(57)【要約】プレニル化カルコンおよびプレニル化フラボンの含有率が従来よりも高い新規なホップ抽出物、前記抽出物の製法、そのようなホップ抽出物を含んでなる薬学的調整品、並びにエストロゲンの欠乏によって、または、性ホルモンに関連する代謝の異常によって生じる病的状態を予防および治療するためのこれらのホップ抽出物の使用が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
α苦味酸の含有率が少なくとも０．５％であり、キサントフモールの含有率が少なくとも２％であり、そして６−プレニルナリンゲニン、８−プレニルナリンゲニンおよびイソキサントフモールからなる群から選択されるプレニル化フラボンの含有率が少なくとも０．５％であることを特徴とするホップ抽出物。
【請求項２】
α苦味酸の含有率が少なくとも０．８％であり、キサントフモールの含有率が少なくとも３％であり、そして６−プレニルナリンゲニン、８−プレニルナリンゲニンおよびイソキサントフモールからなる群から選択されるプレニル化フラボンの含有率が少なくとも０．７％であることを特徴とする、請求項１に記載のホップ抽出物。
【請求項３】
ホップ抽出物を得るための方法であって、
（ａ）Ｃ5〜Ｃ7アルカンまたは超臨界ＣＯ2でホップからドラッグを１回以上抽出し、抽出溶液から残留ドラッグを分離する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られた残留ドラッグを水で１回以上抽出し、前記残留ドラッグを分離する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた残留ドラッグを、アルコール、水性アルコール、ケトン、水性ケトンおよびエステルからなる群から選択される溶媒で１回以上抽出し、得られた抽出溶液を濾過する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた合体した抽出溶液から溶媒を除去し、得られた残留物を乾燥させる工程と、
を含んでなる前記方法。
【請求項４】
工程（ａ）における抽出が１回、２回または３回行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）における溶媒が、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサンおよびｎ−ヘプタンからなる群から選択される、請求項３または４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）における溶媒がｎ−ヘプタンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）における抽出が、６０〜９５℃の温度、好ましくは約９０℃で行われる、請求項３〜６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
工程（ｃ）における溶媒が、メタノール、水性メタノール、エタノール、水性エタノール、アセトン、水性アセトンおよびエチルアセテートからなる群から選択される、請求項３〜７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
工程（ｃ）における溶媒が、８０〜９６％（ｗ／ｗ）エタノール、７４〜９９％（ｗ／ｗ）メタノールおよび６０〜９９％（ｗ／ｗ）アセトンからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｃ）における溶媒が９２％（ｗ／ｗ）エタノールである、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ａ）における溶媒がｎ−ヘプタンであり、そして工程（ｃ）における溶媒が９２％（ｗ／ｗ）エタノールである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ａ）における溶媒が超臨界ＣＯ2であり、そして工程（ｃ）における溶媒が９２％（ｗ／ｗ）エタノールである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１または２に記載の抽出物と、慣用の薬学的に許容できる添加剤とを含んでなる薬学的調整品。
【請求項１４】
エストロゲンの欠乏によって、または、性ホルモンに関連する代謝、特にエストロゲン代謝の異常によって生じる病的状態を予防および治療するための、請求項１または２に記載の抽出物または請求項１３に記載の薬学的調整品の使用。
【請求項１５】
前記病的状態が、更年期障害、性ホルモン依存性癌、良性前立腺肥大症、骨粗鬆症、アルツハイマー病および循環系の病気からなる群から選択される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記性ホルモン依存性癌は、乳癌、前立腺癌および子宮癌からなる群から選択される、請求項１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホップ抽出物、前記抽出物の製法、およびエストロゲンの欠乏によって、または、性ホルモンに関連する代謝、特にエストロゲン代謝の異常によって生じる病的状態を予防および治療するための前記抽出物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホップの最も重要な使い途は、未だ、ビールの製造におけるその使用である。その苦味剤および調味剤のため、ホップはビールの味の決め手となる。さらに、これらの剤は、その抗微生物的な性質によって、ビールの保存と特定の関連があることも分かっている。
【０００３】
８０年代初頭、連邦健康機関のＥ局が、その時代のホップ分野における科学知識から肯定的な論文を発表した（１９８５年１２月５日および１９９０年３月１３日付けのＢｕｎｄｅｓａｎｚｅｉｇｅｒ）。このように、睡眠障害、興奮および不安の処置にホップを用いることは、基本的に容認されている。
【０００４】
すでに長い間、ホップは、市販薬中の緩和な鎮静薬として、薬剤と関連があった。この作用を及ぼしているのは酸化に敏感なα−およびβ−苦味酸であると考えられる。近代において、これらの成分はラジカルトラップ性および脂質過酸化抑制性も示すことが示された（Ｍ．Ｔａｇａｓｈｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５９，  ７４０−７４２（１９９５））。さらに、欧州特許出願０６７７２８９Ａ２には、α−苦味酸およびα−イソ−苦味酸からなる群から選択される化合物を含有する骨粗鬆症の治療するための薬学的組成物が記載されている。
【０００５】
また、ここ数年、α−およびβ−苦味酸に加えて、ホップのフェノール成分がますます詳しく調査されており（Ｊ．Ｈｏｌｚｌ，  Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ  ｆｕｒ  Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒａｐｉｅ  １３，  １５５−１６１（１９９２））、また従来公知のキサントフモール（ｘａｎｔｈｏｈｕｍｏｌ）１に加えて、さらに、フラボン型化合物もホップの苗から見つかっている（Ｊ．Ｆ．Ｓｔｅｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４，  １５７５−１５８５（１９９７），  Ｊ．Ｆ．Ｓｔｅｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔ．  Ａ  ８３２（１−２），  ９７−１０７（１９９９））。これらは、主に、例えば６−または８−プレニルナリンゲニン２および３、並びにイソキサントフモール（ｉｓｏｘａｎｔｈｏｈｕｍｏｌ）４のごときイソプレニル化フラボノイドであった。さらにＳｔｅｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５３，  ７５９−７７５（２０００））は、ホップ種およびホップ分類群の化学分類を調査した。
【０００６】
【化１】
2004537604.tif 000002
【０００７】
ホップを摂取した女性達に生理不順が起こることが何度も確認された。この症状はホップ中のエストロゲン物質に由来するものであるが、いずれの成分とも明確に関連付けることができなかった。しばらくして、ホップのこのエストロゲン作用を確認することができた。すなわち、特に８−プレニルナリンゲニン３がこの症状を引き起こしていることが証明された（Ｓ．Ｒ．Ｍｉｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  ８４，  ２２４９−２２５２（１９９９））．この化合物の生体外でのエストロゲン作用は、エストロゲン受容体に対するその相対結合親和性から現れるものであり、特に、Ｉｓｈｉｋａｗａ−Ｖａｒ−Ｉ−ｃｅｌｌｓ中のアルカリ性ホスファターゼを刺激することによって検知された。その結果、８−プレニルナリンゲニンは、クメストロール、ゲニステインまたはダイドゼインのごとき従来公知のフィトエストロゲンよりも著しく活性であり、かつ、１７β−エストラジオールよりもわずかに弱い効果を生み出すことが証明された。さらにＭｉｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．  Ｍｅｔａｂｏｌ．  ８５，  ４９１２−４９１５（２０００））は、酵母細胞内に発現させた人間のエストロゲン受容体に対するホップの異なるフェノール成分の結合についても報告している。その結果、ここでも８−プレニルナリンゲニンが最も強いエストロゲン作用を示した。６−プレニルナリンゲニン、６，８−ジプレニルナリンゲニンおよび８−ゲラニルナリンゲニンは、８−プレニルナリンゲニンよりも弱いエストロゲン作用を示した。Ｍｉｙａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄ．  ６４．  ５１６−５１９（１９９８））によって、８−プレニルナリンゲニンが卵巣を切除されたラットの子宮の重量および骨密度を正常化することが証明された。さらに、８−プレニルナリンゲニンを初めとする一連の８−プレニル化フラボン誘導体のエストロゲン拮抗作用はＪＰ  ０８  １６５２３８（ｒｅｆ．  ＣＡ  １２５：１５８６３２）に記載されている。
【０００８】
最近の研究によって、ホップの一部のフラボノイド、特にキサントフモール１、が細胞の代謝に影響を与え得ることが証明された。それらのフラボノイドは、腫瘍細胞の成長において重要な役割を果たす酵素反応によい影響を与えることができる。従って、これらの化合物は癌予防剤であると考えられる（ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｒｍａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｐ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ｐｒｅｓｅｎｔ  Ｇｅｒｍａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｐ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  ｃｏｎｃｅｒｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｏｐ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  ｘａｎｔｈｏｈｕｍｏｌ，  Ｍａｒｃｈ  ２４，  １９９８，  Ａｓｃｈｈｅｉｍ）。Ｍｉｒａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  Ｔｏｘ．  ３７（４），  ２７１−２８５  （１９９９））によって、人間の乳癌細胞ＭＣＦ−７、大腸癌細胞系ＨＡＴ−２９および卵巣癌細胞系Ａ−２７８０におけるキサントフモール１およびイソキサントフモール４の強い増殖抑制作用が報告されている。
【０００９】
さらに、キサントフモール１には骨溶解を抑制する作用があることが証明されている。骨粗鬆症に対する治療薬としてのその使用は、欧州特許ＥＰ０６７９３９３Ｂ１に記載されている。発明者らはキサントフモールのエストロゲン作用を主張しているが、前記作用は証明されていない。これに反して、Ｓ．  Ｒ．  Ｍｉｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｈａｒｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  ７，  ８３−８６（１９９７））は、キサントフモールの骨粗鬆症抑制作用は人間の子宮内膜癌細胞系イシカワにもイーストレポータージーンアッセイにも認められないので、前記作用がエストロゲン作用に基づくということをはっきりと除外している（Ｓ．  Ｒ．  Ｍｉｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂｏｌ．  ８４，  ２２４９−２２５２（１９９９））。これらの考察に反して、本発明は、同等の作用を有するキサントフモール１およびイソキサントフモール４がエストロゲン受容体αおよびβに結合することを証明している。
【００１０】
ＫｕｍａｉおよびＯｋａｍｏｔｏ（Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２１，  ２０３−２０７（１９８４））によって、ホップの単なる水性抽出物から得られる高分子量炭水化物分画が、ＰＭＳゴナドトロピンによって前処理された若いラットの卵巣の重量を減少させることが報告されている。ＯｋａｍｏｔｏおよびＫｕｍａｉ（Ａｃｔａ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃａ  １２７，  ３７１−３７７（１９９２））は、前記ホップの単なる水性抽出物の投与による１７βエストラジオールおよびＬＨの血中濃度の減少の観察に基づいて、これらの結果を支持している。
【００１１】
キサントフモールの含有率が高められたホップ抽出物がドイツ特許出願ＤＥ１９９３９３５０Ａ１に記載されている。この抽出物は、ビールおよび果汁の入った清涼飲料に添加される。この抽出物中にプレニル化ナリンゲニンが存在するかどうかは全く知られていない。ある実施態様によれば、キサントフモールは、５０重量％のエタノールを用いて、ホップから抽出される。しかしながら、これは理想的なキサントフモールの抽出方法ではない。その理由は、高い含有量（＞８０重量％）のエタノールが用いられるまでは、抽出物へ移行する割合が高くならないためである。
【００１２】
エストロゲン活性化合物をホップから単離させる方法がＷＯ８３／００７０１Ａ１において特許請求されている。前記方法では、同調因子としてまず水を添加することによってホップからの二酸化炭素抽出物を得た後、エーテルを用いた抽出またはクロマトグラフ法によって前記抽出物からエストロゲン活性化合物を得る。さらに、動物の飼料や化粧品のための添加剤または入浴添加剤としてのこれらの化合物の使用も特許請求されている。これらのエストロゲン活性化合物の種類についての詳細は何も記載されていない。
【００１３】
ビールを醸造するための安定した添加剤を単離するための方法がＷＯ０１／３０９６１Ａ１において特許請求されている。前記方法では、二酸化炭素抽出からのホップかすの残留物を極性溶媒、好ましくは熱湯で抽出した後、得られた抽出物を酸性化し、非極性溶媒、好ましくはヘキサンで洗浄し、任意に乾燥した後、醸造添加物として用いる。残ったかすは廃棄する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の第１の目的は、エストロゲンの欠乏によって、または、性ホルモンに関連する代謝、特にエストロゲン代謝の異常によって生じる病的状態を予防および治療するための薬剤を製造するのに好適な植物抽出物を提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、そのような抽出物の製法、および、前記病的状態を治療するのに好適な前記抽出物を含んでなる薬学的調整品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明によれば、これらの目的は、請求項１および２に記載のホップ抽出物、請求項３〜１２に記載の方法、請求項１３に記載の薬学的調整品、および請求項１４〜１６に記載の前記抽出物または前記薬学的調整品の使用によって達成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、とりわけ、以下の驚くべき観察結果、すなわち、親油性繊維および親水性繊維を取り除いた後に、ホップのフロログルシノール型苦味酸を未だ含有すると同時に、キサントフモール、イソキサントフモールおよび６−および８−プレニルナリンゲニンのごとき遊離および／または結合カルコンおよびフラボンも豊富に含有するホップドラッグから抽出物が得られるということに基づいている。６−および８−プレニルナリンゲニンの含有率が水による予備抽出の温度に依存する事実（実施例３を参照）およびそれは最大約２倍に増えることがあるという事実は、特に驚くべきことである。
【００１８】
図１は、水による予備抽出の温度に対する分析成分の濃度の依存を示している。
【００１９】
そのような抽出物は、Ｃ5〜Ｃ7アルカンまたは超臨界ＣＯ2を用いて１回以上抽出を行い（脂肪を除去する工程）、その後、残ったドラッグ残留物を水で抽出した後、まだ残っているドラッグ残留物をアルコール、水性アルコール、ケトン、水性ケトンおよびエステルからなる群から選択される極性が中位の溶媒を用いて抽出し、そして任意に液−液分散を行うことによって得ることができる。驚くべきことに、ホップの苦味酸の親油性抽出物への移行は完全にではなく部分的にのみ起こる。一方、カルコンおよびフラボンは、水を用いた抽出を行っている間、ドラッグ残留物中にほぼ完全に残ったままである。これにより、薬学的に関連のある成分（苦味酸、カルコン、フラボン）のすべてをバランスのとれた割合で含有するホップ抽出物を得ることができる。いくつかの治療原理を用いたこの有利な組成により、この抽出物は、エストロゲンの欠乏によって、または、他のホルモンに関連する異常によって生じる病的状態に理想的に適用することができる。
【００２０】
本発明によるホップ抽出物は、女性の更年期障害または閉経後の障害を予防および治療するのに好適である。その症状としては、特に、顔面紅潮、鬱病、不安症、精神錯乱、不眠症、並びに、骨粗鬆症、循環系の病気、脳梗塞（脳卒中）、痴呆症および腫瘍のごとき閉経後の深刻な健康上の問題が挙げられる。性ホルモンに関連する代謝の異常が原因であり、かつ、本発明の抽出物を用いて治療することのできる他の病気の例としては、無月経、無排卵性周期、機能性子宮出血、月経前障害および産後抑うつ症が挙げられる。同様に、これらの抽出物は、男性の性ホルモン依存性の病気、例えば良性前立腺肥大または前立腺の癌種の治療に用いることもできる。
【００２１】
本発明のホップ抽出物の驚くほど高いエストロゲン活性は、人間のエストロゲン受容体αおよびβのための競合受容体結合分析法および１７βエストラジオールの活性と比較した組み換え酵母分析法の両方で検出された。これに反して、同量の慣用の標準的なホップ抽出物は、それよりも本質的に低い活性を示すか、まったく活性を示さない。図２は、イーストレポータージーンアッセイにおける比較対象抽出物の活性と、本発明による２種類のホップ抽出物の活性を示している。
【００２２】
本発明によれば、慣用の、特に水性アルコール抽出物と比べて遊離および／または結合カルコンおよびフラボン、特に６−および８−プレニルナリンゲニン、キサントフモールおよびイソキサントフモールの含有率が高いホップ抽出物が提供される。さらに前記ホップ抽出物は、α苦味酸およびおそらくはβ苦味酸（それぞれ、フムロンおよびルポロンおよびそれらの誘導体）も含有する。
【００２３】
さらに、本発明によれば、これらのホップ抽出物の調製法が提供される。前記調製法は、
（ａ）Ｃ5〜Ｃ7アルカンまたは超臨界ＣＯ2を用いてホップドラッグを１回以上抽出し、抽出溶液から残留ドラッグを分離する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られた残留ドラッグを水を用いて１回以上抽出し、前記残留ドラッグを分離する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた残留ドラッグをアルコール、水性アルコール、ケトン、水性ケトンおよびエステルからなる群から選択される溶媒を用いて１回以上抽出し、得られた抽出溶液を濾過する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた合体した抽出溶液から溶媒を除去し、得られた残留物を乾燥させる工程と、
を含んでなる。
【００２４】
各抽出工程におけるドラッグ対溶媒比は、約１：７〜約１：１２である。
【００２５】
工程（ａ）におけるＣ5〜Ｃ7アルカンまたは超臨界ＣＯ2を用いた抽出は、１回、２回または３回行うのが好ましく、３回行うのが特に好ましい。
【００２６】
超臨界ＣＯ2を用いた抽出が特に好ましい。
【００２７】
工程（ａ）で用いたＣ5〜Ｃ7アルカンは、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサンおよびｎ−ヘプタンからなる群から選択されるＣ5〜Ｃ7ｎ−アルカンであることが好ましく、ｎ−ヘプタンであることが特に好ましい。
【００２８】
工程（ｂ）における抽出は、６０〜９５℃の温度、好ましくは９０℃で行われることが好ましい。前記抽出は１時間以上の時間を掛けてもよい。
【００２９】
工程（ｃ）で用いられる溶媒は、エタノール、水性エタノール、メタノール、水性メタノール、アセトン、水性アセトンおよびエチルアセテートからなる群から選択されることが好ましい。８０〜９６％（ｗ／ｗ）エタノール、７４〜９９％（ｗ／ｗ）メタノールおよび６０〜９９％（ｗ／ｗ）アセトンが好ましく、９２％（ｗ／ｗ）エタノールが特に好ましい。
【００３０】
本発明による（乾燥）ホップ抽出物は、α苦味酸の含有率が少なくとも０．５％、好ましくは少なくとも０．８％、特に好ましくは１％であり、キサントフモールの含有率が少なくとも２％、好ましくは少なくとも３％、特に好ましくは４％であり、そしてプレニル化フラボンの含有率が少なくとも０．５％、好ましくは少なくとも０．７％である。前記プレニル化フラボンは、６−プレニルナリンゲニン、８−プレニルナリンゲニンおよびイソキサントフモールからなることが好ましい。本発明において、キサントフモールは前記プレニル化フラボンに包含されない。％表示は、前記乾燥ホップ抽出物の重量に基づいている。
【００３１】
得られた抽出物は、慣用の薬学的に許容できる添加剤と共に、カプセル、フィルム錠またはコーティング錠のごとき薬学的調整品へと加工することができる。フィルム錠およびコーティング錠用の充填剤、結合剤、錠剤分解物質、滑剤および被覆剤、並びに、ゼラチンカプセル用の充填剤としての油脂を薬学的添加物として用いることができる。
【００３２】
本発明による抽出物は、エストロゲンの欠乏によって、または、他のホルモンに関連する異常によって生じる病的状態、例えば特に更年期障害、性ホルモン依存性癌、良性前立腺肥大症、骨粗鬆症、アルツハイマー病および循環系の病気を予防および治療するために用いることができる。性ホルモン依存性癌の場合、本発明による抽出物は、特に乳癌、子宮癌および前立腺癌を予防および治療するために用いることができる。
【００３３】
本発明による抽出物の投与量としては、１日当たり０．００５〜２ｇの抽出物を１〜４回、好ましくは１日当たり０．０２〜１ｇの抽出物を１〜２回投与する。個々の場合、前記投与量は臨床像および各患者の状態に依存し、主治医がそれぞれの必要条件に合わせて調節することができる。
【実施例】
【００３４】
下記実施例によって本発明をさらに詳しく説明するが、それらは本発明を限定するものであると解釈されるべきではない。特に断らない限り、すべての％表示は重量に基づくものである。
【００３５】
比較例：  予備脱脂処理を行わない９６％（Ｗ／Ｗ）エタノールを用いた抽出物の製造
５０ｇのホップドラッグ（種類：Ｈａｌｌｅｒｔａｕｅｒ  Ｍａｇｎｕｍ）を５００ｇの９６％（Ｗ／Ｗ）エタノールと混ぜ合わせて、ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘを用いて細かくした。６０℃で１時間抽出を行った。そして、得られた抽出物をＳｅｉｔｚ１５００型フィルターを用いて濾過した。ドラッグを同じ方法でさらに２回抽出した。抽出溶液を合体したものを回転式蒸発器でエタノールから分離させ、真空乾燥キャビネット内で５０℃で一晩乾燥させた。下記ＨＰＬＣ法を用いて乾燥物から特性成分の含有率を求めた。このＨＰＬＣ法は、他の実施例における成分の測定にも用いられる。
【００３６】
【表１】
2004537604.tif 000003
【００３７】
収率（９６％（ｗ／ｗ）エタノール抽出物）：  １８．３８ｇ⇒３６．８％
ホップのα苦味酸のＨＰＬＣ含有率：  １９．８％
ホップのβ苦味酸のＨＰＬＣ含有率：  ４．２％
キサントフモールのＨＰＬＣ含有率：  １．３％
６−および８−プレニルナリンゲニンおよびイソキサントフモールのＨＰＬＣ含有率：  検出限界値未満（＜０．０１％）
【００３８】
実施例１ａ：（ＣＯ2を用いた抽出の後に水を用いた予備抽出を９０℃で行う）ホップ抽出物の製造
超臨界ＣＯ2、水および９２％（ｗ／ｗ）エタノールを用いた連続抽出：
超臨界ＣＯ2を用いて予備抽出（条件：１０ｍｍの粒径まで粉砕した後、２５０バール／５０℃でＣＯ2を用いて抽出を行い、得られた抽出物を３０％の収率で分離）した８０．６ｇのホップドラッグ（種類：Ｈａｌｌｅｒｔａｕｅｒ  Ｍａｇｎｕｍ）を、まず９６０ｇの水を用いてｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘで５分間抽出した後、攪拌しながら９０℃で１時間抽出した。その後、得られた水抽出物をＳｅｉｔｚ  Ｓｕｐｒａ  Ｆｉｌｔｅｒ１５００で濾過した。その後、まだ幾分湿っている残留ドラッグに対して、８００ｇの９２％（ｗ／ｗ）エタノールを用いた６０℃における１時間の抽出を２回行った。その後、それをＳｅｉｔｚ  Ｓｕｐｒａ１５００で濾過し、得られた抽出溶液を水浴の温度が５５〜６５℃である回転式蒸発器でエタノールから分離させ、乾燥キャビネット内で６０℃で乾燥させた。
【００３９】
収率：
水による抽出からの残留物：  １８．９６ｇ（２３．５％）
９２％（ｗ／ｗ）ＥｔＯＨを用いた抽出からの残留物：  ９．８３ｇ（１２．２％）
（９２％（ｗ／ｗ）ＥｔＯＨを用いた抽出物に基づく）ＨＰＬＣ含有率：
ホップのα苦味酸のＨＰＬＣ含有率：  ２％
ホップのβ苦味酸のＨＰＬＣ含有率：  ０．５％
キサントフモールのＨＰＬＣ含有率：  ５．８３％
６−プレニルナリンゲニンのＨＰＬＣ含有率：  ０．６３％
８−プレニルナリンゲニンのＨＰＬＣ含有率：  ０．２１％
イソキサントフモールのＨＰＬＣ含有率：  ０．４２％
【００４０】
実施例１ｂ：（ＣＯ2を用いた抽出の後に水を用いた予備抽出を９０℃で行う）ホップ抽出物の製造
超臨界ＣＯ2、水および９２％（ｗ／ｗ）エタノールを用いた連続抽出：
まず超臨界ＣＯ2を用いて予備抽出（条件：１０ｍｍの粒径まで粉砕した後、２５０バール／５０℃でＣＯ2を用いて抽出を行い、得られた抽出物を３０％の収率で分離）した５０４．２６ｇのホップドラッグ（種類：Ｈａｌｌｅｒｔａｕｅｒ  Ｍａｇｎｕｍ）を、６ｋｇの水を用いてｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘでまず５分間抽出した後、攪拌しながら９０℃で１時間抽出した。その後、得られた水抽出物をＳｅｉｔｚ  Ｓｕｐｒａ  Ｆｉｌｔｅｒ１５００で濾過した。その後、まだ幾分湿っている残留ドラッグに対して、５ｋｇの９２％（ｗ／ｗ）エタノールを用いた６０℃における１時間の抽出を２回行った。その後、それをＳｅｉｔｚ  Ｓｕｐｒａ１５００で濾過し、得られた抽出溶液を水浴の温度が５５〜６５℃である回転式蒸発器でエタノールから分離させ、乾燥キャビネット内で６０℃で乾燥させた。
【００４１】
収率：
水を用いた抽出からの残留物：  １０５．９ｇ（２１％）
９２％（ｗ／ｗ）ＥｔＯＨを用いた抽出からの残留物：  ６９．３７ｇ（１３．８％）
（９２％（ｗ／ｗ）ＥｔＯＨを用いた抽出物に基づく）ＨＰＬＣ含有率：
ホップのα苦味酸のＨＰＬＣ含有率：  １％
ホップのβ苦味酸のＨＰＬＣ含有率：  ０．５％
キサントフモールのＨＰＬＣ含有率：  ４．４１％
６−プレニルナリンゲニンのＨＰＬＣ含有率：  ０．４９％
８−プレニルナリンゲニンのＨＰＬＣ含有率：  ０．１５％
イソキサントフモールのＨＰＬＣ含有率：  ０．６％
【００４２】
実施例２：（ＣＯ2を用いた抽出の後に水を用いた予備抽出を６０℃で行う）ホップ抽出物の製造
超臨界ＣＯ2、水および９２％（ｗ／ｗ）エタノールを用いた連続抽出
超臨界ＣＯ2を用いて予備抽出（条件：１０ｍｍの粒径まで粉砕した後、２５０バール／５０℃でＣＯ2を用いて抽出を行い、得られた抽出物を３０％の収率で分離）した８０．３６ｇのホップドラッグ（種類：Ｈａｌｌｅｒｔａｕｅｒ  Ｍｇｎｕｍ）を、まず９６４ｇの水を用いてｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘで５分間抽出した後、攪拌しながら６０℃で１時間抽出した。その後、得られた水抽出物をＳｅｉｔｚ  Ｓｕｐｒａ  Ｆｉｌｔｅｒ１５００で濾過した。その後、まだ幾分湿っている残留ドラッグに対して、８００ｇの９２％（ｗ／ｗ）エタノールを用いてｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘでまず５分間抽出を行った後に攪拌しながら６０℃で１時間抽出を行うという工程を２回行った。その後、それをＳｅｉｔｚ  Ｓｕｐｒａ１５００で濾過し、得られた抽出溶液を水浴の温度が５５〜６５℃である回転式蒸発器でエタノールから分離させ、乾燥キャビネット内で６０℃で乾燥させた。
【００４３】
収率：
水を用いた抽出からの残留物：  １７．９１ｇ（２２％）
９２％（ｗ／ｗ）ＥｔＯＨを用いた抽出からの残留物：  ９．９５ｇ（１２．４％）
（９２％（ｗ／ｗ）ＥｔＯＨを用いた抽出物に基づく）ＨＰＬＣ含有率：
ホップのα苦味酸のＨＰＬＣ含有率：  １．５８％
ホップのβ苦味酸のＨＰＬＣ含有率：  ０％
キサントフモールのＨＰＬＣ含有率：  ６．１％
６−プレニルナリンゲニンのＨＰＬＣ含有率：  ０．４％
８−プレニルナリンゲニンのＨＰＬＣ含有率：  ０．０９％
イソキサントフモールのＨＰＬＣ含有率：  ０．２１％
【００４４】
実施例３：（ｎ−ヘプタンを用いた抽出の後に水を用いて９０℃で抽出を行う）ホップ抽出物の製造
２４７．６ｇのホップドラッグ（種類：Ｈａｌｌｅｒｔａｕｅｒ  Ｍａｇｎｕｍ）を、その重量の７倍のｎ−ヘプタンを用いてｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘでまず５分間抽出した後、攪拌しながら１時間抽出した。得られたヘプタン抽出溶液をＳｅｉｔｚ  Ｓｕｐｒａ１５００で濾過した後、同じ方法でそれを再び抽出した。その後、得られた残留ドラッグを真空乾燥キャビネット内でヘプタンから分離させた。そして、乾燥した残留ドラッグ（２０５ｇ）をその重量の１２倍の水と混ぜ合わせた後、９０℃で１時間保持した。その後、それを再び濾過し、そしてまだ幾分湿っている残留ドラッグを、その重量の１０倍の９２％（ｗ／ｗ）エタノールを用いて、攪拌しながら６０℃で２回抽出した。その後、それをＳｅｉｔｚ  Ｓｕｐｒａ１５００で濾過し、得られた抽出溶液を水浴の温度が５５〜６５℃である回転式蒸発器でエタノールから分離させ、乾燥キャビネット内で６０℃で乾燥させた。
【００４５】
収率：
ヘプタンを用いた抽出物：  ２６．４ｇ（１０．７％）
水を用いた抽出物：  ４１．１ｇ（１６．６％）
９２％（ｗ／ｗ）エタノールを用いた抽出物：  ５２．０ｇ（２１．０％）
（９２％（ｗ／ｗ）エタノールを用いた抽出物に基づく）ＨＰＬＣ含有率：
α苦味酸：  ０．８６％
β苦味酸：  ０．０５％
キサントフモール：  ３．３％
６−プレニルナリンゲニン：  ０．４５％
８−プレニルナリンゲニン：  ０．１３％
イソキサントフモール：  ０．２５％
【００４６】
実施例４：  ６−プレニルナリンゲニン、８−プレニルナリンゲニンおよびイソキサントフモールの含有率の、水を用いた予備抽出の温度への依存
抽出：  ＣＯ2を用いて予備抽出された約８０ｇのホップドラッグを、その重量の１２倍の水を用いてｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘでまず５分間抽出した後、攪拌しながら６０、７０、８０、９０および９５℃で１時間抽出した。そして、水を用いて得られた抽出物をＳｅｉｔｚ  Ｓｕｐｒａ１５００で濾過した。その後、まだ幾分湿っている残留ドラッグに対して、８００ｇの９２％（ｗ／ｗ）エタノールを用いてｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘでまず５分間抽出を行った後に攪拌しながら６０℃で１時間抽出を行うという工程を２回行った。その後、それをＳｅｉｔｚ  Ｓｕｐｒａ１５００で濾過し、得られた抽出溶液を水浴の温度が５５〜６５℃である回転式蒸発器でエタノールから分離させ、乾燥キャビネット内で６０℃で乾燥させた。
【００４７】
図１にグラフで表されている結果は、分析されたプレニル化成分の濃度が、水を用いた予備抽出の温度に大きく依存していることを示している。
【００４８】
実施例５：  エストロゲン活性についてのホップ抽出物の検査
人間のエストロゲン受容体α（ＥＲ−α）およびβ（ＥＲ−β）との相互作用について、抽出物、比較対象の抽出物および本発明による抽出物の各成分を検査するために、競合受容体結合分析法を実施した。これにより、放射性標識エストラジオールがまず人間のエストロゲン受容体と結合し、そして検査対象の試験物質で処理された。これにより、サンプルのエストロゲン能に対応する標識エストラジオールの一部が置換された。錯体がヒドロキシルアパタイトに結合した後に、余分なエストラジオールを洗い流した。エストロゲン受容体ＥＲ−αおよびＥＲ−βは、組み換えヒト受容体として市販されている。試験調製物は、それぞれ、１，０００μｌのＴＥＤＧ緩衝液（１０ｍＭトリス、１．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、ｐＨ：７．５）、５μｌの受容体（２００ｎＭ）、１０μｌの３Ｈ−エストラジオールおよび１０μｌのエタノール（コントロール値）、１０μｌのジエチルスチロエストロール（１００ｍＭ、ポジティブコントロール）または１０μｌの抽出物または前記抽出物の成分で構成されていた。前記調製物を慎重に混合し、室温で約１６時間暗所で保温した。保温後、２５０μｌのヒドロキシルアパタイト（ＨＡＰ）を添加してたんぱく質を吸収させた。１５分間の保温の間、前記調製物は、それぞれを５分間ずつずらしながら、手で混合した。１０，０００ｒｐｍで数秒間遠心分離を行うことによって沈殿物を分離し、上澄みをピペットで採取した。得られたペレットを１，０００μｌのＴＥＤＧ緩衝液で３回洗浄し、測定のために１，０００μｌのエタノールを添加し、混合物を懸濁化させ、シンチレーション瓶に移した。９ｍｌの液体シンチレータ（Ｒｅａｄｙ  Ｓａｆｅ，  Ｂｅｃｋｍａｎｎ）を添加した後、Ｂｅｃｋｍａｎｎベータカウンタを用いて、完全な3Ｈウィンドウの測定を行った。
【００４９】
試験物質の結合能の特徴付けは、エストラジオールの置換の量−効果プロットからＥＤ50値を求めることによって行われた。その結果は表１に示されており、検査されたすべての成分について両方のエストロゲン受容体との強い相互作用を示している。驚くべきことに、本発明による抽出物は、単体成分の活性のおかげで、予想よりも基本的に効果的であることが証明された。一方、比較用の抽出物は、本発明による抽出物の活性よりも少なくとも１０倍弱い活性を両方の受容体に対して示した。
【００５０】
【表２】
2004537604.tif 000004
【００５１】
さらに、酵母細胞（サッカロミケス）を用いたレポータージーンアッセイによって、エストロゲン特性について抽出物を試験した。前記細胞を人間のα−エストロゲン受容体およびエストロゲン応答配列とβ−ガラクトシダーゼ酵素のための遺伝子とを含有する発現プラスミドで安定してトランスフェクトした。すべてのサンプルを２０ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯに溶かし、希釈せずに、または、１／１０、１／１００または１／１０００の割合でＤＭＳＯで希釈した後に、１〜１００μｌの培地の入った９６ウェル平底マイクロタイターディッシュに入れた。次に、１００μｌの酵母懸濁液および発色基質クロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを添加した。培地もしくは溶媒のいずれかのみで満たされているかまたは標準的な濃度の１７βエストラジオールの入ったコントロールウェルを各ディッシュに与えた。酵母細胞を３２℃で７２時間培養した後、培地の吸収をマイクロタイターディッシュ光度計で５４０ｎｍで測定した。サンプルは、２回、部分的にチェックした。
【００５２】
【表３】
2004537604.tif 000005
【００５３】
分析の結果を図２に示す。これにより、１７β−エストラジオールの標準的なプロットと比較して活性が（最大刺激の約１０％に相当する）バックグラウンド値よりもはるかに高いそれらの抽出物は「活性である」と分類される。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】水による予備抽出の温度に対する分析成分の濃度の依存を示す。
【図２】実施例で得られたホップ抽出物のエストロゲン活性の結果を示す。
【図１】
2004537604.tif 000006
【図２】
2004537604.tif 000007
【国際公開パンフレット】
2004537604.tif 000008
2004537604.tif 000009
2004537604.tif 000010
2004537604.tif 000011
2004537604.tif 000012
2004537604.tif 000013
2004537604.tif 000014
2004537604.tif 000015
2004537604.tif 000016
2004537604.tif 000017
2004537604.tif 000018
2004537604.tif 000019
2004537604.tif 000020
2004537604.tif 000021
2004537604.tif 000022
2004537604.tif 000023
2004537604.tif 000024
2004537604.tif 000025
2004537604.tif 000026
2004537604.tif 000027
2004537604.tif 000028
2004537604.tif 000029
2004537604.tif 000030
2004537604.tif 000031
2004537604.tif 000032
2004537604.tif 000033
2004537604.tif 000034
【手続補正書】
【提出日】平成15年7月24日(2003.7.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホップ抽出物を得るための方法であって、
（ａ）Ｃ5〜Ｃ7アルカンまたは超臨界ＣＯ2でホップからドラッグを１回以上抽出し、その溶液から残留ドラッグを分離する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られた残留ドラッグを、６０〜９５℃の温度において、水で１回以上抽出し、前記残留ドラッグを分離する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた残留ドラッグを８０〜９６％（ｗ／ｗ）エタノールで１回以上抽出し、得られた抽出溶液を濾過する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた合体した抽出溶液から溶媒を除去し、得られた残留物を乾燥させる工程と、
を含んでなる前記方法。
【請求項２】
工程（ａ）における抽出が１回、２回または３回行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）における溶媒が、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサンおよびｎ−ヘプタンからなる群から選択される、請求項１または２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）における溶媒がｎ−ヘプタンである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）における抽出が約９０℃で行われる、請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
工程（ｃ）における溶媒が９２％（ｗ／ｗ）エタノールである、請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
工程（ａ）における溶媒がｎ−ヘプタンであり、そして工程（ｃ）における溶媒が９２％（ｗ／ｗ）エタノールである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）における溶媒が超臨界ＣＯ2であり、そして工程（ｃ）における溶媒が９２％（ｗ／ｗ）エタノールである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
α苦味酸の含有率が少なくとも０．５％であり、キサントフモールの含有率が少なくとも２％であり、そして６−プレニルナリンゲニン、８−プレニルナリンゲニンおよびイソキサントフモールからなる群から選択されるプレニル化フラボンの含有率が少なくとも０．５％であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１つによって得られうるホップ抽出物。
【請求項１０】
α苦味酸の含有率が少なくとも０．８％であり、キサントフモールの含有率が少なくとも３％であり、そして６−プレニルナリンゲニン、８−プレニルナリンゲニンおよびイソキサントフモールからなる群から選択されるプレニル化フラボンの含有率が少なくとも０．７％であることを特徴とする、請求項９に記載のホップ抽出物。
【請求項１１】
α苦味酸の含有率が少なくとも０．５％であり、キサントフモールの含有率が少なくとも２％であり、そして６−プレニルナリンゲニン、８−プレニルナリンゲニンおよびイソキサントフモールからなる群から選択されるプレニル化フラボンの含有率が少なくとも０．５％であることを特徴とするホップ抽出物と、慣用の薬学的に許容できる添加剤とを含んでなる薬学的調整品。
【請求項１２】
α苦味酸の含有率が少なくとも０．８％であり、キサントモールの含有率が少なくとも３％であり、そして６−プレニルナリンゲニン、８−プレニルナリンゲニンおよびイソキサントフモールからなる群から選択されるプレニル化フラボンの含有率が少なくとも０．７％であることを特徴とするホップ抽出物を含んでなる、請求項１１に記載の薬学的調整品。
【請求項１３】
エストロゲンの欠乏によって、または、性ホルモンに関連する代謝、特にエストロゲン代謝の異常によって生じる病気であって、更年期障害、良性前立腺肥大症、骨粗鬆症、アルツハイマー病および循環系の病気からなる群から選択される病気を予防および治療するための薬剤を調製するための、請求項９または１０に記載のホップ抽出物または請求項１１または１２に記載の薬学的調整品の使用。
【請求項１４】
性ホルモン依存性癌を予防するための薬剤を調製するための、請求項９または１０に記載のホップ抽出物または請求項１１または１２に記載の薬学的調整品の使用。
【請求項１５】
前記性ホルモン依存性癌は、乳癌、前立腺癌および子宮癌からなる群から選択される、請求項１４に記載の使用。
【国際調査報告】
2004537604.tif 000035
2004537604.tif 000036
2004537604.tif 000037
2004537604.tif 000038
2004537604.tif 000039
2004537604.tif 000040
2004537604.tif 000041
2004537604.tif 000042
2004537604.tif 000043
2004537604.tif 000044