(57)【要約】ＤＮＡなどの荷電巨大分子を分画する方法および装置を提供する。ＤＮＡ溶液を、障害物のアレイを含むマトリックス中に添加する。異なる方向で、２つの異なる電場を有する交番電場をかける。交番電場は、一方の電場が、持続時間または強度において他方の電場よりも強い点で非対称であるか、あるいは他の点で非対称である。これにより、ＤＮＡ分子は、サイズにより分画され、マトリックスの反対側まで動かされ、そこで分画ＤＮＡが回収される。分画用電場を、ＤＮＡの添加および回収に使用でき、プロセスを連続して作動することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
荷電巨大分子を分画する方法であって、
分子を障害物を含むマトリックス中に添加し、
非対称に変化する電場をマトリックスにかけることを含む方法。
【請求項２】
非対称な電場をマトリックスにかける段階が、マトリックスのある場所において時間の関数として方向が交番する電場であり、多くのサイクルにわたるその時間平均ベクトルを有する電場をかけることを含み、これにより、時間平均電場ベクトルの一方の側を瞬時に指している場合のサイクルの一部にわたる同じ場所での電場ベクトルの時間積分と、前記時間平均電場ベクトルの反対側を瞬時に指している場合のサイクルの一部にわたる同じ場所での電場ベクトルの時間積分とは、同じ前記時間平均ベクトルに関して空間的に対称ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
非対称電場をマトリックスにかける段階が、
マトリックスに、時間依存的電場
【数１】
2004518663.tif 000004
（時間に対する奇数積分
【数２】
2004518663.tif 000005
は、あらゆるｎにおいて時間平均電場方向にはなく、ｎは任意の正の偶数である）
をかけることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
電場は、
第一波形および第二波形をもつ第一電気パルスおよび第二電気パルスを交番し；
時間に対する第一パルスまたは第二パルスの一方の振幅の積分を、他方のパルスの積分より高く維持し；
第一電気パルスの方向を、第一方向および第二方向内で変化させ、第二電気パルスの方向を、第三方向および第四方向内で変化させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第一波形および第二波形は、方形パルスである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
方形パルスの一方は、他方よりも振幅が高い、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
方形パルスの一方は、他方よりも持続期間が長い、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
電場は、
第一波形および第二波形をもつ第一電気パルスおよび第二電気パルスを交番し；
時間に対する第一パルスまたは第二パルスの振幅の積分を、他方のパルスの積分よりも高く維持し；
第一電気パルスおよび第二電気パルスを、第一の固定方向および第二の固定方向にかけることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
第一波形および第二波形が方形パルスである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
方形パルスの一方は、他方よりも振幅が高い、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
方形パルスの一方は、他方よりも持続時間が長い、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
荷電巨大分子がデオキシリボ核酸（別名ＤＮＡ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
処理が連続して作動する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
分子が障害物のアレイから抽出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
分子が電場を使用して添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
分子が電場を使用して、障害物のアレイから抽出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
分子が分画後に次のプロセス段階に送られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
荷電巨大分子を分画する方法であって、
分子を、障害物のアレイを含むマトリックス中に添加し；
マトリックスに、時間が経過しても振幅が一定である電場をかけ；
電場方向を時間経過と共に変化させ、非対称な電場を作成する
ことを含む、前記方法。
【請求項１９】
電場方向を時間の経過と共に変化させて非対称な電場を作成する段階が、
∫［θ（ｔ）］ｎ＋１ｄｔ（ここでの、θ（ｔ）は、時間平均電場方向に関して、電場方向であり、ｎは、０より大きな、任意の偶数である）があらゆるｎにおいて０にならないよう、電場方向を時間の経過と共に変化させることを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
電場が２つの固定された方向の間で交番する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
荷電巨大分子がデオキシリボ核酸（別名ＤＮＡ）である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
処理が連続して作動する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
分子が障害物のアレイから抽出される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
分子が電場を使用して添加される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
分子が電場を使用して、障害物のアレイから抽出される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
分子が分画後に次のプロセス段階に送られる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
障害物のアレイ、および非対称に交番する電場を含む、荷電巨大分子を分画する装置。
【請求項２８】
非対称に交番する電場が、
マトリックスのある場所において時間の関数として方向が交番し、多くのサイクルにわたるその時間平均ベクトルを有する電場を含み、これにより、前記時間平均電場ベクトルの一方の側を瞬時に指している場合のサイクルの一部にわたる同じ場所での電場ベクトルの時間積分と、前記時間平均電場ベクトルの他方の側を瞬時に指している場合のサイクルの一部にわたる同じ場所での電場ベクトルの時間積分とは、同じ前記時間平均ベクトルに関して空間的に対称ではない、請求項２７の装置。
【請求項２９】
非対称に交番する電場が、
時間依存的電場
【数３】
2004518663.tif 000006
（時間に対する奇数積分
【数４】
2004518663.tif 000007
が、あらゆるｎにおいて、時間平均電場方向ではなく、ｎは正の偶数である）
を含む、請求項２７の装置。
【請求項３０】
非対称に交番する電場が、
第一波形および第二波形をもつ第一電気パルスおよび第二電気パルス；
時間に対する、第一パルスまたは第二パルスの一方の振幅の積分であって、これは他方のパルスの積分より大きく；
第一方向と第二方向の間で変化する第一電気パルスの方向、および第三方向と第四方向の間で変化する第二電気パルスの方向
を含む、請求項２７の装置。
【請求項３１】
第一波形および第二波形は方形パルスである、請求項３０の装置。
【請求項３２】
方形パルスの一方が、他方より振幅が高い、請求項３１の装置。
【請求項３３】
方形パルスの一方が、他方より持続時間が長い、請求項３１の装置。
【請求項３４】
非対称に交番する電場が、
第一波形および第二波形をもつ第一および第二の交番する電気パルス；
時間に対する、第一または第二パルスの一方の振幅の積分であって、これは他方のパルスの積分より大きく；
第一の固定方向および第二の固定方向にかけた第一および第二電気パルス
を含む、請求項２７の装置。
【請求項３５】
第一波形および第二波形が方形パルスである、請求項３４の装置。
【請求項３６】
方形パルスの一方が、他方より振幅が高い、請求項３５の装置。
【請求項３７】
方形パルスの一方が、他方より持続時間が長い、請求項３５の装置。
【請求項３８】
非対称に交番する電場が、
振幅が時間に関して一定である電場を含み、
該電場方向が、∫［θ（ｔ）］ｎ＋１ｄｔ（ここでθ（ｔ）は、時間平均電場方向に関しての電場配向であり、ｎが０より大きな任意の偶数である）が、あらゆるｎにおいて０にならないように時間の経過と共に変化している、請求項２７の装置。
【請求項３９】
電場が２つの固定した方向の間で交番する、請求項３８の装置。
【請求項４０】
荷電分子がデオキシリボ核酸（別名ＤＮＡ）である、請求項２７の装置。
【請求項４１】
装置が連続して作動する、請求項２７の装置。
【請求項４２】
装置が、障害物のアレイから分画した分子を抽出するための抽出構造を含む、請求項２７の装置。
【請求項４３】
装置が、分子を添加するための添加チャネル（群）を含む、請求項２７の装置。
【請求項４４】
分子が電場を使用して障害物のアレイから抽出される、請求項２７の装置。
【請求項４５】
分子が電場を使用して障害物のアレイに添加される、請求項２７の装置。
【請求項４６】
分子が分画後に次のプロセス段階に送られる、請求項２７の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０００年１２月１８日に提出された、仮特許出願番号第６０／２５６，２９８号の優先権を主張し、この全開示内容を参考として本明細書に組み込む。
【０００２】
政府の権利
本発明は、連邦契約承認番号ＭＤＡ９７２−００−１−００３１の下で行なわれ、政府は本発明に特定の権利を有することができる。
【０００３】
発明の分野
本発明は、非対称パルスフィールド電気泳動を使用して、ＤＮＡなどの荷電巨大分子を分画する方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００４】
関連技術
大きなＤＮＡ分子の解析および分画は、大規模なシークエンスプロジェクトの中心的な段階である。慣用的には、ゲル電気泳動を使用し、そのサイズによりＤＮＡ分子を分画する。この方法は、試料添加および分画という二つの段階を含む。まず、電場のスイッチを入れる前に、ＤＮＡを含む試料溶液をゲル板中の添加ウェルに添加する。次に電場をかける。ＤＮＡ分子は負に荷電しているため、電場とは反対の方向に移動する。電場をかけると、ＤＮＡ分子はそのサイズに応じて異なる速度で移動するが、移動する方向は常に同じである。最終的に、試料ＤＮＡ分子は異なるバンドへと分離し、その各々が、図１に示すように、同じサイズのＤＮＡ分子を含む。短いＤＮＡ断片は長いＤＮＡ断片よりもより速く動く。このため、そのサイズにより分離される。しかしこの標準的な方法は、４０ｋｂｐよりも小さいＤＮＡ分子についてのみ有効に作用する。この範囲を超えると、標準的な方法に変更を加えなければならない。特に、かけた電場は、もはやＤＣ（直流）ではあり得ず、２つの異なる方向の間で交番するようにされている。この変更された仕組み（パルスフィールドゲル電気泳動）は、現代分子生物学研究所で日常的に使用されているが、通常１セットのＤＮＡ試料を分画するには数日間を要する。
【０００５】
必要とされながら、これまで提供されていなかった事は、迅速に、また更には連続的に、荷電巨大分子を分画する方法および装置である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の目的と要約
本発明の目的は、荷電巨大分子を迅速に分画する方法および装置を提供することである。
【０００７】
本発明の他の目的は、荷電巨大分子を連続的に分画する方法および装置を提供することである。
【０００８】
本発明のさらに他の目的は、非対称な電気パルスをかける電気泳動を使用して、巨大分子を分画する方法および装置を提供することであり、２つの異なる方向をもつ交番電場をかけ、一方の電場が持続時間または強度において他方の電場よりも強いか、あるいは電場が他の点で非対称である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ＤＮＡなどの荷電巨大分子を分画する方法および装置に関する。ＤＮＡ溶液を、障害物のアレイを含むマトリックス中に添加する。異なる方向で、２つの異なる電場を有する交番電場をかける。交番電場は、一方の電場が持続時間または強度において、他方の電場より強いという点で非対称であるか、あるいは他の点で非対称である。これにより、ＤＮＡ分子はサイズにより分画され、マトリックスの反対側まで動かされ、そこで分画ＤＮＡが回収される。分画用電場を、ＤＮＡの添加および回収に使用でき、プロセスを連続して作動することができる。
【００１０】
本発明の他の重要な目的および特徴は、添付図面と関連した、以下の発明の詳細な説明から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、ＤＮＡなどの荷電巨大分子を分画する方法および装置に関する。ＤＮＡ溶液を、障害物のアレイを含むマトリックス中に添加する。異なる方向で２つの異なる電場を有する交番電場をかける。交番電場は、一方の電場が持続時間または強度において他方の電場よりも強いという点で非対称であるか、あるいは他の点で非対称である。これによりＤＮＡ分子はサイズによって分画され、マトリックスの反対側まで動かされ、そこで分画ＤＮＡは回収される。分画用電場は、プロセスを連続して作動するために、ＤＮＡの添加および回収に使用できる。
【００１２】
本発明は、マイクロ／ナノ加工された支持材料（別名マトリックス）上で巨大分子を分画する方法および装置を提供する。ＤＮＡ分子の動きは、マイクロ／ナノ加工された環境で、正確に制御できるので、ＤＮＡの分画は、１００ｋｂｐより大きなＤＮＡ分子でさえ、短時間（すなわち数秒）以内に、非常に高い分解能でもって行なうことができる。さらに、プロセスは連続作動可能であり、すなわち、同時に、ＤＮＡを添加し、分画し、回収する。さらに、本方法は、マイクロ／ナノ加工構造を利用するので、１つの構成部品として、ラボ・オン・チップデバイスに容易に一体化することができる。
【００１３】
本発明によれば、図２に示すように、ＤＮＡ分子はマトリックス１０の境界線１２上の一点、すなわち添加チャネル１４から入る。分子はその後、マトリックス１０の他方側１３の方に動かされるにつれて、サイズに応じて異なる方向で異なるバンドに分画され、他方側１３で精製ＤＮＡ分子３０は最終的に回収される。ＤＮＡ分子は、一端では短い断片３２に分画され、他端では長い断片３６に分画され、その間では中程度の断片３４に分画される。ＤＮＡ試料を分画する電場（Ｅ１およびＥ２）も、試料の添加および回収に使用でき、プロセスを連続して作動する機能を与える。
【００１４】
ＤＮＡ分子の混合物は、添加チャネルから連続的に出現する。支持材料は、マイクロ／ナノ加工された多孔性構造を含み、ＤＮＡはその中を移動できる。Ｅ１およびＥ２で示す交番電場を全マトリックスにかける。Ｅ１およびＥ２は互いに対しある角度をなし、好ましくは鈍角をなし、異なる強度および／または持続時間を有する。ＤＮＡ分子は交番電場の下で伸長しかつジグザグに動くので、より短い断片はより長い断片に対してある角度をなして動く。
【００１５】
ＤＮＡ分子を、鈍角のような角度をなす２つの方向の間で交番電場にかけた場合、その分子量に応じて伸びの長さは異なる。図３を参照し、伸長したＤＮＡ分子の末端から末端までの長さをｘとする。電場Ｅ１はどのＤＮＡ分子もほぼ同じ変位αｅ１だけ変位させ、一方Ｅ２はどのＤＮＡ分子もほぼβｅ２だけ変位させる、と仮定する（ｅ１およびｅ２は単位ベクトルであり、αおよびβは両方とも正の数であり、ＤＮＡ分子は負に荷電しているので、かけた電場に対して反対方向に移動する）。広範囲の水力学的相互作用が、カウンターイオン層により遮蔽されているという事実により、全ＤＮＡ分子が事実上同じ移動度を示すということが知られているので、これは妥当な仮定である。単純化にするために、αをβよりも大とする。これは、−ｅ２よりも−ｅ１に添ってより長時間電気パルスをかける、および／または、−ｅ２よりも−ｅ１に添って電場をより強力にすることにより達成できる。電場が２つの異なる方向の間で交番するので、ＤＮＡ分子はジグザグに動く。理想的には、電場をｘ＜β＜αとなるように選択する。１パルスサイクル（１サイクルは、Ｅ１をかけ、次にＥ２をかけることを意味する）における、非常に短いＤＮＡ分子（ｘ＜＜β）の正味の移動は、単純に、αｅ１＋βｅ２である。これに対し、非常に長い分子（ｘ＞β）は、１サイクルで（α−β）ｅ１移動する。これは一見予想以上に驚くべきことのようだが、電場が一方から他方に切り替えられれば、図４に示すように、ＤＮＡ鎖の尾部４０が、動きを先導する端部になり、頭部４２がその後に続くことに気が付けば、理解し難くはない。原則的に、伸長したＤＮＡの長さが、βより短いか等しい場合、バンドの角度（このバンドの中に、本技術によりＤＮＡ混合物が分画される）を予測できる。この範囲（ｘ＜βまたはｘ＝β）内で、１回のサイクルにおけるＤＮＡ分子の正味の移動は（α−ｘ）ｅ１＋（β−ｘ）ｅ２である。精製ＤＮＡ分子は、サイクルを数多く繰り返した後、支持材料の底から回収することができる。１回のサイクルで、長さｘまで伸長したＤＮＡ分子は、（α−ｘ）ｅ１＋（β−ｘ）ｅ２だけ移動する。
【００１６】
図４に示すように、交番電場は、ＤＮＡ分子を直線的なコンフォメーションへ伸長させるだけでなく、ＤＮＡ分子をジグザグに動かす。ＤＮＡ分子の初期位置を０と標識する。ＤＮＡの一端の大きな点は、分子の「頭部」４２を示す。分子の反対の端を、「尾部」４０とする。Ｅ１をかけると、ＤＮＡ分子は位置１に移動する。電場をＥ２に切り替えると、尾部４０が動きの先頭となる。１回のサイクルの終了時に、該分子は位置２に移動し、１回のサイクルにおける正味の変位は（α−ｘ）ｅ１＋（β−ｘ）ｅ２である。
【００１７】
電場が意味するのは、１つの障害物の周りの顕微的な電場分布ではなく、数個の障害物の長さ規模の、ある場所の周りにおける空間的な電場平均である。特定の場所における任意の電場（その方向は時間の経過と共に変化する）は、一意的に、瞬間的な電場の方向によって２つの電気パルス系列に分解できる。電気パルスの第一系列は、分子の分画のため電場をかけた全時間にわたり、平均電場ベクトルの一方の側を指した電場を含む。電気パルスの第二系列は、平均電場ベクトルの反対側を指した電場を含む。ある瞬間の電場ベクトルが、平均電場ベクトルと同じ方向または逆の方向である場合、いずれかのパルス系列で排除される。非対称電場が意味するのは、時間の関数として、特定の電場から分解した、２つの電気パルス系列が、時間平均電場方向に関して対称ではない、時間に対するベクトル積分を有することを意味する。言い換えれば、電場、すなわち、場
【数１】
2004518663.tif 000002
（ここで時間に対する奇数積分
【数２】
2004518663.tif 000003
は、あらゆるｎにおいて、時間平均電場方向にはなく、ｎは任意の正の偶数である）である。従って、異なる方向および異なる強度、すなわち異なる持続時間または異なる強度あるいはその両方をもつ電場をかけることにより、非対称な電場をかける。非対称な電場は、方向、持続時間および強度において、シグナルを掃引することによっても作成できる。従来は、電場は、時間に対するベクトル積分が、平均電場に関して対称である第一および第二パルス系列を有する。
【実施例】
【００１８】
実験結果
以下の実施例は、マイクロ加工されたマトリックス１０を使用する。図５に示すように、マトリックス１０は、石英中のマイクロ加工された障害物アレイ２０と、石英基材１６のマイクロ加工側に密閉して結合したキャップ層１８という、二つの部分からなる。石英基材１６は、標準的なマイクロ加工技術を使用して表面が超微細機械加工されている。基材はその後、ガラスキャップ層１８に密閉して結合させる。基材とキャップ層の間の空洞は微細流体チャネルとなり、この中でＤＮＡ分子が分画される。このマイクロ加工されたデバイスの寸法を、図６ａおよび６ｂに示す。図６ａは、マトリックス１０の上面図であり、図６ｂは、マトリックス１０の側面図である。この場合のマトリックス１０は、障害物２０の六方晶系アレイである。それぞれの障害物２０は、円柱状の直径２μｍの柱を含む。隣接する障害物の間で、中心から中心までの距離は４μｍである。全マトリックスにわたる電場の均一性は、マトリックスを囲む周辺構造により正確に制御されている。図７は、Ｔ４（１６９ｋｂｐ）およびＴ７（４０ｋｂｐ）ＤＮＡ分子の分画を示す。パルス条件は、横軸境界線に対して６０°でＥ１＝１２０Ｖ／ｃｍ、−６０°でＥ２＝６０Ｖ／ｃｍである。マトリックスに注入したＤＮＡは、１／２ＴＢＥ緩衝液中１０μｇ／ｍｌのＴ４ＤＮＡ、および１０μｇ／ｍｌのＴ７ＤＮＡである。Ｅ１の持続時間は、Ｅ２のそれと全く同じで、１６６ｍ秒である。電場を交番する周波数は３Ｈｚである。明らかに、ＤＮＡ混合物は２つのバンドに分離する。
【００１９】
このように本発明を詳細に記載したが、前述の記載は、本発明の精神および範囲を限定するものではないことを理解されたい。特許証による保護が望まれるものは、添付の特許請求の範囲に示す。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、従来のゲル電気泳動を示す。
【図２】図２は、本発明によるマイクロ／ナノ加工されたマトリックス中での非対称パルスフィールド電気泳動を示す線図である。
【図３】図３は、本発明の非対称に電気パルスをかける電気泳動の基本原理を示す線図である。
【図４】図４は、伸長したＤＮＡ分子の、非対称に電気パルスがかかった電場における動き方を示す。
【図５】図５は、本発明によるＤＮＡの分画に使用する支持材料（マトリックス）を示す。
【図６】図５で示されたマイクロ加工された支持材料の、図６Ａは上面図であり、図６Ｂは側面図である。
【図７】図７は、Ｔ４およびＴ７ＤＮＡの分画を示す。
【図１】
2004518663.tif 000008
【図２】
2004518663.tif 000009
【図３】
2004518663.tif 000010
【図４】
2004518663.tif 000011
【図５】
2004518663.tif 000012
【図６】
2004518663.tif 000013
【図７】
2004518663.tif 000014
【国際公開パンフレット】
2004518663.tif 000015
2004518663.tif 000016
2004518663.tif 000017
2004518663.tif 000018
2004518663.tif 000019
2004518663.tif 000020
2004518663.tif 000021
2004518663.tif 000022
2004518663.tif 000023
2004518663.tif 000024
2004518663.tif 000025
2004518663.tif 000026
2004518663.tif 000027
2004518663.tif 000028
2004518663.tif 000029
2004518663.tif 000030
2004518663.tif 000031
2004518663.tif 000032
2004518663.tif 000033
2004518663.tif 000034
2004518663.tif 000035
【国際調査報告】
2004518663.tif 000036
2004518663.tif 000037
2004518663.tif 000038