(57)【要約】本発明は、疼痛重要もしくは疼痛調節物質の発見のための方法、帰属するポリヌクレオチド類、ペプチド類、ベクター類および細胞類、それによって同定された化合物類、対応する薬剤または診断剤ならびに疼痛治療におけるそれらの使用に関する。
2004537962.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
苦痛調節物質の発見のための方法であって、
（ａ）−ＪＮＫ３、ＰＩＭ−２、ＬＲ−１１、ＴＦＩＩＦβ、ＧＧＴ−β、ＧＡＴＡ３、ＣＬＣ−７、カタラーゼ、テトラスパニン（ＴＭ４ＳＦ／ＴＳＰＡＮ−６／ＴＭ４−Ｄ）、カゼインキナーゼ１ａ、ＭＡＰ３Ｋ７／ＴＡＫ−１（ＴＧＦ−β活性キナーゼ）、ＢＡＢ１４１１２および／またはスペルミジンシンターゼの群、
−ペプチドまたは蛋白質のためにまたはその一部のために図３４ａ）， ３４ｃ）， ３４ｅ）， ３４ｇ）， ３５ａ）， ３５ｃ）， ３５ｅ）， ３６ａ）， ３６ｃ）， ３７ａ）， ３７ｃ）， ３８ａ）， ３８ｃ）， ３９ａ）， ３９ｃ）， ３９ｅ）， ４０ａ）， ４０ｃ）， ４０ｅ）， ４１ａ）， ４１ｃ）， ４１ｅ）， ４２ａ）， ４２ｅ）， ４３ｃ）， ４３ｅ）， ４４ｅ）， ４５ａ）， ４５ｃ）， ４５ｅ）， 又は４６ｅ）の１つに基づくポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドに少なくとも９０％類似のポリヌクレオチドをコードする前記ペプチドまたは蛋白質の群、
−図３４ｂ）， ３４ｄ）， ３４ｆ）， ３４ｈ）， ３５ｂ）， ３５ｄ）， ３５ｆ）， ３６ｂ）， ３６ｄ）， ３７ｂ）， ３７ｄ）， ３８ｂ）， ３８ｄ）， ３９ｂ）， ３９ｄ）， ４０ｂ）， ４０ｄ）， ４０ｆ）， ４１ｂ）， ４１ｄ）， ４１ｆ）， ４２ｂ）， ４２ｆ）， ４３ｄ）， ４３ｆ）， ４４ｆ）， ４５ｂ）， ４５ｄ）， ４５ｆ） 又は４６ｆ）の１つに基づくアミノ酸配列を有するペプチドまたは蛋白質または前記アミノ酸配列に少なくとも９０％類似のペプチドまたは蛋白質の群、
−および／または図３４ａ）， ３４ｃ）， ３４ｅ）， ３４ｇ）， ３５ａ）， ３５ｃ）， ３５ｅ）， ３６ａ）， ３６ｃ）， ３７ａ）， ３７ｃ）， ３８ａ）， ３８ｃ）， ３９ａ）， ３９ｃ）， ３９ｅ）， ４０ａ）， ４０ｃ）， ４０ｅ）， ４１ａ）， ４１ｃ）， ４１ｅ）， ４２ａ）， ４２ｅ）， ４３ｃ）， ４３ｅ）， ４４ｅ）， ４５ａ）， ４５ｃ）， ４５ｅ）， 又は４６ｅ）の１つに基づくポリヌクレオチドへのストリンジェントな条件下にまたは前記ポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチドを結合する核酸によってコードされる蛋白質の群、
−前記蛋白質類および／またはペプチド類の１種の少なくとも１０個のアミノ酸長さの部分蛋白質の群、
および／または
−ペプチドまたは蛋白質のために、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が図１−３３に示した配列の１つに基づく遺伝子フラグメントを包含する前記ポリヌクレオチドからなる遺伝子がコードする、または前記ペプチドは蛋白質のために前記のような遺伝子に少なくとも９０％類似のポリヌクレオチドがコードする前記ペプチドまたは蛋白質の群から選ばれた、ペプチドまたは蛋白質を合成したような細胞からなる細胞および／または製剤による好適な条件下での被験物質のインキュベーションの方法ステップと、
（ｂ）細胞から合成されたペプチドまたは蛋白質への試験物質の結合の測定またはペプチドまたは蛋白質への試験物質の結合によって変化した少なくとも１つの機能媒介変数の測定の方法ステップとを有する方法。
【請求項２】
細胞がステップ（ａ）の前に遺伝子技術的に操作されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
遺伝子技術的な操作が試験物質によって変化した機能媒介変数の少なくとも１つの測定を可能にすることを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
遺伝子技術的な操作によって細胞内に非内生的に発現したＧ蛋白質の形態が発現され、またはレポーター遺伝子が導入されることを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項５】
細胞が図３４ａ）， ３４ｃ）， ３４ｅ）， ３４ｇ）， ３５ａ）， ３５ｃ）， ３５ｅ）， ３６ａ）， ３６ｃ）， ３７ａ）， ３７ｃ）， ３８ａ）， ３８ｃ）， ３９ａ）， ３９ｃ）， ３９ｅ）， ４０ａ）， ４０ｃ）， ４０ｅ）， ４１ａ）， ４１ｃ）， ４１ｅ）， ４２ａ）， ４２ｅ）， ４３ｃ）， ４３ｅ）， ４４ｅ）， ４５ａ）， ４５ｃ）， ４５ｅ）， 又は４６ｅ）の１つに基づく少なくとも１個のポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドに少なくとも９０％類似のポリヌクレオチドまたは図１−３３に示した配列の１つに基づく１つの遺伝子フラグメントを包含する遺伝子のコード配列からなるポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドに少なくとも９０％類似のポリヌクレオチドを含有するように、前記細胞が遺伝子技術的に操作されることを特徴とする、請求項２ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ポリヌクレオチドが組換えＤＮＡコンストラクトに含有されていることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
細胞が請求項２による遺伝子技術的操作後に、かつ請求項１によるステップ（ａ）の前に、発現を可能にする条件下に、必要がある場合は選択圧下に培養されることを特徴とする、請求項２ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
細胞が両生類細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または不死化細胞または自然の哺乳動物細胞であることを特徴とする、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
結合の測定は、請求項１記載のペプチドまたは蛋白質の公知の標識したリガンドの排除および／または該ペプチドまたは蛋白質に結合した標識した試験物質の活性を介して行われることを特徴とする、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
試験物質によって変化した機能媒介変数の少なくとも１つの測定が受容体、イオンチャンネルおよび／または酵素の調節、阻害および／または活性を介して、特に遺伝子発現、イオン環境、ｐＨまたは膜蛋白質の変化の測定を介して、２ｎｄメッセンジャーの酵素活性度または濃度の変化を介して行われることを特徴とする、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ペプチドまたは蛋白質がステップ（ａ）および（ｂ）において、
−ＪＮＫ３、ＰＩＭ−２、ＬＲ−１１、ＴＦＩＩＦβ、ＧＧＴ−β、ＧＡＴＡ３、ＣＬＣ−７、カタラーゼ、テトラスパニン（ＴＭ４ＳＦ／ＴＳＰＡＮ−６／ＴＭ４−Ｄ）、カゼインキナーゼ１ａ、ＭＡＰ３Ｋ７／ＴＡＫ−１（ＴＧＦ−β活性キナーゼ）、ＢＡＢ１４１１２および／またはスペルミジンシンターゼの群、
−ペプチドまたは蛋白質のために、またはその一部のために図３４ａ）， ３４ｃ）， ３４ｅ）， ３４ｇ）， ３５ａ）， ３５ｃ）， ３５ｅ）， ３６ａ）， ３６ｃ）， ３７ａ）， ３７ｃ）， ３８ａ）， ３８ｃ）， ３９ａ）， ３９ｃ）， ３９ｅ）， ４０ａ）， ４０ｃ）， ４０ｅ）， ４１ａ）， ４１ｃ）， ４１ｅ）， ４２ａ）， ４２ｅ）， ４３ｃ）， ４３ｅ）， ４４ｅ）， ４５ａ）， ４５ｃ）， ４５ｅ）， 又は４６ｅ）の１つに基づくポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドに少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似のポリヌクレオチドをコードする前記ペプチドまたは蛋白質の群、
または
−図３４ｂ）， ３４ｄ）， ３４ｆ）， ３４ｈ）， ３５ｂ）， ３５ｄ）， ３５ｆ）， ３６ｂ）， ３６ｄ）， ３７ｂ）， ３７ｄ）， ３８ｂ）， ３８ｄ）， ３９ｂ）， ３９ｄ）， ４０ｂ）， ４０ｄ）， ４０ｆ）， ４１ｂ）， ４１ｄ）， ４１ｆ）， ４２ｂ）， ４２ｆ）， ４３ｄ）， ４３ｆ）， ４４ｆ）， ４５ｂ）， ４５ｄ）， ４５ｆ） 又は４６ｆ）の１つに基づくアミノ酸配列を有するペプチドまたは蛋白質または前記ペプチドまたは蛋白質に少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似のペプチドまたは蛋白質の群、
−および／または図３４ａ）， ３４ｃ）， ３４ｅ）， ３４ｇ）， ３５ａ）， ３５ｃ）， ３５ｅ）， ３６ａ）， ３６ｃ）， ３７ａ）， ３７ｃ）， ３８ａ）， ３８ｃ）， ３９ａ）， ３９ｃ）， ３９ｅ）， ４０ａ）， ４０ｃ）， ４０ｅ）， ４１ａ）， ４１ｃ）， ４１ｅ）， ４２ａ）， ４２ｅ）， ４３ｃ）， ４３ｅ）， ４４ｅ）， ４５ａ）， ４５ｃ）， ４５ｅ）， 又は４６ｅ）の１つに基づくポリヌクレオチドへのストリンジェントな条件下にまたは前記ポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチドを結合する核酸によってコードされる蛋白質の群、および／または
−前記蛋白質類および／またはペプチド類の１つの少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、特に少なくとも２０個のアミノ酸長さの部分蛋白質の群、から選ばれることを特徴とする、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ペプチドまたは蛋白質のためにステップ（ａ）および（ｂ）において、図１、３−８、１０、１１、１３、１４、１５、１７−２７または３１−３３に示された配列の１つに基づく遺伝子フラグメントを包含するポリヌクレオチドからなる遺伝子がコードし、または前記遺伝子に少なくとも９０％、特に９５％、好ましくは９７％類似のポリヌクレオチドがコードすることを特徴とする、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ペプチドまたは蛋白質のためにステップ（ａ）および（ｂ）において、図２、９、１２、１６または２８−３０に示された配列の１つに基づく遺伝子フラグメントを包含するポリヌクレオチドからなる遺伝子がコードし、または前記遺伝子に少なくとも９０％、特に９５％、好ましくは９７％類似のポリヌクレオチドがコードすることを特徴とする、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
図１−３３の１つに示されたヌクレオチド配列または図１−３３の１つに基づく遺伝子フラグメントを包含する遺伝子のコード配列からなるポリヌクレオチドに、少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に少なくとも９７％まで相当するポリヌクレオチド。
【請求項１５】
図１、３−８、１０、１１、１３、１４、１５、１７−２７または３１−３３の１つ、特に２０または２１つに示されたヌクレオチド配列またはその部分の１つまたは図１、３−８、１０、１１、１３、１４、１５、１７−２７または３１−３３の１つ、特に２０または２１つに基づく遺伝子フラグメントを包含する遺伝子のコード配列からなるポリヌクレオチドに少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に少なくとも９７％まで相当する請求項１４記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
図１−３３の１つに基づくポリヌクレオチドがプローブとして標識され、ｃＤＮＡバンクが前記プローブでハイブリダイズされ、ストリンジェントな条件下に洗浄され、前記プローブが結合したｃＤＮＡクローンが単離され、必要がある場合は配列決定されることによって得られる、少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に少なくとも９７％まで規定された核酸配列に相当するポリヌクレオチド。
【請求項１７】
ポリヌクレオチドの断片が図１−３３の１つに基づき遺伝子特異的オリゴヌクレオチド−プライマーとして算出および合成され、次に前記断片と共にＰＣＲによって１本鎖または２本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリまたはゲノムＤＮＡから出発してテンプレートとして伸長したポリヌクレオチドが発生され、必要がある場合は配列決定されることによって得られる、少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に少なくとも９７％まで規定された核酸配列に相当するポリヌクレオチド。
【請求項１８】
図１、３−８、１０、１１、１３、１４、１５、１７−２７または３１−３３の１つ、特に２０または２１つに基づくポリヌクレオチドが使用されることを特徴とする、請求項１６または１７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
ＲＮＡまたは１本鎖または２本鎖ＤＮＡ、特にｍＲＮＡまたはｃＤＮＡであることを特徴とする、請求項１４ないし１８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
特異的に請求項１４ないし１９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドに結合することができる配列を有するアンチセンス ポリヌクレオチドまたはＰＮＡであることを特徴とする、請求項１４ないし１９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
リボザイムの部分またはその他のＤＮＡ酵素または触媒ＲＮＡまたはＤＮＡであることを特徴とする、請求項２０記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項１４ないし２１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの１つを含有するベクター。
【請求項２３】
ベクターが発現ベクターであることを特徴とする、請求項２２記載のベクター。
【請求項２４】
ベクターがウィルスから、たとえばアデノウィルス、アデノ関連ウィルスまたはヘルペスウィルスから誘導され、および／または前記ベクターが少なくとも１つのＬＴＲ−、ポリＡ−、プロモーター−、および／またはＯＲＩ配列を含有することを特徴とする、請求項２２または２３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２５】
ベクターが請求項１５または１８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする、請求項２２ないし２４のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２６】
請求項１４ないし１９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの１つによってコードされる、ペプチド、特にオリゴペプチドまたはポリペプチド、または蛋白質。
【請求項２７】
ストリンジェントな条件下に図１−３３に基づくポリヌクレオチドの１つまたはそのアンチセンス−ポリヌクレオチドによってハイブリダイズするポリヌクレオチドをコードするペプチド、特にオリゴペプチドまたはポリペプチド、または蛋白質。
【請求項２８】
翻訳後に修飾されたこと、特にグリコシル化、ホスフォリル化、アミド化、メチル化、アセチル化、ＡＤＰリボシル化、ヒドロキシル化、１つの膜アンカーを付けて、分裂または短縮されたことを特徴とする、請求項２６または２７のいずれか１項に記載のペプチドまたは蛋白質。
【請求項２９】
請求項１５または１８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによってコードされることを特徴とする、請求項２６ないし２８のいずれか１項に記載のペプチドまたは蛋白質。
【請求項３０】
請求項２６ないし２９のいずれか１項に記載のペプチドまたは蛋白質に対する抗体。
【請求項３１】
モノクロナール抗体またはポリクロナール抗体であることを特徴とする、請求項３０記載の抗体。
【請求項３２】
抗体が請求項２９記載のペプチドまたは蛋白質に向けられることを特徴とする、請求項３０または３１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３３】
請求項１４ないし２１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項２６ないし２９のいずれか１項に記載のペプチドまたは蛋白質および／または請求項２２ないし２５のいずれか１項に記載のベクターを含有する細胞。
【請求項３４】
両生類細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または不死化細胞または自然の哺乳動物細胞であることを特徴とする、請求項３３記載の細胞。
【請求項３５】
細胞が請求項１５または１８記載の核酸配列、請求項２９記載のペプチドまたは蛋白質、および／または請求項２５記載のベクターを含有することを特徴とする、請求項３３または３４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３６】
導入遺伝子非ヒト哺乳動物の胚細胞および体細胞が動物のゲノムまたは前記動物の祖先の１つのゲノムの中への染色体取り込みの結果として請求項１４ないし２１のいずれか１項に記載の核酸配列の１つを含有する前記導入遺伝子非ヒト哺乳動物。
【請求項３７】
導入遺伝子非ヒト哺乳動物の胚細胞および体細胞が動物のゲノムまたは前記動物の祖先の１つのゲノムの中の染色体操作の結果として請求項１４ないし２１のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列の１つをもはや発現形態で含有しない前記導入遺伝子非ヒト哺乳動物。
【請求項３８】
導入遺伝子非ヒト哺乳動物が齧歯類動物であることを特徴とする、請求項３６または３７のいずれか１項に記載の導入遺伝子非ヒト哺乳動物。
【請求項３９】
ヌクレオチド配列が請求項１５または１８に相当することを特徴とする、請求項３６ないし３８のいずれか１項に記載の導入遺伝子非ヒト哺乳動物。
【請求項４０】
請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の方法による苦痛調節物質として同定可能の化合物。
【請求項４１】
化合物が請求項１１記載の方法により苦痛調節物質として同定可能であることを特徴とする、請求項４０記載の化合物。
【請求項４２】
化合物が請求項１２記載の方法により苦痛調節物質として同定可能であることを特徴とする、請求項４０記載の化合物。
【請求項４３】
化合物が請求項１３記載の方法により苦痛調節物質として同定可能であることを特徴とする、請求項４０記載の化合物。
【請求項４４】
作用物質が請求項２６ないし２９のいずれか１項に記載のペプチドまたは蛋白質と結合することを特徴とする作用物質。
【請求項４５】
作用物質が低分子作用物質であることを特徴とする、請求項４４記載の作用物質。
【請求項４６】
作用物質が請求項２９記載のペプチドまたは蛋白質と結合することを特徴とする、請求項４４または４５のいずれか１項に記載の作用物質。
【請求項４７】
請求項１４ないし２１のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド、請求項２６ないし２９のいずれか１項に記載のペプチドまたは蛋白質、請求項２２ないし２５のいずれか１項に記載のベクター、請求項３０ないし３２のいずれか１項に記載の抗体、請求項３３ないし３５のいずれか１項に記載の細胞、請求項４０ないし４３のいずれか１項に記載の化合物および／または請求項４４ないし４６のいずれか１項に記載の作用物質ならびに必要がある場合は好適なアジュバントおよび／または添加物を含有する薬剤。
【請求項４８】
薬剤が請求項１５または１８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項２９記載のペプチドまたは蛋白質、請求項２５記載のベクター、請求項３２記載の抗体、請求項３５記載の細胞、請求項４１または４２のいずれか１項に記載の化合物および／または請求項４６記載の作用物質を含有することを特徴とする、請求項４７記載の薬剤。
【請求項４９】
薬剤が請求項４１記載の化合物を含有することを特徴とする、請求項４７または４８のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項５０】
薬剤が請求項４２記載の化合物および／または請求項４６記載の作用物質を含有することを特徴とする、請求項４７または４８のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項５１】
請求項１４ないし２１のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドまたはその部分、請求項２６ないし２９のいずれか１項に記載のペプチドまたは蛋白質またはその部分、請求項２２ないし２５のいずれか１項に記載のベクター、請求項３０ないし３２のいずれか１項に記載の抗体またはその部分および／または請求項３３ないし３５のいずれか１項に記載の細胞ならびに必要がある場合は好適な添加物を含有する診断剤。
【請求項５２】
診断剤が請求項１５または１８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたはその部分、請求項２９記載のペプチドまたは蛋白質またはその部分、請求項２５記載のベクター、請求項３２記載の抗体および／または請求項３５記載の細胞を含有することを特徴とする、請求項５１記載の診断剤。
【請求項５３】
診断剤が請求項２０記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする、請求項５１または５２のいずれか１項に記載の診断剤。
【請求項５４】
苦痛治療のための薬剤の製造のため、請求項１４ないし２１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項２６ないし２９のいずれか１項に記載のペプチドまたは蛋白質、請求項２２ないし２５のいずれか１項に記載のベクター、請求項３０ないし３２のいずれか１項に記載の抗体、請求項３３ないし３５のいずれか１項に記載の細胞、請求項４０ないし４３のいずれか１項に記載の化合物、請求項４４ないし４６のいずれか１項に記載の作用物質の使用、および／または
−ＪＮＫ３、ＰＩＭ−２、ＬＲ−１１、ＴＦＩＩＦβ、ＧＧＴ−β、ＧＡＴＡ３、ＣＬＣ−７、カタラーゼ、テトラスパニン（ＴＭ４ＳＦ／ＴＳＰＡＮ−６／ＴＭ４−Ｄ）、カゼインキナーゼ１ａ、ＭＡＰ３Ｋ７／ＴＡＫ−１（ＴＧＦ−β活性キナーゼ）、ＢＡＢ１４１１２および／またはスペルミジンシンターゼの群、
−ペプチドまたは蛋白質のために、またはその一部のために図３４ａ）， ３４ｃ）， ３４ｅ）， ３４ｇ）， ３５ａ）， ３５ｃ）， ３５ｅ）， ３６ａ）， ３６ｃ）， ３７ａ）， ３７ｃ）， ３８ａ）， ３８ｃ）， ３９ａ）， ３９ｃ）， ３９ｅ）， ４０ａ）， ４０ｃ）， ４０ｅ）， ４１ａ）， ４１ｃ）， ４１ｅ）， ４２ａ）， ４２ｅ）， ４３ｃ）， ４３ｅ）， ４４ｅ）， ４５ａ）， ４５ｃ）， ４５ｅ）， 又は４６ｅ）の１つに基づくポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドに少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似のポリヌクレオチドをコードする前記ペプチドまたは蛋白質の群、
または
−図３４ｂ）， ３４ｄ）， ３４ｆ）， ３４ｈ）， ３５ｂ）， ３５ｄ）， ３５ｆ）， ３６ｂ）， ３６ｄ）， ３７ｂ）， ３７ｄ）， ３８ｂ）， ３８ｄ）， ３９ｂ）， ３９ｄ）， ４０ｂ）， ４０ｄ）， ４０ｆ）， ４１ｂ）， ４１ｄ）， ４１ｆ）， ４２ｂ）， ４２ｆ）， ４３ｄ）， ４３ｆ）， ４４ｆ）， ４５ｂ）， ４５ｄ）， ４５ｆ） 又は４６ｆ）の１つに基づくアミノ酸配列を有するペプチドまたは蛋白質または前記ペプチドまたは蛋白質に少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似のペプチドまたは蛋白質の群、
−および／または図３４ａ）， ３４ｃ）， ３４ｅ）， ３４ｇ）， ３５ａ）， ３５ｃ）， ３５ｅ）， ３６ａ）， ３６ｃ）， ３７ａ）， ３７ｃ）， ３８ａ）， ３８ｃ）， ３９ａ）， ３９ｃ）， ３９ｅ）， ４０ａ）， ４０ｃ）， ４０ｅ）， ４１ａ）， ４１ｃ）， ４１ｅ）， ４２ａ）， ４２ｅ）， ４３ｃ）， ４３ｅ）， ４４ｅ）， ４５ａ）， ４５ｃ）， ４５ｅ）， 又は４６ｅ）の１つに基づくポリヌクレオチドへのストリンジェントな条件下にまたは前記ポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチドを結合する核酸によってコードされる蛋白質の群、および／または
−前記蛋白質類および／またはペプチド類の１つの少なくとも１０個、好ましくは１５個、特に２０個のアミノ酸長さの部分蛋白質の群、から選択されたペプチドまたは蛋白質に結合する作用物質の使用。
【請求項５５】
治療が慢性痛に作用することを特徴とする、請求項５４記載の使用。
【請求項５６】
請求項１５または１８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項２９記載のペプチドまたは蛋白質、請求項２５記載のベクター、請求項３２記載の抗体、請求項３５記載の細胞、請求項４１または４２のいずれか１項に記載の化合物、請求項４６記載の作用物質、および／または
−ＪＮＫ３、ＰＩＭ−２、ＬＲ−１１、ＴＦＩＩＦβ、ＧＧＴ−β、ＧＡＴＡ３、ＣＬＣ−７、カタラーゼ、テトラスパニン（ＴＭ４ＳＦ／ＴＳＰＡＮ−６／ＴＭ４−Ｄ）、カゼインキナーゼ１ａ、ＭＡＰ３Ｋ７／ＴＡＫ−１（ＴＧＦ−β活性キナーゼ）、ＢＡＢ１４１１２および／またはスペルミジンシンターゼの群と、
−ペプチドまたは蛋白質のために、またはその一部のために図３４ａ）， ３４ｃ）， ３４ｅ）， ３４ｇ）， ３５ａ）， ３５ｃ）， ３５ｅ）， ３６ａ）， ３６ｃ）， ３７ａ）， ３７ｃ）， ３８ａ）， ３８ｃ）， ３９ａ）， ３９ｃ）， ３９ｅ）， ４０ａ）， ４０ｃ）， ４０ｅ）， ４１ａ）， ４１ｃ）， ４１ｅ）， ４２ａ）， ４２ｅ）， ４３ｃ）， ４３ｅ）， ４４ｅ）， ４５ａ）， ４５ｃ）， ４５ｅ）， 又は４６ｅ）の１つに基づくポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドに少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似のポリヌクレオチドをコードする前記ペプチドまたは蛋白質の群、
または
−図３４ｂ）， ３４ｄ）， ３４ｆ）， ３４ｈ）， ３５ｂ）， ３５ｄ）， ３５ｆ）， ３６ｂ）， ３６ｄ）， ３７ｂ）， ３７ｄ）， ３８ｂ）， ３８ｄ）， ３９ｂ）， ３９ｄ）， ４０ｂ）， ４０ｄ）， ４０ｆ）， ４１ｂ）， ４１ｄ）， ４１ｆ）， ４２ｂ）， ４２ｆ）， ４３ｄ）， ４３ｆ）， ４４ｆ）， ４５ｂ）， ４５ｄ）， ４５ｆ） 又は４６ｆ）の１つに基づくアミノ酸配列を有するペプチドまたは蛋白質または前記ペプチドまたは蛋白質に少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似のペプチドまたは蛋白質の群、から選ばれたペプチドまたは蛋白質に結合する作用物質が使用されることを特徴とする、請求項５４または５５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５７】
請求項４１記載の化合物および／または
−ＪＮＫ３、ＰＩＭ−２、ＬＲ−１１、ＴＦＩＩＦβ、ＧＧＴ−β、ＧＡＴＡ３、ＣＬＣ−７、カタラーゼ、テトラスパニン（ＴＭ４ＳＦ／ＴＳＰＡＮ−６／ＴＭ４−Ｄ）、カゼインキナーゼ１ａ、ＭＡＰ３Ｋ７／ＴＡＫ−１（ＴＧＦ−β活性キナーゼ）、ＢＡＢ１４１１２および／またはスペルミジンシンターゼの群、
−ペプチドまたは蛋白質のために、またはその一部のために図３４ａ）， ３４ｃ）， ３４ｅ）， ３４ｇ）， ３５ａ）， ３５ｃ）， ３５ｅ）， ３６ａ）， ３６ｃ）， ３７ａ）， ３７ｃ）， ３８ａ）， ３８ｃ）， ３９ａ）， ３９ｃ）， ３９ｅ）， ４０ａ）， ４０ｃ）， ４０ｅ）， ４１ａ）， ４１ｃ）， ４１ｅ）， ４２ａ）， ４２ｅ）， ４３ｃ）， ４３ｅ）， ４４ｅ）， ４５ａ）， ４５ｃ）， ４５ｅ）， 又は４６ｅ）の１つに基づくポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドに少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似のポリヌクレオチドをコードする前記ペプチドまたは蛋白質の群、
または
−図３４ｂ）， ３４ｄ）， ３４ｆ）， ３４ｈ）， ３５ｂ）， ３５ｄ）， ３５ｆ）， ３６ｂ）， ３６ｄ）， ３７ｂ）， ３７ｄ）， ３８ｂ）， ３８ｄ）， ３９ｂ）， ３９ｄ）， ４０ｂ）， ４０ｄ）， ４０ｆ）， ４１ｂ）， ４１ｄ）， ４１ｆ）， ４２ｂ）， ４２ｆ）， ４３ｄ）， ４３ｆ）， ４４ｆ）， ４５ｂ）， ４５ｄ）， ４５ｆ） 又は４６ｆ）の１つに基づくアミノ酸配列を有するペプチドまたは蛋白質または前記ペプチドまたは蛋白質に少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似のペプチドまたは蛋白質の群、から選ばれたペプチドまたは蛋白質に結合する作用物質が使用されることを特徴とする、請求項５４ないし５６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５８】
請求項４２記載の化合物および／または請求項４６記載の作用物質が使用されることを特徴とする、請求項５４ないし５６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５９】
請求項１４ないし２１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項２６ないし２９のいずれか１項に記載のペプチドまたは蛋白質、請求項２２ないし２５のいずれか１項に記載のベクター、請求項３０ないし３２のいずれか１項に記載の抗体、請求項３３ないし３５のいずれか１項に記載の細胞の、遺伝子治療のための使用。
【請求項６０】
インビボまたはインビトロ遺伝子治療であることを特徴とする、請求項５９記載の使用。
【請求項６１】
請求項１６ないし１８のいずれか１項、好ましくは請求項１８記載のポリヌクレオチドが使用されることを特徴とする、請求項５９または６０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６２】
請求項１５記載のポリヌクレオチドが使用されることを特徴とする、請求項５９または６０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６３】
請求項２０または２１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドが使用されることを特徴とする、請求項５９または６０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６４】
請求項１４ないし２１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項２６ないし２９のいずれか１項に記載のペプチドまたは蛋白質、請求項２２ないし２５のいずれか１項に記載のベクター、請求項３０ないし３２のいずれか１項に記載の抗体、請求項３３ないし３５のいずれか１項に記載の細胞、請求項４０ないし４３のいずれか１項に記載の化合物および／または請求項４４ないし４６のいずれか１項に記載の作用物質の、診断および／または効能調査のための使用。
【請求項６５】
（ａ）請求項１６ないし１８のいずれか１項、好ましくは請求項１８記載のポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドに少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似のポリヌクレオチドがコードするペプチドまたは蛋白質を合成したような細胞からなる細胞および／または製剤による好適な条件下での被験物質のインキュベーションの方法ステップと、
（ｂ）細胞から合成されたペプチドまたは蛋白質への試験物質の結合の測定またはペプチドまたは蛋白質への試験物質の結合によって変化した少なくとも１つの機能媒介変数の測定の方法ステップとを有する、苦痛調節物質の発見のための方法。
【請求項６６】
細胞がステップ（ａ）の前に遺伝子技術的に操作されることを特徴とする、請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
遺伝子技術的な操作が試験物質によって変化した機能媒介変数の少なくとも１つの測定を可能にすることを特徴とする、請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
細胞が請求項１５ないし１８のいずれか１項、好ましくは請求項１８記載の少なくとも１個のポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドに少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似のポリヌクレオチドを含有するように、前記細胞が遺伝子技術的に操作されることを特徴とする、請求項６６または６７記載のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
細胞が請求項６６記載の遺伝子技術的操作後および請求項６５記載のステップ（ａ）の前に発現を可能にする条件下に、必要がある場合は選択圧下に培養されることを特徴とする、請求項６６ないし６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
請求項３３ないし３５のいずれか１項に記載の細胞が培養され、必要がある場合はペプチドまたは蛋白質が単離されることを特徴とする、請求項２６ないし２９のいずれか１項に記載のペプチドまたは蛋白質の製造方法。
【請求項７１】
苦痛調節物質の発見のための方法において、
−ＪＮＫ３、ＰＩＭ−２、ＬＲ−１１、ＴＦＩＩＦβ、ＧＧＴ−β、ＧＡＴＡ３、ＣＬＣ−７、カタラーゼ、テトラスパニン（ＴＭ４ＳＦ／ＴＳＰＡＮ−６／ＴＭ４−Ｄ）、カゼインキナーゼ１ａ、ＭＡＰ３Ｋ７／ＴＡＫ−１（ＴＧＦ−β活性キナーゼ）、ＢＡＢ１４１１２および／またはスペルミジンシンターゼの群、
−ペプチドまたは蛋白質のために、またはその一部のために図３４ａ）， ３４ｃ）， ３４ｅ）， ３４ｇ）， ３５ａ）， ３５ｃ）， ３５ｅ）， ３６ａ）， ３６ｃ）， ３７ａ）， ３７ｃ）， ３８ａ）， ３８ｃ）， ３９ａ）， ３９ｃ）， ３９ｅ）， ４０ａ）， ４０ｃ）， ４０ｅ）， ４１ａ）， ４１ｃ）， ４１ｅ）， ４２ａ）， ４２ｅ）， ４３ｃ）， ４３ｅ）， ４４ｅ）， ４５ａ）， ４５ｃ）， ４５ｅ）， 又は４６ｅ）の１つに基づくポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドに少なくとも９０％類似のポリヌクレオチドをコードする前記ペプチドまたは蛋白質の群、
−図３４ｂ）， ３４ｄ）， ３４ｆ）， ３４ｈ）， ３５ｂ）， ３５ｄ）， ３５ｆ）， ３６ｂ）， ３６ｄ）， ３７ｂ）， ３７ｄ）， ３８ｂ）， ３８ｄ）， ３９ｂ）， ３９ｄ）， ４０ｂ）， ４０ｄ）， ４０ｆ）， ４１ｂ）， ４１ｄ）， ４１ｆ）， ４２ｂ）， ４２ｆ）， ４３ｄ）， ４３ｆ）， ４４ｆ）， ４５ｂ）， ４５ｄ）， ４５ｆ） 又は４６ｆ）の１つに基づくアミノ酸配列を有するペプチドまたは蛋白質または前記ペプチドまたは蛋白質に少なくとも９０％類似のペプチドまたは蛋白質の群、
−および／または図３４ａ）， ３４ｃ）， ３４ｅ）， ３４ｇ）， ３５ａ）， ３５ｃ）， ３５ｅ）， ３６ａ）， ３６ｃ）， ３７ａ）， ３７ｃ）， ３８ａ）， ３８ｃ）， ３９ａ）， ３９ｃ）， ３９ｅ）， ４０ａ）， ４０ｃ）， ４０ｅ）， ４１ａ）， ４１ｃ）， ４１ｅ）， ４２ａ）， ４２ｅ）， ４３ｃ）， ４３ｅ）， ４４ｅ）， ４５ａ）， ４５ｃ）， ４５ｅ）， 又は４６ｅ）の１つに基づくポリヌクレオチドへのストリンジェントな条件下にまたは前記ポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチドを結合する核酸によってコードされる蛋白質の群、
−前記蛋白質類および／またはペプチド類の１つの少なくとも１０個のアミノ酸長さの部分蛋白質の群、および／または
−ペプチドまたは蛋白質のために、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が図１−３３に示した配列の１つに基づく遺伝子フラグメントを包含する前記ポリヌクレオチドからなる遺伝子がコードし、または前記ペプチドまたは蛋白質のためにこのような遺伝子に少なくとも９０％類似のポリヌクレオチドがコードする前記ペプチドまたは蛋白質の群から選ばれた、ペプチドまたは蛋白質の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、苦痛に重要な物質の発見のための方法、帰属するポリヌクレオチド類、ペプチド類、蛋白質類、ベクター類および細胞類、それによって同定された化合物類、対応する薬剤および診断剤ならびに苦痛治療におけるそれらの使用に関する。
【０００２】
苦痛治療のために、たとえばアセチルサリチル酸、パラセタモール、ジピロン、トラマドール、モルフィンおよびフェタニルのような様々な薬剤が提供されている；しかしまた、アミトリプチリンおよびケタミンのような物質類も苦痛患者の治療に使用される。しかし一層洗練されている治療計画にもかかわらず、特に慢性苦痛状態においてしばしば患者にとり持続的な改善が達成されていない。この点に関しては、特に慢性苦痛の場合に関与する神経細胞の持続的な変化を生じる事実にも原因がある。
【０００３】
近年の苦痛研究は、まさに慢性苦痛状態の進行が、特に後根神経節の侵害受容ニューロンおよび脊髄の後角の部位でのニューロンにおける神経系の形成変化に基づくという基本認識をもたらした（概要として参照：Ｃｏｄｅｒｒｅら１９９３；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ＆Ｈｅｒｄｅｇｅｎ、１９９６）。ニューロンの形成はゆるやかに特定の遺伝子の発現における変化に伴って現れ、該当するニューロンの表現型の、長期に持続する変化をもたらす。ニューロンの形成の考え方は、これまで特に発達過程、学習過程および復元過程に適用されているが、苦痛研究からの新規の結果は、この考え方が病態生理学的過程でも講じられることを示している（Ｔｏｌｌｅ、１９９７）。
【０００４】
苦痛の慢性化は動物実験で現象学的レベルですでに比較的良好に特徴づけられている。慢性苦痛状態の誘導は次のような変化を引き起こす：
・末梢侵害受容器の感度の増加および刺激閾値の低下
・いわゆる静的侵害受容器の活性
・受容領域の再組織化
・脊髄内の励起性増加
この形成変化は、神経節内に見出される１次輸入管についても、脊髄内に局在化されて接続されるニューロンについても記載されており、脊柱上でも、たとえば視床内でも推測されている。学習過程と記憶過程に対して記述された機構と類比的に、関与した細胞内に重要な遺伝子の整合調節を含む特異的遺伝子プログラムが進行し、その発現がそこで決定的に慢性苦痛の病態生理学的症状発現に寄与することが想定される。
【０００５】
従って本発明の出発点は、その調節関連性について、遺伝子の発現において苦痛条件下に変化し、そのため確実に特別の慢性苦痛の発生および処理に参加するような苦痛調節遺伝子を同定することであった。
【０００６】
一連の公知の遺伝子に関しては、すでに種々の苦痛モデルにおいて、たとえば神経伝達物質（物質Ｐ、ＣＧＲＰ）、受容体（物質Ｐ受容体、μ、κ、δ−オピエートレセプター、ＮＭＤＡ受容体）および転写因子（ｃＪｕｎ、ＪｕｎＢ、ｃＦｏｓまたはＫｒｏｘ２４）の調節が検出されている（表１参照）。前記受容体がすでに新規の鎮痛薬の開発のための分子標的として使用されている（Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ、１９９５）という事実は、鎮痛薬の開発、特に対応するスクリーニング方法にとり新規の苦痛調節遺伝子の同定も大きな関心があることを明らかに示唆している。この場合の中心的な考え方は、特に慢性の性質での苦痛の発生または持続性を、苦痛状態で増幅または緩和して形成される前記のような蛋白質がその機能で影響を受けることによって抑制することである。
表１：苦痛動物モデルにおける公知の遺伝子／遺伝子生成物の調節
【０００７】
【表１】
2004537962.tif 000003
ＲＭ、脊髄：ＤＲＧ、後根神経節；ＣＦＡ、完全フロイントアジュバント；ＮＧＦ、神経成長因子
そこから本発明の第１の課題は、苦痛において重要な、特に苦痛調節物質の同定のためのスクリーニング方法を開発することであった。従ってこの発明は、（ａ）−ＪＮＫ３、ＰＩＭ−２、ＬＲ−１１、ＴＦＩＩＦβ、ＧＧＴ−β、ＧＡＴＡ３、ＣＬＣ−７、カタラーゼ、テトラスパニン（ＴＭ４ＳＦ／ＴＳＰＡＮ−６／ＴＭ４−Ｄ）、カゼインキナーゼ１ａ、ＭＡＰ３Ｋ７／ＴＡＫ−１（ＴＧＦ−β活性キナーゼ）、ＢＡＢ１４１１２および／またはスペルミジンシンターゼの群、
−ペプチドまたは蛋白質のためにまたはその一部のために図３４ａ）， ３４ｃ）， ３４ｅ）， ３４ｇ）， ３５ａ）， ３５ｃ）， ３５ｅ）， ３６ａ）， ３６ｃ）， ３７ａ）， ３７ｃ）， ３８ａ）， ３８ｃ）， ３９ａ）， ３９ｃ）， ３９ｅ）， ４０ａ）， ４０ｃ）， ４０ｅ）， ４１ａ）， ４１ｃ）， ４１ｅ）， ４２ａ）， ４２ｅ）， ４３ｃ）， ４３ｅ）， ４４ｅ）， ４５ａ）， ４５ｃ）， ４５ｅ）， 又は４６ｅ）の１つに基づくポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドに少なくとも９０％類似のポリヌクレオチドをコードする前記ペプチドまたは蛋白質の群、−図３４ｂ）， ３４ｄ）， ３４ｆ）， ３４ｈ）， ３５ｂ）， ３５ｄ）， ３５ｆ）， ３６ｂ）， ３６ｄ）， ３７ｂ）， ３７ｄ）， ３８ｂ）， ３８ｄ）， ３９ｂ）， ３９ｄ）， ４０ｂ）， ４０ｄ）， ４０ｆ）， ４１ｂ）， ４１ｄ）， ４１ｆ）， ４２ｂ）， ４２ｆ）， ４３ｄ）， ４３ｆ）， ４４ｆ）， ４５ｂ）， ４５ｄ）， ４５ｆ） 又は４６ｆ）の１つに基づくアミノ酸配列を有するペプチドまたは蛋白質または前記アミノ酸配列に少なくとも９０％類似のペプチドまたは蛋白質の群、
−および／または図３４ａ）， ３４ｃ）， ３４ｅ）， ３４ｇ）， ３５ａ）， ３５ｃ）， ３５ｅ）， ３６ａ）， ３６ｃ）， ３７ａ）， ３７ｃ）， ３８ａ）， ３８ｃ）， ３９ａ）， ３９ｃ）， ３９ｅ）， ４０ａ）， ４０ｃ）， ４０ｅ）， ４１ａ）， ４１ｃ）， ４１ｅ）， ４２ａ）， ４２ｅ）， ４３ｃ）， ４３ｅ）， ４４ｅ）， ４５ａ）， ４５ｃ）， ４５ｅ）， 又は４６ｅ）の１つに基づくポリヌクレオチドへのストリンジェントな条件下にまたは前記ポリヌクレオチドのアンチセンス  ポリヌクレオチドを結合する核酸によってコードされる蛋白質の群、
−前記蛋白質類および／またはペプチド類の１種の少なくとも１０個のアミノ酸長さの部分蛋白質の群、
および／または
−ペプチドまたは蛋白質のために、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が図１−３３に示した配列の１つに基づく遺伝子フラグメントを包含する前記ポリヌクレオチドからなる遺伝子がコードする、または前記ペプチドまたは蛋白質のためにこのような遺伝子に少なくとも９０％類似のポリヌクレオチドがコードする前記ペプチドまたは蛋白質の群から選ばれた、ペプチドまたは蛋白質を合成したような細胞からなる細胞および／または製剤による好適な条件下での被験物質のインキュベーションの方法ステップと、
（ｂ）細胞から合成されたペプチドまたは蛋白質への試験物質の結合の測定またはペプチドまたは蛋白質への試験物質の結合によって変化した少なくとも１つの機能媒介変数の測定の方法ステップと、を有する苦痛調節物質の発見のための方法に関する。
【０００８】
この新規のスクリーニング方法は、ここで物質の潜在的な苦痛効果が苦痛調節物質のペプチドまたは蛋白質構造と前記物質の相互作用を見い出すことができることに基づいている。
【０００９】
この場合、概念「苦痛調節」は生理的な苦痛現象、特に鎮痛作用に及ぼす潜在的な調節の影響に関係する。概念「物質」は、それぞれ薬剤作用物質として好適な化合物、つまり特に低分子作用物質、さらにまた核酸、脂肪、糖類のような他の作用物質、抗体のようなペプチドまたは蛋白質を包含する。
【００１０】
好適な条件下でのインキュベーションは、ここで水性溶媒中の細胞または対応する製剤を含む被検物質が測定前の規定された時間で反応できるようにすることが理解されている。この場合、水性溶媒は、たとえば４℃および４０℃の間、好ましくは室温または３７℃に温度調節してよい。インキュベーション時間は、それぞれのペプチドまたは蛋白質と物質の相互作用に応じて、数秒および数時間の間で変化させてよい。しかし１分および６０分の間の時間が有利である。水性溶媒は好適な塩類および／または緩衝剤系を含有してよく、それによってインキュベーション時に、たとえば溶媒中にｐＨ６および８の間、好ましくはｐＨ７．０−７．５が支配する。この溶媒に、さらに補酵素、栄養物質等のような好適な物質を添加してもよい。好適な条件は、当業者が方法において可能な限り明確な測定値を得るために、前記当業者の経験、文献または簡単にできない予備実験に基づき、ペプチドまたは蛋白質を含む物質の被検相互作用に依存して容易に確定することができる。
【００１１】
特定のペプチドまたは蛋白質を合成した細胞は、このペプチドまたは蛋白質がすでに内生的に発現した細胞または遺伝子技術的に変化されたような細胞であり、それによって前記細胞は前記ペプチドまたは蛋白質を発現し、それに応じて本発明による方法の開始前にペプチドまたは蛋白質を含有する。これらの細胞は、場合により不死化細胞株からなる細胞としてよく、または自然の組織から由来し、かつ前記組織から単離した細胞としてよく、合胞体が多くの場合溶解される。この細胞からなる製剤は、特に細胞からなる均等質、サイトソル、膜フラグメントを有する細胞の膜フラクション、単離した細胞内小器官の浮遊液等を包含する。
【００１２】
ここに列挙した蛋白質およびペプチドは、本発明の枠内で、動物において苦痛が誘発され、適当な時間後に前記動物の特定の組織中の発現パターンを苦痛誘発措置なしの対照動物の発現パターンと比較する苦痛調節作用として同定された。この場合に見い出された変化して発現したペプチドおよび蛋白質は、ＪＮＫ３、蛋白質キナーゼ、ＰＩＭ−２、シグナリング  キナーゼ、ＬＲ−１１、「低密度リポ蛋白質」（“Ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ”）受容体のファミリからなるモザイク蛋白質、ＴＦＩＩＦβ、転写因子、ＧＧＴ−β、ゲラニゲラニルトランスフェラーゼ、ＧＡＴＡ３、転写因子、ＣＬＣ−７、クロリドチャンネル、カタラーゼ、酸素解毒経路酵素のような公知の蛋白質を包含する。見い出された遺伝子フラグメントのさらに深化させた別の解析において、特異的にＺＮＳ内のニューロンに、特にその中でも皮質と海馬状隆起とに見い出され、神経成長およびシナプス形成においてある役割を果たしており、細胞接着（インテグリン）およびシグナル分子（ＰＫＣ、Ｐ１４キナーゼ）の間の仲介物であるべきテトラパニン（ＴＭ４ＳＦ／ＴＳＰＡＮ−６／ＴＭ４−Ｄ）、ＡＰ−３鎖体のホスホリル化によってシナプス形成に寄与するとみられるカゼインキナーゼ１ａ、特異的にＪＮＫキナーゼを活性するＭＡＰ３Ｋ７／ＴＡＫ−１（ＴＧＦ−β活性キナーゼ）、これまで殆ど未知の蛋白質、ＢＡＢ１４１１２、および成長の原因となるスペルミジンシンターゼが苦痛調節していることが確認された。前記蛋白質類がどの種から由来するかは、方法の機能にとり重要ではないが、ヒト、マウス−またはラット−変異体を使用することが有利である。前記蛋白質類は、コードするＤＮＡ−およびアミノ酸配列に関して公知であり、その一般的機能においても記載されている。しかし前記蛋白質類は、これまで先行技術において苦痛と特に苦痛調節との関連性がつけられていなかった。ここでインビボ苦痛モデルにおける発現の変化に関する蛋白質の同定が行われたので、そこから導出された本発明によるスクリーニング方法は、前記の蛋白質類の使用下の将来の薬剤にとり、理論的考察において構築されるのみならず、おそらく大きなインビボ重要性を有する大きな長所を有する。この方法によって苦痛領域において従来使用されていない蛋白質類およびペプチド類と物質の相互作用が苦痛調節物質の発見の基準として可能になるため、この方法によって現在、先行技術において従来公知の、他のペプチド類または蛋白質類による方法で注目されなかった苦痛に重要な物質が場合によって見い出されうる。またこれは新規の本発明による方法の重要な長所である。
【００１３】
使用するペプチドまたは蛋白質は、図３４ａ）， ３４ｃ）， ３４ｅ）， ３４ｇ）， ３５ａ）， ３５ｃ）， ３５ｅ）， ３６ａ）， ３６ｃ）， ３７ａ）， ３７ｃ）， ３８ａ）， ３８ｃ）， ３９ａ）， ３９ｃ）， ３９ｅ）， ４０ａ）， ４０ｃ）， ４０ｅ）， ４１ａ）， ４１ｃ）， ４１ｅ）， ４２ａ）， ４２ｅ）， ４３ｃ）， ４３ｅ）， ４４ｅ）， ４５ａ）， ４５ｃ）， ４５ｅ）， 又は４６ｅ）の１つに基づくポリヌクレオチドがコードするものから選んでもよい。ＪＮＫ３、ＰＩＭ−２、ＬＲ−１１、ＴＦＩＩＦβ、ＧＧＴ−β、ＧＡＴＡ３、ＣＬＣ−７、およびカタラーゼ、同様にテトラスパニン（ＴＭ４ＳＦ／ＴＳＰＡＮ−６／ＴＭ４−Ｄ）、カゼインキナーゼ１ａ、ＭＡＰ３Ｋ７／ＴＡＫ−１（ＴＧＦ−β活性キナーゼ）、ＢＡＢ１４１１２および／またはスペルミジンシンターゼのマウス、ラットおよびヒトのための公知のコードされたｃＤＮＡ配列の多くが表され、もしくはＧＡＴＡ３の場合はラット部分配列のみ、およびＣＣＬ−７の場合はマウスゲノムＤＮＡである。先行技術から従来知られていないものは、本発明の枠内でクローニングされたＰＩＭ−２、ラットのｃＤＮＡ配列である。本発明による方法の場合は、単にポリヌクレオチドの一断片（部分）だけをコードするペプチド類および蛋白質類も使用可能であるが、その場合は少なくともポリペプチド（≧１０アミノ酸）または蛋白質１個としなければならない。最後に、スクリーニング方法については特定の場合で少なくとも１０個のアミノ酸の前記蛋白質類の１つの部分断片のみが必要である。また非常に小さい偏差はペプチドおよび蛋白質との相互作用と共にこの方法の機能に殆ど影響しないので、複写したものの１つが少なくとも９０％類似するＤＮＡ配列がコードするペプチド類および蛋白質類も使用可能である。この場合、９０％の類似性とは、ポリヌクレオチドのコード領域において塩基連鎖が９０％一致していることである。
【００１４】
蛋白質類は、図３４ｂ）， ３４ｄ）， ３４ｆ）， ３４ｈ）， ３５ｂ）， ３５ｄ）， ３５ｆ）， ３６ｂ）， ３６ｄ）， ３７ｂ）， ３７ｄ）， ３８ｂ）， ３８ｄ）， ３９ｂ）， ３９ｄ）， ４０ｂ）， ４０ｄ）， ４０ｆ）， ４１ｂ）， ４１ｄ）， ４１ｆ）， ４２ｂ）， ４２ｆ）， ４３ｄ）， ４３ｆ）， ４４ｆ）， ４５ｂ）， ４５ｄ）， ４５ｆ） 又は４６ｆ）の１つに基づくアミノ酸配列を含むものから選んでもよい。またこれは、主に本発明の枠内で調査されたＰＩＭ−２ラットの配列に至るまで先行技術から公知の配列である。ここでペプチド類および蛋白質類のアミノ酸配列が複写したアミノ酸配列の１つに少なくとも９０％類似している前記ペプチド類および蛋白質類は、アミノ酸連鎖内の僅かな偏差でもペプチドおよび蛋白質と物質の相互作用と共に方法の機能に殆ど影響しないので使用可能である。この場合、９０％の類似性とはアミノ酸連鎖中の一致のことである。
【００１５】
蛋白質類は、ストリンジェントな条件下に図３４ａ）， ３４ｃ）， ３４ｅ）， ３４ｇ）， ３５ａ）， ３５ｃ）， ３５ｅ）， ３６ａ）， ３６ｃ）， ３７ａ）， ３７ｃ）， ３８ａ）， ３８ｃ）， ３９ａ）， ３９ｃ）， ３９ｅ）， ４０ａ）， ４０ｃ）， ４０ｅ）， ４１ａ）， ４１ｃ）， ４１ｅ）， ４２ａ）， ４２ｅ）， ４３ｃ）， ４３ｅ）， ４４ｅ）， ４５ａ）， ４５ｃ）， ４５ｅ）， 又は４６ｅ）の１つに基づくポリヌクレオチドまたはそのアンチセンス  ポリヌクレオチドに結合する核酸によってコードされるものから選んでもよい。この場合「ストリンジェントな条件」とは、完全な塩基対の核酸鎖のみが形成され、安定状態にとどまる条件のことであり、「アンチセンス  ポリヌクレオチド」とは、複数の自然のまたは修飾した核酸からなる分子の塩基連鎖が自然に存在するＲＮＡの部分領域の塩基連鎖に対して相補的である前記分子のことである。
【００１６】
基本的に、すでに１０個のアミノ酸、好ましくは１５個、特に２０個のアミノ酸が完全に特異的であり、または特異的とすることができるので、本発明による方法にとっては、前記蛋白質類および／またはペプチド類の１つの少なくとも１０個のアミノ酸長さの部分蛋白質が使用される場合に充分とすることができる。
【００１７】
しかしペプチド類および蛋白質類は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が図１−３３に示した配列の１つに基づく遺伝子フラグメントを含有する前記ポリヌクレオチドからなる遺伝子がコードするような化合物から選んでもよい。この発明の枠内で、先行技術においてまだ全く知られていないペプチドまたは蛋白質に帰属している苦痛によって調節された遺伝子フラグメントが同定および配列決定された。しかし遺伝子フラグメントの後解析は、幾つかの事例でテトラスパニン（ＴＭ４ＳＦ／ＴＳＰＡＮ−６／ＴＭ４−Ｄ）、カゼインキナーゼ１ａ、ＭＡＰ３Ｋ７／ＴＡＫ−１（ＴＧＦ−β活性キナーゼ）、ＢＡＢ１４１１２および／またはスペルミジンシンターゼへのもう１つの割当を可能にした。それぞれ充分包括的に配列決定した遺伝子フラグメントは、一義的に帰属する遺伝子、ポリヌクレオチドの配列から遺伝子フラグメントが一部である前記ポリヌクレオチドを規定する。対応する遺伝子フラグメントが苦痛調節として同定されたことによって、この遺伝子の明確な生理学的機能も輪郭が明らかになる。当業者は、このフラグメントを包含する完全な遺伝子に公知の方法を介して到達する。つまりポリヌクレオチドは図１−３３の１に従ってプローブとして標識することができ、ｃＤＮＡバンクをこのプローブでハイブリダイズし、ストリンジェントな条件下に洗浄され、前記プローブに結合したｃＤＮＡクローンを単離し、必要がある場合は配列決定することができる。同様に遺伝子もしくはポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの断片が図１−３３の１つに基づき遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーとして検出および合成され、次に前記オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって１本鎖または２本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリまたはテンプレートとてしのゲノムＤＮＡから出発して伸長したポリヌクレオチドを生成し、必要がある場合は配列決定されることによって得られる。この方式は一例を利用して後により詳しく説明する。ペプチド類および蛋白質類の前記群についても、公知の方法に比べ、本発明による方法におけるその使用時に「インビボ」コーティングが保証され、この方法が先行技術において従来公知のスクリーニング方法で場合により注意を引かなかったような潜在的な苦痛調節物質を同定することを可能にする長所が提供される。
【００１８】
この方法が重要な物質の発見を可能にする基準は、たとえば公知のリガンドの排除または結合した物質の大きさによって検出できる蛋白質またはペプチドへの結合かまたはペプチドまたは蛋白質と物質の相互作用による機能媒介変数の変化のいずれかである。この相互作用は、特に調節、阻止および／または受容体の活性、イオンチャンネルおよび／または酵素におくことができ、変化した機能媒介変数は、たとえば遺伝子発現、イオン環境、ｐＨまたは膜蛋白質、もしくは２ｎｄメッセンジャーの酵素活性度または濃度の変化としてよい。
【００１９】
本発明の説明のために、以下、一般に本文中で与えた概念の説明のほかに、特定の、特に請求項において使用した概念が本発明の意味においてどのように理解および解釈されるべきかを明確にするために、その他の定義を記載する。
−物質：これにより化学的化合物を指している。これは狭義の意味で、潜在的に身体の中で作用を発揮できる化合物、低分子作用物質、核酸、脂肪類、糖類、ペプチド類または蛋白質類であり、特にここでは低分子作用物質類である。
−苦痛調節：本発明の意味において、苦痛調節は、物質が苦痛の知覚を直接的または間接的に影響を及ぼすことであり、特に自然の鎮痛性の作用である。
−インキュベーション：インキュベーションとは、生物学的調査対象物、孵化槽または水槽上のような温度調節溶媒中の、たとえば細胞または蛋白質の取込みおよび放置である。この場合、ここで好適な条件下に、生理学的条件下（例３７℃、ｐＨ７．２）または方法において最適な測定が可能になる条件でのインキュベーションである。
−細胞：細胞は自己の代謝と増殖能力によって、自己調節する、開かれた、その環境との永久的な物質交換によって流動平衡状態にある系である。細胞は、別々に培養し、または特に器官からの組織の一部としてよく、そこに個別的にまたはまだ合胞体として存在してよい。
−細胞１個からの製剤：これは化学的、生物学的、機械的または物理的方法を利用して細胞構造の変化のもとに製造される製剤、たとえば膜フラグメント、単離した細胞区画、単離したサイトソル、または組織から得た均等質である。
−ペプチド：ペプチド化合物を介して鎖に結合したアミノ酸からなる化合物。オリゴペプチドは、２個および９個のアミノ酸の間、ポリペプチドは１０個および１００個の間のアミノ酸からなる。
−蛋白質：場合により規定された空間構造を有する、ペプチド結合を介して鎖に結合した１００個以上のアミノ酸からなる化合物。
−ＪＮＫ３：有糸分裂促進因子活性の蛋白質キナーゼのファミリからなる蛋白質キナーゼ。
−ＰＩＭ−２：プロト−オンコゲンおよびセリン−トレオニン−キナーゼ。
−ＬＲ−１１：ＬＤＬ（“Ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ”）受容体ファミリおよびモザイク蛋白質の一員。
−ＴＦＩＩＦＢ：ＲＮＡポリメラーゼＩＩに結合する転写開始因子のβサブユニット。
−ＧＧＴ−β：Ｉ型のゲラニルゲラニルトランスフェラーゼのβサブユニット（ＥＣ２、５、１、３）
−ＧＡＴＡ３：ＧＡＴＡ結合蛋白質の３型。
−ＣＬＣ−７：塩化物チャンネル蛋白質。
−カタラーゼ：反応性の酸素種の解毒において重要な役割を果たす酵素（ＥＣ１．１１．１．６）
−テトラスパニン（ＴＭ４ＳＦ／ＴＳＰＡＮ−６／ＴＭ４−Ｄ）：特異的にニューロンにＺＮＳ内、特にその中でも皮質および海馬状隆起に見い出される。神経成長とシナプス形成においてある役割を果たしており、細胞接着（インテグリン）とシグナル分子（ＰＫＣ、Ｐ１４キナーゼ）間の仲介者であると思われる。
−カゼインキナーゼ１ａ：ＡＰ−３−鎖体のホスホル化によってシナプス形成に寄与するとみられる偏在性の酵素。
−ＭＡＰ３Ｋ７／ＴＡＫ−１（ＴＧＦ−β活性キナーゼ）：特異的にＪＮＫキナーゼを活性化する酵素。
−ＢＡＢ１４１１２：これまで殆ど知られていない蛋白質：ＡＮ：ＢＡＢ１４１１２
−スペルミジンシンターゼ：特に細胞成長の一因とみられる偏在性の酵素
−ポリヌクレオチド：基礎となるヌクレオチドは、基本的に核塩基、ペントーゼおよびホスホル酸からなる核酸の基本構成体である。これはホスホル酸ペントーゼ−エステル化を介して互いに結合した複数のヌクレオチドからなる高分子ポリヌクレオチドに相当する。しかし本発明のもとに、さらに塩基連鎖を維持しているが、ホスホル酸ペントーゼの代わりに修飾した脊柱を提供する修飾したポリヌクレオチドも含まれる。
−少なくとも９０（９５、９７）％類似：これは、検出したポリヌクレオチドとそのコード領域において塩基連鎖に関して少なくとも９０％（９５％、９７％）基準体（図など）と同一であり、検出したペプチド類および蛋白質類とその１次構造において、少なくとも９０％（９５％、９７％）基準体とアミノ酸の連鎖が同一であることである。
−遺伝子：概念「遺伝子」によって、ｍ−またはｐｒａ−ｍＲＮＡまたはその他のＲＮＡ（たとえばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡなど）の合成情報を含有する規定されたヌクレオチド配列を有するゲノム断片を表している。
−遺伝子フラグメント：その塩基連鎖において遺伝子の部分領域を含む核酸断片。
−生理学的に伸長した遺伝子フラグメント：分子生物学的方法、たとえばｃＤＮＡライブラリの連続パターン、核酸混合物またはＰＣＲ仲介方法（いわゆるＲＡＣＥプロトコル）からの相補的ＤＮＡ鎖の引き出しなどによって、その配列において対応する標的器官（脳、脊髄、後根神経節）の中に発現したｍＲＮＡに相当するように伸長される遺伝子フラグメント。
−ペプチドまたは蛋白質への結合：固定のために処理される物質とペプチドまたは蛋白質との間の相互作用。
−機能媒介変数：これは蛋白質（イオンチャンネル、受容体、酵素）の機能と相関する実験の測定量である。
−遺伝子技術的に操作：この場合に遺伝物質が取り込まれるような、細胞、組織または器官の操作。
−内生的な発現：対応する蛋白質が遺伝子技術的な操作によって発現に誘因されずに、好適な培養条件下に細胞株を有する蛋白質の発現。
−Ｇ蛋白質：シグナル蛋白質としてＧ蛋白質によって結合した受容体を活性化させるグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）結合蛋白質のための国際的慣用略語
−レポータ遺伝子：たとえば発光酵素、アルカリホスファターゼまたはグリーン・蛍光蛋白質（ＧＦＰ）のような、簡単な生化学的方法または組織化学的方法を利用してその遺伝子生成物を簡単に検出できる遺伝子のための一般名称。
−（組換え）ＤＮＡコンストラクト：ＤＮＡ分子のインビトロ結合によって発生したＤＮＡ分子の各種の一般名称。
−クローニングベクター：クローニングにより外部遺伝子またはこの遺伝子の部分の担体として利用される核酸分子の一般名称。
−発現ベクター：好適な宿主細胞内への取込み後転写およびベクターの中にクローニングされた外部遺伝子の翻訳を可能にする特異的に構成されたクローニングベクターの名称。
−ＬＴＲ配列：“Ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ”の略語。線状ゲノムの両端に見い出される長い配列領域の一般名称。このような配列領域は、たとえばレトロウィルスのゲノムの中および真核トランスポゾンの末端に生じる。
−ポリ−Ａ−テール：メッセンジャーＲＮＡｓの３’末端にポリアデニル化によって接着するアデニル基（約２０−２５０）
−プロモータ配列：遺伝子の転写、すなわちｍＲＮＡの合成から制御されるＤＮＡ配列領域の名称。
−ＯＲＩ配列：“Ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”の略語。ＯＲＩ配列はＤＮＡ分子に、細胞内の自立単位として増殖することを可能にする。
−エンハンサー配列：一般に多くの遺伝子の発現を様々な規模で増強する比較的短い、部分的に反復して現れる遺伝子要素の名称。
−転写因子：特異的ＤＮＡ配列への結合を介して遺伝子の転写に影響を及ぼす蛋白質の名称。
−培養：好適な培養条件下で細胞または組織を保持すること。
−発現を可能にする条件：これは、関心のある蛋白質の発現を可能にする培養条件の選択および適用である。これには、温度変化、溶媒変更、誘導物質の添加、阻害物質の除去が含まれる。
−インキュベーション時間：細胞または組織をインキュベートするための持続時間。すなわち一定の温度にさらす時間。
−選択圧：ある特定の遺伝子生成物、いわゆる選択マーカーを有する細胞に成長上の長所を調達する培養条件の適用。
−両生類細胞：両生類の種の動物からの細胞。
−細菌細胞：真性細菌目または古細菌の豊穣さに帰属する細胞、またはそれらから由来する細胞
−酵母細胞：子嚢菌類エンドミケス目（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｓｅ）の目に帰属する細胞、またはそれから由来する細胞
−昆虫細胞：六脚類（Ｈｅｘａｐｏｎｄａ）の目に帰属する細胞、またはそれらから由来する細胞
−自然の哺乳動物細胞：その重要な特徴において有機体中に存在する細胞に相当する哺乳動物から由来する細胞。
−不死化哺乳動物細胞：適用した培養条件または遺伝子技術的な操作によって、一般に常法で培養内で行われる分裂頻度を超えて分裂（約１００）する性質を有する細胞。
−標識：検出反応のために対応する修飾または誘導によって、たとえば放射性、蛍光性または発光性により得るようにすること。
−リガンド：身体内または細胞内に存在する分子に特異的に受容体を結合する物質。
−排除：リガンドの結合部位からのリガンドの完全または部分的な除去。
−結合した活性：受容体に結合したリガンド量と相関する生化学的または物理的に検出した測定値。
−調節：制御プロセスの部分として行ったある過程の阻害または活性
−阻害：調節の特別の場合としての、ある過程の阻止／抑制。
−活性：調節の特別の場合としての、ある過程の増強。
−受容体：広義の意味で、作用物質が結合できる全ての原核または真核有機体中に存在する分子。狭義の意味で、作用物質の結合によって細胞内の変化を生ぜしめる膜結合蛋白質または複数の蛋白質錯体。
−イオンチャンネル：陰イオンまたは陽イオンが膜を通り浸透できる膜結合蛋白質または複数の蛋白質錯体。
−酵素：触媒性質を有する蛋白質を含む活性非卵白成分からなる蛋白質または錯体の名称。
−遺伝子発現（発現する／発現可能）：ＲＮＡ（ＲＮＡ発現）または蛋白質（蛋白質発現）への遺伝子の遺伝情報の翻訳
−イオン環境：特定の区画内の１個または複数個のイオン濃度
−膜電位：膜の一方の側で陰イオンおよび他方の側で陽イオンの余剰に基づく膜を介した電位差。
−酵素活性度の変化：酵素の触媒活性の阻害または誘導
−２ｎｄメッセンジャー：細胞外シグナルへの応答としてサイトソル内に形成されるか、サイトソル内へ移動する小分子。この場合は情報を、たとえばｃＡＭＰ、ＩＰ３のような細胞株へ伝達する支援をする。
−（遺伝子）プローブ：核酸を利用して求めている遺伝子または特定のＤＮＡ配列を検出できる核酸の各種の名称。遺伝子プローブ（たとえばビオチン、磁気ビード、ジゴキシニン）の誘導体化によって、特にＤＮＡ分子を混合物から引き出すことができる。プローブとして、クローン遺伝子、遺伝子フラグメント、化学合成オリゴヌクレオチドおよび多くが放射性標識されたＲＮＡも使用される。
−ＤＮＡ：デオキシリボ核酸の国際的名称。
−ゲノムＤＮＡ：真核有機体において細胞の細胞核から由来するＤＮＡのための一般的名称。
−ｃＤＮＡ：“Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ”の略語。ＲＮＡ分子の１本鎖もしくは２本鎖ＤＮＡ複製の名称。
−ｃＤＮＡバンク／ライブラリ：要約して細胞または組織から合成した全てのＲＮＡの全体を表す任意にクローニングしたｃＤＮＡフラグメントの集合の名称。
−ｃＤＮＡクローン：この細胞が人工的に取り込まれたｃＤＮＡフラグメントを含有するような、唯一の細胞から導出した遺伝子的に統一した細胞の個体群の名称。
−ハイブリダイゼーション：２つの独立した１本鎖から塩基対によって生じた２本鎖核酸分子の形成。
−ストリンジェントな条件：完全に塩基対となった核酸鎖のみが形成され、安定した状態になる条件。
−単離する：求めている分子を混合物から見つけ出し、分離すること。
−ＤＮＡ配列決定：ＤＮＡ分子内の塩基の連鎖の決定。
−核酸配列：ＤＮＡ分子の１次構造、すなわちＤＮＡが構成される個々の塩基の連鎖の名称。
−遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー：その塩基組成において求めている遺伝子または求めているｃＤＮＡへのストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にするオリゴ核酸つまり１０−４０塩基長の核酸フラグメント。
−オリゴヌクレオチドプライマーの検出：ハイブリダイゼーションおよび／またはポリメラーゼ連鎖反応に最適であるオリゴヌクレオチドから所定のＤＮＡ配列への手動または計算機支援検索。
−ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応の略語。核酸分子の混合物からインビトロ法で核酸領域の選択的富化のために規定した長さおよび規定した配列。
−ＤＮＡテンプレート：ＰＣＲ（上記参照）を利用したＤＮＡ断片が複製される核酸分子または核酸分子の混合物
−ＲＮＡ：国際的に慣用のリボ核酸の略語。
−ｍＲＮＡ：核から細胞内へ遺伝情報の転移に参加し、ポリペプチドまたは蛋白質の合成情報を含むメッセンジャーリボ核酸の国際的に慣用の略語。
−アンチセンス  ポリヌクレオチド：分子の塩基連鎖が部分領域の塩基連鎖と相補的に自然に存在するＲＮＡである複数の自然のまたは修飾した核酸からなる分子。
−ＰＮＡ：“ｐｅｐｔｉｄｉｃ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ”の国際的に慣用の略語。この場合、ペプチド結合したアミノ酸が鎖を形成し、このアミノ酸が側鎖としてＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイゼーションの能力のある塩基を担う。
−配列：ヌクレオチドまたはアミノ酸の連鎖。本発明に特異的な意味において、それにより核酸配列を指している。
−リボザイム：触媒活性のリボ核酸の名称（たとえばリガーゼ、エンドヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ）
−ＤＮＡ酵素：触媒活性を含有するＤＮＡ分子の名称（たとえばリガーゼ、エンドヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ）
−触媒ＲＮＡ／ＤＮＡ：リボザイムもしくはＤＮＡ酵素（上記参照）の一般的名称。
−アデノウィルス：脊椎動物に存在する細胞病原性ウィルス。
−アデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）：パルボウィルスのファミリに属す。ＡＡＶの効果的な増殖のために、介助ウィルス（たとえばヘルペス−、種痘−またはアデノウィルス）による宿主細胞の重感染が必要である。安定して宿主ゲノムの中へ組み入れられるＡＡＶの性質は、哺乳動物細胞の形質導入ベクターとして関心がもたれている。
−ヘルペスウィルス：ヘルペス感染のウィルス病原体。
−翻訳後修飾：翻訳後に実施される蛋白質またはポリペプチドの変化。これらに含まれるものは、たとえばホスホリル化、グリコシル化、アミド化、アセチル化または蛋白質分解である。
−グリコシル化：蛋白質への個々の糖分子または全糖鎖の付加の名称。
−ホスホリル化：蛋白質、有利にはセリン、トレオニンまたはチロシンのアミノ酸のＯＨ基への、１個または複数個のリン酸塩基の付加の名称。
−アミド化：アミド官能基、たとえばペプチドまたは蛋白質のカルボキシ末端アミノ酸基への、カルボキシ官能基の転換のための名称。
−膜アンカーを具備：疎水分子の付加によって好適な方法で脂肪酸またはその誘導体を細胞の脂質二重層膜へ係留されるように、蛋白質、または他の有機分子の翻訳後の修飾。
−分裂する：この特異的な場合において、複数の従属配列へのペプチドまたは蛋白質の分裂。
−短縮する：複数の個別部分からなる分子を１個または複数個部分だけ短縮すること。
−抗体：溶融性の、または細胞膜に結合した、免疫グロブリンと呼ばれる、抗原のための特異的結合部位を有する蛋白質。
−モノクロナール抗体：抗原のただ１つの抗原決定基に向けた、非常に高い選択性を有する抗体。
−ポリクロナール抗体：抗原の複数の決定基に向けた抗体からなる混合物。
−導入遺伝子：遺伝子的に変化させること。
−非ヒト哺乳動物：ヒト種を除く哺乳動物の全体性（哺乳類の網）
−生殖細胞：第２生殖細胞との融合により新規有機体の形成を可能にする半数ゲノムをもつ細胞。
−体細胞：小器官の構成要素としての二倍細胞。
−染色体の取りこみ：染色体レベルでのヌクレオチド配列への侵襲
−ゲノム：有機体内の全遺伝子の全体性の一般的記述。
−動物の祖先：自然または人工の方法で直線的にその遺伝物質への伝達による他の動物（子孫）と近親性がある動物（祖先）。
−発現可能：核酸分子は、合成情報が蛋白質またはポリペプチドを含み、この蛋白質またはポリペプチドの合成をインビトロまたはインビボで可能にする対応する調節配列を具備している場合に、発現可能である。この前提条件がたとえばコード配列内での侵襲によって無くなると、核酸分子はもはや発現可能ではない。
−齧歯類動物：齧歯目、たとえばラットまたはマウスの目からの動物。
−苦痛調節物質として同定可能：当業者が鎮痛と呼ぶ生体への取り込み時に挙動変化を生ぜしめる物質（抗痛覚性、抗痛覚過敏性または抗異苦痛性）。このスクリーニング方法の場合は、この物質がスクリーニングにおいて機能媒介変数の変化のより強い結合または解除によって明らかに、たとえば１００％、被験物質の平均の結合または相互作用を超えることに関係する。
−化合物：複数の原子からなる、ここでは本発明による方法によって同定された分子としての別の分子の名称。
−作用物質：有機体への適用時に前記有機体内の変化を生ぜしめる化合物。これは、特に有機体に治癒効果を及ぼす有機化学的に合成された分子である。ここでは本発明による蛋白質およびペプチドに結合する特別の分子。
−低分子：分子量＜２ｋＤａをもつ分子。
−薬剤：薬剤取扱法第１条§２の規定に準ずる物質．
−診断剤：疾患を診断するために使用できる化合物または方法
−苦痛治療：苦痛を和らげまたはなくすための方法、あるいは予想される苦痛の発生を抑制するための方法（予感性痛覚脱失）。
−慢性痛：しばしば苦痛感覚が最初の刺激の時点および場所を越えることを特徴とする長期間持続する、身体の苦痛感覚を増大させる苦痛感覚
−遺伝子治療：遺伝子治療とは、遺伝子疾患を好適なゲノムの変化によって原因から治療することを目的とする全ての方法である。
−インビボ遺伝子治療：遺伝子治療を目的とする生体内の遺伝物質の取り込み。一方は二倍細胞で一方は半数細胞で行われる身体侵襲と胚通路侵襲を区別することができる。
−インビトロ遺伝子治療：細胞を後で再び遺伝子治療のためにヒト身体へ使用することを目的としたヒト身体の外部で細胞への遺伝物質の取り込み。
−診断法：疾患を同定するための方法。
−効能調査：生体への作用について化合物の効能を調査することを目的とした調査。
【００２０】
この方法の有利な実施形態において、細胞はステップ（ａ）で遺伝子技術的に操作される。その場合、遺伝物質、特に１個または複数個のポリヌクレオチド配列が細胞の中に取り込まれる。この実施形態のもう１つの有利な変形において、遺伝子技術的な操作が試験物質によって変化した機能媒介変数の少なくとも１つの測定を可能にする。この実施形態において、遺伝子技術的な操作によって、機能媒介変数の変化が全般的にまたは改善されて測定できる前提条件が構築される。その場合、遺伝子技術的な操作によって細胞内に非内生的に発現したＧ蛋白質の形態が発現され、またはレポーター遺伝子が導入されることが特に有利である。これは特に細胞の中への内生的に非存在のまたは生理学的に非発現のＧ蛋白質（ＧＴＰ結合蛋白質）の遺伝子技術的導入、たとえばシグナル経路または非常に易結合性である無差別混交のＧ蛋白質の変化を可能にするキメラＧ蛋白質の導入である。レポーター遺伝子の導入は、さらに遺伝子生成物の（細胞外誘発性の）誘導発現の測定を可能にする。
【００２１】
もう１つの有利な実施形態において、細胞が図３４ａ）， ３４ｃ）， ３４ｅ）， ３４ｇ）， ３５ａ）， ３５ｃ）， ３５ｅ）， ３６ａ）， ３６ｃ）， ３７ａ）， ３７ｃ）， ３８ａ）， ３８ｃ）， ３９ａ）， ３９ｃ）， ３９ｅ）， ４０ａ）， ４０ｃ）， ４０ｅ）， ４１ａ）， ４１ｃ）， ４１ｅ）， ４２ａ）， ４２ｅ）， ４３ｃ）， ４３ｅ）， ４４ｅ）， ４５ａ）， ４５ｃ）， ４５ｅ）， 又は４６ｅ）の１つに基づく少なくとも１個のポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドに少なくとも９０％類似のポリヌクレオチドまたは図１−３３に示した配列の１つに基づく１つの遺伝子フラグメントを包含する遺伝子のコード配列からなるポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドに少なくとも９０％類似のポリヌクレオチドを含有するように、前記細胞が遺伝子技術的に操作される。それによって、たとえば、この方法に使用した細胞または製剤の中に内生的に発現しないペプチドまたは蛋白質が細胞から合成されることを達成することができる。その場合、ポリヌクレオチドが組換えＤＮＡコンストラクトの中に含有されている場合に特に有利である。（組換え）ＤＮＡコンストラクトとは、インビトロで製造されたＤＮＡ分子である。
【００２２】
ステップａ）の前の方法において、細胞が遺伝子技術的に操作される場合、細胞が遺伝子技術的操作後に、およびステップ（ａ）の前に、発現を可能にする条件下に、必要がある場合は選択圧下に培養されることが有利である。培養するとは、細胞もしくはその後継世代の生き残りを保証する条件において前記細胞または組織を維持することである。その場合、これらの条件は、ここで遺伝子技術的な操作によって接合された物質の発現が可能になるように選ばれるべきである。そのために、ｐＨ、酸素濃度および温度が生理学的に保持され、充分な栄養物質および必要な補助要因が付加されるべきである。選択圧は、遺伝子技術的な操作が少なくとも部分的に成功を収めた細胞のみをさらに培養することを可能にする。それに含まれるのは、たとえばＤＮＡコンストラクトを介した耐抗生物質性の導入である。
【００２３】
本発明による方法において、使用した細胞が両生類細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または不死化細胞または自然の哺乳動物細胞である場合、特に有利である。両生類細胞の例はキセノプスオーシテン（Ｘｅｎｏｐｕｓ  Ｏｏｃｙｔｅｎ）であり、細菌細胞はエッシェリキア・コリ（Ｅ−ｃｏｌｉ）細胞であり、酵母細胞はサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり、昆虫細胞はＳｆ９細胞であり、不死化哺乳動物細胞はＨｅＬａ細胞であり、自然の哺乳動物細胞はチャイニーズヒムスターＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ）細胞である。
【００２４】
本発明による方法におけるペプチドまたは蛋白質への物質の結合の検出のための有利な測定方法において、結合の測定は、ペプチドまたは蛋白質の公知の標識したリガンドの排除および／または該ペプチドまたは蛋白質に結合した標識した試験物質の活性を介して行った。その場合、リガンドは同様に結合する被験物質によって結合部位から排除される高い特異性で蛋白質またはペプチドに結合する分子である。標識とは、分子での検出を容易にする人工の修飾である。例は、放射性標識、蛍光標識または発光標識である。
【００２５】
本発明による方法におけるペプチドまたは蛋白質への物質の結合によって解除された機能媒介変数の変化の確定のための別の有利な測定方法において、試験物質によって変化した機能媒介変数の少なくとも１つの測定が受容体、イオンチャンネルおよび／または酵素の調節、阻害および／または活性を介して、特に遺伝子発現、イオン環境、ｐＨまたは膜蛋白質の変化の測定を介して、２ｎｄメッセンジャーの酵素活性度または濃度の変化を介して行われた。それによって、一方で直接物質の作用の測定が受容体、イオンチャンネルおよび／または酵素の影響を介して把握され、他方では有利な被測定例として遺伝子発現、イオン環境、ｐＨ、膜電位、２ｎｄメッセンジャーの酵素活性度または濃度のような可変媒介変数がある。その場合、イオン環境とは、特に細胞区画、特にサイトソル内の１個または複数個のイオンの濃度であり、膜電位とは、生体膜の２面の間の電荷差であり、２ｎｄメッセンジャーとは、たとえば環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、イノソトールトリホスフェート（ＩＰ３）またはジアクリルグリセロール（ＤＡＧ）のような細胞内のシグナル経路のメッセージ物質である。
【００２６】
この方法の有利な変形において、ペプチドまたは蛋白質は、ステップ（ａ）および（ｂ）において、
−ＪＮＫ３、ＰＩＭ−２、ＬＲ−１１、ＴＦＩＩＦβ、ＧＧＴ−β、ＧＡＴＡ３、ＣＬＣ−７、カタラーゼ、テトラスパニン（ＴＭ４ＳＦ／ＴＳＰＡＮ−６／ＴＭ４−Ｄ）、カゼインキナーゼ１ａ、ＭＡＰ３Ｋ７／ＴＡＫ−１（ＴＧＦ−β活性キナーゼ）、ＢＡＢ１４１１２および／またはスペルミジンシンターゼの群、
−ペプチドまたは蛋白質のために、またはその一部のために図３４ａ）， ３４ｃ）， ３４ｅ）， ３４ｇ）， ３５ａ）， ３５ｃ）， ３５ｅ）， ３６ａ）， ３６ｃ）， ３７ａ）， ３７ｃ）， ３８ａ）， ３８ｃ）， ３９ａ）， ３９ｃ）， ３９ｅ）， ４０ａ）， ４０ｃ）， ４０ｅ）， ４１ａ）， ４１ｃ）， ４１ｅ）， ４２ａ）， ４２ｅ）， ４３ｃ）， ４３ｅ）， ４４ｅ）， ４５ａ）， ４５ｃ）， ４５ｅ）， 又は４６ｅ）の１つに基づくポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドに少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似のポリヌクレオチドをコードする前記ペプチドまたは蛋白質の群、
または
−図３４ｂ）， ３４ｄ）， ３４ｆ）， ３４ｈ）， ３５ｂ）， ３５ｄ）， ３５ｆ）， ３６ｂ）， ３６ｄ）， ３７ｂ）， ３７ｄ）， ３８ｂ）， ３８ｄ）， ３９ｂ）， ３９ｄ）， ４０ｂ）， ４０ｄ）， ４０ｆ）， ４１ｂ）， ４１ｄ）， ４１ｆ）， ４２ｂ）， ４２ｆ）， ４３ｄ）， ４３ｆ）， ４４ｆ）， ４５ｂ）， ４５ｄ）， ４５ｆ） 又は４６ｆ）の１つに基づくアミノ酸配列を有するペプチドまたは蛋白質または前記ペプチドまたは蛋白質に少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似のペプチドまたは蛋白質の群、
−および／または図３４ａ）， ３４ｃ）， ３４ｅ）， ３４ｇ）， ３５ａ）， ３５ｃ）， ３５ｅ）， ３６ａ）， ３６ｃ）， ３７ａ）， ３７ｃ）， ３８ａ）， ３８ｃ）， ３９ａ）， ３９ｃ）， ３９ｅ）， ４０ａ）， ４０ｃ）， ４０ｅ）， ４１ａ）， ４１ｃ）， ４１ｅ）， ４２ａ）， ４２ｅ）， ４３ｃ）， ４３ｅ）， ４４ｅ）， ４５ａ）， ４５ｃ）， ４５ｅ）， 又は ４６ｅ）の１つに基づくポリヌクレオチドへのストリンジェントな条件下にまたは前記ポリヌクレオチドのアンチセンス  ポリヌクレオチドを結合する核酸によってコードされる蛋白質の群、および／または
−前記蛋白質類および／またはペプチド類の１つの少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、特に少なくとも２０個のアミノ酸長さの部分蛋白質の群、から選ばれる。
【００２７】
そのもとに公知の配列および機能を有するペプチド類および特に蛋白質類が把握され、これらに関しては先行技術において苦痛における機能が知られていない。
【００２８】
この方法のもう１つの有利な変形において、ペプチドまたは蛋白質のためにステップ（ａ）および（ｂ）において、図１、３−８、１０、１１、１３、１４、１５、１７−２７または３１−３３に示された配列に基づく遺伝子フラグメントを包含するポリヌクレオチドからなる遺伝子がコードし、またはペプチドまたは蛋白質のために前記遺伝子に少なくとも９０％、特に９５％、好ましくは９７％類似のポリヌクレオチドがコードする。
【００２９】
この方法のもう１つの有利な変形において、ペプチドまたは蛋白質のためにステップ（ａ）および（ｂ）において、図２、９、１２、１６または２８−３０に示された配列の１つに基づく遺伝子フラグメントを包含するポリヌクレオチドからなる遺伝子がコードし、またはペプチドまたは蛋白質のために前記遺伝子に少なくとも９０％、特に９５％、好ましくは９７％類似のポリヌクレオチドがコードする。
【００３０】
本発明のもう１つの有利な目的は、図１−３３の１つに示されたヌクレオチド配列または図１−３３の１つに基づく遺伝子フラグメントを包含する遺伝子のコード配列からなるポリヌクレオチドに、少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に少なくとも９７％まで相当するポリヌクレオチドである。その中に、全部または少なくとも一部のいずれかでフラグメントに相当する遺伝子のコード配列に相当するポリヌクレオチドのような示された遺伝子フラグメント自体も包含される。それによって、少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に少なくとも９７％が誘導されたポリヌクレオチドのコード配列または遺伝子のコード配列と塩基連鎖において一致するポリヌクレオチドも意味されている。
【００３１】
ポリヌクレオチドの第１の特別に選ばれた形態は、図１、３−８、１０、１１、１３、１４、１５、１７−２７または３１−３３の１つ、特に２０または２１つに示されたヌクレオチド配列またはその部分の１つまたは図１、３−８、１０、１１、１３、１４、１５、１７−２７または３１−３３の１つ、特に２０または２１つに基づく遺伝子フラグメントを包含する遺伝子のコード配列からなるポリヌクレオチドに少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に少なくとも９７％まで相当するポリヌクレオチドである。
【００３２】
もう１つの有利な目的は、第１の製造方法によって規定されたポリヌクレオチド、すなわち少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に少なくとも９７％まで規定された核酸配列に相当するポリヌクレオチドであり、これは、図１−３３の１つに基づくポリヌクレオチドがプローブとして標識され、ｃＤＮＡバンクがプローブでハイブリダイズされ、ストリンジェントな条件下に洗浄され、プローブが結合したｃＤＮＡクローンが単離され、必要がある場合は配列決定されることによって得られる。ここでポリヌクレオチド、または遺伝子が製造工程を介して規定され、この製造工程によって特定の生成物、一定の公知の遺伝子フラグメントを包含する遺伝子が単離もしくは配列決定することができる。プローブは相補的または対応するヌクレオチド配列に使用することができ、そのために多くが同定のために標識される核酸である。ｃＤＮＡバンクは、可能な限り完全に選択した組織のｍＲＮＡを再現するべき細胞または組織のクローニング化ｃＤＮＡフラグメントである。ハイブリダイゼーションは、２つの１本鎖核酸分子の結合を意味し、洗浄はストリンジェントな条件下に、厳密に一組の塩基を介してハイブリダイズされた核酸分子を介してのみ結合された状態になることを保証するべきである。ｃＤＮＡクローンは遺伝子的に統一された、ここで統一ｃＤＮＡを有する子孫群である。
【００３３】
もう１つの有利な目的は、第２の、製造方法によって規定されたポリヌクレオチド、すなわち少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に少なくとも９７％まで規定された核酸配列に相当するポリヌクレオチドであり、これはポリヌクレオチドの断片が図１−３３の１つに基づき遺伝子特異的オリゴヌクレオチド−プライマーとして算出および合成され、次にそれらと共にＰＣＲによって１本鎖または２本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリまたはゲノムＤＮＡから出発してテンプレートとして伸長したポリヌクレオチドが発生され、必要がある場合は配列決定されることによって得られる。またここでもポリヌクレオチドもしくは遺伝子がもう１つの製造工程を介して規定され、この製造工程により、ある特定の生成物、ある特定の公知の遺伝子フラグメントを含有する遺伝子が単離もしくは配列決定することができる。プライマーは標的ＤＮＡ（いわゆるテンプレート）によってハイブリダイズされ、合成の始点であるオリゴヌクレオチドである。ＰＣＲは、ある特定のポリメラーゼの耐熱性が選択的複製に利用されるポリメラーゼ連鎖反応の略語である。その場合、テンプレートは複製が選択的にハイブリダイズに適したＤＮＡのプライマーによって行われる出発物質として利用される。
【００３４】
第２の特別に選ばれたポリヌクレオチドの形態は、特に、その製造／単離／塩基配列の出発点として図１、３−８、１０、１１、１３、１４、１５、１７−２７または３１−３３の１つ、特に２０または２１つに基づくポリヌクレオチド（遺伝子フラグメント）が使用される場合の、製造方法によって規定されたポリヌクレオチドである。
【００３５】
さらに、このポリヌクレオチドはＲＮＡもしくは１本鎖または２本鎖ＤＮＡ、特にｍＲＮＡまたはｃＤＮＡであることが有利である。
【００３６】
同様に、ポリヌクレオチドは、特異的に本発明に基づくポリヌクレオチドに結合することができる配列を有するアンチセンス−ポリヌクレオチドまたはＰＮＡであることが有利である。その場合、ＰＮＡとは塩基対を担うが、その脊柱がペプチドに結合する“ｐｅｐｔｉｄｉｃ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ”（ペプチド核酸）である。アンチセンス−ポリヌクレオチドは、塩基核酸の少なくとも一部に対して相補的な塩基連鎖を示す。同様に、ポリヌクレオチドはリボザイムの部分またはその他のＤＮＡ酵素または触媒ＲＮＡもしくはＤＮＡであることが有利である。リボザイムとは、触媒活性リボ核酸のことであり、ＤＮＡ酵素とは対応するデオキシリボ核酸、つまり触媒ＲＮＡもしくはＤＮＡである。
【００３７】
本発明のもう１つの目的は、上記ポリヌクレオチドの１つを含有するベクターである。ベクターとは、遺伝子技術的な操作において外部遺伝子を含有し、もしくは伝達することに利用される核酸分子である。その場合、発現ベクターであることが特に有利である。この発現ベクターは、それによって含有された外部遺伝子、ポリヌクレオチドの発現に利用される。
【００３８】
さらに、ウィルスから、たとえばアデノウィルス、アデノ関連ウィルスまたはヘルペスウィルスから誘導されたベクターでありおよび／またはこのベクターは少なくとも１つのＬＴＲ−、ポリＡ−、プロモーター−、および／またはＯＲＩ配列を含有する。ＬＴＲは“Ｌｏｎｇ−ＴｅｒｍｉｎａｌＲｅｐｅａｔ”であり、たとえばウィルスにおいて末端にある部分である。ポリ−Ａ−配列はアデノシン基２０以上の長さのテールである。プロモータ配列は転写のための制御領域である。
【００３９】
本発明のベクターの特に選ばれた形態は、ポリヌクレオチドまたは前記ポリペプチドに少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似の、図図１、３−８、１０、１１、１３、１４、１５、１７−２７または３１−３３、特に２０または２１つに基づくポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドに少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似の、図１、３−８、１０、１１、１３、１４、１５、１７−２７または３１−３３、特に２０または２１つに基づく配列を含有するポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドに少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似の、図１、３−８、１０、１１、１３、１４、１５、１７−２７または３１−３３、特に２０または２１の１つに基づく遺伝子フラグメントから出発した製造方法によって含有されるポリヌクレオチド、を含有するベクターである。
【００４０】
もう１つの目的は、ペプチド、特にオリゴペプチドまたはポリペプチド、またはすでに本発明の目的として記載されたポリヌクレオチドの１つによってコードされる蛋白質である。
【００４１】
本発明のもう１つの目的は、ペプチド、特にオリゴペプチドまたはポリペプチド、またはストリンジェントな条件下に図１−３３に基づくポリヌクレオチドの１つまたはそのアンチセンス−ポリヌクレオチドによってハイブリダイズするポリヌクレオチドをコードする蛋白質である。
【００４２】
また本発明の目的は、ペプチドまたは蛋白質が翻訳後に修飾された場合、特にグリコシル化、ホスフォリル化、アミド化、メチル化、アセチル化、ＡＤＰリボシル化、ヒドロキシル化、１つの膜アンカーを具備し、分裂または短縮されたことである。翻訳後の修飾はたとえば、Ｖｏｅｔ／Ｖｏｅｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１ｓｔＥｄｉｔｉｏｎ、１９９０、９３５−９３８頁から読み取れる。
【００４３】
ペプチドまたは蛋白質の特に選ばれた形態は、ポリヌクレオチドまたは前記ポリペプチドに少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似の、図図１、３−８、１０、１１、１３、１４、１５、１７−２７または３１−３３、特に２０または２１つに基づくポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドに少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似の、図１、３−８、１０、１１、１３、１４、１５、１７−２７または３１−３３、特に２０または２１つに基づく配列を含有するポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドに少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似の、図１、３−８、１０、１１、１３、１４、１５、１７−２７または３１−３３、特に２０または２１の１つに基づく遺伝子フラグメントから出発した製造方法によって含有されるポリヌクレオチドの場合にコードされる。
【００４４】
本発明のもう１つの目的は、すでに本発明の目的として記載したペプチドまたは蛋白質に対する抗体である。その場合、この抗体においてモノクロナール抗体またはポリクロナール抗体である場合に有利である。
【００４５】
抗体の特に選ばれた形態は、前記抗体がペプチドまたは蛋白質に向けられる場合、ポリヌクレオチドまたは前記ポリペプチドに少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似の、図図１、３−８、１０、１１、１３、１４、１５、１７−２７または３１−３３、特に２０または２１つに基づくポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドに少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似の、図１、３−８、１０、１１、１３、１４、１５、１７−２７または３１−３３、特に２０または２１つに基づく配列を含有するポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドに少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似の、図１、３−８、１０、１１、１３、１４、１５、１７−２７または３１−３３、特に２０または２１の１つに基づく遺伝子フラグメントから出発した製造方法によって含有されるポリヌクレオチドの場合にコードされる。
【００４６】
本発明のもう１つの目的は、すでに本出願の目的として記載したポリヌクレオチド、すでに本出願の目的として記載したペプチドまたは蛋白質および／またはすでに本出願の目的として記載したベクターを含有する細胞である。その場合、両生類細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または不死化細胞または自然の哺乳動物細胞である場合、特に有利である。両生類細胞の例はキセノプスオーシテン（Ｘｅｎｏｐｕｓ  Ｏｏｃｙｔｅｎ）であり、細菌細胞の例はエッシェリキア・コリ（Ｅ−ｃｏｌｉ）細胞、酵母細胞の例はサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞の例はＳｆ９細胞、不死化哺乳動物細胞の例はＨｅＬａ細胞および自然の哺乳動物細胞の例はチャイニーズヒムスターＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ）細胞である。
【００４７】
特に選ばれた細胞の形態は、特に選ばれたポリヌクレオチドの形態、特に選ばれたペプチドまたは蛋白質の形態および／または特に選ばれたベクターの形態を包含する。
【００４８】
本発明のもう１つの目的は、導入遺伝子非ヒト哺乳動物の胚細胞および体細胞が動物のゲノムまたは前記動物の祖先の１つのゲノムの中への染色体取り込みの結果としてすでに本発明の目的として記載したポリヌクレオチドの１つを含有する前記導入遺伝子非ヒト哺乳動物である。その場合、染色体取り込みとは、遺伝子技術的操作による侵襲が動物の染色体の中で効果を生じることである。
【００４９】
本発明のもう１つの目的は、導入遺伝子非ヒト哺乳動物の胚細胞および体細胞が動物のゲノムまたは前記動物の祖先の１つのゲノムの中への染色体操作の結果として請求項１４−２１のいずれか１項記載のヌクレオチド配列の１つをもはや発現形態で含有しない前記導入遺伝子非ヒト哺乳動物である。染色体操作は、動物またはその祖先の遺伝子に該当する。「もはや発現しない」とは、ポリペプチドまたは蛋白質の合成情報が、自然の形態で存在しているにもかかわらず、もはや完全な合成が可能ではない場合である。例は、調節配列の変化またはコード領域内の自然の核酸分子の一部の切り取りである。
【００５０】
その場合、導入遺伝子非ヒト哺乳動物が齧歯類動物である場合、特に有利である。
【００５１】
特に選ばれた導入遺伝子非ヒト哺乳動物の形態は、ヌクレオチド配列がポリヌクレオチドの特に選ばれた形態に相当する場合に存在する。
【００５２】
本発明のもう１つの目的は、本発明による方法による苦痛調節物質として同定可能の化合物である。その場合、化合物は特に低分子作用物質、しかしまたペプチド類、蛋白質類および核酸類に関係する。この場合、化合物は、本発明によるスクリーニング方法において結合に関して明らかにより強く、好ましくは被験物質の平均より２倍強く結合し、または機能媒介変数の変更に関して明らかに被験物質の平均から逸脱する特徴を有することを同定可能であることを意味する。
【００５３】
特に選ばれた本発明による化合物の形態は、公知の蛋白質の使用下の方法によって、ＪＮＫ３、ＰＩＭ−２、ＬＲ−１１、ＴＦＩＩＦβ、ＧＧＴ−β、ＧＡＴＡ３、ＣＬＣ−７、カタラーゼ、テトラスパニン（ＴＭ４ＳＦ／ＴＳＰＡＮ−６／ＴＭ４−Ｄ）、カゼインキナーゼ１ａ、ＭＡＰ３Ｋ７／ＴＡＫ−１（ＴＧＦ−β活性キナーゼ）、ＢＡＢ１４１１２および／またはスペルミジンシンターゼの群、ペプチドまたは蛋白質のために、またはその一部のために図３４ａ）， ３４ｃ）， ３４ｅ）， ３４ｇ）， ３５ａ）， ３５ｃ）， ３５ｅ）， ３６ａ）， ３６ｃ）， ３７ａ）， ３７ｃ）， ３８ａ）， ３８ｃ）， ３９ａ）， ３９ｃ）， ３９ｅ）， ４０ａ）， ４０ｃ）， ４０ｅ）， ４１ａ）， ４１ｃ）， ４１ｅ）， ４２ａ）， ４２ｅ）， ４３ｃ）， ４３ｅ）， ４４ｅ）， ４５ａ）， ４５ｃ）， ４５ｅ）， 又は４６ｅ）の１つに基づくポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドに少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似のポリヌクレオチドをコードする前記ペプチドまたは蛋白質の群、または図３４ｂ）， ３４ｄ）， ３４ｆ）， ３４ｈ）， ３５ｂ）， ３５ｄ）， ３５ｆ）， ３６ｂ）， ３６ｄ）， ３７ｂ）， ３７ｄ）， ３８ｂ）， ３８ｄ）， ３９ｂ）， ３９ｄ）， ４０ｂ）， ４０ｄ）， ４０ｆ）， ４１ｂ）， ４１ｄ）， ４１ｆ）， ４２ｂ）， ４２ｆ）， ４３ｄ）， ４３ｆ）， ４４ｆ）， ４５ｂ）， ４５ｄ）， ４５ｆ） 又は４６ｆ）の１つに基づくアミノ酸配列を有するペプチドまたは蛋白質または前記ペプチドまたは蛋白質に少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似のペプチドまたは蛋白質の群、および／または図３４ａ）， ３４ｃ）， ３４ｅ）， ３４ｇ）， ３５ａ）， ３５ｃ）， ３５ｅ）， ３６ａ）， ３６ｃ）， ３７ａ）， ３７ｃ）， ３８ａ）， ３８ｃ）， ３９ａ）， ３９ｃ）， ３９ｅ）， ４０ａ）， ４０ｃ）， ４０ｅ）， ４１ａ）， ４１ｃ）， ４１ｅ）， ４２ａ）， ４２ｅ）， ４３ｃ）， ４３ｅ）， ４４ｅ）， ４５ａ）， ４５ｃ）， ４５ｅ）， 又は４６ｅ）に基づくポリヌクレオチドへのストリンジェントな条件下にまたは前記ポリヌクレオチドのアンチセンス  ポリヌクレオチドを結合する核酸によってコードされる蛋白質の群、および／または苦痛調節物質として同定可能である前記蛋白質類および／またはペプチド類の１つの少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、特に少なくとも２０個のアミノ酸長さの部分蛋白質の群、から選ばれる。
【００５４】
同様に特に選ばれた本発明による化合物の形態は、ペプチドまたは蛋白質のためにステップ（ａ）および（ｂ）において図１、３−８、１０、１１、１３、１４、１５、１７−２７または３１−３３、特に２０または２１の１つに基づく遺伝子フラグメントを包含するポリヌクレオチドからなる遺伝子がコードし、または前記遺伝子に少なくとも９０％、特に９５％、好ましくは９７％類似のポリヌクレオチドがコードする方法によって同定可能である形態である。
【００５５】
同様に、ペプチドまたは蛋白質のためにステップ（ａ）および（ｂ）において図２、９、１２、１６または２８−３０の１つに基づく遺伝子フラグメントを包含するポリヌクレオチドからなる遺伝子がコードし、または前記遺伝子に少なくとも９０％、特に９５％、好ましくは９７％類似のポリヌクレオチドが苦痛調節物質としてコードする方法によって同定可能である化合物が有利である。
【００５６】
もう１つの目的は、本発明によるペプチドまたは蛋白質に結合する作用物質でもあり、この作用物質が低分子作用物質である場合、特に有利である。
【００５７】
特に選ばれた作用物質の形態は、この作用物質が特に選ばれたペプチドまたは蛋白質の形態に結合する場合である。
【００５８】
本発明のもう１つの目的は、少なくとも１つの本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるペプチドまたは蛋白質、本発明によるベクター、本発明による抗体、本発明による細胞、本発明による化合物および／または本発明による作用物質ならびに必要がある場合は好適なアジュバントおよび／または添加物を含有する薬剤である。本発明による薬剤は、液体の剤形として注射液、滴剤またはジュースの形態で、半固形剤形として顆粒、錠剤、ペレット、パッチ、カプセル、プラスタまたはエーロゾルの形態で処理してよく、少なくとも１つの本発明による目的のほかにそれぞれガレーン式形態に応じて必要がある場合は推進剤、充填剤、溶剤、希釈剤、着色剤および／または結合剤を含有する。アジュバントの選択ならびにその使用量は、薬剤が口腔的、経口的、非経口的、腹膜内、皮内、筋内、鼻腔内、口内、直腸内または局部的に、たとえば皮膚感染、粘膜および眼に投与されるべきか否かに依存する。口腔的投与の場合は、錠剤、糖衣錠、カプセル、顆粒、滴剤、ジュースおよびシロップの形態が好適であり、経口的、局所的および吸入的投与の場合は、溶剤、乳剤、易組換え可能の乾燥調剤ならびにスプレーが好適である。溶解した形態でのデポー剤またはプラスタにおける本発明の目的は、必要がある場合は皮膚浸透薬剤を添加して、好適な経皮的投与製剤である。経口または経皮的に適用可能の剤形は、本発明による対象物を遅延して遊離してよい。患者に処方される作用物質量は、患者の体重、投与形態、症状および疾患の重度に依存して変化される。常法により少なくとも１つの本発明による対象物の２〜５００ｍｇ／ｋｇが投与される。薬剤が特に遺伝子治療に使用される場合は、好適なアジュバントまたは添加物として、たとえば生理食塩溶液、安定剤、プロテイナーゼ−、ＤＮＡｓｅ阻害剤が望ましい。
【００５９】
さらに、有利な剤形またはポリヌクレオチド（群）、ペプチドまたは蛋白質、ベクター、抗体、細胞化合物および／または作用物質の特に選ばれた剤形（群）を含有する薬剤が特に有利である。
【００６０】
その場合、薬剤が公知の蛋白質類、ＪＮＫ３、ＰＩＭ−２、ＬＲ−１１、ＴＦＩＩＦβ、ＧＧＴ−β、ＧＡＴＡ３、ＣＬＣ−７、カタラーゼ、テトラスパニン（ＴＭ４ＳＦ／ＴＳＰＡＮ−６／ＴＭ４−Ｄ）、カゼインキナーゼ１ａ、ＭＡＰ３Ｋ７／ＴＡＫ−１（ＴＧＦ−β活性キナーゼ）、ＢＡＢ１４１１２および／またはスペルミジンシンターゼの群と、ペプチドまたは蛋白質のために、またはその一部のために図３４ａ）， ３４ｃ）， ３４ｅ）， ３４ｇ）， ３５ａ）， ３５ｃ）， ３５ｅ）， ３６ａ）， ３６ｃ）， ３７ａ）， ３７ｃ）， ３８ａ）， ３８ｃ）， ３９ａ）， ３９ｃ）， ３９ｅ）， ４０ａ）， ４０ｃ）， ４０ｅ）， ４１ａ）， ４１ｃ）， ４１ｅ）， ４２ａ）， ４２ｅ）， ４３ｃ）， ４３ｅ）， ４４ｅ）， ４５ａ）， ４５ｃ）， ４５ｅ）， 又は ４６ｅ）
の１つに基づくポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドに少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似のポリヌクレオチドをコードする前記ペプチドまたは蛋白質の群、または図３４ｂ）， ３４ｄ）， ３４ｆ）， ３４ｈ）， ３５ｂ）， ３５ｄ）， ３５ｆ）， ３６ｂ）， ３６ｄ）， ３７ｂ）， ３７ｄ）， ３８ｂ）， ３８ｄ）， ３９ｂ）， ３９ｄ）， ４０ｂ）， ４０ｄ）， ４０ｆ）， ４１ｂ）， ４１ｄ）， ４１ｆ）， ４２ｂ）， ４２ｆ）， ４３ｄ）， ４３ｆ）， ４４ｆ）， ４５ｂ）， ４５ｄ）， ４５ｆ） 又は４６ｆ）の１つに基づくアミノ酸配列を有するペプチドまたは蛋白質または前記ペプチドまたは蛋白質に少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似のペプチドまたは蛋白質の群、および／または図３４ａ）， ３４ｃ）， ３４ｅ）， ３４ｇ）， ３５ａ）， ３５ｃ）， ３５ｅ）， ３６ａ）， ３６ｃ）， ３７ａ）， ３７ｃ）， ３８ａ）， ３８ｃ）， ３９ａ）， ３９ｃ）， ３９ｅ）， ４０ａ）， ４０ｃ）， ４０ｅ）， ４１ａ）， ４１ｃ）， ４１ｅ）， ４２ａ）， ４２ｅ）， ４３ｃ）， ４３ｅ）， ４４ｅ）， ４５ａ）， ４５ｃ）， ４５ｅ）， 又は４６ｅ）の１つに基づくポリヌクレオチドへのストリンジェントな条件下にまたは前記ポリヌクレオチドのアンチセンス  ポリヌクレオチドを結合する核酸によってコードされる蛋白質の群、および／または苦痛調節物質として同定可能である前記蛋白質類および／またはペプチド類の１つの少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、特に少なくとも２０個のアミノ酸長さの部分蛋白質の群、の使用下の方法による有利な本発明による化合物を含有する場合、特に有利としてよい。
【００６１】
薬剤が、ペプチドまたは蛋白質のためにステップ（ａ）および（ｂ）において図１、３−８、１０、１１、１３、１４、１５、１７−２７または３１−３３、特に２０または２１の１つに基づく遺伝子フラグメントを包含するポリヌクレオチドからなる遺伝子がコードし、または前記遺伝子に少なくとも９０％、特に９５％、好ましくは９７％類似のポリヌクレオチド、または特に選ばれたペプチドまたは蛋白質の形態に結合する作用物質を含有する方法によって同定可能である化合物を含有する場合も有利である。
【００６２】
本発明のもう１つの目的は、少なくとも１つの本発明によるポリヌクレオチド、ペプチドまたは蛋白質、ベクター、抗体またはその部分および／または本発明による細胞ならびに必要がある場合好適な添加物を含有する診断剤である。その場合、「診断剤」とは、たとえば疾患現象の診断のための補助剤である。
【００６３】
特に有利なのは、ポリヌクレオチド、ペプチドまたは蛋白質またはその部分、ベクター、抗体および／または細胞の特に選ばれた形態を含有する診断剤である。
【００６４】
特異的に本発明によるポリヌクレオチドに結合することができる配列を有するアンチセンス、ポリヌクレオチドまたはＰＮＡである有利なポリヌクレオチドを含有する診断剤の形態も有利である。
【００６５】
本発明のもう１つの目的は、苦痛治療のための薬剤の製造のため、本発明によるポリヌクレオチド、ペプチドまたは蛋白質、ベクター、抗体、細胞、化合物、作用物質の使用および／または
−ＪＮＫ３、ＰＩＭ−２、ＬＲ−１１、ＴＦＩＩＦβ、ＧＧＴ−β、ＧＡＴＡ３、ＣＬＣ−７、カタラーゼ、テトラスパニン（ＴＭ４ＳＦ／ＴＳＰＡＮ−６／ＴＭ４−Ｄ）、カゼインキナーゼ１ａ、ＭＡＰ３Ｋ７／ＴＡＫ−１（ＴＧＦ−β活性キナーゼ）、ＢＡＢ１４１１２および／またはスペルミジンシンターゼの群、
−ペプチドまたは蛋白質のために、またはその一部のために図３４ａ）， ３４ｃ）， ３４ｅ）， ３４ｇ）， ３５ａ）， ３５ｃ）， ３５ｅ）， ３６ａ）， ３６ｃ）， ３７ａ）， ３７ｃ）， ３８ａ）， ３８ｃ）， ３９ａ）， ３９ｃ）， ３９ｅ）， ４０ａ）， ４０ｃ）， ４０ｅ）， ４１ａ）， ４１ｃ）， ４１ｅ）， ４２ａ）， ４２ｅ）， ４３ｃ）， ４３ｅ）， ４４ｅ）， ４５ａ）， ４５ｃ）， ４５ｅ）， 又は ４６ｅ）の１つに基づくポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドに少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似のポリヌクレオチドをコードする前記ペプチドまたは蛋白質の群、
または
−図３４ｂ）， ３４ｄ）， ３４ｆ）， ３４ｈ）， ３５ｂ）， ３５ｄ）， ３５ｆ）， ３６ｂ）， ３６ｄ）， ３７ｂ）， ３７ｄ）， ３８ｂ）， ３８ｄ）， ３９ｂ）， ３９ｄ）， ４０ｂ）， ４０ｄ）， ４０ｆ）， ４１ｂ）， ４１ｄ）， ４１ｆ）， ４２ｂ）， ４２ｆ）， ４３ｄ）， ４３ｆ）， ４４ｆ）， ４５ｂ）， ４５ｄ）， ４５ｆ） 又は４６ｆ）の１つに基づくアミノ酸配列を有するペプチドまたは蛋白質または前記ペプチドまたは蛋白質に少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似のペプチドまたは蛋白質の群、
−および／または図３４ａ）， ３４ｃ）， ３４ｅ）， ３４ｇ）， ３５ａ）， ３５ｃ）， ３５ｅ）， ３６ａ）， ３６ｃ）， ３７ａ）， ３７ｃ）， ３８ａ）， ３８ｃ）， ３９ａ）， ３９ｃ）， ３９ｅ）， ４０ａ）， ４０ｃ）， ４０ｅ）， ４１ａ）， ４１ｃ）， ４１ｅ）， ４２ａ）， ４２ｅ）， ４３ｃ）， ４３ｅ）， ４４ｅ）， ４５ａ）， ４５ｃ）， ４５ｅ）， 又は ４６ｅ）の１つに基づくポリヌクレオチドへのストリンジェントな条件下にまたは前記ポリヌクレオチドのアンチセンス  ポリヌクレオチドを結合する核酸によってコードされる蛋白質の群、および／または
−前記蛋白質類および／またはペプチド類の１つの少なくとも１０個、好ましくは１５個、特に２０個のアミノ酸長さの部分蛋白質の群、から選択されたペプチドまたは蛋白質に結合する作用物質の使用である。
【００６６】
特に有利なのは、慢性痛の治療のための使用である。
【００６７】
有利には、苦痛治療のために、特に選ばれたポリヌクレオチド、ペプチドまたは蛋白質、ベクター、抗体、細胞、化合物、作用物質の使用および／または
−ＪＮＫ３、ＰＩＭ−２、ＬＲ−１１、ＴＦＩＩＦβ、ＧＧＴ−β、ＧＡＴＡ３、ＣＬＣ−７、カタラーゼ、テトラスパニン（ＴＭ４ＳＦ／ＴＳＰＡＮ−６／ＴＭ４−Ｄ）、カゼインキナーゼ１ａ、ＭＡＰ３Ｋ７／ＴＡＫ−１（ＴＧＦ−β活性キナーゼ）、ＢＡＢ１４１１２および／またはスペルミジンシンターゼの群、
−ペプチドまたは蛋白質のために、またはその一部のために図３４ａ）， ３４ｃ）， ３４ｅ）， ３４ｇ）， ３５ａ）， ３５ｃ）， ３５ｅ）， ３６ａ）， ３６ｃ）， ３７ａ）， ３７ｃ）， ３８ａ）， ３８ｃ）， ３９ａ）， ３９ｃ）， ３９ｅ）， ４０ａ）， ４０ｃ）， ４０ｅ）， ４１ａ）， ４１ｃ）， ４１ｅ）， ４２ａ）， ４２ｅ）， ４３ｃ）， ４３ｅ）， ４４ｅ）， ４５ａ）， ４５ｃ）， ４５ｅ）， 又は４６ｅ）の１つに基づくポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドに少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似のポリヌクレオチドをコードする前記ペプチドまたは蛋白質の群、
または
−図３４ｂ）， ３４ｄ）， ３４ｆ）， ３４ｈ）， ３５ｂ）， ３５ｄ）， ３５ｆ）， ３６ｂ）， ３６ｄ）， ３７ｂ）， ３７ｄ）， ３８ｂ）， ３８ｄ）， ３９ｂ）， ３９ｄ）， ４０ｂ）， ４０ｄ）， ４０ｆ）， ４１ｂ）， ４１ｄ）， ４１ｆ）， ４２ｂ）， ４２ｆ）， ４３ｄ）， ４３ｆ）， ４４ｆ）， ４５ｂ）， ４５ｄ）， ４５ｆ） 又は４６ｆ）の１つに基づくアミノ酸配列を有するペプチドまたは蛋白質または前記ペプチドまたは蛋白質に少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似のペプチドまたは蛋白質の群、から選ばれたペプチドまたは蛋白質に結合する作用物質の形態の使用である。
【００６８】
もう１つの非常に有利な苦痛治療のための使用は、第１の特に選ばれた化合物の形態および／または
−ＪＮＫ３、ＰＩＭ−２、ＬＲ−１１、ＴＦＩＩＦβ、ＧＧＴ−β、ＧＡＴＡ３、ＣＬＣ−７、カタラーゼ、テトラスパニン（ＴＭ４ＳＦ／ＴＳＰＡＮ−６／ＴＭ４−Ｄ）、カゼインキナーゼ１ａ、ＭＡＰ３Ｋ７／ＴＡＫ−１（ＴＧＦ−β活性キナーゼ）、ＢＡＢ１４１１２および／またはスペルミジンシンターゼの群、
−ペプチドまたは蛋白質のために、またはその一部のために図３４ａ）， ３４ｃ）， ３４ｅ）， ３４ｇ）， ３５ａ）， ３５ｃ）， ３５ｅ）， ３６ａ）， ３６ｃ）， ３７ａ）， ３７ｃ）， ３８ａ）， ３８ｃ）， ３９ａ）， ３９ｃ）， ３９ｅ）， ４０ａ）， ４０ｃ）， ４０ｅ）， ４１ａ）， ４１ｃ）， ４１ｅ）， ４２ａ）， ４２ｅ）， ４３ｃ）， ４３ｅ）， ４４ｅ）， ４５ａ）， ４５ｃ）， ４５ｅ）， 又は４６ｅ）の１つに基づくポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドに少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似のポリヌクレオチドをコードする前記ペプチドまたは蛋白質の群、
または
−図３４ｂ）， ３４ｄ）， ３４ｆ）， ３４ｈ）， ３５ｂ）， ３５ｄ）， ３５ｆ）， ３６ｂ）， ３６ｄ）， ３７ｂ）， ３７ｄ）， ３８ｂ）， ３８ｄ）， ３９ｂ）， ３９ｄ）， ４０ｂ）， ４０ｄ）， ４０ｆ）， ４１ｂ）， ４１ｄ）， ４１ｆ）， ４２ｂ）， ４２ｆ）， ４３ｄ）， ４３ｆ）， ４４ｆ）， ４５ｂ）， ４５ｄ）， ４５ｆ） 又は４６ｆ）の１つに基づくアミノ酸配列を有するペプチドまたは蛋白質または前記ペプチドまたは蛋白質に少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似のペプチドまたは蛋白質の群、から選ばれたペプチドまたは蛋白質に結合する作用物質に関する。
【００６９】
もう１つの非常に有利な苦痛治療の使用は、第２の特に選ばれた化合物の形態および／または特に選ばれた作用物質の形態に関する。
【００７０】
本発明によるポリヌクレオチド、ペプチドまたは蛋白質、ベクター、抗体および／または細胞の遺伝子治療のための使用。その場合、インビボまたはインビトロ遺伝子治療である場合に特に有利である。「遺伝子治療」とは、核酸から細胞内への導入によってエフェクター遺伝子、多くは蛋白質が発現される治療形態である。原理的にインビボ法とインビトロ法が区別される。インビトロ法は細胞が有機体から除去され、エクスビボでベクターと共に移入され、それに続き同じまたは別の有機体の中に取り込まれる。インビボ遺伝子治療ではベクターが、たとえば腫瘍の予防のために、全身性（たとえば血管を経由）にまたは直接腫瘍の中に投与される。
【００７１】
特に有利なのは、この製造方法によって規定されたポリヌクレオチド、特にその特に選ばれた形態、第２の特に選ばれたポリヌクレオチドの形態が使用される場合の前記使用である。
【００７２】
同様に遺伝子治療における使用で有利なのは、第１の特に選ばれたポリヌクレオチドの形態の使用である。
【００７３】
遺伝子治療における使用で有利なのは、特異的に本発明によるポリヌクレオチドに結合することができる配列を有するアンチセンス  ポリヌクレオチドまたはＰＮＡであるポリヌクレオチドの使用、またはリボザイムまたはその他のＤＮＡ酵素または触媒ＲＮＡまたはＤＮＡの部分である。
【００７４】
本発明のもう１つの目的は、本発明によるポリヌクレオチド、ペプチドまたは蛋白質、ベクター、抗体細胞、化合物および／または作用物質の、診断および／または効能調査のための使用である。その場合「診断」とはある疾患像に帰属する症状の分析であり、「効能調査」とは被験物質の効能、特にその医療的効能に関する調査である。
【００７５】
本発明のもう１つの目的は、別のスクリーニング方法、すなわち
（ａ）製造方法によって規定されたポリヌクレオチド、好ましくは第２の特に選ばれたポリヌクレオチドの形態、または前記ポリヌクレオチドに少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似のポリヌクレオチドがコードするペプチドまたは蛋白質を合成したような細胞からなる細胞および／または製剤による好適な条件下での被験物質のインキュベーションの方法ステップと、
（ｂ）細胞から合成されたペプチドまたは蛋白質への試験物質の結合の測定またはペプチドまたは蛋白質への試験物質の結合によって変化した少なくとも１つの機能媒介変数の測定の方法ステップとを有する、苦痛調節物質の発見のための方法である。
【００７６】
細胞がステップ（ａ）の前に遺伝子技術的に操作されることが有利である。その場合、遺伝子技術的な操作が試験物質によって変化した機能媒介変数の少なくとも１つの測定を可能にする場合、特に有利である。同様に、細胞が少なくとも１つの製造方法によって規定されたポリヌクレオチド、好ましくは第２の特に有利なポリヌクレオチドの形態、または前記ポリヌクレオチドに少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に９７％類似のポリヌクレオチドを含有するように、前記細胞が遺伝子技術的に操作される場合、特に有利である。
【００７７】
さらに有利なこの方法の実施形態は、細胞が遺伝子技術的操作後およびステップ（ａ）の前に発現を可能にする条件下に、必要がある場合は選択圧下に培養される場合である。
【００７８】
本発明のもう１つの目的は、本発明によるポリヌクレオチドおよび／または本発明によるベクターを含有する本発明による細胞３３−３５が培養され、必要がある場合はペプチドまたは蛋白質が単離される本発明によるペプチドまたは蛋白質の製造方法である。
【００７９】
本発明のもう１つの目的は、苦痛調節物質の発見のための方法において、
−ＪＮＫ３、ＰＩＭ−２、ＬＲ−１１、ＴＦＩＩＦβ、ＧＧＴ−β、ＧＡＴＡ３、ＣＬＣ−７、カタラーゼ、テトラスパニン（ＴＭ４ＳＦ／ＴＳＰＡＮ−６／ＴＭ４−Ｄ）、カゼインキナーゼ１ａ、ＭＡＰ３Ｋ７／ＴＡＫ−１（ＴＧＦ−β活性キナーゼ）、ＢＡＢ１４１１２および／またはスペルミジンシンターゼの群、
−ペプチドまたは蛋白質のために、またはその一部のために図３４ａ）， ３４ｃ）， ３４ｅ）， ３４ｇ）， ３５ａ）， ３５ｃ）， ３５ｅ）， ３６ａ）， ３６ｃ）， ３７ａ）， ３７ｃ）， ３８ａ）， ３８ｃ）， ３９ａ）， ３９ｃ）， ３９ｅ）， ４０ａ）， ４０ｃ）， ４０ｅ）， ４１ａ）， ４１ｃ）， ４１ｅ）， ４２ａ）， ４２ｅ）， ４３ｃ）， ４３ｅ）， ４４ｅ）， ４５ａ）， ４５ｃ）， ４５ｅ）， 又は４６ｅ）の１つに基づくポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドに少なくとも９０％類似のポリヌクレオチドをコードする前記ペプチドまたは蛋白質の群、
−図３４ｂ）， ３４ｄ）， ３４ｆ）， ３４ｈ）， ３５ｂ）， ３５ｄ）， ３５ｆ）， ３６ｂ）， ３６ｄ）， ３７ｂ）， ３７ｄ）， ３８ｂ）， ３８ｄ）， ３９ｂ）， ３９ｄ）， ４０ｂ）， ４０ｄ）， ４０ｆ）， ４１ｂ）， ４１ｄ）， ４１ｆ）， ４２ｂ）， ４２ｆ）， ４３ｄ）， ４３ｆ）， ４４ｆ）， ４５ｂ）， ４５ｄ）， ４５ｆ） 又は４６ｆ）の１つに基づくアミノ酸配列を有するペプチドまたは蛋白質または前記ペプチドまたは蛋白質に少なくとも９０％類似のペプチドまたは蛋白質の群、
−および／または図３４ａ）， ３４ｃ）， ３４ｅ）， ３４ｇ）， ３５ａ）， ３５ｃ）， ３５ｅ）， ３６ａ）， ３６ｃ）， ３７ａ）， ３７ｃ）， ３８ａ）， ３８ｃ）， ３９ａ）， ３９ｃ）， ３９ｅ）， ４０ａ）， ４０ｃ）， ４０ｅ）， ４１ａ）， ４１ｃ）， ４１ｅ）， ４２ａ）， ４２ｅ）， ４３ｃ）， ４３ｅ）， ４４ｅ）， ４５ａ）， ４５ｃ）， ４５ｅ）， 又は４６ｅ）の１つに基づくポリヌクレオチドへのストリンジェントな条件下にまたは前記ポリヌクレオチドのアンチセンス  ポリヌクレオチドを結合する核酸によってコードされる蛋白質の群、
−前記蛋白質類および／またはペプチド類の１つの少なくとも１０個のアミノ酸長さの部分蛋白質の群、および／または
−ペプチドまたは蛋白質のために、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が図１−３３に示した配列の１つに基づく遺伝子フラグメントを包含する前記ポリヌクレオチドからなる遺伝子がコードし、または前記ペプチドまたは蛋白質のためにこのような遺伝子に少なくとも９０％類似のポリヌクレオチドがコードする前記ペプチドまたは蛋白質の群から選ばれた、ペプチドまたは蛋白質の使用である。
【００８０】
本発明のもう１つの目的は、図３５ｅ）に示したヌクレオチド配列が少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に少なくとも９７％、または正確に相当するポリヌクレオチドである。
【００８１】
本発明のもう１つの目的は、図３５ｆ）に示したアミノ酸配列が少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に少なくとも９７％、または正確に相当する蛋白質である。
【００８２】
本発明のもう１つの目的は、
−ＪＮＫ３、ＰＩＭ−２、ＬＲ−１１、ＴＦＩＩＦβ、ＧＧＴ−β、ＧＡＴＡ３、ＣＬＣ−７、カタラーゼ、テトラスパニン（ＴＭ４ＳＦ／ＴＳＰＡＮ−６／ＴＭ４−Ｄ）、カゼインキナーゼ１ａ、ＭＡＰ３Ｋ７／ＴＡＫ−１（ＴＧＦ−β活性キナーゼ）、ＢＡＢ１４１１２および／またはスペルミジンシンターゼの群と、
−ペプチドまたは蛋白質のために、またはその一部のために図３４ａ）， ３４ｃ）， ３４ｅ）， ３４ｇ）， ３５ａ）， ３５ｃ）， ３５ｅ）， ３６ａ）， ３６ｃ）， ３７ａ）， ３７ｃ）， ３８ａ）， ３８ｃ）， ３９ａ）， ３９ｃ）， ３９ｅ）， ４０ａ）， ４０ｃ）， ４０ｅ）， ４１ａ）， ４１ｃ）， ４１ｅ）， ４２ａ）， ４２ｅ）， ４３ｃ）， ４３ｅ）， ４４ｅ）， ４５ａ）， ４５ｃ）， ４５ｅ）， 又は４６ｅ）の１つに基づくポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドに少なくとも９０％類似のポリヌクレオチドをコードする前記ペプチドまたは蛋白質の群、
−図３４ｂ）， ３４ｄ）， ３４ｆ）， ３４ｈ）， ３５ｂ）， ３５ｄ）， ３５ｆ）， ３６ｂ）， ３６ｄ）， ３７ｂ）， ３７ｄ）， ３８ｂ）， ３８ｄ）， ３９ｂ）， ３９ｄ）， ４０ｂ）， ４０ｄ）， ４０ｆ）， ４１ｂ）， ４１ｄ）， ４１ｆ）， ４２ｂ）， ４２ｆ）， ４３ｄ）， ４３ｆ）， ４４ｆ）， ４５ｂ）， ４５ｄ）， ４５ｆ） 又は４６ｆ）の１つに基づくアミノ酸配列を有するペプチドまたは蛋白質または前記ペプチドまたは蛋白質に少なくとも９０％類似のペプチドまたは蛋白質の群、
−および／または図３４ａ）， ３４ｃ）， ３４ｅ）， ３４ｇ）， ３５ａ）， ３５ｃ）， ３５ｅ）， ３６ａ）， ３６ｃ）， ３７ａ）， ３７ｃ）， ３８ａ）， ３８ｃ）， ３９ａ）， ３９ｃ）， ３９ｅ）， ４０ａ）， ４０ｃ）， ４０ｅ）， ４１ａ）， ４１ｃ）， ４１ｅ）， ４２ａ）， ４２ｅ）， ４３ｃ）， ４３ｅ）， ４４ｅ）， ４５ａ）， ４５ｃ）， ４５ｅ）， 又は４６ｅ）の１つに基づくポリヌクレオチドへのストリンジェントな条件下にまたは前記ポリヌクレオチドのアンチセンス  ポリヌクレオチドを結合する核酸によってコードされる蛋白質の群、
−前記蛋白質類および／またはペプチド類の１つの少なくとも１０個のアミノ酸長さの部分蛋白質の群、
および／または
−ペプチドまたは蛋白質のために、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が図１−３３に示した配列の１つに基づく遺伝子フラグメントを包含する前記ポリヌクレオチドからなる遺伝子がコードする、またはこのような遺伝子に少なくとも９０％類似のポリヌクレオチドがコードするペプチドまたは蛋白質の群から選ばれた蛋白質またはペプチドに結合する物質の投与による、苦痛治療、特に慢性痛の治療を必要とする、非ヒト哺乳動物またはヒトの治療、特に苦痛治療のための方法である。
【００８３】
投与は、たとえば上記のような薬剤の形態で行ってよい。
【００８４】
本発明のもう１つの目的は、本発明による薬剤の投与、特に本発明による物質および／または本発明による作用物質を含有するような薬剤の投与による、苦痛治療、特に慢性苦痛治療を必要とする非ヒト哺乳動物またはヒトの治療、特に苦痛治療のための方法である。
【００８５】
全体的に本発明の重要な基礎は、苦痛調節の遺伝子と遺伝子フラグメントの同定である。スクリーニング方法は前記基礎に基づいている。しかしまた診断または治療のための使用が上記のように提供される。以下、対応する適用可能性とその他の実施例とを説明する。
１．慢性痛の治療
この配列は脊髄組織から単離した。脊髄の中に一次センサ−ニューロンが後接続された中枢神経系ニューロン上に投影され、これは棘上過程のほかに侵害受容情報である。多数の実験が、慢性痛状態の発展が神経系の形成変形に基づくことを示すことができた（概要としてＣｏｄｅｒｒｅら、１９９３；ＺｉｍｍｅｒｍａｎｎおよびＨｅｒｄｅｇｅｎ、１９９６参照）。特に脊椎の根神経節と脊髄のニューロンにおいて、苦痛に重要な遺伝子の調節を取り上げた形成変形が記載されている。つまり苦痛治療に重要である一連の神経伝達物質受容体について、脊髄中の遺伝子調節が記載されている（表１参照）。この基礎に基づき、発見された苦痛のもとに調節したｃＤＮＡ配列を慢性痛状態の治療（遺伝子治療、アンチセンス、リボザイム）および診断に使用できよう。
１．１  アンチセンス戦略
この場合、完全なｃＤＮＡの核酸配列または部分領域から誘導されて、ｍＲＮＡまたは蛋白質濃度を低減できるカセットが作成される。これは、場合により修飾ヌクレオチド構成要素（たとえばＯ−アリル−リボース）の使用下にヌクレアーゼに対して増加した安定性を有する、たとえばアンチセンス−オリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）としてよい。特に酵素活性度ＲＮＡ分子としてＲＮＡの特異的分裂を触媒するリボザイムの使用が想到可能である。そのほかにこのヌクレアーゼ配列の本発明による配列または部分領域を好適なプロモータの制御下に発現し、それによってインビボまたはエクスビボ治療に好適であるベクターを使用してもよい。さらに、ヌクレアーゼ配列（たとえばＰＮＡｓ、すなわちＰｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）のホスフェート脊柱の交換下にまたはイノシン、ケオシンのようなまたはアセチル−、メチル−、チオ−、および類似に修飾された、アデニン、シチジン、グアノシンｕ、チミジンおよびウリジンのようなウィブトシンのような非慣習的塩基の使用下に内生的ヌクレアーゼによって分解できない、または少量分解できるアンチセンス−カセットも可能である。
１．２  本発明によるヌクレオチド配列によってコードした遺伝子生成物のアンタゴニスト／アゴニストもしくはインヒビター／アクチベータ
これは遺伝子生成物への結合によってその機能を変化させる物質を包含する。これには次のようなものがある：
１．２．１  作用物質スクリーニングの枠内で本発明によるｃＤＮＡの遺伝子生成物の使用下に結合パートナーとして見い出される有機化学物質。
１．２．２  ポリクロナール、キメラ、単鎖、Ｆａｂフラグメントであれ、またはファージ−バンクからなるフラグメントであれ、遺伝子生成物への結合を介して有利に中性抗体として特異的に機能に影響を及ぼす抗体。
１．２．３  アプタマー、すなわち蛋白質に結合する性質を有する核酸または核酸誘導体。それには鏡像対象進化によって得られた鏡像対称と共に、高親和性および高特異的に標的分子を結合できる安定したオリゴヌクレオチドを表す、いわゆる鏡像異性体も含まれる（Ｋｌｕｓｍａｎら、１９９６）。
１．３  遺伝子治療
記載した配列は、そこでたとえば内生的な遺伝性の過剰発現または過小発現を逆制御し、欠失遺伝子生成物の配列を修正し（たとえば外因性カセットによるトランススプライシング）または機能遺伝子生成物を提供するために、前記配列が好適なベクター（たとえばアデノウィルス−ベクターまたはアデノ関連ウィルス−ベクター）へのクローニング後にインビボまたはエクスビボ治療に使用することによって、神経系の疾患、特に慢性痛状態の治療に使用することができる。
２．診断
本発明によるヌクレオチド配列から誘導されたポリヌクレオチド配列（オリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ＆ＲＮＡ分子、ＰＮＡｓ）は、これらの遺伝子配列の発現と関係する状態または疾患の診断に使用することができる。この状態または疾患の例は、慢性痛を含む神経系または神経苦痛（たとえば糖尿病、癌またはエイズによって惹起される）疾患またはアルツハイマー病、パーキンソン病、コレアハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、筋萎縮性側索硬化症および老年痴呆のような神経退行性疾患を含む。ヌクレオチド配列は、多様な方法（ノーザンブロット、サザーンブロット、ＦＩＳＡ解析、ＰＲＩＮＳ解析、ＰＣＲ）で遺伝子生成物の同定または変動する診断的に重要な遺伝性または遺伝性の定量化のいずれかに利用することができる。拡散診断法のほかに、蛋白質または変位する形態を同定し、蛋白質を定量化するために、本発明による核酸によってコードした蛋白質に対する抗体またはアプタマーを診断に使用することができる（たとえばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫細胞化学または免疫細胞化学法を利用）。
【００８６】
遺伝子診断に関しては、遺伝子座の同定のために本発明によるヌクレオチド配列によって誘導した核酸プローブを使用することができる（たとえばＦＩＳＨ、ＦＡＣＳ、ＹＡＣｓ、ＢＡＣｓまたはＰ１カセットのような人工染色体）。
【００８７】
以下の例および図は本発明を説明するものであるが、本発明を何ら制限するものではない。
【００８８】
図および例
図：
図１  遺伝子フラグメント１１１＿１６［ａ）ＤＤＲＴ−ＰＣＲからの初めに配列決定された遺伝子フラグメント、ｂ）第１伸長遺伝子フラグメントに対応、ｃ）第２伸長遺伝子フラグメントに対応］
図２  遺伝子フラグメント１１１＿３３［ａ）ＤＤＲＴ−ＰＣＲからの初めに配列決定された遺伝子フラグメント、ｂ）新規の遺伝子フラグメントに対応］
図３  遺伝子フラグメント１１１＿３９
図４  遺伝子フラグメント１１１＿４５［ａ）ＤＤＲＴ−ＰＣＲからの初めに配列決定された遺伝子フラグメント、ｂ）伸長遺伝子フラグメントに対応］
図５  遺伝子フラグメント１１３＿１５の部分
図６  遺伝子フラグメント１１３＿１５の部分
図７  遺伝子フラグメント１１３＿１５の部分［ａ）ＤＤＲＴ−ＰＣＲからの初めに配列決定された遺伝子フラグメント、ｂ）伸長遺伝子フラグメントに対応］
図８  遺伝子フラグメント１１３＿２０
図９  遺伝子フラグメント１２４＿２９［ａ）ＤＤＲＴ−ＰＣＲからの初めに配列決定された遺伝子フラグメント、ｂ）伸長遺伝子フラグメントに対応］
図１０  遺伝子フラグメント１２４＿４
図１１  遺伝子フラグメント１２７＿３
図１２  遺伝子フラグメント１２７＿３４［ａ）ＤＤＲＴ−ＰＣＲからの初めに配列決定された遺伝子フラグメント、ｂ）第１伸長遺伝子フラグメントに対応、ｃ）第２伸長遺伝子フラグメントに対応］
図１３  遺伝子フラグメント１２７＿８［ａ）ＤＤＲＴ−ＰＣＲからの初めに配列決定された遺伝子フラグメント、ｂ）より包括的的なヒトのヌクレオチド配列（ＲＵＰ）に対応、ｃ）マウスのヌクレオチド配列の上流部分に対応、ｄ）マウスのヌクレオチド配列の下流部分に対応、ｅ）ラットのヌクレオチド配列の上流部分に対応、ｆ）ラットのヌクレオチド配列の下流部分に対応］
図１４  遺伝子フラグメント１３５＿１８
図１５  遺伝子フラグメント１３５＿２
図１６  遺伝子フラグメント１３５＿７
図１７  遺伝子フラグメント１３５＿９の部分［ａ）ＤＤＲＴ−ＰＣＲからの初めに配列決定された遺伝子フラグメント、ｂ）伸長遺伝子フラグメントに対応］
図１８  遺伝子フラグメント１３５＿９の部分［ａ）ＤＤＲＴ−ＰＣＲからの初めに配列決定された遺伝子フラグメント、ｂ）伸長遺伝子フラグメントに対応］
図１９  遺伝子フラグメント１４１＿１
図２０  遺伝子フラグメント１４１＿１３の部分［ａ）ＤＤＲＴ−ＰＣＲからの初めに配列決定された遺伝子フラグメント、ｂ）より包括的的なヒトのヌクレオチド配列に対応（ＡＢＬＩＭおよびＫＩＡＡ０８４３と近親）、ｃ）マウスのヌクレオチド配列に対応、ｄ）ラットのヌクレオチド配列に対応］
図２１  遺伝子フラグメント１４１＿１３の部分［ａ）ＤＤＲＴ−ＰＣＲからの初めに配列決定された遺伝子フラグメント、ｂ）伸長遺伝子フラグメントに対応］
図２２  遺伝子フラグメント１４１＿２４［ａ）ＤＤＲＴ−ＰＣＲからの初めに配列決定された遺伝子フラグメント、ｂ）伸長遺伝子フラグメントに対応］
図２３  遺伝子フラグメント１４１＿６
図２４  遺伝子フラグメント１４６＿１０
図２５  遺伝子フラグメント１５４＿２６
図２６  遺伝子フラグメント１５４＿２９
図２７  遺伝子フラグメント１６４＿１２
図２８  遺伝子フラグメント１６４＿２４の部分
図２９  遺伝子フラグメント１６４＿２４の部分
図３０  遺伝子フラグメント１６４＿２４の部分
図３１  遺伝子フラグメント１８０＿１２
図３２  遺伝子フラグメント１８０＿８
図３３  遺伝子フラグメント８９＿２８
図３４ａ）  ＪＮＫ３のｃＤＮＡ配列、ヒト、α１−亜種；ＡＮ：Ｕ３４８２０
図３４ｂ）  ＪＮＫ３のアミノ酸配列、ヒト、α１−亜種；ＡＮ：Ｕ３４８２０
図３４ｃ）  ＪＮＫ３のｃＤＮＡ配列、ヒト、α２−亜種；ＡＮ：Ｕ３４８１９
図３４ｄ）  ＪＮＫ３のアミノ酸配列、ヒト、α１−亜種；ＡＮ：Ｕ３４８１９
図３４ｅ）  ＪＮＫ３のｃＤＮＡ配列、マウス；ＡＮ：ＡＢ００５６６５
図３４ｆ）  ＪＮＫ３のアミノ酸配列、マウス；ＡＮ：ＡＢ００５６６５
図３４ｇ）  ＪＮＫ３のｃＤＮＡ配列、ラット；ＡＮ：ＨＭ＿０１２８０６
図３４ｈ）  ＪＮＫ３のアミノ酸配列、ラット；ＡＮ：ＨＭ＿０１２８０６
図３５ａ）  ＰＩＭ−２のｃＤＮＡ配列、ヒト；自己クローニング
図３５ｂ）  ＰＩＭ−２のアミノ酸配列、ヒト；自己クローニング
図３５ｃ）  ＰＩＭ−２のｃＤＮＡ配列、マウス；ＡＮ：Ｌ４１４９５
図３５ｄ）  ＰＩＭ−２のアミノ酸配列、マウス；ＡＮ：Ｌ４１４９５
異なる蛋白質長さ：
１．）４０ｋＤａ
２．）３７ｋＤａ
３．）３４ｋＤａ
図３５ｅ）  ＰＩＭ−２のｃＤＮＡ配列、ラット；自己クローニング
図３５ｆ）  ＰＩＭ−２のアミノ酸配列、ラット；自己クローニング
図３５ｇ）  ３５ｂ）に示したＰＩＭ−２配列の蛋白質配列と、遺伝子データベースに記録されたヒトＰＩＭ−２配列ＮＭ＿００６８７５の蛋白質配列との比較
図３６ａ）  ＬＲ１１のｃＤＮＡ配列、マウス；ＡＮ：ＡＢ０１５７９０
図３６ｂ）  ＬＲ１１のアミノ酸配列、マウス；ＡＮ：ＡＢ０１５７９０
図３６ｃ）  ＬＲ１１のｃＤＮＡ配列、ヒト；ＡＮ：Ｙ０８１１０
図３６ｄ）  ＬＲ１１のアミノ酸配列、ヒト；ＡＮ：Ｙ０８１１０
図３７ａ）  ＴＦＩＩＦβのｃＤＮＡ配列、ラット；ＡＮ：Ｄ１０６６５
図３７ｂ）  ＴＦＩＩＦβのアミノ酸配列、ラット；ＡＮ：Ｄ１０６６５
図３７ｃ）  ＴＦＩＩＦβのｃＤＮＡ配列、ヒト；ＡＮ：Ｘ５９７４５
図３７ｄ）  ＴＦＩＩＦβのアミノ酸配列、ヒト；ＡＮ：Ｘ５９７４５
図３８ａ）  ＧＧＴのｃＤＮＡ配列、ラット；ＡＮ：Ｌ２４１１６
図３８ｂ）  ＧＧＴのアミノ酸配列、ラット；ＡＮ：Ｌ２４１１６
図３８ｃ）  ＧＧＴのｃＤＮＡ配列、ヒト；ＡＮ：Ｌ２５４４１
図３８ｄ）  ＧＧＴのアミノ酸配列、ヒト；ＡＮ：Ｌ２５４１１
図３９ａ）  ＧＡＴＡ３のｃＤＮＡ配列、マウス；ＡＮ：ＮＭ＿００８０９１
図３９ｂ）  ＧＡＴＡ３のアミノ酸配列、マウス；ＡＮ：ＮＭ＿００８０９１
図３９ｃ）  ＧＡＴＡ３のｃＤＮＡ配列、ヒト；ＡＮ：ＮＭ＿００２０５１
図３９ｄ）  ＧＡＴＡ３のアミノ酸配列、ヒト；ＡＮ：ＮＭ＿００２０５１
図３９ｅ）  ＧＡＴＡ３の部分ｃＤＮＡ配列、ラット；ＡＮ：ＡＢ０００２１７
図４０ａ）  ＣＣＬ−７のｃＤＮＡ配列、ヒト；ＡＮ：ＡＦ２２４７４１
図４０ｂ）  ＣＣＬ−７のアミノ酸配列、ヒト；ＡＮ：ＡＦ２２４７４１
図４０ｃ）  ＣＣＬ−７のｃＤＮＡ配列、ラット；ＡＮ：Ｚ６７７４４
図４０ｄ）  ＣＣＬ−７のアミノ酸配列、ラット；ＡＮ：Ｚ６７７４４
図４０ｅ）  ＣＣＬ−７のゲノムＤＮＡ配列、マウス；ＡＮ：ＡＨ０６３１０１
図４０ｆ）  ＣＣＬ−７のアミノ酸配列、マウス；ＡＮ：ＡＨ０６３１０１
図４１ａ）  カタラーゼのｃＤＮＡ配列、ラット；ＡＮ：ＮＭ＿０１２５２０
図４１ｂ）  カタラーゼのアミノ酸配列、ラット；ＡＮ：ＮＭ＿０１２５２０
図４１ｃ）  カタラーゼのｃＤＮＡ配列、マウス；ＡＮ：ＮＭ＿００９８０４
図４１ｄ）  カタラーゼのアミノ酸配列、マウス；ＡＮ：ＮＭ＿００９８０４
図４１ｅ）  カタラーゼのｃＤＮＡ配列、ヒト；ＡＮ：ＮＭ＿００１７５２
図４１ｆ）  カタラーゼのアミノ酸配列、ヒト；ＡＮ：ＮＭ＿００１７５２
図４２ａ）  カゼインキナーゼ１ａのｃＤＮＡ配列、ラット；ＡＮ：Ｕ７７５８２
図４２ｂ）  カゼインキナーゼ１αのアミノ酸配列、ラット；ＡＮ：ＡＡＢ１９２２７
図４２ｅ）  カゼインキナーゼ１αのｃＤＮＡ配列、ヒト；ＡＮ：ＮＭ＿００１８９２
図４２ｆ）  カゼインキナーゼ１αのアミノ酸配列、ヒト；ＡＮ：ＮＭ＿００１８９２
図４３ｃ）  テトラスパニン−６のｃＤＮＡ配列、マウス；ＡＮ：ＡＦ０５３４５４
図４３ｄ）  テトラスパニン−６のアミノ酸配列、マウス；ＡＮ：ＡＡＣ６９７１１
図４３ｅ）  テトラスパニンＴＭ４−ＤのｃＤＮＡ配列、ヒト；ＡＮ：ＡＦ１３３４２６
図４３ｆ）  テトラスパニンＴＭ４−Ｄのアミノ酸配列、ヒト；ＡＮ：ＡＦ１３３４２６
図４４ｅ）  ＭＡＰ３Ｋ７／ＴＡＫ−１のｃＤＮＡ配列、ヒト；ＡＮ：ＮＭ＿００３１８８
図４４ｆ）  ＭＡＰ３Ｋ７／ＴＡＫ−１のアミノ酸配列、ヒト；ＡＮ：ＮＭ＿００３１８８
図４５ａ）  スペルミジンシンターゼのｃＤＮＡ配列、ラット；ＡＮ：ＡＦ３３７６３６
図４５ｂ）  スペルミジンシンターゼのアミノ酸配列、ラット；ＡＮ：ＡＡＫ２１２８８
図４５ｃ）  スペルミジンシンターゼのｃＤＮＡ配列、マウス；ＡＮ：Ｌ１９３１１
図４５ｄ）  スペルミジンシンターゼのアミノ酸配列、マウス；ＡＮ：ＡＡＣ３７６６６
図４５ｅ）  スペルミジンシンターゼのｃＤＮＡ配列、ヒト；ＡＮ：ＸＭ＿０４２２７６
図４５ｆ）  スペルミジンシンターゼのアミノ酸配列、ヒト；ＡＮ：ＸＰ＿０４２２７６
図４６ｅ）  ＢＡＢ１４１１２のｃＤＮＡ配列、ヒト；ＡＮ：ＡＫ０２２５８２
図４６ｆ）  ＢＡＢ１４１１２のアミノ酸配列、ヒト；ＡＮ：ＢＡＢ１４１１２
図４７）  種々の苦痛モデルのカゼインキナーゼ
図４８）  種々の苦痛モデルのテトラスパニン（ＴＳＰＡＮ）
図４９）  種々の苦痛モデルのＭ３Ｋ７−キナーゼ
図５０）  応用一般クローニング戦略に対する概要
図５１）  同定した遺伝子および遺伝子フラグメントの調節に関する概要
例
例１
苦痛調節遺伝子の同定、単離および塩基配列決定
１．）方式
次の方式を選択した（説明については図５０参照）：
苦痛調節遺伝子の出発点として、ホルマリンをラット前足に注入する、いわゆるラットのホルマリンモデルを選択した。本発明による遺伝子の苦痛調節発現を検出した標的組織は、セグメントＬ３−Ｌ６におけるラットの脊髄の脊髄部分であった。差異化して調節した遺伝子の単離のために、４種の方法が使用される：・ｃＤＮＡ−ＲＤＡ（ｃＤＮＡ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ；Ｈｕｂａｎｋ＆Ｓｃｈａｔｚ，１９９４）
・ＤＤＲＴ−ＰＣＲ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ＲＴ−ＰＣＲ；Ｌｉａｎｇ＆Ｐａｒｄｅｅ  １９９２，Ｂａｕｅｒら，１９９４）
・Ｓｕｂｔｒａｋｔｉｖｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓｉｅｒｕｎｇ（Ｗａｔｘｏｎ＆Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，１９９３）
・ＳＡＧＥ（Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら，１９９５）
上記方法の比較評価は、この方法が減数ハイブリダイゼーションおよびＳＡＧＥと異なり、高調節および低減調節遺伝子も希少転写物も検出し、さらに短時間のうちに豊富な結果を提供できるため、ＤＤＲＴ−ＰＣＲの選択に至った。
【００８９】
２．）材料および方法
苦痛調節ｃＤＮＡ配列の単離および特性化
Ｌｉａｎｇ＆Ｐａｒｄｅｅ（１９９２）／米国特許第５，２６２，３１１号による方法
修飾：
１．Ｂａｕｅｒら１９９３によるデカマープライマー
２．Ｓｏｍｐａｙｒａｃら１９９５によるオリゴＤＴプライマー混合物
３．ＴＡＥ−ポリアクリルアミド−ゲル電気泳動
表２：使用したオリゴヌクレオチド−プライマー
【００９０】
【表２】
2004537962.tif 000004
動物モデル：ホルマリン試験は、炎症性／持続性苦痛（Ｄｕｉｂｉｓｓｏｎら，１９９７）。この場合、５％ホルマリン溶液５０μｌを（ｕｎｌｉａｔｅｒａｌ）に成ウィスターラットの後足へ注射し、この動物を注射して２４時間後組織抽出のために死亡させた。平行して対照動物に等浸透圧食塩溶液を後足に注射した。
【００９１】
組織抽出。  この動物を断頭し、脊柱を調製し、脊髄を氷温等浸透圧食塩溶液の強い注射によって脊柱から洗出した。硬膜の除去後、Ｌ３〜Ｌ６の部位の脊柱の半分を切り取りし、直ちに液体窒素で凍結した。
【００９２】
ＲＮＡ単離。  組織サンプルから、全ＲＮＡをチロゾール−用キット（ライフテクノロジー）で製造者の指示に従って単離した。ＲＮＡは、紫外線蛍光分析法で定量（２６０ｎｍで絶滅）し、変性ゲル電気泳動によりホルムアルデヒド−アガロースゲル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）で集合度を検査した。
【００９３】
ＤＮａｓｅ消化。  ＤＤＲＴ−ＰＣＲに導入する前に、場合によりＤＮａｓｅ消化によるゲノムＤＮＡの飛越しを除去した。その場合、ＲＮＡ各６μｇを全体積１００μｌの中で１ｘＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｂｕｆｆｅｒ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎ．）、かつ１０ユニットＲＮａｓｅなしのＤＮａｅｓｌ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を３７℃で１５分間インキュベートした。フェノール−クロロホルム抽出後、ＲＮＡを酢酸ナトリウム１／１０Ｖｏｌ．ｐＨ５．２と、エタノール２．５Ｖｏｌ．とを滴定し、ＤＥＰＣ水に溶解し、紫外線蛍光分析法で定量し、新たにホルムアルデヒド−アガロース−ゲル電気泳動によって特性化した。
【００９４】
逆転写酵素。  ＤＮａｓｅ消化ＲＮＡ各２００μｇをまずＯｌｉｇｏｄＴプライマー混合物（３Ｐ１、３Ｐ２または３Ｐ３）２．５μＭにより７０℃で５分のインキュベーションで変性し、氷上で急冷し、次に反応混合物２０μｍの全体積の中で３７℃で６０分間インキュベートした。この反応項は１ｘＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎ．）、１０ｍＭ  ＤＴＴ、各１８．７５μＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、２０ユニットＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）および２００ユニットＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎ．）。それに続き酵素を５分間９９℃に加熱してインキュベートし、ｃＤＮＡ試薬を−２０℃で保管した。
【００９５】
ＤＤＲＴ−ＰＣＲ。  ｃＤＮＡ各２μｌを２０μｌの容量でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にかけた。この反応混合物は１ｘＰＣＲＩＩパッファ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２μＭ各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、０．２μＭデカマープライマー（Ｄｅｋａ１−２６）、０．８μＭＯｌｉｇｏｄＴプライマー混合物（３Ｐ１、３Ｐ２または３Ｐ３）および２μＣｉ［α−３３Ｐ］ｄＡＴＰ（≧２０００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ社）。ＰＣＲサンプルをＰＴＣ２００サーモサイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）で次の温度プロフィルに投じた：９４℃で３分間；９４℃で１５秒の４０サイクル、４０℃で１分間、７０秒以内に７２℃に昇温、７２℃で３０秒；７２℃で１０分間および４℃に保持。
【００９６】
ゲル電気泳動と評価。  ＰＣＲサンプルを真空中で乾燥するまで濃縮し、サンプル緩衝液４μｌ（ブロモフェノールブルー０．２５％、キシレンシアノールＦＦ０．２５％、グリセリン３０％）の中に溶解し、各２μｌを６％トリス−タウリン−ＥＤＴＡ−ポリアクリルアミドゲル（マルチホル−システム、Ｐｒｏｍｅｇａ社）の中に２．５時間５０ワットで電気泳動で分離した。このゲルを、それに続き１時間８０℃で乾燥し、一晩ＢＡＳＩＩＩ検出スクリーン（Ｆｕｊｉ社）で露出した。評価するために、ＳＴＯＲＭホスホル−イメージャ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社）をＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウエアの使用下に使用した。オートラジオグラフィ−データを同じ量範囲で箔に印刷し、次にフラグメントの析出のために使用した。
【００９７】
ＤＤＲＴ−ＰＣＲフラグメントの再増幅。  差異的に調節したＰＣＲバンドを外科用小刃でゲルから切断し、１０分間煮沸して１００μｌに蒸留水の中にゲル断片を溶離した。そのうち２５μｌを全容積５０μｌの中でＰＣＲを利用して新たに増幅した。ＰＣＲ反応混合物は１ｘＰＣＲ−Ｐｕｆｆｅｒｌｌ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）で得た；１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；５０μＭ各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ；Ｍ対応するデカマーの０．２μＭ；１μＭ  １ＰＸ  ＯｌｉｇｏｄＴプライマー混合物および２．５μｌユニットＡｍｐｌｉＴＡＱ−ＤＮＡ−ポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）。ＰＣＲ温度プロフィルは、純正のＰＣＲ反応に相当した（上記参照）。ＰＣＲサンプルをそれに続きサンプル緩衝液１０μｌ（ブロモフェノールブルー０．２５％、キシレンシアノールＦＦ０．２５％、グリセリン３０％）で置換し、３％ＴＡＥ、アガロースゲルの中にホウ化エチジウム１０μｇ／ｍｌで電気泳動で分離し、予想した量のＰＣＲ生成物をゲルから切断した。
【００９８】
ＴＡクローニングベクター内のクローニング。  切断したフラグメントをＱｉａｑｕｉｃｋゲル抽出用キット（Ｑｉａｇｅｎ社）で製造者の指示に従って乾燥濃縮し、蒸留水５μｌの中に収容するまで精製した。それに続き、このフラグメントをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ−ベクターの中にＴＯＰＯＴＡクローニング用キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を利用して製造者の指示に従って結紮し、ＴＯＰ１０Ｆ’−Ｅ．Ｃｏｌ細胞に形質転換させた。この形質転換サンプルをＬＢ−Ａｇａｒプレート上にアンピシリン１００μｇ／ｍｌで塗株し、これを事前に２％Ｘ−Ｇａｌ５０μｌ（Ｓｉｇｍａ社）とイソプロピルチオガラクトシド５０μｌ（Ｓｉｇｍａ社）とで処理した。３７℃で１５時間インキュベーション後に得た細菌クローンをアンピシリン１００μｇ／ｍｌ（１００μｇ／ｍｌ）を加えたＬＢ溶媒５ｍｌの中に移し、一晩３７℃で振盪下にインキュベートした。この培養からプラスミド−ＤＮＡをＱｉａｇｅｎ−Ｓｐｉｎ−Ｍｉｎｉｐｒｅｐ用キット（Ｑｉａｇｅｎ社）の使用下に製造者の指示に従って単離し、プラスミド−ＤＮＡ各５μｌをＥｃｏＲＩ制限とそれに続きＴＡＥアガロースゲル電気泳動とによって特性化した。
【００９９】
配列分析。  この場合プラスミド−ＤＮＡ各５００ｎｇをＴ７−ＰＣＲプライマーでＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔｓ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）の使用下に製造者の指示に従って配列決定し、その反応を自動シーケンサーＡＢＩ３７０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．社）を利用して分析した。このＤＮＡ配列をｂｉｏＳＣＯＵＴソフトウエア（ＬＩＯＮ社、ハイデルベルク）の使用下に遺伝子データベースで検定した。
【０１００】
クローンｃＤＮＡ配列の差異調節の確認。  この場合、ｃＤＮＡフラグメントがＰＣＲ増幅後複製濾紙上に結合し、放射性標識ｃＤＮＡで対照脊髄対ホルマリン脊髄からハイブリダイズした、いわゆる逆ノーザン技術を適用した。
【０１０１】
クローンｃＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅。  この場合プラスミド−ＤＮＡ各５０−１００ｇを容積１００μｌでポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にかけた。反応混合物は１ｘＰＣＲＩＩパッファ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）、１．２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１０％ＤＭＳＯ；各２５０μＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、０．８μＭ  Ｔ７−ＰＣＲ−プライマー、０．８μＭ  Ｍ１３Ｒ−ＰＣＲ−プライマーおよび５ユニットＡｍｐｌｉ−ＴＡＱ−ＤＮＡ−ポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）。ＰＣＲサンプルをＰＴＣ２００サーモサイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）で次の温度プロフィルに投じた：９４℃で３分間；９４℃で１５秒の４０サイクル、５５℃で１５秒間、７２℃で３０秒間、７２℃で１０分間；７２℃で１０分間および４℃に保持。部分標本５μｌを３％ＴＡＥアガロースゲル上で分離し、成功したＰＣＲ−ＲｅｋｔｉｏｎでＰＣＲサンプルをＱｕｉａｑｕｉｃｋＰＣＲ精製用キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を利用して製造者の指示に従って精製し、紫外線蛍光分析法で定量化した。
【０１０２】
スロットブロットＤＮＡ濾紙の製造。  ＨｙｂｏｎｄＮ濾紙をまず１０分間６ｘＳＳＣ緩衝剤で洗溶し、スロットブロット装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ｕｎｄ  Ｓｃｈｕｌｌ社）の中に固定した。ＤＮＡフラグメント各１μｇを６ｘＳＳＣ緩衝剤で希釈し、１０分間煮沸し、それに続き氷上で急冷して変性し、濾紙へ吸引した。この濾紙をそれに続き１０分間１．５Ｍ  ＮａＣｌ／０．５Ｍ  ＮａＯＨ溶液で、１０分間１Ｍ  Ｎａｃｌ／０．５Ｍ  トリス−ＨＣｌｐＨ＝７．０で洗浄し、３０分間室温で乾燥し、５分間紫外線照射（３０２ｎｍ、トランシルミネタ）で濾紙に結合した。
【０１０３】
増幅ＲＮＡの製造（Ｐｏｉｒｉｅｒら，１９９７＆Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎ．社．により修飾）。  この場合、Ｔ７（ｄＴ）１５−プライマー１００ｎｇを含む全ＲＮＡ５μｇを容積１１μｌの中に５分間７０℃で変性し、氷上で急冷した。この変性ＲＮＡを次に全容積２０μｌの中に１ｘＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎ．社）で１０ｍＭ  Ｄｔｔ、各５００μＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよび４００ユニット上記逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎ．社．）で１時間４２℃でインキュベーションし、４℃に冷却した。これに第２鎖合成のために次を添加した：９１μｌ  ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ、３０μｌ  ２ｎｄ−Ｓｔｒａｎｄｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎ．）、３μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、１μｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ−Ｌｉｇａｓｅ（１０Ｕ／μｌ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎ．）、４μｌＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ−ポリメラーゼＩ（１０Ｕ／μｌ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎ．）、１μｌ  Ｒｎａｓｅ  Ｈ（２Ｕ／μｌ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎ．）。次にこのサンプルを２時間１６℃でインキュベートし、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ２μｌ（５Ｕ／μｌ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎ．）の添加後さらに５分間１６℃でインキュベートした。インキュベーションは０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １０μｌの添加と、１０分間６５℃に加熱して行った。フェノール−クロロホルム抽出および沈殿後、７．５Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ  ７０μｌおよび１００％、−２０℃冷エタノール５００μｌで沈積物を遠心分離（５分間、１４０００ｇ、室温）し、７０％エタノール１ｍｌで洗浄し、ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ  ５０μｌに溶解し、Ｓ２００−Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ酸で脱塩した（Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）。部分標本（２μｌ）を紫外線蛍光分析法で定量した。この二重鎖ｃＤＮＡからインビトロで転写ＲＮＡを製造する。この場合、ｃＤＮＡ  ５０μｌ（５−１０μｇ）を全容積１００μｌの中に１ｘ転写緩衝剤（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で、ｒＮＴＰｓ７．５ｍＭ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼミックス１０μｌ（リボマックス−用キット、Ｐｒｏｍｅｇａ社）で３−４時間３７℃でインキュベートし、その後４℃に冷却した。ＲＱ１−ＤＮａｓｅ３μｌ（Ｒｎａｓｅ不含；Ｐｒｏｍｅｇａ社）の添加後、サンプルを１５分間３７℃でインキュベートした。Ｓ２００セフアクリル酸（Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を介してフェノール−クロロホルム抽出および脱塩後、部分標本（２μｌ）を紫外線蛍光分析法で測定する。
【０１０４】
放射線ｃＤＮＡプローブの製造。  増幅ＲＮＡ各２μｇをヘキサメルプライマー混合物０．８μｌ（＝７５０μｇ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）で５分間７０℃に加熱して、それに続き氷上で急冷して変性し、全容積２５μｌの中でＰＣＲ緩衝剤２．５μｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎ．社．）を添加して逆転写した；２．５μｌ  ２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；２．５μｌ  ０．１Ｍ  ＤＴＴ；１μｌ各２０ｍＭ  ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＧＴＰ；１μｌ  １２０μＭ  ｄＣＴＰおよび５μｌ［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ。室温で５分間インキュベート後、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素２μｌ（２００Ｕ／μｌ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎ．社９を添加し、２５℃で１０分間、それに続き４２℃で５０分間インキュベートした。加熱インキュベーション（１５分７０℃）後、プローブをＤＥＰＣ水を入れ５０μｌに増やし、非組込放射活性をＳ２００セフアクリル酸（Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を利用して除去した。溶離物各０．５μｌからβカウンタ（ＬＫＢ社）でチェレンコフばらつきを介して活性を同定した。残りのサンプルの中でＲＮＡを６μｌ  １Ｍ  ＮａＯＨ／１０ｍＭＥＤＴＡ溶液の添加と、６８℃で２０分間のインキュベーションとによりハイブリダイズし、その後ホスフェート緩衝剤１Ｍ  ６０μｌ  ｐＨ＝７．０に添加して中和し、各プレハイブリダイズ複製に加えた。
【０１０５】
プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、洗浄および濾紙の評価。  濾紙はＥｘｐｒｅｓｓｈｙｄ溶液１０ｍｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）と加熱変性ＳａｌｏｍｏｎＳｐｅｒｍ−ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ社）とを入れたハイブリダイゼーションボトルで２０分間６８℃でインキュベートした。プレハイブリダイゼーション混合物の振盪後、同混合物５ｍｌを６８℃溶液の添加後、上記の放射線ｃＤＮＡプローブを加滴定し、この濾紙を回転管炉で一晩６８℃でインキュベートした。その後、複数の洗浄ステップ、室温で１０分間０．２  Ｘ  ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ；４２℃で１５分間０．２  Ｘ  ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳおよび最後に６５℃で１５分間０．２  Ｘ  ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳが続く。この濾紙を湿して箔に接合し、ＢＡＳＩＩＩ検出スクリーン（Ｆｕｊｉ社）に曝露した。評価のために、ＳＴＯＲＭホルホルイメージャ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社）をＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウエアの使用下に使用した。
【０１０６】
３：）結果
このホスホル酸（図５０参照）を適用して３５個の苦痛調節遺伝子の（表３および図５１参照）を初めに分布配列としてリトン化し、さらに作業工程の経過で一部伸長した配列としてクローン化した。
【０１０７】
選択した動物モデルから出発して、適用したクローニング戦略でｃＤＮＡ配列をラットからクローニングした。
【０１０８】
合計で２７の、先行技術から従来未知の、非指定の遺伝子フラグメントがクローニングされ、８個の公知のｃＤＮＡ配列もしくはラットの脊髄からの遺伝子フラグメントがその発現において慢性痛の条件によって調節されるクローニングされた（表４参照−従来未知、非指定遺伝子フラグメント−および表５−公知ｃＤＮＡｓ）。２７の未知の、非指定のｃＤＮＡ配列は、先行技術における機能を介しては何も知られていず、もしくは初めて幾つかの事例においてより深い分析によって多少知られた。我々の調査は、ここで苦痛現象における役割を証明する。しかしラットの種々の組織中の発現パターンの分析は、４ｃＤＮＡｓ（１１１．３９、１１１．４５、１４１．１３、１５４．２９；表５参照）の場合でニューロン組織に焦点を当てたことを示した。それによって慢性痛における新規の診断および治療アプローチの開発のためにこのｃＤＮＡｓは特に重要である。アンチセンス−オリゴスまたはリボザイムによる発現によって、新種のｃＤＮＡｓの役割はさらに調査することができる。
【０１０９】
特に関心があるのは遺伝子フラグメント１４１−１３である。図２０および２１に示した遺伝子フラグメントの伸長は分析において、ここでＵＮＣ−１１５と他のａｂＬＩＭファミリの構成要素と同族であるが、これまで知られていない新規の遺伝子が存在することを明らかにした。従って発現パターンと共に、神経発達において重要なＵＮＣ−１５の役割に鑑みて、この遺伝子フラグメントもしくは遺伝子は特別の重要性がある。
【０１１０】
この遺伝子フラグメントがヒトゲノムの明らかに強く発現する部分に対して強い同族性があるため、遺伝子フラグメント１２７−８も重要である（ＡＮ：染色体１１ｑ１３上のＮＴ＿００９３７９．１）。
【０１１１】
８公知のｃＤＮＡｓの場合は機能が原理的に公知である：
苦痛下で増強して発現するｃＤＮＡｓ：
・ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ
・カタラーゼ
・転写因子ＴＦＩＩＦβ
・転写因子ＧＡＴＡ−３
・ＬＤＬ様受容体ＬＲ−１１
・Ｃｌ−−チャンネルＣＩＣ７
苦痛下に低減して発現するｃＤＮＡｓ：
・ＭＡＰ−キナーゼ／ＪＮＫ３／ＳＡＰＫβ
・ＰＩＭ−２キナーゼ
遺伝子フラグメント（ＧＦ）についてより正確な分析によって発現されたｃＤＮＡｓは次のとおりである。
ＧＦ１１１．３３＝スペルミジンシンターゼ（高調節）
ＧＦ１２４−２９＝ＭＡＰＫ３／ＴＡＫ−１（低調節）
ＧＦ１２７−３４＝ＢＡＢ１４１１２（低調節）
ＧＦ１３５−７＝カゼインキナーゼ１ａ（低調節）および
ＧＦ１６４−２４＝テトラスパニン（ＴＭ４−Ｄ／ＴＳＰＡＮ−６）（低調節）
この場合に特に強調されるべきであるのはＰＩＭ−２キナーゼである。この酵素、ＰＩＭ−１および−３の他のアイソタイプについて、このシグナリング−キナーゼが海馬状隆起内の学習−および記憶過程に参加していることを示すことができた（Ｋｏｎｉｅｔｚｋｏら（１９９９）ＥＭＢＯ  Ｊ．，１８：３３５９−３３６９）。
【０１１２】
本発明の枠内で核酸配列を単離し、特性化し、完全なラットのためにＰＩＭ−２蛋白質をコードした（図３５ｅ、３５ｆ）。ラットからのＰｉｍ−２のための核酸配列および蛋白質配列は、これまで知られていない。さらに、完全な、すなわち全体のコードする領域を含有する、ヒトＰｉｍ−２についてコードするｃＤＮＡを単離した（３５ａ、ｂ）。公刊されたＰＩＭ−２配列（Ａｃｃ．ｎｒ．Ｕ７７７３５）との配列比較は下記の差異を生じた：
【表３】
2004537962.tif 000005
＊苦痛調節名称は出版されたＰｉｍ−２配列に関係する（Ａｃｃｎｒ．Ｕ７７７３５）。
【０１１３】
この調査から苦痛調節１０６４で見い出されたＦｅｌｅｔｉｏｎｅｉｎｅｓヌクレオチドは、これが読取り枠の変化をもたらし、それによって以下に記載した完全に別のＣ末端蛋白質配列を有する蛋白質が生じるので、機能上の重要性がある。
【０１１４】
両方の証明されたＰＩＭ−２蛋白質のＣ末端の比較（完全な比較、図３５ｇ参照）。
ｈＰＩＭ−２（Ａｃｎｒ．Ｕ７７７３５）
ＴＰＱＰＬＱＲＲＰＣＰＦＧＬＵＬＡＴＬＳＬＡＷＰＧＬＡＰＮＧＱＫＳＨＰＮＡＭＳＱＧ
ｈＰＩＭ−２（特許  図２５ｂ）ＰＬＮＰＳＫＧＧＰＡＰＬＡＷＳＬＬＰ
もう１つの例は、Ｏ２およびＨ２Ｏへの転換による細胞にとり有害なＨ２Ｏ２を除去するカタラーゼである。
【０１１５】
蛋白質キナーゼＪＮＫ−３は特異的に中枢神経系の神経細胞の中に発現（Ｍｏｈｉｔら，１９９５）し、一連のオピエートレセプター（たとえばμ−オピエートレセプターおよびＯＲＬ−１など）のために有糸分裂促進因子活性蛋白質キナーゼの前記ファミリから蛋白質キナーゼの後続の活性が記載されている（Ｌｉ＆Ｃｈａｎｇ，１９９６；Ｈａｗｅｓら，１９９８）。
【０１１６】
蛋白質ＬＲ１１は“Ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＬＤＬＲ）”ファミリのモザイク蛋白質である（Ｍｏｗａｌｄら１９９７）。ＬＲ１１−ｍＲＮＡへの最も強い発現は、特にシナプトゲナーゼまたは神経軸索突起における機能を想到容易にする発達依存性の種類で調節される脳内に検出することができた（Ｈｅｒｍａｎｎ−Ｂｏｒｇｍｅｙｅｒら，１９９８）。
表３：成熟ラットにおける２７の（大抵）未知のｃＤＮＡｓの発現
【０１１７】
【表４】
2004537962.tif 000006
調節クローンの配列データ
下表は、表形式に列挙したｃＤＮＡクローン／遺伝子フラグメントへの図の割当を可能にする。
表４：従来未知の、非割当（ｎｉｃｈｔ ｚｕｇｅｏｒｄｎｅｔｅ）遺伝子フラグメント
【０１１８】
【表５】
2004537962.tif 000007
表５：公知のｃＤＮＡ配列からの遺伝子フラグメント
【０１１９】
【表６】
2004537962.tif 000008
例２ａ）
種々の見出された遺伝子フラグメントまたは公知の遺伝子のインサイト−ハイブリダイゼーション
ラットを種々の苦痛モデルに分け、苦痛の誘発後数時間で脊髄断片を得て、インサイト−ハイブリダイゼーションによりＤＮＡプローブと、または各遺伝子または遺伝子フラグメントの発現を調査する特異的抗体と、および対照動物と比較した。
【０１２０】
各モデルはＣＦＡ誘導関節炎（ＣＦＡ）、コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）およびホルマリン試験（ホルマリン）、Ｄ．Ｄｕｂｕｉｓｓｏｎ，Ｓ．Ｇ．Ｄｅｎｎｉｓ，Ｐａｉｎ  ４，１６１−１７４（１９７７）参照。
表５ａはその結果を示す。
【０１２１】
【表７】
2004537962.tif 000009
例２ｂ）
種々の苦痛モデルによる種々の公知の遺伝子（ＴＳＰＡＮ、カゼイン−キナーゼ、およびＭ３Ｋ７キナーゼ）に関する発現レベルの同定。
【０１２２】
ラットにおける対照との比較による種々の苦痛モデルによる発現の範囲は、ＲＴ−ＰＣＲ（上記参照）で調査した。この結果は、図４７、４８および４９から読み取られ、明るい棒は対象動物群に相当し、暗い棒は治療した動物群に相当する。Ｙ軸は相対的な単位である（標準化した発現レベル）。
【０１２３】
例２ｃ）
完全なヒトもしくはラットの配列もしくは例１において見出された図１−３３に基づく遺伝子フラグメントに対応する完全な遺伝子のクローニング
１．）フル−レングス−ラット−ｃＤＮＡ−配列のクローニング
完全なラットｃＤＮＡ配列のクローニングは、ｃＤＮＡバンクの連続スクリーニングまたはＰＣＲ仲介法のいずれかを利用して行う。
【０１２４】
ａ）連続スクリーニング
ｃＤＮＡバンクは求めている遺伝子のｍＲＮＡを発現する組織のｍＲＮＡで作成した。プローブとして１本鎖または２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子が使用され、これらは放射（たとえば［α３２Ｐ］ｄＣＴＰ）または非放射線のいずれかで標識されている（たとえばジゴキシゲニンで標識したＵＴＰ）。細菌またはファージ中に存在するｃＤＮＡバンクは、アガープレート上に塗布され、好適な濾紙膜に伝達後拡散プローブでハイブリダイズされ、ストリンジェントな洗浄手順に従って検出される。この方法で同定されたｃＤＮＡクローンがさらに細分化され、シーンクエンス法によって分析される（これについてはＳａｍｂｒｏｏｋｓら，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら，１９９０参照）。
【０１２５】
ｂ）ＰＣＲ仲介方法
ＰＣＲ仲介方法の場合、調節ｃＤＮＡ配列から出発してオリゴヌクレオチド−ヌプライマーがインセンスまたはアンチセンス定位で検出および合成される。従来の５’−ＲＡＣＥ法（５’−ｃＤＮＡ末端の高速増幅＝Ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ５’−ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）の場合、アンチセンス定位プライマーがｃＤＮＡ合成に使用され、それによって発生した１本鎖ｃＤＮＡがＲＮＡリガーゼを有するオリゴヌクレオチドの結紮または末端トランスフェラーゼとのテーリング反応によって伸長され、次により内側に置かれた（いわゆるｎｅｓｔｅｄ）プライマーとのＰＣＲ反応およびテール特異的プライマーにかけられる。ＰＣＲ増幅体がクローニングされ、シーンクエンス法によって分析される。この方法の変形は、ｃＤＮＡテンプレートから出発して５’方向へも３’方向へもｃＤＮＡ配列を伸長するために、いわゆる抑制ＰＣＲの効果を利用する（Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）。この場合、２本鎖ｃＤＮＡはＲＮＡから出発してラット脊髄から作られ、特異的に修飾したリンカーで結紮する。このｃＤＮＡは次いで遺伝子特異的プライマーおよびリンカー特異的プライマーでＰＣＲを利用して増幅され、増幅生成物がクローニングおよび配列決定される。
２．）均一なヒトｃＤＮＡ配列のクローニング
均一なヒトｃＤＮＡ配列は、上記方法の修正によって単離される。ｃＤＮＡバンクの従来のスクリーニングにおいてヒト由来のバンクが使用され、ハイブリダイゼーションはより低い均一性のｃＤＮＡクローンも検出するために、より低いストリンジェントな条件下に実施される。
【０１２６】
ＰＣＲ仲介戦略の場合、初めに、有利にはコード領域から由来する多数の異なるプライマーによってヒトｃＤＮＡを増幅することが試行される。これが成功しない場合、変性したＰＣＲプライマーを使用してよく、またはより少ないストリンジェントＰＣＲ条件が選ばれる。
【０１２７】
例３：
放射線標識脂質の排出に関する結合の測定によるスクリーニング方法の実施
クロリドチャンネルＣＬＣ−７のためにコードする拡散断片は、構成発現（たとえばＣＭＶプロモータ）または誘導可能の発現を真核細胞の中に可能にする発現ベクターの中でクローニングされる。ＤＮＡは好適なトランスフェクション法、たとえばリポフェクタミン（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）で真核細胞（たとえばＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞またはＮＩＨ−３Ｔ３細胞）の中に取り込まれる。この細胞は、選択試薬（たとえばゼオシン、ヒグロマイシンまたはネオマイシン）の存在中に培養され、そのためＤＮＡコンストラクトを吸収した細胞だけが生き残ることができ、選択がより長くかかる場合、ゲノムの中にも組み込まれている。
【０１２８】
この細胞から出発して、ＣＬＣ−７チャンネルを大量に含有し、結合アッセイに使用できる膜フラクションが得られる。これは、１．）ＣＬＣ−７を含有する膜と、２．）放射線標識脂質（たとえばトリチウム標識した４，４’−ジイソチオシアノスチルベン−２，２’−ジスルフォン酸（ＤＩＤＳ）または［３Ｈ］標識した４−アセトアミド−４’−イソチオシアナートスチルベン−２，２’−ジスルフォン酸（ＳＩＴＳ））と、３．）結合緩衝剤（たとえば５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）と、結合上の被験脂質とからなる。物質ＳＩＴＳおよびＤＩＤＳは、ＣＬＣ−７に発現するＯｏｚｙｔｅｎの機能調査においてＣＬＣ−７を仲介する塩化物流を阻止することができる（非公開結果Ｆｒ．Ｄｒ．Ｄｉｅｗａｌｄ、マインツ大学）。好適な温度（多くは室温）における上記反応混合物（たとえば３０−６０分）のインキュベーション後、非結合放射線脂質分子が濾別される。結合した［３Ｈ］−ＤＩＤＳもしくは［３Ｈ］−ＳＩＴＳへの残量は、シンチレーションコックテールの添加後β計数器（たとえばトリルックス、Ｗａｌｌａｃ社）で測定される。試験物質がＣＬＣ−７−チャンネルへの結合を示す場合、これが低減した放射線組込みとして検出される。この方法は、好適には（９６−、３８４−または１５３６−ウエル）微量滴定プレートで、この方法をロボットを利用してハイスループット−スクリーニング（ＨＴＳ）法で実施するために実施することができるように小型化される。
【０１２９】
例４：
物質の結合によって変化した機能媒介変数の測定による本発明のスクリーニング方法の実施
蛋白質キナーゼＰＩＭ−２のためにコードする拡散断片が、たとえばＥ．ｃｏｌｉのような原核生物において誘導可能の発現を可能にする発現ベクターでクローニングされる。この場合、拡散断片が融合蛋白質として付加的なＮ−またはＣ−またはアミノ酸配列によって発現されるように修飾される。この配列は、ＰＩＭ−２キナーゼの不変の機能において特異的方法を介して、たとえばグルタチオンへの結合を介して蛋白質混合物からの単離を可能にするグルタチオンＳ−トランスフェラーゼフラグメントを介して可能にするべきである。細菌のトランスフェクション、遺伝子（たとえばＩａｃプロモータにおけるＩＰＴＧによる）の誘導および細菌の砕開後に、融合蛋白質を洗浄し、インビトロ−キナーゼの発現に使用される。この場合蛋白質５μｇを３０℃で３０分間キナーゼ緩衝剤５０μｌ（ＰＩＰＥＳ  ２０ｍＭ、ｐＨ７．０、５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、７ｍＭ  β−メルカプトエタノール、０．４ｍＭスペルミン、１０ｍＭｒＡＴＰ）の中に１０μＣｉ［ｒ３２Ｐ］ＡＴＰで置換される。基質として、洗浄したヒストンＨ１蛋白質（Ｓｉｇｍａ社）または細菌発現ＧＳＴ−ＮＦＡＴｃ１融合蛋白質が添加される。インキュベーション時間後、非組込み［ｒ−３２Ｐ］ＡＴＰが濾別され、組み込まれた３２ホスフェートの量がβ−シンチレーション（トリルックス、Ｗａｌｌａｃ社）によって同定される。新規のＰＩＭ−２キナーゼ−インセピター−の微量検定のための発現において、このサンプルで試験物質が一緒に培養され、３２Ｐ−組込みの現象がインヒビターの指標として利用される。この方法は、好適には（９６−、３８４−または１５３６−ウェル）微量滴定において、この方法をロボットを利用して、いわゆるハイスループット−スクリーニング（ＨＴＳ）法として実施するために実施できるように小型化される。
【０１３０】
例５
本発明による作用物質錠剤製剤を含有する薬剤の例
錠剤は、対応するアジュバントを含む本発明による作用物質の混合物の直接の圧縮または作用物質含有の顆粒（必要がある場合別のアジュバントを含む）の圧縮によって製造することができる顆粒は、その場合、たとえば水性顆粒化液とそれに続き前記顆粒の乾燥による湿式顆粒化またはたとえばコンパクト化を介した乾燥顆粒化によって製造することができる。
・直接圧縮
たとえば錠剤あたり：
２５ｍｇ  本発明作用物質
２７１ｍｇ  ルディプレス（ラクトースモノヒドラート、ポビドンＫ３０およびクロスポビドンから直接錠剤化用顆粒）
４ｍｇ  ステアリン酸マグネシウム
３００ｍｇ  合計
アジュバントを含む作用物質の均一な混合物を製造し、この混合物を錠剤成形機で直径１０ｍｍの錠剤に圧縮する。
・乾燥顆粒化
たとえば錠剤あたり：
２５ｍｇ  本発明作用物質
１６６ｍｇ  マイクロクリスタリンセルロース
８０ｍｇ  低置換ヒドロキシプロピルセルロース（Ｉ−ＨＰＣＬＨ１１ＴＭ）
５ｍｇ  高分散二酸化ケイ素
４ｍｇ  ステアリン酸マグネシウム
２８０ｍｇ  合計
マイクロクリスタリンおよびＩ−ＨＰＣを含む作用物質の均一な混合物を製造し、この混合物をコンパクト化する。圧縮体のふるい分け後、発生した顆粒をステアリン酸マグネシウムおよび二酸化ケイ素と混合し、錠剤成形機で直径９ｍｍの錠剤に圧縮する。
・湿式顆粒
たとえば錠剤あたり：
２５ｍｇ  本発明による作用物質
２０５ｍｇ  マイクロクリスタリンセルロース
６ｍｇ  ポビドンＫ３０
１０ｍｇ  クロスポビドン
４ｍｇ  ステアリン酸マグネシウム
２５０ｍｇ  合計
マイクロクリスタリンセルロースおよびクロスポビドンを含む作用物質の均一な混合物を製造し、この混合物を顆粒成形機でポビドンの水溶液で顆粒化する。湿式顆粒がそれに続き再顆粒化され、乾燥槽（５０℃）内で乾燥後１０時間乾燥する。乾燥した顆粒はステアリン酸マグネシウムと共にふるい分けし、最終混合し、錠剤プレスで直径８ｍｍの錠剤に圧縮する。
【０１３１】
例６
本発明による作用物質非経口溶液を含有する薬剤の例
本発明による作用物質１ｇを注射用の水１ｌの中に室温で溶解し、それに続きＮａＣｌ（塩化ナトリウム）の添加によって等張条件で調節する。
【０１３２】
文献：
【０１３３】
【外１】
2004537962.tif 000010
【０１３４】
【外２】
2004537962.tif 000011
【０１３５】
【外３】
2004537962.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は遺伝子フラグメント１１１＿１６を示す。
【図２】
図２は遺伝子フラグメント１１１＿３３を示す。
【図３】
図３は遺伝子フラグメント１１１＿３９を示す。
【図４】
図４は遺伝子フラグメント１１１＿４５を示す。
【図５】
図５は遺伝子フラグメント１１３＿１５の部分を示す。
【図６】
図６は遺伝子フラグメント１１３＿１５の部分を示す。
【図７】
図７は遺伝子フラグメント１１３＿１５の部分を示す。
【図８】
図８は遺伝子フラグメント１１３＿２０を示す。
【図９】
図９は遺伝子フラグメント１２４＿２９を示す。
【図１０】
図１０は遺伝子フラグメント１２４＿４を示す。
【図１１】
図１１は遺伝子フラグメント１２７＿３を示す。
【図１２】
図１２は遺伝子フラグメント１２７＿３４を示す。
【図１３】
図１３は遺伝子フラグメント１２７＿８を示す。
【図１４】
図１４は遺伝子フラグメント１３５＿１８を示す。
【図１５】
図１５は遺伝子フラグメント１３５＿２を示す。
【図１６】
図１６は遺伝子フラグメント１３５＿７を示す。
【図１７】
図１７は遺伝子フラグメント１３５＿９の部分を示す。
【図１８】
図１８は遺伝子フラグメント１３５＿９の部分を示す。
【図１９】
図１９は遺伝子フラグメント１４１＿１を示す。
【図２０】
図２０は遺伝子フラグメント１４１＿１３の部分を示す。
【図２１】
図２１は遺伝子フラグメント１４１＿１３の部分を示す。
【図２２】
図２２は遺伝子フラグメント１４１＿２４を示す。
【図２３】
図２３は遺伝子フラグメント１４１＿６を示す。
【図２４】
図２４は遺伝子フラグメント１４６＿１０を示す。
【図２５】
図２５は遺伝子フラグメント１５４＿２６を示す。
【図２６】
図２６は遺伝子フラグメント１５４＿２９を示す。
【図２７】
図２７は遺伝子フラグメント１６４＿１２を示す。
【図２８】
図２８は遺伝子フラグメント１６４＿２４の部分を示す。
【図２９】
図２９は遺伝子フラグメント１６４＿２４の部分を示す。
【図３０】
図３０は遺伝子フラグメント１６４＿２４の部分を示す。
【図３１】
図３１は遺伝子フラグメント１８０＿１２を示す。
【図３２】
図３２は遺伝子フラグメント１８０＿８を示す。
【図３３】
図３３は遺伝子フラグメント８９＿２８を示す。
【図３４ａ】
図３４ａはＪＮＫ３のｃＤＮＡ配列、ヒト、α１−亜種；ＡＮ：Ｕ３４８２０を示す。
【図３４ｂ】
図３４ｂはＪＮＫ３のアミノ酸配列、ヒト、α１−亜種；ＡＮ：Ｕ３４８２０を示す。
【図３４ｃ】
図３４ｃはＪＮＫ３のｃＤＮＡ配列、ヒト、α２−亜種；ＡＮ：Ｕ３４８１９を示す。
【図３４ｄ】
図３４ｄはＪＮＫ３のアミノ酸配列、ヒト、α１−亜種；ＡＮ：Ｕ３４８１９を示す。
【図３４ｅ】
図３４ｅはＪＮＫ３のｃＤＮＡ配列、マウス；ＡＮ：ＡＢ００５６６５を示す。
【図３４ｆ】
図３４ｆはＪＮＫ３のアミノ酸配列、マウス；ＡＮ：ＡＢ００５６６５を示す。
【図３４ｇ】
図３４ｇはＪＮＫ３のｃＤＮＡ配列、ラット；ＡＮ：ＨＭ＿０１２８０６を示す。
【図３４ｈ】
図３４ｈはＪＮＫ３のアミノ酸配列、ラット；ＡＮ：ＨＭ＿０１２８０６を示す。
【図３５ａ】
図３５ａはＰＩＭ−２のｃＤＮＡ配列、ヒト；自己クローニングを示す。
【図３５ｂ】
図３５ｂはＰＩＭ−２のアミノ酸配列、ヒト；自己クローニングを示す。
【図３５ｃ】
図３５ｃはＰＩＭ−２のｃＤＮＡ配列、マウス；ＡＮ：Ｌ４１４９５を示す。
【図３５ｄ】
図３５ｄはＰＩＭ−２のアミノ酸配列、マウス；ＡＮ：Ｌ４１４９５を示す。
異なる蛋白質長さ：１．）４０ｋＤａ、２．）３７ｋＤａ、３．）３４ｋＤａを示す。
【図３５ｅ】
図３５ｅはＰＩＭ−２のｃＤＮＡ配列、ラット；自己クローニングを示す。
【図３５ｆ】
図３５ｆはＰＩＭ−２のアミノ酸配列、ラット；自己クローニングを示す。
【図３５ｇ】
図３５ｇは３５ｂ）に示したＰＩＭ−２配列の蛋白質配列と、遺伝子データベースに記録されたヒトＰＩＭ−２配列ＮＭ＿００６８７５の蛋白質配列との比較を示す。
【図３６ａ】
図３６ａはＬＲ１１のｃＤＮＡ配列、マウス；ＡＮ：ＡＢ０１５７９０を示す。
【図３６ｂ】
図３６ｂはＬＲ１１のアミノ酸配列、マウス；ＡＮ：ＡＢ０１５７９０を示す。
【図３６ｃ】
図３６ｃはＬＲ１１のｃＤＮＡ配列、ヒト；ＡＮ：Ｙ０８１１０を示す。
【図３６ｄ】
図３６ｄはＬＲ１１のアミノ酸配列、ヒト；ＡＮ：Ｙ０８１１０を示す。
【図３７ａ】
図３７ａはＴＦＩＩＦβのｃＤＮＡ配列、ラット；ＡＮ：Ｄ１０６６５を示す。
【図３７ｂ】
図３７ｂはＴＦＩＩＦβのアミノ酸配列、ラット；ＡＮ：Ｄ１０６６５を示す。
【図３７ｃ】
図３７ｃはＴＦＩＩＦβのｃＤＮＡ配列、ヒト；ＡＮ：Ｘ５９７４５を示す。
【図３７ｄ】
図３７ｄはＴＦＩＩＦβのアミノ酸配列、ヒト；ＡＮ：Ｘ５９７４５を示す。
【図３８ａ】
図３８ａはＧＧＴのｃＤＮＡ配列、ラット；ＡＮ：Ｌ２４１１６を示す。
【図３８ｂ】
図３８ｂはＧＧＴのアミノ酸配列、ラット；ＡＮ：Ｌ２４１１６を示す。
【図３８ｃ】
図３８ｃはＧＧＴのｃＤＮＡ配列、ヒト；ＡＮ：Ｌ２５４４１を示す。
【図３８ｄ】
図３８ｄはＧＧＴのアミノ酸配列、ヒト；ＡＮ：Ｌ２５４１１を示す。
【図３９ａ】
図３９ａはＧＡＴＡ３のｃＤＮＡ配列、マウス；ＡＮ：ＮＭ＿００８０９１を示す。
【図３９ｂ】
図３９ｂはＧＡＴＡ３のアミノ酸配列、マウス；ＡＮ：ＮＭ＿００８０９１を示す。
【図３９ｃ】
図３９ｃはＧＡＴＡ３のｃＤＮＡ配列、ヒト；ＡＮ：ＮＭ＿００２０５１を示す。
【図３９ｄ】
図３９ｄはＧＡＴＡ３のアミノ酸配列、ヒト；ＡＮ：ＮＭ＿００２０５１を示す。
【図３９ｅ】
図３９ｅはＧＡＴＡ３の部分ｃＤＮＡ配列、ラット；ＡＮ：ＡＢ０００２１７を示す。
【図４０ａ】
図４０ａはＣＣＬ−７のｃＤＮＡ配列、ヒト；ＡＮ：ＡＦ２２４７４１を示す。
【図４０ｂ】
図４０ｂはＣＣＬ−７のアミノ酸配列、ヒト；ＡＮ：ＡＦ２２４７４１を示す。
【図４０ｃ】
図４０ｃはＣＣＬ−７のｃＤＮＡ配列、ラット；ＡＮ：Ｚ６７７４４を示す。
【図４０ｄ】
図４０ｄはＣＣＬ−７のアミノ酸配列、ラット；ＡＮ：Ｚ６７７４４を示す。
【図４０ｅ】
図４０ｅはＣＣＬ−７のゲノムＤＮＡ配列、マウス；ＡＮ：ＡＨ０６３１０１を示す。
【図４０ｆ】
図４０ｆはＣＣＬ−７のアミノ酸配列、マウス；ＡＮ：ＡＨ０６３１０１を示す。
【図４１ａ】
図４１ａはカタラーゼのｃＤＮＡ配列、ラット；ＡＮ：ＮＭ＿０１２５２０を示す。
【図４１ｂ】
図４１ｂはカタラーゼのアミノ酸配列、ラット；ＡＮ：ＮＭ＿０１２５２０を示す。
【図４１ｃ】
図４１ｃはカタラーゼのｃＤＮＡ配列、マウス；ＡＮ：ＮＭ＿００９８０４を示す。
【図４１ｄ】
図４１ｄはカタラーゼのアミノ酸配列、マウス；ＡＮ：ＮＭ＿００９８０４を示す。
【図４１ｅ】
図４１ｅはカタラーゼのｃＤＮＡ配列、ヒト；ＡＮ：ＮＭ＿００１７５２を示す。
【図４１ｆ】
図４１ｆはカタラーゼのアミノ酸配列、ヒト；ＡＮ：ＮＭ＿００１７５２を示す。
【図４２ａ】
図４２ａはカゼインキナーゼ１ａのｃＤＮＡ配列、ラット；ＡＮ：Ｕ７７５８２を示す。
【図４２ｂ】
図４２ｂはカゼインキナーゼ１αのアミノ酸配列、ラット；ＡＮ：ＡＡＢ１９２２７を示す。
【図４２ｅ】
図４２ｅはカゼインキナーゼ１αのｃＤＮＡ配列、ヒト；ＡＮ：ＮＭ＿００１８９２を示す。
【図４２ｆ】
図４２ｆはカゼインキナーゼ１αのアミノ酸配列、ヒト；ＡＮ：ＮＭ＿００１８９２を示す。
【図４３ｃ】
図４３ｃはテトラスパニン−６のｃＤＮＡ配列、マウス；ＡＮ：ＡＦ０５３４５４を示す。
【図４３ｄ】
図４３ｄはテトラスパニン−６のアミノ酸配列、マウス；ＡＮ：ＡＡＣ６９７１１を示す。
【図４３ｅ】
図４３ｅはテトラスパニンＴＭ４−ＤのｃＤＮＡ配列、ヒト；ＡＮ：ＡＦ１３３４２６を示す。
【図４３ｆ】
図４３ｆはテトラスパニンＴＭ４−Ｄのアミノ酸配列、ヒト；ＡＮ：ＡＦ１３３４２６を示す。
【図４４ｅ】
図４４ｅはＭＡＰ３Ｋ７／ＴＡＫ−１のｃＤＮＡ配列、ヒト；ＡＮ：ＮＭ＿００３１８８を示す。
【図４４ｆ】
図４４ｆはＭＡＰ３Ｋ７／ＴＡＫ−１のアミノ酸配列、ヒト；ＡＮ：ＮＭ＿００３１８８を示す。
【図４５ａ】
図４５ａはスペルミジンシンターゼのｃＤＮＡ配列、ラット；ＡＮ：ＡＦ３３７６３６を示す。
【図４５ｂ】
図４５ｂはスペルミジンシンターゼのアミノ酸配列、ラット；ＡＮ：ＡＡＫ２１２８８を示す。
【図４５ｃ】
図４５ｃはスペルミジンシンターゼのｃＤＮＡ配列、マウス；ＡＮ：Ｌ１９３１１を示す。
【図４５ｄ】
図４５ｄはスペルミジンシンターゼのアミノ酸配列、マウス；ＡＮ：ＡＡＣ３７６６６を示す。
【図４５ｅ】
図４５ｅはスペルミジンシンターゼのｃＤＮＡ配列、ヒト；ＡＮ：ＸＭ＿０４２２７６を示す。
【図４５ｆ】
図４５ｆはスペルミジンシンターゼのアミノ酸配列、ヒト；ＡＮ：ＸＰ＿０４２２７６を示す。
【図４６ｅ】
図４６ｅはＢＡＢ１４１１２のｃＤＮＡ配列、ヒト；ＡＮ：ＡＫ０２２５８２を示す。
【図４６ｆ】
図４６ｆはＢＡＢ１４１１２のアミノ酸配列、ヒト；ＡＮ：ＢＡＢ１４１１２を示す。
【図４７】
図４７は種々の苦痛モデルのカゼインキナーゼを示す。
【図４８】
図４８は種々の苦痛モデルのテトラスパニン（ＴＳＰＡＮ）を示す。
【図４９】
図４９は種々の苦痛モデルのＭ３Ｋ７−キナーゼを示す。
【図５０】
図５０は応用一般クローニング戦略に対する概要を示す。
【図５１】
図５１は同定した遺伝子および遺伝子フラグメントの調節に関する概要を示す。
【図４７】
2004537962.tif 000013
【図４８】
2004537962.tif 000014
【図４９】
2004537962.tif 000015
【図５０】
2004537962.tif 000016
【図５１】
2004537962.tif 000017
2004537962.tif 000018
2004537962.tif 000019
【国際公開パンフレット】
2004537962.tif 000020
2004537962.tif 000021
2004537962.tif 000022
2004537962.tif 000023
2004537962.tif 000024
2004537962.tif 000025
2004537962.tif 000026
2004537962.tif 000027
2004537962.tif 000028
2004537962.tif 000029
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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