(57)【要約】本発明は多発性硬化症のような脱髄疾患において自己抗体の結合を阻害するための方法と組成物を提供する。本組成物は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質に対する高アフィニティー結合によって選択された組合せファージディスプレイライブラリーから取り出された免疫グロブリンＣＤＲ３配列を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１−１２からなる群から選択される抗原結合ドメイン配列を含んでなる単離ポリペプチドであって、ヒトミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）に特異的に結合するポリペプチド。
【請求項２】
配列番号：１−６からなる群から選択される第１の抗原結合ドメイン配列と、配列番号：７−１２からなる群から選択される第２の抗原結合ドメイン配列を含んでなる、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
第１及び第２抗原結合ドメイン配列の対を含み、該対が、配列番号：１及び２、配列番号：３及び４、配列番号：５及び６、配列番号：７及び８、配列番号：９及び１０、及び配列番号：１１及び１２からなる群から選択される、請求項２に記載の単離ポリペプチド。
【請求項４】
ポリペプチドがＦ（ａｂ）である請求項３に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５】
請求項１に記載のポリペプチドと医薬的に許容可能な担体を含有する医薬組成物。
【請求項６】
ＭＯＧと抗体の混合物を、請求項１に記載のポリペプチドに接触させ、それによって、ＭＯＧ−抗体の結合を阻害する工程を含んでなる、ＭＯＧ−抗体の結合を阻害する方法。
【請求項７】
ＭＯＧと抗体の混合物を、請求項２に記載のポリペプチドに接触させ、それによって、ＭＯＧ−抗体の結合を阻害する工程を含んでなる、ＭＯＧ−抗体の結合を阻害する方法。
【請求項８】
ＭＯＧと抗体の混合物を、請求項３に記載のポリペプチドに接触させ、それによって、ＭＯＧ−抗体の結合を阻害する工程を含んでなる、ＭＯＧ−抗体の結合を阻害する方法。
【請求項９】
ＭＯＧと抗体の混合物を、請求項４に記載のポリペプチドに接触させ、それによって、ＭＯＧ−抗体の結合を阻害する工程を含んでなる、ＭＯＧ−抗体の結合を阻害する方法。
【請求項１０】
ＭＯＧポリペプチドへの自己抗体の結合に関連した脱髄を抑制する方法であって、病原性ＭＯＧポリペプチド−ポリクローナル自己抗体の結合を被っているマモセット又はヒトの宿主に、機能性Ｆｃ部分を持たず、ＭＯＧポリペプチドに特異的に結合するのに十分でＭＯＧポリペプチドへの自己抗体の結合を競合的に阻害する、請求項１に記載のポリペプチドを含んでなる組成物の有効量を投与して、脱髄を抑制する工程を含む方法。
【請求項１１】
ＭＯＧポリペプチドへの自己抗体の結合に関連した脱髄を抑制する方法であって、病原性ＭＯＧポリペプチド−ポリクローナル自己抗体の結合を被っているマモセット又はヒトの宿主に、機能性Ｆｃ部分を持たず、ＭＯＧポリペプチドに特異的に結合するのに十分でＭＯＧポリペプチドへの自己抗体の結合を競合的に阻害する、請求項２に記載のポリペプチドを含んでなる組成物の有効量を投与して、脱髄を抑制する工程を含む方法。
【請求項１２】
ＭＯＧポリペプチドへの自己抗体の結合に関連した脱髄を抑制する方法であって、病原性ＭＯＧポリペプチド−ポリクローナル自己抗体の結合を被っているマモセット又はヒトの宿主に、機能性Ｆｃ部分を持たず、ＭＯＧポリペプチドに特異的に結合するのに十分でＭＯＧポリペプチドへの自己抗体の結合を競合的に阻害する、請求項３に記載のポリペプチドを含んでなる組成物の有効量を投与して、脱髄を抑制する工程を含む方法。
【請求項１３】
ＭＯＧポリペプチドへの自己抗体の結合に関連した脱髄を抑制する方法であって、病原性ＭＯＧポリペプチド−ポリクローナル自己抗体の結合を被っているマモセット又はヒトの宿主に、機能性Ｆｃ部分を持たず、ＭＯＧポリペプチドに特異的に結合するのに十分でＭＯＧポリペプチドへの自己抗体の結合を競合的に阻害する、請求項４に記載のポリペプチドを含んでなる組成物の有効量を投与して、脱髄を抑制する工程を含む方法。
【請求項１４】
組成物がＭＯＧ寛容原性Ｔ細胞エピトープを更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
ＭＯＧポリペプチドへの自己抗体の結合に関連した脱髄を抑制する方法であって、病原性ＭＯＧポリペプチド−ポリクローナル自己抗体の結合を被っているマモセット又はヒトの宿主に、機能性Ｆｃ部分を持たず、ＭＯＧポリペプチドに特異的に結合するのに十分でＭＯＧポリペプチドへの自己抗体の結合を競合的に阻害する、請求項１に記載の複数のポリペプチドを含んでなる組成物の有効量を投与して、脱髄を抑制する工程を含み、複数のポリペプチドの各々が異なったＭＯＧエピトープに特異的に結合する方法。
【請求項１６】
ＭＯＧポリペプチドへの自己抗体の結合に関連した脱髄を抑制する方法であって、病原性ＭＯＧポリペプチド−ポリクローナル自己抗体の結合を被っているマモセット又はヒトの宿主に、機能性Ｆｃ部分を持たず、ＭＯＧポリペプチドに特異的に結合するのに十分でＭＯＧポリペプチドへの自己抗体の結合を競合的に阻害する、請求項２に記載の複数のポリペプチドを含んでなる組成物の有効量を投与して、脱髄を抑制する工程を含み、複数のポリペプチドの各々が異なったＭＯＧエピトープに特異的に結合する方法。
【請求項１７】
ＭＯＧポリペプチドへの自己抗体の結合に関連した脱髄を抑制する方法であって、病原性ＭＯＧポリペプチド−ポリクローナル自己抗体の結合を被っているマモセット又はヒトの宿主に、機能性Ｆｃ部分を持たず、ＭＯＧポリペプチドに特異的に結合するのに十分でＭＯＧポリペプチドへの自己抗体の結合を競合的に阻害する、請求項３に記載の複数のポリペプチドを含んでなる組成物の有効量を投与して、脱髄を抑制する工程を含み、複数のポリペプチドの各々が異なったＭＯＧエピトープに特異的に結合する方法。
【請求項１８】
ＭＯＧポリペプチドへの自己抗体の結合に関連した脱髄を抑制する方法であって、病原性ＭＯＧポリペプチド−ポリクローナル自己抗体の結合を被っているマモセット又はヒトの宿主に、機能性Ｆｃ部分を持たず、ＭＯＧポリペプチドに特異的に結合するのに十分でＭＯＧポリペプチドへの自己抗体の結合を競合的に阻害する、請求項４に記載の複数のポリペプチドを含んでなる組成物の有効量を投与して、脱髄を抑制する工程を含み、複数のポリペプチドの各々が異なったＭＯＧエピトープに特異的に結合する方法。
【請求項１９】
組成物がＭＯＧ寛容原性Ｔ細胞エピトープを更に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
組成物がＭＯＧ寛容原性Ｔ細胞エピトープを更に含む、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この発明は国立保険研究所により与えられる助成金番号ＡＩ４３０７３での政府の支援下でなされた。政府はこの発明に一定の権利を有している。
【０００２】
（発明の分野）
この発明の分野は、ポリペプチド自己抗体抑制剤及びその使用方法である。
【０００３】
（背景）
多発性硬化症（ＭＳ）は３５０，０００人のアメリカ人を蝕み、外傷の次に、若い成人の能力障害の主な原因となっている中枢神経系の慢性再発性緩解性障害疾患である。ＭＳはマクロファージと単核細胞からなる小静脈周囲の白質浸潤（炎症）と、神経線維を遮蔽する髄鞘の破壊（脱髄）により病理学的に特徴づけられる免疫媒介疾患である。
【０００４】
齧歯類の実験用アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、ヒトのＭＳに対する治療法を試験するために最も広く用いられているモデルである。ＭＳに関するかかる伝統的な疾患モデルは一般にＭＳがＴ細胞媒介疾患であるという概念を助長した。しかしながら、免疫攻撃の標的となる自己抗原は同定されておらず、ミエリン損傷に関与している分子メカニズムは分からないままである。ＥＡＥにおけるＣＮＳの炎症はクラスＩＩ−ＭＨＣ分子との関連においてミエリン抗原を認識する自己攻撃的Ｔ細胞により惹起されることが明らかであるが、多くのモデルはＭＳ病巣の早期の脱髄成因を欠いている。Ｂ細胞活性化と抗体応答がＥＡＥの完全な発達に必要であると思われ、ＣＮＳ組織のミエリン化培養物を用いる免疫媒介脱髄に関する初期の研究はエフェクター機構として体液性因子を関連づけた。従って、臨床経過、症理、及びミエリンタンパク質に対する免疫応答に関する基本的な違いによって齧歯類ＥＡＥとヒトＭＳは区別されるので、齧歯類ＥＡＥがヒトにおける効能の強力な指標ではなかったことは驚くべきことではない。
【０００５】
最近、非近交系非ヒト霊長類である、普通のマモセットＣａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓの新規なＭＳ様疾患が明らかにされた。マモセットＥＡＥは、ミエリン特異的自己抗体の存在を必要とする卓越したＭＳ様早期脱髄成因を有しており、これらの抗体とミエリン上のその標的抗原の間の相互作用を理解する機会を提供した。そのモデルの特徴には次のものが含まれる：ａ．穏やかな臨床徴候とＭＳに類似した再発性緩解性過程；ｂ．ＭＳ病巣と区別できない早期のグリオーシスを示す原発性脱髄症状（脱髄プラーク）；ｃ．脳炎誘発性（例えば疾患誘発性）Ｔ細胞クローン及び株の成功裏の養子移入を許容する自然の骨髄キメラ化；ｄ．主要ミエリンタンパク質ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）に対して反応性のＴ細胞の脳炎誘発性レパートリーの多様性；ｅ．異なったミエリン成分による免疫化で生じる異なった疾患表現型：全ミエリンと対比して、ＭＢＰによる免疫化はＥＡＥの非脱髄形態をつくりだす；ｆ．脱髄が抗体媒介であるがまた脳炎誘発性Ｔ細胞応答を必要とし、神経系への自己抗体の接近を容易にするという証明；及びｇ．プラーク形成におけるミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）の重要な役割：非脱髄ＭＢＰ−ＥＡＥにおける抗ＭＯＧ抗体の養子移入は完全に発達したＭＳ様症状を再現する。
【０００６】
ＭＯＧの高度に免疫原生の性質（全ミエリンタンパク質の０．０５％未満）は髄鞘の最外ラメラ上のその細胞外位置に関連しており、そこでは、脳炎誘発性Ｔ細胞による血液脳関門の破壊の意味で病原性抗体に到達できる。マモセットモデルは、ヒトに対して９０−９５％相同性である免疫及び神経系遺伝子を持つ種においてＭＳ様病巣を生じる細胞性及び体液性免疫応答の正確な同定を可能にする。ヒトＭＳとのこのモデルの関連性は、ＭＳ患者におけるＭＯＧに対する強いＴ細胞及び抗体応答であることが最近の発見により更にはっきりとした。
【０００７】
ＭＯＧに対する自己抗体は、多発性硬化症（ＭＳ）の患者及びＭＯＧ誘発性実験用アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）のマモセット霊長類の脳の脱髄病巣中に存在していることが示された。更に、抗ＭＯＧ抗体が、マモセットＥＡＥにおける脱髄病巣の発達のために必須であることが実証されている。また、脱髄病巣の超微細構造の特徴はマモセットとヒトの間で視覚的に区別できないことが示された。ＭＯＧで免疫したマモセットからのポリクローナル抗ＭＯＧ抗体のペプシン消化によって得られたＭＯＧ特異的Ｆ［ａｂ’］２断片はマモセット動物における脱髄の発達を妨げることができることが過去に示されている。同時係属中の米国特許出願第０９／３８４，０３６号と関連の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／１９５４６号を参照のこと。しかしながら、マモセットＥＡＥ中の病原抗体についても、そのアンタゴニストとして作用可能なＦ［ａｂ’］２断片についても、その分子多様性についての情報は今日まで得られていない。
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、脱髄疾患において自己抗体の結合を阻害する方法と組成物を提供する。組成物は、高親和性のＭＯＧ結合に関して選択された組合せファージディスプレイライブラリーから取り出された免疫グロブリンＣＤＲ３配列を含む。ＭＯＧ特異的ＣＤＲ３配列は、配列番号：１−６からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３配列と配列番号：７−１２からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３配列を含む。特定の実施態様では、重鎖ＣＤＲ３配列は配列番号：１であり；重鎖はＶＨ１可変領域サブファミリードメイン又はＶＨ３可変領域サブファミリードメイン内にあり；軽鎖ＣＤＲ３配列は配列番号：７であり；軽鎖はＶκＩＩＩ可変領域サブファミリードメイン又はＶκＩ可変領域サブファミリードメイン内にある。特定の実施態様では、ポリペプチドは、配列番号：１−６からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３配列と配列番号：７−１２からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３配列の双方を含む。ＣＤＲ３配列は、要求されるＭＯＧ結合が維持される限り、多種多様なポリペプチド中に導入することができる。好適な実施態様では、ポリペプチドはＦ（ａｂ）である。
【０００９】
本発明は、請求項１に記載のポリペプチドと医薬的に許容可能な担体を含有する医薬組成物と、ＭＯＧ−抗体の結合を阻害する方法における主題組成物の使用を提供する。一般に、これらの方法はＭＯＧと抗体の混合物を主題のポリペプチドに接触させ、それによって、ＭＯＧ−抗体の結合が阻害される工程を含む。特定の応用では、本方法は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）ポリペプチドへの自己抗体の結合に関連した脱髄を抑制する方法であって、病原性ＭＯＧポリペプチド−ポリクローナル自己抗体の結合を被っているマモセット又はヒトの宿主に、機能性Ｆｃ部分を持たず、ＭＯＧポリペプチドに特異的に結合するのに十分でＭＯＧポリペプチドへの自己抗体の結合を競合的に阻害する主題のポリペプチドを含んでなる組成物の有効量を投与する工程を含む方法であり、それによって脱髄が抑制される。更に特定の実施態様では、投与される組成物はＭＯＧ寛容原性Ｔ細胞エピトープを更に含む。本方法はまた複数の主題のポリペプチドを含む組成物を用いて実施することもでき、その複数のポリペプチドの各々が異なったＭＯＧエピトープに特異的に結合する。
【００１０】
（発明の詳細な記載）
次の説明と実施例は例証のために提供されるもので、発明を限定するものではない。
抗体断片、特にＦ（ａｂ）を製造する方法は当該分野で知られている。（例えば、ここに出典明示により取り込まれるＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）を参照のこと）。主題のポリペプチドは、他のタンパク質と複合体を形成しない状態、種々多様な非共有結合及び結合複合体と複合体を形成した状態、他のペプチド配列と共有的に複合体を形成した状態（ホモ又はヘテロ−キメラタンパク質）等々で提供されうる。
【００１１】
主題の組成物の生化学的合成、分子発現及び精製のために分子及び生化学的方法が利用でき、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｓａｍｂｒｏｏｋ等， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｅｄｓ． Ａｕｓｕｂｅｌ等， Ｇｒｅｅｎｅ ｐｕｂｌ． Ａｓｓｏｃ．， Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ＮＹ）又は当該分野で知られている他のものを参照されたい。細菌細胞（例えば大腸菌）、酵母菌（例えばＳ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、動物細胞（例えばＣＨＯ、３Ｔ３、ＢＨＫ、バキュロウイルス適合性昆虫細胞等々）における異種組換えタンパク質の発現のための材料と方法はよく知られている。開示されたポリペプチドのアミノ酸配列は、選択された発現系に対して最適化された核酸をコードするポリペプチドを逆翻訳するために使用される（Ｈｏｌｌｅｒ等 （１９９３） Ｇｅｎｅ １３６， ３２３−３２８； Ｍａｒｔｉｎ等 （１９９５） Ｇｅｎｅ １５４， １５０−１６６）。
【００１２】
この発明の医薬組成物の調製においては、当業者には明らかなように、様々なビヒクルと賦形剤及び投与経路を使用することができる。代表的な製剤技術は、とりわけＲｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， １９版， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９９５；　例えばＧｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ９版， １９９６， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌに教示されている。
【００１３】
病原ＩｇＧと競合し補体媒介及び抗体依存性細胞毒性を抑制することができるＭＯＧに対して高親和性を持つＦ（ａｂ）断片を産生するために、コンビナトリアル組換えライブラリーが作製された。これらのＦ（ａｂ）断片を、マモセットの疾患を予防し治療する能力について、単独で、またＴ細胞寛容原性ペプチドと組み合わせて試験した。
【００１４】
ＭＯＧに対して反応性のＩｇＧモノクローナル抗体免疫グロブリン血症を伴う進行性脊髄疾患であると最近特定された患者は、自然の実験での抗ＭＯＧ抗体反応の病態生理学的な結果のユニークな例を提供した。ヒトモノクローナル抗体を非脱髄ＥＡＥのマモセット内に養子移入した。養子移入に続いて、マモセットは脱髄を進行させた。この種におけるヒトＩｇＧの移入は耐容性が良好で、Ｆ（ａｂ）断片の阻止能力が養子移入系において実証されている。抗体断片は抗原エピトープを認識するその能力を保持するが、補体を活性化させるか又はマクロファージに結合する能力を欠き、それらは、内因性自己抗体が病的レベルで結合できないように自己抗原を被覆する。
【００１５】
（ＭＯＧ結合ポリペプチドを含む組換えＣＤＲ３）
コンビナトリアルライブラリーの構築は、ｇＩＩＩタンパク質に結合した、ファージ粒子の表面でのＦ［ａｂ］断片の発現に適したベクターで全てのＶＨ及びＶκ配列を無作為に組換えることによって達成される。パニングによってＭＯＧ特異的Ｆ［ａｂ］クローンを選択した後に、我々は可溶型ＭＯＧ特異的Ｆ［ａｂ］断片を発現することができるように、ｇＩＩＩタンパク質遺伝子を除去した。このアプローチ法によって、個々のＦ［ａｂ］断片のＤＮＡ塩基配列決定と免疫学的特徴づけが可能になった。
【００１６】
ＤＮＡ配列の解析により、ＶＨ１サブファミリーの支配的な利用が明らかになった。全部で６０の別個のＦ［ａｂ］断片を解析したところ、５７がＶＨ１サブファミリーのものであり、３がＶＨ３サブファミリーのものであった。この結果は、ＭＯＧ抗原に対する抗体反応における重鎖可変領域遺伝子の利用が高度に制限されていることを実証している。
【００１７】
2004511570.tif 000002
【００１８】
表１はＶＨ及びＶκサブファミリーの利用の頻度を示している。ＶＨ及びＶκサブファミリーの３つの組合せだけが見出された。ＶＨ及びＶκサブファミリーの分布は、ＶＨ１及びＶκＩＩＩの組合せに明らかに支配されている。ＶκＩ及びＩＩＩとのＶＨ３の他の頻度の少ない組合せもまた見出された。このデータは、重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の殆どの組合せはＭＯＧに対する抗体レパートリーを作製するのに必要ではないことを実証している。
【００１９】
2004511570.tif 000003
【００２０】
６０の分析したクローンのなかで、我々は６つの異なったＨ鎖ＣＤＲ３モチーフと５つの異なったκＬ鎖ＣＤＲ３モチーフを同定した（表２に太字で示す−示した対応する完全抗原結合領域は、それぞれ配列番号：１−１２として提供されている）。重鎖ＣＤＲ３は長さと配列の双方について多大な可変性を示す一方、Ｌ鎖ＣＤＲ３は同じ程度には変異していないようであった。全クローン中７３％が最初に掲げた２つのＣＤＲ３モチーフを含んでいた。このデータは、その可変領域サブファミリーの利用に制限されているＭＯＧに対する抗体応答がその抗原結合特性においては多様であることを示している。
【００２１】
ＭＯＧ免疫化動物からのポリクローナル血清Ａｂｓに対して過去に示されたものとは対照的に、モノクローナルＦ［ａｂ］ｓはＭＯＧの線形ペプチドを認識しなかった；有意な結合は、ＭＯＧの細胞外ドメインの全体が存在している場合にだけ見出された。脳組織の免疫組織化学的染色を使用して、我々は、ＭＯＧ特異的Ｆ［ａｂ］断片がまた髄鞘上の天然タンパク質に結合することを示すことができた。我々は、コンビナトリアルライブラリーから選択されたビオチン標識Ｆ［ａｂ］断片によるオリゴデンドロサイトとミエリンの特異的染色を見出したが、そのような染色は負の対照には観察されなかった。
【００２２】
我々は、組換えＦ［ａｂ］断片が、ＭＯＧで免疫化されたマモセット由来のアフィニティー精製された抗ＭＯＧＡｂｓに対して競合することができることも見出した。マモセット抗ＭＯＧ抗ＭＯＧＡｂｓと様々なＦ［ａｂ］断片の間の変位曲線は、ｒＭＯＧに結合したビオチン標識抗ＭＯＧ抗体の量がＦ［ａｂ］断片の濃度の増加によってずれることを明らかにした。これに対して、個々のＦ［ａｂ］断片は、互いに競合することができず、異なったコンフォメーションのエピトープを示している。このコンビナトリアル解析は、ＭＯＧ抗原に対する抗体応答がそのＶＨ及びＶκサブファミリーの使用に制限されているが、その抗原結合部位では多様であることを示している。要するに、組換えＦ［ａｂ］断片は、ＭＯＧ分子の異なったコンフォメーションのエピトープを認識し；無傷のミエリン上の天然ＭＯＧに結合し；天然抗ＭＯＧＡｂｓに対して効率的に競合する。
【００２３】
（マモセットＥＡＥの誘発）　Ｇｅｎａｉｎ等（１９９９） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５， １７０−１７５に記載されたようにしてマモセットにおいてＥＡＥを誘発させた。６匹のマモセットを、１００μｌのリン酸緩衝食塩水に溶解し、３ｍｇ／ｍｌの殺した結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ｈ３７Ｒａ；ＤＩＦＣＯ、デトロイト、ミシガン）を含む等容量のフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）で乳化した５０〜１００μｇの組み換えラットＭＯＧで活発に感作した。ＭＯＧ／ＣＦＡエマルションは０．２ｍｌの全容量にて肩胛及び臀部領域の４箇所の注射部位に皮内的に与えた。ＭＯＧ／ＣＦＡで免疫化した日に、２．５ｍｌの等張食塩水に入れた１ｘ１０１０の不活性化百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）を静脈内投与し、その投与を２日後に繰り返した。比較のために、４匹のマモセットを２００ｍｇの全白質（ＷＭ）／ＣＦＡで感作し、百日咳菌を免疫化後１８〜３９日の間で調べた。ＭＯＧ感作化マモセットは免疫化後９３日まで維持した。ＷＭかＭＯＧの何れかで感作した動物は免疫化後から２１日以内にＥＡＥの徴候を示した。動物を免疫化後１８〜９３日で深い麻酔下で心臓内灌流により屠殺した。
【００２４】
（ヒトからのＭＳ組織）　ヒトＣＮＳ組織を組織診又は死体解剖により３人のＭＳ患者から得た（診断後８週、１１年及び１７年）。患者１は１８歳の白人女性で、３ヶ月の病歴の急性右半身不随、知覚喪失、及び痙縮を持っていた。コンピュータ断層撮影走査により、左頭頂後頭領域に低密度ＷＭが明らかになった。脳の組織診を神経病理学的評価のために実施した。得られた診断は、急性ＭＳに一貫した劇症性炎症性脱髄病状に典型的な、活発に脱髄する炎症性の浮腫状病巣であった。
【００２５】
患者２は３１歳の白人女性で、肢の弱さと知覚麻痺、歩行運動障害、尿失禁、振戦、眼振、及びかすみ目により特徴づけられる慢性進行性ＭＳの８年の病歴を持つ。末期には、患者は車椅子に拘束され、発作と吸引肺炎を起こし、死亡した。死体解剖を死亡から１．５時間以内に実施した。神経病理学的検査の結果、圧倒的な小さく（３−５ｍｍ）散在性で最近の強い炎症性で浮腫状の脱随病巣並びにより大きな線維アストログリオーシスとよく区別できる端を持つよりはっきりしたプラークが明らかになった。
【００２６】
患者３は３４歳の白人女性で、２０歳のときの最初の診断後１０年の間再発し緩解するＭＳの病歴を持っていた。疾患は彼女の人生の最後の７年の間に慢性的な進行性過程に入った。死亡時には、患者は、両側の視神経萎縮、核間眼筋麻痺、痙性不全対麻痺、及び中程度の肢運動失調を呈した。死因は呼吸不全であった。死体解剖を死亡４時間後に行った。この事例の神経病理学的検査の結果、最近の起源の強い炎症性、浮腫状の活発な脱随病巣、並びに活性な慢性的脱随病巣が明らかになった。
【００２７】
（分析のための組織の調製）　試料採取時にペントバルビタール麻酔下で２００ｍｌのリン酸緩衝食塩水と続いて１５０から２００ｍｌの冷ＰＯ４で緩衝した２．５％グルタルアルデヒドによる心臓内灌流で動物を堵殺した。２匹のＭＯＧ感作マモセットを死亡の急性期（免疫化後１４−１６日）の間に採取し、３匹を再発か緩解の何れかの間に（免疫化の２３、２５及び２７日後）急性期の後にとり、１匹を免疫後９３日で２回の再発後に検査した。４匹の全ＷＭ感作動物を急性の発症後で再発の前に免疫後１８、３０、３０及び３９日に検査した。グルタルアルデヒド灌流動物から、ＣＮＳを取り除き、ヘマトキシリン及びエオシン、Ｌｕｓｏｌ Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅ （ミエリンに対して）及びボデイアン銀法（軸索に対して）で染色したホルマリン後固定パラフィン包埋材料について常套的な神経病理検査を実施した。
【００２８】
マモセット組織の微細構造分析のために、１−ｍｍのスライスを、Ｃ７、Ｔ３、Ｌ２、Ｌ５、Ｌ６、及びＬ７の視神経、大脳半球、小脳、脳幹、髄質、及び脊髄から取り出した。また、試料を脊髄神経根及び座骨神経から取り出した。グルタルアルデヒド固定脳組織のスライスを平たい矩形（〜４ｘ６ｍｍ）として切り取り、脊髄を全スライスとして残した。実施例２に記載のＭＳの３つの場合から、３〜５ｍｍ厚の、組織診組織の小片又は死体解剖したＣＮＳ材料のスライスを４℃で４ないし２４時間、浸漬固定し、ついで薄い１−ｍｍのスライスから直径３〜５ｍｍに切断した。次に、グルタルアルデヒド固定組織を、ＰＯ４で緩衝した１％ＯｓＯ４中で氷上で１時間、後固定した。試料を脱水しプロピレンオキシドで清澄にし、エポキシ樹脂に平らに包埋した。エポキシ包埋組織の薄（１μｍ）切片を光学顕微鏡検査（ＬＭ）のために調製し、免疫細胞化学のためにトルイジンブルーで染色するか反応させた。電子顕微鏡検査（ＥＭ）のために、切片を銅グリッド上に配し、鉛とウラン塩（クエン酸鉛及び酢酸ウラニル）で対比させ、炭素コートし、Ｓｉｅｍｅｎｓ １０１又はＨｉｔａｃｈｉ Ｈ ６００−Ｓでスキャンした。
【００２９】
（脱随の超微細パターンはマモセットＥＡＥと急性ＭＳプラークにおいて同一である。）
全てが急性病巣を示しているＭＯＧ誘発ＥＡＥを持つ６匹のマモセットとＭＳの３人のヒトの患者からのＣＮＳ組織を電子顕微鏡検査（ＥＭ）によって試験した。マモセットＥＡＥにおいては、直径が数ｍｍまでの大きな脱随プラークがＣＮＳ全体に散在し、小静脈上に常に集中し、多くの有髄化神経線維がそれに沿って空胞化髄鞘を示す突出縁と血管周囲の炎症により特徴づけられる。ミエリン空胞化のこの典型的なパターンは、層間剥離と膨潤のために個々の髄鞘の拡大から生じ、軸索は数層の無傷のミエリンにより囲まれた一側にずれている。アジュバントに入れた５０μｇの組み換えラットＭＯＧによる免疫化で誘発し、臨床徴候の発症の３日後に堵殺した急性ＥＡＥの動物からの視神経を示す顕微鏡は、脱髄病巣の周囲に大きな髄内空胞が存在し、軸索は他のどこかに通常現れる髄鞘により囲まれていることを証明した。
【００３０】
病巣の中心と縁の間にはミエリン片が載ったマクロファージを含む広い脱髄領域があった。最も印象的な発見は、広がったネットワークとして再配置された破壊ミエリンが凝集物により囲まれた多数の軸索の脱髄領域内に存在することであった。これらの軸索は、膜ネットワークが軸索から徐々に分離し隣接するマクロファージにより取り上げられるので、側方にずれていた。
【００３１】
急性ＭＳにおける線維の脱髄は構造的にはマモセットＥＡＥにみられるものと同一であり、脱髄軸索はミエリンの膜ネットワーク内にある。浮腫状実質組織の他の場所では、ミエリン片の遊離して浮遊する凝集物が一般的であった。神経性徴候の８週の病歴を持つ１８歳の女性患者からの皮質下白質から取り出した組織の電子顕微鏡検査、ＭＲＩスキャンでの白質低密度及び急性ＭＳの診断は上述のものと類似した小胞ネットワークに軸索の周りのミエリンが変換したことを示していた。線維性アストログリア突起、裸軸索及び反応性アメーバ様ミクログリア細胞（下記）をまた同定した。マモセットＥＡＥとヒトＭＳの双方におけるミエリンネットワークの高解像度分析により、正常な組織における無傷のミエリンと比較したとき周期現象が低減した（５−６ｎｍ）２から３層の緩く詰まった膜により囲まれた小胞が明らかになった。
【００３２】
（ＭＯＧ特異的自己抗体はマモセットＥＡＥ病巣におけるミエリン空胞化と関連している。）
ＭＯＧは定量的には少ないタンパク質であり（全ミエリンタンパク質の０．０５％未満）、髄鞘の最外層に豊富に発現される免疫グロブリン（Ｉｇ）様細胞外ドメインを持ち、それが抗体攻撃へ近づけるようにする。ＭＯＧに対する自己抗体は幾つかのＥＡＥモデルにおける脱髄を亢進することが示されているが、これらの抗体とミエリン膜の間の詳細な相互作用は研究されていない。脱髄病巣内の自己抗体結合部位を特定するために、我々は、凍結したエポキシ包埋マモセットＣＮＳ組織について金標識抗ヒトＩｇＧ抗体（マモセットＩｇＧと交差反応性）と続いての銀増強により免疫細胞化学検査を実施した。
【００３３】
インサイツでのマモセット及びヒトＭＳ組織における抗原特異的事故抗原の実証に対しては、ミエリン関連及び対照ペプチドの選択物を免疫金に直接カップリングさせ、組織切片に塗布した。免疫金標識を凍結又は固定組織の超薄切片に対して実施した。（１）マモセットにおいて既知の脳炎誘発活性を持つ３種のＭＯＧペプチド（ヒトＭＯＧのアミノ酸［ａａ］１−２０、ａａ２１−４０、及びａａ４１−６０）；（２）マモセットにおいて脳炎誘発性ではないことが示されている１種のＭＯＧペプチド（ａａ１０１−１２０）；（３）マモセットにおいて脳炎誘発性でＤＲ２ハプロタイプを持つヒトにおいて免疫優性である１種のヒトミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）ペプチド（ａａ８２−１０１）；及び対照として（４）マウス血清アルブミンのペプチド（ＭＳＡ；ａａ５６０−５７４）から金コンジュゲートを調製した。ヒトＭＯＧサブシーケンスを持つペプチドを標準的なＦｍｏｃ科学により合成し、ＨＰＬＣ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．， ハンツビル，アラバマ）により精製した（＞９５％）：ＭＯＧ１−２０、ＭＯＧ２１−４０、ＭＯＧ６１−８０、ＭＢＰ８２−１０１、及びＭＳＡ５６０−５７４。製造者の指示に従って（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ， ストーニーブルック， ニューヨーク）、モノスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−Ｎａｎｏｇｏｌｄ標識試薬（粒子径、１．４ｎｍ）を使用して金コンジュゲートを合成し、続いて十分な透析により未反応ペプチドを除去した。マモセット脊髄組織と活性なＭＳ病巣の１μｍのエポキシ切片について免疫反応性を検出した。このために、切片をナトリウムエトキシドでエッチングし、０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＯ４緩衝食塩水で平衡にし、１０％の正常なウサギ血清で阻止した。切片を室温で２時間の間、ペプチド−免疫金コンジュゲート（バッファー中１：１００）と共にインキュベートした。洗浄後、銀増強（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ）を使用して検出を行った。切片をトルイジンブルーで対比染色した。ＩｇＧの検出のために、切片を１：１００の金標識抗サル又は抗ヒトＩｇＧ（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ）と反応させた。
【００３４】
対照として、切片を、未標識脳炎誘発性ＭＯＧペプチド又はＭＢＰで前処理して反応を阻止するか、金コンジュゲートの適用前に未標識非脳炎誘発性ＭＯＧペプチド（ａａ１０１−１２０）と反応させるか、又は金標識された無関係な抗原（ヒストン又はＭＳＡ）あるいは無関係なＩｇＧ（抗ヤギ）で処理した。脳炎誘発性ＭＯＧペプチドの金コンジュゲートでの標識の特異性もまたウェスタンブロットで評価し、そこではＭＯＧタンパク質を免疫マモセット血清と最初に反応させた。免疫反応性の特異性を決定するために使用した試験及び対照試薬の完全な詳細はＧｅｎａｉｎ等， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ５：１７０−１７５ （１９９９）に見いだすことができる。
【００３５】
動物の脊髄の腰部からの切片を得た。軸索（矢印）の周りの小胞化ミエリンの陽性の反応性（褐色に着色）はＩｇＧの存在を示していた。非脱髄軸索は染色しなかった。ＩｇＧの陽性の反応性は軸索を囲んでいる破壊されたミエリンの小胞化ネットワークにわたって特に見いだされた。
我々は次にミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）とＭＯＧの分泌ペプチドの免疫金標識コンジュゲートの利用により、これらの免疫グロブリンが結合した標的抗原を特定した。これらのミエリン抗原はその一次ＮＨ２残基上の金粒子で直接に標識され、抗原特異的自己抗体をインサイツで検出するために使用された。この技術では、３種の金コンジュゲートＭＯＧペプチドが金コンジュゲート抗ＩｇＧに対して観察されたものと同様のパターンで崩壊する髄鞘のネットワークにわたって共存していた。
【００３６】
これらのペプチドはＭＯＧ免疫化マモセットの血清において生じる脱髄抗体により認識されるＭＯＧのアミノ酸配列を含んでいた（ａａ１−２０、ａａ２１−４０及びａａ６１−８０）。使用した金コンジュゲートＭＯＧペプチド（ａａ２１−４０）は種にわたって保存された配列を有している。ＭＯＧ反応性液滴がまた周囲のマクロファージに見られ、抗ＭＯＧ抗体が結合している内在化ミエリン片の存在を示している。標識抗原との陽性の反応性は、軸索のまわりの小胞ミエリン上及び細胞外空間及びマクロファージ内のミエリン片にインサイツでＭＯＧ特異的抗体が存在していることを示している。（多くの線維のまわりの）正常なミエリンは染色されなかった。
【００３７】
これに対して、ヒトＭＢＰの免疫優性エピトープを含むペプチド（ａａ８２−１０１、霊長類の種にわたって保存）とマウス血清アルブミンの対照ペプチド（ＭＳＡ、ａａ５６０−５７４）の金標識コンジュゲートは、ミエリン膜又はマクロファージを標識できなかった。よって、小胞化ミエリンネットワークはＭＢＰの金コンジュゲートペプチドでもＭＳＡの金コンジュゲートペプチドでも染色されていない（矢印）。
これらの観察は、ＥＡＥのこの非ヒト霊長類モデルにおいて、ＭＯＧに対して特異的な抗体が崩壊しているミエリン膜と直接接触し、小胞化膜ネットワークの形成がこれらの自己抗体による溶菌攻撃から生じることを示している。
【００３８】
（ＭＯＧ特異的自己抗体は急性ヒトＭＳの病巣のミエリン小胞化に関連している。）
我々は次にＭＳ患者から組織診又は死体解剖により得られたＣＮＳ組織内のＭＯＧ及びＭＢＰ特異的自己抗体の存在を同様の免疫金標識で調べた。マモセットＥＡＥにおけるように、金コンジュゲート抗ＩｇＧは、実質組織中に分散したミエリン片の液滴と共に、単一の脱髄軸索の周りの膜ミエリンネットワークを標識した。ＩｇＧは長手方向断面で切断された軸索（矢印）；肥大星状細胞の細胞質（ａｓ）；オリゴデンドロサイト（ｏｌ）の接線方向切片の崩壊した髄鞘に沿って局在化している。濃く染色されたＩｇＧコートミエリン片は実質組織と３つのマクロファージ（おそらくはアメーバ様ミクログリア）において可視できる。また、時折の形質細胞は抗ＩｇＧによる陽性の染色を示した。免疫金標識ミエリン抗原コンジュゲートによって、小胞化ミエリンネットワークは金コンジュゲートＭＯＧペプチドによって強く、また金コンジュゲートＭＢＰによってより少ない度合いで染色されたが、ＭＳＡではされなかった。
【００３９】
ＭＯＧとＭＢＰの金コンジュゲートで標識したＩｇＧ−ミエリン複合体がまたマクロファージに存在したが、星状細胞又はオリゴデンドロサイトには存在しなかった。ＭＯＧ又はＭＢＰ標識形質細胞は遭遇しなかった。金コンジュゲートとの反応性は正常な現れるＭＳ白質内にも血管周囲の炎症性カフの回りにも観察されなかった。全ミエリンに対して免疫化されたマモセットでは、抗ＭＯＧ及び抗ＭＢＰのＩｇ沈着の双方の類似パターンが観察された。白質損傷とマクロファージ活動を伴う他の神経性障害である筋萎縮性側索硬化症からのＣＮＳ組織はミエリン抗原特異的免疫金反応性を示さなかった。これらの発見はヒトＭＳの活発な脱髄病巣におけるＭＯＧ特異的抗体を直接特定し、ＭＯＧ誘発ＥＡＥのような、これらの自己抗体が破壊された髄鞘中での小胞体の形成の原因となる役割を果たしていることを示している。抗ＭＢＰ特異性を持つ可溶性のＢ細胞表面ＩｇはＭＳ脳組織において記述されており、現在の研究では、ＭＢＰ特異的ＩｇはＭＳ病巣の小胞化ミエリンネットワーク内に局在化していた。抗ＭＢＰ抗体は実験的には脱髄症状を開始することは示されていないが、これらの自己抗体は、マクロファージによるレセプター媒介ファゴサイトーシス及び／又は特異的Ｔ細胞へのミエリン自己抗原の提示のような別の病理的機構を媒介しうる。
【００４０】
自己抗体が、ミエリン膜の完全な崩壊の段階を特徴づける小胞、及び細胞外間隙か食細胞に存在するミエリン片に専ら結合しているようであることは注目すべきである。興味深いことに、同様ではあるがより狭いミエリンの小胞化が齧歯類ＥＡＥの初期の研究で報告されており、そこでは一過性の初期の現象として認識された。しかしながら、病巣形成が遅延し、ずっと拡大しているマモセットにおいては、破壊したミエリンが相次いで見出された。正常にミエリン化した線維の中の病巣縁でのミエリンの大規模な空胞形成は、有意な局所的細胞浸潤又はＩｇＧ沈着の不在下で生じ、活発なＭＳ病巣の縁でも報告されている。ミエリン構造のこの変化は脱髄プラークの中心から、又は病巣の縁の活性化されたグリア細胞から拡散する可溶性因子により媒介されている可能性がある。これらの大きな空胞に類似した形態学的な変化はＴＮＦαに暴露されたミエリン化ＣＮＳ培養物において、またより少ない度合いでは、ＥＡＥの動物及びＭＳの患者からの血清に暴露された培養物において報告されている。
【００４１】
ＥＡＥモデルにおける病原性Ｔ細胞応答を標的とする多くの治療的アプローチ法はヒトＭＳに対して成功裡の治療にまだ移されておらず、おそらく、免疫システムの他の成因を考慮に入れる必要があることを示唆している。Ｂ細胞応答はマモセットＥＡＥにおける臨床的疾患及び症状の重症度に対するキー因子であると思われる。現在の結果は、ＭＳ中でのミエリンの広範な破壊における自己抗体の役割を強調し、Ｔ細胞応答によって惹起される疾患において標的器官の重要な抗原に対する抗体が不可逆的な組織損傷の発達に対して必須であることを明確化している。
【００４２】
（ＭＯＧ特異的組み換えＦ（ａｂ’）断片のインビボ投与）
ここで、我々は、ＭＯＧに対する組換え抗体断片を、実在の病原性抗体の結合を競合的に阻止する治療ツールとして使用することができることを示す。特定の実施例では、マモセットを最初にＭＢＰ（非脱髄性）を用いてＥＡＥに感作させ、ついでＭＯＧに対する脱髄抗体を静脈投与する。同時に、一の動物（対照）はプラシーボＦ（ａｂ）注射を受け、他方は組換えＦ（ａｂ）　断片を受ける。対照動物はＥＡＥの臨床的徴候の悪化を示すが、実験動物は示さない。動物を３−５日後に屠殺し、脳と脊髄の組織を得た。対照動物は脱髄病巣の証拠を有しており、実験動物は炎症（細胞浸潤）を持つが脱髄を持たない病巣（ミエリン破壊なし）を有している。この実験は、マモセットがＭＯＧ特異的組換えＦ（ａｂ）断片によって抗体媒介脱髄から保護され得ることを示している。
【００４３】
マモセットに、百日咳菌を含むＣＦＡ中に入れた１ｍｇのＭＢＰを投与したところ、０日で非脱髄ＥＡＥを誘発した。２１日で動物に０．１７ｍｍｏｌ／ｋｇの組換えＭＯＧ特異的Ｆ（ａｂ）又は抗インフルエンザＡ（対照）抗体を静脈内投与し、ついで、０．１７ｍｍｏｌ／ｋｇの８．１８．Ｃ５抗体を投与し、続いて２時間の間にＦ（ａｂ）の第２の静脈内投与を行った。動物は３５日で安楽死させた。組織試料を実施例３に記載されているようにして調製した。高解像度顕微鏡と抗原特異的抗体をインサイツで検出可能なミエリン抗原の免疫金標識ペプチドを使用して、我々は、髄鞘の崩壊の直接の原因であると思われる、ヒトＭＳとマモセットＥＡＥの双方の急性病巣における個々の脱髄軸索のまわりのミエリン／オリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）に特異的な自己抗体を同定した。対照Ｆ（ａｂ）断片、すなわちインフルエンザ抗原に対して作られたもので治療した動物は、頸部脊髄に大きな脱髄プラークが明らかになり、ＭＯＧ特異的Ｆ（ａｂ）断片で治療した動物は、ＭＯＧ特異的Ｆ（ａｂ）断片の投与によりインビボで競合的に阻止されうるので、マモセットにおける抗ＭＯＧ抗体の脱髄活性が無傷のＦｃ断片機能に依存していることを示した。
【００４４】
（ＭＳ様マモセットＥＡＥにおける脳炎誘発性エピトープ決定（ＭＯＧ））
組み換えラットＭＯＧ（ｒＭＯＧ：細胞外ドメインａａ１−１２５）で誘発した脱髄ＥＡＥを持つマモセットにおいて、ＭＯＧに対するＴ細胞反応性（ＰＢＭＣ中での増殖応答）とＢ細胞反応性（血清抗体）の細密な特異性を、ラット及びヒトＭＯＧの双方のアミノ酸配列に対応する（Ｃｈｉｒｏｎ Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ， サンディエゴ，カリフォルニア）オーバーラップ１５−ｍｅｒＰＩＮ−ペプチド（１と３のオフセット）を使用して連続的に研究した。結果：研究した全ての動物（ｎ＝６）は、種にわたって完全に保存された配列であるａａ２７−３６に限定された卓越し持続性のＴ細胞応答を有していた。１匹のマモセットはａａ６２−７２内に位置した第２のＴ細胞エピトープに応答した。血清抗体応答（ｎ＝１０）は、２つの主要なエピトープ、ａａ１３−２１及びａａ６２−７４（それぞれ動物の１００％と６０％）を含むＭＯＧの４つの異なった領域にマッピングされ、更なるエピトープが幾らかの動物で同定された（ａａ２８−３６及び４０−４５）。エピトープ延展は９３日までモニターされた再発性ＥＡＥの動物においてＴ細胞に対しても抗体に対しても観察されなかった。結論：ＭＳ様マモセットＥＡＥにおけるＭＯＧに対する脳炎誘発性応答は限られた数のＢ細胞及びＴ細胞エピトープに制限されているように思われる。これらの知見はヒトＭＳにおける特異的免疫療法の可能性を実証している。
【００４５】
（表面結合抗体でのＢ細胞の検出）
Ｂ細胞を、ＭＯＧ誘発ＥＡＥのＣ．ｊａｃｃｈｕｓマモセットから得た新しく単離した末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）から、ＭＳのヒトから、そして健全なコントロールから抗ＣＤ１９被覆ビーズを使用して確かに選択された。任意の他の適当なＢ細胞マーカーに対する抗体を使用してもよい。２ｘ１０５のＢ細胞（純度＞９８％）を含むスライドを１％のグルタルアルデヒドで固定し洗浄した。ついで単離したＢ細胞を、ヒトＭＯＧ（１−１２０）のＮＨ２末端の配列に対応する１１の２０−ｍｅｒオーバーラップペプチドの混合物の標識した免疫金コンジュゲートと共にインキュベートした；同一のＢ細胞調製物をヒストンの配列に対応する対照ポリペプチド又はＭＢＰペプチドで標識した。スライドを銀で増強し、標識Ｂ細胞を２人の異なった盲観察者によりカウントした。
【００４６】
ＭＯＧ特異的表面免疫グロブリンを発現するＢ細胞はＭＯＧ免疫化マモセットからのＰＢＭＣ中の金コンジュゲートＭＯＧペプチドで簡単に検出された（ｎ＝８）。血清抗ＭＯＧ抗原を生じることが知られているこれらの動物において、循環ＭＯＧ特異的Ｂ細胞は約１：５００から約１：２０００の頻度で生じ、健康で未免疫のマモセットにおいて０−１：１００００に増加した（ｎ＝８）。過剰に加えられた未標識ＭＯＧペプチドは標識化を完全に抑制し、金コンジュゲート対照タンパク質は如何なるＢ細胞も標識できなかった。ヒトでは、循環するＭＯＧ特異的Ｂ細胞は１７人のＭＳ患者の８人で（４７％）、また１８人の健康な対照の９人で（５０％）検出することができた。これらの自己反応性Ｂ細胞の頻度は約１：１１０００から約１：２０００００Ｂ細胞の範囲で、最も高い頻度は再発性−緩解性ＭＳの２人の患者で観察された（それぞれ１：１６０００と１：１１０００）。
この免疫金アッセイは末梢血液中のＭＯＧ特異的Ｂ細胞を感度よく検出する。このアッセイは約１：５００、好ましくは約１：２０００、より好ましくは約１：１００００，更により好ましくは約１：１５０００、そして最も好ましくは約１：２０００００の感度を有する。ヒトでは、自己反応性Ｂ細胞はおよそ５０％の個人で検出することができ、ＭＳ患者と対照に等しく存在している。
【００４７】
上記の実施例では、ＭＯＧ特異的抗体は、単一の脱髄軸索の周りの小胞体への緻密なミエリンの転換が生じ、ＣＮＳ実質組織中に浮遊し又は食細胞（マクロファージとミクログリア）により内在化したミエリン片に転換する領域に専ら局在化された。よって、ミエリンとオリゴデンドロサイトへの直接の溶菌攻撃に加えて、これらの抗体はマクロファージによるレセプター媒介ファーゴサイトーシス、又は抗体依存性細胞障害性の原因であり得、後者はミエリン損傷の可能なエフェクター機構として長く認識されてきた。マモセット系における抗体の受動移送を使用する我々の実験は、組換えＦ（ａｂ）断片のインビボ投与によりモノクローナル抗ＭＯＧ抗体８．１８．Ｃ５の病原の効果を競合的に阻止することができることを示し、ＭＯＧ特異的ＣＤＲ３配列自体ではなく無傷のＦｃ断片がミエリンに対する損傷を媒介することを示している。これらの知見に基づいて、ミエリンに対する毒性効果のない抗体結合の類似体又は競合的抑制剤がＥＡＥと関連する脱髄障害における治療のための合理的なアプローチ法を提供する。よって、本発明は、自己抗原エピトープ、自己抗原抗体断片又はその組み合わせを使用して脱髄自己免疫疾患の治療を達成する。
【００４８】
この明細書中に引用した全ての刊行物及び特許出願を、あたかも各個々の刊行物又は特許出願が出典明示によりここに取り込まれることが示されているかのように、出典明示によりここに取り込む。上記の発明は理解を容易にするための実施例と例証によりある程度の詳細さで説明したが、特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱しない限りそれに所定の変化と変更を加えても良いことは本発明の教唆から当業者にとって明らかであろう。従って、本発明の範囲は、均等物を含む、次の請求の範囲によってのみ限定されるものである。
【国際公開パンフレット】
2004511570.tif 000004
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004511570.tif 000033
【国際調査報告】
2004511570.tif 000034
2004511570.tif 000035