(57)【要約】本発明は、炎症、虚血、喘息、自己免疫疾患、糖尿病、関節炎、アレルギー、病原性生物による感染、及び移植拒絶反応を含む（ただしこれらに限定されない）障害を治療するための、ＣＤ３８を発現する細胞の遊走活性を調節する方法に関する。このような細胞としては、例えば好中球、リンパ球、好酸球、マクロファージ、及び樹状細胞が挙げられる。本発明はさらに、ＣＤ３８のＡＤＰ−リボシルシクラーゼ活性を調節する化合物を同定するよう設計された薬物スクリーニングアッセイ、ならびにＣＤ３８により調節される細胞遊走が関係する障害の治療におけるこのような化合物の使用に関する。本発明は、ＣＤ３８のＡＤＰ−リボシルシクラーゼ活性が走化性にとって必要であるという発見に基づく。さらに、本発明は、マンソン住血吸虫ＣＤ３８相同体の酵素活性を調節する化合物を同定する方法、ならびに蠕虫感染により引き起こされる病原性障害の治療におけるこれらの化合物の使用に関する。これは、マンソン住血吸虫等の蠕虫がＣＤ３８相同体を発現する、という発見に基づく。【特許請求の範囲】
【請求項１】
図１４に記載されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項２】
図１４のＤＮＡ配列を含む請求項１記載の単離核酸分子。
【請求項３】
図１４のＤＮＡ配列を含む単離核酸分子。
【請求項４】
図１４に記載されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む請求項３記載の単離核酸分子。
【請求項５】
ストリンジェントな条件下において請求項１又は請求項３記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズし且つ機能的に同等な遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
【請求項６】
中程度のストリンジェント条件下において請求項１又は請求項３記載の核酸にハイブリダイズし且つ機能的に同等なＳＭ３８遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項７】
ＳＭ３８アンチセンス分子である単離核酸分子。
【請求項８】
図１４のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項９】
図１４のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項１０】
ストリンジェントな条件下において請求項１又は請求項３記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズし且つ機能的に同等な遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
【請求項１１】
中程度のストリンジェント条件下において請求項１又は請求項３記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズし且つ機能的に同等な遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
【請求項１２】
ＳＭ３８タンパク質のシクラーゼドメインを含むＳＭ３８タンパク質の精製フラグメント。
【請求項１３】
少なくとも６個のアミノ酸からなるＳＭ３８タンパク質のフラグメントが共有結合を介してＳＭ３８タンパク質ではない第２のタンパク質のアミノ酸配列に融合したものを含むキメラタンパク質。
【請求項１４】
ＳＭ３８タンパク質に結合することができる抗体。
【請求項１５】
請求項５又は請求項６記載の核酸を含む組換え細胞。
【請求項１６】
請求項５又は請求項６記載の核酸を含む組換え細胞を、コードされるＳＭ３８タンパク質が該細胞によって発現されるように培養する工程、及び発現されたＳＭ３８タンパク質を回収する工程を含む、ＳＭ３８タンパク質の産生方法。
【請求項１７】
（ｉ）基質の存在下でＣＤ３８を発現する細胞をテスト化合物に接触させてＣＤ３８活性レベルを測定する工程、（ｉｉ）別の実験で、基質の存在下でＣＤ３８タンパク質を発現する細胞を対照ビヒクルに接触させてＣＤ３８活性レベルを測定する工程、この際の条件は工程（ｉ）の条件と本質的に同じである、ならびに（ｉｉｉ）工程（ｉ）で測定したＣＤ３８活性レベルを工程（ｉｉ）で測定したＣＤ３８活性レベルと比較する工程を含み、テスト化合物の存在下でのＣＤ３８活性レベルが高ければ、そのテスト化合物がＣＤ３８活性化物質であることを示すものである、ＣＤ３８酵素活性を活性化する化合物の同定方法。
【請求項１８】
（ｉ）化学誘引物質及び基質の存在下でＣＤ３８を発現する細胞をテスト化合物に接触させてＣＤ３８活性レベルを測定する工程、（ｉｉ）別の実験で、ＣＤ３８タンパク質を発現する細胞及び基質を接触させてＣＤ３８活性レベルを測定する工程、この際の条件は工程（ｉ）の条件と本質的に同じである、ならびに（ｉｉｉ）工程（ｉ）で測定したＣＤ３８活性レベルを工程（ｉｉ）で測定したＣＤ３８活性レベルと比較する工程を含み、テスト化合物の存在下でのＣＤ３８活性レベルが低ければ、そのテスト化合物がＣＤ３８阻害物質であることを示すものである、ＣＤ３８酵素活性を阻害する化合物の同定方法。
【請求項１９】
さらに、工程（ｉ）及び（ｉｉ）において化学誘引物質が存在し、ＣＤ３８を発現する前記細胞が化学誘引物質受容体を発現する、請求項１７又は請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ＣＤ３８ ＡＤＰ−リボシルシクラーゼ活性を測定する、請求項１７又は請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
ｃＡＤＰＲのレベルを測定する、請求項１７又は請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
ＮＡＡＤＰのレベルを測定する、請求項１７又は請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
化学誘引物質受容体の後に細胞内カルシウムレベルを測定する、請求項１７又は請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
ＣＤ３８により媒介される細胞遊走を測定する、請求項１７又は請求項１８記載の方法。
【請求項２５】
（ｉ）テスト化合物をＣＤ３８タンパク質に接触させる工程、
（ｉｉ）前記化合物がＣＤ３８タンパク質に結合するか否かを決定する工程、及び
（ｉｉｉ）前記ＣＤ３８タンパク質に結合するテスト化合物を、ＣＤ３８タンパク質の活性を調節するために使用することができる化合物として選択する工程
を含む、ＣＤ３８の活性を調節する化合物の同定方法。
【請求項２６】
（ｉ）基質の存在下でＳＭ３８を発現する細胞をテスト化合物に接触させてＳＭ３８活性レベルを測定する工程、（ｉｉ）別の実験で、基質の存在下でＳＭ３８タンパク質を発現する細胞を対照ビヒクルに接触させてＳＭ３８活性レベルを測定する工程、この際の条件は工程（ｉ）の条件と本質的に同じである、ならびに（ｉｉｉ）工程（ｉ）で測定したＳＭ３８活性レベルを工程（ｉｉ）で測定したＳＭ３８活性レベルと比較する工程を含み、テスト化合物の存在下でのＳＭ３８活性レベルが高ければ、そのテスト化合物がＳＭ３８活性化物質であることを示すものである、ＳＭ３８酵素活性を活性化する化合物の同定方法。
【請求項２７】
（ｉ）化学誘引物質及び基質の存在下でＳＭ３８を発現する細胞をテスト化合物に接触させてＳＭ３８活性レベルを測定する工程、（ｉｉ）別の実験で、ＳＭ３８タンパク質を発現する細胞及び基質を接触させてＳＭ３８活性レベルを測定する工程、この際の条件は工程（ｉ）の条件と本質的に同じである、ならびに（ｉｉｉ）工程（ｉ）で測定したＳＭ３８活性レベルを工程（ｉｉ）で測定したＳＭ３８活性レベルと比較する工程を含み、テスト化合物の存在下でのＳＭ３８活性レベルが低ければ、そのテスト化合物がＳＭ３８阻害物質であることを示すものである、ＳＭ３８酵素活性を阻害する化合物の同定方法。
【請求項２８】
ｃＡＤＰＲのレベルを測定する、請求項２６又は請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
ＮＡＡＤＰのレベルを測定する、請求項２６又は請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
細胞内のカルシウムレベルを測定する、請求項２６又は請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
ＣＤ３８により媒介される細胞遊走を測定する、請求項２６又は請求項２７記載の方法。
【請求項３２】
（ｉ）テスト化合物をＳＭ３８タンパク質に接触させる工程、
（ｉｉ）前記化合物がＳＭ３８タンパク質に結合するか否かを決定する工程、及び
（ｉｉｉ）前記ＳＭ３８タンパク質に結合するテスト化合物を、ＳＭ３８タンパク質の活性を調節するために使用することができる化合物として選択する工程、を含む、ＳＭ３８の活性を調節する化合物の同定方法。
【請求項３３】
ＣＤ３８を発現する細胞をＣＤ３８阻害物質と接触させる工程を含む、ＣＤ３８発現細胞の遊走活性の調節方法。
【請求項３４】
ＣＤ３８を発現する細胞をＣＤ３８活性化物質と接触させる工程を含む、ＣＤ３８発現細胞の遊走活性の調節方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
１．はじめに
本発明は、炎症、虚血、喘息、自己免疫疾患、糖尿病、関節炎、アレルギー、寄生虫等の病原性生物による感染、及び移植拒絶反応を含む（ただしこれらに限定されない）障害を治療するために、ＣＤ３８を発現する細胞の遊走活性（ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を調節する方法に関する。このような細胞としては、例えば好中球、リンパ球、好酸球、マクロファージ、及び樹状細胞が挙げられる。本発明はさらに、ＣＤ３８のＡＤＰ−リボシルシクラーゼ活性を調節する化合物を同定するよう設計された薬物スクリーニングアッセイ、ならびにＣＤ３８により調節される細胞遊走（ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を伴う障害の治療におけるこのような化合物の使用に関する。さらに、本発明は寄生性扁虫であるマンソン住血吸虫に由来するＣＤ３８相同体の単離及び特徴付けに関する。このような相同体（本明細書においてＳＭ３８と呼ばれる）を同定することにより、病原性生物における関連酵素をスクリーニングするように設計された組成物及びアッセイ、ならびにＳＭ３８の活性及び／又は発現を調節する化合物をスクリーニングするための組成物及びアッセイが提供される。このような化合物は、このような寄生虫による感染により生じる病原性障害（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を治療するために使用することができる。本発明は、ＣＤ３８のＡＤＰ−リボシルシクラーゼ活性が走化性にとって必要であるという発見、及びマンソン住血吸虫が寄生虫におけるカルシウム応答を調節することができるＣＤ３８相同体を発現するという発見に基づく。
【０００２】
２．発明の背景
好中球、単球、樹状細胞、好酸球及びリンパ球等の細胞を含む造血由来細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃａｌｌｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌｓ）は、炎症反応の重要な媒介細胞（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｄｉａｔｏｒ）であり、組織の損傷部位もしくは感染部位に移動してそこで新しく到着した細胞がエフェクター機能を発揮することによって、可溶性炎症媒介物質に反応する。
【０００３】
循環している白血球集団の４０〜５０％を占める好中球は、免疫及び炎症の両方にとって特に重要である。好中球は、普段は静止細胞であるが、刺激を受けると、種々の炎症活動を媒介することができる。様々な作用物質が好中球を活性化することができ、この活性化は通常、活性化物質が好中球の表面に発現される特定の受容体に結合することによって媒介される。好中球は、活性化されると、内皮細胞に結合して、組織の損傷部位、病原体又は外来物質に向かって移動することができる。同様に、好酸球も強力な炎症エフェクター細胞であるが、これらの細胞は喘息等のアレルギー性疾患にもっとも関係がある。好中球と同様に、好酸球は、炎症反応を起こしこれを持続させることができる炎症性分子（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の強力な兵器工場を有する。
【０００４】
好酸球や好中球等の集中した細胞（ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ ｃｅｌｌ）は、炎症部位に到着すると、炎症性産物（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｄｕｃｔ）を放出して他の造血由来細胞を該部位に集合する（ｒｅｃｒｕｉｔ）ことにより、さらに炎症を誘導する。あるケースでは、特異的に集合した造血由来細胞によって媒介される炎症反応は、感染物質を取り除くことによって宿主を疾病又は死から守る。他のケース（すなわち自己免疫、虚血／再灌流、移植、アレルギー）では、炎症反応は組織にさらにダメージを与え、病気をもたらす。このように、炎症又は細胞の集合化を変化させる作用物質は、病状を制御するのに有用である可能性がある。
【０００５】
ＣＤ３８の発現は、はじめはＢ細胞系列の細胞に限られると考えられていたが、後に多くのグループが行った実験により、ＣＤ３８が造血由来細胞及び非造血由来細胞の両方において広く発現されることが分かった。また、ＣＤ３８の相同体も、哺乳動物のストローマ細胞（Ｂｓｔ−１）において及び無脊椎動物ジャンボアメフラシ（Ａｐｌｙｓｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）から単離した細胞において発現されることが分かった（ＡＤＰ−リボシルシクラーゼ酵素）（Ｐｒａｓａｄ ＧＳ， １９９６， ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌ ３：９５７−９６４）。
【０００６】
さらに最近になって、ＣＤ３８がＮＡＤ＋グリコヒドロラーゼ（ｇｌｙｃｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）活性及びＡＤＰ−リボシルシクラーゼ活性（これらの活性によってＣＤ３８はその基質であるＮＡＤ＋及びＮＡＤＰからニコチンアミド、ＡＤＰ−リボース（ＡＤＰＲ）、サイクリックＡＤＰＲ（ｃＡＤＰＲ）及びニコチン酸アデニンジヌクレオチドリン酸塩（ＮＡＡＤＰ）を生成することができる）を有する多機能性細胞外酵素であることが分かった（Ｈｏｗａｒｄら， １９９３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１０５６−１０５９；Ｌｅｅら， １９９９ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ３８０；７８５−７９３）。ＣＤ３８により生成される代謝産物のうちｃＡＤＰＲ及びＮＡＡＤＰの２つは、植物、無脊椎動物及び哺乳動物の組織から単離した細胞において細胞内カルシウムの放出を誘導することが判明した。このことは、これらの代謝産物がカルシウム応答の包括的な調節因子（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）である可能性があるを示唆している（Ｌｅｅら， １９９９ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ３８０；７８５−７９３）。
【０００７】
ｃＡＤＰＲ及びＮＡＡＤＰはいずれも、ＩＰ３受容体により制御されるものとは異なるカルシウム貯蔵からのカルシウム放出を誘導することが知られている（Ｃｌａｐｐｅｒ， ＤＬら， １９８７， Ｊ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ． ２６２：９５６１−９５６８）。その代わり、リアノジン受容体のアゴニストはｃＡＤＰＲにより媒介されるカルシウム放出の感度を高め（ｓｅｎｓｉｔｉｚｅ）、リアノジン受容体のアンタゴニストはｃＡＤＰＲ依存性カルシウム放出を遮断するので、ｃＡＤＰＲはリアノジン受容体により調節される貯蔵からのカルシウム放出を調節すると考えられている（Ｇａｌｉｏｎｅ Ａら， １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１４３−１４６）。このように、ｃＡＤＰＲは、リアノジン受容体が発現される筋肉や膵臓等の組織においてカルシウム応答を調節するようである、と提唱されてきた。興味深いことに、寄生性扁虫であるマンソン住血吸虫の筋繊維がリアノジン受容体を発現すること、及びカフェイン等のリアノジン受容体のアゴニストが、寄生虫において細胞内カルシウム放出及び筋収縮を誘導し得ることが最近になって分かった（Ｄａｙら， ２０００ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ １２０：４１７−４２２；Ｓｉｌｖａら， １９９８， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５６：９９７−１００３）。哺乳動物の平滑筋細胞において、アセチルコリンに応答したカルシウム放出は、リアノジン受容体のアンタゴニストによってのみならず、８−ＮＨ２−ｃＡＤＰＲや８−Ｂｒ−ｃＡＤＰＲ等のｃＡＤＰＲの特異的アンタゴニストによっても遮断され得る（Ｇｕｓｅ， ＡＨ， １９９９， Ｃｅｌｌ． Ｓｉｇｎａｌ． １１：３０９−３１６）。
【０００８】
これら及び他の知見は、ｃＡＤＰＲを含むリアノジン受容体のアゴニスト／アンタゴニストが、蠕虫から哺乳動物に至るまで様々な種から単離した細胞においてカルシウム応答を調節することができることを示すが、ＣＤ３８やＳＭ３８等のＡＤＰ−リボシルシクラーゼ酵素が、ｉｎ ｖｉｖｏでのｃＡＤＰＲの産生に必要であるか否かははっきりしていない。さらに、ＣＤ３８の酵素活性を、カルシウム放出、増殖、アポトーシス、遊走、又は他のエフェクター機能等の下流の反応に結びつける直接的な証拠はなかった。したがって、多くの細胞型でＣＤ３８が高レベルで発現されるにもかかわらず、免疫反応におけるＣＤ３８酵素活性についての明確な役割は、明確に確立されていなかった。
【０００９】
３．発明の概要
本発明は、ＣＤ３８酵素活性のアゴニスト又はアンタゴニストの投与を含む、ＣＤ３８を発現する細胞の遊走活性を調節する方法、ならびに小分子、巨大分子及び抗体が関与するｃＡＤＰＲ媒介性シグナル伝達経路に関する。また本発明は、ＣＤ３８遺伝子発現を調節するために使用することができる化合物及びヌクレオチド配列も提供する。
【００１０】
本発明はさらに、寄生性扁虫マンソン住血吸虫に由来するＣＤ３８相同体（本明細書中においてＳＭ３８と呼ばれる）の単離及び特徴付けに関する。このような相同体を同定することにより、病原性微生物（蠕虫等）における関連酵素をスクリーニングするよう設計された組成物及びアッセイ、ならびにＳＭ３８の活性を調節する化合物をスクリーニングするための組成物及びアッセイが提供される。このような化合物は、このような病原性微生物による感染により生じる病原性障害を治療するために使用することができる。
【００１１】
本発明は、ＣＤ３８及び／又はＳＭ３８（ＣＤ３８／ＳＭ３８）の酵素活性を調節する化合物、すなわちＣＤ３８酵素活性のアゴニスト及びアンタゴニストとして機能する化合物をスクリーニングするように設計されたアッセイに関する。さらに、本発明のスクリーニングは、ｃＡＤＰＲが関与するシグナル伝達経路のアンタゴニスト又はアゴニストへと変換されるＣＤ３８／ＳＭ３８の基質を同定するために使用してもよい。また本発明のスクリーニングは、ｃＡＤＰＲが関与するシグナル伝達経路のアゴニスト又はアンタゴニストを直接同定するために使用してもよい。
【００１２】
また本発明は、ＣＤ３８／ＳＭ３８遺伝子発現を調節する化合物をスクリーニングするよう設計されたアッセイにも関する。例えば、細胞系のアッセイを用いて、ＣＤ３８／ＳＭ３８転写を調節する化合物（例えばＣＤ３８／ＳＭ３８遺伝子発現に関与する転写因子の発現、産生又は活性を調節する化合物等）、ＣＤ３８／ＳＭ３８ ｍＲＮＡの翻訳を調節するアンチセンス及びリボザイムポリヌクレオチド、ならびにＣＤ３８／ＳＭ３８調節領域と共に三重らせん構造を形成してＣＤ３８／ＳＭ３８遺伝子の転写を阻害するポリヌクレオチド等をスクリーニングすることができる。
【００１３】
同定された化合物は、造血由来細胞等のＣＤ３８発現細胞の遊走活性が発病の一因となる障害の治療において使用してもよい。このような障害としては、例えばＣＤ３８アンタゴニストを用いて遊走活性を阻害することが望ましい、炎症、虚血、喘息、自己免疫疾患、糖尿病、関節炎、アレルギー、又は移植拒絶反応が挙げられるがこれらに限定されない。対照的に、病原性微生物に感染した被験者又は免疫抑制された被験者においては、例えばＣＤ３８のアゴニストを用いて造血由来細胞の遊走活性を誘導することが望ましい場合がある。さらに、同定された化合物は、ＳＭ３８又は構造的に関連する相同タンパク質を発現する病原性微生物による感染により生じる病原性障害を治療するために使用してもよい。
【００１４】
４．図面の簡単な説明
図面の簡単な説明については後述する。
【００１５】
５．発明の詳細な説明
本発明は、ＣＤ３８ ＡＤＰ−リボシルシクラーゼ活性の調節を含む、細胞の遊走活性を調節する方法に関する。本発明は、ＣＤ３８ＫＯマウス由来の好中球や好酸球等の顆粒球が、体内の炎症及び感染部位に効率的に集合することができないという発見に基づく。本発明は、ＣＤ３８ ＡＤＰ−リボシルシクラーゼ活性は好中球等の顆粒球の初期活性化（ｉｎｉｔｉａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）にとって必須ではないが、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの両方において好中球の走化性を調節するのに非常に重要であるという発見に基づく。特に、ＣＤ３８ ＡＤＰ−リボシルシクラーゼ活性の産物であるｃＡＤＰＲは、好中球の中に存在するカルシウム貯蔵からのカルシウム放出を誘導するのに必要である。この特殊な貯蔵（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ ｓｔｏｒｅ）からのカルシウムの放出は、血漿膜チャンネルを活性化させ及び開かせてカルシウムの容量性流入をもたらすのに必要であり、この流入は、化学誘引物質及び／又は炎症性産物への好中球の直接的な移動を媒介する。
【００１６】
本発明は、ＣＤ３８酵素活性のアゴニストやアンタゴニト等の調節因子ならびに／又はｃＡＤＰＲ依存性カルシウム応答及び走化性の調節因子を同定するために設計されたスクリーニングアッセイを包含する。本発明はさらに、ＣＤ３８により制御された、化学誘引物質及び炎症性産物への細胞の遊走活性に基づいた、障害の治療におけるこのような調節因子の使用に関する。このような障害としては、炎症、虚血、自己免疫疾患、喘息、糖尿病、関節炎、アレルギー、感染症、及び臓器移植拒絶反応が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
また本発明は、寄生虫マンソン住血吸虫に由来するＣＤ３８相同体であるＳＭ３８の同定、単離及び特徴付けにも関する。本発明は、蠕虫等の他の病原性微生物における関連酵素を同定するためのスクリーニングアッセイ、ならびにＳＭ３８の活性及び発現を調節する化合物をスクリーニングするための組成物及びアッセイを包含する。本発明はさらに、ＳＭ３８又はこれに構造的に関係のある分子を発現する生物に感染した動物及びヒトにおける病原性障害を治療するためのこのような調節因子の使用に関する。
【００１８】
以下のサブセクションにおいて、本発明の様々な態様についてさらに詳細に記載する。
【００１９】
５．１．ＳＭ３８遺伝子
マンソン住血吸虫ＳＭ３８のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列を図１４に示す（ＡＴＣＣ寄託番号：    ）。ＳＭ３８ ｃＤＮＡの全てのリーディングフレームが翻訳され、３０３個のアミノ酸からなるオープンリーディングフレームが同定された。開始コドンは７１位ヌクレオチドに位置し、停止コドンは９８１位ヌクレオチドに見られる。
【００２０】
本発明のＳＭ３８ヌクレオチド配列には、（ａ）図１４に記載されたＤＮＡ配列、（ｂ）図１４に記載されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、（ｃ）（ｉ）ストリンジェントな条件［例えばフィルタに結合したＤＮＡに０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４， ７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）， １ｍＭ ＥＤＴＡ中で６５℃にてハイブリダイズさせ、０．１ｘＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中で６８℃にて洗浄する（Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら編， １９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． Ｉ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．， ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ａｔ ｐ．２．１０．３）］下において（ａ）又は（ｂ）に記載されたヌクレオチド配列にハイブリダイズし且つ（ｉｉ）機能的に同等な遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列、ならびに（ｄ）よりストリンジェンシーの低い条件［例えば０．２ｘＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中で４２℃にて洗浄する（Ａｕｓｕｂｅｌら， １９８９（前掲））等の中程度のストリンジェント条件］下で図１４に記載されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列にハイブリダイズし且つ機能的に同等なＳＭ３８遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列が含まれる。ＳＭ３８タンパク質の機能的同等物としては、マンソン住血吸虫以外の種に存在する天然のＳＭ３８が挙げられる。また本発明は、配列（ａ）〜（ｄ）の縮重変異体も含む。また本発明は、例えば（ＳＭ３８遺伝子の核酸配列の増幅反応のため及び／又は該増幅反応のアンチセンスプライマーとして）ＳＭ３８遺伝子調節において有用な、ＳＭ３８アンチセンス分子をコードし得るもしくは該分子として機能し得る核酸分子も含む。
【００２１】
上記ＳＭ３８ヌクレオチド配列以外にも、過度の実験を行うことなく、当分野において周知である分子生物学的技法により、他の種の中に存在するＳＭ３８遺伝子の相同体を同定して簡単に単離することができる。例えば、ｃＤＮＡライブラリー、又は目的の生物から得たゲノムＤＮＡライブラリーを、本明細書中においてハイブリダイゼーションプローブ又は増幅プローブとして記載されるヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションにより、スクリーニングすることができる。
【００２２】
また本発明は、突然変異型ＳＭ３８、ＳＭ３８のペプチドフラグメント、トランケート型ＳＭ３８、及びＳＭ３８融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列も包含する。これらのヌクレオチド配列としては、ＳＭ３８のシクラーゼドメインもしくはこのドメインの一部に対応するポリペプチド又はペプチドをコードするヌクレオチド配列、該ドメインが欠失したトランケート型ＳＭ３８（例えばシクラーゼ領域の全てもしくは一部が欠けている機能的ＳＭ３８等）をコードするヌクレオチド配列が挙げられるがこれらに限定されない。これらのトランケート型もしくは突然変異型ＳＭ３８タンパク質のうちあるものは、天然ＳＭ３８タンパク質のドミナントネガティブ阻害物質として機能し得る。融合タンパク質をコードするヌクレオチドとしては、完全長ＳＭ３８、トランケート型ＳＭ３８、又はＳＭ３８のペプチドフラグメントが、マーカーとして使用することができる酵素、蛍光タンパク質又は発光タンパク質等の無関係のタンパク質もしくはペプチドに融合されたものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
ＳＭ３８ヌクレオチド配列は、当業者に公知である種々の方法を用いて単離することができる。例えば、ＳＭ３８を発現することが分かっている細胞又は組織に由来するＲＮＡを用いて構築されたｃＤＮＡライブラリーを、標識したＳＭ３８プローブを用いてスクリーニングすることができる。あるいは、ゲノムライブラリーをスクリーニングして、ＳＭ３８タンパク質をコードする核酸分子を得ても良い。さらに、本明細書中に開示されるＳＭ３８ヌクレオチド配列に基づいて設計された２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ＳＭ３８核酸配列を得ることができる。この反応に使う鋳型は、ＳＭ３８を発現することが分かっている細胞系又は組織から調製したｍＲＮＡの逆転写によって得たｃＤＮＡであってもよい。
【００２４】
また本発明は、（ａ）前記ＳＭ３８配列及び／又はその相補体（即ちアンチセンス）のいずれかを含むＤＮＡベクター、（ｂ）ＳＭ３８コード配列の発現を指令する調節エレメントに機能的に連結された前記ＳＭ３８配列のいずれかを含むＤＮＡ発現ベクター、（ｃ）宿主細胞の中でＳＭ３８コード配列の発現を指令する調節エレメントに機能的に連結された前記ＳＭ３８配列のいずれかを含む遺伝子操作された宿主細胞、ならびに（ｄ）前記ＳＭ３８配列のいずれかを含むトランスジェニックマウスもしくは他の生物も包含する。本明細書中で使用される調節エレメントとしては、誘導可能及び誘導不可能なプロモーター、エンハンサー、オペレーター、ならびに当業者に公知である発現を駆動及び調節する他のエレメントが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２５】
５．１．２． ＳＭ３８タンパク質及びポリペプチド
ＳＭ３８タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドフラグメント、ＳＭ３８の突然変異形、トランケート形もしくは欠失形、ならびに／又はＳＭ３８融合タンパク質は、種々の用途（抗体の作製、ＳＭ３８活性の調節に関与する他の細胞性遺伝子産物（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ）の同定、及びＳＭ３８の活性を調節するために用いることができる化合物のスクリーニング等を含むがこれらに限定されない）のために調製することができる。
【００２６】
図１４は、ＳＭ３８タンパク質の推定アミノ酸配列を表す。本発明のＳＭ３８アミノ酸配列は、図１４に示すアミノ酸配列を含む。さらに、他の種のＳＭ３８も本発明により包含される。実際に、上記ＳＭ３８ヌクレオチド配列によってコードされるあらゆるＳＭ３８タンパク質は、本発明の範囲内に含まれる。
【００２７】
また本発明は、幾つかの判断基準（カルシウムを動員する第二メッセンジャー（ｃａｌｃｉｕｍ ｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ ｓｅｃｏｎｄ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ）であるｃＡＤＰＲの産生を触媒することによりカルシウム応答を調節する能力を含むがこれらに限定されない）のいずれかによって判断した際に５．１節に記載されるヌクレオチド配列によってコードされるＳＭ３８と機能的に同等であるようなタンパク質も包含する。このような機能的に同等なＳＭ３８タンパク質としては、上記５．１節に記載したＳＭ３８ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の中にアミノ酸残基の付加又は置換を有するタンパク質であってこのような付加又は置換がサイレント変化をもたらし従って機能的に同等な遺伝子産物を産生するようなものであるタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
また、ＳＭ３８の１つ以上のドメインに対応するペプチド、及び完全長ＳＭ３８、ＳＭ３８ペプチド、又はトランケート型ＳＭ３８が無関係のタンパク質に融合されたものである融合タンパク質も本発明の範囲内に含まれ、これらは本明細書中に開示されるＳＭ３８ヌクレオチド及びＳＭ３８アミノ酸配列を元に設計することができる。このような融合タンパク質は、マーカー機能を果たす酵素、蛍光タンパク質又は発光タンパク質との融合体を含む。
【００２９】
ＳＭ３８ポリペプチド及びペプチドは化学的に合成することができるが（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， １９８３， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｎ．Ｙ．を参照されたい）、ＳＭ３８遺伝子配列及び／又はコード配列を含む核酸を発現するための当分野で周知である技法を用いて、組換えＤＮＡ技法によって、ＳＭ３８に由来する大きなポリペプチド及び完全長ＳＭ３８そのものを作製することも有益である。このような方法を用いて、第５．１節に記載されているＳＭ３８ヌクレオチド配列と、適当な転写制御シグナルと、適当な翻訳制御シグナルとを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技法、合成技法、及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換え法を含む（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， １９８９（前掲）及びＡｕｓｕｂｅｌら， １９８９（前掲）に記載されている技法を参照されたい）。
【００３０】
本発明のＳＭ３８ヌクレオチド配列を発現させるために、様々な宿主発現ベクター系を用いてもよい。ＳＭ３８ペプチドもしくはポリペプチドが可溶性誘導体として発現され、分泌されない場合、該ペプチドもしくはポリペプチドは宿主細胞から回収することができる。あるいは、ＳＭ３８ペプチドもしくはポリペプチドが分泌される場合、該ペプチドもしくはポリペプチドは、培養基から回収することができる。このような発現系からのＳＭ３８の精製もしくは濃縮は、当業者に周知である適当な洗浄剤、脂質ミセル、及び方法を用いて行うことができる。このような遺伝子操作された宿主細胞自体は、ＳＭ３８の構造的特徴及び機能的特徴を保つことだけでなく生物学的活性を評価することも重要である場合に（即ち薬物スクリーニングアッセイにおいて）使用することができる。
【００３１】
本発明の目的のために用いることができる発現系としては、ＳＭ３８ヌクレオチド配列を含む組換えバクテリオファージ、プラスミド、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌等の微生物、ＳＭ３８ヌクレオチド配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母、又は哺乳動物細胞のゲノムもしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターを含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
ＳＭ３８タンパク質の正しい修飾、プロセッシング及び細胞内の局在（ｓｕｂ−ｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）が起こるように、適当な発現系を選択することができる。このためには、ＳＭ３８タンパク質を厳密に修飾及びプロセッシングする能力を持つ宿主細胞が好ましい。組換えＳＭ３８タンパク質の長期的な収率の高い産生（例えばスクリーニング目的の細胞系の開発に望ましいもの）を行うためには、安定な発現が好ましい。複製起点を含む発現ベクターを用いるのではなく、適当な発現制御エレメントにより制御されるＤＮＡ及び選択マーカー遺伝子（即ち幾つか例を挙げるとｔｋ、ｈｇｐｒｔ、ｄｈｆｒ、ｎｅｏ及びｈｙｇｒｏ遺伝子等）を用いて、宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡを導入した後、遺伝子操作された細胞を濃縮培地の中で１〜２日間培養した後、選択培地に切りかえてもよい。このように遺伝子操作された細胞系は、ＳＭ３８遺伝子産物の内因活性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を調節する化合物のスクリーニング及び評価において特に有用である。
【００３３】
５．１．３．トランスジェニック動物
ＳＭ３８遺伝子産物は、トランスジェニック動物の体内で発現させることもできる。任意の種の動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、マイクロブタ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ヤギ及び非ヒト霊長類（例えばヒヒ、サル及びチンパンジー等）を含むがこれらに限定されない）を用いて、ＳＭ３８トランスジェニック動物を作製することができる。
【００３４】
当分野で公知である任意の方法を用いて、ＳＭ３８導入遺伝子を動物の体内に導入して、トランスジェニック動物の創始者系列（ｆｏｕｎｄｅｒ ｌｉｎｅ）を作製することができる。このような技法としては、前核微量注入法（ｐｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）（Ｈｏｐｐｅ， Ｐ．Ｃ．及びＷａｇｎｅｒ， Ｔ．Ｅ．， １９８９， 米国特許第４，８７３，１９１号）、レトロウイルスを媒体とした生殖細胞系への遺伝子導入法（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら， １９８５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５２）、胚幹細胞における遺伝子ターゲッティング（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら， １９８９， Ｃｅｌｌ， ５６：３１３−３２１）、胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ， １９８３， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３：１８０３：１８１４）、及び精子を媒体とした遺伝子導入法（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら， １９８９， Ｃｅｌｌ ５７：７１７：７２３）等が挙げられるが、これらに限定されない。このような技法の概説については、Ｇｏｒｄｏｎ， １９８９， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ， Ｉｎｔｌ． Ｒｅｖ． Ｃｙｔｏｌ． １１５：１７１−２２９（本明細書中に参考として全て組み込まれる）を参照されたい。
【００３５】
本発明は、全ての細胞の中にＳＭ３８導入遺伝子を保有するトランスジェニック動物、ならびに全ての細胞ではなく一部の細胞の中に該導入遺伝子を保有する動物（すなわちモザイク動物）を提供する。また、導入遺伝子は、例えばＬａｓｋｏらの教示（Ｌａｓｋｏ， Ｍ．ら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６）に従って、特定の細胞型の中に選択的に導入して活性化することもできる。このような細胞型特異的活性化に必要な調節配列は、具体的な目的の細胞型によって異なり、当業者には自明である。ＳＭ３８導入遺伝子を内因性ＳＭ３８遺伝子の染色体部位の中に組み込みたい場合は、遺伝子ターゲッティングが好ましい。要約すると、このような技法を用いる場合、内因性ＳＭ３８遺伝子に相同な幾つかのヌクレオチド配列を含むベクターは、染色体配列との相同的組換えによって内因性ＳＭ３８遺伝子のヌクレオチド配列の中に組み込んでその機能を妨害する目的で設計される。
【００３６】
トランスジェニック動物を作製したら、標準的な技法を用いて組換えＳＭ３８遺伝子の発現を評価することができる。一回目のスクリーニングは、動物組織を分析して導入遺伝子の組込みが起こったか否かを評価するために、サザンブロット分析又はＰＣＲ技法によって行うことができる。トランスジェニック動物の組織中における導入遺伝子のｍＲＮＡ発現のレベルも、その動物から得た組織サンプルのノーザンブロット分析、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析、及びＲＴ−ＰＣＲ等の技法（ただしこれらに限定されない）を用いて評価することができる。ＳＭ３８遺伝子を発現する組織のサンプルは、ＳＭ３８導入遺伝子の産物に特異的な抗体を用いて免疫細胞化学的方法によって評価することもできる。
【００３７】
５．４．ＳＭ３８タンパク質に対する抗体
ＳＭ３８の１つ以上のエピトープ、ＳＭ３８の保存型変異体（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｖａｒｉａｎｔ）のエピトープ、又はＳＭ３８のペプチドフラグメントを特異的に認識する抗体も、本発明により包含される。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化もしくはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成されるフラグメント、抗−イデオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、及び上記抗体のいずれかのエピトープ結合性フラグメントが含まれるがこれらに限定されない。
【００３８】
本発明の抗体を、以下に記載するように例えば化合物スクリーニング法と一緒に用いて、ＳＭ３８遺伝子産物の発現及び／又は活性に対してテスト化合物が及ぼす影響を評価することができる。
【００３９】
抗体を作製するために、ＳＭ３８タンパク質又はＳＭ３８ペプチドを注射して種々の宿主動物を免疫することができる。このような宿主動物には、幾つか例を挙げると、ウサギ、マウス及びラットが含まれるが、これらに限定されない。宿主の種に応じて、種々のアジュバント（フロイントの完全アジュバント及び不完全アジュバント、水酸化アルミニウム等の無機ゲル（ｍｉｎｅｒａｌ ｇｅｌ）、リゾレシチン等の界面活性剤、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤（ｏｉｌ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）やコリネバクテリウム−パルヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）等のヒトに利用できる可能性のあるアジュバントを含むがこれらに限定されない）を用いて免疫反応を強化することができる。
【００４０】
不均質な抗体分子の集団を含むポリクローナル抗体は、免疫化した動物の血清から得ることができる。モノクローナル抗体は、培養中の連続的な細胞系（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ）により抗体分子を作製する任意の技法によって得ることができる。これらの技法としては、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ技法（１９７５， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７及び米国特許第４，３７６，１１０号）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｓｂｏｒら， １９８３， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２； Ｃｏｌｅら， １９８３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０： ２０２６−２０３０）、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅら， １９８５， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ．７７−９６）が挙げられるが、これらに限定されない。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びこれらのサブクラスを含む任意の免疫グロブリンクラスのものであってもよい。この発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養してもｉｎ ｖｉｖｏで培養してもよい。ｉｎ ｖｉｖｏでＭａｂが高力価で産生されるので、この方法は、現在のところ好適な産生方法である。
【００４１】
さらに、適当な抗原特異性を有するマウス抗体分子から得た遺伝子を適当な生物学的活性を有するヒト抗体分子から得た遺伝子と一緒にスプライシングすることにより「キメラ抗体」を作製するために開発された技法を用いることができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら， １９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８１：６８５１：−６８５５； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら， １９８４， Ｎａｔｕｒｅ， ３１２： ６０４−６０８； Ｔａｋｅｄａら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４）。あるいは、ヒト化抗体（米国特許第５，５８５，０８９号）又は一本鎖抗体（米国特許第４，９４６，７７８、Ｂｉｒｄ， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６； Ｈｕｓｔｏｎら， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５：５８７９−５８８３；及びＷａｒｄら， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４−５４６）を作製するために開発された技法を用いて、ＳＭ３８の１つ以上のエピトープを特異的に認識する抗体を作製することができる。
【００４２】
５．２．ＣＤ３８／ＳＭ３８の活性を調節するのに有用な化合物のスクリーニングアッセイ
本発明は、ＭＣ３８／ＳＭ３８酵素活性、ｃＡＤＰＲを媒介としたシグナル伝達、もしくはＣＤ３８／ＳＭ３８遺伝子発現を調節し従って細胞遊走の調節又は感染症の治療に有用である化合物又は組成物を同定するために設計されたスクリーニングアッセイシステムに関する。
【００４３】
５．２．１．ＣＤ３８の組換え発現
ＣＤ３８／ＳＭ３８活性を調節する化合物又は組成物を同定するために設計されたスクリーニングアッセイを開発するためには、ＣＤ３８／ＳＭ３８タンパク質を組換えにより発現させることが必要である。Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｄ．Ｇ．ら， １９９０， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１：３１１１−３１１８； Ｋｏｇｕｍａ， Ｔ．ら， １９９４， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２２４：１６０−１６２及びＨａｒａｄａ Ｎら， １９９３， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ １５１：３１１１−３１１８（本明細書中に参考として組み込まれる）に記載されているように、ヒト、マウス及びラットを含む幾つかの種から、ＣＤ３８のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列が特徴付けられている。さらに、本明細書中に記載されるマンソン住血吸虫のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列を用いて、ＣＤ３８相同体タンパク質であるＳＭ３８タンパク質を組換え発現することができる。
【００４４】
ＣＤ３８／ＳＭ３８ヌクレオチド配列は、当業者に公知である様々な方法を用いて単離することができる。例えば、標識したＣＤ３８／ＳＭ３８プローブを用いて、ＣＤ３８／ＳＭ３８を発現することが知られている組織から得たＲＮＡを用いて構築したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。あるいは、ゲノムライブラリーをスクリーニングして、ＣＤ３８／ＳＭ３８タンパク質をコードする核酸分子を得ても良い。さらに、既知のＣＤ３８／ＳＭ３８ヌクレオチド配列に基づいて設計された２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより、ＣＤ３８／ＳＭ３８核酸配列を得てもよい。この反応に使われる鋳型は、ＣＤ３８／ＳＭ３８を発現することが知られている細胞系又は組織から調製したｍＲＮＡの逆転写によって得たｃＤＮＡであってもよい。
【００４５】
ＣＤ３８／ＳＭ３８タンパク質、ポリペプチド及びペプチドフラグメント、ＣＤ３８／ＳＭ３８の突然変異形態、トランケート形態、もしくは欠失形態、ならびに／又はＣＤ３８／ＳＭ３８融合タンパク質は、抗体の作製、ＣＤ３８／ＳＭ３８を媒介とした細胞遊走の調節に関与する他の細胞性遺伝子産物の同定、及び細胞遊走を調節するために用いることができる化合物のスクリーニングを含む（ただしこれらに限定されない）様々な用途のために調製することができる。ＣＤ３８／ＳＭ３８融合タンパク質は、マーカー機能を果たす酵素、蛍光タンパク質、ポリペプチドタグ、又は発光タンパク質との融合体を含む。
【００４６】
ＣＤ３８／ＳＭ３８ポリペプチド及びペプチドは化学的に合成することができるが（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， １９８３， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｎ．Ｙ．を参照されたい）、ＣＤ３８／ＳＭ３８から得た大きなポリペプチド及び完全長ＣＤ３８／ＳＭ３８そのものは、ＣＤ３８／ＳＭ３８遺伝子配列及び／又はコード配列を含む核酸を発現させるために当分野において周知である技法を用いて組換えＤＮＡ技術により産生するのが有利である。このような方法を用いて、ＣＤ３８／ＳＭ３８ヌクレオチド配列、適当な転写制御シグナル、及び適当な翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技法、合成技法、及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換え法が挙げられる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， １９８９（前掲）及びＡｕｓｕｂｅｌら， １９８９（前掲）に記載された技法を参照されたい）。
【００４７】
様々な宿主発現ベクター系を利用して、ＣＤ３８／ＳＭ３８ヌクレオチド配列を発現することができる。ＣＤ３８／ＳＭ３８ペプチド又はポリペプチドが可溶性タンパク質又は誘導体（例えば細胞内もしくは細胞外ドメインに対応するペプチド）として発現されて分泌されない場合、該ペプチド又はポリペプチドは、宿主細胞から回収することができる。あるいは、ＣＤ３８ペプチド又はポリペプチドが分泌される場合、該ペプチド又はポリペプチドは、培養基から回収することができる。しかし、発現系は、細胞膜に固定されたＣＤ３８／ＳＭ３８又は機能的同等物を発現する遺伝子操作された宿主細胞も含む。このような発現系からのＣＤ３８／ＳＭ３８の精製又は濃縮は、当業者に周知である適当な洗浄剤、脂質ミセル及び方法を用いて行うことができる。このような遺伝子操作された宿主細胞自体は、ＣＤ３８／ＳＭ３８の構造的特徴及び機能的特徴を保つことだけでなく生物学的活性を評価することも重要である場合に（即ち薬物スクリーニングアッセイにおいて）用いることができる。
【００４８】
本発明の目的のために使用することができる発現系としては、ＣＤ３８／ＳＭ３８ヌクレオチド配列を含む組換えバクテリオファージ、プラスミドもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌等の微生物、ＣＤ３８／ＳＭ３８ヌクレオチド配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母、あるいは、哺乳動物、蠕虫、もしくは昆虫細胞のゲノムから又は哺乳動物もしくは昆虫ウイルスから得たプロモーターを含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物、蠕虫、又は昆虫細胞系が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４９】
ＣＤ３８／ＳＭ３８タンパク質の正しい修飾、プロセッシング及び細胞内の局在が起こるように、適切な発現系を選択することができる。このために、ＣＤ３８／ＳＭ３８タンパク質を適切に修飾及びプロセッシングする能力を有する真核宿主細胞が好ましい。組換えＣＤ３８／ＳＭ３８タンパク質の長期的な収率の高い産生（例えばスクリーニング目的の細胞系の開発に望ましいもの）を行うためには、安定な発現が好ましい。複製起点を含む発現ベクターを用いるのではなく、適当な発現制御エレメントにより制御されるＤＮＡ及び選択マーカー遺伝子（即ち幾つか例を挙げるとｔｋ、ｈｇｐｒｔ、ｄｈｆｒ、ｎｅｏ及びｈｙｇｒｏ遺伝子等）を用いて、宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡを導入した後、遺伝子操作された細胞を濃縮培地の中で１〜２日間増殖させた後、選択培地に切りかえることができる。このように遺伝子操作された細胞系は、ＣＤ３８／ＳＭ３８遺伝子産物の内因活性を調節する化合物のスクリーニング及び評価において特に有用である。
【００５０】
５．２．２．非細胞系アッセイ
本発明に従って、非細胞系のアッセイシステムを用いて、ＣＤ３８と相互作用し（即ちＣＤ３８に結合し）てＣＤ３８の酵素活性を調節する化合物を同定することができる。このような化合物は、ＣＤ３８酵素活性のアンタゴニスト又はアゴニストとして機能することができ、細胞遊走（造血由来細胞を含むがこれに限定されない）を調節するために用いることができる。さらに、このような化合物を用いて、ＳＭ３８又は構造的に関係のある相同体を発現する病原性微生物の成長、筋収縮性、分化、成熟及び繁殖を調節することができる。組換えＣＤ３８／ＳＭ３８（異なる機能的ドメインに対応するペプチド又はＣＤ３８／ＳＭ３８融合タンパク質を含む）を発現させて、ＣＤ３８／ＳＭ３８と相互作用する化合物を同定するためのアッセイにおいて使用することができる。
【００５１】
このためには、可溶性ＣＤ３８／ＳＭ３８を組換え発現させ、ＣＤ３８／ＳＭ３８に結合する化合物を同定するための非細胞系のアッセイで用いることができる。組換え発現させたＣＤ３８／ＳＭ３８ポリペプチド又はＣＤ３８／ＳＭ３８の機能的ドメインのうちの１つ以上を含む融合ペプチドを上記のように調製し、非細胞系のスクリーニングアッセイで用いることができる。例えば、完全長ＣＤ３８／ＳＭ３８、可溶性のトランケート型ＣＤ３８／ＳＭ３８（例えば該分子から細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインのうちの１つ以上が欠失したもの）、細胞外ドメインに対応するペプチド、又はこのアッセイシステムにおいて利益（例えば標識、得られる複合体の単離等）をもたらすタンパク質もしくはポリペプチドに融合されたＣＤ３８／ＳＭ３８の細胞外ドメインを含む融合タンパク質を用いることができる。細胞質ドメインと相互作用する化合物を同定したい場合、ＣＤ３８の細胞質ドメインに対応するペプチド及びＣＤ３８細胞質ドメインを含む融合タンパク質を用いることができる。
【００５２】
またＣＤ３８／ＳＭ３８タンパク質は、細胞膜からもしくは細胞の細胞質ゾルから完全に又は部分的に単離されたものであっても、粗抽出物又は半精製抽出物の一部として存在するものであってもよい。非限定的な例として、ＣＤ３８タンパク質は細胞膜の調製物の中に存在しても良く、ＳＭ３８タンパク質は細胞の細胞質ゾルの調製物の中に存在してもよい。本発明の特定の実施形態において、このような細胞膜は、当業者に公知である方法を用いて調製することができる。
【００５３】
ＣＤ３８／ＳＭ３８に結合する化合物を同定するために用いられるアッセイの原理は、ＣＤ３８／ＳＭ３８とテスト化合物との反応混合物を、これら２つの成分が相互作用及び結合して複合体（これは反応混合物からの除去及び／又は反応混合物中での検出が可能である）を形成することができる程度に十分な条件及び時間で調製する、というものである。次に、結合したテスト化合物の正体を決定する。
【００５４】
このスクリーニングアッセイは、一般に知られている様々な方法のいずれかによって行われる。例えば、このようなアッセイを行う１つの方法は、ＣＤ３８／ＳＭ３８タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質又はテスト物質を固相に結合させ、反応終了時にこの固相に結合したＣＤ３８／テスト化合物複合体又はＳＭ３８／テスト化合物複合体を検出するものである。このような方法の１つの実施形態において、ＣＤ３８／ＳＭ３８反応体（ｒｅａｃｔａｎｔ）を固相表面に結合させ、結合させていないテスト化合物を直接もしくは間接的に標識してもよい。
【００５５】
実際には、マイクロタイタープレートを固相として用いるのが便利である。固定化成分は、非共有結合又は共有結合により固定される。該固相表面は、前もって作製して、保存しておくことができる。このアッセイを実施するために、固定化成分を含むコーティング表面に非固定化成分を加える。反応完了後、形成された複合体がその固相表面上に固定されたままとなるような条件下で、（例えば洗浄により）未反応成分を除去する。固相表面に固定された複合体の検出は、様々な方法で行うことができる。予め固定化されていない成分を前もって標識する場合、表面上に固定化された標識が検出されれば、複合体が形成されたことを示す。予め固定化されていない成分を前もって標識しない場合、固相表面上に固定された複合体を検出するために、間接的な標識を用いる（例えばこの予め固定化されていない成分に特異的な標識した抗体を用いる等）ことができる。
【００５６】
あるいは、液相において反応を行い、ＣＤ３８／ＳＭ３８タンパク質、融合タンパク質又はテスト化合物に特異的な固定化された抗体を用いて未反応成分から反応精製物を分離し、そして形成されたであろうと推定される複合体の他の成分に特異的な標識した抗体を用いて、固定化された複合体を検出することにより、複合体を検出する。
【００５７】
本発明に従って、非細胞系のアッセイは、ＣＤ３８／ＳＭ３８に関係する酵素活性を直接阻害又は活性化する化合物をスクリーニングするために用いることもできる。このような活性としては、ＡＤＰ−リボシルシクラーゼ活性、グリコシル転移活性、及びＮＡＤ＋グリコヒドロラーゼ活性が挙げられるがこれらに限定されない。このために、ＣＤ３８／ＳＭ３８とテスト化合物との反応混合物を基質の存在下にて調製し、ＣＤ３８／ＳＭ３８の酵素活性を、テスト化合物の不在下で観察される活性と比較する。ＣＤ３８／ＳＭ３８酵素活性を検出するアッセイで用いられる基質としては、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ、及びそれらを標識したものが挙げられるがこれらに限定されない。さらに、ニコチンアミドグアニンジヌクレオチド（ＮＧＤ）及びニコチンアミド１、Ｎ６−エテノ−アデニンジヌクレオチド（１，Ｎ６エテノ−ＮＡＤ）等のＮＡＤの誘導体を用いてもよい。
【００５８】
本発明の非限定的な実施例において、ＣＤ３８／ＳＭ３８とテスト化合物と基質との反応混合物を調製し、ＣＤ３８／ＳＭ３８の活性を、テスト化合物の不在下で観察される活性と比較する。この際、テスト化合物の存在下でのＣＤ３８／ＳＭ３８酵素活性のレベルが低ければ、ＣＤ３８／ＳＭ３８アンタゴニストが同定されたことを示す。あるいは、ＣＤ３８／ＳＭ３８とテスト化合物と基質との反応混合物を調製し、ＣＤ３８／ＳＭ３８の活性を、テスト化合物の不在下で観察される活性と比較する。この際テスト化合物の存在下でのＣＤ３８／ＳＭ３８酵素活性のレベルが高ければ、ＣＤ３８／ＳＭ３８アゴニストが同定されたことを示す。
【００５９】
ＣＤ３８／ＳＭ３８の酵素活性は様々な方法で検出することができる。例えば、放射能標識したＮＡＤ、ＮＡＤＰ又はＮＡ等の基質の使用と組み合わせて、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（Ａａｒｈｕｓ Ｒら， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｈｅｍ． ２７０：３０３２７−３０３３３； Ｍｕｌｌｅｒ−Ｓｔｅｆｆｎｅｒ ＨＭ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： ２３９６７−２３９７２； 及びＬｕｎｄ ＦＥら， １９９９， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６２：２６９３−２７０２； Ｈｉｇａｓｈｉｄａ， Ｈ．ら， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：３１２７−３１７７）を用いて、サイクリックアデノシン二リン酸リボース（ｃＡＤＰＲ）、アデノシン二リン酸リボース（ＡＤＰＲ）、及び／又はニコチン酸アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＡＤＰ）のレベルを測定することができる。さらに、ラジオイムノアッセイ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋら， １９９５， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３７１：２０４−２０８； Ｖｕ ＣＱら， １９９７， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２３６： ７２３−７２６； Ｖｕら， Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ ４１９： ３８１−３８８；及びＧｒａｅｆｆ ＲＭら， １９９７， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２８０：２３０−２４１）、バイオアッセイ（Ａａｒｈｕｓ Ｒら， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７０：３０３２７−３０３３３； Ｃｌａｐｐｅｒ ＤＬら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：９５６１：−９５６８；及びＬｅｅら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：１６０８−１６１５）、及び／又は蛍光アッセイ（Ｇｒａｅｆｆ ＲＭら， １９９６， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３５：３７９−：３８６； Ｇｒａｅｆｆら， １９９４， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９： ３０２６０−３０２６７；及びＧａｄａｎｇｉ Ｐら， １９９６， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５６：１９３７−１９４１）を用いて、ｃＡＤＰＲ、ＡＤＰＲ又はＮＡＡＤＰレベルを測定してもよい。本発明のさらに他の実施形態において、ＮＧＤ（ニコチンアミドグアニンジヌクレオチド）やニコチンアミド１，Ｎ６−エテノ−アデニンジヌクレオチド（１，Ｎ６エテノ−ＮＡＤ）等のＮＡＤの誘導体を用いて、ＣＤ３８／ＳＭ３８酵素活性を測定することができる。１，Ｎ６エテノ−ＮＡＤがＣＤ３８により加水分解される場合、得られる生成物のうちの１つは蛍光を発する（Ｍｕｌｌｅｒら， １９８３， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２１２：４５９−４６４；及びＣｏｃｋａｙｎｅ Ｄら， １９９８， Ｂｌｏｏｄ ９２：１３２４−１３３３）。類似体ＮＧＤがＣＤ３８／ＳＭ３８のＡＤＰ−リボシル活性を介して環化される場合、生成物は蛍光化合物を形成し、この蛍光化合物は蛍光計によって検出することができる（Ｇｒａｅｆｆら， １９９６， Ｂｉｏｃｈｅｍ ３５：３７９−３８６；及びＧｒａｅｆｆら， １９９４， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：３０２６０−３０２６７）。
【００６０】
本発明の他の実施形態において、コンピュータモデリング及び検索技術により、ＣＤ３８／ＳＭ３８酵素活性の潜在的な調節因子を同定することが可能である。例えば、アメフラシシクラーゼ活性部位（Ｍｕｎｓｈｉ Ｃ．ら， １９９， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４： ３０７７０−３０７７７）及びＣＤ３８活性部位（Ｌｕｎｄ ＦＥら， １９９９， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６２：２６９３−２７０２； Ｍｕｎｓｈｉ， Ｃら， ２０００， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：２１５６６−２１５７１； Ｇｒａｅｆｆ Ｒら， ２００１， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６：１２１６９−１２１７３）についての知識及びＣＤ３８／ＳＭ３８基質と基質類似体との複合体の研究に基づいて、ＣＤ３８／ＳＭ３８活性の潜在的な調節因子を同定することができる。
【００６１】
活性部位の３次元幾可学構造は、完全な分子構造を決定することができるＸ線結晶学等（例えば、アフラシＡＤＰリボシルシクラーゼの結晶構造について記載しているＰｒａｓａｄ ＧＳら， Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃ． Ｂｉｏｌ． ３：９５７−９６４を参照されたい）の既知の方法を用いて決定することができる。他方、固相又は液相ＮＭＲを用いて、一定の分子内距離（ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｓｔａｎｃｅ）を決定することができる。他の実験的な構造決定方法を用いて、ＣＤ３８活性部位の部分的もしくは完全な幾何学構造を得ることができる。
【００６２】
ＣＤ３８／ＳＭ３８活性部位の構造を決定したら、化合物及びその分子構造についての情報を含むデータベースを検索することにより、候補の調節化合物（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）を同定することができる。このような検索は、決定した活性部位構造と一致する構造を持つ化合物及びその活性部位を画定する基と相互作用する構造を持つ化合物を検索する。このような検索はマニュアルによるものであってもよいが、好ましくはコンピュータ支援によるものである。この検索から見つけ出されたこれらの化合物は、潜在的なＣＤ３８調節化合物である。
【００６３】
あるいは、これらの方法を用いて、既に知られている調節化合物からより優れた調節化合物を同定することができる。例えば、基質としてＮＡＤ／ＮＡＤＰを利用する他の酵素の酵素活性を調節する沢山の化合物（即ちＰＡＲＰファミリー相同体）が既に同定されている。既知の化合物の組成は変更することができ、変更が与える構造的影響は、その新しい組成に適応させた実験及びコンピュータモデリング方法を用いて決定することができる。次に、この変更した構造をその化合物の活性部位構造と比較して、フィット又は相互作用が改善されるか否かを決定する。このようにして、システマティックな組成変更（例えば側基を変更することによるもの等）を素早く評価し、優れた特異性もしくは活性を有する改変された調節化合物もしくは基質を得ることができる。
【００６４】
５．２．３．細胞系のアッセイ
本発明に従って、細胞系のアッセイシステムを用いて、ＣＤ３８／ＳＭ３８の活性を調節する化合物をスクリーニングすることができる。本発明に従って、細胞系のアッセイシステムを用いて、ＣＤ３８の活性を調節することにより化学誘引物質誘導型のＣａ２＋流入及び細胞の遊走を調節する化合物をスクリーニングすることができる。さらに、この細胞系のシステムを用いて、ＳＭ３８の活性を調節することにより細胞内カルシウム放出及び／又は細胞内の筋収縮性を調節する化合物をスクリーニングすることができる。このためには、内因的にＣＤ３８／ＳＭ３８を発現する細胞を用いて化合物をスクリーニングすることができる。このような細胞には、例えば好中球、リンパ球、好酸球、マクロファージ及び樹状細胞が含まれる。さらに、ＳＭ３８を発現するマンソン住血吸虫細胞を用いて化合物をスクリーニングすることができる。あるいは、ＣＤ３８／ＳＭ３８を発現するように遺伝子操作された、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、線維芽細胞等の細胞系を、スクリーニング目的で用いることが可能である。機能的ＣＤ３８タンパク質を発現するように遺伝子操作された宿主細胞を利用したスクリーニングでは、化学誘引物質又は炎症性刺激（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｓｔｉｍｕｌｉ）に反応することができる宿主細胞を使用することが好ましい。ＳＭ３８を発現するように遺伝子操作された宿主細胞を利用したスクリーニングでは、筋収縮を誘導するアセチルコリンや高濃度のＫ＋等の様々な刺激に反応することができるマンソン住血吸虫起源の細胞を使用することが好ましい。さらに、ＣＤ３８／ＳＭ３８タンパク質を発現するように遺伝子操作された卵母細胞やリポソームは、ＣＤ３８／ＳＭ３８活性の調節因子を同定するために開発されたアッセイにおいて用いることができる。
【００６５】
本発明は、ＣＤ３８／ＳＭ３８の酵素活性（ＮＡＤグリコヒドロラーゼ活性、ＡＤＰ−リボシルシクラーゼ活性及び／又はグリコシル転移（交換）活性を含むがこれらに限定されない）のうちの１つ以上を変更する化合物を同定する方法を提供する。特に、ＣＤ３８／ＳＭ３８酵素活性を促進する化合物（即ちアゴニスト）又はＣＤ３８／ＳＭ３８酵素活性を阻害する化合物（即ちアンタゴニスト）を同定することができる。ＣＤ３８酵素活性を阻害する化合物は、化学誘引物質誘導型のカルシウム応答及び細胞遊走に対して阻害性である（図２）。ＣＤ３８酵素活性を活性化する化合物は、化学誘引物質誘導型のカルシウム応答及び細胞遊走を促進する。ＳＭ３８酵素活性を活性化又は阻害する化合物は、ＳＭ３８を発現する病原性生物の生存率又は機能的活性を変更する。このような化合物は、ＣＤ３８／ＳＭ３８の活性化部位と相互作用することにより酵素活性を調節する化合物、又はＣＤ３８／ＳＭ３８への基質の結合を競合／促進する又は基質の触媒反応を競合／阻害する化合物であってもよい（図２）。あるいは、ＣＤ３８／ＳＭ３８タンパク質を修飾する（即ちリン酸化する、リボシル化する等）タンパク質の活性を調節することによりＣＤ３８の活性を調節する化合物を同定することができる（図３）。このようなタンパク質としては、例えば、ＣＤ３８／ＳＭ３８をリボシル化してＣＤ３８／ＳＭ３８を酵素的に不活性とするＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼが挙げられる。さらに、ＣＤ３８／ＳＭ３８発現を調節することにより細胞内の酵素活性レベルを調節する化合物を同定することができる（図４）。
【００６６】
本発明は、（ｉ）基質の存在下でＣＤ３８／ＳＭ３８及び化学誘引物質受容体を発現する細胞をテスト化合物に接触させてＣＤ３８／ＳＭ３８活性のレベルを測定する工程、（ｉｉ）別の実験で、基質の存在下でＣＤ３８／ＳＭ３８タンパク質及び化学誘引物質受容体を発現する細胞を対照ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）に接触させてＣＤ３８／ＳＭ３８活性のレベルを測定する工程、この際の条件は工程（ｉ）と本質的に同じ条件である、ならびに次に（ｉｉｉ）工程（ｉ）で測定したＣＤ３８／ＳＭ３８活性レベルを工程（ｉｉ）で測定したＣＤ３８／ＳＭ３８活性レベルと比較する工程を含み、この際テスト化合物の存在下でのＣＤ３８／ＳＭ３８活性レベルが高ければ、そのテスト化合物がＣＤ３８／ＳＭ３８活性化物質であることを示すものである、ＣＤ３８／ＳＭ３８酵素活性を活性化する化合物の同定方法を提供する。
【００６７】
また本発明は、（ｉ）化学誘引物質及び基質の存在下でＣＤ３８／ＳＭ３８及び化学誘引物質受容体を発現する細胞をテスト化合物に接触させてＣＤ３８／ＳＭ３８活性のレベルを測定する工程、（ｉｉ）別の実験で、ＣＤ３８／ＳＭ３８及び化学誘引物質受容体を発現する細胞を化学誘引物質及び基質に接触させてＣＤ３８／ＳＭ３８活性のレベルを測定する工程、この際の条件は工程（ｉ）と本質的に同じ条件である、ならびに次に（ｉｉｉ）工程（ｉ）で測定したＣＤ３８／ＳＭ３８活性レベルを工程（ｉｉ）で測定したＣＤ３８／ＳＭ３８活性レベルと比較する工程を含み、この際テスト化合物の存在下でのＣＤ３８／ＳＭ３８活性レベルが低ければ、そのテスト化合物がＣＤ３８／ＳＭ３８阻害物質であることを示すものである、ＣＤ３８／ＳＭ３８酵素活性を阻害する化合物の同定方法も提供する。
【００６８】
ＣＤ３８／ＳＭ３８活性を検出するために用いられるアッセイに応じて、上記に記載したＣＤ３８／ＳＭ３８の活性化物質及び阻害物質の同定方法は、工程（ｉ）及び（ｉｉ）において化学誘引物質を含んでも含まなくても良い。例えば、ＣＤ３８／ＳＭ３８ ＡＤＰ−リボシルシクラーゼ活性を直接分析する場合又はＣＤ３８／ＳＭ３８代謝産物の生成を分析する場合、化学誘引物質が存在したり、テスト細胞上に化学誘引物質受容体が発現されたりする必要はない。しかし、例えばＣＤ３８発現細胞において走化性又は細胞内カルシウムレベルの変化を測定する場合、化学誘引物質を含む必要がある。あるいは、ＳＭ３８発現細胞において筋収縮性又は細胞内カルシウムレベルの変化を測定する場合、筋収縮及び／又はカルシウム放出を活性化する刺激物質（例えばアセチルコリン、セロトニン（Ｄａｙら， １９９４， Ｐａｒｉｓｔｏｌ． １０８：４２５−４３２）、ＦＭＲＦ−アミド関連ペプチド（ＦａＲＰ）（Ｄａｙら， １９９４， Ｐａｒｉｓｔｏｌ． １０９：４５５−４５９）又は培地中における高いＫ＋濃度（Ｄａｙら， １９９３， Ｐａｒｉｓｔｏｌ． １０６：４７１−４７７）等を含むがこれらに限定されない）を含む必要がある場合もある。さらに、使用した刺激物質に特異的な受容体を発現する宿主細胞を用いてこれらの実験を行うことが必要であろう。当業者であれば、常套実験を用いることにより、効果的且つ最適なアッセイ条件を決定することができるであろう。
【００６９】
本明細書中で定義される「化学誘引物質」とは、ＣＤ３８によるｃＡＤＰＲ産生に依存するメカニズムを介して細胞の遊走を誘導する化合物又は分子複合体である。このような化学誘引物質の例としては、ｆＭｅｔ−ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。使用可能な他の化学誘引物質としては、エオタキシン（ｅｏｔａｘｉｎ）、ＧＲＯ−１、ＩＰ−１０、ＳＤＦ−１、ＢＬＣ、Ｒａｎｔｅｓ、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ３ａ、ＩＬ−８、ＣＬＳ、ＥＬＣ、Ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ、ＰＡＦ、Ｌｔｂ４、補体ｃ５ａ及びヒスタミンが挙げられる。
【００７０】
上記細胞系を利用する際には、このような細胞系（ＣＤ３８／ＳＭ３８タンパク質を発現する細胞）を、テスト化合物又は対照ビヒクル（例えば偽薬等）に曝露させる。曝露後、細胞を分析してＣＤ３８／ＳＭ３８の活性を測定したり、又はＣＤ３８依存性シグナル伝達経路自体の活性を分析したりすることができる。
【００７１】
標準的な生化学的技法及び生理学的技法を用いて、テスト分子がＣＤ３８／ＳＭ３８の活性を調節する能力を測定することができる。ＣＤ３８／ＳＭ３８ ＡＤＰ−リボシルシクラーゼ活性の活性化もしくは抑制又はｃＡＤＰＲ及び／もしくはＮＡＡＤＰ等のＣＤ３８／ＳＭ３８代謝産物の生成等の応答を測定することができる。ｃＡＤＰＲ、ＡＤＰＲ及び／又はＮＡＡＤＰのレベルは、放射能標識したＮＡＤ、ＮＡＤＰ又はＮＡ等の基質の使用と組み合わせてＨＰＬＣ又はＴＬＣを用いることにより、測定することができる。さらに、上記第５．１．１節に記載したアッセイ等のような、ラジオイムノアッセイ、バイオアッセイ及び／又は蛍光アッセイを用いて、ｃＡＤＰＲ又はＮＡＡＤＰレベルを測定することができる。本発明のさらに他の実施形態において、ＮＧＤ（ニコチンアミドグアニンジヌクレオチド）及びニコチンアミド１，Ｎ６−エテノ−アデニンジヌクレオチド（１，Ｎ６−エテノ−ＮＡＤ）等のＮＡＤの誘導体を用いて、ＣＤ３８／ＳＭ３８活性を測定することができる。
【００７２】
また、細胞系のカルシウム及び／又は遊走アッセイを用いてテスト化合物を分析し、化学誘引物質誘導型のＣＤ３８依存性カルシウム応答及び細胞遊走を阻害又は活性化することができる化合物を同定することもできる。本発明の非限定的な実施形態において、Ｃａ２＋指示薬染料（例えばＩｎｄｏ、Ｆｌｕｏ−３及びＦｕｒａ−Ｒｅｄ等）の蛍光によって、細胞内のＣａ２＋レベルの変化をモニターしてもよい。さらに、ＣＤ３８／ＳＭ３８酵素活性の調節により得られる膜電位の変化は、電位固定法又はパッチ記録法（ｐａｔｃｈ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて測定することができる。また、方向性を持った細胞の移動は、改良型のボイデンチャンバー又はスライドにおいて標準的な走化性アッセイによってモニターしてもよい。このようなアッセイシステムは、本明細書の実施例の中にさらに詳細に説明されている（実施例６を参照されたい）。また筋収縮性は、文献の中に詳細に記載されている標準的なアッセイによって測定することもできる（例えば（Ｄａｙら， １９９４， Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ １０９：４５５−９）及び当該文献に引用された文献等）。
【００７３】
テスト化合物に曝露した後、又はテスト化合物の存在下において、ｆＭＬＰ等の化学誘引物質又は高濃度のＫ＋等の筋肉活性化因子（ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）で細胞を刺激することができ、そして細胞内のカルシウムレベル、ｃＡＤＰＲもしくはＮＡＡＤＰレベル、筋収縮性及び／又は細胞遊走の変化を測定することができる。これらの測定値を、対照ビヒクルで処理した細胞と比較する。テスト化合物の存在下における細胞内Ｃａ２＋レベルの増加、ｃＡＤＰＲの生成量の増加、筋収縮性の増大、及び／又は化学誘導物質への細胞遊走の増加は、その化合物がアゴニストとして機能して、Ｃａ２＋応答を増加させ、筋収縮性を増大させ、及び化学誘引物質誘導型ＣＤ３８依存性細胞遊走を増加させることを示す。テスト化合物の存在下における、細胞内Ｃａ２＋のレベルの減少、ｃＡＤＰＲの生成量の減少、筋収縮性の低下、及び／又は化学誘引物質への細胞遊走の減少は、その化合物がアンタゴニストとして機能して、Ｃａ２＋応答を阻害し、筋収縮性を低下させ、及び化学誘引物質誘導型ＣＤ３８依存性細胞遊走を阻害することを示す（例えば図２及び図３を参照されたい）。
【００７４】
さらに、本発明のアッセイを用いて、（ｉ）ＣＤ３８／ＳＭ３８酵素活性の基質として機能し、ｃＡＤＰＲ依存性Ｃａ２＋シグナル伝達経路のアゴニスト又はアンタゴニストへと変換される化合物を同定することができる（図５）。これらの仕様に合致する化合物は、本明細書の実施例（実施例６、図１１）にさらに詳細に記載されている。あるいは、本発明のアッセイは、（ｉｉ）ｃＡＤＰＲ媒介性Ｃａ２＋シグナル伝達経路を特異的に妨げる化合物を同定するために用いても良い（図６）。本発明の非限定的な実施形態において、テスト化合物は、ＣＤ３８／ＳＭ３８の公知もしくは未知の基質の化学的誘導体を含み得る（例えば基質類似体８−Ｂｒ−βＮＡＤは、ｃＡＤＰＲ媒介性Ｃａ２＋シグナル伝達のアゴニストとして機能する改変型生成物８−Ｂｒ−ｃＡＤＰＲへと変換される）。化学誘引物質又は筋肉刺激物質の存在下で、ＣＤ３８／ＳＭ３８及び適当な化学誘引物質受容体を発現する細胞に、このテスト基質を投与してもよい。ｃＡＤＰＲの活性を調節することができる改変型生成物への改変型テスト基質の変換は、上記方法を利用して測定することができる。またテスト基質を分析して、これらがカルシウム流入、筋収縮性及び／又は細胞遊走に対して及ぼす影響を決定することもできる。テスト基質及び化学誘引物質で処理した細胞において、細胞内でのＣａ２＋の蓄積及び化学誘引物質への遊走を測定し、非改変基質（すなわちＮＡＤ及び化学誘引物質）を与えた細胞と比較することができる。改変型生成物即ち８−Ｂｒ−ｃＡＤＰＲに変換されてｃＡＤＰＲ誘導型カルシウム応答、筋収縮性又は方向性を持った遊走を競合的もしくは非競合的に阻害する化合物は、ｃＡＤＰＲ Ｃａ２＋シグナル伝達経路のアンタゴニストとして同定され、ｃＡＤＰＲ Ｃａ２＋のシグナル伝達経路の競合的もしくは非競合的アゴニストである改変型生成物に変換される化合物は、アゴニスト又は活性化因子として定義される。
【００７５】
本発明のさらに他の実施形態において、ｃＡＤＰＲの活性（即ち誘導型のカルシウム放出及び細胞遊走）を直接変更する（すなわち活性化もしくは不活化する）化合物を、アッセイにおいてテストすることができる。このようなアゴニスト又はアンタゴニストは、細胞内へのＣａ２＋の流入を調節して細胞の遊走活性又は収縮能を変化させると期待される。アンタゴニストであれば、化学誘引物質の存在下において、Ｃａ２＋応答を低下させ、収縮性を低下させ、及び／又は遊走を減少させるであろう。アンタゴニストの例としては、８−ＮＨ２−ｃＡＤＰＲ、８−Ｂｒ−ｃＡＤＰＲ、８−ＣＨ３−ｃＡＤＰＲ、８−ＯＣＨ３−ｃＡＤＰＲ及び７−Ｄｅａｚａ−８−Ｂｒ−ｃＡＤＰＲが挙げられるがこれらに限定されない。これらの仕様に合致する化合物は、本明細書の実施例（実施例６、図１０）にさらに詳しく記載されている。アゴニストは、化学誘引物質の存在下において、Ｃａ２＋応答を増加させ、収縮性を増大させ、及び／又は遊走を増加させるであろう。アゴニストの例としては、２’−デオキシ−ｃＡＤＰＲ、３’−デオキシ−ｃＡＤＰＲ及び２’−ホスホ−ｃＡＤＰＲが挙げられるがこれらに限定されない。ｃＡＤＰＲ活性を直接測定するアッセイとしては、Ｈｏｗａｒｄら（１９９５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１０５６）；Ｇａｌｉｏｎｅら（１９９３， Ｎａｔｕｒｅ ３６５：４５６−４５９）ならびにＬｅｅ及びＡａｒｈｕｓ（１９９１， Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ２：２０３−２０９）により記載されたもの等のバイオアッセイが挙げられる。
【００７６】
さらに、本発明のアッセイは、ＣＤ３８／ＳＭ３８酵素活性を活性化することができ（即ちアゴニスト）且つ細胞内カルシウム貯蔵の枯渇によってカルシウム経路の感度を低下させる（ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚｅ）化合物を同定することができる。このような感度の低下（ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）は、ときには、カルシウム貯蔵の枯渇による細胞遊走又は筋収縮の阻害につながる場合がある。このように、ＣＤ３８／ＳＭ３８酵素アッセイにおいてアゴニストとして機能するが走化性又は筋収縮アッセイにおいてアンタゴニストとして機能する化合物を同定することができる。このようなアッセイ及び化合物は、本発明の範囲内に含まれる。
【００７７】
５．２．４．ＣＤ３８／ＳＭ３８の発現を調節する化合物のアッセイ
本発明に従って、細胞系のアッセイシステムを用いて、細胞内でＣＤ３８／ＳＭ３８の発現を調節する化合物をスクリーニングすることができる。アッセイは、転写もしくは翻訳レベルでＣＤ３８／ＳＭ３８発現を調節する化合物をスクリーニングするように設計することができる。１つの実施形態において、レポーター分子をコードするＤＮＡを、ＣＤ３８／ＳＭ３８遺伝子の調節エレメントに連結して、適当な無傷の細胞、細胞抽出物又は細胞ライゼートの中で、ＣＤ３８／ＳＭ３８遺伝子発現を調節する化合物を同定するために用いることができる。このようなレポーター遺伝子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、成長ホルモン、又は胎盤性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）が挙げられるがこれらに限定されない。このような構築物を細胞内に導入することにより、ＣＤ３８／ＳＭ３８遺伝子発現の調節因子を同定するように設計されたスクリーニングアッセイに有用な組換え細胞を提供する。
【００７８】
細胞をテスト化合物に曝露した後、レポーター遺伝子の発現レベルを定量して、ＣＤ３８／ＳＭ３８発現を調節するそのテスト化合物の能力を測定することができる。アリカリホスファターゼは細胞から分泌されるので、アリカリホスファターゼアッセイは本発明の実施において特に有用である。従って、組織培養上清を、分泌されたアルカリホスファターゼについて分析することができる。さらに、アルカリホスファターゼ活性は、熱量、生物発光、又は化学発光アッセイ（例えばＢｒｏｎｓｔｅｉｎ， Ｉ．ら（１９９４， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：１７２−１７７）に記載されたもの等）によって測定することができる。このようなアッセイは、創薬スクリーニングのための、単純且つ感度の高い、簡単に自動化可能な検出システムを提供する。
【００７９】
ＣＤ３８／ＳＭ３８の翻訳を調節する化合物を同定するために、ＣＤ３８／ＳＭ３８転写産物を含む細胞又はｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞溶解液を、ＣＤ３８／ＳＭ３８ ｍＲＮＡ翻訳の調節についてテストすることができる。ＣＤ３８／ＳＭ３８翻訳の阻害物質について分析するために、テスト化合物を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳抽出物においてＣＤ３８／ＳＭ３８ ｍＲＮＡの翻訳を調節するその能力について分析する。
【００８０】
本発明の実施形態において、ＣＤ３８／ＳＭ３８ ｍＲＮＡ転写産物の翻訳を阻害するもしくは妨げるためのアンチセンス法又はリボザイム法、あるいはＣＤ３８／ＳＭ３８遺伝子の転写を阻害する三重らせん法を用いて、ＣＤ３８／ＳＭ３８の発現レベルを調節することができる。このような方法を利用して、炎症やアレルギー等の障害を治療することができる。この場合、骨髄由来細胞の遊走を妨げるためにＣＤ３８／ＳＭ３８発現の阻害が設計されるか、又はマンソン住血吸虫の生理機能及び病理発生を変えるためにＳＭ３８の阻害が設計される。
【００８１】
アンチセンス法は、ＣＤ３８／ＳＭ３８ ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の設計を行うものである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的なｍＲＮＡ転写産物に結合して翻訳を妨げる。完全に相補的であることが好ましいが、その必要はない。当業者であれば、ハイブリダイズした複合体の解離温度（ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｏｉｎｔ）を決定するための標準的な手法を用いることにより、ミスマッチの許容度を確認することができる。
【００８２】
本発明のさらに他の実施形態において、ＣＤ３８／ＳＭ３８ ｍＲＮＡ転写産物を酵素的に切断するよう設計されたリボザイム分子を用いて、ＣＤ３８／ＳＭ３８ ｍＲＮＡの翻訳及びＣＤ３８／ＳＭ３８の発現を妨げることもできる。（例えば１９９０年１０月４日に公開された国際特許出願公開第ＷＯ９０／１１３６４号；Ｓａｒｖｅｒら， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１２２２−１２２５を参照されたい）。あるいは、体内の標的とされる造血由来細胞の中で、ＣＤ３８／ＳＭ３８遺伝子の調節領域（すなわちＣＤ３８プロモーター及び／又はエンハンサー）に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列をターゲッティングして、ＣＤ３８／ＳＭ３８遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成することにより、内因性ＣＤ３８／ＳＭ３８遺伝子発現を減少させることができる。（一般にＨｅｌｅｎｅ， Ｃ．ら， １９９１， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． ６：５６９−５８４及びＭａｈｅｒ， ＬＪ， １９９２， Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４：８０７−８１５を参照されたい）。
【００８３】
本発明のオリゴヌクレオチド（即ちアンチセンス、リボザイム、及び三重らせんを形成するオリゴヌクレオチド）は、当分野で公知である標準的な方法により、例えば自動ＤＮＡ合成装置（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されているもの等）を用いることにより、合成することができる。あるいは、本発明のオリゴヌクレオチドの発現を指令するために、組換え発現ベクターを構築してもよい。このようなベクターは、当分野において標準的である組換えＤＮＡ技術の方法によって構築することができる。特定の実施形態において、目的が標的細胞内での阻害性オリゴヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏ発現であるような遺伝子療法に用いるために、ウイルスベクター等のベクターを設計してもよい。
【００８４】
５．２．５．本発明に従ってスクリーニングすることができる化合物
上記アッセイは、ＣＤ３８／ＳＭ３８活性を調節する化合物を同定することができる。例えば、ＣＤ３８／ＳＭ３８活性に影響を及ぼす化合物としては、ＣＤ３８／ＳＭ３８に結合して、酵素活性を活性化する化合物（アゴニスト）又は酵素活性を遮断する化合物（アンタゴニスト）が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、ＣＤ３８／ＳＭ３８に直接結合しないが、ＣＤ３８酵素活性を調節するタンパク質の活性を変化させることによりＣＤ３８／ＳＭ３８酵素活性を変化させることができる化合物を同定することができる（図３を参照されたい）。また、ｃＡＤＰＲ ＣＡ２＋シグナル伝達経路を活性化又は阻害する改変型生成物へと変換されるＣＤ３８の基質となる化合物も、本発明のスクリーニングによって同定することができる。また、細胞内でｃＡＤＰＲ Ｃａ２＋シグナル伝達経路を直接活性化もしくは阻害する化合物も、同定することができる。さらに、ＣＤ３８／ＳＭ３８酵素活性を活性化してカルシウム経路の感度を低下させる化合物を同定することもできる。このような感度を低下させる化合物は、細胞遊走を阻害すると期待される。さらに、本発明のスクリーニングを用いて、（ＣＤ３８／ＳＭ３８遺伝子発現に影響を及ぼすことにより）ＣＤ３８／ＳＭ３８遺伝子活性に影響を及ぼす化合物（例えば転写に影響を及ぼしたり又はスプライシングを妨害したりして完全長もしくはトランケート型のＣＤ３８／ＳＭ３８の発現を調節することができるタンパク質や小さな有機分子等の分子を含む）を同定することができる。
【００８５】
本発明に従ってスクリーニングすることができる化合物としては、ＣＤ３８／ＳＭ３８に結合して、ＣＤ３８／ＳＭ３８の公知もしくは未知の基質のいずれかにより誘発される活性を模倣する（すなわちアゴニスト）又はＣＤ３８／ＳＭ３８の公知もしくは未知の基質のいずれかにより誘発される活性を阻害する（すなわちアンタゴニスト）、小さな有機もしくは無機化合物、ペプチド、抗体及びそのフラグメント、ならびに他の有機化合物（例えばペプチド模倣体等）が挙げられるがこれらに限定されない。化学誘引物質又は筋肉刺激物質の存在下又は不在下で、ＣＤ３８／ＳＭ３８に結合して、ＣＤ３８／ＳＭ３８酵素活性（即ちＡＤＰ−リボシルシクラーゼ活性、ＮＡＤグリコヒドロラーゼ活性、グリコシル転移活性）を強める化合物（即ちアゴニスト）、又はＣＤ３８／ＳＭ３８酵素活性を阻害する化合物（即ちアンタゴニスト）が同定される。ＣＤ３８／ＳＭ３８の酵素活性を変更／調節するタンパク質に結合する化合物が同定される。天然基質（即ちＮＡＤ（Ｐ））を模倣する化合物であって、ＣＤ３８／ＳＭ３８酵素活性によってｃＡＤＰＲ誘導型カルシウム放出経路のアゴニスト又はアンタゴニストとして機能する生成物へと変換される化合物を同定することができる。細胞内でｃＡＤＰＲ Ｃａ２＋シグナル伝達経路を直接活性化又は阻害する化合物を同定することができる。
【００８６】
化合物には、例えば以下に挙げるものを含む（ただしこれらに限定されない）可溶性ペプチド等のペプチドが含まれるが、これらに限定されない：ランダムペプチドライブラリーのメンバー（例えばＬａｍ， Ｋ．Ｓ．ら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒら， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８６を参照されたい）；ならびに立体配置がＤ形及び／又はＬ形であるアミノ酸、ホスホペプチド（ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅ）（ランダムな又は一部変性した特異的（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ホスホペプチドライブラリーのメンバーを含むがこれらに限定されない）（例えばＳｏｎｇｙａｎｇ， Ｚ．ら， １９９３， Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７８を参照されたい）、抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗−イデオタイプ抗体、キメラ抗体、又は一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦＡｂ発現ライブラリーフラグメント、ならびにこれらのエピトープ結合性フラグメントを含むがこれらに限定されない）、及び小さな有機もしくは無機分子で構成されたコンビナトリアル化学により得た分子ライブラリーのメンバー。
【００８７】
本発明に従ってスクリーニングすることができる他の化合物としては、（例えば遺伝子発現に関わる調節領域又は転写因子に相互作用することによって）ＣＤ３８／ＳＭ３８遺伝子又はＣＤ３８／ＳＭ３８シグナル伝達経路に関与するある他の遺伝子の発現に影響を及ぼす小さな有機分子、あるいはＣＤ３８／ＳＭ３８の酵素活性もしくはＣＤ３８／ＳＭ３８酵素活性の調節に関わるある他の因子（例えばＣＤ３８／ＳＭ３８をリボシル化することによりＣＤ３８／ＳＭ３８酵素活性を不活化するタンパク質等）の活性に影響を及ぼすこのような化合物が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８８】
５．３．ＣＤ３８／ＳＭ３８の調節因子を含む組成物及びその使用
本発明は、ＣＤ３８を発現する細胞を有効量のＣＤ３８調節化合物（例えば上記第５．１節に記載されたアッセイを用いて同定されるＣＤ３８アゴニスト又はアンタゴニスト等）に接触させる工程を含む、細胞遊走の調節方法を提供する。さらに、本発明は、ＳＭ３８を発現する細胞を有効量のＳＭ３８調節化合物（例えば上記第５．１節に記載されたアッセイを用いて同定されるＳＭ３８アゴニスト又はアンタゴニスト等）に接触させる工程を含む、カルシウム応答及び／又は筋収縮性の調節方法を提供する。ＣＤ３８／ＳＭ３８阻害物質（即ちアンタゴニスト）の「有効量」とは、化学誘引物質誘導型の細胞遊走を減少させ、細胞内カルシウムレベルを低下させ、筋収縮を減少させ、及び／又は上記アッセイのいずれかによって測定したＣＤ３８／ＳＭ３８酵素活性の検出可能な低下に関係する量である。ＣＤ３８／ＳＭ３８活性化物質（即ちアゴニスト）の「有効量」とは、本質的に、化学誘引物質誘導型の細胞遊走を増加させ、細胞内カルシウムレベルを増加させ、筋収縮を増大させ、及び／又は上記アッセイのいずれかによって測定したＣＤ３８／ＳＭ３８酵素活性の検出可能な増加に関係する量である。また本発明の組成物には、改変型ＣＤ３８／ＳＭ３８基質、ＣＤ３８／ＳＭ３８発現の調節因子、及びｃＡＤＰＲのアゴニスト／アンタゴニストも含まれる。
【００８９】
本発明はさらに、上記第５．１節に記載したように同定されるＣＤ３８酵素活性を調節する化合物を含む組成物を被験者に投与する工程を含む、被験者の体内において細胞遊走を調節する方法を提供する。該組成物は、ある量のＣＤ３８酵素の活性化物質もしくは阻害物質、ＣＤ３８発現の調節因子、改変型ＣＤ３８基質、又はｃＡＤＰＲにより制御されるＣａ２＋応答の直接的なアゴニスト／アンタゴニストを含み得る。したがって、本発明は、ＣＤ３８の活性化物質及び阻害物質を含む組成物を提供する。
【００９０】
本発明は、ＣＤ３８の活性、ＣＤ３８の発現、及び／又はｃＡＤＰＲの活性を調節することにより細胞の遊走活性を調節することができる有効量の化合物と薬学的に許容可能な担体とを含む組成物を提供する。特定の実施形態において、「薬学的に許容可能な」という用語は、動物、特にヒトへの使用が、連邦政府もしくは州政府の取締機関により承認されている、又は米国薬局方もしくは他の一般に認可された薬局方に記載されている、という意味である。「担体」という用語は、治療薬と一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。好適な薬学的担体の例は、Ｅ．Ｗ． Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。
【００９１】
本発明は、ＣＤ３８の発現又は活性を調節する化合物の投与による、細胞遊走に関係する様々な疾患及び障害の治療又は予防法を提供する。このような化合物には、ＣＤ３８抗体、ＣＤ３８アンチセンス核酸、ＣＤ３８のアゴニスト及びアンタゴニスト（図２〜３を参照されたい）、改変型ＣＤ３８基質（図５を参照されたい）、ならびにｃＡＤＰＲのアゴニスト及びアンタゴニスト（図６を参照されたい）が含まれるがこれらに限定されない。本発明の非限定的な実施形態において、造血由来細胞の遊走に関係する障害は、ＣＤ３８活性を調節する化合物を投与することにより治療又は予防される。このような障害としては、炎症、虚血、喘息、自己免疫疾患、糖尿病、アレルギー、感染症、関節炎、及び臓器移植拒絶反応が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
本発明の化合物は、ヒトに使用する前に、所望の治療活性又は予防活性についてｉｎ ｖｉｔｒｏでテストした後、ｉｎ ｖｉｖｏでテストするのが好ましい。例えば、特定の治療薬の投与を必要とするか否かを決定するために使用することができるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイとしては、ＣＤ３８を発現する細胞を治療的化合物に曝露するか、さもなくば、該細胞に該化合物を投与してこのような治療薬がＣＤ３８活性に対して及ぼす影響を観察するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイが挙げられる。本発明の特定の実施形態において、化合物が細胞遊走を調節する（即ち活性化もしくは阻害する）能力を分析することができる。
【００９３】
本発明はさらに、マンソン住血吸虫等の蠕虫に感染した被験者に、上記第５．１節に記載したように同定されるＳＭ３８酵素活性を調節する化合物を含む組成物を投与することにより、蠕虫において筋収縮又は他の生理学的パラメータを調節する方法を提供する。この組成物は、ある量のＳＭ３８酵素活性化物質もしくは阻害物質、ＳＭ３８発現の調節因子、改変型ＳＭ３８基質、又はｃＡＤＰＲにより制御されるＣａ２＋応答の直接的なアゴニスト／アンタゴニストを含み得る。従って、本発明は、ＳＭ３８活性化物質及び阻害物質を含む組成物を提供する。
【００９４】
本発明は、ＳＭ３８の活性、ＳＭ３８の発現及び／又はｃＡＤＰＲの活性を調節することによって寄生生物の活動及び生存率を調節することができる有効量の化合物と、薬学的に許容可能な担体とを含む組成物を提供する。特定の実施形態において、「薬学的に許容可能な」という用語は、動物、特にヒトへの使用が、連邦政府もしくは州政府の取締機関により承認されている、又は米国薬局方もしくは他の一般に認可された薬局方に記載されていることを意味する。「担体」という用語は、治療薬と一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。好適な薬学的担体の例は、Ｅ．Ｗ． Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。
【００９５】
本発明は、蠕虫感染に関係する様々な疾患及び障害の治療又は予防法を提供する。このような化合物としては、ＳＭ３８抗体、ＳＭ３８アンチセンス核酸、ＳＭ３８のアゴニスト及びアンタゴニスト（図２〜３を参照されたい）、改変型ＳＭ３８基質（図５を参照されたい）、ならびにｃＡＤＰＲのアゴニスト及びアンタゴニスト（図６を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の非限定的な実施形態において、蠕虫感染に関係する障害は、ＳＭ３８活性を調節する化合物の投与により治療又は予防される。このような障害としては、肝臓及び肺における肉芽腫形成及び線維症が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
本発明の化合物は、ヒトに使用する前に、所望の治療活性又は予防活性についてｉｎ ｖｉｔｒｏでテストした後、ｉｎ ｖｉｖｏでテストするのが好ましい。例えば、特定の治療薬の投与を必要とするか否かを決定するために使用することができるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイとしては、ＳＭ３８を発現する細胞を治療的化合物に曝露するかさもなくば該細胞に該化合物を投与してこのような治療薬がＳＭ３８活性に対して及ぼす影響を観察するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイが挙げられる。本発明の特定の実施形態において、化合物が筋収縮性又は細胞内カルシウム蓄積を調節する（即ち活性化もしくは阻害する）能力を分析することができる。さらに、マンソン住血吸虫感染のマウスモデルにおいて、本発明の化合物がマンソン住血吸虫の病理発生、成長、分化、及び繁殖に対して及ぼす影響について分析することができる。このようなアッセイは、寄生生物の増殖、雌蠕虫の成熟、肝臓及び肺における肉芽腫の量、肝臓、肺、膀胱及び腸管内の卵の量、肺及び肝臓内の蠕虫の量、ならびに尿及び便の中で検出されるミラキジウムの量に及ぼす影響についてのテストを含む。
【００９７】
さらに、本発明の化合物がマンソン住血吸虫の病理発生、成長、分化及び繁殖に及ぼす影響について分析することができる。このような化合物は、マンソン住血吸虫感染のマウスモデルにおいてテストすることができる。このようなアッセイは、寄生生物の増殖、肝臓及び肺における肉芽腫の量、肝臓、肺、膀胱及び腸管内の卵の量、ならびに尿及び便の中で検出されるミラキジウムの量に及ぼす影響についてのテストを含む。
【００９８】
本発明は、有効量の本発明の化合物を被験者に投与することによる治療及び／又は予防方法を提供する。好適な態様において、該化合物は実質的に精製されたものである。被験者は好ましくは動物であり、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトである。
【００９９】
様々な送達系が公知であり、これらは、ＣＤ３８活性、ｃＡＤＰＲ、又はＣＤ３８発現を調節することができる化合物を投与するために用いることができる（例えばリポソームへのカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、該化合物を発現することができる組換え細胞、受容体を媒介とするエンドサイトーシス等）（例えばＷｕ及びＷｕ， １９８７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：４４２９−４４３２を参照されたい）。導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外及び経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。化合物は、任意の便利な経路から、例えば注入もしくはボーラス注射、上皮もしくは粘膜皮膚の内張り（例えば口腔粘膜、直腸及び腸管粘膜等）を介した吸収により投与することができ、また、他の生体活性因子と一緒に投与してもよい。投与は全身投与であっても局所投与であってもよい。例えば吸入器又はネブライザーを使用し、エアロゾル化剤と一緒に製剤化して、肺投与を用いることもできる。
【０１００】
特定の実施形態において、本発明の組成物を身体の特定の領域に局所投与することが望ましい。これは、限定する訳ではないが、例えば外科手術中の局所注入、表面塗布（例えば外科手術後の創傷包帯と一緒に）、注射により、カテーテルを用いて、坐剤を用いて、又は移植片（多孔性、非多孔性、又はゲル状の材料で構成されたシラスチック膜等の膜や繊維等）を用いて、行うことができる。
【０１０１】
また本発明は、医薬組成物も提供する。このような組成物は、ＣＤ３８活性、ｃＡＤＰＲ活性又はＣＤ３８発現を調節することができる治療的有効量の化合物と、薬学的に許容可能な担体とを含む。特定の実施形態において、「薬学的に許容可能な」という用語は、動物、特にヒトへの使用が、連邦政府又は州政府の取締機関により承認されている、又は米国薬局方もしくは他の一般に認可された薬局方に記載されていることを意味する。「担体」という用語は、治療薬と一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。このような薬学的担体は、水又は油等の滅菌液であってもよく、例えば石油、動物、植物又は合成起源のものが含まれる（落花生油、大豆油、鉱油、ごま油等）。水は、医薬組成物を静脈内に投与する場合に、好適な担体である。また、特に注射用溶液としては、食塩水、デキストロース水溶液、及びグリセロール水溶液を液体担体として使用することもできる。組成物は、伝統的な結合剤及び担体（グリセリド等）と一緒に坐剤として製剤化することができる。経口投与用製剤としては、医薬品レベルのマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、糖ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｉｎｅ）、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的担体を含み得る。好適な薬学的担体の例は、Ｅ．Ｗ． Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。このような組成物は、治療的有効量の治療的化合物（好ましくは精製されたもの）を、患者に適切に投与される形状にするような適当な量の担体と一緒に含む。製剤は投与方法に合ったものでなければならない。
【０１０２】
特定の障害又は症状の治療に効果的な本発明の化合物の量は、その障害又は症状の性質によって異なり、標準的な臨床技法によって決定することができる。さらに、最適な投薬量範囲を同定するために、場合によりｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを補助的に使用してもよい。製剤中に使用される正確な用量は、投与経路、及び疾患又は障害の重症度によっても異なり、現場の医師の判断及び各患者の状況に従って決定すべきである。有効な用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくは動物モデルのテストシステムから得た用量−反応曲線から外挿法により決定することができる。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ研究により、該化合物と他の公知の効力のある薬物とを組み合わせて投与したときに相乗作用的もしくは付加的な治療効果が得られることが分かった場合、これらを組み合わせて投与することができる。
【０１０３】
また本発明は、本発明の医薬組成物の成分のうちの１種以上を充填した１個以上の容器を含む医薬パックもしくはキットも提供する。場合により、このような容器には、医薬品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を取り締まる政府当局により規定された様式で書かれた注意書き（ヒト投与のための製造、使用又は販売を取り締まる管轄機関による認可を表す）が添付されていてもよい。
【０１０４】
６．実施例：好中球は、走化性、容量性Ｃａ＋流入（ｃａｐａｃｉｔａｔｉｖｅ Ｃａ＋ ｅｎｔｒｙ）及び細菌浄化のためにＣＤ３８を必要とする
以下のサブセクションは、化学誘引物質により活性化された好中球へのカルシウムの流入が、ＣＤ３８酵素反応により得られる生成物、ｃＡＤＰＲにより制御されることを示すデータを表す。容量性カルシウム流入（ＣＤ３８により生成されるｃＡＤＰＲにより制御される）は、好中球が化学誘引物質に向かって効率良く移動するのに必要である。
【０１０５】
６．１．材料及び方法
６．１．１．マウス
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊｘ１２９ＣＤ３８ＫＯ Ｆ２動物（Ｃｏｃｋａｙｎｅら， １９９８， Ｂｌｏｏｄ ９２：１３２４−１３３３）を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊに６世代（Ｎ６）戻し交配した後、同系交配させて、ホモ接合性類似遺伝子系Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ．１２９ ＣＤ３８ＫＯマウスを作製した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ．１２９（Ｎ６）ＣＤ３８ ＫＯマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊ．１２９（Ｎ８）Ｒａｇ−２ ＫＯマウスとかけあわせた後（Ｓｈｉｎ Ｋａｉら， １９９２ Ｃｅｌｌ ６８：８５５−８６７）、その子孫をかけあわせてホモ接合性二重ＫＯ動物を得ることにより、ＣＤ３８−Ｒａｇ−２二重ＫＯ（ｄＫＯ）マウスを作製した。ＷＴマウス又はＣＤ３８ＫＯマウスから単離した１ｘ１０７個の無傷の骨髄細胞を、致死量の放射線（９５０ｒａｄ）を照射したＷＴ宿主に移植することによって、骨髄キメラマウスを作製した。全てのマウスを飼育し、Ｔｒｕｄｅａｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ａｎｉｍａｌ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙで保管した。
【０１０６】
６．１．２． ｃＡＤＰＲ含有量の測定
全身潅流したＷＴマウス又はＣＤ３８ＫＯマウスからマウス組織を単離し、液体窒素の中で瞬間冷凍した。Ｒａｇ−２ＫＯもしくはＲａｇ−２−ＣＤ３８ ｄＫＯマウスの脛骨及び大腿骨から骨髄細胞を取り出した。次に、過去に記載されているように（Ｖｕら， １９９７ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２３６：７２３−７２６）、マウス組織及び骨髄細胞の中のｃＡＤＰＲ含有量を測定した。
【０１０７】
肺炎連鎖球菌感染。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ （Ｒｏｃｈｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手した１００又は１０００ＣＦＵの肺炎連鎖球菌４型（Ｋｌｅｉｎ株）を気管内に投与して、マウスを感染させた。感染マウスから、血液、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）及び肺組織を回収した（Ｇａｒｖｙら， １９９６ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ２０：４９９−５１２）。肺ホモジェネート及び血液中の細菌力価を、肺あたり又は血液ｍｌあたりで計算した。細胞遠心分離調製物（ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）からＢＡＬ細胞の数を数えた。
【０１０８】
６．１．３． ｉｎ ｖｉｔｒｏ走化性アッセイ
ビオチン結合ＧＲ−１（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）及びＭＡＣＳストレプトアビジンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ａｕｂｕｒｎ ＣＡ）を用いた正の選択により、骨髄好中球を精製した（純度９５％）。孔サイズ３μｍのポリカーボネートフィルタを備えた２４ウェル−トランスウェルプレート（２４−ｗｅｌｌ ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）（Ｃｏｓｔａｒ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）を用いて、走化性アッセイ（Ｆａｌｋら， １９８０， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ３３：２３９−２４７）を行った。培地（ＨＢＳＳ＋Ｃａ２＋＋Ｍｇ２＋）、ｆＭＬＰ（１μＭ， Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）、又はＩＬ−８（１００ｎＭ、Ｓｉｇｍａ）を、チェッカーボードフォーマットの下側及び／又は上側のチャンバーに入れた。１ｘ１０５個の好中球を上側のチャンバーの中に入れ、プレートを３７℃にて４５分間インキュベートした。移行した（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅｄ）細胞を下側のチャンバーから回収し、固定し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ， Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）でカウントした。各サンプル中の細胞の絶対数を決定するために、標準個数のサイズ２０μＭの蛍光マイクロスフィア（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ． Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ， ＰＡ）を各試験管に加え、細胞と一緒にカウントした。移行した細胞の総数＝カウントした好中球の数×ビーズの総数／カウントしたビーズである。幾つかの実験では、好中球を、ＥＧＴＡ（２ｍＭ）中でインキュベートするか、又は８−Ｂｒ−ｃＡＤＰＲ（２５〜１００μＭ， Ｓｉｇｍａ）もしくはＮ（８−Ｂｒ−Ａ）Ｄ＋（１．０ｍＭ）で２０分間、前処理した。
【０１０９】
６．１．４． ＣＤ３８発現
ＷＴマウス又はＣＤ３８ＫＯマウスから、骨髄、血液又は腹膜腔細胞を単離し、抗−マウスＧＲ−１ ＦＩＴＣ、抗−マウスＭＡＣ−１ ＰＥ及び抗−マウスＣＤ３８ ＡＰＣ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）で染色した。フィコール勾配でヒト末梢血好中球を単離した後、抗−ｈＣＤ１５−ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）及び抗−ｈＣＤ３８−ビオチン（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ ＣＡ）で染色した。フローサイトメトリーによりマウス及びヒト好中球を分析した（マウス好中球の場合はＭＡＣ−１＋ＧＲ−１＋及びヒト好中球の場合はＣＤ１５＋）。炎症反応を誘導するために、マウスに１ｍｌの３％チオグリコール酸塩培地（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ ＭＤ）を腹腔内注射した。注射の１２時間後にこれらの動物を犠牲にし、腹膜腔に浸潤している細胞を回収した。
【０１１０】
６．１．４． ＣＤ３８シクラーゼ活性の測定
ＣＤ３８シクラーゼ活性の測定。１ｘ１０６個の精製した骨髄好中球を、９６ウェルマイクロプレート中の１００μｌ ＨＢＳＳ中で３７℃にて２０分間インキュベートした。ＮＧＤ（４０μＭ）（Ｓｉｇｍａ）を加え、次の１０分間、ＮＧＤ＋からｃＧＤＰＲへの酵素的変換を、蛍光定量法（Ｇｒａｅｆｆら， １９９４ Ｊ． ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：３０２６０−３０２６７）により測定した（４１５ｎｍ発光及び３００ｎｍ励起）。
【０１１１】
６．１．５． 好中球の中におけるＲｙＲ−３ ｍＲＮＡ発現
精製した骨髄好中球又は脳組織から単離したＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。投入量０．０３〜２μｇのｃＤＮＡ及びＲｙＲ−３特異的プライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを３０サイクル（アニーリング温度６１℃）行った（Ｇｕｓｅら， １９９９ Ｎａｔｕｒｅ ３９８：７０−７３）。
【０１１２】
Ｎ（８−Ｂｒ−Ａ）Ｄ＋の合成。以前記載されたように（Ａｂｄａｌｌａｈら， １９７５ Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ ５０：４７５−４８１）、Ｎ（８−Ｂｒ−Ａ）Ｄ＋を合成した。
【０１１３】
６．１．６． 細胞内カルシウムの測定
精製した骨髄好中球を、細胞充填用培地（ｃｅｌｌ ｌｏａｄｉｎｇ ｍｅｄｉａ）（Ｃａ２＋及びＭｇ２＋＋１％ＦＢＳ＋４ｍＭプロベネシドを加えたＨＢＳＳ）の中に１×１０７細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。蛍光染料Ｆｌｕｏ−３ ＡＭ（４μｇ／ｍｌ）及びＦｕｒａ Ｒｅｄ ＡＭ（１０μｇ／ｍｌ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）と一緒に細胞を３７℃にて３０分間インキュベートした後、２回洗浄し、細胞充填用培地又はカルシウムを含まない培地中に１×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。幾つかの実験では、５μＭジギトニンを含むカルシウムを含まない培地中で細胞を透過性とした。他の実験では、ＥＧＴＡ（２ｍＭ）、８−Ｂｒ−ｃＡＤＰＲ（１０〜１００μＭ）、ルテニウムレッド（Ｓｉｇｍａ）又はＮ（８−Ｂｒ−Ａ）Ｄ＋（１ｍＭ）と一緒に細胞を予めインキュベートしておいた後、対照担体（ＤＭＳＯ ０．０１％）、ｆＭＬＰ（１μＭ）、ＩＬ−８（１００ｎＭ）、リアノジン（１μＭ）、ｃＡＤＰＲ（１００μＭ）又はタプシガーギン（１μＭ）で刺激した。フローサイトメトリーにより、ＦＬ−１チャンネルの中ではＦｌｕｏ−３の蛍光発光を、及びＦＬ−３チャンネルの中ではＦｕｒａ−Ｒｅｄの蛍光発光を測定して、個々の細胞の中の［Ｃａ２＋］ｉの蓄積を評価した。ＦｌｏｗＪｏ３．２（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ， Ｉｎｃ． Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ， ＣＡ）を用いて、データを分析した。相対的な［Ｃａ２＋］ｉは、一定時間のＦｌｕｏ−３及びＦｕｒａ Ｒｅｄの平均蛍光強度の比率で表した。
【０１１４】
６．２． 結果
ＣＤ３８は、リンパ組織の中で発現される主要なＡＤＰ−リボシルシクラーゼである。ｉｎ ｖｉｖｏでのカルシウム感受性免疫反応におけるＣＤ３８及びｃＡＤＰＲの必要性を直接テストするために、ＣＤ３８ノックアウト（ＣＤ３８ＫＯ）マウスを作成した（Ｃｏｃｋｋａｙｎｅら， １９９８ Ｂｌｏｏｄ ９２：１３２４−１３３３）。ＣＤ３８がマウス中で発現される主要なシクラーゼであるか否かを決定するために、ＣＤ３８ＫＯ及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型（ＷＴ）マウスから単離した組織及び細胞の中のｃＡＤＰＲ含有量を比較した（表１）。
【０１１５】
【表１】
2004518414.tif 000002
８〜１２週齢のＣＤ３８ＫＯもしくはＷＴマウスから単離した組織から、又はＲａｇ−２ＫＯもしくはＲａｇ−２−ＣＤ３８二重ＫＯマウスから単離した骨髄（ＢＭ）骨髄性細胞から抽出物を調製し、ｃＡＤＰＲ含有量について分析した。１回の分析あたり３匹のマウスから単離した組織について精製及び分析を３回別個に行った。＊Ｐ＝０．０１、＊＊Ｐ＝０．０７；Ａｎｏｖａ分析。検出の限界、０．２ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質。
【０１１６】
主にリンパ系細胞又は骨髄性細胞を含むＷＴ組織（例えば脾臓、胸腺及びリンパ系細胞不足骨髄（骨髄性細胞）等）は、簡単に検出できるレベルのｃＡＤＰＲを有していた。これに対し、ＣＤ３８ＫＯマウスから単離したリンパ組織又は骨髄組識ではｃＡＤＰＲは検出されなかった。しかし、脳、腎臓及び心臓等のＣＤ３８ＫＯ組織のｃＡＤＰＲ含有量は、同じＷＴ組織のｃＡＤＰＲ含有量とほぼ等しかった。従って、脳及び心臓等の器官におけるｃＡＤＰＲ産生には他の未知のシクラーゼが関与しているに違いが、ＣＤ３８は、骨髄性細胞及びリンパ系細胞により発現される優勢なＡＤＰ−リボシル−シクラーゼである。
【０１１７】
ＣＤ３８欠陥マウスは、細菌感染によりかかりやすい。先天性の炎症性免疫反応におけるＣＤ３８及びｃＡＤＰＲの必要性をテストするために、ＣＤ３８ＫＯ及びＷＴマウスを肺炎連鎖球菌に感染させ、生存率を評価した（図７Ａ）。ＣＤ３８ＫＯ動物のＬＤ５０はＷＴマウスよりも少なくとも１０倍低いという観察結果を得た。つまり１００コロニー形成単位（ＣＦＵ）は感染後２．５日以内にＣＤ３８ＫＯマウスの５０％を殺傷したが、同じ期間内にＷＴ動物の５０％を殺傷するには１０００ＣＦＵが必要であった。
【０１１８】
ＣＤ３８は反応している免疫細胞及び気管支上皮から発現されるので（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ＪＥら， Ｊ．ｂｉｏｌ Ｒｅｇ Ｈｏｍｅｏｓｔ Ａｇｅｎｔｓ １２：８１−９１）、ＷＴ又はＣＤ３８ＫＯ骨髄を、放射線照射したＷＴ宿主に移植して、肺及び／又は免疫系におけるＣＤ３８発現が防御に必要であるか否かをテストした。再構成したキメラ動物はＣＤ３８＋又はＣＤ３８−欠陥骨髄由来細胞を保有していたが、気管支上皮を含む他の全ての細胞型は、いずれのグループの動物においてもＷＴ起源のものであった。次に、再構成マウスを肺炎連鎖球菌に感染させ、生存率をモニターした（図７Ｂ）。ＣＤ３８ＫＯ骨髄を受容した再構成動物は、ＷＴ骨髄を受容したマウスに比べてはるかに感染しやすかった。このことは、肺炎連鎖球菌感染へのＣＤ３８ＫＯマウスの高い羅病性が、骨髄由来リンパ系細胞及び／又は骨髄性細胞におけるＣＤ３８の欠陥によるものであることを示している。
【０１１９】
肺炎連鎖球菌へのＣＤ３８ＫＯ動物の高い罹病性が、細菌の成長及び全身部位への広がりを抑制できないことによるものであるか否かを決定するために、ＣＤ３８ＫＯ及びＷＴマウスを１０００ＣＦＵの肺炎連鎖球菌に感染させ、感染後１２時間で、肺及び血液中の細菌力価を評価した（図７Ｃ）。ＣＤ３８ＫＯマウスの肺中の細菌力価は対照ＷＴと比較して５倍高かった。しかし、ＣＤ３８ＫＯマウスの血液中の細菌負荷量は、ＷＴマウスに比べて２００〜５００倍多かった。このことは、この細菌がＣＤ３８ＫＯマウスにおいて急速に広まることを示している。
【０１２０】
骨髄性細胞又はリンパ系細胞が細菌の蔓延促進の一因になるか否かを決定するために、Ｒａｇ−２ ＫＯマウス（Ｓｈｉｎ Ｋａｉら， １９９２ Ｃｅｌｌ ６８：８５５−８６７）（リンパ球が不足しているが全ての骨髄性細胞上にＣＤ３８を発現することができる）及びＣＤ３８−Ｒａｇ−２二重ノックアウトマウス（リンパ球が不足しており且つ骨髄性細胞上にＣＤ３８を発現することができない）を１０００ＣＦＵの肺炎連鎖球菌に感染させた後、１２時間後に肺及び血液中の細菌力価を測定した（図７Ｃ）。リンパ系細胞不足ＣＤ３８−Ｒａｇ−２二重ＫＯマウスの肺及び血液中の細菌力価はＣＤ３８ＫＯマウスに見られる細菌力価と同じくらい高く、Ｒａｇ−２ＫＯ又はＷＴマウスに比べて有意に高かった。従って、ＣＤ３８欠陥骨髄性細胞は、肺炎連鎖球菌へのＣＤ３８ＫＯマウスの高い罹病性の一因である。
【０１２１】
ＣＤ３８欠陥好中球は感染部位及び炎症部位に蓄積されない。骨髄性細胞が肺炎連鎖球菌に感染したＣＤ３８ＫＯ動物の肺に適切に漸増されるか否かをテストするために、ＣＤ３８ＫＯ及びＷＴマウスを感染させた後、感染後に肺気道に漸増された細胞を数えた。ＣＤ３８ＫＯ及びＷＴ動物の気道内の細胞の総数は、感染後６〜１８時間、同等に増加した（図８Ａ）。しかし、好中球は、感染後１２〜１８時間でＷＴ動物の肺の中に見られる優性な細胞型であったが、ＣＤ３８ＫＯ動物の肺の中の浸潤細胞は、主にマクロファージから構成されていた（図８Ｂ〜Ｃ）。従って、ＣＤ３８は、感染部位及び炎症部位への好中球の漸増維持に必要であると思われる。
【０１２２】
ＣＤ３８欠陥好中球は、化学誘引物質ｆＭＬＰに対する不完全な走化性反応を起こす。好中球は、局所細胞及び侵入病原体により生成されるケモカイン及び化学誘引物質の勾配に反応して感染部位に移動する（Ｈｕｂら， １９９６ Ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ Ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ （Ｈｏｒｕｋ編）３０１−３２５（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ）；Ｓｅｒｖａｎｔ Ｇ．ら， ２０００ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：１０３７−１０４０；Ｇａｏ， Ｊ．Ｌ．， １９９９ Ｊ．Ｅｘｐ． Ｍｅｄ １８９：６５７−６６２）。化学誘引物質は好中球を速やかに活性化し、ランダムな遊走を誘導する（ケモキネシス）。走化性勾配が存在する場合、活性化された好中球の前縁は、その勾配の最も高い濃度に向かって分極し、方向性を持って移動する（走化性）。好中球は、ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニアラニン（ｐｈｅｎｙａｌａｎｉｎｅ）（ｆＭＬＰ）等の細菌由来ホルミル化ペプチドによりそのＮ−ホルミルペプチド受容体（ＦＰＲ）が刺激されると、感染部位に向かって移動することは、既に証明されている。ＣＤ３８ＫＯ好中球がｆＭＬＰに向かって移動する能力に欠陥があるか否かをテストするために、トランスウェルチェッカーボードアッセイ（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｃｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ａｓｓａｙ）にてＣＤ３８ＫＯ好中球及びＷＴ好中球がケモキネシス及び走化性により遊走する能力を測定した（Ｆａｌｋら， １９８０ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ３３：２３９−２４７）（図８Ｄ）。上側及び下側のチャンバーにｆＭＬＰがなかった場合、又はｆＭＬＰが上側のチャンバーのみにあった場合、少ない（＜２３００細胞）が同等数のＣＤ３８ＫＯ及びＷＴ好中球が下側のチャンバーへと遊走した。等濃度のｆＭＬＰが上側及び下側のチャンバーにあった場合（ケモキネシス条件）、数は増加したが同等数のＷＴ及びＣＤ３８ＫＯ好中球が下側のチャンバーに遊走した。このことは、活性化により誘導されるｆＭＬＰへのケモキネシスが、ＣＤ３８ＫＯ及びＷＴ好中球では等しかったことを示している。ｆＭＰＬが下側のチャンバーのみに在った場合（走化性条件）、下側のチャンバーへのＷＴ好中球の移動はさらに増加した。しかし、ＣＤ３８ＫＯ好中球は、ｆＭＬＰ勾配の不在下に比べて走化性勾配の存在下では遊走性が僅かに高かっただけであった。このことは、ＣＤ３８ＫＯ好中球が、細菌性化学誘引物質によって活性化されて遊走することができるが、走化性勾配には従うことができないことを示している。これがＣＤ３８ＫＯ好中球の一般的特性であるか否かを決定するために、ケモカインＩＬ−８（好中球の強力な活性化物質である）を用いて同じ実験を行った（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉら， １９８９ Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ ８４：１０４５−１０４９）。ｆＭＬＰで観察されたものとは対照的に、ＩＬ−８により誘導されたＣＤ３８ＫＯ及びＷＴ好中球の走化性は同等であった（図８Ｄ）。このように、これらのデータは、ＣＤ３８ＫＯ好中球が、幾つか（ただし全てではない）の化学誘引物質に対して不完全な走化反応を起こすことを示している。
【０１２３】
ＣＤ３８は、好中球上に発現され、酵素的に活性である。ＣＤ３８ＫＯ好中球は走化性において本質的な欠陥を有すると思われるので、マウス及びヒト好中球におけるＣＤ３８の発現及び酵素活性を測定した。ＷＴマウスの骨髄及び血液から単離した好中球は、ＣＤ３８を明らかに発現し（図９Ａ）、同様に、ヒト末梢血好中球もＣＤ３８を発現した（図９Ｂ）。興味深いことに、ＷＴマウスに炎症性物質であるチオグリコール酸塩を腹腔内注射したところ、血液及び腹膜腔から単離した好中球においてＣＤ３８発現が有意に増加した（図９Ｄ）。次に、ＣＤ３８を発現する好中球がシクラーゼ反応を触媒することができるか否かをテストするために、ＷＴ及びＣＤ３８ＫＯ好中球を、ＮＡＤ＋類似体であるニコチンアミドグアニンジヌクレオチド（ＮＧＤ）と一緒にインキュベートした後、ＮＧＤが環化して蛍光化合物サイクリックＧＤＰ−リボース（Ｇｒａｅｆｆら， １９９４ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２６９：３０２６０−３０２６７）（ｃＧＤＰＲ）となる様子を測定した。図９Ｃに示すように、ＮＧＤと一緒にインキュベートすると、ＷＴ好中球はｃＧＤＰＲを速やかに生成したが、ＣＤ３８ＫＯ好中球はこれを生成しなかった。このことは、ＣＤ３８を発現する好中球が、サイクリックヌクレオチドを生成する能力を持つことを示している。
【０１２４】
ｃＡＤＰＲ及びリアノジンは、好中球の中で細胞内カルシウム放出を誘導する。ｃＡＤＰＲはリアノジン受容体（ＲｙＲ）依存性貯蔵（Ｇａｌｉｏｎｅら， １９９１ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１１４３−１１４６）を介して細胞内カルシウム放出を誘導するので、ＲｙＲ／ｃＡＤＰＲカルシウムシグナル伝達経路が好中球において機能的であるか否かをテストした。ＲＴ−ＰＣＲ分析を行ったところ、好中球はＲｙＲ３のｍＲＮＡを発現するが（Ｓｏｒｒｅｎｔｉｎｏ， Ｖ．ら， １９９３ ＴＩＰＳ １４：９８−１０３；Ｈａｋａｍａｔａ Ｙ．ら， １９９２ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３１２：２２９−２３５）、脳内で見られるものに比べてはるかに低レベルであることが分かった（図９Ｄ）。好中球により発現されるＲｙＲが機能的であるか否かをテストするために、カルシウムを含まない緩衝液中で透過性とした後にリアノジンで刺激した好中球において、細胞内カルシウムレベル（［Ｃａ２＋］ｉ）を測定した（図９Ｅ）。リアノジンで刺激した好中球において少量ではあるが再現性のある［Ｃａ２＋］の増加（これはＲｙＲ阻害物質であるルテニウムレッドにより遮断することができる）が観察された（Ｇａｌｉｏｎｅら， １９９１ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１１４３−１１４６）。次に、好中球の中でｃＡＤＰＲが細胞内カルシウム放出を誘導することができるか否かをテストするために、カルシウムを含まない緩衝液の中で好中球を透過性とした後、精製したｃＡＤＰＲで該細胞を刺激した（図９Ｆ）。僅かではあるが簡単に検出することができる細胞内遊離カルシウムの増加が観察された。ｃＡＤＰＲをまず熱不活化により加水分解した場合（Ｌｅｅら， １９８９ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：１６０８−１６１５）又は細胞を８−Ｂｒ−ｃＡＤＰＲ（ＲｙＲへのｃＡＤＰＲの結合を競合的に拮抗するｃＡＤＰＲの不活性類似体）（Ｇｕｓｅら， １９９４ Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ １２：５９３−６３３）で前処理した場合、カルシウム放出は観察されなかった。ｃＡＤＰＲ媒介性カルシウム放出に対するアンタゴニスト８−Ｂｒ−ｃＡＤＰＲの特異性はさらに、８−Ｂｒ−ｃＡＤＰＲがタプシガーギンにより媒介される細胞内遊離カルシウムの蓄積を遮断することができないことを示すことによって証明された（図９Ｇ）。まとめると、これらのデータは、ＲｙＲ及びｃＡＤＰＲを媒介としたメカニズムにより好中球の中で細胞内カルシウムが放出され得ること示す。
【０１２５】
ＣＤ３８により触媒されたｃＡＤＰＲは、ｆＭＬＰにより活性化された好中球の中への細胞外カルシウムの流入に必要である。ケモカイン／化学誘引物質Ｇ−タンパク質共役型受容体（例えばＦＰＲやＩＬ−８受容体等）を介したシグナル伝達により、細胞内カルシウム放出と細胞外カルシウムの流入とが組み合わさることにより、［Ｃａ２＋］ｉが増大する（Ｍｕｒｐｈｙ， Ｐ．Ｍ．， １９９４ Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ １２：５９３−６３３；Ｄｅｍａｕｒｅｘ Ｎ．ら， １９９４ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ２９７：５９５−６０１；Ｓｃｈｏｒｒ Ｗ．ら， １９９９ Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ ２９：８９７−９０４；Ｌｅｗら， １９８９ Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １９：３３８−３４６）。ＣＤ３８ＫＯ好中球は、ｆＭＬＰへの走化性アッセイにおいて欠陥があり、カルシウムを動員する代謝産物であるｃＡＤＰＲを生成する能力を持たないので、ＣＤ３８ＫＯ好中球においてｆＭＬＰに反応したカルシウム動員に欠陥があるという仮説がたてられた。これをテストするために、カルシウムを含まない培地中で、ＣＤ３８ＫＯ又はＷＴ好中球をｆＭＬＰ又はＩＬ−８で刺激し、細胞内カルシウム放出を測定した（図１０Ａ）。ｆＭＬＰで刺激したＷＴ好中球では、すぐに細胞内カルシウムの急激な上昇が観察され、その後５分間かけて徐々に減少した。これに対して、ｆＭＬＰで刺激したＣＤ３８ＫＯ細胞では、ｆＭＬＰで刺激した後の［Ｃａ２＋］ｉの量は約２０％減少し、この［Ｃａ２＋］ｉは、少なくとも２分早く、基準線まで減少した。ｆＭＬＰで刺激したＣＤ３８ＫＯ好中球において見られる［Ｃａ２＋］ｉの低さとは異なり、ＩＬ−８で刺激したＣＤ３８ＫＯ及びＷＴ好中球の［Ｃａ２＋］ｉは同じであった。従って、これらのデータは、ＣＤ３８がｆＭＬＰ刺激後の最適な細胞内カルシウム放出に必要であるが、ＩＬ−８刺激後には必要ではないことを示した。
【０１２６】
次に、ＣＤ３８が細胞外カルシウムの流入に必要であるか否かを評価するために、カルシウム含有培地の中で、刺激したＣＤ３８ＫＯもしくはＷＴ好中球をｆＭＬＰ又はＩＬ−８で刺激した（図１０Ｂ）。ｆＭＬＰをＷＴ好中球に加えた場合、細胞内カルシウム放出による［Ｃａ２＋］ｉの急激な上昇が観察されると同時に、細胞外カルシウムの流入によって、２度目の長い［Ｃａ２＋］ｉの上昇も観察された。極めて対照的に、この反応のカルシウム流入期は、ｆＭＬＰで刺激したＣＤ３８ＫＯ好中球においてほぼ皆無であった。興味深いことに、カルシウム含有培地中においてＷＴ及びＣＤ３８ＫＯ好中球をＩＬ−８で刺激した場合、ＩＬ−８は、ＷＴ及びＣＤ３８ＫＯ好中球の両方において ［Ｃａ２＋］ｉの同等の急激な上昇を誘導し、これは急速に基準線レベルまで減少することが分かった。このことは、ＷＴ又はＣＤ３８ＫＯ好中球のいずれにおいてもＩＬ−８が細胞外カルシウムの流入を誘導しなかったことを示している。
【０１２７】
ｃＡＤＰＲがｆＭＬＰにより刺激された好中球においてカルシウム動員を調節するか否かを決定するために、ＣＤ３８ＫＯ及びＷＴ好中球を、濃度を段階的に高くしたｃＡＤＰＲアンタゴニスト、８−Ｂｒ−ｃＡＤＰＲと一緒に予めインキュベートさせておいた後、ｆＭＬＰ又はＩＬ−８で刺激した（図１０Ｃ）。８−Ｂｒ−ｃＡＤＰＲで処理したＷＴ細胞をｆＭＬＰで刺激した場合、細胞内カルシウムの放出ならびに細胞外カルシウムの流入は用量依存式にＣＤ３８ＫＯ細胞内で見られるレベルにまで低下した。これに対し、ＩＬ−８で刺激した好中球に８−Ｂｒ−ｃＡＤＰＲを加えても、ＷＴ又はＣＤ３８ＫＯ好中球いずれの［Ｃａ２＋］ｉに対しても全く影響を及ぼさなかった。まとめると、これらのデータは、ＣＤ３８により生成されたｃＡＤＰＲがｆＭＬＰに反応した細胞内カルシウム放出及び細胞外カルシウム流入を調節すること、ならびにＣＤ３８とｃＡＤＰＲはいずれも、ＩＬ−８で刺激した好中球におけるカルシウム動員には必要でないことを示す。
【０１２８】
ＣＤ３８により触媒されるｃＡＤＰＲは、ｆＭＬＰへの好中球の走化性に必要であるが、ＩＬ−８への走化性には必要ではない。ｃＡＤＰＲにより媒介されるカルシウム動員がｆＭＬＰへの走化性に必要であるか否かをテストするために、ＷＴ好中球を、ＥＧＴＡ又は８−Ｂｒ−ｃＡＤＰＲと一緒に予めインキュベートした後、チェッカーボード走化性アッセイにおいてｆＭＬＰ又はＩＬ−８への走化性を測定した（図１０Ｄ）。ＷＴ好中球（前処理なし）を、上側のチャンバーの中で培地と一緒に、及び下側のチャンバーの中でｆＭＬＰ又はＩＬ−８と一緒にイキュベートした場合、細胞は下側のチャンバーに効率良く遊走した。しかし、細胞外カルシウムをＥＧＴＡでキレートした場合又は細胞をｃＡＤＰＲアンタゴニストである８−Ｂｒ−ｃＡＤＰＲで前処理した場合、ｆＭＬＰへのＷＴ好中球の走化性は、８０％以上減少した。重要なことは、ＥＧＴＡ又は８−Ｂｒ−ｃＡＤＰＲで処理しても、好中球がＩＬ−８に向かって遊走する能力に対して全く影響を及ぼさなかった。従って、ｃＡＤＰＲ媒介性細胞内カルシウム放出によって調節される細胞外カルシウムの流入は、好中球のｆＭＬＰ誘導型走化性に必要である。
【０１２９】
ＮＡＤ＋の類似体は、ＩＬ−８ではなくｆＭＬＰへの好中球の走化性をＣＤ３８−依存式に阻害する。ＣＤ３８により触媒されるｃＡＤＰＲは、ｆＭＬＰへの好中球の走化性にとって必要であると思われたので、この走化性は、ＣＤ３８によりｃＡＤＰＲシグナル伝達経路のアンタゴニストへと変換され得るＮＡＤ＋類似体で好中球を処理することによって阻害することができるであろう、と予想された。この仮説をテストするために、好中球を、ＣＤ３８によって、本発明者らの初期の実験で使用したｃＡＤＰＲアンタゴニストである８−Ｂｒ−ｃＡＤＰＲへと変換されることができる基質、ニコチンアミド８−ブロモアデニンジヌクレオチド（Ｎ−（８−Ｂｒ−Ａ）Ｄ＋）で前処理した。ｆＭＬＰにより活性化された好中球においてＮ（８−Ｂｒ−Ａ）Ｄ＋が細胞外カルシウムの流入を変化させるか否かをまずテストするために、ＷＴ好中球をＮ（８−Ｂｒ−Ａ）Ｄ＋で前処理しておき、細胞をｆＭＬＰで刺激した後、［Ｃａ２＋］ｉを測定した（図１１Ａ）。Ｎ（８−Ｂｒ−Ａ）Ｄ＋で前処理したところ、ｆＭＬＰで処理した好中球の中への細胞外カルシウムの入り込みを阻害した。次に、ＷＴ及びＣＤ３８ＫＯ好中球をＮ（８−Ｂｒ−Ａ）Ｄ＋で前処理するか又は培地のみの中に入れておいた後、これらがｆＭＬＰ（図１１Ｂ）又はＩＬ−８（図１１Ｃ）に向かって遊走する能力についてテストした。未処理のＷＴ好中球はｆＭＬＰ及びＩＬ−８の両方に向かって移動し、一方、未処理のＣＤ３８ＫＯ好中球はｆＭＬＰへ向かって移動することはできなかったがＩＬ−８へは移動することができた。興味深いことに、ＷＴ好中球をＮ（８−Ｂｒ−Ａ）Ｄ＋で前処理したところ、ｆＭＬＰへの好中球の走化性を著しく低下させたが、ＩＬ−８へ向かって遊走する能力には全く影響を及ぼさなかった。Ｎ（８−Ｂｒ−Ａ）Ｄ＋でＣＤ３８ＫＯ好中球の前処理を行ったところ、ｆＭＬＰ又はＩＬ−８へのＣＤ３８ＫＯ好中球の走化性には全く影響を及ぼさなかった。このことは、Ｎ（８−Ｂｒ−Ａ）Ｄ＋により誘導された、ｆＭＬＰにより媒介される走化性の阻害は、ＣＤ３８依存性であることを示している。まとめると、これらのデータは、ＮＡＤ＋類似体が、ＣＤ３８依存式にカルシウム応答及び好中球の走化性を調節することができることを示している。
【０１３０】
７．実施例：アレルギー性肺疾患のマウスモデル及びＣＤ３８の役割
以下のサブセクションは、ＣＤ３８欠陥好酸球が、アレルゲンにより誘導される気道炎症部位に漸増されることができないことを示すデータについて記載する。
【０１３１】
７．１． 材料及び方法
ＯＶＡによる初回抗原刺激及び感作：Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴマウスを、ミョウバンに吸着させた２０μｇのニワトリオボアルブトニン（ｏｖａｌｂｕｔｎｉｎ， ＯＶＡ）の腹腔内投与により免疫した。免疫したマウスを免疫後３０日で犠牲にし、抗ＣＤ４に直接結合させたＭＡＣＳ磁気ビーズを用いて、ＯＶＡで初回抗原刺激したＣＤ４ Ｔ細胞を脾臓から精製した。抗ＣＤ４結合ＭＡＣＳビーズを用いて、免疫していないＣ５７ＢＬ／６ ＷＴマウスから、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を精製した。ナイーブなもしくはＯＶＡで初回抗原刺激したＴ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴマウス又はＣＤ３８ＫＯ受容マウスに、マウス１匹あたり１ｘ１０７個のＣＤ４ Ｔ細胞の割合で静脈内注射し、それぞれ１０匹のマウスで構成される４つのグループを作製した（図１１Ａ及びＢに図示）。次に受容マウスを、Ｔ細胞移植の直後から７日間連続して、ＯＶＡ（１０μｇ）のＰＢＳ溶液中の気道内投与により感作した。Ｔ細胞移植後８日目にマウスを犠牲にし、上記第６．２．２節に記載したように気管支肺胞（ｂｒｏｎｃｈｅｏａｌｖｅｏｌａｒ）洗浄により肺の気道及び肺胞から浸潤細胞を取り出した。次に、血球計でカウントすることにより細胞の総数を数え、細胞を遠心分離してスライドガラスに載せ、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋで染色し、倍率４００ｘでスライド１枚あたり少なくとも２００個の細胞を同定することにより、分画細胞のカウント（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔ）を行った。
【０１３２】
７．２． 結果
ＣＤ３８が、好中球以外の細胞の肺への漸増を制御するか否かを決定するために、ヒト喘息の特性の多くに似た特性を示すアレルギー性疾患のマウスモデルを用いた（Ｌｌｏｙｄ ＣＭら， ２００１， Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７７：２６３−２９５）。喘息の重要な構成要素は、気道の炎症であり、これは、肺に漸増された好酸球の活性によって誘導されるもしくは悪化すると考えられる。好酸球は主に喘息の病理を担当するが（Ｂｒｏｉｄｅ， ＤＨら， １９９１， Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８８：６３７−６４８）、これらの漸増及び機能は、アレルゲン性の抗原により初回抗原刺激されたＴ細胞によって制御されるようである（Ｇａｖｅｔｔら， １９９４， Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １０：５８７−５９３）。このようなＴ細胞はしばしば、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３等の２型サイトカインならびにエオタキシン等のケモカインを生成する（Ｃｏｈｎ， Ｌ．ら， １９８８， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６１：３８１３−３８１６；Ｄｒａｚｅｎ ＪＭら， １９９６， Ｊ． Ｅｘｐｅｒ Ｍｅｄ． １８３：１−５）。Ｔ細胞の活性化に対するＣＤ３８のあらゆる影響とは無関係にＣＤ３８が好酸球の漸増を調節する能力を検証するために、ＷＴマウスを抗原ＯＶＡで免疫した。３０日後、これらのＯＶＡで初回抗原刺激したマウスから得たＣＤ４ Ｔ細胞を、ＷＴもしくはＣＤ３８ＫＯ受容マウスに移植した。対照として、免疫していないＷＴマウスからナイーブＣＤ４ Ｔ細胞をＷＴもしくはＣＤ３８ＫＯ受容マウスに移植した。次に受容マウスを、Ｔ細胞移植直後から８日間連続してＯＶＡ（１０μｇ）のＰＢＳ溶液の気道内投与により感作した。Ｔ細胞移植後９日目にマウスを犠牲にし、肺の気道内の細胞数を数えた。
【０１３３】
図１２Ａに見られるように、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を受容したか又は初回抗原刺激したＣＤ４ Ｔ細胞を受容したかにかかわらず、実質的な数の好中球がＷＴマウスの気道に漸増された。これとは対照的に、初回抗原刺激したＴ細胞を受容したＣＤ３８ＫＯマウス（ｔｒｉｃｅ）は、ナイーブＴ細胞を受容したＣＤ３８ＫＯマウスに比べてかなり多くの好中球を気道内に有していたが、ＷＴマウスの気道に比べてＣＤ３８ＫＯマウスの気道には比較的少ない数の好中球が漸増された。このように、アレルギー性気道疾患のモデルにおける肺への好中球の漸増も、ＣＤ３８の発現に依存する。
【０１３４】
ＯＶＡで感作したマウスの気道への好酸球の漸増は、初回抗原刺激されたＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ３８の発現の両方の存在に顕著に依存する。図１２Ｂに見られるように、初回抗原刺激を受けたＣＤ４ Ｔ細胞を受容したＣＤ３８ＫＯマウスの肺に漸増された好酸球の数は初回抗原刺激を受けたＣＤ４ Ｔ細胞を受容したＷＴマウスのそれに比べて３０倍少なく、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を受容したＣＤ３８ＫＯマウスの気道に漸増された好酸球の数はナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を受容したＷＴマウスのそれに比べて１０倍少なかった。従って、アレルギー性気道疾患のモデルにおける肺への好酸球の漸増も、ＣＤ３８に依存する。
【０１３５】
８． 実施例：マンソン住血吸虫ＣＤ３８相同体のクローニング
以下のサブセクションは、ＳＭ３８と呼ばれるマンソン住血吸虫ＣＤ３８相同体のクローニング及び配列決定について記載する。マンソン住血吸虫等の蠕虫は、多くの無脊椎動物、脊椎動物、及び植物種に感染して病理発生を引き起こし得る寄生虫として広く定義されている。住血吸虫属は、生息場所が温血脊椎動物の血流に限定されている寄生性扁虫から構成される。マンソン住血吸虫を含む住血吸虫属に属する４つの種は、年間２〜４億人に疾患を引き起こし、毎年多い年で１００万人の死者を出している（ＷＨＯ、１９９６）。さらに、住血吸虫属に属する種のうち少なくとも２種は、家畜のウシ及びヒツジに感染して深刻な経済的損失を引き起こしている。従って、感染したヒト及び／又は動物を治療するために使用することができる効果的な抗生物質を開発することが有益である。住血吸虫感染の病理発生は、主に、ヒト及び動物の様々な組織及び器官に成虫が入り込んで卵を産みつけ、その後そこに肉芽腫が形成されて線維症及び組織の損傷をもたらすことにより引き起こされる。しかし、セルカリア（未成熟蠕虫）及び完全に成熟した蠕虫も、同じく免疫性炎症反応を誘導し得る沢山のタンパク質及び脂質性炎症媒介因子（ｍｅｄｉａｔｏｒ）を放出する（Ｆｕｓｃｏ， ＡＣら， １９９１， Ｊ． Ｐａｒｉｓｔｏｌ． ７７：６４９−６５７）。住血吸虫症のとっておきの治療薬は、筋収縮及び麻痺を即時に引き起こす蠕虫の外皮を通るカルシウムの流入を誘導すると思われる薬物プラジカンテルである（Ｋｏｈｎ， ＡＢら， ２００１， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２７６：３６８７３−３６８７６）。従って、住血吸虫のカルシウム応答（特に筋肉内）を調節する薬物が、この疾患の治療において効果的であろう。
【０１３６】
８．１． 材料及び方法
８．１．１． マンソン住血吸虫ＣＤ３８相同体のクローニング
Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＷ０１７２２９で提供されるＥＳＴ配列に対応するプライマーを作製した。（５’側プライマー：ａｃａｔｃｔｔｔｇｔｇｇｔａｃｔｇａａｔｇｇｃｔｃｇｇ及び３’側プライマー：ｔｇａｇｔａａｔｇｔｃｔｃｇａｃｇｔｔｔｇａｃｃｔｃｇ）。Ｐｈｉｌｌｉｐ Ｌｏ Ｖｅｒｄｅ博士（ＳＵＮＹ， Ｂｕｆｆａｌｏ）からマンソン住血吸虫ｃＤＮＡライブラリーを入手し、上記プライマーを用いてＰＣＲにかけた。このライブラリー（１〜２０μｌ）及びｄＨ２Ｏを７０℃まで１０分間加熱した後、ＰＣＲ試薬の残りと合わせてＰＣＲサイクルを繰り返した。ＰＣＲサイクルは以下の通りであった：９５℃にて５分間を１回行った後、９５℃にて１分間、６５℃にて１分間、及び７２℃にて２分間を３５回繰り返した後、７２℃にて５分間を１回。ＥＳＴ ＡＷ０１７２２９に対応する推定３３０ｂｐバンドを単離し、ＴＯＰＯクローニングを行った後、プローブとして用いて、マンソン住血吸虫ｃＤＮＡライブラリーから２５０，０００プラークをスクリーニングした。５つの陽性クローンを単離した後、プラーク純粋クローン（ｐｌａｑｕｅ ｐｕｒｅ ｃｌｏｎｅ）を作製するために、さらに３回スクリーニングにかけた。全ての５つのクローンの両鎖を全て配列決定した。これらのクローンのうち４つのヌクレオチド配列及びアミノ酸翻訳は全く同じであった（ＳＭ３８と呼ばれる）。停止コドン及びポリアデニル化部位は、これらのＳＭ３８クローンの全てにおいて同定されたが、開始メチオニンはこれらのクローンのいずれにも存在しなかった。ＳＭ３８遺伝子の５’側末端を得るために、単一プライマー伸長法（ＮＡＲ， １９９４， ｖｏｌ ２２， Ｎｏ． １６， ｐ．３４２７−３４２８）を用いた。ＰＣＲの第１ラウンドは、外側ＳＭ３８プライマー（５’ｃａｔｃｇａａｔａａｃｃｃｔｇａｔｔｔｃａｔａａｃａｃ）及びＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ用の万能逆方向プライマー（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）を用いて行った。次にこの反応物２μｌを、内側ｎｅｓｔｅｄ ＳＭ３８プライマー（５’ｇａｔａａａｇｔａａｇａａｃｔｃｇｔｇｃｃ）及び万能逆方向プライマーを用いたＰＣＲにかけた。この反応物から２００ｂｐバンド及び３００ｂｐバンドを同定し、直接配列決定を行った。得られた配列は、ＳＭ３８クローンの５’側末端と１２４ｂｐ重複しており、さらに１５３ｂｐの追加配列を含んでいたが、停止コドンは検出されず、このことは、本発明者らがこの遺伝子の５’側末端をまだ得ていなかったことを示している。従って、マンソン住血吸虫蠕虫の成虫から単離したＲＮＡから調製したｃＤＮＡを用いて、古典的な５”ＲＡＣＥ（ＰＮＡＳ ｖｏｌ ８５ ｐｐ ８９９８−９００２， Ｄｅｃ． １９９８）を行った（ＲＮＡはＰ．Ｌｏ Ｖｅｒｄｅ博士（ＳＵＮＹ Ｂｕｆｆａｌｏ）により提供された）。１０ｘＴａｑ緩衝剤、ｄＮＴＰ、ｃＤＮＡ及びＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＴａｑをｄＴ−ＡＰプライマーと合わせ（詳細についてはｒｅｆ．を参照されたい）、以下のサイクルを行った：９５℃にて５分間の後、５０℃にて２分間及び７２℃にて４０分間。この４０分間のインキュベーションの後、５’側の外側ＳＭ３８プライマー（上記を参照されたい）及びＡＰプライマーを加え、以下の条件下において３５サイクルを繰り返した：９５℃にて１５秒間、４７℃にて３０秒間、７２℃にて２分間の後、７２℃にて５分間伸長。これらの反応物を１．５％アガロースゲル上で泳動させ、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｋｉｔを用いて３００ｂｐバンドを単離した。ＡＰ及び５’外側ＳＭ３８プライマーを用いて５’ＲＡＣＥ生成物を直接配列決定した。その配列の中で２つの潜在的な開始メチオニンが同定され、これらのメチオニン残基の１３〜１９アミノ酸上流に２つの停止コドンが見つかった。続いてＲＡＣＥ生成物をクローニングした。ＳＭ３８配列を含む全ての３つのクローン（ＰＣＲにより作製した２つのクローン及びマンソン住血吸虫ｃＤＮＡライブラリーから得た１つのクローン）は隙間なく重複していた。アセンブルしたところ、ＳＭ３８配列は、５’側非翻訳配列、２つの潜在的開始メチオニン、３０３アミノ酸タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、停止コドン、３’側非翻訳配列、及びポリアデニル化部位を含む１０４９ｂｐの配列を含んでいた。
【０１３７】
８．２． 結果
住血吸虫の筋線維においてカルシウム応答を調節する薬物は、有効な抗蠕虫試薬であると思われるので（Ｋｏｈｎら， ２００１， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６：３６８７３−３６８７６）、本発明者等は、住血吸虫の特定のカルシウム調節標的の同定に着手した。最近になって、住血吸虫がその筋線維の中でリアノジン受容体（ＲｙＲ）を発現することが分かった（Ｄａｙら， ２０００， Ｐａｒａｓｉｔｏｌ． １２０：４１７−４２０；Ｓｉｌｖａら， １９９８， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５６：９９７−１００３）。脊椎動物の平滑筋及び骨格筋において発現されるＲｙＲのアゴニストは、細胞内カルシウム放出、電圧依存性カルシウム流入及び筋収縮性を調節することが知られている。興味深いことに、カフェイン等のＲｙＲアゴニストでマンソン住血吸虫筋線維を処理したところ、細胞内カルシウムの放出を誘導し、筋線維の収縮を誘導した。カフェイン等の薬物はＲｙＲ依存性カルシウム応答を調節することができるが、（少なくとも脊椎動物の筋線維において）ＲｙＲの生理的調節因子（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）は、サイクリックＡＤＰ−リボース（ｃＡＤＰＲ）である。ｃＡＤＰＲは、哺乳動物ＣＤ３８タンパク質等のＡＤＰ−リボシルシクラーゼ酵素及び無脊椎動物アメフラシシクラーゼ酵素によって生成される公知のカルシウムを動員する代謝産物である。住血吸虫がカルシウムを動員する２次メッセンジャーであるｃＡＤＰＲを生成することができる酵素を発現するか否かを決定するために、翻訳されたときに哺乳動物ＣＤ３８及びアメフラシ酵素と相同性を有する住血吸虫配列を求めて、一般利用可能なＥＳＴ配列の検索を行った。隙間なく重複する配列へとアセンブルすることができる３つのＥＳＴ配列（ＥＳＴ ＡＩ０６７０４７、ＥＳＴ ＡＷ０１７２２９及びＥＳＴ Ｎ２０７５６）を同定した（図１３）。このアセンブルされた配列は、ＣＤ３８及びアメフラシシクラーゼ酵素の両方と、限定的ではあるが有意な相同性を共有していた。
【０１３８】
アセンブルされたＥＳＴが事実上、原物に忠実なｃＤＮＡ（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ ｃＤＮＡ）を表すか否かを決定するために、ＥＳＴ ＡＷ０１７２２９の配列からプライマーを調製し、マンソン住血吸虫ｃＤＮＡライブラリーに対してＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応物から３３０塩基対のフラグメントを単離し、配列決定した。予想通り、このフラグメントの配列はＥＳＴの配列と一致した。次にこのフラグメントをプローブとして用い、マンソン住血吸虫ｃＤＮＡライブラリーから２５０，０００個のプラークをスクリーニングした。ＥＳＴプローブにハイブリダイズした５つの独立したプラークを単離し、プラークを精製し、両方のＤＮＡ鎖の配列決定を行った。次に、この配列の情報を用いてさらなるプライマーを設計し、該ｃＤＮＡの５’側末端を単離した（「方法」を参照されたい）。次に、マンソン住血吸虫ライブラリーから単離した完全なｃＤＮＡ配列をアセンブルして、ＥＳＴと比較した。図１３に示すアラインメントは、ＥＳＴ配列の隙間のないアセンブリが正しいこと、及びクローニングされたｃＤＮＡ（ＳＭ３８とも呼ばれる）が、どのＥＳＴにも見られない少なくとも４２１塩基対の更なる配列を含んでいたことを示す。このＤＮＡ配列が翻訳されると、シクラーゼ酵素に典型的な構造モチーフを含む２９９アミノ酸配列が生成する（図１４）（Ｐｒａｓａｄ， ＧＳ， １９９６ Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ． ｂｉｏｌ． ３：９５７−９６４）。特に、ＳＭ３８タンパク質は、アメフラシシクラーゼ酵素（Ｍｕｎｓｈｉ Ｃら， １９９９， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：３０７７０−３０７７７）及び哺乳動物ＣＤ３８（Ｍｕｎｓｈｉ Ｃら， ２０００， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：２１５６６−２１５７１；Ｇｒａｅｆｆ Ｒ． ２００１， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６：１２１６９−１２１７３）に見られる重要な触媒部位及び活性部位の残基とアラインメントされる、保存されたアミノ酸残基を含む（図１５Ａ〜Ｂ）。さらに、シクラーゼ酵素の３次構造のアセンブリにとって重要なシステイン残基（Ｐｒａｓａｄ ＧＳら， １９９６， Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ． ｂｉｏｌ． ３：９５７−９６４）もまたＳＭ３８において保存されている（図１５Ａ〜Ｂ）。重要なことに、ＳＭ３８ ｃＤＮＡ配列は完全なシクラーゼ酵素ドメインをコードする（図１６）。
【０１３９】
これらの結果に基づいて、本発明者等は、マンソン住血吸虫等の住血吸虫が、カルシウム動員の２次メッセンジャーであるｃＡＤＰＲの産生を触媒することができる酵素に、構造レベルで高い相同性を有するタンパク質（ＳＭ３８）をコードすることを証明した。また住血吸虫は、ｃＡＤＰＲに反応して細胞内カルシウムを放出するＲｙＲも発現するので、ＳＭ３８は住血吸虫においてカルシウム応答を調節することができると推測される。さらに、特に住血吸虫の筋線維におけるカルシウム流入の調節は、蠕虫の麻痺及び浄化をもたらすことができるので、本発明者等は、住血吸虫においてＳＭ３８及びＲｙＲ経路のアゴニスト／アンタゴニストが抗蠕虫薬として有効であると予想している。
【０１４０】
本発明は、本明細書中に記載された特定の実施形態によってその範囲を限定されるものではなく、これらの実施形態は、本発明の個々の態様の一例として記載されるのであって、機能的に同等な方法及び構成要素は、本発明の範囲内に含まれる。実際に、本明細書中に示され記載されたもの以外にも、前述の説明及び添付の図面から、当業者には、本発明の様々な変更が自明となろう。このような変更は特許請求の範囲内に含まれるものとする。様々な出版物が本明細書中に引用されているが、これらの内容は本明細書中に参考として全て組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、化学誘引物質のシグナル伝達に対する正常な細胞応答を示す。（１）化学誘引物質が受容体に結合してシグナル伝達を開始する。（２）ＣＤ３８がＮＡＤを加水分解してｃＡＤＰＲを生じ、ｃＡＤＰＲはＣａ２＋の内部貯蔵からの放出を促進する。（３）ｃＡＤＰＲにより制御される内部貯蔵からＣａ２＋が放出され、これにより外部のＣａ２＋チャンネルを活性化する。（４）細胞外Ｃａ２＋が細胞内に流れ込み、遊走を可能にする。
【図２】
図２は、ＣＤ３８によるｃＡＤＰＲ産生の阻害物質は、容量性Ｃａ２＋流入及び化学誘引物質誘導型遊走を妨げることについて示す（スクリーニングはこのような化合物を同定する）。（１）化学誘引物質が受容体に結合してシグナル伝達を開始する。（２）ＣＤ３８の阻害物質が、ＮＡＤの加水分解を妨げる（酵素は不活性であり生成物は作られない）、又はｃＡＤＰＲの生成を特異的に阻害する（ＡＤＰ−リボシルシクラーゼ活性を遮断するが酵素は不活性でない場合がある）。（３）ｃＡＤＰＲの欠乏により、内部貯蔵からのｃＡＤＰＲを媒介としたＣａ２＋放出が起こらない。（４）容量性Ｃａ２＋流入及び遊走は起こらない。
【図３】
図３は、ＣＤ３８酵素活性を調節するタンパク質について示す（スクリーニングはこれらのタンパク質を活性化もしくは不活化する化合物を同定する）。（１）化学誘引物質が受容体に結合してシグナル伝達を開始する。（２）タンパク質ＸがＣＤ３８を修飾してＣＤ３８酵素活性を不活化する。（３）ｃＡＤＰＲの欠乏により、内部貯蔵からのｃＡＤＰＲを媒介としたＣａ２＋放出が起こらない。（４）容量性Ｃａ２＋流入及び遊走は起こらない。
【図４】
図４は、ＣＤ３８発現を調節するタンパク質について示す（スクリーニングはこれらのタンパク質を活性化もしくは不活化する化合物を同定する）。（１）化学誘引物質が受容体に結合してシグナル伝達を開始する。（２）タンパク質ＸがＣＤ３８遺伝子の転写を抑制する。（３）ＣＤ３８の欠乏によりｃＡＤＰＲがなくなるため、内部貯蔵からのｃＡＤＰＲを媒介としたＣａ２＋放出が起こらない。（４）容量性Ｃａ２＋流入及び遊走は起こらない。
【図５】
図５は、ＣＤ３８の代わりとなる基質は、ｃＡＤＰＲの阻害物質を生成して容量性Ｃａ２＋放出を妨げ得ることについて示す（スクリーニングはこのような化合物を同定する）。（１）化学誘引物質が受容体に結合してシグナル伝達を開始する。（２）ＣＤ３８が改変された基質（例えば８−ＢｒＮＡＤ）を加水分解し、改変型生成物（例えば８−Ｂｒ−ｃＡＤＰＲ）を生成する。（３）改変型生成物が、内部貯蔵からのｃＡＤＰＲ誘導型Ｃａ２＋放出を競合的もしくは非競合的に阻害する。（４）容量性Ｃａ２＋流入及び遊走は起こらない。
【図６】
図６は、ｃＡＤＰＲ結合の阻害物質は容量性Ｃａ２＋流入を遮断することを示す。（１）化学誘引物質が受容体に結合してシグナル伝達を開始する（スクリーニングはこのような化合物を同定する）。（２）ＣＤ３８がＮＡＤを加水分解してｃＡＤＰＲを生成する。（３）ｃＡＤＰＲの阻害物質（８−Ｂｒ ｃＡＤＰＲ）は、内部貯蔵からのｃＡＤＰＲ誘導型Ｃａ２＋放出を競合的もしくは非競合的に遮断する。（４）容量性Ｃａ２＋流入及び遊走は起こらない。
【図７】
図７は、ＣＤ３８ＫＯマウスは、肺炎連鎖球菌感染にかかりやすいことを示す。（ａ）Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴマウス（白い円）及びＣＤ３８ＫＯマウス（黒い円）に肺炎連鎖球菌を２回気管内投与して感染させた。その後４日間、感染マウスの生存率をモニターした。（ｂ）放射線照射し、ＷＴ骨髄（白い四角形）又はＣＤ３８ＫＯ骨髄（黒い四角形）で再構成したＷＴマウスに肺炎連鎖球菌を２回投与して感染させ、４日間モニターした。データは、少なくとも５回の独立した実験を行った結果を表す。ｎ＝１０マウス／グループ。（ｃ）ＷＴ又はＲａｇ−２ＫＯマウス（白いバー）及びＣＤ３８ＫＯ又はＣＤ３８−ＲＡＧ−２二重ＫＯマウス（黒いバー）に肺炎連鎖球菌を気管内投与して感染させ、感染の１２時間後に、肺及び末梢血中の細菌力価を測定した。データは３回の独立した実験を行った結果を表す。ｎ＝１０マウス／グループ。＊Ｐ＜０．００１；スチューデントｔ検定。
【図８】
図８は、ＣＤ３８ＫＯ好中球は感染部位に集合せず、細菌由来化学誘引物質に向かって遊走することができないことを示す。（ａ）ＷＴマウス及びＣＤ３８ＫＯマウスに肺炎連鎖球菌を気管内投与して感染させ、感染後の複数の経過時間ポイントにおいて、気道の中の浸潤細胞を回収してカウントした（パネルａ、ＷＴ＝白いバー及びＣＤ３８ＫＯ＝黒いバー）。（ｂ）感染したＷＴマウス及びＣＤ３８ＫＯマウスの肺の中の浸潤細胞の正体及び頻度を、顕微鏡検査（倍率×４００）及びＤｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ染色した細胞遠心分離調製物のカウントによって決定した。（ｃ）ＷＴマウス（白いバー）及びＣＤ３８ＫＯマウス（黒いバー）の肺洗浄における分画した細胞の数を、細胞の平均数×１０６＋（ＳＥ）として表す。５回の独立した実験において同様の結果が得られた。ｎ＝５マウス／グループ／経過時間ポイント。＊Ｐ＜０．０１ ＊＊Ｐ＝０．０１；スチューデントｔ検定。（ｄ）従来のトランスウェルチェッカーボードケモキネシス／走化性アッセイにおいて、ＷＴマウス（白いバー）及びＣＤ３８ＫＯマウス（黒いバー）から精製した骨髄好中球の、培地ｆＭＬＰ又はＩＬ−８に反応して遊走する能力についてテストした。何の刺激も与えない時に、トランスウェルの下側のチャンバーに移動する細胞の数は、ＣＤ３８ＫＯ好中球とＷＴ好中球とでは大きな差はなく、１５００〜２３００細胞であった（図示せず）。同等の濃度の刺激に反応して両方のチャンバーに移動する（ケモキネシス）好中球の数及び走化性勾配（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｇｒａｄｉｅｎｔ）に反応して遊走する好中球の数（走化性）を表す。図示した値は、４回の異なる実験の平均＋Ｓ．Ｅ．である。＊Ｐ＜０．００１；スチューデントｔ検定。
【図９】
図９は、好中球を発現するＣＤ３８はｃＡＤＰＲを産生し、ｃＡＤＰＲ及びリアノジンに反応して細胞内カルシウムを放出することを示す。（ａ）ＷＴマウス及びＣＤ３８ＫＯマウス、又は１２時間前にチオグリコール酸塩を腹腔内注射しておいたＷＴマウス及びＣ３８ＫＯマウスから、骨髄細胞、末梢血細胞及び腹膜腔細胞を単離した。Ｍａｃ−１ｈｉＧＲ−１ｈｉ好中球上でのＣＤ３８発現をフローサイトメトリーにより分析した。ＷＴ好中球上（実線ヒストグラム）及びＣＤ３８ＫＯ好中球上（破線ヒストグラム）でのＣＤ３８の発現を表す。（ｂ）ＣＤ１５＋ヒト末梢血好中球を、抗−ＣＤ３８ｍＡｂ（黒く塗りつぶしたヒストグラム）又はアイソタイプの対照Ａｂ（破線）で染色することにより、ＣＤ３８発現について評価した。（ｃ）ＷＴ及びＣＤ３８ＫＯの骨髄好中球におけるシクラーゼ活性を測定した。ＷＴもしくはＣＤ３８ＫＯの好中球を単独で（ＷＴ＝円及びＣＤ３８ＫＯ＝四角形）又はＮＧＤの存在下で（ＷＴ＝三角形及びＣＤ３８ＫＯ＝ダイヤモンド形）１０分間インキュベートした。蛍光分析により生成物ｃＧＤＰＲの蓄積を測定した。（ｄ）ＲＴ−ＰＣＲによりＲｙＲ３ ｍＲＮＡ発現レベルを測定した。精製したＷＴ骨髄好中球（ＰＭＮ）又は脳組織からｃＤＮＡを単離した。ｃＤＮＡの投入量が示されている。（ｅ〜ｇ）Ｆｌｕｏ−３／Ｆｕｒａ Ｒｅｄを負荷した骨髄好中球においてＦＡＣＳにより細胞内遊離カルシウムレベルを測定した。（ｅ）好中球をジギトニンで透過性とした後、ルテニウムレッドの存在下（オレンジのライン）又は不在下（ブルーのライン）においてリアノジンで刺激した。（ｆ）好中球をジギトニン中で透過性とした後、ｃＡＤＰＲ（ブルーのライン）、熱不活化ｃＡＤＰＲ（緑色のライン）又は８−Ｂｒ−ｃＡＤＰＲ＋ｃＡＤＰＲ（赤いライン）で刺激した。（ｇ）好中球をタプシガーギン（ブルーのライン）又はタプシガーギン＋８−Ｂｒ−ｃＡＤＰＲ（赤のライン）で刺激した。パネルｅ〜ｇの中の全てのデータは、少なくとも３回の独立した実験を行った結果を表す。
【図１０】
図１０は、ＣＤ３８の触媒作用により生成したｃＡＤＰＲは、好中球における細胞内カルシウム放出、細胞外カルシウムの流入及び走化性を調節することを示す。（ａ〜ｃ）Ｆｌｕｏ−３／Ｆｕｒａ Ｒｅｄを負荷した骨髄好中球においてＦＡＣＳにより細胞内遊離カルシウムレベルを測定した。（ａ）ＣＤ３８ＫＯ（赤いライン）及びＷＴ（ブルーのライン）の好中球を、カルシウムを含まない緩衝液の中でｆＭＬＰ又はＩＬ−８で刺激した。（ｂ）ＣＤ３８ＫＯ（赤いライン）及びＷＴ（ブルーのライン）の好中球を、カルシウム含有緩衝液の中でｆＭＬＰ又はＩＬ−８で刺激した。（ｃ）ＣＤ３８ＫＯ（赤いライン）及びＷＴ（ブルーのライン）の好中球を、カルシウム含有培地＋８−Ｂｒ−ｃＡＤＰＲの中で予めインキュベートした後、ｆＭＬＰ又はＩＬ−８で刺激した。パネルａ〜ｃの中の全てのデータは、少なくとも５回の独立した実験を行った結果を表す。（ｄ）ＷＴ好中球を培地ＥＧＴＡ又は８−Ｂｒ−ｃＡＤＰＲと一緒に予めインキュベートした後、下側チャンバーの中にｆＭＬＰ又はＩＬ−８を含むトランスウェルの上側チャンバーの中に入れた。走化性勾配に反応して下側のチャンバーに移動した細胞を回収し、フローサイトメトリーにより数えた。図示した値は、各実験条件当たり３ウェルを用いて３回の別々の実験から得た平均＋Ｓ．Ｅ．である。＊＊Ｐ＝０．００８；Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ検定。
【図１１】
図１１は、ＮＡＤ＋類似体は、ｆＭＬＰで活性化した好中球においてカルシウムの流入及び走化性を調節することを示す。（ａ）染料を負荷したＷＴマウス由来精製骨髄好中球を、培地（ブルーのライン）又は濃度の異なるＮ（８−Ｂｒ−Ａ）Ｄ＋（赤いライン）の中で予めインキュベートした後、ｆＭＬＰで刺激した。フローサイトメトリーにより細胞内カルシウムレベルの変化を測定した。データは、３回の独立した実験を行った結果を表す。（ｂ〜ｃ）ＷＴ好中球（左側のパネル）及びＣＤ３８ＫＯ好中球（右側のパネル）を、培地（黒いバー）又はＮ（８−Ｂｒ−Ａ）Ｄ＋（白いバー）と一緒に予めインキュベートした後、下側チャンバーの中にｆＭＬＰ（パネルｂ）又はＩＬ−８（パネルｃ）を含むトランスウェルの上側チャンバーの中に入れた。走化性勾配に反応して下側チャンバーに移動した細胞を回収し、フローサイトメトリーにより数えた。図示した数値は、３ウェル／実験条件を用いて３回の別々の実験から得た平均＋Ｓ．Ｅ．である。＊Ｐ＜０．００１スチューデントｔ検定。
【図１２】
図１２Ａ及び図１２Ｂは、アレルギー性喘息のモデルにおける好中球及び好酸球の肺への集合は、ＣＤ３８ＫＯマウスにおいて損なわれていることを示す。ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスから得た未感作（ｎａｉｖｅ）ＣＤ４Ｔ細胞又はＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスから得たＯＶＡで初回免疫刺激を行ったＣＤ４ Ｔ細胞を、示されているようにＷＴ Ｃ５７／ＢＬマウス又はＣＤ３８ＫＯ−Ｃ５７ＢＬ／６マウスに移植した。次に受容マウスを連続７日間、ＯＶＡ（１０μｇ）のＰＢＳ溶液の気管内点滴注入によりチャレンジした。一回目のチャレンジを行った後８日目に、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ染色した細胞遠心分離調製物の顕微鏡検査（倍率４００×）により、肺洗浄における好中球（Ａ）及び好酸球（Ｂ）を数えた。
【図１３】
図１３は、マンソン住血吸虫ＳＭ３８ ｃＤＮＡとマンソン住血吸虫ＥＳＴとの比較結果を示す。「方法」に記載されるように、マンソン住血吸虫 ｃＤＮＡライブラリーからＳＭ３８ ｃＤＮＡを単離し、クローニングした。ＳＭ３８のｃＤＮＡは、５’側非翻訳配列（グレーのボックス）、開始メチオニン（下線部）、３０３アミノ酸タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（白いボックス）、停止コドン（下線部）、３’側非翻訳配列（グレーのボックス）、及びポリアデニル化部位（下線部）を含む。完全長ｃＤＮＡを、公表されているマンソン住血吸虫ＥＳＴ配列と比較したところ、ＳＭ３８配列の一部と同一である３つの別々のＥＳＴ配列が見つかった。ＳＭ３８ ｃＤＮＡは、一般データベースには見られない４２１塩基対のユニークな配列（７０ｂｐの５’側非翻訳配列及び３５１ｂｐのオープンリーディングフレーム）を含む。
【図１４】
図１４は、ＳＭ３８ ｃＤＮＡの翻訳産物を示す。ＳＭ３８ ｃＤＮＡは全てのリーディングフレームにおいて翻訳され、３０３個のアミノ酸からなるオープンリーディングフレームが同定された。開始コドンは７１位〜７３位のヌクレオチドに位置し、停止コドンは９８０〜９８３位のヌクレオチドに見られる。
【図１５】
図１５は、ＳＭ３８はアメフラシＡＤＰ−リボシルシクラーゼ及びヒトＣＤ３８シクラーゼと相同であることを示す。ＳＭ３８のタンパク質配列を、アメフラシＡＤＰ−リボシルシクラーゼ（パートａ）及びヒトＡＤＰ−リボシルシクラーゼＣＤ３８（パートｂ）のタンパク質配列とアラインメントした。アメフラシタンパク質とＳＭ３８との間には２１％の同一性、及びヒトＣＤ３８とＳＭ３８との間には２３％の同一性という、高い相同性（ボックスで囲まれた残基）が観察された。シクラーゼタンパク質ファミリーの全てのメンバーの中に存在する保存された１０個のシステイン残基も、ＳＭ３８中に存在する（影付きのボックス）。ＳＭ３８ではまた、ＣＤ３８の中に見られる２個の更なるシステイン（下線部）（アメフラシには見られない）が欠失している。しかし、ＳＭ３８タンパク質は、ＣＤ３８にもアメフラシシクラーゼにも見られないユニークな２個の更なるシステイン残基を含む（下線部）。最も重要なことに、ＣＤ３８及びアメフラシ酵素について同定された活性部位触媒残基（星印がついた残基）も、ＳＭ３８の中に存在する。
【図１６】
図１６は、ＳＭ３８は可溶性タンパク質であることを示す。ＳＭ３８タンパク質が、ＣＤ３８のようなＩＩ型膜結合タンパク質であるか、アメフラシシクラーゼのような可溶性タンパク質であるか、他のシクラーゼファミリータンパク質のようなＧＰＩ結合型タンパク質（ＧＰＩ−ｌｉｎｋｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）であるか、又は分泌タンパク質であるかを決定するために、ＳＭ３８のタンパク質配列を調べた。保存された酵素ドメイン（図１５を参照されたい）には影をつけてある。ＳＭ３８は、該酵素ドメインの５’側にたった２２個のアミノ酸しか含まない。これらの２２個のアミノ酸は疎水性ではないので、該酵素ドメインの５’側にはリーダー配列を同定することができなかった。このことは、ＳＭ３８が分泌タンパク質やＧＰＩ結合型タンパク質ではないことを示している。さらに、５’側膜貫通ドメインは同定されなかった。このことは、ＳＭ３８がＩＩ型膜タンパク質ではないことを示している。従って、ＳＭ３８はアメフラシシクラーゼのような可溶性細胞質タンパク質である可能性が最も高い。
【図１７】
図１７は、ＳＭ３８の逆翻訳産物を示す。ＳＭ３８タンパク質をコードする縮重ＤＮＡ配列を同定するために、ＳＭ３８の３０３アミノ酸コード領域を逆翻訳した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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