(57)【要約】本発明は、血液のプロテインＣ抗凝固系中で抗凝固活性を表すことが可能かつプロテインＣ（ＰＣ）および活性化型プロテインＣ（ＡＰＣ）から選択される野性型血液凝固成分にアミノ酸配列が実質的に相同な変異体血液凝固成分に関し、前記変異体成分は、対応する野性型血液凝固成分により表される抗凝固活性に比較して高められる抗凝固活性を表すことが可能であり、また、前記変異体成分は、それが前記野性型成分と比較してプロテインＣのＧｌａドメインを構成するそのＮ末端アミノ酸残基配列中に最低１個のアミノ酸残基の改変を含有するためにそれぞれの野性型成分と異なる。本発明はまた、ＤＮＡ技術に基づくこうした変異体の製造方法；前記方法における使用に意図されるＤＮＡセグメント；ならびに治療および診断目的上の前記変異体の使用にも関する。
2004527239.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液のプロテインＣ抗凝固系中で抗凝固活性を示すことが可能で、かつプロテインＣ（ＰＣ）および活性化型プロテインＣ（ＡＰＣ）から選択される野性型血液凝固成分にアミノ酸配列が実質的に相同な変異体血液凝固成分であって、対応する野性型血液凝固成分により示される抗凝固活性に比較して高められる抗凝固活性を示すことが可能であり、そして前記野性型成分と比較して、最初の４５のＮ末端アミノ酸残基および指定されるＧｌａドメインを含んで成るそのＮ末端アミノ酸残基配列中に最低１個のアミノ酸残基の改変を含有する点でそれぞれの野性型成分と異なる、変異体血液凝固成分。
【請求項２】
対応する野性型成分と最低９５％のアミノ酸残基配列の同一性を有する、請求項１記載の変異体成分。
【請求項３】
対応する野性型成分と最低９７％のアミノ酸残基配列の同一性を有する、請求項１記載の変異体成分。
【請求項４】
対応する野性型成分と最低９８％のアミノ酸残基配列の同一性を有する、請求項１記載の変異体成分。
【請求項５】
前記最低１個のアミノ酸残基の改変が、置換、欠失もしくは挿入されたアミノ酸残基より構成される、いずれかの先行する請求項記載の変異体成分。
【請求項６】
前記成分が、野性型成分と比較して高められた膜結合親和性を表す変異体ＰＣもしくは変異体ＡＰＣである、いずれかの先行する請求項記載の変異体成分。
【請求項７】
野性型プロテインＣと比較して高められたカルシウム親和性をさらに表す、請求項６記載の変異体成分。
【請求項８】
前記変異体成分が、前記Ｇｌａドメイン中に最低６および場合によっては７〜１０アミノ酸残基の改変を含有する、いずれかの先行する請求項記載の変異体成分。
【請求項９】
前記変異体成分が、置換突然変異Ｈ１０Ｑ、Ｓ１１Ｇ、Ｓ１２Ｎ、Ｄ２３Ｓ、Ｑ３２Ｅ、Ｎ３３ＤおよびＨ４４Ｙを含有する改変されたＧｌａドメインを含有し、前記改変されたＧｌａドメインは以下のアミノ酸配列：
ＡＮＳＦＬＥＥＬＲＱ  ＧＮＬＥＲＥＣＩＥＥ  ＩＣＳＦＥＥＡＫＥＩ  ＦＥＤＶＤＤＴＬＡＦ  ＷＳＫＹＶ（配列番号３）
を有する、請求項１記載の変異体成分。
【請求項１０】
前記Ｇｌａドメインが位置１０、１１、２８、３２もしくは３３から選択される位置でのアミノ酸置換、およびＧｌａドメイン中の最低１個のさらなる改変を含有し、場合によっては、前記最低１個のさらなる改変が位置１２、２３もしくは４４から選択される、請求項１−７のいずれか１つ記載の変異体成分。
【請求項１１】
前記最低１個のアミノ酸改変が位置１２、２３および４４から選択される位置での置換突然変異であり、前記置換突然変異がＳ１２Ｎ、Ｄ２３ＳおよびＨ４４Ｙから選択される、請求項１−７のいずれか１つ記載の変異体成分。
【請求項１２】
前記最低１個のアミノ酸改変が、位置１０、１１、１２、２３、３２、３３および４４から選択される位置に配置され、かつ、場合によっては置換突然変異であり、また、場合によっては、全部の位置１０、１１、１２、２３、３２、３３および４４が改変される、請求項１−７のいずれか１つ記載の変異体成分。
【請求項１３】
前記改変（１個もしくは複数）が置換である、いずれかの先行する請求項記載の変異体成分。
【請求項１４】
最低１個の保存的置換をさらに含有する、いずれかの先行する請求項記載の変異体成分。
【請求項１５】
前記野性型血液凝固成分がヒト起源のものである、請求項１−１４のいずれか１つ記載の変異体成分。
【請求項１６】
いずれかの先行する請求項記載の変異体血液凝固成分をコードするヌクレオチド配列を含んで成るＤＮＡセグメント。
【請求項１７】
適しては発現ベクターである複製可能なベクター、およびその中に挿入された請求項１６記載のＤＮＡセグメントを含んで成る組換えＤＮＡ分子。
【請求項１８】
適してはその中に安定に組込まれる請求項１７記載の組換えＤＮＡ分子をもつ、微生物もしくは動物細胞、適しては培養された動物細胞系を含んで成る宿主細胞。
【請求項１９】
アデノウイルスでトランスフェクトされたヒト腎細胞である、請求項１８記載の宿主細胞。
【請求項２０】
（ａ）野性型血液凝固成分をコードするＤＮＡを提供すること；
（ｂ）前記野性型ＤＮＡ中に最低１個のヌクレオチド改変を導入して、変異体血液凝固成分をコードする改変されたＤＮＡセグメントを形成すること；および
（ｃ）前記改変されたＤＮＡセグメントを複製すること
を含んで成る、請求項１−１５のいずれか１つ記載の変異体血液凝固成分をコードする請求項１６記載のＤＮＡセグメントの製造方法。
【請求項２１】
（ａ）前記変異体成分をコードするＤＮＡセグメントを提供すること；
（ｂ）段階（ａ）で提供される前記ＤＮＡセグメントを発現ベクターに導入すること；
（ｃ）前記ＤＮＡセグメントを含有する前記ベクターを適合する宿主細胞に導入すること；
（ｄ）段階（ｃ）で提供される宿主細胞を、前記変異体成分の発現に必要とされる条件下で培養すること；および
（ｅ）発現された変異体成分を培養された宿主細胞から単離すること
を含んで成る、請求項１−１５のいずれか１つ記載の変異体血液凝固成分の製造方法。
【請求項２２】
有効量の、請求項１−１５のいずれか１つ記載の変異体血液凝固成分、および製薬学的に許容できる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含んで成る製薬学的組成物。
【請求項２３】
請求項１−１５のいずれか１つ記載の変異体血液凝固成分を含んで成る、血液のプロテインＣ抗凝固系に参画する成分をアッセイするための、適してはキットの形態の診断試験系。
【請求項２４】
変異体血液凝固成分が変異体ＡＰＣであり、かつ、前記試験系がプロテインＳもしくは無傷の抗凝固第Ｖ因子の機能的活性をアッセイするための系である、請求項２３記載の診断試験系。
【請求項２５】
凝固阻害量の、請求項１−１５のいずれか１つ記載の変異体血液凝固成分を含んで成る生理学的に耐えられる組成物を患者に投与することを含んで成る、前記患者における凝固の阻害方法。
【請求項２６】
血栓症が阻害される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
凝固が血液凝固障害ＡＰＣ抵抗性を有する個体において阻害される、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
血栓症のような凝固障害の治療もしくは予防のための医薬の製造における、請求項１−１５のいずれか１つ記載の変異体成分の使用。
【請求項２９】
変異体成分が変異体ＰＳとともに変異体ＰＣもしくは変異体ＡＰＣを含んで成る、請求項２８記載の使用。
【請求項３０】
ＡＰＣ抵抗性の治療のための医薬の製造における請求項２８記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高められた抗凝固活性を示す機能的組換えプロテインＣ変異体、および治療もしくは診断目的上のこうした変異体の使用に向けられる。より具体的には、本発明は、改変されたＧｌａドメインを含有するプロテインＣ変異体、および治療もしくは診断目的上のこうした変異体の使用に向けられる。
【背景技術】
【０００２】
プロテインＣは、一般にプロテインＣ抗凝固系と呼称される血液の抗凝固系に参画する大きく生理学的に重要なビタミンＫ依存性タンパク質である。全部のビタミンＫ依存性タンパク質と同様、プロテインＣはＮ末端の４５アミノ酸残基より構成されるＧｌａドメインもしくはＧｌａモジュールを含有し、前記ドメインは下でより詳細に論考されるであろうとおり、膜結合親和性に決定的に重要である。
【０００３】
前記プロテインＣ抗凝固系において、プロテインＣは、血液凝固のダウンレギュレーターとして、その活性化された形態（ＡＰＣ、Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ（活性化型プロテインＣ））のプロテインＣに対し相乗的補助因子として作用する補助因子プロテインＳおよび無傷の第Ｖ因子（ＦＶ）を包含する他のタンパク質と協力して機能して、それにより血液の過剰な凝固を予防し、そして従って血栓症を阻害する。活性化された形態のプロテインＣにより表されるこの抗凝固活性は、活性化型第ＶＩＩＩ因子（ＶＩＩＩａ）および活性化型第Ｖ因子（ＦＶａ）（これらは血液凝固系の他の補助因子である）を特異的に切断かつ分解することにより血液凝固の反応を阻害するその能力から発する。その結果として、血液凝固に必要な成分、すなわち第Ｘ因子（ＦＸ）およびプロトロンビンの活性化が阻害され、そして凝固系の活性がそがれる。従って、プロテインＣは、適正に機能する血液凝固系に大きく生理学的に重要である。
【０００４】
プロテインＣの重要性は臨床的観察結果から推定することができる。例えば、重症の血栓塞栓症はホモ接合性のプロテインＣ欠乏症を伴う個体を冒し、そして冒された個体は彼らの新生児期に既に血栓症を発症する。生じる臨床状態（電撃性紫斑病）は、該状態をプロテインＣで治療しない限り、通常は致死性である。他方、ヘテロ接合性のプロテインＣ欠乏症はより少なく重症の血栓塞栓性の表現型と関連し、そして静脈血栓症に対する比較的軽度の危険因子のみを構成する。この遺伝的特質のキャリアーが、正常プロテインＣレベルを伴う個体に比較して血栓症の５ないし１０倍より高い危険度を有すると推定されている。しかしながら、より重要なことには、血栓症を伴う最も普遍的な遺伝的欠損はプロテインＣ系もまた冒している。この状態は通常ＡＰＣ抵抗性と称され、そして、ＦＶ遺伝子（その突然変異はＦＶのアミノ酸配列中のアミノ酸残基Ａｒｇ５０６のＧｌｎ残基での置換につながる）中の単一の点突然変異により最も頻繁に引き起こされる。Ａｒｇ５０６は、ＡＰＣによる切断作用に対し感受性である活性化型ＦＶ（ＦＶａ）中の３個の切断部位の１個を構成し、そしてこうした突然変異されたＦＶａは、正常のＦＶａよりＡＰＣによりより少なく効率的に分解される（非特許文献１）。
【０００５】
血液凝固系中の抗凝固成分としてのプロテインＣおよび活性化型プロテインＣ（ＡＰＣ）の生理学的重要性は、治療目的上のこれらの物質の潜在的使用を示す。
【０００６】
事実、プロテインＣおよびその活性化された形態ＡＰＣは、既に、治療目的上、若干の程度まで使用されている（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。より具体的には、ヒト血漿から精製されたプロテインＣが、ホモ接合性のプロテインＣ欠乏症での置換療法として使用されており（非特許文献６）、かつまた髄膜炎菌性敗血症による重症の播種性血管内凝固を伴う症例でも成功裏に使用されている（非特許文献７）。さらに、敗血症（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用する）のヒヒモデルにおいて、ＡＰＣが保護的効果を有することが示され、その効果はＡＰＣを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）注入前に与えた場合にととりわけ顕著であった（非特許文献８）。いずれにしても、今日まで得られた結果は、プロテインＣが、上の病状の治療にのみならず、しかしまた凝固系が活性化されている多くの他の病状、例えば静脈血栓症、冠動脈血管の再疎通後、心筋梗塞（ＭＩ）後および血管形成術後の血管閉塞の予防および治療にも有用な薬物となるかもしれないことを示唆する。
【０００７】
血液凝固の混乱に関係した多様な病状の治療的治療が、高められた抗凝固特性を有するプロテインＣの変異体が利用可能であった場合に改良される可能性があることが予見される。さらに、こうした変異体は、改良された性能を有するアッセイを得るためにプロテインＣ系の他の成分についての多様な生物学的アッセイを改良するための試薬として有用であるとみられる。
【０００８】
過去数十年の組換えＤＮＡ技術の発展は、所望の生物学的物質を効率的に製造しかつ／もしくは所望のかつ場合によっては特別に設計された特性を有する生物学的物質を創製する可能性に多大な影響を有した。事実、プロテインＣの機能的変異体のみならず、しかしまた本質的に野性型のプロテインＣも、例えば以下の参考文献で報告されるとおり、組換え技術により製造されている。
【０００９】
特許文献１において、ヒトプロテインＣ誘導体の組換え製造が開示される。しかしながら、ヒト野性型プロテインＣに本質的に対応する機能的活性を有するプロテインＣポリペプチドの製造のみが開示される。最近、本参考文献により製造された野性型プロテインＣが、重症の敗血症の治療で成功裏に使用されている（非特許文献９の刊行前の発表を参照されたい）。
【００１０】
組換え技術により製造されたプロテインＣの使用は、非特許文献１０；非特許文献１１にもまた開示される。
【００１１】
さらに、残基１５８−１６９を包含する活性化ペプチド領域に向けられた突然変異誘発により得られるプロテインＣの機能的変異体は、トロンビンに対する高められた感受性を有するかもしれず、こうした変異体は野性型プロテインＣより迅速にトロンビンにより活性化される（非特許文献１２；非特許文献１３）。これらの研究の１つ（非特許文献１３）において、突然変異体プロテインＣに至る活性化部位周辺に多数の突然変異が導入され、この突然変異体は、トロンビンによるプロテインＣの効率的な活性化に通常必要とされる膜タンパク質トロンボモジュリンの非存在下でさえ。血液の凝固の間に形成されるトロンビンにより比較的容易に活性化された。
【００１２】
より具体的には、非特許文献１３で開示されるトロンビンとの高められた相互作用を有するプロテインＣ変異体は、活性化ペプチド領域中に突然変異を含んで成り、トロンビン切断部位近くの２個の推定の阻害性酸性残基が変えられている。活性化ペプチド領域中の前記変えられた残基、およびまたＧｒｉｎｎｅｌｌら（下記）により開示されるＡｓｎ３１３Ｇｌｎ突然変異も含んで成る１種のプロテインＣの変異体が、最近、インビボで実施された実験で抗凝固薬として十分に機能することが示された（非特許文献１４）。しかしながら、このプロテインＣ変異体において、高められた抗凝固活性はＡｓｎ  ３１３  Ｇｌｎ突然変異により、他の突然変異はトロンビンとの高められた相互作用を生じさせない。
【００１３】
非特許文献１５で、ヒトプロテインＣの機能におけるグリコシル化の役割が検査され、４個の潜在的Ｎ−結合グリコシル化部位、すなわち位置９７、２４８、３１３および３２９のそれぞれを単独に除外するのに部位特異的突然変異誘発が使用されている。その中に開示されるプロテインＣ変異体において、Ｇｌｎがそれぞれ位置９７、２４８および３１３でＡｓｎの代わりに用いられており、そして、位置２４８および３１３でこの置換突然変異を有するプロテインＣ突然変異体が、他の改変された特性に加えて２ないし３倍高められた抗凝固活性を現したことが示される。
【００１４】
野性型プロテインＣのアミノ酸配列、例えばセリンプロテアーゼ（ＳＰ）モジュール中の最低１個のアミノ酸残基の改変（その改変はプロテインＣのグリコシル化を変えない）の導入により、高められた抗凝固活性を表すプロテインＣおよびＡＰＣの機能的変異体が、特許文献２に開示される。その中で具体的に開示される１変異体は、残基番号３００と３１４との間の短いアミノ酸残基伸長内に配置されるＳＰモジュール中の数個の突然変異を含有し、前記変異体は野性型ヒトプロテインＣに比較しておよそ４００％の高められた抗凝固活性を示す。
【００１５】
非特許文献１６において、Ｒｅｚａｉｅらは、Ｇｌｕ３５７Ｇｌｎ突然変異（すなわちキモトリプシンの番号付けを使用する場合にＧｌｕ１９２Ｇｌｎ）を含んで成るプロテインＣ突然変異体を開示する。この突然変異体は純粋な系で約２ないし３倍高められた速度でＦＶａを不活性化するとは言え、血漿中では、該抗凝固活性は野性型のプロテインＣに比較して高められない。該突然変異体がα−１アンチトリプシンおよびアンチトロンビンＩＩＩのようなプロテアーゼ阻害剤により迅速に阻害されるからである。
【００１６】
天然のプロテインＣのＧｌａドメイン中に改変を有するもしくはそれを欠くプロテインＣの変異体もまた以前に報告されている。
【００１７】
例えば、天然のプロテインＣのＧｌａドメインを欠きかつＴｈｒ２５４Ｔｙｒ（すなわち、キモトリプシンの番号付けに基づきＴｈｒ９９Ｔｙｒ）を含んで成るプロテインＣ変異体が、非特許文献１７に開示される。この変異体プロテインＣは、リン脂質の非存在下で純粋なＦＶａすなわち可溶性ＦＶａに対する２倍高められた活性を有するが、しかし、欠けているＧｌａドメインによって血漿中での抗凝固活性を欠いている。
【００１８】
最近、改変されたＧｌａドメインを有する数種のプロテインＣ変異体がＳｈｅｎらにより非特許文献１８で報告された。これらのプロテインＣ変異体はＧｌａドメイン中に数個の置換を含有し、そして、高められたＣａおよび／もしくは膜結合特性、ならびに従って活性化型プロテインＣ（ＡＰＣ）の高められた抗凝固活性も示す。これらの変異体のいくつかはまた、Ｇｌａドメイン中に置換改変を含有する他のプロテインＣ変異体と一緒に特許文献３にも開示されている。後者の参考文献は、全般として、それらのＧｌａドメイン中の改変すなわち置換により、変えられた、例えば高められた膜結合親和性を表す改変されたビタミンＫ依存性ポリペプチドに関係する。該ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、第ＶＩＩ因子もしくはいずれかの他のビタミンＫ依存性タンパク質、例えばプロテインＣを含んで成ることができる。この国際特許出願（ＷＯ）参考文献によればプロテインＣ配列中の位置４がいずれの残基によっても占有されない（例えば、Ｓｈｅｎ（および本発明）の位置１０が該ＷＯ参考文献の位置１１に対応することを意味する）ために、Ｇｌａドメイン残基の番号付けが、ＳｈｅｎらとこのＷＯ参考文献との間で異なることに注意すべきである。
【００１９】
高められた抗凝固活性および／もしくは他の改変された特性を有するプロテインＣ変異体が以前に開示されているとしても、高められた抗凝固活性を示しかつ／または治療および／もしくは診断目的上有用であるとみられる他の有益な特性を有するプロテインＣ変異体の必要性がなお存在する。
【特許文献１】
米国特許出願第ＵＳ−Ａ−４  ７７５  ６２４号明細書（Ｂａｎｇら）
【特許文献２】
国際特許出願第ＷＯ  ９８／４４０００号明細書
【特許文献３】
国際特許出願第ＷＯ  ９９／２０７６７号明細書
【非特許文献１】
Ｄａｈｌｂａｅｃｋ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９４，９４：９２３−９２７
【非特許文献２】
ＶｅｒｓｔｒａｅｔｅとＺｏｌｄｈｏｌｙｉ，Ｄｒｕｇｓ  １９９５，４９：８５６−８８４
【非特許文献３】
Ｅｓｍｏｎら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．１９８７，６７：５１−５７
【非特許文献４】
Ｏｋａｊｉｍａら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１９９０，３３：２７７−２７８
【非特許文献５】
Ｄｒｅｙｆｙｓら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９１，３２５：１５６５−１５６８
【非特許文献６】
ＭａｒｌａｒとＮｅｕｍａｎｎ，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓ．１９９０，１６：２９９−３０９
【非特許文献７】
Ｒｉｖａｒｄら，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１９９５，１２６：６４６−６５２
【非特許文献８】
Ｔａｙｌｏｒら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９８７，７９：９１８−９２５
【非特許文献９】
Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅからの表題“Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ｆｏｒ  Ｓｅｖｅｒｅ  Ｓｅｐｓｉｓ”を伴いかつ２００１年２月９日付の論文
【非特許文献１０】
Ｂｅｒｇら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１９９３，１４：９７２−９７８
【非特許文献１１】
Ｈｏｙｅｒら，Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．１９９４，６７：Ｓｕｐｐｌ．３：２１７−２２０
【非特許文献１２】
Ｅｒｌｉｃｈら，Ｅｍｂｏ．Ｊ．１９９０，９：２３６７−２３７３
【非特許文献１３】
Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  １９９２，３６０：２６１−２６４
【非特許文献１４】
Ｋｕｒｚら，Ｂｌｏｏｄ，１９９７，８９：５３４−５４０
【非特許文献１５】
Ｇｒｉｎｎｅｌｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９１，９７７８−９７８５
【非特許文献１６】
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３，２６８：１９９４３−１９９４８
【非特許文献１７】
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１：２３８０７−２３８１４
【非特許文献１８】
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７３，Ｎｏ．４７，ｐｐ．３１０８６−３１０９１，１９９８
【発明の開示】
【００２０】
本発明は、改変されたＧｌａドメインを含有しかつ高められた抗凝固活性を示すプロテインＣの機能的変異体に関する。本プロテインＣ変異体のこの高められた抗凝固活性は、高められたカルシウムおよび／もしくは膜結合特性から本質的に発し、そして、活性の形態のプロテインＣチモーゲンであるＡＰＣにより主として現され、前記チモーゲンは事実上不活性である。従って、本発明はまた、改変されたＧｌａドメインを含有しかつ高められた抗凝固活性を示すＡＰＣの変異体にも関する。ＧｌａドメインはプロテインＣの最初のアミノ末端４５残基を含んで成り、また、その構造および機能は下でより詳細に論考されるであろう。
【００２１】
本発明により、Ｇｌａドメインへの最低１、適してはいくつか、例えば最低６、およびより具体的には７もしくはそれ以上のアミノ酸残基の改変（１個もしくは複数）の導入が、Ｓｈｅｎら（上記引用文中）によりおよび国際特許出願第ＷＯ  ９９／２０７６７号公開に報告されたＧｌａドメイン中に改変を有する変異体に比較して、改良された特性を有するプロテインＣもしくはＡＰＣ変異体を提供することが発見された。
【００２２】
適しては、本変異体は、１０以上のアミノ酸改変を含有せず、また、適する場合には、この他のＧｌａドメインとプロテインＣのＧｌａドメインとの間の差異が上で論考されたところの数アミノ酸残基を構成するのみでない限り、プロトロンビンもしくは第Ｘ因子由来のＧｌａドメインを有するハイブリッドプロテインＣ変異体のような異なるビタミンＫ依存性タンパク質の間のハイブリッドを包含しない。
【００２３】
さらに高められた抗凝固活性のような改良された特性を現す本発明のプロテインＣ変異体は、例えば治療目的上使用される場合に投薬量もしくは投与の頻度を低下させることにより利益を提供する可能性がある。
【００２４】
本発明はまた、前記方法での使用に意図されるＤＮＡセグメントを用いるＤＮＡ技術に基づくこうした変異体の製造方法、ならびに治療および／もしくは診断目的上の前記変異体の使用にも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
Ａ．プロテインＣの分子配列
プロテインＣ分子は４種の異なる型のモジュールより構成される。アミノ末端からカルボキシ末端の向きで、これらのモジュールは、Ｇｌａモジュール、２個のＥＧＦ様モジュール（すなわち表皮増殖因子相同物モジュール）、および最後に典型的なセリンプロテアーゼ（ＳＰ）モジュールよりなる。血漿中では、循環するプロテインＣの大部分は、制限されたタンパク質分解により一本鎖前駆体から生じられる、成熟二本鎖ジスルフィド結合プロテインＣチモーゲンよりなる。これら二本の鎖は、ＧｌａおよびＥＧＦモジュールを含有する２０ｋＤａのＬ鎖、ならびにＳＰモジュールを構成する４０ｋＤａのＨ鎖である。トロンボモジュリンに結合されたトロンビンによる活性化の間に、ペプチド結合Ａｒｇ−Ｌｅｕ（残基１６９および１７０）がＨ鎖のＮ末端部分で切断され、そして１２アミノ酸残基（残基１５８−１６９）を含んで成る活性化ペプチドが遊離される。本発明に関連して、プロテインＣおよびその変異体のアミノ酸配列中の残基の番号付けは成熟プロテインＣに基づく。
【００２６】
プロテインＣのアミノ酸配列は、対応するｃＤＮＡヌクレオチド配列から推定されており、そして文献に報告されている。さらに、プロテインＣのｃＤＮＡヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列は、ヒトプロテインＣ（ＨＳＰＲＯＴＣと呼称される）について受託番号Ｘ０２７５０、およびウシプロテインＣ（ＢＴＰＢＣと呼称される）について受託番号ＫＯ  ２４３５のもとにＥＭＢＬ遺伝子データベース（ドイツ・ハイデルベルク）から入手可能である。
【００２７】
上に述べられたとおり、ビタミンＫ依存性タンパク質のＧｌａドメインはＮ末端の４５アミノ酸残基を含んで成る。従って、Ｇｌａドメイン全体のアミノ酸配列は、ヒトおよびウシプロテインＣのようなタンパク質について既知であり、その全アミノ酸配列もしくはそのＮ末端部分（４５残基）が決定されている。上のデータベース配列に基づき、ヒトプロテインＣおよびウシプロテインＣのＧｌａドメインは、下に示されるとおり具体的に説明することができる（それぞれ配列番号１および配列番号２）：
ＡＮＳＦＬＥＥＬＲＨ  ＳＳＬＥＲＥＣＩＥＥ  ＩＣＤＦＥＥＡＫＥＩ  ＦＱＮＶＤＤＴＬＡＦ  ＷＳＫＨＶ（配列番号１）
ＡＮＳＦＬＥＥＬＲＰ  ＧＮＶＥＲＥＣＳＥＥ  ＶＣＥＦＥＥＡＲＥＩ  ＦＱＮＴＥＤＴＭＡＦ  ＷＳＫＹＳ（配列番号２）
類似性に関してのこうしたＮ末端配列の比較、ならびに個々の配列間の逸脱は、突然変異誘発（すなわち改変）の標的として適する位置を示す可能性がある。こうした比較のために、Ｇｌａドメインの全アミノ酸配列を知ることは必要ではないかもしれないが、しかし、抗凝固活性に潜在的に重要な位置のアミノ酸残基が決定されている場合は十分である可能性がある。
【００２８】
本発明に関して、通常の１文字もしくは３文字記号を、以下の対応表に示されるとおり、アミノ酸の略語として使用する：
【００２９】
【表１】
2004527239.tif 000003
【００３０】
Ｂ．プロテインＣの変異体
上に述べられたとおり、本発明は組換えプロテインＣの機能的変異体に関し、前記変異体は改変されたＧｌａドメインを含有しかつ高められた抗凝固活性を表す。これらの変異体は、１個もしくはそれ以上、適する場合にはいくつか、および好ましくは１０を越えないアミノ酸残基に関して野性型の組換えプロテインＣと異なり、前記残基は対応する野性型配列中で挿入、欠失もしくは置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）（すなわち置換（ｒｅｐｌａｃｅｄ））されて、それによりプロテインＣの本変異体を生じる。前記差異（１個もしくは複数）はプロテインＣのＡＰＣへの活性化後に維持されるため、本発明はまた、高められた抗凝固活性を有するＡＰＣ変異体に関する。適する一態様によれば、改変（１個もしくは複数）は置換（１個もしくは複数）である。
【００３１】
現在、こうした変異体は、突然変異誘発、とりわけ、オリゴヌクレオチドプライマーの使用を包含する部位特異的突然変異誘発により便宜的に得られる。しかしながら、本発明は、これらの変異体を得る様式に関係なく、機能的な変異体それ自体に関する。
【００３２】
ＰＣとＡＰＣとの間の緊密な関係を鑑み、頻繁には、本発明に関してＰＣとＡＰＣとの間の明確な区別はなされないが、しかし、呼称ＰＣ／ＡＰＣを使用し、そして、これらの物質の一方が考慮されるか双方が考慮されるかは、文脈が示すことができる。
【００３３】
本発明に関して、「変異体」という表現は、野性型分子に比較して高程度の相同性を一般に有する突然変異体分子のような改変された野性型分子を意味する。
【００３４】
従って、こうした変異体が、野性型物質に関して実質的相同性を保存するために、数個のみの改変されたアミノ酸残基、およびおそらくただ１個のアミノ酸残基を包含することが好ましい。これは、治療に使用される変異体に対する可能な免疫応答を回避もしくは少なくとも低減するために、インビボでの治療のための本変異体の使用に関してとりわけ重要である。従って、製薬学的目的上、好ましくは、本変異体は、対応する野性型物質に実質的に相同であり、そして点突然変異、例えば１もしくは数個の単一アミノ酸残基の置換、欠失および／もしくは挿入のみを含有する。好ましくは、該変異体は、インビボでの使用のために、１個以上のアミノ酸残基改変を含有し、かつ、約１０までのアミノ酸残改変を含有することができる。
【００３５】
従って、ＰＣ／ＡＰＣの適する変異体は、高程度、適しては最低９５％、および好ましくは最低９７％、およびとりわけ最低９８％の、野性型成熟ＰＣ／ＡＰＣとのアミノ酸配列の同一性を有する。
【００３６】
本発明の診断の態様に関して、高程度の相同性はもちろんより少なく重要であり、主要件は機能的変異体が野性型タンパク質と比較して高められたレベルで所望の活性を示すことである。
【００３７】
製薬学的目的上、本発明の好ましい態様はヒトＰＣ／ＡＰＣ変異体に関する。しかしながら、本発明はまた、改変されたＧｌａドメインにより高められた抗凝固活性を有する哺乳動物起源、例えばウシまたはマウスもしくはラット起源の変異体のようなネズミ起源の他のＰＣ／ＡＰＣ変異体にも関する。
【００３８】
上で挙げられたとおり、ＧｌａドメインもしくはＧｌａモジュールはビタミンＫ依存性タンパク質ファミリーに特異的であり、そのメンバーは、その中でグルタミン酸（Ｅ）残基がγ−カルボキシグルタミン酸残基（Ｇｌａ）に改変されている特別のタンパク質モジュール（前記Ｇｌａモジュール）を含有する。この改変は、プロテインＣ前駆体中のグルタミン酸残基の側鎖をカルボキシル化するのにビタミンＫを使用する酵素により肝で実施される。それぞれヒトおよびウシプロテインＣのＧｌａドメインについて上で示された配列（配列番号１および２）において、Ｅ残基は従って循環するタンパク質中でＧｌａ残基に転化されている。
【００３９】
ＧｌａモジュールはビタミンＫ依存性タンパク質の最初のアミノ末端４５残基より構成され、そしてカルシウムに結合しかつ負に荷電した凝固活性リン脂質に結合する能力をもつタンパク質を提供する。さらに、ＦＶａおよびＦＶＩＩＩａのタンパク質分解における活性化型プロテインＣ（ＡＰＣ）の機能に決定的に重要である膜接触部位が前記Ｇｌａドメイン中に含有され、ＡＰＣの活性は、膜表面上でのＡＰＣならびに他のタンパク質、すなわち第Ｖ因子およびプロテインＳ補助因子の会合に際して発現される。しかしながら、多様なビタミンＫ依存性タンパク質のＧｌａ含有領域間の高程度の配列の相同性にもかかわらず、これらのタンパク質は広範な膜親和性を表す。これは、低親和性タンパク質であるプロテインＣ、例えばヒトプロテインＣの膜親和性を改変する、およびより具体的には高めることが可能でありうることを示す。
【００４０】
この目的上、高親和性のビタミンＫ依存性タンパク質の構造は、Ｓｈｅｎら（上記）により示唆されたとおり、プロテインＣのような低親和性タンパク質の膜結合親和性および従って抗凝固活性を高める可能性がある可能な改変を示唆するための鋳型としてはたらくことができる。例えば、部位特異的突然変異誘発を、プロテインＺのような高親和性のビタミンＫ依存性タンパク質の構造に似ている構造を有するプロテインＣ変異体を製造するために、野性型プロテインＣで実施することができる。
【００４１】
しかしながら、全部のビタミンＫ依存性タンパク質に妥当であるとみられ、かつ、高められた膜結合親和性を生じさせる可能性のあるアミノ酸改変のための可能な位置を予測するとみられる静電分布についての普遍的原型の存在が、第ＷＯ  ９９／２０７６７号公開で示唆されているとは言え、この原型は、Ｇｌａドメインのいくつかの位置、すなわち１０、１１、２８、３２および３３（本発明に関して使用される番号付けによる）にのみ関する。さらに、Ｓｈｅｎら（上記）により報告されたとおり、プロテインＣは独特の特徴を有することが示されており、かつ、こうした普遍的仮説に必ずしも適合しないとみられる。
【００４２】
本発明により、改変（１個もしくは複数）をプロテインＣのＧｌａドメインに導入して、好ましくはインビボおよびインビトロ双方で高められた抗凝固活性のような改良された特性を表す変異体プロテインＣを製造することができることが、予期しないことに見出された。こうした変異体は、置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）（置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ））、欠失もしくは挿入（付加）のような、最低１、適しては最低６、例えば７〜１０アミノ酸の改変（１個もしくは複数）を含有する。
【００４３】
本発明の一局面によれは、前記最低１個のアミノ酸改変は、位置１０、１１、２８、３２もしくは３３以外のプロテインＣのＧｌａドメインの１位置での１個のアミノ酸残基についての別の残基の置換である。適しては、前記最低１個のアミノ酸改変は位置１２、２３もしくは４４に配置される。本発明のさらなる一局面は、前記最低１個のアミノ酸改変がＳ１２Ｎ、Ｄ２３ＳおよびＨ４４Ｙから選択される置換突然変異であるプロテインＣ変異体に関する。
【００４４】
本発明の他の態様は、前記最低１個のアミノ酸改変が、位置１０、１１、１２、２３、３２、３３および４４から選択される１位置に配置されるプロテインＣ変異体に関する。適しては、位置１０、１１、１２、２３、３２、３３および４４の１個以上、および好ましくは全部が、例えば置換により改変される。
【００４５】
本発明の一局面によれば、前記最低１個のアミノ酸改変は、Ｅ１０Ｇ１１Ｅ３２Ｄ３３、Ｑ１０Ｇ１１Ｅ３２Ｄ３３、Ｇ１１Ｎ１２Ｅ３２Ｄ３３、Ｇ１１Ｅ３２Ｄ３３、Ｅ３２Ｄ３３およびＥ３２以外の１個もしくはそれ以上のアミノ酸改変から構成される。あるいは、本変異体はこれらの改変の１個もしくはそれ以上を含有することができるが、但し、本変異体はＧｌａドメイン中に最低１個のさらなる改変を含有する。
【００４６】
ずっと高められた抗凝固活性を有する特定の一ヒトプロテインＣ変異体は、置換突然変異Ｈ１０Ｑ、Ｓ１１Ｇ、Ｓ１２Ｎ、Ｄ２３Ｓ、Ｑ３２Ｅ、Ｎ３３ＤおよびＨ４４Ｙを含有する。従って、本プロテインＣ変異体は、以下のアミノ酸配列：
ＡＮＳＦＬＥＥＬＲＱ  ＧＮＬＥＲＥＣＩＥＥ  ＩＣＳＦＥＥＡＫＥＩ  ＦＥＤＶＤＤＴＬＡＦ  ＷＳＫＹＶ（配列番号３）
を有する改変されたＧｌａドメインを有する。
【００４７】
置換Ｈ１０Ｑ、Ｓ１１ＧおよびＳ１２Ｎのみ、置換Ｄ２３Ｓ、Ｑ３２ＥおよびＮ３３Ｄのみ、もしくは置換Ｄ２３Ｓ、Ｑ３２Ｅ、Ｎ３３ＤおよびＨ４４Ｙのみを含有する本発明の変異体がわずかに高められた抗凝固活性を表す場合であっても、全部のこれらの置換を含有する上で挙げられた特定の変異体（配列番号３）は、極めて予期しないことに、Ｓｈｅｎら（上記）によりおよび第ＷＯ  ９９／２０７６７号明細書に記述されるプロテインＣ変異体の抗凝固活性に比較してずっと高められた抗凝固活性を表すことが注目されるべきである。
【００４８】
当業者には、置換以外のＧｌａドメイン中の改変が改良された特性を有するプロテインＣ変異体を提供する可能性があることが明らかである。さらに、本明細書でとりわけ挙げられるものより他の置換もまたこうした変異体を提供する可能性がある。こうした置換は保存的もしくは非保存的である可能性がある。普遍的な側鎖の特性に基づき、天然に存在する残基は以下の分類に分割される：
１）ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅを含んで成る疎水性残基；
２）Ｃｙｓ、ＳｅｒおよびＴｈｒを含んで成る中性の親水性残基；
３）ＡｓｐおよびＧｌｕを含んで成る酸性残基；
４）Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＡｒｇを含んで成る塩基性残基；
５）ＧｌｙおよびＰｒｏを含んで成る鎖の向きに影響する残基；ならびに
６）Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅを含んで成る芳香族残基。
【００４９】
非保存的置換は、これらの分類の１種の１メンバーでの別の分類の１メンバーの置換を必要とするかもしれない一方、保存的置換は１アミノ酸残基の同一分類の１メンバーでの置換を必要とするかもしれない。置換突然変異誘発のための目的の位置は、異なる種からの野性型プロテインＣ中で見出されるアミノ酸残基が例えば側鎖の嵩高さ（ｂｕｌｋ）、電荷および／もしくは疎水性に関して異なる位置を包含する。しかしながら、目的の他の位置は、特定のアミノ酸残基が最低数種の異なる種間で異ならないがしかしそれらについて同一であるこうした位置である。こうした位置は生物学的活性にとって潜在的に重要であるからである。最初に候補位置を比較的保存的な様式で置換する。その後、こうした置換が生物学的活性の変化をもたらす場合は、より実質的な置換を導入し、かつ／または、付加、欠失もしくは挿入のような他の改変を行い、そして生じる変異体を生物学的活性についてスクリーニングする。
【００５０】
アミノ酸配列の保存的置換もしくは改変は、野性型プロテインＣのものに類似である機能的および化学的特徴を有する変異体を生じさせることを期待することができるため、適しては、本プロテインＣ変異体は、最低１個の非保存的置換、例えば塩基性残基の代わりの芳香族残基、もしくは酸性残基の代わりの塩基性残基の置換を含有する。
【００５１】
本発明の改変された（すなわち変異体もしくは突然変異体）ＰＣ／ＡＰＣは高められた抗凝固活性を有するため、生物学的活性についての上に挙げられたスクリーニングは、適しては、抗凝固活性の測定に関する。こうした抗凝固活性は、一般には標準的インビトロ凝固アッセイにおける凝固時間を増大させる本変異体の能力として決定することができる。高められた抗凝固活性は、血漿から生じられもしくは組換えＤＮＡ技術により得られるかもしれない野性型ＰＣ／ＡＰＣとの比較で測定する。従って、本発明により有用であるために、該ＰＣ／ＡＰＣ変異体は、野性型物質の抗凝固活性より高い抗凝固活性を表すべきである。適しては、本変異体は、野性型プロテインＣより最低約４００％もしくはそれ以上、例えば１０００％まで、または３０００％までも高められる抗凝固活性を表す。
【００５２】
上のおよび類似の原理に基づき、本発明の好ましい一変異体（配列番号３）を構築した。より具体的には、ＭａｃＤｏｎａｌｄら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９７；３６：５１２０−５１２７）による理論的論文において、全部の既知のＧｌａドメインの配列を比較し、そして負に荷電したリン脂質に結合するこれらのＧｌａドメインの能力と配列を相互に関連付けるための努力がなされた。この分析から、多様なＧｌａドメイン間の負に荷電したリン脂質に対する親和性の大きな変動が、主として位置１０および３２および３３の残基の周辺のアミノ酸配列の差異に関係したことが示唆された。
【００５３】
Ｓｈｅｎらによる以前の論文（Ｊ  ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９８，２７３：３１０８６−３１０９１）において、いくつかの異なる突然変異体を創製し、そしてＭａｃＤｏｎａｌｄらの理論的考慮に従って試験した。これらの突然変異の共通のテーマは、位置１１をセリン（Ｓ）からグリシン（Ｇ）に、また、位置３２をグルタミン（Ｑ）からグルタミン酸（Ｅ、成熟タンパク質中でＧｌａに転化されることができる）、および位置３３をアスパラギン（Ｎ）からアスパラギン酸（Ｄ）に変えることであった。加えて、位置１０および１２はその時点で一方を変えたが、しかし一緒に変えなかった。従って、試験された突然変異体は、Ｇ１１Ｅ３２Ｄ３３（ＧＥＤ）、Ｅ３２Ｄ３３（ＥＤ）およびＥ３２（Ｅ）に加え、Ｅ１０Ｇ１１Ｅ３２Ｄ３３（ＥＧＥＤ）、Ｑ１０Ｇ１１Ｅ３２Ｄ３３（ＱＧＥＤ）、Ｇ１１Ｎ１２Ｅ３２Ｄ３３（ＧＮＥＤ）であった。
【００５４】
ＱＧＥＤおよびＧＮＥＤが抗凝固薬として本質的に同等に有効であったこと、および双方がｗｔ  ＡＰＣより抗凝固性であったことが観察された。ｗｔ  ＡＰＣと比較すると、双方の突然変異体は、負に荷電したリン脂質を含有するリン脂質小胞を優れた様式で結合し、かつまたＣａ２＋もよりきつく結合した。その研究の大部分の有効な突然変異体がｗｔ  ＡＰＣよりもより抗凝固性であった場合でさえ、これは低濃度のリン脂質を使用した場合にのみ見出された。従って、ＡＰＣの改良された酵素活性が使用された全部の膜に対する増大された膜親和性と相互に関連付けられたことが見出された場合であっても、負に荷電したリン脂質に対するＡＰＣの高められた親和性は、低濃度の負に荷電したリン脂質でのＡＰＣの抗凝固（酵素）活性を向上させたのみであったことが示唆された。
【００５５】
Ｓｈｅｎらの研究（Ｊ  ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９８，２７３：３１０８６−３１０９１）により刺激されて本研究を開始した。理念は、おそらくより有効な突然変異が、双方の位置１０、１１および１２の突然変異を１変異体に組み合わせること、ならびに加えて位置２３および４４の突然変異が突然変異体ＡＰＣの有効性に影響を及ぼす可能性があるかどうかを試験することにより創製することができることであった。位置３２および３３は、それは未だ証明されていないとは言え、Ｓｈｅｎらによる研究（Ｊ  ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９８，２７３：３１０８６−３１０９１）から重要であると考えられた。ＧＥＤ、ＥＤ（位置３２、３３）およびＥ（位置３２）に加えてＳｈｅｎらにより試験された突然変異体、すなわち、ＥＧＥＤ、ＱＧＥＤ、ＧＮＥＤは、以下の理由から、位置３２および３３の重要性を確実に証明することができなかった。突然変異体ＥＧＥＤ、ＱＧＥＤ、ＧＮＥＤおよびＧＥＤは全部ｗｔ  ＡＰＣより有効であったが、しかし、２種の突然変異体ＥＤおよびＥはより有効でなかった。これは、位置１０〜１２周辺の突然変異が、より有効なタンパク質を創製したものであった、ならびに、３２および３２の突然変異が必要とされなかった可能性を生じさせた。位置１０〜１２の突然変異は位置３２および３３の突然変異と組み合わせられなければならないことが仮説として出されたがしかし証明されなかった。しかしながら、位置３２および３３の突然変異単独は、高められた抗凝固活性を表すプロテインＣ変異体の創製に不十分であったことが、Ｓｈｅｎら（Ｊ  ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９８，２７３：３１０８６−３１０９１）の研究から明らかであった。下に立証されるであろうとおり、位置１０〜１２（ＱＧＮ変異体）も、位置２３、３２、３３および４４（ＳＥＤＹ変異体）での突然変異誘発も、わずか以上に改良された抗凝固活性をもつ分子を創製しなかった。全部の上で同定された改変を含有する特定の突然変異体（配列番号３）（ＱＧＮＳＥＤＹもしくは「ＡＬＬ」と呼称される）のみが高度に有効であった。
【００５６】
野性型プロテインＣの上で同定された位置で野性型残基を置換するための使用に適するアミノ酸残基に関して、これらのアミノ酸配列と、多様なビタミンＫ依存性タンパク質のリン脂質結合能力との間の相関分析を包含した、異なるＧｌａドメインのアミノ酸配列の比較を実施した。これは、ＱＧＮが位置１０、１１および１２の興味深い一選択肢であったことを示唆した。ヒトプロテインＳおよびウシ第Ｘ因子双方がこれらの配列を含んで成り、また、双方のこれらのタンパク質は負に荷電したリン脂質を高親和性で結合するからである。多くのＧｌａドメイン中で、位置２３はセリン（Ｓ）残基により占有され、そして、それが、本発明の適する変異体を創製する場合にプロテインＣの野性型残基をセリン残基で置換した理由である。位置４４の改変は以前に考慮されていなかったことが注目されるべきである。しかしながら、位置４４にヒスチジン（Ｈ）残基を含有するＧｌａドメインのみがヒトプロテインＣのＧｌａドメインであり、全部の他のＧｌａドメインは位置４４にチロシン残基を有するため、チロシン（Ｙ）での位置４４のヒスチジン残基の置換が有用な改変である可能性があることは論理的であると思われる。
【００５７】
上の論考から、Ｇｌａドメインが４５アミノ酸残基を含有し、そのそれぞれを独立にもしくは組合せで改変することができ、そしてそれにより生じられたＡＰＣ変異体が高められた抗凝固活性を有するさらなる変異体についての検索で特徴づけられなければならないとみられる場合であっても、こうした検索は実際に当業者の到達内にあることが明白である。さらに、従来技術に基づき、例えば前駆体として本明細書でとりわけ開示される変異体を使用して、前駆体の変異体（例えば実験の部でとりわけ製造される変異体）と実質的に同一の特性を有するさらなる変異体を、例えば１もしくは数個の保存的置換を導入することにより、あるいは、Ｇｌａドメインの一部、または改変されることを意図している前駆体の特性にこうした改変が影響を及ぼさないとみられるプロテインＣ分子の他の部分に改変を導入することにより、製造することができる。本質的に変化されないもしくは本変異体と同一の特性を表すこうした変異体は、本変異体に同等であるとみなされ、そして従って本発明により包含されるべきである。
Ｃ．ＤＮＡセグメントおよびその製造法
本発明はまた、ＰＣ／ＡＰＣ変異体に関係したデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）セグメントもしくは配列、例えばこれらの変異体をコードする構造遺伝子、改変されたアミノ酸伸長のコーディング配列を含んで成る突然変異誘発プライマーなどにも関する。
【００５８】
この点において、遺伝暗号の公知の冗長性を考慮に入れなければならない。すなわち、タンパク質を作成するのに使用されるアミノ酸の大部分について、１個以上のコーディングヌクレオチド三重項（コドン）が特定の一アミノ酸残基をコードもしくは規定する可能性がある。従って、多数の異なるヌクレオチド配列が特定の１アミノ酸残基配列をコードするかもしれない。しかしながら、こうしたヌクレオチド配列は、それらが同一アミノ酸残基配列の産生をもたらす可能性があるために機能的に同等とみなされる。さらに、ときに、プリンもしくはピリミジンのメチル化変異体が所定のヌクレオチド配列に組み込まれるかもしれないが、しかし、こうしたメチル化はいかなる方法でもコーディングに影響を及ぼさない。従って、メチル化変異体を含むもしくは含まないかもしれないこうした機能的に同等な配列もまた、本発明により包含される。
【００５９】
本発明の適するＤＮＡセグメントは、本発明の改変された（変異体もしくは突然変異体）ＰＣ／ＡＰＣをコードするＤＮＡ配列を含んで成る。すなわち、該ＤＮＡセグメントは改変されたＰＣ／ＡＰＣをコードする構造遺伝子を含んで成る。しかしながら、本発明のＤＮＡセグメントは、例えば突然変異誘発プライマーとしての使用のために、改変されたアミノ酸伸長を含めて約１５までの数個のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド三重項を含んで成る比較的短い配列よりなってよい。
【００６０】
本発明の構造遺伝子は、好ましくはイントロンを含まない。すなわち、遺伝子はコドンの中断されない配列よりなり、各コドンは前記改変されたＰＣ／ＡＰＣ中に存在するアミノ酸残基をコードする。
【００６１】
本発明の適する一ＤＮＡセグメントは、野性型タンパク質のＧｌａモジュールに対応する該アミノ酸配列中の最低１個のアミノ酸改変（挿入、欠失、置換）を除き、野性型ヒトＰＣ／ＡＰＣに配列が対応するＰＣ／ＡＰＣ変異体を規定するアミノ酸残基配列をコードする。
【００６２】
他の適するＤＮＡセグメントは、前記改変（１個もしくは複数）が位置１０、１１、２８、３２もしくは３３以外の位置のＧｌａドメインのアミノ酸残基配列中に含有されるＰＣ／ＡＰＣ変異体をコードする。好ましい一ＤＮＡセグメントは、改変Ｈ１０Ｑ、Ｓ１１Ｇ、Ｓ１２Ｎ、Ｄ２３Ｓ、Ｑ３２Ｅ、Ｎ３３ＤおよびＨ４４Ｙを含有するＰＣ変異体をコードする。
【００６３】
加えて、本発明は、本ＰＣ／ＡＰＣ変異体をコードする相同なおよび類似のＤＮＡ配列、ならびにそれに相補的なＲＮＡ配列に関する。
【００６４】
本ＤＮＡセグメントは、適しては下（Ｄ節）にさらに説明されるであろうような慣習的発現ベクター／宿主細胞系でＰＣ／ＡＰＣ変異体を産生させるのに使用することができる。
【００６５】
ＤＮＡセグメントそれ自体に関して、これらは公知の技術に従って得ることができる。例えば、チェーンターミネーター配列決定法（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７）のような慣習的配列決定方法を使用してヌクレオチド配列を決定すれば、前記セグメントは、とりわけ大型のＤＮＡセグメントを調製するべきである場合は、適しては自動化合成方法に従って化学的に合成することができる。大型のＤＮＡセグメントはまた、本ＤＮＡセグメントを構成するいくつかの小さなオリゴヌクレオチドの合成、次いで大型のＤＮＡセグメントを形成するためのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび連結によっても製造することができ、公知の方法が使用される。
【００６６】
化学的方法を使用して本ＤＮＡセグメントを合成する場合、野性型分子中の１個もしくはそれ以上のアミノ酸残基をコードする適切な塩基の置換、挿入および／もしくは欠失により、野性型ＰＣ／ＡＰＣをコードするＤＮＡ配列を改変することがもちろん容易である。
【００６７】
適しては、組換えＤＮＡ技術を使用して、改変された構造遺伝子を含んで成る本ＤＮＡセグメントを製造する。従って、ある遺伝子、すなわち野性型ＰＣ／ＡＰＣをコードするｃＤＮＡを含んで成る組換えＤＮＡ分子で出発して、改変されたＰＣ／ＡＰＣをコードする構造遺伝子を含んで成る本発明のＤＮＡセグメントを、前記改変された組換えＤＮＡ分子の発現後に、置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）（置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ））、欠失および／もしくは挿入（付加）のような所望のアミノ酸残基変化を導入するための前記組換えＤＮＡ分子の改変により得ることができる。これらの変化の慣習的一達成方法は、例えばＰＣＲ技術を用いて実施される部位特異的突然変異誘発による。ＰＣＲはポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）の略語であり、そしてＭｕｌｌｉｓとＦａｌｏｏｎａ（１９８７）により最初に報告された。
【００６８】
部位特異的なプライマーに指図される突然変異誘発は今や当該技術分野で標準的であり、そして合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施され、そのプライマーは所望の突然変異（１個もしくは複数）を表す制限された不適合を除き突然変異誘発されるべきＤＮＡを含んで成る一本鎖ファージＤＮＡに相補的である。簡潔には、合成オリゴヌクレオチドを、異種ＤＮＡを含むファージＤＮＡに相補的な鎖の合成を指図するプライマーとして使用し、そして、生じる二本鎖ＤＮＡを、ファージを支援する宿主細菌に形質転換する。形質転換された細菌の培養物をトップアガー上にプレーティングして、該ファージをもつ単一細胞からのプラーク形成を可能にする。この方法において、突然変異されるＤＮＡは、Ｍ１３ファージ中でのクローン化後に得ることができる一本鎖の形態で利用可能でなくてはならない。部位特異的突然変異誘発はまた「ギャップドデュープレックス（ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ）」法（Ｖａｎｄｅｙａｒら，１９８８；ＲａｌｅｉｇｈとＷｉｌｓｏｎ，１９８６）によっても達成することができる。
【００６９】
本発明の適する一態様によれば、部位特異的突然変異誘発は標準的ＰＣＲ技術（ＭｕｌｌｉｓとＦａｌｏｏｎａ，１９８７）を用いて実施する。例示的なＰＣＲに基づく突然変異誘発方法は本開示の実験の部に記述する。本実施例において、突然変異体ＤＮＡセグメントの複製がインビトロで達成され、原核生物細胞も真核生物細胞も使用しない。
【００７０】
明らかに、部位特異的突然変異誘発は、例えば、野性型ＰＣ／ＡＰＣをコードしかつ発現するｃＤＮＡ配列もしくは構造遺伝子を含有するベクターで開始することにより、本明細書に記述されるところのＰＣ／ＡＰＣ変異体をコードする本ＤＮＡセグメントの構築のための便宜的なツールとして使用することができ、前記ベクターは少なくともＤＮＡ複製が可能であり、かつ、本明細書に記述されるところの選択されたヌクレオチドを突然変異して本発明の変異体をコードする本ＤＮＡセグメントの１種もしくはそれ以上を形成する。突然変異されたＤＮＡを含有する前記ベクターの複製は、前記ベクターでの宿主細胞、通常は原核生物細胞の形質転換後に得られるかもしれない。突然変異誘発、複製、発現およびスクリーニングの具体的に説明する方法は、本開示の実験の部に記述する。
Ｄ．ＰＣ／ＡＰＣ変異体の産生
ＰＣ／ＡＰＣ変異体をコードする完全なｃＤＮＡ配列もしくは構造遺伝子を含んで成るこうしたＤＮＡセグメントを使用して、適する宿主細胞、好ましくは真核生物細胞中での前記ｃＤＮＡの発現により、コードされる変異体を産生させることができる。一般に、本発明の変異体のこうした製造法は、本発明の変異体をコードするＤＮＡセグメントを提供すること；発現ベクター中への提供されたＤＮＡセグメントの導入；適合する宿主細胞へのベクターの導入；前記変異体の発現に必要とされる条件下で該宿主細胞を培養すること；および発現された変異体を宿主細胞から収穫すること、の段階を含んで成る。上に挙げられた段階のそれぞれについて、適する方法は本開示の実験の部に記述する。
【００７１】
本発明により使用することができるベクターはＤＮＡ複製ベクターを含んで成り、このベクターは、通常は適する宿主細胞中での自律複製のその能力によって本ＤＮＡセグメントの複製をもたらすように、本発明のＤＮＡセグメントに効果をもたらして連結することができる。
【００７２】
ＤＮＡ複製のみならずしかしまた本発明のＤＮＡセグメントによりコードされる変異体の産生も達成するために、前記ＤＮＡセグメントは発現ベクター、すなわちその中に導入されたＤＮＡセグメントの発現を指図することが可能なベクターに効果をもたらして連結される。ＤＮＡの複製および発現は同一もしくは異なるベクターから達成することができる。
【００７３】
本発明はまた、ＤＮＡ複製および／もしくは発現ベクターに効果をもたらして連結された本発明のＤＮＡセグメントを含有する組換えＤＮＡ分子にも向けられる。
【００７４】
本発明のＤＮＡセグメントを効果をもたらして連結することができるベクターの選択は、例えばタンパク質発現に関して該組換えＤＮＡ分子に望ましい機能特性、および形質転換されるべき宿主細胞に直接依存することが公知である。商業的に入手可能なかつ／もしくは従来技術の文献で開示された多様なベクターが、本ＤＮＡセグメントとともに使用することができるが、但し、こうしたベクターは前記ＤＮＡセグメントの複製を指図することが可能である。ＰＣ／ＡＰＣ変異体の構造遺伝子を含有するＤＮＡセグメントの場合は、好ましくは、該ベクターはまた、該ベクターが前記ＤＮＡセグメントもしくは遺伝子に効果をもたらして連結される場合に該構造遺伝子を発現することも可能である。
【００７５】
本発明の適する一態様は、真核生物細胞発現系、適しては脊椎動物、例えば哺乳動物の細胞発現系に関する。真核生物細胞中で使用することができる発現ベクターは当該技術分野で公知であり、そしていくつかの商業的供給源から入手可能である。一般に、こうしたベクターは所望のＤＮＡセグメントの挿入のための便宜的制限部位を含有する。こうしたベクターの典型的なものは、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、ｐＢＰＶ１／ｐＭＬ２ｄ（インターナショナル  バイオテクノロジーズ  インク（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．））、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（カリフォルニア州ラホヤ）から入手可能なｐＸＴ１、受託番号ＡＴＣＣ  ３７７２２としてアメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ；メリーランド州ロックビル）から入手可能なｐＪ５Ｅω、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ  ３１２５５）ならびに類似の真核生物発現ベクターである。本開示の実験の部では、アデノウイルスでトランスフェクトされたヒト腎細胞中での使用のための発現プラスミドを得るためにｐＲｃ／ＣＭＶ（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国カリフォルニア州から入手可能）を使用した。
【００７６】
本発明の組換えＤＮＡ分子を構築するのに使用される、適する真核生物細胞発現ベクターは、真核生物細胞中で有効である選択マーカー、好ましくは薬剤耐性選択マーカーを包含する。適する薬剤耐性マーカーは、その発現がネオマイシン耐性をもたらす遺伝子、すなわちネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子、Ｓｏｕｔｈｅｒｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１：３２７−３４１（１９８２）である。さらなる適する一薬剤耐性マーカーはジェネチシン（Ｇ４１８）に対する耐性を生じさせるマーカーである。あるいは、選択可能なマーカーは別個のプラスミド中に存在することができ、その場合、２種のベクターは宿主細胞のコトランスフェクションにより導入することができ、そして選択は選択可能なマーカーに対し適切な薬剤中で培養することにより達成する。
【００７７】
本発明の組換えＤＮＡ分子で形質転換されるべき宿主細胞として使用することができる真核生物細胞は、いかなる方法でも制限されないが、但し、細胞培養方法、発現ベクターの繁殖方法および企図される遺伝子産物の発現方法と適合性である細胞系を使用する。適する宿主細胞は酵母および動物細胞を包含する。脊椎動物細胞、およびとりわけ哺乳動物細胞、例えばサル、ネズミ、ハムスターもしくはヒト細胞系が好ましい。適する真核生物宿主細胞は、ＣＣＬ６１としてＡＴＣＣから入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＲＬ１６５８としてＡＴＣＣから入手可能なＮＩＨスイス（Ｓｗｉｓｓ）マウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）および類似の真核生物組織培養細胞系を包含する。本開示の実験の部において、アデノウイルスでトランスフェクトされたヒト腎細胞系２９３（アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、米国メリーランド州ロックビルから入手可能）を使用した。
【００７８】
本発明の発現系を得るために、真核生物、好ましくは哺乳動物の宿主細胞のような適する宿主細胞を本組換えＤＮＡ分子で形質転換し、既知の方法、例えばＧｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌ．，５２：４５６（１９７３）；Ｗｉｇｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：１３７３−７６（１９７９）に開示されるような方法を使用する。
【００７９】
従って、真核生物宿主細胞中で本発明のＤＮＡセグメントを発現するために、一般に、複製起点、本発明のＤＮＡセグメントの上流に配置されるべきであるプロモーター、リボソーム結合部位、ポリアデニル酸化部位および転写終止配列のような、遺伝子発現を制御するための機能的配列を含有する本発明の組換えＤＮＡ分子を使用する。真核生物細胞中で本発明のＤＮＡセグメントを発現するために使用されるべきこうした機能的配列は、ウイルスもしくはウイルス物質から得てよいか、または、例えば前記セグメントが完全な構造遺伝子を含んで成る場合は本ＤＮＡセグメント中に固有に含有されるかもしれない。
【００８０】
真核生物発現系で使用することができるプロモーターは、従って、アデノウイルス２、ポリオーマウイルス、ＳＶ４０などのようなウイルスから得てよい。とりわけ、アデノウイルス２の主要後期プロモーター（ｍａｊｏｒ  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ならびにＳＶ４０の初期プロモーターおよび後期プロモーターが好ましい。
【００８１】
適する複製起点もまたアデノウイルス、ポリオーマウイルス、ＳＶ４０、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）およびウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）のようなウイルス由来であってよい。あるいは、宿主染色体中に組込まれることができるベクターを発現ベクターとして使用する場合、宿主染色体の複製起点を利用してよい。
【００８２】
真核生物発現系が好ましい場合であっても、原核生物発現系もまた本発明とともに使用することができる。さらに、原核生物系は、本発明のＤＮＡセグメントの複製もしくは増幅を達成するのに有利に使用することができ、その後、前記原核生物系中で産生されたＤＮＡセグメントを、例えば真核生物発現系中でのコードされた産物の発現に使用する。
【００８３】
従って、本発明の原核生物ベクターは、原核生物のレプリコン、すなわちそれで形質転換された細菌宿主細胞のような原核生物宿主細胞中での染色体外での組換えＤＮＡ分子の自律複製および維持を指図する能力を有するＤＮＡ配列を包含する。こうしたレプリコンは当該技術分野で公知である。加えて、原核生物のレプリコンを包含する態様は、その発現がそれで形質転換された細菌宿主に薬剤耐性を賦与する遺伝子もまた包含する。典型的な細菌の薬剤耐性遺伝子は、アンピシリンもしくはテトラサイクリンに対する耐性を賦与するものである。
【００８４】
ＤＮＡ複製のみならずしかしまた発現系にも原核生物系を使用する場合、原核生物のレプリコンを包含するこれらのベクターは、それで形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌宿主細胞中での構造遺伝子を含有する本ＤＮＡセグメントの発現、すなわち転写および翻訳を指図することが可能な原核生物プロモーターもまた包含する。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写を起こさせるＤＮＡ配列により形成される発現制御要素である。
【００８５】
細菌宿主と適合するプロモーター配列は、典型的には、本発明のＤＮＡセグメントの挿入のための便宜的制限部位を含有するプラスミドベクター中で提供される。こうしたベクタープラスミドの典型的なものは、バイオラッド  ラボラトリーズ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリフォルニア州リッチモンドから入手可能なｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９、ならびにファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から入手可能なｐＰＬおよびｐＫＫ２２３である。
【００８６】
従って、本発明の遺伝子産物を発現することができる原核生物発現系を得るために、適切な原核生物宿主細胞を、例えばＭａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８２）に開示されるような、使用されるベクターの型に典型的に依存する公知の方法に従って、本発明の組換えＤＮＡ分子で形質転換する。
【００８７】
成功裏に形質転換された原核生物もしくは真核生物細胞を形質転換されない細胞と区別かつそれから分離することができることがもちろん必要である。この目的上、多様な方法が既知であり、そして従来技術の文献に記述されている。
【００８８】
こうした一方法に従って、組換えＤＮＡの存在を、形質転換処置にかけられた細胞由来の単一クローンのコロニーのＤＮＡ含量を検査することによりアッセイする。こうした方法は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３（１９７５）およびＢｅｒｅｎｔら，Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３：２０８（１９８５）により開示されている。
【００８９】
成功裏の形質転換はまた、例えば発現された遺伝子産物に特異的なモノクローナルもしくはポリクローナル抗体を使用する公知の免疫学的方法により、または発現された遺伝子産物の生物学的活性の検出により確認することもできる。
【００９０】
従って、発現ベクターで成功裏に形質転換された細胞は、表される抗原性もしくは生物学的活性により同定することができる。この目的上、形質転換されていることが疑われる細胞のサンプルを収穫し、そして前記生物学的活性もしくは抗原性のいずれかについてアッセイする。
【００９１】
こうした選択された成功裏に形質転換された細胞を使用して、上に開示されたところの所望のＰＣ／ＡＰＣ変異体を産生させる。
Ｅ．生物学的活性についてのアッセイ
本発明のＰＣ／ＡＰＣ変異体の生物学的活性をアッセイするための適する方法は、ＡＰＴＴ系のような血漿凝固系、および精製された第ＶＩＩＩａ因子の分解に関係する試験に基づく。こうした方法は本開示の実験の部により詳細に開示する。
Ｆ．組成物
本ＰＣ／ＡＰＣ変異体は、典型的には、意図された使用に適する組成物の形態で提供される。こうした組成物は、ＰＣ／ＡＰＣ変異体の生物学的活性を保存しかつまたその安定性も与えるべきである。適する組成物は、例えば生理学的に耐えられる担体と組合せの、治療上有効な量の本発明の変異体を含有する治療組成物である。こうした組成物は、治療上有効な量の、その抗凝固活性を高めるためのプロテインＳおよび／もしくは第Ｖ因子のようなさらなる有効成分もまた含有することができる。プロテインＣはカルシウム依存性タンパク質であるため、適しては、本組成物は、好ましくは生理学的量の二価のカルシウムもまた含有する。
【００９２】
一般に組成物の形態、およびとりわけ治療組成物の設計に関して考慮に入れられるべき考慮は当業者に公知であるため、これらをより詳細に記述する必要性は存在しない。
Ｇ．治療方法
本発明により、本ＰＣ／ＡＰＣ変異体が高められた抗凝固活性を表すことが示された。従って、本発明はまた、個体、例えばヒトにおける凝固の阻害方法に関し、前記方法は、治療上有効な量の本発明の変異体ＰＣ／ＡＰＣを含んで成る組成物を前記個体に投与することを含んで成る。治療することができる病状は本明細のどこか別の場所に開示する。
【００９３】
組成物に関して、治療方法の設計に関して考慮されるべき考慮、例えば適する投薬量範囲および投与経路は当業者に公知であり、そして、従って、これらの方法をより詳細に記述する必要性が存在しない。
Ｈ．考察
実験の部で製造されかつＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）と呼称される本発明の特定の一変異体は、ずっと改良された特性を表すことが見出された。
【００９４】
本変異体はｗｔ  ＡＰＣより抗凝固性であり、そしてそれはまた、ＧＮＥＤもしくはＱＧＥＤ（Ｓｈｅｎら、上記により記述される）のような以前の突然変異体より活性でもある。本変異体がずっと高められた活性を表すことは極めて驚くべきことである。一般に、２種の変異体ＱＧＮおよびＳＥＤＹのいずれもいかなる増大された抗凝固活性もしくは負に荷電したリン脂質膜に対する増大された親和性を表さないか、またはわずかにのみ表すからである。これは、Ｇｌａドメインの膜結合能力が非常に複雑でありかつ単一アミノ酸置換により容易に影響を及ぼされないことを示唆する。Ｇｌａドメインの複数の領域が突然変異される場合にのみ、ずっと高められたリン脂質親和性およびずっと増大された抗凝固活性を表すＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）のような独特の変異体を得ることが可能である。
【００９５】
ＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）の抗凝固活性はプロテインＳにより増強され、それは米国特許第５，８３７，８４３号明細書にＳｍｉｒｎｏｖとＥｓｍｏｎにより記述されたキメラＡＰＣ変異体の活性と対照をなす。この変異体はプロテインＣとプロトロンビンとの間のハイブリッドであり、ここでプロトロンビンのＧｌａドメインがプロテインＣ（ＰＣ）中の対応するＧｌａドメインを置換している。とは言え、高められたリン脂質結合のため、このＰＣ／ＡＰＣ変異体は野性型ＡＰＣより抗凝固性であり、その活性はプロテインＳにより増強されない。
【００９６】
また、欧州特許出願第ＥＰ  ０  ２９６  ４１３  Ａ２号明細書は、プロトロンビンとＰＣとの間のみならずしかしまたＦＶＩＩ、ＦＩＸもしくはＦＸとＰＣとの間のプロテインＣハイブリッドにも関する。これらの変異体は、プロトロンビン、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、もしくはＦＸからのＧｌａドメインおよびＰＣからの残部を含有する。しかしながら、これらの変異体において、Ｇｌａドメインは最初のＮ末端４３アミノ酸残基に制限され、そして、従って、これらの変異体はｗｔプロテインＣの位置４４の改変されたアミノ酸残基を含有しない。これらの変異体が、血液塊形成に対する改良された活性もしくは改良された線維素溶解促進効果を有することがその中で述べられているとは言え、これらの変異体はこうした活性に関して十分に特徴づけられていない。ＦＸ／ＰＣハイブリッドのみが製造されかつ特徴づけられ、そしてこのハイブリッドは、第Ｖａ因子の改良された不活性化を別にして、ｗｔ  ＰＣを上回る改良された抗凝固特性を有することが見出されなかった。
【００９７】
本変異体ＧＱＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）でのさらなる極めて予期されない一利点は、それが、ＡＰＣによるその主切断部位、すなわち位置Ａｒｇ５０６で突然変異され（ＦＶ：Ｑ５０６もしくはＦＶ  Ｌｅｉｄｅｎと呼称される）かつＡＰＣ抵抗性と呼称される普遍的な血液凝固障害で存在するＦＶａを切断することが可能であることである。これは、野性型ＡＰＣ（Ａｒｇ３０６（切断される場合にＦＶａの完全な不活性化をもたらす部位である）の切断において非常に乏しい）を上回る一利点である。従って、野性型ＡＰＣと対照的に、本変異体ＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）は、活性化されたＦＶ：Ｑ５０６を切断かつ不活性化することが可能である。Ａｒｇ５０６での切断と対照的に、Ａｒｇ３０６での切断はプロテインＳにより増強される。しかしながら、本変異体ＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）のさらなる一利点は、それがプロテインＳの非存在下でさえ活性化されたＦＶ：Ｑ５０６を切断することである。なおさらに、この切断は、プロテインＳが必要とされない場合であってもプロテインＳにより刺激される。活性化された第Ｖ因子をＡｒｇ３０６で切断する本変異体ＱＧＮＳＥＤＹの能力は、ＡＰＣ抵抗性を伴う患者についてもまた、それを抗凝固薬として魅力的にする。
【００９８】
ＡＰＣへのその活性化後に高められた抗凝固活性を表す組換えプロテインＣ分子が、可能な治療化合物、およびプロテインＣ系の他の成分についての多様な生物学的アッセイで使用されるべき試薬の双方として大きな潜在的使用を有することが明らかである。本発明により、プロテインＣ分子のＧｌａモジュール中の突然変異が、主として高められた膜結合活性により、実質的に高められた抗凝固活性につながる可能性があることが示された。従って、こうした突然変異についての系統的検索が、なおより良好な特性をもつ他のプロテインＣ分子を生じさせるかもしれないことを期待することができる。例えば、高度に特異的な機能をもつＡＰＣ分子、例えばＡｒｇ３０６でＦＶａを切断するさらなる分子を設計し、そして従って血液凝固障害ＡＰＣ抵抗性で存在する前記突然変異されたＦＶに対し良好にはたらくさらなるＡＰＣ変異体を生じさせることが可能になる可能性がある。
【００９９】
高められた抗凝固活性を表す本プロテインＣ変異体が、望ましくない血液凝固が阻害されるべきである全部の状況で有用であることができることが予見される。従って、本変異体は、血栓症および他の血栓塞栓性の病状の予防もしくは治療に使用することができる。播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、アテローム硬化症、心筋梗塞、多様な凝固亢進状態および血栓塞栓症、ならびにまた敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）および敗血症（ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ）がこうした病状を具体的に説明する。本変異体は、例えば心筋梗塞に関連するおよび外科手術に関連する血栓溶解療法後の血栓症予防にもまた使用することができる。本プロテインＣ変異体およびプロテインＳ（野性型プロテインＳもしくはその変異体）の組合せは有用である可能性があり、この組合せ剤はまたＡＰＣに対する補助因子として活性を発現する第Ｖ因子も包含する可能性がある。
【０１００】
本ＰＣ／ＡＰＣ変異体の診断的使用に関して、プロテインＳ、およびまた第Ｖ因子の抗凝固活性についても改良された機能アッセイに対する大きな必要性が存在する。高められた抗凝固活性をもつ突然変異されたＡＰＣがこうしたアッセイで非常に重要であろうことがありそうである。こうしたＡＰＣはより強いシグナルを生じさせることができ、そしてこれは多様なアッセイにおける増大されたＳ／Ｎ比につながることができるからである。
【０１０１】
非常に独特の特性をもつプロテインＣを生じさせるために、プロテインＣの他の部分中の突然変異とＧｌａモジュール中の突然変異を組み合わせることが可能であるかもしれない。イーライ  リリー（Ｅｌｙ  Ｌｉｌｌｙ）の科学者（Ｅｈｒｌｉｃｈら、Ｅｍｂｏ．Ｊ．１９９０，９：２３６７−２３７３；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  １９９２，３６０：２６１−２６４）、およびまた他のグループが、活性化ペプチド領域周辺の突然変異がＴＭの非存在下でさえ容易に活性化されたプロテインＣを生じたことを既に示している。同様に、活性化ペプチド領域中の突然変異の別の組は、合成細胞（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  ｃｅｌｌ）から活性の形態で分泌されたプロテインＣ分子につながった（Ｅｈｒｌｉｃｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９，２６４：１４２９８−１４３０４）。将来の展望において、活性化過程に影響を及ぼす突然変異。および／もしくは触媒活性に影響を及ぼすＳＰモジュール中の突然変異を、Ｇｌａドメイン中の本突然変異と組み合わせることが興味深くなるかもしれない。また、本突然変異の、ＡＰＣとその補助因子との間の相互作用を高めるかもしれない将来の突然変異との組合せも予見される。
実験の部
以下の実施例において、本発明を具体的に説明する適する態様を開示する。しかしながら、これらの実施例は本発明を制限するとして解釈されるべきでない。その中に別の方法で述べられない限り、ヒトＰＣ／ＡＰＣ突然変異を製造し、また、ヒト凝固因子、血漿などを使用した。
【０１０２】
これらの実施例において、以下の材料を使用した。
【０１０３】
リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）およびジェネチシン（Ｇ４１８）はライフ  テクノロジーズ  ＡＢ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＡＢ）、スウェーデンから入手可能であり、また、ダルベッコのイーグル改変培地（ＤＭＥＭ）はギブコ  コーポレーション（Ｇｉｂｃｏ  Ｃｏｒｐ．）から入手可能である。
【０１０４】
トロンビンおよびヒトプロテインＳは以前に記述された方法（Ｄａｈｌｂａｅｃｋら，１９９０；ＤａｈｌｂａｅｃｋとＨｉｌｄｅｎｂｒａｎｄ，１９９４）に従って精製した。
実施例１．プロテインＣの変異体の製造
（ａ）部位特異的突然変異誘発
本研究で使用された多様なプロテインＣ変異体は、本質的にＳｈｅｎら（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９８，２７３：３１０８６−３１０９１およびＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９７７，３６  １６０２５−１６０３１）により以前に記述されたところの組換え技術を用いて創製した。
【０１０５】
Ｊｏｈａｎ  Ｓｔｅｎｆｌｏ博士（大学病院臨床化学部（Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ），スウェーデン・マルメ）からの寛大な贈り物であった完全長のヒトプロテインＣ  ｃＤＮＡクローンを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化し、そして、完全長プロテインＣ  ｃＤＮＡである完全なＰＣコーディング領域を含んで成る結果として生じる制限フラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化された発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶにクローン化した。
【０１０６】
野性型ヒトプロテインＣのコーディング配列を含有する、結果として生じる発現ベクターを、プロテインＣのＧｌａモジュールの部位特異的突然変異誘発に使用し、ここで、標的ＤＮＡの増幅のためのＰＣＲ処置を、以前に記述された（Ｓｈｅｎら、上記）とおり実施した。
【０１０７】
突然変異誘発プライマーを、位置１０、１１、１２、２３、３２、３３および４４の野性型アミノ酸残基の多様な他のアミノ酸での置換を引き起こすための本処理での使用のため設計した。より具体的には、位置１０でヒスチジン（Ｈ）をグルタミン（Ｑ）で置換し；位置１１でセリン（Ｓ）をグリシン（Ｇ）で置換し；位置１２でセリンをアスパラギン（Ｎ）で置換し；位置２３でアスパラギン酸（Ｄ）をセリン（Ｓ）で置換し；位置３２でグルタミン（Ｑ）をグルタミン酸（Ｅ）（成熟タンパク質中でＧｌａ（γ−カルボキシグルタミン酸）に転化されることができる）で置換し；位置３３でアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）で置換し；そして最後に位置４４でヒスチジン（Ｈ）をチロシン（Ｙ）で置換した。これらのプライマーを使用して、以下の変異体（もしくは突然変異体）を製造した：
ＱＧＮと呼称される突然変異体１）（位置１０、１１、１２が突然変異された）。
ＳＥＤと呼称される突然変異体２）（位置２３、３２および３３が突然変異された）。
ＳＥＤＹと呼称される突然変異体３）（位置２３、３２、３３および４４が突然変異された）。
ＱＧＮＳＥＤＹと呼称される突然変異体（突然変異体１）および３）（ＱＧＮおよびＳＥＤＹ）の組合せである）。
【０１０８】
ＧＮＥＤと呼称される突然変異体５）およびＱＧＥＤと呼称される突然変異体６）（双方はＳｈｅｎらにより以前に記述された）を比較として使用した。
【０１０９】
ＱＧＮ突然変異体を製造するために、２種の以下のオリゴヌクレオチドを合成しかつ第一のＰＣＲ処置で使用した。すなわち、プライマーＡはヌクレオチド配列：５’−ＡＡＡ  ＴＴＡ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＧＧＧ  ＡＧＡ  ＣＣＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ−３’（配列番号４）（ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位を包含するベクターｐＲｃ／ＣＭＶ中のヌクレオチド８６０−８９５のセンスに対応する）、を有し、また、プライマーＢはヌクレオチド配列：ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＧＴＴ  ＧＣＣ  ＴＴＧ  ＡＣＧ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＧＡＡ（配列番号５）（位置１０−１２が突然変異された（対応するヌクレオチドの下線付けにより示す）、アミノ酸４−１７をコードするＤＮＡ伸長の第二鎖に対応する）を有した。これらのプライマーＡおよびＢを、ｗｔヒトプロテインＣ  ｃＤＮＡを鋳型として使用したＰＣＲ反応で使用した。ＰＣＲ産物をＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＢｓｔ  ＢＩで切断し、それは突然変異体のアミノ酸残基を含有するおよそ２００ｂｐ長のフラグメントを生じた。このフラグメントを２個の他のＤＮＡ片（一方はｗｔヒトプロテインＣ  ｃＤＮＡの大きな部分をコードするＢｓｒ  ＢＩ−Ｘｂａ  Ｉフラグメントであり、そして他方はＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｘｂａ  Ｉ切断されたｐＲｃ／ＣＭＶベクターである）に連結した。連結されたｃＤＮＡを、制限酵素切断（Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ／Ｂｓｒ  ＢＩ）および配列決定で確認してＱＧＮ突然変異を確認した。
【０１１０】
数段階を行ってＳＥＤＹを創製した。第一は、Ｅ３２Ｄ３３突然変異を既に有したｃＤＮＡ（Ｓｈｅｎら  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９８，２７３：３１０８６−３１０９１）中でＳ２３突然変異を創製することであった。２種のプライマーをＳ２３突然変異のため作成した（一方はプライマーＣと呼称され、そして他方はプライマーＤと呼称される）。プライマーＣはヌクレオチド配列：ＡＴＡ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＴＧＴ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＧＣＣ  ＡＡＧ（配列番号６）（突然変異に下線を付ける）を有し；また、プライマーＤはヌクレオチド配列：ＣＴＴ  ＧＧＣ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＡＣＡ  ＧＡＴ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＴＡＴ（配列番号７）（突然変異に下線を付ける）を有した。突然変異体ｃＤＮＡを創製するために２回のＰＣＲ反応を実施し、ここで、突然変異体ｃＤＮＡ  ＥＤを鋳型として使用し、かつ、ここで、プライマーＡおよびＣを第一の反応で使用した一方、プライマーＤおよびＥを第二の反応で使用した。プライマーＥはヌクレオチド配列：５’−ＧＣＡ  ＴＴＴ  ＡＧＧ  ＴＧＡ  ＣＡＣ  ＴＡＴ  ＡＧＡ  ＡＴＡ  ＧＧＧ  ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＡＧＡ−３’（配列番号８）（Ｘｂａ  Ｉクローニング部位を包含するベクターｐＲｃ／ＣＭＶ中のヌクレオチド９８４−１０１９に対しアンチセンス）を有した。プライマーＡおよびＣを必要とした第一のＰＣＲ反応はプロテインＣ  ｃＤＮＡの５’部分（アミノ酸２８までをコードする）を増幅した一方、プライマーＤおよびＥを必要とした第二のＰＣＲ反応は、アミノ酸１８からプロテインＣの終わりまでをコードするｃＤＮＡの３’部分を生成させた。その後、これらの反応で産生された２産物を、プライマーＡおよびＥを使用したさらなるＰＣＲ反応で組み合わせた。この処置からの最終産物は、位置２３、３２および３３に突然変異を運搬するプロテインＣ全体をコードするｃＤＮＡであった。その後、該ＰＣＲ産物をＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＳａｌ  Ｉで切断し、それは３６０ｂｐの５’フラグメントを生じ、それを精製し、そしてｗｔ  プロテインＣのＳａｌ  Ｉ−Ｘｂａ  Ｉフラグメントとともに、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｘｂａ  Ｉ切断されたｐＲｃ／ＣＭＶベクターに連結した。このベクターは従って、完全長の突然変異体ＳＥＤのｃＤＮＡを含有した。このｃＤＮＡをＰＣＲ反応で鋳型として使用して、突然変異体ＳＥＤＹ（すなわち位置４４がヒスチジンからチロシン（Ｙ）に突然変異された）を創製した。この反応において、プライマーＡを、位置４４を突然変異するように設計されかつ以下のヌクレオチド配列：ＣＴＧ  ＧＴＣ  ＡＣＣ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＧＴＡ  ＣＴＴ  ＧＧＡ  ＣＣＡ  ＧＡＡ  ＧＧＣ  ＣＡＧ（配列番号９）（アミノ酸残基３９−４９をコードする第二鎖に対応し、下線を付けられたコドンは突然変異点である）を有するプライマーＦと組み合わせた。該ＰＣＲ産物をＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＳａｌ  Ｉで切断し、そして約３６０ｂｐ長のフラグメントを、プロテインＣ  ｃＤＮＡの残存する部分、すなわちＳａｌ  Ｉ−  Ｘｂａ  ＩフラグメントおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｘｂａ  Ｉ切断されたｐＲｃ／ＣＭＶに連結した。
【０１１１】
その後、突然変異体ＱＧＮＳＥＤＹをコードする完全に突然変異されたプロテインＣ  ｃＤＮＡを、ＱＧＮおよびＳＥＤＹ突然変異体のｃＤＮＡを使用して創製した。組合せは、制限酵素消化および適切なフラグメントの連結を使用して創製した。従って、ＱＧＮ変異体ｃＤＮＡをＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＢｓｒ  ＢＩで切断し、そして約２００ｂｐ長の５’フラグメントを単離し、そしてＳＥＤＹ  ｃＤＮＡ由来のＢｓｒ  ＢＩ−Ｘｂａ  Ｉフラグメント（約１０００ｂｐ長）と一緒に使用した。該２フラグメントを、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｘｂａ  Ｉ切断されたｐＲｃ／ＣＶＭに連結して、ＱＧＮＳＥＤＹをコードする完全長の変異体プロテインＣ  ｃＤＮＡ（本文中で「ＡＬＬ」ともまた称される）を生成させた。最終生成物を配列決定で試験し、そして正しい突然変異を含有することを見出した。
【０１１２】
記録のために、Ｅ３２Ｄ３３突然変異体は、プライマーＧ：５’−ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＧＴＣ  ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＡＴＣ ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＡＡＴ  ＴＴＣ  ＣＴＴ  ＧＧＣ−３’（配列番号１０）（アミノ酸２７−３８のアンチセンス、Ｅ３２Ｄ３３突然変異に下線を付ける）を使用して、類似の様式で創製した（この突然変異体はＳｈｅｎら  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９８，２７３：３１０８６−３１０９１に詳細に記述される）。
【０１１３】
ＤＮＡ配列決定は全部の突然変異を確認した。ヒト２９３細胞中での細胞培養、発現、精製およびプロテインＣ分子の特徴づけは、記述されるとおり（Ｓｈｅｎ  Ｌら  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９８，２７３：３１０８６−３１０９１）実施した。
【０１１４】
簡潔には、所望の突然変異を含有する、結果として生じるヒトプロテインＣ  ｃＤＮＡを、ＳａｃＩＩおよびＡｐａＩで消化し、そしてその後、ＳａｃＩＩおよびＡｐａＩ消化からのフラグメント（ヌクレオチド７２８−１３１１）を、無傷のヒトプロテインＣフラグメント（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩＩ、５’端ヌクレオチド７２８；およびＡｐａＩ−ＸｂａＩ、ヌクレオチド１３１１−３’端）を含有するベクターｐＵＣ１８にクローン化して、所望の突然変異を含んで成る、すなわち、ヒト野性型配列の代わりに突然変異された配列を含んで成るヒトプロテインＣ突然変異体をコードする、ヒトプロテインＣの完全長ｃＤＮＡを製造した。
【０１１５】
その後、上の突然変異されたヒトプロテインＣ  ｃＤＮＡのそれぞれをＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化し、そして適切な制限フラグメントを、同一の制限酵素で消化していたベクターｐＲｃ／ＣＭＶにクローン化した。得られたベクターを、真核生物細胞中での突然変異されたヒトプロテインＣの発現に使用した。
【０１１６】
適切な宿主細胞のトランスフェクション前に、全部の突然変異を、Ｓａｎｇｅｒら、上記のチェーンターミネーター法によるＤＮＡ配列決定により確認した。
（ｂ）変異体もしくは野性型プロテインＣを産生する安定な形質転換体の製造。
【０１１７】
変異体もしくは野性型プロテインＣを産生する安定な形質転換体を製造するために、アデノウイルスでトランスフェクトされたヒト腎細胞系２９３を、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０μｇ／ｍｌビタミンＫ１を含有するＤＭＥＭ培地中で成長させ、そして、野性型もしくは段階（ａ）からの突然変異誘発されたプロテインＣ  ｃＤＮＡを含んで成る発現ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションは、以前に記述された（Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９８７）ところのリポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）法に従って実施した。簡潔には、２ｍＭのＬ−グルタミンを含有するＤＭＥＭで１００μｌに希釈した２μｇのベクターＤＮＡを、同一緩衝液で１００μｌに希釈した１０μｌのリポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（１μｇ／μｌ）と混合した。混合物を室温で１０〜１５分間保ち、そして培地で１．８ｍｌに希釈し、そしてその後、同一培地で２回洗浄していた細胞（５ｃｍペトリ皿中２５〜５０％コンフルエンス）に添加した。
（ｃ）変異体もしくは野性型プロテインＣの発現。
【０１１８】
（ｂ）からのトランスフェクトされた細胞を１６時間インキュベートし、その後、培地を、１０％仔ウシ血清を含有する完全培地で置き換え、そして細胞を追加の４８〜７２時間インキュベートした。その後、細胞をトリプシン処理し、そして選択培地（１０％血清、４００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０μｇ／ｍｌビタミンＫ１を含んで成るＤＭＥＭ）（Ｇｒｉｎｎｅｌｌら  １９９０）を含有する１０ｃｍ皿に接種した。Ｇ４１８耐性コロニーを３〜５週間の選択後に得た。各ＤＮＡトランスフェクション処置から２４個のコロニーを選択し、そしてコンフルエンスまで成長させた。全部のコロニーを、モノクローナル抗体ＨＰＣ４（ヒトプロテインＣに特異的）を使用するドットブロットアッセイによりスクリーニングして、プロテインＣの発現を検査した。高発現細胞コロニーを選択しかつ選択培地中でコンフルエンスまで成長させた。その後、これらの細胞を馴化培地（血清を欠く選択培地）中で成長させてプロテインＣもしくはその変異体の発現を開始させ、この培地は選択培地と同様、７２時間ごとに交換した。適する時間の期間の後に、それぞれの発現産物を含有する馴化培地を、下の節（ｄ）での前記産物の精製のため収集した。
（ｄ）組換え野性型および突然変異されたタンパク質の精製
ヒト野性型もしくは突然変異体プロテインＣを産生する形質転換体から節（ｃ）で得られた培地を、「偽親和性（ｐｓｅｕｄｏ−ａｆｆｉｎｉｔｙ）」と命名されかつ以前に記述された（Ｙａｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９０，Ｖｏｌ．８，６６５−６１）クロマトグラフィー法を含んで成る単純かつ便宜的精製方法にかけた。
【０１１９】
上で得られた精製されたタンパク質をＹＭ１０フィルター（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ））上で濃縮し、ＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に対し１２時間透析し、そしてその使用まで−８０℃で保存した。
【０１２０】
上の野性型および突然変異体プロテインＣの純度および均一性をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確立した。この電気泳動処置は、還元および非還元条件下で０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の存在下でのポリアクリルアミド（１０〜１５％）スラブゲル電気泳動として行い、ここで前記タンパク質を銀染色（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，１９８１）により可視化した。
実施例２．プロテインＣ突然変異体の特徴づけ
前段階で得られたプロテインＣ突然変異体を特徴づけるために、突然変異体および野性型プロテインＣを活性化し、そして、それらの抗凝固活性を、精製された成分を用いる血漿に基づくアッセイおよび設定を包含する多様な実験系で試験した。
【０１２１】
２種の血漿系を使用し、一方は活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）系であり、また、他方はトロンボプラスチン（ＴＰ）系であった。ＡＰＴＴおよびＴＰ双方の系において、増大する濃度のｗｔもしくは突然変異体ＡＰＣの抗凝固活性を試験した。ＡＰＴＴ系において、ＡＰＣの抗凝固活性はＦＶＩＩＩａおよびＦＶａ双方の分解に依存する一方、ＴＰ系は主としてＦＶａ分解に感受性である。しかしながら、希釈されたＴＰ系は、ＦＶＩＩＩａの分解に対してもまた若干の程度まで感受性である。
（ａ）。ＡＰＴＴ反応によりモニターされるところのＡＰＣ変異体による凝固の阻害。
【０１２２】
（ｉ）方法：血漿（５０μｌ）を５０μｌのＡＰＴＴ試薬（オルガノン  テクニカ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｃａ）からのＡＰＴＴプラテリン（Ｐｌａｔｅｌｉｎ）ＬＳ）と混合し、そして３７℃で２００秒間インキュベートした。凝固を、５０μｌのＡＰＣ（図１に示される最終濃度）および５０μｌの２５ｍＭ  ＣａＣｌ２の混合物で開始した。凝固時間をアメルング（Ａｍｅｌｕｎｇ）凝固計で測定した。
【０１２３】
（ｉｉ）結果：このＡＰＴＴに基づくアッセイにおいて、ｗｔ  ＡＰＣの活性を、本発明の突然変異体１）、３）および４）、すなわちＱＧＮ、ＳＥＤＹおよびＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）の活性、ならびにＳｈｅｎら（Ｊ  ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９８，２７３：３１０８６−３１０９１）により以前に記述された２種の突然変異体、すなわちそれぞれＧＮＥＤおよびＱＧＥＤと呼称される突然変異体５）および６）の活性と比較した。
【０１２４】
図１を参照すれば、ＡＬＬの抗凝固活性はｗｔ  ＡＰＣの抗凝固活性に比較してかなり高められていることが明らかである。使用された最高濃度において、ＡＬＬは１０００秒を越える凝固時間を生じた一方、ｗｔ  ＡＰＣは約２００秒の凝固時間を生じたのみであった。添加されるＡＰＣを伴わない基礎の正常凝固時間は約３０〜４５秒である。他方、２種の以前に記述された突然変異体、ＱＧＥＤおよびＧＮＥＤは非常に異なる結果を生じた。ＧＮＥＤはｗｔ  ＡＰＣよりかなりより活性であった一方、ＱＧＥＤは実のところｗｔ  ＡＰＣより少なく活性であった。本発明の変異体ＱＧＮおよびＳＥＤＹはＧＮＥＤと等しく活性であったが、しかしＡＬＬより少なく活性であった。
【０１２５】
本ＡＰＴＴアッセイにおいて、試薬は標準的な商業的試薬であり、これはＳｈｅｎらによる研究（Ｊ  ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９８，２７３：３１０８６−３１０９１）で使用された試薬と対照的である。その研究では希釈されたＡＰＴＴ試薬を使用した。そうでなければＡＰＣ変異体がｗｔ  ＡＰＣよりも活性の抗凝固薬でなかったためである。Ｓｈｅｎらの参考文献の考察の節において、これは試薬中のリン脂質のレベルによると説明された。高レベルのリン脂質を使用した場合、Ｓｈｅｎらによる研究で使用されたＡＰＣ変異体の増大された活性に気づくことは容易でなかった。希釈された試薬を使用した場合にのみ、著者らはＡＰＣ変異体の抗凝固活性の強い増大を立証することができた。
【０１２６】
本変異体ＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）は、標準レベルのリン脂質でもまた、ｗｔ  ＡＰＣより明らかにずっとより活性であるため、それは独特であるようである。
（ｂ）ＡＰＴＴアッセイにおけるヒトプロテインＳの影響
（ｉ）方法：増大する濃度のプロテインＳをプロテインＳ欠乏の血漿に添加して、図２に示される最終濃度を得た。血漿アリコート（５０μｌ）をＡＰＴＴ試薬と混合し、そしてその後３７℃で２００秒間インキュベートした。ｗｔもしくはＡＬＬ突然変異体（ＱＧＮＳＥＤＹ）いずれかのＡＰＣを５０μｌの容量で添加し（濃度２０ｎＭ）、そしてその後、５０μｌの２５ｍＭ  ＣａＣｌ２の添加により凝固を直ちに開始した。結果を、プロテインＳ欠乏の血漿中でのプロテインＳの濃度に対しプロットされた凝固時間として、図２に示す。
【０１２７】
これらの実験は本質的に図１に言及して上述されたとおり実施し、プロテインＳ欠乏の血漿を正常血漿の代わりに使用した。このプロテインＳ欠乏の血漿はヒト起源のものであり、また、プロテインＳの枯渇は、ヒトプロテインＳに対する高度に効率的なモノクローナル抗体（Ｄａｈｌｂａｅｃｋら（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９０  ２６５：８１２７−３５）により記述されたＨＰＳ５４）を使用する免疫吸収の結果であった。
【０１２８】
（ｉｉ）結果：図２を参照すれば、本発明の好ましい変異体、すなわちＱＧＮＳＥＤＹ変異体が、プロテインＳを枯渇された血漿を使用した場合でもまたｗｔ  ＡＰＣよりかなりより活性であったことが明らかである。とりわけ興味深いのは、外因性のプロテインＳの添加がＱＧＮＳＥＤＹならびにｗｔ  ＡＰＣの抗凝固活性を高めたという観察結果である。プロテインＳの非存在下で、突然変異体ＡＬＬは約１６０秒の凝固時間を生じ、そしてこの凝固時間は試験系中のプロテインＳの添加により３５０秒まで延長された。ｗｔ  ＡＰＣを用いて得られた対応する値は、プロテインＳの非存在下で約１００秒の基礎凝固時間であり、そして、本試験で使用された最高のプロテインＳ濃度の存在下で１５０秒の延長された凝固時間であった。従って、ＡＬＬはプロテインＳの存在および非存在下双方でｗｔ  ＡＰＣより本質的により活性であること、ならびに、ＡＬＬはさらにプロテインＳの存在により増強されることが明らかである。これは、プロテインＳにより刺激されなかったＥｓｍｏｎとＳｍｉｒｎｏｖのＡＰＣ変異体（国際特許出願第ＷＯ  ９８／２０１１８号明細書に記述される）を用いて彼らにより得られた結果と対照的である。明らかに、本変異体ＱＧＮＳＥＤＹは、それがプロテインＳにより刺激されるため、ＥｓｍｏｎとＳｍｉｒｎｏｖにより開示された変異体より優れている。
（ｃ）ＴＰ系によりモニターされるところのＡＰＣ変異体による凝固の阻害
（ｉ）方法：正常血漿（５０μｌ）を、増大する濃度の多様なＡＰＣ変異体（５０μｌ）のアリコートと混合し、その後、組織因子の供給源としての５０倍希釈されたトロンボプラスチンの添加により凝固を開始した。凝固を開始するために、希釈されたトロンボプラスチンは２５ｍＭ  ＣａＣｌ２もまた含有した。
【０１２９】
（ｉｉ）結果：図３から明らかであるとおり、本アッセイで得られた結果はＡＰＴＴ系で得られたものに類似であった。従って、変異体ＱＧＮＳＥＤＹはｗｔ  ＡＰＣよりかなりより活性であった。より具体的には、使用された最高濃度で、変異体ＱＧＮＳＥＤＹ（図３でＡＬＬと呼称される）は、６００秒に近かった凝固時間を生じた。第二の最良の変異体はＧＮＥＤであり、これは最高濃度でおよそ１８０秒の凝固時間を生じた。対照的に、ｗｔ  ＡＰＣは約７０秒の凝固時間を生じたのみであった。外因性のＡＰＣの添加を伴わずに得られた基礎凝固時間はおよそ４０秒であった。
【０１３０】
明らかに、本実験の結果は、ｗｔ  ＡＰＣに比較して、変異体ＱＧＮＳＥＤＹが独特の特性を有することを示唆する。ｗｔ  ＡＰＣは、増大する濃度のｗｔ  ＡＰＣであっても、変異体ＱＧＮＳＥＤＹの抗凝固活性ほど高い抗凝固活性を決して表さないからである。これは、変異体ＱＧＮＳＥＤＹのＧｌａドメインの突然変異誘発により、ｗｔ  ＡＰＣに比較して新たなかつ別個の機能を表す分子が創製されたことを示唆するかもしれない。１つのこうした機能は、ＦＸａにより提供されるＦＶａ中のＡｒｇ５０６部位の保護に関係する可能性がある。ＦＸａがＡｒｇ５０６に近い部位でＦＶａに結合すること、およびこれがＡｒｇ５０６部位の保護をもたらすことが既知である。おそらく、ＱＧＮＳＥＤＹの独特かつ高いリン脂質結合能力が、ＦＸａにより提供される保護を排除する。凝固アッセイの間に、ある量のＦＸａが形成され、そしてこれはＦＶａ中のＡｒｇ５０６部位を切断するｗｔ  ＡＰＣの能力を制限するかもしれない。ＱＧＮＳＥＤＹ変異体が、リン脂質膜のみならずしかしまたＦＶａ分子に対するその高親和性によりＦＸａを置換する可能性があることが可能である。さらに、本試験で使用されたＡＰＣの最高濃度で、ＱＧＮＳＥＤＹ変異体は、ｗｔ  ＡＰＣが可能であるよりもかなり大きく凝固時間を延長させることが可能である。これは、ＡＰＣ変異体ＱＧＮＳＥＤＹが独特のインビボ特性を有するかもしれず、また、既に進行中である凝固反応を阻害することが可能であるかもしれないことを示唆する。
【０１３１】
（ｄ）ＰＴアッセイにおけるプロテインＳの影響
実施例２（ｂ）（ｉ）で記述されたものと同様のプロテインＳ欠乏の血漿を用いた実験もまた実施し、実施例２（ｃ）（ｉ）のトロンボプラスチン系を使用した。それにより得られた結果は、実施例２（ｂ）（ｉｉ）のＡＰＴＴ系について記述されたものに類似であった。簡潔には、ＱＧＮＳＥＤＹ変異体がプロテインＳの非存在下で活性であるが、しかしなお、その活性はプロテインＳにより増強されることが見出された。
実施例３．ＡＰＣによるＦＶａの不活性化
本実施例において、ＡＰＣ変異体ＱＧＮＳＥＤＹの高められた活性を、ＦＶａの分解をより具体的に特徴づけるよう設計されかつ長時間のＦＶａ活性の喪失を立証する系で確立した。
【０１３２】
（ｉ）方法：血漿ＦＶａ（０．７６ｎＭ）（血漿を２５倍希釈し、そしてその中に含有されるＦＶをトロンビンの添加により活性化し、これをＦＶａの供給源として使用した）を、２５μＭのリン脂質小胞（１０％ホスファチジルセリンおよび９０％ホスファチジルコリンの混合物）の存在下にＡＰＣ（０．３９ｎＭ）とともにインキュベートした。緩衝液は、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５および５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡであり、また、温度は３７℃であった。
【０１３３】
多様な時点でアリコートを抜き取り、そして残存するＦＶａ活性をＦＶａアッセイにより測定した。このアッセイは、プロトロンビンのＦＸａに媒介される活性化を増強するＦＶａの能力に基づいた。このアッセイは、ウシＦＸａ（５ｎＭ最終濃度）、５０μＭリン脂質小胞（１０％ホスファチジルセリンおよび９０％ホスファチジルコリンの混合物）、ならびに０．５μＭウシプロトロンビンを含有した。トロンビンの生成は色原体基質Ｓ２２３８（クロモゲニックス  ＡＢ（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ  ＡＢ）から入手可能）を使用して測定した。
【０１３４】
（ｉｉ）結果：ｗｔ  ＡＰＣとのＦＶａのインキュベーションに引き続いて起こるＦＶａ活性の喪失は、主として２個の切断反応、すなわちＡｒｇ５０６およびＡｒｇ３０６での結果である。動的に好ましい反応はＡｒｇ５０６で起こる反応であり、これがインキュベーションの最初の５分の間に観察されるＦＶａ活性の初期の急速な喪失を生じる。Ａｒｇ５０６切断はＦＶａの部分的阻害のみをもたらす。Ｎｉｃｏｌａｅｓら（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９５  ２７０：２１１５８−６６）により示されているとおり、Ａｒｇ５０６で切断されたＦＶａは、ＦＸａに対する補助因子としてなお部分的に活性であり、その活性の約４０％は維持されているからである。他方、Ａｒｇ３０６でのより緩徐な切断はＦＶａ活性の完全な喪失をもたらす。このＡｒｇ３０６の切断は、インキュベーションの５分と２５分との間で観察されるＦＶａ活性の緩徐な減少に反映されるとおり、ゆっくりと進行している。図４から明らかであるとおり、変異体ＱＧＮおよびＳＥＤＹはｗｔ  ＡＰＣよりわずかにのみより良好である一方、本変異体ＱＧＮＳＥＤＹはかなりより強力である。本変異体ＱＧＮＳＥＤＹは、最初の５分の間におよそ２０％のＦＶａ活性までのＦＶ活性の非常に急速な下落を生じるのみならず、しかし最終的にはまたＦＶａをほとんど完全に阻害する。これらの結果は、本変異体ＱＧＮＳＥＤＹがｗｔ  ＡＰＣで見られるものより急速にＡｒｇ５０６でＦＶａを切断するのみならず、しかしｗｔ  ＡＰＣと反対に、Ａｒｇ３０６部位でもまたＦＶａを切断することを示唆する。
【０１３５】
上述されたものに類似の実験（結果は示されない）を実施し、ここで、ＦＶａを不活性化する変異体ＱＧＮＳＥＤＹおよびｗｔ  ＡＰＣの能力を、以前に特徴づけられた変異体ＧＮＥＤのこの能力と比較した（図１および図３を参照されたい）。ＧＮＥＤ変異体は、他の２種の変異体について得られた曲線のほぼ正確に間に配置される曲線を生じることが見出された。すなわち、ＧＮＥＤはｗｔ  ＡＰＣより強力であったが、しかし本変異体ＱＧＮＳＥＤＹより少なく有効であった。これらの実験は、全部、外因性のプロテインＳの添加を伴わずに実施した。得られた結果は、以前に開示されたＧＮＥＤ変異体が中間の活性を有することもまた示す、実施例２（ａ）および（ｃ）で実施されかつそれぞれ図１および図３に具体的に説明される実験の結果と矛盾しなかった。
実施例４．ＡＰＣによるＦＶａの不活性化
本実施例において、ＡＰＣの濃度を変動させ、そして残存するＦｖａ活性を、実施例３（ｉ）に記述されるプロトロンビナーゼアッセイを使用して、１０分のインキュベーション後に測定した。
【０１３６】
（ｉ）方法；希釈された正常混合血漿から得られたＦＶａ（０．７６ｎＭ）を、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２および５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ中で、増大する濃度のＡＰＣ（最終濃度は図５に示される）および２５μＭリン脂質小胞（ホスファチジルセリン／ホスファチジルコリン、１０／９０、ｍｏｌ／ｍｏｌ）とともに３７℃でインキュベートした。ＦＶａ活性を、実施例３（ｉ）に記述されたところのプロトロンビナーゼアッセイで測定した。
【０１３７】
（ｉｉ）結果：図５から、これらの実験は突然変異体ＡＬＬすなわち本変異体ＱＧＮＳＥＤＹの優れた有効性をはっきりと立証することが明らかである。極めて低濃度のＡＰＣさえＦＶａ活性の強力な阻害をもたらした。さらに、突然変異体ＡＬＬは、約４０％の活性を表すＦＶａの中間分解産物をもたらすＡｒｇ５０６部位で切断するのみならず、しかしまたＦＶａ活性のほとんど完全な喪失をもたらすＡｒｇ３０６部位でも切断することが図５の曲線から明らかである。
実施例５．ＡＰＣによる正常およびＱ５０６突然変異体ＦＶａの不活性化
本実施例において、正常血漿ＦＶａをＡＰＣ抵抗性血漿（ＦＶ：Ｑ５０６−ＦＶ  Ｌｅｉｄｅｎについてのホモ接合性を伴う個体から得られた）からのＦＶａで置換した。この実験は外因性のプロテインＳの存在および非存在の双方で実施した。
【０１３８】
（ｉ）方法：正常のプールされた血漿、もしくはホモ接合性のＡＰＣ抵抗性（ＦＶ：Ｑ５０６もしくはＦＶ  Ｌｅｉｄｅｎ）を伴う個体のいずれかから得られた血漿ＦＶａを、Ａｒｇ３０６での切断を確実にするために精製されたヒトプロテインＳ（１００ｎＭ）を添加したことを除き実施例（３）（ｉ）に記述されたとおり０．４ｎＭ  ＡＰＣおよび２５μＭリン脂質小胞とともにインキュベートした。図６に示されるところの時点で残存するＦＶａ活性を測定した。
【０１３９】
（ｉｉ）結果：ｗｔ  ＡＰＣの添加は、Ａｒｇ３０６での切断に対応するＦＶａ活性の緩徐な減少をもたらし、図６中の対応する曲線の傾きは図４に具体的に説明されるｗｔ  ＡＰＣについての曲線の第二の部分に類似であった。対照的に、本変異体ＱＧＮＳＥＤＹ（もしくはＡＬＬ）は、ＡＰＣ変異体によるＡｒｇ３０６でのＦＶａの高められた切断と矛盾しないＦＶ活性のより急速な下落をもたらした。プロテインＳの添加はｗｔ  ＡＰＣおよびＱＧＮＳＥＤＹ双方の効果を高めたが、しかしなお、２種のタンパク質間の差異が残った。従って、プロテインＳはｗｔ  ＡＰＣのみならずしかしまた本ＡＰＣ変異体も刺激し、後者はリン脂質に対するかなり高められた結合親和性を表すと結論することができる。プロテインＳはリン脂質に対するＡＰＣの結合親和性を高めることにより機能することが示唆されているため、これは興味深い。これが、プロテインＳがそれによりはたらく唯一の機構であることができる場合には、プロテインＳの添加がｗｔ  ＡＰＣとＱＧＮＳＥＤＹ変異体との間の差異を減少させることができると期待することができる。
実施例６．ＡＰＣの膜結合親和性
リン脂質膜に結合するｗｔおよび変異体プロテインＣの能力を検討するために、表面プラスマ共鳴技術を使用した。この技術の商業的変形物はバイアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）から入手可能である。本実施例においてはバイアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）２０００を使用した。
【０１４０】
（ｉ）方法：リン脂質小胞を、バイアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）からのＬ１センサーチップの表面上に捕捉した。これらのチップは、共有結合された疎水性脂肪族基をもつデキストランヒドロゲルよりなる。３個の異なる種類の小胞を、押出成形技術を使用して製造し（アベスチン  リポファクト（Ａｖｅｓｔｉｎ  Ｌｉｐｏｆａｃｔ）基本押出成形装置を使用する）、３つの型の小胞は異なるリン脂質組成、すなわち１）１００％ホスファチジルコリン（図７）、２）８０％ホスファチジルコリンおよび２０％ホスファチジルセリン（図（８）、ならびに３）２０％ホスファチジルセリン、２０％ホスファチジルエタノールアミンおよび６０％ホスファチジルコリン（図９）を有した。４種のプロテインＣ突然変異体、すなわちＨＰＣ  ＡＬＬ（すなわちＱＧＮＳＥＤＹ）、ＳＥＤＹ、ＱＧＮおよびＳＥＤ、ならびにｗｔ  ＨＰＣを試験した。これらの実験において、プロテインＣ濃度は０．５μＭであり、また、使用された緩衝液は、５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５であった。
【０１４１】
ホスファチジルコリンを含有する膜は、負に荷電したホスファチジルセリンが膜の一部でない限り、ビタミンＫ依存性タンパク質を結合しない。ホスファチジルエタノールアミンは、膜中でのこの型のリン脂質の存在がプロテインＣの結合を高めることおよびＦＶａの分解の速度を高めることが示されているため、とりわけ興味深い。従って、本実施例において、プロテインＣ変異体がリン脂質の型に対する変えられた特異性を立証したかどうかが検討される。多様な組換えプロテインＣ変異体を３つの型のリン脂質膜により被覆された異なる表面積を含有したチップを有したバイアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）機械に注入した。
【０１４２】
（ｉｉ）結果：０．５μＭのプロテインＣの濃度を使用した。負に荷電したリン脂質膜に対するプロテインＣのＫｄがおよそ１５μＭであるために、この濃度で、ｗｔ  プロテインＣがいかなるとりわけ強い結合も示すことが期待されないためである。従って、これらの実験において、プロテインＣ変異体のいずれかの増大された結合能力をみることが可能であるはずである。図７から明らかであるとおり、１００％ホスファチジルコリンを含有する膜へのプロテインＣ変異体の（あるとしても）非常にわずかな結合が存在した。到達された最大応答単位はわずかに約１６０であった。図８から、２０％ホスファチジルセリンを含有する膜上で、とりわけ、Ｙ軸上にプロットされるような応答の急激な増大により反映されるところのプロテインＣの急速な会合を立証した本変異体ＱＧＮＳＥＤＹ（もしくはＡＬＬ）による、かなり良好な結合が存在したことが明らかである。他の変異体すなわちＱＧＮ、ＳＥＤＹおよびＳＥＤはｗｔ  プロテインＣと同様に挙動した。図９に示される結果は、ＱＧＮＳＥＤＹ（もしくはＡＬＬ）変異体とｗｔ  プロテインＣとの間の最も顕著な差異が、ホスファチジルエタノールアミンを含有する膜を使用した場合に観察されたことを具体的に説明する。ＱＧＮＳＥＤＹ変異体は膜への結合の急激な増大を立証し、そして約７００単位の応答に非常に急速に達した。後に続く２００秒の間に応答はおよそ８５０応答単位に上昇した。解離に次いでプロテインＣ注入を中断し、そして結合されたタンパク質は膜から比較的急速に遊離された。該結合はカルシウム依存性であった。ＥＤＴＡが結合を完全に逆転させたからである。この挙動はビタミンＫ依存性タンパク質から予測される。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
以下において、本発明は図面に言及してより詳細に開示され、ここで：
【図１】発明にかかる、ヒト血漿中での活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）に対する多様なＡＰＣ変異体（突然変異体）の影響を具体的に説明する。以下のＡＰＣ変異体、すなわちヒト野性型（ｗｔ）ＡＰＣ（●）、ＡＰＣ突然変異体ＱＧＮ（□）、ＡＰＣ突然変異体ＱＧＥＤ（▲）、ＡＰＣ突然変異体ＧＮＥＤ（×）、ＡＰＣ突然変異体ＳＥＤＹ（｜）およびＡＰＣ突然変異体ＡＬＬ（もしくはＱＧＮＳＥＤＹ）（△）を検査した。
【図２】発明にかかる、ＡＰＴＴアッセイにおけるＡＰＣ（ｗｔおよび突然変異体）の影響に対するヒトプロテインＳの影響を具体的に説明する。以下のＡＰＣ変異体、すなわちｗｔ  ＡＰＣ（●）およびＡＰＣ突然変異体ＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）（□）を検査した。
【図３】発明にかかる、ヒト血漿中のプロトロンビン時間に対する多様なＡＰＣ変異体の影響を具体的に説明する。以下のＡＰＣ変異体、すなわちｗｔ  ＡＰＣ（●）、ＡＰＣ突然変異体ＱＧＮ（□）、ＡＰＣ突然変異体ＱＧＥＤ（▲）、ＡＰＣ突然変異体ＧＮＥＤ（×）、ＡＰＣ突然変異体ＳＥＤＹ（｜）およびＡＰＣ突然変異体ＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）（△）を検査した。
【図４】発明にかかる、プロトロンビンのＦＸａに媒介される活性化によるトロンビン生成により測定されるところのヒト第Ｖａ因子を不活性化する多様なＡＰＣ変異体の能力を具体的に説明し、前記活性化はＦＶａにより増強される。以下のＡＰＣ突然変異体、すなわちｗｔ  ＡＰＣ（●）、ＡＰＣ突然変異体ＱＧＮ（□）、ＡＰＣ突然変異体ＳＥＤＹ（＋）およびＡＰＣ突然変異ＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）（△）を検査した。
【図５】発明にかかる、ヒト第Ｖａ因子を不活性化する多様なＡＰＣ変異体の能力を具体的に説明し、ＦＶａの活性はプロトロンビナーゼアッセイを用いて測定した。以下のＡＰＣ変異体、すなわちｗｔ  ＡＰＣ（●）、ＡＰＣ突然変異体ＱＧＮ（▲）、ＡＰＣ突然変異体ＳＥＤＹ（△）およびＡＰＣ突然変異ＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）（□）を検査した。
【図６】発明にかかる、ＡＰＣによる正常すなわち野性型（ｗｔ）のＦＶａおよびＱ５０６突然変異体ＦＶａ（ＦＶａ  Ｌｅｉｄｅｎ）の不活性化を具体的に説明する。値は：野性型ＡＰＣでのｗｔ  ＦＶａ（●）；ＡＰＣ突然変異体ＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）でのｗｔ  ＦＶａ（□）；ｗｔ  ＡＰＣでのＲ５０６Ｑ  ＦＶａ（▲）；およびＡＰＣ突然変異体ＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）でのＲ５０６Ｑ  ＦＶａ（×）の不活性化について示す。
【図７−９】発明にかかる、リン膜に結合するｗｔおよび変異体プロテインＣの能力を具体的に説明する。バイアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）からの表面プラスマ共鳴技術を使用した。これらの図において、多様なリン脂質、すなわち１００％ホスファチジルコリン（図７）；２０％ホスファチジルセリンおよび８０％ホスファチジルコリンの混合物（図８）；ならびに２０％ホスファチジルセリン、２０％ホスファチジルエタノールアミンおよび６０％ホスファチジルコリンの混合物（図９）を使用した。全部の試験において、ヒト野性型プロテインＣ（ｗｔ）ならびにＡＰＣ変異体ＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）、ＳＥＤＹ、ＳＥＤおよびＱＧＮを分析した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年5月12日(2003.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液のプロテインＣ抗凝固系中で抗凝固活性を表すことが可能かつプロテインＣ（ＰＣ）および活性化型プロテインＣ（ＡＰＣ）から選択される野性型血液凝固成分にアミノ酸配列が実質的に相同な変異体血液凝固成分であって、前記変異体成分は、対応する野性型血液凝固成分により表される抗凝固活性に比較して高められる抗凝固活性を表すことが可能であり、また、前記変異体成分は、それが、前記野性型成分と比較して、最初の４５のＮ末端アミノ酸残基および指定されるＧｌａドメインを含んで成るそのＮ末端アミノ酸残基配列中に最低１個のアミノ酸残基の改変を含有するためにそれぞれの野性型成分と異なる、変異体血液凝固成分。
【請求項２】
対応する野性型成分と最低９５％のアミノ酸残基配列の同一性を有する、請求項１記載の変異体成分。
【請求項３】
対応する野性型成分と最低９７％のアミノ酸残基配列の同一性を有する、請求項１記載の変異体成分。
【請求項４】
対応する野性型成分と最低９８％のアミノ酸残基配列の同一性を有する、請求項１記載の変異体成分。
【請求項５】
前記最低１個のアミノ酸残基の改変が、置換、欠失もしくは挿入されたアミノ酸残基より構成される、いずれかの先行する請求項記載の変異体成分。
【請求項６】
前記成分が、野性型成分と比較して高められた膜結合親和性を表す変異体ＰＣもしくは変異体ＡＰＣである、いずれかの先行する請求項記載の変異体成分。
【請求項７】
野性型プロテインＣと比較して高められたカルシウム親和性をさらに表す、請求項６記載の変異体成分。
【請求項８】
前記変異体成分が、前記Ｇｌａドメイン中に最低６および場合によっては７〜１０アミノ酸残基の改変を含有する、いずれかの先行する請求項記載の変異体成分。
【請求項９】
前記変異体成分が、置換突然変異Ｈ１０Ｑ、Ｓ１１Ｇ、Ｓ１２Ｎ、Ｄ２３Ｓ、Ｑ３２Ｅ、Ｎ３３ＤおよびＨ４４Ｙを含有する改変されたＧｌａドメインを含有し、前記改変されたＧｌａドメインは以下のアミノ酸配列：
ＡＮＳＦＬＥＥＬＲＱ  ＧＮＬＥＲＥＣＩＥＥ  ＩＣＳＦＥＥＡＫＥＩ  ＦＥＤＶＤＤＴＬＡＦ  ＷＳＫＹＶ（配列番号３）
を有する、請求項１記載の変異体成分。
【請求項１０】
前記Ｇｌａドメインが位置１０、１１、２８、３２もしくは３３から選択される位置でのアミノ酸置換、およびＧｌａドメイン中の最低１個のさらなる改変を含有し、場合によっては、前記最低１個のさらなる改変が位置１２、２３もしくは４４から選択される、請求項１−７のいずれか１つ記載の変異体成分。
【請求項１１】
前記最低１個のアミノ酸改変が位置１２、２３および４４から選択される位置での置換突然変異であり、前記置換突然変異がＳ１２Ｎ、Ｄ２３ＳおよびＨ４４Ｙから選択される、請求項１−７のいずれか１つ記載の変異体成分。
【請求項１２】
前記最低１個のアミノ酸改変が、位置１０、１１、１２、２３、３２、３３および４４から選択される位置に配置され、かつ、場合によっては置換突然変異であり、また、場合によっては、全部の位置１０、１１、１２、２３、３２、３３および４４が改変される、請求項１−７のいずれか１つ記載の変異体成分。
【請求項１３】
前記改変（１個もしくは複数）が置換である、いずれかの先行する請求項記載の変異体成分。
【請求項１４】
変異体が、野性型成分に比較して高められる会合速度でリン脂質膜に結合する、請求項９記載の変異体成分。
【請求項１５】
変異体がそれ自体もしくは活性化される場合に、標準レベルのリン脂質でのＡＰＴＴアッセイにおいてインビトロで測定される抗凝固活性を表し、その活性は野性型成分に比較して高められる、いずれかの先行する請求項記載の変異体成分。
【請求項１６】
変異体がそれ自体もしくは活性化される場合に、単一点突然変異Ａｒｇ５０６Ｇｌｎを含有する突然変異された第Ｖａ因子を分解することが可能である、いずれかの先行する請求項記載の変異体成分。
【請求項１７】
変異体がそれ自体もしくは活性化される場合に、野性型成分に比較して第Ｖａ因子を分解する高められた能力を表す、請求項９記載の変異体成分。
【請求項１８】
最低１個の保存的置換をさらに含有する、いずれかの先行する請求項記載の変異体成分。
【請求項１９】
前記野性型血液凝固成分がヒト起源のものである、請求項１−１８のいずれか１つ記載の変異体成分。
【請求項２０】
いずれかの先行する請求項記載の変異体血液凝固成分をコードするヌクレオチド配列を含んで成るＤＮＡセグメント。
【請求項２１】
適しては発現ベクターである複製可能なベクター、およびその中に挿入された請求項２０記載のＤＮＡセグメントを含んで成る組換えＤＮＡ分子。
【請求項２２】
適してはその中に安定に組込まれる請求項２１記載の組換えＤＮＡ分子をもつ、微生物もしくは動物細胞、適しては培養された動物細胞系を含んで成る宿主細胞。
【請求項２３】
アデノウイルスでトランスフェクトされたヒト腎細胞である、請求項２２記載の宿主細胞。
【請求項２４】
（ａ）野性型血液凝固成分をコードするＤＮＡを提供すること；
（ｂ）前記野性型ＤＮＡ中に最低１個のヌクレオチド改変を導入して、変異体血液凝固成分をコードする改変されたＤＮＡセグメントを形成すること；および
（ｃ）前記改変されたＤＮＡセグメントを複製すること
を含んで成る、請求項１−１９のいずれか１つ記載の変異体血液凝固成分をコードする請求項２０記載のＤＮＡセグメントの製造方法。
【請求項２５】
（ａ）前記変異体成分をコードするＤＮＡセグメントを提供すること；
（ｂ）段階（ａ）で提供される前記ＤＮＡセグメントを発現ベクターに導入すること；
（ｃ）前記ＤＮＡセグメントを含有する前記ベクターを適合する宿主細胞に導入すること；
（ｄ）段階（ｃ）で提供される宿主細胞を、前記変異体成分の発現に必要とされる条件下で培養すること；および
（ｅ）発現された変異体成分を培養された宿主細胞から単離すること
を含んで成る、請求項１−１９のいずれか１つ記載の変異体血液凝固成分の製造方法。
【請求項２６】
有効量の、請求項１−１９のいずれか１つ記載の変異体血液凝固成分、および製薬学的に許容できる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含んで成る製薬学的組成物。
【請求項２７】
変異体血液凝固成分が請求項１６記載の変異体成分である、請求項２６記載の製薬学的組成物。
【請求項２８】
プロテインＳおよび無傷の第Ｖ因子で成る群から選択されるさらなる血液凝固成分を含有する、請求項２６もしくは２７記載の組成物。
【請求項２９】
請求項１−１９のいずれか１つ記載の変異体血液凝固成分を含んで成る、血液のプロテインＣ抗凝固系に参画する成分をアッセイするための、適してはキットの形態の診断試験系。
【請求項３０】
変異体血液凝固成分が変異体ＡＰＣであり、かつ、前記試験系がプロテインＳもしくは無傷の抗凝固第Ｖ因子の機能的活性をアッセイするための系である、請求項２９記載の診断試験系。
【請求項３１】
凝固阻害量の、請求項１−１９のいずれか１つ記載の変異体血液凝固成分を含んで成る生理学的に耐えられる組成物を患者に投与することを含んで成る、前記患者における凝固の阻害方法。
【請求項３２】
血栓症が阻害される、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
凝固が血液凝固障害ＡＰＣ抵抗性を有する個体において阻害される、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
凝固阻害量の請求項９記載の変異体成分を患者に投与し、その変異体は、野性型成分に比較して、増大された会合速度でリン脂質に結合しかつ増大された抗凝固活性を生じさせる、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
血栓症のような凝固障害の治療もしくは予防のための医薬の製造における、請求項１−１９のいずれか１つ記載の変異体成分の使用。
【請求項３６】
変異体成分がプロテインＳもしくは変異体ＰＳとともに変異体ＰＣもしくは変異体ＡＰＣを含んで成る、請求項３５記載の使用。
【請求項３７】
ＡＰＣ抵抗性の治療のための医薬の製造における請求項３５記載の使用。
【国際調査報告】
2004527239.tif 000066
2004527239.tif 000067
2004527239.tif 000068
2004527239.tif 000069
2004527239.tif 000070