(57)【要約】本発明は、酵素一酸化窒素シンターゼの活性の調節に、特に内皮一酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）およびニューロン一酸化窒素シンターゼ（ｎＮＯＳおよびｎＮＯＳμ）の活性の調節に関する。第一の局面によれば、本発明は、ｅＮＯＳのＡＭＰＫが仲介する活性化のモジュレーターの同定方法であって、カルモジュリンおよびカルシウムイオン濃度によってｅＮＯＳのリン酸化を増大または低減させる能力について推定上のモジュレーターを試験する工程を含む方法を提供する。それに代わる局面では、本発明は、ｅＮＯＳのＡＭＰＫが仲介する抑制のモジュレーターの同定方法であって、制限カルシウムイオン存在下でｅＮＯＳのＡＭＰＫが仲介するリン酸化を低減または増大させる能力に対する推定上のモジュレーターを試験する工程からなる方法を提供する。好ましくは、トレオニン４９５の特異的リン酸化が査定される。第二の局面によれば、本発明は、Ｓｅｒ−１４１７でのｎＮＯＳおよびｎＮＯＳμのリン酸化を促進または抑制するモジュレーターの同定方法を提供する。ＡＭＰを活性化する化合物である活性化プロテインキナーゼは、グルコースおよび脂肪酸代謝を促すことにより、ならびにＮＯＳ活性を増大して筋細胞への栄養素および酸素供給を改善し、機械的活動を低減することにより、虚血性心疾患の治療に有用であると予期される。これらの化合物は、肺高血圧症、および閉塞性気道疾患の治療にも効用を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｅＮＯＳ、ｎＮＯＳおよびｎＮＯＳμから成る群から選択される一酸化窒素シンターゼ酵素のＡＭＰＫが仲介する活性化のモジュレーターの同定方法であって、前記酵素のリン酸化を増大または低減させる能力について推定上のモジュレーターを試験する工程を含み、前記増大または低減がカルモジュリンおよびカルシウムイオン濃度に依存する方法。
【請求項２】
Ｓｅｒ−１１７７の特異的リン酸化はカルシウムおよびカルモジュリンの存在下で査定される請求項１記載の方法。
【請求項３】
ｅＮＯＳのＡＭＰＫが仲介する抑制のモジュレーターの同定方法であって、制限カルシウムイオン存在下でｅＮＯＳのＡＭＰＫが仲介するリン酸化を低減または増大させる能力について推定上のモジュレーターを試験する工程を含む方法。
【請求項４】
Ｔｈｒ−４９５の特異的リン酸化が査定される請求項３記載の方法。
【請求項５】
１つ、またはそれ以上の下記の活性：
（ａ）平滑筋収縮に及ぼす効果、
（ｂ）心臓の変力活性に及ぼす効果、
（ｃ）心臓の周期変更活性に及ぼす効果、または
（ｄ）血小板機能に及ぼす効果
がさらに査定される請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記モジュレーターは本明細書中に記載されている活性化物質である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記活性化物質はグルコース代謝および脂肪酸代謝の両方を促進する請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記モジュレーターは本明細書中に記載されている阻害物質である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記モジュレーターは非ニューロン細胞に優先的に作用する請求項３〜８記載のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記モジュレーターはＳｅｒ−１１７７の脱リン酸化を促進し、ｅＮＯＳ活性を抑制する請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項１１】
前記モジュレーターはＴｈｒ−４９５の脱リン酸化を促進し、ｅＮＯＳ活性を刺激する請求項３記載の方法。
【請求項１２】
前記モジュレーターはｎＮＯＳまたはｎＮＯＳμのＳｅｒ−１４１７でのリン酸化を促進する請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項１３】
前記モジュレーターはｎＮＯＳまたはｎＮＯＳμのＳｅｒ−１４１７での脱リン酸化を促進する請求項１または請求項２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、一酸化窒素シンターゼ酵素の活性の調節に、特に内皮およびニューロン一酸化窒素シンターゼの活性の調節に関する。プロテインキナーゼＣおよびＡＭＰ活性化プロテインキナーゼを含めたいくつかのプロテインキナーゼによる内皮およびニューロン一酸化窒素シンターゼのリン酸化は、それらの活性を調節する、ということを我々は見出した。
【０００２】
（発明の背景）
一酸化窒素（ＮＯ）は、近年、非常に広範な種々の細胞機能の重要な仲介物質として認識されており、すべてではないにしても、ほとんどの哺乳類細胞中に存在する（Ｍｏｎｃａｄａ， Ｓ． ａｎｄ Ｈｉｇｇｓ， Ａ．， １９９３）。それは、一連の疾患、高血圧、低コレステロール血症、糖尿病、心疾患、老化、炎症および喫煙作用に関連し、そして脈管生物学において特に重要である。それは、全身の血圧、ならびに血管再造形（Ｒｕｄｉｃ ｅｔ ａｌ．， １９９８）および組織虚血に応答した新脈管形成（Ｍｕｒｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．， １９９８）を調節する。ＮＯは、一酸化窒素シンターゼ酵素（ＮＯＳ）によりアミノ酸のＬ−アルギニンから合成される。
【０００３】
ＮＯＳの３つのアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）が同定されている：すなわち、ニューロン組織中に見出されるニューロンＮＯＳ（ｎｅｕｒｏｎａｌ ＮＯＳ）（ｎＮＯＳ）、および骨格筋中に見出されるもの（ｎＮＯＳμアイソフォーム）；非常に広範な種々の哺乳類組織、例えば活性化マクロファージ、心筋細胞、膠細胞および血管平滑筋細胞に見出される誘導可能なＮＯＳ（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ＮＯＳ）（ｉＮＯＳ）；ならびに血管内皮、心筋細胞および血小板に見出される内皮ＮＯＳ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ＮＯＳ）（ｅＮＯＳ）である。内皮細胞は、内皮層上の血流により発生する剪断応力に応答してＮＯを生成する。
【０００４】
ＮＯシンターゼの３つのアイソフォームは約５５％のアミノ酸配列相同性を有し、触媒作用に関与する領域における強い配列保存を伴う。３つのアイソフォームすべてに関して、ＮＯ合成のメカニズムは、遍在するカルシウム調節タンパク質カルモジュリン（ＣａＭ）の酵素との結合を含む。しかしながら、ＣａＭが結合される条件は、少なくともカルシウム濃度に関する限りにおいて、ｉＮＯＳに関しては異なると思われる。これら３つのＮＯＳ酵素は集中的に研究されており、その分野は近年、再検討されている（例えば、Ｍｉｃｈｅｌ ａｎｄ Ｆｅｒｏｎ（１９９７）； Ｈａｒｒｉｓｏｎ（１９９７）；およびＭａｙｅｒ ａｎｄ Ｈｅｌｌｅｎｓ（１９９７）参照）。ｅＮＯＳは多様にリン酸化され得ることが初期の研究から分かったが、しかし、リン酸化に関与する酵素を含めたこれらのリン酸化事象のメカニズム、ならびにｅＮＯＳ機能の変調におけるリン酸化の役割は分からなかった。
【０００５】
ＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの調節において重要な役割を有し、激しい運動中または虚血中の脂肪酸酸化の加速をもたらすことが知られている代謝ストレス感応プロテインキナーゼである。ＡＭＰＫは脂質代謝の調節物質として周知であり、特に、Ｈａｒｄｉｅ ａｎｄ Ｃａｒｌｉｎｇ（１９９７）で再検討されているように、コレステロール合成においてある役割を有することが知られている。ＡＭＰＫは、運動増強グルコース輸送において重要な役割を有するとも考えられる（Ｈａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９８））が、これはインスリン仲介性グルコース取込みメカニズムとは別物である。ＡＭＰＫは、肝臓、心臓および骨格筋で主に研究されてきた。ＡＭＰＫは精製されており、その酵素サブユニットをコードする遺伝子はクローン化された（国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９４／０１０９３およびＰＣＴ／ＵＳ９７／００２７０および公開ＷＯ９７／２５３４１参照）。
【０００６】
哺乳類ＡＭＰＫ（Ｍｉｔｃｈｅｌｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ． １９９４）は、サッカロミセス・セレビシエＳＮＦ１プロテインキナーゼに相関がある。それは、代替的炭素源上での増殖が必要とする栄養ストレスに対する応答におけるグルコース抑制遺伝子の発現に必要であり（Ｃｅｌｅｎｚａ ａｎｄ Ｃａｒｌｓｏｎ， １９８６）、哺乳類および酵母キナーゼの両方が上流キナーゼにより活性化される（Ｈａｒｄｉｅ ａｎｄ Ｃａｒｌｉｎｇ， １９９７）。ＡＭＰＫは、Ｓｅｒ−７９でのリン酸化による代謝ストレス応答、ならびにアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼおよびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの共在抑制に関与する（Ｈａｒｄｉｅ ａｎｄ Ｃａｒｌｉｎｇ， １９９７）。多様なＡＭＰＫアイソフォームが生じる。それらは、非触媒性サブユニットβおよびγ（Ｍｉｔｃｈｅｌｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ， １９９４； Ｃａｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ， １９９４； Ｓｔａｐｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ， １９９４）とともに、α１またはα２触媒サブユニット（Ｓｔａｐｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ， １９９６； Ｓｔａｐｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ， １９９７ａ）から成るαβγヘテロ三量体を包含し、これらはそれぞれ酵母ｓｉｐ１ｐおよびｓｎｆ４ｐに関する。
【０００７】
ＡＭＰＫα２サブユニット遺伝子は第１染色体上にあり（Ｂｅｒｉ ｅｔ ａｌ．， １９９４）、α１サブユニット遺伝子は第５染色体上にあり、β１およびγ１サブユニット遺伝子は第１２染色体上にあり、β２サブユニット遺伝子は第１染色体上にあり、そしてγ２サブユニット遺伝子は第７染色体上にある（Ｓｔａｐｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ， １９９７ ）。γ３遺伝子は、ゲノムシーケンシングにより生成された発現配列タグ（ＥＳＴ）を用いて検出された（アクセッションナンバー  ＡＡ１７８８９８号）。
【０００８】
ｅＮＯＳをコードする遺伝子のうちの１つは、第７染色体上にあり、ＡＭＰＫのγ２サブユニットに対応する遺伝子のすぐ近くである。ｎＮＯＳをコードする別の遺伝子は、第１２染色体上に見出される（ヒト遺伝子マップ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＳＣＩＥＮＣＥ９６／ｔｓｒｃｈ？ＱＴＥＸＴ＝ｎｉｔｒｉｃ＋ｏｘｉｄｅ＋ｓｙｎｔｈａｓｅ参照）。
【０００９】
近年の研究は、心筋および骨格筋中のＡＭＰＫが激しい運動により、または虚血性ストレスにより活性化される、ということを明示した（Ｗｉｎｄｅｒ ａｎｄ Ｈａｒｄｉｅ， １９９６； Ｖａｖｖａｓ ｅｔ ａｌ， １９９７； Ｋｕｄｏ ｅｔ ａｌ， １９９５）。これにより、これらの組織中のＡＭＰＫアイソフォームの局在化を我々は研究することになった。ＡＭＰＫ−α２アイソフォームは、心筋および骨格筋中の毛管内皮細胞中に存在し、そしてＡＭＰＫ−α１アイソフォームは心筋細胞および脈管中に生じる。内皮細胞中のＡＭＰＫの存在により、基質としての細菌性発現ｅＮＯＳを我々は試験することになり、そして、それがＡＭＰＫ−α１またはＡＭＰＫ−α２により容易にリン酸化されることを見出した。
【００１０】
ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼは内皮ＮＯシンターゼをリン酸化し、調節する、ということを我々は意外にもここに見出した。ＡＭＰＫは２つの部位でｅＮＯＳをリン酸化することが判明した。カルシウムおよびカルモジュリンの存在下では、ヒト配列中のＳｅｒ−１１７７およびウシ配列におけるＳｅｒ−１１７９は、酵素のＣＯＯＨ末端でリン酸化されて、カルモジュリン用量依存性をシフトさせることによりｅＮＯＳの活性化を引き起こす。付加的なカルシウムおよびカルモジュリンの非存在下では、リン酸化はｅＮＯＳカルモジュリン結合配列中のＴｈｒ−４９５でも起こり、その酵素を抑制する。心臓の虚血は、ＡＭＰＫの、およびｅＮＯＳの活性化を引き起こして、Ｓｅｒ−１１７７でのリン酸化の作用に似ている。リン酸化Ｓｅｒ−１１７７に対するホスホペプチド特異的抗体を用いて、この部位が虚血中にリン酸化されることを確証した。我々の結果は、ＡＴＰを低減しＡＭＰを増大し、そしてｅＮＯＳによりシグナルを送って栄養獲得可能性を制御し（動脈血管拡張による）、ならびに心筋収縮を抑制する代謝ストレス間の連関を、それらが同定できるため、特に興味深いものである。これは、内皮細胞および筋細胞の代謝状態を血管供給および機械的要求と結びつける。我々の結果はｅＮＯＳの翻訳後調節に新規の見識を提供し、これは心臓血管および骨格筋分野に関する特別の意義を有する。さらに、ｅＮＯＳとｎＮＯＳとの間の構造および機能の類似性が同定され、それによりこれらの両酵素の活性のモジュレーターを我々は同定できた。
【００１１】
（発明の要約）
第一の局面によれば、本発明は、ｅＮＯＳ、ｎＮＯＳおよびｎＮＯＳμから成る群から選択される一酸化窒素シンターゼ酵素のＡＭＰＫが仲介する活性化のモジュレーターの同定方法であって、前記酵素のリン酸化を増大または低減させる推定上のモジュレーターの能力を試験する工程を含み、前記増大または低減がカルモジュリンおよびカルシウムイオン濃度に依存する方法を提供する。
【００１２】
好ましくは、Ｓｅｒ−１１７７の特異的リン酸化は、カルシウムおよびカルモジュリンの存在下で査定される。
【００１３】
それに代わる局面において、本発明は、ｅＮＯＳのＡＭＰＫが仲介する抑制のモジュレーターの同定方法であって、制限カルシウムイオン存在下でｅＮＯＳのＡＭＰＫの仲介するリン酸化を低減または増大させるその能力に対する推定上のモジュレーターを試験する工程を含む方法を提供する。好ましくは、Ｔｈｒ−４９５の特異的リン酸化が査定される。
【００１４】
Ｓｅｒ−１１７７のリン酸化を増大し、Ｔｈｒ−４９５のリン酸化を低減し得る化合物は、本明細書中では活性化物質と呼ばれ、Ｓｅｒ−１１７７のリン酸化を低減し、Ｔｈｒ−４９５のリン酸化を増大し得る化合物は阻害物質と呼ばれる。
【００１５】
本発明の両局面において、１つ、またはそれ以上の下記の活性は、任意に、本発明の方法により同定される推定上の活性化物質または阻害物質の各々に関して、付加的に査定され得る：
（ａ）平滑筋収縮に及ぼす効果、
（ｂ）心臓の変力活性に及ぼす効果、
（ｃ）心臓の周期変更活性に及ぼす効果、または
（ｄ）血小板機能に及ぼす効果。
【００１６】
ｅＮＯＳカルモジュリン結合部位におけるＴｈｒ−４９５に相当するリン酸化部位がニューロン形態のＮＯＳから欠けており、本発明の方法により同定される阻害物質および活性化物質は少なくともある程度の組織特異性を有することが予測される。
【００１７】
ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼを活性化する化合物は、グルコースおよび脂肪酸代謝を促すことにより、ならびにＮＯＳ活性を増大して筋細胞への栄養および酸素供給を改善し、機械的活動を低減することにより、虚血性心疾患に有用であると予期される。これらの化合物は、肺高血圧症に、そして閉塞性気道疾患にも効用を有する。
【００１８】
本明細書に用いられる、「含んでいる」という用語は、「含んでいる」ことを意味するがこれに限定されないという意味であって、「含む」という用語は対応する意味を有する、と理解されることは明らかである。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
以下の、これらに限定されない実施例および図面を参照としてのみ引用して、ここで本発明を詳細に説明する。
【００２０】
Ｃａ２＋−カルモジュリン（ＣａＭ）の存在下で、ｅＮＯＳはＳｅｒ−１１７７でＡＭＰＫによりリン酸化されて、活性化を生じるが、一方、Ｃａ２＋の非存在下でのｅＮＯＳのリン酸化は、ＣａＭ結合配列中の部位であるＴｈｒ−４９５で優先的に起きて、抑制を生じる、ということが意外にも判明した。リン酸化は単に抑制的である、と従来は考えられていた。心臓の虚血が代謝ストレス感応酵素ＡＭＰＫおよびｅＮＯＳの両アイソフォームの迅速な活性化をもたらす、ということも我々は見出した。これらのデータは、ＡＭＰＫが、動脈血管拡張および心筋収縮低減をもたらす「裏返し」シグナリング経路を操作し、それゆえ、内皮細胞および筋細胞の代謝状態を血管供給および機械的活動に結びつけ得る、ということを示唆する。
【００２１】
実施例１：心筋および骨格筋中のＡＭＰＫ−α２の蛍光免疫局在
共焦点蛍光免疫顕微鏡法が、アフィニティー精製ウサギポリクローナル抗体（抗体４９１−４１４）を用いて、ＡＭＰＫ−α２に対して行われた。蛍光標識抗ウサギ抗体での染色は、α２アイソフォームが心筋および骨格筋の両方の毛管内皮細胞中に優先的に見出されることを示したが、一方心筋細胞および血管では、α１ＡＭＰＫアイソフォームに対して強いが拡散性の染色を示した。骨格筋では、α２アイソフォームが毛管の内皮細胞および速単収縮筋繊維中に見出されたが、一方α１アイソフォームはＩ型好気繊維中に見出された。心筋および骨格筋の両方における毛管内皮細胞中のＡＭＰＫ−α２の局在化を、図１に説明する。
【００２２】
実施例２：ＡＭＰＫは組換えｅＮＯＳをリン酸化する
Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｃｒｅｓｐｏ等（１９９６）の方法によりＣａＭで同時発現させた細菌性発現ｅＮＯＳを、図２の上部パネルに示すようにＡＭＰＫ−α１により、またはＡＭＰＫ−α２によりリン酸化した。免疫沈降ＡＭＰＫ−α２による組換えｅＮＯＳリン酸化を検出した。ＡＭＰＫ−α２の高度に特異的な活性を精製できなかったため、ｅＮＯＳ調節またはα２アイソフォームによるリン酸化の部位のさらなる特性化は、試みなかった。トリプシン消化後のｅＮＯＳ中のリン酸化部位の分析は、３つの別個の部位から生じた４つのホスホペプチドを明示した（図２下部パネルのＡ、Ａ’、Ｂ、Ｃ）。Ｍｉｔｃｈｅｌｈｉｌｌ ａｎｄ Ｋｅｍｐ， １９９９により記載された方法の変法を用いた質量分析法およびエドマンシーケンシングによるリン酸化部位の同定は、図２の下部パネルＡ、Ａ’に示されているようにＳｅｒ−１１７７が最も目立ったリン酸化部位であること、そしてそのリン酸化はＣａ２＋−ＣａＭの存在に依存していることを明示した。
【００２３】
ゲル内トリプシン消化物からのホスホペプチドの単離を、Ｍｉｔｃｈｅｌｈｉｌｌ等（１９９７ａ）により記載されたように実行した。９８％以上の放射能をゲルから回収した。質量分析およびエドマンシーケンシングにより単離され、特性化されたペプチドを、表１に記載する。
【００２４】
【表１】
2004537251.tif 000002
【００２５】
３２Ｐ−リン酸放出シーケンシング（Ｍｉｔｃｈｅｌｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ， １９９７ａ）により、ペプチドＡ、ＴＱＸＦＳＬＱＥＲ中のリン酸化部位の位置を同定した。ＡＭＰＫ−α１によりリン酸化されたｅＮＯＳは、ｅＮＯＳ  ＣＯＯＨ−末端に対する抗体によってもはや認識されなかった、あるいは１００ｍＭのＮＡＤＰＨによりＡＤＰ−セファロースアフィニティーカラムから溶離されなかった。これらの特性は、ｉｎ  ｓｉｔｕにおけるＳｅｒ−１１７７のリン酸化の直接的確証を妨げた。これは、Ｖｅｎｅｍａ等（１９９６）に説明されている。
【００２６】
Ｃａ２＋−ＣａＭの非存在下で、またはＥＧＴＡが存在する場合に、第二の部位であるＴｈｒ−４９５をリン酸化した。これを、図２の下部パネルＢで説明する。この残基は、ｅＮＯＳのオキシダーゼおよびレダクターゼドメイン間のＣａＭ結合配列：
ＴＲＫＫＴ４９５ＦＫＥＶＡＮＡＶＫＩＳＡＳＬＭ
中にある（Ｖｅｎｅｍａ ｅｔ ａｌ， １９９６）。ｅＮＯＳのＮ末端領域中のＳｅｒ−１０１を、リン酸化の副次的部位として同定した（図２の下部パネルのＣ）。
【００２７】
ＡＭＰＫにより、Ｔｈｒ−４９５またはＳｅｒ−１１７７を含有する合成ペプチドを、容易にリン酸化した。カイネティック値はＳＡＭＳペプチド基質と同様であった。Ｔｈｒ−４９５を含有するペプチドＧＴＧＩＴＲＫＫＴＦＫＥＶＡＮＡＶＫは、３９±１０μＭのＫｍおよび６．７±０．６μｍｏｌ／分／ｍｇのＶｍａｘでリン酸化され、一方、Ｓｅｒ−１１７７を含有するペプチドＲＩＲＴＱＳＦＳＬＱＥＲＱＬＲＧは、５４±６μＭのＫｍおよび５．８±０．３μｍｏｌ／分／ｍｇのＶｍａｘでリン酸化された。これらは、３３±３μＭのＫｍおよび８．１±１．５μｍｏｌ／分／ｍｇのＶｍａｘを有する十分特性化されたＳＡＭＳペプチド基質を用いて得られた結果（Ｍｉｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ， １９９６）に匹敵する。ペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏリン酸化は、リン酸化の同定部位を確証する。
【００２８】
実施例３：ＡＭＰＫによるｅＮＯＳのリン酸化に及ぼすＣａ２＋−ＣａＭの効果
Ｂａｌｌｉｇａｎｄ等，１９９５の方法を用いてＬ−［３Ｈ］−シトルリン産生を測定することにより、ｅＮＯＳ活性を確定した。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｃｒｅｓｐｏ ａｎｄ Ｏｒｉｔｉｚ ｄｅ Ｍｏｎｔｅｌｌａｎｏ， １９９６に記載されたように、組換え体ｅＮＯＳをＣａＭと同時に発現させた。部分精製ラット心臓ｅＮＯＳは、多少のＣａ２＋−ＣａＭを含有した。付加的ＥＧＴＡの非存在下で、ＣａＭ依存性を０〜１００ｎＭの付加的ＣａＭ存在下で観察した。Ｃａ２＋−ＣａＭの非存在下および存在下でのリン酸化に伴うＮＯＳ活性の変化を調べるために、ＥＧＴＡ緩衝を用いて、０〜１μＭの範囲でＣａＭ用量反応曲線を作製した。ルーチンに、７〜１５μＭのＥＧＴＡを付加して、付加的ＣａＭに依存させてｅＮＯＳ活性を生じさせた。ｅＮＯＳ検定前にリン酸化反応にＣａ２＋−ＣａＭを用いる場合、余分のＣａ２＋−ＣａＭがごくわずかであるように、または指示濃度が付加的Ｃａ２＋−ＣａＭの総最終濃度を表すように、試料を稀釈する。
【００２９】
心臓ｅＮＯＳを、以下のように部分精製した。２０匹のラットの心臓を、８０ｍｌの氷冷緩衝液Ａ［５０ｍＭ  トリス塩酸、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  ＮａＦ、５ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム、１０μｇ／ｍｌ  トリプシン阻害剤、２μｇ／ｍｌ  アプロチニン、１ｍＭ  ベンズアミジン、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１０％  グリセロール、１％  トリトン−Ｘ−１００］中でホモジネートした。ホモジネートを３０分間氷上に載せて、１６，０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清を２ｍｌの２’，５’−ＡＤＰ−セファロース（Ｂｒｅｄｔ ａｎｄ Ｓｎｙｄｅｒ， １９９０）とともにインキュベートした。懸濁液を２０ｍｌの緩衝液Ａおよび０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する２０ｍｌの緩衝液Ａを用いて、次に２０ｍｌの緩衝液Ｂ［５０ｍＭ  トリス塩酸、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０％  グリセロール、０．１％  トリトン−Ｘ−１００］を用いて、フリットカラム中で洗浄する前に、１時間インキュベートした。２ｍＭ  ＮＡＤＰＨを含有する緩衝液ＢでｅＮＯＳを溶離し、次に遠心分離濾過（ＵＬＴＲＡＦＲＥＥ−ＭＣ ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を施して、ＮＡＤＰＨを除去した。ｎＮＯＳよりｅＮＯＳの選択的検出のために、免疫ブロッティングを行った。
【００３０】
図３の上部パネルに示したように、Ｃａ２＋−ＣａＭの存在下でのＡＭＰＫによるｅＮＯＳのリン酸化は、活性化を起こすが、しかしＣａＭ依存性は保持された。活性化により、用量反応曲線がＣａＭに関して左にシフトした。ホスホペプチドマッピングは、図３の下部パネルに示したように、ｅＮＯＳの活性化がＳｅｒ−１１７７のリン酸化と相関するが、Ｔｈｒ−４９５のリン酸化とは相関しない、ということを明示した。付加的なＣａ２＋−ＣａＭを伴わないリン酸化はＴｈｒ−４９５リン酸化を増強し、Ｓｅｒ−１１７７リン酸化を抑制し、ｅＮＯＳ活性を阻害した（図３上部パネル）。Ｔｈｒ−４９５リン酸化によるｅＮＯＳ活性の阻害は、プロテインキナーゼＣによるこの領域に対応する合成ペプチドのリン酸化がＣａＭ結合を阻害するという初期報告と一致する（Ｍａｔｓｕｂａｒａ ｅｔ ａｌ， １９９６）。同様の結果は、ｎＮＯＳに関して報告されている（Ｌｏｃｈｅ ｅｔ ａｌ， １９９７）。
【００３１】
実施例４：ＡＭＰＫ−α１、ＡＭＰＫ−α２およびｅＮＯＳの活性に及ぼす虚血の効果
単離された還流ラット心臓のＬａｎｇｅｎｄｏｒｆ調製物を、Ｋｕｄｏ等（１９９５）の方法により虚血させた。ＡＭＰＫ−α１およびＡＭＰＫ−α２アイソフォームを、α２（４９０−５１６）またはα１（２３１−２５１）抗体を用いて免疫沈降させ、ＳＡＭＳペプチド基質を用いて検定した（Ｍｉｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ， １９９６； Ｈａｒｄｉｅ ａｎｄ Ｃａｒｌｉｎｇ， １９９７）。ｅＮＯＳ活性を、実施例３に記載されているように測定した。結果を図４に示す。α１およびα２アイソフォームはともに、図４Ａに示したように活性化されるが、これは、ＡＭＰＫが、主にα２アイソフォームを有する毛管内皮細胞、および主にα１アイソフォームを有する心筋細胞の両方で活性化されることを示す。虚血中のＡＭＰＫ活性化はｅＮＯＳ活性化も伴い、図４Ｂおよび４Ｃに示したようにＣａＭ依存性を変化させ、図３に示したようなｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＭＰＫによるｅＮＯＳリン酸化の作用に似ている。
【００３２】
ｅＮＯＳ配列：ＲＩＲＴＱＳｐＦＳＬＱＥＲおよびＧＩＴＲＫＫＴｐＦＫＥＶＡＮＣＶを基礎にした合成ホスホペプチドに対して、ポリクローナル抗体を生じさせた。慣用的方法を用いて、鍵穴吸着ヘモシアニンと結合したホスホペプチドを用いてウサギを免疫感作し、次にフロイントの完全アジュバント中で乳化させた。デホスホペプチドアフィニティーカラムを用いて予備精製後に、対応するホスホペプチドアフィニティーカラムを用いて、抗体を精製した。ＥＩＡおよび免疫ブロッティングの両方を用いて精製抗体の特異性を確証し、それらが組換え脱リン酸−ｅＮＯＳを認識しなかったことを確証した。
【００３３】
Ｓｅｒ−１１７７およびＴｈｒ−４９５リン酸化部位に対する抗ホスホペプチド抗体を用いて、Ｓｅｒ−１１７７のリン酸化が虚血により約３倍増大されたが、これらの条件下ではＴｈｒ−４９５リン酸化の検出可能な変化は認められなかったことが観察された。心筋は、毛管内皮細胞と心筋細胞の両方にｅＮＯＳを含有し（Ｂａｌｌｉｇａｎｄ ｅｔ ａｌ， １９９５）、低レベルのｎＮＯＳμアイソフォームを有する（Ｓｉｌｖａｇｎｏ ｅｔ ａｌ， １９９６）。
【００３４】
３つの型のＮＯＳの配列を図５で比較しているが、これは、ＣａＭ結合領域およびＣ末端を示す。ｎＮＯＳでは、Ｓｅｒ−１４１７はｅＮＯＳのＳｅｒ−１１７７に対応し、一方ｉＮＯＳは切断され、この領域にＧｌｕを有する。ｉＮＯＳおよびｎＮＯＳはともに、ＣａＭ結合領域においてＴｈｒ−４９５に相当するリン酸化可能残基を欠く。
【００３５】
実施例５：ｅＮＯＳリン酸化に及ぼすプロテインキナーゼＣの刺激の効果
０．１％ウシ胎仔血清中（血清飢餓）で２０時間培養したウシ大動脈内皮細胞に、プロテインキナーゼＣ活性化物質である０．１μＭ  フォルボール−１２−ミリスチン酸−１３−酢酸（ＰＭＡ）による処置を５分間施した。ＰＭＡ処置は、抗ホスホペプチド特異的抗体を用いて測定した場合、Ｔｈｒ−４９５でのｅＮＯＳのリン酸化を増大し、Ｓｅｒ−１１７７でのリン酸化を低減した。使用した抗体は、実施例４に記載したものと同一であった。結果を図６に示す。カルシウムを含有しない培地中で培養した細胞において、Ｓｅｒ−１１７７リン酸化が４分の１に低減したことが観察された。さらに、カルシウムを含有する標準培地中で細胞をインキュベートした場合、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７の付加（９０秒間１０μＭ）は、Ｓｅｒ−１１７７リン酸化をさらに７倍増大させた。０．５μＭのオカダ酸を用いた細胞の予備インキュベーションは、ＰＭＡ処理によるＳｅｒ−１１７７の脱リン酸化を妨げ、Ｔｈｒ−４９５のリン酸化を大いに増大させた（結果は平均±ＳＥＭ、ｎ＝６）。オカダ酸はプロテインホスファターゼＰＰ２Ａを抑制するため、結果は、ＰＰ２ＡがＳｅｒ−１１７７の脱リン酸化に関与することを示す。ＰＭＡおよびオカダ酸による処理に応答してＴｈｒ−４９５およびＳｅｒ−１１７７リン酸化で観察された変化は、ｅＮＯＳの活性に反映された。ＰＭＡまたはＰＭＡ＋オカダ酸によるＴｈｒ−４９５のリン酸化増大は、ｅＮＯＳ活性の低減に関連した。オカダ酸単独では、Ｓｅｒ−１１７７リン酸化を増大し、Ｔｈｒ−４９５リン酸化への変化を伴わず、ｅＮＯＳ活性増大に関連した（図６の上部パネル）。
【００３６】
実施例６：ｅＮＯＳのリン酸化に及ぼすホスホジエステラーゼおよびホスファターゼの抑制の効果
実験の詳細は、実施例５と同様であった。ウシ大動脈内皮細胞を、１０ｎＭ  ホスファターゼ阻害物質カリキュリンＡを用いてまたは用いずに１０分間、予備インキュベートし、次に０．５ｍＭ  ホスホジエステラーゼ阻害物質３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を用いてまたは用いずに５分間、インキュベートした。図７に示したように、ＩＢＭＸ処理はＳｅｒ−１１７７のリン酸化およびＴｈｒ−４９５の脱リン酸化の増強を引き起こした。カリキュリンＡを用いた予備インキュベーションは、Ｔｈｒ−４９５の脱リン酸化を妨げた（結果は平均±ＳＥＭ、ｎ＝６）。カリキュリンＡはプロテインホスファターゼＰＰ１を抑制するため、結果は、ＰＰ１がＴｈｒ−４９５の脱リン酸化に関与することを示す。
【００３７】
考察
本発明人によるＳｅｒ−１１７７リン酸化部位の同定以来、他のプロテインキナーゼがこの部位でリン酸化をすることが認識されてきた。特に、プロテインキナーゼＡｋｔ（ＰＫＢとも呼ばれる）は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）による内皮細胞の刺激（Ｆｕｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ， １９９９； Ｍｉｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９９）に、あるいは流体剪断応力（Ｄｉｍｍｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９； Ｇａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９）に応答してＳｅｒ−１１７７をリン酸化する。Ｇａｌｌｉｓ等（１９９９）による研究では、流体剪断応力は、配列ＫＬＱＴＲＰＳＰＧＰＰＰＡ中のＳｅｒ−１１６のリン酸化を刺激する、ということが報告された。ｅＮＯＳ上のこの部位に関与するキナーゼも、リン酸化の機能的効果も未だ同定されていない。このリン酸化部位は、オキシダーゼドメイン中に存在する。
【００３８】
プロテインキナーゼＣによるＴｈｒ−４９５でのｅＮＯＳのリン酸化は、血清飢餓で、フォルボールエステルＰＭＡの存在下で無カルシウム培地中でインキュベートさせた内皮細胞中で起こる、ということを我々は見出した。内皮細胞中のＳｅｒ−１１７７とＴｈｒ−４９５でのリン酸化の間には、相互補足的な関係が存在する。プロテインキナーゼＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで両部位をリン酸化するが、しかしフォルボールエステルによる内皮細胞中のプロテインキナーゼＣの刺激は、Ｔｈｒ−４９５リン酸化の増強、しかしＳｅｒ−１１７７の顕著なリン酸化を引き起こす。Ｓｅｒ−１１７７の脱リン酸化は、オカダ酸により妨げられるが、しかしカリキュリンＡによっては妨げられず、これはホスファターゼＰＰ２Ａが関与することを示す。オカダ酸は、フォルボールエステルに応答してＴｈｒ−４９５のリン酸化も大いに増強する。プロテインキナーゼＣを介して作用するトロンビンも、Ｔｈｒ−４９５のリン酸化およびＳｅｒ−１１７７の脱リン酸化を刺激する。
【００３９】
これに対比して、ホスホジエステラーゼ阻害物質である３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）による内皮細胞の処理は、Ｔｈｒ−４９５でのｅＮＯＳの顕著な脱リン酸化およびＳｅｒ−１１７７リン酸化増強を引き起こす。ＩＢＭＸに応答するＴｈｒ−４９５の脱リン酸化はカリキュリンＡを用いた処理により遮断されるが、これは、ホスファターゼＰＰ１がＴｈｒ−４９５の脱リン酸化に関与することを示唆する。
【００４０】
これらの関係を図８に要約する。骨格筋の運動は、ｅＮＯＳのＳｅｒ−１１７７に対応する部位であるｎＮＯＳμのＳｅｒ−１４１７のリン酸化を生じることを我々は確認した（図５参照）。ラット長指伸筋（ＥＤＬ）の電気的刺激は、ＡＭＰＫを活性化し、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをＳｅｒ−７９（阻害部位）でリン酸化し、およびｎＮＯＳμをＳｅｒ１４１７でリン酸化することが判明した。同様に、３０秒間自転車スプリントのような激しい運動後のヒト骨格筋の生検では、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ中のＳｅｒ−７９でのリン酸化の１０倍増大、ならびにｎＮＯＳμのＳｅｒ−１４１７でのリン酸化の７．５倍増大が認められる（図９参照）。
【００４１】
内皮由来ＮＯは、血栓形成をもたらす未熟血小板の付着および凝集防止に重要な役割を有する（Ｒａｄｏｍｓｋｉ ａｎｄ Ｍｏｎｃａｄａ， １９９３）。心臓血管系に及ぼす高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）増大の防御作用は、血小板ＮＯ産生増大により仲介され得る、という証拠がある。ＨＤＬの一構成成分であるアポリポタンパク質Ｅは、血小板中に存在する受容体（アポＥＲ２）に作用して、ＮＯシグナル伝達経路を刺激する（Ｒｉｄｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｒｉｄｄｅｌｌ ａｎｄ Ｏｗｅｎ， １９９９）。
【００４２】
そのＣＯＯＨ末端のリン酸化によるｅＮＯＳの活性化は、ｅＮＯＳ自己阻害に新規の見解を与える。Ｓｅｒ−１１７７でのリン酸化に伴う活性化増大およびＣａＭ用量依存性のシフトは、ｅＮＯＳにおいて、そしておそらくはｎＮＯＳにおいても、ＣＯＯＨ末端が、ＣａＭ依存性プロテインキナーゼにおけるのと同様に部分自己調節配列として作用することを示唆する（Ｋｅｍｐ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ， １９９１； Ｋｏｂｅ ｅｔ ａｌ， １９９６）。
【００４３】
ｅＮＯＳのＣＯＯＨ末端は、Ｃａ２＋−ＣａＭが結合した場合にのみ完全にＡＭＰＫが接触可能であり、これはこの領域がＣａＭの非存在下で埋没していることと一致する。図５から分かるように、それらのＣＯＯＨ末端においてｅＮＯＳとｎＮＯＳとの間の高レベルの類似性が存在するが、一方でｉＮＯＳは異なっている。低Ｃａ２＋依存性による特性化されるｉＮＯＳ  ＣａＭ結合は標準的ＣａＭ結合配列、ならびにｎＮＯＳキメラでは満たされ得ないＣＯＯＨ末端中の遠位残基の両方を必要とする（Ｒｕａｎ ｅｔ ａｌ， １９９６）。いかなる提案されたメカニズムとも結びつけずに考えると、ｅＮＯＳおよびｎＮＯＳはそれらのＣＯＯＨ末端により自己阻害され、末端部におけるＣａＭ結合およびリン酸化の両方による完全活性のための２段階活性化工程を要するが、一方、ｉＮＯＳはＣａＭ結合のみを必要とする。近年、Ｓａｌｅｒｎｏ等（１９９７）は、ＦＭＮ結合ドメインにおける挿入配列も自己調節に重要であり得ることを提唱した。
【００４４】
従来の研究は、ｅＮＯＳがｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方でリン酸化され得ることを示しているが、しかし、リン酸化の正確な部位およびリン酸化事象の機能は、これまで完全には特性化されていない（Ｍｉｃｈｅｌ ａｎｄ Ｆｅｒｏｎ， １９９７で検討されている）。ｅＮＯＳは、ＡＭＰＫにより活性化される酵素として同定される最初の例であり、そしてリン酸化が、Ｃａ２＋−ＣａＭの獲得可能性によって、活性化または抑制をもたらすため、一般的ではない。その他の酵素、特にサイクリン依存性プロテインキナーゼは、リン酸化により活性化または抑制されるが、しかしこれは、異なるプロテインキナーゼにより触媒される。プロテインキナーゼＣはｅＮＯＳ中のＴｈｒ−４９５をリン酸化するが、このことは、Ｔｈｒ−４９５またはＳｅｒ−１１７７のリン酸化によるｅＮＯＳへの作用の調節経路が交差していることを実証する。例えば糖尿病により誘導される高血糖症に応答するプロテインキナーゼＣの持続的活性化がＳｅｒ−１１７７でのｅＮＯＳのリン酸化を長期的に抑制し、それによりその活性を低減し得るということも考えられる。
【００４５】
ＡＭＰＫによるｅＮＯＳの調節は、酵母ｓｎｆｌｐキナーゼとＡＭＰＫとの間の概念上の関係を拡張する。ｓｎｆｌｐキナーゼは、インベルターゼを分泌することにより環境からのグルコースの供給を調節し、一方哺乳類ＡＭＰＫは循環系の制御に伴って代謝ストレスシグナリングを統括する。したがって、内皮細胞および筋細胞内の細胞内代謝ストレスシグナルは、栄養供給改善を引き起こし、筋肉の機械的活動を抑制し得る。
【００４６】
本発明を分かり易くし、理解するために多少詳細に本発明を説明してきたが、本明細書中に開示された本発明の概念の範囲を逸脱しない限り、本明細書中に記載した実施態様および方法に対する種々の修正および変更が成され得る、ということは当業者には明らかである。
【００４７】
本明細書中に引用した参考文献を以下のページに列挙するが、これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる。
【表２】
2004537251.tif 000003
【表３】
2004537251.tif 000004
【表４】
2004537251.tif 000005
【表５】
2004537251.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】
心臓および前脛骨筋におけるＡＭＰＫ−α２の蛍光免疫局在を示す。
パネルＡは、対照ウサギＩｇＧおよび対照マウスＩｇＧで染色し、抗ウサギＦＩＴＣおよび抗マウステキサスレッドで染色したラット心臓の陰性対照切片を示す。
パネルＢは、ＡＭＰＫ−α２（４９１−５１４）に対するアフィニティー精製ウサギポリクローナル抗体および抗ウサギＦＩＴＣで染色したラット心臓の切片を示す。
パネルＣは、ラット内皮ｒｅｃＡ−１に対するモノクローナル抗体および抗マウステキサスレッドで染色した、パネルＢと同一の切片を示す。
パネルＤは、パネルＢおよびＣの上層を示す。同時染色により、共局在化が観察され得る。矢印は、両抗体により染色される特異的内皮細胞を示している。
パネルＥは、対照ウサギＩｇＧおよび対照マウスＩｇＧで染色し、抗ウサギＦＩＴＣおよび抗マウステキサスレッドで染色したラット前脛骨筋の陰性対照切片を示す。
パネルＦは、ＡＭＰＫ−α２（４９１−５１４）に対するアフィニティー精製ウサギポリクローナル抗体および抗ウサギＦＩＴＣで染色した切片を示す。
パネルＧは、ラット内皮ｒｅｃＡ−１に対するモノクローナル抗体および抗マウステキサスレッドで染色した、パネルＢと同一切片を示す。
パネルＨは、パネルＥおよびＦの上層を示す。同時染色により、共局在化が観察され得る。
【図２】
ＡＭＰＫによる組換えｅＮＯＳのリン酸化を示す。
上部パネル：ｅＮＯＳをラット肝臓ＡＭＰＫ−α１および［γ−３２Ｐ］ＡＴＰとともにインキュベートした。
レーン１：クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、
レーン２：オートラジオグラフ。
下部パネル：ｅＮＯＳの３２Ｐ−トリプシンホスホペプチドマップ。
【図３】
Ｃａ２＋−ＣａＭを付加した場合と付加しない場合の、ＡＭＰＫによるｅＮＯＳのリン酸化の効果を示す。２’，５’−ＡＤＰ−セファロースアフィニティークロマトグラフィーにより精製されたラット心臓ｅＮＯＳを、０．８μＭのＣａＭ／３．２μＭのＣａ２＋の存在下（中黒丸）で、Ｃａ２＋−ＣａＭの非存在下（中黒三角）でＡＭＰＫを用いて、そしてＡＭＰＫを用いず（中白四角）に、リン酸化した。リン酸化後、試料を稀釈し、ｅＮＯＳ活性を測定した。下部パネルは、Ｃａ２＋−ＣａＭの存在下および非存在下でリン酸化されたラット心臓ｅＮＯＳに関するホスホペプチドマップを示す。
【図４】
ＡＭＰＫ−α１、ＡＭＰＫ−α２およびｅＮＯＳの活性に及ぼす虚血の作用を示す。
パネルＡは、ＳＡＭＳペプチド基質を用いて検定される、ＡＭＰＫ−α１およびＡＭＰＫ−α２に特異的な抗体を用いた免疫沈降の結果を示す。示された結果は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）である。
パネルＢは、５００ｎＭのＣａＭで測定されたｅＮＯＳ活性を示す。
パネルＣは、代表的実験に関する全ＣａＭ−用量応答を有するｅＮＯＳ活性を示す。虚血時：０分（中白丸）、１分（中黒菱形）、１０分（中黒丸）および２０分（中白三角）。４回の反復実験の結果は、２０分虚血ｅＮＯＳ  ＣａＭ−依存性が１０分と同様の値を残存した１回の場合以外は、同一であった。
【図５】
ＮＯＳ配列の比較を示す。ｅＮＯＳおよびｎＮＯＳに関するリン酸化部位配列が、ＮＯＳの模式図モデルで示されている。ＣａＭ結合領域（ｅＮＯＳのＴｈｒ−４９５リン酸化部位周辺）から、ＣＯＯＨ末端（ｅＮＯＳのＳｅｒ−１１７７リン酸化部位周辺）に関する配列が示されている。
【図６】
ｅＮＯＳ活性（上部パネル）ならびにＳｅｒ−１１７７およびＴｈｒ−４９５でのリン酸化（下部パネル）に及ぼすフォルボールエステル（ＰＭＡ）およびオカダ酸によるウシ大動脈内皮細胞の処理の効果を示す。
【図７】
Ｓｅｒ−１１７７およびＴｈｒ−４９５でのリン酸化に及ぼす３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）およびカリキュリンＡによるウシ大動脈内皮細胞の処理の効果を示す。
【図８】
プロテインキナーゼＰＫＣ、ＡＭＰＫおよびＡｋｔにより仲介されるＴｈｒ−４９５およびＳｅｒ−１１７７でのリン酸化によるｅＮＯＳの調節の要約を示す。これらの部位でのリン酸化の逆転は、それぞれＩＢＭＸおよびＰＭＡによる細胞の処理に応答してタンパク質ホスファターゼＰＰ１およびＰＰ２Ａにより仲介される。
【図９】
ヒト筋肉中でのｎＮＯＳリン酸化に及ぼす３０秒自転車スプリント運動の効果を示す。ｎＮＯＳは生検物質から抽出され、抗ホスホペプチド抗体を用いてＳｅｒ−１４１７でのリン酸化に関してプローブされた。左パネルは免疫ブロットを示し、右パネルは５個体の定量分析を示す。
【図１】
2004537251.tif 000007
【図２】
2004537251.tif 000008
【図３】
2004537251.tif 000009
【図４】
2004537251.tif 000010
【図５】
2004537251.tif 000011
【図６】
2004537251.tif 000012
【図７】
2004537251.tif 000013
【図８】
2004537251.tif 000014
【図９】
2004537251.tif 000015
【国際公開パンフレット】
2004537251.tif 000016
2004537251.tif 000017
2004537251.tif 000018
2004537251.tif 000019
2004537251.tif 000020
2004537251.tif 000021
2004537251.tif 000022
2004537251.tif 000023
2004537251.tif 000024
2004537251.tif 000025
2004537251.tif 000026
2004537251.tif 000027
2004537251.tif 000028
2004537251.tif 000029
2004537251.tif 000030
2004537251.tif 000031
2004537251.tif 000032
2004537251.tif 000033
2004537251.tif 000034
2004537251.tif 000035
2004537251.tif 000036
2004537251.tif 000037
2004537251.tif 000038
2004537251.tif 000039
2004537251.tif 000040
2004537251.tif 000041
2004537251.tif 000042
2004537251.tif 000043
2004537251.tif 000044
2004537251.tif 000045
2004537251.tif 000046
2004537251.tif 000047
2004537251.tif 000048
2004537251.tif 000049
2004537251.tif 000050
2004537251.tif 000051
2004537251.tif 000052
2004537251.tif 000053
2004537251.tif 000054
2004537251.tif 000055
【国際調査報告】
2004537251.tif 000056