(57)【要約】本発明は、ミトキサントロンのリポソーム製剤、並びにその製造方法と使用方法に関する。リポソームが、カルジオリピンなどのミトキサントロンと結合すると考えられる化合物に加え種々の中性又は荷電リポソーム形成物質の任意のものを含む、ミトキサントロンのリポソーム製剤を、本発明の組成物は含む。リポソーム組成物は、他の活性薬剤の中でも抗新生物物質、抗真菌物質、抗生物質を含む、ミトキサントロン以外の第２の治療薬剤と共に有利に使用できる。治療有効量の製剤を、ヒトなどの哺乳動物に投与する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物疾患の治療方法であって、カルジオリピン含有リポソーム製剤中ミトキサントロン治療有効量と、医薬として許容できる賦形剤とを含む医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、方法。
【請求項２】
哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リポソーム製剤が更にリン脂質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
リポソーム製剤が更にトコフェロールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
リポソーム製剤が更に、ホスファチジルコリン、コレステロール及びトコフェロールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
カルジオリピンが、天然カルジオリピン及び合成カルジオリピンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
リポソームが負電荷を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
リポソームが正電荷を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ミトキサントロンの少なくとも９０％がリポソームに結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ミトキサントロン濃度が、約０．５〜約２ｍｇ／ｍｌの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ミトキサントロン、及びカルジオリピンを含む脂質成分を含むリポソームを含む治療用ミトキサントロン組成物。
【請求項１２】
ミトキサントロンと脂質成分とのモル比が、約１：１０から約１：２０までの範囲である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ミトキサントロン包埋リポソームが、約５μｍ以下のサイズを有する小胞を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
ミトキサントロン包埋リポソームが、約１μｍ以下のサイズを有する小胞を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
ミトキサントロン包埋リポソームが、約０．５μｍ以下のサイズを有する小胞を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
ミトキサントロン包埋リポソームが、約０．１μｍ以下のサイズを有する小胞を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１７】
脂質成分が更に、ホスファチジルコリン、コレステロール、α−トコフェロール、ジパルミトイルホスファチジルコリン、及びホスファチジルセリンからなる群から選択される化合物を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１８】
カルジオリピンが、天然カルジオリピン及び合成カルジオリピンからなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１９】
リポソームが負電荷を有する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２０】
リポソームが正電荷を有する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２１】
リポソームが中性である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２２】
リポソームが、多層膜小胞と単層膜小胞との混合物である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２３】
ミトキサントロンと脂質成分とのモル比が、約１：１０から約１：２０までの範囲である、脂質成分とミトキサントロンを含む治療用ミトキサントロン組成物。
【請求項２４】
脂質成分がリン脂質を含む、請求項２３に記載の治療用ミトキサントロン組成物。
【請求項２５】
脂質成分がホスファチジルコリンを含む、請求項２３に記載の治療用ミトキサントロン組成物。
【請求項２６】
脂質成分が卵ホスファチジルコリンを含む、請求項２３に記載の治療用ミトキサントロン組成物。
【請求項２７】
脂質成分がコレステロールを含む、請求項２３に記載の治療用ミトキサントロン組成物。
【請求項２８】
脂質成分が更に、リン脂質、コレステロール、カルジオリピン、及びトコフェロールを含む、請求項２３に記載の治療用ミトキサントロン組成物。
【請求項２９】
ミトキサントロン濃度が、約０．５〜約２ｍｇ／ｍｌの範囲である、請求項２３に記載の治療用ミトキサントロン組成物。
【請求項３０】
ミトキサントロンの医薬剤形の調製方法であって、ミトキサントロンと結合する成分を含む予め形成されたある量のリポソームを含む容器を得る工程、医薬として許容できる賦形剤中ある量のミトキサントロンを含む容器を得る工程、医薬として許容できる賦形剤中のミトキサントロンの一部と該リポソームとを混合する工程、及びミトキサントロンを該リポソームと結合させて、ミトキサントロンの医薬剤形を得る工程を含む、方法。
【請求項３１】
予め形成されたリポソームが凍結乾燥されている、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）のリポソーム製剤、並びにその製造方法と使用方法に関する。
【０００２】
（背景の説明）
ミトキサントロン、特にその塩酸塩形態は、癌及び多発性硬化症の治療に有用である治療薬剤である。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、商品名ノバントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）（登録商標）の下、注射用製剤として１９８７年に米国での販売に関しミトキサントロン塩酸塩を最初に承認した。ノバントロン（登録商標）は、不活性成分として、塩化ナトリウム（０．８０％ｗ／ｖ）、酢酸ナトリウム（０．００５％ｗ／ｖ）及び酢酸（０．０４６％ｗ／ｖ）を有する、２ｍｇ／ｍｌミトキサントロン遊離塩基に相当する塩酸塩形態を含む、滅菌され非発熱性物質を含まない濃青色の水溶液として提供される。
コルチコステロイドと組み合わせたノバントロン（登録商標）は、進行性ホルモン不応性前立腺癌に関係する疼痛のある患者の治療のための初期化学療法としての使用を承認されている。ノバントロンの推奨投与量は、２１日毎に短期静脈内注入（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）として投与される１２〜１４ｍｇ／ｍ２である。
【０００３】
ノバントロンはまた、他の承認薬剤（単数又は複数）と組み合せて、骨髄性、前骨髄球性、単球性、及び赤血球性の急性白血病を含む、急性非リンパ球性白血病（ＡＮＬＬ）の初期療法における使用が承認されている。推奨投与量は、１〜７日目に連続２４時間注入として投与される７日間のシタラビン１００ｍｇ／ｍ２と一緒に、静脈内注入として投与される１〜３日目に毎日のノバントロン１２ｍｇ／ｍ２である。
【０００４】
ノバントロン（登録商標）はまた、二次性（慢性）進行性、進行性再発性、又は悪化性再発緩解性の多発性硬化症の患者における神経障害及び／又は臨床的再発の頻度の減少における使用が承認されている。ミトキサントロン塩酸塩は、培養中の増殖中及び非増殖中のヒト細胞両方に細胞毒性であるＤＮＡ反応性薬剤であると考えられている。
【０００５】
ミトキサントロンの毒性は、患者に投与できる薬剤の投与量を限定する。更に、ミトキサントロンに曝された細胞における多剤耐性の発生は、その有効性を限定しうる。その結果、例えば、処置細胞における毒性及び多剤耐性発生を最小化することによってその効力を最大化しつつ、ミトキサントロンを十分に可溶化するミトキサントロン製剤が必要とされる。
本発明は、このような組成物と方法を提供する。本発明のこれらの、そして他の利点、並びに更なる発明の特徴は、本明細書で提供される発明の説明から明らかとなろう。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、新規ミトキサントロン組成物、その製造方法、及び特に哺乳動物、とりわけヒトにおける癌などの疾患の治療におけるその使用に関する。本方法は、哺乳動物に医薬として許容できる賦形剤中のミトキサントロンの医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。リポソームが、種々の中性又は荷電リポソーム形成物質の任意のもの、及びミトキサントロンと結合すると考えられるカルジオリピンなどの化合物を含むことができるミトキサントロンのリポソーム製剤を、本発明の組成物は含む。リポソーム形成物質は、極性溶媒中でリポソームを形成する、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、コレステロールなどのようなリン脂質といった両親媒性分子でありうる。リポソーム中のカルジオリピンは、天然源又は合成由来でありうる。リポソームの組成により、リポソームは、正味の負若しくは正電荷を有しうるか、又は中性でありうる。好適なリポソームはまたトコフェロールを含む。広範囲の濃度のミトキサントロンをこの製剤で使用できるが、最も有用な濃度範囲は、０．５から２ｍｇ／ｍｌまでである。ミトキサントロンと脂質成分とのモル比はまた非常に広く変わりうるが、最も有用な範囲は、約１：１０から約１：２０までである。リポソームは、所望のように、そのサイズを制御するために、種々のサイズのフィルターを通過させられうる。リポソーム組成物は、他の活性薬剤の中でも抗新生物物質、抗真菌物質、抗生物質を含む、ミトキサントロン以外の第二の治療薬剤と共に有利に使用することができる。本発明のリポソームは、所望のように、多層膜小胞（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）、単層膜小胞（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）、又はそれらの混合物でありうる。医薬として許容できる賦形剤中の治療有効量の本リポソームを、ヒトなどの哺乳動物に投与する方法が提供される。
【０００７】
剤形の製造の１つの特に好適な方法においては、医薬として許容できる賦形剤中のある量のミトキサントロン（ノバントロン（登録商標）など）を、ミトキサントロンと結合する成分を含む予め形成され凍結乾燥されたリポソームのある量を含む容器に加え、ミトキサントロンをリポソームに結合させ、医薬剤形を提供する。
【０００８】
（好適な実施態様の詳細な説明）
本発明は、組成物、及びその製造と哺乳動物宿主への送達の方法を提供する。組成物及び方法は、ミトキサントロンの溶解性問題の回避、高いミトキサントロンとリポソームの安定性、高濃度でボーラス若しくは短期注入としてミトキサントロンを投与する能力、ミトキサントロン毒性の減少、特に心筋におけるミトキサントロン蓄積の減少、ミトキサントロンの治療効力の増大、及び癌細胞における多剤耐性の調節を特徴とする。製剤でのカルジオリピンの使用は、驚くべき程度までミトキサントロン包埋を改善する。
【０００９】
本発明の組成物は、カルジオリピンを含むミトキサントロンのリポソーム製剤である。一般的には、リポソーム製剤は、公知の技術によって調製できる。例えば、１好適技術では、ミトキサントロンを、カルジオリピンと共に疎水性溶媒に溶解し、カルジオリピンにミトキサントロンとの複合体を形成させる。複合体形成を容易にするために、カルジオリピン／ミトキサントロン含有混合物を蒸発させ、フィルムを形成できる。その後、任意の所望の更なる親油性成分を含む溶液をフィルムに加えることができ、ミトキサントロン／カルジオリピン複合体を、溶液に溶解させるか、徹底的に分散させる。次いで、溶液を蒸発させ、第２の脂質フィルムを形成させることができる。次いで、水性溶媒などの極性溶媒を脂質フィルムに加えることができ、得られた混合物を激しくホモジナイズして、本発明のリポソームを産生できる。
【００１０】
あるいは、親油性成分の全てを、次に蒸発できる適切な溶媒に溶解し、親油性フィルムを形成できる。次いで、水性溶媒などの極性溶媒を脂質フィルムに加えることができ、得られた混合物を激しくホモジナイズして、本発明のリポソームを産生できる。
【００１１】
上記のように、ミトキサントロンを脂質フィルムに溶解させる場合、剤形は便利には、単一バイアルにパッケージングすることができ、これに適切な水溶液を加えて、リポソームを形成できる。あるいは、親油性成分又は予め形成されたリポソームがひとつのバイアルに含まれ、ミトキサントロンを含む水性成分がふたつめのバイアルに提供される２バイアルシステムを調製することができる。水性のミトキサントロン含有成分を、脂質フィルム又は予め形成されたリポソームを含むバイアルに移し変えることができ、ミトキサントロンのリポソーム製剤が、激しい混合、ボルテックス及び／又は音波処理によって形成されうる。
【００１２】
望ましくは、リポソームはいったん形成されると、そのサイズを制御するために適切なフィルターを通し濾過される。適切なフィルターには、濾液から所望のサイズ範囲のリポソームを得るために使用できるものが挙げられる。例えば、リポソームを形成し、その後、５ミクロンフィルターを通し濾過して、約５ミクロン以下の直径を有するリポソームを得ることができる。あるいは、１μｍ、５００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ、又は他のフィルターを用いて、対応するサイズ（ｓｏｚｅ）を有するリポソームを得ることができる。
【００１３】
ミトキサントロン製剤を調製するために、ミトキサントロンを適切な溶媒に溶解する。適切な溶媒は、ミトキサントロンが可溶で、医薬として許容できない量の医薬として許容できない残渣を残さずに、蒸発可能なものである。例えば、エタノール、メタノール、クロロホルム、アセトン、又は生理食塩水などの非極性、僅かに極性、又は極性の溶媒を使用できる。
任意の適切なカルジオリピンが本発明で使用できる。例えば、テトラミリスチルカルジオリピンなどのカルジオリピンが、天然源から精製、又は化学的に合成できる。カルジオリピンが可溶で、医薬として許容できない量の医薬として許容できない残渣を残さずに、蒸発可能な溶媒を含む適切な溶媒中に、カルジオリピンを溶解できる。カルジオリピン溶液は、ミトキサントロンと混合できる。あるいは、カルジオリピンをミトキサントロンで直接溶解できる。リポソームにカルジオリピンを組み込ませることによって、ミトキサントロンのためのリポソームの収容能力は、驚くべき程度まで増大することが見出された。従って、得られたリポソーム製剤が治療用途のために十分安定で、ミトキサントロンのための適切な収容能力を有する限り、適切なカルジオリピン誘導体も、本リポソーム製剤で使用できる。
【００１４】
任意の適切なリポソーム形成物質を、本リポソーム製剤で使用できる。適切なリポソーム形成物質には、親水性部分と疎水性部分とを有する、合成、半合成（修飾天然物の）、又は天然の化合物が挙げられる。このような化合物は両親媒性分子であり、正味の正、負、又は中性の荷電を有しうる。リポソーム形成化合物の疎水性部分は、１つ以上の非極性の、脂肪族鎖、例えば、パルミトイル基を含みうる。適切なリポソーム形成化合物の例には、リン脂質、ステロール、脂肪酸などが含まれる。好適なリポソーム形成化合物には、カルジオリピン、ホスファチジルコリン、コレステロール、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、及びα−トコフェロールが含まれる。
【００１５】
リポソーム形成物質は、それが可溶である、クロロホルムなどの低極性溶媒、又はｎ−ヘキサンなどの非極性溶媒でありうる、適切な溶媒に溶解できる。適切な溶媒には、リポソーム形成物質が可溶で、医薬として許容できない量の医薬として許容できない残渣を残さずに、蒸発可能な溶媒のみが含まれる。ミトキサントロンを含む他の成分をこの溶液と混合して、全ての成分が可溶な溶液を形成でき、次いで溶媒を蒸発させて均一な脂質フィルムを産生できる。溶媒蒸発は、ミトキサントロンと他の親油性成分の安定性を保つ任意の適切な手段によってでありうる。
【００１６】
適切なリポソームは、中性、負又は正荷電でありえ、その荷電は、リポソーム成分の電荷とリポソーム溶液のｐＨとの関数である。例えば、中性ｐＨで、正荷電リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びステアリルアミンの混合物から形成できる。負荷電リポソームは、例えば、ホスファチジルコリン、コレステロール及びホスファチジルセリンから形成できる。好適な実施態様では、リポソームミトキサントロン製剤は、テトラミリストイルカルジオリピン、コレステロール及び卵ホスファチジルコリンを含む。
【００１７】
好適なリポソームミトキサントロン製剤は、ミトキサントロンと脂質との適切な相対的モル量を含む。ミトキサントロンと脂質との適切な相対的モル量は、約１：１〜５０、より好適には約１：２〜４０、より好適には約１：５〜３０、更により好適には約１：１０〜２０、最適には約１：１５の範囲である。
リポソーム製剤はまた、カルジオリピン、ホスファチジルコリン及びコレステロールの適切な相対的モル量を含む。適切な相対的モル量には、カルジオリピン：ホスファチジルコリン：コレステロールが約０．１〜２５：１〜９９：０．１〜５０が挙げられる。より好適には、相対的モル量は、０．２〜１０：２〜５０：１〜２５の範囲であり、更により好適には０．５〜５：４〜２５：２〜１５、更により好適には量は０．７５〜２：５〜１５：４〜１０の範囲であり、最も好ましい比は１：１０：６．８である。好適なリポソーム製剤はまた、α−トコフェロール又は他の適切な抗酸化剤などの抗酸化剤の適切量を含む。適切量は、約０．００１以上から約５重量％以下までの範囲である。
【００１８】
極性溶液、好ましくは生理食塩溶液などの水溶液を脂質フィルムに加え、激しい混合によってフィルムを分散させることによって、リポソームを形成できる。好ましくは、極性溶液はミトキサントロンを含む。溶液は純水でありうるか、又はそれは、塩、緩衝剤、又は他の可溶性活性剤を含みうる。選択された方法が、脂質フィルムと極性溶媒との間の十分な剪断力を誘導し、混合物を強くホモジナイズし、リポソームを形成するならば、任意の混合方法が使用できる。例えば、混合は、ボルテックス、磁気撹拌及び／又は音波処理によってでありうる。多層膜リポソームは、単に溶液をボルテックスすることによって形成できる。単層膜リポソームが所望の場合、音波処理及び／又は濾過工程がプロセスに含まれうる。
【００１９】
リポソームミトキサントロン製剤の好適な製造方法では、凍結乾燥リポソームのバイアルが調製され、ノバントロン（登録商標）を加えて、ミトキサントロンのリポソーム製剤を形成する。凍結乾燥リポソームは、実施例７でより詳細に説明するように、温ブチルアルコールに脂質成分とＤ−α−トコフェリル酸を溶解することによって製造する。トレハロース二水和物を有する温水を、溶液が清澄になるまで、この溶液に混合する。溶液は、滅菌バイアルに０．２２μｍフィルターを通し滅菌濾過し、凍結乾燥する。望ましくは、凍結乾燥製品は、水分含量約１２％以下のオフホワイトのケーキ又は粉末であり、約３から約６までのｐＨを有するリポソームの均一溶液に容易に再構成できるものである。
【００２０】
ノバントロン（登録商標）バイアルからなどのミトキサントロン溶液（１５ｍｇ）７．５ｍｌと正常生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）７．５ｍｌを、凍結乾燥脂質のバイアルに加えることによって、最終剤形を調製する。リポソーム混合物を室温で３０分間水和させ、室温で２分間激しくボルテックスする。浴型音波器で１０分間最大強度で音波処理しつつ、混合物を水和させる。この最終剤形は、再構成後８時間以内での使用のために、４５分かけて、シリンジ又は標準的注入セットに調合されうる。この方法を用いて、加えたミトキサントロンの約７０重量％以上が、リポソーム製剤に包埋されうる。より好ましくは、ミトキサントロンの約８０重量％以上が包埋される。より好ましくは、ミトキサントロンの約８５重量％以上がリポソームに包埋される。更により好ましくは、ミトキサントロンの約９０重量％以上又は約９５重量％以上でさえもリポソームに包埋される。
【００２１】
ミトキサントロン包埋の効率は、リポソーム製剤のアリコートを、水溶液中で一晩透析し、その後、メタノールにリポソームを溶解し、高圧逆相液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる標準的方法によってサンプルを分析することによって決定できる。あるいは、リポソームを、５０，０００×ｇで１時間遠心後、集めることができ、その後、ＨＰＬＣ分析のためにメタノールにそれを溶解することができる。一般的に、リポソーム中のミトキサントロンのカプセル化効率は、最初の投入用量の８０％超であろう。
【００２２】
より一般的には、リポソームミトキサントロンが得られる限り、リポソーム形成の任意の適切な方法が使用できる。従って、乾燥脂質フィルムの形成を含まない溶媒蒸発方法が使用できる。例えば、水・有機相中でエマルジョンを形成させ、有機溶媒を蒸発させることによって、リポソームは製造できる。本発明は、どのようにして製造されたミトキサントロンのリポソーム製剤でも包含することを意図している。
【００２３】
本発明は、非毒性、不活性な医薬として適切な賦形剤に加え、リポソームミトキサントロン製剤を含む医薬製剤、及びこれらの製剤の製造プロセスを含む。医薬として適切な賦形剤によって、固体、半固体、又は液体の希釈剤、充填剤、及び全ての種類の製剤補助剤が理解されるべきである。本発明はまた、投与単位の医薬製剤を含む。このことは、以下のことを意味する：製剤は、個々の部分の形態、例えば、バイアル、シリンジ、カプセル、ピル、座薬、又はアンプルの形態であり、それの、リポソームに包埋されたミトキサントロン含量は、個々の用量の分数又は倍量に相当する。投与量単位は、例えば、１、２、３又は４個々投与量、又は１／２、１／３、又は１／４個々投与量を含みうる。個々の用量は好ましくは、１回の投与で与えられ、１日投与量の全部、半分、又は１／３又は１／４に通常対応するミトキサントロン量を含む。
【００２４】
錠剤、糖衣錠、カプセル、ピル、顆粒、座薬、溶液、懸濁液及びエマルジョン、ペースト、軟膏、ゲル、クリーム、ローション、粉末及びスプレーは、適切な医薬製剤でありうる。座薬は、リポソームミトキサントロンに加え、適切な水溶性又は水不溶性賦形剤を含みうる。適切な賦形剤は、本発明のリポソームミトキサントロンが、治療用途を考慮して十分に安定なもの、例えば、ポリエチレングリコール、特定の脂肪、及びこれらの物質のエステル又は混合物である。軟膏、ペースト、クリーム及びゲルはまた、リポソームミトキサントロンが安定である適切な賦形剤を含みうる。
好ましくは、ミトキサントロン製剤は、全乾燥製剤の約０．１〜５０重量％、好ましくは、約０．５〜２５重量％の濃度で上記医薬製剤に存在すべきである。
上記医薬製剤は、公知の方法に基づき、例えば、リポソームミトキサントロンを一つ又は複数の賦形剤と混合することによって、通常様式で製造される。
【００２５】
活性化合物、及び活性化合物を含む医薬製剤は、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ又はネコなどの任意の哺乳動物で、疾患、特に癌などの細胞増殖によって引き起こされる疾患の予防、軽減及び／又は治療のためのヒト用及び獣医学用医薬で使用される。例えば、イヌのリンパ腫は、本ミトキサントロン製剤によって有効に治療できる。しかし、本製剤は、ヒト患者の治療での使用、特に癌や細胞増殖によって引き起こされる他の疾患のために、特に好適である。本発明の組成物は、ヒトの多発性硬化症、リンパ腫、並びに前立腺、肝臓、卵巣、乳、肺及び結腸の癌の治療で特に使用される。
【００２６】
活性化合物又はその医薬製剤は、局所、経口、非経口、腹腔内、及び／又は直腸に、好ましくは非経口で投与できるが、静脈内投与が好適である。
体重約７０ｋｇのヒトでは、例えば、ミトキサントロン約０．５〜１００ｍｇ／ｍ２が投与される。好ましくは、ミトキサントロン約５．０ｍｇ／ｍ２以上から５０ｍｇ／ｍ２まで、又はより好ましくは約１０ｍｇ／ｍ２以上から約４５ｍｇ／ｍ２までが投与される。更により好ましくは、ミトキサントロン約２０ｍｇ／ｍ２以上〜約４０ｍｇ／ｍ２、更により好ましくは、ミトキサントロン約２５ｍｇ／ｍ２以上〜約４０ｍｇ／ｍ２が投与できる。しかし、記載した投与量から逸脱することも必要でありえ、そして特に、治療すべき患者の性質や体重、疾患の性質や重篤度、製剤の性質、医薬の投与、投与する時間又は間隔、の関数としてそうすることが必要でありうる。従って、ある場合には、上記量未満の活性化合物で扱うことが十分でありえ、他の場合には、活性化合物の上記量を超えうる。適切な量は、経験的及びケースバイケース研究で決定されるように、過剰毒性を有しない治療有効量である。
【００２７】
本組成物の１つの利点は、それが、ミトキサントロン処置の対象となる癌細胞における多剤耐性を調節する方法を提供することである。特に、本リポソーム製剤は、ミトキサントロンによる化学療法を受けた癌細胞がそれへの耐性を発生させる傾向を減少させ、処理細胞が、例えば、カンプトテシン、タキソール、又はドキソルビシンなどの他の治療薬剤への耐性を発生させる傾向を減少させる。従って、他の薬剤は、ミトキサントロンと活性な組合せの形態又は別の投与のいずれかによって、本治療と共に有利に使用できる。
【００２８】
ミトキサントロン投与が、リポソーム製剤への包含によって減少しない哺乳動物腫瘍に対する薬理効力を産生することを実施例は示す。更に、リポソーム製剤として投与するとき、動物はミトキサントロンのより高投与量に耐えることができ、そして、従来のミトキサントロンを与えられた動物よりも、生存時間中央値又は腫瘍体積の減少によって測定されるように良好な結果を動物は有する。マウスとイヌでのより高い血漿濃度、及びマウスでの化合物のより長い消失半減期が示されている。ピーク血漿濃度は、同程度の投与量でマウスで約５０倍高く、イヌで９倍高かった。従来のミトキサントロンのマウス組織濃度は、従来のミトキサントロンと比較して、リポソームミトキサントロンの投与後、心臓、肺、及び腎臓でより低く、肝臓と脾臓でより高かった。従来のミトキサントロン単独と比較して、リポソームミトキサントロンのより高い投与量が投与されるまで、毒性は起こらなかったが、毒性プロフィールは同様であるようである。以前にミトキサントロン単独では観察されなかった毒性はリポソーム製剤で起こらなかった。動物では、リポソームミトキサントロンのより高投与量は、現行の従来の（非リポソーム）製剤での従来のミトキサントロンより、より良好に耐えられ、より有効である。
本発明を説明してきたが、ここで、例示の目的のためにのみ提供され、限定的であることを意図されない特定の実施例に言及する。
【００２９】
実施例１
本実施例は、リポソームミトキサントロンの１製剤を示す。ミトキサントロン（３μモル）を、クロロホルム中にカルジオリピン（３μモル）と共に溶解する。ヘキサンに溶解したホスファチジルコリン（１４μモル）及びクロロホルム中の１０μモルのコレステロールを、撹拌しながらミトキサントロン混合物に加える。約３０℃以下で溶媒を真空下蒸発させ、脂質と薬剤の薄い乾燥フィルムを形成させる。生理食塩水溶液２．５ｍｌを加え、成分を、ボルテックスによるように、激しく混合することによって、リポソームを形成する。次いで、フラスコをボルテックスして多層膜リポソームを提供しうるか、又は音波処理して、小さな単層膜リポソームを提供しうる。
【００３０】
実施例２
本実施例は、リポソームミトキサントロンの別の製剤の調製を示す。約６μＭミトキサントロン、６μＭカルジオリピン、２８μＭホスファチジルコリン及び２０μＭコレステロールの溶液を、適当な溶媒中に調製し、次いで蒸発させる。乾燥脂質／薬剤フィルムを、７％トレハロース−生理食塩水水溶液に分散する。混合物をボルテックスし、音波処理する。次いで、所望のように、リポソームを透析しうる。ＨＰＬＣでアッセイすると、ミトキサントロンカプセル化は、８０％以上である。
【００３１】
実施例３
本実施例は、リポソームミトキサントロンの別の製剤の調製を示す。容積２．５ｍｌ中、薬剤３μＭ、ジパルミトイルホスファチジルコリン１５μＭ、カルジオリピン１μＭ、コレステロール９μＭを使用することによって、ミトキサントロンをリポソームに包埋できる。薬剤と脂質の混合物を真空下蒸発でき、等容積の生理食塩水に再懸濁できる。リポソームを実施例１で記載したように調製する。このシステムでは、ミトキサントロンカプセル化効率は８０％超である。
【００３２】
実施例４
本実施例は、リポソームミトキサントロンの別の製剤の調製を示す。リポソームのこの調製では、２μＭミトキサントロン、２μＭホスファチジルセリン、１１μＭホスファチジルコリン、２μＭカルジオリピン、及び７μＭコレステロールを、溶液に溶解する。リポソームを実施例１のように調製する。ミトキサントロンカプセル化効率８０％超が期待できる。
【００３３】
実施例５
本実施例は、リポソームミトキサントロンの別の製剤を示す。３μモルのカルジオリピンを含むクロロホルムに、ミトキサントロン（３μモル）を溶解でき、混合物に複合体を形成させることができる。複合体形成を容易にするために、クロロホルム溶媒を蒸発除去する。ヘキサンに溶解したホスファチジルコリン（１４μモル）とクロロホルム中１０μモルのコレステロールを乾燥フィルムに加えることができる。混合物を穏やかに撹拌し、３０℃未満で溶媒を真空下蒸発させ、脂質と薬剤の薄い乾燥フィルムを形成させる。次いで、生理食塩水溶液２．５ｍｌを加え、ボルテックスによって成分を激しく混合することによって、リポソームを形成する。次いで、フラスコをボルテックスして、多層膜リポソームを提供でき、そして場合によっては、音波器で音波処理して、小さな単層膜リポソームを提供できる。
【００３４】
実施例６
本実施例は、リポソームミトキサントロンの別の製剤を示す。一般的に、本方法は、ミトキサントロン溶液を得る工程、予め形成したリポソームにミトキサントロン溶液を加える工程、リポソームミトキサントロンが形成するように混合物を平衡化させる工程を含む。ノバントロン（登録商標）の各バイアルは、２ｍｇ／ｍｌミトキサントロン遊離塩基に相当するミトキサントロン塩酸塩、塩化ナトリウム（０．８％ｗ／ｖ）、酢酸ナトリウム（０．００５％ｗ／ｖ）、酢酸（０．０４６％ｗ／ｖ）を含む。ノバントロン（登録商標）溶液は３．０〜４．５のｐＨを有し、１ｍｌ当たりナトリウム０．１４ｍＥｑを含む。
【００３５】
約３５〜４０℃まで温めたｔ−ブチルアルコール約１０ｋｇにＤ−α−トコフェロール酸スクシネート約２ｇを加えることによって、予め形成したリポソームを調製する。トコフェロールが溶解するまで、約５分間溶液を混合する。テトラミリストイルカルジオリピン約６０ｇを溶液に加え、溶液を約５分間混合する。コレステロール約１００ｇを溶液に加え、溶液を約５分超混合し、次いで、卵ホスファチジルコリン約３００ｇを加え、更に５分混合する。約３５〜４０℃の水２，０００ｇを含む第２の水溶液とトレハロース二水和物約１２０ｇを、混合物が清澄になるまで、脂質溶液中に混合する。０．２２ミクロンのポアサイズのＤｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）Ｍｉｌｌｉｐａｋ　２００フィルターを通し、混合物を滅菌濾過し、約１１ｇを滅菌バイアルに充填し、凍結乾燥する。このようにして調製したリポソームは、オフホワイトのケーキ又は粉末の形態で、容易に再構成される。凍結乾燥リポソームの水分含量は約１２％以下である。使用前、凍結乾燥製品を４℃に保存する。
【００３６】
リポソームミトキサントロンを調製するために、ノバントロン（登録商標）バイアルからの７．５ｍｌミトキサントロン溶液（１５ｍｇ）を、正常生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）７．５ｍｌと一緒に凍結乾燥脂質のバイアルに加える。バイアルを穏やかに旋回させ、室温で３０分間水和させ、２分間激しくボルテックスし、浴型音波器で最大強度で１０分間音波処理する。次いで、使用のために、投与量がバイアルから取り出されうる。製品は、４５分かけて、シリンジ又は標準的注入セットのいずれかに分注されうる。望ましくは、リポソームミトキサントロンは、使用まで室温で維持され、再構成８時間以内に使用される。
【００３７】
実施例７
本実施例は、リポソームミトキサントロンの別の製剤を示す。モル比１：１０：６．８でカルジオリピン：ホスファチジルコリン：コレステロールを含む凍結乾燥脂質組成物を調製した。ミトキサントロンと脂質とのモル比、水和時間、音波処理時間を変えながら、２９回試行を行った。正常生理食塩水に対し一晩製剤を透析し、各製剤中に保持されたミトキサントロンの量を測定した。
【００３８】
この研究は以下のことを示した：ミトキサントロンと脂質とのモル比１：１５（ミトキサントロン１ｍｇ当たり、１，１，２，２テトラミリストイルカルジオリピン２ｍｇ、ホスファチジルコリン１２ｍｇ、コレステロール約４ｍｇ）、水和２時間、音波処理１０分間によって、１ｍｇ／ｍｌミトキサントロン溶液に関し９４±３％リポソームミトキサントロン、２ｍｇ／ｍｌミトキサントロン溶液に関し９５±６％リポソームミトキサントロン、１．５ｍｇ／ｍｌミトキサントロン溶液に関し９７％ミトキサントロンの保持が生じた。３０分まで水和時間を減少させても、１ｍｇ／ｍｌミトキサントロン濃度では、製剤中に保持されたミトキサントロン量には有意に影響を及ぼさないようであった。特に記載が無い限り、以下の実施例では、１ｍｇ／ｍｌミトキサントロン製剤を、ミトキサントロンと脂質とのモル比１：１５、水和時間２時間、音波処理時間１０分で調製した。
【００３９】
実施例８
上記リポソーム製剤中のミトキサントロンは、同一濃度の非リポソーム（従来の）ミトキサントロンと比較して、より低い毒性を有し、リポソーム製剤で投与したミトキサントロン少なくとも１５ｍｇ／ｋｇは、マウスに毒性ではないことを以下の実施例は示す。２０〜２２ｇの体重の８０匹のオスＣＤ２Ｆ１マウスを、１週間馴化させ、１ケージ当たり５匹で、各１０匹の動物の８群に無作為に分けた。０日に、全ての群の動物に、薬剤又はビヒクルコントロールを尾静脈に静脈内注射した。投与した容量は、個々の動物体重に基づき変えた。注射後１日おきに、マウス体重を各マウスにつき記録し、臨床的疾患の観察を少なくとも毎日記録した。注射は表１に示すとおりであった。
【００４０】
【表１】
2004511510.tif 000002
【００４１】
最初の５日で、動物のいずれにも有害な臨床副作用は現れなかった。６〜１０日の間で、群１の動物全てが瀕死になった。このような動物の１匹は９日目に死亡し、残りの群１の動物は１０日目に殺した。群４、７、８から各々４匹の動物を意図的に殺し、血液学と臨床化学を研究した。主要器官をまた、緩衝化１０％ホルマリンに固定し、研究した。群１以外のどの群でも毒性の臨床兆候は出現しなかった。研究後、残りの全ての動物を殺し、血液学と臨床化学を研究し、主要器官を緩衝化１０％ホルマリンに固定し、研究した。
【００４２】
種々の群で見られた体重の比較は、群１、即ち従来のミトキサントロン（１５ｍｇ／ｋｇ投与量）を除いて、全ての群で臨床的に僅かの変化を示すか、又は明白な変化はなかった。群１の動物は、９／１０日目までに最大約３５％までの体重を徐々に失った。群２の動物は、最初に１０日目までに２０％の有意な体重喪失を示したが、研究の残りを通じて徐々に回復した。残りの群の全ては、研究を通じて着実に体重が増加した。
【００４３】
本実施例及び以下の実施例で、ビリルビン、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、ヘモグロビン、ヘマトクリット、白血球カウント、赤血球カウント、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、血小板、好中球、桿状核好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球について、血液を分析した。ＡＬＴの臨床的に有意な上昇が、群１のマウスの大部分と、群７のマウスの１匹で１０日目に注目された。同様のＡＳＴ上昇も観察された。群１の２匹のマウスがＢＵＮの僅かな上昇も示したが、クレアチニンはそうではなく、このことは、恐らく脱水又は血液濃縮によって引き起こされる腎前性の効果を示唆している。他の薬剤関連効果は、これらの研究では観察されなかった。
【００４４】
組織病理学は、従来のミトキサントロンとリポソームミトキサントロンで処置したマウスで、脾臓と骨髄の造血組織とリンパ系組織に対する化合物効果を示した。リポソームミトキサントロン処理動物で、全ての投与量レベルで６７日目に完全な回復が見られ、これはリポソームミトキサントロンは細胞毒性がより小さいことを示唆する。
【００４５】
結論として、コントロール、又は最大１５ｍｇ／ｋｇのミトキサントロンのリポソーム製剤のいずれを用いた研究でも、罹患率又は死亡率が見られなかった一方、従来のミトキサントロンＨＣｌの１５ｍｇ／ｋｇ投与量では１００％の罹患率が観察された。
【００４６】
実施例９
実施例７で記載したリポソーム製剤中のミトキサントロンは、従来のミトキサントロンＨＣｌの同一濃度と比較してより低い毒性を有し、ミトキサントロン３５ｍｇ／ｋｇまでは、明白な毒性無くしてリポソーム製剤でマウスに投与できることを以下の実施例は示す。２０〜２２ｇの体重の２０匹の雄性ＣＤ２Ｆ１マウスを、１週間馴化し、１ケージ当たり５匹で、各５匹の動物の４群に無作為に分けた。０日に、全ての群の動物に、薬剤又はビヒクルコントロールを尾静脈に静脈内注射した。投与した容量は、個々の動物体重に基づき変えた。注射後１日おきに、マウス体重を各マウスにつき記録し、臨床的疾患の観察を少なくとも毎日記録した。注射は表２に示すとおりであった。
【００４７】
【表２】
2004511510.tif 000003
【００４８】
最初の５日では、動物のいずれにも有害な臨床副作用は現れなかった。６〜７日目の間で群３の動物全てが瀕死になった。このような動物の１匹は６日目に死亡し、残りの群３の動物を７日目に殺した。他のどの群にも毒性の臨床兆候は現れなかった。研究後、残りの全ての動物を殺し、血液学と臨床化学を実施例８のように研究した。主要器官を緩衝化１０％ホルマリンに固定し、全ての死亡動物で研究した。
【００４９】
種々の群で見られた体重の比較は、従来のミトキサントロンの２５ｍｇ／ｋｇ投与量を受けた群３を除いて、全ての群で臨床的に僅かの変化を示すか、又は明白な変化はなかった。群３の動物は、７日目までに最大約３０％までの体重を徐々に失った。群１の動物は、最初に１０日目までに２０％の有意な体重減少を示したが、研究の残りを通じて徐々に回復した。残りの群の全ては、研究を通じて着実に体重が増加した。
【００５０】
結論として、ビヒクルコントロール、又はミトキサントロンのリポソーム製剤を用いた研究では、罹患率又は死亡率が見られなかった一方、従来のミトキサントロンの２５ｍｇ／ｋｇ投与量で１００％の罹患率が観察された。
【００５１】
実施例１０
実施例７で記載したリポソーム製剤中のミトキサントロンは、従来のミトキサントロンＨＣｌの同一濃度と比較してより低い毒性を有し、リポソーム製剤で投与したミトキサントロン少なくとも３５ｍｇ／ｋｇは、マウスに毒性がないことを以下の実施例は示す。２０〜２２ｇの体重の７０匹の雄性ＣＤ２Ｆ１マウスを、１週間馴化し、１ケージ当たり５匹で、各１０匹の動物の７群に無作為に分けた。０日に、全ての群の動物に、薬剤又はビヒクルコントロールを尾静脈に静脈内注射した。投与した容量は、個々の動物体重に基づき変えた。注射後１日おきに、マウス体重を各マウスにつき記録し、臨床的疾患の観察を少なくとも毎日記録した。注射は表３に示すとおりであった。
【００５２】
【表３】
2004511510.tif 000004
【００５３】
最初の２日で、動物のいずれにも有害な臨床副作用は現れなかった。３日目の間で群２の動物全てが瀕死になり、３匹を殺した。群１、３、４、５、６、７から各々３匹の動物をまた３日目に意図的に殺し、血液学と臨床化学を研究した。群２からの３匹の更なる動物は７日で瀕死の犠牲となり、群１、３、４、５、６、７から３匹の更なる動物をまた殺した。１０日目に残りの群２の動物が死亡した。毒性の他の臨床兆候は６０日目まで観察されなかった。群２以外のどの群でも、毒性の臨床兆候は明白ではなかった。研究後、残りの全ての動物を殺し、実施例８に記載したように、血液学と臨床化学試験を行った。主要器官を緩衝化１０％ホルマリンに固定し、全ての死亡動物で研究した。
【００５４】
種々の群で見られた体重の比較は、従来のミトキサントロンの２５ｍｇ／ｋｇ投与量を受けた群２を除いて、全ての群で臨床的に僅かの変化を示すか、又は明白な変化はなかった。群２の動物は、７日目までに最大約２７％までの体重を徐々に失った。群１及び群５の動物は、最初に有意な体重減少を示したが（それぞれ１３％、８％）、研究の残りを通じて徐々に回復した。残りの群の全ては、研究を通じて着実に体重が増加した。
【００５５】
２５ｍｇ／ｋｇ従来のミトキサントロンを投与した１匹のマウス（群２）及び３５ｍｇ／ｋｇリポソームミトキサントロンを投与した１匹のマウス（群５）は、ＡＬＴ活性で僅かな増加を有したが、３日目に、臨床化学データで、一貫した化合物効果は注目されなかった。白血球細胞に対する細胞毒性効果は、ミトキサントロンを投与した大部分のマウスで注目されたが、ブランクリポソーム投与マウスではそうではなかった。
【００５６】
ＡＳＴとＡＬＴ活性は、より広く変動し、より高レベルに上昇する傾向がある（いくらかの動物でのいくらかの肝障害と一致している）が、７日目では臨床化学データは結論に達しなかった。６７日目、マウスは、ブランクリポソームで処置したマウス（群６）の幾匹かが示したのと同様の非一貫性の増加を示した。
【００５７】
結論として、コントロール、又はミトキサントロンのリポソーム製剤のいずれによる研究でも、罹患率又は死亡率は見られなかった一方、従来のミトキサントロンの２５ｍｇ／ｋｇを受けた群２の動物では１００％の罹患率が観察された。
【００５８】
実施例１１
実施例７で調製したミトキサントロンの多回投与は、従来のミトキサントロンＨＣｌの同一の濃度と比較して、リポソーム製剤が与えられるとき、より良好に耐えられ、５連続日で繰返し投与されたリポソームミトキサントロン少なくとも１０ｍｇ／ｋｇは、マウスに毒性ではないことを以下の実施例は示す。２０〜２２ｇの体重の４０匹の雄性ＣＤ２Ｆ１マウスを、１週間馴化し、１ケージ当たり５匹で、各５匹の動物の８群に無作為に分けた。０日に、全ての群の動物に、薬剤又はビヒクルコントロールを尾静脈に静脈内注射し、その後１日１回５日間注射した。投与した容量は、個々の動物体重に基づき変えた。注射後１日おきに、マウス体重を各マウスにつき記録し、臨床的疾患の観察を少なくとも毎日記録した。注射は表４に示すとおりであった。
【００５９】
【表４】
2004511510.tif 000005
【００６０】
最初の５日で、マウスのいずれにも有害な臨床作用は観察されなかった。６日目に、群１、２、３、６の動物は、毛の逆立ちを示し、背を弓なりに曲げる動作を示した。群２と群３の２匹の動物は瀕死の犠牲となった。残りの群の各々から２匹の動物を分析のために殺した。７日目に、合計して群２から３匹の動物と群３から２匹の動物が瀕死の犠牲となり、群３からの更なる１匹が死亡したと分かり、群６、７、８から１匹の動物を血液学的及び臨床化学的分析のために殺した。６０日目まで残りの動物のいずれでも観察される臨床毒性の兆候は無かった。６０日目で全ての動物を殺した。実施例８で記載したように、血液学的及び臨床化学的試験のために、血液サンプルを集め、主要器官を緩衝化１０％ホルマリンに固定した。
【００６１】
種々の群における動物質量の比較は、群２（５ｍｇ／ｋｇ従来のミトキサントロン）と群３（７．５ｍｇ／ｋｇ従来のミトキサントロン）を除いて、僅か、温和又は非明白であると判断された。これらの動物は、７日目までに約２５％の進行的体重減少を示した。群１（２．５ｍｇ／ｋｇ従来のミトキサントロン）と群６（７．５ｍｇ／ｋｇリポソームミトキサントロン）の動物は最初にその質量の約２８％を失ったが、研究の終わりまで徐々に回復した。他の処理群は、研究中質量変化を示さなかった。
【００６２】
７日目に、群６、７、８から殺したマウスは各々僅かなＡＳＴ上昇を示した。群８からのマウスはまた、増大したアルカリホスファターゼ活性を有し、群６と群７からのマウスは、減少したクレアチニンとアルカリホスファターゼを有した。群２、３、６からの瀕死の犠牲マウスは、好中球とリンパ球のカウントの減少、及び血小板カウントの僅かな減少を有する、顕著な、臨床的に有意の、化合物関連白血球減少症を示した。群１、４、６、７からのマウスは、６４日目に分析され、アルカリホスファターゼとＡＳＴの僅かな上昇を示したが、他の点では正常であった。
【００６３】
処理群全てで、脾臓と骨髄の造血とリンパ系の枯渇、及び腸の絨毛及び／又は陰窩萎縮を組織病理学的検査は示した。リポソームミトキサントロンは、従来のミトキサントロンよりも脾臓に関し細胞毒性が少なく、腸上皮細胞に関しずっと細胞毒性が少ないように思われた。５又は７．５ｍｇ／ｋｇで従来のミトキサントロンを投与した幾匹かのマウスの肝臓でいくらかの肝細胞空胞変性が見られた。対照的に、最小の肝細胞空胞変性が、５ｍｇ／ｋｇリポソームミトキサントロンを与えた１匹のマウスで見られ、７．５ｍｇ／ｋｇリポソームミトキサントロンを与えたマウスでは見られなかった。従来のミトキサントロンとリポソームミトキサントロン投与の両方が、多くのマウスで長軸の骨成長を害するのに十分な骨芽細胞と破骨細胞の枯渇を導いた。従来のミトキサントロンを与えられた全ての生存マウスと２．５ｍｇ／ｋｇでリポソームミトキサントロンを与えられたマウスで、６４日目までに全ての影響の有意な回復が観察された。７．５ｍｇ／ｋｇリポソームミトキサントロンのマウスは、６４日目で造血組織とリンパ系組織で最小の組織学的影響を依然有していた。
【００６４】
リポソームミトキサントロンは、ミトキサントロンの大きく増大した組織濃度を示す組織分布の知見にかかわらず、従来のミトキサントロンよりも、脾臓に関しては細胞毒性が僅かに小さく、腸上皮細胞では細胞毒性がずっと小さいようであった。５又は７．５ｍｇ／ｋｇで従来のミトキサントロンを投与した幾匹かのマウスの肝臓でいくらかの肝細胞空胞変性が見られた。最小の肝細胞空胞変性が、５ｍｇ／ｋｇリポソームミトキサントロンの１匹のマウスだけで見られ、７．５ｍｇ／ｋｇのマウスでは見られなかった。
【００６５】
要約すると、リポソームミトキサントロンを受けたどの群でも、又は２．５ｍｇ／ｋｇの従来のミトキサントロンを受けた群でも、罹患率又は死亡率は見られなかった。対照的に、群２（５ｍｇ／ｋｇ従来のミトキサントロン）と群３（７．５ｍｇ／ｋｇ従来のミトキサントロン）の動物は全て死亡した。
【００６６】
実施例１２
実施例７で記載したリポソーム製剤中のミトキサントロンは、従来のミトキサントロンＨＣｌの同一濃度と比較してより低い毒性を有し、リポソーム製剤で投与したミトキサントロン少なくとも３５ｍｇ／ｋｇは、マウスに毒性がないことを以下の実施例は示す。２０〜２２ｇの体重の３０匹の雄性ＣＤ２Ｆ１マウスを、１週間馴化し、１ケージ当たり５匹で、各５匹の動物の６群に無作為に分けた。０日に、全ての群の動物に、薬剤又はビヒクルコントロールを尾静脈に静脈内注射し、その後１日１回５日間注射した。投与した容量は、個々の動物体重に基づき変えた。注射後１日おきに、マウス体重を各マウスにつき測定し、臨床的疾患の観察を少なくとも毎日記録した。注射は表５に示すとおりであった。
【００６７】
【表５】
2004511510.tif 000006
【００６８】
最初の５日で、マウスのいずれにも有害な臨床作用は観察されなかった。群１、２、５の動物は、毛の逆立ちを示し、背を弓なりに曲げる動作を示した。８日目に、群２と群５の３匹の動物は瀕死の犠牲となり、群５からの１匹の動物は死亡した。８日目に、群６からの３匹の動物を、血液学と臨床化学のために殺した。１０日目に、群２からの１匹の動物が瀕死の犠牲となり、１匹の動物が死亡した。１０日目に群５からの１匹の動物が瀕死の犠牲となった。群１の３匹の動物が１２日までに死亡した。群４の１匹の動物は、１８日目に死亡した。６０日目まで残りの動物のいずれでも、観察される臨床毒性の兆候は無かった。６０日目に全ての動物を殺した。実施例８で記載したように、血液学的及び臨床化学的試験のために、血液サンプルを集め、主要器官を緩衝化１０％ホルマリンに固定した。
【００６９】
種々の群における動物体重の変動は、群２（５ｍｇ／ｋｇ従来のミトキサントロン）と群５（１０ｍｇ／ｋｇリポソームミトキサントロン）を除いて、僅か、温和又は非明白であった。これらの動物は、９日目までに、それぞれ約３５％、約２５％の進行的体重減少を示した。１３日目までに、群１（２．５ｍｇ／ｋｇ従来のミトキサントロン）、群３（５ｍｇ／ｋｇリポソームミトキサントロン）、群４（７．５ｍｇ／ｋｇリポソームミトキサントロン）の動物は、最初に、それぞれその体重の約３０％、７％、３０％を失った。その体重は、研究中徐々に回復した。他の処置群は、研究中質量変化を示さなかった。
【００７０】
ビヒクルコントロール群、又はリポソームミトキサントロン最大５ｍｇ／ｋｇまで（５連続日で１回）を受けた群では、罹患率又は死亡率は見られなかった。従来のミトキサントロン２．５ｍｇ／ｋｇで処置した動物で、罹患率６０％が観察された。リポソームミトキサントロン７．５ｍｇ／ｋｇで処置した動物で、罹患率２０％が観察された。リポソームミトキサントロン１０ｍｇ／ｋｇ又は従来のミトキサントロン５ｍｇ／ｋｇによる処置は、試験したマウス１００％に対し致死的であった。
【００７１】
群２（５ｍｇ／ｋｇ従来のミトキサントロン）と群５（１０ｍｇ／ｋｇリポソームミトキサントロン）からの瀕死の犠牲となった動物は、ＡＳＴとＡＬＴで顕著な上昇を示した。更に、試験した群２のマウスの４匹のうち３匹、及び群５のマウスの４匹のうち１匹のビリルビン濃度は、コントロールマウスより高かった。瀕死の動物は、好中球とリンパ球の減少を有する顕著な白血球減少症を示した。血小板カウントの僅かな変動性減少も観察された。赤血球カウントの最小の増加も観察された。他のパラメータは、有意に影響を受けなかった。７０日目で殺したマウスは、正常の臨床化学を示したが、低い白血球カウントを有した。これらのマウスではリンパ球と好中球は少なかった。他のパラメータは正常であった。
【００７２】
実施例８の単回投与実験では、リポソームミトキサントロンではなく、従来のミトキサントロン１５ｍｇ／ｋｇ投与量は、急性肝障害を意味するＡＬＴの有意な上昇を誘導したが、実施例１０のより高い投与量ではそうではなかった。多回投与データを考慮すれば、従来のミトキサントロンは、重大な肝障害を引き起こす可能性を有することは明白である。最終屠殺からのデータは、有意な回復は起こる（毒性も細胞毒性の証拠も殆ど無いが）ことを示唆する。
より高い投与量群からのマウスは、好中球とリンパ球の明瞭な減少と、血小板の僅かの減少を伴う、白血球と血小板に対する細胞毒性効果を示した。より低い投与量群では、効果はずっと顕著でなかった。５ｍｇ／ｋｇ／日の従来のミトキサントロンと１０ｍｇ／ｋｇ／日のリポソームミトキサントロンは、８日目までにＡＬＴ、ＡＳＴ、ビリルビンの増大による証拠のように、大雑把に言って等価の急性肝障害を引き起こしたことをデータは示す。
【００７３】
要約すると、１０ｍｇ／ｋｇ／日で投与したリポソームミトキサントロンは、５ｍｇ／ｋｇ／日で投与されたときの従来のミトキサントロンと毒性が同等以下であり、毒性及び細胞毒性効果からの有意な回復が明白であったことを、これらの研究からの臨床病理データは示す。リポソームミトキサントロンは、従来のミトキサントロンで安全であると考えられる２倍超である量を安全に投与できることをデータは示す。
【００７４】
実施例１３
実施例７に記載したリポソームミトキサントロン製剤は、従来の製剤で投与したミトキサントロンよりも、哺乳動物血液中で、より高い血漿濃度に達し、より長い半減期を有し、より遅いクリアランス速度を有することを以下の実施例は示す。５ｍｇ／ｋｇで従来のミトキサントロン製剤とリポソームミトキサントロン製剤の単回静脈内投与後、雄性ＣＤ２Ｆ１で薬物動態学的評価を行った。投与後、５分、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間で４匹のマウスの群を殺し、血液と器官を集め、ミトキサントロン含量を分析した。
【００７５】
逆相ＨＰＬＣで、血漿及び組織サンプルをミトキサントロンにつき分析した。血漿サンプル（０．２５ｍｌ）を、０．０１ｍｇ／ｍｌヘキサンスルホン酸、０．５ｍｇ／ｍｌアスコルビン酸、内部標準として０．２５μｇアメタントロンの溶液０．５ｍｌと混合した。３０秒間ボルテックス後、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．５）０．５ｍｌと１Ｍ水酸化ナトリウム１５０μｌを加え、溶液を３０秒間再度ボルテックスした。サンプルを、水平振盪器上１時間、ジクロロメタン１０ｍｌで抽出し、３，０００ｒｐｍで１５分間遠心した。有機層（９ｍｌ）を分離し、窒素下蒸発させた。ＨＰＬＣ分析前に、移動相１０μｌでサンプルを再構成した。組織サンプルを、ｐＨ３．０の０．１Ｍクエン酸緩衝液中２０％アスコルビン酸を含む１ｍｌ溶液でホモジナイズし、上記のようにして抽出した。流速１ｍｌ／分で送られる３３％アセトニトリル、６７％０．１６Ｍギ酸アンモニウム緩衝液の移動相を用いる逆相クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ　μＢｏｎｄａｐａｋ（登録商標）Ｃ−１８）によって、ミトキサントロンを分離した。ミトキサントロンは６００ｎｍで検出した。感度限界は１０ｎｇ／ｍｌであった。
【００７６】
標準的方法で、血漿薬物動力学的パラメータを評価した。血漿濃度−時間曲線の線形回帰分析から、除去速度定数（Ｋ）を計算した。終末相の無限への外挿（Ｃｌａｓｔ／Ｋ）を有する線形台形方法を用いて、曲線下面積（
【００７７】
【外１】
2004511510.tif 000007
【００７８】
）を計算した（但し、Ｃｌａｓｔは最後の測定濃度である）。計算した他のパラメータは、投与量／ＡＵＣとして総全身クリアランス（Ｃｌ）；分布容積（Ｖａｒｅａ）＝Ｃｌ／Ｋ；消失半減期（ｔ１／２）＝０．６９３／Ｋａｒｅａである。
【００７９】
要約すると、静脈内投与後、リポソームミトキサントロンは、従来のミトキサントロンと比べて、有意に高いピーク血漿濃度（５０倍）を産生した。血漿濃度の減少は、従来の製剤とリポソーム製剤に関し、それぞれ６．６分と１時間の消失半減期を有する１次キネティックスに従った。ＡＵＣ値及び最終消失半減期。従来のミトキサントロン後のＣｍａｘ，ＡＵＣ及びｔ１／２値は、それぞれ、０．４１μｇ／ｍｌ，０．１４μｇ・時間／ｍｌ及び０．１１時間であり、リポソームミトキサントロン投与後のこれらの同じパラメータに関し、これらの値は約２１μｇ／ｍｌ，２８μｇ・時間／ｍｌ，及び１時間であった。これらの増加は、化合物のクリアランスと分布容積の両方の減少によって説明できよう。計算された全ミトキサントロンクリアランスは、従来のミトキサントロン（６００ｍｌ／分／ｋｇ）と比較してリポソームミトキサントロン（３ｍｌ／分／ｋｇ）では実質的に減少した。計算した分布容積はまた、従来のミトキサントロン（５．５ｌ／ｋｇ）に対しリポソームミトキサントロン（０．３ｌ／ｋｇ）では、顕著に減少した。
【００８０】
肺と腎臓においてそれぞれ約２０μｇ／ｇと４０μｇ／ｇの従来のミトキサントロン組織濃度を用いて、及びリポソームミトキサントロン投与後これらの同じ組織で１３μｇ／ｇと１６μｇ／ｇの組織濃度を用いて、肺と腎臓に関し、組織からのクリアランスの同様のパターンが観察された。肝臓で、従来のミトキサントロン投与後、ミトキサントロン濃度は、約１９μｇ／ｇから２μｇ／ｇへと徐々に減少し、一方、リポソームミトキサントロンの投与後４時間で、肝臓濃度は、約２５μｇ／ｇから３７μｇ／ｇへと増加し、次いで、４８時間で３０μｇ／ｇへと非常に徐々に下がった。投与後５分で、従来のミトキサントロン（１１μｇ／ｇ組織）に対し、リポソーム製剤で（５．６μｇ／ｇ組織）、ミトキサントロンのより低いピーク濃度が心臓にて検出された。差異は、投与後４８時間まで、少なくとも２倍のままであった。
【００８１】
試験した全ての時点で、リポソームミトキサントロン処置マウスよりも、従来のミトキサントロン処置マウスに関し、従来のミトキサントロンの心臓、肺、腎臓濃度は高かった。試験した全ての時点で、脾臓及び肝臓濃度は、従来のミトキサントロン処置動物よりもリポソームミトキサントロン処置マウスにおいて高く、このことは、リポソーム製剤は、化合物の分布をシフトすることを示している。従来のミトキサントロン投与では、化合物投与後５分と１５分で約１０μｇ／ｇの心臓組織濃度に至り、２４時間と４８時間で、濃度は５〜６μｇ／ｇへと徐々に減少した。リポソームミトキサントロン投与後、心臓ミトキサントロン濃度は、５分で約６μｇ／ｇであり、２４〜４８時間で約２μｇ／ｇへ徐々に減少した。これらのデータは、リポソームミトキサントロンに関し心臓毒性減少の可能性を示唆する。
【００８２】
実施例１４
本実施例は、ヒト白血病細胞に対する、実施例７で製造したリポソームミトキサントロンの効力を示し、従来のミトキサントロン製剤と比較してリポソーム製剤の効力の増加を示す。３回の連続的伝播（腹腔内）によって、ＣＤ２Ｆ１マウスの腹膜で、マウス白血病細胞であるＬ１２１０白血病細胞を増殖させた。最後の接種の８日以内に生じた腹水を、以下の実験で用いた。Ｌ１２１０腹水白血病に対するミトキサントロンのリポソーム製剤と従来の製剤の細胞増殖抑制活性を測定した。動物群の体重を１週間に３回測定し、臨床的瀕死の動物を人道的に殺した。生存マウスを６０日間毎日観察した。薬剤の単回又は多回投与による静脈内注射処置後の群生存時間は、リポソームミトキサントロンと従来のミトキサントロンの相対的抗腫瘍力価の指標であった。
【００８３】
雌性ＣＤ２Ｆ１マウスを、１０匹の動物の８つの群に分け、１０，０００個のＬ１２１０細胞を静脈内注射で接種した。２４時間後、薬剤を投与した。投与量５ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇで、従来のミトキサントロンを投与した。リポソームミトキサントロンは、５、１０、２０、又は３５ｍｇ／ｋｇの投与量で、単回注射として静脈内投与し、各群の生存時間中央値を測定した。実験６０日で、生存動物を殺した。３５ｍｇ／ｋｇ投与量と等価なブランクリポソームと正常生理食塩水もコントロールとして投与した。
【００８４】
未処置動物の生存時間中央値は７日であった。５ｍｇ／ｋｇの従来のミトキサントロンとリポソームミトキサントロンで処置した動物は、それぞれ１２日、１３日の生存中央値を有した。１０ｍｇ／ｋｇ従来のミトキサントロンを与えた動物の生存時間中央値は、２０日であり、２／１０の動物が６０日目に生きていた。１０ｍｇ／ｋｇリポソームミトキサントロンで処置した動物の生存時間中央値は２７日で、４／１０のマウスが６０日目まで生存した。２０ｍｇ／ｋｇでのリポソームミトキサントロンで処理した全ての動物は６０日目まで生存した。試験したリポソームミトキサントロンの最高投与量３５ｍｇ／ｋｇで、９／１０の動物が６０日目まで生存し、１匹の動物は、恐らく化合物毒性のために、１８日目に死んだのが見出された。
【００８５】
これらの単回投与研究は、リポソームミトキサントロンは、従来のミトキサントロンより高投与量で投与でき、臨床結果が改善されることを示唆している。白血病のマウスモデルで、リポソームミトキサントロンは、同等の投与量で、従来のミトキサントロンと比べて、動物生存中央値を改良し、同じ及びより高い投与量の両方で化合物関連死亡率を減少させた。これらの結果は、以下を示唆する：毒性の危険性の増大無く、リポソームミトキサントロン製剤でのミトキサントロンのより高い投与量を投与することが可能でありうる。マウスは、２０ｍｇ／ｋｇ（６０ｍｇ／ｍ２）までのリポソームミトキサントロン投与量に耐え、リポソームミトキサントロン投与量３５ｍｇ／ｋｇ（１０５ｍｇ／ｍ２）まで、有意な毒性を示さなかった。
【００８６】
実施例１５
多回投与で投与したときの実施例７で調製したリポソームミトキサントロンの効力を、本実施例は示す。４０匹の雌性ＣＤ２Ｆ１マウスを、１０匹の動物の４つの群に分け、実施例１４に記載のように、Ｌ１２１０細胞を接種した。接種後２４時間から始め、４日間２４時間毎に、２．５ｍｇ／ｋｇ従来のミトキサントロン又は２．５若しくは５ｍｇ／ｋｇリポソームミトキサントロンでマウスを処置した。
【００８７】
２．５ｍｇ／ｋｇの従来のミトキサントロンとリポソームミトキサントロンで処置したマウスの生存時間中央値は、それぞれ１３日と１４日であった。この生存時間は、実施例１４の単回投与研究で同一濃度で記載されたものと同様であった。これらの処置群で、この投与量レベルで６０日目まで生存した動物はいなかった。５ｍｇ／ｋｇのリポソームミトキサントロンで処置したマウスは、３７日の生存時間中央値を有し、４／１０の動物は６０日目まで生存した。これらのデータは、多回投与で薬剤を投与したとき、従来のミトキサントロンに対するリポソームミトキサントロンの臨床的利益の可能性を示唆する。
【００８８】
実施例１６
本実施例は以下を示す：異種移植ヒト前立腺癌細胞担持マウスで、従来のミトキサントロン処置動物と比べて、実施例７のようなリポソームミトキサントロンの単回投与後、生存を増大し、リポソームミトキサントロンの多回投与後、平均腫瘍容積は減少した。雄性Ｂａｌｂ／ｃ，ｎｕ／ｎｕ，６〜８週齢マウスに５×１０６個のヒトホルモン不応性前立腺腫瘍細胞（ＰＣ−３）を接種した。腫瘍容積が６０〜１００ｍｍ２の範囲になるまで、腫瘍増殖を１週間に２度モニタリングした。次いで、動物を群に分け、４日間１日おきに１回、０．６２５、１．２５、２．５、５ｍｇ／ｋｇの投与量で、従来のミトキサントロンを尾静脈を通し静脈内注射で処置した。リポソームに製剤化したミトキサントロンの投与量は、２．５、５、７．５、１０ｍｇ／ｋｇであった。コントロール動物は、正常生理食塩水又はブランクリポソームを受けた。生存時間中央値を計算し、生存動物全てを３４日目に殺した。
【００８９】
０．６２５、１．２５ｍｇ／ｋｇの従来のミトキサントロンで処置した動物は、３４日目までに１００％の生存を示したが、２．５及び５ｍｇ／ｋｇで処置した動物はどれも生存しなかった。リポソームミトキサントロンの生存率は、２．５ｍｇ／ｋｇ投与量で１００％、５ｍｇ／ｋｇ投与量で９１％、７．５ｍｇ／ｋｇ投与量で４３％、１０ｍｇ／ｋｇ投与量で０％であった。
０．６２５と１．２５ｍｇ／ｋｇ投与量の従来のミトキサントロン、２．５と５ｍｇ／ｋｇのリポソームミトキサントロンによる処理は、同一投与レジメンに従って、実験を繰り返した。これらの実験では、三主軸を測定することによって、１週に１度又は２度腫瘍容積を測定した。
【００９０】
両方の投与量のリポソームミトキサントロンによる処置は、コントロール群及び従来のミトキサントロン処置と比べて、腫瘍容積の有意な減少を引き起こした。腫瘍増殖の有意な遅延は、ＰＣ−３異種移植に関し注目された。従来のミトキサントロンのより高投与量での重大な毒性は、その臨床的有用性を制限していた。リポソームミトキサントロンは、従来のミトキサントロンと比べて、より安全な、より有効な抗腫瘍剤であるようである。
【００９１】
実施例１７
本実施例は、リポソームミトキサントロン製剤は、イヌへの投与後、従来のミトキサントロンよりも、血漿でより高濃度、より遅いクリアランスを有することを示す。０．１３若しくは０．２６ｍｇ／ｋｇで従来のミトキサントロンを静脈注射するか、又は０．２６、０．５８、若しくは０．８７ｍｇ／ｋｇでリポソームミトキサントロンを静脈注射した、イヌ（３／性／群）からの血漿サンプルを、内部標準としてアメタントロンを用いる逆相ＨＰＬＣによって、ミトキサントロンレベルにつき分析した。分析時点は、単回投与後、０、５、３０分、１、２、４、８、２４時間であった。
【００９２】
従来のミトキサントロンを受ける動物の血漿濃度は、低投与量で５分時点で、高投与量で３０分時点で測定できなかった。０．２５８ｍｇ／ｋｇを受けた１匹のオスは、１時間時点で測定可能であった。対照的に、リポソームミトキサントロンを受けた動物の大部分は、低投与量では２時間までの、中及び高投与量では４時間までのミトキサントロン血漿濃度を有した。
Ｃｍａｘ及びＡＵＣ値の両方に反映されるように、リポソームミトキサントロンを投与したときと比べて、従来のミトキサントロンを投与したとき、ミトキサントロンの濃度はかなり低かった（表６）。更に、リポソームミトキサントロンと比べて、従来のミトキサントロンでは、クリアランスは高かった。Ｃｍａｘ及びＡＵＣ値の両方は、リポソームミトキサントロン投与量の増大と共に増大し、一方、クリアランス、分布容積及び消失半減期は、投与量に対し一定であった。性間でこれらのパラメータの差異は無かった。結果を下記の表６に要約する。表６は各パラメータの平均を記載する。表に示す他のパラメータは、ミトキサントロン半減期（ｔ１／２）、分布容積（Ｖ）、クリアランス速度（Ｃｌ）を含む。
【００９３】
【表６】
2004511510.tif 000008
【００９４】
本実施例は以下を示す：イヌにおいて、従来のミトキサントロンの同一投与量と比べて、リポソームミトキサントロンの投与は、ピーク血漿ミトキサントロン濃度で約９倍増加を生じた。リポソーム製剤はまた、ＡＵＣ値増加及びクリアランス速度減少を示した。Ｃｍａｘ及びＡＵＣ値の両方は、投与量増加と共に直線的に増加した。Ｃｍａｘ値は、０．２６、０．５８、０．８７ｍｇ／ｋｇ（５、１２、１７ｍｇ／ｍ２）で約０．５、１．７、２．４μｇ／ｍｌであった。
【００９５】
実施例１８
本実施例は以下を示す：薬剤がリポソームに製剤化されるとき、ミトキサントロンの従来の製剤と比べて、イヌは、より高投与量のミトキサントロンに耐えることができる。１、２３、４３、６５日目に、０（生理食塩水）、０．１２９、又は０．２５８ｍｇ／ｋｇ（２．６又は５ｍｇ／ｍ２）の静脈内投与量で、従来のミトキサントロンをビーグル犬（３／性／群）に投与した。これらの同一日に、０（ブランクリポソーム）、０．２５８、０．５８０、又は０．８６９ｍｇ／ｋｇ（５、１２、又は１７ｍｇ／ｍ２）のリポソームミトキサントロンをビーグル犬（３／性／群）は受けた。化合物関連効果の評価は、臨床観察、体重、食物消費、眼科的及びＥＣＧ検査、臨床病理、血漿薬剤濃度、器官重量、並びに全体的及び顕微鏡的解剖検査に基づいた。
【００９６】
リポソームミトキサントロンの１回投与量の投与後、０．８６９ｍｇ／ｋｇリポソームミトキサントロン群の１匹のオスイヌは、病変、並びに左肢の膨潤、自発運動低下、血色の悪さ、脱水、及び下痢のため、１２日目に殺した。
１匹のブランクリポソームミトキサントロン処置メスイヌは脱毛症を有し、２匹目は、研究の最初の２９日を通し過剰の唾液分泌を有した。０．８６９リポソームミトキサントロン群からの１匹のメスイヌは、３１、３２、３６、５２日目に左側を跛行していたが、その時、そのイヌは、左後肢に腫れ物又は潰瘍と共にその肢の炎症及び膨潤を示した。
【００９７】
体重減少した０．２５８従来のミトキサントロン群のオスを除いて、研究中、動物体重はいずれも影響されなかった。どの群でも食物消費に変化は無かった。
どの検査時点でもＥＣＧパラメータの変化は無かった。
０．１２９及び０．２５８従来のミトキサントロンを投与された動物は、各投与サイクル後４〜１０日で、白血球減少症と血小板減少症を有し、重篤度は投与量に連関した。３週投与サイクルの後半の間、白血球カウントは、正常値にリバウンドする傾向があった。差異的白血球データは、各投与後１０日目に最も重篤である好中球カウントの投与量連関減少を示した。投与量連関リンパ球減少症はまた、各投与サイクルで起こり、各連続的投与で悪化するようであった。貧血は、従来のミトキサントロン動物で起こらなかったが、網状赤血球カウントの減少を証拠とする赤血球毒性の証拠が観察された。網状赤血球カウントは、１０、３２、４６日目に、正常、又は正常値より僅かに高くへ急速にリバウンドした。
【００９８】
リポソームミトキサントロンを与えた動物は、従来のミトキサントロン処置動物で観察されたものと同様の血液学パラメータの変化を有した。研究中殺した動物（０．８６９ｍｇ／ｋｇリポソームミトキサントロン）は、白血球減少症、血小板減少症、及び貧血を有したのは例外である。オスとメスのイヌ両方での網状赤血球カウントの減少とともに、メスイヌで僅かの貧血が見られた。網状赤血球カウントのリバウンドは、オスイヌほど、メスでは速くなかった。
どの投与群の動物でも、凝血又は臨床化学的パラメータの変化は観察されなかった。
【００９９】
検死で、リポソームミトキサントロン０．８６９ｍｇ／ｋｇ群の１匹のオスは、液体充満の胸膜腔と肥厚心臓及び消化管障害を有した。これらの知見は化合物に連関するようである。この投与量で、１匹の動物は、種々のリンパ節の脱色を有した。リポソームミトキサントロン０．５８０と０．８６９群の合計３匹の動物は、注射部位に青色着色を有した。他の知見は、化合物投与のためではなかった。
【０１００】
要約すると、リポソームを単独投与した６匹のイヌのうち１匹、及びリポソームミトキサントロンを投与した１８匹の動物のうち１匹は、跛行を伴う肢の腫れ物を有したが、それは、リポソームそれ自体の投与によるらしい。薬剤がリポソームに製剤化されるとき、イヌはより高投与量のミトキサントロンに耐えることができることを、本研究は示す。
【０１０１】
実施例１９
本実施例は、癌を有する患者へのリポソームミトキサントロンの投与方法、及びリポソームミトキサントロン製剤の安全かつ有効な量の決定方法を示す。組織学的に実証された固形腫瘍を有する患者を治療のために選択する。本研究で、最大耐性投与量（ＭＴＤ）、投与量を限定する毒性、及び静脈内投与後ミトキサントロンの血液の薬物動態学を測定できる。リポソームミトキサントロンの抗腫瘍効果も観察された。疾患進行、又は初期処置終了を要求する毒性の発現が観察されるまで、３週間毎に、リポソームミトキサントロンの静脈内投与で、患者を処置する。処置の安全性及び耐性も測定される。薬物動態学的パラメータは、治療の最初の過程で評価される。心臓状態は、１過程おきに評価する。疾患状態は、適当な手段によって１過程おき後に評価する。６つの投与量レベルを評価する。
市販のノバントロン（登録商標）を本研究で用いる。ミトキサントロンのリポソーム製剤は、実施例７に記載のように調製した。リポソームミトキサントロンを、表７に下記する投与量で、４５分かけて静脈内投与する。
【０１０２】
【表７】
2004511510.tif 000009
【０１０３】
各投与量レベルで３人の患者を研究する。疾患の進行又は非許容毒性の非存在下、３週毎に、薬剤投与を繰り返す。
ＮＣＩ／ＣＴＣ基準に従い、有害事象を格付けする。投与量限定毒性（ＤＬＴ）は、悪心／嘔吐若しくは脱毛症以外の、過感受性反応を含むグレード３若しくは４の非血液学的毒性として、又は好中球減少症以外のグレード４血液学的毒性として、又は３日超続くグレード４好中球減少症として、又は３８．５℃超の温度を有するグレード３若しくは４好中球減少症として定義される発熱性好中球減少症として、又はグレード４嘔吐として、又はグレード４肝トランスアミナーゼ（ＡＳＴ又はＡＬＴ）上昇として、又はＭＵＧＡスキャン後ＬＶＥＦのグレード２（又はそれ以上）減少として定義される、非許容毒性の第１過程の治療内（即ち、２１日）の出現として定義される。
【０１０４】
最大耐性投与量（ＭＴＤ）は、そのレベルで治療した６人の患者のうち１人だけでＤＬＴを引き起こす最高投与量レベルとして定義される。所定の投与量レベルで治療される最初の３人の患者のだれも、投与量限定毒性（ＤＬＴ）を発症しなければ、投与量上昇を続ける。最初の３人の治療患者の１人がＤＬＴを発症するならば、３人の更なる患者が同一投与量レベルに入れる。３人の更なる患者のだれもＤＬＴを発症しないならば、投与量上昇を続ける。ある投与量レベルで治療される更なる３人の患者の１人以上がＤＬＴを発症すれば、投与量上昇を止める。ある投与量レベルで治療される最初の３人の患者のうち２人又は３人がＤＬＴを発症するならば、投与量上昇を止める。その投与量レベルをＭＴＤと宣言する前に基準が満たされるのを確実にするために、６人の患者が可能なＭＴＤで治療されよう。
【０１０５】
先のリポソームミトキサントロン投与後２１日以上で治療の次の過程を投与できえ、そして、絶対的好中球カウント（ＡＮＣ）が１，５００ｍ／ｍ３以上、血小板カウントが１００，０００／ｍｍ３、任意の他の治療関連毒性（脱毛症を除く）からの回復が、ベースライングレード又はグレード１未満であるとき、どれも制限的であることはより少ない。
【０１０６】
毒性の解決のためには、治療を１週間遅らせる。毒性が１週間遅延の後、解決されなければ、もう１週間治療を遅延させ、１週間遅延後行ったであろう同一投与量減少を行う。治療が２週間超保留される必要があるならば、患者は研究から除外される。
【国際公開パンフレット】
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2004511510.tif 000040
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【手続補正書】
【提出日】平成14年11月5日(2002.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物疾患の治療方法であって、カルジオリピン含有リポソーム製剤中ミトキサントロン治療有効量と、医薬として許容できる賦形剤とを含む医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、方法。
【請求項２】
哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リポソーム製剤が更にリン脂質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
リポソーム製剤が更にトコフェロールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
リポソーム製剤が更に、ホスファチジルコリン、コレステロール及びトコフェロールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
カルジオリピンが、天然カルジオリピン及び合成カルジオリピンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
リポソームが負電荷を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
リポソームが正電荷を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ミトキサントロンの少なくとも９０％がリポソームに結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ミトキサントロン濃度が、約０．５〜約２ｍｇ／ｍｌの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ミトキサントロン、及びカルジオリピンを含む脂質成分を含むリポソームを含む治療用ミトキサントロン組成物。
【請求項１２】
ミトキサントロンと脂質成分とのモル比が、約１：１０から約１：２０までの範囲である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ミトキサントロン包埋リポソームが、約５μｍ以下のサイズを有する小胞を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
ミトキサントロン包埋リポソームが、約１μｍ以下のサイズを有する小胞を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
ミトキサントロン包埋リポソームが、約０．５μｍ以下のサイズを有する小胞を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
ミトキサントロン包埋リポソームが、約０．１μｍ以下のサイズを有する小胞を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１７】
脂質成分が更に、ホスファチジルコリン、コレステロール、α−トコフェロール、ジパルミトイルホスファチジルコリン、及びホスファチジルセリンからなる群から選択される化合物を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１８】
カルジオリピンが、天然カルジオリピン及び合成カルジオリピンからなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１９】
リポソームが負電荷を有する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２０】
リポソームが正電荷を有する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２１】
リポソームが中性である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２２】
リポソームが、多層膜小胞と単層膜小胞との混合物である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２３】
ミトキサントロンと脂質成分とのモル比が、約１：１０から約１：２０までの範囲である、脂質成分とミトキサントロンを含む治療用ミトキサントロン組成物。
【請求項２４】
脂質成分がリン脂質を含む、請求項２３に記載の治療用ミトキサントロン組成物。
【請求項２５】
脂質成分がホスファチジルコリンを含む、請求項２３に記載の治療用ミトキサントロン組成物。
【請求項２６】
脂質成分が卵ホスファチジルコリンを含む、請求項２３に記載の治療用ミトキサントロン組成物。
【請求項２７】
脂質成分がコレステロールを含む、請求項２３に記載の治療用ミトキサントロン組成物。
【請求項２８】
脂質成分が更に、リン脂質、コレステロール、カルジオリピン、及びトコフェロールを含む、請求項２３に記載の治療用ミトキサントロン組成物。
【請求項２９】
ミトキサントロン濃度が、約０．５〜約２ｍｇ／ｍｌの範囲である、請求項２３に記載の治療用ミトキサントロン組成物。
【請求項３０】
ミトキサントロンの医薬剤形の調製方法であって、ミトキサントロンと結合する成分を含む予め形成されたある量のリポソームを含む容器を得る工程、医薬として許容できる賦形剤中のある量のミトキサントロンを含む容器を得る工程、医薬として許容できる賦形剤中のミトキサントロンの一部と該リポソームとを混合する工程、及びミトキサントロンを該リポソームと結合させて、ミトキサントロンの医薬剤形を得る工程を含む、方法。
【請求項３１】
予め形成されたリポソームが凍結乾燥されている、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ミトキサントロンと１つ以上の脂質を含む脂質製剤であって、少なくとも１つの脂質はカルジオリピンである、脂質製剤。
【請求項３３】
ミトキサントロンがカルジオリピンと複合体を形成する、請求項３２に記載の脂質製剤。
【請求項３４】
少なくとも約１：５０のミトキサントロンと脂質との相対的モル量を含む、請求項３２又は３３に記載の脂質製剤。
【請求項３５】
少なくとも約１：４０のミトキサントロンと脂質との相対的モル量を含む、請求項３２又は３３に記載の脂質製剤。
【請求項３６】
少なくとも約１：３０のミトキサントロンと脂質との相対的モル量を含む、請求項３２又は３３に記載の脂質製剤。
【請求項３７】
少なくとも約１：２０のミトキサントロンと脂質との相対的モル量を含む、請求項３２又は３３に記載の脂質製剤。
【請求項３８】
少なくとも約１：１５のミトキサントロンと脂質との相対的モル量を含む、請求項３２又は３３に記載の脂質製剤。
【請求項３９】
少なくとも約１：１０のミトキサントロンと脂質との相対的モル量を含む、請求項３２又は３３に記載の脂質製剤。
【請求項４０】
少なくとも約１：５のミトキサントロンと脂質との相対的モル量を含む、請求項３２又は３３に記載の脂質製剤。
【請求項４１】
少なくとも約１：１のミトキサントロンと脂質との相対的モル量を含む、請求項３２又は３３に記載の脂質製剤。
【請求項４２】
約１：１のミトキサントロンと脂質との相対的モル量を含む、請求項３２又は３３に記載の脂質製剤。
【請求項４３】
更にホスファチジルコリン又はコレステロールを含む、請求項３２〜４２のいずれかに記載の脂質製剤。
【請求項４４】
約０．１〜２５：１〜９９：０．１〜５０　カルジオリピン：ホスファチジルコリン：コレステロールの範囲内の、カルジオリピン、ホスファチジルコリン、コレステロールの相対的モル量を含む、請求項４３に記載の脂質製剤。
【請求項４５】
約０．２〜１０：２〜５０：１〜２５　カルジオリピン：ホスファチジルコリン：コレステロールの範囲内の、カルジオリピン、ホスファチジルコリン、コレステロールの相対的モル量を含む、請求項４３に記載の脂質製剤。
【請求項４６】
約０．５〜５：４〜２５：２〜１５　カルジオリピン：ホスファチジルコリン：コレステロールの範囲内の、カルジオリピン、ホスファチジルコリン、コレステロールの相対的モル量を含む、請求項４３に記載の脂質製剤。
【請求項４７】
約０．７５〜２：５〜１５：４〜１０　カルジオリピン：ホスファチジルコリン：コレステロールの範囲内の、カルジオリピン、ホスファチジルコリン、コレステロールの相対的モル量を含む、請求項４３に記載の脂質製剤。
【請求項４８】
約１：１０：６．８　カルジオリピン：ホスファチジルコリン：コレステロールの、カルジオリピン、ホスファチジルコリン、コレステロールの相対的モル量を含む、請求項４３に記載の脂質製剤。
【請求項４９】
更に抗酸化剤を含む、請求項３２〜４８のいずれかに記載の脂質製剤。
【請求項５０】
凍結乾燥されている、請求項３２〜４９のいずれかに記載の脂質製剤。
【請求項５１】
リポソームの形態である、請求項３２〜５０のいずれかに記載の脂質製剤。
【国際調査報告】
2004511510.tif 000042