(57)【要約】本発明の開示は、オリゴマーのプールを作製するために、固体支持体上で、並行な様式で個別にオリゴマー（例えば、オリゴヌクレオチド）を合成するための有効かつ再現可能な方法を提供する。オリゴヌクレオチドのプールは、種々のゲノム適用およびプロテオミクス適用（遺伝子もしくは任意の配列の長いＤＮＡの合成、ＰＣＲ鋳型増幅が挙げられる）、ならびに多重化ＰＣＲまたは転写のためのプライマーを作製するために使用され得る。これらのオリゴヌクレオチド生成物の迅速な入手可能性は、新規のタンパク質設計のプロセス、ワクチン開発、短いＲＮＡフラグメント（例えば、ｓｉＲＮＡ）の産生、オリゴヌクレオチドに基づいた薬物スクリーニングおよびＳＮＰサンプル調製を大きく加速する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一つ以上の保護開始部分を含む単離反応部位を含む、基材上の選択された多量体のアレイの並行合成のための方法であって、該方法は以下：
（ａ）単離反応部位に選択的に照射し、該照射された単離反応部位に、脱保護開始部分を作製する工程；
（ｂ）一つ以上の単量体を、該脱保護開始部分にカップリングさせる工程；
（ｃ）選択された多量体のアレイが合成されるまで、工程（ａ）−工程（ｂ）を繰り返す工程；
を包含する方法であって、該合成された多量体が約７５〜約２００単量体の長さの多量体を含む、方法。
【請求項２】
前記合成された多量体が約１００〜約１２５単量体の長さの多量体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記選択された多量体がＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記選択された多量体がオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記選択された多量体がＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記選択された多量体がＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記選択された多量体がペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記選択された多量体が炭水化物である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載された方法であって、前記脱保護開始部分は、以下：
（ａ）前記基材を、一種以上の光試薬前駆物質を含有する溶液と接触させる工程であって、該溶液が該開始部分と接触する、工程
（ｂ）一種以上の光生成性試薬を産生するために、単離反応部位に選択的に照射する工程であって、ここで、該光生成性試薬が、該照射された単離保護部位で、該開始部分を脱保護化するのに有効である、工程
によって作製される、方法。
【請求項１０】
前記光試薬前駆物質が、酸性前駆物質および塩基性前駆物質からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記単量体が、非保護反応部位および保護反応部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記単量体が、ヌクレオホスホラミダイト、ヌクレオホスホネート
およびこれらのアナログからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記保護開始部分が、酸不安定基によって保護される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記保護開始部分が、リンカー分子を含み、該リンカー分子のそれぞれが、酸不安定基によって保護される反応性官能基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＤＮＡ配列を作製する方法であって、該方法は、以下：
該ＤＮＡ配列の集合に対して適切なオリゴヌクレオチド部分鎖を選択する工程であって、該部分鎖が、該ＤＮＡ配列がアニーリングされた該部分鎖によって形成されるように設計される、工程；
固体支持体上の該部分鎖の並行合成工程であって、該部分鎖が約７５ヌクレオチド長〜約１５０ヌクレオチド長である、工程；
該部分鎖をアニーリングさせる工程；
該ＤＮＡ配列を作製するために、該アニーリングした部分鎖を連結する工程、
を包含する、方法。
【請求項１６】
前記ＤＮＡ配列が１００ｂｐ長〜１，０００ｂｐ長である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＤＮＡ配列が１，０００ｂｐ長〜１０，０００ｂｐ長である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＤＮＡ配列が、遺伝子、遺伝子フラグメント、トランスポゾン、調節領域、転写機構、発現構築物、遺伝子治療構築物、相同組換え構築物、ワクチン構築物、ウイルスゲノム、ベクターおよび人工染色体からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記部分鎖がアニーリングされる前に、該部分鎖が前記固体支持体から切断される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
所定の部分鎖がアニーリングされる前に、該部分鎖が前記固体支持体から切断される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記所定の部分鎖が、前記固体支持体に結合した部分鎖にアニーリングされる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記部分鎖が、制限エンドヌクレアーゼ酵素を使用して、前記固体支持体から切断される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチド部分鎖が一つ以上の逆Ｕリンカーを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記オリゴヌクレオチド部分鎖が、ＲＮａｓｅ  Ａを使用して、前記固体支持体から切断される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記オリゴヌクレオチド部分鎖は、ギャップが、前記アニーリングした部分鎖によって形成された二重鎖ＤＮＡ配列中に存在するように設計される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記二重鎖ＤＮＡ配列中に存在する前記ギャップが、ＤＮＡポリメラーゼを用いて埋められる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＤＮＡ配列を作製する方法であって、該方法は以下：
（ａ）該ＤＮＡ配列の構築のために、適切なオリゴヌクレオチド部分鎖を選択する工程であって、該部分鎖は、二重鎖ＤＮＡ配列が、アニーリングされた部分鎖によって形成されるように設計される、工程；
（ｂ）  固体支持体上の該部分鎖の並行合成工程であって、オリゴヌクレオチド合成の工程あたり９８％以上のカップリング効率が達成される、工程；
（ｃ）該部分鎖をアニーリングさせる工程；
（ｄ）該ＤＮＡ配列を作製するために、該アニーリングした部分鎖を連結する工程、
を包含する、方法。
【請求項２８】
短ＲＮＡ分子のライブラリーを作製する方法であって、該方法は以下：
（ａ）基材上に選択されたオリゴヌクレオチドのアレイを合成する工程であって、ここで、該選択されたオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含み、該基材は、該基材上の特異的な反応部位に保護開始部分を含む工程であって、該工程は以下：
（ｉ）該基材を、一種以上の光試薬前駆物質を含有する溶液が該保護開始部分と接触するように、該溶液と接触させる工程；
（ｉｉ）該特異的な反応部位を単離する工程；
（ｉｉｉ）一種以上の光生成性試薬を産生するために、単離反応部位に選択的に照射する工程であって、該光生成性試薬が、該照射された反応部位で、該開始部分を脱保護化するのに有効である、工程；
（ｉｖ）該基材を、非保護反応部位および保護反応部位を含む単量体と、該単量体の該非保護反応部位が該脱保護開始部分とカップリングして、結合した単量体および保護開始部分を作製する条件下で、接触させる工程；
（ｖ）選択されたオリゴヌクレオチドのアレイが合成されるまで工程（ｉ）−工程（ｉｖ）を繰り返す工程；
を包含し、該選択されたオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ増幅のための二つの特異的なプライマー配列を含む、工程；
（ｂ）該固体支持体から該選択されたオリゴヌクレオチドを切断する工程；
（ｃ）該特異的なプライマー配列を識別するプライマーを使用して、該選択されたオリゴヌクレオチドを増幅する工程であって、該選択されたオリゴヌクレオチドの配列を含む二重鎖ＤＮＡが作製される、工程；
（ｄ）前記ＲＮＡプロモーター配列を識別するＲＮＡポリメラーゼを使用する、増幅された二重鎖ＤＮＡのインビトロ転写工程であって、短ＲＮＡ分子のライブラリーが作製される、工程、
を包含する、方法。
【請求項２９】
前記短ＲＮＡ分子が、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記選択されたオリゴヌクレオチドが一つ以上の逆Ｕリンカーを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記選択されたオリゴヌクレオチドが、ＲＮａｓｅ  Ａを使用して前記固体支持体から切断される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記選択されたオリゴヌクレオチドが一つ以上の制限酵素部位を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ３  ＲＮＡ  ポリメラーゼからなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
ＤＮＡサンプル中の大規模な一塩基多型（ＳＮＰ）検出の方法であって、該方法は以下：
（ａ）該ＤＮＡサンプルからアンプリコンのアレイを増幅するプライマー対のアレイを設計する工程であって、各単位増幅配列は、一つ以上のＳＮＰを含む、工程；
（ｂ）基材上にプライマー対のアレイを合成する工程であって、該基材は、該基材上の特定の反応部位に保護開始部分を含む工程であって、該工程は以下：
（ｉ）該基材を、一種以上の光試薬前駆物質を含有する溶液と接触させる工程であって、該溶液が該保護開始部分と接触する、工程；
（ｉｉ）該特異的反応部位を単離する工程；
（ｉｉｉ）一種以上の光生成性試薬を製造するために、単離反応部位に選択的に照射する工程であって、該光生成性試薬が、該照射された反応部位で、該開始部分を脱保護化するために有効である、工程；
（ｉｖ）該基材を、非保護反応部位および保護反応部位を含む単量体と、該単量体の該非保護反応部位が該脱保護開始部分とカップリングして、結合した単量体および保護開始部分を作製する条件下で、接触させる、工程；
（ｖ）選択されたオリゴヌクレオチドのアレイが合成されるまで、工程（ｉ）−工程（ｉｖ）を繰り返す、工程；
を包含する工程であって、単一のプライマー対が、該基材上の各反応部位で合成される、工程；
（ｂ）該プライマー対を使用する、該アンプリコンのＤＮＡ増幅工程であって、単一のアンプリコンが、該基材上の各反応部位で作製される、工程；
（ｃ）各単位増幅配列中に存在する一つ以上のＳＮＰの検出工程、
を包含する、方法。
【請求項３５】
各単位増幅配列中に存在する一つ以上のＳＮＰが、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、ミスマッチハイブリダーゼーション、一塩基伸長アッセイ、対立遺伝子特異的制限エンドヌクレアーゼ切断に基づいたＲＦＬＰ検出、または対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションによって検出される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＤＮＡサンプル中の大規模な一塩基多型（ＳＮＰ）検出の方法であって、該方法は：
（ａ）該ＤＮＡサンプルから単位増幅配列のアレイを増幅するプライマー対のアレイを設計する工程であって、各プライマー対は、特定のＳＮＰが該ＤＮＡサンプル中に存在する場合、単位増幅配列のみを増幅する、工程；
（ｂ）基材上でプライマー対のアレイを合成する工程であって、該基材が該基材上の特定の反応部位で保護開始部分を含む工程であって、該工程は、以下：
（ｉ）該基材を、一種以上の光試薬前駆物質を含有する溶液と接触させる工程であって、該溶液が該保護開始部分と接触する、工程；
（ｉｉ）該特異的反応部位を単離する工程；
（ｉｉｉ）一種以上の光生成性試薬を製造するために、単離反応部位に選択的に照射する工程であって、該光生成性試薬が、該照射された反応部位で、該開始部分を脱保護するために有効である、工程；
（ｉｖ）該基材を、非保護反応部位および保護反応部位を含む単量体と、該単量体の非保護反応部位が脱保護開始部分とカップリングして、結合した単量体および保護開始部分を作製する条件下で、接触させる工程；
（ｖ）選択されたオリゴヌクレオチドのアレイが合成されるまで、工程（ｉ）−工程（ｉｖ）を繰り返す、工程；
を包含する工程であって、単一のプライマー対が、該基材上の各反応部位で合成される、工程；
（ｂ）該プライマー対を使用する、該アンプリコンのＤＮＡ増幅工程であって、単位増幅配列の該増幅が、該ＤＮＡサンプル中の特定のＳＮＰの存在を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項３７】
オリゴヌクレオチドライブラリーを作製する方法であって、該方法は以下：
（ａ）基材上に選択されたオリゴヌクレオチドのアレイを合成する工程であって、ここで、該選択されたオリゴヌクレオチドは、二つの特異的プライマー配列および配列の可変領域を含み、該基材は、該基材上の特異的な反応部位に保護開始部分を含む工程であって、該工程は以下：
（ｉ）該基材を、一種以上の光試薬前駆物質を含有する溶液と接触させる工程であって、該溶液が該保護開始部分と接触する、工程；
（ｉｉ）該特異的反応部位を単離する工程；
（ｉｉｉ）一種以上の光生成性試薬を製造するために、単離反応部位に選択的に照射する工程であって、該光生成性試薬が、前記照射された反応部位で、該開始部分を脱保護化するために有効である、工程；
（ｉｖ）該基材を、非保護反応部位および保護反応部位を含む単量体と、該単量体の該非保護反応部位が脱保護開始部分とカップリングして、結合した単量体および保護開始部分を作製する条件下で、接触させる工程；
（ｖ）選択されたオリゴヌクレオチドのアレイが合成されるまで工程（ｉ）−工程（ｉｖ）を繰り返す工程；
（ｂ）該固体支持体から該選択されたオリゴヌクレオチドを切断する工程；
（ｃ）該特異的なプライマー配列を識別するプライマーを使用する、該選択されたオリゴヌクレオチドのＤＮＡ増幅工程であって、それによって、該選択されたオリゴヌクレオチドの可変領域配列を含む二重鎖ＤＮＡ配列のオリゴヌクレオチドライブラリーを作製する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦政府によって資金援助された研究または開発に関する記述）
国防総省国防高等研究事務局。
【０００２】
（「マイクロフィッシュ添付物」に対する参照）
非適用。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
（１．発明の分野）
本開示は、高分子合成およびその適用の分野に関連し、特に、既知配列のオリゴヌクレオチドのプールを作製するための、微小流体マイクロアレイプラットフォームを使用する高処理能力オリゴヌクレオチド合成に関連する。
【０００４】
（２．関連技術の記述）
バイオテクノロジーの分野で、最近二、三十年に、驚くべき進歩が生じたが、これは、主に、ゲノム技術および分子生物学の分野の進展のためである。多様な種の天文学的な量の遺伝子コードが作製され、分子生物学の進歩は、また、遺伝子操作として知られる種々の遺伝子要素の組合せを分析、操作および構築するための手段を提供している。これらのＤＮＡ／ＲＮＡ技術は、種々の機能を有する核酸物質の断片を、新規の方法で一緒に結合することによって、新規の有用な核酸配列を作製する。構築された合成配列および結合した核酸配列は、既知の遺伝子、新規遺伝子、プライマー、プロモーター、鋳型、または多くの周知の生化学的適用および生物医学的適用（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、等温複製、転写および連結による鎖長伸長が挙げられる）に対する任意の機能的なモジュールの、複製であり得る。
【０００５】
主に構築物を形成するための遺伝物質を操作するための従来の分子生物学的方法は、酵素に基づいた方法（例えば、核酸フラグメントを切断し、一緒に貼り付けるための制限エンドヌクレアーゼ酵素およびリガーゼ酵素の使用）および新規にサブクローニングしたフラグメントを増幅するためのクローニングベクターの使用を包含する。ＰＣＲは、所望の核酸フラグメントを合成および増幅するための別の強力な方法である。従来の方法は、供給源（例えば、ゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー）からの核酸物質の単離、または生物学的供給源（例えば、細胞、組織サンプルなど）からの直接の単離を包含する。これらの方法は、遅く、大きな労働力を要し、単調であり、そして、多くの場合、さらなる操作のために所望の核酸物質を単離するために、どれくらいの時間を要するか予測不可能である。さらに、ベクターおよびクローニングの使用を介した構築物の形成は、多くの場合、予測不可能でありかつさらに進行を遅らせる事象（例えば、ランダム突然変異形成、組換え、欠失、挿入および再配列）を含む。遺伝子操作の従来の方法の別の不都合は、核酸のより大きなフラグメントは、操作するのがますます困難になることである。
【０００６】
分子生物学の従来の方法はまた、種々のタンパク質の機能を解明し、よりよく理解するために使用され得る構築物を作製するために使用される。系統的な突然変異形成は、タンパク質の配列中の単一のアミノ酸変化の影響を受けたタンパク質の機能を分析するための強力な技術であるが、これらの正確な変異をタンパク質配列中に作製することもまた、大きな労働力を要し、多大な時間を要する。例えば、分子進化方法論は、所望の特性を有するタンパク質を操作するために、非常に強力であることが分かっている。このような方法論としては、ＰＣＲ、カセット式変異誘発、およびＤＮＡシャッフリングとして公知の種々の集合的な方法が挙げられる。ＰＣＲは、既知または未知の配列のフラグメントの混合物を変異誘発させるために使用され得るが、公開されているＰＣＲプロトコルは、ポリメラーゼの低進化性に苦しみ、従って、多くの場合、平均的な大きさの遺伝子に対して、所望のランダムな変異誘発を産生し得ない。この制限は、さらなる研究のための変異配列のアレイの作製に対するＰＣＲの実際的な適用性を制限する。
【０００７】
カセット変異形成は、最適化されるべき遺伝子の特定領域を、合成により突然変異形成したオリゴヌクレオチドで置換する。従って、入手され得る最大限の情報の内容は、統計的に、配列ブロックの大きさおよびランダム配列の数によって制限される。これは、統計的な障害を構成し、現在は最善ではないが、より長い期間の潜在能力を有する他の配列のファミリーを除去する。
【０００８】
近年開発されたＤＮＡシャッフリング法は、遺伝子間の組み換えを利用して、遺伝子が進化され得る速度を劇的に加速させる。ＤＮＡシャッフリング法の例としては、セクシャルＰＣＲ（米国特許第６，４４０，６６８号および同第５，９６５，４０８号）、ならびに「付着伸長（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）」プロセス（ＳｔＥＰ）（米国特許第６，１５３，４１０号および同第６，１７７，２６３号）が挙げられる。セクシャルＰＣＲおよびＳｔＥＰは、ランダムキメラ形成を用いたインビトロ組み換えによってタンパク質を改良するために用いられてきたが、これらの方法論は、シャッフルされない親クローンの低交差率および高いバックグラウンドによって制限される。加えて、これらの方法が、配列相同性の高い領域に適用される場合、それらは、比較的効率が悪く、少数の変異体のみをもたらす。ＤＮＡシャッフリングの改良法（例えば、ハイブリッド酵素の生成のための反復切断（ＩＴＣＨＹ）（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ７：２１３９−２１４４，１９９９）および一過性鋳型上でのランダムキメラ形成（ＲＡＣＨＩＴＴ）（Ｃｏｃｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １９：３５４−３５９，２００１））でさえも、多数の交差現象を引き起こさず、したがって多数の変異体はなお、これらの方法論から逃れる。
【０００９】
多くの多重化用途（例えば、ＰＣＲを用いた、いくつかの異なるＤＮＡ鋳型からのＤＮＡ同時増幅）において、異なる配列の複数のプライマーが必要とされる。伝統的に、これらのプライマーは、別々の反応容器内で合成され、そしてそれらの使用前に組み合わせられる。これらのプロセスは、各配列について、操作（合成、脱保護、および反応容器の開梱）の繰り返しを必要とする。これは、合成の初めにおける固体支持体物質の計量の誤差に起因して、高率で、非等量のプライマーを混合するという結果をもたらす。並行合成プロセスによって、多重化用途のためのオリゴヌクレオチドのプールを生成するための労力および時間の量を有意に減少させることは、非常に望ましい。
【００１０】
多くの多重化用途（例えば、いくつかのＲＮＡ配列の同時転写）において、複数の鋳型ＤＮＡ配列が必要とされる。伝統的に、これらの鋳型は、別々の反応容器内で合成されて、使用前に組み合わせられる。これらのプロセスは、各配列について、操作（合成、脱保護、および反応容器の開梱）の繰り返しを必要とする。これは、合成の初めにおける固体支持体物質の計量の誤差に起因して、高率で、非等量のプライマーを混合するという結果をもたらす。並行合成プロセスによって、多重化用途のためのオリゴヌクレオチドのプールを生成するための労力および時間の量を有意に減少させることは、非常に望ましい。この鋳型は、直接合成され得、そして鋳型のさらなるコピーは、ＰＣＲを用いて得られ得る。
【００１１】
したがって、多様な配列の多数のオリゴヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドのプール；インサートとして使用され得るか、または高分子にアセンブリされ得るか、またはＤＮＡ合成もしくはＲＮＡ合成のための鋳型として構築され得る）を生成するためのハイスループットシステムの必要性がある。好ましくは、これらのオリゴヌクレオチドのプールは、アセンブリされた高分子（例えば、ＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、遺伝子、染色体フラグメント、染色体、調節領域、発現構築物、遺伝子治療構築物、ワクチン構築物、相同組み換え構築物、ベクター、ウイルスゲノム、細菌ゲノムなど）を効率的かつ経済的に生成するために使用される。加えて、高分子をアセンブリするための本方法は、好ましくは、信頼でき、かつ迅速な様式で、的を絞った核酸配列の突然変異誘発を可能にし、したがって分析（例えば、遺伝子、遺伝子フラグメント、ＤＮＡフラグメント、ｍＲＮＡ、ＲＮＡもしくはタンパク質の機能の決定、潜在的抗原をスクリーニングすること、または薬物もしくは他の分子の相互作用のスクリーニング）のための配列の系統的な突然変異誘発を可能にする。
【００１２】
オリゴヌクレオチドを生成するための、伝統的な合成装置上での既存の多重化並行ＤＮＡ合成法（反応毎に一配列を生成する）の使用は、多量のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドのプール）の生成のための必要性を満たし得ない。別々の反応容器内での複数の反応の操作には、労力がかかり、時間がかかり、かつ費用がかかる。加えて、この機器は、小型化されにくい。現行のオリゴヌクレオチドアレイ合成技術がある（例えば、感光性基に保護されたヌクレオチドの光脱保護を用いる；米国特許第５，１４３，８５４号）。しかし、これらのオリゴヌクレオチド合成法は、低いカップリング効率に起因して、低い合成収率を有し、したがって多くの用途にとって十分な長さのオリゴヌクレオチドを生成し得ない（オリゴヌクレオチド合成は約２５マーに限定される）。例えば、この長さのオリゴヌクレオチドを使用して大きなＤＮＡ配列もしくは遺伝子産物をアセンブリおよび合成することは、非現実的であり、そしてこれらの技術を用いてオリゴヌクレオチドを合成する場合に見られる高いエラー率は、容認できない。さらに、これらの技術は、オリゴヌクレオチドを合成するために平面を使用することを基本とするが、これらは、効率的に切断されて少量で回収されなければならない。他の重要な要件は、切断されたオリゴヌクレオチドが、後に続く化学的用途または生物学的用途のため、３’−官能基および／もしくは５’−官能基（例えば、ヒドロキシル基もしくはリン酸基）を有することである。
【００１３】
現行の多重化並行ＤＮＡ合成法はまた、ロボットを利用したアプローチおよびインクジェットベースのアプローチを包含する（Ｒａｙｎｅｒら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８：７４１−４７，１９９８）。これらの技術は、ロボット機器を用いて９６個のＤＮＡ配列を別々の反応容器内で合成するために、もっともしばしば使用される。次いで、配列が脱保護され、固体支持体から切断されて、種々の分子生物学的用途に使用される。９６ウェルタイタープレート上でオリゴヌクレオチドを生成し得る多重化合成装置は、いくつかのオリゴヌクレオチド製造業者および中核施設で使用される。インクジェット印刷プロセスを用いて合成されたＤＮＡ配列は、平面に連結されたままであり、その固定化形態で利用される（Ｈｕｇｈｅｓら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９：３４２−４７，２００１）。これらのプロセスは、従来の合成化学を使用して高純度オリゴヌクレオチドを生成し得るが、この配列は、別々の反応容器内で合成され、このことは、これらのオリゴヌクレオチドの種々の用途へのその後の使用を難しくする。したがって、これらのプロセスの機器の小型化および完全自動化は困難であり、このことは、迅速な多重化並行ＤＮＡ合成に関して、これらのシステムを非現実的にしている。
【００１４】
他の方法および設備もまた、オリゴヌクレオチドの効率的な多重生成を実現するために試みられてきた。多重化に適切であり得る一つの注目すべき微少流体デバイスは、バルブ、ポンプ、絞り排出管、ミキサー、および他の液体操作構造を備える（米国特許第５，８４６，３９６号）。しかし、この流体デバイスの実際的な用途は限定される。なぜなら、このデバイスは、非常に複雑であって（このデバイスは、最小で８層の流体構造からなる）、製造費用が高く、そして拡張性が限定されるからである。加えて、使用される電極ポンプは、２００ボルト〜３００ボルトの高電圧を必要とし、各ポンプは、別々の線のセットによって制御される。数千のこのようなポンプを操作するための制御システムを構築することは、困難であり、そしてポンプ動作の挙動（方向および速度）は、使用される溶液および溶媒の誘電特性および導電性に大きく依存する。代表的に、オリゴヌクレオチド合成は、３つの異なる溶媒中の少なくとも１０の異なる溶液に関与し、これらのポンプがこれら全ての溶液を適切に操作し得るということは、まだ示されていない。オリゴヌクレオチド合成のための好ましい微少流体デバイスは、１層のみの流体デバイスからなり、数十万〜数万の反応セルを含むように容易に規模を変更され得、そしてあらゆる型の溶液／溶媒を扱い得る（例えば、米国特許出願番号０９／８９７，１０６、参考として本明細書中で援用される）。
【００１５】
ＤＮＡマイクロアレイ製造のためのコンビマトリクス（Ｃｏｍｂｉｍａｔｒｉｘ）で開発された電気化学反応ベースのオリゴヌクレオチド合成法（米国特許第６，４４４，１１１号）もまた、多重化合成用途についての潜在力を有する。この技術の核心は、電流で活性試薬（例えば、酸）を生成する電気化学反応である。この技術に関する問題としては、用いられる電極化学反応の効率性および潜在的な副反応、ならびに反応部位がどの程度よく単離されて隣接する反応部位間での活性試薬の混合（「相互干渉」効果）を防ぐか、ということが挙げられる。この反応効率は、合成されたオリゴヌクレオチドの最終品質に有意な効果を及ぼし、そしてあらゆる「相互干渉」効果は、これらの配列の忠実度を有意に低下させる。
【００１６】
オリゴヌクレオチドの並行合成に関する光リソグラフィーのアプローチは、感光性合成化学反応とデジタルマイクロミラーアレイ投射技術との組合せであり、Ｓｉｎｇｈ−Ｇａｓｓｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：９７４−９７８，１９９９）によって示された。しかし、このアプローチの主な限界は、感光性脱保護アプローチと同じ：低収率化学反応の使用、である（Ｐｉｒｒｕｎｇら、Ｊ．Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ．６０：６２７０−６２７６，１９９５；ＭｃＧａｌｌら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：５０８１−５０９０，１９９７）。例えば、この化学反応を用いた２５マーの産物の純度レベルは、１０％より低い可能性がある。この方法からの合成は、実際問題として、２４マーに限定される。この低収率の限界により、感光性化学反応は、プライマー、鋳型としておよび所望の高分子へのアセンブリのために使用されるのに十分な精度と長さとを有するオリゴヌクレオチドの生成には不適切である。したがって、これまでの技術が、並行ＤＮＡ合成によって短時間で高品質のオリゴヌクレオチドプール（数時間で数百から数千、数万、数十万のオリゴヌクレオチド）を生成し得ないことは、合成されたオリゴヌクレオチドの多くの効力ある用途を制限している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
（発明の簡単な要旨）
本開示は、固体支持体上での多重化並行オリゴヌクレオチド合成のための、効率的かつ再現性のある方法を提供する。この方法は、オリゴヌクレオチドの生成およびアセンブリによってＤＮＡ配列を生成するために使用され得る。好ましい実施形態において、合成されたオリゴヌクレオチドは、迅速にアセンブリされて長いＤＮＡ配列（例えば、ＤＮＡ配列、遺伝子フラグメント、遺伝子、トランスポゾン、染色体フラグメント、染色体、調節領域、発現構築物、遺伝子治療構築物、ウイルス構築物、相同組み換え構築物、ベクター、ウイルスゲノム、細菌ゲノムなど）を形成する。この方法は、多用途であり、あらゆる任意のＤＮＡ配列の合成を可能にする。
【００１８】
別の好ましい実施形態において、合成されたオリゴヌクレオチドは、固体表面から切断されて、オリゴヌクレオチドのプール（数百から数千、数万、数十万のオリゴヌクレオチド）を生成する。本開示は、多重化並行ＤＮＡ合成のプロセスを有意に単純化することによって、これまでの公知のオリゴヌクレオチドを合成する方法の欠点を克服し、オリゴヌクレオチドのプールの生成に必要とされる時間を減少させ、プール内に生成される異なるオリゴヌクレオチドの数を増加させる。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドのプールは、公知の配列である。このオリゴヌクレオチドのプールの用途としては、限定ではなく、このオリゴヌクレオチドを長いＤＮＡ配列の生成のために使用することが挙げられ、この長いＤＮＡ配列としては、あらゆる任意の配列；ＰＣＲ鋳型増幅のためのプライマー；多重化ＰＣＲおよび転写のためのプライマー、短いＲＮＡフラグメント（例えば、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）もしくはｓｉＲＮＡ（短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ））；ＳＮＰ（一塩基多型）検出およびサンプル調製のためのＤＮＡフラグメント；ならびにＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、および／もしくはコンビナトリアルライブラリが挙げられる。オリゴマーのプールもまた、ゲノムおよびプロテオームの用途（デノボのタンパク質設計、ワクチン開発、オリゴヌクレオチドベースの薬物スクリーニングを含む薬物スクリーニング（分子進化）を含む）、および大きなオリゴヌクレオチドのプールの使用が必要とされる多くの他の用途のためのライブラリを提供するために使用され得る。
【００１９】
多重化並行オリゴヌクレオチド合成は、合成されたオリゴヌクレオチドの生成もしくはアセンブリによって野生型もしくは改変された部分長もしくは全長ＤＮＡ配列を生成するために使用され得る。好ましい実施形態において、合成されたオリゴヌクレオチドは、迅速にアセンブリされて長いＤＮＡ配列（例えば、ＤＮＡ配列、遺伝子フラグメント、遺伝子、トランスポゾン、染色体フラグメント、染色体、調節領域、発現構築物、遺伝子治療構築物、ウイルス構築物、相同組み換え構築物、ベクター、ウイルスゲノム、細菌ゲノムなど）を形成する。これらのオリゴヌクレオチドの他の用途としては、ＰＣＲ増幅のための鋳型ライブラリ、および多重化ＰＣＲもしくは転写のためのプライマーライブラリの生成が挙げられる。他の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドから長いＤＮＡ配列への迅速な合成およびアセンブリは、新たなタンパク質設計、ワクチン開発、分析（例えば、遺伝子、遺伝子フラグメント、ＤＮＡフラグメント、ｍＲＮＡ、ＲＮＡもしくはタンパク質の機能の決定、潜在的抗原をスクリーニングすること、または薬物もしくは他の分子相互作用のスクリーニング）のための配列の系統的な突然変異を可能にする。
【００２０】
本開示は、有利なことに、現行の化学反応を利用してオリゴヌクレオチドを合成し、そして少なくとも１つの反応試薬を光試薬前駆物質に置き換える。したがって、先行技術の方法（感光性保護基を含むモノマーもしくは反応媒体として高分子コーティング層を必要とする）と異なり、本方法は、従来の化学反応のモノマーを使用し、そして従来の合成化学反応およびプロトコールのわずかな変更を必要とする。本開示に採用された従来の化学反応は、慣習的に、オリゴヌクレオチド合成の１工程あたり９８．５％よりも高い収率を実現する。これは、感光性保護基を用いるこれまでの方法によって得られる８５〜９５％の収率を超える有意な改善である。Ｐｉｒｒｕｎｇら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：６２７０−６２７６，１９９５；ＭｃＧａｌｌら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：５０８１−５０９０，１９９７；ＭｃＧａｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１３５５５−１３５６０，１９９６。この改善された漸進的収率は、診断用途および臨床的用途のための高品質のオリゴヌクレオチドアレイのために重要であり、より長い長さ（例えば、２５、５０、１００、１５０、もしくは２００ヌクレオチド）のオリゴヌクレオチドの合成を可能にする。これらの長さのオリゴヌクレオチドは、これまでの公知の方法（感光性保護基を使用するような方法）を用いて生成され得ない。
【００２１】
本開示の好ましい実施形態は、１つ以上の保護された開始部分を含有する単離された反応部位を含む基材上での、選択されたマルチマーアレイの並行合成のための方法であって、この方法は、以下の工程：
（ａ）単離された反応部位を選択的に照射して、この照射を受けた単離された反応部位に脱保護された開始部分を生成する工程；
（ｂ）１つ以上のモノマーをこの脱保護された開始部分にカップリングさせる工程；
（ｃ）選択されたマルチマーのアレイが合成されてしまうまで工程（ａ）〜（ｂ）を繰り返す工程、
を包含し、ここで、この合成されたマルチマーは、長さ約７５モノマー〜約２００モノマーのマルチマーを含む。
【００２２】
別の好ましい実施形態において、合成されたマルチマーは、長さ約６０モノマー〜約１００モノマーのマルチマー、長さ約１００モノマー〜約１７５モノマーのマルチマー、または長さ約１２５モノマー〜約１５０モノマーのマルチマーを含む。好ましくは、選択されたマルチマーは、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ペプチド、または炭水化物からなる。
【００２３】
上記の方法において、脱保護された開始部分は、好ましくは、以下：基材と１つ以上の光試薬前駆物質を含む液体溶液とを接触させて、この液体溶液がこの開始部分に接触すること；および単離された反応部位を選択的に照射して、１つ以上の光生成性試薬を生成する（ここで、この光生成性試薬は、照射を受けた単離された反応部位で開始部分を脱保護する効力を有する）ことによって生成される。好ましい実施形態において、光試薬前駆物質は、酸性前駆物質および塩基性前駆物質からなる群から選択される。別の好ましい実施形態において、反応に用いられたモノマーは、保護されない反応部位および保護された反応部位を含み、そして好ましくは、ヌクレオホスホルアミダイト、ヌクレオホスホネートおよびそれらのアナログからなる群から選択される。なお別の好ましい実施形態において、保護された開始部分は、酸不安定性（ａｃｉｄ−ｌａｂｉｌｅ）基によって保護され、かつ／またはリンカー分子を含み、各リンカー分子は、この酸感受性基によって保護された反応性官能基を有する。
【００２４】
本開示の別の好ましい実施形態は、ＤＮＡ配列を生成する方法であって、この方法は、以下：
ａ）このＤＮＡ配列のアセンブリに適切なオリゴヌクレオチド部分鎖を選択する工程（ここで、この部分鎖は、このＤＮＡ配列がアニーリングされた部分鎖によって形成されるように設計される）；
ｂ）固体支持体上での部分鎖の並行合成（ここで、この部分鎖は、長さ約７５ヌクレオチチド〜約１５０ヌクレオチドである）；
ｃ）この部分鎖をアニーリングする工程；
ｄ）アニーリングした部分鎖を連結してこのＤＮＡ配列を生成する工程、
を包含する。
【００２５】
好ましい実施形態において、上記の方法によって生成されたＤＮＡ配列は、長さ約１００ｂｐ〜約１，０００ｂｐであり、好ましくは長さ１，０００ｂｐ〜１０，０００ｂｐであり、そして最も好ましくは、長さ１０，０００ｂｐ〜１００，０００ｂｐである。あらゆる任意のオリゴヌクレオチドのセットを合成してＤＮＡ配列をアセンブリする能力を与えることによって、種々の異なるＤＮＡ配列（限定ではなく、遺伝子、遺伝子フラグメント、トランスポゾン、調節領域、転写機構、発現構築物、遺伝子治療構築物、相同組み換え構築物、ウイルス構築物、ウイルスゲノム、ベクター、および人工染色体が挙げられる）が、上記の方法を用いて生成され得る。好ましくは、合成されたオリゴヌクレオチド部分鎖は、この部分鎖がアニーリングする前に、好ましくは制限エンドヌクレアーゼ酵素を用いて、固体支持体から切断される。または、このオリゴヌクレオチド部分鎖が１つ以上のリバースＵリンカーを含むように合成される場合、これらは、好ましくはＲＮａｓｅ  Ａによって固体支持体から切断される。あるいは、所定のオリゴヌクレオチド部分鎖のセットが、この部分鎖がアニーリングされる前に固体支持体から切断され、次いで、これらの所定の部分鎖は、好ましくは固体支持体に結合された部分鎖にアニーリングされる。別の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチド部分鎖は、アニーリングされた部分鎖によって形成された二重鎖ＤＮＡ配列中に間隔が存在し、そしてこの間隔が、好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼによって満たされるように設計される。
【００２６】
本開示のなお別の好ましい実施形態は、ＤＮＡ配列を生成する方法であって、この方法は、以下：
ａ）このＤＮＡ配列のアセンブリに適切なオリゴヌクレオチド部分鎖を選択する工程（ここで、この部分鎖は、二重鎖ＤＮＡ配列がアニーリングされた部分鎖によって形成されるように設計される）；
ｂ）固体支持体上での部分鎖の並行合成（ここで、オリゴヌクレオチド合成の一工程あたり、９８％以上のカップリング効率が達成される）；
ｃ）この部分鎖をアニーリングする工程；
ｄ）アニーリングした部分鎖を連結してこのＤＮＡ配列を生成する工程、
を包含する。
【００２７】
本開示の好ましい実施形態は、短いＲＮＡ分子のライブラリを生成する方法であって、この方法は、以下：
ａ）基材上で、選択されたオリゴヌクレオチドのアレイを合成する工程（ここで、この選択されたオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含み、この基材は、基材上の特異的反応部位に保護された開始部分を含む）であって、以下：
ｉ）この基材と１つ以上の光試薬前駆物質を含む液体溶液とを接触させて、この液体溶液が保護された開始部分に接触する工程；
ｉｉ）特定の反応部位を単離する工程；
ｉｉｉ）単離された反応部位を選択的に照射して、１つ以上の光生成性試薬を生成する工程（ここで、この光生成性試薬は、照射を受けた単離された反応部位で開始部分を脱保護する効力を有する）；
ｉｖ）保護されないモノマーの反応部位が脱保護された開始部分とカップリングして結合されたモノマーと保護された開始部分とを生成するような条件下で、この基材とモノマーとを接触させる工程（ここで、このモノマーは、保護されない反応部位および保護された反応部位を含む）；
ｖ）この選択されたオリゴヌクレオチドのアレイが合成されてしまうまで、工程（ｉ）〜（ｉｖ）を繰り返す工程、
を包含し、ここで、選択されたオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ増幅のための２つの特異的プライマー配列を含む、工程；
ｂ）この選択されたオリゴヌクレオチドの固体支持体からの切断；
ｃ）特異的プライマー配列を認識するプライマーを用いて、この選択されたオリゴヌクレオチドを増幅する工程（ここで、この選択されたオリゴヌクレオチドの配列を含む二本鎖ＤＮＡが生成される）；
ｄ）ＲＮＡプロモーター配列を認識するＲＮＡポリメラーゼを用いた、この増幅された二本鎖ＤＮＡのインビトロ転写（ここで、短いＲＮＡ分子のライブラリが生成される）、
を包含する。
【００２８】
本方法の好ましい実施形態において、生成された短いＲＮＡ分子は、短い干渉性のＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子である。別の好ましい実施形態において、選択されたオリゴヌクレオチドは、１つ以上のリバースＵリンカーを含み（このリンカーは、この選択されたオリゴヌクレオチドを、ＲＮａｓｅ  Ａによって固体支持体から切断されるようにする）、かつ／または１つ以上の制限酵素部位を含む。上記の方法におけるインビトロ転写に使用されるＲＮＡポリメラーゼは、好ましくは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、またはＴ３  ＲＮＡポリメラーゼである。
【００２９】
本開示の別の好ましい実施形態は、ＤＮＡサンプルにおける大規模一塩基多型（ＳＮＰ）検出の方法であって、この方法は、以下：
ａ）ＤＮＡサンプルからアンプリコンのアレイを増幅するプライマー対のアレイを設計する工程（ここで、各アンプリコンは、１つ以上のＳＮＰを含む）；
ｂ）基材上に、このプライマー対のアレイを合成する工程（ここで、この基材は、この基材上の特異的反応部位に、保護された開始部分を含む）てあって、以下：
ｉ）この基材と１つ以上の光試薬前駆物質を含む液体溶液とを接触させて、この液体溶液が保護された開始部分に接触する工程；
ｉｉ）特定の反応部位を単離する工程；
ｉｉｉ）単離された反応部位を選択的に照射して、１つ以上の光生成性試薬を生成する工程（ここで、この光生成性試薬は、照射を受けた単離された反応部位で開始部分を脱保護する効力を有する）；
ｉｖ）保護されないモノマーの反応部位が脱保護された開始部分とカップリングして、結合されたモノマーと保護された開始部分とを生成するような条件下で、この基材とモノマーとを接触させる工程（ここで、このモノマーは、保護されない反応部位および保護された反応部位を含む）；
ｖ）この選択されたオリゴヌクレオチドのアレイが合成されてしまうまで、工程（ｉ）〜（ｉｖ）を繰り返す工程、
を包含し、ここで、単一のプライマー対が、基材上の各反応部位で合成される、工程；
ｂ）このプライマー対を用いた、このアンプリコンＤＮＡ増幅（ここで、単一のアンプリコンは、この基材上の各反応部位で生成される）；
ｃ）各アンプリコン中に存在する１つ以上のＳＮＰの検出；
を包含する。
【００３０】
本開示の好ましい実施形態において、各アンプリコンに存在する１以上のＳＮＰは、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、ミスマッチハイブリダイゼーション、一塩基伸長アッセイ、対立遺伝子特異的制限エンドヌクレアーゼ切断に基づくＲＦＬＰ検出、または対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションにより検出される。
【００３１】
本開示のなお別の好ましい実施形態は、ＤＮＡサンプル中での大規模な一塩基多型（ＳＮＰ）検出の方法であり、以下の工程を包含する：
ａ）そのＤＮＡサンプルに由来するアンプリコンのアレイを増幅するプライマー対のアレイを設計する工程であって、ここで各プライマー対は、特定のＳＮＰがそのＤＮＡサンプル中に存在する場合、アンプリコンを増幅するのみである、工程；
ｂ）そのプライマー対のアレイを基材上で合成する工程であって、ここでその基材は、その基材上の特定の反応部位において保護された開始部分を含み、この工程は、以下：
ｉ）その基材を、１以上の光試薬前駆物質を含む溶液と接触させ、その溶液が、その保護された開始部分と接触するようにする工程；
ｉｉ）その特異的反応部位を単離する工程；
ｉｉｉ）単離された反応部位を選択的に照射して、１以上の光生成性試薬を生成する工程であって、ここでその光生成性試薬は、その照射された反応部位におけるその開始部分を脱保護するに有効である、工程；
ｉｖ）モノマーの保護されていない反応部位が脱保護された開始部分とカップリングして、結合したモノマーおよび保護された開始部位を作り出すような条件下で、その基材とそのモノマーとを接触させる工程であって、ここでこのモノマーが、保護されていない反応部位および保護された反応部位を含む、工程；
ｖ）選択されたオリゴヌクレオチドのアレイが合成されるまで、工程（ｉ）〜（ｉｖ）を繰り返す工程；
を包含し、
ここで１つのプライマー対は、その基材上の各反応部位において合成される、工程；
ｂ）そのプライマー対を用いたそのアンプリコンのＤＮＡ増幅であって、ここでそのアンプリコンの増幅は、そのＤＮＡサンプル中における特定のＳＮＰの存在を示す、工程。
【００３２】
本開示の好ましい実施形態は、オリゴヌクレオチドライブラリーを作製する方法であり、以下の工程を包含する：
ａ）基材上に選択されたオリゴヌクレオチドのアレイを合成する工程であって、ここでその選択されたオリゴヌクレオチドは、２つの特異的プライマー配列および配列の可変領域を含み、ここでその基材は、その基材上の特定の反応部位において保護された開始部分を含み、この工程は、以下：
ｉ）その基材と１以上の光試薬前駆物質を含む液体溶液とを接触させ、その液体溶液がその保護された開始部分と接触するようにする工程；
ｉｉ）その特異的反応部位を単離する工程；
ｉｉｉ）単離された反応部位を選択的に照射して、１以上の光生成性試薬を生成する工程であって、ここでその光生成性試薬は、その照射された反応部位におけるその開始部分を脱保護するに有効である、工程；
ｉｖ）モノマーの保護されていない反応部位が脱保護された開始部分とカップリングして、結合したモノマーおよび保護された開始部位を作り出すような条件下で、その基材とそのモノマーとを接触させる工程であって、ここでこのモノマーが、保護されていない反応部位および保護された反応部位を含む、工程；
ｖ）選択されたオリゴヌクレオチドのアレイが合成されるまで、工程（ｉ）〜（ｉｖ）を繰り返す工程；
を包含する、工程；
ｂ）固体支持体から選択されたオリゴヌクレオチドを切断する工程；
ｃ）その特異的プライマー配列を認識するプライマーを用いた、その選択されたオリゴヌクレオチドのＤＮＡ増幅であって、それによって、その選択されたオリゴヌクレオチドの可変領域配列を含む二本鎖ＤＮＡ配列のオリゴヌクレオチドライブラリーを作製する工程。
【００３３】
（発明の詳細な説明）
本開示は、オリゴヌクレオチドの並行生成のための、一体型の微小流体マイクロアレイプラットフォームに基づいた多重並行ＤＮＡ合成システムに関する。このシステムは、光生成酸化学、並行微量流体およびプログラム可能なデジタル光制御合成装置を利用して、多くの異なる適用を有するオリゴヌクレオチドライブラリーを作製する（図１）。この技術に基づいて、好ましい実施形態において、アレイ合成化学、表面化学、デジタルフォトリソグラフィおよび微小流体の強力な組み合わせを実施する内蔵型の並行合成システムを使用して、固体基材上でオリゴヌクレオチドを合成する。好ましくは、合成されたオリゴヌクレオチドは、固体表面から切断されて、オリゴヌクレオチドのプールを生じる。他の好ましい実施形態において、本開示の方法を使用して、ＤＮＡもしくはＲＮＡのオリゴマーのプールを作製する。オリゴマーのプールのための適用としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：任意の配列を含む、長いＤＮＡ配列を作製するためのオリゴヌクレオチドの使用；ＰＣＲ鋳型増幅のためのプライマー；ＰＣＲおよび転写の多重化のためのプライマー；短いＲＮＡフラグメント（例えば、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）またはｓｉＲＮＡ（短い干渉ＲＮＡ））；ＳＮＰ（単ヌクレオチド多型）検出およびサンプル調製のためのＤＮＡフラグメント；ならびにＤＮＡライブラリー、ＲＮＡライブラリー、オリゴヌクレオチドライブラリーおよび／またはコンビナトリアルライブラリー。オリゴマーのプールをまた使用して、ゲノムおよびプロテオミクスの適用（新規タンパク質設計、ワクチン開発、薬物スクリーニング（分子進化）（オリゴヌクレオチドベースの薬物スクリーニングを含む）およびオリゴヌクレオチドの大きなプールの使用を必要とする他の適用が挙げられる）のためにライブラリーを提供し得る。
【００３４】
本開示の好ましい実施形態において、米国特許第６，４２６，１８４号（本明細書中に参考として援用される）に開示されるようなＰＧＡ化学がオリゴマーの並行生成のために本明細書中に開示される多重並行ＤＮＡ合成システムのために使用される。微小流体アレイチップを多重化反応器として使用し、Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｌｉｇｈｔ  Ｐｒｏｊｅｃｔｏｒを信頼性のある反応制御器として使用し、そして、高度に最適化された従来のホスホラミダイトおよび酸易動性保護化学を基礎をなす合成化学として使用して、開示されるシステムは、大量の並行様式かつ内蔵型の小さなデバイスにおいて、多数の高品質のオリゴヌクレオチドを生じる。
【００３５】
本明細書中に開示される好ましい実施形態において、公知の組成物の配列は、固体支持体上の公知の位置にて合成される。例えば、１ｍｍ２の領域において、少なくとも１〜４の異なる配列が存在し、少なくとも４〜１０の異なる配列が存在し、少なくとも１０〜１００の異なる配列が存在し、少なくとも１００〜４００の異なる配列が存在し、少なくとも４００〜１０，０００の異なる配列が存在し、そして、少なくとも１０，０００〜１，０００，０００の異なる配列が存在する。現在までに、従来の合成化学を使用して多数のオリゴヌクレオチドを作製するための最も効率のよいハイスループットプロセスは、機械的な液体送達および９６タイタープレートもしくは３８４タイタープレートの使用を包含した。本開示は、オリゴマーのプール、オリゴヌクレオチドのプール、およびオリゴヌクレオチドライブラリーを合成するために、スループットにおいて１０〜１０３倍の改善を提供し、そして、非常に減少した生産コストを提供する。
【００３６】
この並行合成システムをまた改変して、種々の分子（例えば、ＲＮＡ、炭化水素、有機低分子、ペプチドおよびペプチド模倣物）を合成し得る。チップ上で合成される分子は、溶液中に放出され得、生物学的アッセイおよび分子計算に適用され得、センサーもしくは細菌／ウイルス検出プローブとして使用され得、ならびに、大きな分子複合体（例えば、遺伝子、遺伝子フラグメント、トランスポゾン、調節領域、転写マシーン（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍａｃｈｉｎｅｓ）、発現構築物、遺伝子治療構築物、相同組換え構築物、ワクチン構築物、ウイルスゲノム、ベクターおよび人工染色体）へと組み立てられ得る。
【００３７】
本開示の１つの好ましい実施形態は、オリゴマー（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡのオリゴマー）のプールを直接ベクターに挿入して、特定の公知の配列の挿入を含む新しいクローンのライブラリーを作製することである。合成オリゴヌクレオチドのプールから作製され得る異なるクローンの数は、少なくとも約１００〜１，０００クローン、少なくとも約１，０００〜８，０００クローン、少なくとも約８，０００〜５０，０００クローン、および少なくとも約５０，０００〜１００，０００クローンである。本開示の別の好ましい実施形態において、オリゴマーのプールは、当業者に周知の方法（例えば、ＰＣＲ）を使用して増幅される。本開示のなお別の好ましい実施形態において、配列特異的な設計に従ってＲＮＡ配列のプールを作製するためのインビトロＲＮＡ転写のために使用される、ＤＮＡ鋳型のプールが作製される。このシステムは、慣用的な作製、ならびに、大きなオリゴヌクレオチドライブラリー、合成遺伝子およびコンビナトリアルライブラリーの使用を可能にする。
【００３８】
いくつかの技術が、本開示の実施のために必要とされており、これらとしては、例えば、以下が挙げられる：化学反応および化合物／生化学化合物のデジタルフォトリトグラフィ合成ーの光生成酸／試薬活性化（米国特許第６，４２６，１８４号、本明細書中に参考として援用される）、微小流体アレイ反応器（米国出願番号第０９／８９７，１０６号、本明細書中に参考として援用される）、オリゴヌクレオチドの酵素精製（米国出願番号第０９／３６４，６４３号、本明細書中に参考として援用される）、オリゴヌクレオチド合成、大規模ＤＮＡ合成のためのオリゴヌクレオチドライブラリー設計、微小流体マイクロアレイ反応器および光学分子を使用する一体型の並行合成システム、装置を操作するためのソフトウェアパッケージ、ならびに、本明細書中に記載されるような大規模ＤＮＡ合成のためのオリゴヌクレオチドライブラリーの設計のためのソフトウェアパッケージ。
【００３９】
（Ａ．化学反応の光生成酸／試薬活性化）
本発明のＤＮＡシステムは、好ましくは、かつ、有利なことには、光生成酸（ＰＧＡ）を使用して、高度に並行な製造プロセスにおいて従来のまたは標準的なオリゴヌクレオチド合成化学を可能にする。固体表面上の分子配列アレイの並行合成のためのＰＧＡ化学の使用は、最初に、米国特許第６，４２６，１８４号（本明細書中に参考として援用される）に開示された。ＰＧＡ化学は、反応においてオリゴヌクレオチドを合成するための試薬のうちの少なくとも１つを光−試薬前駆物質と置き換える。従って、光易動性保護基を含有するモノマー、または、反応媒体としてポリマーコーティング層を必要とする以前に知られている方法とは異なり、本開示は、従来の化学のモノマーを使用し、従来の合成化学およびプロトコールの最低限のバリエーションを必要とする。さらに、チップ上でオリゴヌクレオチドを合成するための以前の方法において使用された特別な光易動性基で保護されたモノマーは、短い有効期限を有するので、大量に保存され得ない。
【００４０】
本開示により適合される光生成酸を利用する従来の化学は、慣用的に、チップ上でのフォトリトグラフィック並行合成のために光易動性保護基を使用する以前から公知の方法により得られる８２〜９７％の収率および低い純度の生成物よりもかなり良い、オリゴヌクレオチドの合成ステップあたり９７〜９９％より良い収率を達成する。Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７−７３（１９９１）；Ｐｉｒｒｕｎｇら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：６２７０−６２７６，（１９９５）；ＭｃＧａｌｌら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：５０８１−５０９０（１９９７）；ＭｃＧａｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１３５５５−１３５６０（１９９６）。この改善した段階的収率は、診断適用および臨床適用のための高品質オリゴヌクレオチドアレイを合成するために重要であり、そしてまた、かなり長い長さのオリゴヌクレオチド（例えば、５０〜２００ヌクレオチド）の合成を可能にする。例えば、５０マーのオリゴヌクレオチドを合成するために、９２％の段階的収率は、０．９２５０＝１．５％のみの合成オリゴヌクレオチドが完全長生成物となり、一方で、９９％の段階的収率は、０．９９５０＝６０．５％の合成オリゴヌクレオチドが完全長生成物となる。合成完全長オリゴヌクレオチドの割合におけるこの劇的な増加は、チップ上でのアッセイのためにかなりの感受性を生じ、かつ、作製されるオリゴヌクレオチドのプールへの適用数が増加する。
【００４１】
好ましい実施形態において、ここで開示される化学を使用して、約４０ヌクレオチド長、約４１ヌクレオチド長、約４２ヌクレオチド長、約４３ヌクレオチド長、約４４ヌクレオチド長、約４５ヌクレオチド長、約４６ヌクレオチド長、約４７ヌクレオチド長、約４８ヌクレオチド長、約４９ヌクレオチド長、約５０ヌクレオチド長、約５１ヌクレオチド長、約５２ヌクレオチド長、約５３ヌクレオチド長、約５４ヌクレオチド長、約５５ヌクレオチド長、約５６ヌクレオチド長、約５７ヌクレオチド長、約５８ヌクレオチド長、約５９ヌクレオチド長、約６０ヌクレオチド長、約６１ヌクレオチド長、約６２ヌクレオチド長、約６３ヌクレオチド長、約６４ヌクレオチド長、約６５ヌクレオチド長、約６６ヌクレオチド長、約６７ヌクレオチド長、約６８ヌクレオチド長、約６９ヌクレオチド長、約７０ヌクレオチド長、約７１ヌクレオチド長、約７２ヌクレオチド長、約７３ヌクレオチド長、約７４ヌクレオチド長、約７５ヌクレオチド長、約７６ヌクレオチド長、約７７ヌクレオチド長、約７８ヌクレオチド長、約７９ヌクレオチド長、約８０ヌクレオチド長、約８１ヌクレオチド長、約８２ヌクレオチド長、約８３ヌクレオチド長、約８４ヌクレオチド長、約８５ヌクレオチド長、約８６ヌクレオチド長、約８７ヌクレオチド長、約８８ヌクレオチド長、約８９ヌクレオチド長、約９０ヌクレオチド長、約９１ヌクレオチド長、約９２ヌクレオチド長、約９３ヌクレオチド長、約９４ヌクレオチド長、約９５ヌクレオチド長、約９６ヌクレオチド長、約９７ヌクレオチド長、約９８ヌクレオチド長、約９９ヌクレオチド長、約１００ヌクレオチド長、約１０５ヌクレオチド長、約１１０ヌクレオチド長、約１１５ヌクレオチド長、約１２０ヌクレオチド長、約１２５ヌクレオチド長、約１３０ヌクレオチド長、約１３５ヌクレオチド長、約１４０ヌクレオチド長、約１４５ヌクレオチド長、約１５０ヌクレオチド長、約１５５ヌクレオチド長、約１６０ヌクレオチド長、約１６５ヌクレオチド長、約１７０ヌクレオチド長、約１７５ヌクレオチド長、約１８０ヌクレオチド長、約１８５ヌクレオチド長、約１９０ヌクレオチド長、約１９５ヌクレオチド長、または約２００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを合成し得る。他の好ましい実施形態において、ここで開示される化学の段階的収率は、生成される全長オリゴヌクレオチド生成物のかなりの割合を可能にする。例えば、好ましい実施形態において、上記の所望の長さのいずれかのオリゴヌクレオチドは、合成される少なくとも約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％のオリゴヌクレオチド生成物が全長となるように合成される。ＰＧＡ化学のより長いオリゴヌクレオチドを作製する能力は、これらの合成オリゴヌクレオチドへの適用範囲をかなり拡げる。
【００４２】
ＰＧＡ合成システムは、酸前駆物質、光増感剤、安定化剤および溶媒を含み得る。酸前駆物質は、光量子または他の励起された分子（光増感剤）との相互作用により移動したエネルギーのいずれかによって、励起の際に酸を生成する。ＤｅＶｏｅら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ  １７：３１３−５５（１９９２）。適切な光増感剤を選択することによって、酸が、所望の波長において生成され得る。安定化剤は、適切なラジカルＨドナーであり、従って、酸形成を増強し得る。表Ｉは、本開示と共に使用するために適切な化合物の例を列挙する。
【００４３】
（表１  例示的なＰＧＡ前駆物質、光増感剤および安定化剤（Ｒ、Ｒｉ＝置換基））
【００４４】
【表１】
2006503586.tif 000002
表Ｉは、ＰＧＡを作製するためのほんのわずかな候補を列挙し（Ｓｕｓ，Ｖ．Ｏ．，Ｌｉｅｂｉｇｓ  Ａｎｎ  Ｃｈｅｍ  ５５６：６５−８４，１９４４；Ｆｒｅｃｈｅｔ，Ｊ．Ｍ．，Ｐｕｒｅ  ＆  Ａｐｐｌ  Ｃｈｅｍ  ６４：１２３９−４８，１９９２；Ｆｏｕａｓｓｉｅｒら、Ｐｕｒｅ  ＆  Ａｐｐｌ  Ｃｈｅｍ  Ａ３１：６７７−７０１，１９９４；Ｃｒｉｖｅｌｌｏ，Ｊ．Ｖ．，Ａｄｖ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉ  ６２：３−４９，１９８４；本明細書中に参考として援用される）、そして、マイクロエレクトロニクスおよび印刷業のためのフォトレジスト処方物において広く使用されている多くの他の化合物が存在する（Ｗｉｌｌｓｏｎ，Ｃ．Ｇ．（１９９４）「Ｏｒｇａｎｉｃ  ｒｅｓｉｓｔ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ」Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｌ．Ｆ．，Ｗｉｌｌｓｏｎ，Ｃ．Ｇ．，およびＢｏｗｄｅｎ，Ｍ．Ｊ．編，Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．ｐｐ．１３８−２６７；ＭａｃＤｏｎａｌｄら、Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  ２７：１５１−５７，１９９４；米国特許第５，１５８，８８５号；本明細書中に参考として援用される）。このような化合物は、ＤＮＡ脱保護反応（５’−ＯＤＭＴ基の脱保護）のための強力な候補であり、酸触媒脱保護反応のための試薬のレパートリーを提供する（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．（１９９１）「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，本明細書中に参考として援用される）。
【００４５】
（Ｂ．多重並行オリゴマー合成のための微小流体反応器）
多重並行オリゴマー合成のための微小流体反応器のための合成システムは、デジタル光プロジェクター（ＤＬＰ）光分子、マイクロアレイ反応器アセンブリ、試薬マニフォールド、およびコンピュータ制御システムを備える。マイクロアレイ反応器アセンブリは、微小流体アレイチップ、および、微小流体アレイチップと試薬マニフォールドとの間の液体連絡を容易にするチップホルダーまたはカートリッジから構成される。１つの好ましい実施形態において、本開示の微小流体アレイチップは、かなり単純化された構造、および、別個の化学反応の並行実行のために現在利用可能なデバイスよりもより頑強な操作機構を有する（米国出願番号第０９／８９７，１０６号、本明細書中に参考として援用される）。微小流体チップの重要な特徴は、微小流体チップが、好ましくは、製造プロセスに複雑さを追加し、チップ操作の強固さおよび信頼性を低下させる、入り組んだ内蔵式のバルブ、ポンプおよび電極のいずれも必要としないことである。この設計は、全ての他の現在最新式の微小流体ベースの技術に好ましく、これは、異なる量および／異なる種類の化学試薬の対応する個々の反応容器への送達を制御するために、複雑な内蔵式の機構を必要とし、このことは、個々の反応容器における異なる化学反応を促進する（米国特許第５，８４６，３９６号）。
【００４６】
本明細書中に開示されるシステムは、上述の化学合成プロセスが高度な並行様式で実施されることを可能にする。開示される微小流体アレイチップは、（外部の）圧力駆動デバイスであり、試薬が別個の反応セルに分配されるように配列される、チャネルを含むシリコン基材から作製される。所定の反応セルにおいて、反応性化学試薬が、外部光源からの光露出によりインサイチュで作製される。チップ自体は小型化され得る。（バイオアッセイ適用のための）例示的なチップは、約１．５×２．０×０．１ｃｍの寸法であり、約２７，０００個までの別個の反応セルを含み、そして、１０μｌのみの合計内容量を有する。チップ内において、流体チャネルおよび反応セルの寸法は、非常に小さく（１０ミクロンのオーダー）、表面と液体との間の質量移動は、より大きいサイズの反応器と比較した場合、有意に増強される。この設計は、化学合成の間の化学反応速度を有意に増強する。
【００４７】
別個の表面部位において異なる化学反応を実施するために、溶液相において光生成性試薬を利用する際の重要な因子は、１つの位置において生成する活性試薬（例えば、Ｈ＋）が、近接する部位に浸潤しないように、化学反応の間に反応部位を単離することである。ここで開示される微小流体アレイチップは、特定の流体流れ状態が維持される限りは、別個の反応セル間の活性試薬の内部混合を防止する。チップは、わずか１０μｌの合計内容量を有し、ｎｌ未満の個々の反応セル容量を有するように高度に小型化される。他の好ましい実施形態において、チップの合計内容量は、約１μｌ、約２μｌ、約３μｌ、約４μｌ、約５μｌ、約６μｌ、約７μｌ、約８μｌ、約９μｌ、約１０μｌ、約１１μｌ、約１２μｌ、約１３μｌ、約１４μｌ、約１５μｌ、約１６μｌ、約１７μｌ、約１８μｌ、約１９μｌ、約２０μｌ、約２５μｌ、約３０μｌ、約３５μｌ、約４０μｌ、約４５μｌ、または約５０μｌである。チップは、簡単な技術を使用して構築され、使用される物質（好ましくはシリコンおよびガラス）は、オリゴヌクレオチド合成化学と完全に適合性である。
【００４８】
チップの好ましい実施形態は、図２に示される。このチップは、４，０００の異なるオリゴヌクレオチド（または任意の他の型のバイオ分子化合物）を作製するように設計され、約２０ｍｍ×１５ｍｍ×１ｍｍの寸法であり、わずか１０μｌの合計内容量を有する。各チップは、シリコン基材から作製され、この基材上で、流体チャネルおよび反応セルが、標準的な半導体エッチングプロセスを使用して製造される（Ｍａｄｏｕ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９７）、本明細書中に参考として援用される）。このチップは、カバーガラスとアノードで結合され、このカバーを通して、光が通過して、光化学反応および蛍光検出を容易にし得る。
【００４９】
チップの操作原理の説明は以下の通りである。図２ａに示すように、オリゴヌクレオチドの合成操作の間、流体流れは、入口を介してアレイチップに流れ、入口流体チャネルに沿って反応セルに入る側流に分かれる。近接する反応セルは、その間にある分離壁によって互いに隔てられている。分離壁の上部表面は、カバーグラスの下側表面とつながっており、従って、近接する反応セル中の側流は、単離壁を介して互いに混合しない。反応セルを通過した後、側流は、出口流体チャネルに合流し、廃液管内にアレイチップを流し出す。光化学反応の間、図２ｂに示すように、光生成性試薬前駆物質を含む流体は、アレイチップに送られ、そして、活性試薬が、右側の照射された反応セルの内側で生成され、左側の照射されていない反応セルの内側では活性試薬が作製されないように、光ビームが右側の反応セルに方向付けられる。適切な流体流れの条件において、右側の反応セル内への流速は、活性試薬が入口チャネルに拡散して戻ることを防止するほど十分に高く、従って、いかなる活性試薬も左側の反応セルに入ることを防止する。この構造的および操作上の設計を伴って、各個々の反応セルは、動力学的に分離されており、複数の別個の化学反応が、任意の選択された群の反応セルの中で、並行に行なわれ得る。
【００５０】
他の好ましい実施形態において、代替的な流体条件が開示される微小流体アレイチップの操作のために使用され得る。例えば、チップの内側の流体は、照射された反応セルにおいて作製される活性試薬の、照射されていない反応セルへの拡散が、照射されていない反応セルにおいて有意な反応を生じない程度であるように、時間が十分短い限りは、光照射時間の間、静止状態に維持され得る。
【００５１】
微小流体アレイチップは、本質的に、個々の反応セルの内側表面で化学反応が起こる、多重化反応器である。反応セルの内側表面は、ガラス窓の下側表面、シリコン基材の上側表面および分離壁の側部表面から構成される。内側表面は、好ましくは、二酸化ケイ素、または、例えば、官能化ポリマーおよび本明細書中に記載されるように、オリゴヌクレオチド合成を容易にするためにリンカー分子で誘導体化されたポリマーのような他の型の適切な化合物から作製される。リンカーの表面密度は１ｐモル／ｍｍ２より高くあり得るが、オリゴヌクレオチド合成のための高い段階収率を達成するためには、適切な表面密度は約０．１〜０．３ｐモル／ｍｍ２であることが実験により示される。表面密度を固定すると、反応セルの表面積および反応収率が、生成されるオリゴヌクレオチドの量を決定する。
【００５２】
かなり多い量のオリゴヌクレオチド部分鎖が連結反応に必要とされる場合、微小流体アレイチップの設計は、反応セル内に孔性物質を含むように改変され得、これによって、オリゴヌクレオチド合成のための基材表面積が増加する。このアプローチにより、合成されるオリゴヌクレオチドの量の１０〜１００倍の増加が、微小流体アレイチップの全体的なサイズおよび合成プロトコールを有意に変更することなく、得られ得る。１つの実施形態において、制御された孔性ガラス膜が、チップ製造プロセスの間にシリコンウェハ上に形成される。ホウケイ酸ガラス膜は、シリコンウェハ上へのプラズマ蒸着によって堆積される。ウェハは、熱変性されて、ホウ素および二酸化ケイ素の隔離された領域を形成する。次いで、酸エッチングプロセスを使用してホウ素が選択的に取り除かれ、孔性ガラス膜を形成し、この膜は、オリゴヌクレオチド合成のための優秀な基材物質である。
【００５３】
別の代替的な実施形態は、架橋ポリスチレンのようなポリマー膜を形成することである。直鎖状ポリスチレンおよびＵＶ活性化架橋試薬を含有する溶液が注入され、次いで、微小流体アレイチップから排出され、チップの内側表面上に薄膜コーティングが残る。反応セル領域を規定するための半透明のマスクを含むチップは、次に、ＵＶ光に曝露され、その結果、反応セル領域内の直鎖状ポリスチレン鎖間の架橋を活性化する。この工程の次に、架橋していないポリスチレンを除くための溶媒洗浄が続き、反応セル領域内に架橋したポリスチレンのみが残る。架橋したポリスチレンはまた、オリゴヌクレオチド合成のための優秀な基材物質である。
【００５４】
（Ｃ．デジタルリトグラフィー）
現在利用可能なシステムに対する基本的な機能拡張としては、マスクレス−デジタルフォトリトグラフィー（Ｍａｓｋｌｅｓｓ−Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）（ＭＤＰ）技術の適用が挙げられる。本明細書中に記載されるデジタルフォトリトグラフィーは、並行ＤＮＡ合成のためのインクジェットベースおよびフォトマスクベースの両方のアプローチに対して際立った利点を提供する。フォトリトグラフィーは、本来、機械的なインクジェットベースの方法よりもかなり高い解像度を有し、従って、自動化および小型化の化学反応により適している。従って、本開示における重要な構成要素は、プログラム可能な空間的光学的モジュレーター（すなわち、デジタルマイクロミラーデバイス（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）（ＤＭＤ，Ｔｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）である。ＤＭＤは、デジタル光プロジェクター（ＤＬＰ）を用いてＴＶディスプレイおよびコンピュータディスプレイに投影するための、Ｔｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓから市販されている反射ディスプレイデバイスである。プロジェクターの光を改変することによって、ＤＬＰは、本質的にマイクロプロジェクターであるＭＤＰシステムに変換される。従って、従来のフォトリトグラフィックシステムにおいて必要とされるフォトマスクは排除される。
【００５５】
ＤＭＤは、１７μｍ×１７μｍのｘ、ｙピッチを有する正方形のマトリクス内に並べられた複数のマイクロミラーを含む。ミラーは、シリコンベースの一体型回路と一体型であり、その自身の軸の周囲で回転するように個々に制御され得る。各ミラーの見出し角（ｔｉｔｌｉｎｇ  ａｎｇｌｅ）に基づいて、各ミラーは、投影レンズの瞳孔の内側または外側のいずれかに入射光を反射し、それによって、スクリーン上に像を生じる。このデバイスを使用して、フォトマスクは、フォトリトグラフィックシステムから排除され得、これは、以前のＤＮＡマイクロアレイ製造技術の最も限定的かつ費用のかかるプロセスのいくつかを排除する。
【００５６】
合成装置の他の好ましい実施形態において、水銀ランプが光源として使用される。３５０〜４５０ｎｍの範囲の中央波長を有するバンドパス光学フィルターを使用して、光酸（ｐｈｏｔｏａｃｉｄ）の励起に対して適切な波長を選択する。７６８×１０２４のＤＭＤを使用して光パターンを生成し、７５〜１００ｍｍのレンズを投影レンズとして使用して、微小流体アレイチップ表面上に像を投影する。チップ表面において、投影されたピクセルの各々は、約３０×３０μｍの寸法である。微小流体アレイチップの表面において、約１０〜３０ｍＷ／ｃｍ２の流れ密度が生じる。薄膜ビームスプリッターおよびＣＣＤビデオカメラを使用して光の整列を容易にする。特に変更を加えることなく、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９）が試薬マニフォールドとして使用される。微小流体アレイチップは、カートリッジ内に置かれ、微小流体チップと試薬マニフォールドとの間の液体連絡を容易にする。カートリッジは、ｘｙｚ移動ステージおよび整列のための傾斜プラットフォーム上に設置される。Ｃ＋＋で書かれているコンピュータソフトウェア（ＡｒｒａｙＤｅｓｉｇｎｅｒ）を使用して、アレイ上の所定のＤＮＡ配列レイアウトに基づく光パターンを生成する。
【００５７】
別の好ましい実施形態において、４０５ｎｍの波長および３０ｍＷ連続出力を有する半導体紫色レーザーダイオードを光源として使用する。半導体レーザーは、Ｎｉｃｈｉａ（Ａｎａｎ−Ｓｈｉ，Ｔｏｋｕｓｈｉｍａ，Ｊａｐａｎ）から市販されており、１０グラム未満の重量である。比較的短い焦点距離を有する小型のレンズを投影レンズとして使用して、光学システムのサイズを減少させる。小型の試薬マニフォールドを構築して試薬の消費を減少し、リサイクル機構を追加し、そして、微小流体アレイチップと光学を統合する。好ましくは、開示されるオリゴマーのプールの作製方法のために、内蔵型かつ持ち運び可能な並行合成装置が使用される。
【００５８】
投影システムの別の好ましい実施形態において、ＵＶ発光ダイオード（ＬＥＤ）をＤＬＰプロジェクターのための光源として使用する。ＵＶ  ＬＥＤは、Ｃｒｅｅ  Ｉｎｃ．（Ｄｕｒｈａｍ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ）ならびにＮｉｃｈｉａ（Ａｎａｎ−Ｓｈｉ，Ｔｏｋｕｓｈｉｍａ，Ｊａｐａｎ）から市販されている。これらのＵＶ  ＬＥＤは、３７５ｎｍ〜４１０ｎｍの波長と、ｍＷ未満〜数１０ｍＷの範囲の電力を有する。
【００５９】
なお別の好ましい実施形態において、ＵＶ  ＬＥＤアレイが光源として使用される。この実施形態に関して、ＤＭＤ光学は、もはや、微小流体アレイチップ上で選択的な照射を行う必要はない。一次元（１Ｄ）または二次元（２Ｄ）のＵＶ  ＬＥＤアレイのいずれかが使用され得る。ＬＥＤアレイは、バーまたはパネル上で別個のＬＥＤを組み立てることによって作製され得る。ＬＥＤアレイはまた、半導体ウェハから直接作製され得、この上にＬＥＤデバイスが製造される。１Ｄ  ＵＶ  ＬＥＤアレイの場合、機械的メカニズム、電気−光学的メカニズムおよび／または電気−機械−光学的メカニズムを使用して、その垂直方向に沿って、１Ｄ  ＵＶ  ＬＥＤアレイを走査することによって二次元の像が得られ得る。２Ｄ  ＵＶ  ＬＥＤアレイの場合、単純な投影レンズ光学を使用して、微小流体アレイチップ上に像を投影し得る。
【００６０】
画像を生成するためにＬＥＤアレイを使用することは、光通信学および光学の分野において周知の技術である。米国特許第５，９５３，４６９号（これは、本明細書中に参考として援用される）は、２次元画像を生成するために１次元ＬＥＤアレイを使用する電気機械光学的方法を記載する。光ファイバーおよび／またはファイバー束は、ＬＥＤアレイから微小流体アレイへと光を連結して、ＬＥＤアレイから生成される熱が微小流体アレイに到達するのを回避するために、有利に使用され得る。さらに、光化学反応を誘発するためにＬＥＤアレイを使用することは、微小流体アレイチップの使用に限定されない。それらは、対応する波長および力を必要とする任意の光化学的適用において使用され得る。例えば、ＵＶ  ＬＥＤアレイはまた、感光性保護基を含む光化学的方法を使用して、ＤＮＡアレイを生成するために使用され得る（Ｐｉｒｒｕｎｇら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：６２７０〜６２７６、１９９５；ＭｃＧａｌｌら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：５０８１〜５０９０、１９９７；ＭｃＧａｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１３５５５〜１３５６０，１９９６）。
【００６１】
（Ｄ．オリゴヌクレオチド合成）
本開示の一実施形態において、新規な化学的アプローチが、光指向性オリゴヌクレオチド合成のために十分に確立された従来のＤＮＡ合成プロトコル（Ｇａｏら、Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２０：１２６９８〜６９９（１９９８）（本明細書中に参考として援用される）を可能にするために、好ましくは使用される。従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成は、リンカー分子が基材表面に結合した時に始まる。この基材表面上に、オリゴヌクレオチド配列アレイが、合成されるはずである（リンカーは、「開始部分」である。これは、別のモノマーが付加され得るモノマーまたはオリゴマーを広範に包含する、用語である）。各リンカー分子は、酸不安定性保護基により保護された反応性官能基（例えば、５’−ＯＨ）を含む。次に、光−酸前駆体または光−酸前駆体とその光感作剤が、基材に適用され、その後、所定の光パターンが、基材表面上に投射される。酸（例えば、プロトン酸（Ｈ＋）が、照射された部位で生成され、これは、図３に示されるような、固体支持体に結合されたリンカー、モノマーまたはヌクレオシドの酸不安定性保護基（例えば、５’−Ｏ  ＤＭＴ基）の脱保護を引き起こす（ＭｃＢｒｉｄｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２４：２４５〜４８（１９８３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｂ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３４１〜４７（１９８６））。
【００６２】
この反応は、末端５’−ＯＨ基を生成し、その後、この末端５’−ＯＨ基は、次のモノマーとのカップリング反応を生じて、モノマーをリンカーに結合するかまたはダイマーを形成する（「モノマー」とは、本明細書中で以後、化学実体として広範に規定され、この化学実体は、化学構造により規定される場合、モノマーもしくはオリゴマーまたはその誘導体であり得る）。結合したモノマーはまた、酸不安定性基により保護された反応性末端官能基を含む。未反応５’−ＯＨ基は、その後、アセチル基でキャップ化される。その後の洗浄工程および酸化工程により、第１合成サイクルは完了する。このＨ＋脱保護反応は、第２組の次のモノマーにカップリングするために利用可能な末端５’−ＯＨを生成するために反復される。これらの脱保護工程、カップリング工程、キャッピング工程、および酸化工程は、望ましい配列が生成されるまで反復される。この合成プロセスは、ＤＮＡ合成の分野で周知であり、ＭｃＢｒｉｄｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒ，２４：２４５〜４８、１９８３（これは、本明細書中に参考として援用される）により記載される。
【００６３】
オリゴヌクレオチド合成を実施するためのある好ましい一連の工程としては、下記のように示されるオリゴヌクレオチドライブラリー合成が挙げられる：
２．ＯＨ官能基を用いた基材表面の誘導体化；
３．表面ＯＨ基への５’−ホスホロアミダイト，２’，３’−Ｏ−メトキシエチリデンＵのカップリング；
４．２’，３’環状部分を開環して２’（３’）−Ｏ−アセチル，２’（３’）−ＯＨ  Ｕを形成すること；
５．第１ホスホロアミダイトモノマーをＵの２’（３’）−ＯＨにカップリングした後、ｎ−１サイクルのカップリング反応（ｎは、合成すべきオリゴヌクレオチドの長さ×４である）を行うことによる、オリゴヌクレオチドの合成；
６．固体表面に結合しているオリゴヌクレオチドからの塩基およびリン酸保護基の除去；
７．脱保護反応により生成する化合物を除去するために徹底洗浄すると同時に、オリゴヌクレオチドが固体表面に共有結合すること。
【００６４】
８．遊離３’−ＨＯ−オリゴヌクレオチドに対するＵ−３’−ＨＯ−オリゴヌクレオチド結合の切断。
【００６５】
図３および図４は、上記オリゴヌクレオチド合成方法に従ってＤＮＡアレイの合成を示す。第１工程において、リンカー分子が、基材表面に結合される（図４ａ）。各リンカー分子は、酸不安定性基により保護される反応性官能基を含む。次に、光−酸前駆体が、基材に適用される。その後、所定の光パターンが、基材表面上に投影される（図４ｂ）。照射された部位にて、酸が生成され、リンカー分子からの酸不安定性保護基の切断を引き起こす。これにより、末端ＯＨ基の形成をもたらす。暗い部位において、酸は生成されず、従って、リンカー分子上の酸不安定性保護基は、インタクトなままである。基材表面は、好ましくは、隣接部位間の酸の拡散を防ぐように設計される。その後、基材表面は洗浄され、その後、第１モノマー（鎖成長することが可能である、ヌクレオホスホロアミダイト、ヌクレオホスホネートまたはアナログ化合物）が供給される。モノマー分子は、脱保護されたリンカー分子にのみ結合する（図４ｃ）。化学結合が、リンカー分子のＯＨ基と、モノマーのリンとの間に形成されて、ホスファイト結合を生じる。これは、適切な洗浄工程、酸化工程、およびキャッピング工程の後に、第１残基の付加を完了する。結合したヌクレオチドモノマーはまた、酸不安定性基により保護される反応性末端官能基を含む。この鎖増殖プロセスは、望ましい長さおよび望ましい化学物質配列のポリマーが、選択されたすべての表面部位に形成されるまで、反復される（図４ｄ〜４ｆ）。
【００６６】
以下は、オリゴヌクレオチド合成のこの好ましい実施形態を実施するための各工程のより詳細な説明である。
【００６７】
（工程１：チップ表面の誘導体化）
好ましい実施形態において、並行遺伝子合成は、高密度官能基を含む表面、その表面分子と固体支持体との間の脱保護安定性結合、および酵素試薬または化学試薬により特異的に切断されて脱保護工程および洗浄工程の後にマイクロアレイ表面から３’−ＯＨオリゴヌクレオチドを放出し得る切断点を含む。これらは、チップまたは他の固体支持体（例えば、ＣＰＧまたはポリスチレンビーズ）を使用する、従来のＤＮＡ合成法のために必要ではないかもしれない特徴である。
【００６８】
一実施形態において、ＳｉＯ２表面（すなわち、微小流体アレイチップリアクターの内側表面）が、Ｈ２Ｏで洗浄され、その後、ＥｔＯＨで洗浄される。その後、Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミドが、リアクターを通してポンピングされる。その後、リアクターの誘導体化済み内側表面が、９５％  ＥｔＯＨでリンスされ、Ｎ２下で１０５℃にて硬化される。そのようにして形成されたリンカーは、安定なリンカーであり、表面が、オリゴヌクレオチドが合成された後に核酸塩基およびリン酸保護基の脱保護のために脱保護剤と反応された場合に、切断に抵抗する。
【００６９】
３’リン酸化オリゴヌクレオチドもまた、化学的リン酸化試薬を使用して後のオリゴヌクレオチド合成用の第１ＤＭＴ層を作製することによって、微小流体アレイ基材上に合成され得る。これらの試薬は、多数の化学試薬供給業者（例えば、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）のから入手可能である。３’リン酸を含むオリゴヌクレオチドは、塩基性条件下（例えば、濃アンモニア水溶液での処理）で切断され得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、ＥｔＯＨ中のＥＤＡを用いて、第１の３’リン酸結合を切断することなく脱保護され得るか、またはオリゴヌクレオチドは、基材からそのオリゴヌクレオチドの切断と同時に脱保護され得る。
【００７０】
（工程２および工程３：２’，３’−Ｏ−メトキシエチリジンＵ−５’−Ｏ−支持体の調製）
以下の反応は、ＣＰＧまたは微小流体アレイ基材のいずれかを使用して、並行して実行し得る。両方の型の支持体は、同じ官能基（ＳｉＯ２）を含み、これにより、同じ型の化学を使用する反応を可能にする。ＣＰＧ合成は、μｍｏｌの最終産物を提供し、この最終産物は、従来の方法（例えば、直接的トリチルモニタリング、ＵＶ、ＨＰＬＣ、および質量分析）を使用して分析され得る。従って、ＣＰＧ合成は、発達プロセスにおけるいくつかの問題を同定して迅速に克服することを補助し得る。微小流体アレイ基材の合成および分析は、ＣＣＤイメージャーまたはレーザースキャナーおよび画像処理ソフトウェア（例えば、ＡｒｒａｙＰｒｏ（Ｃｙｂｅｒｍｅｄｉａ））を使用して達成される。
【００７１】
一実施形態において、上記Ｕ結合は、５’−Ｏ−ホスホロアミダイトウリジンを、リン酸結合の形成を介して表面ＯＨ基とカップリングすることによって形成される（図５；米国特許出願番号１０／０９９，３８２（本明細書中に参考として援用される）。最初に、２’，３’−Ｏ−メトキシエチリジンウリジンまたは２’，３’−Ｏ−メトキシメチリデンウリジンが、公知の方法に従って調製される（Ｆｒｏｍａｇｅｏｔら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２３：２３１５〜２３３１、１９６７（本明細書中に参考として援用される））。これらの化合物は、ＤＮＡヌクレオホルアミダイトを調製するための手順と類似する手順を使用して、対応する５’−ホスホルアミダイトへと変換される（ＭｃＢｒｉｄｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２４：２４５〜４８，１９８３）。この５’−Ｕホスホロアミダイトは、ＣＨ３ＣＮ（５０ｍＭ）中に新たに溶解され、カップリング工程の間の合成サイクルにおいて使用される。代表的な合成プロセスは、以下の通りである。
【００７２】
【表２】
2006503586.tif 000003
その後、Ｕの２’，３’−オルトエステルは、８０％  ＨＯＡｃ／Ｈ２Ｏを室温で約２時間用いる処理または３％  ＴＣＡを室温で６分間用いる処理によって、加水分解されて、２’−アセチル糖または３’−アセチル糖の形成をもたらし、それにより、近接するＯＨ基のうちの１つが反応のために利用可能になることを引き起こす。その後、その表面は、適切な溶媒で洗浄され、乾燥される。同じ反応はまた、光生成される酸前駆体の光照射により生成される光生成される酸（例えば、Ｈ＋）を使用して、達成され得る。光生成される酸は、２’−ＯＨまたは３’−ＯＨを選択的に開け、それによりその反応部位を微小流体アレイチップにおける次の反応工程のために利用可能にし得る。リンカー−５’−Ｏ−Ｕ誘導体化表面は、後のオリゴヌクレオチド合成のために密度／搭載（ｌｏａｄｉｎｇ）および均一性について試験され得る。
【００７３】
（工程４：Ｕ支持体におけるオリゴヌクレオチド合成）
オリゴヌクレオチド合成のこの実施形態の模式図が、図６に示される。上記のように調製されるＵ支持体は、カラム中のＣＰＧ上または微小流体アレイ基材上のいずれかにあり、５’−ＤＭＴヌクレオホスホロアミダイトと接触される（配列により決定されるＡ、Ｃ、ＧまたはＴが、合成される）。このカップリング反応は、Ｕ−２’（３’）−Ｏ−［ホスファイト］−Ｏ−３’−Ｎ（Ｎは、ＤＮＡモノマーである）結合の形成をもたらし、その配列は、５’−ＤＭＴ基で終端する。キャッピング工程、酸化工程、および脱トリチル化反応の後、第２の５’−ＤＭＴヌクレオホスホロアミダイトモノマーが、表面上の５’−ＯＨにカップリングされ得る。このキャッピング反応、酸化反応、脱トリチル化反応、およびカップリング反応は、望ましいオリゴヌクレオチドが合成されるまで、反復される。その後、このオリゴヌクレオチド支持体は、ＴＣＡで処理されて、末端ＤＭＴ基が除去され、ＥＤＡ／ＥｔＯＨ（１：１）で処理されて、塩基およびリン酸保護基ならびに２’（３’）−アセチル基が除去される。
【００７４】
脱保護反応の後、そのオリゴヌクレオチド表面は、適切な溶媒で広範に洗浄されて、保護基の切断から形成された低分子が除去される。最後に、上記オリゴヌクレオチドが、水性水酸化アンモニウムを用いる処理によって表面から切断される。この水性水酸化アンモニウムは、２’（３’）−環状リン酸を加水分解して、遊離３’−ＯＨを有するオリゴヌクレオチドを生じる。リンカー−Ｕ部分もまた、この反応において切断されるが、後の酵素反応においていかなる問題を引き起こさない。切断反応後に回収される反応体積は、短くエバポレートされて、ＮＨ３が除去され得る。オリゴヌクレオチドを合成するための本開示のこの実施形態の重要な利点は、チューブにおいて、第１ヌクレオホスホロアミダイトモノマーをオリゴヌクレオチドの最終収集物にカップリングすることからオリゴヌクレオチドを合成するサイクル全体が、１６時間未満で完了し得る（合成：１０時間（４０マー生成物について１２０工程；脱保護：２時間；および切断：４時間）ことである。
【００７５】
上記に示される脱保護プロセスおよび切断プロセスのための方法は、現在使用される標準的プロセスを超える重要な利点を有する。標準的オリゴヌクレオチド合成製造プロセスにおいて、脱保護工程が、塩基およびリン酸保護基を除去するために合成サイクルの最後に必要とされる。この脱保護プロセスの生成物は、オリゴヌクレオチドと、脱保護の間に形成される小化合物との溶液混合物である。これらのオリゴヌクレオチドは、通常はカラムを通して溶出することまたはスピンカラムを使用することによって、混合物から抽出される（このプロセスは、通常は、脱塩と呼ばれる）。しかし、これらのプロセスは、不利なことに、低い回収効率を示し、オリゴヌクレオチドと低分子との間でのきれいな分離は提供しない。この分離後、収集されたサンプルの体積は、しばしば、減少される必要があり、これにより、オリゴヌクレオチド調製のための時間がさらに長くなる。このプロセスはまた、小型リアクターにおいて生成されるピコモル量の生成物にとって、問題であってある。これは、潜在的な有意なサンプルの損失および混入に起因する。本開示は、これらの不利点を克服するための方法を提供する。この方法において、脱保護および脱塩の後に、簡単な洗浄工程が行われ、この洗浄工程は、合成リアクターにおいて連続的に実施され、その間、オリゴヌクレオチド鎖は、基材表面に結合したままである。副生成物（ほとんどが低分子）を表面から洗浄した後、オリゴヌクレオチドは、塩の混入を伴わない条件下で、数十μｌの容積中で、解放または切断され、洗浄される。
【００７６】
（Ｅ．オリゴヌクレオチドの精製）
固体基材上でのオリゴヌクレオチドの合成の間に、モノマーは、成長するオリゴヌクレオチド鎖に活性化官能基との結合形成を介して付加されるべきである。しかし、このカップリング工程は、１００％の効率ではないので、全長ではないオリゴヌクレオチドが生成される。カップリング工程においてモノマーと適切にカップリングすることができないオリゴヌクレオチド鎖は、失敗（ｆａｉｌｕｒｅ）オリゴヌクレオチドと呼ばれ、好ましくは、後のカップリング工程におけるさらなる反応を防ぐために、合成反応の間にブロックまたはキャップされる。オリゴヌクレオチドがブロックもキャップもされない場合、欠失および望ましくない配列を有するオリゴヌクレオチドが、合成される。本開示においてオリゴヌクレオチドを生成するために使用されるＰＧＡ化学は、オリゴヌクレオチドの合成において１工程について９８％よりも良好な収率を達成することによって、失敗オリゴヌクレオチドの割合を大いに減少するが、失敗オリゴヌクレオチドは、依然として、厄介な問題である。従って、固体基材上で合成されるオリゴヌクレオチドは、好ましくは、主に全長の望ましいオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドプール中のチップから単離されるように、精製される。
【００７７】
本開示の好ましい実施形態において、チップ上（ｏｎ−ｃｈｉｐ）でのハイブリダイゼーションによりチップ上に合成されたオリゴヌクレオチドを精製するための方法が、提供される。図７において示されるように、チップ上に合成されたオリゴヌクレオチドは、それらがヘアピン構造を形成するように、すなわち、それらが、一緒にハイブリダイズする相補的ヌクレオチド配列の２つの領域を、ヘアピン構造のループを形成する介在配列とともに有するように、設計される。図７において、オリゴヌクレオチド中の相補配列は、ＡおよびＢと称され、短い介在配列は、Ｃと呼ばれる。好ましくは、セグメントＣは、特定の制限エンドヌクレアーゼ（Ｒ．Ｅ．）酵素により認識される配列を含む。図７において、セグメントＢは、望ましい配列を有する。チップ上でのオリゴヌクレオチドの合成および脱保護の後、上記ヘアピン構造が、自然に形成する。このオリゴヌクレオチドは、次に、セグメントＣ中にコードされる特定の制限部位を切断するＲ．Ｅ．酵素を含む溶液で、洗浄される。種々のＲ．Ｅ．酵素についての認識部位の配列は、当該分野で周知である。Ｒ．Ｅ．酵素およびその認識配列のリストは、たとえば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）Ｉｎｃ．Ｃａｔａｌｏｇ（本明細書中に参考として援用される）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ参照）、およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（本明細書中に参考として援用される）において、入手可能である。別の実施形態において、逆Ｕ（ｒＵ）またはＵが、ヘアピンループ領域（セグメントＣ）中に組み込まれ得、そしてＲＮアーゼで切断され得る（上記Ｆ節を参照のこと）。
【００７８】
好ましい実施形態において、Ｒ．Ｅ．酵素を含む溶液と、使用される反応条件（酵素切断温度）とは、二本鎖オリゴヌクレオチド構造が、切断の間に変性しないものである。このオリゴヌクレオチド含有基材は、次に、適切な濃度の緩衝溶液を用いて適切な温度（ストリンジェンシー）で洗浄されて、同じオリゴヌクレオチドのセグメントＡとともに１つ以上のミスマッチ部位を含むあらゆるセグメントＢ配列が、除去される。このミスマッチは、点変異、欠失、または挿入であり得、このミスマッチは、セグメントＡもしくはセグメントＢのいずれか、または両方のセグメント中に位置し得る。好ましくは、洗浄条件は、完全一致するＡセグメントおよびＢセグメントの大部分が、ハイブリダイズして基材に結合したままである条件である。ストリンジェントな洗浄の後、チップ上のオリゴヌクレオチドは、チップからセグメントＢを放出する変性条件に供され、これにより、その後の精製セグメントＢの収集が可能になる。
【００７９】
ハイブリダイゼーションによる合成されたオリゴヌクレオチドの精製の別の実施形態は、１つのチップまたは２つの別個のチップにおける別個の位置において、精製されるべきオリゴヌクレオチドとその相補鎖とを合成または配置する工程を包含する。精製される望ましいオリゴヌクレオチドは、本明細書中に開示される方法を使用して合成され基材から切断され、その後、チップに依然として結合している相補鎖とハイブリダイズする。ストリンジェントな洗浄が使用され、あらゆる失敗オリゴヌクレオチドもミスマッチオリゴヌクレオチドも除去され、その後、精製オリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズした鎖が変性条件に暴露された後に収集される。
【００８０】
失敗オリゴヌクレオチドから合成された全長オリゴヌクレオチドを精製するための好ましい実施形態は、失敗オリゴヌクレオチドを消化するためにヌクレアーゼを使用し、その間、合成された全長オリゴヌクレオチドはインタクトなままであることである（本明細書中に参考として援用される、米国特許出願番号０９／３６４，６４３号を参照）。オリゴヌクレオチドの合成の間、全長オリゴヌクレオチドが末端をブロックされ、同時に、失敗オリゴヌクレオチドは、キャップ化される。合成の後、オリゴヌクレオチドは、失敗オリゴヌクレオチド上のキャッピング基が除去されるが、末端ブロックされたオリゴヌクレオチドには影響がないように、処理される。その後、このオリゴヌクレオチドは、失敗オリゴヌクレオチドを分解するヌクレアーゼで処理され、その間、末端ブロックされた全長オリゴヌクレオチドはインタクトなままである。
【００８１】
（Ｆ．オリゴヌクレオチドの切断）
本開示の別の重要な局面は、固体支持体表面からオリゴヌクレオチドを酵素切断することであり、固体支持体が、従来のＣＰＧ基材表面であろうと、微小流体アレイチップの内側表面であろうと関係がない。上記のように、合成されたオリゴヌクレオチドが、そのオリゴヌクレオチド自体に対して最小限の損失および損傷しか伴わずに支持体から解放されることが、重要である。チップからオリゴヌクレオチドを解放するためのある好ましい方法は、ＲＮアーゼ酵素（例えば、ＲＮアーゼＡ）を使用することを介する。ＲＮアーゼＡは、ＲＮＡであるＵ残基およびＣ残基の３’側を特異的に切断するリボヌクレアーゼである。例えば、ＲＮアーゼＡは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド中の３’−リン酸−３’連結部にあるｒＵの３’側を切断し、それにより、３’−ＯＨ基を有する固体表面からオリゴヌクレオチドを解放する。ＲＮアーゼＡの使用は、効率的であり、連結用途に適切なオリゴヌクレオチドを解放することが可能である。なぜなら、そのオリゴヌクレオチドは、３’−ＯＨ基を有するからである。ｒＵを含みＲＮアーゼＡにより切断されるオリゴヌクレオチドの回収率は、約５０％である。なぜなら、ｒＵとオリゴヌクレオチドとのいくつかの結合は、２’−リン酸−３’であり、この結合は、この酵素によっては切断されないからである。切断効率の改善は、米国特許出願番号１０／０９９，３８２（本明細書中に参考として援用される）に開示されるような改変ｒＵを使用することによって、可能である。例えば、遊離３’−ＯＨを有しかつ２’−Ｏにて選択的に保護された化学合成した改変逆Ｕ（ｒＵ）は、３’−リン酸−３’  ＤＮＡオリゴヌクレオチドの形成をもたらし、この３’−リン酸−３’  ＤＮＡは、約１００％収率で切断され得る。
【００８２】
あるいは、制限エンドヌクレアーゼ（Ｒ．Ｅ．）酵素の使用を含む酵素的アプローチは、基材表面から望ましいオリゴヌクレオチドを選択的かつ特異的に切断するために使用される。Ｒ．Ｅ．酵素は、一般的には、４ヌクレオチド長〜８ヌクレオチド長の特定の短いＤＮＡ配列を認識し、この配列内の部位にてＤＮＡを切断する。この酵素は、当業者にとって周知である。本開示の文脈において、Ｒ．Ｅ．酵素はまた、種々の制限酵素認識部位に対応する部位にてＤＮＡ分子を切断するため、および核酸をクローニングするために、使用され得る。さらに、Ｒ．Ｅ．酵素は、遺伝子型分析（例えば、識別マーカーおよびＲＦＬＰ分析）のために使用され得る。上記のように、種々のＲ．Ｅ．酵素の認識部位の配列は、当該分野で周知である。
【００８３】
（Ｇ．オリゴヌクレオチドのリン酸化）
化学合成されたオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡリガーゼによって結合される前に、リン酸化されなければならない。ＤＮＡリガーゼは、ＤＮＡの近接する３’−ヒドロキシル末端と５’−リン酸末端との間におけるホスホジエステル結合の形成を触媒して、２片のＤＮＡを結合する。しかし、本明細書中に開示される方法に従って合成されるオリゴヌクレオチド生成物は、３’末端および５’末端の両方にヒドロキシル基を有する。現在の技術水準において、化学合成されたオリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドキナーゼを使用してリン酸化される。このポリヌクレオチドキナーゼは、ヌクレオチドの５’−三リン酸のγ−リン酸を、核酸分子の５’−ヒドロキシル末端へと転移して、５’−ホスホリル末端ポリヌクレオチドを形成させる。別の代替的かつ潜在的により良好で容易で迅速な方法は、並行合成プロセスの最後に化学リン酸化試薬（下記に示す）を使用して、５’リン酸化オリゴヌクレオチドを直接生成することである。
【００８４】
【化１】
2006503586.tif 000004
なお別の代替法は、ポリヌクレオチドキナーゼを使用してリン酸化を実行することである。このポリヌクレオチドキナーゼは、ヌクレオチドの５’−三リン酸のγ−リン酸を、核酸分子の５’−ヒドロキシル末端へと転移して、５’−ホスホリル末端ポリヌクレオチドを形成させる。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼが、分子生物学において広範に使用されている。組換え体から発現される高品質酵素が、市販されている。最適反応条件は、７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、約５μＭ  ＡＴＰ、３７℃である。他のリン酸化方法は、当該分野で公知である。
【００８５】
（Ｈ．長いＤＮＡ配列の高速合成）
多重並行オリゴヌクレオチド合成は、本明細書中で開示される方法に従って合成されるオリゴヌクレオチドの生成およびアセンブリによって、ＤＮＡ配列を生成するために使用され得る。好ましい実施形態において、合成されるオリゴヌクレオチドは、急速にアセンブルされて、長いＤＮＡ配列（例えば、ＤＮＡ配列、遺伝子フラグメント、遺伝子、トランスポゾン、染色体フラグメント、染色体、調節領域、発現構築物、遺伝子治療構築物、ウイルス構築物、相同組換え構築物、ベクター、ウイルスのゲノム、細菌のゲノムなど）を形成する。好ましくは、本開示は、ＤＮＡで構成される長い核酸配列を生成するために使用される。本明細書中で使用される場合、用語「長いＤＮＡ配列」としては、長さが少なくとも１００塩基対（ｂｐ）〜２００ｂｐまで、少なくとも２００ｂｐ〜４００ｂｐまで、少なくとも４００ｂｐ〜１０００ｂｐまで、少なくとも１０００ｂｐ〜１０，０００ｂｐまで、および少なくとも１０，０００〜１００，０００ｂｐまでのＤＮＡ配列、フラグメント、または構築物が挙げられる。このシステムは、多数のオリゴヌクレオチドの効率的かつ忠実度の高い合成、およびこれらのオリゴヌクレオチドの高分子（例えば、長いＤＮＡ配列）へのアセンブリを提供する。
【００８６】
好ましい実施形態において、高い効率および忠実度で長いＤＮＡ配列を生成するための方法が提供される。好ましい実施形態において、長いＤＮＡ配列（＞４００ｂｐ）についての生成サイクルは、以下の工程を包含する：
・所定の長いＤＮＡ鎖のアセンブリのための適切な部分鎖の計算選択（計算フラグメンテーション（ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ））。
・オリゴヌクレオチド部分鎖の完全な組の並行合成。
・オリゴヌクレオチドのオンチップ脱保護、および副生成物の除去；必要な場合には合成された配列のオンチップ精製。
・３’−ＯＨ遊離配列を得るための、合成されたオリゴヌクレオチドの基材表面からの切断。
・二本鎖の長いＤＮＡ鎖へのオリゴヌクレオチド部分鎖のアニーリング、および連結を使用する長いＤＮＡ配列の合成。
・配列精度を確認するための、長いＤＮＡ配列産物の増幅および配列分析。
【００８７】
長いＤＮＡ配列を生成するための本明細書で記載されるシステムは、野生型部分遺伝子もしくは野生型全長遺伝子、改変型部分遺伝子もしくは改変型全長遺伝子、または変異した部分遺伝子もしくは全長遺伝子、トランスポゾン、染色体フラグメント、染色体、調節領域、発現構築物、遺伝子治療構築物、相同組換え構築物、ベクター、ウイルスゲノム、細菌ゲノムなどのアセンブリを可能にする。組み合わせ配列はまた、例えば、遺伝子Ａ’（遺伝子Ａに関連する遺伝子）中に含まれる改変を遺伝子Ａの配列中へ組み込むことによって生成され得る。組み合わせはまた、例えば、当業者があるタンパク質の活性部位を別の構造体に組み込むことを望む場合には、無関係の遺伝子間で行われ得る。同様に、免疫原性配列は、遺伝子間で交換され得る。ある遺伝子またはポリペプチドの実質的にすべての特性が、本明細書で開示されるシステムを使用して、別の配列に組み込まれ得る。上記のように、このような組み合わせ配列は、当業者によって、例えば、ＰＣＲまたは種々のＤＮＡシャフリング型技術を使用して生成されてきたが、本明細書で記載されるシステムは、これらの技術制限の多くを克服し、それによって、長いＤＮＡ配列の高速かつ忠実度の高いアセンブリを提供する。
【００８８】
目的のＤＮＡ配列は、アニーリングしてねじれ型（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）ＤＮＡ二重鎖を形成する一連のオリゴヌクレオチド配列を生成するために選択され、そして分析される。部分鎖配列は、オリゴヌクレオチドがアニーリングする場合に、完全な二本鎖ＤＮＡ配列がいかなる配列ギャップも有さないが一緒に連結され得るニックを有して生成されるように、設計され得る。あるいは、オリゴヌクレオチド部分鎖配列は、部分鎖がアニーリングした後に、１つ以上のギャップがねじれ型（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）ＤＮＡ二重鎖間に存在するように設計され得、このギャップは、ＤＮＡポリメラーゼによって埋められ得る。例えば、約３０マーのオリゴヌクレオチド配列が選択され、好ましくは、長さが約４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１１０ヌクレオチド、１２０ヌクレオチド、１３０ヌクレオチド、１４０ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、１６０ヌクレオチド、１７０ヌクレオチド、１８０ヌクレオチド、１９０ヌクレオチド、または２００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド配列が選択される。合成するオリゴヌクレオチド配列を選択することにおいて、当業者に周知の以下の一般的な指針に従うべきである：（ａ）部分鎖配列の２つのセグメントは、二重鎖形成についての同等の安定性を有するべきである；（ｂ）ほとんどの二重鎖は、類似のＴｍを有するべきである；（ｃ）安定な一本鎖構造を形成する傾向にある特定の配列（例えば、Ｇの連続）は、可能であれば避けるべきである；（ｄ）反復セグメントは誤整列を生じ得、従って誤った遺伝子配列を生じるので、ギャップを作製することによって避けるべきである。
【００８９】
別の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチド配列は、それ自体にアニーリングし、それによってヘアピンループを有する二重鎖オリゴヌクレオチドを形成するように、合成され得る。ヘアピンループは、例えば、マングビーンヌクレアーゼまたはＲ．Ｅ．酵素を用いて切断され得、そして二本鎖オリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオチドおよび／または二重鎖オリゴヌクレオチドに直接連結されて、長いＤＮＡ配列を生成する。
【００９０】
オリゴヌクレオチド部分鎖が、固体支持体上で合成された後、これらは上記のように固体基支持体から切断される。あるいは、部分鎖のいくつかは、基材に付着したままであり、固体支持体から放出されたオリゴヌクレオチド部分鎖とアニーリングして、所望のＤＮＡ配列を生成する。固体基材（例えば、マイクロアレイプレート）から収集されたオリゴヌクレオチドは、上記のように合成後にオリゴヌクレオチドが単純な洗浄工程に供され、切断され、そして塩混入のない条件下で数十μｌの容積で表面から洗い落とされる場合、容積を減少させることも脱塩精製することも必要なく、その後の工程に直接使用されて、長いＤＮＡ配列を生成し得る。次に、一連のオリゴヌクレオチド部分鎖配列がアニーリングされて、所望のＤＮＡ配列を形成する。形成された大きな合成ＤＮＡ配列は、非特異的ハイブリダイゼーション、非等価な連結効率、および他の理由に起因して形成し得る、短いセグメントから分離される。長い二本鎖ＤＮＡ配列は、マッチ修復酵素（例えば、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ、および／またはｍｕｔ  Ｙ）を使用して、さらに精製され得る。配列精度は、配列決定およびアガロースゲル分析を使用して確認される。さらなるクローニングおよびタンパク質発現（十分に当業者の技術範囲内にある）は、合成された長いＤＮＡ配列の機能確認のために使用され得る。
【００９１】
全長ＤＮＡ鎖へのオリゴヌクレオチド部分鎖のアセンブリのために必要とされる工程は、当業者に周知である。第１の工程において、部分鎖は、緩衝溶液中でアニーリングされるかまたはハイブリダイズされて、長鎖の二重鎖構造を形成する。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチド部分鎖は、それらがアニーリングしてＤＮＡ配列中にいかなるギャップも有さない長いＤＮＡ配列を形成するように、設計される。すなわち、オリゴヌクレオチド部分鎖を一緒に連結して所望のＤＮＡ配列を生成するために、リガーゼのみしか添加される必要がない。別の好ましい実施形態において、ギャップは、部分鎖の計算的選択における特定の制約（例えば、配列重複、融点適合性、および二次構造）に起因して、二重鎖構造中に存在し得る。このギャップは、ＤＮＡポリメラーゼ反応を使用して埋められる。種々のＤＮＡポリメラーゼが、ギャップを埋めるために利用可能であり、このＤＮＡポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノーフラグメント）、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、５’→３’エキソデオキシリボヌクレアーゼ機能を有さないＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノーフラグメント）が使用される。
【００９２】
本開示の別の好ましい実施形態において、固体基材上で合成されたオリゴヌクレオチドは、好ましくは、固体基材上で連結を介して中程度の長さの鎖にアセンブルされ、この中程度の長さの鎖は、その後、好ましくは同様に固体基材上でも、所望の全長の長いＤＮＡ配列にアセンブルされる。このプロセスを行う「カスケード」合成機が、図８に示される。このデバイスは、３つの別個の反応器からなる。まず、流体の流れが、各々の反応器に供給され、小さいＤＮＡフラグメントが別個に合成される。次に、流れの方向が逆転され、そして２つの上流の反応器で合成されたＤＮＡフラグメントが切断され、そして連結によるアセンブリのために下流の反応器に送られる。パリレンチェック弁が、必要な場合に流れを方向付けるために、フローチャネル中に製造され得る。より良い流れ均一性を達成するために、供給チャネルおよび排出チャネルは、主要な流れ方向に沿ってテーパ加工されて、流れ流動の変化に適合される。図９は、図８に示される合成ユニットのアレイを備える、長いＤＮＡ配列を合成するために好ましいデバイスを示す。
【００９３】
本開示の別の好ましい実施形態において、固体基材上で合成されるオリゴヌクレオチドは、固体基材から切断され、そして単離される。オリゴヌクレオチドは、その後、固体基材から分離してアセンブルされる。オリゴヌクレオチドはまた、連結を介して中程度の長さの鎖にアセンブルされ得、その後、この中程度の長さの鎖が全長の長いＤＮＡ配列へとアセンブルされ得る。あるいは、オリゴヌクレオチドは、所望の長いＤＮＡ配列へと直接アセンブルされ得る。
【００９４】
なお別の実施形態において、１つ以上の合成オリゴヌクレオチドが、固体基材に付着されている別のオリゴヌクレオチドに連結される。この方法において、固体表面のストリンジェンシーな洗浄工程が、連結工程の前に反応に組み込まれ得、この洗浄工程は、ハイブリダイゼーション工程中にアニーリングされるほとんどのミスマッチ配列を連結前に洗い流すことを生じる。この方法は、所望の長いＤＮＡ配列を直接生成するために使用され得るか、または中程度の長さの鎖をアセンブルするために使用され得、この中程度の長さの鎖は、その後、固体基材に依然として付着されている他のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされて、最終的な長いＤＮＡ配列産物を形成する。
【００９５】
遺伝子アセンブリのためのオリゴヌクレオチドは、連結のために利用可能な３’−ＯＨを必要とする。オリゴヌクレオチドの５’リン酸化もまた、上記のように達成され得る。アニーリングされたオリゴヌクレオチドを所望の長さのＤＮＡ配列へとアセンブリすることを完了するために、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドの長鎖二重鎖中のニックは、ホスホジエステル結合によって結合されなければならない。ＤＮＡリガーゼは、二重鎖構造中に整列された並列した３’−ヒドロキシル末端基と５’−ホスホリル末端基とを有する場合に、ポリヌクレオチド鎖の結合を触媒するために使用される。オリゴヌクレオチドを一緒に連結するために使用され得るＤＮＡリガーゼとしては、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、およびＤＮＡリガーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼが、この反応のために使用される。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼについて最適な反応条件は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ、５％ポリエチレングリコール−８０００である。さらに、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼは、リン酸化緩衝液の存在下で十分に働くので、リン酸化緩衝液を除去する必要はない。Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼもまた、連結がより高い温度（約６５℃）で行われる場合に使用され得る。
【００９６】
上記で議論されるように、最終的な長鎖ＤＮＡ産物の量は、フェムトモルのオーダーである。より多い量の長いＤＮＡ配列産物が望まれる場合、増幅プロセスは、アセンブリプロセス後に必要とされ得る。１つの実施形態において、ＰＣＲＴＭが、増幅を行うために利用され、これは、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号に詳細に記載されており、各々が本明細書中で参考として援用される。マイクロＰＣＲ反応器（ｍｉｃｒｏ−ＰＣＲ  ｒｅａｃｔｏｒ）もまた、チップ上でこの工程を行うために使用され得る（Ｂｕｒｋｅら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７（３）：１８９−９７、１９９７；Ｂｕｒｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：４８４−８８７、１９９８；本明細書中で参考として援用される）。ＰＣＲＴＭでは、核酸に選択的にハイブリダイズする一対のプライマーが、選択的なハイブリダイゼーションを可能にする条件下で使用される。本明細書中で使用される場合、用語プライマーは、鋳型依存性プロセスにおいて新生核酸の合成をプライミングし得る任意の核酸を含む。プライマーは、二本鎖形態または一本鎖形態で提供され得るが、一本鎖形態が好ましい。プライマーは、多数の鋳型のいずれか１つに依存するプロセスにおいて、所定の鋳型サンプル中に存在する標的遺伝子配列を増幅するために使用される。さらに、様々な長距離ＰＣＲキットがいくつかの会社（例えば、Ｓｉｇｍａ製のＪｕｍｐＳｔａｒｔ  ＲＥＤＡｃｃＴａｑ、およびＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．製のＥＬＯＮＧＡＳＥ酵素ミックス）から市販されている。これらの酵素は、フラグメントを３０Ｋｂまで増幅し得る。
【００９７】
ＤＮＡ増幅のために必要な反応成分は当業者に周知である。ＤＮＡ増幅工程（例えば、変性、ハイブリダイゼーション、および伸長）の温度、インキュベーション時間、およびランプ時間が、実質的にＤＮＡ増幅の効率および他の結果を変化することなく大幅に変化し得ることもまた、当業者に理解される。あるいは、当業者は、これらのパラメータをＤＮＡ増幅反応を最適化するために変更し得る。反応条件およびパラメータにおけるこれらの小規模な改変は、本開示の範囲内に含まれる。
【００９８】
所定の配列に対するアセンブルされた長いＤＮＡ配列産物の配列の確認は、オリゴヌクレオチドを製造するための並行合成プロセス、および長いＤＮＡ配列へのアセンブリの最終確認として使用され得る。長いＤＮＡ配列産物がＰＣＲによって増幅されるかまたは適切なベクター中にクローニングされた後、この産物は、当業者に周知の標準的な配列決定法を使用して配列決定される。これは、市販のシークエンサー（例えば、ＡＢＩ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）製のＡＢＩ  ７３００）、または民間の配列決定サービス（例えば、ＳｅｅｋＲｉｇｈｔ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）が提供するサービス）のいずれかを使用することによって行われ得る。
【００９９】
多くの場合、連結工程およびＰＣＲ工程の後に、合成された長いＤＮＡ配列をクローニングすることが望ましい。エラーのない配列は、クローニングされた長いＤＮＡ配列のサンプルを配列決定すること、および所望の配列を有するサンプル選択することによって得られ得る。本開示の１つの好ましい実施形態は、エラーのない遺伝子を合成することに関する。この実施形態において、サイズが中程度でありかつ部分的に重複している遺伝子セグメント（例えば、長さが５００ｂｐ〜１０００ｂｐである遺伝子セグメント）が、第一に合成され、クローニングされ、そして配列決定される。配列決定の結果から、エラーのないセグメントが選択され、そしてすべての部分的に重複し、エラーのない中程度のセグメントを混合鋳型として用いるＰＣＲを使用して、全長遺伝子がアセンブルされる。合成オリゴヌクレオチドおよび連結／ＰＣＲ産物に関するエラーの割合のために、このアプローチは、合成されたオリゴヌクレオチドを全長遺伝子に直接アセンブルするアプローチよりも、より高い確率でエラーのない全長遺伝子配列を生じる。
【０１００】
図１の下部に記載されるように、上記で開示された方法を使用して、ある長いＤＮＡ配列（すなわち、ＧＦＰ遺伝子）を合成することに関して見出されるエラーの割合は、１．４０‰であった。この同じエラー割合を指針として使用すると、１０００ｂｐのＤＮＡまたは遺伝子セグメントが、予測された（１〜１．４０‰）１０００＝２４．６％のエラーのない産物と共に生成され得る。これらのエラーのない産物は、クローニング、その後の配列決定の使用を通して容易に同定され得る。さらに、より長いＤＮＡ配列は、長さが約１，０００ｂｐの配列を確認したいくつかのセグメントと一緒に連結することによって生成され得る。代替的なこれらのより長いＤＮＡ配列は、融合ＰＣＲ法（図１０）を使用して生成され得る。
【０１０１】
（Ｉ．一塩基多型（ＳＮＰ）検出）
本明細書中で開示されるような多重並行オリゴヌクレオチド合成は、大スケールのＳＮＰ検出用のオリゴヌクレオチドのプールを生成するために試用され得る。ＳＮＰは、個体のゲノム中の特定の位置での安定なヌクレオチド配列変異であり、ゲノムＤＮＡのコード領域および非コード領域の両方に見出され、ヒトゲノム全体にわたって数多く見出される（Ｃｏｏｐｅｒら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６９：２０１−２０５、１９８５）。平均して、ゲノムの１０００ヌクレオチド毎につき１つのＳＮＰが存在する。ＳＮＰコンソーシアム（ＴＳＣ）は、２００万個を超えるＳＮＰを同定しており、その数は依然として増大している。ＳＮＰは、多くの遺伝子疾患を同定することにおける予測価、ならびに望ましくあり得る表現型特性を有し、この表現型特性は多くの場合、集団における限られた数の異なる変異によって引き起こされるので、ＳＮＰの大スケール検出が望ましい。さらに特定のＳＮＰは、疾患を引き起こす変異（例えば、遺伝的乳癌）を生じる（Ｃａｎｎｏｎ−ＡｌｂｒｉｇｈｔおよびＳｋｏｌｎｉｃｋ、Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２３：１−５、１９９６）。ＳＮＰ検出はまた、連鎖不均衡マッピングまたは遺伝的アセンブリ研究を使用する、一般的な多因子疾患を引き起こすかまたは一般的な多因子疾患に寄与する遺伝子についての大スケールの探索において、マーカーとして使用され得る（ＳｃｈａｆｅｒおよびＨａｗｋｉｎｓ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １６：３３−３９、１９９８；Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９６：１５１７３−７７、１９９９）。薬物代謝酵素、薬物輸送体、およびレセプターをコードする遺伝子における機能性ＳＮＰもまた、新しい医学治療を開発、設計するために使用され得る。従って、大スケールのＳＮＰ検出は、集団遺伝学、医学、薬理学、および分子進化研究について有意に科学的かつ実用的な価値を提供する可能性を有する。
【０１０２】
１つの実施形態において、大スケールのＳＮＰ検出は、何百、何千、または何万ものＳＮＰを含むＤＮＡフラグメント（アンプリコン）の増幅を包含する。ほとんどのＳＮＰは、保存ヌクレオチド配列によって分離されるので、平均ゲノム増幅産物は、ただ１つまたは数個のＳＮＰを含む。ゲノム中の大スケールのＳＮＰ検出について、多数のアンプリコンが生成され、そして分析されなければならない。現在の大スケールのＳＮＰ分析における主な制限的工程は、アンプリコンを生成するための多数のプライマーを合成することである。ＰＣＲプライマーオリゴヌクレオチドのプールを生成することは、費用がかかり、かつ時間を消費する。多数の別個のＰＣＲ反応物の調製は、労働集約的であり、誤りを起こしやすく、そしてスケールが何万もの反応物である場合、自動化されたロボットシステムを用いてでも非実用的である。本開示の方法は、その後に分析されるＳＮＰを含むアンプリコンのアレイを増幅するためのプライマーとして使用される、オリゴヌクレオチドのプールの高速かつ効率的な生成を可能することによって、これらの制限を克服する。
【０１０３】
オリゴヌクレオチドプライマーのプールを使用する大スケールのＳＮＰ検出について、１つ以上のＳＮＰを含むアンプリコンの増幅用の一対の特定のプライマーが、本明細書中で開示されるように多重並行オリゴマー合成のために、微小流体反応器の各反応容器中で合成される。各プライマーは、好ましくは、切断可能なリンカーを用いて合成される。別の好ましい実施形態において、微小流体反応器の反応容器またはマイクロチャネルは、疎水性の流体（例えば、鉱油）で封着される。次いで、封着された反応容器は、図１１に示されるようなスーパーマイクロプレートを作製する独立した反応チャンバーとして機能する。各反応容器の生体分子（例えば、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、ペプチドなど）は、インサイチュで合成される。代替的な実施形態において、反応容器は、狭いチャネルおよび／または粘性反応溶液を利用することによって、異なるレベルで単離される。合成プライマーは、反応容器の固体支持体から切断されるか、あるいは一方のプライマーが切断される間に、他方のプライマーが固体支持体に付着したままにされる。
【０１０４】
切断後、増幅試薬（例えば、ＲＮａｓｅ、化学薬品、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、緩衝液、ゲノムＤＮＡなど）が、チップの反応チャンバーに送達され、その後、反応容器が再び独立した反応チャンバーを作製しかつ合成プライマーを使用してアンプリコンの増幅を可能にする条件に供される（図１１）。別の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは、ユニバーサルプライマー配列を含むように設計される。この配列は、所望の場合に、ユニバーサルプライマーを用いるアンプリコンの別の増幅ラウンドを可能にする。なぜなら、アンプリコンは、すべてユニバーサル配列でタグ化されるからである。ユニバーサルプライマーについての従来のＰＣＲ条件は、その後の増幅ラウンドに使用される。このシステムは、独立する一重増幅反応を行う各反応容器を用いて、何万ものアンプリコンを並行に増幅し得、そして多重システムにおける交差相互作用を回避し得る。
【０１０５】
図１１に示されるように生成されたアンプリコンのその後の増幅のための別の方法は、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖のみを加水分解する、改変された制限酵素によって認識されるＤＮＡ配列を組み込み、それによって、切断されるのではなく「ニックを有する」ＤＮＡ分子を生成することである。これらのニックは（３’−ヒドロキシ、５’−ホスフェート）は、鎖置換増幅（Ｗａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３９２−３９６、１９９２；Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ２０：１６９１−９６、１９９２；米国特許第５，２７０，１８４号；本明細書中で参考として援用される）のための開始点として作用する。この方法を利用するために、ニック酵素についての特定の認識部位（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ、Ｎ．Ａｌｗ  Ｉ、Ｎ．ＢｂｖＣ  ＩＡ、およびＮ．ＢｂｖＣ  ＩＢ）が、プライマーにおける２つのユニバーサル配列の一方に組み込まれる。ニック酵素は、二本鎖アンプリコンの一方の鎖を認識しかつ切断し、そして特別なＤＮＡポリメラーゼがニック鎖を伸長しかつ元の鎖を置換するために使用される。次いで、ニック酵素が伸長鎖上で別の切断を行い、そしてＤＮＡポリメラーゼが、再び伸長しＤＮＡ鎖を置換する。この反応は、複数回繰り返され、それによって各アンプリコンについて一本鎖ＤＮＡの複数のコピーが生成される。この線形的な増幅は、標的アンプリコンをさらに増幅するだけでなく、ハイブリダイゼーションに適切な一本鎖ＤＮＡ標的も生成する（図１２）。
【０１０６】
アンプリコンが生成された後、それらは特定の位置での特定のＳＮＰの存在について分析されなければならない。アンプリコンは、好ましくは、チップ上で分析されるか、または分析のためにチップから回収されるかのいずれかである。例えば、リアルタイムアッセイ（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｅａｃｏｎＴＭおよびＴａｑＭａｎＴＭ）が改変され得、そしてチップ上で行われ得る。好ましくは、アンプリコン産物は、ＳＮＰ検出の前に精製される。ＳＮＰは、当業者に周知の多くの方法によって、アンプリコンにおいて検出され得、そして同定され得、これらの方法としては、ＰＣＲＴＭまたはＤＮＡ増幅によるＳＮＰの同定、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ：ＯＬＡ）（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７、１９８８、本明細書中で参考として援用される）、ミスマッチハイブリダイゼーション、質量分析、一塩基伸長アッセイ、対立遺伝子特異的制限エンドヌクレアーゼ切断に基づくＲＦＬＰ検出（ＫａｎおよびＤｏｚｙ、Ｌａｎｃｅｔ  ｉｉ：９１０−９１２、１９７８、本明細書中で参考として援用される）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーション（Ｗａｌｌａｃｅら、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ６：３５４３−３５５７、１９７８、本明細書中で参考として援用される）、ミスマッチ修復検出（ＭＲＤ）（ＦａｈａｍおよびＣｏｘ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ５：４７４−４８２、１９９５、本明細書中で参考として援用される）、ＭｕｔＳタンパク質の結合（Ｗａｇｎｅｒら、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２３：３９４４−３９４８、１９９５、本明細書中で参考として援用される）、一本鎖コンフォメーション多型検出（Ｏｒｉｔａら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５：８７４−８７９、１９８３、本明細書中で参考として援用される）、ミスマッチ塩基対でのＲＮａｓｅ切断（Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２、１９８５、本明細書中で参考として援用される）、異種二重鎖ＤＮＡの化学的切断（Ｃｏｔｔｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：４３９７−４４０１、１９８８、本明細書中で参考として援用される）または酵素的切断（Ｙｏｕｉｌら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：８７−９１、１９９５、本明細書中で参考として援用される）、対立遺伝子特異的プライマー伸長に基づく方法（Ｓｙｖａｎｅｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８：６８４−６９２、１９９０、本明細書中で参考として援用される）、遺伝的ビット分析（ＧＢＡ）（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖら、Ｎｕｃｉ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２２：４１６７−４１７５、１９９４、本明細書中で参考として援用される）、ならびに当該分野で周知の標準的な手順を使用する放射活性および／または蛍光ＤＮＡ配列決定が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、ＳＮＰを検出するために使用される方法は、二倍体のゲノム中の同型接合の対立遺伝子改変体および異型接合の対立遺伝子改変体の間を明確に区別し得る。
【０１０７】
大規模ＳＮＰ検出のために好適な１つの方法が、図１３に図示される。本方法は、増幅チップを利用して、上で開示したように、アンプリコンを１つ以上のＳＮＰで増幅する。その後、このアンプリコンは、別々のチューブに収集され、そしてアンプリコンを増幅するために使用したプライマーがユニバーサルプライマー配列を含んだことに起因して、別の回のアンプリコン増幅産物の産生のために、ユニバーサルプライマーが使用される。ＳＮＰ配列を含むアンプリコンは、変性され、そして検出チップに加えられる。この検出チップは、チップに付着するオリゴヌクレオチド配列を有し、このオリゴヌクレオチド配列は、ＳＮＰをコードする配列を含む一本鎖アンプリコンの５’末端にハイブリダイズする。このチップは、洗浄に供され、いかなる不適合の一本鎖アンプリコンをも除去する；この洗浄は、検出されるＳＮＰにハイブリダイズしない（１塩基対不適合）実質的に全てのアンプリコンを除去するために十分にストリンジェントであるべきである。次に、標識（例えば、蛍光標識）したオリゴヌクレオチドを、チップに加え、これは、一本鎖アンプリコンの３’末端にハイブリダイズする。リガーゼを添加し、その結果、検出されるＳＮＰが存在する場合、標識したオリゴヌクレオチドが、付着の検出され得るオリゴヌクレオチドとライゲーションされる。従って、スクリーニングされるＳＮＰがアンプリコンにおいて存在する場合、これは増幅され、標識された産物が産生される。
【０１０８】
大規模ＳＮＰ検出のために好適な別の方法は、一塩基伸長アッセイ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｂａｓｅ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）である。一塩基伸長アッセイは、オリゴヌクレオチドプライマーの相補的核酸へのアニーリング、およびアニーリングしたプライマーの鎖停止ヌクレオチド（これは、ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される鋳型定方向反応（ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）において添加される）による３’末端の伸長によって実施される。さらに、サイクル一塩基伸長反応は、核酸プライマーを、検出されるべき１塩基を含む領域の直ちに５’側に接してアニーリングすることによって実施され得る。２つの別々の反応を行う。第１の反応において、プライマーを、相補的核酸にアニーリングし、そして検出されるべき１塩基での非野生型改変体に相補的な標識核酸、および野生型塩基に相補的な未標識ジデオキシ核酸を、結合させる。プライマー伸長は、塩基がプライマーに最初に加えられた時に、停止される。伸長プライマーにおける標識の存在は、非野生型改変体の存在の指標である。ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を、プライマー伸長のために使用する。好ましい実施形態において、熱安定性ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ）または熱シークエナーゼ（ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）を使用して、より効率的な周期を可能にする。
【０１０９】
一旦伸長反応が完了すると、標的核酸に結合した第１プローブおよび第２プローブは、反応混合物をハイブリッドの融解温度以上に加熱することによって分離される。次いで、この反応混合物を、ハイブリッドの融解温度以下に冷却し、別の回の伸長反応のために更なるプライマーが標的核酸に結合される。全ての周期の完了後、伸長産物を単離し、分析する。あるいは、ジデオキシヌクレオチド以外の鎖停止方法が使用され得る。例えば、鎖停止は、プライマー上で次に使用し得るヌクレオチドにおいて組み込みが可能なさらなる塩基が存在しない場合に起こる。一塩基伸長アッセイは、上に開示した方法によって増幅されているアンプリコン、または使用されるプライマーのどちらかにおいて、ＳＮＰの存在を検出するために使用され得、このプライマーは、本明細書中で開示されるように固体基材上で直接合成され、スクリーニングされるＤＮＡサンプルにおいて直接ＳＮＰを検出するために使用され得る。
【０１１０】
別の好ましい実施形態において、ＳＮＰの大規模検出のために合成されるオリゴヌクレオチドプライマーが、対立遺伝子特異的ＰＣＲＴＭ（Ｎｅｗｔｏｎら，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １７：２５０３−１６，１９８９、本明細書中に参考として使用される）のために設計され得る。この技術は、不適合３’残基を有するオリゴヌクレオチドが適切な条件下でのＰＣＲのためのプライマーとして機能しないという観察に基づく。従って、プライマー対は、プライマーの１つの３’末端において、異なったヌクレオチドで合成され得、これは、ゲノムの特定の位置で異なったＳＮＰを増幅するように設計され、プライマーの配列によって特定化される。アンプリコンがプライマー対によって産生される場合、従って、検出される特定のＳＮＰが、このＤＮＡサンプル中に存在する。このシステムは、単純かつ信頼性があり、ＳＮＰ遺伝子座において同型接合体であるゲノムから、ＳＮＰ遺伝子座において異型接合体であるゲノムを識別する。
【０１１１】
好ましい実施形態において、上記のアンプリコンの増幅のために必要なプライマーの対、または本明細書中で開示される適用のために必須のオリゴヌクレオチドのプールのためのプライマーの対が、本明細書中で開示される方法に従う固体表面上に合成される１つのオリゴヌクレオチドから産生され得る。この方法において、インサイチュ合成されたオリゴヌクレオチド（好ましくは、切断可能なリンカーで固体基材に付着する）は、別の切断可能なリンカーで互いに分離される１対のプライマー（例えば、逆Ｕ（図１４））を含む。好ましくは、各プライマー配列は、特定のプライミング部位およびユニバーサルプライミング部位を有する。オリゴヌクレオチドが合成された後、これは、リンカーを切断する試薬（例えば、ＲＮａｓｅ  Ａ）に曝され、それにより、固体表面からオリゴヌクレオチドを遊離し、そしてこれを切断して、その結果２つのプライマーが分離される。ＰＣＲ試薬および標的ＤＮＡを、リンカーを切断する試薬と同時またはオリゴヌクレオチドが切断された後に、上述のように反応ウェルに加え得る。好ましい実施形態において、ＰＣＲ試薬を、粘性の高い溶液に、上述のように加える。好ましくはオンチップで起こるＰＣＲおよび特定のＰＣＲ産物は、各反応セルにおいて産生される。各フラグメントが両末端にユニバーサルプライマー部位を有するため、ＰＣＲ産物は、好ましくはチップからチューブへ押し流され、ユニバーサルプライマーを用いるＰＣＲを使用して再増幅される。これらの増幅されたＤＮＡ産物は、ここで、例えば、ＳＮＰ検出または短ＤＮＡライブラリーの産生のために使用可能な状態である。
【０１１２】
２つの逆Ｕ（ｒＵ）リンカーを含み、かつチップ上で合成された切断可能オリゴヌクレオチドの例は、以下のようである：
【０１１３】
【化２】
2006503586.tif 000005
これらのオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅ  Ａに曝され得、これは、ｒＵリンカー部位を切断し、それにより、１つの合成されたオリゴヌクレオチドから２つの別々のプライマーを遊離する。
【０１１４】
（Ｊ．短ＲＮＡ分子またはＲＮＡｉライブラリーの産生）
本開示の別の実施形態は、多数の短ＲＮＡ分子またはＲＮＡｉライブラリーの産生のための方法である。ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）分子は、２本鎖低ＲＮＡ分子（２１〜２３塩基対）である。これらの分子は、標的されたｍＲＮＡを分解することによって遺伝子の発現を抑制する。潜在的に、ＲＮＡｉは、治療剤として開発され得る。例えば、配列特異的ＲＮＡｉサイレンサーは、多くの場合ＨＩＶゲノム全体を網羅するように設計され、多数の部位でウイルスＲＮＡを分解する。このアプローチは、潜在的に、抗ＨＩＶ薬物開発における最も困難な問題（多剤耐性に導くウイルスゲノムにおける高い変異率）を解決し得る。多数の異なった特定の標的配列を含むＲＮＡｉプールを治療剤として使用することにより、「ホットスポット」におけるいかなる変異も、薬物の全体の性能に影響しない。このＲＮＡｉプール戦略はまた、他の領域（例えば、多剤耐性細菌に対する薬物の開発）に適用され得る。転写ＲＮＡｉ配列のプールはまた、ベクターにクローン化され得、ＲＮＡｉライブラリーを産生する。
【０１１５】
好ましい実施形態において、短ＲＮＡ分子またはＲＮＡｉライブラリーの産生は、以下の工程を包含する：
・短ＲＮＡ分子またはＲＮＡｉライブラリーのインビトロ転写のためのオリゴヌクレオチド−ＤＮＡ鋳型の設計。
【０１１６】
・設計されたオリゴヌクレオチドのチップ上での並行合成。
【０１１７】
・オリゴヌクレオチドのオンチップ検出および副生成物の除去；必要な場合、合成された配列のオンチップ精製。
【０１１８】
・基質表面から合成されたオリゴヌクレオチドの切断による３’−ＯＨ遊離配列の取得。
【０１１９】
・ＰＣＲを用いたオリゴヌクレオチドの増幅による二本鎖オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドライブラリーの形成。
【０１２０】
・インビトロ転写による短ＲＮＡ分子またはＲＮＡｉライブラリーの形成。
【０１２１】
他の好ましい実施形態において、合成されたオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡプロモーターに対する配列（例えば、Ｔ７、ＳＰ６、またはＴ３プロモーター）、および／またはユニバーサルプライマー配列を含む。ＲＮＡプロモーター配列は、産生されたオリゴヌクレオチドからの短ＲＮＡ配列の転写を可能にし、それにより、ＲＮＡ分子またはＲＮＡｉライブラリーの混合物の産生を可能にする。
【０１２２】
好ましい実施形態において、多数の短ＲＮＡ分子またはＲＮＡｉライブラリーを産生するためのオリゴヌクレオチドは、インサイチュで合成され（約６０マー）、そして各オリゴヌクレオチドは、好ましくは、ｒＵ、Ｔ７プロモーター、特異的ＲＮＡｉ配列、およびＲ．Ｅ．酵素配列を含む。好ましくは、Ｒ．Ｅ．酵素は、平滑末端フラグメントを産生するために使用される。図１５において示される例において、ＭｌｙＩ酵素についての制限部位を、使用した。オリゴヌクレオチドを合成した後、リンカーを切断する試薬（例えば、ＲＮａｓｅ  Ａ）にこれを曝し、それにより、固体表面からオリゴヌクレオチドを遊離する。次いで、切断したオリゴヌクレオチドを、好ましくはチップからチューブに押し流し、Ｔ７配列にハイブリダイズするプライマーおよびＲ．Ｅ．酵素配列にハイブリダイズするプライマーを用いるＰＣＲを使用して再増幅する。増幅したＤＮＡ配列を、Ｒ．Ｅ．酵素（例えば、３７℃でＭｌｙＩ）で切断し、それにより、共通Ｔ７配列および平滑末端制限部位を有する何千もの特異的ＲＮＡｉ配列を生じる。次いで、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いるインビトロ転写を使用して、何千もの異なった使用可能状態のＲＮＡｉ分子のプールを、産生する。
【０１２３】
ＲＮＡｉ分子のプールを産生するための別の好ましい実施形態を、図１２に示す。この例において、ゲノムＤＮＡの配列を、ユニバーサルプライマー配列および特異的プライマー配列の両方を有するプライマーを用いて増幅する。増幅したＤＮＡ産物を、その後、ユニバーサル配列にハイブリダイズするプライマーであるが、プライマーの１つはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼに特異的な配列もまた含む、プライマーを用いて、再び増幅し、それにより、この配列を、第２回の増幅ＤＮＡ配列内に組み込む。次いで、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを、増幅ＤＮＡに加え、増幅ゲノムＤＮＡ配列を短ＲＮＡ配列内に転写する。
【０１２４】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実施するために含まれる。これは、本発明者らによって本発明の実施においてよく機能することが開示される技術を表し、それによりその実践に好ましい様式を構築すると考えられ得る実施例において開示されることが、当業者によって理解されるべきである。しかし、本発明の開示の点で、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示される特定の実施形態において多くの変更がなされ得、そしてなお類似および同類の結果を得うることを、当業者は理解するべきである。
【実施例】
【０１２５】
（実施例１）
オリゴヌクレオチドＤＮＡチップの並行合成を、合成装置に接続したカートリッジホルダーにおいて保持されるマイクロアレイチップ上で行った。微小反応ウェル表面を、ヒドロキシルシリルで誘導体化し、そして検出チップについて、５’−Ｏ−ＤＭＴ基で末端化されたヌクレオホスホラミデートとカップリングし、そして２’，３’−オルトエステル−Ｕの５’ホスホラミデートとカップリングし、そして、２’，３’−オルトエステル−Ｕで停止する。光検出脱ブロック工程の間、反応セルを、まずＰＧＡ−Ｐ溶液（ヨードジアリール塩および感作物質）で満たした。デジタル光パターンを、所定のチップ配置に従って産生して、反応セルがマイクロアレイプレート上に突出するように並べた。照射反応部位において、５’−ＤＭＴ基を、インサイチュ形成したＰＧＡ（Ｈ＋）および形成した末端５’−ＯＨによって除去したか、またはＵの２’，３’−オルトエステルをインサイチュ形成したＰＧＡ（Ｈ＋）および形成した末端２’−ＯＨまたは末端３’−ＯＨによって水和した。非照射反応部位において、化学反応は起こらなかった。脱ブロック後、リアクターを溶媒で洗浄した。次いで、適切なヌクレオホスホラミダイト（モノマー）を含む溶液を添加し、そして選択された部位におけるＯＨ基をモノマーにカップリングし、伸長する鎖の新規の残基の添加を完了した。オリゴヌクレオチドアレイの合成を、連続合成サイクルにおける一連の所定のデジタル光照射パターンまたはデジタルマスクを通した工程を行うことにより達成した。
【０１２６】
（実施例２）
異なる方法を、固体基材上で合成されたオリゴヌクレオチドの固体基材からの遊離または切断のために使用し得る。３つの異なったリンカーの切断効率を、固体基材からのオリゴヌクレオチドの切断のために好ましいリンカーを決定するために試験した（ｒＵは、２’−アセチルおよび３’−ＤＭＴを有する５’−ホスホラミダイトである；Ｕは、２’−ｆｐｍｐおよび５’−ＤＭＴを有する３’−ホスホラミダイトである；そしてｄＵは、２’−デオキシウリジンである）。始めに、ＥｘｐｅｔｉｄｅＴＭＤＮＡ合成装置および標準的ホスホラミダイト化学を用いて、以下のオリゴヌクレオチドを合成した：
【０１２７】
【化３】
2006503586.tif 000006
配列Ａを、ＣＰＧまたは通常のヌクレオホスホラミダイトまたは２’，３’−オルトエステル−Ｕ（ｒＵ）の５’−ホスホラミダイトとのカップリングのために機能付与したアフィニティ支持体（脱保護条件下で安定であるリンカー、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）上で合成した。チップ基質上のｒＵの表面ＯＨ基とのカップリング後、３％  ＴＣＡを用いた６分間脱ブロックを適用し、２’−ＯＨまたは３’−ＯＨを得、一方で、他のヒドロキシルを、アセチル化した。オリゴヌクレオチドのその後の合成を、ＤＮＡオリゴヌクレオチド合成の標準的プロトコールを用いて行った。配列Ｂおよび配列Ｃについて、ＦｐＭｐ−ＵホスホラミダイトをＣｒｕｃｈｅｍ（ＰＡ）から、そしてｄＵホスホラミダイトをＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入し、合成において使用した。その後、オリゴヌクレオチドの配列を、ＤＮＡオリゴヌクレオチド合成についての標準的プロトコールを用いて合成した。ＣＰＧおよびアフィニティ支持体上のオリゴヌクレオチドを、最初にＥＤＡ／ＥｔＯＨ（１：１）で、室温で２時間脱保護し、次いで、ＥｔＯＨ洗浄して、乾燥させた。オリゴヌクレオチドを、濃アンモニアを用いて、室温で２時間ＣＰＧから切断し、乾燥させ、そしてエタノール沈殿した。オリゴヌクレオチドサンプルの２６０ｎｍ  ＵＶ吸収を測定し、サンプルを−２０℃で保存した。
【０１２８】
溶液中のまたはアフィニティ支持体に結合した、それぞれ１７μｇのオリゴヌクレオチドＡ、ＢおよびＣを、２０μｌの１×ＴＥ緩衝液中１００単位のＲＮａｓｅ  Ａと共に、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、切断産物を、ＢｅｃｋｍａｎのＢｅｃｋｍａｎ  ＭＤＱ装置でのキャピラリー電気泳動によって分析した。この結果は、配列Ｂ（リンカーＲＮＡ  Ｕを含む）が、ＲＮａｓｅ  Ａによって１００％切断されたことを実証した。リンカー逆−Ｕ（ｒＵ）を含む約５０％の配列Ａのみが、切断された。切断されなかったオリゴヌクレオチド産物は、配列Ｃについて単離された。これは、ｄＵが使用されたためであることが予測され、リボヌクレアーゼによって切断されないことが予測される。さらに、インキュベーション時間を延長後に、配列Ａについてのさらなる分解は観察されなかった。その後、ＲＮａｓｅ  Ａ切断配列Ａを、ＤＮＡライゲーションの基質として使用し、これは、３’−ＯＨ基を有する配列を示す。しかし、配列Ａは、８０℃で３時間、濃アンモニアと共にオリゴヌクレオチドをインキュベートすることによって１００％切断され、そして切断されたオリゴヌクレオチド生成物は、さらなる改変無しでＤＮＡライゲーションのために使用し得ることを実証した。
【０１２９】
（実施例３）
微小流体アレイプラットフォーム上でオリゴヌクレオチドを産生し、オリゴヌクレオチドをライゲーションして長いＤＮＡ配列を産生する開示された方法を使用して、機能的全長遺伝子を合成する能力を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を使用して実証した。ＧＦＰファミリーのメンバーは、天然の色素の唯一の公知の種であり、これは、必然的に、１つの遺伝子によってコードされる。何故なら、色素生合成のための基質および必要な触媒部分の両方は、１つのポリペプチド鎖内で提供されるからである（Ｍａｔｚら，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２４（１０）：９５３−５９，２００２）。遺伝子の蛍光性質は、開示された方法によって産生された遺伝子の機能の直接の分析を可能にする。
【０１３０】
ＧＦＰ遺伝子は、７１４塩基対（ｂｐ）長である。ＧＦＰ遺伝子のアセンブリのための好適な部分鎖（コンピューターによる断片化）が選択され、そして４０と４７との間のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを、上記で概略した方法を用いてチップ上で合成した。チップ上で合成された３４のＧＦＰ部分鎖の完全なセットは、以下である：
【０１３１】
【表３】
2006503586.tif 000007
さらに、以下の２つのコントロールオリゴヌクレオチド（Ｐｕｃ２ＰＭ−完全適合およびＰｕｃ２ＭＭ−不適合）もまた、上で概略した方法を用いてチップ上で合成した：
【０１３２】
【表４】
2006503586.tif 000008
ＧＦＰの長い二本鎖ＤＮＡ配列の、短スタッキングオリゴヌクレオチド部分鎖への分断のための設計は、重複相補的領域のアニーリング温度の統一に基づき、例えば、各部分について、６０℃前後のＴｍを設定した。次いで、３４ＧＦＰオリゴヌクレオチド部分鎖のそれぞれを、チップ上で、ｒＵをチップとオリゴヌクレオチドとの間のリンカーとして使用して、合成した。オリゴヌクレオチドを、ＲＮａｓｅを用いて３７℃で、１０〜１００μｇ／ｍｌの濃度で約３０分間〜１２０分間、チップから切断した。次いで、切断したオリゴを、押し流し、濃縮し、そしてエタノール沈殿した。
【０１３３】
ＲＮａｓｅ  Ａ切断の後、遺伝子チップを、１０ｎＭのＣｙ３−Ｐｕｃ２の１５マーのプローブ（Ｐｕｃ２プローブ）（Ｐｕｃ２ＰＭの５’末端とハイブリダイズする）でハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション反応は、６×ＳＳＰＥ（ｐＨ６．６、２５％ホルムアミド）緩衝液中で、室温で１時間行い、そしてこのチップを、その後、同じ緩衝液で洗浄した。次に、このチップを、レーザースキャナで５３２ｎｍでスキャンし、そして画像を、ＡｒｒａｙＰｒｏソフトウェアで分析した。このデータを、Ｐｕｃ２プローブが、Ｐｕｃ２ＰＭコントロール部位で強くハイブリダイズすること（強度＝約４０，０００）、より弱くＰｕｃ２ＭＭコントロール部位とハイブリダイズすること（強度＝約１０，０００）、およびチップ上の任意の他の配列と有意にハイブリダイズしないことを、実証した（図１６）。
【０１３４】
切断したオリゴヌクレオチドを、１つの反応チューブ内にアセンブリさせ、そして１６μｌまでライゲーション反応のために濃縮した。回収したオリゴヌクレオチドを、次いで、４本のチューブに、それぞれオリゴヌクレオチド産物１：４：１６：６４の比で分取した。オリゴは、２５μｌの容積で０〜２０％のＰＥＧ８０００および４０単位のＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と共に７５℃で１分間アセンブリさせ、次いで６０℃で５分間、サーマルサイクラー上で４０サイクルを行った。オリゴヌクレオチド部分鎖の同一のセットをまた、ＣＰＧ上で１ｎＭの濃度およびライゲーションコントロールとして１０ｎＭの濃度で、合成した。全長ＧＦＰライゲーション産物を、ＰＣＲによって検出した。図１７は、全長ＧＦＰライゲーション産物をが、全てのライゲーション反応物中で、種々の効率で産生されることを実証した。ＰＥＧ８０００の反応物への添加は、ライゲーション効率を有意に上げ、そしてより長いフラグメントを生成した。
【０１３５】
合成ＧＦＰ遺伝子を、ｐＴｒｃＨＩＳベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローン化した。図１８は、分析した３０クローン中の１１が、ＧＦＰ遺伝子を含んでいたことを示す。サブクローン化したＧＦＰ遺伝子の１１，８を、チップ作製遺伝子配列についての誤り率を決定するために配列決定した。重要なことに、この実験は、チップ作製全長遺伝子を作製するための開示された方法が、ＣＰＧ由来合成遺伝子の誤り率よりも低い誤り率を有することを実証した。配列決定結果は、サブクローン化ＧＦＰ遺伝子についての計８つの誤りを見出し、開示された方法を用いて、８／（８×７ｌ４）＝１．４０‰（０．１４％）の誤り率を導いた。この誤り率は、大きな遺伝子合成について許容され得、ＣＰＧ合成したＧＦＰ遺伝子より低い（１．６７‰（０．１７％））。配列決定したＧＦＰ全長遺伝子の８つのクローンの中３または３７．５％は、誤りがなかった。
【０１３６】
サブクローン化した合成全長ＧＦＰ遺伝子の機能もまた、試験した。増幅したＧＦＰ遺伝子を、ｐＴｒｃＨＩＳベクター内のＢａｍＨＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位に挿入し、これを、ＸＬ１−ｂｌｕｅコンピテント細胞内に形質転換した。形質転換体を、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天培地上にプレート培養し、そしてＧＦＰ遺伝子の発現を、イソプロピルチオ−β−ガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）を用いて誘導した。ＥＧＦＰ遺伝子（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈより）もまた、ポジティブコントロールとしてｐＴｒｃＨｉｓ内にサブクローン化した。図１９は、全２５６コロニーから観察された増殖する７８の緑色蛍光コロニーを示す（ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを除く）。これは、計３０．５％のクローンが、機能的全長遺伝子を含むチップ作製ＧＦＰ遺伝子を含むことを実証した。
【０１３７】
（実施例４）
合成オリゴヌクレオチド配列中に幾つかの誤りが存在することは不可避であり、これはその後、長いＤＮＡ配列産物に組み込まれ得る。従って、ライゲーションしたオリゴヌクレオチド配列を増幅させる前に、いかなる誤り配列も除去することが、非常に所望される。Ｔ７エンドヌクレアーゼＩは、非完全適合ＤＮＡ、十字状ＤＮＡ構造、ホリディ構造または結合部、ヘテロ二本鎖ＤＮＡ，およびニック二本鎖ＤＮＡを認識し、切断するヌクレアーゼである（ＰａｒｋｉｎｓｏｎおよびＬｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０，１６９−１７８，１９９７）。このヌクレアーゼが、適切にアセンブリした大型ＤＮＡ配列の収率を改善するか否かを決定するため、実施例３で合成されたオリゴヌクレオチドの部分さを、ライゲーションプロセスの前に２つの画分に分離した。第１のフラクションを、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩで処理した。この処理の目的は、ハイブリダイゼーションおよび部分鎖オリゴヌクレオチドのライゲーションの後で任意の不適合ＤＮＡを除去することであった。他の画分は、ヌクレアーゼで処理せず、従って、コントロールとして役立った。
【０１３８】
２つの画分からのライゲーション産物を試験するため、全長ＧＦＰ配列を、プライマーを使用してＰＣＲによって増幅した。図２０は、全長ＧＦＰ配列が、両画分から得られたが、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩで処理した画分から増幅した全長ＧＦＰの量が減少したことを示す。この結果は、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩが、ライゲーションしたＧＦＰ産物の一部を消化しないことを示唆する。さらに、実験は、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩが、非特異的にＤＮＡを分解しないことを実証した。
【０１３９】
Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ消化画分の機能を試験するため、増幅したＧＦＰ遺伝子を、発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓのＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位内に挿入し、ＸＬ１−ｂｌｕｅコンピテント細胞内に形質転換した。次いで、形質転換体を、グリッドプレートに移し、そしてＩＰＴＧによって誘導した。サブクローン化したＥＧＦＰ遺伝子を、再びポジティブコントロールとして使用した。図２１は、ＵＶ照明の下で、緑色蛍光光を、合成ＧＦＰ遺伝子を発現する種々のコロニーから観察したことを示す。意義深いことに、両画分からの約３００コロニーを分析した後、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ消化画分の７５％が緑色蛍光を発し、一方、未処理画分からのコロニーの３１％のみが緑色に輝いた。この結果は、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩは、合成オリゴヌクレオチドのライゲーションの間に生じた不適合産物を除去し、それにより、産生された誤りのない全長ＧＦＰ遺伝子産物の割合が増加したことを示唆する。従って、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩは、ライゲーション産物を浄化するために使用され得、そして産生された長いＤＮＡ配列における誤り率を減少した。
【０１４０】
（実施例５）
合成オリゴヌクレオチド配列を、アニールし、そして一緒に融合して、長いＤＮＡ配列を産生し得る。一緒に融合し得るオリゴヌクレオチド配列の数の限定が存在するか否かを決定するため、４片、６片、および８片を、互いに結合して、図２２に示すように長いＤＮＡ配列を産生した。ＧＦＰ遺伝子の４、６または８のＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲの連続濃縮のために混合し、そして希釈した。図２２中のゲルのレーンを、２〜６で標識し、これは、鋳型ＤＮＡ希釈を示す：レーン２は、１：４である；レーン３は、１：１６である；レーン４は、１：６４である；レーン５は、１：２５６である；そしてレーン６は、１：１０２４である。図２２において実証するように、４、６または８のＤＮＡフラグメントを、融合して、長いＤＮＡ配列を産生し得る。
【０１４１】
（実施例６）
固体基材から合成オリゴヌクレオチドを遊離または切断するための１つの方法は、基材表面から所望のオリゴヌクレオチドを選択的かつ特異的に切断する制限エンドヌクレアーゼ（Ｒ．Ｅ．）酵素の使用を含む酵素的アプローチである。このアプローチを試験するために、ＤｐｎＩＩ  Ｒ．Ｅ．酵素を使用し、２つの相補的オリゴヌクレオチドＤＮＡを切断した。第１のオリゴヌクレオチドは、ＧＦＰ−Ｆ２部５’−ＣＡＣＴＧＧＡＧＴＴＧＴＣＣＣＡＡＴＴＣＴＴＧｇａｔｃｇｇｃｃ−３’であり、第２のオリゴヌクレオチドは、ＤｐｎＩＩ部位５’−ｇｇｃｃｇａｔｃＣＡＡ−３’である。ＤｐｎＩＩ酵素は、配列５’−＾ＧＡＴＣ−３’を認識および切断するため、清浄なオリゴヌクレオチドの単離は、酵素消化後であることが予測される。切断したオリゴヌクレオチドの、溶液相における本発明者らの最初の試験は、成功した。この実験において、２つのオリゴヌクレオチドを、１：５のモル比（ＧＦＰ−Ｆ２部：ＤｐｎＩＩ部位）で混合し、そしてＤｐｎＩＩ酵素を添加するかまたは添加せずに３７℃でインキュベートした。これらの反応を、ＣＥ（キャピラリー電気泳動、７Ｍ尿素を有する１０％ポリアクリルアミドゲル）を用いて種々の時点で分析した。図２３において示されるように、約８０％の長いオリゴヌクレオチドを、ＤｐｎＩＩによって１時間切断した。この実験は、合成オリゴヌクレオチドの基質表面からの、Ｒ．Ｅ．酵素を用いた効率のよい遊離を実証する。
【０１４２】
本開示の他の実施形態において、オリゴヌクレオチド配列が合成され得、その結果、これはそれ自体にアニールし、それにより、ヘアピンループを有する二重のオリゴヌクレオチドを形成する。この二重のＤＮＡを、酵素（例えばＲ．Ｅ．酵素）で消化し、他の二本鎖ＤＮＡおよび／またはオリゴヌクレオチドにライゲーションし得る二本鎖ＤＮＡを形成する。Ｒ．Ｅ．酵素のそれ自身にアニールする合成オリゴヌクレオチドを消化する能力を実証するため、ＦＡＭ標識（ＤＥＦＩＮＥ  ＦＡＭ）を有する以下のオリゴヌクレオチド配列を、通常のＤＭＴチップ表面を有するチップ上で合成した：
【０１４３】
【表５】
2006503586.tif 000009
これらのオリゴヌクレオチド配列の全ては、ＤｐｎＩＩ  Ｒ．Ｅ．酵素によって認識され、かつ切断される５’ＧＡＴＣ−３’部位を含む分子内二本鎖を形成し得る。オリゴヌクレオチドがチップ上で合成され、そしてＥＤＡで脱保護された後、ＤｐｎＩＩ  Ｒ．Ｅ．酵素を、チップを通して３７℃で１時間ポンプ注入した。チップのＦＡＭ画像は、オリゴヌクレオチドがＲ．Ｅ．酵素に曝された後に、ＦＡＭシグナルの９０％が失われることを実証した。この結果は、ＤｐｎＩＩ  Ｒ．Ｅ．酵素が、合成二本鎖オリゴヌクレオチドを切断し得ることを示唆する。
【０１４４】
（実施例７）
本出願において前に示したように、本開示においてオリゴヌクレオチドを産生するために使用するＰＧＡ化学は、オリゴヌクレオチドの合成において、１工程につき９８％よりよい収率を達成する。実際、この化学を用いて合成されたオリゴヌクレオチドの不適合および欠失試験によるハイブリダイゼーション特異性の試験は、この化学は、置換および欠失／挿入変異についての高レベルの識別を実証した。図２４は、１塩基対不適合、欠失または挿入を有する不適合オリゴヌクレオチドからの完全に適合した合成オリゴヌクレオチドの識別のためのチップ上のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの結果を示す。４０マーのＤＮＡオリゴヌクレオチドを、チップの表面上で合成し、そして溶液中で１５マーの標的ＤＮＡにハイブリダイズした。適合対不適合の比は、４７〜１４１倍であることが見出された。従って、５０倍レベルを超える識別が、置換変異について見出され、そして識別の１４０倍を超えるレベルが、欠失または挿入変異について観察される。
【０１４５】
本開示において使用されるこのＰＧＡ化学の効率はまた、この化学の、以前に開示された方法を用いて合成され得るオリゴヌクレオチド配列より有意に長い合成オリゴヌクレオチド配列を産生する能力をもまた、もたらす。プログラム化光定方向合成系を、１００ヌクレオチドまでの長さのオリゴマーを、微小流体アレイチップ上で合成するために使用した。チップ上で合成したオリゴヌクレオチドは、以下のようであった：
【０１４６】
【表６−１】
2006503586.tif 000010
【０１４７】
【表６−２】
2006503586.tif 000011
オリゴヌクレオチドを、１５マープローブ（ＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴ）をその５’末端に含み、かつ種々の大きさ（０〜８５ヌクレオチド長）の非プローブ配列にライゲーションするように設計される。さらに、１塩基不適合１５マープローブ（ＣＴＧＧＣＡＧＴＡＧＣＣＡＣＴ）および１塩基欠失１４マープローブ（ＣＴＧＧＣＡＧＡＧＣＣＡＣＴ）もまた、コントロール配列として、チップ上で合成した。５〜１００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを、チップ上で合成し、そして２つのコントロール配列を、比較目的で、アレイに隣同士に並べて配列した。アレイチップ上でオリゴマーを合成した後、チップを、ＥＤＡで、室温で２時間脱保護し、６×ＳＳＰＥ緩衝液で満たした。Ｃｙ３色素で標識した、１５ヌクレオチドの標的オリゴヌクレオチドを、室温で２時間、６×ＳＳＰＥ中でチップにハイブリダイズさせ、そしてチップをその後、０．００１×ＳＳＰＥ緩衝液で洗浄した。図２５に図示され、図２６に示すように、ハイブリダイゼーションアッセイ後のチップ上の蛍光の存在は、１００マーのオリゴヌクレオチドが、チップ上で合成されたことを実証する。さらに、蛍光強度プロフィールは、これらの長さのオリゴヌクレオチドの合成について、９８．５％の段階的な収率を示し、これは、アレイチップ上のオリゴヌクレオチドを合成するための公知の方法に対する有意な改善である。別の実験において、二重チップ上の１工程あたりの１５〜１００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対する収率の比較は、さらに高い段階的な収率（９８．９％および９９．１％）を実証した。
【０１４８】
（実施例８）
図２８は、ＤＮＡ合成についての微小流体アレイチップの設計の図である。このチップの目的は、非常に高い収率かつ低い誤り率で、オリゴヌクレオチドＤＮＡを合成することである。このチップは、４つの部分アレイを含むように設計され、各々は、２２４反応チャンバーを含む。各反応チャンバーは、４００×４００×１０μｍ３と測定され、そして０．１６ピコモルのオリゴヌクレオチドＤＮＡまでを産生する能力を有する。次いで、このオリゴヌクレオチドＤＮＡを、チップから遊離し得、そして溶液の２０μｌのアリコート内に収集し、そして各オリゴヌクレオチドについての溶液濃度は、約８ｎＭとなる。このオリゴヌクレオチドの濃度は、異なる合成オリゴヌクレオチドを一緒にライゲーションし、長いＤＮＡ配列を形成するために十分である。各部分アレイは、１，０００〜１５００ｂｐ長ＤＮＡセグメントにアセンブリするオリゴヌクレオチドＤＮＡの完全なセットを作製するために十分である。各部分アレイにおける反応チャンバーの数（２２４）もまた、各オリゴヌクレオチドについての多重重複の産生を可能にするために十分大きい。従って、図２８に示される１つのチップは、約１５００×４＝６，０００ｂｐ長のＤＮＡ配列を合成するために使用され得る。この設計を改変し、そして１０，０００ｂｐ以上の長さのＤＮＡ配列を産生するためのチップを作製することは、十分に当業者の範囲内である。
【０１４９】
反応チャンバー設計における主な懸念は、脱ブロック効率を最大にし、そして隣接する反応チャンバー間の光学的および化学的混線を最小化することである。長くかつ狭い誘導管が、反応チャンバーの入口および出口として使用され、光曝露後の反応チャンバー内を酸性に維持するための、十分な化学的制限を提供して、完全な脱ブロック反応を保障する。ＣＦＤ（コンピューター流体力学）シミュレーションを実施し、流体流れ分布、圧力分布、気泡捕捉／除去、および化学的拡散を評価した。この反応チャンバー構成は、化学的制限の有意な改善をもたらし、これは、オリゴヌクレオチド合成の間の誤り率を低下する。
【０１５０】
（実施例９）
オリゴマーのプールを産生するための開示された方法はまた、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）チップを産生するために使用され得る。２５２のオリゴヌクレオチドを、ＲＮＡｉチップ上に上で概説した方法を使用して産生し、各合成されたオリゴヌクレオチドは、３’末端にＳＡＰ１配列（ＴＧＣＡＧＴＴＡＧＣＴＣＴＴＣＣＡＡＴ）を、中央に可変ＲＮＡｉ特異的配列（２２ヌクレオチド長）を、そして５’末端にＴ７プロモーター配列（ＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ）を含む（全長約６０ヌクレオチド）。チップからオリゴヌクレオチドを切断するため、逆Ｕを、全てのオリゴヌクレオチドの３’末端内に組み込んだ。さらに、同じ２つのコントロールオリゴヌクレオチド（Ｐｕｃ２ＰＭ−完全適合およびＰｕｃ２ＭＭ−不適合）（実施例３に開示される）もまた、ＲＮＡｉチップ上で合成した。ＲＮＡｉチップ上で合成したオリゴヌクレオチドの質はまた、実施例３に概説したようなＣｙ３標識化１５マーＰｕｃ２標的とのハイブリダイゼーションによって分析した。
【０１５１】
オリゴヌクレオチド合成後、このオリゴヌクレオチドは、Ｒｎａｃｅ−ｉｔ（ＲＮａｓｅ  Ａ＋ＲＮａｓｅ  Ｔ１、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で、３７℃で６０分間、循環しながらチップから切断した。次いで、切断産物を、１００μｌの体積でエッペンドルフチューブに収集した。切断した５μｌのオリゴヌクレオチドを、ＳＡＰ１およびＴ７特異的配列をユニバーサルプライマーとして使用するＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。使用されるＰＣＲ条件は、以下である：
Ｔａｑ  ＰＣＲ緩衝液                １×
Ｍｇ＋＋                              ２．５ｍＭ
鋳型                        ５μｌの切断産物
プライマー                          各０．２μＭ
ｄＮＴＰ                            各０．５ｍＭ
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ          ２．５単位
総体積                              ５０μｌ
ＰＣＲ反応物を、まず９４℃まで２分間加熱してＤＮＡを変性させ、次いで、以下の反応条件を伴う３５サイクルを実施した：９４℃を３０秒間；５０℃を３０秒間、および７２℃を３０秒間。ＰＣＲ産物は、二本鎖短ＤＮＡフラグメントのプールであった。ＰＣＲ産物の大きさ、ならびに制限酵素ＳＡＰ１で消化されたＰＣＲ産物を、アガロースゲル上で分析した。アガロースゲルの結果は、ＰＣＲ産物が正確な大きさ（６０ｂｐ）であり、そしてＳＡＰ１切断サンプルは、４１ｂｐおよび１９ｂｐの２つのバンドと予測された（図２９）。
【０１５２】
このオリゴヌクレオチドライブラリーの構成要素は、検出チップへのハイブリダイゼーションによって評価され得る。別々の反応における蛍光標識したＳＡＰ１（ｃｙ３標識センス鎖）プライマーおよびＴ７（ｃｙ５標識アンチセンス鎖）プライマーを用いたリニア（ｌｉｎｅａｒ）ＰＣＲ反応のために、５μｌのＰＣＲ産物を用いた。ＰＣＲ条件は、各反応について１つのプライマーだけが使用されること、および総サイクル数が４５であることを除き、基本的に上述と同じであった。リニアＰＣＲは、標識した一本鎖ＤＮＡ分子を産生し、これは、検出チップ上のプローブに相補的である。検出チップを、ＰＣＲ  ＤＮＡ産物およびその転写物の評価のために設計した。２５２のセンスプローブ（Ｓ）および２５２のアンチセンスプローブ（Ａ）を、検出チップ上で、チェス盤パターンで、６つの反復ブロックに配置した。別のブロックにおいて、アンチセンスプローブを、完全適合（Ｓ）、一重検出（ＤＳ）、および二重検出（ＤＤＳ）パターンに配置した。標識化一本鎖ＤＮＡの２つのセットを、検出チップとハイブリダイズさせた。ｃｙ３標識化鎖は蛍光緑色であり、一方、ｃｙ５アンチセンス鎖は、蛍光赤色であった。チップの１つの領域は、赤および緑の両方の色で示される。何故なら、これは、両方の型のＤＮＡフラグメントについてのプローブを含むからである。別の領域は、緑色しか示さない。何故なら、これは、アンチセンス配列についてのプローブしか含まないからであり、したがって、ハイブリダイゼーション事象の特異性を実証する。チップ上の全体の９６％の点が、ハイブリダイゼーションを示し、これを強度によって判断した（しかし、プローブ特性の影響に起因して、強度は定量測定に必須ではない）。これらのハイブリダイゼーション結果は、チップ上で合成されるＤＮＡ鋳型（オリゴヌクレオチド）の高い配列特異性およびＰＣＲ反応のためのこれらのオリゴヌクレオチドの適合性を示す。
【０１５３】
二本鎖ＤＮＡ  ＰＣＲ産物をまた、インビトロ転写について使用し（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ，Ａｍｂｉｏｎ）、一本鎖ＲＮＡを生成した。Ｔ７プロモーターの位置を、アンチセンスＲＮＡ分子を産生するために設計し、これらは、検出チップ上のセンス鎖プローブにハイブリダイズした。ＲＮＡ分子を、ｃｙ３またはｃｙ５  ｄＵＴＰの反応混合物中の添加によって、インビトロ転写の間に標識した。２種のＲＮＡ分子を、転写した：ＳＡＰ１によって消化されたＤＮＡ鋳型は、２１〜２２塩基を有するＲＮＡ分子（ｃｙ３標識）を産生し、そしてＳＡＰ１消化しない鋳型は、４０〜４１塩基を有するＲＮＡ分子（ｃｙ５標識）を産生し、１９塩基は、共通ＳＡＰ１プライマー配列であった。上で使用したのと同じ検出チップを、再び使用し、ＤＮＡ  ＰＣＲ産物のインビトロ転写によって産生されたＲＮＡ分子を分析するために使用した。図３０Ａは、２１〜２２マーおよび４１マーの転写ＲＮＡ配列の両方を使用した、二色同時ハイブリダイゼーション実験からの代表的な画像である。チップは、ｓｉＲＮＡ標的に完全適合のプローブ（Ｓ）および１検出（ＤＳ）または２欠失（ＤＤＳ）を含むプローブを含む。これらのプローブは、Ｓ、ＤＳ、およびＤＤＳの順で縦に配置される。図３０Ｂは、図３０Ｂにおいて行に沿って垂直に示されるハイブリダイゼーション強度の代表的な棒グラフである。各型のプローブが、Ｓ、ＤＳ、またはＤＤＳの順で、左から右へ、３本の棒を一組にして、プロットされる。これらの結果は、ＲＮＡ標的が、完全適合に特異的に結合するが、１欠失プローブにはより弱く結合し、そして２欠失プローブには殆ど結合しないことを実証した。ＲＮＡサンプル全体が、２１〜２２マーの配列および４１マーの配列の両方について、＞８９％のプローブに対しポジティブなシグナルを与えたが、シグナル強度に大きな変動が存在した。
【０１５４】
本明細書中で開示され、特許請求された組成物および方法は全て、本開示に照らして、過度の実験を用いずに作製され得、実行され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態の面から記載されているが、改変が組成物および／または方法に、ならびに本明細書中に記載される方法の工程または一連の工程において、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく適用され得ることが、当業者に明らかである。より具体的には、化学的または生理学的に関連する特定の薬剤が、本明細書中に記載の薬剤と置換され得る一方で、同一または類似の結果が達成されることが、明らかである。全てのこれら類似の置換および改変は、当業者に明らかであり、特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の局面をさらに例示することを包含する。本発明は、本明細書中に提示される具体的な実施形態の詳細な説明と共に、これらの図面のうちの１つ以上を参照することによって、よりよく理解され得る。
【図１】図１は、本明細書中に開示されるようなオリゴヌクレオチドのプールを生成するために使用される技術の模式図である。
【図２】図２は、微小流体アレイ反応器チップの構造および操作の模式図である。
【図３】図３は、従来の酸触媒による脱保護反応と、オリゴヌクレオチド合成においてＰＧＡを用いる脱保護反応との比較である。ＤＭＴ＝４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル。
【図４】図４は、オリゴヌクレオチド合成プロセスの例示である。そのダイアグラム中：Ｌ−リンカー基；Ｐａ−酸不安定性保護基；Ｈ＋−プロトン；Ｔ、Ａ、Ｃ、およびＧ−核塩基ホスホルアミダイト（ｎｕｃｌｅｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）モノマー；ｈｖ−プロトン。
【図５】図５は、Ｕ−ホスホルアミダイトの合成である。
【図６】図６は、オリゴヌクレオチド合成のための好ましい実施形態の模式図である。
【図７】図７は、ハイブリダイゼーション法による精製の模式図である。
【図８】図８は、カスケード合成機の基本的エレメントである：（ａ）小さなＤＮＡフラグメントは、個々の反応器において合成される；（ｂ）その合成された小さなＤＮＡフラグメントは、個々の反応器において切断され、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションを通じたアセンブリのために別の反応器に誘導される。
【図９】図９は、カスケード合成機アレイチップの設計である。
【図１０】図１０は、複数段階の長い遺伝子アセンブリのための融合ＰＣＲ（ｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ）の模式図である。
【図１１】図１１は、Ｓｕｐｅｒ  Ｍｉｃｒｏ  Ｐｌａｔｅ上での大規模ＳＮＰ検出を示す。特異的プライマー対は、同じ反応セルにおいてインサイチュで合成され、その標的サンプルおよび試薬は、その反応セルに添加され、そのプライマーは、基材から切断され、異なるアンプリコンは、各反応セルにおいてＰＣＲによって増幅される。アンプリコンのプールは、その後、集められ、精製され、そのアンプリコン中に存在するＳＮＰが、検出され、同定される。
【図１２】図１２は、ユニバーサルプライマーおよびＴ７プロモーターを使用する一本鎖ＲＮＡ分子の増幅；ニック形成（ｎｉｃｋｉｎｇ）部位を導入し、このことによってＤＮＡポリメラーゼがそのＤＮＡ鎖を伸長させ、置換し、それによって一本鎖ＤＮＡを生成することが可能であるプライマーを使用した一本鎖ＤＮＡの増幅を示す。
【図１３】図１３は、増幅および検出チップを使用して、ＳＮＰを検出するための好ましい実施形態の模式図である。
【図１４】図１４は、２つの逆−Ｕリンカーをオリゴヌクレオチドに組み込むことによって固体支持体上に合成される１つのオリゴヌクレオチドから２つのプライマーを生成し、そのリンカーをＲＮａｓｅ  Ａで切断して、ＤＮＡ増幅に使用され得る２つのプライマーを生成し、オリゴヌクレオチドのプールを生成する模式図である。
【図１５】図１５は、短いＲＮＡ分子のプールの合成の模式図である。
【図１６】Ｐｕｃ２プローブは、Ｐｕｃ２ＰＭコントロール部位（強度＝約４０，０００）と強くハイブリダイズして、Ｐｕｃ２ＭＭコントロール部位（強度＝約１０，０００）とそれほど強くハイブリダイズせず、チップ上の他の配列とは有意にハイブリダイズしなかった。
【図１７】部分鎖ＧＦＰオリゴヌクレオチドをチップ上に合成し、その後、連結して、全長ＧＦＰ遺伝子を生成した。全長ＧＦＰ遺伝子を、ＰＣＲによって増幅した。レーンＡ：ＰＣＲのためのプライマーとしてＧＦＰ−Ｎ３およびＧＦＰ−Ｃ２を使用し、ＤＮＡポリメラーゼとしてＰｆｕを使用した；レーンＢ：ＰＣＲのためのプライマーとしてＧＦＰ−Ｎ３およびＧＦＰ−Ｃ２を使用し、ＤＮＡポリメラーゼとしてＴａｑ（ＳｕｒｅＳｔａｒｔ）を使用した；レーンＣ：ＰＣＲのためのプライマーとしてＧＦＰ−Ｆ２およびＧＦＰ−Ｒ１７を使用し、ＤＮＡポリメラーゼとしてＰｆｕを使用した。Ｔ０．７５μｌ、Ｔ３μｌ、およびＴ１２μｌについては、チップ上に合成された、それぞれ、０．７５μｌ、３．０μｌ、および１２μｌのオリゴヌクレオチドそれぞれを、ライゲーション反応に使用した。Ｃ１ｎＭおよびＣ１０ｎＭは、１ｎＭまたは１０ｎＭのオリゴヌクレオチド濃度を使用したポジティブコントロール連結である。
【図１８】ｐＴｒｃＨｉｓ−ＣｈｉｐＧＦＰ−ＴＡクローンを、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化した。分析した３０クローンのうち計１１クローンが、開示された方法を用いて合成された全長ＧＦＰ遺伝子を含んでいた。
【図１９】図１９は、ＬＢ寒天プレート上でＩＰＴＧにより誘導されたｐＴｒｃＨｉｓ−ＣｈｉｐＧＦＰ−ＴＡクローンを示す。そのクローンが開示された方法を用いて合成された全長の機能的ＧＦＰ遺伝子を含む場合、そのコロニーは、緑色の蛍光を発する。各プレート上の２つのポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを除いて、２５６コロニーのうちの７８コロニー（３０．５％）が緑色の蛍光を発し、よって機能的な全長ＧＦＰ遺伝子を含んだ。
【図２０】図２０は、ＰＣＲ増幅したＧＦＰ生成物である。レーン１は、ＤＮＡラダーである；レーン２は、アセンブリされた全長ＧＦＰ  ＤＮＡのコントロール画分であり；レーン３は、アセンブリされた全長ＧＦＰ  ＤＮＡのＴ７エンドヌクレアーゼＩ処理した画分である。その結果は、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩが、連結されたＧＦＰ  ＤＮＡ生成物のいくらかを消化することを示す。
【図２１】連結されたＧＦＰ構築物の機能が、ＵＶ照射下で観察された。ＧＦＰ構築物の機能的コピーを含むクローンは、Ｅ．ｃｏｌｉで発現された場合に、緑色の蛍光を発した。
【図２２】図２２は、ＰＣＲによるＤＮＡフラグメント融合物である。ＧＦＰ遺伝子に由来する４つ、６つ、または８つのＤＮＡフラグメントを混合し、ＰＣＲのために一連の濃度に希釈した。レーンを２〜６と表示し、それらは、鋳型ＤＮＡの希釈率を示す：レーン２、１：４；レーン３、１：１６；レーン４、１：６４；レーン５、１：２５６；レーン６、１：１０２４。この実験は、４つ、６つ、または８つのＤＮＡフラグメントを融合して、長いＤＮＡ配列を生成しうることを示す。
【図２３】図２３は、溶液およびコントロール中のＤｐｎ  ＩＩ消化ＧＦＰ−Ｆ２ｐａｒｔ／ＤｐｎＩＩＳｉｔｅオリゴヌクレオチドである。１時間後に、そのＧＦＰ−Ｆ２ｐａｒｔ／ＤｐｎＩＩＳｉｔｅオリゴヌクレオチドの約８０％が、固体支持体から溶液へと放出された。
【図２４】図２４は、不適合および欠失試験によるハイブリダイズ特異性を示す。
【図２５】１００ヌクレオチドまでの長さのオリゴマーの合成の例を、微小流体アレイチップ上で実証した。
【図２６】１００ヌクレオチドまでの長さのオリゴマーの合成を、微小流体アレイチップの上で実証した。
【図２７】図２７は、二重チップの１５マー〜１００マーオリゴヌクレオチドについての工程収率の比較である。
【図２８】図２８は、オリゴヌクレオチドを合成し、続いて、共に連結して、大きなＤＮＡ生成物を生成するにあたって使用するための微小流体アレイチップの設計である。
【図２９】アガロースゲルは、オリゴヌクレオチドのプールから生成された６０マーのＰＣＲ生成物が予測されたサイズであり、そのＰＣＲ生成物のＳＡＰ１消化が、予測される４１ｂｐ生成物および１９ｂｐ生成物を生じたことを示す。
【図３０】図３０は、本明細書中に開示される方法に従って、固体基材上に合成されるオリゴヌクレオチド配列のプールからインビトロで生成されたＲＮＡ分子の分析である。
【図１】
2006503586.tif 000012
【図２】
2006503586.tif 000013
【図３】
2006503586.tif 000014
【図４】
2006503586.tif 000015
【図５】
2006503586.tif 000016
【図６】
2006503586.tif 000017
【図７】
2006503586.tif 000018
【図８】
2006503586.tif 000019
【図９】
2006503586.tif 000020
【図１０】
2006503586.tif 000021
【図１１】
2006503586.tif 000022
【図１２】
2006503586.tif 000023
【図１３】
2006503586.tif 000024
【図１４】
2006503586.tif 000025
【図１５】
2006503586.tif 000026
【図１６】
2006503586.tif 000027
【図１７】
2006503586.tif 000028
【図１８】
2006503586.tif 000029
【図１９】
2006503586.tif 000030
【図２０】
2006503586.tif 000031
【図２１】
2006503586.tif 000032
【図２２】
2006503586.tif 000033
【図２３】
2006503586.tif 000034
【図２４】
2006503586.tif 000035
【図２５】
2006503586.tif 000036
【図２６】
2006503586.tif 000037
【図２７】
2006503586.tif 000038
【図２８】
2006503586.tif 000039
【図２９】
2006503586.tif 000040
【図３０】
2006503586.tif 000041
【国際調査報告】
2006503586.tif 000042
2006503586.tif 000043
2006503586.tif 000044
2006503586.tif 000045