(57)【要約】本発明は、除草剤耐性植物、特にＨＰＰＤ阻害性除草剤に耐性の植物の新規な製造方法、該方法に使用し得る酵素をコードする核酸配列、これらの核酸配列を含有する発現カセット、及び、少なくとも１つのこのような発現カセットを含むトランスジェニック植物に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
除草剤によって阻害される代謝経路をバイパスさせ得る少なくとも１つの酵素を植物体内で発現させることを特徴とする植物に除草剤耐性を与える方法。
【請求項２】
除草剤がＨＰＰＤインヒビターであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＨＰＰオキシダーゼ及び／またはＨＰＡＨ及び／またはＨＰＡＣを植物体内で発現させることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＨＰＰオキシダーゼ活性を有していることを特徴とするポリペプチド。
【請求項５】
ＨＰＰＤインヒビターに感受性でないことを特徴とする請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号２のアミノ酸配列、そのフラグメント及びその相同配列を含むことを特徴とする、請求項４または５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号４及び配列番号６、それらのフラグメント及びそれらの相同配列から成る群から選択されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
ＨＰＡＨ活性を有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項９】
ＨＰＰＤインヒビターに感受性でないことを特徴とする請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号８のアミノ酸配列、そのフラグメント及びその相同配列を含むことを特徴とする、請求項８または９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ＨＰＡＣ活性を有していることを特徴とするポリペプチド。
【請求項１２】
ＨＰＰＤインヒビターに感受性でないことを特徴とする請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号１０のアミノ酸配列、そのフラグメント及びその相同配列を含むことを特徴とする請求項１１または１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号１２及び配列番号１４、それらのフラグメント及びそれらの相同配列から成る群から選択されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
請求項４から１４のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードしていることを特徴とする核酸配列。
【請求項１６】
配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号１５のコーディング配列、それらの相同配列、それらのフラグメント、及び、前記配列番号１、３、５または１５に選択的にハイブリダイズし得る配列から成る群から選択された核酸配列を含むことを特徴とする、ＨＰＰオキシダーゼをコードする核酸配列。
【請求項１７】
配列番号７または配列番号１７のコーディング配列、それらの相同配列、それらのフラグメント、及び、前記配列番号７または１７に選択的にハイブリダイズし得る配列から成る群から選択された核酸配列を含むことを特徴とする、ＨＰＡＨをコードする核酸配列。
【請求項１８】
配列番号９、配列番号１１、配列番号１３または配列番号１９のコーディング配列、それらの相同配列、それらのフラグメント、及び、前記配列番号９、１１、１３または１９に選択的にハイブリダイズし得る配列から成る群から選択された核酸配列を含むことを特徴とするＨＰＡＣをコードする核酸配列。
【請求項１９】
請求項１５から１８のいずれか一項に記載の核酸配列から成ることを特徴とするコーディング配列を含む発現カセット。
【請求項２０】
請求項１９に記載の発現カセットを少なくとも１つ含むことを特徴とするクローニング及び／または発現ベクター。
【請求項２１】
請求項１９に記載の発現カセットを少なくとも１つ含むことを特徴とする形質転換植物細胞。
【請求項２２】
請求項１９に記載の発現カセットを少なくとも１つ含むことを特徴とする形質転換植物。
【請求項２３】
請求項１９に記載の発現カセットを少なくとも１つ含むことを特徴とする請求項２２に記載の形質転換植物の種子。
【請求項２４】
請求項１９に記載の発現カセットを少なくとも１つ植物のゲノムに導入することを特徴とする植物の形質転換方法。
【請求項２５】
請求項２２に記載の形質転換植物に除草剤を施用することを特徴とするＨＰＰＤインヒビターによる植物、特に作物の選択的除草方法。
【請求項２６】
請求項２３に記載の種子または請求項２２に記載の形質転換植物を含む圃場区域の雑草を駆除するために、前記雑草に対して毒性であるが本発明の種子または形質転換植物には実質的に無害な用量のＨＰＰＤ阻害性除草剤を圃場の前記区域に施用することを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２２に記載の形質転換植物の栽培方法であって、前記植物の栽培に適した圃場の区域に請求項２３に記載の種子を播種する段階と、雑草が存在する場合にはＨＰＰＤをターゲットとする除草剤を雑草に対して毒性であるが前記種子または前記形質転換植物には実質的に無害な用量で前記圃場の前記区域に施用する段階と、次いで植物が所望の成熟度に到達したときに栽培植物を収穫する段階と、場合によっては収穫した植物から種子を分離する段階とから成る方法。
【請求項２８】
除草剤を発芽前及び／または発芽後に施用することを特徴とする請求項２５から２７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、植物を除草剤、特にＨＰＰＤ阻害性除草剤に耐性にするための新規な方法、この方法に使用し得る酵素をコードする核酸配列、該配列を含有する発現カセット、これらの発現カセットの少なくとも１つを含むトランスジェニック植物に関する。
【０００２】
ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼはパラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸（ＨＰＰ）がホモゲンチジン酸塩に変換される反応を触媒する酵素である。この反応は酸素と共存する鉄（Ｆｅ２＋）の存在下で生じる（Ｎ．Ｐ．Ｃｒｏｕｃｈら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５３，２０，６９９３−７０１９，１９９７）。
【０００３】
更に幾つかの分子がこの酵素を阻害することが知られている。これらの分子は酵素に結合し、ＨＰＰがホモゲンチジン酸塩に変換されるのを阻害する。これらの分子のあるものは除草剤として使用することはできたが、植物体内で生じた反応阻害が被処理植物の葉の白化及び該植物の死を招くことは避けられなかった（Ｋ．Ｅ．Ｐａｌｌｅｔｔら，１９９７  Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ．５０  ８３−８４）。当業界で記載されたＨＰＰＤをターゲットとするこのような除草剤としては特に、イソキサゾール類（欧州特許ＥＰ  ４１８  １７５、ＥＰ  ４７０  ８５６、ＥＰ  ４８７  ３５２、ＥＰ  ５２７  ０３６、ＥＰ  ５６０  ４８２、ＥＰ  ６８２  ６５９、米国特許ＵＳ  ５  ４２４  ２７６）、特にトウモロコシの選択的除草剤であるイソキサフルトール、ジケトニトリル類（欧州特許ＥＰ  ４９６  ６３０、ＥＰ  ４９６  ６３１）、特に２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−ＣＦ３フェニル）プロパン−１，３−ジオン及び２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−２，３−Ｃｌ２フェニル）プロパン−１，３−ジオン、トリケトン類（欧州特許ＥＰ  ６２５  ５０５、ＥＰ  ６２５  ５０８、米国特許ＵＳ  ５，５０６，１９５）、特にスルコトリオンまたはメソトリオン、あるいはピラゾリネート類がある。
【０００４】
ＨＰＰＤが確かにジケトニトリル（ＤＫＮ）のターゲットであることを確認するため及びＨＰＰＤが少なくともある用量でジケトニトリルの唯一のターゲットであることを証明するために、３種類の培地を使用し無菌条件下にＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ種子を発芽させるｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験を実験室で行った。３種類の培地は：
１．Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ培地（Ｔ．Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｆ．Ｓｋｏｏｇ，１９６２。タバコ組織培養物を急速に成長させバイオアッセイを行うための修正培地。Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１５，４７３−４７９）、発芽コントロール実験；
２．用量１ｐｐｍのＤＫＮを加えたＭＳ培地；
３．同じ用量のＤＫＮと５ｍＭ濃度のホモゲンチジン酸塩とを加えたＭＳ培地：である。
【０００５】
培地１では発芽が正常に生じ、各幼植物が鮮やかな緑色の２枚の子葉を生じることが極めて明らかである。以後の発達も正常である。培地２では発芽は生じるが、芽生えた幼植物は白っぽく、２枚の子葉は全く色付いていない。幼植物はその後数日で枯れる。培地３では、発芽が正常に生じ、子葉は鮮やかな緑色である。植物は発達するが、発達が極めて速い。培地中のホモゲンチジン酸塩の量が減少し、白化の初期徴候が現れ、植物の成長が止まり、最終的には培地Ｎｏ．２で行った試験と同様に植物が枯れる。
【０００６】
上記の試験から、ＨＰＰＤが確かに植物体内でＤＫＮのターゲットとなることを確認でき、また、ＨＰＰＤが唯一のターゲットであると考えることができる。これらの試験はまた、培養培地中のホモゲンチジン酸塩は、細胞が正常に機能するため及び植物が生存するためにはホモゲンチジン酸塩が必要な細胞部位まで輸送されることを示す。
【０００７】
植物を除草剤耐性にするために使用し得る３つの戦略が現存する：（１）除草剤またはその活性代謝産物を無毒性分解産物に変換する酵素、例えばブロモキシニル耐性またはバスタ耐性の酵素で解毒する（欧州特許ＥＰ  ２４２  ２３６、ＥＰ  ３３７  ８９９）；（２）ターゲット酵素を除草剤またはその活性代謝産物に対する感受性の低下した機能性酵素、例えばグリホセート耐性酵素に突然変異させる（欧州特許ＥＰ  ２９３  ３５６、Ｓ．Ｒ．Ｐａｄｇｅｔｔｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，３３，１９９１）；または、（３）インヒビターの存在にもかかわらず十分な機能性酵素が得られるように、除草剤に対するターゲット酵素の反応動力学定数に照らして十分な量のターゲット酵素が植物体内で産生されるように感受性酵素を超発現させる。
【０００８】
ＨＰＰＤインヒビター耐性植物を得ることに成功したと記載されたのは上記の三番目の戦略（国際特許ＷＯ  ９６／３８５６７）である。これは、感受性（非突然変異）ターゲット酵素の超発現という簡単な戦略で植物に農業レベルの除草剤耐性を与えることに初めて成功した戦略である。また、Ｃ末端部分に突然変異を有しておりＨＰＰＤインヒビターに対する耐性が改善されたＨＰＰＤが同定されたので、第二戦略の使用による植物の耐性改善も可能になった（国際特許ＷＯ  ９９／２４５８５）。
【０００９】
本発明は、植物を除草剤耐性にするための新規な方法から成る。本発明方法は、新規な即ち第四の除草剤耐性戦略を使用する。この新規な戦略は、除草剤によって阻害される代謝経路をバイパスする段階から成る。この代謝バイパスは以下のように要約できる：
−除草剤“Ｈ”が基質“Ｓ”を生成物“Ｐ”に変換する酵素“Ｅ”の活性を阻害する作用を有しており、生成物Ｐ及びその代謝産物が植物の生命に必須であるとすれば、
−代謝バイパスは、“Ｈ”に感受性でなく“Ｓ”を中間生成物“Ｉ”に変換し得る少なくとも１つの新しいヘテロロガス酵素“ＮＥ”を植物体内で発現させることから成る。その後、植物本来の生合成経路によってまたは同じく“Ｈ”に感受性でない少なくとも１つの別のヘテロロガス酵素“ＯＥ”の発現によって中間生成物“Ｉ”が“Ｐ”に変換される。
−“Ｉ”が、植物によって天然に産生される中間体であるかまたは“Ｈ”に感受性でなく“Ｓ”を“Ｉ”に変換し得る少なくとも１つの新しいヘテロロガス酵素“ＮＥ”の発現によって得られる中間体であるとき、代謝バイパスはまた、“Ｈ”に感受性でなく“Ｉ”を“Ｐ”に変換し得る少なくとも１つの別のヘテロロガス酵素“ＯＥ”を発現させることから成る。
【００１０】
より特定的には本発明は、植物をＨＰＰＤインヒビター耐性にするための新規な方法に関する。該方法はＨＰＰＤの代謝をバイパスすることから成る。
【００１１】
植物体内の代謝バイパス経路がこれまで記載されたことはない。
【００１２】
ＨＰＰをホモゲンチジン酸塩に変換させるためには、先ずＨＰＰオキシダーゼ活性を有している酵素抽出物によってＨＰＰを４−ヒドロキシフェニル酢酸（４−ＨＰＡ）に変換し、次いで４−ＨＰＡ  １−ヒドロラーゼ活性を有している酵素抽出物によって４−ＨＰＡをホモゲンチジン酸塩に変換する（国際特許ＷＯ  ９９／３４００８）。このバイパス経路を図１に示す。
【００１３】
文献調査によれば、ＨＰＰＤのバイパス経路を構築するために必要な酵素活性が１９７０年代に未精製の細菌抽出物で特性決定されたことが判明する。即ち、ＨＰＰオキシダーゼ（ＨＰＰＯ，Ｅ．Ｃ．１．２．３．−）、及び、４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ，Ｅ．Ｃ．１．１４．１３．１８）の活性がそれぞれＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ（Ｂｌａｋｌｅｙ，１９７７）及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ（Ｈａｒｅｌａｎｄら，１９７５）中で同定された。それ以来、ＨＰＡＨだけはＳｕｅｍｏｒｉら（１９９６）によって精製されたが、タンパク質配列も核酸配列も公表されていない。従って、これらの酵素活性をコードする遺伝子を同定することが必要である。
【００１４】
バイパス経路中で、ＨＰＰは４−ＨＰＡを経由してＨＧＡに変換される。ところが、４−ＨＰＡという化合物は植物体内でめったに同定されない。４−ＨＰＡは、アシチルベ、キネンシス（Ａｓｔｉｌｂｅ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ；Ｋｉｎｄｌ，１９６９）、オオバコ（Ｐｌａｎｔａｇｏ種；Ｓｗｉａｔｅｋ，１９７７）、タンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ；Ｄｅｙ  ＆  Ｈａｒｂｏｒｎｅ，１９９７）、ヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ；Ｓｗｉａｔｅｋら，１９９８）、レンギョウ（Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ  ｓｕｓｐｅｎｓａ）の実（Ｌｉｕら，１９９８）、及び、最後に、海藻（Ｕｌｖａ  ｌａｃｔｕｃａ；Ｆｌｏｄｉｎら，１９９９）中に存在している。４−ＨＰＡの起原に関するデータは殆ど存在しない。４−ＨＰＡは、チロシン、シキミン酸塩またはチラミンに由来し得ると考えられるが、植物体内で４−ＨＰＡがどのように変遷しどのような役割を果たしているかについてそれ以上の情報はない。Ｋｉｎｄｌ（１９６９）は、４−ＨＰＡが３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸を経由して分解することを示し、Ｆｌｏｄｉｎら（１９９９）は、４−ＨＰＡが４−ヒドロキシマンデル酸を経由して２，４，６−トリブロモフェノールに変換され、緑藻類（Ｕｌｖａ  ｌａｃｔｕｃａ）に蓄積することを証明した。Ｇｒｏｓｓ（１９７５）は、４−ＨＰＡが幾つかの高等植物の成長調整剤であり得ることを示唆し、Ａｂｅら（１９７４）は、４−ＨＰＡが紅藻類のオーキシンの類似体であると考えている。
【００１５】
ＨＰＰＤの代謝バイパス経路を設計するためには、上記の２つの活性を担当する（１種または複数の）酵素をコードする遺伝子及び核酸配列を予め同定し単離することが必要であった。
【００１６】
本発明による定義
“核酸配列”：特に二重鎖の形態のＤＮＡまたはＲＮＡ型、好ましくはＤＮＡ型のヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列。核酸配列は天然起原、特にゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡでもよく、または、合成もしくは半合成配列でもよい。核酸配列を構成する核酸は、コーディング配列のコドンが配列を発現させる宿主生物に最適になるように、または、１つもしくは複数の制限部位が導入もしくは除去されるように選択されている。合成または半合成の核酸配列の作製方法は当業者に公知である。
【００１７】
“選択的にハイブリダイズし得る配列”：バックグラウンドノイズよりも有意に高いレベルで基準核酸配列とハイブリダイズする核酸配列。バックグラウンドノイズは、存在する別のＤＮＡ配列、特にｃＤＮＡライブラリー中に存在する別のｃＤＮＡのハイブリダイゼーションに関係する。選択的にハイブリダイズし得る配列と上記のような本発明の配列番号によって定義された配列との相互作用によって生じたシグナルのレベルは、バックグラウンドノイズを発生する別のＤＮＡ配列との相互作用によって生じたシグナルのレベルよりもほぼ１０倍、好ましくは１００倍も大きい。相互作用のレベルは例えば、プローブを３２Ｐのような放射性元素で標識することによって測定できる。選択的ハイブリダイゼーションは一般に、極めて緊縮性の培地条件（例えば、０．０３ＭのＮａＣｌ及び０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム、約５０−６０℃）を使用することによって得られる。ハイブリダイゼーションは勿論当業界の常法に従って行うことができる（特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）。
【００１８】
“核酸配列のホモローグ”：基準核酸配列に比べて１つまたは複数の配列修飾を有している核酸配列。これらの修飾は常用の突然変異技術によって得られてもよく、または、ハイブリダイゼーションによる上記配列の作製に使用される合成オリゴヌクレオチドの選択によって得られてもよい。同一アミノ酸の発現に導く核酸の多数の組合せに関しては、本発明の基準配列と対応ホモローグとがかなり違っていてもよい。有利な相同度は、基準配列に比べて少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、いっそう好ましくは少なくとも９０％の相同度であろう。これらの修飾は一般に中性であるのが好ましい。即ち、コーディング配列の場合には、コードされているタンパク質またはペプチドの一次配列にこれらの修飾が影響を与えないのが好ましい。しかしながら、これらの修飾は基準配列に比べて核酸配列の機能に影響を与えない非サイレントの修飾または突然変異を導入してもよい。核酸配列間の相同性を測定し同定する方法は当業者に公知である。例えば、ＰＩＬＥＵＰプログラムまたはＢＬＡＳＴプログラム（特に、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０）を使用し得る。
【００１９】
“フラグメント”：基準核酸またはポリペプチドの配列が部分的に欠失しているが該基準配列の機能は保存している基準核酸またはポリペプチドの配列フラグメント。
【００２０】
“ヘテロローグ”：天然生物体内の同じ機能を有している核酸配列とは異なる核酸配列。ヘテロロガス配列はその天然環境でｉｎ  ｓｉｔｕに修飾された核酸配列から成る。また、その天然生物から単離され次いでこの同じ生物に再導入された核酸配列でもよい。また、別の核酸配列に対してヘテロロガスな核酸配列、即ち、別の配列との間で天然には存在しないような会合を生じている配列でもよい。このような場合としては特に、天然の会合が一般には存在しない種々の核酸配列から構成された発現カセットがある。
【００２１】
“タンパク質配列のホモローグ”：基準タンパク質の一次配列とは異なる一次配列を有しているが該基準配列と同じ機能を果たすタンパク質配列。ポリペプチド間またはタンパク質間の相同性を測定及び同定する方法も当業者に公知である。相同性を計算するために例えばＵＷＧＣＧパッケージ及びＢＥＳＴＦＩＴＴプログラムを使用し得る（Ｄｅｖｅｒｅｘｕら，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２，３８７−３９５）。
【００２２】
“発現カセット”：コーディング配列が宿主生物体内で発現するために必要な種々の機能要素を含む核酸配列。これらの機能要素は転写方向に、コーディング配列に機能的に連結されたプロモーターとも呼ばれる調節プロモーター配列、及び、ターミネーターまたはストップとも呼ばれる調節ターミネーター配列を含む。発現カセットはまた、調節プロモーター配列とコーディング配列との間に、転写アクチベーターまたはエンハンサー及び／またはイントロンのような調節要素を含む。
【００２３】
“宿主生物”：本発明によればこの用語は本質的に植物細胞または植物を意味する。クローニングベクターの場合には、宿主生物はまた細菌、真菌類または酵母でもよい。
【００２４】
“植物細胞”：植物に由来し、カルスのような未分化組織、胚のような分化組織、植物の部分、植物または種子を構成する細胞を意味する。
【００２５】
“植物””特に単子葉類または双子葉類の光合成可能な分化多細胞生物、より特定的には、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、サトウキビ、ナタネ、ダイズ、テンサイ、ジャガイモ、タバコ、綿、クローバー、芝生のような動物の飼料もしくはヒトの食料となるかまたはならない栽培植物、あるいは、ペチュニアのような鑑賞植物、あるいは、バナナの木、ブドウ、ラズベリー、イチゴ、トマト、サラダ菜、など。
【００２６】
“調節プロモーター配列”：植物体内の調節プロモーター配列としては、植物体内で天然に発現される遺伝子の調節プロモーター配列、特に、植物の葉で発現されるプロモーター、例えば細菌、ウイルスもしくは植物起原の“構成性”プロモーターまたは植物のリブロース−ビスカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）の小サブユニットの遺伝子のプロモーターのような“光依存性”プロモーターを使用してもよく、あるいは、使用できる公知の適当なプロモーターのいずれを使用してもよい。植物起原のプロモーターとしては、欧州出願ＥＰ  ０  ５０７  ６９８に記載されているようなヒストンプロモーター、または、イネのアクチンプロモーター（米国特許ＵＳ５，６４１，８７６）が挙げられる。植物ウイルス遺伝子のプロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルスのプロモーター（ＣＡＭＶ  １９Ｓまたは３５Ｓ）、ＣｓＶＭＶ（ＵＳ．．．）のプロモーター、または、サーコウイルスのプロモーター（ＡＵ  ６８９  ３１１）が挙げられる。また、植物の特定領域または組織に特異的な調節プロモーター配列、より特定的には種子特異的プロモーター（［２２］Ｒ．Ｄａｔｌａら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．（１９９７）３，２６９−２９６）、特にナピンのプロモーター（欧州特許ＥＰ  ２５５  ３７８）、ファセオリンのプロモーター、グルテニンのプロモーター、ヘリアンチニンのプロモーター（国際特許ＷＯ  ９２／１７５８０）、アルブミンのプロモーター（ＷＯ  ９８／４５４６０）、オレオシンのプロモーター（ＷＯ  ９８／４５４６１）、ＡＴＳ１またはＡＴＳ３のプロモーター（ＰＣＴ／ＵＳ９８／０６９７８、１９９８年１０月２０日出願、参照によって本発明に含まれるものとする）がある。また、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）のプロモーター、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ）のプロモーター、キチナーゼのプロモーター、グルカナーゼのプロモーター、プロテイナーゼインヒビター（ＰＩ）のプロモーター、ＰＲ１ファミリーの遺伝子のプロモーター、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）のプロモーターまたはｖｓｐＢ遺伝子のプロモーター（米国特許ＵＳ５，６７０，３４９，表３）、ＨＭＧ２プロモーター（米国特許ＵＳ５，６７０，３４９）、リンゴのベータ−ガラクトシダーゼ（ＡＢＧ１）のプロモーターまたはリンゴのアミノシクロプロパンカルボキシレートシンターゼ（ＡＣＣシンターゼ）のプロモーター（国際特許ＷＯ  ９８／４５４４５）から選択された誘導性プロモーターも有利に使用し得る。
【００２７】
“転写アクチベーター（エンハンサー””：例えば、国際出願ＷＯ  ８７／０７６４４に記載されたタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）またはＣａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ＆  Ｆｒｅｅｄによって記載されたタバコ腐食ウイルス（ＴＥＶ）の転写アクチベーターが挙げられる。
【００２８】
“イントロン”：翻訳されない核酸配列。例えば、双子葉植物体内の発現については国際特許出願ＷＯ  ９７／０４１１４に記載されたようなＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのヒストン遺伝子のイントロン１があり、単子葉植物体内の発現については国際特許出願ＷＯ  ９９／３４００５に記載されたイネアクチンの第一イントロンまたはトウモロコシのａｄｈ１イントロンがある。
【００２９】
“コーディング配列”：翻訳される核酸配列。この配列は、有益なタンパク質またはペプチドをコードしており、場合によっては５′位または３′位でシグナルペプチドまたは特定の細胞区画にアドレスするペプチドをコードする配列に融合した配列を含む。
【００３０】
“シグナルペプチドまたはアドレシングペプチド”：Ｎ−またはＣ−末端部で有益なタンパク質またはペプチドに融合し、該タンパク質またはペプチドを特定の細胞区画にアドレスし得る細胞機構によって認識されるペプチド。このようなペプチドとしては特に、有益なタンパク質またはペプチドを葉緑体にアドレスし得る葉緑体トランジットペプチド、または、種々の細胞区画、例えば、液胞、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ装置、などに対するシグナルペプチドがある。このようなタンパク質配列の役割は特に、雑誌Ｐｌａｎｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８８）の３８号に記載されている。この刊行物は、植物細胞の種々の区画へのタンパク質輸送について多くの紙面を費やして記載している（Ｓｏｒｔｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  ｖａｃｕｏｌｅｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｐｐ１２７−１４４；  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｒｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐｐ１４５−１６２；  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ａｎｄ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｉｃ  ｅｎｖｅｌｏｐｐｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｐｐ９１−２０７；  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｙｌａｋｏｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ  ｐｐ２０９−２２１；  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｍｐｏｒｔ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ  ｐｐ３１１−３３８）。
【００３１】
“葉緑体トランジットペプチド”：葉緑体トランジットペプチドは、トランジットペプチド／有益なタンパク質（ペプチド）が融合した融合タンパク質が発現できるように有益なタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列の５′位の核酸配列によってコードされている。トランジットペプチドは、有益なタンパク質またはペプチドを色素体、特に葉緑体にアドレスし得る。融合タンパク質は色素体膜を通過するときにトランジットペプチドと有益なタンパクまたはペプチドとの間で開裂される。トランジットペプチドはＥＰＳＰＳトランジットペプチドのように一本鎖でもよく（米国特許ＵＳ  ５，１８８，６４２）、または、場合によっては成熟ＲｕＢｉｓＣＯ  ｓｓｕのＮ末端部の幾つかのアミノ酸を含む植物のリブロース−ビスカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼの小サブユニット（ＲｕＢｉｓＣＯ  ｓｓｕ）のトランジットペプチドでもよく、あるいはまた、欧州特許ＥＰ  ５０８  ９０９に記載されたような、色素体に局在する成熟タンパク質のＮ末端配列の部分に融合した第一の植物トランジットペプチドと該第一ペプチドに融合した第二の植物トランジットペプチドとから成る多重トランジットペプチド、より特定的には欧州特許ＥＰ  ５０８  ９０９中でコーディング配列に関して記載されたような、トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯ  ｓｓｕのＮ末端の２２個のアミノ酸に融合したヒマワリのＲｕＢｉｓＣＯ  ｓｓｕのトランジットペプチドと該ペプチドに融合したトウモロコシＲｕＢｉｓＣＯ  ｓｓｕのトランジットペプチドとから成る最適化トランジットペプチドでもよい。
【００３２】
“シグナルペプチド”：これらのペプチド配列は特に、雑誌Ｐｌａｎｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９８）の３８号に記載されている。この刊行物は植物細胞の種々の区画へのタンパク質の輸送について多くの紙面を費やして記載している（Ｓｏｒｔｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  ｖａｃｕｏｌｅｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｐｐ１２７−１４４；  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｒｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐｐ１４５−１６２；  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ａｎｄ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｉｃ  ｅｎｖｅｌｏｐｐｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｐｐ９１−２０７；  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｙｌａｋｏｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ  ｐｐ２０９−２２１；  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｍｐｏｒｔ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ  ｐｐ３１１−３３８）。小胞体へのアドレシングペプチドは文献に多くの事例で記載されている（Ｊ．Ｍ．Ｎｅｕｈａｕｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｒｏｇｅｒｓ  Ｓｏｒｔｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  ｖａｃｕｏｌｅｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌｓ  Ｐｌａｎｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３８：１２７−１４４，１９９８）。好ましい小胞体ペプチドは、Ｊ．Ｍ．Ｆｅｒｕｌｌｏら（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３３：６２５−６３３，１９９７）に記載されたタンパクの小胞体ペプチドであり、該ペプチドが有益なタンパク質またはペプチドのＣ末端部に融合している。
【００３３】
“調節ターミネーター配列”：この用語はポリアデニル化配列も含み、植物細胞中または植物体内で機能性のいかなる配列をも意味する。例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのｎｏｓターミネーターのように細菌起原でもよく、ＣａＭＶ  ３５Ｓターミネーターのようにウイルス起原でもよく、あるいは、欧州特許出願ＥＰ  ０  ６３３  ３１７に記載されているヒストンのように植物起原であってもよい。
【００３４】
“ベクター”：少なくとも１つの発現カセットを含み宿主生物を形質転換させるクローニング及び／または発現ベクター。ベクターは発現カセットに加えて少なくとも１つの複製起点を含む。ベクターは発現カセットの導入によって形質転換されたプラスミド、コスミド、バクテリオファージまたはウイルスから構成され得る。形質転換すべき宿主生物に応じたこのような形質転換ベクターは当業者に公知であり、文献にも多数記載されている。植物細胞または植物の形質転換のためには、栽培植物を形質転換させるために使用でき更にそれ自体の複製要素及び発現要素を含んでいるウイルスが特に適当であろう。
【００３５】
好ましくは植物細胞または植物の形質転換用ベクターがプラスミドである。
【００３６】
ＨＰＰオキシダーゼ
本発明の第一の目的はＨＰＰオキシダーゼ及びその対応ポリペプチドをコードする核酸配列に関する。好ましくはＨＰＰオキシダーゼがＨＰＰＤインヒビター、特にイソキサフルトールのようなイソキサゾール及びそれらのジケトニトリル、特に前述のような物質に感受性でない。ＨＰＰオキシダーゼは特に、細菌例えばＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、特にＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓに由来のＨＰＰオキシダーゼである。有利なＨＰＰオキシダーゼは、アイデンティファイアー配列２（配列番号２）、その相同配列及びそのフラグメントによって表される一次アミノ酸配列をもつタンパク質である。
【００３７】
配列番号２に相同のＨＰＰオキシダーゼのタンパク質配列は特に、配列番号４及び配列番号６、それらの相同配列及びそれらのフラグメントによって表される。
【００３８】
配列番号４によって表されるＨＰＰオキシダーゼは、配列番号２のグリシンがアラニンによって置換されたＨＰＰオキシダーゼに対応する。
【００３９】
本発明はまた、上記に定義のようなＨＰＰオキシダーゼをコードする核酸配列に関する。
【００４０】
好ましくはＨＰＰオキシダーゼをコードする配列がＤＮＡ配列、特にゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり、特にヘテロロガス配列または単離配列である。
【００４１】
本発明のＨＰＰオキシダーゼをコードする配列は特に、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号１５によって表されるＤＮＡ配列、それらの相同配列、それらのフラグメント、及び、配列１、３、５または１５に選択的にハイブリダイズし得る配列のコーディング配列から選択される。
【００４２】
配列番号５のコーディング配列は配列番号１に比べて４６３位、６０２位及び１５１１位に３つの突然変異を含む。これらの突然変異はサイレントである。即ち、対応するポリペプチドには修飾が全く導入されない。
【００４３】
４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼ
本発明の第二の目的は、４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼの発現に必要な手段に関する。幾つかのタンパク質抽出物の活性に関する文献の記載に基づいた予測に反して、細菌体内、特にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ中の４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼ活性は本文中で以後ＨＰＡＨ及びＨＰＡＣと呼ぶ２つの酵素の活性を合せた結果であることが確認された。
【００４４】
ＨＰＡＨ
ＨＰＡＨはＨＰＡを本文中で以後代謝産物Ｚと呼ぶ中間代謝産物に変換させる。代謝産物Ｚの構造は未確定である。ＨＰＡＨがＨＰＡの芳香環をヒドロキシル化し、代謝産物Ｚがケトンの形態で安定するという考え方は真剣な検討の対象となり得る。酵素活性に関するこの仮説を図２に表す。
【００４５】
従って本発明の第二の目的は、ＨＰＡＨ及び対応するポリペプチドをコードする核酸配列に関する。好ましくはＨＰＡＨはＨＰＰＤインヒビター、特にイソキサフルトールのようなイソキサゾール及びそれらのジケトニトリル、特に上記に定義のジケトニトリルに感受性でない。ＨＰＡＨは特に、細菌、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、特にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓに由来のＨＰＡＨである。有利なＨＰＡＨは、アイデンティファイアー配列８及び１８（配列番号８及び１８）、それらの相同配列及びそれらのフラグメントによって表される一次アミノ酸配列をもつタンパク質である。
【００４６】
本発明はまた、上記の定義のようなＨＰＡＨをコードする核酸配列に関する。
【００４７】
好ましくは、ＨＰＡＨをコードする配列がＤＮＡ配列、特にゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり、特にヘテロロガス配列または単離配列である。
【００４８】
本発明のＨＰＡＨをコードする配列は特に、配列番号７または１７によって表される配列、それらの相同配列、それらのフラグメント、及び、配列番号７または１７と選択的にハイブリダイズし得る配列のコーディング部分から選択される。
【００４９】
ＨＰＡＣ
ＨＰＡＣは代謝産物Ｚをホモゲンチジン酸塩に変換し得る第二酵素である。
【００５０】
従って本発明の第三の目的は、ＨＰＡＣ及び対応するポリペプチドをコードする核酸配列に関する。好ましくは、ＨＰＡＣは、ＨＰＰＤインヒビター、特に、イソキサフルトールのようなイソキサゾール及びそれらのジケトニトリル、特に上記に定義のジケトニトリルに感受性でない。ＨＰＡＣは特に細菌、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、特にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓに由来のＨＰＡＣである。ＨＰＡＣは好ましくは、アイデンティファイアー配列１０（配列番号１０）、その相同配列及びそのフラグメントによって表される一次アミノ酸配列をもつタンパク質である。
【００５１】
配列番号１０に相同のＨＰＡＣのタンパク質配列は特に配列番号１２、１４及び２０、それらの相同配列、並びに、それらのフラグメントによって表される。
【００５２】
本発明はまた、上記の定義のようなＨＰＡＣをコードする核酸配列に関する。
【００５３】
好ましくはＨＰＡＣをコードする配列がＤＮＡ配列、特にゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり、特にヘテロロガス配列または単離配列である。
【００５４】
本発明のＨＰＡＣをコードする配列は特に、配列番号９、１１、１３または１９によって表される配列、それらの相同配列、それらのフラグメント、及び、配列番号９、１１、１３または１９とハイブリダイズし得る配列のコーディング領域から選択される。
【００５５】
発現カセット
本発明はまた、上記に定義のようなＨＧＡオキシダーゼ、ＨＧＡＨまたはＨＧＡＣをコードする核酸配列から選択された核酸配列を含むコーディング配列を有している発現カセットに関する。
【００５６】
コーディング配列は更に、５′位または３′位に、シグナルペプチドまたはトランジットペプチドをコードする配列を含む。好ましくはコーディング配列が、５′位にＨＧＡオキシダーゼ、ＨＧＡＨまたはＨＧＡＣをコードする配列、及び、葉緑体をアドレスするトランジットペプチド、特に多重トランジットペプチド、より特定的には最適化トランジットペプチドをコードする配列を含む。
【００５７】
従って本発明はまた、トランジットペプチド／ＨＧＡオキシダーゼ、トランジットペプチド／ＨＧＡＨまたはトランジットペプチド／ＨＧＡＣの形態の融合タンパク質に関する。トランジットペプチドの配列は上記の定義と同義であり、特に、欧州特許出願ＥＰ  ５０８  ９０９に記載されたような最適化トランジットペプチドの配列である。
【００５８】
好ましくは、調節プロモーター配列が、コーディング配列を構成的に発現させ得る調節プロモーター配列から選択される。このような配列としては特に、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター、ＣｓＶＭＶプロモーター、イネのアクチンプロモーターまたはヒストンプロモーターの配列がある。
【００５９】
また、バイパスが必要な遺伝子の発現レベルに近い発現レベルで本発明のコーディング配列が発現されるように本発明のコーディング配列を選択してもよい。本発明の発現カセットには植物のＨＰＰＤ調節プロモーター配列から選択された調節プロモーター配列を使用し得る。
【００６０】
同一植物体内で３つの酵素、ＨＰＰオキシダーゼ、ＨＧＡＨ及びＨＧＡＣを発現させるために、対応するコーディング配列と、植物の種々の機能器官におけるそれらの力及び／またはそれらの所在によって異なる発現プロフィルを示す種々の調節プロモーター配列との発現カセットを選択することが可能である。
【００６１】
ＨＧＡＣ＞ＨＧＡＨ＞ＨＰＰオキシダーゼまたはその逆の発現勾配を可能にする調節プロモーター配列を選択してもよい。
【００６２】
ＨＰＰオキシダーゼ、ＨＧＡＨ及びＨＧＡＣを発現させるために、調節プロモーター配列が、植物のＨＰＰＤプロモーター、ヒストンＨ３またはＨ４のプロモーター、特にシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）もしくはトウモロコシのヒストンプロモーター、より特定的には欧州特許出願ＥＰ  ５０７  ６９８に記載されたようなヒストンプロモーター、植物のＲｕＢｉｓＣＯ  ＳＳＵプロモーター、特に国際特許出願ＷＯ９９／２５８４２に記載されたようなヒマワリもしくはトウモロコシのＲｕＢｉｓＣＯ  ＳＳＵプロモーター、ＣａＭＶ  ３５ＳプロモーターまたはＣｓＶＭＶプロモーター、及び、それらの組合せ、特に欧州特許出願ＥＰ  ５０７  ６９８の実施例に記載されたようなヒストン／３５Ｓのハイブリッドプロモーターから成るグループから選択されるのが有利である。単子葉植物体内で発現させるためには、これらの調節プロモーター配列がイネアクチンの第一イントロンと結合するのが有利であろう。
【００６３】
本発明の１つの実施態様によれば、ＨＰＰオキシダーゼをコードする発現カセットが、ヒストンプロモーターと、ＨＰＰオキシダーゼをコードする配列と、ヒストンターミネーターとを含む（図１２；配列番号１５）。
【００６４】
本発明の別の実施態様によれば、ＨＰＡＨをコードする発現カセットが、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターと、ＨＰＡＨをコードする配列と、ＮＯＳターミネーターとを含む（図１１；配列番号１７）。
【００６５】
本発明の別の実施態様によれば、ＨＰＡＣをコードする発現カセットが、ＣｓＶＭＶプロモーターと、ＨＰＡＣをコードする配列と、ＮＯＳターミネーターとを含む（図１０；配列番号１９）。
【００６６】
ベクター：
本発明はまた、少なくとも１つの本発明の発現カセットを含むクローニング及び／または発現ベクターに関する。
【００６７】
本発明の第一の実施態様によれば、ベクターは、上記の定義のようなＨＰＰオキシダーゼ、ＨＧＡＨまたはＨＧＡＣのコーディング配列を含むカセットから１つだけ選択された本発明の発現カセットを含む。
【００６８】
本発明の第二の実施態様によれば、ベクターは、上記の定義のようなＨＰＰオキシダーゼ、ＨＧＡＨまたはＨＧＡＣのコーディング配列を含むカセットから選択された本発明の発現カセットを２つずつ組合せて含む。即ち、同一ベクター中に、ＨＰＰオキシダーゼとＨＧＡＨ、ＨＰＰオキシダーゼとＨＧＡＣ、ＨＧＡＨとＨＧＡＣとの組合せのいずれかが含まれている。
【００６９】
ＨＰＡＨをコードする発現カセットとＨＰＡＣをコードする別の発現カセットとを含むベクターが、上記に定義の２つの発現カセット（配列番号１７及び１９）の組合せを含んでもよい。このような発現カセットを図１３及び配列番号２１で表す。
【００７０】
本発明の第三の実施態様によれば、ベクターは、３つの本発明の発現カセットを含む。第一の発現カセットはＨＰＰオキシダーゼの発現カセット、第二の発現カセットはＨＧＡＨの発現カセット、第三の発現カセットはＨＧＡＣの発現カセットである。このような発現カセットが、上記に定義の３つのカセット（配列番号１５、１７及び１９）の組合せを含んでもよい。このようなベクターを図１４及び配列番号２２によって表す。
【００７１】
上記に定義のような本発明のベクターがまた、別の有益なタンパク質またはペプチドの発現カセットを含んでもよい。
【００７２】
ベクターが複数の発現カセットを含むとき、２つずつの発現カセットの組合せが互いに逆向きで同一線上に配置されてもよく、発散または収束する形態に配置されてもよい。
【００７３】
別の有益なタンパク質またはペプチドの発現カセットは、上記に定義のＨＰＰオキシダーゼ、ＨＧＡＨ及びＨＧＡＣとは異なる有益なタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列を含む。
【００７４】
このような核酸配列としては、形質転換された植物に新規な農業特性を与える遺伝子または形質転換植物の農業品質を改良する遺伝子のような選択マーカーをコードする遺伝子がある。
【００７５】
選択マーカー
選択マーカーをコードする遺伝子としては、抗生物質抵抗性遺伝子、除草剤（ビアラホス、グリホセートまたはイソキサゾール）に耐性の遺伝子、ＧＵＳ酵素のような容易に同定できるリポーター酵素をコードする遺伝子、色素をコードする遺伝子または形質転換細胞中の色素の産生を調節する酵素をコードする遺伝子、が挙げられる。このような選択マーカー遺伝子は特に、特許出願ＥＰ  ２４２  ２３６、ＥＰ  ２４２  ２４６、ＧＢ  ２  １９７  ６５３、ＷＯ  ９１／０２０７１、ＷＯ  ９５／０６１２８、ＷＯ  ９６／３８５６７またはＷＯ  ９７／０４１０３に記載されている。
【００７６】
有益な遺伝子
形質転換植物に新規な農業特性を与える遺伝子としては、幾つかの除草剤に対する耐性を与える遺伝子、幾つかの昆虫に対する抵抗性を与える遺伝子、幾つかの病気に対する耐性を与える遺伝子、などが挙げられる。このような遺伝子は特に、特許出願ＷＯ  ９１／０２０７１及びＷＯ  ９５／０６１２８に記載されている。
【００７７】
除草剤耐性
本発明は特に、形質転換された単子葉植物及び植物細胞に幾つかの除草剤に対する耐性を与える遺伝子を発現させるのに適している。幾つかの除草剤に対する耐性を与える遺伝子としては、ビアラホス耐性を与えるＢａｒ遺伝子、グリホセート及びその塩のようなＥＰＳＰＳをターゲットとする除草剤に対する抵抗性を与える適当なＥＰＳＰＳをコードする遺伝子（ＵＳ  ４，５３５，０６０、ＵＳ  ４，７６９，０６１、ＵＳ  ５，０９４，９４５、ＵＳ  ４，９４０，８３５、ＵＳ  ５，１８８，６４２、ＵＳ  ４，９７１，９０８、ＵＳ  ５，１４５，７８３、ＵＳ  ５，３１０，６６７、ＵＳ  ５，３１２，９１０、ＵＳ  ５，６２７，０６１、ＵＳ  ５，６３３，４３５、ＦＲ  ２  ７３６  ９２６）、グリホセートオキシドレダクターゼをコードする遺伝子（ＵＳ  ５，４６３，１７５）、あるいは、イソキサゾール特にイソキサフトール（ＦＲ  ９５  ０６８００、ＦＲ  ９５  １３５７０）、ジケトニトリル（ＥＰ  ４９６  ６３０、ＥＰ  ４９６  ６３１）、または、トリケトン、特にスルコトリオン（ＥＰ  ６２５  ５０５、ＥＰ  ６２５  ５０８、ＵＳ  ５，５０６，１９５）のようなＨＰＰＤをターゲットとする除草剤に抵抗性を与えるＨＰＰＤをコードする遺伝子が挙げられる。ＨＰＰＤをターゲットとする除草剤に耐性を与えるＨＰＰＤをコードするこのような遺伝子は特許出願ＷＯ  ９６／３８５６７に記載されている。
【００７８】
ＥＰＳＰＳをターゲットとする除草剤に対して抵抗性を与える適当なＥＰＳＰＳをコードする遺伝子としてより特定的には、植物性ＥＰＳＰＳをコードする遺伝子、特に、特許出願ＦＲ  ２  ７３６  ９２６に記載され本文中で以後ＥＰＳＰＳ二重突然変異体と呼ぶ２つの突然変異１０２及び１０６を有するトウモロコシのＥＰＳＰＳをコードする遺伝子、または、米国特許ＵＳ  ５，６３３，４３５の配列番号２及び配列番号３によって表され本文中で以後ＣＰ４と呼ぶＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍから単離されたＥＰＳＰＳをコードする遺伝子が挙げられる。
【００７９】
ＨＰＰＤをターゲットとする除草剤に対する耐性を与えるＨＰＰＤをコードする遺伝子としてより特定的には、特許出願ＷＯ  ９６／３８５６７に記載されているようなシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のＨＰＰＤ及びシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＨＰＰＤが挙げられる。
【００８０】
ＥＰＳＰＳまたはＨＰＰＤをコードする遺伝子、より特定的には上記の遺伝子の場合、これらの酵素をコードする配列の前に、トランジットペプチドをコードする配列、特に米国特許ＵＳ５，５１０，４７１またはＵＳ５，６３３，４４８に記載された“最適化トランジットペプチド”と呼ばれるトランジットペプチドをコードする配列が存在するのが有利である。
【００８１】
昆虫に対する抵抗性
昆虫に対する新規な抵抗特性を与える有益なタンパク質としては特に、文献にも多く記載されており当業者にも公知であるＢｔタンパクが挙げられる。また、Ｐｈｏｔｏｒａｂｄｕｓのような細菌から抽出されたタンパク質が挙げられる（ＷＯ  ９７／１７４３２及びＷＯ  ９８／０８９３２）。
【００８２】
病気に対する抵抗性
病気に対する新規な抵抗特性を与える有益なタンパクまたはペプチドとしては特に、キチナーゼ、グルカナーゼ及びオキサレートオキシダーゼを挙げることができ、これらの全部のタンパク質及びそれらのコーディング配列は文献にも多く記載されている。あるいは、抗菌ペプチド及び／または抗真菌ペプチド、特に植物のチオニンまたはデフェンシンのような１００個未満のアミノ酸から成りシステインに富むペプチドを挙げることができ、より特定的にはシステインと塩基性アミノ酸含有領域との間に１つまたは複数のジスルフィドブリッジを有する任意の起原の溶菌性ペプチド、特に以下の溶菌性ペプチド：アンドロクトニン（ＷＯ９７／３００８２及びＰＣＴ／ＦＲ９８／０１８１４、１９９８年８月１８日出願）またはドロソマイシン（ＰＣＴ／ＦＲ９８／０１４６２、１９９８年７月８日出願）が挙げられる。
【００８３】
本発明の１つの特定実施態様によれば、有益なタンパク質またはペプチドは真菌類エリシターのペプチド、特にエリシチンから選択される（Ｋａｍｏｕｎら，１９９３；Ｐａｎａｂｉｅｒｅｓら，１９９５）。
【００８４】
品質の修飾
また、被修飾植物の構成、特に幾つかの必須脂肪酸の含有量及び品質（ＥＰ  ６６６  ９１８）、または、特に該植物の葉及び／または種子のタンパク質の含有量及び品質を修飾する遺伝子が挙げられる。特に、イオウ含有アミノ酸が富化されたタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる（Ａ．Ａ．Ｋｏｒｉｔら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９１）１９５，３２９−３３４；ＷＯ  ９８／２０１３３；ＷＯ  ９７／４１２３９；ＷＯ  ９５／３１５５４；ＷＯ  ９４／２０８２８；ＷＯ  ９２／１４８２２）。イオウ含有アミノ酸が富化されたこれらのタンパク質はまた、余剰のシステイン及び／またはメチオニンを捕捉して貯蔵し、このような捕捉によってこれらのイオウ含有アミノ酸の過剰産生に付随する毒性の問題が生じる可能性を回避し得る。また、イオウ含有アミノ酸、特にシステインに富むペプチドをコードする遺伝子が挙げられる。このようなペプチドはまた抗菌及び／または抗真菌活性を有している。より特定的には、植物デフェンシン、任意の起原の溶菌性ペプチド、特に以下の溶菌性ペプチド：アンドロクトニン（ＷＯ  ９７／３００８２）及びＰＣＴ／ＦＲ９８／０１８１４、１９９８年８月１８日出願）またはドロソマイシン（ＰＣＴ／ＦＲ９８／０１４６２、１９９８年７月８日出願）が挙げられる。
【００８５】
植物細胞及びトランスジェニック植物
本発明はまた、上記に定義したようなＨＰＰオキシダーゼ、ＨＧＡＨまたはＨＧＡＣの発現カセットを１つ以上含む形質転換された植物細胞及び植物に関する。
【００８６】
本発明の第一の実施態様によれば、植物細胞または植物は、上記に定義のようなＨＰＰオキシダーゼ、ＨＧＡＨまたはＨＧＡＣのコーディング配列を含むカセットから選択された本発明の発現カセットを１つだけ含む。
【００８７】
本発明の第二の実施態様によれば、植物細胞または植物は、上記の定義のようなＨＰＰオキシダーゼ、ＨＧＡＨまたはＨＧＡＣのコーディング配列を含むカセットから選択された本発明の発現カセットを２つずつ組合せて含む。即ち、同一ベクター中にＨＰＰオキシダーゼとＨＧＡＨ、ＨＰＰオキシダーゼとＨＧＡＣ、ＨＧＡＨとＨＧＡＣの組合せのいずれかが含まれている。
【００８８】
本発明の第三の実施態様によれば、植物細胞または植物は、３つの本発明の発現カセットを含む。第一の発現カセットはＨＰＰオキシダーゼの発現カセット、第二の発現カセットはＨＧＡＨの発現カセット、第三の発現カセットはＨＧＡＣの発現カセットである。
【００８９】
上記に定義のような本発明の植物細胞または植物はまた、上記に定義のような別の有益なタンパク質またはペプチドの発現カセットも含み得る。
【００９０】
好ましくは、発現カセットが植物細胞または植物のゲノムに安定に組込まれる。より好ましくは、本発明の植物が稔性であり、本発明の発現カセットがそれらの後代に伝達される。
【００９１】
本発明はまた上記のトランスジェニック植物の種子に関する。これらの種子は、ＨＰＰオキシダーゼ、ＨＧＡＨまたはＨＧＡＣをコードする本発明の発現カセットを含む。
【００９２】
本発明の形質転換植物体内の種々の発現カセットは、同じ形質転換親植物に由来してもよい。この場合、植物は同一ベクター中に含まれていた複数の異なる発現カセットによる一回の形質転換／再生処理から得られてもよく、または、複数のベクターによる同時形質転換（コトランスホーメーション）によって得られてもよい。また、各々が少なくとも１つの本発明の発現カセットを含む親植物の交配によって得られてもよい。
【００９３】
植物細胞及び植物の形質転換
本発明の目的はまた、上記の定義のような少なくとも１つの本発明の核酸配列または発現カセットを導入することによって植物細胞または植物を形質転換する方法を提供することである。このような形質転換は、専門文献特に本出願に引用した参考文献に多くの事例によって記載された任意の適当な公知の手段によって、より特定的には本発明のベクターによって得られる。
【００９４】
１つのシリーズの方法は、ＤＮＡ配列を結合させた粒子によって細胞、葉緑体または組織を攻撃することから成る。別のシリーズの方法は、植物体内に導入する手段としてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｕｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＲｉプラスミドに挿入されたキメラ遺伝子を使用することから成る。マイクロインジェクションまたは電気穿孔あるいはＰＥＧによる直接沈殿のような別の方法も使用できる。当業者は、宿主生物の性質、特に植物細胞または植物の性質に応じた適切な方法を選択できるであろう。
【００９５】
複数の核酸配列または発現カセットを導入することを望む場合、複数の異なる発現カセットを含む１つの本発明ベクターを使用してもよい。また、各々が少なくとも１つの発現カセットを含む複数のベクターを使用する同時形質転換によって宿主生物体内に導入してもよい。
【００９６】
一般的に、本発明のトランスジェニック植物は、植物細胞を形質転換し、次いで植物、好ましくは稔性の植物を形質転換細胞から再生することによって得られる。再生は種の性質に依存して前出の参考文献に記載されているような適当な任意の方法によって得られる。植物細胞の形質転換方法及び植物の再生方法に関しては、特に以下の特許及び特許出願を引用できる：ＵＳ４，４５９，３５５、ＵＳ４，５３６，４７５、ＵＳ５，４６４，７６３、ＵＳ５，１７７，０１０、ＵＳ５，１８７，０７３、ＥＰ２６７，１５９、ＥＰ６０４，６６２、ＥＰ６７２  ７５２、ＵＳ４，９４５，０５０、ＵＳ５，０３６，００６、ＵＳ５，１００，７９２、ＵＳ５，３７１，０１４、ＵＳ５，４７８，７４４、ＵＳ５，１７９，０２２、ＵＳ５，５６５，３４６、ＵＳ５，４８４，９５６、ＵＳ５，５０８，４６８、ＵＳ５，５３８，８７７、ＵＳ５，５５４，７９８、ＵＳ５，４８９，５２０、ＵＳ５，５１０，３１８、ＵＳ５，２０４，２５３、ＵＳ５，４０５，７６５、ＥＰ４４２  １７４、ＥＰ４８６  ２３３、ＥＰ４８６  ２３４、ＥＰ５３９  ５６３、ＥＰ６７４  ７２５、ＷＯ９１／０２０７１及びＷＯ９５／０６１２８。
【００９７】
選択的除草
本発明の目的はまた、ＨＰＰＤインヒビター、特に上記に定義の除草剤を使用した植物、特に作物の選択的除草方法を提供することである。方法の特徴は、作物の播種前、発芽前及び発芽後のいずれかの時期に本発明の形質転換植物に該除草剤を施用することである。
【００９８】
本発明はまた、本発明によって形質転換させた種子または植物を含む圃場の区域の雑草防除方法に関する。方法は、該圃場の区域に、該雑草に有毒であるが本発明によって形質転換させた種子または植物には実質的に全く影響を与えない用量のＨＰＰＤ阻害性除草剤を施用することから成る。
【００９９】
本発明はまた、本発明の形質転換植物の栽培方法に関する。方法は、該形質転換植物の種子を該植物の栽培に適した圃場の区域に播種する段階と、雑草が存在する場合には上記に定義のようなＨＰＰＤをターゲットとする除草剤を該圃場の該区域に該雑草に有毒であるが本発明によって形質転換させた種子または植物には実質的に全く影響を与えない用量で施用する段階と、栽培した植物が所望の成熟度に到達したときに収穫する段階と、場合によっては収穫した植物から種子を分離する段階とから成る。
【０１００】
本発明において、“本発明によって形質転換させた種子または植物には実質的に影響を与えない”という表現は、本発明の形質転換植物は雑草毒性用量の除草剤が施用されたときにも僅かな薬害しか示さないかまたは薬害を全く示さないことを意味する。本発明によれば、“雑草毒性用量”という表現は、雑草を駆除し得る除草剤の用量を意味する。本発明によれば、“僅かな植物毒性”という用語は、白化した葉のパーセンテージが２５％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満であることを意味する。また、他の点では同等であるが形質転換されていない植物、即ち、少なくとも１つの本発明の発現カセットを含まない植物に対して同じ毒性用量を施用すると、このような植物では本発明の形質転換植物で観察される薬害症状よりも顕著な植物毒性症状が観察されることも本発明によって理解されよう。
【０１０１】
上記の２つの方法において、ＨＰＰＤをターゲットとする除草剤の施用は本発明によれば播種前、発芽前または発芽後のいずれの時期に行ってもよい。
【０１０２】
本文中で使用された“除草剤”という用語は、単独で使用されるかまたはその有効性を修飾する添加剤、例えば、活性増進剤（相乗剤）または活性抑制剤（安全剤）と組合せて使用される除草活性物質を意味すると理解されたい。特にＨＰＰＤ阻害性除草剤に関しては前記に定義した。勿論実際の施用にあたっては、上記の除草剤を農業化学に慣用の配合アジュバントとそれ自体公知の方法で組合せる。
【０１０３】
本発明の形質転換植物が別の除草剤に対して耐性の別の遺伝子（例えば、植物にグリホセート耐性を与える突然変異したまたは突然変異しないＥＰＳＰＳをコードする遺伝子）を含むとき、または、形質転換植物が別の除草剤に対して本来的に感受性でないとき、本発明の方法は、ＨＰＰＤインヒビターをこのような除草剤例えばグリホセートと併用し、これらを同時に施用するかまたは異なる時期に施用する処理を含む。
【０１０４】
本発明の種々の特徴は以下の実験実施例からより明らかに理解されよう。
【０１０５】
これらの実施例に後述するすべての方法または処理は実例として示されたものであり、同じ結果に到達するために使用できる様々な方法から選択された１つの方法に対応する。この選択は結果の品質に全く影響せず、従って当業者は同じ結果に到達するために任意の適当な方法を使用し得る。ＤＮＡフラグメントを操作する方法の殆どがＣｏｌｉｇａｎら，（１９９５），Ａｕｓｕｂｅｌら，（１９９５）；Ｍａｎｉａｔｉｓら，（１９８２）  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載されている。
【０１０６】
上記に引用した参考文献の目録、特に、場合によってはシグナルペプチドまたはトランジッシペプチドに組合せた天然型、キメラ型または突然変異型のＨＰＰＤをコードする核酸配列を定義する参考文献の目録は参照によって本特許出願に含まれるものとする。
【０１０７】
実施例Ｉ：Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓに由来のＨＰＰオキシダーゼをコードする遺伝子の同定
ＨＰＰオキシダーゼ（ＨＰＰＯ）はＨＰＰを脱カルボキシル化反応によって４−ＨＰＡに変換する。従ってこの酵素は、ＨＰＰＤをバイパスする代謝経路を構築するために必要な第一酵素活性を触媒する。ＨＰＰオキシダーゼ活性の特性決定は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  Ｓ１の未精製抽出物中で（Ｓｕｅｍｏｒｉら，１９９５）、または、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓの部分精製抽出物中で（Ｂｌａｋｌｅｙ，１９７７）行われた。我々の知る限り、このタンパク質がこれまでに精製されたことはない。この酵素活性を植物体内に導入するためには、その遺伝子を同定する必要がある。種々の方法が考えられる：（１）挿入的突然変異を誘発し、酵素活性の消滅によって遺伝子を同定する、（２）ゲノムライブラリーを使用して微生物の機能相補を試験する、（３）タンパク質を精製し、溯ってその核酸配列を推定する。
【０１０８】
３つの方法は過去に使用されたことがある。機能相補及び挿入的突然変異誘発に関しては、これらの技術ではＨＰＰＯ遺伝子を同定することができなかったので、開発があまり進んでいない。
【０１０９】
Ｉ．１  材料及び方法
Ｉ．１．１−培養条件
Ｉ．１．１．１−富培地
ルリア−ベルタニ（ＬＢ；Ｂｉｏ１０１により販売）培地は分子生物学の実験で細菌（大腸菌、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）を培養するために使用される。Ａ．ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓを培養するためには、５％のヒツジ血液で富化したコロンビア−ＡＮＣ培地（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）が好ましい。この富培地はグラム陰性微生物を阻害する２種類の抗生物質（ナリジキシン酸及びコリマイシン）を含有している。上記の３つの細菌はいずれも３７℃の富培地で増殖できるが、Ａ．ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ及びＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓは一般に２９℃で培養する。
【０１１０】
Ｉ．１．１．２−ＭＡｇ培養培地
Ｂｌａｋｌｅｙ（１９７７）によって記載された培養培地は沈殿する。従って、使用前に濾過する必要がある。最適な“最小”培地に達するまで培地を徐々に変更した。考察された要因は、Ａ．ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓの増殖速度及びＨＰＰＯの酵素活性である。選択した培地（ＭＡｇ）は多少の改良を加えたＭ９培地である（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８２）；Ｎａ２ＨＰＯ４，１２Ｈ２Ｏ（６ｇ／Ｌ）；ＫＨ２ＰＯ４（３ｇ／Ｌ）；ＮＨ４Ｃｌ（１ｇ／Ｌ）；ＮａＣｌ（０．５ｇ／Ｌ）；ＣａＣｌ２（６ｍｇ／Ｌ）；ＦｅＳＯ４，７Ｈ２Ｏ（６ｍｇ／Ｌ）；酵母エキス（２０ｍｇ／Ｌ）；及び最後に、１ｇ／Ｌの濃度の基質（ＨＰＰまたはチロシンまたはクエン酸塩）。培地をオートクレーブで処理する。使用前に、培地１リットルあたり１ｍＬの１Ｍの無菌ＭｇＳＯ４を添加する。
【０１１１】
この最小培地はＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの培養にも使用される。
【０１１２】
Ｉ．１．２．−Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓのゲノムライブラリーの構築
完全な細菌ｃＤＮＡライブラリーを作製し得る確実な技術は存在しない。従って我々はＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓのゲノムライブラリーを作製することにした。この作製のためにコスミド系を選択した。コスミドライブラリーを機能相補実験用に調製し、後になってｈｐｐＯ遺伝子を含有する（１つまたは複数の）コスミドを探し出すために使用した。
【０１１３】
Ｉ．１．２．１−コスミドベクターｐＬＡＦＲ５
Ｉ．１．２．１．１−ベクターの記述
約２０ｋｂのインサートを受容できる接合性コスミドベクターｐＬＡＦＲ−５（Ｋｅｅｎら，１９８８）を使用する。グラム陰性菌に対して広い宿主スペクトルを有しており転移起点及び複製起点を備えたこのベクターはトリパレンタル（ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ）コンジュゲーションによって別の細菌属に伝達されることができ、このため、種々の細菌属中の機能相補を試験するために有用である。このベクターはテトラサイクリン抵抗性を与える。
【０１１４】
Ｉ．１．２．１．２−ベクターの調製
アルカリ性溶菌プロトコル（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８２）を使用してプラスミドｐＬＡＦＲ−５を精製し、ＲＮアーゼで処理し、次いでＢａｍＨＩ及びＳｃａＩで消化する。ＢａｍＨＩによる消化は、Ｓａｕ３Ａによって消化したゲノムＤＮＡインサートが“連結される”部位を開裂し得る。ＳｃａＩによる消化はキャプシド化（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）が可能なｃｏｓ部位を解放し得る。フェノール、クロロホルムで順次抽出した後、ＤＮＡをエタノール沈殿させる。乾燥したＤＮＡを水に溶解させる。このようにして調製したベクターを−２０℃で保存する。
【０１１５】
Ｉ．１．２．２−Ａ．ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓのゲノムＤＮＡの調製
Ｂｌａｋｌｅｙ（１９７７）によって記載された培地（２００ｍＬ）中で調製した２４時間培養物（２００ｍＬ，１８０ｒｐｍ，２９℃）を３，０００ｇ、４℃で１５分間遠心する。細胞ペレットを１０ｍＬの溶菌溶液（ＴＥ  ｐＨ８；０．５％  ＳＤＳ；１ｍｇのプロテイナーゼＫ）に入れ、水浴中で２０分毎に穏やかに撹拌しながら３７℃でインキュベートする。９０分後、溶解した細胞の浮遊液をポリプロピレンＪＡ−２０管に注ぐ。次に１０ｍＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５／２４／１）を添加し、次いで６，０００ｇ、４℃で１５分間遠心する。次に上清を新しいＪＡ２０管に移し、これに１．８ｍＬの１０Ｍの酢酸アンモニウムと１０ｍＬのイソプロパノールとを添加する。２０，０００ｇ、４℃で２０分間遠心後、ペレットを７０％エタノールで洗浄する。乾燥したペレットを１ｍＬのＴＥ，ｐＨ８に入れ、次いで２ｍＬのエッペンドルフ管に移し、これに１０μＬのＲＮアーゼ（１０ｍｇ．ｍＬ−１）を加える。３７℃で３０分間維持した後、８００μＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを再度添加する。遠心後、上清を新しいエッペンドルフ管に移し、０．８ｍＬのクロロホルムで抽出する。次に上清を最終エッペンドルフ管に移し、これに２００μＬの１０Ｍ酢酸アンモニウムと８００μＬのイソプロパノールとを加える。遠心後、ペレットを７０％エタノールで洗浄し、次いでいったん乾燥した後、５００μＬの水に入れる。次にゲノムＤＮＡを−２０℃で保存する。
【０１１６】
Ｉ．１．２．３．−Ａ．ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓのゲノムＤＮＡの調節消化
４０−４５ｋｂのコスミドだけがキャプシド化できる。ベクターが２１．５ｋｂなので、Ａ．ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓのゲノムＤＮＡインサートは１９−２２ｋｂの範囲のサイズでなければならない。これらのフラグメントはＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓのゲノムＤＮＡの調節消化を行うことによって得られる。調節消化の最適条件を決定するために、種々の量のＳａｕ  ３Ａ制限酵素を使用してＡ．ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓのゲノムＤＮＡの消化を行う。０．０８単位のＳａｕ  ３Ａ酵素を使用して３７℃で３０分間の処理が最適消化条件である。このようにして消化したゲノムＤＮＡのサイズは１５−２２ｋｂの範囲である。このようにして消化したゲノムＤＮＡをフェノール、クロロホルムで順次抽出し、最後にエタノールで沈殿させる。
【０１１７】
Ｉ．１．２．４．−ゲノムＤＮＡのコスミドベクターへのＡ．ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓの連結
連結反応は、ＢａｍＨＩ及びＳｃａＩで消化した５００ｎｇのｐＬＡＦＲ−５と、Ｓａｕ３Ａで消化した６５０ｎｇのゲノムＤＮＡと、３２０単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎ．Ｅ．Ｂ．）と５ｍＭのＡＴＰとを含有する１０μＬの最終容量で行う。１２℃で一夜（約１６時間）を要して連結させる。５ｍＭのＡＴＰは、平滑末端（ＳｃａＩ）間の連結を防止し得る（Ｆｅｒｅｔｔｉ  ＆  Ｓｇａｒａｍｅｌｌａ，１９８１）ので、インサートのないベクターのダイマーはλファージの頭部でキャプシド化できない。
【０１１８】
Ｉ．１．２．５−コスミドのキャプシド化及びコスミドライブラリーの増幅
ＧＩＧＡＰＡＣＫ  ＩＩ  ＸＬキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造業者の指示通りに使用してコスミドのキャプシド化を行うと、従来の形質転換技術で得られる効率よりも高いトランスフェクション効率が得られる。コスミドライブラリーを増幅するために、Ｋｅｅｎら（１９８８）は大腸菌ＤＨ−１及びＨＢ１０１の使用を勧めている。実際、これらの菌株がマルトースで培養されたときは、ファージとの結合性がよく従ってコスミドのトランスフェクション効率を高める膜結合タンパク質が産生される。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅの勧告に従って増幅したライブラリーを−８０℃で保存する。コスミドライブラリーを評価するために、約３０個のクローンから単離したプラスミドＤＮＡをＡｐａＩまたはＥｃｏＲＩで消化する。制限プロフィルを０．８％アガロースゲルで観察する。
【０１１９】
Ｉ．１．３−ＨＰＰオキシダーゼの精製
Ｉ．１．３．１−ＨＰＰオキシダーゼ活性の比色アッセイ
精製段階をコントロールすることができるように、Ｂｌａｋｌｅｙ（１９７７）によって記載された比色アッセイを使用してＨＰＰオキシダーゼ活性を追跡する。２ＭのＨＣｌ溶液中の２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（２，４−ＤＮＰＨ）を添加することによって酵素反応を停止させる。２，４−ＤＮＰＨはカルボキシル官能基のα位のケトン官能基と反応する（例：ＨＰＰ）。このようにしてヒドラゾンが形成されるがこれは培地を塩基性にすることによって検出できる。酵素反応中にＨＰＰが完全に４−ＨＰＡに変換されるときはヒドラゾンが形成されないので、塩基性培地は２，４−ＤＨＰＡの特徴である黄色を呈する。酵素反応中にＨＰＰが完全には４−ＨＰＡに変換されないときは、ヒドラゾンの形成が生じ得る。これらのヒドラゾンは塩基性培地を褐色にする。培地の色はＨＰＰの消費量の関数として両端の２つの色の間で変化する。４４５または４５０ｎｍで吸光度を測定する。この試験をもっと容易に処理するために、試験を９６−ウェルのマイクロプレートフォーマットに応用した。反応混合物は、ＧＳＨ（９００μＭ）；ＨＰＰ（１３５μＭ）；ＴＰＰ（１．８ｍＭ）；ＭｇＣｌ２（４．５ｍＭ）；ＦＡＤ（４μＭ）；リン酸カリウムバッファ（９０ｍＭ）ｐＨ７．４から成る。混合物を氷上に維持する。５０μＬの被験画分と１５０μＬの反応混合物とを各ウェルに入れる。３０℃で２０分間維持した後、１３μＬの２，４−ＤＮＰＨ溶液（２ＭのＨＣｌ中に０．１％）で酵素反応を停止させる。混合物を周囲温度で２０分間反応させる。１３μＬの１０ＭのＮａＯＨ溶液を添加することによってヒドラゾンの形成を検出する。標準範囲を準備するために、種々のＨＰＰ濃度の反応混合物を調製する。５０μＬのタンパク質画分を５０μＬのタンパク質抽出バッファで置換する。新しい２，４−ＤＮＰＨ溶液毎に標準曲線を作成する（２，４−ＤＮＰＨ溶液は暗中で６カ月間安定である）。この試験の利点はその迅速性及び単純性であるが、試験が基質の消滅を測定するのであって産生物の出現を測定するのではないという欠点がある。更に、疑陽性が生じる可能性がある。何故なら、チロシンアミノトランスフェラーゼ活性はＨＰＰＯ活性と同じ結果を与えると考えられ、実際に双方の活性によってケトン官能基が消滅するからである。従って我々は、４−ＨＰＡの産生を確認できるような高速及び高感度のＨＰＬＣ法を開発した。
【０１２０】
Ｉ．１．３．２−ＨＰＬＣによって分析された活性試験
小型のＳｐｈｅｒｉｓｏｒｂ  ＯＤＳ２カラム、５０×４．６ｍｍ及び粒度３μｍを使用するＨＰＬＣ法が開発された。クロマトグラフィーはアイソクラチック条件Ａ：９０％；Ｂ：１０％（バッファＡ：Ｈ２Ｏと０．１％のＴＦＡ、バッファＢ；アセトニトリル）、流速０．８ｍＬ．分−１で行い、溶出を２３０ｎｍで追跡する。これらの条件下で、注入後５分後に４−ＨＰＡ、ＨＧＡ、３，４−ＤＨＰＡ及びＨＰＰを分離することが可能である。カラムはＭｅｒｃｋ仕様で製造した。
【０１２１】
Ｉ．１．３．３−タンパク質の精製
このプロトコルの設計では単純性という利点を追求した。
【０１２２】
Ｉ．１．３．３．１−予備試験
予備試験の目的は、酵素活性に対する種々の化合物（ＮａＣｌ、ＫＣｌ、１−プロパノール、エチレングリコール、など）及びｐＨの影響を明らかにすることである。唯一の炭素源としてチロシンを含むＭＡｇ培地（ＭＡｇ−チロシン）で培養したＡ．ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓの未精製抽出物を反応に使用する。被験化合物を反応培地に加える。ＨＰＰＯの酵素活性に対するｐＨの影響を測定するために、複数の異なるリン酸塩バッファを調製する。
【０１２３】
Ｉ．１．３．３．２−精製プロトコル
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ菌株をＬＢ寒天培地またはコロンビア−ＡＮＣ寒天培地で平板培養する。２９℃で１６時間培養した後、コロニーを採取し５ｍＬのＬＢ培地に播種して、１８０ｒｐｍ、２９℃で８時間増殖させる。５０μＬのこの予備培養物（ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅ）を次に、１．５ＬのＭＡｇ−チロシンまたはＭＡｇ−ＨＰＰ培地に接種し、次いで、フィン付きエルレンマイヤーフラスコ（Ｂｅｌｃｏ）に入れて１８０ｒｐｍ、２９℃で培養する。４８時間の培養後、５，０００ｇ、４℃で１５分間遠心することによって細胞を収集する。次に細胞を５０ｍＭのトリス−ＨＣｌバッファ，ｐＨ７．４に再浮遊させ、次いで上記同様に遠心する。ペレットを２ｍＬの５０ｍＭトリス−ＨＣｌバッファ，ｐＨ７．４に入れる。細胞を融氷中でパワー４、３０％パルスで１５分間音波処理する（Ｖｉｂｒａ  Ｃｅｌｌ，Ｓｏｎｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＩＮＣ．，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ，ＵＳＡ）。２０，０００ｇ、４℃で２５分間遠心することによって不溶性破片を除去する。上清を回収する。上清は“未精製抽出物”を構成する。これを液体窒素中で凍結し、次いで−８０℃で保存する（６カ月間は活性の見掛けの損失はない）。未精製抽出物を予め脱塩することなく、５０ｍＭのリン酸塩バッファ，ｐＨ７．４で平衡させた “ＥＭＤ／ＤＥＡＥ  ６５０Ｓ”の弱アニオン交換カラム（Ｍｅｒｃｋ）に充填する。酵素活性の溶出は、ＮａＣｌ濃度勾配（５０ｍＭのリン酸塩バッファ，ｐＨ７．４中の溶液）を使用することによって得られる。酵素活性を含有する画分をプールする。得られたタンパク質溶液を５０ｍＭのリン酸塩バッファ，ｐＨ７．４によって２．７倍に希釈する。次にタンパク質を、５０ｍＭのリン酸塩バッファ，ｐＨ７．４で予め平衡させた “ｓｏｕｒｃｅ  Ｑ”（３０ｍＬ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の強アニオン交換カラム（ＸＫ１６，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に充填する。酵素活性によって同定された有益なタンパク質画分をプールし、次いでＵＶＩＫＯＮ  １０ｋＤａ膜で濃縮する。得られたタンパク質抽出物を次に、１０ｍＭのリン酸塩バッファ，ｐＨ７．４中で平衡させた“ＰＤ１０”カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用するゲル濾過技術によって脱塩し、この同じバッファで溶出させる。タンパク質を次に、１０ｍＭのリン酸塩バッファ，ｐＨ７．４で平衡させたヒドロキシアパタイト（２ｍＬ；ヒドロキシアパタイトＤＮＡグレードＢｉｏ−ＧｅｌＲＴＭ  ＨＴＰゲル；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のカラム（ＸＫ９／１５，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に充填する。リン酸塩勾配を使用することによって酵素活性を溶出させる。酵素活性を含有する画分をプールし、濃縮する。タンパク質濃度が１ｍｇ／ｍＬを上回るときには、ＦＡＤ、ＧＳＨ及びグリセロールをそれぞれ最終濃度：２７μＭのＦＡＤ、１１０μＭのＧＳＨ、０．８％のグリセロールとなるように添加することによって活性タンパク質を保存する。このようにして調製したタンパク質は−８０℃で少なくとも６カ月間保存できる。
【０１２４】
Ｉ．１．３．３．３．−タンパク質の定量
γ−グロブリンを標準として使用するブラッドフォード法（１９７６）に従ってタンパク質を定量する。
【０１２５】
Ｉ．１．３．３．４−タンパク質ゲルの染色
Ｌａｅｍｍｌｉ法（１９７０）に従って１０％ポリアクリルアミドゲル上でタンパク質画分を分析する。泳動後、ゲルのタンパク質をクーマシーブルー法（Ｃｈｕａ、１９８０）を使用するかまたは硝酸銀法（Ｓｃｈｏｅｎｌｅら，１９８４）を使用して染色する。
【０１２６】
Ｉ．１．４−Ｎ末端及び内部ペプチドのタンパク質のマイクロ配列決定
タンパク質のマイクロ配列決定をエドマン法（Ｌａｕｒｓｅｎ、１９７１）を使用して行う。配列決定で最良結果を得るために、当日にゲルを調製する。
【０１２７】
Ｉ．１．４．１−アクリルアミドゲルの調製及びその電気泳動
ＨｏｅｆｅｒＲＴＭミニゲルシステムを使用しＬａｅｍｍｌｉ法（１９７０）に従ってゲル（８．５％、１０％または１２％）を調製する。“変性用ローディングブルー”溶液（１５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ６．８；４％のＳＤＳ；２％（ｖ／ｖ）のβ−メルカプトエタノール；３．３％（ｖ／ｖ）のグリセロール；０．０３％のブロモフェノールブルー；１０ｍＬにする量のｍｉｌｌｉＱ水）でタンパク質を１／３濃度に希釈する。５分間の煮沸後、タンパク質をアクリルアミドゲルに充填する。変性用泳動バッファ（２５ｍＭのトリス塩基；２５０ｍＭのグリシン；０．０１４％（ｖ／ｖ）のβ−メルカプトエタノール；０．１％のＳＤＳ）を使用しゲルあたり１５ｍＡの電流を作用させて周囲温度で泳動させる。
【０１２８】
Ｉ．１．４．２−Ｎ末端の配列決定用調製物
Ｎ末端の配列決定を行うことができるように、半乾燥転移技術を使用してＰＶＤＦ膜（ＰＲＯＢＬＯＴＴＲＴＭ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にゲルを移す。“Ｓｅｍｙ  Ｄｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｅｒ”装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用し、ＣＡＰＳ基剤の培地（トランスファーバッファ：１０ｍＭのＣＡＰＳ，ｐＨ１１．０；１０％（ｖ／ｖ）のメタノール）中、３００ｍＡで３０分間処理してポリペプチドを電気転移させる。トランスファーバッファは、配列決定を“汚染する”危険のあるグリシンを全く含有しない。転移後、ｍｉｌｌｉＱ水で膜を数秒間すすぐ。次にアミド−ブラック（Ａｌｄｒｉｃｈ；ｒｅｆ．：１９．５２４−３）を基剤とする染色用溶液に数秒間浸漬させる。溶液は４５％（ｖ／ｖ）のメタノールと１％（ｖ／ｖ）の酢酸と０．１％（ｍ／ｖ）のアミド−ブラックと６３．９％（ｖ／ｖ）の水とから成る。有益なタンパク質に対応するバンドが可視バンドであるとき、膜をｍｉｌｌｉＱ水で十分にすすぎ、次いで風乾する。有益なタンパク質（６０ｋＤａ）を含む膜部分を切り出して配列決定を依頼する。
【０１２９】
Ｉ．１．４．３−内部ペプチドの配列決定用調製物
ゲル中のタンパク質を可視化するために、ＰＶＤＦ膜の染色に使用したプロトコルとは幾らか異なるアミド−ブラック染色プロトコルを使用する。泳動後のゲルを５０％のメタノールと１０％の酢酸と４０％のｍｉｌｌｉＱ水とから成る溶液で３０分間ずつ２回固定する。４５％のメタノールと１０％の酢酸と４５％の水と０．００３％（ｗ／ｖ）のアミド−ブラックとから成る溶液で染色を行う。タンパク質が次第に出現する。染色によってタンパク質の所在が十分に明らかになると、ゲルをｍｉｌｌｉＱ水で十分にすすぐ。有益なバンドを切り出し、次いでｓｐｅｅｄ−ｖａｃ（Ｓａｖａｎｔ）で脱水する。その長さのほぼ１／３を失ったゲルバンドの配列決定を依頼する。タンパク質をＬｙｓ−Ｃエンドプロテアーゼ（配列決定グレード、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）で消化した後に内部ペプチドが得られる。ポリアクリルアミド中のタンパク質を０．０３％のＳＤＳを含有する１５０μＬのトリス−ＨＣｌバッファ，ｐＨ８．６（０．１Ｍ）中、０．４μｇのＬｙｓ−Ｃエンドプロテアーゼの存在下で３５℃で１８時間消化する。消化したタンパク質をＤＥＡＥ−Ｃ１８  ＨＰＬＣカラム（直径１ｍｍ）に注入する；０．１％のＴＦＡを含有するアセトニトリル勾配（２−７５％）を使用してペプチドを溶出させる。Ｌｙｓ−Ｃエンドプロテアーゼはリシンのカルボキシル側でポリペプチドを特異的に開裂する。
【０１３０】
Ｉ．１．５．１−Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ  ＭｎｄＤ遺伝子を使用する理論的な有効性の検証
プライマー“ＯＺ−ＭｎｄＤ−Ｓ７１１”：ＡＣＧＴＣＡＣＣＧＡ  ＡＧＡＧＧＡＴＧＡＡ  ＡＡＣ及び“ＯＺ−ＭｎｄＤ−ＡＳ１５７８”：ＡＣＧＧＣＣＡＴＴＴ  ＣＧＧＡＣＴＴＴＴＣを使用してＭｎｄＤ遺伝子の一部分（８６７ｂｐ）をＰＣＲによって増幅する。ＰＣＲは以下のプログラムを使用して行う：９５℃で５分間；９５℃で４５秒、５６℃で４５秒を２５サイクル；７２℃で１分間；７２℃で５分間；４℃で保存。反応混合物は２００−５００μＭのｄＮＴＰと２０−２００ｎｇのコスミドまたはゲノムＤＮＡと１００ｐｍｏｌの各プライマーとを最終容量５０μＬ中に含む。
【０１３１】
Ｉ．１．５．２−ＨＰＰオキシダーゼをコードする遺伝子の一部分のＰＣＲによる同定
“ＡｄｖａｎｔａｇｅＲＴＭ−ＧＣゲノムＰＣＲ”キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用してＰＣＲを行う。このキットは特に、ベタインを基剤とするアジュバント“ＧＣメルト”、及び、耐熱ポリメラーゼ混合物−主としてＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）との混合物−を含む。Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓゲノムＤＮＡに対する増幅を以下のプログラムを使用して行う：９４℃で５分間；９４℃で２０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３分を３０サイクル；７２℃で６分間；４℃で保存。反応条件は、反応容量５０μＬに対して４００μＭのｄＮＴＰ、５０ｎｇのゲノムＤＮＡ、１００ｐｍｏｌの各プライマー及び１×“ＧＣメルト”である。これらの条件下で９３７ｂｐのバンドを増幅し、Ｚ２と命名する。
【０１３２】
また、震央（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）のＴｔｈまたはＴｂｒ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ−Ｆｉｎｎｚｙｍｅ）を使用してＰＣＲによる増幅を行ってもよい。Ｔｂｒは添加剤（ＤＭＳＯ、グリセロール、ベタイン）非使用でＰＣＲが可能であることが試験によって証明された唯一の耐熱ポリメラーゼである。これはまた高い適合度をもつ酵素である。
【０１３３】
Ｉ．１．６−コスミドライブラリーのスクリーニング
ジゴキシゲニン標識低温プローブ技術（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，１９９５）を使用してコスミドライブラリーをスクリーニングする。
【０１３４】
Ｉ．１．６．１−Ｚ２−Ｄｉｇプローブの調製
９０μＭのｄＵＴＰ−Ｄｉｇ；１３５μＭのｄＴＴＰ；２２５μＭのｄＡＴＰ；２２５μＭのｄＣＴＰ；２２５μＭのｄＧＴＰから成るｄＮＴＰ混合物を使用する以外は、ＩＩ．５．２項に定義した条件下で最終容量５０μＬ中のＰＣＲによってプローブをジゴキシゲニンで標識する。０．８％のアガロースゲルに３μＬの反応物を充填することによって増幅プローブを定量する。僅かなバックグラウンドノイズが出現する。即ち、ＰＣＲは十分に特異的でない。後で問題が生じることを完全に防止するために、ＰＣＲ全量をゲルに充填し、Ｑｉａｅｘ  ＩＩキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して有益なバンドを抽出する。
【０１３５】
Ｉ．１．６．２−Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ膜へのコスミドライブラリーの転移
大腸菌ＨＢ１０１中で調製したコスミドライブラリーのグリセロール予製液を使用して２ｍＬのＬＢＴ１５培地に接種する。８時間の増殖後、ＯＤ６００を測定する。シャーレ（１４４ｃｍ２）あたり約１，０００個のクローンを平板培養するために系列希釈を行う。３７℃で１６時間の増殖後、細菌をＨｙｂｏｎｄ  Ｎ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に転移させ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍの勧告（１９９５）に従って溶菌させる。遊離したＤＮＡをＵ．Ｖ．照射（４５秒間で１２０ｍＪを放出−Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって膜に固定する。Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ（１９９５）の勧告通りにプロテイナーゼＫで処理することによって細胞破片を膜から除去する。
【０１３６】
Ｉ．１．６．３−プレハイブリダイゼーション−ハイブリダイゼーション−検出
プレハイブリダイゼーション段階及びハイブリダイゼーション段階は揺動プラットフォームに載せたバッグ内でジゴキシゲニン標識プローブ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，１９９５）を用いるハイブリダイゼーション技術を使用して行う。プレハイブリダイゼーション（５×ＳＳＣ；０．５％のＳＤＳ；０．１％のＮ−ラウリルサルコシン；１％のブロッキング剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ｒｅｆ．：１０９６  １７６）；１００μｇ．ｍＬ−１の音波処理し変性したサケ精子）は６５℃で４時間行う。膜のハイブリダイゼーションは６８℃で一夜行う（ジゴキシゲニンで標識し１００℃で５分間変性した２０ｎｇ．ｍＬ−１のプローブを含有する新しいプレハイブリダイゼーション培地）。翌日、バッファＡ（０．５×ＳＳＣ；０．１％のＳＤＳ，６５℃）で４回洗浄することによって余剰のプローブと非特異的ハイブリダイゼーションとを除去する。次に、膜をバッファＢ（１３８ｍＭのリンゴ酸、水酸化ナトリウムペレットによってｐＨ７．５に調整した１４２ｍＭのＮａＣｌ、０．３％のトゥイーン２０）に入れ、周囲温度で５分間平衡させる。次に、ブロッキング剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で膜を３０分間飽和させた後、新しいブロッキング剤溶液で１／１０，０００に希釈したアルカリホスファターゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体（“抗ジゴキシゲニン−ＡＰ、Ｆａｂフラグメント”；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とハイブリダイズさせる。３０分後、膜をバッファＢで１５分ずつ２回洗浄し、次いでアルカリホスファターゼ反応バッファ（０．１Ｍのトリス；０．１ＭのＮａＣｌ；０．０５ＭのＭｇＣｌ２，ｐＨ９．５）で５分間平衡させる。既製の１ｍｌのＣＳＰＤで膜を被覆し、３７℃で１５分間インキュベートする。３７℃のこの段階で抗体に結合したアルカリホスファターゼが迅速に活性化し得る。膜をＨｙｐｅｒｆｉｌｍＲＴＭ  ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に１−１５分間露光することによって現像する。
【０１３７】
Ｉ．１．６．４−サザン法及びＰＣＲによる陽性コスミドの分析
膜ハイブリダイゼーションによって同定したコスミドをＰＣＲ及びサザン法によって同定する。この場合には、アルカリ溶菌（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８２）によって精製したコスミドＤＮＡを制限酵素で消化し、次いで０．８％アガロースゲルで分離する。２０×ＳＳＣ（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９９５）中でサザン法によってゲルをＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋膜（ＡＭｅｒｓｈａｍ）に転移させる。転移後、膜を２×ＳＳＣですすぎ、次に、Ｕ．Ｖ．（４５秒間で１２０ｍＪ放出−Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してＤＮＡを膜に固定する。次に前述の低温プローブ技術を使用して膜を現像する。
【０１３８】
Ｉ．１．７−クローニングベクター及び宿主細菌
ＰＣＲ増幅したＤＮＡ配列は一般には、“ブルー−ホワイト”技術によるスクリーニングが可能なプラスミドｐ−ＧＥＭＴ−ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングする。超発現のためには、遺伝子をｔａｃプロモーターのコントロール下におくプラスミドｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用する。クローニングは一般には、大腸菌ＤＨ５α（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）または大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して行う。超発現のためには、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）が好ましいであろう。
【０１３９】
Ｉ．１．８−アセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）の酵素活性
アセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）活性はＣｈａｎｇ及びＤｕｇｇｌｅｂｙ（１９９７）によって記載された比色法を使用して測定する。反応は総容量２５０μＬでマイクロプレート中で行う。各反応毎に２５μＬの酵素を、５０ｍＭのＫＰｉ，ｐＨ７．０；５０ｍＭのピルビン酸ナトリウム；１ｍＭのＴＰＰ；１０ｍＭのＭｇＣｌ２；１０μＭのＦＡＤから成る２２５μＬの反応培地中、３７℃で３０分間インキュベートする。２５μＬの１０％Ｈ２ＳＯ４を添加することによって反応を停止させる。次にマイクロプレートを６０℃で１５分間インキュベートする。次に、２５０μＬの０．５％クレアチンと５％のα−ナフトールを含む２５０μＬの４ＭのＮａＯＨ溶液（α−ナフトール溶液は使用前１０分以内に調製しなければならない）とを加える。次いでマイクロプレートを６０℃で１５分間、次いで周囲温度で１５分間インキュベートする。桜赤色に呈色する。５２５ｎｍで読み取りを行う（εＭ＝２２，７００Ｍ−１ｃｍ−１）。
【０１４０】
Ｉ．２−結果−考察
ＨＰＰオキシダーゼは、ＨＰＰＤのバイパス代謝経路を創製するために植物に導入したいと我々が要望する第一酵素活性である。ＨＰＰオキシダーゼ活性をコードする遺伝子を同定するために、複数の異なる方法が開発された：（１）挿入的突然変異を誘発し、酵素活性の消滅によって遺伝子を同定する方法、（２）ゲノムライブラリーを使用して微生物の機能相補を試験する方法、（３）タンパク質を精製し、溯って核酸配列を推定する方法。好ましい方法は方法（３）であった。
【０１４１】
Ｉ．２．１−ＨＰＰＯの精製
Ｉ．２．１．１−培養条件の最適化
タンパク質の精製を開始する前に、細菌中で該タンパク質が発現し得る培養条件を決定しておくほうがよい。培養条件を最適化したとき、Ａ．ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓの増殖がスクシネート、フマレートまたはグルコースのような炭素源に依存するときは、ＨＰＰオキシダーゼ活性が検出できないという結果が示される。逆に、ＨＰＰ、チロシンまたはフェニルアラニンを唯一の炭素源として使用してＡ．ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓを培養したときはＨＰＰオキシダーゼ活性が検出される。酵母エキスの量を増加させると（例えば２０ｍｇ．Ｌ−１の代りに２００ｍｇ．Ｌ−１）、酵素活性の産生量の減少が観察される。これらの観察に基づいてＭＡｇ培地を決定する。最後に、高密度培養物（静止相の初期；Ｄ６００〜１）は対数増殖期の培養物（Ｄ６００〜０．４）の場合よりも弱いＨＰＰオキシダーゼ酵素活性を有することが観察される。
【０１４２】
Ｉ．２．１．２−予備試験
前項でＨＰＰＯの産生に最適な培地を決定したので、ここでは、精製プロセス中にＨＰＰオキシダーゼ活性の安定度を低下させない条件を探す。アニオン交換樹脂を使用するクロマトグラフィー及びｐＨに依存するクロマトグラフィーの場合、ｐＨ及び塩に対する酵素の感度を知ることが重要である。最適ｐＨはｐＨ７．０−７．８の範囲であることが観察されたが、これはＢｌａｋｌｅｙ（１９７７）によって既に証明されていた。７５０ｍＭを上回る塩濃度にならないと酵素活性の減少は観察されないので、塩（ＮａＣｌ及びＫＣｌ）に対する酵素の感受性は比較的低いと考えられる。ここで酵素活性が十分に発現し得る条件を知ることができたので、我々は精製中に妨害になり得る要因に対するＨＰＰオキシダーゼ活性の感受性を決定した。従ってＨＰＰＯの精製を開始できる。
【０１４３】
Ｉ．２．２．３−ＨＰＰＯの精製
ＨＰＰＯを精製するために前述のプロトコルを応用する。酵素活性は５０ｍＭのリン酸塩バッファ，ｐＨ７．４中に１５０−２００ｍＭのＮａＣｌを含む溶液によってＤＥＡＥ  ＥＭＤ  ６５０Ｓから溶出する。酵素活性を含有する画分をプールし、４℃で一夜保存する。何故なら、この段階での凍結は活性低下を生じさせるからである。次にタンパク質をＳｏｕｒｃｅ  Ｑ樹脂に充填する。次に５０ｍＭのリン酸塩バッファ，ｐＨ７．４中に１５０−２００ｍＭのＮａＣｌを含む溶液によって酵素活性を溶出させる。酵素活性を含有する画分をプールし、次いでＵＶＩＫＯＮ  １０ｋＤａ膜上で濃縮し、４℃で一夜保存する。最後に、第三段階でヒドロキシアパタイトカラムにリン酸塩勾配を使用することによってＨＰＰＯを精製する。活性は３０ｍＭ付近のリン酸塩濃度で溶出する。ヒドロキシアパタイトカラムから出たＨＰＰオキシダーゼ酵素活性を含有する画分を、硝酸銀染色した８．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析する。ゲルは２つのタンパク質バンドの発生を示す。酵素活性プロフィルとタンパク質溶出プロフィルとの比較によって、我々はＨＰＰＯが高いほうの分子量（約６０ｋＤａ）のタンパク質に対応すると考える。ここに示した試験では、Ａ．ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓから抽出した１．５ｇの可溶性タンパク質を用いて精製を開始し、１５０μｇのタンパク質混合物（約７０μｇのＨＰＰＯを含む）を回収した。比活性に関する精製倍率は決定しなかった。即ち、酵素活性溶出の追跡に適した全反応条件を使用した。更に、タンパク質の同定は精製プロトコルの開発よりも難題であった。各精製段階の終わりに行った反応物のＨＰＬＣ分析は、４−ＨＰＡ標準（ＳＩＧＭＡ）と同じ保持時間をもつ生成物の出現を示す。４０ピコモルのＨＰＰＯタンパク質（６０ｋＤａ）をＰＶＤＦ膜に転移させ、アクリルアミドゲルに含まれていた４０ｐｍｏｌのタンパク質と同時に配列決定を依頼する。膜に転移したタンパク質はＮ末端配列の決定に役立ち、ゲルに含まれていたタンパク質は内部ペプチドの配列を決定するために使用される。
【０１４４】
Ｉ．２．２．４−ＨＰＰＯの配列決定の結果
Ｌｙｓ−ＣエンドプロテアーゼによるＨＰＰＯの消化後にＨＰＬＣの出口で得られる内部ペプチドは極めて少ない。この結果は、タンパク質がリシンを殆ど含有しないことを示唆する。Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼはリシンの後ろを開裂するからである。リシンが比較的少ないとき、エンドペプチダーゼＫで消化することによって長いペプチドフラグメントが生じ、これらはカラムに吸着されて保持され、極めて疎水性の条件を使用したときであっても溶出できない。クロマトグラフィーピークの形状及び見掛けの量に基づいて３つのペプチドを選択し、次いで配列決定する。これらのペプチドをＨＰＬＣカラムから出た順序に従ってペプチドＮｏ．４、ペプチドＮｏ．６、ペプチドＮｏ．１１と命名する。それらの配列はそれぞれ（Ａ）ＷＷＡＥＡＬＫ、ＡＡＡＧＲＩＬＲＬＬ  ＤＤＡＡＧＡＮＡＳＫ、ＸＤＮＲＦＴＡＶＤＦ  ＸＴである（ここにＸは未確定アミノ酸）。Ｎ末端の最初の３０個のアミノ酸の配列は４０％の初期収率で得られる：ＴＳＬＴＶＡＧＲＶＡ  ＱＶＬＳＳＹＶＳＤ  ＶＦＧＶＭＧＮＧＮＶ  Ｙ。開始コドン（ＡＴＧまたはＧＴＧ）に対応するアミノ酸（メチオニンまたはバリン）は検出されない。得られた初期収量（１５ｐｍｏｌのＢＳＡに等価）を内部ペプチドについて得られた初期収量（３０−３５ｐｍｏｌのＢＳＡに等価）に比較すると、タンパク質の一部がＮ末端でブロックされたことが示唆される。得られたＮ末端配列及び内部配列はデータベース中で相同性を全く有していない。ＨＰＰＯ遺伝子をＰＣＲによって同定するために、得られたペプチド配列に基づいて縮重オリゴヌクレオチドを合成する。
【０１４５】
Ｉ．２．３−ＰＣＲ技術の有効性の検証及びｈｐｐＯ遺伝子の一部分の同定
Ｉ．２．３．１−ＰＣＲ技術の有効性の検証
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ種のゲノムＤＮＡの大半ではグアニン及びシトシン塩基の含有率（ＧＣ％）が５９％−６６％の範囲である。しかしながら、Ａ．ａｇｉｌｉｓ（従来のＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇｉｌｉｓ）では６７−６９％（Ｋｏｃｈら，１９９５）、Ａ．ａｔｒｏｃｙａｎｅｕｓでは７０％（Ｊｏｎｅｓら，１９９１）であり、北極海の氷で同定されたＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ種では７３％（Ｊｕｎｇｅら，１９９８）である。グアニン及びシトシンのこのような高い含有率は、ＰＣＲの実施を難しくする。この理由から、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓの“マンガン依存性ジオキシゲナーゼ”（ＭｎｄＤ）（Ｂｏｌｄｔら，１９９５）をコードする遺伝子を使用してＰＣＲ法（ゲノムＤＮＡ、ポリメラーゼ、など）の有効性を検証した。この酵素はＨＰＰ分解経路で３，４−ジヒドロキシフェニルアセテートの芳香環の開環を触媒する。ＭｎｄＤ遺伝子の調節増幅のために、我々は複数の供給業者（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ＡＴＧＣ，Ａｐｐｌｉｇｅｎｅ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｓｉｇｍａ）によって商品化されているｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）の耐熱ポリメラーゼを試験した。どの場合にもＭｎｄＤ遺伝子の増幅が得られる。しかしながら、等価の条件下でＨＰＰＯペプチドをコードする縮重プライマーを使用すると、たとえ添加剤（ＤＭＳＯ、グリセロール）を使用してもｈｐｐＯ遺伝子の増幅は得られない。
【０１４６】
Ｉ．２．３．２−ｈｐｐＯ遺伝子のＮ末端部分のＰＣＲによる同定
我々は、ｈｐｐＯ遺伝子のＮ末端部分に対応すると考えられる９３６ｂｐのＤＮＡ配列を特異的に増幅させた。一方でペプチドＮｏ．６の一部分及びＮ末端ペプチド配列の一部分にそれぞれ対応する縮重プライマーＯｘ３：ＴＴＮＧＣＮＣＣＮＧ  ＣＮＧＣＲＴＣＲＴＣ及びＯＺ１０Ｎ：ＧＡＹＧＴＮＴＴＹＧ  ＧＮＧＴＮＡＴＧＧＧ  ＮＡＡＹＧＧを使用し、他方で“Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＧＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＰＣＲ”キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用することによって増幅が得られる。ＣｌｏｎｔｅｃｈキットはＧＣ塩基に富むゲノムをＰＣＲ処理するように設計されている。該キットは、耐熱ポリメラーゼの混合物（Ｔｔｈを含む）とベタインを基剤とする添加剤とを含む。ＴｔｈはＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから精製された耐熱ポリメラーゼである。各プライマーの縮重度は１０２４である。即ち、１０２４個のうちの１個のプライマーが、求める遺伝子と全く同じ核酸配列を示す。縮重は、１つのアミノ酸が複数のコドンによってコードされ得ることに由来する。例えば、アラニンは４つのコドン（ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＣＧＴ）によってコードされる。プライマーに使用した縮重コードは以下のように定義される：Ｎ＝ＡまたはＴまたはＧまたはＣ；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｙ＝ＴまたはＣ。理論的ハイブリダイゼーション温度はそれぞれ５５．４℃及び５７．６℃である。ＰＣＲに使用した６０℃というハイブリダイゼーション温度にかかわらず、ＯＸ３プライマーだけは非特異的増幅を許容する。我々は、２つの縮重プライマーを使用するＰＣＲによって９３６ｂｐのＤＮＡフラグメントを特異的に増幅させた。我々は、この増幅ＤＮＡが所望のｈｐｐＯ遺伝子に確かに一致することを確認しなければならない。
【０１４７】
Ｉ．２．４−９３６ｂｐのＤＮＡフラグメントの特性
ＰＣＲによって増幅された９３６ｂｐのＤＮＡフラグメントをアガロースゲル上で精製する。次に該フラグメントをｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙに製造業者の指示に従ってクローニングし、次いで配列決定する。得られた核酸配列が翻訳されると、該配列が２つの末端でペプチドＮｏ．６の全部とＮ末端配列の大部分とをコードしていることが観察される。従って、精製及びマイクロ配列決定したタンパク質ＨＰＰＯをコードする遺伝子の一部分が増幅されたと確信できる。核酸配列は塩基グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）を７３％含有する。更に、メッセンジャーＲＮＡの最初の２５０個の塩基中に“ステムループ”形二次構造の形成があり得ることも観察される。この遺伝子の一部分のＰＣＲ増幅が難しい理由はこのような塩基Ｇ及びＣの高い含有率及び二次構造の存在によってある程度説明できる。９３６ｂｐの核酸配列及び対応するタンパク質配列は、データベースに記録された配列との相同性を全く有してしない。我々はここで、Ｎ末端から内部ペプチドＮｏ．６に向かう配向の９３６ｂｐの配列を得ることに成功した。タンパク質はほぼ６０ｋＤａの分子量を有するので、我々が求める遺伝子は約１６５０ｂｐの遺伝子である。従って約７００ｂｐを同定する作業が残っている。このために、コスミドｐＬＡＲＦ５中で作製し大腸菌ＨＢ１０１中で増幅したＡ．ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓのゲノムライブラリーをスクリーニングする。
【０１４８】
Ｉ．２．５−Ａ．ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓのコスミドライブラリーのスクリーニング
作製したゲノムライブラリーを膜に転移させ、次いでジゴキシゲニンで標識した９３６ｂｐのＤＮＡフラグメントをプローブとして用いてスクリーニングする。標準プロトコルは“規格型の”ＤＮＡ（６０％ＡＴ）に合うように設計されているが、９３６ｂｐのフラグメントはＡＴ比率２３％と推定される。規格型ＤＮＡの場合と同様のｄＵＴＰ−Ｄｉｇ／ｄＴＴＰ比を維持するならば、弱く標識されたプローブしか得られないので、検出感度も低い。従って我々は、ｄＵＴＰ−Ｄｉｇ／ｄＴＴＰの割合をプローブ標識に必要な最適の値にする（ＩＩ．７．１の項）。ゲノムライブラリーのスクリーニングによって、異なる制限プロフィルをもつ４つのコスミド（Ｃｏｓ１Ａ、Ｃｏｓ２Ａ、Ｃｏｓ４Ａ、Ｃｏｓ１７Ａ１）を同定し得る。コスミドで得られたサザンハイブリダイセーション結果をＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓのゲノムＤＮＡで得られたサザンハイブリダイセーション結果に比較し、コスミド２Ａを選択する。図１４は、例えば制限酵素ＮｏｔＩでコスミドを消化した場合に使用した手順を示す。最初に、ＮｏｔＩで消化したコスミドベクターｐＬＡＦＲ５がＺ２−Ｄｉｇプローブとハイブリダイズしないことが観察される。これに反して、コスミド１Ａは２．３ｋｂに単一のハイブリダイゼーションバンドを示し、コスミド２Ａ、４Ａ及び１７Ａは４．３及び２．３ｋｂに２つのハイブリダイゼーションバンドを示すことが観察される。また、Ａ．ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓのゲノムをＮｏｔＩで消化すると４．３及び２．３ｋｂの２つのバンドが生じる。これらの結果から、コスミド１Ａは我々が求める情報を全部は含まないと考えられる。別の制限酵素を使用し同様の手順によって処理することによって、コスミド４Ａ及び１７Ａを除外する。次にコスミド２ＡをプローブＺ２−Ｄｉｇの中央で同定されたＮｏｔＩ部位の両側の約３ｋｂの範囲にわたって配列決定する。ゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションの結果は更に、遺伝子が単一コピーとして存在することを示す。６．２ｋｂにわたって配列決定したコスミド２Ａを同定した。ここで我々はＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓのゲノムに由来するこのＤＮＡ配列を分析できる段階に到達した。
【０１４９】
Ｉ．２．６−Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓのゲノムＤＮＡの６．２ｋｂの総合分析
Ｖｅｃｔｏｒ  Ｎｔｉソフトウェアを使用し、コスミド２Ａの配列決定によって得られた６２５５ｂｐの核酸配列に基づいて予測される遺伝子の位置を決定する。ＰＣＲによって同定された９３６ｂｐの配列が再び見出され、この配列は予測される遺伝子の一部を構成していると考えられる。従って予測されるこの遺伝子がｈｐｐＯ遺伝子に対応するという推測は正しいであろう。ＢＬＡＳＴＸアルゴリズムを使用して相同性を探求することによって４つの別の遺伝子（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）の同定が予測される（図３）。遺伝子Ａはアミノ酸運搬体をコードしており、これまでの試験ではグラム陽性菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｎｅｓｔｅｒ  ＆  Ｍｏｎｔｏｙａ，１９７６）中のチロシンアミノトランスフェラーゼ活性を有していることが判明していた遺伝子Ｂはヒスチジノール−ホスフェートアミノトランスフェラーゼをコードしており、遺伝子Ｃは転写調節配列をコードしており、遺伝子Ｄはオペロン調節配列をコードしていると考えられる。
【０１５０】
Ｉ．２．７−ｈｐｐＯ遺伝子の解析
Ｉ．２．７．１−総論
得られた６２５６ｂｐの配列において、ｈｐｐＯ遺伝子（緑色）は５′端の３１４３位のＡＴＧ開始コドンから３′端の４８２３位の終結コドン（赤色）までの範囲である。従って遺伝子の実際の長さは１６８０ｂｐである。遺伝子は塩基Ｇ及びＣを高い含有率で含む（７１．４％のＧＣ）。核酸配列レベルの相同性の探求（ＢＬＡＳＴＮ）では同定が全く得られない。遺伝子をもっと十分に特性決定するために、転写及び翻訳の特異的要素を探求する。
【０１５１】
Ｉ．２．７．２−ｈｐｐＯ遺伝子の転写及び翻訳を特性決定する要素
予測された転写プロモーターボックスを同定する（図４）。“プリブナウボックス”と呼ばれる１０塩基上流（“−１０”）のボックスは３０８２と３０８８との間に局在し（ＡＡＡＡＡＴＡ）、３５塩基上流（“−３５”）のボックスは３０５５−３０５９に局在する（ＴＴＧＣＡ）。決定されたこれらのボックスは標準配列（それぞれＴＡＴＡＡＴ及びＴＡＧＡＣＡ；Ｓｉｎｇｅｒ  ＆  Ｂｅｒ，１９９２）とは多少異なっている。これは、構成的転写を許容する因子との相互作用が弱いこと、あるいは、複数の異なる転写因子との相互作用が必要であることを表す。３０９６位のアデニンが転写開始塩基であろう。最後に、３０６８位と３０７２位との間でＣＡＰタンパク質（カタボライト遺伝子アクチベータータンパク質）の結合部位に対応する配列（ＴＧＴＧＡ）が同定される。このＣＡＰタンパク質結合部位が再び見出されることは培養条件を最適化するときに得られた結果に符合する。結論として、ｈｐｐＯ遺伝子の転写は弱いプロモーター、特にグルコースによって調節される弱いプロモーターのコントロール下にあるに違いないと考えられる。シャイン・ダルガルノ配列（Ｓｉｎｇｅｒ  ＆  Ｂｅｒｇ，１９９２）は小さいリボソームサブユニットに結合し得る。この配列は、ＡＧＧＡコンセンサス配列から類推することによって翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の１２塩基上流で同定される（ＧＡＣＧＡＴ；３１３１位から３１３６位）。我々は更に、メッセンジャーＲＮＡの５′末端部（約２５０塩基対）がステムループ構造を形成し得ることを観察した。開始コドンＡＴＧに隣接のｍＲＮＡの領域の二次構造は翻訳開始段階に影響を与える。即ち、開始コドンＡＴＧまたはシャイン・ダルガルノ配列が分子内対合に含まれているときは開始が全くまたは殆ど無効である。このため、観察されたステップループ構造が翻訳調節機能を有するか否かという疑問が生じる。
【０１５２】
Ｉ．２．７．３−ｔａｃプロモーターのコントロール下のＨＰＰＯの発現
ＨＰＰＯの超発現は、抗体を産生し得る反応速度特性を決定するためにも、構造解析のためにも有利である。遺伝子をベクターｐＫＫ２２３−３に２段階でクローニングする。ｈｐｐＯ遺伝子を同定するために決定した条件下でプライマーＨＰＰ−Ｎ−ｓｅｎｓｅ（ＣＡＴＧＡＣＴＴＣＡ  ＣＴＴＡＣＡＧＴＧＴ  ＣＣ）とＨＰＰ−Ｃ−ｔｅｒｍ（ＣＡＡＡＣＴＧＡＧＴ  ＡＧＣＡＧＣＴＣＡＧ  Ｇ）とを使用するＰＣＲによって増幅した遺伝子をベクターｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙにクローニングする。ｌａｃプロモーターに対してアンチセンス方向のｈｐｐＯ遺伝子を有するクローンを選択する。次いでこの遺伝子をＥｃｏＲＩによって消化する。この消化によってｈｐｐＯ遺伝子を回収し、この遺伝子をＥｃｏＲＩ消化ベクターｐＫＫ２２３−３に挿入する。ｈｐｐＯ遺伝子をｔａｃプロモーターのコントロール下に含むクローンｐＫＫ３−２を選択する。ＩＰＴＧを加えることによってクローンｐＫＫ３−２の発現を誘発すると、ＨＰＰオキシダーゼ活性を検出できる。しかしながら、変性用アクリルアミドゲル上で分離した未精製抽出物中では超発現タンパク質（５７．４ｋＤａ）を検出できない。従って、超発現プロトコルには改良の余地がある。我々は更に、超発現タンパク質の精製を容易にするために、Ｔａｇ配列（ＧＳＴ、ポリヒスチジン、プロテインＡ、など）と融合したＨＰＰＯのクローニングを計画し、最終的には、同定された遺伝子がＨＰＰオキシダーゼ活性をコードするらしいことが判明する。しかしながら、タンパク質配列レベルの相同性を探求すると（ＢＬＡＳＴＸまたはＢＬＡＳＴＰ）、ＨＰＰＯタンパク質はアセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）、ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＯＸ）及びピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）に対して２５％までの相同性を有することが観察される。従って、ＴＰＰ補因子の結合に関するモチーフのような極めて保存されたモチーフを同定することが可能である（図５）。更に、ＨＰＰＯの疎水性プロフィルはＡＬＳについて得られたプロフィル（図示せず）に極めて近似している。同定した遺伝子が、実際にＨＰＰＯをコードしていること、ＨＰＰオキシダーゼ型の副次的活性を有しているＡＬＳ、ＰＯＸまたはＰＤＨをコードしていないことを確認するために、ＨＰＰＯが予測される副次的活性を有するか否かについて試験することにした。
【０１５３】
Ｉ．２．８−ＨＰＰＯ対ＡＬＳ
タンパク質の相同性試験から、ＨＰＰＯはＡＬＳに対して２５％までの一致を有することが判明する。この結果は、一見すると意外ではあるが、ある程度は当然である。即ち、これらの２つの酵素は反応補因子としてＦＡＤとＴＰＰとを使用する。これらの酵素は双方ともが脱カルボキシル化を行う。更に、ＡＬＳの基質の１つがピルベートである。我々の基質は置換βピルベート：ヒドロキシフェニルピルベートである。従って、活性部位の構造が類似しており、その結果としてこれらのタンパク質が共通の酵素活性を有することはあり得る。ＨＰＰＯ中のＡＬＳ活性を探求するために行った我々の実験では陽性対照としてＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのＡＬＳ（Ｃｈａｎｇ  ＆  Ｄｕｇｇｌｅｂｙ，１９９７）及び大腸菌のＡＬＳ（Ｈｉｌｌ  ＆  Ｄｕｇｇｌｅｂｙ，１９９８）から精製した大きい組換えサブユニットを使用した。得られた結果は、ＨＰＰＯがＡＬＳ活性を全く有していないことを示す。この機会に我々はまた、試験した２つのＡＬＳがＨＰＰオキシダーゼ活性を全く有していないことを示す。我々は最後に、ＨＰＰＯが１１５ｐｐｍのイマザピル（ＡＬＳインヒビター、シアナミド）によって阻害されないことを観察する。これらの結果は、ＡＬＳとＨＰＰＯとは共通点（タンパク質配列及び疎水性）を有しているにもかかわらず、明らかに異なる酵素であり、副次的酵素活性を有していないことを示す。
【０１５４】
実施例２：４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子の同定
４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）はアセチル鎖の置換を伴うヒドロキシル化反応によって４−ＨＰＡをＨＧＡに変換する。この酵素の活性は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  Ｓ１の未精製抽出物（Ｓｕｅｍｏｒら，１９９５）またはＰ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓの部分精製抽出物（Ｈａｒｅｌａｎｄ，１９７５）に対して特性決定された。この酵素はＳｕｅｍｏｒｉら（１９９６）によって精製されたが、タンパク質及び遺伝子の配列は未発表である。この酵素活性を植物に導入できるようにするためには遺伝子を同定することが必要である。
【０１５５】
複数の異なる方法を検討する：（１）ゲノムライブラリーを使用して表現型相補及び／または機能相補を試験する、（２）挿入的突然変異を誘発し、その結果生じた酵素活性の消滅によって遺伝子を同定する、（３）タンパク質を精製し、溯って核酸配列を推定する。これらの３つの方法に用いるためにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓを選択した。何故なら、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの様々な種及び菌株に対する有効性が証明された多くの分子生物学ツールが存在するからである。その例として、ｍｉｎｉ−Ｔｎ５トランスポゾン（Ｄｅ  Ｌｏｒｅｎｚｏら，１９９０）、ｐＢＢＲ１ＭＣＳのような広い宿主スペクトルをもつベクター（Ｋｏｖａｃｈら，１９９４、１９９５；Ｄ′Ｓｏｕｚａら，２０００）、及び、コンジュゲーションによる転移技術が挙げられる。ｍｉｎｉ−Ｔｎ５トランスポゾンは、遺伝子を変調するため（ｄｅ  Ｌｏｒｅｎｚｏら，１９９０；Ｆｅｄｉら，１９９６；Ｃａｍｐｏｓ−Ｇａｒｃｉａら，２０００）、または、遺伝子を細菌ゲノムに導入するため（Ｐｒｉｅｔｏら，１９９９）に使用できる。表現型相補による方法が最も迅速で最も簡単であると考えられるのでこの方法を最初に使用した。この方法の後で別の２つの方法を同時に行った。しかしながら、挿入的突然変異誘発による方法は開発が継続されていないのでこの方法には着手しなかった。
【０１５６】
ＩＩ．１−材料及び方法
ＩＩ．１．１−大腸菌中のＰ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓゲノムライブラリーの構築
このライブラリーを構築するために、コスミドｐＬＡＦＲ５及びＰ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓのゲノムＤＮＡを使用する。宿主として大腸菌ＨＢ１０１株を使用する。
【０１５７】
ＩＩ．１．２−４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼの精製
ＩＩ．１．２．１−分光光度法による活性試験
Ｈａｒｅｌａｎｄら（１９７５）が記載した４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼによって触媒される反応では、分子酸素及びＮＡＤＨ，Ｈ＋が消費される。ＮＡＤＨ，Ｈ＋からＮＡＤ＋への酸化を追跡することによって酵素活性を測定する方法を選択した。反応培地は、３００μＭのＮＡＤＨ，Ｈ＋；６．７μＭのＦＡＤ；１００ｍＭのＫＰｉ；１ｍＭのＤＤＴ；１０−５０μｇのタンパク質を含む。基質：１ｍＭの４−ＨＰＡを添加して反応を開始させる。反応を３４０ｎｍまたは２９２ｎｍで２−１０分間追跡する。何故なら、ＮＡＤＨ，Ｈ＋の消費は３４０ｎｍの吸光度の減少として現れるが、ホモゲンチジン酸の産生は２９２ｎｍの吸光度の増加として現れるからである。分光光度試験は極めて迅速であり、精製段階のタンパク質溶出を追跡する常用の手段である。
【０１５８】
ＩＩ．１．２．１−ＨＰＬＣ活性試験
酵素反応をＨＰＬＣで分析することによってＨＧＡの産生を確認し得る（保持時間、ＵＶスペクトル）。酵素試験は上記と同じ条件で行う。しかしながら、反応を停止させるために添加する２０％過塩素酸の使用量を１／３にする。次いで、９０％の相Ａと１０％の相Ｂまたは９２％の相Ａと８％の相Ｂでアイソクラチック溶出を行うＨＰＬＣによって反応物を分析する。相Ａは０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有するｍｉｌｌｉＱ水であり、相Ｂはアセトニトリルに対応する。９０％−１０％のアイソクラチック溶出では、ＨＧＡが１．２分で溶出するが、９２％−８％のアイソクラチック系では、ＨＧＡが１．４分で溶出する。溶出を一般には２３０ｎｍで記録する。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｔｗｅｅｌら（１９８６）は、ホモゲンチセートジオキシゲナーゼを阻害しこれによってＨＧＡを蓄積させるために、２，２′−ビピリジル（非ヘム鉄タンパク質インヒビター）を使用した。このような理由で、２ｍＭの２，２−ビピリジルを幾つかの反応培地に添加する。これらのクロマトグラフィー条件で４−ＨＰＡ及びＨＧＡを同定することが可能である。ＨＰＬＣシステムはＡｌｌｉａｎｃｅ  ２６９０  ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）と９９６ダイオードアレイデテクタ（Ｗａｔｅｒｓ）とから成る。
【０１５９】
ＩＩ．１．２．３−ＨＰＡＨタンパク質の精製
４−ＨＰＡを唯一の炭素源として含有するＭ６３培地でＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓを２９℃、２２０ｒｐｍで４８時間培養する。細菌を６℃、３，０００ｇで１５分間遠心する（Ｂｅｃｋｍａｎｎ  Ｊ２／２１  Ｍ／Ｅ遠心機）。細菌ペレットを音波処理バッファ（０．１ＭのＫＰｉ，ｐＨ７．２；１ｍＭのＭｇＳＯ４；１ｍＭのＤＴＴ；１ｍＭのベンズアミジン塩酸塩；５ｍＭのカプロン酸）に入れる。ベンズアミジン塩酸塩及びカプロン酸はプロテアーゼインヒビターである。音波処理は、４０秒毎にパワー５で２０秒間音波処理しながら９分間継続する（Ｖｉｂｒａ  Ｃｅｌｌ，Ｓｏｎｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＩＮＣ．，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ，ＵＳＡ）。音波処理中にサンプルを氷の融解温度に維持する。音波処理した抽出物を４℃、１５，０００ｇで１５分間遠心する。回収した上清を１％の硫酸ストレプトマイシンによって沈殿させる。沈殿物を４℃、１５，０００ｇで１５分間遠心することによって除去する。上清をＰＤ１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で脱塩し、次いでバッファＡ（２０ｍＭのＫＰｉ，ｐＨ７．２、１０％のグリセロール、１ｍＭのＭｇＳＯ４、１ｍＭのＤＴＴ）で平衡させたＤＥＡＥ／ＥＭＤ  ６５０Ｓカラムに充填する。バッファＢ（バッファＡ；１ＭのＫＣｌ；１００μＭのＦＡＤ）を使用して溶出させる。ＫＣｌ濃度が１５０ｍＭに近い範囲で４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼ酵素活性が溶出する。ＵＶＩＫＯＮ  １０ｋＤａ膜で濃縮し次いでＰＤ１０カラムで脱塩した活性画分を次に、バッファＡ（上述）で平衡させたＲｅｄアフィニティカラム（Ｒｅｄ  １２０  Ａｇａｒｏｓｅ  ｔｙｐｅ  ３０００  ＣＬ，ＳＩＧＭＡ  Ｒｅｆ  Ｒ−０５０３）に充填する。２段階で溶出させる。第一段階ではＦＡＤを最終濃度５０μＭに富化したバッファＡを使用してＲｅｄカラムを洗浄する。第二段階ではタンパク質を溶出させる。このために、バッファＡにＦＡＤ（３ｍＭ）及びＮＡＤＨ，Ｈ＋（１０ｍＭ）を富化する。有益なタンパク質を含有する画分をプールし、濃縮し、−８０℃で凍結する。
【０１６０】
ＩＩ．１．３−Ｎ末端及び内部ペプチドのタンパク質のマイクロ配列決定
精製したタンパク質の配列決定を行うためにＨＰＰオキシダーゼの場合に記載したプロトコルと同じプロトコルを使用した。しかしながら、内部ペプチドを産生させるためには、Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼの代わりにトリプシンでタンパク質を消化した。トリプシンはアルギニン及びリシンの後ろを開裂する。トリプシンによる消化では一般に、Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼによる消化で得られるフラグメントよりも短いフラグメントが得られる。回収したペプチドを正確に配列決定するためには、回収したペプチドをＨＰＬＣで再精製することがときには必要である。
【０１６１】
ＩＩ．１．４−縮重ＰＣＲを使用したＨＰＡＨをコードする遺伝子の一部分の同定
縮重プライマーを合成するために４３頁［原文］に示した縮重コードを使用する。ＰＣＲは２００μＬ管で最終容量５０μＬで行う。反応溶液は、パーキンエルマーバッファと２５０μＭのｄＮＴＰと５０ｎｇのＰ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓゲノムＤＮＡと２酵素単位のＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）とを含有する。反応は、“Ｈｙｂａｉｄ  Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ”サーモサイクラーを使用し、９４℃で３分間；次いで９４℃で３０秒、５０℃で１分、７２℃で１分３０秒を４５サイクル；次に、７２℃で５分間の最終延長；その後に４℃に戻すというサイクルで行う。１０μＬを１％アガロースゲルに充填後、ＰＣＲを評価する。これらの条件下で５３６ｂｐのバンドが同定される。
【０１６２】
ＩＩ．１．５−Ｐ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓのコスミドライブラリーのスクリーニング
コスミドライブラリーをＬＢＴ１５培地で平板培養し、３７℃で１６時間増殖させる。シャーレを４℃に移す。１時間後、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ  ＆  Ｈｏｇｎｅｓｓの方法（１９７５）に従ってコロニーをＨｙｂｏｎｄ  Ｎ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に転移させる。前項で同定し精製した５３６ｂｐのＰＣＲフラグメントを使用して膜をハイブリダイズさせる。３２Ｐによって検出する。“ＤＮＡ  Ｒｅａｄｙ  ｔｏ  Ｇｏ”キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用してプローブを標識する。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及び洗浄をバイアルで行う。５×ＳＳＣ、６％のデンハルト溶液及び０．５％のＳＤＳから成る溶液中で膜を６８℃で４時間プレハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションは６８℃で１６時間行う。洗浄は、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で６５℃で行う。ＫｏｄａｋまたはＡｍｅｒｓｈａｍのフィルムに露光することによって膜を現像する。
【０１６３】
ＩＩ．１．６−Ｐ．ｐｕｔｉｄａ増殖培地
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａを１００μｇ．ｍＬ−１のリファンピシンを含有するルリア−ベルタニ（ＬＢ）または２ＹＴ富培地で培養する。必要に応じて別の抗生物質を添加する（例：１５μｇ．ｍＬ−１のテトラサイクリン）。機能相補を試験するためには４−ＨＰＡを唯一の炭素源として含有する１．５ｇ．Ｌ−１の最小培地Ｍ６３を使用する。この場合には抗生物質を省略する。全部の培養物を２９℃で調製する。
【０１６４】
ＩＩ．１．７−電気穿孔によるＰ．ｐｕｔｉｄａの形質転換
１リットルのＬＢリファンピシン（１００μｇ．ｍＬ−１）培地に、１８０ｒｐｍで振盪しながら２９℃で約１６時間増殖させたＰ．ｐｕｔｉｄａの培養物を接種する。ＯＤ６００ｎｍが１．２に近い値になったとき、３，０００ｇ、４℃で１５分間遠心することによって細胞を収集する。培養培地を除去し、細胞を４℃の４００ｍＬの１０％グリセロールに入れる。細胞を再度３，０００ｇ、４℃で２０分間遠心する。それぞれ２００ｍＬ及び１００ｍＬの１０％グリセロールを順次に用いて４℃で更に２回洗浄する。最後に、細菌を３−１０ｍＬの１０％グリセロールに入れ、次いで１００μＬのアリコートに分け、液体窒素中で直ちに凍結させる。このようにして調製した細菌は−８０℃で少なくとも６カ月保存される。コスミド（ＴｅｔＲ）ＤＮＡを電気穿孔によってＰ．ｐｕｔｉｄａ（ＲｉｆＲ）に導入する。８０ｎｇのコスミドＤＮＡを１００μＬのエレクトロコンピテントな１００μＬのＰ．ｐｕｔｉｄａに電気穿孔（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  ＰｕｌｓｅｒＴＭ）によって導入するために、２ｍｍの電気穿孔キュベット内で、０．９ボルトの電圧下、電気抵抗器の抵抗を２００オームにする。これらの条件下で、時定数τは約４．５ミリ秒である。電気ショック後、細胞を９００μＬのＬＢに入れ、２９℃、１８０ｒｐｍで１時間３０分培養する。形質転換されたＰ．ｐｕｔｉｄａをＬＢ  Ｒｉｆ１００  Ｔｅｔ１５寒天培地上で選択する。
【０１６５】
ＩＩ．１．８−広い宿主スペクトルをもつベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−ＧｍＲの修飾
グラム陰性菌に広い宿主スペクトルをもつｐＢＢＲ１ＭＣＳシリーズのベクター（Ｋｏｖａｃｈら，１９９４、１９９５）を使用した。Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの複製起点を有するこれらのプラスミドは大腸菌中では１細胞あたり約２０−３０コピーで複製される。これらのプラスミドは２つのＮｏｔＩ部位を含んでいる。以後のクローニングを容易にするために、プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−ＧｍＲ上の多重クローニング部位（ＭＣＳ）の外部に存在するＮｏｔＩ部位を削除する。このために、プラスミドをＳｆｉＩで開裂し（５０℃）、次いで平滑末端を得るためにＴ４  ＤＮＡポリメラーゼによって処理する。プラスミドは自身に再連結する（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ−Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）。連結後（１６時間、１６℃）、“野生型”プラスミドがもし存在するならばこれを除去するためにＳｆｉＩで消化し、次いで大腸菌ＤＨ５αに電気穿孔する。ＬＢ  Ｇｍ２０培地上で選択されたクローンからプラスミドＤＮＡを単離する。プラスミドＤＮＡを２つの消化物ＮｏｔＩ及びＮｏｔＩ／ＢｇｌＩＩによって特性決定する。１つのクローンｐＢＢＲ１ＭＣＳ−Ｇｍ−Ｎｏｔ−Ｕを保存する。
【０１６６】
ｐＩＩ．１．９−ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−Ｇｍ−Ｕ中のＣｃｏｓ８のサブクローニング
コスミドＣｃｏｓ８をＮｏｔＩで制限し、次いでアガロースゲルに充填する。泳動後、６つのＤＮＡバンドが観察される：１．７；３；４；５；８；１０ｋｂｐ。バンドをＱｕｉａｅｘＩＩで精製する。更に、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−Ｇｍ−Ｎｏｔ−ＵをＮｏｔＩで制限し、小エビのアルカリホスファターゼ（Ｓ．Ａ．Ｐ．；ｓｈｒｉｍｐ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）を使用して脱リン酸化する。次に、種々の“インサート／ベクター”比を使用して複数の異なるバンドをベクターに連結させる（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、１６時間、１６℃）。連結産物で大腸菌ＤＨ５αを形質転換させる。
【０１６７】
ＩＩ．１．１０−大腸菌とＰ．ｐｕｔｉｄａとの間のトリパレンタルコンジュゲーション
Ｃｃｏｓ８（ＧｍＲ）の複数の異なるサブクローンを大腸菌ＤＨ５αからＰ．ｐｕｔｉｄａ（ＲｉｆＲ）に転移させるために、Ｄｅ  Ｌｏｒｅｎｚｏら（１９９０）によって記載されたプロトコルを使用しフィルター上のトリパレンタルコンジュゲーションによって処理する。回収した細菌をＬＢ  Ｒｉｆ１００  Ｇｍ２０培地及び４−ＨＰＡを唯一の炭素源として有しているＭ６３上で平板培養する。
【０１６８】
ＩＩ．１．１１−プラスミドｐ５ｋｂＣの除去
Ｐ．ｐｕｔｉｄａからプラスミドｐ５ｋｂＣを速やかに除去するために、不適合複製起点戦略を使用し、抗生物質を使用してｐ５ｋｂＣを強制的に除去する。プラスミドｐ５ｋｂＣ（ＧｍＲ）によって相補されたＰ．ｐｕｔｉｄａ（Ｒｉｆ１００）をｐＢＢＲ１ＭＣＳ  ＫｎＲで形質転換させる。得られたクローン（Ｒｉｆ１００  ＧｍＲ  ＫｎＲ）についてそれらの相補活性を検証する。次にクローンを２つの培地：ＬＢ  Ｒｉｆ１００  Ｋｎ１５０  Ｇｍ２０及びＬＢ  Ｒｉｆ１００  Ｋｎ１５０で培養する。これによってｐ５ｋｂＣ及びｐＢＢＲ１ＭＣＳ  ＫｎＲに対する選択圧力またはｐＢＢＲ１ＭＣＳ  ＫｎＲ単独に対する選択圧力が維持される。２９℃で増殖させる。３日毎に継代培養を行う。８回目の継代培養で、出発シャーレにかかわりなくコロニーを４つの異なる培地（Ｍ６３、Ｍ６３＋４−ＨＰＡ、ＬＢ  Ｒｉｆ１００  Ｋｎ１５０  Ｇｍ２０及びＬＢ  Ｒｉｆ１００  Ｋｎ１５０）に継代培養する。２日後及び７日後に増殖状態を記録する。
【０１６９】
ＩＩ．１．１２−酵素活性に関与するタンパク質の同定
ＩＩ．１．１２．１−Ｐ．ｐｕｔｉｄａの未精製抽出物の調製
２つのＰ．ｐｕｔｉｄａクローンをＬＢ  Ｇｍ２０で２４時間培養する。第一のクローンはプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−Ｇｍ−Ｎｏｔ−Ｕを含み、第二のクローンは相補性プラスミドｐ５ｋｂＣを含む。バッファ（０．１ＭのＫＰｉ；１ｍＭのＭｇＳＯ４；１ｍＭのＤＴＴ；１ｍＭのベンズアミジン塩酸塩；５ｍＭのカプロン酸）中で音波処理した後、２０，０００ｇ、４℃で１０分間遠心する。２つの酵素活性測定法を使用して上清の４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼ活性を試験する。未精製抽出物を更に、ＳＤＳ−１０％  ＰＡＧＥによって分析する。
【０１７０】
ＩＩ．１．１２．２−膜への転移、Ｎ末端の配列決定
配列決定は実施例Ｉと同様に行う。
【０１７１】
ＩＩ．１．１２．３−Ｓ７５ゲル濾過
１０Ｋ  ＭａｃｒｏｓｅｐＴＭ（Ｐａｌｌ  Ｆｉｌｔｒｏｎ）を使用し溶出液（５ｍＬ）を４℃で２時間処理して１０倍に濃縮する。５００μＬの濃縮液を７００ｍＬのバッファ（０．０２ＭのＫＰｉ，ｐＨ７．２；１０％のグリセロール；１ｍＭのＭｇＳＯ４；１ｍＭのＤＴＴ；４℃）によってで予め平衡させたＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ  ７５プレップグレードのゲル濾過カラム（ＨｉＬｏａｄ  １６／６０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に０．７ｍＬ．分−１の流速で注入する。クロマトグラフィーは４℃、１ｍＬ．分−１の流速で行う。毎分画分を収集し、４℃で保存する。
【０１７２】
ＩＩ．１．１２．４−ｐＢＢＲ１ＭＣＳ  ＦＴ１２Δ１の構築
ｐＢＢＲ１ＭＣＳ  ＦＴ１２Δ１を構築するために、２段階クローニング戦略を使用する。プラスミドｐ５ｋｂＣをＮｓｉＩ及びＮｏｔＩで消化する。得られた遺伝子１、ｈｐａＨ及び３をコードしているインサートを、ＰｓｔＩ及びＮｏｔＩで消化したｐＢＢＲ１ＭＣＳ−Ｇｍ−Ｎｏｔ−Ｕにクローニングする。得られたクローンをｐＢＢＲ１ＭＣＳ  ＦＴ１２と命名し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｓｓｃＩで制限し、次いで平滑末端を形成し、最後に再連結させる。これによって、遺伝子１と３とが破壊され、ｈｐａＨ遺伝子が出発ベクターのｌａｃプロモーターのコントロール下に配置される。このようにしてプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ  ＦＴ１２Δ１が得られる（図６）。
【０１７３】
ＩＩ．１．１２．５−ｐＬ１ｌａｃ２の構築
実験室には“クローンＬ”と命名されたプラスミドがある。この構築物はＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのプロモーターとＨＰＰＤ遺伝子とをベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−ＫｎＲにクローニングしたものである。ＨＰＰＤ遺伝子プロモーターはＰ．ｐｕｔｉｄａ及び大腸菌中で機能性である。プラスミド“クローンＬ”をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化すると、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのプロモーターとＨＰＰＤ遺伝子とを含むインサートを回収し得る。このインサートを次に、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−ＧｍＲに連結させる。得られたクローンをｐＢＢＲＧ−Ｌ−ＨＰＰＤと命名する。得られたプラスミドを、ＨＰＰＤをコードする遺伝子を除去するためにＮｃｏＩで消化し、このプラスミドを、ＰＣＲで増幅しＡｆｌＩＩＩで消化したｈｐａＣ遺伝子に連結させる。得られた構築物をｐＢＢＲＧ−Ｌ−ＯＲＦ１と命名する。ＰＣＲによってｈｐａＣ遺伝子を増幅するためには、遺伝子の初端及び終端にＡｆｌＩＩＩ部位を導入し得るプライマーを使用する（ＡｆｌＩＩＩ部位はＮｏｔＩ部位に適合性である）。使用したプライマーは、遺伝子の５′に：ＧＣＡＧＧＡＴＧＣＡ  ＣＡＴＧＴＣＣＡＣＣ  ＡＡＧＡＣ、遺伝子の３′に：ＣＧＧＡＣＧＣＣＧＡ  ＣＡＴＧＴＡＴＣＡＧ  ＣＣＴＴＣである。ＰＣＲは、１単位のＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ）、２５０μＭのｄＮＴＰ、２００ｎＭの各プライマー、５０ｎｇのプラスミドｐ５ｋｂＣを使用して行う。ＰＣＲプログラムはＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ９６００上で以下のように行う：９５℃で３分間；次に９４℃で１分、６０℃で３０秒、６８℃で３分を２０サイクル；最後に６８℃で１０分間の最終段階。前項で得られたプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ  ＦＴ１２Δ１をＳｓｐＩ及びＮｏｔＩで制限する。Ｐｆｕで処理することによってＮｏｔＩ部位に平滑末端を形成する。ｈｐａＨ遺伝子をｌａｃプロモーターのコントロール下に含むフラグメント（２４６８ｂｐ）を回収し、ＳｓｐＩで消化したｐＢＢＲＧ−Ｌ−ＯＲＦ１に連結させる。ｈｐａＣ遺伝子とｈｐａＨ遺伝子とをアンチセンス方向で含むクローンを選択し、ｐＬ１ｌａｃ２と命名する。このクローニングはすべて大腸菌ＤＨ５α中で行う。
【０１７４】
ＩＩ．２−結果
Ｐ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓの４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼ活性をコードする遺伝子を同定するために複数の異なる方法を使用できる。我々は先ず、表現型着色法を使用することにした。この方法は簡単で迅速であると考えられる。実際、我々の実験室にはＨＧＡの産生を検出するための表現型スクリーニングツールがある。ここで求められる酵素は４−ＨＰＡをＨＧＡに変換する酵素である。
【０１７５】
ＩＩ．２．１−表現型着色法
大腸菌Ｋ１２が、唯一の炭素源としてチロシンまたは４−ＨＰＡを使用するときに増殖できないことは我々の実験室で観察されていた。我々はまた、大腸菌Ｋ１２がＨＰＰからチロシンを合成し得るチロシンアミノトランスフェラーゼ活性を有することを知見している。この酵素活性は可逆的であり、従って細胞はチロシンからＨＰＰを産生し得る。富培養培地がチロシン富化培地であるとき（１ｇ．Ｌ−１）、チロシンは細菌に取り込まれ、細菌はチロシンを蓄積し、次いでＨＰＰとチロシンとの間の変換反応の平衡定数に従ってチロシンをＨＰＰに変換する。我々は既に実験室で、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのＨＰＰＤを大腸菌Ｋ１２に導入するならばチロシンの脱アミノ化中に産生されたＨＰＰがホモゲンチジン酸塩（ＨＧＡ）に変換されることを観察していた。ＨＰＰＤによって触媒される反応は不可逆的なので、ＨＧＡが細胞中に蓄積し、細胞中で酸化され、次いで自発的に重合し、オークル系（ｏｃｈｒｏｎｏｔｉｑｕｅ）色素を形成して、褐色になる。従って、これをＨＧＡの産生検出手段として利用し得る。求める４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼは４−ＨＰＡをＨＧＡに変換する。従って、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓのゲノムライブラリーを含む大腸菌ＨＢ１０１を、４−ＨＰＡが富化された２ＹＴ寒天培地で平板培養する。２日後、２つのコロニーが褐色になる。従ってこれらのコロニーはホモゲンチジン酸塩を産生する。しかしながら、これらの２つのクローンの未精製抽出物が示す酵素活性は明らかにＨＰＰＤ型の酵素活性であり、求める４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼ活性は顕著でないかまたは全く存在しない。明らかにこの方法では、Ｐ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓのＨＰＰＤをコードする遺伝子を含むコスミドのクローンを選択できるが、４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子を含むコスミドのクローンを選択できない。Ｐ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓの未精製抽出物に対して行ったｉｎ  ｖｉｔｒｏ予備試験ではＨＰＰＤ活性が同定されなかった。Ｐ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓのＨＰＰＤ活性は細菌を富培地で培養したときに発現されるであろうが、４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼ活性は４−ＨＰＡが唯一の炭素源であるときに発現されるであろうと推測できる。この方法では４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼを同定することはできないので、我々はこの酵素を精製することにした。タンパク質をいったん同定すれば、対応する遺伝子を溯って推定することが可能である。
【０１７６】
ＩＩ．２．２−４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼの精製
タンパク質の精製を追跡するために、タンパク質の４−ＨＰＡ依存性ＮＡＤＨ，Ｈ＋オキシダーゼ活性を定量する。従って、上述の精製プロトコルを使用することによってタンパク質を実質的に均一になるまで精製する。ＮＡＤＨ，Ｈ＋オキシダーゼの比活性の増進倍率は調製物次第で一般に５０−１００倍の範囲である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でタンパク質は６０ｋＤａの見掛け分子量を有している。実際、ＤＥＡＥ／ＥＭＤ  ６５０Ｓの出口でＮＡＤＨ，Ｈ＋オキシダーゼ活性及びＨＧＡ産生が明らかに観察される。これに反して、アフィニティカラムの出口では、ＨＧＡの産生を検出することが極めて難しい。しかしながらＮＡＤＨ，Ｈ＋オキシダーゼ活性は依然として、反応培地に添加された４−ＨＰＡに依存している。酵素が単量体であるという仮説に基づくならば、ＨＧＡを産生し得る触媒活性の消滅は、タンパク質がＲｅｄカラムを通過するときにタンパク質の一部が損傷された（例えば、強力に結合した補因子が消滅した）と想定することによって説明できる。ＮＡＤＨ，Ｈ＋の酸化を触媒する部位は影響を受けないのかもしれない。また、求める酵素がヘテロ二量体であると想定してもよい。その場合には酵素活性の消滅はＨＧＡ産生を担当する単量体の消滅によって説明される。文献では様々な細菌種中で多くのヘテロ二量体フラビンモノオキシゲナーゼが同定されており、これらはいずれも芳香性基質を有している（Ａｄａｃｈｉら，１９６４；Ａｒｕｎａｃｈａｌａｍら，１９９２，１９９４；Ｐｒｉｅｔｏら，１９９３；Ｐｒｉｅｔｏ  ＆  Ｇａｒｃｉａ，１９９４；Ａｒｕｎａｃｈａｌａｍ  ＆  Ｍａｓｓｅｙ，１９９４；Ｔａｋｉｚａｗａら，１９９５；Ｘｕｎ，１９９６；Ｘｕｎ  ＆  Ｓａｎｄｖｉｋ，２０００）。しかしながら、これらのヘテロ二量体酵素の機能を説明するために２つの仮説が存在する。
【０１７７】
（１）Ａｒｕｎａｃｈａｌａｍら（１９９２，１９９４）は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａの４−ヒドロキシフェニルアセテート  ３−ヒドロキシラーゼが６５ｋＤａのホモ二量体フラボタンパク質と３８．５ｋＤａの結合用タンパク質とから構成されるという考え方を示している。フラボタンパク質は４−ＨＰＡの存在にかかわりなく単独でＮＡＤＨ，Ｈ＋を酸化する能力を有している。このようなＮＡＤＨ，Ｈ＋の酸化はＮＡＤ＋“プール”に補充することができるが、化学量論的割合のＨ２Ｏ２を生じさせる。結合用タンパク質を加えると、タンパク質複合体が４−ＨＰＡをヒドロキシル化して３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸とする。従って、ＮＡＤＨ，Ｈ＋の酸化を無駄なく利用して代謝産物が合成され得る。結合用タンパク質は単独では酵素活性を全く有していない。
【０１７８】
（２）Ｐｒｉｅｔｏら（１９９３，１９９４）及びＸｕｎ  ＆  Ｓａｎｄｖｉｋ（２０００）は、大腸菌Ｗ（ＡＴＣＣ１１１０５）の４−ＨＰＡ  ３−ヒドロキシラーゼが２成分フラビン拡散性モノオキシゲナーゼ（ＴＣ−ＦＤＭ）の新しい構成員であると考えられることを示唆している。２成分の一方はＨｐａＢ遺伝子によってコードされた５９ｋＤａの単量体酵素４−ヒドロキシフェニルアセテート  ３−ヒドロキシラーゼであり、他方はＨｐａＣ遺伝子によってコードされた１９ｋＤａの単量体フラビン：ＮＡＤＨオキシドレダクターゼである。この場合、ＦＡＤはフラビン：ＮＡＤＨ，Ｈ＋オキシドレダクターゼによってＮＡＤＨ，Ｈ＋を利用して還元される。次にＦＡＤＨ２がオキシゲナーゼによって利用され、分子酸素を使用して基質が酸化される。
【０１７９】
我々が精製した酵素はＮＡＤＨ，Ｈ＋を強力に酸化するが、ホモゲンチジン酸塩を殆ど産生しない。更に、ＮＡＤＨ，Ｈ＋の酸化が４−ＨＰＡの添加量に依存する。これは、我々の酵素がＰｒｉｅｔｏらによって記載された酵素と同じタイプの酵素であることを示唆する。従って、我々は、精製した酵素が所望の４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）であると考える。酵素活性を最適化する結合用タンパク質の同定が後で必要になるかもしれない。従って精製タンパク質に関する生化学的アプローチを継続する。
【０１８０】
ＩＩ．２．３−内部ペプチド及びＮ末端配列の産生
精製タンパク質のマイクロ配列決定をパスツール研究所に依頼した。その結果、Ｎ末端配列ＳＨＰＡＩＳＬＱＡＬ  ＲＧＳＧＡＤＩＱＳＩ  ＨＩＰＹＥＲと、カラムから出る順序に従ってそれぞれペプチドＮｏ．１１Ｃ、１２Ｄ、２０Ａ、２２Ｂ、２３及び２４と命名した６つの内部ペプチド配列：ＡＴＤＦＩＴＰＫ、ＬＧＶＧＱＰＭＶＤＫ、ＶＶＦＡＧＤＳＡＨＧ  ＶＳＰＦＸ、ＶＴＡＬＥＰＱＡＥＧ  ＡＬ、ＩＤＦＱＬＧＷＤＡＤ  ＰＥＥＥＫ、ＬＳＶＰＡＴＬＨＧＳ  ＡＬＮＴＰＤＴＤＴＦが得られた。遺伝子の開始コドン（ＡＴＧまたはＧＴＧ）に正常に対応するアミノ酸（メチオニンまたはバリン）はＮ末端配列には存在しない。ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用するタンパク質塩基の相同性分析から相同タンパク質を同定することはできない。得られたタンパク質配列に基づいて、対応する縮重オリゴヌクレオチドを合成する。精製し部分配列決定したＨＰＡＨタンパク質をコードする遺伝子の一部分を同定するためにこれらのオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲ反応を行う。
【０１８１】
ＩＩ．２．４−ＰＣＲフラグメントの産生
４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子の一部分（５３６ｂｐ）のＰＣＲ増幅は、ペプチド２３及び１２Ｄをそれぞれコードする縮重プライマーＨｙ４Ｒ：ＴＣＹＴＣＮＧＧＲＴ  ＣＮＧＣＲＴＣＣＣＡとＨｙ５Ｆ；ＧＧＮＧＴＮＧＧＮＣ  ＡＲＣＣＮＡＴＧＧＴを使用して得られた。これらのプライマーは５５．４℃のハイブリダイゼーション温度を有しており、それぞれ１２８及び５１２の縮重を示す。増幅した配列をベクターｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙにクローニングし、次いで配列決定した。得られた配列を解析すると、ペプチドＨｙ４Ｒ及びＨｙ５Ｒをコードする配列以外に、内部ペプチド２２Ｂをコードする核酸配列が検出され得る。この内部ペプチドの検出は、我々が確かに精製ＨＰＡＨタンパク質をコードする遺伝子の一部分を増幅したことを確認する。この段階で、ＢＬＡＳＴＸアルゴリズムを使用したタンパク質塩基の相同性検査は、ヒドロキシラーゼ、オキシダーゼ及びモノオキシゲナーゼに対して僅かな相同性が幾つか存在することを示す。次に、完全遺伝子を含有するコスミドを探し出すために、５３６ｂｐのＰＣＲ増幅配列を使用してＰ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓのコスミドライブラリーをスクリーニングする。
【０１８２】
ＩＩ．２．５−Ｐ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓのコスミドライブラリーのスクリーニング
上記で得られた配列をプローブとして使用するコスミドライブラリーのスクリーニングによって４つのコスミドグループを同定し得る。これらのグループの違いは、サザン法による転移後の制限及びハイブリダイゼーションのプロフィルに基づいて判断し得る。コスミドＮｏ．１、２及び６が第一グループを形成し、コスミドＮｏ．３、７及び９が第二グループを形成し、コスミドＮｏ．５及び８が第三グループを形成する。最終グループはコスミドＮｏ．４から成る。ハイブリダイゼーション結果は更に、求めるｈｐａＨ遺伝子がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓのゲノムに単一コピーとして存在することを示唆する。我々は、精製されたＨＰＡＨタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも一部分を含むコスミドを同定した。その間に、Ｐ．ｐｕｔｉｄａは４−ＨＰＡ上で増殖できないが、ＨＧＡを唯一の炭素源として使用することによって増殖できることを観察した。これは、我々が機能相補を試験するための優れたスクリーンを手に入れたことを意味する。従って我々は、これらのコスミドのうちから４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼ活性をコードする機能遺伝子を含むコスミドを決定することができる筈である。
【０１８３】
ＩＩ．２．６−コスミドとの機能相補
前項で同定した９個のコスミドを電気穿孔によってＰ．ｐｕｔｉｄａに導入する。得られたクローンを次に４−ＨＰＡを唯一の炭素源として含むＭ６３培地で継代培養する。７−８日後、コスミドＮｏ．８を含む細菌だけが増殖に成功した。即ち、コスミドＮｏ．８だけが、４−ＨＰＡをＨＧＡに変換するためにＰ．ｐｕｔｉｄａが使用できるすべての発現情報を含んでいる。該コスミドをＣｃｏｓ８と命名する。全部のコスミドによって形質転換を繰り返す。所定のある期間（６−１０日）後に相補性を示し得るのは常にコスミドＮｏ．８である。４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼ活性を発現する最小ＤＮＡフラグメントを決定する我々のアプローチを更に進めるためには、Ｃｃｏｓ８のサブクローニングが必要である。機能相補のスクリーンを使用することによって有益なサブクローンが選択されるであろう。
【０１８４】
ＩＩ．２．７−機能相補によるサブクローニング
コスミドをＮｏｔＩによって消化すると、１．７−１０ｋｂのサイズの６つのＤＮＡフラグメントが得られる。これらのフラグメントをｐＢＢＲ１ＭＣＳ−Ｇｍ−Ｎｏｔ−Ｕにサブクローニングした。Ｃｃｏ８の５つのサブクローンが得られた。制限分析は、４ｋｂ及び１０ｋｂのフラグメントがサブクローニングされないことを示した。他方、最初に観察された５ｋｂのバンドは実際には５．１ｋｂと５．２ｋｂとの二重バンドであったことが判明した。これらのクローンをトリパレンタルコンジュゲーションによって大腸菌からＰ．ｐｕｔｉｄａに移植した。５日後、コスミドＣｃｏｓ８の５．２ｋｂバンドに対応するサブクローンを含有するＰ．ｐｕｔｉｄａだけが４−ＨＰＡを唯一の炭素源として含むＭ６３で増殖した。これは我々が、４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼを含む最小フラグメントを同定したことを意味する。５．２ｋｂのバンドに対応するクローンを５ｋｂＣと命名する。機能相補の結果を確認するために、不適合複製起点戦略を使用しかつ使用抗生物質の選択圧力でプラスミドｐ５ｋｂＣを強制的に除去することによってプラスミドｐ５ｋｂＣの除去を図った。我々は、プラスミドｐ５ｋｂＣが除去されるとＰ．ｐｕｔｉｄａが４−ＨＰＡを唯一の炭素源として増殖する能力を失うことを観察した。この結果から我々は、４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼの酵素活性が明らかにプラスミドｐ５ｋｂＣに含まれていると結論した。従って我々は、機能性ｈｐａＨ遺伝子の同定を可能にすると考えられる５．２ｋｂインサートの配列決定を依頼した。
【０１８５】
ＩＩ．２．８−５．２ｋｂの配列の解析
プラスミドｐ５ｋｂＣの５．２ｋｂのインサートを配列決定した。核酸の相同性検査（ＢＬＡＳＴＮ）によってインサートの３つの部分を同定した。塩基Ｎｏ．１から１４６５までの第一部分はプラスミドＢｉｒｍｉｎｇｈａｍ  ＩｎｃＰ−ａｌｐｈａの一部分に完全に相同である。従って、間違いなくｐＬＡＦＲ５に由来の配列であろうと考えられる。塩基Ｎｏ．１４６６から１６９５までの第二の核酸部分はクローニングプラスミドＭ１３ｍｐ８／ｐＵＣ８の一部分に完全に相同である。従ってこの配列もまたｐＬＡＦＲ−５の構成部分である。実際、ｐＬＡＦＲ−５の多重クローニング部位はｐＵＣ８に由来する（Ｋｅｅｎら，１９８８）、従って、１６８９位及び１６９５位にそれぞれ存在するＥｃｏＲＩ部位及びＳｍａＩ部位（図７）は間違いなくｐＬＡＦＲ−５のクローニング部位であろうと考えられる。塩基１６９６から５２６４までの第三部分（即ち、３５６８ｂｐ）は顕著な相同性を示さない。ＤＮＡのこの部分はＰ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓのゲノムに由来する。ＢＬＡＳＴＸアルゴリズムを使用して５．２ｋｂの配列を解析すると、推定タンパク質が同定される（図７）。即ち、遺伝子１によってコードされるタンパク質は、ベータ−ラクタマーゼ、デヒドラーゼ及びシクラーゼに対して僅かな相同性を示す。前述の項で得られた内部ペプチドをコードする配列が見出されるので、精製されたタンパク質は遺伝子２によってコードされている。従って間違いなく４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼであろうと考えられる。タンパク質の位置合せは、このタンパク質がオキシゲナーゼ及びヒドロキシラーゼに対してある程度の相同性を有していることを示す。遺伝子３によってコードされ得るタンパク質はデータベースに対する相同性を有していない。最後に、遺伝子４はオペロンレギュレーターをコードしていると考えるのが正しいと思われる。
【０１８６】
次にｈｐａＨ遺伝子をより詳細に解析する。得られたＮ末端のタンパク質配列によれば、４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼタンパク質の開始コドンＡＴＧは実際にＡＴＧとインフェーズの開始コドンＧＴＧの７８ｂｐ下流に存在する。リボソームに結合し得るシャイン・ダルガルノ配列ＡＧＧＡは開始コドンＡＴＧの上流に見出されるが開始コドンＧＴＧの上流には見出されない。これは、コーディング領域の起点が開始コドンＡＴＧであることを確認させる。従って、コドンＧＴＧとコドンＡＴＧとの間の部分はプレタンパク質に対応しないと考えるのが正しい。従って、ｈｐａＨ遺伝子は１７３７ｂｐの長さをもち、停止コドンＴＧＡで終結する。遺伝子は７０．９％のＧＣ塩基から構成されている。
【０１８７】
ｈｐａＨ遺伝子の範囲を正確に決定できたので、次にその翻訳産物：ＨＰＡＨタンパク質を解析する。
【０１８８】
ＩＩ．２．９−ＨＰＡＨタンパク質の解析
ｈｐａＨ配列は普遍的コドン系（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｃｏｄｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用して翻訳される。このようにして５６３個のアミノ酸から成るタンパク質が得られる。このアミノ酸数は６２．２ｋＤａの分子量を表す。タンパク質の相同性検査（ＢＬＡＳＴＰ）は、ＨＰＡＨが求める酵素活性とは明らかに異なる酵素活性をコードするグラム陽性生物のタンパク質に対して本質的に約１５−２５％の一致を有していることを示す。このようにして、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｒｇｉｌｌａｃｅｕｓのオキシゲナーゼ、大腸菌の３−（３−ヒドロキシフェニル）プロピオネートヒドロキシラーゼ（ＥＣ１．１４．１３．−）、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ種の２，４−ジヒドロキシベンゾエートモノオキシゲナーゼ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ中のテトラサイクリンの６−ヒドロキシル化を触媒する酵素、及び、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅの推定オキシゲナーゼが見出される。実際、ＨＰＡＨは、フェノールモノオキシゲナーゼ（ｐｈｅＡ）ファミリーのタンパク質及び２，４−ジクロロフェノールヒドロキシラーゼ（ｔｆｄＢ）ファミリーのタンパク質に相同性を示す。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを使用して上記のタンパク質に対応する位置合せを行う（図８）。十分に保存されたボックスが明らかになる。特に、ＦＡＤと相互作用する３つのモチーフが明らかになる。第一のモチーフ（ＧＸＧＸＸＧ）は、ＦＡＤのＡＤＰ部分をタンパク質と相互作用させるβ−α−β構造単位に対応する。第二のモチーフ（Ａ／Ｃ）ＤＧは、ＦＡＤの結合に関与する。第三のモチーフＧ（Ｒ）ＶＸＸ（Ａ）ＧＤ（Ａ）ＸＨはＦＡＤのフラビン部分と相互作用し得る。酵素はＮＡＤＨ，Ｈ＋を利用するが、対応する結合部位（ＧＤＨ）は同定されない。このＮＡＤＨ，Ｈ＋結合部位の欠如は別のＦＡＤモノオキシゲナーゼにもしばしば観察される特徴である。最後に、モチーフ（ＤＸＸＸＬＸＷＫＬＸ  ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ  ＬＬＸＸＹＸＸＥＲ）が観察され、このモチーフも別のヒドロキシラーゼ中に見出されるが（Ｆｅｒｒａｎｄｅｚら，１９９７）、その意味はまだ解明されていない。大腸菌の３−（３−ヒドロキシフェニル）プロピオネートヒドロキシラーゼは４−ＨＰＡに構造的に近似の基質に対するヒドロキシル化反応を触媒するが、この生物情報解析によって得られた情報では我々が間違いなく４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼを同定したという確信は得られない。このような確信を得る唯一の方法は、ｈｐａＨ遺伝子を発現させその酵素活性を試験することである。
【０１８９】
ＩＩ．２．１０−４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼ活性に関与するタンパク質の同定
ＩＩ．２．１０．１−４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼをコードするｈｐａＨ遺伝子の発現
ｈｐａＨ遺伝子が４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼ活性をコードしていることを確認するために、遺伝子を発現させる必要がある。このために、遺伝子Ｎｏ．１及び３を除去してｈｐａＨ遺伝子を出発ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−Ｇｍ−Ｎｏｔ−Ｕのコントロール下に配置し得る２段階クローニング戦略を使用する。得られたプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ  ＦＴ１２Δ１と命名する。このプラスミドで形質転換されたＰ．ｐｕｔｉｄａを富培地で培養した培養物から未精製抽出物を得る。分光光度法（３４０及び２９２ｎｍ）による活性試験によれば、クローンは４−ＨＰＡの添加によって誘発されたＮＡＤＨ，Ｈ＋オキシダーゼ活性を明らかに有しているが、４−ＨＰＡからホモゲンチジン酸塩を合成する能力は有していないことが判明する。他方、ＨＧＡに極めて近い保持時間（ｔｒ＝１．２分対１．４分）を有しているが極めて異なるＵＶスペクトルを有している分子Ｚの出現が観察される。我々は、ＨＰＡＨがその補因子ＦＡＤを還元するためにＮＡＤＨ，Ｈ＋を酸化するという仮説をたてる。反応を開始させるために４−ＨＰＡを添加するので、ＦＡＤは４−ＨＰＡを利用して再び酸化される。従って、４−ＨＰＡは代謝産物Ｚに変換される。この代謝産物のＵＶスペクトルは、環がもはや芳香環でないが、不飽和でもよいことを示唆する。代謝産物Ｚの構造に関する仮説を図２に示す。この実験は、ｌａｃプロモーターがＰ．ｐｕｔｉｄａ中でＩＰＴＧインデューサーの非存在下でも機能性であることを示し、これは、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ中ではｌａｃＩリプレッサーが本来的に存在しないことを示唆する。我々はまた、最初に精製されたタンパク質（ＨＰＡＨ）が本当に４−ＨＰＡを代謝産物Ｚに変換する４−ＨＰＡ依存性ＮＡＤＨ，Ｈ＋オキシダーゼであることを証明する。ＨＰＡＨはＨＧＡを産生しない。従って、４−ＨＰＡ依存性のこのＮＡＤＨ，Ｈ＋オキシダーゼの（１つまたは複数の）パートナータンパク質を同定し、その添加によって４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼ活性が回復し得ることを示す必要がある。
【０１９０】
ＩＩ．２．１０．２−ゲル濾過によるＨＰＡＣタンパク質の同定
Ｒｅｄアフィニティカラム上のＨＰＡＨの精製中に４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼが消滅することを観察した。従って、４−ＨＰＡ依存性ＮＡＤＨ，Ｈ＋オキシダーゼの（１つまたは複数の）パートナータンパク質はＲｅｄ  １２０アフィニティカラムのアガロース樹脂によって保持されないので、流出液から回収されるという仮説をたてた。従って、流出液を精製し、ＨＰＡＨに添加されると４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼ活性を回復させ得る（１つまたは複数の）タンパク質を探すことにした。このために、流出液を限外濾過（１０Ｋ  ＭａｃｒｏｓｅｐＴＭ  １０Ｋ）によって濃縮し、次いでＳ７５ゲル濾過カラムに充填する。１ｍＬ．分−１の流速を使用し、各１ｍＬの画分を収集する。次に、５０μＬの各画分とＲｅｄカラムで予め精製した１０μＬのＨＰＡＨとを混合し標準反応条件下で酵素反応を生じさせる。反応の停止後、反応物をＨＰＬＣで分析する。画分９０−１０８をＨＰＡＨタンパク質に添加すると代謝産物Ｚの産生量が増加し得ることが観察される。ＨＰＡＨを導入しない場合にもこれらの同じ画分中で代謝産物Ｚの産生が検出される。更に、これらの画分に対応するアクリルアミドゲル上で、ＨＰＡＨに等価の分子量をもつタンパク質が観察される。我々は、流出物が少量のＨＰＡＨタンパク質をまだ含有していると結論した。画分１０９−１４３をＨＰＡＨタンパク質に添加するとＨＧＡの産生が観察される。ＨＧＡの産生量が多くなるほど、代謝産物Ｚの産生量が少なくなる。ホモゲンチジン酸塩の最大産生量は画分１１６−１２８によって得られる。画分９５−１４５をアクリルアミドゲルに充填したとき、画分１０９−１４３中には１つのタンパク質が極めて豊富に存在する。即ち、このタンパク質のクロマトグラフィープロフィルがＨＧＡ産生プロフィルに一致する。我々は、このタンパク質をＨＰＡＣと命名することにした。ＨＰＡＣタンパク質をゲルから切り出し、次いでＮ末端をマイクロ配列決定する。得られた配列ＭＴＴＫＴＦＡは、このタンパク質が遺伝子１（図７）によってコードされていることを示す。この遺伝子を以後ｈｐａＣと呼ぶ。この実験は、４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼ活性に２つのタンパク質ＨＰＡＨ及びＨＰＡＣが関与することを示す。しかしながら我々は、これらの２つのタンパク質の相互作用の特性について、（１）ＨＰＡＨとＨＰＡＣの双方ともが酵素活性を有しているのか、または、（２）ＨＰＡＨがＨＰＡＣとの相互作用によって変更され得る酵素活性を有しているのか、については断定できなかった。
【０１９１】
ＩＩ．２．１０．３−ＨＰＡＨとＨＰＡＣとの相互作用の特性
前項の実験は、４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼ活性を復元するためにＨＰＡＨ及びＨＰＡＣタンパク質が必要であることを証明する。これらのタンパク質のそれぞれの役割を説明するために２つの仮説をたてる。この項で我々が提示する結果は、ＨＰＡＣが完全な酵素であることを示唆する。ゲル濾過によって得られた画分１００、１０１及び１０２をプールする。これらの画分は４−ＨＰＡから代謝産物Ｚを産生し得るＨＰＡＨ、即ちＮＡＤＨ，Ｈ＋オキシダーゼ活性を含む。更に、ゲル濾過によって得られた画分１２３、１２４及び１２５をプールする。これらの画分はＨＰＡＣを含む。ＨＰＡＨ及び／またはＨＰＡＣを使用して複数の異なる酵素反応を試験する。これらの反応は２段階で行う。第一反応にＨＰＡＨ（またはＨＰＡＣ）を使用し、３０分後に熱処理（１００℃、１０分）によって反応を停止させる。次にＨＰＡＣ（またはＨＰＡＨ）を添加し、反応を３０分間追跡する。最後に過塩素酸を添加することによって反応を停止させる。また、酵素の１つを水で置換して反応させる。最後に、反応物を煮沸する代わりに反応物を１０ｋＤのＮａｎｏｓｅｐＴＭ（Ｐａｌｌ  Ｆｉｌｔｒｏｎ）で濾過することによって等価の実験を行う。
【０１９２】
得られた結果を表１にまとめる。
【０１９３】
【表１】
2004518417.tif 000003
２つのタンパク質ＨＰＡＨ及びＨＰＡＣを同時に導入するかまたは記載の順序で順次に導入する方法だけがＨＧＡを産生することが観察される。ＨＰＡＨを単独で使用するとき、または、ＨＰＡＨよりも前にＨＰＡＣを導入するとき、代謝産物Ｚだけが検出される。最後に、ＨＰＡＣタンパク質は４−ＨＰＡに対する酵素活性を全く有していない。これらの結果は、代謝産物Ｚが反応中間体であることを示唆する。ＨＰＡＨは４−ＨＰＡを代謝産物Ｚに変換し、この反応がＮＡＤＨ，Ｈ＋を酸化し得る。次に代謝産物ＺがＨＰＡＣによってＨＧＡに変換される。ＨＰＡＣを添加する前にＨＰＡＨタンパク質が変性されたりまたは濾過によって除去されたりすることがあり得るので２つのタンパク質間に物理的相互作用が必要であるとは考えられない。我々はｉｎ  ｖｉｔｒｏで４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼ活性がＨＰＡＣ及びＨＰＡＨタンパク質に依存することを証明した。しかしながら、ゲル濾過後のＨＰＡＣタンパク質は純粋ではなく、富化されているだけである。従って実際には、代謝産物ＺをＨＧＡに変換する別のタンパク質がこの富化抽出物中に存在する可能性も残っている。疑惑を払拭するために、２つの遺伝子（ｈｐａＣ及びｈｐａＨ）を同一ベクターにクローニングすることにした。この場合、４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼ活性が生じる筈であり、その結果として、４−ＨＰＡを唯一の炭素源として含む最小培地でＰ．ｐｕｔｉｄａが増殖できる筈である。
【０１９４】
ＩＩ．２．１０．４−ｈｐａＨ及びｈｐａＣによるＰ．ｐｕｔｉｄａの機能相補
プラスミドｐＬ１ｌａｃ２（図９）は、ｈｐａＣ遺伝子をＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのＨＰＰＤのプロモーターのコントロール下に含み、反対方向でｈｐａＨ遺伝子をｌａｃプロモーターのコントロール下に含むベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−ＧｍＲである。プラスミドを電気穿孔によってＰ．ｐｕｔｉｄａに導入する。次に、唯一の炭素源として４−ＨＰＡを含有するかまたは非含有の最小培地で細菌を平板培養する。５日後、４−ＨＰＡを唯一の炭素源として含むシャーレだけにコロニーが観察される。８日後、コロニーは十分なサイズになっている。これらのコロニーから抽出したプラスミドＤＮＡは全プラスミドｐＬ１ｌａｃ２の存在を明らかに示す。更に、ｈｐａＣ遺伝子またはｈｐａＨ遺伝子を含むベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−ＧＭＲで細菌を形質転換させたときは、Ｐ．ｐｕｔｉｄａが４−ＨＰＡ上で増殖できない。この実験で得られた機能相補は、求める４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼ活性を開始させるためにｈｐａＣ及びｈｐａＨ遺伝子が必要十分であることを明らかに示す。
【０１９５】
実施例ＩＩＩ：複数の異なるサイトゾル発現カセットの構築
ＩＩＩ．１−ＨＰＡＣ
ゲノムＤＮＡのコスミドライブラリーから得られたプラスミド（ｐ５ｋｂＣ）上のＰＣＲによってＨＰＡＣ遺伝子をＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓから単離した。以下のオリゴヌクレオチドを使用した：
ＯＲＦ１の起点（ＡｆｌＩＩＩ）：ＧＣＡＧＧＡＴＧＣＡ  ＣＡＴＧＴＣＣＡＣＣ  ＡＡＧＡＣ；
ＯＲＦ１の終端（ＨｉｎｄＩＩＩ）：ＣＧＧＡＣＧＣＡＡＧ  ＣＴＴＧＣＡＴＣＡＧ  ＣＣＴＴＣ。
【０１９６】
標準条件に従って反応を行った。９９３ｂｐのサイズの増幅フラグメントをプラスミドｐＧＥＭＴｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に供給業者のプロトコルに従ってサブクローニングした。このようにして得られたプラスミドｐＯＺ１５０を配列決定した。ＥｃｏＲＩ＋ＳｐｅＩ消化によって得られたカセットを、同じ酵素で開裂したプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ−ＫＳ＋にクローニングして、プラスミドｐＥＰＡ１３を作製した。除草剤耐性遺伝子の発現カセットをＣｓＶＭＶのコントロール下に含むプラスミドｐＵＣ１９に由来のプラスミドｐＣＨ２７からＣｓＶＭＶプロモーターを単離する。このために、平滑末端を生じさせるＰｆｕポリメラーゼを用い、サーモサイクラーを使用して標準ＰＣＲを以下の処理サイクルで行った：９５℃で５分間を１サイクル、［９５℃で３０秒、５７℃で３０秒、７２℃で１分］を３０サイクル、７２℃で３分間。以下のプライマーを使用した：
Ｎ−ＣｓＶＭＶ：ＧＣＣＣＴＣＧＡＧＧ  ＴＣＧＡＣＧＧＴＡＴ  ＴＧＡＴＣＡＧＣＴＴ  ＣＣ（ＸｈｏＩ部位及びＢｃｌＩ部位を導入）；
Ｃ−ＣｓＶＭＶ：ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＡ  ＴＴＣＡＧＡＴＣＴＡ  ＧＡＡＡＣ（ＥｃｏＲＩ）。
【０１９７】
作製された５６５ｂｐのフラグメントをＸｈｏＩ＋ＥｃｏＲＩで消化後に、ＸｈｏＩ＋ＥｃｏＲＩで予め消化したプラスミドｐＥＰＡ１３に挿入する。プラスミドｐＥＰＡ１４が得られる。ＮｏｓターミネーターがクローニングされたｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ−ＳＫ（−）に由来のプラスミドｐＲＤ１１からＨｉｎｄＩＩ＋ＮｏｔＩ消化によってＮｏｓターミネーターを単離する。得られた２９２ｂｐのフラグメントを同じ酵素で開裂したプラスミドｐＥＰＡ１４にクローニングすると、ｐＥＰＡ１５が得られる。
【０１９８】
ｐＥＰＡ１５カセット＝ＣｓＶＭＶプロモーター−ｈｐａＣ−Ｎｏｓターミネーター（図１０；配列番号１９）。
【０１９９】
ＩＩＩ．２．ＨＰＡＨ
ゲノムＤＮＡのコスミドライブラリーに由来のプラスミド（ｐ５ｋｂＣ）に対するＰＣＲによってＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓからＨＰＡＨを単離した。以下のオリゴヌクレオチドを使用した：
ＯＲＦ１の起点（ＡｆｌＩＩＩ）：ＣＡＧＡＧＧＡＣＧＡ  ＡＣＡＡＣＡＴＧＴＣ  ＣＣＡＣＣ；
ＯＲＦ２の終端３（ＨｉｎｄＩＩＩ）：ＣＴＧＴＧＧＡＴＧＡ  ＡＧＣＴＴＡＡＧＡＧ  ＧＴＴＣＡＧＧＣ。
【０２００】
標準条件で反応を行った。１７２９ｂｐのサイズの増幅フラグメントの平滑末端を、ＥｃｏＲＶで消化したプラスミドｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫにサブクローニングした。このようにして得られたプラスミドｐＥＰＡ１６を配列決定した。ＧＵＳ発現カセット：ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター−ＧＵＳ−Ｎｏｓターミネーターを含むプラスミドｐＢＩ  １２１に由来のプラスミドｐＣＨ１４からＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターを単離する。このために、平滑末端を生じさせるＰｆｕポリメラーゼを用い、サーモサイクラーを使用して標準ＰＣＲを行った：９５℃で５分間を１サイクル；［９５℃で３０秒、６３℃で３０秒、７２℃で１分］を３０サイクル；７２℃で３分間。以下のプライマーを使用した：
Ｎ−ＣａＭＶ：ＧＣＡＴＧＣＣＴＣＧ  ＡＧＣＣＣＡＣＡＧＡ  ＴＧＧ（ＸｈｏＩ部位導入）；
Ｃ−ＣａＭＶ：ＣＣＡＣＣＣＧＧＧＧ  ＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡ  Ｇ（ＢａｍＨＩ部位導入）。
【０２０１】
作製した８３９ｂｐのフラグメントをＸｈｏＩ＋ＢａｍＨＩによって消化した後、ＸｈｏＩ＋ＢｃｌＩによって予め消化したプラスミドｐＥＰＡ１６に挿入する。このようにしてプラスミドｐＥＰＡ１７が得られる。上記と同じ条件のＰＣＲ、即ち、９５℃で５分間を１サイクル；［９５℃で３０秒、５７℃で３０秒、７２℃で１分］を３０サイクル；７２℃で３分間のサイクルのＰＣＲによってプラスミドｐＲＤ１１からＮｏｓターミネーターを単離する。以下のプライマーを使用する：
Ｎ−Ｎｏｓ：ＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣ  ＧＡＴＡＣＣＧＴＣＧ  ＡＣＧ（ＨｉｎｄＩＩＩ導入）；
Ｃ−Ｎｏｓ：ＧＡＡＴＴＧＣＧＧＣ  ＣＧＣＡＡＴＴＣＣＣ  ＧＡＣＣＴＡＧＧＡ  ＡＣＡＴＡＧ（ＮｏｔＩ及びＡｖｒＩＩ導入）。
【０２０２】
得られた３０５ｂｐのフラグメントをＮｏｔＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩによって消化した後、同じ酵素で開裂したプラスミドｐＥＰＡ１７にクローニングするとｐＥＰＡ１８が得られる。
【０２０３】
ｐＥＰＡ１８カセット＝ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター−ｈｐａＨ−Ｎｏｓターミネーター（図１１；配列番号１７）。
【０２０４】
ＩＩＩ．３．ＨＰＰＯ
ゲノムＤＮＡのコスミドライブラリーに由来のコスミド２Ａに対するＰＣＲによってＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓからＨＰＰＯ遺伝子を単離した。以下のオリゴヌクレオチドを使用した：
Ｎ−ｔｅｒｍ−ＨＰＰＯ−ＳｃａＩ：ＧＡＡＴＴＣＡＧＴＡ  ＣＴＴＣＡＣＴＴＡＣ  ＡＧＴＧＴＣＣＧＧＣ（ＥｃｏＲＩ及びＳｃａＩ制限部位導入）；
Ｃ−ｔｅｒｍ−ＨＰＰＯ−ＡｓｕＩＩ−ＸｈｉＩ：ＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡ  ＧＴＴＣＧＡＡＣＡＡ  ＡＣＴＧＡＧＴＡＧＣ  ＡＧＣＴＣＡ（ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ及びＡｓｕＩＩ部位導入）。
【０２０５】
反応を標準条件で行った。得られた１，８００ｂｐのフラグメントをベクターｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に供給業者のプロトコルに従ってクローニングする。このようにして得られたプラスミドｐＯＺ１５１を配列決定した。ＳｐｈＩ＋ＸｈｏＩ消化によって得られたカセットを同じ酵素で開裂したプラスミドｐＢＢＲ１−ＭＣＳ（Ｇｍ）にクローニングするとプラスミドｐＥＰＡ２０が得られた。ＥＰＳＰＳの発現カセット：ヒストンシンプルプロモーター−イントロン２−ＯＴＰ−ＥＰＳＰＳ−ヒストンターミネーターを含むプラスミドｐＵＣ１９に由来のプラスミドｐＣＨ１９からヒストンシンプルプロモーターを単離する。このために、平滑末端を生じさせるＰｆｕを用い、標準ＰＣＲを行った：９５℃で５分間を１サイクル；［９５℃で３０秒、４５℃で３０秒、７２℃で１分］を５サイクル；［９５℃で３０秒、６５℃で３０秒、７２℃で１分］を３０サイクル；７２℃で３分間。以下のプライマーを使用した：
Ｎ−ＳＨ：ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣ  ＣＴＡＧＧＴＣＧＡＧ  ＧＡＧＡＡＡＴＡＴＧ（ＳｐｈＩ及びＡｖｒＩＩ部位導入）；
Ｃ−ＳＨ：ＣＡＴＧＡＧＧＧＧＴ  ＴＣＧＡＡＡＴＣＧＡ  ＴＡＡＧＣ。
【０２０６】
得られた９７０ｂｐのフラグメントをＳｐｈＩによって消化した後、ＳｐｈＩ＋ＳｃａＩによって予め消化したプラスミドｐＥＰＡ２０に挿入する。得られたプラスミドｐＥＰＡ２１中では、ＨＰＰＯ遺伝子の開始ＡＴＧがシンプルヒストンプロモーターの後ろに再形成されている。上記と同じ条件下のＰＣＲ、即ち、９５℃で５分間を１サイクル；［９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分］を３５サイクル；７２℃で３分間のＰＣＲによって同じプラスミドｐＣＨ９からヒストンターミネーターを単離する。以下のプライマーを使用する：
Ｎ−Ｈｉｓｔｅｒ：ＣＴＡＧＡＣＣＴＡＧ  ＧＧＧＡＴＣＣＣＣＣ  ＧＡＴＣ（ＡｖｒＩＩ導入）；
Ｃ−Ｈｉｓｔｅｒ：ＣＣＣＡＣＴＡＧＴＧ  ＴＴＴＡＡＡＴＧＡＴ  ＣＡＧＴＣＡＧＧＣＣ  ＧＡＡＴ（ＳｐｅＩ及びＢｃｌＩ導入）。
【０２０７】
得られた７２６ｂｐのフラグメントをＳｐｅＩ＋ＡｖｒＩＩによって消化した後、ＳｐｅＩで開裂したプラスミドｐＥＰＡ２１にクローニングするとｐＥＰＡ２２が得られる。
【０２０８】
ｐＥＰＡ２２カセット＝ヒストンシンプルプロモーター−ｈｐｐＯ−ヒストンターミネーター（図１２；配列番号１５）。
【０２０９】
ＩＩＩ．４．遺伝子の会合
ＨＰＡＣ遺伝子を含有するカセットをＮｏｔＩ消化によってｐＥＰＡ１５から抽出し、ｐＥＰＡ１８（ＮｏｔＩ＋Ｂｓｐ１２０Ｉ）にクローニングしてｐＥＰＡ１９を形成する（図１３；配列番号２１）。抽出したカセットをｐＥＰＡ２２のＡｖｒＩＩ＋ＳｐｅＩ部位にクローニングできるようにｐＥＰＡ１９をＡｖｒＩＩによって消化する。３つの構築物を含むプラスミドはｐＥＰＡ２３（図１４；配列番号２２）である。
【０２１０】
ＩＩＩ．５．バイナリーベクター
植物をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍで形質転換させるために、３つの構築物をＢｃｌＩによって抽出し、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａのバイナリーベクターに導入できるようにする。
【０２１１】
略号：
2004518417.tif 000004
2004518417.tif 000005
2004518417.tif 000006
【０２１２】
【表２】
2004518417.tif 000007
2004518417.tif 000008
2004518417.tif 000009
2004518417.tif 000010
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【図面の簡単な説明】
【図１】
ＨＰＰをホモチゲン酸塩に変換させるための、バイパス経路を示す。
【図２】
酵素活性に関する仮説を示す。
【図３】
ＢＬＡＳＴＸアルゴリズムを使用して相同性を探求することによって予測された４つの別の遺伝子（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）を示す。
【図４】
同定した、予測された転写プロモーターボックスを示す。
【図５】
同定した、ＴＰＰ補因子の結合に関するモチーフのような極めて保存されたモチーフを示す。
【図６】
ｐＢＢＲ１ＭＣＳ  ＦＴ１２Δ１の構築を示す。
【図７】
プラスミドｐ５ｋｂＣの５．２ｋｂのインサートを配列決定した結果を示す。
【図８】
ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを使用してタンパク質に対応する位置合せを行い、ＨＰＡＨタンパク質の解析を行った結果を示す。
【図９】
プラスミドｐＬ１ｌａｃ２のクローニングサイト図を示す。
【図１０】
ＨＰＡＣをコードする発現カセットは、ＣｓＶＭＶプロモーターと、ＨＰＡＣをコードする配列と、ＮＯＳターミネーターとを含む。
【図１１】
ＨＰＡＨをコードする発現カセットは、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターと、ＨＰＡＨをコードする配列と、ＮＯＳターミネーターとを含む
【図１２】
ＨＰＰオキシダーゼをコードする発現カセットは、ヒストンプロモーターと、ＨＰＰオキシダーゼをコードする配列と、ヒストンターミネーターとを含む
【図１３】
ＨＰＡＨをコードする発現カセットとＨＰＡＣをコードする別の発現カセットとを含むベクターの発現カセットを示す。
【図１４】
ＨＰＰオキシダーゼの発現カセット、ＨＧＡＨの発現カセット、ＨＧＡＣの発現カセットとを含むベクターの発現カセットを示す。
【図１】
2004518417.tif 000018
【図２】
2004518417.tif 000019
【図３】
2004518417.tif 000020
【図４】
2004518417.tif 000021
【図５】
2004518417.tif 000022
【図６】
2004518417.tif 000023
【図７】
2004518417.tif 000024
【図８】
2004518417.tif 000025
【図９】
2004518417.tif 000026
【図１０】
2004518417.tif 000027
【図１１】
2004518417.tif 000028
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2004518417.tif 000031
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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