(57)【要約】本発明は、皮膚ダメージを処置する方法で、上記処置を必要とする対象に塩基性ミルクファクターの薬剤として、または、皮膚病用組成品の投与段階から成る方法に関する。本発明は、さらに、皮膚外観の老化を美容上処置する方法にも関する。皮膚ダメージは、普通の生物学的老化、環境因子、皮膚病、内科的処置、外科的処置、および／または疾病が原因であると思われる。皮膚外観の老化は、しわ、しみ、たるみ、色素沈着過剰、皮膚の厚みの変化および／または肌あれに起因するとされる。好ましい実施態様では、上記処置を要する対象は、皮膚の若々しい外観の増強が必要である。本発明は、さらに、これらの状態を処置する組成品にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚ダメージを処置または予防する組成品で、その組成品が有効量の塩基性ミルクファクターまたはその変異体を含み、前記塩基性ミルクファクターが塩基性からほぼ中性までの等電点を有する多数の細胞増殖刺激因子を含む組成品。
【請求項２】
皮膚外観の老化を美容上処置または予防する組成品で、その組成品が有効量の塩基性ミルクファクターまたはその変異体を含み、前記塩基性ミルクファクターが塩基性からほぼ中性までの等電点を有する多数の細胞増殖刺激因子を含む組成品。
【請求項３】
処置対象の皮膚が実質的に無傷である請求の範囲第１または２項記載の組成品。
【請求項４】
塩基性ミルクファクターがラットＬ６筋芽細胞の増殖を刺激できる請求の範囲第１−３項のいずれかに記載の組成品。
【請求項５】
塩基性ミルクファクターが乳製品をカチオン交換クロマトグラフィーに供することによって調製されたもである請求の範囲第１−４項のいずれかに記載の組成品。
【請求項６】
乳製品が、ミルクホエー、スキムミルク、初乳ホエー、チーズホエーおよび酸ホエーから成る群から選択されたものである請求の範囲第５項記載の組成品。
【請求項７】
乳製品が有蹄類に由来する請求の範囲第６項記載の組成品。
【請求項８】
塩基性ミルクファクターがＢＭＦ−１および／またはＢＭＦ−２である請求の範囲第１−７項のいずれかに記載の組成品。
【請求項９】
塩基性ミルクファクターが、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＰＤＧＦ、ＦＧＦおよびＴＧＦβから成る群から選択される増殖刺激因子を含む請求の範囲第１−８項のいずれかに記載の組成品。
【請求項１０】
実質的にＥＧＦが欠乏する請求の範囲第１−９項記載の組成品。
【請求項１１】
塩基性ミルクファクター濃度が１μｇ／ｍｇ−５００ｍｇ／ｇである請求の範囲第１−１０項のいずれかに記載の組成品。
【請求項１２】
塩基性ミルクファクター濃度が０．０１ｍｇ／ｇ−２００ｍｇ／ｇである請求の範囲第１−１１項のいずれかに記載の組成品。
【請求項１３】
通常の溶媒、分散媒、フィラー、水溶液、サンスクリーン、抗菌剤または抗真菌剤、または吸収促進剤を単独で、または組み合わせて含む請求の範囲第１−１２項のいずれかに記載の組成品。
【請求項１４】
さらに増殖因子、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ジメチルスルフォキサイド、レチノイン酸、銅ペプチド錯体、α−ケト酸、ラノリン、ワセリン、アロエベラ、メチルまたはプロピルパラベンまたは顔料を単独で、または組み合わせて含む請求の範囲第１−１３項のいずれかに記載の組成品。
【請求項１５】
皮膚ダメージの徴候および／または症状を緩和または予防するのに有効な有効量の塩基性ミルクファクターを含む成る請求の範囲第１−１４項のいずれかに記載の組成品。
【請求項１６】
皮膚ダメージの進行を抑制し、あるいは、皮膚ダメージの発症または進行をすべて停止させるのに有効な有効量の塩基性ミルクファクターを含む請求の範囲１−１５項のいずれかに記載の組成品。
【請求項１７】
組成品が美容上許容されるリキッド、クリーム、オイル、ローション、軟膏、ジェル、ロールオンリキッド、スキンパッチ、スプレー、ガラスビーズドレッシング、塩基ミルクファクターを染み込ませた合成ポリマードレッシング、固形、普通化粧用ナイトクリーム、基礎クリーム、サンタンローション、ハンドローション、メークアップ、メークアップベースおよびマスクから成る群から選択される形態である請求の範囲第１−１６項のいずれかに記載の組成品。
【請求項１８】
美容上有効量の塩基性ミルクファクターを含む請求の範囲第１−１７項のいずれかに記載の組成品。
【請求項１９】
皮膚外観の老化の徴候および／または症状を緩和または予防するのに有効な有効量の塩基性ミルクファクターを含む請求の範囲第１−１８項に記載の組成品。
【請求項２０】
皮膚外観の老化の進行を抑制し、あるいは、皮膚外観の老化の発症または進行をすべて停止させるのに有効な有効量の塩基性ミルクファクターを含む請求の範囲第１−１９項に記載の組成品。
【請求項２１】
皮膚ダメージの処置または予防用組成品の製造のための塩基性からほぼ中性までの等電点を有する多量の細胞増殖刺激因子を含む塩基性ミルクファクターの使用法。
【請求項２２】
その処置法が皮膚ダメージの徴候および／または症状を緩和または予防する請求の範囲第２１項記載の使用法。
【請求項２３】
その処置法が皮膚ダメージの進行を抑制し、あるいは、皮膚ダメージの発症または進行をすべて停止させる請求の範囲第２１項または第２２項記載の使用法。
【請求項２４】
処置対象の皮膚が実質的に無傷である請求の範囲第２１−２３項のいずれかに記載の使用法。
【請求項２５】
組成品が請求の範囲第１−２０項のいずれかに記載されている請求の範囲第２１−２４項のいずれかに記載の使用法。
【請求項２６】
皮膚外観の老化の美容処置または予防用組成品の製造のための塩基性からほぼ中性までの等電点を有する多量の細胞増殖刺激因子を含む塩基性ミルクファクターの使用法。
【請求項２７】
その処置が皮膚外観の老化の徴候および／または症状を緩和または予防する請求の範囲第２６項記載の使用法。
【請求項２８】
その処置が皮膚外観の老化の進行を抑制し、あるいは、皮膚外観の老化の発症または進行をすべて停止させる請求の範囲第２６項または第２７項記載の使用法。
【請求項２９】
組成品が請求の範囲第１−２０項のいずれかに記載されている請求の範囲第２６−２８項のいずれかに記載の使用法。
【請求項３０】
請求の範囲第１−２０項のいずれかに記載の組成品を皮膚に投与することを含む皮膚ダメージを処置または予防する方法。
【請求項３１】
処置または予防が皮膚ダメージの徴候および／または症状を緩和または予防する請求の範囲第３０項記載の方法。
【請求項３２】
処置または予防が皮膚ダメージの進行を抑制し、あるいは、皮膚ダメージの発症または進行をすべて停止させる請求の範囲第３０項または第３１項記載の方法。
【請求項３３】
皮膚が実質的に無傷である請求の範囲第３０−３２項のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
皮膚のダメージが正常な生物学的老化、環境因子、皮膚病、内科的処置、外科的処置または疾病の単独または併発による結果である請求の範囲第３０−３３項のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
正常な生物学的老化が遺伝因子によって予定されている請求の範囲第３４項記載の方法。
【請求項３６】
環境因子が食品の不衛生、毒素曝露、汚染物質曝露、電離放射線、Ｘ線、ＵＶ光、太陽、たばこ、アルコールおよびストレスから成る群から選択される請求の範囲第３４項または第３５項記載の方法。
【請求項３７】
皮膚病が座瘡（アクネ）状態、尋常性座瘡（にきび）、ａｃｎｅ　ｒｏｓａｃｅａ（酒さ性座瘡）、角化座瘡、ａｃｔｉｎｏｄｅｍａｔｏｓｉｓ（放射線皮膚病）、血管腫、ａｒｇｙｉａ（銀沈着症）、肝斑、Ｄａｒｉｅｒ（ダリエ）病、着色異常、ほくろ、メラノーマ、母斑、放射線皮膚炎、鼻瘤、ライテス（ｒｈｙｔｅｓ）および皺（ｒｈｙｔｉｄｅｓ）、皮脂腺腫、皮脂嚢胞、脂漏性角化症、表在性基底細胞癌、毛細血管拡張症および毛包上皮腫から成る群から選択される請求の範囲第３４−３６項のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
内科的処置がグルココルチコイド局所投与または血液透析療法である請求の範囲第３４−３７項のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
外科的処置が脂肪吸引、ｓｕｂｓｃｉｓｉｏｎ、電気乾燥法およびレーザー療法を含む群から選択される請求の範囲第３４−３８項のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
疾病が先天性外胚葉異形成、糖尿病、ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ関連感染症、栄養欠乏、腎臓病、閉経、劣性栄養障害型表皮水疱症、Ｅｈｌｅｒｓ　Ｄａｎｌｏｓ症候群、全身性皮膚萎縮、限局性皮膚萎縮、瘢痕性脱毛、壊疽性膿皮症またはホルモン変化であり、単独または併発である請求の範囲第３４−３９項のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
組成品を局所投与する請求の範囲第３０−４０項のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
組成品を皮膚１ｃｍ２当たり０．１ｍｇから２ｇまでの割合で局所投与する請求の範囲４１項記載の方法。
【請求項４３】
請求の範囲第１−２０項のいずれかに記載の組成品を投与することを含む、皮膚外観の老化を美容上処置または予防する方法。
【請求項４４】
その処置または予防が皮膚外観の老化の徴候および／または症状を緩和または予防する請求の範囲第４３項記載の方法。
【請求項４５】
その処置が皮膚外観の老化の進行を抑制し、あるいは、皮膚外観の老化の発症または進行をすべて停止させる請求の範囲第４３項または４４項記載の方法。
【請求項４６】
処置の対象となる皮膚が実質的に無傷である請求の範囲第４３−４５項のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
皮膚外観の老化が皺、しみ、色素過剰、皮膚の厚みの変化、乾燥、肌荒れの単独または併発の結果である請求の範囲第４３−４６項のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
哺乳類に皮膚外観の若々しさの増強が必要である請求の範囲第４３−４７項のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
組成品を局所投与する請求の範囲第４３−４８項のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
組成品を皮膚１ｃｍ２当たり０．１ｍｇから２ｇまでの割合で局所投与する請求の範囲４９項記載の方法。
【請求項５１】
請求の範囲第１−２０項のいずれかに規定した組成品、並びに、請求の範囲３０−４２のいずれかに記載の方法による組成品の使用説明書を含む皮膚ダメージの処置または予防用キット。
【請求項５２】
請求の範囲第１−２０項のいずれかに規定した組成品、並びに、請求の範囲４３−５０のいずれかに記載の方法による組成品の使用説明書を含む皮膚外観の老化の美容処置用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、皮膚のダメージを処置、予防するための組成品および方法に関する。本発明は、皮膚の美容上の外観を改善するための組成品および方法にも関する。
【０００２】
（背景技術）
本明細書に引用する、特許または特許出願を含めた全参考文書を、これによって、参考のために組み入れる。いずれの参考文書も、先行技術を構成する、とは認められていない。参考文書の議論は、その著者が立証していることを明記しており、出願人は、引用文書の精度と関連性を忌避する権利を留保する。ここでは多数の先行技術公報を参照するが、これらの文書が、オーストラリアまたは他の国における技術上の共通一般知識の一部であると、この参照が認めているのではないことは、はっきりと理解されるであろう。
【０００３】
年令に伴う皮膚の外観と機能の着実な劣化は、遺伝的に決定された加齢と様々な環境因子に惹起される皮膚への累積ダメージの併発が原因であると思われる。本来の加齢（即ち、正常な生物学的老化）と環境因子が誘発するダメージを原因とする加速されたまたは早すぎる老化を区別できる。
【０００４】
皮膚の外観と機能の劣化は、しばしば、太陽曝露から生じる紫外線照射、他の環境汚染物質または毒素の曝露などの環境因子および皮膚病によって引き起こされる皮膚のダメージに併発する。環境因子による皮膚のダメージは、正常な生物学的老化の作用を悪化させ、皮膚の機能および外観へのより強い損傷作用を生じる働きがある。若々しい皮膚の外観の衰えは、環境因子を除いて、正常な生物学的老化の結果としての機能および構造の劣化が原因であるとも考えられる。上記の劣化は、局在する皺、しみ、たるみにつながる皮膚の弾力性の喪失、色素過剰、皮膚の厚みの変化、皮膚に機械的外傷または水疱形成を招く罹病過程への感受性を高める肌の乾燥およびあれとして目に見えてくる。
【０００５】
皮膚の外観および機能の劣化は、多数の表皮および真皮組織の細胞および分子過程の生理的変化に起因するとされる（Ｇｉｌｃｈｒｅｓｔ　１９９６によって論評）。皮膚が老化するにつれ、遺伝的に決定される因子および各種環境要素により、皮膚の表皮細胞（ケラチノサイト）および真皮細胞（線維芽細胞）の増殖および生育能が減退し、細胞が老化し、総合的な真皮の細胞充実性が減少する。。これは、どんよりとし、老化した外観と、真皮の厚みの顕著な減少を呈する皮膚を生じる。さらに、コラーゲンを分解するマトリックスメタロプロテアーゼ１を含めたメタロプロテアーゼ酵素と他の真皮マトリックス蛋白の活性を増加させる。コラーゲン（Ｉ型およびＩＩ型）分解速度がコラーゲン産生速度を上回るので、これは、さらに、真皮組織の支持コラーゲン枠構造の切断を生じる。これは、しわやたるみが示すように、構造支持の喪失を招き、真皮薄化の増加に寄与する。
【０００６】
皮膚への内因性および環境によるダメージを予防、処置するために多数の薬剤が使用されてきた。これには、α−ヒドロキシ酸、レチノイド（ビタミンＡおよびレチノイン酸などのその誘導体）、銅ペプチド錯体およびビタミンＣがある。最も多く使用される薬剤のうちの２種類は、レチノイン酸とα−ヒドロキシ酸である。
【０００７】
レチノイン酸は、顔の皮膚の小じわ、しわおよびしみおよびあれといった外観を減少させる抗老化作用を有するとして美容配合品中の活性成分として使用されてきた。レチノイン酸使用の問題は、皮膚ダメージへのレチノイドの有効性が長期療法中に逆転することである。これにより、有益な組織検査パラメーターのほぼ処置前のレベルへの復帰を生じる。
【０００８】
さらに、レチノイン酸は、皺の除去、太陽光誘発による皮膚ダメージの修復、より健康な構造への皮膚の回復を行えないことが認められている。皮膚ダメージの長期処置のためのレチノイド含有組成品の使用は、有意な副作用も呈する場合がある。さらに困難なのは、これらの薬剤の適切な担体への取り込みが問題であるという点である。レチノイン酸は、紅斑、火傷および軽度熱傷、刺激、および太陽光感受性増加を引き起こすことが認められている。また、催奇形物質であることも確認されており、これが、妊娠中の女性による使用を妨げている（Ｇｉｌｃｈｒｅｓｔ　１９９６）。
【０００９】
α−ヒドロキシ酸は、皮膚の厚み、並びに、コラーゲンおよびエラスチン合成を増加させることも報告されている（Ｂｅｒｇｆｅｌｄ　１９９７）。しかし、報告によるα−ヒドロキシ酸による皮膚の変化は、これらの製剤による糜爛および剥脱作用を伴い、これが、急性皮膚ダメージを誘発し、一次治癒反応を生じる。そのため、これらの薬剤は、それらが引き起こすダメージによる皮膚再生を刺激することによって、見かけの、短期有効性を生じる。その結果、皮膚へのα−ヒドロキシ酸の適用は、レチノイン酸について記述したもの（太陽光感受性を含む）を反映する重大な皮膚刺激および副作用を示す可能性がある。最も多く使用されると思われるα−ヒドロキシ酸であるグリコール酸は、皮膚から吸収され、腎臓に、それよりも低い程度で肝臓に毒性を発揮すると思われる。
【００１０】
さらに最近では、天然に産する増殖因子、または内因性組織修復の生理的調節因子であるサイトカインが、皮膚創傷を処置できる薬剤として提案されている。重要なこととして、構造的および機能的統合性を失い、損傷をきたした皮膚（裂傷、貫通創、潰瘍および火傷を含む）の治癒過程は、線維症性瘢痕形成に到る線維増殖反応として進行する。創傷修復は、十分に記述された血腫、炎症、創傷収縮および再上皮化の生理的過程に依存する複雑な一時的な過程である（Ｍａｓｔ　１９９２）。従って、創傷治癒では、臓器は、回復するというよりも継ぎはぎ状態になる（Ｃｌａｒｋ　１９９５）。しかし、実質的に無傷であるか、負傷していない皮膚ダメージの修復は、再生過程に起因するとされ、創傷治癒の過程とは異なる。これは、構造的および機能的統合性が維持され、それによって、環境因子により損傷を受けた皮膚や若々しい外観を失った皮膚を含めた組織のみに起こると思われる。
【００１１】
そのため、塩基性ミルクファクターの投与から成る皮膚ダメージと老化した皮膚の外観の治療的および予防的処置を提供するのが本発明の態様である。ミルクファクターは、真皮コラーゲン産生を刺激し、さらに、真皮の新規のゆるい結合組織を形成しながら、ケラチノサイトおよび線維芽細胞の増殖および生育能を直接高め、真皮の細胞充実性を増加させる。
【００１２】
従って、本発明の目的は、先行技術の問題を克服または軽減し、上記の処置を提供することである。
【００１３】
（発明の開示）
第１の態様で、本発明は、皮膚のダメージを処置または予防する組成品で、その組成品が有効量の塩基性ミルクファクターまたはその変異体を含み、前記塩基性ミルクファクターが塩基性からほぼ中性までの等電点を有する多数の細胞増殖刺激因子を含む組成品を提供する。
【００１４】
ここで使用する「処置または予防」という用語は、皮膚ダメージの治療的処置、あるいは、皮膚ダメージ発生前の防止的または予防的手順を含むことを意図する。従って、処置の対象となる患者は、皮膚ダメージをすでに有しているか、皮膚ダメージを呈するリスクを有することができる。「処置または予防」という用語は、皮膚外観の老化を軽減する美容処置、あるいは、皮膚外観の老化の発生前に実施する予防的美容処置も含むことを意図する。従って、処置対象患者は、外観の老化を示す皮膚を有するか、外観の老化を示す皮膚を有するリスクがあるといえる。
【００１５】
「処置または予防」という用語は、以下の項目も含む：
１）ケラチノサイトおよび線維芽細胞の再生、並びに、既存表皮組織および真皮組織に加わるもので、処置開始前に失われた表皮および真皮組織に置換するために働くことのできるコラーゲン組織を含めた新しい上皮組織、表皮組織および真皮組織の再生；
２）　ケラチノサイトおよび線維芽細胞の保護、並びに、処置開始時に既存する表皮および真皮組織および処置開始後に新たに形成された表皮および真皮組織を囲むコラーゲン組織の保護を含めた既存の上皮、表皮および真皮組織の保護；
３）皮膚機能の改善；
４）皮膚の柔軟性、固さ、滑らかさ、しなやかさおよび／または弾力性を含めた皮膚の若々しい外観の増強；
５）皺の軽減；および／または
６）しみの軽減
【００１６】
本発明の方法において、処置対象の哺乳動物は、人、家畜、コンパニオンアニマルまたは動物園用動物であってよい。
【００１７】
ここで使用する場合の「皮膚のダメージ」という用語は、正常な生物学的老化、環境因子、皮膚病、内科的または外科的処置、または、上述の事項の併発による皮膚への結果的な副作用を含む。皮膚への副作用は、局在化した皺、しみ、たるみにつながる皮膚の弾力性の喪失、色素過剰、皮膚の厚みの変化、機械的外傷や罹病過程への感受性を高め、水疱形成を招く乾燥した肌あれとして目に見える場合がある。目に見えない副作用も含まれる。例えば、皮膚細胞の代謝の悪化変化および皮膚の血管新生の変化である。上記の変化には、皮膚上皮細胞、表皮細胞（ケラチノサイト）、および真皮細胞（線維芽球）の各増殖および生育能の減退がある。上記の変化は、全真皮の細胞充実性を減退させ、コラーゲン（Ｉ型およびＩＩＩ型）変性速度がコラーゲン産生速度を上回るため、コラーゲン枠構造の切断を引き起こす場合がある。
【００１８】
ここで使用する「塩基性ミルクファクター」という用語は、細胞増殖作用を有する乳製品からの増殖因子混合濃縮物を指し、その場合、塩および／またはその主要蛋白成分の比率が変化し、増殖因子は、ほぼ中性から塩基性までの等電点を有する。塩基性ミルクファクターは、チーズホエー（ｗｈｅｙ）、初乳ホエー、スキムミルクまたは酸ホエーから得るのがよい。塩基性ミルクファクターの例は、有機溶媒抽出に供した乳製品濃縮物、乳製品または吸着およびクロマトグラフィーマトリックスからの溶出に供した乳製品の限外濾過物である。乳製品からの塩基性ミルクファクターの調製法は、技術上周知であり、通常（ルーティン）の実験程度で扱うことができる。
【００１９】
重要なこととして、驚くべきことに、本発明者の示すところによれば、インシュリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）とトランスフォーミング成長因子ベーター２（ＴＧＦβ２）の転座によって示されるように、乳製品から入手したほぼ中性から塩基性の等電点を有する増殖因子組成品は皮膚の最上層を有効に通過することができて、適合分子に生物学的作用を発揮し、それらの細胞の代謝変化を招く能力を有する。当業者は、乳製品から入手した他の代りになる適切な増殖因子を容易に使用することができ、そのような作用を有するものを得るには通常程度の実験が要されるだけであろう。
【００２０】
第２の態様では、本発明は、老化した皮膚外観を美容処置または予防する組成品で、その組成品が有効量の塩基性ミルクファクターまたはその変異体を含み、前記塩基性ミルクファクターが塩基性からほぼ中性までの等電点を有する多数の細胞増殖刺激因子を含む組成品を提供する。
【００２１】
ここで使用する「有効量」という用語は、望みの効果を少なくとも部分的に達成する、または、皮膚ダメージの発症を遅らせる、皮膚ダメージの進行を抑制する、あるいは、発症または進行をすべて停止させるのに必要な量を指す。当然、上記の量は、処置する特定の病態、病態の重症度、および年令、身体状態、大きさ、体重および他の併用処置を含む個人のパラメーターに応じることができる。これらの因子は、普通の当業者に周知であり、通常程度の実験で扱うことができる。一般に、確実な医学的または治療判定に従って最小有効量を決定することが好ましい。しかし、医学的理由または他の理由で高めの用量を投与できることを普通の当業者は理解するだろう。
【００２２】
ここで使用する「有効量」という用語は、また、望みの美容効果を少なくとも部分的に達成する、または、老化した皮膚の外観の発症を遅らせる、皮膚ダメージの進行を抑制する、あるいは、発症または進行をすべて停止させるのに必要な量をも指す。当然、上記の量は、処置する特定の状態、状態の重症度、および年令、身体状態、大きさ、体重および他の併用処置を含む個人のパラメーターに応じるのがよい。これらの因子は、普通の当業者に周知であり、通常程度の実験で扱うことができる。一般に、確実な医学的または美容上の判定に従って最小有効量を決定することが好ましい。しかし、医学的理由または他の理由で高めの用量を投与できることが普通の当業者は分かるだろう。
【００２３】
好ましくは、処置対象となる皮膚は、実質的に無傷である。ここで使用する「実質的に無傷」という用語は、構造および機能統合性とバリア機能を維持した皮膚を指す。無傷の皮膚の例は、正常な生物学的老化の徴候を示す（または、示す可能性のある）皮膚、あるいは、再生過程によって皮膚が修復する環境曝露によって損傷を受けた（または損傷を受ける可能性のある）皮膚である。内科的または外科的処置を受けている皮膚も含まれ、その場合、皮膚は実質的に無傷のままである。無傷の皮膚は、負傷した皮膚は含まず、従って、裂傷、貫通創、潰瘍および火傷を除く。
【００２４】
損傷を受けた無傷または負傷していない皮膚の修復は、再生過程に起因するとされる。これは、構造および機能統合性が維持された組織のみに起こると考えられ、それによって、環境因子や老化で損傷を受けた皮膚を含む。この状況は、構造および機能統合性を失い（裂傷、貫通創、潰瘍、火傷を含む）、線維増殖反応として進行し、線維症性瘢痕になる負傷した皮膚の治癒とは区別される。従って、創傷治癒では、臓器は回復するよりも継ぎはぎ状態になる。創傷治癒過程は、再生過程で修復される損傷を受けた無傷の皮膚の修復過程とは異なる。
【００２５】
本発明の好ましい形態では、塩基性ミルクファクターは、ラットのＬ６筋原細胞の増殖を刺激できる。
【００２６】
好ましくは、塩基性ミルクファクターは、乳製品をカチオン交換クロマトグラフィーに供することによって調製する。乳製品のより多くの塩基成分をそこに吸着するような、カチオン交換樹脂が塩基性蛋白の吸着に適していると思われる。十分に高いイオン強度（例、０．２Ｍを越える重量モル濃度）を持った適切な緩衝液でカチオン交換樹脂から蛋白を溶出できる。溶出液は、濾過して、塩またはその他の低分子量混入物質を除去できる。
【００２７】
カチオン交換樹脂は、多数の細胞増殖刺激因子を吸着するのに適したカチオン交換樹脂であるのがよい。不適切なカチオン交換樹脂は、塩基性乳蛋白を結合できるにはポアサイズが小さ過ぎる樹脂である。例えば、ＤＯＷＥＸ　ＡＧ　５０Ｗ　２Ｘ　５０−１００メッシュ樹脂は、多数の塩基性ミルクファクターを吸着するには不適切であると思われる。本発明に従って使用する適切なカチオン交換樹脂は、アガロース主体カチオン交換樹脂である。
【００２８】
ここで使用する「乳製品」という用語は、脂肪および／またはその蛋白構成成分の割合が変化する人または動物の乳汁の誘導体を指す。乳製品の例は、ミルクホエー、スキムミルク、初乳ホエー、チーズホエー、酸（カゼイン）ホエーである。
【００２９】
好ましくは、乳製品は、ミルクホエー、スキムミルク、チーズホエー、酸ホエーから選択する。塩基性ミルクファクターは、その主蛋白成分を変化させたチーズホエーから入手するのがよい。
【００３０】
さらに好ましくは、乳製品は有蹄哺乳動物から誘導する。重要なこととしては、表皮成長因子（ＥＧＦ）は、有蹄哺乳動物の乳汁に存在することは認められていない。
【００３１】
本発明の好ましい形態では、塩基性ミルクファクターは、ＢＭＦ−１および／またはＢＭＦ−２である。ＢＭＦ−１の調製法は、オーストラリア特許６４５５８９に説明されており、その開示全文を、参考に、ここに組み入れている。
【００３２】
ＢＭＦ−２の調製法は、オーストラリア特許７０２００２に説明されており、その開示全文を、参考に、ここに組み入れている。この工程では、塩基性ミルクファクターは、一時的な酸性化および／または、例えば分子篩クロマトグラフィーまたは調節ポア限外濾過を使った酸性条件下での精製によって改質して、活性を高めることができる。従って、ＢＭＦ−２は、分子量範囲約５０００−３０，０００、等電点約６．０より上を有し、塩基性ミルクファクターが一時的酸性化によって改質されている多数の改質乳汁増殖因子である。
【００３３】
好ましくは、塩基性ミルクファクターは、インシュリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インシュリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、線維芽球増殖因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）から成る群から選択される成長因子を含んでいる。
これらの成長因子は、塩基性からだいたい中性の等電点、すなわち約６．０と約１０．５の間の等電点を持っている。
【００３４】
好ましくは、組成品中に存在する増殖因子は、ＥＧＦが欠乏している。
【００３５】
好ましくは、塩基性ミルクファクター濃度は、１μｇ／ｍｇ−５００ｍｇ／ｇである。さらに好ましくは、塩基性ミルクファクター濃度は、０．０１ｍｇ／ｇ−２００ｍｇ／ｇである。
【００３６】
本発明が考慮する製剤には、塩基性ミルクファクターの皮膚塗布に適した配合品がある。適切な担体および／または希釈剤は、当業者に周知で、普通の溶媒、分散媒、フィラー、水溶液、サンスクリーン、抗菌剤および抗真菌剤、あるいは、吸収促進剤、それらの単独または併用のものである。
【００３７】
追加の増殖因子、ビタミンＡ、ＣおよびＥ、ジメチルスルフォキサイド、レチノイン酸、銅−ペプチド錯体、α−ケト酸、ラノリン、ワセリン、アロエベラ、メチルまたはプロピルパラベン、それらの単独か併用したものなどの補助活性成分も組成品に混入できる。
【００３８】
追加の増殖因子は、組成品の活性を増強するために添加できる。増殖因子は、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦβおよびケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）から成る群から選択するのがよい。
【００３９】
好ましくは、組成品は、皮膚ダメージの徴候および／または症状を緩和または予防するのに有効な有効量の塩基性ミルクファクターを含む。
【００４０】
好ましくは、組成品は、皮膚ダメージの進行を抑制する、あるいは、皮膚ダメージの発症または進行をすべて停止させるのに有効な有効量の塩基性ミルクファクターを含む。
【００４１】
好ましい形態では、処置対象の皮膚は、実質的に無傷である。
【００４２】
組成品は、美容上許容されるリキッド、クリーム、オイル、ローション、軟膏、ジェル、ロールオンリキッド、スキンパッチ、スプレー、ガラスビーズドレッシング、塩基性ミルクファクターをしみこませた合成ポリマードレッシング、固形、普通の美容ナイトクリーム、ファウンデーションクリーム、サンタンローション、ハンドローション、虫除け、メークアップ、メークアップベースおよびマスクから成る群から選択した剤型であってもよい。普通培地または薬剤が活性成分と不適合である場合を除いて、本発明の美容組成品でのその使用を考慮する。
【００４３】
薬剤および美容組成品の調製のための方法および担体は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　１８編、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＵＳＡなどの教科書に記述されるように、当業者に周知であり、その内容をここに組み入れる。
【００４４】
好ましくは、組成品は、美容上有効量の塩基性ミルクファクターを含む。さらに好ましくは、組成品は、皮膚外観の老化の徴候および／または症状を緩和または予防するのに有効な有効量の塩基性ミルクファクターを含む。最も好ましくは、組成品は、皮膚外観の老化進行を抑制する、あるいは、皮膚外観の老化の発症または進行をすべて停止させるのに有効な有効量の塩基性ミルクファクターを含む。
【００４５】
本発明の好ましい形態では、処置対象の皮膚は、実質的に無傷である。
【００４６】
別の態様では、本発明は、皮膚ダメージの処置または予防用組成品の製造のための、塩基性からほぼ中性の等電点を有する多数の細胞増殖刺激因子を含む塩基性ミルクファクターの使用を提供する。
【００４７】
好ましくは、処置が、皮膚ダメージの徴候および／または症状を緩和または予防する。さらに好ましくは、処置は、皮膚ダメージの進行を抑制する、あるいは、皮膚ダメージの発症または進行をすべて停止させる。
【００４８】
好ましい形態では、処置対象の皮膚は、実質的に無傷である。
【００４９】
その使用には記載した組成物を用いればよい。
【００５０】
別の態様では、本発明は、皮膚外観の老化の処置または予防用組成品の製造のための、塩基性からほぼ中性の等電点を有する多数の細胞増殖刺激因子を含む塩基性ミルクファクターの使用を提供する。
【００５１】
好ましくは、処置は、皮膚外観の老化の徴候および／または症状を緩和または予防する。さらに好ましくは、処置は、皮膚ダメージの徴候および／または症状を緩和または予防する。さらに好ましくは、処置は、皮膚外観の老化の進行を抑制する、あるいは、皮膚外観の老化の発症または進行をすべて停止させる。
【００５２】
その使用には、記載した組成物を用いればよい。
【００５３】
好ましい形態では、皮膚は、実質的に無傷である。
【００５４】
別の態様では、本発明は、皮膚にここで述べる通りの組成品を投与することから成る皮膚ダメージを処置または予防する方法を提供する。その処置および予防は、皮膚ダメージの徴候および／または症状を緩和または予防することができる。処置または予防は、皮膚ダメージの進行を抑制し、あるいは、皮膚ダメージの発症または進行をすべて停止させることもできる。
【００５５】
好ましくは、処置対象の皮膚は、実質的に無傷である。
【００５６】
好ましくは、皮膚ダメージは、通常の生物学的老化、環境因子、皮膚病、内科的処置、外科的処置または疾病の、単独または併発による結果である。
【００５７】
通常の生物学的老化は、遺伝因子で予定されていると思われる。環境因子は、食品衛生の悪化、毒素曝露、汚染物質曝露、太陽光曝露、電離放射線、Ｘ線、紫外線、たばこ使用、アルコールまたはストレスである。
【００５８】
皮膚病は、座瘡（アクネ）状態、尋常性座瘡（にきび）、ａｃｎｅ　ｒｏｓａｃｅａ（酒さ性座瘡）、角化座瘡、ａｃｔｉｎｏｄｅｒｍａｔｏｓｅｓ（放射線皮膚病）、血管腫、ａｒｇｙｉａ（銀沈着症）、肝斑、Ｄａｒｉｅｒ（ダリエ）病、着色異常、ほくろ、メラノーマ、母斑、放射線皮膚炎、鼻瘤、ｒｈｙｔｅｓ（ライテス）および皺、皮脂腺腫、皮脂嚢胞、脂漏性角化症、表在性基底細胞癌、毛細血管拡張症および毛包上皮腫（Ｏｒｅｎｔｒｅｉｃｈら、２００１）から生じると思われる。
【００５９】
皮膚ダメージは、疾病管理のための薬物投与からも生じる場合がある。好ましくは、疾病は、グルココルチコイドの局所投与または血液透析治療である。
【００６０】
皮膚ダメージが先天性外胚葉異形成、糖尿病、ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ関連感染症、栄養欠乏、腎臓病、閉経、劣性栄養障害型表皮水疱症、Ｅｈｌｅｒｓ　Ｄａｎｌｏｓ症候群、全身性皮膚萎縮、限局性皮膚萎縮、瘢痕性脱毛、壊疽性膿皮症またはホルモン変化で、単独または併発であるものを含めた疾病から生じる場合もある。
【００６１】
皮膚ダメージは、脂肪吸引、サブスシジョン（ｓｕｂｓｃｉｓｉｏｎ）、電気乾燥およびレーザー治療などの外科的処置から生じる場合もある。これらの処置は、まったく外科的であるが、上記処置は、無傷皮膚下の真皮構造が損傷を受け、処置を要するものの、皮膚表面が実質的に無傷のままである。
【００６２】
好ましくは、本組成品は、局所投与する。さらに好ましくは、本組成品は皮膚１ｃｍ２当たり０．１ｍｇ−２ｇの割合で局所投与する。
【００６３】
組成品は、望みの治療または美容効果を達成するために、ある量の塩基性ミルクファクターを皮膚に送達する手段によって局所投与できる、と考えられる。組成品は、患者の皮膚の罹患部に塗布するのがよい。塗布回数は、個人個人の状況による。例えば、組成品は、１日１回、１日２回またはそれよりも多く塗布できる。
【００６４】
別の態様では、本発明は、ここで述べるように、組成品を投与することを含む、皮膚外観の老化を美容的に処置する方法を提供する。本方法は、皮膚外観の老化の徴候および／または症状を緩和または予防できる。本方法は、皮膚外観の老化の進行を抑制し、あるいは、皮膚外観の老化の発症または進行をすべて停止させることもできる。
【００６５】
好ましくは、処置対象皮膚は、実質的に無傷である。
【００６６】
本発明の好ましい形態で、皮膚外観の老化は、皺、たるみ、色素過剰、皮膚の厚みの変化、乾燥または外観のあれの単独または併発の結果である。
【００６７】
好ましくは、哺乳動物は、皮膚の若々しい外観の増強を必要とする。
【００６８】
好ましくは、組成品は、局所投与する。さらに好ましくは、本組成品は皮膚１ｃｍ２当たり０．１ｍｇ−２ｇの割合で局所投与する。
【００６９】
別の態様で、本発明は、ここで述べる通りの組成品と、ここで述べる通りの方法での組成品の使用説明書を含む皮膚ダメージの処置または予防用キットを提供する。
【００７０】
別の態様では、本発明は、ここで述べる通りの組成品と、ここで述べる通りの方法での組成品の使用説明書を含む皮膚外観の老化の美容処置用キットを提供する。
【００７１】
本明細書の目的上、用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「〜を含み、限定するものではない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｂｕｔｎｏｔ　ｌｉｍｉｔｅｄ　ｔｏ）」を意味し、用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、同様の意味を持つ。
【００７２】
（発明を実施するための最良の形態）
ここで、発明を限定するものではない添付の実施例を参考にして、本発明をさらに詳細に説明する。以下の記載は単に発明を説明するものであって、発明の普遍性になんら制限を加えるものではない。
【００７３】
実施例１：皮膚ダメージおよび皮膚外観の老化の美容および治療的処置に適したＢＭＦ−１の製造
ＢＭＦ−１は、オーストラリア特許Ｎｏ．６４５５８９に従って調製した。工程は、固形物を除去するための低温殺菌ホエーのマイクロ濾過、非吸着物質除去のために５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液で平衡化したＳ−セファロースＦａｓｔ　Ｆｌｏｗ　Ｓ（商標）カチオン交換樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）へ増殖促進物質の吸着、１０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ６．５に添加した０．４Ｍ　ＮａＣｌによるＢＭＦ−１の溶出、水に対する透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）および濃縮である。組成品は、液体でおくことも、配合を進めるために凍結乾燥にすることもできる。
【００７４】
実施例２：皮膚ダメージおよび皮膚外観の老化の美容および治療的処置に適したＢＭＦ−２の製造
ＢＭＦ−２は、オーストラリア特許Ｎｏ．７０２００２に従って調製した。実施例１の通りに調製したＢＭＦ−１のサンプル１０ｇを１５０ｍＭ　ＰＢＳに溶解し、０．２Ｍ　ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ　ＨＣｌ　２５０ｍｌに添加し、ｐＨをＮａＯＨで２．５に調整した。２ＬのＣｅｌｌｕｆｉｎｅ　ＧＬ　１０００（商標）（Ａｍｉｃｏｎ）カラムをｐＨ２．５に調整した０．２Ｍ　ＮａＣｌ含有ＨＣｌの１０ｍＭ溶液で平衡化し、１２５ｍｌの溶解ＢＭＦ−１をカラムに掛け、同一溶液で６．８ｍｌ／分で溶出した。吸光度プロファイルが２８０ｎｍで０．４Ａ以下に下がった時から６７５ｍｌを収集した。このプール液を０．１Ｍ炭酸水素アンモニウムに対して透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｅｒｅｄ）した。組成品は、液体にすることも、配合を進めるために凍結乾燥することもできる。
【００７５】
実施例３：塩基性ミルクファクターの皮膚塗布に適した配合品
組成品の全単位を「部」で測定する。ここで特定した塩基性ミルクファクター量を「ｑｓ」とした。
【００７６】
（ｉ）セトマクロゴールクリーム
塩基性ミルクファクター　　　　　　　　　　　　ｑｓ
セトマクロゴール乳化ワックス　　　　　　　　　１５
流動パラフィン（重量）　　　　　　　　　　　　１０
クロロクレゾール　　　　　　　　　　　　　　　０．１
プロピレングリコール　　　　　　　　　　　　　　５
蒸留水を加えて　　　　　　　　　　　　　　　１００とする
【００７７】
セトマクロゴール乳化ワックスを約７０℃でパラフィンを用いて融解した。クロロクレゾールおよびプロピレングリコールを、ほぼ同一温度に加温した約５０部の蒸留水に溶解した。混合後、組成品を重量換算で調整し、冷却するまで攪拌した。次ぎに、塩基性ミルクファクターを適当な濃度になるまで添加し、十分に混合した。
【００７８】
（ｉｉ）水性クリームＡＰＦ
塩基性ミルクファクター　　　　　　　　　　　　ｑｓ
乳化軟膏　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０
グリセロール　　　　　　　　　　　　　　　　　　５
フェノキシエタノール　　　　　　　　　　　　　　１
蒸留水を加えて　　　　　　　　　　　　　　　　１００とする
【００７９】
乳化軟膏を約７０℃で融解した。フェノキシエタノールを蒸留水に溶解し、ほぼ同一温度まで加温した。組成品を混合、重量調整し、冷却するまで攪拌した。次に、十分に攪拌しながら、塩基性ミルクファクターを添加した。
【００８０】
（ｉｉｉ）緩衝化クリームＢＰＣ７３
塩基性ミルクファクター　　　　　　　　　　ｑｓ
クエン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　５
リン酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　　２５
クロロクレゾール　　　　　　　　　　　　　　１
乳化軟膏　　　　　　　　　　　　　　　　　３００
蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　　　６６９
【００８１】
乳化軟膏を穏やかに加熱して融解した後、予め同一温度で蒸留水に溶解していたリン酸ナトリウム、クエン酸およびクロロクレゾールを添加した。組成品を冷却するまでゆっくりと攪拌した。次に、塩基性ミルクファクターを添加し、十分に混合した。
【００８２】
（ｉｖ）乳化軟膏ＡＰＦ
塩基性ミルクファクター　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｑｓ
乳化ワックス　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０
白色液性パラフィン（ｗｈｉｔｅ ｓｏｆｔ ｐａｒａｆｆｉｎ）　　　　　　　　 ５０
流動パラフィン（ｌｉｑｕｉｄ ｐａｒａｆｆｉｎ）（重量換算）　　　　　　 ２０
【００８３】
ワックスおよびパラフィンを合わせて融解し、冷却するまで攪拌した。次に、塩基性ミルクファクターを適当な濃度まで、基剤の一部添加し、徐々に残りを混合した後、十分に攪拌した。
【００８４】
（ｖ）ペプチド軟膏（ネオマイシンおよびバシトラシン軟膏ＢＰＣ７３に使用する場合）
塩基性ミルクファクター　　　　　　　　　　ｑｓ
流動パラフィン　　　　　　　　　　　　　　１０
白色液性パラフィンを加えて　　　　　　　　１００とする
【００８５】
白色液性パラフィンを融解し、流動パラフィンを混合した。その混合物を冷却するまで攪拌した。塩基性ミルクファクターを基剤の一部に滴下し、残りの基剤に混入した。
【００８６】
（ｖｉ）ジェル（リグノカインおよびクロルヘキシジンジェルＡＰＦに使用する場合）
塩基性ミルクファクター　　　　　　　　　　ｑｓ
トラガカント　　　　　　　　　　　　　　　２．５
グリセロール　　　　　　　　　　　　　　　２５
蒸留水を加えて　　　　　　　　　　　　　　１００とする
【００８７】
トラガカントをグリセロールと大部分の蒸留水と混合した。沸騰させた後、混合液を冷却し、塩基性ミルクファクターを添加した。組成品を重量に調整し、よく混合した。最終製品を遮光した。
【００８８】
（ｖｉｉ）スプレー（アドレナリンおよびアトロピンスプレーＢＰＣ７３で使用する場合）
塩基性ミルクファクター　　　　　　　　　　　ｑｓ
メタ亜硫酸水素ナトリウム　　　　　　　　　　　１
クロルブトール　　　　　　　　　　　　　　　　５
プロピレングリコール　　　　　　　　　　　　５０
蒸留水を加えて　　　　　　　　　　　　　１０００とする
【００８９】
（ｖｉｉｉ）スプレー（リンドスプレーで使用する場合）
塩基性ミルクファクター　　　　　　　　　　　ｑｓ
アルコール　　　　　　　　　　　　　　　　　９５％
【００９０】
（ｉｘ）ローション（アミノ安息香酸ローションＢＰＣ７３で使用する場合）
塩基性ミルクファクター　　　　　　　　　　ｑｓ
グリセロール　　　　　　　　　　　　　　　２０
アルコール９５％　　　　　　　　　　　　　６０
蒸留水を加えて　　　　　　　　　　　　　　１００とする
【００９１】
（ｘ）セトマクロゴールローションＡＰＦ
塩基性ミルクファクター　　　　　　　　　　　ｑｓ
セトマクロゴール乳化ワックス　　　　　　　　　３
流動パラフィン　　　　　　　　　　　　　　　１０
グリセロール　　　　　　　　　　　　　　　　１０
クロルヘキシジングルコネート溶液　　　　　　０．１
蒸留水を加えて　　　　　　　　　　　　　　　１００とする
【００９２】
セトマクロゴール乳化ワックスを約６０℃の流動パラフィンで融解した。この混合液に、予め５０部まで希釈したクロルヘキシジン溶液を、急速攪拌しながら、同一温度で蒸留水と共に添加した。混合後、組成品の容積を調整し、冷却するまで、攪拌した。
【００９３】
実施例４：ＢＭＦ−１は、動物の線維芽細胞の増殖および生育能を高める。
Ｂａｌｂ　Ｃ３Ｔ３マウス線維芽球を、処置前に、２４マルチウェル（２４−ｐｌａｃｅ　ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ）で２４時間平板に流し、融合に近い単層を生じた。３回繰り返しで実施したのであるが、細胞を完全増殖培地中で少なくとも一昼夜培養し、無血清培体で洗浄した後、基礎培地（０．１％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ）中で、数種類の濃度のＢＭＦ−１製品（１．０ｍｇ／ｍｌ）に４８−７２時間曝露した。
【００９４】
細胞単層をトリプシン／ＥＤＴＡ（０．１２５％／０．５ｍＭ）で処理し、個々の細胞を分散させた。細胞をペレット化し、Ｈａｎｋｓ平衡化塩溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄した後、細胞数を検定するために、細胞を４５０μｌのＨＢＳＳと５０μｌのトリパンブルーに浮遊させ、血球計算盤を使って手動でカウントした。
生育能を検定するには、細胞を、４℃、合計５００μｌのａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ／ＦＩＴＣ（１μｇ／ｍｌ）とヨウ化プロピジウム（ＰＩ、５μｇ／ｍｌ）で１５分間処理した（Ｖａｎ　Ｅｎｇｅｌａｎｄら、１９９６の方法の変法）。
【００９５】
次に、フローサイトメトリーを使って、細胞生育能を分析した。表１は、ＢＭＦ−１または基礎培地で処理した培養線維芽細胞の生育能を示し、ａｎｎｅｘｉｎ／ＰＩ処理した細胞を次のカテゴリーに分けた：生育細胞（ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ染色陰性およびＰＩ染色陰性）、アポプトーシス（消滅）細胞（ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ染色陽性だがＰＩ染色陰性）および壊死細胞（ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ染色陽性およびＰＩ染色陽性）。
【００９６】
表１は、基礎ＤＭＥＭ培地に比較して、ＢＭＦ−１（１ｍｇ／ｍｌ）が培養線維芽細胞の増殖を約３．０倍刺激することを証明している。生育細胞の割合は、基礎培地に比較して、ＢＭＦ−１処理培養液中で２６％増加した。ＢＭＦ−１は、基礎培地に比較して、アポプトーシスおよび壊死細胞数も、それぞれ、７３％と２１％減少した。従って、ＢＭＦ−１は、培養液中で、線維芽細胞の増殖と生存を刺激する。
【００９７】
2004502788.tif 000002
【００９８】
実施例５：ＢＭＦ製品は、ヒトケラチノサイトの増殖および生育能を高める。
ヒトケラチノサイト（ＨａＣａｔ）の増殖に対するＢＭＦ−１およびＢＭＦ−２の作用を評価するため、細胞を９６穴プレートの平板に流し、融合に近い単層を生じた。３回繰り返しの操作で、細胞を完全増殖培地中で少なくとも一昼夜培養し、少なくとも２時間飢餓させた後、ＤＭＥＭに溶解した一定濃度のＢＭＦ−１またはＢＭＦ−２（０−１．０ｍｇ／ｍｌ）に約４日間曝露した。繰り返し操作の穴は、一定濃度の１０％ＦＢＳに曝露し、陽性対照として使用した。プレートをゆすぎ、メタノールで３０分間固定した後、メチレンブルーで３０分間染色した（Ｏｌｉｖｅｒら、１９８９）。
【００９９】
過剰の着色剤をホウ酸緩衝液で洗い流し、残りの着色剤を酸性化エタノール（１００μｌ／穴）で可溶化した。各穴の光学密度を６３０ｎｍで読み取り、結果を、破線で表した１０％ＦＢＳで得た増殖反応と共に図１に示す。
【０１００】
細胞生育能に対するＢＭＦ−１の作用を評価するため、ヒトケラチノサイト（ＨａＣａｔ）を２４−マルチウェルの平板に流し、融合に近い単層を生じ、完全増殖培地中で約３日間培養した。３回繰り返しで行い、その後、細胞を約４８時間飢餓状態にした後、基礎培地に溶解した一定濃度のＢＭＦ−１（１．０ｍｇ／ｍｌ）に４８−７２時間曝露した。
【０１０１】
細胞単層を、４ｍＭ　ＥＤＴＡで１０分間、次にトリプシン／ＥＤＴＡ（０．１２５％／０．５ｍＭ）で処理し、個々の細胞を分散させた。細胞をペレット化し、ＨＢＳＳで洗浄し、細胞数を検定するため、細胞を４５０μｌのＨＢＳＳおよび５０μｌのトリパンブルーに浮遊させ、血球計算盤で手動カウントした。生育能を評価するため、細胞を総量５００μｌのａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ／ＦＩＴＣ（１μｇ／ｍｌ）およびヨウ化プロピウム（ＰＩ、５μｌ／ｍｌ）の両溶液で４℃で１５分間処理した（Ｖａｎ　Ｅｎｇｅｌａｎｄらの方法の変法）。
【０１０２】
次に、フローサイトメトリーを使って、細胞を分析した（表２参照）。細胞をａｎｎｅｘｉｎ／ＰＩと共に培養し、以下のカテゴリーに分けた；生育細胞（ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ染色陰性およびＰＩ染色陰性）、アポプトーシス（消滅）細胞（ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ染色陽性だがＰＩ染色陰性）および壊死細胞（ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ染色陽性およびＰＩ染色陽性）。
【０１０３】
2004502788.tif 000003
【０１０４】
図１に示すように、ＢＭＦ−１およびＢＭＦ−２は共に、ＨａＣａｔ細胞の増殖を刺激した。ＢＭＦ−１およびＢＭＦ−２で得られた最大反応は、同一アッセイにおける１０％ＦＢＳで処理した細胞（破線、図１）に認められた増殖反応に少なくとも匹敵した。表２に示すように、ＢＭＦ−１（１ｍｇ／ｍｌ）で処理した細胞は、高めの割合が生育し（基礎培地に比較して、約１２％の増加）、アポプトーシスを呈している細胞はそれほど確認されなかった（基礎培地に比較して、約４３％の減少）。従って、ＢＭＦ−１製品は、培養したヒトケラチノサイトの増殖を刺激し、生存を促進する。
【０１０５】
実施例６：ＢＭＦ−１は、ヒト皮膚線維芽細胞によるコラーゲン産生を刺激する。
ヒト皮膚線維芽球を６−穴プレートに約１ｘ１０５ケ／穴の密度で流し、ほぼ融合するまで増殖させた後、基礎培地（ＤＭＥＭおよび０．１％ＦＢＳ）で一昼夜飢餓状態にした。次に、基礎培地中で、一定濃度のＢＭＦ−１（０−２．０ｍｇ／ｍｌ）に４８時間曝露した。コラーゲン含量測定値としてヒドロキシプロリンを定量するため細胞ペレットを採取した（図２）。
【０１０６】
ＢＭＦ−１は、用量に依存して、ヒト皮膚線維芽球によるコラーゲン産生を刺激した（図２）。細胞が細胞外マトリックスとして沈着させるコラーゲン量を細胞ペレットから測定し、細胞をＢＭＦ−１と共に培養した時、基礎培地と比較して約３倍増加することが分かった（図２）。従って、ＢＭＦ−１は、ヒト線維芽細胞によるコラーゲン分泌とこのコラーゲンの細胞外マトリックスへの沈着を刺激する。
【０１０７】
実施例７：ＢＭＦ−１の局所用配合品は、生活皮膚を浸透する。
ＢＭＦ−１を処方し、重量対重量換算でエマルジョン１ｇ当たり約２０ｍｇまで混入する４種類の代表的局所用エマルジョンにした。対照エマルジョンと局所用配合ＢＭＦ−１を調製したブタの皮膚（洗浄、除毛）に、約０．０５ｇ／ｃｍ２の塗布率で塗布した。材料は、計量シリンジ（印で囲んだ部分５．０ｃｍ２当たり２５０μｌ）で塗布し、目に見える皮膚表面の残留物が最少量になるまで、皮膚に綿球ですり込んだ。３０分または９０分後、全層６ｍｍのパンチ生検標本を対照部分と処理部分の両方から採取し、Ｔｉｓｓｕ−Ｔｅｋ　ＯＣＴ（光学的切断温度）化合物中で急速冷凍した。
【０１０８】
ＯＴＣで収集した組織をクリオスタットを使って５−７μｍづつ切断し、アセトンに２０分間固定した後、免疫組織化学検査によって増殖因子染色について評価した。少なくとも１０μｍ離して２枚の切片を切断し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で再水和し、１０％スキムミルク粉末によって室温で３０分間遮断し、ＰＢＳで２−３回洗浄した。希釈一次抗体（ウサギ抗−ＴＧＦβ２ポリクロナール抗体１：２００、ウサギ抗−ＩＧＦ−１ポリクロナール抗体１：２００）１００μｌを各ブタ皮膚切片に添加し、室温で１時間放置した後、ＰＢＳで２−３回洗浄した。１００μｌの希釈二次抗体（ビオチル化抗ウサギＩｇＧ）１：５００を各切片に添加し、室温でさらに１時間放置した後、ＰＢＳで２−３回洗浄し、ストレプトアビジンＣＹ３（１：３００）を切片に室温で４０分間添加した。最後に、切片をＰＢＳで洗浄し、ｉｍｍｕ−ｍｏｕｎｔに載せ、蛍光顕微鏡を使って検査した。各試料から得た２枚の切片のそれぞれから皮膚の完全視野３ヶ所を捕らえて定量を実施した。視野毎の表皮および真皮の平均蛍光強度を、平均背景強度と共に、ＳｉｇｍａＳｃａｎソフトウェア（Ｊａｎｄｅｌ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使って決定した。最終強度測定値（積分光学密度、ＩＯＤとして表す）は、各視野における測定部分の平均強度−背景強度を表し、約６視野を合わせて、各試料についてのＩＯＤを得た。
【０１０９】
ＩＧＦ−１およびＴＧＦβ２は、ＢＭＦ−１の成分で、免疫組織化学的検出法を使って皮膚に検出できる（図３Ａ）。３０分後、ＩＧＦ−１およびＴＧＦβ２両者の免疫組織化学的検出は、エマルジョンのみで処置した対照皮膚（図３Ａ，パネルＡおよびＣ）と比較して、局所用配合ＢＭＦ−１製剤で処置した皮膚で増加した（図３Ａ、パネルＢおよびＤ）。図３Ｂは、エマルジョン単独（オープンバー）に比較して、２０ｍｇ／ｇＢＭＦ−１を含有する２種類のエマルジョン（ＡおよびＢ）（クローズドバー）で処置した皮膚の表皮と真皮に認められたＩＧＦ−１およびＴＧＦβ２の免疫蛍光の定量結果を示す。局所用に処方したＢＭＦ−１で皮膚を処置してから３０分後に得た試料についてＩＧＦ−１免疫蛍光定量を実施したが、ＴＧＦβ２免疫蛍光定量は、処置から９０分後に得た試料について実施した。図３Ｂは、図３Ａで示した観察結果を追認するもので、皮膚を局所用配合ＢＭＦ−１製剤で処置してから３０分後に、ＩＧＦ−１免疫蛍光が増加したことを立証している。皮膚を局所用配合ＢＭＦ−１製剤で処置してから３０分後に、ＴＧＦβ２免疫蛍光が増加することが認められた（図３Ａ、パネルＣおよびＤ）が、最大変化は９０分後に起こったことが分かった。図３Ｂは、皮膚を局所用配合ＢＭＦ−１で処置した後、表皮と真皮の両方でＴＧＦβ２の免疫蛍光が増加したことを示している。これらの結果は、ＩＧＦ−１とＴＧＦβ２が共に、配合品から皮膚を浸透したことを指摘している。これらの試験は、ＢＭＦ−１製剤に含有される増殖因子が皮膚に転移し、表皮および真皮層の両方で検出されることを示しており、従って、配合ＢＭＦ−１の皮膚への利用可能性を確認するものである。
【０１１０】
実施例８：局所用配合ＢＭＦ−１は、生活（ｌｉｖｉｎｇ）皮膚の真皮充実性を増加させる。
ＢＭＦ−１を５種類の基剤の局所用エマルジョンに重量換算で、エマルジョン１ｇ当たりＢＭＦ−１約２ｍｇと２０ｍｇを混入させて配合した。対照エマルジョン、局所用配合ＢＭＦ−１（２および２０ｍｇ／ｇ）を共に、ブタの皮膚（洗浄、除毛）に約０．０５ｇ／ｃｍ２の塗布率で塗布した。材料を計量シリンジ（印で囲んだ部分５．０ｃｍ２当たり２５０μｌ）で塗布し、目に見える皮膚表面の残留物が最少量になるまで、皮膚に綿球ですり込んだ。塗布を３日または４日間隔で４週間繰り返した。局所用配合品の初回塗布から４週間後、さらに、最終塗布から３日後、対照部分と処置部分から全層６ｍｍのパンチ生検標本を採取し、１０％ホルマリンに固定し、組織検査用に処理した。
【０１１１】
各生検標本からのワックス封埋切片をヘマトキシリンおよびエオジンで染色し、相対真皮細胞充実度を採点することによって盲検法で評価した。
【０１１２】
４週間に及ぶ反復塗布後、局所用配合ＢＭＦ−１（２０ｍｇ／ｇ）で処置した皮膚は、対照に比較して、真皮の細胞充実性スコアを増加させることが認められたが、これは処置した皮膚での線維芽球数の増加を反映するものである（図４）。弛緩した結合組織は、稠密な結合組織よりも細胞充実性がより高く、より多くの網状コラーゲン（ＩＩＩ型）を含有するので、細胞充実性スコアの増加とＩＩＩ型コラーゲンの増加（実施例９）は、真皮における新しい弛緩結合組織の沈着増加を証明するものである。
【０１１３】
実施例９：局所用配合ＢＭＦ−１は、生活皮膚でのコラーゲン産生を刺激する。
ＢＭＦ−１を重量換算で、エマルジョン１ｇ当たりＢＭＦ−１約２ｍｇと２０ｍｇを混入させて配合し、ソルボレンクリーム（ｓｏｒｂｏｌｅｎｅ　ｃｒｅａｍ）とした。対照エマルジョン、局所用配合ＢＭＦ−１（２および２０ｍｇ／ｇ）を共に、ブタの皮膚（洗浄、除毛）に約０．０５ｇ／ｃｍ２の塗布率で塗布した。材料を計量シリンジ（印で囲んだ部分５．０ｃｍ２当たり２５０μｌ）で塗布し、目に見える皮膚表面の残留物が最少量になるまで、２頭のブタの皮膚に綿球ですり込んだ。塗布を３日または４日間隔で２週間繰り返した。局所用配合品の初回塗布から２週間後、さらに、最終塗布から３日後、対照部分と処置部分から全層６ｍｍのパンチ生検標本を採取し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ　ＯＣＴ化合物中で急速冷凍した。
【０１１４】
ＯＴＣで収集した組織から１０μｍ切片２片をクリオスタットを使って切断し、アセトンに２５分間固定した後、免疫組織化学検査により、ＩＩＩ型コラーゲン染色について評価した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で再水和し、１０％スキムミルク粉末によって室温で４０分間遮断し、ＰＢＳで２−３回洗浄した。希釈一次抗体（ウサギ抗−ＩＩＩ型コラーゲンポリクロナール抗体１：２００）を各ブタ皮膚切片に添加し、室温で１時間放置した後、ＰＢＳで２−３回洗浄した。１００μｌの希釈二次抗体（ビオチル化抗ウサギＩｇＧ　１：２００）を各切片に添加し、室温でさらに１時間放置した後、ＰＢＳで２−３回洗浄した。ストレプトアビジンＣＹ３（１：２００）を切片に室温で４０分間添加した。最後に、切片をＰＢＳで洗浄し、ｉｍｍｕ−ｍｏｕｎｔに載せ、蛍光顕微鏡を使って検査した。各組織試料から得た２枚の切片を、Ｏｌｙｍｐｕｓ−Ｖａｎｏｘ　Ｐｈｏｔｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅと画像分析ソフトウェアを使って分析した。各切片の真皮から蛍光強度を測定し、陰性対照からの蛍光値を使って標準化した（図５）。真皮の乳頭および網状部分のそれぞれから、４ヶ所の視野を捕らえた。次に、試料１ヶ当たりの平均強度を合わせ、結果を比較した。
【０１１５】
図５に示すように、２週間に及ぶ反復塗布後、局所用配合ＢＭＦ−１は、真皮のＩＩＩ型コラーゲン含量を増加させた。ソルボレンクリームのみで処置した皮膚に比較して、局所用配合ＢＭＦ（２および２０ｍｇ／ｇ）への週２回の曝露は、真皮のＩＩＩ型コラーゲン免疫蛍光を増加させた（図５）。これらの結果は、局所用配合ＢＭＦ−１が、皮膚の真皮繊維芽球による新しいコラーゲン沈着（ＩＩＩ型コラーゲン）を刺激することを証明している。
【０１１６】
実施例１０：ＢＭＦ−１製品は、ヒト皮膚線維芽細胞によるコラーゲンｍＲＮＡ合成を刺激し、マトリックス−メタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ−１）ｍＲＮＡ合成を抑制する。
ヒト皮膚線維芽球を１７５本の組織培養ビン（Ｃｅｌｌｓｔａｒ、Ｇｒｅｉｎｅｒ　ＧｍｂＨ、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ）に接種し、融合まで増殖した後、０．１％ＦＢＳを含有する完全増殖培地（基礎培地）中で一昼夜飢餓状態にした。次に、細胞を、基礎培地中、一定濃度のＢＭＦ−１（０−２．０ｍｇ／ｍｌ）に４８時間曝露した。全ＲＮＡ抽出のため、製造会社の解説書に従って、Ｑｕｉｃｋｐｒｅｐ　ＲＮＡ抽出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ　ＮＪ）を使って細胞ペレットを採取した。各ボトルから抽出したＲＮＡを単一複製体として使用し、遺伝子発現を、４回繰り返し実験の標準ノーザンブロット法によって分析した。
【０１１７】
手短に言うと、ＲＮＡを分光光度分析で定量し、各試料から１０μｇを１％アガロース−ホルムアルデヒドゲル上電気泳動でサイズ分別（ｓｉｚｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）に供した後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，英）に移し、ＵＶ架橋（ＵＶ　Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ　１８００，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，米）によって固定した。膜をアンチセンスリボプローブでヒトプロコラーゲンＩＩＩ、プロコラーゲンＩ、マトリックス−メタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ−１）およびＧａｐＤＨ（構成的に発現させた対照遺伝子）にプローブした。ＭＭＰ−１およびＧａｐＤＨハイブリダイゼーションについては、プレハイブリダイゼーションを５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＰＥ、５ｘＤｅｈａｒｄｔｓ、０．１％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ　ｓｈｅａｒｅｄ　ｓａｌｍｏｎ　ｓｐｅｒｍ　ＤＮＡ中、６５℃で４時間実施した。コラーゲンハイブリダイゼーションについては、ＵＬＴＲＡｈｙｂ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）をハイブリダイゼーション溶液として使用した。１７またはＳＰ６転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，米）と［α−３２Ｐ］ＵＴＰ（ＧｅｎｅＷｏｒｋｓ，Ｔｈｅｂａｒｔｏｎ，オーストラリア）を使ってリボプローブを生成し、ハイブリダイゼーション溶液１ｍｌ当たり１０６ケの取り込み数を最終濃度として使用した。ハイブリダイゼーションは、プレハイブリダイゼーションについて述べた条件を使って１６時間実施した。膜は、顕著に厳重な条件下で洗浄した；室温下、３ｘＳＳＣ−０．１％で３回、６８℃下、２ｘ　ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで３回、その後、６８℃下、０．５ｘＳＳＣ−０．１％ＳＤＳと０．１ｘＳＳＤ−０．１％ＳＤＳで２回洗浄。膜を−８０℃でフィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，英）に２４時間まで曝露した。定量のため、膜をフォスファーイメージプレートに曝露し、これをフォスファーイメージリーダー（Ｆｕｊｉ　ＢＡＳ，日）でスキャンし、バンドの積分光学密度（ＩＯＤ）をイメージマスターＶＤＳソフトウェア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｈｅｃｈ，Ｃａｓｔｌｅ　Ｈｉｌｌ，オーストラリア）で測定した。負荷したＲＮＡ量を調整し、プローブ遺伝子の特異的調節を反映するｍＲＮＡ発現を確実に変化させるために、プロコラーゲンＩＩＩ、ＩおよびＭＭＰ−１シグナルを同一試料からＧａｐＤＨ−ＩＯＤを使って標準化した。
【０１１８】
コラーゲンＩ、ＩＩＩおよびＭＭＰ−１をプローブしたＲＮＡの代表的オートラジオグラムを、各試料のそれぞれのＧａｐＤＨオートラジオグラムと合わせて図６Ａに示す。図６Ｂは、基礎条件下で処理した細胞のそれぞれのＲＮＡ発現からのしわの変化として表すグラフである。０．２ｍｇ／ｍｌで処理した細胞は、基礎条件に比較して、コラーゲンＩおよびＩＩＩｍＲＮＡ発現を少なくとも２倍誘発した。２．０ｍｇ／ｍｌＢＭＦ−１で処理した細胞もコラーゲンｍＲＮＡ発現増加を示した。ＢＭＦ−１の作用は、遺伝子誘発への直接作用であると考えられ、直ちに細胞数の増加を反映するものではない。
【０１１９】
対照的に、ＢＭＦ−１は、ＭＭＰ−１ｍＲＮＡの発現に対する用量依存性阻害作用を有した（図６Ａおよび６Ｂ）。ＭＭＰ−１は、コラーゲン分子分解に重要な酵素であるので、この結果は、ＢＭＦ−１がコラーゲン合成を刺激するだけでなく、その分解も阻害することを意味する。コラーゲン交替は、皮膚に起こる動的過程であるので、合成と分解への相対的作用は、重要な検討事項である。ＢＭＦ−１の、合成を刺激し、分解を阻害する能力は、ＢＭＦ−１による皮膚の処置が、最終的にコラーゲン沈着の全体的な正味の増加を生じることを確実なものとする。これは、測定したコラーゲン量が、低または高レベルＢＭＦ−１で処置した細胞（図２）や皮膚（図５）で類似していた図２および５に示す結果で確認される。図６Ｂに示す結果は、ＢＭＦ−１の用量が高めであると、低用量と同量のＲＮＡ合成を刺激しないことを表しているが、ＢＭＦ−１が、用量に依存して分解酵素ＭＭＰ−１の合成も顕著に阻害するという所見は、ＢＭＦ−１の用量を増加するにつれて、ＭＭＰ−１によるコラーゲンの分解が減少することを証明している。さらに、これは、図２および５に示すように、各ＢＭＦ−１用量で、皮膚線維芽球によるコラーゲン沈着の類似した正味のバランスを生じると思われる。従って、ＢＭＦ−１は、コラーゲンＩおよびＩＩＩ遺伝子発現の両方を上方調節してコラーゲン合成を直接刺激し、ＭＭＰ−１の発現を下方調節してその分解を阻害する。
【０１２０】
実施例１１：ＢＭＦ−１およびＢＭＦ−２製品は、ヒト線維芽細胞によるコラーゲンｍＲＮＡ合成を刺激する。
ヒト皮膚線維芽球を１７５本の組織培養ビン（Ｃｅｌｌｓｔａｒ、Ｇｒｅｉｎｅｒ　ＧｍｂＨ、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ）に接種し、融合まで増殖した後、０．１％ＦＢＳを含有する完全増殖培地（基礎培地）中で一昼夜飢餓状態にした。次に、細胞を、基礎培地中、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＭＦ−１またはＢＭＦ−２に４８時間曝露した。全ＲＮＡ抽出のため、製造会社の解説書に従って、Ｑｕｉｃｋｐｒｅｐ　ＲＮＡ抽出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ　ＮＪ）を使って細胞ペレットを採取した。各ボトルから抽出したＲＮＡを単一複製体として使用し、遺伝子発現を、４回繰り返し実験の標準ノーザンブロット法によって分析した。コラーゲンＩおよびＩＩＩ発現の評価は、実施例１０に述べる通りに実施した。
【０１２１】
コラーゲンＩ、ＩＩＩおよびＭＭＰ−１をプローブしたＲＮＡの代表的オートラジオグラムを、各試料のそれぞれのＧａｐＤＨオートラジオグラムと合わせて図７Ａに示す。図７Ｂは、基礎条件下で処理した細胞のそれぞれのＲＮＡ発現からの変化率（ｆｏｌｄ　ｃｈａｎｇｅ）として表した、処置毎の複製体の結果を合わせたものである。細胞をＢＭＦ−１およびＢＭＦ−２で処理すると、基礎条件に比較して、コラーゲンＩおよびＩＩＩｍＲＮＡ発現を約２倍誘発した。ＢＭＦ−２の方がコラーゲン発現に対する作用が高い傾向があった（図７Ａ）が、総合結果は、比較可能であった（図７Ｂ）。実施例１０で述べたように、ＢＭＦ−１およびＭＢＦ−２によるコラーゲンＲＮＡの刺激は、遺伝子誘発への直接作用の結果であり、単に細胞数の増加を反映するものではない、と考えられる。
【０１２２】
従って、ＢＭＦ−１およびＢＭＦ−２は、コラーゲンＩおよびＩＩＩ遺伝子発現両者の上方調節によってコラーゲン合成を直接刺激できる。
【０１２３】
実施例１２：皮膚ダメージの治療的および予防的処置としての塩基性ミルクファクターの有効性を検討するために使用する方法論
本発明は、太陽を浴びた結果、紫外線照射によって引き起こされる皮膚ダメージを処置するために使用できる。当業者は、容易に請求する発明を検討し、太陽を浴びたことから引き起こされる皮膚ダメージを処置できる。
【０１２４】
例えば、測定した最小紅斑発現量の模擬太陽紫外線に毎日曝露したヘアレス（ｈａｉｒｌｅｓｓ）マウスは、皮膚ダメージまたは光老化を促進した動物モデルとして広く使用されてきた（Ｍａｌｏｎｅｙら、１９９２）。この適切なモデルは、皮膚ダメージを誘発した後、配合したＢＭＦ−１またはＢＭＦ−２（合わせてＢＭＦと呼ぶ）を、単独または活性補助成分との併用で、ダメージを受けた皮膚に塗布するために使用される。その処置の普通以上の構造および機能状態に皮膚を修復または再生し、皮膚の一層の劣化を予防する能力が決定される。
【０１２５】
例えば、本発明の、光によりダメージを受けた皮膚の修復能を検討するには、順化期間（約１週間）後、Ｓｋｈ−１ヘアレスマウスを最小紅斑発現量（ＭＥＤ）のＵＶＡおよびＵＶＢ混合放射線にマウスの全身を週に５回曝露する。これは、照射から２４時間後にマウスの皮膚をピンク色にするおおよその最小量である。皮膚ダメージの徴候が総じて検出できる２０週間目までの連続照射期間後、照射を中止し、マウスに配合ＢＭＦ製品を、０．００１−２００ｍｇ／ｃｍ２の範囲の割合で背部に毎日局所塗布する。好ましくは、処理開始後、特定の時点で、マウスを致死量のペントバルビトンナトリウムの投与によって安楽死させた。皮膚ダメージ修復の有効性の評価および特徴付けに対して、各種方法が技術上周知である。例えば、配合品配合ＢＭＦのＵＶダメージ皮膚修復能を決定するために、組織検査法および免疫組織化学検査法（ヒドロキシプロリン、ｍＲＮＡおよびメタロプロテイナーゼアッセイ）を使った分析用に皮膚を収集する。
【０１２６】
実施例２−１１に示す結果に基づいて、この特殊モデルで使用した本発明が、コラーゲン合成および沈着を増加させ、マトリックス−メタロプロテイナーゼによるマトリックス分解を減少させ、対応する対照処置動物からの皮膚と比較して、真皮の構造および機能を改善する、と発明人は予想する。また、発明人は、本発明が皮膚のケラチノサイトおよび線維芽細胞の増殖および生育能を増強する、とも予想する。発明人は、本発明が、おそらく、しわ、皮膚のたるみ、および皮膚の真皮に起こる他の光老化関連変化を軽減する、とも予想する。さらに、発明人は、本発明が、表皮構造および生育能を改善し、それによって、皮膚を正常、健康な若々しい外観に回復させる、と予想する。
【０１２７】
さらに、本発明の皮膚ダメージ予防能に適した方法は、技術上周知である。例えば、マウスに、ＵＶ光曝露直後、０．００１−２００ｍｇ／ｃｍ２の範囲の用量での配合ＢＭＦ製品の背部への局所塗布を行う（ＭＥＤ）。この処置を２０週まで続け、様々な時点で動物を麻酔した後、安楽死させる。皮膚ダメージ予防の有効性の評価と特徴付けのための各種方法は技術上周知である。好ましくは、標準的な組織、免疫組織化学および生化学検査を使用して、ＢＭＦ処置マウスの皮膚を対照処置マウスの皮膚と比較する。実施例２−１１に示した結果に基づいて、発明人は、この特殊モデルで使用する本発明が皮膚ダメージの徴候を軽減する、と予想する。
【０１２８】
実施例１３：皮膚外観を強化する化粧品としての塩基性ミルクファクターの有効性を検討するために使用する方法論
本発明は、化粧品として使用し、ヒトの皮膚の外観と活力を強化することができる。当業者は、ヒトの皮膚の外観を改善する点について、請求する発明を容易に検討できる。
【０１２９】
例えば、多数の臨床指標を使用して、局所塗布化粧品の皮膚の美容強化能を決定することができる。これらは、皮膚のしわ、皮膚の外観および活力、皮膚の乾燥およびうろこ様状態、皮膚敏感、皮膚の厚さ、皮膚の脆弱性の主観的測定値である。ノギスや超音波による皮膚の厚さを測定し、あるいは、コーネオメーターを使った表皮水分および表皮からの脱水（ＴＥＷＬ，経皮的脱水の測定）の定量による皮膚水分力学を測定するなどして客観的な測定値も考慮できる。同様に、歯科用印象材料を使って、皮膚表面の自然なマイナスの印象を検討し、プロフィロメーターで印象を分析することによって、皮膚表面のあれを測定できる。
【０１３０】
例えば、本発明の、ヒトの皮膚の望ましい美容効果生成能を検討する場合、１日１回から１週間に１回、月に１回までの特定塗布頻度および０．００１−２００ｍｇ／ｃｍ２の塗布率で、美容上の改善を要するいずれかの部位の皮膚への塩基性ミルクファクターの局所塗布を実施するとする。処置開始前および処置開始後の特定時点で、塗布するヒトの皮膚の外観と活力を改善する化粧品の有効性の評価と特徴付けに、様々な方法が技術上周知であるのが好ましい。例えば、皮膚の皺、皮膚の外観および活力、皮膚の乾燥およびうろこ様状態、皮膚敏感、皮膚の厚さ、皮膚の脆弱性、皮膚の水分力学、皮膚の弾力性の測定を使用して、配合品を含有する塩基性ミルクファクターの皮膚への美容改善能を決定した。
【０１３１】
実施例２−１１に示した結果に基づいて、発明人は、本発明が皮膚の外観と活力を改善し、それによって、老化した外観の皮膚を普通以上の健康な、若々しい外観に回復させる、と予想する。
【０１３２】
実施例１４：皮膚のリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）によって引き起こされる皮膚ダメージの処置法として、塩基性ミルクファクターの有効性の検討に使用する方法
本発明は、皮膚のリサーフェシングによって引き起こされる皮膚ダメージの処置法として使用できる。当業者は、高エネルギーパルスレーザーシステムと電気外科的コアブレーション（ｃｏａｂｌａｔｉｏｎ）を使った美容処置後の皮膚再生の転帰を改善するため、特許請求の発明を容易に検討できる。
【０１３３】
例えば、皮膚リサーフェシングは、光損傷皮膚、光誘発の皺、着色異常の矯正、きず痕の改善および皮膚のリコンツアリング（ｒｅｃｎｔｏｕｒｉｎｇ輪郭再形成）で選ばれる美容手順である。皮膚リサーフェシングは、二酸化炭素（ＣＯ２）、エルビウム：イットリウム−アルミニウム−ガーネット（Ｅｒ：ＹＡＧ）またはネオジミウム：イットリウム−アルミニウム−ガーネット（Ｎｄ：ＹＡＧ）などの高エネルギーパルスレーザーまたはコアブレーション技術の電気外科システムを利用する。有効性や有用性があるにもかかわらず、皮膚リサーフェシング技術は、ダメージを受けた皮膚で処置に刺激される修復過程の結果発生する若干の望ましくない副作用も伴う。
【０１３４】
例えば、高エネルギーパルスレーザーシステムおよび電気外科的コアブレーションを使った美容処置後のヒト皮膚の再生転帰を改善する本発明の能力を検討する場合、処置部位の皮膚への配合塩基性ミルクファクターの局所塗布を実施し、１日１回から１週間に１回、月に１回までの特定塗布頻度および０．００１−２００ｍｇ／ｃｍ２の塗布率で、美容上の改善を要するいずれかの部位の皮膚への塩基性ミルクファクターの局所塗布を実施するとする。処置開始前および処置開始後の特定時点で、リサーフェシングを受けたヒトの皮膚の外観と活力を改善する化粧品の有効性の評価と特徴付けに、様々な方法が技術上周知であるのが好ましい。例えば、皮膚リサーフェシング処置による皮膚の若返りを改善するＢＭＦ含有配合品の能力を決定するために、紅斑、浮腫、色素沈着過剰、遅発色素沈着減少、栄養障害瘢痕形成のより詳細な確認と合わせて、皮膚の皺、皮膚の外観、皮膚の厚さ、皮膚の脆弱性、皮膚の弾力性の測定値を使用する。
【０１３５】
実施例２−１２に示す結果に基づいて、発明人は、本発明が、皮膚リサーフェシング処置の美容転帰を改善し、それによって、皮膚を普通以上の健康で若々しい外観を回復する、と予想する。
【０１３６】
本発明は、明快さと理解を得るために幾分詳細に説明したが、本明細書に開示する発明の概念の範囲を逸脱せずに、ここで述べた実施態様および方法への改良および変更を加えることができる。
【０１３７】
ここで引用した参考文献を次頁に挙げ、この場合の参照のため、ここに引用する。
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【０１３８】
（産業上の利用可能性）
本発明における乳製品からカチオン交換クロマトグラフィーによる各種乳製品の精製で得られる塩基性ミルクファクター（ＢＭＦ）は、細胞増殖を刺激する作用があり、ヒトや家畜などの様々な疾病から起こる皮膚ダメージを治療し、また、美容上、老化した皮膚の外観を処置、予防することに適している。
【図面の簡単な説明】
【図１】
全データは、平均値±標準誤差で表す。
ＢＭＦ−１およびＢＭＦ−２の濃度を増加させた時のヒトケラチノサイト（ＨａＣａｔ）細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏ刺激を証明するグラフである。細胞増殖は、波長６３０ｎｍで光学密度（ＯＤ）を測定することによってモニターした。破線は、細胞を１０％ウシ胎児血清で処理した時に得られた反応を表す。
【図２】
ＢＭＦ−１濃度を増加させた時のヒトの皮膚線維芽球におけるコラーゲン産生の増加を証明するヒストグラムである。一昼夜飢餓状態にした後、細胞をＢＭＦ−１に４８時間曝露した。細胞を採取し、細胞１ケ当たりのヒドロキシプロリン量を４種類の複製体試料から測定した。
【図３Ａ】
ブタ皮膚の横断面の顕微鏡写真である。配合２０ｍｇ／ｇＢＭＦ−１か対照配合品（賦形剤単独）をブタの皮膚に局所塗布し、３０分間の暴露後生検標本を得た。切片を調製し、ＴＧＦβ２またはＩＧＦ−１に特異的な抗体を使ってプローブした。結合抗体を蛍光検出法によって可視化した。パネルＡおよびＢは、ＩＧＦ−１の有無について染色した生検材料である（対照および処理材料）が、パネルＣおよびＤは、ＴＧＦβ２について染色した生検材料である（対照および処理材料）。
【図３Ｂ】
３Ａで述べた試料のＩＧＦ−１およびＴＧＦβ２免疫蛍光測定値（積分光学密度ＩＯＤで表す）のグラフであり、９０分後に採取した追加試料の分析結果も示す。対照（□）およびＢＭＦ−１処理皮膚試料（−）の表皮（３Ｂｉ）と真皮（３Ｂｉｉ）両方のＩＧＦ−１およびＴＧＦβ２免疫蛍光平均強度を、各試料の２枚の切片から３ヶ所の視野を捉えて入手した。ＢＭＦ−１を含有する局所用配合エマルジョン２種類の結果を示す。
【図４】
２ｍｇ／ｇまたは２０ｍｇ／ｇのＢＭＦ−１の局所塗布後に収集した皮膚試料の真皮細胞充実性のグラフである。ブタの皮膚をＢＭＦ−１（高用量または低用量）または対照（賦形剤単独）で４週間繰返し処理した。生検標本を採取し、顕微鏡で分析し、線維芽球数に応じて採点した。高めのスコアが高めの細胞充実性と相関する。
【図５】
２ｍｇ／ｇまたは２０ｍｇ／ｇのＢＭＦ−１を２週間反復局所塗布した後のブタ皮膚におけるＩＩＩ型コラーゲン産生のグラフである。ブタの皮膚を局所用ＢＭＦ−１配合品（高用量または低用量）または対照配合品（賦形剤単独）で処理した。生検標本を採取し、切片をＩＩＩ型コラーゲンに特異的な抗体で染色した。蛍光標識二次抗体を使って結合抗体を検出し、画像分析ソフトウェアを使って蛍光強度を定量し、ＩＯＤ（積分光学密度）で表した。
【図６Ａ】
皮膚線維芽細胞から抽出し、コラーゲンＩ、ＩＩＩ、ＭＭＰ−１および対照遺伝子ＧａｐＤＨに対してノーザンブロット分析を使ってプローブした。基礎培地単独（Ｂ）または２ｍｇ／ｇまたは２０ｍｇ／ｇのＢＭＦ−１含有培地中で細胞を４８時間培養した。
【図６Ｂ】
６Ａで述べた複製体４種類の実験のグラフである。プローブしたフィルターをフォスファーイメージプレートに曝露した後にバンド強度を測定し、基礎条件下で培養した細胞と比較した、２ｍｇ／ｇまたは２０ｍｇ／ｇのＢＭＦ−１で処理した細胞からのＲＮＡの遺伝子発現のｆｏｌｄ変化として示す。各試料について、各バンド強度を、それぞれのＧａｐＤＨシグナルに標準化した。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ（ｉ）】
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【図３Ｂ（ｉｉ）】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年5月30日(2002.5.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚ダメージを処置または予防するために使用する場合の組成品で、その組成品が有効量の塩基性ミルクファクターまたはその変異体を含み、組成品が上皮、表皮または真皮組織を再生および／または保護する能力を持つ組成品。
【請求項２】
処置または保護が老化した皮膚外観を軽減する請求の範囲第１項記載の組成品。
【請求項３】
処置対象の皮膚が実質的に無傷である請求の範囲第１または２項記載の組成品。
【請求項４】
塩基性ミルクファクターがラットＬ６筋芽細胞の増殖を刺激できる請求の範囲第１−３項のいずれかに記載の組成品。
【請求項５】
塩基性ミルクファクターが乳製品をカチオン交換クロマトグラフィーに供することによって調製されたものである請求の範囲第１−４項のいずれかに記載の組成品。
【請求項６】
乳製品が、ミルクホエー、スキムミルク、初乳ホエー、チーズホエーおよび酸ホエーから成る群から選択されたものである請求の範囲第５項記載の組成品。
【請求項７】
乳製品が有蹄類に由来する請求の範囲第６項記載の組成品。
【請求項８】
塩基性ミルクファクターがＢＭＦ−１および／またはＢＭＦ−２である請求の範囲第１−７項のいずれかに記載の組成品。
【請求項９】
塩基性ミルクファクターが塩基性から約中性の等電点を有する多数の細胞増殖刺激因子を含む請求の範囲第１−８項に記載の組成品。
【請求項１０】
細胞増殖刺激因子がＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＰＤＧＦ、ＦＧＦおよびＴＧＦβから成る群から選択される請求の範囲第９項記載の組成品。
【請求項１１】
通常の溶媒、分散媒、フィラー、水溶液、サンスクリーン、抗菌および抗真菌剤、または吸収促進剤を単独で、または組み合わせて含む請求の範囲第１−１０項のいずれかに記載の組成品。
【請求項１２】
さらに増殖因子、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ジメチルスルフォキサイド、レチノイン酸、銅−ペプチド錯体、α−ケト酸、ラノリン、ワセリン、アロエベラ、メチルまたはプロピルパラベンまたは顔料を、単独で、または組み合わせて含む請求の範囲第１−１１項のいずれかに記載の組成品。
【請求項１３】
組成品が美容上許容されるリキッド、クリーム、オイル、ローション、軟膏、ジェル、ロールオンリキッド、スキンパッチ、スプレー、塩基性ミルクファクターをしみこませたガラスビーズドレッシング、合成ポリマードレッシング、ソリッド、普通美容ナイトクリーム、ファウンデーションクリーム、サンタンローション、ハンドローション、メークアップ、メークアップベースおよびマスクから成る群から選択される形態である請求の範囲第１−１２項のいずれかに記載の組成品。
【請求項１４】
皮膚外観の老化の進行を抑制し、あるいは、皮膚外観の老化の発症または進行をすべて停止させるのに有効な有効量の塩基性ミルクファクターを含む請求の範囲１−１３項のいずれかに記載の組成品。
【請求項１５】
皮膚ダメージの処置または予防用組成品の製造のための塩基性ミルクファクターまたはその変異体の使用法で、その組成品が上皮、表皮または真皮組織を再生および／または保護する能力を有する使用法。
【請求項１６】
皮膚が実質的に無傷である請求の範囲第１５項記載の使用法。
【請求項１７】
処置または予防が皮膚外観の老化を軽減する請求の範囲第１５または１６項記載の使用法。
【請求項１８】
請求の範囲第１−１４項のいずれかに記載の組成品を調製する請求の範囲第１５−１７項記載の使用法。
【請求項１９】
皮膚ダメージを処置または予防する方法で、その方法が請求の範囲第１−１４項のいずれかに記載の組成品の有効量を必要とする哺乳動物に投与することを含み、その場合、処置または予防が上皮、表皮または真皮組織の再生および／または保護を含む方法。
【請求項２０】
処置または予防が皮膚外観の老化を軽減する請求の範囲第１９項記載の方法。
【請求項２１】
皮膚が実質的に無傷である請求の範囲第１９または２０項記載の方法。
【請求項２２】
皮膚のダメージが正常な生物学的老化、環境因子、皮膚病、内科的処置、外科的処置または疾病の結果である請求の範囲第１９−２１項のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
環境因子が食品の不衛生、毒素曝露、汚染物質曝露、電離放射線、Ｘ線、ＵＶ光、太陽、たばこ、アルコールおよびストレスから成る群から選択される請求の範囲第２２項記載の方法
【請求項２４】
皮膚病が座瘡（アクネ）状態、尋常性座瘡（にきび）、酒さ性座瘡（ａｃｎｅ　ｒｏｓａｃｅａ）、角化座瘡、放射線皮膚病（ａｃｔｉｎｏｄｅｍａｔｏｓｉｓ）、血管腫、銀沈着症（ａｒｇｙｉａ）、肝斑、ダリエ（Ｄａｒｉｅｒ）病、着色異常、ほくろ、メラノーマ、母斑、放射線皮膚炎、鼻瘤、ライテス（ｒｈｙｔｅｓ）および皺（ｒｈｙｔｉｄｅｓ）、皮脂腺腫、皮脂嚢胞、脂漏性角化症、表在性基底細胞癌、毛細血管拡張症および毛包上皮腫から成る群から選択される請求の範囲第２２または２３項記載の方法。
【請求項２５】
疾病が先天性外胚葉異形成、糖尿病、ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ関連感染症、栄養欠乏、腎臓病、閉経、劣性栄養障害型表皮水疱症、Ｅｈｌｅｒｓ　Ｄａｎｌｏｓ症候群、全身性皮膚萎縮、限局性皮膚萎縮、瘢痕性脱毛、壊疽性膿皮症またはホルモン変化であり、単独または併発である請求の範囲第２２−２４項のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
皮膚が実質的に無傷である請求の範囲第１９−２５項記載の方法。
【請求項２７】
皮膚外観の老化が皺、しみ、色素過剰、皮膚の厚みの変化、乾燥、肌荒れの単独または併発の結果である請求の範囲第４３−４６項のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
組成品を局所投与する請求の範囲第１９−２７項のいずれかに記載の方法。
【国際調査報告】
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