(57)【要約】関節鏡検査による応用に適した移植片の調製用に少なくとも１つのヒアルロン酸誘導体を含有する３次元骨格で支持される細胞を含有する生物材料の使用、および関節鏡検査による前記生物材料を移植するための外科用器具のキット。【特許請求の範囲】
【請求項１】
３次元骨格で支持された細胞を含有する生物材料の使用であって、前記骨格が関節鏡検査法による移植に適した自家および／または同種移植片調製用の少なくとも１つのヒアルロン酸誘導体を含有する使用。
【請求項２】
前記自家および／または同種細胞が軟骨細胞、骨細胞、間葉および幹細胞からなる群から選択される請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記３次元骨格がさらに天然ポリマー類、半合成ポリマー類、または合成ポリマー類を含む請求項１〜２のいずれか１つに記載の使用。
【請求項４】
前記天然ポリマーがコラーゲン、コラーゲンおよびグリコサミノグリカン類の共沈物、セルロースのほか、キチン、キトサン、ペクチンまたはペクチン酸、寒天、アガロース、キサンタン、ゲラン、アルギン酸またはアルギン酸塩類、ポリマナンまたはポリグリカン類、デンプン、および天然ゴムなどゲルの形の多糖類からなる群から選択される請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記半合成ポリマー類がアルデヒド類またはそれらの前駆体、ジカルボン酸類またはそれらのハロゲン化物、ジアミン類、セルロースの誘導体、ヒアルロン酸、キチンまたはキトサン、ゲラン、キサンタン、ペクチンまたはペクチン酸、ポリグリカン類、ポリマナン、寒天、アガロース、天然ゴム、またはグリコサミノグリカン類などの作用剤で架橋されたコラーゲンからなる群から選択される請求項３に記載の使用。
【請求項６】
前記合成ポリマー類がポリ乳酸、ポリグリコール酸、それらのコポリマー類または誘導体、ポリジオキサン類、ポリホスファゼン類、ポリスルホン酸樹脂類、ポリウレタン類、およびＰＴＦＥからなる群から選択される請求項３に記載の使用。
【請求項７】
前記ヒアルロン酸誘導体が、
ｉ）カルボキシ官能基の一部または全部が脂肪族系、芳香族系、アリール脂肪族系、環式脂肪族系、または複素環式系のアルコールでエステル化されているヒアルロン酸のエステル類；
ｉｉ）カルボキシ官能基の一部または全部が同じ多糖鎖または他の鎖のアルコール官能基でエステル化されているヒアルロン酸の架橋エステル類；
ｉｉｉ）カルボキシ官能基の一部または全部が脂肪族系、芳香族系、アリール脂肪族系、環式脂肪族系、または複素環式系のポリアルコールでエステル化され、スペーサ鎖によって架橋を生成するヒアルロン酸の架橋エステル類；
ｉｖ）前記ヒアルロン酸誘導体がコハク酸半エステル類、またはヒアルロン酸を有するコハク酸半エステル類の重金属塩類、またはヒアルロン酸の部分または全エステル類から選択され；
ｖ）ヒアルロン酸のＯ−硫酸化またはＮ−硫酸化誘導体、
ｖｉ）ヒアルロン酸の四級アンモニウム塩、またはヒアルロン酸のＯ−硫酸化またはＮ−硫酸化誘導体、または重金属でおそらく部分的に塩化されたヒアルロン酸を有するコハク酸半エステル類からなる群から選択されるその誘導体；
ｖｉｉ）ポリウレタンに共有結合的に結合されたＯ−硫酸化またはＮ−硫酸化ヒアルロン酸およびその誘導体；
からなる群から選択される請求項１〜６のいずれか１つに記載の使用。
【請求項８】
前記３次元骨格が少なくとも１つのヒアルロン酸誘導体からなる請求項１〜７のいずれか１つに記載の使用。
【請求項９】
前記骨格が不織布の形である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記骨格がメッシュの形である、請求項８に記載の使用。
【請求項１１】
前記骨格が無孔の膜の形である、請求項８に記載の使用。
【請求項１２】
前記骨格が有孔の膜の形である、請求項８に記載の使用。
【請求項１３】
前記骨格が海綿の形である、請求項８に記載の使用。
【請求項１４】
薬剤的に、または生物学的に活性の成分に結合した、請求項１〜１３のいずれか１つに記載の使用。
【請求項１５】
前記生物材料が、将来の時点で行われる移植用に細胞生存度の特徴を保存するためにあらかじめ凍結保存されている、請求項１〜１３のいずれか１つに記載の使用。
【請求項１６】
α）その使用が請求項１〜１５のいずれか１つにおいて請求されている生物材料、または
β）ヒアルロン酸誘導体を含まない３次元の生物改変された骨格上に増殖した細胞を含有する生物材料を関節鏡検査手術によって移植するための外科用器具のキットであって：
ａ）滅菌トレー；
ｂ）関節鏡検査におけるガイドとして用いられ、以下に示す器具へのアクセスを得る比較的無菌の弁を有するカニューレ（５）；
ｃ）環状インプリントを生成する病変部を取り囲むと同時に、インプリントと同じ円形および同じ寸法の軟骨組織の小片を取るために用いられる中空チューブによって構成されたマッパサンプラー（１）；
ｄ）ドリルによって病変部の中心に固定され、作動中のカッターアブレーザーへの安定性を保証するガイドワイヤ（３）；
ｅ）マッパサンプラー（１）によって生成されるインプリントの縁内に生物材料（α）または生物材料（β）が引き続いて移植される部位を生成するためのカッターアブレーザー（４）；
ｆ）生物材料、生物材料（α）、または生物材料（β）をあらかじめ調製された病変部に押し入れるマッパ（１）内に導入される中空プランジャー（２）、を含む前記キット。
【請求項１７】
マッパサンプラー（１）が中空であり、プランジャーをその中に挿入することができ、関節の環状面に付着するくぼんだ先端を有し、プランジャーを前進させることによってかけられる圧力を中断させることができる制御システムを有する請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
プランジャー（２）がガイドワイヤを保持するのに十分に大きな中空の円柱であり、マッパと同様、くぼんだ先端を有する請求項１６に記載のキット。
【請求項１９】
カッター（４）のブレードが凹面を生成するようにくぼんでいる請求項１６に記載のキット。
【請求項２０】
前記生物材料（β）の細胞が自家および／または同種であり、軟骨細胞、骨細胞、間葉細胞、および幹細胞からなる群から選択される請求項１６〜１９のいずれか１つに記載のキット。
【請求項２１】
生物材料（β）の３次元骨格が天然ポリマー類、半合成ポリマー類、または合成ポリマー類を含有する請求項１６〜１９のいずれか１つに記載のキット。
【請求項２２】
前記天然ポリマー類がコラーゲン、コラーゲンの共沈物、およびグリコサミノグリカン、セルロース、キチン、キトサン、ペクチンまたはペクチン酸、寒天、アガロース、キサンテン、ゲラン、アルギン酸またはアルギン酸塩類、ポリマナン類またはポリグリカン類、デンプン、または天然ゴム類などゲルの形の多糖類からなる群から選択される請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記半合成ポリマー類がアルデヒド類またはその前駆体、ジカルボン酸またはそのハロゲン化物類、ジアミン類、セルロースの誘導体、ヒアルロン酸、キチンまたはキトサン、ゲラン、キサンテン、ペクチンまたはペクチン酸、ポリグリカン類、ポリマナン、寒天、アガロース、天然ゴム、およびグリコサミノグリカン類などの作用剤で架橋されたコラーゲンからなる群から選択される請求項２１に記載のキット。
【請求項２４】
前記合成ポリマー類がポリ乳酸、ポリグリコール酸、それらのコポリマー類または誘導体、ポリジオキサン類、ポリホスファゼン類、ポリスルホン樹脂類、ポリウレタン、およびＰＴＦＥからなる群から選択される請求項２１に記載のキット。
【請求項２５】
前記生物材料（β）がさらに薬剤的に、または生物学的に活性な成分を含む請求項１６〜２４のいずれか１つに記載のキット。
【請求項２６】
前記薬剤的に、または生物学的に活性な成分が抗炎症剤、抗生物質、増殖因子、抗真菌剤、および抗ウイルス剤からなる群から選択される請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記生物材料（β）が関節鏡検査によって行われる将来の移植を考えてその細胞生存度の特徴を維持するために凍結保存されている請求項１６〜２６のいずれか１つに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、関節鏡検査による応用に適した移植片の調製用に少なくとも１つのヒアルロン酸誘導体を含む３次元骨格で支持された細胞を含有する生物材料の使用、および関節鏡検査により前記生物材料を移植するための外科用器具用キットに関する。
【０００２】
（発明の背景）
関節軟骨修復の目的は、関節面の完全性を修復し、疼痛を減少させ、組織の一層の変質を予防することである。
【０００３】
関節軟骨は、関節の実質的に無摩擦な動きを可能にする組織である。その特別な生物学的特徴により、関節が体重の少なくとも５倍の力を吸収することを可能にする。関節軟骨、または硝子の自己修復能はきわめて限定されており、損傷後に自然再生する軟骨のタイプは最初の組織と同じ特徴を有することがない。それは線維軟骨として知られており、潤滑または機械的衝撃の吸収の特性を有さない。硝子軟骨変性の最終的な局面は、疼痛および可動性の制限を伴い、これは関節のロッキングの原因となりうる。長期的には、変性過程は骨関節炎症など合併症の発生の原因ともなりる。最も重症な場合には、関節、通常は膝を金属の人工関節で置換する必要がある。これは費用のかかる処置であり、多くの人工関節は約１０〜１５年後に交換する必要があるため、永続的なものでもない。このため、膝置換術は５０歳以下の患者における最終的な手段としてのみ行われる。関節軟骨病変は現在、主に疼痛の減少を目標とした関節鏡検査の外科的手技によって治療され、変性過程を遅らせ、可能な場合はいつでも、損傷を修復する。
【０００４】
軟骨の欠損を治療する多くの方法が現在まで適用されてきたが、それらのそれぞれにはいくらかの欠点がある（Ｔ．Ｍｉｎａｓら、『関節軟骨欠損の治療における最新のコンセプト』、Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ、１９９７年６月、第２０巻、第６号）。そのような方法の１つは、軟骨欠損の縁のトリミング、言い換えれば、壊死性組織または疾患組織の除去による病変の縁の病巣清掃術である。髄を刺激する方法は、剥離または穿孔によって軟骨下骨の部分に達し、多能性幹細胞を含有するフィブリン塊の形成を刺激することにある。次いで、その塊は分化し、形を成し、線維軟骨の修復組織を生じる。しかし、その結果生じる組織は、健常な永続的な関節軟骨の機械的特性または生理的または構造的特徴を有することはない。
【０００５】
別の方法は、例えば肋骨軟骨から取った一片の骨膜組織または軟骨膜組織を欠損部に移植することにある。最初、この処置は硝子軟骨の発生を誘発するが、修復組織は周囲の健常組織にはなじみにくく、その後に骨化する。
【０００６】
最近、スウェーデンの研究者チームが、自家軟骨細胞を移植するエキソビボ技術を発明したが、その場合、軟骨細胞はインビトロで成長した小さな軟骨生検から単離され、次いで同じ対象内に再移植される（Ｍ．Ｂｒｉｔｔｂｅｒｇ、Ａ．Ｌｉｎｄａｈｌ、Ａ．Ｎｉｌｓｓｏｎ：「自家軟骨細胞移植による膝の深部軟骨欠損の治療」、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ：１９９４、３３１、８８９〜８９５）。同著者らによれば、培養期において、軟骨細胞は一時的に脱分化し、適切な増殖因子による刺激下に増殖する。傷害部位に移植すると、それらはその表現型の記憶を回復し、結果的に軟骨細胞に再分化し、硝子型軟骨基質の生成が可能となる。外科的手順は実際にかなり複雑である。何よりも、手術は観血療法を必要とする。さらに、軟骨欠損を十分に位置づけ、（同じ手術の過程において取った）骨膜のふたによって覆う必要がある。これを縫合およびフィブリン（自家または同種）の防水シールで軟骨組織に固定し、その中に自家細胞懸濁液を注射できるチャンバーを生成する。実際に、チャンバーが完全にシールされていない場合は、細胞は再び漏出し、手術は失敗する。
【０００７】
要約すると、この手順の主な不利な点は、手術の実行が困難であり、手技が侵襲的であり、移植細胞が完全に分化しないということである。自家および相同の骨軟骨性移植は、外科的に侵襲的で複雑である手技を必要とし、後者によるウイルス伝染のリスクがある。
【０００８】
関節軟骨を再構成する他の試みは、同種軟骨細胞、および軟骨細胞の増殖を刺激しうる増殖因子を含有する合成骨格を移植することにある。
【０００９】
最も頻繁に用いられる合成骨格は、コラーゲンゲル、ポリアンヒドリド、ポリオルソエステル、ポリグリコール酸、およびそのコポリマー類である。前記骨格を用いることの主な不利な点は、移植材料に対する免疫応答によって表される。
【００１０】
アガロース、ヒアルロン酸、フィブリン糊、コラーゲン、およびアルギン酸塩によって構成されるゲル骨格における軟骨細胞培養株が知られている。
【００１１】
しかし、前記ゲルにおける培養は、部位に付着したまま、軟骨構造の再構成を可能にする適切な機械的安定性を提供することがない。さらに、フィブリンなどの物質における軟骨細胞培養株は、線維芽細胞と明らかに類似している細胞に脱分化する。
【００１２】
最後に、アガロースなどの物質によって構成されるゲルは軟骨細胞の再分化を誘発するが、この化合物の使用は人体内用途に対して承認されていない。
【００１３】
以前に記載されているとおり、関節軟骨欠損は支持骨格の非存在下に単離された軟骨細胞の懸濁液によっても治療されている。しかし、軟骨細胞はその生存度を失い、かつ／または欠損中に残存することがなく、線維組織中に埋没した線維軟骨または軟骨の島を形成すると考えられている（米国特許第５，７２３，３３１号）。
【００１４】
この問題を克服するために、出願人は、少なくとも１つのヒアルロン酸誘導体を含有する基質中に分散した軟骨細胞または骨髄間質細胞を含有する注射可能な組成物を発明した（ＰＣＴ特許出願、出願番号ＷＯ００／３７１２４）。
【００１５】
周知のとおり、ヒアルロン酸は、組織水化、プロテオグリカン組織化、細胞分化、増殖、および血管形成などの多くの生物学的過程における重要な役割を果たす（Ｊ．Ａｉｇｎｅｒら、Ｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１９８８、４２、１７２−１８１）。
【００１６】
幹細胞および間葉細胞のインビトロ増殖（ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ９７／１８８４２）のために不織布、膜、海綿、顆粒、ミクロスフェア、管、ガーゼの形、線維芽細胞およびケラチン生成細胞のインビトロ増殖のための有孔の膜と附随した不織布の形（ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９６／３３７５０）、および軟骨細胞の増殖のための不織布の形（Ｊ，Ａｉｇｎｅｒら、Ｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ．１９９８、４２、１７２〜１８１）の３次元骨格の調製について欧州特許第０２１６４５３  Ｂ１号に記載されたとおりに調製されたヒアルロン酸の使用も知られている。
【００１７】
（発明の概要）
出願人は、驚いたことに、ヒアルロン酸誘導体に基づく３次元基質を関節鏡検査時の患者における移植用の細胞材料のための骨格として使用可能であり、かかる基質の使用により関節鏡検査法に伴う上記の問題が解決されることを今や見出した。
【００１８】
その上に細胞が増殖するヒアルロン酸に基づく生体適合性および生体吸収性の３次元基質の使用は、関節鏡検査法における大きな前進を示す。実際に、細胞は３次元の刺激および適切な増殖因子の存在により、基質上で依然増殖している間に軟骨細胞へと分化を開始する。次いで、大量の硝子基質の産生による細胞分化が移植後の病変部位中で継続する。
【００１９】
移植前に、ヒアルロン酸の生体適合性および生体再吸収という周知の特性を有する３次元骨格上に細胞がすでに固定されているということにより、唯一の欠損の覆いが必要なのは、周囲の軟骨組織になじむまで移植片を適所に保持するものであるため、欠損上にシールされ、防水のふたを形成する骨膜のおおいの必要が除去される。したがって、必要とされるものは、フィブリン密閉剤（自家または同種）、または限定された時間の長さのために別の生体糊のである。骨膜のおおいがもはや不要であるということは、別の主な利点を示す。すなわち、スウェーデンのモデルで用いられる関節鏡検査法は、侵襲的でなく、かつより経済的な関節鏡検査で代用することができる。
【００２０】
したがって、本発明の主題は、関節鏡検査法による用途に適した移植の調製用に少なくとも１つのヒアルロン酸誘導体を含有する３次元基質上に増殖した細胞を含有する生物材料の使用である。
【００２１】
本発明はさらに、前記生物材料を移植するための外科用器具のキットであって：
ａ）滅菌トレー；
ｂ）関節鏡検査中に、以下に示す器具セットへのアクセスを得るガイドとして用いられる比較的無菌の弁を有するカニューレ；
ｃ）環状インプリントを生成する病変部を取り囲むと同時に、インプリントと同じ円形および同じ寸法の軟骨組織の小片を取るために用いられる中空の円筒チューブによって構成されたマッパサンプラー；
ｄ）ドリルによって病変部の中心に固定され、使用時のカッターの安定性を保証するガイドワイヤ；
ｅ）マッパサンプラーによって生成されるインプリントの縁内に生物改変された細胞支持が引き続いて移植される部位を生成するために用いられる凹面中空カッターアブレーザー；
ｆ）マッパサンプラーに導入され、生物改変された細胞支持をあらかじめ調製された病変部位に押し入れる中空プランジャー、を含む前記キットに関する。
【００２２】
（本発明の詳細な説明）
本発明による３次元骨格において用いることができるヒアルロン酸誘導体すべてのうち、以下は選り抜きのものである：
カルボキシ基の一部または全部が脂肪族系、芳香族系、アリール脂肪族系、環式脂肪族系、または複素環式系のアルコールでエステル化されているヒアルロン酸のエステル類（ＥＰ０２１６４５３Ｂ１）；
カルボキシ官能基の一部または全部が同じ多糖鎖または他の鎖のアルコール官能基でエステル化されているヒアルロン酸の架橋エステル類（ＥＰ０３４１７４５Ｂ１）；
カルボキシ官能基の一部または全部が脂肪族系、芳香族系、アリール脂肪族系、環式脂肪族系、または複素環式系のポリアルコールでエステル化され、スペーサ鎖によって架橋を生成するヒアルロン酸の架橋エステル類（ＥＰ０２６５１１６Ｂ１）；
ヒアルロン酸を有し、またはヒアルロン酸の部分または全エステル類を有するコハク酸の半エステル類またはコハク酸半エステル類の重金属塩類（ＷＯ９６／３５７２０７）；
ヒアルロン酸のＯ−硫酸化誘導体（ＷＯ９５／２５７５１）またはＮ−硫酸化誘導体（ＷＯ９８／０１９７３）；
四級アンモニウム塩、例えば、Ｎ−硫酸化ヒアルロン酸、Ｏ−硫酸化ヒアルロン酸、重金属でおそらく部分的に塩化されたヒアルロン酸を有するコハク酸半エステル類によって形成される群から選択されるヒアルロン酸またはその誘導体のテトラブチルアンモニウムおよびフェニルトリメチルアンモニウムを有する塩；
ポリウレタンに共有結合的に結合されたＯ−硫酸化またはＮ−硫酸化ヒアルロン酸およびその誘導体（ＷＯ９９／４３７２８）。
【００２３】
本発明の３次元骨格は数種類のヒアルロン酸誘導体の結合も含有することができ、ＵＳ５，５２０，９１６に記載された不織布、特許番号ＥＰ２１６４５３Ｂ１によるメッシュ、ＥＰ４６２４２６Ｂ１に記載された有孔の膜、ＥＰ２１６４５３Ｂ１における無孔の膜、およびＥＰ２１６４５３Ｂ１に記載された海綿など種々の形でありうる。このような基質は、天然ポリマー類、半合成ポリマー類、または合成ポリマー類の結合も含みうる。
【００２４】
本発明によって用いることができる天然ポリマー類は、例えば、コラーゲン、コラーゲンおよびグリコサミノグリカン類の共沈物、セルロースのほか、キチン、キトサン、ペクチンまたはペクチン酸、寒天、アガロース、キサンタン、ゲラン、アルギン酸またはアルギン酸塩類、ポリマナンまたはポリグリカン類、デンプン、および天然ゴムなどゲルの形の多糖類である。
【００２５】
半合成ポリマー類は、例えば、アルデヒド類またはそれらの前駆体、ジカルボン酸類またはそれらのハロゲン化物、ジアミン類、セルロースの誘導体、ヒアルロン酸、キチンまたはキトサン、ゲラン、キサンタン、ペクチンまたはペクチン酸、ポリグリカン類、ポリマナン、寒天、アガロース、天然ゴム、およびグリコサミノグリカン類などの作用剤で架橋されたコラーゲンからなる群から選択しうる。
【００２６】
最後に、用いることができる合成ポリマー類の例は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、コポリマー類またはそれらの誘導体、ポリジオキサン類、ポリホスファゼン類、ポリスルホン酸樹脂類、ポリウレタン類、およびＰＴＦＥである。
【００２７】
本発明の３次元骨格は、抗炎症剤、抗生物質、増殖因子、抗真菌剤、抗菌剤、および抗ウイルス剤など薬剤的に、または生物学的に活性な成分をも含みうる。
【００２８】
本発明の生物材料を調製するために用いられる細胞は、軟骨細胞、骨細胞、間葉細胞、および幹細胞から選択された。
【００２９】
本発明による生物材料を製造するために用いられる細胞培養工程は、Ａｉｇｎｅｒら、「ヒアルロン酸ベンジルエステルに基づく新規な不織構成生物材料による軟骨組織の改変」、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１９８８、４２（２）、１７２−１８１によって記載されている。
【００３０】
ヒアルロン酸誘導体に基づく３次元骨格上に接種後数日、好ましくは１４日後から生物材料は移植の用意ができている。
【００３１】
本発明の生物材料は、実際の移植過程中、すなわち、外科用器具の導入直前の手術中のモザイク形成術で用いられるパッカーで軟骨欠損のサイズに縮小しうる。あるいは、関節鏡検査において、または本発明の関節鏡検査の別の主題のキットの外科用器具を用いることによって一般的に用いられる器具であるカニューレに材料を通過させることができる。
【００３２】
本発明による生物材料は、関節鏡検査法による用途に適した自家移植片と同種移植片の両方を調製するために用いることができる。
【００３３】
本発明の別の利点は、将来の時点で行われる移植用に細胞生存度のその特徴を保存するために前記生物材料を凍結保存できることにある。
【００３４】
本発明による関節鏡検査に用いられる生物材料を移植するための器具のキットは、以下に示す好ましい特徴を有する材料で構成される。
【００３５】
関節鏡検査において、以下に示し、図６（Ｉ）、６（ＩＩ）、８（番号５で表示）に示した器具セットへのアクセスを得るガイドとして用いられる項目（ｂ）で以前示したカニューレは、Ａｉｓｅ３１６鋼であり、内径が１１．５ｍｍであり、長さが１１１ｍｍである。前記の図面では、滅菌弁は表示されていない。
【００３６】
環状インプリントを生成することによって軟骨病変部を取り囲み、同じ形状とサイズの軟骨組織の小片を切り取って除去するために用いられる項目（ｃ）で以前示し、図３、６（Ｉ）、６（ＩＩ）、および８（番号１で表示）で示したマッパサンプラーは、Ａｉｓｅ３１６医用鋼のカニューレであり、長さが１５５ｍｍ、外径が１０．５ｍｍ、内径が９ｍｍである。本発明によるキットのマッパサンプラー１は、プランジャーを保持するのに十分な大きさの中空円筒であり、さらにマッパサンプラーと同様のくぼんだ先端と、プランジャーを前進させることによってかけられる圧力を中断することができる制御システムとを有することを特徴とする。
【００３７】
項目（ｄ）で以前示し、ドリルによって病変部の中心に固定し、使用時のカッターを安定化し、図７（Ｉ）（番号３で表示）に示したガイドワイヤの直径は１ｍｍである。
【００３８】
項目（ｅ）で以前示し、マッパ１によって残されたインプラント縁内に、本発明による関節鏡検査において、その後の移植用に生物材料を用いる部位を生成するために用いられ、図５および７（Ｉ）および７（ＩＩ）（４で表示）に示した凹面中空カッターアブレーザーは、Ａｉｓｅ３１６医用鋼であり、長さが１６２．５ｍｍであり、内径１．２ｍｍ、および外径９．５ｍｍである。
【００３９】
カッター４のブレードは、凸面を生成するようにくぼんでいる。
【００４０】
マッパサンプラー１に導入され、本発明による関節鏡検査において用いられる生物材料を以前に調製された病変部位に押し入れる項目（ｅ）で以前示し、図４、６（Ｉ）、６（ＩＩ）、および８（番号２で表示）で示した中空プランジャーは直径が５ｍｍであり、ガイドワイヤを保持するのに十分な大きさの中空円筒であり、マッパと同様にくぼんだ先端を有する。
【００４１】
前記器具の使用により以下の手術法の実施が可能となる：
Ａ）含気性止血帯を病変部が関節鏡検査によって確認される肢の近位部のまわりに配置し、
Ｂ）針を用いて病変直上の侵入点を確認するために用い、
Ｃ）皮膚をメスで切り、カニューレ５を侵入点に導入し、そこからマッパカッター１を導入し、病変部内に直径９ｍｍの環状インプリントを作成する（マッピング操作）；
Ｄ）マッパ１の中に凹面中空プランジャー２を通し、次にはこの中に直径１ｍｍのガイドワイヤを導入し、ドリルを用いてインプリントの中心に固定する。このガイドワイヤはその後の切断操作を安定化するために使用される；
Ｅ）マッパ１とプランジャー２の両方を除去し、以前用いたマッパ（１）と同じサイズの凹面カッター４を導入する。病変部に対して垂直にカッターを保持し、病変部に適合させ、カッター上のマークした遠位点で止める。
Ｆ）マッパサンプラー１を用いて、生物改変された３次元骨格上に増殖した細胞を含有するあらかじめ「マッピングされた」寸法の生物材料を調製し、その凹面プランジャー２を完備したカニューレ（１）を通じて導入し、生物材料の病変部への適用を可能にする；
Ｇ）中空凹面プランジャー２で骨格をマッパ１から押し出して病変部の凸面中空に入れる；
Ｉ）関節を繰り返し曲げてまっすぐにし、移植片の安定性を点検し、
Ｊ）含気性止血帯をはずし、関節鏡検査装置（光学系およびカニューレ５）を除去する。
【００４２】
本発明によるキットは、ヒアルロン酸誘導体を含まない天然ポリマー類、半合成ポリマー類、または合成ポリマー類によって構成しうる自家および／または同種の細胞を含有する３次元骨格を移植するためにも用いることができる。
【００４３】
天然ポリマー類は、コラーゲン、コラーゲンおよびグリコサミノグリカン類の共沈物、セルロースのほか、キチン、キトサン、ペクチンまたはペクチン酸、寒天、アガロース、キサンタン、ゲラン、アルギン酸またはアルギン酸塩類、ポリマナンまたはポリグリカン類、デンプン、および天然ゴムなどゲルの形の多糖類によって形成される群から選択される。
【００４４】
以下は選り抜きの半合成ポリマー類である：アルデヒド類またはそれらの前駆体、ジカルボン酸類またはそれらのハロゲン化物、ジアミン類、セルロースの誘導体、ヒアルロン酸、キチンまたはキトサン、ゲラン、キサンタン、ペクチンまたはペクチン酸、ポリグリカン類、ポリマナン、寒天、アガロース、天然ゴム、およびグリコサミノグリカン類などの作用剤で架橋されたコラーゲン。
【００４５】
合成ポリマー類は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、コポリマー類またはそれらの誘導体、ポリジオキサン類、ポリホスファゼン類、ポリスルホン酸樹脂類、ポリウレタン類、およびＰＴＦＥによって形成される群から選択される。
【００４６】
さらに、本発明による３次元骨格は、細胞のほかに、抗炎症剤、抗生物質、増殖因子、抗真菌剤、または抗ウイルス剤など薬剤的に、または生物学的に活性な物質を含有しうるとともに、それらは請求の範囲の器具セットを用いた関節鏡検査によるその後の移植用に細胞生存度のそれらの特徴を保存するために凍結保存しうる。
【００４７】
以下の実施例は例示を目的としており、本発明の範囲を限定するものではない。
【００４８】
（実施例１）
生物材料の調製
細胞培養工程は、Ｂｒｕｎら、「軟骨細胞の集合および３次元骨格への再組織化」、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｓｔｅｒ．Ｒｅｓ．１９９８、４６、３３７〜３４６に記載されている。病変部周辺の非荷重部位から取った軟骨組織をＩＩ型コラゲナーゼで処理することによって剥離し、こうして得られた細胞を、胎児ウシ血清、１％ストレプトマイシン−ペニシリン、１％グルタミンを補充したＨＡＭ’ｓＦ１２培地、および以下の栄養性因子、すなわち、ＴＧＦβ１、組み換えヒトＥＧＦ、組み換えヒトインスリン、および組み換えヒトｂＦＧＦをそれぞれ１〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲の量で含有するシャーレに接種する。
【００４９】
細胞をインビトロで１〜４連続継代により増殖させ、次いで、０．５ｘ１０６〜４ｘ１０６細胞／ｃｍ２の細胞密度で、ＨＹＡＬＯＧＲＡＦＴ（登録商標）Ｃ（ＨＹＡＦＦ（登録商標）１１ｔに基づく不織布−ヒアルロン酸の全ベンジルエステル）、および上記の培地上に接種する。培地の各交換時（４８〜７２時間ごとに２〜１０ｍｌ）にアスコルビン酸を５０μｇ／ｍｌ添加する。
【００５０】
（実施例２）
ＭＴＴ試験による細胞生存度の評価
生物材料の細胞生存度を生体ＭＴＴ色素を組み入れることによって測定する（Ｆ．Ｄｅｚｉｎｏｔ、Ｒ．Ｌａｎｇ「細胞の増殖および生存に対する迅速比色判定。感受性および確実性の改善を示すテトラゾリウム色素法の変型」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９８６、２２（８９）、２７１〜２７７）。ＭＴＴ０．５ｍｇ／ｍｌをリン酸緩衝液、ｐＨ７．２（ＰＢＳ）中に溶解することによって調製した溶液を試験材料に添加し、３７℃に設定したインキュベーターに４時間配置する。インキュベーションが完了したところで、ＭＴＴ溶液を吸引し、ＰＢＳで数回、材料を洗浄し、その後にイソプロピルアルコール中１０％ジメチルスルホキシドによって構成された抽出溶液５ｍｌを添加する。遠心分離後、４７０ｎｍでの分光光度測定によって上清の吸光度を測定する。
【００５１】
（実施例３）
カニューレ通過後の細胞生存度回復の検証
実施例２に記載したＭＴＴ試験を用いて、関節鏡検査において一般的に用いられ、ここでは生物材料を配置するために用いられる器具であるカニューレ通過後の細胞生存度を検証する。
結果は図１に報告されているが、実施例１に記載したように調製した生物改変された軟骨構造（Ｈｙａｌｏｇｒａｆｔ（登録商標）Ｃ、寸法２ｘ２ｃｍ）に関して細胞生存度の回復を示す。７２時間後のそのパッケージングにおいて、すなわち最大限の代謝ストレスの状態において、直径９ｍｍのカニューレの中に生物材料を静かに押し出した。カニューレの中空への通過は本発明の材料の細胞生存度を変更しないことがわかった。
【００５２】
（実施例４）
モザイク形成術パッカーによるパッケージング後の細胞生存度回復の検証
再度、実施例２において上述したＭＴＴ試験を用いて、生物改変された構成物の生存度をモザイク形成術において用いられるパッケージング器具で所望の寸法に縮小させ、生物改変された材料のサイズを縮小し、移植用に軟骨の欠損に適合させ、すなわち手術中、外科用器具によるその挿入直前の状態をシミュレートする。
【００５３】
この実験において、細胞構成物を生成物の満了期限（７２時間）までそのパッケージングで維持し、次いでモザイク形成術で用いられるパッカーで直径９ｍｍの切片に分けた。単一断片の生存度を表面単位によって標準化し、残余生物材料と比較した。
【００５４】
図２はこの実験の結果を示す。
【００５５】
上述した細胞生存度試験は、本発明の関節鏡検査による応用、すなわち、最大限の代謝ストレスの状態における最終期限（７２時間）に達した生体構成物は、その生物学的質に影響を及ぼさないことを示した。このことは材料を縮小するために用いられる外科用器具の種類および生成物のパッケージング状態には左右されない。
【００５６】
本発明はこうして記載されているが、用いられる材料および方法を種々のやり方で変更できることは明らかである。かかる変更は発明の趣旨や目的とは異なるとは考えられず、分野の専門家には明らかと思われるようなかかる変更はいずれも特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】
それぞれ棒グラフの形の吸光度で表した細胞生存度の回復に関して、実施例３および４の結果を示し、前記吸光度はＦＬＯＷ分光光度計で測定された絶対単位で表した４７０ｎｍでの座標上で報告されている。
【図２】
それぞれ棒グラフの形の吸光度で表した細胞生存度の回復に関して、実施例３および４の結果を示し、前記吸光度はＦＬＯＷ分光光度計で測定された絶対単位で表した４７０ｎｍでの座標上で報告されている。
【図３】
マッパサンプラーのＡ−Ａに沿って見たそれぞれ略側面図（Ｉ）および略断面図（ＩＩ）である。
【図４】
中空プランジャーのＢ−Ｂに沿って見たそれぞれ略側面図（Ｉ）および略断面図（ＩＩ）である。
【図５】
凹面中空カッターアブレーザーのＡ−Ａに沿って見たそれぞれ略側面図（Ｉ）、略断面図（ＩＩ）、正面図（ＩＩＩ）、および概略拡大（３：１）正面図である。
【図６】
（Ｉ）と（ＩＩ）は、病変部のまわりにインプリントを生成する間のマッパサンプラーを示す略図である。
【図７】
（Ｉ）と（ＩＩ）は、機能している間の病変部の中心に固定されたガイドワイヤによって安定化されたカッターを示す略図である。
【図８】
カッターによってあらかじめ切り取られた３次元骨格上に増殖した細胞を含む生物材料を配置するプランジャーを完備したマッパサンプラーを示す略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年1月24日(2003.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３次元骨格で支持された細胞を含有する生物材料の使用であって、前記骨格が関節鏡検査法による移植に適した自家および／または同種移植片調製用の少なくとも１つのヒアルロン酸誘導体を含有する使用。
【請求項２】
前記自家および／または同種細胞が軟骨細胞、骨細胞、間葉および幹細胞からなる群から選択される請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記３次元骨格がさらに天然ポリマー類、半合成ポリマー類、または合成ポリマー類を含む請求項１〜２のいずれか１つに記載の使用。
【請求項４】
前記天然ポリマーがコラーゲン、コラーゲンおよびグリコサミノグリカン類の共沈物、セルロースのほか、キチン、キトサン、ペクチンまたはペクチン酸、寒天、アガロース、キサンタン、ゲラン、アルギン酸またはアルギン酸塩類、ポリマナンまたはポリグリカン類、デンプン、および天然ゴムなどゲルの形の多糖類からなる群から選択される請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記半合成ポリマー類がアルデヒド類またはそれらの前駆体、ジカルボン酸類またはそれらのハロゲン化物、ジアミン類、セルロースの誘導体、ヒアルロン酸、キチンまたはキトサン、ゲラン、キサンタン、ペクチンまたはペクチン酸、ポリグリカン類、ポリマナン、寒天、アガロース、天然ゴム、またはグリコサミノグリカン類などの作用剤で架橋されたコラーゲンからなる群から選択される請求項３に記載の使用。
【請求項６】
前記合成ポリマー類がポリ乳酸、ポリグリコール酸、それらのコポリマー類または誘導体、ポリジオキサン類、ポリホスファゼン類、ポリスルホン酸樹脂類、ポリウレタン類、およびＰＴＦＥからなる群から選択される請求項３に記載の使用。
【請求項７】
前記ヒアルロン酸誘導体が、
ｉ）カルボキシ官能基の一部または全部が脂肪族系、芳香族系、アリール脂肪族系、環式脂肪族系、または複素環式系のアルコールでエステル化されているヒアルロン酸のエステル類；
ｉｉ）カルボキシ官能基の一部または全部が同じ多糖鎖または他の鎖のアルコール官能基でエステル化されているヒアルロン酸の架橋エステル類；
ｉｉｉ）カルボキシ官能基の一部または全部が脂肪族系、芳香族系、アリール脂肪族系、環式脂肪族系、または複素環式系のポリアルコールでエステル化され、スペーサ鎖によって架橋を生成するヒアルロン酸の架橋エステル類；
ｉｖ）前記ヒアルロン酸誘導体がコハク酸半エステル類、またはヒアルロン酸を有するコハク酸半エステル類の重金属塩類、またはヒアルロン酸の部分または全エステル類から選択され；
ｖ）ヒアルロン酸のＯ−硫酸化またはＮ−硫酸化誘導体、
ｖｉ）ヒアルロン酸の四級アンモニウム塩、またはヒアルロン酸のＯ−硫酸化またはＮ−硫酸化誘導体、または重金属でおそらく部分的に塩化されたヒアルロン酸を有するコハク酸半エステル類からなる群から選択されるその誘導体；
ｖｉｉ）ポリウレタンに共有結合的に結合されたＯ−硫酸化またはＮ−硫酸化ヒアルロン酸およびその誘導体；
からなる群から選択される請求項１〜６のいずれか１つに記載の使用。
【請求項８】
前記３次元骨格が少なくとも１つのヒアルロン酸誘導体からなる請求項１〜７のいずれか１つに記載の使用。
【請求項９】
前記骨格が不織布の形である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記骨格がメッシュの形である、請求項８に記載の使用。
【請求項１１】
前記骨格が無孔の膜の形である、請求項８に記載の使用。
【請求項１２】
前記骨格が有孔の膜の形である、請求項８に記載の使用。
【請求項１３】
前記骨格が海綿の形である、請求項８に記載の使用。
【請求項１４】
薬剤的に、または生物学的に活性の成分に結合した、請求項１〜１３のいずれか１つに記載の使用。
【請求項１５】
前記生物材料が、将来の時点で行われる移植用に細胞生存度の特徴を保存するためにあらかじめ凍結保存されている、請求項１〜１３のいずれか１つに記載の使用。
【請求項１６】
α）３次元骨格で支持された細胞を含有する生物材料であって、前記骨格が少なくとも１つのヒアルロン酸誘導体を含有する生物材料、または
β）ヒアルロン酸誘導体を含まない３次元の生物改変された骨格上に増殖した細胞を含有する生物材料を関節鏡検査手術によって移植するための外科用器具のキットであって：
ａ）滅菌トレー；
ｂ）関節鏡検査におけるガイドとして用いられ、以下に示す器具へのアクセスを得る比較的無菌の弁を有するカニューレ（５）；
ｃ）環状インプリントを生成する病変部を取り囲むと同時に、インプリントと同じ円形および同じ寸法の軟骨組織の小片を取るために用いられる中空チューブによって構成されたマッパサンプラー（１）；
ｄ）ドリルによって病変部の中心に固定され、作動中のカッターアブレーザーへの安定性を保証するガイドワイヤ（３）；
ｅ）マッパサンプラー（１）によって生成されるインプリントの縁内に生物材料（α）または生物材料（β）が引き続いて移植される部位を生成するためのカッターアブレーザー（４）；
ｆ）生物材料、生物材料（α）、または生物材料（β）をあらかじめ調製された病変部に押し入れるマッパ（１）内に導入される中空プランジャー（２）、を含む前記キット。
【請求項１７】
マッパサンプラー（１）が中空であり、プランジャーをその中に挿入することができ、関節の環状面に付着するくぼんだ先端を有し、プランジャーを前進させることによってかけられる圧力を中断させることができる制御システムを有する請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
プランジャー（２）がガイドワイヤを保持するのに十分に大きな中空の円柱であり、マッパと同様、くぼんだ先端を有する請求項１６に記載のキット。
【請求項１９】
カッター（４）のブレードが凹面を生成するようにくぼんでいる請求項１６に記載のキット。
【請求項２０】
前記生物材料（β）の細胞が自家および／または同種であり、軟骨細胞、骨細胞、間葉細胞、および幹細胞からなる群から選択される請求項１６〜１９のいずれか１つに記載のキット。
【請求項２１】
生物材料（β）の３次元骨格が天然ポリマー類、半合成ポリマー類、または合成ポリマー類を含有する請求項１６〜１９のいずれか１つに記載のキット。
【請求項２２】
前記天然ポリマー類がコラーゲン、コラーゲンの共沈物、およびグリコサミノグリカン、セルロース、キチン、キトサン、ペクチンまたはペクチン酸、寒天、アガロース、キサンテン、ゲラン、アルギン酸またはアルギン酸塩類、ポリマナン類またはポリグリカン類、デンプン、または天然ゴム類などゲルの形の多糖類からなる群から選択される請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記半合成ポリマー類がアルデヒド類またはその前駆体、ジカルボン酸またはそのハロゲン化物類、ジアミン類、セルロースの誘導体、ヒアルロン酸、キチンまたはキトサン、ゲラン、キサンテン、ペクチンまたはペクチン酸、ポリグリカン類、ポリマナン、寒天、アガロース、天然ゴム、およびグリコサミノグリカン類などの作用剤で架橋されたコラーゲンからなる群から選択される請求項２１に記載のキット。
【請求項２４】
前記合成ポリマー類がポリ乳酸、ポリグリコール酸、それらのコポリマー類または誘導体、ポリジオキサン類、ポリホスファゼン類、ポリスルホン樹脂類、ポリウレタン、およびＰＴＦＥからなる群から選択される請求項２１に記載のキット。
【請求項２５】
前記生物材料（β）がさらに薬剤的に、または生物学的に活性な成分を含む請求項１６〜２４のいずれか１つに記載のキット。
【請求項２６】
前記薬剤的に、または生物学的に活性な成分が抗炎症剤、抗生物質、増殖因子、抗真菌剤、および抗ウイルス剤からなる群から選択される請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記生物材料（β）が関節鏡検査によって行われる将来の移植を考えてその細胞生存度の特徴を維持するために凍結保存されている請求項１６〜２６のいずれか１つに記載のキット。
【国際調査報告】
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