(57)【要約】微粒子ベースの分析方法、システムおよび用途を提供する。具体的には、粒子のアイデンティティと存在の一方または両方を測定し、場合により、１つもしくはそれ以上の特定の標的分析物の濃度を測定するための分析方法として、共鳴光散乱を利用することについて説明する。生物学的アッセイおよび化学的アッセイにおける、これらの微粒子ベースの方法の用途についても開示する。
2006515420.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）分析波長範囲全体にわたり光を生成する走査光源を準備し、
（ｂ）少なくとも２つの実質的に球形の識別可能な粒子を準備し、
（ｃ）粒子の表面に結合する少なくとも１つの捕捉プローブであって、少なくとも１種の分析物に対して親和性のある少なくとも１つの捕捉プローブを、（ｂ）の粒子に被着し、
（ｄ）第１の分析波長範囲で（ｃ）の粒子各々を１回もしくはそれ以上走査して、各粒子を一意に識別する第１の基準共鳴光散乱信号を、（ｃ）の粒子各々について少なくとも１つ生成し、
（ｅ）少なくとも１つの捕捉プローブと識別された（ｄ）の粒子各々とを相関させ、
（ｆ）（ｅ）の粒子と分析物を少なくとも１種含有する可能性のある試料とを接触させ、ここで、前記試料中に分析物が存在する場合、少なくとも１つの捕捉プローブと少なくとも１種の分析物との間で結合が生じ、
（ｇ）第２の分析波長範囲で（ｆ）の粒子を１回もしくはそれ以上走査して、（ｆ）の粒子各々について第２の結合共鳴光散乱信号を少なくとも１つ生成し、ここで、
１）少なくとも１つの第１の基準共鳴光散乱信号と少なくとも１つの第２の結合共鳴光散乱信号とは、同一であっても異なっていてもよく、
２）少なくとも第１の分析波長範囲と第２の分析波長範囲とは、同一であっても異なっていてもよく、
（ｈ）少なくとも１つの第１の基準光散乱信号のうちのいずれかと、少なくとも１つの第２の光散乱信号のうちのいずれかと、よりなる群から選択される共鳴光散乱信号間の差を比較することで、少なくとも１つの捕捉プローブに対する少なくとも１種の分析物の結合を検出し、そして
（ｉ）ステップ（ｅ）で得た相関と少なくとも１つの第２の結合共鳴光散乱信号とに基づいて、１種もしくはそれ以上の結合された分析物を識別する
ことを含んでなる、分析物を識別するための方法。
【請求項２】
（ａ）分析波長範囲全体にわたり光を生成する走査光源を準備し、
（ｂ）少なくとも２つの実質的に球形の識別可能な粒子を準備し、
（ｃ）粒子の表面に結合する少なくとも１つの捕捉プローブであって、少なくとも１種の分析物に対して親和性のある少なくとも１つの捕捉プローブを、（ｂ）の粒子に被着し、
（ｄ）各々が定義されたローカスを有する（ｃ）の粒子を定義済みの空間配列に付加し、
（ｅ）場合により、分析波長範囲で（ｄ）の粒子を１回もしくはそれ以上走査して、（ｄ）の粒子各々について第１の基準共鳴光散乱信号を少なくとも１つ生成し、
（ｆ）（ｅ）の粒子と分析物を少なくとも１種含有する可能性のある試料とを接触させ、ここで、分析物が存在する場合、少なくとも１つの捕捉プローブと少なくとも１種の分析物との間で結合が生じ、
（ｇ）分析波長範囲で（ｆ）の粒子を１回もしくはそれ以上走査して、（ｆ）の粒子各々について第２の結合共鳴光散乱信号を少なくとも１つ生成し、
（ｈ）少なくとも１つの第１の基準光散乱信号のうちのいずれかと、少なくとも１つの第２の光散乱信号のうちのいずれかと、よりなる群から選択される共鳴光散乱信号間の差を比較することで、少なくとも１つの捕捉プローブに対する少なくとも１種の分析物の結合を検出し、そして
（ｉ）付加された粒子ローカスに基づいて、１種もしくはそれ以上の結合された分析物を識別する
ことを含んでなる、分析物を識別するための方法。
【請求項３】
（ａ）分析波長範囲全体にわたり光を生成する走査光源を準備し、
（ｂ）少なくとも２つの実質的に球形の識別可能な粒子を準備し、
（ｃ）粒子の表面に結合する少なくとも１つの捕捉プローブであって、少なくとも１種の分析物に対して親和性のある少なくとも１つの捕捉プローブを、（ｂ）の粒子に被着し、
（ｄ）分析波長範囲で（ｃ）の粒子各々を１回もしくはそれ以上走査して、各粒子を一意に識別する第１の基準共鳴光散乱信号を、（ｃ）の粒子各々について少なくとも１つ生成し、
（ｅ）少なくとも１つの捕捉プローブと識別された（ｄ）の粒子各々とを相関させ、
（ｆ）（ｅ）の粒子と、検出可能な標識を含んでなる分析物を少なくとも１種含有する可能性のある試料と、を接触させ、ここで、分析物が存在する場合、少なくとも１つの捕捉プローブと少なくとも１種の分析物との間で結合が生じ、そして
（ｇ）ステップ（ｅ）の相関と分析物の検出可能な標識とに基づいて、１種もしくはそれ以上の分析物を識別する
ことを含んでなる、分析物を識別するための方法。
【請求項４】
（ａ）分析波長範囲全体にわたり光を生成する走査光源を準備し、
（ｂ）少なくとも１つの実質的に球形の識別可能な粒子を準備し、
（ｃ）粒子の表面に結合する少なくとも１つの捕捉プローブであって、少なくとも１種の分析物に対して親和性のある少なくとも１つの捕捉プローブを、（ｂ）の粒子に被着し、
（ｄ）場合により、分析波長範囲で（ｃ）の粒子を１回もしくはそれ以上走査して、（ｃ）の粒子各々について第１の基準共鳴光散乱信号を少なくとも１つ生成し、
（ｅ）（ｄ）の粒子と分析物を少なくとも１種含有する可能性のある試料とを接触させ、ここで、分析物が存在する場合、少なくとも１つの捕捉プローブと少なくとも１種の分析物との間で結合が生じ、
（ｆ）分析波長範囲で（ｅ）の粒子を１回もしくはそれ以上走査して、（ｅ）の粒子各々について第２の結合共鳴光散乱信号を少なくとも１つ生成し、そして
（ｇ）少なくとも１つの第１の基準光散乱信号のうちのいずれかと、少なくとも１つの第２の光散乱信号のうちのいずれかと、よりなる群から選択される共鳴光散乱信号間の差を比較することで、少なくとも１つの捕捉プローブに対する少なくとも１種の分析物の結合を検出する
ことを含んでなる、捕捉プローブに対する分析物の結合を検出するための方法。
【請求項５】
（ａ）分析波長範囲全体にわたり光を生成する走査光源を準備し、
（ｂ）１）粒子に付加される少なくとも１つの捕捉プローブと、
２）少なくとも１つの捕捉プローブに結合された少なくとも１種の分析物と、を含んでなる、実質的に球形の識別可能な粒子を少なくとも１つ準備し、
（ｃ）分析波長範囲で（ｂ）の粒子を１回もしくはそれ以上走査して、前記粒子について第１の基準共鳴光散乱信号を少なくとも１つ生成し、
（ｄ）ステップ（ｃ）の粒子の少なくとも１つの捕捉プローブから少なくとも１種の分析物を解離させ、
（ｅ）分析波長範囲で（ｄ）の粒子を１回もしくはそれ以上走査して、粒子各々について第２の解離共鳴光散乱信号を少なくとも１つ生成し、そして
（ｆ）少なくとも１つの第１の基準光散乱信号のうちのいずれかと、少なくとも１つの第２の光散乱信号のうちのいずれかと、よりなる群から選択される共鳴光散乱信号間の差を比較することで、少なくとも１つの捕捉プローブからの少なくとも１種の分析物の解離を検出する
ことを含んでなる、捕捉プローブからの分析物の解離を検出するための方法。
【請求項６】
捕捉プローブを被着する前に分析波長範囲で粒子を走査して、識別用共鳴光散乱信号を生成する請求項１または３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
分析波長範囲が、約２７５から約１９００ナノメートルの範囲の光学波長内で約１から約２０ナノメートルにわたるウィンドウである請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
分析物が、場合により分析方法によって識別される請求項４に記載の方法。
【請求項９】
分析方法が、質量分析法と、蛍光と、吸光度放射活性と、表面プラズモン共鳴と、よりなる群から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
分析方法が、蛍光部分、化学発光部分、粒子、酵素、放射活性タグ、量子ドット、発光部分、吸光部分、インターカレート色素および結合対のメンバよりなる群から選択される検出可能な標識を含んでなる請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
結合された分析物の量が、第１の基準光散乱信号と少なくとも１つの第２の光散乱信号のうちのいずれかよりなる群から選択される共鳴光散乱信号間の差を比較することで測定される請求項１、２または４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
解離した分析物の量が、第１の基準光散乱信号と少なくとも１つの第２の光散乱信号のうちのいずれかよりなる群から選択される共鳴光散乱信号間の差を比較することで測定される請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
検出可能な標識が、蛍光部分、化学発光部分、粒子、酵素、放射活性タグ、発光部分、吸光部分、インターカレート色素および結合対のメンバよりなる群から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
光学波長が約６００から約１６５０ナノメートルの範囲である請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
光学波長が約７７０から約７８０ナノメートルの範囲である請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
粒子の直径が約１００マイクロメートル以下である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
粒子の直径が約７５マイクロメートル以下である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
粒子の直径が約５０マイクロメートル以下である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
粒子が分析波長範囲で光に対して実質的に透過性である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
粒子が、
ａ）実質的に球形の芯と、
ｂ）芯に重なる１つもしくはそれ以上の層と、を含んでなり、
１つもしくはそれ以上の層が、分析波長範囲で光に対して実質的に透過性である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
１つもしくはそれ以上の層が光学的に活性である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
１つもしくはそれ以上の層が生物学的に活性である請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
１つもしくはそれ以上の層が化学的に活性である請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
層の厚さが約１ナノメートルから約１０マイクロメートルの範囲である請求項２２または２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
芯が吸光性である請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
１つもしくはそれ以上の層の厚さが約１ナノメートルから約２０マイクロメートルである請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
１つもしくはそれ以上の層の厚さが約５０ナノメートルから約２０マイクロメートルである請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
芯が、ガラス、シリカ、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、アクリルポリマー、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、フルオロポリマー、シリコーン、セルロース、半導体材料、吸光性材料、金属、磁性材料、鉱物、ナノ粒子、コロイド粒子、金属酸化物、金属硫化物、金属セレン化物およびこれらの複合体よりなる群から選択される材料で構成されるものである請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
磁性材料が酸化鉄である請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
芯が中空である請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
層が、ガラス、シリカ、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、アクリルポリマー、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、フルオロポリマー、シリコーン、セルロース、高分子電解質、鉱物、ナノ粒子、コロイド粒子、金属酸化物、金属硫化物、金属セレン化物およびこれらの複合体よりなる群から独立して選択される材料で構成されるものである請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
粒子が、分析波長範囲での屈折率が約１．４５から約２．１のガラスで構成されるものである請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも１つの捕捉プローブが、タンパク質、核酸、ペプチド核酸、結合対の一メンバ、抗体、生物細胞、微生物、細胞膜断片、細胞小器官、受容体、ウイルス、ウイルス断片、バクテリオファージ、バクテリオファージ断片、有機配位子および有機金属配位子よりなる群から選択される請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも１種の分析物が、試料マトリクス成分を含んでなる試料中に存在する請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１種の分析物が、タンパク質、核酸、ペプチド核酸、生物細胞、微生物、細胞膜断片、細胞小器官、抗体、受容体、ウイルス、ウイルス断片、バクテリオファージ、バクテリオファージ断片および結合対の一メンバよりなる群から選択される請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
結合対の一メンバが、抗原／抗体、抗原／抗体断片、プロテインＡ／抗体、プロテインＧ／抗体、ハプテン／抗ハプテン、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、葉酸／葉酸塩結合タンパク質；ホルモン／ホルモン受容体、レクチン／炭水化物、酵素／酵素補助因子、酵素／基質と、酵素／阻害剤、ペプチド核酸／相補的核酸、ポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド結合タンパク質、ビタミンＢ１２／内因子；相補的核酸セグメント；スルフヒドリル反応性基を含んでなる対、カルボジイミド反応性基を含んでなる対およびアミン反応性基を含んでなる対からなる結合対の組み合わせから選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項３７】
結合対の一メンバが、抗原／抗体、抗原／抗体断片、プロテインＡ／抗体、プロテインＧ／抗体、ハプテン／抗ハプテン、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、葉酸／葉酸塩結合タンパク質；ホルモン／ホルモン受容体、レクチン／炭水化物、酵素／酵素補助因子、酵素／基質と、酵素／阻害剤、ペプチド核酸／相補的核酸、ポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド結合タンパク質、ビタミンＢ１２／内因子；相補的核酸セグメント；スルフヒドリル反応性基を含んでなる対、カルボジイミド反応性基を含んでなる対およびアミン反応性基を含んでなる対からなる結合対の組み合わせから選択される請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
結合対の一メンバが、抗原／抗体、抗原／抗体断片、プロテインＡ／抗体、プロテインＧ／抗体、ハプテン／抗ハプテン、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、葉酸／葉酸塩結合タンパク質；ホルモン／ホルモン受容体、レクチン／炭水化物、酵素／酵素補助因子、酵素／基質、酵素／阻害剤、ペプチド核酸／相補的核酸、ポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド結合タンパク質、ビタミンＢ１２／内因子；相補的核酸セグメント；スルフヒドリル反応性基を含んでなる対、カルボジイミド反応性基を含んでなる対およびアミン反応性基を含んでなる対からなる結合対の組み合わせから選択される請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
捕捉プローブが粒子の表面で合成される請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
捕捉プローブが、天然の基原から単離されたものであるか、粒子の表面に付加される前に別途合成されたものである請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
捕捉プローブを粒子に被着した後に、この粒子を処理して試料マトリクス成分の非特異的結合を防止する請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
粒子を薄膜で被覆して試料マトリクスの成分の非特異的結合を防止した後、薄膜コーティングを活性化して捕捉プローブを付着させる請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
第１の基準共鳴光散乱信号または第２の結合共鳴光散乱信号のいずれかが、ピーク波長位置、ピーク幅、ピーク間の波長間隔、ピーク振幅および偏光依存性特性よりなる群から選択されるスペクトルの特徴を含んでなる請求項１および３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
基準共鳴光散乱信号および結合共鳴光散乱信号が、ピーク波長位置、ピーク幅、ピーク間の波長間隔、ピーク振幅および偏光依存性特性よりなる群から選択されるスペクトルの特徴に基づいて比較される請求項１、２、４および５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
粒子が、光学的活性度のさらに高い層のうちの１層を含んでなる請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
粒子が、生物学的活性度のさらに高い層のうちの１層を含んでなる請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
粒子が、化学的活性度のさらに高い層のうちの１層を含んでなる請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
（ａ）実質的に球形の芯と、
（ｂ）粒子の外面に付加される捕捉プローブと、を含んでなり、
１）約２７５ナノメートルから約１９００ナノメートルの光学波長範囲で約１から約２０ナノメートルの分析波長範囲での走査時における一意な共鳴光散乱信号を特徴とし、
２）直径約１００マイクロメートル以下であり、
３）分析波長範囲で屈折率約１．６から約２．１の間であり、そして
４）分析波長範囲で実質的に非蛍光発光性である、識別可能な粒子。
【請求項４９】
場合により、芯に重なる１つもしくはそれ以上の層を有する請求項４８に記載の粒子。
【請求項５０】
１つもしくはそれ以上の層が光学的に活性である請求項４９に記載の粒子。
【請求項５１】
１つもしくはそれ以上の層が生物学的に活性である請求項４９に記載の粒子。
【請求項５２】
１つもしくはそれ以上の層が化学的に活性である請求項４９に記載の粒子。
【請求項５３】
層の厚さが約１ナノメートルから約１０マイクロメートルの範囲である請求項５１または５２のいずれかに記載の粒子。
【請求項５４】
１つもしくはそれ以上の層の厚さが約５０ナノメートルから約２０マイクロメートルである請求項４９に記載の粒子。
【請求項５５】
（ａ）実質的に球形の芯と、
（ｂ）粒子の外面に付加される捕捉プローブと、を含んでなり、
１）約２７５ナノメートルから約１９００ナノメートルの光学波長範囲で約１から約２０ナノメートルの分析波長範囲での走査時における一意な共鳴光散乱信号を特徴とし、
２）直径約１００マイクロメートル以下であり、
３）分析波長範囲で屈折率約１．６から約２．１の間であり、そして
４）分析波長範囲で実質的に非蛍光発光性である識別可能な粒子であって、
ｉ）厚さが約５０ナノメートルから約２０マイクロメートルの間である光学的に活性な層１つもしくはそれ以上と、
ｉｉ）厚さが約１ナノメートルから１０マイクロメートルの生物学的に活性または化学的に活性な実質的に透明な外側の層１つもしくはそれ以上と、を含んでなり、前記層が（ｉ）の層と重なる、識別可能な粒子。
【請求項５６】
芯が、ガラス、半導体材料、吸光性材料、金属、磁性材料およびこれらの複合体よりなる群から選択される材料で構成されるものである請求項４８に記載の粒子。
【請求項５７】
捕捉プローブが、タンパク質、核酸、ペプチド核酸、結合対の一メンバ、抗体、生物細胞、微生物、細胞膜断片、細胞小器官、受容体、ウイルス、ウイルス断片、バクテリオファージ、バクテリオファージ断片、有機配位子および有機金属配位子よりなる群から選択される請求項４８に記載の粒子。
【請求項５８】
結合対の一メンバが、抗原／抗体；プロテインＡ／抗体、プロテインＧ／抗体、ハプテン／抗ハプテン、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、葉酸／葉酸塩結合タンパク質；ホルモン／ホルモン受容体、レクチン／炭水化物、酵素／酵素補助因子、酵素／基質、酵素／阻害剤、ペプチド核酸／相補的核酸、ポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド結合タンパク質、ビタミンＢ１２／内因子；相補的核酸セグメント；スルフヒドリル反応性基を含んでなる対、カルボジイミド反応性基を含んでなる対およびアミン反応性基を含んでなる対からなる結合対の組み合わせから選択される請求項５７に記載の粒子。
【請求項５９】
請求項４８に記載の識別可能な粒子の集団。
【請求項６０】
（ａ）溶液中に少なくとも１つの実質的に球形の識別可能な粒子を含んでなる微粒子ベースの測定システムであって、これらの粒子は各々、
（ａ）粒子の外面に付加される捕捉プローブを含んでなり、
１）粒子は、約２７５から約１９００ナノメートルの光学波長範囲で約１から約２０ナノメートルにわたるウィンドウのある分析波長範囲での走査時における一意な共鳴光散乱信号を特徴とし、
２）粒子の直径は約７５マイクロメートル以下であり、
３）粒子の屈折率は分析波長範囲で約１．４５および約２．１であり、
前記システムはまた、
（ｂ）分析波長範囲で粒子を走査するための走査光源と、
（ｃ）散乱光を検出するのに適した位置と適した環境に粒子を提示するための光学セルと、
（ｄ）粒子を光学セルに配置するための粒子ハンドリング手段と、
（ｅ）走査された粒子からの光を検出して前記光を電気信号に変換するための検出手段と、を含んでなる、微粒子ベースの測定システム。
【請求項６１】
場合により、粒子を試薬および分析物と接触させるための手段を含んでなる請求項６０に記載のシステム。
【請求項６２】
場合により、前記検出手段によって生成される前記電気信号の取得と分析のために走査光源および検出手段に作動的に接続されたコンピュータを含んでなる請求項６０に記載のシステム。
【請求項６３】
場合により、前記電気信号を粒子のアイデンティティに変換し、場合により、粒子に対する分析物または分析物群の結合の存在または度合いに変換する、データ分析手段を含んでなる請求項６０に記載のシステム。
【請求項６４】
場合により、前記分析物または分析物群の結合を検出または識別するためのデータ分析手段を有する請求項６０に記載のシステム。
【請求項６５】
走査光が、走査用ダイオードレーザ、チューナブルダイオードレーザおよび多色光源よりなる群から選択される光源によって生成される請求項６０に記載のシステム。
【請求項６６】
走査光源が波長選択装置と併用される請求項６５に記載のシステム。
【請求項６７】
走査光源が、ファイバオプティクス光カップリング手段を用いて改質したものである請求項６０に記載のシステム。
【請求項６８】
前記波長選択装置は、場合により、分散型要素、非分散型要素、モノクロメータ、チューナブルフィルタ、プリズム、格子および固定フィルタよりなる群から選択される構成要素を含んでなる請求項６６に記載のシステム。
【請求項６９】
１つもしくはそれ以上の粒子からの散乱光が画像形成手段で検出される請求項６０に記載のシステム。
【請求項７０】
画像形成手段が、
（ａ）走査用ダイオードレーザ光源と、
（ｂ）分光散乱光画像形成および迷光除去に適した光学セルと、
（ｃ）微粒子を分析物および試薬と接触させるための手段と、
（ｄ）顕微鏡と、
（ｅ）デジタルカメラおよびモニタと、
（ｆ）デジタル画像取得ハードウェアと、
（ｇ）必要に応じて（ａ）〜（ｆ）の要素に作動的に接続されたコンピュータと、
（ｈ）（ａ）〜（ｆ）の要素を制御し、データを捕捉し、データを処理するのに適したソフトウェアと、を含んでなる請求項６６に記載の微粒子ベースの測定システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、広義には、粒子識別、分析物のアイデンティティおよび結合度の判定の各要素のうちの１つもしくはそれ以上を含んでなる、共鳴光散乱を利用して微粒子ベースの測定を行うための方法、システムおよび用途ならびに、生物学的および化学的な多重アッセイにおける上記方法の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
小型化と多重化（多数の試料を同時に測定する機能）が進んだことで、生体分析化学の進歩がますます加速している。多くの場合は試料の大きさが限られているため、試料の量を減らしてそれまでより多くの分析物を測定しようとし、これが小型マイクロフルイディクスベースの試料操作系ならびにマイクロスケールの系における新規な分析方法を生むこととなった。一例として、既存のさまざまな生物学的測定法および化学的測定法、たとえば、ＤＮＡシーケンシング、タンパク質分析、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）分析、高速・高解像度分離、ラボオンチップデバイスを利用したクロマトグラフィなどがあげられる。ここ１０年ほどの間では、ゲノミクスやプロテオミクスの大規模な研究用や、ディスカバリー研究における高スループットでのスクリーニング向けの高度平行小型アッセイ系の開発に、ことさら重点がおかれている。一例として、２次元固定式の「バイオチップ」マイクロアレイがあげられ、ごく最近では、大きさがマイクロメートル台の識別可能な粒子があげられる。どちらの取り組みも、核酸間の塩基対ハイブリダイゼーションあるいは、水素結合、疎水性相互作用ならびにポリペプチド間の他の結合機序による、アレイまたは粒子表面の相補的プローブに対する分析物の特異的結合または捕捉に左右されるものである。
【０００３】
マイクロアレイとこれに伴うサポート技術は１９９０年代になって出てきたものであり、現在では確立された産業となっている。。たとえば、フォソグラフィ、固相化学、半導体製造手法を利用して二次元アレイ上に数十万のＤＮＡ配列プローブを構築する製造プロセスのひとつに、アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社のジーンチップ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ）（登録商標）技術がある。この技術については、たとえば、非特許文献１、非特許文献２、ゴールドバーグ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ），Ｍ．Ｊ．およびラヴァ（Ｒａｖａ），Ｒ．Ｐ．、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｉｐｓ（特許文献１）（２００１）、チー（Ｃｈｅｅ），Ｍ．ら、「Ａｒｒａｙｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅｓ  ｏｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｉｐｓ」（特許文献２）（１９９８）に記載されている。また、ハイセック社（Ｈｙｓｅｑ，  Ｉｎｃ．）、モレキュラーダイナミクス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，  Ｉｎｃ．）、ナノジェン（Ｎａｎｏｇｅｎ）、インサイトファーマシューティカルズ社（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．）ならびに従来技術において周知の他社によって、他のＤＮＡマイクロアレイ技術も開発されている。
【０００４】
固定式アレイは、本願明細書では生物学的な系でのタンパク質の系統的研究として定義する、プロテオミクス用にも開発されている。たとえば、表面増強レーザ脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ）を利用したタンパク質のキャラクタリゼーションとクロマトグラフィを含むプロセスのひとつに、サイファージェンバイオシステムズ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社のプロテインチップ（ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ）（登録商標）アレイ技術がある。これらの手法では、レーザによる分子量判定と化学的に活性なタンパク質チップアレイとを併用している。この技術については、たとえば、ハッチェンス（Ｈｕｔｃｈｅｎｓ），Ｔ．Ｗ．、「Ｕｓｅ  ｏｆ  ｒｅｔｅｎｔａｔｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｍａｐｓ」（特許文献３）（２００１）、ハッチェンス（Ｈｕｔｃｈｅｎｓ），Ｔ．Ｗ．、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎａｌｙｔｅｓ」（特許文献４）（１９９８）、（非特許文献３）に記載されている。また、アジレントテクノロジーズ社（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）、ザイオミックス社（Ｚｙｏｍｙｘ，  Ｉｎｃ．）、ケンブリッジアンティボディテクノロジー（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）ならびに従来技術において周知の他社によって、多数の他のタンパク質アレイ技術も開発されている。
【０００５】
測定対象となる分析物のタイプとは関係なく、マイクロアレイは、アレイ内における定位置から各プローブのアイデンティティを求める機能に立脚している。一般に、それぞれのプローブは、基板またはチップの表面上のグリッドにおける既知の座標位置で合成またはスポットされる。これらの「バイオチップ」システムでは多数の分析を同時に行うことができるが、いくつかの欠点が知られている。たとえば、マイクロアレイには結合動態が不十分であるという固有の問題がある。一般的なバイオチップの場合、表面および立体空間（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ）での混合が甘いため、分析物を相補的プローブに結合させるには比較的大きな拡散距離をカバーする必要がある。このため、分析物が表面に達して表面上に拡散するのが遅く、結合反応が不完全であり、プロトコールに要する時間が実質的に長くなる。また、試料の適用とマイクロアレイ上での測定はもともとバッチプロセスであり、自動化にことさら良く適したものではない。マイクロアレイのタイプによっては、高価な上に実験またはアッセイでの必要性が生じた際にすみやかにカスタマイズするのが難しいことがある。マイクロアレイのばらつきが原因で再現性と精度が落ちることもあり、場合によっては測定に実質的な冗長性が必要になる。感度とダイナミックレンジについては、マイクロアレイデータの分析時に問題が生じる旨の報告が頻繁にある。また、固定式マイクロアレイでは、一般にリカバーやソート、ポストプロセスを行ったり、分析物上で以後の測定を行ったりすることができない。最後に、ほとんどのマイクロアレイ系では、分析物の結合を検出するのにフルオロフォアなどのレポーター基が必要である。利点もいくつか報告されてはいる（たとえば、カイェム（Ｋａｙｙｅｍ），Ｊ．Ｆ．、「Ｃｙｃｌｉｎｇ  ｐｒｏｂｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｕｓｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」（特許文献５）（２０００）、非特許文献４を参照のこと）が、外部のレポーター基を使うには、未結合のレポーターからの干渉信号を排除するために、アレイを試料に曝露したらこれを洗浄する必要がある。よって、ほとんどのマイクロアレイ系で得られる測定値は端点測定値である。つまり、マイクロアレイでは分析物とプローブとの間の結合をリアルタイムに連続して測定することはできないのである。
【０００６】
微粒子を利用すると、主にマイクロアレイよりも結合動態の良い、十分に混合された少量の試料でアッセイを行えることから、２次元マイクロアレイの欠点の多くは解決される。試料が十分に混合されていると、固定式アレイの場合に見られるような場所に依存するばらつきがなくなる。さらに、小さな粒度と少ない試料量でプローブの局所的な濃度が増し、プローブに結合するまでに分析物が移動する拡散長が短くなるため、速度が増して結合反応の完了度も高くなる。微粒子の方が自動試料ハンドリングシステムで容易に操作できるため、二次元バイオチップフォーマットに比してカスタマイズや自動化がしやすい。
【０００７】
粒子ベースのアッセイのもうひとつ重要な利点に柔軟性がある。個々の粒子を追跡して操作できるため、原理上は粒子のサブセットで分析物を単離したり別の測定を行ったりすることができる。大きなマスターライブラリから目的に合った粒子のサブセットをすみやかに選択できることから、カスタムアッセイの作成が簡単になる。
【０００８】
しかしながら、結合検出の新機軸に対する要望は依然としてある。上述したように、固定式アレイ系での非標識結合の検出が報告されてはいるが、付随する問題は固定式アレイの場合と同じであるため、粒子ベースのアッセイに外部レポーター基を連続して使用することが依然として大きな欠点になっている。詳細については後述するように、本発明の主な目的は、粒子ベースのアッセイでレポーター基を使う必要性をなくし、プロトコールを単純化し、時間と費用を削減し、結合をリアルタイムで測定可能なようにすることにある。
【０００９】
一般的な粒子ベースのアッセイ系では、それぞれの微粒子の表面に一意なプローブの多くのコピーがある。微粒子は、用途によっては遊離懸濁液の状態で用いられることがあるため、このような場合は、固定式アレイで行っているような形でプローブのアイデンティティと定位置とを結びつけることができない。その代わりに、プローブのアイデンティティを粒子のアイデンティティと一意に結びつけなければならず、一意に決まる識別用の標識またはマーカーをそれぞれの粒子に持たせる必要がある。文献では、粒子の識別は一般に、着色した分子または蛍光分子、バーコード、あるいは他と区別できる蛍光信号を持つナノ粒子を取り込むことで行われている。よって、並列に実施できる粒子ベースのアッセイ数は、利用する具体的な標識を使って区別できる組み合わせの数（フルオロフォア数など）と場合によってはその相対的な豊富さに制限されてしまう。
【００１０】
蛍光ベースの粒子識別の一例に、ルミネックス社（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のフローメトリクス（ＦｌｏｗＭｅｔｒｉｘ）（登録商標）系やラボラトリーマルチアナライトプロファイリング（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｕｌｔｉ−Ａｎａｌｙｔｅ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）（ＬａｂＭＡＰ（登録商標））技術がある。この系では、約１００から１０００までの分析物をフローサイトメトリーで連続して測定することができる。この技術では、２種類もしくはそれ以上の蛍光色素で内部的に標識されたミクロスフェアを利用している。これらのミクロスフェアはさらに、さまざまな組み合わせのフルオロフォアの強度でコードされる。また、このプロセスでは、コードされたミクロスフェアの表面での反応を定量化するために、３つ目の異なるフルオロフォアがレポーター分子に統合される。コードされたミクロスフェアと系の製造については、たとえば、チャンドラー（Ｃｈａｎｄｌｅｒ），Ｖ．Ｓ．ら、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ  ａｐｐａｒａｔｕｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ（特許文献６）（１９９９）に記載されている。多くのフルオロフォアは放出スペクトルが比較的広いため、このクラスの標識を用いて、一般に１０００未満などそこそこの数のパターンを一意に区別することができる。
【００１１】
比較的狭い蛍光放出スペクトルでナノ粒子を用いること（たとえば、チャンドラー（Ｃｈａｎｄｌｅｒ），Ｍ．Ｂ．ら、「Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｔｔａｃｈｅｄ  ｔｏ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｙｅ」（特許文献７）（２００１）、非特許文献５に記載されている）。電気化学的に積層させたコードなどの他の光学的マーカーで粒子をコードする（たとえば、非特許文献６および非特許文献７に記載されている）と、粒子ベースのアッセイが持つ操作上の利点を保ったままで、アッセイの多重性を改善することができる。
【００１２】
本発明では、物性と光学的特性が定義された粒子と光との相互作用に頼っている。具体的には、球形の粒子からの共鳴光散乱（本発明で用いる光と粒子との相互作用は、ミー理論で説明されているため、本願明細書では共鳴ミー散乱と同義に用いられる）を利用して、粒子のアイデンティティと粒子表面への標的種の結合度の一方または両方を求める。光と粒子の相互作用の理論は、非特許文献８、非特許文献９などの多くの参考文献に見られる。本発明が特に関連しているのは共鳴光散乱スペクトルにおける共鳴構造の処理であり、たとえば、非特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５、および特許文献１６に記載されている。散乱光から構造とプロパティ情報を導き出すための計算方法およびコンピュータアルゴリズムの開発について、たとえば、特許文献１７、特許文献１８、特許文献１９、および特許文献２０に記載がある。本発明の微粒子に特に関連があるのは、たとえば、特許文献２１および特許文献２２など、層になっている球の処理である。
【００１３】
実用上は、共鳴光散乱は粒度と屈折率の測定、大気中のエーロゾルや恒星間粒子の研究、他の測定などに利用されている。これについては、非特許文献１１および非特許文献１４の上記にて引用した２つの文献を参照のこと。また、非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献２６ならびに、これらの文献に引用されている参考文献も参照のこと。これらの参考文献では、散乱光スペクトルで共鳴の細かい特徴を正確に検出するにはスペクトル解像度の高い検出方法が必要であることが示されている。チレク（Ｃｈｙｌｅｋ）ら（１９８３）などの最初の頃の報告では、一般的な実験でのピークの波長位置の測定時における相対誤差は１０５で約１部である。最近になって、たとえば非特許文献２４では、ピーク判定の相対精度は２×１０６で約１部から２×１０７で１部である。
【００１４】
非特許文献２７には、抗体被覆ミクロスフェアをその蛍光スペクトルにおける共鳴の特徴で測定した大きさに基づいて区別するための手法が説明されている。この文献に報告されている手法では、少数（報告されている例では２）の粒子部分集団を区別することができた。各部分集団には公称の平均直径があるが、２つの部分集団の平均直径には比較的大きな開きがあった（６．５マイクロメートルと１０マイクロメートル）。要するに、粒径を識別用の標識として利用し、観察された共鳴パターンに理論的な計算値をフィットさせて直径を測定した。上記の文献に開示されているように、直径「標識」で区別できるのは、実質的に平均直径の異なる２つの部分集団だけであった。この取り組みを極めて似通った微粒子からなる大きくて異なる集団の識別に応用することについては、上記の開示には何ら教示されていない。さらに、本発明の方法およびシステムは、非特許文献２７の開示内容に教示されている方法およびシステムとは実質的に異なるものである。この開示には、入射光の波長を一定にし、走査した蛍光スペクトルに光共鳴が生じる蛍光検出方法が教示されている。これとは対照的に、本発明の好ましい実施形態では蛍光には頼らず、走査した入射波長を利用し、非特許文献２７らに開示されているものとは実質的に異なる手段によって散乱光スペクトルを検出する。
【００１５】
非特許文献２８には、粒子の光共鳴のシフトに基づいて誘電性微粒子へのタンパク質の結合を検出することについて記載されている。共鳴は、浸食された（ｅｒｏｄｅｄ）光ファイバへのエバネッセント結合によって励起され、ファイバを伝搬する光の強度が落ちることから検出されていた。この開示に記載のある検出方法は光散乱の測定を利用したものではない。さらに、光共鳴を粒子識別に利用できる可能性については、非特許文献２８は教示していない。
【００１６】
上記ハイタワー（Ｈｉｇｈｔｏｗｅｒ），Ｒ．Ｌ．およびリチャードソン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ），Ｃ．Ｂは、理論モデリングを利用して、入射する線形偏光平面波に対する大きな層状の球の共振応答を計算した。これらの計算結果に基づいて、彼らは、不混和性流体、吸着層、コーティング、ベシクルの研究に、散乱光スペクトルのはっきりとした一意な特徴を利用できることを示唆している。しかしながら、共鳴光散乱スペクトルを微粒子の識別または生物学的および化学的アッセイの検出に利用することは、この開示には教示されていない。
【００１７】
非特許文献２９には、光ファイバへのエバネッセント結合を利用して励起される固体ミクロスフェアの共鳴光散乱の測定について記載されている。この開示の著者らは、これらの光散乱共鳴の測定を利用して、ミクロスフェア表面に結合した種と周囲の溶液に含まれる試薬との間の極めて感受性の高い吸着および反応の測定ができるとしている。しかしながら、このような測定をどうやって行うことができるかについては、同開示には教示されていない。さらに、光共鳴を粒子識別に利用できる可能性についても、非特許文献２９は教示していない。
【００１８】
アーノルド（Ａｒｎｏｌｄ）らの特許文献８には、センサのミクロスフェア内で軌道を描いて移動するフォトンの共鳴シフトに基づいて、物質を検出するための方法およびシステムが記載されている。ファイバへのエバネッセント結合によってミクロスフェアが励起されるような形で、ミクロスフェアを少なくとも１つの光ファイバに結合する。光ファイバを伝搬する光の強度が落ち込ることから共鳴を検出する。この開示に記載のある検出方法は光散乱の測定を利用したものではない。この開示には、複数のミクロスフェアを利用して多数の分析物を検出できることも教示されている。しかしながら、ここに開示の方法では、ミクロスフェアは光ファイバに付着した定位置で維持される。粒子ならびに、結果として付着しているプローブを追跡する上での粒子識別の信号として光共鳴を利用できる可能性については、アーノルド（Ａｒｎｏｌｄ）らは教示もしていなければ示唆もしていない。
【００１９】
【特許文献１】米国特許第６，３０９，８３１号明細書
【特許文献２】米国特許第５，８３７，８３２号明細書
【特許文献３】米国特許第６，２２５，０４７号明細書
【特許文献４】米国特許第５，７１９，０６０号明細書
【特許文献５】米国特許第６，０６３，５７３号明細書
【特許文献６】米国特許第５，９８１，１８０号明細書
【特許文献７】米国特許第６，２６８，２２２号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２００３／０１７４９２３号明細書
【非特許文献１】シェナ（Ｓｃｈｅｎａ），Ｍ．ら、「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０、４６７〜４７０（１９９５）
【非特許文献２】シャロン（Ｓｈａｌｏｎ），Ｄ．ら、「Ａ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ６、６３９〜６４５（１９９６）
【非特許文献３】ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ），Ｓ．Ｒ．ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）  Ａｒｒａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．、６（１）、８６〜９１（２００２）
【非特許文献４】ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ），Ｂ．Ｐ．ら、「Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｎｔｏ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ」、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．７３、１〜７（２００１）
【非特許文献５】スー（Ｘｕ），Ｈ．ら、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＱｂｅａｄＴＭ  ｓｙｓｔｅｍ；  ａ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１（８）、ｅ４３（２００３）
【非特許文献６】ナイスウォーナーピーナ（Ｎｉｃｅｗａｒｎｅｒ−Ｐｅｎａ），Ｓ．Ｒ．ら、「Ｓｕｂｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ  ｍｅｔａｌｌｉｃ  ｂａｒｃｏｄｅｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４、１３７〜１４１（２００１）
【非特許文献７】ウォールトン（Ｗａｌｔｏｎ），Ｉ．Ｄ．ら、「Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｒｉｐｅｄ  ｍｅｔａｌｌｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ７４、２２４０〜２２４７（２００２）
【非特許文献８】ボーレン（Ｂｏｈｒｅｎ），Ｃ．Ｆ．およびハフマン（Ｈｕｆｆｍａｎ），Ｄ．Ｒ．、Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｌｉｇｈｔ  Ｂｙ  Ｓｍａｌｌ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９８３）
【非特許文献９】カーカー（Ｋｅｒｋｅｒ），Ｍ．、Ｔｈｅ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｌｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９６９）
【非特許文献１０】チレク（Ｃｈｙｌｅｋ），Ｐ．ら、「Ｎａｒｒｏｗ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍｉｅ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ」、Ａｐｐｌ．  Ｏｐｔｉｃｓ  １７、３０１９〜３０２１（１９７８）
【非特許文献１１】コンウェル（Ｃｏｎｗｅｌｌ），Ｐ．Ｒ．ら、「Ｒｅｓｏｎａｎｔ  ｓｐｅｃｔｒａ  ｏｆ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｓｐｈｅｒｅｓ」、Ｊ．  Ｏｐｔ．  Ｓｏｃ．  Ａｍｅｒｉｃａ  Ａ  １、６２〜６７（１９８４）
【非特許文献１２】プロバートジョーンズ（Ｐｒｏｂｅｒｔ−Ｊｏｎｅｓ），Ｊ．Ｒ．、「Ｒｅｓｏｎａｎｔ  ｓｐｅｃｔｒａ  ｏｆ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｓｐｈｅｒｅｓ」、Ｊ．  Ｏｐｔ．  Ｓｏｃ．  Ａｍｅｒｉｃａ  Ａ  １、８２２〜８３０（１９８４）
【非特許文献１３】ヒル（Ｈｉｌｌ），Ｓ．Ｃ．およびベンナー（Ｂｅｎｎｅｒ），Ｒ．Ｅ．、「Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ」、Ｊ．  Ｏｐｔ．  Ｓｏｃ．  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｂ  ３、１５０９〜１５１４
【非特許文献１４】レッティエリ（Ｌｅｔｔｉｅｒｉ）、Ｔ．Ｒ．およびマルクス（Ｍａｒｘ）、Ｅ．、「Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ａ  ｌｉｑｕｉｄ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ」、Ａｐｐｌ．  Ｏｐｔｉｃｓ  ２５（２３）、４３２５〜４３３１（１９８６）
【非特許文献１５】チレク（Ｃｈｙｌｅｋ）、Ｐ．およびチャン（Ｚｈａｎ）、Ｊ．、「Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｉｅ  ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ  ｃｒｏｓｓ  ｓｅｃｔｉｏｎ」、Ｊ．  Ｏｐｔ．  Ｓｏｃ．  Ａｍｅｒｉｃａ  Ａ  ６、１８４６〜１８５１（１９８９）
【非特許文献１６】ヒル（Ｈｉｌｌ）、Ｓ．Ｃ．ら、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅｓ  ｏｂｓｅｒｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｓｍａｌｌ  ｓｐｈｅｒｅｓ  ｏｎ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ」、Ａｐｐｌ．  Ｏｐｔｉｃｓ  ２３、１６８０（１９８４）
【非特許文献１７】コンウェル（Ｃｏｎｗｅｌｌ）．Ｐ．Ｒ．ら、「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｉｚｉｎｇ  ｏｆ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ」、Ｊ．  Ｏｐｔ．  Ｓｏｃ．  Ａｍｅｒｉｃａ  Ａ  １、１１８１〜１１８６（１９８４）
【非特許文献１８】ラム（Ｌａｍ）、Ｃ．Ｃ．ら、「Ｅｘｐｌｉｃｉｔ  ａｓｙｍｐｔｏｔｉｃ  ｆｏｒｍｕｌａｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，  ｗｉｄｔｈｓ，  ａｎｄ  ｓｔｒｅｎｇｔｈｓ  ｏｆ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｍｉｅ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ」、Ｊ．  Ｏｐｔ．  Ｓｏｃ．  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｂ  ９、１５８５〜１５９２（１９９２）
【非特許文献１９】チレク（Ｃｈｙｌｅｋ）、Ｐ．、「Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｍｉｅ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅｓ」、Ｊ．  Ｏｐｔ．  Ｓｏｃ．  Ａｍｅｒｉｃａ  Ａ  ７、１６０９〜１６１３（１９９０）
【非特許文献２０】ギマレス（Ｇｕｉｍａｒａｅｓ）、Ｌ．Ｇ．およびナッセンツベイグ（Ｎｕｓｓｅｎｚｖｅｉｇ）、Ｈ．Ｍ．、「Ｕｎｉｆｏｒｍ  ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｉｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅｓ」、Ｊ．  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｏｐｔｉｃｓ  ４１、６２５〜６４７（１９９４）
【非特許文献２１】カイザー（Ｋａｉｓｅｒ）、Ｔ．およびシュヴァイガー（Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒ）、Ｇ．、「Ｓｔａｂｌｅ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｅ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｓｃａｔｔｅｒｅｄ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ  ｆｉｅｌｄｓ  ｏｆ  ａ  ｃｏａｔｅｄ  ｓｐｈｅｒｅ」、Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ｉｎ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ７、６８２〜６８６（１９９３）
【非特許文献２２】ハイタワー（Ｈｉｇｈｔｏｗｅｒ）、Ｒ．Ｌ．およびリチャードソン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）、Ｃ．Ｂ．、「Ｒｅｓｏｎａｎｔ  Ｍｉｅ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ａ  ｌａｙｅｒｅｄ  ｓｐｈｅｒｅ」、Ａｐｐｌ．  Ｏｐｔｉｃｓ  ２７、４８５０〜４８５５（１９８８）
【非特許文献２３】レイ（Ｒａｙ）、Ａ．Ｋ．およびナンダクマール（Ｎａｎｄａｋｕｍａｒ）、Ｒ．、「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｉｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｉｎ−ｌａｙｅｒｅｄ  ｄｒｏｐｌｅｔｓ  ｆｒｏｍ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅｓ」、Ａｐｐｌ．  Ｏｐｔｉｃｓ  ３４、７７５９〜７７７０（１９９５）
【非特許文献２４】ハッカビー（Ｈｕｃｋａｂｙ）、Ｊ．Ｌ．ら、「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｚｅ，  ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ，  ａｎｄ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｄｒｏｐｌｅｔｓ  ｆｒｏｍ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｓｐｅｃｔｒａ」、Ａｐｐｌ．  Ｏｐｔｉｃｓ  ３３、７１１２〜７１２５（１９９４）
【非特許文献２５】ヒル（Ｈｉｌｌ）、Ｓ．Ｃ．ら、「Ｓｉｚｉｎｇ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｓｐｈｅｒｅｓ  ａｎｄ  ｃｙｌｉｎｄｅｒｓ  ｂｙ  ａｌｉｇｎｉｎｇ  ｍｅａｓｕｒｅｄ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｌｏｃａｔｉｏｎｓ：  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｒｄｅｒｓ」、Ａｐｐｌ．  Ｏｐｔｉｃｓ  ２４、２３８０〜２３９０（１９８５）
【非特許文献２６】チレク（Ｃｈｙｌｅｋ）、Ｐ．Ｖ．ら、「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ  ａｎｄ  ｓｉｚｅ  ｏｆ  ｓｐｈｅｒｉｃａｌ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｒｏｍ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｄａｔａ」、Ａｐｐｌ．  Ｏｐｔｉｃｓ  ２２、２３０３〜２３０７（１９８３）
【非特許文献２７】ウィットン（Ｗｈｉｔｔｅｎ）ら、「Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅｓ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ」、Ａｐｐｌ．  Ｏｐｔｉｃｓ  ３４、３２０３〜３２０７（１９９５）
【非特許文献２８】フォルマー（Ｖｏｌｌｍｅｒ）らの「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｈｉｆｔ  ｏｆ  ａ  ｒｅｓｏｎａｎｔ  ｍｉｃｒｏｃａｖｉｔｙ」、Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．  Ｌｅｔｔ．  ８０、４０５７〜４０５９（２００２）
【非特許文献２９】セルペングゼル（Ｓｅｒｐｅｎｇｕｚｅｌ）らの「Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｏｎ  ａｎ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｆｉｂｅｒ」、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｌｅｔｔ  ２０、６５４〜６５６（１９９５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
文献での報告内容とは対照的に、本発明における微粒子識別の基本は共鳴光の散乱パターンに固有の極めて豊富な情報内容を効率的に利用することにある。詳細については本願明細書にて後述するが、共鳴光の散乱パターンは、ピーク位置、ピーク幅、ピーク次数、次数の異なるピーク間の間隔、偏光依存性スペクトルの特性を含むがこれに限定されるものではない、異なる変数の集合が特徴になる場合がある。散乱パターンに影響するメインパラメータすなわち、構造、組成、粒子寸法のうちの１つもしくはそれ以上を粒子ごとに変えることで、同様の微粒子で構成される大きな集合のメンバから区別可能な共鳴光の散乱パターンを実現できる。よって、本発明によれば、同様の微粒子で構成される大きな集団のメンバから極めて豊富かつ異なる集合の散乱パターンが生成され、これが個々の微粒子を区別して識別するための手段となる。
【００２１】
既存の標識手法の主な欠点として、多様性に限りがあるすなわち、識別用の一意な特徴の組み合わせ数に限りがあること、コードされた粒子の用意が難しいこと、デコードの速度および精度、さらに場合によってはコストがあげられる。したがって、そこそこの数から多数までの分析物について結合動態の粒子ベースの測定を同時並列処理するための方法が必要とされている。具体的には、（１）外部のレポーター部分を必要とせずに結合を測定する機能、（２）標的分析物の結合をリアルタイムで定量的に求める機能、（３）場合により、結合信号を増幅する機能、（４）個々の微粒子を識別し、場合により追跡する機能という属性のうちの１つもしくはそれ以上を呈する方法が必要である。その各々で、現状と比して明らかに改善がなされ、全体を総合すれば、既存のアッセイの速度と精度の改善、コストの削減だけでなく、かつては不可能であった新たな応用が可能になる。
【００２２】
本発明は、高い多様性が可能である上に性能の点で現状よりも優れ、高信頼度かつ容易に製造可能な、コスト効率のよい粒子識別・結合検出方法を提供することで、上記の問題を解決するものである。本発明では、散乱スペクトルの決まった特徴を一意な識別パターンまたは光信号として利用して、高解像度の光散乱を新規な応用の仕方で用いて微粒子を識別する。具体的には、本発明では、粒子のアイデンティティの判定と存在の判定の両方に、また場合により粒子の表面への結合度の判定用の分析方法として、共鳴ミー散乱としても知られる共鳴光散乱を利用する。これらの方法については、最先端の技術よりも実質的に改善されたアッセイを提供する目的で、それぞれを併用してもよいし単独で使用してもよい。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、粒子を識別する一意な光散乱共鳴パターンと、結合前後のこれらのパターンの差とに基づいて、粒子に結合された分析物を識別する方法を提供するものである。よって、本発明は、
（ａ）分析波長範囲全体にわたり光を生成する走査光源を準備し、
（ｂ）少なくとも２つの実質的に球形の識別可能な粒子を準備し、
（ｃ）粒子の表面に結合する少なくとも１つの捕捉プローブであって、少なくとも１種の分析物に対して親和性のある少なくとも１つの捕捉プローブを、（ｂ）の粒子に被着し、
（ｄ）第１の分析波長範囲で（ｃ）の粒子各々を１回もしくはそれ以上走査して、各粒子を一意に識別する第１の基準共鳴光散乱信号を、（ｃ）の粒子各々について少なくとも１つ生成し、
（ｅ）少なくとも１つの捕捉プローブと識別された（ｄ）の粒子各々とを相関させ、
（ｆ）（ｅ）の粒子と分析物を少なくとも１種含有する可能性のある試料とを接触させ、ここで、前記試料中に分析物が存在する場合、少なくとも１つの捕捉プローブと少なくとも１種の分析物との間で結合が生じ、
（ｇ）第２の分析波長範囲で（ｆ）の粒子を１回もしくはそれ以上走査して、（ｆ）の粒子各々について第２の結合共鳴光散乱信号を少なくとも１つ生成し、ここで、
１）少なくとも１つの第１の基準共鳴光散乱信号と少なくとも１つの第２の結合共鳴光散乱信号とは、同一であっても異なっていてもよく、
２）少なくとも第１の分析波長範囲と第２の分析波長範囲とは、同一であっても異なっていてもよく、
（ｈ）少なくとも１つの第１の基準光散乱信号のうちのいずれかと、少なくとも１つの第２の光散乱信号のうちのいずれかと、よりなる群から選択される共鳴光散乱信号間の差を比較することで、少なくとも１つの捕捉プローブに対する少なくとも１種の分析物の結合を検出し、そして
（ｉ）ステップ（ｅ）で得た相関と少なくとも１つの第２の結合共鳴光散乱信号とに基づいて、１種もしくはそれ以上の結合された分析物を識別する
ことを含んでなる、分析物を識別するための方法を提供するものである。
【００２４】
別の実施形態において、本発明は、
（ａ）分析波長範囲全体にわたり光を生成する走査光源を準備し、
（ｂ）少なくとも２つの実質的に球形の識別可能な粒子を準備し、
（ｃ）粒子の表面に結合する少なくとも１つの捕捉プローブであって、少なくとも１種の分析物に対して親和性のある少なくとも１つの捕捉プローブを、（ｂ）の粒子に被着し、
（ｄ）各々が定義されたローカスを有する（ｃ）の粒子を定義済みの空間配列に付加し、
（ｅ）場合により、分析波長範囲で（ｄ）の粒子を１回もしくはそれ以上走査して、（ｄ）の粒子各々について第１の基準共鳴光散乱信号を少なくとも１つ生成し、
（ｆ）（ｅ）の粒子と分析物を少なくとも１種含有する可能性のある試料とを接触させ、ここで、分析物が存在する場合、少なくとも１つの捕捉プローブと少なくとも１種の分析物との間で結合が生じ、
（ｇ）分析波長範囲で（ｆ）の粒子を１回もしくはそれ以上走査して、（ｆ）の粒子各々について第２の結合共鳴光散乱信号を少なくとも１つ生成し、
（ｈ）少なくとも１つの第１の基準光散乱信号のうちのいずれかと、少なくとも１つの第２の光散乱信号のうちのいずれかと、よりなる群から選択される共鳴光散乱信号間の差を比較することで、少なくとも１つの捕捉プローブに対する少なくとも１種の分析物の結合を検出し、そして
（ｉ）付加された粒子ローカスに基づいて、１種もしくはそれ以上の結合された分析物を識別する
ことを含んでなる、分析物を識別するための方法を提供するものである。
【００２５】
同様に、本発明は、
（ａ）分析波長範囲全体にわたり光を生成する走査光源を準備し、
（ｂ）少なくとも２つの実質的に球形の識別可能な粒子を準備し、
（ｃ）粒子の表面に結合する少なくとも１つの捕捉プローブであって、少なくとも１種の分析物に対して親和性のある少なくとも１つの捕捉プローブを、（ｂ）の粒子に被着し、
（ｄ）分析波長範囲で（ｃ）の粒子各々を１回もしくはそれ以上走査して、各粒子を一意に識別する第１の基準共鳴光散乱信号を、（ｃ）の粒子各々について少なくとも１つ生成し、
（ｅ）少なくとも１つの捕捉プローブと識別された（ｄ）の粒子各々とを相関させ、
（ｆ）（ｅ）の粒子と、検出可能な標識を含んでなる分析物を少なくとも１種含有する可能性のある試料と、を接触させ、ここで、分析物が存在する場合、少なくとも１つの捕捉プローブと少なくとも１種の分析物との間で結合が生じ、そして
（ｇ）ステップ（ｅ）の相関と分析物の検出可能な標識とに基づいて、１種もしくはそれ以上の分析物を識別する
ことを含んでなる、分析物を識別するための方法を提供するものである。
【００２６】
他の実施形態において、本発明は、
（ａ）分析波長範囲全体にわたり光を生成する走査光源を準備し、
（ｂ）少なくとも１つの実質的に球形の識別可能な粒子を準備し、
（ｃ）粒子の表面に結合する少なくとも１つの捕捉プローブであって、少なくとも１種の分析物に対して親和性のある少なくとも１つの捕捉プローブを、（ｂ）の粒子に被着し、
（ｄ）場合により、分析波長範囲で（ｃ）の粒子を１回もしくはそれ以上走査して、（ｃ）の粒子各々について第１の基準共鳴光散乱信号を少なくとも１つ生成し、
（ｅ）（ｄ）の粒子と分析物を少なくとも１種含有する可能性のある試料とを接触させ、ここで、分析物が存在する場合、少なくとも１つの捕捉プローブと少なくとも１種の分析物との間で結合が生じ、
（ｆ）分析波長範囲で（ｅ）の粒子を１回もしくはそれ以上走査して、（ｅ）の粒子各々について第２の結合共鳴光散乱信号を少なくとも１つ生成し、そして
（ｇ）少なくとも１つの第１の基準光散乱信号のうちのいずれかと、少なくとも１つの第２の光散乱信号のうちのいずれかと、よりなる群から選択される共鳴光散乱信号間の差を比較することで、少なくとも１つの捕捉プローブに対する少なくとも１種の分析物の結合を検出する
ことを含んでなる、捕捉プローブに対する分析物の結合を検出するための方法を提供するものである。
【００２７】
別の実施形態において、本発明は、
（ａ）分析波長範囲全体にわたり光を生成する走査光源を準備し、
（ｂ）１）粒子に付加される少なくとも１つの捕捉プローブと、
２）少なくとも１つの捕捉プローブに結合された少なくとも１種の分析物と、を含んでなる、実質的に球形の識別可能な粒子を少なくとも１つ準備し、
（ｃ）分析波長範囲で（ｂ）の粒子を１回もしくはそれ以上走査して、前記粒子について第１の基準共鳴光散乱信号を少なくとも１つ生成し、
（ｄ）ステップ（ｃ）の粒子の少なくとも１つの捕捉プローブから少なくとも１種の分析物を解離させ、
（ｅ）分析波長範囲で（ｄ）の粒子を１回もしくはそれ以上走査して、粒子各々について第２の解離共鳴光散乱信号を少なくとも１つ生成し、そして
（ｆ）少なくとも１つの第１の基準光散乱信号のうちのいずれかと、少なくとも１つの第２の光散乱信号のうちのいずれかと、よりなる群から選択される共鳴光散乱信号間の差を比較することで、少なくとも１つの捕捉プローブからの少なくとも１種の分析物の解離を検出する
ことを含んでなる、捕捉プローブからの分析物の解離を検出するための方法を提供するものである。
【００２８】
さらに、本発明は、
（ａ）実質的に球形の芯と、
（ｂ）粒子の外面に付加される捕捉プローブと、を含んでなり、
１）約２７５ナノメートルから約１９００ナノメートルの光学波長範囲で約１から約２０ナノメートルの分析波長範囲での走査時における一意な共鳴光散乱信号を特徴とし、
２）直径約１００マイクロメートル以下であり、
３）分析波長範囲で屈折率約１．６から約２．１の間であり、そして
４）分析波長範囲で実質的に非蛍光発光性である、識別可能な粒子を提供するものである。
【００２９】
特定の実施形態において、本発明は、
（ａ）実質的に球形の芯と、
（ｂ）粒子の外面に付加される捕捉プローブと、を含んでなり、
１）約２７５ナノメートルから約１９００ナノメートルの光学波長範囲で約１から約２０ナノメートルの分析波長範囲での走査時における一意な共鳴光散乱信号を特徴とし、
２）直径約１００マイクロメートル以下であり、
３）分析波長範囲で屈折率約１．６から約２．１の間であり、そして
４）分析波長範囲で実質的に非蛍光発光性である粒子であって、
ｉ）厚さが約５０ナノメートルから約２０マイクロメートルの間である光学的に活性な層１つもしくはそれ以上と、
ｉｉ）厚さが約１ナノメートルから１０マイクロメートルの生物学的に活性または化学的に活性な実質的に透明な外側の層１つもしくはそれ以上と、を含んでなり、前記層が（ｉ）の層と重なる、粒子を提供するものである。
【００３０】
また、本発明は、
（ａ）溶液中に少なくとも１つの実質的に球形の識別可能な粒子を含んでなるシステムであって、これらの粒子は各々、
（ａ）粒子の外面に付加される捕捉プローブを含んでなり、
１）粒子は、約２７５から約１９００ナノメートルの光学波長範囲で約１から約２０ナノメートルにわたるウィンドウのある分析波長範囲での走査時における一意な共鳴光散乱信号を特徴とし、
２）粒子の直径は約７５マイクロメートル以下であり、
３）粒子の屈折率は分析波長範囲で約１．４５および約２．１であり、
前記システムはまた、
（ｂ）分析波長範囲で粒子を走査するための走査光源と、
（ｃ）散乱光を検出するのに適した位置と適した環境に粒子を提示するための光学セルと、
（ｄ）粒子を光学セルに配置するための粒子ハンドリング手段と、
（ｅ）走査された粒子からの光を検出して前記光を電気信号に変換するための検出手段と、を含んでなる、微粒子ベースの測定システムを提供するものである。
【００３１】
配列の説明
本件出願の一部をなす以下の詳細な説明、図面、添付の配列の説明から、本発明についてなお一層完全に理解することができる。
【００３２】
以下の配列は米国特許施行規則第１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則」）に準拠し、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）、ＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（施行規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）ならびに実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に従ったものである。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに用いる記号および形式は米国特許施行規則第１．８２２に記載の規則に準拠している。
【００３３】
配列番号１は、実施例９で説明する合成手足口病標的のヌクレオチド配列である。
【００３４】
配列番号２は、実施例９で説明するＪＢＰオリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列である。
【００３５】
配列番号３は、実施例９で説明する修飾ＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｂオリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列である。
【００３６】
配列番号４は、実施例９で説明するＮ−ＪＢＣオリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列である。
【００３７】
配列番号５は、実施例９で説明するフルオレセイン標識オリゴヌクレオチド標的ＪＢＣ−Ｆのヌクレオチド配列である。
【００３８】
配列番号６は、実施例９で説明するフルオレセイン標識オリゴヌクレオチド標的対照Ｌａｃ２−Ｆのヌクレオチド配列である。
【００３９】
配列番号７は、実施例９および１１で説明するフルオレセイン標識オリゴヌクレオチド標的ＪＢＰ−Ｆのヌクレオチド配列である。
【００４０】
配列番号８は、実施例１０で説明する手足口病ＰＣＲ断片ＪＢのヌクレオチド配列である。
【００４１】
配列番号９は、実施例１０で説明するＬａｃ２−５１１  ＰＣＲ非特異的標的断片のヌクレオチド配列である。
【００４２】
配列番号１０〜１３は、実施例１０で説明するようなＰＣＲ標的断片の増幅に用いるオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列である。
【００４３】
配列番号１４は、実施例１１で説明するペプチド核酸プローブＪＢＰ２Ｃのヌクレオチド配列である。
【００４４】
配列番号１５は、実施例１１で説明する修飾ペプチド核酸プローブＪＢＰ２ＢＣのヌクレオチド配列である。
【００４５】
配列番号１６は、実施例１２で説明するＪＢ  ＰＣＲ産物の相補体のヌクレオチド配列である。
【００４６】
配列番号１７は、実施例１３で説明するフルオレセイン標識オリゴヌクレオチドプローブＪＢＰ−Ｓ２ＳＰ３Ｆのヌクレオチド配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
本発明は、高い多様性で並列分析が可能であり、性能の点で現行の方法よりも優れている、特定の分析物の検出および粒子識別を行うための高信頼度かつ容易に製造可能な、コスト効率のよい方法を提供するものである。本発明では、散乱スペクトルの決まった特徴を一意な識別パターンまたは光信号として利用して、高解像度の光散乱を新規な応用の仕方で用いて微粒子を識別する。具体的には、本発明では、粒子のアイデンティティの判定と存在の判定の両方に、また場合により粒子の表面への結合度の判定用の分析方法として、共鳴光散乱を利用する。本発明によれば、分析物が特定の微粒子に結合すると、対象となる分析物と微粒子を識別できる機能が保たれたまま、結合度の判定ができるような形でその微粒子の光学的特性が変化する。
【００４８】
本発明は、（１）粒子の構造、物性、機能性、（２）外部のレポーター部分を必要とせずに結合を測定する機能、（３）粒子を識別する手段、（４）標的分析物の結合をリアルタイムで定量的に求める機能、（５）場合により、結合信号を増幅する機能の点で特徴的なシステムを提供することで、従来技術の先を行くものである。
【００４９】
本願明細書では以下の定義を使用し、特許請求の範囲および明細書を解釈するにあたって参照すべきものとする。
【００５０】
本願開示で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、特に明記しない限り複数の物も示すことがある。よって、たとえば、「粒子（ａ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）」の製造、誘導体化または処理方法というときは、１個もしくはそれ以上の混合物も含み得る。さらに、「ビーズ」、「粒子」、「微粒子」および「ミクロスフェア」など、文法的に何かと等価な表現が使われている場合についても、それぞれの文脈で特に明記しない限り、これらの用語同士の違いを示すことを想定しているわけではない。
【００５１】
「粒子」、「微粒子」、「ビーズ」、「ミクロスフェア」ならびに、文法的にこれらと等価な表現は、好ましくは実質的に球形で、直径が約１００マイクロメートル未満、好ましくは約７５マイクロメートル未満、一層好ましくは約５０マイクロメートル未満である、互いに分離された小さな粒子を示す。
【００５２】
「識別可能な微粒子」という用語は、識別でき、場合により追跡できる微粒子を示す。
【００５３】
「スペクトルの特徴」、「光共鳴構造」、「識別の特徴」、「散乱共鳴」、「共鳴光散乱信号」という用語は、ピーク位置、ピーク幅、ピーク次数、次数の異なるピーク間の間隔，および偏光依存性スペクトルの特性を含むがこれに限定されるものではない、粒子の識別に利用できる共鳴光散乱スペクトルの特徴を示すものとして、本願明細書では同義に用いられる。
【００５４】
「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」という用語は、２つもしくはそれ以上の共有結合された、自然界に存在するか合成製造されるアミノ酸を示すものとして、本願明細書では同義に用いられる。
【００５５】
「分析物」という用語は、本発明の方法による検出またはアッセイ対象となる物質を示す。一般的な分析物としては、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチド核酸、抗体、受容体、分子、生物細胞、微生物、細胞小器官、細胞膜断片、バクテリオファージ、バクテリオファージ断片、全ウイルス、ウイルス断片、結合対の一メンバがあげられるが、これに限定されるものではない。
【００５６】
「標的」および「標的分析物」という用語は、アッセイの標的となる分析物を示すことになる。標的の基原は一般に、生物、ウイルスや細菌などの病原体から、あるいは、たとえば、皮膚、血漿、血清、髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、血球、臓器、腫瘍、さらにはインビトロでの細胞培養成分の試料（細胞培地での細胞の増殖によって得られる条件培地、組換え細胞、細胞成分を含むがこれに限定されるものではない）を含むがこれに限定されるものではない個体から単離される。また、標的は合成基原由来のものであってもよい。
【００５７】
「結合対」という用語には、抗原／抗体、抗原／抗体断片またはハプテン／抗ハプテン系などの免疫タイプの結合対のクラスのいずれをも含み、また、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、葉酸／葉酸塩結合タンパク質、ホルモン／ホルモン受容体、レクチン／特定の炭水化物、酵素／酵素、酵素／基質、酵素／阻害剤またはビタミンＢ１２／内因子などの非免疫タイプの結合対のクラスのいずれをも含む。また、相補的核酸断片（ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、ペプチド核酸配列を含む）ならびにプロテインＡ／抗体またはプロテインＧ／抗体、ポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド結合タンパク質もあげられる。結合対には、マレイミドおよびハロアセチル誘導体をはじめとするスルフヒドリル反応性基、イソチオシアナート、スクシンイミジルエステル、カルボジイミド、ハロゲン化スルホニルなどのアミン反応性基など、共有結合を形成するメンバが含まれることもある。
【００５８】
「捕捉プローブ」、「プローブ」、「結合因子」、「生物活性因子」、「結合配位子」という用語または文法的にこれらと等価な表現は、試料中の複数の分析物に対して非特異的に結合または特定の分析物または分析物群に対して優先的に結合させるのに使用できる、タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体または抗体断片、生物細胞、微生物、細胞小器官、細胞膜断片、バクテリオファージ、バクテリオファージ断片、全ウイルス、ウイルス断片、有機配位子、有機金属配位子など、あらゆる化学的または生物学的構造または部分を示す。
【００５９】
「プローブ結合微粒子」という用語は、捕捉プローブが表面に付着した微粒子を示す。
【００６０】
「配位子」または「反応配位子」という用語は、抗体、レクチン、受容体、結合タンパク質、核酸または化学物質を含むがこれに限定されるものではない、結合対の一メンバとして作用できる化学的部分または「標識」を示す。
【００６１】
「標識」という用語は、核酸、タンパク質または結合対のメンバに付着できる原子または分子を示す。標識については、化学的に反応性の基を介して結合対または核酸に結合させられる。また、標識を化学合成時にオリゴヌクレオチドに付着させてもよいし、標識したヌクレオチドに核酸複製時に取り込むようにしてもよい。標識としては、蛍光部分、化学発光部分、粒子、酵素、放射活性タグ、量子ドット、発光部分、吸光部分、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）および臭化エチジウム（ＥＢ）を含むインターカレート色素、シアニン色素（たとえば、米国特許第５，５６３，０３７号明細書を参照のこと）があげられるであろうが、これに限定されるものではない。
【００６２】
「レポーター」という用語は、検出可能な（好ましくは定量化可能な）シグナルを提供するための「標識」として用いられ、核酸、タンパク質または結合対のメンバに付着できる原子または分子を示す。レポーターは、蛍光、化学発光、放射活性、比色分析、Ｘ線回折または吸収、磁気、酵素活性などによって検出可能なシグナルを提供できる。
【００６３】
「レポーターコンジュゲート」という用語は、分析物に結合可能な抗体、レクチン、受容体または結合タンパク質または他の部分などの結合対の一メンバに結合された「レポーター−標識」を含んでなるコンジュゲートを示す。
【００６４】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、プリンまたはピリミジン塩基または修飾プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドからなるリボ糖リン酸骨格である、あらゆるポリヌクレオチドを示す。「核酸」、「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」の長さに意図した区別はない。
【００６５】
「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」という用語は、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）の糖リン酸骨格ではなく偽ペプチド骨格を有するＤＮＡの類縁体を示す。ＰＮＡはＤＮＡの挙動を模倣し、相補的核酸鎖と結合する。
【００６６】
「オリゴマー」という用語は、２つもしくはそれ以上のモノマーで構成されるプローブまたは標的を示し、本願明細書では、本発明との関連で利用される核酸、ペプチド、ペプチド核酸またはポリマーの構造を説明するのに用いられる。この用語の好ましい使い方は、核酸のリボ糖リン酸骨格を模倣する偽ペプチド骨格上に「核酸塩基」部分の配列を含む、「オリゴヌクレオチド」に似ているペプチド核酸（ＰＮＡ）の構造に関連した使い方にある。
【００６７】
「核酸塩基」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡのプリンまたはピリミジン部分を示す。
【００６８】
「プライマー」という用語は一般に、核酸の「複製」プロセスまたは「増幅」プロセスを開始するよう機能する配列結合オリゴヌクレオチドを意味するものとして用いられる。
【００６９】
「複製」という用語は、核酸分子の核酸鎖の相補鎖がポリメラーゼ酵素によって合成されるプロセスを示す。「プライマーによる」複製では、このプロセスには複製を開始するのに二重「プライマー」の末端ヌクレオチドの（デオキシ）リボース部分の３’位に水酸基（ＯＨ）が必要である。
【００７０】
「増幅」という用語は、核酸配列のコピー数が線形または対数的に増えるようにして、周期的なプロセスで「複製」が繰り返されるプロセスを示す。このような複製プロセスとしては、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）または他の同様の酵素反応があげられるが、これに限定されるものではない。
【００７１】
「プライマーによる核酸増幅」または「プライマーによる増幅」という表現は、プライマーを利用して、核酸分子の線形または対数的な増幅における核酸配列の複製を助ける、従来技術において周知の方法を示す。本願出願人らは、プライマーによる増幅については、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）または鎖置換増幅（ＳＤＡ）を含むがこれに限定されるものではない、従来技術において周知のいくつかのスキームのうちいずれかを用いて行い得るものと考えている。
【００７２】
「相補鎖」という用語は、逆平行な会合で配列の５’末端が他の配列の３’末端と対になるような形で標的核酸の１本の鎖の核酸配列とアライメントされたときに、安定した二本鎖が形成される核酸配列鎖またはペプチド核酸配列鎖を示す。相補性は必ずしも完全でなくてもよい。ミスマッチしたヌクレオチドで安定した二本鎖を形成することができる。
【００７３】
「断片」は、特定領域のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列の画分をなす。「該当する核酸断片」とは、標的核酸配列に取り込まれるか、標的核酸配列の一部であり、診断要素として有用な断片を示す。
【００７４】
「特異的結合」または「特異的分析物結合」という用語は、結合対のメンバである分析物に対する結合対試薬の親和性を示す。
【００７５】
「非特異的結合」という用語は、試料マトリクス成分に対するプローブ−微粒子の非特異的親和性を示す。本発明に関しては、標的分析物が存在する場合に試料マトリクス成分に対してプローブ−微粒子が非特異的親和性を示すことで生じる共鳴シフトとして、「非特異的結合」を求めることができる。
【００７６】
「試料マトリクス成分」という用語は、標的分析物以外の試料マトリクスの成分を示す。試料マトリクス成分としては、タンパク質、脂質、塩、核酸、炭水化物があげられるがこれに限定されるものではなく、一般に分析物を含有する生物試料の天然成分である。
【００７７】
「ストリンジェンシー」という用語は、核酸二本鎖の安定性または形成に影響するパラメータの厳密な制御を示す。これには、温度（Ｔｍ）、カチオン濃度（［Ｎａ＋］、［Ｋ＋］、［Ｍｇ２＋］、［Ｍｎ２＋］）、二本鎖の組成およびヌクレオチド数あるいは、ホルムアミドなどの二本鎖不安定化剤の濃度があり得る。
【００７８】
「分析物の識別」という表現は、アイデンティティが分かっている捕捉プローブへの結合に基づいて分析物のアイデンティティを求めるためのプロセスを示す。
【００７９】
「分析波長範囲」という用語は、本発明の微粒子を走査して共鳴光散乱信号を生成する波長ウィンドウを示す。このウィンドウは一般に、光学波長約２７５から約１９００ナノメートル、好ましくは約６００から約１６５０ナノメートルの場合で、約１から約２０ナノメートルにおよぶ。一層好ましくは、分析波長範囲は、約７７０から約７８０ナノメートルで１０ナノメートルのウィンドウである。分析物または分析物の結合を識別するプロセスでは、本発明の粒子を何回でも走査することができるが、走査は毎回（アッセイの具体的な対象によって実際の範囲は走査ごとに違ってくる場合があると考えられるが）「分析波長範囲」で行われる。
【００８０】
「走査光源」という用語は、分析波長範囲で波長を変えることのできる光源を示す。走査光源には、走査用ダイオードレーザおよびチューナブル色素レーザ、発光ダイオードなどの一定範囲の波長の光を出力する多色光源、波長選択手段との併用でのランプなど、分析波長範囲で可変の光を出力する光源が含まれる。
【００８１】
「基準共鳴光散乱信号」という用語は、捕捉プローブを粒子に被着した後あるいは、捕捉プローブからの分析物の解離を検出する場合は分析物を捕捉プローブに結合させた後に、本発明の粒子を分析波長範囲で走査して生成される共鳴光散乱信号を示す。基準共鳴光散乱信号を利用すれば、粒子とこれに付着したプローブを識別することができ、また、この信号を分析物結合検出の基線として用いることができる。タイミングを変えて粒子を走査すると、多数の基準共鳴信号を得られる。
【００８２】
「結合共鳴光散乱信号」という用語は、粒子を分析物と接触させた後に、本発明の粒子を分析波長範囲で走査して生成される共鳴光散乱信号を示す。結合をリアルタイムでフォローする一連の結合共鳴光散乱信号が得られる。結合の判定については、結合共鳴光散乱信号のうちのいずれかを基準共鳴光散乱信号のうちのいずれかと比較するか、複数の結合共鳴光散乱信号のうちのいずれかを同じシリーズの前の結合共鳴光散乱信号と比較することによって行われる。
【００８３】
「識別用共鳴光散乱信号」という用語は、捕捉プローブを粒子に被着する前に本発明の粒子を分析波長範囲で走査して生成される共鳴光散乱信号を示す。識別用共鳴光散乱信号を利用すると、既知の捕捉プローブを付着させ、そのアイデンティティを識別された粒子と相関させることができるように、粒子を識別することができる。
【００８４】
「解離共鳴光散乱信号」という用語は、分析物を捕捉プローブから解離させた後に、本発明の粒子を分析波長範囲で走査して生成される共鳴光散乱信号を示す。解離をリアルタイムでフォローする一連の解離共鳴光散乱信号が得られる。解離の判定については、解離共鳴光散乱信号のうちのいずれかを基準共鳴光散乱信号のうちのいずれかと比較するか、解離共鳴光散乱信号のうちのいずれかを同じシリーズの前の第２の解離共鳴光散乱信号と比較することによって行われる。
【００８５】
「光学的に活性である」という表現は、粒子の層についていう場合、その層が粒子に関する光散乱共鳴がその層によって新しく生成されるか、あるいはその層によって光散乱共鳴に変化が生じることを意味する。
【００８６】
「生物学的に活性である」という表現は、粒子の層についていう場合、生物学的部分間での相互作用にその層が関与できることを意味する。
【００８７】
「化学的に活性である」という表現は、粒子の層についていう場合、化学的部分間の結合相互作用を含むがこれに限定されるものではない化学的部分間での相互作用にその層が関与できることを意味する。このような層は、捕捉プローブに付着するために特定のリンカー化学を持つことになるか、およびまたは粒子表面での捕捉プローブの直接合成用に誘導体化できると考えられる。
【００８８】
本発明は、微粒子ベースの分析方法、システム、用途を提供するものである。本発明の主な目的は、１種もしくはそれ以上の特定の標的分析物（たとえば、特定のヌクレオチド配列あるいは、抗体または抗原などの特定のタンパク質）の存在、場合によりその濃度を検出し、外部のレポーター基または標識を利用することなく測定を行うための改善された方法を提供することにある。具体的には、本願発明者らは、結合の検出、粒子識別、アッセイの多様性、粒子の調製、本発明の最終用途に関する従来技術の改良について説明する。
【００８９】
本発明の基本要素のひとつは、生物学的アッセイまたは化学的アッセイに必要な測定に合わせて最適化した特定の物性と化学的特性を持つ微粒子を調製し、これを使用することにある。たとえば、該当する分析物に対する特異的捕捉プローブとして機能する化学官能基を微粒子群のメンバの外面に被着することができる。「捕捉プローブ」、「結合因子」、「生物活性因子」、「結合配位子」または文法的にこれらと等価な表現は、試料中で複数の分析物に対して非特異的に、あるいは特定の分析物または分析物群に対して優先的に結合させるのに利用できるタンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体または抗体断片、有機配位子、有機金属配位子などの化学構造または部分を意味する。本発明の一般的な用途では、１つもしくはそれ以上で表面に相補的捕捉プローブが露出した微粒子の集合を適宜構築し、これに該当する分析物を曝露する。分析物の結合が起こり、詳細については本願開示の後半で説明する感受性の高い新規な方法で、これを検出する。
【００９０】
本発明によって提供される、従来技術の大きな進歩のひとつに、共鳴光散乱を新規な形で応用して、標的の結合を測定し、かつ粒子のアイデンティティを判定するための方法がある。この統合された測定のやり方では、共鳴光散乱を粒子のアイデンティティの測定と結合の測定の両方に利用するが、これは本発明に独特なものである。しかしながら、本発明の実用性は、共鳴光散乱によるアイデンティフィケーションの判定と結合判定の組み合わせに限られるものではない。本発明は、さまざまな用途、たとえば、共鳴光散乱による粒子識別の利用のみ、共鳴光散乱による粒子識別と他の手段による結合検出との併用、他の手段による粒子識別と共鳴光散乱による結合検出との併用などを可能にするものである。
【００９１】
これらの新規な要素を組み合わせた本発明の一実施形態では、それぞれの粒子に、その一意な共鳴光散乱スペクトルに基づいて識別コードまたは標識を割り当てる。微粒子の調製時、各微粒子のアイデンティティとその微粒子に対する特異的捕捉プローブの結合との相関を持たせる。この相関によって、混合試料中の１種もしくはそれ以上の分析物の存在を識別することができる。特定の標的部分のその相補的プローブへの結合については、あらかじめ識別された、表面に相補的プローブのあることが分かっている粒子または複数の粒子の共鳴光散乱スペクトルの変化を利用して測定する。
【００９２】
本発明の別の実施形態では、結合の検出と粒子のアイデンティティの判定を独立して行うことができる。たとえば、既知の捕捉プローブで微粒子を誘導体化し、実験中に変化しない特定の定位置におくことができる。特定の粒子のアイデンティティ、よって、その表面に露出しているプローブは、その位置から求められる。詳細については本願開示にて後述する共鳴光散乱手法を利用して、結合を測定することができる。
【００９３】
さらに別の実施形態では、粒子のアイデンティティの判定や追跡を行わないコンビナトリアルな方法で微粒子を誘導体化できる。この場合、共鳴光散乱を利用してスクリーニング法でアッセイの「ヒット」を見つけだし、たとえば質量分析法、蛍光、吸光度、放射活性、表面プラズモン共鳴、あるいは、蛍光部分、化学発光部分、粒子、酵素、放射活性タグ、量子ドット、発光部分、吸光部分、インターカレート色素、結合対のメンバなどの検出可能な標識を利用する従来技術において周知の他の方法で、プローブのアイデンティティを独立して判定することが可能である。この方法のバリエーションとして、詳細については後述する共鳴光散乱または従来技術において周知の他の方法のいずれかによって、コンビナトリアルプロセスの最初から最後まで粒子のアイデンティティを追跡することがあげられる。
【００９４】
本発明のさらに別の実施形態では、共鳴光散乱法によって微粒子を識別および／または追跡し、蛍光部分、化学発光部分、粒子、酵素、放射活性タグ、量子ドット、発光部分、吸光部分、インターカレート色素、結合対のメンバなどの検出可能な標識を利用して、結合を測定することができる。
【００９５】
粒子構造、特性、製造
「粒子」、「微粒子」、「ビーズ」、「ミクロスフェア」ならびに、文法的にこれらと等価な表現は、本願明細書において、互いに分離された小さな粒子を意味する。好ましくは、この粒子は実質的に球形である。「実質的に球形である」という表現は、本願明細書で使用する場合、粒子の形状が約１０％を超えて完全な球から外れないことを意味する。一般に、粒子を走査すなわち、光学波長範囲内の分析波長範囲でさまざまな波長の光を粒子に照射して、共鳴光の散乱パターンの測定を行い、粒子の識別に利用する識別用共鳴光散乱信号を得る。続いて、下記の捕捉プローブと粒子ライブラリのセクションで説明するように、周知のさまざまなプローブを粒子に被着し、プローブのアイデンティティを粒子の識別用共鳴光散乱信号と相関させることができる。原理的には、本発明の測定にはどのような光学波長範囲でも適用できる。好ましくは、光学波長範囲が約２７５から約１９００ナノメートル、一層好ましくは約６００から約１６５０ナノメートルである。好ましくは、分析波長範囲が約１ナノメートルから約２０ナノメートルの間、一層好ましくは約１０ナノメートル幅である。一層好ましくは、分析波長範囲が約７７０から約７８０ナノメートルで１０ナノメートルの幅である。
【００９６】
好ましい一実施形態において、粒子は分析波長範囲で実質的に非蛍光発光性である。「実質的に非蛍光発光性」であるという表現は、本願明細書において使用する場合、粒子の平均蛍光シグナルが、分析波長範囲で平均弾性散乱光シグナルすなわち、入射光と同一波長の散乱光の約１０％未満であることを意味する。
【００９７】
これらの粒子は一般に、実質的に球形の芯と場合により１つもしくはそれ以上の層とで構成される。詳細については後述するように、芯の大きさと組成は用途によって変わり得る。芯だけでなく、粒子には該当する用途に適した機能性を持たせるための層が１つもしくはそれ以上あってもよい。層が含まれる場合、その厚さと屈折率は、具体的な用途での需要と必要な測定値を得るために用いる光の波長とによって変わり得る。たとえば、別の散乱光共鳴の特徴を生み出したり、特徴の相対的な波長位置を変えたりといった有用な光学的特性を、層によって持たせることができる。光学的特性に合わせて用いられる、これらの層を、本願明細書では「光学的に活性な」層と呼び、一般にその厚さの範囲は、全体の所望の粒径によって約０．０５マイクロメートル（５０ナノメートル）から約２０マイクロメートルであるかそれを上回る。
【００９８】
また、本願明細書では化学的に活性な層または生物学的に活性な層と呼ぶ層によって、化学的または生物学的な機能を持たせることもでき、これらの機能を得るには、単一の層または複数の層の厚さは一般に約０．００１マイクロメートル（１ナノメートル）から約１０マイクロメートルであるかそれを上回る（所望の粒径に依存）範囲にすることができる。これらの層は一般に、粒子の外面に形成される。また、これらの層には、生物学的に活性な多孔性構造も含み得る。ここに開示の例では、粒度は、可視光から近赤外線の範囲の光の波長を用いる一般的な生体分析アッセイに適しているが、これらの例の条件は本発明を限定することを意味するものではない。入射波長約７７５ナノメートルで、粒径は好ましくは約１００マイクロメートル以下である。
【００９９】
芯と層の組成ならびに、結果として屈折率も可変である。好ましい実施形態では、組成は、いわゆる「火面」の外にあたる粒子の領域（たとえば、ロール（Ｒｏｌｌ），Ｇ．およびシュヴァイガー（Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒ），Ｇ．、「Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃａｌ  ｏｐｔｉｃｓ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｍｉｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅｓ、Ｊ．  Ｏｐｔ．  Ｓｏｃ．  Ａｍ．  Ａ  １７、１３０１〜１３１１（２０００）を参照のこと）が、該当する波長で光に対して実質的に透過性となるような組成である。本願明細書において使用する場合、「実質的に透過性」とは、構造的共鳴が生じる粒子の領域内での光の吸収が十分に小さく、分析波長範囲で粒子に光を照射したときに、共鳴が観察されたまま残ることを意味する。理論的な計算では、粒子または光学的に活性な層の屈折率の虚成分（「ｋ」で示す）が分析波長範囲で約０．１以下であるときに、粒子内での光の吸収が共鳴を観察できる程度に小さくなるとみられる。７７０から７８０ナノメートルの分析波長範囲でｋ値が０．１以下だということは、吸収係数約１．６μｍ−１以下に相当する。
【０１００】
さらに好ましい実施形態では、該当する波長での透明度に加えて、粒子の屈折率は、粒子が実質的に水性媒質中にあるときに、該当する波長で共鳴光散乱（詳細については後述する）が明らかになるような屈折率である。好ましくは、結合部分の付着などの意図した用途に必要あるいは、化学的または物理的な分解を有意に引き起こすことなくバイオアッセイ反応を得るのに必要な条件に耐えられる程度に、粒子をでこぼこにしておく。また、光学的な理由から、芯は実質的に剛性で、粒子の取り扱い時とアッセイ条件で形状が維持されるものであると好ましい。
【０１０１】
芯に適した材料としては、（該当する波長で）実質的に透明なプラスチックおよび他のポリマー、セラミック、ガラス、鉱物などがあげられる。一例として、上記にて開示した好ましい物性および光学的特性を条件として、標準ガラスおよび特殊ガラス、シリカ、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、アクリルポリマー、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、フルオロポリマー、シリコーン、セルロース、シリコンなどの半導体材料、吸光性材料、金および銀などの金属、ルビーなどの鉱物、金ナノ粒子および量子ドットなどのナノ粒子、コロイド粒子、金属酸化物、金属硫化物、金属セレン化物、酸化鉄などの磁性材料、これらの複合体などがあげられるが、これに限定されるものではない。芯は均質な組成物からなるものであってもよいし、所望の物性および光学的特性に応じて２つもしくはそれ以上のクラスの材料の複合材料であってもよい。
【０１０２】
この芯は本発明を有用なものとする多数の機能を果たし得る。たとえば、芯を光吸収性材料で構成することができるが、これは、共鳴光散乱には無関係であって、吸収されなければ微粒子で屈折して迷光と望ましくないバックグラウンドシグナルになる、特定の光線を吸収する機能をもたせられる。芯があることで得られる別の有用性の例として、磁性材料の利用があげられるが、これは、外部磁力によって粒子を回収し、篩にかけ、移動し、あるいは操作できるように、粒子に磁気的な特性を持たせるものである。役立つ可能性のある実施形態として、たとえば粒子を懸濁させるか水性媒体中で容易に移動したいが、層材料が実質的に水よりも密度の高いものである場合に、芯が中空の粒子を利用することがある。この場合、芯を中空にしておくことで粒子全体の密度を低くできる。
【０１０３】
好ましい実施形態では、微粒子は、均一なガラスミクロスフェアを含んでなる芯で構成される。さらに好ましい実施形態では、微粒子は、上記にて開示した該当する波長で屈折率が約１．４５から２．１、一層好ましくは約１．６から２．１である光学品質のガラスミクロスフェアで構成される。好適な粒子は、たとえばＭｏ−Ｓｃｉ  Ｉｎｃ．（ミズーリ州ローラ（Ｒｏｌｌａ））から市販されている。
【０１０４】
詳細については後述ならびに実施例で説明するように、芯の屈折率を変えることで望ましい光学的特性または物性を持たせることができる。したがって、別の好ましい実施形態において、たとえば中心からの半径方向の距離など位置によって屈折率または他の特性が異なる芯にすることができる。
【０１０５】
本願開示にて上述したように、微粒子には、芯だけでなく、１つもしくはそれ以上の層を含み得る。微粒子に層を含むことの目的は変わり得る。層によって、生物活性因子または化学的結合部位を含む化学官能基の付加、非特異的結合の低減、芯の物理的完全性および化学的完全性の保護に適した表面が得られる。外側の生物学的に活性または化学的に活性な層を形成することに関する詳細については、本願開示の「捕捉プローブと粒子ライブラリ」のセクションに示してある。詳細については後述するように、層を用いることで、粒子集団の識別パターンの多様性を高めるための光学的なインタフェースをさらに増やすこともできる。
【０１０６】
上述したように、層を用いる場合、その寸法、組成と屈折率については望ましい機能に応じて変えられる。好ましい実施形態では、層の組成および屈折率を、該当する波長ですべての層が光に対して実質的に透過性になるように定める。層を用いる場合にその厚さは、好ましくは約１ナノメートルから２０マイクロメートルである。
【０１０７】
したがって、別の好ましい実施形態において、微粒子は芯に１つもしくはそれ以上の層を加えたものからなり、層が兼ね合わせる機能としては、本願開示の「捕捉プローブと粒子ライブラリ」のセクションで説明するように、たとえば生物活性因子を含む化学官能基の付与に好適な表面を提供することがあげられる。
【０１０８】
別の好ましい実施形態では、詳細については後述するように、分析波長範囲で粒子を走査した場合に別の光共鳴構造が明らかになるか、光共鳴構造同士の相対位置が変わるようにして、少なくとも１つの層が構成される。
【０１０９】
別の好ましい実施形態では、微粒子は別の識別の特徴を持たせるか、識別の特徴を変える機能のある層と、１つもしくはそれ以上の別の層とを芯に加えたものからなり、別の層が兼ね備える機能としては、本願開示の「捕捉プローブと粒子ライブラリ」のセクションで説明するように、たとえば生物活性因子を含む化学官能基の付与に好適な表面を提供することがあげられる。
【０１１０】
さらに別の好ましい実施形態では、微粒子は、芯と、さまざまな屈折率の領域を芯の表面または表面付近に含んでなる、識別の特徴を別に加えるか変化させる層を加え、さらに１つもしくはそれ以上の外側の層を加えたものからなり、別の層が兼ね備える機能としては、本願開示の「捕捉プローブと粒子ライブラリ」のセクションで説明するように、たとえば生物活性因子を含む化学官能基の付与に好適な表面を提供することがあげられる。
【０１１１】
層を用いる場合に、それに適した材料としては、該当する波長での透明度などの層の所望の機能による制約（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ）を条件として、芯について列挙したあらゆるクラスの材料ならびに、ナトリウムポリ（スチレンスルホネート）およびポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）などの高分子電解質があげられる。さらに、それぞれの層は組成が均一であっても組成の異なるものであってもよい。
【０１１２】
層については、当業者間で周知のさまざまな方法で微粒子の表面に生成可能である。一例として、アイラー（Ｉｌｅｒ），Ｒ．Ｋ．、「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｉｌｉｃａ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９７９）、ブリンカー（Ｂｒｉｎｋｅｒ），Ｃ．Ｊ．およびシェーラー（Ｓｃｈｅｒｅｒ），Ｇ．Ｗ．、「Ｓｏｌ−ｇｅｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）に記載されているようなゾルゲル化学法があげられる。粒子表面に層を生成する別のやり方として、パーチ（Ｐａｒｔｃｈ），Ｒ．およびブラウン（Ｂｒｏｗｎ），Ｓ．、「Ａｅｒｏｓｏｌ  ａｎｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｒｔｉｃｌｅ−ｐｏｌｙｍｅｒ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ」、Ｊ．  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ６７、２５９〜２７６（１９９８）、ペカレック（Ｐｅｋａｒｅｋ），Ｋ．ら、「Ｄｏｕｂｌｅ−ｗａｌｌｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｄｒｕｇ  ｒｅｌｅａｓｅ」、Ｎａｔｕｒｅ  ３６７、２５８（１９９４）、ハンプラソプワッタナ（Ｈａｎｐｒａｓｏｐｗａｔｔａｎａ），Ａ．、「Ｔｉｔａｎｉａ  ｃｏａｔｉｎｇｓ  ｏｎ  ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ  ｓｉｌｉｃａ  ｓｐｈｅｒｅｓ」、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １２、３１７３〜３１７９（１９９６）、デイヴィス（Ｄａｖｉｅｓ），Ｒ．、「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｕｒｆａｃｅｓ」、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  １０、１２６４〜１２７０（１９９８）、上記文献における参考文献に記載されているような表面化学および封入手法があげられる。蒸着手法も利用できる。たとえば、ゴルマン（Ｇｏｌｍａｎ），Ｂ．およびシノハラ（Ｓｈｉｎｏｈａｒａ），Ｋ．、「Ｆｉｎｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｃｏａｔｉｎｇ  ｂｙ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｖａｐｏｒ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ」、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍ．  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６、１〜６（２０００）、コールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ），Ｋ．Ｅ．ら、「Ｂｒｉｇｈｔ  ｍｅｔａｌ  ｆｌａｋｅ  ｂａｓｅｄ  ｐｉｇｍｅｎｔｓ」、米国特許第６，３８７，４９８号明細書（２００２）を参照のこと。さらに他の取り組みとして、スホルコフ（Ｓｕｋｈｏｒｕｋｏｖ），Ｇ．Ｂ．ら、「Ｓｔｅｐｗｉｓｅ  ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｕｒｆａｃｅｓ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｃｏｌｌｏｉｄ  ｄｅｓｉｇｎ」、Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ９（１０〜１１）、７５９〜７６７（１９９８）、カルーソー（Ｃａｒｕｓｏ），Ｆ．ら、「Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｓｉｌｉｃａ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒｓ  ｏｎ  ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  ｌａｔｅｘ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２０（３３）、８５２３〜８５２４（１９９８）、カルーソー（Ｃａｒｕｓｏ），Ｆ．ら、「Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ���ｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒ  ｆｉｌｍｓ：  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｉｏｎｉｃ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ  ｔｏ  ｌａｙｅｒｓ  ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｏｎｔｏ  ｃｏｌｌｏｉｄｓ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ３２（７）、２３１７〜２３２８（１９９９）、カルーソー（Ｃａｒｕｓｏ），Ｆ．、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｓｔｅｐｗｉｓｅ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２１（２５）、６０３９〜６０４６（１９９９）、マーゲル（Ｍａｒｇｅｌ），Ｓ．およびバムノルカー（Ｂａｍｎｏｌｋｅｒ），Ｈ．、米国特許第６，１０３，３７９号明細書および上記文献に記載の参考文献に記載されているような、層ごとの自己集合法があげられる。
【０１１３】
微粒子の多様性を利用することで本発明の有用性が高まる。一実施形態において、たとえば一連の管、溝、チャネルまたは基板の他の構造にて組織化することで、微粒子を二次元形態で分布させることができ、あるいは特別な構造がなくても表面で自己集合させることもできる。このような形態では、アッセイ中をとおして粒子の相対位置が維持される場合、位置によってアイデンティティが確立されるため、パターンまたは標識に基づいて個々の粒子を識別することは任意にできる。しかしながら、一般には、粒子は相対位置が変わる用途に利用されることがある。この場合、詳細については後述するように、共鳴光散乱法あるいは、蛍光、吸光度、放射活性および表面プラズモン共鳴などの従来技術において周知の他の手法で粒子のアイデンティティを確立できる。
【０１１４】
本発明の目的は、生物学的アッセイおよび化学的アッセイで利用するのに適した、識別可能な微粒子の集団を容易かつコスト効率よく生成する手段を提供することにある。どの粒子生成プロセスにおいても、芯と層の寸法や光学的特性には粒子ごとに本来ばらつきがある。よって、本発明の目的は、こうした本来のばらつきを利用し、場合により、ばらつきを生みだして、粒子を識別するための新規な基礎を作ることにある。微粒子を有用なものとするために、このばらつきを制御するか、あるいは粒子をその物性と光学的特性とに応じて適宜スクリーニングする必要がある。よって、好ましい実施形態では、芯および／または層（用いる場合）の寸法と光学的特性のばらつきを、単一の粒子について上記にて開示した好ましい範囲内におさめる。これは、粒子生成プロセスを正しく制御するか、本発明において開示したような形で利用するのに適した粒子だけを選択する品質管理したスクリーニングを含むようにするなど、いくつかの方法で達成可能である。
【０１１５】
捕捉プローブと粒子ライブラリ
捕捉プローブは、該当する具体的な測定内容に応じて、さまざまな化学的分類を含んでなり得る。一般に、これらは、試料中の標的分子との相互作用に必要な機能を提供する有機分子または生物学的分子であるか、あるいはその分子断片である。従来技術において周知のように、プローブは、たとえばＤＮＡプローブとその標的との間で完全な塩基対相補体から、ストリンジェンシーの低めの塩基対マッチングまで、さまざまな度合いの特異性を持ち得る。同様に、抗体または合成ペプチドなどのペプチド標的またはタンパク質標的のプローブは、プローブの構造とアッセイ条件とによって、極めて特異性が高いこともあればそうでもないこともある。後述の説明において、「プローブ」または「捕捉プローブ」という言葉が用いられている場合、これは特異性の高い化学的または物理的なエンティティあるいは、特異性の異なる１つもしくはそれ以上のエンティティを示すことがある。本発明のプローブ結合微粒子は、該当する捕捉プローブを微粒子の表面に被着して形成できるものである。プローブについては、表面でプローブを直接合成するか、自然界に存在するプローブまたは合成・生成したプローブを付加する方法で、粒子に対して被着することができ、あるいは、詳細については後述するように、従来技術において周知の方法を利用して表面に別々に単離することもできる。
【０１１６】
上述したように、各々の表面に１つもしくはそれ以上の一意な捕捉プローブが露出した一組の微粒子を利用することで、本発明の有用性が高まる。このような組は、通常、微粒子またはプローブの「ライブラリ」と呼ばれる。従来技術において周知のように、粒子ベースの生物学的アッセイでは、通常は特異的捕捉プローブと特定の粒子とを関連付ける必要がある。これは一般に、現状では標識（フルオロフォア、クロモフォア、ナノ粒子、エッチングした「バーコード」など）をそれぞれの粒子に付与するか粒子に取り込むことでなされている。こうした従来の取り組みを本発明の共鳴光散乱による結合の検出と併用してもよい。しかしながら、本発明は、それぞれの粒子の識別にも共鳴光散乱を用いることで、文献に記載の方法とは実質的に異なる新規かつ効率的な別の粒子識別方法を提供するものである。
【０１１７】
捕捉プローブのクラスはタンパク質を含んでなる。「タンパク質」とは、２つもしくはそれ以上の共有結合されたアミノ酸を意味する。よって、「ペプチド」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」という用語ならびに、従来技術において同様に用いられている用語はいずれも、本願開示では類義語として解釈される。アミノ酸は、相対的な順序（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｏｒｄｅｒ）と豊富さ（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）を問わず自然界に存在するものおよび／または合成製造されたものであればよい。この実施形態では、水素結合、静電結合、親水性相互作用および同様の非共有結合による結合機序を利用して、選択された標的に対する結合親和性を高めることができる。結合の特異性を高めるには、従来技術において周知のように、特に３次元構造が好ましい。
【０１１８】
好ましい一実施形態では、捕捉プローブはタンパク質またはその断片である。本発明で用いる微粒子の外側の生物活性層の作成には、たとえばリンカー化学などを利用して表面に適切なプローブが付着するように微粒子を誘導体化することを含み得る。タンパク質捕捉プローブライブラリを作製し、プローブを表面に付着させるための方法は従来技術において周知であり、たとえば、ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ），Ｋ．およびジー（Ｇｅ），Ｌ．、「Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２４３、８７〜１０５（１９９９）、ルヴォ（Ｒｕｖｏ），Ｍ．およびファッシナ（Ｆａｓｓｉｎａ），Ｇ．、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、デッカー（Ｄｅｋｋｅｒ）、ニューヨーク、第７〜２１ページ（１９９９）、ワーグナー（Ｗａｇｎｅｒ），Ｐ．ら、「Ａｒｒａｙｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃａｐｔｕｒｅ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｕｓｅ  ｔｈｅｒｅｏｆ」、米国特許第６，３６５，４１８号明細書（２００２）、ワーグナー（Ｗａｇｎｅｒ），Ｐ．ら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ」、米国特許第６，４０６，９２１号明細書（２００２）、マクヒュー（ＭｃＨｕｇｈ），Ｔ．Ｍ．、「Ｆｌｏｗ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ａｎａｌｙｔｅｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４２、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９４、コルヴィン（Ｃｏｌｖｉｎ）ら、Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ：  Ｍｅｄｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１〜１３、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、イルム（Ｉｌｌｕｍ），Ｌ．ら、「Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １１２、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８５、上記文献に記載の参考文献を参照のこと。タンパク質捕捉プローブのライブラリについては、たとえば植物または動物の細胞抽出物から作製できる。特に有用で好ましいのは、ヒトの抗体などヒトタンパク質のライブラリである。
【０１１９】
タンパク質捕捉プローブは、自然界に存在するポリペプチド、合成ポリペプチドまたはこれら２つのタイプの組み合わせを含んでなり得る。好ましい一実施形態では、捕捉プローブを、コンビナトリアルバイオロジーや、たとえばブラックマン（Ｂｒａｃｋｍａｎｎｎ），Ｓ．およびジョンソン（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ），Ｋ．編、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（２００２）、ショート（Ｓｈｏｒｔ），Ｊ．Ｍ．およびフライ（Ｆｒｅｙ），Ｊ．Ｆ．「Ｅｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」、米国特許第６，３５８，７０９号明細書（２００２）、スチュアート（Ｓｔｕａｒｔ），Ｗ．Ｄ．、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ−ｂａｓｅｄ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、米国特許第５，６８３，８９９号明細書（１９９７）、上記文献に記載の参考文献に記載の定向進化法などの従来技術において周知の手法で、アミノ酸配列が部分的または完全にランダム化するように合成する。
【０１２０】
別の好ましい実施形態において、捕捉プローブは、部分的に自然界に存在するアミノ酸配列と部分的にランダム化されたアミノ酸配列とを含んでなるタンパク質である。
【０１２１】
別の好ましい実施形態では、ランダム化を含むタンパク質捕捉プローブの作製を本発明の微粒子で行う。これにより、インデックス化したプローブライブラリを作製する特に効率的なやり方が得られる。
【０１２２】
タンパク質の結合ライブラリの最適なサイズまたは多様性は、実際の用途に応じて変更できる。特定の試料について統計的に有意な数の結合イベントが起こる場合に、資料を一意的に特徴付けできるため、ライブラリが最も有用なものとなる。たとえば、既知の抗原のほとんどに相互作用できる程度の親和性を持つ組み合わせを少なくとも１つ得るには、抗体１０７から１０８種類の多様性があれば十分であるとされる（たとえば、ウォールト（Ｗａｌｔ），Ｄ．Ｒ．およびミシェル（Ｍｉｃｈａｅｌ），Ｋ．Ｌ．、「Ｔａｒｇｅｔ  ａｎａｌｙｔｅ  ｓｅｎｓｏｒｓ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ」、米国特許第６，３２７，４１０号明細書（２００１）を参照のこと）。抗体スクリーニングに用いられるタンパク質およびペプチドライブラリは一般に、その作製に用いる方法に応じて、メンバ数１０６から１０８であるかこれを上回る（たとえば、ガヴィロンド（Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ），Ｊ．Ｖ．およびラリック（Ｌａｒｒｉｃｋ），Ｊ．Ｗ．、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｔ  Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ」、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９、１２８〜１４５（２０００）、ヘインズ（Ｈａｎｅｓ），Ｊ．およびプラクスン（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ），A．、「Iｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４３、１０７〜１２２（１９９９）を参照のこと）。よって、好ましい一実施形態では、少なくとも１０６、一層好ましくは１０７、最も好ましくは１０８またはこれを上回る異なる捕捉プローブを利用して、抗原の存在をスクリーニングする。一方、結合ライブラリの多様性については、測定の目的が少数の特定の分析物の存在を判定することにある場合は、これを小さくするようにしてもよい。ＨＩＶ、肝炎、癌などの疾患状態における限られた数の特定のバイオマーカーのアッセイが従来技術において周知である（たとえば、ペトリコイン（Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ），Ｅ．Ｆ．ら、「Ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ」、Ｌａｎｃｅｔ  ３５９、５７２〜５７７（２００２）を参照のこと）。通常は、このような状態のスクリーニングには、大規模なゲノムマッピングやプロテオームマッピングの場合よりも必要なプローブの数は少なくてすむ。
【０１２３】
別のクラスの捕捉プローブは、核酸あるいは核酸変異体（後述するペプチド核酸など）を含んでなり、これらは「ＤＮＡ断片」、「ＲＮＡ断片」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「遺伝子プローブ」、「ＤＮＡプローブ」ならびに、従来技術において用いられている同様の用語で知られる場合もあり、いずれも本願開示では類義語とみなす。核酸プローブは、自然界に存在する遺伝子断片、クローニングにより得られた遺伝子断片、合成ポリヌクレオチドまたはこれらのあらゆる組み合わせに由来するヌクレオチド配列を含有し得る。合成ポリヌクレオチドの塩基配列については、オリゴ（Ｏｌｉｇｏ）ＴＭ  ４．０または６．０（ナショナルバイオサイエンス社（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州プリマス（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ））、ベクターＮＴＩ（インフォマックス（Ｉｎｆｏｒｍａｘ）ＴＭ、メリーランド州フレデリック（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ））などの市販のソフトウェアあるいは、オリゴヌクレオチド配列および構造の設計を助ける他のコンピュータプログラムを利用して、特定の核酸標的に合わせて設計できる。従来技術において周知のように、ヌクレオチドには、自然界に存在する糖ホスホジエステル骨格またはその化学的修飾が含まれることがあり、これらの修飾があることで、自然界に存在する遺伝子または遺伝子断片には見られない新規な化学的部分を用いることができる。
【０１２４】
さらに、捕捉プローブはペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブであってもよい。ＰＮＡは、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）の糖リン酸骨格ではなく偽ペプチド骨格を有するＤＮＡの類縁体である。ＰＮＡはＤＮＡの挙動を模し、相補的核酸鎖に結合する。ＰＮＡオリゴマープローブは、核酸塩基へのアセチルリンカーを有するアミノエチルグリシン骨格をベースにするものであってもよい。これらは、Ｂｏｃ／Ｃｂｚモノマーを用いるＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学または固相合成のいずれかで生成される（ドゥホルム（Ｄｕｅｈｏｌｍ），Ｋ．Ｌ．ら、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ５９，５７６７〜５７７３（１９９４）、クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ），Ｌ．ら  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉ．  ３、１７５〜１８３（１９９５）、トムソン（Ｔｈｏｍｓｏｎ），Ｓ．Ａ．  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ２２、６１７９〜６１９４（１９９５）、ガネッシュ（Ｇａｎｅｓｈ），Ｋ．Ｎ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ４、９３１〜９４３（２０００））。ＰＮＡプローブは、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（カリフォルニア州フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ））から購入できる。ＰＮＡオリゴマーについては、核酸プローブに官能性を与える末端修飾因子を用いて設計してもよい。修飾因子はＰＮＡの分析物特異的可変捕捉配列の内部のものであってもよい。
【０１２５】
粒子表面でのＰＮＡなどの核酸プローブまたは偽核酸プローブの作製方法は周知である。代表的な参考文献として、たとえばフルトン（Ｆｕｌｔｏｎ），Ｒ．Ｊ．、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、米国特許第６，０５７，１０７号明細書（２０００）、チャンドラー（Ｃｈａｎｄｌｅｒ），Ｍ．Ｂ．ら、「Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｔｔａｃｈｅｄ  ｔｏ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｙｅ」、米国特許第６，２６８，２２２号明細書（２００１）、チャンドラー（Ｃｈａｎｄｌｅｒ），Ｖ．Ｓ．ら、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ  ａｐｐａｒａｔｕｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ」、米国特許第５，９８１，１８０号明細書（１９９９）、マンデッキ（Ｍａｎｄｅｃｋｉ），Ｗ．、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  ｔｒａｎｓｐｏｎｄｅｒｓ」、米国特許第６，３６１，９５０（２００２）；マンデッキ（Ｍａｎｄｅｃｋｉ），Ｗ．「Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ａｒｒａｙｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｔｒａｎｓｐｏｎｄｅｒｓ  ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＩＢＣ  Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、サンフランシスコ、１９９８年６月、Ｄ＆ＭＤ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ＃１９４１，  Ｄｒｕｇ  ＆  Ｍａｒｋｅｔ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，  ＭＡ  ０１７７２、第１７９〜１８７ページ（１９９９）、ブレンナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ），Ｓ．ら、「Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  （ＭＰＳＳ）  ｏｎ  ｍｉｃｒｏｂｅａｄ  ａｒｒａｙｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８、６３０〜６３４（２０００）、ブレンナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ），Ｓ．ら、「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｏｎ  ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ：  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｃＤＮＡｓ」  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ９７、１６６５〜１６７０（２０００）ならびに、上記文献における参考文献があげられる。あるいは、核酸プローブについては、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（カリフォルニア州フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ））から入手可能なものなどの市販のＤＮＡオリゴヌクレオチド合成剤を利用して、標準的なβ−シアノエチルホスホラミダイトカップリング化学で細孔性ガラス担体表面にて作製することもできる（ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ２２、１８５９（１９８１））。続いて、従来技術において周知のように、共有結合または非共有結合でのカップリングによって合成核酸プローブを微粒子に結合する。オリゴヌクレオチドプローブの５’末端、３’末端またはその両方を、核酸プローブの末端に官能性を与えるβ−シアノエチルホスホラミダイト修飾因子を用いて誘導体化できる。これらの修飾因子としては、アミノ修飾因子、チオ修飾因子、ジチオ修飾因子、カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、分子スペーサ修飾因子、親和性反応配位子または免疫反応配位子があげられるが、これに限定されるものではない。修飾因子の目的は、分子スペーシング（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｐａｃｉｎｇ）、識別可能な微粒子のプローブへの共有結合による架橋または親和性捕捉ができるような機能を核酸プローブに持たせることにある。架橋または結合機能によって、核酸プローブが微粒子表面にコンジュゲートできる。従来技術において周知の多くの異なる化学的方法を利用できる。これらの方法では一般に、アミンまたはスルフヒドリル基などの求核性残基に対して容易に結合できる反応性の求電子性中間体を利用する。これらの基としては、（ａ）マレイミドおよびハロアセチル誘導体を含むがこれに限定されるものではない、スルフヒドリル反応性基と共有結合を形成するメンバ、（ｂ）イソチオシアナート、スクシンイミジルエステルおよびハロゲン化スルホニル含むがこれに限定されるものではない、アミン反応性基、（ｃ）アミノおよびカルボキシル基を含むカルボジイミド反応性基、（ｄ）抗原／抗体またはハプテン／抗ハプテン系などの免疫タイプの結合対のクラスのいずれか、（ｅ）ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、葉酸／葉酸塩結合タンパク質またはビタミンＢ１２／内因子などの非免疫タイプの結合対のクラスのいずれか、（ｆ）相補的核酸セグメントの基のいずれか（ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、ペプチド核酸配列）、（ｇ）プロテインＡまたはＧなどの免疫グロブリン結合タンパク質の基のいずれかがあげられる。カップリングの特性と官能部分の属性に加えて、分子修飾因子をアッセイ信号シグナル（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｉｇｎａｌ）の生成または増幅の一助とすることも可能である。
【０１２６】
本発明に有用な微粒子の表面調製には、たとえば、リンカー化学、ハイブリダイゼーションまたはビオチン／アビジン親和性による親和性捕捉、コンビナトリアル化学、他の従来技術において周知のものを含み得る。通常は、標的の結合が測定可能なイベントであり、試料のキャラクタリゼーションまたはスクリーニングに寄与するような形で、標的配列に対して相補的なヌクレオチド配列が得られるよう核酸プローブを設計する。この場合、結合は相補的な塩基ペアリングによるものであり、完全でなくてもよい。従来技術において周知のように、このような結合のストリンジェンシーはアッセイ条件を変えることで制御可能なものである。タンパク質について上述したように、核酸プローブも、特異的アッセイの需要に応じて配列の全部または一部をランダム化できる可能性のある自然界に存在するヌクレオチド配列と合成ヌクレオチド配列のどのような組み合わせからなるものであってもよい。
【０１２７】
好ましい一実施形態において、捕捉プローブは、自然界に存在するヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドまたはペプチド核酸、クローニングした遺伝子または遺伝子断片などである。
【０１２８】
別の好ましい実施形態において、捕捉プローブは、部分的に自然界に存在するヌクレオチド配列と部分的にランダム化したヌクレオチド配列とを含んでなるポリヌクレオチドまたはペプチド核酸である。
【０１２９】
別の好ましい実施形態において、捕捉プローブは、さまざまなタイプのバイオセンサに役立つ、より一層一般的な有機化学構造、有機／無機配位子、有機金属配位子または同様の複合体を含んでなり得るものであり、たとえば、フィッツジェラルド（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ），Ｄ．Ａ．、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  １６、３８（２００２）、クラヴァット（Ｃｒａｖａｔｔ），Ｂ．Ｆ．およびソーレンセン（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ）  Ｅ．Ｊ．「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ４、６６３〜６６８、２０００、ハージェンロザー（Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ），Ｐ．Ｊ．ら、「Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  Ａｌｃｏｈｏｌ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｎ  Ｇｌａｓｓ  Ｓｌｉｄｅｓ、Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２２（３２）、７８４９−７８５０（２０００）、コーベル（Ｋｏｒｂｅｌ），Ｇ．Ａ．ら、「Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：  Ａ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄｌｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ  Ｅｘｃｅｓｓ  ｏｆ  Ｔｈｏｕｓａｎｄｓ  ｏｆ  Ｓａｍｐｌｅｓ」、Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２３（２）、３６１〜３６２（２００１）、マクベアス（ＭａｃＢｅａｔｈ），Ｇ．ら、「Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｓ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｌｉｇａｎｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｅｎ  Ｍａｓｓｅ」、Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２１（３４）、７９６７〜７９６８（１９９９）および上記文献に記載の参考文献を参照のこと。これらのプローブ構造は、コンビナトリアル化学、直接合成、組織からの抽出などを含むさまざまな方法で誘導体化できるものである。
【０１３０】
尿、脳髄液、血清、血漿などの複雑な生物流体におけるアッセイなど（下記「アッセイ」というタイトルのセクション参照）用途によっては、微粒子を処理して試料マトリクス成分の非特異的結合を防止または低減しなければならないことがある。異種アッセイでの多種多様な固体担体に対する非特異的結合を低減する方法は従来技術において周知であり、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、脱脂粉乳などのタンパク質での処理を含むがこれに限定されるものではない。これらの処理は通常、潜在的な非特異的結合部位をブロックする目的で、捕捉プローブを微粒子に付着させた後かつアッセイ前に行われる。さらに、単一の成分または複数成分の混合物からなる合成ポリマー、自然界に存在するポリマーまたは自己集合単層膜を含んでなる薄膜を表面にコーティングすることで、非特異的結合が起こらない表面を形成することが可能である。この薄膜については、吸着撥水部分で変性させ、非特異的結合をさらに減らすようにしてもよい。たとえば、この薄膜を、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキサイド、デキストランまたは多糖などの親水性ポリマーにしてもよいし、末端官能基が親水性であって、水素結合アクセプタを含有するが水素結合ドナーは含有せず、全体として電気的に中性の自己集合単層膜としてもよい（オストゥーニ（Ｏｓｔｕｎｉ），Ｅ．ら、「Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  ｔｈａｔ  Ｒｅｓｉｓｔ  ｔｈｅ  Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１７、５６０５〜５６２０，（２００１））。このやり方では通常、非特異的結合耐性層を担体上に形成した上で化学的に活性化し、捕捉プローブの付着ができるようにする。たとえば、ホアン（Ｈｕａｎｇ）による同時係属中の米国特許出願第６０／４５１０６８号明細書（本願明細書に援用）に記載の方法を利用し、本発明の微粒子への非特異的吸着を低減することができる。この開示に記載の方法では、ポリエチレングリコールアルキルアクリレートの薄膜を、表面開始原子移動ラジカル重合によって固体担体すなわち微粒子の表面で成長させる。この方法については、以下の実施例７で詳細に説明する。要するに、微粒子をまず開始分子で処理して開始剤被覆微粒子を調製し、これを溶液中にて触媒の存在下で少なくとも１種のポリエチレングリコールアルキルアクリレートモノマーと接触させる。こうして得られるポリエチレングリコールアルキルアクリレートコーティングをさらに活性化し、トリクロロ−ｓ−トリアジン（アブチョウスキ（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ），Ａ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏ．  Ｃｈｅｍ．  ２５２、３５７８〜３５８１および３５８２〜３５８６（１９７７））、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（バートリング（Ｂａｒｔｌｉｎｇ），Ｇ．Ｊ．ら  Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、２４３、３４２〜３４４（１９７３））、塩化トシルおよび塩化トレシルなどの有機塩化スルホニル（ニルソン（Ｎｉｌｓｓｏｎ），Ｋ．およびモスバッハ（Ｍｏｓｂａｃｈ），Ｋ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９８４、１０４、第５６〜６９ページ）を使用することを含むがこれに限���されるものではない従来技術において周知のさまざまな方法で捕捉プローブにコンジュゲートすることもできる。
【０１３１】
タンパク質ライブラリについて上述したように、核酸または有機分子ライブラリの多様性は、最終利用者の具体的な用途によってかなりまちまちになり得る。好ましい実施形態では、ライブラリに含まれるそれぞれの粒子が異なる捕捉プローブ、捕捉プローブのクラスまたは捕捉プローブの定義された混合物を持つことになる。しかしながら、同じ捕捉プローブを持つ粒子を２つ以上ライブラリに入れることでライブラリに冗長性を持たせることも可能である。このようにすると、適度に冗長なライブラリ（プローブ１つあたり３〜５コピー）での特定の分析物の存在測定の確実さが統計的に大きくなるため好ましいことがある。冗長性に対する需要は標的分析物の濃度、利用できる試料をはじめとして、さまざまな要因によって変わる。
【０１３２】
よって、既知の捕捉プローブを事前に付着させてあらかじめ製造した微粒子で商業的に有用なライブラリを構成したり、あるいは、微粒子を特定の表面化学で処理して利用者が特に興味のあるライブラリをカスタム合成できるようにすることができる。プローブについては、別途作製しておいて、従来技術において周知のリンカー化学、架橋化学または他の手法を用いて別のステップで付着させればよい。架橋基の例としては、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド、アミドならびに、スルホネートおよびスルフェートなどの硫黄含有基があげられるが、これに限定されるものではない。架橋化学の例としては、トリアジンおよびビスエポキシドを含むヒドロキシ反応性基、マレイミドおよびハロアセチル誘導体を含むスルフヒドリル反応性基、イソチオシアナート、スクシンイミジルエステルおよびハロゲン化スルホニルなどのアミン反応性基、カルボジイミドなどのカルボキシル反応性基があげられるが、これに限定されるものではない。
【０１３３】
別のやり方では、捕捉プローブを本発明の粒子の表面で直接合成することができる。粒子で直接合成できるプローブとしては、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、ペプチド核酸、ポリペプチドおよびその分子ハイブリッドがあげられるが、これに限定されるものではない。直接合成のやり方では、プローブを粒子で直接化学的または生化学的に合成するのに用いる反応性残基によって誘導体化される粒子を利用する。反応性残基の化学的な連結は、合成後の脱保護および最終的なプローブ結合微粒子のクリンアップ時に微粒子から切断可能なものであってはならない（ロールマン（Ｌｏｈｒｍａｎｎ）ら、ＤＮＡ  ３、１２２２（１９８４）；カドナガ（Ｋａｄｏｎａｇａ），Ｊ．Ｔ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０８、１０〜２３（１９９１）、ラーソン（Ｌａｒｓｏｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２０、３５２５（１９９２）、アンドレアディス（Ａｎｄｒｅａｄｉｓ）ら  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２２８、ｅ５（２０００）、クリシー（Ｃｈｒｉｓｅｙ）ら、ＷＯ／０１４６４７１）。このやり方を使うと、大量生産ならびにライブラリのアセンブリが可能になる。
【０１３４】
要するに、ライブラリを製造するための手段は、実施対象となるアッセイ、ライブラリのタイプ、ライブラリの多様性、冗長性、リンカー化学のタイプ、その他の要因に左右される。有用な粒子ライブラリに対する一般的な要件としては、粒子のアイデンティティと捕捉プローブのアイデンティティとの間に相関があることがあげられる。この相関は、コンビナトリアル法、直接的な自動合成、手作業による合成または他の方法のいずれを用いている場合であっても、ライブラリをどのように合成したか、また相関をいつどのようにして求めたかとは無関係に保存しておくべきものである。
【０１３５】
通常、ライブラリの微粒子はそれぞれ、特異的捕捉プローブまたは捕捉プローブの定義された混合物のコピーを複数持っている。捕捉プローブの最適な表面密度は用途や反応条件によって変わり得る。たとえば、固定化されたＤＮＡプローブに対するＤＮＡハイブリダイゼーション動態が調査されている（チャン（Ｃｈａｎ）ら、「Ｔｈｅ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ」、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６９、２２４３〜２２５５（１９９５）、リヴシット（Ｌｉｖｓｈｉｔｓ），Ｍ．Ａ．、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｇｅｌ−ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ７１、２７９５〜２８０１（１９９６））。タンパク質−タンパク質相互作用についても同様の研究が実施されている（ステンバーグ（Ｓｔｅｎｂｅｒｇ），Ｍ．およびニグレン（Ｎｙｇｒｅｎ），Ｈ．、「Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｓｏｌｉｄ−ｌｉｑｕｉｄ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１３、３（１９９８）。通常、２次元表面アレイと標的分析物を含有する溶液との界面は混ざり方が甘い。２次元固定アレイで効率的な特異的結合を行うためには、通常は最初に表面で非特異的結合を若干生じさせた上で、表面に沿った２次元拡散を続け、これによってハイブリダイゼーションまたは結合を引き起こす。２次元拡散が必要であるがゆえに、プローブの表面密度、結合率に限度が生じ、結果として特定の時間内で生成できるシグナル全体にも限りが出る。これとは対照的に、十分に混合された環境（たとえば、遊離懸濁液またはマイクロ流体デバイスで得られる流体フィールドなど）でなされる粒子ベースのアッセイでは、界面の境界層が連続的に補充されプローブ表面密度が高くなればなるほど望ましい。このようにすることで、結合率が上がり、結合信号が潜在的に大きくなり、プローブ密度が高くなり、感受性が増し、特異性が改善され、非特異的結合の干渉が低減される。本発明では、微粒子表面でのプローブ密度が高いほど、特異的結合に悪影響を及ぼすことなく非特異的結合を低減しやすくなる。粒子ベースのアッセイ、特に本発明のシステムの別の利点として、アッセイに必要な試料の量を原理的に低減できる点があげられる。固定アレイ系では、反応動態をドライブして拡散長が長い問題をなくすためには、分析物をプローブに比して実質的に過剰にしなければならない。一般に、分析物分子のごく一部だけが固定アレイの相補的プローブと相互作用することができる。十分に混合された系で拡散長が短くなるため、すべてのプローブ結合部位にすべての分析物を等しく利用できる。これによって、感受性が増して反応時間が短くなり、アッセイの応答時間も短くなる。
【０１３６】
本発明の好ましい実施形態では、表面化学または捕捉プローブを別途使用することなく、多様な識別可能な微粒子としての微粒子ライブラリが得られる。このようなライブラリは、コンビナトリアル合成用の担体の標識を含むがこれに限定されるものではない多くの目的に利用でき、また、カスタムメイドのスクリーニングライブラリ用の開始材料として利用される。
【０１３７】
別の好ましい実施形態では、特定のリンカー化学、直接合成または捕捉プローブを付着させるための他の手段に適した誘導体化粒子表面を持つ微粒子ライブラリが得られる。このようにしておくと、最終利用者は自己の特定のアッセイの需要に応じたプローブでライブラリを独自に調整することができる。
【０１３８】
さらに別の好ましい実施形態では、粒子のアイデンティティの一覧と相関させた既知の捕捉プローブを持つ粒子で微粒子ライブラリを作製する。このようにしておくと、最終利用者は、自己の特定のアッセイの需要に応じて提供時のライブラリ全体を利用するか、あるいはライブラリをソートして部分集合を形成することができる。
【０１３９】
さらに別の好ましい実施形態では、たとえばコンビナトリアル法で作製した未知の捕捉プローブを持つ粒子で微粒子ライブラリを作製する。このようにしておくと、最終利用者は、共鳴光散乱手によって特定の標的に対する「ヒット」でライブラリをスクリーニングし、従来技術において周知の手法で対応するプローブを特徴付けすることができる。
【０１４０】
アッセイ
本発明で実施する化学的または生物学的アッセイでは、結合対すなわち微粒子の表面にある対の一メンバ（「プローブ」、「結合パートナー」、「受容体」または文法的に同様の用語でも呼ばれる）と試料中に存在する他のメンバ（「標的」、「分析物」または文法的に同様の用語でも呼ばれる）との特定の相互作用を利用できる。通常は、分析物には少なくとも１つのいわゆる「決定基」または「エピトープ」部位があり、これは分析物ごとに一意で相補的プローブ部位に対する結合親和性が高い。
【０１４１】
本発明で可能なアッセイタイプの性質はかなりまちまちである。たとえば、プローブ／標的結合対であれば、抗原と特定の抗体、抗原と特定の抗体断片、葉酸と葉酸塩結合タンパク質、ビタミンＢ１２と内因子、プロテインＡと抗体、プロテインＧと抗体、ポリヌクレオチドと相補的ポリヌクレオチド、ペプチド核酸と相補的ポリヌクレオチド、ホルモンとホルモン受容体、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチド結合タンパク質、ハプテンと抗ハプテン、レクチンと特定の炭水化物、酵素と酵素酵素／基質、酵素／阻害剤または；ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジン、そのハイブリッド、従来技術において周知の他のものの組み合わせのうちいずれからでも選択できるが、ここで対のいずれかのメンバがプローブ、他のメンバが分析物である。結合対はまた、マレイミドおよびハロアセチル誘導体を含むスルフヒドリル反応性基、イソチオシアナート、スクシンイミジルエステル、ハロゲン化スルホニルなどのアミン反応性基、カルボキシルおよびアミノ基などのカルボジイミド反応性基など、共有結合を形成するメンバをも含み得る。
【０１４２】
結合アッセイの具体例としては、抗体、抗原、酵素、免疫グロブリン（Ｆａｂ）断片、レクチンの他、細胞、ハプテン、全細胞、細胞断片、細胞器官、バクテリオファージ、ファージタンパク質、ウイルスタンパク質、ウイルス粒子などの表面に見られるさまざまなタンパク質をはじめとする自然界に存在する標的用のアッセイがあげられる。これには、アレルゲン、汚染物質、自然界に存在するホルモン、成長因子、自然界に存在する薬物、合成薬、オリゴヌクレオチド、アミノ酸、オリゴペプチド、化学的中間体なども含み得る。このようなアッセイの実用的な用途としては、たとえば、健康状態の監視、乱用薬物の検出、妊娠中および出産後の検査、移植時のドナーマッチング、治療用量の監視、癌抗原や病原体などの疾病の検出、バイオディフェンスセンサ、医療および非医療診断試験ならびに、従来技術において周知の同様の用途があげられる。
【０１４３】
タンパク質は、血液型判定、細胞集団の検出、病原体のスクリーニング、病原体、免疫複合体、レクチン、単糖および多糖、生理流体、空気、プロセス流、水などの試料中におけるアレルゲンおよびハプテンの存在に対する免疫反応のスクリーニングなど、多くの診断試験で関心の的である。同様に、核酸またはポリヌクレオチドをプローブとして利用することには、試料中の相補鎖の検出、遺伝子発現用のｍＲＮＡの検出、ゲノムおよびプロテオームマイクロアレイでの用途、ＰＣＲ産物の検出、ＤＮＡシーケンシング、臨床診断、メディカルスクリーニング、多形スクリーニング、法医学的スクリーニング、核酸に特異的に結合するタンパク質の検出、従来技術において周知の他の工程などで、多くの用途が考えられる。
【０１４４】
さまざまな特定のプロトコールを用いてアッセイを行うことが可能である。一般的なプロトコールの概略図を図１に示す。分析物の検出または定量にあたって、一般には試料１１３と微粒子１１０、１１１などを含む溶液とを組み合わせる。ここで、特定のアッセイでの必要に応じて、インキュベーション、洗浄、種々雑多な試薬の添加などのさまざまな別のステップを行うことができる。該当する分析物が存在し、相補的捕捉プローブを持つ微粒子が１つもしくはそれ以上ある場合は、その分析物は、微粒子１１４および１１５で示すように、これらの微粒子に結合することになる。逆に、図１によれば、特定の微粒子に対して相補的な分析物が存在しないときは、たとえば微粒子１１６のように、その粒子では結合は起こらない。
【０１４５】
本発明の一実施形態では、下記の「粒子識別方法およびシステム」というセクションで説明するように、アッセイでの粒子識別のみに共鳴光散乱を利用する。検出については、蛍光、化学発光、ナノ粒子タグならびに、従来技術において周知の他の手法を含むがこれに限定されるものではない従来の検出方法で行う。この実施形態では、結合対のメンバに標識を付加して検出を可能にすることができる。あるいは、微粒子に付着したプローブで標的分析物を捕捉するサンドイッチアッセイを利用してもよい。次に、標識が付加された第２の結合パートナーを利用して捕捉分析物と結合させる。
【０１４６】
別の実施形態では、下記の「粒子ベースの結合測定というセクションで説明するように、結合の検出のみに共鳴散乱を利用する。この実施形態では、粒子識別については、粒子を定位置に残したままにするか、チャンドラー（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）ら、米国特許第５，９８１，１８０号明細書に説明されているような蛍光色素またはチャンドラー（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）ら、米国特許第６，２６８，２２２号明細書に説明されているようなナノ粒子標識を微粒子に付着させて利用するなどの他の手段で行う。さらに、アッセイで１種類のプローブ微粒子しか使用しないのであれば、粒子の識別は必要ない。
【０１４７】
好ましい実施形態では、粒子識別と結合検出の両方を共鳴散乱を利用して行う。結合された分析物の検出と識別については、本開示の「粒子識別方法およびシステム」というセクションと「粒子ベースの結合測定」というセクションで詳細に説明する。これらの章でさらに例示するように、現状では、未結合のレポーター基からの干渉が生じる可能性があるため結合しなかった試料成分を微粒子から分離しなければならないのに対し、本発明では、このステップは任意である。
【０１４８】
本発明の粒子を用いたアッセイを、尿、腹膜液、脳髄液、滑液、細胞抽出液、胃液、糞便、血液、血清、プラズマ、リンパ液、間質液、羊膜液、組織ホモジネート、さらには潰瘍、水ぶくれ、膿瘍、唾液、涙、粘液、汗、乳、精子、膣分泌物からの流体、正常な組織、悪性組織および被疑組織の生検試料をはじめとする組織抽出物、従来技術において周知の他の流体など、分離された生物流体または未濾過の生物流体を含む多岐にわたる試料マトリクスで実施することができる。試料については、土壌、水または空気などの環境基原から、あるいは、廃棄物流、生産ライン、リアクター、発酵装置、細胞培地、消費財、食品から採取するなどの工業基原から得ることも可能である。手法については当業者間で周知のアッセイの細かい内容に応じて、使用前に被検試料を前処理しても構わない。
【０１４９】
粒子識別方法およびシステム
本発明によれば、共鳴光散乱スペクトルにおける高解像度の特徴は、微粒子集団の各メンバについての一意な識別パターンを得る上で有用である。散乱光スペクトルには、特定の波長で特定の幅と形状を持つ共鳴の形としての情報がある。従来技術において周知のように、共鳴特徴の位置、幅、相対強度はいずれも、粒子の粒度と屈折率によって変わる。通常は、共鳴特徴は相応に広い粒度と屈折率の範囲で認められる。しかしながら、本発明で有用な共鳴は一般に、これらの粒子特性の特定の範囲内で形成される。さらに、屈折率の異なる層および／または領域を芯粒子に加えると、大きさと屈折率の特定のパラメータ範囲内で、共鳴光の散乱パターンがさらに豊かなものになると考えられる。さらに、微粒子製造プロセスの如何を問わず、共鳴光の散乱パターンを定義するキーパラメータすなわち粒子の寸法と屈折率には、もともとばらつきがあるか、必要な場合は意図的にばらつきを生じている点は容易に理解できよう。このようなばらつきがあることで、微粒子の大きな集団を作り、その各々に粒子の識別子として利用可能な他とは異なる共鳴光の散乱パターンを持たせることができる。
【０１５０】
本発明による一般的な微粒子を図２に示す。同図には、半径ｒで屈折率ｎの均一な芯１００が示されている。また、図２には、外側の半径ｒ１・・・ｒｍおよび屈折率ｎ１・・・ｎｍの任意数ｍの層１０１．．１０３も示されている。層の数ｍは０でもよく、０よりも大きい場合は、一般に約５未満である。これに関して、「層」という用語には、屈折率のはっきりとした境界のある領域あるいは、はっきりとした境界なしで屈折率が可変の領域を含み得る。いずれの場合も、屈折率と層の寸法のばらつきがゆえに、共鳴光散乱スペクトルが豊かになり、これを利用して粒子の識別に役立てることができる。
【０１５１】
波長λの光が照射されると、粒子はその光の一部を強度Ｉ（λ）で検出器に向かって散乱させる。入射波長の走査時すなわち、入射波長を分析波長範囲で変化させると、波長の関数としての「散乱パターン」または「散乱スペクトル」が得られる。本発明による粒子から共鳴光散乱スペクトルを測定するには、測定のあいだ粒子を入れておく好適な検出セルが必要である。図３に、微粒子からの高解像度共鳴光散乱スペクトルの測定に役立つ光学セル０１４の一実施形態を示す。図４は、光学セル０１４、光検出器００８、微粒子からの高解像度共鳴光散乱スペクトルの測定に用いられる関連のサポート設備を含む関連の実験装置の一実施形態を示している。このような測定の詳細については実施例１に示し、そこにまとめておく。
【０１５２】
実施例１の微粒子は直径約４０マイクロメートルで、波長約７７５ナノメートルでの屈折率は約１．９である。従来技術において周知のように、共鳴波長で散乱する光は、粒子の内部で生じるものであり、散乱される前に必ず粒子の外側の光学領域を介して伝搬されることになる。このため、粒子の外側の光学領域（芯の火面より外側の部分）は該当する波長で実質的に透過性でなければならない。下記の説明では、図３および図４を参照する。Ｄｅｌｒｉｎ（登録商標）およびテフロン（登録商標）ＡＦ  ２４００で構成された光学セル０１４の水性懸濁液中に微粒子を保持する。テフロン（登録商標）ＡＦ  ２４００は、屈折率が水の屈折率に極めて近く、水とセルのウィンドウとの界面での反射や屈折による光学バックグラウンドとこれに伴うノイズを低減できるため、好ましい材料のひとつである。テフロン（登録商標）ＡＦ  １０００はテフロン（登録商標）ＡＦ  ２４００よりも屈折率が水に近く、別の好ましい材料である。さらに別の好ましい材料として、一般にフォトレジスト材料で利用されているフルオロアクリレートがあるが、その屈折率は該当する波長で約１．３８である。当業者であれば、入射光によって粒子を効率よく照射し、散乱光を最低限に抑え、セルの寸法が本発明の意図した用途に合うような設計と材料である限り、他の光学セル構成も可能であることは理解できよう。
【０１５３】
中央に１本の励起用ファイバ００４と、これを六角形のパターンで囲む６本の検出用ファイバ００７とを含んでなるマルチファイバ光プローブ００５が粒子の上にあり、その一端は水層の中まで延在している。励起用ファイバは、走査用ダイオードレーザ００６の出力に接続されている。チューナブル色素レーザならびに、ガスディスチャージランプ、発光ダイオード、白熱ランプなどの多色光源といった別の入射光源を利用してもよいことは、当業者であれば理解できよう。波長選択性の高い入射光を生成するには、所望のスペクトル解像度を達成するために、通常は多色光源に非分散型要素（固定波長帯域通過フィルタ、チューナブル波長帯域通過フィルタ、ホログラフフィルタなど）または分散型要素（モノクロメータ、プリズム、格子など）などの波長選択手段を１つもしくはそれ以上連結する必要がある。
【０１５４】
レンズ、鏡、プリズム、ファイバオプティック装置、ビーム拡大器、他の従来技術において周知の手段などの異なる光カップリング手段で、光を光学系にカップリングしてもよい。
【０１５５】
散乱光の検出については、さまざまな方法で行い得る。実施例に示されるように、微粒子からの散乱光を検出するための好ましい実施形態のひとつに、入射波長を走査して、波長選択性ではないすなわち、波長の異なる光を区別するのには適さない検出器または画像形成装置で光を検出する方法がある。また、原理的には、粒子に多色光を当て、非分散型要素（固定波長帯域通過フィルタ、チューナブル波長帯域通過フィルタ、ホログラフフィルタ、カラーデジタルカメラなどの波長選択性画像形成装置など）または分散型要素（モノクロメータ、プリズム、格子など）などの波長選択性検出手段で散乱光を検出可能であることは、当業者であれば理解できよう。
【０１５６】
レーザを波長で走査すると、その光の一部が粒子と相互作用して散乱する。粒子と相互作用しない光はセルの下にあるウィンドウ０１５を通って外に出る。粒子からあらゆる方向に散乱する光もあるが、好ましい一方向は入射光線からみて１８０度前後であり、これはときとして「後方散乱」光と呼ばれることもある。後方散乱光は６本の検出用ファイバ００７に入り、一緒にされてシリコン光検出器、光電子倍増管などの好適な光検出手段に送られる。この例ではダイオードレーザ００６内に設けられたチョッパーが入射光を変調する。続いて、検出器出力からの電気信号が、変調シグナルと一緒にロックイン増幅器００９に送られる。ロックイン増幅器の出力と、入射波長に比例する「ランプ」シグナルとが、パーソナルコンピュータ０１０の中に示したデータ捕捉ボードに送られる。レーザ走査と散乱光スペクトルの取得および表示はソフトウェアによって制御する。共鳴ピーク位置は検出角依存ではないため、ピーク位置を利用して散乱パターンを定義することは、他の検出ジオミトリにおいても同じように有効である点に注意されたい。
【０１５７】
本発明を説明するにあたり、特定の粒子のスペクトルを、このスペクトルにおける共鳴特徴の位置と幅で特徴付けると有用である。これらの特徴は、分析および特徴付けが可能なスペクトルパターンを含んでなる。スペクトルについては、ピークの検出、畳み込み、ピークフィット、パターン認識ならびに従来技術において周知の他の方法などの多数の方法で分析でき、これらの方法を自動化・コンピュータ化することができる。
【０１５８】
本発明による粒子識別の背景原理を示すには、たとえば図５に示すような単一ロットの微粒子で得た同様の粒子からなる群の散乱スペクトルを考えるとよい。上述したように、それぞれのロット内で、大きさと屈折率にはもともとのばらつきがあり、これを有利に利用して本発明による一意な散乱光スペクトルを得ることができる。ここで、同一ロットから得た６個の粒子（無作為選択）では、一意に区別できる散乱光スペクトルが得られ、これらのスペクトルに基づいて簡単に粒子を識別できることは、容易に判断できる。当業者であれば、自動スペクトル分析法（スペクトルコーディング、パターン認識、フィルタリングなど）を散乱光スペクトルに適用し、ピーク位置、ピーク幅、ピーク次数、次数の異なるピーク間の間隔を含むがこれに限定されるものではないスペクトルの特徴や、粒子集団のそれぞれの粒子ごとに一意な識別「タグ」または「キー」の生成に有用な偏光依存性スペクトルの特性を抽出できることも理解できよう。
【０１５９】
未処理の市販微粒子を一定の目的で修飾すれば、散乱光スペクトルの組み合わせの多様性と豊富さをさらに増やせる点に注意されたい。たとえば、散乱共鳴特徴を増やすまたは変化させることで、識別コードの組み合わせを増やせる可能性を各々が持つ別の層１０１・・・１０３を利用することができる。同様に、屈折率、厚さまたはその両方についての、自然に存在するばらつき、あるいは目的をもって作り出したばらつきによって、散乱スペクトルの有用なばらつきが得られる。これらのばらつきによって、直径だけのばらつきの場合のようなスペクトルパターンのシフトではなく、完全に異なるスペクトルパターンが生成される点に注意されたい。共鳴光散乱スペクトルの豊富さを高める目的で層を加えるという概念を実施例１４〜１９に示す。
【０１６０】
本発明による微粒子の識別に役立つものとするには、芯と層の寸法と屈折率が、光散乱の基本的ミー理論によって得られる限界値内になければならない。端的に言えば、事実上あらゆる大きさと屈折率の粒子がある程度は光と相互作用するが、特定の波長範囲だけについて言えば、これらのパラメータの特定の組み合わせで本発明による識別に役立つスペクトルが得られる。また、該当するアッセイのほとんどが水性媒質中で行われことになるため、分析用の波長は水による光の吸収が原因で生じる干渉が最小限になるように選択しなければならない。さらに、選択する波長は、アークランプ、レーザまたはダイオードレーザなどの入手可能な光源で得られるようなものとする。
【０１６１】
本願発明者らは、コンピュータモデルの利用と以後の実験室での測定をとおして、いくつかの重要なパラメータについての有用な範囲を求めた。以下では、（１）光共鳴特徴を増やすか特徴を変化させる層すなわち、その波長位置が互いに位置的に変化するもの（いわゆる「光学的に活性な」層）と、（２）芯の完全性を保存するか、捕捉プローブの付着または非特異的結合の抑制のために化学的または生物学的に好適な担体として機能するだけの層（「化学的に活性な」層または「生物学的に活性な」層）とを区別する。また、ひとつの層が両方の機能を果たすことも可能であるが、この場合は「光学的に活性である」と同時に好適な化学的または生物学的担体になる。光学的に活性な層の代表的ではあるが限定するものではない一例に、厚さ約５０から２０，０００ナノメートル（２０マイクロメートル）の層がある。
【０１６２】
したがって、識別可能な微粒子の好ましい一実施形態は、直径約１００マイクロメートル以下、好ましくは約７５マイクロメートル以下、一層好ましくは約５０マイクロメートル以下であり、波長約６００から１６５０ナノメートルで屈折率が約１．４５から約２．１、好ましくは約１．６から２．１である、実質的に球形の透明ガラス芯を含んでなる。
【０１６３】
識別可能な微粒子の別の好ましい実施形態は、（１）直径約１００マイクロメートル以下、好ましくは約７５マイクロメートル以下、一層好ましくは約５０マイクロメートル以下であり、波長約６００から１６５０ナノメートルで屈折率が約１．４５から約２．１、好ましくは約１．６から２．１である実質的に球形かつ実質的に透明なガラス芯と、（２）別の共鳴光散乱特徴をサポートまたは既存の特徴を変化させることのできる実質的に透明かつ光学的に活性な層を１層とを含んでなる。
【０１６４】
識別可能な微粒子のさらに別の好ましい実施形態は、（１）直径約１００マイクロメートル以下、好ましくは約７５マイクロメートル以下、一層好ましくは約５０マイクロメートル以下であり、波長約６００から１６５０ナノメートルで屈折率が約１．４５から約２．１、好ましくは約１．６から２．１である実質的に球形かつ実質的に透明なガラス芯と、（２）別の共鳴光散乱特徴をサポートするか既存の特徴を変化させることの一方または両方が可能な実質的に透明かつ光学的に活性な層を１層と、（３）上記の「捕捉プローブと粒子ライブラリ」というセクションで説明した手順に役立つ、厚さ約１ナノメートルから１０マイクロメートルである化学的または生物学的に活性で実質的に透明な層を１層もしくはそれ以上と、を含んでなる。
【０１６５】
識別可能な微粒子のさらに別の好ましい実施形態は、（１）直径約１００マイクロメートル以下、好ましくは約７５マイクロメートル以下、一層好ましくは約５０マイクロメートル以下であり、波長約６００から１６５０ナノメートルで屈折率が約１．４５から約２．１、好ましくは約１．６から２．１である実質的に球形かつ実質的に透明なガラス芯と、（２）各々が別の共鳴光散乱特徴をサポートするか既存の特徴を変化させることの一方または両方が可能な実質的に透明かつ光学的に活性な層を２層もしくはそれ以上と、（３）上記の「捕捉プローブと粒子ライブラリ」というセクションで説明した手順に役立つ、厚さ約１ナノメートルから１０マイクロメートルである化学的または生物学的に活性かつ実質的に透明な層を１層もしくはそれ以上と、を含んでなる。
【０１６６】
本発明の別の好ましい実施形態は、識別可能な微粒子の集団または多様性であり、このような集団は、生物学的または化学的アッセイなどの多数の用途において有用である。具体的な用途に合わせて選択される微粒子のタイプ（すなわち、芯と層の数ならびに組成）は、試料の性質とスクリーニングまたは検出の対象となる分析物数に左右されることになる。候補薬物を求めるための高スループットのスクリーニングまたは疾病バイオマーカーのスクリーニングなどの多くの用途では、本発明による識別可能な微粒子の集団の有用性は、その集団に含まれる一意な微粒子の数に直結する。通常、この数が多くなればなるほど好ましい。上記の実施形態では、芯の半径、層厚およびそれぞれの屈折率を同じ集団内で変え、粒子識別子として利用する極めて豊富な散乱パターンの組を得ることができるため、微粒子の集団の識別に利用できる散乱パターンの考え得る組み合わせ数を極めて大きくすることが可能である（約１０６を上回る数を容易に実現できる）。バイオマーカーのスクリーニングまたは特定の疾病診断などの他の用途では、これよりも少ない数の一意な微粒子があれば十分であろう。
【０１６７】
上述し、かつ図２および図３に示した検出システムおよび方法は、一度に１個の粒子で高解像度散乱光スペクトルを測定するのに適している。この装置は、本発明の原理を示す上で効果的なものではあるが、単一の粒子を光プローブと整列させる必要があり、通常はこれは手作業で行われるため幾分時間を要する。
【０１６８】
単一粒子検出手段に対する改善策のひとつに、担体に設けたチューブや一連のチャネル、くぼみ、溝などの中に粒子を制限して、直線または矩形のアレイにすることがあげられる。このようにした後で、レーザ光線を粒子から粒子へすみやかに動かすか、あるいは粒子を保持している担体を動かすことで、既知の順番で粒子を走査することができる。この場合、最初に粒子のアイデンティティとそのプローブとをスペクトル散乱パターンによって（または他の何らかの手段によって）確立した後、チューブ、溝、くぼみまたはチャネルに既知の順序で粒子を仕込む。実施例では、粒子の取扱をピペットを用いた手作業で行う。自動または半自動のマイクロフルイディクスデバイスを利用したり、ポンプ、注射器、制御弁などの流体制御装置を併用するなど、他の粒子ハンドリング手段が適していることもある点は、当業者であれば理解できよう。粒子を適所においたら、以後はそれらの粒子のアイデンティティをチャネル内の相対的な位置によって維持し、場合により散乱パターンで確認する。同様に、アッセイ時に微粒子を静置しておく、二次元ではあるがそれ以外は何ら構造化していない形では、粒子のアイデンティティをそれぞれの相対位置によって維持する。
【０１６９】
さらに効率的な検出手段のひとつに、共鳴光散乱画像形成を利用したものがある。この方法では、複数の粒子のある視野から、カメラなどの画像形成手段によって共鳴光散乱スペクトルを同時に検出する。このカメラは、入射波長の走査のたびに粒子を繰り返し画像化し、一般に走査時の波長ステップ１回ごとに１枚の画像を取得する。それぞれの画像には、特定の波長での画像内にある各粒子からの散乱強度情報が含まれる。このようにして得られた画像全部の組を適宜処理すれば、それぞれの粒子からの散乱光スペクトルを導出できる。このカメラは、当該用途に必要な速度および感受性が可能なものであれば、どのような画像形成装置であってもよい。カメラは、好ましくはデジタルカメラであり、一層好ましくは二次元ＣＣＤ（電荷結合素子）またはこれと等価な画像形成手段を利用したものである。好ましくは、カメラの機能とデータの取得を、カメラおよび走査光源に作動的に接続されたコンピュータで制御する。前記コンピュータは、これらの目的に適したソフトウェアを有する。さらに、このコンピュータは、データ分析手段、すなわち、ピークの検出、畳み込み、ピークフィット、パターン認識、従来技術において周知の他の方法を含むさまざまな方法を、粒子の識別、結合の検出、分析物または分析物群の識別に利用するソフトウェアを含み得る。代表的な実験用セットアップを図６および図７に概略で示す。図６は、本発明によるスペクトル画像形成に役立つ画像形成光学セル０１９を示している。図７は、測定を行う上で必要な関連の構成要素を示している。方法およびシステムの詳細については実施例２に示し、そこでまとめておく。微粒子の集団を画像形成光学セル０１９で単離して、走査用ダイオードレーザ０２２を光源として利用して顕微鏡０２１で画像化する。粒子については、ランダムに分布させることもできるし、チューブに入れたり、担体に設けた溝、チャネルまたはくぼみの中に制限して、直線または矩形のアレイにするなどの形で、順に分布させておいても構わない。該当する粒子を同時に画像化できるように倍率を設定する。視野内の粒子からの後方散乱光を回収し、デジタルカメラ０２６の平面上の対物レンズ０２０ならびに関連の光学系で画像化する。レーザ波長の走査時、各波長ステップでデジタル画像が取得され、保存される。このため、完全な波長走査によって、インターバル１回につき１枚ですべての粒子の一連のデジタル画像が得られる。特定波長の粒子からの散乱の強度が、その粒子のその波長での散乱画像の輝度に関連している。よって、適切なコンピュータ画像処理とスペクトル分析を利用すれば、すべての粒子の完全な散乱スペクトルを、走査時に得られた一組の画像から抽出することができる。このような一組の画像から抜き出した代表的な画像１枚の例を図８に示す。該当する光（散乱光）１０６は、粒子の縁に沿った光の輪または区切られた輪から発生している（この作用についての説明すなわち、リンチ（Ｌｙｎｃｈ），Ｄ．Ｋ．およびリビングストン（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ），Ｗ．、Ｃｏｌｏｒ  ａｎｄ  Ｌｉｇｈｔ  ｉｎ  Ｎａｔｕｒｅ、ケンブリッジ大学出版（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）（２００１）などを参照のことが明らかである。実施例２で利用する入射光線と散乱光線は独立に偏光され、その２本の偏光軸は互いに平行である。これにより、図８の中央の画像にそれぞれ数字１２、３、６、９で示すように、円の１２：００、３：００、６：００、９：００の位置を中心とした散乱光のセクターが得られる。「１２」と「６」の領域からの散乱光スペクトルが等しく「３」と「９」の領域からの散乱光スペクトルが等しいことが、理論で予測され、結果で確認されている。さらに、２対のセクターのスペクトルは互いに異なっている。これにより、単一のスペクトルではなく、２つの実質的に独立したスペクトルの組み合わせで粒子を識別する機能が得られ、識別可能な粒子の多様性が増し、識別の精度も高くなる。
【０１７０】
たとえば画素１０１の部分集合からの画像の強度を測定し、その波長シリーズで同じことを各画像１０２・・・１０５について繰り返して、上記の輪からの光を画像処理法で測定する（図９参照）。画素の部分集合については、平均強度閾値、シグナル／ノイズまたは他のスペクトル特性閾値、幾何学的特徴、中心を基準にした半径方向位置または方位位置、デジタルフィルタリングなどを含む多種多様な手段で選択できる。画像の強度についても、従来技術において周知のように、画素平均化、画素の部分集合から最大値を取る方法、シグナル／ノイズ比などの統計的規準による加重平均などを含む多種多様な手段で算出できる。複数の粒子のうちの１つについて、実施例２で説明するような特定の選択規則を適用して得られたこのような散乱光スペクトル１５０の例を、図９に示す。この実施例を拡張すれば、微粒子の大きな集団から迅速かつ効率的に散乱スペクトルを測定できよう。これは、薬物の送達、高スループットのバイオメディカルスクリーニング、ゲノムマッピングなどを含む用途で、生物学的または化学的アッセイにおいて文献に報告のある方法に比して特に都合がよい。
【０１７１】
分析物の有用な検出を行うためには、粒子と試薬および分析物とを効果的に接触させるのに適した手段が必要とされる。実験のあいだをとおして、どのような順序と回数で粒子と試薬および分析物とを接触させてもよい形が好ましい。このため、検出セルには、試薬と分析物をセルに送るための少なくとも１つのポート、好ましくは２つもしくはそれ以上のポートと、試薬または分析物と流量の選択を可能にする好適なフロー制御要素が必要である。この用途の実施例では、ピペットを使って手作業で検出セルに粒子を導入し、可撓性の管材でセルに接続された蠕動ポンプまたはシリンジポンプによって試薬と分析物を２つのポート（「流入口」および「流出口」）経由で検出セルに送達する。ポンプと関連のフロー制御弁、チェック弁、流量測定装置などを手で操作するか、あるいはコンピュータ制御して自動操作することができる。得られるシステムにおいて粒子と試薬および分析物とを好適な形で接触させることができるのであれば、ポート、ポンプ、管材、フロー制御要素に対して考え得るさまざまな配置構成を使用できることは、当業者であれば分かるであろう。
【０１７２】
したがって、本発明による微粒子を識別するシステムの好ましい実施形態は、（１）走査用ダイオードレーザ光源と、（２）分光散乱光画像形成および迷光除去に適した光学セルと、（３）微粒子と分析物および試薬とを接触させるための手段と、（４）該当する粒子の集団を含む視野の画像形成に適した光学成分を有する顕微鏡と、（５）デジタルカメラおよびモニタと、（６）デジタル画像取得ハードウェアと、（７）必要に応じて構成要素と作動的に接続されたコンピュータと、（８）構成要素を制御し、データを捕捉し、このデータを処理するのに適したソフトウェアと、を含む画像形成システムを含んでなる。
【０１７３】
微粒子を識別する方法の好ましい実施形態は、（１）微粒子の集団を視野内におき、顕微鏡の焦点をその粒子に合わせ、（２）データ捕捉ソフトウェアを初期化し、（３）開始波長から終了波長までダイオードレーザを走査すると同時に、（４）走査時の各波長ステップごとに視野内のすべての粒子から散乱光を表すデジタル画像を捕捉し、（５）それぞれの粒子について散乱光スペクトルが生成されるように、上記デジタル画像を処理し、（６）スペクトル処理法を適用し、それぞれの粒子について一意な識別用マーカーまたはコードを生成することをさらに含んでなる。
【０１７４】
分析物を識別するための方法
アイデンティティが分かっている捕捉プローブへの結合の検出に基づいて、分析物のアイデンティティを判定できる。試料中に分析物が存在しないことも同じ方法で判定できる。共鳴光散乱の測定を利用した分析物の識別では、さまざまな方法が可能である。
【０１７５】
好ましい一実施形態において、１つもしくはそれ以上の既知の捕捉プローブを粒子に被着した後、第１の分析波長範囲で粒子を走査して第１の基準共鳴光散乱信号を生成し、これを利用してそれぞれの粒子を識別するとともに、捕捉プローブのアイデンティティを識別された粒子と相関させる。何回か走査を繰り返すことで、同じ粒子について多数の第１の基準共鳴光散乱信号を得られる。たとえば、プローブ結合微粒子の製造時に第１の基準共鳴光散乱信号１つを取得し、粒子をアッセイに利用する直前に第２の第１の基準共鳴光散乱信号を得ることができる。第１の基準共鳴光散乱信号のうちのいずれかを利用すれば、微粒子とこれに付着したプローブを識別できる。しかしながら、最も後から得られた第１の基準共鳴光散乱信号を基準信号として利用し、結合を検出すると好ましい。あるいは、第１の分析波長範囲で粒子を走査して、それぞれの粒子について識別用共鳴光散乱信号を生成した上で捕捉プローブを被着する。次に、１つもしくはそれ以上の既知のプローブを粒子に被着する。プローブのアイデンティティを、当該プローブが被着された粒子の識別用共鳴光散乱信号と相関させる。いずれの場合も、粒子と分析物を少なくとも１種含有する可能性のある試料とを接触させ、分析物が存在する場合、捕捉プローブと分析物との間で結合が生じる。第２の分析波長範囲で粒子を走査して第２の結合共鳴光散乱信号を生成する。結合の検出に利用する第２の分析波長範囲は、粒子の識別に利用する第１の分析波長範囲と同一であっても異なっていてもよい。たとえば、特定のピークまたは他のスペクトルの特徴に対応する、第１の分析波長範囲の一部のみを第２の分析範囲として利用して結合を検出しても構わない。粒子を連続して走査すれば、一連の第２の結合共鳴光散乱信号が生成され、結合をリアルタイムでフォローすることができる。結合の検出は、第２の結合共鳴光散乱信号のうちのいずれかと第１の基準共鳴光散乱信号のうちのいずれか、好ましくは最も後で得られたものとを比較するか、第２の結合共鳴光散乱信号のうちのいずれかを同じシリーズで前の第２の結合共鳴光散乱信号と比較して行われる。分析物が試料中に存在しない場合は、比較の対象となった２つの共鳴信号の間には、実験誤差の範囲でしか違いはない。続いて、上述したようにして求められた粒子のアイデンティティとの相関と、少なくとも１つの第２の結合共鳴光散乱信号とに基づいて、結合された各分析物のアイデンティティを判定することができる。必要であれば、比較の対象となった２つの共鳴光散乱信号の差、具体的には、結合時に観察された散乱パターンのシフトの度合いを比較することで、結合された分析物の量（適切な条件下で試料中の分析物の量に直結する）を判定することもできる。こうして、従来技術において周知のように、周知の標準を用いて作製した較正曲線から試料中の分析物の量を判定することができる。
【０１７６】
別の好ましい実施形態では、少なくとも１つの捕捉プローブを粒子に被着し、これをチューブ内あるいは、担体に形成された一連のチャネル、くぼみまたは溝内などの定義された空間配列に加える（ここで、それぞれの粒子に定義されたローカスがある）。この場合、加えられた粒子のローカスによって、粒子とこれに付着したプローブのアイデンティティを判定する。次に、粒子を場合により分析波長範囲で１回もしくはそれ以上走査し、上述したような少なくとも１つの基準共鳴光散乱信号を生成する。粒子と分析物を少なくとも１種含有する可能性のある試料とを接触させ、粒子を分析波長範囲で１回もしくはそれ以上走査して、それぞれの粒子について少なくとも１つの第２の結合共鳴光散乱信号を得る。結合については上述したようにして検出する。加えられた粒子のローカスに基づいて、結合した分析物それぞれが識別される。試料中に存在する分析物の量については、上述のように、比較の対象とした２つの共鳴光散乱信号の差を比較して判定できる。
【０１７７】
別の好ましい実施形態では、少なくとも１つの捕捉プローブを粒子に被着し、この粒子を分析波長範囲で走査して、上述のようにそれぞれの粒子について少なくとも１つの第１の基準共鳴光散乱信号を得る。捕捉プローブを上述のように識別された各粒子と相関させる。これらの粒子と分析物を少なくとも１種含有する可能性のある試料とを接触させるが、この分析物は、蛍光部分、化学発光部分、粒子、酵素、放射活性タグ、量子ドット、発光部分、吸光部分、インターカレート色素などの検出可能な標識を含んでなる。上述した相関に基づいて、従来技術において周知の方法でそれぞれの分析物と分析物の検出可能な標識が識別される。
【０１７８】
粒子ベースの結合または解離測定
先に開示したように、本発明の目的は、改良された粒子、生物学的および化学的アッセイにおけるプローブと標的との間の結合を検出する方法およびシステムを提供することにある。これについて、粒子ベースのアッセイに関する現状の方法に対する本発明の改良点には、基本として、共鳴散乱パターンが粒子の表面またはその近辺での屈折率の変化に影響されやすいという現象が含まれる。従来技術において周知（たとえば、ハイタワー（Ｈｉｇｈｔｏｗｅｒ），Ｒ．Ｌ．およびリチャードソン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ），Ｃ．Ｂ．、「Ｒｅｓｏｎａｎｔ  Ｍｉｅ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ａ  ｌａｙｅｒｅｄ  ｓｐｈｅｒｅ」、Ａｐｐｌ．  Ｏｐｔｉｃｓ  ２７、４８５０〜４８５５（１９８８）ならびに上記文献における参考文献を参照のこと）のように、微粒子表面での屈折率が変わると、共鳴が起こる条件（特に波長）も変わり、共鳴の形状および強度も変わる可能性がある（これらは測定可能な現象である）。水性懸濁液中での微粒子表面への標的分析物の結合は、水の分子が通常は水とは屈折率の異なる化学種で置き換わる際に観察できる。結合分子または構造は通常、水よりも屈折率が大きい。本願発明者らが開発した理論モデルでは、直径約４０マイクロメートルの代表的な微粒子についてみると、タンパク質または核酸層の結合によって、基準または未結合の状態に対する波長で散乱光パターン全体がシフトし、このシフトの量は厚さ約５０ナノメートルまでは結合層の厚さに比例することが分かる。上述したように、厚めの層すなわち約１０マイクロメートルまでの層は利用できるが、厚さが約５０ナノメートルを超える層だと元の共鳴が変化し、場合によってはシフトだけでなく別の光散乱共鳴が生じる。この現象では、レポーター基を用いる必要はなく、既存の粒子ベースのアッセイ技術に対する実質的な改善になる点に注意されたい。また、結合時に発生し得る粒子表面付近での他の変化、たとえば、プローブまたは標的のコンホメーションの変化などがあると、化学的または物理的な群が相対的に移動し、表面付近で質量分布に変化が起こるため、シフトが生じる可能性がある点に注意されたい。従来技術において周知のように、散乱光スペクトルはエバネッセント光波と表面付近での質量分布との相互作用に影響されるため、質量分布に変化が生じるとスペクトルも変化する可能性がある。標的部分結合時のエバネッセント光波に対する正味質量分布の変化は、プローブ、標的、表面電荷、イオン環境および他の要因の具体的な性質によって、粒子表面から離れる方向または粒子表面に近付く方向のいずれかになり得る。このため、得られる共鳴光散乱スペクトルのシフトは、実施するアッセイ次第で「正」（波長の長い方に向かう）か「負」（波長の短い方に向かう）のいずれかになる。
【０１７９】
通常、共鳴光散乱法によって分析物の結合を判定する場合、上述のように粒子を分析物に曝露する前に１回（基線の確立）と粒子を分析物に曝露した後の２回の測定を行う。結合の判定については２つの信号を比較して行うため、一般に「差次的な」測定である。具体的には、捕捉プローブへの分析物の結合を検出するには、少なくとも１つの捕捉プローブを本発明の粒子に被着する。これらの粒子を場合により分析波長範囲で１回もしくはそれ以上走査し、上述のようにそれぞれの粒子について少なくとも１つの第１の基準共鳴散乱信号を生成する。続いて、これらの粒子と分析物を含有する可能性のある試料とを接触させる。さらに、粒子を１回もしくはそれ以上走査して、それぞれの粒子について少なくとも１つの第２の結合共鳴光散乱信号を生成する。分析物の結合の検出については、第２の結合共鳴光散乱信号のうちのいずれかと第１の基準共鳴光散乱信号のうちのいずれか、好ましくは最も後で得られたものとを比較するか、あるいは第２の結合共鳴光散乱信号のうちのいずれかを同じシリーズの前の第２の結合共鳴光散乱信号と比較して行う。試料中の分析物の量は上述のように判定できる。
【０１８０】
また、同様の差次的測定で捕捉プローブからの分析物の解離を検出することも可能である。解離を検出するには、プローブ結合微粒子と少なくとも１種の分析物とを接触させ、分析物がプローブに結合できるようにした後、粒子を分析波長範囲で１回もしくはそれ以上走査して、それぞれの粒子について少なくとも１つの第１の基準共鳴光散乱信号を得る。続いて、従来技術において周知の何らかの手段で分析物を粒子の捕捉プローブから解離させる。分析物をプローブから解離させるのにどの手段を用いるかは、分析物と捕捉プローブの性質によって決まる。たとえば、核酸またはペプチド核酸結合対であれば、温度を上げて二本鎖を溶融させるか、塩基での処理によって解離できるであろう。抗体−抗原結合対であれば、酸または塩基あるいは、尿素、グアニジン塩酸塩またはチオシアン酸ナトリウムなどのカオトロピック剤での処理によって、分析物を解離できよう。解離後、粒子を分析波長範囲で１回もしくはそれ以上走査して、それぞれの粒子について少なくとも１つの第２の解離共鳴光散乱信号を生成する。解離については、第２の結合共鳴光散乱信号のいずれかと第１の基準共鳴光散乱信号のいずれかと比較するか、あるいは第２の結合共鳴光散乱信号のうちのいずれかを同じシリーズの前の第２の結合共鳴光散乱信号と比較することで検出される。
【０１８１】
理想的には、発生するシフトはいずれも標的分析物分子の結合または解離によるものである。本発明で利用する光学作用は、微粒子の環境（温度、イオン強度、媒質の屈折率など）におけるばらつきの影響を受けやすいことがあるため、これらのパラメータの望ましくないばらつきは、それが散乱光パターンを変化させる一因となり得る場合に、「ノイズ」となる。したがって、本発明においては、このような作用を参照して相殺し、分析物による実際の結合によるシフトだけを「シグナル」として残す手段を提供するとよい。これは、たとえば、いくつかの粒子を基準粒子として利用し、これにはプローブを付着させず、必要に応じて非特異的結合を最小限に抑えるように処理しておくことで達成できる。これらの基準粒子で測定されるシフトは、主に環境の変化によって生じるものであり、捕捉プローブを含む粒子から測定されるシフトの相殺に利用できる。
【０１８２】
さらに、共鳴光散乱スペクトルのシフトを測定する場合、取得した散乱スペクトルの波長成分が高い精度で分かることが絶対的に必要である。レーザ走査の起動とコンピュータによるデータ取得の開始との間のタイミングの不確かさが原因で、実際のシフトは起こっていないときにデータに見かけのスペクトルシフトが生じる可能性がある。したがって、スペクトルデータを補正し、偽りの「タイミング」シフトを除去しなければならない。どれだけ大きな波長補正が必要であるか判断するには、波長登録用に特徴が既知でなおかつ安定している基準スペクトルを記録する必要がある。波長補正／登録を十分な精度で行うには、基準スペクトルにおけるスペクトルの特徴がかなりはっきりとしていることがさらに重要である。この補正を、詳細については以下の実施例３で説明するように、エタロン（分光法で半分が銀色で互いに平行な２枚のガラスまたは石英板間の複数の反射によって生じる干渉作用による波長の測定に利用される装置）を利用して行い、極めて正確にアライメントできる波長基準シグナルを生成することができる。
【０１８３】
図１０〜図１６に、本発明によるエタロン補正を利用した、直径４０マイクロメートルの微粒子でのタンパク質層の検出を示す。詳細については実施例３〜６にあげておく。
【０１８４】
本発明の有意な利点のひとつに、粒子ベースのアッセイで結合関連のレポーター基を排除できる可能性がある点があげられる。非標識結合法のなかには、固定アレイ用に開発されたものもあれば、固定表面用のものもある（たとえば、ラルソン（Ｌａｒｓｓｏｎ），Ａ．およびペルソン（Ｐｅｒｓｓｏｎ），Ｂ．、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ」、米国特許第６，２０７，３８１号明細書、リオン（Ｌｙｏｎ），Ｌ．Ａ．ら、「Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｐｐａｒａｔｕｓ」、Ｒｅｖ．  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ７０、２０７６〜２０８１（１９９９）、ティール（Ｔｈｉｅｌ），Ａ．Ｊ．ら、「Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ  ｏｎ  ｇｏｌｄ  ｓｕｒｆａｃｅｓ」、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ６９、４９４８〜４９５６（１９９７）による平面状のバイオセンサで表面プラズモン共鳴を利用）。しかしながら、このような標識を利用しない方法は粒子ベースのアッセイでは存在しない。粒子ベースのアッセイ、フルオロフォア、クロモフォア、ナノ粒子または他のレポーター基に関する文献に記載の方法は、標的に結合させるか、あるいは何らかの形で結合イベントに関連しているかのいずれかである。よって、代表的な測定対象のひとつは、標的と会合することで粒子に結合するレポーターの量になる。測定を行う前に、余分な未結合レポーターを洗い流し、バックグラウンドの高い測定値を排除しなければならない。これには時間がかかり、動的な測定の機会が損なわれる。というのは、基本的に端点だけが検出されるためである。
【０１８５】
本発明では、結合材料だけを散乱光スペクトルにおける波長シフトによって検出するため、いずれにしても未結合標的の存在が測定の邪魔になることはない。本発明にはレポーター基は必要ないが、標的と会合する種を利用して、結合時の粒子表面付近での屈折率の摂動を増やしてアッセイの感受性を高めることはできる。このようなシグナル増幅手段は、好ましくは二酸化チタンまたはシリカのナノ粒子などの分析物に付着する小さな誘電性粒子である。この粒子は、プローブと標的との間の結合に干渉しない程度に小さくなければならず、また散乱光共鳴の検出にも干渉しない程度に小さくなければならない。一般に、このような粒子は大きさが数ナノメートルから数十ナノメートルのものである。
【０１８６】
シグナルを増幅する別のやり方に、酵素反応、抗体／抗原反応あるいは、ローリングサイクル型増幅などのインサイチュ核酸増幅法といった化学反応を利用するやり方がある。このような方法では特に、特定の標的の結合が生じるときにだけ粒子表面に質量が加わる。シグナル増幅種を利用するか否かを問わず、文献に記載の方法で必要な洗浄ステップが任意になり、最も重要なこととして、結合測定を実験の間に依然としてリアルタイムにできる点がある。本発明のこの特徴があることで、完全に新しいクラスの粒子ベースのアッセイ測定、すなわち、それぞれ表面に既知の捕捉プローブのある識別可能な微粒子の大きな集団で時間依存性結合の迅速かつ大規模な並列判定が可能になる。薬物標的のスクリーニング、プロテオミクス、遺伝子またはタンパク質の発現分析といった多岐にわたるエリアでこの技術を応用する大きな機会を、当業者であれば理解できよう。
【０１８７】
これとは別の本発明の利点に、粒子のアイデンティティの判定と分析物の結合度の判定の両方に統合された検出方法およびシステムを利用できることがある。粒子のアイデンティティはスペクトルの特徴の相対的なパターンで含まれ、その特徴の絶対的な位置で含まれるわけではない点に注意されたい。標的が結合すると、相対的なパターン（すなわち粒子のアイデンティティ）が保存され、パターンのシフトは分析物結合の度合いを示すことになる。統合された検出方法を用いることで、現在の方法と比較して全体としてのシステムが単純になり、試薬数が減り、ハードウェアも少なくなり、プロトコールが簡単になることから、現在よりも高速で低コストかつ自動化しやすいシステムが得られる。
【０１８８】
特定の分析物の存在および場合により濃度を求める最終ステップは、特定のプローブまたは捕捉プローブと散乱スペクトルがシフトした微粒子との関連付けである。上述したように、本発明の好ましい実施形態では、この関連付けを、共鳴光散乱スペクトルの特徴のパターンに反映される微粒子の一意なアイデンティティによって提供できる。この方法によれば、特定の標的が結合しているだけでなく、定義された条件下での結合動態をも含む複合試料の結合特性を、１回の実験で判定することが可能である。あるいは、以下の実施例で示すように、特定の分析物の存在および場合により濃度については共鳴光散乱で判定するが、プローブおよび分析物のアイデンティティについては従来技術においてすでに周知の他の手法で判定してもよい。
【実施例】
【０１８９】
以下の実施例において本発明をさらに定義する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示すものではあるが、例示目的であげたものにすぎない点を理解されたい。当業者であれば、上記の説明および以下の実施例から本発明に不可欠な特徴を把握することができ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明にさまざまな変更および改変を施してこれをさまざまな用途および条件に合わせることができる。
【０１９０】
基本方法
実施例で用いる標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング法は従来技術において周知であり、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版局（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）（１９８９）（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））およびＴ．Ｊ．シルハヴィ（Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）およびＬ．Ｗ．エンキスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）著、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）（１９８４）ならびに、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、グリーンパブリッシングアソシエーツアンドウィレイ−インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク州ニューヨーク（１９８７）に記載されている。
【０１９１】
略号の意味は以下のとおりである。「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｃｍ」はセンチメートルを意味し、「μｍ」はマイクロメートルを意味し、「Å」はオングストロームを意味し、「ｍＭ」はミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌａｒ）を意味し、「Ｍ」はモル（ｍｏｌａｒ）を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｐｍｏｌ」はピコモルを意味し、「ｎｍｏｌ」はナノモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「Ｖ」はボルトを意味し、「ｄｃ」は直流を意味し、「g」は引力定数を意味し、「Ｗ」はワットを意味し、「ｍＷ」はミリワットを意味し、「ＰＢＳ」はリン酸緩衝生理食塩水を意味し、「ｒｐｍ」は１分あたりの回転数を意味し、「ＰＥＧＭ」はポリ（エチレングリコール）メタクリレートを意味する。
【０１９２】
以下の実施例に記載の共鳴光散乱スペクトルのシフトは、平均±標準偏差として得たものである。
【０１９３】
実施例１
共鳴光散乱による個々のガラス微粒子の識別
本実施例の目的は、光プローブ系を利用して共鳴光散乱スペクトルで個々のガラス微粒子を識別することについて示すことにあった。
【０１９４】
屈折率約１．９、直径約３５〜４０μｍの球形のガラス微粒子（ミズーリ州ローラ（Ｒｏｌｌａ）のＭＯ−Ｓｃｉ社（ＭＯ−Ｓｃｉ  Ｃｏｒｐ．）、製品番号ＧＬ−０１７５、ロット７２８９５５２−Ｓ１）を、さらに処理することなく利用した。粒子約０．５ｇを蒸留水約１０ｍＬに入れ、マグネチックスターラーバーを用いて懸濁液を生成した。この懸濁液約０．１ｍＬの試料を図３に示すような厚さ約２ｍｍの頂部テフロン（登録商標）ＡＦ  ２４００（デラウェア州ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）のデュポン社（ＤｕＰｏｎｔ  Ｃｏ．））ウィンドウ００１に載せた。場合により懸濁液をテフロン（登録商標）ＡＦ  ２４００のカバーフィルム（厚さ約０．０５から０．１３ｍｍ）００３で覆い、ガラス微粒子００２を頂部ウィンドウ００１の上面で自然に落ち着かせた。続いてセルをスクリューで密閉した。このセルを図４の検出装置の移行ステージにおいた。マルチファイバ光プローブ００５（バージニア州ウィリアムズバーグ（Ｗｉｌｌｉａｍｓｂｕｒｇ）のロマック社（ＲｏＭａｃｋ，Ｉｎｃ．））の中心にある励起用ファイバ００４をチューナブルダイオードレーザ光源００６（モデルＡＱ４３２１、メリーランド州ジャーマンタウン（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ）の安藤電気株式会社（Ａｎｄｏ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．））に接続した。レーザコントローラ内のチョッパーを利用して、レーザ光を変調した。外側の６本の収集用ファイバ００７を光学的に組み合わせ、この組み合わせを光検出器００８（モデル２０１１、カリフォルニア州サンノゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）のニューフォーカス社（Ｎｅｗ  Ｆｏｃｕｓ  Ｉｎｃ．））に接続した。チョッパーを用いて同期検出モードにしたロックイン増幅器００９（モデル５３０１Ａ、テネシー州オークリッジ（Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ）のＥＧ＆Ｇプリンストンアプライドリサーチ（ＥＧ＆Ｇ  Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ））に、シグナル出力を送った。ロックイン増幅器の出力については、パーソナルコンピュータ０１０（デルプレシジョン（Ｄｅｌｌ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）  ４２０ワークステーション、テキサス州ラウンドロック（Ｒｏｕｎｄ  Ｒｏｃｋ）のデルコンピュータ社（Ｄｅｌｌ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））内に示したデータ取得ボード（ＰＣＩ−６１１０Ｅ、テキサス州オースチン（Ａｕｓｔｉｎ）のナショナルインスツルメンツ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））に送った。カスタムソフトウェアを書いてレーザ走査を制御し、散乱光強度を取得して波長の関数として表示した。
【０１９５】
単一の粒子から散乱光スペクトルを取得するには、セルの下に装着した顕微鏡付きビデオカメラ０１２（モデルＫＰ−Ｍ２ＲＮのＣＣＤカメラ、カリフォルニア州サンノゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）の日立インスツルメンツ（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）をイリノイ州バノックバーン（Ｂａｎｎｏｃｋｂｕｒｎ）のレイカマイクロシステムズ（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）のワイルドマクロズーム（Ｗｉｌｄ  Ｍａｋｒｏｚｏｏｍ）タイプ２４６６３４の顕微鏡０１３を接続したもの）を活用して、光学セル０１４を含む移行ステージ０１１を動かすことで、ファイバオプティクスプローブ００５を１つの粒子の上の中心に合わせた。ファイバオプティクスプローブの視野の画像をビデオモニタ０１７に表示した。別の水層０１６を利用して、検出プローブと試料微粒子とを光カップリングした。プローブと１個の粒子とを整列させたら、特定の波長（一般に１５７０から１６２０ｎｍで２０秒）でダイオードレーザ００６を走査した。得られた散乱光スペクトルを取得し、表示し、ディスクに保存した。このプロセスを繰り返して試料中の他の粒子からのスペクトルを得た。代表的なスペクトルの組を図５に示す。それぞれの粒子が一意な散乱スペクトルを持つことが分かる。それぞれの粒子を一意に識別する特徴を抽出するために、これらのスペクトルをさらに自動スペクトル分析法にかけることができる。
【０１９６】
実施例２
共鳴光散乱画像形成によるガラス微粒子の多様性の識別
本実施例の目的は、スペクトル画像形成システムを利用した共鳴光散乱によるガラス微粒子の多様性の識別について示すことにあった。
【０１９７】
図７に示すスペクトル画像形成システムを利用して、複数のガラスミクロスフェアからの共鳴光散乱スペクトルを同時に取得・処理した。頂部のテフロン（登録商標）ＡＦ  ２４００ウィンドウの下に入れた水の代わりに、蒸留水１００部に対してインク（ヒギンズファウンテンペンインディアインク（Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｆｏｕｎｔａｉｎ  Ｐｅｎ  Ｉｎｄｉａ  Ｉｎｋ）、品番４６０３０〜７２３、イリノイ州ベルウッド（Ｂｅｌｌｗｏｏｄ）のサンフォード社（Ｓａｎｆｏｒｄ  Ｃｏ．））１部からなるインクアブソーバ溶液０１８を利用して図３の光学セルを図６に示すように変更した。このインク溶液は、ミクロスフェアと相互作用しなかった入射光を吸収することで、散乱および後方反射からの光学ノイズを低減する機能を果たした。実施例１と同様にして画像形成用光学セル０１９にガラス微粒子００２を入れ、対物レンズ０２０を装着した市販光学顕微鏡０２１（モデルＤＭＲＸＥ、レイカマイクロシステムズ（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ））のステージにおいた。屈折率が約１．９の粒子がこの実施例の粒子の約７０％を占め、屈折率約１．７の粒子が約３０％を占めていた。
【０１９８】
粒子とその液体環境を光学系から分離するのに利用したテフロン（登録商標）ＡＦ  フィルム００３は任意であり、分析結果には影響しなかった。このようなフィルムまたはこれと等価なものを使用するかどうかは、実験の長さ、温度、粒子を囲む溶液からの蒸発損失率、実験のタイムスケールなどの要因によって判断した。フィルム００３を用いる場合は、フィルムと光プローブとの間に別の水層を加え、シグナルを効率よく光カップリングできるようにした。ダイオードレーザ０２２（モデルＶｅｌｏｃｉｔｙ  ６３１２、ニューフォーカス社（Ｎｅｗ  Ｆｏｃｕｓ，Ｉｎｃ．））を光源として利用して、顕微鏡０１３を明視野照明にセットアップした。レーザ出力を直径４ｍｍのプラスチックファイバ０２３にカップリングし、このファイバの出力を、標準光源に代えて顕微鏡の照明用オプティカルトレイン（ｏｐｔｉｃａｌ  ｔｒａｉｎ）においた。ＤＣ約３Ｖで駆動されるミニチュア「ブザー」モータ０２４（フロリダ州レイクパーク（Ｌａｋｅ  Ｐａｒｋ）のマーリン（Ｍａｒｌｉｎ）  Ｐ．  ジョーンズアンドアソシエーツ社（Ｊｏｎｅｓ  ＆  Ａｓｓｏｃ．  Ｉｎｃ．）、品番１２３４２−ＭＤ）のシャフトをファイバに直接取りつけることで、ファイバを機械的に振動させた。この振動によって、画像データの取得と分析に干渉しかねない照明視野内のレーザのスペックルパターンを除去することができた。画像の干渉フリンジをさらに除去するために、顕微鏡の製造業者が付けた標準的なビームスプリッタをペリクルタイプのビームスプリッタ０２５（エドマンドインダストリアルオプティクス（Ｅｄｍｕｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｏｐｔｉｃｓ）、ニュージャージー州バーリントン（Ｂａｒｒｉｎｇｔｏｎ）、品番Ａ３９−４８１）に交換した。
【０１９９】
多様な粒子から同時に散乱スペクトルを取得するために、まず一組の粒子を顕微鏡の視野内におき、対物レンズ０２０の焦点を合わせた。ダイオードレーザの波長によっては、レーザ自体あるいは、ヘリウムネオンレーザなどのレーザと一時的に交換した別の光源で試料に光線を照射することで、これを実現した。視野内で該当する粒子に焦点を合わせたら、一般に７７０から７８０ｎｍの波長で２０秒間レーザを走査した。この走査の間、デジタルカメラ０２６（モデルＫＰ−Ｍ２ＲＮ、日立インスツルメンツ（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））で各波長での視野の完全な散乱光画像を取得した。それぞれの画像をパーソナルコンピュータ０１０（デルプレシジョン（Ｄｅｌｌ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）  ４２０ワークステーション）にインストールした画像捕捉ボード０２７（ＩＭＡＣ  ＰＣＩ−１４０９、ナショナルインスツルメンツ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））で捕捉した。カスタムソフトウェアを書いてそれぞれの画像を保存した。波長の走査によって、走査波長それぞれについて一組のリンク画像が得られた。典型的な画像を図８に示す。
【０２００】
一組の波長リンク画像から視野内のそれぞれの粒子の散乱スペクトルを判定するために、たとえば、図８の画像に見られるようなそれぞれの粒子中心の反射光１０７の明るい点を囲む輪の形をした散乱光画像１０６の一部など、各粒子に対応する画像の代表的な領域を識別するソフトウェアを書いた。この実施例では、入射光線と散乱光線を独立に偏光したが、その２本の偏光軸は互いに平行である。これにより、図８の中央の画像にそれぞれ数字１２、３、６、９で示すように、円の１２：００、３：００、６：００、９：００の位置を中心とした散乱光のセクターが得られる。「１２」と「６」の領域からの散乱光スペクトルが等しく「３」と「９」の領域からの散乱光スペクトルが等しいことが、理論で予測され、結果で確認されている。さらに、２対のセクターのスペクトルは互いに異なっている。これにより、単一のスペクトルではなく、２つの実質的に独立したスペクトルの組み合わせで粒子を識別する機能が得られ、識別可能な粒子の多様性が増し、識別の精度も高くなる。
【０２０１】
単一の粒子について偏光依存性スペクトルの概念を図９に示す。「１２」と「３」の位置の領域は、粒子の散乱スペクトルを表すために画素を選択した該当領域として識別された。画素については以下のようにして選択した。まず、画像の領域（たとえば、図９の１２：００）を大きな画像から選択した。選択したエリア内で、それぞれの画像を単一の波長で取得する、画像Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３  ・・・  Ｌｎのスタックの各画素で表されるスペクトルを、ソフトウェアで計算した。次に、選択アルゴリズムを利用して、対応するスペクトルが選択規準を満たすかこれを超える画素を選び出した。この実施例では、量（Ｍａｘ−Ｍｉｎ）／Ｍｉｎ（式中、Ｍａｘはスペクトル強度の最大値、Ｍｉｎはスペクトル強度の最小値である）が最高になる（Ｍｉｎ＝０の場合、ソフトウェアがＭｉｎ＝１に設定）選択エリアで１０から２０画素を選ぶことを規準とした。これらの画素のスペクトルを平均した。このようなスペクトルの例を図９の右側に示す。図示されているのは、「１２」の領域と「３」の領域のスペクトルである。上述したように、これらの領域のスペクトルは異なっている。
【０２０２】
上記の画素選択規準は例示にすぎず、スペクトルピークと下にあるスペクトル基線との間のコントラストの一測定結果を表している。他の規準または規準の組み合わせを利用して大きな集合から特定の画素を選択することも可能であろう。
【０２０３】
多様な粒子を識別するのに一意なスペクトルを用いることについて、以下の例に示す。対のスペクトル（それぞれの粒子で一方を「１２」の領域、他方を「３」の領域から）を、上述したようにして８７個の異なる粒子から得た。それぞれのスペクトルには波長７７０ｎｍから７８０ｎｍで１５００個のデータ点が含まれていた。これらのスペクトルを「指紋」として利用し、粒子を識別した。各粒子の「１２」のスペクトルを同じ集合内の他のすべての粒子の「１２」のスペクトルと比較した。定量的に、相関係数の二乗（Ｒの二乗）をそれぞれの粒子の「１２」のスペクトルと他のすべての粒子の「１２」のスペクトルとの間で計算した。これと同じ相関計算をそれぞれの粒子の「３」のスペクトルと同じ集合内の他のすべての「３」のスペクトルとの間でも行った。いずれかの粒子（粒子ｎとする）が同じ集合内の他のいずれかの粒子（粒子ｍとする）と十分似ているように見えるか否かを次のアルゴリズムに従って判断し、それぞれの粒子の「指紋」の一意性の度合いを判定した。
ＩＦ  Ｒ−Ｓｑｕａｒｅｄ（Ｐｎ，  Ｐｍ，  １２）  ＞  Ｔ  ＡＮＤ  Ｒ−Ｓｑｕａｒｅｄ（Ｐｎ，  Ｐｍ，３）  ＞  Ｔ  ＴＨＥＮ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ＿ｍａｔｃｈ  ＝  Ｔｒｕｅ
Ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ：  Ｐａｒｔｉｃｌｅ＿ｍａｔｃｈ  ＝  Ｆａｌｓｅ
式中、
Ｒ−Ｓｑｕａｒｅｄ（Ｐｎ，  Ｐｍ，  １２）＝散乱光画像の「１２」の位置から得た粒子ｎと粒子ｍの散乱光スペクトルの間の相関係数の二乗
Ｒ−Ｓｑｕａｒｅｄ（Ｐｎ，  Ｐｍ，  ３）＝散乱光画像の「３」の位置から得た粒子ｎと粒子ｍの散乱光スペクトルの間の相関係数の二乗
Ｔ＝閾値
粒子同士が同じアイデンティティを持つとされた場合はＰａｒｔｉｃｌｅ＿ｍａｔｃｈ＝Ｔｒｕｅ、それ以外はＦａｌｓｅ
【０２０４】
画素選択と粒子類似性の規準を発展させる目的は、ある集合内ですべての粒子を一意に識別するための効果的な手段を開発することにあった。スペクトルが十分に一意であって、閾値が適切に選択されている場合に、上記のアルゴリズムでどの粒子のマッチも存在しない形が理想である。この実施例では、Ｔを０．７５から１．０の間に設定することで、８７個の粒子すべてについて完全に一意なスペクトル信号が得られた。これは、「偽陽性」がまったくなかった、すなわち、マッチするものとして割り当てられた２個の粒子がまったくなかったことを意味する。Ｔを０．６０まで減らすと、マッチのストリンジェンシーが低くなり、若干似ている粒子同士が同一であるとして受け入れられるため、４９５０組のうち１０件の偽陽性が生じた（精度が１００％から９９．８％に落ちた）。よって、この実施例では、偽陽性をなくす上で閾値０．７５が適切であった。
【０２０５】
また、「偽陰性」すなわち、異なる環境条件下または画素選択規準の光のばらつきがある状態で、違うタイミングで行う同一粒子の２回の走査が、選択したアルゴリズムでマッチしないかどうかを試験する必要もあった。このようなばらつきとは関係なく粒子を忠実に識別する機能を以下のようにして試験した。４個の粒子で、同一粒子に対してタイミングを変えるか画素選択規準のばらつきを小さくして行った、独立した別々のスペクトルスキャンを画像データソースとして利用した。これらの粒子について合計で１３種類のばらつきを利用した。繰り返すが、設定をＴ＝０．７５としたところ、偽陰性のない状態で完全なマッチが得られた。Ｔを０．９０まで上げると、４９５０組のうち７件の偽陰性が生じ（精度が１００％から９９．９％に落ち）、Ｔ＝０．９５で精度は１００％から９９．７％に落ちた（４９５０組のうち偽陰性１４件）。これは、極めて高いストリンジェンシー要件を利用すると、わずかに異なる条件で同一粒子から得たスペクトルの小さなばらつきが、マッチしない結果につながる場合があるという事実を反映している。しかしながら、この実施例では、代表的な粒子集合では、極めて高い精度の粒子識別結果が得られるような形で画素選択規準と類似性規準を定義可能だということが、明らかに示されている。
【０２０６】
ここに示す実施例は例示目的のものにすぎず、簡単に拡張および自動化してさらに多くの粒子を識別・追跡することが可能であろう。たとえば、当業者であれば、一歩進んだ画素選択規準、パターン認識手法、スペクトルコーディング方法を開発し、多くの粒子のある視野内でそれぞれの粒子の位置を定めて識別することができよう。
【０２０７】
実施例３
共鳴光散乱を利用したビオチニル化微粒子でのアビジン結合の検出
本実施例の目的は、共鳴光散乱を利用してビオチニル化ガラス微粒子へのアビジン結合の検出について示すことにあった。シラン化学を利用してガラス微粒子の表面にアミン基を導入した。続いて、これらの微粒子をスルホ−ＮＨＳ−ＳＳビオチンとの反応によってビオチニル化した。共鳴光散乱を利用してビオチニル化微粒子へのアビジン結合を検出した。粒子からのアビジン切断時の結合信号の可逆性についても示した。
【０２０８】
Ａ．微粒子の表面調製
まず最初に、高屈折率ガラス微粒子（ミズーリ州ローラ（Ｒｏｌｌａ）のＭｏ−Ｓｃｉ社（Ｍｏ−Ｓｃｉ  Ｃｏｒｐ．）、製品番号ＧＬ−０１７５、ロット７２８９５５２−Ｓ１、屈折率約１．９）を０．５Ｍ  ＨＮＯ３で室温にて５分間洗脱して清浄した。これらのガラス粒子を以下の一連のステップで処理した。脱イオン水でのすすぎ、５〜１０％ＮａＯＨで室温にて３０分間の処理、水でのすすぎ、真空オーブンにて１１０℃で一晩の乾燥。
【０２０９】
清浄後のガラス微粒子を、無水トルエン中にて２４時間還流することで、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）のアルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、製品番号４４０１４０、ロット番号２０５１５ＤＡ）でシラン化し、粒子の表面にアミン基を導入した。反応混合物を濾過し、シラン化微粒子を単離した。続いて、シラン化微粒子をトルエンおよびアセトンで順にすすいだ後、０．５〜１時間空気乾燥させ、オーブンにて４時間から一晩の時間をかけて１１０〜１２０℃で硬化させた。
【０２１０】
シラン化微粒子におけるアミン基の表面占有率を滴定によって判定した。滴定前、１％酢酸溶液１ｍＬを含有する蒸留水５０ｍＬにシラン化微粒子０．３ｇを分散させた。酢酸を利用してガラス微粒子を軟化し、すべてのアミン基に滴定剤が行き渡るようにした。微粒子分散液を攪拌し、４時間で４０℃まで加熱した後、室温まで冷ました上で滴定を行った。続いて、希釈した過塩素酸（０．０２５９Ｎ）を滴定剤として用いて、微粒子表面のアミン基を滴定した。表面アミン占有率は微粒子１グラムあたり０．０４５ｍｍｏｌであることが分かった。これらのシラン化微粒子をＥＳＣＡ（化学分析用の電子分光）でも分析した。ＥＳＣＡの結果から、シラン化微粒子表面要素の約５％がアミン基由来の窒素原子であることが分かった。
【０２１１】
Ｂ．微粒子表面のビオチニル化
ｐＨ７．４、０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に濃度２５ｍｇ／ｍＬで溶解させた２倍モル過剰のスルホスクシンイミジル−２−（ビオチンアミド）エチル−１，３−ジチオプロピオネート（スルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン）（イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）のピアースバイオテクノロジー社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）、製品番号２１３３１、ロット番号ＤＤ５３９２７）中にてシラン化微粒子をインキュベートすることで、ビオチニル化を実施した。このとき、微粒子を上記溶液中で０．５〜１時間室温にてインキュベートした。表面のアミン基は中性ｐＨ値以上でＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ）と反応し、ビオチンと微粒子表面との共有結合が生じる。マイクロ濃縮器（セントリプラス（Ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ）（登録商標）遠心フィルタ、モデルＹＭ−１００、マサチューセッツ州ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ）のミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））を使用して、緩衝液での洗浄によって未反応のスルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチンを除去した。続いてビオチニル化微粒子を真空中室温にて一晩乾燥させた。
【０２１２】
Ｃ．ビオチン−アビジン結合
実施例２に基づく手順を利用して、微粒子の散乱光スペクトルを測定した。パートＢの手順で調製したビオチニル化微粒子をｐＨ７．４、０．４Ｍ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．３Ｍ  ＮａＣｌ）ＰＢＳ緩衝液に分散させた。この懸濁液のアリコートを光学セルに入れた。この実験のために、図６に示すセル０１９から上側のテフロン（登録商標）ＡＦ  フィルム００３を取り除き、セル側面に流体流入口と流出口のポートを取り入れて、フローセルとして利用できるように変更した。多数の微粒子が含まれる視野を選択した。続いて、７７０および７８０ｎｍでダイオードレーザ光源０２２を５０秒間走査した。各波長間隔で、視野内にあるすべての粒子からの散乱光のデジタル画像を画像捕捉ボード０２７で取得し、パーソナルコンピュータ０１０にインストールしたソフトウェアでデータを格納および分析した。視野内のいくつかの微粒子を、たとえば図１０Ａに示すように後の詳細なスペクトル分析用に選択した。図１０Ａは、波長走査時に波長ステップ１回あたり１枚ずつ得られた１５００枚の散乱光画像のうちの１枚である。実施例２で説明したようにして波長依存性散乱光画像全体を分析することで、この粒子の散乱光スペクトルを得た。図１０Ａ左上の微粒子からの散乱光スペクトルを図１０Ｂに示す。
【０２１３】
アビジンをビオチニル化表面に結合させるために、フルオレセインイソチオシアナート標識アビジン（ＦＩＴＣ−アビジン）（ミシガン州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）のシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、製品番号Ａ２０５０、ロット０９１Ｋ４８４２、ＦＩＴＣ／タンパク質モル比＝３．９）５６μｇ／ｍＬをｐＨ７．４、０．４Ｍ  ＰＢＳ緩衝液に加えたものからなる溶液を、流量約１．４５ｍＬ／分で１５分間ビオチニル化微粒子の間に流した。次に、試料セルを純粋なＰＢＳ緩衝液でフラッシュし、結合前に使用したものと同じ媒質で共鳴光散乱を測定できるようにした。フルオレセイン標識の蛍光検出によって結合を独立に確認した。
【０２１４】
散乱光スペクトル間の絶対波長シフトを正確に測定するには、レーザ走査トリガータイミングにおけるばらつきを明らかにする必要がある。ここでは、２つのエタロンを利用し、極めて正確に整合させることが可能な波長基準シグナルを生成して、走査タイミングのばらつきを補正することでこれを実現した。このエタロン参照手法の詳細については、下記のセクションＥ．で説明する。アビジン結合前後の波長整合スペクトル比較の一例を図１０Ｃに示す。ＦＩＴＣ−アビジン結合前と後のスペクトルの相互相関係数の二乗（Ｒの二乗）をスペクトル間の誘導波長シフトの関数として算出することで、シフトを定量化した。２つのスペクトルのうちの一方を他方に対して人工的に波長シフトさせ、両者間のＲの二乗値を算出した。次に、スペクトルを再度シフトさせ、Ｒの二乗値を再計算するといった具合にして、シフトと相関との関係を生成した。Ｒの二乗値は、ＦＩＴＣ−アビジンを微粒子に加えると誘導される自然なシフトに対応する波長シフトで、最大になると思われた。この分析の結果を図１１に示す。同図では、エタロン相関の最大値と散乱スペクトル相関の最大値との差としてシフトを示してある。スペクトル整合後、アビジン結合によって誘導された波長シフトは、独立した粒子４個について２日間で得た、５４件の独立したレーザ走査比較結果からなるデータセットで、０．０３４±０．００７ｎｍであった。
【０２１５】
上記と同一のプロトコールを用いて、別の日に別の実験工程で得た上記に匹敵するデータセットでは、アビジンの特異的結合時に波長シフトが０．０３８±０．０１０（Ｎ＝測定３６回、粒子１個）となったことから、スペクトルシフト測定の日による再現性が良好であることが明らかになった。
【０２１６】
タンパク質判定用のブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法（ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７２、２４８〜２５４（１９７６））を利用して、ビオチニル化微粒子でのアビジンの結合も定量化した。ビオチニル化試薬スルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチンでビオチン微粒子リンケージにジスルフィド結合を加えると、２−メルカプトエタノールまたはジチオトレイトール（ＤＴＴ）などの還元剤によってアビジン−ビオチンコンジュゲート全体を微粒子から切断することが可能である。アビジン結合微粒子を５０ｍＭ  ＤＴＴ（シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、製品番号Ｄ−９７７９、ロット番号０７２Ｋ０９１６）中、ｐＨ７．４、０．４Ｍ  ＰＢＳで４０分インキュベーションした後、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法を利用してどれだけのアビジンがインキュベーション上清に放出されたかを判定した。結果は、微粒子でアビジンがほぼ単層膜を占有している状態に相当する、微粒子１グラムあたりアビジン２．２８ｎｍｏｌであった。
【０２１７】
Ｄ．ＤＴＴ切断
ＤＴＴ処理により微粒子からビオチン／アビジン複合体を除去して、アビジン結合によって生じる共鳴光散乱スペクトルシフトの可逆性を試験した。ＤＴＴによって、ステップＢで得られた微粒子に対するビオチンリンケージのジスルフィド結合が減少した。５０ｍＭ  ＤＴＴを、ｐＨ７．４、０．４Ｍ  ＰＢＳに加えたもの約４０ｍＬを光学セルに通すとともに微粒子の表面を流した後、１５分間のインキュベーションを行った。続いて、ｐＨ７．４、０．４Ｍ  ＰＢＳで試料セルをフラッシュし、共鳴光散乱スペクトルを得た。ＤＴＴ処理の前と後の散乱スペクトルを図１２に示し、上述したような自己相関関数で測定した相対シフトを図１３に示す。複数回の実験と異なる微粒子で、ＤＴＴ処理によって誘導される逆シフトを確認し、平均を取ったところ−０．０３４±０．００７ｎｍであったことから、微粒子からビオチン／アビジン複合体が除去されたことが分かった。
【０２１８】
これらの結果は、共鳴光散乱を利用して多様な微粒子でのタンパク質の結合と放出を検出可能であることを示している。
【０２１９】
Ｅ．エタロンを利用した波長整合
共鳴光散乱スペクトルのシフトを測定する場合、取得した散乱スペクトルの波長成分が高い精度で分かることが絶対的に必要である。レーザ走査の起動とコンピュータによるデータ取得の開始との間のタイミングの不確かさが原因で、実際のシフトは起こっていないときにデータに見かけのスペクトルシフトが生じる可能性がある。したがって、スペクトルデータを補正し、偽りの「タイミング」シフトを除去しなければならない。どれだけ大きな波長補正が必要であるか判断するには、波長登録用に特徴が既知でなおかつ安定している基準スペクトルを記録する必要がある。波長補正／登録を十分な精度で行うには、基準スペクトルにおけるスペクトルの特徴がかなりはっきりとしていることがさらに重要である。
【０２２０】
本願発明者らは、エタロンの平面スペクトルを基準スペクトルとして用いることにした。エタロンとは、分光法で半分が銀色で互いに平行な２枚のガラスまたは石英板間の複数の反射によって生じる干渉作用による波長の測定に利用される装置のことである。本願発明者らは、厚さが異なる２枚のガラス板（具体的には、厚さ１ｍｍと０．１５ｍｍのホウケイ酸ガラス）を利用して、干渉パターンの高周波成分と低周波数成分とを得た。理想的なエタロンの透過量についての数式すなわちエアリ関数は以下のとおりとなる。
【０２２１】
【数１】
2006515420.tif 000003
【０２２２】
式中、
Ｔ＝透過量
Ｒ＝鏡の反射率
Φ＝光線の往復の位相変化
鏡の表面で無視される位相変化がある場合は、次のようになる。
【０２２３】
【数２】
2006515420.tif 000004
【０２２４】
式中、
λ＝光の波長
ｎ＝鏡と鏡の間にある材料の屈折率
ｄ＝鏡と鏡との距離
θ＝入射光線の角度
【０２２５】
厚さが異なり、異なるスペクトル周波数（あるいは比較的「広い」干渉フリンジと「狭い」干渉フリンジ）が得られる２つのエタロンを直列で使用して、偽の「タイミング」シフトが狭い干渉フリンジ１つを上回る場合にデータが誤って整合される可能性を排除した。レーザの走査を行う都度、エタロンスペクトルを共鳴光散乱スペクトルと一緒に取得した。比較対象となる２回のレーザ走査の基準エタロンスペクトルを自己相関アルゴリズムで分析し、偽スペクトルシフトがある場合にその大きさを判定して、これを利用して共鳴光散乱データを補正した。２つのスペクトルは互いに波長増分的にシフトし、両者間の自己相関係数を各波長増分ごとにコンピュータで求めた。スペクトルが最もよい状態で整合したときに自己相関係数が最大になり、基準エタロンスペクトルの相関が最大になったときに相当する波長シフトを利用して、対応する共鳴光散乱スペクトルの見かけ上のシフトを補正した。
【０２２６】
スペクトルシフトの比較対象となる２つの散乱光スペクトルの一例を図１４Ａに示す。図示のように、これらのスペクトルは波長整合されていないため、真のスペクトルシフトは未知である。各波長の走査時、入射光の一部を同時にエタロンに送り、その走査での波長スケールが正確に反映された干渉パターンを生成する。比較対象となる２つの散乱光スペクトルに関連した２つのエタロンスペクトルの一例を図１４Ｂに示す。次に、オリジナルのスペクトル対（図１４Ａ）同士とエタロンのトレース（図１４Ｂ）同士の相関分析を行った。このような分析の一例を図１４Ｃに示す。この図は、オリジナルのスペクトルが０．１８５ｎｍシフトし、エタロンのスペクトルが０．１４５ｎｍシフトしたことを示している。したがって、結合による散乱光スペクトルの正味のシフト量はこれら２つのシフトの差すなわち０．０４０ｎｍになる。波長を補正したスペクトルを図１４Ｄに示す。
【０２２７】
実施例４
共鳴光散乱を利用したビオチン−アビジンベースのサンドイッチアッセイにおける複数のタンパク質層の結合の検出
本実施例の目的は、共鳴光散乱を利用して、ガラス微粒子でのビオチン−アビジンの相互作用に基づく複数のタンパク質層の結合を測定することについて示すことにあった。ビオチニル化ガラス微粒子を、アビジン、ビオチニル化抗−ウシＩｇＧ、ウシＩｇＧと順に反応させた。共鳴光散乱を利用して各ステップの後の結合を検出した。
【０２２８】
Ａ．表面調製および微粒子表面ビオチニル化
実施例３（ステップＡおよびＢ）で説明したものと同じ高屈折率ガラス微粒子と同じ微粒子表面ビオチニル化プロトコールを利用した。
【０２２９】
Ｂ．ビオチン−アビジン結合
共鳴光散乱を利用したインサイチュでの結合の検出を行うために、実施例３で説明したものと同じ手順を利用した。アビジン結合前に、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ（０．０１Ｍリン酸ナトリウム、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ）ＰＢＳ中にてビオチニル化微粒子での共鳴光散乱スペクトルを得た。続いて、アビジン（卵白由来、シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、製品番号Ａ９２７５、ロット番号２２Ｋ７０１７）７５μｇ／ｍＬを、ｐＨ７．４、０．４Ｍ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．３Ｍ  ＮａＣｌ）ＰＢＳ緩衝液に加えたものからなる溶液２０ｍＬを、ビオチニル化微粒子を仕込んだ試料セルに、約１．５ｍＬ／分の流量で流した。続いて、純粋なｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＰＢＳでセルをフラッシュし、結合前に使用したものと同じ媒質で共鳴光散乱を測定できるようにした。
【０２３０】
Ｃ．アビジン−ビオチニル化抗体結合
ステップＢの後、ビオチニル化抗−ウシ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）［Ｈ＋Ｌ］［ヤギ］（ペンシルバニア州ギルバーツビル（Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ）のロックランド社（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｎｃ．）、製品番号６０１−１６０２、ロット番号１０４０、ＩｇＧ分子全体にビオチニル化部位をランダムに分布させたもの、ＩｇＧ分子１個あたりビオチニル化部位約１０〜２０）５０μｇ／ｍＬを、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＰＢＳに加えたものからなる溶液２０ｍＬを、流量約１．５ｍＬ／分で試料セルに通した。続いて、微粒子をビオチニル化抗−ウシＩｇＧ溶液中にて１時間インキュベートした。その後、同じＰＢＳで試料セルをフラッシュし、複数の共鳴光散乱スペクトルを得た。
【０２３１】
Ｄ．抗体−抗原結合
ステップＣの後、ウシＩｇＧ（シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、製品番号Ｉ−５５０６、ロット番号０４２Ｋ９０２３）５０μｇ／ｍＬを、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＰＢＳに加えたものからなる溶液２０ｍＬを、流量約１．５ｍＬ／分で試料セルに通した。続いて、微粒子をウシＩｇＧ溶液中にて１時間インキュベートした。その後、同じＰＢＳで試料セルをフラッシュし、複数の共鳴光散乱スペクトルを得た。
【０２３２】
ステップＢ〜Ｄで得られたスペクトルの例を図１５に示す。すべてのスペクトルを実施例３で説明したようにしてエタロン補正値と整合させた。ステップＢ、Ｃ、Ｄのスペクトルシフトを自己相関法（Ｎ＝１８での測定の全平均）で基準（未結合の）状態と比較したところ、それぞれ０．０３１±０．００５ｎｍ、０．０６９±０．００７ｎｍ、０．０７７±０．００８ｎｍであった。これらの結果から、アビジン、抗−ＩｇＧ、ＩｇＧの連続的な結合を個々に測定可能であることが明らかに分かる。ウシＩｇＧの結合によって誘導されるシフトの増大量はアビジンの結合やビオチニル化抗−ウシＩｇＧの結合によって誘導される場合に比して小さかった。ランダムな配向でアビジンに結合したビオチニル化抗−ウシＩｇＧ分子ならびにその抗原結合端が、ウシＩｇＧ分子の結合に最適な形で整合・露出しなかった可能性が最も高い。
【０２３３】
Ｅ．ＤＴＴ切断
実施例３で説明したものと同じＤＴＴ処理を実施して、ビオチン／アビジン／抗−ＩｇＧ／ＩｇＧ複合体を微粒子から切断した。別々の実験と微粒子すべてで逆スペクトルシフトが観察され、開始条件に対する平均シフトは０．０２６±０．００８ｎｍ（Ｎ＝１８での測定）であった。これらの結果から、結合していたタンパク質層のほとんどがＤＴＴ処理で微粒子から放出され、第１のビオチン／アビジン層の一部だけが表面に残ったことが分かる。
【０２３４】
実施例５
共鳴光散乱を利用したプロテインＧベースのサンドイッチアッセイにおける複数のタンパク質層の結合の検出
本実施例の目的は、共鳴光散乱を利用してガラス微粒子での配向を制御した複数のタンパク質層の結合を測定することについて示すことにあった。プロテインＧ’を二官能基架橋剤でアミン誘導体化微粒子にカップリングした。プロテインＧ’微粒子に対するマウスＩｇＧ、さらには抗−マウスＩｇＧの結合を共鳴光散乱で検出した。
【０２３５】
Ａ．微粒子表面でのプロテインＧ’の表面調製および誘導体化
実施例３（ステップＡ）で説明したものと同じ高屈折率ガラス微粒子（ＲＩ＝１．９、Ｍｏ−Ｓｃｉ  ＧＬ−０１７５）と同じアミノシラン化プロトコールを利用して、微粒子表面でアミン基を導入した。このような微粒子を本願明細書ではアミン微粒子と呼ぶ。プロテインＧは、Ｇ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ株の群から調製された細菌膜タンパク質である。このタンパク質は、哺乳動物ＩｇＧ分子の定常領域（Ｆｃ）に特異的に結合できる。よって、プロテインＧを利用してＩｇＧ分子の配向を制御することができる。プロテインＧ’は、Ｆｃ結合部位は保持されているが、アルブミン、Ｆａｂ、膜結合部位の欠如した切断タンパク質である。このため、天然の形態よりもＩｇＧに対する特異性が高い。プロテインＧ’を二官能基リンカーであるジメチルピメリミデート・２ＨＣＬ（ＤＭＰ）でアミン微粒子にカップリングした。プロテインＧ’（シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）製品Ｐ−４６８９、ロット０４２Ｋ１５４５１）をトリス−ＨＣｌ緩衝液から凍結乾燥させ、架橋緩衝液（ｐＨ８．０、０．１Ｍ  ＰＢＳ）に緩衝液交換する必要があった。プロテインＧ’（１ｍｇ）を脱イオン水０．５ｍＬに溶解させ、セントリプラス（Ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ）（登録商標）ＹＭ−１０マイクロ濃縮器（マサチューセッツ州ビレリカ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）のミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．））を用いて緩衝液塩を除去した。このプロセスを３回繰り返し、ｐＨ８．０のＰＢＳ０．５ｍＬでプロテインＧ’を再構成した。同時に、ＤＭＰ（イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）のピアースバイオテクノロジー社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）、製品番号２０６６６、ロットＤＨ５５６８２）約１０ｍｇをｐＨ８．０、０．１Ｍ  ＰＢＳ  １ｍＬに溶解させた後、アミン微粒子０．６ｇをＤＭＰ溶液に加えた。この混合物をボルテックスした後、室温にて約０．５時間インキュベートした。その後、マイクロ濃縮器を利用してＰＢＳ緩衝液で余分なＤＭＰを洗い流し、ＤＭＰ反応微粒子をプロテインＧ’溶液に移した。この微粒子懸濁液をボルテックスした後、ローテーターに入れたまま約１．５時間インキュベートした。続いて、上清を除去し、ｐＨ８．５、０．２Ｍトリス緩衝液を加えて反応物を急冷し、この溶液を１時間インキュベートした。続いて、水平ローターを用いて微粒子をＰＢＳ緩衝液で３回遠心洗浄し、微粒子を回収した。
【０２３６】
直接ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫反応吸着測定法）を利用してプロテインＧ’微粒子を試験し、プロテインＧ’が微粒子にうまく結合していることを確認し、プローブ密度を判定した。ＥＬＩＳＡ試験では、正確に秤量した一連のプロテインＧ’微粒子と対照微粒子（プロテインＧ’を含有しない）をウサギ抗−ニワトリＩｇＹ、（Ｈ＋Ｌ）、ペルオキシダーゼコンジュゲート（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）、カタログ番号３１４０１、ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート）中にて異なる濃度でインキュベートした。続いて、微粒子を７回洗浄した。ＯＰＤ基質（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）、カタログ番号３４００６）溶液をプロテインＧ’微粒子試料および対照微粒子試料それぞれに加え、これらの試料を１５分間インキュベートした。このインキュベーション後、各試料に停止溶液（１Ｍ硫酸）を加えた。ペルオキシダーゼコンジュゲート標準を同じようにして処理した。各微粒子試料から得た上清と同容量の標準溶液とを９６ウェルのマイクロタイタープレートに移し、吸光度を測定した。対照微粒子試料では極めて低い吸光度であった。プロテインＧ’微粒子で高酵素コンジュゲート濃度にて得られた飽和吸光度を用いて、プロテインＧ’の表面密度を算出した。プロテインＧ’の算出表面密度は微粒子１グラムあたり０．４４ｐｍｏｌであり、プロテインＧ’の各分子が２個のＩｇＧ分子と結合した（アケルストローム（Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ），Ｂ．およびブジョルク（Ｂｊｏｒｃｋ）Ｌ．、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６１、１０２４０〜１０２４７（１９８６））と仮定された。溶液中の遊離酵素の活性と比較して、固定化された酵素の活性は小さくなる場合があった。このように、ＥＬＩＳＡの結果は遊離酵素から得た標準曲線に基づく不正確なものであるため、酵素活性抑制係数を求めて活性の補正に利用した。余分なプロテインＧ’微粒子をウサギ抗−ニワトリＩｇＹ、（Ｈ＋Ｌ）、ペルオキシダーゼコンジュゲートの極めて薄い希釈溶液に加えた中でインキュベーションを行って、結合実験を実施した。プロテインＧ’微粒子への結合前と後のペルオキシダーゼコンジュゲート溶液の酵素活性の差から、粒子が占めた酵素活性を求めた。続いて粒子での酵素活性を測定した。粒子で測定された酵素活性に対するプロテインＧ’粒子に占めた酵素活性の比として、酵素活性抑制係数を算出した。この酵素活性抑制係数を判定したところ、３回の試験でそれぞれ２６、１９、１８であった。活性抑制係数の中央値を１９にしてプロテインＧ’表面密度を補正し、微粒子１グラムあたりの補正プロテインＧ’表面密度である８．３６ｐｍｏｌを得た。
【０２３７】
プローブ表面密度の判定には、別のやり方も利用した。プロテインＧ’をＤＭＰでアミン微粒子にカップリングしたときと同じようにして、プロテインＧ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８  コンジュゲート（モレキュラープローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、カタログ番号Ｐ−１１０６５）を、切断可能な二官能基リンカーである３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ、ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）、カタログ番号２１５７８）でアミン微粒子にカップリングした。続いて、プロテインＧ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８  コンジュゲートを５０ｍＭ  ＤＴＴで３７℃にて一晩切断し、完全に切断されるようにした。切断物からの上清を分光光度計で検査し、製造業者が提示している消光係数７１，０００ｃｍ−１Ｍ−１で、４９４ｎｍでの吸光度をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８色素の濃度の算出に利用した。続いて、製造業者が求めたタンパク質１モルあたり色素２．３モルの比から、プロテインＧの濃度を算出した。この結果から、プロテインＧの密度は微粒子１グラムあたり１．３ｎｍｏｌであり、補正ＥＬＩＳＡでの結果と比して約１５０倍であることが分かった。この結果から、微粒子でのプロテインＧプローブ密度の判定用にＥＬＩＳＡの結果を補正するには、酵素活性抑制係数では不十分な場合があることが示唆された。しかしながら、全リンキング化学（ａｌｌ  ｌｉｎｋｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）で調製された微粒子にＥＬＩＳＡ試験を適用することは可能であり、この開示の誘導体化微粒子のほとんどでプローブ密度測定に用いられた。バッチごとのプローブ導出効率の比較にはＥＬＩＳＡでの結果は有効であるが、プローブ密度の絶対数の判定には適さないことがある。
【０２３８】
Ｂ．マウスＩｇＧの結合
実施例３で説明したものと同じ手順を、共鳴光散乱によるインサイチュでの結合の検出に利用した。マウスＩｇＧの結合前に、ｐＨ７．２、２５ｍＭ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５ｍＭ  ＮａＣｌ）ＰＢＳ緩衝液中のプロテインＧ’微粒子で基準スペクトルとして共鳴光散乱スペクトルを得た。続いて、マウスＩｇＧ（シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、製品番号Ｉ５３８１、ロット番号０４２Ｋ９０２７）５０μｇ／ｍＬを同じｐＨ７．２のＰＢＳ緩衝液に加えたものからなる溶液１５ｍＬを、プロテインＧ’微粒子の入った試料セルに、流量約１．５ｍＬ／分で循環させながら０．５時間通した。続いて、試料セルを純粋なｐＨ７．２のＰＢＳ緩衝液でフラッシュし、結合前に使用したものと同じ媒質で共鳴光散乱を測定できるようにした。
【０２３９】
Ｃ．抗マウスＩｇＧ結合
ステップＢの後、Ｆａｂ特異的ヤギ抗−マウスＩｇＧ（シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）製品Ｍ６８９８、ロット０１２Ｋ４８１１）４０μｇ／ｍＬを、ｐＨ７．２、２５ｍＭ  ＰＢＳに加えたものからなる溶液１５ｍＬを、試料セルに流量約１．５ｍＬ／分で循環させながら０．５時間通した。その後、同じＰＢＳで試料セルをフラッシュし、複数実験の共鳴光散乱スペクトルを得た。
【０２４０】
相関結果から、ステップＢ（プロテインＧ’微粒子でのマウスＩｇＧの結合）後の共鳴シフトは基準（未結合の）状態に対して０．０５４±０．００７ｎｍであり、ステップＣ（マウスＩｇＧへの抗マウスＩｇＧの結合）後のシフトは基準（未結合の）状態に対して０．１１１±０．０１６ｎｍであることが分かった。したがって、ＩｇＧ分子の配向を制御しておくと、シフトは結合分子の大きさに比例した。
【０２４１】
実施例６
共鳴光散乱を利用したリアルタイムでの結合の検出
本実施例の目的は、共鳴光散乱を利用してガラス微粒子でのタンパク質の結合をリアルタイムで検出することについて示すことにあった。プロテインＧ’微粒子に対するマウスＩｇＧの結合を時間の関数として測定した。
【０２４２】
Ａ．ガラス微粒子でのプロテインＧ’の表面調製および誘導体化
実施例５（ステップＡ）で説明したものと同じ高屈折率ガラス微粒子（ＲＩ＝１．９、Ｍｏ−Ｓｃｉ  ＧＬ−０１７５）と同じプロテインＧ’導出プロトコールを利用して、プロテインＧ’微粒子を生成した。
【０２４３】
Ｂ．マウスＩｇＧの結合のリアルタイムでの検出
共鳴光散乱を利用したインサイチュでの結合の検出を行うために、実施例３で説明したものと同じ手順を利用した。マウスＩｇＧ結合前に、ｐＨ７．２、２５ｍＭ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５ｍＭ  ＮａＣｌ）ＰＢＳ緩衝液中にて、基準スペクトルとしてプロテインＧ’微粒子での共鳴光散乱スペクトルを得た。続いて、マウスＩｇＧ（シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、製品番号Ｉ５３８１、ロット番号０４２Ｋ９０２７）１５ｍＬを同じｐＨ７．２のＰＢＳ緩衝液に加えたものを、プロテインＧ’微粒子を仕込んだ試料セルに、流量約１．５ｍＬ／分で循環させながら約３０〜６０分間通した。５分ごとに、循環を停止させ、共鳴光散乱スペクトルを得た上で循環を再開した。このため、結合動態をリアルタイムにフォローすることができた。インキュベーション終了時、純粋なｐＨ７．２のＰＢＳ緩衝液で試料セルをフラッシュし、結合前に使用したものと同じ媒質で共鳴光散乱を測定した。これらのリアルタイム結合検出実験を、マウスＩｇＧ濃度１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬで実施した。自己相関分析を利用して共鳴波長のシフトを得た。
【０２４４】
試験したマウスＩｇＧ濃度で共鳴シフトの経時変化が認められる、この研究の結果を、表１にまとめるとともに図１６に示しておく。各データ点は３〜４個の異なる微粒子での平均であり、誤差指示線は測定の標準偏差を示す。これらのデータから明らかなように、試験したマウスＩｇＧ濃度が高くなればなるほど、共鳴シフトが時間の経過につれて大きくなったことから、結合率が高くなった。また、これらのデータでは、マウスＩｇＧ濃度が５０μｇ／ｍＬを超えると共鳴シフトならびに結果として結合が最大に達したが、一方、濃度１０μｇ／ｍＬだと飽和結合レベルの約７０％しか観察されなかったことも分かる。このように、共鳴光散乱の検出は準単一層結合検出の影響を受けやすい。
【０２４５】
【表１】
2006515420.tif 000005
【０２４６】
このプロセスには混合の関与する余地がなかったため、図１６に示す結合動態は拡散限定結合率を反映しただけのものである。実際の生物学的結合動態については、物質移動速度を高めるためのマイクロ流体混合装置を用いて、リアルタイムで測定できる。
【０２４７】
緩衝液でのフラッシュ後に測定した共鳴シフトは、インキュベーション終了時ではあるが緩衝液でのフラッシュ前に得られたものと同じであった。この結果から、緩衝生理食塩水中の低濃度のタンパク質分子は、スペクトルを得た媒質のスペクトルにほとんど何の影響もおよぼさなかったことが分かる。したがって、本願発明者らは、純粋な緩衝液にて得たスペクトルを、マウスＩｇＧ溶液で得たダイナミックデータに対する開始点および０シフト基準として利用することができた。タンパク質と核酸の濃度が高い、血清または細胞抽出物などの実際の生物試料では、共鳴光散乱スペクトルは単に媒質が変わっただけの理由でシフトする。こういった場合は、その生物試料の開始点をリアルタイム検出用の０シフトの基準点として利用することになろう。
【０２４８】
実施例７
共鳴光散乱検出を利用した血清バックグラウンドでのタンパク質結合アッセイ
本実施例の目的は、共鳴光散乱を利用した血清バックグラウンドでの特異的結合の検出について示すことにあった。微粒子にポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭ）を被覆して非特異的結合を減らし、続いて蛍光色素であるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８をＰＥＧＭコーティングの水酸基とカップリングした。蛍光色素をカップリングした粒子に対する抗Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８抗体の結合を、希釈したウサギ血清中にて共鳴光散乱を利用して検出した。
【０２４９】
Ａ．表面開始ＡＴＲＰ（原子移動ラジカル重合）を利用した微粒子での非特異的結合耐性層の形成
血清および細胞抽出物などの実際の生物試料では、通常は高濃度のタンパク質バックグラウンドに分析物が含まれる。微粒子に対してバックグラウンドタンパク質が非特異的に結合することで、偽の診断結果が得られてしまうため、これを防ぐ必要がある。本願発明者らは、表面開始ＡＴＲＰによって形成したポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭ）コーティングの層を利用して、微粒子への非特異的結合を低減した。
【０２５０】
ハッセマン（Ｈｕｓｓｅｍａｎ）ら（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ３２、１４２４〜１４３１（１９９９））が説明している合成手順を利用して、開始剤である５−トリクロロシリルペンチル２−ブロモ−２−メチルプロピオネートを調製した。続いて、後述するようにして、この開始剤を清浄済みのガラス微粒子と反応させた。実施例３（ステップＡ）で説明したものと同じ高屈折率ガラス微粒子（ＲＩ＝１．９、Ｍｏ−Ｓｃｉ  ＧＬ−０１７５）と同じ清浄手順を利用して、微粒子を使用前に真空オーブンにて１１０℃で一晩乾燥させた。ガラス製品をすべて清浄し、オーブンにて１１０℃で２時間から一晩かけて乾燥させた。乾燥トルエン（ＥＭ  サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、製品番号ＴＸ０７３２−６）１００ミリリットルを、２５０ｍＬ容の丸底フラスコに入れ、ピリジン（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、製品番号Ｐ５７５０６、バッチ番号０３０１２ＬＡ、使用前に４Åモレキュラーシーブで一晩乾燥）４５μＬを加えた。続いて、乾燥させた清潔な微粒子８ｇと５−トリクロロシリルペンチル２−ブロモ−２−メチルプロピオネート開始剤２５０μＬとを加えた。このフラスコをガラス栓で密閉し、室温にて強く攪拌しながら４時間反応を進めた。微粒子を濾過により単離し、トルエン１００ｍＬおよびアセトン１００ｍＬで順次すすいだ。続いて、微粒子を回収し、乾燥させ、オーブンにて１１０℃で２時間から一晩かけて硬化させた。
【０２５１】
これで、この開始剤付き粒子は重合できる状態になった。水溶液中、室温にてＡＴＲＰを行った。ホアン（Ｈｕａｎｇ）、同時係属中の米国特許出願第６０／４５１０６８号明細書（本願明細書に援用）に記載の開示内容に基づいて、上記の組成物を最適化した。ポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭモノマー、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、製品Ｐ４０９５３７、バッチ１５３０４ＢＣ、平均Ｍｎ＝３６０）４６グラムと脱イオン水１２０ｍＬとを、２５０ｍＬ容の丸底フラスコに加えた。この溶液を窒素下で０．５時間攪拌した。続いて、ビピリジル（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、製品Ｄ２１６３０５、バッチ０８０１５ＣＯ）０．４６ｇとＣｕＣｌ２（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、製品２０３１４９、ロット０４９０７ＥＡ）２８ｍｇとを加えたところ、無色の溶液が明るい青色に変わった。続いて、ＣｕＣｌ（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）２２４３３２、ロット０８３１９  ＪＡ）１４０ｍｇを加えたところ、溶液が暗い褐色に変化した。窒素パージをさらに１５分間継続し、続いて、開始剤付き微粒子２ｇを加えた。反応物を窒素雰囲気で密閉し、４時間放置した。その時間経過後、微粒子を濾過により単離し、色が洗い流されるまで大量の脱イオン水ですすいだ。続いて、微粒子を回収し、真空中、室温にて一晩乾燥させた。
【０２５２】
微粒子におけるＰＥＧＭコーティングの存在を、ＥＳＣＡ（化学分析用の電子分光）とＴｏＦ−ＳＩＭＳ（飛行時間型二次イオン質量分析）画像形成法で確認した。ＥＳＣＡでは、試料表面の一番上１００Åにおける元素組成が得られる。ＰＥＧＭ被覆微粒子および裸のガラス微粒子の表面の元素比率をＥＳＣＡで求めたものを表２に示す。この表のデータから明らかなように、Ｂａ、Ｔｉ、Ｂ、Ｃａ、Ｓｉなど、裸のガラス微粒子に含まれるほとんどのバルク元素は、Ｃが主要な元素であるＰＥＧＭ被覆微粒子の表面では検出されなかったか、そうでなければ有意に低いレベルで存在していることが明らかになった。この結果から、微粒子表面でのＰＥＧＭコーティングの占有率が良いことが分かる。ＴｏＦ−ＳＩＭＳ画像形成では、表面にある化学種の空間分布を得られ、これを利用して個々の微粒子におけるＰＥＧＭコーティングの均一性をチェックすることができる。ＴｏＦ−ＳＩＭＳ画像形成の結果から、表面にはバルク金属イオンの小さな点がいくつかある以外、ほとんどの微粒子の表面がＰＥＧＭコーティングで覆われたことが明らかになった。
【０２５３】
アビジン−ＦＩＴＣコンジュゲート（シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、製品番号Ａ２０５０、ロット０９１Ｋ４８４２）５０μｇ／ｍＬをｐＨ７．４、０．４Ｍ  ＰＢＳ緩衝液に加えたものからなる溶液に粒子を曝露することで、ＰＥＧＭ被覆微粒子へのタンパク質の非特異的吸着を試験した。裸の微粒子についても同じようにして処理して対照とした。微粒子の蛍光顕微鏡検査を行ったところ、ＰＥＧＭ被覆微粒子では対照に比してアビジンの非特異的吸着量が有意に減少したことが分かった。非特異的結合の減少は、ＰＥＧＭ被覆微粒子と対照微粒子の両方を、アビジン−ＦＩＴＣ溶液への曝露前に０．２５％ＢＳＡブロックステップで処理した後で大きくなった。
【０２５４】
【表２】
2006515420.tif 000006
【０２５５】
Ｂ．ＰＥＧＭ被覆微粒子の活性化と、これに対する蛍光色素プローブのカップリング
トリクロロ−ｓ−トリアジン（アブチョウスキ（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ），Ａ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏ．  Ｃｈｅｍ．  ２５２、３５７８〜３５８１および３５８２〜３５８６（１９７７））、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（バートリング（Ｂａｒｔｌｉｎｇ），Ｇ．Ｊ．ら  Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、２４３、３４２〜３４４（１９７３））、塩化トシルおよび塩化トレシルなどの有機塩化スルホニル（ニルソン（Ｎｉｌｓｓｏｎ），Ｋ．およびモスバッハ（Ｍｏｓｂａｃｈ），Ｋ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９８４、１０４、第５６〜６９ページ）をはじめとする、多くの異なる化学的な方法を利用して、ＰＥＧＭコーティングをさらに活性化し、生物配位子にコンジュゲートすることが可能である。このプロセスは一般に、ＰＥＧＭ鎖の水酸基と反応させることで、タンパク質分子中のアミンまたはスルフヒドリル基などの求核性残基と容易にカップリングできる反応性求電子性中間体を生成して行われる。中性ｐＨ、おだやかな条件でカップリング生成物の収率が高くなり、結果の安定性が良好であることから、塩化トレシルを選択した。
【０２５６】
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８を配位子例として利用した場合の、ＰＥＧＭ被覆微粒子の活性化と配位子カップリング向けのプロトコールは以下のとおりとした。上述したようにして用意しておいた乾燥ＰＥＧＭ被覆ガラス微粒子（２ｇ）を、アセトン：水（ｖ／ｖ）３０：７０および７０：３０、アセトンで２回、乾燥アセトン（アセトン１リットルあたりモレキュラーシーブ２５ｇの比で４Åモレキュラーシーブにて一晩乾燥させたもの）で３回を各々５０ｍＬで連続的に洗浄した。続いて、このＰＥＧＭ被覆ガラス微粒子を、乾燥アセトン７ｍＬと、使用前に４Åモレキュラーシーブで一晩乾燥させた乾燥ピリジン３５０μＬとが入った乾燥したフラスコに移した。この混合物をマグネティックスターラーで攪拌し、氷／水浴に入れた。塩化トレシル（３６０μＬ）（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、製品番号３２４７８７、バッチ番号０１９１０ＡＢ）を１０分の時間をかけて懸濁液に滴下して加えた。続いて、攪拌しながら氷／水浴中にて反応を１．５時間継続させた。反応の終了時、微粒子を濾過により単離し、アセトン；アセトン中５ｍＭ  ＨＣｌ３０％、５０％、７０％（ｖ／ｖ）；最後に、１ｍＭ  ＨＣｌをそれぞれ５０ｍＬずつで２回洗浄した。活性化微粒子を真空中で室温にて軽く乾燥させ、デシケーター内で４℃にて保管した。
【０２５７】
以下の手順を使用して、カップリング緩衝液としての０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．２中、トレシル化微粒子にＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８色素をカップリングした。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヒドラジド、ナトリウム塩（オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ）のモレキュラープローブス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）、製品番号Ａ−１０４３６、ロット３４Ｃ１）１ミリグラムをカップリング緩衝液２ｍＬに溶解させた。マイクロ濃縮器を利用して上述のようにトレシル化微粒子（０．５ｇ）を冷たいカップリング緩衝液で軽く洗浄し、続いてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８溶液に移した。３６時間４℃にて攪拌しながらカップリング反応を進行させた。続いて上清をピペットで取り出し、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５緩衝液中０．１Ｍメルカプトエタノールで５時間反応物を急冷した。０．２Ｍ酢酸ナトリウム−０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．５緩衝液、０．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液、蒸留水、０．２Ｍ、ｐＨ７．５  ＰＢＳ緩衝液で順に微粒子を洗浄した。微粒子を室温にて軽く乾燥させ、後で使用するために冷蔵庫で保管した。
【０２５８】
直接ＥＬＩＳＡでＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８微粒子を試験してカップリングがうまくいっていることを確認するとともに、実施例５のステップＡで説明したものと同じ手順でプローブ密度を判定した。ＥＺ−ＬｉｎｋＴＭプラス活性化ペルオキシダーゼキット（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）、カタログ番号３１４８９）とモレキュラープローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）（カタログ番号Ａ−１１０９４）から入手した抗−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ウサギＩｇＧとを利用して、抗−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲートを調製した。対照微粒子試料で観察された吸光度は極めて低かったため、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８微粒子での高い酵素コンジュゲート濃度で得られた飽和吸光度を利用してＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８表面密度を算出した。算出した表面密度は微粒子１グラムあたり０．４２ｐｍｏｌであった。この場合、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８表面密度を補正する酵素活性抑制係数の判定には何もしなかった。
【０２５９】
Ｃ．血清バックグラウンドにおける抗体結合の検出
モレキュラープローブス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）から抗−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ウサギＩｇＧ画分（製品番号Ａ−１１０９４、ロット番号７５８１）を入手し、ウサギ血清１０ｍｇ／ｍＬを用いて５０μｇ／ｍＬの濃度まで希釈して、ステップＢで説明したようにして調製したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８色素結合微粒子への結合を試験した。タンパク質５０ｍｇ／ｍＬを含有するウサギ血清（シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）製品Ｒ９１３３、ロット０４１Ｋ９０８９）を、ｐＨ７．２、２５ｍＭ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５ｍＭ  ＮａＣｌ）ＰＢＳ緩衝液で希釈し、タンパク質濃度を１０ｍｇ／ｍＬにした。共鳴光散乱での結合検出の前に、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８色素結合微粒子約５０ｍｇを１０ｍｇ／ｍＬウサギ血清溶液１．５ｍＬ中にて１時間インキュベートし、非特異的結合部位をさらにブロックした。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８色素結合微粒子をＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した後、ＰＢＳ緩衝液に分散させた。これらの分散Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８色素結合微粒子を結合実験のために試料セルに仕込んだ。共鳴光散乱を利用したインサイチュでの結合の検出を行うために、実施例３で説明したものと同じ手順を利用した。ウサギＩｇＧの結合前に、基準スペクトルとして、ｐＨ７．２、２５ｍＭ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５ｍＭ  ＮａＣｌ）ＰＢＳ緩衝液中でＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８色素結合微粒子の共鳴光散乱スペクトルを得た。続いて、同じｐＨ７．２のＰＢＳ緩衝液中、ウサギ血清タンパク質１０ｍｇ／ｍＬを含有する溶液１２ｍＬを、試料セルに流量約１．５ｍＬ／分で循環させながら０．５時間通し、非特異的結合を試験した。続いて、純粋なｐＨ７．２のＰＢＳで試料セルをフラッシュし、基準スペクトルを得たものと同じ媒質で共鳴光散乱を測定した。その後、ウサギ血清１０ｍｇ／ｍＬ中抗−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ウサギＩｇＧ  ５０μｇ／ｍＬを含有する溶液１０ｍＬを、試料セルに流量約１．５ｍＬ／分で循環させながら０．５時間通した。インキュベーション終了時、純粋なｐＨ７．２のＰＢＳで試料セルをフラッシュし、基準スペクトルを得たものと同じ媒質で共鳴光散乱を測定した。
【０２６０】
自己相関分析を利用して、血清バックグラウンド試験ステップおよび抗−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ウサギＩｇＧ結合ステップ用に共鳴波長のシフトを得た。バックグラウンド試験ステップとウサギＩｇＧ結合ステップの平均シフトはそれぞれ、０．００４±０．００４ｎｍおよび０．０３７±０．００６ｎｍであった。これらの値は、３個の異なる微粒子と９つの異なるレーザ走査前後の実験対の平均である。波長シフトの結果から、バックグラウンド試験ステップではシフトがほとんどないことが分かり、非特異的結合に対する耐性が良好であろうと思われた。ウサギＩｇＧ結合ステップでの波長シフトは、おそらく異なる系での結合強度が低いことから、プロテインＧ’−マウスＩｇＧ結合（実施例５）で観察されたものよりかなり小さかった。
【０２６１】
実施例８
共鳴光散乱検出を利用したＥ．  ｃｏｌｉ細胞抽出物バックグラウンドにおける複数タンパク質の結合アッセイ
本実施例の目的は、Ｅ．  ｃｏｌｉ細胞抽出物バックグラウンドにおける２種類のプローブ微粒子混合物での共鳴光散乱を利用した多重アッセイについて示すことにあった。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８とマウスＩｇＧ微粒子との混合物を多重アッセイに利用し、それぞれの対応する抗体に対する粒子の結合を共鳴光散乱で検出した。
【０２６２】
Ａ．Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８微粒子およびマウスＩｇＧ微粒子の調製
ＰＥＧＭコーティングは同一であるが捕捉配位子が異なる、すなわち、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８とマウスＩｇＧである、２種類のプローブ微粒子を、実施例７（ステップＡおよびステップＢ）で説明した手順に従って調製した。ＰＥＧＭコーティングを利用して高タンパク質濃度のバックグラウンドにおける非特異的結合を防止した。ＰＥＧＭコーティング、塩化トレシル活性化、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８の活性化微粒子へのカップリングで利用する手順については、実施例７で説明する。マウスＩｇＧを塩化トレシル活性化微粒子に同じようにしてカップリングした。ＰＢＳ緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ８．２）をカップリング緩衝液として利用した。マウスＩｇＧ（シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、製品Ｉ  ５３８１）１０ミリグラムをカップリング緩衝液に溶解させ、１ｍｇ／ｍＬの溶液を生成した。塩化トレシル活性化微粒子（０．５ｇ）を冷カップリング緩衝液で軽く洗浄し、マウスＩｇＧ溶液５ｍＬに移した。微粒子懸濁液を約３６時間４℃で攪拌した。続いて上清をピペットで取り出し、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５緩衝液中０．１Ｍメルカプトエタノール（アルドリッチケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．）製品Ｍ３７０１）からなる溶液５ｍＬで５時間反応物を急冷した。続いて、０．２Ｍ酢酸ナトリウム−０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．５緩衝液、０．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液、蒸留水、さらには０．２Ｍ、ｐＨ７．５ＰＢＳ緩衝液で微粒子を連続洗浄した。微粒子を室温にて軽く乾燥させ、使用するまで冷蔵庫で保管した。
【０２６３】
Ｂ．Ｅ．  ｃｏｌｉ細胞抽出物の調製
Ｅ．  ｃｏｌｉ細胞抽出物を、多重アッセイデモンストレーション用の競合タンパク質バックグラウンドとして利用した。Ｅ．  ｃｏｌｉ細菌細胞（０．５ｍＬ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）のインビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏ．）、ＤＨ１０ＢＴＭ細胞、カタログ番号１８２９０−０１５、ロット１１７２４７４）を２５０ｍＬのミラーＬＢブロス（ヴァージニア州ハーンドン（Ｈｅｒｎｄｏｎ）のメディアテック社（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）、カタログ番号４６−０５０ＣＭ  ロット４６０５０００９）に接種し、振盪インキュベーターにて３７℃、２２５ｒｐｍで一晩、培養をインキュベートした。５，０００×ｇで１５分間の遠心分離を利用して細胞を回収した。細胞ペレットの量は約１．０ｇであった。細胞ペレットから上清を除去し、ＣｅｌＬｙｔｉｃＴＭ  Ｂ細菌細胞溶解試薬（シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）製品Ｂ３５５３、ロット０５２ｋ９３１９）１５ｍＬを加え、懸濁液を十分に混合して細胞を完全に再懸濁させた。この細胞抽出懸濁液を振盪しながら室温にて１５分間インキュベートして細胞を完全に抽出し、２５，０００×ｇで２０分間遠心分離して不溶物をペレット化した。可溶性タンパク質を含有する上清を慎重に除去した。可溶性タンパク質の約９０〜９５％がこの画分で認められた。ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法（上記ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ））で総タンパク質濃度を求めたところ、４．４ｍｇ／ｍＬであった。
【０２６４】
Ｃ．Ｅ．  ｃｏｌｉ細胞抽出物のバックグラウンドにおける抗体結合の検出
共鳴光散乱を利用した多重アッセイについて示すために、ステップＡで調製したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８微粒子とマウスＩｇＧ微粒子とを同じ重量で混合した。この微粒子混合物を、１０ｍＭ、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液中１％ＢＳＡ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、製品Ｂ４２８７）１．５ｍＬで室温にて３時間インキュベートし、非特異的結合部位をさらにブロックした。このインキュベーションに続いて、ＰＢＳ緩衝液１．５ｍＬで２回洗浄し、ＰＢＳ緩衝液に再懸濁させた。続いて、懸濁させた微粒子を結合実験用に試料セルに仕込んだ。どの微粒子がＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８で標識されたかを判定するために、４８８ｎｍのＡｒイオンレーザ（２５ｍＷ、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）のオムニクローム社（Ｏｍｎｉｃｈｒｏｍｅ  Ｃｏｒｐ．））を用いて蛍光色素を励起させ、励起カットオフ高域通過フィルタを出力光路に挿入して蛍光の放出を調べた。蛍光発光性微粒子と非蛍光発光性微粒子の両方を含むフィールドを共鳴光散乱実験用に選択した。蛍光発光性微粒子はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識微粒子であり、非蛍光発光性微粒子はマウスＩｇＧ−標識微粒子であると思われた。この図の蛍光画像とプレーンな画像を比較のために図１７に示す。この研究では、共鳴光散乱を識別できるようにする上で必要な自動パターン認識ソフトウェアを利用できなかったため、蛍光を使って粒子を識別した点に注意されたい。実験のあいだ微粒子は適所に保たれたため、その位置を利用して微粒子を追跡した。しかしながら、必要なソフトウェアがあれば、実施例１および２に示すような粒子の識別と追跡ならびに結合の検出に、共鳴光散乱を利用することも可能であろう。
【０２６５】
共鳴光散乱を利用したインサイチュでの結合の検出を行うために、実施例３で説明したものと同じ手順を利用した。まず、基準スペクトルとして、ｐＨ７．２、２５ｍＭ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５ｍＭ  ＮａＣｌ）ＰＢＳ緩衝液中で選択した微粒子の共鳴光散乱スペクトルを得た。続いて、３回の結合ステップの測定を実施し、競合バックグラウンドタンパク質からの非特異的結合があるか否かをチェックするとともに、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８プローブとウサギ抗−マウスＩｇＧとの間ならびに、マウスＩｇＧプローブと抗Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ウサギＩｇＧとの間に交叉反応があるかどうかを試験した。ステップ１では、バックグラウンドの試験として、同じＰＢＳ緩衝液中Ｅ  ．ｃｏｌｉ細胞抽出タンパク質２．２ｍｇ／ｍＬからなる溶液１２ｍＬを、試料セルに流量約１．５ｍＬ／分で循環させながら０．５時間通した。ステップ２では、抗−Ａｌｅｘａ  ４８８ウサギＩｇＧ（モレキュラープローブス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）製品番号Ａ−１１０９４、ロット番号７５８１）をステップ１で用いたものと同じ細胞抽出物溶液に加え、作業濃度を５０μｇ／ｍＬとし、この溶液を試料セルに流量約１．５ｍＬ／分で循環させながら０．５時間通して微粒子に対する抗−Ａｌｅｘａ  ４８８ウサギＩｇＧの結合を試験した。ステップ３では、ウサギ抗−マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（非結合、ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）、製品３１１８８、ロットＥＥ７６１５２７）をステップ２で使った溶液に加えて作業濃度を５０μｇ／ｍＬとし、この溶液を試料セルに流量約１．５ｍＬ／分で循環させながら０．５時間通して微粒子に対する抗−マウスＩｇＧの結合を試験した。各ステップの後にはＰＢＳ緩衝液での洗浄を行い、それぞれの洗浄ステップの後にスペクトルを得た。
【０２６６】
細胞抽出物バックグラウンド試験ステップ、抗−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ウサギＩｇＧ結合ステップ、ウサギ抗−マウスＩｇＧ結合ステップの後に、自己相関分析を利用してＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８微粒子とマウスＩｇＧ微粒子の両方について共鳴波長のシフトを得た。結果を表３にまとめておく（シフトはいずれも開始時に得たスペクトルを基準にしたものである）。以下の表に示す値は、３個の異なる微粒子と９つの異なるレーザ走査前後の実験対の平均である。
【０２６７】
【表３】
2006515420.tif 000007
【０２６８】
表３のデータから明らかなように、両方のタイプの微粒子でのバックグラウンド試験ステップでの平均シフトはほぼ０であったことから、バックグラウンドタンパク質の非特異的結合がないことが分かった。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８微粒子では、第２のステップでの抗−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ウサギＩｇＧ結合時に０．０３４±０．００６ｎｍで対応する共鳴波長のシフトが認められ、そのシフトが第３のステップでほぼ変化しないまま保たれた。マウスＩｇＧ微粒子では、第２のステップでシフトがほぼ０、第３のステップでのシフトは０．０５６±０．００７ｎｍであった。これらの結果から、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８プローブに対する抗−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ウサギＩｇＧの結合とマウスＩｇＧプローブに対する抗−マウスＩｇＧの結合を除いて、２つの抗体と２つの配位子の間には交叉反応がなかったことが明白である。これらの結果は、多重アッセイでの検出に共鳴光散乱が役立つことを示している。
【０２６９】
実施例９
共鳴光散乱を利用した特異的ＤＮＡ分析物検出用のＤＮＡプローブ結合微粒子
本実施例の目的は、核酸プローブに結合した微粒子を利用して核酸分析物を特異的に検出するのに共鳴光散乱を利用することについて示すことにあった。蛍光標識分析物をアッセイ対照として用いて、ＤＮＡプローブ−微粒子に対する分析物の特異的結合を確認した。
【０２７０】
Ａ．微粒子の調製
高屈折率ガラス微粒子（カタログ番号ＧＬ−０１７５、ミズーリ州ローラ（Ｒｏｌｌａ）のＭｏ−Ｓｃｉ社（Ｍｏ−Ｓｃｉ  Ｃｏｒｐ．））を実施例３で説明したようにして調製した。核酸オリゴマープローブへのカップリングについて実施例３で説明したように、清浄済みのガラス微粒子をシラン化して表面反応性アミン基を生成した。このアミン誘導体化ガラス微粒子を、スルホスクシンイミジル（ＮＨＳ）４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）をアミン基にカップリングすることで、さらにマレイミド基で誘導体化した。アミン誘導体化ガラス微粒子４００ｍｇのアリコートを、１３０ｍＭ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６、スルホ−ＳＭＣＣ（イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）のピアースバイオテクノロジー社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）、製品番号２２３２２）１３．３ｍｇ／ｍＬと３３．３％ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）とからなる反応混合物に加えた。この混合物を１．５ｍＬ容の丸底チューブに入れ、これを室温にて１時間回転させて表面のアミンをスルホ−ＳＭＣＣのＮＨＳ基と反応させた。マレイミド誘導体化微粒子を、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７．２（ＰＢＳ）５００μＬで室温にて洗浄した。ソーバルマイクロスピン（Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ）微量遠心機（コネチカット州ニュータウン（Ｎｅｗｔｏｗｎ）のケンドロラボラトリープロダクツ（Ｋｅｎｄｒｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））にて１２，０００ｒｐｍで室温にて、マイクロ濃縮器（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）１００、マサチューセッツ州ベバリー（Ｂｅｖｅｒｌｅｙ）のアミコンＡｍｉｃｏｎ，  Ｗ．Ｒ．  Ｇｒａｃｅ  Ｃｏ．）を用いて、懸濁微粒子を遠心分離して緩衝液を除去した。マイクロ濃縮器を用いて微粒子をＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。マレイミド誘導体化微粒子ペレットを１．５ｍＬ容の第２の丸底反応管に移し、４℃で保管した。
【０２７１】
実施例７で説明したようなＰＥＧＭコーティングを使用して、非特異的結合耐性層のある第２の微粒子セットを生成した。実施例７で説明したように、チオ活性化オリゴヌクレオチドとのコンジュゲーションのために、ＰＥＧＭ表面を塩化トレシルで活性化させた。
【０２７２】
Ｂ．オリゴヌクレオチドプローブとオリゴヌクレオチドプローブ結合微粒子の調製
エバーソール（Ｅｂｅｒｓｏｌｅ）らによる同時係属中の米国特許出願第６０／４３４９７４号明細書（本願明細書に援用）に記載されている、配列番号１として示す手足口病（ＦＭＤ）合成標的核酸配列を特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ配列を設計した。アッセイに利用したＦＭＤオリゴヌクレオチドプローブ特異的配列（ＪＢＰ）は、配列番号２で示す５’  ＴＣＡＡＣＣＡＧＡＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＣＡＴＧＴＣＡＡＣＡＡＡＡＣＡＣＧＧＡＣＣＣＧＡＣＴＴＡＡ  ３’であった。この配列を後述するようにして５’末端と３’末端で修飾し、配列番号３で示す修飾ＦＭＤプローブ（ＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｂ）：Ｃ６−Ｓ−Ｓ（Ｓｐ）２−ＴＣＡＡＣＣＡＧＡＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＣＡＴＧＴＣＡＡＣＡＡＡＡＣＡＣＧＧＡＣＣＣＧＡＣＴＴＡＡ−Ｂ  ３’を得た。「Ｂ」はＤＮＡ合成時に、β−シアノエチルホスホラミダイト合成化学（ビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）  ＣＰＧ、ヴァージニア州スターリング（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ）のグレンリサーチ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ））に用いられる細孔ガラス固体担体に付着させた３’カップリング試薬として配列に加えた、３’ビオチン基である。「Ｓｐ」は、１８原子スペーサーアームホスホラミダイト、１８−Ｏ−ジメトキシトリチルヘキサエチレングリコール，１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト（ヴァージニア州スターリング（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ）のグレンリサーチ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ））を示す。β−シアノエチル化学を利用して、これらのスペーサー部分のうちの２つをプローブ配列とプローブ架橋部分との間の５’末端にカップリングし、分子スペーサとして機能させた。「Ｃ６−Ｓ−Ｓ」（１−Ｏ−ジメトキシトリチルヘキシル−ジスルフィド、１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、ヴァージニア州スターリング（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ）のグレンリサーチ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ））は、架橋チオール修飾因子として用いたジスルフィド部分である。
【０２７３】
マレイミド誘導体化微粒子へのカップリング用の修飾ＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｂプローブを調製するために、０．２Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８．３中１００ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）４００μＬを用いて、７０ｎｍｏｌのプローブからジスルフィド修飾因子を切断し、チオール活性化プローブを作製した。３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．４を１００μＬと１００％エタノール１０００μＬとを加えて十分に混合することで、エタノール沈殿を利用して上記のチオール活性化プローブをＣ６−チオ基およびＤＴＴから精製した。ＤＮＡ沈殿物をソーバルマイクロスピン（Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ）微量遠心機にて１２，０００ｒｐｍで室温での遠心分離により遠心してペレット化した。このオリゴヌクレオチドペレットを７０％エタノールで２回洗浄し、２回蒸留水２００μＬに溶解させた。
【０２７４】
パートＡで説明したようにして調製した、マレイミド誘導体化微粒子（４００μｇ）を、チオール活性化ＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｂプローブとのカップリング用に、１．５ｍＬ容の丸底反応管に移した。上述のように調製したチオール活性化ＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｂプローブ（７０ｎｍｏｌ）を反応管に加えた。続いて、ＰＢＳ５００μＬ、ｐＨ７．４を加えて反応管を回転させ、微粒子を混合して再懸濁させる目的で室温にて２時間、表面のマレイミド基をチオール活性化プローブと反応させた。ＤＮＡプローブ結合微粒子を室温にてＰＢＳ５００μＬで洗浄した。ソーバルマイクロスピン（Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ）微量遠心機にて１２，０００ｒｐｍで室温にて、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）１００マイクロ濃縮器を用いて、懸濁微粒子を遠心分離してＰＢＳを除去した。微粒子をＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、続いてＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｂプローブ結合微粒子ペレットを１．５ｍＬ容の微量遠心管に移し、４℃で保管した。
【０２７５】
もうひとつのプローブすなわち、配列番号４で示すＮ−ＪＢＣ（５’  ＮＨ２−ＴＴＡＡＧＴＣＧＧＧＴＣＣＧＴＧＴＴＴＴＧＴＴＧＡＣＡＴＧＴＣＣＴＣＣＴＧＣＡＴＣＴＧＧＴＴＧＡ−Ｂ  ３’）は、ＭＷＧ  バイオテック社（Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）（ノースカロライナ州ハイポイント（Ｈｉｇｈ  Ｐｏｉｎｔ））によって合成された。このプローブには、５’アミン基と３’ビオチン基とが含まれていた。このプローブを５’アミンによってトレシル活性化ＰＥＧＭ微粒子にカップリングした。具体的には、１００μＭ  Ｎ−ＪＢＣ  ＤＮＡ  １００μＬを、０．２Ｍ  ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ８．２中、トレシル化ＰＥＧＭ微粒子４０ｍｇと一緒に３日間室温にてインキュベートした。続いて、このＮ−ＪＢＣプローブ結合微粒子を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）１００マイクロ濃縮器を用いて０．１Ｍ  ＰＢＳ、ｐＨ７．２中にて２回洗浄した。微粒子ペレットを１．５ｍＬ容の微量遠心管に移した。このＮ−ＪＢＣプローブ結合微粒子をＪＢＣ−ＰＥＧＭとし、４℃で保管した。
【０２７６】
Ｃ．蛍光を利用したＤＮＡプローブ結合微粒子へのＦＭＤオリゴヌクレオチド標的ＤＮＡのハイブリダイゼーション捕捉の検出
３’フルオレセインタグ（ＪＢＣ−Ｆ）、具体的には、ＪＢＰプローブ配列（配列番号２および配列番号３）と相補的である、配列番号５で示す５’  ＴＴＡＡＧＴＣＧＧＧＴＣＣＧＴＧＴＴＴＴＧＴＴＧＡＣＡＴＧＴＣＣＴＣＣＴＧＣＡＴＣＴＧＧＴＴＧＡ−Ｆ  ３’で標識したＦＭＤ特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチド標的を利用して、微粒子プローブの機能性を試験した。ＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｂプローブに対して相補的な配列を持たない第２のオリゴヌクレオチドを設計し、フルオレセイン標識非特異的標的対照（Ｌａｃ２−Ｆ）すなわち、配列番号６で示す５’  ＴＧＡＡＴＴＴＧＡＴＴＧＣＧＡＧＴＧＡＧＡＴＡＴＴＴＡＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＣＧＣＡＧＡＣ−Ｆ  ３’として作用させた。
【０２７７】
ＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｂプローブ修飾微粒子（２μＬ）を、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ緩衝液２０μＬ中、１０μＭ  ＪＢＣ−Ｆ（配列番号５）またはＬａｃ２−Ｆ（配列番号６）２μＬと混合し、ローリングミキサにて室温で１時間ハイブリダイズした。チューブを軽く遠心して微粒子をペレット化し、上清を除去した。続いて、軽くボルテックスおよび遠心分離しながら、アッセイ微粒子を、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ緩衝液のアリコート２００μＬで３回洗浄した。最終洗浄後、微粒子を０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ緩衝液５０μＬに懸濁させた。各試料から得た懸濁微粒子１マイクロリットルを、ベクタシールド（ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ）（登録商標）マウンティングメディウム（Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ）（カリフォルニア州バーリンゲーム（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）のベクターラボラトリーズ社（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．））２μＬにてスライドガラスにのせた。スポットＲＴＫＥ  ＣＣＤカメラ（ミシガン州スターリングハイツ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  Ｈｅｉｇｈｔｓ）のダイアグノスティックインスツルメンツ社（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｉｎｃ．））を取りつけた蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ  ４０、カールツァイスマイクロイメージング社（ニューヨーク州ソーウッド（Ｔｈｏｒｗｏｏｄ）のＣａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ，  Ｉｎｃ．））下で試料を観察した。
【０２７８】
得られた蛍光顕微鏡写真から、ＪＢＣ−Ｆ  ＤＮＡ標的はＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｂ−結合微粒子に捕捉されるが、Ｌａｃ２−Ｆ非特異的対照標的は捕捉されないことが分かった。標的のないＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｂ−結合微粒子のバックグラウンドの自己蛍光についても試験した。自己蛍光は、フルオレセイン標識ＪＢＣ−Ｆ標的の結合による蛍光よりも弱かった。これらの結果から、ＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｂ−結合微粒子がＪＢＣ−Ｆ標的配列に特異的であることが分かった。
【０２７９】
Ｄ．共鳴光散乱を利用したＤＮＡプローブ結合微粒子へのＦＭＤオリゴヌクレオチド標的ＤＮＡのハイブリダイゼーション捕捉の検出
次に、共鳴光散乱を利用して、ＤＮＡプローブ結合微粒子へのＤＮＡ標的の結合を検出した。使用した手順は実施例２および３で説明したものと同様とした。パートＡおよびＢで説明したようにして調製したＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｂプローブ結合微粒子を、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  ナトリウムリン酸緩衝液、ｐＨ７．４（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ緩衝液）に分散させた。この懸濁液の２μＬのアリコートを、実施例３で説明して図６に示した事例と同様にして光学フローセルに入れた。少数（２〜６）の微粒子が含まれる視野を選択した。アッセイのバックグラウンドスペクトルを判定するために「予備走査」測定値を得た。実施例３で説明したように、続いて７７０から７８０ｎｍの間で５０秒間ダイオードレーザ光源を走査し、１５００枚の画像を捕捉して、画素スタックファイルとして格納し、システムのパーソナルコンピュータにインストールしたソフトウェアで分析した。実施例３で説明して図８に示した事例と同様にして、視野内のいくつかの微粒子を以後の詳細なスペクトル分析用に選択した。実施例２で説明したようにして波長依存性散乱光画像の全セットを分析することで、この粒子からの散乱光スペクトルを得た。ＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｂプローブ結合微粒子から得た散乱光スペクトルは、実施例２で説明して図９に示した事例と同様であった。
【０２８０】
共鳴光散乱アッセイを後述のように実施し、各インキュベーション／洗浄ステップ後にスペクトル測定値を得た。０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ緩衝液中、濃度１μＭの対照Ｌａｃ２−Ｆ標的ＤＮＡ約５ｍＬを、ＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｂプローブ結合微粒子に流量約１ｍＬ／分で連続して流し、廃棄物として回収した。続いて、廃液チューブを元の試料に戻し入れ、標的ＤＮＡの残りの５ｍＬを閉ループシステムで１時間再循環させた。続いて、ＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｂプローブ結合微粒子を０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ緩衝液１０ｍＬで洗浄し、廃液を破棄した。洗浄後に、ＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｂプローブ結合微粒子の共鳴光散乱スペクトルスキャンを得た。続いて、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ緩衝液中、プローブ特異的ＪＢＣ−Ｆオリゴヌクレオチド標的の１μＭ試料約５ｍＬをフローセルに加え、微粒子に１時間連続して流した。続いて、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ緩衝液１０ｍＬで上記の微粒子を洗浄した。繰り返すが、洗浄後にＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｂプローブ結合微粒子の共鳴光散乱スペクトルスキャンを得た。
【０２８１】
結果を表４に示す。微粒子に対するＬａｃ２−Ｆ標的オリゴヌクレオチドの非特異的結合時に、共鳴光の散乱パターンにおける負のシフトが観察された。また、ＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｂプローブ結合微粒子に対する特異的ＪＢＣ−Ｆ標的オリゴヌクレオチドの結合時に、共鳴光の散乱パターンにおける有意な負のシフトが観察された。これらの結果から、非特異的または特異的オリゴヌクレオチド標的に対するオリゴヌクレオチドプローブ結合微粒子の結合によって、粒子の共鳴光散乱スペクトルに負の共鳴波長シフトが生じることが分かる。また、これらの結果は、共鳴光散乱を用いて微粒子にカップリングした特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブへのオリゴヌクレオチドＤＮＡ標的の結合を検出することについても示している。
【０２８２】
【表４】
2006515420.tif 000008
【０２８３】
Ｅ．蛍光を利用したＤＮＡプローブ結合ＰＥＧＭ被覆微粒子へのＦＭＤオリゴヌクレオチド標的ＤＮＡのハイブリダイゼーション捕捉の検出
配列番号７で示す、３’フルオレセインタグ（ＪＢＰ−Ｆ）（５’  ＴＣＡＡＣＣＡＧＡＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＣＡＴＧＴＣＡＡＣＡＡＡＡＣＡＣＧＧＡＣＣＣＧＡＣＴＴＡＡ−Ｆ  ３’）で標識されたＦＭＤ特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチド標的を用いて、微粒子プローブの機能性を試験した。フルオレセイン標識非特異的標的（Ｌａｃ２−Ｆ）配列番号６を対照として用いた。
【０２８４】
Ｎ−ＪＢＣプローブ結合ＰＥＧＭ被覆微粒子（ＪＢＣ−ＰＥＧＭ）２マイクロリットルを０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ緩衝液２０μＬ中１０μＭ  ＪＢＰ−ＦまたはＬａｃ２−Ｆ（配列番号６）２μＬと混合し、ローリングミキサで室温にて１時間ハイブリダイズした。微粒子を遠心分離により軽くペレット化し、上清を除去した。続いて、軽くボルテックスおよび遠心しながら、微粒子を０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ緩衝液２００μＬで３回洗浄した。続いて、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ緩衝液５０μＬに微粒子を懸濁させた。各試料から得た懸濁微粒子１マイクロリットルをスライドガラスにのせ、蛍光顕微鏡下で上述のように観察した。
【０２８５】
得られた蛍光顕微鏡写真から、特異的ＪＢＰ−Ｆ  ＤＮＡ標的は微粒子に捕捉されたがＬａｃ２−Ｆ非特異的対照標的は捕捉されなかったことが分かる。これらの結果は、Ｎ−ＪＢＣプローブ結合ＰＥＧＭ被覆微粒子がＪＢＰ−Ｆ標的ＤＮＡに対して特異的であったことを示している。
【０２８６】
Ｆ．共鳴光散乱を利用したＤＮＡプローブ結合ＰＥＧＭ被覆微粒子へのＦＭＤオリゴヌクレオチド標的ＤＮＡのハイブリダイゼーション捕捉の検出
共鳴光散乱を利用して、Ｎ−ＪＢＣプローブ結合ＰＥＧＭ被覆微粒子への標的ＤＮＡの結合を検出した。使用した手順は実施例２および３で説明したものと同様とした。ＪＢＣ−ＰＥＧＭ微粒子を０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍナトリウムリン酸緩衝液、ｐＨ７．４（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ緩衝液）に分散させた。この懸濁液のアリコート２μＬを光学的フローセルに入れた。「予備走査」測定結果を得てアッセイのバックグラウンドスペクトルを判定し、実施例３にて上述し、図８に示したものと同様に、視野内のいくつかの微粒子を以後の詳細なスペクトル分析用に選択した。ＪＢＣ−ＰＥＧＭ微粒子から取得した散乱光スペクトルは実施例２にて説明し、図９に示したものと同様であった。
【０２８７】
共鳴光散乱アッセイを後述のように実施し、各インキュベーション／洗浄ステップ後にスペクトル測定値を得た。０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ緩衝液中、濃度１μＭの対照Ｌａｃ２−Ｆ標的ＤＮＡ約５ｍＬを流量約１ｍＬ／分でＪＢＣ−ＰＥＧＭ微粒子に連続して流し、廃棄物として回収した。続いて、廃液チューブを元の試料に戻し入れ、標的ＤＮＡの残りの５ｍＬを閉ループシステムで１時間再循環させた。続いて、微粒子を０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ緩衝液１０ｍＬで洗浄し、廃液を破棄した。洗浄後に微粒子の共鳴光散乱スペクトルスキャンを得た。
【０２８８】
前の微粒子をセルから取り出し、新しいＪＢＣ−ＰＥＧＭ微粒子と交換した。繰り返すが、アッセイのバックグラウンドスペクトルを「予備走査」測定によって判定した。続いて、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ緩衝液中プローブ特異的ＪＢＰ−Ｆオリゴヌクレオチド標的の１μＭの試料約５ｍＬをフローセルに加え、微粒子に連続して流した。続いて、廃液チューブを元の試料に戻し入れ、標的ＤＮＡの残りの５ｍＬを閉ループシステムで１時間再循環させた。続いて、微粒子を０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ緩衝液１０ｍＬで洗浄した。繰り返すが、洗浄後に微粒子の共鳴光散乱スペクトルスキャンを得た。
【０２８９】
結果を表４に示す。ＪＢＣ−ＰＥＧＭ微粒子に対するＬａｃ２−Ｆ標的オリゴヌクレオチドの非特異的結合時に、共鳴光の散乱パターンに有意ではない負のシフトが観察された。共鳴光の散乱パターンにおける有意な負のシフトは、ＪＢＣ−ＰＥＧＭ微粒子への特異的ＪＢＰ−Ｆ標的オリゴヌクレオチド結合で観察された。これらの結果から、ＤＮＡプローブ結合ＰＥＧＭ被覆微粒子は上述の未被覆のＤＮＡプローブ結合微粒子と挙動は同様であるが、非特異的標的のバックグラウンド共鳴が少ないことが分かる（表４）。
【０２９０】
実施例１０
共鳴光散乱を利用したＤＮＡプローブ結合微粒子へのＰＣＲ産物標的のハイブリダイゼーション捕捉の検出
本実施例の目的は、核酸プローブに結合した微粒子を利用したＰＣＲ産物ＤＮＡ分析物の検出に共鳴光散乱を用いることについて示すことにあった。
【０２９１】
Ａ．微粒子の調製とオリゴヌクレオチドプローブのカップリング
ＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｂプローブ結合微粒子を実施例９で説明したようにして調製した。
【０２９２】
Ｂ．ＰＣＲ標的の調製
配列番号８として示す２０６ｂｐの増幅ＦＭＤ  ＤＮＡ断片（ＪＢ）と、配列番号９で示す５１１ｂｐの増幅ＬａｃＩＱ断片（Ｌａｃ２−５１１）とを、標準的なＰＣＲプロトコールを使用して以下のように生成した。配列番号１０で示すフォワードプライマーであるＰ２ＦＷＤ、５’  ＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＴＧＧＧＣＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣ  ３’を２ｐｍｏｌと、配列番号１１で示すリバースプライマーであるＰ３３−４、５’  ＡＴＧＡＧＣＴＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＴＴＴＧＧＣ  ３’を２０ｐｍｏｌとを用いて、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯプラスミドベクター（カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）のインヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローニングした５１６ｂｐの合成ＦＭＤ標的（配列番号１）インサートから２０６ｂｐのＰＣＲ断片を非対称ＰＣＲ産物として生成した。続いて、この産物５マイクロリットルをＰ２ＦＷＤ  ５ｐｍｏｌおよびＰ３３−４  ５０ｐｍｏｌの存在下にて再増幅した。
【０２９３】
配列番号１２で示すフォワードプライマーであるＬａｃ１ｐｓｔ、５’  ＡＴＡＣＴＧＣＡＧＡＡＣＧＣＧＴＣＡＧＴＧＧＧＣＴＧＡＴＣＡ  ３’を２ｐｍｏｌと、配列番号１３で示すリバースプライマーであるＬａｃ４ｅｃｏ、５’  ＡＣＡＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＡＧＣＴＧＴＣＴＴＣＧＧＴＡＴＣＧＴＣＧＴＡ  ３’を２０ｐｍｏｌとを用いて、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯプラスミドベクターにクローニングしたＥ．  ｃｏｌｉ  ＬａｃＩＱインサートから５１１ｂｐのＰＣＲ断片を非対称ＰＣＲ産物として生成した。続いて、この産物５マイクロリットルをＬａｃ１ｐｓｔ  ５ｐｍｏｌとＬａｃ４ｅｃｏ  ５０ｐｍｏｌの存在下にて再増幅した。非対称ＰＣＲ反応混合物には、最終容量５０μＬのＰＣＲ緩衝液（１０×：１００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２００ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．７５、２０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１％トリトンＸ−１００、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）中、２００μＭ  ｄＮＴＰと２．５単位のＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（カリフォルニア州ラホーヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）のストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））が含まれていた。ジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）（登録商標）９６００サーマルサイクラー（コネチカット州ノーウォークのパーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐ．））で増幅を行った。試料を９４℃で２分間変性させた後、９４℃で２０秒間の変性、５５℃で２０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の伸張を３５サイクル行った。増幅サイクル終了後、最終的な鎖伸張を７２℃で５分間行った。続いて、試料を４℃まで勾配し、試料分析までその温度で維持した。
【０２９４】
この増幅ＤＮＡ産物を非対称増幅産物の収率についてアガロースゲル電気泳動で分析した。臭化エチジウム０．５μｇ／ｍＬを含有する０．５×ＴＢＥ緩衝液（メリーランド州シルバースプリング（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ）のダイジーンダイアグノスティクス社（Ｄｉｇｅｎｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．））中、１．５％ＳｅａＫｅｍ（登録商標）ＬＥアガロース（メイン州ロックランド（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）のＦＭＣ  バイオプロダクツ（ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ））上でＰＣＲ産物を分離した。増幅試料から得た４μＬのアリコートをゲルローディング緩衝液１μＬと混合し、アガロースゲルにロードした。ゲルに１００Ｖ（または５．９Ｖ／ｃｍ）を印加して、ゲル電気泳動を１時間実施した。臭化エチジウム染色ＤＮＡバンドを可視化し、イーグルアイ（Ｅａｇｌｅ  Ｅｙｅ  ＩＩ）スチルビデオシステム（カリフォルニア州ラホーヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）のストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使ってデジタル的に記録した。
【０２９５】
共鳴光散乱を利用したＤＮＡプローブ結合微粒子へのＦＭＤ  ＰＣＲ産物標的ＤＮＡのハイブリダイゼーション捕捉の検出
実施例３および９で説明し、図９に示したようにして、共鳴光散乱の検出を行った。各インキュベーション／洗浄ステップ後に共鳴光散乱測定値を得た。実施例９で説明したように、ＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｂプローブ結合微粒子懸濁液の２から３μＬのわずかなアリコートを光学セルに入れた。少数（２から６）の微粒子を含む図８に示したものと同様の視野を選択した。アッセイのバックグラウンドを記録するために、予備走査測定値を得た。非特異的対照ＰＣＲ標的断片であるＬａｃ２−５１１  ＤＮＡ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ緩衝液５ｍＬ中ＰＣＲ産物５ｐｍｏｌ）約５．０ｍＬを流量約１ｍＬ／分で微粒子に連続して流し、閉ループシステムで１時間再循環させた。続いて、ＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｂプローブ結合微粒子を０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ緩衝液１０ｍＬで洗浄し、廃液を破棄した。洗浄後に、ＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｂプローブ結合微粒子の共鳴光散乱スペクトルスキャンを得た。特異的ＪＢ  ＰＣＲ標的断片（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ緩衝液５ｍＬ中５ｐｍｏｌ）約５．０ｍＬを微粒子に１時間連続して流した後、１０ｍＬを０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。繰り返すが、洗浄後にＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｂプローブ結合微粒子の共鳴光散乱スペクトルスキャンを得た。
【０２９６】
これらの結果を表５に示す。共鳴光の散乱パターンにおける負のシフトは微粒子に対するＬａｃ２−Ｆ  ＰＣＲ断片の非特異的結合時に観察された。特異的ＰＣＲ標的であるＪＢ  ＰＣＲ産物を分析物として使用した場合は、共鳴光の散乱パターンにおける有意な負のシフトがＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｂプローブ結合微粒子への結合時に観察された。これらの結果から、オリゴヌクレオチドプローブ結合微粒子は、ＰＣＲ特異的分析物への結合時にその共鳴光散乱スペクトルに負の共鳴波長のシフトを呈することが分かる。また、これらの結果は、微粒子に結合した共鳴光散乱およびＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを使用し、ＰＣＲ生成ＤＮＡ分析物を検出することについても示している。
【０２９７】
【表５】
2006515420.tif 000009
【０２９８】
実施例１１
共鳴光散乱によるＰＮＡプローブ結合微粒子へのＤＮＡ結合の検出
本実施例の目的は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブに連結した微粒子への核酸分析物の結合を共鳴光散乱を用いて検出することについて示すことにあった。ＰＮＡは、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）の糖リン酸骨格ではなく偽ペプチド骨格を持つＤＮＡの類縁体である。ＰＮＡはＤＮＡの挙動を模倣し、相補的核酸鎖を結合する。ＰＮＡに特有の化学的・物理的・生物学的特性を利用して、強力な生体分子ツール、アンチセンスおよび抗遺伝子薬、分子プローブ、バイオセンサを生成した。ニュートラルなペプチド様骨格によって、塩濃度とは独立した標的核酸への一層強力かつ特異的な結合が得られる。このため、本願発明者らは、ＰＮＡプローブ結合微粒子を利用したＤＮＡ分析物のハイブリダイゼーション捕捉の実現可能性に踏み込んでみたかった。蛍光標識オリゴヌクレオチド分析物をアッセイ対照として利用し、ＰＮＡ微粒子へのＤＮＡ分析物の特異的結合を確認した。
【０２９９】
Ａ．微粒子の調製
高屈折率ガラス微粒子（カタログ番号ＧＬ−０１７５、ミズーリ州ローラ（Ｒｏｌｌａ）のＭｏ−Ｓｃｉ社（Ｍｏ−Ｓｃｉ  Ｃｏｒｐ．））を実施例３で説明したようにして調製した。清浄済みのガラス微粒子をシラン化し、ＰＮＡオリゴマープローブとのカップリング用の表面反応性アミン基を生成した。このアミン誘導体化ガラス微粒子を、実施例９で説明したようにしてマレイミド基でさらに誘導体化した。マレイミド誘導体化微粒子ペレットを第２の１．５ｍＬ容の丸底反応管に移し、４℃で保管した。
【０３００】
Ｂ．微粒子へのＰＮＡオリゴマープローブのカップリング
ＰＮＡオリゴマーを共鳴光散乱アッセイプローブとして利用することについて示す目的で、実施例９および１０で説明したＦＭＤ配列を特異的に検出するためのＰＮＡプローブ塩基配列を設計した。選択した配列は、配列番号１４で示す５’  ＴＣＣＧＴＧＴＴＴＴＧＴＴＧＡＣ  ３’（ＪＢＰ２Ｃ）であった。この実施例で用いた修飾ＪＢＰ２ＣＰＮＡオリゴマープローブ配列すなわち、配列番号１５で示す５’  Ｂ−ＯＯ−ＴＣＣＧＴＧＴＴＴＴＧＴＴＧＡＣ−Ｃｙ  ３’（ＪＢＰ２ＢＣ）については、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（カリフォルニア州フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ））が合成した。ＪＢＰ２ＢＣ  ＰＮＡオリゴマーを５’末端（Ｎ−末端）でビオチン部分（Ｂ）で修飾した。「ＯＯ」はＰＮＡオリゴマーとビオチン部分との間のリンカーを示す。システイン残基（Ｃｙ）アミノ酸部分を利用してＪＢＰ２ＢＣ  ＰＮＡオリゴマーを３’末端（Ｃ−末端）で修飾した。システインの遊離チオール基を利用してＰＮＡオリゴマーをマレイミド誘導体化微粒子にカップリングした。
【０３０１】
ＰＮＡオリゴマープローブを微粒子にカップリングするにあたり、１００μＭ  ＪＢＰ２ＢＣ  ＰＮＡオリゴマー２０μＬをｐＨ７．４のＰＢＳ中マレイミド誘導体化微粒子４０ｍｇに加えた。反応混合物をローリングミキサで室温にて２時間インキュベートした。ソーバルマイクロスピン（Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ）微量遠心機にて１２，０００ｒｐｍで室温にてＭｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）１００マイクロ濃縮器を利用し、懸濁微粒子を遠心分離して未反応のＪＢＰ２ＢＣ  ＰＮＡオリゴマーおよびＰＢＳを除去した。微粒子をＰＢＳで２回洗浄した。ＪＢＰ２ＢＣ  ＰＮＡプローブ結合微粒子ペレットを１．５ｍＬ容の微量遠心管に移し、４℃で保管した。
【０３０２】
Ｃ．蛍光を利用したＰＮＡプローブ結合微粒子へのＦＭＤオリゴヌクレオチド標的ＤＮＡのハイブリダイゼーション捕捉の検出
３’フルオレセインで標識したＦＭＤ特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチド標的（ＪＢＰ−Ｆ）すなわち、ＪＢＰ２ＢＣ  ＰＮＡプローブに相補的な配列である、配列番号７で示す５’  ＴＣＡＡＣＣＡＧＡＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＣＡＴＧＴＣＡＡＣＡＡＡＡＣＡＣＧＧＡＣＣＣＧＡＣＴＴＡＡ−Ｆ  ３’を利用して、ＰＮＡプローブ結合微粒子の機能性を試験した。ＪＢＰ２ＢＣ  ＰＮＡプローブに相補的な配列を含まない、実施例９で説明したフルオレセイン標識Ｌａｃ２−Ｆオリゴヌクレオチド（配列番号６）を、非特異的対照として利用した。
【０３０３】
ＪＢＰ２ＢＣ  ＰＮＡプローブ結合微粒子（２μＬ）を、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ緩衝液２０μＬ中１０μＭ  ＪＢＰ−Ｆアッセイ標的２μＬまたはＬａｃ２−Ｆ対照標的１０μＭと混合し、ローリングミキサで室温にて１時間ハイブリダイズした。実施例９で説明したように、微粒子をペレット化し、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ緩衝液２００μＬで３回洗浄した。最終洗浄後、微粒子を０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ緩衝液５０μＬに懸濁させた。試料（１μＬ）をベクタシールド（ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ）（登録商標）マウンティングメディウム（Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ）（カリフォルニア州バーリンゲーム（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）のベクターラボラトリーズ社（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．））２μＬにてスライドガラスにのせた。試料を実施例９で説明したように蛍光顕微鏡下で観察した。
【０３０４】
蛍光顕微鏡写真から、特異的ＪＢＰ−Ｆアッセイ標的がＰＮＡプローブ結合微粒子に捕捉され、Ｌａｃ２−Ｆ非特異的対照標的は捕捉されないことが分かった。標的のないＰＮＡプローブ結合微粒子のバックグラウンドの自己蛍光についても試験した。自己蛍光は、フルオレセイン標識ＪＢＣ−Ｆ標的の結合による蛍光よりも弱かった。これらの結果から、ＪＢＰ２ＢＣ  ＰＮＡプローブ結合微粒子がそれぞれの標的ＪＢＰ−Ｆ配列に特異的であったことが分かる。
【０３０５】
Ｄ．ＰＮＡプローブ結合微粒子を利用した共鳴光散乱の検出
ＰＮＡプローブ結合微粒子に対するＤＮＡ標的の共鳴光散乱を利用して結合を検出した。使用した手順は実施例２、３および９で説明したものと同様とした。パートＡおよびＢで説明したようにして調製したＪＢＰ２ＢＣ  ＰＮＡプローブ結合微粒子を０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４に分散させ、得られた微粒子懸濁液の少量のアリコート（２から３μＬ）を、実施例３で説明して図６に示したものと同様の光学セルに入れた。図８に示し、実施例９で説明したものと同様で、少数（２から６）の微粒子を含む視野を選択した。画像を捕捉し、画素スタックファイルとして保存し、システムのパーソナルコンピュータにインストールしたソフトウェアで分析した。実施例９で説明したように、予備走査測定値を得てアッセイのバックグラウンドを記録した。
【０３０６】
０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ緩衝液中１μＭ  Ｌａｃ２−Ｆ非特異的標的ＤＮＡ約５ｍＬをＪＢＰ２ＢＣ  ＰＮＡプローブ結合微粒子に流量約１ｍＬ／分で連続して流し、回収し、閉ループシステムで１時間再循環させた。続いて、このＪＢＰ２ＢＣ  ＰＮＡプローブ結合微粒子を０．３Ｍ、ＰＢＳ緩衝液１０ｍＬで洗浄し、廃液を破棄した。洗浄後に共鳴光散乱測定値を得た。続いて、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ緩衝液中１μＭ  ＪＢＰ−Ｆ特異的標的ＤＮＡ約５ｍＬをフローセルに加え、微粒子に１時間連続して流した後、１０ｍＬを０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。繰り返すが、実施例３で説明したような共鳴光散乱スペクトルスキャンを洗浄後にＪＢＰ２ＢＣ  ＰＮＡプローブ結合微粒子から得た。
【０３０７】
これらの結果を表６に示す。共鳴光の散乱パターンにおける負のシフトは微粒子に対するＬａｃ２−Ｆ標的オリゴヌクレオチドの非特異的結合時に観察された。また、これらの結果から、ＪＢＰ２ＢＣ  ＰＮＡプローブ結合微粒子への特異的ＪＢＰ−ＦオリゴヌクレオチドＤＮＡ標的の結合時に共鳴光の散乱パターンにさらに大きな負のシフトが観察されたことも分かり、ＰＮＡオリゴマー結合微粒子へのＤＮＡオリゴヌクレオチド結合を検出する目的での共鳴光散乱の有用性が示される。非特異的分析物または特異的分析物のいずれかとして、オリゴヌクレオチドＤＮＡ標的がＰＮＡオリゴマー結合微粒子に結合すると、共鳴光散乱スペクトルに負の共鳴波長のシフトが観察された。
【０３０８】
【表６】
2006515420.tif 000010
【０３０９】
実施例１２
共鳴光散乱を利用したＰＮＡプローブ結合微粒子へのＰＣＲ産物標的のハイブリダイゼーション捕捉の検出
本実施例の目的は、共鳴光散乱を利用してＰＮＡプローブ結合微粒子でＰＣＲ産物分析物を検出することについて示すことにあった。
【０３１０】
Ａ．微粒子の調製とオリゴヌクレオチドプローブのカップリング
ＪＢＰ２ＢＣ  ＰＮＡプローブ結合微粒子は実施例１１で用いたものと同一とした。
【０３１１】
Ｂ．ＰＣＲ標的の調製
ＪＢＰ２ＢＣ  ＰＮＡプローブ結合微粒子に対する非特異的ＰＣＲ試験標的は、実施例１０でＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｂプローブ結合微粒子の試験に用いた５１１ｂｐの増幅Ｌａｃ２−５１１非対称ＰＣＲ産物（配列番号９）と同一とした。特異的試験標的は、フォワードプライマー（Ｐ２ＦＷＤ、配列番号１０）を２０ｐｍｏｌとリバースプライマー（Ｐ３３−４、配列番号１１）を２ｐｍｏｌで用いたこと以外は実施例１０と同様にして増幅した、配列番号１６で示す２０６ｂｐの増幅ＪＢ非対称ＰＣＲ産物の相補体（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）とした。続いて、この産物５マイクロリットルを、フォワードプライマー５０ｐｍｏｌとリバースプライマー５ｐｍｏｌの存在下で再増幅した。
【０３１２】
Ｃ．共鳴光散乱を利用したＪＢＰ２ＢＣ  ＰＮＡプローブ結合微粒子へのＦＭＤ  ＰＣＲ産物標的ＤＮＡのハイブリダイゼーション捕捉の検出
実施例１０で説明したように、ＪＢＰ２ＢＣ  ＰＮＡプローブ結合微粒子懸濁液２から３μＬの少量のアリコートを光学セルに入れた。図８に示し、実施例９、１０および１１で説明したものと同様で、少数（２から６）の微粒子を含む視野を選択した。実施例１０で説明したようにして共鳴光散乱の検出を実施し、各インキュベーション／洗浄ステップ後にスペクトル測定値を得た。Ｌａｃ２−５１１  ＰＣＲ断片とＪＢ  ＰＣＲ標的断片をそれぞれ対照およびアッセイ標的として用いた。
【０３１３】
表７の結果から、ＪＢＰ２ＢＣ  ＰＮＡプローブ結合微粒子に対するＪＢ  ＰＣＲ産物の結合時に共鳴光の散乱パターンに有意な負のシフトが観察されたことが分かり、ＰＮＡオリゴマー結合微粒子に結合した特異的ＰＣＲ  ＤＮＡ標的を検出する目的での共鳴光散乱が示される。
【０３１４】
【表７】
2006515420.tif 000011
【０３１５】
実施例１３
共鳴光散乱を利用した微粒子からのＤＮＡプローブの切断の検出
本実施例の目的は、ＤＮＡプローブ結合微粒子へのＤＮＡ標的分析物の捕捉時に観察される負の共鳴光散乱スペクトルシフトが、ＤＮＡプローブへの核酸の結合によるものである点を示すことにある。蛍光標識分析物をアッセイ対照として利用し、核酸結合微粒子への分析物の特異的結合を確認し、形成されたハイブリダイゼーション複合体がカップリング架橋剤の切断時に除去されることも確認した。
【０３１６】
Ａ．微粒子の調製
実施例３、９および１０で説明したようにして、高屈折率ガラス微粒子を調製し、シラン化して表面反応性アミン基を生成した。これらのアミン誘導体化ガラス微粒子を、チオール修飾オリゴヌクレオチドプローブにカップリングするピリジルジチオ基でさらに誘導体化し、後述するようなジスルフィド結合を形成した。このジスルフィド結合はＤＴＴで切断可能であり、これを微粒子からのオリゴヌクレオチドプローブまたは核酸ハイブリダイゼーション複合体の除去に利用できる。
【０３１７】
ピリジルジチオ基での微粒子の修飾に使用したカップリング剤は、スルホスクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）（イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）のピアースバイオテクノロジー社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．））であった。このカップリング剤には、微粒子表面のアミン基にスルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ架橋剤をカップリングするＮＨＳ基が分子の一端にある。アミン誘導体化ガラス微粒子の１００μｇのアリコートを、１００ｍＭ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ１２２ｍｇ／ｍＬ、２５％ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）からなる反応混合物に加えた。この混合物を１．５ｍＬ容の丸底チューブに入れ、これを室温にて２時間回転させて表面のアミンをスルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰのＮＨＳ基と反応させた。得られたピリジルジチオ誘導体化微粒子を５００μＬのｐＨ７．４のＰＢＳで室温にて洗浄した。ソーバルマイクロスピン（Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ）微量遠心機にて１２，０００ｒｐｍで室温にて、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）１００マイクロ濃縮器を用いて懸濁微粒子を遠心分離し、緩衝液とスルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰを除去した。微粒子をＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。ピリジルジチオ誘導体化微粒子ペレットを第２の１．５ｍＬ容の丸底チューブに移し、４℃で保管した。
【０３１８】
Ｂ．オリゴヌクレオチドプローブ
オリゴヌクレオチドプローブは、実施例９で説明し、配列番号２で示したＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｂとした。ＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｂをピリジルジチオ誘導体化微粒子に後述のようにしてカップリングした。また、ピリジルジチオ誘導体化微粒子には、配列番号１７で示す３’標識フルオレセインプローブ（ＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｆ）Ｃ６−Ｓ−Ｓ（Ｓｐ）２−ＴＣＡＡＣＣＡＧＡＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＣＡＴＧＴＣＡＡＣＡＡＡＡＣＡＣＧＧＡＣＣＣＧＡＣＴＴＡＡ−Ｆ  ３’もカップリングした。このプローブについては、誘導体化微粒子のピリジルジチオ基と反応させるためにジスルフィド部分で５’末端でも修飾した。
【０３１９】
修飾ＪＢＰプローブすなわち、ピリジルジチオ誘導体化微粒子へのカップリング用のＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３ＦおよびＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｂを作製するにあたり、ジスルフィド修飾因子を別々の反応混合物中で各ＪＢＰプローブで切断した。反応混合物には、ＰＢＳ緩衝液６００μＬ中に一方のＪＢＰプローブ７０ｎｍｏｌと、１００ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）とが含まれていた。チオール修飾オリゴヌクレオチドをＣ６−チオ基およびＤＴＴからエタノール沈殿によって精製した。３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．４を１００マイクロリットルと、１００％エタノール１０００μＬとを各反応に加え、溶液を十分に混合した。ＤＮＡ沈殿物をソーバルマイクロスピン（Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ）微量遠心機にて１２，０００ｒｐｍで室温にて遠心分離してペレット化した。ＪＢＰプローブペレットを７０％エタノールで２回洗浄した後、別々の反応管で２回蒸留水２００μＬに溶解させた。ｐＨ７．４のＰＢＳを５００μＬ加え、室温にて２時間回転させて表面のピリジルジチオ基をチオール活性化ＪＢＰプローブと反応させることで、両方のオリゴヌクレオチドを１．５ｍＬ容の丸底チューブにてピリジルジチオ誘導体化微粒子１００μｇにカップリングした。両タイプのＪＢＰプローブ結合微粒子の調製物を室温にて５００μＬのＰＢＳで洗浄した。ソーバルマイクロスピン（Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ）微量遠心機にて１２，０００ｒｐｍで室温にてＭｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）１００マイクロ濃縮器を用いて、懸濁微粒子を遠心分離し、ＰＢＳ、ＤＴＴ、未反応のＪＢＰプローブを除去した。微粒子をＰＢＳで２回洗浄した。ＪＢＰプローブ結合微粒子ペレットを１．５ｍＬ容の微量遠心管に移し、４℃で保管した。
【０３２０】
Ｃ．ＤＮＡ−プローブ結合微粒子へのＪＢＰオリゴヌクレオチド標的ＤＮＡのハイブリダイゼーション捕捉の蛍光検出
スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰを利用した微粒子へのＪＢＰプローブの架橋によって形成されるジスルフィド結合が切断可能であることを示すために、ジスルフィド結合をＤＴＴで還元した。ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液中ＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｆプローブ結合微粒子のアリコート５０μＬを、０．２Ｍ  ＤＴＴ  ５０μＬで１０分間処理した。続いて、ツァイス（Ｚｅｉｓｓ）蛍光顕微鏡下にて、実施例９で説明したようにして微粒子を観察した。得られた蛍光顕微鏡写真から蛍光微粒子はすでに蛍光性ではないことが分かり、ピリジルジチオ交換反応によって生成されたジスルフィド結合がＤＴＴで切断されたことが示された。
【０３２１】
実施例９で説明したように、ＪＢＰ特異的ＪＢＣ−Ｆ（配列番号５）標的と非特異的対照Ｌａｃ２−Ｆ（配列番号６）とを利用して、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ架橋剤を用いた場合の微粒子に対するＪＢＰプローブの結合すなわち、上述のＪＢＰ  Ｓ２ＳＰ３Ｂプローブ結合微粒子がＪＢＣ−Ｆ  ＤＮＡ標的に特異的に結合できるか否かを試験した。
【０３２２】
実施例９で説明したようにして現像した顕微鏡写真から、ＪＢＣ−Ｆ  ＤＮＡ標的が蛍光ＪＢＰプローブ／ＪＢＣ標的ハイブリダイゼーション複合体を形成することでＪＢＰプローブ結合微粒子に捕捉されたことが分かった。Ｌａｃ２−Ｆ対照標的は捕捉されなかった。これらの結果から、ＪＢＰ／ジスルフィド結合微粒子はＪＢＣ−Ｆ標的配列に特異的であることが分かる。続いて、ＪＢＰプローブ／ＪＢＣ標的ハイブリダイゼーション複合体を０．２Ｍ  ＤＴＴで上述のように微粒子から切断した。得られた顕微鏡写真から、ハイブリダイゼーション複合体切断微粒子の方が蛍光性がかなり低いことが分かり、ハイブリダイゼーション複合体の少なくとも一部がＪＢＰ結合微粒子から切断されたことが示された。
【０３２３】
ＪＢＰプローブ結合（ｗ／スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）微粒子を利用した共鳴光散乱の検出
共鳴光散乱を利用して、ＪＢＰ結合微粒子に対するＪＢＣ−Ｆ（配列番号５）標的ＤＮＡの結合を検出した。手順は実施例２、３および９で説明したものと同様とした。上記のパートＡおよびＢで説明したようにして調製したＪＢＰ結合微粒子を、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４に分散させ、得られた微粒子懸濁液の少量のアリコート（２〜３μＬ）を、実施例３で説明し、図６に示したものと同様の光学セルに入れた。図８に示したものと同様に、少数（２から６）の微粒子が含まれる視野を選択した。画像を捕捉し、画素スタックファイルとして保存し、システムのパーソナルコンピュータにインストールされたソフトウェアで分析した。実施例９と同様に、予備走査測定値を得てアッセイのバックグラウンドを記録した。
【０３２４】
特異的標的ＪＢＣ−Ｆ  ＤＮＡ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中１μＭ）約５ｍＬを微粒子に流量約１ｍＬ／分で連続して流し、閉ループシステムで１時間再循環させた。続いて、微粒子を０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ、ｐＨ７．４  １０ｍＬで洗浄し、廃液を破棄した。洗浄後に共鳴光散乱スペクトル測定値を得た。続いて、還元剤（０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ８．４中０．１Ｍ  ＤＴＴ）を３０分間加えた後、１０ｍＬを０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄した。繰り返すが、洗浄後に共鳴光散乱スペクトル測定値を得た。
【０３２５】
表８に示す結果から、ＤＮＡ標的を加えた後の共鳴光の散乱パターンにおける有意な負のシフトならびに、微粒子からプローブ標的複合体を切断した後の別の負のシフトが認められる。これらのデータから、負のように見えるシフトはＤＮＡ（核酸）プローブが架橋剤によって微粒子に結合して生じたものだということが分かる。これらのデータから、微粒子にカップリングした核酸の影響は、共鳴光散乱アッセイでの核酸分析物の結合時に生成された共鳴波長のシフトが負になるようなものであるように見える。
【０３２６】
【表８】
2006515420.tif 000012
【０３２７】
実施例１４
高屈折率の芯プラス１層を有する微粒子の予測共鳴光散乱スペクトル、１組の共鳴
本実施例の目的は、コンピュータシミュレーションを利用して、高屈折率の均質な芯の他に層を１層有する微粒子の共鳴光散乱スペクトルを予測することにあった。１０ｎｍ厚のタンパク質層による作用も予測する。
【０３２８】
球形の多層微粒子から得た共鳴光散乱のコンピュータモデルを利用して、シミュレーションを構成した。使用したモデルは、カイザー（Ｋａｉｓｅｒ），Ｔ．およびシュヴァイガー（Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒ），Ｇ．、Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ｉｎ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ７（６）、６８２〜６８６（１９９３）などの参考文献に記載の周知の概念と式を拡張したものである。これらのモデルでは、直径（芯）または厚さ（層）と屈折率（ＲＩ）に最大１０層まで指定できる。シミュレーションでは以下のパラメータを用いた。
媒質の屈折率（ＲＩ）：１．３３
開始波長：７７０
終了波長：７８０
散乱角：１８０度
検出全受光角：２１．７度
【０３２９】
芯の直径と屈折率ならびに層の厚さと屈折率を変えた。微粒子の外側に屈折率１．４５の均一な１０ｎｍ厚の層を加えることで、タンパク質層の結合をモデル化した。
【０３３０】
粒子ごとの仕様
粒子番号を、シミュレーションで利用したパラメータすなわち、芯径（図１８のＤＣｏｒｅ）、芯の屈折率（図１８のＲＩＣｏｒｅ）、層１の厚さ（図１８のＴ１）、層１の屈折率（図１８のＲＩＬ１）と一緒に表９に一覧で示す。
【０３３１】
【表９】
2006515420.tif 000013
【０３３２】
予測散乱パターンを図１８〜図１９に示す。芯径と層のばらつき、芯と層の屈折率（ＲＩ）のばらつきによって、粒子（粒子１〜７）の識別用マーカーとして利用するのに適した散乱パターンにばらつきが生じる。これらの結果は、均質な芯プラス１層を識別可能な微粒子の有用性を示すものである。
【０３３３】
１０ｎｍ厚のタンパク質層を加えると、標的タンパク質の結合を検出するのに適した全体としての散乱パターンにシフトが生じる（粒子８）。タンパク質層を含む粒子の散乱プロットと基準粒子の散乱プロットとを比較することで、図１９に示すように結合による効果が可視的に分かる。便宜上、結合ｖｓ．未結合の粒子を比較する２つのプロットを示してあり、一方では結合時に生じるパターンのシフトが分かりやすいように波長スケールを拡大してある。この比較では基準粒子に対する結合しか示されていないが、実施例の他の粒子でも同じ作用が認められる。
【０３３４】
実施例１５
低屈折率の芯プラス１層を有する微粒子の予測共鳴光散乱スペクトル、１組の共鳴
本実施例の目的は、コンピュータシミュレーションを利用して、低屈折率の均質な芯の他にこれよりも屈折率が高い層を１層有する微粒子の共鳴光散乱スペクトルを予測することにあった。１０ｎｍ厚のタンパク質層による作用も予測する。
【０３３５】
実施例５で説明したようにして、媒質のＲＩ、開始波長ならびに終了波長、散乱角、検出の全受光角について当該実施例の場合と同一の値を用いて、シミュレーションのスペクトルを算出した。芯の直径と屈折率ならびに層の厚さと屈折率を変えた。微粒子の外側に屈折率１．４５の均一な１０ｎｍ厚の層を加えることで、タンパク質層の結合をモデル化した。
【０３３６】
粒子ごとの仕様
粒子番号を、シミュレーションで利用したパラメータすなわち、芯径（図２０のＤＣｏｒｅ）、芯の屈折率（図２０のＲＩＣｏｒｅ）、層１の厚さ（図２０のＴ１）、層１の屈折率（図２０のＲＩＬ１）と一緒に表１０に一覧であげておく。この実施例では、粒子１は均質な芯のみで、これを基準とした。残りの粒子では、全体の粒度が粒子１と同じになるように芯および層厚を定める。粒子２にはタンパク質を加えるため、タンパク質結合の検出について示す目的で、粒子２を基準粒子にするものとする。
【０３３７】
【表１０】
2006515420.tif 000014
【０３３８】
予測散乱パターンを図２０〜図２１に示す。これらの結果は、低屈折率の均質な芯プラスこれよりも屈折率の高い１層の識別可能な微粒子としての有用性を示している。このような微粒子では、層と媒質との間の高／低屈折率遷移によって生成される一組の散乱共鳴が生じる。火面外側の芯径のばらつき（火面の定義については、たとえば、ロール（Ｒｏｌｌ），Ｇ．およびシュヴァイガー（Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒ），Ｇ．、Ｊ．  Ｏｐｔ．  Ｓｏｃ．  Ａｍ．  Ａ  １７（７）、１３０１〜１３１１（２０００）を参照のこと）、層厚のばらつき、芯および層の屈折率（ＲＩ）のばらつきによって、粒子（Ｎｏ．１〜７）の識別用マーカーとして利用するのに適した散乱パターンにばらつきが生じる。１０ｎｍ厚のタンパク質層を加えると、図２１に示すように標的タンパク質の結合を検出するのに適した全体としての散乱パターンにシフトが生じる（Ｎｏ．８）。
【０３３９】
実施例１６
高屈折率のコアプラス１層を有する微粒子の予測共鳴光散乱スペクトル、２組の共鳴
本実施例の目的は、コンピュータシミュレーションを利用して、高屈折率の均質な芯の他にこれよりも屈折率が低い層を１層有する微粒子の共鳴光散乱スペクトルを予測することにあった。１０ｎｍ厚のタンパク質層による作用も予測する。
【０３４０】
実施例５で説明したようにして、媒質のＲＩ、開始波長ならびに終了波長、散乱角、検出の全受光角について当該実施例の場合と同一の値を用いて、シミュレーションのスペクトルを算出した。芯の直径と屈折率ならびに層の厚さと屈折率を変えた。微粒子の外側に屈折率１．４５の均一な１０ｎｍ厚の層を加えることで、タンパク質層の結合をモデル化した。
【０３４１】
粒子ごとの仕様
粒子番号を、シミュレーションで利用したパラメータすなわち、芯径（図２２のＤＣｏｒｅ）、芯の屈折率（図２２のＲＩＣｏｒｅ）、層１の厚さ（図２２のＴ１）、層１の屈折率（図２２のＲＩＬ１）と一緒に表１１に一覧であげておく。この実施例では、粒子１は均質な芯のみで、これを基準とした。残りの粒子では、全体の粒度が粒子１と同じになるように芯および層厚を定める。粒子２にはタンパク質を加えるため、タンパク質結合の検出について示す目的で、粒子２を基準粒子にするものとする。
【０３４２】
【表１１】
2006515420.tif 000015
【０３４３】
予測散乱パターンを図２２〜図２３に示す。これらの結果は、高屈折率の均質な芯プラスこれよりも屈折率の低い１層の識別可能な微粒子としての有用性を示している。このような微粒子では、実施例６の粒子と比較して別の散乱共鳴が生じる。これらの別の共鳴は、芯と層との間の高／低屈折率遷移によって生成されるが、これは上記の遷移が２組目の共鳴を生むだけの十分なものであるためである。芯径と層のばらつき、芯と層の屈折率（ＲＩ）のばらつきによって、粒子（Ｎｏ．１〜７）の識別用マーカーとして利用するのに適した散乱パターンにばらつきが生じる。１０ｎｍ厚のタンパク質層を加えると、図２３に示すように標的タンパク質の結合を検出するのに適した全体としての散乱パターンにシフトが生じる（Ｎｏ．８）。
【０３４４】
実施例１７
低屈折率の芯プラス２層を有する微粒子の予測共鳴光散乱スペクトル、２組の共鳴
本実施例の目的は、コンピュータシミュレーションを利用して、低屈折率の均質な芯の他に、一方が他方よりも屈折率の高い２層を有する粒子の共鳴光散乱スペクトルを予測することにあった。１０ｎｍ厚のタンパク質層による作用も予測する。
【０３４５】
実施例５で説明したようにして、媒質のＲＩ、開始波長ならびに終了波長、散乱角、検出の全受光角について当該実施例の場合と同一の値を用いて、シミュレーションのスペクトルを算出した。微粒子の外側に屈折率１．４５の均一な１０ｎｍ厚の層を加えることで、タンパク質層の結合をモデル化した。
【０３４６】
粒子ごとの仕様
粒子番号を、シミュレーションで利用したパラメータすなわち、芯径（図２４のＤＣｏｒｅ）、芯の屈折率（図２４のＲＩＣｏｒｅ）、層１および２の厚さ（それぞれ図２４のＴ１およびＴ２）、層１および層２の屈折率（それぞれ図２４のＲＩＬ１およびＲＩＬ２と一緒に表１２に一覧であげておく。この実施例では、粒子１は均質な芯のみで、これを基準とした。残りの粒子では、全体の粒度が粒子１と同じになるように芯および層厚を定める。粒子２にはタンパク質を加えるため、タンパク質結合の検出について示す目的で、粒子２を基準粒子にするものとする。
【０３４７】
【表１２】
2006515420.tif 000016
【０３４８】
予測散乱パターンを図２４に示す。これらの結果は、低屈折率の均質な芯プラス２層（一方が他方よりも屈折率が高い）の識別可能な微粒子としての有用性を示している。このような微粒子では、第２の層と媒質との間の高／低屈折率遷移と、芯と第１の層との間の高／低屈折率遷移によって生成される複数の散乱共鳴が生じる。芯径と層のばらつき、芯および層の屈折率（ＲＩ）のばらつきによって、粒子の識別用マーカーとして利用するのに適した散乱パターンにばらつきが生じる。この実施例では、基準粒子だけを示してある。５つのパラメータを単独でまたはその２つ以上を一度に変えると、上述した実施例と同様に一意なスペクトルが生成される。１０ｎｍ厚のタンパク質層を加えると、標的タンパク質の結合を検出するのに適した全体としての散乱パターンにシフトが生じる。簡単にするために、基本的な事例だけを示してある。どの組み合わせでもパラメータを変えると散乱光パターンが変化することから、粒子集団に対する識別用マーカーの多様性を高めることの有用性が示される。
【０３４９】
実施例１８
中心の黒い芯を有する微粒子の予測共鳴光散乱スペクトル
本実施例の目的は、コンピュータシミュレーションを利用して、芯が２つの部分からなる粒子の共鳴光散乱スペクトルを予測することにあった。内側の部分は光学的に不透明な球であり、外側の部分は光学的に透明な殻である。１０ｎｍ厚のタンパク質層による作用も予測する。
【０３５０】
実施例５で説明したようにして、媒質のＲＩ、開始波長ならびに終了波長、散乱角、検出の全受光角について当該実施例の場合と同一の値を用いて、シミュレーションのスペクトルを算出した。微粒子の外側に屈折率１．４５の均一な１０ｎｍ厚の層を加えることで、タンパク質層の結合をモデル化した。
【０３５１】
粒子ごとの仕様
粒子番号を、シミュレーションで利用したパラメータすなわち、芯径（図２５のＤＩｎｎｅｒＣｏｒｅ）、外芯径（図２５のＤＯｕｔｅｒＣｏｒｅ）、外芯の屈折率（図２５のＲＩＯｕｔｅｒＣｏｒｅ）と一緒に表１３に一覧であげておく。この実施例では、粒子１は均質な芯のみで、これを基準とした。残りの粒子では、全体の粒度が粒子１と同じになるように芯の内径および外径を定める。粒子１１にはタンパク質を加えるため、タンパク質結合の検出について示す目的で、粒子１１を基準粒子にするものとする。
【０３５２】
【表１３】
2006515420.tif 000017
【０３５３】
予測散乱パターンを図２５〜図２７に示す。図２６では、芯径約２９μｍ未満で、吸収芯が存在しても何の影響も観察されないことが分かる。これらの芯の直径は火面の直径よりも小さい。吸収芯の直径が火面の直径に達したときに光共鳴の消失が示されている。この実施例では、火面は直径３１から３２μｍである。芯径が増えるにつれて影響速度が非常に高くなる。芯が３１μｍの粒子ではいくつか共鳴構造が認められる。この芯が３２μｍになると、共鳴は実質的に破壊される。内側の吸収芯が大きくなるにつれて、事実上粒子の大半を含んでなる。吸収芯径の値によっては、共鳴パターンにゆっくりと変化する波状構造を生じるが、先の実施例で見られた鋭利な共鳴構造は戻ってこない。図２７は、２層芯の外側でのタンパク質結合の検出について示すものであり、この芯は吸収球を含んでなる。この実施例では、芯の直径は火面の直径よりも小さいため、これが共鳴の特徴の生成に干渉することはない。
【０３５４】
この実施例の結果から、火面の内側にある構造は光共鳴の生成に干渉しないことが分かる。よって、たとえば、内側の粒子の直径を火面の直径未満にして、磁気ミクロスフェアまたは着色ミクロスフェアなどの光吸収性の高い内側の粒子で芯を構成できる。内側の吸収芯の直径が火面の直径と同じになると、この実施例の１３〜１８の粒子で示されるように、共鳴散乱の特徴を生成できなくなる。これについては、物理的に、共鳴散乱の特徴を生じている光線が、全反射によってトラップされる粒子外面のすぐ内側の軌道を伝搬するからだと分かれば理解できよう。火面は粒子の物理的な外面の内側にあり、光線が伝搬する領域を画定している。吸収芯がこの領域に入り込む程度に大きくなると、それによって光線が吸収されて共鳴を生じる機能が破壊される。
【０３５５】
「中心の黒い」２層微粒子の表面でのタンパク質層の結合は、共鳴を生成できる程度に芯が小さい粒子の散乱パターンのシフトとして検出される
【０３５６】
実施例１９
半径方向に屈折率が異なる芯を有する微粒子の予測共鳴光散乱スペクトル
本実施例の目的は、コンピュータシミュレーションを利用して、中心からの距離の関数として芯の屈折率が変わる粒子の共鳴光散乱スペクトルを予測することにあった。１０ｎｍ厚のタンパク質層による作用も予測する。
【０３５７】
実施例５で説明したようにして、媒質のＲＩ、開始波長ならびに終了波長、散乱角、検出の全受光角について当該実施例の場合と同一の値を用いて、シミュレーションのスペクトルを算出した。芯の他に半径によって層の屈折率を変えた９層で屈折率のばらつきをモデル化した。半径によっていくつかのタイプの屈折率のばらつきを用いて、線形のばらつきと非線形のばらつきを示した。微粒子の外側に屈折率１．４５の均一な１０ｎｍ厚の層を加えることで、タンパク質層の結合をモデル化した。
【０３５８】
粒子ごとの仕様
粒子１すなわち基準粒子を除いて、粒子番号を、シミュレーションで利用したパラメータすなわち、芯の屈折率（図２８のＲＩＣｏｒｅ）、層１、２、３、・・・９の屈折率（それぞれ図２８のＲＩＬ１〜ＲＩＬ９）と一緒に表１４に一覧であげておく。この実施例では、粒子１は均質な芯のみで、これを基準とした。残りの粒子では、全体の粒度が粒子１と同じになるように芯および層厚を定める。粒子５にはタンパク質を加えるため、タンパク質結合の検出について示す目的で、粒子５を基準粒子にするものとする。簡単にするために、図面には全部の層を示したわけではない点に注意されたい。粒子１すなわち均質な構造の基準粒子は芯径４０μｍで芯のＲＩが１．８である。粒子２〜８は、芯径が８μｍで層厚は２μｍであり、粒子２〜８の全体の直径が粒子１と同じ４０μｍになるようにしてある。
【０３５９】
【表１４】
2006515420.tif 000018
【０３６０】
予測散乱パターンを図２８〜図２９に示す。これらの結果は、中心からの距離の関数として屈折率が変化する芯の有用性を示している。この実施例の結果は、半径方向に屈折率が変わるように粒子を製造することで、識別可能な微粒子の集団を構成できる可能性を示している。このような粒子の集団では、どのような生成方法でも自然なばらつきが生じ、こうしたばらつきがゆえに、光散乱パターンによって一意に区別できる粒子が得られる。半径方向に変化する芯の表面でのタンパク質層の結合は、散乱パターンのシフトとして検出される。
【０３６１】
実施例２０
媒質の屈折率が共鳴光散乱スペクトルに及ぼすと予測される影響
本実施例の目的は、コンピュータシミュレーションを利用して、微粒子を入れる媒質の屈折率が変わることで共鳴光散乱スペクトルにどのような影響がおよぶかを予測することにあった。この実施例では、光学的に活性な層を加えていない均質な球について考える。媒質の屈折率を変えることによる影響をタンパク質層の結合による影響と比較する。
【０３６２】
実施例５で説明したようにして、開始波長ならびに終了波長、散乱角、検出の全受光角について当該実施例の場合と同一の値を用いてシミュレーションのスペクトルを算出した。媒質の屈折率については変化させた。微粒子の外側に屈折率１．４５の均一な１０ｎｍ厚の層を加えることで、タンパク質層の結合をモデル化した。
【０３６３】
粒子ごとの仕様
粒子番号を、シミュレーションで利用したパラメータすなわち、芯径（図３０のＤＣｏｒｅ）、芯の屈折率（図３０のＲＩＣｏｒｅ）、媒質の屈折率（ＲＩ）と一緒に表１５に一覧であげておく。
【０３６４】
【表１５】
2006515420.tif 000019
【０３６５】
予測散乱パターンを図３０〜図３１に示す。図３１（一番上と下のスペクトルのペア）に示すように、媒質の屈折率が変わると相対ピーク強度ならびに一貫した波長のシフトに変化がある。図３１（中段のスペクトルのペア）に示すように、タンパク質層を基準粒子に加えると、相対ピーク強度は変化せずにスペクトルにだけシフトが認められる。
【０３６６】
実施例２１
屈折率２．５の材料を用いた場合にシグナル増幅が及ぼすと予測される影響
本実施例の目的は、コンピュータシミュレーションを利用して、標的分子に付着させた高屈折率の構造（ＴｉＯ２ナノ粒子など）を微粒子表面への標的の結合時における波長シフトの増大に用いることの影響を予測することにあった。
【０３６７】
実施例５で説明したようにして、媒質のＲＩ、開始波長ならびに終了波長、散乱角、検出の全受光角について当該実施例の場合と同一の値を用いて、シミュレーションのスペクトルを算出した。タンパク質層を加えてある２層微粒子の外側に、厚さがナノ粒子の特定の質量に対応する高屈折率材料からなる薄層を加えることで、増幅作用をモデル化した。この実施例では、増幅構造の屈折率を２．５にした。
【０３６８】
粒子ごとの仕様
粒子番号を、シミュレーションで利用したパラメータすなわち、芯径（図３２のＤＣｏｒｅ）、芯の屈折率（図３２のＲＩＣｏｒｅ）、層１の厚さ（図３２のＴ１）、層１の屈折率（図３２のＲＩＬ１）、タンパク質層の厚さ（図３２のＴ２）、タンパク質層の屈折率（図３２のＲＩＬ２）、増幅層の厚さ（図３２のＴ３）、増幅層の屈折率（図３２のＲＩＬ３）と一緒に表１６に一覧であげておく。
【０３６９】
【表１６】
2006515420.tif 000020
【０３７０】
増幅層の厚さの増加の効果が図３２〜３３に示されている。さらに増幅材料が加えられるにつれて、波長のシフトが、増幅材料を使わない場合に比べて、増加しているこれらの結果は、標的分子に付着させた高屈折率の構造（ＴｉＯ２ナノ粒子など）を微粒子表面への標的の結合時における波長シフトの増大に用いることの有用性を示している。これは、結合信号の微粒子での増幅に関する一般的な概念である。結合した標的だけを測定するため、付着させた増幅構造のない未結合標的分子が散乱スペクトルに対して干渉作用を持つことはない点に注意されたい。
【０３７１】
実施例２２
屈折率２．２の材料を用いた場合にシグナル増幅が及ぼすと予測される影響
本実施例の目的は、コンピュータシミュレーションを利用して、標的分子に付着させた高屈折率の構造（ナノ粒子の金属または金属酸化物または他の組成物）を微粒子表面への標的の結合時における波長シフトの増大に用いることの影響を予測することにあった。
【０３７２】
実施例５で説明したようにして、媒質のＲＩ、開始波長ならびに終了波長、散乱角、検出の全受光角について当該実施例の場合と同一の値を用いて、シミュレーションのスペクトルを算出した。タンパク質層を加えてある２層微粒子の外側に、厚さがナノ粒子の特定の質量に対応する高屈折率材料からなる薄層を加えることで、増幅作用をモデル化した。この実施例では、増幅構造の屈折率を実施例１２の場合よりもわずかに低い２．２にした。
【０３７３】
粒子ごとの仕様
粒子番号を、シミュレーションで利用したパラメータすなわち、芯径（図３４のＤＣｏｒｅ）、芯の屈折率（図３４のＲＩＣｏｒｅ）、層１の厚さ（図３４のＴ１）、層１の屈折率（図３４のＲＩＬ１）、タンパク質層の厚さ（図３４のＴ２）、タンパク質層の屈折率（図３４のＲＩＬ２）、増幅層の厚さ（図３４のＴ３）、増幅層の屈折率（図３４のＲＩＬ３）と一緒に表１７に一覧であげておく。
【０３７４】
【表１７】
2006515420.tif 000021
【０３７５】
増幅層の厚さを増すことによる影響を図３４〜３７に示す。増幅材料を足せば足すほど、増幅材料を使用した場合に比して波長シフトが大きくなる。実施例１２の屈折率の高い材料よりも実施例１３の屈折率の低い材料の方が、増幅作用がわずかに小さいことが認められる。
【０３７６】
これらの結果は、標的分子に付着させた高屈折率の構造（ナノ粒子の金属、金属酸化物または他の組成物の層など）を微粒子表面への標的の結合時における波長シフトの増大に用いることの有用性を示している。これは、結合信号の微粒子での増幅に関する一般的な概念である。結合した標的だけを測定するため、付着させた増幅構造のない未結合標的分子が散乱スペクトルに対して干渉作用を持つことはない点に注意されたい。
【０３７７】
スペクトルの狭い共鳴ピークの形と強度は、計算に利用する波長ステップの大きさに影響される場合がある点に注意されたい。上記のコンピュータシミュレーションによる実施例すなわち実施例５〜１３ではいずれも、波長ステップを２０００とした。場合によっては、ステップの大きさを小さくすることで、表示対称となる別の狭い共鳴を生成できることもあったが、しかしながら、これは上記の実施例に示した結果を実質的に何ら変化させないものであった。実際の測定では、粒子の識別と結合の測定にどの共鳴を利用するかは、検出設備で得られる解像度によって決まる。
【図面の簡単な説明】
【０３７８】
【図１】多分析物試料から選択した標的の捕捉と、プローブのうちのひとつに対して相補的ではない標的の非結合を示す、本発明による粒子ベースの特異的結合アッセイの概略図である。
【図２】任意の数ｍの層で被覆された芯を示す層状微粒子の図である。芯と各層は半径Ｒと屈折率ｎで特徴付けられる。Ｒとｎの粒子ごとのばらつきによって、本発明によるそれぞれの粒子の識別に利用可能な一意な散乱光パターンが生じる。
【図３】微粒子を保持するための光学セルと、微粒子を照明するとともに散乱光の強度を測定するための光プローブの概略図である。
【図４】微粒子からの散乱光の測定に利用される光プローブ検出システムの概略図である。構成要素については一定の縮尺で示されているわけではない。
【図５】本発明による一意な粒子のアイデンティティを構築可能な異なる微粒子から得た一組の散乱光スペクトルである。
【図６】微粒子を保持するための光学セルと、粒子を同時に画像形成するとともに散乱光の強度を測定するための顕微鏡レンズの概略図である。
【図７】本発明による多様な微粒子からの散乱光の測定に利用する画像形成検出システムの概略図である。構成要素については一定の縮尺で示されているわけではない。
【図８】入射光の単一の波長で図７の画像形成検出システムによって取得した、微粒子群からの散乱光のデジタル画像である。入射光と散乱光の両方を偏光させた。偏光方向は平行とした。１２、３、６、９の数字は、明細書で説明したそれぞれの粒子の散乱光画像の領域を示す。
【図９】単一粒子から得た一組の波長関連散乱光画像と、該当する２つの領域（偏光１２および偏光３）から得た抽出散乱光スペクトルである。
【図１０Ａ】実施例３によるビオチニル化ガラス微粒子から得た散乱光のデジタル画像である。
【図１０Ｂ】実施例３によるビオチニル化微粒子の散乱光スペクトルである。
【図１０Ｃ】実施例３によるビオチニル化微粒子でのアビジン結合前と後の散乱光スペクトルの比較を示す。
【図１１】実施例３で説明したように、図１０Ｃのエタロンデータと散乱スペクトルの自己相関関数を示す。
【図１２】実施例３で説明したように、図１０Ｃの同じ微粒子でＤＴＴ処理後に得られるスペクトルシフトである。
【図１３】実施例３で説明したように、図１２のエタロンデータと散乱スペクトルの自己相関関数を示す。
【図１４Ａ】分析物の結合の前と後に得られた２つの散乱光スペクトルの例を示す。波長スケールはまだ正確には整合していない。
【図１４Ｂ】図１４Ａのスペクトル走査時に得られた２つのスタックしたエタロンからの干渉パターンを示す。
【図１４Ｃ】散乱光スペクトル（強度）とエタロンパターン（エタロン）の相関分析について示す。
【図１４Ｄ】実施例３で説明したように、エタロンが整合した状態での分析物結合前後における波長補正散乱光スペクトルを示す。
【図１５】実施例４で説明したように、サンドイッチアッセイの連続的な結合ステップと、その後のＤＴＴによる切断での単一微粒子の散乱スペクトルを示す。
【図１６】実施例６で説明したように、プロテインＧ’微粒子へのＩｇＧ結合時の共鳴波長の経時変化を示す。
【図１７】実施例８で説明したように、蛍光微粒子を示すためのアルゴンイオンレーザ照明下での微粒子群の画像（Ａ）と、同じエリアの平面図を示すためのダイオードレーザ照明下での微粒子群の画像（Ｂ）を示す。
【図１８−１９】実施例１４に説明されている微粒子の予測共鳴光散乱スペクトルを示す。
【図２０−２１】実施例１５に説明されている微粒子の予測共鳴光散乱スペクトルを示す。
【図２２−２３】実施例１６に説明されている微粒子の予測共鳴光散乱スペクトルを示す。
【図２４】実施例１７に説明されている微粒子の予測共鳴光散乱スペクトルを示す。
【図２５−２７】実施例１８に説明されている微粒子の予測共鳴光散乱スペクトルを示す。
【図２８−２９】実施例１９に説明されている微粒子の予測共鳴光散乱スペクトルを示す。
【図３０−３１】実施例２０に説明されている微粒子の予測共鳴光散乱スペクトルを示す。
【図３２−３３】実施例２１に説明されている微粒子の予測共鳴光散乱スペクトルを示す。
【図３４−３７】実施例２２に説明されている微粒子の予測共鳴光散乱スペクトルを示す。
【配列表】
2006515420.tif 000022
2006515420.tif 000023
2006515420.tif 000024
2006515420.tif 000025
2006515420.tif 000026
2006515420.tif 000027
【図１】
2006515420.tif 000028
【図２】
2006515420.tif 000029
【図３】
2006515420.tif 000030
【図４】
2006515420.tif 000031
【図５】
2006515420.tif 000032
【図６】
2006515420.tif 000033
【図７】
2006515420.tif 000034
【図８】
2006515420.tif 000035
【図９】
2006515420.tif 000036
【図１０Ａ】
2006515420.tif 000037
【図１０Ｂ】
2006515420.tif 000038
【図１０Ｃ】
2006515420.tif 000039
【図１１】
2006515420.tif 000040
【図１２】
2006515420.tif 000041
【図１３】
2006515420.tif 000042
【図１４Ａ】
2006515420.tif 000043
【図１４Ｂ】
2006515420.tif 000044
【図１４Ｃ】
2006515420.tif 000045
【図１４Ｄ】
2006515420.tif 000046
【図１５】
2006515420.tif 000047
【図１７Ａ】
2006515420.tif 000048
【図１７Ｂ】
2006515420.tif 000049
【図１８】
2006515420.tif 000050
【図１９】
2006515420.tif 000051
【図２０】
2006515420.tif 000052
【図２１】
2006515420.tif 000053
【図２２】
2006515420.tif 000054
【図２３】
2006515420.tif 000055
【図２４】
2006515420.tif 000056
【図２５】
2006515420.tif 000057
【図２６】
2006515420.tif 000058
【図２７】
2006515420.tif 000059
【図２８】
2006515420.tif 000060
【図２９】
2006515420.tif 000061
【図３０】
2006515420.tif 000062
【図３１】
2006515420.tif 000063
【図３２】
2006515420.tif 000064
【図３３】
2006515420.tif 000065
【図３４】
2006515420.tif 000066
【図３５】
2006515420.tif 000067
【図３６】
2006515420.tif 000068
【図３７】
2006515420.tif 000069
【国際調査報告】
2006515420.tif 000070