(57)【要約】本発明は一般に、インスリン感作性抗糖尿病性チアゾロジンジオンに結合する、ミトコンドリア膜に由来するポリペプチド群、及び該ポリペプチド群をコードする核酸配列に関する。本発明は、本発明のポリペプチドに結合する治療薬を同定する方法に関する。本発明はさらに、このような生物学的効果を必要とする哺乳動物において代謝障害を治療又は調節するのに有用な方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトNEET関連代謝機能不全疾患又は状態の治療、予防又は診断に有用な化合物を同定する方法であって、前記化合物がミトNEETと直接的に相互作用するかどうかを測定するステップを含む前記方法。
【請求項２】
前記ミトNEET関連代謝機能不全疾患又は状態が、代謝機能不全、糖尿病、ブドウ糖耐性異常、肥満、心臓血管障害、癌又は腫瘍、神経変性障害、又は炎症性障害から成る群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記方法が、インスリン非依存性糖尿病の治療、予防又は診断に有用な化合物を同定するために行われる、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記方法が、アルツハイマー病又はパーキンソン病の治療、予防又は診断に有用な化合物を同定するために行われる、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
該化合物がミトNEETと直接的に相互作用するかどうかを測定するステップにおいて、該ステップが、標識付きチアゾロジンジオン類似体の特異結合を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記標識付きチアゾロジンジオン類似体がPPARγ節約型である、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記チアゾロジンジオン類似体が、4-アジド-N-[2-(｛[6-(2-｛4-[(2,4-ジオキソ-1,3-チアゾリジン-5-イル)メチル]フェノキシ｝エチル)ピリジン-3-イル]アセチル｝アミノ)エチル]-2-ヒドロキシベンズアミドである、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
ミトNEET関連代謝機能不全疾患又は状態を治療又は予防する方法であって、該治療又は予防を必要とする哺乳動物に、請求項1に記載の方法によって同定された治療上有効量の化合物を投与することを含む前記方法。
【請求項９】
前記ミトNEET関連代謝機能不全疾患又は状態が、糖尿病、ブドウ糖耐性異常、肥満、心臓血管障害、癌又は腫瘍、神経変性障害、又は炎症性障害から成る群から選択される、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、インスリン非依存性糖尿病、アテローム性動脈硬化、高血圧、アルツハイマー病又はパーキンソン病の治療のために行われる、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
ミトNEETポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体。
【請求項１２】
哺乳動物細胞のミトNEET関連代謝機能不全疾患又は状態と相関する示差発現遺伝子を検出する方法であって、該方法が、ミトNEET関連代謝機能不全疾患又は状態から生じたと疑われる細胞に由来する試験試料中で、ミトNEET核酸配列によってコードされた1種以上の示差発現遺伝子生成物を検出するステップを含み、示差発現生成物が検出されると、このことは、該試料が由来する該細胞のミトNEET関連代謝機能不全疾患又は状態と相関されることを特徴とする前記方法。
【請求項１３】
患者における代謝障害の進行をモニタリングする方法であって、該方法が：
a)  最初の時点で、患者試料中で、分離されたミトNEETポリペプチドであるマーカーの発現を検出し；
b)  後続の時点で、ステップa)を繰り返し；そして
c)  ステップa)及びb)で検出された発現のレベルを比較し、そしてこれから、該代謝障害の進行をモニタリングする
ことを含むことを特徴とする前記方法。
【請求項１４】
代謝障害を直すための試験化合物の有効性を評価する方法であって、該方法が：
a)  該試験化合物に暴露された、患者から得られた第1試料中での、分離ミトNEETポリペプチド又は関連ポリペプチドであるマーカーの発現と、
b)  該試験化合物に暴露されない、該患者から得られた第2試料中での該マーカーの発現と
を比較することを含み、
該第2試料に対して、該第1試料中でのマーカーの発現レベルが有意に低い場合、このことは、該試験化合物が治療にとって有効であることを示すことを特徴とする、前記方法。
【請求項１５】
患者におけるミトNEET関連代謝機能不全疾患又は状態を治療、予防又は診断するための化合物を選択する方法であって、該方法が：
(a)  前記患者から試料細胞を得；
(b)  複数の試験化合物の存在において、該試料のアリコートを別個に暴露し；
(c)  該アリコートのそれぞれにおける、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及びSEQ ID NO:6のマーカーから成る群から選択されたマーカーの発現、又は該マーカーの翻訳後修飾を比較し、そして
(d)  当該試験化合物を含有するアリコート中での該マーカーの発現レベルを、他の試験組成物に対して変化させる試験化合物のうちの1つを選択する
ことを含むことを特徴とする、前記方法。
３
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般に、インスリン感作性抗糖尿病性チアゾロジンジオンに結合する、ミトコンドリア膜に由来するポリペプチド群、及び該ポリペプチド群をコードする核酸配列を同定することに関する。本発明は、本発明のポリペプチドに結合する治療薬を同定する方法に関する。本発明はまた、アンチセンス分子に関する。本発明はさらに、このような生物学的効果を必要とする哺乳動物において代謝障害を治療又は調節するのに有用な方法に関する。これはミトNEET関連代謝機能不全疾患又は状態の診断、治療又は予防を含む。これらの疾患又は状態の一例としては、PPARγ関連疾患又は状態、糖尿病、「代謝症候群」又は症候群X、心臓血管疾患、神経変性疾患、癌及び炎症性疾患であると考えられる疾患又は状態が挙げられる。本発明はまた、このようなポリペプチドに対する特異性を有する抗体に関する。加えて、本発明はさらに、代謝障害、腫瘍障害、炎症性障害及び心臓血管障害を含む広範囲の病状の治療又は予防のために、本発明のポリペプチドに対する抗体を診断プローブとして又は治療薬として使用すること、並びに、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を診断プローブとして又は治療薬として使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
インスリン非依存性糖尿病(NIDDM)又はII型糖尿病は、骨格筋、肝臓及び脂肪を含む周辺組織のインスリン抵抗性を特徴とする。その結果として生じる高血糖はしばしば脂質代謝不全を伴う。このような脂質代謝不全は、心臓血管の合併症、例えばアテローム性動脈硬化及び高血圧を招くおそれがある。
【０００３】
チアゾリジンジオンは、構造的に関係する抗糖尿病性化合物から成る群であり、この化合物群は、インスリン抵抗性動物における標的組織(骨格筋、肝臓及び脂肪)のインスリン感受性を増大させる。高血糖に対するこれらの効果に加えて、チアゾリジンジオンはまた、NIDDM動物モデルにおける脂質及びインスリン・レベルを低減する。チアゾリジンジオンであるトリグリタゾン、ロシグリタゾン及びピオグリタゾンは、NIDDMの発生に先立つ代謝状態であるブドウ糖耐性障害のヒト患者においても、NIDDM患者におけるの同じこれらの有益な効果を有することが判っている(例えばNolan他、N. Eng. J. Med. 331, 1188-1193, 1994)。これらの作用メカニズムは不明のままであるが、チアゾリジンジオンがインスリン分泌、或いは、インスリン受容体結合部位の数又はアフィニティを増大させる原因とはならないことは知られている。このことは、チアゾリジンジオンがインスリン・シグナル伝達系における後受容体事象を増幅することを示唆する｛Colca及びMorton, New Antidiabetic Drugs(C. J. Bailey及びP.R. Flatt編)、Smith-Gordon, New York, 255-261, 1990, Chang他、Diabetes 32:839-845, 1983｝。
【０００４】
チアゾリジンジオンは、培養された前脂肪細胞系における分化の有効なインデューサーであることが判っている(Hiragun他、J. Cell Physiol. 134;124-130, 1988; Sparks他、J. Cell. Physiol. 146:101-109, 1991; Kletzien他、Mol. Pharmacol. 41:393-398, 1992)。前脂肪細胞系をチアゾリジンジオン、ピオグリタゾンで処理すると、脂肪細胞特異的遺伝子aP2及びアジプシン、並びにグルコース輸送タンパク質GLUT-1及びGLUT-4の発現が増大する。これらのデータは、in vivoで見られるチアゾリジンジオンの低血糖効果を、脂肪組織を介して提供できることを示唆している。しかし、全身のグルコース利用に対する脂肪組織の関与の推定値は1〜3%にすぎないので、脂肪細胞の変化によって、チアゾリジンジオンの低血糖効果を説明できるかどうかは不明のままである。さらに、脂肪組織は、これらの化合物の薬理学的特性にとって必要とならない場合がある(Burant他、J Clin Invest 100:2900-2908, 1997)。加えて、チアゾリジンジオンは食欲調節障害(国際公開第94/25026号パンフレット参照)、及び骨髄脂肪細胞含量の増大(Williams他、Diabetes 42,補足1,p.59A 1993)にも関与している。
【０００５】
ペルオキシソーム増殖因子活性化型受容体γ(PPARγ)は、リガンド活性化型転写因子のステロイド/甲状腺/レチノイド上科のオーファン員である。PPARγは、独立した遺伝子によってコードされた密接に関連しあうPPAR亜科の1つである(Dreyer他、Cell 68:879-887, 1992; Schmidt他、J. Cell Physiol. 146:101-1091992; Zhu他、J. Biol. Chem. 268:26817-26820, 1993; Kliewer他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7335-7359, 1994)。3種の哺乳動物PPARが同定され、PPARα, γ及びNUC-1と呼ばれている。PPARα及びγの同族体がカエル、Xenopus laevisにおいて同定されているが、PPARβと称される第3Xenopus PPARはNUC-1同族体ではなく、このことはいずれか又は両方の種に付加的なサブタイプがあり得ることを示唆することになる。
【０００６】
PPARは、高濃度(マイクロモル)の長鎖脂肪酸及びペルオキシソーム増殖因子(Isseman及びGreen, Nature 347, 645-650, 1990; Gottlicher, Proc. Natl. Acad. USA 89, 4653-4657, 1992)によって種々の程度にまで活性化される。ペルオキシソーム増殖因子は、除草剤、フタル酸塩可塑剤及び脂質低下薬のフィブレート・クラスを含む構造的に多様な化合物群である。これらのデータはPPARが真正な受容体であることを示唆するが、これらのPPARは「オーファン」のままである。それというのもこれらの化合物のうち、PPARと直接的に相互作用することが判っているものはないからである。
【０００７】
PPARは、レチノイドX受容体を有するヘテロダイマーとして、PPAR応答要素(PPRE)と呼ばれるDNA配列要素に結合することにより、標的遺伝子の発現を調節する(Keller及びWhali、Trends Endocrin. Met. 4:291-296, 1993において検討)。今日まで、PPREは、脂質代謝を調節するタンパク質をコードする多数の遺伝子のエンハンサーにおいて同定されている。これらのタンパク質は、脂肪酸のペルオキシソーム・ベータ酸化に必要とされる3種の酵素、中鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ、ミトコンドリア・ベータ酸化における主要酵素、及びaP2、専ら脂肪細胞中に発現される脂質結合タンパク質を含む。脂肪酸及び脂質低下薬によるPPARの活性化と結びつくPPAR標的遺伝子の性質は、脂質ホメオスタシスにおけるPPARの生理的役割を示唆する(Keller及びWhali, Trends Endocrin. Met. 4:291-296, 1993)。
【０００８】
PPARγ2と呼ばれるPPARγの第2イソ型が、マウス脂肪細胞ライブラリーからクローニングされた(Tontonoz他、Genes & Dev. 8, 1224-1234, 1994)。PPARγ1及びγ2は、受容体のN-最末端のわずか30個のアミノ酸だけが異なっており、おそらくは単独の遺伝子から生じる。PPARγ2は際立って脂肪特異的に発現され、そしてその発現は、いくつかの前脂肪細胞系の分化経過中に顕著に誘発され；さらに、PPARγ2の強制的な発現は、非脂肪細胞系中の脂肪細胞特異的ap2エンハンサーを活性化するのに十分であることが判った。これらのデータは、PPARγ2が脂肪細胞分化において重要な役割を演じることを示唆する。
【０００９】
チアゾリジンジオン、ピオグリタゾンは、クロロアムフェニコルアセチル・トランスフェラーゼ・リポーター遺伝子の上流で、脂質結合タンパク質aP2のエンハンサー/プロモーターを含有するキメラ遺伝子の発現を刺激することが報告されている(Harris 及びKletzien, Mol. Pharmacol. 45:439-445, 1994)。欠失分析により、ピオグリタゾン応答の原因となるほぼ30bp領域を同定した。興味深いことに、独立した研究において、この30bpフラグメントはPPREを含有することが判っている(Tontonoz他、Genes & Dev. 8, 1224-1234, 1994)。まとめて述べるならば、これらの研究は、チアゾリジンジオンが、PPARとの相互作用によって転写レベルでの遺伝子発現を調節する可能性を示唆した。
【００１０】
インスリン感作性チアゾリジンジオンは、乳癌、大腸癌、膵臓癌、及び肝臓癌における潜在的抗癌剤としての効果を示した(例えばMueller, E.他、Molecular Cell(1998), 1(3), 465-470; Tanaka, T.他、Cancer Research (2001), 61(6), 2424-2428; Itami,他、International Jounal of Cancer (2001), 94(3), 370-376; Goeke, R他、Digestion (2001), 64(2), 75-80;Okano, H他, Anti-Cancer Drugs(2002), 13(1), 59-65;及びWO/0243716)。
【００１１】
現存の証拠が示唆するところによれば、核受容体との単純な直接的相互作用では、これらの有望な薬剤の薬理学的特性を説明することはできない。PPAR核受容体を直接に標的とすることによって、薬理学的特性に改善を加えようという試みは、成功するかどうかまだ明らかにされていない。付加的な作用部位が該当することもあり得る。我々は、チアゾリジンジオンがミトコンドリアにも直接的に結合することを示し、そして光アフィニティ・プローブを使用して、この相互作用のための潜在的標的として、「ミトNEET（mitoNEET）」と呼ばれる17kDaのタンパク質に標識付けした。
【００１２】
特徴付けされていない造血幹細胞/前駆細胞タンパク質(MDS029)として記載されたヒト・ポリペプチドの相同アミノ酸及び核酸配列が開示されている(Genbank 寄託番号NM_018464)。
【００１３】
特徴付けされていないマウス・ポリペプチドの相同アミノ酸及び核酸配列が開示されている(Genbank 寄託番号NM_134007)。
【発明の開示】
【００１４】
発明の概要
本発明の1実施態様は、分離されたミトコンドリア膜ポリペプチド群である。これらのポリペプチドは、インスリン感作性抗糖尿病性チアゾロジンジオンと結合し、本明細書中に記載された分離核酸配列又はオリゴヌクレオチドによってコードされる。いくつかの観点において、本発明は分離タンパク質、これらの官能性変異体、又はフラグメントを含む。別の実施態様の場合、本発明のタンパク質の変異体又は断片はそれぞれの活性を維持する。好適な細胞系において発現されたタンパク質、分離タンパク質又はタンパク質断片を単独で、又はその他の関連するミトコンドリア・タンパク質と一緒に使用することにより、本明細書中で主張された治療に有用な化合物を見いだすことができる。
【００１５】
本発明のポリペプチドをコードする分離核酸分子、又は核酸分子配列の相補形、並びに、この核酸配列を含有するベクター及び宿主細胞も本発明に含まれる。ベクターによってコードされたタンパク質の発現に適した条件下で、本明細書に記載された1つ又は2つ以上のベクターで形質転換された宿主細胞を培養することによって、ポリペプチドを産生する方法も提供される。
【００１６】
別の観点において、本発明は、患者におけるミトNEET関連代謝機能不全疾患又は状態の治療のための試験治療薬を同定する方法であって、本発明の核酸配列のうちの1つ又は2つ以上を発現させることができる試験細胞個体群を準備し；試験細胞個体群を試験治療薬と接触させ；これらの核酸配列のうちの1つ又は2つ以上の発現を検出し；その発現を、疾患段階が既知である基準細胞個体群内の核酸配列の発現と比較し；そして試験細胞個体群と基準細胞個体群との間に発現レベルの差が存在する場合には、これを同定するステップを伴う方法に関する。異なる実施態様の場合、患者は哺乳動物、又はより好ましくはヒトであってよい。加えて、試験治療薬は、ミトNEET関連代謝機能不全疾患又は状態に対する既知の薬剤、又はミトNEET関連代謝機能不全疾患又は状態に対する未知の薬剤であってよい。治療薬は、本発明のポリペプチドのうちの1つ以上に対する選択性を有する抗体であってよい。治療されるべきミトNEET関連代謝機能不全疾患又は状態は、下記のものから選択することができる：関連糖尿病性異常脂質血症及び混合型異常脂質血症を含む異常脂質血症、症候群X(本明細書中では、これは代謝症候群を包含する)、心不全、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化、動脈硬化及び高トリグリセリド血症を含む心臓血管疾患、II型糖尿病、I型糖尿病、インスリン抵抗、高脂質血、炎症、上皮過剰増殖疾患(湿疹及び乾癬を含む)、肺及び内臓に関連する状態、並びに、肥満、拒食症、過食症及び神経性拒食症のような障害の患者における食欲の調節及び摂食に関連する状態。具体的には、本発明の化合物は、高血圧、アテローム性動脈硬化、動脈硬化、高トリグリセリド血症、及び混合型異常脂質血症を含む、糖尿病及び心臓血管疾患及び状態の治療及び予防において有用である。
【００１７】
1観点において、本発明は、患者におけるミトNEET関連代謝機能不全疾患又は状態の治療の有効性を評価する方法であって、該方法が、本発明の核酸配列のうちの1つ又は2つ以上を発現させることができる試験細胞個体群を準備し；これらの核酸配列のうちの1つ又は2つ以上の発現を検出し；その発現を、疾患段階が既知である基準細胞個体群内の核酸配列の発現と比較し；そして試験細胞個体群と基準細胞個体群との間に発現レベルの差が存在する場合には、これを同定するステップを伴う方法に関する。種々の実施態様の場合、患者は哺乳動物、又はより好ましくはヒトであってよい。他の実施態様の場合、試験細胞個体群は、in vitro、ex vivoで哺乳動物患者から準備するか、或いは、哺乳動物患者においてin vivoで提供することができる。核酸配列の発現量は、基準細胞個体群と比較して、試験細胞個体群において増大又は減小することがある。
【００１８】
更なる観点において、本発明は、ミトNEET関連代謝機能不全疾患又は状態を診断する方法であって、該方法が、本発明の核酸配列のうちの1つ又は2つ以上を発現させることができる試験細胞個体群を準備し；これらの核酸配列のうちの1つ又は2つ以上の発現を検出し；その発現を、疾患段階が既知である基準細胞個体群内の核酸配列の発現と比較し；そして試験細胞個体群と基準細胞個体群との間に発現レベル又は翻訳後変化、例えばリン酸化反応の差が存在する場合には、これを同定するステップを伴う方法に関する。種々の実施態様の場合、患者は哺乳動物、又はより好ましくはヒトであってよい。他の実施態様の場合、試験細胞個体群は、in vitro、ex vivoで哺乳動物患者から提供するか、或いは、哺乳動物患者においてin vivoで提供することができる。核酸配列の発現量は、基準細胞個体群と比較して、試験細胞個体群において増大又は減小することがある。
【００１９】
更なる観点において、本発明は、患者におけるミトNEET関連代謝機能不全疾患又は状態の罹患しやすさ、該疾患又は状態に罹患する素因、又は該疾患又は状態の存在を同定又は決定する方法に関する。この観点において、該方法は、本発明の核酸配列のうちの1つ又は2つ以上を発現させることができる試験細胞個体群を準備し；これらの核酸配列のうちの1つ又は2つ以上の発現を検出し；その発現を、疾患段階が既知である基準細胞個体群内の核酸配列の発現と比較し；そして試験細胞個体群と基準細胞個体群との間に発現レベルの差が存在する場合には、これを同定するステップを伴う。患者は哺乳動物、又はより好ましくはヒトであってよい。
【００２０】
別の観点において、本発明は、ミトNEET関連代謝機能不全疾患又は状態の患者、又は該疾患又は状態を発生させるおそれのある患者に、本発明の核酸配列のうちの1つ又は2つ以上の発現又は活性を調節する物質を投与することにより、ミトNEET関連代謝機能不全疾患又は状態を治療する方法に関する。この物質は、疾患細胞中でアップレギュレートされた本発明の配列のうちの1つ又は2つ以上の発現量を減小させる物質であってよい。或いは、この物質は、ダウンレギュレートされた本発明の配列のうちの1つ又は2つ以上の発現量を増大させる物質であってもよい。加えて、物質は、核酸配列によってコードされたポリペプチドに対する抗体、アンチセンス核酸分子、ペプチド、ポリペプチド・アゴニスト、ポリペプチド・アンタゴニスト、ペプチド擬似体、小分子、又は別の薬剤であってよい。
【００２１】
本発明はまた、アンチセンス化合物、具体的にはオリゴヌクレオチドであって、ミトNEETをコードする核酸の標的とされ、そしてミトNEETの発現を調節するアンチセンス化合物に関する。本発明のアンチセンス化合物を含む製薬組成物及びその他の組成物も提供される。さらに、細胞又は組織内でミトNEETの発現を調節する方法であって、前記細胞又は組織を本発明のアンチセンス化合物又は組成物のうちの1つ又は2つ以上と接触させることを含む方法が提供される。さらに、本発明のアンチセンス化合物又は組成物のうちの1つ又は2つ以上の治療上又は予防上有効な量を投与することにより、ミトNEETの発現に関連する疾患又は状態に罹患している又は罹患しやすいことが疑われる動物、具体的にはヒトを治療する方法も提供される。
【００２２】
本発明はまた、本発明の核酸配列のうちの2つ又は3つ以上を検出するための1つ又は2つ以上の試薬を含有するキットを含む。加えて、本発明は、本発明の核酸配列のうちの2つ又は3つ以上を検出することができるプローブ核酸アレイに関する。
【００２３】
本発明のポリペプチド、核酸、抗体、又は治療薬を使用することにより、患者におけるミトNEET関連代謝機能不全疾患又は状態を治療することができる。ミトNEET関連代謝機能不全疾患又は状態の治療は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて行われてよい。種々の実施態様の場合、本発明のポリペプチド及び核酸を含有する治療組成物を使用することにより、糖尿病、「代謝症候群」、神経変性疾患、癌、心臓血管疾患、及び炎症性疾患を治療することができる。これらの治療組成物は、製薬上許容可能なキャリヤと、加えて活性成分、例えば糖尿病薬、心臓血管薬、抗癌剤及び抗炎症薬とを含むことができる。
【００２４】
本発明の方法によって同定されたポリペプチド、核酸、抗体又は治療薬、或いは、ミトNEET関連疾患又は状態の診断、治療又は予防に使用するための組成物を、製薬上許容可能なキャリヤとともに含有するキットであって、治療組成物が本発明のポリペプチド、本発明のポリペプチドのアゴニスト、又は本発明のポリペプチドのアンタゴニストである、キットも提供される。
【００２５】
本発明の別の実施態様は、生体試料中の本発明の核酸又はポリペプチドのレベルをモニタリングすることに基づいて、ミトNEET関連代謝機能不全疾患又は状態の治療の有効性を評価するためのマーカー及び方法である。
【００２６】
本発明の別の特徴及び利点は、下記詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明の1実施態様は、本発明のミトNEETポリペプチドをコードする分離核酸配列である。好ましくは、核酸は：
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3のDNA配列、SEQ ID NO:1の残基67〜384、SEQ ID NO:2の残基112〜435、又はSEQ ID NO:3の残基133〜456と、緊縮条件下でハイブリッド形成可能な核酸配列、又は遺伝子コードの縮重を除いて前記条件下でハイブリッド形成可能な核酸配列；
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1の残基67〜384、SEQ ID NO:2の残基112〜435、又はSEQ ID NO:3の残基133〜456のDNA配列に対して約70%以上の相同性を有する核酸配列；
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1の残基67〜384、SEQ ID NO:2の残基112〜435、又はSEQ ID NO:3の残基133〜456の配列を含む核酸配列；及び
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1の残基67〜384、SEQ ID NO:2の残基112〜435、又はSEQ ID NO:3の残基133〜456の相補配列
から成る群から選択される。
【００２８】
本発明の別の実施態様は、分離ミトNEETポリペプチドである。アミノ酸配列は：
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5又はSEQ ID NO:6のアミノ酸配列に対して約81%以上の相同性を有するアミノ酸配列；
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5又はSEQ ID NO:6のアミノ酸配列の置換、欠失又は挿入変異体；及び
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5又はSEQ ID NO:6の対立遺伝子変異体
から成る群から選択することができる。
【００２９】
配列変異体
当業者に知られた種々の方法によって、ミトNEETのアミノ酸配列変異体をコードするDNAを調製することができる。これらの方法の一例としては、天然源(天然発生型アミノ酸配列変異体の場合)からの分離、又はオリゴヌクレオチド媒介性(又は特定部位的)突然変異誘発、PCR突然変異誘発、及びミトNEETの早期調製された変異体又は非変異体バージョンのカセット突然変異誘発による調製が挙げられる。これらの技術は、ミトNEET核酸(DNA又はRNA)、又はミトNEET核酸に対して相補的な核酸を利用することができる。
【００３０】
オリゴヌクレオチド媒介性突然変異誘発が、NEET DNAの置換、欠失及び挿入変異体を調製するための好ましい方法である。この技術は、例えばAdelman他、DNA, 2: 183(1983)によって記載されているように当業者によく知られている。手短にいえば、所望の突然変異形をコードするオリゴヌクレオチドをDNA鋳型とハイブリッド形成することにより、ミトNEET DNAが変化させられる。この場合、鋳型は、mitoNEETの無変化又は天然型DNA配列を含有するプラスミド又はバクテリオファージの一本鎖形である。ハイブリッド形成後、DNAポリメラーゼを使用することにより、鋳型の第2相補鎖全体を合成する。この鎖はこうしてオリゴヌクレオチド・プライマーを組み入れることになり、そしてミトNEET DNA内に、選択された変化をコードすることになる。
【００３１】
一般に、25以上のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを使用する。最適なオリゴヌクレオチドは12〜15個のヌクレオチドを有することになる。これらのヌクレオチドは、突然変異形をコードするヌクレオチドのいずれの側でも鋳型に対して完全に相補的になる。このことは、オリゴヌクレオチドが一本鎖DNA鋳型分子と適正にハイブリッド形成することを保証する。オリゴヌクレオチドは、Crea他によって記載されているように、当業者に知られた技術を用いて容易に合成される(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:5765, 1978)。
【００３２】
標準的な技術を用いて、二本鎖プラスミド(又はその他の)DNAを変性することにより、一本鎖DNA鋳型を生成することもできる。
【００３３】
(例えばアミノ酸配列変異体を生成するために)天然型DNA配列を変える際には、好適なハイブリッド形成条件下で、オリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型とハイブリッド形成する。次いで、オリゴヌクレオチドを合成用プライマーとして使用して、DNA重合酵素、通常はDNAポリメラーゼIのクレノウ断片を添加することにより、鋳型の相補鎖を合成する。こうしてヘテロ二本鎖分子を形成することにより、DNAの一方の鎖がミトNEETの突然変異形をコードし、そして他方の鎖(元の鋳型)が、ミトNEETの天然型無変化配列をコードするようにする。次いで、このヘテロ二本鎖分子を好適な宿主細胞、通常はE. coli JM101のような原核生物内に形質転換する。細胞をアガロース平板上で平板培養し、そして32-リン酸塩で放射性同位体標識付けされたオリゴヌクレオチド・プライマーを使用してスクリーニングすることにより、突然変異型DNAを含有する細菌コロニーを同定する。次いで突然変異領域を取り出し、タンパク質産生に適したベクター、一般には、好適な宿主の形質転換のために典型的に採用されたタイプの発現ベクター内に配置する。
【００３４】
すぐ上で説明した方法を改変して、両プラスミド鎖が突然変異を含有するホモ二本鎖分子を形成することができる。これらの改変は次の通り行われる：一本鎖オリゴヌクレオチドを上述の単鎖鋳型とアニーリングする。3つのデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボアデノシン(dATP)、デオキシリボグアノシン(dGTP)、及びデオキシリボチミジン(dTTP)を、dCTP-(α35S)と呼ばれる変性チオ-デオキシリボサイトシン(Amersham Corporationから得ることができる)と合体させる。この混合物を鋳型-オリゴヌクレオチド複合体に添加する。この混合物にDNAポリメラーゼが添加されると、突然変異塩基を除いて鋳型に対して同一のDNAの鎖が生成される。加えて、この新しいDNA鎖は、dCTPの代わりにdCTP-(α35S)を含有することになる。dCTP-(α35S)は制限エンドヌクレアーゼ消化からDNA鎖を保護するのに役立つ。ヘテロ二本鎖の鋳型鎖を好適な制限酵素でニッキングした後、鋳型鎖は、突然変異誘発されるべき部位を含有する領域を超えて、ExoIII ヌクレアーゼ又は別の好適なヌクレアーゼで消化することができる。次いで反応を停止させて、部分的にのみ一本鎖を有する分子を残す。次いで、4種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸全て、ATP、及びDNAリガーゼの存在においてDNAポリメラーゼを使用して、完全二本鎖DNAホモ二本鎖を形成する。次いで、このホモ二本鎖分子を上述のように、好適な宿主細胞、例えばE.coli JM 101中に形質転換することができる。
【００３５】
置換されるべき2種以上のアミノ酸を有するミトNEET突然変異体をコードするDNAは、いくかの方法のうちの1つで生成することができる。アミノ酸はポリペプチド鎖内に一緒に密接して配置されると、所望のアミノ酸置換形の全てをコードする1つのオリゴヌクレオチドを使用して、同時に突然変異させることができる。しかし、アミノ酸が互いにある程度の距離を置いて配置される(約11個以上分のアミノ酸だけ分離)場合には、所望の変化のすべてをコードする単独のオリゴヌクレオチドを生成することは一層難しくなる。その代わりに、2つの別の方法のうちの一方を採用することができる。
【００３６】
第1の方法の場合、置換されるべき各アミノ酸に対して、別個のオリゴヌクレオチドを生成する。次いでオリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型DNAと同時にアニールし、そして鋳型から合成された第2のDNA鎖は、所望のアミノ酸置換形の全てをコードすることになる。
【００３７】
別の方法は、所望の突然変異体を産生するための2つ又は3つ以上のラウンドの突然変異誘発に関する。第1ラウンドは単独の突然変異体に関して説明した通りである。すなわち、鋳型のために野生型DNAを使用し、そして第1の所望のアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドを、この鋳型とアニールし、次いでヘテロ二本鎖DNA分子を生成する。突然変異誘発の第2ラウンドは、突然変異誘発の第1ラウンドで産生された突然変異DNAを鋳型として利用する。こうして、この鋳型は、既に1つ又は2つ以上の突然変異形を含有する。付加的な所望のアミノ酸置換形をコードするオリゴヌクレオチドを、この鋳型とアニールし、そしてその結果得られるDNA鎖は今や、突然変異の第1及び第2の双方のラウンドから生じた突然変異をコードする。その結果生じたDNAは、突然変異誘発の第3ラウンドにおいて鋳型として使用することができ、以下同様である。
【００３８】
ミトNEETのアミノ酸変異体を形成するには、PCR突然変異誘発も適している。下記論議はDNAに言及しているが、この技術がRNAで応用されることも明らかである。PCR技術は一般に下記手順を意味する(Erlich、前出、Higuchiによる章、第61〜70頁参照)：少量の鋳型DNAをPCRにおける出発材料として使用する場合、鋳型DNA内の対応領域とは配列が僅かに異なるプライマーを使用することにより、比較的大量の特異的DNA断片を生成することができる。このDNA断片は、プライマーが鋳型とは異なる位置でのみ鋳型配列と異なっている。このプラスミドDNA内への突然変異の導入に際しては、突然変異の位置をオーバーラップさせ、そして突然変異を含有するように、プライマーの1つを設計し；他のプライマーの配列は、プラスミドの対向鎖の配列の延在と同一でなければならないが、しかし、この配列は、プラスミドDNAに沿った任意の場所に配置することができる。とはいうものの、第2のプライマーの配列は、第1プライマーの配列から200個のヌクレオチド以内に配置されることが好ましく、これにより、最後には、プライマーと境を接するDNAの増幅領域全体を容易に配列決定することができる。今説明したようなプライマー対を使用したPCR増幅の結果、DNA断片個体群が生じる。これらのDNA断片は、プライマーによって特定される突然変異の位置、及び場合によってはその他の位置において異なっている。それというのも、鋳型のコピーは若干エラーが生じやすいからである。
【００３９】
生成物材料に対する鋳型の比が極端に低い場合、生成物DNA断片の大部分は所望の突然変異を組み入れている。この生成物材料を使用して、標準的なDNA技術を用いてPCR鋳型として使用されるプラスミド内の対応領域を置換する。突然変異体第2プライマーを使用するか、或いは異なる突然変異体プライマーで第2PCRを実施し、そして結果として生じた2つのPCR断片を、3部(又は4部以上の)ライゲーションでベクター断片に同時にライゲートすることにより、別個の位置での突然変異を同時に導入することができる。
【００４０】
別の変異体製造方法は、Well他(Gene, 34:315 >1985)によって説明された技術に基づく。出発材料は、突然変異されるべきミトNEET DNAを含むプラスミド(又はその他のベクター)である。突然変異されるべきミトNEET DNA内のコドンが同定される。同定された突然変異部位のそれぞれの側には、固有の制限エンドヌクレアーゼ部位が存在しなければならない。もしこのような制限部位が存在しない場合には、上記オリゴヌクレオチド媒介性突然変異誘発法を用いて、これらの制限部位を生成することにより、ミトNEET DNA内の好適な位置に制限部位を導入することができる。プラスミド内に制限部位を導入した後、プラスミドをこれらの部位で切断することにより、これを線状化する。制限部位間のDNA配列をコードするがしかし所望の突然変異を含有する二本鎖オリゴヌクレオチドを、標準的な手順を用いて合成する。2つの鎖を別個に合成し、次いで標準技術を用いて互いにハイブリッド形成する。この二本鎖オリゴヌクレオチドはカセットとも呼ばれる。このカセットは、線状化プラスミドの末端と適合可能な3'及び5'末端を有するように構成されているので、このカセットはプラスミドに直接的にライゲートすることができる。このプラスミドは今や、突然変異型ミトNEET DNA配列を含有する。
【００４１】
タンパク質の共有結合修飾
本発明の範囲には、本発明のタンパク質又は抗体の共有結合修飾が含まれる。共有結合修飾の1タイプは、ポリペプチドの標的アミノ酸残基を有機誘導体化剤と反応させることを含む。有機誘導体化剤は、本発明のタンパク質の選択された側鎖又はN又はC末端基と反応することができる。二官能性剤を用いた誘導体化は、例えば、抗体精製法において使用するための水不溶性支持マトリックス又は支持面にタンパク質を架橋するのに有用であり、またその逆も当てはまる。一般に使用される架橋剤は、例えば1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェニルエタングルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシミニド・エステル、例えば4-アジドサリチル酸を有するエステル、ジスクシニミジル・エステルを含むホモ二官能性イミドエステル、例えば3,3'-ジチオビス(スクシニミジルプロピオネート)、二官能性マレイミド、例えばビス-N-マレイミド-1,8-オクタン、及びメチル-3-[(パジドフェニル)ジチオ]プロピオイミデートを含む。
【００４２】
他の修飾は、対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基に対するそれぞれグルタミニル残基及びアスパラギニル残基の脱アミド化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化反応、、リシン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のアミノ基のメチル化(T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co, San Francisco, 第79〜86頁(1983)参照)、N末端アミンのアセチル化、及び任意のC末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【００４３】
本発明の範囲内に含まれるポリペプチドの共有結合修飾の別のタイプは、ポリペプチドの天然型グリコシル化パターンを変化させることを含む。「天然型グリコシル化パターンを変化させる」とは、本明細書における目的上、(根底を成すグリコシル化部位を除去することによって、又は化学的及び/又は酵素的手段によってグリコシル化を欠失させることにより)天然型配列に見いだされる1つ又は2つ以上の炭水化物部分を欠失させること、及び/又は、天然型配列には存在しない1つ又は2つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味する。加えて、この言い回しは、存在する種々の炭水化物部分の性質及び比率の変化を伴う、天然型タンパク質のグリコシル化の質的な変化を含む。ポリペプチドにグリコシル化部位を付加することは、アミノ酸配列を変化させることによって達成することができる。この変化は、例えば天然型配列(O-結合されたグリコシル部位に対応する)に1つ又は2つ以上のセリン又はスレオニン残基を付加するか、或いは天然型配列を1つ又は2つ以上のセリン又はスレオニン残基によって置換することによって実現することができる。アミノ酸配列は、任意にはDNAレベルでの変化によって、具体的には、予め選択された塩基においてポリペプチドをコードするDNAを突然変異させることによって変えることができ、これにより、所望のアミノ酸に翻訳されることになるコドンが生成される。
【００４４】
ポリペプチド上の炭水化物部分の数を増大させる別の手段は、ポリペプチドにグリコシドを化学的又は酵素的にカップリングすることである。このような方法は、例えば1987年9月11日付けで発行された国際公開第87/05330号パンフレット、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 第259〜306頁(1981)に記載されている。
【００４５】
ポリペプチド上に存在する炭水化物部分を除去することは、化学的又は酵素的に、或いは、グリコシル化のための標的として使用されるアミノ酸残基をコードするコドンを突然変異置換することにより達成することができる。化学的な脱グリコシル化技術は当業者に知られており、例えばHakimuddin他、Arch. Biochem. Biophys, 259:52(1987)及びEdge他, Anal. Biochem., 118:131(1981)によって記載されている。ポリペプチド上の炭水化物成分の酵素的切断は、Thotakura他, Meth. Enzymol., 138:350(1987)によって記載されているように、種々のエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼを使用することにより達成することができる。
【００４６】
本発明のタンパク質又は抗体の共有結合修飾の別のタイプは、種々の非タンパク質性ポリマーのうちの1つ、例えばポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール又はポリオキシアルキレンに、ポリペプチド又は抗体を、米国特許第4,640,835号；同第4,496,689号；同第4,301,144号；同第4,670,417号；同第4,791,192号；同第4,179,337号の各明細書(概論としてはRoberts M.J.他, Adv. Drug Del. Rev. 54:459-476, 2002, Harris J.M.他、Drug Delivery Systems 40:538-551, 2001参照)に示されているように結合することを含む。
【００４７】
ミトNEET、モジュレーター又は抗体上に見いだされるリシンのアミノ末端α-アミノ基又はε-アミノ基と反応することができる官能基は：炭酸塩、例えばp-ニトロフェニル、スクシニミジル；カルボニルイミダゾール；アズラクトン；環状イミドチオン；イソシアネート又はイソチオシアネート；塩化トレシル(欧州特許第714402号明細書、同第439508号明細書)；及びアルデヒドを含む。ミトNEET、モジュレーター又は抗体上でカルボン酸基、反応性カルボニル基、及び酸化炭水化物部分と反応することができる官能基は；第一アミン；及びヒドラジン及びヒドラジド官能基、例えばアシルヒドラジド、カルバゼート、セミカルバメート、チオカルバゼートなどを含む。反応基、例えばチオール；マレイミド、スルホン及びフェニルグリオキサルとの、好適に活性化されたポリマーのための付着部位として、ミトNEET、モジュレーター又は抗体上で利用可能な場合にはメルカプト基を使用することもできる。例えば米国特許第5,093,531号明細書(この開示内容を参考のため本明細書中に引用する)を参照されたい。求電子中心と反応することができるその他の求核基の一例としては、例えばヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、チオール及び活性メチレンなどが挙げられる。
【００４８】
本発明の好ましい1実施態様の場合、ミトNEET、モジュレーター又は抗体のN末端アミノ基又はリシンのε-アミノ基、及び活性化PEGとを使用して、二次アミン又はアミド結合を形成する。本発明の別の好ましい観点の場合、Chamow他、Bioconjugate Chem. 5: 133-140(1994)及び米国特許第5,824,784号明細書に記載されているように、好適な還元剤、例えばNaCNBH3、NaBH3、ピリジンボランなどで還元することにより、ミトNEET、モジュレーター又は抗体のN末端一次アミノ基と、単鎖又は分岐鎖PEGアルデヒドとの間に、第二アミンの結合を形成する。
【００４９】
本発明の別の好ましい実施態様の場合、アミド形成リンカー、例えばスクシニミジル・エステル、又は環状イミドチオンなどで活性化されたポリマーを使用することにより、ミトNEET、モジュレーター又は抗体と、ポリマーとの間に結合をもたらす。例えば、米国特許第5,349,001号明細書；及び同第5,405,877号明細書；及びGreenwald他、Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 17:101-161, 2000を参照されたい。これらの文献を参考のため本明細書中に引用する。ミトNEET、モジュレーター又は抗体の遊離アミノ基に結合することができる1つの好ましい活性化ポリ(エチレングリコール)は、単鎖又は分岐鎖N-ヒドロキシスクシニリミドポリ(エチレングリコール)を含み、これは、ポリ(エチレングリコール)の琥珀酸エステルをN-ヒドロキシスクシニリミドで活性化することによって調製することができる。
【００５０】
本発明の別の好ましい実施態様は、他の活性化ポリマーを使用することにより、ε-アミノ基又はその他の基を介して、ポリマーとミトNEET、モジュレーター又は抗体との共有結合を形成することを含む。例えば、末端活性化ポリマーのイソシアネート又はイソチオシアネート形を使用することにより、リシンアミノ基との尿素又はチオ尿素に基づく結合を形成することができる。
【００５１】
本発明の別の好ましい観点において、米国特許第5,122,614号、同第5,324,844号、及び同第5,612,640号の各明細書(これらを参考のため本明細書中に引用する)に記載されたタンパク質アミノ基を用いて、カルバメート(ウレタン)結合を形成する。一例としては、N-スクシニミジルカーボネート、パラ-ニトロフェニルカーボネート、及びカルボニルイミダゾール活性化ポリマーが挙げられる。本発明の別の好ましい実施態様の場合、PEGのベンゾトリアゾールカーボネート誘導体を、ミトNEET、モジュレーター又は抗体上のアミノ基に結合する。
【００５２】
クローニング・ビヒクル内へのDNAの挿入
天然型又は変異型ミトNEETをコードするcDNA又はゲノムDNAを、更なるクローニング(DNAの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入する。多くのベクターが入手可能であり、好適なベクターは、1)DNA増幅又はDNA発現のために使用されるようになっているかどうか、2)ベクター内へ挿入されるべきDNAのサイズ、及び3)ベクターが形質転換されるべき宿主細胞、に応じて選択されることになる。それぞれのベクターは、その機能(DNAの増幅又はDNAの発現)、及び適合可能な宿主細胞に応じて種々の成分を含有する。ベクター成分の一例としては、一般に、下記のうちの1つ又は2つ以上が挙げられる：シグナル配列、複製起点、1つ又は2つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター及び転写終結配列。
【００５３】
複製起点成分
発現ベクター及びクローニング・ベクターの双方は、選択された1つ又は2つ以上の宿主細胞内でベクターが複製するのを可能にする核酸配列を含有する。一般に、クローニング・ベクターにおいて、この配列は、ベクターが宿主染色体DNAとは独立して複製するのを可能にする配列であり、複製配列又は自己複製配列の起点を含む。このような配列は種々の細菌、酵母及びウィルスに関してよく知られている。プラスミドpBR322に由来する複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適しており、2μプラスミド起点は酵母に適しており、そして種々のウィルス起点(SV40、ポリオーマ、アデノウィルス、VSV又はBPV)は、哺乳動物細胞におけるクローニング・ベクターに有用である。一般に複製成分起点は、哺乳動物発現ベクターには必要とされていない(初期プロモーターを含有するという理由だけから、SV40起点が典型的に使用されることがある)。
【００５４】
たいていの発現ベクターは、「シャトル」ベクターであり、すなわち、これらのベクターは、1つ以上のクラスの生物内で複製可能であるが、しかし、発現のために別の生物内にトランスフェクトすることができる。例えば、ベクターをE.coli内にクローニングし、次いで同じベクターを、たとえこれが宿主細胞染色体から独立して複製することができなくても、発現のために酵母又は哺乳動物細胞内にトランスフェクトする。
【００５５】
宿主ゲノム中に挿入することにより、DNAを増幅することもできる。このことは、宿主としてBacillus種を使用して、例えばBacillusゲノムDNAに見いだされる配列に対して相補的なDNA配列をベクター内に含むことにより、容易に達成される。Bacillusにこのベクターをトランスフェクトする結果、ゲノムとの相同組換えが生じ、ミトNEET DNAが挿入される。しかし、ミトNEETをコードするゲノムDNAの回収は、外生的に複製されたベクターの回収よりも複雑である。なぜならば、ミトNEET DNAを摘出するには制限酵素消化が必要となるからである。
【００５６】
選択遺伝子成分
発現ベクター及びクローニング・ベクターは、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有すべきである。この遺伝子は、選択的培地中で成長した形質転換宿主細胞の生存又は成長に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されていない宿主細胞は、培地内で生存することはない。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質又はその他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、又はテトラサイクリンに耐性を与えるタンパク質、(b)栄養要求性欠陥を補完するタンパク質、又は(c)天然培地から入手できない重要な栄養素を供給するタンパク質、をコードし、例えばBacilliに関してはD-アラニン・ラセマーゼをコードする遺伝子である。
【００５７】
選択スキームの一例は、宿主細胞の成長を阻止するための薬剤を利用する。異種遺伝子による形質転換が成功した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を発現させ、ひいては選択計画を生き延びる。このような優性選択の例では、薬剤ネオマイシン(Southern他、J. Molec. Appl. Appl. Genet., 1:327>1982)、マイコフェノール酸(Mulligan他、Science, 209: 1422>1980)、又はヒグロマイシン(Sugden他、Mol. Cell. Biol., 5:410-413>1985)を使用する。上記3つの例は、それぞれ好適な薬剤G418又はネオマイシン(ゲネチシン)、xgpt(マイコフェノール酸)、又はヒグロマイシンに対する耐性を提供するために、真核細胞制御下で細菌遺伝子を採用する。
【００５８】
哺乳動物細胞に適した選択可能マーカーの別の例は、ミトNEET核酸、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)又はチミジンキナーゼを取り込む能力を有する細胞を同定可能にするマーカーである。哺乳動物細胞形質転換体は、選択圧力下に置かれる。この場合、形質転換体だけがマーカーを取り込んでいることによって生き残るように固有に適合される。形質転換体を所定の条件下で培養することにより、選択圧力が加えられる。この条件において、培地内の選択剤の濃度は連続的に変化し、これにより、選択遺伝子及びミトNEETをコードするDNAの両方を増幅させる。増幅は、成長にとって重要なタンパク質の産生をより必要とする遺伝子が、組換え体細胞の継続世代の染色体内部で相前後して繰り返されるプロセスである。増幅されたDNAからは、増大したミトNEET量が合成される。
【００５９】
例えば、メトトレキサート(Mtx)、DHFRの競合的アンタゴニストを含有する培地内で形質転換体の全てを培養することにより、DHFR選択遺伝子で形質転換された細胞を先ず同定する。野生型DHFRが採用される場合の好適な宿主細胞は、DHFR活性に欠けたChineseハムスター卵巣(CHO)細胞系であり、これらの細胞は、Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216>1980によって記載されているように調製し、繁殖させる。次いで形質転換細胞を、増大されたレベルのメトトレキサートに対して暴露する。このことは、DHFR遺伝子、及びこれと同時に、発現ベクターを含む他のDNA、例えばPF4A受容体をコードするDNAの複数コピーの合成をもたらす。例えばMtxに対して高耐性である突然変異型DHFR遺伝子が採用される場合、この増幅技術は、内生的DHFRが存在するにもかかわらず、他の任意の好適な宿主、例えばATCC No. CCL61 CHO-K1と一緒に用いることができる(欧州特許第117,060号明細書)。或いは、PF4A受容体、野生型DHFRタンパク質、及び別の選択可能マーカー、例えばアミノグリコシド3'ホスホトランスフェラーゼ(APH)をコードするDHA配列で形質転換又は同時形質転換された宿主細胞(具体的には内生的DHFRを含有する野生型宿主)を、選択可能マーカーのための選択剤、例えばアミノグリコシド抗生物質、例えばカナマイシン、ネオマイシン又はG418を含有する培地内での細胞成長によって選択することができる。米国特許第4,965,199号明細書を参照されたい。
【００６０】
酵母内で使用するのに適した選択遺伝子は、酵母プラスミドYRp7内に存在するtrp 1遺伝子である(Stinchcomb他、Nature, 282:39>1979; Kingsman他、Gene, 7:141>1979;又はTschemper他、Gene, 10: 157>1980)。trp 1遺伝子は、トリプトファン中で成長する能力に欠けた酵母の突然変異型菌株、例えばATCC No. 44076又はPEP4-1に、選択マーカーを提供する(Jones, Genetics, 85:12>1977)。酵母宿主細胞ゲノム内のtrp 1損傷の存在は次いで、トリプトファンの不存在における成長によって、形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。同様に、Leu2遺伝子を担持する既知のプラスミドによって、Leu2欠失酵母菌株(ATCC 20,622又は38,626)を補完する。
【００６１】
プロモーター成分
発現ベクター及びクローニング・ベクターは通常、宿主生物によって認識されるプロモーターを含有し、ミトNEET核酸に作用可能にリンクされている。プロモーターは、構造的遺伝子の開始コドンに対して上流(5')に配置された未翻訳配列(一般に約100〜1000bP以内)であり、これらの配列は、配列が作用可能にリンクされている特定の核酸配列、例えばミトNEETの転写及び翻訳を制御する。このようなプロモーターは典型的には、2つのクラス、すなわち誘導プロモーター及び構成プロモーターに分類される。誘導プロモーターは、培養条件の何らかの変化、例えば栄養素の有無又は温度の変化に応じて、プロモーターの制御下でDNAからの転写レベルの増大を開始するプロモーターである。現時点で、種々の潜在的な宿主細胞によって認識された多数のプロモーターがよく知られている。制限酵素消化によって源DNAからプロモーターを取り出し、そして分離プロモーター配列をベクター内に挿入することにより、これらのプロモーターをミトNEETコードDNAに作用可能にリンクする。ミトNEET DNAの増幅及び/又は発現を導くために、天然型ミトNEETプロモーター配列及び多くの異種プロモーターを使用することができる。しかし、異種プロモーターが好ましい。それというのもこれらは一般に、天然型ミトNEETプロモーターと比較して、より大きな転写及びより高い収量を可能にするからである。
【００６２】
原核生物宿主とともに使用するのに適したプロモーターは、ラクタマーゼ及びラクトース・プロモーター系(Chang他, Nature, 275:615>1978;及びGoeddel他, Nature,281:544>1979)、アルカリ・ホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系(Goeddel, Nucleic Acids Res., 8; 4057>1980及び欧州特許36,776号明細書)、及びハイブリッド・プロモーター、例えばtacプロモーター(deBoer他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 20: 21-25>1983)を含む。しかしその他の既知の細菌プロモーターも適している。これらのヌクレオチド配列は発表されており、これにより当業者であれば、任意の所要制限部位を供給するためのリンカー又はアダプターを使用して、これらの配列をミトNEETコードDNAに作用可能にライゲートすることが可能になる(Siebenlist他、Cell. 20: 269>1980)。細菌系内で使用するためのプロモーターはまた一般には、ミトNEETコードDNAに作用可能にリンクされたShine-Dalgarno(S.D.)配列を含有することになる。
【００６３】
酵母宿主と一緒に使用するのに適したプロモート配列は、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ (Hitzeman他、J. Biol. Chem., 255:2073>1980)、又は他の糖分解酵素(Hess他, J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149>1968; 及びHolland, Biochemistry, 17: 4900>1978)、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-ホスフェートイソメラーゼ、3-ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びクルコキナーゼのためのプロモーターを含む。
【００６４】
成長条件によって制御される転写の付加的な利点を有する誘導プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソシトクロムC、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、並びにマルトース及びガラクトースの利用に応答可能な酵素のためのプロモーター領域である。酵母発現において使用するのに適したベクター及びプロモーターは、さらにHitzeman他の欧州特許出願公開第73,657号明細書に記載されている。酵母エンハンサーはまた、酵母プロモーターと一緒に使用されると有利である。
【００６５】
プロモーター配列が真核生物に関して知られている。事実上全ての真核細胞遺伝子が、転写開始部位からほぼ25〜30個の塩基だけ上流側に配置された、ATが豊富な領域を有している。多くの遺伝子の転写開始から70〜80個の塩基だけ上流側に見いだされた別の配列が、CXCAAT領域であり、この領域においてXは任意のヌクレオチドであってよい。ほとんどの真核細胞遺伝子の3'末端に、AATAAA配列が位置しており、この配列は、コード配列の3'末端にポリA尾部を付加するためのシグナルであってよい。これらの配列の全ては、哺乳動物発現ベクター内に好適に挿入される。
【００６６】
哺乳動物宿主細胞内のベクターから生じるミトNEET転写は、ウィルス、例えばポリオーマ・ウィルス、鶏痘ウィルス(1989年7月5日付けで発行された英国特許第2,211,504号明細書)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス2)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、B型肝炎ウィルス、及び最も好ましくはシミアンウィルス40(SV40)から得られるプロモーターによって、異種哺乳動物プロモーター、例えばアクチン・プロモーター又は免疫グロブリン・プロモーターから、熱ショック・プロモーターから、及び通常はミトNEET配列と関連するプロモーターから制御される。ただしこの場合、このようなプロモーターは宿主細胞系と適合性を有するものとする。
【００６７】
SV40ウィルスの初期及び後期プロモーターは、SV40制限断片として好都合に得られる。SV40制限断片はまた、SV40ウィルス複製起点をも含有する。Fiers他、Nature, 273:113(1978); Mulligan及びBerg, Science, 209:1422-1427(1980);Pavlakis他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:7398-7402(1981)。ヒト・サイトメガロウィルスの前初期プロモーターは、HindIII E制限断片として好都合に得られる。Greenaway他, Gene, 18:355-360 (1980)。ウシ乳頭腫ウィルスをベクターとして使用して、哺乳動物宿主内にDNAを発現させるシステムが、米国特許第4,419,446号明細書に開示されている。このシステムの改変が、米国特許第4,601,978号明細書に記載されている。また、免疫インターフェロンをコードするcDNAをサル細胞中に発現させることに関しては、Gray他、Nature, 295:503-508(1982)を；単純ヘルペスウィルスに由来するチミジンキナーゼ・プロモーターの制御下で、マウス細胞中にヒトβインターフェロンcDNAを発現させることに関しては、Reyers他, Nature, 297:598-601(1982)を；培養されたマウス及びウサギ細胞中にヒト・インターフェロンβ1遺伝子を発現させることに関しては、Canaani及びBerg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 5166-5170(1982)を；そして、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用して、CV-1サル腎細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、Chineseハムスター卵巣細胞、HeLa細胞、及びマウスNIH-3T3細胞中に細菌CAT配列を発現させることに関しては、Gorman他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:6777-6781(1982)を参照されたい。
【００６８】
エンハンサー要素成分
ベクター中にエンハンサー配列を挿入することにより、高等真核細胞によって本発明のミトNEETをコードするDNAを転写する量がしばしば増大される。エンハンサーは、通常約10〜300bpのDNAのcis活性要素であり、これらの要素は、転写量を増大させるようにプロモーターに対して作用する。エンハンサーは、配向及び位置に関して比較的独立しており、転写ユニットに対して5'(Laimins他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 993 >1981)及び3'(Lusky他, Mol. Cell Bio., 3: 1108 >1983)の側に、イントロン内に(Banerji他, Cell, 33: 729 >1983)、並びにコード配列自体の内部(Osborne他, Mol. Cell Bio., 4: 1293 >1984)に見いだされる。多くのエンハンサー配列が現在、哺乳動物遺伝子において知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。とは言え、典型的には、真核細胞ウィルスに由来するエンハンサーを使用することになる。一例としては、複製起点の後期側に位置するSV40エンハンサー(bp 100-270）、サイトメガロウィルス初期プロモーター・エンハンサー、複製起点の後期側に位置するポリオーマ・エンハンサー、及びアデノウィルス・エンハンサーが挙げられる。真核生物プロモーターの活性化のための要素を促進することに関しては、Yaniv, Nature, 297: 17-18(1982)も参照されたい。エンハンサーは、ミトNEET DNAに対して位置5'又は3'で、ベクター内にスプライスすることができるが、しかしプロモーターから部位5'に配置されるのが好ましい。
【００６９】
転写終結成分
真核宿主細胞(酵母、菌類、昆虫、植物、動物、ヒト、又は多細胞生物に由来する有核細胞)中に使用される発現ベクターは、転写の終結、及びmRNAの安定化に必要な配列を含有することになる。このような配列は一般に、真核生物又はウィルスのDNA又はcDNAの5'及び場合によっては3'未翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、ミトNEETコードmRNAの未翻訳部分内でポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチド・セグメントを含有する。3'未翻訳領域はまた、転写終結部位を含む。
【００７０】
所望のコーティング配列及び制御配列の上記成分のうちの1つ又は2つ以上の含有する好適なベクターの構造は、標準的なライゲーション技術を採用する。分離されたプラスミド又はDNA断片を、所要のプラスミドを生成するのに望ましい形態で切断し、調整して再ライゲートする。
【００７１】
構成されたプラスミド内の正確な配列を確認するための分析の際、ライゲーション混合物を使用して、E.coli K12菌株294(ATCC 31,446)、及び適切な場合にはアンピシリン又はテトラサイクリン耐性により選択された成功した形質転換体を形質転換する。形質転換体に由来するプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化によって分析し、且つ/又は、Messing他, Nucleic Acids Res., 9: 309(1981)によって、又はMaxam他、Methods in Enzymology, 65:499(1980)の方法によって配列決定する。
【００７２】
本発明の実施に特に有用なのは、ミトNEETコードDNAの哺乳動物細胞中で一時的発現を可能にする発現ベクターである。一般に、一時的発現は、宿主細胞中で効率的に複製することができる発現ベクターの使用を伴うので、宿主細胞は、発現ベクターの多数のコピーを蓄積し、そして発現ベクターによってコードされた高いレベルの所望のポリペプチドを合成する。好適な発現ベクター及び宿主細胞を含む一時的発現系は、クローニングされたDNAによってコードされるポリペプチドの好都合なポジティブな同定を可能にし、また、所望の生物学的又は生理学的特性に関してこのようなポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。従って、ミトNEET様活性を有するミトNEETの類似体及び変異体を同定することを目的として、一時的発現系は本発明において特に有用である。
【００７３】
組換え脊椎動物細胞培養におけるミトNEETの合成に適合するのに適した他の方法、ベクター及び宿主細胞が、Gething他、Nature, 293:620-625>1981；Mantei他、Nature, 281：40-46 >1979；Levinson他；欧州特許第117,060号明細書；及び同第117,058号明細書に記載されている。PF4A受容体の哺乳動物細胞培養発現のために特に有用なプラスミドは、pRK5(欧州特許出願公開第307,247号明細書)又はpSV16B(1989年11月22日付けで出願された米国特許出願第07/441,574号明細書、この開示内容を参考のため本明細書中に引用する)である。
【００７４】
宿主細胞の選択及び形質転換
本明細書中のベクターのクローニング又は発現に好適な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母又は高等真核細胞である。好適な原核生物は、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物、例えばE.coli、Bacilli、例えばB. subtilis、Pseudomonas種、例えばP. aerupinosa、Salmonella typhimurium、又はSerratia marcescensを含む。1つの好ましいE.coliクローニング宿主は、E.coli 294(ATCC 31,446)であるが、その他の菌株、例えばE.coli B、E.coli chi-1776 (ATCC 31,537)、及びE.coli W3110(ATCC 27,325)も好適である。これらの例は本発明を限定するものではなく、一例にすぎない。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌すべきである。或いは、クローニングのin vitro法、例えばPCR又はその他の核酸ポリメラーゼ反応も好適である。
【００７５】
原核生物に加えて、真正微生物、例えば糸状菌又は酵母が、ミトNEET DNAを含有するベクターに適した宿主である。下等真核宿主微生物の中では、Saccharomyces cerevisiae又は一般的なパン酵母が、最も一般的に使用される。しかし、多数のその他の属、種及び菌株、例えばS. pombe >Beach及びNurse, Nature, 290: 140(1981)、Kluyveromyces lactis >Louvencourt他, J. Bacteriol., 737(1983)、yarrowia >欧州特許第402,226号明細書、Pichia pastoris >欧州特許第183,070号明細書、Trichoderma reesia >欧州特許第244,234号明細書、Neurospora crassa >Case他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263(1979)、及びAspergillus宿主、例えばA. nidulans >Ballance他, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289(1983)；Tilburn他, Gene, 26: 205-221(1983)；Yelton他, Proc. natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474(1984)及びA. niger >Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479(1985)も共通して利用可能であり、本明細書中で有用である。
【００７６】
グリコシル化ミトNEETポリペプチドの発現に適した宿主細胞を、多細胞生物から誘導する。このような宿主細胞は、複雑なプロセッシング及びグリコシル化活性が可能である。原則的には、脊椎動物培養に由来するか無脊椎動物培養に由来するかとは無関係に、任意の高等真核細胞培養が作用可能である。無脊椎動物細胞の一例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。数多くのバキュロ・ウィルス菌株及び変異体、及びSpodoptera frugiperda(芋虫)、Aedes aegypti(蚊)、Aedes albopictus(蚊)、Drosophila melanogaster(ショウジョウバエ)、及びBombyx mori宿主細胞のような宿主に由来する相応の許容性昆虫宿主細胞が同定されている。例えば、Luckow他, Bio Technology, 6: 47-55(1988)；Miller他, in Genetic Engineering, Setlow, J.K.他編, 第8巻(Plenum Publishing, 1986), 第277〜279頁；及びMaeda他、Nature, 315: 592-594(1985)を参照されたい。このような種々のウィルス菌株、例えばAutographa californica NPVのL-1変異体、及びBombyx mori NPVのBm-5菌株を公的に入手することができ、そしてこのようなウィルスは、特にSpodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションのために、本発明に基づいて本明細書中のウィルスとして使用することができる。綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト及びタバコの植物細胞培養を宿主として利用することができる。典型的には、細菌Agrobacterium tumefaciensの或る特定の菌株と一緒にインキュベートすることによって、植物細胞をトランスフェクトする。細菌Agrobacterium tumefaciensは、ミトNEET DNAを含有するように予め操作されている。A. tumefaciensと一緒に植物細胞培養をインキュベートしている間、ミトNEETコードDNAは植物細胞宿主に移され、これにより植物細胞宿主にトランスフェクションが施され、そして植物細胞宿主は好適な条件下でミトNEET DNAを発現させることになる。加えて、植物細胞と適合可能な調節配列及びシグナル配列、例えばノパリンシンターゼ・プロモーター及びポリアデニル化シグナル配列が入手可能である。Depicker他, J. Mol. Appl. Gene, 1:561(1982)。加えて、T-DNA 780遺伝子の上流領域から分離されたDNAセグメントは、組換えDNA含有植物組織における植物発現可能遺伝子の転写レベルを活性化するか又は増大させることができる。1989年6月21日付けで発行された欧州特許第321,196号明細書を参照されたい。
【００７７】
しかし、脊椎動物細胞が最も関心を持たれており、培養(組織培養)中の脊椎動物細胞の増殖が近年日常的な手順となっている(Tissue Culture, Academic Press, Kruse及びPatterson編(1973))。有用な哺乳動物宿主細胞系の例は、SV40(COS-7, ATCC CRL 1651)によって形質転換されたサル腎臓CV1系；ヒト胚腎臓系(293、又は、懸濁培養における成長のためにサブクローニングされた293細胞)(Graham他, J. Gen Virol., 36:59(1977))；新生ハムスター腎細胞(BHK, ATCC CCL 10)；Chinese hamster 卵巣細胞/-DHFR(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 >1980)；マウス・セルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 >1980)；サル腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；アフリカン・ミドリザル腎細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587)；ヒト頸癌細胞(HELA, ATCC CCL 2)；イヌ腎細胞(MDCK, ATCC CCL 34)；バッファロー・ラット肝細胞(BRL 3A, ATCC CRL 1442)；ヒト肺細胞(W138, ATCC CCL 75)；ヒト肝細胞(Hep G2, HB 8065)；マウス乳房腫瘍(MMT 060562, ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather他、Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 >1982)；MRC 5細胞；FS4細胞；及びヒト肝臓癌細胞系(Hep G2)である。好ましい宿主細胞は、ヒト腎臓293及びChineseハムスター卵巣細胞である。
【００７８】
宿主細胞には本発明の上記発現ベクター又はクローニング・ベクターをトランスフェクトし、これらの宿主細胞を好ましくは上記ベクターで形質転換し、必要に応じて改変されたコンベンショナルな栄養培地中で培養し、これによりプロモーターを誘発し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅する。
【００７９】
トランスフェクションとは、任意のコード配列が実際に発現されるかどうかとは無関係に、宿主細胞によって発現ベクターを取り込むことを意味する。数多くのトランスフェクション法、例えばCaPO4及びエレクトロポレーションが当業者に知られている。このベクターの作業の指示が宿主細胞内部で発生するときに、トランスフェクションが成功したと一般に認識される。
【００８０】
形質転換は、DNAを生物中に導入して、DNAが染色体外要素として、又は染色体成分によって複製可能になるようにすることを意味する。使用される宿主細胞に応じて、このような細胞に適した標準的な技術を用いて、形質転換を行う。Sambrook他(前出)の1.82項に記載されているように、塩化カルシウムを採用するカルシウム処理が、一般に原核生物、又は実質的な細胞壁バリアを含有するその他の細胞のために用いられる。Shaw他, Gene, 23:315, (1983)及び1989年6月29日付けで発行された国際公開第89/05859号パンフレットに記載されているように、或る特定の植物細胞の形質転換のために、Agrobacterium tumefaciensの感染を用いる。このような細胞壁を有さない哺乳動物細胞に対しては、Sambrook他(前出)の16.30-16.37項に記載されたリン酸カルシウム沈澱法が好ましい。哺乳動物細胞宿主系形質転換の一般的な特徴は、1983年8月16日付けで発行された米国特許第4,399,216号明細書にAxelによって記載されている。Van Solingen他, J. Bact., 130:946(1977)及びHsiao他, Proc. Natl. Acad. Sci(米国), 76:3829(1979)の方法に従って、酵母内への形質転換を実施する。しかし、核注入、エレクトロポレーション、又はプロトプラスト融合によるような、細胞中にDNAを導入するための他の方法を用いることもできる。
【００８１】
宿主細胞の培養
本発明のミトNEETポリペプチドを産生するために使用される原核細胞を、Sambrook他において概ね説明されているような好適な培地内で培養する。
【００８２】
本発明のミトNEETを産生するために使用される哺乳動物宿主細胞は、種々の培地内で培養することができる。商業的に入手可能な培地、例えばHam's F10(Sigma)、最小必須培地(>MEM, Sigma)、RPM1-1640(Sigma)、及びDulbeccoの変性イーグル培地(>DMEM, Sigma)は、宿主細胞を培養するのに適している。加えて、Ham及びWallace, Meth. Enz., 58:44(1979), Barnes及びSato, Anal. Biochem., 102:255(1980), 米国特許第4,767,704号；同第4,657,866号；同第4,927,762号；又は同第4,560,655号の各明細書；国際公開第90/03430号；同第87/00195号の各パンフレット；U.S. Pat. No. Re. 30,985；又は米国特許第5,122,469号明細書(これらすべての開示内容を参考のため本明細書中に引用する)を、宿主細胞のための培地として使用することができる。これらの培地のいずれかに、ホルモン及び/又はその他の成長因子(インスリン、トランフェリン又は上皮成長因子)、塩(例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、緩衝液(例えばHEPES)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えばGentamycin（登録商標）)、微量元素(通常マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される)、及びグルコース又は同等のエネルギー源を、必要に応じて補足することができる。任意の他の所要の補足物質を、当業者に知られた好適な濃度で含むこともできる。培養条件、例えば温度及びpHなどは、発現のために選択された宿主細胞と一緒に以前に用いられた条件であり、当業者には明らかである。
【００８３】
本開示において言及される宿主細胞は、in vitroで培養された細胞、並びに宿主動物内に位置する細胞を包含する。
【００８４】
さらに本発明のミトNEETは、相同組換えによって、又はミトNEETコードDNAをすでに含有する細胞内に導入された制御要素を利用した組換え産生法によって産生できることが想定される。例えば、強力なプロモーター/エンハンサー要素、サプレッサー、又は外生的転写モジュレーター要素を、所望のミトNEETをコードするDNAの転写に影響を与えるのに十分な近さ及び配向で、所期宿主細胞のゲノム中に挿入する。制御要素は本発明のミトNEETをコードしないが、しかしDNAは宿主細胞ゲノム中に存在する。次に、本発明のミトNEETを形成する細胞、又は所望の場合には発現レベルの増減に関してスクリーニングする。
【００８５】
ミトNEETの治療組成物及び投与
所望の純度を有するミトNEETと、任意の生理学的に許容可能なキャリヤ、賦形剤、又は安定剤(Remington's Pharmaceutical Sciences (前出))とを、凍結乾燥ケーキ又は水溶液の形態で混合することにより、貯蔵のために調製する。許容可能なキャリヤ、賦形剤又は安定剤は、採用された投与量及び濃度において、受容者に対して非毒性であり、そして緩衝剤、例えばリン酸塩、クエン酸塩、及びその他の有機酸；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量(約10個未満の残基)ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；単糖、二糖、及び、グルコース、マンノース又はデキストリンを含むその他の炭水化物；キレート剤、例えばEDTA；糖アルコール、例えばマンニトール又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；及び/又は非イオン性界面活性剤、例えばTween, Pluronics又はポリエチレングリコール(PEG)を含む。
【００８６】
糖尿病、「代謝症候群」、神経変性疾患、癌、心臓血管疾患及び炎症性疾患の治療に有用な組成物の一例としては、標的遺伝子生成物の発現及び/又は活性を阻害する抗体、小型有機及び無機分子、ペプチド、ホスホペプチド、アンチセンス及びリボザイム分子、三重らせん分子などが挙げられる。
【００８７】
活性成分を生の化学物質として単独で投与することも可能ではあるが、製薬配合物として活性成分を提供することが好ましい。本発明は、1種以上の製薬上許容可能なキャリヤ、アジュバント又は希釈剤との組み合わせにおいて、本発明の治療上有効な化合物を含む製薬組成物を含む。本発明はまた、炎症又は患者の疾患に付随する炎症を治療する方法を含み、この方法は、このような炎症又は障害を有する患者に本発明の治療上有効量の化合物を投与することを含む。また本発明の化合物群には、製薬上許容可能なその塩が含まれる。「製薬上許容可能な塩」という用語は、アルカリ金属塩を形成するため、及び遊離酸又は遊離塩基の付加塩を形成するために一般に使用される塩を包含する。塩の性質は、これが製薬上許容可能であるならば重要ではない。本発明の化合物の好適な製薬上許容可能な酸付加塩を無機酸又は有機酸から調製することができる。このような無機酸の例は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸、リン酸である。好適な有機酸は、有機酸の脂肪族、脂環式、芳香族、アラリファティック、複素環式、カルボン酸及びスルホン酸クラスから選択することができる。これらの例は、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、琥珀酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、メシル酸、サリチル酸、ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸(パモン酸)、メタスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、トルエンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、スルファニル酸、ステアリン酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、アルギン酸、β-ヒドロキシ酪酸、サリチル酸、ガラクタル酸、及びガラクツロン酸から選択することができる。本発明の化合物の好適な製薬上許容可能な塩基付加塩は、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及び亜鉛から形成された金属塩、又はN,N'-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン(N-メチル-グルカミン)及びプロカインから形成された有機塩を含む。これらの塩の全ては本発明の対応化合物から、例えば好適な酸又は塩基を本発明の化合物と反応させることにより、コンベンショナルな手段によって調製することができる。
【００８８】
また本発明には、1種又は2種以上の非毒性の製薬上許容可能なキャリヤ及び/又は希釈剤及び/又はアジュバント及び/又は賦形剤(これらをまとめて本明細書中では「キャリヤ」材料と呼ぶ)、及び所望の場合にはその他の活性成分との組み合わせにおいて、本発明の1種又は2種以上の化合物を含む製薬組成物も含まれる。こうして、本発明の化合物を薬品の製造に使用することができる。本明細書中に前述したように調製された本発明の化合物の製薬組成物は、非経口投与のための溶液又は凍結乾燥粉末として調製することができる。使用前に好適な希釈剤又はその他の製薬上許容可能なキャリヤを添加することにより、粉末を戻すことができる。液状配合物は、緩衝等張水溶液であってよい。本発明の化合物は、任意の好適な経路によって、好ましくはこのような経路に適合された製薬組成物の形態で、そして意図される治療に効果的な投与量で投与することができる。化合物及び組成物は例えば、血管内、腹腔内、静脈内、皮下、筋内、髄内、経口又は局所投与することができる。経口投与のためには、製薬組成物は例えば錠剤、カプセル剤、懸濁液又は液体の形態であってよい。活性成分は、組成物として注射によって投与することもできる。例えば、正常等張食塩水、水中標準5%デキストロース、又は緩衝酢酸ナトリウム溶液又は緩衝酢酸アンモニウム溶液を好適なキャリヤとして使用することができる。このような配合物は、非経口投与に特に適しているが、しかし、経口投与のために使用することもでき、或いは、吹送のための定量吸入器又はネブライザー内に含有することもできる。賦形剤、例えばポリビニルピロリドン、ゼラチン、ヒドロキシセルロース、アカシア、ポリエチレングリコール、マンニトール、塩化ナトリウム又はクエン酸ナトリウムを添加することが望ましい場合がある。製薬組成物は、特定量の活性成分を含有する投与単位の形態で形成されるのが好ましい。このような投与単位の例は、錠剤又はカプセル剤である。投与される治療上活性の化合物の量、及び本発明の化合物及び/又は組成物による疾患状態の治療のための投与計画は、患者の年齢、体重、性別及び病状、疾患の重症性、投与の経路及び頻度、及び採用される特定の化合物を含む種々のファクターに依存し、ひいては大幅に変化することがある。製薬組成物は、約0.1〜2000mg、好ましくは0.5〜500mg、及び最も好ましくは約1〜100mgの活性成分を含有することができる。一日の投与量は約0.01〜100mg/体重1kg、好ましくは約0.1〜50mg/体重1kg、そして最も好ましくは約1〜20mg/体重1kgが好適である場合がある。一日の投与量は、1日当たり1回〜4回で投与することができる。治療目的の場合、本発明の化合物は通常、指示された投与経路に適した1種又は2種以上のアジュバントと組み合わされる。経口投与の場合、化合物は、ラクトース、蔗糖、澱粉、アルカン酸のセルロース・エステル、セルロースアルキル・エステル、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸及び硫酸のナトリウム塩及びカルシウム塩、ゼラチン、アカシア・ゴム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、及び/又はポリビニルアルコールと混和し、次いで好都合な投与のために錠剤化又はカプセル化することができる。このようなカプ���ル剤又は錠剤は、制御放出配合物を含有することができ、この制御放出配合物は、徐放性材料、例えば単独の又はワックスを有するモノステアリン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、又はヒドロキシプロピルメチルセルロース中の活性化合物の分散体の形で提供することができる。非経口投与の配合物は、水性又は非水性等張滅菌注射溶液又は懸濁液の形態を成してよい。これらの溶液及び懸濁液は、経口投与用配合物における使用に関して述べたキャリヤ又は希釈剤のうちの1種又は2種以上を有する滅菌粉末又は顆粒から調製することができる。化合物は、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、トウモロコシ油、綿実油、落花生油、ごま油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウム、及び/又は種々の緩衝液中に溶解させることができる。製薬調製物は、錠剤形態の場合には、必要に応じて粉砕、混合、顆粒化及び圧縮を伴うコンベンショナルな製薬技術に従って；硬質ゼラチン・カプセル剤形態の場合には、粉砕、混合及び充填を伴うコンベンショナルな製薬技術に従って形成される。液体キャリヤを使用する場合、調製物はシロップ、エリクシル、エマルジョン、又は水性又は非水性懸濁液の形態を成すことになる。このような液状配合物は経口投与するか、或いは軟質ゼラチン・カプセル剤内に充填することができる。直腸投与の場合、本発明の化合物は賦形剤、例えばココアバター、グリセリン、ゼラチン又はポリエチレングリコールと合体させ、そして成形して座剤を形成することもできる。本発明の方法は、本発明の化合物の局所投与を含む。局所投与とは、本発明の化合物を外側から表皮に、また口腔に塗布すること、及びこのような化合物を耳、目及び鼻内に注入することを含む、非全身投与を意味する。化合物は血流に顕著には流入しない。全身投与とは、口腔、静脈内、腹腔内、及び筋内投与を意味する。局所投与に対する治療的又は予防的効果に必要とされる本発明の化合物(以後、活性成分と呼ぶ)の量は、選択された化合物、治療を受けている状態の性質及び重症性、及び治療を受けている動物に応じてもちろん変化することになり、そして最終的には医師の判断によって決定される。
【００８９】
獣医学用途及び人間の医療用途双方のための本発明の局所用配合物は従って、1種又は2種以上の許容可能なキャリヤ、及び任意には他の治療成分と一緒に活性成分を含む。キャリヤは、配合物のその他の成分と適合性があるという意味において「許容可能」でなければならず、またその受容者に対して有害であってはならない。局所投与に適した配合物は、皮膚を通して治療が必要な部位に浸透するのに適した液状又は半液状調製物、例えばリニメント剤、ローション、クリーム、軟膏又はペースト、及び目、耳又は鼻に投与するのに適した滴剤を含む。活性成分は局所投与の場合、配合物の0.01〜5.0wt%を含むことができる。
【００９０】
本発明による滴剤は、滅菌水性又は油性溶液又は懸濁液を含むことができ、そして殺菌剤及び/又は防かび剤及び/又は任意の好適な保存剤の好適な水溶液中に活性成分を溶解させ、そして好ましくは界面活性剤を含むことにより調製することができる。その結果得られた溶液を次いで濾過によって澄ませ、好適な容器に移し、次いでこの容器を密封し、オートクレーブ処理によって、又は30分間にわたって90〜100℃に維持することにより滅菌する。或いは、溶液は、濾過して無菌法により容器に移すことにより滅菌することもできる。滴剤中に含めるのに適した殺菌剤及び/又は防かび剤の例は、硝酸フェニル水銀又は酢酸フェニル水銀(0.00217c)、塩化ベンザルコニウム(0.01%)及び酢酸クロルヘキシジン(0.01%)である。油性溶液を調製するのに適した溶剤は、グリセロール、希釈アルコール、及びプロピレングリコールを含む。
【００９１】
本発明によるローションは、皮膚又は目への塗布に適したローションである。洗眼液(眼用ローション)は、任意には殺菌剤を含有する滅菌水溶液を含むことができ、そして、滴剤の調製と同様の方法によって調製することができる。皮膚への塗布のためのローション又はリニメント剤は、乾燥を加速し、そして皮膚を冷やすための物質、例えばアルコール又はアセトン、及び/又は、保湿剤、例えばグリセロール、又は油、例えばヒマシ油又は落花生油を含むこともできる。本発明によるクリーム、軟膏又はペーストは、外部からの塗布のための活性成分の半固形配合物である。これらは、微粉又は粉末の形態の活性成分を、単独で又は水性又は非水性流体の形態の溶液又は懸濁液中で、好適な機械装置を用いて、脂肪性又は非脂肪性基剤と混合することにより形成することができる。基剤は炭化水素、例えば硬質、軟質又は液状パラフィン、グリセロール、蜜蝋、金属石けん；粘漿剤；天然起源の油、例えばアーモンド、トウモロコシ、落花生、ヒマシ又はオリーブ油；羊毛脂又はその誘導体、又は脂肪酸、例えばステアリン酸又はオレイン酸を、アルコール、例えばプロピレングリコール又はマクロゴールと一緒に含むことができる。配合物は任意の好適な界面活性剤、例えばアニオン性、カチオン性又は非イオン性界面活性剤、例えばソルビタン・エステル又はそのポリオキシエチレン誘導体を組み入れることができる。懸濁化剤、例えば天然ゴム、セルロース誘導体、又は無機材料、例えばケイ質シリカ、及びその他の成分、例えばラノリンを含むこともできる。その他のアジュバント及び投与様式が製薬業界において良く、しかも幅広く知られている。本発明は特定の実施態様に関して説明したが、これらの実施態様の詳細は、本発明を限定するものとして解釈してはならない。
【００９２】
in vivo投与のために使用されるべきミトNEET又は断片は、無菌でなければならない。このことは、凍結乾燥及び戻し処理の前又は後で、滅菌濾膜を通して濾過することにより容易に達成される。
【００９３】
治療用ミトNEET組成物は一般には、滅菌アクセス・ポートを有する容器、例えば静脈内輸液用バッグ、又は皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有するバイアル内に入れられる。
【００９４】
ミトNEET又はミトNEET抗体の投与経路は、周知の方法に基づく。ミトNEET又はミトNEET抗体は、例えば静脈内、腹腔内、脳内、筋内、眼内、動脈内又は病変内経路での注射又は輸液によって投与されるか、或いは、下記のような徐放性システムによって投与される。ミトNEET又は断片は、輸液又はボーラス注入によって連続的に投与される。ミトNEET抗体は同様に投与されるか、或いは血流中又はリンパ中に投与される。
【００９５】
徐放性調製物の好適な例は、成形物品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態の半透性ポリマー・マトリックスを含む。徐放性マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号明細書、欧州特許第58,481号明細書)、L-グルタミン酸とガンマエチル-L-グルタメートとのコポリマー(Sidman他、Biopolymers, 22: 547-556 >1983)、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)(Langer他、L. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277> 1981, 及びLanger, Chem. Tech., 12: 98-105 > 1982)、エチレンビニルアセテート(Langer他、前出)又はポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸(欧州特許第133,988号明細書)を含む。徐放性ミトNEET組成物はまた、リポソームで捕捉されたミトNEETを含む。ミトNEETを含有するリポソームは、それ自体公知の方法：独国特許第3,218,121号明細書；Epstein他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692(1985)；Hwang他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034(1980)；欧州特許第52,322号明細書；同第36,676号明細書；同第88,046号明細書；同第143,949号明細書；同第142,641号明細書；日本国特許出願第83-118008号明細書；米国特許第4,485,045号及び同第4,544,545号の各明細書；及び欧州特許第102324号明細書によって調製される。通常、リポソームは、脂質含有率が約30%を上回るコレステロールである小さな(約200〜800オングストローム)単層型であり、選択される比率は、最適なミトNEET治療に合わせて調節される。
【００９６】
治療に採用されるべきミトNEETの有効量は、例えば治療対象、投与経路、及び患者の状態に依存することになる。従って、最適な治療効果を得るために、必要に応じて治療専門家が投与量を滴定し、そして投与経路を変更することが必要となる、典型的には、医師は、投与量が所望の効果を達成する量に至るまで、ミトNEET又は断片を投与することになる。この治療の進行は、コンベンショナルなアッセイによって容易にモニタリングされる。
【００９７】
ミトNEET又はその抗体の分析法はすべて、下記試薬のうちの1種又は2種以上を使用する：標識付き被検体類似体、固定化被検体類似体、標識付き結合パートナー、固定化結合パートナー、及び立体複合体。標識付き試薬は「トレーサー」としても知られている。使用される標識(これはプローブとして使用するためのミトNEET核酸に標識付けするのに有用でもある)は、任意の検出可能な機能を有し、この機能は被検体及びその結合パートナーの結合を妨害することはない。多数の標識が免疫アッセイにおいて使用するのに知られており、その例は、直接的に検出され得る部分、例えば蛍光色素標識、化学発光標識及び放射性標識、並びに、検出のために反応又は誘導体化させなければならない部分、例えば酵素を含む。このような標識の例は、放射性同位体32P、14C、125I、3H及び131I、フルオロフォア、例えば希土類キレート、又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルセリフェラーゼ、例えば蛍光ルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ(米国特許第4,737,456号明細書)、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ、例えばグルコース・オキシダーゼ、ガラクトース・オキシダーゼ、及びグルコース-6-ホスフェート・デヒドロゲナーゼ、色素前駆体を酸化するために過酸化水素を採用する酵素、例えばHRP、ラクトペルオキシダーゼ、又はミクロペルオキシダーゼとカップリングされた複素環式オキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチン・オキシダーゼ、ビオチン/アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定的フリーラジカルなどを含む。
【００９８】
タンパク質又はポリペプチドにこれらの標識を共有結合するために、コンベンショナルな方法を利用することができる。例えば、カップリング剤、例えばジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、ビス-イミデート、及びビス-ジアゾ化ベンジジンなどを使用して、抗体に上述の蛍光標識、化学発光標識及び酵素標識を施すことができる。例えば、米国特許第3,940,475号明細書(蛍光測定)及び同第3,645,090号明細書(酵素)；Hunter他, Nature, 144: 945(1962); David他, Biochemistry, 13: 1014-1021(1974)；Pain他, J. Immunol. Methods, 40:219-230(1981)；及びNygren, J. Histochem. Cytochem., 30:407-412(1982)を参照されたい。この場合の好ましい標識は、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼのような酵素である。これらの酵素を含むこのような標識を抗体に複合することは、免疫アッセイ技術の当業者にとっては標準的な操作手順である。例えばO'Sullivan他「Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugate for Use in Enzyme Immunoassay」(Methods in Enzymology, J.J. Langone及びH. Van Vunakis編, 第73巻(Academic Press, New York, New YOrk, 1981)第147-166頁参照。このような結合法は、ミトNEET、又はすべてがタンパク性であるその抗体とともに使用するのに適している。
【００９９】
試薬の固定化が、或る特定のアッセイ法のために必要である。固定化は、溶液中に遊離したままの任意の被検体から結合パートナーを分離することを伴う。このことは従来より、結合パートナー又は被検体類似体をアッセイ処置前に不溶化すること、水不溶性マトリックス又は表面に吸着すること(Bennich他、米国特許第3,720,760号明細書)、共有結合すること(例えばグルタルアルデヒド架橋を利用)、又はパートナー又は類似体を例えば免疫沈降により後で不溶化すること、によって達成される。
【０１００】
競合アッセイ又はサンドイッチ・アッセイとして知られる他のアッセイ法が十分に確立されており、商業的な診断業界において幅広く使用されている。
【０１０１】
競合アッセイは、トレーサー類似体が、共通の結合パートナー上の限定された数の結合部位を巡って、試料被検体と競合する能力に依存する。結合パートナーは一般に、競合前又は競合後に不溶化され、次いで結合パートナーに結合されたトレーサー及び被検体が、未結合のトレーサー及び被検体から分離される。この分離は、デカントによって(結合パートナーが競合反応後に前不溶化された場合)、又は遠心分離によって(結合パートナーが競合反応後に沈降された場合)達成される。試料被検体の量は、マーカー物質の量によって測定して、結合済トレーサーの量と反比例する。既知の量の被検体との投与量-応答曲線を準備し、そして試験結果と比較することにより、試料中に存在する被検体の量を定量する。これらのアッセイは、検出可能なマーカーとして酵素が使用される場合には、ELISAシステムと呼ばれる。
【０１０２】
「均質」アッセイと呼ばれる別種の競合アッセイは、相分離を必要としない。この場合、酵素と被検体との複合体が調製され、抗被検体が被検体に結合すると抗被検体の存在が酵素活性を修飾するように使用される。この場合、ミトNEET又はその免疫活性断片が、酵素、例えばペルオキシダーゼへの二官能性有機ブリッジと複合される。複合体は、抗ミトNEETと一緒に使用するために選択されるので、抗ミトNEETの結合は、標識の酵素活性を阻害又は増強する。この方法自体はEMITの名称で広く実施されている。
【０１０３】
均質アッセイのための立体障害法において立体複合体が使用される。これらの複合体は、低分子量ハプテンを小型被検体に共有結合することにより合成されるので、ハプテンに対する抗体は実質的に、被検体と同時に複合体と結合することはできない。このアッセイ手順において、試料中に存在する被検体は抗被検体と結合することになり、これにより抗ハプテンが複合体に結合するのを可能にし、その結果、複合ハプテンの特性に変化が生じ、例えばハプテンがフルオロフォアの場合、蛍光が変化する。
【０１０４】
ミトNEET又はミトNEET抗体の決定のために、サンドイッチ・アッセイが特に有用である。順次サンドイッチ・アッセイにおいて、試料被検体を吸着するために、固定化結合パートナーが使用される。試料は洗浄により取り出され、結合済被検体は、標識付き結合パートナーを吸着するのに使用され、次いで結合済材料が残留トレーサーから分離される。結合済トレーサーの量は、試料被検体に対して正比例する。「同時」サンドイッチ・アッセイの場合、標識付き結合パートナーを加える前に試料が分離されることはない。一方の抗体として抗ミトNEETモノクローナル抗体を使用し、他方の抗体としてポリクローナル抗ミトNEET抗体を使用した順次サンドイッチ・アッセイが、ミトNEET活性のための試料を試験する上で有用である。
【０１０５】
前述のものは、ミトNEET及び抗体の診断アッセイの一例に過ぎない。これらの被検体の決定のために現在又は今後開発される他の方法が、上述のバイオアッセイを含めて本発明の範囲に含まれる。
【０１０６】
抗体
ポリクローナル及びモノクローナル抗体調製のための標準的な技術によって、ミトNEETポリペプチドを免疫原として使用することにより、抗体を生成することができる。完全長ポリペプチド又はタンパク質を使用することができ、或いは、本発明は免疫原として使用するための抗原ペプチド断片を提供する。本発明のタンパク質の抗原ペプチドは、アミノ酸配列の8つ以上(好ましくは10, 15, 20又は30)のアミノ酸残基を含み、タンパク質のエピトープを包含するので、ペプチドに対して生じた抗体は、タンパク質との特異的免疫複合体を形成する。
【０１０７】
抗原ペプチドによって包含される好ましいエピトープは、タンパク質の表面上に位置する領域、例えば親水性領域である。ヒドロパシー・プロット又は同様の分析を用いて親水性領域を同定することができる。
【０１０８】
好適な対象(例えばウサギ、ヤギ、マウス又はその他の哺乳動物)を免疫化することにより抗体を調製するために、免疫原が使用されるのが典型的である。好適な免疫原調製物は、例えば組換え発現された化学合成ポリペプチドを含有することができる。調製物はさらに、アジュバント、例えばFreundの完全又は不完全なアジュバント、又は同様の免疫賦活剤を含むことができる。
【０１０９】
本明細書中に使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン分子の免疫活性部分、すなわち抗原、例えば本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を意味する。本発明の所与のポリペプチドに特異的に結合する分子は、ポリペプチドと結合するが、しかしポリペプチドを自然の状態において含有する試料中、例えば生体試料中の他の分子とは実質的に結合しない分子である。免疫グロブリン分子の免疫活性部分の例は、F(ab)及びF(ab')2断片を含む。これらの断片は、抗体を酵素、例えばペプシンで処理することにより生成することができる。「抗体」という用語は、軽鎖及び重鎖可変領域(VL及びVH)だけを含有するFv断片；ジスルフィド結合によって結合されたFv断片(Brinkmann他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:547-551(1993))；可変領域及び定常領域の一部、(Fab)'2、ダイマーFabs又はトリマーFabsを含有するFab断片(多価及び/又は多特異的であってよい)；単鎖抗体(ScFv)(Bird他、Science 242:424-426(1988)；Huston他、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:5879-5883(1988))、単鎖マルチマー(ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディなど)(多価及び/又は多特異的であってよい)を含む。本発明はポリクローナル及びモノクローナル抗体を提供する。本明細書中に使用される「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位の唯一の種を含有する抗体分子の個体群を意味する。
【０１１０】
免疫原として本発明のポリペプチドで好適な対象を免疫化することにより、ポリクローナル抗体を上述のように調製することができる。免疫化された対象における抗体力価は、標準的な技術、例えば固定化ポリペプチドを使用して酵素結合イムノソルベント・アッセイ(ELISA)によって、所定の時間にわたってモニタリングすることができる。所望の場合には、抗体分子を哺乳動物から(例えば血液から)分離し、さらによく知られた技術、例えばタンパク質Aクロマトグラフィによってさらに精製することにより、IgG画分を得ることができる。免疫化後の好適な時点で、例えば特異抗体力価が最高である時点で、対象から抗体生成細胞を獲得し、これらの細胞を使用することにより、標準的な技術、例えば最初はKohler及びMilstein(1975) Nature 256: 495-497によって記載されたハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor他(1983) Immunol Today 4:72)、EBV-ハイブリドーマ技術(Cole他(1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 第77〜96頁)、又はトリオーマ技術によって、モノクローナル抗体を調製することができる。ハイブリドーマ産生技術はよく知られている(Current Protocols in Immunology (1994) Coligan他(編) John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y.を全体的に参照)。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的なELISAアッセイを用いて、当該ポリペプチドと結合する抗体に関して、ハイブリドーマ培養上澄みをスクリーニングすることにより検出される。
【０１１１】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマの調製とは異なり、当該ポリペプチドとの組換え組み合わせ免疫グロブリン・ライブラリー(例えば抗体ファージ表示ライブラリー)をスクリーニングすることにより、ミトNEETポリペプチドに対するモノクローナル抗体を同定し、そして分離することができる。ファージ表示ライブラリーを生成してスクリーニングするためのキットが商業的に入手可能である(例えば、Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01；及びStratagene SurfZAPJ Phage Display Kit, Catalog No. 240612)。加えて、抗体表示ライブラリーを生成してスクリーニングする際に特に使用されやすい方法及び試薬の例は、例えば米国特許第5,223,409号明細書；国際公開第92/18619号；同第91/17271号；同第92/20791号；同第92/15679号；同第93/01288号；同第92/01047号；同第92/09690号；同第90/02809号の各パンフレット；Fuchs他(1991) Bio Technology 9:1370-1372; Hay他(1992) Hum. Antibody Hybridomas 3:81-85; Huse他(1989) Science 246:1275-1281; Griffiths他(1993) EMBO J. 12:725-734に見いだすことができる。
【０１１２】
ミトNEET抗体の調製
ミトNEET及びアジュバントを複数回皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより、動物内にミトNEETに対するポリクローナル抗体が一般に引き起こされる。二官能価剤又は誘導体化剤を使用して、免疫化されるべき種内で免疫原性のタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシ・サイログロブリン、又は大豆トリプシン・インヒビターに、標的アミノ酸配列を含有するミトNEET又はフラグメントを複合することが有用である場合がある。官能価剤又は誘導体化剤は例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシニミドエステル(システイン残基を介した複合)、N-ヒドロキシスクシニミド(リシン残基を介した複合)、グルタルアルデヒド、無水琥珀酸、SOCl2又はR'N=C=NR(R及びR'は異なるアルキル基である)である。
【０１１３】
(それぞれウサギ又はマウスに対して)1mg又は1μgの複合体を3容積のFreund完全アジュバントと合体させ、そして溶液を複数部位に皮下注射することにより、免疫原性複合体又は誘導体に対して動物を通常免疫化させる。1か月後、Freund不完全アジュバント中の元の量の1/5〜1/10の複合体を用いて、複数部位に皮下注射することにより、動物をブーストする。7〜14日後に動物から採血し、血清を抗ミトNEET滴定に関してアッセイする。滴定が水平状態になるまで動物をブーストする。好ましくは、同じミトNEETの複合体ではあるがしかし、異なるタンパク質に複合され且つ/又は異なる架橋剤を介して複合された複合体で、動物をブーストする。組換え体細胞培養においてタンパク質融合体として、複合体を形成することもできる。また、免疫応答を高めるために、ミョウバンのような凝集剤が使用される。動物を類似宿主細胞で免疫化することが好都合の場合がある。類似宿主細胞は、別の種の標的受容体を発現させるように形質転換されている。
【０１１４】
免疫化動物から脾臓細胞を回収し、そしてコンベンショナルな形式で、例えば骨髄腫細胞との融合、又はEpstein-Barr(EB)-ウィルス形質転換によって細胞を固定化し、そして所望抗体を発現させるクローンをスクリーニングすることによって、モノクローナル抗体を調製する。モノクローナル抗体は、他の既知のミトNEETポリペプチドとは交差反応しないことが好ましい。
【０１１５】
加えて、例えば国際公開第87/02671号パンフレット；欧州特許出願公開第184,187号；同第171,496号；同第173,494号；同第86/01533号の各明細書；米国特許第4,816,567号明細書；欧州特許出願公開第125,023号明細書；Better他(1988) Science 240:1041-1043；Liu他(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu他(1987) J. Immuno. 139:3521-3526; Sun他(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218；Nishimura他(1987) Canc. Res. 47: 999-1005；Wood他(1985) Nature 314:446-449；及びShaw他(1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559)；Morrison (1985) Science 229: 1202-1207；Oi他(1986) Bio/Techniques 4/214; 米国特許第5,225,539；Jones他(1986)Nature 321:552-525 ;Verhoeyan他(1988) Science 239:1534;及びBeidler他(1988) J. Immunol. 141:4053-4060に記載されている方法を用いて、当業者に知られた組換えDNA技術によって、キメラ及びヒト化モノクローナル抗体を産生することができる。
【０１１６】
ヒト患者の治療のためには、完全ヒト抗体が特に望ましい。このような抗体はトランスジェニック・マウスを使用して産生することができる。トランスジェニックマウスは、内生的免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子を発現させることはできず、しかしヒト重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子を発現させることができる。トランスジェニック・マウスは、選択された抗原、例えばミトNEETポリペプチドの全て又は一部で通常の形式で免疫化される。コンベンショナルなハイブリドーマ技術を用いて、抗原に対するモノクローナル抗体を得ることができる。トランスジェニック・マウスによって収容されたヒト免疫グロブリン・トランス遺伝子は、B細胞分化中に再配列し、続いてクラススイッチ及び体細胞突然変異を被る。こうして、このような技術を用いて、治療上有用なIgG, IgA及びIgE抗体を産生することが可能である。このヒト抗体産生技術の概観に関しては、Lonberg及びHuszar(1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93)を参照されたい。ヒト抗体及びヒト・モノクローナル抗体のこの産生技術、及びこのような抗体の産生プロトコルの詳細な論議に関しては、米国特許第5,625,126号明細書；同第5,633,425号明細書；同第5,569,825号明細書；同第5,661,016号明細書；同第5,545,806号明細書を参照されたい。加えて、上記技術と同様の技術を用いて、選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに、Abgenix, Inc(Freemont, Calif.)のような企業が従事することができる。
【０１１７】
ファージ表示ライブラリー(均質、及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381(1991)；Marks他, J. Mol. Biol., 222:581(1991))を含む、当業者に知られた種々の技術を用いて、ヒト抗体を産生することもできる。ヒト・モノクローナル抗体の調製のためには、Cole他及びBoerner他の技術も利用可能である(Cole他、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 第77頁(1985)、及びBoerner他, J. Immunol., 147(1):86-95(1991))。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えばマウス内に導入することにより、ヒト抗体を形成することができる。これらのトランスジェニック動物において、内生的免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されている。攻撃時には、遺伝子再配列、集成及び抗体レパートリーを含む全ての点でヒトに見られるものと酷似しているヒト抗体産生が観察される。このアプローチは例えば、米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,661,016号の各明細書、及び下記科学分野の刊行物：Marks他., Bio Technology 10, 779783(1992)；Lonberg他, Nature 368 856-859(1994)；Morrison, Nature 368, 812-13(1994)；Fishwild他、Nature Biotechnology 14, 845-51(1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996)；Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93(1995)に記載されている。
【０１１８】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、2つ以上の異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒト又はヒト化抗体である。この事例において、結合特異性のうちの一方はPAに対するものであり；他方の結合特異性は、任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又は受容体又は受容体サブユニットに対するものである。
【０１１９】
二重特異性抗体の形成方法は当業者に知られている。伝統的には、二重特異性抗体の組換え産生は、2つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖対の同時発現に基づいている。この重鎖/軽鎖対において、2つの重鎖は異なる特異性を有している(Milstein 及びCuello, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖がランダムに取り合わされていることにより、これらのハイブリドーマ(クワドローマ)は、10個の異なる抗体分子から成る潜在的混合物を産生し、これらの抗体分子のうちの1つだけが正しい二重特異性構造を有している。正しい分子の精製は通常、アフィニティ・クロマトグラフィ工程によって達成される。同様の手順が、1993年5月13日付けで発行された国際公開第93/08829号パンフレット、及びTraunecker他, EMBO J., 10:3655-3659(1991)に開示されている。
【０１２０】
所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗体-抗原合体部位)を、免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合することができる。融合は好ましくは、免疫グロブリン重鎖定常ドメインと行われる。このドメインはヒンジ、CH2及びCH3領域の少なくとも一部を含む。融合体の少なくとも1つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含有する、第1重鎖定常領域(CHI)を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、及び所望の場合には免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAを、別個の発現ベクター内に挿入し、これらの好適な宿主生物内に同時トランスフェクトする。二重特異性抗体の生成のさらなる詳細に関しては、例えばSuresh他、Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
【０１２１】
国際公開第96/27011号パンフレットに記載された別のアプローチによれば、抗体分子対の間の界面を遺伝子工学的に作り出すことにより、組換え体細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセンテージを最大化することができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのCH3領域の少なくとも一部を含む。この方法の場合、第1抗体分子の界面から生じる1つ又は2つ以上の小型アミノ酸側鎖の代わりに、より大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)を配置する。大型アミノ酸側鎖の代わりにより小さなアミノ酸側鎖(アラニン又はトレオニン)を配置することにより、大型側鎖と同一又は同様のサイズの補償「キャビティ」が、第2抗体分子の界面上に形成される。このことは、他の不所望な最終生成物、例えばホモダイマーの量を上回るように、ヘテロダイマー収量を増加させるためのメカニズムを提供する。
【０１２２】
完全長抗体又は抗体断片(例えばF(ab')2 二重特異性抗体)として、二重特異性抗体を調製することができる。抗体断片から二重特異性抗体を生成するための技術が文献に記載されている。例えば、化学結合を用いて、二重特異性抗体を調製することができる。Brennan他, Science 229:81(1985)に記載された手順の場合、無傷の抗体をタンパク質分解することにより、F(ab')2断片を生成する。ジチオール錯化剤砒酸ソーダの存在において、これらの断片を還元することにより、近接ジチオールを安定化し、そして分子間ジスルフィド形成を防止する。次いで、生成されたFab'断片をチオニトロベンゾエート(TNB)誘導体に変換する。Fab'-TNB誘導体のうちの一方を、メルカプトエチルアミンで還元することにより、Fab'-チオールに再変換し、そして等モル量の他方のFab'-TNB誘導体と混合することにより、二重特異性抗体を形成する。産生された二重特異性抗体を、酵素を選択的固定化するための物質として使用することができる。
【０１２３】
Fab'断片をE.coliから直接的に回収して化学的にカップリングすることにより、二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby他(J. Exp. Med. 175:217-225(1992))は、完全ヒト化二重特異性抗体F(ab')2分子の産生を記載している。それぞれのFab'断片をE.coliから別個に分泌させ、そしてこの断片に指向性化学カップリングをin vitroで施すことにより、二重特異性抗体を形成する。こうして形成された二重特異性抗体は、ErbB2受容体を過剰発現させる細胞及び正常ヒトT細胞に結合し、また、ヒト乳癌標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性をトリガーすることができた。
【０１２４】
組換え体細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を形成して分離するための種々の技術も記載されている。例えば、ロイシン・ジッパーを使用して二重特異性抗体が産生されている。Kostelny他, J. Immunol. 148(5):1547-1553(1992)。Fos及びJunタンパク質に由来するロイシン・ジッパー・ペプチドを、遺伝子融合によって、2つの異なる抗体のFab'部分に結合した。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元することにより、モノマーを形成し、次いで再酸化させることにより、抗体へテロダイマーを形成した。この方法は、抗体ホモダイマーの産生のために利用することもできる。Hollinger他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448(1993)によって記載された「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を形成するための別のメカニズムを提供している。断片は、リンカーによって軽鎖可変ドメイン(VL)に結合された重鎖可変ドメイン(VH)を含む。軽鎖可変ドメインは、同じ鎖の2つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎる。従って1つの断片のVHドメイン及びVLドメインを強制的に、別の断片の相補的なVLドメイン及びVHドメインと対合させ、これにより2つの抗原結合部位を形成する。単鎖Fv(sFv)ダイマーの使用によって二重特異性抗体断片を形成するための別の戦略も報告されている。Gruber他、J.Immunol. 152:5368(1994)を参照されたい。
【０１２５】
3価を有する抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる(Tutt他、J.Immunol. 147:60(1991))。この場合、所与のポリペプチド上の2つの異なるエピトープに、一例としての二重特異性抗体を結合することができる。或いは、白血球上のトリガー分子、例えばT-細胞受容体分子(例えばCD2, CD3, CD28又はB7)、又はIgGに対するFc受容体(FcγR)、例えばFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、及びFcγRIII(CD16)に結合するアームと、アームを合体させることにより、本発明の特定タンパク質を発現させる細胞に細胞防御メカニズムを集中させることができる。二重特異性抗体を使用することにより、本発明の特定タンパク質を発現させる細胞に、細胞毒性薬を局在化させることもできる。これらの抗体は、本発明のタンパク質に対する結合アームと、細胞毒性薬又は放射性核種キレート剤、例えばEOTUBE, DPTA, DOTA又はTETAと結合するアームとを有している。別の当該二重特異性抗体はポリペプチドと結合し、さらに組織因子(TF)と結合する。
【０１２６】
抗体の製薬組成物
本明細書中で規定されたポリペプチド、並びに本明細書中で開示されたスクリーニング・アッセイによって同定された他の分子と特異結合する抗体を、製薬組成物の形態で、種々の傷害の治療のために投与することができる。
【０１２７】
ポリペプチドが細胞内に位置し、抗体全体が阻害剤として使用される場合、抗体を内部化することが好ましい。しかしリポフェクチン又はリポソームを使用して抗体又は抗体断片を細胞内に送達することもできる。抗体断片が使用される場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に応じて、標的タンパク質配列と結合する能力を維持するペプチド分子を構成することができる。このようなペプチドは、化学的に合成し、且つ/又は、組換えDNA技術によって産生することができる。例えばMarasco他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照されたい。本明細書中の配合物はまた、治療されている特定の兆候にとって必要な2種以上の活性化合物、好ましくは互いに不都合な影響を与えることのない相補的な活性を有する化合物を含有することもできる。或いは又は加えて、組成物は、その機能を高める物質、例えば細胞毒性剤、サイトカイン、化学治療剤、又は成長阻害剤を含むことができる。このような分子は、所期目的にとって効果的な量の組み合わせで好適に存在する。
【０１２８】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれコロイド薬物送達システム(例えばリポソーム、アルブミン・ミクロ球体、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロ・エマルジョンにおける、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル、及びポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセル内に捕捉することもできる。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences(前出)に開示されている。
【０１２９】
in vivo投与のために使用されるべき配合物は無菌でなければならない。このことは、滅菌濾膜を通した濾過により容易に達成される。
【０１３０】
徐放性調製物を調製することができる。徐放性調製物の好適な例は、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含む。これらのマトリックスは成形物品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態を成している。徐放性マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル(例えばポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリアクチド(米国特許第3,773,919号明細書)、L-グルタミン酸及びL-グルタミン酸エチルのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLLTRON DEPOT（登録商標）(乳酸-グリコール酸コポリマーと、酢酸ロイプロリドとから成る注射可能なミクロ球体)、及びポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び酪酸-グリコール酸のようなポリマーは、100日以上にわたって、分子の放出を可能にするが、或る特定のヒドロゲルは短時間にわたってタンパク質を放出する。カプセル化された抗体が長時間にわたって体内に残っていると、これらは37℃における湿分に対して暴露された結果として、変性又は凝集するおそれがある。その結果、生物学的活性が失われ、免疫原性に変化が生じることがある。関与するメカニズムに応じた安定性を得るために、道理にかなった戦略を考え出すことができる。例えば、凝集メカニズムがチオジスルフィド相互交換による分子間S-S結合形成であることが発見された場合、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、湿分含量を制御し、好適な添加剤を使用し、そして特異的ポリマー・マトリックス組成物を発生させることにより、安定化を達成することができる。
【０１３１】
ミトNEET及びその抗体の使用
ミトNEETをコードする核酸は、組織に対して特異的な分類のための診断手段として使用することができる。例えば、in situ ハイブリッド形成法、及びノーザン及びサザン・ブロッティング法、及びPCR分析のような処置を用いて、ミトNEETをコードするDNA及び/又はRNAが、評価されている細胞型に存在するかどうかを見極めることができる。
【０１３２】
ミトNEET受容体抗体は、特異的な細胞又は組織内でのミトNEET発現のための診断アッセイにおいて有用である。抗体は、上述のミトNEETと同様に標識付けし、且つ/又は、不溶性マトリックス上に固定化する。
【０１３３】
ミトNEET抗体はまた、組換え細胞培養又は天然源からミトNEETをアフィニティ精製するのに有用である。
【０１３４】
ミトNEET及びその抗体に適した診断アッセイは、それ自体良く知られている。このようなアッセイは競合アッセイ及びサンドイッチ・アッセイ、及び立体阻害アッセイを含む。競合法及びサンドイッチ法は、方法の不可欠な部分として相分離ステップを採用するのに対して、立体阻害アッセイは、単一の反応混合物中で行われる。基本的には、ミトNEETアッセイに関して、またミトNEETと結合する物質に関して、同じ手順が用いられるが、アッセイされる物質の分子量に応じて、或る特定の方法が好まれる。従って、試験されるべき物質は、抗原であれ抗体であれその状態には無関係に本明細書中では被検体と呼ばれる。被検体に結合するタンパク質は、これらの抗体であれ、細胞表面受容体であれ、抗原であれ、結合パートナーと呼ばれる。
【０１３５】
ミトNEETに対する抗体を使用することにより、(例えば細胞溶解物又は可溶化細胞上澄み中で)タンパク質を検出することにより、ポリペプチド発現の豊富さ及びパターンを評価することができる。ミトNEETを免疫沈降させるために抗体を使用することにより、種々の条件を診断することができる、関連タンパク質の補体を評価することが可能になる。抗体を診断上使用することにより、臨床試験処置の一部として組織中のタンパク質レベルをモニタリングし、例えば、所与の治療計画を有効性を見極めることができる。抗体を検出可能物質にカップリングすることにより、検出を容易にすることができる。検出可能物質の例は、種々の酵素、補欠分子族、蛍光材料、ルミネッセント材料、生物ルミネッセント材料、及び放射性材料を含む。好適な酵素の例は、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、a-ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンステラーゼを含み；好適な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン/ビオチン及びアビジン/ビオチンを含み；好適な蛍光材料の例は、ウンベリフェロン、フルオロセイン、フルオロセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオロセイン、塩化ダンシル又はフィコエリトリンを含み；ルミネッセント材料の例はルミノールを含み；生物ルミネッセント材料の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンを含み、そして好適な放射性材料の例は、125I、131I、35S又は3Hを含む。
【０１３６】
生体活性ミトNEET含量が増大した抗体又は膜を有するか又は有さない精製ミトNEETタンパク質を使用することにより、下記のような種々の用途に対して潜在的な有用性を有する化合物を発見/スクリーニングすることができる。
【０１３７】
糖尿病のアッセイ
種々のアッセイを用いることにより、ミトNEET及び/又はミトNEET関連タンパク質と相互作用する化合物に関して試験することができる。例えば、ミトNEETとの直接的な相互作用を評価するのに加えて、ミトNEETと関連する酵素活性に影響を与える能力に関して、化合物を評価することができる。その一例としては、特にミトコンドリアにおける脂肪酸酸化に関与する酵素が挙げられる。このアプローチの一例は、ミトNEETを含有する、分離された膜又は無傷のミトコンドリアを使用して、脂肪酸アシル-CoAエステルのβ-酸化の速度を測定することである。HPLCによって、又は補因子又は基質の還元速度によって評価して、生成物の出現によって代謝体を測定する(例えば図9)。次いで、これらの酵素活性に対してミトNEET活性を調節するときに活性である化合物を、無傷の細胞(例えば肝細胞、含脂肪細胞、など)中で評価することができる。この場合、細胞からの抽出後、HPLCによって中間体を測定する。次いで、これらのアッセイにおいてミトNEET活性を調節し、また治療薬になるための好適な特性をも含有する活性化合物は、糖尿病の動物モデルにおける抗糖尿病作用、例えば循環するグルコース及びインスリンのレベルの低下、及びインスリン依存性遺伝子発現の改善をもたらすことが期待される(例えばHofmann, C., Lornez, K.,及びColca, J.R.(1991) Endocrinology, 129:1915-1925; Hofmann, C., Lornez, K.,及びColca, J.R.(1991) Endocrinology, 130:735-740)。
【０１３８】
心臓血管、内皮及び血管形成活性のアッセイ
種々のアッセイを用いることにより、心臓血管、内皮及び血管形成活性に関して、本明細書中のミトNEETを試験することができる。このようなアッセイは、下記実施例において提供されるアッセイを含む。
【０１３９】
米国特許第5,773,414号明細書に開示されているように、エンドセリン・アンタゴニスト活性に関して試験するためのアッセイは、ラット心室結合アッセイ(受容体アッセイで、ヨウ素処理エンドセリン-1結合を阻害するミトNEETの能力が試験される)、エンドセリン受容体結合アッセイ(ウサギ腎動脈血管平滑筋細胞を使用して、放射性標識付きエンドセリン-1の無傷細胞結合を試験する)、イノシトール・ホスフェート蓄積アッセイ(第2メッセンジャーの細胞内レベルを測定することにより、Rat-I細胞内で機能活性を見極める)、アラキドン酸放出アッセイ(培養された血管平滑筋内のエンドセリン刺激されたアラキドン酸放出を低減する添加化合物の能力を測定する)、in vitro(分離血管)研究(オスNew Zealandウサギ由来の内皮を使用)、及びin vitro(オスSprague-Dawleyラットを使用)を含む。
【０１４０】
組織生成活性のアッセイの一例としては、国際公開第95/16035号パンフレット(骨、軟骨、腱)、国際公開第95/05846号パンフレット(神経、ニューロン)、及び国際公開第91/07491号パンフレット(皮膚、内皮)に記載されたアッセイが挙げられる。
【０１４１】
創傷治癒活性のアッセイは例えば、Winter, Epidermal Wound Healing, Maibach, HI及びRovee, DT編(Year Book Medical Publishers, Inc., Chicago)第71-112頁(Eaglestein 及びMertzの論文によって変更)、J. Invest. Dermatol., 71:382-384(1978)に記載されたアッセイを含む。
【０１４２】
いくつかの心臓肥大アッセイがある。in vitroアッセイは、成熟ラット心臓ミオサイトの拡大の誘発を含む。このアッセイの場合、事実上、Piper他によって「Adult ventricular rat heart muscle cell」｛Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research, H.M. Piper編(Belrin: Springer-Verlag, 1990)、第36〜60頁｝に詳細に記載された手順の変更に従って、単独の(オスSprague-Dawley)ラットから心室ミオサイトを分離する。この手順は、成熟心室ミオサイトの分離、及び棒状表現型におけるこれらの細胞の長期培養を可能にする。フェニレフリン及びプロスタグランジンF2(PGF2)は、これらの成熟細胞における拡大応答を誘発することが判っている。心臓肥大の種々の潜在的阻害剤による、PGF2又はPGF2類似体(例えばフルプロステノール)及びフェニレフリンによって誘発されるミオサイト拡大の阻害が、次いで試験される。
【０１４３】
抗高血圧作用の有効性は、インスリン抵抗性高血圧を示す動物モデルにおいて、間接的又は直接的手段によって測定することができる｛例えばHypertension 24(1), 106-10, (1994); Metabolism, Clinical and Experimental 44: 1105-9(1995))。ミトNEET同定化合物の有効性は、in vitroで直接的に測定することもできる(例えばJournal of Clinical Investigation 96: 354-60, (1995))。
【０１４４】
腫瘍活性のアッセイ
よく知られている種々の動物モデルを使用することにより、腫瘍の発生及び病原におけるミトNEETの役割をさらに理解し、そして抗体、及びミトNEETのその他のアンタゴニスト、例えば小分子アンタゴニストを含む候補治療薬の有効性を試験することができる。
【０１４５】
このようなモデルのin vivoの性質は、特にヒト患者における応答を予測する。腫瘍及び癌(例えば乳癌、大腸癌、前立腺癌、肺癌など)の動物モデルは、非組換え及び組換え(トランスジェニック)動物の両方を含む。非組換え動物モデルは例えば、齧歯類、例えばマウス・モデルを含む。このようなモデルは、標準技術、例えば皮下注射、尾静脈注射、脾臓埋込み、腹腔内埋込み、腎被膜下埋込み、又は整形外科的埋込み、例えば大腸組織内に埋め込まれた大腸癌細胞を使用して、腫瘍細胞を同系マウス中に導入することにより生成することができる。例えば、1997年9月18日付けで発行された国際公開第97/33551号明細書を参照されたい。腫瘍研究において最も頻繁に使用される動物種は、おそらく免疫不全マウス、具体的にはヌードマウスである。胸腺形成不全/無形成のヌードマウスが、ヒト腫瘍異種移植片の宿主としてうまく作用することができると観察されたので、このマウスはそのために幅広く使用されるようになった。常染色体劣性nu遺伝子は、極めて多数の明確なヌードマウス共通遺伝子系統内に導入されている。これらの系統は例えばASW, A/He, AKR, BALB/c, B I O.LP, C17, CM, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, 1/st, NC, NFR, NFS, NFS1N, NZB, NZC, NZW, P, RIII及びSJLを含む。加えて、ヌードマウス以外の多種多様の他の遺伝性免疫不全動物も育種され、腫瘍異種移植片の受容体として使用されている。更なる詳細に関しては、例えばThe Nude Mouse in Oncology, Rese E. Boven and B. Winograd編(CRC Press, Inc., 1991)を参照されたい。
【０１４６】
このような動物内に導入される細胞は、既知の腫瘍/癌細胞系、例えば上記腫瘍細胞系のいずれか、及び例えばB104-1-1細胞系(neu癌原遺伝子をトランスフェクトされた安定的なN1H-3T3細胞系)；ras-トランスフェクト型N1H-3T3細胞；Caco-2(ATCC HTB-37)；又は中分化等級IIヒト大腸腺癌細胞系、HT-29(ATCC HTB-38)；又は腫瘍及び癌から誘導することができる。
【０１４７】
腫瘍又は癌細胞の試料は、手術を受けた患者から、液体窒素中の凍結及び保存を伴う標準的な条件を用いて得ることができる。Kannali他, Br. J. Cancer, 48:689-696(1983)。
【０１４８】
種々の手順によって、動物、例えばヌードマウス内に腫瘍細胞を導入することができる。マウス中の皮下(s.c)スペースは、腫瘍埋込みに極めて適している。腫瘍は固形塊として、又はトロカールの使用による針生検として、又は細胞懸濁液として移植することができる。固形塊又はトロカール移植の際に、s.c.スペース内に、好適なサイズの腫瘍組織断片を導入する。原発腫瘍又は安定的な腫瘍細胞系から、細胞懸濁液を新たに調製し、そしてこれを皮下注射する。腫瘍細胞は皮下インプラントとして注入することもできる。この位置で、皮膚結合組織の下方部分とs.c.組織との間に接種材料がデポジットされる。
【０１４９】
例えば、Drebin他, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83:9129-9133(1986)に記載されているように、ラット神経芽細胞腫細胞(これらの細胞から最初にi7eu腫瘍遺伝子が分離された)、又はneuトランスフェクト型N1H-3T3細胞をヌードマウス内に埋込むことによって、肺癌の動物モデルを生成することができる。
【０１５０】
同様に、大腸ガン細胞を動物、例えばヌードマウス内に継代接種し、これらの動物中に腫瘍を出現させることにより、大腸ガン動物モデルを生成することもできる。ヌードマウスにおけるヒト大腸癌の同所移植モデルに関しては、例えばWang他、Cancer Research, 54:4726-4728(1994)及びToo他、Cancer Research, 55:681-684(1995)に記載されている。このモデルは、AntiCancer, Inc.(San Diego, California)によって販売されているいわゆる「METAMOUSE」に基づいている。
【０１５１】
動物中に生じる腫瘍は、取り出してin vitroで培養することができる。in vitro培養から得られた細胞は、次いで動物に継代接種することができる。このような腫瘍は、更なる試験又は薬物スクリーニングのための標的として使用することができる。或いは、継代接種の結果生じた腫瘍を分離し、継代接種前細胞からRNAを分離し、そして、1又は2以上の継代接種ラウンド後に分離された細胞を、当該遺伝子の示差発現に関して分析することもできる。このような継代接種技術は、任意の既知の腫瘍又は癌細胞系を用いて行うことができる。例えば、Meth A, CMS4, CMS5, CMS2 1, 及びWEHI-164は、BALB/cメスマウスの化学誘導型線維肉腫であり(DeLeo他、J. Exp. Med., 146: 720(1977))、これらの線維肉腫は、種々の物質の抗腫瘍活性を研究するための高度に制御可能なモデル系を提供する。Palladino他、J. Immunol., 138:4023-4032(1987)。手短かにいえば、腫瘍細胞を細胞培養中でin vitroで増殖させる。動物への注入前に、細胞系を洗浄し、細胞密度約10 x 106〜10 x 107細胞/mlで、緩衝液中に懸濁する。次いで動物に細胞懸濁液を皮下で感染させ、1〜3週間にわたって腫瘍を出現させておく。
【０１５２】
加えて、最も十分に研究されている試験癌腫の1つである、マウスのLewis肺(3LL)癌を、研究腫瘍モデルとして使用することができる。この腫瘍モデルにおける有効性は、肺の小型細胞癌腫(SCCL)と診断されたヒト患者の治療における有益な効果と相関されている。この腫瘍は、罹患マウスからの腫瘍断片、又は培養中に維持された細胞の注入時に正常マウス中に導入することができる。Zupi他、Br. J. Cancer, 41:補足4, 30(1980)。証拠が示すところによれば、単一細胞でさえも、その注入から腫瘍が開始することができ、極めて高い比率の感染腫瘍細胞が生き延びる。この腫瘍モデルに関する更なる情報に関しては、Zacharski, Haemostasis, 16:300-320(1986)。
【０１５３】
埋込まれた腫瘍を有する動物モデル中の試験化合物の有効性を評価する1方法は、治療の前後の腫瘍のサイズを測定することである。伝統的には、埋込まれた腫瘍のサイズはスライド・キャリパーを用いて、二次元又は三次元で測定されている。二次元に限定された測定値は、腫瘍のサイズを正確には反映しないので、通常は数式を用いて対応容積に換算される。しかし腫瘍サイズの測定値は極めて不正確である。薬物候補の治療効果は、治療によって誘発された成長遅延及び特異的な成長遅延としてよりよく記述することができる。腫瘍成長の記述の別の重要な変数は、腫瘍容積倍加時間である。腫瘍成長の計算及び記述のためのコンピューター・プログラム、例えばRygaard及びSpang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals, Wu及びSheng編(Basel, 1989), 第301頁によって報告されたプログラムも利用可能である。
【０１５４】
ただし、治療後の壊死及び炎症応答は実際には、少なくとも最初は腫瘍サイズを増大させることがある。従って、これらの変化は形態測定法とフローサイトメトリー分析との組み合わせによって、注意深くモニタリングされる必要がある。
【０１５５】
さらに、標準的なトランスジェニック動物産生技術を用いて、本明細書中で規定されたミトNEET遺伝子のコード部分を、当該動物のゲノム内に導入することにより、組換え(トランスジェニック)動物モデルを作成することができる。トランスジェニック操作の標的として使用することができる動物の一例としては、マウス、ラット、ウサギ、テンジクネズミ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、及びヒト以外の霊長類、例えばヒヒ、チンパンジー及びサルが挙げられる。このような動物中にトランス遺伝子を導入する周知の技術は、前核マイクロインジェクション(米国特許第4,873,191号明細書)；生殖細胞系内へのレトロウィルス媒介性遺伝子導入(例えばVan der Putten他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82; 6148-615(1985))；胚幹細胞への遺伝子標的法(Thompson他, Cell, 56: 313-321(1989))；胚のエレクトロポレーション(Lo, Mol Cell. Biol., 3: 1803-1814(1983))；及び精子媒介性遺伝子導入を含む。Lavitrano他, Cell, 57:717-73(1989)。概論に関しては、例えば米国特許第4,736,866号明細書を参照されたい。
【０１５６】
本発明の目的上、トランスジェニック動物は、それらの細胞の一部にのみトランス遺伝子を担持する動物(モザイク動物)を含む。トランス遺伝子は、単一のトランス遺伝子として、又はコンカテマー内、例えば頭-頭タンデム又は頭-尾タンデム内で一体化することができる。特定の細胞型内にトランス遺伝子を選択的に導入することは、下記の技術、例えばLasko他, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89: 6232 636(1992)の技術によって達成することができる。トランスジェニック動物におけるトランス遺伝子の発現は、標準技術によってモニタリングすることができる。例えば、サザン・ブロット分析又はPCR増幅を用いることにより、トランス遺伝子の一体化を検証することができる。次いでin situ ハイブリッド形成、ノーザンブロット分析、PCR、又は免疫細胞化学のような技術を用いて、mRNA発現レベルを分析することができる。動物は、腫瘍又は癌の発生の徴候に関してさらに試験される。
【０１５７】
或いは、ミトNEETをコードする内生的遺伝子と、動物の胚細胞内に導入された同じポリペプチドをコードする改変ゲノムDNAとの相同組換えの結果として、本明細書中で規定されたミトNEETをコードする欠陥遺伝子又は改変遺伝子を有する「ノックアウト」動物を構成することもできる。ミトNEETをコードするゲノムDNAの一部を欠失させるか、或いは、別の遺伝子と置換することができる。この別の遺伝子は、例えば、一体化をモニタリングするのに使用することができる選択可能マーカーをコードする遺伝子である。典型的には数キロベースの無改変フランキングDNA(5'末端及び3'末端の双方に位置する)が、ベクター内に含まれる。相同組換えベクターの説明に関しては、例えばThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照されたい。ベクターが(例えばエレクトロポレーションによって)胚幹細胞系内に導入され、導入されたDNAが内生的DNAと相同組換えされている細胞が選択される。例えばLi他、Cell, 69:915(1992)を参照されたい。次いで、選択された細胞を動物の胚盤胞内に注入する(例えばマウス又はラット)ことにより、凝集キメラを形成する。例えばBradley (Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. I. Robertson編(IRL: Oxford, 1987)、第113〜152頁。次いでキメラ胚を、偽妊娠した好適なメス里親動物中に埋め込み、そして胚を誕生させることにより、「ノックアウト」動物を形成することができる。生殖細胞中に相同組換えDNAを収容する子孫は、標準技術によって同定することができ、この子孫を使用して、動物の全ての細胞が相同組換えDNAを含有する動物を育種することができる。ノックアウト動物は、例えば或る特定の病理状態に対する防御能力を有すること、及び、ミトNEETの不存在に起因して、病理状態を発生させることを特徴とすることができる。
【０１５８】
ミトNEETと特異的に結合する抗体、及びその他の薬物候補は、動物の自然発生癌の治療において試験することもできる。データは、対照群と比較した、生存、応答及び毒性の差に関して評価される。正の応答は、好ましくは生活の質の改善及び/又は寿命の増大を伴う、腫瘍の退縮の証拠を必要とすることがある。
【０１５９】
加えて、動物の自然腫瘍、例えばイヌ、ネコ及びヒヒの線維肉腫、腺癌、リンパ腫、軟骨腫、又は平滑筋肉腫を試験することもできる。これらのうち、イヌ及びネコにおける哺乳動物腺癌が好ましいモデルである。それというのもその出現及び挙動が、ヒトのそれと極めて類似しているからである。しかし、このモデルの使用は、このタイプの腫瘍が動物にまれにしか発生しないことにより限定される。
【０１６０】
当業者に知られた他のin vitro及びin vivoでの代謝、心臓血管及び腫瘍試験も本明細書において適している。
【０１６１】
代謝、心臓血管及び腫瘍研究の結果は、抗体結合研究によってさらに検証することができる。これらの研究において、代謝、心臓血管及び腫瘍アッセイにおいて使用された上皮細胞、内皮細胞又はその他の細胞に対するミトNEETの効果を阻害する抗ミトNEET抗体の能力が試験される。抗体の例は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、及びヘテロ複合抗体を含む。
【０１６２】
細胞に基づく腫瘍アッセイ
心臓血管、内皮及び血管形成障害、例えば腫瘍に対する、細胞に基づくアッセイ及び動物モデルを用いて、本明細書中の心臓血管、内皮及び血管形成アッセイの発見事項を検証し、そしてさらに、本明細書中で規定された遺伝子と、不所望な心臓血管細胞、内皮細胞及び血管形成細胞の成長の発生及び病原との関係を理解することができる。不所望な心臓血管細胞、内皮細胞及び血管形成細胞、例えば腫瘍細胞の成長の発生及び病理におけるミトNEETの役割は、ミトNEETによって刺激又は阻害されるものとして同定されている細胞又は細胞系を使用することによって試験することができる。
【０１６３】
異なるアプローチの場合、特定の心臓血管、内皮及び血管形成障害に関与することが知られている細胞型の細胞に、ミトNEETを感染させ、そして、ミトNEETが過剰な成長を誘発するか又は成長を阻害する能力を分析する。心臓血管、内皮及び血管形成障害が癌である場合、好適な腫瘍細胞は例えば、安定的な腫瘍細胞系、例えばB 104-1-1細胞系(neu癌原遺伝子をトランスフェクトされた安定的なNIH-3T3細胞系)及びras-トランスフェクト型NIH-3T3細胞を含む。これらの腫瘍細胞系には、所望の遺伝子をトランスフェクトし、発癌性成長に関してモニタリングすることができる。次いで、このようなトランスフェクト済細胞系を使用して、形質転換細胞の成長に対して細胞増殖抑制活性又は細胞傷害活性を発揮することにより、又は抗体依存性細胞傷害性(ACDD)の仲立ちをすることにより、発癌性細胞成長を阻害するポリクローナル又はモノクローナル抗体又は抗体組成物の能力を試験することができる。本明細書中で規定された遺伝子のコード配列をトランスフェクトされた細胞は、心臓血管、内皮及び血管形成障害、例えば癌の治療のための薬物候補を同定するために幅広く使用することができる。
【０１６４】
加えて、(上述のような)トランスジェニック動物中の腫瘍から誘導された初代培養を、本明細書中の、細胞に基づくアッセイに使用することができるが、安定的な細胞系が好ましい。トランスジェニック動物に由来する連続的な細胞系を誘導するための技術が当業者に知られている。例えばSmall他、Mol Cell, Biol., 5:642-648(1985)を参照されたい。
【０１６５】
薬物候補のスクリーニング・アッセイ
本発明は、ミトNEET機能を調節する化合物を同定するために、化合物をスクリーニングする方法を包含する。モジュレーター候補のスクリーニング・アッセイは、ミトNEETと結合又は複合する化合物、又はミトNEETと他の細胞タンパク質との相互作用を妨害する化合物を同定するように構成される。このようなスクリーニング・アッセイは、化学ライブラリーのハイスループット・スクリーニングを施しやすいアッセイを含むことになり、これによりアッセイは小分子薬物候補の同定に特に適したものになる。
【０１６６】
アッセイは種々のフォーマットで実施することができる。これらのフォーマットは、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学スクリーニング・アッセイ、イムノアッセイ、及び細胞に基づくアッセイを含み、これらのアッセイは当業者において十分に特徴付けされている。このようなアッセイの例は、ミトNEET又はミトNEET活性の過剰によって引き起こされる脂肪酸β-酸化の阻害を克服しようする試みである。この阻害を克服又は調節することができる化合物は、潜在的な薬物発見候補として、更なる評価に進む。
【０１６７】
モジュレーターに対する全てのアッセイは、これらのアッセイが、候補と、本明細書中で規定された核酸によってコードされたミトNEETとの相互作用を可能にするのに十分な条件下で、且つ十分な時間にわたって、これら2つの成分が接触するのを必要とする点で共通している。
【０１６８】
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は分離するか又は反応混合物中で検出することができる。特定の実施態様の場合、ミトNEET又は薬物候補は、共有結合又は非共有結合によって、固相上、例えばマイクロタイター・プレート上に固定化される。
【０１６９】
固体表面にミトNEETの溶液をコーティングし、そしてこの表面を乾燥させることにより、非共有結合が一般に達成される。或いは、固定化されるべきミトNEETに対して特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を使用することにより、固体表面にこの抗体を定着させることができる。アッセイは、検出可能標識によって標識付けすることができる非固定化成分を、固定化成分、例えば定着された成分を含有するコーティング済表面に添加することにより実施される。反応が完了すると、反応していない成分が例えば洗浄によって除去され、そして固体表面上に定着された複合体が検出される。
【０１７０】
本来は固定化されていない成分が、検出可能な標識を担持する場合、表面上に固定化された標識が検出されると、このことは、複合が発生したことを示す。本来は固定化されていない成分が標識を担持しない場合、例えば固定化された複合体と特異的に結合する標識付き抗体を使用することにより、複合を検出することができる。
【０１７１】
候補化合物がミトNEETと相互作用しはするが、しかし結合はしない場合、化合物とそのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質相互作用を検出するのによく知られた方法によってアッセイすることができる。このようなアッセイは、伝統的なアプローチ、例えば架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィ・カラムを通した同時精製を含む。加えて、タンパク質相互作用は、Fields及び共同研究者(Fields及びSong, Nature (London), 340: 245-246(1989)；Chien他, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582(1991))によって記載された、また、Chevray及びNathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5789-5793(1991)によって開示された、酵母に基づく遺伝系を使用することにより、モニタリングすることができる。多くの転写アクチベーター、例えば酵母GAL4は、物理的に不連続的な2つのモジュール・ドメインから成り、一方はDNA結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。前記刊行物に記載された酵母発現系(一般には「2ハイブリッド系」と呼ばれる)は、この特性を利用し、そして2つのハイブリッド・タンパク質を採用し、一方のタンパク質では、標的タンパク質がGAL4のDNA結合ドメインと融合され、また他方のタンパク質では、候補活性化タンパク質が活性化ドメインと融合される。GAL4-活性化プロモーターの制御下で、GAL I-lacZレポーター遺伝子が、タンパク質相互作用を介したGAL4活性の再構成に応じて発現する。相互作用しているポリペプチドを含有するコロニーが、P-ガラクトシダーゼに対する発色基質を用いて検出される。2ハイブリッド技術を用いて2つの特異的タンパク質間のタンパク質相互作用を同定するためのキット(MATCHMAKER)一式が、Clontechから商業的に入手可能である。
【０１７２】
このシステムは、特異的なタンパク質相互作用に関与するタンパク質ドメインをマッピングし、またこれらの相互作用に不可欠なアミノ酸残基を特定するために、拡張することもできる。
【０１７３】
ミトNEETとその他の細胞内又は細胞外成分との相互作用を妨害する化合物を、下記のように試験することができる：通常、2つの生成物の相互作用及び結合を可能にする条件下で、またこのような時間にわたって、遺伝子と細胞内又は細胞外成分との生成物を含有する反応混合物を調製する。結合を阻害する候補化合物の能力を試験するために、次いで、試験化合物の不存在及び存在において反応を実施する。加えて、プラセボを第3反応混合物に添加することにより、これを正の対照として使用することができる。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合(複合体形成)を、上述のようにモニタリングする。複合体形成が対照反応物中に発生し、しかし試験化合物を含有する反応混合物中には発生しないことは、試験化合物が、試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を妨害することを示す。
【０１７４】
ミトNEETがコマイトジェンConAの存在において内皮細胞の増殖を刺激する能力を有する場合には、スクリーニング法の一例は、この能力を利用する。具体的には、増殖アッセイの場合、ヒト臍静脈内皮細胞を獲得し、そして96ウェル平底培養皿内で培養し(Costar, Cambridge, MA)、これに細胞の増殖を促進するのに適した、Con-A(Calbioche, La Lolla, Ca)を含有する反応混合物を補足し、スクリーニングされるべき化合物を添加し、そして37℃でインキュベーション後、培養を3-H-チミジンでパルス処理し、そしてガラス繊維フィルター(Cambridge Technology, Watertwon, MA)上に採取する。3部の培養の平均3-(H)チミジン組み入れ数(cpm)を、液体シンチレーション・カウンター(Beckman Instruments, Irvine, CA)を使用して測定する。有意な3-(H)チミジン組み入れ数は、内皮細胞増殖の刺激を示す。
【０１７５】
アンタゴニストをアッセイするために、上記アッセイを実施するが、しかしこのアッセイの場合、スクリーニングされるべき化合物と一緒にミトNEETを添加し、そして、ミトNEETの存在において化合物が3(H)チミジン組み入れを阻害することができる場合、このことは、化合物がミトNEETに対するアンタゴニストであることを示す。或いは、競合的阻害アッセイに適した条件下で、ミトNEET及び潜在的アンタゴニストと、膜結合型ミトNEET受容体又は組換え受容体とを合体させることにより、アンタゴニストを検出することができる。ミトNEETを例えば放射活性によって標識付けすることにより、受容体に結合されたミトNEET分子の数を用いて、潜在的なアンタゴニストの有効性を見極めることができる。
【０１７６】
潜在的なアンタゴニストのより具体的な例は、免疫グロブリンとミトNEETとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、及び具体的には抗体を含む。これらの抗体の一例としては、ポリクローナル及びモノクローナル抗体及び抗体断片、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体、このような抗体又は断片のキメラ又はヒト化バージョン、並びにヒト抗体及び抗体断片が挙げられる。
【０１７７】
或いは、潜在的なアンタゴニストは、密接に関連するタンパク質、例えば受容体を認識するがしかし何の効果も与えず、これによりミトNEETの作用を競合的に阻害するミトNEET突然変異形であってもよい。
【０１７８】
アンタゴニストの別のアッセイの場合、受容体を発現させる哺乳動物細胞又は膜調製物を、候補化合物の存在において、標識付きミトNEETと一緒にインキュベートする。次いで、この相互作用を高めるか又はブロックする化合物の能力を測定することができる。
【０１７９】
別の潜在的なポリペプチド・アンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンス構造である。この技術において、例えば、アンチセンス分子は、標的mRNA(又はゲノムDNA)とハイブリッド形成し、そして本発明のタンパク質のタンパク質翻訳(又はmRNA転写)を防止することにより、mRNA(又は転写)の翻訳を直接的にブロックするように作用する。アンチセンス技術を用いることにより、三重らせん構造又はアンチセンスDNA又はRNAを介して遺伝子発現を制御することができる。これらの方法は両方とも、ポリヌクレオチドの、DNA又はRNAとの結合に基づいている。例えば、成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の5'コード部分を使用することにより、約10〜100塩基対長のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを構成する。転写に関与する遺伝子領域に対して相補的であるように、DNAオリゴヌクレオチドを構成し(三重らせん--Lee他, Nucl. Acids Res., 6:3073(1979)；Cooney他, Science, 241:456(1988)；Dervan他, Science, 251:1360(1991))、これによりポリペプチドの転写及び産生を防止する。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、in vivoでmRNAとハイブリッド形成し、mRNA分子のポリペプチドへの翻訳をブロックする(アンチセンス--Okano, Neurochem., 56:560(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)。上述のオリゴヌクレオチドを細胞に送達することにより、アンチセンスRNA又はDNAをin vivoで発現させてポリペプチドの産生を阻害することができる。アンチセンスDNAが使用される場合、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の約-10位置〜+10位置の翻訳開始部位から導入されたオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０１８０】
アンチセンスRNA又はDNA分子は一般に、最小で約5塩基長、約10塩基長、約15塩基長、約20塩基長、約25塩基長、約30塩基長、約35塩基長、約40塩基長、約45塩基長、約50塩基長、約55塩基長、約60塩基長、約65塩基長、約70塩基長、約75塩基長、約80塩基長、約85塩基長、約90塩基長、約95塩基長、約100塩基長、又はそれ以上である。
【０１８１】
好ましくは、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、例えば約5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45又は50ヌクレオチド長であってよい。当業者に知られた手順によって、化学合成及び酵素ライゲーション反応を用いて、アンチセンス核酸を構成することができる。例えば、天然発生型ヌクレオチド又は種々に修飾されたヌクレオチドを使用して、アンチセンス核酸(例えばアンチセンス・オリゴヌクレオチド)を化学的に合成することができる。修飾ヌクレオチドは、分子の生物学的安定性を高めるように、又は、アンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成された二重らせんの物理的安定性を高めるように構成され、例えばホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換型ヌクレオチドを使用することができる。アンチセンス核酸を生成するように使用することができる修飾ヌクレオチドの例は、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ-D-ガラクトシルケオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、ベータ-D-マンノシルケオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、及び2,6-ジアミノプリンを含む。或いは、発現ベクターを使用して、アンチセンス核酸を生物学的に産生することができる。この発現ベクター内には、核酸がアンチセンス配列でサブクローニングされている(すなわち、挿入された核酸から転写されたRNAは、下記項にさらに記載するように、当該標的核酸に対するアンチセンス配向を有することになる)。
【０１８２】
本発明のアンチセンス核酸分子は典型的には患者に投与されるか、或いは、in situで生成されることにより、本発明の選択されたポリペプチドをコードする細胞mRNA及び/又はゲノムRNAとハイブリッド形成するか又は結合し、これにより、例えば転写及び/又は翻訳を阻害することによって、発現を阻害する。ハイブリッド形成は、コンベンショナルなヌクレオチド相補性によって行うことにより、安定的な二重らせんを形成するか、或いは、例えばDNA二重らせんに結合するアンチセンス核酸分子の場合、二重らせんの主溝内での特異的な相互作用によって行うことができる。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の一例は、組織部位での直接的な注射を含む。或いは、アンチセンス核酸分子を修飾することにより、選択された細胞を標的とし、次いで全身投与することができる。例えば、全身投与の場合、例えばアンチセンス核酸分子をペプチド、又は細胞表面受容体又は抗原に結合する抗体に結合することにより、アンチセンス分子が受容体、又は選択された細胞表面上に発現された抗原に特異的に結合するように、アンチセンス分子を修飾することができる。本明細書中に記載されたベクターを使用して、アンチセンス核酸分子を細胞に送達することもできる。アンチセンス分子の細胞内濃度を十分なものにするために、アンチセンス核酸分子が強力なpol II又はPol IIIプロモーターの制御下に配置されているベクター構造が好ましい。
【０１８３】
本発明のアンチセンス核酸分子は、a-アノマー核酸分子であってよい。a-アノマー核酸分子は、相補RNAを有する特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する。これらのハイブリッドの場合、通常のa-ユニットとは異なり、鎖は互いに平行に延びている(Gaultier他(1987) Nucleic Acids Res. 15:6625-6641)。アンチセンス核酸分子は、2'-o-メチルリボ核酸(Inoue他 (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148)又はキメラRNA-DNA類似体(Inoue他 (1987) FEBS Lett. 215:327-330)を含むこともできる。
【０１８４】
受容体をコードする遺伝子は、当業者に知られた多数の方法、例えばリガンド・パニング及びFACSソーティングによって同定することができる。Coligan他, Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5(1991)。発現クローニングを採用することが好ましい。この場合、ミトNEETに対して応答性の細胞からポリアデニル化RNAを調製し、そしてこのRNAから形成されたcDNAライブラリーを複数のプールに分け、これらを使用してCOS細胞、又はミトNEETに対して応答性ではないその他の細胞にトランスフェクトを施す。ガラス・スライド上で成長した、トランスフェクトを施された細胞を、標識付きミトNEETに暴露する。ヨウ素処理、又は部位特異的タンパク質キナーゼに対応する認識部位の内包を含む種々の手段により、ミトNEETを標識付けすることができる。固定及びインキュベーションに続いて、スライドにオートラジオグラフィー分析を施す。陽性プールを同定し、そして相互活性サブプール・プロセス及び再スクリーニング・プロセスを用いて、サブプールを調製して再トランスフェクトを施し、最終的に、推定受容体をコードする単一クローンを産出する。
【０１８５】
受容体同定のための別のアプローチとして、細胞膜、又は受容体分子を発現させる抽出調製物と、ミトNEETを光アフィニティ結合することができる。PAGEによって架橋材料を分離し、そしてX線フィルムに暴露する。受容体を含有する標識付き複合体を摘出し、分離してペプチド断片にし、そしてタンパク質ミクロ配列決定を施すことができる。ミクロ配列決定から得られたアミノ酸配列を使用することにより、一連の縮重オリゴヌクレオチド・プローブを、cDNAライブラリーをスクリーニングするように構成して、推定受容体をコードする遺伝子を同定することになる。
【０１８６】
治療されるべき代謝障害、心臓血管障害及び腫瘍障害のタイプ
症候群X(代謝症候群を含む)は、過剰インスリン血、肥満、トリグリセリド、尿酸、20フィブリノゲン、低密度LDL粒子、プラスミノゲン・アクチベーター・インヒビター1(PaI-1)のレベルの上昇、及びHDLcレベルの低下を含む異常の集まりとして緩やかに定義されている。
【０１８７】
同様の代謝条件は、関連糖尿病性異常脂質血症、及び混合型異常脂質血症、症候群X(本出願において定義されているように、これは代謝症候群を包含する)、心不全、高コレステロール血症、心臓血管疾患(アテローム性動脈硬化、動脈硬化を含む)、及び高トリグリセリド血症、II型糖尿病、I型糖尿病、インスリン抵抗、高脂質血、炎症、上皮過剰増殖疾患25(湿疹及び乾癬を含む)、肺及び内臓に関連する状態、並びに、肥満、拒食症、過食症及び神経性拒食症のような障害の患者における食欲の調節及び摂食に関連する状態を含む。具体的には、本発明の化合物は、高血圧、アテローム性動脈硬化、動脈硬化、高トリグリセリド血症、及び混合型異常脂質血症を含む、糖尿病及び心臓血管疾患及び状態の治療及び予防において有用である。
【０１８８】
本明細書中に記載された心臓血管、血管形成及び内皮アッセイに活性を有し、且つ/又は、心臓血管系に局在化されることが判っている遺伝子生成物を有するミトNEET又はそのモジュレーターは、種々の心臓血管障害、内皮障害及び血管形成障害に治療用途を有すると考えられている。これらの障害は、血管に影響を与える全身性障害、例えば糖尿病を含む。その治療有用性は、動脈、毛細血管、静脈、及び/又はリンパ管の疾患を含むことができる。下記治療の例は、筋肉疲労疾患の治療、骨粗鬆症の治療、インプラントを固定してインプラントの周りの細胞成長を刺激し、従ってその所期部位に対するインプラントの付着を容易にすること、好適な場合には組織又は血清中のIGF安定性の増大、及びIGF受容体に対する結合力の増大(それというのも、IGFは、ヒトの骨髄赤血球及び顆粒球前駆細胞の成長を高めることがin vitroで示されているからである)を含む。
【０１８９】
ミトNEET又はそのモジュレーターを採用することにより、赤血球生成又は顆粒球生成を刺激し、創傷治療又は組織再生、及び組織、例えば結合組織、皮膚、骨、軟骨、筋肉、肺又は腎臓の再成長と関係する関連治療を促進し、血管形成を促進し、内皮細胞の遊走を刺激又は阻害し、そして血管平滑筋の成長及び内皮細胞生成を増強することもできる。ミトNEET又はアゴニストによって仲立ちされて生じる血管形成増大は、虚血性組織に対して、また、冠動脈狭窄に続いて生じる心臓内の側副環状動脈発生に対して有益である。
【０１９０】
このようなポリペプチドの作用を阻害し、例えば、創傷治癒中の過剰な結合組織の産生又は肺線維産生をミトNEETが促進する場合、このような産生を制限するために、アンタゴニストが使用される。このことは、急性心筋梗塞及び心不全の治療を含む。
【０１９１】
さらに、本発明は、治療上有効量のミトNEET、又はこれに対するアゴニスト又はアンタゴニストを投与することにより、根底にある原因とは無関係に、心臓肥大の治療を可能にする。
【０１９２】
目的がヒト患者の治療である場合、ミトNEETは好ましくは組換えヒト・ミトNEETポリペプチド(rhmitoNEETポリペプチド)である。心臓肥大の治療は、多種様々な病態から生じ得る、その種々の段階のいずれかにおいて実施することができる。これらの病態は、心筋梗塞、高血圧、肥大性心筋症、及び弁膜逆流を含む。治療は、根底にある心臓障害とは無関係に、心筋の構造損傷を伴う又は伴わない、心臓肥大の進行の全ての段階に及ぶ。
【０１９３】
分子に対するアンタゴニストとは対照的に、任意の特定の兆候に対して分子自体又はそのアゴニストを使用するべきかどうかは、主に、この場合の分子が心臓脈管化、内皮細胞の生成又は血管形成を促進するか、或いは、これらの状態を阻害するかどうかに応じて、決定されることになる。例えば分子が血管形成を促進する場合、そのアンタゴニストは、血管形成を制限又は防止するのが望まれる障害の治療に有用となる。このような障害の例は、血管腫瘍、例えば、糖尿病性網膜症又は未熟児網膜症又は黄斑変性及び増殖性硝子体網膜症と関連する網膜、脈絡膜又は角膜における血管腫、腫瘍血管形成、新血管形成、関節リウマチ、クローン病、アテローム性動脈硬化、卵巣過剰刺激、乾癬、新血管形成と関連する子宮内膜症、バルーン血管形成に続いて生じる再狭窄、例えば、手術後に形成されるケロイドに見られる瘢痕組織産生過剰、心筋梗塞後の線維形成、又は肺線維形成と関連する線維性障害を含む。
【０１９４】
とは言うものの、分子が血管形成を阻害する場合には、上記状態の治療のために分子を直接的に使用することが期待される。
【０１９５】
他方において、分子が血管形成を刺激する場合、血管形成が望まれる兆候に対して、分子がそれ自体で(又はそのアゴニストが)使用されることになる。これらの兆候は、例えば末梢血管疾患、高血圧、炎症性脈管炎、レーノー疾患及びレーノー現象、動脈瘤、動脈再狭窄、血栓性静脈炎、リンパ管炎、リンパ水腫、創傷治癒及び組織修復、虚血再潅流傷害、狭心症、心筋梗塞、例えば急性心筋梗塞、慢性心臓疾患、心疾患、例えば鬱血性心不全、及び骨粗鬆症である。
【０１９６】
しかし分子が血管形成を阻止する場合には、そのアンタゴニストが、血管形成が望まれる状態の治療のために使用される。
【０１９７】
ミトNEET又はそのアゴニスト又はアンタゴニストが、血管関連薬物ターゲッティングのために有用なものとして、又は障害の治療又は予防のための治療標的として役立つ具体的な疾患タイプを以下に記す。
【０１９８】
アテローム性動脈硬化は、脂質の蓄積に起因する、動脈中で肥厚化した内膜プラークの蓄積、平滑筋細胞の増殖、及び動脈壁内部の線維組織の形成によって特徴付けされる疾患である。疾患は、任意の器官内の大型、中型及び小型の動脈に作用する。内皮細胞及び血管平滑筋細胞の機能変化は、これらのプラークの蓄積及び退縮を調節する上で重要な役割を演じることが知られている。
【０１９９】
高血圧は、全身動脈、肺動脈、又は門脈系内の血管圧力の上昇を特徴とする。圧力上昇は、内皮細胞機能障害及び/又は血管疾患から生じることがあり、且つ/又は内皮細胞機能障害及び/又は血管疾患を招くことがある。
【０２００】
炎症性脈管炎は、巨細胞性動脈炎、高安動脈炎、(微小血管障害形を含む)結節性多発性動脈炎、川崎病、顕微鏡的多発性血管炎、ヴェグナー肉芽腫症、種々の伝染性関連の血管障害(ヘーノホ-シェーンライン紫斑病)を含む。内皮細胞の変化は、これらの疾患において重要であることが示されている。レイノー病及びレイノー現象は、低温に対する暴露時の四肢を通した間欠的な異常な循環障害を特徴とする。内皮細胞機能の変化は、この疾患において重要であることが判っている。
【０２０１】
動脈瘤は、内皮細胞及び/又は血管平滑筋細胞の変化と関連する動脈又は静脈樹状体の嚢状又は紡錘状の拡張である。
【０２０２】
動脈再狭窄(動脈壁の再狭窄)は、血管形成に続いて、内皮細胞及び血管平滑筋細胞の機能変化及び増殖の結果として発生することがある。
【０２０３】
血栓性静脈炎及びリンパ管炎は、それぞれ静脈及びリンパ管の炎症性障害である。これらの障害は、内皮細胞機能の変化から生じることがあり、且つ/又は内皮細胞機能の変化を招くことがある。同様に、リンパ水腫は、内皮細胞機能から生じたリンパ管障害に関与する状態である。
【０２０４】
良性及び悪性血管腫瘍から成る群は、血管系の細胞要素の異常増殖及び成長を特徴とする。例えば、リンパ管腫はリンパ系の良性腫瘍であり、これらの腫瘍は、新生児に通常発生する、リンパ管の先天性でしばしば嚢胞性の奇形である。
【０２０５】
嚢胞性腫瘍は隣接組織内に成長する傾向がある。嚢胞性腫瘍は通常、頚部領域及び腋窩領域に発生する。これらの腫瘍は、四肢の軟組織内に発生することもある。主な症状は、拡張された、しばしば網状の構造化リンパ管、及び結合組織によって取り囲まれたリンパ嚢胞である。
【０２０６】
リンパ管腫は、不適当に結合された胚リンパ管又は胚リンパ管の欠如によって引き起こされると推測される。その結果、局所的なリンパ排出障害が生じる。
【０２０７】
これらに対するミトNEETアンタゴニストの別の用途は、腫瘍血管形成の防止にある。この血管形成は、腫瘍の脈管形成により腫瘍の成長及び/又は転移を可能にすることに関与する。このプロセスは新しい血管の成長に依存する。新生物、及び腫瘍血管形成に関与する関連状態の例は、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、肝臓癌、卵巣癌、テコーマ、男性胚腫、頚癌、子宮内膜癌、子宮内膜増殖症、子宮内膜症、線維肉腫、絨毛癌、頭頚部癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、肝芽腫、カポジ肉腫、メラノーマ、皮膚癌、血管腫、海綿状血管腫、血管芽細胞腫、膵臓癌、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、グリア芽腫、神経鞘腫、乏突起膠腫、髄芽細胞腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、尿路癌、甲状腺癌、ウィルムス腫瘍、腎細胞癌、前立腺癌、母斑症と関連する異常血管増殖、浮腫(例えば脳腫瘍と関連する浮腫)、及びメグズ症候群を含む。
【０２０８】
加齢性黄斑変性(AMD)は、高齢世代における重篤な視力損失の主な原因である。AMDの浸出型は、脈絡膜新生血管形成及び網膜色素上皮細胞剥離を特徴とする。脈絡膜新生血管形成は予後の劇的な悪化と関連するので、これに対するミトNEETアゴニストは、AMDの重症性を低減する上で有用であることが期待される。
【０２０９】
外傷の治癒、例えば創傷治癒及び組織修復を目的として、ミトNEET又はそのアゴニストが使用される。新しい血管の形成及び退縮は、組織の治癒及び修復にとって必須である。このカテゴリーは、骨、軟骨、腱、靭帯、及び/又は神経組織の成長又は再生、並びに創傷治癒及び組織の修復及び置換、及び、火傷、切開及び潰瘍の治療を含む。
【０２１０】
骨が通常は形成されない環境内で軟骨及び/又は骨の成長を誘発するミトNEET又はそのモジュレーターは、ヒト及びその他の動物における骨折及び軟骨損傷又は欠陥の治癒に適用される。ミトNEET又はそのアゴニスト又はアンタゴニストを採用するこのような調製物は、閉鎖骨折並びに開放骨折の低減に、そして人工関節の固定の改善にも予防的に使用することができる。骨形成剤によって誘発される新規の骨形成は、先天性、外傷誘発型、又は腫瘍性の切除誘発型頭蓋顔面欠陥の修復に関与し、そしてまた、美容整形手術にも有用である。
【０２１１】
ミトNEET又はそのモジュレーターは、例えば褥瘡、血管不全、外科創傷及び外傷などと関連する潰瘍を含む非回復期創傷のより良い又はより速い閉鎖を促進するのに有用である場合もある。
【０２１２】
ミトNEETモジュレーターはその他の組織、例えば器官(例えば膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚又は内皮を含む)、筋肉(平滑筋、骨格筋又は心筋)、及び血管(血管内皮を含む)組織を生成又は再生するための活性、又はこのような組織を含む細胞の成長を促進するための活性を示すこともできることが期待される。所望の効果の一部は、線維性瘢痕化を阻害又は調節して、正常組織の再生を可能にすることにより発揮することができる。
【０２１３】
ミトNEETモジュレーターは、内臓保護又は再生、及び肺又は肝臓線維症、種々の組織における再潅流傷害、及び全身性サイトカイン損傷から生じた状態の治療に有用である場合がある。また、ミトNEET又はそのモジュレーターは、前駆体組織又は細胞からの上記組織の分化を促進又は阻害するのに有用であるか、或いは上記組織の成長を阻害するのに有用である場合もある。
【０２１４】
ミトNEETモジュレーターは、歯周病の治療及び他の歯修復プロセスに使用することもできる。このような物質は、骨形成細胞を引き付けるか、或いは、骨形成細胞の成長を刺激するか、或いは、骨形成細胞の前駆体の分化を誘発するための環境を提供することができ、ミトNEET又はこれに対するアゴニスト又はアンタゴニストは、骨及び/又は軟骨の修復の刺激を介して、或いは炎症又は炎症性プロセスに媒介された組織破壊プロセス(コラゲナーゼ活性、破骨細胞活性など)をブロックすることにより、骨粗鬆症又は変形性関節症を治療するのに有用な場合もある。それというのも血管は、骨のターンオーバー及び成長の調節に重要な役割を演じるからである。
【０２１５】
ミトNEET又はそのモジュレーターに帰属され得る組織再生活性の別のカテゴリーは、腱/靭帯形成である。このような組織が通常は形成されない環境において、腱/靭帯様組織又はその他の組織の形成を誘発するタンパク質が、ヒト及びその他の動物における腱又は靭帯の断裂、及び腱又は靭帯のその他の欠陥を治療するのに適用される。このような調製物は、腱又は靭帯の損傷を防止するのに予防的に使用し、また骨又はその他の組織に対する腱又は靭帯の固定を改善し、腱又は靭帯組織の損傷を修復するのにも使用することができる。ミトNEET又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの組成物によって誘発される新規の腱/靭帯様組織形成が、先天性、外傷誘発型、又はその他の起源のその他の腱/靭帯欠陥の修復に関与し、そして腱又は靭帯の付着又は修復のための美容整形手術にも有用である。本明細書中の組成物は、腱又は靭帯形成細胞を引き付けるか、或いは、腱又は靭帯形成細胞の成長を刺激するか、或いは、腱又は靭帯形成細胞の前駆体の分化を誘発し、或いは、腱/靭帯細胞又は前駆体の成長をex vivoで誘発してin vivoに戻し、これにより組織修復を生じさせるための環境を提供することができる。本明細書中の組織は、腱炎、手根管症候群、及び腱又は靭帯の欠陥に有用な場合もある。組成物は好適なマトリックス及び/又は金属イオン封鎖剤を、当業者によく知られているキャリヤとして含むこともできる。
【０２１６】
ミトNEET又はそのモジュレーターは、神経細胞の増殖、並びに神経及び脳の組織再生、すなわち、神経細胞又は神経組織の変性、死又は外傷に関与する、中枢及び末梢神経系の疾患及びニューロパシー、並びに機械的障害及び外傷障害の治療のために有用である場合もある。より具体的には、ミトNEET又はそのアゴニストを末梢神経系疾患、例えば末梢神経損傷、末梢性ニューロパシー及び局所性神経皮膚炎、並びに中枢神経系疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化、及びシャイ・ドレーガー症候群の治療に使用することができる。本発明に従って治療することができる更なる状態は、機械的障害及び外傷障害、例えば脊髄障害、頭部外傷、及び脳血管疾患(例えば脳卒中)を含む。化学療法又はその他の医学療法から生じる末梢性ニューロパシーは、ミトNEETアゴニスト又はアンタゴニストを用いて治療することもできる。
【０２１７】
別の兆候として、虚血-再潅流傷害がある。虚血-再潅流傷害に続いて発生する事象の続発症の開始及び調節において、内皮細胞機能不全が重要である場合がある。
【０２１８】
さらに別の兆候として、関節リウマチがある。関節炎のリウマチ形及び血清反応陰性形の病原においては、血管成長及び脈管構造を通した炎症細胞ターゲッティングが、重要な要素である。
【０２１９】
ミトNEET又はそのモジュレーターは、心臓肥大患者に予防的に投与し、これにより状態の進行を防止し、そして、無症候患者の死を含む突然死を回避することもできる。このような予防治療は、重症左心室肥大(成人では最大壁厚35mm以上、又は小児ではこれに匹敵する値)と診断された患者の事例において、又は心臓上の血流力学負荷が特に強い事例において、特に適切であることが保証される。
【０２２０】
ミトNEET又はそのモジュレーターは、心房性細動の管理において有用な場合がある。心房性細動は、肥大性心筋症と診断された患者の主要部分に発生する。さらに別の兆候は、狭心症、心筋梗塞、例えば急性心筋梗塞、及び心不全、例えば鬱血性心不全を含む。更なる非腫瘍性状態は、乾癬、及び未熟児網膜症を含む糖尿病性及びその他の増殖性網膜症、水晶体後線維増殖症、血管新生緑内障、甲状腺過形成(グレーブス病を含む)、角膜及びその他の組織の移植、慢性炎症、肺炎症、ネフローゼ症候群、子癇前症、腹水、心膜滲出(例えば心膜炎と関連する滲出)、及び胸膜滲出を含む。
【０２２１】
上述の点において、内皮、上皮又は特異性細胞の機能、増殖及び/又は形状に変更又は影響を与えることが示された、本明細書中に記載されたミトNEET又はそのモジュレーターは、上記障害のうちの多く又は全ての病因及び病原において重要な役割を演じると考えられ、そしてこのようなものとして、これらのプロセスを増大又は阻害するための治療標的として使用することができ、或いは、これらの障害における血管関連薬ターゲッティングのために使用することもできる。
【０２２２】
1.診断アッセイ
生体試料中の本発明のポリペプチド又は核酸の存在又は不存在を検出する方法の例は、被験者から生体試料を獲得し、生体試料と、本発明のポリペプチド又は核酸(例えばmRNA, ゲノムDNA)を検出することができる化合物又は物質とを接触させることにより、本発明のポリペプチド又は核酸を生体試料中で検出することに関与する。ミトNEETポリペプチドをコードするmRNA又はゲノムDNAを検出するための好ましい物質は、ミトNEETポリペプチドをコードするmRNA又はゲノムDNAとハイブリッド形成することができる標識付き核酸プローブである。核酸プローブは例えば完全長cDNA、例えばSEQ ID NO:1の核酸、又はその一部、例えば最小で15, 30, 50, 100, 250又は500ヌクレオチド長で、ミトNEETポリペプチドをコードするmRNA又はゲノムDNAと緊縮条件下で特異的にハイブリッド形成するのに十分なオリゴヌクレオチドであってよい。本発明の診断アッセイに使用するのに適した他のプローブが本明細書中に記載されている。
【０２２３】
ミトNEETポリペプチドを検出するための好ましい物質は、ミトNEETポリペプチドと結合することができる抗体、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。抗体はポリクローナル、又はより好ましくはモノクローナルであってよい。無傷抗体又はその断片(例えばFab又はF(ab')2)を使用することができる。プローブ又は抗体に関する「標識」という用語は、検出可能な物質をプローブ又は抗体とカップリング(すなわち物理的結合)することにより、プローブ又は抗体に直接的に標識を付けること、並びに、直接的に標識付けされた別の試薬との反応性によりプローブ又は抗体に間接的に標識を付けることを包含するものとする。間接的な標識付けの例は、蛍光標識付き二次抗体を使用して一次抗体を検出すること、及びDNAプローブをビオチンで末端標識付けすることにより蛍光標識付きストレプトアビジンでこのプローブを検出できるようにすることを含む。「生体試料」という用語は、被験者から分離された組織、細胞、及び体液、並びに被験者中に存在する組織、細胞及び体液を含むものとする。すなわち、本発明の検出方法を用いて、in vitro及びin vivoで生体試料中のmRNA、タンパク質、又はゲノムDNAを検出することができる。例えば、mRNAのin vitro検出技術は、ノーザン・ハイブリッド形成法及びin situハイブリッド形成法を含む。ミトNEETポリペプチドのin vitro検出技術は、酵素結合イムノソルベント・アッセイ(ELISA)、ウェスタン・ブロット法、免疫沈降法、及び免疫蛍光法を含む。ゲノムDNAのin vitro検出技術は、サザン・ハイブリッド形成法を含む。さらに、ミトNEETポリペプチドのin vivo検出技術は、ポリペプチドに対する標識付き抗体を患者中に導入することを含む。例えば、抗体に放射性マーカーを標識付けし、被験者中のマーカーの存在及び位置は、標準画像形成技術によって検出することができる。
【０２２４】
1実施態様の場合、生体試料は、被験者から得られたタンパク質分子を含有する。或いは、生体試料は、被験者から得られたmRNA分子、又は被験者から得られたゲノムDNA分子を含有することもできる。好ましい生体試料は、被験者からコンベンショナルな手段によって分離された末梢血白血球試料である。
【０２２５】
別の実施態様の場合、方法はさらに、対照被験者から得られた対照生体試料を獲得し、対照試料を、ミトNEETポリペプチド、又はミトNEETポリペプチドをコードするmRNA又はゲノムDNAを検出することができる化合物又は物質と接触させることにより、ポリペプチド、又はポリペプチドをコードするmRNA又はゲノムDNAの存在を生体試料中で検出し、そして対照試料中のポリペプチド、又はポリペプチドをコードするmRNA又はゲノムDNAの存在と、試験試料中のポリペプチド、又はポリペプチドをコードするmRNA又はゲノムDNAの存在とを比較することに関与する。
【０２２６】
本発明はまた、生体試料(試験試料)中の本発明のポリペプチド又は核酸の存在を検出するためのキットを包含する。このようなキットを使用することにより、被験者がミトNEETポリペプチドの異常な発現と関連する障害(例えばアンドロゲン依存性前立腺癌)に罹患しているかどうか、或いは、このような障害を引き起こすリスクがこの患者において増大しているかどうかを見極めることができる。例えば、キットは、生体試料中のポリペプチド又はポリペプチドをコードするmRNAを検出することができる標識付き化合物又は物質と、試料(ポリペプチドと結合する抗体、又はポリペプチドをコードするDNA又はmRNAと結合するオリゴヌクレオチド・プローブ)中のポリペプチド又はmRNAの量を見極めるための手段とを含むことができる。キットは、ポリペプチド又はポリペプチドをコードするmRNAの量が正常レベルを上回るか又は下回ると、被験者がポリペプチド異常発現と関連する障害に罹患しているか、或いはこのような障害を引き起こすリスクを有することを観察するための指示書を含むこともできる。
【０２２７】
抗体に基づくキットの場合、キットは例えば:(1)ミトNEETポリペプチドに結合する第1の抗体(例えば固形支持体に付着される)；及び任意には(2)ポリペプチド又は第1抗体に結合して、検出可能な物質に複合される第2の異なる抗体とを含んでよい。
【０２２８】
オリゴヌクレオチドに基づくキットの場合、キットは、例えば：(1)ミトNEETポリペプチドをコードする核酸配列とハイブリット形成するオリゴヌクレオチド、例えば検出可能に標識付けされたオリゴヌクレオチド、又は(2)ミトNEETポリペプチドをコードする核酸分子を増幅するために有用なプライマー対とを含むことができる。
【０２２９】
キットは、例えば緩衝剤、保存剤又はタンパク質安定剤を含むこともできる。キットは、検出可能な物質(例えば酵素又は基質)を検出するのに必要な成分を含んでもよい。キットは、対照試料又は一連の対照試料を含有することもできる。このような対照試料は、分析して含有試験試料と比較することができる。キットの各成分は通常、個々の容器内部に密封され、そして種々の容器のすべては、被験者がポリペプチド異常発現と関連する障害に罹患しているか、又はこのような障害を引き起こすリスクを有するかどうかを観察するための指示書と一緒に、単一のパッケージ内に入れられている。
【０２３０】
2.予後アッセイ
本明細書中に記載された方法をさらに診断アッセイ又は予後アッセイとして利用することにより、患者がミトNEETポリペプチドの異常発現又は活性と関連する疾患又は障害を有しているか、又はこのような疾患又は障害を引き起こすリスクを有していることを同定することができる。例えば、本明細書に記載されたアッセイ、例えば、先行診断アッセイ又は後続アッセイを利用することにより、被験者がミトNEETポリペプチドの異常発現又は活性と関連する障害を有しているか、或いはこのような障害を引き起こすリスクを有していることを同定することができる。或いは、診断アッセイを利用することにより、被験者がこのような疾患又は障害を有しているか、或いはこのような疾患又は障害を引き起こすリスクを有していることを同定することもできる。このように、本発明は、試験試料を被験者から獲得し、そして本発明のポリペプチド又は核酸(例えばmRNA, ゲノムDNA)を検出し、ポリペプチド又は核酸が存在する場合、被験者がポリペプチド異常発現又は活性と関連する疾患又は障害に罹患しているか、又はこのような障害を引き起こすリスクを有すると診断される。本明細書に記載された「試験試料」は、当該被験者から得られた生体試料を意味する。例えば試験試料は体液(例えば血清)、細胞試料、又は組織であってよい。
【０２３１】
さらに、本明細書中に記載された予後アッセイを用いることにより、ミトNEETポリペプチドの異常発現又は活性と関連する疾患又は障害を治療するために物質(例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド擬似体、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、又はその他の薬物候補)を被験者に投与することができるかどうかを見極めることができる。例えばこのような方法を用いることにより、特異的な物質又は物質クラス(例えば、ポリペプチドの活性を減小させるタイプの物質)で被験者を効果的に治療できるかどうかを見極めることができる。こうして、本発明は、ポリペプチドの異常発現又は活性と関連する障害に対する物質で効果的に被験者を治療できるかどうかを見極める方法であって、試料を獲得し、そしてポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸を検出する(例えば、ポリペプチド又は核酸が存在する場合、ポリペプチドの異常発現又は活性と関連する障害を治療するためにこの物質を被験者に投与できると診断される)方法を提供する。
【０２３２】
本発明の方法を用いることにより、本発明の遺伝子における遺伝子損傷又は突然変異を検出し、これにより、遺伝子損傷を有する被験者がミトNEETポリペプチドの異常発現又は活性を特徴とする障害のリスクを有しているかどうかを見極めることができる。好ましい実施態様の場合、この方法は、被験者から得られた細胞試料中で、ミトNEETポリペプチド・コード遺伝子の完全性に影響を与える変化、又はミトNEETポリペプチド・コード遺伝子の誤発現、の少なくとも一方を特徴とする遺伝子損傷又は突然変異の有無を検出することを含む。例えば、このような遺伝子損傷又は突然変異は、1)遺伝子からの1つ又は2つ以上のヌクレオチドの欠失；2)遺伝子への1つ又は2つ以上のヌクレオチドの付加；3)遺伝子の1つ又は2つ以上のヌクレオチドの置換；4)遺伝子の染色体再配置；5)遺伝子のメッセンジャーRNA転写レベルの変化；6)遺伝子の異常な修飾、例えばゲノムDNAのメチル化パターンの異常な修飾；7)遺伝子のメッセンジャーRNA転写の非野生型スプライシング・パターンの存在；8)遺伝子によってコードされたタンパク質の非野生型レベル；9)遺伝子の対立遺伝子欠損；及び10)遺伝子によってコードされたタンパク質の不適切な翻訳後修飾、のうちの少なくとも1つの存在を突き止めることによって検出することができる。本明細書中に記載されたように、当業者に知られた数多くのアッセイ技術があり、これらは遺伝子における損傷を検出するために用いることができる。
【０２３３】
或る特定の実施態様の場合、損傷の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(例えば米国特許第4,683,195号明細書及び同第4,683,202号明細書参照、例えばアンカーPCR又はRACE PCR、又はライゲーション連鎖反応(LCR)(例えばLandegran他(1988) Science 241:1077-1080;及びNakazawa他(1994) Proc Natl. Acad. Sci. USA 91:360-364)におけるプローブ/プライマーの使用を伴う。これらのうち後者のライゲーション連鎖反応(LCR)が、遺伝子中の点突然変異を検出するのに特に有用であり得る(例えばAbravaya他(1995) Nucleic Acids Res. 23:675-682)。この方法は、患者から細胞試料を捕集し、試料の細胞から核酸(例えばゲノム核酸、mRNA又はその両方)を分離し、遺伝子(もし存在するなら)のハイブリッド形成及び増幅が生じるような条件下で、選択された遺伝子と特異的にハイブリッド形成する1つ又は2つ以上のプライマーと、核酸試料とを接触させ、そして増幅生成物の有無を検出するか、或いは増幅生成物のサイズを検出して長さを対照試料と比較するステップを含むことができる。本明細書中の突然変異を検出するのに用いられる技術のいずれかとともに、予備増幅ステップとして、PCR及び/又はLCRを使用するのが望ましいと予想される。
【０２３４】
別の増幅法は：自己維持型配列複製(Guatelli他(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878)、転写増幅系(Kwoh他, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177)、Q-ベータ・レプリカーゼ(Lizardi他(1988) Bio Technology 6:1197)、又は任意の他の核酸増幅法を含み、これに続いて、当業者によく知られた技術を用いて、増幅分子を検出する。これらの検出スキームは、このような分子が極めて少数で存在する場合、核酸分子の検出に特に有用である。
【０２３５】
別の実施態様の場合、試料細胞から選択された遺伝子中の突然変異を、制限酵素切断パターンの変化によって同定することができる。例えば、試料及び対照DNAを分離し、(任意には)増幅し、1つ又は2つ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化し、そして断片長サイズをゲル電気泳動法によって測定して比較する。試料と対照DNAとの間の断片長サイズの差は、試料DNA中の突然変異を示す。さらに、配列特異的リボザイム(例えば米国特許第5,498,531号明細書)を使用することにより、リボザイム切断部位の発生又は欠損による特異的突然変異の存在に関してスコアリングすることができる。
【０２３６】
他の実施態様の場合、試料核酸及び対照核酸、例えばDNA又はRNAを、数百又は数千のオリゴヌクレオチド・プローブを含有する高密度アレイとハイブリッド形成することにより、遺伝子突然変異を同定することができる(Cronin他(1996)Human Mutation 7:244-255; Kozal他(1996) Nature Medicine 2:735-759)。例えば遺伝子突然変異は、Cronin他(前出)に記載された発光型DNAプローブを含有する二次元アレイ内で同定することができる。手短にいえば、プローブの第1ハイブリッド形成アレイを用いて、試料中及び対照中のDNAの長い延在部分を通して走査して、連続的なオーバラップ・プローブの線状アレイを形成することにより、配列間の塩基変化を同定することができる。このステップは、点突然変異の同定を可能にする。このステップに続いて、第2ハイブリッド形成アレイを使用する。第2ハイブリッド形成アレイは、検出された全ての変異体又は突然変異形に対して相補的なより小さな特異的プローブ・アレイを使用することにより、特異的な突然変異の特徴付けを可能にする。それぞれの突然変異アレイは、一方は野生型遺伝子に対して相補的であり、他方は突然変異遺伝子に対して相補的である、平行なプローブのセットから成っている。
【０２３７】
さらに別の実施態様の場合、当業者に知られた種々の配列決定反応のいずれかを用いて、選択された遺伝子を直接的に配列決定し、そして試料核酸の配列と対応野生型(対照)配列とを比較することにより、突然変異を検出することができる。配列決定反応の例は、Maxim及びGilbert((1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560)又はSanger(1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463によって開発された技術に基づく反応を含む。診断アッセイを行う場合((1995) Bio Techniques 19:448)、質量分析による配列決定(例えば国際公開第94/16101号パンフレット；Cohen他(1996) Adv. Chromatogr. 36:127-162；及びGriffin他(1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147-159参照)を含めて、種々の自動配列決定手順のいずれかを利用できることも考えられる。
【０２３８】
選択された遺伝子中の突然変異を検出する他の方法は、切断剤からの保護を利用して、RNA/RNA又はRNA/DNAヘテロ二本鎖におけるミスマッチ塩基を検出する方法を含む(Myers他(1985) Science 230:1242)。一般に、ミスマッチ切断技術は、野生型配列を含有する(標識付き)RNA又はDNAを、組織試料から得られた潜在的に突然変異型のRNA又はDNAとハイブリッド形成することにより形成されたへテロ二本鎖を提供することを伴う。二本鎖は二本鎖の一本鎖領域を切断する物質で処理する。このような一本鎖領域は、対照鎖と試料鎖との間の塩基対ミスマッチに基づいて存在することになるような領域である。RNA/DNA二本鎖をRNaseで処理することにより、ミスマッチ領域を消化することができ、そしてRNA/DNAハイブリッドをS1ヌクレアーゼで処理することにより、ミスマッチ領域を消化することができる。他の実施態様の場合、DNA/DNA又はRNA/DNA二本鎖を、ヒドロキシルアミン又は四酸化オスミウム、及びピペリジンで処理することにより、ミスマッチ領域を消化することができる。ミスマッチ領域の消化後、その結果生じた材料を、次いで変性ポリアクリルアミド・ゲル上でサイズによって分離することにより、突然変異部位を見極める。例えばCotton他(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397; Saleeba 他(1992) Methods Enzymol. 217:286-295参照。好ましい実施態様の場合、対照DNA又はRNAを検出のために標識付けすることができる。
【０２３９】
さらに別の実施態様の場合、ミスマッチ切断反応は、1種又は2種以上のタンパク質を採用する。これらのタンパク質は、細胞試料から得られたcDNA中の点突然変異を検出してマッピングするための規定のシステム内で、二本鎖DNA中のミスマッチ塩基対(いわゆるADNAミスマッチ修復酵素)を認識する。例えば、E.coliのmutY酵素は、G/AミスマッチにおいてAを切断し、そしてHeLa細胞から得られたチミジンDNAグリコシラーゼは、G/TミスマッチにおいてTを切断する(Hsu他、(1994) Carcinogenesis 15:1657-1662)を切断する。1実施態様によれば、選択された配列、例えば野生型配列に基づいたプローブを、試験細胞に由来するcDNA又は他のDNA生成物とハイブリッド形成する。二本鎖をDNAミスマッチ修復酵素で処理し、そしてもし切断生成物があるならば、これらの生成物を電気泳動法プロトコルなどから検出することができる。例えば米国特許第5,459,039号明細書参照。
【０２４０】
他の実施態様の場合、電気泳動易動度の変化を用いて、遺伝子中の突然変異を同定する。例えば、一本鎖DNA高次構造多型(SSCP)を用いることにより、突然変異型核酸と野生型核酸との間の電気泳動易動度の差を検出することができる(Orita他(1989)Proc. Natl. Acad. Sci.. USA 86:2766;Cotton(1993) Mutat. Res. 285:125-144; Hayashi(1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79)。試料核酸及び対照核酸の一本鎖DNA断片を変性し、そして復元させておく。一本鎖核酸の二次構造は配列に応じて変化し、そして、結果として生じた電気泳動易動度の変化は、単一の塩基変化の検出さえも可能にする。DNA断片は標識付けするか、或いは標識付きプローブで検出することができる。アッセイの感度は、(DNAではなく)RNAを使用することにより高めることができる。このRNAにおいて、二次構造は配列の変化に対してより感度が高い。好ましい実施態様の場合、この方法はへテロ二本鎖分析を利用することにより、電気泳動易動度の変化に基づいて、へテロ二本鎖を分離する(Keen他(1991) Trends Genet. 7:5)。
【０２４１】
さらに別の実施態様の場合、所定の勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミド・ゲル中の突然変異型又は野生型断片の運動を、変性勾配ゲル電気泳動法(DGGE)を用いてアッセイする(Myers他、(1985) Nature 313:495)。分析法としてDGGEを用いると、例えば、ほぼ40pbの、高融点GCが豊富なDNAの'GCクランプをPCRによって付加することにより、これが完全には変性しないことを保証するように、DNAを修飾する。別の実施態様の場合、変性勾配の変わりに温度勾配を使用することにより、対照DNAと試料DNAとの易動度の差を同定する(Rosenbaum及びReissner (1987) Biophys. Chem. 265:12753)。
【０２４２】
点突然変異を検出するための他の技術の例としては、選択的オリゴヌクレオチド・ハイブリッド形成法、選択的増幅法、又は選択的プライマー伸長法が挙げられる。例えば既知の突然変異が中心に配置されたオリゴヌクレオチド・ポリマーを調製し、そして次いで、完全なマッチが見いだされる場合だけハイブリッド形成を許す条件下で、これらのオリゴヌクレオチド・ポリマーを標的DNAとハイブリッド形成することができる(Saiki他(1986) Nature 324:163)；Saiki他(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230)。オリゴヌクレオチドがハイブリッド形成膜と付着されて標識付き標的DNAとハイブリッド形成されると、このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、PCR増幅型標的DNA又は多数の異なる突然変異形とハイブリッド形成される。
【０２４３】
或いは、選択的PCR増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術を、本発明とともに用いることができる。特異的増幅のためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中心 (従って増幅は、示差ハイブリッド形成に依存する)(Gibbs他(1989) Nucleic Acids Res. 17:2437-2448)に、又は好適な条件下ではミスマッチがポリメラーゼ伸長を防止又は低減することができる1つのプライマーの3'最末端(Prossner(1993)Tibtech 11:238)に、当該突然変異を担持することができる。加えて、突然変異領域に新規の制限部位を導入して、切断に基づく検出を行うのが望ましいことがある(Gasparini他(1992) Mol. Cell Probes 6:1)。或る特定の実施態様の場合、増幅のためにTaqリガーゼを使用して、増幅を実施することもできることが予想される(Barany(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189)。このような場合、5'配列の3'末端に完全な一片がある場合にのみライゲーションが発生するようになっており、増幅の有無を調べることによって、特異的部位における既知の突然変異の存在を検出するのを可能にする。
【０２４４】
本明細書中に記載された方法は、例えば本明細書中に記載された1種以上のプローブ核酸又は抗体試薬を含む前パッケージングされた診断キットを利用して、実施することができる。このキットを、例えば臨床環境において好都合に使用することにより、ミトNEETポリペプチドをコードする遺伝子に関与する疾患又は疾病の症状又は家族歴を示す患者を診断することができる。
【０２４５】
さらに、ミトNEETポリペプチドが発現される任意の細胞型又は組織、好ましくは末梢血白血球を、本明細書中の予後アッセイに利用することができる。
【０２４６】
3.ファーマコゲノミクス
本明細書中に記載されたスクリーニング・アッセイによって同定して、ミトNEETポリペプチドの活性又は発現に対して刺激効果又は阻害効果を有する物質又はモジュレーターを個体に投与することにより、ポリペプチドの異常活性と関連する障害を(予防的又は治療的に)処理することができる。このような処理と相俟って、個体の薬理ゲノム学(すなわち、個体の遺伝子型と、外来化合物又は薬物に対するその個体の応答との間の関係についての研究)的特性を考察することができる。治療の代謝の相違は、薬理学的に活性な薬物の投与量と血中濃度との関係を変化させることによって、重大な毒性又は治療の失敗を招くおそれがある。従って、個体の薬理ゲノム学的特性は、個体の遺伝子型の考察に応じて、予防又は治療のために効果的な物質(例えば薬物)の選択を可能にする。このような薬理ゲノム学的特性は、適切な投与量及び治療計画を見極めるためにさらに用いられる。個体中のミトNEETポリペプチドの活性、本発明の核酸の発現、又は本発明の遺伝子の突然変異含量を見極めることにより、個体の治療又は予防に好適な物質を選択することができる。
【０２４７】
薬理ゲノム学は、患者における薬物動態の変化及び異常な作用に基づく、薬物に応じた臨床上有意な遺伝性変化を取り扱う。例えばLinder(1997)Clin. Chem. 43(2):254-266参照。一般に、2つのタイプの薬理ゲノム学的条件を区別することができる。身体に対する薬物の作用形式を変化させる単独因子として伝達される遺伝条件を、「変化薬物作用」と呼ぶ。薬物に対する身体の作用形式を変化させる単独因子として伝達される遺伝条件を、「変化薬物代謝」と呼ぶ。これらの薬理ゲノム学的条件は、希少な欠陥又は多形として発生することができる。
【０２４８】
従って、個体中のミトNEETポリペプチドの活性、ポリペプチドをコードする核酸の発現、又はポリペプチドをコードする遺伝子の突然変異含量を見極めることにより、個体の治療又は予防に適した物質を選択することができる。加えて、薬理ゲノム学的研究により、薬物代謝酵素をコードする多形対立遺伝子の遺伝子型特定を、個体の薬物応答表現型の同定に適用することもできる。この知識は、これを投与又は薬物選択に適用すると、不都合な反応又は治療の失敗を回避することができ、ひいては、ポリペプチドの活性又は発現のモジュレーター、例えば本明細書に記載されたスクリーニング・アッセイ例の1つによって同定されたモジュレーターで患者を治療すると、治療上又は予防上の効率を高めることができる。
【０２４９】
4.臨床試験中の効果のモニタリング
ミトNEETポリペプチドの発現又は活性(例えば異常な細胞増殖及び/又は分化を調節する能力)に対する物質(例えば薬物、化合物)の影響は、基本的な薬物スクリーニングにおいてだけではなく、臨床試験においてもモニタリングすることができる。例えば、本明細書に記載されたスクリーニング・アッセイによって見極めた、遺伝子発現、タンパク質レベル又はタンパク質活性を増大させるための物質の有効性を、遺伝子発現、タンパク質レベル又はタンパク質活性の減小を示す患者の臨床試験において、モニタリングすることができる。或いは、スクリーニング・アッセイによって見極めた、遺伝子発現、タンパク質レベル又はタンパク質活性を減小させるための物質の有効性を、遺伝子発現、タンパク質レベル又はタンパク質活性の増大を示す患者の臨床試験において、モニタリングすることができる。このような臨床試験の場合、ミトNEETポリペプチドの発現又は活性、及び好ましくは、前立腺癌に関連しているその他のポリペプチドの発現又は活性を、マーカーとして用いることができる。
【０２５０】
例えば、本発明のものを含めて、(例えば本明細書に記載されたスクリーニング・アッセイにおいて同定された)ミトNEETポリペプチドの活性又は発現を調節する物質(例えば化合物、薬物又は小分子)で治療することにより細胞中で調節される遺伝子を同定することができる。従って、例えば臨床試験において前立腺癌、例えばアンドロゲン非依存性前立腺癌に対する物質の効果を研究するために、細胞を分離し、そしてRNAを調製し、そして、本発明の遺伝子及び障害に関与するその他の遺伝子の発現レベルに関して分析することができる。遺伝子発現(すなわち遺伝子発現パターン)のレベルは、本明細書中に記載されたノーザン・ブロット分析又はRT-PCRによって、或いは、生成されたタンパク質の量を測定することによって、或いは、本明細書中に記載された方法のうちの1つによって、或いは、本発明の遺伝子又はその他の遺伝子の活性レベルを測定することによって量化することができる。こうして、遺伝子発現パターンは、この物質に対する細胞の生理学的応答を示すマーカーとして役立つことができる。従って、この応答状態は、この物質で個体を治療する前、及び治療中の種々の時点で見極めることができる。
【０２５１】
好ましい実施態様の場合、本発明は、物質(例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド擬似体、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、又は本明細書中に記載されたスクリーニング・アッセイによって同定されたその他の薬物候補)で被験者を治療することの有効性をモニタリングする方法であって、(i)この物質の投与前に患者から投与前試料を獲得し、(ii)(任意にはアンドロゲンの存在及び不存在において)投与前試料中の本発明のポリペプチド又は核酸のレベルを検出し；(iii)患者から1種又は2種以上の投与後試料を獲得し；(iv)(任意にはアンドロゲンの存在及び不存在において)投与後試料中の本発明のポリペプチド又は核酸のレベルを検出し；(v)投与前試料中の本発明のポリペプチド又は核酸のレベル(又はアンドロゲン誘発性)を、投与後試料中の本発明のポリペプチド又は核酸のレベルと比較し；(vi)これに応じて、患者への物質の投与を変化させる、ステップを含む方法を提供する。例えば、ポリペプチドの発現又は活性を低減するために、すなわち、物質の有効性を増大させるためには、物質の投与量を増大させることが望ましいことがある。
【０２５２】
核酸転移
目下好ましいin vitro核酸転移技術は、ウィルス(例えばアデノウィルス、レンチウィルス、I型単純ヘルペス・ウィルス、又はアデノ随伴ウィルス(AAV))ベクター、又は非ウィルス・ベクターのトランスフェクション、及び脂質に基づくシステムを含む(遺伝子の脂質媒介性転移のための有用な脂質は、例えばDOTMA、DOPE、及びDC-Cholであり；例えばTonkinson他、Cancer Investigation, 11M:54-65(1996)を参照されたい)。遺伝子治療に使用するのに最も好ましいベクターは、ウィルス、最も好ましくはアデノウィルス、AAV、レンチウィルス、又はレトロウィルスである。ウィルスベクター、例えばレトロウィルス・ベクターは、1つ以上の転写プロモーター/エンハンサー又は遺伝子座定義要素、又は他の手段、例えば交互スプライシング、核RNA輸送、又はメッセンジャーの翻訳後修飾による遺伝子発現を制御するその他の要素を含む。加えて、レトロウィルス・ベクターのようなウィルス・ベクターは核酸分子を含み、この核酸分子は、ミトNEETコード遺伝子の存在において転写されると、この遺伝子に作用リンクされ、そして翻訳開始配列として作用する。このようなベクター構造はまた、パッケージング・シグナル、長い末端反復配列(LTR)又はこれらの一部、及び、使用されたウィルスに適した正及び負の鎖プライマー結合部位(これらがウィルス・ベクター内に既存でなければ)を含む。加えて、このようなベクターは典型的には、ミトNEETが配置された宿主細胞からミトNEETを分泌させるためのシグナル配列を含む。好ましくは、これを目的とするシグナル配列は哺乳動物シグナル配列、最も好ましくはミトNEETに対応する天然型シグナル配列である。任意には、ベクター構造は、ポリアデニル化を導くシグナル、並びに、1つ又は2つ以上の制限部位及び翻訳集結配列を含むこともできる。例えば、このようなベクターは典型的には、5'LTR、tRNA結合部位、パッケージング・シグナル、第2鎖DNA合成の基点、及びYLTR又はその部分を含む。非ウィルスベクターである他のベクター、例えばカチオン性脂質、ポリリジン、及びデンドリマーを使用することができる。
【０２５３】
いくつかの状況において、標的細胞を標的とする物質、例えば細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に対して特異的な抗体、標的細胞上の受容体に対応するリガンドなどを備えた核酸源を提供することが望ましい。リポソームを採用する場合、エンドサイトーシスと関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質は、取込みを標的とし、且つ/又は容易にするために使用することができ、このようなタンパク質は例えば、特定の細胞型に対して向性のキャプシドタンパク質、循環において内部化されるタンパク質に対応する抗体、及び細胞内局在化を標的として細胞内半減期を向上させるタンパク質である。受容体媒介性エンドサイトーシス技術は、例えばWu他, J. Biol. Chem., 262:4429-4432(1987)；及びWagner他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414(1990)に記載されている。現在知られている遺伝子マーキング・プロトコル及び遺伝子治療プロトコルの概説に関しては、Anderson他, Science, 256:808-813(1992)を参照されたい。また、国際公開第93/256733号パンフレット及びこれに引用された参考文献も参照されたい。
【０２５４】
レトロウィルス粒子及び構造タンパク質を形成するのに好適な遺伝子治療及び方法を、例えば米国特許第5,681,746号明細書に見いだすことができる。
【０２５５】
治療のための投与
ミトNEET又はそのモジュレーターの治療上有効な投与量は、もちろん、治療(予防を含む)されるべき病理状態、投与方法、治療に使用されている化合物のタイプ、関与する同時治療、患者の年齢、重量、一般医療状態、病歴などのようなファクターに応じて変化することになり、そして投与量の決定法は当業者によく知られている。従って、医師は投与量を滴定し、そして必要に応じて投与経路を変えることにより、最大治療効果を得ることになる。ミトNEETがヒト・ミトNEETを含むヒト患者調製物の治療のための狭い宿主域を有している場合、天然型配列ヒト・ミトNEETが好ましい。医師は、投与量が当該状態の治療にとって望ましい効果を達成する量になるまで、ミトNEETを投与することになる。例えば、目的がCHFの治療である場合、その量は、この状態と関連する進行性心臓肥大を阻害する量である。この治療の進行状況は、心エコー検査によって容易にモニタリングされる。同様に、肥大型心筋症患者において、ミトNEETは経験に基づいて投与することができる。
【０２５６】
併合療法
当該障害を予防又は治療する上でのミトNEET又はそのモジュレーターの有効性は、活性物質を連続的に、又はこの目的にとって効果的な別の物質との組み合わせにおいて、同じ組成物中で又は別個の組成物として投与することによって改善することができる。例えば、糖尿病又はインスリン抵抗症候群(例えば症候群X)の治療のために、化合物/物質を、PPARγモジュレーター、メトホルミン、スルホニル尿素、又はその他のインスリン分泌モジュレーター、α-グルコシダーゼ阻害剤、及び/又はインスリンと合体させることができる。他の脂質低下剤、特にアトルバスタチン及び同様の物質と合体させることにより、より有利にすることが可能になる。減量治療との組み合わせも考えられる。心臓肥大の治療のために、ミトNEET治療を、既知の心臓ミオアサイト肥大ファクターの阻害剤、例えばcc-アドレナリン作用薬の薬(例えばフェニルエフリン)；エンドセリン-1阻害剤(例えばBOSENTAN（登録商標）及びMOXONODIN（登録商標）)；CT-1に対する阻害剤(米国特許第5,679,545号明細書)；LIFに対する阻害剤；ACE阻害剤；デス-アスパルテート-アンジオテンシンI阻害剤(米国特許第5,773,415号明細書)、及びアンジオテンシンII阻害剤の投与と組み合わせることができる。
【０２５７】
高血圧と関連する心臓肥大を治療するために、P-アドレナリン受容体遮断薬、例えばプロプラノロール、チモロール、テトラロロール、カルテオロール、ナドロール、ベタキソロール、ペンブトロール、アセトブトロール、アテノロール、メトプロロール、又はカルベジロール；ACE阻害剤、例えばキナプリル、カプトプリル、エナラプリル、ラミプリル、ベナゼプリル、フォシノプリル、又はリシノプリル；利尿薬、例えばクロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチルクロチアジド、ベンズチアジド、ジクロルフェナミド、アセタゾールアミド、又はインダパミド；及び/又はカルシウム・チャネル遮断薬、例えばジルチアゼム、ニフェジピン、ベラパミル、又はニカルジピンとの組み合わせで投与することができる。高血圧の治療のためには、他の物質、特に利尿薬との組み合わせが、より有利である。一般名によって本明細書中で規定された治療薬を含む製薬組成物は、商業的に入手可能であり、そして、投与量、投与、副作用、禁忌などに関する製造業者の指示書に従って投与することができる。例えば、Physicians' Desk Reference(Medical Economics Data Production Co.: Montvale, N.J., 1997)、第51版を参照されたい。肥大型心筋症の治療における複合治療の好ましい候補は、P-アドレナリン作用遮断薬(例えばプロプラノロール、チモロール、テトラロロール、カルテオロール、ナドロール、ベタキソロール、ペンブトロール、アセトブトロール、アテノロール、メトプロロール又はカルベジロール)、ベラパミル、ジフェジピン又はジルチアゼムである。高血圧に関連する肥大の治療は、カルシウム・チャネル遮断薬、例えばジリチアゼム、ニフェジピン、ベラパミル、又はニカルジピン；P-アドレナリン作用遮断薬；利尿薬、例えばクロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチルクロチアジド、ベンズチアジド、ジクロルフェナミド、アセタゾールアミド、又はインダパミド；及び/又はACE-インヒビター、例えばキナプリル、カプトプリル、エナラプリル、ラミプリル、ベナゼプリル、フォシノプリル、又はリシノプリルの使用を必要とすることがある。
【０２５８】
他の兆候に対しては、ミトNEET又はモジュレーターを、骨損傷及び/又は軟骨損傷、創傷、又は当該組織の治療に対して有益な他の物質と組み合わせることができる。これらの物質は、種々の成長因子、例えばEGF、PDGF、TGF-、又はTGF-、IGF、TGF、FGF及びCTGFを含む。
【０２５９】
加えて、癌を治療するのに使用されるミトNEET又は調製物は、上記で規定された細胞毒性薬、化学治療薬、又は成長阻害薬と組み合わせることができる。また癌の治療のために、放射性物質の照射又は投与を伴うかどうかとは関わりなく、ミトNEET又はそのアンタゴニストを、連続的に、又は放射線治療と組み合わせて好適に投与する。
【０２６０】
ミトNEET又はそのモジュレーターとの組み合わせで投与される治療薬の有効量は、医師又は獣医師の判断に任される。治療を受けるべき状態を最大限管理するように、所定の量が投与され、調節される。例えば、高血圧を治療するためには、これらの量は、利尿薬又はジギタリスの使用、及び高血圧又は低血圧、腎臓機能障害のような状態を考慮に入れる。加えて投与量は、使用されるべき治療薬のタイプ、及び治療されている特定の患者のようなファクターに依存することになる。典型的には、採用される量は、所与の治療薬がPAポリペプチドなしで投与される場合に使用されるのと同じ投与量となる。
【０２６１】
乳癌の治療のために、ミトNEET又はモジュレーターを、例えば化学治療を伴うトラスツズマブ(ヘルセプチン)、パクリタキセル、ドセタキセル、エピルビシン、ミトキサントロン、トポテカン、カペシタビン、ビノレルビン、チオテパ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、カルボプラチン又はシスプラチン、プリカマイシン、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、トレミフィン、又はプロゲスチンとの組み合わせで投与することができる。
【０２６２】
急性リンパ球性白血病の治療のために、ミトNEET又はそのモジュレーターを、例えばドキソルビシン、シタラビン、シクロホスファミド、エトポシド、テニポシド、アロプリノール、又は自家骨髄移植との組み合わせで投与することができる。
【０２６３】
急性骨髄性及び骨髄単球性白血病の治療のために、ミトNEET又はそのモジュレーターを、例えばゲムツズマブ・オゾガマイシン(マイロタルグ)、ミトキサントロン、イダルビシン、エトポシド、メルカプトプリン、チオグアニン、アザシチジン、アムサクリン、メトトレキサート、ドキソルビシン、トレチノイン、アロプリノール、ロイカフェレシス、プレドニゾン、又は急性前骨髄球白血病用の三酸化ヒ素との組み合わせで投与することができる。
【０２６４】
慢性骨髄性白血病の治療のために、ミトNEET又はそのモジュレーターを、例えばブスルファン、メルカプトプリン、チオグアニン、シタラビン、プリカマイシン、メルファラン、自家骨髄移植、又はアロプリノールとの組み合わせで投与することができる。
【０２６５】
慢性リンパ球性白血病の治療のために、ミトNEET又はそのモジュレーターを、例えばビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、クラドリビン(2-クロロデオキシアデノシン;CdA)、同種骨髄移植、アンドロゲン、又はアロプリノールとの組み合わせで投与することができる。
【０２６６】
多発性骨髄腫の治療のために、ミトNEET又はそのモジュレーターを、例えばエトポシド、シタラビン、アルファ・インターフェロン、デキサメタゾン、又は自家骨髄移植との組み合わせで投与することができる。
【０２６７】
肺癌(小細胞及び非小細胞)の治療のために、ミトNEET又はそのモジュレーターを、例えばシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、エトポシド、ミトマイシン、イフォスファミド、パクリタキセル、イリノテサン、又は放射線治療との組み合わせで投与することができる。
【０２６８】
大腸・直腸癌の治療のために、ミトNEET又はそのモジュレーターを、例えばカペシタビン、メトトレキサート、ミトマイシン、カルムスチン、シスプラチン、イリノテサン又はフロクスウリジンとの組み合わせで投与することができる。
【０２６９】
腎臓癌の治療のために、ミトNEET又はそのモジュレーターを、例えばアルファ-インターフェロン、プロゲスチン、輸液用FUDR、フルオロウラシルとの組み合わせで投与することができる。
【０２７０】
前立腺癌の治療のために、ミトNEET又はそのモジュレーターを、例えばケトコナゾール、ドキソルビシン、アミノグルテチミド、プロゲスチン、シクロホスファミド、シスプラチン、ビンブラスチン、エトポシド、スラミン、PC-SPES、又はリン酸エストラムスチンとの組み合わせで投与することができる。
【０２７１】
メラノーマの治療のために、ミトNEET又はそのモジュレーターを、例えばカルムスチン、ロムスチン、メルファラン、チオテパ、シスプラチン、パクリタキセル、タモキシフェン又はビンクリスチンとの組み合わせで投与することができる。
【０２７２】
卵巣癌の治療のために、ミトNEET又はそのモジュレーターを、例えばドセタキセル、ドキソルビシン、トポテカン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、エトポシド又はリポソーム・ドキソルビシンとの組み合わせで投与することができる。
【０２７３】
新たに調製された未加工ラット肝臓ミトコンドリア、又は保存凍結されたウシ脳ミトコンドリア画分(B3/B4)を、125I-4-アジド-N-[2-(｛[6-(2-｛4-[(2,4-ジオキソ-1,3-チアゾリジン-5-イル)メチル]フェノキシ｝エチル)ピリジン-3-イル]アセチル｝アミノ)エチル]-2-ヒドロキシベンズアミドと架橋することにより、ミトNEETを標識付けした。これらの研究に際して、([6-(2-｛4-[(2,4-ジオキソ-1,3-チアゾリジン-5-イル)メチル]フェノキシ｝エチル)ピリジン-3-イル]酢酸)との競合を利用することにより、結合特異性を示した。図1に示すように、矢印(ミトNEET)によって示された特異的に架橋されたバンドを、1% Triton X 114で可溶化し、またこれにより、総タンパク質に対する部分富化をもたらした。可溶化された架橋タンパク質を0.75M硫酸アンモニウム(AS)で沈降させることにより、ミトNEETの更なる富化及び濃縮を達成した。この濃度は、溶液中のTritonを維持しつつ、タンパク質の沈降を許す硫酸アンモニウムの最適濃度であった。Triton X 114の濃縮及び除去は、HPLCによる最適な分離にとって重要であった。
【０２７４】
濃縮されたミトNEETをHPLCによって分離した。新鮮なラット肝臓ミトコンドリア試料又はウシ脳ミトコンドリア画分から、同一の結果を得た。このことは同様のタンパク質が関与していることを示唆する。HPLCによる分離の代表パターンを図2に示す。放射性ピークの同定は、線放射分析検出器によって単純化された。ほぼ55%アセトニトリルのこれらの条件下で、ほぼ30分目にミトNEETピークを溶離した。競合体([6-(2-｛4-[(2,4-ジオキソ-1,3-チアゾリジン-5-イル)メチル]フェノキシ｝エチル)ピリジン-3-イル]酢酸)を含有する架橋インキュベーションから得られた試料を有する平行流は、このピークを欠いた(図示せず)。オートラジオグラフィーとともに実施されたSDS-PAGEは、その方法が、特異的に4-アジド-N-[2-(｛[6-(2-｛4-[(2,4-ジオキソ-1,3-チアゾリジン-5-イル)メチル]フェノキシ｝エチル)ピリジン-3-イル]アセチル｝アミノ)エチル]-2-ヒドロキシベンズアミドと架橋されたタンパク質の優れた精製を可能にすることを実証した(図2)。
【０２７５】
無固定の無染色ゲルから水溶離手順によって、また、ミトNEET架橋タンパク質を高収量で濃縮した。このアプローチの場合、([6-(2-｛4-[(2,4-ジオキソ-1,3-チアゾリジン-5-イル)メチル]フェノキシ｝エチル)ピリジン-3-イル]酢酸)を用いて、又はこれを用いずに、80個の個別の管を架橋し、Triton X 114で可溶化し、硫酸アンモニウム沈降によって濃縮し、次いでこれに、固定又は染色されていない18% Tris Glycineゲル上でSDS-PAGEを施した。当該バンドをマーキングし、「方法」の項で記載したように切り出した。図3は、当該バンドがミトNEETの水溶離に関して切り出される前及び切り出された後の代表的なゲルの代表的なオートラジオグラムを示す。これらのゲルの再暴露によって、適正なバンドの中心が切除されていることを確認した。この手順は、最高収量のミトNEET架橋タンパク質を生成した。
【０２７６】
無固定で無染色の18% Tris Glycineゲルから得られた精製ミトNEETをすすぎ、そしてプロテオミック同定のために処理した。ラット肝臓ミトコンドリア及びウシ・ミトコンドリア画分双方からの調製物は、これらが「造血幹細胞/前駆細胞タンパク質MDSO29と類似する」という注釈付きを伴って、同じタンパク質であることを示した(図4)。ヒト及びマウス双方のタンパク質の予測配列はほとんど同一である。
【０２７７】
我々は、N末端配列決定による同定を確認した。無傷のタンパク質の配列決定は、N末端がブロックされ得ると示唆することに成功しなかった。ゲル中では、CNBrによる消化は、6-kDa架橋断片を生成した(図5)。この断片から部分配列データを獲得し、標識付きタンパク質のMS/MS同定を支援した。同定されたタンパク質のウシ、ヒト及びマウスの完全予測配列を図6に示す。これらの3つの配列は、十分に保存されており、4-アジド-N-[2-(｛[6-(2-｛4-[(2,4-ジオキソ-1,3-チアゾリジン-5-イル)メチル]フェノキシ｝エチル)ピリジン-3-イル]アセチル｝アミノ)エチル]-2-ヒドロキシベンズアミド架橋を含有するCNBr断片を含む非膜全域部分中で同一である。
【０２７８】
次に我々は、合成ペプチドを調製することにより、タンパク質に対する抗体を生成しようとした。予測された非膜全域から3つのペプチドを選択し、これらを合成した。これらをN末端から順番に、A, B及びCと名付けた(図6、パネルA)。ペプチドをそれぞれ2匹のウサギ中に複合して注射した。採取された血液のそれぞれから得られた血清を、各ペプチドのドット・ブロットによって最初に滴定した。ペプチドA及びBで免疫化されたウサギの双方から得られた血清は、各ペプチドを認識した。ペプチドCで免疫化されたウサギからは反応性は見いだされなかった。ペプチドBで免疫化されたウサギ#470に由来する血清中で、最高滴定(>30,000)が得られた。ドット・ブロット上での任意の血清と他のペプチドとの交差反応はなく、また、1:100という低希釈での免疫前血清のいずれかとの反応もなかった。
【０２７９】
ペプチドA及びペプチドB双方に対して生成される抗血清は、ウェスタン・ブロット上でミトNEETを認識するが、しかし最大の反応は、ペプチドBで免疫化されたウサギから生成された血清との反応であった。図7は、ラットの脳、肝臓及び骨格筋から得られた未加工ミトコンドリア画分を使用して、架橋反応の代表的なウェスタン・ブロットを実証する。抗体は、各組織内の特異的に架橋されたバンドと同じサイズのタンパク質バンドを認識した。染色の程度は、これらの試料中で架橋する125I-4-アジド-N-[2-(｛[6-(2-｛4-[(2,4-ジオキソ-1,3-チアゾリジン-5-イル)メチル]フェノキシ｝エチル)ピリジン-3-イル]アセチル｝アミノ)エチル]-2-ヒドロキシベンズアミドの強度に対して比例した。
【０２８０】
これらのウェスタン・ブロット上で認識されたバンドの細胞内局在化が、架橋タンパク質の細胞内局在化と同じであるかどうかを見極めるために、我々はウシの脳由来の蔗糖密度精製画分上で、架橋及びウェスタン・ブロットを行った。以前の研究では、蔗糖密度バンド3及び4が、ミトコンドリア・マーカー琥珀酸シトクロムCレダクターゼに関して富化されていると示唆されていた。以前の結果からの予期通り、架橋バンドは、これらのミトコンドリア画分中で富化された(図8)。SDS-PAGEに続いて、これらの試料の代表ゲルを総タンパク質に関して染色するか(図8、上図)、又は免疫前血清(左下）、抗ペプチドB(下中央)、又はプロヒビチン(右下)、既知のミトコンドリア・タンパク質を使用して、ウェスタン・ブロット用の膜に移した。プロヒビチン及びミトNEET染色は、同じ画分内で行われ、ミトNEET染色には、チアゾリジンジオン(TZD)特異的架橋をオーバーレイした。
【０２８１】
図1〜6に要約された試験は、インスリン感作チアゾリジンジオン(TZD)のための新規の標的の同定を示す。図7及び8に要約された研究は、ミトコンドリア画分中のこの標的の存在を確認する。図9及び10に要約された研究は、新規の標的の機能が長鎖脂肪酸の酸化を調節することであることを示唆する。図11に要約された試験は、ミトNEETが脂質代謝の調節に関与するという観点を支持する。これらの研究は、我々の発明の基礎及び支えを成す。我々の発明は、この新規の標的を新規の治療に用いることにより、本明細書中で概略を述べたような疾患を治療することを含む。
【０２８２】
全ての参考文献、特許明細書、又は特許出願明細書の全体を参考のため、本明細書中に記載されたものとして引用する。
【０２８３】
下記実施例を参照しながら本発明をさらに説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。
【実施例】
【０２８４】
実施例1
4-アジド-N-[2-(｛[6-(2-｛4-[(2,4-ジオキソ-1,3-チアゾリジン-5-イル)メチル]フェノキシ｝エチル)ピリジン-3-イル]アセチル｝アミノ)エチル]-2-ヒドロキシベンズアミドの合成及びヨウ素処理
【化１】
2006515171.tif 000002
【０２８５】
ピオグリタゾンのカルボン酸類似体、([6-(2-｛4-[(2,4-ジオキソ-1,3-チアゾリジン-5-イル)メチル]フェノキシ｝エチル)ピリジン-3-イル]酢酸)
【化２】
2006515171.tif 000003
と、エチルアミンを含有するp-アジド-ベンジル基とをカップリングすることにより、標題化合物を合成した。精製された化合物を、固相ヨードゲンで無担体でヨウ素処理し、そしてヨウ素処理された生成物を精製して、そして暗所内に保存した。
【０２８６】
実施例2
【０２８７】
ウシ脳ミトコンドリアをウシの脳から捕集した。この手順は、現地の食品加工工場から得られたばかりの去勢牛の脳を解剖することを伴った。すすがれた脳を分画緩衝液(250mM蔗糖、50mM Tris、pH=8.0であり、1μg/mlペプスタチンA、5μg/mlロイペプチン、10μg/mlバシトラシン、及び0.1mM PMSFを含有する)中で均質化した。Beckman Ti50において5000rpmで核を除去するのに続いて、ミトコンドリア・ぺレットを20,000 x g(Beckman Ti50ローターにおいて12,500 rpm)で捕集し、そして蔗糖密度遠心分離によってさらに富化した。膜画分を1.18密度バンド及び1.20密度バンドの頂部から捕集し、50mM Tris中で再懸濁し、そして遠心分離によって捕集した。画分(「B3/B4」)を使用するまで-80℃で保存した。
【０２８８】
実施例3
【０２８９】
未加工ラット肝臓、骨格筋、及び脳のミトコンドリア富化画分を下記の通り調製した。Sprague-Dawleyラットを麻酔し、そして脚の筋肉、肝臓、及び全脳を取り出して、低温MLB(225mM蔗糖、6mM K2HPO4、5mM MgCl2、20mM KCl, 2mM EDTA EGTA, pH=7.4)に移した。組織を切り刻み、すすぎ、そして5容積のMLB中で、ポリトロン(設定値7；3 x 15秒)を用いて均質化した。破壊されていない細胞及び核(750 x g)を取り除くのに続いて、ミトコンドリア富化画分を5分間にわたって、15,800 x gで捕集した。ルーズなペレットを廃棄し、そして稠密な中心ぺレットをMLB中に再懸濁し、そして10分間にわたって11,800 x gで再捕集した。最終ぺレットを50mM Tris(pH=8)中で5〜8mg/ml総タンパク質で再懸濁し、そして使用するまで-80℃で凍結した。
【０２９０】
実施例4
【０２９１】
100μl膜、競合用チアゾリジンジオン(通常は100μM ([6-(2-｛4-[(2,4-ジオキソ-1,3-チアゾリジン-5-イル)メチル]フェノキシ｝エチル)ピリジン-3-イル]酢酸)、25μM 最終濃度)を含む又は含まない50μl 4% DMSO、及び50μl無担体125I-4-アジド-N-[2-(｛[6-(2-｛4-[(2,4-ジオキソ-1,3-チアゾリジン-5-イル)メチル]フェノキシ｝エチル)ピリジン-3-イル]アセチル｝アミノ)エチル]-2-ヒドロキシベンズアミド(0.1〜0.2μCi/管)を含有する、最終容積200μl中で架橋反応を実施した。アセトニトリド中適量の125I-4-アジド-N-[2-(｛[6-(2-｛4-[(2,4-ジオキソ-1,3-チアゾリジン-5-イル)メチル]フェノキシ｝エチル)ピリジン-3-イル]アセチル｝アミノ)エチル]-2-ヒドロキシベンズアミドを使用直前に暗所内で真空下において乾燥させた。反応物を室温で15分間にわたってインキュベートし、そしてこの反応を、開管内でUV線に当てることにより(Stratalinker内で180,000ジュールまで)、反応を停止させた。次いで、15,000 x gのTOMYマイクロ遠心分離器内で5分間にわたって遠心分離を行うのに続いて、架橋済試料を50mM Tris(pH=8.0)ですすいだ。すすいだぺレットを100μlの50mM Tris中に再懸濁した。
【０２９２】
再懸濁されたぺレットを1% Triton X 114にもたらすことにより、選択的に架橋されたミトNEETの最適な選択的可溶化を達成する。5分間にわたって室温で揺するのに続いて、15分間にわたる18,000 x gでの遠心分離の後、架橋済ミトNEETの大部分が上澄み中に残った。30分間にわたってTLAにおいて450,000 x gで遠心分離したあと、架橋済ミトNEETはまた上澄み中に残った。これにより、汚染タンパク質のほとんどが除去された。
【０２９３】
硫酸アンモニウムで沈降させることにより、Triton X 114を試料から除去した。等容積の1.5M 硫酸アンモニウムをTriton X 114容積に添加することにより、タンパク質を塩析して溶液中に洗剤を残した。この規模で、この手順を3回繰り返し、沈降タンパク質の収率を最大化した。タンパク質沈降物がTriton含有上澄み上に浮かばないように特別の注意を払うことが必要である。
【０２９４】
沈降タンパク質を、SDS-PAGEゲル(10〜20%又は18% Tris Glycine)の直接分離、又はHPLCのために濃縮した。HPLCハードウェアは、脱ガス器を備えたAgilent 1100シリーズ4元ポンプ、オートサンプラー、及びUV走査ダイオード・アレイ検出器から成っている。ガンマ・インライン検出器は、ガンマ-Cフロー・セルを備えたPackard Flow-one β RAM シリーズA-500検出器であった。ソフトウェア及びデータを、NT 4.0のGateway E-3100 PCを通して制御した。完全なUVスペクトル・データを、Agilent HPLC Chemstation Spectral SWモジュールで捕集し、そしてAgilent Chemstation ソフトウェア(改訂a.09.01)で処理した。UV吸収は、ペプチド結合吸収最大値に相当する214nmでモニタリングした。ラジオマチック・フローセルはガンマ-C(125μl容積)であった。このセルはシンチレート体を必要としないので、完全なHPLC流出液を捕集することができた。Phenomenex Synergi max-RP C12 TMS末端キャップ型逆相、80Å孔径5μ x 4.6mm ID, 250mm長を使用して、最も有用な分離が発生した。ガード・カラムは、RP-1SecurityGuard カートリッジ(Phenomenex), 4 x 2.0mmであった。感知できるほどの標的タンパク質収量を提供しない標準タンパク質カラムの相当の試験後、カラム及びガード・カラムを選択した。プログラミングされた勾配溶離で試料を溶離した。この溶離は、70%溶液A(水/0.05% TFA v/v)30%B(ACN/0.05% TFA v/v)で始まった。勾配は、最初の15分間にわたって30%で保持され；次いでBを30分間にわたって30%から55%に増大させ、次いで15分で80%まで増大させた。走行終了時に、5分間の再等化後時間で、最初の条件を再確立した。流量は試験全体を通して1ml/分で固定した。Gilsonモデル203上で、1.5ml円錐管内に画分を1ml/管で捕集し、乾燥させ、還元性Tris Glycine 試料緩衝液中に再懸濁した。
【０２９５】
画分を18%Tris Glycine ポリアクリルアミド・ゲル(Invitrogen)上で電気泳動させた。ある場合には、ゲルを固定して銀染色し、他の場合には、無固定で無染色ゲルを乾燥させることにより、ゲルからのタンパク質回収量を最大化させた。オートラジオグラムをオーバーレイすることにより、当該バンドを局在化させた。
【０２９６】
特異的に架橋されたタンパク質を電気泳動ゲルから摘出した。
【０２９７】
実施例5
分離された架橋済タンパク質を同定するために、摘出された架橋済タンパク質を還元し、アルキル化し、そしてDigestPro ロボット(ABIMED)を使用して、変性ブタ・トリプシン(Promega)でin-situ消化した。手短に言えば、ゲルスポットを反応バイアル内に置き、そしてPeltier 加熱/反応ブロック内で固定した。600μlマイクロバイアル(BioRad)からキャップを取り除き、そして捕集ラック内に置くことにより、ペプチド捕集管を調製した。消化されたペプチドを60%アセトニトリル/5%ギ酸で抽出した。ペプチド抽出物を、乾燥させて水中10μlの5%ギ酸中で戻すまで、Speed-VAC遠心分離器内に置いた。
【０２９８】
Micromass CapLCにカップリングされたMicromass Qtof ultima 機器上で、NanoLCタンデム質量分析(ナノLC-MS/MS)を実施した。総試料量5.5μlから典型的には5μlを注入し、そしてカラム・スイッチング法を用いて前濃縮した。補助ポンプを使用して、試料をC18 Pepmap（登録商標）プレカラム(0.3 x 5mm)上で、20μl/分で0.1%ギ酸を供給することにより、試料を前濃縮して脱塩した。脱塩後、プレカラムを分析カラム(75μm ID C-18 Pepmap, LCパッケージング)とインラインでスイッチし、そして水中0.1%のギ酸の勾配で、300nl/分で溶離し、90%アセトニトリルを含有する0.1%ギ酸をQtof内へ直接的に供給した。タンデムMSデータを取得し、Macromass MassLyxnソフトウェアによって処理した。
【０２９９】
ナノスプレイMS/MSデータを用いて、試験データと、タンパク質及びDNAデータベースから導出された予測データと比較することにより、タンパク質を同定した。SAM Chemistry MS lab NTサーバー上に維持されたMASCOT(Matrix Science)プログラムを使用して、NCBInrタンパク質データベースに対して、タンデムMSデータを探索した。
【０３００】
実施例6
タンパク質同定のために使用された最終ゲル上の材料量を最適化し、同定を確認するために、最大80レーンの個別の反応物をマーキングし、ゲル・バンドを切り出した。再水和及び乾燥を利用して、これらのレーンからミトNEETを溶離する手順を開発した。乾燥ゲル上に17-kDaオートラジオグラム・バンドを配向し、125I画像の上側コーナー及び下側コーナーの両方で、20ゲージ・ニードルを使用して位置マーキングした。バンドを切り出し、そして乾燥済ゲル切片をH2Oの液滴で再水和した。「水溶離された」ミトNEETを濃縮し、そしてさらに、MS/MS同定前にSDS-PAGE上で精製するか、又はCnBr断片の生成のために使用した。当該タンパク質バンドを外科用メスで再び切り出し、そして乾燥させたゲル切片をH2Oの液滴で再水和した。70%ギ酸中で調製された40mM CnBr(Sigma)500μlとともにインキュベーションすることにより、CnBr消化を達成した。室温で一晩にわたって消化した後、ゲル切片をSpeed Vac Concentrator(Savant)内で乾燥させ、500μlの水で再水和し、そして再び乾燥させた。次いでゲル切片を200μl H2O中で再水和し、そして、水溶離によってCnBr断片を放出した。これらのゲルの電気溶離によって、更なる回収が生じることはなかった。試料を最後に濃縮し、そして18% Tris-グリシンゲル(Invitrogen)上で走行させた。電気泳動に続いて、ゲルをImmobilon-Psq(Millipore)にブロットした。ブロットを0.1% クーマシーR-250で染色し、脱染し、そして空気乾燥させた。ブロットを-80℃でBiomax MS フィルムに暴露し、このフィルムは、6-kDa断片を同定した。この断片には、アミノ末端配列決定を施した。Applied Biosystems モデル492 Procise cLCタンパク質シーケンサー上で、自動エドマン分解法によって、アミノ末端配列決定を実施した。
【０３０１】
実施例7
ミトNEET同定を確認するための抗体の生成は、まず、抗体をそれに対して生じさせるのに好適なペプチドを同定することを伴う。4-アジド-N-[2-(｛[6-(2-｛4-[(2,4-ジオキソ-1,3-チアゾリジン-5-イル)メチル]フェノキシ｝エチル)ピリジン-3-イル]アセチル｝アミノ)エチル]-2-ヒドロキシベンズアミドとの架橋から同定されたタンパク質を、J. F. Kezdy及びR. A. Poormanによって社内で開発された一連のコンピュータ・プログラムを用いて評価した。両親媒性らせん領域は、抗原部位である確率が極めて高い。主要プログラムは、両親媒性アルファらせんパターンに対応するタンパク質を試験する。次いでこれらの配列を、Cho-Fasman及びロビンソンの予測配座プログラムによって試験することにより、実際に潜在的な両親媒性らせんがタンパク質配座内に存在する任意の確率を有するかどうかを見る。3つのプログラム全てが一致すると、この配列は、タンパク質標的と交差反応する抗ペプチド抗体を産生する高い確率を有する。3つのペプチドを選び、そしてApplied Biosystems 433Aペプチド合成器上で合成した。9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)基を、Nα-アミノ保護基として使用した。それぞれの残基は、HBTU/NMPプロトコルを使用して単一カップリングした。N-末端Fmoc基の除去後、一時的側鎖保護基を除去し、そして95% TFA/5%スカベンジャー(エチルメチルスルフィド/アニソール/1,2-エタンジチオール, 1:3:1)で2時間にわたって室温で処理することにより、ペプチドをこれらの樹脂から切断した。未加工ペプチドを、低温ジエチルエーテルを用いて切断溶液から沈降させ、濾過し、希酢酸中に溶解し、減圧下で乾燥するまで蒸発させ、そして残留物を再溶解し、そして水から凍結乾燥させた。未加工ペプチドを水中に溶解させ、濾過し、そして調製逆相カラム(Vydac C-18, 22 x 250mm, 10ミクロン)上に4ml/分100%A(A:水中0/1% TFA、B:アセトニトリル中0.07%TFA)でローディングした。使用された勾配は0〜10%B、10分間、次いで10〜50% B、200分間であった。220nm及び280nmにおける吸光度によってカラム流出物をモニタリングした。分析逆相システム(Vydac C-18, 4.6 x 250nm, 5ミクロン)、上述の溶剤及び波長において、1.0ml/分で20分間の0から70%Bの線形勾配を用いて画分をモニタリングした。画分をプールし、減圧下でアセトニトリルを蒸発させ、そして水溶液を凍結乾燥させた。オープンアクセス・エレクトロスプレイ質量分析によって、ペプチドを特徴付けた。
【０３０２】
ペプチドA, B及びC(図6)をキーホール・リンペット・ヘモシアニンに複合し、そしてウサギをCovance Research Products(Denver, Pa.)によって免疫化した。
2匹のウサギそれぞれを、ペプチド毎に、3注入プロトコルに基づいて免疫化した。それえぞれの事例において、全てのペプチドに対する、スポット濃度投与量曲線(0.01〜10μg)に対して血清を試験した。ペプチドA及びBに関しては、最初の採血以後、正の反応を得た。ペプチドCは免疫応答を顕在化させなかった。A又はBに対する抗血清は、他のペプチドのいずれに対しても交差反応することはなかった。
【０３０３】
これらの抗血清を用いたウェスタン分析を下記のように行った。タンパク質試料を還元用試料緩衝液中で熱変性し、そして18% Tris-グリシンSDS/PAGEゲル上にローディングした。電気泳動に続いて、ゲルをPVDF膜にエレクトロブロットした。ブロットされた膜を、5%粉ミルク、0.05% Tween-20及び0.02%アジ化ナトリウムを含有するTBS, pH8.0中で、2時間にわたって室温でブロックした。ウサギ抗-ミトNEETペプチドB血清の1:30,000希釈物(試験ブロットの滴定によって測定)を、ブロックされた膜とともに一晩にわたって4℃でインキュベートした。対照ブロットを、同じウサギから得られた前免疫化血清の1: 30,000希釈物とともにインキュベートした。加えて、ウサギ抗プロヒビチン抗体の1:400希釈物(Research Diagnostics Inc.)を使用して、プロヒビチン・レベル、ミトコンドリア・タンパク質マーカーを検出するために、対照ブロットを調製した。一次抗血清インキュベーションに続いて、0.05% Tween-20を含有するTBSを用いて、膜を6 x 5分洗浄した。次いで、5%粉ミルクを含有するTBS中のアルカリ性リン酸塩複合モノクローナル抗ウサギIgG(Sigma#A2556)の1:50,000希釈物と一緒に、1時間にわたって室温で、膜をインキュベートした。次いで膜をTBS中で3 x 10分洗浄し、そして免疫反応性バンドを、BCIP/NBT Blue Liquid Substrate (Sigma #B-3804)で同定した。展開したブロットを室温で乾燥させ、Biomax MSオートラジオグラフィ・フィルムに暴露することにより、免疫反応性バンドと、特異的に架橋された放射能バンドとの正しいアラインメントを見極めた。図7及び8は、125I-4-アジド-N-[2-(｛[6-(2-｛4-[(2,4-ジオキソ-1,3-チアゾリジン-5-イル)メチル]フェノキシ｝エチル)ピリジン-3-イル]アセチル｝アミノ)エチル]-2-ヒドロキシベンズアミドによって特異的に架橋されたタンパク質に相応して、ウェスタン・ブロット上にミトNEETが局在化されることを示している。
【０３０４】
実施例8
実施例6のように合成された完全長ミトNEETを、N末端ビオチンを含有するように伸長させる。ストレプトアビジン・ビードにミトNEETを付着させた結果、ミトコンドリア源から可溶化された多数のタンパク質が選択的に会合した(図9)。多数のこれらのタンパク質は同定されており、脂肪酸酸化に関与することが知られている。可溶化ミトコンドリア調製物に過剰合成ミトNEETを添加することにより、脂肪酸酸化が阻害される(図10)。ミトNEET機能を調節すると、脂肪酸酸化が増大すると予期される。本明細書中に記載したような有用なモジュレーターを見いだすためのこのようなアプローチは、内生的又は過剰発現型ミトNEETを含有する合成ペプチド又は膜とともに採用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０３０５】
【図１】図1。代表的な10〜20% SDS-PAGEゲル(クーマシー染色、左図)及びオートラジオグラム(右図)。実施例1に記載したように([6-(2-｛4-[(2,4-ジオキソ-1,3-チアゾリジン-5-イル)メチル]フェノキシ｝エチル)ピリジン-3-イル]酢酸)(TZD)の不存在(-)又は25μM(+)の存在において、ラット肝臓ミトコンドリア中で、125I-PNU-1010174との架橋を行う。レーン1及び2は、すすがれたミトコンドリア・ぺレットに由来し、レーン3及び4は、1% Triton X 114で可溶化された同じインキュベーションを表し、そしてレーン5及び6は、Triton X 114可溶性材料の硫酸アンモニウム(AS)沈降物である。
【図２】図2。競合体を伴って又は伴わずに行われた14の別個のインキュベーションに由来するTriton X 114可溶性ミトNEETの硫酸アンモニウム・ぺレットを、実施例4に記載したように、200μlの総容積中に再懸濁し、そしてこれにHPLCを施した。マイナス競合体条件の代表データを示す。右上図はUVプロフィール(214nm)を示す。インライン・ガンマ検出器から得られた125Iプロフィールを右下図に示す。左図は、銀染色されたゲル(左上図)、及び当該画分の対応オートラジオグラム(左下図)を示す。データは、代表的なラット肝臓ミトコンドリア調製物に関して示されている。画分31中に見られる125I架橋ミトNEETは、([6-(2-｛4-[(2,4-ジオキソ-1,3-チアゾリジン-5-イル)メチル]フェノキシ｝エチル)ピリジン-3-イル]酢酸)の合体された存在において架橋された調製物中には存在しなかった(図示せず)。
【図３】図3。競合体を伴って又は伴わずに行われた80の別個のインキュベーションに由来するTriton X 114可溶性ミトNEETの硫酸アンモニウム・ぺレットを、実施例4に記載したように、SDS-PAGE還元性試料緩衝液中に再懸濁し、そしてこれに18% Trisグリシン・ゲル上の電気泳動法を施した。ゲル溶離の当該バンドを切除する前(上図)及び後(下図)には、代表的なゲルのオートラジオグラム(競合体([6-(2-｛4-[(2,4-ジオキソ-1,3-チアゾリジン-5-イル)メチル]フェノキシ｝エチル)ピリジン-3-イル]酢酸)を有するレーンと有さないレーンとが交互に形成されている)が示されている。
【図４】図4。太字のペプチドは、トリプシン消化された精製架橋タンパク質からMS/MSによって同定されたトリプシンペプチドである。同定されたペプチドを使用したデータベース検索とマッチングしたこれらのペプチドを含有する予測ペプチド配列中に、これらのペプチドが含まれる。チアゾリジンジオンと相互作用し、そしてミトコンドリア内に位置することが示されたこのポリペプチドは、「ミトNEET」と呼ばれる。
【図５】図5。上図は、架橋ミトNEETの代表的なCnBr切断を示す。ウシ脳ミトコンドリアを使用したインキュベーションから得られた80片のゲル切片から形成された溶離材料は、図6に記載したように、更なる処理なしに濃縮するか、或いは、CnBr切断させた。次いで、濃縮された材料は、18% SDSポリアクリルアミド・ゲル上で再電気泳動させ、そしてPVDF膜上に移した。これらの膜を、クーマシー・ブルー(左上図)で染色し、そしてX線フィルムに暴露した(右図)。架橋プローブを含有する無傷ミトNEET及び6-kDa CnBr断片が矢印によって示されている。MSによって同定されたタンパク質の配列と比較したN-末端配列の結果を下図に示す。
【図６】図6。B図は、ウシ(SEQ ID NO:4)、ヒト(SEQ ID NO:5)、及びマウス(SEQ ID NO:6)のミトNEETのアミノ酸配列のアラインメントを示す。ウシ・ミトNEET対ヒト・ミトNEETと、マウス・ミトNEET対ヒト・ミトNEETとの差を太字で示す。「ニート」モチーフは影をつけて表す。A図は、実施例7に記載されたマウス・ミトNEETに対する抗体の生成に関して形成された3種のペプチド(A, B及びC)を示す。マウス・ミトNEETアミノ酸配列におけるペプチドA及びCの位置は、B図において下線をつけて示す。マウス・ミトNEETアミノ酸配列におけるペプチドBの位置は、図Bにおいて斜字で示す。C図は、予測膜貫通らせん(TMらせん)を示し、この場合、残基1〜12は膜の外側に位置し、残基13〜35はTMらせん(太線で示す)であり、そして残基36〜108は膜の内側にある。架橋の予測部位はM61とT108との間である。残基105〜108(KKET)は、予測cAMP-cGMP依存性タンパク質キナーゼ・リン酸化反応部位(下線で示す)である。残基7〜10(SAVR)及び77〜79(SKK)は、予測タンパク質キナーゼ・リン酸化反応部位(斜字で示す)である。
【図７】図7。25μMの([6-(2-｛4-[(2,4-ジオキソ-1,3-チアゾリジン-5-イル)メチル]フェノキシ｝エチル)ピリジン-3-イル]酢酸)との競合を伴わずに(-)又は競合を伴って(+)、実施例7に記載されたラットの脳、骨格筋、及び肝臓に由来する未加工ミトコンドリア画分を用いて、125I-4-アジド-N-[2-(｛[6-(2-｛4-[(2,4-ジオキソ-1,3-チアゾリジン-5-イル)メチル]フェノキシ｝エチル)ピリジン-3-イル]アセチル｝アミノ)エチル]-2-ヒドロキシベンズアミドとの架橋反応を行った。次いで本明細書中に記載したように、膜を洗浄し、1%トリトンX 114で可溶化し、そしてこれに電気泳動及びウェスタン・ブロッティングを施した。免疫前血清(左上)又はペプチドBに対する抗血清(右上図、両方とも1:300)とともにインキュベートするのに続いて、PVDFブロットを染色した。これらのブロットのフィルム画像を、代表する下図に示す。
【図８】図8。25μMの([6-(2-｛4-[(2,4-ジオキソ-1,3-チアゾリジン-5-イル)メチル]フェノキシ｝エチル)ピリジン-3-イル]酢酸)を伴わずに(TZD -)又は伴って(+)、不連続的なスクロース勾配(B1〜B4;密度1.1-1.4)から、ウシの脳膜画分を用いて、125I-4-アジド-N-[2-(｛[6-(2-｛4-[(2,4-ジオキソ-1,3-チアゾリジン-5-イル)メチル]フェノキシ｝エチル)ピリジン-3-イル]アセチル｝アミノ)エチル]-2-ヒドロキシベンズアミドとの架橋反応を行った。試料に、18% Tris-グリシン還元性ゲル上で電気泳動を施し、そしてこれを染色するか(上図)、又はウェスタン・ブロットに際してPVDF膜にブロットした(下図)。1:30,000希釈率のウサギ#470の免疫化前抗血清(左図)、1:30,000希釈率のウサギ#470のペプチドB免疫化後抗血清(中央図)、及びウサギ抗プロヒビチン(Research Diagnostics, Inc.)、ミトコンドリア膜マーカータンパク質(右図)を使用して、ウェスタン分析を行った。各ブロットの対応オートラジオグラムを、それぞれのウェスタン分析の図の下に示す。
【図９】図9。N末端伸長部分上でビオチンで合成されたミトNEETを、ストレプトアビジン・ビードに結合した(1時間)。これに続いて、過剰のビオチン、及び最後にラットの脳、骨格筋及び肝臓ミトコンドリアから可溶化した膜を結合した。ビードを洗浄し、次いで、pHの低減(0.1Mグリシン、pH=2.3)によって、結合されたタンパク質を溶離した。溶離されたタンパク質をSDS-PAGEゲル上で分離し、銀染色することにより、溶離されたタンパク質を明らかにした。ミトコンドリア・タンパク質のサブセットを選択的に結合し、次いでミトNEETを含有するビードから溶離した(常に他のレーン)。
【図１０】図10。合成ミトNEETの付加を伴うか又は伴わずに、可溶化ミトコンドリアによって、パルミトイルCoAの酸化を測定した。CoASH、NAD、FAD及び1mM パルミトイル CoAの存在において反応を実施した。過剰の合成ミトNEETペプチド11Aの不存在(黒丸)及び存在(黒四角)において、インキュベーション後の種々の時点における残留パルミトイルCoAが示されている。ミトコンドリア膜(白三角)の不存在においては基質の損失はなかった。HPLCによって、基質及び生成されたCoA生成物を測定した。
【図１１】図11。分化された脂肪細胞におけるミトNEETの誘発。3T3L1前脂肪細胞(線維芽細胞)及び完全分化された脂肪細胞から膜ペレットを調製し、これらを図8に示すような架橋反応及びウェスタン・ブロットのために使用した。ミトNEETタンパク質(右上図)及び架橋(下図)の含量は、分化された脂肪細胞において増大した。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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