(57)【要約】癌、例えば前立腺癌の治療及び診断のための組成物及び方法について開示する。組成物は、１以上の前立腺特異的タンパク質、その免疫原性部分、又はそのような部分をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。あるいは、治療用組成物は、前立腺特異的タンパク質を発現する抗原提示細胞、又はこのようなタンパク質を発現する細胞に特異的なＴ細胞を含むことができる。このような組成物は、例えば、前立腺癌の如き疾患の予防及び治療のために、使用されることができる。サンプル中の、前立腺腫瘍タンパク質、又はこのようなタンパク質をコードするｍＲＮＡの検出に基づく診断方法も提供される。
2004537252.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺特異的蛋白質、またはその変異体の少なくとも免疫原性部分含む単離ポリペプチドであって、該蛋白質が以下から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、前記ポリペプチド：
（ａ）配列番号２、３、８−２９、４１−４５、４７−５２、５４−６５、７０、７３−７４、７９、８１、８７、９０、９２、９３、９７、１０３、１０４、１０７、１０９−１１１、１１５−１６０、１７１、１７３−１７５、１７７、１８１、１８８、１９１、１９３、１９４、１９８、２０３、２０４、２０７、２０９、２２０、２２２−２２５、２２７−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３５０−３６５、３８１、３８２、３８４、３８６、３８９、３９０、３９２、３９３、３９６、４０１、４０２、４０７、４０８、４１０、４１３、４１５−４１９、４２２、４２６、４２７、４３２、４３４、４３５、４４２−４４４、４４６、４５０、４５２、４５３、４５９−４６１、４６８−４７１又は、４７２−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、及び５３６のいずれか１の中に記載された配列；
（ｂ）中程度のストリンジェント条件下前記配列のいずれかとハイブリダイズする配列；及び
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の配列のいずれかの相補体。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、配列番号２、３、８−２９、４１−４５、４７−５２、５４−６５、７０、７３−７４、７９、８１、８７、９０、９２、９３、９７、１０３、１０４、１０７、１０９−１１１、１１５−１６０、１７１、１７３−１７５、１７７、１８１、１８８、１９１、１９３、１９４、１９８、２０３、２０４、２０７、２０９、２２０、２２２−２２５、２２７−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３５０−３６５、３８１、３８２、３８４、３８６、３８９、３９０、３９２、３９３、３９６、４０１、４０２、４０７、４０８、４１０、４１３、４１５−４１９、４２２、４２６、４２７、４３２、４３４、４３５、４４２−４４４、４４６、４５０、４５２、４５３、４５９−４６１、４６８−４７１、４７２−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、及び５３６のいずれか１の中に記載されたポリヌクレオチド配列、又は前記ポリヌクレオチド配列のいずれかの相補体によりコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１による単離ポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１０８、１１２、１１３、１１４、１７２、１７６、１７８、３２７、３２９、３３１、３３９、３８３、４７７−４８３、４９６、５０４、５０５、５１９、５２０、５２２、５２５、５２７、５３２、５３４、及び５３７−５５０のいずれか１に記載された配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項４】
前立腺特異的蛋白質、又は抗原特異的抗血清と反応する変異体の能力が本質的に低下しないような１以上の置換、欠失、付加及び／又は挿入に於いて異なるその変異体の、少なくとも１５アミノ酸残基をコードする単離ポリヌクレオチドであって、該蛋白質が配列番号２、３、８−２９、４１−４５、４７−５２、５４−６５、７０、７３−７４、７９、８１、８７、９０、９２、９３、９７、１０３、１０４、１０７、１０９−１１１、１１５−１６０、１７１、１７３−１７５、１７７、１８１、１８８、１９１、１９３、１９４、１９８、２０３、２０４、２０７、２０９、２２０、２２２−２２５、２２７−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３５０−３６５、３８１、３８２、３８４、３８６、３８９、３９０、３９２、３９３、３９６、４０１、４０２、４０７、４０８、４１０、４１３、４１５−４１９、４２２、４２６、４２７、４３２、４３４、４３５、４４２−４４４、４４６、４５０、４５２、４５３、４５９−４６１、４６８−４７１、４７２−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、及び５３６のいずれか１の中に記載された配列、又は前記配列のいずれかの相補体に列挙された配列を含むポリヌクレオチドによりコードされたアミノ酸配列を含む、前記ポリヌクレオチド。
【請求項５】
前立腺特異的蛋白質、又はその変異体をコードする単離ポリヌクレオチドであって、該蛋白質が配列番号２、３、８−２９、４１−４５、４７−５２、５４−６５、７０、７３−７４、７９、８１、８７、９０、９２、９３、９７、１０３、１０４、１０７、１０９−１１１、１１５−１６０、１７１、１７３−１７５、１７７、１８１、１８８、１９１、１９３、１９４、１９８、２０３、２０４、２０７、２０９、２２０、２２２−２２５、２２７−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３５０−３６５、３８１、３８２、３８４、３８６、３８９、３９０、３９２、３９３、３９６、４０１、４０２、４０７、４０８、４１０、４１３、４１５−４１９、４２２、４２６、４２７、４３２、４３４、４３５、４４２−４４４、４４６、４５０、４５２、４５３、４５９−４６１、４６８−４７１、４７２−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、及び５３６のいずれか１つ、又は前記配列のいずれかの相補体中に記載された配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含む、前記ポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号２、３、８−２９、４１−４５、４７−５２、５４−６５、７０、７３−７４、７９、８１、８７、９０、９２、９３、９７、１０３、１０４、１０７、１０９−１１１、１１５−１６０、１７１、１７３−１７５、１７７、１８１、１８８、１９１、１９３、１９４、１９８、２０３、２０４、２０７、２０９、２２０、２２２−２２５、２２７−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３５０−３６５、３８１、３８２、３８４、３８６、３８９、３９０、３９２、３９３、３９６、４０１、４０２、４０７、４０８、４１０、４１３、４１５−４１９、４２２、４２６、４２７、４３２、４３４、４３５、４４２−４４４、４４６、４５０、４５２、４５３、４５９−４６１、４６８−４７１、４７２−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、及び５３６のいずれか１の中に記載された配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項７】
中程度のストリンジェント条件下、配列番号２、３、８−２９、４１−４５、４７−５２、５４−６５、７０、７３−７４、７９、８１、８７、９０、９２、９３、９７、１０３、１０４、１０７、１０９−１１１、１１５−１６０、１７１、１７３−１７５、１７７、１８１、１８８、１９１、１９３、１９４、１９８、２０３、２０４、２０７、２０９、２２０、２２２−２２５、２２７−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３５０−３６５、３８１、３８２、３８４、３８６、３８９、３９０、３９２、３９３、３９６、４０１、４０２、４０７、４０８、４１０、４１３、４１５−４１９、４２２、４２６、４２７、４３２、４３４、４３５、４４２−４４４、４４６、４５０、４５２、４５３、４５９−４６１、４６８−４７１、４７２−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、及び５３６のいずれか１の中に記載された配列にハイブリダイズする配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか１に記載のポリヌクレオチドに相補的である単離ポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項４〜８のいずれか１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の発現ベクターにより形質転換又はトランスフェクションされた宿主細胞。
【請求項１１】
配列番号２、３、８−２９、４１−４５、４７−５２、５４−６５、７０、７３−７４、７９、８１、８７、９０、９２、９３、９７、１０３、１０４、１０７、１０９−１１１、１１５−１６０、１７１、１７３−１７５、１７７、１８１、１８８、１９１、１９３、１９４、１９８、２０３、２０４、２０７、２０９、２２０、２２２−２２５、２２７−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３５０−３６５、３８１、３８２、３８４、３８６、３８９、３９０、３９２、３９３、３９６、４０１、４０２、４０７、４０８、４１０、４１３、４１５−４１９、４２２、４２６、４２７、４３２、４３４、４３５、４４２−４４４、４４６、４５０、４５２、４５３、４５９−４６１、４６８−４７１、４７２−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、及び５３６のいずれか１の中に記載されたポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチド配列のいずれかの相補体によりコードされたアミノ酸配列を含む前立腺特異的蛋白質と特異的に結合する単離抗体、又はその抗原結合断片。
【請求項１２】
配列番号４９６、５０４、５０５、５０９−５１７、５１９、５２０、５２２、及び５３９−５５１から成る群から選ばれるアミノ酸に特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項１３】
配列番号５０２、５０３、及び５０６−５０８から成る群から選ばれる相補性決定領域を含むモノクローナル抗体。
【請求項１４】
請求項１に記載の少なくとも１のポリペプチドを含む融合蛋白質。
【請求項１５】
前記融合蛋白質が、その融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドによりトランスフェクトされた宿主細胞内においてその融合蛋白質の発現を増大させる発現エンハンサーを含む、請求項１４に記載の融合蛋白質。
【請求項１６】
前記融合蛋白質が請求項１に記載のポリペプチド内に存在しないＴヘルパー・エピトープを含む、請求項１４に記載の融合蛋白質。
【請求項１７】
前記融合蛋白質がアフィニティー・タグを含む、請求項１４に記載の融合蛋白質。
【請求項１８】
請求項１４に記載の融合蛋白質をコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１９】
生理学的に許容される担体とともに、以下の：
（ａ）請求項１に記載のポリペプチド；
（ｂ）請求項４に記載のポリヌクレオチド；
（ｃ）請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の抗体；
（ｄ）請求項１４に記載の融合タンパク質；及び
（ｅ）請求項１８に記載のポリヌクレオチド；
から成る群から選ばれる少なくとも１の成分を含む医薬組成物。
【請求項２０】
免疫刺激剤と、以下の：
（ａ）請求項１に記載のポリペプチド；
（ｂ）請求項４に記載のポリヌクレオチド；
（ｃ）請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の抗体；
（ｄ）請求項１４に記載の融合タンパク質；及び
（ｅ）請求項１８に記載のポリヌクレオチド
から成る群から選ばれる少なくとも１の成分を含むワクチン。
【請求項２１】
前記免疫刺激剤がアジュバントである、請求項２０に記載のワクチン。
【請求項２２】
前記免疫刺激剤が主にＩ型反応を誘導する、請求項２０に記載のワクチン。
【請求項２３】
患者に請求項１９に記載の医薬品組成物の有効量を投与することを含む、患者に於ける癌発達を阻害する方法。
【請求項２４】
患者に請求項２０に記載のワクチンの有効量を投与することを含む、患者に於ける癌発達を阻害する方法。
【請求項２５】
医薬許容される担体又は賦形剤とともに、請求項１に記載のポリペプチドを発現する抗原提示細胞を含む医薬組成物。
【請求項２６】
前記抗原提示細胞が樹状細胞又はマクロファージである、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
免疫刺激剤とともに、請求項１に記載のポリペプチドを発現する抗原提示細胞を含むワクチン。
【請求項２８】
前記免疫刺激剤がアジュバントである、請求項２７に記載のワクチン。
【請求項２９】
前記免疫刺激剤が主にＩ型反応を誘導する、請求項２７に記載のワクチン。
【請求項３０】
前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項２７に記載のワクチン。
【請求項３１】
患者に配列番号１−１１１、１１５−１７１、１７３−１７５、１７７、１７９−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２−３３５、３４０−３７５、３８１、３８２、及び３８４−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、及び５３６のいずれか１に記載されたポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドを発現する抗原提示細胞の有効量を投与し、そしてそれにより患者に於ける癌発達を阻害することを含む、患者に於ける癌発達を阻害する方法。
【請求項３２】
前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記癌が前立腺癌である、請求項２３、２４、及び３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
生物学的サンプルを前立腺特異的蛋白質と特異的に反応するＴ細胞と接触させることを含む、生物学的サンプルから腫瘍細胞を除くための方法であって、該蛋白質が以下の群から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み：
（ｉ）  配列番号１−１１１、１１５−１７１、１７３−１７５、１７７、１７９−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２−３３５、３４０−３７５、３８１、３８２、及び３８４、４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、及び５３６；及び
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドの相補体；
そして上記接触工程が上記サンプルから前記前立腺特異的蛋白質発現細胞の除去を可能にするために十分な条件下及び時間にわたり実施される前記方法。
【請求項３５】
前記生物学的サンプルが血液又はその画分である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
患者に請求項３４に記載の方法に従って処理された生物学的サンプルを投与することを含む、患者に於ける癌の発達を阻害する方法。
【請求項３７】
Ｔ細胞の刺激及び／又は増加を可能にするために十分な条件下及び時間にわたりＴ細胞を、以下の、
（ｉ）請求項１に記載のポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号１−１１１、１１５−１７１、１７３−１７５、１７７、１７９−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２−３３５、３４０−３７５、３８１、３８２、及び３８４−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、及び５３６のいずれか一に提供される配列を含むポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド；
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び／又は
（ｉｖ）（ｉ）又は（ｉｉ）のポリペプチドを発現する抗原提示細胞、から成る群から選ばれる少なくとも１の成分と接触させることを含む、前立腺腫瘍蛋白質特異的Ｔ細胞を刺激し及び／又は増加させる方法。
【請求項３８】
請求項３７の方法に従って調製されたＴ細胞を含む、単離Ｔ細胞集団。
【請求項３９】
請求項３８に記載のＴ細胞集団の有効量を患者に投与することを含む、患者に於ける癌発達を阻害する方法。
【請求項４０】
以下のステップを含む、患者に於ける癌発達を阻害する方法：
（ａ）以下の：
（ｉ）請求項１に記載のポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号１−１１１、１１５−１７１、１７３−１７５、１７７、１７９−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２−３３５、３４０−３７５、３８１、３８２、及び３８４−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、及び５３６のいずれか１の配列を含むポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド；
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；又は
（ｉｖ）（ｉ）又は（ｉｉ）のポリペプチドを発現する抗原提示細胞；
から成る群から選択される少なくとも１の成分と、患者から単離されたＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｔ細胞が増殖するように、インキュベートし；そして
（ｂ）増殖したＴ細胞の有効量を上記患者に投与し、そしてそれにより患者に於ける癌発達を阻害する。
【請求項４１】
以下のステップを含む、患者に於ける癌発達を阻害する方法：
（ａ）以下の：
（ｉ）請求項１に記載のポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号１−１１１、１１５−１７１、１７３−１７５、１７７、１７９−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２−３３５、３４０−３７５、３８１、３８２、及び３８４−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、及び５３６のいずれか１の配列を含むポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド；
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；又は
（ｉｖ）（ｉ）又は（ｉｉ）のポリペプチドを発現する抗原提示細胞；
から成る群から選択される少なくとも１の成分と、患者から単離されたＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｔ細胞が増殖するように、インキュベートし；
（ｂ）少なくとも１の増殖細胞をクローニングし；そして
（ｃ）上記のクローン化されたＴ細胞の有効量を患者に投与し、そしてそれにより上記患者に於ける癌発達を阻害する。
【請求項４２】
以下のステップを含む、患者に於ける癌の存在又は不存在を決定する方法：
（ａ）患者から得た生物学的サンプルを、以下の：
（ｉ）配列番号１−１１１、１１５−１７１、１７３−１７５、１７７、１７９−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２−３３５、３４０−３７５、３８１、３８２、及び３８４−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、及び５３６のいずれか１に記載されたポリヌクレオチド；
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドの相補体；
群から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列を含む前立腺腫瘍蛋白質に結合する結合性作用物質と接触せしめ；
（ｂ）上記サンプル中にある、上記結合作用物質と結合するポリペプチドの量を検出し；そして
（ｃ）前もって決めておいたカットオフ値とポリペプチドの量を比較しそしてそれから、患者に於ける癌の存在又は非存在を決定する。
【請求項４３】
前記結合性作用物質が抗体である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記癌が前立腺癌である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
以下の段階を含む、患者に於ける癌の進行をモニタリングする方法：
（ａ）第１時間点において患者から得た生物学的サンプルと、配列番号１−１１１、１１５−１７１、１７３−１７５、１７７、１７９−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２−３３５、３４０−３７５、３８１、３８２、及び３８４−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、及び５３６のいずれか１に記載されたポリヌクレオチド配列、又は前記ポリヌクレオチド配列の相補体によりコードされたアミノ酸配列を含む前立腺腫瘍蛋白質に結合する結合性作用物質と接触せしめ；
（ｂ）上記結合性作用物質に結合するサンプル中のポリペプチドの量を検出し；
（ｃ）その後の時間点において上記患者から得た生物学的サンプルを用いて上記ステップ（ａ）及び（ｂ）を繰り返し；そして
（ｄ）ステップ（ｃ）において検出されたポリペプチドの量と、ステップ（ｂ）において検出された量を比較し、そしてそれから患者に於ける上記癌の進行をモニタリングする。
【請求項４７】
前記結合性作用物質が抗体である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記癌が前立腺癌である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
以下のステップを含む、患者に於ける癌の存在又は非存在を決定する方法：
（ａ）患者から得た生物学的サンプルと、配列番号１−１１１、１１５−１７１、１７３−１７５、１７７、１７９−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２−３３５、３４０−３７５、３８１、３８２、及び３８４−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、及び５３６のいずれか１に記載されたポリヌクレオチド配列、又は前記ポリヌクレオチド配列の相補体によりコードされたアミノ酸配列を含む前立腺特異的蛋白質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを、接触させ；
（ｂ）上記サンプル中の、上記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を検出し；そして
（ｃ）上記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を、前もって決定されたカットオフ値と比較し、そしてそれから上記患者に於ける癌の有無を決定する。
【請求項５１】
前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量がポリメラーゼチェインリアクションを用いて決定される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量がハイブリダイゼーションアッセイを用いて決定される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
以下のステップを含む、患者の癌の進行をモニタリングする方法：
（ａ）患者から得た生物学的サンプルと、配列番号１−１１１、１１５−１７１、１７３−１７５、１７７、１７９−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２−３３５、３４０−３７５、３８１、３８２、及び３８４−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、及び５３６のいずれかに列挙されたポリヌクレオチド配列、又は前記ポリヌクレオチド配列の相補体によりコードされたアミノ酸配列を含む前立腺腫瘍蛋白質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを、接触させ；
（ｂ）上記サンプル中の、上記オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を検出し；
（ｃ）その後に時間点において上記患者から得た生物学的サンプルを用いて、上記ステップ（ａ）及び（ｂ）を繰り返し；そして
（ｄ）ステップ（ｃ）において検出されたポリヌクレオチドの量とステップ（ｂ）において検出された量とを比較し、そしてそれから上記患者の癌の進行をモニタリングする。
【請求項５４】
前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量が、ポリメラーゼチェインリアクションを用いて決定される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量がハイブリダイゼーションアッセイを用いて決定される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
以下を含む診断用キット：
（ａ）１以上の請求項１１に記載の抗体；及び
（ｂ）リポーター基を含む検出用試薬。
【請求項５７】
前記抗体が固体支持体上に固定化されている、請求項５６に記載のキット。
【請求項５８】
前記検出用試薬が抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡ又はレクチンを含む、請求項５６に記載のキット。
【請求項５９】
前記レポーター基が放射性同位体、蛍光基、化学発光基、酵素、ビオチン、及び染料粒子から成る群から選択される、請求項５６に記載のキット。
【請求項６０】
配列番号２、３、８−２９、４１−４５、４７−５２、５４−６５、７０、７３−７４、７９、８１、８７、９０、９２、９３、９７、１０３、１０４、１０７、１０９−１１１、１１５−１６０、１７１、１７３−１７５、１７７、１８１、１８８、１９１、１９３、１９４、１９８、２０３、２０４、２０７、２０９、２２０、２２２−２２５、２２７−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３５０−３６５、３８１、３８２、３８４、３８６、３８９、３９０、３９２、３９３、３９６、４０１、４０２、４０７、４０８、４１０、４１３、４１５−４１９、４２２、４２６、４２７、４３２、４３４、４３５、４４２−４４４、４４６、４５０、４５２、４５３、４５９−４６１、４６８−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、及び５３６のいずれか１の中に記載されたポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチド配列のいずれかの相補体によりコードされたアミノ酸配列を含む前立腺特異的蛋白質をコードするポリヌクレオチドに、中程度のストリンジェント条件下にハイブリダイズする１０〜４０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド。
【請求項６１】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号２、３、８−２９、４１−４５、４７−５２、５４−６５、７０、７３−７４、７９、８１、８７、９０、９２、９３、９７、１０３、１０４、１０７、１０９−１１１、１１５−１６０、１７１、１７３−１７５、１７７、１８１、１８８、１９１、１９３、１９４、１９８、２０３、２０４、２０７、２０９、２２０、２２２−２２５、２２７−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３５０−３６５、３８１、３８２、３８４、３８６、３８９、３９０、３９２、３９３、３９６、４０１、４０２、４０７、４０８、４１０、４１３、４１５−４１９、４２２、４２６、４２７、４３２、４３４、４３５、４４２−４４４、４４６、４５０、４５２、４５３、４５９−４６１、４６８−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、及び５３６のいずれか１の中に記載された１０〜４０ヌクレオチドを含む、請求項６０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６２】
以下を含む診断用キット：
（ａ）請求項６１に記載のオリゴヌクレオチド；及び
（ｂ）ポリメラーゼチェインリアクション又はハイブリダイゼーションアッセイにおける使用のための診断用試薬。
【請求項６３】
前記細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バキュロウイルス、及び哺乳動物細胞から成る群から選ばれる、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項６４】
請求項１０に記載の宿主細胞により製造される組換えタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、一般に、癌、例えば、前立腺癌の療法および診断に関する。さらに詳しくは、本発明は、前立腺特異的タンパク質の少なくとも一部分を含んでなるポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。このようなポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、前立腺癌の予防および治療、およびこのような癌の診断およびモニターのためのワクチンおよび医薬組成物において使用することができる。
発明の背景
前立腺癌は男性の間の癌の最も普通の形態であり、５０歳を超える男性において３０％の発生率である。圧倒する臨床的証拠は、ヒトの前立腺癌は骨へ転移する傾向を有し、そしてこの疾患はアンドロゲン依存症からアンドロゲン耐性状態に不可避的に進行し、患者の死亡率を増加させる。この支配的な疾患は米国における男性の間の癌の死亡の第２の主要な原因である。
【０００２】
この疾患の療法がかなり研究されているにもかかわらず、前立腺癌は治療が困難なままである。普通に、治療は外科手術および／または放射線療法に基づくが、これらの方法は症例の有意な百分率において無効である。２つの従来同定された前立腺特異的タンパク質−前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）およびプロスタチックアシッドホスファターゼ（ＰＡＰ）−は制限された療法および診断の可能性を有する。例えば、ＰＳＡレベルは常には前立腺癌の存在と十分に相関せず、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）を包含する、非前立腺癌の症例の百分率において陽性である。さらに、ＰＳＡの測定値は前立腺の体積と相関し、そして転移のレベルを示さない。
【０００３】
これらおよび他の癌についての療法がかなり研究されているにもかかわらず、前立腺癌を効果的に診断および療法することは困難である状態である。したがって、このような癌を検出し、治療する改良された方法がこの分野において必要とされている。本発明は、これらの必要性を満足し、さらに他の関係する利点を提供する。
発明の要約
簡単に述べると、本発明は、癌、例えば、前立腺癌の診断および療法の組成物および方法を提供する。１つの面において本発明は、前立腺特異的タンパク質の少なくとも一部分を含んでなるポリペプチド、またはその変異型を提供する。ある種の部分および他の変異型は、抗原特異的抗血清と反応する変異型の能力が実質的に減少しないように、免疫原性である。ある種の態様内において、ポリペプチドは前立腺特異的タンパク質の少なくとも免疫原性部分、またはその変異型を含んでなり、腫瘍タンパク質は下記の配列から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含んでなる：（ａ）配列番号１〜１１１、１１５〜１７１、１７３〜１７５、１７７、１７９〜３０５、３０７〜３１５、３２６、３２８、３３０、３３２〜３３５、３４０〜３７５、３８１、３８２、３８４−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、及び５３６の任意の１つに記載する配列；（ｂ）中程度にストリンジェントな条件下に前記配列の任意のものにハイブリダイゼーションする配列；および（ｃ）配列（ａ）または（ｂ）の任意の相補物。ある種の特定の態様において、このようなポリペプチドは、下記のいずれか１つに記載する配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を包含するタンパク質の、少なくとも一部分、またはその変異型を含んでなる：配列番号１１２〜１１４、１７２、１７６、１７８、３２７、３２９、３３１、３３６、３３９、３７６〜３８０、３８３、４７７−４８３、４９６、５０４、５０５、５１９、５２０、５２２、５２５、５２７、５３２、５３４、５３７−５５０。
【０００４】
本発明は、さらに、前述のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその一部分（例えば、前立腺特異的タンパク質の少なくとも１５アミノ酸残基をコードする部分）、このようなポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクター、およびこのような発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【０００５】
他の面の範囲内において、本発明は、前述のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物を提供する。
本発明の関係する面の範囲内において、ワクチンが提供される。このようなワクチンは、前述のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと、免疫刺激剤とを含んでなる。
【０００６】
本発明は、さらに、（ａ）前立腺特異的タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗体結合フラグメントと、（ｂ）薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物を提供する。ある態様においては、本発明は、配列番号５０２、５０３、及び５０６−５０８から成る群から選ばれる相補性決定領域を含むモノクローナル抗体とともに、配列番号４９６、５０４、５０５、５０９−５１７、５２２、及び５４１−５５０から成る群から選ばれるアミノ酸配列に特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。
さらなる局面において、（ａ）前述のポリペプチドを発現する抗原提示細胞と、（ｂ）薬学上許容される担体または賦形剤とを含んでなる医薬組成物を提供する。抗原提示細胞は、樹枝状細胞、マクロファージ、単球、繊維芽細胞およびＢ細胞を包含する。
【０００７】
関係する面の範囲内において、（ａ）前述のポリペプチドを発現する抗原提示細胞と、（ｂ）免疫刺激剤とを含んでなるワクチンが提供される。
本発明は、さらに、他の面において、少なくとも１つの前述のポリペプチドを含んでなる融合タンパク質、ならびにこのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０００８】
関係する面の範囲内において、融合タンパク質と、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、薬学上許容される担体との組合わせを含んでなる医薬組成物が提供される。
さらに、他の面の範囲内において、融合タンパク質と、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、免疫刺激剤との組合わせを含んでなるワクチンが提供される。
【０００９】
それ以上の面の範囲内において、本発明は、前述の医薬組成物またはワクチンを患者に投与することを含んでなる、患者において癌の発生を阻止する方法を提供する。
本発明は、さらに、他の面の範囲内において、前立腺特異的タンパク質と特異的に反応するＴ細胞と生物学的試料を接触させることを含んでなり、前記タンパク質を発現する細胞を前記試料から除去することを可能とする条件下にかつ十分な時間の間接触工程を実施する、生物学的試料から腫瘍細胞を除去する方法を提供する。
【００１０】
関係する面の範囲内において、前述したように処理した生物学的試料を患者に投与することを含んでなる、患者において癌の発生を阻止する方法が提供される。
さらに、他の面の範囲内において、Ｔ細胞の刺激および／または発現を可能とする条件下にかつ十分な時間の間、Ｔ細胞を下記の１またはそれ以上と接触させることを含んでなる、前立腺腫瘍タンパク質に対して特異的なＴ細胞を刺激および／または拡張する方法が提供される：（ｉ）前述のポリペプチド；（ｉｉ）このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および／または（ｉｉｉ）このようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞。
【００１１】
それ以上の面の範囲内において、本発明は、有効量の前述のＴ細胞集団を患者に投与することを含んでなる、患者において癌の発生を阻止する方法を提供する。
本発明は、下記の工程を含んでなる、患者において癌の発生を阻止する方法が提供される：（ａ）患者から単離されたＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を下記の１またはそれ以上とインキュベートする：（ｉ）前立腺腫瘍タンパク質の少なくとも免疫原性部分；（ｉｉ）このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および（ｉｉｉ）このようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞；そして（ｂ）有効量の増殖したＴ細胞を患者に投与し、これにより患者における癌の発生を阻止する。増殖した細胞は、患者への投与前に、クローニングすることができるが、これは不必要である。
【００１２】
それ以上の面の範囲内において、本発明は、下記の工程を含んでなる、患者における癌の存在または不存在を決定する提供される：（ａ）患者から得られた生物学的試料を前述のポリペプチドに結合する結合因子と接触させ：（ｂ）試料中で結合因子に結合するポリペプチドの量を検出し；そして（ｃ）前記ポリペプチドの量を前もって決定したカットオフ値と比較し、それから患者における癌の存在または非存在を決定する。好ましい態様の範囲内において、結合因子は抗体、より好ましくはモノクローナル抗体である。癌は前立腺癌であることができる。
【００１３】
本発明は、また、他の面の範囲内において、患者における癌の進行をモニターする方法を提供する。このような方法は下記の工程を含んでなる：（ａ）患者から得られた生物学的試料を第１時点において前述のポリペプチドに結合する結合因子と接触させ；（ｂ）試料中で結合因子に結合するポリペプチドの量を検出し；（ｃ）引き続く時点において患者から得られた生物学的試料を使用して工程（ａ）および（ｂ）を反復し；そして（ｄ）工程（ｃ）において検出されたポリペプチドの量を工程（ｂ）において検出された量と比較し、それから患者における癌の進行をモニターする。
【００１４】
本発明は、また、他の面の範囲内において、下記の工程を含んでなる患者における癌の存在または不存在を検出する方法が提供される：（ａ）前立腺特異的タンパク質をコードするポリヌクレオチドに対してハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドと、患者から得られた生物学的試料を接触させ；（ｂ）試料中でオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド、好ましくはｍＲＮＡのレベルを検出し；（ｃ）オリゴヌクレオチドに対してハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドのレベルを前もって決定したカットオフ値と比較し、それから患者における癌の存在または不存在を決定する。ある種の態様の範囲内において、例えば、前述のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはこのようなポリヌクレオチドの１成分に対してハイブリダイゼーションする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応を介して、ｍＲＮＡの量を検出する。他の態様の範囲内において、前述のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはこのようなポリヌクレオチドの１成分に対してハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーション技術により、ｍＲＮＡの量を検出する。
【００１５】
関係する面において、下記の工程を含んでなる患者における癌の進行をモニターする方法が提供される：（ａ）前立腺特異的タンパク質をコードするポリヌクレオチドに対してハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドと、患者から得られた生物学的試料を接触させ；（ｂ）試料中でオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドの量を検出し；（ｃ）引き続く時点において患者から得られた生物学的試料を使用して工程（ａ）および（ｂ）を反復し；そして（ｄ）工程（ｃ）において検出されたポリヌクレオチドの量を工程（ｂ）において検出されたポリヌクレオチドの量と比較し、それから患者における癌の進行をモニターする。
【００１６】
それ以上の範囲内において、本発明は、前述のポリペプチドに結合する抗体、例えば、モノクローナル抗体、ならびにこのような抗体を含んでなる診断キットを提供する。また、１またはそれ以上の前述のオリゴヌクレオチドのプローブまたはプライマーを含んでなる診断キットが提供される。
本発明のこれらの面および他の面は、下記の詳細な説明および添付図面を参照すると、明らかとなるであろう。本明細書に開示するすべての参考文献は、各々が個々の引用されるようにそれらの全体において、引用することによって本明細書の一部とされる。
【００１７】
配列の同定
配列番号１はＦ１−１３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２はＦ１−１２について決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３はＦ１−１２について決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号４はＦ１−１６について決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号５はＨ１−１について決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号６はＨ１−９について決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号７はＨ１−４について決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号８はＪ１−１７について決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号９はＪ１−１７について決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０はＬ１−１２について決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１はＬ１−１２について決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２はＮ１−１８６２について決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３はＮ１−１８６２について決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４はＪ１−１３について決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５はＪ１−１３について決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６はＪ１−１９について決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７はＪ１−１９について決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８はＪ１−２５について決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９はＪ１−２５について決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０はＪ１−２４について決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１はＪ１−２４について決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２はＫ１−５８について決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３はＫ１−５８について決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４はＫ１−６３について決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５はＫ１−６３について決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６はＬ１−４について決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７はＬ１−４について決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８はＬ１−１４について決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９はＬ１−１４について決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０はＪ１−１２について決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１はＪ１−１６について決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２はＪ１−２１について決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３はＫ１−４８について決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４はＫ１−５５について決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５はＬ１−２について決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６はＬ１−６について決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３７はＮ１−１８５８について決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８はＮ１−１８６０について決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９はＮ１−１８６１について決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０はＪ１−１８６４について決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１はＰ−５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２はＰ−８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３はＰ−９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４はＰ−１８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５はＰ−２０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６はＰ−２９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７はＰ−３０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４８はＰ−３４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４９はＰ−３６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０はＰ−３８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５１はＰ−３９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５２はＰ−４２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３はＰ−４７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５４はＰ−４９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５５はＰ−５０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５６はＰ−５３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５７はＰ−５５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５８はＰ−６０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５９はＰ−６４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６０はＰ−６５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６１はＰ−７３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６２はＰ−７５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６３はＰ−７６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６４はＰ−７９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６６はＰ−８４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６６はＰ−６８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６７はＰ−８０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６８はＰ−８２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６９はＵ１−３０６４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７０はＵ１−３０６５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７１はＶ１−３６９２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７２は１Ａ−３９０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７３はＶ１−３６８６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７４はＲ１−２３３０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７５は１Ｂ−３９７６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７６はＶ１−３６７９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７７は１Ｇ−４７３６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７８は１Ｇ−４７３９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７９は１Ｇ−４７４１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８０は１Ｇ−４７４４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８１は１Ｇ−４７３４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８２は１Ｈ−４７７４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８３は１Ｈ−４７８１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８４は１Ｈ−４７８５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８５は１Ｈ−４７８７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８６は１Ｈ−４７９６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８７は１Ｉ−４８０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８８は１Ｉ−４８１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８９は１Ｉ−４８１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９０は１Ｊ−４８７６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９１は１Ｋ−４８８４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９２は１Ｋ−４８９６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９３は１Ｇ−４７６１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９４は１Ｇ−４７６２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９５は１Ｈ−４７６６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９６は１Ｈ−４７７０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９７は１Ｈ−４７７１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９８は１Ｈ−４７７２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９９は１Ｄ−４２９７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１００は１Ｄ−４３０９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０１は１Ｄ．１−４２７８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０２は１Ｄ−４２８８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０３は１Ｄ−４２８３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０４は１Ｄ−４３０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０５は１Ｄ−４２９６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０６は１Ｄ−４２８０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０７はＦ１−１２（また、Ｐ５０４Ｓと呼ぶ）について決定された全長のｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０８はＦ１−１２について予測されたアミノ酸配列である。
配列番号１０９はＪ１−１７について決定された全長のｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１０はＬ１−１２（Ｐ５０１Ｓともいう）について決定された全長のｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１１はＮ１−１８６２（Ｐ５０３Ｓともいう）について決定された全長のｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１２はＪ１−１７について予測されたアミノ酸配列である。
配列番号１１３はＬ１−１２（Ｐ５０１Ｓともいう）について予測されたアミノ酸配列である。
配列番号１１４はＮ１−１８６２（Ｐ５０３Ｓともいう）について予測されたアミノ酸配列である。
配列番号１１５はＰ８９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１６はＰ９０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１７はＰ９２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１８はＰ９５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１９はＰ９８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２０はＰ１０２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２１はＰ１１０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２２はＰ１１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２３はＰ１１４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２４はＰ１１５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２５はＰ１１６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２６はＰ１２４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２７はＰ１２６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２８はＰ１３０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２９はＰ１３３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３０はＰ１３８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３１はＰ１４３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３２はＰ１５１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３３はＰ１５６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３４はＰ１５７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３５はＰ１６６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３６はＰ１７６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３７はＰ１７８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３８はＰ１７９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３９はＰ１８５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４０はＰ１９２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４１はＰ２０１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４２はＰ２０４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４３はＰ２０８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４４はＰ２１１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４５はＰ２１３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４６はＰ２１９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４７はＰ２３７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４８はＰ２３９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４９はＰ２４８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５０はＰ２５１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５１はＰ２５５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５２はＰ２５６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５３はＰ２５９について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５４はＰ２６０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５５はＰ２６３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５６はＰ２６４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５７はＰ２６６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５８はＰ２７０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５９はＰ２７２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６０はＰ２７８について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６１はＰ１０５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６２はＰ１０７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６３はＰ１３７について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６４はＰ１９４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６５はＰ１９５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６６はＰ１９６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６７はＰ２２０について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６８はＰ２３４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６９はＰ２３５について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７０はＰ２４３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７１はＰ７０３Ｐ−ＤＥ１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７２はＰ７０３Ｐ−ＤＥ１について予測されたアミノ酸配列である。
配列番号１７３はＰ７０３Ｐ−ＤＥ２について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７４はＰ７０３Ｐ−ＤＥ６について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７５はＰ７０３Ｐ−ＤＥ１３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７６はＰ７０３Ｐ−ＤＥ１３について予測されたアミノ酸配列である。
配列番号１７７はＰ７０３Ｐ−ＤＥ１４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７８はＰ７０３Ｐ−ＤＥ１４について予測されたアミノ酸配列である。
配列番号１７９は１Ｇ−４７３６について決定された延長されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号１８０は１Ｇ−４７３８について決定された延長されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号１８１は１Ｇ−４７４１について決定された延長されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号１８２は１Ｇ−４７４４について決定された延長されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号１８３は１Ｈ−４７７４について決定された延長されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号１８４は１Ｈ−４７８１について決定された延長されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号１８５は１Ｈ−４７８５について決定された延長されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号１８６は１Ｈ−４７８７について決定された延長されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号１８７は１Ｈ−４７９６について決定された延長されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号１８８は１Ｉ−４８０７について決定された延長されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号１８９は１Ｉ−４８１０について決定された３’ｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号１９０は１Ｉ−４８１１について決定された３’ｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号１９１は１Ｊ−４８７６について決定された延長されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号１９２は１Ｋ−４８８４について決定された延長されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号１９３は１Ｋ−４８９６について決定された延長されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号１９４は１Ｇ−４７６１について決定された延長されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号１９５は１Ｇ−４７６２について決定された延長されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号１９６は１Ｈ−４７６６について決定された延長されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号１９７は１Ｈ−４７７０について決定された３’ｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号１９８は１Ｈ−４７７１について決定された３’ｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号１９９は１Ｈ−４７７２について決定された延長されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２００は１Ｄ−４３０９について決定された延長されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２０１は１Ｄ．１−４２７８について決定された延長されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２０２は１Ｄ−４２８８について決定された延長されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２０３は１Ｄ−４２８３について決定された延長されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２０４は１Ｄ−４３０４について決定された延長されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２０５は１Ｄ−４２９６について決定された延長されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２０６は１Ｄ−４４２８０ ついて決定された延長されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２０７は１０−ｄ８ｆｗについて決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２０８は１０−Ｈ１０ｃｏｎについて決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２０９は１１−Ｃ８ｒｅｖについて決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２１０は７．ｇ６ｆｗｄについて決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２１１は７．ｇ６ｒｅｖについて決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２１２は８−ｂ５ｆｗｄについて決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２１３は８−ｂ５ｒｅｖについて決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２１４は８−ｂ６ｆｗｄについて決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２１５は８−ｂ６ｒｅｖについて決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２１６は８−ｄ４ｆｗｄについて決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２１７は８−ｄ９ｒｅｖについて決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２１８は８−ｇ３ｆｗｄについて決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２１９は８−ｇ３ｒｅｖについて決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２２０は８−ｈ１１ｒｅｖについて決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２２１はｇ−ｆ１２ｆｗｄについて決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２２２はｇ−ｆ３ｒｅｖについて決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２２３はＰ５０９Ｓについて決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２２４はＰ５１０Ｓについて決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２２５はＰ７０３ＤＥ５について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２２６は９−Ａ１１について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２２７は８−Ｃ６について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２２８は８−Ｈ７について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２２９はＪＰＴＰＮ１３について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２３０はＪＰＴＰＮ１４について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２３１はＪＰＴＰＮ２３について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２３２はＪＰＴＰＮ２４について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２３３はＪＰＴＰＮ２５について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２３４はＪＰＴＰＮ３０について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２３５はＪＰＴＰＮ３４について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２３６はＰＴＰＮ３５について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２３７はＪＰＴＰＮ３６について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２３８はＪＰＴＰＮ３８について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２３９はＪＰＴＰＮ３９について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２４０はＪＰＴＰＮ４０について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２４１はＪＰＴＰＮ４１について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２４２はＪＰＴＰＮ４２について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２４３はＪＰＴＰＮ４５について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２４４はＪＰＴＰＮ４６について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２４５はＪＰＴＰＮ５１について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２４６はＪＰＴＰＮ５６について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２４７はＰＴＰＮ６４について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２４８はＪＰＴＰＮ６５について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２４９はＪＰＴＰＮ６７について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２５０はＪＰＴＰＮ７６について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２５１はＪＰＴＰＮ８４について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２５２はＪＰＴＰＮ８５について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２５３はＪＰＴＰＮ８６について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２５４はＪＰＴＰＮ８７について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２５５はＪＰＴＰＮ８８について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２５６はＪＰ１Ｆ１について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２５７はＪＰ１Ｆ２について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２５８はＪＰ１Ｃ２について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２５９はＪＰ１Ｂ１について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２６０はＪＰ１Ｂ２について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２６１はＪＰ１Ｄ３について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２６２はＪＰ１Ａ４について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２６３はＪＰ１Ｆ５について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２６４はＪＰ１Ｅ６について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２６５はＪＰ１Ｄ６について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２６６はＪＰ１Ｂ５について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２６７はＪＰ１Ａ６について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２６８はＪＰ１Ｅ８について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２６９はＪＰ１Ｄ７について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２７０はＪＰ１Ｄ９について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２７１はＪＰ１Ｃ１０について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２７２はＪＰ１Ａ９について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２７３はＪＰ１Ｆ１２について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２７４はＪＰ１Ｅ１２について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２７５はＪＰ１Ｄ１１について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２７６はＪＰ１Ｃ１１について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２７７はＪＰ１Ｃ１２について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２７８はＪＰ１Ｂ１２について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２７９はＪＰ１Ａ１２について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２８０はＪＰ８Ｇ２について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２８１はＪＰ８Ｈ１について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２８２はＪＰ８Ｈ２について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２８３はＪＰ８Ａ３について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２８４はＪＰ８Ａ４について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２８５はＪＰ８Ｃ３について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２８６はＪＰ８Ｇ４について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２８７はＪＰ８Ｂ６について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２８８はＪＰ８Ｄ６について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２８９はＪＰ８Ｆ５について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２９０はＪＰ８Ａ８について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２９１はＪＰ８Ｃ７について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２９２はＪＰ８Ｄ７について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２９３はＪＰ８Ｄ８について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２９４はＪＰ８Ｅ７について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２９５はＪＰ８Ｆ８について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２９６はＪＰ８Ｇ８について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２９７はＪＰ８Ｂ１０について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２９８はＪＰ８Ｃ１０について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号２９９はＪＰ８Ｅ９について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号３００はＪＰ８Ｅ１０について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号３０１はＪＰ８Ｆ９について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号３０２はＪＰ８Ｈ９について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号３０３はＪＰ８Ｃ１２について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号３０４はＪＰ８Ｅ１１について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号３０５はＪＰ８Ｅ１２について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号３０６はペプチドＰＳ２＃１２についてのアミノ酸配列である。
配列番号３０７はＰ７１１Ｐについて決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号３０８はＰ７１２Ｐについて決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号３０９はＣＬＯＮＥ２３について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号３１０はＰ７７４Ｐについて決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号３１１はＰ７７５Ｐについて決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号３１２はＰ７１５Ｐについて決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号３１３はＰ７１０Ｐについて決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号３１４はＰ７６７Ｐについて決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号３１５はＰ７６８Ｐについて決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号３１６〜３２５は以前に単離された遺伝子の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２６はＰ７０３ＰＤＥ５について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号３２７はＰ７０３ＰＤＥ５について予測されたアミノ酸配列である。
配列番号３２８はＰ７０３Ｐ６．２６について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号３２９はＰ７０３Ｐ６．２６について予測されたアミノ酸配列である。
配列番号３３０はＰ７０３ＰＸ−２３について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号３３１はＰ７０３ＰＸ−２３について予測されたアミノ酸配列である。
配列番号３３２はＰ５０９Ｓについて決定された全長のｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３３はＰ７０７Ｐ（また、１１−Ｃ９と呼ぶ）について決定された延長されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号３３４はＰ７１４Ｐについて決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号３３５はＰ７０５Ｐ（また、９−Ｆ３と呼ぶ）について決定されたｃＤＮＡ酸配列である。
配列番号３３６は７０５Ｐについて予測されたアミノ酸配列である。
配列番号３３７はペプチドＰ１Ｓ＃１０のアミノ酸配列である。
配列番号３３８はペプチドｐ５のアミノ酸配列である。
配列番号３３９はペプチドＰ５０９Ｓについて予測されたアミノ酸配列である。
配列番号３４０はＰ７７８Ｐについて決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４１はＰ７８６Ｐについて決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４２はＰ７８９Ｐについて決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４３はホモサピエンスＭＭ４６ｍＲＮＡに対する相同性を示すクローンについて決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４４はホモサピエンスＴＮＦ−アルファ刺激ＡＢＣタンパク質（ＡＢＣ５０）ｍＲＮＡに対する相同性を示すクローンについて決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４５はホモサピエンスＥ−カドヘリンのｍＲＮＡに対する相同性を示すクローンについて決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４６はヒト核−コード化ミトコンドリアセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ）に対する相同性を示すクローンについて決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４７はホモサピエンス自然耐性関連マクロファージタンパク質２（ＮＲＡＭＰ２）に対する相同性を示すクローンについて決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４８はホモサピエンスホスホグルコムターゼ関係タンパク質タンパク質（ＰＧＭＲＰ）に対する相同性を示すクローンについて決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４９はプロテオソームサブユニットｐ４０のヒトｍＲＮＡに対する相同性を示すクローンについて決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５０はＰ７７７Ｐについて決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５１はＰ７７９Ｐについて決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５２はＰ７９０Ｐについて決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５３はＰ７８４Ｐについて決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５４はＰ７７６Ｐについて決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５５はＰ７８０Ｐについて決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５６はＰ５４４Ｐについて決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５７はＰ７４５Ｐについて決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５８はＰ７８２Ｐについて決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５９はＰ７８３Ｐについて決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６０は未知の１７９８４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６１はＰ７８７Ｐについて決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６２はＰ７８８Ｐについて決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６３は未知の１７９９４について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６４はＰ７８１Ｐについて決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６５はＰ７８５Ｐについて決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６６〜３７５はＢ３０５Ｄのスプライス変異型について決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３７６は配列番号３６６の配列によりコードされる予測されたアミノ酸配列である。
配列番号３７７は配列番号３７２の配列によりコードされる予測されたアミノ酸配列である。
配列番号３７８は配列番号３７３の配列によりコードされる予測されたアミノ酸配列である。
配列番号３７９は配列番号３７４の配列によりコードされる予測されたアミノ酸配列である。
配列番号３８０は配列番号３７５の配列によりコードされる予測されたアミノ酸配列である。
配列番号３８１はＢ７１６Ｐについて決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８２はＰ７１１Ｐについて決定された全長のｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８３はＰ７１１Ｐについて予測されたアミノ酸配列である。
配列番号３８４はＰ１０００ＣのｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８５はＣＧＩ−８２のｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８６は２３３２０のｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８７はＣＧＩ−６９のｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８８はＬ−イジトール−２−デヒドロゲナーゼのｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８９は２３３７９のｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９０は２３３８１のｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９１はＫＩＡＡ０１２２のｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９２は２３３９９のｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９３は以前に同定された遺伝子のｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９４はＨＣＬＢＰのｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９５はトランスグルタミナーゼのｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９６は以前に同定された遺伝子のｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９７はＰＡＰのｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９８はＥｔｓ転写因子ＰＤＥＦのｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９９はｈＴＧＲのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４００はＫＩＡＡ０２９５のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０１は２２５４５のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０２は２２５４７のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０３は２２５４８のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０４は２２５５０のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０５は２２５５１のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０６は２２５５２のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０７は２２５５３のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０８は２２５５８のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０９は２２５６２のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１０は２２５６５のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１１は２２５６７のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１２は２２５６８のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１３は２２５７０のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１４は２２５７１のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１５は２２５７２のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１６は２２５７３のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１７は２２５７３のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１８は２２５７５のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１９は２２５８０のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２０は２２５８１のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２１は２２５８２のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２２は２２５８３のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２３は２２５８４のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２４は２２５８５のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２５は２２５８６のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２６は２２５８７のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２７は２２５８８のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２８は２２５８９のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２９は２２５９０のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３０は２２５９１のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３１は２２５９２のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３２は２２５９３のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３３は２２５９４のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３４は２２５９５のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３５は２２５９６のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３６は２２８４７のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３７は２２８４８のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３８は２２８４９のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３９は２２８５１のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４０は２２８５２のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４１は２２８５３のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４２は２２８５４のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４３は２２８５５のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４４は２２８５６のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４５は２２８５７のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４６は２３６０１のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４７は２３６０２のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４８は２３６０３のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４９は２３６０６のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５０は２３６１２のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５１は２３６１４のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５２は２３６１８のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５３は２３６２２のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５４は葉酸ヒドロラーゼのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５５はＬＩＭタンパク質のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５６は既知の遺伝子のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５７は既知の遺伝子のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５８は以前に同定された遺伝子のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５９は２３０４５のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６０は２３０３２のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６１は２３０５４のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６２〜４６７は既知の遺伝子のｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６８〜４７１はＰ７１０ＰのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７２はＰ１００１ＣのｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７３はＰ７７５Ｐ（２７５０５ともいう）の第１スプライス変異体の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７４はＰ７７５Ｐ（１９９４７ともいう）の第２スプライス変異体の決定ｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７５はＰ７７５Ｐ（１９９４１ともいう）の第３スプライス変異体の決定ｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７６はＰ７７５Ｐ（１９９３７ともいう）の第４スプライス変異体の決定ｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７７は配列番号４７４によりコードされる第１推定アミノ酸配列である。
配列番号４７８は、配列番号４７４の配列によりコードされる第２推定アミノ酸配列である。
配列番号４７９は、配列番号４７５の配列によりコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号４８０は、配列番号４７３の配列によりコードされる第１推定アミノ酸配列である。
配列番号４８１は、配列番号４７３の配列によりコードされる第２推定アミノ酸配列である。
配列番号４８２は、配列番号４７３の配列によりコードされる第３推定アミノ酸配列である。
配列番号４８３は、配列番号４７３の配列によりコードされる第４推定アミノ酸配列である。
配列番号４８４は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原Ｒａ１２の最初の３０アミノ酸である。
配列番号４８５はＰＣＲプライマーＡＷ０２５である。
配列番号４８６はＰＣＲプライマーＡＷ００３である。
配列番号４８７はＰＣＲプライマーＡＷ０２７である。
配列番号４８８はＰＣＲプライマーＡＷ０２６である。
配列番号４８９−５０１は、エピトープ・マッピング試験において使用されたペプチドである。
配列番号５０２は、抗−Ｐ５０３Ｓモノクローナル抗体２０Ｄ４に関する相補性決定領域の決定ｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０３は、抗−Ｐ５０３Ｓモノクローナル抗体ＪＡ１の相補性決定領域の決定ｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０４と５０５は、エピトープ・マッピングにおいて使用されたペプチドである。
配列番号５０６は、抗−Ｐ７０３Ｐモノクローナル抗体８Ｈ２の相補性決定領域の決定ｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０７は、抗−Ｐ７０３Ｐモノクローナル抗体７Ｈ８の相補性決定領域の決定ｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０８は、抗−Ｐ７０３Ｐモノクローナル抗体２Ｄ４の相補性決定領域の決定ｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０９−５２２は、エピトープ・マッピング試験において使用されたペプチドである。
配列番号５２３は、Ｐ７０３Ｐに対する抗体を産生するために使用したＰ７０３Ｐの成熟形態である。
配列番号５２４は、Ｐ７０３Ｐの推定全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号５２５は、配列番号５２４によりコードされた推定アミノ酸配列である。
配列番号５２６は、Ｐ７９０Ｐの全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号５２７は、Ｐ７９０Ｐの推定アミノ酸配列である。
配列番号５２８と５２９はＰＣＲプライマーである。
配列番号５３０は配列番号３３６のスプライス変異体のｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３１は、配列番号５３０のオープン・リーディング・フレームのｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３２は、配列番号５３１の配列によりコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号５３３は、Ｐ７７５Ｐの推定ＯＲＦのＤＮＡ配列である。
配列番号５３４は配列番号５３３によりコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号５３５は、Ｐ５１０Ｓの最高の全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３６はＰ５１０Ｓの第２の全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３７は配列番号５３５によりコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号５３８は配列番号５３６によりコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号５３９は、ペプチドＰ５０１Ｓ−３７０である。
配列番号５４０はペプチドＰ５０１Ｓ−３７６である。
配列番号５４１−５５０はＰ５０１Ｓエピトープである。
配列番号５５１はＰ５０１Ｓのアミノ酸５４３−５５３に対応する。
【００１８】
発明の詳細な説明
前述したように、本発明は、一般に、癌、例えば、前立腺癌を治療および診断する組成物および方法に関する。本明細書に記載する組成物は、前立腺特異的ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、結合因子、例えば、抗体、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）および／または免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞）を含むことができる。本発明のポリペプチドは、一般に、前立腺特異的タンパク質の少なくとも一部分（例えば、免疫原性部分）またはその変異型を含んでなる。「前立腺特異的タンパク質」は、本明細書において提供される代表的アッセイを使用して測定して、正常組織における発現レベルよりも、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍のレベルで前立腺腫瘍細胞中で発現されるタンパク質である。ある種の前立腺特異的タンパク質は、前立腺癌に苦しめるられている患者の抗血清と検出可能に（イムノアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットにより）反応する腫瘍タンパク質である。本発明のポリヌクレオチドは、一般に、このようなポリペプチドのすべてまたは一部分をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配列、あるいはこのような配列に対して相補的であるＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含んでなる。抗体は、一般に、前述のポリペプチドに結合することができる、免疫系タンパク質、またはその抗原結合性フラグメントである。抗原提示細胞は、前述のポリペプチドを発現する樹枝状細胞、マクロファージ、繊維芽細胞およびＢ細胞を包含する。このような組成物において使用できるＴ細胞は、一般に、前述のポリペプチドに対して特異的であるＴ細胞である。
【００１９】
本発明は、ヒト前立腺特異的タンパク質の発見をベースとする。特定の前立腺特異的タンパク質、またはその一部分をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１〜１１１、１１５〜１７１、１７３〜１７５、１７７、１７９〜３０５、３０７〜３１５、３２６、３２８、３３０、３３２〜３３５、３４０〜３７５、３８１、３８２、３８４−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、及び５３６で提供される。前立腺特異的タンパク質の少なくとも一部分を含んでなるポリペプチド配列は、配列番号１１２〜１１４、１７２、１７６、１７８、３２７、３２９、３３１、３３６、３３９、３７６〜３８０、３８３、４７７−４８３、４９６、５０４、５０５、５１９、５２０、５２２、５２５、５２７、５３２、５３４、及び５３７−５５０で提供される。
前立腺特異的タンパク質のポリヌクレオチド
本明細書において記載する前立腺特異的タンパク質またはその一部分または変異型をコードする任意のポリヌクレオチドは、本発明に包含される。好ましいポリヌクレオチドは、前立腺特異的タンパク質の一部分をコードする、少なくとも１５の連続ヌクレオチド、好ましくは３０の連続ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも４５の連続ヌクレオチドを含んでなる。より好ましくは、ポリヌクレオチドは前立腺特異的タンパク質の免疫原性部分をコードする。また、このような配列に対して相補的であるポリヌクレオチドは本発明に包含される。ポリヌクレオチドは一本鎖（コーディングまたはアンチセンス）または二本鎖であることができ、そしてＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成）またはＲＮＡ分子であることができる。ＲＮＡ分子は、イントロンを含有しかつ１対１の方法でＤＮＡ分子に対応するＨｎＲＮＡ、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子を包含する。追加のコーディングまたは非コーディング配列は本発明のポリヌクレオチド内に存在することができるが、これは不必要であり、そしてポリヌクレオチドは他の分子および／または支持分子に連鎖することができるが、これ不必要である。
【００２０】
ポリヌクレオチドは自然配列（すなわち、前立腺特異的タンパク質またはその一部分をコードする内因的配列）を含んでなることができるか、あるいはこのような配列の変異型を含んでなることができる。ポリヌクレオチド変異型は、コード化ポリペプチドの免疫原性が天然タンパク質に関して減少しないように、１またはそれ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含有することができる。コード化ポリペプチドの免疫原性に対する効果は、一般に、本明細書において記載するように評価することができる。変異型は、天然前立腺特異的タンパク質またはその一部分をコードするポリヌクレオチド配列に対して、好ましくは少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性を示す。用語「変異体」は、異種起源の相同遺伝子をも包含する。
【００２１】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列は、後述するように最大の対応で整列させたとき、２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が同一である場合、「同一」であると言う。典型的には、配列の類似性の局所的領域を同定および比較する比較ウィンドウにわたって配列を比較することによって、２つの配列の間の比較は実行される。「比較ウィンドウ」は、本明細書において使用するとき、２つの配列が最適に整列された後、配列を同一数の隣接位置の参照配列と比較することができる、少なくとも約２０、通常３０〜約７５、４０〜約５０の隣接位置のセグメントを意味する。
【００２２】
比較のために最適な配列の整列は、デフォルトパラメーターを使用して、Ｍｅｇａｌｉｇｎプログラム（Ｍｅｇａｌｉｇｎ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  ｓｕｉｔｅ  ｏｆ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、ウイスコンシン州マディソン）に従い実施することができる。このプログラムは、下記の参考文献に記載されている、いくつかの整列スキームを具体化する：Ｄａｙｈｏｆｆ、Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  −  Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．  Ｉｎ  Ｄａｙｈｏｆｆ、Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ワシントンＤ．Ｃ．Ｖｏｌ．  ５、Ｓｕｐｐｌ．  ３、３４５−３５８；Ｈｅｉｎ  Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ  ｐｐ．  ６２６−６４５  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．  １８３、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ；Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ、Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ、Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、Ｅ．Ｄ．（１９７１）Ｃｏｍｂ．  Ｔｈｅｏｒ．  １１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ、Ｎ．  Ｎｅｓ、Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ、Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ、Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  −  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｃａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ、Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンフランシスコ；Ｗｉｌｂｕｒ、Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ、Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：７２６−７３０。
【００２３】
好ましくは、「配列同一性の百分率」は、少なくとも２０位置の比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、ここで２つの配列の最適な整列について参照配列（これは付加または欠失を含まない）に比較して、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列の一部分は２０％またはそれより大きい、通常５〜１５％または１０〜１２％の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでなることができる。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を決定して合致した位置の数を計算し、合致した位置の数を参照配列中の位置の総数（すなわち、ウィンドウのサイズ）で割り、結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることによって、百分率を計算する。
【００２４】
変異型は、また、別に、自然遺伝子、またはその一部分または補体に対して実質的に相同性であることができる。このような変異型は、天然前立腺特異的タンパク質をコードする天然に存在するＤＮＡ配列（または相補的配列）に対して、適度にストリンジェントな条件下にハイブリダイゼーションすることができる。好適な中程度のストリンジェント条件は下記の条件を包含する：５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中の前洗浄；５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣにおける一夜後ハイブリダイゼーション；次いで０．１％のＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣの各々を使用する６５℃において２０分間の洗浄。
【００２５】
当業者は認識するように、遺伝暗号の縮重の結果、本明細書において記載するポリペプチドをコードする多数のヌクレオチド配列が存在する。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を支持する。それにもかかわらず、コドン使用が異なるために変化するポリヌクレオチドは特別に本発明の範囲内に包含される。さらに、本明細書において提供されるポリヌクレオチド配列を含んでなる遺伝子のアレレ（Ａｌｌｅｌｅｓ）は、本発明の範囲内に入る。アレレは、ヌクレオチドの１またはそれ以上の突然変異、例えば、欠失、付加および／または置換の結果として変更される内因的遺伝子である。生ずるｍＲＮＡおよびタンパク質は変更された構造または機能を有することができるが、それらは不必要である。アレレは、標準的技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベースの配列の比較）により同定することができる。
【００２６】
ポリヌクレオチドは種々の技術により製造することができる。例えば、ポリヌクレオチドは、下記においていっそう詳細に説明するように、腫瘍関連発現（すなわち、本明細書において提供される代表的アッセイを使用して測定して、正常組織におけるよりも前立腺特異的において少なくとも５倍大きい発現）についてｃＤＮＡのマイクロアレイをスクリーニングすることによって、同定することができる。このようなスクリーニングは、Ｓｙｎｔｅｎｉマイクロアレイ（カリフォルニア州パロアルト）を製造業者の使用説明書に従い（そしてＳｃｈｅｎａ他、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：１０６１４−１０６１９、１９９６およびＨｅｌｌｅｒ他、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４：２１５０−２１５５、１９９７に記載されているように）実行することができる。あるいは、本明細書に記載するタンパク質を発現する細胞、例えば、前立腺特異的細胞から調製したｃＤＮＡから、ポリペプチドを増幅することができる。ストリンジェント条件下にポリヌクレオチドはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅することができる。このアプローチのために、本明細書において提供される配列に基づいて配列特異的プライマーを本明細書において提供される配列に基づいて設計することができ、そして購入または合成することができる。
【００２７】
よく知られている技術に従い増幅された部分を使用して、適当なライブラリー（例えば、前立腺特異的ｃＤＮＡライブラリー）から全長の遺伝子を単離することができる。このような技術において、増幅に適当な１またはそれ以上のポリヌクレオチドのプローブまたはプライマーを使用して、ライブラリー（ｃＤＮＡまたはゲノム）をスクリーニングする。好ましくは、より大きいヌクレオチドを含むようにライブラリーをサイズで選別する。遺伝子の５’および上流領域を同定するために、ランダムプライムドライブラリーはまた好ましい。イントロンおよび延長５’配列のために、ゲノムライブラリーは好ましい。
【００２８】
ハイブリダイゼーション技術のために、部分的配列をよく知られている技術に従い標識化することができる（例えば、ニックトランスレーションまたは３２Ｐを使用する末端標識化により）。次いで変性細菌コロニー（またはファージプラークを含有する菌叢）を含有するフィルターを標識化プローブとハイブリダイゼーションすることによって、細菌またはバクテリオファージのライブラリーをスクリーニングする（下記の文献を参照のこと：Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）。ハイブリダイゼーションコロニーまたはプラークを選択し、延長し、そしてＤＮＡをそれ以上の分析のために単離する。例えば、部分的配列からのプライマーおよびベクターからのプライマーを使用して、ｃＤＮＡクローンを分析して、追加の配列の量を決定することができる。制限地図および部分的配列を発生させて、１またはそれ以上のオーバーラップするクローンを同定することができる。次いで標準的技術に従い、完全な配列を決定することができ、この技術は１系列の欠失クローンの発生を含むことができる。次いで生ずるオーバーラップする配列を単一の隣接配列に組立てる。よく知られている技術に従い適当なフラグメントを結合することによって、全長のｃＤＮＡ分子を発生させることができる。
【００２９】
あるいは、部分的ｃＤＮＡ配列から全長のコーディング配列を得る多数の増幅技術が存在する。このような技術において、ＰＣＲにより増幅を一般に実施する。種々の商業的に入手可能なキットを使用して、増幅工程を実施することができる。例えば、この分野においてよく知られているソフトウェアを使用して、プライマーを設計することができる。プライマーは好ましくは２２〜３０ヌクレオチド長さであり、少なくとも５０％のＧＣ含量を有し、約６８℃〜７２℃の温度においてターゲット配列にアニーリングさせる。増幅された領域を前述したように配列決定し、そしてオーバーラップする配列を隣接に組立てることができる。
【００３０】
１つのこのような増幅技術は逆ＰＣＲであり（Ｔｒｉｇｌｉａ他、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：８１８６，１９８８参照）、これは遺伝子の既知の領域においてフラグメントを発生させるために制限酵素を使用する。次いでフラグメントを分子内結合により環化し、既知の領域に由来する発散プライマーを用いる別のアプローチにおいて、リンカー配列に対するプライマーおよび既知の領域に対して特異的なプライマーを使用する増幅により、部分的配列に隣接する配列を回収することができる。典型的には、同一リンカープライマーおよび既知の領域に対して特異的な第２プライマーを使用する増幅の第２ラウンドに、増幅された配列を付す。既知の配列から反対方向におけるエクステンションを開始する２つのプライマーを使用する、この手順の変法は、ＷＯ９６／３８５９１号に記載されている。他のこのような技術は、「ｃＤＮＡ末端の急速増幅」またはＲＡＣＥとして知られている。この技術において、ポリＡ領域またはベクター配列にハイブリダイゼーションする。内部プライマーおよび外部プライマーを使用して、既知の配列の５’および３’である配列を同定する。追加の技術は捕捉ＰＣＲ（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ他、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．  １：１１１−１９、１９９１）およびウォーキングＰＣＲ（Ｐａｒｋｅｒ他、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９：３０５５−６０、１９９１）を包含する。全長のｃＤＮＡ配列を得るために、増幅を用いる他の方法を使用することもできる。
【００３１】
ある場合において、発現された配列標識（ＥＳＴ）データベース、例えば、遺伝子バンクから入手可能であるデータベースの中に準備されている配列の分析により、全長のｃＤＮＡ配列を得ることが可能である。オーバーラップするＥＳＴについての検索は一般によく知られているプログラム（例えば、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ検索）に従い実行し、そしてこのようなＥＳＴを使用して隣接全長配列を発生させることができる。全長ＤＮＡ配列は、ゲノム断片の分布によっても得られうる。
【００３２】
前立腺特異的タンパク質の一部分をコードするｃＤＮＡ分子のある種の核酸配列は、配列番号１〜１１１、１１５〜１７１、１７３〜１７５、１７７、１７９〜３０５、３０７〜３１５、３２６、３２８、３３０、３３２〜３３５、３４０〜３７５、３８１、３８２、３８４−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、及び５３６で提供される。これらのポリヌクレオチドの単離を後述する。
ポリヌクレオチド変異型は、一般に、化学的合成を包含する、この分野において知られている方法、例えば、固相ホスホルアミダイト化学的合成により製造することができる。ポリヌクレオチド配列の修飾は、また、標準的突然変異誘発技術、例えば、オリゴヌクレオチドに向けられた部位特異的突然変異誘発により導入することができる（Ａｄｅｌｍａｎ他、ＤＮＡ  ２：１８３、１９８３参照）。あるいは、ＤＮＡが適当なＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ７またはＳＰ６）を使用してベクターの中に組込まれるかぎり、前立腺特異的タンパク質、またはその一部分をコードするＤＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ転写により、ＲＮＡ分子を発生させることができる。ある種の部分を使用して、本明細書において記載する、コード化ポリペプチドを製造することができる。さらに、選択的に、コード化ポリペプチドがｉｎ  ｖｉｖｏにおいて発生するように、一部分を患者に添加することができる（例えば、前立腺特異的ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ構築物で抗原提示細胞、例えば、樹枝状細胞をトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞を患者に投与することによって）。
【００３３】
コーディング配列に対して相補的な配列の部分（すなわち、アンチセンスポリヌクレオチド）を、また、プローブとして使用するか、あるいは遺伝子の発現をモジュレートするために使用することができる。アンチセンスＲＮＡに転写することができるｃＤＮＡ構築物を組織の細胞の中に導入して、アンチセンスＲＮＡの産生を促進することもできる。本明細書において記載するように、タンパク質の発現を阻害するために、アンチセンスポリヌクレオチドを使用することができる。三重らせんの形成により遺伝子の発現をコントロールするために、アンチセンス技術を使用することができ、このような形成はポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために十分に開く二重らせんの能力を危うくする（下記の文献を参照のこと：Ｇｅｅ他、ＨｕｂｅｒおよびＣａｒｒ、Ｍｏｌｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ａｐｐｏｒｏａｃｈｅｓ、Ｆｕｔｕｒａ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ｍｔ．  Ｋｉｓｃｏ、ＮＹ；１９９４））。あるいは、遺伝子のコントロール領域（例えば、プロモーター、エンハンサーまたは転写開始部位）とハイブリダイゼーションし、かつ遺伝子の転写をブロックするか、あるいは転写物のリボソームへの結合を阻害することによって翻訳をブロックするように、アンチセンス分子を設計することができる。
【００３４】
コーディング配列の一部分または相補的配列の一部分を、また、遺伝子の発現を検出するプローブまたはプライマーとして設計することができる。プローブを種々のリポーターグループ、例えば、放射性核種または酵素で標識化することができ、このようなプローブは好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド長さ、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長さ、なおより好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド長さである。プライマーは、前述したように、好ましくは２２〜３０ヌクレオチド長さである。
【００３５】
任意のポリヌクレオチドをさらに修飾して、ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を増加させることができる。可能修飾は下記のものを包含するが、これらに限定されない：５’および／または３’末端におけるフランキング配列の付加；バックボーン中のホスホジエステラーゼ連鎖よりむしろホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチルの使用；および／または非伝統的塩基、例えば、イノシン、クエオシンおよびワイブトシン、ならびにアセチル−、チオ−および他の修飾された形態のアデニン、シチジン、グアニン、チミンおよびウリジンの包含。
【００３６】
本明細書において記載するヌクレオチド配列を、確立された組換えＤＮＡ技術により、種々の他のヌクレオチド配列に結合させることができる。例えば、ポリヌクレオチドを種々のクローニングベクター、例えば、プラスミド、ファージミド、ラムダファージ誘導体およびコスミドの中にクローニングすることができる。特に問題のベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ発生ベクターおよび配列決定ベクターを包含する。一般に、ベクターは少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位および１またはそれ以上の選択可能なマーカーを含有するであろう。他の因子は所望の使用に依存し、そして当業者にとって明らであろう。
【００３７】
ある種の態様において、哺乳動物細胞の中へのエントリー、およびその中の発現を可能とするように、ポリヌクレオチドを処方することができる。このような処方物は、後述するように、療法上の目的に特に有用である。当業者は理解するように、ターゲット細胞中でポリヌクレオチドの発現を達成する多数の方法が存在し、そして任意の適当な方法を使用することができる。例えば、ポリヌクレオチドをウイルスベクターの中に組込むことができ、このようなウイルスベクターの例は、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、またはワクシニアまたは他のポックスウイルス（例えば、トリポックスウイルス）であるが、これらに限定されない。このようなベクターの中にＤＮＡを組込む技術は、当業者によく知られている。レトロウイルスのベクターは、選択可能なマーカーの遺伝子（トランスデュースされた細胞の同定または選択を促進するために）および／またはターゲッティング部分、例えば、特異的ターゲット細胞上のレセプターのリガンドをコードする遺伝子をさらに転移または組込んで、ベクターターゲットを特異的とすることができる。また、ターゲッティングは、この分野において知られている方法により、抗体を使用して達成することができる。
【００３８】
療法上の目的のための他の処方物は、コロイド状分散系、例えば、高分子複合体、モノカプセル、ビーズ、および脂質をベースとする系、例えば、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを包含する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて送出系として使用するために好ましいコロイド状系はリポソーム（すなわち、人工的膜小胞）である。このような系の調製および使用はこの分野においてよく知られている。
前立腺特異的ポリペプチド
本発明の関係において、ポリペプチドは、本明細書において記載するように、少なくとも前立腺特異的タンパク質の免疫原性部分またはその変異型を含んでなることができる。前述したように、「前立腺特異的タンパク質」は、正常な前立腺細胞及び／又は前立腺腫瘍細胞により発現されるタンパク質である。前立腺特異的タンパク質であるタンパク質は、また、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）において、前立腺癌を有する患者からの抗血清と検出可能に反応する。本明細書において記載するポリペプチドは任意の長さであることができる。自然タンパク質に由来する追加の配列および／または異種配列が存在することができ、そしてこのような配列はそれ以上の免疫原性または抗原性を有することができる（しかし不必要である）。
【００３９】
「免疫原性部分」は、本明細書において使用するとき、Ｂ細胞および／またはＴ細胞の表面抗原レセプターにより認識される（すなわち、特異的に結合される）タンパク質の部分である。このような免疫原性部分は、前立腺特異的タンパク質またはその変異型の一般に少なくとも５アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１０、なおより好ましくは少なくとも２０アミノ酸残基を含んでなる。ある種の好ましい免疫原性部分は、Ｎ−末端のリーダー配列および／またはトランスメンブランドメインが欠失されているペプチドを包含する。他の好ましい免疫原性部分は、成熟タンパク質に関して、小さいＮ−末端および／またはＣ−末端の欠失（例えば、１〜３０アミノ酸、好ましくは５〜１５アミノ酸）を含有することができる。
【００４０】
免疫原性部分は、一般に、よく知られている技術、例えば、下記の文献およびその中に引用されている参考文献において要約されている技術により同定することができる。このような技術は、抗原特異的抗体、抗血清および／またはＴ細胞系統またはクローンと反応する能力について、ポリペプチドをスクリーニングすることを含む。本明細書において使用するとき、抗血清および抗体は、抗原に特異的に結合する（すなわち、それらがＥＬＩＳＡまたは他のアッセイにおいてタンパク質と反応するが、無関係のタンパク質を検出可能に反応しない）場合、「抗原特異的」である。このような抗体は、本明細書において記載するように、よく知られている技術に従い製造することができる。天然前立腺特異的タンパク質の免疫原性部分は、全長のポリペプチドの反応性よりも実質的に低いレベルで、このような抗血清および／またはＴ細胞と反応する部分である（例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴ細胞の反応性のアッセイにおいて）。このような免疫原性部分は、このようなアッセイにおいて、全長のポリペプチドの反応性に類似するか、あるいはそれより大きいレベルで反応することができる。このようなスクリーニングは、一般に、当業者によく知られている方法、例えば、下記の文献に記載されている方法により実行することができる：ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８。例えば、ポリペプチドを固体の支持体上に固定化し、患者の血清と接触させて、血清中の抗体が固定化されたポリペプチドに結合できるようにする。次いで非結合血清を除去し、結合した抗体を、例えば、１２５Ｉ標識化プロテインＡで検出することができる。
【００４１】
前述したように、組成物は種々の天然前立腺特異的タンパク質を含んでなることができる。ポリペプチドの「変異型」は、本明細書において使用するとき、ポリペプチドの免疫原性が実質的に減少しないように、１またはそれ以上の置換、欠失、付加および／または挿入において天然前立腺特異的タンパク質と異なるポリペプチドである。換言すると、抗原特異的抗血清と反応する能力は、自然タンパク質に関して、増強されるか、あるいは変化しないか、あるいは自然タンパク質に関して、５０％より少なく、好ましくは２０％より少なく減少することができる。このような変異型は、一般に、上記ポリペプチド配列の１つを修飾し、修飾されたポリペプチドと抗原特異的抗体または抗血清との反応性を、本明細書において記載するように、評価することによって同定することができる。好ましい変異型は、１またはそれ以上の部分、例えば、Ｎ−末端のリーダー配列またはトランスメンブランドメインが除去されているものを包含する。他の好ましい変異型は、小さい部分（例えば、１〜３０アミノ酸、好ましくは５〜１５アミノ酸）が成熟タンパク質のＮ−末端および／またはＣ末端から除去されている変異型を包含する。ポリペプチドの変異型は、同定されたポリペプチドに対して好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の同一性（後述するように測定する）を示す。
【００４２】
好ましくは、変異型は保存的置換を含有する。「保存的置換」は、ペプチド化学の当業者がポリペプチドの二次構造およびヒドロパシーの特質が実質的に変化しないことを期待するような、アミノ酸が同様な性質を有する他のアミノ酸で置換されている置換である。アミノ酸の置換は、一般に、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の特質に基づいて実施することができる。例えば、負に帯電したアミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を包含する；正に帯電したアミノ酸は、リシンおよびアルギニンを包含する；そして同様な親水性値を有する非帯電極性頭部基をもつアミノ酸は、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；およびセリン、スレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンを包含する。保存的変化を表すことができるアミノ酸の他のグループは下記のものを包含する：（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。変異型は、また、または別に、非保存的変化を含むことができる。好ましい態様において、変異型ポリペプチドは、５またはそれより少ないアミノ酸の置換、欠失または付加により自然配列と異なる。変異型は、また（または別に）、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造およびヒドロパシーの特質に対する影響が最小であるアミノ酸の欠失または付加により修飾することができる。
【００４３】
前述したように、ポリペプチドは、共翻訳的または翻訳後にタンパク質の転移を指令するシグナル（又はリーダー）配列をタンパク質のＮ−末端に含んでなることができる。ポリペプチドは、また、ポリペプチド（例えば、ポリ−Ｈｉｓ）の合成、精製または同定を容易にするために、あるいは固体の支持体へのポリペプチドの結合を増強するために、リンカーまたは他の配列に結合させることができる。例えば、ポリペプチドを免疫グロブリンＦｃ領域に結合することができる。
【００４４】
種々のよく知られている技術を使用して、ポリペプチドを製造することができる。前述したようにＤＮＡ配列によりコードされる組換えポリペプチドは、当業者に知られている種々の発現ベクターを使用してＤＮＡ配列から容易に製造することができる。組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含有する発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、任意の適当な宿主細胞において発現を達成することができる。適当な宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞および高等真核細胞を包含する。好ましくは、用いる宿主細胞は大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）、酵母または哺乳動物細胞系統、例えば、ＣＯＳまたはＣＨＯである。組換えタンパク質またはポリペプチドを培地の中に分泌する適当な宿主／ベクター系からの上清を、まず、商業的に入手可能なフィルターで濃縮することができる。濃縮後、濃縮物を適当な精製マトリックス、例えば、アフィニティーマトリックスまたはイオン交換樹脂に適用することができる。最後に、１またはそれ以上の逆相ＨＰＬＣ工程を用いて、組換えポリペプチドさらに精製することができる。
【００４５】
また、合成手段により、この分野においてよく知られている技術を使用して、約１００より少ないアミノ酸、一般に約５０より少ないアミノ酸を有するタンパク質および他の変異型を発生させることができる。例えば、このようなポリペプチドは、任意の商業的に入手可能な固相技術、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成法により合成することができ、ここでアミノ酸を成長するアミノ酸鎖に順次に付加する。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ８５：２１４９−２１４６、１９６３。ポリペプチドの自動化合成装置は、供給会社、例えば、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）／アプライド・バイオシステムス・ディビジョン（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）（フォスターシティー、カリフォルニア州）から商業的に入手可能であり、そして製造業者の使用説明書に従い操作することができる。
【００４６】
ある種の特定の態様において、ポリペプチドは、本明細書において記載する複数のポリペプチドを含んでなるか、あるいは本明細書において記載する少なくとも１つのポリペプチドおよび無関係の配列、例えば、既知の前立腺特異的タンパク質を含んでなる融合タンパク質であることができる。融合タンパク質は、例えば、Ｔヘルパーエピトープ（免疫学的融合相手）、好ましくはヒトにより認識されるＴヘルパーエピトープの提供を補助するか、あるいは自然組換えタンパク質よりも高い収率におけるタンパク質の発現を補助する（発現エンハンサー）ことができる。ある種の好ましい融合相手は、免疫学的融合相手および発現増強融合相手の両方である。他の融合相手は、タンパク質の溶解度を増加するか、あるいは所望の細胞内区画へのタンパク質のターゲッティングを可能とするように選択することができる。なおそれ以上の融合相手は、タンパク質の精製を促進する、親和標識を包含する。
【００４７】
融合タンパク質は、一般に、化学的結合を包含する、標準的技術に従い製造することができる。好ましくは、融合タンパク質は組換えタンパク質として発現され、発現系において、非融合タンパク質に関して、増加したレベルの産生を可能とする。簡単に述べると、ポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列を別々に組立て、適当な発現ベクターの中に結合することができる。ペプチドのリンカーを使用するか、または使用しないで、ポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端は、配列のリーディングフレームが相の中にあるように、第２ポリペプチドをコードする配列の５’末端に結合される。これにより、両方の成分ポリペプチドの生物学的活性が保持される単一の融合タンパク質への翻訳が可能となる。
【００４８】
各ポリペプチドがその二次および三元構造にフォルディングされることを保証するために十分な距離で、第１および第２のポリペプチド成分を分離するために、ペプチドリンカー配列を使用することができる。このようなペプチドリンカー配列を、この分野においてよく知られている標準的技術に従い、融合タンパク質の中に組込む。適当なペプチドリンカー配列は下記の因子に基づいて選択することができる：（１）柔軟な延長したコンフォメーションを採用する能力；（２）第１および第２のポリペプチド上のエピトープと相互作用できる二次構造を採用する能力；および（３）ポリペプチドの機能的エピトープと反応しうる疎水性または帯電した残基の欠如。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ残基を含有する。他の付近の中性アミノ酸、例えば、ＴｈｒおよびＡｌａをリンカー配列において使用することもできる。リンカーとして通常使用することができるアミノ酸配列は、下記の文献に記載されているアミノ酸配列を包含する：Ｍａｒａｔｅａ他、Ｇｅｎｅ  ４０：３９−４６、１９８５；Ｍｕｒｐｈｙ他、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３；８２５８−８２６２、１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号。リンカー配列は、一般に、１〜約５０アミノ酸長さであることができる。第１および第２のポリペプチドが機能的ドメインを分離しかつ立体障害を防止するために使用できる非必須Ｎ−末端アミノ酸残基を有するとき、リンカー配列は不必要である。
【００４９】
結合したＤＮＡ配列は、適当な転写または翻訳領域因子に作用可能に連鎖される。ＤＮＡの発現に関係する調節因子は、第１ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に対して５’のみに位置する。同様に、翻訳および転写終止シグナルを終わらせるために必要な停止コドンは、第２ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に対して３’のみに位置する。
【００５０】
また、無関係の免疫原性タンパク質と一緒に本発明のポリペプチドを含んでなる融合タンパク質が提供される。好ましくは、免疫原性タンパク質は再生応答を誘発することができる。このようなタンパク質の例は、破傷風、結核および肝炎タンパク質を包含する（例えば、下記の文献を参照のこと：Ｓｔｏｕｔｅ他、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．  Ｍｅｄ．３３６：８６−９１、１９９７）。
【００５１】
好ましい態様において、免疫学的融合タンパク質はプロテインＤ、すなわち、グラム陰性菌インフルエンザ菌Ｂ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の表面タンパク質に由来する（ＷＯ９１／１８９２６号）。好ましくは、プロテインＤ誘導体はほぼ１／３のタンパク質（例えば、第１Ｎ−末端の１００〜１１０アミノ酸）を含んでなり、そしてプロテインＤ誘導体は脂質化することができる。ある種の好ましい態様において、リポプロテインＤ融合タンパク質の最初の１０９残基をＮ−末端に含めて、追加の外因的Ｔ細胞エピトープをポリペプチドに与えかつ大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）における発現レベルを増加させる（こうして発現エンハンサーとして機能する）。脂質テイルは、抗原提示細胞への抗原の最適な提示を保証する。他の融合相手は、インフルエンザウイルスからの非構造タンパク質、ＮＳ１（血球凝集素）を包含する。典型的には、Ｎ−末端の８１アミノ酸を使用するが、Ｔヘルパーエピトープを包含する異なるフラグメントを使用することができる。
【００５２】
他の態様において、免疫学的融合相手はＬＹＴＡとして知られているタンパク質、またはその一部分（好ましくはＣ−末端部分）である。ＬＹＴＡはサッカロミセス・ニゥモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来し、アミラーゼＬＹＴＡ（ＬｙｔＡ遺伝子によりコードされる；Ｇｅｎｅ  ４３：２６５−２９２、１９８６）として知られているＮ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼを合成する。ＬＹＴＡはペプチドグリカンバックボーン中のある種の結合を特異的に分解するオートリシンである。ＬＹＴＡタンパク質のＣ−末端ドメインは、コリンまたはいくつかのコリンアナローグ、例えば、ＤＥＡＥに対するアフィニティーに関係する。この性質は、融合タンパク質の発現に有用なプラスミドを発現する大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）Ｃ−ＬＹＴＡの発生に利用されてきている。アミノ末端にＣ−ＬＹＴＡフラグメントを含有するハイブリッドタンパク質の精製は記載された（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７９５−７９８、１９９２参照）。好ましい態様において、ＬＹＴＡの反復部分を融合タンパク質の中に組込むことができる。反復部分は残基１７８において開始するＣ−末端領域の中に見出される。特に好ましい反復部分は残基１８８〜３０５を組込んでいる。
【００５３】
一般に、「単離された」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、そのもとの環境から取出されたものである。例えば、天然タンパク質は自然系の中に共存する物質のあるものまたはすべてから分離される場合、それは単離される。好ましくは、このようなポリペプチドは少なくとも約９０％の純度、より好ましくは少なくとも約９５％の純度、最も好ましくは少なくとも約９９％の純度である。ポリヌクレオチドは、例えば、自然環境の一部分ではないベクターの中にクローニングされる場合、それは単離されたと考慮される。
結合因子
本発明は、さらに、前立腺特異的タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントのような因子を提供する。本明細書において使用するとき、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、検出可能レベルで（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて）前立腺特異的タンパク質と反応するが、同様な条件下に無関係のタンパク質と検出可能に反応しない場合、それは前立腺特異的タンパク質「に特異的に結合する」と言われる。本明細書において使用するとき、「結合」は、複合体が形成するように、２つの別々の分子の間の非共有結合のアソシエーションを意味する。結合する能力は、例えば、複合体形成についての結合定数を決定することによって、評価することができる。結合定数は、複合体濃度を成分濃度の積で割って得られる値である。一般に、複合体形成の結合定数が約１０３Ｌ／モルを超えるとき、２つの成分は本発明の関係において「結合」すると言われる。結合定数は、この分野においてよく知られている方法により決定することができる。
【００５４】
結合因子は、本発明において提供される代表的アッセイを使用して、癌、例えば、前立腺癌をもつ患者と癌をもたない個体とを識別することができる。換言すると、前立腺特異的タンパク質に結合する抗体または他の結合因子は、疾患をもつ患者の少なくとも約２０％における癌の存在を示すシグナルを発生し、そして癌をもたない個体の少なくとも約９０％における疾患の不存在を示す陰性シグナルを発生するであろう。結合因子がこの要件を満足するかどうかを決定するために、癌をもつ患者および癌をもたない個体（標準的臨床試験を使用して決定する）からの生物学的試料（例えば、血液、血清、尿および／または腫瘍バイオプシー）を、本明細書において記載するように、結合因子に結合するポリペプチドの存在についてアッセイすることができる。疾患をもつ試料およびもたない試料の統計学的に有意な数をアッセイすべきであることは明らかであろう。各結合因子は上記基準を満足すべきである；しかしながら、当業者は認識するように、結合因子を組合わせて使用して感受性を改良することができる。
【００５５】
上記要件を満足する任意の因子は結合因子であることができる。例えば、結合因子は、ペプチド成分を含むか、あるいは含まない、リボソーム、ＲＮＡ分子またはポリペプチドであることができる。好ましい態様において、結合因子は抗体またはその抗原結合性フラグメントである。より好ましくは、本発明の方法において使用される抗体は、補体の活性化及び抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の仲介による腫瘍細胞の溶解を誘導する能力をもつ。ことなるクラス及びサブクラスの抗体は、上記特性が異なる。例えば、ＩｇＧ２ａとＩｇＧ３クラスは、抗体がそれに対して生じたところの抗原を発現する標的細胞への結合の間に血清補体を活性化することができ、そしてＡＤＣＣを仲介することができる。
抗体は当業者に知られている種々の技術により製造することができる。例えば、下記の文献を参照のこと：ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８。一般に、抗体は、本明細書において記載するモノクローナル抗体の発生を包含する、細胞培養技術により製造することができるか、あるいは、組換え抗体の産生を可能とするために、適当な細菌または哺乳動物細胞宿主の中に抗体遺伝子をトランスフェクトすることによって製造することができる。１つの技術において、ポリペプチドを含んでなる免疫原を最初に広範な種類の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジまたはヤギ）に注射する。工程において、本発明のポリペプチドは修飾を含まない免疫原として働くことができる。あるいは、特に比較的短いポリペプチドについて、ポリペプチドを担体タンパク質、例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニンに結合する場合、よりすぐれた免疫応答を誘発することができる。好ましくは１またはそれ以上のブースター免疫化の中に組込んだ前もって決定したスケジュールに従い、免疫原を動物宿主に注射し、そして周期的に動物から採血する。次いで、例えば、適当な固体の支持体にカップリングされたポリペプチドを使用するアフィニティークロマトグラフィーにより、ポリペプチドに対して特異的なポリクローナル抗体をこのような血清から精製することができる。
【００５６】
問題の抗原性ポリペプチドに対して特異的モノクローナル抗体は、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６：５１１−５１９、１９７６の技術およびその技術の改良を使用して製造することができる。簡単に述べると、これらの方法は所望の特異性（すなわち、問題のポリペプチドとの反応性）を有する抗体を製造することができる永久分裂能化細胞系統の調製を包含する。このような細胞系統は、例えば、前述したように免疫化された動物から得られた脾細胞から製造することができる。次いで、脾細胞を、例えば、骨髄腫細胞融合相手、好ましくは免疫化動物と同系であるものにより永久分裂能化する。種々の融合技術を使用することができる。例えば、脾細胞および骨髄腫細胞を非イオン性洗浄剤と数分間組合わせ、次いでハイブリッド細胞の成長を支持するが、骨髄腫細胞の成長を支持しない選択的培地上に低い密度でプレートすることができる。好ましい選択技術において、ＨＡＴ（ハイポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を使用する。十分な時間、通常約１〜２週後、ハイブリッドのコロニーが得られる。単一コロニーを選択し、それらの培養上清をポリペプチドに対する結合について試験する。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマは好ましい。
【００５７】
成長するハイブリドーマコロニーの上清から、モノクローナル抗体を単離することができる。さらに、種々の技術、例えば、適当な脊椎動物の宿主、例えば、マウスの腹腔の中へのハイブリドーマ細胞系統の注射を使用して収率を増大することができる。次いでモノクローナル抗体を腹水または血液から収集することができる。慣用技術、例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈降、および抽出により、汚染物質を抗体から除去することができる。本発明のポリペプチドは、精製方法、例えば、アフィニティークロマトグラフィー工程において使用することができる。
【００５８】
本発明のポリペプチドに特異的に結合するマウス及びウサギ・モノクローナル抗体の調製を以下に詳細に説明する。しかしながら、本発明の抗体は、マウス由来のものに限定されない。ヒト抗体も本発明において使用されうるし、好ましいものであることが証明されうる。このような抗体は、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ． （Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓａ， ｐ．７７， １９８５）により記載されるようなヒト・ハイブリドーマを使用して得られうる。本発明は、組換え手段により作られた抗体、例えば、可変領域と定常領域が異なる種に由来するキメラ抗体、及びその相補性決定領域が異なる種に由来するＣＤＲ−グラフト抗体であって、米国特許第４，８１６，５６７号及び第５，２２５，５３９号中に記載されるものをも包含する。キメラ抗体は、所望の生物学的活性、例えば、ヒト補体の活性化及びＡＤＣＣの仲介をもつヒト抗体分子の遺伝子とともに所望の抗原特異性をもつマウス抗体分子の遺伝子をスプライスすることにより調製されうる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１： ６８５１， １９８４； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３１２： ６０４， １９８４； Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３１４： ４５２， １９８５）。
【００５９】
ある種の態様において、抗体の抗原結合性フラグメントは好ましいことがある。このようなフラグメントは、標準的技術を使用して製造できる、Ｆａｂフラグメントを包含する。簡単に述べると、プロテインＡビーズカラム（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８）上のアフィニティークロマトグラフィーにより、免疫グロブリンをウサギ血清から精製し、パパインで消化してＦａｂおよびＦｃフラグメントを生成することができる。プロテインＡビーズカラム上のアフィニティークロマトグラフィーにより、ＦａｂおよびＦｃフラグメントを分離することができる。
【００６０】
本発明のモノクローナル抗体を１またはそれ以上の治療因子にカップリングすることができる。これに関して適当な治療因子は、放射性核種、分化誘導因子、薬剤、トキシン、およびそれらの誘導体を包含する。好ましい放射性核種は、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、２１１Ａｔ、および２１２Ｂｉを包含する。好ましい薬剤は、メトトレキセート、およびピリミジンおよびプリンアナローグを包含する。好ましい分化誘導因子は、ホルボールエステルおよび酪酸を包含する。好ましいトキシンは、リシン、アブリン、ジフテリアトキシン、コレラトキシン、ゲロニン、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）エキソトキシン、シゲラ［赤痢菌］（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）トキシン、およびアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質を包含する。
【００６１】
治療因子を適当なモノクローナル抗体に直接的または間接的（例えば、リンカー基を介して）にカップリング（例えば、共有結合）することができる。各々が他方と反応できる置換基を有するとき、因子と抗体との間の直接的反応が可能である。例えば、一方上の求核基、例えば、アミノまたはスルフヒドリル基は、他方上のカルボニルを含有する基、例えば、無水物または酸ハロゲン化物と、またはアルキル基を含有するすぐれた離脱基（例えば、ハロゲン化物）と反応することができる。
【００６２】
あるいは、リンカー基を介して治療因子および抗体をカップリングさせることが望ましいことがある。リンカー基は、抗体を因子と分離させて結合能力を妨害することを回避する、スペーサーとして機能することができる。リンカー基は、また、因子または抗体上の置換基の化学的反応性を増加し、こうしてカップリング効能を増加する働きをすることができる。化学的活性の増加は、また、そうでなければ不可能である、因子の使用、または因子上の官能基の使用を促進することができる。
【００６３】
当業者にとって明らかになるように、ホモ−およびヘテロ−機能的である種々の二官能価または多官能価の試薬（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、イリノイ州ロックフォード、のカタログに記載されているもの）をリンカー基として使用することができる。カップリングは、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基または酸化炭水化物残基を通して実施することができる。このような方法を記載する多数の参考文献、例えば、米国特許第４，６７１，９５８号（Ｒｏｄｗｅｌｌ他）が存在する。
【００６４】
本発明の免疫複合体の抗体部分から遊離されたとき、治療因子がいっそう効力があるとき、細胞の中へのインターナリゼーションの時または間に切断可能であるリンカー基を使用することが望ましい。多数の異なる切断可能なリンカー基が記載されてきている。これらのリンカー基からの因子の細胞内解放のメカニズムは、ジサルファイド結合の還元（例えば、米国特許第４，４８９，７１０号、Ｓｐｉｔｌｅｒ）、光不安定化結合の照射（例えば、米国特許第４，６２５，０１４号、Ｓｅｎｔｅｒ他）、誘導化アミノ酸側鎖の加水分解（例えば、米国特許第４，６３８，０４５号、Ｋｏｈｎ他）、血清補体仲介加水分解（例えば、米国特許第４，６７１，９５８号、Ｒｏｄｗｅｌｌ他）、および酸触媒加水分解（例えば、米国特許第４，５６９，７８９号、Ｂｌａｔｔｌｅｒ他）により切断を包含する。
【００６５】
抗体に２以上の因子をカップリングさせることが望ましいことがある。１つの態様において、複数の分子の因子を１つの抗体にカップリングさせる。他の態様において、２以上の型の因子を１つの抗体にカップリングさせる。特定の態様を無視して、２以上の因子との免疫複合体を種々の方法で製造することができる。例えば、２以上の因子を抗体分子に直接的にカップリングさせるか、あるいは複数の結合部位を提供するリンカーを使用することができる。あるいは、担体を使用することができる。
【００６６】
担体は、直接的またはリンカー基を介する共有結合を包含する、種々の方法で因子を支持することができる。適当な担体は、タンパク質、例えば、アルブミン（例えば、米国特許第４，５０７，２３４号、Ｋａｔｏ他）、ペプチドおよび多糖、例えば、アミノデキストラン（例えば、米国特許第４，６９９，７８４号、Ｓｈｉｈ他）を包含する。担体は、非共有結合により、または包封、例えば、リポソーム小胞内の包封（例えば、米国特許第４，４２９，００８号および米国特許第４，８７３，０８８号）により因子を支持することができる。放射性核種に対して特異的な担体は、放射性ハロゲン化された小さい分子およびキレート化化合物を包含する。例えば、米国特許第４，７３５，７９２号には、代表的な放射性ハロゲン化された小さい分子およびそれらの合成が開示されている。放射性核種のキレートをキレート化化合物から形成することができる。このようなキレート化化合物は、金属または金属酸化物、放射性核種と結合するドナー原子として、窒素および硫黄原子を含有する化合物を包含する。例えば、米国特許第４，６７３，５６２号（Ｄａｖｉｓｏｎ他）には、代表的な放射性キレート化化合物およびそれらの合成が開示されている。
【００６７】
抗体および免疫複合体の種々の投与経路を使用することができる。典型的には、投与は静脈内、筋肉内、皮下または切除した腫瘍ベッド中であろう。明らかになるように、抗体／免疫複合体の正確な投与量は、使用する抗体、腫瘍上の抗原密度、および抗体のクリアランス速度に依存するであろう。
Ｔ細胞
免疫療法組成物は、また、または選択的に、前立腺特異的タンパク質に対して特異的なＴ細胞を含んでなることができる。このような細胞は、一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで標準的手順に従い調製ことができる。例えば、Ｔ細胞は患者の骨髄、末梢血、または骨髄または末梢血の画分から、商業的に入手可能な細胞分離系、例えば、Ｎｅｘｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．， Ｉｒｖｉｎｅ， ＣＡから入手可能なＩＳＯＬＥＸ（商標）（また、米国特許第５，２４０，８５６号、米国特許第５，２１５，９２６号、ＷＯ８９／０６２８０号、ＷＯ９１／１６１１６号およびＷＯ９２／０７２４３号参照）を使用して単離することができる。あるいは、Ｔ細胞は関係するまたは無関係のヒト、非ヒト哺乳動物、細胞系統または培養物に由来することができる。
【００６８】
Ｔ細胞を前立腺特異的ポリペプチド、前立腺特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはこのようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）で刺激することができる。ポリペプチドに対して特異的なＴ細胞を発生させる条件下にかつ十分な時間の間、このような刺激は実施される。好ましくは、前立腺特異的ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、送出ベヒクル、例えば、微小球内に存在させて、特定のＴ細胞の発生を促進する。
【００６９】
Ｔ細胞がポリペプチドで被覆されているか、あるいはポリペプチドをコードする遺伝子を発現するターゲット細胞を殺す場合、Ｔ細胞は前立腺特異的ポリペプチドに対して特異的であると考慮する。種々の標準的技術に従い、Ｔ細胞の特異性を評価することができる。例えば、クロム解放アッセイまたは増殖アッセイにおいて、陰性対照に比較して、溶解および／または増殖の２倍より大きい増加の刺激指数はＴ細胞の特異性を示す。このようなアッセイは、例えば、Ｃｈｅｎ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５４：１０６５−１０７０、１９９４に記載されているように実施することができる。あるいは、Ｔ細胞の増殖の検出は種々の既知の技術により達成することができる。例えば、Ｔ細胞の増殖検出はＤＮＡ合成速度の増加を測定することによって達成することができる（例えば、Ｔ細胞の培養物をトリチウム化チミンでパルス標識化し、ＤＮＡの中に組込まれたトリチウム化チミンの量を測定することによって）。前立腺特異的ポリペプチド（１００ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは２００ｎｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ）と３〜７日間接触させると、Ｔ細胞の増殖は少なくとも２倍増加するであろう。２〜３時間前述したような接触は、標準的サイトカインアッセイにより測定して、Ｔ細胞を活性化させ、ここでサイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＦＮ−γ）のレベルの２倍の増加はＴ細胞の活性化を示す（下記の文献を参照のこと：Ｃｏｌｇａｎ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．  １、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｎｃｅ（Ｇｒｅｅｎ  １９９８）。前立腺特異的ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現ＡＰＣに応答して活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋であることができる。前立腺特異的タンパク質特異的Ｔ細胞を標準的技術に従い拡張することができる。好ましい態様において、Ｔ細胞は患者または関係するまたは無関係のドナーに由来し、刺激および拡張後に患者に投与される。
【００７０】
療法上の目的で、前立腺特異的ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはＡＰＣに応答して増殖するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の数をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて拡大することができる。例えば、Ｔ細胞を前立腺特異的ポリペプチドに、またはこのようなポリペプチドに対応する短いペプチドに、Ｔ細胞成長因子、例えば、インターロイキン−２および／または前立腺特異的ポリペプチドを合成する刺激因子の細胞を添加するか、あるいはしないで、再暴露させることができる。あるいは、前立腺特異的タンパク質の存在下に増殖する１またはそれ以上のＴ細胞の数をクローニングにより増加させることができる。細胞をクローニングする方法はこの分野においてよく知られており、そして限界希釈法を包含する。
医薬組成物およびワクチン
ある種の面において、本明細書に開示するポリペプチド、Ｔ細胞および／または結合因子を医薬組成物または免疫原性組成物（すなわち、ワクチン）の中に組込むことができる。医薬組成物は１またはそれ以上のこのような化合物と、薬学上許容される担体とを含んでなる。ワクチンは１またはそれ以上のこのような化合物と、免疫刺激剤を含んでなる。免疫刺激剤は、外因性抗原に対する免疫応答を増強する任意の物質であることができる。免疫刺激剤の例は、アジュバント、生物分解性微小球（例えば、ポリ乳酸ガラクチド）およびリポソーム（その中に化合物を組込む；例えば、米国特許第４，２３５，８７７号参照）を包含する。ワクチン調製物は、一般に、例えば、下記の文献に記載されている：Ｍ．Ｆ．  ＰｏｗｅｌｌおよびＭ．Ｊ．  Ｎｅｗｍａｎ、編、“Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ（ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ）”、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（ＮＹ、１９９５）。本発明の範囲内に入る医薬組成物およびワクチンは、また、生物学的に活性または不活性であることができる、他の化合物を含有することができる。例えば、他の腫瘍抗原の１またはそれ以上の免疫原性部分は、組成物またはワクチン内に、融合ポリペプチドの中に組込まれて、または別々の化合物として、存在することができる。
【００７１】
医薬組成物またはワクチンは、ポリペプチドがｉｎ  ｓｉｔｕで発生されるように、１またはそれ以上の前述のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有することができる。前述したように、ＤＮＡは核酸発現系、細菌およびウイルス発現系を包含する、当業者に知られている種々の送出系内に存在することができる。多数の遺伝子送出技術はこの分野においてよく知られており、例えば、Ｒｏｌｌａｎｄ、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｈｅｒａｐ．  Ｄｕｒｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １５：１４３−１９８、１９９８、およびその中に引用されている参考文献に記載されている。適当な核酸発現系は、患者における発現のために必要なＤＮＡ配列を含有する（例えば、適当なプロモーターおよび終止シグナル）。細菌の送出系は、細胞表面上でポリペプチドの免疫原性部分を発現するか、あるいはこのようなエピトープを分泌する細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｒｉｎ）の投与を包含する。好ましい態様において、ウイルス発現系（例えば、ワクシニアまたは他のポックスウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルス）を使用してＤＮＡを導入することができ、これは非病原性（欠陥）、複製競合ウイルスの使用を含むことができる。適当な系は、例えば、下記の文献に開示されている：Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈ他、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：３１７−３２１、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒ他、Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ５６９：８６−１０３、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒ他、Ｖａｃｃｉｎｅ  ８：１７−２１、１９９０；米国特許第４，６０３，１１２号、米国特許第４，７６９，３３０号、および米国特許第５，０１７，４８７号；ＷＯ８９／０１９７３号；米国特許第４，７７７，１２７号；ＧＢ２，２００，６５１号；ＥＰ０，３４５，２４２号；ＷＯ９１／０２８０５号；Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６−６２７、１９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４、１９９１；Ｋｏｌｌｓ他、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：２１５−２１９、１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒ他、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：１１４９８−１１５０２、１９９３；Ｇｕｚｍａｎ他、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８８：２８３８−２８４８、１９９３；およびＧｕｚｍａｎ他、Ｃｉｒ．  Ｒｅｓ．  ７３：１２０２−１２０７、１９９３。このような発現系の中にＤＮＡを組込む技術は当業者によく知られている。ＤＮＡは、また、例えば、下記の文献に記載されかつ概観されているように、「裸」であることができる：Ｕｌｍｅｒ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５−１７４９、１９９３およびＣｏｈｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１６９１−１６９２、１９９３。細胞の中に効率よく輸送される、生物分解性ビーズ上にＤＮＡを被覆することによって、裸ＤＮＡの吸収を増加させることができる。
【００７２】
当業者に知られている任意の適当な担体を本発明の医薬組成物において使用することができるが、担持の型は投与モードに依存して変化するであろう。本発明の組成物は、例えば、局所、経口、鼻、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下または筋肉内投与を包含する、任意の適当な投与方法のために処方することができる。非経口投与、例えば、皮下注射のために、担体は好ましくは水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックスまたは緩衝液を含んでなる。経口投与のために、任意の前述の担体または固体の担体、例えば、マンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウムを使用することができる。生物分解性微小球（例えば、ポリ乳酸ポリコレート）をまた本発明の医薬組成物の担体として使用することができる。適当な生物分解性微小球は、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号および米国特許第５，０７５，１０９号に開示されている。
【００７３】
このような組成物は、また、緩衝液（例えば、中性緩衝化生理食塩水またはリン酸塩緩衝液）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸、例えば、グリシン、酸化防止剤、キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）および／または保存剤を含んでなることができる。あるいは、本発明の組成物は凍結乾燥物として処方することができる。また、化合物をよく知られている技術に従いリポソーム内にカプセル化することができる。
【００７４】
種々の免疫刺激剤を、本発明のワクチンにおいて使用することができる。例えば、アジュバントを添加することができる。大部分のアジュバントは、急速な異化から抗原を保護するように設計された物質、例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油、および免疫応答の刺激因子、例えば、脂質Ａ、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）またはヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来タンパク質を含有する。適当なアジュバントは商業的に入手可能であり、例えば、次の通りである：フロインド不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ミシガン州デトロイト）；メルクアジュバント６５（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、ニュージャージイ州ターウェイ）；アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウムゲル（明礬）またはリン酸アルミニウム；カルシウム、鉄または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；カチオンまたはアニオン的に誘導化された多糖；ポリホスファゼン；生物分解性微小球；モノホスホリル脂質ＡおよびクイルＡ。サイトカイン、例えば、ＧＭ−ＣＳＦまたはインターロイキン−２、−７、または−１２をアジュバントとして使用することもできる。
【００７５】
本発明において提供されるワクチンにおいて、アジュバント組成物は好ましくは主としてＴｈ１型の免疫応答を誘導するように設計される。高いレベルのＴｈ１−型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は、投与された抗原に対する細胞仲介免疫応答の誘導を好む傾向がある。対照的に、高いレベルのＴｈ２−型サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＴＮＦ−β）は、ヒト免疫応答の誘導を好む傾向がある。本発明において提供されるワクチンの適用後、患者はＴｈ１−型およびＴｈ２−型応答を包含する免疫応答を支持するであろう。応答が主としてＴｈ１−型である、好ましい態様において、Ｔｈ１−型サイトカインのレベルはＴｈ２−型サイトカインのレベルよりも大きい程度に増加するであろう。これらのサイトカインのレベルは標準的アッセイに従い容易に評価することができる。サイトカインのファミリーの概観については、下記の文献を参照のこと：ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７：１４５−１７３，１９８９。
【００７６】
主としてＴｈ１−型応答の誘発において使用するために好ましいアジュバントは、例えば、モノホスホリル脂質Ａ、好ましくは３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）とアルミニウム塩との組合わせを包含する。ＭＰＬアジュバントは、リビ・イムノケム・リサーチ・インコーポレーテッド（Ｒｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）（モンタナ州ハミルトン；米国特許第４，４３６，７２７号、米国特許第４，８７７，６１１号、米国特許第４，８６６，０３４号および米国特許第４，９１２，０９４号参照）から入手可能である。ＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチド（ＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されてない）もまた主としてＴｈ１応答を誘導する。このようなオリゴヌクレオチドはこの分野においてよく知られており、そして、例えば、ＷＯ９６／０２５５５号に記載されている。他の好ましいアジュバントはサポニン、好ましくはＱＳ２１であり、単独でまたは他のアジュバントと組合わせて使用することができる。例えば、増強された系はモノホスホリル脂質Ａとサポニン誘導体との組合わせ、例えば、ＷＯ９４／００１５３号に記載されているＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの組合わせ、またはＷＯ９６／３３７３９号に記載されているような、ＱＳ２１がコレステロールでクエンチされている低いレアクトゲニック（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）組成物を包含する。他の好ましい組成物は、水中油型エマルジョンおよびトコフェロールを含んでなる。水中油型エマルジョン中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを含む特に効力のあるアジュバント処方物は、ＷＯ９５／１７２１０号に記載されている。抗原、免疫応答エンハンサーおよび適当な担体または賦形剤の組合わせを生ずる、よく知られている方法により、本発明において提供される任意のワクチンを製造することができる。
【００７７】
本明細書に記載する組成物は、持続放出性処方物（すなわち、投与後に化合物を遅く放出するカプセルまたはスポンジのような処方物）の一部分として投与することができる。このような処方物は、一般に、よく知られている技術により製造し、例えば、経口、経直腸または皮下移植により、または所望のターゲット部位における移植により投与することができる。持続放出性処方物は、担体マトリックスの中に分散されたおよび／または速度コントロール膜により取り囲まれた溜内に含有された、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体を含有することができる。このような処方物において使用する担体は生物適合性であり、また、生物分解性であることができる；好ましくは処方物は比較的一定レベルで活性化合物を放出する。持続放出性処方物中に含有される活性化合物の量は、移植部位、放出の速度および期待する期間および治療または予防すべき症状の特質に依存する。
【００７８】
種々の送出ベヒクルを医薬組成物およびワクチンにおいて使用して、腫瘍細胞をターゲットとする抗原特異的免疫応答の産生を促進することができる。送出ベヒクルは、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）、例えば、樹枝状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、単球および効率よいＡＰＣｓであるように操作することができる他の細胞を包含する。このような細胞は、遺伝的に修飾して、抗原を提示する能力を増加し、Ｔ細胞の応答の活性化および／または維持を改良し、抗腫瘍作用それ自体を有しおよび／または受容体と免疫学的に適合性とする（すなわち、ＨＬＡハプロタイプの合致）ことができるが、これは不必要である。ＡＰＣｓは一般に種々の生物学的流体および器官、例えば、腫瘍および腫瘍周囲組織から単離することができ、そしてオートロガス、同種異系、同系または異種の細胞であることができる。
【００７９】
本発明のある種の好ましい態様において、抗原提示細胞として樹枝状細胞またはその子孫を使用する。樹枝状細胞は高度に効力があるＡＰＣｓ（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２４５−２５１、１９９８）であり、そして予防的または治療的抗腫瘍免疫性を誘発するための生理学的アジュバントとして有効であることが示された（ＴｉｍｍｅｒｍａｎおよびＬｅｖｙ、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｍｅｄ．  ５０：５０７−５２９、１９９９参照）。一般に、樹枝状細胞はそれらの典型的な形状に基づいて（ｉｎ  ｓｉｔｕ星状、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで可視の顕著な細胞質プロセス（樹枝突起））、高効率で抗原を取り込み、プロセスし、そして提示するそれらの能力、並びにナイーブなＴＳ細胞応答を活性化させるそれらの能力に基づいて同定することができる。樹枝状細胞は、もちろん、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて普通に見出されない、特異的細胞表面のレセプターまたはリガンドを発現するように操作することができ、そしてこのような修飾された樹枝状細胞は本発明により意図される。樹枝状細胞に対する代替物として、分泌された小胞抗原負荷樹枝状細胞（エキソソームと呼ぶ）をワクチンにおいて使用することができる（Ｚｉｔｖｏｇｅｌ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  ４：５９４−６００、１９９８参照）。
【００８０】
樹枝状細胞および子孫は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周辺組織浸潤細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血または任意の他の適当な組織または流体から得ることができる。例えば、末梢血から収集した単球培養物にサイトカイン、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３および／またはＴＮＦαの組合わせを添加することによって、樹枝状細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで分化させることができる。あるいは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガンドおよび／または樹枝状細胞の成熟および増殖を誘導する１またはそれ以上の他の化合物を培地に添加することによって、末梢血、臍帯血または骨髄から収集したＣＤ３４陽性細胞を樹枝状細胞に分化させることができる。
【００８１】
樹枝状細胞は、従来、簡単な方法で２つのよく特性決定された表現型に区別することを可能とする、「未熟」および「成熟」細胞としてカテゴリー化されている。しかしながら、この命名法は分化のすべての可能な中間段階を排除すると解釈すべきではない。未熟樹枝状細胞は、抗原の吸収およびプロセシングについて高い能力を有するＡＰＣとして特徴づけられ、これはＦｃγレセプター、マンナナーゼレセプターおよびＤＥＣ−２０５マーカーの高い発現と相関する。成熟表現型は典型的にはこれらのマーカーの低い発現により特徴づけられるが、細胞表面の分子の高い発現はＴ細胞の活性化、例えば、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ、付着分子（例えば、ＣＤ５４およびＣＤ１１）および共同刺激分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及び４−１ＢＢ）に関係する。
【００８２】
前立腺特異的タンパク質（またはその一部分または他の変異型）をコードするポリヌクレオチドでＡＰＣｓを一般にトランスフェクトし、こうして前立腺特異的ポリペプチド、またはその免疫原性部分が細胞表面上で発現されるようすることができる。このようなトランスフェクションはｅｘ  ｖｉｖｏで実施することができ、次いでこのようなトランスフェクトされた細胞を含んでなる組成物またはワクチンを、本明細書において記載するように、療法上の目的で使用することができる。あるいは、樹枝状細胞または他の抗原提示細胞をターゲットとする遺伝子送出ベヒクルを患者に投与し、ｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクションを発生させることができる。ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、例えば、樹枝状細胞のトランスフェクションは、一般に、この分野において知られている方法、例えば、ＷＯ９７／２４４７０号に記載されている方法、またはＭａｈｖｉ他、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７５：４５６−４６０、１９９７に記載されている遺伝子ガンアプローチを使用して、実行することができる。樹枝状細胞または子孫細胞を前立腺腫瘍ポリペプチド、ＤＮＡ（裸またはプラスミドベクター内）またはＲＮＡと；または抗原を発現する細菌またはウイルス（例えば、ワクシニア、フォウポックス、アデノウイルスまたはレンチウイルスのベクター）とインキュベートすることによって、樹枝状細胞の抗原負荷を達成することができる。負荷の前に、Ｔ細胞ヘルプを提供する免疫学的相手（例えば、担体分子）にポリペプチドを共有結合させることができる。あるいは、樹枝状細胞を非複合化免疫学的相手で、別々にまたはポリペプチドの存在下に、パルスすることができる。
癌の療法
本発明の他の面において、本明細書に記載する組成物を癌、例えば、前立腺癌の免疫療法に使用することができる。このような方法において、医薬組成物およびワクチンを典型的には患者に投与する。本明細書において使用するとき、「患者」は温血動物、好ましくはヒトを意味する。患者は癌をもつか、あるいはもたないことができる。したがって、前述の医薬組成物およびワクチンを使用して癌の発生を予防するか、あるいは癌を有する患者を治療することができる。この分野において一般に受け入れられている悪性腫瘍の存在を包含する基準を使用して、癌を診断することができる。一次腫瘍の外科的除去および／または放射線療法または慣用の化学療法薬剤の投与のような治療の前または後に、医薬組成物およびワクチンを投与することができる。
【００８３】
ある種の態様において、免疫療法は活性免疫療法であることができ、この免疫療法において、免疫応答改変因子（例えば、本明細書に開示するポリペプチドおよびポリヌクレオチド）の投与で腫瘍に対して反応させるように、内因性宿主免疫系のｉｎ  ｖｉｖｏ刺激により治療を実施する。
他の態様において、免疫療法は受身免疫療法であることができ、この免疫療法において、治療は確立された腫瘍−免疫反応性を有する因子（例えば、エフェクター細胞または抗体）の送出を包含し、このような因子は抗腫瘍作用を直接的または間接的に仲介することができ、そして無傷の宿主免疫系必ずしも依存しない。エフェクター細胞の例は次の通りである：前述のＴ細胞、Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球およびＣＤ４＋Ｔ−ヘルパー浸潤リンパ球）、キラー細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞およびリンホカイン活性化キラー細胞）、Ｂ細胞および本発明において提供されるポリペプチドを発現する抗原提示細胞（例えば、樹枝状細胞およびマクロファージ）。本明細書に記載するポリペプチドに対して特異的なＴ細胞レセプターおよび抗体レセプターをクローニングし、発現させ、適応免疫療法のための他のベクターまたはエフェクター細胞の中に転移させることができる。本発明において提供されるポリペプチドは、また、受身免疫療法のための抗体または抗イディオタイプ抗体を発生させるために使用することができる（前述したようにそして米国特許第４，９１８，１６４号に記載されているように）。
【００８４】
エフェクター細胞は、一般に、本明細書において記載するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ成長により適応免疫療法のための十分な量で得ることができる。ｉｎ  ｖｉｖｏ抗原認識を保持させて単一抗原特異的エフェクター細胞の数を数１０９に拡大する培養条件は、この分野においてよく知られている。このようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件は、典型的には、しばしばサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）および非分裂フィーダー細胞の存在下に、抗原で間欠的に刺激することを包含する。前述したように、本発明において提供される免疫反応性ポリペプチドを使用して抗原特異的Ｔ細胞培養物を拡張して、免疫療法のために十分な数の細胞を発生させることができる。特に、この分野においてよく知られている標準的技術に従い、抗原提示細胞、例えば、樹枝状細胞、マクロファージ、単球、繊維芽細胞またはＢ細胞を免疫反応性ポリペプチドでパルスするか、あるいは１またはそれ以上のポリヌクレオチドでトランスフェクトすることができる。例えば、組換えウイルスまたは他の発現系における発現を増加するために適当なプロモーターを有するポリヌクレオチドで、抗原提示細胞をトランスフェクトすることができる。療法において使用するための培養したエフェクター細胞は成長し、広く分布し、そしてｉｎ  ｖｉｖｏにおいて長期間生き残ることができなくてはならない。研究において、ＩＬ−２を補充した抗原を使用する反復刺激により、ｉｎ  ｖｉｖｏで成長し、実質的な数で長期間生き残るように、培養したエフェクター細胞を誘導することができることが示された（例えば、Ｃｈｅｅｖｅｒ他、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １５７：１７７、１９９７参照）。
【００８５】
あるいは、本明細書に記載するポリペプチドを発現するベクターを患者から取った抗原提示細胞の中に導入し、同一患者の中への移植し戻すためにｅｘ  ｖｉｖｏでクローン的に増殖させることができる。この分野において知られている手段を使用して、好ましくは無菌形態で、静脈内、空洞内、腹腔内または腫瘍内の投与により、トランスフェクトされた細胞を患者の中に再導入することができる。
【００８６】
本明細書に開示する療法組成物の投与の経路および頻度、ならびに投与量は、個体毎に変化し、標準的技術に従い容易に確立することができる。一般に、医薬組成物およびワクチンは注射により（例えば、皮膚内、筋肉内、静脈内または皮下）、鼻内（例えば、吸引による）または経口的に投与することができる。好ましくは、１〜１０投与量を５２週の期間にわたって投与することができる。好ましくは、６投与量を１月の間隔で投与し、そしてブースターワクチン接種をその後周期的に与える。適当な投与量は、前述したように投与したとき、抗腫瘍免疫応答を促進することができる化合物の量であり、そして基底（すなわち、未処理）レベルより少なくとも１０〜５０％上である。このような応答は、患者における抗腫瘍抗体を測定するか、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて患者の腫瘍細胞を殺すことができる細胞溶解性エフェクター細胞のワクチン依存的発生により、モニターすることができる。このようなワクチンは、また、非ワクチン接種患者に比較して、ワクチン接種した患者において改善された臨床的結果（例えば、いっそう頻繁な寛解、完全なまたは部分的またはより長い無疾患の生存）に導く免疫応答を引き起こすことができる。一般に、１またはそれ以上のポリペプチドを含んでなる医薬組成物およびワクチンについて、投与量の中に存在する各ポリペプチドの量は約１００μｇ〜５ｍｇ／ｋｇ宿主の範囲である。適当な投与量は患者のサイズとともに変化するが、典型的には約０．１ｍｌ〜約５ｍｌの範囲である。
【００８７】
一般に、適当な投与量および治療の養生法は、療法的および／または予防的利益を提供するために十分な気圧で１またはそれ以上の活性化合物を提供する。このような応答は、非治療患者に比較して治療した患者において改善された臨床的結果（例えば、いっそう頻繁な寛解、完全なまたは部分的またはより長い無疾患の生存）を確立することによって、モニターすることができる。前立腺特異的タンパク質に対する前もって存在する免疫応答の増加は、一般に、臨床的結果の改善と相関する。このような免疫応答は、一般に、標準的増殖、細胞障害性またはサイトカインのアッセイにより評価することができ、このようなアッセイは治療前後に患者から得られた試料を使用して実施することができる。
癌を検出する方法
一般に、癌は患者から得られた生物学的試料（例えば、血液、血清、尿および／または腫瘍バイオプシー）中の１またはそれ以上の前立腺特異的タンパク質および／またはこのようなタンパク質腸溶性コーティングポリヌクレオチドの存在に基づいて、患者において検出することができる。換言すると、このようなタンパク質は癌、例えば、前立腺癌の存在または非存在を示すマーカーとして使用することができる。さらに、このようなタンパク質は他の癌の検出について有用であることがある。本発明において提供される結合因子は、一般に、生物学的試料中の因子に結合する抗原のレベルの検出を可能とする。ポリヌクレオチドのプライマーおよびプローブを使用して腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを検出することができ、これはまた癌の存在または非存在を示す。一般に、前立腺腫瘍配列は、正常組織におけるよりも腫瘍組織において少なくとも３倍高いレベルで存在するであろう。
【００８８】
試料中のポリペプチドマーカーを検出する結合因子を使用する種々のアッセイフォーマットが当業者に知られている。例えば、下記の文献を参照のこと：ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８。一般に、患者における癌の存在または非存在は、（ａ）患者から得られた生物学的試料を結合因子と接触させ；（ｂ）結合因子に結合するポリペプチドのレベルを試料中で検出し；そして（ｃ）ポリペプチドのレベルを前もって決定したカットオフ値と比較することによって、決定することができる。
【００８９】
好ましい態様において、このアッセイは固体の支持体上に固定化された結合因子を使用して、試料の残りからポリペプチドを結合し、除去することを包含する。次いでリポーター基を含有し、結合因子／ポリペプチド複合体に特異的に結合する検出試薬を使用して、結合したポリペプチドを検出することができる。このような検出試薬は、例えば、ポリペプチドまたは抗体に特異的に結合する結合因子を含んでなるか、あるいは結合因子、例えば、抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡまたはレクチンに特異的に結合する他の因子を含んでなることができる。あるいは、競合アッセイを利用することができ、ここでポリペプチドをリポーター基で標識化し、結合因子を試料とインキュベートした後、固定化された結合因子に結合させる。試料中の成分が標識化ポリペプチドの結合因子への結合を阻害する程度は、固定化された結合因子との試料の反応性を示す。このようなアッセイにおいて使用するために適当なポリペプチドは、前述したように、結合因子が結合する全長の前立腺特異的タンパク質およびその一部分を包含する。
【００９０】
固体の支持体は、タンパク質を結合させることができる、当業者に知られている任意の物質であることができる。例えば、固体の支持体はマイクロタイタープレート中の試験ウェルまたはニトロセルロースまたは他の適当な膜であることができる。あるいは、支持体はビーズまたはディスク、例えば、ガラス、ガラスファイバー、ラテックスまたはプラスチック材料、例えば、ポリスチレンまたはポリ塩化ビニルであることができる。支持体は、また、磁気粒子または繊維の光学的センサー、例えば、米国特許第５，３５９，６８１号に記載されているものであることができる。結合因子は、当業者に知られている種々の技術に従い固体の支持体上に固定化することができ、これらの技術は患者および科学文献に豊富に記載されている。本発明において、用語「固定化」は非共有結合のアソシエーション、例えば、吸着、および共有結合（これは因子と支持体上の官能基との間の直接的結合または架橋剤による結合であることができる）の両方を意味する。マイクロタイタープレート中のウェルまたは膜への吸着による固定化は好ましい。このような場合において、適当な緩衝液中の結合因子を固体の支持体と適当な時間の間接触させることによって、吸着を達成することができる。接触時間は温度とともに変化するが、典型的には約１時間〜約１日である。一般に、プラスチックのマイクロタイタープレートのウェル（例えば、ポリスチレンまたはポリ塩化ビニル）を約１０ｎｇ〜約１０μｇ、好ましくは約１００ｎｇ〜約１μｇの範囲の量の結合因子と接触させることは、適切な量の結合因子の固定化のために十分である。
【００９１】
固体の支持体への結合因子の共有結合は、一般に、最初に、支持体および結合因子上の官能基、例えば、ヒドロキシル基の両方と反応する二官能価の試薬と反応させることにより達成される。例えば、ベンゾキノンを使用するか、あるいは支持体上のアルデヒド基を結合因子上のアミンおよび活性水素と凝縮させることによって、適当なポリマーのコーティングを有する支持体に結合因子を共有結合させることができる（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９１、Ａ１２−Ａ１３参照）。
【００９２】
ある態様において、このアッセイは２つの抗体のサンドイッチアッセイである。このアッセイは、まず、固体の支持体、普通にマイクロタイタープレートのウェル上に固定化された抗体を試料と接触させ、こうして、試料中のポリペプチドを固定化された抗体に結合させることによって実行することができる。次いで非結合試料を固定化ポリペプチド−抗体複合体から除去し、リポーター基を含有する検出試薬（好ましくはポリペプチド上の異なる部位に結合することができる第２抗体）を添加する。次いで固体の支持体に結合して止まる検出試薬の量を、特定のリポーター基に適当な方法により測定する。
【００９３】
さらに詳しくは、いったん抗体が前述したように固体の支持体上に固定化されると、残りのタンパク質結合部位を典型的にはブロックする。適当なブロッキング剤、例えば、ウシ血清アルブミンまたはＴｗｅｅｎ  ２０（商標）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、ミゾリー州セントルイス）は当業者に知られている。次いで固定化抗体を試料とインキュベートし、そしてポリペプチドを抗体に結合させる。インキュベーション前に、試料を適当な緩衝液、例えば、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で希釈する。一般に、適当な接触時間（すなわち、インキュベーション時間）は、前立腺癌を有する個体から得られた試料中のポリペプチドの存在を検出するために十分である。好ましくは、接触時間は、結合したポリペプチドと非結合ポリペプチドとの間の平衡において達成されるレベルの約９５％であるレベルを達成するために十分である。当業者は認識するように、ある時間にわたって起こる結合レベルをアッセイすることによって、平衡を達成するために必要な時間を容易に決定することができる。室温において、約３０分のインキュベーション時間は一般に十分である。
【００９４】
次いで固体の支持体を適当な緩衝液、例えば、０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０（商標）を含有するＰＢＳで洗浄することによって、非結合試料を除去することができる。次いでリポーター基を含有する第２抗体を添加する。好ましいリポーター基は前述の基を包含する。
次いで結合したポリペプチドを検出するために十分な時間の間、検出試薬を固定化抗体−ポリペプチド複合体とインキュベートする。一般に、ある時間にわたって起こる結合レベルをアッセイすることによって、適当な時間を決定することができる。次いで非結合検出試薬を除去し、結合した検出試薬をリポーター基により検出する。リポーター基の検出に使用する方法は、リポーター基の性質に依存する。放射性基について、シンチレーションカウンティングまたはオートラジオグラフィー法は一般に適当である。分光光度測定法を使用して色素、発光基および蛍光基を検出することができる。異なるリポーター基（普通に放射性または蛍光基または酵素）にカップリングされた、アビジンを使用して、ビオチンを検出することができる。酵素のリポーター基は一般に基質を添加し（一般に特定の時間の間）、次いで反応生成物の分光測定または他の分析により検出することができる。
【００９５】
癌、例えば、前立腺癌の存在または不存在を決定するために、固体の支持体に結合しているリポーター基から検出されたシグナルを一般に前もって決定したカットオフ値と比較する。１つの好ましい態様において、癌を検出するカットオフ値は、癌をもたない患者からの試料と固定化抗体をインキュベートしたとき得られた、平均シグナルである。一般に、前もって決定したカットオフ値よりも３標準偏差大きいシグナルを発生する試料は、癌について陽性であると考える。別の好ましい態様において、カットオフ値は、下記の文献の方法に従い、レシーバー・オペレーター・カーブ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｏｒ  Ｃｕｒｖｅ）を使用して決定される：Ｓａｋｅｔｔ他、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｎｅ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、１９８５、ｐ．  １０６−７。簡単に述べると、この態様において、診断試験結果についての各可能なカットオフ値に対応する真の陽性割合（すなわち、感受性）および偽の陽性割合（１００％の特異性）の対のプロットから、カットオフ値を決定することができる。上左隅に最も近いプロットのカットオフ値（すなわち、最大面積を取り囲む値）は最も正確なカットオフ値であり、そしてこの方法により決定されたカットオフ値よりも高いシグナルを発生する試料は陽性であると考えることができる。あるいは、カットオフ値をプロットに沿って左にシフトさせて、偽の陽性割合を最小にするか、あるいは右にシフトさせて、偽の陰性割合を最小にすることができる。一般に、この方法により決定されたカットオフ値よりも高いシグナルを発生する試料は癌について陽性であると考えられる。
【００９６】
関係する態様において、アッセイはフロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）またはストリップ・テスト・フォーマットで実施し、ここで結合因子を膜、例えば、ニトロセルロース上に固定化する。フロースルー試験において、試料が膜を通過するとき、試料中のポリペプチドは固定化結合因子に結合する。第２に、第２結合因子を含有する溶液が数を通過するとき、標識化結合因子は結合因子−ポリペプチド複合体に結合する。次いで、結合した第２結合因子の検出を前述したように実行することができる。ストリップ試験において、結合因子が結合した膜の１端を試料を含有する溶液の中に浸漬させる。試料は膜に沿って第２結合因子を含有する領域を通して、固定化結合因子の領域へ移動する。固定化抗体の領域における第２結合因子の濃縮は、癌の存在を示す。典型的には、その部位における第２結合因子の濃縮は、視的に読取ることができるパターン、例えば、線を発生する。このようなパターンの非存在は陰性結果を示す。一般に、前述のフォーマットにおいて、２抗体サンドイッチアッセイにおいて陽性シグナルを発生するために十分であるレベルのポリペプチドを生物学的試料が含有するとき、視的に識別できるパターン発生するように、膜上に固定化された結合因子の量は選択される。このようなアッセイにおいて使用するために好ましい結合因子は、抗体およびそれらの抗原結合性フラグメントである。好ましくは、膜上に固定化された抗体の量は、約２５ｎｇ〜約１μｇ、より好ましくは約５０ｎｇ〜約５００ｎｇの範囲である。典型的には、このような試験は非常に少量の生物学的試料を使用して実行することができる。
【００９７】
もちろん、本発明のタンパク質または結合因子とともに使用するために適当な、多数の他のアッセイプロトコルが存在する。上の説明は単なる例示であることを意図する。例えば、当業者にとって明らかなように、生物学的試料中の前立腺特異的ポリペプチドに結合する抗体を検出するために、このようなポリペプチドを使用するように、上記プロトコルを容易に変更することができる。このような前立腺特異的タンパク質特異的抗体の検出を癌の存在と相関させることができる。
【００９８】
また、または選択的に、生物学的試料中の前立腺特異的タンパク質と特異的に反応するＴ細胞の存在に基づいて、癌を検出することができる。ある種の方法において、患者から単離されたＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含んでなる生物学的試料を、前立腺特異的タンパク質、このようなペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはこのようなポリペプチドの少なくとも免疫原性部分を発現するＡＰＣとインキュベートし、Ｔ細胞の存在または非存在を検出する。適当な生物学的試料は単離されたＴ細胞を包含するが、これらに限定されない。例えば、日常的技術（例えば、末梢血リンパ球のフィコール／ハイパーク（Ｆｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ）密度勾配遠心）により、Ｔ細胞を患者から単離することができる。Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで３７℃において前立腺特異的ポリペプチド（例えば、５〜２５μｇ／ｍｌ）と２〜９日間（典型的には４日間）インキュベートすることができる。前立腺腫瘍タンパク質の非存在下にＴ細胞試料の他のアリコートをインキュベートして対照として働かせることが望ましいことがある。ＣＤ４＋Ｔ細胞について、Ｔ細胞の増殖を評価することによって、活性化を検出することが好ましい。ＣＤ８＋Ｔ細胞について、細胞溶解活性を評価することによって、活性化を検出することが好ましい。無疾患患者におけるよりも少なくとも２倍大きい増殖レベルおよび／または少なくとも２０％大きい細胞溶解活性レベルは、患者における癌の存在を示す。
【００９９】
前述したように、また、または選択的に、生物学的試料中の前立腺特異的タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルに基づいて、癌を検出することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイにおいて、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、生物学的試料に由来する前立腺特異的ｃＤＮＡの一部分を増幅することができ、ここでオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも一方は前立腺特異的タンパク質をコードするポリヌクレオチドに対して特異的である（すなわち、それに対してハイブリダイゼーションする）。次いでこの分野においてよく知られている技術、例えば、電気泳動を使用して、増幅されたｃＤＮＡを分離し、検出する。同様に、前立腺特異的タンパク質をコードするポリヌクレオチドに対して特異的にハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用して、生物学的試料中の腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在を検出することができる。
【０１００】
アッセイ条件下にハイブリダイゼーションを可能とするために、オリゴヌクレオチドのプライマーおよびプローブは、少なくとも１０ヌクレオチド長さ、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長さである、前立腺特異的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部分に対して少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９０％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を含んでなる。好ましくは、オリゴヌクレオチドのプライマーおよび／またはプローブは、上記において定義した、適度にストリンジェントな条件下に、本明細書に開示するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対してハイブリダイゼーションするであろう。本明細書に記載する診断法において通常使用することができる、オリゴヌクレオチドのプライマーおよび／またはプローブは好ましくは少なくとも１０〜４０ヌクレオチド長さである。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１〜１１１、１１５〜１７１、１７３〜１７５、１７７、１７９〜３０５、３０７〜３１５、３２６、３２８、３３０、３３２〜３３５、３４０〜３７５、３８１、３８２、３８４−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、及び５３６に記載する配列を有するＤＮＡ分子の少なくとも１０隣接ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５隣接ヌクレオチドを含んでなる。ＰＣＲをベースとするアッセイおよびハイブリダイゼーションアッセイの両方についての技術はこの分野においてよく知られている（例えば、下記の文献を参照のこと：Ｍｕｌｌｉｓ他、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．  Ｑｕａｎｔ．  Ｂｉｏｌ．  ５１：２６３，１９８７；Ｅｒｌｉｃｈ編、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９８９）。
【０１０１】
１つの好ましいアッセイにおいて、ＲＴ−ＰＣＲを使用し、ここでＰＣＲを逆転写と組み合わせて適用する。典型的には、ＲＮＡを生物学的試料、例えば、バイオプシー組織から抽出し、逆転写してｃＤＮＡ分子を生成する。少なくとも１つの特異的プライマーを使用するＰＣＲ増幅はｃＤＮＡ分子を発生し、これを、例えば、ゲル電気泳動により分離し、可視化することができる。被験患者からおよび癌をもたない個体から取った生物学的試料について、増幅を実行することができる。２桁の大きさにわたるｃＤＮＡのいくつかの希釈物について、増幅反応を実行することができる。非癌試料の同一希釈物に比較して被験患者の試料のいくつかの希釈物における２倍またはそれより大きい発現の増加は、典型的には陽性と考える。
【０１０２】
他の態様において、開示された組成物を癌進行のマーカーとして使用することができる。この態様において、癌の診断について前述したアッセイを経時的に実行し、そして１またはそれ以上の反応性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルの変化を評価することができる。例えば、アッセイを６カ月〜１年の期間の間２４〜７２時間毎に実行し、その後、必要に応じて実行することができる。一般に、検出されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが経時的増加する患者において、癌は進行している。対照的に、反応性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが一定に止まるか、あるいは時間とともに減少するとき、癌は進行していない。
【０１０３】
ある種のｉｎ  ｖｉｖｏ診断アッセイを腫瘍について直接的に実行することができる。１つのこのようなアッセイは腫瘍細胞を結合因子と接触させることを包含する。次いで結合した結合因子をリポーター基により直接的または間接的に検出することができる。また、このような結合因子は組織学的用途において使用することができる。
【０１０４】
前述したように、感度を改良するために、多数の前立腺特異的タンパク質マーカーを所定の試料においてアッセイすることができる。本発明において提供される異なるタンパク質に対して特異的な結合因子を、単一のアッセイにおいて組合わせることができることは明らかであろう。日常的実験をベースとしてタンパク質マーカーを選択して、最適な感度を生ずる組合わせを決定する。さらに、または選択的に、本発明において提供されるタンパク質についてのアッセイを、他の既知の腫瘍抗原についてのアッセイと組合わせることができる。
診断キット
本発明は、さらに、上記診断方法において使用するためのキットを提供する。このようなキットは、診断アッセイを実行するために必要な２またはそれ以上の構成成分を含んでなる。構成成分は化合物、試薬、容器および／または装置であることができる。例えば、キット内の１つの容器は、前立腺特異的タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含有することができる。このような抗体またはフラグメントは、前述したように、支持物質に結合された形態で提供することができる。１またはそれ以上の追加の容器は、アッセイにおいて使用すべき因子を取り囲むことができる。このようなキットは、また、または選択的に、抗体結合の直接的または間接的検出に適当なリポーター基を含有する、前述の検出試薬を含有することができる。
【０１０５】
あるいは、生物学的試料中の前立腺特異的タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを検出するようにキットを設計することができる。このようなキットは、一般に、前立腺特異的タンパク質をコードするポリヌクレオチドに対してハイブリダイゼーションする、少なくとも１つの前述のオリゴヌクレオチドのプローブまたはプライマーを含んでなる。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用することができる。このようなキット内に存在することができる追加の成分は、前立腺特異的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの検出を促進する第２オリゴヌクレオチドおよび／または診断試薬または容器を包含する。
【０１０６】
下記の実施例は本発明の例示であるが、本発明を限定するものと解釈すべきではない。
実施例
実施例１
前立腺特異的ポリペプチドの単離および特性決定
この実施例において、前立腺腫瘍ｃＤＮＡライブラリーからのある種の前立腺特異的ポリペプチドの単離を記載する。
【０１０７】
製造業者のプロトコールに従いＤＮＡ合成のためのスーパースクリプト・プラスミド系（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）およびプラスミドクローニングキット（ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、マリイランド州２０８９７ガイサースバーグ）を使用して、ヒト前立腺腫瘍ｃＤＮＡ発現ライブラリーをポリＡ＋ＲＮＡから構築した。詳しくは、前立腺腫瘍組織をポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ、スイス国）で均質化し、トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）試薬（ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の指示に従いを使用して、全ＲＮＡを抽出する。次いでクイアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）オロゴテックススピンカラムｍＲＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州９１３５５サンタクラリタ）を製造業者のプロトコールに従いを使用して、ポリＡ＋ＲＮＡを精製した。ＮｏｔＩ／オリゴ−ｄＴ１８プライマーを使用して、第１鎖ｃＤＮＡを合成した。二本鎖ｃＤＮＡを合成し、ＥｃｏＲＩ／ＢＡＸＩアダプター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）と結合させ、ＮｏｔＩで消化した。クロマ・スピン（Ｃｈｒｏｍａ  Ｓｐｉｎ）−１０００カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）でサイズ分画した後、ｃＤＮＡをｐＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ部位の中に結合し、エレクトロンマックス（ＥｌｅｃｔｒｏｎＭａｘ）大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ細胞（ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の中にエレクトロポレーションにより形質転換させた。
【０１０８】
同一手順を使用して、正常ヒト膵臓ｃＤＮＡ発現ライブラリーを６組織検体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプールから調製した。独立コロニーの数の測定、インサートを担持するクローンの百分率、平均インサートサイズおよび配列分析により、ｃＤＮＡライブラリーを特性決定した。前立腺腫瘍ライブラリーは１．６４×１０７の独立コロニーを含有し、コロニーの７０％はインサートを有し、そして平均インサートサイズは１７４５塩基対であった。正常膵臓ｃＤＮＡライブラリーは３．３×１０６の独立コロニーを含有し、コロニーの６９％はインサートを有し、そして平均インサートサイズは１１２０塩基対であった。両方のライブラリーについて、配列分析はコロニーの大部分が全長のｃＤＮＡ配列を有し、ｍＲＮＡから合成され、ｒＲＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡの汚染は混合であることを示した。
【０１０９】
下記の文献に記載されているように、多少の変更を加えて、上記前立腺腫瘍および正常膵臓ｃＤＮＡライブラリーを使用して、ｃＤＮＡライブラリーのサブトラクションを実行した：Ｈａｒａ他、Ｂｌｏｏｄ  ８４：１８９−１９９、１９９４。詳しくは、前立腺腫瘍−特異的サブトラクテッドｃＤＮＡライブラリーを次のようにして発生させた。正常膵臓ｃＤＮＡライブラリー（７０μｇ）をＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ、およびＳｆｕＩで消化し、次いでＤＮＡポリメラーゼクレノーフラグメントと充填反応を実行した。フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈降後、ＤＮＡを１００μｌのＨ２Ｏ中に溶解し、加熱変性し、１００μｌ（１００μｇ）のフォトプローブビオチン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州バーリンゲイム）と混合した。製造業者が推奨するように、生ずる混合物を氷上において２７０ワットの太陽灯で２０分間照射した。追加のフォトプローブビオチン（５０μｌ）を添加し、ビオチニル化反応を反復した。ブタノールで５回抽出した後、ＤＮＡをエタノール沈降させ、２３μｌのＨ２Ｏ中に溶解してドライバーＤＮＡを形成した。
【０１１０】
トレーサーＤＮＡを形成するために、１０μｇの前立腺腫瘍ｃＤＮＡライブラリーをＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化し、フェノール−クロロホルム抽出し、クロマ・スピン−４００カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に通過させた。エタノール沈降後、トレーサーＤＮＡを５μｌのＨ２Ｏ中に溶解した。トレーサーＤＮＡを１５μｌのドライバーＤＮＡおよび２０μｌの２×ハイブリダイゼーション緩衝液（１．５ＭのＮａＣｌ／１０ｍＭのＥＤＴＡ／５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５／０．２％のドデシル硫酸ナトリウム）と混合し、鉱油をオーバーレイし、完全加熱変性した。試料を直ちに６８℃の水浴の中に移し、２０時間インキュベートした（長いハイブリダイゼーション［ＬＨ］）。次いで、この混合物をストレプトアビジンで処理し、次いでフェノール／クロロホルムで抽出した。この方法をさらに３回反復した。サブトラクテッドＤＮＡを沈降させ、１２μｌのＨ２Ｏ中に溶解し、８μｌのドライバーＤＮＡおよび２０μｌの２×ハイブリダイゼーション緩衝液と混合し、６８℃において２時間ハイブリダイゼーションした（短いハイブリダイゼーション［ＳＨ］）。ビオチニル化二本鎖ＤＮＡを除去した後、サブトラクテッドｃＤＮＡをクロラムフェニコール耐性ｐＢＣＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州９２０３７ラジョラ）のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位の中に結合させ、エレクトロマックズ（ＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ）大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ細胞の中にエレクトロポレーションにより形質転換して、前立腺腫瘍特異的サブトラクテッドｃＤＮＡライブラリー（「前立腺サブトラクション１」と呼ぶ）を発生させた。
【０１１１】
サブトラクテッドｃＤＮＡライブラリーを分析するために、プラスミドＤＮＡを１００の独立クローンから調製し、サブトラクテッド前立腺腫瘍特異的ライブラリーからランダムに取り上げ、インサートのサイズに基づいてグループに分けた。パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）／アプライド・バイオシステムス・ディビジョン（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）自動化配列決定装置３７３Ａ型（フォスターシティー、カリフォルニア州）を使用するＤＮＡ配列決定により、代表的なｃＤＮＡクローンをさらに特性決定した。６つのｃＤＮＡクローン（以後Ｆ１−１３、Ｆ１−１２、Ｆ１−１６、Ｈ１−１、Ｈ１−９およびＨ１−４と呼ぶ）は、サブトラクテッド前立腺特異的ｃＤＮＡライブラリーに富んでいることが示された。Ｆ１−１２について決定された３’および５’ｃＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号２および３で記載し、Ｆ１−１３、Ｆ１−１６、Ｈ１−１、Ｈ１−９およびＨ１−４について決定された３’ｃＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号１および４〜７で記載する。
【０１１２】
遺伝子バンクにおいて、ＥＭＢＬおよびＧｅｎｅＢａｎｋデータベース（リリース９６）を使用して、単離されたクローンのｃＤＮＡ配列を既知の配列と比較した。前立腺腫瘍ｃＤＮＡクローンの４つ、Ｆ１−１３、Ｆ１−１６、Ｈ１−１およびＨ１−４は、下記の以前に同定されたタンパク質をコードすることが決定された：前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ヒト腺カリクレイン、ヒト腫瘍発現増強遺伝子、およびミトコンドリアシトクロムＣオキシダーゼサブユニットＩＩ。Ｈ１−９は、以前に同定されたヒトの自律的に複製する配列と同一であることが見出された。Ｆ１−１２のｃＤＮＡ配列に対する有意な相同性は見出されなかった。
【０１１３】
引き続く研究はＦ１−１２の全長のｃＤＮＡ配列の単離に導いた。この配列を配列番号１０７に記載し、対応する予測されたアミノ酸配列は配列番号１０８に記載する。
低い存在量の前立腺腫瘍特異的遺伝子をクローニングするために、前述の前立腺腫瘍ｃＤＮＡライブラリーを正常膵臓ｃＤＮＡライブラリーでサブトラクトし、そして以前にサブトラクションされた前立腺腫瘍特異的ｃＤＮＡライブラリー中の３つの最も豊富な遺伝子：ヒト腺カリクレイン、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、およびミトコンドリアシトクロムＣオキシダーゼサブユニットＩＩでサブトラクトすることによって、ｃＤＮＡライブラリーのサブトラクションを実行した。詳しくは、ｐＣＤＮＡ３．１中の１μｇの各ヒト腺カリクレイン、ＰＳＡ、およびミトコンドリアシトクロムＣオキシダーゼサブユニットＩＩのｃＤＮＡをドライバーＤＮＡに添加し、サブトラクションを前述したように実行して、第２のサブトラクテッドｃＤＮＡライブラリー（以後「スパイクを有するサブトラクテッド前立腺腫瘍特異的ｃＤＮＡライブラリー」と呼ぶ）を形成した。
【０１１４】
スパイクを有するサブトラクテッド前立腺腫瘍特異的ｃＤＮＡライブラリーから、２２のｃＤＮＡクローンを単離した。クローン（Ｊ１−１７、Ｌ１−１２，Ｎ１−１８６２、Ｊ１−１３、Ｊ１−１９、Ｊ１−２５、Ｊ１−２４、Ｋ１−５８、Ｋ１−６３、Ｌ１−４およびＬ１−１４と呼ぶ）について決定された３’および５’ｃＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号８−９、１０−１１、１２−１３、１４−１５、１６−１７、１８−１９、２０−２１、２２−２３、２４−２５、２６−２７および２８−２９で記載する。クローン（Ｊ１−１２、Ｊ１−１６，Ｊ１−２１、Ｋ１−４８、Ｋ１−５５、Ｌ１−２、Ｌ１−６、Ｎ１−１８５８、Ｎ１−１８６０、Ｎ１−１８６１、Ｎ１−１８６４と呼ぶ）について決定された３’ｃＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号３０〜４０で記載する。前述したように、これらの配列を遺伝子バンク中の配列と比較すると、５つの最も豊富なＤＮＡ種（Ｊ１−１７、Ｌ１−１２およびＮ１−１８６２；それぞれ、配列番号８−９，１０−１１および１２−１３）に対して有意な相同性は明らかにされなかった。残りの２つの最も豊富な種のうちで、一方（Ｊ１−１２；配列番号３０）は以前に同定されたヒト肺界面活性剤アソシエートタンパク質と同一であり、そして他方（Ｋ１−４８；配列番号３３）は、２−アリールプロピオニル−ＣｏＡエピメラーゼについてのＲ．ｎｏｖｂｅｇｉｃｕｓ  ｍＲＮＡに対して多少の相同性を有すると決定された。スパイクを有するサブトラクテッド前立腺腫瘍特異的ｃＤＮＡライブラリーから単離された１７の低い存在量のｃＤＮＡクローンのうちで、４つ（Ｊ１−１６、Ｋ１−５５、Ｌ１−６およびＮ１−１８６４；それぞれ、配列番号３１、３４、３６および４０）は以前に同定された配列と同一であり、２つ（それぞれ、Ｊ１−２１およびＮ１−１８６０；配列番号３２および３８）は非ヒト配列に対して多少の相同性を示し、そして２つ（Ｌ１−２およびＮ１−１８６１；それぞれ、配列番号３５および３９）は既知のヒト配列に対して多少の相同性を示すことが見出された。ポリペプチドＪ１−１３、Ｊ１−１９、Ｊ１−２４、Ｊ１−２５、Ｋ１−５８、Ｋ１−６３、Ｌ１−４、Ｌ１−１４（それぞれ、配列番号１４−１５、１６−１７、２０−２１、１８−１９、２２−２３、２４−２５、２６−２７、２８−２９）に対して、有意な相同性は見出されなかった。
【０１１５】
引き続く研究は、Ｊ１−１７、Ｌ１−１２およびＮ１−１８６２（それぞれ、配列番号１０９〜１１１）について全長のｃＤＮＡ配列の単離に導いた。対応する予測されたアミノ酸配列を配列番号１１２〜１１４で記載する。また、Ｌ１−１２をまたＰ５０１Ｓと呼ぶ。
それ以上の実験において、前立腺腫瘍ｃＤＮＡライブラリーを３つの正常前立腺ポリＡ＋ＲＮＡのプールから調製した正常前立腺ｃＤＮＡでサブトラクトすることによって、４つの追加のクローンが同定された（「前立腺サブトラクション２」と呼ぶ）。３つのクローン（以後Ｕ１−３０６４、Ｕ１−３０６５、Ｖ１−３６９２および１Ａ−３９０５と呼ぶ）について決定されたｃＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号６９〜７２で記載する。決定された配列を遺伝子バンク中の配列と比較すると、Ｕ１−３０６５に対する有意な相同性は明らかにされなかった。
【０１１６】
スパイクを有する前立腺腫瘍特異的ｃＤＮＡライブラリーを正常膵臓ｃＤＮＡライブラリーでサブトラクトすることによって、スパイクを使用する第２のサブトラクション「前立腺サブトラクション２」と呼ぶ）を実行し、さらにＰＳＡ、Ｊ１−１７、肺界面活性剤アソシエートタンパク質、ミトコンドリアＤＮＡ、シトクロムＣオキシダーゼサブユニットＩＩ、Ｎ１−１８６２、自律的に複製する配列、の中に結合１２および腫瘍発現増強遺伝子でスパイクした。４つの追加のクローン（以後ｖ１−３６８６、Ｒ１−２３３０、１Ｂ−３９７６およびｖ１−３６７９と呼ぶ）が単離された。これらのクローンについて決定されたｃＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号７３〜７６で記載する。決定された配列を遺伝子バンク中の配列と比較すると、Ｖ１−３６８６およびＲ１−２３３０に対する有意な相同性は明らかにされなかった。
【０１１７】
前述の３つの前立腺サブトラクションのそれ以上の分析（前立腺サブトラクション２、スパイクを有するスパイクを有するサブトラクテッド前立腺腫瘍特異的ｃＤＮＡライブラリー、および前立腺サブトラクション２）において、１６の追加のクローン（１Ｇ−４７３６、１Ｇ−４７３８、１Ｇ−４７４１、１Ｇ−４７４４、１Ｇ−４７３４、１Ｈ−４７７４、１Ｈ−４７８１、１Ｈ−４７８５、１Ｈ−４７８７、１Ｈ−４７９６、１Ｉ−４８１０、１Ｉ−４８１１、１Ｊ−４８７６、１Ｋ−４８８４および１Ｋ−４８９６と呼ぶ）が同定された。前述したように決定された配列を遺伝子バンク中の配列と比較すると、１Ｇ−４７４１、１Ｇ−４７３４、１Ｉ−４８０７、１Ｊ−４８７６および１Ｋ−４８９６（それぞれ、配列番号７９、８１、８７、９０および９２）に対する有意な相同性は明らかにされなかった。単離されたクローンをさらに分析すると、１Ｇ−４７３６、１Ｇ−４７３８、１Ｇ−４７４１、１Ｇ−４７４４、１Ｈ−４７７４、１Ｈ−４７８１、１Ｈ−４７８５、１Ｈ−４７８７、１Ｈ−４７９６、１Ｉ−４８０７、１Ｊ−４８７６、１Ｋ−４８８４および１Ｋ−４８９６について延長されたｃＤＮＡ配列が決定され、それぞれ、配列番号１７９〜１８８および１９１〜１９３で記載し、そして１Ｉ−４８１０および１Ｉ−４８１１について追加の部分的ｃＤＮＡ配列が決定された、それぞれ、配列番号１８９および１９０で記載する。
【０１１８】
前立腺サブトラクション２を使用する追加の研究において、さらに３つのクローンが単離された。それらの配列を前述したように決定し、最近のＧｅｎＢａｎｋに対して比較した。すべての３つのクローンは既知の遺伝子に対して相同性を有することが見出され、これらはシステインに富んだタンパク質、ＫＩＡＡ０２４２、およびＫＩＡＡ０２８０（それぞれ、配列番号３１７、３１９および３２０）である。Ｓｙｎｔｅｎｉマイクロアレイ（Ｓｙｎｔｅｎｉ、カリフォルニア州パロアルト）によりこれらのクローンをさらに分析すると、すべての３つのクローンは大部分の前立腺腫瘍および前立腺ＢＰＨ、ならびに試験した正常前立腺組織の大部分において過剰発現されたが、すべての他の正常組織における発現は低かった。
【０１１９】
正常膵臓ｃＤＮＡライブラリーを正常膵臓ｃＤＮＡでサブトラクトすることによって、追加のサブトラクションを実行した（「前立腺サブトラクション３」）。これにより、６つの追加のクローン（１Ｇ−４７６１、１Ｇ−４７６２、１Ｈ−４７６６，１Ｈ−４７７０、１Ｈ−４７７１および１Ｈ−４７２２と呼ぶ）（それぞれ、配列番号９３〜９８）が同定された。これらの配列を遺伝子バンク中の配列と比較すると１Ｇ−４７６１および１Ｈ−４７７１（それぞれ、配列番号９３および９７）に対する有意な相同性は明らかにされなかった。単離されたクローンをさらに分析すると、１Ｇ−４７６１、１Ｇ−４７６２、１Ｈ−４７６６および１Ｈ−４７２２について延長されたｃＤＮＡ配列が決定され、それぞれ、配列番号１９４〜１９６および１９９で記載し、そして１Ｈ−４７７０および１Ｈ−４７７１について追加の部分的ｃＤＮＡ配列が決定された、それぞれ、配列番号１９７および１９８で記載する。
【０１２０】
３人の前立腺癌患者からのポリＡ＋ＲＮＡのプールから調製された、前立腺腫瘍ｃＤＮＡライブラリーを正常膵臓ｃＤＮＡライブラリーでサブトラクトする（前立腺サブトラクション４）と、８つのクローン（１Ｄ−４２９７、１Ｄ−４３０９、１Ｄ．１−４２７８、１Ｄ−４２８８、１Ｄ−４２８３、１Ｄ−４３０４、１Ｄ−４２９６および１Ｄ−４２８０と呼ぶ）（それぞれ、配列番号９９〜１０７）が同定された。これらの配列を前述したように遺伝子バンク中の配列と比較した。１Ｄ−４２８３および１Ｄ−４３０４（それぞれ、配列番号１０３および１０４）に対して、有意な相同性は見出されなかった。単離されたクローンをさらに分析すると、１Ｄ−４３０９、１Ｄ．１−４２７８、１Ｄ−４２８８、１Ｄ−４２８３、１Ｄ−４３０４、１Ｄ−４２９６および１Ｄ−４２８０について延長されたｃＤＮＡ配列が決定され、それぞれ、配列番号２００〜２０６で記載する。
【０１２１】
前述の前立腺サブトラクション１および前立腺サブトラクション２において単離されたｃＤＮＡクローンをコロニーＰＣＲ増幅し、そしてマイクロアレイ技術（Ｓｙｎｔｅｎｉ、カリフォルニア州パロアルト）により、前立腺腫瘍、正常前立腺および種々の他の正常組織における、それらのｍＲＮＡ発現レベルを測定した。簡単に述べると、ＰＣＲ増幅生成物をアレイフォーマットでスライド上に点在させ、各生成物はアレイ中のユニーク位置を占有した。ｍＲＮＡを試験すべき組織試料から抽出し、逆転写し、蛍光標識化ｃＤＮＡプローブを発生させた。マイクロアレイを標識化ｃＤＮＡプローブでプロービングし、スライドを走査し、蛍光強度を測定した。この強度はハイブリダイゼーション強度と相関する。２つのクローン（Ｐ５０９ＳおよびＰ５１０Ｓ）は前立腺腫瘍および正常前立腺において過剰発現され、そして試験したすべての他の正常組織（肝臓、膵臓、皮膚、骨髄、脳、乳房、副腎、膀胱、精巣、唾液腺、大腸、腎臓、卵巣、肺、脊髄、骨格筋および結腸）において低いレベルで発現された。Ｐ５０９ＳおよびＰ５１０Ｓについて決定されたｃＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号２２３および２２４で記載する。前述したように、これらの配列を遺伝子バンク中の配列と比較すると、以前に同定されたＥＳＴｓについて多少の相同性が明らかにされた。
【０１２２】
追加の研究において、Ｐ５０９Ｓクローンについて全長のｃＤＮＡ配列が単離された。この配列を配列番号３３２で記載し、対応する予測されたアミノ酸配列を配列番号３３９で記載する。Ｐ５１０Ｓの２つの変異型全長ｃＤＮＡ配列を、配列番号５３７と５３８に提供する対応の推定アミノ酸配列にそれぞれ対応する配列番号５３５と５３６に提供する。
実施例２
前立腺特異的ポリペプチドの組織特異性の決定
遺伝子特異的プライマーを使用して、代表的な前立腺特異的ポリペプチドＦ１−１６、Ｈ１−１，Ｊ１−１７（また、Ｐ５０２Ｓと呼ぶ）、Ｌ１−１２（また、Ｐ５０１Ｓと呼ぶ）、Ｆ１−１２（また、Ｐ５０４Ｓと呼ぶ）およびＮ１−１８６２（また、Ｐ５０３Ｓと呼ぶ）についてｍＲＮＡ発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲにより種々の正常組織および腫瘍組織において検査した。
【０１２３】
簡単に述べると、前述したようにトリゾール剤を使用して種々の正常組織および腫瘍組織から全ＲＮＡを抽出した。１〜２μｇの全ＲＮＡおよびスーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を４２℃において１時間使用して、第１鎖の合成を実施した。次いで遺伝子特異的プライマーを使用するＰＣＲにより、ｃＤＮＡを増幅した。ＲＴ−ＰＣＲの半定量的特質を保証するために、検査した組織の各々についての内部対照としてβ−アクチンを使用した。まず、第１鎖ｃＤＮＡの連続希釈物を調製し、β−アクチン特異的プライマーを使用してＰＣＲアッセイを実行した。β−アクチン鋳型の直線範囲の増幅を可能としかつ初期コピー数の差を反映するために十分に感受性である、希釈物を選択した。これらの条件を使用して、各組織からの各逆転写反応について、β−アクチンレベルを測定した。ＤＮアーゼ処理により、そして逆転写酵素を添加しないで調製した第１鎖ｃＤＮＡを使用するとき、陰性ＰＣＲ結果を保証することによって、ＤＮＡ汚染を最小にした。
【０１２４】
４つの異なる腫瘍組織（２人の患者からの前立腺腫瘍、３人の患者からの乳房腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍）、および前立腺、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、骨格筋、皮膚、胃、精巣、骨髄および脳を包含する、１６の異なる正常組織において、ｍＲＮＡ発現レベルを検査した。Ｆ１−１６は前立腺腫瘍組織、結腸腫瘍および正常前立腺において高度にレベルで発現され、そして正常の肝臓、皮膚および精巣において低いレベルで発現されることが見出され、発現は検査した他の組織において検出不可能であった。Ｈ１−１は前立腺腫瘍組織、肺腫瘍、乳房腫瘍、正常前立腺、正常結腸および正常脳において高度にレベルで発現され、正常肺、膵臓、骨格筋、皮膚、小腸、骨髄において非常に低いレベルで発現されることが見出され、そして他の組織において検出されなかった。Ｊ１−１７（Ｐ５０２Ｓ）それはＬ１−１２（Ｐ５０１Ｓ）は前立腺において特異的に過剰発現されるように見え、両方の遺伝子は前立腺腫瘍および正常前立腺において高いレベルで発現されるが、検査したすべての他の組織において低い〜検出不可能なレベルで発現された。Ｎ１−１８６２（Ｐ５０３Ｓ）は前立腺腫瘍の６０％において過剰発現され、そして正常の結腸および腎臓において検出可能であることが見出された。こうして、ＲＴ−ＰＣＲの結果が示すように、Ｆ１−１６、Ｈ１−１、Ｊ１−１７（Ｐ５０２Ｓ）、Ｎ１−１８６２（Ｐ５０３Ｓ）およびＬ１−１２（Ｐ５０１Ｓ）は前立腺特異的であるか、あるいは前立腺において有意に増加したレベルで発現される。
【０１２５】
さらに、ＲＴ−ＰＣＲ試験を行ったところ、Ｆ１−１２（Ｐ５０４Ｓ）が、前立腺腫瘍の６０％に過剰発現し、正常な腎臓内では検出できるが他のすべての被検組織では検出できないことが分かった。同様に、Ｒ１−２３３０は、前立腺腫瘍の４０％に過剰発現され、正常な腎臓と肝臓内では検出できるが他のすべての被検組織では検出できないことが分かった。Ｕ１−３０６４は前立腺腫瘍の６０％に過剰発現され、乳房腫瘍と結腸腫瘍にも発現されるが、正常な組織内では検出されないことが分かった。
【０１２６】
Ｒ１−２３３０、Ｕ１−３０６４およびＩＤ−４２７９をＲ１−ＰＣＲによって特性決定を行った結果、これら３種の抗原が前立腺および／または前立腺腫瘍内で過剰発現されることが分かった。
四つの前立腺腫瘍、二つの正常前立腺の試料、二つのＢＰＨ前立腺、ならびに正常な結腸、腎臓、肝臓、肺臓、膵臓、骨格筋、脳、胃、精巣、小腸および骨髄のノーザン分析を行った結果、Ｌ１−１２（Ｐ５０１Ｓ）が、前立腺腫瘍と正常な前立腺内で過剰発現されるが、他の正常な被検組織には検出されないことが分かった。Ｊ１−１７（Ｐ５０２Ｓ）は、二つの前立腺腫瘍内に検出されたが他の被検組織内では検出されなかった。Ｎ１−１８６２（Ｐ５０３Ｓ）は、三つの前立腺腫瘍内で過剰発現され、かつ正常な前立腺、結腸および腎臓内で発現されるが、他の被検組織内では発現されないことが分かった。Ｆ１−１２（Ｐ５０４Ｓ）は、二つの前立腺腫瘍内で高度に発現されそして他のすべての被検組織内では検出できないことが分かった。
【０１２７】
上記マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）技法を利用して、本願に記載されている代表的な抗原の、前立腺腫瘍、乳房腫瘍ならびに以下の正常組織：前立腺、肝臓、膵臓、皮膚、骨髄、脳、乳房、副腎、膀胱、精巣、唾液腺、大腸、腎臓、卵巣、肺臓、脊髄、骨格筋および結腸内での発現レベルを測定した。Ｌ１−１２（Ｐ５０１Ｓ）は、正常前立腺と前立腺腫瘍内で過剰発現され、そして正常な骨格筋内でのいくらかの発現が検出されることが見出された。Ｊ１−１２とＦ１−１２（Ｐ５０４Ｓ）の両者は、前立腺腫瘍内で過剰発現され、そして他のすべての被検組織内てせの発現は低いかまたは検出できないことが見出された。Ｎ１−１８６２（Ｐ５０３Ｓ）の発現は、前立腺腫瘍と正常な前立腺では高レベルであり、正常な大腸と正常な結腸では低レベルであり、他のすべての被検組織では検出できないことが見出された。Ｒ１−２３３０は前立腺腫瘍と正常前立腺内で過剰発現され、かつ他のすべての被検組織内ではより低いレベルで発現されることが見出された。ＩＤ−４２７９は、前立腺腫瘍と正常前立腺内で過剰発現され、正常な脊髄内ではより低いレベルで発現され、かつ他のすべての被検組織内では検出できないことが見出された。
【０１２８】
Ｐ５０１Ｓ（配列番号：１１０）が乳房腫瘍内で発現した程度を特に調べるマイクロアレイ分析をさらに行った結果、乳房腫瘍内のみならず転移性乳房腫瘍（２／３１）内で中程度の過剰発現がなされ、正常組織内では無視できる低発現であることが明らかになった。このデータは、Ｐ５０１Ｓが前立腺腫瘍内のみならず各種乳房腫瘍内でも発現することを示唆している。
【０１２９】
Ｖａｓｍａｔｚｉｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９５ ： ３００−３０４， １９９８に記載されている３２ ＥＳＴ（発現配列のタグ）の各種腫瘍と正常組織における発現レベルを、上記のマイクロアレイ技法で検査した。これらのクローンのうち２種（Ｐ１０００ＣおよびＰ１００１Ｃと呼称する）が、前立腺腫瘍と正常前立腺で過剰発現され、かつ他のすべての被検組織（正常な大動脈、胸腺、静止ＰＢＭＣと活性化ＰＢＭＣ、上皮細胞、脊髄、副腎、胎児組織、皮膚、唾液腺、大腸、骨髄、肝臓、肺臓、樹状細胞、胃、リンパ節、脳、心臓、小腸、骨格筋、結腸および腎臓）内での発現は低レベル〜検出不能のレベルであることが見出された。Ｐ１０００ＣとＰ１００１Ｃの決定されたｃＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号：３８４と４７２に示してある。Ｐ１００１Ｃの配列は、前に分離した、ＪＭ２７タンパク質のヒトｍＲＮＡに対していくらか相同性を示すことが見出された。Ｐ１０００Ｃの配列には、有意な相同性は見られなかった。
【０１３０】
Ｆ１−１２の全長ｃＤＮＡ配列（Ｐ５０４Ｓとも呼称される。配列番号：１０８）がコードするポリペプチドの発現を、免疫組織化学分析法で試験した。ウサギ抗Ｐ５０４Ｓポリクローナル抗体を、標準の技法で、全長Ｐ５０４Ｓタンパク質に対して生成させた。続いて、前記ポリクローナル抗体の単離と特性決定を、当該技術分野で公知の方法で実施した。免疫組織化学分析の結果、Ｐ５０４Ｓポリペプチドが、前立腺癌の被検試料（ｎ＝５）の１００％に発現されることが分かった。
【０１３１】
ウサギ抗Ｐ５０４Ｓポリクローナル抗体は、良性前立腺細胞に、同じ細胞質顆粒染色では標識しないが軽い核染色（ｌｉｇｈｔ ｎｕｃｌｅａｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ）では標識するようであった。正常細胞を分析した結果、前記コードされたポリペプチドは、正常なヒト組織のいくつかには発現されるがすべての正常組織内で発現されるわけではないことが見出された。ウサギ抗Ｐ５０４Ｓポリクローナル抗体によるポジティブ細胞質染色が、正常なヒトの腎臓、肝臓、脳、結腸および肺関連マクロファージ（ｌｕｎｇ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）に見出されたが、心臓と骨髄はネガティブであった。
【０１３２】
このデータは、Ｐ５０４Ｓポリペプチドが前立腺癌組織内に存在し、かつ良性の前立腺過形成組織と前立腺癌組織の間の染色に定性的および定量的な差があることを示し、このことは、このポリペプチドが、前立腺腫瘍内に選択的に検出することができるので、前立腺癌を診断するのに有用であることを示唆している。
実施例３
ＰＣＲベースのサブトラクション法による、前立腺特異的ポリペプチドの単離と特性決定
１０種類の他の正常組織（脳、心臓、腎臓、肝臓、肺臓、卵巣、胎盤、骨格筋、脾臓および胸腺）のｃＤＮＡでサブトラクトされ、次いでＰＣＲ増幅の第一ラウンドに付された正常前立腺由来のｃＤＮＡを含有するｃＤＮＡサブトラクションライブラリィをＣｌｏｎｔｅｃｈから購入した。このライブラリーを、製造業者のプロトコルにしたがって、ＰＣＲ増幅の第二ラウンドに付した。得られたｃＤＮＡ断片を、ベクターのｐＴ７ Ｂｌｕｅ Ｔベクター（米国ＷＩ州所在のＮｏｖａｇｅｎ）中のサブクローン化し、次にそのベクターで、ＸＬ−１Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’イー・コリ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換した。ＤＮＡを独立したクローンから単離し、次いでＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ Ｍｏｄｅｌ ３７３Ａを使用して配列を決定した。
【０１３３】
５９種のポジティブクローンの配列を決定した。これらクローンのＤＮＡ配列を、上記遺伝子バンクのクローンのＤＮＡ配列と比較した結果、これらのクローンのうちの２５種（以後、Ｐ５， Ｐ８， Ｐ９， Ｐ１８， Ｐ２０， Ｐ３０， Ｐ３４， Ｐ３６， Ｐ３８， Ｐ３９， Ｐ４２， Ｐ４９， Ｐ５０， Ｐ５３， Ｐ５５， Ｐ６０， Ｐ６４， Ｐ６５， Ｐ７３， Ｐ７６， Ｐ７９およびＰ８４と呼ぶ）に対する有意な相同性を示さなかった。これらクローンについて決定されたｃＤＮＡ配列をそれぞれ、配列番号４１〜４５、４７〜５２および５４〜６５に示す。Ｐ２９， Ｐ４７， Ｐ６８， Ｐ８０およびＰ８２（それぞれ配列番号：４６， ５３および６６〜６８）は、先に確認したＤＮＡ配列に対していくらかの相同性を示すことが見出された。本発明の発明者らが知っている限り、これらの配列が、前立腺内に存在していることは、今まで報告されていなかった。
【０１３４】
上記のＰＣＲベースの方法を使ってさらに試験した結果、１８０種を超える追加のクローンが単離され、その中の２３種のクローンは既知の配列に対し有意な相同性を全く示さないことが見出された。これらのクローンの決定されたｃＤＮＡ配列は、配列番号：１１５〜１２３， １２７， １３１， １３７， １４５， １４７〜１５１， １５３， １５６〜１５８および１６０に示してある。２３種のクローン（配列番号：１２４〜１２６， １２８〜１３０， １３２〜１３６， １３８〜１４４， １４６， １５２， １５４， １５５および１５９）は、先に挙げたＥＳＴ類に対していくらか相同性を示すことが見出された。追加の１０種のクローン（配列番号：１６１〜１７０）が、既知の遺伝子に対しいくらかの相同性を有することが見出された。Ｐ２０配列を含有するより大きいｃＤＮＡクローン類は、Ｐ７０３Ｐと呼称される遺伝子のスプライスバリアントの一例である。ＤＥ１， ＤＥ１３およびＤＥ１４と呼称されるこれらバリアントの決定されたＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号：１７１， １７５および１７７に示してあり、対応する予想アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号：１７２， １７６および１７８に示してある。伸長スプライス形態（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｓｐｌｉｃｅｄ ｆｏｒｍ）のＰ７０３の決定されたｃＤＮＡ配列は、配列番号：２２５に示してある。ＤＥ２およびＤＥ６と呼称されているスプライスバリアントのＤＮＡ配列はそれぞれ、配列番号：１７３と１７４に示してある。
【０１３５】
腫瘍組織〔前立腺（ｎ＝５）、乳房（ｎ＝２）、結腸および肺臓〕、正常組織〔前立腺（ｎ＝５）、結腸、腎臓、肝臓、肺臓（ｎ＝２）、卵巣（ｎ＝２）、骨格筋、皮膚、胃、小腸および脳〕、および活性化ＰＢＭＣと非活性化ＰＢＭＣ内の代表的クローンのｍＲＮＡ発現レベルを、上記のＲＴ−ＰＣＲで測定した。発現は、特にことわらない限り、各組織のタイプの一つの試料で試験した。
【０１３６】
Ｐ９は、匹敵する発現を示した正常な結腸を除くすべての正常な被検組織に比べて、正常な前立腺および前立腺腫瘍に高度に発現されることが見出された。Ｐ２０すなわちＰ７０３Ｐ遺伝子の一部が、１２種のすべての正常な被検組織に比べて、正常な前立腺と前立腺腫瘍に高度に発現されることが見出された。肺臓を除くすべての正常組織に比べて乳房腫瘍（ｎ＝２）、結腸腫瘍および肺臓腫瘍において（２試料中１試料）見られたＰ２０の発現の増大は余り大きくなかった。肺臓と胃を除く他の正常組織に比べて、正常な前立腺、前立腺腫瘍および乳房腫瘍においてＰ１８の発現が増大することが見出された。大部分の他の正常組織に比べて、正常な前立腺において観察されるＰ５の発現は余り大きくなかった。しかしいくらか上昇した発現が正常な肺臓とＰＢＭＣに見られた。Ｐ５の増大した発現が、前立腺腫瘍（５試料中の２試料）、乳房腫瘍および肺臓の一試料に見出された。Ｐ３０については、１２種の他の正常な被検組織のうちの６種に比べて、類似の発現が、正常な前立腺と前立腺腫瘍に見られた。増大した発現が、乳房腫瘍、肺臓腫瘍の一試料および結腸腫瘍の一試料ならびに正常なＰＭＢＣにも見られた。Ｐ２９は、大多数の正常組織に比べて、前立腺腫瘍内（５試料中５試料）および正常前立腺内（５試料中５試料）で、過剰発現されることが見出された。しかしＰ２９のかなりの発現が、正常な結腸と正常な肺臓（２試料中２試料）で観察された。Ｐ８０は、他のすべての正常な被検組織と比べて、前立腺腫瘍（５試料中５試料）および正常前立腺（５試料中５試料）で過剰発現されることが見出され、かつ結腸腫瘍にも増大した発現が見られた。
【０１３７】
さらに試験した結果、以後、１０−ｄ８， １０−ｈ１０， １１−ｃ８， ７−ｇ６， ８−ｂ５， ８ｂ６， ８−ｄ４， ８−ｄ９， ８−ｇ３， ８−ｈ１１， ９−ｆ１２および９−ｆ３と呼称される１２種の追加のクローンが単離された。１０−ｄ８， １０−ｈ１０， １１−ｃ８， ８−ｄ４， ８−ｄ９， ８−ｈ１１， ９−ｆ１２および９−ｆ３の決定されたＤＮＡ配列はそれぞれ、配列番号：２０７， ２０８， ２０９， ２１６， ２１７， ２２０， ２２１および２２２に示してある。７−ｇ６， ８−ｂ５， ８−ｂ６および８−ｇ３の決定された正（ｆｏｒｗａｒｄ）と逆（ｒｅｖｅｒｓｅ）のＤＮＡ配列をそれぞれ、配列番号：２１０と２１１；２１２と２１３；２１４と２１５；および２１８と２１９に示してある。これらの配列を遺伝子バンクの配列と比較した結果、９−ｆ３の配列に対する有意な相同性は全く見られなかった。クローンの１０−ｄ８， １１−ｃ８および８−ｈ１１は、さきに単離したＥＳＴ類に対していくらかの相同性を示すことが見出されたが、１０−ｈ１０， ８−６５， ８−ｂ６， ８−ｄ４， ８−ｄ９， ８−ｇ３および９−ｆ１２は先に挙げた遺伝子類にいくらか相同性を示すことが見出された。７−Ｇ６と８−Ｇ３の特性決定をさらに行ったところ、それぞれ、既知の遺伝子ＰＡＰとＰＳＡに対し同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示した。
【０１３８】
これらクローンのｍＲＮＡ発現レベルを、上記マイクロアレイ技法を用いて測定した。クローン７−Ｇ６， ８−Ｇ３， ８−Ｂ５， ８−Ｂ６， ８−Ｄ４， ８−Ｄ９， ９−Ｆ３， ９−Ｆ１２， ９−Ｈ３， １０−Ａ２， １０−Ａ４， １１−Ｃ９および１１−Ｆ２は、前立腺腫瘍と正常前立腺内で過剰発現されることが見出されたが、他の被検組織中の発現は低いかまたは検出不能であった。８−Ｆ１１の増大した発現が、前立腺腫瘍と正常前立腺、膀胱、骨格筋および結腸に見られた。１０−Ｈ１０の増大した発現が前立腺腫瘍と正常前立腺、膀胱、肺臓、結腸、脳および大腸に見られた。９−Ｂ１の増大した発現が、前立腺腫瘍、乳房腫瘍と正常前立腺、唾液腺、大腸および皮膚に見られたが、１１−Ｃ８の増大した発現は前立腺腫瘍と正常前立腺および大腸に見られた。
【０１３９】
上記ＰＣＲ−ベースの正常前立腺サブトラクション由来の追加のｃＤＮＡ断片は、マイクロアレイ技法とＲＴ−ＰＣＲの両者によって、前立腺特異的であることが見出された。このクローン（９−Ａ１１と呼称する）の決定されたｃＤＮＡ配列は、配列番号：２２６に示してある。この配列を、公的データベースの配列と比較したところ、既知の遺伝子ＨＯＸＢ１３に対する同一性が９９％であることが分かった。
【０１４０】
さらに試験した結果、クローン８−Ｃ６と８−Ｈ７が単離された。これらクローンの決定されたｃＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号：２２７と２２８に示してある。これらの配列は、先に単離したＥＳＴ類にいくらか相同性を示すことが分かった。
ＰＣＲとハイブリッド形成をベースとする方法を採用して、クローンＰ２０に対しより長いｃＤＮＡ配列（Ｐ７０３Ｐとも呼称する）を得て、その遺伝子の５′末端を逐次延長した３種の追加のｃＤＮＡ断片を得た。これらの断片は、Ｐ７０３ＰＤＥ５， Ｐ７０３Ｐ６．２６およびＰ７０３ ＰＸ−２３と呼称されるが（配列番号：３２６， ３２８および３３０；予想される対応アミノ酸配列はそれぞれ配列番号：３２７， ３２９および３３１に示してある）は追加の５′配列を含有している。Ｐ７０３ＰＤＥ５はｃＤＮＡライブラリー（＃４１〜２６）を、Ｐ７０３Ｐの一部をプローブとして使ってスクリーニングすることによって回収した。Ｐ７０３Ｐ６．２６は、３種の前立腺腫瘍ｃＤＮＡの混合物から回収し、そしてＰ７０３ＰＸ−２３は、ｃＤＮＡライブラリー（＃４３８−４８）から回収した。同時に、これら追加の配列は、推定シグナル配列（ｐｕｔａｔｉｖｅ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の一部とともにすべての推定成熟セリンプロテアーゼ（ｐｕｔａｔｉｖｅ ｍａｔｕｒｅ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ）を含有している。Ｐ７０３Ｐの推定全長ｃＤＮＡ配列を配列番号５２４に提供する。これは、配列番号５２５に提供される推定アミノ酸配列に対応する。
【０１４１】
正常組織のプールに対してサブトラクトされた前立腺腫瘍プールのＰＣＲベースサブトラクションライブラリー（ＪＲ：ＰＣＲサブトラクションと呼称）を使ってさらに試験した結果、１３種の追加のクローンが単離され、それらクローンのうち７種類は公知のＧｅｎＢａｎｋの配列に対して有意な相同性を共有していなかった。これら７種のクローン（Ｐ７１１Ｐ， Ｐ７１２Ｐ， ノベル２３， Ｐ７７４Ｐ， Ｐ７７５Ｐ， Ｐ７１０ＰおよびＰ７６８Ｐ）の決定されたｃＤＮＡ配列はそれぞれ、配列番号：３０７−３１１，３１３および３１５に示してある。残りの６種のクローン（配列番号：３１６と３２１〜３２５）は、既知の遺伝子に対していくらかの相同性を共有していることが分かった。１３種のクローンはすべて、マイクロアレイ分析によって、前立腺腫瘍、ＢＰＨおよび正常前立腺を含む前立腺組織において、正常な非前立腺組織に比べて、３倍以上の過剰発現を示した。クローンＰ７１１Ｐ， Ｐ７１２Ｐ， ノベル２３およびＰ７６８Ｐは、試験を行った大部分の前立腺腫瘍とＢＰＨ組織（ｎ＝２９）および大部分の正常前立腺組織（ｎ＝４）で過剰発現を示したが、すべての正常組織ではバックグラウンドの発現〜低い発現のレベルであった。クローンＰ７７４Ｐ， Ｐ７７５ＰおよびＰ７１０Ｐは比較的発現が低く、前立腺腫瘍とＢＰＨの少数の試料内で発現したが、正常前立腺ではネガティブ発現〜低い発現であった。
【０１４２】
配列番号：３０７に示す部分配列を採用して、前立腺ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、Ｐ７１１Ｐの全長ｃＤＮＡを得た。具体的に述べると、方向性をもってクローン化された前立腺ｃＤＮＡライブラリーを標準方法を利用して調製した。このライブラリーの１００万個のコロニイを、ＬＢ／Ａｍｐプレート上で平板培養を行った。ナイロン膜フィルターを使用してこれらのコロニーを持ち上げ、これらフィルターによって採取されたｃＤＮＡを、紫外線によって変性して該フィルターに架橋させた。配列番号：３０７のＰ７１１Ｐ ｃＤＮＡ断片に放射線標識を付けて、これらのフィルターとハイブリッドを形成するのに使用した。陽性のクローンを選択し、ｃＤＮＡを調製して、自動Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ配列決定器を使用して配列を決定した。Ｐ７１１Ｐの決定された全長の配列を配列番号：３８２に示し、そして対応する予想アミノ酸配列を配列番号：３８３に示してある。
【０１４３】
ＰＣＲとハイブリッド形成法に基づいた方法を使用して、上記の２種のクローン１１−Ｃ９と９−Ｆ３について追加のｃＤＮＡ配列の情報を得た。なおこれらクローンはそれぞれ、以後Ｐ７０７ＰおよびＰ７１４Ｐ（配列番号：３３３と３３４）と呼ぶ。最新のＧｅｎＢａｎｋと比較した結果、Ｐ７０７Ｐは、既知の遺伝子ＨｏｘＢ１３のスプライスバリアントであることが見出された。対照的にＰ７１４Ｐに対して有意な相同性は見られなかった。
【０１４４】
クローン８−Ｂ３， Ｐ８９， Ｐ９８， Ｐ１３０およびＰ２０１（１９９８年２月９日付けで出願された米国特許願第０９／０２０，９５６号に開示されている）は、Ｐ７０５Ｐと呼称される一つの連続配列（配列番号：３３５、予想アミノ酸配列は配列番号：３３６に示してある）内に含まれていることが見出された。なおＰ７０５Ｐは既知の遺伝子ＮＫＸ３．１のスプライスバリアントであることが確認されている。
【０１４５】
Ｐ７７５Ｐについてのさらなる試験は、Ｐ７７５Ｐ遺伝子の全てのスプライス変異体である４つの追加の配列（配列番号４７３−４７６）をもたらした。配列番号４７４の配列は、２つのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦｓ）を含むことが分った。これらのＯＲＦｓによりコードされる推定アミノ酸配列を、配列番号４７７と４７８に提供する。配列番号４７５のｃＤＮＡ配列は、配列番号４７９のアミノ酸配列をコードするＯＲＦを含むことが判明した。配列番号４７３のｃＤＮＡ配列は、４つのＯＲＦｓを含むことが分った。これらのＯＲＦｓによりコードされる推定アミノ酸配列を、配列番号４８０−４８３に提供する。
その後の試験は、５つの前立腺遺伝子Ｐ７０４Ｐ、Ｐ７１２Ｐ、Ｐ７７４Ｐ、Ｐ７７５Ｐ、及びＢ３０５Ｄを含む、Ｃａｔ Ｅｙｅ症候群領域として知られる、染色体２２ｑ１１．２上のゲノム領域の同定を導いた。このゲノム領域内のこれら５つの遺伝子の各々の相対的な位置を図１０に示す。それ故、この領域は、悪性腫瘍と関連することができ、そして他の潜在的な腫瘍遺伝子がこの領域内に含まれることができる。上記の試験は、配列番号５３４のアミノ酸配列をコードする、（配列番号５３３に提供される）Ｐ７７５Ｐについての潜在的なオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の同定を導いた。
【０１４６】
実施例４
ポリペプチド類の合成
ポリペプチド類は、ＨＰＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）で活性化を行うＦＭＯＣの化学を利用するＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３０Ａペプチド合成装置で合成した。Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ配列をペプチドのアミノ末端に結合させて、ペプチドのコンジュゲーション、同定化面への結合まはた標識化を行う方法が提供される。ペプチドの固体支持体からの切断は以下の切断混合物：トリフルオロ酢酸：エタンジチオール：チオアニソール：水：フェノール（４０：１：２：２：３）を使用して実施することができる。この切断を２ｈｒ行った後、ペプチドを冷メチル−ｔ−ブチル−エーテルで沈澱させることができる。得られたペプチドのペレットを、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する水に溶解し、凍結乾燥した後、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣで精製する。なお水（０．１％ＴＦＡ含有）に溶解して得た０％〜６０％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の勾配液を用いてペプチドを溶出させる。純品の画分を凍結乾燥した後、エレクトロスプレイ法もしくは他のタイプの質量分析法およびアミノ酸分析法を利用してペプチドの特性を決定する。
【０１４７】
実施例５
ＰＣＲベースのサブトラクションによる前立腺特異的ポリペプチド類のさらなる単離と特性決定
上記の前立腺原発腫瘍ｍＲＮＡから得たｃＤＮＡライブラリーを、正常前立腺由来のｃＤＮＡでサブトラクトした。そのサブトラクションはＰＣＲベースのプロトコル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して実施した。なおこのプロトコルは、より大きな断片が得られるように改変した。その改変プロトコルにしたがって、テスター（ｔｅｓｔｅｒ）とドライバー（ｄｒｉｖｅｒ）の二本鎖ｃＤＮＡを、６ヌクレオチドの制限部位を認識する５種の制限酵素（ＭｌｕＩ， ＭｓｃＩ， ＰｖｕＩＩ， ＳａｌＩおよびＳｔｕＩ）で別個に消化した。この消化を行った結果、ＣｌｏｎｔｅｃｈのプロトコルにしたがてＲｓａＩで消化して得られる３００ｂｐという平均の大きさではなくて、平均の大きさが６００ｂｐのｃＤＮＡを得た。上記改変によって、上記サブトラクションの効率は影響を受けなかった。次に、２種のテスター集団を異なるアダプター（ａｄａｐｔｅｒ）でつくり、そしてドライバーライブラリーはアダプターなしのままであった。
【０１４８】
次に、テスターとドライバーのライブラリーに、過剰のドライバーｃＤＮＡを使ってハイブリッドを形成させた。第一ハイブリッド形成ステップで、ドライバーを、二つのテスターｃＤＮＡの集団の各々と別個にハイブリッドを形成させた。その結果、（ａ）ハイブリッドを形成しなかったテスターｃＤＮＡ、（ｂ）他のテスターｃＤＮＡとハイブリッドを形成したテスターｃＤＮＡ、（ｃ）ドライバーｃＤＮＡとハイブリッドを形成したテスターｃＤＮＡおよび（ｄ）ハイブリッドを形成しなかったドライバーｃＤＮＡの集団が生成した。次に上記の二つの別個のハイブリッド形反応生成物を混合し、追加の変性されたドライバーｃＤＮＡの存在下で再びハイブリッドを形成させた。この第二のハイブリッド形成反応によって、（ａ）〜（ｄ）の集団に加えて、一種のアダプターを有するテスターｃＤＮＡが第二のアダプターを有するテスターｃＤＮＡとハイブリッドを形成している第５集団（ｅ）が生成した。したがって、第二ハイブリッド形成ステップによって、アダプター特異的プライマーによるＰＣＲ増幅に用いる鋳型として使用できる、差をもって（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）発現される配列が豊富になった。
【０１４９】
次に、末端を満たし、次いで、ＰＣＲ増幅を、アダプター特異的プライマーを用いて実施した。ドライバーｃＤＮＡとハイブリッドを形成しなかったテスターｃＤＮＡを含有する集団（ｅ）のみが指数関数的に増幅された。次に第二ＰＣＲ増幅ステップを実施して、バックグランドを減らし、差をもって発現される配列をさらに豊富にした。
【０１５０】
このＰＣＲベースのサブトラクション法は、特異的に発現されるｃＤＮＡを平均化するので、前立腺腫瘍組織内で過剰発現されるまれな転写物が回収可能になる。このような転写物は従来のサブトラクション法によって回収することは困難である。
前立腺腫瘍内で過剰発現されることが知られている遺伝子に加えて、さらに７７種のクローンが確認された。これら部分ｃＤＮＡの配列は配列番号：２９〜３０５に示してある。これらクローンの大部分はデータベースはに対して有意な相同性を有していなかった。例外は以下のものであった。すなわちＪＰＴＰＮ２３〔配列番号：２３１；ピッグバロシン（ｐｉｇ ｖａｌｏｓｉｎ）含有タンパク質に類似している〕、ＪＰＴＰＮ３０（配列番号：２３４；プロテアソームサブユニットに対するラットｍＲＮＡに類似している）ＪＰＴＰＮ４５〔配列番号：２３４；ラットのノルベギクス（ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）細胞質型ＮＡＤＰ依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼに類似している〕、ＪＰＴＰＮ４６（配列番号：２４４；ヒトサブクローンＨ８４ｄ４ ＤＮＡの配列に類似している）、ＪＰ１Ｄ６〔配列番号：２６５；ジー・ガルス（Ｇ． ｇａｌｌｕｓ）のダイニンの軽鎖Ａに類似している〕、ＪＰ８Ｄ６（配列番号：２８８；ヒトＢＡＣクローンＲＧ０１６Ｊ０４に類似している）。ＪＰ８Ｆ５（配列番号：２８９；ヒトサブクローンＨ８３Ｂ５ ＤＮＡ配列に類似している）およびＪＰ８Ｅ９（配列番号：２９９；ヒトＡｌｕ配列に類似している）が例外である。
【０１５１】
正常前立腺のプールに対してサブトラクトされた前立腺腫瘍のプールからなるＰＣＲベースのサブトラクションライブラリー（ＰＴ−ＰＮＰＣＲサブストラクションと呼称する）を使用した追加の試験によって、３種の追加のクローンを得た。これらのクローンのｃＤＮＡ配列を、ＧｅｎＢａｎｋの最新の発表物と比べた結果、Ｐ７１５Ｐ及びＰ７６７Ｐと呼称される２種のクローン（配列番号：３１２と３１４）に対する有意な相同性は認められなかった。残りのクローンは、既知の遺伝子ＫＩＡＡ００５６（配列番号：３１８）に対していくらか相同性を示すことが見出された。マイクロアレイ分析法を用いて、各種組織内でのｍＲＮＡの発現レベルを測定したところ、上記３種のクローンはすべて、前立腺腫瘍とＢＰＨ組織内で過剰発現することが見出された。具体的に述べると、クローンＰ７１５Ｐは、大部分の前立腺腫瘍とＢＰＨ組織において、大多数の正常前立腺の試料内および胎児組織内に見られる高い発現の３倍以上も過剰発現されたが、その外のすべての正常組織内ではネガティブ発現〜低発現であった。クローンＰ７６７Ｐは、いくつもの前立腺腫瘍とＢＰＨ組織内で過剰発現され、正常前立腺の試料の半数においては中程度の発現であり、そしてその外のすべての被検正常組織ではバックグランド発現〜低発現であった。
【０１５２】
上記マイクロアレイによってさらに、上記ＰＴ−ＰＮ ＰＣＲサブトラクションライブラリー、および正常組織のｃＤＮＡのプールでサブトラクトされた前立腺腫瘍由来のｃＤＮＡを含有するＤＮＡサブトラクションライブラリーを分析して、２７種の追加のクローン（配列番号：３４０〜３６５および３８１）を分離した。なおこれら追加のクローンは前立腺腫瘍内で過剰発現されることが確認された。また配列番号：３４１， ３４２， ３４５， ３４７， ３４８， ３４９， ３５１， ３５５〜３５９， ３６１， ３６２および３６４のクローンは、正常前立腺内で発現されることが見出された。２６種のクローンすべての各種正常組織内での発現は低いかまたは検出不能であること、が見出されたが、例外のＰ５４４Ｓ（配列番号：３５６）は小腸内で発現されることが見出された。上記２６種のクローンの内１０種（配列番号：３４０〜３４９）は、先に挙げた配列に対しいくらかの相同性を示すことが見出された。配列番号：３５０、３５１、及び３５３−３６５のクローンには、有意な相同性が見出されなかった。
【０１５３】
（Ｐ７９０Ｐともいう）配列番号３５２のクローンについてのさらなる試験は、配列番号５２６の全長ｃＤＮＡ配列の単離を導いた。この対応の推定アミノ酸を配列番号５２７に提供する。２つの定量的ＰＣＲ実験からのデータは、Ｐ７９０Ｐが、１５のテストされた前立腺腫瘍サンプル中１１で過剰発現され、そして脊髄内で低レベルで発現され、テストされた他の正常サンプルの全てにおいて発現されなかったことを示した。さらなるＰＣＲ実験及びマイクロアレイ実験からのデータは、正常前立腺及び前立腺腫瘍内での過剰発現を示したが、テストされた他の組織内ではほとんど又は全く発現されなかったことを示した。Ｐ７９０Ｐは、その後、先に同定されたＧ−タンパク質結合前立腺組織レセプターに対するかなりのホモロジーを示すことが、発見された。
【０１５４】
実施例６
マウスのペプチドによる初回免疫とＣＴＬ系の増殖
６．１  この実施例では、Ｐ５０２Ｓ遺伝子を発現する細胞に特異的なＣＴＬ細胞系の調製について説明する。
ヒトＨＬＡ Ａ２．１（米国ＣＡ州ラホーヤ所在のＴｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＬ． Ｓｈｅｒｍａｎ博士提供）の導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｕｅ）を発現するマウスを、Ｐ２Ｓ＃１２ペプチド（ＶＬＧＷＶＡＥＬ；配列番号：３０６）で免疫化した。なおこのペプチドは、Ｔｈｅｏｂａｌｄら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９２ ： １１９９３−１１９９７， １９９５に記載の方法を以下のように改変して利用し、Ｐ５０２Ｓ遺伝子（本願ではＪ１−１７とも呼称される。配列番号：８）から誘導される。マウスは、Ｐ２Ｓ＃１２ １００μｇと、Ｂ型肝炎ウィルスタンパク質由来のＩ−Ａｂ結合ペプチド１２０μｇとを不完全フロイントアジュバントに乳化したもので免疫化した。３週間後、これらのマウスを殺し、ナイロンメッシュを使用して単細胞の懸濁液を調製した。次に、細胞を、１０％ＦＣＳ，２ｍＭグルタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、非必須アミノ酸類（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、２×１０−５Ｍ  ２−メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍｌペニシリンとストレプトマイシンを含有する完全媒体（ＲＰＭＩ−１６４０；米国ＭＤ州ガイサーズバーグ所在のＧｉｂｃｏ ＢＲＬ）中に、６×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させ、次いで、放射線を照射された（３０００ｒａｄ）Ｐ２Ｓ＃１２でパルスされた（５ｍｇ／ｍｌのＰ２Ｓ＃１２と１０ｍｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリン）ＬＰＳブラスト（７μｇ／ｍｌの硫酸デキストランと２５μｇ／ｍｌのＬＰＳの存在下、３日間培養されたＡ２トランスジェニック脾臓細胞）の存在下で培養した。６日後、細胞（５×１０５／ｍｌ）を、２．５×１０６／ｍｌのペプチドでパルスされ放射線照射（２０，０００ｒａｄ）されたＥＬ４Ａ２ｋｂ細胞（Ｓｈｅｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８ ： ８１５−８１８， １９９２）と３×１０６／ｍｌのＡ２トランスジェニック脾臓支持細胞で、再刺激を行った。細胞を、２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養した。当該細胞系をクローン化するためにそなえて、上記のように週１回ベースで再刺激を続けた。
【０１５５】
刺激細胞としてのペプチドパルスＥＬ４ Ａ２ｋｂ腫瘍細胞（１×１０４細胞／ウェル）および３０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で増殖させた支持細胞としてのＡ２トランスジェニック脾臓細胞（５×１０５細胞／ウェル）を用い、限界希釈法によって、Ｐ２Ｓ＃２細胞系をクローン化した。１４日目に、先に述べたのと同様にして再刺激を行った。２１日目に、増殖しているクローンを分離して培養を続けた。これらのクローンのうちいくつかは、Ｐ５０２Ｓを形質導入されたヒト繊維芽細胞（ＨＬＡ Ａ２．１発現）に対する反応性（溶菌反応）が、対照の繊維芽細胞に対する反応性より有意に高いことを示した。一例を図１に示す。
【０１５６】
このデータは、Ｐ２Ｓ＃１２が、ヒトＨＬＡ Ａ２ｋｂ分子として発現されるＰ５０２Ｓタンパク質の天然のエピトープであることを示している。
６．２  この実施例は、マウスのＣＴＬ細胞系と、Ｐ５０１Ｓ遺伝子を発現する細胞に対して特異的なＣＴＬクローンの調製を例示する。
この一連の試験は上記の試験と同様にして行った。Ｐ５０１Ｓ遺伝子（本願ではＬＩ−１２とも呼ぶ、配列番号：１１０）由来のＰ１Ｓ＃１０ペプチド（配列番号：３３７）でマウスを免疫化した。Ｐ１Ｓ＃１０ペプチドを、公表されたＨＬＡ−Ａ２結合モチーフ（Ｐａｒｋｅｒ， Ｋ．Ｃ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５２ ： １６３， １９９４）によって定義される潜在的ＨＬＡ−Ａ２結合配列についてＰ５０１Ｓの予想ポリペプチド配列を分析することによって得られた。Ｐ１Ｓ＃１０ペプチドを、実施例４に記載されているようにして合成し、次いでＴ細胞ベースの競合検定法を利用して、ＨＬＡ−Ａ２の結合性について実験で検査した。予想されるＡ２結合ペプチドを、ＨＬＡ−Ａ２結合インフルエンザマトリックスペプチドｆｌｕ Ｍ５８に対し特異的なＨＬＡ−Ａ２制限ＣＴＬクローン（Ｄ１５０Ｍ５８）に対するＨＬＡ−Ａ２特異的ペプチドの提示に競合する性能について試験した。Ｄ１５０Ｍ５８ ＣＴＬは、ペプチドｆｌｕ Ｍ５８の自己提示に応答してＴＮＦを分泌する。この競合検定法において、１００〜２００μｇ／ｍｌの試験ペプチドを、Ｄ１５０Ｍ５８ ＣＴＬ上のＨＬＡ−Ａ２に結合させるため、該ＣＴＬの培養物に添加した。３０分後、試験ペプチドまたは対照ペプチドとともに培養されたＣＴＬを、ｆｌｕ Ｍ５８ペプチドに対するそれらの抗原量応答（ａｎｔｉｇｅｎ ｄｏｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）について、標準ＴＮＦバイオアッセイで試験した。図３に示すように、ペプチドＰ１Ｓ＃１０は、ｆｌｕ Ｍ５８のＨＬＡ−Ａ２制限提示に競合し、このことはペプチドＰ１Ｓ＃１０がＨＬＡ−Ａ２に結合することを示す。
【０１５７】
ヒトＨＬＡ ２ｋｂに対する導入遺伝子を発現するマウスを、Ｔｈｅｏｂａｌｄら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９２ ： １１９９３−１１９９７， １９９５に記載の方法を以下のように変形して利用し免疫化した。６２．５μｇのＰ１Ｓ＃１０と１２０μｇのＢ型肝炎ウィルスタンパク質由来のＩ−Ａｂ結合ペプチドとを不完全フロイドアジュバントに乳化したものでマウスを免疫化した。３週間後、これらのマウスを殺し、ナイロンメッシュを使用して単細胞懸濁液を調製した。次に、細胞を、完全媒体（上記のような）に、６×１０６細胞／ｍｌで再懸濁させて、放射線照射（３０００ｒａｄ）Ｐ１Ｓ＃１０パルス（２μｇ／ｍｌ  Ｐ１Ｓ＃１０と１０ｍｇ／ｍｌ  β２−ミクログロブリン）ＬＰＳブラスト（７μｇ／ｍｌの硫酸デキストランと２５μｇ／ｍｌのＬＰＳの存在下、３日間培養されたＡ２トランスジェニック脾臓細胞）の存在下で培養した。６日後、上記の２．５×１０６／ｍｌのペプチドでパルスされた、放射線照射（２０，０００ｒａｄ）ＥＬ４ Ａ２ｋｂ細胞と、３×１０６／ｍｌのＡ２トランスジェニック脾臓支持細胞で再刺激を行った。細胞を２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養した。クローン化するための準備として、週１回ベースで細胞を再刺激した。生体外で３ラウンド刺激した後、図４に示すように、Ｐ１Ｓ＃１０パルスＪｕｒｋａｔ Ａ２ｋｂターゲットおよびＰ５０１Ｓ形質導入Ｊｕｒｋａｔターゲットを認識する一つの細胞系が生成した。
【０１５８】
Ｐ１Ｓ＃１０特異的ＣＴＬ系を、刺激細胞としてのペプチドパルスＥＬ４ Ａ２ｋｂ腫瘍細胞（１×１０４細胞／ウェル）と、３０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で増殖させた支持細胞としてのＡ２トランスジェニック脾臓細胞（５×１０５細胞／ウェル）を用い限界希釈法でクローン化した。１４日目に、細胞を、先に述べたように再刺激を行った。２１日目、生存可能なクローンを分離して、培養を続けた。図５に示すように、これらクローンのうち五つが、Ｐ５０１Ｓ形質導入Ｊｕｒｋａｔ Ａ２ｋｂターゲットに対し特異的な細胞溶解反応性を示した。このデータは、Ｐ１Ｓ＃１０が、ヒトＨＬＡ−Ａ２．１分子として発現されるＰ５０１Ｓタンパク質の天然のエピトープであることを示している。
【０１５９】
実施例７
前立腺抗原による裸ＤＮＡ（ｎａｋｅｄ ＤＮＡ）の免疫化を利用するＣＴＬの生体内での初回免疫
上記の前立腺特異的抗原Ｌ１−１２はＰ５０１Ｓとも呼称される。ＨＬＡ Ａ２ｋｂ Ｔｇマウス（米国ＣＡ州ラホーヤ所在のＴｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＬ． Ｓｈｅｒｍａｎ博士提供）に、ベクターＶＲ１０１２中の１００μｇのＰ５０１Ｓを、筋肉内または皮膚内に注射することによって免疫化した。これらのマウスは、２週間間隔で３回免疫化を行った。最後の免疫化を行ってから２週間後、免疫脾臓細胞を、Ｊｕｒｋａｔ Ａ２ｋｂ−Ｐ５０１Ｓを形質導入された刺激細胞とともに培養した。ＣＴＬ系を一週間毎に刺激した。生体外で刺激してから２週間後、Ｐ５０１Ｓを形質導入されたターゲットに対するＣＴＬの活性を評価した。８匹のマウスの内２匹が、強い抗Ｐ５０１Ｓ ＣＴＬ応答を発生した。これらの結果は、Ｐ５０１Ｓが少なくとも一つの天然のプロセスされたＨＬＡ−Ａ２制限ＣＴＬエピトープを含有していることを示している。
【０１６０】
実施例８
前立腺特異的ポリペプチド類を認識するヒトＴ細胞の性能
この実施例は、前立腺腫瘍ペプチドに特異的なＴ細胞がヒト腫瘍を認識する性能を例示する。
ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｖａｎ Ｔｓａｉら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８ ： ６５−７５， １９９８のプロトコルにしたがって樹状細胞を使ってＰ５０２Ｓ（Ｊ１−１７とも呼称する）由来のＰ２Ｓ−１２ペプチド（配列番号３０６）に、生体外でプライムされた。得られたＣＤ８＋Ｔ細胞のマイクロカルチャーを、オートロガス繊維芽細胞またはＰ５０２Ｓ遺伝子を発現するため形質導入された繊維芽細胞によって提示されるＰ２Ｓ−１２ペプチドを認識する前記マイクロカルチャーの性能について、γインターフェロンＥＬＩＳＰＯＴ検定法（Ｌａｌｖａｎｉら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８６ ： ８５９−８６５， １９９７参照）で試験した。簡単に述べると、３μｇ／ｍｌのヒトβ２−ミクログロブリンと、１μｇ／ｍｌのＰ２Ｓ−１２ペプチドまたは対照のＥ７５ペプチドの存在下、１０４繊維芽細胞に対するＴ細胞の滴定数（ｔｉｔｒａｔｉｎｇ ｎｕｍｂｅｒ）を２連で検定した。さらに、Ｐ５０２Ｓ遺伝子を形質導入されたオートロガス繊維芽細胞、または対照としてのＨＥＲ−２／ｎｅｕを形質導入された繊維芽細胞についてＴ細胞を同時に検定した。この検定を行う前に、繊維芽細胞を１０ｎｇ／ｍｌのγインターフェロンで４８ｈｒ処理して、クラスＩ ＭＨＣの発現をアップグレードした。前記マイクロカルチャーのうちの一つ（＃５）が、ペプチドパルス繊維芽細胞と形質導入された繊維芽細胞の両者を強く認識することをγインターフェロンＥＬＩＳＰＯＴ検定法で示した。図２Ａは、Ｐ２Ｓ−１２ペプチドでパルスされた繊維芽細胞上のＴ細胞の数が増大するにつれてγインターフェロンのスポットの数が強く増大したが（黒色バー）、対照のＥ７５ペプチドパルスされた場合は増大しなかった（白色バー）ことを示している。このことは、これらのＴ細胞が、Ｐ２Ｓ−１２ペプチドを特異的に認識できることを示している。図２Ｂに示すように、このマイクロカルチャーは、Ｐ５０２Ｓ遺伝子を発現するため形質導入された繊維芽細胞上のＴ細胞の数が増大するにつれてγインターフェロンのスポットの数が増大することを示したが、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子の場合、このような現象を示さなかった。これらの結果は、Ｐ２Ｓ−１２ペプチドがＰ５０２Ｓタンパク質の天然のエピトープであるということを確認する追加の証拠を提供している。さらに、これは、ヒトＴ細胞レパトア中に、このエピトープを認識することができる高親和性Ｔ細胞が存在していることも示している。また、これらのＴ細胞は、Ｐ５０２Ｓ遺伝子を発現するヒト腫瘍を認識できるはずである。
【０１６１】
実施例９
ヒト血液内での前立腺抗原特異的ＣＴＬ応答の誘発
この実施例は、前立腺特異的抗原が、正常なヒトの血液内でＣＴＬ応答を誘発する性能を例示する。
１０％のヒト血清、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭＣＳＦおよび３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４を含有するＲＰＭＩ培地内で５日間増殖させることによって、オートロガス樹状細胞（ＤＣ）を、正常なドナーのＰＢＭＣ由来の単核細胞培養物から分化させた。培養を行った後、ＤＣに、５Ｍ．Ｏ．Ｉ．にて、組換えＰ５０１Ｓ発現スクシニアウィルスを、一夜感染させ、次に２μｇ／ｍｌのＣＤ４０リガンドを添加することによって８ｈｒ成熟させた。ウィルスは紫外線を照射することによって不活性化した。ＣＤ８＋細胞を、磁気ビーズを使用する正の選択によって分離し、次いで初回免疫培養を２４ウェルのプレートで開始した。５回の刺激サイクルを行った後、オートロガスＰ５０１Ｓ形質導入繊維芽細胞で刺激したとき、γインターフェロンを特異的に産生するＣＤ８＋系が確認された。細胞系３Ａ−１のＰ５０１Ｓ特異的活性は、Ｐ５０１Ｓを形質導入されたオートロガスＢ−ＬＣＬに、刺激サイクルを追加することによって維持できた。細胞系３Ａ−１は、Ｐ５０１Ｓを発現するために形質導入されたオートロガスＢ−ＬＣＬを特異的に認識するがＥＧＦＰ形質導入オートロガスＢ−ＬＣＬを認識しないことが分かった。このことは細胞毒性検定（５１Ｃｒ放出）とγインターフェロンの産生（γインターフエロンＥｌｉｓｐｏｔ；上記文献とＬａｌｖａｎｉら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８６ ： ８５９−８６５， １９９７参照）によって測定される。これら検定の結果は図６Ａと６Ｂに示してある。
【０１６２】
実施例１０
前立腺特異的抗原内に含まれている天然エピトープの確認
９量体のペプチドｐ５（配列番号：３３８）を、Ｐ７０３抗原（Ｐ２０とも呼称される）から誘導した。このｐ５ペプチドは、ヒトＨＬＡ−Ａ２ドナー内で免疫原性があり、天然のエピトープである。抗原特異的ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞は、ｐ５ペプチドでパルスされた単核細胞で、生体外で刺激を繰り返すことによって、プライムすることができる。これらのＣＴＬは、ＥＬＩＳＰＯＴ検定法（上記のような）およびクロムリリース検定法の両者で、ｐ５パルス及びＰ７０３−Ｐ形質導入ターゲット細胞を特異的に認識する。その上に、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスをｐ５で免疫化すると、Ｐ７０３Ｐを発現するＨＬＡ−Ａ２ｋｂ又はＨＬＡ−Ａ２形質導入ターゲット細胞を認識するＣＴＬ系が生成する。
【０１６３】
Ｐ５が天然にプロセスされたエピトープであることを証明する最初の試験を、ＨＬＡ−Ａ２ｋｂトランスジェニック・マウスを用いて行った。ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスの足蹠の皮下に、１００μｇのｐ５ペプチドと１４０μｇのＢ型肝炎ウィルスコアペプチド（Ｔｈペプチド）を含有するフロイント不完全アジュバントを注射して免疫化した。免疫化してから３週間後、免疫化マウス由来の脾臓細胞を、ペプチドパルスＬＰＳブラストで、生体外にて刺激した。一次生体外刺激を行ってから５日後に、ＣＴＬ活性をクロムリリース検定法で評価した。対照の抗原のＰ７０３とＨＬＡ−Ａ２ｋｂを発現する、レトロウィルスで形質導入された細胞を、ターゲットとして使用した。ｐ５パルスターゲットとＰ７０３Ｐ発現ターゲットの両者を特異的に認識するＣＴＬ系が確認された。
【０１６４】
ヒトの生体外での初回免疫の実験は、ｐ５ペプチドがヒト内において免疫原性であることを示した。１０％のヒト血清、５０ｎｇ／ｍｌのヒトＧＭ−ＣＳＦおよび３０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−４を含有するＲＰＭＩ培地で５日間培養することによって、樹状細胞（ＤＣ）を、正常なヒトドナーのＰＢＭＣ由来の単核細胞培養物から分化させた。培養を行った後、そのＤＣを１μｇ／ｍｌ ｐ５ペプチドでパルスし、次に、ＣＤ８＋Ｔ細胞強化ＰＢＭＣとともに培養した。ＣＴＬ系を、ｐ５パルス単核細胞で、一週間毎に再刺激した。ＣＴＬの培養を開始してから５〜６週間後、ＣＴＬがｐ５パルスターゲット細胞を認識することが確認された。ＣＴＬは、Ｐ７０３Ｐを発現するように形質導入されたヒト細胞を認識することがさらに示された。これは、ｐ５が天然にプロセスされたエピトープであることを証明するものである。
【０１６５】
実施例１１
乳房腫瘍由来の抗原の前立腺内での発現
抗原のＢ３０５Ｄを、乳房腫瘍から、ディフェレンシャルディスプレイ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ）によって分離することは、１９９６年８月２０日付けで出願された米国特許願第０８／７００，０１４号に記載されている。いくつもの異なるスプライス形態の上記抗原が分離された。これらスプライス形態について決定されたｃＤＮＡ配列は配列番号：３６６〜３７５に示してあり、配列番号：２９２， ２９８および３０１〜３０３の配列それぞれに対応する予想アミノ酸配列は配列番号：２９９〜３０６に示してある。さらなる試験において、配列番号３６６のｃＤＮＡ配列のスプライス変異体が単離され、これは、オープン・リーディング・フレームのフレーム・シフトを導く、８８４位に追加のグアニン残基を含むことが発見された（配列番号５３０）。このＯＲＦの決定されたＤＮＡ配列を、配列番号５３１に提供する。このフレームシフトは、Ｂ３０５Ｄの他のアイソフォームに共通するＣ末端ドメインを含むがそのＮ末端領域が異なる２９３アミノ酸から成る（配列番号５３２に提供される）タンパク質配列を作り出す。
【０１６６】
各種の腫瘍組織と正常組織内でのＢ３０５Ｄの発現レベルを、リアルタイムＰＣＲおよびノーザン分析法で試験した。その結果、Ｂ３０５Ｄは、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、正常前立腺および正常精巣内で高度に発現されるが、その外のすべての被検組織（結腸腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、および正常な骨髄、結腸、腎臓、肝臓、肺臓、卵巣、皮膚、小腸、胃）での発現は低いかまたは検出不能であった。
【０１６７】
実施例１２
前立腺特異的抗原による全遺伝子初回免疫と刺激の技法を利用する生体外でのヒトＣＴＬの生成
Ｐ５０１Ｓをレトロウィルスで形質導入したオートローガス繊維芽細胞（例えばＹｅｅら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １５７ （９） ； ４０７９−４０８６， １９９６参照）で、生体外にて全遺伝子初回免疫を行う方法を利用して、上記γインターフェロンＥＬＩＳＰＯＴ分析法で確認されるように、Ｐ５０１Ｓ（Ｌ１−１２としても知られている）を形質導入されたオートロガス繊維芽細胞を特異的に認識するヒトＣＴＬ系が誘導された。Ｐ５０１Ｓを形質導入されたＨＬＡ不適正繊維芽細胞系のパネルを使用して、これらのＣＴＬ系が、制限されたＨＬＡ−Ａ２クラスＩ対立遺伝子であることを示した。具体的に述べると、１０％のヒト血清、５０ｎｇ／ｍｌのヒトＧＭ−ＣＳＦおよび３０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−４を含有するＲＰＭＩ培地内で５日間増殖させることによって、樹状細胞（ＤＣ）を、正常なヒトドナーのＰＢＭＣ由来の単核細胞培養物から分化させた。培養後、ＤＣに、組換えＰ５０１Ｓワクシニアウィルスを、感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ．）５で一夜感染させ、次いで３μｇ／ｍｌのＣＤ４０リガンドを添加することによって一夜成熟させた。ウィルスを紫外線を照射して不活性化した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、磁気ビーズシステムを利用して分離し、初回免疫培養を、標準の培養法を用いて開始した。レトロウィルスでＰ５０１Ｓを形質導入されたオートロガス一次繊維芽細胞を用いて、７〜１０日毎に培養物の再刺激を行った。４回の刺激サイクルの後にＰ５０１Ｓを形質導入されたオートロガス繊維芽細胞で刺激したとき、γ−インターフェロンを特異的に産生するＣＤ８＋Ｔ細胞系が確認された。このＰ５０１Ｓ特異的活性は、培養物を、ＩＬ−１５の存在下、Ｐ５０１Ｓ形質導入繊維細胞で続けて刺激することによって維持できた。Ｐ５０１Ｓを形質導入されたＨＬＡ不適正繊維芽細胞系のパネルをつくって、前記応答の制限対立遺伝子を定めた。ＥＬＩＳＰＯＴ検定法でγインターフェロンを測定することによって、前記Ｐ５０１Ｓの特異的応答は、ＨＬＡ−Ａ２によって制限されることが分かった。これらの結果は、Ｐ５０１Ｓに対するＣＤ８＋ＣＴＬの応答を誘発できることを示している。
【０１６８】
認識されたエピトープを同定するために、Ｐ５０１ＳをコードするｃＤＮＡを各種制限消化により断片化し、そしてレトロウイルス発現ベクターｐＢＩＢ−ＫＳにサブクローン化した。レトロウイルス上清を、ヘルパー・パッケージング・ラインＰｈｏｅｎｉｘ−Ａｍｐｈｏのトランスフェクションにより作製した。次に、上清を、ＣＴＬスクリーニングのためにＪｕｒｋａｔ／Ａ２ｋｂ細胞に形質導入するために使用した。ＣＴＬを、Ｐ５０１Ｓ断片の“ライブラリー”により形質導入された上にＡ２ｋｂ標的に対するＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてスクリーニングした。最初の陽性断片Ｐ５０１Ｓ／Ｈ３とＰ５０１Ｓ／Ｆ２を配列決定し、そして配列番号１１３のそれぞれアミノ酸１０６−５５３とアミノ酸１３６−５４７をコードしていることを発見した。Ｈ３の切断は、配列番号１１３のアミノ酸残基１０６−３５１をコードするために作られた。これは、ＣＴＬを刺激することができず、それ故、アミノ酸残基３５１−５４７にそのエピトープは局在化される。アミノ酸１−４７２（断片Ａ）とアミノ酸１−３５１（断片Ｂ）をコードするさらなる断片も構築した。断片Ｂでなく断片Ａは、ＣＴＬを刺激し、これは、そのエピトープをアミノ酸残基３５１−４７２に局在化した。この領域を表す重複する２０−ｍｅｒと１８−ｍｅｒペプチドを、ＩＦＮ−ガンマ・アッセイにおいてＪｕｒｋａｔ／Ａ２ｋｂ細胞  対  ＣＴＬをパルスすることによりテストした。ペプチドＰ５０１Ｓ−３６９（２０）とＰ５０１Ｓ−３６９（１８）だけがＣＴＬを刺激した。この領域を表す９−ｍｅｒと１０−ｍｅｒペプチドを合成し、そして同様にテストした。ペプチドＰ５０１Ｓ−３７０（配列番号５３９）は、強い応答を与える最小の９−ｍｅｒであった。ペプチドＰ５０１Ｓ−３７６（配列番号５４０）も弱い応答を与えた。これは、それが交差反応性エピトープを表すかもしれないということを示唆している。
【０１６９】
その後の試験において、ＭＨＣクラスＩ−制限，Ｐ５０１Ｓ−特異的，オートロガスＣＤ８ Ｔ細胞をプライムするために、Ｐ５０１Ｓを形質導入された原発ヒトＢ細胞の能力を調べた。原発Ｂ細胞は、ＣＤ４０リガンド及びＩＬ−４中での培養によりホモ接合ＨＬＡ−Ａ２ドナーのＰＢＭＣから得、ベクターｐＢＩＢ内の組換えＰ５０１Ｓにより高頻度で形質導入し、そしてブラストサイジン−Ｓで選択した。インビトロ・プライミングのために、精製ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、９６−ウェル・マイクロカルチャー形式において、オートロガスＣＤ４０リガンド＋ＩＬ−４由来，Ｐ５０１Ｓ形質導入Ｂ細胞とともに培養した。これらのＣＴＬマイクロカルチャーを、Ｐ５０１Ｓ形質導入Ｂ細胞で再刺激し、そして次に特異性についてアッセイした。この最初のスクリーニングの後、バックグラウンドを超える有意なシグナルをもつマイクロカルチャーが、同じくＰ５０１Ｓで形質導入されたオートロガスＥＢＶ形質転換Ｂ細胞（ＢＬＣＬ）上でクローン化された。検出のためのＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴを用いて、上記ＣＤ８ Ｔ細胞クローンのいくつかが、対照抗原により形質導入されたＢＬＣＬではなく、ＢＬＣＬ／Ｐ５０１Ｓに対する反応性により証明されるように、Ｐ５０１Ｓに対して特異的であることが発見された。抗−Ｐ５０１Ｓ ＣＤ８ Ｔ細胞特異性がＨＬＡ−Ａ２−制限されていることも、さらに証明された。第１に、抗−ＨＬＡ−Ａ， Ｂ， Ｃモノクローナル抗体（Ｗ６．３２）、抗−ＨＬＡ−Ａ， Ｂ， Ｃモノクローナル抗体（Ｂ１．２３．２）、及び対照モノクローナル抗体を用いた抗体ブロッキング実験は、抗−ＨＬＡ−Ａ， Ｂ， Ｃ抗体だけが、Ｐ５０１Ｓ発現性オートロガスＢＬＣＬの認識をブロックすることを示した。第２に、抗−Ｐ５０１Ｓ ＣＴＬも、Ｐ５０１Ｓを形質導入されたＨＬＡ−Ａ２適合、ヘテロロガスＢＬＣＬを認識したが、対応のＥＧＦＰ形質導入対照ＢＬＣＬは認識しなかった。
【０１７０】
実施例１３
マイクロアレイ分析法による前立腺特異的抗原の確認
この実施例では、前立腺腫瘍ｃＤＮＡライブラリーからの特定の前立腺特異的ポリペプチドの分離について述べる。
上記のヒト前立腺腫瘍ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、マイクロアレイ分析法を利用してスクリーニングして、非前立腺正常組織（精巣を除く）と比べて、前立腺腫瘍および／または正常前立腺組織内で少なくとも３倍もの過剰発現を示すクローンを確認しした。３７２のクローンが確認され、３１９のクローンの配列決定に成功した。表Ｉはこれらクローンの概要を示し、これらクローンは配列番号３８５〜４００に示してある。これら配列のうち、配列番号：３８６， ３８９， ３９０および３９２は新規な遺伝子に対応し、そして配列番号３９３と３９６は、先に確認した配列に対応している。残りの配列（配列番号：３８５， ３８７， ３８８， ３９１， ３９４， ３９５および３９７〜４００）は、表Ｉに示すように既知の配列に対応している。
【０１７１】
【表１】
2004537252.tif 000003
【０１７２】
【表２】
2004537252.tif 000004
ＣＧＩ−８２は他の試験した正常組織に比べ、前立腺組織中で４．０６倍過剰な発現を示した。それは前立腺腫瘍の４３％、正常前立腺の２５％にて過剰発現されていたが、試験した他の正常組織では検出されなかった。Ｌ−イディトール−２脱水素酵素は試験した他の正常組織に比べ、前立腺組織で４．９４倍過剰な発現を示した。それは前立腺腫瘍の９０％、正常前立腺の１００％にて過剰発現されていたが、試験した他の正常組織では検出されなかった。Ｅｔｓ転写因子ＰＤＥＦは試験した他の正常組織に比べ、前立腺組織で５．５５倍過剰な発現を示した。それは前立腺腫瘍の４７％、正常前立腺の２５％にて過剰発現されていたが、試験した他の正常組織では検出されなかった。ｈＴＧＲ１は試験した他の正常組織に比べ、前立腺組織にて９．１１倍の過剰発現を示した。それは前立腺腫瘍の６３％にて過剰発現されていたが、正常前立腺を含む試験した他の正常組織では検出されなかった。ＫＩＡＡ０２９５は試験した他の正常組織に比べ、前立腺組織で５．５９倍過剰な発現を示した。それは前立腺腫瘍の４７％にて過剰発現されていたが、正常前立腺組織を含む試験した他の正常組織では低値であり検出不能であった。前立腺酸性フォスファターゼは試験した他の正常組織に比べ、前立腺組織で９．１４倍過剰な発現を示した。それは前立腺腫瘍の６７％、正常前立腺の５０％では過剰発現されていたが、試験した他の正常組織では検出されなかった。トランスグルタミナーゼは試験した他の正常組織に比べ、前立腺組織で１４．８４倍過剰な発現を示した。それは前立腺腫瘍の３０％、正常前立腺の５０％で過剰発現されていたが、試験した他の正常組織では検出されなかった。高密度リポ蛋白質結合蛋白質（ＨＤＬＢＰ）は試験した他の正常組織に比べ、前立腺組織で２８．０６倍過剰な発現を示した。それは前立腺腫瘍の９７％、正常前立腺の７５％で過剰発現されていたが、試験した他の全ての正常組織では検出されなかった。ＣＧＩ−６９は試験した他の正常組織に比べ、前立腺組織で３．５６倍過剰な発現を示した。それは前立腺腫瘍の９０％以上、及び正常前立腺の７５％に検出された少数遺伝子であった。この遺伝子の正常組織中での発現は極めて低かった。ＫＩＡＡ０１２２は試験した他の正常組織に比べ、前立腺組織で４．２４倍過剰な発現を示した。それは前立腺腫瘍の５７％で過剰発現されていたが、正常前立腺組織を含む全ての正常組織では検出不能であった。１９１４２．２バンガー（ｂａｎｇｕｒ）は試験した他の正常組織に比べ、前立腺組織で２３．２５倍過剰な発現を示した。それは前立腺腫瘍の９７％、正常前立腺の１００％では過剰発現されていた。試験した他の正常組織では検出不能であった。５５６６．１ワン（Ｗａｎｇ）は試験した他の正常組織に比べ、前立腺組織で３．３１倍過剰な発現を示した。それは前立腺腫瘍の９７％、正常前立腺の７５％では過剰発現され、さらに正常骨髄、膵臓及び活性化ＰＢＭＣでも過剰発現されていた。新規クローン２３３７９は試験した他の正常組織に比べ、前立腺組織で４．８６倍過剰な発現を示した。それは前立腺腫瘍の９７％、正常前立腺の７５％では過剰発現されていたが、試験した他の全ての正常組織では検出不能であった。新規クローン２３３９９は試験した他の正常組織に比べ、前立腺組織で４．０９倍過剰な発現を示した。それは前立腺腫瘍の２７％にて過剰発現されていたが、正常前立腺組織を含む試験した全ての正常組織にて検出不能であった。新規クローン２３３２０は試験した他の正常組織に比べ、前立腺組織で３．１５倍過剰な発現を示した。それは全ての前立腺腫瘍及び正常前立腺組織の５０％にて検出可能であった。それはまた正常結腸及び気管でも発現されていた。その他の正常組織はこの遺伝子を高レベルには発現していない。
【０１７３】
実施例１４
エレクトロニックサブトラクションによる前立腺特異的抗原の同定
本実施例はエレクトロサブトラクション法を利用した前立腺特異的抗原の同定を記す。
ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ヒトＥＳＴデータベース中に存在する潜在的前立腺特異的遺伝子をエレクトロニックサブトラクション法（Ｖａｓｍａｔｉｚｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：３００−３０４， １９９８記載に同類）にて同定した。各種前立腺ライブラリー由来のＥＳＴクローン（４３，４８２）の配列を人バンク公開ヒトＥＳＴデータベースより得た。各前立腺ＥＳＴ配列をＢＬＡＳＴＮ（国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の問合わせ配列として利用し、ヒトＥＳＴデータベースを探索した。同一物と判定された（１００塩基対以上長さの整合配列を持ち、この領域全体の整合密度が７０％以上のもの）全てのものをクラスターとしてグループ化（整列）した。２００以上のＥＳＴを含むクラスターは、それらが繰り返し要素を表している可能性があること、又はリボソーマル蛋白質の様に高度に発現されている遺伝子である可能性があることから廃棄された。２またはそれ以上のクラスターが共通のＥＳＴｓを持つ場合には、これらクラスターを”スーパーサブクラスター”としてグループ化した結果、４，３４５種類の前立腺スーパークラスターを得た。
【０１７４】
ジェンバンクリリース中に示されている４７９種類のヒトｃＤＮＡライブラリーに関する記録をダウンロードし、これらｃＤＮＡライブラリー記録のデータベースを作製した。これら４７９種類のｃＤＮＡライブラリーは３グループ、プラス（正常前立腺及び前立腺腫瘍ライブラリー、及び発現が望まれる乳線細胞株）、マイナス（発現が望まれないその他の正常成体組織からのライブラリー）及びその他（発現に関連性がないと考えられる胎児組織、乳児組織、女性にのみ認められる組織、非前立腺腫瘍及びに前立腺細胞株以外の細胞株からのライブラリー）にグループ化された。これらライブラリーグループの要約を表ＩＩに示す。
【０１７５】
【表３】
2004537252.tif 000005
各スーパークラスターをスーパークラスター内のＥＳＴｓに関し分析した。各ＥＳＴクローンの起源の組織を記録、利用してスーパークラスターを４グループに分類した：１型−プラスグループライブラリーのみに認められるＥＳＴクローン；マイナス又はその他のグループライブラリーに関しては発現は検出されない；２型−プラス及びその他のグループライブラリーだけに由来するＥＳＴクローン；マイナスグループでは発現は検出されない；３型−プラス、マイナス又はその他のグループ由来ＥＳＴクローンであるが、プラスグループ由来ＥＳＴ数はマイナス又はその他のグループ由来の数に比べ高いもの；そして４型−プラス、マイナス及びその他グループライブラリー由来ＥＳＴであるが、プラスグループ由来ＥＳＴ数はマイナスグループ由来数に比べ高いもの。本分析により４，３４５の乳腺クラスターを同定した（表ＩＩＩ参照）。これらクラスターより、３，１７２個のＥＳＴクローンがリサーチジェネッティックス社より発注され、９６−ウエル型プレートの中に凍結グリセロールストックとして受け取られた。
【０１７６】
【表４】
2004537252.tif 000006
挿入体はシンテニ（Ｓｙｎｔｅｎｉ）マイクロアレー分析に適したアミノ酸結合ＰＣＲプライマーを利用しＰＣＲ増幅した。特定のクローンについて１種類以上のＰＣＲ産物が得られた場合には、マイクロアレー法によりサブトラクション法を分析し、腫瘍対正常組織ｍＲＮＡ比が高いエレクトロニックサブトラクション乳腺クローンを同定した。全部で、上記エレクトロニックサブトラクション法からの２，５２８クローンをマイクロアレイ分析により分析して、高レベルの腫瘍をもっていた上記エレクトロニックサブトラクション乳房クローン対正常組織ｍＲＮＡを同定した。この様なスクリーニングはシンテニー（パロアルト、カリフォルニア州（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ））マイクロアレーを使い、メーカー指示書（及び本質的にＳｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１０６１４−１０６１９， １９９６及びＨｅｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ， Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：２１５０−２１５５， １９９７記載の如くに）に従い実施された。これら分析中、クローンはチップ上に配列され、続いて正常及び腫瘍前立腺ｃＤＮＡならびに各種その他正常組織から作られた蛍光プローブを用いプロービングされた。スライドをスキャンし、蛍光強度が測定された。
【０１７７】
３以上の発現比（即ち、前立腺腫瘍及び正常前立腺ｍＲＮＡのレベルが他の正常組織ｍＲＮＡのレベルに比べ少なくとも３倍である）を持つクローンを前立腺腫瘍特異的配列として特定した（表ＩＶ）。これらクローンの配列は、配列番号４０７、４１３、４１６−４１９、４２２、４２６、４２７及び４５０に示された特定の新規配列と共に、配列番号４０１−４５３に提供されている。
【０１７８】
【表５】
2004537252.tif 000007
【０１７９】
【表６】
2004537252.tif 000008
【０１８０】
【表７】
2004537252.tif 000009
【０１８１】
実施例１５
マイクロアレー分析による前立腺特異的抗原の更なる同定
本実施例は、前立腺腫瘍ｃＤＮＡライブラリーより得た追加の前立腺特異的ポリペプチドの分離を記す。
【０１８２】
上述のヒト前立腺腫瘍ｃＤＮＡ発現ライブラリーをマイクロアレー分析にてスクリーニングし、非前立腺正常組織（精巣は含まない）に比べ、前立腺腫瘍及び／又は正常前立腺組織中に少なくとも３倍過剰な発現を示すクローンを特定した。１４２のクローンが同定され、配列決定された。これらクローンの一部を配列番号４５４−４６７に示す。これらの内、配列番号４５９−４６１は新規遺伝子である。その他の（配列番号４５４−４５８、及び４６１−４６７）は既知配列である。
【０１８３】
実施例１６
前立腺特異的抗原Ｐ７１０Ｐの更なる特性分析
本実施例はＰ７１０Ｐの完全長クローニングを記す。
上記前立腺ｃＤＮＡライブラリーを上記Ｐ７１０Ｐ断片を用いスクリーニングした。１００万個のクローンをＬＢ／アンピシリンプレート上に播かれた。ナイロン膜フィルターを用いてこれらコロニーを吊り上げ、次にこれらフィルターにより拾い上げられたｃＤＮＡは変性され、そしてＵＶ光によりフィルター上に架橋された。Ｐ７１０Ｐ断片は放射線標識され、フィルターとのハイブリダイズに利用された。陽性ｃＤＮＡクローンを選別し、そのｃＤＮＡを回収、自動Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｒｉｓｉｏｎシークエンサーにより配列決定した。４種類の配列を得、配列番号４６８−４７１に示した。これらの配列は、Ｐ７１０Ｐ遺伝子の異なるスプライス変異型を表すようである。
【０１８４】
実施例１７
前立腺特異的抗原Ｐ５０１Ｓの蛋白質発現
本実施例はＥ．ｃｏｌｉ、バキュロウイルスおよび哺乳動物細胞での前立腺特異的抗原Ｐ５０１Ｓの発現と精製とを説明する。
ａ）Ｅ．ｃｏｌｉでの発現
完全長型Ｐ５０１Ｓの発現を、まずｐＥＴ１７ｂ中Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原Ｒａ１２（配列番号４８４）の先頭３０個のアミノ酸の下流に、リーダー配列（配列番号１１３のアミノ酸３６−５５３）を持たないＰ５０１Ｓをクローニングし試みた。具体的にはプライマーＡＷ０２５（配列番号４８５）およびＡＷ００３（配列番号４８６）を使用するＰＣＲをＰ５０１のＤＮＡを用いて実施した。ＡＷ０２５はＨＩｎｄＩＩＩ部位を含むセンスクローニングプライマーである。ＡＷ００３はＥｃｏＲＩ部位を含む、アンチセンスクローニングプライマーである。ＤＮＡ増幅は、１０×Ｐｆｕバッファー５μｌ、２０ｍＭのｄＮＴＴＰｓを１μｌ、１０μＭ濃度のＰＣＲプライマーをそれぞれ１μｌ、水４０μｌ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ））を１μｌと１００ｎｇ／μｌのＤＮＡを１μｌ用いて行った。９５℃での変性を３０秒間実施した後、９５℃３０秒間、６０℃１分間、７２℃３分間を１０サイクル、９５℃３０秒間、６５℃１分間、７２℃３分間を２０サイクル行い、最後に７２℃１０分間サイクルを実施した。ＰＣＲ産物はＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩを用いＲａ１２ｍ／ｐＥＴ１７ｂにクローニングされた。得られた融合構築体（Ｒａ１２−Ｐ５１０Ｓ−Ｆと呼ぶ）の配列をＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１８５】
融合構築体はＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、ｐＬｙｓＳおよびＣｏｄｏｎＰｌｕｓＥ．ｃｏｌｉ（ストラタジーン）内に形質導入され、カナマイシン入りＬＢブロス中に一晩増殖させた。得られた培養体をＩＰＴＧを使い誘導した。蛋白質をＰＶＤＦ膜に転写し、５％の脱脂ミルク（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎバッファー中）でブロッキングし、３回洗浄してからマウス抗Ｈｉｓタグ抗体（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））と１時間インキュベーションした。膜を３回洗浄してからＨＲＰ−プロテインＡ（ザイメッド（Ｚｙｍｅｄ））で３０分間プロービングした。最後に膜を３回洗浄し、ＥＣＬ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））で発光させた。ウエスタンブロットでは発現は検出されなかった。同様にＲａ１２−Ｐ５０１Ｓ−Ｆ融合体を使いＣＥ６ファージ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））によりＢＬ２１ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ中に発現した場合も、ウエスタンブロットでは発現は検出されなかった。
Ｐ５０１ＳのＮ末端断片（配列番号１１３のアミノ酸３６−３２５）を、以下の様にしてｐＥＴ１７ｂ中、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原Ｒａ１２の先頭３０個のアミノ酸の下流にクローニングした。Ｐ５０１ＳＤＮＡを用い、プライマーＡＷ０２５（配列番号４８５）とＡＷ０２７（配列番号４８７）を用いたＰＣＲを実施した。ＡＷ０２７はＥｃｏＲＩ部位と停止コドンを含むアンチセンスクローニングプライマーである。ＤＮＡ増幅は本質的に上記同様に実施された。得られたＰＣＲ産物をｐＥＴ１７ｂ中Ｒａ１２のＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。融合構築体（Ｒａ１２−Ｐ５０１Ｓ−Ｎと称する）はＤＮＡ配列決定により確認された。
Ｒａ１２−Ｐ５０１Ｓ−Ｎ融合構築体は本質上記同様にしてＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、ｐＬｙｓＳおよびＣｏｄｏｎＰｌｕｓ中での発現に使用された。ウエスタンブロット分析を用いたところ、想定分子量３６ｋＤａに蛋白質のバンドが観察された。より高分子のバンドも幾つか観察されたが、これらは組換え体蛋白質の会合体と思われる。Ｒａ１２−Ｐ５０１Ｓ−Ｆ融合体をＣＥ６ファージを使ったＢＬ２１ＣｏｄｏｎＰｌｕｓでの発現に使用した場合には、ウエスタンブロットではなにも検出されなかった。
【０１８６】
Ｐ５０１ＳのＣ末端部分（配列番号１１３のアミン酸２５７−５５３）をＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原Ｒａ１２（配列番号４８４）の先頭３０個のアミノ酸の下流に含む融合構築体を用い、プライマーＡＷ０２６（配列番号４８８）およびＡＷ００３（配列番号４８６）を用いたＰＣＲを実施した。ＡＷ０２６はＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むセンスクローニングプライマーである。ＤＮＡ増幅は実質上記同様にして実施された。得られたＰＣＲ産物はｐＥ１７ｂ中Ｒａ１２のＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニングされた。融合構築体の配列（Ｒａ１２−Ｐ５０１Ｓ−Ｃと称する）は確認された。
Ｒａ１２−Ｐ５０１Ｓ−Ｃ融合構築体を上記同様にして、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、ｐＬｙｓＳおよびＣｏｄｏｎＰｌｕｓでの発現に使用した。ウエスタンブロットでは少量の蛋白質が検出され、同時に幾つかの分子量会合体も観察された。Ｒａ１２−Ｐ５０１Ｓ−Ｃ融合体をＣＥ６ファージで誘導したＢＬ２１ＣｏｄｏｎＰｌｕｓでの発現に用いた場合にも、ウエスタンブロットにより発現が検出された。
【０１８７】
ｂ）バキュロウイルスでのＰ５０１Ｓの発現
Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現システム（ＢＲＬライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ））を用い、昆虫細胞中にＰ５０１Ｓを発現させた。完全長のＰ５０１Ｓ（配列番号１１３）をＰＣＲで増幅し、ドナープラスミドｐＦａｓｔＢａｃＩのＡｂａＩ部位にクローニングした。組換え体ｂａｃｍｉｄおよびバキュロウイルスは、メーカー指示書に従い調製した。組換え体バキュロウイルスをＳｆ９細胞中に増幅し、高力価ウイルスストックを用いＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞（インビトロゲン）に感染させ、組換え体蛋白質を作った。完全長蛋白質であることは、組換え体蛋白質のＮ末端の配列を決定することと、ウエスタンブロット分析により確認した（図７）。具体的には６ウエルプレート中の、６０万個のＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞に無関係なコントロールウイルスであるＢＶ／ＥＣＤ＿ＰＤ（レーン２）、各種量のＰ５０１Ｓ用組換え体バキュロウイルスを感染させるか（レーン４−８）、または未感染の状態に置いた（レーン３）。細胞溶解物を還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、抗Ｐ５０１Ｓモノクローナル抗体Ｐ５０１Ｓ−１０Ｅ３−Ｇ４Ｄ３（以下の如くに調製）を用いたウエスタンブロットにより分析した。レーン１はビオチン化された蛋白質分子量マーカー（バイオラブス（ＢｉｏＬａｂｓ））である。
【０１８８】
昆虫細胞での組換え体Ｐ５０１Ｓの局在性を次の様にして調べた。Ｐ５０１Ｓを過剰発現する昆虫細胞を核、ミトコンドリア、膜および細胞質に分画した。等蛋白質量の各分画をＰ５０１Ｓに対するモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットにより分析した。分画方法によれば、核とミトコンドリア分画は共に原形質膜の成分をいくらか含んでいる。しかし膜分画は基本的にはミトコンドリアおよび核を含んでいない。Ｐ５０１Ｓに対は膜成分を含む全ての分画に存在していることが見いだされ、Ｐ５０１Ｓが組換え体蛋白質を発現している昆虫細胞の原形質膜に関連するらしいことが示唆された。
【０１８９】
ｃ）哺乳動物細胞でのＰ５０１Ｓの発現
完全長のＰ５０１Ｓ（５５３ＡＡ）をｐＣＥＰ４（インビトロゲン）、ｐＶＲ１０１２（バイカル、サンジェゴ、カリフォルニア州（Ｖｉｃａｌ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））およびｐＢＩＢと呼ばれるレトロウイルスベクターｐＢＭＮの変型体を含む各種哺乳動物細胞発現ベクターにクローニングした。Ｐ５０１Ｓ／ｐＣＥＰ４およびＰ５０１Ｓ／ｐＶＲ１０１２の繊維芽細胞ＨＥＫ２９３へのトランスフェクションは、Ｆｕｇｅｎｅトランスフェクション試薬（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ））を用いて実施した。簡単に説明すると、Ｆｕｇｅｎｅ試薬２μｌを１００μｌの無血清培地に希釈し、室温で５−１０分間インキュベーションした。この混合液を１μｇのＰ５０１ＳプラスミドＤＮＡに加え、短時間混合したのち室温で３０分間インキュベーションした。Ｆｕｇｅｎｅ／ＤＮＡ混合体を細胞に加え、２４−４８時間インキュベーションした。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３繊維芽細胞での組換え体Ｐ５０１Ｓの発現は、Ｐ５０１Ｓに対するモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットにより検出された。
【０１９０】
ＣＨＯ−Ｋ細胞（米国標準培養コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メリーランド州（ＭＤ））へのｐ５０１Ｓ／ｐＣＥＰ４のトランスフェクションは、ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒトランスフェクション試薬（ジーンセラピーシステムス（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、サンジェゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア州（ＣＡ））を使用し実施した。簡単に述べると、１５μｌのＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒを５００μｌの無血清培地中に希釈し、室温で１０分間インキュベーションした。ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ／培地混合液を、５００μｌの無血清培地中に希釈された２μｇのプラスミドに加え、短時間混合してから３０分間、室温にてインキュベーションした。ＣＨＯ−Ｋ細胞をＰＢＳで濯ぎ血清蛋白質を除いてから、ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ／ＤＮＡ混合液を加え、５時間インキュベーションした。次にトランスフェクションされた細胞に等量の２×培地を与え、２４−４８時間インキュベーションした。
一過性に感染させたＣＨＯ−Ｋ細胞のＰ５０１をＳＦＡＣＳ分析した結果、Ｐ５０１Ｓが表面で発現していることが示された。発現は下記の様にしてＰ５０１Ｓペプチドに対し作られたウサギのポリクローナル抗血清を用い検出された。フローサイトメトリーによる分析はＦａＣＳｃａｎ（ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用い行われ、データはＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔプログラムを使い解析された。
【０１９１】
実施例１８
前立腺特異的ポリペプチドに対する抗体の調製と特性解析
ａ）Ｐ５０１Ｓに対する抗体の調製と特性解析
前立腺特異的抗原Ｐ５０１Ｓのカルボキシ末端に対するマウスモノクローナル抗体を以下の様にして調製した。
Ｐ５０１Ｓの切断片（配列番号１１３のアミノ酸３５５−５２６）を作製し、ｐＥＴ２８ｂベクター（ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ））中にクローニングし、ヒスチジンタグの付いたチオレドキシン融合蛋白質としてＥ．ｃｏｌｉ内に発現させた。ｔｒｘ−Ｐ５０１Ｓ融合蛋白質はニッケルクロマトグラフィーにて精製され、トロンビンで消化してｔｒｘ断片が除かれ、そして酸で沈降してから逆相ＨＰＬＣにかけられ更に精製された。
マウスは切断Ｐ５０１Ｓ蛋白質で免疫された。抗Ｐ５０１Ｓポリクローナル血清を含むと思われるマウスより得た血清を、精製Ｐ５０１Ｓおよびｔｒｘ−Ｐ５０１Ｓ蛋白質を使ったＥＬＩＳＡアッセイを用いＰ５０１Ｓ特異的反応性について試験した。Ｐ５０１Ｓと特異的に反応すると思われた血清は次にウエスタンブロット分析によりＰ５０１Ｓ反応性についてスクリーニングされた。Ｐ５０１Ｓ特異的抗体成分を含むマウスを屠殺し、その脾臓細胞を用い、通常の方法にて抗Ｐ５０１Ｓ抗体を酸性するハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの上清はまずＥＬＩＳＡを使ってＰ５０１Ｓ特異的反応性について試験し、続いてＰ５０１Ｓ誘導細胞との反応性についてＦＡＣＳ分析を行った。これらの結果に基づき１０Ｅ３と呼ばれるモノクローナルハイブリドーマを得て、さらにサブクローニングした。多数のサブクローンが作製され、ＥＬＩＳＡを用いてＰ５０１Ｓに対する特異的反応性について試験し、そしてＩｇＧのイソ型が判定された。この分析の結果を下表Ｖに示す。試験した１６のサブクローンの内、以後の研究のためにモノクローナル抗体１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３を選択した。
【０１９２】
【表８】
2004537252.tif 000010
【０１９３】
１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３のＰ５０１Ｓに対する特異性はＦＡＣＳ分析により調べられた。具体的には、細胞が固定され（２％フォルムアルデヒド、１０分）、浸透化処理（０．１％サポニン、１０分）してから０．５−１μｇ／ｍｌの１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３で染色し、続いて二次ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇ抗体（ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅ）、サンジェゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア（ＣＡ））とインキュベーションした。次にＥｘｃａｌｂｕｒ蛍光発色細胞ソーターを使い、細胞のＦＩＴＣ蛍光分析を行った。形質導入細胞のＦＡＣＳ分析では、レトロウイルスを使ってＢ−ＬＣＬにＰ５０１Ｓを形質導入した。感染細胞の分析では、Ｂ−ＬＣＬにＰ５０１Ｓを発現しているワクシニアベクターを感染させた。これらのアッセイの特異性を示すために、別の抗原（Ｐ７−３Ｐ）を形質導入したＢ−ＬＣＬと未感染のＢ−ＬＣＬベクターを用いた。１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３はＰ５０１Ｓ形質導入Ｂ−ＬＣＬに結合するだけでなくＰ５０１Ｓ感染Ｂ−ＬＣＬ細胞にも結合するが、非感染細胞またはＰ７０３Ｐ形質導入細胞には結合しないことが示された。
【０１９４】
１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３により認識されるエピトープが細胞の表面上または細胞内コンパートメント内のどちらにあるか決定するために、Ｂ−ＬＣＬをＰ５０１Ｓまたはコントロール抗原としてのＨＬＡ−Ｂ８で形質導入し、上記同様に固定し浸透化してから、あるいは直接１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３で染色して上記同様に分析した。１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３によるＰ５０１Ｓの特異的認識には浸透化処理が必要なことが見いだされ、この抗体により認識されるエピトープが細胞内にあることが示唆された。
それぞれ高レベル、中レベルおよび低レベルにＰ５０１Ｓを発現することが知られている３種類の腫瘍細胞株Ｌｎｃａｐ、ＰＣ−３およびＤＵ−１４５との１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３反応性を、細胞を浸透化処理し、上記同様に処理して調べた。ＰＣ−３に比べＬｎｃａｐとの間で１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３のより高い活性が見いだされ、そしてＤＵ−１４５に比べＰＣ−３との間でより高い活性が見いだされた。これらの結果はリアルタイムＰＣＲの結果に一致し、抗体がこれら腫瘍細胞株において特異的にＰ５０１Ｓを認識すること、そして前立腺腫瘍細胞株に認識されたエピトープも細胞内に存在することを示している。
【０１９５】
Ｐ５０１Ｓに関する１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３の特異性はウエスタンブロットでも示された。前立腺癌細胞株Ｌｎｃａｐ、ＤＵ−１４５およびＰＣ−３、一過性にＰ５０１ＳをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞、およびトランスフェクションしていないＨＥＫ２９３細胞から細胞溶解物を作製した。これら溶解物に関する１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３を用いたウエスタンブロット分析は、Ｌｎｃａｐ、ＰＣ−３およびＰ５０１ＳトランスフェクションＨＥＫ細胞には４６ｋＤａの免疫反応性バンドを示したが、ＤＵ−１４５または非トランスフェクションＨＥＫ２９３細胞についてはそれを示さなかった。判定量的ＰＣＲ分析はＰ５０１ｍＲＮＡがＬｎｃａｐで発現されており、ＰＣ−３細胞ではそれに比べ低いものの検出可能であったがＤＵ−１４５細胞では全く検出されなかったことから、Ｐ５０１ＳｍＲＮＡの発現もこれらの結果に一致している。細菌で発現され、精製された組換え体Ｐ５０１Ｓ（Ｐ５０１ＳＳｔｒ２と呼ぶ）は、発現ベクターＶＲ１０１２またはｐＣＥＰ４を用いＨＥＫ２９３細胞内に一過性に発現された完全長のＰ５０１Ｓ同様に１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３によって認識された（２４ｋＤａ）。Ｐ５０１Ｓの推定分子量は６０．５ｋＤａであったが、トランスフェクションしたＰ５０１Ｓも“未変性”Ｐ５０１Ｓもその疎水的性質より若干低い移動度で移動した。
【０１９６】
前立腺癌および正常組織切片のパネル（前立腺、副腎、乳房、子宮頸部、結腸、十二指腸、胆嚢、回腸、腎臓、卵巣、膵臓、甲状腺、骨格筋、脾臓および精巣）について免疫化学分析を行った。組織サンプルはホルマリン液に２４時間固定され、パラフィン包埋されてから１０ミクロンの切片にされた。組織切片は浸透処理されてから１時間１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３とインキュベーションされた。ＨＲＰ−標識抗マウスに続いてＤＡＢクロモゲンとインキュベーションしてＰ５０１Ｓの免疫反応性を視覚化した。Ｐ５０１Ｓは正常前立腺および前立腺癌の両方に強く発現されていることが見いだされたが、試験したその他の組織には検出されなかった。
１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３により認識されるエピトープを特定するために、エピトープマッピング法を利用した。１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３作製時に使用したＰ５０１Ｓ断片全体をカバーする、１３種類の重複する２０−２１ｍｅｒのシリーズ（５アミノ酸が重複する；配列番号４８９−５０１）を合成した。平底型の９６ウエルマイクロタイタープレートにマウスを免疫する際使用したペプチドまたはＰ５０１Ｓ断片を、１マイクログラム／ｍｌにて２時間、３７℃でコーティングした。次にウエルを吸引してから１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むリン酸バッファー生理食塩水で２時間、室温にてブロッキングし、続いて０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄した。精製した抗体１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３を２倍希釈でＰＢＳＴ中に加え（１０００ｎｇ−１６ｎｇ）、室温で３０分間インキュベーションした。続いてＰＢＳＴで６回洗浄した後、１：２００００の割合のＨＲＰ標識ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）アフィニピュア（Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ）Ｆ（ａｂ‘）断片（ジャクソンイムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、ウエストグローブ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ）、ペンシルバニア州）と３０分間インキュベーションした。次にプレートを洗浄し、テトラメチルジジン中に１５分間インキュベーションした。反応は１Ｎの硫酸を加え停止し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使って４５０ｎｍでプレートを測定した。図８に示す様に配列番号４９６のペプチド（Ｐ５０１Ｓのアミノ酸４３９−４５９に相当）およびＰ５０１Ｓ断片との間では反応性が認められたが、残りのペプチドとの間には反応性は認められず、１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３により認識されるエピトープが配列番号１１３のアミノ酸４３９−４５９に局在することが示された。
【０１９７】
Ｐ５０１Ｓの組織特異性をさらに調べるため、主要な正常臓器およびこれら組織由来の新生物を包含する約４７００種のヒト組織についてマルチアレー免疫組織化学分析を行った。これらヒト組織サンプルのうち６５種類が前立腺由来であった。直径０．６ｍｍの組織片をホルマリン固定し、パラフィンに包埋した。サンプルを１０ｍＭのクエン酸バッファー、ＰＨ６．０を用いＨＩＥＲで前処理し、１０分間煮沸した。切片を１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３で染色し、ＨＲＰを用いてＰ５０１Ｓ免疫反応性を視覚化した。６５種類全ての前立腺組織サンプル（正常５例、未治療前立腺腫瘍５５例、ホルモン不応性前立腺腫瘍５例）が陽性であり、明瞭な各周辺の染色を示した。検討した他の組織は全てＰ５０１Ｓ発現について陰性であった。
【０１９８】
ｂ）Ｐ５０３Ｓに対する抗体の調製と特性分析
上記のＰ５０１Ｓと実質同様にして、細菌にＰ５０３Ｓ（配列番号１１４のアミノ酸１１３−２４１）の断片を発現させ、精製してウサギおよびマウスの免疫に用いた。マウスモノクローナル抗体は上記の如く標準的ハイブリドーマ技術を用い単離された。ウサギモノクローナル抗体は、イムジェニクスファーマシューティカル（Ｉｍｍｇｅｎｉｃｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（バンクーバー（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ）、ブリティッシュコロンビア州、カナダ）にて選択的リンパ細胞抗体（ＳＬＡＭ）法を用い単離された。下表ＶＩにはＰ５０３Ｓに対し作られたモノクローナル抗体が掲載されている。
【０１９９】
【表９】
2004537252.tif 000011
【０２００】
ウサギモノクローナル抗体２０Ｄ４およびＪＡ１に関する相補性決定領域（ＣＤＲｓ）をコードするＤＮＡ配列を決定し、それぞれを配列番号５０２および５０３を得た。
各抗体のエピトープ結合領域をより規定するために、配列番号１１４のアミノ酸１０９−２１３をカバーする一連の重複ペプチドを作製した。これらペプチドを用い、以下のＥＬＩＳＡにより抗Ｐ５０３Ｓモノクローナル抗体のエピトープマップを作製した。免疫源として用いたＰ５０３Ｓの組換え体断片を陽性コントロールに使用した。９６ウエルのマイクロタイタープレートを２０ｎｇ／ウエルの濃度のペプチドまたは組換え体抗原で一晩、４℃コーティングした。プレートを吸引し、１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを含むリン酸バッファー生理食塩水で室温、２時間ブロッキングしてから、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳで洗浄した。精製しＰＢＳＴ中に希釈されたウサギモノクローナル抗体をウエルに加え、３０分間、室温にてインキュベーションした。これに続いてＰＢＳＴにて６回洗浄を行い、１：２０００希釈したプロテインＡ  ＨＰＲ標識体とさらに３０分間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴにて６回洗浄し、さらに１５分間テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）とインキュベーションした。反応は１Ｎの硫酸を加え停止され、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使って４５０ｎｍでプレートを測定した。マウスモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡは、アッセイが上手くいった組織培養の上清を用い実施された。
陰性コントロールのＳＰ２上清を除いて、全ての抗体が組換え体Ｐ５０３Ｓ断片に結合した。２０Ｄ４、ＪＡ１および１Ｄ１２は配列番号１１４のアミノ酸１５１−１６９に相当するペプチド＃２１０１（配列番号５０４）と完全に結合した。１Ｃ３は配列番号１１４のアミノ酸１６５−１８４に相当するペプチド＃２１０２（配列番号５０５）と結合した。９Ｃ１２は配列番号１１４のアミノ酸１２０−１３９に相当するペプチド＃２０９９（配列番号５２２）と結合した。その他の抗体はこれら研究で検討しなかった領域に結合した。
エピトープマッピングに続いて、安定してＰ５０３Ｓを発現している細胞株を使ったＦＡＣＳ分析により抗体を試験し、抗体が細胞表面エピトープに結合することを確認した。コントロールプラスミドで安定にトランスフェクションされた細胞を陰性コントロールとして用いた。細胞は固定せずに生染色された。抗Ｐ５０３Ｓモノクローナル抗体０．５ｕｇが加えられ、細胞は２回洗浄する前に氷上にて３０分間インキュベーションし、それからＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギまたはマウス二次抗体と２０分間インキュベーションされた。２回洗浄した後、細胞をエクスキャリバー（Ｅｘｃａｌｉｂｕｒ）蛍光発色セルソーターを使って分析された。モノクローナル抗体１Ｃ３、１Ｄ１２、９Ｃ１２、２０Ｄ４およびＪＡ１はＰ５０３Ｓの細胞表面エピトープと結合するが、８Ｄ３は結合しないことが見いだされた。
【０２０１】
いずれの組織がＰ５０３Ｓを発現しているか決定するために、実質上記同様にして正常組織のパネル（前立腺、副腎、乳房、子宮頸部、結腸、十二指腸、胆嚢、回腸、腎臓、卵巣、膵臓、甲状腺、骨格筋、脾臓および精巣）について免疫化学分析を行った。ＨＲＰ−標識抗マウスまたは抗ウサギ抗体に続いて、ＴＭＢとインキュベーションしＰ５０３Ｓの免疫活性を視覚化した。Ｐ５０３Ｓは前立腺組織内に強く、そして子宮頸部、結腸、回腸および腎臓では弱く発現されているが、副腎、乳房、十二指腸、胆嚢、卵巣、膵臓、甲状腺、骨格筋、脾臓および精巣では発現していないことが分かった。
【０２０２】
ウエスタンブロット分析を用い、抗Ｐ５０３Ｓモノクローナル抗体の特異性について調べた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを細菌内に発現させ、それより精製した組換え体（ｒｅｃ）Ｐ５０３Ｓと完全長Ｐ５０３ＳをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞由来の溶解物について行った。蛋白質はニトロセルロース膜に転写され、抗体濃度１ｕｇ／ｍｌの抗Ｐ５０３モノクローナル抗体（２０Ｄ４、ＪＡ１、１Ｄ１２、６Ｄ１２および９Ｃ１２）それぞれを用いてウエスタンブロットが行われた。蛋白質は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識されたヤギ抗マウスモノクローナル抗体、またはプロテインＡセファローズを用い検出された。モノクローナル抗体２０Ｄ４は約分子量１４ｋＤａの組換え体Ｐ５０３Ｓ（アミノ酸１１３−２４１）と完全長Ｐ５０３ＳがトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞溶解体中の２３．５ｋＤａの蛋白種を検出した。その他の抗Ｐ５０３Ｓモノクローナル抗体はウエスタンブロットと同様の特異性を示した。
【０２０３】
ｃ）Ｐ７０３Ｐに対する抗体の調製と特性分析
ウサギは、上記同様に細菌内に発現され、それより精製された切断型（Ｐ７９３Ｐｔｒ１；配列番号１７２）または完全長成熟型（Ｐ７０３Ｐｆｌ；配列番号５２３）の組換え体７０３Ｐ蛋白質で免疫された。アフィニティー精製ポリクローナル抗体は、固相支持体に結合された免疫源Ｐ７０１ＰｆｌまたはＰ７０３Ｐｔｒｌを用い作製された。ウサギモノクローナル抗体はイムジェニクスファーマシューティカル（Ｉｍｍｇｅｎｉｃｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）にてＳＬＡＭ法を用い単離された。下表ＶＩＩにはＰ７０３Ｐに対し作られたポリクローナルおよびモノクローナル両抗体が掲載されている。
【０２０４】
【表１０】
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【０２０５】
ウサギモノクローナル抗体８Ｈ２、７Ｈ８および２Ｄ４に関する相補性決定領域をコードしているＤＮＡ配列を決定し、それぞれ配列番号５０６−５０８に示した。
エピトープマッピング研究を上記同様に実施した。モノクローナル抗体２Ｄ４および７Ｈ８は特異的に配列番号５０９（配列番号１７２のアミノ酸１４５−１５９に相当）および配列番号５１０（配列番号１７２のアミノ酸１１−２５に相当）とそれぞれ結合することが見いだされた。ポリクローナル抗体２５９４は配列番号５１１−５１４のペプチドと、そしてポリクローナル抗体９４２７は配列番号５１５−５１７のペプチドと結合することが見いだされた。
抗Ｐ７０３Ｐ抗体の特異性は以下の様にしてウエスタンブロットにより決定された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを（１）細菌に発現させた組換え体抗原；（２）完全長のＰ７０３Ｐを発現しているプラスミドでトランスフェクトされていない、あるいはトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞およびＬｔｋ−／−細胞の溶解物；および（３）これら細胞培養体より単離された上清について実施した。蛋白質はニトロセルロース膜に転写してから抗体濃度１ｕｇ／ｍｌの抗体濃度での抗Ｐ７０３Ｐポリクローナル抗体＃２５９４を用いウエスタンブロットした。蛋白室は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した抗ウサギ抗体を用い検出された。組換え体Ｐ７０３Ｐには３５ｋＤａの免疫反応性のバンドが観察されるだろう。組換え体Ｐ７０３Ｐにはエピトープが付いているため、若干高分子として移動する。完全長のＰ７０３Ｐをトランスフェクションされた細胞の溶解物および上清では、Ｐ７０３Ｐに相当する３０ｋＤａのバンドが観察された。特異性を確認するために、安定してコントロールプラスミドがトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞由来の溶解物についても試験したが、Ｐ７０３Ｐの発現は認められなかった。その他の抗Ｐ７０３Ｐ抗体も同様の結果を示した。
免疫組織研究は抗Ｐ７０３Ｐモノクローナル抗体を用い、上記同様にして実施された。Ｐ７０３Ｐは正常前立腺と前立腺腫瘍組織では高レベルに発現しているが、試験したその他全ての組織（乳癌、肺癌および正常腎臓）では検出されないことが判明した。
【０２０６】
実施例１９
前立腺特異的抗原Ｐ５０１Ｓの細胞表面発現および染色体局在の特性分析
本実施例は前立腺特異抗原Ｐ５０１Ｓが細胞表現に発現していることを示す研究と、それに合わせＰ５０１Ｓに関する考え得る染色体上の局在を決定するための研究について説明する。
蛋白質Ｐ５０１Ｓ（配列番号１１３）は１１の膜貫通ドメインを持つと推定されている。抗Ｐ５０１Ｓモノクローナル抗体１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３（上記実施例１７）により認識されるエピトープは細胞内に存在しているという発見に基づき、以下の膜貫通決定因子からＰ５０１Ｓの細胞外ドメインを推測できると考えられた。図９は膜貫通ドメインの推定局在と実施例１７記載の細胞内エピトープを示す概略図である。下線の付いた配列は推定膜貫通ドメインを、太字の配列は推定細胞外ドメインを、イタリックの配列は推定細胞内ドメインを表している。太字と下線付きの配列を用いてポリクローナルウサギ抗血清が作られた。膜貫通ドメインの局在はＨＨＭＴＯＰを用いＴｕｓｎａｄｙとＳｉｍｏｎの報告同様に推定された（膜内蛋白質のアミン酸組成の支配原則：トポロジー推定の応用（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  Ｇｏｖｅｒｎｉｎｇ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｇｒａｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｔｏｐｏｌｏｇｙ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、２８３：４８９−５０６、１９９８）。
図９に拠れば、アミノ酸２７４−２９５および３２３−３４２に対応する膜貫通ドメインに並んでいるＰ５０１Ｓドメインは細胞外と推定される。配列番号５１８のペプチドはＰ５０１Ｓのアミノ酸３０６−３２０に相当し、推定細胞外ドメイン内にある。ヒスチジンがアスパラギニンに置換されている以外は配列番号５１８のペプチドに同一である、配列番号５１９のペプチドは上記の様にして合成された。Ｃｙｓ−ＧｌｙがペプチドのＣ末端に加えられ、キャリアー蛋白質への結合が促進された。前記サポートからのペプチドの切り出しは、以下の切断混合体を用い実施された：トリフルオロ酢酸：エタンジオール：チオアニソール；水：フェノール（４０：１：２：２：３）。２時間切断した後、ペプチドは冷エーテル中に沈殿させられた。次にペプチド沈査は１０％ｖ／ｖ酢酸に溶解され、Ｃ１８逆相ｈｐｌｃで精製する前に凍結乾燥された。５−６０％のアセトニトリル（０．０５％ＴＦＡを含む）の水溶液（０．０５％ＴＦＡを含む）勾配を用いペップチドを溶出した。ペプチド純度はｈｐｌｃおよびマススペクトロメトリーにより聡明され、＞９５％であるとされた。精製ペプチドを用い、上記同様にしてウサギポリクローナル抗血清を作製した。
【０２０７】
Ｐ５０１Ｓの表面発現はＦＡＣＳ分析により検証された。細胞を１０μｇ／ｍｌのポリクローナル抗Ｐ５０１Ｓペプチド抗血清で染色し、洗浄した後二次ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギＩｇ抗体（ＩＣＮ）とインキュベーション、さらに洗浄した後エクスキャリバー蛍光発色細胞ソーターを用いＦＩＴＣ蛍光について分析した。形質導入された細胞のＦＡＣＳ分析では、Ｂ−ＬＣＬにＰ５０１Ｓがレトロウイルスを用い形質導入された。これらアッセイの特異性を示すために、無関係な抗原（Ｐ７０３Ｐ）が形質導入された、または形質導入されていないＢ−ＬＣＬも平行して染色された。前立腺腫瘍細胞株のＦＡＣＳ分析にはＬｎｃａｐ、ＰＣ−３およびＤＵ−１４５が用いられた。前立腺細胞株は細胞分離培地を用い組織培養プレートから剥がされ、上記同様に染色された。全てのサンプルはＦＡＣＳ分析にかけられる前にプロピジウムヨード（ＰＩ）で処理され、ＰＩ排除（即ち生きている非透過性の）細胞よりデータを得た。配列番号５１９のペプチドに対し作製されたウサギポリクローナル血清は形質導入されＰ５１０Ｓを発現している細胞の表面を特異的に認識することが示され、このポリクローナル血清により認識されるエピトープが細胞外にあることが示された。
【０２０８】
Ｐ５０１Ｓが細胞表面上に発現されるか生物化学的に決定するために、Ｌｎｃａｐ細胞の周辺膜を単離し、ウエスタンブロット分析にかけた。具体的にはＬｎｃａｐ細胞をダンス型ホモジェナイザーを使い、５ｍｌのホモジェナイゼーションバッファー（２５０ｍＭショ糖、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０、完全プロテアーゼ阻害剤１錠（ベーリンガーマンハイム））中に溶解した。溶解液サンプルは１０００ｇ、５分間、４℃で遠心分離した。次にその上清を、１０分間、４℃、８０００ｇの遠心分離にかけた。８０００ｇ遠心分離の上清を回収し、３０分間、４℃にて１００，０００ｇの遠心分離にかけ周辺膜を回収した。次にサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、マウスモノクローナル抗体１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３（上記実施例１７に記載）を用い、上記同様の条件のウエスタンブロットにかけた。組換え体精製Ｐ５０１ＳおよびＰ５０１Ｓでトランスフェクションされ、それを過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞をＰ５０１Ｓ検出の陽性コントロールに含めた。ＬＣＬ細胞溶解物を陰性コントロールとして含めた。Ｐ５０１ＳはＬｎｃａｐ全細胞溶解物、８０００ｇ（内膜）分画だけでなく１００，０００ｇ（原形質膜）分画中に検出できた。これらの結果はＰ５０１Ｓが周辺膜に発現、局在していることを示している。
【０２０９】
配列番号５１９のペプチドに対し作製されたウサギポリクローナル抗血清はこのペプチドだけでなく、配列番号５１８の対応する未変性ペプチドも特異的に認識することを示すために、ＥＬＩＳＡ分析を行った。これら分析では平底型の９６ウエルマイクロタイタープレートを、１μｇ／ｍｌの配列番号５１９のペプチド、全推定細胞外ドメインをカバーする配列番号５２０のより長いペプチド、Ｐ５０１Ｓ特異的抗体である１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３により認識されるエピトープである配列番号５２１のペプチド、または免疫ペプチド配列を含まないＰ５０１Ｓ断片（配列番号１１３のアミノ酸３５５−５２６に相当）のいずれかで２時間、３７℃にてコーティングした。ウエルを吸引した後１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むリン酸バッファー生理食塩水で２時間、室温にてブロッキングし、続いて０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄した。精製した抗Ｐ５０１Ｓポリクローナルウサギ血清を２倍希釈でＰＢＳＴ中に加えて（１０００ｎｇ−１２５ｎｇ）から室温で３０分間インキュベーションした。続いてＰＢＳＴで６回洗浄し、１：２００００の割合のＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）アフィニピュア（Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ）Ｆ（ａｂ‘）断片と３０分間インキュベーションした。次にプレートを洗浄し、テトラメチルジジン中に１５分間インキュベーションした。反応は１Ｎの硫酸を加え停止し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使って４５０ｎｍでプレートを測定した。図１１に示す様に、抗Ｐ５０１Ｓポリクローナルウサギ血清は免疫に使用した配列番号５１９のペプチドだけでなく、配列番号５２０のより長いペプチドも特異的に認識したが、関係のないＰ５０１Ｓ由来ペプチドおよび断片は認識しなかった。
【０２１０】
別の研究では、ウサギはＰ５０１Ｓ配列に由来し、図９に示す様に細胞外または細胞内にあると推測されるペプチドで免疫された。ポリクローナル血清が単離され、上記同様にして血清中のポリクローナル抗体が精製された。Ｐ５０１Ｓとの特異反応性を調べるために、Ｐ５０１Ｓまたは無関係な抗原Ｐ７０３Ｐで形質導入されたＢ−ＬＣＬ、又はＰ５０１Ｓを発現するワクシニアウイルスを感染させたＢ−ＬＣＬの何れかを用いたＦＡＣＳ分析を行った。表面発現に関しては、上記同様に死細胞および未変性でない細胞を分析から除外した。細胞内染色については、上記同様に細胞を固定し、浸透化した。Ｐ５０１Ｓのアミノ酸１８１−１９８に相当する配列番号５４８のペプチドに対し作製されたウサギポリクローナル血清はＰ５０１Ｓの表面エピトープを認識することが見いだされた。Ｐ５０１Ｓのアミノ酸５４３−５５３に相当する配列番号５５１のペプチドに対し作製されたウサギポリクローナル血清は、別の実験で未変性または透過処理された細胞がこのポリクローナル抗体で認識されたことから、細胞外または細胞内にあると思われるエピトープを認識することが見いだされた。同様の推測理由から、それぞれＰ５０１Ｓのアミノ酸１０９−１２２、５３９−５５３、５０９−５２０、３７−５４、３４２−３５９、２９５−３２３、２１７−２７４、１４３−１６０および７５−８８に相当する配列番号５４１−５４７、５４９および５５０の配列は、抗体により認識されたＰ５０１Ｓの潜在的表面エピトープであると考えることができる。
【０２１１】
Ｐ５０１Ｓの染色体局在はＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ４放射ハイブリッドパネル（リサーチジェネティクス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用い決定された。メーカーの指示に従い、ハイブリッドパネルのＤＮＡプールを使ったＰＣＲには配列番号５２８および５２９のＰＣＲプライマーを使用した。３８サイクルの増幅の後、反応産物を１．２％アガロースゲル上で分離し、その結果をホワイトヘッド研究所／ＭＩＴゲノム研究センター（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｃｈ）ウエブサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃｏｎｔｉｇ／ｒｈｍａｐｐｅｒ．ｐｌ）を通じ分析され、適当な染色体局在を決定した。この方法を用いＰ５０１Ｓは第１染色体長腕上、ｑ３２とｑ４２の間にあるＷＩ−９６４１にあるとマップされた。第１染色体のこの領域は遺伝性前立腺癌の前立腺癌感受性に連鎖している（Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４：１３７１−１３７４、１９９６およびＢｅｒｔｈｏｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６２：１４１６−１４２４、１９９８）。これらの結果は、Ｐ５０１Ｓが前立腺癌の悪性化にある役割を果たしている可能性を示唆している。
上記より、ここでは例示を目的として発明の具体的実施態様を記載したが、発明の精神および範囲から逸脱することなく各種変更が可能であることが分かるだろう。従って、本発明は添付の請求の範囲以外のものに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
第１図は、対照繊維芽細胞と比較して、代表的な前立腺特異的ポリペプチドＰ５０２Ｓを発現する繊維芽細胞を殺すＴ細胞の能力を図解する。示すように、溶解百分率を１系列のエフェクター：ターゲット比としてを示す。
【図２】
第２Ａ図および第２Ｂ図は、代表的な前立腺特異的ポリペプチドＰ５０２Ｓを発現する細胞を認識する。各場合において、異なる数のレスポンダーについてγ−インターフェロンのスポットの数が示されている。第２Ａ図において、対照Ｅ７５ペプチドでパルスした繊維芽細胞に比較して、Ｐ２Ｓ−１２ペプチドでパルスした繊維芽細胞についてのデータが提示されている。第２Ｂ図において、ＨＥＲ−２／ｎｅｕを発現する繊維芽細胞に比較して、Ｐ５０２Ｓを発現する繊維芽細胞についてのデータが提示されている。
【図３】
第３図は、Ｐ５０１Ｓに由来するＰ１Ｓ＃１０ペプチドがＨＬＡ−Ａ２に結合することを示すペプチド競合結合アッセイを表す。ペプチドＰ１Ｓ＃１０は、ＴＮＦ解放バイオアッセイにおいてＣＴＬクローンＤ１５０Ｍ５８に対するｆｌｕＭ５８ペプチドのＨＬＡ−Ａ２制限提示を阻害する。Ｄ１５０Ｍ５８ＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ２結合性インフルエンザ基質ペプチドｆｌｕＭ５８に対して特異的である。
【図４】
第４図は、ＥＧＦＰトランスデュースドＪｕｒｋａｔ  Ａ２Ｋｂに比較して、Ｐ１Ｓ＃１０パルスドＪｕｒｋａｔ  Ａ２ＫｂターゲットおよびＰ５０１ＳトランスデュースドＪｕｒｋａｔ  Ａ２Ｋｂターゲットを特異的に溶解する、Ｐ１Ｓ＃１０免疫化マウスから発生したＴ細胞系統の能力を図解する。示すように、溶解百分率を１系列のエフェクター／ターゲット比としてを示す。
【図５】
第５図は、代表的な前立腺特異的ポリペプチドＰ５０２Ｓを発現するＪｕｒｋａｔ  Ａ２Ｋｂ細胞を認識しかつ特異的溶解するＴ細胞クローンの能力を図解し、これによりＰ１Ｓ＃１０ペプチドがＰ５０１Ｓポリペプチドの自然にプロセシングされたエピトープでありうることを証明する。
【図６】
第６Ａ図および第６Ｂ図は、代表的な前立腺特異的抗原（Ｐ５０１Ｓ）に対するＣＤ８＋細胞系統（３Ａ−１）の特異性を図解するグラフである。第６Ａ図は５１Ｃｒ解放アッセイの結果を示す。示すように、比溶解百分率を１系列のエフェクター：ターゲット比としてを示す。第６Ｂ図は、変化するエフェクター：ターゲット比において、Ｐ５０１ＳでトランスデュースしたオートロガスＢ−ＬＣＬで刺激された３Ａ−１細胞によるインターフェロン−ガンマの産生を示す。
【図７】
図７は、バキュロウイルス内でのＰ５０１Ｓの発現を示すウェスタンブロットである。
【図８】
図８は、Ｐ５０１Ｓに対するエピトープ・マッピング試験の結果を示す。
【図９】
図９は、トランスメンブランドメイン並びに推定細胞内ドメイン及び細胞外ドメインの位置を示す、Ｐ５０１Ｓタンパク質の略図である。
【図１０】
図１０は、染色体２２ｑ１１．２のＣａｔ Ｅｙｅ症候群領域内の前立腺遺伝子Ｐ７７５Ｐ、Ｐ７０４Ｐ、Ｂ３０５Ｄ、Ｐ７１２Ｐ、及びＰ７７４Ｐの位置を示す、ゲノム地図である。
【図１１】
図１１は、Ｐ５０１Ｓペプチドに特異的な抗体のＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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