(57)【要約】本発明は、ヒドロキシル化されたプロリン残基を含有するコラーゲン様化合物の製造方法に関する。プロリン残基のヒドロキシル化が真菌、好ましくは酵母、とりわけハンセヌラ  ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）からのプロリルヒドロキシラーゼにより達成される組換えのコラーゲン様化合物の製造がとりわけ興味深い。また、本発明は、ゼラチン加水分解物、とりわけゼラトンもしくはペプトンのようなコラーゲン様オリゴペプチドの添加を特徴とするこうしたプロリルヒドロキシラーゼによるプロリン残基のヒドロキシル化の制御方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
真菌のプロリルヒドロキシラーゼを使用することを特徴とする、ヒドロキシル化されたプロリン残基を含有するコラーゲン様化合物の製造方法。
【請求項２】
プロリルヒドロキシラーゼが単細胞真菌、好ましくは酵母、より好ましくはハンセヌラ  ポリモルファからである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
コラーゲン様化合物が真菌もしくは真菌様の真核微生物中で産生される、請求項１もしくは２記載の方法。
【請求項４】
真菌が単細胞真菌、好ましくは酵母である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
コラーゲン様化合物が、ハンセヌラ  ポリモルフィア（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ビール酵母菌（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイベロミセス  ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ヤロウィア  リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｙｐｏｌｉｔｉｃａ）もしくはクリプトコックス  クルバツス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）、好ましくはハンセヌラ  ポリモルフィア（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）中で産生される、請求項３もしくは４記載の方法。
【請求項６】
組換えのコラーゲン様化合物が産生される、先行する請求項、請求項１もしくは２のいずれか記載の方法。
【請求項７】
組換えのコラーゲン様化合物が宿主生物体にとって外因性である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
組換えのコラーゲン様化合物が、宿主生物体にとって過剰発現された内因性のコラーゲン様化合物である、請求項６記載の方法。
【請求項９】
真菌もしくは真菌様の真核微生物を培養すること、および内因性の真菌のコラーゲン様化合物を単離することの段階を含んで成る、内因性の真菌のコラーゲン様化合物の製造方法。
【請求項１０】
内因性の真菌のコラーゲン様化合物がハンセヌラ  ポリモルフィアからである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
真菌が単細胞真菌、好ましくは酵母、とりわけハンセヌラ  ポリモルフィアである、請求項９もしくは１０記載の方法。
【請求項１２】
真菌のプロリルヒドロキシラーゼによるプロリン残基のヒドロキシル化が、ゼラチン加水分解物、とりわけゼラトンもしくはペプトンのようなコラーゲン様オリゴペプチドの添加により制御される、先行する請求項のいずれか記載の方法。
【請求項１３】
コラーゲン様オリゴペプチドが、７より高い、好ましくは８より高い、より好ましくは９より高い等電点を有する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
真菌のプロリルヒドロキシラーゼによるプロリン残基のヒドロキシル化がエクステンシンの添加により制御される、請求項１−１１のいずれか記載の方法。
【請求項１５】
先行する請求項のいずれかに従って得ることができるコラーゲン様化合物。
【請求項１６】
真菌、好ましくはハンセヌラ  ポリモルフィアからのプロリルヒドロキシラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ヒドロキシル化されたプロリン残基を含有するコラーゲン様化合物の製造方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
コラーゲンは線維性タンパク質の一族の集合的名称である。構造的には、コラーゲンは、三重らせんドメインの形成を見込む−（Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ）ｎ−三残基（ｔｒｉｐｌｅｔ）の反復配列をそれらの一次配列中に含有する３本のポリペプチド鎖の集成物であるとして特徴づけられる。生合成において、コラーゲンを形成するポリペプチド鎖はいくつかの翻訳後修飾を受ける。おそらく、これらの修飾の最も顕著なものは、反復する−（Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ）ｎ−三残基のＹａａの位置のプロリン残基の４−ヒドロキシプロリンへのヒドロキシル化である。タンパク質鎖が３７℃で三重らせんのコンホメーションにフォールディングするために、適切な数のＹａａの位置のプロリン残基がヒドロキシル化されることが必要であり、そしてなお、４℃でヒドロキシル化されないゼラチンはインビトロで三重らせんを形成しない。ヒドロキシル化が存在しない場合、該ペプチド鎖は非らせんのまま留まり、そして安定なコラーゲン構造に自己集成することができない。−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ−三残基中のＹａａの位置のプロリンの４−ヒドロキシプロリンへのヒドロキシル化を司る酵素がプロリン４−水酸化酵素である。
【０００３】
コラーゲンは、美容外科、組織工学および創傷の治療のような多数の医学的応用で生物材料として使用されている。ゼラチンは変性かつ部分的に分解されたコラーゲンである。それもまた、カプセル、外科用スポンジ、創傷の治療、ワクチン、薬物送達系のような多様な医学的および製薬学的応用で使用されており、それはゲル化剤として食品工業で使用されており、また、それは写真工業で使用されている。天然のコラーゲン（およびゼラチン）の最も顕著な供給源は動物の骨および皮である。しかしながら、ずっと前から、とりわけ高等級の医学的応用のため、しかしまたコラーゲンもしくはゼラチンの一定の組成を必要とする応用のためにも、代替の供給源が望ましいことが認識されている。とりわけ、微生物によるコラーゲンの製造は、とりわけこうしたコラーゲンがなんらかの形態でヒト被験体により取り込まれる場合に、コラーゲンの動物もしくはヒトさえの供給源の使用に関連する免疫学的、ウイルスおよびプリオンに関係する危険を緩和するために有利であるとみられる。一般に、コラーゲンの製造のための適する真核微生物は真菌、およびとりわけ酵母である。低級の真核生物の生物体が、フォールディングされていない一本鎖のヒドロキシル化されない前駆体のコラーゲンをヒドロキシル化された三重らせんのコラーゲンに転化するための翻訳後機構を所有しないことは普遍的な知識である。
【０００４】
とりわけ、従来技術は、真菌およびとりわけ酵母が酵素プロリン４−水酸化酵素を欠くことである。ヒドロキシル化された三重らせんのコラーゲンを産生する真菌およびとりわけ酵母のような低級の微生物を有するために、動物（ヒト）起源からのプロリン４−水酸化酵素を微生物宿主中で共発現する。
【０００５】
いくつかの報告は、プロリルヒドロキシラーゼを共発現する酵母中でのヒドロキシル化されたコラーゲンの産生を記述している。
【０００６】
国際特許出願第ＷＯ９３／０７８８９号明細書には、組換えＤＮＡ系を使用する酵母細胞を包含する多様な細胞中でのプロコラーゲンもしくはコラーゲンの合成が記述される。プロリン４−水酸化酵素を天然に発現する動物細胞が使用される。翻訳後酵素を欠く細胞を、プロリン４−水酸化酵素のようなこうした酵素をコードする遺伝子で形質転換してよい。実施例中に、ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）を組換え（異種）コラーゲン遺伝子およびプロリン４−水酸化酵素の組換え（異種）遺伝子で形質転換する方法が記述される。
【０００７】
国際特許出願第ＷＯ９７／１４４３１号明細書は、酵母中での組換えプロコラーゲン（ヒドロキシル化されないコラーゲン）の産生に関する。この文書において、「酵母はプロコラーゲンのプロリン残基をヒドロキシル化するのに必要な酵素を合成しない」ことが明確に示される。ニワトリのプロリン４−水酸化酵素の酵母株ＧＹ５１９６およびＧＹ５１９８への導入後に、３５℃まで安定な三重らせん構造が生じられたことが示される。コラーゲンの三重らせん構造の分析は、ヒドロキシプロリンの存在の直接の証拠を示した。
【０００８】
国際特許出願第ＷＯ９７／３８７１０号明細書において、コラーゲンをコードする配列を含んで成る第一の発現ベクターおよび翻訳後酵素もしくはそのサブユニットをコードする配列を含んで成る第二の発現ベクターが導入される、宿主細胞中でのコラーゲンの産生が記述される。ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）およびハンセヌラ  ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）のような酵母細胞を包含する多様な宿主細胞が挙げられる。実施例中で、ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）中での発現のためのヒトプロリン４−水酸化酵素の遺伝子およびヒトコラーゲンタイプＩＩＩの遺伝子を含有する組換えベクターの構築が記述される。該文書は、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）中でのヒトプロリン４−水酸化酵素および三重らせんの形態のヒトコラーゲンＩＩＩ双方の発現を示す。
【０００９】
また、最近の学術的刊行物において、酵母中で共発現される翻訳後酵素プロリン４−水酸化酵素を有することの必要性が例示されている。Ｖｕｏｒｅｌａら（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊ．１６、６７０２−６７１２およびＶａｕｇｈａｎら（１９９８）ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１７、５１１−５１８において最初に、酵母ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）がプロリルヒドロキシラーゼを発現するように工作され、そしてその後、タイプＩＩＩプロコラーゲンの遺伝子の導入に際して、水酸化された機能的な三重らせんのプロコラーゲンＩＩＩを産生することが示された。Ｔｏｍａｎら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、ｖｏｌ．２７５、５月８日発行（ｗｗｗ．ｊｂｃ．ｏｒｇ、Ｍ００２２８４２００）は、組換えヒトタイプＩプロコラーゲンの産生を記述し、組織由来のタイプＩコラーゲンに比較してそのプロリン含量の８２％が、ニワトリプロリン４−水酸化酵素の共発現に際してヒドロキシル化されて、安定な三重らせん構造をもたらした。
【００１０】
いくつかの欠点が、ヒドロキシル化されたコラーゲンの産生のための酵母にとって外来のプロリン４−水酸化酵素の酵母中の導入に関係する。プロリン４−水酸化酵素の発現のための情報を含有する適切な遺伝子構築物の構築のために余分の段階を実施しなければならない。酵母細胞中の付加的な遺伝子構築物の導入は、酵母により大きな緊張をかけて、形質転換の効率の低下をもたらし、従って酵母の成功裏の形質転換のためにより多くの物質を必要とする。動物（ヒト）の水酸化酵素の共発現は、酵母により産生されるコラーゲン（およびゼラチン）の相対的に低い収量をもたらす（Ｖｕｏｒｅｌａら（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊ．１６、６７０２−６７１２およびＫｅｉｚｅｒ−Ｇｕｎｎｉｋら（２０００）Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９、２９−３６）。低いゼラチン収量をもたらすことを別にして、例えばピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）中での組換えヒトプロリン４−水酸化酵素の過剰発現は、細胞の形態学の変化および成長の阻害を引き起こす。
【００１１】
国際特許出願第ＷＯ９６／３９５２９号明細書は、その端に哺乳動物（ヒト）のプレプロコラーゲンシグナルが目的の異種タンパク質に動作可能なように連結される、宿主細胞からの異種タンパク質の分泌に関する。とりわけ、ハンセヌラ  ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）が宿主細胞として挙げられる。ちなみに、この文書は、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）中での内因性のコラーゲン様化合物の産生を挙げている。Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）の上清中のタンパク質から得られるそれぞれ１４および１３アミノ酸残基の２種の末端配列に基づき、著者らは、該タンパク質がコラーゲンに関係するタンパク質に相同であったと結論づけた。１４および１３アミノ酸残基の２種の配列はＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ反復配列として報告されている（国際特許出願第ＷＯ９６／３９５２９号明細書中の配列表の配列番号８および配列番号９を参照されたい）。既知のコラーゲン配列との見出された配列の合致研究において、該既知化合物がヒドロキシル化されたプロリンを含有することが挙げられている。国際特許出願第ＷＯ９６／３９５２９号明細書は、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）により分泌されるコラーゲン様タンパク質中のヒドロキシプロリンの存在を明確に記述せず、また、それは、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）がコラーゲン様化合物を分泌するという観察結果からのいかなる種類の応用可能性も示唆しない。
【００１２】
（発明の要約）
ヒドロキシル化されたプロリン残基を含んで成るコラーゲンおよびコラーゲン様化合物の製造方法を提供することが、本発明の一目的である。
【００１３】
発明者らは、真菌、とりわけ酵母が前駆体コラーゲン中のプロリン残基の翻訳後ヒドロキシル化のための酵素を所有しないことを教示する、従来技術における一般的意見と逆に、ある種の真菌、とりわけ単細胞性の真菌がプロリルヒドロキシラーゼ活性を表すことを見出した。該技術は、ヒドロキシル化されたコラーゲンを得るために動物（ヒト）のプロリン４−水酸化酵素を共発現することが必要であることを教示する。発明者らは、いかなる異種（外因性）のプロリン４−水酸化酵素も共発現することなく組換えコラーゲンを製造するために、ハンセヌラ  ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）を形質転換した。この内因性の水酸化酵素活性は、いくつかの原核生物および他の生物体で観察されかつ遊離のプロリンに作用することのみが可能でありかつペプチド中に組込まれるプロリン残基に作用することが可能でないプロリルヒドロキシラーゼ活性と基本的に異なる（Ｓｈｉｂａｓａｋｉら、（１９９９）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４０、５２２７−５２３０）。
【００１４】
（詳細な記述）
驚くべきことに、ヒドロキシル化されたコラーゲンが、マウスタイプＩコラーゲン配列を含んで成る発現系のみでのＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）の形質転換によって、かつ外因性の動物（ヒト）のプロリン４−水酸化酵素の発現のためのいかなる形態の情報も不在の下で、得られた。従って、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）は、予期しないことに、内因性のプロリルヒドロキシラーゼ活性を表す。実験は酵母Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）を用いて実施されたとは言え、本発明は他の酵母および糸状菌にもまた当てはまることが予見される。従って、本明細において、酵母ならびに糸状菌を包含する「真菌」もしくは「真菌の」という用語を使用する。
【００１５】
真菌のプロリルヒドロキシラーゼ活性に加え、発明者らは、この活性を制御することができることを見出した。微生物の成長のために使用される培養もしくは醗酵培地（中の成分）に依存して、プロリン残基のヒドロキシル化を誘導もしくは予防することができる。動物組織（例えば膵）からの酵素的（トリプシン）加水分解物の培地中での存在は、コラーゲン様化合物中のプロリン残基の真菌のヒドロキシル化をもたらす。加水分解物中に存在するある種の補助因子が真菌のプロリルヒドロキシラーゼ活性である役割を演じているかもしれないとは言え、主たる役割はゼラチンもしくはコラーゲン様化合物の加水分解に由来するオリゴペプチドに帰されるはずである。おそらく、無傷のゼラチンもしくはコラーゲン様化合物は同様にプロリンのヒドロキシル化の誘導物質として作用することができるが、しかし、こうした化合物のゲル化しない画分が実務の目的上より適する。相対的に純粋なゼラチン加水分解物は、ゼラトン（ｇｅｌａｔｏｎｅ）の名称で商業的に入手可能である一方、動物組織の加水分解物はペプトンとして商業的に入手可能である。微生物の培養もしくは醗酵培地からゼラチン加水分解物および／もしくは動物組織の加水分解物を省くことは、プロリン残基の真菌のヒドロキシル化が起こることを予防する。
【００１６】
実施例は、ペプトンの存在下でＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）を成長させることがヒドロキシル化されたコラーゲン様生成物をもたらすことを示している。いかなる補充物（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）も伴わないかもしくはカザミノ酸（カザミノ加水分解物）で補充された無機／最少培地の存在下での醗酵はヒドロキシル化をもたらさない。水酸化酵素活性の差異は、最もありそうには、ペプトンの刺激効果の結果である。多様な動物細胞に類似して、細胞表面のコラーゲン受容体が関与する可能性がある。この点から、特定の部分的アミノ酸配列がある役割を演じている可能性がある。
【００１７】
本質的に、コラーゲンはおよそ９．５という相対的に高い等電点（ｐＩ）を有する。結果として、慎重に単離かつ消化される場合、加水分解物もまた匹敵する相対的に高い等電点を有する。実施例で使用されるペプトンはおよそ９．５のｐＩを有する。比較実験において、およそ４．５のｐＩを有する純粋なゼラチンのトリプシン消化物の＜１０ｋＤａの画分を使用した。ペプトンにより誘導されたおよび＜１０ｋＤａのゼラチン画分により誘導されたヒドロキシル化の程度の比較は、平均で５倍より大きい程度のペプトンにより誘導されたヒドロキシル化を示した。従って、相対的に高い等電点を有するコラーゲン様タンパク質を誘導物質として使用することが有利である。等電点の至適値が存在することがありそうである。
【００１８】
コラーゲン様タンパク質よりほかの他のタンパク質が同様に水酸化酵素活性に対する誘導的な効果を有するかもしれないことが予見される。好ましくは、こうしたタンパク質は、好ましくは高い等電点とともにヒドロキシプロリン残基を含んで成る。例えばエクステンシンはこれらの特性を組み合わせる。エクステンシンは、植物の成長、調節、ストレス応答、細胞−細胞認識および生殖生理学である役割を演じており、そして植物界全体に広範に分布している。エクステンシンはヒドロキシプロリン豊富な糖タンパク質であり、それはまた塩基性アミノ酸セリン、バリン、チロシン、リシンおよびいくつかの場合はトレオニンも豊富である。該ペプチドバックボーンは反復するヒドロキシプロリンを含んで成る。本来、ヒドロキシプロリン成分は大きくグリコシル化されている。
【００１９】
ゼラチンもしくはコラーゲン様オリゴペプチドを除けば、ペプトン中の１種もしくはそれ以上の成分（おそらく組合せの）がＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）中の水酸化酵素の補助因子（１種もしくは複数）として作用する可能性がある。動物のプロリルヒドロキシラーゼの既知の補助因子は、アスコルビン酸、α−ケトグルタル酸およびＦｅ２＋である。
【００２０】
従って、本発明は、真菌のプロリルヒドロキシラーゼを使用することを特徴とする、ヒドロキシル化されたプロリン残基を含有するコラーゲン様化合物の製造方法を提供する。好ましくは、プロリルヒドロキシラーゼは単細胞性の真菌、好ましくは酵母、とりわけハンセヌラ  ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）からである。
【００２１】
また、真菌のプロリルヒドロキシラーゼによるプロリン残基のヒドロキシル化が、ゼラチン加水分解物、とりわけゼラトンもしくはペプトンのようなコラーゲン様オリゴペプチドの添加により制御される、ヒドロキシル化されたプロリン残基を含有するコラーゲン様化合物の製造方法も提供される。好ましくは、コラーゲン様オリゴペプチドは７より高い、より好ましくは８より高い、なおより好ましくは９より高い等電点を有する。理論的には、１２より高いポリリシンもしくはポリアルギニンのｐＩ値を得ることができる。本来、１１．５より高いｐＩ値をもつタンパク質は稀に見出される。さらなる一態様において、真菌のプロリルヒドロキシラーゼによるプロリン残基のヒドロキシル化がエクステンシンの添加により制御される。
【００２２】
本発明の好ましい一態様において、組換えコラーゲン様化合物が製造される。組換えは、コラーゲン様化合物もしくは真菌の水酸化酵素をコードする外因性（異種）遺伝子の導入、しかしまたコラーゲン様化合物もしくは真菌の水酸化酵素および／またはそれらの組合せをコードする内因性遺伝子の過剰発現のような、宿主生物体のいずれかの遺伝子操作を指す。
【００２３】
組換えタンパク質の産生および適する発現ベクターの構築は、それ自体既知の方法に従って実施することができ、そして、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９、およびＡｕｓｕｂｅｌら  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、グリーン  パブリッシング  アソシエーツ  アンド  ワイリー  インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク  １９８９に見出すことができる。これらの方法は、インビトロの組換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボの組換え／遺伝子組換えを包含する。
【００２４】
ウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリおよびヒトコラーゲンを包含する数種の別個のコラーゲンの型が脊椎動物で同定されている。１９種の既知のコラーゲンの包括的総説が国際特許出願第ＷＯ９７／３８７１０号明細書に示される。本発明の方法において、天然のコラーゲンをコードするいずれかの核酸配列もしくは核酸配列の組合せを含んで成る１種の発現ベクターもしくは複数の発現ベクターを使用することができる。発現ベクター中には、プロコラーゲンの産生のために付加的な情報を組込んでよい。プロコラーゲンは、三量体への集成、溶解性、精製もしくは他の機能において補助しかつなんらかの段階でＮ−プロテイナーゼ、Ｃ−プロテイナーゼもしくは他のタンパク質により切断されてコラーゲンを生じる、付加的なＣ末端および／もしくはＮ末端ペプチドを有するコラーゲンを指す。発現ベクター中のこうした情報の組込みは、コラーゲン（高度に規則正しい三量体構造）もしくはゼラチン（集成されない（ｎｏｎ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ）もしくは無作為に集成された（ｒａｎｄｏｍｌｙ  ａｓｓｅｍｂｌｅｄ）構造）の形成に対する制御を可能にする。
【００２５】
また、発現ベクターは、構成および誘導可能なプロモーター、開始シグナル、選択マーカー、分泌シグナルを包含する多数の適する転写および翻訳因子のいずれかを装備することができる。
【００２６】
本発明の方法はコラーゲン様化合物の製造に関し、そして（既知の）天然のコラーゲンの製造に制限されない。Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ−反復配列もしくはＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ反復配列の伸長を含んで成るタンパク質をコードする非天然の配列もまた、真菌の水酸化酵素によるヒドロキシル化にさらされる。コラーゲン様化合物は天然および非天然のコラーゲンを指す。コラーゲン様化合物は、膠原（ｃｏｌｌａｇｅｎｏｕｓ）、部分的に非膠原もしくは完全に非膠原の性質および／または親水コロイド、非親水コロイド、親水性もしくは疎水性の性質をもつ特注設計のアミノ酸配列のような合成であることができる。本発明のコラーゲン様化合物はＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ三残基の伸長を含有し、好ましくはそれらはＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ三残基の最低５、より好ましくは最低１０個の連続する反復配列を含有する。コラーゲン様化合物の膠原の特性が生じるために、最低５、好ましくは最低１０個のＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ三残基の伸長は、プロリンおよびヒドロキシプロリンが豊富でなくてはならない。変動が起こるとは言え、天然の哺乳動物のコラーゲンにおいて、Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ三残基の伸長中のＧｌｙを包含するアミノ酸の総数のおよそ２０％がプロリンおよび／もしくはヒドロキシプロリンである。普遍的には、ヒドロキシプロリンはＹａａの位置に見出される。魚類、とりわけ冷水魚においては、プロリンおよび／もしくはヒドロキシプロリンのこのパーセンテージはかなりより低い（例えば１５％未満もしくは１０％未満でさえある）。非天然の合成もしくは特注設計のコラーゲン様化合物ではいかなるパーセンテージのプロリン残基も導入することができる。従って、本発明のコラーゲン様化合物は、Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ三残基の最低５個、好ましくは最低１０個の連続する反復配列の伸長を含有し、そして、最低５％、好ましくは最低１０％、より好ましくは最低１５％の三残基がプロリンおよび／もしくはヒドロキシプロリン残基を含有する。
【００２７】
プロリルヒドロキシラーゼ活性がＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）で確かめられていれば、この活性を司る酵素を単離することができる。多様な酵母抽出物を分画して、ヒドロキシル化活性を生じさせる可能なタンパク質集団（１種もしくは複数）を狭めることができ、ついには特定のタンパク質を単離することができる。より具体的には、酵素は、カラムクロマトグラフィー、とりわけアフィニティークロマトグラフィーを適用することにより精製かつ／もしくは単離することができる。例えば、酵母のプロリン４−水酸化酵素の精製および／もしくは単離は、ペプトンを含有する培地中で成長されたＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）の細胞ライセートをポリＬ−プロリン／ＧＰＰ親和性カラムに適用することにより実施することができる（Ｋ．Ｉ．ＫｉｖｉｒｉｋｋｏとＲ．Ｍｙｌｌｙｌａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７）。溶離液としてポリＬ−プロリン／ＧＰＰ（３ｍｇ／ｍｌ）が適する。その後、例えばスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００を使用するゲル濾過段階を実施する。プロリン４−水酸化酵素活性は、ヒドロキシル化に共役される２−オキソ［１−１４Ｃ］グルタル酸（ｇｌｕｔｅｒａｔｅ）の脱炭酸に基づくインビトロアッセイによりモニターすることができる（Ｋ．Ｉ．ＫｉｖｉｒｉｋｋｏとＲ．Ｍｙｌｌｙｌａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８２）。質量フィンガープリント法（ｍａｓｓ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｉｎｔｉｎｇ）を精製された酵素で実施することができる。
【００２８】
従って、本発明はまた、真菌、好ましくはハンセヌラ  ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）からのプロリン４−水酸化酵素にも関する。
【００２９】
単離された真菌のプロリン４−水酸化酵素の配列は、標準的方法論を使用して決定することができる。単離された真菌のプロリン４−水酸化酵素の配列に基づき、この酵素をコードする遺伝情報を同定することができる。より具体的には、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）のプロリン４−水酸化酵素のＮ末端アミノ酸配列が、１種もしくはそれ以上の内部アミノ酸配列と一緒に決定される。縮重プライマーを包含する特異的プライマーを設計することができ、それを、標準的方法論を使用して、プロリン４−水酸化酵素遺伝子を同定、単離および増幅するのに適用することができる。例えば、設計された（縮重）プライマーを使用することにより、さらなるクローニングに使用することができる遺伝子を（ＲＴ）ＰＣＲにより単離する。
【００３０】
既知の水酸化酵素との相同性に基づき、オリゴヌクレオチドの（縮重）伸長を設計しそして酵母ＤＮＡとハイブリダイズさせるのに使用することができる。プロリルヒドロキシラーゼのゼラチンもしくはコラーゲン様化合物結合ドメインが、この目的上とりわけ有用である可能性がある。より具体的には、遺伝子の単離を、動物のプロリン４−水酸化酵素のαサブユニットに基づくプローブを用いる、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）から単離されたゲノムＤＮＡもしくはｍＲＮＡでの低ストリンジェンシーのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションにより実施することができる。最後に、プロリン４−水酸化酵素をコードする遺伝子を、動物およびウイルスの水酸化酵素の触媒上重要なαサブユニット配列に基づく縮重プライマーを使用して単離することができる。
【００３１】
Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）から単離されたプロリン４−水酸化酵素の遺伝子に基づき、他の真菌、とりわけ他の酵母株中の関係する遺伝子を同定することが可能である。他の酵母株中の関係する遺伝子は、おそらく、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）からのプロリン４−水酸化酵素のような類似の活性を有する類似のタンパク質をもたらすことができる。
【００３２】
真菌、とりわけ酵母のプロリン４−水酸化酵素をコードする単離されたヌクレオチド配列を、発現ベクターに組込みそして微生物宿主を形質転換するのに使用することができる。該発現ベクターはまた動物（ヒト）のコラーゲン遺伝子を含んでもよい。とりわけ真菌、とりわけ単細胞性の真菌もしくは真菌様の真核微生物を、好ましくは組換えコラーゲンの発現と組合せで真菌、とりわけ酵母のプロリルヒドロキシラーゼを発現させるために形質転換することができる。ヒドロキシル化されたコラーゲンを産生させるための、好ましくは組換えコラーゲンの発現と組合せでの酵母のプロリン４−水酸化酵素の発現に、酵母細胞がとりわけ好ましい。
【００３３】
本発明の別の局面は、真菌の内因性（同種）コラーゲン様化合物の製造に関する。Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ三残基の伸長、より具体的にはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ三残基の伸長を含んで成るポリペプチドが、酵母、とりわけハンセヌラ  ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）で同定されかつそれから単離されることができる。酵母（ハンセヌラ  ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ））のプロリン４−水酸化酵素の作用に際して、このコラーゲン様化合物がヒドロキシル化される。とりわけ、Ｙａａの位置のプロリン残基が４−ヒドロキシプロリンにヒドロキシル化される。こうした微生物の（内因性の酵母の）コラーゲン様化合物は動物もしくはヒトのコラーゲンの代替であることができる。天然の非動物タンパク質はプリオンおよびウイルスを含まない。酵母中での内因性の水酸化酵素活性は成長を阻害せず、また、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）中でのコラーゲン様化合物の収量を減少させない。他の真菌は内因性の（ヒドロキシル化された）コラーゲン様化合物の発現のための遺伝子および機構（の一部）を所有する可能性がある。従って、真菌およびとりわけ酵母のような他の発現宿主を、内因性のＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）のコラーゲン様化合物の産生に使用することができる。
【００３４】
本発明の本局面において、真菌もしくは真菌様の真核微生物を培養すること、および内因性の真菌のコラーゲン様化合物を単離することの段階を含んで成る、内因性の真菌のコラーゲン様化合物の製造方法が提供される。好ましくは、真菌は単細胞性の真菌、好ましくは酵母、とりわけハンセヌラ  ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）である。好ましくは、内因性の酵母のコラーゲン様化合物はＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）からである。
【００３５】
本発明によれば、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）のプロリン４−水酸化酵素は、ヒドロキシル化されたコラーゲン様化合物の産生のために、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）もしくは他の微生物宿主中で（過剰）発現させることができる。コラーゲン様化合物は、微生物宿主にとって外因性（異種）もしくは内因性（同種）であることができる。
【００３６】
プロテオームのツールにより、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）のコラーゲン様タンパク質をコードする遺伝子を単離することができる。タンパク質のゲル中トリプシン消化後に、内部アミノ酸配列をＱ−ｔｏｆ分析により決定することができる。その後、縮重プライマーの設計および（ＲＴ）ＰＣＲにより、コラーゲン様タンパク質をコードする遺伝子を単離することができる。
【００３７】
また、本発明によれば、コラーゲン様化合物をコードするＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）の遺伝子（１種もしくは複数）を、（ヒドロキシル化された）コラーゲン様化合物の産生のために、好ましくは真菌のプロリン４−水酸化酵素と組合せで、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）もしくは他の微生物宿主中で（過剰）発現させることができる。
【００３８】
本発明の製造のための好ましい宿主は真菌もしくは真菌様の真核微生物である。適する糸状菌は、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）のものである。とりわけ、ヒドロキシル化されたコラーゲンもしくはコラーゲン様化合物の産生のための有用な系は、単細胞性の真菌、とりわけ酵母細胞である。商業的スケールでのタンパク質の製造のための好ましい工業的に応用可能な酵母細胞は、ハンセヌラ  ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ビール酵母菌（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイベロミセス  ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ヤロウィア  リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｙｐｏｌｉｔｉｃａ）およびクリプトコックス  クルバツス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）であるが、しかし、他の微生物宿主が同様に応用可能であると判明するかもしれない。
【００３９】
とりわけ有用な微生物はメチロトローフの酵母ハンセヌラ  ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）である。メタノールでの成長は、全細胞タンパク質の３０〜４０％までを構成する可能性のあるＭＯＸ、ＤＡＳおよびＦＭＤＨのようなメタノール代謝の重要な酵素の誘導をもたらす。ＭＯＸ、ＤＡＳおよびＦＭＤＨ産生をコードする遺伝子は非常に強力な誘導可能プロモーターにより制御される。これらのプロモーターのいずれか単一の１種または２種もしくは全３種の組合せを使用して、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）での異種遺伝子の高レベル発現を得ることができる。コラーゲンおよび／もしくは目的の真菌のプロリルヒドロキシラーゼをコードする遺伝子を、誘導可能なＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）プロモーターの制御下で発現ベクターにクローン化する。生成物の分泌が望ましい場合は、ビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のプレプロ接合因子α１のような酵母中の分泌のためのシグナル配列をコードするポリヌクレオチドを、コラーゲンおよび／もしくは目的の真菌のプロリルヒドロキシラーゼのコーディング配列と同じ読み枠で融合する。加えて、発現ベクターは、ＵＲＡ３もしくはＬＥＵ２のような栄養要求性マーカーを含有してよい。
【００４０】
既知の技術を適用することにより、発現ベクターを使用してＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）宿主細胞を形質転換する。Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）のとりわけ有用な一特徴は、ゲノム中への１００コピーまでの発現ベクターの自然的組込みである。たいてい、組込まれたＤＮＡは頭から尾の配置を表す多量体を形成する。組込まれた外来ＤＮＡは、非選択的条件下でさえ数種の組換え株中で有糸分裂的に安定であることが示されている。高コピーの組込みの現象は、該系の高生産性の潜在能力をさらに大きくする。
【００４１】
下述されるとおり、水酸化酵素活性は宿主生物体の培養もしくは醗酵培地への適する誘導物質の添加により制御することができる。挙げられるところの適する誘導物質はコラーゲン様オリゴペプチドである。有利には、こうした適する誘導物質は、必ず、実施例で顕著に使用されるペプトンのような動物起源のコラーゲン様オリゴペプチドでなくてはならない。適する誘導物質はまた、（１）微生物もしくは植物の系において組換え的に産生されることができるか、（２）上述されたようなＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）からの内因性の酵母のコラーゲン様タンパク質であることができるか、もしくは（３）化学的に合成されることができる。従って、本発明の特定の一利点は、完全に動物を含まない（ａｎｉｍａｌ−ｆｒｅｅ）組換えのコラーゲンもしくはゼラチンの産生系が得られることである。
【００４２】
実施例
実施例１
材料および方法
酵母株およびプラスミド
β−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素（ＬＥＵ  ２）が欠失しているＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）株ＮＣＹＣ  ４９５  ｌｅｕ１．１を組換えゼラチン産生に使用した。メタノールに誘導されるゼラチン発現のため、われわれは、ＬＥＵ選択可能なマーカー、カナマイシン耐性マーカー、ならびにメタノール酸化酵素（ＭＯＸ）プロモーターおよびアミノ酸化酵素（ＡＭＯ）ターミネーターを含有する発現カセットを含有するプラスミドｐＨＩＰＸ４を使用した。構成的ゼラチン発現のため、われわれは、発現カセットがＭＯＸプロモーターの代わりに転写伸長因子（ＴＥＦ１）プロモーターを含有したことを除きｐＨＩＸ４と同一であるプラスミドｐＨＩＰＸ７を使用した。ベクターｐＣＯＬ１Ａ１−１からのビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα接合因子プレプロシグナルおよびマウスタイプＩコラーゲンの１．０ｋｂのらせん状ドメインを含有する１２６８ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩフラグメントを、ベクターｐＨＩＰＸ４およびｐＨＩＰＸ７のＨｉｎｄ  ＩＩＩ／Ｓａｌ  Ｉ部位に挿入した。これはｐＨＩＸ４−１Ａ１およびＰＨＩＸ７−１Ａ１を生じた。全部の分子技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９により記述されたとおり、もしくは製造元のプロトコルに従って実施した。
Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）の形質転換
形質転換に使用されたプラスミドはＳｃａ  Ｉで直鎖状にした。電気穿孔法によるＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）の形質転換は、ジーンパルサー（ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ）（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））を使用して、Ｆａｂｅｒら（１９９４）Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、２５、３０５−３１０に従って実施した。最少ブドウ糖プレート上で３７℃で３日間の成長後に、数個のコロニーをＰＣＲ確認のため選択した。細胞を、１Ａ１−１  ＦＷ−プライマー：５’−ＣＴＴＣＣＣＡＧＡＴＧＴＣＣＴＡＴＧＧＣＴＡＴＧＡＴＧ−３’およびＡＭＯ−プライマー：５’−ＴＧＴＣＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣＴＴＧＴＧＣＡＣＧ−３’を使用して、いかなる前処理もなしにＰＣＲに直接使用した。
培地組成
形質転換体の選択のための最少ブドウ糖プレートは、１．３４％のアミノ酸を含まない酵母窒素基剤（ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ）（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ））、１％ブドウ糖および１．５％アガーを含有した。無機ブドウ糖培地を、供給バッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）醗酵発現実験のためにＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）を前培養するのに使用し、そして１リットルあたり：２．５ｇの硫酸アンモニウム、０．２５ｇの硫酸マグネシウム七水和物、０．７ｇのリン酸水素二カリウム三水和物、３．０ｇのリン酸二水素ナトリウム一水和物、０．５ｇの酵母抽出物、５０ｇのブドウ糖、０．０２ｍｇのビオチン、０．６ｍｇのチアミンおよび１ｍＬのビシュニアック（Ｖｉｓｈｎｉａｃ）微量元素溶液を含有した。
【００４３】
醗酵基礎塩培地は、１リットルあたり：２６．７ｍｌのリン酸（８５％）、０．９３ｇの硫酸カルシウム二水和物、１８．２ｇの硫酸カリウム、１４．９ｇの硫酸マグネシウム七水和物、４．１３ｇの水酸化カリウムおよび４．３ｍｌの微量元素を含有した。微量塩溶液は、１リットルあたり：４．５ｇの塩化銅二水和物、０．０９ｇのヨウ化カリウム、３．５ｇの塩化マンガン四水和物、０．２ｇのモリブデン酸ナトリウム二水和物、０．０２ｇのホウ酸、１．０８ｇの硫酸コバルト七水和物、４２．３ｇの硫酸亜鉛七水和物、６５．０ｇの硫酸鉄（ＩＩ）七水和物、０．６ｇのチアミン、０．２ｇのビオチンおよび５．０ｍｌの硫酸（９６％）を含有した。
Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）によるゼラチンの醗酵的産生
Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）形質転換体の供給バッチ醗酵は１Ｌ醗酵槽（アプリコン（Ａｐｐｌｉｋｏｎ））中で実施した。醗酵の開始時に、醗酵槽は４５０ｍｌのＦＢＳ培地を含有し、これに、示された場合は５０ｍｌの１０％（ｗ／ｖ）カザミノ酸溶液（メルク（Ｍｅｒｃｋ））、５０ｍｌの１０％（ｗ／ｖ）ペプトン溶液（デュチェファ（Ｄｕｃｈｅｆａ））もしくは５０ｍｌの限外濾過された１０％（ｗ／ｖ）ペプトン溶液を添加した。
【００４４】
６０ｇ／ｌのブドウ糖（ｗ／ｖ）を、バッチ相の間、炭素源として使用した。温度は３７℃に、攪拌は５００ｒｐｍに、そして通気速度は１Ｌ／分に設定した。至適の結果のためには、ｐＨを水酸化アンモニウム（２５％）でｐＨ５．０に調節した。醗酵槽に５０ｍＬの前培養物を接種した。バッチ相のブドウ糖が完全に消費された場合に、通気および攪拌をそれぞれ２Ｌ／分および１０００ｒｐｍに増大させた。供給バッチ相を、１２ｍｌ／Ｌの微量塩を含有する５０％ブドウ糖（ｗ／ｖ）溶液を１０ｍＬ／ｈの速度で供給することにより開始した。ｐＨは、２５％水酸化アンモニウムの添加により５．０で維持した。
【００４５】
追加の５ｇのカゼイン加水分解物もしくは５ｇのペプトンを、湿細胞重量が約１８０ｇ／ｌに達した場合に培地に補充した。ＰＨＩＸ７−１Ａ１形質転換体による継続的ゼラチン発現のために、その後、ブドウ糖供給バッチ相を継続した。ｐＨＩＸ４−１Ａ１形質転換体によるゼラチンのメタノールに誘導される発現のために、メタノール供給バッチを、１２ｍｌ／ｌの微量塩を含有する１００％メタノールを供給することにより開始した。供給速度は当初１ｍｌ／ｈに設定し、そして最大で８ｍｌ／ｈまで徐々に増大させた。供給バッチ相の間、酸素の限界を回避するため、溶解酸素濃度を２０％より上に保った。醗酵を通じて、２ｍｌの培養物サンプルを約１２時間の間隔で採取した。サンプルは２０，０００ｇで１分間回転し、そして上清を使い捨ての０．２２μｍフィルターを使用して濾過した。
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、Ｎ末端タンパク質配列決定およびイムノブロッティング
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、還元変性条件下にミニ  プロテアン（Ｍｉｎｉ  ＰＲＯＴＥＡＮ）ＩＩ系（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））で実施した。ゲルをクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ  Ｒ−３５０）で染色した。Ｎ末端タンパク質配列決定のために、ミニ  トランス−ブロット  セル（Ｍｉｎｉ  Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｃｅｌｌ）（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））中で１００Ｖを１時間適用することにより、イモビロン  Ｐ［Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ］ＳＱ（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））にタンパク質をブロッティングした。転写緩衝液は１リットルの１０％メタノール、ｐＨ１１．０あたり２．２ｇのＣＡＰＳであった。ブロットをクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ  Ｒ−３５０）で染色し、そして選択されたバンドを切り放した。エドマン分解を使用するＮ末端配列決定を実施した。
【００４６】
イムノブロッティングのため、タンパク質を電気泳動的にＰＶＤＦフィルターに転写し、そしてフィルターを、ＴＢＳＴ（０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１．５Ｍ  ＮａＣｌ；０．１％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０）中５％脱脂粉乳で室温で１時間ブロッキングした。フィルターを、モノクローナル抗ｍｙｃ抗体（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）；ＴＢＳＴ中１％脱脂粉乳中１：２０．０００）とともに一夜インキュベートし、ＴＢＳＴで洗浄し、そしてアルカリホスファターゼ（ＡＰ）に結合された二次抗体（ヤギ抗マウス、シグマ（Ｓｉｇｍａ）；；ＴＢＳＴ中１％脱脂粉乳中１：１０．０００）とともに１時間インキュベートした。フィルターをＴＢＳＴで洗浄し、そしてその後ＡＰ緩衝液（０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．５；０．５Ｍ  ＭｇＣｌ２；および０．１Ｍ  ＮａＣｌ）ですすいだ。抗体結合を、３３μｌの５−ブロモ４−コロ３−インドルホスフェート（５０ｍｇ／ｍｌ）および６６μｌのニトロブルーテトラゾリウム（５０ｍｇ／ｍｌ）（ＵＳＢ）を含有する１０ｍｌのＡＰ緩衝液中でフィルターをインキュベートすることにより検出した。
ヒドロキシル化の程度
内因性（実施例２を参照されたい）の膠原タンパク質および組換えタンパク質双方中のＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ三残基のＹａａの位置のプロリン残基のヒドロキシル化の程度を、以下のとおり計算した。すなわち、連続的アミノ酸配列決定段階でのグリシン、プロリンおよびヒドロキシプロリンのピークの発生および減少を、連続的段階で得られた各アミノ酸の相対的シグナル強度を比較することにより分析した。
【００４７】
最初に、同一のアミノ酸の新たなシグナルを独力で生じさせなかった段階（例えばヒドロキシプロリンについて段階４、５、７、８および１０）で減少速度を分析した。その後、減少速度を、新たなプロリンもしくはヒドロキシプロリンのシグナルを生じさせた配列決定段階について内挿し、そして前の段階から残存するプロリンもしくはヒドロキシプロリンのシグナルを、各段階で得られた付加的なシグナル（補正されたシグナル）を評価するために新たなシグナルから差し引いた。シグナルはまた、連続する三残基について観察された感受性のゆっくりした全体的減少についても補正した。最後に、配列決定段階３、６および９での補正されたプロリンおよびヒドロキシプロリンのシグナルの総和を、連続する段階での補正されたシグナルがほぼ等モルの量の物質に対応すると想定して、段階２、５および８での補正されたプロリンのシグナルと比較した：
Ｐｉ−１＝Ｐｉ＋Ｃ・Ｏｉ
ここで、ＰおよびＯはそれぞれ補正されたプロリンおよびヒドロキシプロリンのピーク高であり、ｉは配列決定段階の番号であり、そしてＣは、プロリンおよびヒドロキシプロリンのシグナルの相対強度を関係付ける未知の変換係数である。Ｃはこの等式から計算することができるため、プロリン残基ｉ（グリシン残基ｉ＋１のすぐＮ末端）のヒドロキシル化の程度は：
％ＯＨｍ＝１００＊Ｃ・Ｏｉ／（Ｐｉ＋Ｃ・Ｏｉ）
として計算することができる。
結果
組換えのヒドロキシル化されたゼラチンの構成的およびメタノールに誘導される産生
２８ｋＤａの理論的分子量をもつゼラチン分子をコードする１．０ｋｂのマウスＣＯＬ１Ａ１  ｃＤＮＡフラグメントに融合されたビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α接合因子プレプロシグナルを含有するベクターｐＣＯＬ１Ａ１−１からの１２６８ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ  ＤＮＡフラグメントを、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）発現ベクターｐＨＩＰＸ７およびｐＨＩＰＸ４にクローン化した。かように得られたベクターｐＨＩＰＸ７−１Ａ１およびｐＨＩＰＸ４−１Ａ１を、それぞれ構成的およびメタノールに誘導される組換えのゼラチン発現を可能にするようにＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）を形質転換するのに使用した。
【００４８】
コロニーＰＣＲの後に、形質転換体を無機ＦＢＳ培地中での醗酵のため選択した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、それぞれｐＨＩＰＸ７およびｐＨＩＰＸ４形質転換体を使用する細胞外培地中でのゼラチンの構成的およびメタノールに誘導される産生を示した（それぞれ図１および２を参照されたい）。発現培地にペプトンを補充した。１５ｋＤａの見かけの分子量をもつＣＯＬ１Ａ１の分解生成物を、全部の醗酵で観察することができた。
【００４９】
異なる醗酵の１５Ｋｄａのゼラチンタンパク質のバンドをブロットから摘出し、そしてＮ末端アミノ酸配列を決定した。
【００５０】
異なる醗酵の間に産生された、産生されたゼラチンのＮ末端アミノ酸配列を以下の表１に示す。
【００５１】
見出されたＮ末端は、実際、組換えＣＯＬ１Ａ１  ｃＤＮＡ遺伝子産物の内部配列である。さらに、ペプトンを培地に補充した場合、生成物中のプロリンは４−ヒドロキシプロリンにヒドロキシル化された。
【００５２】
観察された１５ｋＤａのコラーゲンフラグメントが成長培地に添加されたペプトン由来であったという可能性を排除するために、ペプトンの低分子量画分を新たな醗酵で使用し、そして、組換えゼラチン生成物を培地中のペプトン残留物から慎重に分離した。１０％（ｗ／ｖ）のペプトン溶液の５０ｍｌを、１０ｋＤａのカットオフのフィルターを使用して限外濾過した。メンブレンを通過したペプトンの低分子量成分およびペプチドを、ｐＨＩＰＸ４−１Ａ１形質転換体を用いる発現実験の間に醗酵培地に添加した。＜１０ｋＤａの添加された限外濾過されたペプトン画分のＳＤＳ  ＰＡＧＥは、１０ｋＤａより上のタンパク質バンドを示さなかった（図は示されない）。細胞により発現かつ分離された組換えゼラチンフラグメントをその後、同一の型の新たな１０ｋＤａのカットオフのフィルターで限外濾過し、そして蒸留水で３回洗浄して残余の＜１０ｋＤａのペプトン残留物を除去した。限外濾過されかつその後洗浄された醗酵上清のＳＤＳ  ＰＡＧＥは、１５ｋＤａに１本のバンドを示した（図は示されない）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびブロッティング後に得られた精製された１５ｋＤａの生成物のＮ末端配列決定は、組換えゼラチンの内部配列およびヒドロキシル化されたプロリンの存在を示した（表１）。
【００５３】
内因性のＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）タンパク質のポリ［Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ］伸長に比較して組換えゼラチンの異なる配列により（実施例２を参照されたい）、また、配列決定データ中の若干のノイズにより、組換えゼラチンのＹａａの位置でのヒドロキシル化の程度は、材料および方法の節に記述された手順に従って計算することが困難であった。多様な決定におけるＹａａの位置でのＨｙｐ／（Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ）の推定値は、約３５モル％の平均値を伴い、２５から５０モル％まで変動した。
【００５４】
成長培地に添加された補充物に対する誘導の特異性を検討するために、ペプトンを：（１）カザミノ酸（コラーゲンのようにプロリンが豊富である）、（２）遊離のヒドロキシプロリン、（３）ペプトンの全体的なアミノ酸組成を模倣する遊離アミノ酸の混合物、（４）純粋なゼラチン（すなわち脱アミド化されかつ部分的に分解された動物のタイプＩおよびタイプＩＩＩコラーゲン）（前にトリプシンで消化され、再度トリプシンを不活性化するよう熱処理され、そして＞１０ｋＤａの画分を除去するよう限外濾過された）、（５）合成のポリプロリン、ならびに（６）合成のポリ−４−ヒドロキシプロリンと比較した。結果を表１に示す。すなわち、成長培地中のヒドロキシル化されたゼラチンの＜１０ｋＤａの消化物を用いてのみ、組換えゼラチンの特異的なペプチジル−プロリル−４−ヒドロキシル化が、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）の発現の間に得られた。ペプトンと比較すると、組換えゼラチンのヒドロキシル化の生じるレベルは低かった（５〜１０％）。
【００５５】
適するコラーゲン様の誘導物質のペプチドは必ずしも動物起源のものである必要はないが、しかし、（１）微生物もしくは植物系中で組換え的に産生されることができるか、（２）Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）中で検出されるような内因性の酵母のコラーゲン様タンパク質である（実施例２を参照されたい）ことができるか、もしくは（３）化学的に合成することができることが示される。従って、完全に動物を含まない組換えのコラーゲンもしくはゼラチン産生系を得ることができる。多様な動物細胞に類似して、細胞表面のコラーゲン受容体が必要とされる可能性がある。
【００５６】
観察されたプロリンヒドロキシル化活性に関与するペプトン中の活性成分を解明するために、動物のプロリルヒドロキシラーゼのある種の既知の補助因子を含有する組成物を調製した。ペプトン中のこれらの補助因子の可能な存在がヒドロキシル化酵素の活性化を司るかもしれない。醗酵培地は、とりわけ：アスコルビン酸、α−ケトグルタル酸、Ｆｅ２＋硫酸塩で補充した。この組成物を、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）での組換えゼラチンの発現の間に醗酵培地（無機／最少培地）に添加（２回）した。産生されたゼラチンのヒドロキシル化は観察されなかった。従って、これらの補助因子は、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）での組換えゼラチンのヒドロキシル化において不可欠でない。
【００５７】
【表１】
2004516010.tif 000002
【００５８】
結論：外因性の水酸化酵素を使用せずに、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）により、ヒドロキシル化された組換えのゼラチンを産生させることが可能である。該産生は発現の様式（すなわち構成的もしくはＭｅＯＨに誘導される）に依存しない。４−ヒドロキシプロリン残基は三残基のＹａａの位置にのみ見出される。また、醗酵培地中でのペプトンの使用により、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）中のプロリルヒドロキシラーゼ活性を制御することも可能である。
【００５９】
実施例２
略語：ＣＡＰＳ、３−シクロへキシルアミノ−１−プロパンスルホン酸；ＣＢＢ、クマシーブリリアントブルー；ＨＰＬＣ、高速液体クロマトグラフィー；Ｈｙｐ、４−ヒドロキシプロリン；ＰＡＧＥ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動；ＳＤＳ、ドデシル硫酸ナトリウム；ｖｖｍ、１分あたりの醗酵培地容量（Ｌ）あたりの容量（空気のＬ）；ＹＰＤ、酵母抽出物、ペプトンおよびＤ−ブドウ糖。材料および方法
酵母株
酵母株ハンセヌラ  ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＮＣＹＣ  ４９５を全部の実験で使用した。
振とうフラスコ中での培地および成長条件
Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）は、ＹＰＤ培地（１％酵母抽出物、２％ペプトンおよび２％ブドウ糖；デュチェファ（Ｆｕｃｈｅｆａ））、もしくは無機ブドウ糖培地（１リットルあたり２．５ｇの硫酸アンモニウム、０．２５ｇの硫酸マグネシウム七水和物、０．７ｇのリン酸水素二カリウム三水和物、３．０ｇのリン酸二水素ナトリウム一水和物、０．５ｇの酵母抽出物、５０ｇのブドウ糖、０．０２ｍｇのビオチン、０．６ｍｇのチアミンおよび１ｍＬのビシュニアック（Ｖｉｓｈｎｉａｃ）微量元素溶液を含有した）中３７℃で成長させた。
供給バッチ醗酵における培地および成長条件
Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）の供給バッチ醗酵を１Ｌ醗酵槽（アプリコン（Ａｐｐｌｉｋｏｎ））中で実施した。醗酵の開始時に、醗酵槽は５００ｍＬの醗酵基礎塩培地を含有し、これに５ｇのカゼイン加水分解物（メルク（Ｍｅｒｃｋ））もしくは５ｇのペプトン（デュチェファ（Ｄｕｃｈｅｆａ））を添加した。醗酵基礎塩培地は、１リットルあたり：２６．７ｍＬのリン酸（８５％）、０．９３ｇの硫酸カルシウム二水和物、１８．２ｇの硫酸カリウム、１４．９ｇの硫酸マグネシウム七水和物、４．１３ｇの水酸化カリウムおよび４．３ｍＬの微量元素を含有した。微量元素は、１リットルあたり：４．５ｇの塩化銅二水和物、０．０９ｇのヨウ化カリウム、３．５ｇの塩化マンガン四水和物、０．２ｇのモリブデン酸ナトリウム二水和物、０．０２ｇのホウ酸、１．０８ｇの硫酸コバルト七水和物、４２．３ｇの硫酸亜鉛七水和物、６５．０ｇの硫酸鉄（ＩＩ）七水和物、０．６ｇのチアミン、０．０２ｇのビオチンおよび５．０ｍｌの硫酸（９６％）を含有した。ブドウ糖（６０ｇ／Ｌ）をバッチ相醗酵の間の炭素源として使用した。温度を３７℃に、攪拌を５００ｒｐｍに、そして通気速度を１ｖｖｍに設定した。ｐＨは水酸化アンモニウム（２５％）でｐＨ５．０に調節した。
【００６０】
醗酵槽に、無機ブドウ糖培地中で一夜成長された培養物５０ｍｌを接種した。バッチ相のブドウ糖が完全に消費された場合に、追加の５ｇのカゼイン加水分解物もしくは５ｇのペプトンを醗酵槽に添加した。同一の型の補充物をこの段階および醗酵の開始時に一定して使用した。その後、通気および攪拌をそれぞれ２ｖｖｍおよび１０００ｒｐｍに増大させ、そして供給バッチ相を、１２ｍＬ／Ｌの微量塩を含有する５０％（ｗ／ｖ）ブドウ糖溶液を１０ｍＬ／ｈの速度で供給することにより開始した。ｐＨを２５％水酸化アンモニウムの添加により５．０で維持した。醗酵全体の間で、酸素の限界を回避するために、溶解酸素濃度を２０％より上に保った。醗酵は細胞湿重量が約３００ｇ／Ｌに達した場合に停止した。醗酵を通じて、２ｍＬの培養物サンプルを約１２時間の間隔で採取した。サンプルは微小遠心機中２０，０００ｇで１分間回転し、そして使い捨ての０．２２μｍフィルターを使用して上清を濾過した。
Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）細胞の熱処理
Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）細胞の熱処理は以下のとおり実施した。すなわち、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）の２０ｍｌの培養物を、使い捨ての１０×４×４５ｍｍキュベットを使用してコーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）比色計２５４で測定される６００ｎｍで１．５の光学密度まで成長させた。細胞を、３，０００ｇで１０分間の遠心分離により収穫し、１００ｍＭ  ＮａＣｌで４回洗浄して培地成分を除去し、そして０．５ｍＬの１００ｍＭ  ＮａＣｌに再懸濁した。密閉された１．５ｍＬプラスチックチューブ（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ））中の細胞をその後、７０℃の水浴中で２０分間熱処理し、氷上に１分間置き、そして微小遠心機中、２０，０００ｇで遠心分離した。細胞の顕微鏡分析は、熱処理が検出可能な細胞溶解を引き起こさなかったことを示した。上清を膠原タンパク質の存在について分析した。
示差的アセトン沈殿
以前に０℃に冷却されたアセトンを、熱処理されたＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）細胞の冷却された細胞を含まない上清に一滴ずつ添加した。生じるタンパク質沈殿物を、微小遠心機中２０，０００ｇで１５分間遠心分離した。
ヒドロキシプロリンの検出
タンパク質の量を、ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）から購入されたビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）（ＢＣＡ）アッセイを使用して最初に決定した。１０μｇのタンパク質の真空乾燥されたサンプルを、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）Ｐｉｃｏ  Ｔａｑワークステーション（ウォーターズ  コーポレーション（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））で１１０℃で一夜、６Ｎ  ＨＣｌ蒸気中で加水分解した。遊離のヒドロキシプロリンの検出はＣｒｅｅｍｅｒｓら（１９９７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２：６５６−６５８により記述されるとおり実施した。
全アミノ酸組成
タンパク質（１０μｇ）をヒドロキシプロリンの検出について記述されたとおり加水分解した。遊離のアミノ酸を、ＡｃｃＱ  Ｔａｑ法（ウォーターズ  コーポレーション（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））を使用して、６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート誘導体化した。誘導体化されたアミノ酸を、ジャスコ（Ｊａｓｃｏ）８２０−ＦＰ検出器およびウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）ノバパック（Ｎｏｖａｐａｋ）Ｃ１８逆相カラムを装備されたウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）６００  Ｓ  ＨＰＬＣ系で分析した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＮ末端配列決定
変性剤としてのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を、還元条件下で、バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ミニ  プロテアン（Ｍｉｎｉ  ＰＲＯＴＥＡＮ）ＩＩ系（７ｃｍ×１０ｃｍ）でＬａｅｍｍｌｉ（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ、２２７：６８０−６８５の緩衝液系を使用して実施した。０．５ｍｍ厚の１５％アクリルアミドゲルを使用した。ゲルを、１０％酢酸を含有する水中１０％ＭｅＯＨ中０．１％クマシーブリリアントブルー（ファストゲル  ブルー（ＰｈａｓｔＧｅｌ  Ｂｌｕｅ）Ｒ−３５０、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））で１時間染色し、そして、７００ｍｌの水を含有する１Ｌビーカー中でマグネトロン中のゲルを１０分間煮沸することにより脱染した。Ｎ末端タンパク質配列決定のために、タンパク質を、ミニ  トランス−ブロット  セル（Ｍｉｎｉ  Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｃｅｌｌ）（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））中で１００Ｖを１時間適用することにより、イモビロン  Ｐ［Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ］ＳＱ（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））にブロッティングした。転写緩衝液は１リットルの１０％メタノール、ｐＨ１１あたり２．２ｇのＣＡＰＳであった。ブロットをクマシーブリリアントブルー（ファストゲル  ブルー（Ｐｈａｓｔｇｅｌ  Ｂｌｕｅ）Ｒ−３５０）で染色し、そして選択されたバンドを切り放した。エドマン分解を使用するＮ末端配列決定を実施した。配列決定反応中の４−ヒドロキシプロリンの量を定量した。
結果
振とうフラスコ培養物からの膠原タンパク質の単離および精製
ＹＰＤ培地中で成長された洗浄されたＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）細胞の熱処理に際してタンパク質が放出された。３８ｋＤａのタンパク質のバンドが観察された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、図３、レーン１を参照されたい。７０℃の代わりに３７℃でインキュベートされた場合には、洗浄されたＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）細胞からタンパク質が放出されなかった。上述された醗酵培地と対照的に、振とうフラスコ中でその中で細胞が成長されたＹＰＤは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により示されるとおり、タンパク質のバンドを含有しなかった（図４、レーン１）。また、これは、図３中のタンパク質が培地由来でなかったがしかし細胞それら自身に由来したことを示す。細胞の顕微鏡分析が、熱処理が検出可能な細胞溶解を引き起こさなかったことを示したため、タンパク質はおそらく細胞表面由来であった。醗酵槽では、振とうフラスコと反対に、観察されたタンパク質は、おそらく剪断力により細胞から放出された。振とうフラスコ中で成長された洗浄された熱処理された細胞から放出されたタンパク質の可能な膠原の性質を検討するために、示差的アセトン沈殿を、放出されたＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）タンパク質で実施した。Ｗｅｒｔｅｎら（１９９９）Ｙｅａｓｔ  １５：１０８７−１０９８は、４０容量％のアセトンで沈殿する非膠原の細胞外のピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のタンパク質を、８０容量％のアセトンで沈殿する組換えのコラーゲン様タンパク質から分離するのに示差的アセトン沈殿を使用した。洗浄されたＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）細胞の熱処理により放出されたタンパク質のいくらかは４０容量％のアセトンで沈殿した（図３、レーン２）。４０％アセトン沈殿物の除去、および上清中のアセトン濃度を４０から８０容量％まで増大させた後に、他のタンパク質が沈殿した（図３、レーン３）。この画分を４０〜８０％アセトン沈殿物と称する。タンパク質沈殿物を、アセトン沈殿前の出発容量より５倍より少ない容量の水に溶解し、そのためアセトン沈殿はまた濃縮効果も有した。２０ｍＬの振とうフラスコ培養物由来の４０〜８０％沈殿物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中の約３８ｋＤの大きさの最も顕著なタンパク質のバンドは、クマシー染色されたバンドの強度から推定されるとおり、約１μｇのタンパク質に対応した。また、その中で細胞が成長されたＹＰＤ培地を示差的アセトン沈殿したが、しかしはっきりしたタンパク質のバンドは検出されなかった（図４、レーン２および３）。
【００６１】
ヒドロキシプロリンアッセイは、熱処理により洗浄された細胞から生じられたタンパク質の４０〜８０％アセトン沈殿物が、乾燥されたタンパク質沈殿物の加水分解後に８％（ｗ／ｗ）のヒドロキシプロリンを含有したことを示した。ヒドロキシプロリンは細胞由来のタンパク質の４０％アセトン沈殿物中で検出されなかった。全体のアミノ酸組成の分析は、４０〜８０％沈殿物中の細胞由来のタンパク質の膠原の性質をさらに確認した。大量のグリシン（２６．２モル％）、プロリン（９．９モル％）および４−ヒドロキシプロリン（９．８モル％）が観察された。これは、この画分中の膠原タンパク質の全体的な豊富さを示す。
【００６２】
その後、アセトン沈殿された画分のそれぞれ中の最も豊富なタンパク質のＮ末端アミノ酸配列を決定した（すなわち、図３に示されるところの４０％中の４０ｋＤのタンパク質および４０〜８０％アセトン沈殿物中の３８ｋＤのタンパク質）。結果を表２に示す。４０％アセトン沈殿物中の４０ｋＤのタンパク質のＮ末端配列（表２）は膠原でなかったが、しかし、４０〜８０％アセトン沈殿物中の３８ｋＤのタンパク質のＮ末端は最低７個の連続する［Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ］三残基よりなった。おそらく、なおより多い連続する［Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ］三残基が存在する。配列決定を２１アミノ酸後で終了したためである。われわれの知る限り、連続的な［Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ］／［Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ］三残基のこうした長い伸長は、いかなる動物のコラーゲン中にも存在しない。
【００６３】
独占的に、［Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ］のＹａａの位置のプロリン残基のみがヒドロキシル化された。この厳格な配列特異性は動物のコラーゲンで観察されると同一である。連続的なアミノ酸配列決定段階におけるグリシン、プロリンおよびヒドロキシプロリンのピークの発生および減少を、連続的段階で得られる各アミノ酸の配列決定クロマトグラム中の相対的シグナル強度を比較することにより分析した。従って、３個の最もＮ末端の［Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ］三残基の位置Ｙａａのヒドロキシル化の程度は、５０〜６５モル％の範囲にあると推定された。位置Ｘａａのプロリンは決してヒドロキシル化されなかったため、最初の３個の［Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ］三残基中のプロリンヒドロキシル化の全体のレベルは２５〜２８モル％であった。三残基のＸａａの位置のプロリンの低い発生率を伴う伸長においては、ヒドロキシル化の程度の平均がＹａａの位置で起こる程度（例えば５０〜６５モル％）に近づくことができることに注意されたい。上述されたアミノ酸分析は、洗浄された熱処理された細胞の４０〜８０％アセトン沈殿物中でのおよそ５０モル％のプロリンヒドロキシル化の全体の程度を示した。
【００６４】
０．１００という６００ｎｍでの光学密度を伴う２０ｍｌの振とうフラスコ培養物から単離された３８ｋＤａのタンパク質は、クマシー染色されたバンドの強度から推定されるとおり、約０．５μｇのタンパク質（すなわち低細胞密度の培養物１ｌあたり２５μｇの放出されるタンパク質）に対応した。配列決定クロマトグラムは、この量がエドマン分解の間に見出されるアミノ酸収量に対応したことを示した。
【００６５】
【表２】
2004516010.tif 000003
【００６６】
高細胞密度の供給バッチ醗酵におけるコラーゲン様タンパク質の分析
３８ｋＤのタンパク質はＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）の振とうフラスコ培養物から単離することができた（上述されるとおり）のみならず、しかしまたペプトンで補充された高細胞密度の供給バッチ培養物の細胞外培地中でも見出すことができた。醗酵培地のサンプルを醗酵の間に採取し、そして遠心分離および精密濾過による細胞の除去後にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図５）。
【００６７】
３８ｋＤのタンパク質は、クマシー染色されたバンドの強度から推定されるとおり、醗酵の終了時に約５０ｍｇ／Ｌの濃度で存在する。このタンパク質が振とうフラスコ培養物から単離されたものと同一であったことを確かめるために、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した（表３；表１もまた参照されたい）。事実、これは真実であるように思われた。
【００６８】
【表３】
2004516010.tif 000004
【００６９】
しかしながら、それは今やヒドロキシル化されなかった。醗酵の終了時に存在する総細胞外タンパク質のアミノ酸分析は、高いグリシンおよびプロリン含量（それぞれ１８および１０モル％）を示し、膠原タンパク質ドメインからの有意の全体的な寄与を示す。ヒドロキシプロリンは、事実、アミノ酸分析で存在しなかった。
【００７０】
振とうフラスコ培養物と対照的に、熱処理は、醗酵槽で成長された細胞からコラーゲン様タンパク質を単離することが明らかに必要でない。おそらく、該タンパク質は、醗酵槽中での攪拌による剪断力により細胞から機械的に放出される。
【００７１】
醗酵基礎塩培地を、供給バッチ醗酵実験でカゼイン加水分解物の代わりにペプトンで補充した場合、再度、３８ｋＤのタンパク質が培地中で見出された。Ｎ末端配列決定は、数個の連続する［Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ］三残基の同一の一次アミノ酸配列を示したが、しかし、三残基の最もＣ末端の位置のプロリンは今や４−ヒドロキシプロリンにヒドロキシル化された（表３）。複数のＮ末端の［Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ］三残基を含む同一の３８ｋＤのタンパク質がペプトンの存在に関係なく見出されたため、このタンパク質がペプトン由来であったという可能性は排除することができる。
【００７２】
成長培地に添加された補充物に対する誘導の特異性を検討するための表１に提示されるところの比較実験を、内因性のＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）のゼラチン産生について実施した。３８ｋＤａのバンドの分析は、１５ｋＤａの組換えのバンドの産生について得られたと同一の結果を示した。ペプトンおよび＜１０ｋＤａのペプトン画分の存在下でのみ、ヒドロキシプロリン残基が、構成的もしくはＭｅＯＨに誘導される発現に関係なく観察された。成長培地へのカザミノ酸、遊離の４−ヒドロキシプロリンもしくは遊離のアミノ酸の添加は、ヒドロキシプロリン残基の形成をもたらさなかった。
【００７３】
４−ヒドロキシプロリンは、３８ｋＤのタンパク質の［Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ］三残基の最もＣ末端の位置に独占的に存在するため、培地中の十分に分解されたペプトン由来の遊離の４−ヒドロキシプロリンがタンパク質合成の間に該タンパク質に取り込まれることは高度にありそうにない。こうした特異性は、プロリンのものと異なる４−ヒドロキシプロリンに特異的なコドン（１種もしくは複数）およびｔＲＮＡの存在を必要とするか、でなければコラーゲンをコードするｍＲＮＡもしくは新たに合成された完成していないタンパク質の伸長の配列の情況のリボソームに媒介される認識を必要とするかのいずれかとみられる。事実、対照実験は、遊離のヒドロキシプロリンの取り込みがコラーゲン生成物中のヒドロキシプロリンの存在の原因でないことを示した。従って、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（Ｖｕｏｒｅｌａら  １９９７）およびビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｖａｕｇｈａｎら  １９９８）についてのより早期の報告と対照的に、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）は、［Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ］配列のＹａａの位置のプロリンを部位特異的様式で４−ヒドロキシプロリンにヒドロキシル化する内因性のプロリン４−水酸化酵素を含有すると結論づけることができる。
【００７４】
Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）の内因性の酵素は、この生物体中で発現される組換えタンパク質のヒドロキシル化に使用されるかもしれないか、でなければ、該酵素は、異種宿主中での多様な組換えタンパク質基質のヒドロキシル化のためにこうした宿主中で組換え酵素として発現させてよい。
【図面の簡単な説明】
【図１】
発明にかかる、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）による組換えゼラチンの構成的発現。矢印は１５ｋＤａのゼラチン生成物を示す。
【図２】
発明にかかる、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）による組換えゼラチンのメタノールに誘導される発現。矢印は１５ｋＤａのゼラチン生成物を示す。
【図３】
発明にかかる、ＹＰＤ培地中で成長されたＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）細胞からのタンパク質のクマシーブリリアントブルーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ。Ｍ：低分子量タンパク質マーカー（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））。レーン１、７０℃での熱処理および細胞の除去後の上清；レーン２、４０％（容量）アセトンで沈殿されたタンパク質；レーン３、４０％沈殿物を除去しかつ４０％（容量）アセトン上清を８０％（容量）アセトンにした後に沈殿されたタンパク質。矢印は３８ｋＤａのコラーゲン様タンパク質を示す。
【図４】
発明にかかる、その中でＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）細胞が成長されたＹＰＤ培地のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。Ｍ：低分子量タンパク質マーカー（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））。レーン１、細胞の除去後のＹＰＤ培地；レーン２、培地の４０％（容量）アセトン沈殿物；レーン３、４０％沈殿物を除去しかつ４０％（容量）アセトン上清を８０％（容量）アセトンにした後に沈殿されたタンパク質。
【図５】
発明にかかる、ペプトンで補充された培地でのブドウ糖供給バッチ醗酵の間にＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）により産生された細胞外タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。１０μＬの培地上清を各ウェルに負荷した。レーン１、２、３：それぞれ醗酵の２４、４０および７０時間後。Ｍ：広範囲の正確なタンパク質標準（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））。３８ｋＤａの内因性タンパク質のバンドが観察される。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004516010.tif 000042
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