(57)【要約】本発明は、ＮＥＴ（ＥＲＰ／ＳＡＰ−２）タンパク質の活性の制御、およびＮＥＴタンパク質の活性を修飾または調節する化合物に関する。さらに、本発明は、新規な前血管新生化合物または抗血管新生化合物を同定するためのＮＥＴのアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、およびこれらの化合物の治療における使用に関する。また、本発明はＮＥＴ遺伝子に突然変異のあるトランスジェニック動物にも関する。
2004512051.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生を調節するか、または血管新生疾患に関連する病状の予防および／または治療に有効である化合物の同定方法におけるＮＥＴポリペプチドの全てもしくは部分、またはＮＥＴポリペプチドの全てもしくは部分を発現する細胞の使用。
【請求項２】
ＮＥＴポリペプチドが、
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の対立遺伝子変異体、
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質のスプライス変異体および
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の別の種類の相同タンパク質
からなる群より選択される請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ＮＥＴポリペプチドの部分が、Ａボックス（ヒト）＝配列番号２のａａ１−９０、Ｂボックス（ヒト）＝配列番号２のａａ１３３−１５１、Ｃボックス（ヒト）＝配列番号２のａａ３２１−３７８、Ｄボックス（ヒト）＝配列番号２のａａ２９０−２９９、ＮＩＤドメイン（ヒト）＝配列番号２のａａ１５３−３０８；ＪＥＸドメイン（ヒト）＝配列番号２のａａ２３３−３５３；ＣＩＤドメイン（ヒト）＝配列番号２のａａ２７４−２８２；Ａボックス（マウス）＝配列番号４のａａ１−９０、Ｂボックス（マウス）＝配列番号４のａａ１３３−１５１、Ｃボックス（マウス）＝配列番号４のａａ３２３−３８０、Ｄボックス（マウス）＝配列番号４のａａ２９１−３０１、ＮＩＤドメイン（マウス）＝配列番号４のａａ１５５−１９７； ＪＥＸドメイン（マウス）＝配列番号４のａａ２２２−２５３；ＣＩＤドメイン（マウス） ＝配列番号４のａａ２７５−２２０に相当するフラグメントから選択されるＮＥＴフラグメントからなる請求項１に記載の使用。
【請求項４】
化合物の同定方法がＮＥＴの転写活性の変調を検出することからなる請求項１に記載の使用。
【請求項５】
化合物の同定方法がＮＥＴ／ＤＮＡ相互作用の変調を検出することからなる請求項１に記載の使用。
【請求項６】
化合物の同定方法がＮＥＴリン酸化の変調を検出することからなる請求項１に記載の使用。
【請求項７】
化合物の同定方法が、他のポリペプチドエレメントと相互作用するＮＥＴポリペプチドの全てまたはフラグメントの能力を評価することからなる請求項１に記載の使用。
【請求項８】
化合物がＮＥＴのアゴニストである請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
化合物がＮＥＴのアンタゴニストである請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
血管新生疾患に関連する病状が不充分な脈管化を含みそして血管新生の増加を必要とするものであって、それらは心臓虚血または末梢虚血、傷治癒の不良、脈管再狭窄、褥瘡またはうっ血性潰瘍、胃腸潰瘍、胎盤機能不全症、無菌壊死、骨折治癒の不良、肺性高血圧および全身性高血圧、発作、血管性痴呆、アルツハイマー病、ＣＡＤＡＳＩＬ、甲状腺擬嚢胞、リンパ性浮腫等から選択されるものである請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
血管新生疾患に関連する病状が増加された脈管化を含みそして血管新生の阻害を必要とするものであって、それらはアテローム性動脈硬化症、血管腫、血管内皮腫、いぼ、発毛、瘢痕ケロイド、アレルギー性湿疹、不正子宮出血、濾胞性嚢胞、卵巣過剰刺激、子宮内膜症、呼吸窮迫、腹水、腹膜硬化（透析患者）、癒着形成（腹腔外科）、筋肉および心臓作用過剰負荷、肥満、慢性関節リウマチ、滑膜炎、骨および軟骨伸延、骨髄炎、パンヌス成長、骨増殖体形成、炎症および感染症（肝炎、肺炎、糸球体腎炎）、喘息、鼻ポリープ、種々の臓器（肝、腎臓、上皮）の移植、未熟児網膜症、糖尿病性網膜症、脈絡膜および他の眼内疾患、白軟化症、甲状腺炎、甲状腺肥大、膵臓移植等から選択されるものである請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
血管新生疾患に関連する病状がカポジ肉腫、腫瘍および／またはＮＥＴが活性化されているその他の病状から選択されるものである請求項９に記載の使用。
【請求項１３】
血管新生を調節する化合物を同定する方法であって、その方法が、
ｉ）哺乳類ＮＥＴ転写因子を含む組成物を提供すること；
ｉｉ）その組成物と候補化合物とを接触させること；並びに
ｉｉｉ） ＮＥＴ機能を調節する上記候補化合物の能力を評価すること
からなる方法。
【請求項１４】
評価工程がＮＥＴの転写活性の変調を検出することからなる請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｎｅｔの転写活性の変調が、転写因子のＮＥＴ転写活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインから構成されるキメラタンパク質の制御下において発現されたレポーター遺伝子の発現レベルの変化からなる請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
転写因子の前記ＤＮＡ結合ドメインがＧＡＬ４−ＤＮＡ結合ドメインである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
発現の検出が、安定にトランスフェクトされた哺乳類細胞においてなされる請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
評価工程がＮＥＴ／ＤＮＡ相互作用の変調を検出することからなる請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
ＮＥＴ／ＤＮＡ相互作用がゲルシフトアッセイによって評価される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＮＥＴ／ＤＮＡ相互作用が、ＮＥＴタンパク質に結合する標識されたヌクレオチドの定量化によって評価される請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
評価工程の検出が、ＮＥＴリン酸化の変調を検出することからなる請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
ＮＥＴリン酸化の変調の検出が、キナーゼ活性の結果としてのＮＥＴリン酸化を測定することからなる請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
キナーゼがｐ３８α、ｐ３８β、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２またはＪＮＫ３である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
評価工程が、その他のポリペプチドエレメントまたは核酸と相互作用するＮＥＴポリペプチドの全てまたはフラグメントの能力を評価することからなる請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
核酸と相互作用するＮＥＴポリペプチドの能力が、ＳＲＥエレメントと相互作用するＮＥＴ ＳＲＦ結合ドメインの能力からなる請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
他のポリペプチドと相互作用するＮＥＴポリペプチドの能力が、ＣｔＢＰエレメントと相互作用するＮＥＴ ＣｔＢＰ結合ドメイン（ＣＩＤ）の能力からなる請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
組成物が細胞または細胞抽出物である請求項１３に記載の方法。
【請求項２８】
化合物がＮＥＴのアゴニストである請求項１３に記載の方法。
【請求項２９】
化合物がＮＥＴのアンタゴニストである請求項１３に記載の方法。
【請求項３０】
ＮＥＴ遺伝子に突然変異を含む非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３１】
突然変異が欠失である請求項３０に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３２】
欠失が、選択的にスプライシングされたエキソン２を欠くＮＥＴ ｍＲＮＡをもたらす請求項３１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３３】
突然変異が１つの対立遺伝子に作用する請求項３０に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３４】
突然変異が両方の対立遺伝子に作用する請求項３０に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３５】
動物がげっ歯類である請求項３０に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３６】
げっ歯類がマウスである請求項３５に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３７】
血管新生を調節する化合物の能力を測定する方法であって、その方法は請求項３０〜３６のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物に該化合物を投与し、次いでその血管新生を未処置対照動物におけるそれと比較することからなる方法。
【請求項３８】
血管新生疾患に関連する病状を予防および／または治療するために有効な化合物を同定する方法であって、その方法は請求項３０〜３６のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物に該化合物を投与し、血管新生を測定し、未処置対照動物における血管新生と比較することからなる方法。
【請求項３９】
ＮＥＴ転写因子との結合または相互作用または競合を介して血管新生を調節することができる化合物。
【請求項４０】
ＮＥＴ転写因子が活性化状態にある請求項３９に記載の化合物。
【請求項４１】
ＮＥＴ遺伝子の低下調節または発現阻止を行うことが可能なアンチセンス核酸である請求項３９または４０に記載の化合物。
【請求項４２】
化合物が細胞内結合タンパク質である請求項３９または４０に記載の化合物。
【請求項４３】
化合物がＮＥＴドミナントネガテイブ突然変異体である請求項３９または４０に記載の化合物。
【請求項４４】
請求項３９〜４３に記載の化合物を血管新生疾患に関連する病状に罹患した患者に投与することからなる該疾患の予防および／または治療の方法。
【請求項４５】
疾患がカポジ肉腫、腫瘍またはがんからなる群から選択される請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
疾患がアテローム性動脈硬化症、血管腫、血管内皮腫、いぼ、発毛、瘢痕ケロイド、アレルギー性浮腫、機能不全性不正子宮出血、濾胞性嚢胞、卵巣高刺激、子宮内膜症、呼吸窮迫、腹水、腹膜硬化（透析患者）、接着形成（腹手術）、筋肉および心臓作用過剰負荷、肥満、慢性関節リウマチ、滑膜炎、骨および軟骨伸延、骨髄炎、パンヌス増殖、骨増殖体形成、炎症および感染症（肝炎、肺炎、糸球体腎炎）、ぜん息、鼻ポリープ、種々の臓器移植（肝臓、腎臓、上皮）、未熟児網膜症、糖尿病性網膜症、脈絡膜および他の眼内の疾患、白軟化症、甲状腺炎、甲状腺肥大、膵臓移植からなる群から選択される請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
細胞または組織におけるＮＥＴタンパク質のレベルを増加させることからなる動物中の血管新生を減少させる方法であって、そのＮＥＴタンパク質が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の対立遺伝子変異体、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質のスプライス変異体および配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の他種と相同なタンパク質からなる群から選択される上記方法。
【請求項４８】
他種由来の相同タンパク質がマウスＮＥＴタンパク質である請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ＮＥＴタンパク質を発現させる条件下においてＮＥＴをコードするベクターで細胞または組織がトランスフェクトされる請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
細胞中のＮＥＴタンパク質のレベルを減少させるか、またはＮＥＴ活性のレベルを減少させることからなる、動物における血管新生を増加させる方法。
【請求項５１】
細胞にＮＥＴアンチセンス核酸を導入することによってＮＥＴタンパク質のレベルを減少させ、そのアンチセンス核酸が細胞内状況下でＮＥＴ ｍＲＮＡにハイブリダイズする請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ＮＥＴへの結合および不活性化に十分なレベルで、ＮＥＴに特異的に結合する一本鎖のＦｖ抗体（ｓｃＦｖ）を細胞中に導入することによりＮＥＴタンパク質の活性を減少させる請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
細胞中のＮＥＴタンパク質のレベルを減少させるか、またはＮＥＴ活性のレベルを減少させることからなる、動物内およびＮｅｔが活性化されている状況下において血管新生を減少させる方法。
【請求項５４】
細胞にＮＥＴアンチセンス核酸を導入することによってＮＥＴタンパク質のレベルを減少させ、そのアンチセンス核酸が細胞内状況下でＮＥＴ ｍＲＮＡにハイブリダイズする請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
ＮＥＴに結合して不活性化するのに十分なレベルで、ＮＥＴに特異的に結合する一本鎖のＦｖ抗体（ｓｃＦｖ）を細胞中に導入することによって、ＮＥＴタンパク質の活性を減少させる請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
ＮＥＴを不活性化するのに十分なレベルで、正味のトランスドミナント突然変異体を誘導することによりＮＥＴタンパク質の活性を減少させる請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
血管新生疾患に関連する病状の予防および／または治療を目的とした医薬品の製造のための、ＮＥＴ活性を調節することが可能な化合物または該化合物の製薬上許容され得る塩の使用。
【請求項５８】
化合物がＮＥＴのアンタゴニストである請求項５７に記載の使用。
【請求項５９】
血管新生疾患に関連する病状がカポジ肉腫、腫瘍およびがんからなる群から選択される請求項５８に記載の使用。
【請求項６０】
化合物がｐ３８のシグナル伝達経路の阻害剤である請求項５７〜５９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６１】
化合物が４−［５−（４−フルオロフェニル）−４−（４−（ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］フェニルメチルスルホキシドである請求項６０に記載の使用。
【請求項６２】
化合物がＥＲＫシグナル伝達経路の阻害剤である請求項５７〜５９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６３】
化合物が２−（２−アミノ−３−メトキシフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オンである請求項６２に記載の使用。
【請求項６４】
化合物が１，４−ジアミノ−２，３−ジシアノ−１，４−ビス［２−アミノフェニルチオ］ブタジエンである請求項６２に記載の使用。
【請求項６５】
血管新生疾患に関連する病状が、心臓虚血または末梢虚血、傷治癒の不良、脈管再狭窄、床擦れまたはうっ血性潰瘍、胃腸潰瘍、胎盤機能不全症、無菌壊死、骨折の治癒減損、肺性高血圧および全身性高血圧、発作、血管性痴呆、アルツハイマー病、ＣＡＤＡＳＩＬ、甲状腺擬嚢胞、リンパ性浮腫、アテローム性動脈硬化症、血管腫、血管内皮腫、いぼ、発毛、瘢痕ケロイド、アレルギー性湿疹、不正子宮出血、濾胞性嚢胞、卵巣過剰刺激、子宮内膜症、呼吸窮迫、腹水、腹膜硬化（透析患者）、癒着形成（腹腔外科）、筋肉および心臓作用過剰負荷、肥満、慢性関節リウマチ、滑膜炎、骨および軟骨伸延、骨髄炎、パンヌス成長、骨増殖体形成、炎症および感染症（肝炎、肺炎、糸球体腎炎）、喘息、鼻ポリープ、種々の臓器（肝、腎臓、上皮）の移植、未熟児網膜症、糖尿病性網膜症、脈絡膜および他の眼内疾患、白軟化症、甲状腺炎、甲状腺肥大、膵臓の移植などからなる群から選択されるものである請求項５７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、ＮＥＴ（ＥＲＰ／ＳＡＰ−２）タンパク質の活性の調節、およびＮＥＴタンパク質の活性を修飾または調節する化合物に関する。さらに、本発明は、前（ｐｒｏ−）血管新生または抗（ａｎｔｉ−）血管新生の新規化合物を同定するためのＮＥＴのアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、およびこれらの化合物の治療における使用に関する。また、本発明はＮＥＴ遺伝子に突然変異のあるトランスジェニック動物に関する。
【０００２】
【発明の背景】
哺乳類細胞において、ＴＣＦ（三量体形成因子（Ｔｅｒｎａｒｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｆａｃｔｏｒ））転写因子は、ｅｔｓ１ファミリーに属する。それらは自身のＥｔｓのＤＮＡ結合ドメイン（８５アミノ酸）を介してＳＲＦダイマー（血清応答因子）に結合する際に血清応答エレメント（ＳＲＥ）に結合することができる能力を分担する。三量体形成因子には任意の方向づけの必要性はないが、ＳＲＦコンセンサス部位（ＣＣ（Ａ／Ｔ）６ＧＧ）の隣にＳＲＥコンセンサス配列（Ｃ／Ａ）（Ｃ／Ａ）ＧＧＡ（Ａ／Ｔ）の存在が必要である。数個の即時型遺伝子プロモーターにおけるこれら２つの配列の近傍は、血清または増殖因子としてののマイトジェンに応答するのみならず、ホルボールエステルおよびストレス刺激にも応答して、それらの転写を誘導する。これらの配列は、Ｅｔｓタンパク質およびＳＲＦが構造的に結合しているｃ−ｆｏｓプロモーターにおいて最初に同定された。
【０００３】
ＴＣＦファミリーの既知のメンバーは、Ｅｌｋ−１、ＳＡＰ−１およびＮｅｔ（ＳＡＰ−２、ＥＲＰ）である。これらのタンパク質は広範に発現されている。
ＴＣＦ転写因子のこのサブファミリーは、種々の機能ドメインの存在に関係する強い配列相同性パターンによって定義される。アミノ末端から始まりカルボキシル末端まで、ＴＣＦファミリーのメンバーは、それらのポリペプチド配列中に少なくとも４つの下記の相同性ボックスを示す。
− ＡボックスはＥＴＳ ＤＮＡ結合ドメインとも呼ばれ、それはＳＲＥコンセンサス配列の結合に直接関与する；
− Ｂボックス（短い親水性領域）は、ＳＲＦとの相互作用に関与する；
−　Ｃボックスの上流に位置するＤボックスは、ＭＡＰＫ標的ドメインに存在する；
− ＣボックスおよびＣ末端配列は、ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ、ＪＮＫおよびｐ３８）によるリン酸化部位（６〜７個の（Ｓ／Ｔ）Ｐモチーフ）を含みそして転写活性化ドメインに存在する。
ＴＣＦによる転写活性化の誘導には、この調節ドメインにおけるＭＡＰＫによるＴＣＦのリン酸化が必要である。
【０００４】
ヒトまたはマウスのポリペプチドのアミノ酸配列に関するＡ、Ｂ、ＣおよびＤボックスの位置は、Ａ（ヒト）＝１−９０、Ｂ（ヒト）＝１３３−１５１、Ｃ（ヒト）＝３２１−３７８、Ｄ（ヒト）＝２９０−２９９；Ａ（マウス）＝１−９０、Ｂ（マウス）＝１３３−１５１、Ｃ（マウス）＝３２３−３８０、Ｄ（マウス）＝２９１−３０１である。
【０００５】
三量体のＴＣＦ−ＳＲＦ−ＳＲＥ複合体の形成は、タンパク質／ＤＮＡ結合（ＳＲＥに対するＴＣＦおよびＳＲＦに対するＳＲＦコンセンサス配列）およびＴＣＦ Ｂ−ボックスとＳＲＦとの間のタンパク質／タンパク質の相互作用を同時に必要とする。この複合体アセンブリーは、ＭＡＰＫによるＴＣＦリン酸化によって促進される。
【０００６】
マウスのＮｅｔは、１９９４年にＧｉｏｖａｎｅ ｅｔ ａｌ． （Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， ８， １５０２−１５１３ （１９９４））によってクローン化され、また、Ｔ． ＬｉｂｅｒｍａＮＥＴ ａｌ． （ＥＲＰ ａ ｎｅｗ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｅｔｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ／ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ ： ｃｌｏｎｉｎｇ， ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９９４， １４ ： ３２９２−３０９） （ＥＲＰ）（受入番号 Ｌ１９９５３）によって報告されている。ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいては、ヒトの配列はＺ３６７１５、マウスの配列はＺ３２８１５である。マウスｎｅｔ遺伝子の染色体局在は１０Ｃ−Ｄ１に、そして対応するヒトｎｅｔ遺伝子は１２ｑ２２−２３にマッピングされた。この最後の遺伝子座は現在、ＥＬＫ３と称呼される。この局在化は、ｓａｐ２遺伝子に一致する。Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙおよびＨＧＭＷは、今や、ｅｌｋ３が、ｎｅｔ／ｅｒｐ（マウス）およびそれのヒトに相当するｓａｐ−２（ヒト）座のための共通の座であるということを承認した（Ｇｉｏｖａｎｅ ｅｔ ａｌ．「マウスおよびヒトのゲノムの３つの相同領域における、ｅｓｔサブファミリーのメンバーである、ｎｅｔ、ｅｌｋ１およびｓａｐ１（ＥＬＫ３、ＥＬＫ１およびＥＬＫ４）の位置」、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ （１９９５） ２９ ：７６９−７２）。
【０００７】
正常の細胞内容物におけるＮｅｔは転写においてリプレッサー活性を示す。これは、ＭＡＰＫリン酸化およびＴＣＦ形成の両方への競合を介して説明され得る。Ｎｅｔアンチセンスは、血清によって刺激された場合にＳＲＥ活性を刺激する。リン酸化部位における競合の仮説は、ｃ−ｆｏｓのＳＲＥにおけるＮｅｔタンパク質のＤＮＡ結合活性が極わずかであることによって有効とされる。また、ＴＣＦ依存性転写における抑制活性は、それらのＥＴＳ−ドメイン結合を含む競合機構を介したｂＨＬＨ転写因子に関して最近記載された（Ｙａｔｅｓ ｅｔ ａｌ． Ｉｄヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質は、ＴＣＦ ＥＴＳ−ドメイン転写因子によって核タンパク質複合体形成を阻害する。ＥＭＢＯ Ｊ． （１９９９） １８ ：９６８−７６）。
【０００８】
また、各ＣＴＦのなかで、Ｎｅｔにはヘリックス−ループ−へリックスタンパク質−タンパク質相互作用モチーフが含まれるａａ１５３−２０８間に存在する新規な阻害ドメイン（Ｎｏｖｅｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｄｏｍａｉｎ）であるＮＩＤをも有する特殊性がある。このＮＩＤは、Ｎｅｔによる特異的なＤＮＡ結合を阻害するだけでなく、活性化されたｒａｓのシグナリングがない場合の転写活性化もまた阻害する（Ｍａｉｒａ ｅｔ ａｌ． ＮＥＴ（ＥＲＰ／ＳＡＰ２） ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｒａｓ ｉｎｄｕｃｔｉｂｌｅ ＴＣＦｓ， ｈａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｄｏｍａｉｎ ｗｉｔｈ ｒｅｓｅｍｂｌａｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ ｍｏｔｉｆ． ＥＭＢＯ Ｊ． （１９９６） １５ ： ５８４９−６５）。またＮｅｔは、第二の阻害ドメインであるＣＩＤをａａ ２７４−２８２に有し、ＣＩＤはＣｔＢＰと相互作用する（Ｃｒｉｑｕｉ−Ｆｉｌｉｐｅ ｅｔ ａｌ． ＮＥＴ， ａ ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｒａｓ ｓｗｉｔｃｈａｂｌｅ ＴＣＦ， ｃｏｎｔａｉｎｓ ａ ｓｅｃｏｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｄｏｍａｉｎ， ｔｈｅ ＣＩＤ， ｔｈａｔ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ＣｔＢＰ ａｎｄ ｄｅ−ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ． ＥＭＢＯ Ｊ． （１９９９） １８ ：３３９２−３４０３）。
【０００９】
ＮｅｔのＣドメインは、種々のＭＡＰＫコンセンサスリン酸化部位（Ｔ／Ｓ−Ｐ）において、ＭＡＰＫカスケードのアクチベータ−の領域からのシグナリングを統合する。このアクチベータ−の性質によって、Ｎｅｔの転写ポテンシャルは、その細胞下の転位によって制御される。Ｎｅｔ配列は、Ｄボックスに核局在シグナル（ＮＬＳ）、そしてＥｔｓ ＤＮＡ結合ドメインに核輸送シグナル（ＮＥＳ）を含む。Ｃ． Ｄｕｃｒｅｔ 等 （ｔｈｅ ＮＥＴ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｎｕｃｌｅａｒ ｅｘｐｏｒｔ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａｎｉｓｏｍｙｃｉｎ， ＵＶ ａｎｄ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ． Ｍ．Ｃ．Ｂ， １９： ７０７６−７０８７）により、ＪＮＫ経路がＮｅｔタンパク質の活性な核輸送を誘導するということが示された。この作用は、活性な核輸送に必要とされる、ＣＲＭ１へのＮＥＳの結合を阻害するレプトマイシンＢによって阻害される。この活性なＮＥＳの存在は、Ｎｅｔ配列に特異的である。このように、ＪＮＫはＮｅｔリン酸化に関与するが、この活性化はこの細胞質のシャッフリングによる転写活性化を生じない。ＪＮＫは、ＪＥＸボックス（ａａ ２３３−２５３）のリン酸化によって核−細胞質のシャッフリングを誘導する。反対に、転写活性化には、ｐ３８およびＥＲＫ１−２ （Ｒａｓ）経路によるＣボックスのリン酸化が関与する（Ｄｕｃｒｅｔ ｅｔ ａｌ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， 印刷中）。
【００１０】
Ｎｅｔ転写活性は、がん遺伝子のＲａｆによって活性化されるのではなく、がん遺伝子のＲａｓ、ＳｒｃおよびＭｏｓによって活性化され得る。従ってＥＲＫはＮｅｔの転写活性化には直接関与していないということが分かった。
【００１１】
本技術分野においては、細胞内の過程におけるＮＥＴの分子機能をよりよく理解することが必要である。さらに別のＮＥＴ機能および／または細胞内成分との相互作用を同定することが技術的に必要である。本発明では、下記に議論されるように、この必要に関して述べる。
【００１２】
本明細書中に記載のいずれもの参照の引用は、該参照が本出願に対する「先行技術」として利用できるものとして解釈されるべきではない。
【００１３】
【発明の要約】
前述のように、本発明はＮｅｔ転写因子の新規な機能の同定に関する。全く予想外のことだが、本出願人は、ＮＥＴが血管新生に関与しそして哺乳類におけるＮｅｔ遺伝子突然変異が血管系に影響を与えるということを見出した。本出願人は今や、通常の条件下でＮＥＴが血管新生のリプレッサーであるということを実証した。また本出願人は、ＮＥＴが特定のＳｅｒ残基のリン酸化によって活性化され得ることを示し、また活性化されたＮＥＴが血管新生を促進することを発見した。活性化されたＮＥＴが介する血管新生には、ＶＥＧＦの分泌が含まれる。そしてＮｅｔが活性化されている状況において、ＮＥＴの低下調節がＶＥＧＦ分泌を減少させ、血管新生を減少させる。さらに、Ｎｅｔが活性化されている状況では、ＮＥＴの低下調節により腫瘍形成が阻害され、低酸素性腫瘍に至ることが示された。
【００１４】
これらの知見によって、ＮＥＴは血管新生の制御における重要な中間物質であることが分かる。正常な状況でのＮＥＴの低下調節は血管新生を増加させる。一方、疾患の状態またはＮＥＴが活性化されている状態でのＮＥＴの低下調節は、血管新生の減少をもたらす。この発見により、Ｎｅｔ活性の変調による血管新生調節での新規治療方法に対する目標達成のための手段が提供される。また、この発見により、血管新生ないし血管新生疾患を包含する疾病の新規な研究用モデル系が提供されるし、またこれら疾病の予防または治療に有用な化合物を同定するための新規なスクリーニング方法も提供される。
【００１５】
従って、本発明の第一の特徴は、血管新生を調節するか、または血管新生疾患に関連する病状の予防および／または治療に有用である化合物を同定する方法におけるＮＥＴポリペプチドの全てまたは部分の使用を提供することにある。あるいはまた、本発明は、このような方法におけるＮＥＴポリペプチドの全てまたは部分を発現する細胞の使用を提供することにある。具体的な実施態様において、ＮＥＴポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の対立遺伝子変異体、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のスプライス変異体、および配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する他種のタンパク質と相同のタンパク質からなる群から選択される。他の実施態様において、本発明方法で使用されるＮＥＴポリペプチドの部分は、Ａボックス（ヒト）＝ａａ１−９０、Ｂボックス（ヒト）＝ａａ１３３−１５１、Ｃボックス（ヒト）＝ａａ３２１−３７８、Ｄボックス（ヒト）＝ａａ２９０−２９９、ＮＩＤドメイン（ヒト）＝ａａ１５３−３０８； ＪＥＸドメイン（ヒト）＝ａａ２３３−３５３； ＣＩＤドメイン（ヒト）ａａ２７４−２８２； Ａボックス（マウス）＝ａａ１−９０、Ｂボックス（マウス）＝ａａ１３３−１５１、Ｃボックス（マウス）＝ａａ ３２３−３８０、Ｄボックス（マウス）＝ａａ２９１−３０１； ＮＩＤドメイン（マウス）＝ａａ １５５−１９７；ＪＥＸドメイン（マウス）＝ａａ２２２−２５３； ＣＩＤドメイン（マウス）＝ａａ２７５−２２０に対応するフラグメントから選択されるＮＥＴのフラグメントを含む。マウスのＮＥＴポリペプチド配列は配列番号４に提供されている。
【００１６】
化合物を同定する方法は、ＮＥＴの転写活性の変調を検出するか、またはＮＥＴ／ＤＮＡ相互作用の変調もしくはＮＥＴリン酸化の変調を検出するか、または他のポリペプチドエレメントと相互作用するＮＥＴポリペプチドの全てまたはフラグメントの能力を評価することからなる。
【００１７】
好ましい実施態様において、該化合物はＮＥＴのアンタゴニストであって、該化合物は血管新生疾患に関連する病状、例えばカポジ肉腫、腫瘍および／またはＮＥＴが活性化されている他の病状の予防および／または治療のために使用できる。血管新生疾患に関連する病状にはがんおよび固形腫瘍があるが、その場合にはＮＥＴのアンタゴニストが血管新生化合物として作用し（Ｎｅｔが活性化されている状態において）次いで腫瘍の予防、減少または後退をもたらす。
【００１８】
他の好ましい実施態様において、該化合物はＮＥＴのモジュレーター（アゴニストまたはアンタゴニストのいずれか）であり、そして該化合物はＮＥＴが活性化されていない状態で（または、細胞が形質転換されない条件下で）血管新生疾患に関連する病状の予防および／または治療に使用することができる。このような病状は、不十分な脈管化を含みそして血管新生の増加を必要とする。また、このような病状は、増加した脈管化を含みそして血管新生の阻害を必要とする。
【００１９】
前述したように、ＮＥＴは血管新生の調節にとって重要な因子である。有利なことに、本発明は、Ｎｅｔの活性すなわち血管新生を調節する分子のスクリーニング方法を提供する。当業界における任意のスクリーニング方法、特に高いスループットスクリーニング方法を使用することができる。従って、本発明は血管新生を調節する化合物の同定方法を提供する。その方法は （ｉ） 哺乳類のＮＥＴ転写因子からなる組成物を提供すること、（ｉｉ） その組成物を候補化合物と接触させることおよび （ｉｉｉ） ＮＥＴ機能を調節する該候補化合物の能力を評価することからなる。この方法の組成物は、細胞もしくは細胞抽出物または半精製抽出物もしくは精製されたＮＥＴポリペプチドであることができる。具体的な実施態様において、評価工程はＮＥＴの転写活性の変調を検出することからなり、例えば、ＮＥＴの転写活性化ドメインおよび転写因子のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン）からなるキメラタンパク質の制御下で発現されたレポーター遺伝子の発現のレベルにおける変化を検出することからなる。発現の検出は、一時的にまたは安定にトランスフェクションされた哺乳類細胞において実施することができる。別の実施態様において、評価工程は、例えばゲルシフトアッセイまたはＮＥＴタンパク質に結合する標識されたヌクレオチドの定量化を用いて、ＮＥＴ／ＤＮＡ相互作用の変調を検出することからなる。さらに別の実施態様において、評価工程は、ＮＥＴのリン酸化の変調を検出することからなる。ＮＥＴのリン酸化の変調の検出は、キナーゼ活性の結果としてＮＥＴのリン酸化を測定することからなることができる。該キナーゼはｐ３８α、ｐ３８β、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２またはＪＮＫ３であることができる。さらに別の実施態様において、評価工程は、他のポリペプチドエレメントと相互作用するＮＥＴポリペプチドの全てまたはフラグメントの能力を評価すること、例えばＳＲＥエレメントと相互作用するＮＥＴ ＳＲＦ結合ドメインの能力を評価すること、またはＣｔＢＰエレメントと相互作用するＮＥＴ ＣｔＢＰ結合ドメイン（ＣＩＤドメイン）の能力を評価すること、または両方を評価することからなる。本発明のスクリーニング方法により、Ｎｅｔのアゴニストまたはアンタゴニストを同定することができる。
【００２０】
また、本発明の別の特徴は、ＮＥＴ遺伝子の突然変異からなるトランスジェニック非ヒト動物を提供することにある。具体的な実施態様において、その突然変異とは欠失である。好ましい実施態様において、その欠失が、選択的にスプライシングされたエキソン２を欠くＮＥＴ ｍＲＮＡをもたらす。この突然変異は、１つの対立遺伝子または両方の対立遺伝子に影響を及ぼすことがある。具体的な実施態様において上記動物はげっ歯類であるが、マウスが好ましい。
【００２１】
本発明のトランスジェニック動物により、血管新生疾患に関連する病状を調べるためのモデル系およびこれらの疾患の予防および／または治療に有用な化合物をスクリーニングおよび／または試験するためのモデル系が提供される。また、トランスジェニック動物由来の器官（例えば網膜、大動脈など）は、このような化合物をスクリーニングおよび／または試験するのに有用である。
【００２２】
それ故に、本発明の別の特徴は、血管新生を調節することができる化合物の能力を測定する方法を提供することにある。あるいはまた、本発明は、血管新生疾患に関連する病状の予防および／または治療に有効な化合物を同定する方法を提供する。好ましい方法は、ＮＥＴ遺伝子に突然変異を含むトランスジェニック動物に該化合物を投与し、次いで血管新生を未処置対照動物のそれと比較することからなる。
【００２３】
別の特徴において、本発明は血管新生を調節することが可能である化合物を提供する。具体的な実施態様において、血管新生の調節は、ＮＥＴ転写因子との結合または相互作用または競合を介して生じる。他の具体的な実施態様において、該化合物は活性化されたＮＥＴ転写因子（すなわちリン酸化されたＮＥＴ）と特異的に結合するかまたは相互作用することができる。これに関しては、本発明者等により、ＮＥＴの活性化はマウスの配列の３２９、３３７、３５９、３６５、３９８、４０３の位置およびヒト配列の３２７、３３５、３５７、３６３、３９６、４０１の位置において、少なくとも６個のＳｅｒ／Ｔｈｒリン酸化モチーフ（Ｓ／Ｔ−Ｐモチーフ）の１つまたはそれ以上を含むということが確定された。３５９および３６５の位置（マウス）におけるリン酸化、または３５７および３６３の位置（ヒト）におけるリン酸化は、ＮＥＴの活性化に特に重要である。他の実施態様において、該化合物は、ＮＥＴリン酸化の上流における任意の特異的な事象の制御を介して血管新生を調節することができる。
【００２４】
本発明化合物は、ＮＥＴ遺伝子の低下調節または発現阻止を行うことが可能であるアンチセンス核酸であることができる。他の実施態様において、本発明の化合物は、細胞内結合タンパク質であることができる。さらに、別の実施態様において、本発明の化合物は、ＮＥＴのドミナントネガテイブ突然変異体であることができる。
【００２５】
さらに別の特徴において、本発明は、細胞内のＮＥＴのレベルおよび／またはＮＥＴの生物学的活性を調節することが可能な化合物を細胞に投与することにより、細胞におけるＮＥＴ発現を調節する方法を提供する。本発明の好ましい特徴において、該細胞は、任意の血管新生疾患に関連する病状に罹患した患者の細胞であり、該方法は、血管新生を調節することが可能な化合物を患者の細胞に投与することからなる。具体的な実施態様において、ＮＥＴのレベルまたはＮＥＴ活性の調節は、ＮＥＴ転写因子との結合または相互作用または競合を介して生じる。該化合物は小分子、ＮＥＴ遺伝子の発現を低下調節するかまたは発現阻止することが可能なアンチセンス核酸、細胞内結合タンパク質またはＮＥＴのドミナントネガテイブ突然変異体であることができる。該化合物は小分子またはポリペプチドであることができ、それらのＮＥＴとの相互作用によりＮＥＴ転写因子の核局在化が防止される。
【００２６】
別の特徴において、本発明は、血管新生疾患に関与する病状の予防または治療を目的とした医薬品を製造するための、ＮＥＴ活性を調節する化合物またはそのような化合物の製薬上許容され得る塩の使用を提供する。該化合物は、ＮＥＴのアゴニストまたはアンタゴニストであることができる。
【００２７】
さらに別の実施態様において、本発明は、細胞中のＮＥＴタンパク質のレベルを増加させることからなる、正常な（即ち、ＮＥＴが活性化されていない）状況下で組織における血管新生を減少させる方法を提供する。ＮＥＴタンパク質はマウスＮＥＴであることができるが、さらに好ましくはヒトＮＥＴである。好ましい実施態様では、ＮＥＴタンパク質を発現させ得る条件下でＮＥＴをコードするベクターを細胞にトランスフェクトした。
【００２８】
あるいはまた、所望の場合には、本発明は、細胞中のＮＥＴタンパク質のレベルを減少させるかまたは細胞中のＮＥＴタンパク質の活性を減少させることからなる、正常な（即ち、ＮＥＴが活性化されていない）状況下で組織における血管新生を増加させる方法を提供する。ＮＥＴタンパク質のレベルは、ＮＥＴアンチセンス核酸を細胞に導入することによって減少させることができ、そのアンチセンス核酸は細胞内条件下でＮＥＴ ｍＲＮＡにハイブリダイズする。あるいはまた、ＮＥＴタンパク質の活性は、ＮＥＴに結合して不活性化するのに十分なレベルで、ＮＥＴに特異的に結合する一本鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）を細胞に導入することによって減少させることができる。
【００２９】
さらに別の実施態様において、より好ましくはＮＥＴが活性化されている状態において、本発明は、細胞中のＮＥＴタンパク質のレベルを減少させること、または細胞中のＮＥＴタンパク質の活性を減少させることからなる、組織中の血管新生を減少させる方法を提供する。ＮＥＴタンパク質のレベルは、細胞中へＮＥＴアンチセンス核酸を導入することによって減少させることができ、そのアンチセンス核酸は細胞内条件下でＮＥＴ ｍＲＮＡにハイブリダイズする。あるいは、ＮＥＴタンパク質の活性は、 ＮＥＴに結合して不活性化するのに十分なレベルで、ＮＥＴに特異的に結合する一本鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）を細胞中に導入することによって減少させることができる。
【００３０】
これらの目的およびその他の目的は本発明によって述べられているが、それについては添付の図面並びに下記の詳細な説明および実施例でさらに詳しく説明する。
【００３１】
図面の詳細な説明
図１：特異的にトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞からの慣熟培地によって誘導されたマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）上のＨＵＶＥＣ細胞による微小管形成
ＮＩＨ３Ｔ３細胞に、ｐＣＥＦＬ−ＧＰＣＲ（図１ａ）単独で、ｐ６０１Ｄ−アンチセンス−ＮＥＴを有するｐＣＥＦＬ−ＧＰＣＲ（図１ｃ）またはｐ６０１Ｄ−トランスドミナント−ＮＥＴを有するｐＣＥＦＬ−ＧＰＣＲ （図１ｅ）でトランスフェクトした。ＨＵＶＥＣ細胞とのインキュベーションの前に、慣熟培地のいくつかを（ｂ） ０．２μｇ／ｍｌの抗マウスＶＥＧＦポリクローナル抗体（総ヤギＩｇＧ；Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ）または（ｄおよびｆ）１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＶＥＧＦ−Ａ （Ｒ＆Ｄ）のいずれかを用いてインキュベートした。各プレートを２４時間後に観察した（位相差、元倍率、×４０）。
【００３２】
図２：慣熟培地におけるＨＵＶＥＣ細胞の増殖
ＮＩＨ３Ｔ３細胞に、ＧＰＣＲ用のコントロールベクター（ｐＣＥＦＬ）、即ち、アンチセンス−Ｎｅｔのためのコントロールベクター（ｐ６０１Ｄ）を有するＧＰＣＲ用ベクター、ＧＰＣＲおよびアンチセンス−ＮｅｔのためのベクターまたはＧＰＣＲおよびトランスドミナント（ＴＤ）−Ｎｅｔのためのベクターをトランスフェクトした。
【００３３】
図３：内因性Ｎｅｔのリン酸化
ＮＩＨ３Ｔ３細胞に、ＧＰＣＲのためのコントロールベクター（ｐＣＥＦＬ） （第１列）またはＧＰＣＲのためのベクター（第２列）を上記のようにしてトランスフェクトした。１４時間後、 細胞を洗い、２．５時間増殖培地に置いた。次いで細胞をＳＢ ２０３５８０ （１０μＭ）（Ａｌｅｘｉｓ Ｃｏｒｐ．）またはＵ０１２６ （１０μＭ） （Ｐｒｏｍｅｇａ）で３０分間処理した。６時間後、抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびホスホセリン３６５ Ｎｅｔに対する抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ ２Ｆ３， Ｄｕｃｒｅｔ ｅｔ ａｌ．（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，出版中）または活性化型ＥＲＫに対する抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ）でのウエスタンブロッテイングにより解析した。
【００３４】
図４：ＧＰＣＲによるＶＥＧＦプロモーターの活性化にはＮｅｔが必要
ＮＩＨ３Ｔ３細胞に、ＧＰＣＲのコントロールベクター（ｐＣＥＦＬ）＋アンチセンス−Ｎｅｔのコントロールベクター（ｐ６０１Ｄ）、ｐＣＥＦＬ＋アンチ（Ａｎｔｉ）Ｎｅｔ、ＧＰＣＲ＋ｐ６０１Ｄ、ＧＰＣＲ＋アンチＮｅｔ、およびレポーター（即ちｍｄｍ２−Ｌｕｃ、ｐ２１−Ｌｕｃ、ＶＥＧＦ−ＬｕｃおよびｐＣＭＶ−ＬａｃＺ）を上記のようにトランスフェクトした。細胞を収集し、溶解し次いでルシフェラーゼアッセイを標準方法で実施した。
【００３５】
図５：トランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞からの慣熟培地におけるＶＥＧＦペプチドレベル
等量のＮＩＨ３Ｔ３細胞に、前述のようにしてｐＣＥＦＬ（ＧＰＣＲのベクター）、ＧＰＣＲ＋ｐ６０１Ｄ （アンチＮｅｔのベクター）、ＧＰＣＲ＋アンチＮｅｔ、■Ｒａｓ （Ｒａｓ Ｖ１２の不活化コントロール）、Ｒａｓ−Ｖ１２＋ｐ６０１Ｄ、Ｒａｓ−Ｖ１２＋アンチＮＥＴ、ｐ６０１Ｄ、アンチＮＥＴおよびピュ−ロマイシン発現ベクター（ｐＳＧ５ Ｐｕｒｏ）をトランスフェクトした。２ｎＭのピュ−ロマイシンを洗浄後添加した。４８時間後、慣熟培地を回収し、細胞をトリプシン処理し、１ｍｌの培地に再懸濁し、生細胞をトリパンブルー染色後にカウントした。ＶＥＧＦペプチドレベルを、ＥＬＩＳＡ（Ｍｏｕｓｅ−ＶＥＧＦ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ｋｉｔ， Ｒ＆Ｄ）によって測定し、その結果を細胞数について補正した。
【００３６】
図６： ＧＰＣＲ形質転換されたクローンからの慣熟培地におけるＶＥＧＦペプチドレベル
ＮＩＨ３Ｔ３細胞をｐＣＥＦＬまたはＧＰＣＲで形質転換し、ネオマイシン（ＳＩＧＭＡ）によって選択した。個々のクローンを選び、成長させ次いで上記のようにＶＥＧＦペプチドレベルを解析した。
【００３７】
図７：コントロール（ｐ６０１Ｄ）およびアンチＮｅｔベクターをトランスフェクトしたプールまたは単離したＧＰＣＲ形質転換されたクローンからの慣熟培地におけるＶＥＧＦペプチドレベル
ＧＰＣＲで形質転換されたいくつかのクローンを、ピュ−ロマイシン発現ベクターと共にｐ６０１ＤまたはアンチＮｅｔで形質転換するかまたはトランスフェクトし、次いで２ｎＭのピュ−ロマイシンで処理して安定に形質転換されたＧＰＣＲ−コントロールクローン、ＧＰＣＲ−アンチＮｅｔクローンおよびｐ６０１ＤまたはアンチＮｅｔでトランスフェクトされたＧＰＣＲクローンのプールを得た。ＶＥＧＦペプチドのレベルをＥＬＩＳＡ（マウス−ＶＥＧＦ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅキット、Ｒ＆Ｄ）によって測定し、その結果を細胞数について修正した。
【００３８】
図８：ＧＰＣＲ−コントロールおよびＧＰＣＲ−アンチＮｅｔのプールおよびクローンにおけるＮｅｔおよびＥｌｋの発現
ＧＰＣＲクローンに、ピューロマイシンベクターと共にｐ６０１ＤまたはアンチＮＥＴをトランスフェクトし、４８時間ピューロマイシンで選択した。ＧＰＣＲ−コントロールおよびＧＰＣＲ−アンチＮＥＴクローンを、 ２４時間１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において増殖させた（それらは集約しなかった）。細胞を収集し、抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ並びにＮｅｔ、Ｅｌｋ−１およびＴＢＰに対する抗体でのウエスタンブロッテイングによって解析した。
【００３９】
図９：ＧＰＣＲ−コントロールクローンおよびＧＰＣＲ−アンチＮｅｔクローンによって形成された腫瘍の容量
異なるクローン由来の約１０６細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳに再懸濁し、８〜１０週令の雌のＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（７匹のマウス／クローン、ＧＰＣＲ−コントロールおよびＧＰＣＲ−アンチＮｅｔの両クローンに対して２個のクローン）の左側腹部に皮下注射した。注入後６〜１６日後、最小および最大の腫瘍直径を２日毎にカリパスで測定し、腫瘍の容量を式：容量＝（４／３）×π×（１／２×小さい方の直径＋１／２×大きい方の直径）２ｓを用いて計算した。
【００４０】
図１０：ヌードマウスのＧＰＣＲクローンおよびＧＰＣＲアンチ−Ｎｅｔクローンによって生じた腫瘍の様子
腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（図９に対する凡例を参照）を、注入後１６日目に写真に撮った。矢印は、腫瘍によって誘導された新規に形成された血管を示すものである。
【００４１】
図１１：腫瘍における血管の密度
マウスを注入後１６日目に殺し、腫瘍を除去し、１０μｍのパラフィンセクションを作製した。腫瘍における血管を、ＣＤ３１に対する抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で検出した。
【００４２】
図１２：腫瘍における血管でカバーされた領域
各クローンからの５つの腫瘍から得られたＣＤ３１で染色したパラフィンセクションを、コンピュータ制御された顕微鏡で解析した。各セクションからランダムに選択した５つの部分を、デジタルカメラで１０倍に記録し、さらに形態計測的解析をＮＳＵＲＦＸソフトウェアを用いて実施した。
【００４３】
図１３：腫瘍における低酸素性緊張の相違
マウスを殺す４時間前に、低酸素症のマーカーであるＥＦ５ （Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ； １０ｍＭ） を腫瘍を有するマウスに注入した（１ｍｇ／マウス）。低温槽部分（１０μｍ）をＣｙ５に結合させた抗−ＥＦ５抗体で染色し（Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、デジタルカメラを具備したコンピュータ制御の蛍光顕微鏡で解析した。Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）により提供されたプロトコールに従った。
【００４４】
図１４：マウスＮｅｔ遺伝子座の標的化された突然変異誘発
（Ａ）野生型Ｎｅｔ対立遺伝子、標的ベクターおよび組換え変異体のＮｅｔ対立遺伝子の略図
欠失したエキソン２は翻訳開始コドンを含み、Ｎｅｔタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン中に１〜６９アミノ酸をコードする。サザンブロット解析に用いた３′プローブの位置、並びにＸｂａで消化された１３Ｋｂ（野生型）および５ｋｂ（変異対立遺伝子）の各フラグメントが示されている。ＢはＢａｍＨＩ、ＸはＸｂａＩの略記である。
（Ｂ）ヘテロ接合の（＋／−）異種交配からの子孫由来のＸｂａＩで消化されたＤＮＡのサザンブロット解析
３′プローブを用いたハイブリダイゼーションにより、野生型対立遺伝子（ＷＴ）の１３ｋｂのフラグメントまたは５ｋｂの標的化された対立遺伝子（Ｍ）のフラグメントに対応するバンドが得られた。
（Ｃ） 同じ子孫のＰＣＲ解析
遺伝子型は、一番上に表示され、矢印は、野生型（ＷＴ、１５５０ｂｐ）および標的化された対立遺伝子（Ｍ， １３００ｂｐ）に対する特異的な増幅産物を示すものである。ＰＣＲプライマーセット（ＵＣ５４、ＵＣ５６、ＵＣ５７）は標的化されたスキームに示されている。
【００４５】
（Ｄ）ＲＴ−ＰＣＲによるＮｅｔ転写物の検出
Ｅ１６野生型およびホモ接合の変異型胚から単離したＲＮＡは、Ｎｅｔ遺伝子の異なるエキソン（エキソン１〜エキソン４）由来のプライマーとのＲＴ−ＰＣＲ反応に使用された。ＲＴ−ＰＣＲプライマーセットは、パネルの左部分に示されている。エキソン２の欠失について予期されたように、エキソン１／エキソン２のセットまたはエキソン２／エキソン３のセットとの変異体（−／−）ＲＮＡには増幅が全く見られない。しかし、野生型胚のように、変異体におけるエキソン３およびエキソン４（ｅｘ３／ｅｘ４のセット）の間で増幅産物が観察される。エキソン１およびエキソン３ （ｅｘｌ／ｅｘ３のセット）の間のＲＴ−ＰＣＲ反応は、小さな方の産物（９０ｂｐ）が野生型（２１７ｂｐ）に比較してホモ接合の変異型胚に存在するということを示している。
（Ｅ）２週令の野生型、ヘテロ接合型およびホモ接合型のマウス由来の肺タンパク質抽出物のウエスタンブロット解析
４９−ｋＤａ Ｎｅｔタンパク質の量は、ヘテロ接合変異動物（＋／−）で減少し、ホモ接合突然変異動物（−／−）中でで完全に消失する。しかし、新規な４２ｋＤａタンパク質のバンドが変異体抽出物中に出現する（へテロ接合型）。
【００４６】
図１５：Ｎｅｔδ／δマウスの表現型
（Ａ，Ｂ） Ｎｅｔδ／δマウスの生存を、野生型およびヘテロ接合型（＋／δ）動物と比較した。（Ｃ） 表現型の標本図は、Ｎｅｔδ／δマウスによって明らかになった。この動物は、出生後６日で呼吸困難の徴候を示し、２日後に死んだ。胸腔は、乳び流出を代表する乳状の液体で満ちていることが見出された。
【００４７】
図１６：Ｎｅｔδ／δ胸腔の組織学的解析
ヘマトキシリン−エオシン染色された野生型マウス胸郭（Ａ）および変異型マウス胸郭（Ｂ）の断面図が示されている。棒＝０．８ｍｍ。呼吸困難の徴候はＮｅｔδ／δマウスでは８日齢で観察され、それはコントロールとしての同腹のＮｅｔ＋／＋マウスと一緒にこの組織学的調査のために殺された。胸膜腔は、はっきりと変異体中で拡張し、乳び流出（星印）によって満たされている。この流出の蓄積による肺および心臓の圧縮に注意されたい。写真（Ｃ）および（Ｄ）は、それぞれ（Ａ）および（Ｂ）において描かれた点線の四角い部分の拡大図である。Ｎｅｔδ／δマウスの胸壁（Ｄ）は、コントロール（Ｃ）に比較してリンパ管を拡張した。Ｒは肋骨； Ｉｖはリンパ管。棒＝０．２ｍｍ
【００４８】
図１７：Ｎｅｔδ／δマウスにおける胸部リンパ管の拡張
Ｎｅｔ＋／＋、ＶＥＧＦＲ３＋／−（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）およびＮｅｔδ／δ、ＶＥＧＦＲ３＋／−マウス（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）のリンパ管は、Ｘ−Ｇａｌ染色（青）によって視覚化される。（Ｂ、ＤおよびＦ）１０日齢で乳び胸症に至ったＮｅｔδ／δマウス。変異型胸壁（Ｂ）のリンパ管は、同腹のコントロール（Ａ）と比較して拡張されている。棒＝９０μｍ。同じ動物の心膜（ＣおよびＤ）のリンパ管および胸部皮膚（ＥおよびＦ）のリンパ管は、Ｎｅｔδ／δマウスで変わらない（棒＝４２μｍ）。５日齢マウスでは、胸膜が流出し始める前に、胸部リンパ管が、同腹子コントロール（Ｇ）と比較してＮｅｔδ／δ（Ｈ）ではすでに拡張されている。Ｒは肋骨；ｉｃは肋間領域。（棒＝９０μｍ）。
【００４９】
図１８：Ｅ７．５およびＥ８．５段階の胚におけるＮｅｔＴ（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、ＨおよびＪ）並びにＶＥＧＦ−Ｒ２（Ｂ、Ｄ、Ｆ、ＩおよびＫ）ｍＲＮＡ発現の全封入（ｗｈｏｌｅ−ｍｏｕｎｔ）原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション法による検出
（Ａ， Ｂ） Ｅ７．５胚。（Ｃ， Ｄ）それらの卵黄嚢におけるＥ８．５胚の側面からみた写真。（Ｅ， Ｆ） Ｅ８．５胚の切開された卵黄嚢における発現。（Ｇ）切開された栄養膜の錐体の内側表面内のＮｅｔ発現。Ｅ８．５段階の胚で観察された標識の腹側（Ｈ、Ｉ）および背側（Ｊ， Ｋ）の写真。略記：ａｌ、尿嚢；ｃｈ、絨毛膜；ｄａ、背部大動脈；ｅｍ、胚組織； ｅｐ、栄養膜の錐体； ｅｘ、胚−外組織； ｈｔ、心臓； ｓｖ、静脈洞； ｙｓ、卵黄嚢。
【００５０】
図１９：Ｅ９．５およびＥ１０．５におけるＮｅｔ（Ａ、ＣおよびＥ）およびＶＥＧＦ−Ｒ２（Ｂ、ＤおよびＦ）の転写物の全封入ｍＲＮＡ検出
（Ａ， Ｂ） Ｅ９．５胚の側面から見た写真。（Ｃ、Ｄ）Ｅ１０．５胚の頭部領域における発現。（Ｅ、Ｆ）Ｅ１０．５段階の胚からの主要な領域の側面からみた写真。略記：ａｏ、大動脈； ｂ、鰓弓； ｆｌ、前肢； ｆｎ、前頭鼻骨塊； ｈｖ、頭導管； ｉｓｖ、内体節管（ｉｎｔｅｒｓｏｍｉｔｉｃ ｖｅｓｓｅｌ）； ｍｄ、下顎突起； ｍｘ、上顎突起； ｓｌ、硬節； ｕｖ、臍静脈。
【００５１】
図２０：Ｅ７．５、Ｅ８．５、Ｅ１２．５、およびＥ１４．５段階における原位置ハイブリダイゼーションによるＮｅｔおよびＶＥＧＦ−Ｒ２発現の比較分析
凍結された連続部分は、ＮｅｔおよびＶＥＧＦ−Ｒ２プローブによって、写真に示したようにハイブリダイズされた。ここに示された段階の各列は、組織学を示すための明るい視野を含む（図４と同じ）。（Ａ−Ｃ）および（Ｄ−Ｆ）は、母体の脱落膜に存在する、それぞれＥ７．５およびＥ８．５の胚の部分を示す。（Ｇ−Ｉ）および（Ｊ−Ｌ）は、それぞれＥ１２．５およびＥ１４．５の胚の矢状の部分を示す。略記：ａｄ、副腎； ｅｐ、栄養膜錐体； ｇｔ、生殖細管； ｈｄ、頭部； ｈｔ、心臓； ｉｎ、腸； ｒｉ、肋骨； ｌｉ、肝臓； Ｉｘ、喉頭； ｍｄ、下顎骨； ｔｌ、尾； ｙｓ、卵黄嚢。
【００５２】
図２１：Ｅ１６．５における隣接した矢状部分におけるＮｅｔおよびＶＥＧＦ−Ｒ２の発現（Ａ−Ｆ）およびＥ１４．５およびＥ１６．５段階における肢軟骨分化中のＮＥＴ発現（Ｇ−Ｊ）
（Ｂ）および（Ｅ）は、それぞれ頭部および胸部領域においてＮｅｔ発現を示し、一方（Ｃ）および（Ｄ）はＶＥＧＦ−Ｒ２パターンを示す。略記： ｃａ、ｃａｒｓｕｓ； ｃｐ、脈絡叢； ｄ， 指； ｉｍ， 指間の間葉； ｈｔ，心臓； ｌｉ，肝臓； ｌｕ， 肺； ｎｃ， 鼻軟骨； ｏｓ， 骨化性中心； ｐｖｐ， 神経周囲の血管嚢； ｒｉ、肋骨； ｔａ， 足根； ｔｏ，舌； 心室領域。
【００５３】
図２２：マウスの角膜におけるｒｈＦＧＦ−２によって誘発された血管新生
本技術は、本質的にはＫｅｎｙｏ氏等（Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ． １９９６， ３７ ： １６２５−１６３２）によって記述された。ｂＦＧＦ（９０ｎｇ）およびスクラルフェート（４５ｎｇ）を含むハイドロンペレットを、Ｎｅｔの野生型および変異型のマウスの両方の角膜に移植した。ペレット移植後３〜６日にそれらの眼を生体顕微鏡検査法によって検査した。
【００５４】
図２３：マウスの大動脈環血管新生アッセイにおける微小血管形成
本技術は、本質的にはＧｉｏｖａｎｅ氏等（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １９９４， ８， １５０２−１３）により記述されたものである。１２ウェルの組織培養等級プレートを、２００μｌのＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で覆い、３０分間３７℃でゲルにした。胸部大動脈を６〜８週齢のＮｅｔの野生型マウスおよび変異型マウスから摘出した。大動脈部分（１ｍｍ長） を、この層の頂上に横倒しにして置き、２００μＬのＭａｔｒｉｇｅｌで直に覆い、３０分間でゲルにした。次いで、それらの輪を、内皮細胞成長に最適な増殖因子の組合わせで補填された血清非含有培地中で５日間インキュベートした（ＣｌｏＮＥＴｉｃｓ， ＣＡ）。５日目に、新芽を顕微鏡で検査した。
【００５５】
図２４：Ｎｅｔポリペプチドのドメイン； 図２４ａ（ヒト）、図２４ｂ（マウス）
Ａボックス： （ｅｔｓドメイン）， Ｉｗｑｆｌｌｑｌｌｌ（ＮＥＳ）；Ｂボックス（ＳＲＦ相互作用）； ＮＩＤ（Ｎｅｔ阻害ドメイン） ； ＪＥＸ （リン酸化によって誘導されるＪＮＫ相互作用および輸送）；ＣＩＤ （ＣｔＢＰ相互作用ドメイン） ； Ｄボックス （ＮＬＳおよびＥＲＫ１＋ｐ３８結合）；Ｃボックス（リン酸化誘導転写活性化）。
【００５６】
【発明の詳述】
ＮＥＴの生物学的機能についてはほとんど知られていないため、ＮＥＴの活性の生物学的標的を同定するためにトランスジェニックマウスにおけるＮＥＴの欠失の影響を確認する研究がなされた。本発明は、部分的には、このようなトランスジェニックマウスの発現系での観察に基づくものである。
【００５７】
従って、本発明は、小分子または天然産物のスクリーニングにおいて使用するための、ＮＥＴタンパク質をコードするヒトｃＤＮＡ、相同体、スプライシング変異体（ｖａｒｉａｎｔ）、一点変異体（ｓｉｎｇｌｅ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｎｔ）もしくは欠失変異体、並びにこれらの配列によりコードされるタンパク質の使用に関する。実施例に記載の２−ハイブリッド系の使用、ＮＥＴリン酸化の評価、活性が記載されたＮＥＴの修飾が、本発明の方法において使用できる。
【００５８】
また、ＮＥＴは、血管新生を調節する目的で、遺伝子治療法に使用できる（コード化分子およびアンチセンス分子の両方を使用することができる）。ＮＥＴの過剰発現または低下調節をベースとしたこれらの遺伝子治療に関する病状については後で述べるとおりである。
【００５９】
血管新生疾患に関連する病状には、がんおよび固形腫瘍が含まれる。該疾患ではＮＥＴのアンタゴニストが抗血管新生化合物として作用し（Ｎｅｔが活性化されている状況において）、腫瘍成長の予防、減少または後退に至る。本発明の方法または化合物が単独で、または治療方法の一部分として使用され得る疾患の例としては線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸肉腫、膵臓がん、胸部がん、子宮がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺がん、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管がん、絨毛癌、セミノーマ、胚がん、ウィルムス腫瘍、頚部がん、精巣がん、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞種および網膜芽細胞種を挙げることができる。
【００６０】
別の好ましい実施態様において、該化合物はＮＥＴのモジュレーター（アゴニストまたはアンタゴニストのいずれか）であって、その化合物はＮＥＴが活性化されていない状態（細胞が形質転換していない状態）において血管新生疾患に関連する病状の予防および／または治療に使用することができる。
【００６１】
このような病状は不十分な血管新生を含み、血管新生の増加を必要とする。これらの病状には心臓または末梢の虚血、創傷治癒の不良、脈管再狭窄、うっ血性潰瘍の褥瘡、胃腸管潰瘍、胎盤機能不全症、無菌壊死、骨折の治癒の不良、肺性高血圧および全身性高血圧（血管ｐｒｕｎｉｎｇ）、発作、血管性痴呆、アルツハイマー病、ＣＡＤＡＳＩＬ、甲状腺偽嚢胞、リンパ性浮腫などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６２】
また、このような病状は増加された脈管化を含み、血管新生の阻害を必要とする。これらの病状にはアテローム性動脈硬化、血管腫、血管内皮腫、いぼ、毛髪成長、瘢痕ケロイド、アレルギー性浮腫、機能不全症不正子宮出血、小胞シスト、卵巣刺激過多、子宮内膜症、呼吸窮迫、腹水、腹膜硬化（透析患者）、接着形成（腹部手術）、筋肉および心臓負担過重、肥満、慢性関節リウマチ、滑膜炎、骨および軟骨破壊、骨髄炎、パンヌス成長、骨棘形成、炎症および感染症（肝炎、肺炎、糸球体腎炎）、喘息、鼻ポリープ、種々の臓器（肝臓、腎臓、…上皮）の移植、未熟児網膜症、糖尿病性網膜症、脈絡膜および他の眼内疾患、白軟化症、甲状腺炎、甲状腺肥大、膵臓移植などが含まれるが、これらに限定されるものでない。
【００６３】
本発明のこれらおよびその他の特徴、特に、ＮＥＴタンパク質の発現、抗ＮＥＴ抗体の生成、ＮＥＴの変調のスクリーニングアッセイ、ＮＥＴのアンタゴニストまたはアゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイ、および特に遺伝子治療適用のための、ＮＥＴをコードするベクターの送達については、次のセクションで詳細に論ずる。セクションの見出しは、単に読み手の利便性のために準備されたものであり、いずれの点においても限定されるものとして考えるべきではない。
【００６４】
定義
本発明は、任意の動物、特に哺乳類または鳥類、さらに好ましくはヒトから供給されるＮＥＴポリペプチドをコードする遺伝子、例えば、ＮＥＴの全長または天然に存在する形態、および該遺伝子の任意のフラグメントの使用を意図する。本明細書中で用いられる用語「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするヌクレオチドの集合であって、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ核酸を包含する。ここで使用する「ＮＥＴ」は、ＮＥＴポリペプチドを意味し、「ｎｅｔ」はＮＥＴポリペプチドをコードする遺伝子を示す。また、ＮＥＴタンパク質は、ＥＬＫ−３、Ｓａｐ−２およびＥＲＰとして知られている。ヒトｎｅｔ遺伝子の核酸配列は、配列番号１に記載されており、対応するポリペプチドは配列番号２に与えられている。マウスｎｅｔ遺伝子の核酸配列は配列番号３に提供されており、それに対応するポリペプチドは配列番号４に与えられている。
【００６５】
本発明に従って、当業者の技術範囲内において従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術を用いることができる。このような技術は文献に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （ここでは“Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａＬ， １９８９”）； ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ Ｈ （Ｄ．Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ． １９８５）； Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｍ．Ｊ． Ｇａｉｔ ｅｄ． １９８４）； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ［Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ． （１９８５）］； Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ［Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ， ｅｄｓ． （１９８４）］； Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ［Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｄ． （１９８６）］； Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ ［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， （１９８６）］； Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８４）； Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． （１９９４） を参照されたい。
それ故に、本明細書中に用いられる場合には、次の用語は下記に明示された定義を有する。
【００６６】
「クローニングベクター」は、レプリコン、例えばプラスミド、ファージまたはコスミドであって、それには別のＤＮＡセグメントが結合してその結合されたセグメントの複製をもたらすことができる。「レプリコン」とは、生体内でＤＮＡ複製の自律性単位として機能する、即ち、それ自身の制御下で複製が可能である、任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。クローニングベクターは、一方の細胞の型で複製することができ、他方の型で発現することができる（「シャトルベクター」）。
【００６７】
「カセット」とは、特定の認識部位でベクター中に挿入され得るＤＮＡのセグメントを意味する。ＤＮＡのセグメントは、所定のポリペプチドをコードし、そのカセット部位および制限部位は、転写および翻訳のための適切なリーディングフレーム中にカセットが確実に挿入されるように設計されている。
このようなＤＮＡが細胞内部に導入された場合には、細胞は、外因性または異種ＤＮＡによって「トランスフェクトされ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）」たのである。トランスフェクトされたＤＮＡが表現型の変化に影響を与える場合には、細胞は、外因性または異種のＤＮＡによって「形質転換され（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」たのである。形質転換したＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに結合（共有結合）することができる。
【００６８】
「核酸分子」とは、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」） のリン酸エステルポリマー形態を意味するか、または一本鎖形態または二重らせんへリックスのいずれかにおけるそれらの任意のホスホエステル類縁体、例えば、ホスホロチオエートおよびチオエステルを意味する。二重らせんＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡヘリックスが可能である。核酸分子、特にＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子という用語は、該分子の一次構造および二次構造にのみ関するものであり、それを任意の特定の三次構造に限定しない。このように、この用語には、特に線状または環状のＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、プラスミドおよび染色体に見出される二重らせんＤＮＡが含まれる。特定の二重らせんＤＮＡ分子の構造を論ずる際に、配列は、転写されないＤＮＡ鎖（即ち、ｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）の５′〜３′方向に沿った配列のみを与える通例によって本明細書中では記載され得る。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。
【００６９】
核酸分子の一本鎖形態を適当な温度および溶液イオン強度の条件下で他の核酸分子にアニールすることができる場合には、核酸分子は、他の核酸分子（例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ）へ「ハイブリダイズ可能（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ）」である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ、同上参照）。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。相同核酸を予めスクリーニングするために、低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションの条件、５５℃のＴｍに対応して、例えば、５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、０．２５％ ミルク、およびホルムアミドなし；または３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳを使用することができる。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、より高いＴｍ、例えば、５×または６×ＳＣＣを有する４０％ホルムアミドに対応する。高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、最も高いＴｍ、例えば、５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＣＣに対応する。ハイブリダイゼーションには、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーにより塩基間のミスマッチが可能であるが、２つの核酸が相補的な配列を含むことが必要である。核酸のハイブリダイゼーションに好適なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび技術的に周知である相補性の程度、可変性に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きくなればなるほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドに対するＴｍ値が増大する。核酸のハイブリダイゼーションの（より高いＴｍ値に対応する）相対的な安定性は以下の順序：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡで減少する。長さ１００ヌクレオチドよりも大きいハイブリッドに対して、Ｔｍを計算する方程式が導き出された（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、同上、９．５０−０．５１参照）。より短い核酸、即ち、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのために、ミスマッチの部位がさらに重要になり、そしてオリゴヌクレオチドの長さがそれの特異性を決める（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、同上、１１．７−１１．８を参照せよ）。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドであり、好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチドであり、さらに好ましくはその長さが少なくとも約２０ヌクレオチドである。
【００７０】
具体的な実施態様において、「標準的ハイブリダイゼーション条件」という用語は、５５℃のＴｍを意味し、上記のような条件で使用する。好ましい実施態様においてＴｍは６０℃であり、より好ましい実施態様ではＴｍは６５℃である。
【００７１】
本明細書中で使用する「オリゴヌクレオチド」という用語は、ＮＥＴをコードするゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子にハイブリダイズ可能な、一般的には少なくとも１８ヌクレオチドの核酸を意味する。オリゴヌクレオチドは、例えば、３２Ｐ−ヌクレオチドまたは標識例えばビオチンが共有結合されたヌクレオチドによって標識されることができる（同上、標識されたＮＥＴポリペプチドに関する議論参照）。１つの実施態様において、標識されたオリゴヌクレオチドは、ＮＥＴをコードする核酸の存在を検出するためのプローブとして用いることができる。別の実施態様において、オリゴヌクレオチド（標識され得る一方または両方）は、ＮＥＴの全長またはフラグメントのいずれかのクローニングか、またはＮＥＴをコードする核酸の存在を検出するためのＰＣＲプライマーとして使用することができる。さらに別の実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドはＮＥＴ ＤＮＡ分子とトリプルへリックスを形成することができる。一般的に、オリゴヌクレオチドは、合成によって、好ましくは核酸合成機で製造される。従って、オリゴヌクレオチドは、非天然に生じるホスホエステルアナログ結合、例えばチオエステル結合などを用いて製造することができる。
【００７２】
ＤＮＡの「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合に、生体内または生体外の細胞中でポリペプチドに転写および翻訳される二重らせんＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５′（アミノ）末端にある開始コドンおよび３′（ボックス）カルボキシル末端にある翻訳停止コドンによって決定される。コード配列は、真核性配列、原核性ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核性（例えば哺乳類）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、およびさらに合成ＤＮＡ配列を含むが、これらに限定されるものでない。コード配列が真核細胞における発現を目的とする場合には、通常、ポリアデニル化シグナルおよび転写末端配列はコード配列の３′に位置する。
【００７３】
「ＮＥＴアンチセンス」とは、ＮＥＴｍＲＮＡ分子の少なくとも一部分に相補的であるＲＮＡ分子またはＤＮＡの分子である。このようなアンチセンスポリヌクレオチドは、細胞中のＮｅｔポリペプチドｍＲＮＡの転写および／または翻訳を阻害するために使用することができ、それによって細胞中のＮｅｔポリペプチドの量の減少に影響を与える。Ｎｅｔアンチセンスに対するコード配列はベクターに導入されることができ、さらに細胞中で発現されることができる。従って、ＮｅｔアンチセンスはｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡ、メチルホスホネート骨格核酸、ホスホロチオエート骨格核酸、ポリアミド核酸および技術的に知られた同様のアンチセンス構造である。
【００７４】
「転写調節配列および翻訳調節配列」とは、ＤＮＡ調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターおよびそれらの同等物であり、宿主細胞においてコード配列の発現を提供する。真核細胞ではポリアデニル化シグナルが、調節配列である。
【００７５】
「プロモーター配列」は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼに結合し、次いでコード配列の下流（３′方向）の転写を開始することが可能なＤＮＡ調節領域である。本発明を明確にするために述べれば、プロモーター配列は、転写開始部位のそれの３′末端に結合し、上記のバックグラウンドで検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最低数の塩基またはエレメントを含むために上流（５′方向）に伸長する。プロモーター配列内には転写開始部位（例えば、ヌクレア−ゼＳ１でマッピングされることにより好都合に定義される）並びにＲＮＡポリメラーゼの結合の原因となるタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。
【００７６】
コード配列は細胞中の転写調節配列および翻訳調節配列の「制御下」にあり、その時にＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、次いで（コード配列がイントロンを含む場合には）トランス−ＲＮＡがスプライシングを受け、コード配列によってコードされたタンパク質に翻訳される。
【００７７】
本明細書中で使用する全ての文法形態およびスペリングの語尾変化で表される「相同の（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」という用語は、「共通の進化起源（ｃｏｍｍｏｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｏｒｉｇｉｎ）」を有する諸タンパク質間の類縁関係を意味し、例えばスーパーファミリー（例えば、イムノグロブリンスーパーファミリー）由来の蛋白質および異なる種類由来の相同タンパク質（例えば、ミオシン軽鎖など）の間の類縁関係を意味する（Ｒｅｅｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｃｅｌｌ ５０：６６７）。このようなタンパク質（およびそれらのコード遺伝子）は、高度のそれらの配列類似性によって表される配列相同性を有する。
【００７８】
従って、全ての文法形態で表される「配列類似性（ｓｅｑｕｅｓｎｃｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」という用語は、共通の進化的起源を有するかまたは有しないタンパク質の核酸またはアミノ酸の配列間の同一性または一致の程度を意味する（Ｒｅｅｃｋ ｅｔ ａｌ．， 同上参照）。しかし、普通の慣用および本出願では、「相同の」という用語は、例えば「高度に」のような副詞によって修飾された場合には、配列類似性を意味するものであって、共通の進化的起源を意味するものではない。
【００７９】
具体的な実施態様において、２つのＤＮＡ配列は、それらのヌクレオチドの少なくとも約５０％（好ましくは少なくとも約７５％および最も好ましくは少なくとも約９０％または９５％）がＤＮＡ配列の決められた一定の長さに一致する場合には「実質的に相同」または「実質的に類似」する。実質的に相同である配列は、配列データバンクの配列において、または例えば特定の系に定義されたようなストリンジェントな条件下のサザンハイブリダイゼーション実験において入手し得る標準的なソフトウェアを用いてそれらの配列を比較することによって同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を定義することは、当業者の技術の範囲内である。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， 同上； ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ， 同上； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、同上を参照されたい。
【００８０】
同様に、特定の実施態様において、２つのアミノ酸配列は、アミノ酸の３０％以上が同一であるかまたは約６０％以上が類似である（機能的に同一な）場合には、「実質的に相同」または「実質的に類似」である。好ましくは、類似または相同の配列は、例えば、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ７， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のパイルアッププログラムを用いる整列によって同定される。
【００８１】
「に対応する」（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ）という用語は、類似性または相同性が、測定される分子と正確な位置が同一であるかまたは異なっているにせよ、類似または相同の配列に言及するのに本明細書において使用される。核酸またはアミノ酸の配列の整列には、スペースが含まれることがある。このように、「に対応する」という用語は、配列類似性に関するものであり、アミノ酸残基またはヌクレオチド塩基の数に関するものではない。
【００８２】
また、本発明は、任意の供給源、特にヒトｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーからゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡが単離され得るかどうかについて、ＮＥＴをコードする哺乳類遺伝子の使用を意図するものである。ｎｅｔ遺伝子を得る方法は、上記のように、技術的によく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９， 上記参照）。
【００８３】
従って、任意の動物細胞はｎｅｔ遺伝子の分子クローニングの核酸の供給源として役に立つ可能性がある。該ＤＮＡは、クローン化されたＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ「ライブラリー」）から技術的に知られた標準方法によって得ることができ、さらに好ましくは高レベル発現のタンパク質の組織（例えば、内皮細胞、繊維芽細胞、軟骨細胞、胸腺、脾臓、軟骨）から調製されたｃＤＮＡライブラリーから、化学合成によって、ｃＤＮＡクローニングによって、または所望の細胞から精製されたゲノムＤＮＡまたはそれのフラグメントのクローニングによって得られる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， １９８９， ｓｕｐｒａ； Ｇｌｏｖｅｒ， Ｄ．Ｍ． （ｅｄ．）， １９８５， ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＭＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｔｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｕ．Ｋ． Ｖｏｌ． Ｉ， ＩＩ参照）。ゲノムＤＮＡから誘導されたクローンは、コード配列の外に調節領域およびイントロンＤＮＡ領域を含むことができ、ｃＤＮＡから誘導されたクローンはイントロン配列を含まない。供給源が何であろうとも、遺伝子はその増殖のために好適なベクターに分子的にクローン化されるべきである。
【００８４】
また本発明では、ＮＥＴとして同一または相同な機能活性を有する、ＮＥＴの対立遺伝子の変異体、スプライシング変異体、類縁体および誘導体並びに他種由来のそれらの相同物をコードする遺伝子（即ち、ｃＤＮＡ）の使用も考えられる。ＮＥＴに関連する誘導体および類縁体の産生および使用は、本発明の範囲内にある。具体的な実施態様において、その誘導体または類縁体は機能的に活性であって、即ち、全長の野生型ＮＥＴに関連した１つ以上の機能的な活性を示すことができる。
【００８５】
ＮＥＴ誘導体は、機能的に同等な分子を提供する置換、付加または欠失によって、コードする核酸配列を変更させることによって作製され得る。未変性のＮＥＴに関する機能活性を増加または上昇させた誘導体を作製するのが好ましい。
【００８６】
スクレオチドコード配列の縮退のために、ＮＥＴ遺伝子と実質的に同じアミノ酸配列、例えば単一のアミノ酸変異体を含むアミノ酸配列をコードするその他のＤＮＡ配列を本発明の実施に使用することができる。これらには、ＮＥＴ遺伝子の配列内に同一のアミノ酸をコードする種々のコドンの置換によって変わり、従ってサイレントな変化をする対立遺伝子、他種由来の相同遺伝子およびＮＥＴ遺伝子の全てまたは部分を含むヌクレオチド配列があるが、それらに限定されるものではない。同様に、本発明に用いられるＮＥＴ誘導体には、機能的に等価なアミノ酸残基がその配列内の残基の代わりに置換されて保存的アミノ酸置換をもたらす改変された配列を含むＮＥＴタンパク質のアミノ酸配列の全てまたは部分を一次アミノ酸配列として含むものがあるが、これらに限定されるものでない。例えば、配列内に存在する１個以上のアミノ酸は同様な極性の他のアミノ酸によって置換されることができ、機能的等価物として作用し、サイレントな改変を生じる。配列内のアミノ酸の置換分は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択されてもよい。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。芳香環構造を含むアミノ酸にはフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが含まれる。極性の中性アミノ酸にはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リシンおよびヒスチジンが含まれる。負に荷電した（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸がある。このような改変は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または等電点によって測定される見掛け上の分子量に影響を及ぼすとは思われない。
【００８７】
特に好ましい置換は、
− 正電荷が維持され得るようにＡｒｇの代わりにＬｙｓおよびその逆；
− 負電荷が維持され得るるようにＡｓｐの代わりにＧｌｕおよびその逆；
− 遊離の−ＯＨが維持され得るようにＴｈｒの代わりにＳｅｒ；および
− 遊離の−ＣＯＮＨ２が維持され得るようにＡｓｎの代わりにＧｌｎである。
【００８８】
アミノ酸置換がさらに、特に好ましい性質を有するアミノ酸を置換させるために導入されることもある。例えば、Ｃｙｓは、他のＣｙｓとのジスルフィド橋のための可能な部位として導入されることができる。Ｈｉｓは、特に「触媒」部位として導入され得る（即ち、Ｈｉｓは酸または塩基として作用することができ、生化学的触媒作用において最も普通のアミノ酸である）。Ｐｒｏは、特にその平坦な構造のために導入され得ることがあり、該タンパク質の構造中にβ−ターンを誘導する。
【００８９】
本発明に使用されるＮＥＴ誘導体および類縁体をコードする遺伝子は、技術的に知られた多様な方法によって製造できる。それらを製造する操作は、遺伝子またはタンパク質レベルで行うことができる。例えば、クローン化されたｎｅｔ遺伝子配列は、技術的に知られた任意の膨大なストラテジーによって改変されることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ、１９８９、同上）。該配列は、制限エンドヌクレア−ゼで適当な部位において除去され、次いでさらに酵素的な修飾を施され、所望ならば、生体外で単離され、そしてライゲーションされる。ＮＥＴの誘導体または類縁体をコードする遺伝子の製造において、ＮＥＴ遺伝子として同じ翻訳のリーディングフルーム内に改変された遺伝子を、翻訳停止シグナルによって中断されずに所望の活性がコードされる遺伝子領域に確実に残存させるよう注意がなされなければならない。
【００９０】
さらに、ＮＥＴをコードする核酸配列は、生体外または生体内で突然変異されて、翻訳配列、開始配列および／または末端配列を創出し、および／または破壊することができるか、またはコード領域において変異を作製し、および／またはスプライシングを調節し、および／または新規な制限エンドヌクレアーゼ部位を形成することができるか、または、さらに生体外改変を促進するために前から存在するものを破壊することができる。１つの実施態様においてかつ本発明のトランスジェニック動物の調製のために、このような突然変異が、ＮｅｔＴ機能を不活性化し、翻訳配列および／または開始配列を優先的に破壊または改変する。別の実施態様においてかつ遺伝子治療の目的にために、このような突然変異は、変異されたＮｅｔ遺伝子産物の機能的な活性を増強することができる。技術的に知られた突然変異のための任意の技術を使用することができる。例えば、生体外での部位特異的突然変異誘発（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ， １９７８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５３：６５５１； Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， １９８４， ＤＮＡ ３：４７９−４８８； Ｏｌｉｐｈａｎｔ ｅｔ ａＬ， １９８６， Ｇｅｎｅ ４４：１７７； ＨｕｔｃｈｉｎｓｏＮＥＴ ａｌ， １９８６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８３：７１０）、ＴＡＢ（Ｒ）リンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等を使用できるが、これらに限定されるものでない。ＰＣＲ技術は、部位特異的突然変異誘発にとって好ましい（Ｈｉｇｕｃｈｉ， １９８９、“Ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｔｏ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ ＤＮＡ”， ｉｎ ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｈ． Ｅｒｉｉｃｈ， ｅｄ．， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｈａｐｔｅｒ ６， ｐｐ． ６１−７０参照）。
【００９１】
同定されそして単離された遺伝子は、次に適切なクローニングベクターに挿入することができる。技術的に知られた多数のベクター−宿主系を使用することができる。可能なベクターとしてはプラスミドまたは改変されたウイルスを挙げることができるが、これに限定されない。しかし、ベクター系は、使用す宿主細胞と両立しなければならない。ベクターの例には、Ｅ． ｃｏｌｉ、バクテリオファージ、例えばλ誘導体、またはプラスミド例えばｐＢＲ３２２誘導体またはｐＵＣプラスミド誘導体、例えばｐＧＥＸベクター、ｐｍａｌ−ｃ、ｐＦＬＡＧなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【００９２】
クローニングベクターへの挿入は、例えば、相補的突出末端を有するクローニングベクターへＤＮＡフラグメントを結合させることによって達成することができる。しかし、ＤＮＡをフラグメントにするのに使用する相補的認識部位がクローニングベクター中に存在しない場合には、ＤＮＡ分子の末端は酵素的に改変することができる。あるいは、所望される任意の部位は、ＤＮＡ末端をヌクレオチド配列（リンカー）を結合させることによって生産され得る。即ち、これらの結合されたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特異的に化学合成されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。組換え分子は、遺伝子配列の多くのコピーが生じるように、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポーレーション法などによって宿主細胞に導入されることができる。好ましくは、クローン化された遺伝子またはｃＤＮＡは、１つのシャトルベクタープラスミド上に含有され、クローニング細胞（例えば大腸菌）の拡張をもたらし、さらに所望されるならば、適切な発現細胞系へのその後の挿入のたに容易な精製を施す。例えば、シャトルベクターは１種以上の有機体中で複製可能なベクターである。それは酵母２μプラスミド由来の配列と大腸菌プラスミド由来の配列とを結合させることによってＥ． ｃｏｌｉおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの両方における複製用に調製されることができる。
【００９３】
ＮＥＴポリペプチドの発現
ＮＥＴをコードするヌクレオチド配列、その誘導体または類縁体、または例えばキメラタンパク質を含む機能的に活性なその誘導体は、適切な発現ベクター、即ち、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必須のエレメントを含有するベクターに挿入されることができる。このようなエレメントは、ここで「プロモーター」と呼ばれる。このように、ＮＥＴをコードする核酸は、 発現ベクターのプロモーターと操作可能に会合する。ｃＤＮＡおよびゲノム配列の両方が、このような調節配列の制御下でクローン化されそして発現され得る。また、発現ベクターは複製起点を含むのが好ましい。
【００９４】
必須の転写シグナルおよび翻訳シグナルは、組換え発現ベクター内に提供されることができるか、またはＮＥＴをコードする未変性（ｎａｔｉｖｅ）遺伝子および／またはその隣接領域によって供給されることができる。
【００９５】
潜在的な宿主ベクター系には、ウイルス感染した哺乳類細胞系（例えば、ワクシニアウイルス、 アデノウイルスなど）；ウイルス感染した昆虫細胞系（例えば、バキュロウイルス）；微生物、例えば、酵母ベクターを含む酵母；またはバクテリオファージ、ＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡで形質転換されたバクテリアが含まれるが、これらに限定されるものではない。ベクターの発現エレメントは、それの強さおよび特異性が変化する。使用する宿主ベクター系に左右されるが、多数の適当な転写エレメントおよび翻訳エレメントのうちの任意の１つを使用することができる。
【００９６】
組換えＮＥＴタンパク質またはそれらの機能フラグメント、誘導体、キメラ構築物または類縁体は、組換えによるコード配列の増幅後、染色体に組み込んで発現されることができる。この点に関して、多数の増幅系のうち任意のものが、高レベルの安定した遺伝子発現を達成するのに使用できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９，前記、参照）。
【００９７】
ＮＥＴをコードする核酸からなる組換えベクターが導入された細胞は、その細胞によるＮＥＴの発現をもたらす条件下で適当な細胞培養培地中において培養される。
【００９８】
クローニングベクターにＤＮＡフラグメントを挿入するための前述の任意の方法は、適当な転写／翻訳制御シグナルおよびタンパク質コード配列からなる遺伝子を含有する発現ベクターを構築するのに使用することができる。これらの方法には、生体外組換えＤＮＡ技術および合成技術並びに生体内組換え（遺伝的組換え）が含まれる。
【００９９】
ＮＥＴタンパク質の発現は、技術的に知られた任意のプロモーター／エンハンサーエレメントによって制御され得るが、これらの調節エレメントは、発現のために選択された宿主において機能性でなければならない。ＮＥＴ遺伝子発現を制御するのに使用できるプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１， Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３′末端の長い繰り返し配列に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ， ｅｔ ａｌ．， １９８０， Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）； 例えばβ−ラクタマーゼプロモーターのような真核生物用発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ， ｅｔ ａｌ．， １９７８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７５：３７２７−３７３１）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ， ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８０：２１−２５）；“Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ”ｉｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ， １９８０， ２４２：７４−９４もまた参照されたい； 酵母または他の菌類由来のプロモーターエレメント、例えばＧａｌ ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコール脱水素酵素）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター；および組織特異的に発現し、トランスジェニック動物に利用されている、動物の転写制御領域：膵臓の線房細胞において活性を有するエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｃｅｌｌ ３８：６３９−６４６； Ｏｒｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ５０：３９９−４０９； ＭａｃＤｏｎａｌｄ， １９８７， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５）； 膵臓β細胞において活性を有するインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−１２２， リンパ球の細胞において活性を有する免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｃｅｌｌ ３８：６４７−６５８； Ａｄａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−５３８； Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７：１４３６−１４４４）、精巣、胸、リンパ球細胞およびマスト細胞において活性であるマウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｃｅｌｌ ４５：４８５−４９５）、肝臓で活性を有するアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． １：２６８−２７６）、肝臓で活性を有するα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：１６３９−１６４８； Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８）、肝臓で活性を有するα１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． １：１６１−１７１）、骨髄性細胞において活性を有するβ−グロブリン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−３４０； Ｋｏｌｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）、脳のオリゴデンドロサイト細胞において活性を有するミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｃｅｌｌ ４８：７０３−７１２）、骨格筋において活性を有するミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−２８６）、および視床下部で活性を有するゴナトトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域（ＭａｓｏＮＥＴ ａＬ， １９８６， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−１３７８）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１００】
本発明のＤＮＡ配列を発現するのに多様な宿主／発現ベクターの組合わせを使用することができる。有用な発現ベクターは、例えば、染色体のセグメント、非染色体およぶ合成ＤＮＡ配列からなることができる。適当なベクターには、ＳＶ４０の誘導体および知られたバクテリアのプラスミド、例えば、Ｅ． ｃｏｌｉプラスミド ｃｏｌ Ｅ１、ｐＣＲｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体、プラスミド例えばＲＰ４、ファージＤＮＡＳ、例えば、ファージ１の多数の誘導体、例えば、ＮＭ９８９、および他のファージＤＮＡ、例えば、Ｍ１３および糸状単鎖ファージＤＮＡ；酵母プラスミド、例えば２μプラスミドまたはそれの誘導体 、真核細胞において有用なベクター、例えば昆虫細胞または哺乳類細胞において有用なベクター、プラスミドおよびファージＤＮＡの組合わせから誘導されたベクター、例えばファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を用いて改変したプラスミド、およびそれらの同等物が含まれる。
【０１０１】
例えば、バキュロウイルス発現系において、非融合型トランスファーベクター［例えば、ｐＶＬ９４１（ＢａｍＨＩクローニング部位；Ｓｕｍｍｅｒｓ）、ｐＶＬ１３９３（ＢａｍＨ１、ＳｍａＩ、ＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ、ＸｍａＩＩＩ、ＢｇｌＩＩ、およびＰｓｔＩクローニング部位；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＶＬ１３９２（ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＮｏｔＩ、ＸｍａＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ、ＳｍａＩ、およびＢａｍＨＩクローニング部位；Ｓｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、およびブルー／ホワイト組換えスクリーニング可能である；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などであるがこれに限定されない］および融合型トランスファーベクター［例えばｐＡｃ７００（ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩクローニング部位、ここでＢａｍＨＩ認識部位は開始コドンで始まる；Ｓｕｍｍｅｒｓ）、ｐＡｃ７０１およびｐＡｃ７０２ （ｐＡｃ７００と同じだが、異なるリーデイングフレームを有する）、ｐＡｃ３６０ （ポリヘドリン開始コドンの３６塩基対下流にあるＢａｍＨＩクローニング部位；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（１９５））、およびｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（３つの異なるリーデイングフレーム、およびＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＮｃｏＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、ＰｒｏＢｏｎｄ精製のためのＮ末端ペプチド、およびプラークのブルー／ホワイト組換えスクリーニング；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ （２２０））などであるが、これらに限定されない］の両方を使用することができる。
【０１０２】
本発明での使用のために考えられる哺乳類用発現ベクターには、誘導プロモーター、例えばジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）プロモーターを有するベクターが含まれる。例えば、ＤＨＦＲ発現ベクターまたはＤＨＦＲ／メタロプロテナーゼ共増幅ベクターを有するいずれかの発現ベクター、例えばｐＥＤ（ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＳｂａＩ、ＳｍａＩ、およびＥｃｏＲＩクローニング部位、クローン化された遺伝子およびＤＨＦＲの両方を発現するベクター；Ｋａｕｆｍａｎ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １６．１２（１９９１）を参照されたい）がある。あるいは、グルタミン合成酵素／メチオニンスルホキシミン共増幅ベクター、例えばｐＥＥ１４（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ、ＳｍａＩ、ＳｂａＩ、ＥｃｏＲＩ、およびＢｃｌＩクローニング部位、ここで該ベクターはグルタミン合成酵素およびクローン化された遺伝子を発現する；Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）がある。別の実施態様において、エプステインバールウイルス（ＥＢＶ）の制御下エピソームの発現を導くベクターを使用することができる。例えば、ｐＲＥＰ４（ＢａｍＨ１、ＳｆｉＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩ、ＰｖｕＩＩおよびＫｐｎＩクローニング部位、 構成性ラウス肉腫ウイルスの長い末端繰り返し（Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓ Ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ）（ＲＳＶ−ＬＴＲ）プロモーター、ハイグロマイシン選択可能なマーカー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４（ＢａｍＨＩ、ＳｆｉＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩ、ＰｖｕＩＩ、およびＫｐｎＩクローニング部位、構成性ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）即時型遺伝子、ハイグロマイシン選択可能なマーカー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＥＰ４（ＫｐｎＩ、ＰｖｕＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＳｆｉＩ ＢａｍＨＩクローニング部位、誘導可能なメタロチオネインＩＩａ遺伝子プロモーター、ハイグロマイシン選択可能なマーカー：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ８（ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩ、およびＫｐｎＩクローニング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ヒスチジノール選択可能なマーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ９（ＫｐｎＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＳｆｉＩ、およびＢａｍＨＩクローニング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、Ｇ４１８選択可能なマーカー； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＥＢＶＨｉｓ（ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ハイグロマイシン選択可能なマーカー、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂を介してＮ末端ペプチド精製可能であり、エンテロキナーゼによって分解される；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）がある。本発明において使用するための選択可能な哺乳類発現ベクターには、ｐＲｃ／ＣＭＶ （ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、ＳｂａＩ、およびＡｐａＩクローニング部位、Ｇ４１８選択；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲｃ／ＲＳＶ （ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｅＩ、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、ＸｂａＩクローニング部位、Ｇ４１８選択；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが含まれる。本発明による使用のためのワ��シニアウイルス哺乳類発現ベクター（Ｋａｕｆｍａｎ，１９９１，同上参照）には、ｐＳＣ１１（ＳｍａＩクローニング部位、ＴＫ−およびβ−ｇａｌ選択）、ｐＭＪ６０１（ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＡｆｌＩ、ＮａｒＩ、ＢｓｐＭＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＡｐａＩ、ＮｈｅＩ、ＳａｃＩＩ、ＫｐｎＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位；ＴＫ−およびβ−ｇａｌ選択）、およびｐＴＫｇｐｔＦ１Ｓ（ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＡｃｃＩ、ＨｉｎｄＩＩ、ＳｂａＩ、ＢａｍＨＩ、およびＨｐａクローニング部位、ＴＫまたはＸＰＲＴ選択）を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【０１０３】
また、酵母発現システムは、ＮＥＴを発現するために本発明に従って使用することができる。例えば、二つのみ挙げれば、非融合型ｐＹＥＳ２ベクター（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＧｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または融合型ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂で精製され、エンテロキナーゼで除去されたＮ−末端ペプチド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）があるが、それらを本発明に従って使用することができる。
【０１０４】
一旦、特定の組換えＤＮＡ分子が同定され、単離されれば、技術的に知られたいくつかの方法を使用して、それを増殖させることができる。一旦好ましい宿主系および増殖条件が確立されれば、組換え発現ベクターを量的に増殖させ、調製することができる。予め説明したように、使用できる発現ベクターには、いくつかの例を挙げれば、下記のベクターまたはそれらの誘導体、即ちヒトまたは動物のウイルス、例えば、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルス、昆虫ウイルス、例えばバキュロウイルス、酵母ベクター、バクテリオファージベクター（例えば、λ）、並びにプラスミドおよびコスミドＤＮＡベクターを挙げることができるが、それらに限定されるものではなである。
【０１０５】
さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の特別な方法で遺伝子産物を改変しかつ処理する宿主細胞系を選択してもよい。種々の宿主細胞はタンパク質の翻訳および翻訳後処理並びに修飾のために特徴的かつ特異的な機構を有する。適切な細胞系または宿主系は、発現される外来タンパク質の所望の修飾および処理を確実にするよう選択することができる。酵母での発現は生物学的に活性な産物を産生することができる。真核細胞での発現は未変性のフォールデイングの可能性を増大させることができる。さらに、哺乳類細胞での発現は、ＮＥＴ活性の再構築、または構築のためのツールを提供することが可能である。さらに、種々のベクター／宿主発現系は、処理反応（例えばタンパク質分解開裂反応）の後に種々の程度で影響を及ぼすことがある。
【０１０６】
ベクターは技術的に知られた方法、例えばトランスフェクション法、エレクトロポーレーション法、マイクロインジェクション法、トランスダクション法、細胞融合法、ＤＡＥＡデキストラン法、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション法（リソソーム融合法）、遺伝子銃の使用またはＤＮＡベクタートランスポーターで所望の宿主細胞に導入される（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：９６３−９６７； Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ， １９８８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：１４６２１−１４６２４； Ｈａｒｔｍｕｔ ｅｔ ａｌ．， カナダ特許出願第２，０１２，３１１号、１９９０年３月１５日出願を参照されたい）。
【０１０７】
タンパク質の可溶化形態は、例えば界面活性剤で処理することによって、さらに所望の場合には音波処理かまたは上記のような他の機械的手法で培養液を回収するかまたは封入体を可溶化することにより得ることができる。可溶化されたか、または可溶なタンパク質は、多様な方法、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、等電点フォーカスィング、２次元ゲル電気泳動、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニテイー、イムノアフィニテイー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、異なる溶解性、免疫沈降法、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準技術を使用して単離することができる。
【０１０８】
ＮＥＴに対する抗体
本発明によれば、組換えまたは化学合成によって製造されるＮＥＴポリペプチドもしくはそのフラグメントまたはその他の誘導体もしくは類縁体、例えば融合タンパク質は、ＮＥＴポリペプチドを認識する抗体を産生するための抗原またはイムノゲンとして使用され得る。例えば、分子が免疫グロブリン（抗体）またはＴ細胞抗原受容体のような免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用可能である場合、その分子は「抗原性」である。抗原性ポリペプチドには少なくとも約５個の、好ましくは少なくとも約１０個のアミノ酸が含まれる。分子の抗原部分は、抗体またはＴ細胞受容体認識に対するイムノ優性である抗原部分であることができるか、または免疫性を付与するために担体分子に抗原部分をコンジュゲートすることによって分子に抗体を産生させるのに使用する部分であることができる。抗原性を有する分子はそれ自体免疫性である必要はない。即ち、該分子は担体なしで免疫応答を生ずることが可能である。
【０１０９】
このような抗体としてはポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。本発明の抗ＮＥＴ抗体は交差反応性であることができる。即ち、それらは異なる種からのＮＥＴを認識することが可能である。ポリクローナル抗体は交差反応性の可能性が非常に高い。あるいはまた、本発明の抗体はＮＥＴの単一の形態（例えばマウスのＮＥＴ）に特異的であることができる。このような抗体はヒトＮＥＴに特異的であるのが好ましい。
【０１１０】
技術的に知られた多様な方法は、ＮＥＴポリペプチドまたはその誘導体もしくは類縁体に対するポリクローナル抗体の製造のために使用することができる。抗体製造用に、ＮＥＴポリペプチドまたはその誘導体（例えばフラグメントまたは融合タンパク質）の注入によって種々の宿主動物を免疫化することができる。その動物にはウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。一つの実施態様において、ＮＥＴポリペプチドまたはそのフラグメントは、免疫抗原性担体、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にコンジュゲートすることができる。多様なアジュバントは宿主の種によるが、免疫応答性を増加させるのに使用することができる。そのアジュバントとしては、（完全な、または不完全な）フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リソレシチンのような表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばＢＣＧ（カルメット−ゲラン菌）およびコリネバクテリウム・パルブムを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【０１１１】
ＮＥＴポリペプチドまたはそのフラグメント、類縁体もしくは誘導体に対するモノクローナル抗体の調製のために、培養中継代細胞系によって抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用することができる。これらにはＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ［Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７ （１９７５）］によって最初に開発されたハイブリドーマ法、並びにトリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術［Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２ １９８３； Ｃｏｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８０：２０２６−２０３０ （１９８３）］、およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術［Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ． ７７−９６ （１９８５）］が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明のさらに別の実施態様において、モノクローナル抗体は無菌動物において産生されることができる［１９８９年１２月２８日発行の国際特許公開 ＷＯ ８９／１２６９０］。事実、本発明によれば、適当な生物学的活性を有するヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒にＮＥＴポリペプチドに対して特異的なマウス抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることによって、「キメラ抗体」を製造するために開発された技術［ＭｏｒｒｉｓｏＮＥＴ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５９：８７０ （１９８４）； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８ （１９８４）；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４ （１９８５）］を使用することができる。このような抗体は本発明の範囲内にある。このようなヒトまたはヒト化キメラ抗体はヒトの疾患または疾病（後述）の治療に使用するのが好ましい。その理由は、ヒト抗体またはヒト化抗体それ自体は、異種間抗体よりも免疫応答、特にアレルギー反応を誘導する可能性が遥かに少ないからである。
【０１１２】
本発明によると、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体の製造について記載の技術［Ｈｕｓｔｏｎの米国特許第５，４７６，７８６号および第５，１３２，４０５号； 米国特許第４，９４６，７７８号］を適合させて、ＮＥＴポリペプチドに特異的な一本鎖抗体を製造することができる。本発明の別の実施態様では、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築について記載の技術［Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１ （１９８９）］を使用すると、ＮＥＴポリペプチドまたはその誘導体もしくは類縁体に所望の特異性を有するモノクローナルなＦａｂフラグメントを迅速かつ容易に同定することができる。
【０１１３】
抗体分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは、知られた技術によって製造することができる。例えば、このようなフラグメントには抗体分子をペプシン消化することによって製造され得るＦ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド橋を還元することによって製造され得るＦａｂ’フラグメント並びにパパインおよび還元試薬で抗体分子を処理することによって製造され得るＦａｂフラグメントがあるが、それらの限定されるものではない。
【０１１４】
抗体の製造において、所望抗体のスクリーニングは、技術的に知られた方法、例えばラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ （酵素結合型イムノソルベントアッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射定量測定法、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散法、ｉｎ ｓｉｔｕ イムノアッセイ（例えばコロイド状の金、酵素またはラジオアイソトープ標識を用いる）、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えばゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光検査法、プロテインＡアッセイおよび免疫電気泳動アッセイなどで遂行することができる。一つの実施態様において、抗体結合は一次抗体上の標識を検出することによって検出される。別の実施態様において、一次抗体はその一次抗体に対する二次抗体または試薬の結合を検出することによって検出される。別の実施態様において二次抗体は標識される。イムノアッセイにおける結合を検出するための多くの方法が技術的に知られており、それらは本発明の範囲内に含まれる。例えば、ＮＥＴポリペプチドの特異的なエピトープを認識する抗体を選択するために、このようなエピトープを含有するＮＥＴポリペプチドフラグメントに結合する生成物のための生成されたハイブリドーマを検定することができる。特定の種類の動物由来のＮＥＴポリペプチドに特異的な抗体を選択するために、その種類の動物由来の細胞によって発現されたか、または単離されたＮＥＴポリペプチドとの正の結合をベースとして選択することができる。
【０１１５】
前述の抗体は、上記または技術的に知られた検出技術のいずれかを用いて、ＮＥＴポリペプチドの局在化および活性に関連する技術的に知られた方法、例えば、ウエスタンブロッテイング、原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ） ＮＥＴポリペプチドイメージング、適切な生理学的試料中のそれらのレベル測定等の方法において使用することができる。
【０１１６】
具体的な実施態様として、ＮＥＴポリペプチドの活性をアゴナイズまたはアンタゴナイズする抗体を産生させることができる。このような抗体は、リガンドを同定するための下記の各アッセイを用いて試験することができる。特に、このような抗体は細胞内に発現されたｓｃＦｖ抗体であることができる。
【０１１７】
スクリーニングアッセイ
血管新生におけるＮｅｔの役割の同定によって、新規な抗−または前−血管新生化合物の設計およびスクリーニングが可能になる。従って、ＮＥＴポリペプチドの構造をベースとしたアゴニストまたはアンタゴニストの合理的な設計に加えて、本発明では技術的に知られた種々のスクリーニングアッセイを用いたＮＥＴの特異的リガンドを同定するための別法が意図される。
【０１１８】
技術的に知られた任意のスクリーニング方法を使用して、ＮＥＴのアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするか、あるいはＮＥＴ／ＤＮＡ結合のアンタゴニストをスクリーニングすることができる。
【０１１９】
本発明は、小分子のリガンドまたはリガンド類縁体および擬態物に対するスクリーニング並びに生体内でＮＥＴに結合しそしてＮＥＴの活性をアゴナイズまたはアンタゴナイズする天然のリガンドに対するスクリーニングを意図する。例えば、天然産物ライブラリーは、ＮＥＴ活性をアゴナイズまたはアンタゴナイズする分子について本発明のアッセイを用いてスクリーニングすることができる。
【０１２０】
ＮＥＴ活性をアゴナイズするか、またはアンタゴナイズする分子または化合物、および／またはＮＥＴ／ＤＮＡ相互作用を調節する分子または化合物により、Ｎｅｔによって制御される遺伝子の発現の調節解除（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）および／または血管新生の調節解除に関与する病状を含む疾病の予防および／または治療のための新規な方法（ｖｅｎｕｅ）が提供され得る。
【０１２１】
この点に関して、本発明はまた、ＮＥＴ活性をアゴナイズまたはアンタゴナイズする分子または化合物、および／またはＮＥＴ／ＤＮＡ相互作用を調節する分子または化合物の治療上有効な量を投与することからなる、ＮＥＴ活性を阻害または活性化させる必要を有するか、またはＮｅｔ転写因子の制御下で遺伝子発現を調節する必要を有する患者の治療方法を提供する。本発明は、医薬品製造用のこのような分子または化合物の使用を提供する。
【０１２２】
アンタゴニストの同定またはスクリーニングは、例えばＸ線結晶解析、中性子解析、核磁気共鳴スペクトロメトリーおよび構造決定のためのその他の技術を用いてタンパク質の構造特性を決定することによってさらに促進される。これらの技術は、アゴニストおよびアンタゴニストの合理的な設計または同定のための方法を提供するものである。
【０１２３】
別の方法では、大きなライブラリーを作製するために組換えバクテリオファージを用いる。「ファージを用いた方法（ｐｈａｒｇｅ ｍｅｔｈｏｄ）」［Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０ （１９９０）； Ｃｗｉｒｌａ， ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８７：６３７８−６３８２ （１９９０）； ＤｅｖｉｌＮＥＴ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９：４０４−４０６ （１９９０）］を用いて、非常に大型（１０６−１０８化学物質）のライブラリーを構築することができる。二番目の方法では、主として化学的方法が使用されるが、それにはＧｅｙｓｅｎ法［ＧｅｙｓｅＮＥＴ ａｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２３：７０９−７１５ （１９８６）； ＧｅｙｓｅＮＥＴ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ １０２：２５９−２７４ （１９８７）］およびＦｏｄｏｒ等による方法［Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７−７７３ （１９９１）］がその例として挙げられる。Ｆｕｒｋａ ｅｔ ａｌ． ［１４ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ｖｏｌｕｍｅ ５， Ａｂｓｔｒａｃｔ ＦＲ：０１３ （１９８８）； Ｆｕｒｋａ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ３７：４８７−４９３ （１９９１）］、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ ［１９８６年１２月発行の米国特許第４，６３１，２１１号］ およびＲｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ． ［１９９１年４月２３日発行の米国特許第５，０１０，１７５号］ には、アゴニストまたはアンタゴニストとして試験され得るペプチドの混合物を製造するための方法が記載されている。
【０１２４】
別の特徴において、合成ライブラリー［Ｎｅｅｄｅｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１０７００−４（１９９３）；Ｏｈｌｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： １０９２２−１０９２６ （１９９３）； Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．， 国際特許公開 ＷＯ ９２／００２５２； Ｋｏｃｉｓ ｅｔ ａｌ．， 国際特許公開 ＷＯ ９４２８０２８， それらのそれぞれは完全に参照により本発明に組み込まれる］およびそれらの同等物を本発明に従ってＮＥＴリガンドをスクリーニングするのに使用することができる。
【０１２５】
スクリーニングは、ＮＥＴを発現する組換え細胞を用いてか、あるいはまた、例えば前記のように組換えで製造された精製タンパク質を用いて実施することができる。例えば、ＮＥＴのＤＮＡ結合部分かまたはＮＥＴのタンパク質結合部分を含む標識された可溶性ＮＥＴの能力を用いて、前述の文献に記載のようにライブラリーをスクリーニングすることができる。
【０１２６】
一つの実施態様において、ＮＥＴは直接的に標識されることができる。別の実施態様において、標識された二次試薬を使用して所定の分子（例えば、固相支持体に結合する分子）へのＮＥＴの結合を検出することができる。結合は、酵素標識によるｉｎ ｓｉｔｕ 発色団形成によって検出することが可能である。適当な酵素には、アルカリホスファターゼおよびホースラデイッシュペルオキシダーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。別の実施態様において、異なる所定のアクセプター分子上に２つの酵素標識を有する２つの発色性基質を用いて２色アッセイを使用することができる。交差反応性および単反応性のリガンドは２色アッセイで同定できる。
【０１２７】
本発明で使用するその他の標識には、着色されたラテックスビーズ、磁気性ビーズ、蛍光標識（いくつかのフルオロホアを挙げれば、例えば蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、テキサスレッド（ＴＲ）、ローダミン、遊離またはキレート化させたランタニド族の塩、特にＥｕ３＋がある）、化学蛍光分子、ラジオアイソトープまたは磁気共鳴イメージングラベルがある。２色アッセイは、２以上の着色されたラテックスビーズ、または種々の波長で発光するフルオロホアを用いて実施することができる。標識されたものは視覚的に、または機械的／光学的手段によって検出することができる。機械的または光学的手段には、蛍光活性化される選別手段、即ち、ＦＡＣＳの類似品、およびマイクロマニュピュレーター除去手段が含まれる。
【０１２８】
ここで実証されるように、ＮＥＴタンパク質のレベルは、タンパク質の代謝性標識によって評価することができる。［３５Ｓ］−メチオニンで補填された培養培地の存在下での組織バイオプシーの生体外インキュベーション中に代謝性標識が生じる場合には、検出されたマーカーのそれぞれのレベルが生体外条件によって影響され得る。［３５Ｓ］−メチオニンによる代謝性の（または生合成の）標識の外に、本発明はさらに、［１４Ｃ］−アミノ酸および［３Ｈ］−アミノ酸（不安定ではない位置に置換されるトリチウムを用いる）での標識を意図するものである。このように各化合物のサンプルまたはライブラリーは、その中のタンパク質を、例えば銀、金、クマジーブルーまたはアミド−シュワルツを用いた比色分析の染色、いくつかの技術を挙げれば、例えば［３２Ｐ］−正リン酸塩、［１２５Ｉ］、［１３１Ｉ］によるアイソトープ標識、蛍光または化学発光法によるタグ、並びに、標識された抗体または特異的に結合するマーカーのパートナーを用いた免疫学的検出によって標識後、直接的に標識することができる。
【０１２９】
また、ＮＥＴ ｃＤＮＡおよび誘導体を酵母スクリーニングにおいて２−ハイブリッド系で使用すると、ＮＥＴ、ＮＥＴ／ＤＮＡ結合のアゴニストまたはアンタゴニストに対するリガンドを同定することができ、そしてリン酸化可能であるか、またはＮｅｔリン酸化を阻害するタンパク質を同定することができる。
【０１３０】
Ｎｅｔ転写因子活性のモジュレータ−
いくつかの化合物は、本出願人によってＮｅｔ転写因子のモジュレータ−として同定された。それらは例えば、ｐ３８シグナル経路の阻害剤であるＳＢ２０３５８０：４−［５−（４−フルオロフェニル）−４−（４−（ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）フェニルメチルフルオキシド、またはＥＲＫシグナル経路の阻害剤であるＰＤ９８０５９：２−（２−アミノ−３−メトキシフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オンおよびＵ０１２６：１，４−ジアミノ−２，３−ジシアノ−１，４ビス［２−アミノフェニルチオ］ブタジエンである。
【０１３１】
医薬組成物
本発明の任意の化合物またはＮＥＴアンチセンスは、生体内で製薬上許容され得るビヒクルまたは担体中に導入されるのが好ましい。「製薬上許容され得る」という表現は、ヒトに投与した際に生理的に許容され得るものであって、かつアレルギーまたは類似の望ましくない反応、例えば胃部不快感、眩暈などを典型的には起さない分子および組成物について適用される。好ましくは、本明細書中で使用されるように、「製薬上許容され得る」という用語は、連邦政府または州政府の監督官庁によって認可されたか、または、動物およびさらに好ましくはヒト用に合衆国薬局方または他の一般的に認可された薬局方に列挙されたものを意味する。「担体」という用語は、化合物が一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを意味する。このような製薬上の担体は滅菌用液体、例えば水および油状物であって、例えば石油、動物油、植物油、合成油、例えば落花生油、大豆油、ミネラルオイル、ごま油などであることができる。水または生理的食塩水並びに水性デキストロースおよびグリセロール溶液は、特に注入可能な溶液用の担体として使用するのが好ましい。好ましい製薬担体は、Ｅ．Ｗ． Ｍａｒｔｉｎによる“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載されている。
【０１３２】
トランスジェニック動物
「動物」という用語は、本明細書においてはヒト以外の全ての脊椎動物を含む意味で使用される。それはまた、胚の段階および胎児の段階を含む発育中の全ての段階における個々の動物を含む。「トランスジェニック動物」とは、例えばマイクロインジェクションまたは組換えウイルスを用いた感染によるような細胞より小さいレベルでの慎重な遺伝的操作によって、直接的または間接的に受け取られた遺伝子情報を有する１つ以上の細胞を含む動物である。この誘導されたＤＮＡ分子は染色体内で結合され得るか、または染色体外で複製可能なＤＮＡであることができる。「生殖細胞系トランスジェニック動物」という用語は、遺伝情報が生殖細胞系に導入され、それによってその情報を子孫に移すことができる能力を与えるトランスジェニック動物を意味する。事実、このような子孫がその情報のいくつかまたは全てを有する場合には、その後それらはまたトランスジェニック動物になる。
【０１３３】
該情報は、レシピエントが属する動物の種には無関係であり、特定の個々のレシピエント、またはレシピエントが既に有する遺伝情報には無関係である。この最後の場合には、導入された遺伝子は天然の内因性遺伝子に比較すると異なって発現され得る。
【０１３４】
遺伝子は、単離されたＲＮＡ鋳型由来のｃＤＮＡを直接的合成またはいくつかのそれの組合わせにより調製することによって、遺伝子供給源から該遺伝子を単離することによって獲得することができる。
【０１３５】
発現されるためには、遺伝子は調節領域に操作可能に結合されるべきである。プロモーターのような調節領域を使用すると、ある種の組織または成長段階のある種の段階まで遺伝子発現を増加、減少、調節または指定することができる。プロモーターは、天然に生じるプロモーターである必要はない。本発明の「トランスジェニック非ヒト動物」は、非ヒト動物の生殖細胞系に「導入遺伝子」を導入することによって産生される。細胞へのＤＮＡの導入を可能にする方法は、一般的に利用可能であって、技術的によく知られている。導入遺伝子を導入する様々な方法を使用することができる。一般的に、接合体はマイクロインジェクションのための最良の標的である。マウスでは、雄の前核が直径約２０μｍのサイズに達すると、ＤＮＡ溶液の１〜２ｐＬの再現可能な注入が可能になる。遺伝子導入用標的としての接合子の使用には、大きな利点がある。大抵の場合、注入されたＤＮＡは、最初の卵割の前に宿主遺伝子に導入される（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ， ｅｔ ａｌ．， （１９８５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２，４４３８−４４４２）。この結果、トランスジェニック非ヒト動物のほとんど全ての細胞は組み込まれた導入遺伝子を有する。一般的に、これはまた、生殖細胞の５０％が導入遺伝子を収容するので、初代の子孫への導入遺伝子の効率的な伝達をもたらすことになる。接合子のマイクロインジェクションは、本発明の実施において導入遺伝子を組み込むのに好ましい方法である。
【０１３６】
また、レトロウイルス感染も、非ヒト動物に導入遺伝子を導入するのに使用できる。発育中の非ヒト胚は、胚盤胞段階まで生体外で培養することができる。この間、割球はレトロウイルス感染に対する標的であることができる（Ｊａｅｎｉｃｈ， Ｒ． （１９７６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７３， １２６０−１２６４）。割球の効率的な感染は、透明帯を除去するための酵素的処置によって得られる（ＨｏｇａＮＥＴ ａｌ．， （１９８６） ｉｎ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．）。導入遺伝子を導入するのに使用するウイルスベクター系は、典型的には導入遺伝子を有する複製不良なレトロウイルスである（Ｊａｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９８５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２， ６９２７−６９３１； Ｖａｎ ｄｅｒ ＰｕｔｔｅＮＥＴ ａｌ．， （１９８５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２， ６１４８−６１５２）。トランスフェクションはウイルス産生細胞の単層上の割球を培養することによって容易かつ効率的に達成される（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ， 前記； Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔａｌ．， （１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ． ６：３８３−３８８）。あるいはまた、後の段階で感染させることもできる。ウイルスまたはウイルス産生細胞を、胞胚腔に注入することができる（Ｊａｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９８２） Ｎａｔｕｒｅ ２９８：６２３−６２８）。取り込みはトランスジェニック非ヒト動物を形成した細胞の一部においてのみ生じるので、初代動物のほとんどが導入遺伝子のモザイクになる。さらに、作製された動物は、ゲノムの種々の位置に導入遺伝子のレトロウイルスの挿入を含有する。これらの挿入は一般的に子孫において分離する。さらにまた、妊娠中期胚の子宮内レトロウイルス感染によって、低い効率ではあるが、生殖細胞に導入遺伝子を導入することができる（Ｊａｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９８２） 前記）。
【０１３７】
導入遺伝子の導入の標的細胞の三番目のタイプは、胚性幹細胞（ＥＳ）である。ＥＳ細胞は、生体外で培養された移植前の胚から得られる（Ｅｖａｎｓ， Ｍ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， （１９８１） Ｎａｔｕｒｅ ２９２， １５４−１５６； Ｂｒａｄｌｅｙ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３０９． ２５５−２５８； Ｇｏｓｓｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．， （１９８６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３， ９０６５−９０６０； ａｎｄ ＲｏｂｅｒｔｓｏＮＥＴ ａｌ．， （１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２２．４４５−４４８）。導入遺伝子は、ＤＮＡトランスフェクションまたはレトロウイルスが仲介する形質導入によって効率的にＥＳ細胞に導入される。得られた形質転換されたＥＳ細胞は、その後、非ヒト動物由来の胚盤胞と合一され得る。ＥＳ細胞は胚をコロニー化し、得られたキメラ動物の生殖細胞系に寄与する（再考用としてＪａｅｎｉｓｃｈ， Ｒ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０． １４６８−１４７４参照）。
【０１３８】
導入されたＤＮＡおよびその発現の存在を評価する方法は容易に入手できかつ技術的によく知られている。このような方法には、外来ＤＮＡを検出するためのＤＮＡ（サザン）ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、並びにＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を検出するためのウエスタンブロットがあるが、これらに限定されるものではない。これらの方法には、ＭＤＭ２を検出するための免疫学的技術および組織化学的技術が含まれる。
【０１３９】
本明細書中で使用する「導入遺伝子」とは、例えば後記実施例に記載の手段によるようにヒト介在によって非ヒト動物の生殖細胞系列中に導入されるＤＮＡ配列である。
【０１４０】
遺伝子治療およびトランスジェニックベクター
前述のように、「ベクター」とは、宿主細胞への本発明核酸の運搬のための任意の手段である。好ましいベクターはウイルスベクターであって、例えばレトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスである。すなわち、ＮＥＴをコードする遺伝子もしくはｃＤＮＡ、またはそれのＮＥＴポリペプチドドメインフラグメント、またはＮＥＴ ＳｃＦｖまたはＮＥＴドミナント突然変異体（ｍｕｔａｎｔ ｄｏｍｉｎａｎｔ）またはＮＥＴアンチセンスは、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）、生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でウイルスベクターを用いるか、またはＤＮＡの直接導入を介して導入される。標的化された組織における発現は、例えばウイルスベクターもしくは受容体リガンドを用いて、または組織特異的なプロモーターを用いてまたは両方を用いて、特定の細胞に対してトランスジェニックベクターを標的化することによって遂行できる。
【０１４１】
前述で指摘したように、本発明の発現ベクターを使用すると、ＮＥＴ活性のモジュレータ−のスクリーニングまたは生物学的試験のために細胞にトランスフェクトするか、または遺伝子治療（例えば、ＮＥＴ活性のレベルを増加または減少させる目的で）のためにまたは生体外でｎｅｔ遺伝子またはｎｅｔアンチセンス遺伝子を送達するために細胞にトランスフェクトすることの両方を行うことができる。また、アンチ（ａｎｔｉ）−ＮＥＴ ｓｃＦｖを発現するベクターは、下記に論じられる技術を用いて導入することができる。
【０１４２】
生体内または生体外における標的化（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）および治療方法に通常使用されるベクターは、ＤＮＡを基盤としたベクターおよびレトロウイルスベクターである。ウイルスベクターの構築化および使用の方法は技術的に知られている［例えば、Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｒｏｓｍａｎ， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０ （１９９２）参照］。ウイルスベクターは 複製において欠損があるのが好ましい。即ち、それらは標的細胞において自律的複製ができない。一般的に、本発明の範囲内で使用する複製欠損ウイルスベクターのゲノムは、感染した細胞中のウイルスの複製に必要である少なくとも１つの領域を欠失する。これらの領域は、当業者に知られた任意の方法によって、（全体または部分的に）削除され得るかまたは非機能的にさせるかのいずれかであることができる。これらの技術には、全除去および置換（他の配列による、特に挿入された核酸による）、部分的欠失または本質的な（複製のための）領域への１つ以上の塩基付加が含まれる。このような技術は、生体外（単離されたＤＮＡ上で）実施されるか、または遺伝子操作の技術を用いるか、または突然変異誘発剤による処置によって原位置で実施され得る。複製欠損ウイルスは、ウイルス粒子をカプセル化するのに必要なそのゲノム配列を保持するのが好ましい。
【０１４３】
ＤＮＡウイルスベクターには弱毒化または欠損ＤＮＡウイルス例えば、ヘルペス単純（ｓｉｍｐｌｅｘ）ウイルス（ＨＳＶ）、パピローマウイルス、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、レンチウイルス等があるが、これらに限定されるものではない。完全にまたはほとんど完全にウイルス遺伝子を欠く欠損遺伝子が好ましい。欠損ウイルスは、細胞に導入後には複製能がなく、したがって産生ウイルス感染に達しない。欠損ウイルスベクターを使用すると、ベクターが他の細胞に感染可能であることに関係なく、特定の局在化した領域中の細胞への投与が可能になる。このように、特定の組織を特異的に標的化することができる。特定のベクターの例には、欠損ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）ベクター［Ｋａｐｌｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２：３２０−３３０ （１９９１）］、糖タンパク質Ｌ遺伝子を欠く欠損ヘルペスウイルスベクター［特許公開 ＲＤ ３７１００５ Ａ］、または他の欠損ヘルペスウイルスベクター［国際特許公開　ＷＯ ９４／２１８０７， １９９４年９月２９日公開； 国際特許公開　ＷＯ ９２／０５２６３， １９９４年４月２日公開］およびＳｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．［Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．９０：６２６−６３０ （１９９２）； また Ｌａ Ｓａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９８８−９９０ （１９９３）参照］に記載されたような弱毒化アデノウイルスベクター、および欠損アデノ随伴ウイルスベクター［Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：３０９６−３１０１ （１９８７）； Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３：３８２２−３８２８ （１９８９）； Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：３９８８−３９９６ （１９８８）］があるが、これらに限定されるものではない。
【０１４４】
好ましくは、生体内投与には適当な免疫抑制処置をウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター）と併せて用いると、ウイルスベクターおよびトランスフェクトされた細胞の免疫不活化が避けられる。例えば、免疫抑制サイトカイン例えばインターロイキン−１２ （ＩＬ−１２）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）または抗ＣＤ４抗体を、ウイルスベクターに対する体液性または細胞性免疫応答をブロックするのに投与することができる［例えば、Ｗｉｌｓｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ （１９９５）を参照されたい］。さらに、最小数の抗原を発現させるために設計されるウイルスベクターを使用するのが有利である。
【０１４５】
本発明は、遺伝子治療適用のために治療上有効量のＮＥＴアンチセンスまたはＮＥＴ ＳｃＦｖまたはＮＥＴドミナント変異体を発現するベクターの送達を意図する。ＮＥＴドミナント変異体の例には、Ｍａｉｒａ ｅｔ ａｌ．（ＥＭＢＯ Ｊ． （１９９６） １５：５８４９−６５）によって提供されるＣ１２またはＧＡＬ−Ｎ６がある。本明細書中において「治療上有効な量」という表現は、少なくとも約１５％、好ましくは少なくとも約５０％、さらに好ましくは少なくとも９０％のＮＥＴ活性を減少させ、最も好ましくは臨床的に十分なＮＥＴ活性の阻害またはＮＥＴによって制御される遺伝子の発現の調節解除を防ぐのに十分な量の意味で使用される。あるいはまた、治療上有効な量は、宿主において臨床的に有意の状態での改善をもたらすのに十分な量である。
【０１４６】
あるいはまた、本発明は、遺伝子治療適用のために治療上有効な量のＮＥＴを発現するベクターの送達を意図する。本明細書中の「治療上有効な量」という表現は、宿主に対する活性、機能および応答において少なくとも約１５％、好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも９０％減少させるのに十分な量、そして最も好ましくは臨床的に有意の欠損を防ぐにの十分な量であることを意味するのに使用される。あるいはまた、治療上有効な量は、宿主において臨床的に有意な状態での改善をもたらすのに十分な量であることを意味する。
【０１４７】
ウイルス性または非ウイルス性の任意のベクターは、製薬上許容され得るビヒクルまたは担体中に生体内導入されるのが好ましい。「製薬上許容され得る」という表現は、ヒトに投与された場合に、生理学上受容されることができかつ胃部不快感、眩暈などのようなアレルギーまたは類似の望ましくない反応を典型的に生じない分子または組成物に関する。好ましくは、本明細書中で使用する「製薬上許容され得る」という用語は、動物、さらに特にはヒトでの使用において、連邦政府または州政府の監督官庁が承認済みであるか、または合衆国薬局方、または一般的に認められた薬局方に列挙されているということを意味する。「担体」という用語は、該化合物がそれと一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルに関する。このような医薬担体は、滅菌済みの液体、例えば水および油状物、例えば、石油または動物油、植物油、石油、例えば、落花生油、大豆油、ミネラルオイル、ごま油等であることができる。水または水溶液、塩水溶液、および水性デキストロースおよびグリセロール溶液は、好ましくは、特に注入可能な溶液用の担体として用いられる。好ましい医薬担体は、Ｅ．Ｗ． Ｍａｒｔｉｎ．による“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載がある。
【０１４８】
アデノウイルスベクター
好ましい実施態様において、ベクターはアデノウイルスベクターである。アデノウイルスは、多様なタイプの細胞に本発明の核酸を効率的に運搬するために修飾することのできる真核性ＤＮＡウイルスである。多様な抗原型アデノウイルスが存在する。これらの抗原型のうち本発明の範囲内では２型または５型のヒトアデノウイルス（Ａｄ２またはＡｄ５）または動物起源のアデノウイルスを用いるのが好ましい（Ｗ０９４／２６９１４参照）。本発明の範囲内で使用できる動物起源のアデノウイルスには、イヌ、ウシ、マウス（例：Ｍａｖ１， Ｂｅａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５ （１９９０） ８１）、ヒツジ、ブタ、トリ、およびサル（例： ＳＡＶ）の各起源のアデノウイルスが含まれる。動物起源のアデノウイルスは好ましくはイヌアデノウイルスであり、より好ましくはＣＡＶ２アデノウイルス（例えば、ＭａｎｈａｔｔａｎまたはＡ２６／６１種（ＡＴＣＣ ＶＲ−８００））である。
【０１４９】
好ましくは、本発明の複製欠損アデノウイルスベクターには、ＩＴＲ、キャプシド化配列および所定の核酸が含まれる。さらにより好ましくは、アデノウイルスベクターの少なくともＥ１領域が機能していないことである。好ましくはＥ１領域の欠失は、Ａｄ５アデノウイルスの配列における４５５〜３３２９ヌクレオチド（ＰｖｕＩＩ−ＢｇｌＩＩフラグメント）、あるいは３８２〜３４４６（ＨｉｎｄＩＩ−Ｓａｕ３Ａフラグメント）に及ぶ。また、他の領域、特にＥ３領域（Ｗ０９５／０２６９７）、Ｅ２領域（Ｗ０９４／２８９３８）、Ｅ４領域（Ｗ０９４／２８１５２、Ｗ０９４／１２６４９およびＷ０９５／０２６９７）または任意の後期遺伝子Ｌ１−Ｌ５も修飾されることができる。
【０１５０】
好ましい実施態様において、アデノウイルスベクターはＥ１領域（Ａｄ １．０）に欠失を有する。Ｅ１欠失アデノウイルスの例はヨーロッパ特許第１８５，５７３号に開示されており、その内容は参照により本発明に組み込まれる。別の好ましい実施態様において、アデノウイルスベクターはＥ１およびＥ４領域（Ａｄ ３．０）において欠失を有する。Ｅ１／Ｅ４−欠失アデノウイルスの例は、Ｗ０９５／０２６９７およびＷ０９６／２２３７８に開示されており、その内容は本明細書に参照として組み込まれる。さらに別の好ましい実施態様において、アデノウイルスベクターは、Ｅ４領域および核酸が挿入されるＥ１領域中に欠失を有する（フランス（Ｆｒ）特許第９４１３３５５号参照、その内容は本明細書に参照により組み込まれる）。
【０１５１】
本発明の複製欠損組換えアデノウイルスは、当業者に知られた任意の技術によって製造することができる（Ｌｅｖｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ １０１ （１９９１） １９５， ＥＰ １８５ ５７３； Ｇｒａｈａｍ， ＥＭＢＯ Ｊ． ３ （１９８４） ２９１７）。特に、それらは、なかんずく、アデノウイルスおよび所定のＤＮＡ配列を担持するプラスミドとの間の相同組換えによって製造することができる。適当な細胞系へのアデノウイルスおよびプラスミドの共トランスフェクション（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）の後に相同組換えが実施される。用いる細胞系は、好ましくは（ｉ）該エレメントによって形質転換可能であり、さらに（ｉｉ）複製欠損アデノウイルスのゲノムの部分に相補可能である配列を、好ましくは、組換えの危険性を避けるために組込まれた形態で含むべきである。使用できる細胞系の例としては、ヒト真核性腎臓細胞系２９３（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６ （１９７７） ５９）（それはＡｄ５アデノウイルスのゲノムの左手部分（１２％）をそのゲノムに組込まれて含有する）並びにＷ０９４／２６９１４およびＷ０９５／０２６９７の各出願中に記載のようなＥ１およびＥ４機能を補足することができる細胞系を挙げることができる。組換えアデノウイルスは、当業者に周知である標準的な分子生物学技術を用いて回収および精製される。従って、本発明はまた欠損組換えアデノウイルスにも関する。そのゲノムはＮＥＴをコードする遺伝子またはｃＤＮＡ、またはそれのＮＥＴポリペプチドドメインフラグメント、およびＮＥＴ ＳｃＦｖまたはＮＥＴドミナント変異体をコードする配列を含有する。
【０１５２】
アデノ随伴ウイルスベクター
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、安定かつ部位特異的な方法でそれらが感染する細胞のゲノム中への組込みが可能である比較的小さなサイズのＤＮＡウイルスである。それらは細胞の成長、形態または分化になんらかの影響をもたらすことなく広範な細胞に感染することができ、そしてそれらはヒトの病状に関与するようには思われない。ＡＡＶゲノムはクローン化され、配列決定されそして特性付けられた。それは約４７００塩基を含み、各末端には約１４５塩基の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）領域が含まれ、ウイルスの複製起点として利用される。そのゲノムの残りは、キャプシド化機能を担持する２つの必須領域に分割される。該領域は、ウイルス複製およびウイルス遺伝子発現に含まれるｒｅｐ遺伝子を含むゲノムの左手部分、およびウイルスのキャプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を含むゲノムの右手部分である。
【０１５３】
生体内および生体外で遺伝子を運搬するためのＡＡＶから誘導されたベクターの使用についての記載がある（ＷＯ ９１／１８０８８；ＷＯ ９３／０９２３９；ＵＳ ４，７９７，３６８、ＵＳ ５，１３９，９４１、ＥＰ ４８８ ５２８参照）。これらの出版物には、ｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子が欠失し、所定の遺伝子によって置換される多様なＡＡＶ誘導構築物、並びに生体外（培養細胞中に）または生体内（有機体中に直接的に）に所定の該前記遺伝子を伝達するためのこれらの構築物の使用が記載されている。本発明の複製欠損組換えＡＡＶは、２つのＡＡＶ逆方向末端繰り返し配列（ＩＴＲ）領域に隣接する所定の核酸配列を含有するプラスミド並びにＡＡＶキャプシド化遺伝子（ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子）を担持するプラスミドとを、ヒトヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）で感染させる細胞系に一緒にトランスフェクトすることによって調製することができる。生産されるＡＡＶ組換え体は、次いで標準法によって精製される。
【０１５４】
従って、本発明はまた、ＡＡＶ−誘導組換えウイルスに関し、そのウイルスのゲノムは、ＡＶ ＩＴＲに隣接する、ＮＥＴをコードする遺伝子またはｃＤＮＡ、またはそのＮＥＴポリペプチドドメインフラグメント、ＮＥＴ ＳｃＦｖまたはＮＥＴドミナント変異体をコードする配列を含む。本発明はまた、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接する、ＮＥＴをコードする遺伝子もしくはｃＤＮＡ、またはそのＮＥＴポリペプチドドメインフラグメント、ＮＥＴ ＳｃＦｖまたはＮＥＴドミナント変異体をコードする配列を含むプラスミドに関する。このようなプラスミドはそのままで、所望により、リポソームベクター（シュードウイルス）に取り込まれるプラスミドを用いて、核酸配列を運搬するのに使用することができる。
【０１５５】
レトロウイルスベクター
別の実施態様において、ＮＥＴをコードするｎｅｔ遺伝子もしくはｃＤＮＡ、またはそれのＮＥＴポリペプチドドメインフラグメント、またはＮＥＴ ＳｃＦｖまたはＮＥＴドミナント変異体は、例えば、ＡｎｄｅｒｓｏＮＥＴ ａｌ， 米国特許第５，３９９，３４６号； Ｍａｉｍ ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｃｅｌｌ ３３：１５３； ＴｅｍｉＮＥＴ ａｌ， 米国特許第４，６５０，７６４号； ＴｅｍｉＮＥＴ ａｌ．， 米国特許第４，９８０，２８９号； Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：１１２０； ＴｅｍｉＮＥＴ ａｌ．， 米国特許第５，１２４，２６３； ヨーロッパ特許第４５３２４２号， ヨーロッパ特許第１７８２２０号；ＢｅｒｎｓｔｅｉＮＥＴ ａｌ． ＧｅＮＥＴ． Ｅｎｇ． ７ （１９８５） ２３５； ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３ （１９８５） ６８９； Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙらによって１９９５年３月１６日に公開された国際特許公開番号ＷＯ ９５／０７３５８、およびＫｕｏ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｂｌｏｏｄ ８２：８４５に記載のようにして、レトロウイルスベクターに導入することができる。それらのレトロウイルスは、分裂中の細胞に感染したウイルスを組込んでいる。 そのレトロウイルスのゲノムには２つのＬＴＲ、１つのキャプシド化配列および３つのコード領域（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）が含まれる。組換えレトロウイルスベクターにおいて、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子は、一般的に全体または部分が欠失しており、所定のある異種の核酸配列で置換されている。これらのベクターは、異なる型のレトロウイルス、例えばＨＴＶ、ＭｏＭｕＬＶ（「マウスモロニー（Ｍｏｌｏｎｙ）白血病ウイルス」ＭＳＶ（「マウスモロニー肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「ハーベイ肉腫ウイルス」）；ＳＮＶ（「脾臓壊死ウイルス」）；ＲＳＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）およびフレンドウイルスから構築されることができる。欠損レトロウイルスベクターは、Ｗ０９５／０２６９７に開示されている。
【０１５６】
一般的に、核酸配列を含む組換えレトロウイルスを構築するために、ＬＴＲ、キャプシド化配列およびコード配列を含むプラスミドが構築される。この構築物は、パッケージング細胞系をトランスフェクトするのに使用され、該細胞系は、プラスミド中では欠損するレトロウイルスの機能をトランスに（ｉｎ ｔｒａｎｓ）供給することができる。従って、一般的に、パッケージング細胞系は、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を発現することができる。このようなパッケージング細胞系は、先行技術文献、特に、細胞系ＰＡ３１７（ＵＳ４，８６１，７１９）；ＰｓｉＣＲＩＰ細胞系（Ｗ０９０／０２８０６）およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ細胞系（Ｗ０８９／０７１５０）に記載されている。さらに、組換えレトロウイルスベクターは、転写活性を抑制するためのＬＴＲ内、並びに、ｇａｇ遺伝子の一部を含むこともある広範な被抱配列内に修飾を含むことができる（Ｂｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１ （１９８７） １６３９）。組換えレトロウイルスベクターは、当業者に知られた標準技術によって精製される。
【０１５７】
レトロウイルスベクターは、感染粒子として機能するか、または単回のトランスフェクションを受けるために構築され得る。前者の場合には、ウイルスは、がん性の形質転換性質の原因であるもの以外のそれの遺伝子の全てを維持するために改変され、そしてＮＥＴをコードする遺伝子もしくはｃＤＮＡ、またはそれのＮＥＴのポリペプチドドメインフラグメント、またはＮＥＴ ＳｃＦｖまたはＮＥＴドミナント変異体を発現するために修飾されることができる。非感染性のウイルスベクターは、ウイルスのパッケージングシグナルを破壊するよう製造されるが、しかし非相同遺伝子およびパッケージングシグナルを含有するよう設計される共誘導されたウイルスのパッケージングを必要とする構造遺伝子を保持する。すなわち、産生されるウイルス粒子は別のウイルスを産生することができない。
標的化された遺伝子運搬は、１９９５年１０月に公開された国際特許公開ＷＯ９５／２８４９４に記載されている。
【０１５８】
非ウイルス性ベクター
あるいはまた、ＮＥＴをコードする遺伝子もしくはｃＤＮＡ、またはそのＮＥＴポリペプチドドメインフラグメント、ＮＥＴ ＳｃＦｖまたはＮＥＴドミナント変異体を含むベクターは、リポフェクションによって生体内に導入することができる。過去１０年間、生体外での核酸のカプセル化およびトランスフェクションのためのリポソームの使用が増加している。リポソーム仲介によるトランスフェクションで生じた困難および危険を抑えるように設計された合成カチオン脂質を使用すると、マーカーをコードする遺伝子の生体内トランスフェクション用のリポソームを調製することができる［Ｆｅｉｇｎｅｒ， ｅｔ． Ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８４：７４１３−７４１７ （１９８７）； Ｍａｃｋｅｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：８０２７−８０３１ （１９８８）； Ｕｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−１７４８ （１９９３）参照］。カチオン性脂質の使用は、負に帯電した核酸のカプセル化を促進し、さらにまた負に荷電した細胞膜による融合も促進させることができる［Ｆｅｉｇｎｅｒ ａｎｄ Ｒｉｎｇｏｌｄ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：３８７−３８８ （１９８９）］。核酸の運搬のために特に有用な脂質化合物および組成物は、国際特許公開Ｗ０９５／１８８６３およびＷ０９６／１７８２３、および米国特許第５，４５９，１２７に記載されている。生体内で特定の臓器に外来性遺伝子を導入するためのリポフェクションの使用には、一定の実用的利点がある。特定の細胞へのリポソームの分子ターゲティングは、一つの有利な分野を示す。明白なことだが、個々の細胞型への直接的なトランスフェクションが、細胞異質性を有する組織（例えば膵臓、肝臓、腎臓および脳）において特に利点がある。脂質は、標的化の目的のために他の分子に化学的に結合させることができる［Ｍａｃｋｅｙ， ｅｔ． ａｌ．、同上］。標的のペプチド、例えば、ホルモンまたは神経伝達物質およびタンパク質、例えば抗体、または非ペプチド分子は、化学的にリポソームに結合可能である。
【０１５９】
また、その他の分子もトランスフェクションを促進するのに有用であり、その例としてはカチオン性オリゴポリペプチド（例えば国際特許公開Ｗ０９５／２１９３１）、ＤＮＡ結合タンパク質から誘導されたペプチド（例えば国際特許公開Ｗ０９６／２５５０８）またはカチオン性ポリマー（例えば国際特許公開Ｗ０９５／２１９３１）を挙げることができる。
【０１６０】
生体内でベクターを裸のＤＮＡプラスミドとして導入することも可能である。遺伝子治療用の裸のＤＮＡベクターは、技術的に知られた方法、例えばトランスフェクション法、エレクトロポーレーション法、マイクロインジェクション法、形質導入法、細胞融合法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム沈殿法、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタートランスポーターの使用［例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：９６３−９６７ （１９９２）； Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：１４６２１−１４６２４ （１９８８）； Ｈａｒｔｍｕｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎａｄｉａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ２，０１２，３１１， ｆｉｌｅｄ Ｍａｒｃｈ １５，１９９０； Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：２７２６−２７３０ （１９９１）参照］によって、所望の宿主細胞中に導入することができる。また、受容体が仲介するＤＮＡ送達法も使用することができる［Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． ＧｅＮＥＴｈｅｒ． ３：１４７−１５４ （１９９２）； Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：４４２９−４４３２ （１９８７）］。
それ故に、本発明はまた、ＮＥＴをコードする遺伝子またはｃＤＮＡ、またはそれのＮＥＴポリペプチドドメインフラグメント、またはＮＥＴ ＳｃＦｖまたはＮＥＴドミナント変異体をコードする配列を含むプラスミドに関する。
以下に、本発明をよく理解できるように実施例について述べるが、それらは単に説明のためであって、本発明を限定するものではない。
【０１６１】
実験材料および実験方法
プラスミドおよび細胞系
ｐＣＥＦＬ、ｐＣＥＦＬ−ＧＰＣＲ、ｐ６０１Ｄ−アンチセンスＮＥＴおよびｐ６０１Ｄ（空のベクター）はＧｉｏｖａｎｅ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １９９４， ８， １５０２−１３）に記載されている。
Ｇａｌ４−Ｎ５はＭａｉｒａ ｅｔ ａｌ．（ＥＭＢＯ Ｊ． （１９９６） １５：５８４９−６５）に記載されている。
ｐＲＡＳ Ｖ１２、ΔＲａｓはＧｉｏｖａｎｅ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ （１９９５） ２９：７６９−７２．）に記載されている。
【０１６２】
微小管形成
ａ．ＮＩＨ３Ｔ３細胞（Ｃ１１）を、ｐＣＥＦＬ−ＫＳＨＶＧＰＣＲ（マウスＥＦ１２プロモーター）およびアンチＮＥＴ発現ベクターまたは対応する空のベクター（ｐ６０１Ｄ：ＢｅｄｄｉｎｔｏＮＥＴ ａｌ．１９８９，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １０６：３７−４６）を使用して、リン酸カルシウム法によってトランスフェクトした。沈殿物を適用後１６時間経過してから、細胞を２回ＤＭＥＭで洗浄し、０．０５％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中で４８時間インキュベートした。培地を回収し、直に試験するかまたは−８０℃に貯蔵した。
ｂ．ＨＵＶＥＣ細胞（継代数４〜６回）を、１０％ＦＣＳ、ヘパリン（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＣＧＦ（内皮細胞増殖因子、Ｓｉｇｍａ、５０ｎｇ／ｍｌ）およびグルタミン（２ｍＭ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２Ｋ中で増殖させた。
【０１６３】
ｃ．２４マルチウェルプレートのウェルを、４℃において１２０ｍｌ／ウェルの生長因子の減少されたマトリゲルマトリックス（Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｄｕｃｅｄ ＭＡＴＲＩＧＥＬ Ｍａｔｒｉｘ；Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）でコートし、３７℃で３０分間インキュベートした。
ｄ．トリプシン化されたＨＵＶＥＣ細胞を、０．５〜１．０％ ＦＣＳ、ヘパリン（５０ｎｇ／ｍｌ）およびグルタミン（２ｍＭ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２Ｋに再懸濁し、次いで上記のマトリックスで被覆されたウェルに播種した（１０，０００細胞／ウェル）。
一旦細胞が接着したら（約４〜６時間）、工程「ａ」からの慣熟培地を添加した（１：１ 容量：容量）。プレートを１６〜２４時間後観察した。
【０１６４】
ｅ．生体外での血管新生活性の抗ＶＥＧＦ抗体阻害および組換えＶＥＧＦ刺激。
工程「ａ」からの慣熟培地を、０．２ｍｇ／ｍｌの抗マウスＶＥＧＦポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ）または５０ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ）とともに１時間３７℃でインキュベートし、次いで工程「ｄ」のように被覆されたマトリックスに添加し、ウェルにＨＵＶＥＣを播種した。
プレートを１６〜２４時間後観察した。
【０１６５】
ＥＳ細胞、胚およびマウスの遺伝子型
ＥＳ細胞または尾生検由来のゲノムＤＮＡを単離し、１００μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁した。遺伝子型を決定するために、１５μｌのＤＮＡをＸｂａで消化し、そして標的化構築物の外側の３′領域から単離した３．８ｋｂを用いてサザンブロッテイングにより解析した。通常の解析のために、マウスは対立遺伝子特異的プライマー、即ちＵＣ５４（配列番号１５）、ＵＣ５６（配列番号１６）およびＵＣ５７（配列番号１７）を用いてＰＣＲにより遺伝子型が決定された。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間の１サイクル、次いで９４℃で３０秒、６４℃で３０秒および７２℃で４５秒の３０サイクル、並びに７２℃で５分間の１サイクルであった。メーカー（Ｓｉｇｍａ）の使用説明書に記載のとおりに、各プライマー２００ｎｇ＋ＰＣＲ試薬（Ｓｉｇｍａ）を含有する２５μＬの反応物中で０．５μＬ ＤＮＡを使用した。生成物のサイズは、野生型由来の１５５０ｂｐおよび標的対立遺伝子由来の１３００ｂｐである。
【０１６６】
ＲＴ−ＰＣＲプロトコール
ＲＮＡを、メーカーの指示どおり、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）でマウス組織から抽出した。１μｇの総ＲＮＡを種々のエキソン特異的なプライマーを用いた逆転写に使用した。増幅反応の条件は、Ｇｉｏｖａｎｅ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， １９９５， ２９： ７６９−７２）によって記述されている。使用した各プライマーの対は、次のとおりであった。即ち
2004512051.tif 000003
【０１６７】
ＰＣＲ産物を５％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動、エチジウムブロミドでの染色、Ｕ．Ｖ．下での視覚化によって解析した。
【０１６８】
ウェスタンブロット
Ｕｌｔｒａｔｕｒａｘホモジナイザーを用いてＲＩＰＡバッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．５％ デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．０、２μｇ／ｍｌ アプロチニン、２μｇ／ｍｌ　ロイペプチン、および１００μｇ／ｍｌ フェニルメチルスルフォニルフロリド）で組織を抽出した。タンパク質（２００−３００μｇ）を１０％ＳＤＳ ＰＡＧＥ上で電気泳動し、ニトロセルロース膜上に移し、精製３７５抗体および増大された化学ルミネッセンス検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて検出した。
【０１６９】
【実施例】
実施例１：ＫＳＨＶ／ＨＨＶ８ ＯＲＦ ７４によって誘発される血管新生はＮＥＴによって仲介される
カポジ肉腫ウイルス（ＫＳＨＶ／ＨＨＶ８）は血管新生を刺激する（Ｂｏｓｈｏｆｆ， Ｎａｔｕｒｅ， ３９１， ２４−２５（１９９８））。そのＯＲＦ７４はＧタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）をコードする。そのＧＰＣＲは形質転換させており、ＥＲＫおよびｐ３８キナーゼシグナル伝達カスケードおよびＶＥＧＦａを含む経路を介して血管新生の表現型を誘導する。ＮＩＨ３Ｔ３におけるＧＰＣＲ発現は、主にＶＥＧＦａといった、培地中への血管新生因子の分泌を誘導する（Ｂａｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。慣熟培地は、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）中で増殖するヒト臍帯血管上皮細胞（ＨＵＶＥＣ）による微小管形成を誘導し（図１ａ）、ＶＥＧＦａに対する抗体はこの活性を中和する（図１ｂ）［（Ｂａｉｓ ｅｔ ａｌ．． Ｎａｔｕｒｅ， ３９１， ８６−８９ （１９９８）参照）。
【０１７０】
ＮＥＴがＫＳＶＨ／ＨＨＶ８ＯＲＦ７４によって誘発される血管新生に関与するかどうかを決定するために、アンチセンスＮＥＴ ＲＮＡまたはトランスドミナントＮＥＴ変異体（Ｇａｌ．Ｎｅｔ ２１９−４０９＝Ｇａｌ４．Ｎ５）のいずれかによってＮｅｔが低下調節された場合に、ＧＰＣＲを発現する細胞からの慣熟培地による微小管形成を試験した。
【０１７１】
本技術は、本質的には（Ｂａｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９８）に記載のとおりである。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に維持し、６ウェルプレート中で、ｐＣＥＦＬ−ＧＰＣＲ単独、ｐ６０１Ｄ−アンチセンス−ＮＥＴを有するｐＣＥＦＬ−ＧＰＣＲ、またはｐ６０１Ｄ−トランスドミナントＮｅｔを有するｐＣＥＦＬ−ＧＰＣＲをＢＢＳリン酸カルシウム法によってトランスフェクトした。１６時間後、細胞を洗浄し、２４時間新しい培地に維持した。ＨＵＶＥＣ細胞とのインキュベーション前に、慣熟培地のいくらかを、（ｂ） ０．２μｇ／ｍｌの抗マウス−ＶＥＧＦポリクローナル抗体（総ヤギＩｇＧ； Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ）または（ｄおよびｆ）１０ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ）のいずれかとともに、１時間２１℃でインキュベートした。２４マルチウェルプレートのウェルを１５０μｌ／ウェルのＭＡＴＲＩＧＥＬ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ）で被覆し、３０分間３７℃でインキュベートした。１０％ウシ血清含有培地中のＨＵＶＥＣ細胞（１０５／ウェル）を添加し、慣熟培地を一旦添加し、細胞を接着させた。 プレートを２４時間後に観察した（位相差、元倍率、×４０）。
【０１７２】
ＮＥＴが、アンチセンスｎｅｔ ＲＮＡ（図１ｃ）またはトランスドミナントＮｅｔ異性体（Ｇａｌ．ＮＥＴ ２１９−４０９；図１ｅ）のいずれかによって低下調節された場合に、ＧＰＣＲ発現細胞からの慣熟培地によって形成された微小管が阻害された。
ＶＥＧＦａを慣熟培地に添加すると、活性を誘導する微小管を回復したので、ＶＥＧＦａ産生はこの阻害に関与する（図１ｄおよびｃ、および１ｆおよび１ｅを比較されたい）。
【０１７３】
ＧＰＣＲを発現するＮＴＨ３Ｔ３からの慣熟培地は、培養プレート上で成長するＨＵＶＥＣ細胞の増殖を刺激する［（Ｂａｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９８）参照］。ＧＰＣＲにより誘導されるＨＵＶＥＣの増殖におけるＮｅｔの低下調節の効果を決定するために、Ｎｅｔがアンチセンスｎｅｔ ＲＮＡまたはトランスドミナントＮｅｔ変異体（Ｇａｌ．ＮＥＴ ２１９−４０９， ＴＤ）のいずれかによって低下調節される場合のＨＵＶＥＣ細胞の増殖を試験した。
【０１７４】
ＮＴＨ３Ｔ３細胞を、ＧＰＣＲに対するコントロールベクタ（ｐＣＥＦＬ）、ＧＰＣＲに対するベクター、およびアンチセンス−Ｎｅｔに対するコントロールベクター（ｐ６０１Ｄ）；ＧＰＣＲに対するベクターおよびアンチセンス−Ｎｅｔまたはトランスドミナント（ＴＤ）−Ｎｅｔを用いて上記のようにトランスフェクシトした。１０％ウシ血清含有培地中ＨＵＶＥＣ細胞（１０５）をウェル毎に添加し（６ウェルクラスター、Ｃｏｓｔａｒ ３５１６）、慣熟培地を一度添加し、細胞を接着させた。４８時間後、細胞をトリプシンで処理し、１ｍｌの培地中に再懸濁し、生細胞をトリパンブルー染色後にカウントした。
【０１７５】
これらの結果は、アンチセンスｎｅｔ ＲＮＡまたはトランスドミナント変異体（ＴＤ）タンパク質のいずれかによるＮｅｔの低下調節は、ＧＰＣＲ により誘導されるＨＵＶＥＣの増殖を減少させるということを示す（図２）。コントロールは、ＧＰＣＲを発現するＮＩＨ３Ｔ３からの慣熟培地が、培養プレート上で成長するＨＵＶＥＣ細胞の増殖を刺激することを示した［図２を参照し、ＧＰＣＲおよびコントロールベクターを比較されたい］。
【０１７６】
以下の例においては、Ｎｅｔを介してＧＰＣＲにより誘発される血管新生の機序には、ＥＲＫおよびｐ３８ ＭＡＰキナーゼシグナリングカスケードのＧＰＣＲ活性化、内因性Ｎｅｔのリン酸化、ＶＥＧＦａプロモーターの転写活性化、およびＶＥＧＦａペプチドの分泌が関与することが見出された。
【０１７７】
実施例２：Ｎｅｔを介してＧＰＣＲにより誘発される血管新生の機序には内因性Ｎｅｔのリン酸化が関与する：
内因性Ｎｅｔのリン酸化はホスホセリン３６５を認識するリン酸特異的な抗体でなされた。この抗体は、ＥＲＫおよびｐ３８シグナリングカスケードによるＮｅｔのリン酸化により誘導される活性化に重要である。
ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、前記のように、ＧＰＣＲに対するコントロールベクター（ｐＣＥＦＬ）またはＧＰＣＲに対するベクター（ｐＣＥＦＬ−ＧＰＣＲ）でトランスフェクトした。１４時間後、細胞を洗浄し、２．５時間成長培地に置いた。次いで、細胞をＳＢ ２０３５８０（１０μＭ）（Ａｌｅｘｉｓ Ｃｏｒｐ．）またはＵ０１２６（１０μＭ）（Ｐｒｏｍｅｇａ） で３０分間処置した。６時間後、抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびホスホセリン３６５Ｎｅｔに対する抗体［２Ｆ３抗体Ｇｉｏｖａｎｅ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（１９９５） ２９：７６９−７２）］ または活性化されたＥＲＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてウエスタンブロッテイングにより解析した。
【０１７８】
結果は図３に示されている。ＧＰＣＲは、Ｎｅｔのリン酸化を誘導し（列１，２）、阻害剤であるＳＢ ２０３５８０およびＵ ０１２６のそれぞれによって示されるように、その誘導はｐ３８およびＥＲＫ経路の両方に依存している（列３、４；ＳＢ ２０３５８０は使用条件下においてはＥＲＫ活性化を阻害しないことに注目されたい）。
トランスフェクトされたＮｅｔのリン酸化により、およびＧａｌ４−Ｎｅｔ（２１９−４０９）を用いた転写活性アッセイにおいて同様の結果（データは示さていない）が得られた。これらのデータは、ＥＲＫおよびｐ３８経路の両方を介して、ＧＰＣＲがリン酸化およびＮｅｔの活性化を誘導することを示している。ｐ３８経路またはＥＲＫ経路の阻害剤がＮＥＴのリン酸化を阻害し、従ってＧＰＣＲによって誘発される血管新生を阻害するということが分かる。
【０１７９】
実施例３：Ｎｅｔを介してＧＰＣＲにより誘発される血管新生の機序にはＶＥＧＦａプロモーターの転写活性化が関与する：
Ｎｅｔがアンチセンスｎｅｔ ＲＮＡによって低下調節される場合に、ＧＰＣＲによるＶＥＧＦプロモーター活性化におけるＮｅｔの役割を試験した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＧＰＣＲのコントロールベクター（ｐＣＥＦＬ）＋アンチセンスＮｅｔのコントロールベクター（ｐ６０１Ｄ）；ｐＣＥＦＬ＋アンチＮｅｔ；ＧＰＣＲ＋ｐ６０１Ｄ；ＧＰＣＲ＋アンチＮｅｔ並びにレポーター：ｍｄｍ２−Ｌｕｃ； ｐ２１−Ｌｕｃ； ＶＥＧＦ−ＬｕｃおよびｐＣＭＶ−ＬａｃＺで前記のようにトランスフェクトした。細胞を収集し、溶解し、次いでルシフェラーゼアッセイを標準法によって実施した。
ＧＰＣＲは、トランス活性化アッセイにおけるＶＥＧＦａプロモーターを活性化することが見出された（図４参照）。アンチセンスでのＮｅｔの低下調節は、ＶＥＧＦａプロモーターのＧＰＣＲ活性化を阻害した。低下調節は、アンチセンスｎｅｔがＧＰＣＲの存在下ではｍｄｍ２およびｐ２１ＷＡＦ１プロモーターの活性に影響を及ぼさないという点で特異的であるようである。
【０１８０】
実施例４： Ｎｅｔを介してＧＰＣＲ により誘発される血管新生の機序にはＶＥＧＦａペプチドの分泌が関与する：
繊維芽細胞におけるＧＰＣＲ発現がＶＥＧＦａペプチドの分泌を誘導するかどうかを試験するために、等量のＮＩＨ３Ｔ３細胞をｐＣＥＦＬ（ＧＰＣＲのベクター）； ＧＰＣＲ＋ｐ６０１Ｄ （アンチＮｅｔのコントロールベクター）；ＧＰＣＲ＋アンチＮｅｔ；ΔＲａｓ；Ｒａｓ−Ｖ１２＋ｐ６０１Ｄ；Ｒａｓ−Ｖ１２＋アンチ−Ｎｅｔ；ｐ６０１Ｄ；ピュ−ロマイシン発現ベクターを有するアンチ−Ｎｅｔを用いて、前記のようトランスフェクトした。洗浄後、２ｎＭのピュ−ロマイシンを添加した。４８時間後、慣熟培地を収集し、細胞をトリプシン処理し、１ｍｌの培地中に再懸濁し、次いで生細胞をトリパンブルー染色後にカウントした。ＶＥＧＦペプチドレベルをＥＬＩＳＡによって測定し（マウス−ＶＥＧＦ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅキット、Ｒ＆Ｄ）、その結果を細胞数について補正した。
【０１８１】
繊維芽細胞におけるＧＰＣＲ発現は、図５でＧＰＣＲベクターとコントロールのベクターとを比較することによって示されるように、培地中へのＶＥＧＦａペプチドの分泌を誘導した。アンチセンスのｎｅｔは、培地中へのＶＥＧＦａペプチドの分泌を阻害した。
Ｒａｓがん遺伝子は、ＶＥＧＦａ発現（Ａｒｂｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ＵＳＡ， ９４， ８６１−８６６ （１９９７））およびＮｅｔ活性（Ｇｉｏｖａｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ Ｄｅｖ， ８， １５０２−１５１３， （１９９４））の両方を刺激する。
【０１８２】
これらの結果は、Ｒａｓ−Ｖ１２によって誘導されたＶＥＧＦａペプチド分泌が、ｎｅｔアンチセンスによって阻害されたということを示している。
誘導されない条件下においてＮｅｔはリプレッサーである（Ｇｉｏｖａｎｅ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。アクチベータ−の不在下におけるＮｅｔのアンチセンスはＶＥＧＦａペプチドレベルを増加させたが、それは基本条件の下ではＮｅｔがＶＥＧＦａ産生のリプレッサーであることを示している。
この例によれば、Ｎｅｔ活性化物質（例えば、Ｒａｓがん遺伝子）が存在しない場合には、Ｎｅｔ発現の阻害またはＮｅｔ活性の阻害がＶＥＧＦａペプチド分泌の増加を介して血管新生を促進することができるということが立証される。
【０１８３】
また、この実施例によれば、Ｎｅｔが（例えば、Ｒａｓがん遺伝子によって）活性化されている場合に、Ｎｅｔの発現の阻害またはＮｅｔ活性の阻害は、ＶＥＧＦａペプチド分泌の減少を介して血管新生を阻害または減少させることができるということも立証される。
また、この実施例によれば、ＮｅｔがＥＲＫおよび／またはｐ３８経路を介したリン酸化（例えば、ＧＰＣＲによる）により活性化される場合、そのような状況でのＮｅｔ発現の阻害またはＮｅｔ活性の阻害は、ＶＥＧＦａペプチド分泌の減少を介して血管新生を阻害または減少させることができるということも立証される。
【０１８４】
Ｎｅｔ発現の阻害は、アンチセンスＮｅｔ、例えばｐ６０１ＤのＥｃｏＲＩ部位の逆方向での完全ｃＤＮＡ（Ｇｉｏｖａｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｄｅｖ． １９９４， ８ １５０２−１３）、ｓｃＦＶ、ｄｓ ＲＮＡで得られる。Ｎｅｔ活性の阻害は、ＮｅｔドミナントのＧａｌ−Ｎｅｔ、例えばＧａｌ．Ｎ５もしくはＣ１２により、またはリン酸化の阻害またはＮｅｔ核転移の阻害によって得られる。
【０１８５】
実施例５：ＮＥＴの低下調節はＶＥＧＦａ分泌を減少させる：
ＶＥＧＦａ分泌におけるＮＥＴの低下調節の役割を調査する目的で、アンチセンスｎｅｔの存在下または不在下でＧＰＣＲを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞の安定なクローンを調製した。
ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＧＰＣＲを発現するベクターおよび選択可能なマーカーである「ネオマイシン」を用いて形質転換させ、個々のクローンを取出し、増殖させ、次いでＶＥＧＦペプチドの発現を、空のベクターをトランスフェクトしたコントロールクローンと比較して解析した（図６）。
【０１８６】
２つの典型的なクローンを選択し、ピューロマイシン耐性を共に有するアンチセンスｎｅｔを発現するベクターまたはコントロールベクターを用いて再度形質転換させ、次いでピューロマイシンについて選択した（図７）。減少されたレベルのＶＥＧＦペプチドを発現するいくつかの独立したクローンを増殖させた。アンチセンスＮｅｔで形質転換されたクローンのプールの解析により、短期間の実験（図５参照）と同様に、それの全ての効果はＶＥＧＦａ分泌を減少させることであることが示された。
【０１８７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッテイングによるクローンの解析により、ＮＥＴ発現が減少するということが示された（アンチセンスおよびコントロールのクローンを参照されたい。図８；ＴＢＰは等量負荷のためのコントロールである）。
Ｎｅｔに対する高い相同性（タンパク質レベルで７５％）を有するタンパク質であるＥｌｋ１の発現は減少されなかったが、そのことはこのアンチセンスが特異的であることを示している。またこのアンチセンスは、Ｈ−ＲａｓおよびＧＰＣＲの発現に全く影響しなかった（データは示されていない）。
これらの結果から、ＮＥＴ活性がＧＰＣＲによって刺激される場合に、Ｎｅｔ発現の阻害がＶＥＧＦａペプチド分泌を減少させ、それ故にアンチセンスのアンチＮｅｔがＶＥＧＦａペプチド分泌の減少を介して血管新生を阻害または減少させることができるということが確認される。
【０１８８】
実施例６：Ｎｅｔの低下調節はＧＰＣＲによる腫瘍形成を阻害する：
腫瘍の血管新生におけるＮＥＴの役割を調査するために、アンチセンスｎｅｔと一緒にまたはアンチセンスｎｅｔなしでＧＰＣＲを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞の安定なクローンを調製した（実施例５参照）。
腫瘍成長は、ＧＰＣＲクローンおよびＧＰＣＲ−アンチｎｅｔクローンを皮下注射した（１回の注射につき約１０６細胞）ＢａｌｂＣ ｎｕ／ｎｕ８週齢雌マウスにおいて試験した。ＧＰＣＲクローンは、ＧＰＣＲ−アンチセンス−ｎｅｔクローンよりも大きな腫瘍を形成した（図９）が、それはＮｅｔの低下調節がＧＰＣＲによる腫瘍形成を阻害することを示している。
試験し５つのクローンについて、Ｎｅｔの低下調節は腫瘍の容量を約７０％（平均２１０〜３０ｍｍ２）減少させた。
【０１８９】
実施例７：Ｎｅｔの低下調節によって低酸素性腫瘍が生じる：
ＧＰＣＲ腫瘍は赤い色をしており、腫瘍によって誘発された新しく形成された血管と関連していることが観察された（図１０、矢印参照）。対照的に、ＧＰＣＲ／アンチセンス−ｎｅｔ腫瘍は小さく、外見的には血管は全く見えなかった。
腫瘍における血管を、ＣＤ３１ （ＰＥＣＡＭ−１）に対する抗体を用いてパラフィンセクションで検出した。腫瘍の濃密な脈管構造はＧＰＣＲ腫瘍において検出された（図１１、ａおよびｃ）が、一方、ＧＰＣＲ／アンチセンス−ｎｅｔ腫瘍には血管がほとんどなかった。ＧＰＣＲ／アンチセンス−ｎｅｔクローンにおける血管によって覆われている表面領域は、ＧＰＣＲクローンに比較して７５％減少した（図１２）。減少された血管密度は、ＧＰＣＲ／アンチセンス−ｎｅｔクローンによって形成された腫瘍の酸素レベルがより低いことを示唆する。各腫瘍は、低酸素症の確認マーカーであるＥＦ５に対する蛍光免疫組織化学によって解析した（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。腫瘍を有するマウスにＥＦ５（１ｍｇ／マウス）を注入し、そして４時間後セクションを準備し、Ｃｙ５に結合する抗−ＥＦ５抗体で染色し、デジタルカメラの付いたコンピュータ制御の蛍光顕微鏡で解析した。コントロールＧＰＣＲクローンに比較するとＧＰＣＲ／アンチセンス−ｎｅｔクローンにおいては、より高いレベルのＥＦ５結合が存在した（図１３）。これらのデータは、Ｎｅｔを欠くＧＰＣＲ腫瘍が、恐らくは減少された血管密度によるのであろうが、低酸素性であることを示している。
【０１９０】
以上のことから考えると、これらの結果からは、Ｎｅｔが腫瘍血管新生に必要であるということが分かる。また、これらの結果は、ＮＥＴの阻害剤が固形腫瘍の治療に有用な薬剤を提供することができるということをも立証している。
【０１９１】
実施例８：ｎｅｔ遺伝子に欠失を有するマウスの構築（Ｎｅｔδ変異型マウス）
ｎｅｔ遺伝子は、マウスでは相同組換えによって調節された。ＮｅｔのＤＮＡ結合ドメインをコードするエキソン２は、ＰＧＫ−ｎｅｏカセットによって置換された（図１４Ａ）。
【０１９２】
Ｎｅｔ遺伝子のクローニング
Ｎｅｔ遺伝子を、マウス１２９／Ｓｖ系由来のゲノムＤＮＡを含むλＥＭＢＬ３ファージライブラリーからクローン化した。エキソン２を含有するクローンは、サザンブロット解析およびＤＮＡ配列決定によって特性付けされた。
ターゲッテイングベクターは、ｎｅｔゲノムクローンの５′末端由来の１１．５−ｋｂ ＢａｍＨＩ−Ａｖａｌフラグメント、１．８−ｋｂ ＰＧＫ−ｎｅｏカセット、およびｎｅｔゲノムクローンの３′末端由来の１．２−ｋｂ ＡｖａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳベクターに挿入することにより構築された。
【０１９３】
Ｎｅｔ遺伝子の標的破壊
ターゲッテイング構築物を、ＮｏｔＩ消化によりベクターから切り取り、Ｄ４ ＥＳ細胞にエレクトロポーレーションを施した［Ｄｅｉｒｉｃｈ ａｎｄ Ｄｏｌｌｅ （１９９７） ＧｅＮＥＴａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ （ｅｄ． Ｓ．Ｔ． Ｋｌｕｇ， Ｒ． Ｔｈｉｅｌ） ｐｐ １１１−１２３． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅに記載のとおりの方法］。Ｇ４１８耐性ローン由来のゲノムＤＮＡは、サザンブロット解析によって特性付けられた。ＤＮＡをＸｂａＩで消化し、各ブロットを、ｎｅｔゲノムクローンの３’末端由来の３．８−ｋｂ ＮｃｏＩ−ＮｃｏＩフラグメントからなるプローブとハイブリダイズした。野生型対立遺伝子は１３−ｋｂフラグメントを、そして突然変異型対立遺伝子は５−ｋｂフラグメントを産生する。
【０１９４】
ヘテロ接合型ｎｅｔ ＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６胚盤胞に注入してキメラマウスを作製した。生殖細胞系を介して変異型Ｎｅｔ対立遺伝子に伝達したキメラマウスを使用して、２つの異なる遺伝的バックグラウンド（１２９／ＳｖおよびＣ５７ＢＬ／６）にＮｅｔ欠失変異体（ＮＥＴ δ）系マウスを作製した。各マウスを、プライマーのＵＣ５４、ＵＣ５６およびＵＣ５７を用いてのマウスの尾由来のゲノムＤＮＡでのＰＣＲによってスクリーニングした。野生型対立遺伝子は１５５０−ｂｐフラグメントを、そして突然変異型対立遺伝子は１３００−ｂｐフラグメントを産生する。
【０１９５】
2004512051.tif 000004
【０１９６】
図１４（Ａ）は、野生型Ｎｅｔ対立遺伝子、ターゲッテイングベクターおよび組換え変異型Ｎｅｔ対立遺伝子の略図である。欠失型エキソン２は、翻訳開始コドンを含み、Ｎｅｔタンパク質のＤＮＡ結合ドメインにおけるアミノ酸１〜６９をコードする。サザンブロット解析に使用する３′プローブの位置は、１３Ｋｂ（野生型対立遺伝子）および５ｋｂ（変異型対立遺伝子）のＸｂａＩで消化されたフラグメントと同様に示されている。Ｂ， ＢａｍＨＩ、Ｘ， ＸｂａＩ。
【０１９７】
遺伝子は、サザンブロッテイング（図１４Ｂ）およびＰＣＲ（図１４Ｃ、プライマーおよびプローブについては図１４Ａ参照）によるマウスＤＮＡの解析によって示されるように改変された。。図１４（Ｂ）は、ヘテロ接合型（＋／−）交雑由来の子孫からのＸｂａＩ−消化されたＤＮＡのサザンブロット解析を示す。３′プローブを用いたハイブリダイゼーション法によって、野生型対立遺伝子（ＷＴ）の１３ｋｂまたは標的化された対立遺伝子（Ｍ）の５ｋｂのフラグメントに対応するバンドが得られた。図１４（Ｃ）は、同じ子孫のＰＣＲ解析を示す。遺伝子型は図の一番上に示され、矢印は野生型（ＷＴ、１５５０ ｂｐ）および標的対立遺伝子（Ｍ、１３００ｂｐ）に対する特異的な増幅産物を示している。ＰＣＲプライマーセット（ＵＣ５４、ＵＣ５６、ＵＣ５７）は、ターゲッテイングスキームに示されている。実験材料および実験方法、即ち、「ＥＳ、胚およびマウスの遺伝子型」を参照されたい。
【０１９８】
マウスは、新規な選択的にスプライシングされたエキソン２を欠くｍＲＮＡを示し（図１４Ｄ）、そしてエキソン３の翻訳開始から得られるＤＮＡ結合ドメイン欠失の変異型タンパク質を発現する（Ｎｅｔ δ、図１４Ｅ）。図１４（Ｄ）は、ＲＴ−ＰＣＲによるＮｅｔ転写物の検出を示す。Ｅ１６野生型およびホモ接合型変異型胚から単離されたＲＮＡは、Ｎｅｔ遺伝子（エキソン１〜エキソン４）の異なるエキソン由来のプライマーとのＲＴ−ＰＣＲ反応に使用した。ＲＴ−ＰＣＲプライマーセットは、パネルの左側に示されている。エキソン２の欠失が予期されたように、ｅｘ１／ｅｘ２またはｅｘ２／ｅｘ３セットを有する変異型（−／−）ＲＮＡでは増幅が見られない。野生型胚のように、変異型胚においてエキソン３とエキソン４（ｅｘ３／ｅｘ４セット）との間において増幅産物が観察された。エキソン１とエキソン３（ｅｘ１／ｅｘ３セット）との間のＲＴ−ＰＣＲ反応は、野生型（２１７ｂｐ）に比較してより小さな産物（９０ｂｐ）がホモ接合型の変異体胚で存在するということを示している。図１４（Ｅ）は、２週齢の野生型、ヘテロ接合型およびホモ接合型マウス由来の肺タンパク質抽出物のウエスタンブロット解析を示している。４９−ｋＤＡ Ｎｅｔタ」ンパク質の量は、ヘテロ接合型（＋／−）で減少し、ホモ接合型変異型動物（−／−）では完全に消失する。しかし、新規な４２ｋＤＡタンパク質バンドは、（ヘテロ接合型と同様に）変異体抽出物に出現している。
【０１９９】
実施例９：マウスにおけるＮｅｔ遺伝子突然変異は血管系に影響する：
ヘテロ接合型＋／δ １２９Ｓｖマウスを交差した場合に、約２５％の子孫が突然変異に対してホモ接合型（図１５Ａ）であると見出されたが、１０週齢以内に約９０％のホモ接合型動物が、乳び胸症の特徴である胸腔中の乳びの蓄積（図１５Ｃ）による呼吸困難で死んだ（図１５Ｂ）。いくつかの例において血管欠損が観察された（データは示されていない）が、透過性は低かった。乳び胸症のマウスの各セクションの組織学的試験では、ホモ接合型変異体マウスが循環器系の構造またはネットワークの欠陥によるリンパ性ドレナージに欠損を示す拡張型リンパ管（リンパ管拡張症；図１６、Ｉｖ参照）を有することが示された。そのリンパ管を、リンパ管にβ−ガラクトシダーゼを発現するヘテロ接合型のＶＥＧＦ−Ｒ３−β−ｇａｌノックインマウスを用いて同定した（Ｄｕｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。このバックグラウンドで、乳び胸症罹患のｎｅｔ δ／δマウスにおいて、それらのリンパ管は胸腔では拡張していたが（図１７Ａ＋Ｂ）、心臓（Ｃ＋Ｄ）または真皮（Ｅ＋Ｆ）では拡張はみられなかった。拡張型血管は、乳び症のない５日齢のδ／δマウスの胸腔（Ｇ ＆ Ｈ）に、そして１７．５ｄｐｃと同じ位早期に（データは示されてない）観察された。
１２９Ｓｖマウスにおけるリンパ管の表現型、およびいくらかのマウスで観察された血管の表現型は、Ｎｅｔが高発現している内皮細胞中のＮｅｔ機能損失の直接的な結果であろう。
【０２００】
実施例１０：Ｎｅｔは内皮細胞において高発現される：
Ｎｅｔの発現を、全封入（図１８、１９） およびセクション（図２０、２１）での原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーションによって胚形成中に調査した。Ｅ７．５において、ｎｅｔおよびＶＥＧＦ−Ｒ２（内皮細胞マーカー）の発現が、大変良く似ている（図２０、ＢおよびＣ）。Ｅ８．５において、ｎｅｔおよびＶＥＧＦ−Ｒ２は初期リンパ管卵黄嚢において共発現しており（図１８、Ｅ−Ｆ）、脈管形成している。心内膜において（図２０、Ｈ−Ｉ）および尿嚢において（図１８、ＪおよびＫ）も同様である。Ｅ９．５およびＥ１０．５ではｎｅｔおよびＶＥＧＦ−Ｒ２は、体節間（ｉｎｔｅｒ−ｓｏｍｉｔｉｃ）の血管、大動脈（図１９、Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）および主要な頭部の血管（図１９）において共発現されている。後のＥ１２．５、Ｅ１４．５およびＥ１６．５においては、尾、肝臓、心臓、肺および腸（図２０、Ｇ−Ｌ）でのｎｅｔおよびＶＥＧＦ−Ｒ２の多くの共発現領域が存在し、ｎｅｔが、内皮細胞中で高発現していることを示している。しかし、ｎｅｔおよびＶＥＧＦ−Ｒ２発現に相違があり、それは特に軟骨分化の領域で高発現している（図２１、Ｇ−Ｊ）点にある。脈管形成および血管形成中のＮｅｔの発現は、マウスにおけるｎｅｔ突然変異の結果を説明することができる（乳び胸症）。
【０２０１】
実施例１１：Ｅｇｒ−１遺伝子はＮｅｔに対する標的遺伝子である：
さらに、本発明により、Ｅｇｒ−１がｎｅｔδ／δ胚の肝臓およびいくつかの主要な血管中で過剰発現していることが見出された（データは示されていない）。Ｅｇｒ−１は、ＳＲＥモチーフを有する即時型遺伝子であり、従ってこれは、Ｅｇｒ−１がＮｅｔの標的遺伝子であるということの証明となっている。
面白いことには、Ｅｇｒ−１は血管病理学に関係する［（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ， １９９９）および（ＹａＮＥＴ ａｌ． Ｊ． Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ２０００ Ｍａｒ ； １０５（５）： ５５３−４）］。Ｅｇｒ−１は、特に血管形成術に起因する機械的損傷後の新内膜の形成に必要である。また、それは、明らかにその組織因子の調節を介しての低酸素血症中の脈管系におけるフィブリン沈着にとっても必要である。アテローム性動脈硬化症の病変において、特に平滑筋細胞において発現が持続している。δ／δ ｎｅｔマウスは、Ｎｅｔの低下調節がＥｇｒ−１活性を増加させるということを示唆している。それ故に、Ｎｅｔリプレッサー活性の回復は、血管形成術後の再狭窄の治療およびアテローム性動脈硬化症の治療において有用である。
【０２０２】
実施例１２：正常な条件下のＮｅｔは血管新生のリプレッサーである：
血管新生におけるＮｅｔの役割は角膜嚢技術で詳細に調べられた。この技術はＹｏｓｈｉｄａ等（Ｈｉｓｔｏｌ． Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．， １４，１２８７−１２９４ （１９９９））に記載されている。
ｂＦＧＦによって誘発される血管新生は、ｎｅｔδ／δマウスではそれらの野生型の同腹子と比較して減少しており（図２２）、ＮｅｔがｂＦＧＦによって誘発される血管新生に必要であるということを示している。
また、血管新生は、基本条件では単離された大動脈輪から伸長した内皮細胞によって研究されている。この技術は、Ｂｒｏｗｎ等（Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ， ７５， ５３９−５５５ （１９９６））に記載されている。
【０２０３】
変異型マウスからの血管伸長が増加していた（図２３）。この結果は血清（基本条件）中におけるアンチセンスｎｅｔの作用に関連しており、それはＮｅｔの抑制を除去し、その結果、ＶＥＧＦぺプチドレベルを刺激するのである（図５）。
これらの結果は、基本条件下では血管新生がＮｅｔによって阻害されるということを示している。また、これらの結果は、Ｎｅｔの過剰発現またはＮｅｔ変異細胞中のＮｅｔ発現の回復が、血管新生の調節を増加させるということも示唆している。
【０２０４】
実施例１３：哺乳類のＮＥＴ活性を調節する試薬のスクリーニング
前記の結果からは、ＧＰＣＲまたはＲａｓからＶＥＧＦ産生へのシグナル伝達経路における中間物としての血管新生におけるＮｅｔの役割についての強い証拠が提供された。従って、ＧＰＣＲまたはＲａｓによるＮｅｔの活性化を防止する化合物は有用な抗血管新生薬剤を提供する。
いくつかのタイプのスクリーニングアッセイ、例えば細胞のレポーター遺伝子アッセイ、ＮＥＴ／ＤＮＡ相互作用、酵母におけるタンパク質／タンパク質相互作用、リン酸化アッセイを意図することができる。
【０２０５】
１３−Ａ） Ｇａｌ４−Ｎｅｔ（Ｃ−末端）／ｇａｌ４−レポーター遺伝子（Ｒａｓで形質転換された細胞または血管新生刺激によって活性化された細胞）に対する細胞内レポーター遺伝子アッセイ
この試験は、細胞をベースとした３８４ウェルフォーマットの、一般的なデュアルレポーター遺伝子アッセイとして記載されている。レポーター遺伝子システムで安定にトランスフェクトし、形質転換された２種のヒト細胞系が得られた。即ち、
ＨＣＴ１１６クローンは、１） ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインとＮｅｔ転写活性化ドメイン（Ｃ−ドメイン）との間の融合タンパク質および ２）ＧＡＬ４プロモーターの制御下におけるＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定に発現する。
【０２０６】
非特異的に転写活性と相互作用する分子の選択を避けるために、負の調節がＳＷ４８０結腸がんクローンを用いて付与され、高レベルのβ−カテニンタンパク質を発現し、さらにこの特定のアッセイにおいてはＴ細胞因子／Ｌｅｆ依存性プロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定に発現するか、または任意の他の遺伝子レポーターアッセイにおいては三量体複合体因子ファミリーに関与しないプロモーターの制御下でそのレポーター遺伝子を安定に発現する。
【０２０７】
このアッセイは４つの段階からなる。即ち、（ｉ） ３８４ウェルプレート上の所定の２つの細胞系に播種し、３７℃で一晩インキュベートする（培地：フェノールレッド非含有Ｄ−ＭＥＭ＋０．２２μｍフィルターで濾過した１０％ ＦＣＳ）；（ｉｉ） 候補化合物を添加する；（ｉｉｉ） ＬｕｃＬｉｔｅ試薬（Ｐａｃｋａｒｄ， Ｋｉｔ ＦｉｒｅＬｉｔｅ）を添加し、２４時間インキュベーション（負の調節）の後にＭｉｃｒｏｂｅｔａＴＭＴｒｉｌｕｘ （ＥＧ＆Ｇ Ｗａｌｌａｃ） 上のホタルルシフェラーゼシグナルの読み（β−カテニン依存性転写の読み出し）を行う；および （ｉｖ） ＲｅｎＬｉｔｅ試薬を添加し、ＭｉｃｒｏｂｅｔａＴＭＴｒｉｌｕｘ（ＥＧ＆Ｇ Ｗａｌｌａｃ）上のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼシグナルの読み出し（ＮＥＴ依存性転写の読み出し）を行う；からなる。
所定の分子はＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを阻害するが、しかしＮＥＴアッセイ（Ｎｅｔ阻害剤）に対するホタル活性を阻害しない。また、アクチベーターはこのスクリーニングにおいてＲｅｎｉｌｌａ活性のアクチベーターを選択することによって見出すことも可能である。
【０２０８】
１３−Ｂ） Ｎｅｔ／ＤＮＡ相互作用：
ＮＥＴのこの性質は、いくつかの実験設定において実証されることができる。
− ゲルシフト法（Ｇｉｏｖａｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ Ｄｅｖ． １９９４， ８， １５０２−１３）
− ＮＥＴタンパク質上で保持された標識オリゴヌクレオチド（２−ストランド）の定量。標識されたオリゴヌクレオチドのこの配列はＳＲＥ配列に由来し；Ｎｅｔタンパク質は、真核細胞または原核細胞において（Ｅ． ｃｏｌｉまたはバキュロウイルスのいずれかで）部分的に−ＤＮＡ相互作用ドメイン−または完全長のいずれかで発現されることができ、好ましくはそれの精製を促進する目的で融合タンパク質（Ｈｉｓ、ＨＡ、ＧＳＴ、ｍｙｃ ．．．．）として発現されることができる。この標識されたオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号１４　５′ＴＣＧＡＧＣＣＧＧＡＡＧＴＧＡＣＧＴＣＧＡ ３′（Ｇｉｏｖａｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ Ｄｅｖ． １９９４， ８， １５０２−１３を参照せよ。）であることができる。
【０２０９】
１３−Ｃ） 酵母におけるタンパク質／タンパク質相互作用：
１３−Ｃ−１． 酵母におけるＳＲＥ上のＮｅｔ／ＳＲＦ相互作用
この試験は、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、ＮｅｔがＳＲＥに結合するためにＳＲＦと予め相互作用する必要性を阻害することによってＮｅｔ依存性転写を阻害できる小分子のスクリーニングにある。
− 酵母ＣＬ９系は、一般的に２−ハイブリッド系のスクリーニングツールとして使用されるが、ＧＡＬ４依存性の転写に依存したレポーターシステムを用いてトランスフェクトされる。機能性転写因子のタンパク質／タンパク質相互作用を介する再構築はレポーター遺伝子の発現に至る。ここで、該ＤＮＡ上の特異的なＳＲＥ配列に結合する所定のタンパク質の能力を用いることができるので、ハイブリッド転写因子のこの人為的な再構築は、部分的に必要とされるのみである。高いバックグラウンドを避ける目的で、以下の構築物を使用する：
【０２１０】
− ＮｅｔのＡおよびＢドメインａａ １３３−２６５（ＤＮＡ結合およびＳＲＦ結合ドメイン）に限定されたＮｅｔの部分的ｃＤＮは、（選択マーカーと共に）酵母発現プラスミドにクローン化された。
− ＳＲＦの部分的ｃＤＮＡ（Ｎｅｔ相互作用ドメインおよびＳＲＥ相互作用ドメインの両方に限定されたものである）は、ｐＧＡＤ１Ｏプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にＧａｌ４転写活性化ドメインと共にフレームを合わせてクローン化された。
− ＳＲＥエレメント　５′ＴＡＣＡＣＡＧＧＡＴＧＴＣＣＡＴＡＴＴＡＧＧＡＣＡ ３′（配列番号 １５）は、β−ガラクトシダーゼ、ＵＲＡ３またはＣＡＮ１、ＬＥＵ２、ＨＩＳ３、ＣＹＨ２、ＧＦＰ、．．．（該レポータータンパク質は、比色定量法、蛍光測定法または酵素的方法によって検出することができる）のようなレポーター遺伝子の発現を導くレポータープラスミドのプロモーター配列としてクローン化された。
【０２１１】
これらの３種のプラスミド（各プラスミド１μｇ）は、Ｇｉｅｔｚ ｅｔ ａｌ． （１９９５， ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＬｉＡＣ／ＳＳ−ＤＮＡ／ＰＥＧ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ． Ｙｅａｓｔ， １１ ： ３５５−３６０）に記載のように、ＬｉＡＣ／ＰＥＧで処理することによって該酵母株中で形質転換された。ＮｅｔおよびＳＲＦの両方の発現は、相互作用するタンパク質としてレポーター遺伝子の発現を導く。該酵母株は、ＰＤＲ遺伝子ファミリーまたはＥＲＧ６遺伝子のいずれかに突然変異を導入することによって透過性になる。これらの遺伝子は解毒過程に関与する。
【０２１２】
該酵母系は、支持体のゲル化用の寒天を含有するかまたは含有せずに、ＹＮＢ最小培地（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ （アミノ酸なし） ？ ６、７ｇ／Ｌ；グルコース（２０ｇ／Ｌ）上で培養する。
タンパク質／タンパク質の相互作用を阻害する小分子は、レポーター遺伝子の活性（比色定量上の、感受性、…）を欠損する酵母を生育させる。
この試験は、それぞれのＮｅｔおよびＳＲＦ相互作用ドメインを構築物中で用いることによってＮｅｔ−ＳＲＦ相互作用に簡易化され、また限定されることができる。この場合には、ｃＤＮＡの対応するフラグメントが、ＧＡＬ４タンパク質の転写活性化ドメインとの融合タンパク質（Ｎｅｔ−ＴＡまたはＳＲＦ−ＴＡ）の発現用のｐＧＡＤＩＯプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中でクローン化される。
【０２１３】
次いで他の１つが、ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質（それぞれ、ＳＲＦ−ＢＤまたはＮｅｔ−ＢＤ）の発現用のｐＧＢＴ９ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中でクローン化される。
ここで（ＣＬ９株：リバース２−ハイブリッドと称呼されるこの実験に使用されたＣＬ９は、ＪＣ９８１株のｃｙｈ２変異体である。ＣＹＨ２は、シクロヘキシミドの存在下で生育する能力を付与する。ＣＬ９株は、プラスミドによってトランスフェクトされ（ｔｒｐ１−９０１座位に組み込まれ）、その際、野生型ＣＹＨ２遺伝子はＧａｌｌ（ＵＡＳ）プロモーターの制御下において発現され、ＵＡＳプロモーターはシクロヘキシミド感受性またはレポーター遺伝子発現のいずれかを制御している。
【０２１４】
このように、この試験は、透過性（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ）酵母でのリバース２−ハイブリッド試験にある。タンパク質間の相互作用を阻害する小分子は、選択性生育培地（１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミド）上に酵母の成長をもたらす。
これらの分子は、シクロヘキシミド含有培地上で同様のプロトコールによって試験される。
小分子の試験は、１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミドを含有する選択培地上で形質転換された酵母を増殖させることからなる。試験する分子の滴を、デイッシュの表面に置く。陽性の分子は、成長輪（ｇｒｏｗｔｈ ｈａｌｏ）を与える分子である。次いで陽性はレポーター遺伝子の発現をチェックすることによって証明される。
【０２１５】
１３−Ｃ−２） Ｎｅｔ−ＣｔＢＰ相互作用：
この二番目のリバース２−ハイブリッド試験を使用するが、今度は、Ｎｅｔ ｃＤＮＡがＣＩＤボックスもまた含み、そこでＣｔＢＰタンパク質との相互作用ドメインがマッピングされた。ＳＲＦ ｃＤＮＡはＣｔＢＰ ｃＤＮＡによって置換された。形質転換された酵母のプロセッシングは同一である。
実施例１３Ｃ−１ および２に関して、いくつかのプロトコールは米国特許の第５，２８３，１７３号； 第５，４６８，６１４号； 第５５２５４９０号； 第５，５８０，７３６号； 第５，８８５，７７９号に記載の文献から入手可能である。
【０２１６】
１３−Ｄ） Ｎｅｔリン酸化：
Ｎｅｔのリン酸化は、ＥＬＩＳＡ法または抗ホスホＮｅｔ抗体によって被覆されたＣｙｔｏｓｔａｒプレート（Ｆｌａｓｈｐｌａｔｅｓ）、またはＨＴＲＦ法のいずれかで定量化されることができる。
同時に選択遺伝子（ハイグロマイシン耐性、ネオマイシン耐性、．．．．）を含む発現ベクターで安定にトランスフェクトされた、Ｒａｓで形質転換された哺乳類細胞のクローンにおいて、強力なプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーターのような）の制御下で、Ｎｅｔは過剰発現される。Ｎｅｔタンパク質は、特定のモノクローナル抗体（Ｆｌａｇ、ｍｙｃ−タグ、ＨＡ、．．．）によって認識可能なペプチドとともに、それのＮ末端またはそれのＣ末端のいずれかでタグを付される。細胞をＭＷ９６プレートに播種し（１００００〜１０００００細胞／ウェル）、ＮＥＴのリン酸化の阻害剤として評価されるべき分子によって処理するか、または処理しない。
【０２１７】
ＨＮＴＧバッファー（Ｈｅｐｅｓ ２０ｍＭ ｐＨ ７．５、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ ０．１％、グリセロール１０％、およびホスファターゼおよびプロテアーゼの阻害剤：１ｍＭ Ｎａ３Ｖ０４、アプロチニン２．２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌアンチペイン、１０μｇ／ｍｌベンズアミジン、１μｇ／ｍｌダイズトリプシン阻害剤、１μｇ／ｍｌキモスタチン、１μｇ／ｍｌペプスタチン−Ａ）、またはＲＩＰＡバッファー（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８．０、ＮａＣｌ １５０ ｍＭ、１％ ＮＰ−４０、０．５％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ Ｎａ３Ｖ０４、１００μＭフェニルメチルスルホニルフルオレート（ＰＭＳＦ）、２５μｇ／ｍｌアプロチニン、２５μｇ／ｍｌロイペプチン）のいずれか中に該分子を添加後２４時間経過すると細胞は溶解される。
【０２１８】
次いで、細胞溶解液をモノクローナル抗体２Ｆ３で予め被覆したＭＷ９６プレートに移す。この抗体は、リン酸化されたＮＥＴタンパク質に特異的に結合する。
実験は、以下の伝統的なＥＬＩＳＡ法で実施する。各ウェル中のリン酸化されたＮｅｔの量の定量は、二次標識された抗−タグ抗体の結合を介して示される。この標識によって、酵素測定、比色定量測定、蛍光測定または放射活性測定による、結合した抗体の定量が可能になる。
【０２１９】
別の方法は、正リン酸Ｐ３３またはＰ３２で細胞抽出液を標識し、ＭｏＡＢ ２Ｆ３で予め被覆したＭＷ９６ Ｃｙｔｏｓｔａｒプレート（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中で細胞溶解液をインキュベートすることによる。３回のプレート洗浄後に、結合した放射活性をシンチレーションカウンターでカウントする。
これらの方法に代替する他の方法は、標識されたユーロピウムクリプテート ＭｏＡｂ ２Ｆ３を用いることによるＨＴＲＦのスクリーニング方法の適用にある。この場合には、各試薬は、細胞溶解液（ユーロピウムクリプテートで標識されたＭｏＡｂ ２Ｆ３およびＡＰＣ（アロフィコシアニン）で標識された抗−タグ抗体）中に直接添加する。より簡易化する場合には、この二次抗体をさらにまたビオチン化することができる。すなわち反応混合物にＡＰＣ−ストレプトアビジンを添加する。
【０２２０】
このアッセイにおいては、ユーロピウムが３３７ｎｍで励起する際に、抗−ホスホＮｅｔ Ｅｕクリプテートおよび抗−タグＡＰＣ（Ｎｅｔリン酸化による）の近接により、ユーロピウムとアロフィコシアニン（ＡＦＣ）との間で蛍光転移が生じる。２つの蛍光発光が、一方は６２２ｎｍでそして他方は６６５ｎｍで生じる。次いでこれらの蛍光発光率を測定する。即ち、＜＜（６６５／６２２）×１００００である。
【０２２１】
１３−Ｅ） Ｎｅｔ誘導ペプチド（Ｄボックス）またはＮｅｔタンパク質の、それらのキナーゼ活性をベースとするｐ３８またはＥＲＫスクリーニングテストにおける基質としての使用
この試験のために、一連のペプチドまたは組換えタンパク質：
−組換え哺乳類ｐ３８（αまたはβ）
−組換え哺乳類ＥＲＫ１、ＥＲＫ２
−組換え哺乳類ＪＮＫ１、ＪＮＫ２またはＪＮＫ３
を生産する。
【０２２２】
これらのタンパク質は融合タンパク質（Ｅ．ｃｏｌｉまたはバキュロウイルスのいずれかにおける産生後、容易に精製され得るようなＨＡ−タグまたはＧＳＴ）であることができる。
−基質：ヒトまたはマウスのＮｅｔタンパク質のＣボックスまたはＤボックス（ヒトではａａ２８９−４０７）の活性化ドメインまたは完全長Ｎｅｔタンパク質（前述のように発現される）に対応する組換えペプチド
【０２２３】
キナーゼ反応は、放射標識されたγ−ＡＴＰの存在下で実施する。反応混合物を３０℃で１時間分子の存在下でインキュベートすることができ、次いでその反応を停止させ、各プレートをプレートシンチレーションリーダーにおいてカウントする。
このプロトコールの非放射能適応は、前記の蛍光トランスファーアッセイ（ＨＴＲＦ）を用いることによって可能である。
この場合には、Ｎｅｔ基質はタグを付され、キナーゼ反応の後に１３−Ｄに記載のと同じ試薬を使用することができた（ここでは冷ＡＴＰで実施）。Ｎｅｔがタグを付されていない場合には、それをビオチン化することができ、次いでストレプトアビジンＡＰＣの使用が必要とされる。
【０２２４】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施態様によって、その範囲を限定されるものではない。実際には、本明細書に記載のものの外に、種々の変形が、前記の記載および添付図面から当業者にとっては自明である。このような変形は、本発明の特許請求の範囲内にあるものである。
【０２２５】
参考文献
Ａｒｂｉｓｅｒ， Ｊ．Ｌ．， Ｍｏｓｅｓ， Ｍ．Ａ．， Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ， Ｃ．Ａ．， Ｇｈｉｓｏ， Ｎ．， Ｃａｏ， Ｙ．， Ｋｌａｕｂｅｒ， Ｎ．， Ｆｒａｎｋ， Ｄ．，Ｂｒｏｗｎｌｅｅ， Ｍ．， Ｆｌｙｎｎ， Ｅ．， Ｐａｒａｎｇｉ， Ｓ．， Ｂｙｅｒｓ， Ｈ．Ｒ． ａｎｄ ＦｏＵｃｍａｎ， Ｊ． （１９９７） Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ Ｈ−ｒａｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｔｕｍｏｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｐａｔｈｗａｙｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｉ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ９４， ８６１−８６６．
Ｂａｉｓ， Ｃ．， Ｓａｎｔｏｍａｓｓｏ， Ｂ．， Ｃｏｓｏ， Ｏ．， Ａｒｖａｎｉｔａｋｉｓ， Ｌ．， Ｒａａｋａ， Ｅ．Ｇ．， Ｇｕｔｋｉｎｄ， Ｊ．Ｓ．， Ａｓｃｈ， Ａ．Ｓ．， Ｃｅｓａｒｍａｎ， Ｅ．， Ｇｅｒｓｈｅｎｇｏｒｎ， Ｍ．Ｃ．， Ｍｅｓｒｉ， Ｅ．Ａ． ａｎｄ Ｇｅｒｈｅｎｇｏｒｎ， Ｍ．Ｃ． （１９９８） Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｆＫａｐｏｓｉ’ｓ ｓａｒｃｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｉｓ ａ ｖｉｒａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ａｎｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ［ｓｅｅ ｃｏｍｍｅｎｔｓ］， ［ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｅｒｒａｔｕｍ ａｐｐｅａｒｓ ｉｎ Ｎａｔｕｒｅ １９９８ Ｍａｒ １２；３９２（６６７２）：２１０］， Ｎａｔｕｒｅ， ３９１， ８６−８９．
Ｂｏｓｈｏｆｆ， Ｃ． （１９９８） Ｋａｐｏｓｉ’ｓ ｓａｒｃｏｍａ． Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｔｏ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ［ｎｅｗｓ； ｃｏｍｍｅｎｔ］． Ｎａｔｕｒｅ， ３９１， ２４−２５．
Ｂｒｏｗｎ， Ｋ．Ｊ．， Ｍａｙｎｅｓ， Ｓ．Ｆ．， Ｂｅｚｏｓ， Ａ．， Ｍａｇｕｉｒｅ， Ｄ．Ｊ．， Ｆｏｒｄ， Ｍ．Ｄ． ａｎｄ Ｐａｒｉｓｈ， Ｃ．Ｒ． （１９９６） Ａ ｎｏｖｅｌ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ， ７５， ５３９−５５５．
Ｄｕｍｏｎｔ， Ｄ．Ｊ．， Ｊｕｓｓｉｌａ， Ｌ．， Ｔａｉｐａｌｅ， Ｊ．， Ｌｙｍｂｏｕｓｓａｋｉ， Ａ．， Ｍｕｓｔｏｎｅｎ， Ｔ．， Ｐａｊｕｓｏｌａ， Ｋ．， Ｂｒｅｉｔｍａｎ， Ｍ． ａｎｄ Ａｌｉｔａｌｏ， Ｋ． （１９９８） Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｆａｉｌｕｒｅ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ＶＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−３． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８２， ９４６−９４９．
Ｅｖａｎｓ， Ｓ．Ｍ．， Ｂｅｒｇｅｒｏｎ， Ｍ．， Ｆｅｒｒｉｅｒｏ， Ｄ．Ｍ．， Ｓｈａｒｐ， Ｆ．Ｒ．， Ｈｅｒｍｅｋｉｎｇ， Ｈ．， Ｋｉｔｓｉｓ， Ｒ．Ｎ．， Ｇｅｅｎｅｎ， Ｄ．Ｌ．， Ｂｉａｌｉｋ， Ｓ．， Ｌｏｒｄ， Ｅ．Ｍ． ａｎｄ Ｋｏｃｈ， Ｃ．Ｊ． （１９９７） Ｉｍａｇｉｎｇ ｈｙｐｏｘｉａ ｉｎ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ． ＡｄｖＥｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ， ４２８， ５９５−６０３．
Ｇｉｏｖａｎｅ， Ａ．， Ｐｉｎｔｚａｓ， Ａ．， Ｍａｉｒａ， Ｓ．Ｍ．， Ｓｏｂｉｅｓｚｃｚｕｋ， Ｐ． ａｎｄ Ｗａｓｙｌｙｋ， Ｂ． （１９９４） ＮＥＴ， ａ ｎｅｗ ｅｔｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｔｈａｔ ｉｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ Ｒａｓ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ， ８，１５０２−１５１３．
Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ， Ｅ．Ｓ． ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｔ． （１９９９） Ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ Ｅｇｒ−１−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅＮＥＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ［ｃｏｍｍｅｎｔ］． Ａｍ ＪＰａｔｈｏｌ， １５４， ６６５−６７０．
Ｙｏｓｈｉｄａ， Ａ．， Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｓ．， Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ， Ｔ． ａｎｄ Ｉｎｏｍａｔａ， Ｈ． （１９９９） Ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ． Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ， １４， １２８７−１２９４．
【図面の簡単な説明】
【図１】
特異的にトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞からの慣熟培地によって誘導されたマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）上のＨＵＶＥＣ細胞による微小管形成。
【図２】
慣熟培地におけるＨＵＶＥＣ細胞の増殖。
【図３】
内因性Ｎｅｔのリン酸化。
【図４】
ＧＰＣＲによるＶＥＧＦプロモーターの活性化にはＮｅｔが必要。
【図５】
トランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞からの慣熟培地におけるＶＥＧＦペプチドレベル。
【図６】
ＧＰＣＲ形質転換されたクローンからの慣熟培地におけるＶＥＧＦペプチドレベル。
【図７】
コントロール（ｐ６０１Ｄ）およびアンチＮｅｔベクターをトランスフェクトしたプールまたは単離したＧＰＣＲ形質転換されたクローンからの慣熟培地におけるＶＥＧＦペプチドレベル。
【図８】
ＧＰＣＲ−コントロールおよびＧＰＣＲ−アンチＮｅｔのプールおよびクローンにおけるＮｅｔおよびＥｌｋの発現。
【図９】
ＧＰＣＲ−コントロールクローンおよびＧＰＣＲ−アンチＮｅｔクローンによって形成された腫瘍の容量。
【図１０】
ヌードマウスのＧＰＣＲクローンおよびＧＰＣＲアンチ−Ｎｅｔクローンによって生じた腫瘍の様子。
（Ａ）　ＧＰＣＲクローンの腫瘍
（Ｂ）　ＧＰＣＲ‐アンチ Ｎｅｔクローンの腫瘍
矢印：腫瘍によって誘導された新規に形成された血管
【図１１】
腫瘍における血管の密度。
【図１２】
腫瘍における血管でカバーされた領域。
【図１３】
腫瘍における低酸素性緊張の相違。
【図１４】
マウスＮｅｔ遺伝子座の標的化された突然変異誘発。
（Ａ）野生型Ｎｅｔ対立遺伝子、標的ベクターおよび組換え変異体のＮｅｔ対立遺伝子の略図
（Ｂ）ヘテロ接合の（＋／−）異種交配からの子孫由来のＸｂａＩで消化されたＤＮＡのサザンブロット解析
（Ｃ）同じ子孫のＰＣＲ解析
（Ｄ）ＲＴ−ＰＣＲによるＮｅｔ転写物の検出
（Ｅ）２週令の野生型、ヘテロ接合型およびホモ接合型のマウス由来の肺タンパク質抽出物のウエスタンブロット解析
【図１５】
Ｎｅｔδ／δマウスの表現型。
（Ａ、Ｂ）　Ｎｅｔδ／δマウスの生存を、野生型およびヘテロ接合型（＋／δ）動物と比較したもの
（Ｃ）　表現型の標本図
【図１６】
Ｎｅｔδ／δ胸腔の組織学的解析。
（Ａ）　野生型マウス胸郭
（Ｂ）　変異型マウス胸郭
（Ｃ）　（Ａ）における点線の四角い部分の拡大図
（Ｄ）　（Ｂ）における点線の四角い部分の拡大図
【図１７】
Ｎｅｔδ／δマウスにおける胸部リンパ管の拡張。
【図１８】
Ｅ７．５およびＥ８．５段階の胚におけるＮｅｔＴ（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、ＨおよびＪ）並びにＶＥＧＦ−Ｒ２（Ｂ、Ｄ、Ｆ、ＩおよびＫ）ｍＲＮＡ発現の全封入（ｗｈｏｌｅ−ｍｏｕｎｔ）原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション法による検出。
（Ａ、Ｂ）　Ｅ７．５胚
（Ｃ、Ｄ）　それらの卵黄嚢におけるＥ８．５胚の側面から見た写真
（Ｅ、Ｆ）　Ｅ８．５胚の切開された卵黄嚢における発現
（Ｇ）　切開された栄養膜の錐体の内側表面内のＮｅｔ発現
（Ｈ―Ｋ）　Ｅ８．５段階の胚で観察された標識の腹側および背側の写真
【図１９】
Ｅ９．５およびＥ１０．５におけるＮｅｔ（Ａ、ＣおよびＥ）およびＶＥＧＦ−Ｒ２（Ｂ、ＤおよびＦ）の転写物の全封入ｍＲＮＡ検出。
（Ａ、Ｂ）　Ｅ９．５胚の側面から見た写真
（Ｃ、Ｄ）　Ｅ１０．５胚の頭部領域における発現
（Ｅ、Ｆ）　Ｅ１０．５段階の胚からの主要な領域の側面から見た写真
【図２０】
Ｅ７．５、Ｅ８．５、Ｅ１２．５、およびＥ１４．５段階における原位置ハイブリダイゼーションによるＮｅｔおよびＶＥＧＦ−Ｒ２発現の比較分析。
（Ａ−Ｃ、Ｄ−Ｆ）　母体の脱落膜に存在するＥ７．５およびＥ８．５胚の部分
（Ｇ−Ｉ、Ｊ−Ｌ）　Ｅ１２．５およびＥ１４．５の胚の矢状部分
【図２１】
Ｅ１６．５における隣接した矢状部分におけるＮｅｔおよびＶＥＧＦ−Ｒ２の発現（Ａ−Ｆ）およびＥ１４．５およびＥ１６．５段階における肢軟骨分化中のＮＥＴ発現（Ｇ−Ｊ）。
（Ｂ、Ｅ）　頭部および胸部領域におけるＮｅｔ発現
（Ｃ、Ｄ）　頭部および胸部領域におけるＶＥＧＦ−Ｒ２パターン
【図２２】
マウスの角膜におけるｒｈＦＧＦ−２によって誘導された血管新生。
（Ａ、Ｂ）　Ｎｅｔ野生型および変異型マウスのペレット移植角膜の生体顕微鏡検査結果
【図２３】
マウスの大動脈環血管新生アッセイにおける微小血管形成。
【図２４ａ】
（ヒト）Ｎｅｔポリペプチドのドメイン
Ａボックス：（ｅｔｓドメイン），Ｉｗｑｆｌｌｑｌｌｌ（ＮＥＳ）
Ｂボックス：（ＳＲＦ相互作用）
ＮＩＤ：（Ｎｅｔ阻害ドメイン）
ＪＦＸ：（リン酸化によって誘導されるＪＮＫ相互作用および輸送）
ＣＩＤ：（ＣｔＢＰ相互作用ドメイン）
Ｄボックス：（ＮＬＳおよびＥＲＫ１＋ｐ３８結合）
Ｃボックス：（リン酸化誘導転写活性化）
【図２４ｂ】
（マウス）Ｎｅｔポリペプチドのドメイン
Ａボックス：（ｅｔｓドメイン），Ｉｗｑｆｌｌｑｌｌｌ（ＮＥＳ）
Ｂボックス：（ＳＲＦ相互作用）
ＮＩＤ：（Ｎｅｔ阻害ドメイン）
ＪＦＸ：（リン酸化によって誘導されるＪＮＫ相互作用および輸送）
ＣＩＤ：（ＣｔＢＰ相互作用ドメイン）
Ｄボックス：（ＮＬＳおよびＥＲＫ１＋ｐ３８結合）
Ｃボックス：（リン酸化誘導転写活性化）
【図１】
2004512051.tif 000005
【図２】
2004512051.tif 000006
【図３】
2004512051.tif 000007
【図４】
2004512051.tif 000008
【図５】
2004512051.tif 000009
【図６】
2004512051.tif 000010
【図７】
2004512051.tif 000011
【図８】
2004512051.tif 000012
【図９】
2004512051.tif 000013
【図１０】
2004512051.tif 000014
【図１１】
2004512051.tif 000015
【図１２】
2004512051.tif 000016
【図１３】
2004512051.tif 000017
【図１４】
2004512051.tif 000018
【図１５】
2004512051.tif 000019
【図１６】
2004512051.tif 000020
【図１７】
2004512051.tif 000021
【図１８】
2004512051.tif 000022
【図１９】
2004512051.tif 000023
【図２０】
2004512051.tif 000024
【図２１】
2004512051.tif 000025
【図２２】
2004512051.tif 000026
【図２３】
2004512051.tif 000027
【図２４ａ】
2004512051.tif 000028
【図２４ｂ】
2004512051.tif 000029
【国際公開パンフレット】
2004512051.tif 000030
2004512051.tif 000031
2004512051.tif 000032
2004512051.tif 000033
2004512051.tif 000034
2004512051.tif 000035
2004512051.tif 000036
2004512051.tif 000037
2004512051.tif 000038
2004512051.tif 000039
2004512051.tif 000040
2004512051.tif 000041
2004512051.tif 000042
2004512051.tif 000043
2004512051.tif 000044
2004512051.tif 000045
2004512051.tif 000046
2004512051.tif 000047
2004512051.tif 000048
2004512051.tif 000049
2004512051.tif 000050
2004512051.tif 000051
2004512051.tif 000052
2004512051.tif 000053
2004512051.tif 000054
2004512051.tif 000055
2004512051.tif 000056
2004512051.tif 000057
2004512051.tif 000058
2004512051.tif 000059
2004512051.tif 000060
2004512051.tif 000061
2004512051.tif 000062
2004512051.tif 000063
2004512051.tif 000064
2004512051.tif 000065
2004512051.tif 000066
2004512051.tif 000067
2004512051.tif 000068
2004512051.tif 000069
2004512051.tif 000070
2004512051.tif 000071
2004512051.tif 000072
2004512051.tif 000073
2004512051.tif 000074
2004512051.tif 000075
2004512051.tif 000076
2004512051.tif 000077
2004512051.tif 000078
2004512051.tif 000079
2004512051.tif 000080
2004512051.tif 000081
2004512051.tif 000082
2004512051.tif 000083
2004512051.tif 000084
2004512051.tif 000085
2004512051.tif 000086
2004512051.tif 000087
2004512051.tif 000088
2004512051.tif 000089
2004512051.tif 000090
2004512051.tif 000091
2004512051.tif 000092
2004512051.tif 000093
2004512051.tif 000094
2004512051.tif 000095
2004512051.tif 000096
2004512051.tif 000097
2004512051.tif 000098
2004512051.tif 000099
2004512051.tif 000100
2004512051.tif 000101
2004512051.tif 000102
2004512051.tif 000103
2004512051.tif 000104
2004512051.tif 000105
2004512051.tif 000106
2004512051.tif 000107
2004512051.tif 000108
2004512051.tif 000109
2004512051.tif 000110
2004512051.tif 000111
2004512051.tif 000112
2004512051.tif 000113
2004512051.tif 000114
2004512051.tif 000115
2004512051.tif 000116
2004512051.tif 000117
2004512051.tif 000118
2004512051.tif 000119
2004512051.tif 000120
2004512051.tif 000121
2004512051.tif 000122
2004512051.tif 000123
2004512051.tif 000124
2004512051.tif 000125
2004512051.tif 000126
2004512051.tif 000127
2004512051.tif 000128
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004512051.tif 000129
2004512051.tif 000130
【国際調査報告】
2004512051.tif 000131
2004512051.tif 000132
2004512051.tif 000133
2004512051.tif 000134
2004512051.tif 000135