(57)【要約】多発性硬化症（ＭＳ）由来Ｂリンパ芽球様細胞株によって産生されたＲＴ陽性レトロウイルス粒子から得たＲＮＡに対してｇａｇおよびｅｎｖプライマーを使ったＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、レトロウイルス配列を特徴づけた。ヒト内在性レトロウイルスＲＴＶＬ−Ｈ／ＨＥＲＶ−Ｈファミリーの潜在的に機能的なＲＧＨサブグループに対して高いホモロジーを持つ配列変異体が見つかった。同じ配列は、ＭＳ患者血漿試料の粒子フラクションにも特異的に見いだされ、対照には存在しなかった。サザンウェスタンブロットにより、サイズと機能が他のレトロウイルスのヌクレオキャプシドタンパク質ＧａｇＮＣに一致する核酸結合タンパク質の存在が証明された。健常ヒト個体および非ヒト動物から得た単核血球へのレトロウイルスの伝播を示す事象が見いだされた。ＭＳ患者の末梢血に由来する細胞培養物は、５〜１５％のＣＤ３＋Ｔ細胞を含み、かかる培養物には、ｐｏｌ領域由来の領域を含むｅｎｖ配列の独特なスプライス変異体が同定された。
2004502407.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単核細胞に感染し、その中で複製する能力を有する、ＲＴＶＬ−Ｈ／ＨＥＲＶ−Ｈファミリーに属する単離された形、またはレトロウイルス粒子形のヒト内在性レトロウイルス。
【請求項２】
Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標）密度勾配媒体で細胞培養上清または無細胞血清試料の超遠心分離を行った後、レトロウイルス粒子を含むフラクションを回収することによって得ることができる請求項１に記載のレトロウイルス。
【請求項３】
ＲＧＨレトロウイルスのプロテアーゼ（ｐｏｌ）領域由来の領域を含むスプライスされたＨＥＲＶ−Ｈ　ＲＧＨレトロウイルスｅｎｖ　ｍＲＮＡ配列をコードする請求項１または請求項２に記載のレトロウイルス。
【請求項４】
スプライスされたｍＲＮＡ配列が本願明細書に記載の配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９および配列番号５０ならびにそれらの変異体および部分配列からなる群より選択されるプロテアーゼコード領域由来の領域を含む請求項３に記載のレトロウイルス。
【請求項５】
多発性硬化症（ＭＳ）患者、自己免疫疾患を患っている患者、糖尿病を患っている患者および悪性腫瘍を患っている患者からなる群より選択されるヒト対象から単離することができる請求項１から４のいずれか一項に記載のレトロウイルス。
【請求項６】
前記ヒト対象の末梢血に由来する細胞培養物から単離することができる請求項５に記載のレトロウイルス。
【請求項７】
ＭＳ患者の末梢血に由来する細胞培養物から単離することができ、該細胞培養物が少なくとも２％のＣＤ３＋Ｔ細胞を含む請求項６に記載のレトロウイルス。
【請求項８】
ＭＳ、自己免疫疾患、糖尿病または悪性腫瘍を患っていないヒト対象由来の血球に感染し、その中で複製する能力を有する請求項１から７のいずれかに一項に記載のレトロウイルス。
【請求項９】
非血球ヒト細胞に感染する能力を有する請求項１から８のいずれか一項に記載のレトロウイルス。
【請求項１０】
非ヒト細胞に感染する能力を有する請求項１から９のいずれか一項に記載のレトロウイルス。
【請求項１１】
コウモリ、ウサギおよび齧歯類からなる群より選択される動物に由来する細胞に感染する能力を有する請求項１０に記載のレトロウイルス。
【請求項１２】
ＲＧＨウイルスである請求項１から１１のいずれか一項に記載のレトロウイルス。
【請求項１３】
Ｈｉｒｏｓｅら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９３，１９２：５２−６１に公表されたＲＧＨ−２ウイルス配列に少なくとも８０％一致する核酸配列を含む請求項１から１２のいずれか一項に記載のレトロウイルス。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のレトロウイルスの種内感染性（伝播性）を検出する方法であって、請求項５に記載の患者からレトロウイルスを単離するステップ、該単離ウイルスをＭＳ、自己免疫疾患、糖尿病または悪性腫瘍を患っていないヒト対象に由来する単核細胞の培養物と接触させるステップ、およびレトロウイルスによる前記細胞の感染を検出するステップを含む前記方法。
【請求項１５】
単核細胞培養物の感染が、本願明細書に記載するように、感染培養物におけるＲＴ活性の出現によって、またはインジケーター細胞における感染性レトロウイルスのレスキューに関するアッセイによって検出される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
単核細胞培養物の感染が、該培養物の細胞における、本明細書に記載の配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９および配列番号５０ならびにそれらの変異体および部分配列からなる群より選択されるプロテアーゼコード領域由来の領域を含む、ＲＧＨレトロウイルスのプロテアーゼ（ｐｏｌ）領域由来の領域を含むスプライスされたＨＥＲＶ−Ｈ　ＲＧＨレトロウイルスｅｎｖ　ｍＲＮＡ配列の出現によって検出される請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のレトロウイルスの種間感染性（伝播性）を検出する方法であって、請求項５に記載のヒト対象からレトロウイルスを単離するステップ、該単離ウイルスを非ヒト個体由来の単核細胞の培養物と接触させるステップ、およびレトロウイルスによる前記細胞の感染を検出するステップを含む前記方法。
【請求項１８】
単核細胞培養物の感染が、本願明細書に記載するように、感染培養物におけるＲＴ活性の出現によって、またはインジケーター細胞における感染性レトロウイルスのレスキューに関するアッセイによって検出される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
単核細胞培養物の感染が、該培養物の細胞における、本明細書に記載の配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９および配列番号５０ならびにそれらの変異体および部分配列からなる群より選択されるプロテアーゼコード領域由来の領域を含む、ＲＧＨレトロウイルスのプロテアーゼ（ｐｏｌ）領域由来の領域を含むスプライスされたＨＥＲＶ−Ｈ　ＲＧＨレトロウイルスｅｎｖ　ｍＲＮＡ配列の出現によって検出される請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
接触させる単核細胞培養物がＰＨＡを含む単核細胞刺激化合物で前もって刺激される請求項１４から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
単核細胞が血球である請求項１４から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
多発性硬化症（ＭＳ）患者、自己免疫疾患を患っている患者、糖尿病を患っている患者および悪性腫瘍を患っている患者からなる群より選択されるヒト対象由来の単核細胞の培養物であって、前記細胞が、レトロウイルスのプロテアーゼコード（ｐｏｌ）領域由来の領域を含むスプライスされたＨＥＲＶ−Ｈ　ＲＧＨレトロウイルスｅｎｖ　ｍＲＮＡ配列を発現させる能力を有することを特徴とする培養物。
【請求項２３】
スプライスされたｍＲＮＡ配列が本願明細書に記載の配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９および配列番号５０ならびにその変異体および部分配列からなる群より選択されるプロテアーゼコード領域由来の領域を含む請求項２２に記載の培養物。
【請求項２４】
少なくとも２％のＣＤ３＋Ｔ細胞を含む請求項２２または２３に記載の培養物。
【請求項２５】
多発性硬化症、自己免疫疾患、糖尿病および悪性腫瘍からなる群より選択される疾患を診断する方法であって、前記疾患のいずれかを患っていると疑われる患者から単核血球を単離し、請求項２２または２３に記載のｍＲＮＡ配列または前記ｍＲＮＡ配列から翻訳されたポリペプチドを前記細胞中に検出することを含む前記方法。
【請求項２６】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のレトロウイルスに関係する疾患を診断する方法であって、請求項５に記載のヒト対象からレトロウイルスを単離するステップおよび請求項１４から２０のいずれか一項に記載の方法に従ってその感染性を試験するステップを含む前記方法。
【請求項２７】
診断される疾患が多発性硬化症である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のレトロウイルスの存在に関係する臨床症状を示す疾患を患っている患者を処置する方法であって、前記レトロウイルスによる患者の細胞の感染および／または前記レトロウイルスに感染しうる患者の細胞への前記レトロウイルスの移動を少なくとも部分的に防止する能力を有する有効量の薬剤を患者に投与することを含む前記方法。
【請求項２９】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のレトロウイルスの感染によって形質転換（不死化）した細胞に関係する臨床症状を示す疾患を患っている患者を処置する方法であって、かかる形質転換（不死化）細胞を少なくとも部分的に排除する能力を有する有効量の薬剤を患者に投与することを含む前記方法。
【請求項３０】
疾患が多発性硬化症を含む脱髄疾患、自己免疫疾患、糖尿病および悪性腫瘍からなる群より選択される請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のレトロウイルスの存在に関係する臨床症状を示す疾患の管理に医薬として使用するための抗ウイルス剤。
【請求項３２】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のレトロウイルスに関係する疾患を管理するための医薬の製造における抗ウイルス剤の使用。
【請求項３３】
疾患が脱髄疾患、悪性腫瘍、糖尿病および自己免疫疾患からなる群より選択される請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
抗ウイルス剤が請求項１から１３のいずれか一項に記載のレトロウイルスを選択的に抑制または排除する薬剤である請求項３２または３３に記載の使用。
【請求項３５】
薬剤が抗体、アンチセンス核酸およびリボザイムからなる群より選択される請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のレトロウイルスに対する免疫応答に関係する臨床症状を示す疾患を管理する方法であって、前記免疫応答を少なくとも部分的に抑制する能力を有する有効量の薬学的活性化合物を患者に投与することを含む前記方法。
【請求項３７】
薬学的活性化合物が請求項３または請求項４に記載のレトロウイルスによって特異的に誘発される免疫応答に対して作用する請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
薬学的活性化合物がＣＤ３＋、ＣＤ４−およびＣＤ８−Ｔ細胞を含む活性化Ｔ細胞の生物活性を抑制するか、またはかかるＴ細胞を排除するように作用する請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
請求項５に記載のヒト対象において、請求項１から１３のいずれか一項に記載のレトロウイルスに対する免疫応答を少なくとも部分的に抑制する能力を有する薬学的活性化合物を含む薬学的組成物。
【請求項４０】
薬学的活性化合物が請求項１から１３のいずれか一項に記載のレトロウイルスによって特異的に誘発される免疫応答に対して作用する請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
薬学的活性化合物がＣＤ３＋、ＣＤ４−およびＣＤ８−Ｔ細胞を含む活性化Ｔ細胞の生物活性を抑制するか、またはかかるＴ細胞を排除するように作用する請求項３９または４０に記載の組成物。
【請求項４２】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のレトロウイルスによる患者の細胞の感染および／または前記レトロウイルスに感染しうる患者の細胞への前記レトロウイルスの移動を少なくとも部分的に防止する能力を有する薬学的活性化合物を含む薬学的組成物。
【請求項４３】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のレトロウイルスの感染によって形質転換（不死化）した細胞を患者の体内で少なくとも部分的に排除する能力を有する薬学的活性化合物を含む薬学的組成物。
【請求項４４】
ＲＧＨレトロウイルスのプロテアーゼ（ｐｏｌ）領域由来の領域を含む対立遺伝子的に存在するスプライスされたＨＥＲＶ−Ｈ　ＲＧＨレトロウイルスｅｎｖ　ｍＲＮＡ配列の、多発性硬化症を含む脱髄疾患、自己免疫疾患、糖尿病および悪性腫瘍からなる群より選択される疾患の発生または状態に関するマーカーとしての使用。
【請求項４５】
ｍＲＮＡ配列が、本願明細書に記載の配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９および配列番号５０ならびにその変異体および部分配列からなる群より選択されるプロテアーゼコード領域由来の領域を含む請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のレトロウイルスの産生を抑制する能力を有する化合物を同定する方法であって、請求項１から１３のいずれか一項に記載のレトロウイルスを産生する能力を有する細胞を候補化合物に曝露し、前記化合物の存在下で前記細胞によって産生されるウイルスの量を、前記化合物の不在下で前記細胞によって産生されるウイルスの量と比較し、よって前記細胞からのウイルスの産生を抑制する能力を有する化合物を同定することを含む前記方法。
【請求項４７】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のレトロウイルスによる標的細胞の感染を防止する能力を有する化合物を同定する方法であって、請求項１から１３のいずれか一項に記載のレトロウイルスに感染しやすい標的細胞を、前記ウイルスを含む試料に候補化合物の存在下で曝露し、前記化合物の存在下での標的細胞の感染の程度を決定し、よって前記ウイルスによる標的細胞の感染を防止する能力を有する化合物を同定することを含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、内在性レトロウイルスに関係する疾患を診断し、処置する分野に関する。特に本発明は、多発性硬化症などの脱髄疾患を患っているヒト患者の大部分に見いだされるレトロウイルスが、単核血球を含むヒト細胞および非ヒト細胞に伝播しうることを示す証拠を提出する。具体的には、ＭＳ患者ならびに自己免疫疾患および悪性腫瘍を患っている患者の血球から単離されたレトロウイルスｍＲＮＡには、ｅｎｖ領域とｐｏｌ領域の一部とを含む特定のスプライス変異体が存在するが、健常被験者の血球から単離されたｍＲＮＡにはこれが存在しない。これらの発見はかかる疾患を診断し、処置するための新しいアプローチの可能性をもたらす。
【０００２】
（技術的背景および先行技術）
多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経系を冒す脱髄性炎症性疾患である。この疾患の病因はまだよくわかっていない。疫学研究により、環境因子がＭＳ発症の一因であり、その因子はおそらく１または複数のウイルスであることが示されている（Ｍａｒｔｙｎ，１９９１；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，１９９４）。ＭＳの群発とみられる事象もその表われかもしれない（Ｈａａｈｒら，１９９７）。
【０００３】
ＭＳ患者由来の短期培養リンパ球中にレトロウイルス様粒子が観察されたのに続いて、数人のＭＳ患者に由来する末梢血単核細胞から自発形成した細胞株が樹立された（Ｈａａｈｒら，１９９１）。これらの細胞株は成熟したＥＢＶ粒子を時折発現させると共に、Ｃ型レトロウイルス様粒子も産生する（Ｓｏｍｍｅｒｌｕｎｄら，１９９３；Ｍｕｎｃｈら，１９９５）。これらのレトロウイルス粒子は逆転写酵素（ＲＴ）活性を持ち（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，１９９７；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，１９９９）、ＨＴＬＶ−１と共通する抗原決定基をいくつか持っているが、既知の外因性レトロウイルスとは抗原レベルで別個のものである（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，１９９７）。
【０００４】
主に垂直伝播する内在性レトロウイルスは、哺乳類ゲノムの至る所に見いだされ、哺乳類ゲノムの数パーセントを占めている。内在性レトロウイルスが自己免疫疾患に関与するのではないかと言われている（Ｈｏｈｅｎａｄｌら，１９７９；Ｋｒｉｅｇら，１９９２；Ｄａｌｇｌｉｅｓｈ，１９９７）。過去に一度だけ、ヒト内在性レトロウイルスＨＴＤＶ／ＨＥＲＶ−Ｋが（病理学的意味を持つ可能性のある）粒子として、奇形癌細胞株ではっきりと証明されている（Ｔｏｅｎｊｅｓら，１９９６；Ｂｏｌｌｅｒら，１９９３）。ＨＴＤＶ／ＨＥＲＶ−Ｋが患者血漿中に粒子として存在するかどうかはまだ決定されていない。
【０００５】
ＷＯ９９／５３１０３には、ＭＳ細胞株によって産生されたヒト内在性レトロウイルスＨＥＲＶ−Ｈの変異体の存在が報告されている。ＨＥＲＶ−Ｈ変異体ＲＧＨ−２と高いホモロジーを示すＨＥＲＶ−Ｈ配列は、３３人のＭＳ患者のうち２４人の無細胞血漿中にも、粒子レベルで特異的に見いだされたが、自己免疫疾患または他の疾患を持つ患者から採取した２９の血漿試料と、健常対照者から採取した２０の血漿試料には、その存在を見いだすことができなかった。上記のレトロウイルス粒子には、他のレトロウイルスのヌクレオキャプシドタンパク質Ｇａｇ　ＮＣと類似した核酸結合タンパク質が見いだされる。
【０００６】
またＷＯ９９／５３１０３には、レトロウイルス粒子またはキャプシド形成したビリオン様粒子における上記特許出願に開示されたＲＧＨウイルス由来の配列番号１またはその部分配列もしくは変異体の検出に基づいて、ＭＳを含む脱髄疾患を診断し、かかる疾患を患っている患者を細分し、そして／またはＭＳを含む脱髄疾患の活動性の段階をモニターする方法が開示されている。ＷＯ９９／５３１０３には、かかる配列、部分配列または変異体にハイブリダイズする能力を有するプローブを含む診断薬、前記配列、部分配列または変異体によってコードされるエピトープまたはタンパク質もしくはペプチドと反応する抗体、および／またはまたはかかる方法のためのかかるエピトープも開示されている。
【０００７】
しかし、ＭＳ患者のゲノムに存在する通常なら休止状態にある内在性レトロウイルスが複製期に入り、よって健常なヒト対象の細胞および内在性レトロウイルスの存在に関係する疾患を患っている患者の細胞に伝播されることを示す証拠は、今まで得られていなかった。
【０００８】
本明細書に記載する発見は、内在性レトロウイルスの潜在的感染性を強く示唆するものである。これらの発見によれば、ＭＳは、そしておそらくは他の疾患も、通常なら休止状態にあるレトロウイルスの複製および伝播性に関係することが示唆される。これは、ＨＴＤＶ／ＨＥＲＶ−Ｋと雄生殖細胞腫瘍との関係（Ｂｏｌｌｅｒら，１９９７；Ｔｏｅｎｊｅｓら，１９９６）に類似する現象であり、また最近の報告によれば、内在性レトロウイルスと推定されるもうひとつの（ＨＥＲＶ−Ｗ／ＥＲＶ−９）ＭＳにおける発現（Ｐｅｒｒｏｎら；Ｇａｒｓｏｎら；Ｋｏｍｕｒｉａｎ−Ｐｒａｄｅｌら）、ＨＥＲＶ−Ｋ変異体（ＩＤＤＭＫ１，２２２）によってコードされるスーパー抗原および配列の１型糖尿病における血漿での発現（Ｃｏｎｒａｄら）とも類似する現象であるといえるだろう。
【０００９】
ＲＧＨウイルスは、内在性レトロウイルスのＲＴＶＬ−Ｈ／ＨＥＲＶ−Ｈ（ｔＲＮＡＨｉｓによる転写のプライミング）ファミリーに属する。このＣ型様レトロウイルスファミリーは、腫瘍レトロウイルスであるヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−１／−２）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）およびＥＲＶ−９と近縁である。機能的タンパク質を潜在的にコードするゲノムＲＴＶＬ−Ｈクローンが記載されており（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら）、非常に興味深いことに、最近になって完全なｅｎｖオープンリーディングフレームを持つＨＥＲＶ−Ｈ配列が記載されている（Ｌｉｎｄｅｓｋｏｇら，１９９９；Ｂｌｏｎｄら，１９９９）。ＨＥＲＶ−Ｈ／ＲＴＶＬ−Ｈ　ＲＮＡは正常リンパ球、胎盤組織および一部の新生物に見いだされるが（Ｍｅｄｓｔｒａｎｄら，１９９２；Ｍａｇｅｒら，１９８７；Ｋｅｌｌｅｈｅｒら，１９９６；Ｌｏｅｗｅｒら，１９９３；Ｊｏｈａｎｓｅｎら，１９８９）、ＲＧＨ粒子そのものは今まで報告されていないし、その潜在的伝播性も報告されていない。ＲＧＨ−２　ＬＴＲ領域は２つ（ＬＴＲタイプ１）または１つ（ＬＴＲタイプ１ａおよび２）ではなく３つのクラス１反復配列を含むので、ＬＴＲタイプ（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄら、１９９３）に基づく分類によれば、ＲＧＨはＲＴＶＬ−Ｈウイルスとも異なる。２つのＲＧＨクローンが記載されている。すなわち公表されたＲＧＨ−１クローンは４８６９ｂｐ長さであってｐｏｌの一部とｅｎｖ−３’ＬＴＲ領域とを包含し、したがってｇａｇを欠いているのに対し、公表されたＲＧＨ−２クローンは８７１５ｂｐ長であって、完全なコード能力、すなわち５’ＬＴＲ　ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ　３’ＬＴＲを含んでいる。ＭＳ患者材料から単離されるｃＤＮＡクローンの大部分は、ｇａｇ配列を含むので、完全長クローンＲＧＨ−２に近い関係にある。ＲＧＨ様配列は半数体ゲノムあたり約１００コピー存在すると報告されている（Ｈｉｒｏｓｅら，１９９３）。
【００１０】
染色体ＤＮＡパネル（Ｃｏｒｉｅｌｌ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ、米国）に対するｇａｇ−プライムドＰＣＲに続いて配列決定を行うことにより、現時点までに、本発明者らは、ヒトゲノムの６番染色体およびＸ染色体上にＲＧＨ様配列が存在することを確認した。ヒトゲノムデータベースの最新の検索では２番、３番、５番、７番、１０番、１１番、１４番、１６番、１９番、ＸおよびＹ染色体上にＲＧＨ−２相同コピーが見つかった。
【００１１】
ＷＯ９９／５３１０３に開示されているレトロウイルス粒子は逆転写酵素活性を持ち、ＨＴＬＶ−１と共通する抗原決定基をいくつか持っているが、既知の外因性レトロウイルスとは抗原レベルで別個のものである。これらはヒト内在性レトロウイルスＨＥＲＶ−Ｈファミリーの配列変異体と関係があり、ＲＮＡ　ＰＣＲによって得られるアンプリコンは、ＨＥＲＶ−ＨクローンＲＧＨ−２（Ｈｉｒｏｓｅら，１９９３）およびＬｉｎｄｅｓｋｏｇら（１９９９）に記載の完全なＥｎｖオープンリーディグフレームを持つＨＥＲＶ−Ｈクローンに対して、核酸レベルで８０％を超えるホモロジーを持つ。レトロウイルス粒子は、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら（１９９７）、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら（１９９９）、Ｍｏｅｌｌｅｒ−Ｌａｒｓｅｎら（１９９８）、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら（１９９８）、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら（２０００）にも記載されている。
【００１２】
ＲＧＨ２レトロウイルス類を含むＲＴＶＬ−Ｈ／ＨＥＲＶ−Ｈファミリーに属する内在性レトロウイルスはヒト血球に伝播するらしいことを示す証拠をここに提出する。また、かかる内在性レトロウイルスは、血球以外のヒト細胞に伝播するだけでなく、種の異なる細胞に感染することもできること、すなわち非ヒト種に対して外因性レトロウイルスとして作用する能力を有することも、本明細書で明らかにする。
【００１３】
ＷＯ９９／５３１０３に開示されているように、また本明細書でも上に述べたように、ＭＳ細胞株中で産生された、またはＭＳ患者の血液から単離されたウイルス粒子中に存在するＨＥＲＶ−Ｈ　ＲＧＨ２配列は、ＲＧＨ−２配列およびＨＥＲＶ−Ｈ　Ｅｎｖリーディングフレームに対して８０％を超えるホモロジーを示す。後述するように、ＭＳ患者由来の血球には異常スプライスされたＨＥＲＶ−Ｈ　ｅｎｖ　ｍＲＮＡが含まれるが、健常対照者由来の血球にはこれが含まれず、この異常スプライスされたＨＥＲＶ−Ｈ　ｅｎｖ　ｍＲＮＡは、感染性ＨＥＲＶ−Ｈ　ＲＧＨ２レトロウイルス粒子を産生するまたは産生することができる細胞の遺伝子マーカーになりうる。
【００１４】
さらに、様々な個体からのかかる異常スプライスされたｍＲＮＡ分子の数を比較すると、このｍＲＮＡをコードする遺伝情報が単一の内在性ＨＥＲＶ−Ｈ遺伝子座または少数のかかる遺伝子座に由来するらしいことが示唆される。
【００１５】
本発明の基礎をなす上記の極めて予想外な発見から示唆されることの一つは、脱髄疾患および他の疾患の適切かつ有効な抗ウイルス処置法または免疫処置法を計画することによって、かかる疾患を管理することができるようになるだろうということである。さらにこれらの発見は診断法または予後判定法を改良するための基礎にもなる。
【００１６】
（発明の概要）
したがって本発明は、第一の態様として、ＲＴＶＬ−Ｈ／ＨＥＲＶ−Ｈファミリーに属する単離された形またはレトロウイルス粒子形のヒト内在性レトロウイルスであって、単核細胞に感染し、その中で複製する能力を有するヒト内在性レトロウイルスに関する。
【００１７】
さらなる態様として本発明は、かかるレトロウイルスの種内感染性（伝播性）を検出する方法であって、多発性硬化症などの脱髄疾患を患っている患者、自己免疫疾患を患っている患者、糖尿病を患っている患者または悪性腫瘍を患っている患者からレトロウイルスを単離するステップ、前記単離ウイルスを上記いずれの疾患も患っていないヒト対象（被験者）由来の単核細胞の培養物と接触させるステップ、および前記レトロウイルスによる前記単核細胞の少なくとも一部の感染を検出するステップを含む前記方法を提供する。
【００１８】
また、さらなる態様として、上述したレトロウイルスの種間感染性（伝播性）を検出する方法であって、同じく上述した患者からレトロウイルスを単離するステップ、前記単離ウイルスを非ヒト個体由来の単核細胞の培養物と接触させるステップ、および前記レトロウイルスによる前記細胞の感染を検出するステップを含む前記方法も提供する。
【００１９】
本発明のさらなる目的は以下に挙げるものを提供することである：
多発性硬化症（ＭＳ）患者、自己免疫疾患を患っている患者、糖尿病を患っている患者および悪性腫瘍を患っている患者からなる群より選択されるヒト対象（患者）由来の単核細胞の培養物であって、前記細胞が、レトロウイルスのプロテアーゼコード（ｐｏｌ）領域由来の領域を含むスプライスされたＨＥＲＶ−Ｈ　ＲＧＨレトロウイルスｅｎｖ　ｍＲＮＡ配列を発現させる能力を有することを特徴とする前記培養物；
多発性硬化症、自己免疫疾患、糖尿病および悪性腫瘍からなる群より選択される疾患を診断する方法であって、前記疾患のいずれかを患っていると疑われる患者から単核血球細胞を単離し、本明細書に記載の配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９および配列番号５０ならびにそれらの変異体および部分配列からなる群より選択されるプロテアーゼコード領域由来の領域を含むレトロウイルスのプロテアーゼコード（ｐｏｌ）領域由来の領域を含むスプライスされたＨＥＲＶ−Ｈ　ＲＧＨレトロウイルスｅｎｖ　ｍＲＮＡ配列を前記細胞中に検出することを含む前記方法；
本発明のレトロウイルスに関係する疾患を診断する方法であって、上記いずれかの疾患を患っているヒト対象からレトロウイルスを単離するステップおよび上記の方法に従ってその感染性を試験するステップを含む方法；
本発明のレトロウイルスの存在に関係する臨床症状を示す疾患を患っている患者を処置する方法であって、前記レトロウイルスによる患者の細胞の感染、感染に対する有害な免疫応答および／または前記レトロウイルスに感染しうる患者の細胞への前記レトロウイルスの移動を少なくとも部分的に防止する能力を有する有効量の薬剤を患者に投与することを含む方法；
本発明のレトロウイルスの感染によって形質転換（不死化）した細胞に関係する臨床症状を示す疾患を患っている患者を処置する方法であって、かかる形質転換（不死化）細胞を少なくとも部分的に排除する能力を有する有効量の薬剤を患者に投与することを含む前記方法；
本発明のレトロウイルスの存在に関係する臨床症状を示す疾患の管理に医薬として使用するための抗ウイルス剤；
本発明のレトロウイルスに関係する疾患を管理するための医薬の製造における抗ウイルス剤の使用；
本発明のレトロウイルスに対する免疫応答に関係する臨床症状を示す疾患を管理する方法であって、前記免疫応答を少なくとも部分的に抑制する能力を有する有効量の薬学的活性化合物を患者に投与することを含む方法；および
上記いずれかの疾患を患っているヒト対象において、本発明のレトロウイルスに対する免疫応答を少なくとも部分的に抑制する能力を有する薬学的活性化合物を含む薬学的組成物。
【００２０】
他の態様として、本発明は、次に挙げるものにも関係する：
本発明のレトロウイルスによる患者の細胞の感染および／または前記レトロウイルスに感染しうる患者の細胞への前記レトロウイルスの移動を少なくとも部分的に防止する能力を有する薬学的活性化合物を含む薬学的組成物；
本発明のレトロウイルスの感染によって形質転換（不死化）した細胞を患者の体内で少なくとも部分的に排除する能力を有する薬学的活性化合物を含む薬学的組成物；および
ＲＧＨレトロウイルスのプロテアーゼ（ｐｏｌ）領域由来の領域を含む対立遺伝子的に存在するスプライスされたＨＥＲＶ−Ｈ　ＲＧＨレトロウイルスｅｎｖ　ｍＲＮＡ配列の、多発性硬化症を含む脱髄疾患、自己免疫疾患、糖尿病および悪性腫瘍からなる群より選択される疾患の発生または状態に関するマーカーとしての使用。
【００２１】
（発明の詳細な開示）
ＭＳ患者由来の血球培養物における内在性レトロウイルス粒子の存在は、同様のウイルス粒子を健常ヒト対象に見いだすことができないことから、この疾患と関係があるかもしれないことは、既に知られている。本発明は、ＲＴＶＬ−Ｈ／ＨＥＲＶ−Ｈファミリーに属するある種のヒト内在性レトロウイルスが単核細胞に伝播（感染）し、その中で複製する能力を有するという予想外の発見に基づいている。以下に概説するように、この予想外の驚くべき発見から、かかる感染性レトロウイルスが脱髄疾患、特に多発硬化症の発症に関与する可能性、またおそらくは例えば糖尿病などの自己免疫疾患および悪性腫瘍の発症にも関与する可能性が考えられる。したがって、本発明者らによるこれらの成果は、かかる疾患の処置に対する新しい治療的アプローチを設計できることを示唆し、さらにこれらの発見は、診断法および予後判定法を改良するための基礎にもなりうる。
【００２２】
したがって本発明の目的の一つは、ＲＴＶＬ−Ｈ／ＨＥＲＶ−Ｈファミリーに属する単離された形またはレトロウイルス粒子形のヒト内在性レトロウイルスであって、単核細胞に感染し、その中で複製する能力を有するヒト内在性レトロウイルスを提供することである。具体的一実施形態として、かかるレトロウイルスは、ＲＧＨレトロウイルスのプロテアーゼ（ｐｏｌ）領域由来の領域を含むスプライスされたＨＥＲＶ−Ｈ　ＲＧＨレトロウイルスｅｎｖ　ｍＲＮＡ配列をコードするレトロウイルスである。かかるレトロウイルスには、スプライスされたｍＲＮＡ配列が本明細書に記載の配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９および配列番号５０ならびにそれらの変異体および部分配列からなる群より選択されるプロテアーゼコード領域由来の領域を含んでいるレトロウイルスが包含される。
【００２３】
「部分配列」という用語は、上記いずれかの特定配列の少なくとも１０、１５、２０、３０、４０または５０ヌクレオチドを含む配列を意味する。「変異体」という用語は、これら特定配列のいずれとも同一ではないが、これらの配列のいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の配列一致度を持つ配列を意味する。これら２つの用語は組み合わせることができる。すなわち本発明は、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９および配列番号５０のいずれかの変異体であって、上記いずれかの配列の少なくとも１０、１５、２０、３０、４０または５０ヌクレオチドの部分配列と少なくとも８０％の配列一致度を持つ変異体の検出も包含する。例えば１または複数のヌクレオチドの欠失、置換および挿入などによって特定配列の部分配列および変異体を作成する方法は、当業者にはわかるだろう。
【００２４】
本明細書で使用する用語「配列一致度」は、与えられた配列を上記いずれかの特定配列の類似部分と比較することを表す。最良の配列整列結果を得た後、一致度を計算する。これには、ＧＣＧウィスコンシンパッケージ、バージョン９．１（ウィスコンシン州マジソン、サイエンスドライブ５７５、米国５３７１１、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ））などのコンピュータプログラムを使用し、ｇａｐウェイト（５０）、鎖長ウェイト（３）、平均マッチ（１０，０００）、平均ミスマッチ（−９，０００）については、プログラムＢｅｓｔｆｉｔで提案されているデフォルト値を用いるとよいだろう。
【００２５】
単離された、かかるスプライスドｍＲＮＡ配列は、いずれも約９５０ｂｐのサイズを持ち、ＰＢＳ配列の下流にあるリーダー領域に同じスプライスドナー部位を含み、かつｐｏｌのうちインテグラーゼをコードする部分にスプライスアクセプター部位を含む、スプライスされたｅｎｖ　ｍＲＮＡ配列であった。これらの９５０ｂｐフラグメントでは、プロテアーゼコード領域に由来する１０４ｂｐの領域が、スプライスドナー部位とスプライスアクセプター部位の間に挿入されていた。これらのスプライスされたｍＲＮＡ配列は、ＭＳ患者および糖尿病を患っている患者から単離されたレトロウイルス中に検出されたが、これらの配列を健常被験者に検出することはできなかった。これら９５０ｂｐのスプライスされた配列は、ＲＧＨ２リーダー／インテグラーゼおよびｅｎｖ領域と８７〜９５％の一致度を持ち、相互にそしてヒトＴ細胞白血病細胞株から単離された公表済みの配列と９８〜１００％の一致度を持つことがわかった。興味深い発見は、３人のＭＳ患者と１人の真性糖尿病患者から単離された１０クローンであって、９５０ｂｐスプライスドｍＲＮＡ配列の１０４ｂｐプロテアーゼコード領域の７つの変異体に相当するものを、変異体の１つを基準配列として整列したところ、４人のクローン由来源患者のうち３人から、基準配列に対して２つの類似した置換を持つ１つの変異体を単離できることがわかったことである。この発見は、これら特定の置換の存在が、ヒトゲノム中の同じ遺伝子座にあるＲＧＨ対立遺伝子のマーカーまたは異なる遺伝子座にある近縁ＲＧＨ遺伝子のマーカーであることを、強く示唆している。
【００２６】
これらの発見から、９５０ｂｐ配列の存在そのものがＭＳまたは他の疾患の存在に関するマーカーになりうることが示唆され、また、この配列の特定の変異体が対立遺伝子的に存在するらしいという事実から、かかる特定配列および／またはかかる配列を含むレトロウイルスがとりわけ興味深い疾患マーカー候補になりうることが示唆されることは、理解されるだろう。
【００２７】
本発明のレトロウイルスは、例えば多発性硬化症（ＭＳ）などの脱髄疾患、自己免疫疾患、真性糖尿病、または白血病を含む悪性腫瘍を患っている患者から、例えば前記ヒト対象の末梢血に由来する血球、血漿または細胞培養物などから単離することができる。これに関連して、かかる患者に由来する血球培養物は、その表面のＣＤ抗原によってＣＤ３＋、ＣＤ４−およびＣＤ８−Ｔ細胞であると特徴づけられる特定タイプのＴ細胞を、常にかなりの割合で含むことがわかった。本発明のレトロウイルスを産生する血球培養物において、かかるＴ細胞の割合は、典型的には単核細胞の１〜２０％の範囲にあり、例えば少なくとも２％、例えば２〜１５％の範囲である。
【００２８】
本発明のレトロウイルスには、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標）密度勾配媒体で細胞培養上清または無細胞血漿試料の超遠心分離を行い、続いて完全なレトロウイルス粒子を含むフラクションを回収することによって得ることができるレトロウイルスが包含される。細胞培養上清または無細胞血漿試料からＯｐｔｉｐｒｅｐ勾配での超遠心分離を使ってレトロウイルス粒子を精製するプロトコールを下記実施例に記載する。
【００２９】
本発明のレトロウイルスには、単離された形のＲＴＶＬ−Ｈ／ＨＥＲＶ−Ｈファミリーのヒト内在性レトロウイルスが包含される。「単離された形」という用語は、患者血清または細胞培養上清から例えば下記実施例に記載するプロトコールなどを使って精製されたレトロウイルスを包含するが、これに限定されるわけではない。
【００３０】
本発明のレトロウイルスは、下記の実施例で証明するように、ＭＳ、自己免疫疾患、糖尿病または悪性腫瘍を患っていないヒト対象に由来する血球に感染して、その中で複製する能力を有する。また、本レトロウイルスは、例えば肝細胞などの非血球ヒト細胞に感染する能力も持つことがわかった。
【００３１】
しかし、本レトロウイルスは、属内伝播能力を有するだけでなく、非ヒト細胞に感染する能力も持っている。すなわち本レトロウイルスは属間感染性を示す。実施例で証明するように、本レトロウイルスは、コウモリ、ウサギおよび齧歯類由来の細胞に伝播することができる。
【００３２】
具体的な実施形態として、本発明の感染性内在性レトロウイルスは、Ｈｉｒｏｓｅら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９３，１９２：５２−６１に公表されたＲＧＨ−２ウイルス配列に対して少なくとも８０％同一な核酸配列を含むレトロウイルスを含むＲＧＨウイルスである。
【００３３】
さらなる態様として、本発明は、本発明の内在性レトロウイルスの種内感染性（伝播性）を検出する方法を提供する。この方法には、単離したレトロウイルスを、ＭＳ、自己免疫疾患、糖尿病または悪性腫瘍を患っていないヒト対象に由来する血球などの単核細胞の培養物と接触させること、およびレトロウイルスによる前記細胞の感染を検出することが含まれる。感染の検出は、いくつかの方法で行うことができる。このように、感染性を検出する一つの方法として、当技術分野で知られるＲＴ活性検出方法、例えば一般にＲＴ−ＰＣＲおよびＰＥＲＴ（Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）アッセイと呼ばれる高感度なＲＴ活性検出用のアッセイを用いて、感染した培養物におけるＲＴ活性の出現または増加によって感染を検出するか、または感染性レトロウイルスを保有していると疑われる細胞、例えばＭＳ患者の末梢血に由来する細胞培養物を、非伝播性レトロウイルスコンストラクトを保有する細胞株と共培養した後、下記の実施例で詳述するように、インジケーター細胞への感染性レトロウイルスのレスキューに関するアッセイを行うことによって感染を検出する。
【００３４】
具体的な実施形態として、単核細胞培養物の感染は、前記培養物の細胞における、本明細書に記載の配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９および配列番号５０ならびにそれらの変異体および部分配列からなる群より選択されるプロテアーゼコード領域由来の領域を含むＲＧＨレトロウイルスのプロテアーゼ（ｐｏｌ）領域由来の領域を含むスプライスされたＨＥＲＶ−Ｈ　ＲＧＨレトロウイルスｅｎｖ　ｍＲＮＡ配列の出現によって検出される。
【００３５】
上記のアッセイの他にも、本発明のレトロウイルスによる細胞培養の感染は、感染細胞のクローン増殖の発生によって検出することもできる。
【００３６】
また、本発明の内在性レトロウイルスの種間感染性（伝播性）を検出する方法を提供することも、本発明の目的である。この方法には、脱髄疾患、自己免疫疾患、糖尿病または悪性腫瘍を患っているヒト対象からレトロウイルスを単離した後、単離したウイルスを非ヒト個体由来の血球を含む単核細胞の培養物と接触させるステップ、およびレトロウイルスによる前記細胞の感染を、レトロウイルスによる細胞の感染を検出するための上記いずれかの方法を使って検出するステップが含まれる。この方法では、レシピエント単核細胞は齧歯類、ウサギまたはコウモリなどの任意の非ヒト動物に由来してよい。
【００３７】
レトロウイルスによる感染を検出するための上記方法のいくつかの好ましい実施形態では、レトロウイルスと接触させるレシピエント単核細胞が、ＰＨＡを含む単核細胞刺激化合物で予め刺激しておいた単核細胞の培養物の形をとる。
【００３８】
本発明のさらなるもう一つの目的は、多発性硬化症（ＭＳ）患者、自己免疫疾患を患っている患者、糖尿病を患っている患者、および悪性腫瘍を患っている患者からなる群より選択されるヒト対象に由来する単核細胞の培養物であって、前記細胞が、レトロウイルスのプロテアーゼコード（ｐｏｌ）領域由来の領域を含むスプライスされたＨＥＲＶ−Ｈ　ＲＧＨレトロウイルスｅｎｖ　ｍＲＮＡ配列を発現させる能力を有するものを提供することである。この培養物の具体的実施形態として、培養物は、発現されるスプライスドｍＲＮＡ配列が、本明細書に記載の配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９および配列番号５０ならびにそれらの変異体および部分配列からなる群より選択されるプロテアーゼコード領域由来の領域を含んでいる細胞を含む。かかる培養物には、ある割合のＣＤ３＋、ＣＤ４−およびＣＤ８−Ｔ細胞を含む培養物が包含される。本発明のレトロウイルスを産生する単核細胞培養物におけるかかるＴ細胞の割合は典型的には単核細胞の１〜２０％の範囲にあり、例えば少なくとも２％、例えば２〜１５％の範囲である。
【００３９】
本発明の重要な目的の一つは、多発性硬化症、自己免疫疾患、糖尿病および悪性腫瘍からなる群より選択される疾患を診断する方法である。この方法では、第１ステップとして、かかる疾患のいずれかを患っていると疑われる患者から単核血球を単離した後、本明細書に記載の配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９および配列番号５０ならびにそれらの変異体および部分配列からなる群より選択されるプロテアーゼコード領域由来の領域を含むような配列を含む当該レトロウイルスのプロテアーゼコード（ｐｏｌ）領域由来の領域を含むスプライスされたＨＥＲＶ−Ｈ　ＲＧＨレトロウイルスｅｎｖ　ｍＲＮＡ配列を、前記細胞中に検出することが含まれる。
【００４０】
ＷＯ９９／５３１０３には、ＲＧＨウイルスによってコードされる特定のペプチド抗原が開示されており、これらの抗原は、ヒト対象をかかる抗原に対する抗体の存在について血清学的に検査する際の試薬として使用することができる。ＷＯ９９／５３１０３では、かかる抗原をＥＬＩＳＡアッセイによるＭＳ患者および対照被験者（Ｃ）の検査に試薬として使用したところ、これらの特定抗原は０．８〜１．５の範囲のＭＳ：Ｃ　ＥＲ比を与えることがわかった。本発明のレトロウイルスの抗原成分を同様の方法で診断試薬として応用することは、本発明の範囲に包含される。一例として、具体的新規ペプチド：ＬＳＤＬＳＱＩＳＨＬＤＳＦＳＳＮＴＫＮＰＡＱＦは、１．６という高いＭＳ：Ｃ　ＥＲ比を与える（ＭＳ血清８対対照血清８）。
【００４１】
さらなる態様として、本発明は、本発明のレトロウイルスに関係する疾患を診断する方法であって、多発性硬化症を含む脱髄疾患、自己免疫疾患、糖尿病または悪性腫瘍を患っていると疑われるヒト対象からレトロウイルスを単離するステップおよび以下の実施例に詳述する上記いずれかの方法に従ってその感染性を試験するステップを含む方法に関する。
【００４２】
上述した疾患に関係する内在性レトロウイルスがヒト細胞に対して感染性であるという発見に基づいて、かかる疾患を管理する方法が考えられる。したがって本発明は、一態様において、本発明のレトロウイルスの存在に関係する臨床症状を示す疾患を患っている患者を処置する方法であって、前記レトロウイルスによる患者の細胞の感染および／または前記レトロウイルスに感染しうる患者の細胞への前記レトロウイルスの移動を少なくとも部分的に防止する能力を有する有効量の薬剤を患者に投与することを含む前記方法を提供する。この文脈において「移動」という用語は、感染性レトロウイルスを保有する細胞が感受性標的細胞に移動することによって、レトロウイルスが細胞−細胞接触を介して感受性標的細胞に感染できるようになる、体内の感受性細胞へのレトロウイルスのターゲティングが包含される。
【００４３】
本発明の処置方法には、体内の新しい細胞の感染過程の少なくとも１つのステップを妨害する能力を有する化合物、例えばレトロウイルスを保有する不死化細胞を少なくとも部分的に好ましくは選択的な様式で排除する化合物、かかる細胞の移動を防止または抑制する化合物、細胞−細胞接触を妨害する化合物、または標的細胞へのレトロウイルスの伝播（感染）を妨害する化合物などを使用することができる。かかる方法に使用することができる化合物としては、抗ウイルス剤、抗体、アンチセンス核酸、核酸結合タンパク質およびリボザイムなどが挙げられる。
【００４４】
本発明の内在性ウイルスに関係する疾患、例えば多発性硬化症を含む脱髄疾患、自己免疫疾患、糖尿病および悪性腫瘍などの臨床症状は、上記レトロウイルスに対する免疫応答に関係すると考えられる。かかる免疫応答は「直接的」（すなわち感染細胞上の抗原に対する応答）であるかもしれないし、「間接的」（すなわち他の細胞抗原に対する免疫応答）であるかもしれない。
【００４５】
したがって本発明は、もう一つの態様として、上記の疾患を管理する方法であって、かかる疾患を患っていると疑われる患者に、かかる免疫応答を少なくとも部分的に抑制する能力を有する有効量の薬学的活性化合物を投与することを含む前記方法に関する。この点で有用な化合物には、例えば活性化されて免疫応答を生じる免疫系の細胞を抑制する化合物などがある。具体的実施形態として、レトロウイルス感染に対する免疫応答を少なくとも部分に抑制する能力を有する薬学的活性化合物は、本明細書に記載の配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９および配列番号５０ならびにそれらの変異体および部分配列からなる群より選択されるプロテアーゼコード領域由来の領域を含むような配列を含む、レトロウイルスのプロテアーゼコード（ｐｏｌ）領域由来の領域を含むスプライスされたＨＥＲＶ−Ｈ　ＲＧＨレトロウイルスｅｎｖ　ｍＲＮＡ配列を発現させるレトロウイルスによって特異的に誘発される免疫応答に対して作用する化合物である。さらなる他の実施形態として、薬学的活性化合物は、ＣＤ３＋、ＣＤ４−およびＣＤ８−Ｔ細胞を含む活性化Ｔ細胞の生物活性を抑制するか、またはかかるＴ細胞を排除するように作用する化合物である。
【００４６】
さらなる他の態様として、本発明のレトロウイルスの存在に関係する臨床症状を示す疾患の管理に医薬として使用される抗ウイルス剤、ならびにかかるレトロウイルスに関係する疾患、例えば脱髄疾患、悪性腫瘍、糖尿病および自己免疫疾患などを管理するための医薬の製造における抗ウイルス剤の使用も提供する。この文脈において「抗ウイルス剤」という表現は、レトロウイルスの感染性および複製および／または感染の病的症状、例えば患者の自己免疫状態をもたらす場合もある有害な免疫症状を防止または抑制する任意の化合物を示すものとして、最も広義に理解すべきである。現在使用されている抗ウイルス剤の使用が考えられるが、本発明のレトロウイルスを選択的に抑制または排除する抗ウイルス剤を開発するか、または既知の抗ウイルス剤から選択することができると考えられる。抗体、アンチセンス核酸およびリボザイムを抗ウイルス剤として使用することは、本発明の範囲に包含される。
【００４７】
本発明のもう一つの目的は、請求項４に記載のように、ヒト対象において、本発明のレトロウイルスに対する免疫応答を少なくとも部分的に抑制する能力を有する薬学的活性化合物を含む薬学的組成物、例えば薬学的活性化合物が本発明のレトロウイルス（例えば上述のスプライスされたＨＥＲＶ−Ｈ　ＲＧＨレトロウイルスｅｎｖ　ｍＲＮＡ配列を発現させるレトロウイルスなど）によって特異的に誘発される免疫応答に対して作用することを特徴とする組成物、および薬学的活性化合物がＣＤ３＋、ＣＤ４−およびＣＤ８−Ｔ細胞を含む活性化Ｔ細胞の生物活性を抑制するか、またはかかるＴ細胞を排除するように作用する化合物であることを特徴とする組成物などを提供することである。
【００４８】
さらに、本発明のレトロウイルスによる患者の細胞の感染および／または前記レトロウイルスに感染しうる患者の細胞へのレトロウイルスの移動を少なくとも部分的に防止する能力を有する薬学的活性化合物を含む薬学的組成物、ならびに前記レトロウイルスの感染によって形質転換（不死化）した細胞を患者の体内で少なくとも部分的に排除する能力を有する薬学的活性化合物を含む薬学的組成物も提供する。
【００４９】
潜在的抗ウイルス活性を持つ化合物は、単核細胞培養からのレトロウイルスの産生に基づくスクリーニングアッセイを使って同定することができる。通常（すなわち該化合物の存在下で）レトロウイルス粒子を産生する細胞からのレトロウイルスの産生を抑制する化合物は、潜在的抗レトロウイルス活性を持つと評価されるだろう。典型的なアッセイは樹立培養Ｂリンパ芽球様ＭＳ由来細胞株を使って行われるだろう。細胞を標準的なマイクロタイタープレートのウェルに分注し、細胞培養培地中でウイルス粒子を産生させる。ウイルス粒子は、超遠心分離によって調製したＯｐｔｉｐｒｅｐ勾配中で、その構造を確認することによって検出することができる。次に候補化合物を加え、試験化合物の存在下でのウイルス粒子の産生を適当な手段によって分析する。例えば、完全なウイルス粒子の産生は、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ勾配での超遠心分離によって分析することができる。典型的には、候補化合物の効果はいくつかの異なる濃度で試験されるだろう。ウイルス産生の阻害は、当該候補化合物が潜在的抗ウイルス活性を持つことを示すと採点される。このようなスクリーニングアッセイによって潜在的抗ウイルス活性を持つと認定された化合物は抗ウイルス剤として、または医薬品になりうる抗ウイルス剤を開発する際のリード化合物として役立ちうる。
【００５０】
もう一つの選択肢として、潜在的抗ウイルス活性を持つ化合物に関するスクリーニングアッセイは感染性アッセイに基づいてもよい。典型的アッセイでは、本発明のウイルスに感染しうる標的細胞、例えば健常対照者由来の培養ＰＨＡ刺激リンパ球が、本発明のレトロウイルスを含む試料に、候補化合物の存在下または不在下で曝露されるだろう。レトロウイルスを含む試料としては、例えば、レトロウイルス粒子を産生する細胞株（例えば上述のＢリンパ芽球様ＭＳ由来細胞株）の細胞上清またはレトロウイルスを含む無細胞血漿試料を挙げることができる。細胞上清中に存在するレトロウイルス粒子によるリンパ球の感染を防止するか実質的に減少させる候補化合物は抗ウイルス活性を持つと評価される。かかる化合物もまた抗ウイルス剤として、または医薬品になりうる抗ウイルス剤を開発する際のリード化合物として役立ちうる。感染性アッセイは、ＰＨＡ刺激リンパ球におけるレトロウイルスの活性化を示すための生物学的試験であって、下記の実施例に説明する既に確立された試験に基づいてもよい。
【００５１】
感染性レトロウイルス粒子を産生するＭＳ由来細胞株の培養物を使って、ウイルスポリペプチド、例えば体内でスーパー抗原として働くことによって自己免疫応答を誘発しうるポリペプチドなどの合成を防止する化合物を同定することもできる。典型的スクリーニングでは、免疫アッセイが、細胞株そのものまたは細胞上清を使ってＭＳ由来の細胞株におけるウイルス特異的エピトープの産生を示すスクリーニング試験として設定されるだろう。
【００５２】
重要な態様として、本発明は、ＲＧＨレトロウイルスのプロテアーゼ（ｐｏｌ）領域由来の領域を含む対立遺伝子的に存在するスプライスされたＨＥＲＶ−Ｈ　ＲＧＨレトロウイルスｅｎｖ　ｍＲＮＡ配列の、多発性硬化症を含む脱髄疾患、自己免疫疾患、糖尿病および悪性腫瘍からなる群より選択される疾患の発生または状態に関するマーカーとしての使用に関する。これに関して「対立遺伝子的に存在する」という表現は、ヒトゲノム中の同じ遺伝子座にあるＲＧＨ対立遺伝子、または異なる遺伝子座にある近縁ＲＧＨ遺伝子のマーカーの存在を示す。具体的実施形態として、かかる使用は、本明細書に記載の配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９および配列番号５０ならびにそれらの変異体および部分配列からなる群より選択されるプロテアーゼコード領域由来の領域を含むｍＲＮＡ配列に基づく。
【００５３】
以下の非制限的実施例および添付の図面で本発明をさらに詳細に説明する。
【００５４】
【実施例１〜４】
（材料および方法）
細胞
血液試料は全てインフォームドコンセントを得た上で採取した。ヘパリン処理血をフィコールイソパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｉｓｏｐａｑｕｅ）密度勾配遠心分離にかけた。単離された単核細胞からの長期培養自発形質転換細胞株の樹立は、先に記載されている方法（Ｍｕｎｃｈら，１９９５）で行った。
【００５５】
ＦＬＫ−ＢＬＶ（ヒツジ胎仔−ウシ白血病ウイルス）（ＢＬＶ＋）は、国立獣医学血清研究所（Ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｓｅｒｕｍ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コペンハーゲン）から入手し、２つのＨＴＬＶ−１感染Ｔ細胞株Ｃ９１−ＰＬ（ＨＴＬＶ−１＋）およびＣ８１６６（ＨＴＬＶ−１Δｇａｇ）はＭＲＣエイズ試薬プロジェクト（ＭＲＣ　ＡＩＤＳ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｐｒｏｊｅｃｔ、ロンドン）から入手した。ＥＢＶ産生細胞株Ｂ９５−８はＡＴＣＣから入手した。細胞株にはヒト血清の代わりにウシ胎仔血清を補足し、細胞株の生育は別の研究室で行われた。
【００５６】
血漿
血液試料は全てインフォームドコンセントを得た上で採取した。試料は、健常ボランティアまたはオーフス大学病院神経内科、マルセリボルグ（Ｍａｒｓｅｌｉｓｂｏｒｇ）病院（オーフス）皮膚科、ＲｙのＭＳ病院、またはミデルファート病院内科（いずれもデンマーク）の患者から採取した。試料は各診療所で採取され、採取後直ちに手渡しされた。試料は全て本発明者らの研究室で処理した。４０ｍｌのクエン酸塩添加血試料から無細胞および無細胞片血漿試料を得た（約１０ｍｌの血漿）。最初の遠心分離後、血漿を吸引し、さらに４℃、１０００×ｇで３０分間の遠心分離にかけて、残っている細胞片をペレット化した。吸引の後、血漿試料を下記のように処理した。
【００５７】
粒子状ＲＮＡ精製
レトロウイルスＲＮＡを細胞培養上清および血漿試料から精製した。すなわち１．３リットルの懸濁培養物を４℃、２５００ｘｇで３０分間遠心分離した。無細胞上清を吸引し、６０ｍｌチューブで、その上清の下に４ｍｌの５０％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ−ＮａＣｌ／Ｈｅｐｅｓ（Ｎｙｃｏｍｅｄ）クッション液を層状に充填し、４℃、４５，０００ｘｇで２時間超遠心分離した。Ｏｐｔｉｐｒｅｐとは、ショ糖とは異なりレトロウイルス粒子を傷つけないヨウ素化ノニオン密度勾配媒体（Ｎｙｃｏｍｅｄ　Ｐｈａｒｍａ（ノルウェー））である（Ｍｏｅｌｌｅｒ−Ｌａｒｓｅｎら，１９９８）。
【００５８】
上記クッション液とその上に近接して層をなしているレトロウイルス含有媒体とを混合し（５〜６ｍｌ）、細胞片を除去するために０．４５μｍフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ　３２、Ｇｅｌｍａｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で濾過し、２０％Ｏｐｔｉｐｒｅｐになるように調節した。１１．２ｍｌ　Ｏｐｔｉｓｅａｌ（Ｂｅｃｋｍａｎｎ）チューブに入れて、Ｂｅｃｋｍａｎｎ　ＮＶＴｉローターで、３６４，０００ｘｇで３．５時間遠心分離した。遠心分離後に各４００〜５００μｌ（１２滴）のフラクションを集めた。各フラクションについてＲＴ活性を測定した。大きなＲＴ活性を持つ５〜６フラクションを５体積の溶解結合バッファー（Ｄｙｎａｌ（ノルウェー））中でそのまま溶解し、１試料あたり１００μｌのビーズ（ｍＲＮＡ　Ｄｉｒｅｃｔキット、Ｄｙｎａｌ（ノルウェー））を添加し、製造者の指示書に従うことによって、ポリＡ　ＲＮＡを精製した。
【００５９】
無細胞血漿試料は上記と同様に５０％Ｏｐｔｉｐｒｅｐに重層し、超遠心分離し、濾過した。レトロウイルス／Ｏｐｔｉｐｒｅｐ混合物を５体積の溶解結合バッファー（Ｄｙｎａｌ（ノルウェー））中でそのまま溶解し、上述のようにｍＲＮＡ−Ｄｉｒｅｃｔキット（Ｄｙｎａｌ（ノルウェー））を使って１試料あたり５０μｌのビーズでポリＡ　ＲＮＡを精製した。
【００６０】
直ちに使用しない場合は、ＲＮＡ結合ビーズを８０％ＥｔＯＨに入れて−８０℃で保存した。使用前に、各ＲＮＡ試料を増幅用ＤＮアーゼ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、製造者の指示書に従って処理した。氷冷した後、ＲＮＡとの複合体を形成した常磁性ビーズを含むバッファーをＤＥＰＣ処理したｄｄＨ２Ｏと交換することによってＤＮアーゼを除去した。
【００６１】
ＰＥＲＴ（ｐｒｏｄｕｃｔ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）アッセイ
５μｌのバッファーＡで、５μｌの勾配フラクションに対して、基本的に先に記載されている通りに、超高感度ＲＴアッセイ（ＰＥＲＴ（Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ））を行った（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，１９９９；Ｌｕｇｅｒｔら，１９９６；Ｓｉｌｖｅｒら，１９９３；Ｐｙｒａら，１９９４）。
【００６２】
ＲＴ−ＰＣＲ、クローニングおよびシークエンシング
ＲＴ−ＰＣＲにはＧｅｎｅＡｍｐ　ＲＮＡ　ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）を使用し、１反応につき１ＵのＴａｑポリメラーゼを使用した点を除いて、製造者の提案に従って行った。第１鎖合成にはビーズ−オリゴｄＴ複合体化ＲＮＡテンプレートを使用し、ランダムヘキサマーを使ってプライミングした。一部の実験では、下流プライマーを使って特異的にプライミングしたｃＤＮＡ合成によって、ＲＮＡテンプレートの完全性を確認した。この場合、対応する上流プライマーを使ってプライミングした対照ｃＤＮＡ合成は陰性だった。
【００６３】
ＰＣＲ用プライマーセット：本発明者らはまず様々なレトロウイルスコンセンサスプライマーを低ストリンジェンシー条件で使用した。その結果、内在性レトロウイルス配列に関するアッセイを行うこととし、その後、内在性レトロウイルスパネルのＨＥＲＶ−Ｈ／ＲＴＶＬ−Ｈ　ｇａｇコンセンサスプライマー（Ｍｅｄｓｔｒａｎｄら，１９９２）を使って陽性の結果を得た。これらのプライマーはＰ．ＭｅｄｓｔｒａｎｄおよびＪ．Ｂｌｏｍｂｅｒｇ両氏の厚意により寄贈されたものである。
【００６４】
５’−ＣＴＴＴＴＡＴＴＡＣＣＣＡＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣＧＡＹＡＴ−３’（配列番号１７）／５’−ＴＴＡＧＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＴＣＴＣＴＴＴＴＣＣＡＲＴＧ−３’（配列番号１８）。
【００６５】
次に本発明者らは、ｇａｇ（Ｉ，ＩＩ）領域用およびすぐ上流のｅｎｖ領域用のＲＧＨ特異的プライマーセットを開発した。
【００６６】
Ｉ：５’−ＣＧＴＴＴＡＣＡＴＡＴＣＡＣＴＣＣＣＴＴＣＣＴＡＧＴＣＴＣＴＧＴ−３’（配列番号１９）／５’−ＧＣＡＴＴＡＡＣＣＴＴＧＡＣＴＡＴＧＴＣＴＴＴＡＧＣＴＣＣＡＧ−３’（配列番号２０）（５０℃）および／または
ＩＩ：５’−ＡＴＴＴＴＡＴＴＡＣＣＣＡＡＴＣＴＧＣＴＣＣＡＡＡＣＡＴ−３’（配列番号２１）／５’−ＡＧＧＴＧＡＧＴＴＧＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＴＴＴＴＴＡ−３’（配列番号２２）（５０℃）；
５’−ＧＡＴＣＣＴＣＣＣＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＴ−３’（配列番号２３）／５’−ＧＧＡＡＧＴＡＴＴＧＧＡＧＧＧＴＧＣＣＣＴＧＣＣ−３’（配列番号２４）（６０℃）。
【００６７】
反応は全てＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒで行った。第１鎖合成条件：室温で５分、４２℃で４５分および９５℃で５分の後、４℃に冷却。ＰＣＲ：９５℃で２分を１サイクルの後、括弧内に示したアニーリング温度を使って、９４℃で１分、アニーリング２分、７２℃で３分（１０秒ずつ伸長）を４５／５０サイクル。この後、７２℃で７分間の最終伸長反応を行った。各アッセイでは、ＤＮＡテンプレートが増幅されていないことを保証するために、各ステップに対応する水対照を、ＲＴを含まない正副一対の各反応と共に含めた。ＳｕｒｅＣｌｏｎｅ　Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使って各産物をｐＵＣにクローニングし、ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍキット（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使って自動シークエネーター（ＡＢＩ３７７）で配列決定した。
【００６８】
サウスウェスタン解析
６０ｍｌの懸濁培養物を上述のように第一遠心分離にかけた。４℃で７０，０００ｘｇの超遠心分離（ＳＷ４１ローター／Ｂｅｃｋｍａｎｎ）を１時間行うことによってウイルス粒子をペレット化し、２０μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）／０．１％アジ化ナトリウムに再懸濁し、使用するまで４℃で保存した。各試料のタンパク質濃度を比色アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄプロテインアッセイ）によって決定した。
【００６９】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の前に、各試料の半量を免疫沈降にかけて、同時精製されたＥＢＶ粒子を除去した。２．５Ｍ　ＮａＣｌ、５０ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ９）および各１０μｇ／ｍｌの抗体９２４３および９２４７（抗ＥＢＶ膜およびキャプシド、Ｄｕｐｏｎｔ）を含む１／１０体積の溶液を各試料に加え、その混合物を室温で１５分間インキュベートした。この時点で、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）に懸濁したプロテインＡ−セファロース（６ＭＢ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１ｍｌを加えた。室温で１０分間インキュベートした後、プロテインＡセファロース−抗体−ＥＢＶ複合体を沈殿させるために、混合物を４℃、１２，０００ｘｇで５分間遠心分離した。１／３体積の溶解バッファー、すなわち３％ＮＰ−４０、０．３％ＳＤＳ、３％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、４５０ｍＭ　ＮａＣｌおよび１５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を添加することによって、上清に溶解操作を施した。溶解した各ウイルス試料から等量のタンパク質を４〜２０％ＮＯＶＥＸゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。着色Ｍｒマーカー（Ｓｉｇｍａ）を各ゲルで同時に電気泳動した。陽性対照はＢＬＶおよびＨＴＬＶ−１とした。その他の対照は培養培地およびＢ９５−８である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の試料は全て超遠心分離によって調製した。電気泳動の後、６２．５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１３．５ｍＭグリシン、５％ＥｔＯＨおよび０．１％ＳＤＳ中で、ゲルをニトロセルロースフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にエレクトロブロッティングした。電気泳動とその後のブロッティングはＮＯＶＥＸ　Ｅｘｃｅｌｌアセンブリで行った。ｓｓＤＮＡプローブはＲａｎｄｏｍ　Ｐｒｉｍｅｄ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）とα−３２Ｐ−ｄＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）とを使用し、製造者の推奨に従って放射標識した。テンプレートは、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化したλＤＮＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）とした。プローブは使用前に９０℃で１０分間熱変性させた。ブロッティングの後、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１×デンハート液、５０ｍＭ　ＮａＣｌを含むバッファー中でニトロセルロースフィルターを平衡化し、同じバッファー中の放射標識プローブと共に室温で１時間インキュベートした。フィルターを同じバッファーでよく洗浄し、風乾し、Ｆｕｊｉ　Ｘ線フィルム（Ｓａｎｔａｘ）に−８０℃で露出した。
【００７０】
伝播
健常ボランティアから採取したクエン酸塩添加血のフィコールイソパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｉｓｏｐａｑｕｅ）密度勾配遠心分離によって単離したリンパ球試料を、以前に報告されているように播種し培養した（Ｍｕｎｃｈら，１９９５）（１０７細胞／アリコート）。１０ｍｌにつき２μｌのＰＨＡ（Ｄｉｆｃｏ）を添加した。２日後に、ＭＳ細胞株から精製し、超遠心分離によってペレット化し、ＴＮＥに懸濁し、濾過したレトロウイルス粒子を添加した（１アリコートあたり培養物６０ｍｌ分の粒子）。これは無細胞感染に相当する。得られた懸濁液を培養し、毎週２回顕微鏡で調べ、ＰＥＲＴ（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，１９９９）用の上清試料を定期的に集めた。顕著なクローン増殖の出現に付随してＲＴ活性が観察された場合に、レトロウイルスの伝播が成功したと見なした。これは通常約１ヶ月後に起こる。持続的クローン増殖とは、例えば継代を行わない週１回の栄養補給に対して、週３回の栄養補給と継代培養とを必要とするような増殖速度の増加を指す。これは多くの細胞クラスター（クローン）の出現を伴う。対応する対照は死滅する。これらの対照は、各伝播アッセイ用のレシピエントリンパ球調製物の並行ＰＨＡ刺激および無処理培養物とした。ドナー培養物から混入した細胞が存在しないことは染色体解析によって確認した（伝達は雄（男性）ドナーから雌（女性）レシピエントに起こるか、またはその逆方向に起こる）。樹立伝播培養物の上清から得られるレトロウイルス粒子を上述のように濃縮し、ＲＴ−ＰＣＲによって特徴づけた。
【００７１】
（実施例１）
ＭＳ由来細胞株によって産生されるレトロウイルス粒子中のＲＧＨ配列の同定
Ｂリンパ芽球様細胞株をＭＳ患者の静脈血から樹立した（表１）。細胞株は長期間培養後に自発的に生成した。全ての細胞株を、マイコプラズマ汚染について試験し、反復分析によって陰性であることがわかった。
【００７２】
粒子を細胞培養上清からＯｐｔｉｐｒｅｐ勾配での超遠心分離によって精製した。そのレトロウイルス性は、各勾配フラクションに対してネガティブ染色電子電子顕微鏡検査（ＥＭ）を行い、また各勾配フラクションに対して高感度ＰＥＲＴ（Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）アッセイ（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，１９９９；Ｌｕｇｅｒｔら，１９９６；Ｓｉｌｖｅｒら，１９９３；Ｐｙｒａら，１９９４）も行うことによって確認した。粒子中のＲＮＡの存在は、培養物を［５−３Ｈ］−ウリジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で２４時間チェイスしてから収集し、次に、各勾配フラクションのＴＣＡ沈殿を行い、βカウンターでカウントすることによって証明した。ＰＥＲＴ活性、ＥＭにおけるレトロウイルスの存在およびＲＮＡ含量は、勾配中の同じ位置にあった（Ｍｏｅｌｌｅｒ−Ｌａｒｓｅｎら，１９９８）。
【００７３】
細胞培養上清から単離されたレトロウイルスＲＮＡテンプレートに対してＲＴ−ＰＣＲを行った後、クローニングしたアンプリコンを配列決定することにより、まず本発明者らは、細胞株ＭＳ１５３３、ＭＳ１８４４、ＭＳ１８４５およびＭＳ１８５１によって産生されるレトロウイルス粒子中に、ヒト内在性レトロウイルスＨＥＲＶ−Ｈ変異体ＲＧＨ−２（Ｈｉｒｏｓｅら，１９９３）（図１．１）に対して高いホモロジーを持ついくつかのｇａｇフラグメントおよびｅｎｖフラグメントを同定した。ＲＧＨに対するホモロジーのレベルは８０〜９５％の範囲にあった。細胞株から得られる物質では、粒子レベルでのＲＧＨ　ＲＮＡのパッケージングが、ＥＭによって構造を確認しうるレトロウイルス粒子とＲＴ活性とのＯｐｔｉｐｒｅｐ勾配での同時移動によって、はっきりと証明される。精製レトロウイルス粒子で免疫処置したＷｉｓｔａｒラットは、ＨＥＲＶ−Ｈ配列から翻訳された潜在的に免疫原性の合成ペプチドに対して、特異的な血清学的応答を示すが、この粒子中の全てのレトロウイルスタンパク質がＨＥＲＶ−Ｈによってコードされているかどうかの判断はまだなされていない。ビリオンに異種ＲＮＡが同時パッケージングされる現象（Ｌｉｎｉａｌ，１９９０）は、よく知られているので、ビリオンタンパク質をコードしているゲノム中のレトロウイルス配列は他にもあるかもしれない。
【００７４】
さらに本発明者らは、当研究室の標準的方法によって精製したＭＳ細胞株粒子ＲＮＡを、最近報告されたＥＲＶ−９−ＭＳに関するネステッドプライマーセットＳＴ１−１／−２およびＲＴ−ＰＣＲ条件（Ｐｅｒｒｏｎら，１９９７）を使って調べた。その結果は陰性だった。
【００７５】
表１．１　（Ｂリンパ芽球様細胞株をＭＳ患者の静脈血から樹立した）
細胞株は広範囲にわたる培養系列の一部として樹立され、２ヶ月を超える培養後に生成した。これらは増殖し続ける。外部ＥＢＶ源の関与はなかった。細胞株の由来は、ＲＦＬＰマッピングおよびＨＬＡ−ＤＯβタイピングによって確認した（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，１９９７）。
【００７６】
【表１】
2004502407.tif 000003
（実施例２）
ＭＳ患者から得られる血漿に特異的に存在するＨＥＲＶ−Ｈ配列
ＲＧＨ相同配列が粒子レベルでもインビボでＭＳに関係しているかどうかを決定するために、臨床標本、すなわちＭＳ患者、自己免疫疾患患者および健常対照者から採取した無細胞濾過超遠心分離血漿試料に対してＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。血漿から単離された粒子から抽出したＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにかけた後、クローニングしたアンプリコンの配列決定を行うことによってアッセイした。血漿ＲＴ−ＰＣＲおよびシークエンシング解析の結果を表１．１に示す。ＭＳ患者配列の例を図２（配列番号９〜１０）に示す。粒子レベルでのＲＧＨ配列の発現は、ＭＳに特異的だった（ＭＳ患者由来の無細胞血漿試料３３検体のうち２４検体）。これらの配列は自己免疫疾患患者から採取した無細胞血漿試料２９検体および健常対照者から採取した無細胞血漿試料２０検体には存在しなかった。
【００７７】
このように様々なＲＧＨ配列変異体が、細胞株上清から得られるウイルス粒子にも、様々なＭＳ患者から得られる血漿の粒子フラクションにも見いだされた。転写されるゲノムコピー数、または分子間に相補性があるかどうかは、現在のところわかっていない。
【００７８】
（実施例３）
ＭＳ細胞株由来のレトロウイルスにおけるＨＬＴＶ／ＢＬＶ　Ｇａｇ　ＮＣタンパク質相当物のサザンウェスタン解析による検出
粒子から単離されるタンパク質の機能的特徴を決定するために、ＮＣとＲＮＡ（またはｓｓＤＮＡ）の間の相互作用に関与する特徴的なＣＸ２ＣＸ４ＨＸ４Ｃモチーフを持ったジンクフィンガードメインを含むＧａｇヌクレオキャプシド（ＮＣ）タンパク質を探した。このモチーフは、レトロウイルスの間に１コピーまたは２コピーとして存在することが知られている（Ｍａｇｅｒら，１９８７）。興味深いことに、ＲＴＶＬ−Ｈでは２回出現するもののどちらも不完全であるこのモチーフ（Ｍａｇｅｒら，１９８７）は、ＲＧＨでも２回出現するが、その一方は完全なコピーである。本発明者らがＲＴ−ＰＣＲアッセイで使用した２つのｇａｇプライマーセットは、このモチーフをまたいでいる。
【００７９】
電気泳動で分離した粒子由来のタンパク質を再生条件下にｓｓＤＮＡと共にインキュベートするという、Ｍｏｒｏｚｏｖら（１９９２）によって概略が記されている方法を用いて、本発明者らは、ＨＴＬＶおよびＢＬＶのＧａｇ　ＮＣタンパク質に相当する核酸結合タンパク質が、アッセイした３つのＭＳ細胞株から得られるレトロウイルスにも存在することを証明した（図３）。１０〜２０ｋＤの範囲に存在する３本のｓｓＤＮＡ結合バンドの中央のバンドがレトロウイルスヌクレオキャプシドタンパク質に相当すること、ＭＳ細胞株（レーン２、３および７）、ＨＴＬＶ−１（レーン５）およびＢＬＶ（レーン６）のバンドパターンが類似していること、およびＥＢＶ産生細胞Ｂ９５−８のレーン（レーン４）には対応するバンドが無いので中央のバンドがＥＢＶ由来である可能性は排除されることを、いくつかのデータが示している。さらに、同じフィルターをＨＴＬＶ−１＋血清によるウェスタンブロットに使用すると、ｐ１５バンドはちょうどＨＴＬＶ−１の３本のｓｓＤＮＡ結合バンドの中央のバンドに一致する（図示しない）。
【００８０】
電気泳動に先立って、溶解したペレットから免疫沈降によってＥＢＶを除去した場合も、レトロウイルス感染細胞株で観察されるバンドパターンは、非沈降材料に見いだされるパターンと同一だった（図示しない）。
【００８１】
他の２本のバンドの起源はよくわからない。Ｃ８１６６（レーン８）に同様のバンドが存在しないことから、これらのバンドもレトロウイルスに起源を持つかもしれないことが示唆される。Ｃ８１６６における６０ｋＤバンドの起源はわからない。
【００８２】
（実施例４）
ＭＳ細胞株によって産生されるレトロウイルスの伝播性
本実施例ではＭＳ細胞株によって産生されるレトロウイルスの伝播性を調べた。無細胞Ｃ型様レトロウイルス（ＨＴＬＶ−１）は、低効率ではあるものの、感染能力を有するので（ＤｅＲｏｓｓｉら，１９８５）、ＭＳ細胞株から得られる精製粒子を使って、健常ヒト個体由来の培養ＰＨＡ刺激リンパ球を感染させた。健常ヒト個体由来のＰＨＡ刺激リンパ球にレトロウイルスを伝播させようとする２３実験のうち８実験でＲＴ活性と持続的クローン増殖とが同時に起こったことは、伝播の表われであると解釈され、このことはそれぞれの対照培養物では活性と増殖が起こらなかったことによって裏付けられた。持続的クローン増殖とは、多くの浮遊細胞クラスター（クローン）と遊離の単一芽細胞様細胞との出現を伴う増殖速度の著しい増加を表す。対応する対照は死滅する。
【００８３】
これらの実験で本発明者らは、ＭＳ１５３３、ＭＳ１８４４またはＭＳ１８７４を用いた２３の独立した感染のうち８つで、ＲＴ活性とクローンの存在を証明した。対応する対照は全て非形質転換体のままであり、ＲＴ活性を持たなかった。感染後１ヶ月以上経ってから、形質転換したと推定される３つの独立した細胞培養物（２つはＭＳ１５３３により、１つはＭＳ１８４４による）から産生される勾配精製レトロウイルス粒子中に、ＲＧＨ配列の存在が明らかになった。ドナーおよび感染したレシピエントから得られるＲＧＨ配列を図４に示す。記載したドナー配列とレシピエント配列との間の相違は伝播の可能性を排除するものではない。ＲＧＨ変異体は単一の配列ではなく（少なくともドナーでは）分子集団を構成するからである。興味深いことに、ドナーおよびレシピエントから単離されたクローンでは、ＣＸ２ＣＸ４ＨＸ４ＣモチーフがＲＧＨ−２よりもよく保存されている。ＰＨＡ刺激対照培養がいずれも形質転換を起こさなかったことと、感染したレシピエントにおける粒子産生とは、伝播を示している。
【００８４】
（実施例１〜４の考察）
上記の実施例では、ＭＳと内在性レトロウイルスファミリーＨＥＲＶ−Ｈの間にある特別な関係を証明した。６つのＭＳ由来細胞株から得られる上清にＲＧＨ相同変異体が粒子レベルで存在することを証明した。また本発明者らは、３３人のＭＳ患者のうち２４人の血漿に粒子状のＲＧＨが特異的に存在することも証明した。
【００８５】
この内在性レトロウイルスが伝播性を持ちうることは、健常者由来のリンパ球への精製ビリオンの無細胞伝播によって実証される。レシピエント中に既に存在する内在性配列の活性化という可能性もないわけではないが、ＥＢＶが原因となってそのような活性化が起こりえたというのは疑わしいと本発明者らは考えている。ＥＢＶがレトロウイルスと同時精製されるとは思われないし、またｉ）健常リンパ球試料はいずれも決して活性化／感染されていないこと、ｉｉ）細胞の培養期間が短い（４〜８週間）こと、ｉｉｉ）クローン増殖とＲＴ活性とが同時に観察されること、およびｉｖ）対照細胞は全て死滅したことから、健常リンパ球の自発的なＥＢＶ形質転換は考えられないと思われる。以前に本発明者らは、ＭＳ疾患活動度と、ＨＴＬＶ−１由来Ｅｎｖポリペプチドに対する交差反応性抗体の存在との間に相関関係があることを証明した。この血清学的研究にはＭＳ患者４８人、他の神経系疾患を持つ患者１９人および健常対照者５７人が参加した。ＨＴＬＶ−１由来Ｅｎｖポリペプチドに対する血清学的交差反応性は、ＭＳ血清の６０％以上に見いだされた（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，１９９９）。本発明者らは、ＭＳ患者および対照者から得た新鮮血漿に対してＰＥＲＴアッセイも使用し、その結果、ＭＳ患者試料１７検体のうち７検体は、測定可能なＲＴ活性を持つが、２１検体の対照試料は全て陰性であることを明らかにした（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，１９９９）。ＭＳ患者血清中のＭＭＴＶ／Ｄ型様レトロウイルスであるＨＴＤＶ／ＨＥＲＶ−Ｋ　Ｇａｇに対する血清学的反応性がないことは、最近の研究によって証明されている（Ｂｏｌｌｅｒら，１９９７）。
【００８６】
最近、ＥＲＶ−９／Ｃ型関連（ＭＳＲＶ）配列が、５人のＭＳ患者の血漿試料中に存在すること（Ｐｅｒｒｏｎら，１９９７）、またＭＳ患者１７人のうちの９人、対照者４４人のうちの３人の血清に存在すること（Ｇａｒｓｏｎら，１９９８）が報告された。公表されたＭＳＲＶコンセンサス配列（２３０４ｂｐ）（Ｐｅｒｒｏｎら，１９９７）はいくつかのヒトゲノム配列、すなわちＡＣ００００６４およびＵ８５１９６に、約９０％相同であるので、ＭＳＲＶは外来性である可能性はあるものの、おそらくは内在性ＥＲＶ−９変異体なのだろう。あるいは、ＭＳＲＶは最近記載されたＨＥＲＶ−Ｗファミリー（Ｂｌｏｎｄら，１９９９）に属するのかもしれない。本発明者らがＭＳ細胞株から得られる粒子中にかかる配列の存在を示すことができなかったとしても、ＨＥＲＶ−Ｈ／ＲＧＨ−２およびＭＳＲＶ／ＥＲＶ−９／ＨＥＲＶ−ＷがＣ型オンコウイルス亜科の同じサブセクションに属するという事実は、本発明者らが同じ現象の２つの側面を見ていることを示しているのかもしれない。
【００８７】
最近、いくつかの自己免疫疾患について、レトロウイルスの関連が報告されている。先に述べたインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）へのＨＥＲＶ−Ｋ変異体の関わり（Ｃｏｎｒａｄら，１９９７）の他にも、シェーグレン症候群では、外因性と推定されるＤ型様レトロウイルスのｐｏｌ配列が唾液腺に見いだされた（Ｇｒｉｆｆｉｔｈら，１９９７）。もう一つの研究では、外因性と推定されるＤ型様レトロウイルス由来のｐｏｌ配列がリンパ節に見いだされた（Ｙａｍａｎｏら，１９９７）。全身性エリテマトーデスの研究では、短いＣ型様内在性レトロウイルスＥｎｖペプチドおよびＨＴＬＶ−１由来Ｇａｇペプチドに対する血清反応性が記載されている（Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎら，１９９６）。最後に、慢性関節リウマチでは、ＲＴＶＬ−Ｈ配列が存在しない滑液における複数の内在性レトロウイルスｐｏｌ配列の示差的発現が報告されている（Ｎａｋａｇａｗａら，１９９７）。
【００８８】
ＭＳは通常なら複製的に休止状態にある内在性レトロウイルスの産生と関係することが示唆される。これが自己免疫応答を誘発することによって原因因子となるかどうかはまだ十分な証拠がない。しかし本明細書に記載する研究では、粒子レベルでのＨＥＲＶ−Ｈ／ＲＧＨ配列の存在は、明らかにＭＳ特異的である。これは疾患過程への直接的かつ特異的な関わりを示すのだろう。活動性疾患を持つＭＳ患者から採取した血漿試料が全てＨＥＲＶ−Ｈ／ＲＧＨ陽性だったこともその理由である。ＭＳの場合、この疾患の疫学からは、内在性レトロウイルスの複製が原因因子であるとすると、活性化機序は外部起源を持つらしいことが示唆される。示唆に富む可能性として、まだ同定されていない外因性レトロウイルスおよび／または（本発明者や他の研究者が以前から示唆しているように）ヘルペスウイルスグループの一員との相互作用が挙げられる。発現した内在性レトロウイルスの役割としては、ＲＴを介した非レトロウイルスＲＮＡウイルスとの相互作用（Ｋｌｅｎｅｍａｎら，１９９７）も考えることができる。
【００８９】
（実施例５〜８）
序論
以下の実施例では、ヒト内在性レトロウイルスＨＥＲＶ−Ｈ／ＲＧＨの配列変異体に関係し、かつ数人のＭＳ患者の末梢血単核細胞から自発的に形成された長期細胞培養物によって産生されるレトロウイルス粒子が、他の細胞、すなわち非血球ヒト細胞および非ヒト細胞に伝播しうることを、さらに証明する。これらの長期細胞培養物が、主としてＢ細胞と少量のＣＤ３＋、ＣＤ４−、ＣＤ８−Ｔ細胞との混成集団からなることも、明らかにする。
【００９０】
（実施例５）
ＲＧＨ／ＨＥＲＶ−Ｈレトロウイルス粒子の種内伝播
ＭＳ患者の末梢血に由来する長期細胞培養物をレトロウイルスベクターコンストラクトを保有する細胞株と共培養した後、逆転写酵素（ＲＴ）活性に関するアッセイと、インジケーター細胞でのレトロウイルスベクターコンストラクトのレスキューに関するアッセイを行うことによって、種内伝播を証明した。簡単に概略を述べると、この共培養アッセイの背景にある原理は、レトロウイルスの伝播は細胞−細胞接触にある程度依存するということ、すなわち無細胞伝播は可能であるが、無細胞伝播が起こる頻度は低いということである（ｄｅ　Ｒｏｓｓｉら，１９８５）（実施例６参照）。
【００９１】
以下に述べるアッセイの初期段階では、ＬａｃＺドナー細胞をレトロウイルス産生細胞と共培養することにより、細胞−細胞接触が可能になる。ＬａｃＺドナー細胞はＬａｃＺマーカー遺伝子を持つレトロウイルスベクターコンストラクトを保有している。このコンストラクト自体に伝播性はないが、このコンストラクトはトランスに動態化されうる。ＬａｃＺドナー細胞はレトロウイルス粒子を産生する細胞と共培養される。ＬａｃＺドナー細胞がレトロウイルスによるウイルス産生性感染を起こすと、それ以降に産生される感染性レトロウイルス粒子の一部は（動態化された）コンストラクトを含むだろう。これらのレトロウイルス粒子は共培養上清中に産生される。この上清（レトロウイルス粒子を含むが細胞は濾過によって完全に除去されているもの）を、上記コンストラクトを保有しないインジケーター細胞に添加すると、これらのインジケーター細胞の（無細胞）レトロウイルス感染により、レトロウイルスベクターコンストラクトがインジケーター細胞に形質導入されるだろう。インジケーター細胞を固定して染色すると、青色細胞は、ＬａｃＺマーカー遺伝子の遺伝子産物（β−ガラクトシダーゼ）が存在する場合にのみ見いだされることになり、ＬａｃＺマーカー遺伝子は、レトロウイルス感染が感染性レトロウイルス粒子を介してＬａｃＺドナー細胞からインジケーター細胞にＬａｃＺマーカー遺伝子を形質導入した場合にのみ存在するだろう。このアッセイの主要原理は、Ｐｏｒｔｅｒら（１９９８）に記載されている。
【００９２】
伝播のモニタリングは、青色インジケーター細胞および／またはＲＴ活性の増加／減少の欠如をアッセイすることによって行われる。ＯＤ値で測定されるＰＥＲＴアッセイによれば、新規な粒子産生を伴わない上清では、産生されたレトロウイルス粒子のＲＴ活性が、分解を反映して３７℃で３日後には約１／３に減少することがわかる。
【００９３】
下記の結果は以下のように解釈される：
青色細胞なし、ＲＴ活性の減少：伝播なし；
青色細胞なし、ＲＴ活性の増加／減少の欠如：レトロウイルスの新規産生があるので伝播の可能性あり。コンストラクトは動態化されないのかもしれない；
青色細胞あり、ＲＴ活性の減少：コンストラクトが動態化されるので、伝播の可能性あり。レトロウイルス産生量は低いのかもしれない；
青色細胞あり、ＲＴ活性の増加／減少の欠如：伝播。
【００９４】
レトロウイルス産生性長期ＭＳ細胞培養物を週に３回、０．５ｘ１０６細胞／ｍｌの密度で継代し、Ｃｏｓｔａｒ製ボトルにて、２００ｉ．ｕ．／ｍｌのペニシリン（Ｌｅｏ）、０．２ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｒｏｓｃｏ）、２９０ｍｇ／ｍｌのグルタミン（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔ）および１０％熱不活化ヒト血清（Ｓｋｅｊｂｙ病院（デンマーク）の血液バンクから入手した血清プール）を補足したＲＰＭＩ１６４０（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）で培養した。
【００９５】
インジケーター細胞は、ヒト横紋筋肉腫細胞株ＴＥ６７１であり、ＬａｃＺドナー細胞はＴＥＬａｃＺ細胞である。ＴＥＬａｃＺはＭＦＧｎｌｓＬａｃＺレトロウイルスベクターを保有するＴＥ６７１のクローンである（Ｔａｋｅｕｃｈｉら，１９９４）。ＴＥ６７１およびＴＥＬａｃＺは週に１回、０．５ｘ１０６細胞／ｍｌの密度で継代し、Ｃｏｓｔａｒ製ボトルにて、５％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清、Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補足し、かつ２００ｉ．ｕ．／ｍｌのペニシリン（Ｌｅｏ）、０．２ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｒｏｓｃｏ）および１４５ｍｇ／ｍｌのグルタミン（Ｓｉｇｍａ）を補足したＤ−ＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養した。
【００９６】
標準的伝播アッセイでは、６穴トレイ（Ｆａｌｃｏｎ　１１４６、非組織培養コート）を、ＰＢＳ（標準的なリン酸緩衝食塩水、すなわち１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１５０ｍＭリン酸ナトリウム塩、ｐＨ７．４）中、１０μｇ／ｍｌのヒトフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ　Ｆ−０８９５）を使って、室温で２時間コーティングする。次に、フィブロネクチンを吸引し、ウェルをＰＢＳ中、２％ＢＳＡ（ＦＡＦ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で３０分間ブロッキングする。次にウェルを培養培地で洗浄し、ＴＥ６７１またはＴＥＬａｃＺを３ｘ１０４細胞／２ｍｌ培地／ウェルの密度で播種し、ＣＯ２キャビネット中、３７℃で培養する。フィブロネクチンはウイルス粒子と標的細胞との共存によって伝播の可能性を助長する（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，１９９９）。
【００９７】
３日後に培地を吸引し、レトロウイルス産生ＭＳ細胞（レトロウイルス産生ＭＳ細胞用の成長培地（ただしＨＳ濃度は５％）に入っているもの）を３ｘ１０５細胞／２ｍｌ培地／ウェルの密度で加える。ＭＳ細胞の添加後に、トレイを室温にて１８５ｘｇで１０分間遠心分離し、そのトレイを再びＣＯ２キャビネット中、３７℃で培養する。典型的な実験には次に挙げる細胞の組合わせを正副一対ずつ含める。
【００９８】
ＴＥＬａｃＺ＋ＭＳ細胞±フィブロネクチン±洗浄；ＴＥＬａｃＺ＋模擬感染±フィブロネクチン±洗浄；ＴＥ６７１＋模擬感染±フィブロネクチン±洗浄。フィブロネクチンを使用しない対照は、ＢＳＡでブロッキングしたトレイまたはＣｏｓｔａｒ製ボトルである。５日間の共培養後に、ウェルの半数をＰＢＳで穏やかに３回洗浄し、全てのウェルに新しい培地（ＨＳ濃度５％）を最高５〜６ｍｌ補充する。この洗浄ステップによりほとんどのＭＳ細胞は除去されるが、ウェル壁またはインジケーター細胞に結合したＭＳ細胞は除去されない。さらに３日間の共培養後に、各ウェルから１ｍｌの試料を採取し、ＲＴアッセイ用に調製する。残りの培養物を各ウェルから吸引し、０．４５μｍフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ，Ｇｅｌｍａｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）で濾過する（ＰＢＳで飽和）。この無細胞上清を、Ｎｕｎｃｌｏｎグリッド付き培養ディッシュ（Ｎｕｎｃ１６９５５８Ａ）中のＴＥ６７１インジケーター細胞上に、１〜２培養ディッシュ／ウェルの割合で播く。インジケーター細胞は、前日に２．５ｘ１０５細胞／５ｍｌ培地／ディッシュの密度で播種し、ＣＯ２キャビネット中、３７℃で培養する。濾過した無細胞上清を添加する前に、３．５ｍｌの培地をディッシュから吸引する。次にディッシュをＣＯ２キャビネット中、３７℃で４〜５日間培養する。ディッシュから上清を吸引し、各ディッシュから１ｍｌの試料を採取してＲＴアッセイ用に調製する。５ｍｌ／ディッシュの０．０５％グルタルアルデヒド／ＰＢＳを添加することによって細胞を固定する。ディッシュを室温で１５分間インキュベートした後、ＰＢＳで２回洗浄する。次に細胞を、以下の方法により、β−ガラクトシダーゼ発現に関して組織化学的に染色する。すなわち２ｍｌの染色液を各ディッシュに加え、それらを、光を通さないようにかつ気密的に包装し、３７℃で２４時間インキュベートする。染色液を吸引し、ディッシュを５ｍｌのＰＢＳで２回洗浄する。２ｍｌのｄｄＨ２Ｏを加え、ディッシュ全面を青色細胞について顕微鏡（Ｌｅｉｔｚ　Ｗｅｔｚｌａｒ製顕微鏡）で調べる。染色液は使用直前に調製され、４０ｍｇ／ｍｌのＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド；Ｓｉｇｍａ）／ＤＭＳＯ溶液を、５ｍＭフェロシアン化カリウム、５ｍＭフェリシアン化カリウム、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２（ｐＨ７）で１：４０希釈したものからなる。
【００９９】
このアッセイの典型的なタイムチャートは次のように概説することができる（ＬａｃＺドナー細胞、レトロウイルス産生細胞およびインジケーター細胞の全てが１日目に培養状態にあるとすると）
１日目：６穴トレイをフィブロネクチンコーティングし、ＴＥ６２１および／またはＴＥＬａｃを播種；
３日目：レトロウイルス産生ＭＳ細胞を添加して共培養；
８日目：ウェルを洗浄；
１０日目：グリッド付きディッシュにインジケーター細胞を播種；
１１日目：共培養上清を濾過し、インジケーター細胞に導入；ＲＴ試料採取；
１５日目：インジケーターの上清を吸引；細胞を固定して染色；ＲＴ試料採取；
１６日目：採点。
【０１００】
採点は陽性／陰性として行うこともできるし、感染多重度（ＭＯＩ）を使って行うことができる。ＭＯＩは非感染細胞（Ｐ）の割合から式：ＭＯＩ＝−（ｌｏｇＰ）／０．４３４３を使って決定することができる。すなわち、形質導入の成功につながるウイルスの数（ｎｖ）を標的細胞の数（ｎｃ）に対する割合として表したものが感染多重度である（ＭＯＩ＝ｎｖ／ｎｃ）。ある細胞がウイルスの１つに感染する確率は１／ｎｃであるから、ある細胞が非感染細胞である確率（Ｐ）は［１−（１／ｎｃ）］ｎｖである。したがってｌｏｇＰ＝ｎｖｌｏｇ［１−（１／ｎｃ）］である。ｎｃ＞３×１０３であるとすると、ｎｃｌｏｇ［１−（１／ｎｃ）］＝−０．４３４３である。ＭＯＩは単純な陽性−陰性採点による伝播アッセイの非線形性を補正する。もう一つの選択肢として、以下の定量的測光アッセイを使ってβ−ガラクトシダーゼの比活性を決定することもできる（Ｆｅｌｇｎｅｒら，１９９４）。
【０１０１】
細胞をＰＢＳで洗浄し、３５０ｍｌの２５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００中で溶解し、溶解物を−８０℃で少なくとも１時間保存する。β−ガラクトシダーゼの量を決定するために、５０ｍｌの溶解物および希釈液を５０ｍｌのＰＢＳ／０．５％ＢＳＡおよび１５０ｍｌの６０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．０）、１ｍＭ　ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ　ＫＣｌ、５０ｍＭβ−メルカプトエタノール、０．１％クロロフェノールレッドガラクトピラノシド（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）と混合する。遮光下に３７℃でインキュベートした後、５７８ｎｍでの吸収を測定し、精製酵素（Ｓｉｇｍａ）を使って得た標準曲線を使ってβ−ガラクトシダーゼのｐｇ数に換算する。これらの値を各溶解物中のタンパク質の総量に対して規格化する。体積１０ｍｌの溶解物を１５０ｍｌのｄｄＨ２Ｏおよび４０ｍｌのＢｉｏ−Ｒａｄプロテインアッセイ試薬と混合する。５９５ｎｍでの吸収をＢＳＡ標準曲線を使ってタンパク質のμｇ数に換算する。
【０１０２】
比活性はβ−ガラクトシダーゼのｐｇ数／タンパク質のμｇ数として表される。統計的な比較はスチューデントのｔ検定によって行った。
【０１０３】
逆転写酵素（ＲＴ）活性のアッセイ：ＲＴはレトロウイルス粒子中に存在するレトロウイルス特異的酵素である。したがってＲＴ活性のモニタリングは、レトロウイルス粒子の新規産生をモニタリングする方法になる。レトロウイルス粒子数は極めて少ないので、少量の上清で直接アッセイするには、ＰＣＲに基づく高感度なＲＴアッセイが必要である。一般的アッセイおよびＭＳ長期細胞培養物のＲＴ特性は、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら（１９９９）に記載されている。
【０１０４】
超高感度ＲＴアッセイ（ＲＴ−ＰＣＲまたはＰＥＲＴ（Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ））は、外因性ＲＮＡテンプレートを、試料に含まれるＲＴによって増幅可能なＤＮＡに変換することに基づいている。これらのアッセイは基本的にＰｙｒａら（１９９４）に記載されているように行われる。
【０１０５】
各１ｍｌの細胞培養上清を吸引によって得る。試料を０．２μｍ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ　Ｍｉｎｉｓａｒｔ）に通し、４℃、６３，０００ｘｇで１００分間（Ｓｉｇｍａ　３Ｋ−３０）または１００，０００ｘｇで１時間（Ｂｅｃｋｍａｎｎ製ＳＷ５５）遠心分離する。上清を吸引し、ペレットを上清１ｍｌにつき５μｌの割合のバッファーＡに懸濁する（バッファーＡ：５０ｍＭ　ＫＣｌ、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ　ＤＴＴ、０．２５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０２５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、５０％グリセロール）。試料はＲＴ活性の損失を防ぐために同じ日に採取し処理しなければならない。バッファーＡ中の試料は、−７０℃で保存する。
【０１０６】
このアッセイの初期のステップはＲＮアーゼフリーの条件で行わなければならない。各アッセイの前に、ＲＮアーゼフリーの０．５ｍｌエッペンドルフチューブで液量１．４μｌのプライマー９ｐｍｏｌに０．２８ｐｍｏｌのＭＳ２　ＲＮＡを加えることによって、テンプレート（ＭＳ２　ＲＮＡ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とプライマー（ＲＴ−１：５’−ＣＡＴＡＧＧＴＣＡＡＡＣＣＴＣＣＴＡＧＧＡＡＴＧ−３’（配列番号２５））とをアニールさせる。ＲＮＡ／プライマーを９５℃で５分間加熱し、３７℃で３０分間インキュベートし、４℃で冷却し（５分）、短時間遠心分離し、次のステップでは氷上に置いておく。６０ｍＭ　ＫＣｌ、６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、９．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１２ｍＭ　ＤＴＴ、０．４５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、１ｍＭ　ｄＡＴＰ、１ｍＭ　ｄＣＴＰ、１ｍＭ　ｄＧＴＰ、１ｍＭ　ｄＴＴＰおよび０．１５μｇ／μｌのＢＳＡを含む混合物２３．６μｌを、０．６μｌのＲＮアーゼ阻害剤（４０Ｕ／μｌ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）と共に加える。
【０１０７】
次に、バッファーＡに再懸濁したペレット３μｌを加え、ＰＣＲ用の鉱油を重層し、３７℃で５時間、９５℃で７分間インキュベートし、４℃で冷却した（５分間）。このＲＴ反応系に対して、７５μｌのＰＣＲバッファーを油越しに添加することによって、ＰＣＲを行った（１．５μｌのＲＴ−１（１４ｐｍｏｌ）、１μｌのＲＴ−２希釈液（２５ｐｍｏｌ：ＲＴ−２：５’−ＴＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＴＣＣＴＧＴＣＧＡＧ−３’（配列番号２６）、１μｌの煮沸ＲＮアーゼＡ（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、１μｌ　Ｔａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ、５Ｕ／μｌ）、２．８μｌの１Ｍ　ＫＣｌ、７．５μｌの１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）および６０．２μｌのｄｄＨ２Ｏ）。この混合物を、３７℃で３０分間インキュベートした後、９４℃で３０秒、５５℃で１００秒、７２℃で１１０秒を２５サイクル行い、４℃で５分間冷却した。これらの熱サイクルは全てＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　４８０　Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒで行う。
【０１０８】
ＰＥＲＴアッセイは２種類の検出法を使って、すなわち基本的には記載されている通りに、増幅産物をハプテン結合オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた後、ＥＬＩＳＡを行うか、またはＴａｑＭａｎ法（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）に適合させることによって実施することができる。後者の場合は、フォワード（順方向）プライマーとリバース（逆方向）プライマーの間の増幅されたＭＳ２配列領域に結合するオリゴヌクレオチドであって、２つの蛍光色素（５’端のフルオレセイン（レポーター）および３’端のローダミン（消光剤））で標識したものを、プローブとして使用した。ＰＣＲ中に、アニールしたプローブはＴａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって加水分解されるので、放出される蛍光を分光光度計で示差的に測定することが可能になる。
【０１０９】
各試料は三重または二重に解析され、全ての実験に「盲」アッセイ対照を含める。陽性対照はクローン化されたＲＴ酵素（Ｌｉｆｅ　ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙまたはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）である。ＥＬＩＳＡ検出は次のように行われる：ＮＵＮＣ　９６穴タイタープレートをコーティングバッファー（２００ｍＭ　ＮａＣｌ、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４））中、５０μｇ／μｌのアビジン溶液５０μｌでコーティングし、光を通さないように包装し、室温で一晩インキュベートする。プレートを２００ｍＭ　ＮａＣｌ、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．３％Ｔｗｅｅｎ　２０で３回洗浄し、各ウェルを２００μｌのブロッキングバッファーで室温にて３０分間ブロッキングし（２００ｍＭ　ＮａＣｌ、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０、２０％ＦＣＳ）、３回洗浄して、ハイブリダイゼーションの準備が完了する。２５μｌのＰＣＲ反応系を１０μｌのハイブリッド形成混合物（０．６２５μｌ　ＲＴ−３Ｂｉｏ（１０ｐｍｏｌ、５’−ＴＴＡＡＴＧＴＣＴＴＴＡ−ＧＣＧＡＧＡＣＧＣ−３’（配列番号２７））、０．４μｌの５００ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８）、０．３７５μｌの１Ｍ　ＫＣｌ、０．１５μｌのＲＴ−５Ｄｉｇ（１０ｐｍｏｌ、５’−ＡＴＧＧＣＴＡＴＣＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡＧＣ−３’（配列番号２８）、１．０μｌの１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７．４５μｌのｄｄＨ２Ｏ）が入っている０．５ｍｌエッペンドルフチューブに加え、９５℃で５分間、４５℃で３０分間インキュベートし、４℃で冷却し（５分）、３５μｌのハイブリダイゼーション混合物を各被覆ウェルに加え、室温で３０分間インキュベートし、ウェルを５回洗浄する。
【０１１０】
次に５０μｌのＦａｂ抗ジゴキシゲニン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ；ＴＢＳ／０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８）で６２５倍希釈）を各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートし、５回洗浄し、基質バッファー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に溶解した基質（リン酸ｐ−ニトロフェニル）５０μｌを加え、２０分間インキュベートし、ＯＤ４０５をＥＬＩＳＡリーダーで測定する。
【０１１１】
表５．１（ＰＥＲＴアッセイ（ＯＤ）およびβ−ガラクトシダーゼ誘導によってアッセイした伝播性の実例）
【０１１２】
【表２】
2004502407.tif 000004
【０１１３】
（実施例６）
ＲＧＨ／ＨＥＲＶ−Ｈレトロウイルス粒子の種内伝播
本実施例では、ＭＳ患者の末梢血に由来する長期細胞培養物から精製したレトロウイルス粒子の、健常個体由来の刺激または非刺激末梢血リンパ球への無細胞伝播と、それに続く逆転写酵素（ＲＴ）活性のアッセイおよび形質転換レシピエント培養物の特徴づけによって、種内伝播を証明した。簡単に概略を述べると、この無細胞伝播アッセイの背景にある原理は次の通りである。すなわちレトロウイルスの伝播はある程度細胞−細胞接触に依存している。つまり無細胞伝播は可能であるが、無細胞伝播が起こる頻度は低い（ｄｅ　Ｒｏｓｓｉら，１９８５；Ｆａｎら，１９９２）。
【０１１４】
ＭＳ患者の末梢血に由来する長期細胞培養物から精製したレトロウイルス粒子を、健常個体由来の培養ＰＨＡ刺激または非刺激リンパ球に伝播させることを試みる。レトロウイルスを健常個体由来のかかるリンパ球に伝播させようと試みた実験の約１／３でＲＴ活性と持続的クローン増殖が同時に起こったことは伝播の表われであると解釈され、この解釈は各対照培養物では活性と増殖が認められなかったことによって裏付けられた。
【０１１５】
持続的クローン増殖とは、例えば継代を行わない週１回の栄養補給に対して、週３回の栄養補給と継代培養とを必要とし、多くの浮遊細胞クラスター（クローン）および遊離の単一芽細胞様細胞の出現を伴うような、増殖速度の著しい増加を指す。レトロウイルスの伝播は常に成功するわけではない。レシピエント培養物のおよそ１／３が上述のような持続的増殖を始めるだろう。ドナー培養物から混入した細胞が存在しないことは性染色体の染色体解析によって確認する（伝達は雄ドナーから雌レシピエントに起こるか、またはその逆方向に起こる）。対応する対照は、最終的に死滅する。
【０１１６】
染色体解析を行うには、細胞を標準的な解析用に調製する。すなわち有糸分裂を中期で停止させるために、増殖期の細胞をコルセミド（１００μｌ〜１０ｍｌ培養、３７℃で３０分間インキュベート）で処理し、次に低張性ＫＣｌ（培養１０ｍｌに対して０．５６％液１０ｍｌ）で処理（５分間）して染色体を展開した後、固定し（メタノール：氷酢酸３：１）、キナクリンバンド染色（Ｑバンド染色）を行う。著しくＡＴリッチなＤＮＡ、例えばポリ（ｄＡ）−ポリ（ｄＴ）などは、キナクリン蛍光を著しく増大させるが、ＧＣ含有ＤＮＡは顕微鏡で可視化する前に蛍光を消光する（Ｕ．Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ博士、私信、Ｃｏｍｉｎｇｓら，１９７５を参照）。
【０１１７】
一例として、ＲＴ活性およびクローンの存在は、４種類のレトロウイルス産生性ＭＳ細胞培養物を使って実施した独立した感染の約１／３で証明された。対応する対照は全て未形質転換状態のままであり、ＲＴ活性を持たなかった。感染後１ヶ月以上経ってから形質転換したと推定される細胞培養物から産生された勾配精製ウイルス粒子に、ＨＥＲＶ−Ｈ／ＲＧＨ配列変異体が確認された。
【０１１８】
アッセイの段取りは次の通りである。健常ボランティアのクエン酸添加血試料５０ｍｌからフィコールイソパック（Ａｍｅｒｓｈａｍ）密度勾配遠心分離（９００ｘｇ、室温で３０分間）によってリンパ球を単離した。それらの細胞を実施例５で述べたように播種し培養した（１０７細胞／アリコート）。６本のボトルを用意し、そのうちの１〜３本に１０ｍｌあたり２μｌのＰＨＡ（Ｄｉｆｃｏ）を加えた。２日後に、ＭＳ患者由来の長期細胞培養物の上清から精製したレトロウイルス粒子（１アリコートあたり培養上清１００ｍｌ）を４本のボトルに加えた。これは無細胞感染に相当する。
【０１１９】
ＭＳ細胞は実施例５で述べたように培養した。これらのＭＳ細胞によるレトロウイルス粒子の産生は一定せずかなり少量だったがそれでも持続的であった。レトロウイルス粒子は細胞培養物から上清に放出される。それをレトロウイルスの調製および精製用に集めた。増殖条件が最適になり、よってウイルス産生が最適になるように、上清収集の２４時間前に、細胞を１／３の新しい培地で希釈する。１回のウイルス精製には１．２〜１．４ｘ６細胞／ｍｌの細胞懸濁液４００〜５００ｍｌを使用した。４℃、１０００ｘｇで３０分間の遠心分離により、細胞および細胞片を上清から除去した。上清を、４ｍｌの５０％ＯｐｔｉＰｒｅｐクッション液（ＯｐｔｉＰｒｅｐは、Ｎｙｃｏｍｅｄ　Ｐｈａｒｍａ（ノルウェー・オスロ）からのヨウ素化、非イオン性密度勾配媒体イオジキサノールの商品名である）を底に入れる余裕が十分に残るような体積で、６０ｍｌのＳｏｒｖａｌｌ遠心分離管に移した。ＯｐｔｉＰｒｅｐは、ショ糖とは異なりレトロウイルス粒子を傷つけない。これらのチューブを、ＳｏｒｖａｌｌローターＡ６４１を用いて、４℃、４５，０００ｘｇで２時間遠心分離する。クッションに近接している媒体を４〜５ｍｌ残して、上清を吸引によってチューブから取り出す。クッションと上層の媒体とを混合し、勾配の濃度を最終的に調節するために、混合物の体積を測定する。勾配の濃度は２０％ＯｐｔｉＰｒｅｐが最適である。希釈には緩衝食塩溶液を使用する（０．８％ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４）。混合物を０．４５μｍフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ、Ｇｅｌｍａｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）で濾過し、１１．２ｍｌ　Ｕｌｔｒａｃｌｅａｒ　Ｔｕｂｅ（Ｂｅｃｋｍａｎｎ）に移し、ニアバーティカルローター（Ｂｅｃｋｍａｎ　ＮＶＴ６５）を用いて４℃、３６４，０００ｘｇで３．５時間遠心分離する。遠心分離に続いて、チューブ底部の穿刺により、各０．５ｍｌのフラクションを収集した。フラクション２〜５を集めて、伝播アッセイに使用した。これらのフラクションをプールし、緩衝食塩水で希釈し、ＳＷ４１ローターを用いて４℃、１５０，０００ｘｇで９０分間の最終遠心分離によってペレット化した。
【０１２０】
得られたペレットを１００μｌのＴＮＥバッファー（５０Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に再懸濁した。通常は、プールしたフラクションを４本のチューブに入れて遠心分離して４００μｌのウイルス懸濁液を得て、それらを上述のように調製した４本のボトルに１００μｌずつ加えた。これらの懸濁液を培養し、倒立顕微鏡（Ｌｅｉｔｚ　Ｗｅｔｚｌａｒ顕微鏡）で毎週２回調べ、ＰＥＲＴ（実施例５参照）用の上清試料を定期的に採取した。レトロウイルスの伝播は、著しいクローン増殖の出現と同時にＲＴ活性が観察された場合に、成功したと判断する。これは通常約１ヶ月後に起こる。対応する対照は最終的に死滅する。これらの対照は各伝播アッセイ用のレシピエントリンパ球調製物の並行ＰＨＡ刺激および非刺激培養物とした。逆転写酵素（ＲＴ）活性のアッセイは上述のように行った。
【０１２１】
樹立伝播培養物の上清から得られるレトロウイルス粒子も上述したようにＯｐｔｉＰｒｅｐ勾配超遠心分離によって精製し、以下のＲＴ−ＰＣＲによって特徴づけた。すなわち各勾配フラクションについてＲＴ活性をアッセイし、大きなＲＴ活性を持つ５〜６フラクションを５〜１０体積の溶解結合バッファー（Ｄｙｎａｌ（ノルウェー））中でそのまま溶解し、１試料あたり１００μｌのビーズ（ｍＲＮＡ　Ｄｉｒｅｃｔキット、Ｄｙｎａｌ（ノルウェー））を加え、製造者の指示書に従うことによって、ポリＡ　ＲＮＡを精製した。すぐに使用しない場合は、ＲＮＡ結合ビーズを８０％ＥｔＯＨ中、−８０℃で保存した。使用前に各ＲＮＡ試料を増幅用ＤＮアーゼ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で製造者の指示書に従って処理した。氷冷した後、ＲＮＡとの複合体を形成した常磁性ビーズを含むバッファーをＤＥＰＣ−ｄｄＨ２Ｏと交換することによって、ＤＮアーゼを除去した。
【０１２２】
ＲＮＡ　ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）にはＧｅｎｅＡｍｐ　ＲＮＡ　ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）を使用し、１反応につき１ＵのＴａｑポリメラーゼを使用した点を除いて、製造者の提案に従って行った。
【０１２３】
第１鎖合成にはビーズ−オリゴｄＴ複合体化ＲＮＡテンプレートを使用し、ランダムヘキサマーを使ってプライミングした。一部の実験では、下流プライマーを使って特異的にプライミングしたｃＤＮＡ合成によって、ＲＮＡテンプレートの完全性を確認した。この場合、対応する上流プライマーを使ってプライミングした対照ｃＤＮＡ合成は陰性だった。
【０１２４】
ＰＣＲ用プライマーセット：ｇａｇ（Ｉ，ＩＩ）およびすぐ上流のｅｎｖ領域用のＨＥＲＶ−Ｈ／ＲＧＨ特異的プライマーセット：
Ｉ：５’−ｄ（ＣＧＴＴＴＡＣＡＴＡＴＣＡＣＴＣＣＣＴＴＣＣＴＡＧＴＣＴＣＴＧＴ）−３’（配列番号２９）／５’−ｄ（ＧＣＡＴＴＡＡＣＣＴＴＧＡＣＴＡＴＧＴＣＴＴＴＡＧＣＴＣＣＡＧ）−３’（配列番号３０）（５０℃）および／または
ＩＩ：５’−ｄ（ＡＴＴＴＴＡＴＴＡＣＣＣＡＡＴＣＴＧＣＴＣＣＡＡＡＣＡＴ）−３’（配列番号３１）／５’−ｄ（ＡＧＧＴＧＡＧＴＴＧＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＴＴＴＴＴＡ）−３’（配列番号３２）（５０℃）；
５’−ｄ（ＧＡＴＣＣＴＣＣＣＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＴ）−３’（配列番号３３）／５’−ｄ（ＧＧＡＡＧＴＡＴＴＧＧＡＧＧＧＴＧＣＣＣＴＧＣＣ）−３’（配列番号３４）（６０℃）。
【０１２５】
反応は、全てＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ　４８０で行った。第１鎖合成条件：室温で５分、４２℃で４５分および９５℃で５分の後、４℃に冷却。ＰＣＲ：９５℃で２分を１サイクルの後、括弧内に示したアニーリング温度を使って、９４℃で１分、アニーリング２分、７２℃で３分（１０秒ずつ伸長）を４５／５０サイクル。この後、７２℃で７分間の最終伸長反応を行った。各アッセイでは、ＤＮＡテンプレートが増幅されていないことを保証するために、各ステップに対応する水対照を、ＲＴを含まない正副一対の各反応と共に含めた。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって解析し、ＳｕｒｅＣｌｏｎｅ　Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使って各産物をｐＵＣにクローニングし、ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍキット（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使って自動シークエネーター（ＡＢＩ３７７）で配列決定した。図５および６は２つの独立したアッセイにおけるＲＴ活性の経時変化の例である。
【０１２６】
下記表６．１は、ドナーおよび感染したレシピエント由来のレトロウイルス粒子から単離されるＨＥＲＶ−Ｈ／ＲＧＨ関連配列の翻訳を示す。
【０１２７】
表６．１（ドナーおよび感染したレシピエント由来のレトロウイルス粒子から単離されるＨＥＲＶ−Ｈ／ＲＧＨ関連配列の翻訳）
【０１２８】
【表３】
2004502407.tif 000005
（ＨＴＬＶ−１：配列番号３５；ＲＴＶＬ−Ｈ：配列番号３６；ＲＧＨ−２：配列番号３７；１５３３Ｄ：配列番号３８；３．１０Ｒ：配列番号３９；３．３０Ｒ：配列番号４０）。
【０１２９】
上記ドナー配列とレシピエント配列の間の相違は、伝播の可能性を排除するものではない。ＨＥＲＶ−Ｈ／ＲＧＨ変異体は単一の配列ではなく（少なくともドナーでは）分子集団を構成するからである。ＰＨＡ刺激対照培養がいずれも形質転換を起こさなかったことと、感染したレシピエントにおける粒子産生も、伝播を示している。
【０１３０】
（実施例７）
ＲＧＨ／ＨＥＲＶ−Ｈレトロウイルス粒子の種間伝播
ＲＧＨ／ＨＥＲＶ−Ｈレトロウイルス粒子の種間伝播を、非ヒト種由来のＰＨＡ刺激または非刺激細胞を、ＭＳ患者の末梢血に由来する長期細胞培養物から精製したレトロウイルス粒子と共に培養した後、逆転写酵素（ＲＴ）活性についてアッセイすることによって証明した。
【０１３１】
レトロウイルス粒子に関する詳細、ＰＥＲＴアッセイに関する詳細および長期ＭＳ細胞培養物に関する詳細は実施例５および６に記載の通りである。本実施例では、上記実施例５および６の記載とは異なる実験設定の詳細と共に、レトロウイルスの種間伝播の原理を概説する。
【０１３２】
内在性レトロウイルスは、ゼノトロピック（すなわち宿主の細胞に感染しないが、しばしば他の種には感染することができる）、エコトロピック（宿主種に限定されるが、その種内の体細胞に感染しうる）またはアンホトロピック（宿主でも遠縁の種でも複製することができる）のいずれかと定義される。したがって内在性レトロウイルス自体は、感染性である場合も感染性でない場合もあり、感染性である場合は、種の境界を越えることができる場合も越えることはできない場合もある。多くの内在性レトロウイルスは水平伝播によって他の種に広がっていることが知られている（Ｔｏｄａｒｏ，１９７５）。
【０１３３】
したがって長期ＭＳ細胞培養物由来の感染性と推定されるレトロウイルス粒子は、他の種由来の細胞にも感染することができるかもしれない。ゲノムのレトロウイルスコピーからの干渉を避けるためには、種間伝播アッセイ用の種として自明な選択肢は、内在性レトロウイルスの宿主種（この場合はヒト）とは進化的に明確に異なる種、すなわち内在性レトロウイルスが生殖系に進入する前にヒト／霊長類系統から分岐した種である。ほとんど全てのＨＥＲＶ類は、旧世界ザルと新世界ザルの分岐前後またはそれ以降に霊長類系統に進入した（Ａｎｄｅｒｓｓｅｎら（１９９７）を参照）。したがって齧歯類細胞またはウイルス許容齧歯類細胞株は自明な候補であると思われる。
【０１３４】
ヒト細胞への伝播に関するアッセイで得られた結果とは対照的に、種の壁を越えて細胞（例えばウサギ細胞または他の齧歯類細胞またはコウモリ細胞）に伝播させようとする試みは後述する設定では持続的なクローン増殖（多くの浮遊細胞クラスターおよび遊離の単一芽細胞様細胞の出現を伴う増殖速度の著しい増加）をもたらさない。むしろ、ＰＥＲＴアッセイによって測定されるＲＴ活性には明瞭なしかし一過性のピークが観察され、これは伝播を示していると解釈される。感染したと推定される細胞も非感染と推定される細胞も最終的には死滅する。
【０１３５】
レトロウイルス粒子の無細胞転移をウサギリンパ球でアッセイした。ウサギリンパ球は５０ｍｌのヘパリン処理血試料からフィコールイソパック（Ａｍｅｒｓｈａｍ）密度勾配遠心分離（室温、９００ｘｇで３０分）によって単離し、それらの細胞を実施例５に記載したように播種し培養した（５ｘ１０６細胞／アリコート）。別法として、ヒト血清ではなく熱不活化ウサギ血清を培養培地に補足した。
【０１３６】
４〜５本のボトルを用意し、そのそれぞれに１０ｍｌあたり２μｌのＰＨＡ（Ｄｉｆｃｏ）を加えた。２日後に、ＭＳ患者由来の長期細胞培養物の上清から精製したレトロウイルス粒子（１アリコートあたり培養上清１００ｍｌ）を３〜４本のボトルに加えた。これは無細胞感染に相当する。あるいは濾過した上清を細胞に直接加えた。ＭＳ細胞は実施例５で述べたように培養した。
【０１３７】
感染したと推定されるウサギ細胞を、基本的に実施例６に概説した通りに培養し、モニターした。細胞を倒立顕微鏡（Ｌｅｉｔｚ　Ｗｅｔｚｌａｒ顕微鏡）で週に２回調べ、ＰＥＲＴ用の上清試料を定期的に採取した。ＲＴ活性が観察される場合はレトロウイルスの伝播が可能であるとみなした。ＲＴ活性は、通常、経時的に一過性のピークを示す。対照細胞はＲＴ陰性のままである。図７に一例を示す。
【０１３８】
このアッセイ法のもう一つの応用例として、新たに調製したマウス脾マクロファージまたはウイルス許容コウモリ肺細胞株（ＣＣＬ８８）を使って同様の実験を設定した。さらにもう一つの応用例として、ＬａｃＺコンストラクト（または同様のコンストラクト）を実施例５で述べたように形質導入すれば、ＲＴアッセイとβ−ガラクトシダーゼ活性の誘導に関するアッセイとによる伝播の評価が可能になるだろう。
【０１３９】
（実施例８）
ＭＳ患者の末梢血に由来する長期細胞培養物のフローサイトメトリーによる解析：表面マーカーの特徴づけ
タイプの異なる白血球は細胞表面の示差的タンパク質、すなわちＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ　ｏｆ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；分化クラスター）抗原によって特徴づけることができ、また多くの場合、分類することができる。各ＣＤ抗原は、その表面タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を結合することができる。様々な抗体に蛍光色素を結合することにより、異なる細胞を、それらがレーザービームの中を流れる時に発する蛍光によって同定することができる。いわゆるＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ）解析である。
【０１４０】
この技術を使ってＭＳ患者の末梢血に由来する長期細胞培養物をさらに特徴づけた。Ｓｏｍｍｅｒｌｕｎｄら（１９９３）に概説されているように、これらの培養物は元々「ＭＳ細胞株」と定義され、免疫細胞化学を用いてＢリンパ芽球性であることが明らかにされた。以下に述べるさらに高感度なフローサイトメトリー解析により、培養物中の細胞の大部分はＢ細胞（ＣＤ１９＋）であるが、一部の細胞は実際にはＴ細胞（ＣＤ３＋）であることがわかった。したがってこれらの細胞培養物は、共存する細胞タイプの混成集団を構成する。したがってレトロウイルス粒子の活発な産生には集団内での相互作用が必要であること、あるいはＢ細胞またはＴ細胞のどちらかがレトロウイルスを産生することが考えられる。細胞を以下のように特徴づけた。
【０１４１】
ＭＳ患者の末梢血に由来する長期細胞培養物の細胞数をトリパンブルーで数えた（標準的生死判別法）。１ｘ１０６細胞をＶ字遠心管に入れ、１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）で１回洗浄し（４００ｘｇ、室温で１０分間遠心分離）、２％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を補足したＲＰＭＩ１６４０（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）で１回洗浄した。細胞を再懸濁し、ＦＡＣＳチューブ（Ｓｔｒｕｅｒｓ−ＫｅｂｏＬａｂ　１０７　１０２−５２０）に５００，０００細胞／チューブの割合で移した。細胞を室温、４００ｘｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。まず最初に、一組の様々な抗体、すなわち抗ＣＤ３（細胞受容体複合体、Ｔ細胞）、抗ＣＤ４（ＭＨＣ　ＩＩ関連抗原認識におけるアクセサリー分子、Ｔ細胞のサブグループ、単球、マクロファージ）、抗ＣＤ８（ＭＨＣ　Ｉ関連抗原認識におけるアクセサリー分子、Ｔ細胞のサブグループ）、抗ＣＤ１０（共通急性リンパ芽球性白血病抗原（ＣＡＬＬＡ）、造血幹細胞）、抗ＣＤ１４（ＬＰＳ複合体受容体、Ｂ細胞、単球、マクロファージ）、抗ＣＤ１９（増殖の調節、Ｂ細胞）、抗ＣＤ４５（白血球共通抗原）、抗ＣＤ５６（細胞接着分子、ＮＫ細胞）、および抗ＨＬＡ−ＤＲ（組織タイプ）を試験した（抗体は全てＢｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから入手）。異なる蛍光色素を異なる抗体に結合させる場合は１本のチューブに２以上のマーカーを使用することができる。
【０１４２】
各抗体２０μｌを抗体に加え、その混合物を室温、暗所で１５分間インキュベートし、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄した（上述のように遠心分離）。次に安全キャビネット内でボルテックスしながら、５００μｌの１％ホルムアルデヒド／ＰＢＳを加えた。フローサイトメトリーでの読み取りまで細胞を暗所に冷蔵保存した（オーフス郡病院（デンマーク・オーフス）の免疫血液学研究室で）。
【０１４３】
続けて試験を行うには、以下の抗体が適当であり重要であることがわかった。すなわち、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ１９である。
【０１４４】
結果は次の通りだった。細胞のほとんどはＣＤ１９＋細胞であると同定された。すなわちそれらはＢ細胞である。どのＭＳ細胞培養物も一部はＣＤ３＋細胞であるようだった。すなわちどのＭＳ細胞培養も一部はＣＤ４−かつＣＤ８−である。後者のカテゴリーの正確なパーセンテージの例を次の表に示す。
【０１４５】
表８．１（ＭＳ患者の末梢血に由来する長期細胞培養物におけるＣＤ３＋細胞の割合）
【０１４６】
【表４】
2004502407.tif 000006
【０１４７】
末梢血中のほとんどのＴ細胞はＣＤ４＋またはＣＤ８＋である。これらのマーカーを持たないＣＤ３＋細胞の発見は興味深い知見である。ＣＤ３＋フラクションのさらなる特徴づけを行うには、これら２つの細胞タイプの分離と拡大した抗体パネルが必要だろう。
【０１４８】
（実施例９）
ＭＳ患者の単核細胞におけるＨＥＲＶ−Ｈ（ＲＧＨ）ｍＲＮＡスプライス変異体の発現
１．序論および要約
本実施例では、スプライスされたＨＥＲＶ−Ｈ　ｍＲＮＡ配列変異体がＭＳ患者の単核細胞から得られる細胞ＲＮＡにインビボで発現されることを報告する。配列変異体はＭＳ患者および自己免疫患者の血液試料の一部から得られる細胞中に特異的に見いだされた。健常対照者の単核細胞には配列変異体は見いだされなかった。
【０１４９】
内因性ＨＥＲＶ−Ｈウイルスファミリーは大きな欠失と停止コドンとを含む約１０００個の欠損性メンバーからなるが、１００コピーはほぼ完全長であり、機能的タンパク質を潜在的にコードする（ＭａｇｅｒおよびＦｒｅｅｍａｎ　１９８７；Ｈｉｒｏｓｅら，１９９３；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら，１９９３）。オープンリーディングフレームを持つ１つのｅｎｖ配列が単離され、インビトロで転写されている（ＬｉｎｄｅｓｋｏｇおよびＢｌｏｍｂｅｒｇ，１９９９）。インビボでのＨＥＲＶ−Ｈ　ＲＮＡの発現はあまりよく特徴づけられていないが、転写が正常細胞でも悪性細胞でも起こることを示す証拠は蓄積されつつある（Ｈｉｒｏｓｅら，１９９３；Ｌｉｎｄｅｓｋｏｇら，１９９３；ＬｉｎｄｅｓｋｏｇおよびＢｌｏｍｂｅｒｇ，１９９７）。ＨＥＲＶ−Ｈサブゲノム転写物のスプライシングについては記載があり、多様にスプライスされたｍＲＮＡ種の複雑なパターンが明らかにされている（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら，１９９０；ＬｉｎｄｅｓｋｏｇおよびＢｌｏｍｂｅｒｇ，１９９７）。
【０１５０】
臨床標本、すなわちＭＳ患者、様々な自己免疫疾患を持つ患者および健常対照者から採取した血液試料でＲＴ−ＰＣＲ解析を行うことによって、スプライスされたＨＥＲＶ−Ｈ　ｅｎｖ　ｍＲＮＡ配列変異体を証明した。単核細胞を単離し、全細胞ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲによってアッセイした。アンプリコンをクローン化し、配列決定した。
【０１５１】
２．実験
血液試料は全てインフォームドコンセントを得た上で健常ボランティア、またはオーフス大学病院神経内科、マルセリボルグ病院（オーフス）皮膚科、ＲｙのＭＳ病院もしくはミデルファート病院内科（いずれもデンマーク）の患者から採取した。血液試料は各診療所で、１．４ｍｌのＣＰＤ−アデニン溶液（Ｍｅｄａ（デンマーク））が入ったＶＴ−１００ＳＣＰＤＡ　Ｖｅｎｏｊｅｃｔチューブ中に採取され、採取後直ちに手渡しされた。
【０１５２】
試料は全て本発明者らの研究室で直ちに処理した。実施例６で述べたように遠心分離によって単核細胞を単離し、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水：１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１５０ｍＭリン酸Ｎａ（ｐＨ７．４））で２回洗浄し、Ｔｒｉｚｏｌ（ＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に１０７細胞／ｍｌの密度で懸濁した。細胞ＲＮＡの抽出は製造者の指示書に従って行った。直ちに使用しない場合は、ＲＮＡペレットを８０％ＥｔＯＨ（ＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏ溶液）に入れて−８０℃で保存した。ＲＴ−ＰＣＲ解析のために、ＲＮＡペレットを８０％ＥｔＯＨで２回洗浄し、風乾し、１０７細胞あたり５０μｌのＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに懸濁した。ＲＴ−ＰＣＲ解析には７μｌを使用した。ＲＮＡアリコートは−８０℃で保存した。
【０１５３】
ＲＴ−ＰＣＲはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使って行った。ｃＤＮＡ合成の前に、ＲＮＡをＤＮアーゼＩ（デオキシリボヌクレアーゼＩ、増幅用、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、適当なステップに０．０１Ｕ／μｌのリボヌクレアーゼ阻害剤（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含めて、製造者の指示書に従って処理した。反応は全てＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒモデル２４００で行った。
【０１５４】
６５℃にてＥＤＴＡで処理することによってＤＮアーゼＩを不活化した後、ＲＮＡをＲＧＨ２配列から設計したプライマーに７０℃で１０分間アニールさせた（Ｈｉｒｏｓｅら，１９９３）。
（ｉ）５’−ＧＧＧＡＡＴＴＡＧＴＧＧＡＡＴＡＡＣＴＣＴＴＴＴＴＴＧＴＴＧ−３’（配列番号４１）（Ｔｍ＝５９．８℃）
【０１５５】
ｃＤＮＡ合成はプロトコールに定められた条件を使って実施し、ＲＮＡをＲＮアーゼＨ（リボヌクレアーゼＨ、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で消化した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使って製造者の指示書に従ってｃＤＮＡを精製した。ｃＤＮＡをＥＢバッファー２５μｌｘ２に溶出させ、ＰＣＲのテンプレートとして直ちに使用しない限り、小分けして−８０℃で保存した。
【０１５６】
ＰＣＲは、１５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ　ＫＣｌ、２．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２００μＭ　ｄＮＴＰ、０．５μＭの各プライマー、２．５Ｕ　ＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）および５μｌのｃＤＮＡを含む反応液５０μｌを使って、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒモデル２４００で行った。ＰＣＲ条件は９５℃で１０分を１サイクル、９４℃で２０秒、５９℃で２０秒、７２℃で３０秒を５０サイクル、そして７２℃で２分を１サイクルとした。
【０１５７】
ＰＣＲ増幅に使用したプライマーは、ＲＧＨ２配列（Ｈｉｒｏｓｅら，１９９３）中の想定したプライマー結合部位（ＰＢＳ）およびｅｎｖオープンリーディングフレームを含むＨＥＲＶ−Ｈ配列（Ｌｉｎｄｅｓｋｏｇら，１９９９）から設計した。
（ｉｉ）５’−ＣＡＴＧＡＡＡＴＴＴＧＧＴＧＣＣＴＴＧＡＣＴＣＧＧＡＴ−３’（配列番号４２）（Ｔｍ＝６３．８℃）；
（ｉｉｉ）５’−ＧＡＧＡＴＡＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＧＧＴＡＧＡＧＧＡＴＧＡ−３’（配列番号４３）（Ｔｍ＝６１．３℃）。
【０１５８】
ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動によって解析した。適当なバンドを切り出し、ｐＣＲ（登録商標）２．１ベクター（Ｏｒｉｇｉｎａｌ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ蛍光標識プライマーサイクルシークエンシングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使って両方向に配列決定した。シークエンス反応をＡＬＦｅｘｐｒｅｓｓ　ＤＮＡ自動シークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）で解析し、ｆａｓｔａおよびｂｌａｓｔプログラム（ウィスコンシンパッケージ、バージョン９．１、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ））を使って配列解析を行った。
【０１５９】
上記プライマー（ｉ）をｃＤＮＡ合成に使用し、上記プライマー（ｉｉ）および（ｉｉｉ）をＰＣＲ増幅に使用して、ＭＳ患者、自己免疫患者および健常対照者の試料を比較したところ、バンドパターンの変動が認められた。２０人のＭＳ患者、３人の自己免疫疾患患者（ＡＵ）、１人の白血病患者および１０人の健常対照者から採取した試料で、８５０ｂｐ（±数ｂｐ）のＰＣＲフラグメントが増幅された。３７人のＭＳ患者中１４人、３人のＡＵ患者中３人、１５人の自己免疫対照者中１人、１４人の健常対照者中２人および１人の白血病患者では、さらにもう一つの９５０ｂｐ（±数ｂｐ）フラグメントが増幅された。
【０１６０】
８５０ｂｐフラグメントと９５０ｂｐフラグメントの配列を解析したところ、いずれも、ＰＢＳ配列の下流にあるリーダー領域中に同じスプライスドナー部位を含み、かつｐｏｌのうちインテグラーゼをコードする部分にスプライスアクセプター部位を含むスプライスされたｅｎｖ　ｍＲＮＡ配列だった。８５０ｂｐフラグメントでは、上記２つの部位が直接つながっていたのに対して、９５０ｂｐフラグメントでは、プロテアーゼコード領域に由来する１０４ｂｐの追加領域が上記２つの部位の間に挿入されて、選択的にスプライスされたもう１つのｅｎｖ　ｍＲＮＡを与えていた。
【０１６１】
本実験では、ＲＴＶＬＨ２（ＰＢＳ）配列およびＲＧＨ２（ｅｎｖ）配列（ＭａｇｅｒおよびＦｒｅｅｍａｎ，１９８７；Ｈｉｒｏｓｅら，１９９３）に由来するＰＣＲ用プライマーを使用したが、おそらくそれが健常者試料にも選択的にスプライスされたｅｎｖ　ｍＲＮＡ配列が認められた理由だろう。本発明者らの経験では、ＲＧＨ２配列に由来するＰＣＲプライマーを使用すると、一般に広範なＨＥＲＶ−Ｈ配列群が検出され、ＭＳ患者、他の自己免疫患者または健常対照者から採取した試料の区別が付かない（結果を示さず）。
【０１６２】
８５０ｂｐ配列は、ＲＧＨ２リーダー／インテグラーゼおよびｅｎｖ領域と９０から９５％のホモロジーを持ち、互いに９３から９７％のホモロジーを持っていた。ほとんどの配列は１００ｂｐのｅｎｖオープンリーディングフレーム（ｅｎｖ　ＰＣＲプライマーの５’側）を含んでいた。
【０１６３】
９５０ｂｐ配列はＲＧＨ２配列と８７から９５％のホモロジーを持ち、相互にそしてヒトＴ細胞白血病細胞株（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ｕ８８８９６；ＬｉｎｄｅｓｋｏｇおよびＢｌｏｍｂｅｒｇ，１９９７）から単離された公表済みの配列と９８〜１００％のホモロジーを持っていた。類似のスプライシング構造を持つ２つの配列が２人の健常献血者から単離された（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号Ｕ８８８９７、Ｕ８８８９８；ＬｉｎｄｅｓｋｏｇおよびＢｌｏｍｂｅｒｇ，１９９７）。これらの配列は、細胞株配列ｕ８８８９６と９１％および９３％相同であり、プロテアーゼ領域だけを比較すると８３％および９０％相同である。
【０１６４】
１０４ｂｐのプロテアーゼコード領域を含む配列変異体の整列を表９．１に示す。表９．１の配列は３人のＭＳ患者（ＭＳ１、ＭＳ２およびＭＳ３）および１人の真性糖尿病患者（ＡＵ１）から単離された１０クローン（７変異体）に相当する。これらの配列変異体は、クローンＭＳ１−１と比較して一塩基変化、すなわち置換および欠失を含んでいる。クローンＭＳ１−１の配列は一人のＭＳ患者だけに見いだされ、Ｔ細胞白血病細胞株から単離された配列（ｕ８８８９６、ＬｉｎｄｅｓｋｏｇおよびＢｌｏｍｂｅｒｇ，１９９７）と同一だった。
【０１６５】
表９．２では、挿入されたプロテアーゼ領域の配列をｕ８８８９６配列（上記参照）と比較して、相違する部分を取り上げている。材料は表５と同じ、すなわち４人の患者から独立してクローニングされた１０個の９５０ｂｐフラグメントである。表９．２で解析した領域は、ｕ８８８９６配列（基準配列）のスプライスドナー部位（１位）で始まり、スプライスアクセプター部位（１０４位）で終わっている。以下の説明ではこの領域をＰＳＲと呼ぶ。
【０１６６】
患者ＭＳ１からクローニングされた一つのＰＳＲ配列は、基準配列と同一であるが、患者ＭＳ２から得た一つのＰＳＲ配列は８２位と９７位に２つの置換を示す。これら２つの置換は３人（ＭＳ２、ＭＳ３およびＡＵ１）が共通して持っていた。これは、８２位と９７位が、ヒトゲノム中の同じ遺伝子座にあるＲＧＨ対立遺伝子のマーカーであるか、または異なる遺伝子座にある近縁のＲＧＨ遺伝子のマーカーであることを示しているのだろう。同様に、２人（ＭＳ２およびＡＵ１）が共通して持っているＰＳＲ５３位の一塩基欠失も、もう一つのこのようなマーカーに相当しうる。
【０１６７】
患者ＭＳ２から得られる一つのＰＳＲ領域の１３位にある一塩基変化と、ＡＵ１から得られる２つのＰＳＲ領域の７５位にある一塩基置換は、上述のようなさらなる遺伝子マーカーに相当するかもしれないし、逆転写中にプロウイルスＤＮＡに導入されたエラーに起因するのかもしれない。
【０１６８】
表９．１（３人のＭＳ患者および１人の自己免疫疾患（すなわち真性糖尿病）患者から得られた選択的にスプライスされたｅｎｖ　ｍＲＮＡ中のプロテアーゼコード領域の配列変異体の整列）
下記の配列は１０クローン、すなわちＭＳ１−１、ＭＳ２−１、ＭＳ２−２（＝ＡＵ１−４）、ＭＳ２−３、ＭＳ２−４（＝ＭＳ３−１、ＡＵ１−３）、ＡＵ１−１、ＡＵ１−２に相当する。スプライス部位を矢印で示す。ＭＳ１−１に対する１ｂｐの欠失または置換を太字体で示す。小文字＝不確かな塩基、〜＝未決定、Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ、Ｎ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ。
【０１６９】
【表５】
2004502407.tif 000007
（ＭＳ２−１：配列番号４４；ＭＳ２−４：配列番号４５；ＭＳ２−２：配列番号４６；ＡＵ１−１：配列番号４７；ＭＳ１−１：配列番号４８；ＭＳ２−３：配列番号４９；ＡＵ１−２：配列番号５０）
【０１７０】
表９．２（３人のＭＳ患者および１人の真性糖尿病患者から得られたオルターナティブにスプライスされたｅｎｖ　ｍＲＮＡ中のプロテアーゼ領域の７つの配列変異体とヒトＴ細胞白血病細胞株から単離された配列ｕ８８８９６（ＢｌｏｍｂｅｒｇおよびＬｉｎｄｅｓｋｏｇ，１９９７）との整列、変異位置だけを示す）Ｘ＝配列未決定
【０１７１】
【表６】
2004502407.tif 000008
【０１７２】
（引用文献）
Ａｎｄｅｒｓｓｅｎ Ｓ， Ｓｊｏｔｔｅｍ Ｅ， Ｓｖｉｎｅｎｇ Ｇ， Ｊｏｈａｎｓｅｎ Ｔ： キヌザル、アフリカミドリザルおよびヒトから単離された霊長類特異的レトロウイルス様要素のＬＴＲの比較解析（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＬＴＲｓ ｏｆ ｔｈｅ ＥＲＶ−Ｈ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｐｒｉｍａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｍａｒｍｏｓｅｔ， ａｆｒｉｃａｎ ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ ａｎｄ ｍａｎ）． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １９９７， ２３４：１４−３０。
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＭＳ細胞株から得られる粒子状のＲＧＨ配列の例を示す図である。ＲＮＡテンプレートはＯｐｔｉｐｒｅｐ勾配で精製したＭＳ細胞株ＭＳ１５３３、ＭＳ１８４５およびＭＳ１８５１由来のレトロウイルス粒子から得た。ＲＧＨ−２の対応する配列（Ｈｉｒｏｓｅら，１９９３）を整列に含めた（上：ＲＧＨ−２１５８９−１８７２（配列番号１）；下：ＲＧＨ−２２１４１−２３１３（配列番号２））。ＭＳ１５３３／ＭＳ１８４５配列（上）（配列番号３／配列番号４）はプライマーセットＩを使って得た。一方、ＭＳ１５３３／ＭＳ１８５１（下）（配列番号５／配列番号６）はプライマーセットＩＩを使って得た。原因がＴａｑエラー率にあると考えるには変異が大きすぎるので、クローンはＲＧＨ−２（完全長ＲＧＨクローン）の真の変異体であるらしい。「．．．」は整列を最適化するために導入したギャップを示す。
【図２】ＭＳ患者血漿から得られる粒子状ＲＧＨ配列の例として、ＭＳ患者２０９４（配列番号９）および２０９５（配列番号１０）から採取した無細胞濾過超遠心分離血漿試料からｅｎｖプライムドＲＴ−ＰＣＲによって得た配列を示す図である。ＲＧＨ−１（配列番号７）およびＲＧＨ−２（配列番号８）の対応する配列（Ｍｅｄｓｒａｎｄら，１９９２）を整列に含めた。原因がＴａｑエラー率にあると考えるには変異が大きすぎるので、クローンはＲＧＨ−２（完全長ＲＧＨクローン）の真の変異体であるらしい。「．．．．」は整列を最適化するために導入したギャップを示す。
【図３】ＭＳ細胞株から単離されたレトロウイルス粒子中のｓｓＤＮＡ結合タンパク質のサウスウェスタン解析を表す図である。記載のＭＳ細胞株の成長培地を超遠心分離することによって得たレトロウイルスペレットを、ｓｓＤＮＡ結合タンパク質の存在について、比較サウスウェスタン解析法によって分析した。Ｍｒマーカーを左に示す。左側の矢印：ヒト血清（ＨＳ）を含む非調整培地にも存在する３５ｋＤタンパク質。］：三重のｓｓＤＮＡ結合バンド。レーン１：ヒト血清、２：ＭＳ１５３３、３：ＭＳ１８５１、４：Ｂ９５−８（ＥＢＶ＋）、５：Ｃ９１−ＰＬ（ＨＴＬＶ−１＋）、６：ＦＬＫ（ＢＬＶ＋）、７：ＭＳ１８４５、８：Ｃ８１６６−（ＨＴＬＶ−１Δｇａｇ）。ゲルは低Ｍｒ領域での分解能が最適になるような条件で泳動したので、高Ｍｒタンパク質（＞４０ｋＤ）に関する交差反応性の分解能はよくない。ＭＳ細胞株中の３本の低分子量バンド（Ｍｒ １０〜２０ｋＤ）は陽性対照レトロウイルスＨＴＬＶ−１およびＢＬＶでも見つかるが、ＭＳバンドパターンはサイズにわずかな相違を示す。細胞株Ｃ８１６６は、３つの突然変異型ＨＴＬＶ−１ゲノムを含み、そのｇａｇ領域とｅｎｖ領域からの発現は起こらないことが知られている（Ｂｈａｔら，１９９３）。ＥＢＶ産生株Ｂ９５−８のレーンでは、低Ｍｒ領域にバンドが２本だけ存在する。３本のバンドのうち中央のバンドがないことから、これはＥＢＶ関連バンドではあり得ないことがはっきりと証明される。Ｂ９５−８を使用した主な理由は、ＭＳ細胞株の低Ｍｒ　ｓｓＤＮＡバンドのうち中央のバンドがＥＢＶ由来でないことを確認することだったが、Ｂ９５−８がいくつかの伝播性ＳＭＲＶ−Ｈ　Ｄ型レトロウイルス様配列を含むことは心に留めておくべきである（Ｓｕｎら，１９９５）。ＨＴＬＶ−１　ｔａｘ　遺伝子産物ｐ４０Ｔａｘは、他のジンクフィンガーモチーフを含むトランス調節タンパク質である。ｐ４０Ｔａｘがビリオン中にパッケージングされることはほとんどないので、このアッセイでＴａｘ関連バンドが観測されることはないだろう。
【図４】ＣＸ２ＣＸ４ＨＸ４Ｃに相当するｇａｇ配列領域の翻訳図である。ＨＴＬＶ−１（配列番号１１）およびＲＴＶＬ−Ｈ（配列番号１２）（Ｍａｇｅｒら，１９８７）およびＲＧＨ−２（配列番号１３）（Ｈｉｒｏｓｅら，１９９３）（翻訳したもの）の配列（プロテアーゼドメインの上流）、ならびにＭＳ１５３３ドナー（Ｄ）（配列番号１４）および感染したレシピエント（Ｒ）（配列番号１５／配列番号１６）からＯｐｔｉｐｒｅｐによって精製したレトロウイルス粒子をｇａｇプライムドＲＴ−ＰＣＲにかけて得た配列の翻訳の例である。「＊」は停止コドンを示し、「．．．．」は整列を最適化するために導入したギャップを示す。プロリン含有量が高いことに注目されたい。ＣＸ２ＣＸ４ＨＸ４Ｃ．．．．ＣＸ３ＨＸ４Ｃというモチーフはドナークローンにもレシピエントクローンにも保存されている。
【図５】ＰＥＲＴ（Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）アッセイを表す図である。ＭＳ患者の末梢血由来の長期細胞培養物から精製したレトロウイルス粒子の無細胞伝播を示している。健常ヒト個体由来のＰＨＡ刺激リンパ球をレシピエントとして使用した。その結果をＯＤ（ＰＥＲＴ／１０６細胞数）として表す。
【図６】もう一つのＰＥＲＴアッセイを表す図である。ＭＳ患者の末梢血由来の長期細胞培養物から精製したレトロウイルス粒子の無細胞伝播を示している。健常ヒト個体由来のＰＨＡ刺激リンパ球をレシピエントとして使用した。その結果をＯＤ（ＰＥＲＴ／１０６細胞数）として表す。
【図７】ＰＥＲＴアッセイを表す図である。ＭＳ患者の末梢血由来の長期細胞培養物から精製したレトロウイルス粒子の無細胞伝播を示している。ウサギ由来のＰＨＡ刺激リンパ球をレシピエントとして使用した。その結果をＯＤ（ＰＥＲＴ／１０６細胞数）として表す。
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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