(57)【要約】ヒトリンホトキシンベータ受容体に特異的な多価抗体構築物、並びに対象における癌の治療および腫瘍容量の抑制におけるその使用を開示する。本発明はヒトリンホトキシンベータ受容体（ＬＴ−β−Ｒ）アゴニストである多価抗体構築物を提供する。１つの実施形態において、多価抗体構築物はＬＴ−β−Ｒエピトープに特異的な抗原認識部位少なくとも１つを含む。特定の実施形態においては、抗原認識部位少なくとも１つはｓｃＦｖドメイン上に位置し、別の実施形態においては全ての抗原認識部位はｓｃＦｖドメインに位置する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンホトキシン−βレセプター（ＬＴ−β−Ｒ）エピトープに対して特異的な抗原認識部位を少なくとも１つ含む、多価抗体。
【請求項２】
少なくとも１つの抗原認識部位が、ｓｃＦｖドメイン上に位置する、請求項１に記載の多価抗体。
【請求項３】
全ての抗原認識部位が、ｓｃＦｖドメイン上に位置する、請求項１に記載の多価抗体。
【請求項４】
前記抗体構築物が、単一特異性である、請求項１に記載の多価抗体。
【請求項５】
前記抗体構築物が、ＣＢＥ１１が結合するエピトープに対して特異的である、請求項４に記載の多価抗体。
【請求項６】
前記抗体構築物が、４価である、請求項５に記載の多価抗体。
【請求項７】
前記抗体構築物が、ＢＨＡ１０エピトープに対して特異的である、請求項４に記載の多価抗体。
【請求項８】
前記抗体構築物が、４価である、請求項７に記載の多価抗体。
【請求項９】
少なくとも１つの抗原認識部位が、ｓｃＦｖドメイン上に位置する、請求項４〜８のいずれか１項に記載の多価抗体。
【請求項１０】
全抗原認識部位が、ｓｃＦｖドメイン上に位置する、請求項４〜８のいずれか１項に記載の多価抗体。
【請求項１１】
前記抗体構築物が、二重特異性である、請求項１に記載の多価抗体。
【請求項１２】
前記抗体構築物がＢＫＡ１１、ＣＤＨ１０、ＢＣＧ６、ＡＧＨ１、ＢＤＡ８、ＣＢＥ１１およびＢＨＡ１０よからなるリンホトキシン−βレセプター（ＬＴ−β−Ｒ）エピトープの群の少なくとも２つのメンバーに対して特異的である、請求項１１に記載の多価抗体。
【請求項１３】
前記抗体構築物が、ＣＢＥ１１エピトープおよびＢＨＡ１０エピトープに対して特異的である、請求項１２に記載の多価抗体。
【請求項１４】
前記抗体構築物が、４価である、請求項１３に記載の多価抗体。
【請求項１５】
前記抗体構築物が、２つのＣＢＥ１１特異的抗原認識部位および２つのＢＨＡ１０特異的認識部位を有する、請求項１４に記載の多価抗体。
【請求項１６】
少なくとも１つの抗原認識部位が、ｓｃＦｖドメイン上に位置する、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の多価抗体。
【請求項１７】
全抗原認識部位が、ｓｃＦｖドメイン上に位置する、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の多価抗体。
【請求項１８】
癌の処置のための医薬の調製のための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項の多価抗体構築物の有効量および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項２０】
被験体に請求項１９の組成物の有効量を投与する工程を包含する、該被験体における癌を治療する方法。
【請求項２１】
該前記被験体が、ヒトである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
配列番号１を含む核酸。
【請求項２３】
配列番号３を含む核酸。
【請求項２４】
配列番号５を含む核酸。
【請求項２５】
配列番号７を含む核酸。
【請求項２６】
配列番号９を含む核酸。
【請求項２７】
配列番号２を含むポリペプチド。
【請求項２８】
配列番号４を含むポリペプチド。
【請求項２９】
配列番号６を含むポリペプチド。
【請求項３０】
配列番号８を含むポリペプチド。
【請求項３１】
配列番号１０を含むポリペプチド。
【請求項３２】
請求項２２〜３１に記載の核酸のいずれか１つを含む、発現ベクター。
【請求項３３】
請求項３２に記載の発現ベクターを含む、細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は２００２年１２月２０日に出願された米国特許出願６０／４３５１５４の優先権を主張する。本出願はまた２００２年１２月２０日に出願された米国特許出願６０／４３５１８５に関連する。これ等の特許および特許出願の各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は免疫学および癌の診断および治療の分野に属する。特に治療方法において化学療法剤と組み合わせた多価リンホトキシンベータ受容体（ＬＴ−β−Ｒ）アゴニスト抗体構築物の製造および使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
リンホトキシンベータ受容体（ＬＴ−β−Ｒ）は、免疫系における発達において、および、濾胞性樹状細胞を含む免疫系における細胞の多数および乾湿細胞型の多数の機能的維持において、十分検討された役割を有する腫瘍壊死因子ファミリーのメンバーである（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ら．，１９９６，Ｉｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５６：１３７）。ＬＴ−β−Ｒに対する既知のリガンドにはＬＴα１／β２およびＬＩＧＨＴと称される第２のリガンドが包含される（Ｍａｕｒｉ  ら．，１９９８，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８：２１）。可溶性リガンドまたはアゴニスト抗受容体モノクローナル抗体のいずれかによるＬＴ−β−Ｒの活性化は特定の癌の死滅を誘導することがわかっている（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ，Ｊ．Ｌ．ら．（１９９６），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：８６７−８７８および米国特許６，３１２，６９１号）。
【０００４】
本発明は多価のＬＴ−β−Ｒアゴニストおよびその治療上の使用を提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明はヒトリンホトキシンベータ受容体（ＬＴ−β−Ｒ）アゴニストである多価抗体構築物を提供する。１つの実施形態において、多価抗体構築物はＬＴ−β−Ｒエピトープに特異的な抗原認識部位少なくとも１つを含む。特定の実施形態においては、抗原認識部位少なくとも１つはｓｃＦｖドメイン上に位置し、別の実施形態においては全ての抗原認識部位はｓｃＦｖドメインに位置する。
【０００６】
本発明はリンホトキシン−ベータ受容体（ＬＴ−β−Ｒ）エピトープに特異的な抗原認識部位少なくとも１つを含む多価抗体を提供する。１つの実施形態においては、抗原認識部位少なくとも１つはｓｃＦｖドメイン上に位置する。別の実施形態においては、全ての抗原認識部位がｓｃＦｖドメイン内に位置する。更に別の実施形態においては、抗体構築物は、例えばＣＢＥ１１が結合するエピトープに対して単一特異性である。更に別の実施形態においては、本発明の多価抗体は４重特異性である。更に別の実施形態においては、抗体構築物はＢＨＡ１０エピトープに特異的である。本発明の更に別の実施形態においては抗体構築物は二重特異性である。１つの実施形態においては、抗体構築物はＣＢＥ１１特異的抗原認識部位２つおよびＢＨＡ１０特異的認識部位２つを有する。
【０００７】
抗体構築物は二価、三価、四価または五価であってよい。特定の実施形態においては、抗体構築物は単一特異性である。１つの実施形態において、抗体構築物はＣＢＥ１１が結合するエピトープに対し手特異的であり、そして一部の実施形態においては４価である。別の実施形態においては、抗体構築物はＢＨＡ１０が結合するエピトープに対して特異的であり、そして一部の実施形態においては４価である。特定の実施形態においては、抗原認識部位の少なくとも１つがｓｃＦｖドメイン内に位置する。特定の実施形態においては、全ての抗原認識部位がｓｃＦｖドメイン内に位置する。他の抗体構築物はヒトＬＴ−β受容体上の異なるエピトープに対して多重特異性であってよい。特定の実施形態においては、抗体構築物は二重特異性である。他の実施形態においては、抗体構築物はＢＫＡ１１、ＣＤＨ１０、ＢＣＧ６、ＡＧＨ１、ＢＤＡ８、ＣＢＥ１１およびＢＨＡ１０よりなるリンホトキシン−ベータ受容体（ＬＴ−β−Ｒ）エピトープの群のメンバー少なくとも２つに対して特異的である。１つの実施形態においては、抗体構築物はＣＢＥ１１およびＢＨＡ１０が結合するエピトープに対して特異的であり、そして特定の実施形態においては、４価である。１つの実施形態においては、抗体構築物はＣＢＥ１１特異的抗原認識部位２つおよびＢＨＡ１０特異的認識部位２つを有する。多重特異性抗体構築物のいずれかにおいて、抗原認識部位少なくとも１つはｓｃＦｖドメイン上に位置し、そして特定の実施形態においては、全ての抗原認識部位がｓｃＦｖドメイン上に位置する。
【０００８】
本発明は更に配列番号１〜１０を含む抗体構築物並びにこれをコードする核酸およびベクター、およびその核酸およびベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０００９】
別の特徴において、本発明は対象となる抗体構築物および薬学的に受容可能なキャリアを含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態においては、医薬組成物は更に有効量の化学療法剤を含んでよく、ここで該組成物の対象への投与により腫瘍の超相加作用的抑制がもたらされる。別の特徴において、本発明は対象となる多価抗体構築物の有効量および薬学的に受容可能なキャリアを含むか、これを負荷されることができる医薬品送達装置を提供する。特定の実施形態においては、医薬品送達装置は更に有効量の化学療法剤を含むか、これを負荷されることができ、ここで該装置を用いた構築物および薬剤の投与により腫瘍の超相加作用的抑制がもたらされる。
【００１０】
別の特徴において、本発明は対象となる抗体構築物の有効量を対象に投与することを含む対象における癌の治療のための方法を提供する。特定の実施形態においては、対象はヒトである。本発明はまた対象に対象となる抗体構築物の有効量を投与する工程を含む対象における腫瘍容量の抑制の方法を提供する。特定の実施形態においては、腫瘍容量の抑制方法は対象となる抗体構築物有効量および化学療法剤を対象に投与することを含み、ここで該構築物および該薬剤の投与は腫瘍の超相加作用的抑制をもたらす。
【００１１】
本発明は更に、対象となる医薬組成物または薬剤送達装置および場合によりその使用説明書を含むキットを提供する。このようなキットの使用は例えば治療用途を包含する。特定の実施形態においては、何れかのキットに含有される対象となる組成物は凍結乾燥されており、使用前に再水和する必要がある。
【００１２】
１つの実施形態においては、本発明の多価抗体を含む医薬組成物は更に化学療法剤有効量を含み、ここで該組成物の投与により腫瘍の超相加作用的抑制がもたらされる。本発明はまた本発明の多価抗体構築物の有効量および薬学的に受容可能なキャリアを含む医薬組成物を記載する。１つの実施形態においては、医薬組成物は更に化学療法剤の有効量を含み、ここで該組成物の投与により腫瘍の超相加作用的抑制がもたらされる。
【００１３】
本発明は本発明の多価抗体構築物の有効量および薬学的に受容可能なキャリアを含むか、これを負荷されることができる医薬品送達装置を包含する。１つの実施形態においては、医薬品送達装置は化学療法剤の有効量を含むか、これを負荷されることができ、ここで該装置を用いた該構築物および該薬剤の投与により腫瘍の超相加作用的抑制がもたらされる。
【００１４】
本発明はまた本発明の多価抗体を含む組成物を含む、対象における癌の治療のためのキットを包含する。１つの実施形態においては、キットはまた取扱説明書を含む。別の実施形態においては、キットは化学療法剤を含む。
【００１５】
本発明はまた本発明の多価抗体構築物の有効量を対象に投与する工程を含む該対象における腫瘍容量を抑制する方法を記載する。
【００１６】
本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な説明および請求項から明らかにされる。
【００１７】
（発明の詳細な説明）
（１．定義）
簡便のために、本発明を更に説明する前に、明細書、実施例および請求項中で使用する特定の用語をここに定義する。
【００１８】
特段の記載が無い限り単数表記は複数表記を包含するものとする。
【００１９】
「投与する」という用語は例えば医薬組成物、対象の系に対し、または対象の特定の領域に対し、又は対象に対し、治療薬を包含する本発明の化合物の送達のための何れかの方法を包含する。「全身投与」、「全身に投与する」、「末梢投与」および「末梢に投与する」という表現は本明細書においては、患者の系内に進入し、これにより代謝および他の同様の過程に付されるように、中枢神経系へ直接ではない化合物、薬剤または他の物質の投与、例えば皮下投与を意味する。「非経腸投与」および「非経腸的に投与する」とは、通常は注射による、経腸的および局所的な投与以外の投与の様式を意味し、そして例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、硬膜内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内および胸骨内の注射および注入を包含する。
【００２０】
本明細書においては「抗体」という用語は完全な、未損傷の抗体、およびＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖおよびその他のフラグメントを意味する。完全な、未損傷の抗体には、例えばモノクローナル抗体、例えばネズミモノクローナル抗体、キメラ抗体、抗イディオタイプ抗体、抗−抗−イディオタイプ抗体、および、ヒト化抗体、並びにその多価の形態が包含される。「免疫グロブリン」または「抗体」（本明細書においては、互換的に使用する）とは、２つの重鎖および２つの軽鎖よりなる基本的な４ポリペプチド鎖構造を有する抗原結合蛋白を指し、ここで該鎖は例えば抗原を特異的に結合する能力を有する鎖間のジスルフィド結合により安定化されている。重鎖および軽鎖は共にドメイン内に折り込まれる。「ドメイン」という用語は例えばβプリーツシートおよび／または鎖内ジスルフィド結合により安定化されたペプチドループを含む（例えば３〜４ペプチドループを含む）重鎖または軽鎖のポリペプチドの球状の領域を指す。ドメインは更に本明細書においては、「定常」ドメインの場合は種々のクラスのメンバーのドメイン内の配列の変異の相対的欠如、または、「可変」ドメインの場合は種々のクラスのメンバーのドメイン内の顕著な変異に基づいて、「定常」または「変異」とされる。軽鎖上の「定常」ドメインは「軽鎖定常領域」、「軽鎖定常ドメイン」、「ＣＬ」領域または「ＣＬ」ドメインとも互換的に称される。重鎖上の「定常」ドメインは「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域または「ＣＨ」ドメインとも互換的に称される。軽鎖上の「可変」ドメインは「軽鎖可変領域」、「軽鎖可変ドメイン」、「ＶＬ」領域または「ＶＬ」ドメインとも互換的に称される。重鎖上の「可変」ドメインは「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域または「ＣＨ」ドメインとも互換的に称される。
【００２１】
「領域」という用語は抗体鎖の部分または区分を指し、そして、本明細書において定義する定常または可変ドメイン、並びに該ドメインのより異なる部分または区分を包含する。例えば、軽鎖可変ドメインまたは領域は本明細書において定義するとおり「フレームワーク領域」即ち「ＦＲ」内に展開している「相補性決定領域」即ち「ＣＤＲ」を包含する。
【００２２】
免疫グロブリンまたは抗体は単量体または多量体の形態で存在できる。「抗原結合フラグメント」という用語は免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチドフラグメントを指し、抗原に結合するか、または、抗原結合（即ち特異的結合）のための未損傷の抗体と（即ち自身の誘導元である未損傷の抗体と）競合する。「コンホーメーション」という用語は蛋白またはポリペプチド（例えば抗体、抗体鎖、そのドメインまたは領域）の３次構造を指す。例えば「軽（または重）鎖のコンホーメーション」という表現は、軽（または重）鎖の可変領域の３次構造を指し、そして、「抗体コンホーメーション」または「抗体フラグメントコンホーメーション」という表現は抗体またはそのフラグメントの３次構造を指す。
【００２３】
結合フラグメントは、組み換えＤＮＡ法によるか、または、未損傷の免疫グロブリンの酵素的または化学的切断により製造する。結合フラグメントにはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ‘）２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ、単一鎖および単一鎖抗体が包含される。「二重特異性」または「２官能性」の免疫グロブリンまたは抗体以外については、免疫グロブリンまたは抗体はその結合部位の各々を同一としていると理解される。「二重特異性」または「２官能性の抗体」は２つの異なる重／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工のハイブリッド抗体である。二重特異性抗体はハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結を含む種々の方法により製造できる。例えばＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ＆  Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ら．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１５４７−１５５３（１９９２）を参照できる。
【００２４】
「抗体構築物」という用語は抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインから得られる抗原結合フラグメント２つ以上を含む組み換え分子を指し、そして、５種のＩｇクラス（例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）の何れかから選択される抗体の定常領域の全体または部分を含んでよい。例えば、抗体構築物は単一の鎖可変フラグメントをそのＣ末端において自身の重鎖が含んでいる抗体から作成してよい。別の例においては、抗体構築物は単一鎖の可変フラグメントを自身のカルボキシおよびアミノ末端において含む抗体の２つの重鎖の定常領域の全体または部分から作成してよい。これ等の構築物の各々の例を図６に模式的に示す。別の例においては、抗体構築物は可変領域２つ以上を有する重鎖２つおよび可変領域１つ以上を有する軽鎖２つを含んでよく、ここで重鎖２つはジスルフィド結合または他の共有結合により連結されている。別の例においては、抗体構築物は可変領域２つ以上を含む重鎖２つを含んでよく、ここで重鎖２つはジスルフィド結合または他の共有結合により連結されている。これ等の構築物の各々の例を図７に模式的に示す。本発明の抗体構築物の別の例は本発明の詳細な説明および実施例に記載するとおりである。
【００２５】
「抗原」という用語は本明細書においては特定の抗体と反応する分子を意味する。
【００２６】
「抗原結合部位」または「抗原認識部位」という用語は抗原上のエピトープに特異的に結合する抗体の領域を指す。
【００２７】
「癌」または「新生物」という用語は一般的には何れかの悪性新生物または細胞の自発的成育または増殖を指す。用語は本明細書においては、完全に生育した悪性新生物並びに前悪性の患部の両方を包含するものとする。例えば「癌」を有する対象は腫瘍または白血病のような白血球増殖を有することができる。特定の実施形態においては、癌を有する対象は腫瘍、例えば固形腫瘍を有する対象である。固形腫瘍を包含する癌は例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、精巣癌、肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、膵臓癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、乳癌並びに前立腺、胃、皮膚、腹部、食道および膀胱の癌を包含する。
【００２８】
「化学療法剤」という用語は外来の細胞または腫瘍細胞のような悪性細胞により誘発される疾患を治療するために使用される何れかの小分子または組成物を指す。化学療法剤の非限定的な例は、ＤＮＡ合成を途絶する薬剤を包含し、そしてトポイソメラーゼＩの阻害剤であり、アルキル化剤であり、または、植物アルカロイドである。「ＤＮＡ合成を途絶する薬剤」という用語はＤＮＡ合成の過程を低減するか抑制することができる何れかの分子または化合物を指す。ＤＮＡ合成を途絶させる薬剤の例は、ヌクレオシド類縁体、例えばピリミジンまたはプリン類縁体、例えばゲムシタビン、またはアントラサイクリン化合物、例えばアドリアマイシン、ダウノムブシン、ドキソルビシンおよびイダムビシン、および、エピポドフィロトキシン、例えばエトポシドおよびテニポシドである。「トポイソメラーゼＩ阻害剤」という用語はトポイソメラーゼＩ酵素の生物学的活性を抑制または低減する分子または化合物を指す。カンプトサールが挙げられる。「アルキル化剤」という用語は蛋白または核酸のような他の分子の親核基（例えばアミン、アルコール、フェノール、有機および無機の酸）と反応し、これによりアルキル基（例えばエチルまたはメチル基）を付加させることができる何れかの分子または化合物を指す。化学療法剤として使用されるアルキル化剤の例はビスルファン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、チオテパ、種々のニトロソ尿素化合物および白金化合物、例えばシスプラチンおよびカルボプラチンを包含する。「植物アルカロイド」という用語は生物学的に活性であり細胞毒性である植物に由来するアルカリ性の窒素含有分子のファミリーに属する化合物を指す。植物アルカロイドの例はタキサン類、例えばタキソール、ドセタキセルおよびパクリタキセル、および、ビンカ類、例えばビンブラスチン、ビンクリスシンおよびビノレルビンを包含する。
【００２９】
「キメラ抗体」という用語は自身の軽鎖および重鎖の遺伝子が種々の種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから遺伝子工学により典型的には構築されている抗体を指す。例えばマウスモノクローナル抗体の遺伝子の可変（Ｖ）セグメントをヒト定常（Ｃ）セグメント、例えばＩｇＧ１およびＩｇＧ４に連結してよい。ヒトアイソタイプＩｇＧ１が好ましい。即ち典型的なキメラ抗体はマウス抗体由来のＶまたは抗原結合ドメインおよびヒト抗体由来のＣまたはエフェクタードメインよりなるハイブリッド蛋白である。
【００３０】
「有効量」という用語は例えばインビトロまたはインビボのいずれかで腫瘍の容量を低減することを包含する所望の結果をもたらすために十分な本発明の化合物を含む化合物、物質または組成物の量を指す。本発明の医薬組成物の有効量は患者における癌の発達を軽減、安定化、防止または遅延させることを含む所望の臨床結果をもたらすために十分な医薬組成物の量である。何れの場合においても本発明の化合物の有効量は１回以上の投与において投与することができる。これ等上記したインジケーターの検出および測定は当業者の知るとおりであり、例えば腫瘍付加の低減、腫瘍大きさの抑制、二次腫瘍の増殖の低減、腫瘍組織における遺伝子発現、バイオマーカーの存在、リンパ節の関与、組織学的等級および核の等級である。
【００３１】
「エピトープ」という用語は優先的および特異的に抗体または抗体構築物が結合する抗原の領域である。モノクローナル抗体は分子的に定義することができる分子の単一の特異的なエピトープに優先的に結合する。本発明においては、多重エピトープは多重特異性抗体により認識されることができる。
【００３２】
「腫瘍容量の抑制」という用語は、腫瘍の容量の低減または減少の何れかを指す。
【００３３】
「ヒト化免疫グロブリン」または「ヒト化抗体」という用語はヒト化免疫グロブリンまたは抗体鎖少なくとも１つ（即ちヒト化軽鎖または重鎖の少なくとも１つ）を含む免疫グロブリンまたは抗体を指す。「ヒト化免疫グロブリン鎖」または「ヒト化抗体鎖」（すなわち「ヒト化免疫グロブリン軽鎖」または「ヒト化免疫グロブリン重鎖」）という用語は、ヒトの免疫グロブリンおよび抗体に実質的に由来する可変のフレームワーク領域および非ヒトの免疫グロブリンまたは抗体に実質的に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば少なくとも１つのＣＤＲ、好ましくは２つのＣＤＲ、より好ましくは３つのＣＤＲ）を含み、そして、更に定常領域（例えば軽鎖の場合は少なくとも１つの定常領域またはその区分、および好ましくは重鎖の場合は３つの定常領域）を含む可変の領域を有する免疫グロブリンまたは抗体の鎖（即ちそれぞれ軽鎖または重鎖）を指す。「ヒト化可変領域」（例えば「ヒト化軽鎖可変領域」または「ヒト化重鎖可変領域」）という用語は、ヒト免疫グロブリンまたは抗体に実質的に由来する可変フレームワーク領域および非ヒト免疫グロブリンまたは抗体に実質的に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変の領域を指す。
【００３４】
「リンホトキシン−ベータ受容体（ＬＴ−β−Ｒ）アゴニスト」という用語はＬＴ−β−Ｒ、細胞表面ＬＴ−β−Ｒクラスタリングおよび／またはＬＴ−β−Ｒシグナリングに結合するリガンドを増強できる何れかの薬剤を指す。
【００３５】
「多価抗体」または「多価抗体構築物」という表現は抗原認識部位１つより多くを含む抗体または抗体構築物を指す。例えば「２価」抗体構築物は抗原認識部位２つを有し、「４価」抗体構築物は抗原認識部位４つを有する。「単一特異性」、「二重特異性」、「三重特異性」、「４重特異性」等の用語は本発明の多価抗体構築物中に存在する異なる抗原認識部位特異性の数（抗原認識部位の数とは異なる）を指す。例えば、「単一特異性」抗体構築物の抗原認識部位は全て同じエピトープに結合する。「二重特異性」抗体構築物は第１のエピトープに結合する抗原認識部位少なくとも１つおよび第１のエピトープとは異なる第２のエピトープに結合する抗原認識部位少なくとも１つを有する。「多価単一特異性」抗体構築物は全てが同じエピトープに結合する複数の抗原認識部位を有する。「多価２重特異性」抗体構築物は複数の抗原認識部位を有し、その一部の数量は第１のエピトープに結合し、一部の数量は第１のエピトープとは異なる第２のエピトープに結合する。「二重特異性−１」（「ＢＳ−１」とも称する）、「二重特異性−２」（「ＢＳ−２」とも称する）、「単一特異性−１」（「ＭＳ−１」とも称する）および「単一特異性−２」（「ＭＳ−２」とも称する）という用語は本明細書において更に説明する特定の抗体構築物を指す。本発明の１つの実施形態においては、抗体は、図６Ｂに示す通り、抗体がＣＢＥ１１抗原認識部位４つを含む単一特異性４価抗体である。
【００３６】
「患者」または「対象」または「宿主」とはヒトまたは非ヒトの動物のいずれかを指す。
【００３７】
「医薬品送達装置」という用語は対象に治療薬または薬剤を投与するために使用してよい何れかの装置を指す。医薬品送達装置の非限定的な例には皮下シリンジ、マルチチャンバーシリンジ、ステント、カテーテル、経皮パッチ、マイクロニードル、マイクロアブレイダーおよび移植可能な制御放出装置が包含される。１つの実施形態においては、「医薬品送達装置」という用語は注射前に２成分を混合できるデュアルチャンバーのシリンジを指す。
【００３８】
「薬学的に許容される」という用語は本明細書においては、調和の取れた医学上の判断の範囲内において、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答または他の問題または合併症を伴うことなく人間および動物の組織に接触させて使用することに適しており、合理的な利益／危険性の比率に相応した化合物、物質、組成物および／または剤型を指す。
【００３９】
「薬学的に受容可能なキャリア」という用語は本明細書においては、身体の一部の臓器または区分から身体の別の臓器または区分に対象となる化合物を運搬または輸送する時に関与する液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤または溶媒カプセル化剤のような薬学的に許容される物質、組成物またはベヒクルを意味する。担体は製剤の他の成分と適合し、患者に対して傷害性を有さないという意味で「許容できる」ものでなければならない。薬学的に受容可能なキャリアとして機能できる物質の一部の例は、（１）糖類、例えば乳糖、グルコースおよびスクロース；（２）澱粉類、例えばコーンスターチおよびバレイショ澱粉；（３）セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロース、エチルセルロースおよびセルロースアセテート；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤、例えばカカオ脂および坐剤用ワックス；（９）油、例えばピーナツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および大豆油；（１０）グリコール類、例えばプロピレングリコール；（１１）ポリオール類、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；（１２）エステル、例えばエチルオレエートおよびエチルラウレート；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質非含有水；（１７）等張性食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；および（２２）医薬品製剤で使用される他の非毒性の適合性物質を包含する。
【００４０】
「薬学的に許容される塩」という用語は化合物の相対的に非毒性の無機および有機の酸付加塩を指す。
【００４１】
「Ｆｖフラグメント」という用語は自身の重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む抗体のフラグメントを指す。Ｆｃフラグメントという用語は自身の重鎖の定常ドメインを含む抗体のフラグメントを指す。
【００４２】
「単一鎖可変フラグメントまたはｓｃＦｖ」という用語は重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインが連結したＦｖフラグメントを指す。ｓｃＦｖフラグメントの１つ以上が他の抗体フラグメント（例えば重鎖または軽鎖の定常ドメイン）に連結して抗原認識部位１つ以上を有する抗体構築物を形成してよい。
【００４３】
「腫瘍の超相加作用的抑制」という用語は個々の薬剤の各々に起因する薬剤の組み合わせの作用の合計よりも大きい腫瘍容量の総減少を指す。１つの実施形態においては、超相加作用的抑制は、ＬＴ−β−ＲアゴニストとＬＴ−β−Ｒアゴニストではない化学療法剤の組み合わせの投与により得られる平均腫瘍抑制が、ＬＴ−β−Ｒアゴニストまたは化学療法剤の何れか単独の個別投与により得られる腫瘍抑制の合計より統計学的に有意に高値である場合を包含する。ＬＴ−β−Ｒアゴニストと化学療法剤の複合投与により得られる腫瘍抑制が個々の化合物の予測される相加値より「統計学的に高値である」かどうかは、本発明の詳細な説明に記載する種々の統計学的な方法で決定してよい。
【００４４】
「相乗作用的」という用語は何れかの２つ以上の単一の薬剤の相加的作用よりも更に有効である組み合わせを指す。本発明の１つの実施形態においては、相乗作用的という用語はＬＴ−β−Ｒアゴニストと化学療法剤の両方が個々に腫瘍容量を抑制する能力を有している超相加作用的抑制の組み合わせの型を包含する。「強化」という用語は薬剤の独立した作用の合計よりも２つ以上の薬剤の同時作用が高値となる場合を指す。特定の実施形態においては、強化とはＬＴ−β−Ｒアゴニストまたは化学療法剤の僅か一方が腫瘍容量を抑制する能力を有する超相加作用的抑制の型を指す。
【００４５】
対象における癌を「治療すること」または癌を有する対象を「治療すること」とは癌の程度が低減するか抑制されるように例えば薬剤の投与のような薬学的処置に対象を付すことを指す。治療には例えば、医薬組成物のような組成物の投与が包含され、そして、病理学的事象の開始より予防的に、またはその後に実施してよい。
【００４６】
「腫瘍容量」という用語は腫瘍自身プラス適宜罹患リンパ節を含む腫瘍の総サイズを指す。腫瘍容量は当該分野で知られている種々の方法により、例えばカリパス、コンピューター断層撮影（ＣＴ）または磁気共鳴撮影（ＭＲＩ）走査を用いた腫瘍の寸法の測定および例えばｚ軸直径に基づく、または球状、楕円または立方体のような標準的形状に基づく等式を用いた計算により測定してよい。
【００４７】
（２．多価ＬＴ−β−Ｒアゴニスト抗体構築物およびその製造方法）
１つの実施形態において、本発明の多価抗体構築物はリンホトキシン−ベータ受容体のアゴニストであり、そして、受容体に結合してＬＴ−β−Ｒシグナリングを誘導するドメイン少なくとも２つを含む。これらの構築物は、ＬＴ−ベータ受容体に結合するための特異的な抗原認識部位を含む可変領域２つ以上を含有する重鎖および可変領域１つ以上を含有する軽鎖を含むことができるか、または、ＬＴ−ベータ受容体に結合するための特異的なＣＤＲを含む可変領域２つ以上を含有する軽鎖または重鎖のみを含むように構築することができる。
【００４８】
１つの特徴において、本発明はヒトリンホトキシン−ベータ受容体（ＬＴ−β−Ｒ）アゴニストである多価抗体構築物を提供する。１つの実施形態においては、多価抗体構築物はＬＴ−β−Ｒエピトープに特異的な抗原認識部位少なくとも１つを含む。特定の実施形態においては、抗原認識部位の少なくとも１つはｓｃＦｖドメイン内に位置し、別の実施形態においては全ての抗原認識部位がｓｃＦｖドメイン内に位置する。
【００４９】
抗体構築物は２価、３価、４価または５価であってよい。特定の実施形態においては、抗体構築物は単一特異性である。１つの実施形態においては、抗体構築物はＣＢＥ１１が結合するエピトープに特異的である。別の実施形態においては、本発明の抗体はＣＢＥ１１抗原認識部位４つを含む単一特異性の４価のＬＴ−β−Ｒアゴニスト抗体である。別の実施形態においては、抗体構築物はＢＨＡ１０エピトープに対して特異的であり、ある実施形態においては４価である。これ等の実施形態のいずれにおいても、少なくとも１つの抗原認識部位はｓｃＦｖ上に位置してよく、そしてこれ等の実施形態の特定のものにおいては、全ての抗原認識部位がｓｃＦｖドメイン上に位置してよい。抗体は多重特異的であってよく、その場合本発明の抗体はヒトＬＴ−β受容体の種々異なるエピトープに結合する。
【００５０】
特定の実施形態においては、抗体構築物は二重特異性である。他の実施形態においては抗体構築物は以下の抗体、即ち：ＢＫＡ１１、ＣＤＨ１０、ＢＣＧ６、ＡＧＨ１、ＢＤＡ８、ＣＢＥ１１およびＢＨＡ１０のうちの１つが結合するエピトープよりなるリンホトキシン−ベータ受容体（ＬＴ−β−Ｒ）エピトープの群のメンバー少なくとも２つに対して特異的である。１つの実施形態においては、抗体構築物はＣＢＥ１１およびＢＨＡ１０抗体が結合するエピトープに対して特異的であり、そして特定の実施形態においては、４価である。１つの実施形態においては、抗体構築物はＣＢＥ１１特異的抗原認識部位２つおよびＢＨＡ１０特異的抗原認識部位２つを有し、その場合、抗体は２重特異性４価ＬＴ−β−Ｒアゴニスト抗体である。多重特異性抗体構築物のいずれかにおいて、抗原認識部位少なくとも１つはｓｃＦｖドメイン上に位置してよく、そして特定の実施形態においては、全ての抗原認識部位がｓｃＦｖドメイン上に位置する。
【００５１】
更に別の実施形態においては、本発明の抗体構築物は以下のポリヌクレオチド配列およびコードされたポリペプチド配列を含む。
【表Ａ】
2006515750.tif 000002
【００５２】
実施例１〜９は上記の表において列挙した二重特異性、単一特異性および５量体のＬＴ−β−Ｒアゴニスト抗体構築物を得るための詳細な説明を与える。これ等の構築物の特定のものの模式図は図６Ａおよび６Ｂに示す通りである。しかしながら本発明の他のＬＴ−β−Ｒアゴニスト抗体構築物を以下に概説するとおり当該分野で知られた方法を用いて構築しても良い。このような構築物の数例を図７に示す。
【００５３】
抗原認識部位または全体の可変領域は親抗体１つ以上から誘導してよい。親抗体は天然の抗体または抗体フラグメント、天然の抗体から適合された抗体または抗体フラグメント、ＬＴ−ベータ受容体に特異的であることがわかっている抗体または抗体フラグメントの配列を用いて新規に構築された抗体を包含する。親抗体から誘導してよい配列は重鎖および／または軽鎖の可変領域および／またはＣＤＲ、フレームワーク領域またはその別の区分を包含する。
【００５４】
多価の多重特異性抗体は可変領域２つ以上を含む重鎖および／または可変領域１つ以上を含む軽鎖を含有してよく、ここで可変領域の少なくとも２つはＬＴ−ベータ受容体の異なるエピトープを認識する。
【００５５】
多価の抗ＬＴ−β−Ｒ抗体はネズミまたはヒト化ＢＨＡ１０（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ  ら．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：３３（１９９５）；Ｂｒｏｗｎｉｎｇ  ら．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：８６７（１９９６））および／またはネズミまたはヒト化ＣＢＥ１１（米国特許６，３１２，６９１号）を包含する親抗ＬＴ−β−Ｒ抗体から誘導される種々の配列を用いて種々の方法で構築してよい。
【００５６】
モノクローナル抗ＬＴ−β−Ｒ抗体を生産する以下のハイブリドーマ細胞系統を用いて抗ＬＴ−β−Ｒ抗体を生産してよく、それより抗体構築物配列が誘導され、そしてこれ等は既にブタペスト条約に基づいてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されており、そして以下のＡＴＣＣ受託番号で登録されている。
【表Ｂ】
2006515750.tif 000003
【００５７】
しかしながら種々の他の多価抗体構築物が当業者により日常的な組み換えＤＮＡ技術、例えば、ＰＣＴ国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；欧州特許出願１８４，１８７；欧州特許出願１７１，４９６；欧州特許出願１７３，４９４；ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ８６／０１５３３；米国特許４，８１６，５６７；欧州特許出願１２５，０２３；Ｂｅｔｔｅｒ  ら．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕ  ら．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕ  ら．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎ  ら．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ら．（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄ  ら．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９；Ｓｈａｗ  ら．（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉ  ら．（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４：２１４；米国特許５，２２５，５３９；Ｊｏｎｅｓ  ら．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ  ら．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；Ｂｅｉｄｌｅｒ  ら．（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０；およびＷｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３４９，ｐｐ．２９３−９９（１９９１））に記載のものを用いて開発できる。好ましくは非ヒト抗体はヒト定常ドメインに非ヒト抗原結合ドメインを連結することにより「ヒト化」される（例えばＣａｂｉｌｌｙ等、米国特許４，８１６，５６７；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，ｐｐ．６８５１−５５（１９８４）参照）。
【００５８】
対象となる抗ＬＴ−β−Ｒ抗体構築物を作成するために使用してよい別の方法は以下の文献、即ち：Ｇｈｅｔｉｅ，Ｍａｒｉａ−Ａｎａ  ら．（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９７：１３９２−１３９８；Ｗｏｌｆｆ，Ｅｄｉｔｈ  Ａ．ら．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５；  Ｇｈｅｔｉｅ，Ｍａｒｉａ−Ａｎａ  ら．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４；７５０９−７５１４；Ｋｉｍ，Ｊ．Ｃ．ら．（２００２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９７（４）：５４２−５４７；Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａ，Ａｎｅｔａ  ら．（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：４７−６６；Ｃｏｌｏｍａ  Ｍ．Ｊ．ら．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１５：１５９−１６４；Ｚｕｏ，Ｚｈｕａｎｇ  ら．（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｕｐｐｌ．）１３（５）：３６１−３６７；Ｓａｎｔｏｓ  Ａ．Ｄ．ら．（１９９９）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５：３１１８ｓ−３１２３ｓ；Ｐｒｅｓｔａ，Ｌｅｏｎａｒｄ  Ｇ．（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｌｏｇｙ  ３：２３７−２５６；ｖａｎＳｐｒｉｅｌ，Ａｎｎｅｍｉｅｋ  ら．（２０００）ｒｅｖｉｅｗ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ２１（８）３９１−３９７に記載されている。
【００５９】
候補となる抗体構築物は種々の知られた試験法を用いて活性のあるものをスクリーニングして良い。例えば結合特異性を調べるスクリーニング試験は当該分野でよく知られており、日常的に実施されている。このような試験法の包括的な説明はＨａｒｌｏｗ  ら．（Ｅｄｓ），ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，Ｃｈａｐｔｅｒ  ６を参照できる。後述する実施例は候補ＬＴ−β−Ｒアゴニスト抗体構築物によるＬＴ−β−Ｒ活性化の薬効を測定するための試験法を与える。
【００６０】
上記したとおり製造されたＬＴ−β−Ｒアゴニスト抗体構築物は医薬組成物として使用するために適する純度まで精製してよい。一般的に、精製された組成物は組成物中に存在する全ての物質種の約８５％超、存在する全物質種の約８５％、９０％、９５％、９９％以上となる１種を有する。目的の物質種は組成物が本質的に単一の物質種よりなる本質的な均質物（従来の検出方法では組成物中に夾雑物質種が検出できない）となるまで精製してよい。当業者の知るとおり、本発明のポリペプチドは蛋白精製のための標準的な方法、例えば免疫アフィニティークロマトグラフィー、サイズエクスクルージョンクロマトグラフィー等により、本明細書の記載を参考にしながら精製できる。ポリペプチドの純度は当該分野で知られた多くの方法、例えばアミノ末端アミノ酸配列分析、ゲル電気泳動質量スペクトル分析により測定してよい。
【００６１】
一部の実施形態においては、本発明の多価抗体および抗体フラグメントを化学修飾して所望の作用を得てよい。例えば本発明の抗体および抗体フラグメントのペギル化は、例えば以下の参考文献、即ち、Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３：４−１０（１９９２）；ＥＰｐ１５４３１６；ＥＰ０４０１３８４（各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるとおり、当該分野で知られたいずれかのペギル化方法により行ってよい。好ましくは、ペギル化は反応性のポリエチレングリコール分子（または類似の反応性の水溶性重合体）を用いながら、アシル化反応またはアルキル化反応を介して行う。本発明の抗体および抗体フラグメントのペギル化のための好ましい水溶性重合体はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。本明細書においては、「ポリエチレングリコール」とはモノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールのような他の蛋白を誘導するために使用されているＰＥＧの形態の何れも包含する。
【００６２】
本発明のペギル化抗体および抗体フラグメントの製造方法は一般的には、（ａ）抗体または抗体フラグメントがＰＥＧ基１つ以上と結合するような条件下でＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体のようなポリエチレングリコールに抗体または抗体フラグメントを反応させること、および、（ｂ）反応産物を得ること、の工程を包含する。当業者は知られたパラメーターおよび所望の結果に基づいて、旨適な反応条件またはアシル化反応を選択する。
【００６３】
ペギル化抗体および抗体フラグメントは一般的に本明細書に記載する抗体および抗体フラグメントを投与することにより緩解または変調される状態を治療するために使用してよい。一般的に、ペギル化抗体および抗体フラグメントは非ペギル化抗体および抗体フラグメントと比較して延長された半減期を有する。ペギル化抗体および抗体フラグメントは単独で、共に、または、他の医薬組成物と組み合わせて使用してよい。
【００６４】
本発明の他の実施形態においては、抗体またはその抗原結合フラグメントは当該分野で知られた手法を用いてアルブミンにコンジュゲートする。
【００６５】
本発明の別の実施形態においては、多価抗体またはそのフラグメントを修飾することにより潜在的なグリコシル部位を低減または除去する。このような修飾された抗体はしばしば、「グリコシル化抗体」と称される。抗体またはその抗原結合フラグメントの結合親和性を向上させるために、抗体のグリコシル化部位を例えば突然変異誘発（例えば部位指向性突然変異誘発）により改変することができる。「グリコシル化部位」は糖残基の結合のための位置として真核細胞により認識されるアミノ酸残基を指す。オリゴ糖のような炭水化物が結合しているアミノ酸は典型的にはアスパラギン（Ｎ−連結）、セリン（Ｏ−連結）およびスレオニン（Ｏ−連結）残基である。抗体または抗原結合フラグメント内の潜在的なグリコシル化部位を発見するためには、例えばＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓにより与えられるウェブサイトのような公開されたデータベースを用いることにより抗体の配列を調べる（Ｎ連結グリコシル化の予測のためにはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＧｌｙｃ／およびＯ連結グリコシル化部位の予測のためにはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＯＧｌｙｃ／参照）。抗体のグリコシル化部位の改変のための別の方法は米国特許６，３５０，８６１および５，７１４，３５０に記載されている。
【００６６】
本発明の更に別の実施形態においては、未修飾の抗体と比較して少なくとも１つの定常領域媒介の生物学的エフェクター機能が低減されるように抗体の定常領域が修飾されるように、多価抗体またはそのフラグメントを改変する。Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）への結合が低減されるように本発明の抗体を修飾するためには、抗体の免疫グロブリン定常領域セグメントをＦｃＲ相互作用のために必要な特定の領域において突然変異させることができる（例えばＣａｎｆｉｅｌｄ  ら．（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３；およびＬｕｎｄ，Ｊ．ら．（１９９１）Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２６５７参照）。抗体のＦｃＲ結合能力の低下はまた、ＦｃＲ相互作用に依存している別のエフェクター機能、例えばオプソニン作用および貪食作用および抗原依存性細胞毒性も低減する場合がある。
【００６７】
本発明の特定の実施形態においては、本発明は更に例えばエフェクター細胞上の補体または受容体のようなエフェクター分子に結合する能力のような改変されたエフェクター機能を有する多価抗体を特徴とする。特に、本発明のヒト化抗体は改変された定常領域、例えばＦｃ領域を有し、ここでは、Ｆｃ領域中のアミノ酸残基少なくとも１つが異なる残基または側鎖により置き換えられることにより、ＦｃＲに結合する抗体の能力を低減する。抗体のＦｃＲ結合能力の低下はまた、ＦｃＲ相互作用に依存している別のエフェクター機能、例えばオプソニン作用および貪食作用および抗原依存性細胞毒性も低減する場合がある。１つの実施形態においては、修飾されたヒト化抗体はＩｇＧクラスのものであり、例えば未修飾のヒト化抗体と比較して改変されたエフェクター機能をヒト化抗体が有するようにＦｃ領域におけるアミノ酸残基置換少なくとも１つを含む。特定の実施形態においては、本発明のヒト化抗体は免疫原性がより低くなるような（例えば望ましくないエフェクター細胞活性、溶解または補体結合を誘発しないような）および／またはＬＴβＲに対する特異性を保持しつつより望ましい半減期を有するような改変されたエフェクター機能を有している。
【００６８】
或は、本発明はＦｃＲ結合、例えばＦｃγＲ３結合を増強するように改変された定常領域を有する多価ヒト化抗体を特徴とする。このような抗体は例えば特に本発明の癌分野での使用のためにＡＤＣＣ活性を増強するべくエフェクター細胞機能をモジュレートするために有用である。
【００６９】
本明細書においては、「抗体依存性細胞媒介細胞毒性」および「ＡＤＣＣ」とは、ＦｃＲを発現する非特異性細胞毒性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）が標的細胞上の結合抗体を認識し、その後標的細胞の溶解を誘発するような細胞媒介反応を指す。ＡＤＣＣを媒介する第１の細胞、即ちＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球は抗体、例えば抗体と他の薬剤または抗体のコンジュゲートのＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。
【００７０】
更に別の実施形態においては、本発明の多価抗ＬＴ−β−Ｒ抗体は超相加作用的態様において腫瘍容量を抑制するように化学療法剤にコンジュゲートすることができる。本発明の抗体にコンジュゲートできる化学療法剤の例は、放射線コンジュゲート（９０Ｙ、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１８６Ｒｈ等）、腫瘍活性化プロドラッグ（マイタンシノイド、ＣＣ−１０６５類縁体、クリケアミシン誘導体、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド等）、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素を包含する。
【００７１】
（３．多価ＬＴ−β−Ｒアゴニスト抗体構築物の使用を含む複合治療）
本発明は更に癌の治療および／または腫瘍生育の抑制のための化学療法剤と組み合わせた多価ＬＴ−β−Ｒアゴニスト抗体の使用を提供する。同様に種々の化学療法剤の何れかを、本発明の方法において使用、または使用のために試験してよいが、ただし、アゴニストと薬剤の組み合わせはアゴニストおよび薬剤の単独の作用の単純和により期待されるものよりも大きい腫瘍抑制を達成しなければならない。このような化学療法剤は抗代謝剤、アルキル化剤、白金系薬剤、アントラサイクリン、抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤および他のものを包含してよい。種々の形態の化学療法剤および／または他の生物活性剤を使用してよい。これ等には例えば非荷電性分子、分子複合体、塩、エーテル、エステル、アミド等が包含され、これ等は移植、注射または何らかの他の方法で腫瘍内に挿入されれば生物学的に活性化されるものである。
【００７２】
本発明の多価抗体と組み合わせて使用できる化学療法剤はそれらが癌細胞内の特定の化学物質にどのように影響するか、どの細胞活性または過程を薬剤が干渉するか、および、細胞周期のどの特定の段階に薬剤が影響するかにより数種類に分類できる。
【００７３】
特定の実施形態においては、化学療法剤はＤＮＡの合成を途絶させる薬剤である。１つの実施形態においては、ＤＮＡの合成を途絶させる薬剤はヌクレオシド類縁体化合物である。特定の実施形態において、ヌクレオシド類縁体化合物はゲムシタビンである。特定の実施形態においては、ＤＮＡ合成を途絶させる薬剤はアントラサイクリン化合物であり、そして特定の実施形態においては、アントラサイクリン化合物はアドリアマイシンである。
【００７４】
別の実施形態においては、化学療法剤はトポイソメラーゼＩ阻害剤である。特定の実施形態においては、トポイソメラーゼＩ阻害剤はカンプトサールである。
【００７５】
他の実施形態における化学療法剤はアルキル化剤である。アルキル化剤は直接ＤＮＡに作用し、癌細胞の繁殖を防止する。薬剤のクラスとして、これ等の薬剤は期特異的ではない（換言すれば、細胞周期の全期において作用する）。アルキル化剤は慢性の白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、多発性骨髄腫および肺、乳房および卵巣の特定の癌に対して共通して活性である。アルキル化剤の例には、ブスルファム、シスプラチン、カルボプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イフォスファミド、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、メクロレタミン（窒素マスタード）およびメルファランを包含する。１つの実施形態において、アルキル化剤は白金化合物であり、そして特定の実施形態においては、カルボプラチンおよびシスプラチンよりなる群から選択される。特定の実施形態においては、白金化合物はシスプラチンである。
【００７６】
更に別の実施形態においては、化学療法剤は植物アルカロイドである。１つの実施形態においては、植物アルカロイドはタキサンであり、そして特定の実施形態においては、タキソールである。
【００７７】
本発明の多価抗体は癌を治療するための化学療法剤と組み合わせて使用することができ、その場合、化学療法剤および多価抗体の組み合わせは超相加作用を有する。本明細書においては、「腫瘍の超相加作用的抑制」とは、ＬＴ−β−Ｒアゴニストと化学療法剤の組み合わせの投与により得られる平均腫瘍抑制が、ＬＴ−β−Ｒアゴニストまたは化学療法剤の何れか単独の個別投与により得られる腫瘍抑制の合計より統計学的に有意に高値である場合を包含する。ＬＴ−β−Ｒアゴニストと化学療法剤の複合投与により得られる腫瘍抑制が個々の化合物の予測される相加値より「統計学的に高値である」かどうかは、以下に記載する通り決定してよい。このような超相加作用的抑制は前述において定義したとおり強化されているか、または相乗作用となっていて良い。
【００７８】
一般的に、超相加作用的抑制は個々の治療によりその投与群においてそれぞれもたらされる平均腫瘍容量の減少の合計と比較した場合に、統計学的に有意な超相加作用的である平均腫瘍容量の減少を複合投与が投与群においてもたらすかどうかを調べることにより評価してよい。平均腫瘍容量の減少は対照群と投与群の平均腫瘍容量の間の差として計算してよい。腫瘍容量の区分的抑制、「区分的影響」（Ｆａ）は対照群平均腫瘍容で投与群平均腫瘍容量の減少を割ることにより計算してよい。１．０００のＦａは腫瘍の完全な抑制を示す。統計学的に有意な強化について試験することは各投与群に関するＦａの計算を必要とする。複合投与に関する期待される相加作用的Ｆａは、組み合わせの何れかの要素を投与された群の平均のＦａの合計として捉えている。例えば両側１標本ｔ検定を用いて実験により得られた結果がどの程度偶然のみに起因するものであるかをｐ値を尺度として評価してよい。０．０５未満のｐ値は、例えば約０．０５〜約０．０４；約０．０４〜約０．０３；約０．０３〜約０．０２；約０．０２〜約０．０１を含めて、統計学的に有意とみなされ、即ち、偶然のみによるとは考えにくい。特定の場合においては、ｐ値は０．０１未満であってよい。即ち、複合投与群のＦａは複合体が強化された超相加作用的効果がもたらすものとみなすためには単一要素の投与群について期待される相加Ｆａよりも統計学的に有意に高値で無ければならない。
【００７９】
相乗作用が複合投与に起因するものであるか否かは、中央値−作用／複合指数のイソボログラム法により評価してよい（Ｃｈｏｕ  ら．，（１９８４）Ａｄ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．２２：２７）。この方法においては、複合指数（ＣＩ）値はＬＴ−β−Ｒアゴニスト単独、化学療法剤単独および決められたモル比における２者の複合体の中央値−作用プロットから誘導したパラメーターに基づいて異なる用量−作用水準について計算する。ＣＩ値＜１、例えば約０．８５〜約０．９５；約０．７０〜約０．８５；約０．３０〜約０．７０；約０．１０〜約０．３０は相乗作用を示す。更に別の実施形態においては、複合指数は０．１０未満である。この分析は好ましくは、用量作用分析（Ｂｉｏｓｏｆｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）に関わるＣａｌｃｕＳｙｎ，Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて実施する。
【００８０】
超相加作用的効果が複合療法について存在しているか否かを分析するための当該分野において知られた、または後に開発される何れかの方法が適当な化学療法剤のスクリーニングにおける使用を意図される。
【００８１】
腫瘍の超相加作用的抑制が起こるか否かを決定するための化学療法剤と組み合わせる候補ＬＴ−β−Ｒアゴニストの試験方法は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる本出願と同日に出願された「癌の新しい複合療法」と題された出願人等の同時係争中のＰＣＴ出願および２００２年１２月２０日に出願された６０／４３５１８５に記載されている。
【００８２】
（４．医薬組成物）
本発明は上記したＬＴ−β−Ｒアゴニスト抗体構築物を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態においては、医薬組成物は更に化学療法剤を含んでよい。１つの特徴において、本発明は薬学的に受容可能なキャリア（添加剤）および／または希釈剤１つ以上と共に製剤された上記化合物１つ以上の治療有効量を含む薬学的に許容される組成物を提供する。別の特徴において、特定の実施形態である本発明の化合物はそのまま、または薬学的に受容可能なキャリアとの混合物として投与してよく、また、他の化学療法剤と併用して投与してよい。即ち、併用（複合）療法は最初に投与したものの治療効果が後のものを投与した時点で完全に消失していないような方法における活性化合物の逐次的、同時および個別、または共投与を包含する。
【００８３】
選択される投与経路に関わらず、適当に水和された形態で使用してよい本発明の化合物、および／または、本発明の医薬組成物は、当該分野で知られている薬学的に許容される剤型に製剤する。本発明の化合物は単独で投与することも可能であるが、化合物を医薬品製剤（組成物）として投与することが好ましい。本発明の化合物は他の医薬品と同様、ヒトまたは獣医科における使用のための何れかの好都合な方法において投与するために製剤してよい。
【００８４】
後に詳述するとおり、本発明の医薬組成物は特に固体または液体形態において投与するために製剤してよく、例えば以下のもの、即ち（１）経口投与、例えばドレンチ剤（水性、または非水性の溶液または懸濁液）、錠剤、例えば口腔内、舌下用、および全身吸収、塊状、粉末、顆粒、舌上適用ペースト；（２）非経腸投与、例えば皮下、筋肉内、静脈内または硬膜外注射、例えば滅菌溶液または懸濁液、または除放性製剤；（３）局所適用、例えばクリーム、軟膏または制御放出パッチまたは皮膚用スプレー；（４）膣内または直腸内、例えばペサリー剤、クリームまたはフォーム剤；（５）舌下；（６）眼内；（７）経皮；または（８）鼻内投与に適合させたものである。１つの実施形態においては、医薬組成物は非経腸投与のために製剤される。１つの実施形態においては、医薬組成物は動脈内注射用に製剤される。別の実施形態においては、医薬組成物は全身投与のために製剤される。
【００８５】
他の場合において、本発明の化合物は酸性官能基１つ以上を含んでよく、従って、薬学的に許容される塩基と薬学的に許容される塩を形成することができる。
【００８６】
水和剤、乳化剤および潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、並びに、着色料、離型剤、コーティング剤、甘味料、フレーバー剤および芳香剤、保存料および抗酸化剤もまた組成物中に存在してよい。
【００８７】
本発明の製剤は経口、経鼻、局所（口腔内および舌下を含む）、直腸、膣内および／または非経腸の投与に適するもの包含する。製剤は好都合には単位剤型で提供してよく、そして、薬品分野でよく知られた何れかの方法により製造してよい。単回剤型を製造するために担体材料と組み合わせてよい活性成分の量は治療すべき宿主、投与の特定の様式に応じて変動する。単回剤型を製造するために担体材料と組み合わせてよい活性成分の量は一般的には治療効果をもたらす化合物の量である。
【００８８】
本発明の化合物の経口投与用の液体剤型は薬学的に許容される乳液、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルを包含する。活性成分の他に液体剤型は当該分野で一般的に使用されている不活性の希釈剤、例えば水および他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカーボネート、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油脂類（特に綿実油、ピーナツ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルおよびこれ等の混合物を含有してよい。不活性希釈剤の他に経口用組成物はまた補助剤、例えば湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味料、フレーバー剤、着色料、芳香剤および保存料を含有してよい。懸濁液は活性化合物のほかに、懸濁剤、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカントおよびこれ等の混合物を含有してよい。
【００８９】
経口投与に適する本発明の製剤はカプセル、カシェ剤、丸薬、錠剤、ロゼンジ（通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカントであるフレーバー添加基材を用いる）、粉末、顆粒または水性または非水性の液体中の溶液または懸濁液、または水中油型または油中水型の液体乳液、またはエリキシルまたはシロップ、またはパスチル（ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアのような不活性基材をも散る）および／またはマウスウォッシュ等の形態であってよく、これ等の各々は活性成分として本発明の化合物の所定の量を含有する。本発明の化合物は塊状、舐め薬またはペーストとして投与してもよい。
【００９０】
経口投与のための本発明の固体剤型（カプセル、錠剤、丸薬、ドラジェ剤、粉末、顆粒等）においては、活性成分を薬学的に受容可能なキャリア１種以上、例えばクエン酸ナトリウムまたはリン酸２カルシウム、および／または以下の何れか、即ち、（１）充填剤または膨張剤、例えば澱粉、乳糖、スクロース、グルコース、マンニトールおよび／またはケイ酸；（２）バインダー、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシア；（３）湿潤剤、例えばグリセロール；（４）錠剤崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、バレイショまたはタピオカ澱粉、アルギン酸、特定のケイ酸塩および炭酸ナトリウム；（５）溶解遅延剤、例えばパラフィン；（６）吸収加速剤、例えば第４アンモニウム化合物；（７）水和剤、例えばセチルアルコール、グリセロールモノステアレートおよび非イオン性の界面活性剤；（８）吸着剤、例えばカオリンおよびベントナイト粘土；（９）潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体のポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびこれ等の混合物；および（１０）着色剤と混合する。カプセル、錠剤および丸薬の場合においては、医薬組成物はまた緩衝剤を含んでよい。同様の型の固体組成物は、乳糖またはミルクシュガー並びに高分子量ポリエチレングリコール等のような賦形剤を用いたソフトおよびハードシェルのゼラチンカプセル中の充填剤としても使用してよい。
【００９１】
錠剤は場合により補助的成分１種以上と共に圧縮または成型することにより作成してよい。圧縮錠剤はバインダー（例えばゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、保存料、錠剤崩壊剤（例えばナトリウム澱粉グリコレートまたは交差結合カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤または分散剤を用いて製造してよい。成型錠剤は不活性の液体希釈剤で湿潤化された粉末化合物の混合物を適当な機械で成型することにより作成してよい。本発明の医薬組成物の錠剤および他の固体剤型、例えばドラジェ剤、カプセル、丸薬および顆粒は場合によりコーティングおよびシェル材、例えば腸溶性コーティングおよび医薬品製剤分野でよく知られた他のコーティングを用いて打刻または調製してよい。また例えば所望の放出特性を与える種々の比率のヒドロキシプロピルメチルセルロース、他の重合体マトリックス、リポソームおよび／または微小球を用いて内包する活性成分の緩徐なまたは制御された放出を与えるように製剤しても良い。また急速放出用に製剤、例えば凍結乾燥してもよい。これ等は例えば細菌保持フィルターを通した濾過により、または、滅菌水または他の滅菌注射用媒体に使用直前に溶解する滅菌固体組成物の形態に滅菌剤を配合することにより滅菌しても良い。これ等の組成物はまた場合により不透明化剤を含有してよく、そして、胃腸管の特定の区域において、場合により遅延した態様で、活性成分のみ、またはこれを優先的に放出する組成物であってよい。使用してよい包埋組成物の例は重合体物質およびワックスである。活性成分はまた適宜上記した賦形剤１種以上を用いてマイクロカプセルの形態としてもよい。
【００９２】
本発明の化合物の局所または経皮投与のための剤型は、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入剤を包含する。活性化合物を滅菌条件下に薬学的に受容可能なキャリアと、そして何れかの保存料、緩衝剤、高圧ガス共に適宜、混合してよい。軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは本発明の活性化合物のほかに、賦形剤、例えば動物および植物性の脂肪、油脂、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛またはこれ等の混合物を含有してよい。粉末およびスプレーは本発明の化合物の他に、賦形剤、例えば乳糖、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミドの粉末またはこれ等の物質の混合物を含有することができる。スプレーは更に、慣用的な高圧ガス、例えばクロロフルオロ炭化水素および揮発性未置換炭化水素、例えばブタンおよびプロパンを含有できる。
【００９３】
非経腸投与に適する本発明の医薬組成物は薬学的に許容される滅菌等張性の水性または非水性の溶液、分散液、懸濁液または乳液、または、使用直前に滅菌注射用溶液または分散液中に希釈再調製する滅菌粉末１種以上と組み合わせて本発明の化合物１つ以上を含有し、これは、糖類、アルコール、抗酸化剤、緩衝剤、殺菌剤、製剤を意図するレシピエントの血液と等張とするための溶質または懸濁または濃厚化剤を含有してよい。これ等の組成物はまた補助物質、例えば保存料、水和剤、乳化剤および分散剤も含有してよい。対象となる化合物に対する微生物の作用の防止は種々の抗細菌剤および抗カビ剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等を含有させることにより確保する。等張性付与剤、例えば糖類、塩化ナトリウム等を組成物に配合することも望ましい。更にまた、注射用医薬品形態の延長された吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる薬剤の配合により行ってよい。
【００９４】
一部の場合においては、薬剤の作用を延長させるために、皮下または筋肉内注射からの薬剤の吸収を遅延させることが望ましい。これは水溶性の乏しい結晶性または不定形の物質の液体懸濁物を使用することにより達成してよい。次に薬剤の吸収速度は溶解の速度に依存しており、後者はまた結晶の大きさおよび結晶型に依存している。或は、非経腸投与薬剤形態の遅延された吸収は脂質ベヒクル中に薬剤を溶解または懸濁することにより達成される。
【００９５】
注射用デポ形態ポリラクチド−ポリグリコリドのような生体分解性の重合体中に対象となる化合物のマイクロカプセルマトリックスを形成することにより作成する。薬剤の重合体に対する比および使用する特定の重合体の性質により、薬剤放出の速度は制御できる。他の生体適合性重合体の例はポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）を包含する。デポ型注射製剤はまた身体組織と適合性のあるリポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬剤を捕獲させることにより調製される。
【００９６】
（５．送達方法および装置）
本発明の医薬組成物は医薬品送達装置の種々のものを用いて投与してよく、これには皮下シリンジ、マルチチャンバーシリンジ、ステント、カテーテル、経皮パッチ、マイクロニードル、マイクロアブレイダーおよび移植可能な制御放出装置が包含される。１つの実施形態においては、医薬品送達装置はＬＴ−β−Ｒアゴニスト抗体構築物の少なくとも有効量を含むか、負荷することができる。このような装置は送達前に装置中で抗体構築物の凍結乾燥形態を希釈再調製する能力を有する。一部の実施形態においては、医薬品送達装置は少なくともＬＴ−β−Ｒアゴニスト有効量および化学療法剤有効量を含有するか、これを負荷できる。装置は一部の実施形態においてはＬＴ−β−Ｒアゴニスト抗体構築物および化学療法剤を同時に送達または投与することができる。装置は装置を用いた投与の前に抗体構築物および化学療法剤を混合する能力を有する。更に別の実施形態においては、装置はアゴニスト抗体構築物および化学療法剤を順次連続して投与することができる。
【００９７】
１つの医薬品送達装置は注射前に２成分を混合すること、または、それらを逐次的に送達することが可能なマルチチャンバーシリンジである。典型的なデュアルチャンバーシリンジおよび予備充填されたこのようなシリンジの自動製造方法はＮｅｕｅ  Ｖｅｒｐａｃｋｕｎｇ，Ｎｏ．３，１９８８，ｐ．５０−５２；Ｄｒｕｇｓ  Ｍａｄｅ  ｉｎ  Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｖｏｌ．３０，Ｐａｇ．１３６−１４０（１９８７）；Ｐｈａｒｍ．Ｉｎｄ．４６，Ｎｒ．１０（１９８４）ｐ．１０４５−１０４８およびＰｈａｒｍ．Ｉｎｄ．４６，Ｎｒ．３（１９８４）ｐ．３１７−３１８に記載されている。シリンジ型アンプルは針の連結のための前方ボトル型開口部、２個のピストンおよび前方チャンバー内の凍結乾燥粉末を後方チャンバー内の希釈再調製用液体と混合するための外部型バイパスを有するデュアルチャンバーである。記載された方法はシリンジ筒部の洗浄およびシリコン処理、複数の筒部のキャリアトレーへの挿入、滅菌、筒部後方末端を通過する中央ピストンの導入、トレーの上下反転、前方開口部を通過する粉末溶液の導入、凍結乾燥による乾燥粉末化、凍結乾燥チャンバー内存続時における前方開口部の閉鎖、トレーの反転、筒部後方末端を通過する希釈再調製液の導入、後方ピストンの挿入、トレーからの生成物の除去、および、最終的な制御およびパッケージングの主要工程を包含する。種々の成分で予備充填されたアンプルをシリンジと共に使用するために製造してよい。
【００９８】
別の実施形態においてはマルチチャンバーシリンジはＬｙｏ−ｊｅｃｔシステム（Ｖｅｔｔｅｒ  ＰｈａｒｍａＴｕｒｍ，Ｙａｒｄｌｅｙ，ＰＡ）である。Ｌｙｉ−Ｊｅｃｔを用いることにより、薬剤を凍結乾燥させながら直接シリンジ内に入れることができ、これを迅速希釈再調製および注射のための希釈剤とパッケージにする。これは特許４，８７４，３８１号および５，０８０，６４９号に記載されている。
【００９９】
別の実施形態においては、化合物は２つの個別のシリンジ、カテーテル、マイクロニードル、または注射を可能にする別の装置を用いて投与される。
【０１００】
本発明の医薬組成物はまた微小球、リポソーム、他の微粒子送達システムまたは除放性製剤を罹患組織近傍またはそれと関連させて設置するか、血流中に投入することにより投与しても良い。除放性担体の適当な例は坐剤またはマイクロカプセルのような形状付与品の形態の半透過性重合体マトリックスを包含する。移植可能な、または、マイクロカプセルの除放性マトリックスは、ポリラクチド（米国特許３，７７３，３１９；ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタメートの共重合体（Ｓｉｄｍａｎ  ら．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２，ｐｐ．５４７−５６（１９８５））；ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはエチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒ  ら．，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５，ｐｐ．１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２，ｐｐ．９８−１０５（１９８２））を包含する。
【０１０１】
本発明の組成物は目的とする特定の臨床状態を治療するために有効な用量で投与される。所定の用途に対する好ましい医薬品製剤および治療上効果的な用量用法は例えば患者の状態および体重、所望の治療の程度、および、治療に対する患者の耐容性を考慮すれば、当業者のよく知るものである。
【０１０２】
経皮パッチは身体に対し本発明の化合物の制御された送達を行うという利点を更に有している。このような剤型は適切な媒体中に化合物を溶解または分散することにより作成できる。吸収促進剤もまた皮膚を経由する化合物の流入を増大させるために使用できる。このような流入の速度は、速度制御メンブレンを用いるか、または化合物を重合体のマトリックスまたはゲルに分散させることにより制御できる。
【０１０３】
（６．治療方法）
実施例９に記載する通り、そして図９および１０に示す通り、本発明の多価抗体構築物はインビボで腫瘍重量を有意に低減することにおいて有効である。
【０１０４】
従って、本発明は更に場合により前述した送達装置を用いて医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む癌の新たな治療方法を提供する。本発明の方法は何れかの癌、例えば固形腫瘍を治療するために使用してよい。本発明の化合物で治療できる固形腫瘍の例えば乳房、精巣、肺、卵巣、子宮、子宮頚部、膵臓、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）、結腸並びに前立腺、胃、皮膚、腹部、食道および膀胱の癌である。特定の実施形態においては、方法は対象となる医薬組成物の有効量を対象に非経腸的に投与することを含む。１つの実施形態においては、方法は対象となる組成物を対象に動脈内投与することを包含する。１つの実施形態においては、方法は対象となる組成物の有効量を対象の腫瘍への供給動脈血に直接投与することを含む。１つの実施形態においては、方法は対象となる組成物の有効量をカテーテルを用いて癌の腫瘍への供給動脈血に直接投与することを含む。対象となる組成物を投与するためにカテーテルを使用する実施形態においては、カテーテルの挿入は蛍光顕微鏡またはカテーテルの挿入を観察および／またはガイドできる当該分野で知られた他の方法によりガイドまたは観察してよい。別の実施形態においては、方法は化学塞栓形成法を含む。例えば化学塞栓形成法は油脂基材と混合した樹脂様物質（例えばエチオドール中のポリビニルアルコール）および化学療法剤１つ以上よりなる組成物で癌性の腫瘍に血液供給している血管を遮蔽することを含む。更に別の実施形態においては、方法は対象となる組成物の対象への全身投与を包含する。
【０１０５】
一般的には、本発明の医薬品組成物を利用した化学塞栓形成法または直接の動脈内または静脈内の注射による療法は典型的には部位とは無関係に同様の方法で実施する。慨すれば、塞栓形制すべき領域の血管造影（血管の地図）、または、より典型的には、特定の実施形態においては、Ｘ線撮影しながら、動脈または静脈（塞栓形成すべき、または注射すべき部位により異なる）内に挿入したカテーテルを介して放射線不透明性の造影剤を注射することによりまず動脈造影を実施してよい。カテーテルは経皮的に、または外科的処置により挿入してよい。次に血流が停止したことが観察されるまでカテーテルを介して本発明の医薬組成物を還流することにより血管を閉塞させる。閉塞は血管造影を反復することにより確認する。直接注射を用いる形態においては、次に血管に所望の用量の本発明の医薬組成物を注入する。
【０１０６】
塞栓形成療法は一般的には治療すべき腫瘍または血管の塊の間質全体に渡る阻害剤を含有する組成物の分布をもたらす。動脈管腔に充填されている塞栓粒子の物理的塊が血液供給の閉鎖をもたらす。この作用に加えて、抗血管形成因子の存在が腫瘍または血管の塊に血液供給する新しい血管の形成を防止し、血液供給の遮断の無力化作用を増強する。直接の動脈内または静脈内の投与は一般的には同じく治療すべき腫瘍または血管の塊の間質全体に渡る阻害剤を含有する組成物の分布をもたらす。しかしながら、血液供給は一般的にはこの方法により閉鎖されるとは期待されない。
【０１０７】
本発明の１つの特徴内において、肝臓または他の組織の原発および二次的な腫瘍は塞栓形成または直接の動脈内または静脈内の注射療法を用いて治療される。慨すれば、カテーテルを大腿または上腕動脈を介して挿入し、そして、蛍光ガイダンスの下に動脈系を経由してこれを操舵することにより肝動脈まで進行する。腫瘍に血液供給している血管の完全な遮断を行うために必要な位置まで肝動脈血管分枝内にカテーテルを進行させる一方で可能な限り多くの正常構造に血液供給している動脈分枝は温存する。理想的にはこれは肝動脈の分節分枝であるが、腫瘍の範囲およびその個々の血液供給によっては、胃十二指腸動脈の起点から遠位の全肝動脈または複数の個別の動脈を遮断する必要がある場合もある。所望のカテーテル位置が達成された後、遮断すべき動脈内の流動が停止するまで、好ましくは観察された後でも更に５分間、動脈カテーテルを介して組成物（上記）を注射することにより動脈を塞栓させる。動脈の閉塞はカテーテルを介して放射線不透明の造影剤を注射し、そして蛍光顕微鏡またはＸ線フィルムにより以前は造影剤で充填された血管がもはやそうではないことを明らかにすることにより確認してよい。直接注射を用いる実施形態においては、所望の用量で動脈カテーテルを介して組成物（上記）を注射することにより動脈に注入する。閉塞すべき供給動脈の各々で同様の操作法を反復してよい。
【０１０８】
大部分の実施形態においては、対象となる医薬組成物は予防的または治療的な投与の部分とし配合された治療薬または他の物質の治療有効量を患者に送達するために十分な量で送達すべき物質を配合する。粒子内の活性化合物の所望の濃度は薬剤の吸収、不活性化および排出の速度、並びに化合物の送達速度により異なる。用量の値はまた緩解すべき状態の重症度によっても異なる。何れかの特定の対象に対しては、特定の用量用法は、個体の必要性および組成物の投与を管理または監督する担当者の専門的判断に応じて、経時的に調節しなければならない。典型的には用量は当業者の知る手法を用いて決定される。選択された用量水準は使用する本発明の特定の化合物またはそのエステル、塩またはアミドの活性、投与経路、投与時期、使用する特定の化合物の排出または代謝の速度、治療期間、使用する特定の化合物と組み合わせて使用される他の薬剤、化合物および／または物質、治療すべき患者の年齢、性別、体重、状況、全身状態および病歴および医学分野で知られている類似の要因を含む種々の要因により異なる。
【０１０９】
用量は患者のｋｇ体重当りの組成物の量に基づく。他の量は当業者の知るとおりであり、容易に決定される。或は、本発明の用量は組成物の血漿中濃度を参照して決定してよい。例えば最大血漿中濃度（Ｃｍａｘ）および０時〜無限の血漿中濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ（０−４））を使用してよい。本発明の用量はＣｍａｘおよびＡＵＣ（０−４）の上記値をもたらすもの、および、これ等のパラメーターに関してより高値または低値をもたらす他の用量を包含する。
【０１１０】
当該分野の医師または獣医師は必要な医薬組成物の有効量を容易に決定して処方できる。例えば医師または獣医師は、所望な治療効果を達成するために必要な量より低値の水準で医薬組成物中に用いられる本発明の化合物の投与を開始し、そして、所望の効果が達成されるまで徐々に用量を増大させることができる。
【０１１１】
一般的に、本発明の化合物の適当な一日当たり用量は治療効果をもたらすために有効である最低用量となる化合物の量である。このような有効用量は一般的には上記した要因により変動する。
【０１１２】
ある患者において最も効果的な治療をもたらす何れかの特定の化合物の投与の厳密な時間および量は特定の化合物の活性、薬物動態および生体利用性、患者の生理学的状態（例えば年齢、性別、疾患の型および段階、全身状態、所定の用量への応答性および投薬の型）、投与経路等により異なる。本明細書に記載するガイドラインを用いて投与の旨適化、例えば投与に旨適な時間および／または量の決定を行ってよく、これは対象のモニタリングおよび用量および／または時期の調節よりなる日常的な実験を必要とするのみである。
【０１１３】
対象に投与を行う間、患者の健康状態は２４時間の期間中、所定の時点において関連する指針１つ以上を測定することによりモニタリングしてよい。このようなモニタリングの結果に従って、治療、例えば投与の追加、投与量、投与時期、製剤を最適にしてもよい。同様のパラメーターを測定することにより患者を定期的に再評価して改善の程度を調べるが、このような再評価の初回は典型的には治療開始から４週目の終了時であり、その後の再評価は治療の間は４週〜８週おき、そしてその後は３カ月おきに行う。治療は数ヶ月〜数年継続するが、ヒトの場合は最低１ヶ月が典型的な治療期間である。投与する薬剤の量および場合により投与時間の調節はこれ等の再評価に基づいて行ってよい。
【０１１４】
治療は化合物の旨適用量より低値の少用量を用いて開始してよい。その後、旨適な治療効果が得られるまで用量は少量ずつ増量してよい。
【０１１５】
本発明の数種の化合物または他の化学療法剤の複合使用は、異なる成分の作用の開始と持続時間は相補的であるため、何れの個々の成分の必要用量も低減する場合がある。このような複合療法の場合、異なる活性物質を共に、または個別に、そして１日のうちで同時に、または異なる時点において送達して良い。対象となる化合物の毒性および治療有効性は、例えばＬＤ５０およびＥＤ５０を測定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的操作法により測定してよい。大きい治療指数を示す組成物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用しても良いが、副作用を低減するためには所望の部位に化合物をターゲティングする送達システムを設計するように留意しなければならない。
【０１１６】
細胞培養試験および動物試験で得られたデータをヒトにおける使用に関わる用量の範囲を設定する際に使用してよい。何れかの補給物またはそれに含まれる何れかの成分の用量は好ましくは毒性が僅か〜皆無であるＥＤ５０を含む循環系濃度の範囲内とする。用量はこの範囲内において、使用する容量および投与経路により変動する。本発明の薬剤に関しては、治療有効用量は細胞培養試験から予め推定してよい。用量は動物モデルにおいては、細胞培養において決定されるように、ＩＣ５０（即ち症状の半最大抑制を達成する被験化合物の濃度）を含む循環血漿中濃度範囲を達成するように設定される。このような情報はヒトにおける有用用量をより正確に決定するために使用してよい。血漿中濃度は例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定してよい。
【０１１７】
（７．キット）
本発明は種々の癌を治療するためのキットを提供する。例えばキットは前述した医薬組成物１つ以上および場合によりその取扱説明書を含んでよい。更に別の実施形態においては、本発明は医薬組成物１つ以上およびその組成物の投与を行うための装置１つ以上を含むキットを提供する。例えば対象となるキットは医薬組成物および癌性の腫瘍内への組成物の直接の動脈内注射を行うためのカテーテルを含んでよい。別の実施形態においては、対象となるキットは送達装置と共に使用するための場合により医薬品として製剤されるか凍結乾燥されたＬＴ−β−Ｒアゴニスト抗体構築物の予備充填されたアンプルを含んでよい。
【実施例】
【０１１８】
（例示）
本発明をここで一般的に記載したが、本発明の特定の特徴および実施形態の説明の目的のためであって本発明を制限する意図が全くない以下の実施例を参照することにより更に容易に理解できる。
【０１１９】
本発明の実施は特段の記載が無い限り、当該分野で知られている細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組み換えＤＮＡおよび免疫学の従来の手法を使用する。このような手法は文献に記載されている。例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：  １９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．，１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓ  ら．，米国特許４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ  ら．，ｅｄｓ），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）を参照できる。
【０１２０】
ｍｕＢＨＡ１０およびｍｕＣＢＥ１１可変領域、ネズミ−ヒトＢＨＡ１０およびＣＢＥ１１キメラ抗体、再形状化（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ＢＨＡ１０およびＣＢＥ１１可変ドメイン、ｈｕＢＨＡ１０およびｈｕＣＢＥ１１をコードする発現ベクター、５量体ｃｈＣＢＥ１１抗体およびこれ等を精製および試験する方法は以前に本出願人の同時係争中のＰＣＴ出願ＷＯ９６／２２７８８、ＷＯ０２／３０９８６およびＰＣＴ／ＵＳ０３／２０７６２２記載されており、これ等は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２１】
（実施例１  ｈｕＣＢＥ１１／ｈｕＢＨＡ１０二重特異性−１抗体の構築および発現）
ｈｕＣＢＥ１１／ｈｕＢＨＡ１０二重特異性−１重鎖はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＣＥＰ４−由来ＥＢＶ発現ベクターｐＣＨ２７４のＮｏｔＩ部位内にｐＸＷ０１８由来の１０８７ｂｐＢｓｒＧＩ−ＮｏｔＩｓｃＦｖ−含有フラグメントおよびｐＥＡＧ１３２５由来の１１７０ｂｐＮｏｔＩ−ＢｓｒＧ１ｈｕＣＢＥ１１重鎖フラグメントをサブクローニングすることにより構築し、プラスミドｐＸＷ０２０を生成した。ｐＸＷ０２０の２．２６ｋｂＮｏｔＩインサートのＤＮＡ配列を確認した。成熟二重特異性−１重鎖のｃＤＮＡ配列は図１Ａに示し、そのコードするアミノ酸配列は図１Ｂに示し；これは２ＸＧｌｙ４Ｓｅｒ可撓性リンカーによりそのＣ末端に連結されたｈｕＢＨＡ１０ｓｃＦｖを有するｈｕＣＢＥ１１重鎖を含む。ｈｕＣＢＥ１１／ｈｕＢＨＡ１０二重特異性−１抗体はｐＸＷ０２０およびｐＡＮＤ０７６、即ちｈｕＣＢＥ１１軽鎖のためのＥＢＶ発現ベクターで同時トランスフェクトすることにより２９３−ＥＢＮＡ細胞内で一過性に発現させた。ｐＡＮＤ０７６にコードされた成熟二重特異性−１軽鎖のｃＤＮＡおよびコードされたアミノ酸配列を図２Ａおよび２Ｂに示す。二重特異性−１構築物は図６Ａに模式的に示す。ｈｕＣＢＥ１１／ｈｕＢＨＡ１０二重特異性−１抗体構築物は一過性にトランスフェクトされた細胞から採取したコンディショニングされた培地のウエスタンブロット分析により確認した。ヘテロ４量体抗体は、ウエスタンブロットを抗ヒトＩｇＧ（重鎖プラス軽鎖）−特異的抗体（親ｈｕＢＨＡ１０、ＥＢＶ発現ベクターｐＫＪＳ０４６およびｐＫＪＳ０４９の同時トランスフェクションにより作成、親ｈｕＣＢＥ１１、ＥＢＶ発現ベクターｐＡＮＤ０７６および陽性対照としてのｐＡＮＤ０９０および陰性対照としての空ベクターｐＣＨ２７４の同時トランスフェクションにより作成）をプローブとして行った場合に検出された。ｈｕＣＢＥ１１／ｈｕＢＨＡ１０二重特異性−１抗体構築物の特異性はフローサイトメトリーにより試験した場合にＨＴ２９およびＣＯＳ７細胞の両方において表面ＬＴ−β−Ｒｏｎを染色するその能力により確認した。ｐＸＷ０２０およびｐＡＮＤ０７６による２９３−ＥＢＮＡ細胞の大規模同時トランスフェクションを行って精製用の抗体を作成した。
【０１２２】
（実施例２  ｓｃＦｖ．ｈｕＣＢＥ１１の構築）
ｈｕＣＢＥ１１の単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ．ｈｕＣＢＥ１１）の構築における第１工程はｐＸＷ０２２と称される突然変異誘発鋳型を作成するためにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋クローニングベクターの２．９１ｋｂＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩベクター骨格フラグメント内にＥＢＶ発現ｐＡＮＤ０９０由来のｈｕＣＢＥ１１重鎖可変ドメインを担持する４３７ｂｐＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをサブクローニングすることである。ｈｕＣＢＥ１１軽鎖可変ドメインを担持するｐＵＣ系プラスミドｐＡＮＤ０７４を以下のプライマー（ａ）ｈｕＣＢＥ１１軽鎖の成熟Ｎ末端にインフレームのＢｓｔＥＩＩ部位、５’重鎖ＦＲ４残基および３Ｘ可撓性Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカーを付加させるための５’ＣＡＡ  ＴＣＴ  ＣＡＡ  ＡＧＣ  ＴＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＧＧＴ  ＣＡＣ  ＣＧＴ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＴＧＧ  ＧＧＧ  ＣＧＧ  ＧＧＧ  ＧＴＣ  ＣＧＧ  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＣＧＧ  ＧＴＣ  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＴＧＧ  ＣＧＧ  ＡＡＧ  ＴＧＡ  ＴＡＴ  ＣＣＡ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＣＣＡ  Ｇ３’（配列番号１１）およびそのリバース相補体、および、（ｂ）リンカーの第２のＧｌｙ４Ｓｅｒの３’末端をＢａｎＨＩ部位としながらｈｕＣＢＥ１１鎖可変ドメインのＣ末端にインフレームの２ＸＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーを付加するための５’ＧＣＡ  ＣＣＡ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＡＧＡ  ＴＣＡ  ＡＡＧ  ＧＧＧ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＧＴＴ  ＣＡＧ  ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＴＣＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＣＣＡ  ＧＴＧ  ＡＣ３’（配列番号１２）を用いて製造元の推奨するプロトコルに従ってＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットを用いた部位指向性突然変異誘発に付した。５’および３’リンカーの両方を含む突然変異体軽鎖プラスミドは導入されたＢｓｔＥＩＩおよびＢａｍＨＩ部位およびＢｇｌＩＩ制限部位の消失をスクリーニングすることにより同定した。得られたプラスミドｐＸＷ０２４の４０５ｂｐＢｓｔＥＩＩ−ＢＡｍＨＩリンカー付ｈｕＣＢＥ１１軽鎖インサートのＤＮＡ配列を確認した。ｐＸＷ０２２由来の４１２ｂｐＮｏｔＩ−ＢｓｔＥＩＩｈｕＣＢＥ１１重鎖可変ドメインフラグメントおよびｐＸＷ０２４由来の４０５ｂｐのＢｓｔＥＩＩ−ＢａｍＨＩリンカー付ｈｕＣＢＥ１１軽鎖フラグメントを２．９４ｋｂＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩベクター骨格フラグメントｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋クローニングベクター内にサブクローニングしてｐＸＷ０２５を作成した。ｐＸＷ０２５内の８１７ｂｐのＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩｓｃＦｖ．ｈｕＣＢＥ１１インサートのＤＮＡ配列を確認したところ、それは軽鎖可変ドメインのＣ末端に融合して２ＸＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーを有する、３ＸＧｌｙ４Ｓｅｒ可撓性リンカーにより軽鎖可変ドメインに連結された重鎖可変ドメイン（そのシグナル配列を有する）を含んでいた。
【０１２３】
（実施例３  ｓｃＦｖ．ｈｕＣＢＥ１１−Ｆｃ融合の構築および発現）
ｓｃＦｖ．ｈｕＣＢＥ１１が親ｈｕＣＢＥ１１ｍＡｂのＬＴβＲ結合活性を温存していることを確認するために、２ＸＧｌｙ４ＳｅｒリンカーｓｃＦｖ．ｈｕＣＢＥ１１が可溶性ヒトＩｇＧ１Ｆｃ（ｓｃＦｖ．ｈｕＣＢＥ１１−Ｆｃ）のＮ末端に結合した可溶性融合蛋白を構築した。この構築物も相応に発現させた。Ｌｏ  ら．，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：４９５−５００により記載されているものと同様の組み換えヒトＩｇＧ１ＦｃｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＥＡＧ１３９７をプライマー５’ＧＴＴ  ＣＴＧ  ＧＡＴ  ＴＣＣ  ＧＧＣ  ＧＴＣ  ＧＧＧＡＴＣ  ＣＧＡ  ＧＣＣ  ＣＡＡ  ＡＴＣ  ＴＡＧ  ＴＧＡ  ＣＡＡ  Ｇ３’（配列番号１３）およびそのリバース相補体を用いながらＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ部位指向性突然変異誘発に付し、ヒンジの５’末端においてインフレームのＢａｍＨＩを付加した。突然変異したプラスミドは導入されたＢａｍＨＩ部位をスクリーニングすることにより同定した。得られたプラスミドｐＸＷ０２３の７１１ｂｐＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩＦｃフラグメントのＤＮＡ配列を確認した。ｐＸＷ０２５由来の８１７ｂｐのＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩｓｃＦｖ．ｈｕＣＢＥ１１フラグメントおよびｐＸＷ０２３の７１１ｂｐのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩＦｃフラグメントをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＣＥＰ４誘導ＥＢＶ発現ベクターｐＣＨ２７４のＮｏｔＩ部位にサブクローニングしてプラスミドｐＸＷ０２６を作成した。発現ベクターｐＸＷ０２６内の１．５３ｂｐのＮｏｔＩｓｃＦｖ．ｈｕＣＢＥ１１−ＦｃｃＤＮＡのＤＮＡ配列を確認した。プラスミドｐＸＷ０２６を２９３−ＥＢＮＡ細胞に一過性のトランスフェクトした。ｓｃＦｖ．ｈｕＣＢＥ１１−Ｆｃ融合蛋白の発現は一過性にトランスフェクトした細胞から採取したコンディショニングされた培地のウエスタンブロット分析により確認した。予測された大きさの単独二量体融合蛋白は、ウエスタンブロットを抗ヒトＦｃ−特異的抗体（親ｈｕＣＢＥ１１、ＥＢＶ発現ベクターｐＡＮＤ０７６および陽性対照としてのｐＡＮＤ０９０および陰性対照としての空ベクターｐＣＨ２７４の同時トランスフェクションにより作成）をプローブとして行った場合に検出された。ｓｃＦｖ．ｈｕＣＢＥ１１−Ｆｃの特異性はフローサイトメトリーにより試験した場合にＨＴ２９細胞上の表面ＬＴｂＲを染色するその能力により確認した。ｐＸＷ０２６による２９３−ＥＢＮＡ細胞の大規模トランスフェクションを行って精製用の抗体を作成した。
【０１２４】
（実施例４  ｈｕＣＢＥ１１／ｈｕＢＨＡ１０二重特異性−２抗体の構築および発現）
Ｆｃ−ｓｃＦｖ．ｈｕＢＨＡ１０およびｓｃＦｖ．ｈｕＣＢＥ１１−Ｆｃ融合蛋白の両方による発現およびＬＴβＲ結合を明らかにした後に、ｈｕＣＢＥ１１／ｈｕＢＨＡ１０二重特異性−２と称される両者単一のｓｃＦｖを含有する複合単一融合蛋白を構築した。ｈｕＣＢＥ１１／ｈｕＢＨＡ１０二重特異性−２抗体発現ベクターは、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＣＥＰ４−由来ＥＢＶ発現ベクターｐＣＨ２７４のＮｏｔＩ部位内にｐＸＷ０１８由来の１０８７ｂｐＢｓｒＧＩ−ＮｏｔＩＦｃ−ｓｃＦｖ．ｈｕＢＨＡ１０−含有フラグメントおよびｐＸＷ０２６由来の１２２０ｂｐＮｏｔＩ−ＢｓｒＧ１ｓｃＦｖ．ｈｕＣＢＥ１１−Ｆｃフラグメントをサブクローニングすることにより構築し、プラスミドｐＸＷ０２７を生成した。ｐＸＷ０２７の２．３１ｋｂＮｏｔＩインサートのＤＮＡ配列を確認した。ｐＸＷ０２７によりコードされる成熟ｈｕＣＢＥ１１／ｈｕＢＨＡ１０二重特異性−２抗体構築物のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列は図３Ａおよび３Ｂに示す通りであり；これはｓｃＦｖ．ｈｕＢＨＡ１０に融合した２ＸＧｌｙ４Ｓｅｒ可撓性リンカーでＦｃのＣ末端で連結されたヒトＩｇＧ１Ｆｃに融合した２ＸＧｌｙ４Ｓｅｒ可撓性リンカーによりＣ末端で連結されたｓｃＦｖ．ｈｕＣＢＥ１１を含む。二重特異性−２抗体の模式図を図６Ａに示す。ｈｕＣＢＥ１１／ｈｕＢＨＡ１０二重特異性−２抗体構築物をｐＸＷ０２７によるトランスフェクションにより２９３−ＥＢＮＡ細胞中で一過性に発現させた。ｈｕＣＢＥ１１／ｈｕＢＨＡ１０二重特異性−２抗体構築物の発現は一過性にトランスフェクトした細胞から採取したコンディショニングされた培地のウエスタンブロット分析により確認した。単独二量体抗体はウエスタンブロットを抗ヒトＦｃ−特異的抗体（Ｆｃ−ｓｃＦｖ．ｈｕＢＨＡ１０、ＥＢＶ発現ベクターｐＸＷ０１８のトランスフェクションにより作成、ｓｃＦｖ．ｈｕＣＢＥ１１−Ｆｃ、陽性対照としてのＥＢＶ発現ベクターｐＸＷ０２６および陰性対照としての空ベクターｐＣＨ２７４のトランスフェクションにより作成）をプローブとして行った場合に検出された。ｈｕＣＢＥ１１／ｈｕＢＨＡ１０二重特異性−２抗体構築物の特異性はフローサイトメトリーにより試験した場合にＨＴ２９およびＣＯＳ７細胞の両方において表面ＬＴｂＲを染色するその能力により確認した。ｐＸＷ０２７による２９３−ＥＢＮＡ細胞の大規模トランスフェクションを行って精製用の抗体を作成した。
【０１２５】
（実施例５  単一特異性−１４価ＣＢＥ１１抗体の構築および発現）
ｈｕＣＢＥ１１／ｈｕＢＨＡ１０二重特異性−１および２抗体に設計が同様である単一特異性抗体をｈｕＣＢＥ１１誘導抗原結合部位４つを有するように設計した。ＣＢＥ１１４価単一特異性抗体の模式図を図６Ｂに示す。４価ＣＢＥ１１抗体の構築にはＦｃのＣ末端に融合するためのｓｃＦｖ．ｈｕＣＢＥ１１の再操作が必要であった。鋳型ｐＸＷ０２５によりコードされるｓｃＦｖ．ｈｕＣＢＥ１１の再操作における第１工程はｈｕＣＢＥ１１ｓｃＦｖの５’末端にインフレームのＸｍａｌ部位、ついて可撓性２ＸＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーを付加するための突然変異誘発プライマー（ａ）：５‘ＧＧＡ  ＣＴＧ  ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＧＧＴ  ＣＣＣ  ＣＧＧ  ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＡＧＧ  ＡＧＧ  ＴＧＧ  ＣＧＧ  ＣＴＣ  ＣＧＡ  ＧＧＴ  ＡＣＡ  ＡＣＴ  ＧＧＴ  ＧＧ３’（配列番号１４）およびそのリバース相補体、およびｈｕＣＢＥ１１重鎖可変ドメインのＦＲ２内の内部Ｘｍａｌ部位を除去するための（ｂ）５’ＣＡＴ  ＧＴＡ  ＴＴＧ  ＧＴＴ  ＴＣＧ  ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＡＣＣ  ＧＧＧ  ＡＡＡ  ＧＧＧ  ＧＣＴ  ＧＧＡ  Ｇ３’（配列番号１５）およびそのリバース相補体を用いたＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ部位指向性突然変異誘発であった。突然変異したプラスミドは適切な位置における内部Ｘｍａｌ部位の消失および新しいＸｍａｌ部位の獲得があるものをスクリーニングした。得られたプラスミドｐＸＷ０３２における７８６ｂｐのＢａｍＨＩ−ＸｍａｌｈｕＣＢＥ１１ｓｃＦｖインサートのＤＮＡ配列を確認した。鋳型ｐＸＷ０３２は、ｓｃＦｖ軽鎖可変ドメインＦＲ４の末端に終止コドンを付加し、３’ＮｏｔＩクローニング部位を付加するための突然変異誘発プライマー：５’ＧＣＡ  ＣＣＡ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＡＧＡ  ＴＣＡ  ＡＡＴ  ＧＡＧ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＧＡＴＣＣ３’（配列番号１６）およびそのリバース相補体を用いたＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ部位指向性突然変異誘発に付した。突然変異したプラスミドはＮｏｔＩ部位の獲得があったものをスクリーニングした。得られたプラスミドｐＸＷ０３５の７６７ｂｐのＸｍａｌ−ＮｏｔＩリンカー付ｓｃＦｖ．ｈｕＣＢＥ１１インサートのＤＮＡ配列を確認した。ｐＥＡＧ１３９７由来の７５２ｂｐのＮｏｔＩ−Ｘｍａｌ可溶性ｈｕＩｇＧ１ＦｃフラグメントおよびｐＸＷ０３５由来の７６７ｂｐのＸｍａＩ−ＮｏｔＩリンカー付ｓｃＦｖ．ｈｕＣＢＥ１１フラグメントをｐＣＥＰ４−誘導ＥＢＶ発現ベクターｐＣＨ２７４のＮｏｔＩ部位にサブクローニングし、ｐＸＷ０３８を作成した。ｐＸＷ０３８の１．５２ｋｂのＮｏｔＩＦｃ−ｓｃＦｖ．ｈｕＣＢＥ１１インサートのＤＮＡ配列を確認した。可溶性ｓｃＦｖ．ｈｕＣＢＥ１１はｐＸＷ０３８による２９３−ＥＢＮＡ細胞の一過性トランスフェクションにより発現できる。
【０１２６】
ｐＥＡＧ１３２５由来の１１７０ｂｐのＮｏｔＩ−ＢｓｒＧＩｈｕＣＢＥ１１重鎖フラグメントおよびｐＸＷ０３８由来の１０５７ｂｐのＢｓｒＧＩ−ＮｏｔＩＦｃ−ｓｃＦｖ．ｈｕＣＢＥ１１フラグメントをｐＣＥＰ４誘導ＥＢＶ発現ベクターｐＣＨ２７４のＮｏｔＩ部位にサブクローニングしてｐＸＷ０３９を作成した。ｐＸＷ０３９内の２．２３ｋｂのＮｏｔＩインサートのＤＮＡ配列を確認し；それは２ＸＧｌｙ４Ｓｅｒ可撓性リンカーによりそのＣ末端に連結されたｈｕＣＢＥ１１ｓｃＦｖを有するｈｕＣＢＥ１１重鎖を含有する。単一特異性−１ｈｕＣＢＥ１１はｐＸＷ０３９およびｐＡＮＤ０７６、即ちｈｕＣＢＥ１１軽鎖に関わるＥＢＶ発現ベクターによる２９３−ＥＢＮＡ細胞の一過性に同時トランスフェクションにより発現できる。ｈｕＣＢＥ１１単一特異性−１抗体構築物の成熟重鎖のＤＮＡおよびアミノ酸配列は図４Ａおよび４Ｂ、並びに図６Ｂに示す。
【０１２７】
（実施例６  単一特異性−２の４価ｈｕＣＢＥ１１抗体の構築および発現）
ｈｕＣＢＥ１１／ｈｕＢＨＡ１０二重特異性−２抗体と同様の構造を有する単一特異性の４価のｈｕＣＢＥ１１抗体を構築した。ＣＢＥ１１４価単一特異性抗体の模式図は図６Ｂに示す通りである。構築は以下のクローニング操作法に従って実施した。ｐＸＷ０２６由来の１２２０ｂｐのＮｏｔＩ−ＢｓｒＧＩＦｃ−ｓｃＦｖ．ｈｕＣＢＥ１１フラグメントおよびｐＸＷ０３８由来の１０５７ｂｐのＢｓｒＧＩ−ＮｏｔＩＦｃ−ｓｃＦｖ．ｈｕＣＢＥ１１フラグメントをｐＣＥＰ４誘導ＥＢＶ発現ベクターｐＣＨ２７４のＮｏｔＩ部位にサブクローニングしてｐＸＷ０４０を作成した。ｐＸＷ０４０内の２．２８ｋｂのＮｏｔＩインサートのＤＮＡ配列を確認し；それはｓｃＦｖ．ｈｕＣＢＥ１１に融合した２ＸＧｌｙ４Ｓｅｒ可撓性リンカーによるＦｃＣ末端において連結されたヒトＩｇＧ１Ｆｃに融合した２ＸＧｌｙ４Ｓｅｒ可撓性リンカーによるそのＣ末端において連結されたｓｃＦｖ．ｈｕＣＢＥ１１を含有する。ｐＸＷ０４０によりコードされた成熟単一特異性−２ｈｕＣＢＥ１１構築物のＤＮＡおよびアミノ酸配列を図５Ａおよび５Ｂ、そして模式的に６Ｂに示す。単一特異性−２抗体構築物はｐＸＷ０４０によるトランスフェクションにより２９３−ＥＢＮＡ細胞において一過性に発現できる。
【０１２８】
（実施例７  ５量体キメラＣＢＥ１１の構築および発現）
ＣＢＥ１１可変ドメインのクローニングおよびキメラＣＢＥ１１（ｃｈＣＢＥ１１）カッパ軽鎖およびＩｇＧ１重鎖それぞれのためのＥＢＶ発現ベクターｐＥＡＧ９８２およびｐＥＡＧ９８３の構築は、参照により本明細書に組み込まれる出願人の同時係争中のＰＣＴ出願ＷＯ０２／３０９８６において記載したとおりである。
【０１２９】
Ｓｍｉｔｈ  ら．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：２２２６はＩｇＧ定常領域へのＣ末端ＩｇＭテイルピースの付加は重合体組み換えＩｇＭ様抗体を作成し、その結合親和性を大きく増大させたことを報告している。野生型ＩｇＧ１Ｃ末端ＰＧＫ配列がヒトＩｇＭＣ末端配列ＴＧＫ  ＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭ  ＳＤＴＡＧＴＣＹ（配列番号２１）で置き換えられる、Ｓｍｉｔｈ等により記載されたＣ末端テイルピースを倍加させる、部位指向性突然変異誘発により、ＩｇＭ由来の１８アミノ酸Ｃ末端テイルピースをキメラＣＢＥ１１−ｈｕＩｇＧ１重鎖のＣ末端に付加した。ｐＵＣ誘導クローニングベクター中ＳａｌＩ−ＮｏｔＩフラグメントとしてヒトＩｇＧ１ＦｃｃＤＮＡを含有する鋳型ｐＥＡＧ４０９を、プロリン４４５（ＫａｂａｔＥＵナンバリング）をスレオニンに突然変異させ、ＩｇＭテイルピースの最初の８アミノ酸を付加させている突然変異誘発プライマー５’ＧＡＡ  ＧＡＧ  ＣＣＴ  ＣＴＣ  ＣＣＴ  ＧＴＣ  ＴＡＣ  ＣＧＧ  ＧＡＡ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＣＣＴ  ＧＴＡ  ＣＡＡ  ＣＧＴ  ＧＴＣ  ＣＣＴ  ＧＴＧ  ＡＧＴ  ＧＣＧ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＣ３’（配列番号２２）を用いながら製造元の推奨するプロトコルに従ってＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＢｉｏｔｅｃｈＵＳＥ突然変異誘発キットを用いながらユニーク部位排除（ＵＳＥ）突然変異誘発に付した。突然変異したプラスミドは導入されたＲｓａＩおよびＡｆｌＩＩＩ部位をスクリーニングすることにより同定した。得られたプラスミドｐＥＡＧ４２３のＩｇＧｃＤＮＡのＣ末端を含有するＮｓｉ−ＮｏｔＩインサートのＤＮＡ配列を確認した。
【０１３０】
鋳型プラスミドｐＥＡＧ４２３を、ＩｇＭテイルピースの最後の１０アミノ酸を付加する突然変異誘発プライマー５’ＣＣＣ  ＴＧＴ  ＡＣＡ  ＡＣＧ  ＴＧＴＣ  ＣＣ  ＴＧＧ  ＴＣＡ  ＴＧＴ  ＣＣＧ  ＡＣＡ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＧＣＡ  ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＡＣＴ  ＧＡＧ  ＴＧＣ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  Ｃ３’（配列番号２３）を用いて別のＵＳＥ突然変異誘発に再度付した。突然変異したプラスミドは導入されたＤｄｅＩおよびＰｖｕＩＩ部位をスクリーニングすることにより同定した。得られたプラスミドｐＥＡＧ４２７のＦｃｃＤＮＡ配列を確認した。キメラＣＢＥ１１−ＩｇＧ１重鎖のＣ末端にＩｇＭテイルピースを付加するために、ｐＥＡＧ９８３由来の１．５７ｋｂＮｏｔＩ−ＮｓｉＩフラグメントおよびｐＥＡＧ４２７由来の０．１２ｋｂのＮｓｉＩ−ＮｏｔＩフラグメントをいｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）誘導ＥＢＶ発現ベクターｐＣＨ２６９のＮｏｔＩ部位にサブクローニングして、プラスミドｐＥＡＧ９９５を作成した。
【０１３１】
５量体キメラＣＢＥ１１抗体は重鎖ベクターｐＥＡＧ９９５および軽鎖ベクターｐＥＡＧ９８２で２９３−ＥＢＮＡ細胞を一過性に同時トランスフェクトすることにより作成した。ｐＥＡＧ９９５およびｐＥＡＧ９８２によりコードされる推定成熟ｃＤＮＡ配列を図１１に示す。トランスフェクトされた細胞は単量体および５量体のｃｈＣＢＥ１１の両方を分泌し、結合親和性は大きく増大していた。ウエスタンブロット分析によれば、ｐＥＡＧ９９５での同時トランスフェクションにおいて生産された重鎖は野生型ｃｈＣＢＥ１１−ＩｇＧ１重鎖ベクターｐＥＡＧ９８３での同時トランスフェクションにおいて生産されたものよりも大きいサイズを有していたことがわかった。ｐＥＡＧ９８２およびｐＥＡＧ９９５による一過性の同時トランスフェクションを大規模化して精製のための５量体抗体を作成した。
【０１３２】
（実施例８  多価抗ＬＴＢＲ抗体のインビトロ分析）
腫瘍細胞の成育の抑制における、本発明の多価抗体、例えば二重特異性−１、二重特異性−２、単一特異性１および単一特異性２抗体のインビトロの薬効を測定するために、多価抗体をＣＢＥ１１およびＢＨＡ１０抗体の種々の形態に対して平行して試験した。
【０１３３】
抗体は以下の操作法に従って調製した。ヒト化ＣＢＥ１１およびヒト化ＢＨＡ１０抗体は安定発現ＣＨＯ細胞系統から作成した。二重特異性１、二重特異性２、単一特異性１、単一特異性２およびキメラＣＢＥ１１５量体抗体をＥＢＮＡ２９３細胞における一過性の発現により作成した。７抗体全てをまずプロテインＡセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上のクロマトグラフィーにより精製した。ヒト化ＣＢＥ１１は更にＦｒａｃｔｏｇｅｌ  Ｈｉｃａｐ  ＴＭＡＥ（ＥＭ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）およびフェニルセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上のクロマトグラフィーにより精製した。ヒト化ＢＨＡ１０および二重特異性−１抗体は更に、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  Ｈｉｃａｐ  ＳＥ（ＥＭ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）上のクロマトグラフィーにより精製した。キメラＣＢＥ１１５量体は更にセファロース６Ｂ上のサイズエクスクルージョンクロマトグラフィーにより精製した。
【０１３４】
各抗体（キメラＣＢＥ１１５量体を除く）少量を更にＢ３０００ＳＷ（ＴｏｓｏＨａａｓ）上のサイズエクスクルージョンクロマトグラフィーにより精製し、凝集物（二量体およびより大型の凝集物）があればそれを除去した。１．４の消光係数をヒト化ＣＢＥ１１、ヒト化ＢＨＡ１０およびＣＢＥ１１５量体に対して使用した。１．６の消光係数を二重特異性−１および単一特異性１に対して使用した。１．７の消光係数を二重特異性２および単一特異性２に対して使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量スペクトル分析によれば精製された抗体は少なくとも９５％未損傷であることがわかった。
【０１３５】
本発明の多価抗体の抗腫瘍活性を測定するためにＨＴ２９腺癌細胞系統を用いてインビトロで腫瘍細胞生育を抑制する能力があるかどうか各抗体を調べた。結腸腺癌細胞系統ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ）を１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％ＮＥＡＡを添加したＭＥＭイーグル培地中、３７℃５％ＣＯ２下に生育させた。ＨＴ２９細胞をヒトインターフェロンγ（８０Ｕ／ｍｌ）および種々の濃度の抗体剤を含有する倍地中、９６穴プレートのウェルに播種した（５０００個／ウェル）。培養４日間の後、ミトコンドリア中で還元されて５７０ｎｍにおいて吸収を示す着色したホルマザン生成物であるＭＴＴ［３，４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）２．５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］で生存細胞を染色した。
【０１３６】
ＨＴ２９腺癌細胞系統の成育は図８に示すとおり種々の抗ＬＴＢＲアゴニスト抗体（およびインターフェロンガンマ）の存在下、種々の程度まで低減された。各抗ＬＴＢＲ剤は活性の最大値（４５０ｎｍにおける最小吸光度値）に応じて種々の定常値に達した。この定常値はＬＴＢＲ活性化剤の力価の尺度とした。ヒト化ＢＨＡ１０は最も効果の低い薬剤であり（最小Ａ４５０＝０．９）、次いでヒト化ＣＢＥ１１（最小Ａ４５０＝０．８）であった。ヒト化ＣＢＥ１１およびヒト化ＢＨＡ１１を対にすることにより薬効は有意に増大する（最小Ａ４５０＝０．６）が、単一の４価分子（二重特異性１）中でｈｕＢＨＡ１０抗原結合領域をｈｕＣＢＥ１１に組み合わせることではより高度に薬効が増大した（最小Ａ４５０＝０．５）。抗原結合部位１０箇所を有するＣＢＥ１１５量体が最も強力な薬剤（最小Ａ４５０＝０．３）であった。総括すると、二重特異性（ＢＨＡ１０／ＣＢＥ１１）および単一特異性（ＣＢＥ１１）４価抗体はｈｕＣＢＥ１１およびｈｕＢＨＡ１０と比較して腫瘍細胞生育を抑制する能力が増強されていた。
【０１３７】
（実施例９  胸腺欠如ヌードマウスにおけるｈｕＢＨＡ１０および二重特異性１および２へのＷｉＤｒヒト結腸直腸腺癌の比較応答）
ＷｉＤｒヒト結腸直腸腺癌インビトロ細胞系統をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｙｐｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。細胞系統を１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸および１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム、９０％ウシ胎児血清を含有、１０％抗生物質は無添加となるように調節した２ｍＭＬ−グルタミンおよびＥａｒｌｅＢＳＳを添加した最小必須イーグル培地中４継代インビトロで継代した。
【０１３８】
Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）より２２０匹の雌性胸腺欠如ヌードマウスを入手した。動物を固体別に耳パンチでマークし、その後、無作為割付した。試験群および対照群への無作為割付の当日、動物にＢｉｏＭｅｄｉｃ動物ＩＤチップを移植した。動物には、右脇腹領域皮下に、２ｘ１０Ｅ６細胞／マウス（ＲＰＭＩ−１６４０ｗ／ｏ血清）の細胞接種物を移植した。移植後５日に、腫瘍サイズ測定値を記録し、測定は毎日、または、一日おきに、移植後７日目の段階まで継続した。
【０１３９】
バーニアカリパスで測定した場合に最低５ｍｍ（長さ）ｘ５ｍｍ（幅）のサイズの腫瘍を有するマウスを選択した。マウスをＬａｂＣａｔソフトウエアを用いて試験群および対照群に無作為割付した。初期体重を記録し、そして投与は以下の通り投与群に対して行った。
【０１４０】
（表１）
【０１４１】
【表１】
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投与の効果は以下のインジケーター、即ち、初期体重、１週２回の腫瘍サイズと体重の測定、第１４日、２４日、３５日（投与第７日、１７日、２８日）におけるｈｕＢＨＡ１０群の血清試料（眼球後出血）、および、第１３日、２３日、３４日（投与代７日、１８日、２８日）におけるＢＳ１群および溶媒対照群の１０匹の血清試料（眼球後出血）、により評価した。
【０１４２】
ＷｉＤｒヒト結腸腺癌腫瘍の二重特異性−１に対する応答を図９に示す。ＷｉＤｒヒト結腸腺癌腫瘍生育の抑制における二重特異性−１およびｈｕＣＢＥ１１の薬効の比較は図１０に示す通りである。
【０１４３】
（等価物）
本発明は特に新しい抗体構築物を提供する。対象となる特定の実施形態を論じたが、上記明細書は説明のためのものであり、限定するものではない。本発明の多くの変更は本明細書を参照すれば当業者には容易なものである。添付した請求項はこのような実施形態および変更の全てを特許請求するものであり、本発明の完全な範囲は請求項およびその完全な範囲の等価物、および、明細書およびそのような変更を参照することにより決定されるべきである。
【０１４４】
本発明に記載した全ての出版物および特許は個々の出版物または特許が特定して、そして個別に参考により組み込まれるように記載されるように、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。利害関係が生じる場合は、本発明の出願はそこに記載する何れの定義も含めて、調整を行う。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１Ａ】図１Ａは、ｈｕＣＢＥ１１／ｈｕＢＨＡ１０二重特異性−１抗体構築物の成熟重鎖のポリヌクレオチド（配列番号１）を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ｈｕＣＢＥ１１／ｈｕＢＨＡ１０二重特異性−１抗体構築物の推定ポリペプチド配列（配列番号２）を示す。
【図２】図２は、ｈｕＣＢＥ１１／ｈｕＢＨＡ１０二重特異性−１抗体構築物の成熟軽鎖のポリヌクレオチド（配列番号３）および推定ポリペプチド配列（配列番号４）をそれぞれ示す。
【図３Ａ】図３Ａは、成熟ｈｕＣＢＥ１１／ｈｕＢＨＡ１０二重特異性−２抗体構築物のポリヌクレオチド（配列番号５）を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、成熟ｈｕＣＢＥ１１／ｈｕＢＨＡ１０二重特異性−２抗体構築物の推定ポリペプチド配列（配列番号６）を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ｈｕＣＢＥ１１単一特異性−１抗体構築物の成熟重鎖のポリヌクレオチド（配列番号７）を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ｈｕＣＢＥ１１単一特異性−１抗体構築物の成熟重鎖の推定ポリペプチド配列（配列番号８）を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、成熟ｈｕＣＢＥ１１単一特異性−２抗体構築物のポリヌクレオチド（配列番号９）を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、成熟ｈｕＣＢＥ１１単一特異性−２抗体構築物の推定ポリペプチド配列（配列番号１０）を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、適切に網がけされた領域により示される可変ドメインを有する二重特異性抗体構築物の３次構造の模式図である。図６ＡはＣＢＥ１１およびＢＨＡ１０抗原認識部位を含む二重特異性−１および二重特異性−２抗体の構造を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、適切に網がけされた領域により示される可変ドメインを有する二重特異性抗体構築物の３次構造の模式図である。図６ＢはＣＢＥ１１抗原認識部位を含む単一特異性−１および単一特異性２の４価の抗体の構造を示す。
【図７】図７は、本発明の方法を用いて製造してよい他の抗体構築物の３次構造の模式図である。
【図８】図８は、ｈｕＣＢＥ１１／ｈｕＢＨＡ１０二重特異性−１および二重特異性−２抗体構築物（それぞれ黒丸および黒四角）、単一特異性−１および単一特異性−２抗体構築物（それぞれ黒三角および黒ひし形）、ヒト化抗体ｈｕＣＢＥ１１（白三角）、ヒト化抗体ｈｕＢＨＡ１０（白四角）、ヒト化抗体ｈｕＣＢＥ１１およびｈｕＢＨＡ１０複合投与（白ひし形）および５量体ｃｈｕＣＢＥ１１抗体（白丸）を含む８種のアゴニスト抗ＬＴ−β−Ｒ抗体に関する抗体濃度の関数としてのＨＴ２９細胞増殖を示すグラフである。
【図９】図９は、二重特異性−１（白三角、白四角、白丸および黒丸）、ベヒクル（ＰＢＳ対照、ばつ）およびタキソール（白四角）の記載された用量の関する移植後種々の日数において観察された腫瘍の重量により測定された二重特異性−１に対するＷｉＤｒヒト結腸腺癌腫瘍の応答を示すグラフである。各用量の初回および最終回の投与は矢印で示す。
【図１０】図１０は複数の腫瘍抑制実験で得られたデータとのｈｕＣＢＥ１１および二重特異性−１の活性の回顧的比較を示す。データは各試験における第３４日またはだい３５日のいずれかにおいて以下の式、即ち：（１００−（１００ｘ（試験群平均／プラセボ対照群平均）））を用いて計算した腫瘍生育の％抑制に基づいて計算した。グラフ上の各データポイントは試験で得られた１つの実験の試験群を示す。
【図１１Ａ−１】図１１Ａは、ＣＢＥ１１抗体の５量体形態を含む配列を示す。図１１Ａは成熟５量体キメラＣＢＥ１１重鎖のポリヌクレオチド（配列番号１７）および推定ポリペプチド配列（配列番号１８）を示す。
【図１１Ａ−２】図１１Ａは、ＣＢＥ１１抗体の５量体形態を含む配列を示す。図１１Ａは成熟５量体キメラＣＢＥ１１重鎖のポリヌクレオチド（配列番号１７）および推定ポリペプチド配列（配列番号１８）を示す。
【図１１Ｂ】図１１ＢはＣＢＥ１１抗体の５量体形態を含む配列を示す。図１１Ｂは成熟キメラＣＢＥ１１軽鎖のポリヌクレオチド（配列番号１９）および推定ポリペプチド配列（配列番号２０）を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ−１】
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【図１１Ａ−２】
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【図１１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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