクレオチド配列を含む核酸とハイブリダイズする核酸；および、
ｇ）配列番号５〜６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸、
からなる群より選択される核酸、
を含む。
【００４５】
第一の実施形態によれば、本発明に係る組換えベクターは、そこに挿入された核酸を増幅するのに用いられ、続いて、望ましい細胞宿主に形質転換またはトランスフェクションさせる。
第二の実施形態によれば、本発明に係る組換えベクターは、本発明に係る核酸に加えて、核酸およびそれをコードするｍＲＮＡの転写および／または翻訳を指示する、または、それらを制御する調節シグナルまたはヌクレオチド配列を含む発現ベクターに相当する。
【００４６】
好ましい実施形態によれば、本発明に係る組換えベクターは、特に、以下の要素を含む：
（１）挿入しようとする核酸の発現を調節するための要素またはシグナル（例えばプロモーターおよび／またはエンハンサー配列）；
（２）このようなベクターに挿入しようとする本発明に係る核酸内に含まれるヌクレオチドコーディング領域、前記コーディング領域は、（１）に記載の調節要素またはシグナルを伴う相に置かれる；および、
（３）（２）に記載の核酸のヌクレオチドコーディング領域の転写の開始および終結に適切な核酸。
【００４７】
また、本発明は、親油性物質の輸送に関与する、または、候補の染色体領域が第二染色体上、より正確には２ｑアーム上、さらにより正確には２ｑ３４遺伝子座に位置する全ての病状に関与する短鎖または完全長ＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つをコードするｃＤＮＡ核酸を含む欠損組換えウイルスに関する。
他の本発明の好ましい実施形態において、当該欠損組換えウイルスは、親油性物質の輸送に関与するＡＢＣＡ１２ポリペプチドアイソフォームのいずれか一つをコードするｇＤＮＡ核酸を含む。好ましくは、当該ＡＢＣＡ１２ポリペプチドアイソフォームは、それぞれ配列番号５〜６から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４８】
他の好ましい実施形態において、本発明は、ＲＳＶ−ＬＴＲまたはＣＭＶ初期プロモーターから選択されるプロモーターの制御下で、完全長または短鎖  ＡＢＣＡ１２ポリペプチドをコードする核酸を含む、欠損組換えウイルスに関する。
【００４９】
特定の実施形態によれば、本発明に係る核酸を、宿主細胞、特にインビボで哺乳動物から得られた宿主細胞に導入する方法は、適切な調節配列の制御下に置かれた医薬上適合可能なベクターおよび本発明に係る「裸の（ｎａｋｅｄ）」核酸を、選択された組織（例えば平滑筋組織）のレベルに局所注射することによって導入する工程を含み、当該「裸の」核酸は、この組織の細胞に吸収される。
【００５０】
本発明の特定の実施形態によれば、組成物が、ＡＢＣＡ１２タンパク質アイソフォームのいずれか一つのインビボ生産のために提供される。この組成物は、溶液中、生理学的に許容できるビヒクルおよび／または添加剤中、適切な調節配列の制御下に置かれたＡＢＣＡ１２ポリペプチドをコードする核酸を含む。
【００５１】
それゆえに、本発明はまた、配列番号５または６から選択されるアミノ酸配列を含む短鎖または完全長ＡＢＣＡ１２ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物に関し、ここで該核酸は、適切な調節要素の制御下に置かれる。
従って、本発明はまた、層状魚鱗癬に罹った患者または被験者の予防または治療を意図した医薬組成物に関し、当該医薬組成物は、１またはそれ以上の生理学的に適合可能な添加剤と組み合わせて、短鎖または完全長ＡＢＣＡ１２タンパク質のいずれか一つをコードする核酸を含む。
【００５２】
さらに本発明は、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ１３）に罹った患者または被験者の予防または治療を意図した医薬組成物に関し、当該医薬組成物は、１またはそれ以上の生理学的に適合可能な添加剤と組み合わせて、短鎖または完全長ＡＢＣＡ１２タンパク質をコードする核酸を含む。
さらに本発明は、多形先天性白内障に罹った患者または被験者の予防または治療を意図した医薬組成物に関し、当該医薬組成物は、１またはそれ以上の生理学的に適合可能な添加剤と組み合わせて、短鎖または完全長ＡＢＣＡ１２タンパク質をコードする核酸を含む。
【００５３】
好ましくは、このような組成物は、配列番号１〜４のいずれか一つのヌクレオチド配列を含む核酸を含み、ここで該核酸は、適切な調節要素またはシグナルの制御下に置かれる。
加えて、本発明は、染色体遺伝子座２ｑ３４に位置する病状（例えばＩＤＤＭ、層状魚鱗癬、多形先天性白内障）に罹った患者または被験者の予防または治療を意図した医薬組成物に向けられており、当該医薬組成物は、１またはそれ以上の生理学的に適合可能な添加剤と組み合わせて、本発明に係る組換えベクターを含む。
【００５４】
また、本発明は、親油性物質の輸送の機能障害に罹った被験者の予防または治療を目的とした薬剤を製造するための、短鎖または完全長ＡＢＣＡ１２タンパク質をコードする本発明に係る核酸の使用に関する。
また、本発明は、親油性物質の輸送の機能障害、または、染色体遺伝子座２ｑ３４に位置する病状（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、またはインスリン依存性糖尿病）に罹った被験者の予防または治療を目的とした薬剤を製造するための、ＡＢＣＡ１２タンパク質アイソフォームのいずれか一つをコードする核酸を含む本発明に係る組換えベクターの使用に関する。
【００５５】
従って、本発明の主題はまた、親油性物質の輸送、または、染色体遺伝子座２ｑ３４に位置する病状（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、またはインスリン依存性糖尿病）に関与するＡＢＣＡ１２タンパク質またはポリペプチドアイソフォームのいずれか一つをコードする本発明に係る核酸を含む組換えベクターである。
【００５６】
また、本発明は、親油性物質の欠損症、または、染色体遺伝子座２ｑ３４に位置する病状（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、またはインスリン依存性糖尿病）に関連する病気または状態の治療および／または予防を意図した医薬組成物を調製するための、このような組換えベクターの使用に関する。
また、本発明は、このような本発明に係る組換えベクターでエクスビボにおいて遺伝的に改変された細胞、または、組換えベクターを生産する細胞の使用に関し、該細胞は、体内に移植され、生物学的に活性なＡＢＣＡ１２ポリペプチドアイソフォームのいずれか一つをインビボで持続的および効果的に発現させる。
【００５７】
また、本発明は、親油性物質輸送の機能障害、または、染色体遺伝子座２ｑ３４に位置する病状（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、またはインスリン依存性糖尿病）に罹った被験者の予防および／または治療を目的とした薬剤を製造するための、ＡＢＣＡ１２タンパク質アイソフォームのいずれか一つをコードする本発明に係る核酸の使用に関する。
【００５８】
また、本発明は、親油性物質輸送の機能障害、または、染色体遺伝子座２ｑ３４に位置する病状（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、またはインスリン依存性糖尿病）に罹った被験者の予防および／または治療を目的とした薬剤を製造するための、本発明に係るＡＢＣＡ１２ポリペプチドアイソフォームのいずれか一つをコードする核酸を含む本発明に係る組換えベクターの使用に関する。
【００５９】
また、本発明は、親油性輸送の機能障害、または、染色体遺伝子座２ｑ３４に位置する病状（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、またはインスリン依存性糖尿病）に罹った被験者の予防および／または治療を目的とした薬剤を製造するための、本発明に係るＡＢＣＡ１２ポリペプチドアイソフォームのいずれか一つをコードする核酸を含む本発明に係る組換え宿主細胞の使用に関する。
【００６０】
また、本発明は、親油性物質輸送の機能障害に関連する病状、または、染色体遺伝子座２ｑ３４（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、またはインスリン依存性糖尿病）に位置する病状の治療および／または予防のための医薬組成物を調製するための、本発明に係る組換えベクター、好ましくは欠損組換えウイルスの使用に関する。
【００６１】
本発明は、親油性物質の輸送の欠損症に関連する心臓血管疾患、または、染色体遺伝子座２ｑ３４に位置する病状（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、またはインスリン依存性糖尿病）の治療および／または予防を意図した医薬組成物を調製するための、このような組換えベクターまたは欠損組換えウイルスの使用に関する。
【００６２】
従って、本発明はまた、１またはそれ以上の本発明に係る組換えベクターまたは欠損組換えウイルスを含む医薬組成物に関する。
また、本発明は、本発明に係るウイルスまたはこのようなウイルスを生産する細胞で、エクスビボで遺伝的に改変された細胞の使用に関し、当該細胞は、体内に移植され、生物学的に活性なＡＢＣＡ１２タンパク質のいずれか一つを持続的および効果的にインビボで発現させる。
【００６３】
本発明が示すところによれば、本発明に係るＡＢＣＡ１２ポリペプチドアイソフォームをコードする核酸をウイルスベクターに取り込ませることが可能であり、それにより、これらのベクターは、生物学的に活性な、成熟したポリペプチドを効果的に発現させることが可能である。より特定には、本発明が示すところによれば、ＡＢＣＡ１２タンパク質アイソフォームのいずれか一つのインビボ発現は、アデノウイルスの直接投与、または、生産細胞もしくはこのような核酸を取り込んだアデノウイルスもしくはレトロウイルスで遺伝的に改変された細胞の移植により得ることができる。
【００６４】
それに関して、本発明の他の主題は、１またはそれ以上の本発明に係る欠損組換えウイルスに感染した哺乳動物細胞のいずれかに関する。より特定には、本発明は、これらウイルスに感染したヒト細胞の集団のいずれかに関する。これらは、特に、血液由来の細胞（全能性幹細胞または前駆体）、線維芽細胞、筋原細胞、肝細胞、ケラチノサイト、平滑筋および内皮細胞、グリア細胞などであり得る。
【００６５】
本発明の他の主題は、１またはそれ以上の本発明に係る欠損組換えウイルス、または、組換えウイルスを生産する細胞に感染した哺乳動物細胞、および、細胞外基質を含むインプラントに関する。好ましくは、本発明に係るインプラントは、１０５〜１０１０細胞を含む。より好ましくは、当該インプラントは、１０６〜１０８細胞を含む。
【００６６】
より特定には、本発明のインプラントにおいて、該細胞外基質は、ゲル化化合物、および、必要に応じて、細胞を固定させる支持体を含む。
また、本発明は、本発明の核酸、より特定には、配列番号１〜４のいずれか一つまたはその相補ヌクレオチド配列を含む核酸を含む組換え宿主細胞に関する。
また、本発明は、本発明の核酸、より特定には、配列番号１〜４のいずれか一つで示されたヌクレオチド配列またはその相補ヌクレオチド配列を含む核酸を含む組換え宿主細胞に関する。
【００６７】
他の観点によれば、本発明はまた、本発明に係る組換えベクターを含む組換え宿主細胞に関する。それゆえに、本発明はまた、本発明の核酸のいずれか、より特定には、配列番号１〜４のヌクレオチド配列のいずれか一つまたはその相補ヌクレオチド配列を含む核酸を含む組換えベクターを含む組換え宿主細胞に関する。
【００６８】
特定には、本発明は、配列番号１〜４のいずれか一つまたはその相補ヌクレオチド配列を含む核酸を含む組換えベクターを含む組換え宿主細胞に関する。
また、本発明は、配列番号１〜４のいずれか一つで示されたヌクレオチド配列またはその相補ヌクレオチド配列を含む核酸を含む組換えベクターを含む組換え宿主細胞に関する。
また、本発明は、配列番号５または６のアミノ酸配列のいずれか一つを含むポリペプチドをコードする核酸を含む組換えベクターを含む組換え宿主細胞に関する。
【００６９】
また、本発明は、配列番号５または６のいずれか一つのアミノ酸配列またはそのペプチド断片もしくは変異体を含むポリペプチドを生産する方法に関し、前記方法は、以下の工程を含む：
ａ）適切なベクターに前記ポリペプチドをコードする核酸を挿入すること；
ｂ）工程ａ）に記載の組換えベクターで予め形質転換した宿主細胞を適切な培地で培養すること、または、工程ａ）に記載の組換えベクターで宿主細胞をトランスフェクトすること；
ｃ）調節された培養液を回収すること、または、例えば音波破砕または浸透圧性ショックで宿主細胞を溶解すること；
ｄ）前記培養液から、または工程ｃ）で得られた細胞溶解物から前記ポリペプチドを分離および精製すること；および、
ｅ）必要に応じて、生産された組換えポリペプチドを特徴付けること。
【００７０】
配列番号５または６から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに「相同な」と称されるポリペプチドも、本発明の一部を構成する。このような相同なポリペプチドは、同等のアミノ酸による１またはそれ以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む。
【００７１】
本発明に係るＡＢＣＡ１２ポリペプチドアイソフォームは、特に、１）配列番号５または６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むポリペプチド、２）配列番号５または６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むポリペプチドのポリペプチド断片または変異体、または、３）配列番号５または６から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに「相同な」と称されるポリペプチドである。
【００７２】
特定の実施形態において、本発明に係る抗体は、
１）配列番号５または６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むポリペプチド、
２）配列番号５または６から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのポリペプチド断片または変異体、または、
３）配列番号５または６から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに「相同な」と称されるポリペプチド対して向けられる。このような抗体は、Ｋｏｚｂｏｒ等（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ， （１９８３）４：７２）により説明されたトリオーマ技術またはハイブリドーマ技術を用いて生産される。
【００７３】
従って、本発明の主題は、加えて、本発明に係るポリペプチドのいずれか一つの存在をサンプル中で検出する方法であり、前記方法は、以下の工程を含む：
ａ）試験しようとするサンプルと、抗体とを接触させること、該抗体は、
１）配列番号５または６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むポリペプチド、
２）配列番号５または６から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのポリペプチド断片または変異体、
３）配列番号５または６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むポリペプチドに「相同な」と称されるポリペプチドに対して向けられ、および、
ｂ）形成された抗原／抗体複合体を検出すること。
【００７４】
また、本発明は、本発明に係るポリペプチドのいずれか一つの存在をサンプル中で診断または検出するためのボックスまたはキットに関し、前記ボックスは、以下を含む：
ａ）１）配列番号５または６のいずれか一つのアミノ酸配列を有するペプチド、２）配列番号５または６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むポリペプチドのポリペプチド断片または変異体、または、３）配列番号５または６のアミノ酸配列を含むポリペプチドに「相同な」ポリペプチド、に対して向けられた抗体、および、
ｂ）形成された抗原／抗体複合体を検出するための試薬。
【００７５】
また、本発明は、本発明に係る核酸を含む医薬組成物に関する。
また、本発明は、親油性物質の欠損症輸送、または、染色体遺伝子座２ｑ３４に位置する病状（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、またはインスリン依存性糖尿病）に関連する病気の予防または治療を意図した、本発明に係るＡＢＣＡ１２ポリペプチドアイソフォームのいずれか一つをコードする核酸を含む医薬組成物、および、ＡＢＣＡ１２本発明に係るポリペプチドのいずれか一つを含む医薬組成物を提供する。
【００７６】
また、本発明は、ＡＢＣＡ１２遺伝子の欠損症または親油性物質輸送に関連する病状を治療するための新規の治療方法に関し、当該治療方法は、本発明に係るＡＢＣＡ１２タンパク質アイソフォームのいずれか一つをコードする核酸をインビボで輸送および発現させることを含む。
従って、本発明は、ＡＢＣＡ１２遺伝子の欠損症もしくは親油性物質の輸送の異常に関連する病状、または、染色体遺伝子座２ｑ３４に位置する病状（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、またはインスリン依存性糖尿病）の、新規の治療および／または予防方法を提供する。特定には、本発明は、患者または被験者において改善された親油性物質輸送を再生または促進する方法を提供する。
【００７７】
従って、本発明はまた、親油性物質輸送の機能障害に罹った被験者の予防および／または治療を意図した医薬組成物に関し、当該医薬組成物は、１またはそれ以上の生理学的に適合可能なビヒクルおよび／または添加剤と組み合わせて、ＡＢＣＡ１２タンパク質アイソフォームのいずれか一つをコードする核酸を含む。
【００７８】
本発明の特定の実施形態によれば、組成物が、ＡＢＣＡ１２タンパク質のいずれか一つのインビボ生産のために提供される。この組成物は、溶液中、生理学的に適合可能なビヒクルおよび／または添加剤中、適切な調節配列の制御下に置かれたＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つをコードする核酸を含む。
【００７９】
それゆえに、本発明はまた、配列番号５または６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む組成物に関し、ここで該核酸は、適切な調節要素の制御下に置かれる。
好ましくは、このような組成物は、適切な調節要素の制御下に置かれた配列番号１〜４のいずれか一つのヌクレオチド配列を含む核酸を含む。
【００８０】
また、本発明は、親油性物質輸送の機能障害、または、染色体遺伝子座２ｑ３４に位置する病状（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、またはインスリン依存性糖尿病）に罹った被験者の予防または治療を意図した医薬組成物に関し、当該医薬組成物は、１またはそれ以上の生理学的に適合可能なビヒクルおよび／または添加剤と組み合わせて、本発明に係る組換えベクターを含む。
【００８１】
他の観点によれば、本発明の主題はまた、親油性物質の欠損症輸送により発症する病気、または、染色体遺伝子座２ｑ３４に位置する病状（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、またはインスリン依存性糖尿病）を処置する、予防方法または治療方法であり、このような方法は、本発明に係るＡＢＣＡ１２ポリペプチドアイソフォームの一つをコードする核酸を患者に投与することを含み、前記核酸は、１またはそれ以上の生理学的に適切なビヒクルおよび／または添加剤と組み合わされる。
【００８２】
本発明は、親油性物質の輸送の機能障害、または、染色体遺伝子座２ｑ３４に位置する病状（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、またはインスリン依存性糖尿病）に罹った患者または被験者を予防および／または治療するための、医薬組成物に関し、当該医薬組成物は、１またはそれ以上の生理学的に適切なビヒクルおよび／または添加剤と組み合わせて、配列番号５または６から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの治療上有効な量を含む。
【００８３】
特定の実施形態によれば、少なくとも本発明に係る核酸を、宿主細胞、特にインビボで哺乳動物から得られた宿主細胞導入する方法は、医薬上適合可能なベクター、および、適切な調節配列の制御下に置かれた本発明に係る「裸の」核酸を含む調製物を、選択された組織（例えば平滑筋組織）のレベルに局所注射により導入する工程を含み、当該「裸の」核酸は、この組織の細胞に吸収される。
【００８４】
さらに他の観点によれば、本発明の主題はまた、ＡＢＣＡ１２遺伝子および／または親油性物質輸送の欠損症により発症する病気、および／または、染色体遺伝子座２ｑ３４に位置する病気（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、またはインスリン依存性糖尿病）を処置する予防方法または治療方法であり、このような方法は、本発明に係るＡＢＣＡ１２ポリペプチドアイソフォームの一つの治療上有効な量を患者に投与することを含み、前記ポリペプチドは、１またはそれ以上の生理学的に適切なビヒクルおよび／または添加剤と組み合わされる。
【００８５】
また、本発明は、ＡＢＣＡ１２タンパク質アイソフォームのいずれか一つに作用する低分子物質および化合物をスクリーニングする方法を提供し、当該方法により、それらの機能障害を効果的に治療および予防するために改善された親油性物質輸送を再生または改善できるポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニスト、または、染色体遺伝子座２ｑ３４に位置する病状のいずれか（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、またはインスリン依存性糖尿病）を治療できるポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを同定することができる。これらの方法は、親油性物質の欠損症輸送による病気、または、染色体遺伝子座２ｑ３４に位置する病状のいずれか（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、またはインスリン依存性糖尿病）の処置で治療上使用することのできる低分子物質および化合物を同定するのに有用である。
【００８６】
それゆえに、本発明はまた、親油性物質の欠損症輸送により発症する病気、または、染色体遺伝子座２ｑ３４に位置する病気（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、またはインスリン依存性糖尿病）を予防および／または治療するための、活性成分をスクリーニングするための、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つ、または、ＡＢＣＡ１２本発明に係るポリペプチドのいずれか一つを発現する細胞の使用に関する。
【００８７】
また、本発明は、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つの化合物または低分子物質、アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法に関し、前記方法は、以下の工程を含む：
ａ）ＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つと、検出可能なマーカーを含む脂質基質とを含む膜小胞を調製すること；
ｂ）アゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物と共に、工程ａ）で得られた小胞をインキュベートすること；
ｃ）検出可能なマーカーを含む脂質基質をの放出を定性的および／または定量的に測定すること；および、
ｄ）工程ｂ）で得られた放出の測定と、アゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物で前もってインキュベートしていない小胞によって標識された脂質基質の放出の測定とを比較すること。
【００８８】
第一の特定の実施形態において、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドは、配列番号５または６をそれぞれ含む。
【００８９】
また、本発明は、化合物または低分子物質、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つのアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法に関し、前記方法は、以下の工程を含む：
ａ）細胞を得ること、該細胞は、例えば、自然に、またはトランスフェクトした後に、ＡＢＣＡ１２をコードする核酸のいずれか一つを有する細胞が、対応するＡＢＣＡ１２ポリペプチドを発現することができる細胞系であり；
ｂ）検出可能なマーカーで標識したアニオンの存在下で、工程ａ）に記載の細胞をインキュベートすること；
ｃ）これら細胞に浸透しなかった過量の標識したアニオンを除去するために、工程ｂ）に記載の細胞を洗浄すること；
ｄ）ＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つに関するアゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物と共に、工程ｃ）で得られた細胞をインキュベートすること；
ｅ）標識したアニオンの流出を測定すること；および、
ｆ）工程ｅ）で測定された標識したアニオンの流出値と、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つに関するアゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物の存在下で前もってインキュベートしていない細胞で測定された、標識したアニオンの流出値とを比較すること。
【００９０】
【発明の詳述】
全般的な定義
本発明は、本発明のＡＢＣＡ１２ポリペプチドをコードするヒト遺伝子の単離を目的としており、ＡＢＣＡ１２の完全長および短鎖アイソフォームまたは天然に存在する形態、ならびに、全ての動物、特に哺乳動物または鳥類、より特定にはヒト源から得られたそれらのあらゆる抗原性断片を包含する。
【００９１】
本発明において、従来の分子生物学、微生物学、および当業界技術における組換えＤＮＡ技術が用いられる。このような技術は、文献に完全に説明されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ． ２ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｇｌｏｖｅｒ， １９８５， ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｐｒａｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ， ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ＭＲＬ Ｐｒｅｓｓ， ＬＴＤ．， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｕ．Ｋ．， Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ， １９８５， Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ； Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ， １９８４， Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ； Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， １９８６， Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ； ａｎｄ Ｐｅｒｂａｌ， １９８４， Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ）。
【００９２】
本明細書で用いられるように、「遺伝子」という用語は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド構造物を意味し、例えばｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ核酸が挙げられる。
本発明の目的のための「単離された」という用語は、それ本来の環境（それが天然に存在する環境）から取り出された生体物質（核酸またはタンパク質）を示す。
【００９３】
例えば、植物または動物中に天然状態で存在するポリヌクレオチドは、単離されたとはいわない。植物または動物のゲノムに天然に挿入されている同ポリヌクレオチドが、隣接する核酸から分離された場合、「単離された」ものとする。
このようなポリヌクレオチドは、ベクターに含ませることができ、および／またはこのようなポリヌクレオチドは、組成物に含ませることもできるが、ベクターまたは組成物はその自然な環境を構成しないため、単離された状態のままである。
【００９４】
「精製された」という用語において、物質は、他の化合物の存在が排除された完全に純粋な形態で存在する必要はない。当該用語は、むしろ相対的な定義である。
ポリヌクレオチドは、少なくとも１桁、好ましくは２または３桁、さらに好ましくは４または５桁の規模で出発原料または天然物質を精製した後、「精製された」状態である。
本明細書の目的に関して、「ヌクレオチド配列」という表現は、ポリヌクレオチドまたは核酸のいずれかを示すために用いることができる。「ヌクレオチド配列」という表現は、遺伝物質そのものを含み、従って、その配列に関する情報に限定されない。
【００９５】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」という用語は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列、あるいは、２以上のヌクレオチドのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含み、一本鎖形態、または、二重の二本鎖形態のいずれでもよい。
「核酸」は、共有結合で結合したヌクレオチドというサブユニットからなる高分子化合物である。核酸としては、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）およびポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が挙げられ、そのいずれも、一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡとしては、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および半合成ＤＮＡが挙げられる。タンパク質をコードするヌクレオチドの配列は、センス配列またはコーディング配列という。
【００９６】
「ヌクレオチド」という用語は、天然のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）、および、改変ヌクレオチドの両方を示し、ここで改変ヌクレオチドとは、少なくとも１つの改変、例えば（１）プリン類似体、（２）ピリミジン類似体、または（３）類似の糖を含み、このような改変ヌクレオチドの例は、例えばＰＣＴ出願ＷＯ９５／０４０６４に記載される。
【００９７】
本発明の目的において、第一のポリヌクレオチドは、第二のポリヌクレオチドに「相補」的であるとみなされ、この場合、第一のヌクレオチドの各塩基は、方向が逆の第二のポリヌクレオチドの相補塩基と対になっている。相補塩基とは、ＡとＴ（もしくはＡとＵ）、またはＣとＧである。
「異種」ＤＮＡは、細胞または細胞の染色体部位に天然に存在しないＤＮＡを意味する。好ましくは、異種ＤＮＡとしては、細胞に対して外来性の遺伝子が挙げられる。
【００９８】
本明細書で用いられるように、「相同な（相同な）」という用語は、その全ての文法上の形態および綴りのバリエーションにおいて、「共通の進化の起源」を持つタンパク質間の関係を意味し、例えば、スーパーファミリー（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）からのタンパク質、および、異なる種からの相同タンパク質（例えば、ミオシン軽鎖など）が挙げられる（Ｒｅｅｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｃｅｌｌ ５０ ：６６７））。このようなタンパク質（およびそのコーディング遺伝子）は配列相同性を有し、これは、その高レベルの配列の類似性により反映されている。
【００９９】
従って、「配列の類似性」という用語は、その全ての文法上の形態において、核酸間またはタンパク質のアミノ酸配列間の同一性または一致の程度を意味し、ここで上記核酸またはタンパク質のアミノ酸配列は、共通の進化的起源を有してもよいし、または有していなくてもよい［上述のＲｅｅｃｋ等を参照］。
しかしながら、一般的な使用および本発明の用途において、「相同な」という用語は、例えば「高く」などの副詞で修飾されている場合、配列類似性を意味し、共通の進化の起源を意味しないことがある。
【０１００】
特定の実施形態において、定義された長さのＤＮＡ配列にわたり、少なくとも約５０％（好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９０または９５％）のヌクレオチドがマッチした場合は、２種のＤＮＡ配列は「実質的に相同な」または「実質的に類似した」である。実質的に相同な配列の同定は、配列データバンクで利用可能な、または、例えばその特定のシステム用に定義されたストリンジェントな条件下におけるサザンハイブリダイゼーション実験で利用可能な標準的なソフトウェアを用いて配列を比較することによってなすことができる。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は、当業界の技術範囲内でなされる（例えば、上述のＭａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．； Ｇｌｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ． １９８５． ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ， ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅａｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ＭＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｔｄ， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｕ．Ｋ．； Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ， １９８５． Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎを参照）。
【０１０１】
同様に、特定の実施形態において、アミノ酸の３０％超が同一、または、約６０％超が類似する（機能的に同一）場合は、２種のアミノ酸配列は「実質的に相同」または「実質的に類似」している。好ましくは、類似または相同配列は、例えばＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ７， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）パイルアッププログラムを用いたアライメントによって同定される。
【０１０２】
本発明の目的のために、２種のヌクレオチド間またはアミノ酸配列間の「パーセンテージ同一性」は、必要に応じて比較用ウィンドウを介して並べられた２種の配列を比較することによって決定することができる。
従って、比較用ウィンドウ中のヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２種の配列の最適なアライメントが得られるように、参照配列（これら付加またはこれら欠失を含まない）に対して付加または欠失（例えば「ギャップ」）を含ませてもよい。
【０１０３】
上記パーセンテージは、比較された２種の配列（核酸またはペプチド）で同一な核酸塩基または同一なアミノ酸残基が観察された位置の数を測定し、続いて、２種の塩基間またはアミノ酸残基間で同一性が存在する位置の数を、比較用ウィンドウにおける位置の総数で割り、続いて、パーセンテージ配列同一性を得るために結果に１００を掛けることによって計算される。
【０１０４】
比較に最適な配列アライメントは、ＷＩＳＣＯＮＳＩＮ ＧＥＮＥＴＩＣＳ ＳＯＦＴＷＡＲＥ ＰＡＣＫＡＧＥ， ＧＥＮＥＴＩＣＳ ＣＯＭＰＵＴＥＲ ＧＲＯＵＰ（ＧＣＧ）社（５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｏｃｔｏｒ ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩＳＣＯＮＳＩＮ）のパッケージに含まれる既知のアルゴリズムで補助されたコンピューターを用いて達成することができる。
例として、ＢＬＡＳＴソフトウェア（１９９６年３月のバージョンＢＬＡＳＴ１．４．９、１９９８年２月のＢＬＡＳＴ２．０．４、および、１９９８年９月のＢＬＡＳＴ２．０．６）の補助で、もっぱらデフォルトパラメータを用いてパーセンテージ配列同一性を作製することが可能である（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ， １９９０，． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５：４０３−４１０； Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ， １９９７， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２５：３３８９−３４０２）。Ｂｌａｓｔは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等のアルゴリズムを用いて、参照「リクエスト」配列に類似した／相同な配列を検索する。用いるリクエスト配列およびデータベースは、ペプチド型または核酸型が可能であり、どのような組み合わせも可能である。
【０１０５】
本明細書において、「〜に対応する」という用語は、正確な位置が、類似性または相同性が測定された分子と同一であろうと異なっていようとも、類似配列または相同配列を意味する場合に用いられる。核酸またはアミノ酸配列アライメントは、スペースを含んでいてもよい。従って、「〜に対応する」という用語は、配列の類似性を意味するものであって、アミノ酸残基またはヌクレオチド塩基のナンバリングを意味するものではない。
【０１０６】
本発明のＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つをコードする遺伝子は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれの場合も、いずれかの源、特にヒトｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーから単離することができる。遺伝子を得る方法は、上述した通り当業界周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ． ２ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照）。
【０１０７】
従って、どのような動物細胞でもＡＢＣＡ１２遺伝子のいずれか一つの分子クローニングのための核酸源として利用できる可能性がある。ＤＮＡは、当業界既知の標準的な方法でクローン化ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ「ライブラリー」）から得ることができ、好ましくはタンパク質および／または転写物が高レベルで発現される組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから、化学合成、ｃＤＮＡクローニング、または、望ましい細胞から精製されたゲノムＤＮＡもしくはその断片のクローニングにより得ることができる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ． ２ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｇｌｏｖｅｒ， １９８５， ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ＭＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｔｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｕ．Ｋを参照）。
【０１０８】
ゲノムＤＮＡから得られたクローンは、コーディング領域に加えて、調節およびイントロンＤＮＡ領域を含み得る；ｃＤＮＡから得られたクローンは、イントロン配列を含まない。源が何であれ、遺伝子は、遺伝子を増殖させるために適切なベクターに分子クローニングすべきである。
【０１０９】
ゲノムＤＮＡからの遺伝子の分子クローニングにおいて、ＤＮＡ断片を作製するが、そのいくつかが所望の遺伝子をコードし得る。様々な制限酵素を用いてＤＮＡを特異的な部位で開裂させることができる。あるいは、マンガンの存在下でＤＮアーゼを用いてＤＮＡを断片化してもよいし、または、例えば音波破砕によりＤＮＡを物理的に切断することもできる。次に、直鎖状のＤＮＡ断片は、標準的な技術で大きさに従って分離することができ、この技術としては、これらに限定されないが、アガロース、および、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、並びに、カラムクロマトグラフィーが挙げられる。
【０１１０】
ＤＮＡ断片が作製されたら、所望のＡＢＣＡ１２遺伝子を含む特定のＤＮＡ断片の同定を数種の方法で行うことができる。例えば、ＡＢＣＡ１２遺伝子もしくはその特異的ＲＮＡまたはその断片のいずれか一つの一部分量を利用でき、精製かつ標識が可能である場合、作製されたＤＮＡ断片は、標識プローブへの核酸ハイブリダイゼーションによってスクリーニングすることができる（Ｂｅｎｔｏｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９７７）， １９６：１８０； Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃ ａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． （１９７５）７２：３９６１）。例えば、ＡＢＣＡ１２タンパク質から得られた部分的なコーディング配列情報に対応するオリゴヌクレオチドセットを調製し、ＡＢＣＡ１２をコードするＤＮＡのためのプローブとして用いることができ（これは後述する特定の実施例で行われている）、または、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡのためのプライマーとして用いることもできる（例えば、ＲＴ−ＰＣＲのためのポリ−Ｔプライマーと組み合わせられる）。好ましくは、ＡＢＣＡ１２核酸または本発明のポリペプチドに非常に独特な断片が選択される。プローブに実質的に相同なこれらＤＮＡ断片は、ハイブリダイズし得る。上述したように、相同性の度合いが高ければ高いほど、よりストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いることができる。特定の実施形態において、相同なＡＢＣＡ１２遺伝子を同定するのに、様々なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が用いられる。
【０１１１】
例えば、遺伝子が、本明細書で説明されたＡＢＣＡ１２タンパク質のいずれか一つの、等電的、電気泳動的アミノ酸組成または部分的なアミノ酸配列を有するタンパク質産物をコードする場合、遺伝子の特性に基づきさらなる選択を行うことができる。従って、遺伝子の存在は、その発現産物の物理的、化学的または免疫学的な特性に基づくアッセイにより検出することができる。例えば、適切なｍＲＮＡをハイブリッドして選択したｃＤＮＡクローンまたはＤＮＡクローンを選択することができ、これは、例えば、ＡＢＣＡ１２において知られている類似した、または同一の電気泳動移動、等電点電気泳動または非平衡ｐＨゲル電気泳動の挙動、タンパク分解の消化マップ、または抗原性特性を有するタンパク質を生産する。
【０１１２】
また、本発明のＡＢＣＡ１２遺伝子は、ｍＲＮＡセレクション、すなわち核酸ハイブリダイゼーション、続いてインビトロで翻訳することによって同定することができる。この方法に従って、ヌクレオチド断片は、ハイブリダイゼーションにより相補ｍＲＮＡを単離するのに用いられる。このようなＤＮＡ断片は、利用可能な精製ＡＢＣＡ１２ＤＮＡに相当し得るか、または、部分的なコーディング配列情報から設計された合成オリゴヌクレオチドであり得る。単離されたｍＲＮＡの産物のインビトロでの翻訳産物を、免疫沈降分析または機能的分析（例えば、チロシンホスファターゼ活性）することによって、ｍＲＮＡ、すなわち所望の配列を含む相補ＤＮＡ断片を同定する。加えて、細胞から単離したポリソームを、本発明のＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つに対して特異的に向けられた固定化抗体へ吸着させることによって、特異的なｍＲＮＡを選択することができる。
【０１１３】
放射標識したＡＢＣＡ１２のｃＤＮＡを、テンプレートとして、選択されたｍＲＮＡ（吸着したポリソームから選択された）を用いて合成することができる。続いて、放射標識したｍＲＮＡまたはｃＤＮＡをプローブとして用いて、他のゲノムＤＮＡ断片のなかから相同なＡＢＣＡ１２ＤＮＡ断片を同定することができる。
【０１１４】
本発明に係る核酸の「変異体」は、参照ポリヌクレオチドと比較して１またはそれ以上の塩基が異なる核酸を意味すると理解される。変異核酸は、天然起源（例えば天然に存在する対立遺伝子変異体）であってもよく、または、例えば変異誘発技術により得られた非天然の変異体であってもよい。
【０１１５】
一般的に、参照（一般的に野生型）核酸のヌクレオチド配列と、変異核酸のヌクレオチド配列が非常に類似しており、多くの領域において同一であり、参照核酸と変異核酸との差は小さい。
変異核酸に存在するヌクレオチド改変は、サイレントであってもよく、サイレントとは、前記変異核酸によりコードされたアミノ酸配列が変異により変化しないことを意味する。
【０１１６】
しかしながら、変異核酸中のヌクレオチドの変化はまた、参照核酸がコードするポリペプチドに対して、変異核酸がコードするポリペプチドにける置換、付加または欠失をもたらすこともある。加えて、コーディング領域におけるヌクレオチド改変は、ポリペプチドのアミノ酸配列における保存的または非保存的な置換を生じさせることもある。
【０１１７】
好ましくは、本発明に係る変異核酸は、実質的に参照核酸のポリペプチドと同じ機能または生物活性を保存するポリペプチド、またあるいは、最初の参照核酸でコードされるポリペプチドに対して向けられた抗体により認識される能力を保存するポリペプチドをコードする。
従って、いくつかの変異核酸は、ポリペプチドの変異形態をコードしており、それらの系統的な研究により、問題のタンパク質の構造−活性の関係を推測することが可能である。研究される病気に関連したこれら変異体の知識は、病状の分子的原因を理解することが可能になるため、重要である。
【０１１８】
「断片」は、参照核酸に比べて長さが減少しており、参照核酸と同一のヌクレオチド配列を共通部分をカバーして含むヌクレオチド配列を意味すると理解される。このような本発明に係る核酸「断片」は、必要に応じて、より大きいポリヌクレオチドに含まれてもよく、ここでその断片は、ポリヌクレオチドの成分である。このような断片は、本発明に係る核酸の、長さが８、１０、１２、１５、１８、２０〜２５、３０、４０、５０、７０、８０、１００、２００、５００、１０００または１５００個の連続したヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドを含む、または、それからなる。
【０１１９】
「核酸分子」は、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンもしくはシチジン；「ＲＮＡ分子」）、または、デオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンもしくはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）、または、それらのホスホエステル類似体のいずれか（例えばホスホロチオエートやチオエステル）からなる、一本鎖または二本鎖ヘリックスのいずれかの形態のリン酸エステルの高分子形態を意味する。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡヘリックスが可能である。核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子という用語は、分子の１次および２次構造のみを意味しており、いかなる特定の３次形態にも限定されない。従って、この用語は、特に、直鎖状または環状ＤＮＡ分子（例えば制限断片）、プラスミドおよび染色体で見出される二本鎖ＤＮＡを含む。本明細書において、特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を考察する際、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’への方向の配列のみを示す通常の規則に従って記載される。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的処置を施されたＤＮＡ分子である。
【０１２０】
適切な温度および溶液のイオン強度の条件下で、核酸分子の一本鎖形態が他方の核酸分子にアニール可能な場合、核酸分子は、他の核酸分子、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡに「ハイブリダイズ可能」である（上述のＳａｍｂｒｏｏｋ等を参照）。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。相同な核酸の予備スクリーニングのためには、Ｔｍが５５°に相当する低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を用いる事ができ、例えば、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％ミルク、およびホルムアミド非含有；または、３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳである。より高いＴｍに相当する中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、例えば、５×または６×ＳＣＣを含む４０％ホルムアミドである。最も高いＴｍに相当する高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＣＣである。ハイブリダイゼーションにおいて、２種の核酸が相補配列を含むことが必要であるが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間にミスマッチが存在してもよい。核酸をハイブリダイズさせるのに適切なストリンジェンシーは、核酸の長さ、および、相補性の程度、当業界周知の変数に依存する。２種のヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きければ大きいほど、そのような配列を有する核酸のハイブリッドのためのＴｍ値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性（より高いＴｍに相当する）は、以下の順番で減少する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００ヌクレオチドより多いハイブリッドのために、Ｔｍを計算するための方程式が得られた（上述のＳａｍｂｒｏｏｋ等を参照）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに関しては、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（上述のＳａｍｂｒｏｏｋ等を参照）。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸の最低限の長さは、少なくとも約１０個のヌクレオチド；好ましくは少なくとも約１５個のヌクレオチド；より好ましくは少なくとも約２０個のヌクレオチドの長さである。
【０１２１】
特定の実施形態において、「標準的なハイブリダイゼーション条件」という用語は、Ｔｍが５５℃であることを意味し、上述した条件が利用される。好ましい実施形態において、Ｔｍは６０℃であり；より好ましい実施形態において、Ｔｍは６５℃である。
【０１２２】
本発明の目的における「高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件」は、以下の条件を意味すると理解される；
１−メンブレンの競合およびプレハイブリダイゼーション：
４０μｌのサケ精子ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）＋４０μｌのヒト胎盤ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を混合する。
９６℃で５分間変性させ、次に、氷中に混合物を浸する。
２×ＳＳＣを除去し、メンブレンを含むハイブリダイゼーションチューブ中に４ｍｌのホルムアミドミックスを注ぐ。
２種の変性ＤＮＡの混合物を加える。
４２℃で５〜６時間、回転させながらインキュベーションする。
【０１２３】
２−標識プローブの競合：
標識かつ精製したプローブに、リピートの量に応じて１０〜５０μｌのＣｏｔＩ  ＤＮＡを加える。
９５℃で７〜１０分間変性させる。
６５℃で２〜５時間インキュベートする。
３−ハイブリダイゼーション：
プレハイブリダイゼーションミックスを除去し、
４０μｌのサケ精子ＤＮＡ＋４０μｌのヒト胎盤ＤＮＡとを混合し、９６℃で５分間変性させ、次に氷中に浸す。
ハイブリダイゼーションチューブに、４ｍｌのホルムアミドミックス、２種のＤＮＡと変性標識プローブ／ＣｏｔＩ  ＤＮＡの混合物を加える。
４２℃で１５〜２０時間、回転させながらインキュベートする。
【０１２４】
４−洗浄および露光：
室温で２×ＳＳＣ中で１回洗浄し、リンスする。
室温で５分間、２×ＳＳＣ中で２回洗浄し、６５℃で０．１％ＳＤＳ中で洗浄する。
１５分間、０．１×ＳＳＣ中で２回洗浄し、６５℃で０．１％ＳＤＳ中で洗浄する。
透明プラスチックラップでメンブレンを包み、露光する。
【０１２５】
高ストリンジェンシー条件下の、２０個のヌクレオチド〜数百のヌクレオチドの様々な長さの核酸分子のハイブリダイゼーションに、上述したハイブリダイゼーション条件が適用される。上述のハイブリダイゼーション条件は、当業者既知の技術に従って、ハイブリダイゼーションが検索される核酸の長さ、または、選択された標識のタイプの機能に応じて調節することができる、ということは言うまでもない。適切なハイブリダイゼーション条件は、例えば、ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓによるマニュアル（１９８５年、上述のとおり）に記載の技術に従って調節することができる。
【０１２６】
本明細書で用いられるように、「オリゴヌクレオチド」という用語は、一般的に少なくとも１５個のヌクレオチドの、本発明に係る核酸にハイブリダイズ可能な核酸を意味する。オリゴヌクレオチドは、例えば、３２Ｐ−ヌクレオチド、または、ビオチンのような標識が共有結合で結合したヌクレオチドで標識することができる。一実施形態において、標識オリゴヌクレオチドを、本発明のＡＢＣＡ５〜６、９〜１０のポリペプチドをコードする核酸の存在を検出するためのプローブとして用いることができる。他の実施形態において、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０核酸のいずれか一つの完全長または断片をクローニングすること、または、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０のいずれか一つをコードする核酸の存在を検出することのいずれかのために、オリゴヌクレオチド（その一つまたは両方が標識され得る）をＰＣＲプライマーとして用いることができる。さらなる実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＡＢＣＡ１２ＤＮＡ分子のいずれか一つとのトリプルヘリックスを形成することができる。一般的に、オリゴヌクレオチドは、合成により調製され、好ましくは核酸シンセサイザーで調製される。従って、オリゴヌクレオチドは、天然に存在しないホスホエステル類似結合（例えばチオエステル結合など）を用いて調製することができる。
【０１２７】
「相同組換え」は、ベクターの外来ＤＮＡ配列を染色体に挿入することを意味する。好ましくは、ベクターは、相同組換えに特異的な染色体部位を標的にする。特異的な相同組換えのために、ベクターは、染色体配列に対して十分に長い相同領域を含み、染色体へ相補的に結合し、ベクターを取り込ませることができる。より長い相同領域、および、配列類似性のより大きい度合いにより、相同組換えの効率を高めることができる。
【０１２８】
ＤＮＡの「コーディング配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合、インビトロまたはインビボで、細胞中で転写されポリペプチドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コーディング配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン、および、３’（カルボキシル）末端の翻訳停止コドンにより決定される。コーディング配列としては、これらに限定されないが、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物｛例えば、哺乳動物｝のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、さらに合成ＤＮＡ配列が挙げられる。コーディング配列が真核細胞で発現するように意図された場合、ポリアデニル化シグナルと転写終結配列とは、通常、コーディング配列の３’に位置する。
【０１２９】
転写および翻訳制御配列は、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどのＤＮＡ調節配列であり、これらは、宿主細胞でのコーディング配列の発現を与える。真核細胞において、ポリアデニル化シグナルが、制御配列である。
【０１３０】
「調節領域」とは、核酸の発現を調節する核酸配列を意味する。調節領域は、通常は特定の核酸（相同領域）の発現を引き起こす配列を含んでもよいし、または、異なる起源の配列（異なるタンパク質または合成タンパク質の発現を引き起こす）を含んでもよい。特に、上記配列は、真核生物もしくはウイルスの遺伝子の配列でも、誘導配列でもよく、これらは、特異的または非特異的な方法で、および、誘導的または非誘導的な方法で遺伝子の転写を促進または抑制する。調節領域は、複製起点、ＲＮＡスプライシング部位、エンハンサー、転写終結配列、標的細胞の分泌経路へポリペプチドを導くシグナル配列、およびプロモーターを含む。
【０１３１】
「異種源」からの調節領域は、天然には発現された核酸に関連しない調節領域である。異種の調節領域としては、異なる種からの調節領域、異なる遺伝子からの調節領域、ハイブリッド調節配列、および、自然には存在しないが当業界の通常の技術を有するものにより設計された調節配列が挙げられる。
【０１３２】
「カセット」は、特異的な制限部位でベクターに挿入することができるＤＮＡセグメントを意味する。所定のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメント、ならびに、カセットおよび制限部位は、転写および翻訳に適したリーディングフレームへのカセットの挿入が確実になるよう設計される。
【０１３３】
「プロモーター配列」は、細胞でＲＮＡポリメラーゼを結合させ、コーディング配列の下流（３’方向）の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的において、プロモーター配列は、転写開始部位によりその３’末端で結合し、上流（５’方向）に伸長しており、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写が開始されるのに必要な最少数の塩基または要素を含む。プロモーター配列内には、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングにより簡単に定義された）、同様に、ＲＮＡポリメラーゼの結合をもたらすタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が含まれ得る。
【０１３４】
コーディング配列は、細胞の転写および翻訳制御配列の「制御下」であり、その際、ＲＮＡポリメラーゼはコーディング配列をｍＲＮＡに転写し、次にトランスＲＮＡをスプライシングし、コーディング配列によりコードされるタンパク質に翻訳される。
【０１３５】
「シグナル配列」は、細胞表面で発現されるタンパク質のコーディング配列の始めの部分に含まれる。この配列は、シグナルペプチド、すなわち成熟したポリペプチドのＮ末端をコードしており、当該ペプチドは、宿主細胞でポリペプチドが移行されるように導く。「移行シグナル配列（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、本明細書において、この種のシグナル配列を意味するのに用いられる。移行シグナル配列は、真核生物および原核生物が生来持っている様々なタンパク質に関連して見出すことができ、しばしば両方のタイプの生物において機能する。
【０１３６】
「ポリペプチド」は、共有結合で連結したアミノ酸残基からなる高分子化合物である。アミノ酸は、以下の一般構造を有する：
【化１】
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【０１３７】
アミノ酸は、側鎖Ｒに基づき７つのグループに分類される：（１）脂肪族の側鎖、（２）ヒドロキシル（ＯＨ）基を含む側鎖、（３）硫黄原子を含む側鎖、（４）酸性基またはアミド基を含む側鎖、（５）塩基性基を含む側鎖、（６）芳香環を含む側鎖、および、（７）プロリン、側鎖がアミノ基に融合したイミノ酸。
【０１３８】
「タンパク質」は、生細胞において構造的または機能的役割を果たすポリペプチドである。
本発明のポリペプチドおよびタンパク質は、グリコシル化されていてもよいし、または、グリコシル化されていなくてもよい。
【０１３９】
「相同性」は、共通の進化起源を反映する配列類似性を意味する。ポリペプチドまたはタンパク質は、相当な数のそれらのアミノ酸が（１）同一であるか、または（２）化学的に類似したＲ側鎖を有するかのいずれかである場合、相同性または類似性を有すると考えられる。核酸は、相当な数のそれらのヌクレオチドが同一である場合、相同性を有すると考えられる。
【０１４０】
「単離されたポリペプチド」または「単離されたタンパク質」は、通常はその自然状態でそれらと関連する化合物（例えば、他のタンパク質またはポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質）を実質的に含まないポリペプチドまたはタンパク質である。「単離された」とは、他の化合物を含む人工または合成の混合物、または、例えば不完全な精製により、安定剤の添加、または、製薬上許容できる薬剤への混合により存在し得る、生物活性に干渉しない不純物の存在の排除を意味しない。
【０１４１】
本発明に係るポリペプチドの「断片」は、アミノ酸配列が参照ポリペプチドよりも短い、全体にわたりこれら参照ポリペプチドと同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味すると理解される。このような断片は、必要に応じて、より長いポリペプチドに含まれ、そのポリペプチドの一部となり得る。このような本発明に係るポリペプチドの断片は、５、１０、１５、２０、３０〜４０、５０、１００、２００または３００個のアミノ酸の長さを有し得る。
【０１４２】
本発明に係るポリペプチドの「変異体」は、主に、アミノ酸配列が、参照ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、付加または欠失を１またはそれ以上含むポリペプチドを意味すると理解され、アミノ酸置換は、保存的または非保存的のいずれでもよいと理解される。
ポリペプチドまたはタンパク質の「変異体」は、ポリペプチドまたはタンパク質から誘導され、そのポリペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つの生物学的特性を保持する類似体、断片、誘導体、または変異体のいずれかである。ポリペプチドまたはタンパク質の異なる変異体は、自然界に存在し得る。これら変異体は、タンパク質をコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列における差異により特徴付けられる対立遺伝子のバリエーションでもよく、または、スプライシングの差異または翻訳後修飾を含んでもよい。また、変異体は、実質的に同じ生物活性を有するが、異なる種から得られた関連タンパク質も含む。
【０１４３】
当業者であれば、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加、または差し換え（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を有する変異体を製造することができる。これら変異体は、特に以下の物が挙げられる：（ａ）１またはそれ以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸で置換された変異体、（ｂ）１またはそれ以上のアミノ酸がポリペプチドまたはタンパク質に付加された変異体、（ｃ）１またはそれ以上のアミノ酸が置換基を含む変異体、および、（ｄ）ポリペプチドまたはタンパク質が他のポリペプチド（例えば血清アルブミン）と融合した変異体。これら変異体を得る技術には、遺伝的（抑制、欠失、変異など）、化学的、および酵素的技術が挙げられ、これらは当業者に既知である。
【０１４４】
このような対立遺伝子バリエーション、類似体、断片、誘導体、変異体、および改変（オルタナティブｍＲＮＡスプライシング形態およびオルタナティブ翻訳後修飾形態を含む）が、ポリペプチドの生物学的特性のいずれか一つを保持するポリペプチドの誘導体を生産する場合、それらは、本発明の範囲内に含まれることを意味する。
【０１４５】
「ベクター」は、レプリコン、例えばプラスミド、ウイルス、ファージまたはコスミドであり、これらベクターに、他のＤＮＡセグメントが結合し、結合したセグメントの複製が起こる。「レプリコン」は、自発的なインビボでのＤＮＡ複製の単位として機能する遺伝学的要素のいずれか（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）、すなわち、それ自身の制御下で複製可能な要素である。
【０１４６】
また、本発明は、クローニングベクターに関し、当該クローニングベクターは、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドと同一または相同な機能活性を有する、本発明のＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれかの類似体および誘導体、ならびに、他の種からのそれらの同族体をコードする遺伝子を含む。ＡＢＣＡ１２に関する誘導体および類似体の生産および使用は、本発明の範囲内である。特定の実施形態において、上記誘導体または類似体は、機能的に活性であり、すなわち、完全長で、野生型の本発明のＡＢＣＡ１２ポリペプチドに関連する１またはそれ以上の機能的な活性を示すことが可能である。
【０１４７】
ＡＢＣＡ１２誘導体は、機能的に同等な分子を与える置換、付加または欠失により、コードする核酸配列を改変することによって製造できる。好ましくは、野生型ＡＢＣＡ１２に関連する機能活性を強化または増加させた誘導体を生産することである。あるいは、このような誘導体は、本発明のＡＢＣＡ１２ポリペプチドの天然リガンドに対して、同一またはより大きい親和性を有するＡＢＣＡ１２細胞外ドメインの可溶性断片をコードし得る。このような可溶性誘導体は、ＡＢＣＡ１２に結合するリガンドの阻害剤である可能性がある。
【０１４８】
ヌクレオチドコーディング配列の縮重により、ＡＢＣＡ１２遺伝子と実質的に同じアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を、本発明を実施するのに用いることができる。この他のＤＮＡ配列としては、これらに限定されないが、対立遺伝子、他の種からの相同遺伝子、および、配列中で同じアミノ酸残基をコードする異なるコドンを置換し、それによりサイレント変化を生じさせて改変されたＡＢＣＡ１２遺伝子の全部または部分を含むヌクレオチド配列が挙げられる。同様に、本発明のＡＢＣＡ１２誘導体としては、これらに限定されないが、１次アミノ酸配列として、ＡＢＣＡ１２タンパク質のいずれか一つのアミノ酸配列の全部、または部分を含む誘導体が挙げられ、ここで、該配列は、機能的に同等なアミノ酸残基が配列中の残基に代わって置換され、保存的アミノ酸置換が生じた改変配列を含む。例えば、上記配列中の１またはそれ以上のアミノ酸残基は、機能的に同等に作用する類似した極性を有する他のアミノ酸で置換することができ、それによりサイレント改変を生じる。上記配列中でのアミノ酸置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば、非極性の（疎水性の）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。芳香環構造を含むアミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが挙げられる。極性が中性のアミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正電荷を有する（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが挙げられる。負電荷を有する（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。このような改変は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定される見かけの分子量または等電点に影響を与えないことが期待される。
【０１４９】
特に好ましい置換としては、以下が挙げられる：
正電荷が維持されるように、Ａｒｇの代わりにＬｙｓ、および、その逆；
負電荷が維持されるように、Ａｓｐの代わりにＧｌｕ、および、その逆；
遊離の−ＯＨが維持されるように、Ｔｈｒの代わりにＳｅｒ；および、
遊離のＣＯＮＨ２が維持されるように、Ａｓｎの代わりにＧｌｎ。
【０１５０】
また、アミノ酸置換は、特に好ましい特性を有するアミノ酸で置換するために導入してもよい。例えば、他のＣｙｓとのジスルフィド架橋のための潜在部位として、Ｃｙｓを導入することができる。Ｈｉｓは、特に「触媒性の」部位として導入することができる（すなわち、Ｈｉｓは酸または塩基として作用することができ、生化学的な触媒作用において最も一般的なアミノ酸である）。Ｐｒｏは、その特に平面構造により導入され、それによりタンパク質構造中にβ−ターンを誘発させる。
【０１５１】
本発明のＡＢＣＡ１２誘導体および類似体をコードする遺伝子は、当業界既知の様々な方法で製造することができる。それらを生産させる操作は、遺伝子またはタンパク質レベルでなされ得る。例えば、クローン化ＡＢＣＡ１２配列は、多数の当業界既知の方法のいずれかによって修飾することができる（上述のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９）。その配列は、制限エンドヌクレアーゼにより適切な部位で開裂させることができ、続いて、必要に応じてさらに酵素的に改変させ、単離し、インビトロでライゲーションさせる。ＡＢＣＡ１２の誘導体または類似体をコードする遺伝子の生産は、改変された遺伝子がＡＢＣＡ１２遺伝子と同じ翻訳リーディングフレーム内に保持され、所望の活性がコードされた領域において翻訳停止シグナルにより断絶されていないことを確かめるべきである。
【０１５２】
加えて、ＡＢＣＡ１２をコードする核酸は、インビトロまたはインビボで変異させることができ、それにより、翻訳配列、開始配列、および／または停止配列を作製および／または破壊したり、または、コーディング領域においてバリエーションを作製したり、および／または、新しい制限エンドヌクレアーゼ部位を形成したり、または、すでに存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を破壊したり、さらなるインビトロでの改変を促進したりすることができる。好ましくは、このような変異は、変異ＡＢＣＡ１２遺伝子産物の機能活性を強化する。当業界既知のいずれの変異誘発技術も用いることができ、当該技術としては、特に、インビトロの部位特異的変異導入（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９７８）Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５３：６５５１； Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， （１９８４）ＤＮＡ， ３：４７９−４８８； Ｏｌｉｐｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．， （１９８６）Ｇｅｎｅ ４４：１７７； Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８６）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８３：７１０； Ｈｕｙｇｅｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９６）， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２（８）：８９３− ８９８）、および、ＴＡＢ（Ｒ）リンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用が挙げられる。部位特異的変異導入には、ＰＣＲ技術が好ましい（ＨｉｇｕｃｈＩ、１９８９， “Ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｔｏ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ ＤＮＡ”， ｉｎ ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｈ． Ｅｒｌｉｃｈ， ｅｄ．， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｈａｐｔｅｒ ６， ｐｐ．６１−７０）。
【０１５３】
次に、同定され、単離されたＡＢＣＡ１２遺伝子は、適切なクローニングベクターに挿入することができる。当業界既知の多数のベクター−宿主系を用いることができる。可能なベクターとしては、これらに限定されないが、プラスミドまたは改変ウイルスが挙げられるが、ベクター系は、用いられる宿主細胞に適合していなければならない。ベクターの例としては、これらに限定されないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、バクテリオファージ、例えばラムダ誘導体、または、プラスミド、例えばｐＢＲ３２２誘導体もしくはｐＵＣプラスミド誘導体、例えば、ｐＧＥＸベクター、ｐｍａｌ−ｃ、ｐＦＬＡＧ等が挙げられる。クローニングベクターへの挿入は、例えば、ＤＮＡ断片を相補的な付着末端を有するクローニングベクターにライゲーションすることによって行うことができる。しかしながら、ＤＮＡ断片に用いられた相補的な制限部位がクローニングベクターに存在しない場合、ＤＮＡ分子の末端を酵素的に修飾することができる。あるいは、ヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ末端にライゲーションすることによって、所望の部位のいずれかを製造できる；これらのライゲーションされたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする、特定の化学合成されたオリゴヌクレオチドを含み得る。組換え分子を、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション等を介して宿主細胞に導入し、多くの遺伝子配列コピーを生成することができる。好ましくは、クローン化遺伝子は、シャトルベクタープラスミドに含まれ、これは、クローニング細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）での増殖を与え、必要であればその後の適切な発現細胞系へ挿入するための精製を容易にする。例えば、シャトルベクターは、１を超過するタイプの生物において複製することができるベクターであり、これは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの両方において複製させるために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉプラスミドからの配列と酵母２ｍプラスミドからの配列とを連結させることによって調製することができる。
【０１５４】
その代わりの方法において、適切なクローニングベクターへの挿入後、「ショットガン」方法で所望の遺伝子を同定および単離することができる。例えばサイズ分画による所望の遺伝子の濃縮は、クローニングベクターへの挿入の前に行うことができる。
【０１５５】
ＡＢＣＡ１２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または、それらの抗原性断片、誘導体または類似体、または、機能的に活性な誘導体（そのキメラタンパク質を含む）を、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパク質−コーディング配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入することができる。このような要素は、本明細書において「プロモーター」と記載される。従って、本発明のＡＢＣＡ１２ポリペプチドをコードする核酸は、本発明の発現ベクターにおいて、プロモーターと作用上関連している。このような調節配列の制御下でｃＤＮＡおよびゲノム配列の双方をクローニングおよび発現させることができる。また、発現ベクターは、好ましくは複製起点を含む。
【０１５６】
必要な転写および翻訳シグナルを組換え発現ベクターに供給することができ、または、それらをＡＢＣＡ１２および／またはそのフランキング領域をコードする野生型遺伝子によって補ってもよい。
【０１５７】
可能な宿主−ベクター系としては、これらに限定されないが、ウイルスに感染した哺乳動物細胞系（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）；ウイルスに感染した昆虫細胞系（例えば、バキュロウイルス）；微生物、例えば酵母ベクターを含む酵母；または、バクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡで形質転換した細菌が挙げられる。ベクターの発現要素は、それらの強度と特異性において様々である。用いられる宿主−ベクター系に応じて、多数の適切な転写および翻訳要素のいずれか一つを用いることができる。
【０１５８】
本発明の組換えＡＢＣＡ１２タンパク質、または、機能的断片、誘導体、キメラ構造体、または、その類似体は、組換えによりコーディング配列を統合した後に、染色体により発現させることができる。それに関して、多数の増幅系のいずれかを用いて、高レベルの安定な遺伝子発現を達成することができる（上述のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９を参照）。
【０１５９】
本発明に係るＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つをコードする核酸を含む組換えベクターを有する細胞は、細胞がＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つを発現するような条件下で、適切な細胞培地中で培養される。
【０１６０】
上述した、ＤＮＡ断片をクローニングベクターへ挿入するための方法のいずれかを用いて、適切な転写／翻訳制御シグナルおよびタンパク質コーディング配列からなる遺伝子を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、インビトロでの組換えＤＮＡ、および、合成技術、および、インビボでの組換え（遺伝子組換え）が挙げられる。
【０１６１】
ＡＢＣＡ１２ポリペプチドの発現は、当業界既知のプロモーター／エンハンサー要素のいずれかにより調節できるが、これらの調節要素は、発現用に選択された宿主において機能的でなければならない。ＡＢＣＡ１２遺伝子発現を制御するのに用いることができるプロモーターとしては、これらに限定されないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ， １９８１ Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’側の長い末端反復中に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ， ｅｔ ａｌ．， １９８０， Ｃｅｌｌ， ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ７８：１４４１− １４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｎａｔｕｒｅ， ２９６：３９−４２）；原核生物の発現ベクター、例えばβ−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ− Ｋａｍａｒｏｆｆ． ｅｔ ａｌ．， １９７８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ７５：３７２７−３７３１）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ， ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８０：２１−２５）；また、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ， １９８０， ２４２：７４−９４に記載の「Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ」も参照；酵母または他の菌類からのプロモーター要素、例えばＧａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター；および、動物の転写制御領域、これは、組織特異性を示し、トランスジェニック動物で用いられている：エラスターゼＩ遺伝子制御領域、これは、膵臓腺房細胞で活性である（Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｃｅｌｌ， ３８：６３９−６４６； Ｏｍｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ．， ５０：３９９−４０９； ＭａｃＤｏｎａｌｄ， １９８７）；インスリン遺伝子制御領域、これは、膵臓β細胞で活性である（Ｈａｎａｈａｎ， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ， ３１５：１１５−１２２）、免疫グロブリン遺伝子制御領域、これは、リンパ細胞で活性である（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｃｅｌｌ， ３８：６４７−６５８； Ａｄａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ， ３１８：５３３−５３８； Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ７：１４３６−１４４４）、マウス乳腺ガンウイルス制御領域、これは、精巣、乳房、リンパ細胞および肥満細胞で活性である（Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｃｅｌｌ， ４５：４８５−４９５）、アルブミン遺伝子制御領域、これは、肝臓で活性である（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．， １：２６８− ２７６）、α−胎児性タンパク質遺伝子制御領域、これは、肝臓で活性である（Ｋｒｕｍｌａ���ｆ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ５：１６３９−１６４８； Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３５：５３−５８）、α１−抗トリプシン遺伝子制御領域、これは、肝臓で活性である（Ｋｅｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．， １：１６１−１７１）、β−グロビン遺伝子制御領域、これは、骨髄細胞で活性である（Ｍｏｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ， ３１５：３３８−３４０； Ｋｏｌｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｃｅｌｌ， ４６：８９−９４）、ミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域、これは、脳のオリゴデンドロサイト細胞で活性である（Ｒｅａｄｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｃｅｌｌ， ４８：７０３−７１２）、ミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域、これは、骨格筋で活性である（Ｓａｎｉ， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ， ３１４：２８３−２８６）、および、ゴナトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域、これは、視床下部で活性である（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３４：１３７２−１３７８）。
【０１６２】
本発明のＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つをコードする核酸を含む発現ベクターは、５種の一般的な方法により同定することができる：（ａ）所望のプラスミドＤＮＡまたは特異的なｍＲＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、（ｂ）核酸ハイブリダイゼーション、（ｃ）選択マーカー遺伝子の機能の存在または非存在、（ｄ）適切な制限エンドヌクレアーゼを用いた分析、および、（ｅ）挿入された配列の発現。第一の方法においては、核酸をＰＣＲにより増幅して、増幅産物を検出することができ、第二の方法においては、発現ベクターに挿入された外来遺伝子の存在を、挿入されたマーカー遺伝子と相同な配列を含むプローブを用いた核酸ハイブリダイゼーションにより検出することができる。第三の方法において、組換えベクター／宿主系を、外来遺伝子のベクターへの挿入により生じる特定の「選択マーカー」遺伝子の機能（例えば、ｂ−ガラクトシダーゼ活性、チミジンキナーゼ活性、抗生物質への耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスの封入体（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）の形成など）の存在または非存在に基づき同定および選択することができる。他の例において、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つをコードした核酸がベクターの「選択マーカー」遺伝子配列に挿入された場合、ＡＢＣＡ１２核酸インサートを含む組換え体は、ＡＢＣＡ１２遺伝子機能がないことによって同定できる。第四の方法において、組換え発現ベクターは、適切な制限酵素で消化することによって同定される。第五の方法において、発現タンパク質が機能的に活性なコンフォメーションであることを仮定した場合、組換え発現ベクターは、組換え体により発現された遺伝子産物の活性、生化学的、または、免疫学的特徴を分析することによって同定できる。
【０１６３】
本発明の核酸を発現させるのに多様な宿主／発現ベクターの組み合わせを用いることができる。例えば、有用な発現ベクターを、染色体配列、非染色体配列および合成ＤＮＡ配列のセグメントから構成することができる。適切なベクターとしては、ＳＶ４０の誘導体、および、既知の細菌プラスミド、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのプラスミドｃｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｇｅｎｅ、６７：３１−４０）、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体、ＲＰ４のようなプラスミド；ファージＤＮＡ、例えば、ファージ１の多数の誘導体、例えば、ＮＭ９８９、および他のファージＤＮＡ、例えばＭ１３、および、線状一本鎖ファージＤＮＡ；酵母プラスミド、例えば２ｍプラスミドもしくはそれらの誘導体；真核細胞で有用なベクター、例えば昆虫または哺乳動物細胞で有用なベクター；プラスミドとファージＤＮＡとを組み合わせて得られたベクター、例えばファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を用いるために改変されたプラスミド；などが挙げられる。
【０１６４】
例えば、バキュロウイルス発現系において、非融合トランスファーベクター、例えば、これらに限定されないが、ｐＶＬ９４１（ＢａｍＨ１クローニング部位；Ｓｕｍｍｅｒｓ）、ｐＶＬ１３９３（ＢａｍＨ１、ＳｍａＩ、ＸｂａＩ、ＥｃｏＲ１、ＮｏｔＩ、ＸｍａＩＩＩ、ＢｇｌＩＩ、およびＰｓｔＩクローニング部位；インビトロジェン社）、ｐＶＬ１３９２（ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＮｏｔＩ、ＸｍａＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ、ＳｍａＩ、およびＢａｍＨ１クローニング部位；Ｓｕｍｍｅｒｓおよびインビトロジェン社）、およびｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ＢａｍＨ１、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＮｃｏＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、青／白組換えスクリーニングが可能；インビトロジェン社）、および、融合トランスファーベクター、例えば、これらに限定されないが、ｐＡｃ７００（ＢａｍＨ１およびＫｐｎＩクローニング部位、ここでＢａｍＨ１認識部位が開始コドンを有する；Ｓｕｍｍｅｒｓ）、ｐＡｃ７０１およびｐＡｃ７０２（ｐＡｃ７００と同じであるが、異なるリーディングフレームを有する）、ｐＡｃ３６０（ポリヘドリン開始コドンの３６塩基対下流のＢａｍＨ１クローニング部位；インビトロジェン社（１９５））、および、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（ＢａｍＨ１、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＮｃｏＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、ＰｒｏＢｏｎｄ精製のためのＮ末端ペプチド、および、プラークの青／白組換えスクリーニングを有する、３種の異なるリーディングフレーム；インビトロジェン社（２２０）を用いることができる。
【０１６５】
本発明での使用を考慮した哺乳動物発現ベクターとしては、誘導性プロモーター、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーターを有するベクター、例えば、ＤＨＦＲ発現ベクターを含む発現ベクターのいずれか、または、ＤＨＦＲ／メトトレキセート共増幅ベクター、例えばｐＥＤ（クローン化遺伝子およびＤＨＦＲの両方を発現するベクターと共に、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＳｂａＩ、ＳｍａＩ、およびＥｃｏＲＩクローニング部位；Ｋａｕｆｍａｎ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １６．１２ （１９９１）を参照）。あるいは、グルタミンシンセターゼ／メチオニンスルホキシミン共増幅ベクター、例えばｐＥＥ１４（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ、ＳｍａＩ、ＳｂａＩ、ＥｃｏＲＩ、およびＢｃｌＩクローニング部位、ここでベクターは、グルタミンシンターゼとクローン化遺伝子とを発現する；セルテック社）が挙げられる。他の実施形態において、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）の制御下でエピゾームの発現に向けられたベクターを用いることができ、例えばｐＲＥＰ４（ＢａｍＨ１、ＳｆｉＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩ、ＰｖｕＩＩ、およびＫｐｎＩクローニング部位、構成的ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ハイグロマイシン選択的マーカー；インビトロジェン社）、ｐＣＥＰ４（ＢａｍＨ１、ＳｆｉＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩ、ＰｖｕＩＩ、およびＫｐｎＩクローニング部位、構成的ｈＣＭＶ前初期遺伝子、ハイグロマイシン選択的マーカー；インビトロジェン社）、ｐＭＥＰ４（ＫｐｎＩ、ＰｖｕＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＳｆｉＩ、ＢａｍＨ１クローニング部位、誘導性メタロチオネインＩＩａ遺伝子プロモーター、ハイグロマイシン選択的マーカー：インビトロジェン社）、ｐＲＥＰ８（ＢａｍＨ１、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩ、およびＫｐｎＩクローニング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ヒスチジノール選択的マーカー；インビトロジェン社）、ｐＲＥＰ９（ＫｐｎＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＳｆｉＩ、およびＢａｍＨ１クローニング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、Ｇ４１８選択的マーカー；インビトロジェン社）、およびｐＥＢＶＨｉｓ（ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ハイグロマイシン選択的マーカー、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂により精製可能であり、エンテロキナーゼで開裂されたＮ末端ペプチド；インビトロジェン社）。本発明で用いる選択可能な哺乳動物発現ベクターとしては、ｐＲｃ／ＣＭＶ（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、ＳｂａＩ、およびＡｐａＩクローニング部位、Ｇ４１８選択；インビトロジェン社）、ｐＲｃ／ＲＳＶ（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｅＩ、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、ＸｂａＩクローニング部位、Ｇ４１８選択；インビトロジェン社）などが挙げられる。本発明に係る使用のためのワクシニアウイルス哺乳動物発現ベクター（上述のＫａｕｆｍａｎ， １９９１を参照）としては、これらに限定されないが、ｐＳＣ１１（ＳｍａＩクローニング部位、ＴＫ−およびｂ−ｇａｌ選択）、ｐＭＪ６０１（ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＡｆｌＩ、Ｎａ���Ｉ、ＢｓｐＭＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＡｐａＩ、ＮｈｅＩ、ＳａｃＩＩ、ＫｐｎＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位；ＴＫ−およびｂ−ｇａｌ選択）、および、ｐＴＫｇｐｔＦ１Ｓ（ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＡｃｃＩ、ＨｉｎｄＩＩ、ＳｂａＩ、ＢａｍＨＩ、およびＨｐａクローニング部位、ＴＫまたはＸＰＲＴ選択）。
【０１６６】
また、酵母発現系も、本発明に従って、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つを発現させるのに用いることができる。例えば、非融合ｐＹＥＳ２ベクター（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＧｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢａｍＨ１、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位；インビトロジェン社）、または、融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＩＩＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂で精製され、エンテロキナーゼで開裂したＮ末端ペプチド；インビトロジェン社）であり、２種のみを記載したが、これらは本発明に従って用いることができる。
【０１６７】
特定の組換えＤＮＡ分子が同定され、単離されたら、当業界既知の数種の方法を用いて、それを増殖させることができる。適切な宿主系と成長条件が確立されたら、組換え発現ベクターを増やし、大量に調製することができる。上述したように、用いることができる発現ベクターとしては、これらに限定されないが、以下のベクターまたはその誘導体が挙げられる：ヒトまたは動物ウイルス、例えばワクシニアウイルスまたはアデノウイルス；昆虫ウイルス、例えばバキュロウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、ラムダ）、および、プラスミドおよびコスミドＤＮＡベクターなどが挙げられる。
【０１６８】
加えて、挿入された配列の発現を調節する宿主細胞株か、または、所望の特定の様式で遺伝子産物を改変、処理する宿主細胞株を選択することができる。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後プロセシングおよび修飾（例えばシグナル配列のグリコシル化、開裂など）のための特徴的で特異的なメカニズムを有する。発現された外来タンパク質の所望の修飾およびプロセシングを確実にするのに適切な細胞系または宿主系が選択できる。非グリコシル化コアタンパク質産物を生産するために、例えば、細菌系における発現を用いることができる。しかしながら、細菌中で発現された膜貫通ＡＢＣＡ１２タンパク質は、適切に折りたたまれない可能性がある。酵母中での発現は、グリコシル化産物を生産し得る。真核細胞中での発現により、異種タンパク質の「本来の」グリコシル化およびフォールディングの可能性を増加させることができる。その上、哺乳動物細胞中での発現は、ＡＢＣＡ１２活性の再構築または構築のための手段を供給し得る。その上、異なるベクター／宿主発現系は、プロセシング反応、例えばタンパク分解性の開裂に異なる程度の影響を与え得る。
【０１６９】
ベクターは、当業界既知の方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、ジーンガンの使用またはＤＮＡベクター輸送体によって、所望の宿主細胞に導入される（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６７：９６３−９６７； Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ， １９８８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６３：１４６２１−１４６２４；Ｈａｒｔｍｕｔ等の１９９０年３月１５日に出願されたカナダ国特許出願第２，０１２，３１１号）。
【０１７０】
細胞は、外来性または異種ＤＮＡが細胞の内部に導入された際に、これらＤＮＡにより「トランスフェクト」される。トランスフェクトされたＤＮＡが表現型の変化に影響を与えた場合、細胞は、外来性または異種ＤＮＡにより「形質転換」される。好ましくは、形質転換するＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに統合されるべきである（共有結合にて）。
【０１７１】
内在性膜タンパク質として発現される組換えマーカータンパク質を、標準的な方法で単離、精製することができる。一般的に、内在性膜タンパク質は、界面活性剤で膜を溶解することによって得ることができ、界面活性剤としては、例えば、これらに限定されないが、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トリトンＸ−１００ポリオキシエチレンエステル、Ｉｐａｇｅｌ／ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０）（オクチルフェノキシ）−ポリエトキシエタノール、ジゴキシン、ナトリウムデオキシコレートなどが挙げられ、それらの混合物も含まれる。懸濁液の音波破砕により可溶化を強化することができる。タンパク質の可溶性形態は、例えば、培養液を回収するか、または、界面活性剤での処理、必要に応じて上述の音波破砕もしくは他の機械的な処置により封入体を溶解することによって得ることができる。様々な技術、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、等電電気泳動、２次元ゲル電気泳動、クロマトグラフィー｛例えば、イオン交換、親和性、免疫親和性、およびサイズ分画カラムクロマトグラフィー｝、遠心分離、溶解性の差異、免疫沈降反応を用いて、または、タンパク質精製のためのその他の標準的な技術のいずれかによって、可溶化または可溶性タンパク質を単離することができる。
【０１７２】
あるいは、本発明に係る核酸またはベクターは、リポフェクションによりインビボで導入することができる。これまでの十年間、インビトロでの核酸のカプセル化およびトランスフェクションのために、リポソームの使用が増えてきた。リポソーム介在トランスフェクションが遭遇する困難および危険を限定するように設計された合成カチオン脂質を、マーカーをコードする遺伝子のインビボでのトランスフェクションのためのリポソームを調製するのに用いることができる（Ｆｅｌｇｎｅｒ， ｅｔ． ａｌ．（１９８７． ＰＮＡＳ ８４／７４１３）；Ｍａｃｋｅｙ等（１９８８． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５ ：８０２７− ８０３１）；Ｕｌｍｅｒ等（１９９３． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−１７４８）。カチオン脂質の使用は、負電荷を有する核酸のカプセル化を促進することができ、また、負電荷を有する細胞膜との融合も促進し得る（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３３７：３８７−３８８））。
【０１７３】
核酸の移動に特に有用な脂質化合物および組成物は、国際特許公報ＷＯ９５／１８８６３およびＷＯ９６／１７８２３、ならびに、米国特許第５，４５９，１２７号に記載されている。外来遺伝子をインビボで特定の器官に導入するためのリポフェクションの使用は、確実な実施上の利点を有する。リポソームの特定の細胞に対する分子ターゲティングは、利益の一領域を示す。特定の細胞型にトランスフェクションを向けることは、細胞が不均一な組織、例えば膵臓、肝臓、腎臓、および脳において特に好ましいことは明らかである。脂質は、ターゲティング目的で他の分子に化学的に結合することができる｛上述のＭａｃｋｅｙ等を参照｝。標的化ペプチド（例えば、ホルモンまたは神経伝達物質）、および、タンパク質（例えば抗体、または非ペプチド分子）がリポソームに化学的に結合できる。
【０１７４】
インビボでの核酸トランスフェクションを容易にするのに他の分子も有用であり、例えばカチオン性オリゴペプチド｛例えば、国際特許公報ＷＯ９５／２１９３１｝、ＤＮＡ結合タンパク質から誘導されたペプチド（例えば、国際特許公報ＷＯ９６／２５５０８）、またはカチオン性ポリマー（例えば、国際特許公報ＷＯ９５／２１９３１）が挙げられる。
【０１７５】
インビボで、裸のＤＮＡプラスミドとしてベクターを導入することも可能である（米国特許第５，６９３，６２２号、５，５８９，４６６号および５，５８０，８５９号を参照）。遺伝子治療のための裸のＤＮＡベクターは、当業界既知の方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、ジーンガンの使用、または、ＤＮＡベクター輸送体の使用により所望の宿主細胞に導入することができる（上述のＷｕ ｅｔ ａｌ．， １９９２を参照；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ， １９８８， 上述の通り；Ｈａｒｔｍｕｔ等の１９９０年３月１５日に出願されたカナダ国特許出願第２，０１２，３１１号；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：２７２６−２７３０）。受容体介在ＤＮＡ輸送方法もまた、用いることができる（Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ３：１４７−１５４； Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ， １９８７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：４４２９−４４３２）。
【０１７６】
「製薬上許容できるビヒクルまたは添加剤」としては、投与方法において製薬上許容できる希釈剤および充填剤が挙げられ、これらは滅菌されており、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて配合された水性または油性懸濁液のいずれでもよい。特定の製薬上許容できる担体、および、担体に対する活性化合物の割合は、組成物の溶解性および化学特性、特定の投与様式、および標準的な製剤の実施により決定される。
【０１７７】
本発明の全ての核酸、ポリペプチド、ベクターまたは宿主細胞は、好ましくは、インビボで製薬上許容できるビヒクルまたは添加剤に導入される。「製薬上許容できる」という句は、ヒトに投与された場合に、生理学的に許容できるが、一般的にアレルギー性の反応または類似した都合の悪い反応（例えば胃の不調、眩暈など）が生じない分子全体および組成物を意味する。好ましくは、本明細書で用いられるように、「製薬上許容できる」という用語は、連邦または州政府の調節機関により承認されていることを意味し、または、動物、より特定にはヒトにおいて用いられる米国薬局方または他の一般的に認識された薬局方に列挙されていることを意味する。「添加剤」という用語は、希釈剤、アジュバント、添加剤またはビヒクルを意味し、それらと共に化合物が投与される。このような製薬上の担体は、滅菌溶液（例えば水または油）であり得、例えば、鉱油、動物、植物性または合成起源、例えば落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの滅菌溶液が挙げられる。水または水溶液、食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液が、特に注射用溶液のために、添加剤として好ましく用いられる。適切な製薬上の添加剤は、Ｅ．Ｗ． Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。
【０１７８】
通常、本発明は、遺伝子治療用途のための、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つの治療上有効な量を発現し得るベクターの運搬を考慮する。「治療上有効な量」という句は、本明細書において、宿主の活性、機能、および応答における臨床上顕著な欠乏を少なくとも約１５パーセント、好ましくは少なくとも５０パーセント、より好ましくは少なくとも９０パーセント減少させるのに十分な量を意味するものとして用いられ、さらにより好ましくは、宿主の活性、機能、および応答における臨床上顕著な欠乏を防ぐのに十分な量を意味するものとして用いられる。あるいは、治療上有効な量は、宿主において臨床上顕著な状態での改善を起こすのに十分な量である。
【０１７９】
完全長および短鎖ＡＢＣＡ１２タンパク質をコードするｃＤＮＡ分子
本出願人は、新規のヒトＡＢＣＡ様遺伝子を同定し、ＡＢＣＡ１２と示し、この遺伝子が染色体２ｑ３４の領域に位置することを決定した（図１）。本出願人はまた、本発明において様々なＡＢＣＡ１２転写物を同定し、転写物Ａ〜Ｄ、および、２つのヒト対応タンパク質アイソフォームをコードするヒトＡＢＣＡ１２遺伝子に対応する全長コーディング配列（ＣＤＳ）を指定した。
表１に、ＡＢＣＡ１２  ｍＲＮＡの長さ、コーディングヌクレオチド配列長さ、ポリアデニル化部位の位置、同様に、推定のタンパク質サイズを要約する。
【０１８０】
【表１】
2004527237.tif 000004
【０１８１】
ヒトの新規のＡＢＣＡ１２遺伝子の転写物Ａは、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有する９１１２個のヌクレオチドからなり、および、２２１位のヌクレオチド（翻訳開始のためのＡＴＧコドンの塩基Ａ）から始めて、８００８位のヌクレオチド（停止コドンＴＡＡの第二塩基Ａ）までの、７７８８ｂｐのオープンリーディングフレームを含む。２種の推定のポリアデニル化シグナル（配列ＡＡＴＡＡＡを有する）が存在し、これは、配列番号１の配列の８３１５位および９０７４位のヌクレオチドから開始される。
【０１８２】
本発明によれば、ＡからのＡＢＣＡ１２のｃＤＮＡ（配列番号１）は、配列番号５のアミノ酸配列を含む２５９５個のアミノ酸（ａａ）の完全長ＡＢＣＡ１２ポリペプチドをコードする７７８８ｂｐのコーディング配列を含む。
【０１８３】
ヒトの新規のＡＢＣＡ１２遺伝子の転写物Ｂは、配列番号２に記載の８８７５個のヌクレオチドからなり、２２１位のヌクレオチド（翻訳開始のためのＡＴＧコドンの塩基Ａ）から始めて、７７７１位のヌクレオチド（停止コドンＴＡＡの第二塩基Ａ）までの７５５１ｂｐのオープンリーディングフレームを含む。推定のポリアデニル化シグナル（配列ＡＡＴＡＡＡを有する）が存在し、これは、配列番号２の配列の８０７８位および８８３７位のヌクレオチドから開始される。
本発明によれば、ＡＢＣＡ１２のｃＤＮＡ形態Ｂ（配列番号２）は、配列番号６のアミノ酸配列を含む２５１６個のアミノ酸の短い長さのＡＢＣＡ１２ポリペプチドをコードする７５５１ｂｐのコーディング配列を含む。
【０１８４】
ヒトの新規のＡＢＣＡ１２遺伝子の転写物Ｃは、配列番号３に記載の８３５０個のヌクレオチドからなり、２２１位のヌクレオチド（翻訳開始のためのＡＴＧコドンの塩基Ａ）から始めて、８００８位のヌクレオチド（ＴＡＡ停止コドンの第二塩基Ａ）までの７７８８ｂｐのオープンリーディングフレームを含む。推定のポリアデニル化シグナル（配列ＡＡＴＡＡＡを含む）が存在し、これは、配列番号３の配列の８３１５位のヌクレオチドから開始される。
【０１８５】
本発明によれば、ＡＢＣＡ１２のｃＤＮＡ（配列番号３）は、配列番号５のアミノ酸配列を含む２５９５個のアミノ酸の完全長ＡＢＣＡ１２ポリペプチドをコードする７７８８ｂｐのコーディング配列を含む。
新規のヒトＡＢＣＡ１２遺伝子の転写物Ｄは、配列番号４に記載の８１１３個のヌクレオチドからなり、２２１位のヌクレオチド（翻訳開始のためのＡＴＧコドンの塩基Ａ）から始めて、７７７１位のヌクレオチド（ＴＡＡ停止コドンの第二塩基Ａ）までの７５５１ｂｐのオープンリーディングフレームを含む。推定のポリアデニル化シグナル（配列ＡＡＴＡＡＡを有する）が存在し、これは、配列番号４の配列の８０７８位のヌクレオチドから開始される。
【０１８６】
本発明によれば、ＡＢＣＡ１２のｃＤＮＡ（配列番号４）は、配列番号６のアミノ酸配列を含む２５１６個のアミノ酸の短い長さのＡＢＣＡ１２ポリペプチドをコードする７５５１ｂｐのコーディング配列を含む。
また、本出願人は、ＡＢＣＡ１２遺伝子が特異的な発現パターンを有することを決定し、これは、対応するタンパク質アイソフォームが組織特異的な機能を示し得ることを示す（実施例３）。実際には、組織分布の電子的な分析により、ＡＢＣＡ１２転写物が異なる組織由来の様々なＥＳＴとマッチすることが示され、それにより、皮膚／上皮組織での優先的な発現が示された。
【０１８７】
本出願人は、さらに、ＡＢＣＡ１２遺伝子の全長コーディング配列（ＣＤＳ）に対応する可能性のある転写配列を決定し、当該転写配列は、本発明に従って、サンプル中のＡＢＣＡ１２遺伝子またはヌクレオチド発現産物の様々な検出手段を製造するために特に有用である。
従って、本発明は、配列番号１〜４を含む核酸またはその相補ヌクレオチド配列に向けられる。
また、本発明は、配列番号１〜４で示されたヌクレオチド配列を含む核酸またはその相補ヌクレオチド配列に関する。
また、本発明は、配列番号１〜４の少なくとも８個の連続したヌクレオチド、または、その相補ヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
【０１８８】
また、本発明の主題は、配列番号１〜４のいずれか一つを含む核酸と少なくとも８０％のヌクレオチド同一性を有する核酸、または、その相補ヌクレオチド配列を含む核酸である。
また、本発明は、配列番号１〜４のいずれか一つを含む核酸と、少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、および、さらにより好ましくは９８％のヌクレオチド同一性を有する核酸、または、その相補ヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
本発明の他の主題は、高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１〜４のいずれか一つを含む核酸、または、その相補ヌクレオチド配列を含む核酸とハイブリダイズする核酸である。
【０１８９】
また、本発明は、配列番号５または６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸に関する。
本発明は、配列番号５または６で示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸に関する。
また、本発明は、配列番号５または６のアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。
また、本発明は、配列番号５または６で示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。
また、本発明は、配列番号５または６のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、または、それらのペプチド断片に関する。
また、本発明は、配列番号５または６のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、および、さらにより好ましくは９８％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドに関する。
【０１９０】
好ましくは、本発明に係るポリペプチドは、本発明に係る配列番号５または６のアミノ酸配列を含むポリペプチドの、長さが４、５〜１０、１５、１８または２０〜２５、３５、４０、５０、７０、８０、１００または２００個の連続したアミノ酸を有する。
【０１９１】
５２％アミノ酸配列同一性を有するＡＢＣＡ１およびＡＢＣＡ４輸送体、または、全配列に渡り４３〜６２％の範囲で同一性を有するＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０遺伝子のように、ＡＢＣＡ１２タンパク質はまた、表２に記載されたような高い保存を示す。ＡＢＣＡ１２の長いアミノ酸配列と、ＡＢＣＡ４、ＡＢＣＡ７（Ｋａｍｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ， ２０００， ２７８（３）：７８２−９）、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ９（ＥＰ００４０３４４０）遺伝子のアミノ酸配列とのアライメントにより、全配列に渡り２８〜３６％の範囲の同一性が明らかになった。ＡＢＣＡ１２の短いアミノ酸配列を用いても同じような結果が得られる。
【０１９２】
【表２】
2004527237.tif 000005
【０１９３】
ヌクレオチドプローブおよびプライマー
本発明に係る核酸（ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、ｃＤＮＡ）にハイブリダイズするヌクレオチドプローブおよびプライマーも本発明の一部を構成する。
本発明によれば、配列番号１〜４のいずれか一つを含むポリヌクレオチドから誘導された核酸断片、または、相補ヌクレオチド配列の核酸断片は、ＡＢＣＡ１２遺伝子のヌクレオチド配列、または、それらの断片もしくは変異体（変異または多型を含む）の少なくとも１つのコピーの存在を、サンプル中で検出するのに有用である。
【０１９４】
本発明に係るヌクレオチドプローブまたはプライマーは、配列番号１〜４のいずれか一つを含むヌクレオチド配列、または、相補ヌクレオチド配列を含む。
本発明に係るヌクレオチドプローブまたはプライマーは、配列番号１〜４のいずれか一つを含む核酸の少なくとも８個の連続したヌクレオチド、または、相補ヌクレオチド配列を含む。
【０１９５】
好ましくは、本発明に係るヌクレオチドプローブまたはプライマーは、本発明に係る核酸の、特に配列番号１〜４のいずれか一つを含む核酸の、長さが１０、１２、１５、１８または２０〜２５、３５、４０、５０、７０、８０、１００、２００、５００、１０００、１５００個の連続したヌクレオチド、または、相補ヌクレオチド配列を有する。
あるいは、本発明に係るヌクレオチドプローブまたはプライマーは、本発明に係る核酸の、より特定には配列番号１〜４のいずれか一つを含む核酸の、長さが１２、１５、１８、２０、２５、３５、４０、５０、１００、２００、５００、１０００、１５００個の連続したヌクレオチドを有する断片、または、相補ヌクレオチド配列からなる、および／または含む。
【０１９６】
従って、本発明に係るヌクレオチドプローブまたはプライマーの定義は、上述した高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１〜４のいずれか一つを含む核酸または相補ヌクレオチド配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドも含む。
好ましい実施形態によれば、本発明に係るヌクレオチドプライマーは、配列番号７〜３８のいずれか一つのヌクレオチド配列、または、相補核酸配列を含む。  ＡＢＣＡ１２遺伝子の様々な領域を増幅することができるプライマー配列を以下の表３に記載する。配列番号１における配列番号７〜３８の各プライマーの位置、および、そのハイブリダイジング領域を表３に示す。「Ｃｏｍｐ」という略語は、相補核酸配列を意味する。
【０１９７】
【表３】
2004527237.tif 000006
【０１９８】
本発明に係るヌクレオチドプライマーまたはプローブは、当業者周知の適切な方法のいずれかにより調製することができ、例えば、クローニングおよび制限酵素の作用により、または、Ｎａｒａｎｇｅ等（１９７９， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ， ６８：９０−９８）またはＢｒｏｗｎ等（１９７９， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ， ６８：１０９−１５７）によるホスホジエステル法などの技術に従った直接の化学合成、Ｂｅａｕｃａｇｅ等のジエチルホスホアミダイト法（１９８１， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ， ２２： １８５９−１８６２）、または、欧州特許第ＥＰ０，７０７，５９２号に記載の固体支持体技術により、調製することができる。
【０１９９】
本発明に係る核酸のそれぞれは、上述のオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーも含み、必要に応じて、分光分析、光化学、生化学、免疫化学または化学的手段により検出できるマーカーを含ませることによって標識することができる。例えば、このようなマーカーは、放射性同位体（３２Ｐ、３３Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ）、蛍光性分子（５−ブロモデオキシウリジン、フルオレセイン、アセチルアミノフルオレン、ジゴキシゲニン）、または、リガンド（例えばビオチン）から構成され得る。プローブの標識は、好ましくは、プライマー伸長により、あるいは５’または３’末端への付加により標識分子をポリヌクレオチドに含ませることによって実行される。核酸断片の非放射性標識の例としては、特に、フランス国特許第７８１０９７５号またはＵｒｄｅａ等の論文（１９８８， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １１：４９３７−４９５７）またはＳａｎｃｈｅｚ−ｐｅｓｃａｄｏｒ等の論文（１９８８， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２６（１０）：１９３４−１９３８）に記載されている。
【０２００】
好ましくは、本発明に係るヌクレオチドプローブおよびプライマーは、シグナルを増幅させるようなタイプの構造的特徴を含んでもよく、例えばＵｒｄｅａ等により説明されたプローブ（１９９１， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ．， ２４：１９７−２００）またあるいは欧州特許第ＥＰ０，２２５，８０７号（ＣＨＩＲＯＮ）に記載のプローブが挙げられる。
【０２０１】
本発明に係るオリゴヌクレオチドプローブは、特に、ゲノムＤＮＡを用いるサザン型ハイブリダイゼーションで用いることができ、またあるいは、サンプル中で対応する転写の発現を検索する場合、対応するメッセンジャーＲＮＡを用いるノーザン型ハイブリダイゼーションにおいて用いることもできる。
また、本発明に係るプローブおよびプライマーは、ＰＣＲ増幅産物の検出に用いることができ、またあるいは、ミスマッチ検出に用いることもできる。
【０２０２】
本発明に係るヌクレオチドプローブまたはプライマーは、固体支持体上に固定されてもよい。このような固体支持体は、当業者周知であり、マイクロタイタープレートのウェル表面、ポリスチレンビーズ、磁気ビーズ、ニトロセルロースバンドまたは微粒子（例えばラテックス粒子）で構成される。
【０２０３】
従って、本発明はまた、サンプル中で、配列番号１〜４のヌクレオチド配列のいずれか一つを含む核酸もしくは相補ヌクレオチド配列、または、配列番号１〜４のいずれか一つの核酸断片または変異体もしくは相補ヌクレオチド配列の存在を検出する方法に関し、前記方法は、以下の工程を含む：
１）１またはそれ以上の本発明に係るヌクレオチドプローブまたはプライマーと、試験しようとするサンプルとを接触させること；
２）プローブとサンプル中に存在する核酸との間で形成され得る複合体を検出すること。
【０２０４】
本発明に係る検出方法の特定の実施形態によれば、オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーが、支持体に固定される。
他の観点によれば、オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーが検出可能なマーカーを含む。
【０２０５】
加えて、本発明は、サンプル中で、本発明に係る核酸の存在を検出するためのボックスまたはキットに関し、前記ボックスまたはキットは、以下を含む：
ａ）上述の１またはそれ以上のヌクレオチドプローブまたはプライマー；
ｂ）必要に応じて、ハイブリダイゼーション反応に必要な試薬。
【０２０６】
第一の観点によれば、当該検出ボックスまたはキットは、プローブまたはプライマーが支持体に固定されていることを特徴とする。
第二の観点によれば、当該検出ボックスまたはキットは、オリゴヌクレオチドプローブが検出可能なマーカーを含むことを特徴とする。
【０２０７】
上述の検出キットの特定の実施形態によれば、このようなキットは、本発明に係る複数のオリゴヌクレオチドプローブおよび／またはプライマーを含み、当該オリゴヌクレオチドプローブおよび／またはプライマーは、所定の標的核酸を検出するのに用いることができ、またあるいは、本発明に係る核酸の、より特定には配列番号１〜４のいずれか一つを含む核酸もしくは相補ヌクレオチド配列のコーディング領域または非コーディング領域にある変異を検出するのに用いることができる。
【０２０８】
従って、支持体に固定化された本発明に係るプローブは、マトリックスに並べることもでき、例えば「ＤＮＡチップ」がある。このように並べられたマトリックスは、特に、米国特許第５，１４３，８５４号、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９０／１５０７０およびＷＯ９２／１００９２に記載される。
オリゴヌクレオチドプローブが高密度で固定化された支持体マトリックスは、例えば、米国特許第５，４１２，０８７号および公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９５／１１９９５に記載される。
【０２０９】
本発明に係るヌクレオチドプライマーは、本発明に係る核酸のいずれか一つ、より特定には配列番号１〜４のいずれか一つのヌクレオチド配列を含む核酸または相補ヌクレオチド配列を増幅するのに用いることができる。あるいは、本発明に係るヌクレオチドプライマーは、配列番号１〜４のいずれか一つの核酸断片または変異体、または、相補ヌクレオチド配列を増幅するのに用いることができる。
【０２１０】
特定の実施形態において、本発明に係るヌクレオチドプライマーは、配列番号１〜４のいずれか一つを含む核酸もしくは配列番号１〜４のいずれか一つで示された核酸、または、相補ヌクレオチド配列の核酸を増幅するのに用いることができる。
【０２１１】
本発明の他の主題は、サンプル中に含まれる、本発明に係る核酸、より特定には、ａ）配列番号１〜４のいずれか一つもしくは相補ヌクレオチド配列、ｂ）配列番号１〜４のいずれか一つで示された、もしくは、相補ヌクレオチド配列を含む核酸を増幅する方法に関し、前記方法は、以下の工程を含む：
ａ）増幅反応に必要な試薬の存在下で、標的核酸の存在が疑われるサンプルと、１対のヌクレオチドプライマーとを接触させること、ここで該１対のヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーション位置が、それぞれ増幅が求められる標的核酸の領域の５’側と３’側とに位置する；および、
ｂ）増幅された核酸を検出すること。
【０２１２】
上述した増幅方法を実施するために、上述のヌクレオチドプライマーのいずれか一つを使用することが好ましい。
加えて、本発明の主題は、本発明に係る核酸、より特定には配列番号１〜４のいずれか一つを含む核酸もしくは相補ヌクレオチド配列、または、配列番号１〜４のいずれか一つで示された核酸もしくは相補ヌクレオチド配列を増幅するためのボックスまたはキットであって、前記ボックスまたはキットは、以下を含む：
ａ）本発明に係る１対のヌクレオチドプライマー、ここで該１対のヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーション位置は、それぞれ増幅が求められる標的核酸の５’側および３’側に位置する；および、必要に応じて、
ｂ）増幅反応に必要な試薬。
【０２１３】
このような増幅ボックスまたはキットは、好ましくは、少なくとも１つの、上述した１対のヌクレオチドプライマーを含む。
加えて、本発明の主題は、配列番号１〜４のいずれか一つを含む核酸もしくは相補ヌクレオチド配列の全部または一部を増幅するためのボックスまたはキットであって、前記ボックスまたはキットは、以下を含む：
１）本発明に係る１対のヌクレオチドプライマー、ここで該１対のヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーション位置は、それぞれ増幅が求められる標的核酸の５’側および３’側に位置する；および、必要に応じて、
２）増幅反応に必要な試薬。
【０２１４】
このような増幅ボックスまたはキットは、好ましくは、少なくとも１つの、上述した１対のヌクレオチドプライマーを含む。
また、本発明は、サンプル中で、本発明に係る核酸の存在を検出するためのボックスまたはキットに関し、前記ボックスまたはキットは以下を含む：
ａ）１またはそれ以上の本発明に係るヌクレオチドプローブ；
ｂ）必要に応じて、ハイブリダイゼーション反応に必要な試薬。
【０２１５】
第一の観点によれば、当該検出ボックスまたはキットは、ヌクレオチドプローブおよびプライマーが、支持体に固定されていることを特徴とする。
第二の観点によれば、当該検出ボックスまたはキットは、ヌクレオチドプローブおよびプライマーが検出可能なマーカーを含むことを特徴とする。
【０２１６】
上述の検出キットの特定の実施形態によれば、このようなキットは、本発明に係る複数のオリゴヌクレオチドプローブおよび／またはプライマーを含み、所定の標的核酸の検出、またあるいは、本発明に係る核酸のコーディング領域または非コーディング領域における変異の検出に用いることができる。本発明の好ましい実施形態によれば、標的核酸は、配列番号１〜４のいずれか一つのヌクレオチド配列または相補核酸配列を含む。あるいは、標的核酸は、配列番号１〜４のいずれか一つを含む核酸の核酸断片もしくは変異体、または、相補ヌクレオチド配列である。
【０２１７】
本発明によれば、本発明に係るプライマーは、一般的に、配列番号７〜３８のいずれか一つの全部または一部もしくは相補配列を含む。
本発明に係るヌクレオチドプライマーは、被験者の遺伝子型決定の方法および／または集団の遺伝子型決定方法において特に有用であり、特に、被験者における特定の対立遺伝子形態もしくは対立遺伝子のグループの特定の形態（ハプロタイプ）と、これら被験者における特定の表現型（特徴）の存在（例えば、これら被験者が、候補の染色体領域が第二染色体上、より正確には２ｑアーム上、さらにより正確には２ｑ３４遺伝子座に位置する病状（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、またはインスリン依存性糖尿病）を発症させる素因）との間の関連の研究において特に有用である。
【０２１８】
組換えベクター
また、本発明は、本発明に係る核酸を含む組換えベクターに関する。本発明の目的における「ベクター」は、環状または直鎖状ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を意味すると理解され、これらは、一本鎖または二本鎖形態のいずれかである。
【０２１９】
好ましくは、このような組換えベクターは、以下の核酸から選択される核酸を含み得る：
ａ）配列番号１〜４のいずれか一つのヌクレオチド配列を含む核酸、または、相補ヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号１〜４のいずれか一つで示されたヌクレオチド配列を含む核酸、または、相補ヌクレオチド配列、
ｃ）配列番号１〜４のいずれか一つのヌクレオチド配列を含む核酸の、少なくとも８個の連続したヌクレオチドを有する核酸、または、相補ヌクレオチド配列；
ｄ）配列番号１〜４のいずれか一つのヌクレオチド配列を含む核酸と、少なくとも８０％のヌクレオチド同一性を有する核酸、または、相補ヌクレオチド配列；
ｅ）配列番号１〜４のいずれか一つのヌクレオチド配列を含む核酸と、８５％、９０％、９５％または９８％のヌクレオチド同一性を有する核酸、または、相補ヌクレオチド配列；
ｆ）高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、１）配列番号１〜４のいずれか一つもしくは相補ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列を含む核酸とハイブリダイズする核酸；
ｇ）配列番号５または６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸；および、
ｈ）配列番号５または６から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸。
【０２２０】
第一の実施形態によれば、本発明に係る組換えベクターは、そこに挿入された核酸を増幅し、続いて望ましい細胞宿主に形質転換またはトランスフェクションするのに用いられる。
第二の実施形態によれば、本発明に係る組換えベクターは、本発明に係る核酸に加えて、調節シグナルまたはヌクレオチド配列を含む発現ベクターに相当し、当該調節シグナルまたはヌクレオチド配列は、核酸およびそれをコードするｍＲＮＡの転写および／または翻訳に向けられた、または、制御するものである。
【０２２１】
好ましい実施形態によれば、本発明に係る組換えベクターは、特に、以下の要素を含み得る：
（１）挿入しようとする核酸の発現を調節する要素またはシグナル、例えばプロモーターおよび／またはエンハンサー配列；
（２）このようなベクターに挿入しようとする本発明に係る核酸内に含まれるヌクレオチドコーディング領域、前記コーディング領域は、（１）に記載の調節要素またはシグナルを含むフェーズに置かれる；および、
（３）（２）に記載の核酸のヌクレオチドコーディング領域の転写の開始および終結に適切な核酸。
【０２２２】
加えて、本発明に係る組換えベクターは、１またはそれ以上の、細胞宿主中でそれらの増幅または発現が検索される複製起点、マーカーまたは選択的マーカーを含み得る。
一例として、細菌プロモーターとしては、ＬａｃＩまたはＬａｃＺプロモーター、Ｔ３またはＴ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、λファージＰＲまたはＰＬプロモーターが挙げられる。
【０２２３】
真核細胞のためのプロモーターとしては、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）ウイルスチミジンキナーゼプロモーター、またあるいは、マウスメタロチオネイン−Ｌプロモーターが挙げられる。
一般的に、適切なプロモーターの選択に関して、当業者は、好ましくは上述したＳａｍｂｒｏｏｋ等の教本 （１９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ． ２ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、または、Ｆｕｌｌｅｒ等により説明された技術（１９９６， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎ： Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）を参照することができる。
【０２２４】
ＡＢＣＡ１２遺伝子のゲノム配列の発現が検索される場合、大きい挿入配列を含ませることが可能なベクターを用いることが好ましい。特定の実施形態において、バクテリオファージベクター、例えばＰ１バクテリオファージベクター、例えば、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ により説明されたベクターｐ１５８もしくはベクターｐ１５８／ｎｅｏ８（１９９２， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．， ８：１−１６；１９９４， Ｍａｍｍ． Ｇｅｎｏｍｅ， ５：３９７−４０４）が好ましく用いられる。
【０２２５】
本発明に係る好ましい細菌ベクターとしては、例えば、ベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）、またあるいは、ｐＡＡ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）およびｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ）のようなベクターが挙げられる。
また、他の市販のベクター、例えばベクターｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＡ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴＩ、ｐＳＧ（ストラタジーン社）も挙げられる。
【０２２６】
また、バキュロウイルスタイプのベクター、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来のＳｆ９系（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１７１１）のトランスフェクト細胞に用いられるベクターｐＶＬ１３９２／１３９３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）も挙げられる。
また、アデノウイルスベクター、例えば２型または５型のヒトアデノウイルスが挙げられる。
【０２２７】
また、本発明に係る組換えベクターは、レトロウイルスのベクターまたはアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）であり得る。このようなアデノ随伴ベクターとしては、例えばＦｌｏｔｔｅ等（１９９２， Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ， ７：３４９−３５６）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９８９， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６３：３８２２−３８２８）、または、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ＢＡ等（１９９６， Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．， ５９：５６１−５６９）で説明されている。
【０２２８】
本発明に係るポリヌクレオチドを発現させるため、後者を宿主細胞に挿入しなければならない。本発明に係るポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、細胞を形質転換またはトランスフェクトするための当業者周知の技術に従って、プライマー培地物中か、または、細胞系の形態のいずれかで、インビトロで行うことができる。また、ＡＢＣＡ１２欠損症に関連する病気の予防または治療のために、本発明に係るポリヌクレオチドのインビボまたはエクスビボでの導入を行うこともできる。
【０２２９】
本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを宿主細胞に導入するために、当業者は、好ましくは、様々な技術、例えばリン酸カルシウム沈殿技術（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， １９７３， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ５２：４５６−４５７ ； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ， ７ ： ２７４５−２７５２）、ＤＥＡＥデキストラン（Ｇｏｐａｌ， １９８５， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ， ５：１１８８− １１９０）、エレクトロポレーション（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ， １８９６， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ６：７１６−７１８ ； Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．， ８１（２２）：７１６１−５）、直接的なマイクロインジェクション（Ｈａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ， １０１：１０９４−１０９５）、ＤＮＡで充填したリポソーム（Ｎｉｃｏｌａｕ ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ， １４９：１５７−７６； Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９７９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７６：３３４８−３３５２）を参照することができる。
【０２３０】
ポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたら、そのポリヌクレオチドは、細胞のゲノムに安定して統合され得る。統合は、相同組換えによりゲノムの正確な部位で達成することもできるし、または、ランダムに統合してもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、宿主細胞中で、エピソーム断片の形態で、安定して維持することができ、このエピソームは、細胞周期から独立して、または、細胞周期と同調した方法で、該ポリヌクレオチドを保持および複製させる配列を含む。
【０２３１】
特定の実施形態によれば、本発明に係るポリヌクレオチドを、宿主細胞、特にインビボで哺乳動物から得られた宿主細胞にを導入する方法は、医薬上適合可能なベクターと、適切な調節配列の制御下に置かれた本発明に係る「裸の」ポリヌクレオチドとを含む調製物を、選択された組織のレベルに局所注射で導入する工程を含み、上記選択された組織とは、例えば心筋組織であり、当該「裸の」ポリヌクレオチドはこの組織の筋細胞で吸収される。
【０２３２】
インビトロおよびインビボで使用するための「裸の」ポリヌクレオチドを含む組成物は、例えばＰＣＴ出願第ＷＯ９５／１１３０７号で説明されており（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ， Ｉｎｓｅｒｍ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｔｔａｗａ）、同様に、Ｔａｃｓｏｎ等による論文（１９９６， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２（８）：８８８−８９２）およびＨｕｙｇｅｎ等による論文（１９９６， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２（８）：８９３−８９８）で説明される。
本発明の特定の実施形態によれば、ＡＢＣＡ１２タンパク質のいずれか一つのインビボ生産のための組成物が提供される。この組成物は、溶液中、生理学的に許容できるベクター中、適切な調節配列の制御下に置かれたＡＢＣＡ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０２３３】
選択された宿主生物に注入されたベクターの量は、注入部位に応じて変えることができる。ガイドに従って、ＡＢＣＡ１２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを約０．１〜約１００μｇの範囲で、動物の体に、好ましくはＡＢＣＡ１２遺伝子欠損症に関連する病気を発症しやすい患者に注入することができる。従って、本発明はまた、ＡＢＣＡ１２欠損症に罹った患者または被験者の予防または治療を意図した医薬組成物に関し、当該医薬組成物は、１またはそれ以上の生理学的に適合可能な添加剤と組み合わせて、短鎖または完全長ＡＢＣＡ１２タンパク質をコードする核酸を含む。
好ましくは、このような組成物は、配列番号１〜４のいずれか一つのヌクレオチド配列を含む核酸を含み、ここで該核酸は、適切な調節要素またはシグナルの制御下に置かれる。
【０２３４】
加えて、本発明の主題は、ＡＢＣＡ１２欠損症に罹った患者または被験者の予防または治療を意図した医薬組成物であり、当該医薬組成物は、１またはそれ以上の生理学的に適合可能な添加剤と組み合わせて、本発明に係る組換えベクターを含む。
また、本発明は、親油性物質輸送の機能障害、または、染色体遺伝子座２ｑ３４に位置する病状（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、またはインスリン依存性糖尿病）に罹った被験者の予防または治療を目的とした薬剤を製造するための、ＡＢＣＡ１２タンパク質アイソフォームのいずれか一つをコードする本発明に係る核酸の使用に関する。
【０２３５】
また、本発明は、親油性物質輸送の機能障害、または、染色体遺伝子座２ｑ３４に位置する病状（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、またはインスリン依存性糖尿病）に罹った被験者の予防または治療を目的とした薬剤を製造するための、本発明に係る、ＡＢＣＡ１２タンパク質のいずれか一つをコードする核酸を含む組換えベクターの使用に関する。
【０２３６】
従って、本発明の主題はまた、ＡＢＣＡ１２タンパク質またはポリペプチドのいずれか一つをコードする本発明に係る核酸を含む組換えベクターである。
また、本発明は、親油性物質の欠損症の輸送に関連する病気または状態、または、染色体遺伝子座２ｑ３４に位置する病状（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、またはインスリン依存性糖尿病）の治療および／または予防を意図した医薬組成物を調製するための、このような組換えベクターの使用に関する。
【０２３７】
また、本発明は、このような本発明に係る組換えベクターでエクスビボにおいて遺伝的に改変された細胞の使用、または、組換えベクターを生産する細胞の使用に関し、ここで該細胞は、体内に移植され、少なくとも生物学的に活性なＡＢＣＡ１２ポリペプチドをインビボで持続的および効果的に発現させる。
身体の遺伝子治療方法に有用なベクター、および、このようなベクターを含む組成物である。
【０２３８】
また、本発明は、ＡＢＣＡ１２欠損症に関連する病状の治療のための、新規の治療方法に関する。本発明は、遺伝子治療によりＡＢＣＡ１２欠損症の病状を治療する可能性を示すことによって従来技術の不利益に対する有利な解決法を提供しており、当該遺伝子治療は、親油性物質の輸送、または、染色体遺伝子座２ｑ３４に位置する病状に関与する少なくとも１つのＡＢＣＡ１２タンパク質をコードする遺伝子のインビボでのトランスファーおよび発現によってなされる。従って、本発明は、例えば、糖尿病、動脈硬化症、炎症、心臓血管障害、代謝障害、親油性物質関連の病状、層状魚鱗癬、および多形先天性白内障のような関連病状を、特異的に有効に治療する簡単な手段を提供する。
【０２３９】
遺伝子治療は、欠乏または異常（変異、異所発現など）を修正すること、および、遺伝情報を病気に罹った細胞または器官に導入することによって治療上利益のあるタンパク質の発現を起こすこと、を含む。この遺伝情報を、器官より抽出された細胞にエクスビボで導入し、続いて改変細胞を身体に再導入してもよいし、または、直接インビボで適切な組織に導入してもよい。
【０２４０】
この第二のケースにおいて、様々な技術が存在し、なかでも、ＤＮＡとＤＥＡＥデキストランとの複合体（Ｐａｇａｎｏ ｅｔ ａｌ．， １９６７． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， １：８９１）、ＤＮＡと核タンパク質との複合体（Ｋａｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：３７５）、ＤＮＡと脂質との複合体（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８７， ＰＮＡＳ ８４：７４１３）、リポソームの使用（Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９８０， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２５５：１０４３１）などを用いた様々なトランスフェクション技術が挙げられる。ごく近年、遺伝子輸送のためのベクターとしてウイルスを用いる技術が、これらの物理的なトランスフェクション技術の有望な代替法として登場してきた。それに関して、様々なウイルスが、特定の細胞集団に感染することができる能力に関して試験された。特に、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＨＭＳ、ＭＭＳなど）、ＨＳＶウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびアデノウイルスである。
【０２４１】
従って、本発明はまた、ＡＢＣＡ１２欠損症に関連する病状の治療のための新規の治療方法に関し、インビボでＡＢＣＡ１２をコードする遺伝子を輸送および発現させることを含む。特に好ましい方法において、本出願人は、少なくとも１つのＡＢＣＡ１２タンパク質アイソフォームをコードする核酸を含む組換えベクターを構築し、これら組換えベクターをインビボで投与することが可能であること、さらに、この投与により、細胞病理学的な影響を与えずに、少なくとも１つの生物学的に活性なＡＢＣＡ１２タンパク質を、安定して効果的にインビボで発現させることができるということを見出した。
【０２４２】
アデノウイルスは、特に、ＡＢＣＡ１２遺伝子の輸送および発現のための効率的なベクターを構成する。ベクターとして組換えアデノウイルスを使用することにより、所望の治療効果を得るのに十分に高いレベルの所定の遺伝子発現を得ることができる。遺伝子の安定な発現を可能にする、他のウイルスベクター、例えばレトロウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）も特許請求される。
【０２４３】
従って、本発明は、ＡＢＣＡ１２欠損症の治療および予防のための新規の方法を提供する。
従って、本発明の主題はまた、欠損組換えウイルスであり、当該欠損組換えウイルスは、親油性物質の代謝、または、染色体遺伝子座２ｑ３４に位置する病状（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、またはインスリン依存性糖尿病）に関与する少なくとも１つのＡＢＣＡ１２タンパク質アイソフォームをコードする本発明に係る核酸を含む。
【０２４４】
また、本発明は、ＡＢＣＡ１２欠損症の治療および／または予防に有用であり得る医薬組成物の調製のためのこのような欠損組換えウイルスの使用に関する。
また、本発明は、このような本発明に係る欠損組換えウイルスでエクスビボで遺伝的に改変された細胞、または、欠損組換えウイルスを生産する細胞の使用に関し、ここで該細胞は、体内に移植され、少なくとも１つの生物学的に活性なＡＢＣＡ１２ポリペプチドをインビボで持続的および効果的に発現させる。
【０２４５】
本発明は、有害な影響を与えない制御されたＡＢＣＡ１２の発現の誘導を、このタンパク質の発現に通常は関与しない器官において可能にするため、特に有利である。特に、短鎖または完全長ＡＢＣＡ１２タンパク質の顕著な放出は、本発明のベクターを生産する細胞、または、エクスビボで本発明のベクターで感染させた細胞を移植することによって得られる。
【０２４６】
本発明に関して生産されたこれらＡＢＣタンパク質輸送体の活性は、ヒトまたは動物のＡＢＣＡ１２型であり得る。本発明に関して用いられた核酸配列としては、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＲＮＡ（レトロウイルスの場合）、または、例えば、１またはそれ以上のイントロンｇＤＮＡが挿入されたｃＤＮＡを含むハイブリッド構造が可能である。また本発明は、合成または半合成の配列を含み得る。特に有利な形態において、ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡが用いられる。特に、ｇＤＮＡの使用により、ヒト細胞においてより優れた発現が可能である。それらを本発明に係るウイルスベクターに組み込むことによって、これらの配列は、特に、適切な制限部位を挿入するために、例えば部位特異的突然変異誘発により好ましく改変される。実際には、従来技術に記載の配列は本発明に係る使用のためには構成されておらず、適応する前に、実質的な発現を得るために必要性を検証してもよい。本発明に関して、ヒトＡＢＣＡ１２タンパク質のいずれか一つをコードした核酸配列の使用が好ましい。その上、ＡＢＣＡ１２タンパク質のいずれか一つの誘導体をコードする構成物を用いることも可能である。ＡＢＣＡ１２タンパク質のいずれか一つの誘導体は、例えば、野生型配列に対する変異、欠失および／または付加により得られるすべての配列を含む。これらの改変は、当業者既知の技術によってなされ得る（下記の一般的な分子生物学的な技術を参照）。次に、このようにして得られた誘導体の生物活性を、特に細胞からの基質の流出の測定を説明した実施例において示すように、容易に測定することができる。また、本発明の目的のための誘導体は、プローブとして野生型配列またはそれらの断片を用いて、核酸ライブラリーからハイブリダイゼーションすることによって得ることができる。
【０２４７】
これらの誘導体は、特に、それらの結合部位に対するより高い親和性を有する分子、より大きいプロテアーゼ耐性を示す分子、より高い治療効率、もしくはより少ない副作用を有し、必要に応じて新規の生物学的特性を有する分子である。また、当該誘導体は、インビボでの発現を改善できる改変ＤＮＡ配列も含まれる。
【０２４８】
第一の実施形態において、本発明は、短鎖または完全長ＡＢＣＡ１２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含む欠損組換えウイルスに関する。他の本発明の好ましい実施形態において、欠損組換えウイルスは、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つのアイソフォームをコードするゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を含む。好ましくは、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドは、それぞれ配列番号５または６から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０２４９】
本発明のベクターは、様々なタイプのウイルスから調製できる。好ましくは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）またはレトロウイルス由来のベクターが用いられる。直接投与や、移植される予定の細胞のエクスビボでの改変のためには、アデノウイルスを用い、または、生産細胞の移植のためには、レトロウイルスを用いることが好ましい。
【０２５０】
本発明に係るウイルスは、欠陥ウイルスであり、すなわち、標的細胞で自立的に複製することができない。通常、本発明で用いられる欠損ウイルスのゲノムは、それゆえに、少なくとも感染細胞で前記ウイルスを複製するのに必要な配列が欠失している。これらの領域は、除去される（完全または部分的に）、または、非機能的にされる、または、他の配列で、特にＡＢＣＡ１２タンパク質のいずれか一つをコードする核酸配列で置換される、のいずれかであり得る。好ましくは、上記欠損ウイルスは、ウイルス粒子のキャプシド化に必要なそのゲノムの配列をそれでもなお保持する。
【０２５１】
より特定にアデノウイルスに関しては、構造および特性がいくぶん多様な様々な血清型を特徴とする。これら血清型のなかでも、２または５型のヒトアデノウイルス（Ａｄ２またはＡｄ５）、または、動物起源のアデノウイルス（出願ＷＯ９４／２６９１４を参照）が、本発明で好ましく用いられる。本発明で用いられる動物起源のアデノウイルスのなかでも、イヌ、ウシ、マウス（例えば、Ｍａｖ１がある：Ｂｅａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５（１９９０）８１）、ヒツジ、ブタ、鳥類またはサル（例えば、ＳＡＶ）起源のアデノウイルスが挙げられる。動物起源のアデノウイルスとして好ましくは、イヌのアデノウイルスであり、より好ましくはＣＡＶ２アデノウイルス［例えば、ＭａｎｈａｔｔａｎまたはＡ２６／６１株（ＡＴＣＣ  ＶＲ−８００）］である。好ましくは、ヒトもしくはイヌ、または、複合起源のアデノウイルスが、本発明に関して用いられる。好ましくは、本発明の欠損アデノウイルスは、ＩＴＲ、キャプシド化させる配列、および、ＡＢＣＡ１２タンパク質のいずれか一つをコードする配列を含む。好ましくは本発明のアデノウイルスのゲノムにおいて、少なくともＥ１領域が非機能化される。本発明のアデノウイルスのゲノムにおいて、さらにより好ましくは、Ｅ１遺伝子、および、Ｅ２、Ｅ４およびＬ１〜Ｌ５遺伝子の少なくとも一つが、非機能的である。考慮されたウイルス遺伝子は、当業者既知のいかなる技術によって非機能化でき、特に、考慮された遺伝子で、全て抑制、置換、部分的欠失、または、１またはそれ以上の塩基を付加することによって、非機能化できる。このような改変は、例えば、遺伝子工学技術により、または、変異誘発物質での処理により、インビトロ（単離されたＤＮＡに）、または、インサイチュで達成できる。また、他の領域も改変することができ、特に、Ｅ３（Ｗ０９５／０２６９７）、Ｅ２（Ｗ０９４／２８９３８）、Ｅ４（Ｗ０９４／２８１５２、Ｗ０９４／１２６４９、Ｗ０９５／０２６９７）およびＬ５（Ｗ０９５／０２６９７）領域である。好ましい実施形態によれば、本発明に係るアデノウイルスは、Ｅ１およびＥ４領域に欠失を含み、ＡＢＣＡ１２のいずれか一つをコードする配列は、不活性化したＥ１領域のレベルに挿入される。他の好ましい実施形態によれば、本発明に係るアデノウイルスは、Ｅ４領域とＡＢＣＡ１２のいずれか一つをコードする配列（フランス国特許出願ＦＲ９４１３３５５）とが挿入されるレベルで、Ｅ１領域に欠失を含む。
【０２５２】
本発明に係る欠損組換えアデノウイルスは、当業者既知のいかなる技術によっても調製することができる（Ｌｅｖｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．， １９９１ Ｇｅｎｅ １０１； ＥＰ １８５ ５７３； ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ， １９８４， ＥＭＢＯ Ｊ．， ３：２９１７）。特に、当該アデノウイルスは、アデノウイルスと、特に、短鎖または完全長ＡＢＣＡ１２タンパク質をコードする核酸を含むプラスミドとの間の相同組換えによって、調製することができる。相同組換えは、前記アデノウイルスおよびプラスミドを適切な細胞系にコトランスフェクションすることによって達成される。用いられる細胞系は、好ましくは、（ｉ）前記要素によって形質転換可能でなければならない、および、（ｉｉ）組換えのリスクを回避するために、欠損アデノウイルスゲノムの部分を補足できる配列を、好ましくは統合された形態で含まなければならない。系の例としては、ヒト胎児腎臓系２９３（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， １９７７， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．， ３６：５９）が挙げられ、この系は、特に、そのゲノムに統合された、Ａｄ５アデノウイルスのゲノムの左の部分（１２％）を含み、または、特に出願番号ＷＯ９４／２６９１４およびＷ０９５／０２６９７で説明されたＥ１およびＥ４の機能を補足することができる系が挙げられる。
【０２５３】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に関しては、比較的サイズが小さいＤＮＡウイルスであり、これらは、安定な部位特異的な方法で、それらが感染する細胞のゲノムに統合される。アデノ随伴ウイルスは、細胞性成長、形態学または分化にいかなる影響を誘発させることなく、広範な細胞に感染することができる。その上、アデノ随伴ウイルスは、ヒトでの病状に関与しないと思われる。ＡＡＶのゲノムが、クローン化され、配列解析され、特徴付けられている。ＡＡＶは、約４７００個の塩基からなり、各末端に、ウイルスの複製起点として作用する約１４５塩基の逆位反復領域（ＩＴＲ）を含む。そのゲノムの残りの部分は、キャプシド化機能を有する２つの主要な領域に分けられ、ゲノムの左側の部分は、ウイルス性複製とウイルス性遺伝子の発現とに関与するｒｅｐ遺伝子を含み、ゲノムの右側の部分は、ウイルスキャプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を含む。
【０２５４】
インビトロおよびインビボでの遺伝子輸送のための、ＡＡＶ由来のベクターの使用が、文献で説明されている（特に、ＷＯ９１／１８０８８；ＷＯ９３／０９２３９；ＵＳ４，７９７，３６８、ＵＳ５，１３９，９４１、ＥＰ４８８５２８を参照）。これらの出願は、ＡＡＶ由来の様々な構成物を説明しており、それにおいて、ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子が除去され、所定の遺伝子で置換されており、それらの使用は、前記所定の遺伝子をインビトロで（培養物中の細胞に）またはインビボで（直接的に生物に）輸送するためである。しかしながら、これら文書のいずれも、インビボまたはエクスビボでのＡＢＣＡ１２タンパク質のいずれか一つの輸送および発現のための組換えＡＡＶの使用、または、このような輸送の利益について、記載も示唆もしていない。本発明に係る欠損組換えＡＡＶは、ヒトヘルパーウイルス（例えばアデノウイルス）を感染させた細胞系へ、２つのＡＡＶ逆位反復領域（ＩＴＲ）に隣接した短鎖または完全長ＡＢＣＡ１２タンパク質をコードする配列を含むプラスミドと、ＡＡＶキャプシド化遺伝子（ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）を含むプラスミドとをコトランスフェクションすることによって、調製することができる。次に、作製された組換えＡＡＶは、従来の技術により精製される。
【０２５５】
ヘルペスウイルスおよびレトロウイルスに関しては、組換えベクターの構築は、広く文献で説明されており、特に、Ｂｒｅａｋｆｉｅｌｄ等（１９９１ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ， ３：２０３）；ＥＰ４５３２４２、ＥＰ１７８２２０、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ等（１９８５）；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ（１９８５． ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ３：６８９）などを参照できる。
【０２５６】
特に、レトロウイルスは、統合型のウイルス（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ）であり、分裂した細胞に感染する。レトロウイルスのゲノムは、本質的には、２つの長い末端反復（ＬＴＲ）、キャプシド化配列、および、３つのコーディング領域（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を含む。レトロウイルス由来の組換えベクターにおいて、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子は、一般的に完全または部分的に欠失しており、所定の異種核酸配列で置換されている。これらベクターは、様々なタイプのレトロウイルス、例えば、特にＭｏＭｕＬＶ（「マウスモロニー白血病ウイルス」、または、ＭｏＭＬＶとも呼ばれる）、ＭＳＶ（「マウスモロニー肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「ハーベイ肉腫ウイルス」）；ＳＮＶ（「脾臓ネクローシスウイルス」）；ＲＳＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）またはフレンドウイルスから生産することができる。
【０２５７】
本発明に係るＡＢＣＡ１２タンパク質のいずれか一つをコードする配列を含む組換えレトロウイルスを構築するために、一般的に、特にＬＴＲ、キャプシド化配列および前記コーディング配列を含むプラスミドを構築し、いわゆるキャプシド化細胞系をトランスフェクトするのに用いられ、プラスミドの翻訳においてレトロウイルス機能の欠陥を提供することができる。通常、キャプシド化系は、それゆえに、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を発現することができる。このようなキャプシド化系は、従来技術で説明されており、特に、ＰＡ３１７系（ＵＳ４，８６１，７１９）、ＰｓｉＣＲＩＰ系（ＷＯ９０／０２８０６）、および、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２系（ＷＯ８９／０７１５０）である。その上、組換えレトロウイルスは、転写活性を抑制するために、ＬＴＲのレベルでの改変を含ませることができ、同様に、ｇａｇ遺伝子の部分を含む拡張されたキャプシド化配列を含ませることができる（Ｂｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６１：１６３９）。作製された組換えレトロウイルスは、次に、従来の技術で精製される。
【０２５８】
本発明を実施するために、欠損組換えアデノウイルスを用いることが好ましい。アデノウイルスの特に有利な特性は、親油性基質の輸送活性を有するタンパク質のインビボでの発現に好ましい。本発明に係るアデノウイルスベクターは、それらの移植を考慮すると、精製懸濁液のインビボでの直接投与、または、細胞（特に自己由来の細胞）のエクスビボでの形質転換が、特に好ましい。その上、本発明に係るアデノウイルスベクターは、加えて、例えば、特にそれらの非常に高い感染効率のような相当な利益を示し、それにより少量のウイルス性懸濁液を用いて感染を行うことが可能である。
【０２５９】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、ＡＢＣＡ１２タンパク質のいずれか一つをコードする配列を含むレトロウイルスベクターを生産する系が、インビボでの移植に用いられる。この目的に用いることができる系は、特に、ＰＡ３１７（ＵＳ４，８６１，７１９）、ＰｓｉＣｒｉｐ（ＷＯ９０／０２８０６）およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２（ＵＳ５，２７８，０５６）細胞であり、これらは本発明に係る短鎖または完全長ＡＢＣＡ１２タンパク質をコードする核酸配列を含むレトロウイルスが生産されるように改変された細胞である。例えば、全能性幹細胞、血液細胞系の前駆体を、被験者から回収し、単離することができる。これらの細胞を培養する場合、細胞は、次に、マクロファージに特異的なウイルス、非ウイルスまたは非ウイルスプロモーターの制御下で、または、それ自身のプロモーターの制御下で、短鎖または完全長ＡＢＣＡ１２タンパク質をコードする配列を含むレトロウイルスのベクターでトランスフェクトされる。次に、これら細胞は、被験者に再導入される。これら細胞の分化は、ＡＢＣＡ１２タンパク質の少なくとも１つを発現する血液細胞を生じさせる可能性がある。
【０２６０】
好ましくは、本発明のベクターにおいて、ＡＢＣＡ１２タンパク質のいずれか一つをコードする配列は、感染細胞でそれを発現させるシグナルの制御下に置かれる。これらシグナルは、相同または異種の発現シグナルであり、いわゆる、通常ＡＢＣＡ１２タンパク質の発現を生じさせるシグナルとは異なるシグナルである。また、当該シグナルは、特に、他のタンパク質または合成配列の発現を生じさせる配列でもよく、特に、真核生物もしくはウイルス遺伝子の配列または誘導された配列でもよく、特異的な方法、またあるいは、誘導性の方法で遺伝子転写を刺激または抑制する。一例として、感染が望まれる細胞のゲノムから誘導されたプロモーター配列、または、ウイルスのゲノムから誘導されたプロモーター配列が可能であり、特に、Ｅ１Ａのプロモーター、または、アデノウイルスの主要後期プロモーター（ＭＬＰ）遺伝子、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲなどであり得る。真核生物のプロモーターのなかでも、ユビキタスプロモーター（ＨＰＲＴ、ビメンチン、α−アクチン、チューブリンなど）、中間フィラメントのプロモーター（デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰなど）、治療用遺伝子のプロモーター（ＭＤＲ、ＣＦＴＲまたはＶＩＩＩ型ファクターなどのプロモーター）、組織特異的プロモーター（ピルビン酸キナーゼ、ビリン、脂肪酸結合腸タンパク質のプロモーター、平滑筋細胞α−アクチンのプロモーター、肝臓に特異的なプロモーター；ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＩ、ヒトアルブミンなど）、または、刺激に対応するプロモーター（ステロイドホルモン受容体、レチノイン酸受容体など）が挙げられる。加えて、これらの発現配列は、エンハンサーまたは調節配列などの付加によって修飾することができる。その上、挿入遺伝子が発現配列を含まない場合、欠損ウイルスのゲノムのこのような配列の下流に発現配列を挿入することができる。
【０２６１】
特定の実施形態において、本発明は、ＲＳＶ−ＬＴＲまたはＣＭＶ初期プロモーターから選択されるプロモーターの制御下にある、ＡＢＣＡ１２タンパク質のいずれか一つをコードする核酸を含む欠損組換えウイルスに関する。
【０２６２】
上述したように、本発明はまた、親油性物質の輸送に関連する病状、または、染色体遺伝子座２ｑ３４に位置する病状（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、またはインスリン依存性糖尿病）の治療および／または予防のための医薬組成物を調製するための、上述したウイルスのいずれかの使用に関する。
【０２６３】
また、本発明は、上述した１またはそれ以上の欠損組換えウイルスを含む医薬組成物に関する。これら医薬組成物は、局所的、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内または経皮経路などにより投与するために調合することができる。好ましくは、本発明の医薬組成物は、注射可能な製剤用、特に例えば患者の門脈への静脈注射用の製薬上許容できるビヒクルまたは生理学的に適合可能な添加剤を含む。それらは特に、等張滅菌溶液、または、乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物と合わせられ、これらは、滅菌水または生理食塩水の場合に応じて加えられ、注射用溶液を調製することができる。患者の門脈への直接注射は、肝臓のレベルでの感染を標的化し、それによりこの臓器のレベルでの治療効果を高めることを可能にするために好ましい。
【０２６４】
注射に用いられる欠損組換えウイルスの用量は、様々なパラメーターの機能、および、特に、用いられるウイルスベクター、投与様式、関連のある病状、または、所望の治療継続時間の機能などに応じて、調節することができる。一般的に、本発明に係る組換えアデノウイルスは、１０４〜１０１４ｐｆｕ／ｍｌ、好ましくは１０６〜１０１０ｐｆｕ／ｍｌの用量の形態で配合され、投与される。「ｐｆｕ」（プラーク形成単位）という用語は、ウイルス溶液の感染力に相当し、適切な細胞培養に感染させ、一般的に４８時間後、感染細胞の溶解により生じるプラーク数を測定することによって測定される。ウイルス溶液のｐｆｕタイターを測定する技術は、文献で報告される。
【０２６５】
レトロウイルスに関しては、本発明に係る組成物は、それらの移植を目的として、直接、生産細胞を含んでよい。
それに関して、本発明の他の主題は、１またはそれ以上の上述の欠損組換えウイルスで感染させたすべての哺乳動物細胞に関する。より特定には、本発明は、これらのウイルスで感染させたすべてのヒト細胞集団に関する。哺乳動物細胞としては、特に、血液起源の細胞（全能性幹細胞または前駆体）、線維芽細胞、筋原細胞、肝細胞、ケラチノサイト、平滑筋および内皮細胞、グリア細胞などが挙げられる。
【０２６６】
本発明に係る細胞は、初代培養物から得ることができる。これらを、当業者既知のいずれかの技術によって回収し、次に、それらを増殖させる条件下で培養することができる。より特定に線維芽細胞に関しては、これらは、容易にバイオプシーから得ることができ、例えばＨａｍ（１９８０）により説明された技術に従ってなされる。これら細胞は、ウイルス感染に直接用いてもよいし、または、その後の使用を考慮した自己由来のライブラリー構築のために、例えば凍結することによって保存してもよい。本発明に係る細胞は、例えば予備的ライブラリーから得られた二次培養でもよい（例えば、ＥＰ２２８４５８、ＥＰ２８９０３４、ＥＰ４０００４７、ＥＰ４５６６４０を参照）。
【０２６７】
次に、培養中の細胞を本発明に係る組換えウイルスで感染させ、少なくとも１つの生物学的に活性なＡＢＣＡ１２タンパク質を生産する能力をそれらに付与する。感染は、当業者既知の技術に従って、インビトロで行われる。特に、用いられる細胞のタイプ、および、細胞あたりの所望のウイルスコピー数に応じて、当業者は、感染の多重度や、必要に応じて、生産される感染サイクル数を、調節することができる。これら工程は、細胞がインビボで投与を目的とされる場合、適切な無菌条件下で行わなければならないことは言うまでもない。細胞の感染に用いられる組換えウイルスの用量は、所望の目的に従って当業者により調節することができる。上述のインビボ投与での条件は、インビトロでの感染に適用させることができる。レトロウイルスでの感染に関して、本発明に係る組換えレトロウイルスを生産する細胞と、感染させる細胞を共培養させることもできる。それにより、レトロウイルスの精製を省くことを可能にする。
【０２６８】
本発明の他の主題は、１またはそれ以上の本発明に係る欠損組換えウイルス、または、組換えウイルスを生産する細胞に感染した哺乳動物細胞、および、細胞外基質を含むインプラントに関する。好ましくは、本発明に係るインプラントは、１０５〜１０１０個の細胞を含む。より好ましくは、それらは、１０６〜１０８個の細胞を含む。
より特定には、本発明のインプラントにおいて、細胞外基質は、ゲル化化合物、および、必要に応じて、細胞を固定させる支持体を含む。
【０２６９】
本発明に係るインプラントの調製のために、様々なタイプのゲル化剤を用いることができる。ゲル化剤は、ゲルの構造を有するマトリックスに細胞を封入するのに用いられ、必要に応じて、細胞の支持体への固定を強化するのに用いられる。それゆえに、様々な細胞の接着剤をゲル化剤として用いることができ、例えば、特にコラーゲン、ゼラチン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、レクチンなどが挙げられる。好ましくは、コラーゲンが本発明で用いられる。これは、ヒト、ウシまたはマウス由来のコラーゲンであり得る。より好ましくは、Ｉ型コラーゲンが用いられる。
【０２７０】
上述したように、本発明に係る組成物は、好ましくは、細胞を固定させる支持体を含む。固定という用語は、細胞の支持体への接着および／または付着を起こさせる生物学的および／または化学的および／または物理的相互作用のすべての形態を示す。その上、細胞は、用いられる支持体を被覆する、もしくは、この支持体の内部に浸透する、またはその両方のいずれかが可能である。本発明に関して、固体の、非毒性および／または生体適合性の支持体を用いることが好ましい。特に、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）繊維、または、生物起源の支持体を用いることが可能である。
【０２７１】
従って、本発明は、遺伝子座２ｑ３４に統計的に関連する病状（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、およびインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ１３））の治療または予防のための非常に有効な手段を提供する。
加えて、この治療は、ヒトおよびすべての動物（例えばヒツジ、ウシ、家畜（イヌ、ネコなど）、ウマ、魚類など）のいずれにも適用させることができる。
【０２７２】
組換え宿主細胞
本発明は、本発明の核酸、より特定には、配列番号１〜４から選択されたヌクレオチド配列またはその相補ヌクレオチド配列を含む核酸を有する組換え宿主細胞に関する。
また、本発明は、本発明の核酸、より特定には、配列番号１〜４で示されたヌクレオチド配列または、その相補ヌクレオチド配列を含む核酸を有する組換え宿主細胞に関する。
【０２７３】
他の観点によれば、本発明はまた、本発明に係る組換えベクターを含む組換え宿主細胞に関する。それゆえに、本発明はまた、本発明の核酸のいずれか、より特定には、配列番号１〜４から選択されたヌクレオチド配列、または、その相補ヌクレオチド配列を含む核酸を有する組換えベクターを含む組換え宿主細胞に関する。
【０２７４】
また、本発明は、配列番号１〜４のいずれか一つで示されたヌクレオチド配列またはその相補ヌクレオチド配列を含む核酸を有する組換えベクターを含む組換え宿主細胞に関する。
【０２７５】
本発明に係る好ましい宿主細胞としては、例えば、以下のものが挙げられる。
ａ）原核宿主細胞：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株（ＤＨ５−α株）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ株、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株、または、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ種の株；
ｂ）真核宿主細胞：ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２）、Ｃｖ１細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０）、Ｓｆ−９細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７１１）、ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−６１）または３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−６３６１）。
【０２７６】
ＡＢＣＡ１２ポリペプチドを生産する方法
また、本発明は、配列番号５または６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むポリペプチドを生産する方法に関し、前記方法は、以下の工程を含む：
ａ）適切なベクターに前記ポリペプチドをコードする核酸を挿入すること；
ｂ）工程ａ）に記載の組換えベクターで予め形質転換した宿主細胞を適切な培地で培養すること、または、工程ａ）に記載の組換えベクターで宿主細胞をトランスフェクトすること；
ｃ）調節された培養液を回収すること、または、例えば音波破砕または浸透圧性ショックで宿主細胞を溶解すること；
ｄ）前記培養液から、または工程ｃ）で得られた細胞溶解物から前記ポリペプチドを分離および精製すること；および、
ｅ）必要に応じて、生産された組換えポリペプチドを特徴付けること。
【０２７７】
本発明に係るポリペプチドは、このポリペプチドに対して、または、前もって固定化されたその断片または変異体に対する抗体を持つイムノアフィニティクロマトグラフィーカラムに結合させることによって特徴付けることができる。
他の観点によれば、本発明に係る組換えポリペプチドを、適切な一連のクロマトグラフィーカラムに通して精製することができ、これは、当業者既知の方法や、例えばＦ． Ａｕｓｕｂｅｌ等（１９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ）に記載の方法に従ってなされ得る。
【０２７８】
また、本発明に係るポリペプチドは、均質な溶液または固相のいずれかにおける従来の化学合成技術によって調製することもできる。例として、本発明に係るポリペプチドは、Ｈｏｕｂｅｎ Ｗｅｙｌによって説明される均質な溶液（１９７４， Ｍｅｕｔｈｏｄｅ ｄｅｒ Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｅ． Ｗｕｎｓｃｈ Ｅｄ．， １５−Ｉ：１５−ＩＩ）、または、Ｍｅｒｒｆｉｅｌｄにより説明された固相合成技術（１９６５， Ｎａｔｕｒｅ， ２０７（９９６）：５２２−５２３； １９６５， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １５０（６９３）：１７８−１８５）のいずれかにおける技術で調製することができる。
【０２７９】
また、配列番号５または６から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに「相同な」と称されるポリペプチドも、本発明の一部を構成する。このような相同なポリペプチドは、配列番号５または６の同等のアミノ酸による、１またはそれ以上のアミノ酸置換を含有するアミノ酸配列を含む。
【０２８０】
本発明に係る「同等のアミノ酸」は、例えば、当業者周知の技術による、Ｄ型の残基でのＬ型の残基の置換、または、ピログルタミン酸でのグルタミン酸（Ｅ）の置換を意味すると理解される。例として、少なくとも１つのＤ型の残基を含むペプチド合成がＫｏｃｈにより説明されている（１９７７）。他の観点によれば、同じクラスに属する２種のアミノ酸、すなわち２種の非電荷の極性、非極性、塩基性または酸性アミノ酸もまた、同等のアミノ酸とみなされる。
【０２８１】
少なくとも１つの非ペプチド結合（例えばレトロ逆結合（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｅ ｂｏｎｄ）（ＮＨＣＯ）、カルバ結合（ｃａｒｂａ ｂｏｎｄ）（ＣＨ２ＣＨ２）またはケトメチレン結合（ＣＯ−ＣＨ２）を含むポリペプチドもまた、本発明の一部を構成する。
好ましくは、少なくとも１つのアミノ酸の１またはそれ以上の付加、欠失、置換を含む本発明に係るポリペプチドは、非改変ポリペプチドに対する抗体によって認識されるそれらの能力を保持し得る。
【０２８２】
抗体
本発明に係るＡＢＣＡ１２ポリペプチドは、特に、１）配列番号５または６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むポリペプチド、２）配列番号５または６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むポリペプチドのポリペプチド断片または変異体、または、３）配列番号５または６から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに「相同な」と称されるポリペプチドが、特に、患者において、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドの正常形態または改変形態の生産を検出するための抗体を調製するのに用いることができる。
【０２８３】
また、配列番号５または６から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに「相同な」と称されるポリペプチドに対する抗体も本発明の一部を構成する。このような抗体は、配列番号５または６の同等のアミノ酸による１またはそれ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む相同なポリペプチドに対する。
【０２８４】
本発明の目的のための「抗体」は、特に、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、または、断片（例えばＦ（ａｂ）’２およびＦａｂ断片）、または、本発明に係る標的ポリペプチドまたはポリペプチド断片を認識する１次抗体のドメインを含むポリペプチドのいずれかを意味すると理解される。
モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎにより説明された技術（１９７５， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５−４９７）に従ってハイブリドーマから調製することができる。
【０２８５】
本発明によれば、組換えまたは化学合成により製造されたポリペプチド、および、それらの断片または他の誘導体もしくは類似体（融合タンパク質も含む）は、本発明に係るポリペプチドを認識する抗体を生成するための免疫原として用いることができる。このような抗体としては、これらに限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂ断片、およびＦａｂ発現ライブラリーが挙げられる。本発明の抗ＡＢＣＡ１２抗体は、交差反応を起こし得、例えばそれらは異なる種からの対応するＡＢＣＡ１２ポリペプチドを認識し得る。ポリクローナル抗体は、交差反応を起こす可能性がより大きい。あるいは、本発明の抗体は、ＡＢＣＡ１２のいずれか一つの１本鎖形態に特異的であり得る。好ましくは、このような抗体は、ヒトＡＢＣＡ１２ポリペプチドアイソフォームのいずれか一つに特異的である。
【０２８６】
当業界既知の様々な方法を、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つ、それらの誘導体または類似体に対するポリクローナル抗体を生産するのに用いることができる。抗体生産のために、短鎖もしくは完全長ＡＢＣＡ１２ポリペプチドまたはそれらの誘導体（例えば、断片または融合タンパク質）を注入することにより、様々な宿主動物が免疫化することができ、宿主動物としては、これらに限定されないが、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどが挙げられる。一実施形態において、短鎖もしくは完全長ＡＢＣＡ１２ポリペプチドまたはそれらの断片は、免疫原性担体、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合させることができる。免疫応答を増加させるために、宿主種に応じて、様々なアジュバントを用いることができ、これらに限定されないが、フロインド（完全および不完全）、鉱物ゲル（例えば水酸化アルミニウム）、表面活性物質（例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン）、ペプチド、油性エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント（例えばＢＣＧ｛カルメット−ゲラン杆菌｝およびコリネバクテリウム−パルヴム）が挙げられる。
【０２８７】
ＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つ、または、それらの断片、類似体もしくは誘導体に対するモノクローナル抗体の調製に関して、培養中の連続細胞系による抗体分子の生産に貢献する技術のいずれかが使用できる。このような技術は、これらに限定されないが、初めにＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎにより開発されたハイブリドーマ技術（１９７５， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５−４９７）、同様に、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ， ４：７２； Ｃｏｔｅ ｅｔ ａｌ． １９８３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８０：２０２６−２０３０）、および、ヒトモノクローナル抗体を生産するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｉｎ： Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎａｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ． ７７−９６）。本発明の追加の実施形態において、モノクローナル抗体を無菌動物中で生産できる（ＷＯ８９／１２６９０）。実際、本発明によれば、「キメラ抗体」生産のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５９：８７０； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｎａｔｕｒｅ， ３１２：６０４−６０８； Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ， ３１４：４５２−４５４）を用いることができ、当該技術は、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つに特異的なマウス抗体分子から得られた遺伝子を、適切な生物活性のヒト抗体分子から得られた遺伝子と接合することにある。このような抗体は、本発明の範囲内である。このようなヒトまたはヒト化したキメラ抗体を、ヒトの病気または障害の治療に用いることが好ましく（以下で説明する）、なぜなら、ヒトまたはヒト化した抗体は、免疫応答、特にそれら自身のアレルギー応答を誘発する可能性が、異種の抗体よりもかなり低いためである。
【０２８８】
本発明によれば、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドに特異的な一本鎖抗体を生産するために、一本鎖抗体を生産するのに説明された技術（Ｈｕｓｔｏｎの、米国特許第５，４７６，７８６号および第５，１３２，４０５号；米国特許第４，９４６，７７８号）を用いることができる。本発明の追加の実施形態は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築について説明された技術を利用し（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１）、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つまたはその誘導体もしくは類似体に関する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片を迅速かつ簡便に同定できる。
【０２８９】
抗体分子のイディオタイプを含む抗体断片は、既知の技術によって製造できる。例えば、このような断片は、これらに限定されないが、抗体分子のペプシン消化によって製造できるＦ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を減らすことによって製造できるＦａｂ’断片、および、抗体分子をパパインと還元剤で処理することによって製造できるＦａｂ断片がある。
【０２９０】
抗体の製造において、所望の抗体のスクリーニングが、当業界で既知の技術によって達成でき、当該技術として、例えば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素様免疫吸着法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射定量測定法、ゲル内拡散沈降反応、免疫拡散分析、インサイチュイムノアッセイ（例えば、金コロイド、酵素または放射性同位体標識を用いる）、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集分析（例えば、ゲル凝集分析、血球凝集反応分析）、補体結合分析、免疫蛍光測定法、タンパク質Ａ分析（ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ａｓｓａｙ）、および免疫電気泳動分析などがある。一つの実施形態において、抗体結合は、一次抗体上の標識を検出することによって検出される。他の実施形態において、一次抗体は、二次抗体または試薬と、一次抗体との結合を検出することによって検出される。さらなる実施形態において、二次抗体が標識される。イムノアッセイにおける結合を検出するための多くの方法が当業界で既知であり、本発明の範囲内である。例えば、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つの特異的なエピトープを認識する抗体を選択するために、生成したハイブリドーマを、このようなエピトープを含むＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つの断片に結合する産物に関して分析することができる。特定の動物種からＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つに特異的な抗体を選択するために、その特定の動物の細胞によって発現された、または、その特定の動物の細胞から単離されたＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つのポジティブ結合に基づき選択することができる。
【０２９１】
前述の抗体は、例えばウエスタンブロッティングのようなＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つの局在および活性、インサイチュでのＡＢＣＡ１２ポリペプチド、適切な生理学的サンプルにおけるそれらの量の測定等に関する当業界で既知の方法で、上述した、または当業界で既知の検出技術のいずれかによって用いることができる。
【０２９２】
特定の実施形態において、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つの活性を作動または拮抗する抗体を生産することができる。このような抗体は、以下で説明するリガンドを同定するための分析を用いて試験できる。
【０２９３】
本発明は、１）配列番号５または６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むポリペプチド、２）配列番号５または６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むポリペプチドのポリペプチド断片または変異体、または、３）配列番号５または６から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに「相同な」と称されるポリペプチドに向けられた抗体に関し、これも本発明の一部を構成しており、Ｋｏｚｂｏｒ等により説明されるトリオーマ技術またはハイブリドーマ技術（１９８３， ハイブリドーマ， ２（１）：７−１６）で製造することができる。
【０２９４】
また、本発明は、米国特許第４，９４６，７７８号またはＭａｒｔｉｎｅａｕ等（１９９８， ＪＭｏｌ Ｂｉｏｌ， ２８０（１）：１１７− １２７）で説明されたような一本鎖Ｆｖ抗体断片（ＳｃＦｖ）に関する。
また本発明に係る抗体は、Ｒｉｄｄｅｒ等により説明されたファージライブラリー（１９９５， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮＹ）， １３（３）：２５５−２６０）、または、Ｒｅｉｎｍａｎｎ等（１９９７， ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ、１３（１１）：９３３−９４３）およびＬｅｇｅｒ等（１９９７， Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ８（１）：３−１６）により説明されたヒト化抗体を用いて得られた抗体断片を含む。
【０２９５】
本発明に係る抗体調製物は、サンプル中に存在する抗原の存在および／または量の同定を意図した免疫学的な検出試験において有用である。
本発明に係る抗体は、加えて、同位体または例えば蛍光のような非同位体である検出可能なマーカーを含んでよく、また、当業者に周知の技術によってビオチンのような分子とカップリングしてもよい。
【０２９６】
従って、本発明の他の主題は、サンプル中における本発明に係るポリペプチドの存在の検出方法であり、前記方法は、以下の工程を含む：
ａ）試験しようとするサンプルと、抗体とを接触させること、該抗体は、１）配列番号５または６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むポリペプチド、２）配列番号５または６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むポリペプチドのポリペプチド断片または変異体、または、３）配列番号５または６から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに「相同な」と称されるポリペプチドに対して向けられており、および、
ｂ）形成された抗原／抗体複合体を検出すること。
【０２９７】
また、本発明は、サンプル中で、本発明に係るポリペプチドの存在を診断または検出するためのボックスまたはキットに関し、前記ボックスは、以下を含む：
ａ）１）配列番号５または６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むポリペプチド、２）配列番号５または６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むポリペプチドのポリペプチド断片または変異体、または、３）配列番号５または６から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに「相同な」と称されるポリペプチドに対する抗体、および、
ｂ）形成された抗原／抗体複合体を検出するための試薬。
【０２９８】
医薬組成物および治療方法
また、本発明は、病状の予防および／または治療を意図した医薬組成物に関し、当該医薬組成物は、ＡＢＣＡ１２機能的ポリペプチド、特に配列番号５または６のアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも１つの有効量を生産させることが可能なポリヌクレオチドの治療上有効な量を含むことを特徴とする。
【０２９９】
また、本発明は、ＡＢＣＡ１２本発明に係るポリペプチドのいずれか一つをコードする核酸を含む医薬組成物、および、ＡＢＣＡ１２遺伝子の欠損症に関連する病気の予防および／または治療を意図した本発明に係るＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つを含む医薬組成物を提供する。
また、本発明は、ＡＢＣＡ１２遺伝子の欠損症に関連する病状を治療するための新規の治療方法に関する。
また、本発明は、親油性物質の輸送の異常に関連する病状、または、染色体遺伝子座２ｑ３４に位置する病状（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、またはインスリン依存性糖尿病）の治療および／または予防のための新規の方法を提供する。
【０３００】
従って、本発明はまた、ＡＢＣＡ１２タンパク質の機能障害に罹った被験者の予防または治療を意図した医薬組成物に関し、当該医薬組成物は、１またはそれ以上の生理学的に適合可能なビヒクルおよび／または添加剤と組み合わせて、少なくとも１つのＡＢＣＡ１２タンパク質をコードする核酸を含む。
【０３０１】
本発明の特定の実施形態によれば、少なくとも１つのＡＢＣＡ１２タンパク質のインビボ生産のための組成物を提供する。この組成物は、溶液中、生理学的に許容できるビヒクルおよび／または添加剤中、適切な調節配列の制御下に置かれたＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つをコードする核酸を含む。
それゆえに、本発明はまた、配列番号５または６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む組成物に関し、ここで該核酸は、適切な調節要素の制御下に置かれる。
好ましくは、このような組成物は、適切な調節要素の制御下に置かれた配列番号１〜４のヌクレオチド配列を含む核酸を含む。
【０３０２】
他の観点によれば、本発明の主題はまた、ＡＢＣＡ１２遺伝子の欠損症により発症する病気を処置する予防方法および／または治療方法であり、このような方法は、本発明に係るＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つをコードする核酸を患者に投与する工程を含み、前記患者において、前記核酸は、必要に応じて、１またはそれ以上の生理学的に適合可能なビヒクルおよび／または添加剤と組み合わされる。
【０３０３】
また、本発明は、親油性物質の輸送における機能障害、または、染色体遺伝子座２ｑ３４に位置する病状（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、またはインスリン依存性糖尿病）に罹った被験者の予防または治療を意図した医薬組成物に関し、当該医薬組成物は、１またはそれ以上の生理学的に適合可能な添加剤と組み合わせて、本発明に係る組換えベクターを含む。
【０３０４】
特定の実施形態によれば、本発明に係る核酸を、宿主細胞、特にインビボで哺乳動物から得られた宿主細胞に導入する方法は、医薬上適合可能なベクター、および、適切な調節配列の制御下に置かれた本発明に係る「裸の」核酸を含む調製物を、選択された組織（例えば平滑筋組織）のレベルに局所注射により導入する工程を含み、、当該「裸の」核酸は、この組織の細胞に吸収される。
【０３０５】
また、本発明は、様々な形態で予防および／または治療を意図した薬剤を製造するための、またより特定には、親油性物質の輸送における機能障害、または、染色体遺伝子座２ｑ３４に位置する病状（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、またはインスリン依存性糖尿病）に罹った被験者を治療するための薬剤を製造するための、本発明に係る短鎖または完全長のＡＢＣＡ１２タンパク質をコードする核酸の使用に関する。
【０３０６】
また、本発明は、親油性物質の輸送における機能障害、または、染色体遺伝子座２ｑ３４に位置する病状（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、またはインスリン依存性糖尿病）に罹った被験者の予防および／または治療を目的とした薬剤を製造するための、本発明に係るＡＢＣＡ１２タンパク質アイソフォームのいずれか一つをコードする核酸を含む組換えベクターの使用に関する。
【０３０７】
上述したように、本発明はまた、親油性物質の輸送に関連する病状、および／または、ＡＢＣＡ１２遺伝子の欠損症に関連する病状の治療および／または予防のための医薬組成物を調製するための、本発明に係る欠損組換えウイルスの使用に関する。
本発明は、親油性物質の輸送に関連した機能障害の治療および／または予防を意図した医薬組成物を調製するための、このような欠損組換えウイルスの使用に関する。従って、本発明はまた、１またはそれ以上の本発明に係る欠損組換えウイルスを含む医薬組成物に関する。
【０３０８】
また、本発明は、本発明に係るウイルスによりエクスビボで遺伝的に改変された細胞、または、このようなウイルスの生産細胞の使用に関し、これらが体内に移植されることにより、少なくとも１つの生物学的に活性なＡＢＣＡ１２タンパク質の持続的および効果的なインビボでの発現が生じる。
【０３０９】
本発明は、短鎖または完全長ＡＢＣＡ１２ポリペプチドをコードする核酸をウイルスベクターに取り込ませることを可能にし、これらのベクターは、生物学的に活性な成熟形態の効果的な発現を可能にすることを示す。より特定には、本発明は、ＡＢＣＡ１２遺伝子のインビボ発現は、アデノウイルスの直接投与により、または、生産細胞の移植もしくはこのようなＤＮＡを取り込んだアデノウイルスまたはレトロウイルスで遺伝的に改変された細胞の移植により得ることができることを示す。
【０３１０】
好ましくは、本発明の医薬組成物は、注射用製剤のための、特に、例えば患者の門脈への静脈注射のための、製薬上許容できるビヒクルまたは生理学的に適合可能な添加剤を含む。これらは、特に、等張滅菌溶液、または、乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物と合わせられ、これらは、滅菌水または生理的食塩水の場合に応じて加えられ注射可能な溶液が調製される。好ましくは患者の門脈への直接注射であり、なぜなら、肝臓のレベルの感染を標的化し、それによって治療的効果をその臓器のレベルに集中させることが可能とするためである。
【０３１１】
「製薬上許容できるビヒクルまたは添加剤」は、投与方法に応じた製薬上許容できる希釈剤および充填剤を含み、滅菌され、さらに、適切な分散剤または湿潤剤、および懸濁化剤を用いて配合した水性または油性懸濁液でもよい。特定の製薬上許容できる担体と、活性化合物の担体に対する割合は、化合物の可溶性や化学的特性、特定の投与様式、および、標準の医薬基準によって決定される。
【０３１２】
本発明の核酸、ポリペプチド、ベクター、または宿主細胞のいずれも、製薬上許容できるビヒクルまたは添加剤を用いてインビボで導入されることが好ましい。「製薬上許容できる」という句は、生理学的に許容できる分子全体および組成物を意味し、ヒトに投与した際に、アレルギー性反応や、急性胃蠕動、眩暈などのような類似の有害反応を通常生じない。好ましくは、本明細書で用いられるように、「製薬上許容できる」という用語は、連邦政府または州政府の調節機関によって承認されていること、または、米国薬局方または動物、より特定にはヒトにおける使用に関して一般的に認められた他の薬局方に列挙されていることを意味する。「添加剤」という用語は、希釈剤、アジュバント、添加剤、またはビヒクルを意味し、これらと共に化合物は投与される。このような医薬担体としては、水や油のような滅菌した液体が挙げられ、例えば、石油、動物性、植物性もしくは合成由来、例えば落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などがある。特に注射可能な溶液に関しては、水もしくは水溶液、食塩水、ならびに、水性デキストロースおよびグリセロール溶液が添加剤として好ましく用いられる。適切な医薬用添加剤は、Ｅ．Ｗ． Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」で説明される。
【０３１３】
本発明に係る医薬組成物は、経口、直腸、非経口、静脈内、皮下または皮内経路のいずれによっても等しく良好に投与することができる。
他の観点によれば、本発明の主題はまた、脂質物質輸送の欠陥により発症する病気を処置する予防方法および／または治療方法であり、当該方法は、短鎖または完全長ＡＢＣＡ１２ポリペプチドをコードする核酸を患者または被験者に投与することを含み、前記核酸は、１またはそれ以上の生理学的に適合可能なビヒクルおよび／または添加剤と組み合わされる。
【０３１４】
他の実施形態において、本発明に係る核酸、組換えベクターおよび組成物は、小胞、特にリポソーム中で運搬することができる（Ｌａｎｇｅｒ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９：１５２７−１５３３； Ｔｒｅａｔ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ， Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ （ｅｄｓ．）， Ｌｉｓｓ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ３５３−３６５； ａｎｄ Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ， １９８９， Ｉｎ： Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ， Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ （ｅｄｓ．）， Ｌｉｓｓ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ３１７−３２７を参照）。
【０３１５】
さらなる観点において、本発明に係る核酸で形質転換されて、大量の本発明に係るＡＢＣＡ１２ポリペプチドを発現する組換え細胞を、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドを必要とする被験者に移植することができる。好ましくは、拒絶反応を防ぐために、本発明に係るＡＢＣＡ１２をコードする核酸で形質転換された自己細胞を移植することができ、あるいは、高分子マトリックス内で免疫認識や拒絶反応を防ぐ可溶性因子を生産する技術が、非自己細胞を保護するために利用可能である。
【０３１６】
本発明に係る核酸、ポリペプチド、組換えベクター、組換え宿主細胞、および組成物の投与がなされる被験者は、好ましくはヒトであるが、動物のいずれかでもよい。従って、当業界の通常の技能を有するものによって容易に認識できるように、本発明の方法および医薬組成物は、全ての動物、特に哺乳動物への投与に特に適しており、上記動物としては、これらに限定されないが、家畜、例えばネコまたはイヌ検体、飼育動物、例えば、これらに限定されないが、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジおよびブタ検体、野生動物（野生または動物園に存在するいずれも）、研究用動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコなど、鳥類、例えばニワトリ、シチメンチョウ、鳴鳥類などであり、すなわち、獣医学的使用のための動物である。
好ましくは、核酸、組換えベクターまたは組換え宿主細胞を含む医薬組成物は、上述したように、患者または被験者に投与される。
【０３１７】
ＡＢＣＡ１２ポリペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニスト化合物のスクリーニング方法
他の観点によれば、本発明はまた、脂質物質輸送の欠陥による病気、または、染色体遺伝子座２ｑ３４に位置する病状（例えば層状魚鱗癬、多形先天性白内障、またはインスリン依存性糖尿病）の処置に有用な治療用途のための、化合物または低分子物質をスクリーニングする様々な方法に関する。
【０３１８】
従って、本発明はまた、ＡＢＣＡ１２における機能障害により発症する病気の予防および／または治療のための活性成分をスクリーニングするための、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つ、または、短鎖または完全長ＡＢＣＡ１２ポリペプチドを発現する細胞の使用に関する。ＡＢＣＡ１２ポリペプチドの触媒部位およびオリゴペプチドまたは免疫原性断片は、広範な既存の技術によって生産物ライブラリーをスクリーニングするのに役立つ。このタイプのスクリーニングで用いられるポリペプチド断片は、溶液中で遊離してもよいし、固体支持体に結合させてもよいし、細胞表面または細胞中に存在してもよい。次に、ＡＢＣＡ１２ポリペプチド断片と試験物質（ｔｅｓｔｅｄ ａｇｅｎｔ）との結合複合体の形成を測定できる。
【０３１９】
所定のタンパク質に対する親和性を有する産物に近づくことができるハイフラックススクリーニング（ｈｉｇｈ−ｆｌｕｘ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）において用いることのできる他の生産物スクリーニング技術が、出願ＷＯ８４／０３５６４において説明される。この方法をＡＢＣＡ１２タンパク質に応用することによって、様々な生産物が固体表面上で合成される。これらの生産物は、対応するＡＢＣＡ１２タンパク質またはその断片と反応し、その複合体は洗浄される。次に、短鎖および／または完全長ＡＢＣＡ１２タンパク質を結合させた生産物は、当業者において既知の方法で検出される。また、中和されていない抗体もペプチドを捕獲し支持体上に固定するために用いることができる。
【０３２０】
他の可能性としては、競合抗体を中和するＡＢＣＡ１２のいずれか一つ、短鎖または完全長ＡＢＣＡ１２タンパク質、および、ＡＢＣＡ１２タンパク質と結合する可能性のある生産物を用いた生産物スクリーニング方法を行うことが挙げられる。この方法において、上記抗体は、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドまたはタンパク質を含む共通の抗原単位を有するペプチドの存在を検出するのに用いることができる。
【０３２１】
ＡＢＣＡ１２の活性を増加させるそれらの能力に関して評価される生産物としては、特に、分子の活性化に関与するキナーゼ特異的ＡＴＰ同族体が挙げられ、同様に、ホスファターゼも挙げられ、これは前記キナーゼにより起こる脱リン酸化を防ぐことができる可能性がある。特に、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）の阻害剤である、テオフィリンおよび３−イソブチル−１−メチルキサンチン型、または、アデニルシクラーゼフォルスコリン活性化剤が挙げられる。
【０３２２】
従って、本発明は、膜または小胞間での親油性物質の転移の方法に基づいた、生産物、すなわち化合物、低分子物質などをスクリーニングするいずれかの方法の使用に関し、当該転移方法は、全ての合成タイプまたは細胞タイプ、すなわち組み込まれたヒトＡＢＣＡ１２をコードする核酸を構造的に発現する、または、該核酸を含む哺乳動物、昆虫、細菌または酵母の全てのタイプ中に存在する。この作用には、標識された親油性物質類似体を用いることができる。
【０３２３】
その上、多数の輸送体の破壊（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）が説明されており（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｈａｚｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２７４： １９３４−４１）、特徴的な表現型を有する細胞変異体を用いることを検討し、ＡＢＣＡ１２タンパク質でそれらの機能を補足し、スクリーニング目的でその全体を用いることが可能である。
【０３２４】
また、本発明は、親油性物質の輸送に作用する化合物または低分子物質、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法に関し、前記方法は、以下の工程を含む：
ａ）少なくとも短鎖または完全長ＡＢＣＡ１２ポリペプチド、および、検出可能なマーカーを含む脂質基質を含む膜小胞を調製すること；
ｂ）アゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物と共に、工程ａ）で得られた小胞をインキュベートすること；
ｃ）検出可能なマーカーを含む脂質基質をの放出を定性的および／または定量的に測定すること；および、
ｄ）工程ｂ）で得られた放出の測定と、アゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物で前もってインキュベートされていない小胞による標識した親油性基質の放出の測定とを比較すること。
【０３２５】
ＡＢＣＡ１２ポリペプチドは、配列番号５または６から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０３２６】
上記スクリーニング方法の第一の観点によれば、膜小胞は、合成の脂質小胞であり、当業者周知の技術に従って調製することができる。この特定の観点によれば、ＡＢＣＡ１２タンパク質は、組換えタンパク質であり得る。
第二の観点によれば、膜小胞は、少なくとも１つのＡＢＣＡ１２ポリペプチドを発現する細胞から得られた細胞質膜の小胞である。これらは、短鎖または完全長ＡＢＣＡ１２ポリペプチドを天然に発現する細胞、または、少なくとも１つのＡＢＣＡ１２ポリペプチドをコードする核酸もしくは少なくとも１つのＡＢＣＡ１２ポリペプチドをコードする核酸を含む組換えベクターでトランスフェクトされた細胞であり得る。
【０３２７】
上記スクリーニング方法の第三の観点によれば、脂質基質は、コレステロールまたはホスファチジルコリンから選択される。
第四の観点によれば、脂質基質は、例えば３Ｈまたは１２５Ｉから選択される同位体で放射性標識される。
第五の観点によれば、脂質基質は、蛍光性化合物、例えばＮＢＤまたはピレンで標識される。
【０３２８】
第六の観点によれば、標識された親油性物質、および、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つを含む膜小胞が、工程ｂ）の前に、固体支持体の表面に固定される。
第七の観点によれば、小胞により放出された蛍光または放射活性の測定は、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドによる脂質基質輸送の活性を直接反映している。
【０３２９】
また、本発明は、脂質物質輸送に作用する化合物または低分子物質、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つのアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法に関し、前記方法は、以下の工程を含む；
ａ）細胞を得ること、例えば、天然で、または、ＡＢＣＡ１２をコードする核酸のいずれか一つで細胞をトランスフェクトした後に、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つを発現する細胞系であり；
ｂ）検出可能なマーカーで標識したアニオンの存在下で、工程ａ）の細胞をインキュベートすること；
ｃ）工程ｂ）の細胞を洗浄し、これら細胞に浸透しなかった過量の標識したアニオンを除去すること；
ｄ）ＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つに対するアゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物で、工程ｃ）で得られた細胞をインキュベートすること；
ｅ）標識したアニオンの流出を測定すること；および、
ｆ）工程ｅ）で測定された標識したアニオンの流出値と、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つのアゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物の存在下で前もってインキュベートされていない細胞で測定された標識したアニオンの流出値とを比較すること。
【０３３０】
第一の特定の実施形態において、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つは、配列番号５または６のアミノ酸配列を含む。
第二の観点によれば、上述のスクリーニング方法で用いられた細胞は、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つを自然には発現しない細胞、またあるいは、少量しか発現しない細胞であり得、前記細胞は、ＡＢＣＡ１２ポリペプチドのいずれか一つをコードした核酸の発現を導くことが可能な本発明に係る組換えベクターでトランスフェクトされる。
第三の観点によれば、細胞は、アニオン輸送が自然に欠損している細胞、または、１またはそれ以上のイオンチャンネル阻害剤（例えばＶｅｒａｐａｍｉｌＴＭまたはテトラエチルアンモニウム）で前処理された細胞であり得る。
【０３３１】
前記スクリーニング方法の第四の観点によれば、アニオンは、放射活性で標識されたヨウ化物、例えばＫ１２５ＩまたはＮａ１２５Ｉの塩である。
第五の観点によれば、標識されたアニオンの流出の測定は、実験時間中に定期的に測定され、それにより、この流出の反応速度測定も確率することが可能になる。
第六の観点によれば、標識したアニオンの流出値は、所定時間の細胞培養物の上清に存在する標識したアニオン量を測定することによって決定される。
第七の観点によれば、標識したアニオンの流出値は、細胞溶解産物で見出された放射活性と、細胞培養物の上清で見出された放射活性との合計に対する総放射活性と比較した、細胞培養物の上清で見出された放射活性の比率として決定される。
以下の実施例は、本発明をさらに説明することを意図したものであって、本発明を限定しない。
【０３３２】
【実施例】
実施例１：ヒトＡＢＣＡ１２遺伝子の配列データベースにおける検索
ＡＢＣＡ１様遺伝子の、Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ等により説明された発現された配列タグ（ＥＳＴ）（Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ． １９９６ Ｏｃｔ；５（１０）：１６４９−５５）を、ＢＬＡＳＴ２を用いたＧｅｎｂａｎｋおよびＵｎｉＧｅｎｅヌクレオチド配列データベース検索に用いた（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９７ Ｓｅｐ １；２５（１７）：３３８９−４０２）。選択されたメインのタンパク質配列データベースは、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ、ＴｒＥＭＢＬ、ＧｅｎｐｅｐｔおよびＰＩＲであった。
【０３３３】
複数のアライメントを、ＧＣＧパッケージおよびＤｉａｌｉｇｎ２プログラムからのＧＡＰソフトウェア（Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｍ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． １９９６ Ｏｃｔ ２９；９３（２２）：１２０９８−１０３）、ＦＡＳＴＡ３パッケージ（Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． １９８８ Ａｐｒ；８５（８）：２４４４−８）ならびにＳＩＭ４（Ｆｌｏｒｅａ ｅｔ ａｌ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．， １９９８ Ｓｅｐ；８（９）：９６７−７４）により作製した。本出願人らのプロセスで用いられた特定のＡＢＣＡモチーフは、ＴＭＮ、ＴＭＣ、ＮＢＤ１およびＮＢＤ２であり、これらは文献に記載されている（Ｂｒｏｃｃａｒｄｏ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ． １９９９ Ｄｅｃ ６；１４６１（２）：３９５−４０４）。これは、ＡＢＣＡ１で、Ｎ末端において残基６３０〜８４６（ＴＭＮ＝エキソン１４〜１６）に相当し、および、Ｃ末端の膜スパンセットにおいて１６４７〜１８７７（ＴＭＣ＝エキソン３６〜４０）に相当する。ＮＢＤは、伸長したヌクレオチド結合ドメインに相当し、すなわち、ＡＢＣＡ１では、Ｎ末端ドメインのアミノ酸８８５〜１１５２（ＮＢＤ１＝エキソン１８〜２２）、および、Ｃ末端ドメインの１９１８〜２１３２（ＮＢＤ２＝エキソン４２〜４７）に及ぶ。
【０３３４】
実施例２：ヒトＡＢＣＡ１２ｃＤＮＡの５’伸長
この実施例は、完全長および短鎖ヒトＡＢＣＡ１２タンパク質をコードするｃＤＮＡ分子の単離および同定を説明する。配列データベースの検索は、ＡＢＣＡ１２に属する可能性のあるＥＳＴの２つのグループを証明した。これら２つの部分的なｃＤＮＡ配列の連結をＲＴ−ＰＣＲで行った。続いて、生じた部分的なＡＢＣＡ１２ｃＤＮＡ配列の５’および３’伸長を、胎盤、精巣および胎児の脳を用いた５’ＲＡＣＥおよびＲＴ−ＰＣＲの組み合わせにより行った。
【０３３５】
新規のＡＢＣＡ１２遺伝子と他のファミリーメンバーとを区別することができるオリゴヌクレオチドプライマーは、様々なヒト組織からのＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲにより特異的なｃＤＮＡ転写物を同定するのに用いられた。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、直接配列解析してもよいし、または、始めにクローニングしてから配列解析してもよい。とりわけこの後者の工程は、特に、２種の部分的なｃＤＮＡ配列を連結するために行われた。それにより、追加の２３０ｂｐの断片に対応するオルタナティブスプライシング現象が明示された。続いて、完全ＯＲＦ配列を決定するために５’および３’ＲＡＣＥ工程も行った。３’ＲＡＣＥ工程により、２つのオルタナティブポリアデニル化シグナルが明示された。最終的に、このようにして、ＲＴ−ＰＣＲおよび直接の配列解析により４種の可能性のある転写物が同定された。マッピング実験により、染色体遺伝子座２ｑ３４の位置が明らかになった。
【０３３６】
逆転写
総量１１．５μｌにおいて、５００ｎｇのオリゴｄＴと混合した５００ｎｇのｍＲＮＡポリ（Ａ）＋（クロンテック社）を７０℃で１０分間変性させ、続いて氷上で冷却した。１０ユニットのＲＮＡｓｉｎ、１０ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのｄＮＴＰ、スーパースクリプトファーストストランド緩衝液、および、２００ユニットのスーパースクリプトＩＩ（ライフテクノロジーズ社）を加えた後、反応液を４２℃で４５分間インキュベートした。我々は、胎盤、精巣、および、胎児の脳からのポリ（Ａ）ｍＲＮＡを用いた。
【０３３７】
ＰＣＲ
各ポリメラーゼ連鎖反応は、４００μＭの各ｄＮＴＰ、２ユニットのＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ；パーキンエルマー社）、０．５μＭの各プライマー、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、ＰＣＲ緩衝液、および、５０ｎｇのＤＮＡもしくは約２５ｎｇのｃＤＮＡ、または、ｌ／５０ｅの一次のＰＣＲ混合物を含んでいた。反応は、パーキンエルマー９７００サーマルサイクラーを用いて、９６ウェルマイクロタイタープレート中で、３０サイクル行われた。最初に９４℃で１０分間変性させた後、各サイクルは、変性工程が３０秒（９４℃）、ハイブリダイゼーション工程が３０秒（６４℃で２サイクル、６１℃で２サイクル、５８℃で２サイクル、および、５５℃で２８サイクル）、および、伸長工程が１分／ｋｂ（７２℃）で構成された。最後の７２℃で７分間の伸長でＰＣＲを終了させた。ＲＴ−ＰＣＲの場合、逆転写酵素を含まないコントロール反応、および、ｃＤＮＡの代わりに水を含む反応が各サンプルで行われた。
【０３３８】
ＤＮＡ配列解析
ＰＣＲ産物を分析し、アガロースゲル電気泳動で定量し、Ｐ１００カラムで精製する。ＡＢＩプリズムビッグダイターミネーターサイクルシーケンシングキット（パーキンエルマーアプライドバイオシステムズ社）を用いて、精製したＰＣＲ産物を配列解析した。配列解析反応混合物を、マイクロコン−１００マイクロコンセントレーター（アミコン社，Ｂｅｖｅｒｌｙ）を用いて精製した。配列解析反応を、製造者プロトコールに従って（アプライドバイオシステムズ、パーキンエルマー）、ＡＢＩ３７７ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマーアプライドバイオシステムズ社）を用いて分析した。
【０３３９】
ｃＤＮＡ末端の５’および３’迅速増幅（ＲＡＣＥ）
５’および３’ＲＡＣＥ分析を、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅キット（クロンテック社， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を用いて行った。製造者の指示に従って、ヒト胎盤ポリＡ＋ＲＮＡ（クロンテック社）をテンプレートとして用いて、５’および３’ＳＭＡＲＴ  ｃＤＮＡライブラリーを作製した。第一増幅プライマーおよび入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーをｃＤＮＡ配列から設計した。入れ子ＰＣＲのアンプリマーをクローニングした。特定のクローンのインサートをユニバーサルプライマー（Ｒｅｖおよび−２１）を用いたＰＣＲで増幅し、両方の鎖を配列解析する。配列番号２０、２１、２４、１１および配列番号２８、２９に記載のプライマーを用いて、ＡＢＣＡ１２の５’および３’末端をそれぞれ同定した。
【０３４０】
プライマー
ＧＣＧパッケージからのＰｒｉｍｅまたはオリゴ４（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．）ソフトウェアを用いてオリゴヌクレオチドを選択した。プライマーをライフテクノロジーズ社に注文し、さらなる精製を行わずに用いた（表３）。
【０３４１】
物理的マッピング
製造者プロトコールに従って、ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ４放射線ハイブリッドパネル（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いたマッピングによるＰＣＲを行い、染色体遺伝子座２ｑ３４上のヒトＡＢＣＡ１２遺伝子の染色体局在を決定した。
【０３４２】
実施例３：ＡＢＣＡ１２遺伝子の組織分布の電子的分析
組織分布の電子的分析を行った。転写物の配列（配列番号１〜４）は、６つの異なるインサイトテンプレート（番号５４７１４．１、１３３７１９８．１、８８３５２．１、１３３７１０２．１、２２２６７７．１、および３８５７８０．１（インサイトテンプレートの２０００年９月のデータベース［ＬＧＴｅｍｐｌａｔｅＳＥＰ２０００］）（それぞれ５、１、２、１、１４、および１ＥＳＴで構成される）に適合する。これら全ＥＳＴの組織起源は、ＡＢＣＡ１２転写物の優先的な皮膚／上皮細胞発現を示す可能性がある（２４ＥＳＴのうち１２ＥＳＴは扁平細胞、上皮細胞または皮膚由来である）。
【０３４３】
実施例４：哺乳動物細胞におけるＡＢＣＡ１２核酸を含む発現ベクターの構築
ＡＢＣＡ１２遺伝子は、哺乳動物細胞で発現させることができる。一般的な真核生物の発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写開始を起こすプロモーター、タンパク質をコードする配列、および、転写終結および転写物のポリアデニル化に必要なシグナルを含む。また、該発現ベクターは、追加のシグナル、例えばエンハンサー、コザック配列およびｍＲＮＡスプライシングに必要な配列も含む。効率的な転写は、ＳＶ４０ウイルスプロモーターの初期および後期要素、レトロウイルスのＬＴＲ、または、ＣＭＶウイルス初期プロモーターを用いて得られる。しかしながら、例えばアクチンプロモーターのような細胞要素も用いることができる。多くの発現ベクターを用いて本発明を実施することができ、このようなベクターの例としては、ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社）が挙げられる。
【０３４４】
実施例５：正常および変異ＡＢＣＡ１２ポリペプチドの生産
実施例２において単離が望まれる完全対応ｃＤＮＡがコードする正常ＡＢＣＡ１２ポリペプチド、または、完全長ｃＤＮＡを実施例２に記載の技術により得ることができる変異ＡＢＣＡ１２ポリペプチドを、バキュロウイルスベクターを用いた細菌または昆虫細胞発現系、または、ワクシニアウイルスベクターを用いた、もしくは用いない哺乳動物細胞において簡単に生産することができる。目下、全ての方法が広範に説明されており、当業者に知られている。それらの詳細な説明は、例えばＦ． Ａｕｓｕｂｅｌ等（１９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ）で見出される。
【０３４５】
実施例６：変異ＡＢＣＡ１２ポリペプチドに対して向けられた抗体の生産
本発明における抗体は、様々な方法で調節することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １ ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ， ｃｈａｐｔｅｒ １１， １９８９）。例えば、抗体を含む血清の生産を誘導するために、本発明のポリペプチドを発現する細胞を動物に注入する。説明された方法のいずれにおいても、タンパク質は、コンタミネーションを起こさないように調製、精製される。続いて、このような調製物は、より高い活性を有するポリクローナル抗血清を生産させる目的で、動物に導入される。
【０３４６】
好ましい方法において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。このようなモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を用いて調製することができる（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ， １９７５， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５ ； Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ， １９７６， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：２９２； Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ， １９７６， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ６：５１１； Ｈａｍｍｅｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９８１， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ．Ｙ．， ｐｐ． ５６３−６８１）。一般的に、このような方法は、動物（好ましくはマウス）を、ポリペプチド、またより好ましくはポリペプチドを発現する細胞で免疫化することを含む。これら細胞は、適切な組織培養液中で培養することができる。しかしながら、１０％ウシ胎仔血清（５６℃で不活性化した）、および、約１０ｇ／Ｌの非必須アミノ酸、１０００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むイーグル培地（改変Ｅａｒｌｅ）で細胞を培養することが好ましい。
【０３４７】
これらマウスの脾細胞を抽出し、適切な骨髄腫細胞系と融合する。しかしながら、ＡＴＣＣより入手できる親の骨髄腫細胞系（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好ましい。融合した後、得られたハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地中で選択的に維持し、続いて、Ｗａｎｄｓ等により説明されたように希釈を制限することによりクローニングする（１９８１， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ， ８０：２２５−２３２）。このような選択の後に得られたハイブリドーマ細胞を試験して、ポリペプチドに結合可能な抗体を分泌するクローンを同定する。
【０３４８】
その上、ポリペプチドに結合可能な他の抗体を抗イディオタイプ抗体を用いた２段階の方法により生産することができ、このような方法は、抗体がそれ自身抗原であり、結果的に他の抗体を認識する抗体を得ることができる、という事実に基づいている。この方法に従って、タンパク質に特異的な抗体を、動物、好ましくはマウスを免疫化するのに用いられる。続いて、この動物の脾細胞を用いて、ハイブリドーマ細胞を生産し、後者をスクリーニングし、特異的な抗体−タンパク質複合体への結合能力がポリペプチドによりブロックされ得る抗体を生産するクローンを同定することができる。これら抗体を用いて動物を免疫化し、タンパク質に特異的な抗体の形成を大量に誘導することができる。
【０３４９】
本明細書で説明された方法に従って、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ ならびに本発明の抗体の他の断片を用いることが好ましい。このような断片は、一般的に、例えばパパイン（Ｆａｂ断片を生産するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２ 断片を生産するため）などの酵素を用いてタンパク質分解による開裂を行うことにより生産される。あるいは、タンパク質を認識する分泌された断片は、組換えＤＮＡまたは合成化学技術を適用することによって生産できる。
【０３５０】
ヒトにおけるインビボでの抗体の使用においては、「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を用いることが好ましい。このような抗体は、上述のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞から誘導された遺伝学的構造物を用いて生産することができる。キメラ抗体を生産する方法は、当業者既知である（参考として、以下を参照：Ｍｏｒｒｉｓｏｎ （１９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２）；Ｏｉ等（１９８６， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， ４：２１４）；Ｃａｂｉｌｌｙ等の米国特許第４，８１６，５６７号 ； Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ等のＥＰ１７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等のＥＰ１７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ等のＷＯ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ等のＷＯ８７０２６７１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ等（１９８４， Ｎａｔｕｒｅ， ３１２：６４３）；および、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ等（１９８５， Ｎａｔｕｒｅ， ３１４：２６８）。
【０３５１】
実施例７：ＡＢＣＡ１２遺伝子における多型／変異の決定
転写物の配列またはＡＢＣＡ１２遺伝子のゲノム配列における多型または変異の検出を、様々なプロトコールに従って行うことができる。好ましい方法は、直接的な配列解析である。
ｍＲＮＡ調製物を得ることができる患者に関して、好ましい方法は、ｃＤＮＡを調製すること、および、それらを直接配列解析することからなる。ＤＮＡしか利用できない患者の場合、および、対応する遺伝子の構造が未知または部分的に既知である転写物の場合、そのイントロン−エキソン構造、同様に、対応する遺伝子のゲノム配列を正確に決定することが必要である。それゆえに、この方法は、まず第一に、ゲノムＤＮＡ ＢＡＣまたは研究される転写物に対応するコスミドクローンを単離すること、対応するクローンのインサートを配列解析すること、および、ｃＤＮＡ配列と得られたゲノムＤＮＡの配列とを比較することによりイントロン−エキソン構造を決定すること、を含む。
【０３５２】
直接的な配列解析による変異の検出技術は、病気に関するホモ接合体から得られた、または、少なくとも８個体（４個体は研究された病状に罹っており、４個体は罹っていない）から得られた、もしくは、研究された集団からの少なくとも３２の関連のない個体から得られた、ＡＢＣＡ１２遺伝子のゲノム配列を比較することを含む。配列の相違が多型を構成する。野生型タンパク質アイソフォームのアミノ酸配列を改変する多型の全てが、より特定には、家系における変異と病気（遺伝子型−表現型の相関を示す）との共分離（ｃｏｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）の研究、もしくは、薬理遺伝学的研究における治療剤分子に対する薬理学的応答の研究、または、ケース／コントロール関係の研究における発散性のケースの分析に関して、考察が望まれる前記タンパク質の機能に影響を与えることができる変異である可能性がある。
【０３５３】
実施例８：原因の変異またはＡＢＣＡ１２遺伝子の転写の差に関連する病気に関する原因遺伝子の同定
実施例７で説明した方法により同定された変異のなかで、病気表現型に関連するもの全てが原因となる可能性がある。これらの結果の確認は、罹患した個体およびそれらの親族（そのＤＮＡが利用できる）全てにおいて遺伝子の配列解析を行うことによってなされる。
その上、実施例２で説明された方法により、罹患した個体または罹患していない個体に特異的なＲＮＡを用いたノーザンブロットまたはＲＴ−ＰＣＲ分析により、研究された遺伝子の発現レベルにおける顕著な変化の検出、特に遺伝子が転写されないことに関する検出が可能である。
【０３５４】
実施例９：ＡＢＣＡ１２核酸を含む組換えベクターの構築
ヒトＡＢＣＡ１２タンパク質をコードする核酸の合成：
ヒト細胞（例えば、胎盤組織、クロンテック社， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ， ＵＳＡ、またはＴＨＰ１細胞）から単離されたトータルＲＮＡ（５００ｎｇ）をヒトＡＢＣＡ１２遺伝子のｃＤＮＡ合成のための源として用いることができる。ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する方法は、当業界周知である。例えば、システム「スーパースクリプトワンステップＲＴ−ＰＣＲ」（ライフテクノロジーズ社， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ， ＵＳＡ）を用いることができる。
【０３５５】
ＡＢＣＡ１２ｃＤＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーをこの目的に用いることができ、当該オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号７〜３８のいずれかに記載の配列を含む。これらオリゴヌクレオチドプライマーは、ＡＢＩ３９４型のＤＮＡシンセサイザー（アプライドバイオシステムズ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いたホスホアミダイト方法により合成することができる。
【０３５６】
制限酵素ＮｏｔＩにより認識される部位を増幅されたＡＢＣＡ１２ｃＤＮＡに組み込み、挿入が望まれるｃＤＮＡ領域を第二増幅工程により、組換えベクターに連結することができ、ここで第二増幅工程は、２００μＭの各前記ジデオキシヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰと、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社、ＬａＪｏｌｌａ， ＣＡ， ＵＳＡ）との存在下で、テンプレートとして５０ｎｇのヒトＡＢＣＡ１２ｃＤＮＡと、上記で用いられたＡＢＣＡ１２特異的オリゴヌクレオチドプライマー（０．２５μＭ）（その５’末端に制限酵素ＮｏｔＩで認識される部位（５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’）を含む）とを用いる。
【０３５７】
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ用サーモサイクラー装置（Ｃｅｔｕｓ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ， ＵＳＡ）を用いて、３０サイクルを超過して実施することができ、各サイクルは、９５℃で１分間の変性工程、５０℃で１分間の復元工程、および、７２℃で２分間の伸長工程を含む。
【０３５８】
ヒトＡＢＣＡ１２遺伝子ｃＤＮＡの発現ベクターへのクローニング：
次に、ヒトＡＢＣＡ１２ｃＤＮＡインサートは、発現ベクター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーターと、エンハンサー配列と、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルとを含むｐＣＭＶベクター（Ｂｅｇ ｅｔ ａｌ．， １９９０， ＰＮＡＳ， ８７：３４７３； Ａｐｐｌｅｂａｕｍ−Ｂｏｄｅｎ， １９９６， ＪＣＩ ９７）のＮｏｔＩ制限部位にクローニングし、ｐＡＢＣＡ１２を指定する発現ベクターを生産することができる。
【０３５９】
クローン化ｃＤＮＡの配列は、ＡＢＩ３１０型のキャピラリーシーケンサー（アプライドバイオシステムズ社， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いた反応セット「ＡＢＩプリズムビッグダイターミネーターサイクルシーケンシングレディ」（アプライドバイオシステムズ社， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ， ＵＳＡ）により、２つの鎖を配列解析することによって確認することができる。
【０３６０】
ヒトＡＢＣＡ１２遺伝子のｃＤＮＡを含む組換えアデノウイルスベクターの構築：
発現ベクターｐＣＭＶ−βの改変：
発現ベクターｐＣＭＶ−β（クロンテック社， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ， ＵＳＡ， ＧｅｎｅＢａｎｋ参照番号ＵＯ２４５１）のβ−ガラクトシダーゼｃＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩで消化することにより除去し、以下の部位：ＮｏｔＩ、ＡｓｃＩ、ＲｓｒＩＩ、ＡｖｒＩＩ、ＳｗａＩ、およびＮｏｔＩを５’末端から３’末端で含むマルチクローニング部位で置換し、ＮｏｔＩ制限部位の領域でクローニングすることができる。このマルチクローニング部位の配列は、５’−ＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣＣＧＧＡＣＣＧＣＣＴＡＧＧＡＴＴＴＡＡＡＴＣＧＣＧＧＣＣＣＧＣＧ−３’である。改変発現ベクターｐＣＭＶのＥｃｏＲＩ部位とＳａｎＩ部位との間のＤＮＡ断片を単離し、シャトルベクターｐＸＣＸＩＩ（ＭｃＫｉｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｇｅｎｅ， １９：３３； ＭｃＧｒｏｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １６３：６１４）の改変ＸｂａＩ部位へクローニングすることができる。
【０３６１】
シャトルベクターｐＸＣＸＩＩの改変：
５’末端から３’末端にわたりＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｆｉＩ、ＰｍｅＩ、ＮｈｅＩ、ＳｒｆＩ、ＰａｃＩ、ＳａｌＩおよびＸｂａＩ制限部位を含み、配列：５’ＣＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣＧＧＣＣＴＣＣＧＴＧＧＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＣ−３’を有するマルチクローニング部位を、ベクターｐＸＣＸＩＩのＸｂａＩ部位のレベル（３３２９位のヌクレオチド）に挿入することができる（ＭｃＫｉｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｇｅｎｅ １９：３３； ＭｃＧｒｏｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １６３：６１４）。
次に、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、ＦＶ４０の供与体および受容体スプライシング部位、ならびに、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルを含む改変ベクターｐＣＭＶ−βから単離されたＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩＤＮＡ断片をｐＣＭＶ−１１を指定する改変シャトルベクターｐＸＣＸのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ部位にクローニングした。
【０３６２】
シャトルベクターｐＡＤ１２−ＡＢＣＡの調製：
上述したＲＴ−ＰＣＲ反応によりヒトＡＢＣＡ１２ｃＤＮＡを得て、ＮｏｔＩ部位のレベルでベクターｐＣＭＶ−１２にクローニングし、ベクターｐＣＭＶ−ＡＢＣＡ１２を得る。
【０３６３】
ＡＢＣ１２組換えアデノウイルスの構築：
ＭｃＧｒｏｒｙ等により説明された技術（１９８８， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １６３：６１４）に従ってヒトＡＢＣＡ１２ｃＤＮＡを含む組換えアデノウイルスを構築することができる。
簡単にいえば、ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａの技術に従って（１９８７， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ７：２７４５−２７５２）、ベクターｐＡＤ１２−ＡＢＣＡをベクターｔＧＭ１７でコトランスフェクトする。
同様に、ベクターｐＡＤ１２−ルシフェラーゼを構築し、ベクターｐＪＭ１７でコトランスフェクトした。
【０３６４】
組換えアデノウイルスをＰＣＲ増幅で同定し、２回の精製サイクルを行い、その後、ヒト胎児の腎臓細胞系ＨＥＫ２９３においてラージスケール増幅する（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ， ＵＳＡ）。
アデノウイルスベクターで感染後４８〜７２時間に感染細胞を回収し、５回の凍結−解凍溶解サイクルを行う。
フレオン（ハロカーボン１１３， Ｍａｔｈｅｓｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔ， Ｓｃａｕｃｕｓ， Ｎ．Ｊ． ＵＳＡ）を用いて粗溶解物を抽出し、０．２％マウスアルブミン（シグマケミカル社、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）を添加した塩化セシウム中で２回沈殿させ、１５０ｎＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、および１ｍＭのＣａＣｌ２で構成される緩衝液で十分に透析する。
【０３６５】
組換えアデノウイルスを−７０℃で貯蔵し、それらを動物に投与する前、または、それらを培養中の細胞とインキュベーションする前に滴定する。
除去された領域の構造的部分に位置するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ増幅でスクリーニングすることによって、コンタミネーションした野生型アデノウイルスが存在しないことを確認する。
【０３６６】
ヒトＡＢＣＡ１２ｃＤＮＡ発現の確認：
ＡＢＣＡ１２タンパク質より誘導した、配列番号５または６で示されるアミノ酸配列の全部または一部を含む合成ポリペプチド断片をウサギと雛に注射することによって、ヒトＡＢＣＡ１２ポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体を上述したように調製することができる。これらポリクローナル抗体を用いて、ヒトＡＢＣＡ１２遺伝子の発現を細胞および動物モデルで免疫ブロッティングおよび／または免疫検出により検出および／または定量する。
【０３６７】
細胞におけるヒトＡＢＣＡ１２ｃＤＮＡｉｎのインビトロ発現：
リポフェクトアミン（ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ， ＵＳＡ）を用いて、または、塩化カルシウムを用いた共沈により（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ７：２７４５−２７５２）、初代培養におけるＨＥＫ２９３系細胞およびＣＯＳ−７系細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ， ＵＳＡ）、同様に、線維芽細胞を発現ベクターｐＣＭＶ−ＡＢＣＡ１２でトランスフェクトする（５〜２５μｇ）。
また、これら細胞をベクターｐＡＢＣＡ１２−ＡｄＶで感染させることもできる（感染指数、ＭＯＩ＝１０）。
トランスフェクト細胞および／または感染細胞を用いた免疫ブロッティングによりヒトＡＢＣＡ１２遺伝子の発現をモニターすることができる。
【０３６８】
様々な動物モデルにおけるヒトＡＢＣＡ１２遺伝子のインビボ発現：
実験の０日目に、適切な量（１００〜３００μｌ）の、１０８〜１０９溶解プラーク形成単位（ｐｆｕ）の精製組換えアデノウイルス（ｐＡＢＣＡ−ＡｄＶまたはｐＬｕｃｉｆ−ＡｄＶ）を含む培地を、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、コントロールマウス、および、トランスジェニックモデルまたはノックアウトマウスモデルの両方）の伏在静脈に注入する。
アデノウイルス投与の前（０日目）と後（２、４、７、１０、１４日目）で脂質物質の総量を測定することによって、脂質物質輸送におけるＡＢＣＡ１２タンパク質の生理学的な役割を評価する。
【０３６９】
ベクターｒＬｕｃｉｆ−ＡｄＶおよびｒＡＢＣＡ−ＡｄＶの投与の５日後に、放射活性標識産物を用いた反応速度研究を行い、ＡＢＣＡ１２発現の脂質物質輸送に対する効果を評価する。
その上、ＡＢＣＡ１２遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスおよびウサギの製造は、Ｖａｉｓｍａｎ（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．， １９９５ Ｍａｙ １９；２７０（２０）： １２２６９−７５）およびＨｏｅｇ（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．， １９９６ Ｆｅｂ ２３；２７１（８）：４３９６−４０２）の教示に従って、内因性プロモーター（例えばＣＭＶまたはａｐｏＥ）の制御下のヒトＡＢＣＡ１２ｃＤＮＡを含む構造を用いて行うことができる。
ＡＢＣＡ１２の発現の長期効果の、脂質の反応速度に関する評価を上述のように行うことができる。
【０３７０】
本発明は、本明細書で説明された特定の実施形態の範囲に限定されない。実際に、当業者であれば、本明細書で説明された実施形態に加えて、本発明の様々な改変が前述の記載および添付の図面から明白である。このような改変は、請求項の範囲内に含まれるように意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＡＢＣＡ１２遺伝子を含む染色体２ｑ３４領域部分の物理的地図を示す。マイクロサテライトマーカーＤ２Ｓ３１７、Ｄ２Ｓ１４３、Ｄ２Ｓ１３７、Ｄ２Ｓ１２８、Ｄ２Ｓ１３７１、およびＤ２Ｓ１６４の位置を示す。ヒト染色体遺伝子座２ｑ３４上の多形先天性白内障、魚鱗癬、および糖尿病、インスリン依存性のリンケージも示す。
【図２Ａ】
配列番号１を含む１つのＡＢＣＡ１２のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。開始コドン、停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを太字で示す。プライマーおよびリバースプライマーを、それぞれ一重下線および二重下線で示す。
【図２Ｂ】
図２Ａの続きである。
【図２Ｃ】
図２Ｂの続きである。
【図３Ａ】
配列番号２を含むＡＢＣＡ１２のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。開始コドン、停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを太字で示す。
【図３Ｂ】
図３Ａの続きである。
【図３Ｃ】
図３Ｂの続きである。
【図４Ａ】
配列番号３を含むＡＢＣＡ１２のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。開始コドン、停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを太字で示す。
【図４Ｂ】
図４Ａの続きである。
【図４Ｃ】
図４Ｂの続きである。
【図５Ａ】
配列番号４を含むＡＢＣＡ１２のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。開始コドン、停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを太字で示す。
【図５Ｂ】
図５Ａの続きである。
【図５Ｃ】
図５Ｂの続きである。
【図６】
配列番号５を含むＡＢＣＡ１２タンパク質のより長い鎖のアイソフォームのアミノ酸配列を示す。開始コドン、停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを太字で示す。
【図７】
配列番号６を含むＡＢＣＡ１２タンパク質の短鎖アイソフォームのアミノ酸配列を示す。開始コドン、停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを太字で示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004527237.tif 000181
【国際調査報告】
2004527237.tif 000182
2004527237.tif 000183
2004527237.tif 000184