(57)【要約】内在性ｍＲＮＡおよび実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるのに有用な組換え構築物について開示する。特に、とりわけ好適な核酸配列およびその逆相補体を含む組換え構築物を用いて、この好適な核酸配列に近接した相同的な内在性ＲＮＡ（すなわち標的ＲＮＡ）の発現を変化させることが可能である。
2004512020.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主で発現させるとＲＮＡを生成するＤＮＡ配列に作動的に結合されたプロモーターを含む組換え構築物であって、
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であり、（ａ）に近接した２つの相補的なＲＮＡ領域と、を有し、
発現されるＲＮＡが、標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものであることを特徴とする、組換え構築物。
【請求項２】
宿主で発現させるとＲＮＡを生成するＤＮＡ配列に作動的に結合されたプロモーターを含む組換え構築物であって、
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であり、（ａ）の５’に位置するＲＮＡ領域と、
（ｃ）（ａ）の３’に位置する、（ｂ）のＲＮＡの逆相補体と、を有し、
発現されるＲＮＡが、標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものであることを特徴とする、組換え構築物。
【請求項３】
宿主で発現させるとＲＮＡを生成するＤＮＡ配列に作動的に結合されたプロモーターを含む組換え構築物であって、
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であり、（ａ）の５’に位置する２つの相補的なＲＮＡ領域と、を有し、
発現されるＲＮＡが、標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものであることを特徴とする、組換え構築物。
【請求項４】
宿主で発現させるとＲＮＡを生成するＤＮＡ配列に作動的に結合されたプロモーターを含む組換え構築物であって、
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であり、（ａ）の３’に位置する２つの相補的なＲＮＡ領域と、を有し、
発現されるＲＮＡが、標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものであることを特徴とする、組換え構築物。
【請求項５】
宿主で発現させるとＲＮＡを生成するＤＮＡ配列に作動的に結合されたプロモーターを含む組換え構築物であって、
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であり、（ａ）の中に位置する２つの相補的なＲＮＡ領域と、を有し、
発現されるＲＮＡが、標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものであることを特徴とする、組換え構築物。
【請求項６】
宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であるＲＮＡ領域（単数または複数）が非天然型の合成ＲＮＡ配列を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の組換え構築物。
【請求項７】
宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であるＲＮＡ領域（単数または複数）が植物ウイルスのＲＮＡを含まないことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の組換え構築物。
【請求項８】
標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるための方法であって、
（ａ）請求項１〜５に記載の組換え構築物のうちいずれかを用いて宿主を形質転換し、
（ｂ）標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現が減少した宿主を選択することを含むことを特徴とする、方法。
【請求項９】
標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるための方法であって、
（ａ）請求項６に記載の組換え構築物を用いて宿主を形質転換し、
（ｂ）標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現が減少した宿主を選択することを含むことを特徴とする、方法。
【請求項１０】
標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるための方法であって、
（ａ）請求項７に記載の組換え構築物を用いて宿主を形質転換し、
（ｂ）標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現が減少した宿主を選択することを含むことを特徴とする、方法。
【請求項１１】
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であり、（ａ）に近接した２つの相補的なＲＮＡ領域と、を有するＲＮＡであって、
宿主に導入されると標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものであることを特徴とする、ＲＮＡ。
【請求項１２】
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であり、（ａ）の５’に位置するＲＮＡ領域と、
（ｃ）（ａ）の３’に位置する、（ｂ）のＲＮＡの逆相補体と、を有するＲＮＡであって、
宿主に導入されると標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものであることを特徴とする、ＲＮＡ。
【請求項１３】
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であり、（ａ）の５’に位置する２つの相補的なＲＮＡ領域と、を有するＲＮＡであって、
宿主に導入されると標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものであることを特徴とする、ＲＮＡ。
【請求項１４】
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であり、（ａ）の３’に位置する２つの相補的なＲＮＡ領域と、を有するＲＮＡであって、
宿主に導入されると標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものであることを特徴とする、ＲＮＡ。
【請求項１５】
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であり、（ａ）の中に位置する２つの相補的なＲＮＡ領域と、を有するＲＮＡであって、
宿主に導入されると標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものであることを特徴とする、ＲＮＡ。
【請求項１６】
宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であるＲＮＡ領域（単数または複数）が非天然型の合成ＲＮＡ配列を含む、請求項１１〜１５のいずれかに記載のＲＮＡ。
【請求項１７】
宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であるＲＮＡ領域（単数または複数）が植物ウイルスのＲＮＡを含まない、請求項１１〜１５のいずれかに記載のＲＮＡ。
【請求項１８】
標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるための方法であって、
（ａ）請求項１１〜１５のＲＮＡのうちいずれかを宿主に導入し、
（ｂ）標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現が減少した宿主を選択することを含むことを特徴とする、方法。
【請求項１９】
標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるための方法であって、
（ａ）請求項１６に記載の組換え構築物を宿主に導入し、
（ｂ）標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現が減少した宿主を選択することを含むことを特徴とする、方法。
【請求項２０】
標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるための方法であって、
（ａ）請求項１７に記載の組換え構築物を宿主に導入し、
（ｂ）標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現が減少した宿主を選択することを含むことを特徴とする、方法。
【請求項２１】
宿主で発現させるとＲＮＡを生成するＤＮＡ配列に作動的に結合されたプロモーターを含む組換え構築物であって、
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のゲノムの核酸配列によってコードされる２つの相補的なＲＮＡ領域（ただし、前記配列が標的ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡと実質的に類似の配列をコードしないものであり、前記領域が（ａ）に近接していることを条件とする）と、を有し、
発現されるＲＮＡが、標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものであることを特徴とする、組換え構築物。
【請求項２２】
宿主で発現させるとＲＮＡを生成するＤＮＡ配列に作動的に結合されたプロモーターを含む組換え構築物であって、
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のゲノムの核酸配列によってコードされるＲＮＡ領域（ただし、前記配列が標的ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡと実質的に類似の配列をコードしないものであり、（ａ）の５’に位置することを条件とする）と、
（ｃ）（ａ）の３’に位置する、（ｂ）の核酸の逆相補体と、を有し、
発現されるＲＮＡが、標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものであることを特徴とする、組換え構築物。
【請求項２３】
宿主で発現させるとＲＮＡを生成するＤＮＡ配列に作動的に結合されたプロモーターを含む組換え構築物であって、
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のゲノムの核酸配列によってコードされ、かつ、（ａ）の５’に位置する、２つの相補的なＲＮＡ領域（ただし、前記配列が標的ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡと実質的に類似の配列をコードしないものであることを条件とする）と、を有し、
発現されるＲＮＡが、標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものであることを特徴とする、組換え構築物。
【請求項２４】
宿主で発現させるとＲＮＡを生成するＤＮＡ配列に作動的に結合されたプロモーターを含む組換え構築物であって、
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のゲノムの核酸配列によってコードされ、かつ、（ａ）の３’に位置する、２つの相補的なＲＮＡ領域（ただし、前記配列が標的ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡと実質的に類似の配列をコードしないものであることを条件とする）と、を有し、
発現されるＲＮＡが、標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものであることを特徴とする、組換え構築物。
【請求項２５】
宿主で発現させるとＲＮＡを生成するＤＮＡ配列に作動的に結合されたプロモーターを含む組換え構築物であって、
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のゲノムの核酸配列によってコードされ、かつ、（ａ）の中に位置する、２つの相補的なＲＮＡ領域（ただし、前記配列が標的ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡと実質的に類似の配列をコードしないものであることを条件とする）と、を有し、
発現されるＲＮＡが、標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものであることを特徴とする、組換え構築物。
【請求項２６】
宿主のゲノムの核酸配列が、この宿主で発現されない配列である、請求項２１〜２５に記載の組換え構築物。
【請求項２７】
宿主のゲノムの核酸配列が、この宿主で発現される配列である、請求項２１〜２５に記載の組換え構築物。
【請求項２８】
標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるための方法であって、
（ａ）請求項２１〜２５に記載の組換え構築物のうちいずれかを用いて宿主を形質転換し、
（ｂ）標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現が減少した宿主を選択することを含むことを特徴とする、方法。
【請求項２９】
標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるための方法であって、
（ａ）請求項２６に記載の組換え構築物を用いて宿主を形質転換し、
（ｂ）標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現が減少した宿主を選択することを含むことを特徴とする、方法。
【請求項３０】
標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるための方法であって、
（ａ）請求項２７に記載の組換え構築物を用いて宿主を形質転換し、
（ｂ）標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現が減少した宿主を選択することを含むことを特徴とする、方法。
【請求項３１】
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のゲノムの核酸配列によってコードされる２つの相補的なＲＮＡ領域（ただし、前記配列が標的ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡと実質的に類似の配列をコードしないものであり、この領域が（ａ）に近接していることを条件とする）と、を有するＲＮＡであって、
宿主に導入されると標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものであることを特徴とする、ＲＮＡ。
【請求項３２】
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のゲノムの核酸配列によってコードされるＲＮＡ領域（ただし、前記配列が、標的ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡと実質的に類似の配列をコードしないものであり、（ａ）の５’に位置することを条件とする）と、
（ｃ）（ａ）の３’に位置する、（ｂ）のＲＮＡの逆相補体と、を有するＲＮＡであって、
宿主に導入されると標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものであることを特徴とする、ＲＮＡ。
【請求項３３】
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のゲノムの核酸配列によってコードされる２つの相補的なＲＮＡ領域（ただし、前記配列が標的ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡと実質的に類似の配列をコードしないものであり、この領域が（ａ）の５’に位置することを条件とする）と、を有するＲＮＡであって、
宿主に導入されると標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものであることを特徴とする、ＲＮＡ。
【請求項３４】
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のゲノムの核酸配列によってコードされ、かつ、（ａ）の３’に位置する、２つの相補的なＲＮＡ領域（ただし、前記配列が標的ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡと実質的に類似の配列をコードしないものであることを条件とする）と、を有するＲＮＡであって、
宿主に導入されると標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものであることを特徴とする、ＲＮＡ。
【請求項３５】
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のゲノムの核酸配列によってコードされ、かつ、（ａ）の中に位置する、２つの相補的なＲＮＡ領域（ただし、前記配列が標的ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡと実質的に類似の配列をコードしないものであることを条件とする）と、を有するＲＮＡであって、
宿主に導入されると標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものであることを特徴とする、ＲＮＡ。
【請求項３６】
宿主のゲノムの核酸配列が、この宿主で発現されない配列である、請求項３１〜３５のいずれかに記載のＲＮＡ。
【請求項３７】
宿主のゲノムの核酸配列が、この宿主で発現される配列である、請求項３１〜３５のいずれかに記載のＲＮＡ。
【請求項３８】
標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるための方法であって、
（ａ）請求項３１〜３５に記載のＲＮＡのうちいずれかを宿主に導入し、
（ｂ）標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現が減少した宿主を選択することを含むことを特徴とする、方法。
【請求項３９】
標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるための方法であって、
（ａ）請求項３６に記載のＲＮＡを宿主に導入し、
（ｂ）標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現が減少した宿主を選択することを含むことを特徴とする、方法。
【請求項４０】
標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるための方法であって、
（ａ）請求項３７に記載のＲＮＡを宿主に導入し、
（ｂ）標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現が減少した宿主を選択することを含むことを特徴とする、方法。
【請求項４１】
必須植物遺伝子を同定またはスクリーニングするための方法であって、
（ａ）構成的プロモーターを含み、必須植物遺伝子の発現を高い頻度で減少させることができる組換え構築物を用いて、植物細胞を形質転換し、
（ｂ）工程（ａ）で得られた形質転換後の植物細胞をすべて定量化し、
（ｃ）必須植物遺伝子の発現を減少させない対照物から得られる形質転換後の植物細胞をすべて定量化し、
（ｄ）工程（ｂ）から選択される形質転換後の植物細胞の定量化と、工程（ｃ）から選択される形質転換後の植物の細胞の定量化とを比較することを含み、工程（ｃ）から選択される形質転換後の植物の細胞の定量化が工程（ｂ）から選択される形質転換後の植物細胞の定量化を実質的に超えるものであることを特徴とする、方法。
【請求項４２】
必須植物遺伝子を同定またはスクリーニングするための方法であって、
（ａ）必須植物遺伝子の発現を高い頻度で減少させることができる構成的プロモーターをさらに含む請求項１〜５のいずれかに記載の組換え構築物を用いて、植物細胞を形質転換し、
（ｂ）工程（ａ）で得られた形質転換後の植物細胞をすべて定量化し、
（ｃ）必須植物遺伝子の発現を減少させない対照物から得られる形質転換後の植物細胞をすべて定量化し、
（ｄ）工程（ｂ）から選択される形質転換後の植物細胞の定量化と、工程（ｃ）から選択される形質転換後の植物の細胞の定量化とを比較することを含み、工程（ｃ）から選択される形質転換後の植物の細胞の定量化が工程（ｂ）から選択される形質転換後の植物細胞の定量化を実質的に超えるものであることを特徴とする、方法。
【請求項４３】
必須植物遺伝子を同定またはスクリーニングするための方法であって、
（ａ）必須植物遺伝子の発現を高い頻度で減少させることができる構成的プロモーターをさらに含む請求項６のいずれかに記載の組換え構築物を用いて、植物細胞を形質転換し、
（ｂ）工程（ａ）で得られた形質転換後の植物細胞をすべて定量化し、
（ｃ）必須植物遺伝子の発現を減少させない対照物から得られる形質転換後の植物細胞をすべて定量化し、
（ｄ）工程（ｂ）から選択される形質転換後の植物細胞の定量化と、工程（ｃ）から選択される形質転換後の植物の細胞の定量化とを比較することを含み、工程（ｃ）から選択される形質転換後の植物の細胞の定量化が工程（ｂ）から選択される形質転換後の植物細胞の定量化を実質的に超えるものであることを特徴とする、方法。
【請求項４４】
必須植物遺伝子を同定またはスクリーニングするための方法であって、
（ａ）必須植物遺伝子の発現を高い頻度で減少させることができる構成的プロモーターをさらに含む請求項７のいずれかに記載の組換え構築物を用いて、植物細胞を形質転換し、
（ｂ）工程（ａ）で得られた形質転換後の植物細胞をすべて定量化し、
（ｃ）必須植物遺伝子の発現を減少させない対照物から得られる形質転換後の植物細胞をすべて定量化し、
（ｄ）工程（ｂ）から選択される形質転換後の植物細胞の定量化と、工程（ｃ）から選択される形質転換後の植物の細胞の定量化とを比較することを含み、工程（ｃ）から選択される形質転換後の植物の細胞の定量化が工程（ｂ）から選択される形質転換後の植物細胞の定量化を実質的に超えるものであることを特徴とする、方法。
【請求項４５】
２つの相補的なＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列が、配列番号１２、１３または３４に記載の配列のうちいずれかの中で構成されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の組換え構築物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、遺伝子発現を減少させることに関し、特に、内在性ｍＲＮＡおよび実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させる上で有用な組換え構築物に関する。
【０００２】
発明の背景
多くの遺伝子の協調発現を必要とする複雑な生理学的・生化学的にプロセスのひとつに植物の発達がある。こうした遺伝子発現の協調パターンを変えることで、栄養面または耐病性面で形質が改善された新種の植物を作り出すことができる。組換えＤＮＡ手法が用いられるようになったことで、他の植物遺伝子の発現に直接的な影響をおよぼすことなく特定の植物遺伝子各々の発現パターンを変えることが可能になった。このようにして、植物全体、特定の組織または発達段階において個々の遺伝子の発現パターンを強めたり少なくしたりすることができる。したがって、プロモーターとターミネーターとを用いてトランスジーンを構築し、これをさまざまな生物体で発現させることが現在では常道となっている。
【０００３】
しかしながら、文献では導入したトランスジーンに予想通りの発現パターンを示さないものがあるという報告がいくつかなされている。このような予想外の発現パターンは、線虫から植物まで多岐にわたる生物体で見られる。たとえば、強力なプロモーターの制御下で内在性遺伝子のトランスジェニックコピーを導入した植物のなかには、ときおりその遺伝子に対するｍＲＮＡを蓄積できないものがある。さらに、トランスジーンに対する配列相同性を持つ内在性遺伝子から得られるｍＲＮＡはいずれも、内在性遺伝子産物の発現を効果的に排除しつつｍＲＮＡを蓄積することができない。これは、ペチュニアに含まれるカルコン合成酵素のトランスジーンが内在性カルコン合成酵素遺伝子の抑制を引き起こしたことで初めて明らかになった（Ｎａｐｏｌｉら　（１９９０）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　２：２７９〜２８９）。
【０００４】
導入したトランスジーンと内在性遺伝子の両方の発現が抑制されるため、この現象は「コサプレッション（同時抑制）」と呼ばれた（概要については、Ｖａｕｃｈｅｒｅｔら　（１９９８）　Ｐｌａｎｔ　Ｊ　１６：６５１〜６５９；Ｇｕｒａ　（２０００）　Ｎａｔｕｒｅ　４０４：８０４〜８０８を参照のこと）。コサプレッション技術はＪｏｒｇｅｎｓｅｎらに付与された１９９９年７月２７日発行の米国特許第５，２３１，０２０号の主題をなしている。コサプレッションは、植物生物学者の間では「ジーンサイレンシング」または転写後型ジーンサイレンシング（ＰＴＧＳ）とも呼ばれ、蠕虫およびハエについて研究している者の間では「ＲＮＡ干渉」と呼ばれ（ＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙおよびＦｉｒｅ　（１９９８）　ＴＩＧ　１４：２５５〜２５８；Ｆｉｒｅら　（１９９８）　Ｎａｔｕｒｅ　３９１：８０６〜８１１；Ｈａｍｍｏｎｄら　（２０００）　Ｎａｔｕｒｅ　４０４：２９３〜２９６；１９９９年７月１日公開の国際特許出願公開第ＷＯ９９／３２６１９号公報）、真菌を扱う研究者には「ｑｕｅｌｌｉｎｇ」と呼ばれている（ＲｏｍａｎｏおよびＭａｃｉｎｏ　（１９９２）　Ｍｏｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　６：３３４３〜３３５３）。
【０００５】
アンチセンスＲＮＡ遺伝子またはセンスＲＮＡ遺伝子の一方によって特定の遺伝子の発現が阻害される機序は明確になっていない。トランスジェニック植物で所望の下方制御が達成される頻度は一般に低く、遺伝子、そのプロモーターの強度と特異性、形質転換方法、トランスジーン挿入イベントの複雑さなどによって異なる。（Ｇｒａｎｔ　（１９９９）　Ｃｅｌｌ　９６：３０３〜３０６；Ｓｅｌｋｅｒ　（１９９９）　Ｃｅｌｌ　９７：１５７〜１６０。）
【０００６】
ＰＴＧＳはウイルスおよびトランスポゾンによる感染に対処するために発達した古くからの自己防衛機構のひとつではないかと推測される。この病原体由来の耐性は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）または他の何らかの異常な核酸が宿主の細胞に存在することが引き金になって生じるように思われる。これはウイルスによる襲撃を示すものである。通常、細胞のまわりを自由に移動しているＲＮＡは、宿主遺伝子とこの遺伝子がコードするタンパク質との間の中間体としての一本鎖メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のはずである。異常なＲＮＡが侵入してくると、この侵入してきた核酸配列にマッチするｍＲＮＡはいずれも活動停止してしまう。引き金となるものが宿主の遺伝子配列の一部と相同であれば、宿主とウイルス遺伝子の両方がサイレンシングされる（Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ　（１９９６）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　８：１８３３〜１８４４）。１９９９年４月１日に公開されたＷＯ９９／１５６８２および１９９８年８月２０日に公開されたＷＯ９８／３６０８３には、ジーンサイレンシング材料と方法とについて説明されている。これらの公報には、特に、サイレンシング対象の標的遺伝子と相同な遺伝子配列の全体または一部と結合させた植物ウイルスの核酸配列を含む発現構築物を導入することによる植物ゲノム遺伝子発現のサイレンシングについて記載されている。
【０００７】
１９９９年１０月２１日に公開されたＷＯ９９／５３０５０には、発現されるＲＮＡが分子内二本鎖ＲＮＡ構造を形成できるように、センス配列とアンチセンス配列とで構成され、標的核酸に特異的なＲＮＡ分子をコードするキメラ構築物が記載されている。このようなＲＮＡがトランスジェニック生物体で発現すると、細胞内の相同的な標的核酸配列がすべてジーンサイレンシングされる。
【０００８】
Ｂｉｒｄらに付与された１９９９年８月２５日発行の米国特許第５，９４２，６５７号ならびに１９９３年１１月２５日公開のＷＯ９３／２３５５１号には、標的遺伝子およびプロモーターの各々と相同な複数の異なるＤＮＡ領域を有する単一の制御遺伝子を導入することで、２つまたはそれ以上の遺伝子を阻害する植物遺伝子の発現の協調阻害について記載されている。このプロモーターは、各標的遺伝子の発現を阻害する上記のような異なる領域のＲＮＡから転写するように適合化された植物で作用するものである。
【０００９】
本発明では、これまで従来の説明がなされていなかった方法で後述するような好適なＤＮＡ配列またはこの配列由来のＲＮＡ配列を利用することについて説明する。これらの配列ならびにその逆相補体を用いて、ＤＮＡ配列またはこの配列由来のＲＮＡ配列と近接した核酸断片との間で実質的な類似点のある内在性ゲノム配列の発現を減少させることができる。この現象の詳細について本願明細書で説明する。
【００１０】
発明の開示
本発明は、宿主で発現させるとＲＮＡを生成するＤＮＡ配列に作動的に結合されたプロモーターを含む組換え構築物であって、
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であり、（ａ）に近接した２つの相補的なＲＮＡ領域と、を有し、
発現されるＲＮＡが、標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものである、組換え構築物に関する。
【００１１】
第２の実施形態において、本発明は、宿主で発現させるとＲＮＡを生成するＤＮＡ配列に作動的に結合されたプロモーターを含む組換え構築物であって、
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であり、（ａ）の５’に位置するＲＮＡ領域と、
（ｃ）（ａ）の３’に位置する、（ｂ）のＲＮＡの逆相補体と、を有し、
発現されるＲＮＡが、標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものである、組換え構築物に関する。
【００１２】
第３の実施形態において、本発明は、宿主で発現させるとＲＮＡを生成するＤＮＡ配列に作動的に結合されたプロモーターを含む組換え構築物であって、
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であり、（ａ）の５’に位置する２つの相補的なＲＮＡ領域と、を有し、
発現されるＲＮＡが、標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものである、組換え構築物に関する。
【００１３】
第４の実施形態において、本発明は、宿主で発現させるとＲＮＡを生成するＤＮＡ配列に作動的に結合されたプロモーターを含む組換え構築物であって、
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であり、（ａ）の３’に位置する２つの相補的なＲＮＡ領域と、を有し、
発現されるＲＮＡが、標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものである、組換え構築物に関する。
【００１４】
第５の実施形態において、本発明は、宿主で発現させるとＲＮＡを生成するＤＮＡ配列に作動的に結合されたプロモーターを含む組換え構築物であって、
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であり、（ａ）の中に位置する２つの相補的なＲＮＡ領域と、を有し、
発現されるＲＮＡが、標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものである、組換え構築物に関する。
【００１５】
上記組換え構築物の別の態様において、宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であるＲＮＡ領域（単数または複数）は非天然型の合成ＲＮＡ配列を含むものである。
【００１６】
上記組換え構築物のさらに他の態様において、宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であるＲＮＡ領域（単数または複数）は植物ウイルスのＲＮＡを含まないものである。
【００１７】
第６の実施形態において、本発明は、標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるための方法であって、
（ａ）上述した組換え構築物のうちいずれかを用いて宿主を形質転換し、
（ｂ）標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現が減少した宿主を選択することを含む方法に関する。
【００１８】
第７の実施形態において、本発明は、（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であり、（ａ）に近接した２つの相補的なＲＮＡ領域と、を有するＲＮＡであって、
宿主に導入されると標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものであるＲＮＡを含む、組換え構築物に関する。
【００１９】
第８の実施形態において、本発明は、（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であり、（ａ）の５’に位置するＲＮＡ領域と、
（ｃ）（ａ）の３’に位置する、（ｂ）のＲＮＡの逆相補体と、を有するＲＮＡであって、
宿主に導入されると標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものであるＲＮＡを含む、組換え構築物に関する。
【００２０】
第９の実施形態において、本発明は、（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であり、（ａ）の５’に位置する２つの相補的なＲＮＡ領域と、を有するＲＮＡであって、
宿主に導入されると標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものであるＲＮＡを含む、組換え構築物に関する。
【００２１】
第１０の実施形態において、本発明は、（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であり、（ａ）の３’に位置する２つの相補的なＲＮＡ領域と、を有するＲＮＡであって、
宿主に導入されると標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものであるＲＮＡを含む、組換え構築物に関する。
【００２２】
第１１の実施形態において、本発明は、（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であり、（ａ）の中に位置する２つの相補的なＲＮＡ領域と、を有するＲＮＡであって、
宿主に導入されると標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものであるＲＮＡを含む、組換え構築物に関する。
【００２３】
上記ＲＮＡの別の態様において、宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であるＲＮＡ領域（単数または複数）は非天然型の合成ＲＮＡ配列を含むものである。
【００２４】
上記組換え構築物のさらに他の態様において、宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であるＲＮＡ領域（単数または複数）は植物ウイルスのＲＮＡを含まないものである。
【００２５】
第１２の実施形態において、本発明は、標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるための方法であって、
（ａ）上述したＲＮＡのうちいずれかを宿主に導入し、
（ｂ）標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現が減少した宿主を選択することを含む方法に関する。
【００２６】
第１３の実施形態において、本発明は、宿主で発現させるとＲＮＡを生成するＤＮＡ配列に作動的に結合されたプロモーターを含む組換え構築物であって、
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のゲノムの核酸配列によってコードされる２つの相補的なＲＮＡ領域（ただし、前記配列が標的ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡと実質的に類似の配列をコードしないものであり、前記領域が（ａ）に近接していることを条件とする）と、を有し、
発現されるＲＮＡが、標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものである、組換え構築物に関する。
【００２７】
第１４の実施形態において、本発明は、宿主で発現させるとＲＮＡを生成するＤＮＡ配列に作動的に結合されたプロモーターを含む組換え構築物であって、
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のゲノムの核酸配列によってコードされるＲＮＡ領域（ただし、前記配列が標的ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡと実質的に類似の配列をコードしないものであり、（ａ）の５’に位置することを条件とする）と、
（ｃ）（ａ）の３’に位置する、（ｂ）の核酸の逆相補体と、を有し、
発現されるＲＮＡが、標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものである、組換え構築物に関する。
【００２８】
第１５の実施形態において、本発明は、宿主で発現させるとＲＮＡを生成するＤＮＡ配列に作動的に結合されたプロモーターを含む組換え構築物であって、
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のゲノムの核酸配列によってコードされ、かつ、（ａ）の５’に位置する、２つの相補的なＲＮＡ領域（ただし、前記配列が標的ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡと実質的に類似の配列をコードしないものであることを条件とする）と、を有し、
発現されるＲＮＡが、標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものである、組換え構築物に関する。
【００２９】
第１６の実施形態において、本発明は、宿主で発現させるとＲＮＡを生成するＤＮＡ配列に作動的に結合されたプロモーターを含む組換え構築物であって、
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のゲノムの核酸配列によってコードされ、かつ、（ａ）の３’に位置する、２つの相補的なＲＮＡ領域（ただし、前記配列が標的ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡと実質的に類似の配列をコードしないものであることを条件とする）と、を有し、
発現されるＲＮＡが、標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものである、組換え構築物に関する。
【００３０】
第１７の実施形態において、本発明は、宿主で発現させるとＲＮＡを生成するＤＮＡ配列に作動的に結合されたプロモーターを含む組換え構築物であって、
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のゲノムの核酸配列によってコードされ、かつ、（ａ）の中に位置する、２つの相補的なＲＮＡ領域（ただし、前記配列が標的ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡと実質的に類似の配列をコードしないものであることを条件とする）と、を有し、
発現されるＲＮＡが、標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものである、組換え構築物に関する。
【００３１】
上記組換え構築物の別の態様において、宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であるＲＮＡ領域（単数または複数）は非天然型の合成ＲＮＡ配列を含むものである。
【００３２】
上記組換え構築物のさらに他の態様において、宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であるＲＮＡ領域（単数または複数）は植物ウイルスのＲＮＡを含まないものである。
【００３３】
第１８の実施形態において、本発明は、標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるための方法であって、
（ａ）上述した組換え構築物のうちいずれかを用いて宿主を形質転換し、
（ｂ）標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現が減少した宿主を選択することを含む方法に関する。
【００３４】
第１９の実施形態において、本発明は、（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のゲノムの核酸配列によってコードされる２つの相補的なＲＮＡ領域（ただし、前記配列が標的ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡと実質的に類似の配列をコードしないものであり、この領域が（ａ）に近接していることを条件とする）と、を有するＲＮＡであって、
宿主に導入されると標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものである、ＲＮＡに関する。
【００３５】
第２０の実施形態において、本発明は、（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のゲノムの核酸配列によってコードされるＲＮＡ領域（ただし、前記配列が、標的ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡと実質的に類似の配列をコードしないものであり、（ａ）の５’に位置することを条件とする）と、
（ｃ）（ａ）の３’に位置する、（ｂ）のＲＮＡの逆相補体と、を有するＲＮＡであって、
宿主に導入されると標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものである、ＲＮＡに関する。
【００３６】
第２１の実施形態において、本発明は、（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のゲノムの核酸配列によってコードされる２つの相補的なＲＮＡ領域（ただし、前記配列が標的ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡと実質的に類似の配列をコードしないものであり、この領域が（ａ）の５’に位置することを条件とする）と、を有するＲＮＡであって、
宿主に導入されると標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものである、ＲＮＡに関する。
【００３７】
第２２の実施形態において、本発明は、（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のゲノムの核酸配列によってコードされ、かつ、（ａ）の３’に位置する、２つの相補的なＲＮＡ領域（ただし、前記配列が標的ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡと実質的に類似の配列をコードしないものであることを条件とする）と、を有するＲＮＡであって、
宿主に導入されると標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものである、ＲＮＡに関する。
【００３８】
第２３の実施形態において、本発明は、（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のゲノムの核酸配列によってコードされ、かつ、（ａ）の中に位置する、２つの相補的なＲＮＡ領域（ただし、前記配列が標的ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡと実質的に類似の配列をコードしないものであることを条件とする）と、を有するＲＮＡであって、
宿主に導入されると標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものである、ＲＮＡに関する。
【００３９】
上記ＲＮＡの別の態様において、宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であるＲＮＡ領域（単数または複数）は非天然型の合成ＲＮＡ配列を含むものである。
【００４０】
上記組換え構築物のさらに他の態様において、宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であるＲＮＡ領域（単数または複数）は植物ウイルスのＲＮＡを含まないものである。
【００４１】
第２４の実施形態において、本発明は、標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるための方法であって、
（ａ）上述したＲＮＡのうちいずれかを宿主に導入し、
（ｂ）標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現が減少した宿主を選択することを含む方法に関する。
【００４２】
第２５の実施形態において、本発明は、必須植物遺伝子を同定またはスクリーニングするための方法であって、
（ａ）構成的プロモーターを含み、必須植物遺伝子の発現を高い頻度で減少させることができる組換え構築物を用いて、植物細胞を形質転換し、
（ｂ）工程（ａ）で得られた形質転換後の植物細胞をすべて定量化し、
（ｃ）必須植物遺伝子の発現を減少させない対照物から得られる形質転換後の植物細胞をすべて定量化し、
（ｄ）工程（ｂ）から選択される形質転換後の植物細胞の定量化と、工程（ｃ）から選択される形質転換後の植物の細胞の定量化とを比較することを含み、工程（ｃ）から選択される形質転換後の植物の細胞の定量化が工程（ｂ）から選択される形質転換後の植物細胞の定量化を実質的に超えるものである方法に関する。
【００４３】
第２６の実施形態において、本発明は、必須植物遺伝子を同定またはスクリーニングするための方法であって、
（ａ）ＤＮＡ配列に作動的に結合されたプロモーターを含む本発明の組換え構築物であって、必須植物遺伝子の発現を高い頻度で減少させることができる構成的プロモーターをさらに含む本発明の組換え構築物のうちいずれかを用いて、植物細胞を形質転換し、
（ｂ）工程（ａ）で得られた形質転換後の植物細胞をすべて定量化し、
（ｃ）必須植物遺伝子の発現を減少させない対照物から得られる形質転換後の植物細胞をすべて定量化し、
（ｄ）工程（ｂ）から選択される形質転換後の植物細胞の定量化と、工程（ｃ）から選択される形質転換後の植物の細胞の定量化とを比較することを含み、工程（ｃ）から選択される形質転換後の植物の細胞の定量化が工程（ｂ）から選択される形質転換後の植物細胞の定量化を実質的に超えるものである、方法に関する。
【００４４】
本件出願の一部をなす以下の詳細な説明および添付の図面ならびに配列表から、本発明を一層よく理解することができる。
【００４５】
配列表の簡単な説明
添付の配列表（配列番号１〜３５）は、本願明細書にて述べるさまざまなプラスミドを設計する上で用いるオリゴヌクレオチド配列、あるいは、これらのプラスミドのうちいくつかに見られる相補的な領域の配列を説明するものである。
配列番号１は、ダイズＦａｄ２−１遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅に使用され、プラスミドｐＫＳ６７に挿入してプラスミドｐＫＳ９１を作製するためのオリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
配列番号２は、ダイズＦａｄ２−１遺伝子のＰＣＲ増幅に使用され、プラスミドｐＫＳ６７に挿入してプラスミドｐＫＳ９１を作製するためのオリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
配列番号３は、ダイズＦａｄ２−１遺伝子のＰＣＲ増幅に使用され、プラスミドｐＫＳ６７に挿入してプラスミドｐＫＳ９１を作製するためのオリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
配列番号４は、ダイズＦａｄ２−１遺伝子のＰＣＲ増幅に使用され、プラスミドｐＫＳ６７に挿入してプラスミドｐＫＳ９１を作製するためのオリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
配列番号５は、ダイズＦａｄ２−１遺伝子のＰＣＲ増幅に使用され、プラスミドｐＫＳ６７に挿入してプラスミドｐＫＳ９１を作製するためのオリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
配列番号６は、ダイズＦａｄ２−１遺伝子のＰＣＲ増幅に使用され、プラスミドｐＫＳ６７に挿入してプラスミドｐＫＳ９１を作製するためのオリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
配列番号７は、さまざまな制限酵素部位をプラスミドｐＫＳ１７に挿入してプラスミドｐＫＳ１０２を作製するのに用いるリンカーオリゴヌクレオチドである。
配列番号８は、ダイズＣｅｒ３遺伝子のＰＣＲ増幅に使用され、プラスミドｐＫＳ６７に挿入してプラスミドｐＫＳ１００を作製するためのオリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
配列番号９は、ダイズＣｅｒ３遺伝子のＰＣＲ増幅に使用され、プラスミドｐＫＳ６７に挿入してプラスミドｐＫＳ１００を作製するためのオリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
配列番号１０は、ダイズＣｅｒ３遺伝子のＰＣＲ増幅に使用され、プラスミドｐＫＳ６７に挿入してプラスミドｐＫＳ１００を作製するためのオリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
配列番号１１は、ダイズＣｅｒ３遺伝子のＰＣＲ増幅に使用され、プラスミドｐＫＳ６７に挿入してプラスミドｐＫＳ１００を作製するためのオリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
配列番号１２は、プラスミドｐＫＳ１０６およびｐＫＳ１２４に見られるＥＬＶＩＳＬＩＶＥＳという名前の１×相補的リピートを示す。
配列番号１３は、プラスミドｐＫＳ１３３に見られるＥＬＶＩＳＬＩＶＥＳという名前の２×相補的リピートを示す。
配列番号１４は、ＥＬＶＩＳＬＩＶＥＳ相補的な領域のＰＣＲ増幅に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
配列番号１５は、ＥＬＶＩＳＬＩＶＥＳ相補的な領域のＰＣＲ増幅に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
配列番号１６は、ダイズＦａｄ２−１遺伝子のＰＣＲ増幅に使用され、プラスミドｐＫＳ１１１を作製するためにプラスミドｐＫＳ１０６に挿入される５９９ヌクレオチド断片を作製するオリゴヌクレオチドプライマーの配列である、
配列番号１７は、ダイズＦａｄ２−１遺伝子のＰＣＲ増幅に使用され、プラスミドｐＫＳ１０６に挿入してプラスミドｐＫＳ１１１を作製する５９９ヌクレオチド断片を得るためのオリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
配列番号１８は、ダイズＦａｄ２−１遺伝子のＰＣＲ増幅に使用され、標的配列のサイズの要件を試験する際に用いられる共通の５’オリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
配列番号１９は、ダイズＦａｄ２−１遺伝子のＰＣＲ増幅に使用され、２５ｂｐの断片を作製するための３’オリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
配列番号２０は、ダイズＦａｄ２−１遺伝子のＰＣＲ増幅に使用され、７５ｂｐの断片を作製するための３’オリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
配列番号２１は、ダイズＦａｄ２−１遺伝子のＰＣＲ増幅に使用され、１５０ｂｐの断片を作製するための３’オリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
配列番号２２は、ダイズＦａｄ２−１遺伝子のＰＣＲ増幅に使用され、３００ｂｐの断片を作製するための３’オリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
配列番号２３は、ダイズＦａｄ２−１遺伝子のＰＣＲ増幅に使用され、６００ｂｐの断片を作製するための３’オリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
配列番号２４は、ｐＫＳ１１１から得られる５９９ヌクレオチドのＦａｄ２−１　ＮｏｔＩ断片とダイズΔ−９不飽和化酵素から得られる９６９ヌクレオチドの断片とを囲む２×ＥＬＶＩＳＬＩＶＥＳの相補的な領域を含むｐＢＳ６８から得られる２×ＥＬＶＩＳＬＩＶＥＳの相補的リピート領域を示す。
配列番号２５は、ＬｅａプロモーターのＰＣＲ増幅に使用される５’オリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
配列番号２６は、ＬｅａプロモーターのＰＣＲ増幅に使用される３’オリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
配列番号２７は、ファゼオリン３’末端のＰＣＲ増幅に使用される５’オリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
配列番号２８は、ファゼオリン３’末端のＰＣＲ増幅に使用される３’オリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
配列番号２９は、２種類のダイズガラクチノール合成酵素遺伝子ＧＡＳ１およびＧＡＳ２（それぞれ４１１ヌクレオチドおよび４３５ヌクレオチド）から得られる断片を含むｐＫＳ１４９から得られる２×ＥＬＶＩＳＬＩＶＥＳの相補的リピート領域を示す。この領域は、ダイズ後期胚プロモーター（ＬＥＡ）およびファゼオリン３’ターミネーター領域と機能的に結合されている。この領域全体を、ダイズＫｔｉプロモーターおよびターミネーター領域に制御される２×ＥＬＶＩＳＬＩＶＥＳの相補的リピート領域を含むｐＫＳ１３６のＢａｍＨＩ部位にクローニングする。
配列番号３０は、ダイズガラクチノール合成酵素遺伝子ＧＡＳ１のＤＮＡ配列を示す。
配列番号３１は、配列番号３０すなわちダイズガラクチノール合成酵素遺伝子ＧＡＳ１の推定上の翻訳産物のＤＮＡ配列を示す。
配列番号３２は、ダイズガラクチノール合成酵素遺伝子ＧＡＳ２のＤＮＡ配列を示す。
配列番号３３は、配列番号３２すなわちダイズガラクチノール合成酵素遺伝子ＧＡＳ２の推定上の翻訳産物のＤＮＡ配列を示す。
配列番号３４は、フィトエン不飽和化酵素断片を含有するプラスミドＰＨＰ１７８９４を構築する際に用いられる、プラスミドＰＨＰ１７９６２から得られる相補的な領域ＳＨＨ３を示す。相補的な領域はそれぞれ８−２１２および３０５−５０９からである。ＥｃｏＲＶ、ＫｐｎＩ、ＫｓｐＩ、ＳｐｈＩおよびＮｃｏＩの制限エンドヌクレアーゼ部位を相補的な領域間のクローニング部位として用いることができる。
配列番号３５は、ダイズアセトラクテート合成酵素（ＡＬＳ）遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
配列番号３６は、ダイズＦａｄ２−１遺伝子のＰＣＲ増幅に使用され、５０ｂｐの断片を作製するための３’オリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
【００４６】
発明の詳細な説明
本件開示内容との関連で、多数の用語を使用しなければならない。
【００４７】
「宿主」という用語は、ヒトまたは非ヒトを問わず、遺伝子発現を減少させる目的で組換え構築物を安定してまたは一過的に導入可能な生物体またはその細胞を示す。
【００４８】
本願明細書において使用する場合、「単離された核酸断片」は、合成、非天然または改変したヌクレオチド塩基を任意に含有する一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形での単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つまたはそれ以上のセグメントで構成されるものであってもよい。ヌクレオチド（通常はその５’−一リン酸の形態で見られる）を一文字表記で以下のように示す。アデニル酸またはデオキシアデニル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡ）は「Ａ」、シチジル酸またはデオキシシチジル酸は「Ｃ」、グアニル酸またはデオキシグアニル酸は「Ｇ」、ウリジン酸は「Ｕ」、デオキシチミジン酸は「Ｔ」、プリン（ＡまたはＧ）は「Ｒ」、ピリミジン（ＣまたはＴ）は「Ｙ」、ｇまたはＴは「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴは「Ｈ」、イノシンは「Ｉ」、ヌクレオチドは「Ｎ」である。
【００４９】
「機能的に等価である細断片」および「機能的に等価な細断片」という表現は、本願明細書では同義に用いられる。これらの表現は、断片または細断片が活性酵素をコードするか否かを問わず遺伝子発現を改変または特定の表現型を生む能力が保たれた単離された核酸断片の一部またはサブ配列を示す。たとえば、この断片または細断片をキメラ遺伝子の設計に用いて、形質転換した植物で所望の表現型を得ることができる。活性酵素をコードするか否かを問わず、核酸断片またはその細断片を植物プロモーター配列に対して適当な配向で結合させることで、キメラ遺伝子をコサプレッションまたはアンチセンスで使用するように設計することも可能である。
【００５０】
「相同性」、「相同的な」、「実質的に類似の」および「実質的に対応する」という表現は、本願明細書では同義に用いられる。これらの表現は、１つまたはそれ以上のヌクレオチド塩基の違いが遺伝子発現を媒介または特定の表現型を生む核酸断片の能力に影響しない核酸断片を示す。また、これらの表現は、得られる核酸断片の機能的特性が最初の未修飾の断片に対して実質的に変わることのない、ヌクレオチド１つまたはそれ以上の欠失または挿入などの本発明の核酸断片の修飾も含む。したがって、当業者であれば明らかなように、本発明は具体的に例示した配列以外の配列も包含することは理解できよう。
【００５１】
さらに、当業者であれば、本発明に包含される実質的に類似の核酸配列が、中程度にストリンジェントな条件（たとえば、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃）下で、本願明細書において例示する配列とハイブリダイズする機能または本発明のプロモーターと機能的に等価である本願明細書において報告するヌクレオチド配列のいずれかの部分にハイブリダイズされる機能によっても定義されることが分かるであろう。ストリンジェンシー条件については、近親の生物体から得られる、機能的酵素が重複する遺伝子などの極めて類似した断片に対して、関連の遠縁の生物体から得られる相同的な配列など中程度に類似した断片をスクリーニングするように調節することができる。ストリンジェンシー条件はハイブリダイゼーション後の洗浄によって決まる。一組の好ましい条件として、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを室温にて１５分間から開始し、続いて２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを４５℃にて３０分間を繰返し、さらに０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを５０℃で３０分間を２回繰り返す一連の洗浄があげられる。一層好ましいストリンジェントな条件の組では温度を高めにする。この場合、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの最後の３０分間の洗浄２回の温度を６０℃に上げること以外は上記と同じ洗浄である。極めてストリンジェントな条件の別の好ましい組として、最終洗浄２回を０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃にて行うことがあげられる。
【００５２】
標的ｍＲＮＡに対して相同性のある構築物におけるＲＮＡ領域と標的（内在性）ｍＲＮＡとの実質的な類似度に鑑みると、このような配列は少なくとも２５ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド長、さらに好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド長、一層好ましくは少なくとも２００ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも３００ヌクレオチド長であるものとし、少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、さらに好ましくは少なくとも９０％同一、最も好ましくは少なくとも９５％同一であるものとする。
【００５３】
相同的な配列を検出するように設計された多種多様な比較方法を用いて配列のアライメントと類似率の計算値を求めることができる。その一例として、ＬＡＳＡＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングパッケージのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ウィスコンシン州マディソンのＤＮＡＳＴＡＲ　Ｉｎｃ．）があげられるが、これに限定されるものではない。ここではＣｌｕｓｔａｌ法でのアライメント（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ　（１９８９）　ＣＡＢＩＯＳ．　５：１５１〜１５３）をデフォルトのパラメータ（ＧＡＰ　ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ　ＬＥＮＧＴＨ　ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）で用いて配列のマルチプルアライメントを実施する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いる対アライメントについてのデフォルトのパラメータおよびタンパク質配列の同一率の計算は、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ　ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ　ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸では、これらのパラメータをＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ　ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ　ＳＡＶＥＤ＝４とする。
【００５４】
「遺伝子」とは、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）の制御配列を含む、特定のタンパク質を発現する核酸断片を示す。「未変性遺伝子」とは、それぞれの制御配列がある自然界に見られる遺伝子を示す。「キメラ遺伝子」とは、自然界では一緒に見られることのない制御配列とコード配列とを含む、未変性遺伝子ではない遺伝子を示す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる起源由来の制御配列およびコード配列または同一起源由来の制御配列およびコード配列を含むが、自然界で見られるものとは異なる形で配列されたものであってもよい。「外来」遺伝子とは、宿主生物では通常見られないが、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子を示す。外来遺伝子は自然界の生物体に挿入した未変性遺伝子またはキメラ遺伝子を持つ場合がある。「トランスジーン」とは、形質転換法によってゲノムに導入された遺伝子である。
【００５５】
「必須植物遺伝子」という用語は、本願明細書において使用する場合、植物の正常な成長、発達および／または生存に必要な産物をコードする遺伝子を示す。ＡＬＳに加えて、必須植物遺伝子の一例として、アミノ酸、核酸または脂質の生合成における律速酵素があげられるが、これに限定されるものではない。また、機能が明らかになっていない多くの遺伝子が必須であり得ると思われる。化学的または遺伝的な手段によって必須植物遺伝子を抑制すると、成長および／または発達の状態が変化することになる。必須遺伝子が植物のゲノムにおいて特有のものであると、抑制を行うことで植物が枯れる場合がある。これは植物用の多くの除草剤の基礎となっていることである。
【００５６】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を示す。「制御配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内またはコード配列の下流（３’非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡのプロセシングまたは安定性あるいは関連のコード配列の翻訳に影響するヌクレオチド配列を示す。制御配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロンおよびポリアデニル化の認識配列を含み得るが、これに限定されるものではない。
【００５７】
「プロモーター」とは、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を示す。プロモーター配列は、近位と一層遠位の上流要素からなり、後者の要素はエンハンサーと呼ばれることが多い。したがって、「エンハンサー」とはプロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、プロモーターの生得的な要素、あるいは、プロモーターのレベルまたは組織特異性を高めるために挿入された異種要素であってもよい。プロモーターは、全体が未変性遺伝子由来であってもよいし、自然界に見られる異なるプロモーター由来の異なる要素からなるものであってもよいし、合成ＤＮＡセグメントを含むものでもよい。プロモーターが変われば、異なる組織または細胞型で、あるいは異なる発達段階にて、あるいは異なる環境条件に応答して遺伝子の発現を指示できることは、当業者であれば理解できよう。ほとんどの細胞型でほとんどの時期に遺伝子を発現させるプロモーターのことを一般に「構成的プロモーター」と呼ぶ。植物細胞において有用なさまざまなタイプの新たなプロモーターが絶え間なく発見されている。これについては、ＯｋａｍｕｒｏおよびＧｏｌｄｂｅｒｇ、（１９８９）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ　１５：１〜８２の編纂書籍に多数の例が見られる。また、ほとんどの場合、制御配列の正確な境界が完全に定義されていることはないため、いくつかのバリエーションのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を持つことがある点も理解されたい。
【００５８】
「イントロン」とは、タンパク質配列の一部をコードしない遺伝子における介在配列である。つまり、このような配列はＲＮＡに転写はされるが、転写後に切除されて翻訳はなされない。また、この用語は切除後のＲＮＡ配列にも用いられる。「エキソン」とは、転写され、遺伝子由来の成熟したメッセンジャーＲＮＡで見出されるが、最終的な遺伝子産物をコードする配列の一部であるとは限らない遺伝子の配列の一部である。
【００５９】
「翻訳リーダー配列」とは、遺伝子のプロモーター配列とコード配列との間に位置するＤＮＡ配列を示す。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列上流の完全にプロセシングされたｍＲＮＡに存在する。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡへの一次転写物のプロセシング、ｍＲＮＡの安定性または翻訳効率に影響する場合がある。翻訳リーダー配列の一例については説明がなされている（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｒ．およびＦｏｓｔｅｒ，Ｇ．Ｄ．　（１９９５）　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３：２２５）。
【００６０】
「３’非コード配列」とは、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を示し、ポリアデニル化の認識配列や、ｍＲＮＡのプロセシングまたは遺伝子発現に影響することができる制御シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常はｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクト（ｔｒａｃｔ）の付加に影響することが特徴である。異なる３’非コード配列の使用例が、Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔら、（１９８９）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１：６７１〜６８０に記載されている。
【００６１】
「ＲＮＡ転写物」とは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写によって得られる産物を示す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全相補コピーである場合、これは一次転写物と呼ばれる。また、一次転写物の転写後プロセシングによって誘導されるＲＮＡ配列の場合もあるが、これは成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、イントロンを持たず、細胞によってタンパク質に翻訳可能なＲＮＡを示す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡ鋳型と相補的であり、この鋳型から酵素逆転写酵素を用いて合成されたＤＮＡを示す。ｃＤＮＡは、一本鎖であってもよいし、あるいはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて二本鎖形態に変換したものであってもよい。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含み、細胞内またはｉｎ　ｖｉｔｒｏにてタンパク質に翻訳可能なＲＮＡ転写物を示す。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的となる一次転写物またはｍＲＮＡの全体または一部に対して相補的であり、標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を示す（米国特許第５，１０７，０６５号）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物すなわち、５’非コード配列、３’非コード配列、イントロンまたはコード配列のどの部分でのものであってもよい。「機能的ＲＮＡ」とは、場合によっては翻訳されないが、それでも細胞プロセスに対する影響力を持つ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡまたは他のＲＮＡを示す。「相補体」および「逆相補体」という用語は、本願明細書ではｍＲＮＡ転写物に関して同義に用いられ、メッセージのアンチセンスＲＮＡを定義することを想定している。
【００６２】
「標的ｍＲＮＡ」という用語は、宿主における発現を減少させる対象となるｍＲＮＡを示す。
【００６３】
「内在性ＲＮＡ」という用語は、天然型であるか非天然型であるか、すなわち、組換え手段、突然変異誘発などによって導入したものであるか否かを問わず、本発明の組換え構築物を用いての形質転換前に宿主のゲノムに含まれる核酸配列によってコードされるＲＮＡを示す。
【００６４】
「非天然型の」という表現は、自然界で普通に見られるものとは一致しない人工の状態を意味する。
【００６５】
「作動的に結合された」という表現は、単一の核酸断片で核酸配列が一方の機能が他方によって調節されるような形で関連していることを示す。たとえば、プロモーターはコード配列の発現を調節できる場合にそのコード配列と作動的に結合されている（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）。コード配列については、センス方向またはアンチセンス方向で制御配列に作動的に結合させることができる。もうひとつの例として、本発明の相補的なＲＮＡ領域を、直接または間接的に、標的ｍＲＮＡの５’または標的ｍＲＮＡの３’に対して、あるいは標的ｍＲＮＡ内で作動的に結合させることができる。あるいは、第１の相補的な領域が標的ｍＲＮＡの５’でその相補体が３’である。
【００６６】
「発現」という用語は、本願明細書において使用する場合、機能的最終産物を生成することを示す。遺伝子の発現には、遺伝子の転写とｍＲＮＡの前駆体または成熟タンパク質への翻訳を伴う。「アンチセンス阻害」とは、標的タンパク質の発現を抑制できるアンチセンスＲＮＡ転写物を生成することを示す。「コサプレッション」とは、同一または実質的に類似の外来または内在性遺伝子の発現を抑制できるセンスＲＮＡ転写物を生成することを示す（米国特許第５，２３１，０２０号）。
【００６７】
「成熟」タンパク質とは、翻訳後処理されたポリペプチドすなわち、一次翻訳産物に存在するプレペプチドまたはプロペプチドが除去されたポリペプチドを示す。「前駆体」タンパク質とは、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物すなわち、プレペプチドおよびプロペプチドが残っている一次産物を示す。プレペプチドおよびプロペプチドは細胞内局在シグナルであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００６８】
「安定した形質転換」とは、核ゲノムと細胞小器官のゲノムの両方を含む宿主生物ゲノムに核酸断片を移行させ、遺伝的に安定した遺伝を行うことを示す。これとは対照的に、「一過的な形質転換」とは、宿主生物の核またはＤＮＡ含有細胞小器官に核酸断片を移行させ、統合または安定した遺伝のない遺伝子発現を行うことを示す。形質転換された核酸断片を含む宿主生物を「トランスジェニック」生物体と呼ぶ。コメ、トウモロコシおよび他の単子葉植物の細胞を形質転換するための好ましい方法は、粒子加速または「遺伝子銃」形質転換技術（Ｋｌｅｉｎら、（１９８７）　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３２７：７０〜７３；米国特許第４，９４５，０５０号）またはトランスジーンを含む適切なＴｉプラスミドを用いるアグロバクテリウムによる方法（Ｉｓｈｉｄａ　Ｙ．ら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：７４５〜７５０）を用いるものである。
【００６９】
本願明細書において使用する標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング手法は従来技術において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ：　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、１９８９（以下、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）に十分な説明がなされている。
【００７０】
「組換え」という用語は、組換えを行わなければ分離されている２つの配列セグメントを、たとえば化学合成や遺伝子エンジニアリング手法での単離した核酸セグメントの操作などによって人工的に組み合わせることを示す。
【００７１】
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」とは、特定のＤＮＡセグメントを大量に合成するための手法であり、一連のサイクルの繰返しからなるものである（コネチカット州ノーウォークのＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。一般に二本鎖ＤＮＡは熱で変性されるため、標的セグメントの３’境界と相補的な２つのプライマーを低温でアニーリングし、続いて中間の温度で伸長させる。この３つの連続した工程をまとめてサイクルと呼ぶ。
【００７２】
「組換え構築物」、「発現構築物」、「組換え発現構築物」という用語は、本願明細書では同義に用いられる。このような構築物は、それ自体がベクターであってもよいし、ベクターと併用されるものであってもよい。ベクターを用いる場合、どのベクターを選択するかは、当業者間で周知のように宿主植物を形質転換する際に用いる方法に左右される。たとえば、プラスミドベクターを用いることができる。当業者であれば、本発明の単離された核酸断片を含む宿主細胞をうまく形質転換し、選択し、増殖させるためにベクターに不可欠な遺伝的要素が分かるであろう。また、当業者であれば、独立した異なる形質転換イベントでは得られる発現のレベルやパターンが異なる（Ｊｏｎｅｓら、（１９８５）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　４：２４１１〜２４１８；Ｄｅ　Ａｌｍｅｉｄａら、（１９８９）　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２１８：７８〜８６）ため、所望の発現レベルおよびパターンを示す系を得るには複数のイベントをスクリーニングしなければならないことも理解できよう。このようなスクリーニングは、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のウェスタン分析または表現型解析によって行うことができる。
【００７３】
植物におけるコサプレッション構築物については、センス方向で内在性ｍＲＮＡとの相同性を持つ核酸配列の過発現に注目して設計されたものがあるが、この構築物では過発現した配列との相同性があるＲＮＡがすべて減少する（Ｖａｕｃｈｅｒｅｔら　（１９９８）　Ｐｌａｎｔ　Ｊ　１６：６５１〜６５９；Ｇｕｒａ　（２０００）　Ｎａｔｕｒｅ　４０４：８０４〜８０８）。この現象の全体としての効率は低く、ＲＮＡ減少の度合いには大きなムラがある。最近の研究で、ｍＲＮＡコード配列全体またはその一部を相補的な配向で取り込む「ヘアピン」構造を用いて、発現されたＲＮＡの潜在的な「ステム−ループ」構造を得ることについて説明がなされている（１９９９年１０月２１日公開の国際特許出願公開第ＷＯ９９／５３０５０号）。この方法では、回収されたトランスジェニック植物におけるコサプレッションの頻度が高くなる。もうひとつのバリエーションでは、植物のウイルス配列を用いて近位ｍＲＮＡコード配列の抑制または「サイレンシング」を指示することについて説明されている（１９９８年８月２０日公開の国際特許出願公開第ＷＯ９８／３６０８３号）。このような同時抑制現象はいずれも機械論的には解明されていないが、最近の遺伝的証拠からこの複雑な状況の謎が解かれつつある（Ｅｌｍａｙａｎら　（１９９８）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１０：１７４７〜１７５７）。
【００７４】
驚くべきことに、かつ予想外にも、好適な核酸配列およびその逆相補体を用いて、好適な核酸配列およびその逆相補体に近接した相同的な内在性ＲＮＡ（すなわち標的ＲＮＡ）の発現を改変できることが明らかになった。後述するように、好適な核酸配列およびその逆相補体は、宿主におけるどの内在性ＲＮＡとも無縁のものであってもよいし、宿主のゲノムの核酸配列によってコードされるものであってもよい。ただし、核酸配列が標的ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡと実質的に類似の配列をコードしないことを条件とする。
【００７５】
このように、本発明は、１回のプラスミド形質転換で単一または複数の遺伝子コサプレッションを達成するための極めて効率的かつ確固とした方法を提供するものである。詳細については後述するが、この構築物は、抑制の標的となるｍＲＮＡ（単数または複数）コード領域またはその断片と結合したプロモーターと、標的とは無縁の短い相補的な配列とで構成される。相補的な配列は、標的配列の両５’、両３’またはいずれかの側に配向させることができるものである。この相補的な配列は、約４０〜５０ヌクレオチド長であると好ましく、５０〜１００ヌクレオチド長であるとさらに好ましく、１００〜３００ヌクレオチド以上であると最も好ましい。相補的な配列は標的とは無縁であるが、他のどのような起源に由来するものであってもよい。これらの配列の好ましい実施形態としては、植物の配列、バクテリアの配列、動物の配列、ウイルスまたはファージの配列、あるいはどの生物体でも発生しないとされる完全に人工的すなわち非天然型の配列（下記の「ＥＬＶＩＳＬＩＶＥＳ」を参照のこと）があげられるが、これに限定されるものではない。いずれの配列も、実施例４で後述するような多数ある配列アライメントプログラムのうちのひとつを用いて他の既知の配列と比較または相互に比較することが可能である。
【００７６】
「高い頻度」という表現は、本願明細書において抑制効率に関して使用する場合、標的抑制表現型を呈する形質転換系の割合を示す。高い頻度の割合は少なくとも１５〜９５％の範囲ならびにこの範囲に含まれる整数値での割合が想定される。好ましい実施形態として、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％があげられる。
【００７７】
本発明は、宿主で発現させるとＲＮＡを生成するＤＮＡ配列に作動的に結合されたプロモーターを含む組換え構築物であって、
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であり、（ａ）に近接した２つの相補的なＲＮＡ領域と、を有し、
発現されるＲＮＡが、標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものである、組換え構築物に関する。
【００７８】
別の態様において、本発明は、宿主で発現させるとＲＮＡを生成するＤＮＡ配列に作動的に結合されたプロモーターを含む組換え構築物であって、
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のゲノムの核酸配列によってコードされる２つの相補的なＲＮＡ領域（ただし、前記配列が標的ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡと実質的に類似の配列をコードしないものであり、前記領域が（ａ）に近接していることを条件とする）と、を有し、
発現されるＲＮＡが、標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものである、組換え構築物に関する。
【００７９】
本発明を実施するにあたっては、どのようなプロモーターでも使用することが可能である。たとえば、β−コングリシニンプロモーター、Ｋｕｎｉｔｚ型ダイズトリプシンインヒビター（ＫＳＴＩまたはＫｔｉ）プロモーター、Ｇｌｙ　ｍ　Ｂｄ２８Ｋプロモーター、Ｔ７プロモーター、３５Ｓプロモーターおよびβ−ファゼオリンプロモーターがあげられる。好ましいプロモーターはβ−コングリシニンのα’−サブユニットのプロモーターである（本願明細書ではβ−コングリシニンプロモーターと呼ぶ）。β−コングリシニンのα’−サブユニットのプロモーターでの組換え発現構築物を含む同時抑制された植物では、β−コングリシニンのαサブユニットとα’サブユニットの両方を抑制されることが多い（１９９７年１２月１８日公開の国際特許出願公開第ＷＯ９７／４７７３１号に記載されており、その開示内容全体を本願明細書に援用する）。特に好ましいプロモーターは種子特異的な発現が可能なプロモーターである。種子は一次ソース消費型タンパク質および油であり、種子特異的発現では非種子組織における潜在的な有害作用を一切排除できるため、これは特に有用な場合がある。
【００８０】
種子特異的プロモーターの一例としては、種子貯蔵タンパク質（多くの植物で種子タンパク質全体の最大９０％まで占めることがある）のプロモーターがあげられるが、これに限定されるものではない。種子貯蔵タンパク質は、厳密に制御され、種子において極めて組織特異的かつ段階特異的な形でほぼ独占的に発現される（Ｈｉｇｇｉｎｓら、（１９８４）　Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５：１９１〜２２１；Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、（１９８９）　Ｃｅｌｌ　５６：１４９〜１６０）。さらに、種子の発達における段階が変わると異なる種子貯蔵タンパク質を発現させることができる。
【００８１】
種子特異的遺伝子の発現については、すでに詳細な検討がなされている（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、（１９８９）　Ｃｅｌｌ　５６：１４９〜１６０およびＨｉｇｇｉｎｓら、（１９８４）　Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５：１９１〜２２１における概説を参照のこと）。現在、トランスジェニック双子葉植物における種子貯蔵タンパク質遺伝子の種子特異的発現には膨大な数の例がある。こうした例には、マメのβ−ファゼオリン（Ｓｅｎｇｕｐｔａ−Ｇｏｐａｌａｎら、（１９８５）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：３３２０〜３３２４；Ｈｏｆｆｍａｎら、（１９８８）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：７１７〜７２９）、マメのレクチン（Ｖｏｅｌｋｅｒら、（１９８７）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　６：３５７１〜３５７７）、ダイズのレクチン（Ｏｋａｍｕｒｏら、（１９８６）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８３：８２４０〜８２４４）、ダイズのＫｕｎｉｔｚ型トリプシンインヒビター（Ｐｅｒｅｚ−Ｇｒａｕら、（１９８９）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１：０９５〜１１０９）、ダイズのｂ−コングリシニン（Ｂｅａｃｈｙら、（１９８５）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　４：３０４７〜３０５３；マメのビシリン（Ｈｉｇｇｉｎｓら、（１９８８）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：６８３〜６９５）、マメのコンビシリン（Ｎｅｗｂｉｇｉｎら、（１９９０）　Ｐｌａｎｔａ　１８０：４６１〜４７０）、マメのレグミン（Ｓｈｉｒｓａｔら、（１９８９）　Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２１５：３２６〜３３１）；ナタネ種子のナピン（Ｒａｄｋｅら、（１９８８）　Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７５：６８５〜６９４）など、双子葉植物から得られる遺伝子ならびに、トウモロコシの１５ｋＤのゼイン（Ｈｏｆｆｍａｎら、（１９８７）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　６：３２１３〜３２２１）、トウモロコシの１８ｋＤのオレオシン（Ｌｅｅら、（１９９１）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：６１８１〜６１８５）、オオムギのβ−ホルデイン（Ｍａｒｒｉｓら、（１９８８）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３５９〜３６６）およびコムギのグルテニン（Ｃｏｌｏｔら、（１９８７）　ＥＭＢＯ　Ｊ．６：３５５９〜３５６４）などの単子葉植物から得られる遺伝子が含まれる。さらに、キメラ遺伝子構築物において異種コード配列に作動的に結合された種子特異的遺伝子のプロモーターもトランスジェニック植物でその時間的および空間的な発現パターンを維持する。このような例としては、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　２Ｓの種子貯蔵タンパク質遺伝子プロモーターを用いてＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓおよびＢｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓの種子でエンケファリンペプチドを発現させること（Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅら、（１９８９）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　７：９２９〜９３２）、マメのレクチンおよびマメのβ−ファゼオリンプロモーターを用いてルシフェラーゼを発現させること（Ｒｉｇｇｓら、（１９８９）　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ．　６３：４７〜５７）、さらにはコムギのグルテニンプロモーターを用いてクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを発現させること（Ｃｏｌｏｔら、（１９８７）　ＥＭＢＯ　Ｊ．６：３５５９〜３５６４）などがあげられる。
【００８２】
上述したように、本発明を実施するにあたっては、構成的、組織特異的または誘導型プロモーターなど、どのようなタイプのプロモーターであっても使用することができる。構成的プロモーターの一例としては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写開始領域、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴ−ＤＮＡ由来の１’−プロモーターまたは２’−プロモーター、ユビキチン１プロモーター、Ｓｍａｓプロモーター、シンナミルアルコール脱水素酵素プロモーター（米国特許第５，６８３，４３９号）、Ｎｏｓプロモーター、ｐＥｍｕプロモーター、ルビスコプロモーター、ＧＲＰ１−８プロモーター、さらには当業者間で周知のさまざまな植物遺伝子から得られる他の転写開始領域があげられる。
【００８３】
誘導型プロモーターの一例には、低酸素状態または低温ストレスによって誘導可能なＡｄｈ１プロモーター、熱ストレスによって誘導可能なＨｓｐ７０プロモーター、光によって誘導可能なＰＰＤＫプロモーターがある。また、他に有用なのが化学的に誘導可能なプロモーターである。
【００８４】
発達制御下にあるプロモーターの例としては、葉、根、果実、種子または花などの特定の組織で優先的に転写を開始するプロモーターがあげられる。一例としてのプロモーターに葯特異的プロモーター５１２６がある（米国特許第５，６８９，０４９号および同第５，６８９，０５１号）。上述したものに加えて、種子特異的プロモーターの他の例として、２７ｋＤのγゼインプロモーターおよびｗａｘｙプロモーター、Ｂｏｒｏｎａｔ，Ａ．、Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｍ．Ｃ．、Ｒｅｉｎａ，Ｍ．、Ｐｕｉｇｄｏｍｅｎｅｃｈ，Ｐ．およびＰａｌａｕ，Ｊ．；Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ａ　２８　ｋＤ　ｇｌｕｔｅｌｉｎ−２　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　ｍａｉｚｅ：　Ｃｏｍｍｏｎ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　５’　ｆｌａｎｋｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ａｍｏｎｇ　ｚｅｉｎ　ａｎｄ　ｇｌｕｔｅｌｉｎ　ｇｅｎｅｓ；Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ．４７、９５〜１０２（１９８６）およびＲｅｉｎａ，Ｍ．、Ｐｏｎｔｅ，Ｉ．、Ｇｕｉｌｌｅｎ，Ｐ．、Ｂｏｒｏｎａｔ，Ａ．およびＰａｌａｕ，Ｊ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ｃｌｏｎｅ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ａ　Ｚｃ２　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒｏｍ　Ｚｅａ　ｍａｙｓ　Ｗ６４　Ａ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１８（２１）、６４２６（１９９０）があげられるが、これに限定されるものではない。ｗａｘｙプロモーターに関する以下のサイトを参照のこと。Ｋｌｏｅｓｇｅｎ，Ｒ．Ｂ．、Ｇｉｅｒｌ，Ａ．、Ｓｃｈｗａｒｚ−Ｓｏｍｍｅｒ，Ｚ．Ｓ．およびＳａｅｄｌｅｒ，Ｈ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｗａｘｙ　ｌｏｃｕｓ　ｏｆ　Ｚｅａ　ｍａｙｓ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３、２３７〜２４４（１９８６）。胚、果皮および胚乳で発現するプロモーターが、２０００年３月２日公開の国際出願第ＷＯ００／１１１７７号および２０００年３月９日公開の国際出願第ＷＯ００／１２７３３号に開示されている。それぞれの公報の開示内容全体を本願明細書に援用する。
【００８５】
本発明を実施するにあたっては、異種または非異種（すなわち内在性）のプロモーターのどちらを使用することもできる。
【００８６】
次に、当業者間で周知の従来の手段を用いて、宿主で発現させると特定の基準を満たすＲＮＡを生成するＤＮＡ配列にプロモーターを作動的に結合させる
【００８７】
宿主は、遺伝子発現を変える目的で本発明の組換え構築物を安定してまたは一過的に導入可能なものであれば、どのような生物体またはその細胞であってもよい。好適な宿主の一例として、植物、動物、原虫、バクテリア、ウイルスまたは真菌があげられるが、これに限定されるものではない。植物は、単子葉植物、双子葉植物または裸子植物であってもよい。動物は、脊椎動物であっても無脊椎動物であってもよい。好ましい微生物は農業または工業的に用いられている微生物である。真菌としては、カビと酵母の両方の形態の生物体を含む。
【００８８】
植物としては、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ；多栽培作物（アルファルファ、オオムギ、マメ、トウモロコシ、ワタ、アマ、エンドウマメ、ナタネ、コメ、ライムギ、ベニバナ、ソルガム、ダイズ、ヒマワリ、タバコ、コムギなど）；蔬菜類（アスパラガス、ビーツ、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、キュウリ、ナス、レタス、タマネギ、コショウ、ジャガイモ、ペポカボチャ、ダイコン、ホウレンソウ、カボチャ、タロイモ、トマト、ズッキーニなど）；果実および堅果（アーモンド、リンゴ、アンズ、バナナ、クロイチゴ、ブルーベリー、カカオ、サクランボ、ココナツ、ツルコケモモ、ナツメヤシ、ｆａｊｏａ、ハシバミ、ブドウ、グレープフルーツ、グァバ、キウイ、レモン、ライム、マンゴー、メロン、ネクタリン、オレンジ、パパイヤ、パッションフルーツ、モモ、ラッカセイ、ナシ、パイナップル、ピスタチオ、プラム、ラズベリー、イチゴ、タンジェリン、ウォールナッツ、スイカなど）があげられる。
【００８９】
ヒトまたは非ヒト脊椎動物の例としては、哺乳動物、魚類、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、齧歯類、ハムスター、マウス、ラット、テンジクネズミ、ウサギ、霊長類があげられる。無脊椎動物としては、線虫、他の蠕虫、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、他の昆虫があげられる。代表的な昆虫目としては、　Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ、Ｄｉｐｔｅｒａ、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、Ｈｏｍｏｐｔｅｒａがあげられる。
【００９０】
宿主で発現されるＤＮＡ配列は、
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ１）この宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であり、標的ｍＲＮＡに近接した２つの相補的なＲＮＡ領域であって、発現されると標的ＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるＲＮＡ、あるいは、
（ｂ２）この宿主のゲノムの核酸配列によってコードされる２つの相補的なＲＮＡ領域（ただし、前記配列が標的ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡと実質的に類似の配列をコードしないものであり、前記領域が（ａ）に近接していることを条件とする）であって、発現されるＲＮＡが、標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものであるＲＮＡを生成する。
【００９１】
相補的なＲＮＡ領域は、以下のいずれかを含むものであってもよい。
（ａ）宿主のゲノムに通常は存在しないすなわち、宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係な核酸配列または
（ｂ）相補的な領域をコードする宿主のゲノムの核酸配列（ただし、前記配列が標的ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡと実質的に類似の配列をコードしないことを条件とする）。
【００９２】
（ａ）の宿主のゲノムに通常は存在しない核酸配列に鑑みると、宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であるＲＮＡ領域（単数または複数）は、非天然型の合成ＲＮＡ配列を含むものであってもよい。さらに他の態様において、これらのＲＮＡ領域（単数または複数）は、任意に、植物ウイルスのＲＮＡを含むものであっても含まないものであってもよい。
【００９３】
（ｂ）の相補的な領域をコードする宿主のゲノムの核酸配列（ただし、前記配列が標的ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡと実質的に類似の配列をコードしないことを条件とする）に鑑みると、この配列は、宿主のゲノムに存在してもよい転写核酸配列または非転写核酸配列を含む。すなわち、この配列は宿主で発現されるものであっても発現されないものであってもよい。
【００９４】
本願明細書において述べる相補的なＲＮＡ領域は、標的ｍＲＮＡに近接している。「近接して」という表現は、相補的な領域が標的ｍＲＮＡの５’または標的ｍＲＮＡの３’に作動的に結合されているか、標的ｍＲＮＡ内あるいは標的ｍＲＮＡの５’および３’内にある、すなわち、相補的な領域または配列を標的ｍＲＮＡのいずれかの端で見いだせることを意味する。
【００９５】
相補的なＲＮＡ領域は、標的ｍＲＮＡの発現を変化させるのに適していればどのようなサイズのものであってもよい。相補的な配列は、約４０〜５０ヌクレオチド長であると好ましく、一層好ましくは５０〜１００ヌクレオチド長であり、最も好ましくは１００〜３００ヌクレオチドを上回る。これらの相補的な配列は、当業者間で周知の従来の方法を用いて合成することが可能なものである。
【００９６】
本発明を実施するにあたって利用できる適した相補的なＲＮＡ領域の一例としては、配列番号１２および１３、バクテリアの配列、刺胞動物の配列または人工配列または天然型の配列があげられるが、これに限定されるものではない。
【００９７】
もうひとつの実施形態において、本発明は、標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるための方法であって、
（ａ）本願明細書で述べる組換え構築物のうちいずれかを宿主に導入し、
（ｂ）標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現が減少した宿主を選択することを含む方法に関する。
【００９８】
形質転換の方法については上述してあり、当業者間で周知である。
【００９９】
所望の表現型を持つ宿主に何を選択するかは、発現を変更しようとしている標的ｍＲＮＡ次第である。上述したように、標的ｍＲＮＡは、宿主における発現を変更したいｍＲＮＡであればどのようなものであってもよい。一般に、本発明の組換え構築物で形質転換した宿主から得られるＲＮＡとの間で相同性があるものとする。２つ以上の標的ｍＲＮＡが本発明の組換え構築物で形質転換した宿主から得られるＲＮＡとの間で相同性のあるものであれば、これらの標的ｍＲＮＡの発現を減少させることができる。
【０１００】
さらに他の実施形態において、本発明は、ＤＮＡ配列の代わりにＲＮＡを含む組換え構築物に関する。したがって、このＲＮＡは、
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であり、（ａ）に近接した２つの相補的なＲＮＡ領域と、を有するＲＮＡであって、
宿主に導入されると標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるものである。
【０１０１】
別の態様において、本発明は、ＤＮＡ配列の代わりにＲＮＡを含む組換え構築物であって、ＲＮＡが、
（ａ）宿主で発現される少なくとも１つの標的ｍＲＮＡに対する相同性と、
（ｂ）この宿主のゲノムの核酸配列によってコードされる２つの相補的なＲＮＡ領域（ただし、前記配列が標的ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡと実質的に類似の配列をコードしないものであり、前記領域が（ａ）に近接していることを条件とする）と、を有し、
発現されるＲＮＡが、標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させる組換え構築物に関する。
【０１０２】
上述したように、相補的なＲＮＡ領域は、以下のいずれかを含むものであってもよい。
（ａ）宿主のゲノムに通常は存在しないすなわち、宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係な核酸配列または
（ｂ）相補的な領域をコードする宿主のゲノムの核酸配列（ただし、前記配列が標的ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡと実質的に類似の配列をコードしないことを条件とする）。
【０１０３】
（ａ）の宿主のゲノムに通常は存在しない核酸配列に鑑みると、宿主のいずれの内在性ＲＮＡとも無関係であるＲＮＡ領域（単数または複数）は、非天然型の合成ＲＮＡ配列を含むものであってもよい。さらに他の態様において、これらのＲＮＡ領域（単数または複数）は、任意に、植物ウイルスのＲＮＡを含むものであっても含まないものであってもよい。
【０１０４】
（ｂ）の相補的な領域をコードする宿主のゲノムの核酸配列（ただし、前記配列が標的ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡと実質的に類似の配列をコードしないことを条件とする）に鑑みると、この配列は、宿主のゲノムに存在してもよい転写核酸配列または非転写核酸配列を含む。
【０１０５】
本願明細書において述べる相補的なＲＮＡ領域は、標的ｍＲＮＡに近接している。「近接して」という表現は、相補的な領域が標的ｍＲＮＡの５’または標的ｍＲＮＡの３’に作動的に結合されているか、標的ｍＲＮＡ内あるいは標的ｍＲＮＡの５’および３’内にある、すなわち、相補的な領域または配列を標的ｍＲＮＡのいずれかの端で見いだせることを意味する。
【０１０６】
また、
（ａ）本願明細書で述べるＲＮＡのうちいずれかを宿主に導入し、
（ｂ）標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現が減少した宿主を選択することを含む、標的ｍＲＮＡまたは実質的に類似の内在性ｍＲＮＡの発現を減少させるための方法において、上記のＲＮＡを使用することができる。
【０１０７】
さらに他の態様では、本発明は、必須植物遺伝子を同定またはスクリーニングするための方法であって、
（ａ）構成的プロモーターを含み、必須植物遺伝子の発現を高い頻度で減少させることができる組換え構築物を用いて、植物細胞を形質転換し、
（ｂ）工程（ａ）で得られた形質転換後の植物細胞をすべて定量化し、
（ｃ）必須植物遺伝子の発現を減少させない対照物から得られる形質転換後の植物細胞をすべて定量化し、
（ｄ）工程（ｂ）から選択される形質転換後の植物細胞の定量化と、工程（ｃ）から選択される形質転換後の植物の細胞の定量化とを比較することを含み、工程（ｃ）から選択される形質転換後の植物の細胞の定量化が工程（ｂ）から選択される形質転換後の植物細胞の定量化を実質的に超えるものである方法に関する。
【０１０８】
本発明の方法を使用して、どのような必須植物遺伝子でも同定またはスクリーニングすることが可能である。この方法の重要な態様のひとつに、構成的プロモーターと、必須植物遺伝子の発現を高い頻度で減少させることができる組換え構築物とを用いる点がある。
【０１０９】
必須植物遺伝子については上記にて定義したとおりである。
【０１１０】
構成的プロモーターは上記にて定義したとおりである。好ましくは、構成的プロモーターは、このプロモーターの制御下での遺伝子の発現によって高いレベルでｍＲＮＡが得られる、高レベルの構成的プロモーターまたは強い構成的プロモーターである。
【０１１１】
本発明を実施するにあたっては、必須植物遺伝子の発現を高い頻度で減少させることができる構成的プロモーターを含むどのような組換え構築物であっても使用することができる。好ましい実施形態では、組換え構築物は、プロモーターが構成的プロモーターであることを条件に、ＤＮＡ配列に作動的に結合されたプロモーターを含む本発明のいずれの組換え構築物であってもよい。高い頻度という表現については上記にて定義してある。
【０１１２】
上述したような標準的な形質転換方法を利用して、どのような植物細胞でも形質転換することができる。
【０１１３】
構成的プロモーターを含み、かつ、必須植物遺伝子の発現を減少させるように設計された組換え構築物を用いて形質転換した植物細胞の数を定量化し、必須植物遺伝子の発現が減少しない対照物から得られる形質転換後の植物細胞の数と比較する。対照物で形質転換した植物細胞の数が、必須植物遺伝子の発現を減少させるように設計した組換え構築物で形質転換した植物細胞の数を実質的に上回る場合、必須植物遺伝子が同定／スクリーニングされたことになる。「実質的に上回る」とは、少なくとも５倍の差があり、好ましくは１０倍の差があることを意味する。また、４倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍よりもさらに差があると好ましい。このように、対照物で形質転換した植物細胞の数の方が、必須植物遺伝子の発現を減少させるように設計した組換え構築物で形質転換した植物細胞の数よりも少なくとも５倍多いものとする。
【０１１４】
実施例
以下の実施例において本発明についてさらに定義する。これらの実施例では、特に明記しない限り部およびパーセントはいずれも重量基準であり、度は摂氏である。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態について示すものではあるが、例示目的にすぎない点に注意されたい。当業者であれば、上記の説明および以下の実施例から本発明の本質的な特徴を確認することができ、その趣旨および範囲を逸脱することなく、本発明にさまざまな変更および改変を施してさまざまな用途および条件に適合させることができる。なお、本願明細書において用いる参考文献に記載の開示内容を本願明細書に援用する。
【０１１５】
実施例１
ダイズ不定胚培養物の形質転換
ダイズ形質転換の安定した汎用プロトコール：
液体培地（ＳＢ５５またはＳＢＰ６）３５ｍｌ中、ロータリーシェーカーにて、１５０ｒｐｍ、２８℃で、蛍光と白熱光を昼１６時間／夜８時間のスケジュールで照射して、ダイズ胚形成懸濁培養液を維持する。組織約３５ｍｇを液体培地３５ｍｌに播種することによって、培養物を４週間ごとに継代培養する。
【０１１６】
【表１】
2004512020.tif 000003
【０１１７】
粒子銃による方法（Ｋｌｅｉｎら　（１９８７）　Ｎａｔｕｒｅ　３２７：７０）を用いて、ダイズの胚形成懸濁培養物をｐＴＣ３で形質転換する。この形質転換には、デュポンのＢｉｏｌｉｓｔｉｃ　ＰＤＳ１０００／ＨＥ機器（ヘリウム改造）を使用する。
【０１１８】
１μｍの金粒子の６０ｍｇ／ｍｌ懸濁液５０ｍｌに、ＤＮＡ５μｌ（１μｇ／μｌ）と、スペルミジン２０μｌ（０．１Ｍ）と、ＣａＣｌ２（２．５Ｍ）５０μｌとを（この順で）加える。この粒子調製物を３分間攪拌し、微量遠心管にて１０秒間スピンし、上清を取り除く。ＤＮＡがコーティングされた粒子を７０％エタノール４００μｌ中で１回洗浄し、無水エタノール４０μｌに再懸濁させる。このＤＮＡ／粒子懸濁液を１秒ずつ３回超音波処理する。次に、ＤＮＡをコーティングした金粒子５μｌを各マクロキャリアーディスクにのせる。選択の目的で、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）に対する耐性を与えるプラスミドを、該当するサイレンシング構築物と一緒にボンバードしてもよい。
【０１１９】
４週間経過した懸濁培養物約３００〜４００ｍｇを６０×１５ｍｍの空のペトリ皿に入れ、残っている液体をピペットで組織から取り除く。各形質転換実験について、約５〜１０プレートの組織にボンバードを行うのが普通である。膜破壊圧を１０００ｐｓｉに設定し、チャンバを水銀２８インチの真空まで脱気する。保持用スクリーンから約３．５インチ離して組織を配置し、３回ボンバードする。このボンバードに続いて、組織を液体中に戻し、上述したようにして培養する。
【０１２０】
ボンバードの１１日後、ハイグロマイシン５０ｍｇ／ｍｌを含有する新鮮なＳＢ５５と液体培地を交換する。選択培地を毎週新しくする。ボンバードの７週間後、形質転換していない壊死胚形成培養物から緑色の形質転換組織が成長しているのが観察される。単離した緑色組織を取り出し、個々のフラスコに播種して、クローン的に増殖させた新たな形質転換胚形成懸濁培養物を生成する。このように、新たな系をそれぞれ独立した形質転換イベントとして処理する。これらの懸濁液を未成熟の発達段階に保たれた胚の懸濁液として維持したり、あるいは個々の不定胚を成熟および発芽させることで植物全体に再生させることができる。
【０１２１】
形質転換胚形成培養物の独立した系を液体培養物から取り出し、ホルモンまたは抗生物質を含まない固体の寒天培地（ＳＢ１０３）にのせる。蛍光と白熱光を昼１６時間／夜８時間のスケジュールで照射して、胚を２６℃で４週間培養する。この期間中、個々の胚をクラスターから取り出し、脂肪酸組成の変化についてスクリーニングする（実施例３）。Ｆａｄ２のコサプレッションによって、多価不飽和脂肪酸が減少し、オレイン酸含量が増加する。
【０１２２】
標的遺伝子のコサプレッションによって生じる検出可能な表現型はどのようなものであってもこの段階でスクリーニング可能である点に注意されたい。この表現型には、タンパク質含量、炭水化物含量、生育速度、生存度または正常に発達してダイズ植物になる機能などの変化を含むがこれに限定されるものではない。
【０１２３】
実施例２
トウモロコシの形質転換
トウモロコシ形質転換の安定した汎用プロトコール
トウモロコシのＨｉ−ＩＩ株におけるプラスミドＤＮＡの形質転換を、標準的なＨｉ−ＩＩボンバードメント形質転換プロトコール（Ｓｏｎｇｓｔａｄ　Ｄ．Ｄ．ら、（１９９６）　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ　３２：１７９〜１８３）に従って行う。トウモロコシ未成熟胚（約１〜１．５ｍｍ長）を培養することによって、Ｎ６塩と、Ｅｒｉｋｋｓｏｎビタミンと、プロリン０．６９ｇ／ｌと、２，４−Ｄ２ｍｇ／ｌと、ショ糖３％とを含有する５６０Ｐ培地で細胞を形質転換する。暗所にて２８℃で４〜５日間インキュベーションした後、５６０Ｐ培地から胚を取り出し、ショ糖１２％を含有すること以外は５６０Ｐと同じである５６０Ｙ培地にて、胚盤を上にして培養する。この培地で胚を３時間順化させた後、形質転換を行う。ＵＢＩ：ｍｏＰＡＴ：ｐｉｎＩＩ＋ＵＢＩ：ＧＵＳ：ｐｉｎＩＩプラスミドを含有する混合物あるいは、この２種類のプラスミドに本発明のいずれかの構築物を組み合わせたものと粒子銃とを併用して、未成熟胚の胚盤表面を標的する（ＵＢＩは、ユビキチン−１プロモーターである。Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら（１９８９）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏ　１２：６１９〜６３２。ｍｏＰＡＴは、１９９８年７月１６日公開の国際出願第ＷＯ９８／３０７０１号に引用されている除草剤グルホシネートアンモニウムに耐性を与える「単子葉植物最適化フォスフィノスリシンアシルトランスフェラーゼ」遺伝子を示す。ｐｉｎＩＩ（プロテイナーゼインヒビター）ターミネーターは、Ａｎら　（１９８９）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１：１１５〜１２２に記載されている。ＧＵＳ遺伝子（β−グルクロニダーゼ）については、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら　（１９８６）　ＰＮＡＳ　８３：８４４７〜８４５１に記載されている）。Ｂｉｏ−Ｒａｄから入手可能なＰＤＳ−１０００ヘリウム銃を用いて、６５０ＰＳＩ破壊ディスクを使用して１試料あたり１ショットで胚を形質転換する。１ショットあたりのＤＮＡ量は平均で約０．１６６７ｕｇである。対照ＤＮＡ（ＰＡＴ／ＧＵＳ）または対照と本発明のいずれかの構築物との混合物のどちらかを用いて、１穂あたり同じ数の胚にボンバードを行う。ボンバード後、すべての胚を培養し、５６０Ｌ培地（Ｎ６塩、Ｅｒｉｋｓｓｏｎビタミン、チアミン０．５ｍｇ／ｌ、ショ糖２０ｇ／ｌ、２，４−Ｄ１ｍｇ／ｌ、プロリン２．８８ｇ／ｌ、ｇｅｌｒｉｔｅ２．０ｇ／ｌ、硝酸銀８．５ｍｇ／ｌ）で保持する。ボンバードの２〜７日後、両方の処理試料の胚をすべて、プロリンを含有せず、ビアラホスを含有する３ｍｇ／ｌ）、上述したビアラホスＰｉｏｎｅｅｒ　５６０Ｐ培地３ｍｇ／ｌを含むＮ６ベースの培地に移す。プレートを暗所にて２８℃に維持し、２週間ごとに新鮮な培地を加えながらコロニーの回復具合を観察する。
【０１２４】
トウモロコシの一過的アッセイ：
２週間ごとに新鮮な５６０Ｐ培地に継代培養することによって、高ＩＩ型カルスの状態を維持する。健康なカルスを０．７７ｍｍ２のナイロンメッシュに通し、２，４−Ｄ２ｍｇ／ｌを含むＭＳ培養液に培地４０ｍｌあたり組織３グラムの密度で再懸濁させる。この細胞懸濁液を、ピペットを用いて４ｍｌのアリコート（各々細胞約３００ｍｇを含む）をガラス濾紙に移し、真空装置でのボンバードを行うことができるようにする。次に、各濾紙を５６０Ｐ培地にのせ、暗所にて２６℃で培養する。２〜４日後、濾紙を培養液から取り出し、真空装置を用いて余分な液体を除去する。次に、細胞の付着した濾紙を、すでに確立されている方法（上記の例を参照のこと）で、１μｍの金粒子と６５０ｐｓｉの破壊ディスクとを用いてショット（デュポンのＢｉｏｌｉｓｔｉｃｓ　ＰＤＳ１０００／Ｈｅ銃を使用）する。ボンバード直後、濾紙を５６０Ｐ培養液に戻し、暗所にて２６℃で培養する。すべてのＤＮＡを調節し、最終濃度を１μｇ／全ＤＮＡ／粒子調製チューブ（６ショット）とする。代表的な実験は以下のようなショットである。
【０１２５】
ＧＵＳ　ＤＮＡ＋対照ＤＮＡ＋ルシフェラーゼＤＮＡ
ＧＵＳ　ＤＮＡ＋サイレンシング構築物ＤＮＡ＋ルシフェラーゼＤＮＡ
【０１２６】
ボンバードの２日後、細胞をフィルタから掻き取り、タンパク質を抽出し、デュアル−ルシフェラーゼレポーターアッセイプロトコール（ウィスコンシン州マディソンのプロメガ社）に概説されているようなルシフェラーゼアッセイを用いて酵素活性を求める。同じ抽出物を用いて、ＲａｏおよびＦｌｙｎｎ　（１９９０）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　８：３８〜４０のプロトコールで蛍光定量的なＧＵＳアッセイを行う。以下の実施例８に示すデータをＧＵＳ／ルシフェラーゼ単位の比としてプロットする。
【０１２７】
実施例３
トランスジェニックダイズの不定胚の表現型では、得られる再生植物から種子表現型が推定される
ダイズの成熟不定胚は接合胚の良好なモデルである。液体培養物で球状胚の状態にある間、ダイズ不定胚には、成熟しているダイズ接合胚では典型的に認められるトリアシルグリセロールまたは貯蔵タンパク質が極めて少量しか含まれない。この発達段階では、全極性脂質（リン脂質および糖脂質）に対する全トリアシルグリセリドの比は、不定胚培養を開始した発達段階のダイズ接合胚では一般的なように約１：４である。球状の段階でも顕著な種子タンパク質であるβ−コングリシニンのα’サブユニット、ｋｕｎｉｔｚ型トリプシンインヒビター３および種子レクチンのｍＲＮＡは本質的に欠如している。成熟不定胚状態への分化を可能にするためにホルモンを含まない培地に移行する際、トリアシルグリセロールが最も豊富な脂質クラスになる。同様に、β−コングリシニンのα’−サブユニット、ｋｕｎｉｔｚ型トリプシンインヒビター３および種子レクチンのｍＲＮＡが、全ｍＲＮＡ個体群の中で極めて豊富なメッセージになる。この点では、ダイズ不定胚系はｉｎ　ｖｉｖｏにて成熟しているダイズ接合胚と極めて類似した挙動を示すため、脂肪酸生合成経路において遺伝子の発現を変える表現型の作用を分析するための良好かつ迅速なモデル系なのである。
【０１２８】
最も重要なのは、このモデル系がトランスジェニック胚由来の植物から種子の脂肪酸組成を予想できるものであるという点である。これについては、国際特許出願公開第ＷＯ９３／１１２４５号および同第ＷＯ９４／１１５１６号に記載のプロトコールに従って構築した２通りの実験における２種類のアンチセンス構築物を用いて実証する。すなわち、１９９３年６月１０日公開の国際特許出願公開第ＷＯ９３／１１２４５号（同公報の開示内容を本願明細書に援用する）に記載されているようなダイズミクロソームΔ１５不飽和化酵素を含むキメラ遺伝子（実験１）または１９９４年５月２６日公開の国際特許出願公開第ＷＯ９４／１１５１６号（同公報の開示内容を本願明細書に援用する）に記載されているようなダイズミクロソームΔ１２不飽和化酵素（実験２）を用いて、液体培養物の球状胚を形質転換した。種子特異的プロモーター（β−コングリシニンプロモーター）の制御下で遺伝子構築物をアンチセンス方向にて導入し、成熟胚を発生させた。ベクターのみ（対照）を用いて形質転換した系と、アンチセンスキメラ遺伝子を持つベクターを用いて形質転換した系から得られる成熟不定胚の脂肪酸含量ならびに、この成熟不定胚から再生した植物の種子の脂肪酸含量を求めた。
【０１２９】
各系から得られる一組の胚の脂肪酸含量を分析し、この同じ系から得られる別の胚の組を植物に再生させた。メタノールＨ２ＳＯ４（２．５％）０．５ｍＬ中での個々の種子の直接的なエステル交換またはバルク（ｂｕｌｋ）種子試料をヘキサン抽出した後にナトリウムメトキシドの１％メタノール溶液０．８ｍＬのアリコートをエステル交換する方法によって、単一胚の脂肪酸の分析を行った。等量の水を加えた後、メタノール溶液からヘキサンに脂肪酸メチルエステルを抽出した。いずれの場合も、形質転換していない対照と比較してトランスジェニック胚系の１８：３量が減少した場合は、この形質転換株に由来する植物の分離している種子で１８：３量の対応する減少の様子も観察した（表２）。
【０１３０】
【表２】
2004512020.tif 000004
【０１３１】
また、同じアンチセンス構築物を含む異なる系を、不定胚での脂肪酸の分析と植物への再生に使用した。対照系と比較した場合に、形質転換胚系の約５５％で１８：１含量の増加が認められた（表３）。同一のアンチセンス構築物を含む異なる不定胚系から再生させた植物のダイズ種子は、不定胚としてオレイン酸塩の含量が多い形質転換体と同様の頻度（５３％）であった（表３）。時折、胚系がキメラになることがある。すなわち、ある系の胚の１０〜７０％にトランスジーンが含まれない場合がある。トランスジーンを含む残りの胚は、いずれの場合もクローンとして認められている。このような場合、この系から分析した胚の大半がトランスジェニック表現型を持つものであったとしても、野生型とトランスジェニック表現型の両方を持つ植物を単一のトランスジェニック系から再生することができる。この一例を表４に示す。表中、単一胚系から再生させた５つの植物のうち、３つで高オレイン酸の表現型が得られ、２つは野生型であった。ほとんどの場合、単一のトランスジェニック系から再生させた植物はいずれも、トランスジーンを含む種子を持つことになる。したがって、トランスジェニックの成熟不定胚系で観察された脂肪酸表現型の変化で、この系に由来する植物の種子の脂肪酸組成の変化が推測できるという結論が得られた。
【０１３２】
【表３】
2004512020.tif 000005
【０１３３】
【表４】
2004512020.tif 000006
【０１３４】
単一胚系から再生させた５種類の植物から得た１５〜２０の種子の平均。植物番号２、９および１１のみ１８：１表現型の高い種子がある。
【０１３５】
実施例４
核酸配列の分析
ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（ＧｅｎＢａｎｋ　ＣＤＳ翻訳物、３次元構造Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎタンパク質データバンクから得られる配列、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベースの最新のメジャーリリース、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪデータベースのデータを冗長性を排除して含む）にある配列との類似性についてＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ；　Ａｌｔｓｃｈｕｌら　（１９９３）　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／を参照）サーチを実施して、標的領域または相補的な領域を含む核酸配列を分析する。Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）が提供しているＢＬＡＳＴＮのアルゴリズムを用いて、「ｎｒ」データベースに含まれる一般利用可能なすべてのＤＮＡ配列との類似性について核の配列を分析する。また、すべての読み枠でＤＮＡ配列を翻訳し、ＮＣＢＩが提供しているＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（ＧｉｓｈおよびＳｔａｔｅｓ　（１９９３）　Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３：２６６〜２７２）を用いて「ｎｒ」データベースに含まれる一般利用可能なすべてのタンパク質配列と類似性の比較を行うことも可能である。便宜上、ＢＬＡＳＴで計算した際にサーチしたデータベースに含まれる配列と単なる偶然でマッチしたＤＮＡ配列のマッチのＰ値（確率）を本願明細書では「ｐＬｏｇ」値とする。この値は、得られたＰ値の対数を負にしたものを表す。したがって、ｐＬｏｇ値が大きくなればなるほど、ｃＤＮＡ配列とＢＬＡＳＴの「ヒット」が相同的なタンパク質を表す尤度が高くなる。
【０１３６】
実施例５
アンチセンスｖｓ．「伝統的な」コサプレッションｖｓ．「相補的な領域」のコサプレッションを用いた、Ｆａｄ２発現減少量の比較
以下、ダイズ脂肪酸不飽和化酵素（Ｆａｄ）を用いる同様の実験において、アンチセンス、「伝統的な」コサプレッションおよび「相補的な領域」のコサプレッション（ＣＲＣ）をいくつか比較する。Ｆａｄ２−１は、オレイン酸側鎖に二重結合を導入して多価不飽和脂肪酸を形成する、ダイズから得られるΔ−１２不飽和化酵素をコードする遺伝子座である。Ｆａｄ２−１発現量が減少することでオレイン酸が蓄積（１８：１または単一の二重結合がある１８炭素脂肪酸テイル）され、これに対応して多価不飽和脂肪酸の含量が減少する。
【０１３７】
アンチセンス構築物には、強力なプロモーターの後ろに逆方向でＦａｄ２−１コード領域全体またはその一部が含まれる。「アンチセンス」ＲＮＡの発現はハイブリダイゼーションイベントによる相同的な内在性遺伝子の正常な翻訳を妨げるものであると思われる。「伝統的な」コサプレッション構築物は、強力なプロモーターの後ろに通常のセンス方向でＦａｄ２−１全体またはその一部を含む。「同時抑制されている」ＲＮＡが発現されることで、導入したＲＮＡならびに実質的に類似の配列を有するすべてのＲＮＡの一部または全部の排除につながる、特徴化がなされていない機序が活性化されるものと思われる。使用したＣＲＣ構築物は、逆相補体方向で複製されたＦａｄ２−１コード領域の一部（３００ｂｐ）を含むものであり、Ｆａｄ２−１に特異な相補的な領域が形成されている。
【０１３８】
これらの実験で用いたプラスミドは、当業者間で周知の標準的なクローニング方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら　（１９８９）　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、ＣＳＨＬ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）で作製したものである。開始プラスミドのｐＫＳ１８ＨＨ（米国特許第５，８４６，７８４号、その内容を本願明細書に援用する）には、Ｔ７プロモーターおよび３５Ｓカリフラワーモザイクウイルスプロモーターの制御下でＥ．ｃｏｌｉ株Ｗ６７７から得られたハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）が含まれる。したがって、プラスミドｐＫＳ１８ＨＨは、λ　ＤＥ３（ｌａｃＶ５制御下でＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つ）に対して溶原性であるＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）［ノバジェンより］などのＥ．　ｃｏｌｉの特定の株でＨＰＴ酵素を発現させるＴ７プロモーター／ＨＰＴ／Ｔ７ターミネーターカセットを含むことになる。また、プラスミドｐＫＳ１８ＨＨは、ダイズなどの植物でＨＰＴ酵素を構成的に発現させる３５Ｓ／ＨＰＴ／ＮＯＳカセットも含む。これらの２つの発現系を用いることで、バクテリアと植物の両方の系でプラスミドを含む細胞を同定する手段として用いられるハイグロマイシンの存在下で成長を選択することが可能になる。また、ｐＫＳ１８ＨＨは、他のキメラ遺伝子をこのベクターにクローニングするのに適した３つの独特な制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。プラスミドＺＢＬ１００（２０００年３月２日公開の国際出願第ＷＯ００／１１１７６号）は、ＮＯＳ　３’ターミネーターが減少したｐＫＳ１８ＨＨの誘導体のひとつである。プラスミドｐＫＳ６７は、ＮｏｔＩクローニング部位の前にβ−コングリシニンプロモーターが挿入され、これにファゼオリン３’ターミネーターが続いたＺＢＬ１００誘導体である（１９９４年５月２６日公開の国際出願第ＷＯ９４／１１５１６号に記載されている）。ＰＫＳ９１は、Ｎｏｔ　Ｉ部位に挿入されたダイズＦａｄ２遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ヘアピン断片を持つｐＫＳ６７の誘導体である。ダイズＦａｄ２−１ＤＮＡを用いてのＰＣＲ反応に以下のようなプライマーを使用した（配列はいずれも５’から３’である）。
【０１３９】
【表５】
2004512020.tif 000007
【０１４０】
３通りの反応の産物（Ａ）＋（Ｂ）＋（Ａ／ＡＳ）を一緒にライゲートし、制限酵素Ｎｏｔ　Ｉで消化し、ＫＳ６７のＮｏｔ　Ｉ部位に１．３ｋｂの断片をクローニングする。このセクションに示す実験ではプラスミドｐＫＳ９１を使用した。２．５ｋｂのプラスミドｐＫＳ１７には、ｐＳＰ７２（プロメガバイオシステムズから入手）およびＴ７プロモーター／ＨＰＴ／Ｔ７　３’ターミネーター領域が含まれており、３５Ｓ／ＨＰＴ／ＮＯＳカセットを含む３．２ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片をｐＫＳ１８ＨＨからクローニングしたオリジナルのベクターである。プラスミドｐＫＳ１０２は、ＸｈｏＩおよびＳａｌＩで消化し、リョクトウヌクレアーゼで処理して平滑末端を生成し、以下のリンカーにライゲートするために挿入したｐＫＳ１７誘導体である。
【０１４１】
【表６】
2004512020.tif 000008
【０１４２】
プラスミドｐＫＳ８３は、ｐＫＳ１７のＢａｍＨＩ部位にライゲートしたＫｔｉ３プロモーター／ＮｏｔＩ／Ｋｔｉ３　３’ターミネーター領域を含むＭＬ７０の２．３ｋｂのＢａｍＨＩ断片である（１９９４年５月２６日公開の国際出願第ＷＯ９４／１１５１６号に記載されている）。プラスミドｐＫＳ１０３は、ＮｏｔＩ部位にライゲートした（Ｆａｄ２相補的な配列を含む）ｐＫＳ９１の１．３ｋｂのＮｏｔＩ断片を持つｐＫＳ８３の誘導体である。
【０１４３】
さらに多数のコサプレッション構築物を比較するために、これに見合うだけの数のアンチセンス系を持つには、Ｆａｄ　６をＦａｄ　２−１と同時ボンバードするアンチセンス実験を含めることが必要であった。Ｆａｄ６は、（Ｆａｄ２がミクロソーム分画に見られるのに対して）色素体に見られるΔ−１２不飽和化酵素をコードする遺伝子である。Ｆａｄ２とＦａｄ６とを同時に抑制すると、Ｆａｄ２の抑制だけの場合よりも強力であったり、あるいは異なる表現型が得られると考えられていた。しかしながら、その後Ｆａｄ６は表現型を生じないことが明らかになったため、Ｆａｄ２およびＦａｄ６の両方を用いてのアンチセンス実験で得られる表現型はＦａｄ２−１含量の変化を反映するのみである。
【０１４４】
対照胚（個体数２８６）の平均１８：１含量は標準偏差（ＳＤ）６．２％で９％（実範囲４〜２２％）であった。このため、１８：１が平均から２ＳＤを上回り、観察された最大対照値よりも高い値まで増加するＦａｄ２−１の減少陽性を表すのにオレイン酸含量２５％を選択した。１８：１含量が２５％以上の胚が系に少なくとも１つある場合、これをアンチセンスまたはコサプレッションイベントとして計数する。２回の実験を組み合わせ、約３０の系を生成した。
【０１４５】
【表７】
2004512020.tif 000009
【０１４６】
アンチセンスまたはコサプレッションによって発現が減少したトランスジェニック植物を分析する際に考慮すべきもうひとつの点にキメラ化がある。上記のアンチセンスおよびコサプレッションの実験では、検出された陽性のイベント系にはオレイン酸含量が増加した１０のうち１つの胚しか含まれないことがあった。これらの実験ではいずれも分析１リットルあたり１０胚を用いているため、オレイン酸含量（Δ−１２発現が減少した形質転換体を示す目安となり得る２５％を上回るまたはこれ未満）に対して実際の胚数をプロットすることで、キメラ化データをグラフで表すことが可能である。したがって、系のキメラ化がほとんどないか全くない場合、その胚ではいずれも野生型とは対照的に表現型が抑制されることになる。ＣＲＣ（灰色の四角）形質転換体ではキメライベントが少なめでも一貫してオレイン酸含量が高いというデータは、極めて説得力があるように思われる。
【０１４７】
もうひとつの問題に、系の発現表現型を減少させる効率がある。ここに開示の実験および実施例６の結果から、胚で極めて高い１８：１含量を得るには、アンチセンスまたは「伝統的な」コサプレッションのいずれか（すなわちコサプレッション、ＣＲＣを含む相補的な領域との対比）の場合よりも、標的配列に近接して相補的な領域を含む構築物の方が効果的であった。実験で得られた抑制レベルは、これに対応して植物に含まれるオレイン酸含量が増加する形に反映される。平均１８：１含量が高くなればなるほど、抑制の度合いが大きくなる。この構築物を含む相補的な領域ではオレイン酸含量が５０％であったが、これは対照平均を５ＳＤより上回っている。
【０１４８】
【表８】
2004512020.tif 000010
【０１４９】
Ｆａｄ２−１含量を減らして胚で１８：１含量を高くするにはＣＲＣが最も効率がよく効果的な方法であるように思われる。実施例３から明らかなように、トランスジェニック植物での胚のオレイン酸含量と種子のオレイン酸含量との間には表現型相関がある。このため、５１％を超える胚系を得る実験が最も望ましい。このような実験ではオレイン酸が８０％を超える種子を確実に得られるように思われるためである。
【０１５０】
検出した中で最も陽性の種子系はオレイン酸８０％に近い（またはこれよりも多い）ことに注意されたい。そうではなかった少数のものは、オレイン酸の最大含量が３０％から５０％の範囲の胚系由来であるように思われる。現在まで、胚の最大オレイン酸含量が３０％で表現型が陽性の系から最良の種子表現型が得られたことはなく、常にオレイン酸含量が５１％以上の産生系で最良の種子表現型が得られる。また、生成した中で上位５つの胚系（いずれもオレイン酸５０％を上回る）では種子において最良の表現型が得られ（８０％を超える）、最下位４つの胚系（いずれも胚のオレイン酸５０％未満）ではいずれも種子のオレイン酸含量が８０％未満であった。
【０１５１】
実施例６
標的配列および相補的な配列はいずれもその内在性相同体を同時抑制することが可能である
相補的な領域をコサプレッション構築物の標的領域に含めると、得られる形質転換体の効率および均一性が改善される（実施例５）。次のステップは、この方法で２つ以上の遺伝子を抑制することができた場合に試験を行うことである。ダイズのチオエステラーゼ遺伝子から得られる６００ヌクレオチドの標的を囲む、Ｆａｄ２−１から得られる３００ヌクレオチドの相補的な領域を用いた予備段階での結果では両方の遺伝子が抑制される。この結果は、ふたつの理由から興味深いものであった。まず第１に、実施例５の構築物とは異なり、Ｆａｄ２から得られる相補的な領域がチオエステラーゼ配列で中断された。第２に、発現のＦａｄ２減少が起こった系ではいずれも非相補的な標的配列（チオエステラーゼ）が阻害されたことから、標的と相補的な領域での発現の減少効率は等しかったのではないかと思われる。
【０１５２】
いずれかの相補的な領域を用いていずれかの標的配列の発現を効率よく抑えることができるか否かをさらに試験するために、ダイズのロウ質変異３（ｃｅｒ３）座から得られる相補的な領域と併用してＦａｄ２−１を標的として用いて構築物を作製した。ｃｅｒ３は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａでのロウの生合成に関与することが知られている２１の遺伝子産物のうちひとつをコードする（Ｈａｎｎｏｕｆａら　（１９９６）　Ｐｌａｎｔ　Ｊ　１０：４５９〜６７）。ｃｅｒ３遺伝子が１つ阻害されてもダイズで目に見える表現型は起こらない。また、Ｆａｄ２活性を含む脂肪酸代謝経路との間での相互作用が知られていない生合成経路にｃｅｒ３は関与している。プラスミドｐＫＳ１００は、ｐＫＳ６７の誘導体である。以下のプライマー（５’から３’方向）およびｃｅｒ３　ＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を実施する。
【０１５３】
【表９】
2004512020.tif 000011
【０１５４】
２つの反応の産物を一緒にライゲートし、ＮｏｔＩで消化し、ｐＫＳ６７のＮｏｔＩ部位にクローニングする。次に、ダイズＦａｄ２−１から得た５１６ｂｐのＳｃａＩ断片を、（Ｃｅｒ３　ＤＮＡ内で、相補的な配列からほんの一部を取り除いて）ＦｓｐＩで消化したｐＫＳ１００にライゲートし、ｐＢＳ５８を形成する。制限酵素での消化を利用して、センスまたはアンチセンス方向にＦａｄ２断片を含むプラスミドを選択した。ダイズで試験した全ての構築物においてＦａｄ２の発現が効率的に減少すると思われる。
【０１５５】
実施例７
ＥＬＶＩＳＬＩＶＥＳに相補的な領域によるＦａｄ２のダイズにおける抑制
「合成の相補的な領域」（ＳＣＲ）を持つ構築物を作製した。Ｆａｄ　２　ＣＲ／ＴＥ２標的は検討した系ひとつに含まれる両方の内在性遺伝子を抑制し、Ｃｅｒ３／Ｆａｄ２構築物はＦａｄ２を抑制するため、どの相補的な配列を使っても標的の発現を減少させることができるのではないかと推定された。この例では、生物学的に誘導した遺伝子またはゲノムの一部であることが分かっていない相補的な配列（すなわち、本願発明者の心から「合成」または呼び起こした配列）の間に標的配列を配置する。したがって、標的ＤＮＡはセンスまたはアンチセンス方向であり、相補的なＲＮＡは既知の核酸配列のいずれとも無関係であろう。抑制用の標的遺伝子の切片を放り込むことが可能な標準的な「抑制ベクター」を設計することが可能である。プラスミドｐＫＳ１０６、ｐＫＳ１２４およびｐＫＳ１３３がこの一例である。プラスミドベクターはいずれも、Ｔ７誘導型プロモーターなどのプロモーターを持つハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼなどの抗生物質選択遺伝子を持つことは、当業者であれば理解できよう。
【０１５６】
ｐＫＳ１０６はβ−コングリシニンプロモーターを利用し、かたやｐＫＳ１２４および１３３プラスミドはＫｔｉプロモーターを利用する。これらのプロモーターはいずれも、ダイズの種子で強い組織特異的発現を示す。ｐＫＳ１０６はファゼオリン遺伝子からの３’終結領域を利用し、ｐＫＳ１２４および１３３はＫｔｉ　３’終結領域を利用する。ｐＫＳ１０６および１２４は、ＮｏｔＩ部位を囲む３６ヌクレオチドのＥａｇＩ−ＥＬＶＩＳＬＩＶＥＳ配列のシングルコピーを含む（カッコで示すアミノ酸は相補鎖から逆翻訳される）：配列番号１２。
【０１５７】
【表１０】
2004512020.tif 000012
【０１５８】
ｐＫＳ１３３はＮｏｔＩ部位を囲むＥＬＶＩＳＬＩＶＥＳの２×コピーを含む：配列番号１３。
【０１５９】
【表１１】
2004512020.tif 000013
【０１６０】
シングルＥＬリンカー（ＳＣＲ）を複製して約４０ヌクレオチドずつステムを長くすることが可能であるということである。一連のベクターでＳＣＲ長４０ｂｐから３００ｂｐまでがカバーされる。また、さまざまな標的遺伝子長が評価段階にある。標的の長さと相補的な領域の長さとを特定の組み合わせにすると、標的の抑制が最適化されると思われるが、予備段階での結果では、抑制現象はさまざまな範囲のサイズおよび配列で十分に機能することが明らかになっている。また、最適な状態で抑制するための長さと比によっては、いくらか定められた異なる標的配列および／または相補的な領域が変わることがあると思われる。
【０１６１】
プラスミドｐＫＳ１０６は、ＥＬＶＩＳＬＩＶＥＳのＥａｇＩ断片（配列番号１２）をｐＫＳ６７のＮｏｔＩ部位に置くことで作製される。ＥＬＶＩＳＬＩＶＥＳ断片は、２つのプライマーを使用し、他にはＤＮＡを用いることなく、ＰＣＲによって作製される。
【０１６２】
【表１２】
2004512020.tif 000014
【０１６３】
【表１３】
2004512020.tif 000015
ＰＣＲ反応の産物をＥａｇＩで消化（５’−ＣＧＧＣＣＧ−３’）した後、ＮｏｔＩ消化ｐＫＳ６７にライゲートする。Δ−１２不飽和化酵素遺伝子（Ｆａｄ２、ヌクレオチド３９９〜９９７）から得られる５９９ヌクレオチドの断片を、アンチセンス方向でｐＫＳ１０６のＮｏｔＩ部位に挿入することによって、ｐＫＳ１１１を作製する。Ｆａｄ２断片は、以下のプライマーおよびＦａｄ２　ＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲで作製される。
【０１６４】
2004512020.tif 000016
【０１６５】
このＰＣＲ産物をＮｏｔＩで消化（５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’）した後、ＮｏｔＩ消化ｐＫＳ１０６にライゲートする。相補的な配列の全長は４７ヌクレオチド（８ヌクレオチドがＮｏｔＩ部位から、フランキング塩基がさらに３つ）である。Ｆａｄ２を同時抑制すると、多価不飽和脂肪酸の産生量が低下し、これに伴ってオレイン酸（１８：１）のダイズへの蓄積量が増える。（上記実施例３を参照のこと）。ｐＫＳ１１１で形質転換した２２の系のうち１８の系でのオレイン酸濃度は、ベクターのみの対照と比して２〜５倍であったことから、回復したトランスジェニック植物の８２％でコサプレッションが生じていることが分かる。Ｆａｄ２の短いセグメント（６００ｂｐ）を囲むシングルＳＣＲ（ＥＬＶＩＳＬＩＶＥＳまたはＥＬ）を配置するだけで、実施例５のＣＲＣ構築物を用いて得られる効率と等しい効率でコサプレッションを与えるには十分であるようにみえる。「ＥＬＶＩＳＬＩＶＥＳ」および「ＥＬ」という用語は、本願明細書では同義に用いられる。
【０１６６】
さらに別のプラスミドを用いて、この例を試験することが可能である。たとえば、ｐＫＳ１２１は、ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ消化ｐＫＳ１０２に挿入されたｐＫＳ８３に類似のＫｔｉ３プロモーター／ＮｏｔＩ／Ｋｔｉ３の３’ターミネーター断片類似物を含有する。配列番号１４および１５から得られるＥａｇＩ消化ＥＬＶＩＳＬＩＶＥＳクローニング部位をｐＫＳ１２１のＮｏｔＩ部位に挿入し、ｐＫＳ１２４を作製する。ｐＫＳ１１１から得られるＦａｄ２断片をＮｏｔＩ消化ｐＫＳ１２４にライゲートし、ｐＫＳ１３２を作製する。ＥａｇＩ消化ＥＬ　ＰＣＲ産物をＮｏｔＩ消化ｐＫＳ１２４にライゲートし、２×ＥＬ　ｐＫＳ１３３を作製することができる。さらに別の２×ＥＬベクターであるｐＫＳ１５１は、３５Ｓ−ＣａＭＶプロモーターのある第２のハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子が付加されていること以外はｐＫＳ１３３と類似している。同様の方法で、どのような合成配列または天然型配列を使用してもよい。ｐＫＳ１１１から得られる５９９ｂｐのダイズＦａｄ２断片をＮｏｔＩ消化ｐＫＳ１３３に付加すると、ｐＫＳ１３６が得られる。
【０１６７】
１×ＥＬ（ｐＫＳ１３２）を用いてのＦａｄ２抑制の効率を、２×ＥＬ（ｐＫＳ１３６）構築物を用いてのＦａｄ２抑制と比較した。ｐＫＳ１３２およびｐＫＳ１３６を用いて個々の形質転換実験からダイズ胚のハイグロマイシン耐性系を単離した。ｐＫＳ１３２を含有する９８の系のうち、６９％で高オレイン酸の表現型が見られた。ｐＫＳ１３６を含有する５４の系のうち、７０％で高オレイン酸の表現型が見られた。このように、１×および２×ＥＬ構築物はいずれもＦａｄ２標的遺伝子を効率よく抑制していた。
【０１６８】
実施例８
Ｆａｄ２標的配列の長さが抑制効率に影響する
標的の長さを試験し、ＥＬ構築物における抑制効率への影響を求めた。表７に示すプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、２５、５０、７５、１５０、３００および６００断片のＦａｄ２を作製して、２×ＥＬに相補的な領域間に置いた。ＰＣＲ産物をＮｏｔ　Ｉで切断し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにライゲートし、この断片の配列を確認した。さらに、Ｎｏｔ　Ｉ消化断片をｐＫＳ１５１のＮｏｔＩにライゲートした。
【０１６９】
【表１４】
2004512020.tif 000017
【０１７０】
【表１５】
2004512020.tif 000018
【０１７１】
表８に示す結果から、標的の長さと抑制効率との間には明らかな相関があることが分かる。Ｆａｄ２の最も長い（６００ｂｐ）断片は、３００ｂｐの断片に比べてＥＬ構築物で抑制される可能性がほぼ２倍であり、５０ｂｐおよびそれ未満の断片は有効ではない。
【０１７２】
実施例９
２×ＥＬによって複数の標的配列を抑制することが可能である
構築物をアセンブルし、ＥＬの相補的な配列間に複数の標的配列を用いて同時に抑制を行うことができるか否かを試験した。ダイズΔ−９不飽和化酵素から得られる９６９ｂｐの断片を５９９ｂｐのＦａｄ２断片の隣りにあるｐＫＳ１３６に挿入し、ｐＢＳ６８を作製した。両方の不飽和化酵素断片を２×ＥＬに相補的な領域でフランキングした（２×ＥＬ−Ｆａｄ２−Δ９−２×ＥＬ、この配列を配列番号２４に示す）。
【０１７３】
Δ−９不飽和化酵素は、１８−炭素脂肪酸の９位で二重結合を触媒し、ステアリン酸（１８：０）からオレイン酸（１８：１）を形成する。これは、オレイン酸をリノレイン酸（１８：２）に変換する１２位の二重結合を触媒するΔ−１２　Ｆａｄ２の場合と同様である。独特なＦａｄ２遺伝子を抑制すると、多価不飽和脂肪酸を犠牲にしてオレイン酸が蓄積される。Δ−９不飽和化酵素を抑制すると、不飽和脂肪酸をすべて犠牲にしてステアリン酸が蓄積される。しかしながら、ダイズにはいくつかのΔ−９不飽和化酵素がある（少なくとも３）ため、ひとつのメンバの抑制がどのように油の組成に影響するのかは不明である。実施例１および３で概説したようにして形質転換プロトコールと油の組成分析を実施した。
【０１７４】
ｐＢＳ６８を用いてダイズを形質転換すると、１１３のハイグロマイシン耐性系が得られた。このうち、７２で油の表現型が若干（６４％）認められた。抑制された７２の系の表現型は、１８が高ステアリン酸塩、２３が高オレイン酸塩、３１が高オレイン酸塩および高ステアリン酸塩であった。したがって、単一のＥＬ構築物で複数の標的を効率よく抑制することができる。
【０１７５】
実施例１０
ＥＬＶＩＳＬＩＶＥＳ構築物におけるダイズガラクチノール合成酵素遺伝子の抑制
ラフィノース糖は植物に広く見られるショ糖のＤ−ガラクトース含有オリゴ糖誘導体の一グループである。ラフィノース糖は以下の式で表されることが特徴である。［Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→６）ｎ−α−グルコピラノシル−（１→２）−β−Ｄ−フルクトフラノシド（式中、ｎ＝０からｎ＝４がそれぞれ、ショ糖、ラフィノース、スタキオース、ベルバスコース、ａｊｕｇｏｓｅとして知られている）。
【０１７６】
多くの種で豊富であるとはいえ、ラフィノース糖は経済的に重要ないくつかの作物種を効率的に利用する上での障壁になっているのである。腸粘膜にα−ガラクトシダーゼが存在しないことが主な理由で、動物はラフィノース糖を直接消化することができない［Ｇｉｔｚｅｌｍａｎｎら　（１９６５）　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ　３６：２３１〜２３６；Ｒｕｔｌｏｆｆら　（１９６７）　Ｎａｈｒｕｎｇ　１１：３９〜４６］。しかしながら、下部腸のミクロフローラはラフィノース糖を容易に発酵させることができ、腸の酸性化と、二酸化炭素、メタンおよび水素ガスの生成につながる［Ｍｕｒｐｈｙら　（１９７２）　Ｊ．Ａｇｒ．Ｆｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．２０：８１３〜８１７；Ｃｒｉｓｔｏｆａｒｏら　（１９７４）　ｉｎ　Ｓｕｇａｒｓ　ｉｎ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、Ｈ．Ｌ．ＳｉｐｐｌｅおよびＫ．Ｗ．ＭｃＮｕｔｔ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、第２０章、３１３〜３３５；Ｒｅｄｄｙら　（１９８０）　Ｊ．Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　４５：１１６１〜１１６４］。これによって生じる膨満は、動物、特にヒトの食餌におけるマメ科の植物の用途を著しく制限してしまう場合がある。ラフィノース糖が存在することでヒトの食餌におけるマメ科植物の用途が制約を受けるのは残念なことである。これらの種の多くは、この点以外は優良なタンパク質源および可溶性繊維源であるためである。ラフィノース糖を含有しないさまざまな食用マメの方が、ヒトや動物の食餌には価値が高く、栄養価が望ましい食用のマメ科の植物を手広く利用しやすくなるであろう。
【０１７７】
ラフィノース糖の生合成は十分に特徴化されている［Ｄｅｙ　（１９８５）　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｓｔｏｒａｇｅ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ　ｉｎ　Ｇｒｅｅｎ　Ｐｌａｎｔｓ、Ｐ．Ｍ．ＤｅｙおよびＲ．Ａ．Ｄｉｘｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、ｐｐ．５３〜１２９を参照のこと］。ラフィノース糖生合成のコミットされた（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）反応には、ＵＤＰ−ガラクトースおよびｍｙｏ−イノシトールからのガラクチノールの合成が関与する。この反応を触媒する酵素がガラクチノール合成酵素（イノシトール１−α−ガラクトシルトランスフェラーゼ；ＥＣ２．４．１．１２３）である。ラフィノースおよびラフィノース糖ファミリにおける上位の相同物のショ糖からの合成は、明確なガラクトシルトランスフェラーゼ（たとえば、ラフィノース合成酵素およびスタキオース合成酵素）によって触媒されると考えられている。多くの種での研究から、還元炭素のフラックスをラフィノース糖の生合成にする制御の鍵となる酵素はガラクチノール合成酵素なのではないかと思われる［Ｈａｎｄｌｅｙら　（１９８３）　Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．　１０８：６００〜６０５；Ｓａｒａｖｉｔｚら　（１９８７）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　８３：１８５〜１８９］。過発現の結果としてまたはアンチセンス阻害によってガラクチノール合成酵素の活性を変えると、特定の組織で生成されるラフィノース糖の量が変わるであろう。
【０１７８】
従来技術においてすでに知られている関連のガラクチノール合成酵素遺伝子には、米国特許第５，７７３，６９９号および同第５，６４８，２１０号、Ｋｅｒｒら、「Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｇａｌａｃｔｉｎｏｌ　Ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｚｕｃｃｈｉｎｉ　ａｎｄ　Ｓｏｙｂｅａｎ（ズッキーニおよびダイズから得られるガラクチノール合成酵素のヌクレオチド配列）」、ＳｐｒｅｎｇｅｒおよびＫｅｌｌｅｒ　（２０００）　Ｐｌａｎｔ　Ｊ　２１：２４９〜２５８に開示されている配列がある。おそらく関連している配列も国際特許出願公開第ＷＯ９８／５０５５３号、Ｌｉｇｈｔｎｅｒ、「Ｃｏｒｎ　Ｇｌｙｃｏｇｅｎｉｎ（トウモロコシグリコゲニン）」に開示されている。ダイズガラクチノール合成酵素をコードする２つの遺伝子がすでに同定されている（配列番号３０および３２、予測翻訳産物を配列番号３１および３３に示す、２０００年４月１１日出願の米国特許仮特許出願第６０／１９６５５０号に提示されている）。独特なダイズＦａｄ２遺伝子とは異なり、ダイズには複数のガラクチノール合成酵素遺伝子があることが知られている。ガラクチノール合成酵素をコードする遺伝子は複数あるため、ラフィノース糖レベルへの影響を検出するには、２以上の遺伝子を抑制する必要がある場合があると思われる。
【０１７９】
２×ＥＬカセットのＮｏｔＩ部位においてクローニングした２つのガラクチノール合成酵素ダイズ遺伝子であるＧａｓ１（３９０ｂｐ、配列番号３０の１３〜４０２から得られる）およびＧａｓ２（３９９ｂｐ、配列番号３２の１２９〜５２７から得られる）の断片を含むプラスミド構築物をアセンブルした。プロモーター領域はダイズの後期胚プロモーター（Ｌｅａ）であった。
配列番号２５　５’−ＡＴＴ　ＡＡＣ　ＣＴＣ　ＡＡＴ　ＴＣＴ　ＴＣＴ　ＡＡＧ（Ｍ９７２８５の２５位〜４５位）
配列番号２６　５’−ＴＴＣ　ＡＡＡ　ＧＡＴ　ＣＡＡ　ＴＴＡ　ＴＴＴ　ＣＣ　（Ｍ９７２８５の９９５位〜１１１２位）というプライマーを用いて、ゲノムＡ２８７２ダイズＤＮＡからＬｅａプロモーター（Ｌｅｅら　（１９９２）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１００：２１２１〜２１２２；ジーンバンク寄託番号Ｍ９７２８５）を増幅し、ファゼオリン３’末端（配列番号２７および２８に示すプライマーを用いて増幅）を加えた。次に、Ｌｅａプロモーター−２×ＥＬ−Ｇａｓ１−Ｇａｓ２−２×ＥＬ−ファゼオリン３’−末端カセット全体をｐＫＳ１３６のＢａｍＨＩ部位にクローニングし、ｐＫＳ１４９ベクターを作製した（ｐＫＳ１４９の完全なＥＬ領域の配列を配列番号２９に示す）。植物に導入すると、ｐＫＳ１３６は、Ｆａｄ２（Ｋｔｉプロモーターで制御）およびＧａｓ遺伝子（Ｌｅａプロモーターで制御）の両方を阻害する。Ｋｔｉプロモーターは胚で活性であるため、上記の例で説明したように、高オレイン酸の表現型について胚をスクリーニングすることが可能である。ハイグロマイシン耐性として単離した１１９の系のうち、６５％で高オレイン酸の表現型が認められた。
【０１８０】
これらの抑制された系はＧａｓ抑制カセットを含んでいるはずであり、実生でラフィノース糖のアッセイを行うことができる（初期胚段階の間はＬｅａは活性ではない）。ラフィノース糖（ガラクチノール、ラフィノース、スタキオースなど）については、薄層クロマトグラフィを用いて検出することが可能である。植物試料をヘキサンで抽出した後、乾燥させる。次に、乾燥させた材料を８０％メタノールに再懸濁させ、室温にて１〜２時間インキュベートし、遠心し、上清１〜２マイクロリットルをＴＬＣプレート（ニュージャージー州ＧｉｂｂｓｔｏｗｎのＥＭ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手したＫｉｅｓｅｌｇｅｌ　６０　ＣＦ；カタログ番号１３７４９−６）に滴下する。エチルアセテート：イソプロパノール：２０％酢酸（３：４：４）中にて１〜１．５時間ＴＬＣを実施する。空気乾燥させたプレートに２％硫酸を噴霧し、炭になった糖が検出されるまで加熱する。図２に示されるように、ラフィノース糖が極めて少ないことが知られている対照（Ｌｏｗ　４）と比較して、ＧＡＳ−ＥＬを付した２つの系でラフィノース糖のレベルが減少している（一番下のバンド）のが分かる。これらの系では、野生型のダイズと比較してラフィノース糖が６０％減少しているのではないかと推測される。
【０１８１】
実施例１１
ＥＬＶＩＳＬＩＶＥＳ構築物を用いて必須植物遺伝子をスクリーニングすることができる
分枝鎖アミノ酸であるイソロイシン、ロイシンおよびバリンの生合成における最初の共通ステップは、アセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳ）としても知られるアセトラクテート合成酵素（ＡＬＳ）によって触媒される（Ｋｅｅｌｅｒら、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１９９３　１０２：１００９〜１８）。スルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジンを含むいくつかのクラスの構造的に無関係な除草剤による、自然界の植物ＡＬＳに対する阻害は致死的である（Ｃｈｏｎｇ　ＣＫ、Ｃｈｏｉ　ＪＤ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ　２０００　２７９：４６２〜７）。ダイズでＡＬＳをコードする遺伝子の抑制も致死的なものとなるはずである。このため、ＡＬＳなどの十分な確証が得られている除草剤標的をＥＬベクターに挿入し、形質転換スクリーニングプロセスを用いて必須植物遺伝子を同定できるか否かを試験することができる。仮にできる場合、高スループットの方法で他の必須植物遺伝子をスクリーニングし、潜在性のある新規な除草剤標的を同定することができる。「必須植物遺伝子」という用語は、本願明細書において使用する場合、植物の正常な成長、発達および／または生存に必要な産物をコードする遺伝子を示す。ＡＬＳに加えて、必須植物遺伝子の例として、アミノ酸、核酸または脂質の生合成における律速酵素があげられるが、これに限定されるものではない。また、機能が明らかになっていない多くの遺伝子が必須であり得ると思われる。
【０１８２】
ハイグロマイシンの選択時にダイズのＥＬ−ＡＬＳ−ＥＬ構築物が発現されると、ＨＰＴ遺伝子が存在する場合ですら回復されるイベントは極めてわずかしかないはずである。後期胚形成までＥＬ−ＡＬＳ−ＥＬ転写単位が発現されないと、形質転換イベントの回復は、ＨＰＴ遺伝子しか含まないベクターの対照物で得られるイベントに近い数になるはずである。３５Ｓプロモーター（ｐＫＳ１６１）を用いてＥＬ−ＡＬＳ−ＥＬの構成的発現を達成することが可能である。上述したＬＥＡプロモーター（ｐＫＳ１６３）を用いて、後期胚形成／発芽まで制限されたＥＬ−ＡＬＳ−ＥＬの発現を達成することが可能である。
【０１８３】
ＫＳ１６１を作製するには、ＥＬリンカー（配列番号１２）をｐＫＳ５０のＮｏｔＩ部位にクローニングし、ｐＫＳ１３７（ＨＰＴ遺伝子が２つあるプラスミドに１ｋｂの３５Ｓ　ＣａＭＶプロモーターと７００ｂｐのｎｏｓ３’末端とを有するＥＬに相補的な領域１つであり、２つの遺伝子のうち一方はＴ７プロモーターを持ち、他方は３５Ｓプロモーターを持つ）を作製した。次に、ダイズＡＬＳ遺伝子から得られる２０８ｂｐのＨｉｎｄ　ＩＩＩ／ＥｃｏＲ　Ｉ断片（配列番号３５、断片は８９１〜１１１４位から得たものである）をｐＫＳ１３７のＨｉｎｄ　ＩＩＩ／ＥｃｏＲ　Ｉ部位にクローニングし、ｐＫＳ１６１を作製した。ｐＫＳ１６３を作製するには、ＥＬリンカー（配列番号１２）をｐＫＳ１２７のＮｏｔＩ部位にクローニングし、ＫＳ１３９（ＨＰＴ遺伝子が２つあるプラスミドに実施例１０で得られるＬｅａプロモーターおよびファゼオリン３’末端のあるＥＬに相補的な領域１つであり、２つの遺伝子のうち一方はＴ７プロモーターを持ち、他方は３５Ｓプロモーターを持つ）を作製した。次に、ダイズＡＬＳ遺伝子から得られる２０８ｂｐのＨｉｎｄ　ＩＩＩ／ＥｃｏＲ　Ｉ断片（配列番号３５、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片は８９６〜１１０３位から得たものである）をＫＳ１３９のＨｉｎｄ　ＩＩＩ／ＥｃｏＲ　Ｉ部位にクローニングし、ＫＳ１６３を作製した。
【０１８４】
ＫＳ１６１およびＫＳ１６３を８２１の組織に形質転換した（実施例１）。この組織の形質転換効率は、通常では組織１グラムあたりクローン２００〜５００個の範囲である。ボンバードおよびハイグロマイシン含有培地への移行の４週間後にＫＳ１６１およびＫＳ１６３を用いた２つの別々の形質転換実験で得られた結果は以下のとおりである。
【０１８５】
実験１
ＫＳ１６１（３５Ｓ　ＡＬＳ　ＥＬ）１６個のクローン／組織１グラム
ＫＳ１６３（ＬＥＡ　ＡＬＳ　ＥＬ）２４７個のクローン／組織１グラム
実験２
ＫＳ１６１（３５Ｓ　ＡＬＳ　ＥＬ）４３個のクローン／組織１グラム
ＫＳ１６３（ＬＥＡ　ＡＬＳ　ＥＬ）４６７個のクローン／組織１グラム
【０１８６】
どちらの実験でも、おそらく胚形成段階全体にわたって内在性ＡＬＳ遺伝子が抑制されたことが原因で３５Ｓ　ＥＬ−ＡＬＳベクターではクローン数が＞９０％減少した。したがって、３５Ｓ−ＥＬ構築物（ＫＳ１３７）およびＬＥＡ−ＥＬ構築物（ＫＳ１３９）に挿入した新規な遺伝子断片について得られたクローン数の違いを、対応する内在性遺伝子が必須であるか否かを判定し、よってこれが潜在的な除草剤の標的であるか否かを判定する上での目安として利用することができる。粒子ボンバードから数週間以内で未知の遺伝子断片が形質転換効率におよぼす影響を測定することができるため、これは新たな除草剤の標的候補を同定するための手軽な手段である。一般的なスクリーニングでは、ＫＳ１３７およびＫＳ１３９を空ベクター対照物、ＫＳ１６１を陽性（ＡＬＳ）対照物として使用し、さまざまな遺伝子断片も用いて組織にボンバードを行い、ＰＣＲによって増幅してＨｉｎｄ　ＩＩＩおよびＥｃｏＲ　Ｉ部位を含むようにし、ＫＳ１３７およびＫＳ１３９のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位にクローニングする。
【０１８７】
ＥＬ構築物を用いて抑制頻度が改善されることで、信頼できるスクリーニング方法を得られる可能性が出てくる。２つの実験で統計的に決定的な差になるようにするには、ｐＫＳ１３７またはｐＫＳ１３９に含まれる標的配列によって、有意な率でハイグロマイシン回復形質転換イベントを抑制しなければならない。「高い頻度」という表現は、本願明細書において抑制効率に関して使用する場合、標的抑制表現型を呈する形質転換系の割合を示す。高い頻度の割合は少なくとも１５〜９５％の範囲ならびにこの範囲に含まれる整数値での割合が想定される。好ましい実施形態として、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％があげられる。
【０１８８】
実施例１２
ＥＬ構築物を用いてトウモロコシでセルロース合成酵素を抑制
セルロース合成酵素遺伝子は、植物におけるセルロース形成に関与するタンパク質ファミリをコードする（Ｐｅａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）　９３、１２６３７〜１２６４２；Ｓａｘｅｎａら、（１９９０）、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１５、６７３〜６８４）。セルロース合成酵素（ｃｅｓＡ）をコードするいくつかのトウモロコシ遺伝子が最近になってクローニングされ、特徴付けられた（２０００年２月２４日公開の国際特許出願公開第ＷＯ００／０９７０６号）。これらの遺伝子のうち４つすなわち、ｃｅｓＡ１、ｃｅｓＡ４、ｃｅｓＡ５、ｃｅｓＡ８から得られる断片を用いて、１×ＥＬがトウモロコシにおいてこれらの遺伝子の抑制を指示できるか否かを試験した。
【０１８９】
ｃｅｓＡ１、ｃｅｓＡ４、ｃｅｓＡ５、ｃｅｓＡ８について、ｃＤＮＡクローンの５’末端から得られる１ｋｂの断片（５’−ＵＴＲおよびＯＲＦ配列を含む）をそれぞれ別々に１×ＥＬ（配列番号１２）構築物の内部ＮｏｔＩ部位にクローニングした。これらの「ＥＬ−ｃｅｓＡ−ＥＬ」カセット各々を、ｆ３．７プロモーター（柄特異的発現を若干優先する弱い構成的プロモーター）と、プロテイナーゼインヒビター３’末端（ジャガイモから得られるｐｉｎＩＩ、Ａｎら　（１９８９）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１：１１５〜１２２）と、３５Ｓ：ＢＡＲ：ｐｉｎＩＩ選択マーカーとを含むプラスミドに挿入した。ｐｉｎＩＩ　３’末端のあるＧＵＳ遺伝子をドライブするＩＮ２プロモーターを含む対照プラスミドも作製した。
【０１９０】
構築物各々を用いてのトウモロコシの形質転換実験で得られる結果を表９に示す。４つのｃｅｓＡ遺伝子構築物各々について２５の系を単離し、対照については１８の系を単離した。植物の高さと柄の直径は、平均すると、抑制構築物を含む系の方が対照物よりも小さかった。穂の高さはｃｅｓＡ１およびｃｅｓＡ５含有系の方が短かった。乾物全体に対するセルロースの平均割合は通常、対照植物で４６％である。ｃｅｓＡ１＞ｃｅｓＡ５＞ｃｅｓＡ８＞ｃｅｓＡ４の順で、すべてのｃｅｓＡ構築物にセルロースが４６％未満の系があった。ＤＮＡサザンブロット分析によってセルロースの割合が低かった系を試験し、単一コピートランスジーン挿入物が含まれるのはどれかを求めた。いずれにおいてもセルロースの割合が低く単一のトランスジーンを持つ系が少なくとも１つあった。
【０１９１】
【表１６】
2004512020.tif 000019
【０１９２】
これらの結果から、１×ＥＬ構築物内に含まれるｃｅｓＡ遺伝子断片を持つ植物でセルロースレベルが変化することが分かる。これは、トウモロコシでのｃｅｓＡの抑制が検出可能な表現型であり、トウモロコシではＥＬ制御抑制が活性であるという意味と解釈される。ｆ３．７プロモーターは本件特許出願に記載の他のプロモーター（３５Ｓ−ＣａＭＶ、Ｋｔｉなど）と比べると弱いプロモーターであり、ｃｅｓＡは大きな多遺伝子ファミリである点に注意されたい。このような要因が抑制の頻度および／または程度に影響しているかもしれないのである。
【０１９３】
実施例１３
ＧＵＳに相補的な領域を用いてのトウモロコシにおけるＧＦＰの一過的な抑制
この実施例で用いた発現カセットはいずれも、トウモロコシのユビキチンプロモーター（ｎｔ１〜８９９）と、トウモロコシのユビキチン５’未翻訳リーダー配列（ｎｔ９００〜９８２）と、トウモロコシのユビキチンイントロン１（ｎｔ９８３〜１９９２）とを含むものである。プラスミドＰＨＰ７９２１では、コード配列（ｎｔ２０１５〜２７３１）はトウモロコシでの発現用にコドンが最適化されたＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）である。プラスミドＰＨＰ３９５３では、コード配列（ｎｔ２０１３〜３８２１）はＧＵＳである。両方のカセットにはＳ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍのプロテイナーゼインヒビターＩＩ遺伝子から得られるポリアデニル化シグナル配列が含まれる（ＰＩＮＩＩ　ＴＥＲＭ、ＰＨＰ７９２１のｎｔ２７３７〜３０４７およびＰＨＰ３９５３のｎｔ３８８３〜４１９２）。
【０１９４】
この研究での発現カセットの構築ではいずれも当業者間で周知の標準的な組換えＤＮＡ法を使用した。断片挿入の向きとプラスミド構築物の最終構造については、標準的なアガロースゲル分析および／またはプラスミドのシーケンシングを用いて決定した。
【０１９５】
プラスミドＰＨＰ７９２１を用いて、以下のようにしてＧＦＰコード配列のほんの一部の相補的な領域（ＣＲ）を作製した。プラスミドＤＮＡをＸｈｏＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で処理して、ＧＦＰコード配列の３’末端付近のｎｔ２４３６〜２６７５を表す２４４ｂｐの平滑末端断片を放出させた。次に、この断片をＧＦＰの停止コドンのすぐ下流のＨｐａＩ部位（ｎｔ２７３５）でＰＨＰ７９２１に戻した。もとの配列とは逆方向に挿入断片を持つ組換えプラスミドを同定した。このプラスミドをＰＨＰ１６３９１と呼ぶ。
【０１９６】
異種ＧＦＰ−ＣＲを含むＧＵＳの発現カセットを以下のようにして構築した。ＰＨＰ１６３９１のＧＦＰ−ＣＲ全体をＢｓｒＧＩ断片（ｎｔ２４６４〜２９４７、４８３ｂｐ）として単離した。この断片は、ステムが２１４ｂｐでループが５５ｎｔのＣＲを形成できる配列を含む。この断片を上述したようにしてクレノウで末端平滑化し、３ヶ所の異なる部位でＰＨＰ３９５３のＧＵＳ発現カセットに挿入した。プラスミドＰＨＰ１６５６１は、開始コドンのすぐ５’側のＰＨＰ３９５３のＢａｍＨＩ部位（占有）（ｎｔ２００６）に挿入したＧＦＰ−ＣＲを持つ。プラスミドＰＨＰ１６５６２は、停止コドンのすぐ３’側のＰＨＰ３９５３のｎｔ３９１９でＰａｃＩ部位（平滑化するためにＴ４ポリメラーゼで処理）に挿入したＧＦＰ−ＣＲを持つ。同様に、プラスミドＰＨＰ１６５６３はＧＵＳコード配列内にてＰＨＰ３９５３のｎｔ２３９８でＳｎａＢＩ部位に挿入したＧＦＰ−ＣＲを持つ。
【０１９７】
２週間ごとに新鮮な５６０Ｐ（Ｎ６塩、Ｅｒｉｋｋｓｏｎビタミン、プロリン０，６９ｇ／ｌ、２，４−Ｄ２ｍｇ／ｌ、ショ糖３％）培地に継代培養することによって、高ＩＩ型カルスの状態を維持した。健康なカルスを０．７７ｍｍ２のナイロンメッシュに通して押し出し、秤量し、２，４−Ｄ２ｍｇ／ｌを含むＭＳ培養液に培地４０ｍｌあたり組織３グラムの密度で再懸濁させた。孔の大きなピペットを用いて溶液を上下にピペットで動かし、細胞を均一に懸濁させ、真空装置を用いて４ｍｌのアリコート（３００ｍｇ）をガラス濾紙の上に集めた。この濾紙には各々細胞約３００ｍｇが含まれていたが、これを５６０Ｐ培地にのせ、暗所にて２６℃で培養した。２〜４日後、濾紙を培養液から取り出し、真空装置を用いて余分な液体を除去した。次に、デュポンのＢｉｏｌｉｓｔｉｃｓ粒子銃を用いて、１ｕｍの金粒子を使うように手を加えた標準的なＨｉ−ＩＩボンバードメント形質転換プロトコール（Ｓｏｎｇｓｔａｄ　Ｄ．Ｄ．ら、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ　３２：１７９〜１８３、１９９６）で細胞にＤＮＡを入れた。濾紙を５６０Ｐ培養液に戻し、暗所にて２６℃で培養した。すべてのＤＮＡを同じ比率で調節し、最終濃度を全ＤＮＡ／粒子調製物１ｕｇ（各調製管で混合した各ＤＮＡ０．３３ｕｇを６ショットで用いた）とした。この実験は以下のとおりとした。各処理で１０プレート（２通りのＤＮＡ調製物それぞれについて５つずつ）をボンバードした。
【０１９８】
【表１７】
2004512020.tif 000020
【０１９９】
分析を行うために、処理内のプレートを５対にグループ分けした（各対には、同じプラスミド処理について異なるＤＮＡ調製物でショットを行ったプレートを含む）。ボンバードの２日後、２つの対になったプレートから得られる組織をすべて合わせ、培養液５ｍｌに再懸濁させた。孔の大きなピペットで混合した後、１ｍｌのアリコートを１．５ｍｌのエッペンドルフ管に移した。微量遠心管にて１０００ＲＰＭで２分間細胞を遠心し、上清（培養液）をデカントした。それぞれの管に、「プロメガ社のルシフェラーゼＰａｓｓｉｖｅ　Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ」１５０ｕｌを加え、氷上にて温度を平衡にし、ハンドドリル式Ｋｏｎｔｅｓチューブプラスチックｐｅｓｔｉｌ（抽出とこれに続くルシフェラーゼアッセイではプロメガ社のデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイプロトコール（技術告示第ＴＭ０４０号）を用いて細胞を分離した。微量遠心管にて３０００ＲＰＭで３分間遠心して細胞片をペレット化し、上清をピペットで移した。この抽出物のアリコートをＧＵＳおよびルシフェラーゼの両方の蛍光定量に使用した（それぞれ５０および２０ｕｌ）。基質を加えた後１０から４０分の間のレート測定値としてＧＵＳ酵素活性を求め、データをｐｍｏｌ　ＭＵ／分／ｍｌ／抽出物（勾配）単位で表した。ＲａｏおよびＦｌｙｎｎのプロトコール（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１９９０　８：３８〜４０に従って、ＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ　ＦＬＵＯＲＯＳＫＡＮ　ＡｓｃｅｎｔＦＬにて蛍光定量ＧＵＳアッセイを実施した。Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍｏｎｏｌｉｇｈｔ　２０１０を製造業者の指示に従って用いて、プロメガ社のプロトコールも併用してルシフェラーゼ活性の蛍光定量分析値を得た。各複製について両方のマーカーを評価したところ、内部対照（ルシフェラーゼ）が得られ、これを基準に相対的なＧＵＳ活性を評定することが可能であった。したがって、ＧＵＳ／ルシフェラーゼ単位の比としてデータをプロットした（Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの絶対蛍光定量単位は極めて高いため、ＧＵＳ活性の正規化に用いる前にルシフェラーゼ活性の生の値をいずれも１０で割ってある）。
【０２００】
【表１８】
2004512020.tif 000021
【０２０１】
【表１９】
2004512020.tif 000022
【０２０２】
このような一過的な発現の実験における上記の結果（表１０参照）から、標的の５’側に相補的な領域をおいても標的遺伝子の発現は減少しないようにみえる。しかしながら、最適な条件下または安定した形質転換実験では、相補的な領域を標的の５’におくだけで標的の発現が十分に減少すると考えられる。
【０２０３】
実施例１４
修飾ダイズの相補的な領域によるトウモロコシＰＤＳの抑制
多クローニング部位を囲む相補的な領域としてダイズＫｔｉプロモーターから得られる２０５ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片を用いてさらに別の抑制構築物を作製した。Ｋｔｉ断片のコピー２つを逆の繰返しの形でライゲートし、続いてＰＣＲで修飾して都合の悪い制限部位を除去するとともに、両端と２つの相補的な配列の間の領域とにクローニング部位を加え、ＳＨＨ３カセットを形成した（配列番号３４を参照のこと）。このようにして得られるプラスミド（ＰＨＰ１７９６２）をＳＨＨ３配列のソースとして用いた。Ｋｔｉ配列は通常トウモロコシゲノムには見られないものであるため、ＳＨＨ３領域だけでは内在性トウモロコシ遺伝子の抑制が起こるとは思えない。しかしながら、内在性標的配列の一部を相補的なＫｔｉ配列間のクローニング部位に挿入すると、相同的な内在性遺伝子転写物は影響を受けるはずである。
【０２０４】
内在性遺伝子をサイレンシングする際のＳＨＨ３の有用性を試験するために、Ｚｅａ属トウモロコシのフィトエン不飽和化酵素遺伝子（ＰＤＳ−１）のコード配列の約８０％に相当する１３８５ｂｐのＮｈｅＩ断片（Ｐｉｏｎｅｅｒ　ＥＳＴ　ｃｎｌｃｚ９１Ｒ、ジーンバンク寄託番号第Ｌ３９２６６）を上述したようにしてクレノウ酵素で処理して末端を平滑化し、続いてＳＨＨ３のＥｃｏＲＶ部位にライゲートしてＰＨＰ１７８９４を生成した。次に、このＳＨＨ３−ＰＤＳ断片を１８６５ｂｐのＨｐａＩ断片として中間ベクター構築物に移し、ｐｉｎＩＩターミネーターによって得られるポリアデニル化シグナルを用いてユビキチンプロモーター：ユビキチンイントロン１（米国特許第５，５１０，４７４号および同第５，６１４，３９９号）の制御下においた（Ａｎら　（１９８９）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１：１１５〜１２２）。このようにして得られる植物転写単位を、ＣａＭＶ３５Ｓ−ビアラホス選択マーカー要素を含むバイナリーベクター（ＰＨＰ１５５７８）に移し、ＰＨＰ１７９１４を生成した。この構築物を、スーパーバイナリープラスミドｐＳＢ１を持つＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ系統ＬＢＡ４４０４のコンピテント細胞（（Ｉｓｈｉｄａら　（１９９６）　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　１４：７４５〜７５０）に電気穿孔した。このプロセスによって、ＰＨＰ１７９１４とｐＳＢ１の複合配列を含む融合体プラスミドが得られる。この融合体プラスミドをＰＨＰ１７９３９と名付け、以下のようにしてＺｅａ属トウモロコシの未成熟胚の形質転換に利用した。
【０２０５】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによるトウモロコシの形質転換
受粉約１０日後（ＤＡＰ）のトウモロコシの新たに単離した未成熟胚を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍと一緒にインキュベートした。形質転換に好ましい遺伝子型は高度に形質転換可能な遺伝子型Ｈｉ−ＩＩ（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ（１９９１）Ｍａｉｚｅ　Ｇｅｎ　Ｃｏｏｐ　Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ　６５：９２〜９３）である。Ｈｉ−ＩＩで選り抜きの近交配系と交雑させることで作製したＦ１ハイブリッドを用いてもよい。未成熟胚のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ処理後、有毒レベルの除草剤を含む培地にて胚を培養した。除草剤耐性遺伝子を与えた細胞と、結合された遺伝子（単数または複数）だけが、選択培地で成長した。このようにして選択したトランスジェニックイベントを伝播して植物全体に再生し、種子を生成し、トランスジーンを子孫に伝えた。
【０２０６】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの調製
米国特許第５，５９１，６１６号に従って遺伝子操作したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＬＢＡ４４０４を構築し、配列番号３４に示す相補的な領域によって抑制されるＰＤＳ遺伝子と選択マーカー遺伝子とを持たせた。一般に、選択マーカーにはＢＡＲ（Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら　（１９９２）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　２１６：４１５〜４２６）またはＰＡＴ（Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎら　（１９８８）　Ｇｅｎｅ　７０：２５〜３７）を使用すればよい。
【０２０７】
遺伝子操作した構築物を植物の形質転換に使用するために、まず、最小ＡＢ培地［最小ＡＢ培地には以下の成分を含む。脱イオン水８５０．０００ｍｌ；ストック溶液８００Ａ５０．０００ｍｌ；Ｐｈｙｔａｇａｒ９ｇ、これについては適量にした（Ｑ．Ｓ．ｔｏ　ｖｏｌｕｍｅ）後に加える；ストック溶液８００Ｂ＃５０．０００ｍｌ；グルコース＃５．０００ｇ；スペクチノマイシン５０／ｍｇ／ｍｌストック＃２．０００ｍｌ。使用法は以下のとおりである。洗練した（ｐｏｌｉｓｈｅｄ）脱イオン水に成分を順次溶解させる；１リットルあたり１００ｍｌ未満で洗練した脱イオン水を用いて適量にする；滅菌し、６０℃まで冷却する。＃を付した成分は、滅菌および温度まで冷却した後に加える。ストック溶液８００Ａは、以下の成分を含む。脱イオン水９５０．０００ｍｌ；第二リン酸カリウムＫ２ＨＰＯ４　６０．０００ｇ；水和第一リン酸ナトリウム２０．０００ｇ。使用方法は以下のとおりである：洗練した脱イオン水に成分を順次溶解させる；水酸化カリウムを用いてｐＨを７．０に調整する；ｐＨを調整した後、洗練した脱イオン水を用いて適量にする；滅菌し、６０℃まで冷却する。ストック溶液８００Ｂは以下の成分を含む：脱イオン水９５０．０００ｍｌ；塩化アンモニウム２０．０００ｇ；硫酸マグネシウム７−Ｈ２Ｏ　６．０００ｇ、ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ；塩化カリウム３．０００ｇ；塩化カルシウム（無水物）０．２００ｇ；硫酸第一鉄七水和物０．０５０ｇ。使用方法は以下のとおりである：洗練した脱イオン水に成分を順次溶解させる；洗練した脱イオン水を用いて適量にする；滅菌し、６０℃まで冷却する］にバクテリアを播種してシングルバクテリアコロニーのマスタープレートを作製した。次に、２８℃で暗所にて３日間、ひっくり返したバクテリアプレートをインキュベートする。次に、最小Ａ培地［最小Ａ培地は以下の成分を含む：脱イオン水９５０．０００ｍｌ；第二リン酸カリウムＫ２ＨＰＯ４　１０．５００ｇ；第一リン酸カリウムＫＨ２ＰＯ４　４．５００ｇ；硫酸アンモニウム１．０００ｇ；クエン酸ナトリウム二水和物０．５００ｇ；２０％ショ糖溶液＃１０．０００ｍｌ；１Ｍ硫酸マグネシウム＃１．０００ｍｌ。使用方法は以下のとおりである：洗練した脱イオン水に成分を順次溶解させる；脱イオン水を用いて適量にする；滅菌し、６０℃まで冷却する。＃を付した成分は、滅菌および温度まで冷却した後に加える］のプレートからシングルコロニーを選択して、作業用プレートを作製し、ＹＰ培地［最小ＹＰ培地は以下の成分を含む：脱イオン水９５０．０００ｍｌ；酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）５．０００ｇ；ペプトン（Ｄｉｆｃｏ）１０．０００ｇ；塩化ナトリウム５．０００ｇ；バクトアガー１５．０００ｇ、これについては適量にした後に加える；スペクチノマイシン５０ｍｇ／ｍｌストック＃１．０００ｍｌ。使用方法は以下のとおりである：洗練した脱イオン水に成分を順次溶解させる；水酸化カリウムを用いてｐＨを６．８に調整する；ｐＨを調整した後に洗練した脱イオン水を用いて適量にする；滅菌し、６０℃まで冷却する。＃を付した成分は、滅菌および温度まで冷却した後に加える］のプレートに画線した。次に、ＹＰ培地のバクテリアプレートをひっくり返して２８℃で暗所にて１〜２日間インキュベートした。
【０２０８】
形質転換の１日前に植物の同時形質移入共存培養用のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを調製した。フラスコに入れた最小Ａ培地３０ｍｌに、スペクチノマイシン５０μｇ／ｍｌと、アセトシリンゴン１００μＭと、１から２日経過した作業用プレートから得た約１／８ループのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍとを入れた。次に、２８℃で２００ｒｐｍ、暗所にて一晩（約１４時間）かけてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを成長させた。対数期中期にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを収集し、標準的な微生物的手法および標準的な曲線を用いて、５６１Ｑ培地＋アセトシリンゴン１００μＭ中に３から５×１０８ＣＦＵ／ｍｌで再懸濁させた。
【０２０９】
未成熟胚の調製
トウモロコシ植物の制御受粉の９から１０日後、発達中の未成熟胚は不透明で長さ１〜１．５ｍｍであり、Ａｇｒｏ感染にちょうどよいサイズである。市販の５０％漂白剤およびＴｗｅｅｎ１滴の中で３０分間、穀皮のある穂（ｈｕｓｋｅｄ　ｅａｒ）を滅菌し、続いて滅菌水で２回洗浄した。無菌状態で穀果から未成熟胚を取り出し、培地５６１Ｑ＋アセトシリンゴン１００μＭで構成される滅菌保持液２ｍｌに入れた［培地５６１Ｑは以下の成分を含む：濾過したＤ−Ｉ水９５０．０００ｍｌ；Ｃｈｕ（Ｎ６）塩基性塩（シグマＣ−１４１６）４．０００ｇ；Ｅｒｉｋｓｓｏｎビタミン混合物（１０００×シグマ−１５１１）１．０００ｍｌ；チアミン．ＨＣＬ．４ｍｇ／ｍｌ　１．２５０ｍｌ；２，４−Ｄ０．５ｍｇ／ｍｌ（Ｎｏ．２Ａ）３．０００ｍｌ；Ｌ−プロリン０．６９０ｇ；ショ糖６８．５００ｇ；グルコース３６．０００ｇ。使用方法は以下のとおりである：洗練した脱イオン水に成分を順次溶解させる；ＫＯＨでｐＨを５．２に調整する；ｐＨを調整した後、洗練した脱イオン水を用いて適量にする；濾過滅菌する（オートクレーブなし）］。
【０２１０】
胚のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染と共存培養
切除した未成熟胚から保持液をデカントし、調製済みのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍと交換した。約５分間ゆっくり混合してインキュベーションした後、未成熟胚からＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍをデカントした。次に、未成熟胚を５６２Ｐ培地［培地５６２Ｐは以下の成分を含む：濾過したＤ−Ｉ水９５０．０００ｍｌ；Ｃｈｕ（Ｎ６）塩基性塩（シグマＣ−１４１６）４．０００ｇ；Ｅｒｉｋｓｓｏｎビタミン混合物（１０００×シグマ−１５１１）１．０００ｍｌ；チアミン．ＨＣＬ．４ｍｇ／ｍｌ　１．２５０ｍｌ；２，４−Ｄ０．５ｍｇ／ｍｌ　４．０００ｍｌ；Ｌ−プロリン０．６９０ｇ；ショ糖３０．０００ｇ；Ｇｅｌｒｉｔｅ３．０００ｇ、これについては適量にした後に加える；硝酸銀２ｍｇ／ｍｌ＃０．４２５ｍｌ；アセトシリンゴン１００ｍＭ＃１．０００ｍｌ。使用方法は以下のとおりである：洗練した脱イオン水に成分を順次溶解させる；ＫＯＨでｐＨを５．８に調整する；ｐＨを調整した後、洗練した脱イオン水を用いて適量にする；滅菌し、６０℃まで冷却する。＃を付した成分は、滅菌および温度まで冷却した後に加える］のプレートに移し、胚盤表面を上に向け、２０℃で３日間暗所にてインキュベートした後、２８℃で３日間、培地５６２Ｐ＋１００ｍｇ／ｍｌ　ｃａｒｂｅｎｅｃｉｌｌｉｎで暗所にてインキュベートした（米国特許第５，９８１，８４０号を参照のこと）。
【０２１１】
トランスジェニックイベントの選択
インキュベーションに続いて、未成熟胚を５６３Ｏ培地［培地５６３Ｏは以下の成分を含む：濾過したＤ−Ｉ水９５０．０００ｍｌ；Ｃｈｕ（Ｎ６）塩基性塩（シグマＣ−１４１６）４．０００ｇ；Ｅｒｉｋｓｓｏｎビタミン混合物（１０００×シグマ−１５１１）１．０００ｍｌ；チアミン．ＨＣＬ．４ｍｇ／ｍｌ　１．２５０ｍｌ；ショ糖３０．０００ｇ；２，４−Ｄ　０．５ｍｇ／ｍｌ（Ｎｏ．２Ａ）　３．０００ｍｌ；Ｌ−プロリン０．６９０ｇ；Ｍｅｓ緩衝液０．５００ｇ；寒天（シグマＡ−７０４９、精製）８．０００ｇ、これについては適量にした後に加える；硝酸銀２ｍｇ／ｍｌ＃０．４２５ｍｌ；ビアラホス１ｍｇ／ｍｌ＃３．０００ｍｌ；Ａｇｒｉｂｉｏ　Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ５０ｍｇ／ｍｌ＃２．０００ｍｌ。使用方法は以下のとおりである：洗練した脱イオン水に成分を順次溶解させる；ｋｏｈを用いてｐＨを５．８に調整する；ｐＨを調整した後、洗練した脱イオン水を用いて適量にする；滅菌し、６０℃まで冷却する。＃を付した成分は、滅菌および温度まで冷却した後に加える］に移し、イベントを選択できるようにした。形質転換ＤＮＡは、この例ではＢＡＲ遺伝子である除草剤耐性遺伝子を持ち、これがビアラホスに耐性を与える。１０から１４日の間隔で、胚を５６３Ｏ培地に移した。活発に成長している推定上のトランスジェニック胚形成組織は６〜８週間で目に見えるようになった。
【０２１２】
実施例１５
修飾ダイズの相補的な領域によるトウモロコシＰＤＳの抑制
Ｔ０植物の再生
トランスジェニック胚形成組織を２８８Ｗ培地［培地２８８Ｗは以下の成分を含む：Ｄ−ＩＨ２０　９５０．０００ｍｌ；ＭＳ塩４．３００ｇ；Ｍｙｏ−イノシトール０．１００ｇ；ＭＳビタミンストック溶液（Ｎｏ．３６Ｊ）５．０００ｍｌ；Ｚｅａｔｉｎ．５ｍｇ／ｍｌ１．０００ｍｌ；ショ糖６０．０００ｇ；寒天（シグマＡ−７０４９、精製）８．０００ｇ、これについては適量にした後に加える；ＩＡＡ０．５ｍｇ／ｍｌ＃２．０００ｍｌ；０．１ＭｍＡＢＡ＃１．０００ｍｌ；ビアラホス１ｍｇ／ｍｌ＃３．０００ｍｌ；Ａｇｒｉｂｉｏ　Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ５０ｍｇ／ｍｌ＃２．０００ｍｌ。使用方法は以下のとおりである：洗練した脱イオン水に成分を順次溶解させる；ｐＨ５．６に調整する；ｐＨを調整した後、洗練した脱イオン水を用いて適量にする；滅菌し、６０℃まで冷却する。細胞生物学用のＧｅｌｒｉｔｅ３．５ｇ／Ｌを加える。＃を付した成分は、滅菌および温度まで冷却した後に加える］に移し、不定胚が成熟するまでか、あるいは約１０から１８日間、２８℃で暗所にてインキュベートする。胚盤および子葉鞘が十分に画定された個々の成熟不定胚を２７２胚発芽培地［培地２７２は以下の成分を含む：脱イオン水９５０．０００ｍｌ；ＭＳ塩４．３００ｇ；Ｍｙｏ−イノシトール０．１００ｇ；ＭＳビタミンストック溶液５．０００；ショ糖４０．０００ｇ；Ｇｅｌｒｉｔｅ１．５００ｇ、これについては適量にした後に加える。使用方法は以下のとおりである：洗練した脱イオン水に成分を順次溶解させる；ｐＨ５．６に調整する；ｐＨを調整した後、洗練した脱イオン水を用いて適量にする；滅菌し、６０℃まで冷却する］に移し、光線下２８℃でインキュベートする。苗条と根が出た後、個々の植物を土の入った鉢に移し、一般的な園芸方法を用いて寒さに慣らす。次に、植物のＰＤＳ−サイレンス表現型について評価を行う。
【０２１３】
フィトエン不飽和化酵素は、植物でのカロチノイドの生合成における律速ステップを触媒する（Ｍｉｓａｗａら、Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ　（１９９３）　４（５）：８３３〜８４０）。これは、ノルフラゾンなどのブリーチング除草剤のすでに知られている標的である。導入したＳＨＨ３−フランキングＰＤＳ１によって内在性フィトエン不飽和化酵素のコサプレッションを行うと、若い植物を光線下でインキュベートした場合に同様のブリーチング表現型が得られる（Ｔｈｏｍａｓら　（２００１）Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ　２５（４）：４１７〜４２５；Ｋｕｍａｇｉら　（１９９５）　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　９２：１６７９〜１６８３；Ｒｕｉｚら　（１９９８）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１０：９３７〜９４６）。
【図面の簡単な説明】
【図１】脂肪酸不飽和化酵素であるダイズ遺伝子Ｆａｄ２について、アンチセンス、「伝統的なコサプレッション」および相補的な領域の発現の減少に関する実験でのキメラ化の結果を示す。キメラ化は、所望の形質の表現型特性を示す個々の形質転換系において単離された個体の割合を示す目安となる。
【図２】ＴＬＣ分離後に可視化したダイズの全糖を示す。各レーンの最低バンドはラフィノース糖およびスタキオース糖である。「Ｌｏｗ　４」のレーンは、ラフィノース／スタキオース糖のレベルが極めて低いことが知られているダイズ系から単離したものである。２つの「ＧＡＳ−ＥＬ」系はいずれも周囲の系で見られるよりもラフィノース／スタキオースのレベルが低いことから、ＥＬ構築物に含まれるＧＡＳ１／ＧＡＳ２断片が、これらの系でガラクチノール合成酵素の活性を抑制していることが分かる。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004512020.tif 000102
2004512020.tif 000103
【国際調査報告】
2004512020.tif 000104
2004512020.tif 000105
2004512020.tif 000106
2004512020.tif 000107
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