(57)【要約】本発明は、極性および非極性細胞の細胞膜における新規局在を示すいくつかの改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを提供する。本発明の改変されたＡＢＣトランスポータは、天然の先端を標的にしたＡＢＣトランスポータ、とりわけｃＭＯＡＴ、ＭＤＲ３またはＭＲＰ４のアミノ酸配列を含み、ここで上記の天然のＡＢＣトランスポータの末端トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフは変異する。本発明の単離された、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチド、および上記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、以下の適用に役立つ：第１に、それらは細胞に薬物耐性表現型を誘導するために使用される。第２に、それらは化学療法および他の治療への適用中に非極性細胞を保護するために使用される。第３に、それらは対応する天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドの新規アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするために使用される新規細胞系統を生み出すために使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
極性細胞の基底外側膜において、または非極性細胞の細胞膜において主に局在する改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドであって、通常は極性細胞の頂上（細管）膜に蓄積する天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのアミノ酸配列からなり、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２から５８までのいずれか一つに示された配列を有する前記天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのＣ−末端トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの１以上のアミノ酸残基が置換されているか、または欠失する、前記改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチド。
【請求項２】
トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの第一の位置のスレオニンが異なるアミノ酸残基により置換される、請求項１の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチド。
【請求項３】
異なるアミノ酸残基がアラニンである、請求項２の改変されたＡＢＣトランスポータ。
【請求項４】
トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの第２の位置のリジンが異なるアミノ酸残基により置換される、請求項１の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチド。
【請求項５】
異なるアミノ酸残基がアラニンまたはプロリンである、請求項４の改変されたＡＢＣトランスポータ。
【請求項６】
トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの３つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基により置換される、請求項１の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチド。
【請求項７】
トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの３つのアミノ酸残基のそれぞれがアラニンにより置換される、請求項６の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチド。
【請求項８】
トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの３つのアミノ酸残基がそれぞれアラニン、プロリン、およびバリンにより置換される、請求項６の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチド。
【請求項９】
トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの３つのアミノ酸残基が欠失する、請求項１の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチド。
【請求項１０】
通常は極性細胞の頂上（細管）膜に蓄積する天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドが、細管多特異的有機アニオントランスポータ（ｃＭＯＡＴ）、ＭＤＲ３およびＭＲＰ４からなる群から選択される、請求項１の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチド。
【請求項１１】
天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドがヒトｃＭＯＡＴ、ヒトＭＤＲ３またはヒトＭＲＰ４である、請求項１０の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチド。
【請求項１２】
緑色蛍光蛋白質（ｇｆｐ）に共有結合した請求項１の改変されたＡＢＣトランスポータを含む融合ポリペプチド。
【請求項１３】
極性細胞の基底外側膜において、または非極性細胞の細胞膜において主に局在する、改変された細管多特異的有機アニオントランスポータ（ｃＭＯＡＴ）ポリペプチドであって、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２またはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５３またはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５５に示された配列を有する天然のｃＭＯＡＴポリペプチドのＣ−末端トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの１以上のアミノ酸残基が置換されているか、または欠失する、前記天然のｃＭＯＡＴポリペプチドのアミノ酸配列からなる、前記改変されたｃＭＯＡＴポリペプチド。
【請求項１４】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２に示された配列を有する、前記天然のｃＭＯＡＴポリペプチドのＣ−末端トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの１以上のアミノ酸残基が置換されているか、または欠失する、請求項１３の改変されたｃＭＯＡＴポリペプチド。
【請求項１５】
トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの第一の位置のスレオニンが異なるアミノ酸残基により置換される、請求項１４の改変されたｃＭＯＡＴポリペプチド。
【請求項１６】
異なるアミノ酸残基がアラニンである、請求項１５の改変されたｃＭＯＡＴポリペプチド。
【請求項１７】
トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの第２の位置のリジンが異なるアミノ酸残基により置換される、請求項１４の改変されたｃＭＯＡＴポリペプチド。
【請求項１８】
異なるアミノ酸残基がアラニンまたはプロリンである、請求項１７の改変されたｃＭＯＡＴポリペプチド。
【請求項１９】
トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの３つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基により置換される、請求項１４の改変されたｃＭＯＡＴポリペプチド。
【請求項２０】
トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの３つのアミノ酸残基のそれぞれがアラニンにより置換される、請求項１９の改変されたｃＭＯＡＴポリペプチド。
【請求項２１】
トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの３つのアミノ酸残基がそれぞれアラニン、プロリン、およびバリンにより置換される、請求項１９の改変されたｃＭＯＡＴポリペプチド。
【請求項２２】
トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの３つのアミノ酸残基が欠失する、請求項１３の改変されたｃＭＯＡＴポリペプチド。
【請求項２３】
緑色蛍光蛋白質（ｇｆｐ）に共有結合した請求項１３の改変されたｃＭＯＡＴを含む融合ポリペプチド。
【請求項２４】
極性細胞の基底外側膜において、または非極性細胞の細胞膜において主に局在する、改変されたＭＤＲ３ポリペプチドであって、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５７に示された配列を有する天然のＭＤＲ３ポリペプチドのＣ−末端トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフが欠失する、前記天然のＭＤＲ３ポリペプチドのアミノ酸配列からなる、前記改変されたＭＤＲ３ポリペプチド。
【請求項２５】
緑色蛍光蛋白質（ｇｆｐ）に共有結合した請求項２４の改変されたＭＤＲ３を含む融合ポリペプチド。
【請求項２６】
極性細胞の基底外側膜において、または非極性細胞の細胞膜において主に局在する、改変されたＭＲＰ４ポリペプチドであって、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５４に示された配列を有する天然のＭＲＰ４ポリペプチドのＣ−末端トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフが欠失する、前記天然のＭＲＰ４ポリペプチドのアミノ酸配列からなる、前記改変されたＭＲＰ４ポリペプチド。
【請求項２７】
緑色蛍光蛋白質（ｇｆｐ）に共有結合した請求項２６の改変されたＭＲＰ４を含む融合ポリペプチド。
【請求項２８】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４に示されたアミノ酸配列からなる、改変された細管多特異的有機アニオントランスポータ（ｃＭＯＡＴ）ポリペプチド。
【請求項２９】
緑色蛍光蛋白質（ｇｆｐ）に共有結合した請求項２８の改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドを含む融合ポリペプチド。
【請求項３０】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６に示されたアミノ酸配列を含む、改変された細管多特異的有機アニオントランスポータ（ｃＭＯＡＴ）ポリペプチド。
【請求項３１】
緑色蛍光蛋白質（ｇｆｐ）に共有結合した請求項３０の改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドを含む融合ポリペプチド。
【請求項３２】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０に示されたアミノ酸配列を含む、改変された細管多特異的有機アニオントランスポータ（ｃＭＯＡＴ）ポリペプチド。
【請求項３３】
緑色蛍光蛋白質（ｇｆｐ）に共有結合した請求項３２の改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドを含む融合ポリペプチド。
【請求項３４】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２に示されたアミノ酸配列を含む、改変された細管多特異的有機アニオントランスポータ（ｃＭＯＡＴ）ポリペプチド。
【請求項３５】
緑色蛍光蛋白質（ｇｆｐ）に共有結合した請求項３４の改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドを含む融合ポリペプチド。
【請求項３６】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６に示されたアミノ酸配列を含む、改変された細管多特異的有機アニオントランスポータ（ｃＭＯＡＴ）ポリペプチド。
【請求項３７】
緑色蛍光蛋白質（ｇｆｐ）に共有結合した請求項３６の改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドを含む融合ポリペプチド。
【請求項３８】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４９に示されたアミノ酸配列からなる、改変されたＭＤＲ３ポリペプチド。
【請求項３９】
緑色蛍光蛋白質（ｇｆｐ）に共有結合した請求項３８の改変されたＭＤＲ３ポリペプチドを含む融合ポリペプチド。
【請求項４０】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５１に示されたアミノ酸配列からなる、改変されたＭＲＰ４ポリペプチド。
【請求項４１】
緑色蛍光蛋白質（ｇｆｐ）に共有結合した請求項４０の改変されたＭＲＰ４ポリペプチドを含む融合ポリペプチド。
【請求項４２】
通常は極性細胞の頂上（細管）膜に蓄積する、天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのアミノ酸配列からなる、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸であって、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２から５８までのいずれか一つに示されたアミノ酸配列を有する、前記天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのＣ−末端トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの１以上のアミノ酸残基が置換されているか、または欠失する、前記核酸。
【請求項４３】
前記ヌクレオチド配列が以下のものからなる群から選択される対応する野生型遺伝子に関連する突然変異を含む、請求項４２の単離された核酸：
（ｉ）前記Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフを欠失する改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドをコードするために十分な前記野生型遺伝子のコード領域の３′末端からのヌクレオチドの欠失；
（ｉｉ）前記Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフの第１アミノ酸配列が置換されている、改変されたＡＢＣトランスポータをコードするために十分な前記野生型遺伝子のコード領域の３′末端内のヌクレオチドの置換；
（ｉｉｉ）前記Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフの第２アミノ酸配列が置換されている、改変されたＡＢＣトランスポータをコードするために十分な前記野生型遺伝子のコード領域の３′末端内のヌクレオチドの置換；および
（ｉｖ）前記Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフの３つすべてのアミノ酸配列が置換されている、改変されたＡＢＣトランスポータをコードするために十分な前記野生型遺伝子のコード領域の３′末端内のヌクレオチドの置換。
【請求項４４】
改変されたＡＢＣトランスポータが前記Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフの第１アミノ酸におけるスレオニンからアラニンへの置換を含む、請求項４３の単離された核酸。
【請求項４５】
改変されたＡＢＣトランスポータが前記Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフの第２アミノ酸におけるリジンからアラニンまたはプロリンへの置換を含む、請求項４３の単離された核酸。
【請求項４６】
改変されたＡＢＣトランスポータがトリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの３つのアミノ酸残基それぞれのアラニンへの置換を含む、請求項４３の単離された核酸。
【請求項４７】
改変されたＡＢＣトランスポータがトリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの３つのアミノ酸残基のそれぞれのアラニン、プロリンおよびバリンへの置換を含む、請求項４３の単離された核酸。
【請求項４８】
改変された細管多特異的有機アニオントランスポータ（ｃＭＯＡＴ）、改変されたＭＤＲ３または改変されたＭＲＰ４ポリペプチドをコードする、請求項４３の単離された核酸。
【請求項４９】
改変されたｃＭＯＡＴ、改変されたＭＤＲ３または改変されたＭＲＰ４ポリペプチドが改変されたヒトｃＭＯＡＴ、改変されたヒトＭＤＲ３または改変されたヒトＭＲＰ４ポリペプチドである、請求項４８の単離された核酸。
【請求項５０】
改変された細管多特異的有機アニオントランスポータ（ｃＭＯＡＴ）ポリペプチドをコードする単離された核酸であって、以下の群から選択されるヌクレオチド配列からなる前記核酸：
（ｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３で示されたヌクレオチド配列；および
（ｉｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４で示されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
【請求項５１】
改変された細管多特異的有機アニオントランスポータ（ｃＭＯＡＴ）ポリペプチドをコードする単離された核酸であって、以下のものからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む前記核酸：
（ｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５で示されたヌクレオチド配列；および
（ｉｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６で示されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
【請求項５２】
改変された細管多特異的有機アニオントランスポータ（ｃＭＯＡＴ）ポリペプチドをコードする単離された核酸であって、以下のものからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む前記核酸：
（ｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９で示されたヌクレオチド配列；および
（ｉｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０で示されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
【請求項５３】
改変された細管多特異的有機アニオントランスポータ（ｃＭＯＡＴ）ポリペプチドをコードする単離された核酸であって、以下のものからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む前記核酸：
（ｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１で示されたヌクレオチド配列；および
（ｉｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２で示されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
【請求項５４】
改変された細管多特異的有機アニオントランスポータ（ｃＭＯＡＴ）ポリペプチドをコードする単離された核酸であって、以下の群から選択されたヌクレオチド配列を含む前記核酸：
（ｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５で示されたヌクレオチド配列；および
（ｉｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６で示されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
【請求項５５】
改変されたＭＤＲ３ポリペプチドをコードする単離された核酸であって、以下の群から選択されたヌクレオチド配列からなる前記核酸：
（ｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４８で示されたヌクレオチド配列；および
（ｉｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４９で示されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
【請求項５６】
改変されたＭＲＰ４ポリペプチドをコードする単離された核酸であって、以下のものからなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる前記核酸：
（ｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５０で示されたヌクレオチド配列；および
（ｉｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５１で示されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
【請求項５７】
極性細胞の頂上（細管）膜に蓄積するＡＢＣトランスポータポリペプチドをコードする核酸のコード領域の一部分を欠失すること、または置換することを含む、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドをコードする核酸を作製する方法であって、前記部分が前記ＡＢＣトランスポータのＣ−末端トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの第１もしくは第２アミノ酸残基、または前記Ｃ−末端トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの３つすべてのアミノ酸残基をコードし、前記モチーフがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２から５８までのいずれか一つに示された配列を有する前記方法。
【請求項５８】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１で示されたコード領域の一部分を欠失すること、または置換することを含む、改変されたヒト細管多特異的有機アニオントランスポータ（ｃＭＯＡＴ）ポリペプチドをコードする核酸を作製する方法であって、前記部分が前記ｃＭＯＡＴのＣ−末端トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの第１もしくは第２アミノ酸残基、または前記Ｃ−末端トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの３つすべてのアミノ酸残基をコードし、前記モチーフがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２に示された配列を有する前記方法。
【請求項５９】
コード領域の一部分を欠失すること、または置換することが、前記ｃＭＯＡＴのＣ−末端トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの第１もしくは第２アミノ酸残基、または前記Ｃ−末端トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの３つすべてのアミノ酸残基をコードするコード領域の部分に対応するか、または相補的な配列内に欠失または置換を含むプライマーを使用してｃＭＯＡＴをコードする核酸を増幅すること；および欠失または置換がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のコード領域の残りに導入される、増幅された核酸を選択することを含む、請求項５８の方法。
【請求項６０】
プライマーがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６；ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７；ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９；ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０；ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３２；およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、またはそれに相補的な、請求項５８の方法。
【請求項６１】
天然のヒトＭＤＲ３ポリペプチドをコードするコード領域の一部分を欠失することを含む、改変されたヒトＭＤＲ３ポリペプチドをコードする核酸を作製する方法であって、前記部分が前記天然のヒトＭＤＲ３のＣ−末端トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフをコードし、前記モチーフがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５７に示された配列を有する前記方法。
【請求項６２】
コード領域の一部分を欠失することが、前記コード領域またはその相補体の３′末端にハイブリダイズするプライマーを使用して、天然のヒトＭＤＲ３をコードする核酸を増幅すること（ここで前記プライマーは前記Ｃ−末端トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフをコードする前記コード領域の部分に対応するか、または相補的な配列内に欠失を含む）；および欠失がＭＤＲ３をコードするコード領域の残りに導入される、増幅された核酸を選択することを含む、請求項６１の方法。
【請求項６３】
プライマーがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６０で示されたヌクレオチド配列を含むか、またはそれに相補的な、請求項６２の方法。
【請求項６４】
天然のヒトＭＲＰ４ポリペプチドをコードするコード領域の一部分を欠失することを含む、改変されたヒトＭＲＰ４ポリペプチドをコードする核酸を作製する方法であって、前記部分が前記天然のヒトＭＲＰ４のＣ−末端トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフをコードし、前記モチーフがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５４に示された配列を有する前記方法。
【請求項６５】
コード領域の一部分を欠失することが、前記コード領域またはその相補体の３′末端にハイブリダイズするプライマーを使用して、天然のヒトＭＲＰ４をコードする核酸を増幅すること（ここで前記プライマーは前記Ｃ−末端トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフをコードする前記コード領域の部分に対応するか、または相補的な配列内に欠失を含む）；および欠失がＭＲＰ４をコードするコード領域の残りに導入される、増幅された核酸を選択することを含む、請求項６４の方法。
【請求項６６】
プライマーがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６２に示されたヌクレオチド配列を含むか、またはそれに相補的な請求項６５の方法。
【請求項６７】
改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドをコードする請求項４２の単離された核酸が、細胞において前記ポリペプチドの発現を促進するプロモータ配列と操作可能に結合する、前記核酸を含む遺伝子構築物。
【請求項６８】
前記核酸が緑色蛍光蛋白質（ｇｆｐ）をコードする核酸と同じリーディングフレーム中にあり、そのため改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを前記ｇｆｐとの融合ポリペプチドとして発現させることができる、請求項６７の遺伝子構築物。
【請求項６９】
改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドをコードする請求項５０の単離された核酸が、細胞において前記ポリペプチドの発現を促進するプロモータ配列と操作可能に結合する、前記核酸を含む遺伝子構築物。
【請求項７０】
前記核酸が緑色蛍光蛋白質（ｇｆｐ）をコードする核酸と同じリーディングフレーム中にあり、そのため改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを前記ｇｆｐとの融合ポリペプチドとして発現させることができる、請求項６９の遺伝子構築物。
【請求項７１】
改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドをコードする請求項５１の単離された核酸が、細胞において前記ポリペプチドの発現を促進するプロモータ配列と操作可能に結合する、前記核酸を含む遺伝子構築物。
【請求項７２】
前記核酸が緑色蛍光蛋白質（ｇｆｐ）をコードする核酸と同じリーディングフレーム中にあり、そのため改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを前記ｇｆｐとの融合ポリペプチドとして発現させることができる、請求項７１の遺伝子構築物。
【請求項７３】
改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドをコードする請求項５２の単離された核酸が、細胞において前記ポリペプチドの発現を促進するプロモータ配列と操作可能に結合する、前記核酸を含む遺伝子構築物。
【請求項７４】
前記核酸が緑色蛍光蛋白質（ｇｆｐ）をコードする核酸と同じリーディングフレーム中にあり、そのため改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを前記ｇｆｐとの融合ポリペプチドとして発現させることができる、請求項７３の遺伝子構築物。
【請求項７５】
改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドをコードする請求項５３の単離された核酸が、細胞において前記ポリペプチドの発現を促進するプロモータ配列と操作可能に結合する、前記核酸を含む遺伝子構築物。
【請求項７６】
前記核酸が緑色蛍光蛋白質（ｇｆｐ）をコードする核酸と同じリーディングフレーム中にあり、そのため改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを前記ｇｆｐとの融合ポリペプチドとして発現させることができる、請求項７５の遺伝子構築物。
【請求項７７】
改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドをコードする請求項５４の単離された核酸が、細胞において前記ポリペプチドの発現を促進するプロモータ配列と操作可能に結合する、前記核酸を含む遺伝子構築物。
【請求項７８】
前記核酸が緑色蛍光蛋白質（ｇｆｐ）をコードする核酸と同じリーディングフレーム中にあり、そのため改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを前記ｇｆｐとの融合ポリペプチドとして発現させることができる、請求項７７の遺伝子構築物。
【請求項７９】
改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドをコードする請求項５５の単離された核酸が、細胞において前記ポリペプチドの発現を促進するプロモータ配列と操作可能に結合する、前記核酸を含む遺伝子構築物。
【請求項８０】
前記核酸が緑色蛍光蛋白質（ｇｆｐ）をコードする核酸と同じリーディングフレーム中にあり、そのため改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを前記ｇｆｐとの融合ポリペプチドとして発現させることができる、請求項７９の遺伝子構築物。
【請求項８１】
改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドをコードする請求項５６の単離された核酸が、細胞において前記ポリペプチドの発現を促進するプロモータ配列と操作可能に結合する、前記核酸を含む遺伝子構築物。
【請求項８２】
前記核酸が緑色蛍光蛋白質（ｇｆｐ）をコードする核酸と同じリーディングフレーム中にあり、そのため改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを前記ｇｆｐとの融合ポリペプチドとして発現させることができる、請求項８１の遺伝子構築物。
【請求項８３】
当分、および化合物の存在下で細胞が増殖および／または生存能を改変されるのに十分な条件下で、前記細胞に改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現させることを含む、１以上の前記化合物に対する細胞の耐性を促進する方法であって、前記改変されたＡＢＣトランスポータが対応する天然のＡＢＣトランスポータのアミノ酸配列を含み、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２から５８までのいずれか一つに示された配列を有する前記天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのＣ−末端トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの１以上のアミノ酸残基が置換されているか、または欠失する前記方法。
【請求項８４】
天然のＡＢＣトランスポータが細管多特異的有機アニオントランスポータ（ｃＭＯＡＴ）、ＭＤＲ３およびＭＲＰ４からなる群から選択される請求項８３の方法。
【請求項８５】
前記細胞が極性細胞であり、そして前記改変されたＡＢＣトランスポータが主に前記極性細胞の基底外側膜に局在する請求項８３の方法。
【請求項８６】
極性細胞が上皮細胞である請求項８５の方法。
【請求項８７】
上皮細胞が培養ＭＤＣＫ細胞、培養Ｃａｃｏ−２細胞、肝細胞、腸細胞、および海馬ニューロンからなる群から選択される、請求項８６の方法。
【請求項８８】
前記細胞が非極性細胞であり、そして前記改変されたＡＢＣトランスポータが前記非極性細胞の細胞膜に局在する、請求項８３の方法。
【請求項８９】
非極性細胞が線維芽細胞、造血細胞、培養Ｌ１２１０細胞および培養Ｊｕｒｋａｔ細胞からなる群から選択される、請求項８８の方法。
【請求項９０】
化合物が以下のものからなる群から選択される細胞毒性または細胞分裂阻止化合物である請求項８３の方法：
（ｉ）改変されたＡＢＣトランスポータにより細胞から運ばれることが可能な化学療法剤；
（ｉｉ）改変されたＡＢＣトランスポータにより細胞から運ばれることが可能な抗菌剤；
（ｉｉｉ）改変されたＡＢＣトランスポータにより細胞から運ばれることが可能な抗真菌剤。
【請求項９１】
発現された、改変されたＡＢＣトランスポータにより細胞からの化合物のエフラックスが促進され、それにより前記化合物への細胞の耐性を促進する、請求項８３の方法。
【請求項９２】
化合物がグルタチオン抱合体として細胞から輸送される、請求項９１の方法。
【請求項９３】
改変されたＡＢＣトランスポータをコードする核酸を細胞に導入することをさらに含む請求項８３の方法。
【請求項９４】
当分、およびブスルファンの存在下で非極性細胞が増殖および／または生存能を改変されるのに十分な条件下で、前記細胞に改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドを発現させることを含む、ブスルファンに対する前記細胞の耐性を促進する方法であって、前記改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドが天然のｃＭＯＡＴのアミノ酸配列を含み、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２またはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５３、またはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５５に示された配列を有する前記天然のｃＭＯＡＴのＣ−末端トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの１以上のアミノ酸残基が置換されているか、または欠失する前記方法。
【請求項９５】
改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドが天然のｃＭＯＡＴのアミノ酸配列を含み、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２のＣ−末端トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの１以上のアミノ酸残基が置換されているか、または欠失する請求項９４の方法であって、前記置換または欠失が以下のものからなる群から選択される前記方法：
（ｉ）トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの第１の位置におけるスレオニンからアラニンへの置換；
（ｉｉ）トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの第２の位置におけるリジンから異なるアミノ酸残基への置換；
（ｉｉｉ）トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの３つすべてのアミノ酸残基から異なるアミノ酸残基への置換；および
（ｉｖ）トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの３つのアミノ酸残基の欠失。
【請求項９６】
（ｉｉ）における異なるアミノ酸残基がアラニンまたはプロリンである、請求項９５方法。
【請求項９７】
（ｉｉｉ）のそれぞれの異なるアミノ酸残基がアラニンである請求項９５の方法。
【請求項９８】
（ｉｉｉ）の異なるアミノ酸残基がそれぞれアラニン、プロリンおよびバリンである請求項９５の方法。
【請求項９９】
改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドをコードする核酸を非極性細胞に導入することをさらに含む、請求項９４の方法。
【請求項１００】
改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドをコードする核酸がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３に示されたヌクレオチド配列、またはそれに対する縮退ヌクレオチド配列からなる、請求項９９の方法。
【請求項１０１】
当分、およびブスルファンの存在下で非極性細胞が増殖および／または生存能を改変されるのに十分な条件下で、前記細胞に改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドを発現させることを含む、ブスルファンに対する前記細胞の耐性を促進する方法であって、ここで前記改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４に示されたアミノ酸配列からなる前記方法。
【請求項１０２】
改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドをコードする核酸を非極性細胞に導入することをさらに含む請求項１０１の方法。
【請求項１０３】
改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドをコードする核酸がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３に示されたヌクレオチド配列、またはそれの縮退ヌクレオチド配列からなる、請求項１０２の方法。
【請求項１０４】
対象への細胞毒性または細胞分裂阻止化合物の投与中に、非極性細胞を含む生物または組織の前記非極性細胞を保護する方法であって、以下のことを含む前記方法：
（ｉ）当分、および前記非極性細胞から前記細胞毒性または細胞分裂阻止化合物を前記細胞が効率的に輸送するか、またはさもなければ前記化合物に対して耐性を獲得するのに十分な条件下で前記細胞に請求項１の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現させること；および
（ｉｉ）場合により、天然のＡＢＣトランスポータを発現する細胞の増殖を停止、または阻害するために十分な前記天然のＡＢＣトランスポータの阻害剤の十分な量を投与すること、ここで前記天然のＡＢＣトランスポータは前記改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドが由来したものとは異なり、そして前記細胞毒性または細胞分裂阻止化合物の輸送に関与し、そしてここで前記天然のＡＢＣトランスポータを発現する細胞は改変されたＡＢＣトランスポータを発現する非極性細胞と異なる。
【請求項１０５】
改変されたＡＢＣトランスポータを発現する非極性細胞が造血系の細胞であり、そして天然のＡＢＣトランスポータを発現する細胞が上皮細胞である、請求項１０４の方法。
【請求項１０６】
上皮細胞が肝細胞、腸細胞、および海馬ニューロンからなる群から選択される、請求項１０５の方法。
【請求項１０７】
天然のＡＢＣトランスポータを発現する細胞が極性腫瘍細胞または非極性腫瘍細胞である、請求項１０４の方法。
【請求項１０８】
（ｉ）の改変されたＡＢＣトランスポータが改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドであり、そして（ｉｉ）の天然のＡＢＣトランスポータが天然のＭＲＰ１，天然のＭＲＰ３，天然のＭＲＰ４、天然のＭＲＰ５、天然のＭＲＰ６，天然のＭＤＲ３、および天然のＰ−ｇｐからなる群から選択される、請求項１０４の方法。
【請求項１０９】
（ｉ）の改変されたＡＢＣトランスポータが改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドであり、そして（ｉｉ）の天然のＡＢＣトランスポータが天然のＭＲＰ１であり、そして細胞分裂阻止または細胞毒性化合物がＭＲＰ１またはＭＲＰ２の基質である、請求項１０８の方法。
【請求項１１０】
（ｉ）の改変されたＡＢＣトランスポータが改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドであり、そして（ｉｉ）の天然のＡＢＣトランスポータが天然のＭＲＰ３であり、そしてここで細胞分裂阻止または細胞毒性化合物がＭＲＰ２またはＭＲＰ３の基質である、請求項１０８の方法。
【請求項１１１】
（ｉ）の改変されたＡＢＣトランスポータが改変されたＭＤＲ３ポリペプチドであり、そして（ｉｉ）の天然のＡＢＣトランスポータが天然のＭＲＰ１，天然のＭＲＰ２，天然のＭＲＰ３，天然のＭＲＰ４、天然のＭＲＰ５、天然のＭＲＰ６，および天然のＰ−ｇｐからなる群から選択される請求項１０４の方法。
【請求項１１２】
（ｉｉ）の天然のＡＢＣトランスポータが天然のＭＲＰ２であり、そして天然のＭＲＰ２阻害剤が、α―ナフチルイソチオシアネート、クロルプロマジン、シクロスポリン、エストラジオール−１７β−グルクロニド、エチニルエストラジオール、グリコリソコレート−３α−Ｏ−スルフェート、リソコレート−３α−Ｏ−グルクロニド、マンガン−ビリルビン、ファロイジン、タウロコレート、およびタウロリソコレートからなる群から選択される、請求項１１１の方法。
【請求項１１３】
（ｉ）の改変されたＡＢＣトランスポータが改変されたＭＤＲ４ポリペプチドであり、そして（ｉｉ）の天然のＡＢＣトランスポータが天然のＭＲＰ１，天然のＭＲＰ２，天然のＭＲＰ３，天然のＭＲＰ５、天然のＭＲＰ６，天然のＭＤＲ３および天然のＰ−ｇｐからなる群から選択される請求項１０４の方法。
【請求項１１４】
（ｉｉ）の天然のＡＢＣトランスポータが天然のＭＲＰ２であり、そして天然のＭＲＰ２阻害剤が、α―ナフチルイソチオシアネート、クロルプロマジン、シクロスポリン、エストラジオール−１７β−グルクロニド、エチニルエストラジオール、グリコリソコレート−３α−Ｏ−スルフェート、リソコレート−３α−Ｏ−グルクロニド、マンガン−ビリルビン、ファロイジン、タウロコレート、およびタウロリソコレートからなる群から選択される、請求項１１３の方法。
【請求項１１５】
対象への細胞毒性または細胞分裂阻止化合物の投与中に、極性細胞を含む生物または組織の前記極性細胞の耐性を促進する方法であって、以下のことを含む前記方法：
（ｉ）当分、および前記細胞からの前記細胞毒性または細胞分裂阻止化合物の輸送を促進するか、さもなければ前記化合物に対する耐性を促進するのに十分な条件下で前記極性細胞に請求項１の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現させること；および
（ｉｉ）場合により、天然のＡＢＣトランスポータを発現する細胞の増殖を阻止、または阻害するために十分な前記天然のＡＢＣトランスポータ阻害剤の量を投与すること、ここで前記天然のＡＢＣトランスポータは前記改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドが由来したものとは異なり、そして前記細胞毒性または細胞分裂阻止化合物の輸送に関与し、そしてここで前記天然のＡＢＣトランスポータを発現する前記細胞が改変されたＡＢＣトランスポータを発現する極性細胞と異なる。
【請求項１１６】
改変されたＡＢＣトランスポータを発現する極性細胞が上皮細胞であり、そして天然のＡＢＣトランスポータを発現する細胞が非極性細胞である、請求項１１５の方法。
【請求項１１７】
上皮細胞が肝細胞、腸細胞、および海馬ニューロンからなる群から選択される、請求項１１６の方法。
【請求項１１８】
天然のＡＢＣトランスポータを発現する細胞が造血系の非極性細胞である、請求項１１６の方法。
【請求項１１９】
（ｉ）の改変されたＡＢＣトランスポータが改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドであり、そして（ｉｉ）の天然のＡＢＣトランスポータが天然のＭＲＰ１，天然のＭＲＰ３，天然のＭＲＰ４、天然のＭＲＰ５、天然のＭＲＰ６，天然のＭＤＲ３、および天然のＰ−ｇｐからなる群から選択される請求項１１５の方法。
【請求項１２０】
（ｉ）の改変されたＡＢＣトランスポータが改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドであり、そして（ｉｉ）の天然のＡＢＣトランスポータが天然のＭＲＰ１であり、そして細胞分裂阻止または細胞毒性化合物がＭＲＰ１またはＭＲＰ２の基質である、請求項１１５の方法。
【請求項１２１】
（ｉ）の改変されたＡＢＣトランスポータが改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドであり、そして（ｉｉ）の天然のＡＢＣトランスポータが天然のＭＲＰ３であり、そして細胞分裂阻止または細胞毒性化合物がＭＲＰ２またはＭＲＰ３の基質である、請求項１１５の方法。
【請求項１２２】
（ｉ）の改変されたＡＢＣトランスポータが改変されたＭＤＲ３ポリペプチドであり、そして（ｉｉ）の天然のＡＢＣトランスポータが天然のＭＲＰ１，天然のＭＲＰ２，天然のＭＲＰ３，天然のＭＲＰ４、天然のＭＲＰ５、天然のＭＲＰ６，および天然のＰ−ｇｐからなる群から選択される請求項１１５の方法。
【請求項１２３】
（ｉｉ）の天然のＡＢＣトランスポータが天然のＭＲＰ２であり、そして天然のＭＲＰ２阻害剤が、α―ナフチルイソチオシアネート、クロルプロマジン、シクロスポリン、エストラジオール−１７β−グルクロニド、エチニルエストラジオール、グリコリソコレート−３α−Ｏ−スルフェート、リソコレート−３α−Ｏ−グルクロニド、マンガン−ビリルビン、ファロイジン、タウロコレート、およびタウロリソコレートからなる群から選択される、請求項１２２の方法。
【請求項１２４】
（ｉ）の改変されたＡＢＣトランスポータが改変されたＭＤＲ４ポリペプチドであり、そして（ｉｉ）の天然のＡＢＣトランスポータが天然のＭＲＰ１，天然のＭＲＰ２，天然のＭＲＰ３，天然のＭＲＰ５、天然のＭＲＰ６，天然のＭＤＲ３および天然のＰ−ｇｐからなる群から選択される請求項１１５の方法。
【請求項１２５】
（ｉｉ）の天然のＡＢＣトランスポータが天然のＭＲＰ２であり、そして天然のＭＲＰ２阻害剤が、α―ナフチルイソチオシアネート、クロルプロマジン、シクロスポリン、エストラジオール−１７β−グルクロニド、エチニルエストラジオール、グリコリソコレート−３α−Ｏ−スルフェート、リソコレート−３α−Ｏ−グルクロニド、マンガン−ビリルビン、ファロイジン、タウロコレート、およびタウロリソコレートからなる群から選択される、請求項１２４の方法。
【請求項１２６】
請求項６７の遺伝子構築物により形質転換された単離された細胞であって、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現する、前記細胞。
【請求項１２７】
請求項６８の遺伝子構築物により形質転換された単離された細胞であって、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現する、前記細胞。
【請求項１２８】
請求項６９の遺伝子構築物により形質転換された単離された細胞であって、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現する、前記細胞。
【請求項１２９】
請求項７０の遺伝子構築物により形質転換された単離された細胞であって、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現する、前記細胞。
【請求項１３０】
請求項７１の遺伝子構築物により形質転換された単離された細胞であって、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現する、前記細胞。
【請求項１３１】
請求項７２の遺伝子構築物により形質転換された単離された細胞であって、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現する、前記細胞。
【請求項１３２】
請求項７３の遺伝子構築物により形質転換された単離された細胞であって、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現する、前記細胞。
【請求項１３３】
請求項７４の遺伝子構築物により形質転換された単離された細胞であって、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現する、前記細胞。
【請求項１３４】
請求項７５の遺伝子構築物により形質転換された単離された細胞であって、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現する、前記細胞。
【請求項１３５】
請求項７６の遺伝子構築物により形質転換された単離された細胞であって、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現する、前記細胞。
【請求項１３６】
請求項７７の遺伝子構築物により形質転換された単離された細胞であって、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現する、前記細胞。
【請求項１３７】
請求項７８の遺伝子構築物により形質転換された単離された細胞であって、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現する、前記細胞。
【請求項１３８】
請求項７９の遺伝子構築物により形質転換された単離された細胞であって、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現する、前記細胞。
【請求項１３９】
請求項８０の遺伝子構築物により形質転換された単離された細胞であって、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現する、前記細胞。
【請求項１４０】
請求項８１の遺伝子構築物により形質転換された単離された細胞であって、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現する、前記細胞。
【請求項１４１】
請求項８２の遺伝子構築物により形質転換された単離された細胞であって、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現する、前記細胞。
【請求項１４２】
主に基底外側膜に改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドを有する、単離されたＭＤＣＫ細胞であって、前記改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドが：
（ｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４からなる配列；
（ｉｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６を含む配列；
（ｉｉｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０を含む配列；および
（ｉｖ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６を含む配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、前記細胞。
【請求項１４３】
主に細胞膜に改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドを有する、単離されたＬ１２１０細胞であって、前記改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドが：
（ｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４からなる配列；
（ｉｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６を含む配列；
（ｉｉｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０を含む配列；および
（ｉｖ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６を含む配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、前記細胞。
【請求項１４４】
前記改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドを発現しないＬ１２１０細胞に比べ、ブスルファンに対して増大した耐性を有する、請求項１４３の単離されたＬ１２１０細胞。
【請求項１４５】
主に基底外側膜に改変されたＭＤＲ３ポリペプチドを有する単離されたＭＤＣＫ細胞であって、前記改変されたＭＤＲ３ポリペプチドがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４９のアミノ酸配列を有する、前記細胞。
【請求項１４６】
主に細胞膜に改変されたＭＤＲ３ポリペプチドを有する単離されたＬ１２１０細胞であって、前記改変されたＭＤＲ３ポリペプチドがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４９のアミノ酸配列を有する、前記細胞。
【請求項１４７】
主に基底外側膜に改変されたＭＲＰ４ポリペプチドを有する単離されたＭＤＣＫ細胞であって、前記改変されたＭＲＰ４ポリペプチドがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５１のアミノ酸配列を有する、前記細胞。
【請求項１４８】
主に細胞膜に改変されたＭＲＰ４ポリペプチドを有する単離されたＬ１２１０細胞であって、前記改変されたＭＲＰ４ポリペプチドがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５１のアミノ酸配列を有する、前記細胞。
【請求項１４９】
改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドをコードする核酸により形質転換された単離された細胞であって、前記改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドが、通常は極性細胞の頂上（細管）膜に蓄積する天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのアミノ酸配列からなり、ここで、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２から５８までのいずれか一つに示された配列を有する前記天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのＣ−末端トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの１以上のアミノ酸残基が置換されているか、または欠失する、前記細胞。
【請求項１５０】
請求項１４８の単離された細胞であって、前記細胞が極性細胞であり、そして前記改変されたＡＢＣトランスポータが主に前記細胞の基底外側膜に蓄積する、前記細胞。
【請求項１５１】
請求項１４８の単離された細胞であって、前記細胞が非極性細胞であり、そして前記改変されたＡＢＣトランスポータ主に前記細胞の細胞膜に蓄積する、前記細胞。
【請求項１５２】
通常は極性細胞の頂上（細管）膜に蓄積する天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドの基質を同定するための方法であって、以下のことを含む前記方法：
（ｉ）対応する改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを細胞に発現すること、ここで前記改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドは前記天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのアミノ酸配列からなり、ここでＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２から５８までのいずれか一つに示された配列を有する前記天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのＣ−末端トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの１以上のアミノ酸残基は置換されているか、または欠失する；そして
（ｉｉ）天然のＡＢＣトランスポータまたは対応する改変されたＡＢＣトランスポータを発現しない細胞に比較した改変されたＡＢＣトランスポータを発現する細胞からの化合物のエフラックスを測定すること、ここで改変されたＡＢＣトランスポータを発現する細胞からのエフラックスは化合物が対応する天然のＡＢＣトランスポータの基質であることを示す。
【請求項１５３】
エフラックスが細胞から運ばれる化合物の抱合体の量を測定することにより測定される、請求項１５２の方法。
【請求項１５４】
抱合体がグルタチオン抱合体である、請求項１５３の方法。
【請求項１５５】
細胞がＬ１２１０細胞である、請求項１５２の方法。
【請求項１５６】
細胞がＭＤＣＫ細胞である、請求項１５２の方法。
【請求項１５７】
通常は極性細胞の頂上（細管）膜に蓄積する天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのアンタゴニストを同定するための方法であって、以下のことを含む前記方法：
（ｉ）対応する改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを細胞に発現させること、ここで前記改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドは前記天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのアミノ酸配列からなり、ここでＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２から５８までのいずれか一つに示された配列を有する前記天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのＣ−末端トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの１以上のアミノ酸残基は置換されているか、または欠失する；および；
（ｉｉ）（ａ）天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドの活性に拮抗する能力を試験される化合物；および（ｂ）前記天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドの既知の基質化合物の存在下で細胞をインキュベートすること；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）と別の試料において、前記基質化合物の存在下で細胞をインキュベートすること；および
（ｉｖ）（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の基質化合物のエフラックスを比較すること、ここで（ｉｉｉ）に比べて（ｉｉ）の低下したエフラックスは、試験される化合物が前記天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。
【請求項１５８】
既知の基質が以下のものからなる群から選択される、請求項１５７の方法：ロイコトリエンＣ４（ＬＴＣ４）；ビリルビン；モノグルクロノシルビリルビン；ビスグルクロノシルビリルビン；ロイコトリエンＤ４（ＬＴＤ４）；１，３−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン；モノ−クロロビマン（チオライト）；７−クロロ−４−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール；１７β−グルクロノシルエストラジオール；３α−スルファトリソコリルタウリン；フルオ−３；グルタチオンジスルフィド；ｐ−アミノヒプレート；ジゴキシン；パクリタキセル；ベラパミル；ビンブラスチン；ホスファチジルコリン；短鎖ホスファチジルコリン類似体；［α−３２Ｐ］８−アジド−ＡＴＰ；［α−３２Ｐ］ＡＴＰ；［３Ｈ］ベラパミル；アジドチミジンモノホスフェート；９−（２−ホスホニルメトキシエチル）アデニン（ＰＭＥＡ）；６−メルカプトプリン；ｃＡＭＰ；ｃＧＭＰ；シルデナフィル（Ｐｆｉｚｅｒ）；トレキンシン（Ｓｉｇｍａ）；およびザプリナスト（Ｓｉｇｍａ）。
【請求項１５９】
基質が１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン；モノ−クロロビマン（チオライト）；７−クロロ−４−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール；）６−メルカプトプリン；およびパクリタキセルからなる群から選択される、請求項１５８の方法。
【請求項１６０】
細胞がＬ１２１０細胞である、請求項１５７の方法。
【請求項１６１】
細胞がＭＤＣＫ細胞である、請求項１５７の方法。
【請求項１６２】
通常は極性細胞の頂上（細管）膜に蓄積する天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのアゴニストを同定するための方法であって、以下のことを含む前記方法：
（ｉ）対応する改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを細胞に発現させること、ここで前記改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドは前記天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのアミノ酸配列からなり、ここでＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２から５８までのいずれか一つに示された配列を有する前記天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのＣ−末端トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの１以上のアミノ酸残基は置換されているか、または欠失する；および；
（ｉｉ）（ａ）天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドの活性を作動する能力を試験される化合物；および（ｂ）前記天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドの既知の基質化合物の存在下で細胞をインキュベートすること；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の別の試料において、前記基質化合物の存在下で細胞をインキュベートすること；および
（ｉｖ）（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の基質化合物のエフラックスを比較すること、ここで（ｉｉｉ）に比べて（ｉｉ）の促進されたエフラックスは、試験される化合物が前記天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのアゴニストであることを示す。
【請求項１６３】
既知の基質が以下のものからなる群から選択される、請求項１６２の方法：ロイコトリエンＣ４（ＬＴＣ４）；ビリルビン；モノグルクロノシルビリルビン；ビスグルクロノシルビリルビン；ロイコトリエンＤ４（ＬＴＤ４）；１，３−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン；モノ−クロロビマン（チオライト）；７−クロロ−４−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール；１７β−グルクロノシルエストラジオール；３α−スルファトリソコリルタウリン；フルオ−３；グルタチオンジスルフィド；ｐ−アミノヒプレート；ジゴキシン；パクリタキセル；ベラパミル；ビンブラスチン；ホスファチジルコリン；短鎖ホスファチジルコリン類似体；［α−３２Ｐ］８−アジド−ＡＴＰ；［α−３２Ｐ］ＡＴＰ；［３Ｈ］ベラパミル；アジドチミジンモノホスフェート；９−（２−ホスホニルメトキシエチル）アデニン（ＰＭＥＡ）；６−メルカプトプリン；ｃＡＭＰ；ｃＧＭＰ；シルデナフィル（Ｐｆｉｚｅｒ）；トレキンシン（Ｓｉｇｍａ）；およびザプリナスト（Ｓｉｇｍａ）。
【請求項１６４】
基質が１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン；モノ−クロロビマン（チオライト）；７−クロロ−４−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール；）６−メルカプトプリン；およびパクリタキセルからなる群から選択される、請求項１６３の方法。
【請求項１６５】
細胞がＬ１２１０細胞である、請求項１６２の方法。
【請求項１６６】
細胞がＭＤＣＫ細胞である、請求項１６２の方法。
【請求項１６７】
通常は極性細胞の頂上（細管）膜に蓄積する天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのモジュレーターを同定するための方法であって、以下のことを含む前記方法：
（ｉ）対応する改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを細胞に発現させること、ここで前記改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドは前記天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのアミノ酸配列からなり、ここでＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２から５８までのいずれか一つに示された配列を有する前記天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのＣ−末端トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの１以上のアミノ酸残基は置換されているか、または欠失する；および；
（ｉｉ）１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンの存在下で細胞をインキュベートすること；
（ｉｉｉ）（ａ）天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドの活性を調節する能力を試験される化合物の存在下で（ｉｉ）の細胞をインキュベートすること；および
（ｉｖ）（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の２，４−ジニトロ−フェニルグルタチオン（ＤＮＰ−ＧＳ）のエフラックスを比較すること、ここで（ｉｉｉ）に比較した（ｉｉ）の増大したエフラックスは、試験される化合物が前記天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのアゴニストであることを示し、ここで（ｉｉｉ）に比較した（ｉｉ）の低下したエフラックスは、試験される化合物が前記天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。
【請求項１６８】
細胞がＬ１２１０細胞である、請求項１６７の方法。
【請求項１６９】
細胞がＭＤＣＫ細胞である、請求項１６７の方法。
【請求項１７０】
天然の細管多特異的有機アニオントランスポータ（ｃＭＯＡＴ）のモジュレーターを同定するための方法であって、以下のことを含む前記方法：
（ｉ）改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドをＬ１２１０細胞に発現させること、ここで前記改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドは天然のｃＭＯＡＴポリペプチドのアミノ酸配列を含み、ここでＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２またはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５３またはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５５に示された配列を有する前記天然のｃＭＯＡＴのＣ−末端トリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの１以上のアミノ酸残基は置換されているか、または欠失する；
（ｉｉ）１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンの存在下で細胞をインキュベートすること；
（ｉｉｉ）（ａ）天然のｃＭＯＡＴポリペプチドの活性を調節する能力が試験される化合物の存在下で（ｉｉ）の細胞をインキュベートすること；および
（ｉｖ）（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の２，４−ジニトロ−フェニルグルタチオン（ＤＮＰ−ＧＳ）のエフラックスを比較すること、ここで（ｉｉｉ）に比較した（ｉｉ）の増大したエフラックスは、試験される化合物が前記天然のｃＭＯＡＴポリペプチドのアゴニストであることを示し、ここで（ｉｉｉ）に比較した（ｉｉ）の低下したエフラックスは、試験される化合物が前記天然のｃＭＯＡＴポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。
【請求項１７１】
前記改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドが：
（ｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４からなる配列；
（ｉｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６を含む配列；
（ｉｉｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０を含む配列；および
（ｉｖ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６を含む配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１７０の方法。
【請求項１７２】
天然のＭＤＲ３ポリペプチドのモジュレーターを同定するための方法であって、以下のことを含む前記方法：
（ｉ）改変されたＭＤＲ３ポリペプチドをＬ１２１０細胞に発現させること、ここで前記改変されたＭＤＲ３ポリペプチドはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４９のアミノ酸配列からなる；
（ｉｉ）［３Ｈ］パクリタキセルの存在下で細胞をインキュベートすること；
（ｉｉｉ）（ａ）天然のＭＤＲ３ポリペプチドの活性を調節する能力が試験される化合物の存在下で（ｉｉ）の細胞をインキュベートすること；および
（ｉｖ）（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の［３Ｈ］パクリタキセルのエフラックスを比較すること、ここで（ｉｉｉ）に比較した（ｉｉ）での増大したエフラックスは、試験される化合物が前記天然のＭＤＲ３ポリペプチドのアゴニストであることを示し、ここで（ｉｉｉ）に比較した（ｉｉ）の低下したエフラックスは、試験される化合物が前記天然のＭＤＲ３ポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。
【請求項１７３】
天然のＭＲＰ４ポリペプチドのモジュレーターを同定するための方法であって、以下のことを含む前記方法：
（ｉ）改変されたＭＲＰ４ポリペプチドをＬ１２１０細胞に発現させること、ここで前記改変されたＭＲＰ４ポリペプチドはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５１のアミノ酸配列からなる；
（ｉｉ）６−メルカプトプリンの存在下で細胞をインキュベートすること；
（ｉｉｉ）（ａ）天然のＭＲＰ４ポリペプチドの活性を調節する能力が試験される化合物の存在下で（ｉｉ）の細胞をインキュベートすること；および
（ｉｖ）（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の６−チオ−ＩＭＰのエフラックスを比較すること、ここで（ｉｉｉ）に比較した（ｉｉ）での増大したエフラックスが、試験される化合物が前記天然のＭＲＰ４ポリペプチドのアゴニストであることを示し、ここで（ｉｉｉ）に比較した（ｉｉ）の低下したエフラックスが、試験される化合物が前記天然のＭＲＰ４ポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は一般に、細胞、組織、器官および生物全体の薬物耐性を調節することができる新規蛋白質に関する。より具体的には、本発明は通常は極性細胞の細管（頂上）膜に局在するＡＴＰ‐結合カセットトランスポーター（これ以後、“ＡＢＣポンプ”または“ＡＢＣトランスポータ”）ポリペプチドのいくつかの改変された形状を提供し、ここでそれらは１以上の薬物、抗生物質、または他の化合物の輸送またはエフラックスを調節し、ここで本発明の改変されたＡＢＣトランスポータは極性細胞の基底外側膜に局在するか、または非極性細胞の細胞膜に蓄積する。いくつかの改変された細管多特異的有機アニオントランスポータ（ｃａｎａｌｉｃｕｌａｒ ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｒｇａｎｉｃ ａｎｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ： ｃＭＯＡＴ）ポリペプチド（当技術分野で“ＭＲＰ２”としても既知）、改変されたＭＤＲ３ポリペプチド、および改変されたＭＲＰ４ポリペプチドは本明細書で例示され、それらは上記ポリペプチドの非改変形に比べ、細胞膜内に異なって発現されるか、または局在することができる。本発明の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドはさらに抗生物質、化学療法剤、および抗真菌化合物を含む範囲の化合物に対する細胞の耐性を調節することが可能であり、したがって本発明は明らかに、（ｉ）細胞に多剤耐性表現型を誘導する；および（ｉｉ）化学療法および他の適用中に極性および非極性細胞を保護するために、本発明の単離された、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドおよび同じものをコードするヌクレオチド配列の両方の使用に拡大する。また、本発明の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドはとりわけ、ＡＢＣトランスポータポリペプチドの活性を調節する化合物（すなわち、アゴニストまたはアンタゴニスト）のスクリーニング、または具体的な化合物のエフラックスが特定のＡＢＣトランスポータポリペプチドにより調節されるかどうかを決定するために有用である。ハイスループットスクリーニングプロトコルが本明細書に記載される。本発明は改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドおよび同じものを含む遺伝子構築物をコードする単離された核酸を提供する。
【０００２】
一般的事項
本明細書は、本明細書の末尾に提示される、プログラムＰａｔｅｎｔｌｎ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　３．１を使用して作製されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列情報を含む。それぞれのヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、数字見出し＜２１０＞続いて配列番号（たとえば＜２１０＞１，＜２１０＞２など）により表わされた配列で識別される。それぞれのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の長さ、配列の型（ＤＮＡ、蛋白質（ＰＲＴ）など）および供与源生物は、数字見出し＜２１１＞、＜２１２＞および＜２１３＞の項目で提供される情報によりそれぞれ示される。本明細書で表されるヌクレオチドまたはアミノ酸配列は“ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：”とその後の識別番号により説明される。たとえば、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１は＜４００＞１で示される数字見出しに提供される情報を表す。
【０００３】
分類のために、ヒトの天然のｃＭＯＡＴをコードする遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１で示され、そして対応するアミノ酸配列はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２で示される。また、天然のｃＭＯＡＴのＣ−末端部分はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３７で提示される。
【０００４】
第１の改変されたｃＭＯＡＴをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３で示され、そして対応するアミノ酸配列はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４で示される。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４のアミノ酸配列は、本発明のΔｃＭＯＡＴポリペプチド（本明細書で“ΔＴ１５４３ΔＫ１５４４ΔＦ１５４５”とも呼ばれる）に対応し、そのＣ−末端部分はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４４に提示される。
【０００５】
第２の改変されたｃＭＯＡＴをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５で示され、そして対応するアミノ酸配列はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６で示される。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６のアミノ酸配列は、本発明のＴ１５４３ＡＫ１５４４ＰＦ１５４５Ｖポリペプチドに対応し、そのＣ−末端部分はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３８に提示される。
【０００６】
第３の改変されたｃＭＯＡＴをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７で示され、そして対応するアミノ酸配列はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８で示される。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８のアミノ酸配列は、本発明のＳ１５４２Ａポリペプチドに対応し、そのＣ−末端部分はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３９に提示される。
【０００７】
第４の改変されたｃＭＯＡＴをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９で示され、そして対応するアミノ酸配列はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０で示される。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０のアミノ酸配列は、本発明のＴ１５４３Ａポリペプチドに対応し、そのＣ−末端部分はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０に提示される。
【０００８】
第５の改変されたｃＭＯＡＴをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１で示され、そして対応するアミノ酸配列はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２で示される。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２のアミノ酸配列は、本発明のＫ１５４４Ａポリペプチドに対応し、そのＣ−末端部分はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４１に提示される。
【０００９】
第６の改変されたｃＭＯＡＴをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３で示され、そして対応するアミノ酸配列はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４で示される。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４のアミノ酸配列は、本発明のＦ１５４５Ａポリペプチドに対応し、そのＣ−末端部分はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４２に提示される。
【００１０】
第７の改変されたｃＭＯＡＴをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５で示され、そして対応するアミノ酸配列はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６で示される。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６のアミノ酸配列は、本発明のＴ１５４３Ａ　Ｋ１５４４Ａ　Ｆ１５４５Ａポリペプチドに対応し、そのＣ−末端部分はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４３に提示される。
【００１１】
改変されたＭＤＲ３をコードする遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４８に示され、Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフを欠失する（たとえば末端の４アミノ酸配列が欠失している）、本発明の改変されたヒトＭＤＲ３ポリペプチドの対応するアミノ酸配列はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４９に提示される。改変されたＭＤＲ３をコードする配列は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５９およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６０で示されたプライマー配列を使用して、天然のヒトＭＤＲ３ｃＤＮＡから増幅される。
【００１２】
改変されたＭＲＰ４をコードする遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５０に示され、Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフを欠失する（たとえば末端の３アミノ酸配列が欠失している）、本発明の改変されたヒトＭＲＰ４ポリペプチドの対応するアミノ酸配列はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５１に提示される。改変されたＭＲＰ４をコードする配列は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６１およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６２で示されたプライマー配列を使用して、天然のヒトＭＲＰ４ｃＤＮＡから増幅される。
【００１３】
本明細書で表されるヌクレオチド残基の名称は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨されたものであり、Ａはアデニンを表し、Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表し、Ｔはチミンを表し、Ｙはピリミジン残基を表し、Ｒはプリン残基を表し、Ｍはアデニンまたはシトシンを表し、Ｋはグアニンまたはチミンを表し、Ｓはグアニンまたはシトシンを表し、Ｗはアデニンまたはチミンを表し、Ｈはグアニン以外のヌクレオチドを表し、Ｂはアデニン以外のヌクレオチドを表し、Ｖはチミン以外のヌクレオチドを表し、Ｄはシトシン以外のヌクレオチドを表し、そしてＮは任意のヌクレオチド残基を表す。
【００１４】
任意の１以上の先行技術文書を含む、先行技術に関する本明細書の参考文献は謝辞、または提言として受け入れるべきではなく、上記の先行技術はオーストラリアにおける共通の一般的な知識であるか、またはオーストラリアにおける共通の一般的な知識の一部である。
【００１５】
本明細書を通して、特記しない限り、“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）”という用語、または“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）”もしくは“含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”のような変形は、述べられた段階もしくは要素もしくは完全体、または段階もしくは要素もしくは完全体の群の包含を意味し、任意の他の段階もしくは要素もしくは完全体、または要素もしくは完全体の群の排除を意味しない。
【００１６】
本明細書で使用する“から由来する”という用語は、必ずしも直接具体的な供与源からではなくても、明示された完全体がその供与源から得られることを示すと理解すべきである。
【００１７】
当業者は、本明細書に記載された発明が具体的に記載されたもの以外の変更および修正を受けてもよいことを認識するであろう。本発明はそのような変更および修正を包含すると理解すべきである。また、本発明は個々にまたは全体的に本明細書に表されるか、または示された段階、特徴、組成物および化合物のすべてを包含する。
【００１８】
本発明は、例示だけを目的とした、本明細書に記載された具体的な態様により範囲を限定されるべきではない。本明細書に記載した機能的に等価の生成物、組成物および方法は明らかに本発明の範囲内である。
【００１９】
発明の背景
細菌感染、真菌感染の治療、およびより具体的には各種腫瘍および／または癌の治療はしばしば、ケモトキシンおよび／またはケモスタティック（ｃｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ）化合物（たとえば、ビンカアルカロイド、シスプラチン、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｐｈａｎ）（ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ））、硫酸ビンクリスチン、メルクロルエタン（ｍｅｒｃｈｌｏｒｅｔｈａｎｅ）、エトポシドを含む各種抗癌化学療法剤のような、腫瘍を殺すか、またはその増殖を阻害する化合物）の投与；および、たとえば各種抗生物質のような、宿主細胞および／または侵入する病原体を殺す各種化合物の投与を含む。細胞毒性物質の大部分は細胞周期を通じてより速やかに動く細胞、たとえば定常期または停止期には存在しない細菌、または大きな増殖部分を有する腫瘍に対してより効果的である。
【００２０】
腫瘍細胞への薬物の輸送（すなわちインフラックス）、およびその後のエフラックスは、化学療法剤のような任意の薬剤の効力を支配する重要な因子である。
たとえば投与された薬物に対する多剤耐性（ＭＤＲ）または他面発現耐性を含む、薬物動態学的および／または生化学的耐性が、徐々に発生することがある。化合物の存在下で生き残る、成長する、または増殖する、細胞、細胞群、組織、器官、または生物の能力は“耐性”により表される。したがって、“耐性”細胞は上記の化合物の存在下で生き残る、そして好ましくは成長および／または増殖する能力を有する。
【００２１】
今後、特記しない限り、“薬物耐性”という用語はＭＤＲの現象を含む、薬物動態学的耐性および／または生化学的耐性を意味すると理解すべきである。
薬物耐性は一般に、標的細胞、組織、器官または生物における低濃度の薬物に関連する。これは、薬物の減少した細胞内蓄積、および／または不完全な輸送、および／または減少した吸収、および／または変化した薬物分布、および／または薬物の生体内変化、および／または投与部位からの薬物の促進された排出および／または作用のためである。薬物耐性の発生は、そのようなケモトキシンおよび／またはケモスタティック化合物、たとえば各種抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、および化学療法剤、とりわけ、アントラサイクリン、エピポドフィロトキシン、およびビンカアルカロイドによる、ヒトおよび動物における多くの状態の成功した治療における主な障害である。
【００２２】
抗癌治療の場合、薬物耐性が反応性の腫瘍をもはや化学療法に反応しない耐性腫瘍に変換させてしまう。
一方、たとえば癌または病原物質による感染のような疾患の治療中に、細胞分裂阻止および／または細胞毒性化合物からある細胞、組織、および器官を保護することも所望される。それらの細胞、組織および器官における薬物耐性の獲得は非常に望ましい成り行きである。たとえば、化学療法中の造血系の保護は何人かの癌患者の生存の可能性を高めるかもしれない。当然、そのような場合、保護をするためには細胞からの薬物のエフラックスを最大にすることが重要である。
【００２３】
したがって、薬物耐性は効果的な治療を妨害することが可能である。
各種薬物耐性細胞系統、たとえば、複数の薬物に耐性の齧歯類細胞系統、およびヒトＫＢ癌細胞系統（ＨｅＬａサブクローン）由来の多剤耐性（ＭＤＲ）系統が同定されている。これらの系統はコルヒチン、ビンブラスチン、またはアドリアマイシンに対する耐性に関して選択された（たとえば、Ｋａｒｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２１，１２８５−１２８８；Ａｋｉｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８５）Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１１，１１７−１２６；Ｓｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，（Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６１，７７６２−７７７０；Ｓｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３２：６４３−６４５；およびＳｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６，４０３９−４０４４を参照されたい）。
【００２４】
細胞の耐性に関与する細胞膜を通る薬物のエフラックスは、１以上の特定の膜輸送体により媒介される（Ｃｏｌｅ　ａｎｄ　Ｄｅｅｌｅｙ（１９９８）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ　２０，９３１−９４０；Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２９，６０７−６４９；Ｈｉｇｇｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ（１９９２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．８，６７−１１３）。これらの膜輸送体はいわゆるＡＴＰ‐結合カセット（ＡＢＣ）トランスポータのスーパーファミリーに属する。
【００２５】
たとえば、肝細胞、神経細胞、および免疫系のある細胞のような培養または初代上皮細胞は特徴的な極性表現型を維持する。血漿蛋白質の大部分は、培養または初代上皮細胞の頂上（細管）または基底外側膜ドメインのいずれかへのそれらの分布に基づいて識別可能である。これらの細胞の両方の膜ドメイン表面上に等しく分布する蛋白質はほとんど同定されていない（Ｍｅｌｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉ．Ｓｕｐｐｌ．１７，１−７）。ＡＢＣトランスポータは一般にそのような極性細胞の基底外側膜を目標にする（たとえば、ＭＲＰ１、ＭＲＰ３、およびＭＲＰ６）。あるいは、ＡＢＣトランスポータは頂上（細管）膜を標的にしてもよい［たとえば、多剤耐性‐関連蛋白質２（ＭＲＰ２）としても既知の細管多特異的有機アニオントランスポータ（ｃＭＯＡＴ）、Ｐ‐糖蛋白質（Ｐ‐ｇｐ）トランスポータおよびその相同体（たとえばＭＤＲ２，ＭＤＲ３）、およびＭＲＰ４］。
【００２６】
ＡＢＣトランスポータの基質は、両親媒性有機カチオンおよびアニオンである傾向がある。
当業者は、ＡＢＣトランスポータが、たとえば４−ＮＱＯ、ソルビン酸、ケトコナゾール、エコナゾール、オリゴマイシン、アンチマイシン、パロモマイシン、コルヒチン、ビンブラスチン、およびアドリアマイシンのような広範囲の化合物の輸送を担うことを知っているであろう。
【００２７】
多くの病原微生物、たとえば鵞口瘡カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）およびマラリヤ原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｕｍ）は投与された治療薬の毒性を回避するか、またはさもなければ耐性を発現するためにＡＢＣトランスポータ媒介薬物エフラックス機序を使用することができるということも示されている（Ｃｏｗｍａｎ　ａｎｄ　Ｆｏｏｔｅ（１９９０）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．２０，５０３−５１３；Ｆｏｏｔｅ　ｅｔ　ａｌ（１９８９）Ｃｅｌｌ　５７，９２１−９３０；Ｐｒａｓａｄ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２７，３２０−３２９；Ｓａｎｇｌａｒｄ　ｅｔ　ａｌ（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９，２３７８−２３８６）。
【００２８】
Ｐ−ｇｐ、ＭＲＰ１、ＭＲＰ２（ｃＭＯＡＴ）、ＭＲＰ３、ＭＲＰ４、ＭＲＰ５，ＭＲＰ６、ＭＤＲ２，およびＭＤＲ３蛋白質はすべてＡＴＰを必要とするエネルギー依存的機序により細胞から薬物を排出する膜局在蛋白質である。肝臓では、Ｐ−ｇｐ、ＭＲＰ２（ｃＭＯＡＴ）、ＭＲＰ４、ＭＤＲ３は少なくとも、頂上（細管）膜を横切ってある範囲の有機化合物を胆汁に輸送する。非極性細胞では、ＭＲＰ２（ｃＭＯＡＴ）は細胞内小胞に蓄積し、細胞膜にはこの蛋白質の蓄積はほとんど見られなかった（Ｈａｒｒｉｓ　ｅｔ　ａｌ（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ　２４，２０８７６−２０８８１）。これらのいわゆる“頂上”ＡＢＣトランスポータ蛋白質と対照的に、ＭＲＰ１、ＭＲＰ３、およびＭＲＰ６蛋白質は通常極性細胞の基底外側（洞様）膜で機能する。ＡＢＣトランスポータの増大した活性が、それらが発現されるすべての細胞における具体的な薬物の細胞内蓄積を低下させ、細胞は投与された薬物に耐性を生じることになる。
【００２９】
いくつかのヒトＰ−糖蛋白質（Ｐ−ｇｐ）、たとえばＭＤＲ１，ＭＤＲ２，
およびＭＤＲ３が同定されている。これらの蛋白質をコードする遺伝子はハムスターｍｄｒ遺伝子に相同である（たとえば、Ｒｏｎｉｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ，３０９，６２６−６２８；Ｇｒｏｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ　３２３，７２８−７３１およびＧｒｏｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，３３７−３４１を参照されたい）。ＭＤＲ１およびＭＤＲ２蛋白質は多剤耐性ヒトＫＢ癌細胞系統に発現される（Ｆｏｊｏ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２，７６６１−７６６５；Ｒｏｎｉｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８３，４５３８−４５４２）。ＭＤＲ１遺伝子は高度な薬物耐性細胞系統のすべて（Ｒｏｎｉｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８３，４５３８−４５４２；Ｓｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１，７７６２−７７７０；Ｓｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３２：６４３−６４５；ａｎｄ　Ｓｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６，４０３９−４０４４）、およびある正常および腫瘍組織（Ｆｏｊｏ　ｅｔ　ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４，２６５−２６９）において過剰発現される、４．５‐Ｋｂ　ｍＲＮＡをコードする。さらに、Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ　４７，３８１−３８９はヒトＭＤＲ１　ｍＲＮＡの全コード領域に関する１組の重複ｃＤＮＡｓの単離を記載している。またヒトＭＤＲ１遺伝子は、薬物耐性ヒト細胞に由来するゲノムＤＮＡを使用して薬物耐性表現型に形質転換されているマウス細胞に高レベルで発現される。この発見は、ＭＤＲ１遺伝子の発現がＭＤＲ表現型の発生に関与可能なことを示唆する（Ｓｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６１，７７６２−７７７０；Ｓｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３２：６４３−６４５；およびＳｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６，４０３９−４０４４）。数人の別の研究者が、単離された細胞に多剤耐性を与える、単離され、そして発現されたマウスｍｄｒ遺伝子の能力を記載している（Ｇｒｏｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，３３７−３４１；Ｇｒｏｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ　３２３，７２８−７３１；Ｕｅｄａ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，５０５−５０８）。
【００３０】
天然のＰ−糖蛋白質は大部分の正常組織には見られないが、哺乳動物の各種組織、たとえば腎臓、肝臓、小腸、結腸、子宮分泌上皮、および副腎が誘導型のＰ−ｇｐを発現することが見出されている。極性細胞、たとえば尿細管または小腸粘膜におけるそのような細胞、肝臓、および膵臓において、Ｐ−ｇｐは分極した様式で発現され、そして管腔刷子縁に局在する。したがって、Ｐ−ｇｐは腎臓の近位尿細管細胞の頂上表面、腸上皮細胞の頂上表面、膵臓の小管の頂上表面および肝細胞の２面上に局在する。副腎細胞においてだけ、Ｐ−ｇｐは膜に均一に分布する。Ｐ−ｇｐの正常な機能は十分に証明されていないが、細胞から毒性物質を除去できることが知られている（Ｇａｔｍａｉｔａｎ　ａｎｄ　Ａｒｉａｓ（１９９３）Ａｄｖ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　２４：７７−９７）。
【００３１】
Ｐ−ｇｐはｉｎ　ｖｉｖｏでリン酸化され、そして初期の研究は、Ｐ−ｇｐのリン酸化状態の変化は哺乳動物細胞の相対的薬物耐性の差に関連していることを証明し、リン酸化機序が薬物トランスポータのエフラックス活性の調節に関与するかもしれないことを示唆する（Ｃｅｎｔｅｒ（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１１５，１５９−１６６；Ｈａｍａｄａ　ｅｔ　ａｌ（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４７，２８６０−２８６５）。
【００３２】
Ｐ−ｇｐ媒介薬物耐性は、Ｐ−ｇｐの輸送機能を阻害するＰ−ｇｐモジュレーターまたはアンタゴニストの投与によりある程度改善され、患者に投与された化学療法剤を蓄積させるであろう。しかし、Ｐ−ｇｐモジュレーターは患者の造血系の同時保護および抗癌治療のための組合せ療法、とりわけＭＤＲ１が造血細胞において異所性に発現され、そして化学療法剤およびＰ−ｇｐモジュレーターが腫瘍形成を阻害または予防するために投与される場合、有用ではない。これはＰ−ｇｐモジュレーターが内在性Ｐ−ｇｐ活性を阻害することに加え、異所性に発現されたＭＤＲ１蛋白質の活性を阻害するためである。
【００３３】
ｃＭＯＡＴトランスポータ活性は、正常ラットと細管輸送活性を欠如する変異体（ＴＲ／ＧＹ）とを比較することにより、はじめに肝細胞において特徴付けられた（Ｏｕｄｅ　Ｅｌｆｅｒｉｎｋ，ｅｔ　ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ．１２４１，２１５−２６８）。Ｅｖｅｒｓ，Ｒ．，ｅｔ　ａｌ．（Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ．（１９８８）１０１，１３１０−１３１９）は、ｃＭＯＡＴをコードするｃＤＮＡを発現する極性腎ＭＤＣＫ細胞において組換えｃＭＯＡＴ蛋白質の薬物輸送活性が主に頂上膜に限定されることを証明した。その後、免疫染色もｃＭＯＡＴ蛋白質が主に肝細胞の頂上膜において発現されることを明らかにした（Ｋｏｎｉｇ　ｅｔ　ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ．１４６１，３７７−３９４）。
【００３４】
また本発明者らは、天然のｃＭＯＡＴは非極性細胞の細胞膜には蓄積できないことを見い出した（Ｈａｒｒｉｓ　ｅｔ　ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ　２４，２０８７６−２０８８１）。この発現パターンのため、天然のｃＭＯＡＴポリペプチドがたとえば造血系のある細胞のような非極性細胞に薬物耐性を与えることはほとんどない。
【００３５】
化学療法剤に暴露された腫瘍では、天然のＭＲＰ１トランスポータ活性が増大し、それにより腫瘍細胞に獲得耐性を与える（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８９）Ｊ　Ｎａｔｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．８１，１１６−１２４；Ｓｌａｐａｋ，Ｃ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．（１９９４）Ｂｌｏｏｄ　８４，３１１３−３１２１）。
【００３６】
リン酸化がＳ．セレビジアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｙｃｆ１蛋白質の活性を調節すると提案されている。Ｙｃｆ１は酵母細胞の液胞膜上に位置するヒトＭＲＰ１のオルトログである（Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，３３４４９−３３４５４；Ｓｚｃｚｐｋａ　ｅｔ　ａｌ（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２２８５３−２２８５７）。
【００３７】
非小細胞肺癌の治療のような癌細胞の治療では、化学療法剤に関するＭＲＰ１媒介薬物耐性は獲得されない。むしろ、耐性は治療の最初に発生し（すなわち固有耐性）、ＭＲＰ１蛋白質の高い構成性レベルの発現を示唆する（Ｚａｍａｎ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５３，１７４７−１７５０）。結果として、進行した腫瘍、再発した腫瘍、または固有のＭＲＰ１媒介耐性を示す腫瘍を有する患者の治療には、しばしば高用量の化学療法剤（複数の化学療法剤）を必要とする。そのような高投与量計画の潜在的利点は一般に、使用された細胞毒性化学療法剤により誘発される、骨髄細胞の破壊を含む骨髄抑制により一般に相殺されるか、または損なわれる。
【００３８】
化学療法剤の細胞毒性作用からの骨髄の保護はマウスモデルにおいて試みられてきた。たとえば、ＭＤＲ１はマウス骨髄細胞において異所性に発現されている。しかし、そのような方法では骨髄増殖性症候群がマウスに現れ、ある造血系統の細胞が分化し、異常に増殖する（Ｂｕｎｔｉｎｇ，Ｋ．Ｄ．ｅｔ　ａｌ．，（１９９８）Ｂｌｏｏｄ　９２，２２６９−２２７９）。
【００３９】
発明の概要
本発明の結果に至った研究において、本発明者らは改善された治療方法を提供し、および／または造血系に対する薬物の有害な副作用を軽減するために、ＡＢＣトランスポータポリペプチドにより媒介される薬物耐性を調節するための新規手段を同定しようと試みた。本発明者らは極性および非極性細胞の細胞膜において新しい分布特性を有する改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを生み出している。これらの新規分布特性は、遺伝子技術および慣例の薬物投与方法の両方を含む組合せ療法の使用を含む、遺伝子治療による細胞の治療を促進する。
【００４０】
より具体的には、本発明は主に基底外側（洞様）膜に移行するか、または非極性細胞の細胞膜に局在することができる、改変されたｃＭＯＡＴ、ＭＤＲ３およびＭＲＰ４ポリペプチドを含む、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを提供する。したがって改変されたポリペプチドは、対応する天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドに比べ驚くべき、そして新しい蓄積を示す。
【００４１】
好ましくは、本発明の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドは、活性ＡＢＣトランスポータポリペプチドのＣ−末端領域の少なくとも１アミノ酸残基が置換されているか、または欠失している突然変異を含む、上記活性ＡＢＣトランスポータポリペプチドからなる。
【００４２】
別の態様において、本発明の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドは活性ＡＢＣトランスポータポリペプチドに存在するトリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの少なくとも１アミノ酸残基が置換されているか、または欠失している突然変異を含む、上記活性ＡＢＣトランスポータポリペプチドからなる。
【００４３】
本明細書に記載の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドの新規局在パターンは、細胞からのあるリガンド薬物のエフラックスを促進し、それに対して耐性を与える。本発明は明らかに、新規の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドの作用様式と一致した、本明細書に記載されたそのようなポリペプチドの任意の、およびすべての使用に拡大する。
【００４４】
とりわけ、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドは細胞上の１以上の化合物に耐性を与える。たとえば、耐性は感染または疾病の治療に使用される細胞分裂阻止または細胞毒性化合物に与えられる。より具体的には、細胞毒性または細胞分裂阻止化合物による患者の治療中に非極性細胞（たとえば造血系の細胞）の保護が必要な場合、改変されたポリペプチドが有用である。
【００４５】
実際、本発明の改変されたＡＢＣトランスポータは、基底外側膜からのエフラックスを促進することにより、通常は極性細胞の頂上に局在するＡＢＣトランスポータにより代謝される任意の医薬品に対して耐性を与えるために有用である。
【００４６】
あるいは、またはさらに、本発明の改変されたＡＢＣトランスポータは細胞膜からのエフラックスを促進することにより、非極性細胞に新規に耐性を与えるために有用である。本明細書に例示されるとりわけ好ましい態様において、改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドをＬ１２１０細胞に異所性に発現させることにより、ブスルファンに対する耐性がその細胞に与えられる。
【００４７】
この与えられた耐性の結果として、化学ライブラリーをスクリーニングし、それによって他の方法では臨床試験または使用前に同定することができないであろう新規細胞毒を同定することにより、改変されたＡＢＣトランスポータを初期の段階で任意の毒性物質を同定するために使用することができる。いったん同定されれば、所望する作用（たとえば毒性）を得るために、具体的な細胞型または遺伝的背景に対して任意の医薬品の適切な投与レベルが容易に決定される。
【００４８】
さらに、本発明の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドは異種のＡＢＣトランスポータのモジュレーターと組合せて使用される。
さらに、本発明の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドはＡＢＣトランスポータ活性、基質特異性、薬物代謝、または薬物輸送をアッセイするための新規細胞系統を開発するために使用される。
【００４９】
上記のアッセイはとりわけ、ＡＢＣトランスポータ活性を調節する新規医薬品の同定に適する。したがって、本発明の別の側面はＡＢＣトランスポータポリペプチドの新規アゴニストおよびアンタゴニストの発見のための簡単で確かな、ｉｎ　ｖｉｖｏスクリーニング系を企図する。さらに、スクリーニング系はあるＡＢＣトランスポータによるエフラックスが具体的な薬物の代謝における重要な経路であるかどうかを確かめるために使用することができる。
【００５０】
本発明の別の側面は、本発明の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を提供する。好ましくは、核酸分子は細菌細胞、酵母、真菌細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞にその発現を促進するためのプロモータ配列に操作可能に結合する。
【００５１】
本発明のこの態様に従った遺伝子構築物は、細胞、とりわけ非極性細胞に新規薬物耐性を与えるため、あるいは細胞から特定の薬物を輸送するためにとりわけ有用である。したがって、本発明の別の態様は、対象遺伝子構築物を含み、本発明の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現する細胞を提供する。
【００５２】
とりわけ好ましい態様において、一般に細胞膜内に改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現する非極性細胞（たとえば線維芽細胞または造血系の細胞）が産生され、そこでは上記トランスポータは細胞からのあるリガンド薬物のエフラックスにおいて機能し、それに耐性を与える。
【００５３】
あるいは、主に基底外側膜に改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現する極性細胞（たとえば、ＭＤＣＫもしくはＣａｃｏ−２細胞のような培養した上皮細胞、または肝細胞、腸細胞もしくは海馬ニューロンのような初代上皮細胞）が産生される。
【００５４】
本発明の別の側面は、極性細胞の頂上膜へのポリペプチドの効率的な移動またはトランスサイトーシスを促進するための輸送シグナルペプチドを企図する。
【００５５】
好ましい態様の詳細な説明
本発明の一側面は、対応する天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドに比較して、細胞膜において新しい分布をする改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを提供する。
【００５６】
先の記載から、ＡＢＣトランスポータポリペプチドは極性および非極性細胞の頂上膜内に異なった局在をしてもよいことは明らかであろう。たとえば、天然のｃＭＯＡＴ、天然のＭＲＰ４，天然のＰ−ｇｐ、および天然のＰ−ｇｐ相同体（ＭＤＲ２およびＭＤＲ３）は一般に、肝細胞のような極性細胞の頂上膜ドメインに見出される。したがって、天然のトランスポータは細管膜を横切って有機アニオンを胆汁に輸送するように機能する。また、天然のポリペプチドは非極性細胞の細胞内に局在する。これらの頂上蛋白質とは対照的に、ヒトのＭＲＰ１、ＭＲＰ３，およびＭＲＰ６ポリペプチドは極性細胞の基底外側膜に局在する。
【００５７】
したがって、好ましい態様において、本発明は通常極性細胞の頂上膜に見出されるそれらのＡＢＣトランスポータポリペプチドの改変された形状を包含する。とりわけ好ましい態様において、本発明の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドは改変されたｃＭＯＡＴポリペプチド、改変されたＭＤＲ３ポリペプチド、または改変されたＭＲＰ４ポリペプチドである。
【００５８】
好ましくは、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドが由来する天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドは、たとえばヒト、ラット、ウサギ、またはマウスのような、ヒトまたは非ヒト哺乳動物のポリペプチドである。とりわけ好ましい態様において、ポリペプチドはヒト由来である。
【００５９】
この態様に従って、本発明の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４、６、１０、１２、１６、４８または４９のいずれか一つに提示されたアミノ酸配列からなる。上記アミノ酸配列のそれぞれの十分な説明は、本明細書の２〜４ページにとりわけ提示される。これらの改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドの作製のための方法は、本明細書に記載の例示された主題から明らかであろう。
【００６０】
本発明の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドは極性細胞の細胞膜に蓄積することが可能であるが、天然に存在する形状と比べ、本発明の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドは極性細胞の基底外側膜に主に分布することが可能である。
【００６１】
“基底外側膜に主に”とは、上記の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドの大部分が極性細胞の基底外側膜に見出されることを意味する。好ましくは、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドの約７０％以上が基底外側膜に見出され、そしてより好ましくは、約８０％以上、そしてさらにより好ましくは、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドの約９０％以上が極性細胞の基底外側膜に局在する。
【００６２】
極性細胞の型は当業者には既知であろう。これらは培養上皮細胞、たとえば、ＭＤＣＫ細胞、Ｃａｃｏ−２細胞、および肝細胞のような初代上皮細胞、ならびに腸系列、たとえば尿細管を含む腎臓、肝臓、小腸粘膜を含む小腸、肝臓、および膵臓の細胞を含む。
【００６３】
別の態様において、本発明の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドは、非極性細胞の細胞膜に蓄積する。本発明の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドは非極性細胞の細胞膜に蓄積するという本発明者らの重要な観察結果は驚くべきことで、そのような細胞の細胞膜には天然に存在する形状の検出可能な蓄積が見られないことから、予期しないことである。
【００６４】
非極性細胞の型は当業者には公知であろう。これらはたとえば、造血系を形成する非上皮細胞、およびＬ１２１０細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞のような培養細胞型を含む。
【００６５】
好ましくは、本発明の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドは、突然変異を含む活性なＡＢＣトランスポータポリペプチドからなり、ここで上記ＡＢＣトランスポータポリペプチドのＣ−末端領域の少なくとも１アミノ酸残基は置換されるか、または欠失する。
【００６６】
本明細書では、“Ｃ−末端領域”という用語または類似した用語、たとえば“Ｃ−末端”は、天然の、または天然に存在するＡＢＣトランスポータポリペプチドの少なくともＣ−末端２０アミノ酸を含む部分を意味すると理解すべきである。好ましくは、“Ｃ−末端領域”はＡＢＣトランスポータポリペプチドの少なくともＣ−末端１０アミノ酸、そしてさらにより好ましくはＡＢＣトランスポータポリペプチドの少なくともＣ−末端５アミノ酸を含む。
【００６７】
とりわけ好ましい態様において、天然に存在するＡＢＣトランスポータポリペプチドのＣ−末端領域の３アミノ酸残基を含む配列は変異するか、または欠失する。本明細書に記載の主題から明らかなように、“Ｃ−末端領域”は一般にＴ−Ｋ−Ｆモチーフを含むアミノ酸配列を含む。
【００６８】
“Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフ”という用語、または類似の用語は、極性細胞の頂上膜に通常存在するＡＢＣトランスポータポリペプチドのアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を表すと理解すべきであり、ここで上記のアミノ酸配列は以下のものからなる群から選択される：
（ｉ）スレオニン−リジン−フェニルアラニン（すなわちＴ−Ｋ−Ｆ）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２）；
（ｉｉ）スレオニン−アラニン−フェニルアラニン（すなわちＴ−Ａ−Ｆ）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５３）；
（ｉｉｉ）スレオニン−アラニン−リジン（すなわちＴ−Ａ−Ｌ）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５４）；
（ｉｖ）スレオニン−グルタミン酸−ロイシン（すなわちＴ−Ｅ−Ｌ）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５５）；
（ｖ）スレオニン−リジン−アルギニン（すなわちＴ−Ｋ−Ｒ）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５６）；
（ｖｉ）スレオニン−グルタミン−アスパラギン（すなわちＴ−Ｑ−Ｎ）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５７）；および
（ｖｉｉ）アラニン−リジン−アルギニン（すなわちＡ−Ｋ−Ｒ）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５８）。
【００６９】
この点に関して、本発明者らは先に本明細書で説明したＴ−Ｋ−Ｆモチーフが、通常極性細胞の頂上膜に主に蓄積する多数のＡＢＣトランスポータポリペプチド中に存在することを示している。また、Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフは、通常極性細胞の基底外側膜に主に蓄積するＡＢＣトランスポータのＣ−末端領域には存在しないことを理解すべきである。
【００７０】
驚くべきことに、ｃＭＯＡＴ、ＭＤＲ３、またはＭＲＰ４のＴ−Ｋ−Ｆモチーフの突然変異または欠失は、極性および非極性細胞の両方の空間的蓄積を変化させる。より具体的には、Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフの突然変異または欠失は、非極性細胞の細胞膜において、または主に極性細胞の基底外側膜において蓄積することが可能な改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを生み出す。これらの変化した蓄積のパターンは、極性および非極性細胞型の薬物耐性を修正する場合に役に立つ。
【００７１】
別の態様において、本発明の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドは突然変異を含む活性なＡＢＣトランスポータポリペプチドからなり、ここで上記の活性なＡＢＣトランスポータポリペプチド中に存在するトリペプチドＴ−Ｋ−Ｆモチーフの少なくとも１アミノ酸残基は置換されているか、または欠失している。好ましくは、Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフの少なくとも２アミノ酸残基が置換されているか、または欠失している。より好ましくは、Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフの３つすべてのアミノ酸残基が置換されているか、または欠失している。先の記載から明らかなように、そのような置換または欠失が、極性および非極性細胞の両方の細胞膜内の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドの局在を変化させる。
【００７２】
改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドは、当業者に既知のいずれかの方法により、たとえばＦｍｏｃケミストリーを使用することにより作製された合成ペプチドであってもよい。あるいは、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドは組換え手段により作製されてもよく、ここで天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドをコードする核酸は変異を誘発され、変異した配列が細胞に発現して、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを生み出す。
【００７３】
置換は、異なる慣用の、または非慣用のアミノ酸残基によりアミノ酸が置き換えられるいずれかのアミノ酸変化を包含する。本発明の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを作製するために、天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのＣ−末端領域のアミノ酸は、異なる性質を有する他の慣用の、または非慣用のアミノ酸に置換されてもよい。たとえば新規アミノ酸は、基礎となるアミノ酸に以下のものからなる群から選択される、異なる性質を加えてもよい：疎水性、親水性、疎水性モーメント、抗原性、およびα‐へリックス構造、またはβ‐シート構造を形成するか、または破壊する傾向。
【００７４】
本明細書に企図される慣用のアミノ酸残基は表１に記載される。本明細書に企図される非慣用アミノ酸残基は表２に記載される。
本発明に包含される置換は、一般に“非保存的”であろう。これは、天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドに存在するアミノ酸残基が異なる性質を有するアミノ酸により置換されることを意味する。そのような非保存的置換は、一般に異なる群のアミノ酸の基礎アミノ酸への置換を含む。たとえば、非荷電残基が荷電残基に置換されてもよく、または疎水性残基がアラニンに置換されてもよい。
【００７５】
とりわけ好ましいアミノ酸置換は、Ｓｅｒ⇔Ａｌａ；Ｔｈｒ⇔Ａｌａ；Ｌｙｓ⇔ＡｌａまたはＰｒｏ；およびＰｈｅ⇔ＡｌａまたはＶａｌからなる群から選択される。
【００７６】
アミノ酸置換は、Ｃ−末端領域内にクラスター化するか、または分散するかのいずれかの複数の残基からなっていてもよく、そして好ましくは天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのＴ−Ｋ−Ｆモチーフ内か、またはそれに直接接して位置する。したがって、Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ（すなわちＴ−Ｋ−Ｆモチーフ）のＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａへのクラスター化した置換は明らかに本発明の範囲内である。
【００７７】
アミノ酸欠失は、Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフを含むＡＢＣトランスポータポリペプチドのＣ−末端領域内の１以上のアミノ酸残基が除去される突然変異である。アミノ酸欠失は、通常約１〜１０アミノ酸残基からなる。
【００７８】
アミノ酸挿入は、ＡＢＣトランスポータポリペプチドのＣ−末端領域に１以上のアミノ酸残基が添加される突然変異であり、好ましくはＴ−Ｋ−Ｆモチーフを分離させる。
【００７９】
【表１】
2004512831.tif 000002
【００８０】
【表２】
2004512831.tif 000003
【００８１】
【表３】
2004512831.tif 000004
【００８２】
【表４】
2004512831.tif 000005
【００８３】
本発明のとりわけ好ましい態様において、ｃＭＯＡＴポリペプチド、Ｐ−ｇｐポリペプチド、ＭＤＲ３ポリペプチド、またはＭＲＰ４ポリペプチドのＣ−末端から１〜４アミノ酸残基を欠失させて、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを生み出す。あるいは、少なくとも推定Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフの第１または第２アミノ酸残基が欠失するか、または置換される。ｃＭＯＡＴに関して本明細書で例示されるように、場合によってはさらにＦ１５４５の突然変異または欠失を含む、Ｔ１５４３および／またはＫ１５４４の突然変異または欠失は、著しく蛋白質ターゲッティングを変化させる。同様に本明細書で例示されるように、ｃＭＯＡＴ、ＭＤＲ３、またはＭＲＰ４の全Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフの欠失は蛋白質の細胞局在を変化させた。
【００８４】
したがって、本発明のとりわけ好ましい態様は、実質的にＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４、６、１０、１２，１６、４８、もしくは４９のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を有する改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドからなる改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチド、または対応する天然の蛋白質のＣ−末端領域から５アミノ酸までが除去された、そして好ましくは、Ｃ−末端領域から１０〜２０アミノ酸が除去された、その機能的変異体を提供する。本明細書では、“機能的変異体”は、天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドとは異なる膜ドメインに局在するにもかかわらず、天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドの輸送機能を有する、任意の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを意味する。
【００８５】
本発明のこの側面は、改変されたＡＢＣトランスポータを含む、任意の融合蛋白質、とりわけ本明細書で例示される改変されたＡＢＣトランスポータと緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）間の融合ポリペプチドを含む。
【００８６】
本発明の第２の側面は明らかに、本明細書に記載の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドをコードする単離された核酸に拡張する。
本発明のこの側面は、機能的ＡＢＣトランスポータポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子に関し、ここで天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は以下のものからなる群から選択される突然変異を有する：
（ｉ）野生型遺伝子配列のコード領域の３′末端から少なくとも９ヌクレオチドの欠失；
（ｉｉ）Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフをコードする上記遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部を欠失する、野生型遺伝子配列のコード領域の３′末端からの欠失；
（ｉｉｉ）Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフをコードする上記遺伝子のヌクレオチド配列を変異させる、野生型遺伝子配列のコード領域の３′末端内の置換；
（ｉｖ）Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフをコードする上記遺伝子のヌクレオチド配列を変異させる、野生型遺伝子配列のコード領域の３′末端内の挿入；
（ｖ）野生型遺伝子配列のコード領域の３′末端内に停止コドンを導入し、それによって上記遺伝子のＴＫＦモチーフをコードするヌクレオチド配列が翻訳されるのを妨げる任意の突然変異。
【００８７】
好ましくは、上記のサブパラグラフ（ｉ）に記載された欠失は、対応する天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード領域の３′末端から、少なくとも約１０ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約１１ヌクレオチド、そしてより好ましくは少なくとも約１２ヌクレオチドの欠失を含む。
【００８８】
とりわけ好ましい態様において、本発明の単離された核酸はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３、５、９、１１、または１５のいずれか一つに示された改変されたｃＭＯＡＴをコードする遺伝子のヌクレオチド配列からなる。
【００８９】
別の態様において、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドをコードする核酸は、実施例に記載の突然変異をその中に含むプライマーを使用して、増幅により作製される。当業者に既知のように、増幅された変異体配列はプライマーのヌクレオチド配列、またはそのコード領域の３′末端でそれに相補的な配列を含むであろう。したがって、本発明はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６から３３、３７、５９〜６２からなる群から選択されるヌクレオチド配列、および上記ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯのいずれか一つに相補的なヌクレオチド配列を含む改変されたＡＢＣトランスポータを明らかに包含する。
【００９０】
細胞、たとえば哺乳動物細胞に本発明の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現させるために、発現可能な形態の核酸分子を適切なプロモータ配列と操作可能に結合させることが所望される。
【００９１】
本明細書で使用される、“発現可能な形態の核酸分子”は、上記の蛋白質コード領域によりコードされた、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドの発現を調節することができるプロモータまたは他の調節配列と操作可能な結合をする蛋白質コード領域を含む。当業者に既知のように、そのような発現は一般に適切な細胞宿主中で行われる。
【００９２】
本明細書における“プロモータ”に関する記載は、そのもっとも適用範囲の広い状況において、古典的ゲノム遺伝子の転写調節配列を含むと理解すべきである。そのような調節配列は、発生および／または外部刺激に反応するか、または組織特異的様式で遺伝子発現を変化させるＣＣＡＡＴボックス配列および付加的な調節エレメント（たとえば上流活性化配列、エンハンサおよびサイレンサ）と共に、またはそれらを含まずに、正確な転写開始に要求されるＴＡＴＡボックスを含む。本明細書において、“プロモータ”という用語はまた、本発明の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドをコードする核酸を生み出す、活性化する、または発現を促進することができる組換え、合成または融合分子を記載するために使用される。好ましいプロモータは、上記核酸分子の発現をさらに促進させる、および／または空間的発現および／または一時的発現を変化させるような１以上の特定の調節エレメントの付加的なコピーを含んでいてもよい。
【００９３】
プロモータ配列の制御調節下に核酸分子を置く（すなわち“操作可能な結合をする”）ことは、発現がプロモータ配列により制御されるように上記分子を並べることを意味する。プロモータは一般に、それらが制御する遺伝子に対して５′側（上流）に配置されるが、必ずしもそのようではない。異種プロモータ／構造遺伝子組合せを作製するために、プロモータは一般に、そのプロモータと天然の状況において制御する遺伝子間との距離とほぼ同じ、遺伝子転写開始部位からの距離に配置される。さらに、プロモータを含む調節エレメントは通常、遺伝子の転写開始部位の２ｋｂ内に配置される。当技術分野で既知のように、この距離のある程度の変動にはプロモータ機能を損なわずに適応できる。同様に、調節配列エメントの制御下に配置される異種遺伝子に関連したそのようなエレメントの好ましい配置は、その天然の状況、すなわち遺伝子がどこから由来したか、におけるエレメントの配置により説明される。
【００９４】
さらに、当技術分野で既知のように、この距離の変動が起きてもよい。
好ましくは、プロモータ配列は細菌細胞、酵母、真菌細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞における改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドの発現を促進する。
【００９５】
大腸菌のような細菌に無傷のポリペプチドを産生させるための必要条件は、有効なリボソーム結合部位を持った強力なプロモータの使用である。大腸菌のような細菌細胞における発現に適した代表的なプロモータは、ｌａｃｚプロモータ、温度感受性λＬもしくはλＲプロモータ、Ｔ７プロモータ、またはＩＰＴＧ‐誘導ｔａｃプロモータを含むが、それらに限定されない。大腸菌における本発明の核酸分子を発現するための多数の他のベクター系は当技術分野で既知であり、たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ（１９８７）．Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（ＩＳＢＮ　０４７１５０３３８）またはＳａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載される。細菌および効率的なリボソーム結合部位における発現のための適切なプロモータを持つ多数のプラスミド、とりわけ、たとえばｐＫＣ３０（λＬ：Ｓｈｉｍａｔａｋｅ　ａｎｄ　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ　２９２，１２８）、ｐＫＫ１７３−３（ｔａｃ：Ａｍａｎｎ　ａｎｄ　Ｂｒｏｓｉｕｓ（１９８５）．Ｇｅｎｅ　４０、１８３）、ｐＥＴ−３（Ｔ７：Ｓｔｕｄｉｅｒ　ａｎｄ　Ｍｏｆｆａｔ（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９，１１３）、発現ベクターのｐＦＬＥＸ系列（Ｐｆｉｚｅｒ　Ｉｎｃ．，ＣＴ，ＵＳＡ）または発現ベクターのｐＱＥ系列（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）が記載されている。
【００９６】
真核細胞発現ベクターに使用のための適切なプロモータは、哺乳動物細胞、Ｓｆ９またはＳｆ２１（スポドプテラ　フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））細胞、酵母細胞および真菌細胞における発現を調節することができるものを含む。真核細胞における発現のための好ましいプロモータは、とりわけｐ１０プロモータ、ＭＭＴＶプロモータ、ポリへドロンプロモータ、ＳＶ４０初期プロモータおよびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ−ＩＥ）プロモータ、イムノグロブリン産生細胞由来のプロモータ（米国特許第４，６６３，２８１号を参照されたい）、ポリオーマウイルスプロモータ、および各種レトロウイルス由来のＬＴＲ（たとえば、マウス白血病ウイルス、マウスまたはラウス肉腫ウイルスおよびＨＩＶ）を含む。他の発現制御配列の例としては、たとえばＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどに由来するエンハンサまたはプロモータが挙げられる。
【００９７】
本発明の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドのための好ましい発現可能な形態は、上記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびそれに操作可能に結合するプロモータを遺伝子発現構築物またはベクター内に配置することにより得られる。
【００９８】
したがって、本発明の別の側面は、本発明の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を提供する。
遺伝子構築物は好ましくは、プラスミドまたはレトロウイルスベクターである。本発明の目的に適切な多数の発現ベクターが記載され、容易に入手することができる。発現ベクターは、ＣＭＶプロモータおよびＢＧＨターミネータ配列を含むｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｍｅｄｏｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ　Ｐｔｙ　Ｌｔｄ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）に基づいていてもよい。あるいは、ＳＧ５発現ベクター（Ｇｅｅｎｅ　ｅｔ　ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１５，３６９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），またはｐＱＥ系列のベクター（Ｑｉａｇｅｎ）がそのような目的のためにとりわけ有用である。
【００９９】
好ましい哺乳動物プラスミドを基にした遺伝子発現構築物は、ｐＲｃ／ＣＭＶプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であり、それは哺乳動物宿主細胞における発現にＣＭＶプロモータを利用する。あるいは、プロモータに隣接するＨａｒｖｅｙマウス肉腫ウイルス（Ｈａ−ＭＳＶ）長反復配列（ＬＴＲｓ）および改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドをコードする核酸を含むレトロウイルス発現ベクターを使用してもよい。一つの好ましいＨａ−ＭＳＶはｐＣ０１発現ベクターである。
【０１００】
本明細書に記載の遺伝子構築物は、複製の細菌起源に対応した遺伝子配列、および／または原核もしくは真核細胞、組織または生物における上記構築物の維持および複製に適した選択可能なマーカー遺伝子をさらに含んでいてもよい。そのような配列は当技術分野で既知である。
【０１０１】
選択可能なマーカー遺伝子は、上記の選択可能な遺伝子がない場合、細胞増殖を妨げるか、もしくは遅延させる、または細胞死に至らせることになる化合物に対して、細胞に耐性を与えることができる遺伝子を含む。当業者は、たとえばアンピシリン、クラフォラン、ゲンタマイシン、Ｇ−４１８，ヒグロマイシン、リファンピシン、カナマイシン、ネオマイシン、スペクチノマイシン、またはテトラサイクリンに耐性を与えるような抗生物質耐性遺伝子が一般にそのような遺伝子構築物において選択可能なマーカーとして使用されることを認識している。
【０１０２】
複製の起源および／または選択可能なマーカー遺伝子は、好ましくは改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドをコードするコーディング配列から分離される。
【０１０３】
組換えプラスミド、コスミド、バクテリオファージ分子または他の組換え分子を作製するための方法は当業者に既知であり、そして不適切な実験を行わずに実行することができる。
【０１０４】
任意の発現ベクターを含む、本発明の遺伝子構築物は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ細胞培養物への導入およびそれにおける発現、または培養細胞のゲノムへの統合を伴った、もしくは伴わない、細胞系統および／またはトランスジェニック動物への導入が可能である。
【０１０５】
本明細書に企図されたとりわけ好ましい態様において、遺伝子構築物は改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドをコードする核酸をヒト細胞に移行させる遺伝子治療に使用される。好ましくは、そのような移行は身体の治療中に、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現するヒト細胞をヒトに移植する目的のためである。遺伝子送達系は、たとえばレトロウイルスを基にしたベクター、またはアデノウイルスを基にしたものを使用したウイルスであってもよいか、あるいは任意のプラスミドＤＮＡを基にした送達系を含む、非ウイルス送達系を使用してもよい。たとえば、ヒト造血細胞もしくは骨髄細胞、または消化管の細胞にＡｄ２１または本発明の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現する他のアデノウイルスをトランスフェクトし、そしてトランスフェクトされた細胞は適切な器官における薬物耐性を促進するためにヒト患者のその器官に移植される。身体の遺伝子治療の方法は当業者に既知である（Ｆｉｂｉｓｏｎ（２０００）Ｎｕｒｓ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ　Ａｍ．３５，７５７−７７２）。
【０１０６】
また、本発明は本発明の核酸分子を含む形質転換された細胞を提供する。
特記しない限り、本明細書で使用する “細胞”という単語は細胞のクローン化または非クローン化群を含むと理解すべきである。細胞の群は全組織、器官、もしくは生物に、または上記組織、器官または生物の一部に機能的に組織化されてもよい。“細胞”という用語はさらに、単離された細胞または細胞の群の任意の溶解物を含むべきである。
【０１０７】
本明細書で使用する“形質転換された細胞”という用語は、形質転換された細胞の子孫を含むことも意味する。
宿主細胞は、哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞、イヌ細胞、ラット細胞、ウサギ細胞またはマウス細胞であり、そしてさらにより好ましくは、細胞はヒトの薬物感受性初代上皮細胞または、たとえば骨髄細胞、消化管細胞、または造血系細胞のような非上皮細胞である。
【０１０８】
本明細書において有用であると企図される真核細胞系統の例としては、ＮＩＨ３Ｔ３，ＣＯＳ、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、マウスＣ１２７、マウスＬ１２１０、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＷＩ３８，ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、およびＭＤＣＫ細胞系統が挙げられる。そのような細胞系統を当業者は容易に手に入れることができる。
【０１０９】
とりわけ好ましい態様において、宿主細胞は非極性細胞、たとえばマウス白血病細胞系統Ｌ１２１０、あるいは極性細胞、たとえばＭＤＣＫ細胞である。
ワクチン組成物の免疫原性成分の発現のために、細胞に単離された核酸分子、または同じものを含む遺伝子構築物を導入するための手段は当業者に既知である。与えられた生物に使用される技術は、既知の成功した技術に依存する。動物細胞に組換えＤＮＡを導入するための方法は、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ‐デキストランにより媒介されるトランスフェクション、たとえばリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ，ＭＤ、ＵＳＡ）および／またはセルフェクチン（Ｇｉｂｃｏ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用することによる、リポソームにより媒介されるトランスフェクション、ＰＥＧ媒介ＤＮＡ取込、エレクトロポレーション、および、たとえばＤＮＡ被覆タングステンまたは金粒子を使用することによる微粒子ボンバードメントを含む（Ａｇｒａｃｅｔｕｓ　Ｉｎｃ．，ＷＩ．ＵＳＡ）。
【０１１０】
さらに、本発明の遺伝子構築物による哺乳動物細胞のトランスフェクションは薬物感受性表現型から薬物耐性表現型への極性細胞および非極性細胞の形質転換を生み出す。したがって、たとえば化学療法剤（たとえばブスルファン）のようなある薬物により通常損傷を受けるか、または殺されるであろう細胞は、ほとんどまたは全く有害作用のないより高レベルの薬物暴露に耐えることが可能である。したがって細胞は、各種化学療法剤に曝される腫瘍細胞において観察される多剤耐性表現型に匹敵する表現型を獲得する。
【０１１１】
したがって、本発明のこの態様に従った遺伝子構築物は細胞、とりわけ非極性細胞に新規薬物耐性を与えるため、あるいは細胞から具体的な薬物を輸送するためにとりわけ有用である。
【０１１２】
細胞が非極性細胞、たとえば線維芽細胞および造血系の細胞を含む非上皮細胞である場合、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドは一般に細胞膜内に局在する。このことは、そうでなければ低下したエフラックス能力を有する非極性細胞に耐性を与える。
【０１１３】
あるいは、細胞が極性細胞、たとえば培養上皮（たとえばＭＤＣＫ、Ｃａｃｏ２）または初代上皮細胞（たとえば、肝細胞、腸細胞、海馬ニューロン）である場合、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドは驚くべきことに、主に基底外側膜に分布する。改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドの極性細胞の基底外側膜への局在は、基底外側膜による細胞からのあるリガンド薬物のエフラックスを促進し、それに耐性を与える。
【０１１４】
感染または疾患の治療に使用される細胞分裂阻止または細胞毒性化合物のような１以上の化合物に対して細胞に耐性を与えることが、発現された、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドにとって非常に望ましい。たとえば、細胞分裂阻止または細胞毒性化合物による患者の治療中は、非極性細胞（たとえば造血系の細胞）の保護が所望される。
【０１１５】
本明細書で使用する “化合物”という用語は、明確な化学構造を有する任意の天然物、または合成化合物、とりわけ細胞へ、または細胞から能動輸送されることが可能な天然物、または合成化合物を意味すると理解すべきである。当業者は、能動輸送がエネルギー依存的輸送方法、たとえばＡＴＰもしくはＧＴＰ、またはそれらのヌクレオチド類似体を使用した輸送方法を表すことを認識するであろう。好ましくは、本発明に従って耐性または感受性が調節される化合物は、ＡＢＣトランスポータ、膜トランスポータ、または類似のトランスポータにより輸送される化合物である。
【０１１６】
より好ましくは、本発明に従って耐性または感受性が調節される化合物は天然物または合成化合物である。またこれら、たとえば抗菌、抗真菌、およびより好ましくは、化学療法剤は、ヒトまたは他の動物の疾患の治療および／または予防に有用である。
【０１１７】
好ましい抗菌剤は抗生物質である。抗生物質はキノロン系抗生物質、スルホンアミド系抗生物質、セファロスポリン系抗生物質、またはアミノグリコシド系抗生物質を含む。これらは、以下のものからなる群から選択されてもよい：アシクロビル、アドリアマイシン、アンチマイシン、アミカシン、アモキシシリン、アモキシシリン／クラブラネート（オウグメンチン）、アンフォテリシンｂ（フンギゾン）、アンピシリン、アトバクオン（メプロン）、アジスロマイシン（ジスロマックス）、セファゾリン、セフェピム、（マキシピム）、セフタジジム、セファタキシム（クラフォラン）、セフォテタン（セフォタン）、セフポドキシム（バンチン）、セフチゾキシム（セフィゾクス）、セフトリアキソン（ロセフィン）、セフロキシム（ジナセフ）、セファレキシン、クロトリマゾール（マイセレックス）、シプロフロキサシン（シプロ）、クラリスロマイシン（ビアキシン）、クリンダマイシン（クレオシン）、オキシサイクリン、エリスロマイシンラクトビオネート、ファムシクロビル（ファムビル）、フルコナゾール（ジフルカン）、ホスカーネット（ホスカビル）、ガンシクロビル、ゲンタマイシン、イミペネム／シラスタチン（プリマキシン）、イソニアジド、イトラコナゾール（スポラノックス）、ナフシリン、ニトロフラントイン、ニスタチン、オリゴマイシン、パロモマイシン、ペニシリンｇ、ピペラシリン／タゾバクタム（ゾシン）、リファンピン（リファジン）、チカルシリン／クラブラネート（チメンチン）、トブラマイシン、トリメソプリム、スルファメソキサゾール、バラシクロビル（バルトレックス）、およびバンコマイシン。本発明はまた、上記抗生物質のクロリド塩もしくは硫酸化誘導体に対してか、または任意の誘導体もしくは関連化合物に対して耐性を与えることに拡大する。
【０１１８】
好ましい抗真菌化合物は、イミダゾール（ビフォナゾール［すなわち、１−（α−ビフェニル−４−イルベンジル）−イミダゾール］、クロトリマゾール、イントラコナゾール、フルコナゾール、エコナゾールニトレート、ケトコナゾール、アスタミゾール、メトロニダゾール（フラジル）およびミコナゾールニトレート［すなわち、１−［２，４−ジクロロ−β−（２，４−ジクロロベンルオキシ）フェネチル］イミダゾールニトレート］を含む）；アリルアミン（塩酸テルバフィンおよびテルフェナジンを含む）；塩酸アモロルフィン（塩酸シス−４−［（ＲＳ）−３−［４−（１，１−ジメチルプロピル）フェニル］−２−メチルプロピル］−２，６−ジメチルモルホリン）ならびにそれらのクロリド塩および硫酸化誘導体、ならびにそれに加えて誘導体および関連化合物である。
【０１１９】
“化学療法剤”は、哺乳動物細胞を生存不能にすることが可能な細胞分裂阻止および／または細胞毒性化合物（すなわち細胞毒）である。化学療法剤は、少なくとも成長および／または増殖のための細胞の能力を軽減させるであろう（細胞分裂阻止）。化学療法剤の細胞毒性および／または細胞分裂阻止性は、動物の癌もしくは前癌細胞、または腫瘍の治療的または予防的処置において、これらの化合物に有用性を与える。
【０１２０】
好ましい化学療法剤は、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｐｈａｎ）（ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ））、シスプラチン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ＢＣＮＵ、メルファラン、メルクロルエタン、硫酸ビンブラスチン、およびエトポシド（ＶＰ−１６、ＶＰ−１６−２１３、またはＶｅＰｅｓｉｄ）からなる群から選択される。他の化学療法剤は硫酸ビンクリスチン、オンコビン、ベルバン、ベルサル、タキソール、およびエピポドフィロトキシン（ポドフィロトキシンおよびその合成誘導体、テニポシド（ＶＭ−２６）を含む）からなる群から選択されるビンカアルカロイドを含む。エストロゲン受容体アンタゴニスト、タモキシフェン、および抗腫瘍抗生物質アドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ルビドマイシン、セルビジン、ダウロブラシチナ、プリコマイシン、およびミトキサンスロン、およびそれらのクロリド塩または硫酸化誘導体、およびそれに加えて関連化合物も化学療法に有用である。
【０１２１】
本発明の別の側面は、細胞に当分の間、および上記細胞が化合物の存在下で増殖および／または生存能力が変化するために十分な条件下で、上記細胞に改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現させることを含む、上記化合物への上記細胞の耐性を促進する方法を提供する。細胞の生存能力のアッセイは、詳細に記載（Ｃｕｉ　ｅｔ　ａｌ（１９９９）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５，９２９−９３７）されていて、本発明の改変されたＡＢＣトランスポータを発現する細胞の促進された耐性を測定するために容易に適用可能である。
【０１２２】
本発明のこの態様は明らかに、試験される化合物または薬物の存在下で増殖および／または生存能力が促進されることを包含する。対応する天然のＡＢＣトランスポータとは異なる膜局在と共に、任意の基質のエフラックスを促進させるための本発明の改変されたＡＢＣトランスポータの保持された能力のために、上記トランスポータは対応する天然のＡＢＣトランスポータに比べ、細胞分裂阻止／細胞毒性化合物のエフラックスを促進する。いずれの理論または作用様式にも束縛されないが、化合物は細胞から輸送される前にグルタチオン、グルクロネート、またはスルフェートに抱合していてもよい。
【０１２３】
たとえば、改変されたＡＢＣトランスポータおよび対応する内在性の天然のＡＢＣトランスポータの両方を発現するトランスフェクトされた極性細胞からの細胞分裂阻止／細胞毒性薬物基質のエフラックスは、頂上および基底外側膜の両方により起こり、それによって非トランスフェクト極性細胞に比べ、総エフラックスを促進する。
【０１２４】
同様に、改変されたＡＢＣトランスポータおよび対応する内在性の天然のＡＢＣトランスポータの両方を発現するトランスフェクトされた非極性細胞からの細胞毒性／細胞分裂阻止薬物基質は、細胞内小胞に局在するよりむしろ、それらのエフラックスが細胞膜により起こり、それによって非トランスフェクト極性細胞に比べ、総エフラックスを促進する。本明細書で例示するように、本発明の改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドの異所性発現は、非トランスフェクトＬ１２１０細胞に比べ、ブスルファンへのＬ１２１０細胞の耐性を促進する。
【０１２５】
ヒトまたは哺乳動物の組織における天然に存在するＡＢＣトランスポータポリペプチドの分布パターンは、ヒトおよび動物における薬物耐性の部位特異的促進をさらに含むように、本発明のこの側面の範囲の拡大を提供する。本発明のこの態様に従って、本発明の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドは、上記の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドが由来するものとは異なるＡＢＣトランスポータ（すなわち、異種ＡＢＣトランスポータポリペプチド）の１以上の阻害剤と組み合わせて使用される。
【０１２６】
したがって、本発明の別の側面は、対象への細胞毒性または細胞分裂阻止化合物の投与中に、上記非極性細胞を含む生物または組織の非極性細胞を保護する方法を提供し、上記方法は以下のことを含む：
（ｉ）当分の間、および上記非極性細胞が上記細胞毒性または細胞分裂阻止化合物を効率的に輸送するために、またはさもなければ上記化合物に耐性を獲得するために十分な条件下で、上記細胞に改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現させること、；そして
（ｉｉ）場合により、上記ＡＢＣトランスポータを発現する細胞の増殖を阻止、または阻害するために十分な条件下で、１以上のＡＢＣトランスポータを投与すること、ここで上記ＡＢＣトランスポータは、上記の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドが由来するものとは異なり（すなわち、異種ＡＢＣトランスポータポリペプチド）、上記細胞毒性または細胞分裂阻止化合物の輸送に関与する。
【０１２７】
好ましくは、上記サブパラグラフ（ｉｉ）の細胞は、極性細胞または非極性細胞である。好ましくは、上記サブパラグラフ（ｉ）の非極性細胞は造血系の細胞である。
【０１２８】
とりわけ好ましい態様において、細胞毒性／細胞分裂阻止化合物は、たとえばブスルファンのような化学療法剤である。
たとえば、改変されたｃＭＯＡＴは非造血腫瘍細胞を除去する化学療法中に造血系を保護するために使用してもよい。好ましくは、そのような治療計画中、非造血細胞のＰ−ｇｐ活性を阻害し、化学療法剤の効力を促進するために１以上のＰ−ｇｐアンタゴニストを投与することができる。またＰ−ｇｐ活性が阻害される場合、そのような阻害は上皮腫瘍細胞、またはかわりにＰ−ｇｐを過剰発現する非極性腫瘍細胞の内在性Ｐ−ｇｐ活性に関するものであることがとりわけ好ましい。
【０１２９】
同様に、改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドは造血系を保護するため、好ましくは非血液腫瘍細胞の頂上膜のＭＤＲ活性を阻害するために１以上のＭＤＲアンタゴニスト、および腫瘍形成を阻害するために１以上の化学療法剤と組み合わせて使用することができる。
【０１３０】
同様に、改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドは造血系を保護するため、好ましくは腫瘍細胞の基底外側膜におけるＭＲＰ１およびその相同体の活性を阻害するために１以上のアンタゴニスト、および腫瘍を除去するために１以上の化学療法剤と組み合わせて使用することができる。
【０１３１】
別の態様において、改変されたＭＤＲ３ポリペプチドは造血系を保護するため、好ましくは非造血腫瘍細胞の膜におけるｃＭＯＡＴ活性を阻害するために１以上のｃＭＯＡＴアンタゴニスト、および／またはＭＤＲ相同体活性を阻害するために１以上のアンタゴニスト、および／または腫瘍細胞の基底外側膜におけるＭＲＰ１およびその相同体の活性を阻害するために１以上のアンタゴニスト、ならびに腫瘍を除去するために１以上の化学療法剤と組み合わせて使用することができる。
【０１３２】
別の態様において、改変されたＭＤＲ相同体ポリペプチドは造血系を保護するため、好ましくは非造血腫瘍細胞の膜におけるｃＭＯＡＴ活性を阻害するために１以上のｃＭＯＡＴアンタゴニスト、および／またはＰ−ｇｐ活性を阻害するために１以上のＰ−ｇｐアンタゴニスト、および／または腫瘍細胞の基底外側膜におけるＭＲＰ１およびその相同体の活性を阻害するために１以上のアンタゴニスト、ならびに腫瘍を除去するために１以上の化学療法剤と組み合わせて使用することができる。
【０１３３】
先の記載から、改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドまたは改変されたＭＤＲ３ポリペプチドまたは改変されたＭＲＰ４ポリペプチドを、対応する天然に存在するＡＢＣトランスポータポリペプチドが存在しないか、または活性でない、任意の非極性細胞に耐性を与えるために使用できるということは明らかであろう。そのような態様において、この特徴が明らかに本発明に包含されるにもかかわらず、本発明は非血液腫瘍細胞における同時の、または連続した内在性ＡＢＣトランスポータ活性の阻害を必要としないことも明らかであろう。
【０１３４】
本発明はさらに、好ましくは腫瘍形成性非極性細胞において異種ＡＢＣトランスポータポリペプチド活性を阻害する１以上のＡＢＣトランスポータアンタゴニストの使用、および腫瘍を除去するための１以上の化学療法剤の使用と一緒に、対応する天然に存在するＡＢＣトランスポータポリペプチドが頂上膜ドメインにすでに存在するか、活性である極性細胞に薬物耐性の促進を提供する。
【０１３５】
したがって、別の態様において、本発明は対象への細胞毒性または細胞分裂阻止化合物の投与中に、極性細胞を含む生物または組織の上記極性細胞の耐性を促進する方法を提供し、上記方法は以下のことを含む：
（ｉ）当分の間、および上記極性細胞から上記細胞毒性または細胞分裂阻止化合物の効率的な輸送を促進するか、またはさもなければ上記化合物への耐性を促進させるために上記細胞に対して十分な条件下で、上記細胞に改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを導入するか、または発現させること；そして
（ｉｉ）場合により、当分の間、および細胞の増殖を阻止または阻害するために十分な条件下で、上記細胞のＡＢＣトランスポータの１以上の阻害剤を投与すること、ここで上記ＡＢＣトランスポータは、上記の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドが由来するものとは異なり（すなわち、異種ＡＢＣトランスポータポリペプチド）、上記細胞毒性または細胞分裂阻止化合物の輸送に関与する。
【０１３６】
好ましくは、上記サブパラグラフ（ｉｉ）の細胞は、非極性細胞である。好ましくは、極性細胞は初代上皮細胞である（たとえば、とりわけ肝細胞、腸細胞、または海馬ニューロン）。
【０１３７】
ｃＭＯＡＴポリペプチドおよび他の種の相同ポリペプチドの好ましい阻害剤を表３に示す。
【０１３８】
【表５】
2004512831.tif 000006
【０１３９】
本発明は対象への細胞分裂抑制化合物または細胞毒性化合物の投与を明らかに企図し、ここで上記化合物は、極性および非極性系列または型の両方の細胞のサブセットにおいて上記化合物に対する耐性を促進するための、本発明の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドの、すぐ後の投与（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）または共投与または前投与により、それらの細胞にその作用を及ぼす。たとえば、ヒトの造血系に対する一般的に細胞毒性である化合物の細胞毒性作用は、それらの造血細胞への本発明の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドの、すぐ後の投与、または共投与、または前投与により緩和されてもよく、それにより化合物に対するそれらの耐性を高める。そのような研究方法の利点は、とりわけ細胞への細胞毒性および細胞分裂阻止化合物の適用、たとえば癌の化学療法に関する限り、当業者には明らかである。
【０１４０】
本発明は、化合物に対する細胞の耐性を促進するために上記化合物のインフラックス／エフラックスを必要とする、任意のおよびすべての改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドの使用に拡大する。
【０１４１】
本発明の方法は、任意の細胞の薬物耐性を促進するために広範囲に適用可能であるため、細胞は本明細書に記載の任意の極性もしくは非極性細胞または細胞系統であってもよい。好ましくは、ヒトまたは他の哺乳動物の非癌性または非感染性宿主細胞である。本発明のとりわけ好ましい態様において、細胞はたとえば、造血系の細胞のような非極性細胞である。
【０１４２】
本発明はさらに、上記化合物に対する細胞の耐性を促進するための、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドをコードする任意のおよびすべての核酸分子の使用に拡大する。好ましくは、本発明のこの態様は、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチド、または上記ポリペプチドの機能的変異体をコードする単離された核酸分子を、細胞、組織、器官または生物全体に導入する別の段階を含む。
【０１４３】
この態様はさらに、遺伝子治療のために当技術分野で認められた方法を使用して、細胞、組織、器官または生物において改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを新規に産生するｉｎ　ｖｉｖｏ遺伝子治療の方法を含む。たとえば、骨髄に形質導入し、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドの発現を変化させ、それにより骨髄細胞に化学療法剤に対する耐性を与えることができる。形質導入された骨髄を自家移植後、より効率的な化学療法を癌患者に適用することができる。本発明のこの態様の実行に使用される核酸分子は、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドをコードする、本明細書に記載の例示された核酸、またはその相同体、類似体もしくは誘導体であってもよい。
【０１４４】
本明細書に記載の遺伝子治療技術はまた、化学療法による骨髄抑制を改善するために使用してもよい。とりわけ、ｃＭＯＡＴのような、グルタチオン抱合トランスポータと相乗効果を有する、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼアイソザイムは、化学療法剤の細胞毒性を低下させる。したがって、本発明の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドおよびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼを共発現する１以上のベクターは、たとえば肝臓による解毒の効率を高めるために有用である。同じまたは異なるベクターからの本発明の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドおよびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼの共発現は明らかに本明細書に企図される。
【０１４５】
そのような遺伝子治療技術はまた、肝機能障害を治療するために使用することができる。肝機能障害は、遺伝病（デュビン‐ジョンソン症候群）から、または胆汁鬱滞を起こすような生活スタイルに影響された機能障害のために起こる可能性がある。非極性細胞の肝臓への移植は可能であるが、これらの細胞は通常細管空間を形成する構造にならない。さらに、極性細胞の細管膜に通常分布するＡＢＣトランスポータは、そのような非極性細胞において細胞内に局在する。本発明の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現するように遺伝的に形質転換された非極性細胞は、基質を代謝し、代謝産物を洞様空間に輸送し、最後には腎臓によって濾過されるように機能する。
【０１４６】
さらに、本発明の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドは、ＡＢＣトランスポータ活性、基質特異性、または薬物代謝もしくは薬物輸送をアッセイするための新規細胞系統を開発するために使用される。明らかに、本発明の改変されたＡＢＣトランスポータを発現する細胞は、任意の具体的な薬物の代謝におけるトランスポータの役割を確定するために有用である。
【０１４７】
したがって、本発明の別の側面は、ＡＢＣトランスポータポリペプチドの新規アゴニストおよびアンタゴニストの発見のための簡単で、信頼性の高いｉｎ　ｖｉｖｏスクリーニング系を企図する。
【０１４８】
とりわけ、本発明は天然に存在するＡＢＣトランスポータポリペプチドの新規アゴニストおよびアンタゴニストの発見のための簡単で、信頼性の高いｉｎ　ｖｉｖｏスクリーニング系を企図する。本発明の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドが天然に存在する等価物と同じ機能を有し、そして極性および非極性細胞型の細胞膜に共に局在するという本発明者らの観察は、これらの細胞における内在性ＡＢＣトランスポータ活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するための、ハイスループットスクリーニングにおける本発明の用途を示す。本発明は明らかに、非特異性に多少寛容な迅速なハイスループットスクリーニング、および／またはより高い特異性を有する小規模の機能的スクリーニング、および／または、たとえば改変された蛋白質の変異体を使用した、アゴニスト／アンタゴニスト分子の結合部位の評価のような、確定しようとする化学的構造／機能関係を評価するための定量的動態学的研究を利用する方法を企図する。
【０１４９】
好ましくは、本発明は以下のことを含む、天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドの基質を同定するための方法を企図する：
（ｉ）対応する改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを細胞に発現させること、ここで上記の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドは上記の天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのアミノ酸配列からなり、ここでＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２〜５８までのいずれか一つに示された配列を有する上記の天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのＣ−末端Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフの１以上のアミノ酸残基は置換されているか、欠失している；
（ｉｉ）天然のＡＢＣトランスポータまたは対応する改変されたＡＢＣトランスポータを発現しない細胞に関連する改変されたＡＢＣトランスポータを発現する細胞からの化合物のエフラックスを測定すること、ここで改変されたＡＢＣトランスポータを発現する細胞からのエフラックスは、化合物が対応する天然のＡＢＣトランスポータの基質であることを示す。
【０１５０】
細胞からの化合物のエフラックスを測定するために、標準法を使用することができる。
好ましい態様において、本発明はさらに以下のことを含む天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドの阻害剤を同定するための方法を提供する：
（ｉ）対応する改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを細胞に発現させること、ここで上記の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドは上記の天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのアミノ酸配列からなり、ここでＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２〜５８までのいずれか一つに示された配列を有する上記の天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのＣ−末端Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフの１以上のアミノ酸残基は置換されているか、欠失している；
（ｉｉ）（ａ）ＡＢＣトランスポータポリペプチドの活性を阻害する能力を試験される化合物；および（ｂ）上記の天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドの既知の基質化合物の存在下で細胞をインキュベートすること；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）と異なる試料中において、上記の基質化合物の存在下で細胞をインキュベートすること；そして
（ｉｖ）（ｉｉ）および（ｉｉｉ）における基質化合物のエフラックスを比較すること、ここで（ｉｉｉ）に比較した（ｉｉ）における減少したエフラックスは、試験される化合物が天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドの阻害剤であることを示す。
【０１５１】
改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドおよび対応する天然に存在するＡＢＣトランスポータポリペプチドの類似した活性に基づき、このアッセイにおいて同定された阻害性化合物はまた、対応する天然に存在するＡＢＣトランスポータポリペプチドの阻害剤であることが好ましい。
【０１５２】
本明細書に記載のアッセイ形態はＡＢＣトランスポータ機能の新規アゴニストの確定に容易に適合するということは当業者には明らかであろう。したがって、このアッセイの別の態様は、以下のことを含む天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのアゴニストを同定するための方法を提供する：
（ｉ）対応する改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを細胞に発現させること、ここで上記の改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドは上記の天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのアミノ酸配列からなり、ここでＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２〜５８までのいずれか一つに示された配列を有する上記の天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのＣ−末端Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフの１以上のアミノ酸残基は置換されているか、欠失している；
（ｉｉ）（ａ）ＡＢＣトランスポータポリペプチドの活性に作動する能力を試験される化合物；および（ｂ）上記の天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドの既知の基質化合物の存在下で細胞をインキュベートすること；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）と異なる試料中において、上記の基質化合物の存在下で細胞をインキュベートすること；そして
（ｉｖ）（ｉｉ）および（ｉｉｉ）における基質化合物のエフラックスを比較すること、ここで（ｉｉｉ）に比較した（ｉｉ）における促進されたエフラックスは、試験される化合物が天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのアゴニストであることを示す。
【０１５３】
改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドおよび対応する天然に存在するＡＢＣトランスポータポリペプチドの類似した活性に基づき、このアッセイにおいて同定されたアゴニストはまた、対応する天然に存在するＡＢＣトランスポータポリペプチドのアゴニストであることが好ましい。
【０１５４】
別の態様において、アゴニストは以下のことを含む方法により同定されてもよい；
（ｉ）極性および非極性細胞の細胞膜に改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現させること、；
（ｉｉ）（ａ）ＡＢＣトランスポータポリペプチドの活性に作動する能力を試験される化合物；および（ｂ）上記の天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドの既知の基質化合物の存在下で細胞をインキュベートすること；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）と異なる試料中において、上記の基質化合物および試験される上記化合物の存在下で、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現しない同質遺伝子型細胞をインキュベートすること；そして
（ｉｖ）（ｉｉ）および（ｉｉｉ）における基質化合物のエフラックスを比較すること、ここで（ｉｉｉ）に比較した（ｉｉ）における促進されたエフラックスは、試験される化合物が天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのアゴニストであることを示す。
【０１５５】
好ましくは、同質遺伝子型細胞は本明細書に記載のアッセイ形態に使用される基質化合物を輸送することができる任意のＡＢＣトランスポータポリペプチドを発現しない。
【０１５６】
ＭＲＰ１、ＭＲＰ２，およびＭＲＰ３により輸送される好ましい基質は表４に記載される。これらのトランスポータの基質は一般に、少なくとも１アニオン性残基、たとえばグルクロノシル、カルボキシル、グルタチオニル、またはスルフェートに連結した、ビリルビン、エストラジオール、またはアラキドン酸塩のような親油性部分を有する。当業者に公知のように、抱合した基質、とりわけグルタチオン抱合体は一般に非抱合型で細胞に提供されてもよく、ここでそれはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼのような内在性酵素の作用により抱合する。
【０１５７】
改変されたｃＭＯＡＴの好ましい基質は、ロイコトリエンＣ４（ＬＴＣ４；Ｄｕ　Ｐｏｎｔ）；ビリルビン；モノグルクロノシルビリルビン（Ｊｅｄｌｉｔｓｃｈｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ．３２７，３０５−３１０；Ｋａｍｉｓａｋｏ　ｅｔ　ａｌ（１９９９）Ｈｅｐａｔｏｌ．３０，４８５−４９０）；ビスグルクロノシルビリルビン（Ｊｅｄｌｉｔｓｃｈｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ．３２７，３０５−３１０；Ｋａｍｉｓａｋｏ　ｅｔ　ａｌ（１９９９）Ｈｅｐａｔｏｌ．３０，４８５−４９０）；ロイコトリエンＤ４（ＬＴＤ４）；１，３−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン；モノクロロビマン（チオライト、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）；７−クロロ−４−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（Ｓｉｇｍａ）；１７β−グルクロノシルエストラジオール（Ｄｕ　Ｐｏｎｔ）；３α−スルファトリソコリルタウリン；Ｆｌｕｏ−３（Ｎｉｅｓ　ｅｔ　ａｌ（１９９８）Ｈｅｐａｔｏｌ．２８，１３３２−１３４０）；グルタチオンジスルフィド（Ｌｅｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ．，３１４，４３３−４３７）、およびｐ−アミノヒプレート（Ｌｅｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ（２０００）印刷中）を含む。輸送アッセイに関しては以下の放射リガンドが好ましい：［３Ｈ］−ＬＴＣ４（Ｄｕ　Ｐｏｎｔ）、［３Ｈ］７β−グルクロノシルエストラジオール；［３Ｈ］モノグルクロノシルビリルビン。蛍光基質Ｆｌｕｏ−３の使用も好ましい。容易に測定できる他の基質は、グルタチオン抱合体を形成することができる以下の化合物を含む：１，３−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン；モノクロロビマン（チオライト、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）；および７−クロロ−４−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（Ｓｉｇｍａ）を含む。これらの化合物のうち、１，３−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンはＤＮＰ−ＳＧに変換し；モノクロロビマン（チオライト、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）はビマン−ＳＧに変換し；７−クロロ−４−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（Ｓｉｇｍａ）は４−ニトロフェニル−２−オキサ−１，３−ジアゾール−ＳＧに変換する。
【０１５８】
改変されたＭＤＲ３の基質は、ジゴキシン、パクリタキセル、ベラパミル、ビンブラスチン、ホスファチジルコリン、および短鎖ホスファチジルコリン類似体を含み、そしてこれらは好都合には輸送アッセイのために放射標識される。たとえば、［１２α−３Ｈ］ジゴキシンはＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓから容易に入手可能であり；［３Ｈ］パクリタキセルはＭｏｒａｖｅｋ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｃ，（Ｌａ　Ｂｒｅｓａ，ＣＡ，ＵＳＡ）から容易に入手可能であり；［α−３２Ｐ］８−アジド−ＡＴＰおよび［α−３２Ｐ］ＡＴＰはＩＣＮ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（Ｃｏｓｔａ　Ｍｅｓａ，ＣＡ，ＵＳＡ）から容易に入手可能である。また［３Ｈ］ベラパミルはＭＤＲ３のアッセイに役立つと他に記載されている（Ｄｏｐｐｅｎｓｃｈｍｉｔｔ　ｅｔ　ａｌ（１９９９）Ｊ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｅｘｐ　Ｔｈｅｒ　２８８，３４８−３５７）。
【０１５９】
改変されたＭＲＰ４の基質は上記の両親媒性アニオン、ヌクレオチド類似体、または環状ヌクレオチドを含む。輸送アッセイに好ましい基質は以下のものを含む：アジドチミジンモノホスフェート；９−（２−ホスホニルメトキシエチル）アデニン（すなわちＰＭＥＡ）（Ｓｃｈｕｅｔｚ　ｅｔ　ａｌ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ　５，１０４８−１０５１）；６−メルカプトプリン；１，３−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン；ｃＡＭＰ；ｃＧＭＰ；シルデナフィル（Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）（Ｐｆｉｚｅｒ）；トレキンシン（Ｔｒｅｑｕｉｎｓｉｎ）（Ｓｉｇｍａ）；およびザプリナスト（Ｚａｐｒｉｎａｓｔ）（Ｓｉｇｍａ）。輸送アッセイのために、これらの基質は好都合には放射標識化合物として提供される。
【０１６０】
【表６】
2004512831.tif 000007
【０１６１】
【表７】
2004512831.tif 000008
【０１６２】
【表８】
2004512831.tif 000009
【０１６３】
上記の態様に従って、これらのアッセイで使用される既知の基質は、細胞分裂阻止化合物または細胞毒性化合物、たとえば任意の１以上の各種抗生物質、または化学療法剤であってもよく、それらはアッセイで使用される改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドが由来するＡＢＣトランスポータポリペプチドにより通常はトランスサイトーシスされる。そのような細胞分裂阻止化合物または細胞毒性化合物を使用するためのアッセイを適合させる場合、促進または抑制されたエフラックスは細胞の促進された生存能力および／または増殖、または抑制された生存能力および／または増殖をそれぞれ評価してもよい。これは、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドのアゴニストの存在による細胞毒または細胞分裂阻止化合物の任意の促進されたエフラックスが、一般に適切な条件下で細胞の生存能力および／または増殖を促進することになるためである。同様に、アンタゴニスト化合物の存在による任意の抑制されたエフラックスは、細胞毒および細胞分裂阻止化合物の適切な濃度における細胞の生存能および／または増殖を抑制する作用を有するであろう。
【０１６４】
好ましくは、既知の基質化合物はグルタチオン、グルクロネート、またはスルフェートとの抱合体を形成することができる。たとえば、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンはグルタチオンと抱合して２，４−ジニトロフェニルグルタチオン（ＤＮＰ−ＧＳ）を形成する。同様に、モノ−クロロビマン（チオライト、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）はグルタチオン抱合体ビマングルタチオンを形成する。同様に、７−クロロ−４−ニトロベンゼン−２−オキサ−１，３−ジアゾール（Ｓｉｇｍａ）は細胞中でグルタチオンと抱合して４−ニトロフェニル−２−オキサ−１，３−ジアゾールグルタチオンを形成する。このアッセイ形態において、エフラックスは好都合には培地中におけるこれらの化合物の出現により測定される。たとえば、改変されたＡＢＣトランスポータを発現する細胞は、しばらく１クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）に暴露し、その後洗浄し、そして試験されるアゴニストまたはアンタゴニスト候補とインキュベートする。インキュベーション後、分光光度法により上清における２，４−ジニトロフェニルグルタチオンの存在を調べ、そしてその出現速度がアゴニストまたはアンタゴニスト化合物の活性の尺度である。この方法は、ハイスループット様式に容易に修正される（Ｂｒｏａｒｄ，Ｐ．（１９８４）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　１２４，１５３−１６５；Ｏｌｉｖｅ　ａｎｄ　Ｂｒｏａｒｄ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　１２２４，２６４−２６８）。
【０１６５】
使用されるアッセイ形態は、ヌクレオチドトラッピングアッセイ、または細胞単層の使用を含む、輸送をアッセイするための任意の都合のよい形態であってもよい。
【０１６６】
上記の態様において、非極性細胞の使用が好ましく、なぜならそれらは改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドの天然の等価物をそれらの細胞膜に通常は発現しないからである。しかし、極性細胞も使用することが可能で、なぜなら頂上膜ドメインに局在する内在性ＡＢＣトランスポータポリペプチドに比べ、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドは細胞膜のより広い表面領域に蓄積するからである。これらのアッセイを行うために極性細胞を使用する場合、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドによる細胞からの細胞毒または細胞分裂阻止化合物のエフラックスは、極性細胞の細胞膜における任意の内在性の天然に存在するＡＢＣトランスポータポリペプチドによるエフラックスの数倍のレベル（少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５〜７倍）である。
【０１６７】
このスクリーニング方法を使用して検出される化合物は、結局癌治療において化学増感剤として使用することができる。
本発明の別の側面は、Ｔ−Ｋ−ＦモチーフがＡＢＣトランスポータポリペプチドの環境内にあることを条件として、頂上膜に対して蛋白質をターゲッティングさせるための、移動可能な輸送シグナルペプチドとしてのＴ−Ｋ−Ｆモチーフの使用を企図する
本発明はまた、以下の非限定的な実施例に関連して記載される。
【０１６８】
実施例１
改変されたｃＭＯＡＴ（ＭＲＰ２）ポリペプチド
はじめに
ｃＭＯＡＴは多剤耐性関連蛋白質（ＭＲＰｓ）として当技術分野で既知のサブファミリーのＡＢＣトランスポータである。ＭＲＰｓについてのいくつかの総説が発行されている（Ｂｏｒｓｔ　ｅｔ　ａｌ．（２０００）Ｊ　Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．９２，１２９５−１３０２；およびＫｏｎｉｇ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９９）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　１４６１，３７７−３９４を参照されたい。ＭＲＰ１からＭＲＰ６と呼ばれる６種の既知のヒトＭＲＰｓがある。ｃＭＯＡＴはＭＲＰ２に対応する。ＭＲＰｓは細胞から広範囲の化合物を運び出す。ＭＲＰ１は最初にそして最も広範に特徴が調べられたメンバーであり（Ｃｏｌｅ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５８，１６５０−１６５４）、そしてｃＭＯＡＴと４９％の配列同一性を有する（Ｂｕｃｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９６）Ｊ　Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１５０９１−１５０９８；Ｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９７）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７２．Ｇ１６−Ｇ２２；Ｐａｕｌｕｓｍａ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７１，１１２６−１１２８；およびＴａｎｉｇｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５６，４１２４−４１２９）。
【０１６９】
ＭＲＰ１およびｃＭＯＡＴは類似した基質を有し、それらの基質はグルタチオン抱合体、グルクロニド抱合体、還元グルタチオン、および化学療法剤を含む。ｃＭＯＡＴの機能は、ｃＭＯＡＴ欠乏ラットＧＹ／ＴＲ２（Ｊａｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８５）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　５，５７３−５７９；Ｊａｎｓｅｎ　ＲＳ（１９８７）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　７１，７１−７６；およびＫｉｔａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７，３５５７−３５６１）およびＥＨＢＲ（Ｈｏｓｏｋａｗａ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９２）Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．４２，２７−３４）の使用により、初めにＭＲＰ１とは異なることが示された。
【０１７０】
ＭＲＰ１およびｃＭＯＡＴの分布パターンも異なる。ＭＲＰ１は造血系、血液脳関門、肺を含む多くの組織において、ならびに肝臓および腎臓では低発現レベルで、身体の至る所に見出される。対照的に、ｃＭＯＡＴは肝臓において著しいレベルで、そして腎臓においてはより少ない程度に見出されるだけである。両蛋白質が発現されるこれら２つの組織において、それらは特異的な局在が異なる。ＭＲＰ１は基底外側膜（洞様）膜において見出され、したがって潜在的な分泌産物が血流に戻るよう方向を変えるように作用してもよい。逆に、ｃＭＯＡＴは頂上膜だけに見出され、このことは身体からの最終的な排出をするための、化合物の排出ポンプとしての機能を説明する。両蛋白質は肝細胞に見出すことができるが、ＭＲＰ１より高レベルのｃＭＯＡＴの発現は、血液から胆汁への排泄産物のベクトル輸送を生み出す。
【０１７１】
初期の実験において、ｃＭＯＡＴをトランスフェクトされた造血細胞は、蛋白質の細胞内蓄積および最小の細胞膜局在のために機能的なｃＭＯＡＴを発現しなかった。類似した結果がその後他の研究者らにより報告されている（Ｅｖｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１，１３１０−１３１９を参照されたい）。対照的に、ＭＲＰ１は同様にトランスフェクトされた細胞において完全な細胞膜局在を示す。
【０１７２】
本発明者らは、上皮細胞系統および造血系統細胞の両方において、ＭＲＰ１およびｃＭＯＡＴの局在の差を生み出すソーティングシグナルを証明しようと試みた。緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）融合蛋白質および部位特異的変異誘発を使用して、極性ＭＤＣＫ細胞におけるｃＭＯＡＴの排他的な局在の原因となる配列モチーフを同定した。モチーフの欠失は、極性ＭＤＣＫ細胞ではｃＭＯＡＴの外側局在を生じ、Ｌ１２１０細胞では細胞膜に局在させる。変異した蛋白質は、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンとグルタチオンとの抱合により生じた既知のｃＭＯＡＴ基質、２，４−ジニトロフェニルグルタチオン（ＤＮＰ−ＧＳ）を輸送する。
【０１７３】
実験方法
遺伝子構築物をコードする緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）融合蛋白質
ＧＦＰは、以下に記載のように、ＭＲＰ１またはｃＭＯＡＴポリペプチドのＣ−末端領域に融合し、ＭＲＰ１−ｇｆｐまたはｃＭＯＡＴ−ｇｆｐ融合蛋白質の局在の検出を容易にした。
【０１７４】
ヒトｃＭＯＡＴ　ｃＤＮＡは、ＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、停止コドンを除去してクローニングのために適切な酵素部位を導入する。ｃＤＮＡは以下のような、開始コドンに隣接したＮｈｅｌ部位を添加するセンスプライマー：
【０１７５】
【化１】
2004512831.tif 000010
【０１７６】
そして以下のような、最終コドンの後にＡｇｅｌ部位を添加し、停止コドンを除去するアンチセンスプライマー：
【０１７７】
【化２】
2004512831.tif 000011
【０１７８】
を使用して増幅された。
ポリメラーゼ連鎖反応生成物はＮｈｅｌ／Ａｇｅｌにより消化し、Ｎｈｅｌ／Ａｇｅｌ消化ＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）に連結した。
【０１７９】
さらに、ヒトＭＲＰ１　ｃＤＮＡは上記のパラグラフにおいて記載のように、同じポリメラーゼ連鎖反応法を使用して、ＨＬ６０ＡＤＲ細胞からクローニングし、ＥＧＦＰ−Ｎ１（ＳａｃＩＩ／Ａｇｅｌ）に連結したが、異なる増幅プライマーを使用した。開始コドンに隣接するＳａｃＩＩ部位を導入する、使用したＭＲＰ１センスプライマーは以下の通りであった：
【０１８０】
【化３】
2004512831.tif 000012
【０１８１】
Ａｇｅｌ部位を添加し、ＭＲＰ１の停止コドンを除去するアンチセンスプライマーは以下の通りであった：
【０１８２】
【化４】
2004512831.tif 000013
【０１８３】
上記のｃＭＯＡＴ−ｇｆｐおよびＭＲＰ１−ｇｆｐ構築物（トランスフェクションにつきＤＮＡ１μｇ）は、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥトランスフェクションキット（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、ＭＤＣＫ細胞およびＬ１２１０細胞に別々にトランスフェクトした。ＭＤＣＫ細胞のトランスフェクションはＴｒａｎｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅｓ（Ｃｏｓｔａｒ，２４ｍｍｘ３μｍ　ポリカーボネート膜）を使用して行い、細胞の分極を可能にした。細胞は、共焦点顕微鏡観察のためにＲａｄｉａｎｃｅ　２０００　Ｌａｓｅｒ　Ｓｃａｎｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍに連結したＮｉｋｏｎ　ＴＥ３００倒立顕微鏡およびＬａｓｅｒｓｈａｒｐ　２０００　ｉｍａｇｉｎｇ　ｓｏｆｔｗｅｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して観察した。
【０１８４】
Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフを欠失するｃＭＯＡＴポリペプチド（ΔｃＭＯＡＴ）の発現
Ｃ−末端Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフが欠失し（本明細書では“ΔｃＭＯＡＴ”）、そしてＧＦＣタグがない、改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドをコードする改変されたｃＭＯＡＴヌクレオチド配列は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キットを使用して作製された。この構築物を作製するために、哺乳動物発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にｃＭＯＡＴ　ｃＤＮＡを含む鋳型ＤＮＡ（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５６，４１２４−４１２９）はセンスプライマー（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６；表５）および以下のようなアンチセンスプライマーを使用して増幅し：
【０１８５】
【化５】
2004512831.tif 000014
【０１８６】
それによって天然のｃＭＯＡＴのアミノ酸残基Ｔｈｒ１５４３、Ｌｙｓ１５４４、およびＰｈｅ１５４５をコードする９ヌクレオチドが欠失したＤＮＡを作製した。
【０１８７】
別々の反応由来の２つのクローンの成功した変異誘発は配列決定により確認された。Ｌ１２１０細胞における安定なトランスフェクタントがその後の研究のために選択された。
【０１８８】
部位特異的変異誘発
ｃＭＯＡＴの置換突然変異は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して行われた。所望する突然変異を含む合成相補的オリゴヌクレオチド（表５）のバッチを使用して、野生型ｃＭＯＡＴ　ｃＤＮＡを含む２本鎖プラスミドベクターを、変異体配列を増幅するための鋳型として使用し、そのプライマーはｃＭＯＡＴ　ｃＤＮＡのコード領域の３′末端にアニーリングし、そしてＰｆｕＴｕｒｂｏ　ＤＮＡポリメラーゼ酵素により触媒されるローリングサークル増幅反応で伸長させた。使用したアニーリングおよび伸長温度は製造業者の支持に従った。とりわけ、個々の事例において５〜１０ｎｇの鋳型ＤＮＡから増幅するために、それぞれ１９分間の伸長サイクルを使用した。
【０１８９】
このように、プライマー配列は付着ニックを含む変異したプラスミドに取り込まれた。温度サイクリングに続き、生成物をエンドヌクレアーゼＤｐｎＩで処理し、メチル化およびヘミメチル化配列を含む鋳型ＤＮＡだけを消化した。当該ニックを持つベクター変異体ＤＮＡはその後大腸菌株ＸＬ−１ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換し、ニックを修復し、変異したＤＮＡ配列を複製した。変異したプラスミドのそれぞれにより形質転換された大腸菌は、カナマイシン含有プレート上で選択された。コロニーを培養し、ＤＮＡをそこから単離し、そして回収したプラスミドのヌクレオチド配列解析により突然変異を確かめた。
【０１９０】
いくつかの改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドのＣ末端領域のアミノ酸配列をコードする９ヌクレオチドの部位特異的変異誘発に使用したフォワードプライマーの配列を表５に示す。太字のアミノ酸配列は部位特異的変異誘発により導入されたものである。リバースプライマーの相補的ヌクレオチド配列は容易に導かれる。
【０１９１】
【表９】
2004512831.tif 000015
【０１９２】
２，４−ジニトロフェニルグルタチオン（ＤＮＰ−ＧＳ）輸送
ＤＮＰ−ＧＳは１−クロロー２，４−ジニトロベンゼンに暴露することによりＬ１２１０細胞において作製され、そのエフラックスは先に記載のように測定した（Ｏｌｉｖｅ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　１２２４，２６４−２６８）。
【０１９３】
免疫蛍光法
Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフを欠失する非標識変異体ｃＭＯＡＴ（すなわちΔｃＭＯＡＴ）の検出および局在確認は、抗体Ｍ２　ＩＩＩ６（Ｋａｍｉｙａ　Ｐｔｙ　Ｌｔｄ）を使用して免疫蛍光法により行われた。２ｘ１０５細胞をＰＢＳＦ（２．５％ウシ胎児血清を補足したリン酸緩衝生理食塩水）で洗浄した。ジギトニン（５μｇ／ｍｌ）を使用して細胞を透過性にし、室温で１５分間インキュベートした。その後細胞をＰＢＳＦで３回洗浄し、初代抗体（２μｇ）と共に室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳＦで２回洗浄した。細胞は蛍光イソチオシアネート結合Ｆ（ａｂ′）２（Ｓｉｌｅｏｕｓ，Ｈａｗｔｈｏｒｎ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）（１：８０希釈）と共に室温で３０分間インキュベートした。最後に細胞を３回洗浄し、ＰＢＳＦに再懸濁してその後の共焦点顕微鏡観察の準備を整えた。
【０１９４】
Ｐ−糖蛋白質の検出は抗体ＭＲＫ１６（Ｋａｍｉｙｓ　Ｐｔｙ　Ｌｔｄ．）を使用して行った。２ｘ１０５細胞をＰＢＳＦで洗浄し、初代抗体（２μｇ）と共に室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳＦで２回洗浄した。細胞は蛍光イソチオシアネート結合Ｆ（ａｂ′）（１：４００希釈）と共に３０分間インキュベートし、３回洗浄し、ＰＢＳＦに再懸濁してその後の共焦点顕微鏡観察の準備を整えた。
【０１９５】
結果
ＭＤＣＫ細胞におけるｃＭＯＡＴ−ｇｆｐおよびＭＲＰ１−ｇｆｐ融合蛋白質の局在
検討中の蛋白質の局在を都合よく検出するために、ＧＦＰ融合蛋白質を作製し、上記のように、蛍光生成物を視覚化するための共焦点顕微鏡観察を使用して、それらの局在を視覚化した。
【０１９６】
抗ｃＭＯＡＴ特異的抗体を使用して、先に天然のｃＭＯＡＴがＭＤＣＫ細胞の頂上膜に局在することが示された（Ｅｖｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１，１３１０−１３１９；およびＣｕｉ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９９）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５，９２９−９３７）。本研究において、極性ＭＤＣＫ細胞の頂上膜に局在する、Ｃ末端に融合したＧＦＰを持つヒトｃＭＯＡＴは天然の蛋白質の局在と一致する（図１）。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜上で増殖する極性ＭＤＣＫ細胞の頂上膜は、膜に接着した表面（基底外側）とは反対に、培地に面した表面である。
【０１９７】
ＭＲＰ１はブタ腎臓上皮細胞系統の基底外側膜に局在することが先に示されている（ＬＬＣ−ＰＫ１）（Ｅｖｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７，１２１１−１２１８）。本研究では、Ｃ末端に融合したＧＦＰを持つヒトＭＲＰ１も極性ＭＤＣＫ細胞の基底外側膜局在を示した（図２）。
【０１９８】
これらの研究は、ＭＲＰ１およびｃＭＯＡＴのＧＦＰへの融合が、基底外側膜および頂上膜へのこれらの蛋白質の正常なターゲッティングを妨害しないことを証明する。
【０１９９】
ＭＤＣＫ細胞におけるΔｃＭＯＡＴの発現
ＭＲＰ１およびｃＭＯＡＴのＣ末端配列のアラインメントは、ＭＲＰ１にないｃＭＯＡＴのＣ末端モチーフ（本明細書では“Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフ”）を明らかにした。ＴＫＦモチーフがｃＭＯＡＴの頂上局在に影響を与えるか否かを確かめるために、３つのＣ末端残基が欠失したΔｃＭＯＡＴ−ｇｆｐを構築した。極性ＭＤＣＫ細胞において発現されるとき、ｃＭＯＡＴ−ｇｆｐの頂上局在とは対照的に、ΔｃＭＯＡＴ−ｇｆｐは外側および／ｎまたは基底外側膜に主に局在することが見出された（図３）。
【０２００】
ＭＤＣＫ細胞におけるｃＭＯＡＴ−ｇｆｐ置換変異体の局在
ΔｃＭＯＡＴ−ｇｆｐのＴＫＦモチーフの特性をさらに検討するため、および各残基の相対的重要性を確定するために、個々のアラニン突然変異がｃＭＯＡＴ−ｇｆｐ構築物の残基位置１５４３−１５４５のそれぞれに導入された（表５）。残基１５４２〜１５４４（Ｓ−Ｔ−Ｋ）が予言されたリン酸化部位を形成するため、残基１５４２もアラニンに変異された。図４Ａから４ＥまではＭＤＣＫ細胞におけるこれらの変異体のそれぞれの局在を示す。置換の効果は、天然の蛋白質と比べた変異体の局在における変化を視覚化することにより確かめられた。Ｔ１５４３ＡおよびＫ１５４４Ａ変異体（表５）は細胞内小胞における蛋白質蓄積の増加を伴った、頂上および基底外側ターゲッティングを共に示した。Ｆ１５４５Ａ変異体（表５）は天然のｃＭＯＡＴに比較して、ＭＤＣＫ細胞における変化した局在を示さなかった。３つの残基すべてのアラニンへの突然変異は（すなわち、表５におけるＴ１５４３ＡＫ１５４４ＡＦ１５４５Ａ変異体）も蛋白質を基底外側膜に局在させた。
【０２０１】
Ｌ１２１０細胞におけるｃＭＯＡＴの発現
初期の研究において、本発明者らはマウス白血病細胞系統Ｌ１２１０において発現されたｃＭＯＡＴによるＤＮＰ−ＧＳの輸送の証拠をほとんど見いだせなかった（データは示さない）。この機能の欠如は、蛋白質がこれらの細胞において細胞膜に局在しなかったことを示す。この観察を確かめるために、ｃＭＯＡＴ−ｇｆｐをＬ１２１０細胞に発現させ、それらがわずかに膜に局在するだけで主に細胞内小胞に局在することが見出された（図５Ａ）。ΔｃＭＯＡＴ−ｇｆｐはＭＤＣＫ細胞において基底外側膜に局在したため、Ｌ１２１０細胞膜に局在することが可能かどうかを確かめることに興味を抱いた。ｃＭＯＡＴ−ｇｆｐとは対照的に、ΔｃＭＯＡＴ−ｇｆｐはほとんどもっぱら細胞膜に局在してＬ１２１０細胞に発現された（図５Ｂ）。局在を確かめるために、免疫蛍光法によりＧＦＰタグなしに、ｃＭＯＡＴおよびΔｃＭＯＡＴを安定発現する細胞を検討した。ｃＭＯＡＴは細胞内に検出され、図５Ａに示されたものと同じ分布である、細胞内における小胞性の局在をした（図５Ｃ）。ΔｃＭＯＡＴポリペプチドは、細胞膜に検出され（図５Ｄ）、図５Ｂに示したΔｃＭＯＡＴポリペプチドと同じ局在を示した。
【０２０２】
これらのデータは、ｃＭＯＡＴのＴＫＦモチーフの欠失が非極性細胞Ｌ１２１０細胞の膜への蛋白質の成功したターゲッティングを示唆する。しかし、ΔｃＭＯＡＴまたはΔｃＭＯＡＴ−ｇｆｐを発現するいくつかのＬ１２１０細胞は多少細胞内蓄積を示した。
【０２０３】
２，４−ジニトロフェニルグルタチオン輸送
Ｌ１２１０細胞は非接着性および非極性であり、ｃＭＯＡＴの輸送機能を評価するための都合のよい細胞系統として潜在的に使用することができる。図６に示すように、ΔｃＭＯＡＴを安定発現するＬ１２１０細胞は、対照Ｌ１２１０細胞または天然のｃＭＯＡＴ蛋白質を発現するＬ１２１０細胞に比べ、ＤＮＰ−ＧＳの著しく高いエフラックスを示した。
【０２０４】
考察
ヒトｃＭＯＡＴは肝臓および腎臓の極性上皮細胞の頂上膜に特異的に局在する。この局在はＭＤＣＫ細胞（Ｅｖｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１，１３１０−１３１９；およびＣｕｉ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９９）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５，９２９−９３７）およびＬＬＣ−ＰＫ１細胞（Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９９）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒ−ｍａｃｏｌ．５６，１２１９−１２２８；およびＫａｗａｂｅ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９９）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．４５６，３２７−３３１）において実験的に追試することが可能であり、本発明者らは本研究においてｃＭＯＡＴ−ｇｆｐ融合蛋白質も頂上膜に局在することを示す（図１）。このことから、頂上局在のためのターゲッティングシグナルを確定するための変異解析を行った。ｃＭＯＡＴのＣ末端からの３アミノ酸の欠失（ΔｃＭＯＡＴ−ｇｆｐ）は、ＭＤＣＫ細胞において基底外側膜への蛋白質のターゲッティングの劇的な変化、ならびに外側および頂上膜へのより少ない程度のターゲッティングを引き起こした。極性細胞における変異体の局在は、通常はＴ−Ｋ−Ｆモチーフを持たないＭＲＰ１のそれに類似した（図２）。この観察は、３アミノ酸モチーフがｃＭＯＡＴを頂上膜に方向付け、そして任意の基底外側膜ターゲッティングシグナルを支配することを示唆する。
【０２０５】
さらに、Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフの欠失はまた、非極性Ｌ１２１０細胞の細胞膜に局在する、改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドを生じる。対照的に野生型ｃＭＯＡＴは主にＬ１２１０細胞の細胞内にある。
【０２０６】
Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフの性状をさらに調べるために、アラニンを各残基の位置に別々に導入し、そして３残基すべてがアラニンに置換された付加的な変異体が作製された。
【０２０７】
本発明者らのデータは、機能的Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフはコンセンサス配列Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｈｙにより特徴付けられることを示唆し、ここでＸは任意のアミノ酸を表し、Ｈｙは疎水性残基である（Ｓｏｎｇｙａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７５，７３−７７）。たとえば、Ｔ１５４３Ａ変異体は基底外側および頂上の両方を標的とする（非極性ターゲッティング）、天然のｃＭＯＡＴ蛋白質に匹敵する変化したターゲッティング、および小胞への増大した蓄積を示し、ターゲッティング機序における多少の不安定性を示した。この結論はまた、ＴＫＦ−ＡＡＡ変異体により得られた結果と一致する。Ｆ１５４５Ａ変異体は通常のターゲッティングを変化させず、位置１５４５のアラニンが十分に疎水性なため、通常のターゲッティングがおこることを示唆する。したがって、Ｋ１５４４Ａも基底外側膜を標的としたため、任意の残基（Ｘ）はｃＭＯＡＴの位置１５４５において耐性があるが位置１５４４では耐性でなくてもよい。
【０２０８】
興味深いことに、位置１５４２のセリン残基は予言されたリン酸化部位を形成し、そしてこのセリン残基の突然変異が融合蛋白質を頂上下小胞に局在させた。これらのデータは、Ｓ１５４２がリン酸化されてもよく、そして頂上膜への動員を調節することができることを暗示する。
【０２０９】
ＭＤＣＫ細胞と比較したＬ１２１０細胞におけるｃＭＯＡＴのソーティングには顕著な差がある。Ｌ１２１０細胞において発現される場合、ｃＭＯＡＴ輸送機能は最小であった（結果は示さない）。ｃＭＯＡＴを発現する細胞の免疫蛍光研究およびｃＭＯＡＴ−ｇｆｐを発現する細胞の共焦点イメージングは共にＬ１２１０細胞における蛋白質の細胞内局在を確証する（図５）。ｃＭＯＡＴおよびｃＭＯＡＴ−ｇｆｐ由来のＴ−Ｋ−Ｆモチーフの欠失が変異体蛋白質を細胞膜に発現させ、膜から天然のｃＭＯＡＴを閉め出すのは、この頂上ターゲッティングモチーフであることを示唆する。膜における蛋白質の安定性はまた、ＭＤＣＫ細胞およびＬ１２１０細胞間で異なる。ＭＤＣＫ細胞ではΔｃＭＯＡＴ−ｇｆｐは細胞の大部分において基底外側に局在する。
【０２１０】
実施例２
配列アラインメントおよび分子モデリング由来の他のＡＢＣトランスポータポリペプチドにおけるＴＫＦモチーフ
【０２１１】
実験方法
Ｐ−糖蛋白質およびＭＲＰサブファミリー由来の３７ＡＢＣトランスポータのＣ末端細胞質ドメインの蛋白質配列は、ＣｌｕｓｔａＩＷアラインメントプログラムを使用して、ヒスチジンパーミアーゼ（ＨｉｓＰ）により並べられた。ＡＮＧＩＳインターネットサイトにおけるＢｉｏｎａｖｉｇａｔｏｒ（ｅＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．によるＢｉｏｎａｖｉｇａｔｏｒ）を使用して、多重配列アラインメントをＨｉｓＰ結晶構造の座標と共に使用し、ＭＲＰ１およびｃＭＯＡＴ由来のＣ末端細胞質ドメインの相同性モデルを作製した。モデルはＲｉｇｏｒｏｕｓ　Ｍｏｄｅｌｓ　ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｂａｇｙａｎ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．１５，４８８−５０６）を使用して作製し、Ｓｗｉｓｓ　Ｐｄｂ　Ｖｉｅｗｅｒ（ｖ３．６ｂ３）を使用して提示した（Ｇｕｅｘ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９７）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　１８，２７１４−２７２３）
【０２１２】
結果
図７に示されたアラインメントは、基底外側膜を標的にするＭＲＰ１、ＭＲＰ３，ＭＲＰ５，およびＭＲＰ６と比較したとき、頂上膜に局在するそれらのＭＲＰ蛋白質（４つの種由来のｃＭＯＡＴ）がＣ末端Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフを有することを示す。Ｐ−ｇｐ、ＭＤＲ３，およびＭＲＰ４蛋白質も、それらのＣ末端に潜在的なＴ−Ｋ−Ｆモチーフを有する。
【０２１３】
ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）由来のヒスチジンパーミアーゼのＡＴＰ結合サブユニットの構造座標（Ｈｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ　３９６，７０３−７０７）および全ＡＢＣトランスポータ配列アラインメントにより、ＭＲＰ１およびｃＭＯＡＴの等価領域の相同性モデルを構築した（図８）。ｃＭＯＡＴのＣ末端モチーフはＨｉｓＰを持つアラインメントを越えて伸長するため、Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフの正確な位置を予言することはできない。しかし、モデルはＴ−Ｋ−Ｆモチーフが蛋白質の外側に位置し、ＡＴＰ結合カセットおよび細胞質サブユニット界面に含まれる領域から離れていることを予言する。さらに、モチーフの外側の位置はターゲッティング過程に関与する他の蛋白質との相互作用に好都合であろう。
【０２１４】
考察
Ｔ−Ｋ−Ｆモチーフの欠失はＭＲＰ１に対するｃＭＯＡＴの配列類似性を増し、ＭＲＰ１で観察されたものと同じ基底外側膜ターゲッティングを生じる。サブユニットの三次構造およびモチーフの位置を検討するために、ＨｉｓＰの結晶構造を基に、ＭＲＰ１およびｃＭＯＡＴ両方の相同性モデルを構築した。相同性モデルの比較はＭＲＰ１およびｃＭＯＡＴのＣ末端の長さの差を明らかに示す。ＴＫＦモチーフが頂上局在に関与するだけであるか否か、またはそれが伸長の空間的配置およびＡＢＣトランスポータ蛋白質の他の部分に結合／改変させる予言されたＴ−Ｋ−Ｆモチーフであるか否かは、明らかでない。ｃＭＯＡＴの相同性モデルから、おそらくＴ−Ｋ−Ｆモチーフは相互作用に役立ち、サブユニット内に埋もれていないと考えられる。また、このモデルのＣ末端の位置は、モチーフがＡＴＰ結合部位のような機能的に重要な領域と相互作用しないことを示唆する。このことはさらに、Ｌ１２１０細胞において発現される場合、２，４−ジニトロフェニルグルタチオンを輸送する欠失変異体ΔｃＭＯＡＴの能力により支持される（図６）。
【０２１５】
ＭＲＰ１またはｃＭＯＡＴのＣ末端へのＧＦＰの結合は、ｃＭＯＡＴの正確なターゲッティングを妨害しなかった。図８の相同性モデルに基づき、Ｃ末端へリックスの位置はＧＦＰがサブユニットの外側に位置することを示唆する。したがって、ＧＦＰの位置はＴ−Ｋ−Ｆモチーフが自由に暴露され、機能するためにカルボキシル化される必要がないことを示唆するであろう。これを支持して、ウサギｃＭＯＡＴはヒト、マウス、およびラットｃＭＯＡＴと同じ位置に予言されたＴ−Ｋ−Ｆモチーフを有するが、下流に別の２１アミノ酸を含む（図７）。
【０２１６】
ＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターのＣＭＶプロモータ下に、ＧＦＰ融合蛋白質は一定のレベルで発現された。ｃＭＯＡＴ−ｇｆｐ融合蛋白質は、図１に示すように極性ＭＤＣＫ細胞の大部分で頂上側に局在した。ｃＭＯＡＴは卵巣癌細胞系統（Ｋｏｏｌ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５７，３５３７−３５４７）、腎明細胞癌（Ｓｃｈａｕｂ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１０，１１５９−１１６９）、肺、胃、および結直腸癌細胞（Ｎａｒａｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２４０，６０６−６１１）に発現されることが見出されている。
【０２１７】
基底外側ＭＲＰ蛋白質ＭＲＰ１、ＭＲＰ３，ＭＲＰ５，およびＭＲＰ６とｃＭＯＡＴのアラインメントは、基底外側トランスポータにおけるモチーフの欠失を示す（図７）。このアラインメントに基づき、ｃＭＯＡＴ残基１５３９−１５４５は基底外側蛋白質と比較してＣ末端伸長の全長であるため、ターゲッティング機序において役割を果たすであろう。
【０２１８】
実施例３
改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドはＬ１２１０細胞にブスルファンへの耐性を与える。
【０２１９】
ブスルファンは通常グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼにより細胞質中でグルタチオンに抱合し（Ｃｚｅｒｗｉｎｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ（１９９６）Ｄｒｕｇ　Ｍｅｔ．Ｄｉｓｐｏｓ．２４，１０１５−１０１９）、抱合体がおそらくｃＭＯＡＴの基質であることを示唆する。したがって、ブスルファンに耐性を与える改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドの能力がＬ１２１０細胞において測定された。とりわけ、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４に示されたアミノ酸配列を有するΔｃＭＯＡＴポリペプチドは実施例１に記載のようにＬ１２１０細胞に発現された。トランスフェクトされた細胞はブスルファンの一連の濃度に暴露した。野生型Ｌ１２１０細胞、および天然のｃＭＯＡＴまたはΔｃＭＯＡＴのいずれかを発現するトランスフェクトされたＬ１２１０細胞の生存はブスルファンの存在下で測定された。生存はまた、ブスルファンに暴露されなかった細胞の増殖に比較して評価された。細胞増殖および生存は標準方法を使用してアッセイした（Ｄｅｎｉｚｏｔ　ｅｔ　ａｌ（１９８６）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　８９，２７１−２７７）。図８に提示されたデータは、ΔｃＭＯＡＴを発現するそれらの細胞が非トランスフェクトＬ１２１０細胞、または天然のｃＭＯＡＴを発現するＬ１２１０細胞よりブスルファンに対して著しく高い耐性を有していたことを示す（すなわち、ＩＣ５０の２倍の増加がΔｃＭＯＡＴを発現する細胞で測定された）。
【０２２０】
ΔｃＭＯＡＴがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６、１０、１２、および１６に示された他の改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドと機能的に等価であることに基づき、本開示から非極性細胞に任意の化合物への耐性を与える他の配列の有用性を当業者は認識するであろう。
【０２２１】
実施例４
ＡＢＣトランスポータのモジュレーターをスクリーニングするための改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチドの使用
造血系列、たとえばＬ１２１０細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞の細胞懸濁液の細胞膜に対する改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドのターゲッティングにより、ｃＭＯＡＴにより輸送される治療薬、またはｃＭＯＡＴを調節する治療薬は細胞から輸送されるそれらの能力のために検出される。改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドをコードする、変異したｃＭＯＡ　ｃＤＮＡ配列を安定してトランスフェクトされる細胞を、細胞毒性ではないレベルにおいてそのような新規治療薬と共にインキュベートする。インキュベーション後、細胞の上清をＨＰＬＣにより分析し、薬物が代謝されたか否かを測定する。あるいは蛍光化学物質の場合、細胞はフローサイトメトリーにより、ｃＭＯＡＴ排出機能による蛍光の減少を調べる。Ｆｌｕｏ−３のようなｃＭＯＡＴの既知の蛍光基質を使用して、ｃＭＯＡＴの潜在的モジュレーターを、フローサイトメトリーにより測定された蛍光化合物の輸送の阻害を検出することにより試験する。
【０２２２】
好ましくは、改変されたＡＢＣトランスポータポリペプチド（すなわち、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４、６、１０、１２、または１６で示される改変されたｃＭＯＡＴポリペプチド；ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４９の改変されたｃＭＯＡＴポリペプチド、またはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５１の改変されたｃＭＯＡＴポリペプチドの任意の一つ）を発現するＬ１２１０細胞は適切な基質、たとえば、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンまたはモノ−クロロビマン（チオライト、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）または７−クロロ−４−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートし、それらを吸光度または蛍光を測定することによりアッセイする。その後トランスフェクトされた細胞は；（ｉ）適宜、天然のｃＭＯＡＴ、ＭＤＲ３，またはＭＲＰ４である対応する天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドの阻害剤候補、または活性剤候補（すなわち試験試料）と共に；および（ｉｉ）候補化合物を添加せずに（すなわち対照試料）それぞれインキュベートする。グルタチオン抱合体の細胞からのエフラックス速度は培地中のグルタチオン抱合体の吸光度または蛍光を測定することにより、試験試料および対照試料共に測定する。試験化合物の吸光度または蛍光が対照試料の吸光度または蛍光と有意に異なる試料が選択される。グルタチオン抱合体の、より促進された細胞からのエフラックスを誘発する候補化合物（たとえば、対照試料の吸光度または蛍光と比べた試験化合物の高い吸光度または蛍光）は天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのアゴニストとして分類され、細胞からのグルタチオン抱合体のエフラックスを減少させる候補化合物（すなわち、対照試料の吸光度または蛍光と比べた試験化合物の減少した吸光度または蛍光）は天然のＡＢＣトランスポータポリペプチドのアンタゴニストとして分類される。場合により、このスクリーニングはハイスループット形態、たとえばグルタチオン抱合体を検出する能力に基づいた複数の試料のＦＡＣＳスクリーニングに容易に適合する。
【０２２３】
実施例５
改変されたＭＤＲ３ポリペプチド
本発明者らは、実施例１に記載のｃＭＯＡＴに対して確立された方法を使用して、Ｌ１２１０細胞およびＭＤＣＫ細胞の両方において、ＴＫＦモチーフ候補を欠失する改変されたＭＤＲ３ポリペプチド（すなわちＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４９）の局在を証明しようと試みた。緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）融合蛋白質のようなポリペプチドを発現させることにより、改変されたＭＤＲ３の局在の確定は促進される。
【０２２４】
実験方法
ＧＦＰとの融合蛋白質としての改変されたＭＤＲ３をコードする遺伝子構築物　以下に記載のように、ＭＤＲ３−ｇｆｐ融合蛋白質の局在の検出を容易にするために、ＧＦＰをヒトＭＤＲ３ポリペプチドのＣ末端領域に融合させる。
【０２２５】
ヒトＭＤＲ３　ｃＤＮＡは、ＰｆｕＴｕｒｂｏ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応により天然のＭＤＲ３をコードするｃＤＮＡ（受託番号：ＸＭ　０２９０５７）から増幅し、停止コドンを除去し、クローニングに適切な制限酵素部位を導入する。改変されたＭＤＲ３をコードするＤＮＡは、以下のような開始コドンに隣接したＮｈｅＩ部位を添加するセンスプライマー：
【０２２６】
【化６】
2004512831.tif 000016
【０２２７】
および以下のような最終コドンの後にＡｇｅｌ部位を添加して停止コドンを除去するアンチセンスプライマー：
【０２２８】
【化７】
2004512831.tif 000017
【０２２９】
を使用して増幅する。
ポリメラーゼ連鎖反応生成物は、Ｎｈｅｌ／Ａｇｅｌにより消化し、Ｎｈｅｌ／Ａｇｅｌ消化ＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）に連結し、改変されたＭＤＲ３をコードするヌクレオチド配列をすぐ上流で、そのベクター中のＧＦＰをコードするヌクレオチド配列のフレーム内に導入する。
【０２３０】
改変されたＭＤＲ３−ｇｆｐ構築物（トランスフェクションごとにＤＮＡ　１μｇ）は、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥトランスフェクションキット（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、ＭＤＣＫ細胞およびＬ１２１０細胞にトランスフェクトされる。ＭＤＣＫ細胞のトランスフェクションは、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅｓ（Ｃｏｓｔａｒ，２４ｍｍｘ３μｍ　ポリカーボネート膜）を使用して行い、細胞分極を可能にする。細胞は、共焦点顕微鏡観察のためにＲａｄｉａｎｃｅ　２０００　Ｌａｓｅｒ　Ｓｃａｎｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍに連結したＮｉｋｏｎ　ＴＥ３００倒立顕微鏡およびＬａｓｅｒｓｈａｒｐ　２０００　ｉｍａｇｉｎｇ　ｓｏｆｔｗｅｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して観察する。
【０２３１】
ｇｆｐタグを持たない改変されたＭＤＲ３ポリペプチドの発現
改変されたＭＤＲ３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（すなわち、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４８）はＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キットを使用して作製し、ＧＦＰタグをコードするヌクレオチド配列をもたないクローニングを容易にする。この構築物を作製するために、哺乳動物発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５６，４１２４−４１２９）中に野生型ＭＤＲ３　ｃＤＮＡを含む鋳型ＤＮＡを、天然のＭＤＲ３のＴ−Ｋ−Ｆモチーフをコードするヌクレオチドを含まないプライマーを使用して増幅する。成功したクローンの変異誘発は配列決定によって確かめ、ｐＲｃ／ＣＭＶベクター中のそれらのクローンはＬ１２１０細胞にトランスフェクトされる。
【０２３２】
［３Ｈ］パクリタキセルの輸送は、改変されたＭＤＲ３ポリペプチドを発現するＬ１２１０細胞で測定し、任意のＭＤＲ３ポリペプチドを異所性に発現しない対照Ｌ１２１０細胞からの［３Ｈ］パクリタキセルのエフラックスと比較する。
【０２３３】
結果
改変されたＭＤＲ−ｇｆｐ融合蛋白質の局在
検討中の蛋白質の局在を都合よく検出するために、ＧＦＰ融合蛋白質を作製し、上記のように、蛍光生成物を視覚化するための共焦点顕微鏡観察を使用して、それらの局在を視覚化する。
【０２３４】
極性ＭＤＣＫ細胞に発現される場合、改変されたＭＤＲ３ポリペプチドは天然のＭＤＲ３に比べて変化した局在をすることが見出され、ここで改変されたポリペプチドはもはや主として頂上膜に局在することはない。
Ｌ１２１０細胞において、改変されたＭＤＲ３ポリペプチドは細胞膜に見出される。
【０２３５】
［３Ｈ］パクリタキセルの輸送
ＧＦＰタグを持たない改変されたＭＤＲ３ポリペプチドを安定して発現するＬ１２１０細胞は対照Ｌ１２１０細胞に比べ、［３Ｈ］パクリタキセルの有意に高いエフラックスをする。
【０２３６】
実施例６
改変されたＭＲＰ４ポリペプチド
はじめに
本発明者らは、実施例１および５に記載された方法を使用して、Ｌ１２１０細胞およびＭＤＣＫ細胞の両方においてＴＫＦモチーフ候補を欠如する改変されたＭＲＰ４ポリペプチド（すなわち、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５１）の局在を、これらの細胞系統において異所性に発現される改変されたＭＲＰ４−ｇｆｐ融合ポリペプチドの局在を分析することにより証明しようと試みた。
【０２３７】
実験方法
ＧＦＰとの融合蛋白質としての改変されたＭＤＲ３をコードする遺伝子構築物
ＧＦＰをヒトＭＲＰ４ポリペプチドのＣ末端領域に融合させ、以下に記載のように、ＭＲＰ４−ｇｆｐ融合蛋白質局在の検出を容易にする。
【０２３８】
ヒトＭＲＰ４　ｃＤＮＡは、ＰｆｕＴｕｒｂｏ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してポリメラーゼ連鎖反応により天然のＭＲＰ４をコードするｃＤＮＡ（受託番号：ＸＭ０３６４５３）から増幅し、停止コドンを除去し、クローニングのために適切な制限酵素部位を導入する。改変されたＭＲＰ４をコードするｃＤＮＡは以下のような開始コドンに隣接したＮｈｅｌ部位を添加するセンスプライマー：
【０２３９】
【化８】
2004512831.tif 000018
【０２４０】
および以下のような最終コドンの後にＡｇｅｌ部位を添加して停止コドンを除去するアンチセンスプライマー：
【０２４１】
【化９】
2004512831.tif 000019
【０２４２】
を使用して増幅する。
ポリメラーゼ連鎖反応生成物は、Ｎｈｅｌ／Ａｇｅｌにより消化し、Ｎｈｅｌ／Ａｇｅｌ消化ＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）に連結し、改変されたＭＲＰ４をコードするヌクレオチド配列をすぐ上流で、そのベクター中のＧＦＰをコードするヌクレオチド配列のフレーム内に導入する。
【０２４３】
改変されたＭＲＰ４−ｇｆｐ構築物（トランスフェクションごとにＤＮＡ　１μｇ）は、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥトランスフェクションキット（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、ＭＤＣＫ細胞およびＬ１２１０細胞にトランスフェクトされる。ＭＤＣＫ細胞のトランスフェクションは、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅｓ（Ｃｏｓｔａｒ，２４ｍｍｘ３μｍ　ポリカーボネート膜）を使用して行い、細胞分極を可能にする。細胞は、共焦点顕微鏡観察のためにＲａｄｉａｎｃｅ　２０００　Ｌａｓｅｒ　Ｓｃａｎｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍに連結したＮｉｋｏｎ　ＴＥ３００倒立顕微鏡およびＬａｓｅｒｓｈａｒｐ　２０００　ｉｍａｇｉｎｇ　ｓｏｆｔｗｅｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して観察する。
【０２４４】
ｇｆｐタグを持たない改変されたＭＲＰ４ポリペプチドの発現
改変されたＭＲＰ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（すなわち、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５０）はＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キットを使用して作製し、ＧＦＰタグをコードするヌクレオチド配列をもたないクローニングを容易にする。この構築物を作製するために、哺乳動物発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５６，４１２４−４１２９）中に野生型ＭＲＰ４　ｃＤＮＡを含む鋳型ＤＮＡを、天然のＭＲＰ４のＴ−Ｋ−Ｆモチーフをコードするヌクレオチドを含まないプライマーを使用して増幅する。成功したクローンの変異誘発は配列決定によって確かめ、ｐＲｃ／ＣＭＶベクター中のそれらのクローンはＬ１２１０細胞にトランスフェクトされる。
【０２４５】
改変されたＭＲＰ４ポリペプチドを発現するＬ１２１０細胞に放射標識した６−メルカプトプリンを添加し、６−チオ−ＩＭＰのエフラックスを天然のＭＲＰ４を発現するＬ１２１０細胞の６−チオ−ＩＭＰのエフラックス、または任意のＭＲＰ４ポリペプチドを異所性に発現しない対照Ｌ１２１０細胞の６−チオ−ＩＭＰのエフラックスと比較する。
【０２４６】
結果
改変されたＭＲＰ４−ｇｆｐ融合蛋白質の局在
検討中の蛋白質の局在を都合よく検出するために、ＧＦＰ融合蛋白質を作製し、上記のように、蛍光生成物を視覚化するための共焦点顕微鏡観察を使用して、それらの局在を視覚化する。
【０２４７】
極性ＭＤＣＫ細胞において発現される場合、改変されたＭＲＰ４−ｇｆｐポリペプチドは天然のＭＲＰ４に比べ、変化した局在を示すことが見出され、ここで改変されたポリペプチドはもはや主として頂上膜には局在しない。
Ｌ１２１０細胞において、改変されたＭＲＰ４ポリペプチドは細胞膜に見出される。
【０２４８】
６−メルカプトプリン輸送
ＧＦＰタグを持たない改変されたＭＲＰ４ポリペプチドを安定発現するＬ１２１０細胞は、対照Ｌ１２１０細胞または天然のＭＲＰ蛋白質を発現する細胞に比べ、著しく高く６−チオ−ＩＭＰをエフラックスする。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、細胞のコンフルエント単層においてｃＭＯＡＴ‐ｇｆｐを発現する代表的なＭａｄｉｎｅ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞の写真のコピーである。蛍光はトップダウン画像（上部パネル）では細胞全体にわたり明白である。しかし、横断面では、ＸＺ画像は蛋白質の特異的な頂上部（ＡＰ）局在および、最小の基底外側（ＢＬ）ターゲッティングを示す（下部パネル）。カバーガラスは自己蛍光のために細胞の頂上表面上に線として検出される。すべての縮尺線は５ミクロンを示す。
【図２】
図２は、トップダウン画像（上部パネル）ではＭＲＰ１‐ｇｆｐを発現するコンフルエントＭＤＣＫ細胞が、基底外側（ＢＬ）膜における蛍光のために環状の外観を有することを示す、写真のコピーである。ＸＺ画像（下部パネル）では、ＭＲＰ１‐ｇｆｐの外側ターゲッティングが、明確にされた細胞‐細胞膜により確かめられる。ＡＰ、頂上。
【図３】
図３は、トップダウン画像（上部パネル）では、ΔｃＭＯＡＴ‐ｇｆｐを発現するコンフルエントＭＤＣＫ細胞が、ＭＲＰ１‐ｇｆｐに類似した外観（図２）を持ち、環状に見えることを示す写真のコピーである。ＸＺ画像（下部パネル）では、ΔｃＭＯＡＴ‐ｇｆｐが、蛍光蛋白質により輪郭が描かれた、細胞‐細胞膜による明確な外側局在を示す。頂上（ＡＰ）ターゲッティングはＧＦＰに融合した天然のｃＭＯＡＴに比べ最小である。
【図４】
図４はｃＭＯＡＴ部分のＴ−Ｋ−Ｆモチーフの突然変異を含む改変されたｃＭＯＡＴ‐ｇｆｐ融合蛋白質の局在を示す写真のコピーである。以下のように各図の上部パネルは、細胞のトップダウン画像を表し、一方下部パネルは細胞のＸＺ画像を表す。
図４ＡはＴ１５４３Ａ突然変異体が融合蛋白質の非極性分布をすることを示す写真のコピーである。蛍光は頂上（ＡＰ）および基底外側（ＢＬ）膜の両方で検出されたトップダウン画像の環状外観を与えるが、ＸＺ画像（下部パネル）は非極性分布を示す。細胞内蛍光はバックグラウンド自己蛍光のためであり、ＧＦＰのためではない。
図４ＢはＫ１５４４Ａ突然変異体も融合蛋白質の極性分布を失い、蛋白質が頂上および基底外側膜において検出されることを示す写真のコピーである。
図４ＣはＦ１５４５Ａ突然変異体が天然の蛋白質と同じ局在をすることを示す写真のコピーである。
図４Ｄは、トリプル突然変異体（すなわちＴ１５４３ＡＫ１５４４ＡＦ１５４５Ａ）がトップダウン画像（上部パネル）では頂上に局在するが、ＸＺ画像（下部パネル）では頂上および基底外側膜の両方に分布し、非極性分布を示唆することを示す写真のコピーである。
図４Ｅは、Ｓ１５４２Ａ変異体が明瞭な分布を示さないことを示す写真のコピーであり、細胞膜は蛋白質の蛍光により輪郭が描かれているが、ＸＺ画像（下部パネル）でより綿密に観察すると、蛍光は膜下小胞中にあると考えられる。
【図５】
図５は、以下のようにＬ１２１０細胞におけるｃＭＯＡＴポリペプチドの分布を示す写真のコピーである：
図５Ａは、ｃＭＯＡＴ‐ｇｆｐにより一過性にトランスフェクトされたＬ１２１０細胞を示す写真のコピーである。ｃＭＯＡＴ‐ｇｆｐの大部分は細胞内小胞に蓄積され、細胞膜局在は最小であった。
図５Ｂは、ΔｃＭＯＡＴ‐ｇｆｐにより一過性にトランスフェクトされたＬ１２１０細胞を示す写真のコピーである。ΔｃＭＯＡＴ‐ｇｆｐの大部分は細胞膜に局在した。
図５Ｃは、Ｌ１２１０細胞においてｃＭＯＡＴに結合するＭ２　ＩＩＩ６抗体を示す写真のコピーである。天然のｃＭＯＡＴは核（Ｎ）を囲む細胞内小胞中に検出された。この局在はｃＭＯＡＴ‐ｇｆｐ局在と一致する。
図５Ｄは、Ｌ１２１０細胞においてΔｃＭＯＡＴに結合するＭ２　ＩＩＩ６抗体を示す写真のコピーである。ΔｃＭＯＡＴは細胞膜中に検出され、ΔｃＭＯＡＴ‐ｇｆｐにより見出されたＴＫＦモチーフ欠失の効果を裏づける。
【図６】
図６は、分光光度法により測定した、Ｌ１２１０細胞による上清への一定の時間間隔におけるＤＮＰ−ＧＳのエフラックスを示すグラフである（Ｏｌｉｖｅ　ｅｔ　ａｌ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２２４，２６４−２６８）。対照Ｌ１２１０細胞（○）および野生型ｃＭＯＡＴによりトランスフェクトされたそれらの細胞（■）は同じエフラックス速度であった。ΔｃＭＯＡＴを発現するＬ１２１０細胞（▲）は細胞外培地へのＤＮＰ−ＧＳの輸送を増大させた。ＤＮＰ−ＧＳのバックグラウンド輸送は構成性ＭＲＰ１のためであった。結果は３回の別々の実験の平均値±Ｓ．Ｄ．である。
【図７】
図７は、ＨｉｓＰ蛋白質を持つ多数の種由来のＡＢＣトランスポータ蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列アラインメントのグラフである。このアラインメントは３７ＡＢＣトランスポータのＣ末端細胞質ドメインのアラインメントに由来する。ｃＭＯＡＴ相同体は基底外側を標的にした蛋白質ＭＲＰ１、ＭＲＰ３，およびＭＲＰ６と比べ、異なるＣ末端範囲を有する。アラインメントにより提示される配列は、以下の天然に存在するＡＢＣトランスポータ蛋白質のＣ末端部分である：ＨｉｓＰ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４５）；ヒトｃＭＯＡＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７）；マウスｃＭＯＡＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４６）；ラットｃＭＯＡＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８）；ウサギｃＭＯＡＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９）；ヒトＰ−ｇｐ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０）；ラットＰ−ｇｐ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１）；ヒトＭＤＲ３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２）；ヒトＭＲＰ１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３）；およびヒトＭＲＰ４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４７）。各配列のＴＫＦモチーフは太字で表す。
【図８】
図８は、ＨｉｓＰの結晶構造に基づいた、天然のＭＲＰ１（上部パネル）および天然のｃＭＯＡＴ（下部パネル）のＣ−末端ドメインの相同性モデルの写真のコピーである。画像は膜から細胞質へのサブユニットを見下ろしている。下部面はＣ−末端へリックスである（各パネルにおいて“Ｃ−末端”と記される）。天然のｃＭＯＡＴのＣ−末端へリックスは明らかに天然のＭＲＰ１より長い。Ｔ−Ｋ−ＦモチーフはｃＭＯＡＴのＣ−末端へリックスの末端に位置する。
【図９】
図９は、ΔｃＭＯＡＴ（すなわちＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４）を発現するＬ１２１０細胞の化学療法剤ブスルファンに対する増大した耐性を示すグラフである。細胞はブスルファンの一連の濃度範囲（Ｘ−軸）でインキュベートし、縦軸に示すように、生き残った細胞の割合を測定した。細胞は、野生型細胞（◆）；天然のｃＭＯＡＴを発現するＬ１２１０細胞（−■−）；またはΔｃＭＯＡＴを発現するＬ１２１０細胞（−△−）のいずれかであった。ΔｃＭＯＡＴを発現するＬ１２１０細胞の最適指数関数モデルも示す。ΔｃＭＯＡＴを発現するＬ１２１０細胞は試験した他の細胞よりブスルファンに対して少なくとも２倍高いＩＣ５０を有していた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
2004512831.tif 000029
【図８】
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【図９】
2004512831.tif 000031
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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