(57)【要約】ストレプトコッカスポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチドが開示される。前記ポリペプチドは、動物のストレプトコッカス感染の予防又は治療に有用なワクチン成分である。該タンパク質抗原を製造する組換え方法及びストレプトコッカス細菌感染を検出するための診断分析法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下から選択されるポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド：
（ａ）表Ｂ、Ｅ又はＨから選択される第２ポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）表Ｂ、Ｅ又はＨから選択される第２ポリペプチドと少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）表Ｂ、Ｅ又はＨから選択されるアミノ配列を有するポリペプチド又はその断片、類似体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）表Ｂ、Ｅ又はＨから選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）表Ｂ、Ｅ又はＨから選択される配列を有するポリペプチドに対して結合特異性を有する抗体を産生可能なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）表Ｂ、Ｅ又はＨから選択されるポリペプチドのエピトープ保持部をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが（ａ）である、請求項１の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが（ｂ）である、請求項１の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが（ｃ）である、請求項１の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが（ｄ）である、請求項１の単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが（ｅ）である、請求項１の単離ポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが（ｆ）である、請求項１の単離ポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドが（ｇ）である、請求項１の単離ポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドが表Ｂから選択される、請求項７の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記エピトープ保持部が表Ｃから選択される、請求項９の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドが表Ｅから選択される、請求項７の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記エピトープ保持部が表Ｆから選択される、請求項１１の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１〜１２のいずれか１項のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１〜１２のいずれか１項のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記ＤＮＡが発現制御領域に操作的に連結されている、請求項１３のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１６】
請求項１５のベクターで形質移入された宿主細胞。
【請求項１７】
前記ポリペプチドの発現に適する条件下、請求項１６記載の宿主細胞を培養する工程を含む、ポリペプチドの製造方法。
【請求項１８】
以下から選択される構成要素を含む単離ポリペプチド：
（ａ）表Ｂ、Ｅ又はＨから選択されるアミノ酸配列を有する第２ポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）表Ｂ、Ｅ又はＨから選択されるアミノ酸配列を有する第２ポリペプチドと少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド；
（ｃ）表Ｂ、Ｅ又はＨから選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｄ）表Ｂ、Ｅ又はＨから選択されるアミノ酸配列又はその断片、類似体若しくは誘導体を有するポリペプチド；
（ｅ）表Ｂ、Ｅ又はＨから選択される配列を有する第２ポリペプチドに対して結合特異性を有する抗体を産生可能なポリペプチド；
（ｆ）表Ｂ、Ｅ又はＨから選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのエピトープ保持部；
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、若しくは（ｆ）のポリペプチドであって、Ｎ末端Ｍｅｔ残基が欠失されているポリペプチド；又は
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、若しくは（ｆ）のポリペプチドであって、分泌性アミノ酸配列が欠失されているポリペプチド。
【請求項１９】
前記ポリペプチドが（ｆ）である、請求項１８のポリペプチド。
【請求項２０】
前記ポリペプチドが表Ｂから選択される、請求項１９のポリペプチド。
【請求項２１】
前記エピトープ保持部が表Ｃから選択される、請求項２０のポリペプチド。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが表Ｅから選択される、請求項１９のポリペプチド。
【請求項２３】
前記エピトープ保持部が表Ｆから選択される、請求項２２のポリペプチド。
【請求項２４】
ポリペプチドがキメラポリペプチドを形成するように連結されるという条件で、表Ｂ、Ｅ又Ｈから選択される２種以上のポリペプチドを有するキメラポリペプチド。
【請求項２５】
請求項１８〜２４のいずれか１項記載のポリペプチドと、医薬的に許容性のキャリヤー、希釈剤又はアジュバントを含むワクチン組成物。
【請求項２６】
髄膜炎、中耳炎、菌血症又は肺炎感染に感受性の個体の髄膜炎、中耳炎、菌血症又は肺炎感染の治療的又は予防的処置方法であって、治療的又は予防的量の請求項２５記載の組成物を前記個体に投与する工程を含む方法。
【請求項２７】
ストレプトコッカス感染に感受性の個体のストレプトコッカス細菌感染の治療的又は予防的処置方法であって、治療的又は予防的量の請求項２５記載の組成物を前記個体に投与する工程を含む方法。
【請求項２８】
前記個体が哺乳類である、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
前記個体が哺乳類である、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
前記個体がヒトである、請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
前記個体がヒトである、請求項２７記載の方法。
【請求項３２】
前記細菌感染が、Ｓ．ニュモニエ、Ａ群ストレプトコッカス（ピオゲン）、Ｂ群ストレプトコッカス（ＧＢＳ又はアガラクティエ）、ディスガラクティエ、ウレビス、ノカルジア又はストレプトコッカス・アウレウスである、請求項２７記載の方法。
【請求項３３】
前記細菌感染がＳ．ニュモニエである、請求項２７記載の方法。
【請求項３４】
ストレプトコッカス感染に感受性であるか又はストレプトコッカス感染された動物のストレプトコッカス感染の予防的又は治療的処置のための請求項２５記載のワクチン組成物の使用であって、予防的又は治療的量の該組成物を前記動物に投与することを含む使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、抗原、エピトープ及びこのエピトープに向けられる抗体に係り、さらに詳細には、ストレプトコッカス感染の予防、診断又は治療に有用なストレプトコッカス・ニュモニエ病原のポリペプチド抗原に関する。
【０００２】
発明の背景
Ｓ．ニュモニエは、人、とりわけ乳児、高齢者及び免疫無防備状態人における病気の重要な物質である。それは、世界中で高い罹患率及び死亡率の菌血症／敗血症、肺炎、髄膜炎のような浸潤性の病気の患者から、頻繁に単離される細菌である。適切な抗生物質による治療によってさえ、未だに肺炎球菌感染の多くは死に至る。抗細菌薬の発展によって肺炎球菌性病気による全体的な死亡率は減少してきたが、抵抗性のある肺炎球菌生体の存在が今日の世界の主要な問題になってきた。有効な肺炎球菌ワクチンが、Ｓ．ニュモニエ病に関する罹患率及び死亡率に大きな影響力を与えることができた。このようなワクチンは、乳児及び幼児の中耳炎の阻止にも有用だろう。
【０００３】
肺炎球菌ワクチンを開発するための努力は、一般的に肺炎球菌莢膜多糖体に対する免疫応答を生じさせることに集中している。８０種より多くの肺炎球菌莢膜血清型が、抗原性の相異に基づいて同定されている。最も頻繁に病気を引き起こした２３種の肺炎球菌莢膜多糖体を含め、現在入手可能な肺炎球菌ワクチンは、主にいくつかの莢膜多糖体の不十分な免疫原性、血清型の多様性及び血清型の経時的、地理的領域及び年齢群分布の相異に関連する重大な欠点がある。特に、すべての血清型に対して幼児を保護するために現在開発している現存のワクチン及び莢膜接合ワクチンの失敗が、他のＳ．ニュモニエ成分の評価を刺激している。莢膜多糖体の免疫原性は改良できるが、未だ血清型特異性が多糖体ベースワクチンの主要な限界を表している。抗原性的に保存された免疫原性肺炎球菌タンパク質抗原それ自体又は付加成分と組み合わせた使用は、タンパク質ベース肺炎球菌ワクチンの可能性を提供する。
【０００４】
発明の名称“ストレプトコッカス・ニュモニエ抗原及びワクチン”で、１９９８年５月７日に公開されたＰＣＴ ＷＯ ９８／１８９３０は、抗原性であると特許請求している特定のポリペプチドについて述べている。しかし、これらポリペプチドの生物活性は何ら報告されていない。同様に、必要な種の共通ワクチン候補である配列保存も何ら報告されていない。
ＰＣＴ ＷＯ ００／３９２９９は、ポリペプチド及びこれらポリペプチドをコードするポリヌクレオチドについて述べている。ＰＣＴ ＷＯ ００／３９２９９は、ＢＶＨ−３及びＢＶＨ−１１と呼ばれるポリペプチドが、肺炎球菌による致命的な実験的感染を保護することを実証している。
従って、ストレプトコッカス感染の予防、診断及び／又は治療用の成分として使用可能なストレプトコッカス抗原について、満たされていない要望が残っている。
【０００５】
発明の概要
以下から選択されるポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド；
（ａ）表Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ又はＨから選択される第２ポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）表Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ又はＨから選択される第２ポリペプチドと少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）表Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ又はＨから選択されるアミノ配列を有するポリペプチド；又はその断片、類似体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）表Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ又はＨから選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）表Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ又はＨから選択される配列を有するポリペプチドに対して結合特異性を有する抗体を産生可能なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）表Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ又はＨから選択されるポリペプチドのエピトープ保持部をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド。
【０００６】
他の局面では、本発明のポリヌクレオチドでコードされた新規なポリペプチド、医薬品又はワクチン成分、発現制御領域に操作的に連結された本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、並びに前記ベクターで形質移入された宿主細胞及び前記宿主細胞を発現に適した条件下で培養する工程を含むポリペプチドの製造方法が提供される。
【０００７】
発明の詳細な説明
ＢＶＨ−３及びＢＶＨ−１１ポリペプチドの部分は内部にあることが分かった。他の部分は、病気を引き起こす被包ｓ．ニュモニエ菌株のような重要な菌株には存在しなかった。内部でない部分を含むポリペプチドがあると有利だろう。ポリペプチドの大部分が内部にあると、これら部分は細菌上で露出されない。しかし、これら部分は、組換えポリペプチド内で非常に免疫原性であり、かつ感染に対する保護を与えないだろう。ほとんどの菌株に存在する部分を含むポリペプチドがあっても有利だろう。
本発明は、特異的な免疫応答を得るため、望ましくない部分が欠失及び／又は修飾されているポリペプチドに関する。
本発明によって、保護ドメインを含むポリペプチド又はこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供される。
【０００８】
驚くべきことに、ポリペプチドの望ましくない部分が欠失又は修飾されると、該ポリペプチドは望ましい生物特性を有する。このことは、特許出願ＰＣＴ ＷＯ ９８／１８９３０で、これら部分のいくらかがエピトープ保持部であるとして記述されたという事実を考えると驚くべきことである。ＰＣＴ ＷＯ ００／３７１０５のような他の公報では、ヒスチジン三つ組残基及び二重コイル領域として同定された部分が重要であると述べられた。本発明者らは、特定部分が欠失及び／又は修飾されたポリペプチドＢＶＨ−３及ＢＶＨ−１１の変異体及びこれらポリペプチドびキメラが生物学的特性を有し、かつ特異的な免疫応答を発生させることを見出した。
【０００９】
一局面によって、本発明は、本出願、表及び図面に開示されているような配列を含む第２ポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明の一局面により、以下から選択されるポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチドが提供される；
（ａ）表Ｂ、Ｅ又はＨから選択される第２ポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）表Ｂ、Ｅ又はＨから選択される第２ポリペプチドと少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）表Ｂ、Ｅ又はＨから選択されるアミノ配列を有するポリペプチド又はその断片、類似体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）表Ｂ、Ｅ又はＨから選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）表Ｂ、Ｅ又はＨから選択される配列を有するポリペプチドに対して結合特異性を有する抗体を産生可能なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）表Ｂ、Ｅ又はＨから選択されるポリペプチドのエピトープ保持部をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド。
【００１０】
一局面によって、本発明は、表Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ若しくはＨから選択される配列を含む第２ポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、又はその断片、類似体若しくは誘導体をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
一局面によって、本発明は、表Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ若しくはＨから選択される配列を含む第２ポリペプチドと少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド又はその断片、類似体若しくは誘導体をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
一局面により、本発明は、表Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ若しくはＨから選択されるアミノ酸配列を特徴とするポリペプチド、又はその断片、類似体若しくは誘導体に関する。
【００１１】
一局面によって、本発明は、表Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ若しくはＨから選択される配列を含む第２ポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
一局面によって、本発明は、表Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ若しくはＨから選択される配列を含む第２ポリペプチドと少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
一局面により、本発明は、表Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ若しくはＨから選択されるアミノ酸配列を特徴とするポリペプチドに関する。
【００１２】
一局面によって、本発明は、表Ｂ、Ｅ若しくはＨから選択される配列を含む第２ポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド又はその断片、類似体若しくは誘導体をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
一局面によって、本発明は、表Ｂ、Ｅ若しくはＨから選択される配列を含む第２ポリペプチドと少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド又はその断片、類似体若しくは誘導体をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
一局面により、本発明は、表Ｂ、Ｅ若しくはＨから選択されるアミノ酸配列を特徴とするポリペプチド又はその断片、類似体若しくは誘導体に関する。
【００１３】
一局面により、本発明は、表Ｂ、Ｅ若しくはＨから選択される配列を含む第２ポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
一局面により、本発明は、表Ｂ、Ｅ若しくはＨから選択される配列を含む第２ポリペプチドと少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
一局面により、本発明は、表Ｂ、Ｅ若しくはＨから選択されるアミノ酸配列を特徴とするポリペプチドに関する。
【００１４】
本発明により、ポリペプチド及びキメラポリペプチドをコードするすべてのヌクレオチドは、本発明の範囲内である。
さらなる実施形態では、本発明のポリペプチド又はキメラポリペプチドは抗原性である。
さらなる実施形態では、本発明のポリペプチド又はキメラポリペプチドは免疫原性である。
さらなる実施形態では、本発明のポリペプチド又はキメラポリペプチドは個体内で免疫応答を誘発することができる。
【００１５】
さらなる実施形態では、本発明は、上で定義したような本発明のポリペプチド又はキメラポリペプチドに対して結合特異性を有する抗体を産生させることのできるポリペプチドにも関する。
一実施形態では、表Ａ（ＢＶＨ−３）又は表Ｄ（ＢＶＨ−１１）のポリペプチドは、少なくとも１つのエピトープ保持部を含む。
さらなる実施形態では、本発明のポリペプチドの断片は、表Ｃ及びＦで特定される１つ以上のエピトープ保持部を含む。断片は、表Ｃ及びＦの少なくとも１５相接アミノ酸のポリペプチドを含む。断片は、表Ｃ及びＦの少なくとも２０相接アミノ酸のポリペプチドを含む。
さらなる実施形態では、表Ａ（ＢＶＨ−３）のポリペプチドのエピトープ保持部は、表Ｃに列挙されている少なくとも１つのポリペプチドを含む。
さらなる実施形態では、表Ｂ（ＢＶＨ−１１）のポリペプチドのエピトープ保持部は、表Ｆに列挙されている少なくとも１つのポリペプチドを含む。
【００１６】
“結合特異性を有する”抗体とは、選択されたポリペプチドを認識して結合するが、実質的に生体試料のような試料中の他の分子は認識かつ結合しない抗体である。特異的結合は、ＥＬＩＳＡアッセイにより、その選択されたポリペプチドを抗原として使用して測定することができる。
特に定義しない場合、本明細書で用いるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。本明細書で言及するすべての公開公報、特許出願、特許、及びその他の参照文献は、参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。矛盾する場合は、定義を含め、本明細書が支配する。さらに、材料、方法及び実施例は説明のためだけであり、限定する意図ではない。
【００１７】
本発明により、生物学的研究における“保護”は、生存曲線、率又は期間における有意な増加によって定義される。対数ランク試験を用いて生存曲線を比較する統計解析、及びフィッシャー正確試験を用いて生存率と死亡までの日数を比較する統計解析は、それぞれＰ値を計算し、かつ２群間の相異が統計的に意味があるかどうかを決定するのに有用である。Ｐ値０．０５は、意味がないとみなされる。
【００１８】
本明細書で使用する場合、本発明のポリペプチドの“断片”、“誘導体”又は“類似体”は、１つ以上のアミノ酸残基が、保存又は非保存アミノ酸残基（好ましくは保存）で置換されているポリペプチドを包含し、天然又は非天然でよい。一実施形態では、本発明のポリペプチドの誘導体及び類似体は、図面に示される配列又はその断片と約７０％の同一性を有する。すなわち、残基の７０％が同一である。さらなる実施形態では、ポリペプチドは７５％より高い相同性を有する。さらなる実施形態では、ポリペプチドは８０％より高い相同性を有する。さらなる実施形態では、ポリペプチドは８５％より高い相同性を有する。さらなる実施形態では、ポリペプチドは９０％より高い相同性を有する。さらなる実施形態では、ポリペプチドは９５％より高い相同性を有する。さらなる実施形態では、ポリペプチドは９９％より高い相同性を有する。さらなる実施形態では、本発明のポリペプチドの誘導体及び類似体は、約２０個未満、さらに好ましくは１０個未満のアミノ酸残基置換、修飾又は欠失を有する。
【００１９】
好ましい置換は、保存型、すなわち置換される残基が疎水性、大きさ、電荷又は官能基のような物理的又は化学的性質を共有するとして当業者に公知の置換である。
当業者には、本発明のタンパク質又はポリペプチドの類似体又は誘導体が、本発明の文脈における用途、すなわち抗原性／免疫原性物質としての用途を見出すことが分かるだろう。従って、例えば１つ以上の付加、欠失、置換等を含むタンパク質又はポリペプチドは本発明に包含される。さらに、あるアミノ酸を同様の“タイプ”の別のアミノ酸で置換することができる。例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸と置換することである。
【００２０】
ＣＬＵＳＴＡＬプログラムのようなプログラムを用いてアミノ酸配列を比較することができる。このプログラムは、アミノ酸配列を比較し、どちらかの配列に適するようにスペースを挿入することで最適なアラインメントを見つける。最適なアラインメントについてのアミノ酸の同一性又は類似性（同一性プラスアミノ酸タイプの保存）を計算することができる。ＢＬＡＳＴｘのようなプログラムは、同様な配列の最長の伸びを調整し、適合値を割り当てる。従って、それぞれ異なったスコアを有し、いくつかの領域の類似が見られる対照を得ることができる。本発明では、両タイプの同一性解析が熟考される。
これとは別のアプローチでは、類似体又は誘導体は、例えば所望のタンパク質又はポリペプチドを効率的に標識化することによって、精製しやすい部分を取り込んだ融合タンパク質である。その“標識”を除去する必要があるか、又は融合タンパク質自体が有用な十分の抗原性を保持する場合もある。
【００２１】
本発明のさらなる局面では、本発明のタンパク質若しくはポリペプチド、又はその類似体若しくは誘導体の抗原性／免疫原性断片が提供される。
本発明の断片は、１つ以上のこのようなエピトープ領域を含むか、又はこのよな領域に十分に類似し、その抗原性／免疫原性特性を保持すべきである。従って、本発明の断片については、それら断片が本明細書で述べるようなタンパク質若しくはポリペプチドの特定部分、類似体又は誘導体に１００％同一でありうるので、同一性の程度はおそらく無関係である。この場合もやはり、重要な問題は、断片が抗原性／免疫原性特性を保持することである。
従って、類似体、誘導体及び断片について重要なことは、それらが誘導されるタンパク質又はポリペプチドと少なくとも同程度の抗原性／免疫原性を有することである。
【００２２】
本発明により、本発明のポリペプチドはポリペプチドとキメラポリペプチドの両方を包含する。
該ポリペプチドの生物学的又は薬理学的特性を変える他の成分、すなわち半減期を増やすためのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；精製を容易にするためのリーダー又は分泌性アミノ酸配列；プレプロ−及びプロ−配列；及び（ポリ）サッカリドに融合しているポリペプチドも含まれる。
さらに、アミノ酸領域が多型性であることが分かっている場合、１つ以上の特定のアミノ酸を変えて、異なるストレプトコッカス菌株の異なるエピトープをより効率的に模倣することが望ましい。
【００２３】
さらに、本発明のポリペプチドは、末端−ＮＨ２アシル化（例えばアセチル化、又チオグリコール酸アミド化、例えばアンモニア若しくはメチルアミンによる末端カルボキシアミド化により）によって修飾して安定性を与え、すなわち支持体又は他の分子に連結又は結合するために疎水性を高めることができる。
該ポリペプチド断片、類似体及び誘導体のヘテロ及びホモポリペプチド多量体も熟考される。これらポリマー形態としては、例えば、アビジン／ビオチン、グルテルアルデヒド又はジメチルスーパーイミダートのような架橋剤で架橋されている１種以上のポリペプチドが挙げられる。このようなポリマー形態としては、組換えＤＮＡ技術で生成された多シストロンｍＲＮＡから生じる２種以上のタンデム又は反転相接配列を含有するポリペプチドが挙げられる。
【００２４】
好ましくは、本発明のポリペプチドの断片、類似体又は誘導体は、少なくとも１つの抗原性領域、すなわち少なくとも１つのエピトープを含む。
抗原性ポリマー（すなわち合成多量体）の形成を達成するため、ビスハロアセチル基、ニトロアリールハライド等を有するポリペプチドを利用でき、該試薬はチオ基に特異的である。従って、異なるペプチドの２個のメルカプト基間の連結は単結合であるか、又は少なくとも２個、典型的には少なくとも４個で、１６個以下であるが、通常約１４個以下の炭素原子の連結基で構成される。
【００２５】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチド断片、類似体又は誘導体は、メチオニン（Ｍｅｔ）開始残基を含まない。好ましくは、ポリペプチドはリーダー又は分泌配列（シグナル配列）を取り込まない。本発明のポリペプチドのシグナル部は、確立された分子生物学的技法に従って決定できる。一般に、関心のあるポリペプチドは、ストレプトコッカス培養から単離し、引き続き配列決定により成熟タンパク質の最初の残基、ひいては成熟ポリペプチドの配列を決定することができる。
【００２６】
別の局面により、医薬的に許容性のキャリヤー、希釈剤又はアジュバントが混合されて、本発明の１種以上のストレプトコッカスポリペプチドを含むワクチン組成物が提供される。好適なアジュバントとしては、油、すなわちフロイント完全アジュバント又は不完全アジュバント；塩、すなわちＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ４（ＳＯ４）２、シリカ、カオリン、カーボンポリヌクレオチド、すなわちポリＩＣ及びポリＡＵが挙げられる。好ましいアジュバントとしては、Ｑｕｉｌａ及びＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌが挙げられる。本発明のワクチンは、注射、急速注入、鼻咽頭吸収、皮膚吸収、若しくは頬側によって非経口的に、又は経口的に投与することができる。医薬的に許容性のキャリヤーとして、破傷風トキソイドも挙げられる。
用語ワクチンは、抗体をも含む意である。本発明により、ストレプトコッカス感染及び／又はストレプトコッカス感染を媒介とする病気及び症状の治療又は予防のための、本発明のポリペプチドに対して結合特異性を有する１種以上の抗体の使用も提供される。
【００２７】
本発明のワクチン組成物は、レプトコッカス感染及び／又はＰ．Ｒ． Ｍｕｒｒａｙ （主筆），Ｅ．Ｊ． Ｂａｒｏｎ， Ｍ．Ａ． Ｐｆａｌｌｅｒ， Ｆ．Ｃ． Ｔｅｎｏｖｅｒ及びＲ．Ｈ． Ｙｏｌｋｅｎに記載されているようなストストレプトコッカス感染によって媒介される病気及び症状の治療又は予防のために用いられる。参照によって本明細書に取り込まれる臨床生物学のマニュアル，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ． 第６版， １９９５， １４８２ｐ。一実施形態では、本発明のワクチン組成物は、髄膜炎、中耳炎、菌血症又は肺炎の治療又は予防のために用いられる。一実施形態では、本発明のワクチン組成物は、ストレプトコッカス感染及び／又はストレプトコッカス感染、特にＳ．ニュモニエ、Ａ群ストレプトコッカス（ピオゲン）、Ｂ群ストレプトコッカス（ＧＢＳ又はアガラクティエ）、ディスガラクティエ、ウレビス、ノカルジア及びストレプトコッカス・アウレウスによって媒介される病気又は症状の治療又は予防のために使用される。さらなる実施形態では、ストレプトコッカス感染は、Ｓ．ニュモニエである。
【００２８】
特定の実施形態では、ワクチンは胎児、高齢者及び免疫無防備状態の個体のようなストレプトコッカス感染の恐れのある個体に投与される。
本出願で使用する場合、用語“個体”は哺乳類を包含する。さらなる実施形態では、哺乳類はヒトである。
ワクチン組成物は、好ましくは約０．００１〜１００μｇ／ｋｇ（抗原／体重）、さらに好ましくは０．０１〜１０μｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．１〜１μｇ／ｋｇの単位剤形で、約１〜６週間の免疫化間の間隔で１〜３回投与される。
ワクチン組成物は、好ましくは約０．１μｇ〜１０ｍｇ、さらに好ましくは１μｇ〜１ｍｇ、最も好ましくは１０〜１００μｇの単位剤形で、約１〜６週間の免疫化間の間隔で１〜３回投与される。
【００２９】
別の局面により、表Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ若しくはＨから選択されるアミノ酸配列を特徴とするポリペプチド、又はその断片、類似体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドが提供される。
別の局面により、表Ｂ、Ｅ若しくはＨから選択されるアミノ酸配列を特徴とするポリペプチド、又はその断片、類似体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドが提供される。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする、表Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ又はＨに示されるものである。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする、表Ｂ、Ｅ又はＨに示されるものである。
【００３０】
図に示されるポリヌクレオチド配列は、縮重したコドンによって変化しうるが、依然として本発明のポリペプチドをコードしていることが明かである。従って、本発明は、さらに配列間に５０％の同一性を有する上述のポリヌクレオチド配列（又はその相補的配列）にハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。一実施形態では、配列間の少なくとも７０％の同一性。実施形態では、配列間の少なくとも７５％の同一性。一実施形態では、配列間の少なくとも８０％の同一性。一実施形態では、配列間の少なくとも８５％の同一性。一実施形態では、配列間の少なくとも９０％の同一性。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、ストリンジェント条件、すなわち少なくとも９５％の同一性を有する条件下でハイブリダイズ可能である。さらなる実施形態では、９７％より高い同一性である。
当業者は、ハイブリダイゼーションに適したストリンジェント条件を容易に決めることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，（１９８９）分子クローニング： 実験室マニュアル，第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．；分子生物学の最新プロトコル ，（１９９９） Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら編集， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎ．Ｙ．参照）。
【００３１】
さらなる実施形態では、本発明は、ストリンジェント条件下で
（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列又は
（ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の補体
のどちらかにハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、
前記ポリペプチドが表Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ若しくはＨから選択される配列又はその断片又は類似体を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、ストリンジェント条件下で
（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列又は
（ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の補体
のどちらかにハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、
前記ポリペプチドが表Ｂ、Ｅ若しくはＨから選択される配列又はその断片又は類似体を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
【００３２】
さらなる実施形態では、本発明は、ストリンジェント条件下で
（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列又は
（ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の補体
のどちらかにハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、
前記ポリペプチドが表Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ若しくはＨから選択される配列又はその断片又は類似体を含むポリペプチド由来の少なくとも１０個の相接アミノ酸残基を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、ストリンジェント条件下で
（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列又は
（ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の補体
のどちらかにハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、
前記ポリペプチドが表Ｂ、Ｅ若しくはＨから選択される配列又はその断片又は類似体を含むポリペプチド由来の少なくとも１０個の相接アミノ酸残基を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
【００３３】
さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、表Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ若しくはＨに示される本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
当業者には容易に分かるように、ポリヌクレオチドには、ＤＮＡとＲＮＡの両者を包含する。
本発明は、本出願で述べるポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドをも包含する。
【００３４】
さらなる局面では、本発明のポリペプチド又はその断片、類似体若しくは誘導体をコードポリヌクレオチドは、ＤＮＡ免疫化法に使用できる。すなわち、それらを注射すると複製かつ発現可能なベクター中に取り込み、それによって抗原性ポリペプチドをインビボ産生することができる。例えば、真核生物細胞内で機能的であるＣＭＶプロモーターの制御下プラスミドベクター中にポリヌクレオチドを取り込むことができる。好ましくは、該ベクターは筋肉内注射される。
【００３５】
別の局面により、本発明のポリペプチドの製造方法であって、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主内で発現させ、その過剰発現されたポリペプチド産物を回収することによる組換え法による方法が提供される。これとは別に、ポリペプチドは、確立された化学合成法、すなわち結合されて全ポリペプチドを生成する（ブロック連結反応）オリゴヌクレオチドの液相又は固相合成によって製造することができる。
【００３６】
ポリヌクレオチド及びポリペプチドの獲得及び評価の一般的な方法は、以下の参照文献に記載されている：Ｓａｍｂｒｏｏｋら，分子クローニング：実験室マニュアル， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８９；分子生物学の最新プロトコル， Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら編集， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； ＰＣＲクローニングプロトコル，分子クローニングから遺伝子工学， Ｗｈｉｔｅ Ｂ．Ａ．編集， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， １９９７， ４９０ページ；タンパク質精製，原理と実施， Ｓｃｏｐｅｓ Ｒ．Ｋ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，第３版， １９９３， ３８０ページ；免疫学の最新プロトコル， Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．ら編集， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。これら文献は、参照によって本明細書に取り込まれる。
【００３７】
組換え製造では、ポリペプチドをコードするベクターで宿主を形質移入してから、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、又は遺伝子を増幅するのに適するように修飾した栄養培地で培養する。好適なベクターは、選択した宿主内で生存可能かつ複製可能なベクターであり、染色体性、非染色体性及び合成ＤＮＡ配列、例えば細菌性プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウィルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡを組み合わせて誘導されるベクターが挙げられる。制限酵素を用いて、プロモーター、リボゾーム結合部位（コンセンサス領域又はシャイン−ダルガルノ配列）、及び任意にオペレーター（制御要素）を含む発現制御領域に操作的にポリペプチド配列が連結されるように、ポリペプチド配列をベクターの適切な部位に取り込むことができる。所定の宿主及びベクターに適する発現制御領域の個々の成分は、確立された分子生物学の原理に従って選択することができる（参照によって本明細書に取り込まれているＳａｍｂｒｏｏｋ，ら，分子クローニング：実験室マニュアル，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒａｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；分子生物学の最新プロトコル，Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら編集， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）。好適なプロモーターとしては、限定するものではないがＬＴＲ又はＳＶ４０プロモーター、大腸菌ｌａｃ、ｔａｃ又はｔｒｐプロモーター及びファージｌａｍｂｄａ ＰＬプロモーターが挙げられる。ベクターは、好ましくは複製及び選択マーカの起源、すなわちアンピシリン抵抗性遺伝子を取り込む。好適な細菌性ベクターとしては、ｐＥＴ、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９、ｐｂｓ、ｐＤ１０ ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５及び真核生物ベクターｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬが挙げられる。宿主細胞は、細菌、すなわち大腸菌、バシラス・サチリス、ストレプトマイセス；真菌、すなわちアスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ニデュランス；酵母菌、すなわちサッカロミセス又は真核生物、すなわちＣＨＯ、ＣＯＳが挙げられる。
【００３８】
培養でポリペプチドが発現されると、典型的には細胞を遠心分離で収穫し、物理的又は化学的手段によって破壊し（発現されたポリペプチドが培地中に分泌されていない場合）生成した粗抽出物を保持して関心のあるポリペプチドを単離する。培地又はライセートからのポリペプチドの精製は、該ポリペプチドの特性によって決まる確立された方法、すなわち硫酸アンモニウム若しくはエタノール沈殿、酸抽出、アニオン若しくはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーによって達成することができる。最終精製はＨＰＬＣを用いて達成できる。
【００３９】
ポリペプチドは、リーダー又は分泌配列により、又はこれら配列なしで発現されうる。前者の場合、リーダーを翻訳後プロセシングで除去するか（参照によって本明細書に取り込まれる米国特許第４，４３１，７３９号；第４，４２５，４３７号；及び第４，３３８，３９７号参照）又は化学的に除去した後、発現ポリペプチドを精製する。
さらなる局面により、本発明のストレプトコッカスポリペプチドは、ストレプトコッカス感染、特にＳ．ニュモニエ感染のための診断試験に使用できる。いくつかの診断方法が可能であり、例えば生体試料中のストレプトコッカス生物体を検出する方法であり、以下の手順に従う：
ａ）患者から生体試料を得；
ｂ）本発明のストレプトコッカスポリペプチドと反応性の抗体又はその断片を、前記生体試料と共にインキュベートして混合物を生成し；かつ
ｃ）ストレプトコッカスの存在を示、前記混合物内で特異的に結合される抗体又は断片を検出する。
【００４０】
これとは別に、前記抗体を含有するか、又は含有すると疑われる生体試料内におけるストレプトコッカス抗原に特異的な抗体の検出方法は、以下のように行われる：
ａ）患者から生体試料を得；
ｂ）１種以上の本発明のストレプトコッカスポリペプチド又はその断片を、前記生体試料と共にインキュベートして混合物を生成し；かつ
ｃ）ストレプトコッカスに特異的な抗体の存在を示す、前記混合物内で特異的に結合される抗体又は断片を検出する。
当業者は、この診断試験がエンザイム−リンクドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ又はラテックス凝集アッセイのような免疫学的試験を含むいくつかの形態を取り、基本的に該ポリペプチドに特異的な抗体が生物体内に存在するかどうかを決定することを認識している。
【００４１】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を用い、ストレプトコッカスを含有すると疑われる生体試料中の該細菌の存在を検出するためのＤＮＡプローブを設計することができる。この発明の検出方法は、以下の工程を含む：
ａ）患者から生体試料を得る工程；
ｂ）本発明のポリペプチド又はその断片をコードするＤＮＡ配列を有する１種以上のＤＮＡプローブを、前記生体試料と共にインキュベートして混合物を生成する工程；及び
ｃ）ストレプトコッカス細菌の存在を示す、前記混合物内で特異的に結合されるＤＮＡプローブを検出する工程。
【００４２】
この発明のＤＮＡプローブは、例えば、ストレプトコッカス感染の診断法としてポリメラーゼ連鎖反応を用いる循環ストレプトコッカス検出、すなわち試料中のＳ．ニュモニエ核酸の検出に使用できる。
プローブは、従来法によって合成でき、固相上に固定化するか、又は検出可能な標識で標識化できる。この出願で好ましいＤＮＡプローブは、本発明のストレプトコッカス・ニュモニエポリペプチドの少なくとも約６個の相接ヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴマーである。
【００４３】
患者のストレプトコッカス検出の別の診断方法は以下の工程を含む：
ａ）本発明のポリペプチド又はその断片と反応性の抗体を、検出可能な標識で標識化する工程；
ｂ）この標識化抗体又は標識化断片を患者に投与する工程；及び
ｃ）ストレプトコッカスの存在を示す、前記患者内で特異的に結合される標識化抗体又は標識化断片を検出する工程。
【００４４】
本発明のさらなる局面は、本発明のストレプトコッカスポリペプチドの、ストレプトコッカス感染の診断及び特に治療用の特異的抗体の製造のための免疫原としての使用である。好適な抗体は、適切なスクリーニング方法、例えば特定抗体の試験モデル内におけるストレプトコッカス感染に対して受動的に保護する能力を測定することによって決定できる。動物モデルの一例は本明細書の実施例に記載されているマウスである。抗体は、全体的な抗体又はその抗原結合性断片でよく、いずれの免疫グロブリン分類に属してもよい。抗体又は断片は動物起源、具体的には哺乳類起源、さらに詳細にはマウス、ラット又はヒト起源でよい。それは、天然抗体若しくは抗体断片でよく、又は所望により、組換え抗体若しくは抗体断片でよい。用語組換え抗体又は抗体断片は、分子生物学的方法を用いて生成された抗体又は抗体断片を意味する。抗体又は抗体断片はポリクロナールでよく、好ましくはモノクロナールである。それは、ストレプトコッカス・ニュモニエポリペプチドに関連する多くのエピトープに特異的であってよいが、好ましくは１つのエピトープに特異的である。
【００４５】
本発明のさらなる局面は、本発明のストレプトコッカスポリペプチドに向けられる抗体の、受動免疫化のための使用である。本出願で述べる抗体を使用することができる。好適な抗体は、適切なスクリーニング方法、例えば特定抗体の試験モデル内におけるストレプトコッカス感染に対して受動的に保護する能力を測定することによって決定できる。動物モデルの一例は本明細書の実施例に記載されているマウスである。抗体は、全体的な抗体又はその抗原結合性断片でよく、いずれの免疫グロブリン分類に属してもよい。抗体又は断片は動物起源、具体的には哺乳類起源、さらに詳細にはマウス、ラット又はヒト起源でよい。それは、天然抗体若しくは抗体断片でよく、又は所望により、組換え抗体若しくは抗体断片でよい。用語組換え抗体又は抗体断片は、分子生物学的方法を用いて生成された抗体又は抗体断片を意味する。抗体又は抗体断片はポリクロナールでよく、好ましくはモノクロナールである。それは、ストレプトコッカス・ニュモニエポリペプチドに関連する多くのエピトープに特異的であってよいが、好ましくは１つのエピトープに特異的である。
以下は、本出願で開示する配列をまとめた参照表である。
【００４６】
表Ａ、Ｂ及びＣ ＢＶＨ−３−の変異体及びエピトープ
表Ａ
2004501618.tif 000002
【００４７】
表Ｂ
2004501618.tif 000003
＊＊サイレント突然変異、すなわちポリペプチドはＮｅｗ１又はＮｅｗ５６と同一である。
【００４８】
表Ｃ ＢＶＨ−３のエピトープ
2004501618.tif 000004
【００４９】
表Ｄ、Ｅ及びＦ ＢＶＨ−３−の変異体及びエピトープ
表Ｄ
2004501618.tif 000005
【００５０】
表Ｅ
2004501618.tif 000006
【００５１】
表Ｆ ＢＶＨ−３のエピトープ
2004501618.tif 000007
【００５２】
表Ｇ及びＨ キメラ−
表Ｇ
2004501618.tif 000008
＊ 任意のアミノ酸
【００５３】
表Ｈ
2004501618.tif 000009
【００５４】
実施例１
この実施例は、ここで使用する細菌株、プラスミド、ＰＣＲプライマー、組換えタンパク質及びハイブリドーマ抗体について述べる。
Ｓ．ニュモニエ ＳＰ６４（血清型６）及びＳＰ６３（血清型９）の臨床用単離物は、Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ ｄｅ ｌａ Ｓａｎｔｅ Ｐｕｂｌｉｑｕｅ ｄｕ Ｑｕｅｂｅｃ， Ｓａｉｎｔｅ−Ａｎｎｅ−ｄｅ−Ｂｅｌｌｅｖｕｅによって提供され；Ｒｘ１株、２型株Ｄ３９及び３型株ＷＵ２の非被包誘導体は、アラバマ大学， バーミンガムからＤａｖｉｄ．Ｅ．Ｂｒｉｂｅｓによって提供され、３型臨床用単離物Ｐ４２４１はＣｅｎｔｒｅ ｄｅ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ ｅｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｌｏｇｉｅ ｄｕ Ｃｅｎｔｒｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌｉｅｒ ｄｅ ｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｌａｖａｌ， Ｓａｉｎｔｅ−Ｆｏｙから提供された。大腸菌株ＤＨ５α （Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｓｂｕｒｇ， ＭＤ）； ＡＤ４９４ （λＤＥ３） （Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）及びＢＬ２１ （λＤＥ３） （Ｎｏｖａｇｅｎ）並びにプラスミド超リンカーｐＳＬ３０１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）；ｐＣＭＶ−ＧＨベクター（テキサス州ダラスのテキサス大学生化学部のＳｔｅｐｈｅｎ Ａ． Ｊｏｈｎｓｔｏｎ博士から贈呈）；ｐＥＴ３２及びｐＥＴ２１ （Ｎｏｖａｇｅｎ）及びｐＵＲＶ２２．ＨＩＳ発現ベクター（図３０）をこの研究で使用した。ｐＵＲＶ２２．ＨＩＳベクターは、機能性ＰＲプロモーターが欠失されているバクテリオファージλ ｃＩ８５７温度感受性リプレッサー遺伝子のカセットを含有する。プロモーターλＰＬの制御下、３０〜３７℃から３７〜４２℃の範囲で昇温することでｃＩ８５７リプレッサーを不活性化すると該遺伝子が誘発される。組換えプラスミドの生成に用いるＰＣＲプライマーは、５’末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有し、それによって増殖幅産物の消化プラスミドベクターへの方向性クローニングが可能になる。下表１に、使用するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーがリストされている。ＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１及びＢＶＨ−１１−２遺伝子産物をコード化する遺伝子配列の配置は、図２５、図２６及び図２７にそれぞれまとめられている。
【００５５】
表１ ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーのリスト
2004501618.tif 000010
2004501618.tif 000011
2004501618.tif 000012
2004501618.tif 000013
2004501618.tif 000014
【００５６】
標準的な方法に従って分子生物学技法を行った。例えば、参照によって本明細書に取り込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．， Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．，“分子クローニング 実験室マニュアル”Ｖｏｌ．１−２−３（第２版） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照せよ。ＰＣＲ増幅産物が制限エンドヌクレアーゼで消化し、同様に消化され、又は適合性付着末端を生成する酵素で消化された線状プラスミドｐＳＬ３０１、ｐＣＭＶ−ＧＨ、ｐＥＴ若しくはｐＵＲＶ２２．ＨＩＳ発現ベクターに結合した。組換えｐＳＬ３０１及び組換えｐＣＭＶ−ＧＨプラスミドをｐＥＴ発現ベクター中のインフレームクローニング用の制限酵素で消化した。ｐＥＴベクターを使用する場合、クローンを全長又は不完全ＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１又はＢＶＨ−１１−２分子の発現のために大腸菌ＢＬ２１（λＤＥ３）又はＡＤ４９４（λＤＥ３）中に導入する前に、まず大腸菌ＤＨ５α内に固定した。結果として生じた各プラスミド構成物をヌクレオチド配列解析で確認した。組換えタンパク質は、チオレドキシン及びＨｉｓ−ｔａｇ（ｐＥＴ３２発現系）とのＮ末端融合；Ｈｉｓ−ｔａｇ（ｐＥＴ２１発現系）とのＣ末端融合；又はＨｉｓ−ｔａｇ（ｐＵＲＶ２２．ＨＩＳ発現系）とのＮ末端融合として発現した。発現組換えタンパク質は、超音波処理ＩＰＴＧ−（ｐＥＴ系）又はＨｉｓ−Ｂｉｎｄ金属キレーション樹脂（ＱＩＡｇｅｎ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）を用いる熱−（ｐＵＲＶ２２．ＨＩＳ）誘発大腸菌の遠心分離後に得られる上清フラクションから精製した。Ｓ．ニュモニエＳＰ６４から産生された遺伝産物は、表２にリストされる。ＢＶＨ−３−Ｓｐ６３タンパク質（配列番号：１０のアミノ酸残基２１〜８４０）をコードする遺伝子断片は、ＰＣＲ−プライマーセットＯＣＲＲ４７９−ＯＣＲＲ４８０及びクローニングベクターｐＳＬ３０１を用いてＳ．ニュモニエＳＰ６３から生成した。ＢＶＨ−３−Ｓｐ６３分子発現用ｐＥＴ３２ベクター内におけるインフレームクローニングのため組換えｐＳＬ３０１−ＢＶＨ−３Ｓｐ６３が消化された。
【００５７】
表２． Ｓ．ニュモニエＳＰ６４から産生された不完全なＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１、ＢＶＨ−１１−２及びキメラ遺伝子産物のリスト
2004501618.tif 000015
2004501618.tif 000016
ｗ／ｏ ｓｓ：シグナル配列なし。ＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１及びＢＶＨ−１１−２タンパク質配列の解析は、推定疎水性リーダー配列の存在を示唆した。
＊ キメラについてコードされるアミノ酸は遺伝子産物として発現され、加えられた付加非必須アミノ酸残基Ｍはメチオニン、Ｋはリジン、Ｌはロイシン、Ｇはグリシン及びＰはプロリンである。
【００５８】
ハイブリドーマを分泌するモノクロナール抗体（Ｍａｂ）は、Ｆａｚｅｋａｓ Ｄｅ Ｓｔ−Ｇｒｏｔｈ ａｎｄ Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ （Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５： １−２１， １９８０）を改変した（Ｊ． Ｈａｍｅｌ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２３： １６３−１７０， １９８７）方法により、免疫化したマウス由来の脾臓細胞と、非分泌ＨＧＰＲＴ−欠乏マウス骨髄腫ＳＰ２／０細胞の融合によって得た。メスのＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ， Ｓｔ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ， Ｑｕｅｂｅｃ， Ｃａｎａｄａ）を、Ｓ．ニュモニエ株ＳＰ６４由来のＢＶＨ−３Ｍ（チオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−ＢＶＨ−３Ｍ融合タンパク質／ｐＥＴ３２系）、ＢＶＨ−１１Ｍ（チオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−ＢＶＨ−１１Ｍ融合タンパク質／ｐＥＴ３２系）、ＢＶＨ−１１−２Ｍ（チオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−ＢＶＨ−１１−２Ｍ融合タンパク質／ｐＥＴ３２系）、ＢＶＨ−１１Ｂ（チオレドキシン−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−ＢＶＨ−１１Ｂ融合タンパク質／ｐＥＴ３２系）、ＢＶＨ−３Ｍ（Ｈｉｓ・Ｔａｇ−ＢＶＨ−３融合タンパク質／ｐＵＲＶ２２．ＨＩＳ系）又はＮＥＷ１（ＮＥＷ１−Ｈｉｓ・Ｔａｇ融合タンパク質／ｐＥＴ２１系）遺伝子産物で免疫化して、それぞれＭａｂシリーズＨ３−、Ｈ１１−、Ｈ１１２−、Ｈ１１Ｂ−、Ｈ３Ｖ−、及びＨＮ１−を得た。ハイブリドーマの培養上清は、まず、Ｈａｍｅｌら（前出）に記載されている手順に従い、精製組換えＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１及び／又はＢＶＨ−１１−２タンパク質又は熱殺Ｓ．ニュモニエ細胞の懸濁液の製剤を塗布したプレートを用いて酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってスクリーニングした。さらに特徴づけするために選択したＭａｂ−分泌ハイブリドーマは、以下の実施例２から表３及び表４にリストされている。Ｍａｂ免疫グロブリンのクラス及びサブクラスは、商業的に入手可能な試薬（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ， ＡＬ）を用いてＥＬＩＳＡによって決定した。
【００５９】
さらに、キメラポリペプチドをコードするキメラ遺伝子のクローニングと発現及びこれらキメラポリペプチドによるワクチン接種後に観察された保護について述べる。
操作してキメラ遺伝子内に包含されるべき遺伝子断片を増幅したオリゴヌクレオチド対を用い、遺伝子の３’末端に対応するＢＶＨ−３及びＢＶＨ−１１遺伝子断片をＰＣＲで増幅した。用いたプライマーは５’末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有し、その結果として増幅産物の消化プラスミドベクターへの方向性インフレームクローニングが可能になった（表１及び表２）。ＰＣＲ−増幅産物を制限エンドヌクレアーゼで消化し、線状プラスミドｐＥＴ２１又はｐＳＬ３０１ベクターに結合した。結果のプラスミド構成物をヌクレオチド配列解析で確認した。ＰＣＲ産物を含有する組換えｐＥＴ２１プラスミドを、第２ＤＮＡ断片のインフレームクローニング及びキメラ肺炎球菌タンパク質分子をコードするキメラ遺伝子産生のための制限酵素による消化で線状にした。ＰＣＲ産物を含有する組換えｐＳＬ３０１プラスミドを、ＤＮＡ挿入断片を得るための制限酵素で消化した。生成した挿入ＤＮＡ断片を精製し、所定のキメラ遺伝子に対応する挿入断片をキメラ遺伝子の産生用ｐＥＴ２１ベクターに結合した。表２にリストされている組換えキメラポリペプチドは、Ｈｉｓ−ｔａｇとのＣ末端融合としてだった。Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ金属キレーション樹脂（ＱＩＡｇｅｎ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）を用いて超音波処理ＩＰＴＧ−誘発大腸菌培養の遠心分離から得た上清フラクションから発現組換えタンパク質を精製した。
【００６０】
８匹のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）群を、１５〜２０μｇのＱｕｉｌＡアジュバントの存在下同定されたいずれかのアフィニティ精製Ｈｉｓ・Ｔａｇ−融合タンパク質２５μｇで３週間の間隔をおいて２回皮下的に免疫化した。最後の免疫化後１０〜１４日に、マウスに、Ｓ．ニュモニエ３型株ＷＵ２の１０Ｅ５−１０Ｅ６ ＣＦＵを静脈内投与した。このポリペプチド及び断片は保護免疫応答を誘発可能である。
【００６１】
表 ２Ａ
2004501618.tif 000017
【００６２】
実施例２
この実施例は、Ｍａｂｓ及び実施例１で述べた組換え不完全タンパク質を用いた、標的エピトープを保有するペプチドドメインの同定について述べる。
Ｍａｂｓによって認識されるエピトープを特徴づけるため、不完全なＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１又はＢＶＨ−１１−２遺伝子産物に対してＥＬＩＳＡで試験した。不完全遺伝子産物は、Ｓ．ニュモニエＳＰ６３株から産生されたＢＶＨ−３−Ｓｐ６３を除き、Ｓ．ニュモニエＳＰ６４株から産生された。ポジティブ対照として、各抗体の反応性を全長ＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１又はＢＶＨ−１１−２組換えタンパク質で調べた。数ケースでは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びニトロセルロース紙上の移動による遺伝子産物の分離後ウェスタンイムノブロット法によってＭａｂ反応性を評価した。観察された反応性は、以下の表３及び表４に示される。
【００６３】
表３．ＢＶＨ−３−反応性Ｍａｂｓと１１種のＢＶＨ−３遺伝子産物及びＢＶＨ−１１Ｍ分子グループとのＥＬＩＳＡ反応性
2004501618.tif 000018
【００６４】
（表３の続き）
2004501618.tif 000019
ＮＴ：試験せず
＋／−：非常に低い反応性であるが、バックグラウンドより高く、おそらく非特異的Ｍａｂ結合性
【００６５】
2004501618.tif 000020
【００６６】
2004501618.tif 000021
【００６７】
2004501618.tif 000022
【００６８】
2004501618.tif 000023
【００６９】
エピトープの推定位置は、図２８及び図２９に要約されている。表３のデータから分かるように、ＢＶＨ−３−反応性Ｍａｂｓは、ＢＶＨ−３Ａ及びＢＶＨ−３Ｂ分子の両方と反応するＨ１１−ＴＧ１１及びＨ３Ｖ−１５Ａ１０を除き、２グループ、すなわちＢＶＨ−３Ａ−及びＢＶＨ−３Ｂ−反応性Ｍａｂｓに分割できる。ＢＶＨ−３Ａ−反応性Ｍａｂｓは、ＢＶＨ−３Ｃ組換えタンパク質との反応性又は反応性欠如によって、２サブグループの抗体にサブ分割できる。ＢＶＨ−３Ｃタンパク質と反応性のＭａｂは、ＢＶＨ−３及びＢＶＨ−１１タンパク質の両方で共有されるエピトープを認識した。表４で見られるように、これらＢＶＨ−３−及びＢＶＨ−１１−交差反応性Ｍａｂｓは、ＢＶＨ−１１Ａ及びＢＶＨ−１１−２Ｍ組換えタンパク質とも反応性だった。ＢＶＨ−３Ｂ−反応性Ｍａｂｓは、それぞれＮＥＷ１、ＮＥＷ２及びＮＥＷ３組換えタンパク質との反応性に応じて３サブグループにサブ分割できる。いくつかのＭａｂｓは、ＮＥＷ１タンパク質とだけ反応性であるが、他のＭａｂｓはＮＥＷ１とＮＥＷ２又はＮＥＷ１とＮＥＷ３組換えタンパク質と反応性だった。
【００７０】
Ｈ１１−７Ｇ１１及びＨ３Ｖ−１５Ａ１０は、ＢＶＨ−３上の１箇所より多くの位置のエピトープと反応する。Ｈ１１−７Ｇ１１のＢＶＨ−３ＡＤ、ＢＶＨ−３Ｂ、ＢＶＨ−３Ｃ、ＢＶＨ−１１Ａ及びＢＶＨ−１１−２Ｍ分子との反応性は、Ｈ１１−７Ｇ１１エピトープがＨＸＸＨＸＨ配列を含むことを示唆している。この配列は、ＢＶＨ−３及びＢＶＨ−１１／ＢＶＨ−１１−２タンパク質配列中、それぞれ６及び５回反復される。Ｍａｂ Ｈ１１−７Ｇ１１のＮＥＷ１０分子との反応性の欠如は、該エピトープがＨＧＤＨＸＨ配列を含むことを示唆している。ＢＶＨ−３上のＨ３Ｖ−１５Ａ１０エピトープの複数位置マッピングは、Ｍａｂと、重ならない２個のＢＶＨ−３断片との反応性によって示唆される。
【００７１】
興味深いことに、Ｍａｂｓ Ｈ３−７Ｇ２、Ｈ３Ｖ−９Ｃ６及びＨ３Ｖ−１６Ａ７はＢＶＨ−３ Ｓｐ６３と反応性でないので、Ｓ．ニュモニエＳＰ６４のＢＶＨ−３分子上のアミノ酸２４４と４２０との間に含まれる１７７−アミノ酸断片上に、それらの対応エピトープを配置できる（図３１）。
表４のデータから分かるように、ＢＶＨ−１１−及び／又はＢＶＨ−１１−２と反応性であり、かつＢＶＨ−３分子を認識しないＭａｂｓは、そのＢＶＨ−１１Ａ及びＮＥＷ１０組換えタンパク質との反応性に応じて３グループに分割できる。いくつかのＭａｂｓはＢＶＨ−１１Ａ又はＮＥＷ１０組換えタンパク質のどちらかと排他的に反応するが、他のＭａｂｓはＢＶＨ−１１ＡとＮＥＷ１０組換えタンパク質の両方と反応性だった。
【００７２】
実施例３
この実施例は、エピトープのマッピング用のＢＶＨ−３及びＢＶＨ−１１−２遺伝子ライブラリーの構成について述べる。
ＢＶＨ−３及びＢＶＨ−１１−２遺伝子ライブラリーは、それぞれヌクレオチド１８３７〜４９０９（配列番号：２）にわたるＢＶＨ−３遺伝子配列又はヌクレオチド１７２〜２６３０にわたるＢＶＨ−１１−２遺伝子配列（配列番号：５）を含有する組換えｐＣＭＶ−ＧＨ及びＰＳＬ３０１プラスミドＤＮＡと、Ｎｏｖａｔｏｐｅ（登録商標）ライブラリー構成及びスクリーニングシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて構築した。ＢＶＨ−３又はＢＶＨ−１１−２遺伝子断片を含有する組換えプラスミドは、ＱＩＡｇｅｎキット（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いて精製し、それぞれ制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｂａＩで消化した。生成したＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩ ＤＮＡ断片はＱＩＡｇｅｎ製のＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて精製し、ランダム切断ＤＮＡの生成のためＤｎａｓｅ Ｉで消化した。５０〜２００塩基対のＤＮＡ断片を精製し、Ｔ４ ＤＮＡ ポリメラーゼで処理して標的ＤＮＡ末端に平滑化し、単一の３’ｄＡ残基を加え、製造業者によって示される手順に従って（Ｎｏｖａｔｏｐｅ（登録商標）システム， Ｎｏｖａｇｅｎ）ｐＳＣＲＥＥＮ−Ｔ−ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に結合した。それぞれＢＶＨ−３又はＢＶＨ−１１−２遺伝子由来の小さいエピトープを発現する大腸菌クローンの遺伝子ライブラリーは、免疫プローブとしてＭａｂｓを用いる標準的なコロニーリフト法によってスクリーニングした。コロニースクリーニングは、非常に高いバックグラウンドをコロニーリフトに生じさせるＭａｂｓでは成功しなかった。さらに、エピトープ発現コロニーの検出に失敗したＭａｂｓもあった。反応性の欠如は、おそらく産生される組換えタンパク質の量が少ないこと、又は異なるタンパク質ドメインから成るコンホメーション依存性エピトープの認識によって説明できる。ポジティブクローンからのＤＮＡ挿入断片の配列決定によって標的エピトープをコードするセグメントの位置を決定した。データは表５に示される。組換えｐＳＣＲＥＥＮ−Ｔベクター中へのＤＮＡ挿入によってコードされるポリペプチドを精製し、後述する実施例６で免疫原として使用することができる。
【００７３】
ＭａｂｓによるＢＶＨ−３及びＢＶＨ−１１−２遺伝子ライブラリーのスクリーニングから得られたペプチド配列は、不完全遺伝子産物に対するＭａｂのＥＬＩＳＡ反応性と一致する。予想通り、Ｈ１１−７Ｇ１１から得られたアミノ酸配列は配列ＨＧＤＨＸＨを含んでいた。この知見は、Ｍａｂｓに認識されるエピトープの位置のさらなる証拠を与える。興味深いことに、Ｍａｂｓ Ｈ１１２−１０Ｇ９、Ｈ１１２−１０Ａ２及びＨ１１Ｂ−１１Ｂ８は、同一のペプチド配列（ＢＶＨ−１１−２タンパク質配列上のアミノ酸残基５９４〜６７９）に対して反応性であるが、アミノ酸残基６５８〜６９８にわたる配列に対応するクローンは、Ｍａｂ Ｈ１１Ｂ−１１Ｂ８によってしか選択されず、従ってアミノ酸残基６５８〜６７９（配列番号：１６３）間のＨ１１Ｂ−１１Ｂ８ エピトープの位置を明らかにした。Ｍａｂｓ Ｈ１１２−１０Ｇ９、Ｈ１１２−１０Ａ２、及びＨ１１Ｂ−１１Ｂ８は、アミノ酸残基５９４〜６７９（配列番号：２２）に対応するペプチド配列上に近接して位置する３つの別個の非オーバーラッピングエピトープに対して配向される。
【００７４】
表５．ＭａｂｓによりＢＶＨ−３及びＢＶＨ−１１−２遺伝子ライブラリーから得られたペプチド配列
2004501618.tif 000024
【００７５】
（表５の続き）
2004501618.tif 000025
【００７６】
実施例４
この実施例は、ＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１及び／又はＢＶＨ−１１−２と反応性の抗体を生産するための組換えタンパク質による動物の免疫化について述べる。
ＮＺＷウサギ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｓｔ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ， Ｑｕｅｂｅｃ， Ｃａｎａｄａ）を８０μｇのＱｕｉｌＡアジュバント（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ， Ｈｏｒｎｂｙ， Ｃａｎａｄａ）の存在下５０μｇ又は１００μｇの精製ＢＶＨ−３Ｍ、Ｌ−ＢＶＨ−３ＡＤ、ＮＥＷ１、ＮＥＷ１３、又はＬ−ＢＶＨ−１１組換えタンパク質で、複数部位に皮下的に免疫化した。これらウサギを、３週間の間隔をおいて２回、同一抗原で追加免疫化し、各免疫化前及び最後の免疫化後６〜２８日に血液試料を収集した。血清試料を免疫前、後１ｓｔ、後２ｎｄ、又は後３ｒｄ注射と名付けた。免疫化に対するウサギの免疫応答は、塗布抗原として組換えＢＶＨ−３Ｍ（ＢＶＨ−３Ｍ−Ｈｉｓ・Ｔａｇ 融合タンパク質／ｐＥＴ２１系）若しくはＢＶＨ−１１Ｍ（ＢＶＨ−１１Ｍ−Ｈｉｓ・Ｔａｇ融合タンパク質／ｐＥＴ２１系）タンパク質又は熱殺Ｓ．ニュモニエＲｘ−１細胞の懸濁液を用いてＥＬＩＳＡによって評価した。ＥＬＩＳＡ力価は、吸収Ａ４１０値がバックグラウンド値より０．１超える最高の血清希釈の逆数として定義した。下表６に示されるように、全動物で免疫化後ＢＶＨ−３及び／又はＢＶＨ−１１エピトープと反応性の抗体が誘発された。組換え又は肺炎球菌抗原と反応性の抗体は、免疫前血清には存在しなかった。組換え抗原の単一注射後、各ウサギの血清中で免疫化に対する免疫応答が検出できた。試験した各抗原による第２注射後の抗体応答は、抗体力価の大きな増加を特徴とした。興味深いことに、Ｓ．ニュモニエと反応性の抗体の良い力価、第３免疫化後に５２，０００の平均力価が得られ、従って天然の肺炎球菌エピトープが組換え大腸菌遺伝子産物上で発現されることを立証した。これらデータは、ＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１及び／又はＢＶＨ−１１−２遺伝子産物、及び肺炎球菌病の予防及び治療用ワクチンとしてそれぞれＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１及び／又はＢＶＨ−１１−２遺伝子産物に対して産生される抗体の潜在的な用途を支持する。
【００７７】
表６．ＢＶＨ−３及びＢＶＨ−１１遺伝子産物による免疫化に対するウサギ抗体応答
2004501618.tif 000026
ＮＴ：試験せず
【００７８】
実施例５
この実施例は、ＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１又はＢＶＨ−１１−２遺伝子産物に対して産生される抗体の投与による致死実験的肺炎球菌感染に対する動物の保護について述べる。
Ｂｒｏｄｅｕｒら（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７１：２６５−２７２，１９８４）によって記載された方法に従い、Ｍａｂ分泌ハイブリドーマ細胞で腹腔内に接種されたマウスの腹水から、高力価Ｍａｂ製剤を得た。実施例４で述べたようにＢＶＨ−３Ｍで免疫化したウサギから血清試料を収集した。第３免疫化後に収集したウサギ血清及び腹水を、４５〜５０％飽和硫酸アンモニウムを用いる沈殿による抗体の精製に使用した。抗体製剤をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、透析した。
【００７９】
ＣＢＡ／Ｎ （ｘｉｄ）マウス（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ， ＭＡ）に、 ０．１ｍｌの精製ウサギ抗体又は０．２ｍｌの腹水を腹腔内注射後、約２００ＣＦＵの３型Ｓ．ニュモニエ株ＷＵ２を静脈内誘発した。対照マウスは無菌ＰＢＳ又は免疫前ウサギ血清又は無関係なＮ．髄膜炎組換えタンパク質抗原で免疫化したウサギ由来の血清から精製された抗体を受けた。１グループのマウスは、抗−ＢＶＨ−３の投与前にＳ．ニュモニエで誘発した。Ｓ．ニュモニエ誘発種菌の試料をチョコレート寒天プレート上に塗布し、ＣＦＵ数を決定し、かつ誘発用量を検証した。Ｓ．ニュモニエ感染に対する高い感受性のため、ＣＢＡ／Ｎマウスを選択した。ＣＢＡ／Ｎマウスに静脈内注射したＷＵ２のＬＤ５０は、≦１０ＣＦＵと推定される。死は、少なくとも７日間に２４時間の間隔で記録された。
【００８０】
ウサギ抗−ＢＶＨ−３抗体を注射したマウスから得た保護データは、下表７に示される。抗−ＢＶＨ−３抗体を受けた１０匹のマウスのうち９匹が誘発に生き残ったのに対し、対照抗体又はＰＢＳ緩衝液を注射した１０匹のマウスはゼロだった。誘発後に投与した場合でさえ、ＢＶＨ−３−Ｍ分子に対して産生される抗体が受動的に保護するという観察は、既に確立された感染からさえ死を阻止するという抗−ＢＶＨ−３抗体の能力を実証した。
【００８１】
表７．ＷＵ２７肺炎球菌で静脈内誘発されたＣＢＡ／ＮマウスにおけるＢＶＨ−３−Ｍ遺伝子に対するウサギ抗体の保護効果
2004501618.tif 000027
０．１ｍｌのウサギ抗体の腹腔内投与前後に、１０００ＣＦＵのＷＵ２ Ｓ．ニュモニエでＣＢＡ／Ｎマウスを感染させた。
【００８２】
他の実験では、免疫前及び免疫血清から調製された０．１ｍｌのウサギ抗体を、２８０ＣＦＵのＳ．ニュモニエＰ４２４１ ３型株による鼻腔内誘発の４時間前にＣＢＡ／Ｎマウスに腹腔内投与した。下表８に示されるように、すべての免疫化マウスが誘発に生き残ったが、免疫前血清抗体又は緩衝液のみを受けた９匹のマウスはいずれも感染後６日生存しなかった。誘発後１１日のＳ．ニュモニエ血液培養は、すべての残存マウスでネガティブだった。さらに、ＢＶＨ−１１／ＢＶＨ−１１−２に対して向けられるモノクロナール抗体Ｈ１１２−１０Ｇ９又はＨ１１２−１０Ｇ９とＨ１１Ｂ−７Ｅ１１の混合物を受けたマウスで１００％保護が観察された。
【００８３】
表８．Ｐ４２４１肺炎球菌で鼻腔内誘発されたＣＢＡ／ＮマウスにおけるＢＶＨ−３−Ｍ遺伝子産物に対するウサギ抗体又は抗−ＢＶＨ−１１／ＢＶＨ−１１−２特異性Ｍａｂｓの受動的伝達の保護効果
2004501618.tif 000028
【００８４】
要するに、表７及び表８の結果は、ＢＶＨ−３ＭのようなＢＶＨ−３遺伝子産物による動物の免疫化が、実験的な菌血症及び肺炎感染を阻止可能な保護抗体を誘発したことを明白に立証している。
【００８５】
腹水を注射したマウスについて得られた保護データは下表９に示される。０．２ｍｌの数セットの腹水の体積０．２ｍｌの投与は、実験的感染による死を阻止した。例えば、Ｈ１１２−３Ａ４ ＋ Ｈ１１２−１０Ｇ９及びＨ１１２−１０Ｇ２ ＋ Ｈ１１２−１０Ｄ７セットの２種のＭａｂｓ は、実験的感染に対して完全な保護を与えた。これらデータは、ＢＶＨ−１１及び／又はＢＶＨ−１１−２エピトープを標的にする抗体が効率的な保護を与えることを示した。Ｍａｂｓ Ｈ１１２−３Ａ４、Ｈ１１２−１０Ｇ９、Ｈ１１２−１０Ｄ７、Ｈ１１２−１０Ａ２、Ｈ１１２−３Ｅ８、Ｈ１１２−１０Ｃ５、Ｈ１１Ｂ−１１Ｂ８、Ｈ１１Ｂ−１５Ｇ２、Ｈ１１Ｂ−１Ｃ９、Ｈ１１Ｂ−７Ｅ１１、Ｈ１１Ｂ−１３Ｄ５及びＨ１１−１０Ｂ８が、少なくとも１つの保護Ｍａｂｓ対内に存在し、かつ保護エピトープに対して保護的かつ反応的であると言われた。保護供与エピトープのＢＶＨ−１１−２分子上の位置は、表１０及び図２９にまとめられている。保護Ｍａｂｓ Ｈ１１２−３Ａ４、Ｈ１１２−１０Ｇ９、Ｈ１１２−１０Ｄ７、Ｈ１１２−１０Ａ２、Ｈ１１２−３Ｅ８、Ｈ１１２−１０Ｃ５、Ｈ１１Ｂ−１１Ｂ８、Ｈ１１Ｂ−１５Ｇ２、Ｈ１１Ｂ−１Ｃ９、Ｈ１１Ｂ−７Ｅ１１、Ｈ１１Ｂ−１３Ｄ５及びＨ１１−１０Ｂ８は、すべてＢＶＨ−１１−２分子上のアミノ酸残基２７１〜８３８に対応するＮｅｗ１０タンパク質と反応性だった。これら１２Ｍａｂｓのうち６種は、ＮＥＷ１９タンパク質内に存在するエピトープに対して向けられ、３種の保護ＭａｂｓはＮＥＷ１４を認識した。興味深いことに、Ｍａｂ Ｈ１１２−３Ａ４及びＨ１１２−１０Ｃ５は、アミノ酸残基７６９と８３７の間に含まれるカルボキシル末端に位置するＢＶＨ−１１−２に対して排他的な別個のエピトープと反応した。また、肺炎球菌ＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１及びＢＶＨ−１１−２分子によって共有されるエピトープと反応性のＭａｂｓ Ｈ１１−７Ｇ１１、Ｈ１１−６Ｅ７及びＨ３−４Ｆ９は、保護Ｈ１１２−１０Ｇ９又はＨ１１２−１１Ｂ８ Ｍａｂと組合せて与えた場合でさえ保護に成功しなかった。これらＭａｂｓは、それぞれ最初の２２５、２２８及び２２６アミノ酸残基を含むＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１及びＢＶＨ−１１−２分子のアミノ末端に位置するエピトープを認識した。ＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１及びＢＶＨ−１１−２タンパク質配列の比較から、多数のアミノ酸が、これら２２５−２２８残基を含むアミノ末端部分内で、全体的に７２．８％の同一性で保存されることが明らかになった（図３２）。
【００８６】
要するに、表９及び表１０に示されるデータは、保護誘発ＢＶＨ−１１−又はＢＶＨ−１１−２−エピトープが、それぞれＢＶＨ−１１及びＢＶＨ−１１−２タンパク質上のアミノ酸２２９〜８４０及び２２７〜８３８を含有するカルボキシ末端産物内に含まれることを示唆している。
【００８７】
表９．ＢＶＨ−１１−及び／又はＢＶＨ−１１−２−特異性Ｍａｂｓによる受動的免疫化は、致死実験的肺炎球菌感染からマウスを保護できる。
2004501618.tif 000029
Ｓ．ニュモニエＷＵ２による静脈内誘発４時間前に全体で０．２ｍｌの腹水をＣＢＡ／Ｎマウスに腹腔内注射した。
【００８８】
表１０． ＢＶＨ−１１−２分子上における保護を与えるエピトープの誘導される位置
2004501618.tif 000030
【００８９】
要するに、この実施例で示されるデータは、Ｓ．ニュモニエ病の予防、診断又は治療のための療法手段として、ＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１又はＢＶＨ−１１−２分子に対して産生される抗体の潜在的用途を実証している。
【００９０】
実施例６
この実施例は、実施例１で述べたＭａｂを用いた表面露出ペプチドドメインの局在化について述べる。
Ｓ．ニュモニエ３型株ＷＵ２は、０．５％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で富化したＴｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ （ＴＨ）ブロス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｄｅｔｒｏｉｔ ＭＩ）内、３７℃で８％ＣＯ２雰囲気で成長させ、０．２６０のＯＤ６００を得た（〜１０８ ＣＦＵ／ｍｌ）。この細菌懸濁液を１ｍｌ試料に等分し、Ｓ．ニュモニエ細胞を遠心分離でペレットにし、ハイブリドーマ培養上清内で再懸濁させた。この細菌緩衝液を２時間４℃でインキュベートした。試料を遮断緩衝液［２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ］内で２回洗浄してから、遮断緩衝液内で希釈された１ｍｌのヤギフルオレッセイン（ＦＩＴＣ）が接合した抗−マウスＩｇＧ＋ＩｇＭを添加した。さらに室温での６０分インキュベーション後、試料を遮断緩衝液内で２回洗浄し、ＰＢＳ緩衝液中の０．２５％ホルムアルデヒドで１８〜２４時間４℃で固定した。細胞をＰＢＳ緩衝液内で１回洗浄し、５００μｌのＰＢＳ緩衝液に再懸濁させた。フローサイトメトリー（Ｅｐｉｃｓ（登録商標） ＸＬ； Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｉｎｃ．）で解析するまで、細胞は暗所で４℃に保持した。１万（１０，０００）個の細胞を試料ごとに解析し、結果を％蛍光及び蛍光指数（ＦＩ）値として示した。％蛍光は、フルオレッセイン標識化Ｓ．ニュモニエ細胞を１００で除した数であり、ＦＩ値は、Ｍａｂ上清で処理した肺炎球菌の蛍光値を、接合体のみ又は対照の無関係なＭａｂで処理した肺炎球菌の蛍光値で除した平均値である。ＦＩ値１は、該Ｍａｂが細菌の表面で検出されなかったことを指すのに対し、２より高いＦＩ値は、少なくとも１０％の肺炎球菌細胞が標識化されているときにポジティブと考えられ、該Ｍａｂは細胞表面露出エピトープと反応性であることを示した。下表１１には、フローサイトメトリーで試験したＭａｂｓで得られたデータがまとめれれている。
【００９１】
フローサイトメトリー解析は、ＢＶＨ−３Ｃ及び／又はＢＶＨ−１１Ａ分子と反応性のＭａｂｓが細胞表面に結合しないことを明らかにした。対照的に、Ｍａｂｓ Ｈ３Ｖ−９Ｃ６及びＨ３Ｖ−１６Ａ７を除き、ＮＥＷ １、ＮＥＷ ２、ＮＥＷ ３、ＮＥＷ ２２又はＮＥＷ ２３ ＢＶＨ−３遺伝子産物と反応性のＭａｂｓは、肺炎球菌の表面で検出された。これらデータは、ＢＶＨ−３のアミノ末端に位置する最初の２２５アミノ酸残基は内部にあることを示した。Ｍａｂｓ Ｈ３Ｖ−９Ｃ６ 及びＨ３Ｖ−１６Ａ７の結合性の欠如は、該配列の、Ｓ．ニュモニエＳＰ６３のＢＶＨ−３分子から欠けている１７７アミノ酸に対応するいくつかの部分が、抗体にアクセスできないようであることを示唆している。
【００９２】
ＢＶＨ−１１−及び／又はＢＶＨ−１１−２−反応性Ｍａｂｓの結果は、表面露出と保護との間に良い関係があることを明らかにした。フローサイトメトリー分析で決定されるように内部エピトープと反応性の全Ｍａｂｓは保護的でないのに対し、実施例５で述べたすべての保護的Ｍａｂｓは、フローサイトメトリーで正のシグナルを与えた。９．０のＦＩ値及び８１．２の％蛍光がＭａｂ Ｈ１１−７Ｇ１１で得られたが、このＭａｂは保護を示さなかった。追加分析を行い、このＭａｂ及びその対応エピトープが抗−感染性免疫に関与するかどうかをさらに評価することができる。
【００９３】
表１１．フローサイトメトリー解析によるＳ．ニュモニエの表面におけるＭａｂｓの結合性から得られた結果
2004501618.tif 000031
2004501618.tif 000032
【００９４】
実施例７
この実施例は、ＢＶＨ−３及びＢＶＨ−１１−２のペプチドエピトープによる動物の免疫化について述べる。
Ｍａｂ ３Ａ４−エピトープ（配列番号：２４）をコードするＤＮＡ断片（配列番号：５上のヌクレオチド２４２１〜２６２６）を含有する組換えｐＳＣＲＥＥＮ−Ｔベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を、エレクトロポレーション（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ ａｐｐａｒａｔｕｓ， ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｌａｂｓ， Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ， Ｃａｎａｄａ）で大腸菌Ｔｕｎｅｒ（λＤＥ３）ｐＬｙｓＳ［ＢＬ２１（Ｆ’ｏｍｐＴ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−） ｇａｌ ｄｃｍ ｌａｃＹＩ ｐＬｙｓＳ （Ｃｍｒ）］（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。この株では、融合タンパク質の発現は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（λＤＥ３プロファージ上に存在し、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能なｌａｃプロモーターの制御下のそれ自体）によって認識されるＴ７プロモーターで制御される。ｐＬｙｓＳプラスミドは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの天然インヒビターであるＴ７リゾチームのコーディングによる基本的な融合タンパク質発現レベルを減少させる。
【００９５】
５０ｍＭ ブドウ糖、１００μｇ／ｍｌ カルベニシリン及び３４μｇ／ｍｌ クロラムフェニコールで補充したＬＢブロス（ペプトン １０ｇ／ｌ、酵母エキス ５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ）内３７℃で、２５０ＲＰＭで撹拌しながら、６００ｎｍにおける吸収が０．７の値に達するまで形質転換体を成長させた。そして、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭまで添加し、Ｔ７ｇｅｎｅ１０タンパク質−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−３Ａ４．１融合タンパク質の過剰発現を誘発し、さらに２５０ＲＰＭで撹拌しながら、２５℃で３時間インキュベーションを行った。８００ｍｌの培養から誘発された細胞を遠心分離でペレットにし、−７０℃で凍結させた。６ヒスチジン残基配列（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）の、金属キレーションＮｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ， Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ， Ｃａｎａｄａ）上に固定化された二価カチオン（Ｎｉ２＋）に対する結合性に基づくアフィニティクロマトグラフィーによって、可溶性細胞フラクションから融合タンパク質を精製した。要するに、ペレット化細胞を解凍し、トリス緩衝ショ糖溶液（５０ｍＭ トリス、２５％（ｗ／ｖ）ショ糖）に再懸濁させ、−７０℃で１５分間凍結させた。細胞を１５分間氷上で２ｍｇ／ｍｌリゾチームの存在下インキュベート後、超音波処理で破壊した。このライセートを１２０００ ＲＰＭで３０分間遠心分離し、１００ＲＰＭで撹拌しながら４℃で一晩中インキュベーションした上清にニッケル荷電Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（ＱＩＡｇｅｎ）を添加した。２０ｍＭトリス、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾールから成るｐＨ ７．９の緩衝液で樹脂を洗浄後、融合３Ａ４．１タンパク質を、２５０ｍＭイミダゾールで補充した同一の緩衝液で溶出した。塩及びイミダゾールの除去は、４℃でＰＢＳに対する透析によって行った。タンパク質濃度はＢＣＡタンパク質分析試薬キット（Ｐｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で決定し、７６０μｇ／ｍｌに調整した。
【００９６】
エピトープペプチド配列による免疫化が病気に対する防御を与えうるかを評価するため、６匹のメスＣＢＡ／Ｎ （ｘｉｄ） マウス（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のグループ を、アフィニティ精製したＴ７ｇｅｎｅ１０タンパク質−Ｈｉｓ・Ｔａｇ−３Ａ４．１融合タンパク質で３週間の間隔をおいて３回皮下誘発し、又は対照としてＰＢＳ中ＱｕｉｌＡアジュバントのみを皮下注射した。３回目の免疫化後１２〜１４日で、マウスをＳ．ニュモニエＷＵ２株で皮下誘発するか又はＰ４２４１株で鼻腔内誘発する。Ｓ．ニュモニエ誘発種菌をチョコレート寒天プレート上に塗布してＣＦＵの数を測定し、誘発用量を検証した。誘発用量は約３００ＣＦＵである。１４日間毎日死亡が記録され、誘発後１４日に、生存マウスを犠牲にし、血液試料をＳ．ニュモニエ生体の存在について試験した。３Ａ４．１タンパク質又は試験した他のタンパク質は、感染に生き残っているマウスの数又は死亡までの平均日数が、対照の偽免疫化グループに比し、３Ａ４．１−免疫化グループ内で有意に大きい場合に、保護的と言われる。
【００９７】
実施例８
この実施例は、ＢＶＨ−３断片及びその変異体を用いた肺炎球菌に対する抗体応答の改善について述べる。
実施例２、３及び６で提示した不完全な遺伝子産物、エピトープ発現コロニー及び生きている無傷肺炎球菌とのＭａｂ反応性の研究から得られた結果を合わせると、表面露出エピトープと内部エピトープとを線引きすることができる。効率的に肺炎球菌細胞に結合されるＭａｂｓによって検出されるエピトープは、配列番号６に示されるＢＶＨ−３のアミノ酸残基２２３〜１０３９間に含まれる領域に認められた。ＢＶＨ−３−カルボキシルハーフ内の保護エピトープの存在は、ＮＥＷ１分子で免疫化したマウスがＰ４２４１株による致死的感染から保護されることを実証することで確認された。
【００９８】
遺伝子配列の比較から、いくつかの株では、配列番号６に示されるように、アミノ酸２４４〜４２０をコードするＢＶＨ−３の領域を欠くので、該株によって引き起こされる病気を阻止するためのワクチンにおけるこの配列の有用性は欠如していることを示唆している（配列番号：９対配列番号：１）。さらに、ＢＶＨ−３断片又はその変異体は、偏在する表面露出保護エピトープに対する免疫応答を目標とする普遍的な高効率のワクチンを開発する目的で設計された。ＮＥＷ１（配列番号：６からアミノ酸残基４７２〜１０３９をコードする）及びＮＥＷ４０（配列番号：６からアミノ酸残基４０８〜１０３９をコードする）と命名されるＢＶＨ−３遺伝子断片は、適切な遺伝子断片の増幅のために操作されたオリゴヌクレオチドの対を用いてＰＣＲによりＳ．ニュモニエ株ＳＰ６４から増幅した。各プライマーは５’末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有し、その結果として増幅産物の消化プラスミドベクターへの方向性インフレームクローニングが可能になった。ＰＣＲ増幅産物を制限エンドヌクレアーゼで消化し、同様に消化された線状プラスミドｐＥＴ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ）発現ベクターに結合した。オリゴヌクレオチドプライマーＨＡＭＪ４８９（ｃｃｇａａｔｔｃｃａｔａｔｇｃａａａｔｔｇｇｇｃａａｃｃｇａｃｔｃ； ＮｄｅＩ）及びＨＡＭＪ２７９ （ｃｇｃｃａａｇｃｔｔｃｇｃｔａｔｇａａａｔｃａｇａｔａａａｔｔｃ； ＨｉｎｄＩＩＩ）をＮＥＷ４０構成に使用した。クローンを、まず大腸菌ＤＨ５α内で安定化後、不完全な遺伝子産物の発現用大腸菌ＢＬ２１（λＤＥ３）中に導入した。ＮＥＷ１及びＮＥＷ４０由来の変異体は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製のＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット及び適切な突然変異を取り込むように設計されたオリゴヌクレオチドを用いて突然変異で得た。組換え分子のＣ末端上の６ヒスチジンｔａｇの存在が、ニッケルクロマトグラフィーによる該タンパク質の精製を単純にした。下表１２及び１３は、それぞれ突然変異実験に用いたプライマーの配列及び生成された変異遺伝子産物を示す。プライマーセット３９、４０、４６、４７又は４８を用いた突然変異実験の結果はサイレント変化となり、発現の過程で、ＢＶＨ−３遺伝子と、より短い二次翻訳開始産物の断片とが共発現されることが観察されたので、所望の遺伝子又は遺伝子断片の発現を向上させる目的で行った。
【００９９】
表１２．ＢＶＨ−３不完全遺伝子についての部位特異的突然変異で用いられるＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーセットのリスト
2004501618.tif 000033
2004501618.tif 000034
【０１００】
表１３． Ｓ．ニュモニエＳＰ６４から産生された不完全な変異ＢＶＨ−３遺伝子産物のリスト
2004501618.tif 000035
＊下線を付したアミノ酸残基は、タンパク質配列の修飾を示す。ヌクレオチド／アミノ酸残基は、ＮＥＷ１０５、ＮＥＷ１０６及びＮＥＷ１０７構成物で欠失されている。
＊＊サイレント突然変異、すなわちポリペプチドはＮｅｗ１と同一である。
【０１０１】
実施例１で前述したように免疫化した７又は８匹のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を病原性Ｓ．ニュモニエＰ４２４１株による鼻腔内誘発に対する保護実験に使用した。マウスを感染後１０〜１４日間観察した。表１５のデータは、明らかにＮＥＷ３５Ａ分子が親ＮＥＷ１と保護という点で同等であることを示している。興味深いことに、ＮＥＷ４０−及びＮＥＷ５６−免疫化グループでは、８匹の動物のうち７及び８匹が生存するという高い生存率が得られた。同様に、アミノ酸残基２３３〜１０３９を含むＮＥＷ２５が、致死的感染から８匹の動物のうち７匹を保護した。
【０１０２】
表１４． 実験的肺炎におけるＢＶＨ−３断片又はその変異体によって媒介される保護
2004501618.tif 000036
【０１０３】
さらに、ワクチン接種動物由来血清抗体の結合能力のフローサイトメトリー解析は、ＮＥＷ４０及びＮＥＷ５６抗体が、ＢＶＨ−３Ｍに対して産生される抗体よりも効率的に生きている無傷の肺炎球菌を標識することを明かにした（表１５）。
【０１０４】
表１５． フローサイトメトリーで測定されたＳ．ニュモニエ３型株ＷＵ２の表面におけるマウス血清抗体の結合性
2004501618.tif 000037
＊ ｎｄ： 行わず
【０１０５】
サイトメトリーの結果は、蛍光指数値として表され、この蛍光指数は、試験血清で処理した肺炎球菌の平均蛍光値をフルオレッセイン接合体のみで処理した肺炎球菌のバックグラウンド蛍光値で除した値である。これらフローサイトメトリー分析では、全血清を１：５０の希釈で使用し、ＢＶＨ−３Ｃ断片又はＱｕｉｌａアジュバントのみで免疫化したマウス由来の血清はバックグラウンド値と同様の値を与えた。
要するに、保護及び肺炎球菌の抗体結合性データは、ＮＥＷ１又はＮＥＷ４０分子及びその変異体を用いたワクチン接種が、保存されている保護的な表面露出エピトープへの免疫応答を方向づけることを示している。
【０１０６】
実施例９
この実施例は、すべてではないにしても多くのＳ．ニュモニエ株に存在するＢＶＨ−１１−２保存保護的表面露出エピトープに対応するキメラエピトープをコードするキメラ欠失（ｄｅｌｅｔａｎｔ）ＢＶＨ−１１−２遺伝子のクローニング及び発現について述べる。
Ｓ．ニュモニエ株ＳＰ６４ ＢＶＨ−１１−２遺伝子由来のヌクレオチド１６６２〜１７４２、１８０６〜２１５３、２１９３〜２４１４及び２４８４〜２６２７にわたる配列番号：５から生じる断片を増幅するように操作されたオリゴヌクレオチドの対を用いるＰＣＲによって、４つの遺伝子領域に対応するＢＶＨ−１１−２遺伝子断片を増幅した。
【０１０７】
使用したプライマーＨＡＭＪ４９０−４９１、ＨＡＭＪ４９２−ＨＡＭＪ４９３、ＨＡＭＪ４９４−ＨＡＭＪ４９５、ＨＡＭＪ４９６−ＨＡＭＪ３５４は、５’末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有し、その結果として増幅産物の消化ｐＥＴ２１ｂ（＋）プラスミドベクターへの方向性インフレームクローニングが可能になった（表１６）。ＰＣＲ−増幅産物を制限エンドヌクレアーゼで消化し、プライマー対ＨＡＭＪ４９０−ＨＡＭＪ４９１で得られたＰＣＲ増幅断片を除き、同様に消化された線状プラスミドｐＳＬ３０１ベクターに結合した。ＨＡＭＪ４９０−ＨＡＭＪ４９１ ＰＣＲ−増幅産物は、ＱＩＡｇｅｎ （Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）製のＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いてアガロースゲルから精製し、何ら前もって制限エンドヌクレアーゼ消化もせずにｐＧＥＭ−Ｔプラスミドに結合した。生成したプラスミド構成物をヌクレオチド配列解析によって確認した。各４種を含有する組換えプラスミドを、ＰＣＲ増幅に使用される各プライマー対の５’末端と対応する制限エンドヌクレアーゼで消化した。断片を前述したようにアガロースゲルから精製し、すべてＢＶＨ１１−２遺伝子の４種の領域のインフレームクローニング用制限酵素ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化された線状プラスミドｐＥＴ２１ｂ（＋）に結合した。クローンをまず大腸菌ＤＨ５α上で安定化後、キメラ肺炎球菌タンパク質分子の発現用の大腸菌ＢＬ２１（λＤＥ３）中に導入した。
生成したＮＥＷ４３遺伝子配列（配列番号：２５７）は図３３に示される。
ＮＥＷ４３タンパク質（配列番号：２５８）の推定アミノ酸配列は図３４に示される。
【０１０８】
表１６． ＮＥＷ４３、ＶＰ４３Ｓ及びＮＥＷ８６の構成に使用したＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーのリスト
2004501618.tif 000038
【０１０９】
表１７．　ＮＥＷ４３の構成のためＳ．ニュモニエＳＰ６４から生成された不完全なＢＶＨ−１１−２遺伝子断片のリスト
2004501618.tif 000039
【０１１０】
表１８． ＮＥＷ４３遺伝子から生成されたＮＥＷ８６及びＶＰ４３Ｓ遺伝子の特性
2004501618.tif 000040
【０１１１】
ＶＰ４３Ｓ及びＮＥＷ８６と命名されたＮＥＷ４３−誘導分子は、表１６及び１８に記載されるＰＣＲプライマーとｐＥＴ２１発現プラスミドベクターを用いて遺伝子増幅及びクローニング実験から生成された。ＮＥＷ４３由来の変異体は、 Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ部位特異的突然変異キット及び適切な突然変異を取り込むように設計されたオリゴヌクレオチドを用いて突然変異により生成された。組換え分子のＣ末端上の６ヒスチジンｔａｇの存在が、ニッケルクロマトグラフィーによる該タンパク質の精製を単純にした。下表１９及び２０は、それぞれ突然変異実験に使用したプライマーの配列及び生成されたＮＥＷ４３変異遺伝子産物を示す。
【０１１２】
表１９． ＮＥＷ４３遺伝子についての部位特異的突然変異で用いたＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーセットのリスト
2004501618.tif 000041
【０１１３】
表２０． Ｓ．ニュモニエＳＰ６４から生成されたＮＥＷ４３変異遺伝子産物のリスト
2004501618.tif 000042
＊ 下線を付したアミノ酸残基は、タンパク質配列の修飾を表す。ヌクレオチド／アミノ酸残基は、ＮＥＷ８８Ｄ１、ＮＥＷ８８Ｄ２及びＮＥＷ８８構成物では欠失されている。
【０１１４】
実施例１で前述したように免疫化した７又は８匹のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を、病原性Ｓ．ニュモニエＰ４２４１株による鼻腔内誘発に対する保護実験に使用した。表２１のデータは、明らかにＮＥＷ１９、ＮＥＷ４３及びその変異体が実験的肺炎に対して保護することを示している。
【０１１５】
表２１． 実験的肺炎におけるＮＥＷ１９及びＮＥＷ４３断片又はその変異体によって媒介される保護
2004501618.tif 000043
【０１１６】
実施例１０
この実施例は、カルボキシル末端又はアミノ末端でのＮＥＷ４３又はその変異体に対する融合におけるＢＶＨ−３又はその変異体のカルボキシ末端領域に対応するキメラタンパク質をコードするキメラ遺伝子のクローニング及び発現について述べる。
ＢＶＨ−３の不完全な変異遺伝子及びＮＥＷ４３又はＮＥＷ４３変異遺伝子を含むキメラ遺伝子は、実施例１で述べた手順に従って設計した。これらキメラ遺伝子によってコードされるポリペプチドは、表２２にリストされている。要するに、プライマーが５’末端に制限エンドヌクレアーゼを有するように操作されたオリゴヌクレオチドの対を用いてＰＣＲにより、キメラ遺伝子に包含されるべき遺伝子断片が増幅され、その結果として該増幅産物の消化プラスミドベクターへの方向性インフレームクローニングが可能になった（表２３及び表２４）。ＰＣＲ増幅産物を制限エンドヌクレアーゼで消化し、線状プラスミドｐＳＬ３０１ベクターに結合した。生成したプラスミド構成物をヌクレオチド配列解析で確認した。ＰＣＲ産物を含有する組換えｐＳＬ３０１プラスミドを同一のエンドヌクレアーゼ制限酵素で再消化してＤＮＡ挿入断片を得た。結果として生じたＤＮＡ挿入断片を精製し、所定のキメラ遺伝子に対応する挿入断片をキメラ遺伝子生成用ｐＵＲＶ２２−ＮｄｅＩベクターに結合した。発現された組換えタンパク質は、複数のクロマトグラフ的精製工程を用い、超音波処理した熱誘導大腸菌培養の遠心分離から得られた上清フラクションから精製した。
【０１１７】
表２２． ＢＶＨ−３の不完全な変異遺伝子及びＮＥＷ４３又はＮＥＷ４３変異遺伝子を含むキメラ遺伝子によってコードされるポリペプチドのリスト
2004501618.tif 000044
＊　キメラに対してコードされたアミノ酸が遺伝子産物として現され、追加のアミノ酸残基が加えられた。Ｍはメチオニン、Ｇはグリシン、Ｐはプロリンである。
【０１１８】
表２３． 表２２にリストされたポリペプチドをコードするキメラ遺伝子生成用に設計されたＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対のリスト
2004501618.tif 000045
【０１１９】
表２４． 表２２にリストされたポリペプチドをコードするキメラ遺伝子生成用に設計されたＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーのリスト
2004501618.tif 000046
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＰ６４ ＢＶＨ−３遺伝子のＤＮＡ配列；配列番号：１である。
【図２】ヌクレオチド１７７７〜４８９６に完全なＳＰ６４ ＢＶＨ−３遺伝子を含有するＤＮＡ配列；配列番号：２である。
【図３】ＳＰ６４ ＢＶＨ−１１遺伝子のＤＮＡ配列；配列番号：３である。
【図４】ヌクレオチド４５〜２５６７に完全なＳＰ６４ ＢＶＨ−１１遺伝子を含有するＤＮＡ配列；配列番号：４である。
【図５】ヌクレオチド１１４〜２６３０に完全なＳＰ６４ ＢＶＨ−１１−２遺伝子を含有するＤＮＡ配列；配列番号：５である。
【図６】ＳＰ６４ ＢＶＨ−３ポリペプチドのアミノ酸配列；配列番号：６である。
【図７】ＳＰ６４ ＢＶＨ−１１ポリペプチドのアミノ酸配列；配列番号：７である。
【図８】ＳＰ６４ ＢＶＨ−１１−２ポリペプチドのアミノ酸配列；配列番号：８である。
【図９】ＳＰ６３ ＢＶＨ−３遺伝子のＤＮＡ配列；配列番号：９である。
【図１０】ＳＰ６３ ＢＶＨ−３ポリペプチドのアミノ酸配列；配列番号：１０である。
【図１１】４Ｄ４．９ポリペプチドのアミノ酸配列；配列番号：１１である。
【図１２】７Ｇ１１．７ポリペプチドのアミノ酸配列；配列番号：１２である。
【図１３】７Ｇ１１．９ポリペプチドのアミノ酸配列；配列番号：１３である。
【図１４】４Ｄ３．４ポリペプチドのアミノ酸配列；配列番号：１４である。
【図１５】８Ｅ３．１ポリペプチドのアミノ酸配列；配列番号：１５である。
【図１６】１Ｇ２．２ポリペプチドのアミノ酸配列；配列番号：１６である。
【図１７】１０Ｃ１２．７ポリペプチドのアミノ酸配列；配列番号：１７である。
【図１８】１４Ｆ６．３ポリペプチドのアミノ酸配列；配列番号：１８である。
【図１９】Ｂ１２Ｄ８．２ポリペプチドのアミノ酸配列；配列番号：１９である。
【図２０】７Ｅ４．１ポリペプチドのアミノ酸配列；配列番号：２０である。
【図２１】１０Ｄ７．５ポリペプチドのアミノ酸配列；配列番号：２１である。
【図２２】１０Ｇ９．３ポリペプチド、１０Ａ２．２ポリペプチド及びＢ１１Ｂ８．１ポリペプチドのアミノ酸配列；配列番号：２２である。
【図２３】１１Ｂ８．４ポリペプチドのアミノ酸配列；配列番号：２３である。
【図２４】Ｍａｂ Ｈ１１Ｂ−１１Ｂ８標的エピトープのアミノ酸配列；配列番号：１６３である。
【図２５】ＢＶＨ−３遺伝子並びにその全長及び不完全ポリペプチドの遺伝子配列コーディングの位置の概略的な説明図であり、ＤＮＡ断片間の関係が相互に示される。
【図２６】ＢＶＨ−１１遺伝子並びにその全長及び不完全ポリペプチドの遺伝子配列コーディングの位置の概略的な説明図であり、ＤＮＡ断片間の関係が相互に示される。
【図２７】ＢＶＨ−１１−２遺伝子並びにその全長及び不完全ポリペプチドの遺伝子配列コーディングの位置の概略的な説明図であり、ＤＮＡ断片間の関係が相互に示される。
【図２８】ＢＶＨ−３タンパク質と、特定のモノクロナール抗体によって認識される内部及び表面エピトープの位置の概略的な説明図である。
【図２９】ＢＶＨ−１１−２タンパク質と、特定のモノクロナール抗体によって認識される保護表面エピトープの位置の概略的な説明図である。
【図３０】プラスミドｐＵＲＶ２２．ＨＩＳのマップであり、ＫａｎＲ、カナマイシン抵抗性コーディング領域；ｃＩ８５７、バクテリオファージλ ｃＩ８５７温度感受性リプレッサー遺伝子；ｌａｍｂｄａ ｐＬ、バクテリオファージλ転写プロモーター；Ｈｉｓ−ｔａｇ、６−ヒスチジンコーディング領域；ターミネーター、Ｔ１転写ターミネーター；ｏｒｉ、複製のｃｏｌＥ１起源。
【図３１】ＢＶＨ−３Ｍ（ｓｐ６４）とＢＶＨ−３（Ｓｐ６３）タンパク質のアミノ酸配列の、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ配列解析ソフトウェア（バージョン６．５．３）のプログラムＣｌｕｓｔａｌ Ｗを用いた比較を示しており、配列の下にコンセンサスラインがあり、記号“＊”及び“．”は、それぞれ同一及び同様のアミノ酸残基を示す。
【図３２】ＢＶＨ−３、ＢＶＨ−１１及びＢＶＨ−１１−２タンパク質のアミノ酸配列の、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ配列解析ソフトウェア（バージョン６．５．３）のプログラムＣｌｕｓｔａｌ Ｗを用いた比較を示しており、配列の下にはコンセンサスラインがあり、記号“＊”及び“．”は、それぞれ同一及び同様のアミノ酸残基を示す。
【図３３】ＮＥＷ４３遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号：２５７）である。
【図３４】ＮＥＷ４３ポリペプチドの推定ＤＮＡ配列（配列番号：２５８）である。
【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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