(57)【要約】【課題】【解決手段】本発明は微生物培養方法に関するものであり、培養液の酸化還元電位の低下を可能にするものであって、前記培養が空気と比較して水素及び／又は窒素を含む還元ガスによって得られた還元状態下で行われることを特徴とする。さらに本発明は代謝フローを修正しながら微生物を培養する方法に関するものである。本発明は特に食品分野に適用され、その中でもアルコール飲料の生産に適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養液の酸化還元電位を減少させることを可能にする微生物培養方法であって、水素及び／又は窒素を含有し、空気と比較して還元性のガスによって還元状態を得、この還元状態下で前記培養を行うことを特徴とする微生物培養方法。
【請求項２】
前記培養の間、代謝フローを修正することを可能にする微生物培養方法であって、水素及び／又は窒素を含有し、空気と比較して還元性のガスによって還元状態を得、この還元状態下で前記培養を行うことを特徴とする微生物培養方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、当該方法が酵母を使用した発酵から成ることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、アルコール度数の低い無炭酸飲料の生産を酵母を使用した発酵によって開放容器中、特に大桶中で行い、特にワイン関連飲料および蒸留飲料の生産を行うことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、グリセロール生産量が増加し、エタノール生産量が減少することを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、グリセロール／エタノール比が、還元状態下において１．５から５まで、好ましくは２から４まで増加することを特徴とする記載の方法。
【請求項７】
請求項３に記載の方法であって、炭酸アルコール飲料の生産を酵母を使用した発酵によって閉塞容器中、特にボトルまたはキャスク中で行い、特にセミスパークリングワイン、スパークリングワイン、シャンパン、リンゴ酒およびビールの生産を行うことを特徴とする方法。
【請求項８】
前記培養の間に生産された貯蔵糖、特にトレハロースおよびグリコーゲン量を増加させることを特徴とする請求項２または３に記載の方法。
【請求項９】
酵母の生産、特に、製パンのための酵母、食物酵母の生産、および酵母エキスの生産を行うことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
水素ガス下で微生物培養を行うことを特徴とする請求項１ないし９のいずれか記載の方法。
【請求項１１】
窒素ガス下で微生物培養を行うことを特徴とする請求項１ないし９のいずれか記載の方法。
【請求項１２】
水素および窒素の混合ガス下で微生物培養を行うことを特徴とする請求項１ないし９のいずれか記載の方法。
【請求項１３】
請求項１ないし９のいずれか記載の方法であって、微生物培養が空気と比較して水素及び／又は窒素並びに前記培養の見地から適格な補足ガスを含む還元状態下で行われることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、当該ガスが少なくとも０．５容積％の水素及び／又は窒素を構成し、好ましくは３容積％から５０容積％までの間の水素及び／又は窒素を構成することを特徴とする方法。
【請求項１５】
還元ガスが５容積％未満の水素含有量であることを特徴とする請求項１３および１４のいずれか記載の方法。
【請求項１６】
請求項１３ないし１５のいずれか記載の方法であって、補足ガスが不活性ガス、特にアルゴン、ヘリウムから選択され、そして酸素、二酸化炭素、亜酸化窒素、およびこれらを任意の比率で含む混合ガスから選択され、好ましくは二酸化炭素および酸素、並びにこれらの混合ガスから選択されることを特徴とする方法。
【請求項１７】
水素および二酸化炭素を含むガス下で微生物培養を行うことを特徴とする請求項１３ないし１６のいずれか記載の方法。
【請求項１８】
酵母がサッカロミセス属であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
水素及び／又は窒素を含有し、空気と比較して還元性のガスの使用方法であって、微生物培養液の酸化還元電位を減少させる使用方法。
【請求項２０】
微生物培養の間、代謝フローを修正する請求項１９に記載の使用方法。
【請求項２１】
酵母を使用した発酵過程中の請求項１９または２０に記載の使用方法。
【請求項２２】
請求項１９ないし２１のいずれか記載の使用方法であって、無炭酸飲料の生産をアルコール度数を下げつつ、酵母を使用した発酵によって開放溶液中、特に大桶中で行い、特にワイン関連飲料および蒸留飲料の生産を行う使用方法。
【請求項２３】
請求項１９ないし２１のいずれか記載の使用方法であって、生産グリセロール量を増加、および生産エタノール量を減少させるための使用方法。
【請求項２４】
グリセロール／エタノール比を還元状態下で１．５から５、好ましくは２から４までに増加させる請求項２３に記載の使用方法。
【請求項２５】
請求項１９ないし２１のいずれか記載の使用方法であって、炭酸アルコール飲料の生産を酵母を使用した発酵によって閉塞容器、特にボトルまたはキャスク中で行い、特にセミスパーリングワイン、スパークリングワイン、シャンパン、リンゴ酒およびビールの生産を行う使用方法。
【請求項２６】
前記培養の間に生産された貯蔵糖、特にトレハロースおよびグリコーゲン量を増加させる請求項１９ないし２１のいずれか記載の使用方法。
【請求項２７】
請求項１９ないし２１、および２６のいずれか記載の使用方法であって、酵母の生産、特に製パンのための酵母、食物酵母の生産、および酵母エキスの生産のための使用方法。
【請求項２８】
還元ガスが水素から成ることを特徴とする請求項１９ないし２７のいずれか記載の使用方法。
【請求項２９】
還元ガスが窒素から成ることを特徴とする請求項１９ないし２７のいずれか記載の使用方法。
【請求項３０】
還元ガスが水素および窒素の混合ガスから成ることを特徴とする請求項１９ないし２７のいずれか記載の使用方法。
【請求項３１】
請求項１９ないし２７のいずれか記載の使用方法であって、空気と比較して還元性のガスが水素及び／又は窒素と微生物を培養する見地から適切な補足ガスとを含むことを特徴とする使用方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の使用方法であって、還元ガスが少なくとも０．５容積％の水素及び／又は窒素、好ましくは３容積％から５０容積％までの間の水素及び／又は窒素を含むことを特徴とする使用方法。
【請求項３３】
還元ガスが５容積％未満の水素含量であることを特徴とする請求項３１または３２のいずれか記載の使用方法。
【請求項３４】
請求項３１ないし３３のいずれか記載の使用方法であって、補足ガスが不活性ガス、特にアルゴン、ヘリウムから選択され、そして酸素、二酸化炭素、亜酸化窒素およびこれらを任意の比率で含む混合ガスから選択され、好ましくは二酸化炭素および酸素、並びにこれらの混合体から選択されることを特徴とする使用方法。
【請求項３５】
還元ガスが水素および二酸化炭素を含むことを特徴とする請求項３１ないし３４のいずれか記載の使用方法。
【請求項３６】
請求項１ないし３、および８ないし１８のいずれか記載の方法によって得られた酵母、特に製パンのための酵母、食物酵母、および酵母エキス。
【請求項３７】
請求項１ないし８、および１０ないし１８のいずれか記載の方法によって得られたアルコール度数の低い無炭酸飲料、特にワイン関連飲料および蒸留飲料、炭酸アルコール飲料、特にセミスパークリングワイン、スパークリングワイン、シャンパン、ビールおよびリンゴ酒。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は微生物をガス流によって得られる還元状態下での微生物培養に関するものである。
【０００２】
さらに本発明は、食品生産の修正及び／又は制御を酵母を使用した発酵によって還元状態下で行い、例えばアルコール飲料、日用品およびこれに類する生産物の生産に関するものである。
【０００３】
本発明はまた、バイオマス（ｂｉｏｍａｓｓ）、特に酵母または酵母、食物酵母、共生酵母（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔｓ）の生産、および酵母エキスの生産に関するものである。
【０００４】
本発明はまた、活性物質の生産に関するものであり、特に製薬産業または獣医産業に有用である。
【０００５】
本発明は、酸化還元電位を微生物培養の間、特に酵母を使用した発酵の間、上記生産物の作成のために減少させることを可能にし、代謝フロー（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｆｌｏｗｓ）、そしてその結果としての組成及び／又は前記生産物の特性を修正及び／又は制御することを可能にする過程に密接に関係している。
【０００６】
【従来の技術】
酸化還元は細胞同化および異化反応中の主要な段階であり、その変化の方向は酸化還元電位（Ｅｈ）によって決定される。これは発酵状態のパラメーターであり、その変化は微生物の物理化学的環境を修正し、微生物の代謝活性および生理機能に影響を与える。
【０００７】
酵母は発酵飲料の生産に広く用いられている。
【０００８】
酵母において、発酵のレドックスバランスは通常はエタノール生産によって保たれている。さらに酵母はいくつかの発酵性糖を使用してバイオマスおよび二次生産物を合成する。この二次生産物の主要なものとしてグリセロールがあり、これはエタノールと水に次ぐワインの第三成分である。この生産は生合成に利用可能な還元補酵素量に依存している。糖発酵の間、エタノールおよびグリセロールの形成はレドックスバランスを維持するために重要である。
【０００９】
他の生産物は大量合成され、最終生産物の感受特性を修正する。それらは主に有機酸である。有機酸、例えばスクシネートまたはアセテートの発酵間形成はまた、レドックスバランスに影響を与える。スクシネートはシトレートおよびα−ケトグルタレートを介した酸化経路によって形成され、またはオキサロアセテートを介した還元経路によって形成される。発酵状態は不可欠のものである。アセテートはまたアセトアルデヒドからアルデヒドデヒドロゲナーゼによって形成される。
【００１０】
酵母はまた、発酵芳香を伴う揮発性化合物、すなわち高級アルコール、アルデヒドおよびエステルによって特徴づけられる。これらの生産物は炭水化物、脂質、および窒素代謝から誘導される。このために、これらの生産はまた、流れの分配の可能な修正に依存しており、その間レドックス電位の変化が生じる。
【００１１】
糖代謝から、酵母菌株はまた貯蔵オリゴ糖、例えばグリコーゲンおよびトレハロースを合成し、環境ストレスに応答することもある。前記２つのオリゴ糖は蓄積し、このとき炭素源は培養液中で枯渇し、菌株はもはや窒素源または硫黄源をもたない。またこの間熱ストレスまたは浸透ストレスをかける。
【００１２】
貯蔵糖は酵母の安定性および乾燥を向上させるために重要な役割を果たす。このため、この濃度は活性乾燥酵母の生産における決定的パラメーターとなる。実際には、乾燥サイクルの高温に耐えるために、グリコーゲンフラクションは維持エネルギーを細胞に提供し、他方ではトレハロースは細胞部位に対しては膜安定因子として使用される。乾燥中、酵母は大量のトレハロース（１０−１５乾燥重量％）を蓄積することができ、さらに乾燥酵母の質が細胞のトレハロース含有量と直接的な関係にあると考えられる。
【００１３】
残存脱水（Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｔｏ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）はトレハロースの合成と相関があり、再水和中、トレハロースは分解する。実際には、トレハロースは膜のリン酸基と結合し、水と置き換わることによって脱水中にリン酸基を安定化させる。貯蔵および保護因子として機能することに加えて、これらの糖は細胞周期の進行においてある役割を担っており、細胞は炭素制限下においては低成長率を示す。
【００１４】
現状の知識を考慮すると、レドックス電位の変化は生産物および、おそらく代謝中間体の分配をも修正することが可能である。
【００１５】
今まで、発酵培養液の酸化還元電位を修正するために、その手順は加熱処理（例えば低温殺菌）または追加の酸化還元添加因子（例えばアスコルビン酸、サルファイト（ｓｕｌｐｈｉｔｅｓ）およびその類似物質）のいずれかを伴うものである。
【００１６】
これらの方法は得られた生産物の特性を修正することができるにもかかわらず、課せられた基準のために、アグリ−フードスタッフ（例えばぶどう酒学）、製薬学、獣医学分野で菌株的に使用することができない。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は上記した不利な点を改善することであり、微生物を培養する方法を提供することである。この培養方法は細胞中で代謝フローを修正することを可能にし、培養液のレドックス電位を変える。
【００１８】
本発明の目的はまた、酵母を使用した発酵方法を提供することであり、これによりアグリ−フードスタッフへの応用、特にぶどう酒学、または製薬学または獣医学への応用が見込まれる。これは毒性がなく最終生産物に有害でないことを意味するものである。
【００１９】
本発明の別の目的は、発酵による生産方法を促進し単純化することを可能にする方法を提供することである。
【００２０】
本発明の目的はまた、貯蔵年数、特に酵素または酵母の貯蔵年数を向上することを可能にする方法を提供することである。
【００２１】
本発明の１つの目的はまた、発酵生産物、例えば低アルコール度数の飲料水（ワイン、ビール、およびそれに類するもの）を提供することであり、及び／又は修正された感覚刺激性特性を提供することである。
【００２２】
本発明の別の目的はまた、発酵、食品酵母または酵母エキスを提供することであり、これらは向上した特性を有し、特に貯蔵、栄養性及び／又は感覚受容性の観点からは向上した特性を有している。
【００２３】
最後に、本発明の主題は微生物を培養する方法であって、この方法は培養液の酸化還元電位を減少させることを可能にし、前記培養を還元状態下で行うことを特徴とする。この還元状態は空気と比較して還元性のガスによって得られるものであり、還元ガスは水素及び／又は窒素を含む。
【００２４】
さらに本発明の主題は微生物を培養する方法であって、アルコール度数の低い無炭酸飲料を生産する方法である。特にワイン飲料および蒸留飲料、炭酸アルコール飲料、特にセミスパークリングワイン、スパークリングワイン、シャンパン、ビールおよびりんご酒を生産する方法である。この生産は酵母、特にパン酵母、食物酵母、および酵母エキスによるものである。
【００２５】
本主題はまた、上記方法によって得られた生産物である。
【００２６】
本発明の主題はまた、ガス流によって得られた還元状態の使用であって、上記したように培養液の酸化還元電位を減少させて微生物を培養し、発酵生産物を作成することである。この発酵生産物はアグリ−フードスタッフ産業、製薬またはパラ製薬産業（ｐａｒａｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｙ）または獣医産業を対象としたものである。
【００２７】
本主題はまた、上記還元状態を使用して代謝フローを微生物培養中に修正することである。
【００２８】
本主題はまた、上記還元状態を使用して上記した生産物を作成することである。
【００２９】
【課題を解決するための手段】
本発明による方法はより詳細に以下に説明する。
【００３０】
本発明は実施され、かなり驚くことには、本発明は培養液のレドックス電位を変化して微生物培養を行うことを可能にし、その手段として空気と比較して還元性のガス流を用いる。還元ガス流とは例えば水素及び／又は窒素を含むガス流（空気と異なる）である。そして得られた還元状態は代謝フローを培養の間修正することを可能にした。
【００３１】
ここまで示してきたように、代謝フローを特定化合物の生産に向けて方向づけることを可能とし、及び／又は、その制御方法において、得られた生産物の特性を修正することを可能にした。
【００３２】
より具体的には、本発明は代謝フローまたは酵母発酵中の二次発酵の速度論を修正することを可能にし、これはぶどう酒学への適用と関連している。
【００３３】
ここまで示してきたように、微生物培養中に生産された貯蔵糖量をバイオマス生産のために増加させることを可能にした。
【００３４】
微生物の生存度を上に定めたような還元状態下で増加させることを可能にし、得られた酵素の貯蔵期間を延ばすことが可能になった。
【００３５】
本発明によると、“還元状態”とは空気と比較して還元性のガス流を用いて得られる状態をいい、培養液と接触して前記培養液の酸化還元電位を、前記ガス流のない状態、すなわち空気中、ないしはこれと等価な全ての状態での値と比較して減少させることができる。
【００３６】
本発明は実際の還元媒体中（レドックス電位は０未満）における培養である。またそれだけでなく、ガス流が初期酸化培養液の酸化還元電位を減少させることができる場合における培養である。それはたとえ前記ガス流を用いて達成される最終電位がそれ自体プラスのままであってもである（酸化培養液はこの場合において最終分析においても存在している）。
【００３７】
レドックス電位の値は特に培養液組成およびそのｐＨに依存していると想起される。参照はレドックス電位の低下を評価しており、この電位は同じ培養組成で近似のｐＨを有する本発明に従って得られる。
【００３８】
本発明の方法によれば、上記に定めたような還元状態は、空気と異なるガスを用いて得られ、および還元状態は後者よりもさらに還元している。それは微生物培養液において、従来の培養状態下で得られたものよりも小さいレドックス電位を得ることを可能にするという意味においてである。これを“還元状態”という表現を用いて定義している。この状態は水素もしくは窒素のみ、またはその混合形態で構成される。これは１つ及び／又は他のこれらのガスが補足ガスと呼ばれる１以上のガスと混合形態をとることを可能にする。ここでの補足ガスとは“培養の観点から受け入れられる補足ガス”をいう。
【００３９】
補助ガスは不活性ガス、特にアルゴン、ヘリウムから選択されるだけでなく、酸素、二酸化炭素および一酸化二窒素、並びに１以上のこれらのガスを任意の比率で混合したガスからも選択される。すなわち補助ガスは単一ガスからなるものと、混合ガスからなるものがある。
【００４０】
これは“培養の観点から受け入れられる”ものであると考えられる。それが否定的に後者に干渉しないという意味においてであり、それゆえに満足のいくものであって、微生物の発育を向上させる。
【００４１】
更にガスは考慮される適用分野（例えば、ぶどう酒学、食品学、製薬学または獣医学およびそれに類する分野）での基準や認可を満たすガスから選択される。これは実際には現在知られている基準を広げ、継続的に変化を与え、正式に新規化合物の出現および使用を認可することになる（例えば、現在オゾンの使用がフランスで認められている）。
【００４２】
補助ガスは好ましくは二酸化炭素もしくは酸素、およびこれらの混合体から選択される。
【００４３】
混合体が使用されたとき、ガス流は好ましくは少なくとも水素及び／又は窒素の０．５容積％を含み、より好ましくは水素及び／又は窒素の３容積％から５０容積％までの間である。
【００４４】
使いやすさおよび安全のために、水素含有量は好ましくは５％未満から選択される。
【００４５】
当然のことながら先行テキストを読んでいくと、ガス流の組成は使用された系および予想される用途によって変化し、および課される費用制約条件よっても変化する。１例として、水素／窒素混合体の優先使用について述べており、これは微生物培養のために行い、ぶどう酒学の適用を対象とし、またはバイオマスの生産を対象とし、または乳酸バクテリアの培養を対象としている。
【００４６】
典型的には、例えば、使用される微生物（酵母）の性質に応じてバイオマスの生産に水素／酸素混合体を使用することを言及することができる。
【００４７】
バイオマスの生産の間、貯蔵糖（特にグリコーゲン、トレハロース）の蓄積を促進するために窒素流のみを使用することを言及することができる。
【００４８】
本発明のとおりに、本方法は微生物を用いた従来の（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｌｙ）培養手順に従って行われる。
【００４９】
これは特に酵母を使用した発酵であり、または選択された用途（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）に従う微生物成長のための他の手順を使用して行われる。
【００５０】
上記ガス流と接触した培養液を運ぶ手段がさらに提供される。
【００５１】
本発明によるガスはそれ以前に適用され、及び／又はその間既知の手段によって微生物の生育を行う。
【００５２】
本発明による方法は連続的またはバッチ形式で行われ、後者の様式はしばしば産業的観点から選ばれる。
【００５３】
本用途の詳細を後にはっきりと示すように、本発明による方法は、微生物中の代謝フローを修正することを可能にする。“代謝フローの修正”とは、微生物培養中の生産の方向性を制御することを意味するものと理解できる。すなわち、可能な限り通常得られる他の生産物を犠牲にして特定生産物を得るだけでなく、これらの流れの特徴を修正し、特に生産率、適切な圧力増加、およびそれに類する要素の観点から行う。
【００５４】
言い換えれば、本方法は微生物培養中に前記代謝フローを方向づけおよび制御することを可能にし、最終的には従来状態下で同じ培養を行うことによって得られるものとは異なる組成を得ることが目的である。可能であれば、特定の新規物質（従来生産、すなわち本発明に基づく還元状態との接触のない状態中では通常は得られない物質）の生産を伴うものである。
【００５５】
本発明の方法はまた、代謝フローを修正することを可能にする。これは反応特性のレベルにおいてである。典型的には、閉鎖容器（例えばボトル）中で酵母を使用して行う発酵の場合について述べている。この容器中での二次発酵プロセスの速度は上記した還元状態下で向上することができる。
【００５６】
また、代謝フローの修正は生産された細胞中の貯蔵糖、特にトレハロースおよびグリコーゲンの蓄積に対応している。
【００５７】
本発明のさらなる特定用途を以下に示す。しかしながらこれに限るものではなく、あくまで例証に過ぎない。
【００５８】
本発明の１つの実施例によれば、本方法はぶどう酒学で使用される種類の微生物が適用される。これは無炭酸アルコール飲料（二次発酵はしない）の作製のためであり、例えばワイン関連飲料（ｗｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ｂｅｖｅｒａｇｅｓ）または蒸留飲料がある。
【００５９】
発酵は通常はサッカロミセス属の酵母の使用を伴い、主にタンク（開放容器）中、典型的にはバッチ形式で行われる。
【００６０】
本発明によって定められたような還元状態が使用されるとき、高グリセロール含有量の飲料が生産され、それは従来状態下で生産された同じ種類の飲料と比較して多く、すなわち培養液のレドックス電位は減少しない。
【００６１】
グリセロール生産の増加はエタノール生産を犠牲にして起こる。それはすなわち直接的に無炭酸低アルコール飲料を得ることを可能にし、その間抽出プロセスによって脱アルコールを避け、当該飲料を生産する。
【００６２】
本発明に基づく方法は、それゆえに特に低アルコール飲料、例えば低アルコールワインを基礎にした飲料の生産に適用する。この場合において、少なくとも５容積％のエタノール含有量を維持することが好ましい。これによってワインの香り・風味が回復し、消費者にも評価される。これは揮発性化合物の保持のためであり、これらのエタノール中の感覚を刺激する性質が原因である。
【００６３】
しかしながら本発明は、上記した閾値よりも低アルコール飲料の生産に適用される。この場合、新規官能的性質をもった低アルコール飲料の生産を可能にする。
【００６４】
本発明による方法はまた、飲料生産にも適用される。この飲料は同等のアルコール％をもって感覚を刺激する性質を、例えば蒸留飲料セクター中で向上する。
【００６５】
本発明による方法は十分に完全な回復および不揮発性化合物の非分解を可能にするという利点を有するだけでなく、特に従来の脱アルコール化といった処理方法で発生していた苦味の形成が無くなる。
【００６６】
本発明による方法は、すなわち発酵生産された飲料の特性を制御することを可能にする。特に感覚を刺激する性質およびアルコール度数という観点からである。それは特に飲料の通常の感覚を刺激する性質を保持または増強し、その間にアルコール度数を下げる。別の場合では、今までにない感覚を刺激する特性を有する飲料を生産することが可能となり、またはテキスチャーは従来方法では得ることができない。例えば高グリセロール含有量のワインの生産について述べている。このワインは“ロピー（ｒｏｐｙ）”ワインと呼ばれている。
【００６７】
本発明による方法は、すなわち酵母または酵母と同じ種類の微生物を使用したあらゆる種類の発酵に適用できる。ここでエタノール生産の減少、及び／又はグリセロール生産の増加が望まれる。
【００６８】
異なる実施例によって、本方法は酵母発酵に適用され、閉塞容器中で行われる（例えばボトルまたはキャスク）。これは二次発酵を伴う飲料の生産のためである。
【００６９】
それらは例えば主にサッカロミセス属の酵母による発酵を伴い、スパークリングワイン、ビールまたはリンゴ酒の生産を行う。
【００７０】
この場合において、本発明により定められた還元状態下では、二次発酵の速度を向上することができる。これはボトル中の圧力の増加（ｉｎｃｒｅａｓｅ）を加速させることによる。
【００７１】
それはシャンパン、スパークリングワイン、セミスパークリングワイン、ビールまたはリンゴ酒といった種類の飲料をより簡易にそして迅速な方法で作製することを可能にする。
【００７２】
本発明の他の実施例によれば、本方法は酵素、食品酵母、または酵母エキスの作製のための微生物に適用される。これらは食品分野で使用されるだけでなく医療分野または獣医分野でも使用される。
【００７３】
実施例として、サッカロミセス属およびカンジダ属の培養について述べている。これは酵素または製パンのための酵母の生産のためである。また、サッカロミセス属、クルイベロマイス（ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅ）属、およびカンジダ属の培養についても述べている。これは食品酵母の生産、特に、医薬または獣医用途（ｕｓｅ）のためである。および酵母エキス、すなわちラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、レウコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属およびストレプトコッカステルモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）属のバクテリアの培養について述べている。これは乳業で使用される乳酸菌の生産のためである。
【００７４】
本発明に基づくような定められた還元状態が使用されるとき、より多くの貯蔵糖、特にトレハロースおよびグリコーゲンが例えば生産される。
【００７５】
貯蔵糖の含有量は重要な因子であり、また活性乾燥酵母の生産中の決定的なパラメーターでもある。この酵母は前記酵母を脱水する方法によって得られる。
【００７６】
微生物の良好な生存可能性が本発明の還元状態下では同時に観察される。
【００７７】
それゆえに本方法によって、当該脱水酵母の生産を向上することができる。
【００７８】
食事療法分野でも適用することができる。乾燥食品酵母が自然食品の成分として有用であり、タンパク質、ビタミンＢおよびミネラル分に富んでいる。
【００７９】
また、製薬およびパラ製薬（ｐａｒａｐｈａｒｍａｃｙ）中で適用することができる。これは濃縮乾燥酵母が栄養サプリメント中に組み込まれ、特にそれらが含む微量元素の高い生物学的利用能を通して行われる。および酵母エキスは製薬発酵中で有用であるだけでなく、微生物中、特に成長培養液の作製のためでもある。
【００８０】
本発明による方法はまた、食品分野に適用することができる。自己分解酵母（ａｕｔｏｌｙｓｅｄ ｙｅａｓｔｓ）は特によく風味と合う成分であり、特に風味のよいスナックまたは香りのよいビスケットによく合う。酵母エキスはブイヨン、野菜スープおよびそれに関連する料理中には昔から入れられてきた成分であり、それだけでなく成長因子、ペプタイドおよびアミノ酸に富んだ成分でもあり、微生物を培養する方法として有用である。
【００８１】
本発明による方法は、生きた酵母を使用するあらゆる産業、例えばぶどう酒生産、醸造、りんご酒醸造、製パン産業だけでなく、製薬、パラ製薬、動物薬産業にまで適用することができ、特に、共生薬剤の迅速な発展を伴う。
【００８２】
本発明はすなわち上記に示した方法によって得られたあらゆる生産物に関係する。
【００８３】
本発明を以下に与えた実施例を用いて図示した。但しこれは本発明をここに示すものだけに制限するものではない。
【００８４】
図１は、異なるレドックス電位（Ｅｈ）によるエタノールおよびグリセロールの生産を示す図であって、条件は最小培養液上での連続発酵である。実施例１に示した。
【００８５】
図２ａから図２ｄ、および図３ａから図３ｄは、エタノールおよびグリセロールの収量をそれぞれ示したものであり、ガスの無い状態、および三つの異なる通気（４つの異なるレドックス電位）下でアルコール発酵を行う。実施例２に示した。
【００８６】
図４、５および図６は、エタノール生産、ボトル内圧力、およびアルコール％（二次発酵中の決定的なパラメーター）の経時変化をそれぞれ示している。条件としては二次発酵を伴うボトル中で発酵を行った。実施例３に示した。
【００８７】
図７および図８および図９は長期にわたるレドックス電位（Ｅｈ）、残余糖量のモニタリング、およびグリセロール生産のモニタリング（二次発酵の補助的パラメーター）をそれぞれ示したものである。条件としては二次発酵を伴うボトル中で発酵を行った。実施例３に示した。
【００８８】
図１０および図１１は貯蔵糖、グリコーゲンおよびトレハロースの定量分析を示した図である。最小培養液およびブドウ液培養液上でそれぞれレドックス電位（Ｅｈ）の関数として示している。実施例４に示した。
【００８９】
図１２および図１３は細胞の生育能力を示し、その間生理的塩類中およびワイン中でそれぞれ貯蔵する。実施例５に示した。
【００９０】
【発明の実施の形態】
実施例
Ｉ−本発明による還元状態の効果と発酵培養液の酸化還元電位の値
この実験のために、３つの種類のガス体、すなわち窒素のみのもの、水素を４％含む窒素／水素混合体、および水素のみのものを使用した。
【００９１】
これらの異なるガスの通気効果と無機培養液のレドックス電位（Ｅｈ）値の関係を調べた。以下に示す組成分はサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の生育に適している無機培養液である。
【００９２】
無機培養液の組成
蒸留水１Ｌあたりの量
（ＮＨ４）２ＳＯ４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５
ｇ
ＫＨ２ＰＯ４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３ｇ
ＭｇＳＯ４　７Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．５ｇ
ＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５ｍｇ
ＺｎＳＯ４　７Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４．５ｍｇ
ＣｏＣｌ２　６Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．３ｍｇ
ＣａＣｌ２　２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４．５ｍｇ
ＦｅＳＯ４　７Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３ｍｇ
ＮａＭｏＯ４　２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．４ｍｇ
Ｈ３ＢＯ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１ｍｇ
ＫＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｍｇ
消泡剤シリコン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０２５ｍｌ
エルゴステロール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｍｇ
Ｔｗｅｅｎ　８０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４２０ｍｇ
エタノール　１ｍＭ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４６ｍｇ
グルコース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２３ｇ
ビオチン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０５ｍｇ
カルシウムパントテナート　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１ｍｇ
ニコチン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１ｍｇ
イノシトール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５ｍｇ
チアミンＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１ｍｇ
ｐ−アミノ安息香酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．２ｍｇ
ピリドキシンＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１ｍｇ
ｐＨ＝４．１
次にブドウ液培養液（ぶどう酒醸造適用に相当）におけるこれらのガスの効果を調べた。
【００９３】
第１段階として、Ｅｈ値を無菌培養液（すなわち接種されていない培養液）上で調べ、第二段階として接種した培養液上で調べた。
【００９４】
ガスまたはガス混合体を発酵培養液中に通気しＥｈ値を得た。これらの実験は２５℃で行い、一定にとどまると考えられる培養液のｐＨで行った。
【００９５】
表１に最小培養液上で得られたレドック電位（Ｅｈ）の値を示した。
【００９６】
【表１】
2004502424.tif 000002
表２にブドウ液培養液上で得られたレドックス電位（Ｅｈ）の値を示した。
【００９７】
【表２】
2004502424.tif 000003
比較として、従来状態（ガス流がない状態）下での無菌ブドウ液培養液の電位は４００ｍＶである。
【００９８】
ＩＩ−本発明による還元状態の効果と発酵の代謝フロー
実施例１：最小培養液における実験
本実験はサッカロミセスセレビシエＣＢＳ８０６６菌株を使用した。この菌株は無機培養液（グルコースを制限し、実施例Ｉに与えた組成に相当するビタミンおよび不飽和脂肪酸を補足したもの）中で生育させた。酵母は嫌気状態下で連続培養され、温度は３０℃と一定に保ち、ｐＨ５に維持した。希釈率Ｄ（液体容量あたりの供給率は０．０５ｈ−１から０．３ｈ−１までと読み取られた。
【００９９】
Ｅｈとして３つの値、すなわち１００ｍＶ、−１００ｍＶおよび−３００ｍＶを適用し、異なるガスを使用した。
【０１００】
発酵中における代謝フローの変更を代謝フローの分布の定量分析によって求めた。
【０１０１】
観察結果を図１に示した。Ｄ＝０．１ｈ−１での各Ｅｈ値状態におけるエタノールおよびグリセロール量（ｇ／ｌ）を示した。還元培養液中では炭素の流れ（ｃａｒｂｏｎ ｆｌｏｗ）はエタノール生産を犠牲にしてグリセロール生産へ偏向した。
【０１０２】
代謝産物−基質化学量論のモニタリングによって得られたこの結果を表３に示した。
【０１０３】
この表に示された結果に照らしてみると、還元状態（水素ガスおよび水素／窒素混合体）下において、グリセロール合成が酸化状態（窒素通気）と比較して増加し、このときエタノール合成は犠牲にされ大幅に減少している。これらの状態下で、窒素下での発酵から水素下での発酵に移行したとき、グリセロール／エタノール比は倍になる。
【０１０４】
実施例２：ブドウ液培養液における実験
本実験はサッカロミセスセレビシエＲＣ２１２のブドウ酒菌株を使用した。発酵はブドウ液培養液（およそ１６５ｇ／ｌの発酵性糖を含有）においてバッチ式で１４５時間行い、温度は２５℃に維持した。これは産業的培養液であって、物理化学的な性質および栄養物質の濃度は無機培養液とは異なる。この培養液は高濃度の糖、およびバランスのとれたグルコース−フルクトース混合液で構成された基質で現象を再現させる可能性を有している。この実験はバッチ培養で現象を制御することを可能にする。
【０１０５】
４つのレドックス電位（Ｅｈ）状態で試験を行い、以下のリアクター、
ガス通気なしのリアクター（図２ａおよび図３ａ）
窒素を通気したリアクター（図２ｂおよび図３ｂ）
窒素／水素を通気したリアクター（図２ｃおよび図３ｃ）
水素を通気したリアクター（図２ｄおよび図３ｄ）
を使用した。
【０１０６】
長期にわたり、バイオマス、ｐＨ、Ｅｈの変化、エタノールおよびグリセロールの生産、並びに残余糖量をモニターした。
【０１０７】
本結果は３回繰り返したその平均値を示している。
【０１０８】
エタノールに関しては図式２ａから図２ｄ中に図示し、グリセロールに関しては図式３ａから図式３ｄに図示した。
【０１０９】
ブドウ液中の糖濃度は変化する（ブドウ栽培品種に依存した１５０ｇ／ｌから３５０ｇ／ｌまでの液）。得られた結果は、形成エタノール／発酵糖（ｍｏｌ／ｍｏｌ）比および形成グリセロール／発酵糖（ｍｏｌ／ｍｏｌ）だけでなくグリセロール／エタノール比を考慮して解釈すべきである。
【０１１０】
この代謝産物−糖化学量論の分析によって、恒成分培養槽中の最小培養液の実験におけるように、エタノール経路を犠牲にしてグリセロール経路に偏向することを確認した。このとき酵母は還元状態下にある。
【０１１１】
このような結果はぶどう酒造りへの適用との関連において、発酵飲料を低アルコール度数で生産することを可能にし、その間グリセロール生産を維持する（または増加する）。グリセロールはこくのあるワインを作る。
【０１１２】
代謝産物−基質化学量論のモニタリングによって得られたこの結果を表３に示した。
【０１１３】
（１）恒成分培養槽中の発酵（Ｄ＝０．１ｈ−１、最小培養液（２３ｇ／ｌのグルコース）：実施例１）
（２）ブドウ液におけるバッチ発酵（１００時間（１６５ｇ／ｌの発酵糖））：実施例２）
収量を方向性回帰係数として図２ａから図２ｄおよび図３ａから図３ｄまでに示した。
【０１１４】
図式２ａ：ｙ＝１．７９ｘ−１０５．００；収率＝９４％
図式２ｂ：ｙ＝１．２９ｘ−２３．４７；収率＝９３％
図式２ｃ：ｙ＝０．９１ｘ−４５．９２；収率＝９６％
図式２ｄ：ｙ＝０．８５ｘ−７２．４２；収率＝８８％
図式３ａ：ｙ＝０．０６ｘ−３．５１；収率＝９８％
図式３ｂ：ｙ＝０．１０ｘ−６．９２；収率＝９５％
図式３ｃ：ｙ＝０．０９ｘ−４．４６；収率＝９３％
図式３ｄ：ｙ＝０．１１ｘ−８．０８；収率＝９４％
比較のために、この表にはミクニック（Ｍｉｃｈｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９９７ （Ｙｅａｓｔ， ｖｏｌ．１３， ７８３−７９３））、およびオウラ（Ｏｕｒａ， １９７７ （Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ．４， １９−３５））によってリポートされた値を先行技術として示してある。２番目の参照文献は５人の異なる著者による要約に対応するものである。
【０１１５】
【表３】
2004502424.tif 000004
実施例３：シャンパン培養液における実験
ぶどう酒の開始酵母菌株にはサッカロミセス属のものが使用される。この培養液は糖分に富んだアルコール飲料を補足したワインを基礎としたものから成る。
【０１１６】
４つのＥｈ状態で試験を行い、以下のボトリング、
ガス通気なしのボトリング
窒素通気をを伴うボトリング
窒素／水素通気を伴うボトリング
水素通気を伴うボトリング
を使用した。
【０１１７】
（６週間）経過後、Ｅｈの変化、エタノールおよびグリセロール生産、酵母細胞の生存度、圧力変化および残余糖量（グルコース＋フルクトース）をモニターした。
【０１１８】
二次発酵を評価する決定的パラメーターのモニタリング
これは実際、エタノール生産および圧力変化の測定並びに得られたアルコール度数の計算を伴う。
【０１１９】
図式４、５および６中に表わされた曲線に照らしてみると、３週間後に観察された。１２．５％はボトル中で試験されたＥｈ状態に関係なく得られた。この値は法律によればあらゆるシャンパンの製造のために必要であると想起される。
【０１２０】
補助的パラメーターのモニタリング
これはＥｈの測定、並びにグリセロール量および残余糖量の測定を伴う。
【０１２１】
図式７を参照とすると、６週間にわたるＥｈの測定は、その値が長期にわたりボトル中で維持されるということを結論づけることを可能にする。
【０１２２】
残余糖量に関しては、図式８の曲線に照らしてみると、試験されたＥｈ状態に依存しており、酵母による糖の消費は同じようには起こらない。還元状態下に置かれたこの菌株は酸化環境下よりも急速に発酵性糖を消費する。
【０１２３】
最後に、図式９を参照すると、グリセロールの生産は実質的には適用された異なる状態によって変化しないことが解る。
【０１２４】
この実験はボトル中での発酵の間の生産物の物理化学的変化を示している。Ｅｈの修正のために異なる還元状態を使用する。
【０１２５】
ＩＩＩ−本発明による還元状態の効果と貯蔵糖の含有量
実施例４：最小培養液の実験
サッカロミセスセレビシエＣＢＳ８０６６はグルコース制限無機培養液においてバッチ式で生育させた。この培養液組成は実施例Ｉで与えられた組成と一致し、３０℃、３００ｒｐｍ（回転／分）で撹拌した。
【０１２６】
２つのＥｈ状態で試験を行い、以下のリアクター
窒素通気下でのリアクター
水素通気下でのリアクター
を使用した。
【０１２７】
生育を１４時間行い、トレハロースおよびグリコーゲンのアッセイを行うために細胞サンプルを集めた。この手順はＰａｒｒｏｕ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｏｉｓ， １９９７ （Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ． ２４８， １８６−１８８）に従った。
【０１２８】
この示された結果は２つのアッセイの手段に相当する。
【０１２９】
酵母細胞内部の貯蔵糖の蓄積の定量分析を図式１０に示す。図式１０は、還元状態下において、本発明によれば、その菌株は貯蔵オリゴ糖を合成し、その量は酸化状態下でのものと比較して多いことを示している。これは物理化学的環境の修正に応じている。
【０１３０】
実施例５：ブドウ液培養液の実験
本実験ではブドウ酒菌株のサッカロミセスセレビシエＲＣ２１２を使用した。発酵はバッチ式で１４５時間、およそ１６５ｇ／ｌの発酵性糖を含むブドウ液培養液上で行い、温度は２５℃に維持した。
【０１３１】
４つのＥｈ状態で試験を行い、以下のリアクター
ガス通気のないリアクター
窒素通気を伴うリアクター
窒素／水素通気を伴うリアクター（本発明による状態）
水素通気を伴うリアクター（本発明による状態）
を使用した。
【０１３２】
細胞がトレハロースおよびグリコーゲンのアッセイのためにアルコール発酵の１２８時間後に集められ、事実上は全ての発酵性糖が消費された（およそ９９．９％）。
【０１３３】
細胞の生存度はメチレンブルーを用いて長期にわたって測定した。集められたサンプルはその後４℃で特別の注意を払うことなく貯蔵された。細胞の一部は生理食塩水に入れ、その他の細胞を集められたワイン培養液中に入れた。生存度を長期にわたりモニターした。
【０１３４】
トレハロースおよびグリコーゲンのアッセイ
本結果は２回繰り返したその平均値を示している。
【０１３５】
図式１１に図示された定量的分析から、酵母は酸化状態下よりも本発明に基づく還元状態下であるときに貯蔵糖をより蓄積することが解る。
【０１３６】
この蓄積は窒素下に置かれた培養液上で最適であることが観察された。しかし非還元ガスは培養液のレドックス電位を低下に導いた。これはガス（窒素）がない場合のレドックス電位の値と比較したものである。
【０１３７】
長期にわたる生存度のモニタリング
図式１２および１３に与えられた曲線に照らしてみると、生存度は、窒素／水素下に置かれたリアクターから生じた細胞において最適であることがわかる。この場合において、この混合体と一致するＥｈ値は最も最適であるように見え、酵母細胞の長期にわたるよりよい貯蔵をすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
各Ｅｈ値におけるエタノールおよびグリセロールの生産（Ｄ＝０．１ｈ−１）を示す図。
濃度（ｇ／ｌ）
エタノール　グリセロール
形成アルコール
【図２ａ】
ガス通気なしでのエタノール収量を示す図。
エタノール生産（ｍＭ）
【図２ｂ】
窒素通気下でのエタノール収量を示す図。
エタノール生産（ｍＭ）
グルコース＋フルクトース消費（ｍＭ）
【図２ｃ】
窒素／水素通気下でのエタノール収量を示す図。
エタノール生産（ｍＭ）
グルコース＋フルクトース消費（ｍＭ）
【図２ｄ】
水素通気下でのエタノール収量を示す図。
エタノール生産（ｍＭ）
グルコース＋フルクトース消費（ｍＭ）
【図３ａ】
ガスなしでのグリセロール収量を示す図。
グリセロール生産（ｍＭ）
グルコース＋フルクトース消費（ｍＭ）
【図３ｂ】
窒素通気下でのグリセロール収量を示す図。
グリセロール生産（ｍＭ）
グルコース＋フルクトース消費（ｍＭ）
【図３ｃ】
窒素／水素通気下でのグリセロール収量を示す図。
グリセロール生産（ｍＭ）
グルコース＋フルクトース消費（ｍＭ）
【図３ｄ】
水素通気下でのグリセロール収量を示す図。
グリセロール生産（ｍＭ）
グルコース＋フルクトース消費（ｍＭ）
【図４】
４週間にわたるエタノール生産のモニタリングを示す図。
週数
Ｎ２パッケージング
Ｎ２／Ｈ２パッケージング
Ｈ２パッケージング
【図５】
６週間にわたるアルコール％のモニタリングを示す図。
圧力（ｂａｒ）（１６℃）
週数
ガスなし
Ｎ２パッケージング
Ｎ２／Ｈ２パッケージング
【図６】
４週間にわたるアルコール％のモニタリングを示す図。
アルコール％
週数
ガスなし
Ｎ２パッケージング
Ｎ２／Ｈ２パッケージング
Ｈ２パッケージング
【図７】
６週間にわたるＥｈ値のモニタリングを示す図。
Ｅｈ（ｍＶ）
週数
ガスなし
Ｎ２パッケージング
Ｎ２／Ｈ２パッケージング
Ｈ２パッケージング
【図８】
６週間にわたる残余糖量のモニタリングを示す図。
グルコース＋フルクトース（ｇ／ｌ）
週数
Ｎ２パッケージング
Ｎ２／Ｈ２パッケージング
Ｈ２パッケージング
【図９】
４週間にわたるグリセロール生産のモニタリングを示す図。
グリセロール量（ｇ／ｌ）
ガスなし
Ｎ２パッケージング
Ｎ２／Ｈ２パッケージング
Ｈ２パッケージング
【図１０】
培養液中の２つのＥｈ状態における貯蔵糖量を示す図。
乾燥重量（ｍｇ／ｇ）
トレハロース　　グリコーゲン
窒素下
水素下
【図１１】
４つのＥｈ状態における貯蔵糖量を示す図。
乾燥重量（ｍｇ／ｇ）
トレハロース　　グリコーゲン
ガスなし
窒素下
窒素／水素下
水素下
【図１２】
生理食塩水貯蔵中の細胞生存度（％）を示す図。
細胞生存度（％）
日数
ガスなし
窒素下
窒素／水素下
水素下
【図１３】
ワイン貯蔵中の細胞生存度（％）を示す図。
細胞生存度（％）
日数
ガスなし
窒素下
窒素／水素下
水素下
【図１】
2004502424.tif 000005
【図２ａ】
2004502424.tif 000006
【図２ｂ】
2004502424.tif 000007
【図２ｃ】
2004502424.tif 000008
【図２ｄ】
2004502424.tif 000009
【図３ａ】
2004502424.tif 000010
【図３ｂ】
2004502424.tif 000011
【図３ｃ】
2004502424.tif 000012
【図３ｄ】
2004502424.tif 000013
【図４】
2004502424.tif 000014
【図５】
2004502424.tif 000015
【図６】
2004502424.tif 000016
【図７】
2004502424.tif 000017
【図８】
2004502424.tif 000018
【図９】
2004502424.tif 000019
【図１０】
2004502424.tif 000020
【図１１】
2004502424.tif 000021
【図１２】
2004502424.tif 000022
【図１３】
2004502424.tif 000023
【国際公開パンフレット】
2004502424.tif 000024
2004502424.tif 000025
2004502424.tif 000026
2004502424.tif 000027
2004502424.tif 000028
2004502424.tif 000029
2004502424.tif 000030
2004502424.tif 000031
2004502424.tif 000032
2004502424.tif 000033
2004502424.tif 000034
2004502424.tif 000035
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2004502424.tif 000037
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2004502424.tif 000040
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2004502424.tif 000057
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2004502424.tif 000059
2004502424.tif 000060
2004502424.tif 000061
2004502424.tif 000062
2004502424.tif 000063
2004502424.tif 000064
【国際調査報告】
2004502424.tif 000065
2004502424.tif 000066
2004502424.tif 000067
2004502424.tif 000068
2004502424.tif 000069
2004502424.tif 000070