(57)【要約】本発明は、配列番号：１のヒト癌原遺伝子を含む発現ベクターで形質転換された哺乳動物の細胞株；ヒト癌原遺伝子を含む核酸構造物が導入された哺乳動物の受精卵；哺乳動物受精卵から発生した、癌が誘発された形質転換哺乳動物、および前記遺伝子から転写されたｍＲＮＡの全部または一部と相補的な塩基配列を有するプローブまたは前記ｍＲＮＡから解読されたタンパク質の全部または一部に特異的に結合する抗体を含む、乳房癌、腎臓癌、卵巣癌または胃癌から選ばれた診断用キットを提供する。【選択図】図２８
2004516844.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１の塩基配列を有するヒト癌原遺伝子を含む発現ベクターで形質転換された哺乳動物細胞。
【請求項２】
前記哺乳動物細胞が、マウス細胞株ＨＣＣＲ−１Ｍ（寄託番号第ＫＣＴＣ  ０９２３ＢＰ号）またはヒト細胞株ＨＣＣＲ−１Ｈ（寄託番号第ＫＣＴＣ  ０９２２ＢＰ号）である請求項１に記載の哺乳動物細胞。
【請求項３】
配列番号：１の塩基配列を有するヒト癌原遺伝子を含む核酸構造物が導入された哺乳動物の受精卵。
【請求項４】
前記哺乳動物がマウスＦＶＢである請求項３に記載の受精卵。
【請求項５】
前記哺乳動物の受精卵が、マウス受精卵ＨＣＣＲ−１（寄託番号第ＫＣＴＣ  ０９２４ＢＰ号）である請求項４に記載の受精卵。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれか１項に記載の受精卵から発生した、癌が誘発された形質転換哺乳動物。
【請求項７】
前記癌が乳頭状の腺癌である請求項６に記載の形質転換哺乳動物。
【請求項８】
配列番号：１の塩基配列を有するヒト癌原遺伝子から発現されたｍＲＮＡの全部または一部と相補的な塩基配列を有するプローブ、または前記ｍＲＮＡから解読されたタンパク質または該タンパク質の一部に特異的に結合する抗体を含む、乳房癌、腎臓癌、卵巣癌および胃癌から成る群から選択された癌の診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、配列番号：１の塩基配列を有するヒト癌原遺伝子を含む発現ベクターで形質転換された哺乳動物の癌細胞、癌原遺伝子を含む核酸構造物が導入された哺乳動物の受精卵、その哺乳動物の受精卵から発生した、癌が誘発された形質転換哺乳動物、およびその癌原遺伝子を用いた乳房癌、腎臓癌、卵巣癌、または胃癌診断用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトを含む高等動物は、約１００，０００個の遺伝子を有しているが、これらのうち約１５％のみが発現され、発生、分化、恒常性（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）、刺激に対する反応、細胞分裂周期の調節、老化およびアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ； ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）などのような個人の生物学的過程の特性はどの遺伝子が発現するかによって決定される（Ｌｉａｎｇ， Ｐ． ａｎｄ Ａ． Ｂ． Ｐａｒｄｅｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５７： ９６７−９７１（１９９２）参照）。
【０００３】
腫瘍形成のような病理学的現象は、遺伝子突然変異によって誘発され、遺伝子発現の変化をもたらす。
【０００４】
腫瘍形成は、特定染色体部位の消失、癌原遺伝子の活性化およびｐ５３遺伝子を含む他の腫瘍抑制遺伝子の失活などのような種々の遺伝的変化によって誘発されると報告されている（Ｂｉｓｈｏｐ， Ｊ． Ｍ．， Ｃｅｌｌ， ６４： ２３５−２４８（１９９１）；およびＨｕｎｔｅｒ， Ｔ．， Ｃｅｌｌ， ６４： ２４９−２７０（１９９１）参照））。さらに、ヒト癌の１０〜３０％は癌原遺伝子の増幅を通じて発癌遺伝子が活性化されることによって発病すると報告されている。
【０００５】
したがって、癌原遺伝子の活性化は多くの癌の病因学研究に重要な役割を果し、これを明らかにすることが要求されている。
【０００６】
そこで、本発明者は、子宮頸部癌の腫瘍形成に介入する機構を遺伝子レベルで接近した結果、ヒト子宮頸部癌１（ＨＣＣＲ−１）と命名された新規な癌原遺伝子が癌細胞中に特異に過発現されるという意外な事実を発見し（韓国特許公開第２００１−３９５６６号）、腫瘍形成に介入された機構を糾明するためにこの遺伝子が導入されたヒト癌細胞株とＨＣＣＲ−１癌原遺伝子を用いて癌が誘発された形質転換哺乳動物を製造しようと鋭意研究した。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子が導入された哺乳動物細胞を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子を含む哺乳動物受精卵およびこの受精卵から発生した形質転換哺乳動物を提供することである。
【０００９】
本発明の更に他の目的は、ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子を用いて乳房癌、腎臓癌、卵巣癌または胃癌診断用キットを提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明の一実施態様に従って、本発明では配列番号：１の塩基配列を有するＨＣＣＲ−１癌原遺伝子を含む発現ベクターで形質転換された哺乳動物細胞株が提供される。
【００１１】
【発明を実施するための最良の形態】
本発明の哺乳動物細胞および形質転換哺乳動物の製造に用いられる配列番号：１のヒト癌原遺伝子（以下、ＨＣＣＲ−１と称する）は、染色体１２番の長腕（１２ｑ）に位置し、一つのオープン・リーディング・フレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）を有し、これは配列番号：２、分子量５０ｋＤａのタンパク質をコードする。
【００１２】
コドンの縮退（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）および本発明の癌原遺伝子を発現させようとする特定生物において選好されるコドンを考慮した場合、配列番号：１のＤＮＡ配列の多様な変化および変形は、発現されるタンパク質のアミノ酸配列を変えない範囲内のコーディング領域または癌原遺伝子の発現に影響を及ぼさない範囲内の非−コーディング領域で行われることができる。したがって、本発明の癌原遺伝子と実質的に同様な塩基配列を有するポリヌクレオチドおよびその断片もまた本発明の範疇に含まれる。本願に用いられる「実質的に同様なポリヌクレオチド」とは、本発明の癌原遺伝子と塩基配列が８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを意味する。
【００１３】
本発明の癌原遺伝子ＨＣＣＲ−１は、ヒトの癌組織から得られるか、通常のＤＮＡまたはペプチド合成方法に従って合成することができる。また、このように製造されたＨＣＣＲ−１癌原遺伝子を通常のベクターに挿入して発現ベクターを製造できる。
【００１４】
この発現ベクターを適切な哺乳動物細胞に導入して発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳動物細胞を得ることができる。本発明者らは、前記遺伝子を哺乳動物発現用ベクターｐｃＤＮＡ３（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入して得られたｐｃＤＮＡ３／ＨＣＣＲ−１と命名された発現ベクターを、分化したマウス繊維芽細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）およびヒト胎生期腎臓細胞株２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）に導入してＨＣＣＲ−１ＭおよびＨＣＣＲ−１Ｈと命名された哺乳動物細胞を得、これらを各々特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定により、２０００年１２月２６日付で韓国生命工学研究所遺伝子銀行（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＫＣＴＣ）；住所：大韓民国大田廣域市儒城區魚隠洞５２番地韓国生命工学研究所（Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＫＲＩＢＢ））に寄託番号第ＫＣＴＣ  ０９２２ＢＰ号として寄託した。
【００１５】
このようにして製造された本発明の哺乳動物細胞はヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ−１を過発現し、腫瘍巨大細胞の形態学的特性を有する。たとえば、マウス細胞ＨＣＣＲ−１Ｍは多角形の細胞形を有し、明らかな核小体（ｎｕｃｌｅｏｌｉ）を有する分葉核、よく発達した粗面小胞体（ｒｏｕｇｈ ｓｕｒｆａｃｅｄ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ： ｒＥＲ）およびゴルジ体を有し、細胞の表面には不均一な大きさの微細絨毛を有し、非定形有糸分裂をする。また、前記ヒト細胞株ＨＣＣＲ−１Ｈは野生型細胞に比べて細胞のサイズと細胞充実性（ｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ）が大きい。
【００１６】
本発明の哺乳動物細胞は腫瘍形成能を有しており、哺乳動物に移植する場合、触知性腫瘍（ｐａｌｐａｂｌｅ ｔｕｍｏｒ）などのような癌腫を形成する。また、このような癌腫から分離した細胞も本発明の細胞と同様な特性を有する。たとえば、ＨＣＣＲ−１Ｍ細胞が移植されたヌードマウスに形成された触知性腫瘍から細胞から単離したＨＣＣＲ−１ＭＮと命名された細胞は、ＨＣＣＲ−１Ｍ細胞と類似した形態学的特性を有する。
【００１７】
本発明の哺乳動物細胞は、ヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ−１を過発現して多量のＨＣＣＲ−１タンパク質を生成し、このタンパク質が乳房癌と関わると報告されているＤ５２タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ００３２８８）（Ｂｙｒｎｅ， Ｊ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５５， ２８９６−２９０３ （１９９５）；およびＢｒｙｎｅ， Ｊ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， １６， ８７３−８８１（１９９８））と相互作用し、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）とテロメラーゼの活性を増加させ、細胞周期チェックポイント（Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）調節機能を失い、ｅｇｒ−１遺伝子の発現を下向き調整する過程を経て悪性腫瘍に転換される。特に、この過程において、細胞周期調節に係わる腫瘍抑制遺伝子ｐ５３の発現が増加するが、生成したｐ５３タンパク質の大部分が失活することによって腫瘍抑制機能を果さないため、悪性腫瘍に転換されるとみられる。すなわち、ヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ−１は上位段階（ｕｐｓｔｒｅａｍ ｌｅｖｅｌ）で腫瘍抑制遺伝子ｐ５３の機能を失活（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）させるとみられる。したがって、このＨＣＣＲ−１癌原遺伝子の部位特異的変位誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を通じてｐ５３遺伝子の調節を担当するＨＣＣＲ−１癌原遺伝子の特定配列を確認できれば、この配列を変位させることによりｐ５３遺伝子の活性を復元できる。
【００１８】
また、前記ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子を含む核酸構造物を適切な哺乳動物の受精卵、たとえば、マウスの受精卵に導入して形質転換受精卵を得、この受精卵を適切なレシピエントの子宮に着床させて発生させた後、出産させて形質転換哺乳動物を得る。このような形質転換哺乳動物の製造方法は当業界によく知られており、少なくとも８細胞期以前段階の受精卵に導入することが好ましい。
【００１９】
このように製造された形質転換哺乳動物は、ヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ−１を過発現し、乳房組織に乳頭状の腺癌の特性、たとえば、被膜（ｃａｐｓｕｌｅ）のない局限性結節（ｗｅｌｌ−ｃｉｒｃｕｍｓｃｒｉｂｅｄ ｎｏｄｕｌｅ）、乳頭状構造と腺または管類似構造、中央部に広範囲な壊死が起り、外部には正常の乳房組織が隣接し、立方形または卵形の細胞形、不明確な細胞境界、そして相当量の顆粒性、好酸性細胞質の特性を有する。
【００２０】
前記形質転換哺乳動物を交配させて形質転換受精卵が得られる。本発明者らは、図２１に示す構造を有する、ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子を含むＤＮＡ構造物が導入されたＦＶＢ／Ｎマウスの受精卵（ＨＣＣＲ−１と命名される）を、特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定により、２０００年１２月２６日付で韓国生命工学研究所遺伝子銀行（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＫＣＴＣ）；住所：大韓民国大田廣域市儒城區魚隠洞５２番地韓国生命工学研究所（Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＫＲＩＢＢ））に寄託番号第ＫＣＴＣ  ０９２４ＢＰ号として寄託した。
【００２１】
本発明に係る哺乳動物細胞および形質転換哺乳動物はヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ−１を過発現して癌を形成するので、発癌性物質または抗酸化剤のような抗癌性物質の探索などに有用できる。
【００２２】
また、ヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ−１は、胃癌、腎臓癌、卵巣癌および乳房癌組織において過発現されるので、この遺伝子の発現産物はこれらの癌の診断に効果的に利用できる。前記遺伝子産物を用いた癌診断方法は、たとえば、前記遺伝子から発現されたｍＲＮＡまたはタンパク質と特異的に結合するプローブまたは抗体を用いて対象者の乳房、腎臓、卵巣または胃組織から分離したｍＲＮＡまたはタンパク質試料と結合させた後当分野で公知の様々な方法でＨＣＣＲ−１  ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出することにより、対象者が過発現されたヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ−１産物を有しているか否かを判断する過程を含む。前記プローブまたは抗体を放射線同位元素または酵素などで標識すると容易に前記遺伝子産物を確認できる。したがって、本発明では、前記ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子から発現されたｍＲＮＡまたはタンパク質に特異的に結合するプローブまたは抗体を含む、乳房癌、腎臓癌、卵巣癌または胃癌の診断用キットを提供する。前記プローブは、ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子のｍＲＮＡ全部または一部と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、このｍＲＮＡに特異的に結合する限りいずれを使用してもよく、このうち、配列番号：３の塩基配列を有することが好ましい。前記プローブはヒトの組織から分離するか、公知のＤＮＡ合成方法に従って合成できる。また、前記抗体は当分野で公知の方法に従って製造できる。
【００２３】
下記の実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を制限しない。
【００２４】
＜参照例１：透過顕微鏡観察（ＴＥＭ）＞
細胞または組織試料をリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．４）中の２．５％グルタルアルデヒドで固定した後、２％四酸化オスミウム（ｏｓｍｉｕｍ ｔｅｔｒｏｘｉｄｅ）で更に固定した。試料は順次濃度の高いエタノールを用いて脱水した後、Ｅｐｏｎ８１２（Ｓｉｇｍａ）に封じ込んだ。重合反応（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）後、超微細切片（ｕｌｔｒａｔｈｉｎ ｓｅｃｔｉｏｎ）を作って酢酸ウラニルとクエン酸鉛で二重染色し、透過電子顕微鏡（１２００ＥＸ、ＪＥＯＬ、Ｊａｐａｎ）で観察した。
【００２５】
＜参照例２：ウェスタンブロット分析＞
ラムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）［Ｎａｔｕｒｅ ２２７： ６８０−６８５ （１９７０）］によって記述された方法に従って細胞からタンパク質試料を得、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲル上に分離されたタンパク質をニトロセルロース膜に電気的に移動させた後、抗体とともに反応させた。次いで、この膜を洗浄した後、１：１，０００の比率で稀釈したペルオキシダーゼが結合したヤギ抗ラット免疫グロブリン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を２次抗体として含むブロッキング溶液と反応させた。ＥＣＬ−ウェスタンブロット検出キット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ， Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてタンパク質を確認した。
【００２６】
＜参照例３：免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）分析＞
組織を１次抗体とともに反応させた後、５μｍ断片に切断した。１次抗体の結合を、ビオチン標識した２次抗体、アビジン、ビオチン標識した西洋ワサビペルオキシダーゼ、および色素原（ＨＩＳＴＯＳＴＡＩＮ−ＢＵＬＫ ＫＩＴＳ、Ｚｙｍｅｄ）としてのＡＥＣ（アミノエチル  カルバゾール）によって視覚化した。
【００２７】
＜参照例４：全ＲＮＡの単離＞
市販のシステム（ＲＮｅａｓｙ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｋｉｔ， Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，ドイツ）を用いて組織試料または細胞から全ＲＮＡを抽出し、メッセージクリーンキット（ｍｅｓｓａｇｅ ｃｌｅａｎ ｋｉｔ， ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐ．）を用いて不純物ＤＮＡを除去した。
【００２８】
＜参照例５：ノーザンブロット分析＞
全ＲＮＡ試料２０μｇを１％ホルムアルデヒドアガロースゲルで電気泳動させた後、ナイロン膜（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）に移し、レディプライムＩＩ（Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ ＩＩ）ランダムプライムされた標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、イギリス）を用いて調製した、３２Ｐ標識ランダムプライムされたプローブを用いて４２℃で一晩ハイブリッド化した。ノーザンブロット分析を２回繰り返してデンシトメータ（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）で定量し、同じブロットをβ−アクチン（ａｃｔｉｎ）プローブでハイブリッド化してｍＲＮＡ総量を確認した。
【００２９】
＜調製例１：ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子を含む発現ベクターの構成＞
配列番号：１の塩基配列で表されるヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ−１のｃＤＮＡ全長を含む発現ベクターｐＣＥＶ−ＬＡＣ／ＨＣＣＲ−１が導入された大腸菌ＪＭ−１０９／ＨＣＣＲ１（寄託番号第ＫＣＴＣ  ０６６７ＢＰ号）の培養液から発現ベクターｐＣＥＶ−ＬＡＣ／ＨＣＣＲ−１を分離した後、制限酵素ＳａｌＩで切断して全長ＨＣＣＲ−１のｃＤＮＡを含む２．１ｋｂ断片を得た。
【００３０】
哺乳動物発現用ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をＸｈｏＩで切断してＳａｌＩと相補性の末端を作った後、これに２．１ｋｂ  ＳａｌＩ断片を挿入して全長ＨＣＣＲ−１  ｃＤＮＡを含む発現ベクターｐｃＤＮＡ３／ＨＣＣＲ−１を得た。
【００３１】
＜調製例２：ＨＣＣＲ−１に対する抗体の生成＞
抗ＨＣＣＲ−１抗体の調製に用いられるＨＣＣＲ−１タンパク質を得るために、大腸菌ＪＭ−１０９／ＨＣＣＲ１（寄託番号第ＫＣＴＣ  ０６６７ＢＰ号）の培養液から発現ベクターｐＣＥＶ−ＬＡＣ／ＨＣＣＲ−１を分離した後、配列番号：４および５のプライムされたを用いてポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）を行って配列番号：１の塩基配列１２３〜４７３番領域（配列番号：２のアミノ酸配列３９〜１５５番）のみを増幅させた。このようにして得られたＰＣＲ産物をベクターｐＭＡＬ−ｐ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ．， 米国）のＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ部位に挿入して組換えベクターｐＭＡＬ−ｐ２／ＨＣＣＲ−１−ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌを得た後、このベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＡＴＣＣ  ４７０９２）に形質転換させた。形質転換体をＬＢ培地で振盪培養した後培養液を１／１００に稀釈し、さらに３時間培養した。これに１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ， Ｓｉｇｍａ）を添加してＨＣＣＲ−１癌原遺伝子の発現を誘導した。この際、発現されたタンパク質はＨＣＣＲ−１タンパク質のＣ−末端部とｐＭＡＬ−ｐ２ベクター由来のマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ、約４２ｋＤａ）が融合された約６４ｋＤａの融合タンパク質である。この培養液からｐＭＡＬタンパク質融合精製システム（ｐＭＡＬ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｓｉｏｎ ＆ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ．， 米国）を用いて６４ｋＤａ融合タンパク質を精製した。
【００３２】
次いで、１０匹の３月齢のニュージーランドホワイトウサギ（体重約２．５ｋｇ）に前記融合タンパク質１ｍｇを１週間に１回ずつ３回腹腔内投与した。血液サンプルを免疫化したウサギから採血し、遠心分離してポリクロナール抗体を含む血清を得た。
【００３３】
＜実施例１：ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子でトランスフェクトされたマウス細胞の調製＞
マウスの繊維芽細胞株から分化したＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）に、調製例１でリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ， Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて得られた発現ベクターｐｃＤＮＡ３／ＨＣＣＲ−１をトランスフェクトし、得られたＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ）を補充したウェイマウス（Ｗａｙｍｏｕｔｈ）ＭＢ７５２／１培地（Ｇｉｂｃｏ、米国）で培養し、ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子でトランスフェクトされたＮＩＨ／３Ｔ３を得た。これをＨＣＣＲ−１Ｍと命名し、韓国生命工学研究所付設遺伝子銀行に２０００年１２月２６日付で寄託番号第ＫＣＴＣ  ０９２３ＢＰ号として寄託した。
【００３４】
＜実施例２：ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子でトランスフェクトされたヒト細胞の調製＞
マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞の代わりに、ヒト胎生期腎臓由来の２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）を用いたことを除いては、実施例１と同様な方法で、ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子でトランスフェクトされた細胞を得た。得られたヒト細胞をＨＣＣＲ−１Ｈと命名し、韓国生命工学研究所付設遺伝子銀行に２０００年１２月２６日付で寄託番号第ＫＣＴＣ  ０９２２ＢＰ号として寄託した。
【００３５】
＜比較例：ｐｃＤＮＡ３ベクターでトランスフェクトされた比較細胞の調製＞  発現ベクターｐｃＤＮＡ３／ＨＣＣＲ−１の代わりにベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いたことを除いては、実施例１と同様な方法を繰り返してｐｃＤＮＡ３ベクターでトランスフェクトされた比較細胞を得た。
【００３６】
＜実施例３：マウス細胞ＨＣＣＲ−１Ｍの形態学的特性＞
（段階１）ＨＣＣＲ−１Ｍ細胞の位相差特性
実施例１で得られたＨＣＣＲ−１Ｍ細胞をウェイマウスＭＢ７５２／１培地中で単層培養した後位相差顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、米国）で観察した。この際、対照として野生型ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を用いた。
【００３７】
図１Ａおよび１Ｂは、各々単層培養されたＨＣＣＲ−１Ｍ細胞および野生型ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の位相差顕微鏡写真である。図１Ａおよび１Ｂから分かるように、野生型ＮＩＨ／３Ｔ３細胞は長くて細い核と貧弱な細胞質を有する紡錘形細胞であるのに対し、ＨＣＣＲ−１Ｍ細胞は卵形の核と多量の細胞質を有する多角形模様である。
【００３８】
（段階２）ヘマトキシリン−エオシン染色
実施例１で得られたＨＣＣＲ−１Ｍ細胞をウェイマウスＭＢ７５２／１培地中で単層培養した後ヘマトキシリン−エオシン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−ｅｏｓｉｎ， Ｈ ＆ Ｅ）で染色して観察した。
【００３９】
図２は、単層培養されたＨＣＣＲ−１Ｍ細胞のヘマトキシリン−エオシン染色結果を示す。図２から分かるように、ＨＣＣＲ−１Ｍ細胞では核の多態性（ｐｌｅｉｏｍｏｒｐｈｉｓｍ）、特徴的な核小体（ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｎｕｃｌｅｏｌｉ）、粒状のクロマチンパターン、腫瘍巨大細胞、および非定形有糸分裂が観察された。
【００４０】
（段階３）透過電子顕微鏡観察
実施例１で得られたＨＣＣＲ−１Ｍ細胞を用いて参照例１の方法で透過電子顕微鏡観察を行った。
【００４１】
図３は、ＨＣＣＲ−１Ｍ細胞の透過電子顕微鏡写真であり、スケールバーの長さは３μｍに該当する。円で表わした部分をより高倍率で観察した結果を挿入図（スケールバーの長さ１μｍ）で示した。図３から分かるように、ＨＣＣＲ−１Ｍ細胞はその表面に不均一な大きさの微細絨毛を有し、顕著な核小体を有する分葉核、よく発達した粗面小胞体（ｒｏｕｇｈ ｓｕｒｆａｃｅｄ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ：ｒＥＲ）およびゴルジ体を有する（円内）。
【００４２】
以上の結果を総合すると、ＨＣＣＲ−１細胞は腫瘍巨大細胞の形態学的特性を有することが分かる。
【００４３】
＜実施例４：マウス細胞株ＨＣＣＲ−１Ｍの腫瘍形成能試験＞
実施例１で得られたＨＣＣＲ−１Ｍ細胞を５×１０６個ずつ９匹の５週齢のヌードマウス（ａｔｈｙｍｉｃ ｎｕ／ｎｕ ｏｎ ＢＡＬＢ／ｃ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ；デドック化学研究所）の体幹外側後側面に皮下注射した。
【００４４】
その結果、２１日後に、ＨＣＣＲ−１Ｍを注射した９匹のすべてのヌードマウスにおいて触知性腫瘍（ｐａｌｐａｂｌｅ ｔｕｍｏｒ）が形成された。図４は触知性腫瘍が形成されたヌードマウスの写真である。この結果から、ＨＣＣＲ−１Ｍ細胞が腫瘍形成能を有することが分かる。
【００４５】
腫瘍が直径１．５〜２．５ｃｍに達したとき、ヌードマウスを屠殺して腫瘍を取り出し、後続の腫瘍分析および腫瘍細胞株確立過程の試料として用いた。
【００４６】
＜実施例５：マウス細胞株ＨＣＣＲ−１Ｍが移植されたヌードマウスの腫塊の特性＞
ＨＣＣＲ−１Ｍ細胞の同種移植によって誘導されたヌードマウスの腫塊の特性を次のように調査した。
【００４７】
（段階１）ヘマトキシリン−エオシン染色
実施例４で得られたヌードマウスの腫塊をヘマトキシリン−エオシンで染色した。
【００４８】
図５は、ヌードマウスの腫塊をヘマトキシリン−エオシンで染色した結果（×２５０）である。図５から分かるように、ヌードマウスの腫塊は繊維性小孔（ｆｉｂｒｏｕｓ ｓｔｏｍａ）によって分離された典型的な上皮性細胞巣（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｎｅｓｔｓ）を有する。
【００４９】
（段階２）透過電子顕微鏡観察
実施例４で得られたヌードマウスの腫塊を参照例２の方法で透過電子顕微鏡観察した。
【００５０】
図６は、ヌードマウス腫塊の透過電子顕微鏡写真であり、スケールバーの長さは３μｍに該当する。円で表わした部分をより高倍率で観察した結果を挿入図（スケールバーの長さ０．５μｍ）で示した。図６から分かるように、ヌードマウスの腫塊細胞はよく発達した小器官を有し、これらはデスモソーム（ｄｅｓｍｏｓｏｍｅ）によってしっかりと連結されている。この結果から、ＨＣＣＲ−１Ｍ細胞が上皮細胞に変化したことが分かる。
【００５１】
（段階３）免疫組織化学分析
抗−レチクリン繊維、抗−ケラチン、抗−ＥＭＡ抗体（上皮膜抗原）および抗−ビメンチン抗体（ＤＡＫＯ）のそれぞれを１次抗体として用いて、実施例４で得られたヌードマウスの腫塊の組織免疫化学分析を参照例３の方法で行った。
【００５２】
図７−１のＡおよびＢ、並びに図７−２のＣおよびＤは、ヌードマウスの腫塊において、各々レチクリン繊維、ケラチン、ＥＭＡおよびビメンチンタンパク質の発現を示す免疫組織化学分析結果である。図７−１のＡおよびＢ、並びに図７−２から分かるように、細胞巣はレチクリン繊維で囲まれており（図７−１のＡ）、細胞は、ケラチン（図７−１のＢ）およびＥＭＡ（図７−２のＣ）のような上皮標識タンパク質、および、間葉標識タンパク質であるビメンチン（図７−２のＤ）を共発現した。これらの結果から、ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子が間葉ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を上皮細胞に転化させることが分かる。
【００５３】
特に、発癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）が導入された間葉ＮＩＨ／３Ｔ３細胞は一般的に肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）に進行するが、本発明のＨＣＣＲ−１Ｍ細胞を同種移植されたヌードマウスでは触知性腫塊が発達する。
【００５４】
＜実施例６：ＨＣＣＲ−１Ｍを同種移植したヌードマウスからの癌細胞株の調製＞
実施例４で得られたヌードマウスの腫塊から細胞を分離して２０％ウシ胎児血清を含むウェイマウスＭＢ７５２／１培地で培養した。この細胞をＨＣＣＲ−１ＭＮと命名した。
【００５５】
＜実施例７：マウス癌細胞株ＨＣＣＲ−１ＭＮの形態学的特性＞
実施例６で得られたＨＣＣＲ−１ＭＮ細胞の形態学的特性を調査するために、実施例３の段階１と同様の方法で位相差顕微鏡観察を行った。
【００５６】
図８は、単層培養されたＨＣＣＲ−１ＭＮ細胞の位相差顕微鏡写真（×３００）である。図８から分かるように、ＨＣＣＲ−１ＭＮ細胞は実施例３の段階１で示されたＨＣＣＲ−１Ｍ細胞と類似した形態学的特性を有する。
【００５７】
＜実施例８：ＨＣＣＲ−１ＭおよびＨＣＣＲ−１ＭＮのウェスタンブロット分析＞
マウス細胞株ＨＣＣＲ−１ＭとＨＣＣＲ−１ＭＮにおけるＨＣＣＲ−１癌原遺伝子の発現を調査するために、調製例２で得られた抗−ＨＣＣＲ−１血清を用いて、実施例１および６で得られたＨＣＣＲ−１ＭおよびＨＣＣＲ−１ＭＮ細胞のウェスタンブロットを参照例２の方法で行った。この際、比較のために、野生型ＮＩＨ／３Ｔ３細胞と比較例で得られた対照ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を用いてウェスタンブロットを行った。
【００５８】
図９は、ＨＣＣＲ−１ＭおよびＨＣＣＲ−１ＭＮ細胞におけるＨＣＣＲ−１癌原遺伝子の発現を示すウェスタンブロット結果である。図９から分かるように、ＨＣＣＲ−１ＭとＨＣＣＲ−１ＭＮ細胞では、ＨＣＣＲ−１タンパク質が過発現されたが、野生型ＮＩＨ／３Ｔ３細胞およびｐｃＤＮＡ３ベクターでトランスフェクトされた対照ＮＩＨ／３Ｔ３細胞では、ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子の発現が少なく、現われたバンドは微かであった。
【００５９】
＜実施例９：ヒト細胞ＨＣＣＲ−１Ｈの特性＞
ヒト細胞株ＨＣＣＲ−１Ｈの形態学的特性を調査するために、ＨＣＣＲ−１Ｈ細胞を用いて実施例３の段階１と同様の方法で位相差顕微鏡観察を行った。対照群として野生型２９３細胞を用いた。
【００６０】
図１０Ａおよび１０Ｂは、各々単層培養されたＨＣＣＲ−１Ｈおよび野生型２９３細胞の位相差顕微鏡写真（×３００）である。図１０Ａおよび１０Ｂから分かるように、ＨＣＣＲ−１Ｈ細胞は野生型２９３細胞に比べて細胞のサイズと細胞充実性（ｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ）が上昇した。
【００６１】
＜実施例１０：ヒト細胞株ＨＣＣＲ−１Ｈの腫瘍形成能試験＞
ヒト細胞株ＨＣＣＲ−１Ｈの腫瘍形成能を調査するために、実施例２で得られたＨＣＣＲ−１Ｈ細胞を用いて実施例４と同様の方法で腫瘍形成能試験を行った。
【００６２】
ＨＣＣＲ−１Ｈ細胞を異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）されたヌードマウスは、２１日後に触知性腫塊を示した。この結果から、ＨＣＣＲ−１Ｈ細胞が腫瘍形成能を有することが分かる。
【００６３】
腫瘍が直径１〜１．５ｃｍに達したとき、ヌードマウスを屠殺して腫瘍を取り出し、後続の腫瘍分析の試料として用いた。
【００６４】
＜実施例１１：ヒト細胞株ＨＣＣＲ−１Ｈが移植されたヌードマウス腫塊の特性＞
ヒト細胞株ＨＣＣＲ−１Ｈの同種移植によって誘導されたヌードマウス腫塊の特性を次のように調査した。
【００６５】
（段階１）ヘマトキシリン−エオシン染色
実施例１０で得られたヌードマウスの腫塊をヘマトキシリン−エオシンで染色した。
【００６６】
図１１は、ヌードマウスの腫塊をヘマトキシリン−エオシンで染色した結果（×２５０）である。図１１から分かるように、ヌードマウスの腫塊は異型（ａｔｙｐｉｓｍ）の細胞形、多形態性（ｐｌｅｏｍｏｒｐｈｉｓｍ）、核小体の増大、細胞質に対する核比率の増加などの典型的な上皮細胞癌種の特性を有する。
【００６７】
（段階２）免疫組織化学分析
抗−サイトケラチン８、抗−サイトケラチン１９および抗−ビメンチン抗体（ＤＡＫＯ）のそれぞれを１次抗体として用いて、実施例１０で得られたヌードマウスの腫塊の免疫組織化学分析を参照例３の方法で行った。
【００６８】
図１２−１のＡ並びに図１２−２のＢおよびＣは免疫組織化学分析の結果（×２５０）であり、触知可能な腫塊に置けるサイトケラチン８、サイトケラチン１９およびビメンチンタンパク質のそれぞれの発現を示す。図１２−１のＡ並びに図１２−２のＢおよびＣから分かるように、ヌードマウス腫塊細胞はサイトケラチン８および１９のような上皮標識タンパク質（図１２Ａおよび１２Ｂ）および、間葉標識タンパク質であるビメンチン（図１２Ｃ）を共発現した。これらの結果から、ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子が中間葉２９３細胞を上皮細胞に変化させることが分かる。
【００６９】
＜実施例１２：ヒト細胞株ＨＣＣＲ−１Ｈのノーザンブロット分析＞
ヒト細胞株ＨＣＣＲ−１ＨにおけるＨＣＣＲ−１癌原遺伝子の発現レベルを調査するために、実施例２で得られたＨＣＣＲ−１Ｈ細胞から参照例４の方法に従って全ＲＮＡを分離した後、３２Ｐ−標識されたランダムプライムされたＨＣＣＲ−１  ｃＤＮＡプローブを用いて参照例５の方法でノーザンブロットを行った。
【００７０】
図１３は、ＨＣＣＲ−１Ｈ細胞および野生型２９３細胞におけるＨＣＣＲ−１癌原遺伝子の発現を示すノーザンブロットの結果である。図１３から分かるように、ＨＣＣＲ−１Ｈ細胞は約２．１ｋｂサイズの単一ｍＲＮＡを過発現するのに対し、野生型２９３細胞の場合は発現が確認できなかった。
【００７１】
＜実施例１３：マウス細胞においてＨＣＣＲ−１癌原遺伝子によって誘導された腫瘍形成機構＞
マウス細胞においてＨＣＣＲ−１癌原遺伝子によって誘導された腫瘍形成機構を調査するために、一般的な腫瘍形成過程に係わると報告されているタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）とテロメラーゼ活性の異常、細胞周期チェックポイント（ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）調節機能の喪失、ｅｇｒ−１、ｃ−ｆｏｓおよびＧＡＰＤＨ発現の変化などを次のように調査した。
【００７２】
（段階１）ＰＫＣ活性分析
一般的に、腫瘍ＰＫＣ（タンパク質キナーゼＣ）−媒介信号伝達過程における異常を発生させる。ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子がタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性を変化させることを確認するために、野生型ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、比較例で得られたｐｃＤＮＡ３ベクターでトランスフェクトされた対照ＮＩＨ／３Ｔ３細胞および実施例１で得られたＨＣＣＲ−１Ｍ細胞を用いてＰＫＣ活性分析を行った。
【００７３】
ＰＫＣ活性をＳｉｇｍａＴＥＣＴＴＭタンパク質キナーゼＣ分析システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて製造社の指示に従って測定した。この際、ＰＫＣ活性はリン脂質の非存在下と存在下において、毎分基質に導入されるＰＫＣ量の差として定義される。各々の値は、３回の独立的な実験の平均±標準偏差として示した。
【００７４】
図１４は、野生型ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ｐｃＤＮＡ３ベクターでトランスフェクトされた対照ＮＩＨ／３Ｔ３細胞およびＨＣＣＲ−１Ｍ細胞のＰＫＣ活性を示すグラフである。図１４から分かるように、ＨＣＣＲ−１Ｍ細胞のＰＫＣ活性は野生型細胞より約１０倍程度高く、この結果からＨＣＣＲ−１癌原遺伝子が細胞内のＰＫＣ活性を上昇させることが分かる。
【００７５】
（段階２）テロメラーゼ活性の分析
一般的に、腫瘍においては増加したＰＫＣの活性によってテロメラーゼ活性が非正常的に増加するが、野生型ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、比較例で得られたｐｃＤＮＡ３ベクターでトランスフェクトされた対照ＮＩＨ／３Ｔ３細胞および実施例１で得られたＨＣＣＲ−１Ｍ細胞を用いてテロメラーゼ活性分析を行った。
【００７６】
テロメラーゼ活性は、テロメラーゼＰＣＲ−ＥＬＩＳＡキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、米国）を用いて製造社の指示に従って測定した。この際、このキットに含まれたヒトテロメラーゼに陽性である不死化したヒト腎臓由来の２９３細胞を陽性対照群として用い、Ｒｎａｓｅで予め処理した２９３細胞を陰性対照群として用いた。分析試験は１×１０３細胞と等量の抽出量で行った。４回の独立的な実験で得られた吸光度（ＯＤ）値を示した（平均±標準偏差）。
【００７７】
図１５は、陽性対照群細胞、陰性対照群細胞、野生型ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ｐｃＤＮＡ３ベクターでトランスフェクトされた対照ＮＩＨ／３Ｔ３細胞およびＨＣＣＲ−１Ｍ細胞のテロメラーゼ活性を示すグラフである。図１５から分かるように、野生型ＮＩＨ／３Ｔ３細胞のテロメラーゼ活性は検出可能な程度に微かである反面、ＨＣＣＲ−１Ｍ細胞のテロメラーゼ活性は野生型細胞に比べて約７倍程度増加した。また、陽性対照群細胞は高いテロメラーゼ活性を示した反面、陰性対照群細胞は活性を示さなかった。このような結果は、以前の研究結果（Ｈｏｌｔ， Ｓ． Ｅ．， Ｗｒｉｇｈｔ， Ｗ． Ｅ． ａｎｄ Ｓｈａｙ Ｊ． Ｗ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １６， ２９３２−２９３９（１９９６））と一致するもので、ＨＣＣＲ−１Ｍ細胞が活性化したＰＫＣによって高いテロメラーゼ活性を有することを示す。
【００７８】
（段階３）細胞周期試験
一般的に、腫瘍細胞は細胞周期調節に関与する遺伝子に異常を与えるが、ＨＣＣＲ−１Ｍ細胞の成長特性において変化があるかを調査するために、ＨＣＣＲ−１Ｍ細胞の細胞周期プロファイルを次のように調査した。
【００７９】
対数増殖期（ｍｉｄ−ｌｏｇ ｐｈａｓｅ）のＨＣＣＲ−１Ｍおよび野生型ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を０．５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で３６時間培養して成長を停止させた後、トリプシンで処理し、収集した後７０％エタノールで固定した。次いで、固定した細胞２×１０６個にヨウ化プロピジウム染色溶液（Ｓｉｇｍａ）５０μｇ／ｍｌおよびＲＮａｓｅ  Ａ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）１００ユニット／ｍｌを加え、３０分間反応させた後、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて４８８ｎｍ波長で蛍光分析して細胞ＤＮＡ含量を測定した。この結果をＭｏｄｆｉｔ  ５．２ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析して試料当り最少１×１０４個細胞があることを確認した。
【００８０】
次いで、ＨＣＣＲ−１細胞および野生型ＮＩＨ／３Ｔ３細胞のＧ０／Ｇ１、Ｓ、およびＧ２／Ｍ期における相対的細胞含量を測定し、その結果を表１に示す。
【００８１】
【表１】
2004516844.tif 000003
表１から分かるように、野生型ＮＩＨ／３Ｔ３およびＨＣＣＲ−１Ｍ細胞においてＳ期細胞の含量は各々２０．６％および３１．５％であった。このような結果から、多数のＨＣＣＲ−１Ｍ細胞がＧ０／Ｇ１期からＳ期に変化したことが分かる。
【００８２】
血清−依存性細胞周期の変化を調査するために、ＨＣＣＲ−１Ｍ細胞と野生型ＮＩＨ／３Ｔ３を各々０．５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で３６時間培養して細胞の成長を停止させた後、２０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地に移して培養しながら、予め定められた時間に収集して、Ｇ０／Ｇ１、ＳおよびＧ２／Ｍ期の相対的細胞の含量を測定し、その結果を表２に示す。
【００８３】
【表２】
2004516844.tif 000004
表２から分かるように、血清不足状態である０時に野生型ＮＩＨ／３Ｔ３細胞のＳ期細胞の含量は８％であったのに対し、ＨＣＣＲ−１Ｍ細胞のＳ期細胞の含量は２１．８％であった。このような結果は血清不足で誘導されたＧ０／Ｇ１期の抑止（ａｒｒｅｓｔ）がＨＣＣＲ−１癌原遺伝子の過発現によって相対的に阻止されたことを示す。また、２０％血清を含む培地に移して細胞の成長抑止を解消した後は、ＨＣＣＲ−１Ｍ細胞のＳ期細胞の含量が野生型ＮＩＨ／３Ｔ３細胞に比べて１０％以上一貫して増加した。このような結果から、ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子の過発現がＧ０／Ｇ１期を短縮させ、Ｓ期細胞数を増加させて細胞の成長を撹乱させることが分かる。
【００８４】
（段階４）ｅｇｒ−１、ｃ−ｆｏｓおよびＧＡＰＤＨの発現パターン
一般的に、ｅｒｇ−１、ｃ−ｆｏｓおよびＧＡＰＤＨの発現パターンが腫瘍の形成に係わるが、実施例１で得られたＨＣＣＲ−１Ｍ細胞において、ｅｇｒ−１、ｃ−ｆｏｓおよびＧＡＰＤＨの発現パターンを次のように調査した。
【００８５】
対数増殖期（ｍｉｄ−ｌｏｇ ｐｈａｓｅ）のＨＣＣＲ−１Ｍおよび野生型ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を０．５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で３６時間培養して成長を停止させた後（休止期）、２０％血清を含むＤＭＥＭ培地で０、１５、３０、６０、１２０分間培養して成長を促進させた（分裂期）。休止期と分裂期の細胞から参照例４の方法に従って全ＲＮＡを分離した後、３２Ｐ−ランダムプライムされたｅｇｒ−１、ｃ−ｆｏｓおよびＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡプローブを用いて参照例５の方法でノーザンブロットを行った。
【００８６】
図１６Ａ、１６Ｂおよび１６Ｃは、各々ＨＣＣＲ−１Ｍ細胞および野生型ＮＩＨ／３Ｔ３細胞においてｅｇｒ−１、ｃ−ｆｏｓおよびＧＡＰＤＨの発現を示すノーザンブロットの結果である。図１６Ａ〜１６Ｃから分かるように、ＨＣＣＲ−１Ｍ細胞は分裂期にｅｒｇ−１の発現が野生型細胞に比べて下向き調整（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）され、これとは対照的に、ＧＡＰＤＨの発現が上向き調整（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）され、ｃ−ｆｏｓ発現には有意の変化がなかった。
【００８７】
このような結果を総合すると、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞においてＨＣＣＲ−１遺伝子が調節異常によって過発現（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）されると、ＰＫＣとテロメラーゼが活性化され、細胞周期チェックポイント調節機能を失い、ｅｇｒ−１の発現が下向き調整されることによって悪性腫瘍に転換されることが分かる。
【００８８】
＜実施例１４：ヒト細胞においてＨＣＣＲ−１癌原遺伝子によって誘導された腫瘍形成機構＞
ヒト細胞においてＨＣＣＲ−１癌原遺伝子によって誘導された腫瘍形成機構を調査するために、一般的に腫瘍に係わると報告されているｐ５３腫瘍抑制遺伝子、ＭＤＭ２、Ｂａｘ、ｐ２１ＷＡＦ１、ｐ１６ＩＮＫ４Ａおよびｐ１４ＡＲＦ遺伝子の発現パターンを次のように調査した。
【００８９】
（段階１）ｐ５３腫瘍抑制遺伝子の発現パターン
ＨＣＣＲ−１Ｈ細胞におけるｐ５３遺伝子の発現パターンを調査するために、ウェスタンブロットとノーザンブロットを次のように行った。
【００９０】
まず、実施例２で得られたＨＣＣＲ−１Ｈ細胞および野生型２９３細胞を破砕した後、野生型ｐ５３にのみ反応する抗−ｐ５３モノクローナル抗体ＤＯ−７（アミノ酸３７〜４５；Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｌｔｄ．， イギリス）または野生型と変異型ｐ５３に反応するＡｂ−５（クローン  ＤＯ−７）（アミノ酸残基３７〜４５；ＮＥＯＭＡＲＫＥＲＳ， ＩＮＣ．ＣＡ）を用いて参照例２の方法でウェスタンブロットを行った。この際、同一のブロットを抗−ヒトマウスβ−アクチン抗体（シグマ社）と反応させてタンパク質総量を確認した。
【００９１】
図１７Ａは、ＨＣＣＲ−１Ｈ細胞および野生型２９３細胞におけるｐ５３腫瘍抑制遺伝子の発現を示すウェスタンブロット結果であり、図１７Ｂは同一のブロットのβ−アクチンを示すウェスタンブロット結果である。図１７Ａから分かるように、ＨＣＣＲ−１Ｈ細胞においては野生型２９３細胞に比べてｐ５３タンパク質の発現レベルが著しく上昇した。
【００９２】
また、実施例２で得られたＨＣＣＲ−１Ｈ細胞を２％ウシ胎児血清と２ｍＭグルタミン（Ｓｉｇｍａ）を含むメチオニン欠乏ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）で２時間培養した後、Ｌ−３５Ｓメチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）１００μｌで細胞を標識化した。これらの細胞を１×ハンクス（Ｈａｎｋｓ）緩衝溶液（Ｇｉｂｃｏ， ＵＳＡ）で洗浄した後、Ｌ−メチオニンを含む正常のＲＰＭＩ−１６４０培地で０．５、１、２、または４時間培養した。次いで、細胞を免疫沈降反応液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、１０ｍＭ  ベンズアミジン、ペプスタチン１μｇ／ｍｌ、１０ｍＭ  硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ））に溶解し、タンパク質Ａ−セファロース溶液（Ｓｉｇｍａ）５０μｌで洗浄した後、定量した。細胞破壊液を抗ｐ５３抗体で免疫沈降反応させた後（Ｋｅｓｓｌｅｒ， Ｓ． Ｗ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １１５， １６１７−１６２３（１９７５））ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。この際、ｐ５３遺伝子のない対照群としてＨｅｐ３Ｂ肝癌細胞（ＡＴＣＣ  ＨＢ−８０６４）を用いて同様の実験を行った。
【００９３】
図１８は、ヒトＨＣＣＲ−１Ｈ細胞および野生型ヒト２９３細胞において腫瘍抑制遺伝子ｐ５３の発現を示す免疫沈降反応結果である。図１８から分かるように、ＨＣＣＲ−１Ｈ細胞においてｐ５３タンパク質の発現レベルが野生型２９３細胞に比べて著しく上昇した。したがって、ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子による腫瘍形成過程でｐ５３タンパク質は高いレベルで発現されるが、不活性化したタンパク質形態として残っており、腫瘍抑制機能を果さないと考えられる。
【００９４】
（段階２）ＭＤＭ２、ｂａｘ、ｐ２１ＷＡＦ１、ｐ１６ＩＮＫ４Ａおよびｐ１４ＡＲＦ遺伝子の発現パターン
ｐ５３腫瘍抑制タンパク質はＭＤＭ２、Ｂａｘおよびｐ１４ＡＲＦが関与する調節ループ（ｌｏｏｐ）の一部であり、腫瘍抑制遺伝子ｐ２１ＷＡＦ１およびｐ１６ＩＮＫ４Ａに直接影響を及ぼすので、ＨＣＣＲ−１Ｈ細胞におけるＭＤＭ２、Ｂａｘ、ｐ２１ＷＡＦ１、ｐ１６ＩＮＫ４Ａおよびｐ１４ＡＲＦ活性を調査した。
【００９５】
実施例２で得られたＨＣＣＲ−１Ｈ細胞、および抗−ＭＤＭ２、抗−Ｂａｘ、抗−ｐ２１ＷＡＦ１および抗−ｐ１６ＩＮＫ４Ａ抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｄｕｃｔｓ，米国）およびｐ１４ＡＲＦ抗体（Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ、米国）を用いて、参照例２の方法でウェスタンブロットを行った。同一のブロットをβ−アクチンでハイブリッド化して総タンパク質含量を確認した。
【００９６】
図１９−１のＡ、Ｃ、およびＥ、ならびに図１９−２のＧおよびＩは、各々ＨＣＣＲ−１Ｈ細胞におけるＭＤＭ２、Ｂａｘ、ｐ２１ＷＡＦ１、ｐ１６ＩＮＫ４Ａおよびｐ１４ＡＲＦ遺伝子の発現を示すウェスタンブロットの結果であり、図１９−１のＢおよびＤ、並びに図１９−２のＦ、ＨおよびＪは、各々前記ブロットのβ−アクチンを示すウェスタンブロットの結果である。図１９−１のＡ、Ｃ、およびＥ、ならびに図１９−２のＧから分かるように、ＭＤＭ２、Ｂａｘ、ｐ２１ＷＡＦ１、ｐ１６ＩＮＫ４Ａおよびｐ１４ＡＲＦタンパク質は野生型２９３細胞に比べて減少した。このような結果は、ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子の過発現はＭＤＭ２、Ｂａｘ、ｐ２１ＷＡＦ１およびｐ１６ＩＮＫ４Ａ遺伝子の転写を抑制することにより、これらのタンパク質の発現を減少させることを示す。
【００９７】
この結果を段階１の結果と総合すると、ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子の過発現はｐ５３タンパク質の安定性を増加させるが、このｐ５３タンパク質はＭＤＭ２、ｂａｘおよびｐ２１ＷＡＦ１遺伝子の発現を陽性調節する自己調節ループを形成しないと考えられる。特に、図１９−１のＥおよび図１９−２のＧから分かるように、ＨＣＣＲ−１Ｈ細胞において、キナーゼ抑制タンパク質ファミリーｐ２１ＷＡＦ１とｐ１６ＩＮＫ４Ａはｐ５３−非依存的機構によって下向き調整された。また、図１９−２のＩから分かるように、ｐ１４ＡＲＦは野生型２９３またはＨＣＣＲ−１細胞において異常発現されないとみられ、このような結果は、ＭＤＭ２−ｐ１４ＡＲＦループの変化がｐ５３不活性化機構でないことを示す。
【００９８】
このような結果を実施例１３の段階３の結果と総合すると、マウスとヒト細胞の両方においてＨＣＣＲ−１癌原遺伝子の過発現が細胞周期の調節に影響を及ぼし、細胞周期調節因子であるｐ５３およびｐ２１と関連性があることが分かる。
【００９９】
（段階３）ＨＣＣＲ−１タンパク質と相互作用するタンパク質の分析
ＨＣＣＲ−１タンパク質と相互作用するパートナータンパク質を調査するために、酵母２−ハイブリッドスクリーン（ｙｅａｓｔ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｃｒｅｅｎ）分析を次のように行った。
【０１００】
大腸菌ＪＭ−１０９／ＨＣＣＲ１（寄託番号第ＫＣＴＣ  ０６６７ＢＰ号）の培養液から発現ベクターｐＣＥＶ−ＬＡＣ／ＨＣＣＲ−１を分離した後、制限酵素ＳａｌＩで切断し、得られたＨＣＣＲ−１癌原遺伝子をｐＬｅｘＡ  ＤＮＡ−結合ドメインを含む酵母２−ハイブリッドベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ部位に挿入して、ｐＬｅｘ  ＤＮＡ−結合ドメインとＨＣＣＲ−１タンパク質の融合タンパク質を発現するベクターｐＬｅｘＡ−ＨＣＣＲ−１を得た。このベクターｐＬｅｘＡ−ＨＣＣＲ−１を酵母ＥＧＹ４８（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国）とともに４２℃で１０分間加熱して酵母を形質転換させた。この酵母をｐＢ４２ＡＤ（ｐＬｅｘＡ−活性化ドメインを含む）と融合したヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国）で同様な方法で形質転換させた。形質転換体のある平板からレプリカ−プレーティング法に従ってレプリカを得た後、Ｔｒｐ−、Ｌｅｕ−、Ｈｉｓ−選択平板培地上で培養し、β−ガラクトシダーゼフィルターリフト分析（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｆｉｌｔｅｒ ｌｉｆｔ ａｓｓａｙ）を行った。この際、形質転換体がｃＤＮＡライブラリーから由来するパートナー遺伝子を有する場合は、ｐＬｅｘＡ活性化ドメインと融合したパートナータンパク質がｐＬｅｘＡ  ＤＮＡ−結合ドメインと融合したＨＣＣＲ−１タンパク質と結合することによりＸ−ｇａｌの入っている平板培地で青色コロニーを形成する。偽陽性（ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）を除去するために酵母交配分析（ｙｅａｓｔ ｍａｔｉｎｇ ａｓｓａｙ）を行った（Ｇｕａｒｅｎｔｅ， Ｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０， １６３９−１６４１（１９９３））。
【０１０１】
得られたクローンからＨＣＣＲ−１タンパク質と相互作用するパートナータンパク質をコーディングする遺伝子をスクリーニングした。
【０１０２】
このコロニーをグルコース培地で培養した後、ガラスビーズを用いてパートナー遺伝子を含むベクターを抽出した。このベクターを大腸菌ＫＣ８（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国）菌株にエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）方法で導入した後、形質転換体をＭ９最少培地に塗抹して形質転換体を選別した。得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出した後、さらに大腸菌ＤＨ５αに形質転換させ、ＬＢ培地で培養してプラスミドＤＮＡを増幅した。この培養液からプラスミドＤＮＡを抽出し、ＨｉｎｄＩＩＩで切断してパートナー遺伝子を含む約１ｋｂ断片を得た。このパートナー遺伝子の塩基配列を分析した結果、この遺伝子はＴＰＤ５２Ｌ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号第ＮＭ００３２８８号）として確認された。この遺伝子がコーディングするＤ５２タンパク質はヒト乳房癌において発現レベルが高いことから確認されたもので、カルシウムが媒介する信号伝達過程と細胞増殖において重要な役割を果すことが知られている（Ｂｙｒｎｅ， Ｊ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５５， ２８９６−２９０３（１９９５）； およびＢｒｙｎｅ， Ｊ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， １６， ８７３−８８１（１９９８））。
【０１０３】
（段階４）ＨＣＣＲ−１とＴＰＤ５２Ｌ２遺伝子の同時トランスフェクト
ＨＣＣＲ−１タンパク質とＤ５２タンパク質の相互作用を確認するために、次のように同時トランスフェクトした。
【０１０４】
まず、大腸菌ＪＭ−１０９／ＨＣＣＲ１（寄託番号第ＫＣＴＣ  ０６６７ＢＰ号）の培養液から発現ベクターｐＣＥＶ−ＬＡＣ／ＨＣＣＲ−１を分離し、ＳａｌＩで切断してＨＣＣＲ−１全長ｃＤＮＡ配列を得た。その後発現ベクターＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐＦＡＬＧ−ＣＭＶ（Ｓｉｇｍａ、米国）のＳａｌＩ部位に挿入してＦＬＡＧとＨＣＣＲ−１の融合タンパク質を発現する発現ベクターｐＦＬＡＧ−ＨＣＣＲ−１を得た。また、段階３で得られたＴＰＤ５２Ｌ２遺伝子をＧＳＴ遺伝子が挿入された発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）のＮｏｔＩ部位に挿入してＧＳＴとＤ５２の融合タンパク質を発現する発現ベクターｐＧＳＴ−ＴＰＤ５２Ｌ２を得た。
【０１０５】
前記発現ベクターｐＦＬＡＧ−ＨＣＣＲ−１とｐＧＳＴ−ＴＰＤ５２Ｌ２をＣＨＯ細胞に同時トランスフェクトした後、ＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、４８時間後にＣＨＯ細胞をトリプシン処理した後に収集した。ＣＨＯ細胞をＰＢＳで洗浄し、ＩＰ緩衝溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ４０、２ｍＭ  バナジウム酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｖａｎａｄａｔｅ）、１０ｍＭ  フッ化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、１０ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０μｇ／ｍｌアプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎｅ）、１０μｇ／ｍｌ  ロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎｅ）、１０μｇ／ｍｌ  ペプスタチン（ｐｅｐｓｔａｔｉｎｅ）、１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド）で再懸濁した。細胞懸濁液を２７ゲージ針に通した後、得られた細胞破壊液をスピンして非破壊された細胞をペレット化した。上清液を前免疫ＩｇＧおよびタンパク質Ａビーズ（Ｓｉｇｍａ、米国）で予め掃除（ｐｒｅｃｌｅａｒ）した後、細胞破壊液中のＦＬＡＧ−ＨＣＣＲ−１またはＧＳＴ−ＴＰＤ５２Ｌ２融合タンパク質を抗−ＦＬＡＧまたは抗−ＧＳＴ抗体（Ｓｉｇｍａ、米国）を用いて免疫沈降させて除去した（Ｋｅｓｌｅｒ， Ｓ．Ｗ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １１５， １６１７−１６２３（１９７５））。残ったタンパク質試料を抗−ＧＳＴまたは抗−ＦＬＡＧ抗体を用いて参照例２の方法でウェスタンブロットを行った。
【０１０６】
図２０Ａおよび２０ＢはＧＳＴタンパク質およびＦＬＡＧタンパク質を示すウェスタンブロット分析した結果である。図２０Ａおよび２０Ｂから分かるように、両析出物において融合タンパク質が検出された。このような結果から、Ｄ５２タンパク質はＨＣＣＲ−１タンパク質と結合して相互作用することが分かる。
【０１０７】
＜実施例１５：形質転換マウスの製造＞
ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子がイン・ビボで腫瘍形成を誘導するかを確認するために、ＣＭＶプロモータの下でＨＣＣＲ−１癌原遺伝子を発現する形質転換マウスを製造した。
【０１０８】
まず、形質転換マウスの製造に用いるＨＣＣＲ  ｃＤＮＡを得るために、大腸菌ＪＭ−１０９／ＨＣＣＲ１細胞（寄託番号第ＫＣＴＣ  ０６６７ＢＰ号）を培養し、それから発現ベクターｐＣＥＶ−ＬＡＣ／ＨＣＣＲ−１を分離し、ＳａｌＩで切断して全長ＨＣＣＲ−１  ｃＤＮＡを得、これをｐｃＤＮＡ３ベクターのＸｈｏＩ部位に挿入して発現ベクターｐｃＤＮＡ３−ＨＣＣＲ−１を得た。この発現ベクターｐｃＤＮＡ３−ＨＣＣＲ−１をＳａｌＩとＸｍｎＩで切断し、０．７％アガロースゲル上で電気泳動させた後、エレクトロエルーション（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）法で分離した。分離したＤＮＡ断片を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液中で透析し、最終濃度が４ｎｇ／ｍｌになるようにした。このように得られたＤＮＡは図２１に示すように、ＣＭＶプロモータ、ＨＣＣＲ−１  ｃＤＮＡ遺伝子およびウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡ配列を含む構造を有する。
【０１０９】
このＤＮＡをマウスＦＶＢ／Ｎ菌株（Ｓａｍｙｕｋ Ｃｏｒｐ．， ＣＡＭＴＡＫＯ， Ｋｏｒｅａ）の受精卵に前核ＤＮＡ微細注入法（ｐｒｏｎｕｃｌｅａｒ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）（Ｇｏｒｄｏｎ， Ｊ． Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７， ７３８２−７３８４ （１９８０））に従って次のように導入した。前記ＤＮＡ溶液を１細胞期の受精卵の前核に微細注入した後、２０時間培養して２細胞期に達した受精卵のみを選別して擬妊娠したレシピエントＩＣＲマウス（Ｓａｍｙｕｋ Ｃｏｒｐ．， ＣＡＭＴＡＫＯ， Ｋｏｒｅａ）の卵管の膨大部に移植した。レシピエントマウスから産子マウスを得、産子マウスの尻尾生検から得たＤＮＡ試料でサザンブロットを行った。
【０１１０】
図２２は、ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子が導入された受精卵から発生した形質転換マウスの写真である。図２２から分かるように、形質転換マウスは胸部に隣接した右側の脇の下部に約１．５×１．５ｃｍサイズの腫瘍を有している。
【０１１１】
形質転換マウスの腫瘍を分離した後、肉眼で観察した。
【０１１２】
図２３は、形質転換マウスの胸部腫瘍写真である。図２３から分かるように、形質転換マウスの腫瘍は被膜（ｃａｐｓｕｌｅ）のない局限性結節（ｗｅｌｌ−ｃｉｒｃｕｍｓｃｒｉｂｅｄ ｎｏｄｕｌｅ）である。
【０１１３】
腫瘍の形態学的特性を調査するために、形質転換マウスの腫瘍をヘマトキシリン−エオシンで染色した。図２４は、形質転換マウス腫瘍のヘマトキシリン−エオシン染色結果（×１００）である。図２４から分かるように、腫瘍は乳頭状構造と腺または管類似構造からなり、中央部には広範囲な壊死が起っており、腫瘍の外部に正常の胸部組織が隣接している。腫瘍細胞は立方形または卵形であり、その境界を区別することが難しく、相当量の顆粒性、好酸性細胞質を有する。腫瘍細胞は大きくて多形態性および過染色性である核酸を有し、非定形を含む多くの有糸分裂を有する。このような結果から、形質転換マウスの腫瘍は胸部の生殖管乳頭状の腺癌特性を有することが分かる。
【０１１４】
図２５は、形質転換マウス腫瘍の電子顕微鏡写真（スケールバーは２μｍ）である。図２５から分かるように、腫瘍細胞は卵形の模様を有し、多量の細胞小器官を有する。腫瘍細胞の核は塊（ｃｌｕｍｐ）をなしており、縁に染色質と核小体を有し、細胞質は相当量のミトコンドリアと小嚢化した粗面小胞体で詰められている。細胞はデスモソームによって連結されている。
【０１１５】
得られた形質転換マウスの受精卵をＨＣＣＲ−１と命名し、韓国生命工学研究所付設遺伝子銀行に２０００年１２月２６日付で寄託番号第ＫＣＴＣ  ０９２４ＢＰ号として寄託した。
【０１１６】
＜実施例１６：乳房癌、腎臓癌、卵巣癌および胃癌組織におけるＨＣＣＲ−１癌原遺伝子の発現＞
ヒト乳房癌、腎臓癌、卵巣癌および胃癌組織において、ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子の発現レベルを調査するために、癌患者から切出した乳房癌、腎臓癌、卵巣癌および胃癌組織から、参照例４の方法で全ＲＮＡを分離し、３２Ｐ−標識されたランダムプライムされたＨＣＣＲ−１全体ｃＤＮＡプローブを用いて参照例５の方法でノーザンブロットを行った。この際、比較のために切出した正常の乳房、腎臓、卵巣および胃癌組織を用いて同様の実験を行った。
【０１１７】
図２６Ａは、ヒト乳房癌、腎臓癌、卵巣癌および胃癌組織において、ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子の発現を示すノーザンブロットの結果であり、図２６Ｂは、同一のブロットをβ−アクチンプローブでハイブリッド化したノーザンブロットの結果である。図２６Ａおよび２６Ｂから分かるように、ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子はヒト乳房癌、腎臓癌、卵巣癌および胃癌組織において正常の組織に比べて過発現されている。
【０１１８】
また、前記乳房癌、腎臓癌、卵巣癌および胃癌組織で発現されたＨＣＣＲ−１タンパク質を調査するために、前記乳房癌、腎臓癌、卵巣癌および胃癌組織に対して調製例２で得られた抗−ＨＣＣＲ−１血清を用いて参照例２の方法でウェスタンブロットを行った。
【０１１９】
図２７は、ヒト乳房癌、腎臓癌、卵巣癌および胃癌組織において、ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子の発現を示すウェスタンブロットの結果である。図２７から分かるように、ヒト乳房癌、腎臓癌、卵巣癌および胃癌組織においてこれらの正常部位に比べて５０ｋＤａサイズのＨＣＣＲ−１タンパク質が過発現されている。
【０１２０】
＜実施例１７：ヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ−１の染色体上の位置＞
調製例１で得られた全長ＨＣＣＲ−１  ｃＤＮＡをランダムプライム標識キット（ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｋｉｔ， Ｐｒｏｍｅｇａ， 米国）を用いて標識してプローブを得た。このプローブを用いてヒト胎盤ゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）をスクリーニングして約２０ｋｂサイズのゲノムＤＮＡを得た。
【０１２１】
このゲノムＤＮＡを用いて文献（Ｃｈｅｒｉｆ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７， ６６３９−６６４３（１９９０））の方法に従って蛍光イン・サイチューハイブリダイゼーション法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＦＩＳＨ法）を行った。すなわち、ゲノムＤＮＡをニック・トランスレーション・キット（ｎｉｃｋ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ， Ｖｙｓｉｓ， ＩＬ， ＵＳＡ）を用いてスペクトルレッド（ＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ）−ｄＵＴＰ（Ｖｙｓｉｓ， ＩＬ， ＵＳＡ）で標識した後、スライドを蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、米国）で観察し、染色体をＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）で対照染色した。
【０１２２】
図２８は、ヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ−１のヒト染色体上の位置を示す蛍光イン・サイチューハイブリダイゼーションの結果であって、これから、ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子は１２番染色体の長腕（１２ｑ）に位置することが分かる。
【０１２３】
本発明を具体的な実施態様と関連させて記述したが、添付した特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内で、当該分野の熟練者が本発明を多様に変形および変化させ得ると理解されなければならない。
【０１２４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、各々マウスＨＣＣＲ−１Ｍ細胞および野生型ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の位相差顕微鏡写真である。
【図２】図２は、単層培養されたＨＣＣＲ−１Ｍ細胞のヘマトキシリン−エオシン染色結果である。
【図３】図３は、ＨＣＣＲ−１Ｍ細胞の透過電子顕微鏡写真である。
【図４】図４は、ＨＣＣＲ−１Ｍ細胞を同種移植された触知性腫瘍（ｐａｌｐａｂｌｅ ｔｕｍｏｒ）を示すヌードマウスの写真である。
【図５】図５は、ＨＣＣＲ−１Ｍ細胞を同種移植されたヌードマウスの触知性腫塊をヘマトキシリン−エオシンで染色した結果である。
【図６】図６は、ＨＣＣＲ−１Ｍ細胞を同種移植されたヌードマウスの触知性腫塊の透過電子顕微鏡写真である。
【図７−１】図７−１ＡおよびＢは、各々ＨＣＣＲ−１Ｍ細胞で同種移植されたヌードマウスの触知性腫塊においてレチクリン繊維、およびケラチンの発現を示す免疫組織化学分析結果である。
【図７−２】図７−２ＣおよびＤは、各々ＨＣＣＲ−１Ｍ細胞で同種移植されたヌードマウスの触知性腫塊において上皮細胞膜抗原およびビメンチンの発現を示す免疫組織化学分析結果である。
【図８】図８は、単層培養されたＨＣＣＲ−１ＭＮ細胞の位相差顕微鏡写真である。
【図９】図９は、ＨＣＣＲ−１ＭおよびＨＣＣＲ−１ＭＮ細胞において、ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子の発現を示すウェスタンブロット結果である。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、各々単層培養されたＨＣＣＲ−１Ｈおよび野生型２９３細胞の位相差顕微鏡写真である。
【図１１】図１１は、ＨＣＣＲ−１Ｈ細胞を異種移植されたヌードマウスの触知性腫塊をヘマトキシリン−エオシンで染色した結果である。
【図１２−１】図１２―１Ａは、ＨＣＣＲ−１Ｈ細胞で異種移植されたヌードマウスの触知性腫塊において、サイトケラチン８の発現を示す免疫組織化学分析結果である。
【図１２−２】図１２―２ＢおよびＣは、ＨＣＣＲ−１Ｈ細胞で異種移植されたヌードマウスの触知性腫塊において、サイトケラチン１９およびビメンチンの発現を示す免疫組織化学分析結果である。
【図１３】図１３は、ＨＣＣＲ−１Ｈ細胞においてＨＣＣＲ−１癌原遺伝子の発現を示すノーザンブロット結果である。
【図１４】図１４は、ＨＣＣＲ−１Ｍ細胞およびｐｃＤＮＡ３ベクターでトランスフェクトされた対照ＮＩＨ／３Ｔ３細胞および野生型ＮＩＨ／３Ｔ３細胞のタンパク質キナーゼＣ活性を示すグラフである。
【図１５】図１５は、ＨＣＣＲ−１Ｍ細胞およびｐｃＤＮＡ３ベクターでトランスフェクトされた陽性対照群２９３細胞、陰性対照群細胞、母体（ｐａｒｅｎｔａｌ）野生型ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、対照ＮＩＨ／３Ｔ３細胞のテロメラーゼ活性を示すグラフである。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｃは、ＨＣＣＲ−１Ｍ細胞において、ｅｇｒ−１、ｃ−ｆｏｓおよびグリセルアルデヒド−２−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）の発現を示すノーザンブロット結果である。
【図１７】図１７Ａは、ＨＣＣＲ−１Ｈ細胞において、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３の発現を示すウェスタンブロット結果であり、図１７Ｂは同一のブロットのβ−アクチンを示すウェスタンブロット結果である。
【図１８】図１８は、ＨＣＣＲ−１Ｈ細胞において、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３の発現を示す免疫沈降反応結果である。
【図１９−１】図１９−１Ａ、Ｃ、およびＥは、各々本発明の他の実施態様によるＨＣＣＲ−１Ｈ細胞において、ＭＤＭ２、Ｂａｘ、ｐ２１ＷＡＦ１、遺伝子の発現を示すウェスタンブロット結果であり、図１９−１ＢおよびＤは、各々前記ＡおよびＣのブロットのβ−アクチンを示すウェスタンブロット結果である。
【図１９−２】図１９−２ＧおよびＩは、各々本発明の他の実施態様によるＨＣＣＲ−１Ｈ細胞において、ｐ１６ＩＮＫ４Ａおよびｐ１４ＡＲＦ遺伝子の発現を示すウェスタンブロット結果であり、図１９−２Ｆ、ＨおよびＪは、各々前記図１９−１Ｅ並びに図１９−２ＧおよびＩのブロットのβ−アクチンを示すウェスタンブロット結果である。
【図２０】図２０Ａは、ＦＬＡＧとＨＣＣＲ−１の融合タンパク質を発現するベクターおよびＧＳＴとＤ５２の融合タンパク質を発現するベクターで同時トランスフェクトされたＣＨＯ細胞のＦＬＡＧタンパク質を免疫沈降反応させて得られた沈澱物において、ＧＳＴタンパク質のウェスタンブロット分析した結果であり、図２０ＢはＦＬＡＧとＨＣＣＲ−１の融合タンパク質を発現するベクターおよびＧＳＴとＤ５２の融合タンパク質を発現するベクターで同時トランスフェクトされたＣＨＯ細胞のＧＳＴタンパク質を免疫沈降反応させて得られた沈澱物において、ＦＬＡＧタンパク質のウェスタンブロット分析した結果である。
【図２１】図２１は、ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子を含む核酸構造を示す模式図である。
【図２２】図２２は、癌原遺伝子ＨＣＣＲ−１が導入された受精卵から発生して癌が誘発された形質転換マウスの写真である。
【図２３】図２３は、癌原遺伝子ＨＣＣＲ−１が導入された受精卵から発生した形質転換マウスの乳房腫瘍写真である。
【図２４】図２４は、癌原遺伝子ＨＣＣＲ−１が導入された受精卵から発生した形質転換マウスの乳房腫瘍をヘマトキシリン−エオシンで染色した結果である。
【図２５】図２５は、ヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ−１が導入された受精卵から発生した形質転換マウスの乳房腫瘍の電子顕微鏡写真である。
【図２６】図２６Ａは、ヒト乳房癌、腎臓癌、卵巣癌および胃癌組織においてヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ−１の発現を示すノーザンブロットの結果であり、図２６Ｂは、同一のブロットをβ−アクチンプローブでハイブリッド化したノーザンブロットの結果である。
【図２７】図２７は、ヒト乳房癌、腎臓癌、卵巣癌および胃癌組織においてＨＣＣＲ−１癌原遺伝子の発現を示すウェスタンブロットの結果である。
【図２８】図２８は、ヒト癌原遺伝子ＨＣＣＲ−１のヒト染色体上の位置を示す蛍光イン・サイチューハイブリダイゼーション法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＦＩＳＨ法）の結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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