(57)【要約】本発明は、ストレプトアビジンに対する高い親和性を有するペプチドを提供する。これらのペプチドは、関心対象のタンパク質の検出、定量、および精製を容易にするため、融合タンパク質の一部として発現され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０ μＭ未満の解離定数でストレプトアビジンと結合するペプチドであって、ジスルフィド結合または環化していないペプチド。
【請求項２】
１０ μＭ未満の解離定数でストレプトアビジンと結合するペプチドであって、該ペプチドのアミノ酸配列が、ＨＰＱ、ＨＰＭ、ＨＰＮ、またはＨＱＰモチーフを含有していないペプチド。
【請求項３】
２３ ｎＭ未満の解離定数でストレプトアビジンと結合するペプチド。
【請求項４】
解離定数が１ μＭ未満である、請求項１または２記載のペプチド。
【請求項５】
解離定数が１００ ｎＭ未満である、請求項４記載のペプチド。
【請求項６】
解離定数が５０ ｎＭ未満である、請求項５記載のペプチド。
【請求項７】
解離定数が１０ ｎＭ未満である、請求項３記載のペプチド。
【請求項８】
解離定数が５ ｎＭ未満である、請求項７記載のペプチド。
【請求項９】
配列番号：１〜２９のうちのいずれか一つの少なくとも１０個の連続アミノ酸を含む、請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項１０】
配列番号：１〜２９のうちの一つの少なくとも２５個の連続アミノ酸を含む、請求項９記載のペプチド。
【請求項１１】
配列番号：１〜２９のうちのいずれか一つの少なくとも５０個の連続アミノ酸を含む、請求項１０記載のペプチド。
【請求項１２】
配列番号：１〜２９のうちのいずれか一つの少なくとも１００個の連続アミノ酸を含む、請求項１１記載のペプチド。
【請求項１３】
配列番号：１〜２９または３５のうちのいずれか一つのアミノ酸配列を含む、請求項１〜３いずれか一項記載のペプチド。
【請求項１４】
請求項１〜３いずれか一項記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項１５】
請求項１４記載の核酸を含むベクター。
【請求項１６】
（ａ）１０ μＭ未満の解離定数でストレプトアビジンと結合し、ジスルフィド結合もしくは環化していないペプチド；
（ｂ）１０ μＭ未満の解離定数でストレプトアビジンと結合し、ＨＰＱ、ＨＰＭ、ＨＰＮ、もしくはＨＱＰモチーフを含有していないペプチド；または
（ｃ）２３ ｎＭ未満の解離定数でストレプトアビジンと結合するペプチド
に共有結合で連結された、関心対象のタンパク質を含む融合タンパク質。
【請求項１７】
ペプチドが、関心対象のタンパク質のアミノ末端もしくはカルボキシ末端に付着しているか、またはペプチドが、関心対象のタンパク質のアミノ末端とカルボキシ末端との間に位置している、請求項１６記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
ペプチドが、プロテアーゼ感受性部位を含むリンカーによって、関心対象のタンパク質に連結されている、請求項１６記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
請求項１６記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項２０】
請求項１９記載の核酸を含むベクター。
【請求項２１】
ストレプトアビジン結合融合タンパク質を作製する方法であって、
（ａ）請求項１６記載の融合タンパク質をコードする遺伝子を、宿主細胞において発現させる段階；および
（ｂ）該融合タンパク質の産生にとって適切な条件下で、該宿主細胞を培養する段階
を含む方法。
【請求項２２】
関心対象のタンパク質を試料から精製する方法であって、
（ａ）（ｉ）１０ μＭ未満の解離定数でストレプトアビジンと結合し、ジスルフィド結合もしくは環化していないペプチド；
（ｉｉ）１０ μＭ未満の解離定数でストレプトアビジンと結合し、かつＨＰＱ、ＨＰＭ、ＨＰＮ、もしくはＨＱＰモチーフを含有していないペプチド；または
（ｉｉｉ）２３ ｎＭ未満の解離定数でストレプトアビジンと結合するペプチド：と共有結合で連結された該関心対象のタンパク質を含む融合タンパク質を、該試料中で発現させる段階；
（ｂ）該融合タンパク質と該ストレプトアビジンとの間の複合体形成を可能にする条件下で、該試料をストレプトアビジンと接触させる段階；
（ｃ）該複合体を単離する段階；および
（ｄ）該融合タンパク質を回収し、それにより該関心対象のタンパク質を該試料から精製する段階
を含む方法。
【請求項２３】
試料中の請求項１６記載の融合タンパク質の存在を検出する方法であって、
（ａ）該融合タンパク質とストレプトアビジンとの間の複合体形成を可能にする条件下で、該試料をストレプトアビジンと接触させる段階；
（ｂ）該複合体を単離する段階；および
（ｃ）該ストレプトアビジンの存在を検出する段階であって、該ストレプトアビジンの存在が該試料中の該融合タンパク質の存在を示す段階
を含む方法。
【請求項２４】
段階（ｃ）が、複合体内のストレプトアビジンの存在を検出する段階を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
段階（ｃ）が、複合体から回収されたストレプトアビジンの存在を検出する段階を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
段階（ｃ）が、試料中の融合タンパク質の量と相関しているストレプトアビジンの量を測定する段階をさらに含む、請求項２３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
政府の後援を受けた研究に関する言及
本発明は、グラント番号Ｒ０１ＧＭ５３９３６で国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）より、そしてグラント番号ＮＣＣ−２−１０６９でＮＡＳＡより資金提供を受けた。政府は、本発明における一定の権利を有しうる。
【０００２】
発明の背景
一般的に、本発明は、関心対象のタンパク質を精製または検出するための新規な化合物および方法を特徴とする。
【０００３】
タンパク質の酵素活性、結合特異性、または三次元構造の決定は、細胞溶解物またはインビトロ翻訳抽出物の中に存在する化合物のような、他成分の複雑な混合物からのタンパク質の精製を必要とする場合が多い。全ゲノム配列決定プロジェクトの結果として既知タンパク質の数は劇的に増加しつつあり、タンパク質の検出および精製のための親和性試薬を生成させるための、伝統的な時間のかかるモノクローナル抗体作製に代わるものを見出すことが重要になってきた。さらに、伝統的なカラムクロマトグラフィ法を使用した新規タンパク質の精製は、高い収率および純度のタンパク質の回収をもたらす精製プロトコルを開発するための、多大な試行錯誤を必要とする場合が多い。
【０００４】
従って、安価な試薬を活用し、かつ複数のクロマトグラフィ段階を必要とすることなく高度に精製されたタンパク質をもたらす、関心対象のタンパク質に一般的に適用されうる精製法が必要とされている。
【０００５】
発明の概要
本発明の目的は、関心対象のタンパク質の精製、検出、または定量のための改良された試薬を提供することである。特に、本発明の高親和性ストレプトアビジン結合ペプチドは、関心対象のタンパク質を含む融合タンパク質の精製のための親和性タグとして使用されうる。
【０００６】
従って、第一の面において本発明は、１０ μＭ未満の解離定数でストレプトアビジンと結合し（すなわち、１０ μＭのＫｄよりも強くストレプトアビジンと結合し）、かつジスルフィド結合または環化していないペプチドを提供する。好ましくは、解離定数は、５ μＭ以下、１ μＭ以下、１００ ｎＭ以下、５０ ｎＭ以下、２５ ｎＭ以下、１０ ｎＭ以下、またはさらには５ ｎＭ以下である。一つの好ましい態様において、解離定数は、１０ μＭ未満、５ μＭ未満、１ μＭ未満、１００ ｎＭ未満、５０ ｎＭ未満、または２５ ｎＭ未満であり；かつ０．０１ ｎＭ超、０．１ ｎＭ超、１ ｎＭ超、５ ｎＭ超、または１０ ｎＭ超である。もう一つの好ましい態様において、解離定数の値は、５ μＭ〜１ μＭ、１ μＭ〜１００ ｎＭ、１００ ｎＭ〜５０ ｎＭ、５０ ｎＭ〜２５ ｎＭ、２５ ｎＭ〜１０ ｎＭ、１０ ｎＭ〜５ ｎＭ、５ ｎＭ〜１ ｎＭ、または５ ｎＭ〜０．１ ｎＭ（両端を含む）の範囲のうちの一つに含まれている。
【０００７】
関連する面において、本発明は、１０ μＭ未満の解離定数でストレプトアビジンと結合するペプチドを提供する。ペプチドのアミノ酸配列は、ＨＰＱ、ＨＰＭ、ＨＰＮ、またはＨＱＰモチーフを含有していない。好ましくは、解離定数は、５ μＭ以下、１ μＭ以下、１００ ｎＭ以下、５０ ｎＭ以下、２５ ｎＭ以下、１０ ｎＭ以下、または５ ｎＭ以下である。一つの好ましい態様において、解離定数は、１０ μＭ未満、５ μＭ未満、１ μＭ未満、１００ ｎＭ未満、５０ ｎＭ未満、または２５ ｎＭ未満であり；かつ０．０１ ｎＭ超、０．１ ｎＭ超、１ ｎＭ超、５ ｎＭ超、または１０ ｎＭ超である。もう一つの好ましい態様において、解離定数の値は、５ μＭ〜１ μＭ、１ μＭ〜１００ ｎＭ、１００ ｎＭ〜５０ ｎＭ、５０ ｎＭ〜２５ ｎＭ、２５ ｎＭ〜１０ ｎＭ、１０ ｎＭ〜５ ｎＭ、５ ｎＭ〜１ ｎＭ、または５ ｎＭ〜０．１ ｎＭ（両端を含む）の範囲のうちの一つに含まれている。
【０００８】
もう一つの関連する面において、本発明は、２３ ｎＭ未満、１０ ｎＭ未満、または５ ｎＭ未満の解離定数でストレプトアビジンと結合するペプチドを提供する。一つの好ましい態様において、ペプチドはジスルフィド結合または環化していない。もう一つの好ましい態様において、解離定数は、２３ ｎＭ未満、１０ ｎＭ未満、または５ ｎＭ未満であり；かつ０．０１ ｎＭ超、０．１ ｎＭ超、または１ ｎＭ超である。もう一つの好ましい態様において、解離定数の値は、２０ ｎＭ〜１０ ｎＭ、１０ ｎＭ〜５ ｎＭ、５ ｎＭ〜１ ｎＭ、または５ ｎＭ〜０．１ ｎＭ（両端を含む）の範囲のうちの一つに含まれている。
【０００９】
他の関連する面において、本発明は、本発明のペプチドをコードする核酸、およびそのような核酸を含むベクターを提供する。
【００１０】
さらに、本発明のペプチドと関心対象のタンパク質とを含む、融合タンパク質をコードする融合核酸を生成するために、標準的な遺伝子融合技術が使用されうる。融合タンパク質は、ストレプトアビジンに対するペプチドの高い親和性に基づき、精製、検出、または定量されうる。
【００１１】
従って、一つのそのような面において、本発明は、（ａ）１０ μＭ未満の解離定数でストレプトアビジンと結合し、かつジスルフィド結合もしくは環化していないペプチド、（ｂ）１０ μＭ未満の解離定数でストレプトアビジンと結合し、かつＨＰＱ、ＨＰＭ、ＨＰＮ、もしくはＨＱＰモチーフを含有していないペプチド、または（ｃ）２３ ｎＭ未満の解離定数でストレプトアビジンと結合するペプチドのうちの一つと共有結合で連結された、関心対象のタンパク質を含む融合タンパク質を提供する。好ましい態様において、ペプチドは、関心対象のタンパク質のアミノ末端もしくはカルボキシ末端に付着しているか、またはペプチドは関心対象のタンパク質のアミノ末端とカルボキシ末端との間に位置する。好ましくは、ペプチドは、プロテアーゼ感受性部位を含むリンカーによって関心対象のタンパク質と連結される。
【００１２】
関連する面において、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸、およびこれらの融合核酸を含むベクターを提供する。
【００１３】
さらに本発明は、本発明の融合タンパク質を作製する方法を提供する。この方法は、融合タンパク質をコードする核酸配列を有するベクターを適切な宿主細胞へとトランスフェクトする段階、および融合タンパク質の発現にとって適切な条件下で宿主細胞を培養する段階を含む。
【００１４】
本明細書に記載された融合タンパク質は、関心対象のタンパク質を試料から精製する方法において使用されうる。そのような方法は、（ａ）１０ μＭ未満の解離定数でストレプトアビジンと結合し、かつジスルフィド結合もしくは環化していないペプチド、（ｂ）１０ μＭ未満の解離定数でストレプトアビジンと結合し、かつＨＰＱ、ＨＰＭ、ＨＰＮ、もしくはＨＱＰモチーフを含有していないペプチド、または（ｃ）２３ ｎＭ未満の解離定数でストレプトアビジンと結合するペプチドのうちの一つと共有結合で連結された融合タンパク質として、関心対象のタンパク質を発現させる段階を含む。融合タンパク質を含む試料は、融合タンパク質とストレプトアビジンとの間の複合体形成を可能にする条件下で、ストレプトアビジンと接触させる。複合体を単離し、融合タンパク質を複合体から回収し、それにより関心対象のタンパク質を試料から精製する。一つの好ましい態様において、融合タンパク質からストレプトアビジン結合ペプチドを切断することにより、関心対象のタンパク質が融合タンパク質から回収される。
【００１５】
さらにもう一つの面において、本発明は試料中の本発明の融合タンパク質の存在を検出する方法を提供する。この方法は、（ａ）融合タンパク質とストレプトアビジンとの間の複合体形成を可能にする条件下で、試料をストレプトアビジンと接触させる段階、（ｂ）複合体を単離する段階、ならびに（ｃ）複合体内の、または複合体からの回収後の、ストレプトアビジンの存在を検出する段階を含む。ストレプトアビジンの存在は、試料中の融合タンパク質の存在を示す。好ましくは、段階（ｃ）は、複合体内の、または複合体からの回収の後の、ストレプトアビジンの量を測定する段階も含む。試料中の融合タンパク質の量は、測定されたストレプトアビジンの量と相関し、かつそれから計算されうる。例えば、ペプチド１分子当たり１分子のストレプトアビジンと結合するペプチドを含む融合タンパク質の場合、試料中の融合タンパク質の量は、測定されたストレプトアビジンの量とおよそ同一であると予測される。一つの好ましい態様において、ストレプトアビジンの量は、ストレプトアビジンと反応するか、またはストレプトアビジンと共有結合で連結された化合物と反応する抗体を用いたウェスタン分析またはＥＬＩＳＡ分析を使用して決定される。もう一つの好ましい態様において、ストレプトアビジンは酵素、放射標識、蛍光標識、またはその他の検出可能基と共有結合で連結され、ストレプトアビジンの量はその酵素活性、放射能、または蛍光のような検出可能基の特徴に基づき、標準的な技術を使用して決定される。
【００１６】
本発明の様々な面の好ましい態様において、ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：１〜２９または３５のうちのいずれか一つの少なくとも１０個、２５個、５０個、７５個、もしくは１００個の連続アミノ酸を含むか、または５個〜１５０個、１０個〜１００個、２０個〜７５個、もしくは３０個〜５０個（両端を含む）のアミノ酸からなる。好ましくは、ペプチドのアミノ酸配列は、ＬＰＱ、ＱＰＱ、ＥＰＱ、ＨＰＡ、ＨＰＤ、またはＨＰＬモチーフを含む。他の好ましい態様において、アミノ酸配列は、配列番号：１〜２９または３５のうちのいずれか一つを含む。さらに他の好ましい態様において、ペプチドは、配列番号：１〜２９または３５のうちのいずれか一つと、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。
【００１７】
ストレプトアビジンに対する本発明のペプチドの親和性は、ペプチドにジスルフィド結合を組み込むか、またはペプチドを環化させることによって増加されうる。ペプチドを束縛することにより、ペプチドに固有の無秩序さの量（即ち、エントロピー）が減少し、従ってこれらのペプチドのストレプトアビジンとの結合は、より少ないエネルギーを必要とするようになり得る。ストレプトアビジンと結合した本発明のペプチドの三次元構造を、実験的に決定するか、またはストレプトアビジンの既知の結晶構造に基づきモデル化し、ストレプトアビジンに対する親和性をさらに改良しうる、ペプチドに対する可能な修飾を決定するために使用することも企図される。
【００１８】
本明細書において使用されるように、「核酸」とは、２個またはそれ以上の共有結合で結合した、天然に存在するかまたは修飾された、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列を意味する。
【００１９】
「ペプチド」とは、２個以上の共有結合で結合した、天然に存在するかまたは修飾されたアミノ酸の配列を意味する。「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書において相互に交換可能に使用される。
【００２０】
「共有結合で連結された」とは、一連の共有結合によって共有結合で結合または接続していることを意味する。タンパク質と共有結合で連結される基は、タンパク質のアミノ末端、カルボキシ末端、アミノ末端とカルボキシ末端との間、またはアミノ酸の側鎖に付着されうる。
【００２１】
「ストレプトアビジン」とは、任意のストレプトアビジン分子もしくはその断片、またはストレプトアビジン分子もしくはその断片と少なくとも８０％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を有する、任意のタンパク質を意味する（例えば、Ｈａｅｕｐｔｌｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：３０５、１９８３参照）。好ましいストレプトアビジンの断片は、ストレプトアビジンのタンパク質分解による切断産物である「コア」ストレプトアビジンである（Ｂａｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５９、３６９−３７６、１９８９）。好ましくは、ストレプトアビジン分子またはその断片は、ビオチンまたはその他のストレプトアビジン結合分子と結合することができる。ストレプトアビジンまたはストレプトアビジン断片は、酵素、放射標識、蛍光標識、またはその他の検出可能基と共有結合で連結されるように、化学的にまたは遺伝子融合技術もしくはタンパク質合成によって修飾されうる。これらの検出可能基は、標準的な方法を使用して、細胞もしくは試料の中のストレプトアビジンと結合した融合タンパク質の存在もしくは位置を決定するするため、またはストレプトアビジンと結合した融合タンパク質の量を定量するために使用されうる。
【００２２】
「環化した」とは、非直鎖状であることを意味する。ペプチドは、ペプチドのＮ末端アミノ基または残基の側鎖と、Ｃ末端カルボキシル基または残基の側鎖との間の共有結合の形成によって環化されうる。例えば、ペプチド・ラクタムは、Ｎ末端アミノ基またはアミノ酸側鎖のアミノ基と、Ｃ末端カルボキシル基またはカルボキシルもしくはアミドを含む側鎖との間の環化によって形成されうる。その他の可能な環化には、システイン側鎖内のチオール基と、Ｎ末端アミノ基、Ｃ末端カルボキシル基、またはもう一つのアミノ酸の側鎖との反応によるチオエステルの形成が含まれる。ジスルフィド結合を、２個のシステイン残基間で形成させることもできる。本明細書において使用されるように、「非環化ペプチド」とは、前記の環化を全く有していない直鎖状のペプチドである。
【００２３】
「解離定数」とは、本明細書に記載された電気泳動移動度シフトアッセイ法を使用して測定される、ストレプトアビジンとの結合に関する解離定数を意味する。特定の解離定数「未満」とは、特定の解離定数によって表された結合強度より強くストレプトアビジンと結合することができることを意味する。
【００２４】
「精製」とは、天然状態において付随している他成分から、化合物、例えばタンパク質を分離することを意味する。典型的には、天然状態において会合しているタンパク質および天然に存在する有機分子を、少なくとも５０％重量含まない場合、そのタンパク質は実質的に純粋である。好ましくは、タンパク質は、少なくとも７５％重量、より好ましくは少なくとも９０％重量、最も好ましくは少なくとも９９％重量、純粋である。他の好ましい態様において、タンパク質は、出発材料よりも、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、または１００倍、純粋である。純度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィ、光学密度、ＨＰＬＣ分析、ウェスタン分析、またはＥＬＩＳＡのような任意の適切な方法によってアッセイされうる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、「分子生物学における現行プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０００参照）。
【００２５】
「複合体から回収された」とは、ストレプトアビジンと融合タンパク質との複合体から物理的に分離されることを意味する。例えば、ストレプトアビジンと結合した融合タンパク質を、融合タンパク質のストレプトアビジンに対する親和性を低下させる条件下で（即ち、低いか、もしくは高い塩濃度で、または低いか、もしくは高いｐＨ値で）インキュベートするか、またはストレプトアビジンとの結合に関して融合タンパク質と競合する分子の存在下でインキュベートすることができる。好ましくは、複合体から放出された融合タンパク質またはストレプトアビジンのいずれかが、カラムクロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、またはウェスタン分析のような標準的な手法を使用して単離される。
【００２６】
本発明は、関心対象のタンパク質の検出および精製に関する多数の利点を提供する。例えば、本発明の方法は、各関心対象のタンパク質に特異的な抗体またはその他の親和性試薬の生成を必要としないため、これらの方法は、任意のタンパク質に普遍的に適用されうる。さらに所望ならば、ストレプトアビジン結合ペプチドは、融合タンパク質の精製後のペプチドの除去を可能にする、プロテアーゼ切断可能リンカーによって、関心対象のタンパク質と接続されうる。本明細書に記載された方法を使用した、ストレプトアビジンに対する親和性に基づく融合タンパク質の精製は、ヘキサヒスチジン親和性タグまたはマルトース結合タンパク質親和性タグを使用して得られるより、有意に高い純度での融合タンパク質の単離を可能にした。さらに、ストレプトアビジンは、未修飾の状態で、または（ＦＩＴＣ−ストレプトアビジンもしくはアルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジンのような）検出可能基、もしくは（ストレプトアビジン−アガロースのような）クロマトグラフィ基質で共有結合で標識された状態で、購入されうる安価な試薬である。これらの試薬が入手可能であることにより、本発明の融合タンパク質の検出および精製のための方法が単純化される。
【００２７】
その他の本発明の特徴および利点は、以下の詳細な説明、および特許請求の範囲より明らかであると考えられる。
【００２８】
詳細な説明
本発明の方法は、ストレプトアビジンに対する著しく高い親和性（１０ μＭ未満のＫｄ）を有するペプチドの発見に由来する。これらのペプチドは、ｍＲＮＡディスプレイ法を使用して、ランダム化された非束縛ペプチドのライブラリーから選択された。タンパク質が、通常ペプチド認識において機能するものである場合を除き、非束縛直鎖状ペプチド・ライブラリーは、一般的に、タンパク質に対する高親和性リガンドを与えないという事実を考慮すると、選択されたペプチドの高い親和性は、特に驚くべきものであった（Ｃｌａｃｋｔｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ １２：１７３−１８４（１９９４）；Ｋａｔｚ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６：２７−４５、１９９７）。ストレプトアビジンに対する高い親和性を有するその他の多くのペプチドが、ｍＲＮＡディスプレイ法またはリボソーム・ディスプレイ（Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３（３）：２６８−７３、１９９９）、またはファージ・ディスプレイ（米国特許第５，８２１，０４７号）のようなその他の選択法を使用して単離されうる。
【００２９】
例示的な選択されたストレプトアビジン結合ペプチドの結合特徴が、表１に記載されており、これらのペプチドの配列が、図３に列挙されている。表１の第１列には、ペプチド名（ＳＢ１〜ＳＢ２０）が列挙されている。比較のため、１９残基によって隔離された２個のＨＰＱモチーフを有する、非選択の配列（「非選択」と呼ばれる）が、第１行に挙げられている。ＳＢ１９−Ｃ４は、後述されるペプチドＳＢ１９の短縮変異体である。ペプチドは、所有するＨＰＱおよび類似トリペプチド・モチーフの数によって分類されている。第２列は、各ペプチド内のトリペプチド・モチーフの数、およびそれらを隔離しているアミノ酸残基の数を示す。第３列は、ペプチドの結合およびストレプトアビジン・カラムからの特異的溶出の割合（％）を表している。この割合（％）は、２個のＨＰＱモチーフを有する対照非選択ペプチドに関するわずか０．１６％と比較して、選択されたペプチドに関しては、８．３％から８８％までの範囲であった。
【００３０】
第４列は、本明細書に記載されたＥＭＳＡアッセイ法において測定されるような、ストレプトアビジンとペプチドとの間の相互作用に関して既知の場合のＫｄを示している。独立した測定の数（ｎ、括弧内で示されている）に基づくＫｄの標準偏差は、第５列に示されている。解離定数は、ペプチドＳＢ５の１１０ ｎＭからペプチドＳＢ２の４．８ ｎＭまでの範囲であった。
【００３１】
【表１】
2004537965.tif 000002
【００３２】
選択されたペプチドのストレプトアビジンとの結合をさらに特徴づけするため、ペプチドＳＢ１９の短縮変異体を構築して、どの領域が高親和性ストレプトアビジン結合にとって必要であるかを決定した（図５）。最大５６残基の欠失は、結合強度に対する観察可能な効果を有していなかった。例えば、ペプチドＳＢ１９−Ｃ４は、選択された構築物からの最初の３８残基のみ（＋Ｃ末端配列ＭＭＳＧＧＣＫＬＧ、配列番号：３６）を保持しており、ストレプトアビジンに対して４．９ ｎＭの解離定数を有していた（表１）。対照的に、Ｎ末端短縮変異（Ｎ１〜Ｎ３）によって、ストレプトアビジン・カラムから特異的に溶出するコードされたペプチドの割合％が低下した（全長ＳＢ１９に関する８５％と比較して、短縮変異体は０．０５８％〜６９％）。これらの結果より、ストレプトアビジンとの結合のための決定因子が、ＳＢ１９ペプチドのＮ末端３８残基全体に及ぶことが示唆された。
【００３３】
表１に示されているような高親和性ストレプトアビジン結合ペプチドは、多数の用途を有している。例えばこれらのペプチドは、１個または複数の本発明のストレプトアビジン結合ペプチドと接合した融合タンパク質として、関心対象のタンパク質を発現させることにより、タンパク質精製のために使用されうる。一つのそのような精製法において、融合タンパク質を含む試料が、固定化されたストレプトアビジンと共にインキュベートされる。ストレプトアビジンに対する親和性を有さないか、または弱い親和性を有するタンパク質が洗浄除去され、次いで融合タンパク質が、ビオチン、ビオチン類似体、もう一つのストレプトアビジン融合タンパク質、または基質との結合に関して融合タンパク質と競合する任意の化合物の添加によって、ストレプトアビジン基質から選択的に溶出される。または、融合タンパク質は、基質に加えられる緩衝液のｐＨを増加させるか、または減少させることにより、基質から溶出されうる。
【００３４】
後に詳述されるように、この一般的なプロトコルは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抽出物からのストレプトアビジン結合ペプチドを含む融合タンパク質の一段階精製において使用され、極めて純粋なタンパク質を高い収率で与えた。この融合タンパク質は、小さいサイズのため、共有結合で連結された関心対象のタンパク質の三次元構造または活性に影響を与えないと予想される、ＳＢ１９−Ｃ４ペプチドの最初の３８アミノ酸を含有していた。その他の本発明のストレプトアビジン結合ペプチドを含む融合タンパク質の精製も、同様に実施されうる。
【００３５】
さらに、前記の精製プロトコルの様々な修飾が、当業者には明らかであり（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（前記）参照）、そのような修飾は本発明に含まれる。特に、ストレプトアビジン結合ペプチドの親和性タグとしての使用は、ハイスループットのタンパク質の作製および精製にとって望ましい。例えば、マルチウェル・フォーマットでの融合タンパク質の精製が、自動装置により洗浄され溶出される磁性ストレプトアビジン・ビーズを使用して実施されうる。本発明の方法は、標準的な技術を使用して、インビトロ翻訳混合物、または原核生物、酵母、昆虫、もしくは哺乳動物細胞のようなその他の抽出物から融合タンパク質を精製するためにも適合されうる。必要であれば、抽出物由来の試料をストレプトアビジンと接触させる前に、抽出物中の任意の遊離ビオチンと結合するよう、アビジンを抽出物に添加できる。任意の遊離ビオチンをアビジンと結合させることにより、ビオチンが、ストレプトアビジンとの結合に関してストレプトアビジン結合ペプチドと競合することが防止されうる。
【００３６】
所望ならば、試料中の本発明の融合タンパク質の存在は、ストレプトアビジンが融合タンパク質を結合することを可能にする条件下で、融合タンパク質をストレプトアビジン（即ち、未標識ストレプトアビジン、または検出可能基で標識されたストレプトアビジン）と共にインキュベートすることにより検出されうる。好ましくは、未結合のストレプトアビジンが、ストレプトアビジンと結合した融合タンパク質から分離される。次いで、融合タンパク質と結合しているストレプトアビジンが検出される。または、融合タンパク質と結合したストレプトアビジンが、融合タンパク質から物理的に分離され、次いで標準的な方法を使用して検出される。例えば、融合タンパク質と結合しているか、または融合タンパク質から分離されたストレプトアビジンを検出するには、ストレプトアビジンと反応するか、またはストレプトアビジンと共有結合で連結された化合物と反応する抗体を使用して、ウェスタン分析またはＥＬＩＳＡ分析が実施されうる。ストレプトアビジンが酵素、放射標識、蛍光標識、またはその他の検出可能基と共有結合で連結されている場合には、ストレプトアビジンの量が、その酵素活性、放射能、または蛍光のような検出可能基の特徴に基づき、標準的な技術を使用して決定されうる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（前記）参照）。またはストレプトアビジンを、酵素、放射標識、蛍光標識、またはその他の検出可能基と共有結合で連結されたストレプトアビジン結合化合物と接触させ、その検出可能基を本明細書に記載されるようにアッセイしてもよい。
【００３７】
本発明者らは、所望の結合親和性または活性を有するタンパク質を単離するための多様な選択法において使用されうる、全長タンパク質をコードする合成ＤＮＡライブラリーを生成させるための、改良された方法も開発した。所望の数のアミノ酸を含むタンパク質のライブラリーの生成は、しばしば短縮型タンパク質をもたらす内部開始事象の数、および未熟な終止コドンまたは所望の終止コドンの除去をもたらすフレームシフトの数によって制限される。例えば、固相ＤＮＡ合成中には、カップリングおよびキャッピングの効率が不完全なため、フレームシフトを引き起こす挿入および欠失が起こりうる。さらに、ＤＮＡテンプレート内のランダム領域は、コードされたタンパク質の未熟な短縮をもたらす終止コドンをコードしうる。これらの問題を解決するため、本発明者らは、小さなＤＮＡカセットを合成し、ＤＮＡカセットのライブラリーを、２個のタンパク質親和性タグをコードする配列に関して濃縮するために、ｍＲＮＡディスプレイ技術を使用したインビトロ選択を実施する方法を開発した。これらのＤＮＡカセットは、フレームシフトおよび未熟な終止コドンを欠いている。次いで、選択されたＤＮＡカセットは、制限酵素で切断され、全長ＤＮＡライブラリーを生成させるためにライゲーションされる（図８Ａ〜８Ｆ）（Ｃｈｏら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９７：３０９−３１９、２０００）。
【００３８】
この方法の一つの好ましい態様において、オープン・リーディング・フレームと機能的に連結された翻訳エンハンサー配列を含有しており、かつピューロマイシンで終結する、ｍＲＮＡディスプレイ・テンプレートが、以前に記載されたようにして（Ｃｈｏら（前記））、生成される。オープン・リーディング・フレームは、ＦＬＡＧタグおよびヘキサヒスチジン・タグのような、２個の異なるタンパク質親和性タグをコードする。好ましくは、一方のタグは、コードされたペプチドのアミノ末端に位置し、もう一方のタグは、カルボキシ末端に位置する。ｍＲＮＡディスプレイ・テンプレートは、ｍＲＮＡディスプレイされたペプチドを生成させるためにインビトロで翻訳される（Ｃｈｏら（前記））。フレームシフトまたは未熟な終止コドンを含有していないテンプレートによってコードされた、ｍＲＮＡディスプレイされたペプチドは、両方の親和性タグを含むはずである。対照的に、フレームシフトまたは未熟な終止コドンを含むテンプレートは、Ｃ末端親和性タグを含まないペプチドをコードする（図８Ｄ）。さらに、内部で開始するｍＲＮＡディスプレイ・テンプレートは、Ｎ末端親和性タグを含まないペプチドを産生する（図８Ｃ）。ｍＲＮＡディスプレイされたペプチドのライブラリーは、これらのタグの存在に基づくｍＲＮＡディスプレイされたペプチドの精製によって、両方の親和性タグを含むペプチドに関して濃縮される（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（前記）参照）。例えば、ｍＲＮＡディスプレイされたペプチドが、一方の親和性タグを含むペプチドと結合するよう設計された基質にアプライされ、親和性タグを含まないｍＲＮＡディスプレイ・ペプチドが洗浄除去されうる。次いで、親和性タグを含むｍＲＮＡディスプレイ・ペプチドが溶出され、もう一方の親和性タグと結合するよう設計された第二の基質に加えられる。この精製工程から回収されたｍＲＮＡディスプレイ・ペプチドは、両方の親和性タグを含むメンバーに関して濃縮されており、従って全長ペプチドに関して濃縮されている。これらのｍＲＮＡディスプレイされたペプチドは、二本鎖ＤＮＡが生成するよう逆転写される。次いで、増幅されたＤＮＡが、制限酵素によって切断される。好ましくは、この制限消化によって、ＤＮＡカセットから親和性タグをコードする配列が除去される。次いで、切断されたＤＮＡカセットが、全長ＤＮＡテンプレートを生成させるためにライゲーションされる。
【００３９】
前記の実験を、以下のように実施した。
【００４０】
ストレプトアビジン結合ペプチド・ライブラリーの生成
関心対象のペプチドまたはタンパク質を選択するためのｍＲＮＡディスプレイ法は、リボソームのＡ部位に進入し、新生ペプチドと共有結合を形成することによって機能する、翻訳を終結させる抗生物質ピューロマイシンを利用する。ｍＲＮＡの３’末にピューロマイシンを共有結合で付着させることによって、ポリペプチドとそのコーディング・メッセージとの間の共有結合的連結が、インビトロ翻訳中にインサイチューで達成されうる（Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．９：５２１−５２９、１９９９；Ｌｉｕら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１８：２６８−２９３、２０００）。次いで、これらのｍＲＮＡ−ペプチド融合体を精製し、インビトロの選択に供することにより、新規ペプチド・リガンドが単離される。
【００４１】
記載されたようにして（Ｃｈｏら（前記））、１０８アミノ酸のポリペプチドをコードするＤＮＡライブラリーを合成した。ライブラリーは、共にコンカテマー化された短いカセットからなっていた。各カセットは、両親媒性のαヘリックスまたはβ鎖の形成と適合性の、極性対無極性アミノ酸側鎖パターンを有するランダムペプチドをコードしていた（Ｃｈｏら（前記））。ランダム領域は、８８アミノ酸であり、ヘキサヒスチジン・タグを含むＣ末端不変領域が続いていた（図１Ａ）。
【００４２】
ライブラリーは、ＤＮＡレベルで２．４×１０１４の複雑度を有していた。それを、記載されたように（Ｌｉｕら（前記）；Ｃｈｏら（前記））、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して転写し（図１Ａ）、その後Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、「リンカー」オリゴヌクレオチドを３’末に追加した。リンカーは、２１ヌクレオチド長のｄＡ伸張の後に、ポリエチレングリコール・リンカーが続き、配列ｄＡ−ｄＣ−ｄＣ−ピューロマイシンが続くものからなっていた（Ｌｉｕら（前記））。
【００４３】
このピューロマイシン終結ｍＲＮＡを、キャッピングされたｍＲＮＡのための標準的な条件下で、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）インビトロ翻訳キットを使用して、インビトロで翻訳した。１０ｍＬの反応混合物に、２ｍＣｉ ３５Ｓ−メチオニンを補充し、全メチオニン濃度を１０ μＭとした。反応混合物は、３００ ｎＭのピューロマイシン連結ｍＲＮＡ分子のライブラリーも含んでいた。３０℃で１時間後、ＭｇＣｌ２およびＫＣｌをそれぞれ２０ ｍＭおよび７１０ ｍＭになるよう添加し、ディスプレイされたペプチドの収率を増加させるため、反応混合物を室温で５分間さらにインキュベートした。このインビトロ翻訳により、ピューロマイシン部分を介してそれらのコーディングｍＲＮＡと連結された、ポリペプチド１．２×１０１４個が産生された。
【００４４】
次いで、これらのｍＲＮＡディスプレイされたペプチドを、ｍＲＮＡと融合していないポリペプチドを除去するため、（リンカー内のオリゴｄＡ配列と結合する）オリゴｄＴセルロースで精製した。この精製法については、反応混合物を、オリゴｄＴ結合緩衝液（１Ｍ ＮａＣｌ、５０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５％トリトンＸ−１００、および５ ｍＭ ２−メルカプトエタノール（ｐＨ７．９））および８０ ｍｇのオリゴｄＴセルロース（タイプ７、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で１０倍に希釈し、４℃で３０分間撹拌しながらインキュベートした。その混合物を、カラム（Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐクロマトグラフィ・カラム、Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）へ加え、排出させ、１０ｍＬのオリゴｄＴ洗浄緩衝液（３００ ｍＭ ＮａＣｌ、２０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍ ＥＤＴＡ、０．２５％トリトンＸ−１００、および５ ｍＭ ２−メルカプトエタノール（ｐＨ７．９））で洗浄し、１ｍＬの０．５×オリゴｄＴ洗浄緩衝液で洗浄した。ｍＲＮＡディスプレイされたペプチドを、４．５ｍＬの水＋５ ｍＭ ２−メルカプトエタノールで、それぞれ０．１５％および１５μｇ／ｍＬの最終濃度でトリトンＸ−１００およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を含むチューブへと溶出させた。
【００４５】
オリゴｄＴセルロース・カラムから溶出したｍＲＮＡディスプレイされたペプチドを、ポリペプチドと融合していないｍＲＮＡを除去するため、ポリペプチド上のヘキサヒスチジン・タグと結合するＮｉ−ＮＴＡアガロースでさらに精製した。オリゴｄＴセルロース精製から溶出した画分を、０．５ｍＬのＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を含むＮｉ結合緩衝液［６Ｍ塩化グアジニウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ ｍＭリン酸ナトリウム、１０ ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．１％トリトンＸ−１００、５ ｍＭ ２−メルカプトエタノール、４μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、および５μｇ／ｍＬ ＢＳＡ（ｐＨ８．０）］に曝し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、基質を排出させ、１２カラム容量のＮｉ結合緩衝液で洗浄し、同緩衝液＋１００ ｍＭイミダゾールで溶出させた。溶出した画分を合わせ、１ ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．０１％トリトンＸ−１００、５０ μＭ ＥＤＴＡ、０．５ ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．５μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、および５０μｇ／ｍＬ ＢＳＡ（ｐＨ７．６）で平衡化された２個の連続的なＮＡＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して脱塩した。
【００４６】
次いで、ｍＲＮＡ濃度が約５ ｎＭであり、酵素濃度が１Ｕ／ μＬであることを除き、製造業者の指示に従い、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を使用して、ｍＲＮＡ部分を逆転写した。反応において高い収率を保証するため、２個のプライマー（スプリントされた（ｓｐｌｉｎｔｅｄ）ライゲーション（Ｃｈｏら（前記））に由来する１ μＭの「スプリント（ｓｐｌｉｎｔ）」、および１ μＭの３’ＰＣＲプライマー）の混合物を使用した。４２℃で３０分後、反応混合の温度を２分間５０℃に上昇させ、次いでペプチド折り畳みを徐々に可能にするために５分かけて室温にまで冷却した。最後に、内容物をＮＡＰカラムを使用して脱塩し、シンチレーション計数に供した。精製され逆転写されたｍＲＮＡ−ペプチド融合体の３５Ｓカウントを、３５Ｓ−メチオニン・ストックと比較し、翻訳反応物中の全メチオニン濃度（１０ μＭ）を考慮に入れることにより、この試料中のディスプレイされたペプチドの数が、６．７×１０１２であることが決定された。それは、重複を事実上含有していなかったため、この数は、ライブラリーの複雑度も表す（翻訳において使用されたピューロマイシン−リンカー・テンプレートの複雑度は、回収されたディスプレイされたペプチドの数よりも約３５倍大きかった）。
【００４７】
図１Ｂに示されるように、ｍＲＮＡディスプレイされたペプチドの合成および精製由来の試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させた。
【００４８】
ストレプトアビジン結合ペプチドの選択
ストレプトアビジンに対する高い親和性を有するペプチドの選択のため、前記のｍＲＮＡディスプレイされたペプチドのライブラリーを、還元条件下のストレプトアビジン結合緩衝液（４０ ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、３００ ｍＭ ＫＣｌ、２ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％トリトンＸ−１００、５ ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ、および１μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ（ｐＨ７．４））の中で、固定化されたストレプトアビジン（ウルトラリンク固定化ストレプトアビジンプラス（Ｕｌｔｒａｌｉｎｋ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｐｌｕｓ）、約４ ｍｇ／ｍＬ；Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）と共にインキュベートした。使用されたゲルの量は、全容量５．５ｍＬ中０．５ｍＬであった。室温で２０分間インキュベートした後、内容物を使い捨てクロマトグラフィ・カラムにロードし、排出させ、１４カラム容量のストレプトアビジン結合緩衝液で洗浄し、１０分間隔でストレプトアビジン結合緩衝液＋２ ｍＭ Ｄ−ビオチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の連続的な５回のアリコートで、溶出させた（図１Ａ）。この精製の後に残存していたライブラリーの画分は、０．０８％であった。溶出画分を合わせ、ＮＡＰカラムで脱塩し、次いで記載された条件およびプライマーを使用して（Ｃｈｏら（前記））、二本鎖ＤＮＡライブラリーを再生させるために８ｍＬ反応混合物中でＰＣＲ増幅した。
【００４９】
これで１回目の選択が完了し、残りの６回においては、翻訳の規模を１０倍縮小し、ストレプトアビジン・カラムを洗浄するためのカラム容量数を増加させた（２回目は３２容量；３回目、４回目、および６回目は４０容量；５回目および７回目は２５容量）点を除き、同じプロトコルに従った。５回目および７回目のストレプトアビジン結合選択は、間で増幅を行うことなく、前回の選択からのストレプトアビジン・カラム溶出物に対し直接的に実施した（ビオチンは、ＮＡＰカラムに３回連続的に通すことによって除去した）。７回目の選択の後に増幅されたＰＣＲ産物を、製造業者のプロトコルに従い、ＴＯＰＯ ＴＡクローニング・キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、クローニングした。ストレプトアビジン・カラムと結合し、それから溶出したライブラリーの画分は、毎回増加し、７回目には６１％に達した（図２Ａ）。
【００５０】
選択されたライブラリーの特徴づけ
７回目の選択からの溶出物を、ＰＣＲによって増幅した。ライブラリー構築物のＲＮＡまたはＤＮＡ部分ではなく、ディスプレイされたペプチドが、ストレプトアビジンとの相互作用を担っていることを確認するため、得られたＰＣＲ ＤＮＡを使用して、ディスプレイされたペプチドのライブラリーを合成した。ＲＮＡ分解酵素Ａによるライブラリーの処理は、基質との結合／基質からの溶出の程度を低下させなかった（図２Ｂ）。また、ビオチンで飽和されたストレプトアビジンは、ペプチド・ライブラリーとの結合を示さなかった（図２Ｂ）。これらの結果は、選択されたペプチドのストレプトアビジン基質との相互作用が、基質の他成分ではなく、ライゲーションしていないタンパク質に特異的であることを証明した。
【００５１】
選択されたペプチドの配列分析
７回目のＰＣＲ ＤＮＡからランダムに選択したクローン３３個を、配列決定のため選択した。２０個の異なる配列が観察された（図３）。驚くべきことに、２０個の配列は、全て、２ヌクレオチドの欠失または１ヌクレオチドの付加によって、意図されたフレーム（フレーム１）からフレーム３へのフレームシフトを起こしていた。従って、設計された極性対無極性残基パターンは廃棄され、パターン化されていない本質的にランダムな配列が残された。選択前には、ライブラリー・メンバーの約半分が、オープン・リーディング・フレーム全体にわたりフレーム１で存在していた（Ｃｈｏら（前記））。フレーム３は、配列ＨＰＱの頻度が増加したために、フレーム１よりも濃縮されたと考えられる。フレーム１は、設計された極性／無極性パターンのため、低い配列ＨＰＱの存在率（１：４５，０００ライブラリーメンバー）を有している。対照的に、フレーム３は、同じ長さの、各位置で等しい４ヌクレオチド全ての混合物を含むライブラリーのＨＰＱ配列の予想存在率（１：１９３）と頻度が類似している、はるかに高いＨＰＱ配列の予想存在率（１：６４）を有していた。また、フレーム３は、ヒスチジンに富んでおり、従って、Ｎｉ−ＮＴＡカラムへの保持を可能にした。Ｎｉ−ＮＴＡ精製プロトコルは、ペプチドをディスプレイしていないライブラリーｍＲＮＡ分子を排除することを目的としていたが、少数のヒスチジンを含むペプチドが排除されるよう十分にストリンジェントな条件下では実施されなかった。フレーム２は、終止コドンの高い存在率を有していた。
【００５２】
２０個のクローンのうちの１９個は、少なくとも１個のＨＰＱモチーフを有し、５個のクローンは、そのようなモチーフを２個含有していた（表１）。クローンを、ＨＰＱおよび関連トリペプチド・モチーフの存在回数によって組織化した（表１）。２個のモチーフ間にアミノ酸が存在する場合、その数は、４個〜７４個の範囲であった。
【００５３】
ペプチドの結合親和性
ストレプトアビジンに対する親和性を決定するため、２０個の選択された各ペプチドを迅速にアッセイするため、ペプチドの調製、タグ化、および精製のための新たな方法を使用した。ＤＮＡタグ化されたペプチドの生成のため、単一挿入物を含むプラスミドを、ライブラリー構築について記載されたのと同じ５’ＰＣＲプライマー（Ｃｈｏら（前記））、および３’ＲＮＡ配列を
2004537965.tif 000003
へと改変する新たな３’プライマー
2004537965.tif 000004
を使用したＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用した。この配列は、配列５’−ソラーレン−ＴＡＧＣＣＧＧＴＧ−Ａ１７−ＣＣ−ピューロマイシン−３’（ここで下線が施された塩基は、３’−メトキシヌクレオチドであり、残りの塩基はデオキシヌクレオチドである）（オリゴヌクレオチドは、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡの試薬を使用して合成された）を有している光架橋リンカーへとアニーリングされるよう設計された。この新たなプライマーは、定常Ｃ末端ペプチド配列を、ＷＳＧＧＣＨＨＨＨＨＨＳＳＡ（配列番号：３２）から、リンカーへとアニーリングされるため最後の３個のアミノ酸が翻訳され得ないＷＳＧＧＣＫＬＧＴＧＹ（配列番号：３３）へと変化させた。各ＤＮＡテンプレートを、記載されたようにして（Ｃｈｏら（前記））、転写し、ゲル精製し、次いで、２ μＭ ｍＲＮＡ、４ μＭリンカー、５０ ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、２００ ｍＭ ＫＣｌ、および１０ ｍＭスペルミジン（ｐＨ７．４）、７０℃、２分間という条件下でソラーレンリンカーと共にインキュベートし、次いで５分かけて４℃にまで冷却した。次いで試料を低温室で、９６ウェルプレート内に置き（５０ μＬ／ウェル）、その１インチ上方に、ＵＶランプ（３６６ｎｍ、Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｇａｂｒｉｅｌ、ＣＡ、モデル番号ＵＶＬ−２１）を１５分間吊り下げた。次いで、Ｇ−５０セファデックス・スピン・カラム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用して反応混合物を脱塩した。前記と同様にして、翻訳／ディスプレイ反応およびオリゴｄＴ精製を実施した。最後にｍＲＮＡを分解し、短いＤＮＡオリゴヌクレオチドと融合したペプチドを残すため、ＲＮＡ分解酵素Ａ（２００ｎｇ／ｍＬ、１０分、室温）を添加した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって完全に分解されたことを確認した。
【００５４】
得られた精製されたＤＮＡタグ化ペプチド（ＤＴＰ）を、およそ５００ ｐＭの３５Ｓ−標識ＤＴＰを、全容量３００ μＬのストレプトアビジン結合緩衝液中の５０ μＬのストレプトアビジン基質と混合し、撹拌しながら室温で１０分間インキュベートする、ストレプトアビジン・カラム結合アッセイにおいて分析した。次いで、内容物をクロマトグラフィ・カラムにロードした。カラムを排出させ、８０カラム容量のストレプトアビジン結合緩衝液で洗浄し、次いで１５分かけてストレプトアビジン結合緩衝液＋２ ｍＭビオチン（それぞれ３カラム容量）の連続３回のアリコートで溶出させた。ストレプトアビジンと結合し、ビオチンで溶出したＤＴＰの画分を決定するため、全ての画分（素通り（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）、洗浄物、溶出物、および不可逆的に結合したカウント）を、シンチレーション計数によって分析した（表１）。２個のＨＰＱモチーフ（１９アミノ酸によって隔離）が導入された、非選択のクローンは、配列
2004537965.tif 000005
（下線が施された部分は、クローンＳＢ２のＨＰＱ領域と同一）をコードしていた。
【００５５】
この分析の結果は、表１に示されている。比較のため、１９残基によって隔離された２個のＨＰＱモチーフを、ライブラリーの対照非選択メンバーへと導入した。ストレプトアビジン・カラムから特異的に溶出したこの対照ペプチドの低い割合（０．１６％）により、２個のＨＰＱモチーフの存在が、高親和性結合にとって十分ではないことが示された。対照的に、より大きな割合（８．３〜８８％）の選択されたペプチドが、洗浄工程中カラムに保持され、次いでビオチンにより特異的に溶出された。
【００５６】
選択されたペプチドのストレプトアビジンに対する解離定数を、電気泳動移動度シフトアッセイ法（ＥＭＳＡ）を使用して測定した。このアッセイにおいては、ゲルのウェル底に集合するよう、溶液の密度を増加させるための５％グリセロールが添加されたストレプトアビジン結合緩衝液中の、変動する量の純粋ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）と共に、ＤＴＰをインキュベートした。室温で２０分間インキュベートした後、反応混合物を低温室に移動し、そこで１０分間維持した後、２×ＴＢＥ、０．１％トリトンＸ−１００、および５％グリセロールを含む１０％ポリアクリルアミド：ビスアクリルアミド（３７．５：１、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）ゲル（厚さ０．７ｍｍ、高さ１６ｃｍ、幅１８ｃｍ）へと注意深くロードした。１３ワットで３０分間予備泳動させたゲル、および泳動緩衝液を予め４℃に冷却した。次いで、低温室で１３ワットでゲルを泳動させたところ、ゲルの温度は、約２０℃にまで上昇した。特定のＤＴＰの移動度に依って、４５分〜１２０分間、ゲルを泳動させた。次いでゲルを１５分間、１０％酢酸および１０％メタノールで固定し、電気泳動紙（Ａｈｌｓｔｒｏｍ、Ｍｔ．Ｈｏｌｌｙ Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＰＡ）に転写し、乾燥させ、ホスホイメージャー（ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して分析した。
【００５７】
ＤＴＰ上の短いＤＮＡオリゴヌクレオチド・タグは、それらが未変性ゲル中を移動することを可能にし、未標識リガンド（即ち、ストレプトアビジン）の添加は、クローンのうちのいくつかの移動度シフトを引き起こした。各滴定におけるＤＴＰの濃度は１ ｎＭ未満であり、従って解離定数（Ｋｄ）は、ＤＴＰの半分に移動度シフトを起こさせるストレプトアビジンの濃度により近似されうる。Ｋｄを決定するため、いくつかの異なる測定を、２５％〜７５％の結合ＤＴＰの範囲で行った（この範囲に含まれない値は、バックグラウンド、およびゲル中の結合バンドと未結合バンドとの近接のため信頼性が低かった）。Ｋｄを、式Ｋｄ＝［ストレプトアビジン］＊Ｒ（Ｒは、結合ＤＴＰに対する未結合ＤＴＰの比（シフト・バンドに対する非シフト・バンドの比である）を使用して決定した。異なる時点で調製されたゲルでの独立した測定を、各クローンについて使用した（異なる測定の数ｎは、表１に示されている）。ストレプトアビジン濃度は、１モノマー当たり５７，０００のモル吸光係数を使用して、ＵＶ２８２によって測定した。
【００５８】
ストレプトアビジンの存在下でのこれらの移動度シフトの例は、図４Ａに示されている。いくつかのクローンは、シフトを示さないか、または不明瞭なバンドを示し、そのことから、これらの複合体の寿命がこの方法を使用した検出にとっては短かすぎたことが示唆された。本発明者らは、最も良好な挙動を示したクローンを５個選択し、ある範囲のストレプトアビジン濃度に応答して起こるそれらの移動度シフトを定量的に調査した。ペプチドＳＢ１９についてのストレプトアビジン滴定実験の例は、図４Ｂに示されており、データは図４Ｃにグラフ化されている。クローンの解離定数は、１１０ ｎＭ〜５ ｎＭ未満の範囲であった（表１）。これらの驚くべき程に高い親和性は、モノクローナル抗体−抗原相互作用のものに匹敵しており、このことから、ランダム非束縛ペプチド・ライブラリーであっても、通常ペプチド結合において機能しないタンパク質に対して結合活性のある（ａｖｉｄ）リガンドの起源となりうることが証明された。
【００５９】
クローンＳＢ１９の精査
クローンＳＢ１９は、１個のＨＰＱモチーフのみを保有し、カラム結合アッセイにおいて８５％結合し、ストレプトアビジンに対する１０ ｎＭのＫｄを有していた（表１）。一連のＣ末端短縮構築物（Ｃ１〜Ｃ４）を構築し、ストレプトアビジン・カラム結合アッセイ法においてアッセイした（図５）。クローンＳＢ１９のＣ末端短縮分析は、最初の５’プライマー、ならびに様々な位置で配列を短縮し、３５Ｓ取り込みを増加させるためＣ末端定常領域内の（ＡｓｐおよびＴｒｐをコードしている）２個のコドンをメチオニンと交換する、一連の３’プライマーを用いてクローンを増幅することにより、標準的な方法を使用して、実施された。Ｎ末端定常配列を変化させなかったことを除き、類似のプライマーをＮ末端短縮分析のために使用した。
【００６０】
最大５６残基の欠失は、結合強度に対する観察可能な効果を有していなかった。ペプチドＳＢ１９−Ｃ４は、選択された構築物からの最初の３８残基のみ（＋Ｃ末端ＭＭＳＧＧＣＫＬＧ配列、配列番号：３６）を保持していた。ＨＰＱモチーフのＨＧＡへの変異により、活性が３桁減少した（構築物Ｃ４をＭ１と比較）。Ｎ末端短縮構築物（Ｎ１〜Ｎ３）からの結果は、ペプチドＳＢ１９のＮ末端３８残基全体に結合決定因子が拡がっていることを示唆した。従って、試験されたペプチドのうちＳＢ１９−Ｃ４が、このアッセイ法において完全な活性を保持している最小のペプチドであった。ペプチドＳＢ１９−Ｃ４のＥＭＳＡ分析は高親和性ストレプトアビジン結合を確認したが、ペプチドの一画分（１３％）は、＞１ μＭのストレプトアビジン濃度ですら不活性であった。しかしながら不活性ペプチドの量に関する補正の後、大部分（８７％）は、４．９ ｎＭという見かけのＫｄを有していた。
【００６１】
ストレプトアビジン結合ペプチドを含む融合タンパク質の精製
ＳＢ１９−Ｃ４ストレプトアビジン結合ペプチドの最初の３８アミノ酸（図７Ａ）を含む融合タンパク質を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現させ、次いで細胞溶解物から精製した。融合タンパク質の発現については、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞をアミノ末端からカルボキシ末端へ、マルトース結合タンパク質、ＳＢ１９−Ｃ４配列の最初の３８残基、ヘキサヒスチジン・タグ、および２ｒ１８−１９ｄＮと呼ばれるもう一つのペプチドを含む融合タンパク質をコードする、マルトース結合タンパク質−−ストレプトアビジン結合ペプチド−−Ｈｉｓ６−−関心対象のタンパク質挿入物を含むプラスミド（図６Ａ〜６Ｃ）により形質転換した。この挿入物は、標準的な分子生物学の技術（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（前記）参照）を使用して構築した。融合タンパク質のこれらのドメインは、それぞれドメインの適切な折り畳みを可能にするために、少数のアミノ酸によって隔離されている。
【００６２】
３７℃で一晩、１０ｍｌの５０ ｍｇ／リットルのカナマイシンを含むＬＢ培地の中で、カナマイシン耐性コロニーを選択し、増殖させた。このスターター培養物を、１０００ｍｌの５０ ｍｇ／リットルのカナマイシンを含むＬＢ中に１００倍希釈し、３７℃で１．８のＯＤ６００まで３７℃で培養物を増殖させた。１ ｍＭ ＩＰＴＧの添加によって融合タンパク質の発現を誘導し、培養物をさらに２時間増殖させた。細胞を、５０００×ｇで２０分間の遠心分離によりペレット化した。ペレット化された細胞を、最初の容量の５％の１ ｍＭ ＥＤＴＡおよびＭＢＰ緩衝液（１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ．ＨＣｌ、１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ．Ｎａ＋、２００ ｍＭ ＫＣｌ、０．２５％ｗ／ｗトリトンＸ−１００、および１０ ｍＭ ＢＭＥ（ｐＨ７．４））に再懸濁させ、−２０℃で一晩かけて徐々に凍結させた。午前中、試料を溶解させ、氷上で超音波処理した。４℃で１４，０００×ｇで２０分間の遠心分離の後、上清の収集によって細胞溶解物を得た。
【００６３】
融合タンパク質を精製するため、８カラム容量のＭＢＰ緩衝液で洗浄しておいた、約１ ｍｇ／ｍｌの受容能を有する、固定化されたストレプトアビジンを含むカラムに、細胞溶解物を加えた。次いで、１２カラム容量のＭＢＰ緩衝液でカラムを洗浄した。融合タンパク質を、２ ｍＭビオチンを含むＭＢＰ緩衝液で溶出させた。細胞溶解物および溶出したタンパク質の試料を、８％ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図７Ｂ）。精製されたタンパク質を含むレーンは、予想サイズのバンドを有していた。わずかに高い移動度の微弱なバンドを除き、その他のバンドは観察されなかった（図７Ｂ）。このバンドは、おそらく、アミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかから少数のアミノ酸を失っていたが、ストレプトアビジン結合ペプチドは保持しており、従ってストレプトアビジン・カラムと結合する能力を保持していた、融合タンパク質の分解産物であった。固定化されたストレプトアビジンを含むカラムにロードされた融合タンパク質の３０％が、１２カラム容量の緩衝液でカラムを洗浄した後、回収された。従って、融合タンパク質のストレプトアビジンに対する高い親和性は、相当量の所望の融合タンパク質を保持しつつ、混入タンパク質を除去するためにカラムを徹底的に洗浄することを可能にした。
【００６４】
融合タンパク質のマルトース結合タンパク質部分と結合するアミロース樹脂、またはヘキサヒスチジン・タグと結合するＮｉ−ＮＴＡ樹脂のいずれかを使用して、細胞溶解物から同じタンパク質を精製する同様の試みにより、同じ予想サイズのバンドが得られた。しかしながら、混入バンドもいくつか存在していた。
【００６５】
融合タンパク質のストレプトアビジンに対する親和性のビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）分析
ＳＢ１９−Ｃ４ストレプトアビジン結合ペプチドの最初の３８アミノ酸を含むもう一つの融合タンパク質を発現させ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から精製した。この融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へ、マルトース結合タンパク質、ＳＢ１９−Ｃ４配列の最初の３８アミノ酸、およびヘキサヒスチジン・タグを含有していた（図９Ｂ、配列番号：４１）。この融合タンパク質をコードするプラスミド（図９Ａ、配列番号：４０）を、標準的な分子生物学の技術を使用して構築し、前記と同様にして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において融合タンパク質を発現させるために使用した。この融合タンパク質を、融合タンパク質のマルトース結合タンパク質部分と結合するアミロース樹脂を使用し、次いでヘキサヒスチジン・タグと結合するＮｉ−ＮＴＡ樹脂を使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抽出物から精製した。
【００６６】
融合タンパク質のストレプトアビジンに対する親和性を測定するため、融合タンパク質内の遊離アミノ基をビアコア・チップへと架橋することによって、融合タンパク質をビアコア・チップ上に固定化した。ストレプトアビジンを含む緩衝液をチップ上に流し、ストレプトアビジンが固定化された融合タンパク質と結合することを可能にした（図１０Ｂ）。これにより、ビアコア・チップに接着しているストレプトアビジンの量に比例して、ビアコア応答単位が増加した。次いで、ストレプトアビジンを含まない緩衝液をチップ上に流したところ、固定化された融合タンパク質からストレプトアビジンが解離するにつれ、ビアコア応答単位が減少した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。ストレプトアビジンの融合タンパク質との結合の会合速度を測定するため、１．６ μＭ、０．８ μＭ、０．４ μＭ、０．２ μＭ、０．１ μＭ、または０．０５ μＭというストレプトアビジン濃度（それぞれ図１０Ｂ中、線「ａ」〜「ｆ」）を、ビアコアチップ上に流した。緩衝液は、４０ ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、３００ ｍＭ ＫＣｌ、２ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ｗ／ｖトリトンＸ−１００、および５ ｍＭ ２−メルカプトエタノール（ｐＨ７．４）も含有していた。このデータを、以前に記載されたようにして（「ビアコアＸ機器ハンドブック（ＢＩＡＣＯＲＥ Ｘ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）」、ＡＡ版、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、 Ｕｐｐｓａｌａ Ｓｗｅｄｅｎ、１９９７）、５×１０４／Ｍ／ｓの会合速度ｋａを計算するために使用した。解離速度を測定するため、２３ μＭ、１１．５ μＭ、または５．７５ μＭストレプトアビジンを含む前記緩衝液のパルスを施し、次いでストレプトアビジンを含まない緩衝液をチップ上に流した（図１０Ａ）。このデータを、解離速度ｋｄについての２×１０−３／ｓの上限を計算するために使用した（「ビアコアＸ機器ハンドブック（ＢＩＡＣＯＲＥ Ｘ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）」（前記））。これらの計算された会合速度および解離速度に基づくと、この融合タンパク質によるストレプトアビジンの結合に関する解離定数Ｋｄは４０ ｎＭ未満であった。この結果は、ストレプトアビジン・カラム結合アッセイ法およびＥＭＳＡ法において観察されたＳＢ１９−Ｃ４ペプチドのストレプトアビジンに対する高親和性結合（表１）を確認するものである。さらにこの結果は、このペプチドが、融合タンパク質の一部として発現された場合、ストレプトアビジンに対する高い親和性を維持することを証明している。
【００６７】
その他の態様
前述の記載より、様々な用法および条件のために採用するため、本明細書に記載された発明に対し改変および修飾を施しうることは、明白であると考えられる。そのような態様も、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【００６８】
この明細書において言及された刊行物は、全て独立した刊行物または特許出願が、それぞれ具体的に個々に本明細書に組み入れられると示されたのと同じ程度に、参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】ライブラリーの構造および選択スキームを示す、本発明に係るインビトロ選択法の概略図である。ＤＮＡライブラリーのメンバーは、５’末から３’末へ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｔ７）、タバコモザイクウイルス翻訳エンハンサー（ＴＭＶ）、開始コドン（ＡＴＧ）、８８個のランダムなアミノ酸、ヘキサヒスチジン・タグ（Ｈ６）、および３’定常領域（Ｃｏｎｓｔ）を有している。
【図１Ｂ】異なる調製段階における、ライブラリー由来試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。第１レーンは、３５Ｓメチオニンを用いたｍＲＮＡディスプレイ・テンプレートの翻訳の結果を示している。大部分のカウントが、遊離ペプチド（遊離ｐｅｐ）を表しているが、有意の量のｍＲＮＡ−ペプチド共有結合融合体（ｍＲＮＡ−ｐｅｐ）も存在している。添加されたテンプレートとは無関係のもう一つのバンド（ＮＳ、非特異的）も存在し、ゲルのウェルにもカウントが残存している。ＲＮＡ分解酵素Ａの添加により、ｍＲＮＡ−ペプチドに対応するバンドは、遊離ペプチドよりわずかに高い位置へとシフトしうる。残りのレーンは、連続的なオリゴｄＴ精製およびＮｉ−ＮＴＡ精製の結果を示し、最後に逆転写（ＲＴ）の結果を示している。
【図２】Ａは、各選択回における、ストレプトアビジンに結合し、ビオチンで溶出した、ディスプレイされたペプチドに由来する３５Ｓカウントの画分を示す棒グラフである。
Ｂは、図２Ａ中の７回目の選択の出力から生成された、ペプチド・ライブラリーに関する溶出プロフィールを示すグラフである。第１の画分は、素通りを表している。ビオチンは示された時点で添加された。プロットは、完全な、逆転写されたディスプレイされたペプチド（ｍＲＮＡ−ｐｅｐ）、ＲＮＡ分解酵素Ａで処理された同一試料、および予めビオチンを飽和させた（過剰のビオチンは、ライブラリーを基質に曝す前に洗浄除去した）ストレプトアビジン・カラムに加えられた、ＲＮＡ分解酵素処理試料の結合を比較している。
【図３】７回目の選択からの２０個のクローンの配列（配列番号：１〜２０）のリストである。「＃」列は、各配列が観察された回数を示している。ＨＰＱ配列は、太字で示されている。末端の非ランダム配列には、下線が施されている。６個のＣ末端残基は示されていない。
【図４】Ａは、４個の異なるＤＮＡタグ化ペプチドのストレプトアビジンとの結合を証明している、電気泳動移動度シフト（ＥＭＳＡ）分析を示す未変性ゲルの写真である。１ μＭストレプトアビジンの非存在下（−）および存在下（＋）での各クローンの移動が示されている。クローンのうちのいくつかは、異なる高次構造を表していると推測される、複数のバンドを示している。矢印は、カウントの一部を含む場合が多い、ゲルのウェル位置を示す。
Ｂは、ストレプトアビジンによる全長クローンＳＢ１９の滴定を示す、未変性ゲルの写真である。各レーンのストレプトアビジン濃度は、左から右へ、３．８ ｎＭ、６．６ ｎＭ、１０ ｎＭ、１５ ｎＭ、２３ ｎＭ、３５ ｎＭ、および６１ ｎＭである。
Ｃは、図４Ｂに示されたデータの曲線適合である（最低濃度のストレプトアビジンを用いた点については、結合したペプチドの画分を正確に決定できない）。ペプチドが均質であり、かつ１００％活性であると仮定すると、この実験からのデータは、ペプチドＳＢ１９のストレプトアビジンとの結合に関する１０ ｎＭのＫｄを与える。
【図５】ペプチドＳＢ１９の短縮変異体の配列の列挙である（配列番号：２１〜２９）。全長（ＦＬ）、Ｃ末端欠失（Ｃ１〜Ｃ４）、Ｎ末端欠失（Ｎ１〜Ｎ３）、および点変異（Ｍ１）のペプチド配列が、示されている。「結合率％」とは、ストレプトアビジン・カラム結合アッセイ法におけるこれらのペプチドの実績をさす。
【図６Ａ】ストレプトアビジン結合ペプチドを含む融合タンパク質の発現のために使用された、プラスミドのヌクレオチド配列（配列番号：３７）である。
【図６Ｂ】アミノ末端からカルボキシ末端へ、マルトース結合タンパク質、ストレプトアビジン結合ペプチド（配列番号：３５、図７Ａ）、ヘキサヒスチジン・タグ、および２ｒ１８−１９ｄＮと呼ばれるもう一つのペプチドを含む、コードされたタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：３８）である。
【図６Ｃ】２ｒ１８−１９ｄＮのアミノ酸配列（配列番号：３９）である。
【図７】Ａは、図６Ｂに挙げられた融合タンパク質の精製のための親和性タグとして使用された、ストレプトアビジン結合ペプチドのアミノ酸配列（配列番号：３５）である。このペプチドは、ＳＢ１９−Ｃ４ペプチド（図５）の最初の３８アミノ酸を含む。
Ｂは、カラムに加えられた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶解物の純度（レーン１）と比較した、ストレプトアビジン・カラムからの溶出後の融合タンパク質の純度（レーン２）を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。
【図８Ａ〜８Ｆ】プレ選択法の概略図である。図８Ａは、タバコモザイクウイルス翻訳エンハンサー配列（ＴＭＶ）、開始メチオニン・コドン（ＡＵＧ）、および２個のタンパク質親和性タグ（ＦＬＡＧおよびＨｉｓ６）をコードするオープン・リーディング・フレームのセクションが標識されている、ピューロマイシンで終結するｍＲＮＡディスプレイ・テンプレートを示す図である。図８Ｂは、フレームシフトおよび未熟な終止コドンを含まず、従って両方の親和性タグを含む全長タンパク質をコードする、ｍＲＮＡディスプレイ・テンプレートを示す図である。図８Ｃは、内部で開始し、Ｎ末端ＦＬＡＧタグを欠いた対応する短縮型タンパク質をディスプレイする、ｍＲＮＡディスプレイ・テンプレートを示す図である。図８Ｄは、オープン・リーディング・フレーム内に欠失を有しており、従ってＣ末端Ｈｉｓ６タグを欠いた対応するフレームシフト・タンパク質をディスプレイするｍＲＮＡディスプレイ・テンプレートを示している。図８Ｅは、コードされたタンパク質内の両方のタンパク質親和性タグの存在に基づき精製された、図８ＢからのｍＲＮＡディスプレイ・テンプレートの逆転写を示す図である。図８Ｆは、各カセット内にコードされているＩＩＳ型制限酵素の切断部位を示している。これらの酵素で切断されたプレ選択されたカセットのライゲーションにより、全長ＤＮＡライブラリーが作製される。
【図９Ａ】マルトース結合タンパク質、ストレプトアビジン結合ペプチド（配列番号：３５、図７Ａ）、およびヘキサヒスチジン・タグを含む融合タンパク質をコードするベクターの、ポリヌクレオチド配列である。
【図９Ｂ】コードされた融合タンパク質のアミノ酸配列である。ＳＢ１９−Ｃ４ペプチドの最初の３８アミノ酸を含むストレプトアビジン結合ペプチドの配列に、下線が施されている。
【図１０Ａ】ビアコア・チップ上に固定化された図９Ｂに挙げられた融合タンパク質からのストレプトアビジンの解離に関する、様々な時間長にわたるビアコア応答単位のグラフである。線「ａ」のストレプトアビジン濃度は２３ μＭ、線「ｂ」の濃度は１１．５ μＭ、線「ｃ」の濃度は５．７５ μＭである。このデータは、解離速度ｋｄに関する２×１０−３／ｓの上限を計算するために使用された。
【図１０Ｂ】固定化された融合タンパク質へのストレプトアビジンの会合、およびその後の解離を示すグラフである。線「ａ」〜「ｆ」のストレプトアビジン濃度は、それぞれ１．６ μＭ、０．８ μＭ、０．４ μＭ、０．２ μＭ、０．１ μＭ、および０．０５ μＭである。このデータは、５×１０４／Ｍ／ｓという会合速度ｋａを計算するために使用された。
【図１Ａ】
2004537965.tif 000006
【図１Ｂ】
2004537965.tif 000007
【図２】
2004537965.tif 000008
【図３】
2004537965.tif 000009
【図４】
2004537965.tif 000010
【図５】
2004537965.tif 000011
【図６Ａ】
2004537965.tif 000012
2004537965.tif 000013
2004537965.tif 000014
【図６Ｂ】
2004537965.tif 000015
【図６Ｃ】
2004537965.tif 000016
【図７】
2004537965.tif 000017
【図８】
2004537965.tif 000018
【図９Ａ】
2004537965.tif 000019
2004537965.tif 000020
2004537965.tif 000021
【図９Ｂ】
2004537965.tif 000022
【図１０Ａ】
2004537965.tif 000023
【図１０Ｂ】
2004537965.tif 000024
【国際公開パンフレット】
2004537965.tif 000025
2004537965.tif 000026
2004537965.tif 000027
2004537965.tif 000028
2004537965.tif 000029
2004537965.tif 000030
2004537965.tif 000031
2004537965.tif 000032
2004537965.tif 000033
2004537965.tif 000034
2004537965.tif 000035
2004537965.tif 000036
2004537965.tif 000037
2004537965.tif 000038
2004537965.tif 000039
2004537965.tif 000040
2004537965.tif 000041
2004537965.tif 000042
2004537965.tif 000043
2004537965.tif 000044
2004537965.tif 000045
2004537965.tif 000046
2004537965.tif 000047
2004537965.tif 000048
2004537965.tif 000049
2004537965.tif 000050
2004537965.tif 000051
2004537965.tif 000052
2004537965.tif 000053
2004537965.tif 000054
2004537965.tif 000055
2004537965.tif 000056
2004537965.tif 000057
2004537965.tif 000058
2004537965.tif 000059
2004537965.tif 000060
2004537965.tif 000061
2004537965.tif 000062
2004537965.tif 000063
2004537965.tif 000064
2004537965.tif 000065
2004537965.tif 000066
2004537965.tif 000067
2004537965.tif 000068
2004537965.tif 000069
2004537965.tif 000070
2004537965.tif 000071
2004537965.tif 000072
2004537965.tif 000073
2004537965.tif 000074
2004537965.tif 000075
2004537965.tif 000076
2004537965.tif 000077
【国際調査報告】
2004537965.tif 000078
2004537965.tif 000079
2004537965.tif 000080