(57)【要約】ｇｂ１ａおよびｇｂ２サブユニットのヘテロマーであるＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストである物質の同定方法を提供する。ここで、該物質は、ｇｂ１ｂおよびｇｂ２サブユニットまたはｇｂ１ｃおよびｇｂ２サブユニットのヘテロマーであるＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストではない。該物質は、種々の状態、例えば、てんかん及び或る種の疼痛症候群の治療に有用である。
2004501375.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＡＢＡＢ受容体のｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストの同定方法であって、
（ａ）物質が、ｇｂ１ａサブユニットを含むＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストであることを判定すること、および
（ｂ）該物質が、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃサブユニットを含むＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストではないことを判定することを含んでなる、方法。
【請求項２】
さらに以下の工程、すなわち、
（ｃ）該物質がシナプス後カリウム電流を活性化することを判定する工程、
（ｄ）該物質がＧＡＢＡ抑制性シナプス後電流を前シナプス的には抑制しないことを判定する工程、
（ｅ）該物質がＧＡＢＡＡ受容体のアゴニストではないことを判定する工程、
（ｆ）該物質が、電位依存性カルシウムチャンネルに負に共役したＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストであることを判定する工程の１以上を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ｇｂ１ａサブタイプ特異的結合性物質である物質の同定方法であって、
（ａ）物質をｇｂ１ａ細胞、ｇｂ１ｂ細胞およびｇｂ１ｃ細胞に別々にさらすこと、
（ｂ）該ｇｂ１ａ細胞、ｇｂ１ｂ細胞およびｇｂ１ｃ細胞への該物質の結合を定量することを含んでなり、
該ｇｂ１ａ細胞への該物質の結合の量が、ｇｂ１ｂおよびｇｂ１ｃの両方の細胞への該物質の結合の量より少なくとも３倍大きい場合には、該物質が、該ｇｂ１ａサブタイプ特異的結合性物質である、方法。
【請求項４】
該ｇｂ１ａ細胞が、ｇｂ２をコードする発現ベクターと、ｇｂ１ａをコードする発現ベクターとを含み、該細胞を、ｇｂ２およびｇｂ１ａが発現されｇｂ１ａヘテロマーが形成される条件下で培養する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
該ｇｂ１ｂ細胞が、ｇｂ２をコードする発現ベクターと、ｇｂ１ｂをコードする発現ベクターとを含み、該ｇｂ１ｂ細胞を、ｇｂ２およびｇｂ１ｂが発現されｇｂ１ｂヘテロマーが形成される条件下で培養し、
該ｇｂ１ｃ細胞が、ｇｂ２をコードする発現ベクターと、ｇｂ１ｃをコードする発現ベクターとを含み、該ｇｂ１ｃ細胞を、ｇｂ２およびｇｂ１ｃが発現されｇｂ１ｃヘテロマーが形成される条件下で培養する、請求項５記載の方法。
【請求項６】
該ｇｂ１ａサブタイプ特異的結合性物質がｇｂ１ａ受容体の機能的応答を活性化するか否かを判定することを更に含む、請求項３、４または５記載の方法。
【請求項７】
ｇｂ１ａサブタイプ特異的結合性物質の同定方法であって、　（ａ）ｇｂ１ａ細胞を準備すること、
（ｂ）物質の存在下および不存在下、該細胞をガバペンチンまたはプレガバリンにさらすこと、
（ｃ）該物質の存在下および不存在下の該ｇｂ１ａヘテロマーへのガバペンチンまたはプレガバリンの結合を測定すること、
ここで、ガバペンチンまたはプレガバリンの結合の量が、該物質の不存在下より該物質の存在下で少ない場合には、
（ｄ）該物質がｇｂ１ｂ細胞およびｇｂ１ｃ細胞に結合するか否かを判定することを含んでなり、
該物質がｇｂ１ｂ細胞およびｇｂ１ｃ細胞に結合しない場合には、該物質がｇｂ１ａサブタイプ特異的結合性物質である、方法。
【請求項８】
該ｇｂ１ａ細胞が、ｇｂ２をコードする発現ベクターと、ｇｂ１ａをコードする発現ベクターとを含み、該細胞を、ｇｂ２およびｇｂ１ａが発現されｇｂ１ａヘテロマーが形成される条件下で培養する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
該ｇｂ１ｂ細胞が、ｇｂ２をコードする発現ベクターと、ｇｂ１ｂをコードする発現ベクターとを含み、該ｇｂ１ｂ細胞を、ｇｂ２およびｇｂ１ｂが発現されｇｂ１ｂヘテロマーが形成される条件下で培養し、
該ｇｂ１ｃ細胞が、ｇｂ２をコードする発現ベクターと、ｇｂ１ｃをコードする発現ベクターとを含み、該ｇｂ１ｃ細胞を、ｇｂ２およびｇｂ１ｃが発現されｇｂ１ｃヘテロマーが形成される条件下で培養する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該ｇｂ１ａサブタイプ特異的結合性物質がｇｂ１ａ受容体の機能的応答を活性化するか否かを判定することを更に含む、請求項７、８または９記載の方法。
【請求項１１】
ＧＡＢＡＢ受容体のｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストの同定方法であって、
（ａ）アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞内で機能的ｇｂ１ａヘテロマーを形成するようｇｂ１ａおよびｇｂ２を発現しＫｉｒをも発現するアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞を準備すること、
（ｂ）該卵母細胞膜を横切るカリウムイオン流を観察しながら、工程（ａ）の卵母細胞を物質にさらすこと、
（ｃ）アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞内で機能的ｇｂ１ｂヘテロマーを形成するようｇｂ１ｂおよびｇｂ２を発現しＫｉｒをも発現するアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞を準備すること、
（ｄ）該卵母細胞膜を横切るカリウムイオン流を観察しながら、工程（ｃ）の卵母細胞を該物質にさらすこと、
（ｅ）アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞内で機能的ｇｂ１ｃヘテロマーを形成するようｇｂ１ｃおよびｇｂ２を発現しＫｉｒをも発現するアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞を準備すること、
（ｆ）該卵母細胞膜を横切るカリウムイオン流を観察しながら、工程（ｅ）の卵母細胞を該物質にさらすことを含んでなり、
該物質への該卵母細胞の曝露が、工程（ｂ）ではカリウムイオン流の増加を引き起こすが工程（ｄ）および（ｆ）では該増加を引き起こさない場合には、該物質がＧＡＢＡＢ受容体のｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストである、方法。
【請求項１２】
（ｉ）工程（ａ）の卵母細胞が、ｇｂ１ａ、ｇｂ２およびＫｉｒをコードするＲＮＡを微量注入されており、
（ｉｉ）工程（ｃ）の卵母細胞が、ｇｂ１ｂ、ｇｂ２およびＫｉｒをコードするＲＮＡを微量注入されており、
（ｉｉｉ）工程（ｅ）の卵母細胞が、ｇｂ１ｃ、ｇｂ２およびＫｉｒをコードするＲＮＡを微量注入されている、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）、（ｄ）および（ｆ）の観察をパッチクランプ記録により行う、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストの同定方法であって、
（ａ）物質がｇｂ１ａ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定し、
（ｂ）該物質がｇｂ１ｂ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定し、
（ｃ）該物質がｇｂ１ｃ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定することを含んでなり、
該物質が該ｇｂ１ａ細胞においてはＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するが、該ｇｂ１ｂ細胞においてもｇｂ１ｃ細胞においても該応答を活性化しない場合には、該物質がｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストであることを特徴とする方法。
【請求項１５】
該機能的応答が細胞内カルシウムレベルの減少である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
細胞内カルシウムレベルの減少をカルシウム指示色素の使用により測定する、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
該カルシウム指示色素が、フルオ−３、フラ−２、フルオ−４、フルオ−５、エクオリン、カルシウムグリーン−１、オレゴングリーン、４８８　ＢＡＰＴＡ、ＳＮＡＲＦ−１およびインド−１よりなる群から選ばれる、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストの同定方法であって、
（ａ）ｇｂ１ａ細胞を準備すること、
（ｂ）該ｇｂ１ａ細胞にカルシウム指示色素を装填すること、
（ｃ）物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ａ細胞における該カルシウム指示色素の蛍光特性を測定すること、
（ｄ）ｇｂ１ｂ細胞を準備すること、
（ｅ）該ｇｂ１ｂ細胞にカルシウム指示色素を装填すること、
（ｆ）該物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ｂ細胞における該カルシウム指示色素の蛍光特性を測定すること、
（ｇ）ｇｂ１ｃ細胞を準備すること、
（ｈ）該ｇｂ１ｃ細胞にカルシウム指示色素を装填すること、
（ｉ）該物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ｃ細胞における該カルシウム指示色素の蛍光特性を測定することを含んでなり、
該物質の不存在下と比較した場合の該物質の存在下での蛍光特性の変化が工程（ｃ）では測定されるが、工程（ｆ）および工程（ｉ）では測定されない場合には、該物質がｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストである、方法。
【請求項１９】
該カルシウム指示色素が、フルオ−３、フラ−２、フルオ−４、フルオ−５、エクオリン、カルシウムグリーン−１、オレゴングリーン、４８８　ＢＡＰＴＡ、ＳＮＡＲＦ−１およびインド−１よりなる群から選ばれる、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
蛍光特性の変化が蛍光発光最大の強度の増加、発光最大の波長のシフト、または吸収最大の波長のシフトである、請求項１８または１９記載の方法。
【請求項２１】
ｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストの同定方法であって、
（ａ）物質が、ｇｂ１ａ受容体を発現するがｇｂ１ｂ受容体をもｇｂ１ｃ受容体をも発現しないメラノトローフ細胞系においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定すること、
（ｂ）該物質がｇｂ１ｂ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定すること、
（ｃ）該物質がｇｂ１ｃ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定することを含んでなり、
該物質が該メラノトローフ細胞系においてはＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するが、該ｇｂ１ｂ細胞においても該ｇｂ１ｃ細胞においても該応答を活性化しない場合には、該物質がｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストである、方法。
【請求項２２】
該メラノトローフ細胞系が、ｍＩＬ３９細胞およびｍＩＬ−ｔｓＡ５８細胞よりなる群から選ばれる、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該機能的応答が、イオンチャンネルの活性の調節、カルシウム濃度の変化、アゴニストと該ＧＡＢＡＢ受容体との相互作用により誘導されるプロモーターにより発現が制御されるレポーター遺伝子からのシグナルの変化、および膜電流の変化よりなる群から選ばれる、請求項２１または２２記載の方法。
【請求項２４】
膜電流の変化が、内向き整流性カリウム電流の活性の調節または電位依存性カルシウムチャンネルの活性の調節により生じる、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
該ｇｂ１ｂ細胞およびｇｂ１ｃ細胞が、いずれのＧＡＢＡＢ受容体サブユニットをも天然では発現しない細胞であり、機能的ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃ受容体を形成するようｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃサブユニットおよびｇｂ２サブユニットをコードする発現ベクターで形質転換された細胞である、請求項２１記載の方法。
【請求項２６】
ｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストの同定方法であって、
（ａ）アポエクオリンを発現するｇｂ１ａ細胞を準備すること、
（ｂ）該ｇｂ１ａ細胞内でエクオリンが形成されるよう、該ｇｂ１ａ細胞にセレンテラジンを装填すること、
（ｃ）物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ａ細胞においてカルシウムと該エクオリンとの相互作用により生じた発光を測定すること、
（ｄ）アポエクオリンを発現するｇｂ１ｂ細胞を準備すること、
（ｅ）該ｇｂ１ｂ細胞内でエクオリンが形成されるよう、該ｇｂ１ｂ細胞にセレンテラジンを装填すること、
（ｆ）該物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ｂ細胞においてカルシウムと該エクオリンとの相互作用により生じた発光を測定すること、
（ｇ）アポエクオリンを発現するｇｂ１ｃ細胞を準備すること、
（ｈ）該ｇｂ１ｃ細胞内でエクオリンが形成されるよう、該ｇｂ１ｃ細胞にセレンテラジンを装填すること、
（ｉ）該物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ｃ細胞においてカルシウムと該エクオリンとの相互作用により生じた発光を測定することを含んでなり、
該物質の不存在下より該物質の存在下で少ない発光が、工程（ｃ）では測定されるが、工程（ｆ）および工程（ｉ）では測定されない場合には、該物質がｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストである、方法。
【請求項２７】
ｇｂ１ｂヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）物質が、ｇｂ１ａサブユニットを含むＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストであることを判定すること、
（ｂ）該物質が、ｇｂ１ｂサブユニットを含むＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストではないことを判定することを含んでなる方法。
【請求項２８】
さらに以下の工程、すなわち、
（ｃ）該物質がシナプス後カリウム電流を活性化することを判定する工程、
（ｄ）該物質がＧＡＢＡ抑制性シナプス後電流を前シナプス的には抑制しないことを判定する工程、
（ｅ）該物質がＧＡＢＡＡ受容体のアゴニストではないことを判定する工程、
（ｆ）該物質が、電位依存性カルシウムチャンネルに負に共役したＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストであることを判定する工程の１以上を含む、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
ｇｂ１ｂヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）物質をｇｂ１ａ細胞およびｇｂ１ｂ細胞に別々にさらすこと、
（ｂ）該ｇｂ１ａ細胞およびｇｂ１ｂ細胞への該物質の結合を定量することを含んでなり、
該ｇｂ１ａ細胞への該物質の結合の量が、該ｇｂ１ｂ細胞への該物質の結合の量より少なくとも３倍大きい場合には、該物質が、ｇｂ１ｂヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的である、方法。
【請求項３０】
ｇｂ１ｂヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）ｇｂ１ａ細胞を準備すること、
（ｂ）物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ａ細胞をガバペンチンまたはプレガバリンにさらすこと、
（ｃ）該物質の存在下および不存在下の該ｇｂ１ａヘテロマーへのガバペンチンまたはプレガバリンの結合を測定すること、
ここで、工程（ｃ）におけるガバペンチンまたはプレガバリンの結合の量が、該物質の不存在下より該物質の存在下で少ない場合には、
（ｄ）該物質がｇｂ１ｂ細胞に結合するか否かを判定することを含んでなり、　該物質がｇｂ１ｂ細胞に結合しない場合には、該物質が、ｇｂ１ｂヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質である、方法。
【請求項３１】
該ｇｂ１ａ細胞が、ｇｂ２をコードする発現ベクターと、ｇｂ１ａをコードする発現ベクターとを含み、該ｇｂ１ａ細胞を、ｇｂ２およびｇｂ１ａが発現されｇｂ１ａヘテロマーが形成される条件下で培養し、
該ｇｂ１ｂ細胞が、ｇｂ２をコードする発現ベクターと、ｇｂ１ｂをコードする発現ベクターとを含み、該ｇｂ１ｂ細胞を、ｇｂ２およびｇｂ１ｂが発現されｇｂ１ｂヘテロマーが形成される条件下で培養する、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
ｇｂ１ｂヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質がｇｂ１ａ受容体の機能的応答を活性化するか否かを判定することを更に含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
ｇｂ１ｂヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞内で機能的ｇｂ１ａヘテロマーを形成するようｇｂ１ａおよびｇｂ２を発現しＫｉｒをも発現するアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞を準備すること、
（ｂ）該卵母細胞膜を横切るカリウムイオン流を観察しながら、工程（ａ）の卵母細胞を物質にさらすこと、
（ｃ）アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞内で機能的ｇｂ１ｂヘテロマーを形成するようｇｂ１ｂおよびｇｂ２を発現しＫｉｒをも発現するアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞を準備すること、
（ｄ）該卵母細胞膜を横切るカリウムイオン流を観察しながら、工程（ｃ）の卵母細胞を該物質にさらすことを含んでなり、
該物質への該卵母細胞の曝露が、工程（ｂ）ではカリウムイオン流の増加を引き起こすが工程（ｄ）では該増加を引き起こさない場合には、該物質が、ｇｂ１ｂヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質である、方法。
【請求項３４】
（ｉ）工程（ａ）の卵母細胞が、ｇｂ１ａ、ｇｂ２およびＫｉｒをコードするＲＮＡを微量注入されており、
（ｉｉ）工程（ｃ）の卵母細胞が、ｇｂ１ｂ、ｇｂ２およびＫｉｒをコードするＲＮＡを微量注入されている、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
工程（ｂ）および（ｄ）の観察をパッチクランプ記録により行う、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
ｇｂ１ｂヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）物質がｇｂ１ａ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定すること、
（ｂ）該物質がｇｂ１ｂ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定することを含んでなり、
該物質がｇｂ１ａ細胞においてはＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するが、ｇｂ１ｂにおいては該応答を活性化しない場合には、該物質が、ｇｂ１ｂヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的である、方法。
【請求項３７】
該機能的応答が細胞内カルシウムレベルの減少である、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
細胞内カルシウムレベルの減少をカルシウム指示色素の使用により測定する、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
該カルシウム指示色素が、フルオ−３、フラ−２、フルオ−４、フルオ−５、エクオリン、カルシウムグリーン−１、オレゴングリーン、４８８　ＢＡＰＴＡ、ＳＮＡＲＦ−１およびインド−１よりなる群から選ばれる、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
ｇｂ１ｂヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）ｇｂ１ａ細胞を準備すること、
（ｂ）該ｇｂ１ａ細胞にカルシウム指示色素を装填すること、
（ｃ）物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ａ細胞における該カルシウム指示色素の蛍光特性を測定すること、
（ｄ）ｇｂ１ｂ細胞を準備すること、
（ｅ）該ｇｂ１ｂ細胞にカルシウム指示色素を装填すること、
（ｆ）該物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ｂ細胞における該カルシウム指示色素の蛍光特性を測定することを含んでなり、
該物質の不存在下と比較した場合の該物質の存在下での蛍光特性の変化が工程（ｃ）では測定されるが、工程（ｆ）では測定されない場合には、該物質が、ｇｂ１ｂヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質である、方法。
【請求項４１】
該カルシウム指示色素が、フルオ−３、フラ−２、フルオ−４、フルオ−５、エクオリン、カルシウムグリーン−１、オレゴングリーン、４８８　ＢＡＰＴＡ、ＳＮＡＲＦ−１およびインド−１よりなる群から選ばれる、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
蛍光特性の変化が蛍光発光最大の強度の増加、発光最大の波長のシフト、または吸収最大の波長のシフトである、請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
ｇｂ１ｂヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）物質が、ｇｂ１ａ受容体を発現するがｇｂ１ｂ受容体を発現しないメラノトローフ細胞系においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定すること、
（ｂ）該物質がｇｂ１ｂ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定することを含んでなり、
該物質が該メラノトローフ細胞系においてはＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するが、該ｇｂ１ｂにおいては該応答を活性化しない場合には、該物質が、ｇｂ１ｂヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的である、方法。
【請求項４４】
該メラノトローフ細胞系が、ｍＩＬ３９細胞およびｍＩＬ−ｔｓＡ５８細胞よりなる群から選ばれる、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
該機能的応答が、イオンチャンネルの活性の調節、カルシウム濃度の変化、アゴニストと該ＧＡＢＡＢ受容体との相互作用により誘導されるプロモーターにより発現が制御されるレポーター遺伝子からのシグナルの変化、および膜電流の変化よりなる群から選ばれる、請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
膜電流の変化が、内向き整流性カリウム電流の活性の調節または電位依存性カルシウムチャンネルの活性の調節により生じる、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
該ｇｂ１ｂ細胞が、いずれのＧＡＢＡＢ受容体サブユニットをも天然では発現しない細胞であり、機能的ｇｂ１ｂ受容体を形成するようｇｂ１ｂサブユニットおよびｇｂ２サブユニットをコードする発現ベクターで形質転換された細胞である、請求項４３記載の方法。
【請求項４８】
ｇｂ１ｂヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）アポエクオリンを発現するｇｂ１ａ細胞を準備すること、
（ｂ）該ｇｂ１ａ細胞内でエクオリンが形成されるよう、該ｇｂ１ａ細胞にセレンテラジンを装填すること、
（ｃ）物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ａ細胞においてカルシウムと該エクオリンとの相互作用により生じた発光を測定すること、
（ｄ）アポエクオリンを発現するｇｂ１ｂ細胞を準備すること、
（ｅ）該ｇｂ１ｂ細胞内でエクオリンが形成されるよう、該ｇｂ１ｂ細胞にセレンテラジンを装填すること、
（ｆ）該物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ｂ細胞においてカルシウムと該エクオリンとの相互作用により生じた発光を測定することを含んでなり、
該物質の不存在下より該物質の存在下で少ない発光が、工程（ｃ）では測定されるが、工程（ｆ）では測定されない場合には、該物質が、ｇｂ１ｂヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的である、方法。
【請求項４９】
ｇｂ１ｃヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）物質が、ｇｂ１ａサブユニットを含むＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストであることを判定すること、
（ｂ）該物質が、ｇｂ１ｃサブユニットを含むＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストではないことを判定することを含んでなる方法。
【請求項５０】
さらに以下の工程、すなわち、
（ｃ）該物質がシナプス後カリウム電流を活性化することを判定する工程、
（ｄ）該物質がＧＡＢＡ抑制性シナプス後電流を前シナプス的には抑制しないことを判定する工程、
（ｅ）該物質がＧＡＢＡＡ受容体のアゴニストではないことを判定する工程、
（ｆ）該物質が、電位依存性カルシウムチャンネルに負に共役したＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストであることを判定する工程の１以上を含む、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
ｇｂ１ｃヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）物質をｇｂ１ａ細胞およびｇｂ１ｃ細胞に別々にさらすこと、
（ｂ）該ｇｂ１ａ細胞およびｇｂ１ｃ細胞への該物質の結合を定量することを含んでなり、
該ｇｂ１ａ細胞への該物質の結合の量が、該ｇｂ１ｃ細胞への該物質の結合の量より少なくとも３倍大きい場合には、該物質が、ｇｂ１ｃヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的である、方法。
【請求項５２】
ｇｂ１ｃヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）ｇｂ１ａ細胞を準備すること、
（ｂ）物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ａ細胞をガバペンチンまたはプレガバリンにさらすること、
（ｃ）該物質の存在下および不存在下の該ｇｂ１ａヘテロマーへのガバペンチンまたはプレガバリンの結合を測定すること、
ここで、工程（ｃ）におけるガバペンチンまたはプレガバリンの結合の量が、該物質の不存在下より該物質の存在下で少ない場合には、
（ｄ）該物質がｇｂ１ｃ細胞に結合するか否かを判定することを含んでなり、　該物質がｇｂ１ｃ細胞に結合しない場合には、該物質が、ｇｂ１ｃヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質である、方法。
【請求項５３】
該ｇｂ１ａ細胞が、ｇｂ２をコードする発現ベクターと、ｇｂ１ａをコードする発現ベクターとを含み、該ｇｂ１ａ細胞を、ｇｂ２およびｇｂ１ａが発現されｇｂ１ａヘテロマーが形成される条件下で培養し、
該ｇｂ１ｃ細胞が、ｇｂ２をコードする発現ベクターと、ｇｂ１ｃをコードする発現ベクターとを含み、該ｇｂ１ｃ細胞を、ｇｂ２およびｇｂ１ｃが発現されｇｂ１ｃヘテロマーが形成される条件下で培養する、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
ｇｂ１ｃヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質がｇｂ１ａ受容体の機能的応答を活性化するか否かを判定することを更に含む、請求項４９、５１または５２記載の方法。
【請求項５５】
ｇｂ１ｃヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞内で機能的ｇｂ１ａヘテロマーを形成するようｇｂ１ａおよびｇｂ２を発現しＫｉｒをも発現するアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞を準備すること、
（ｂ）該卵母細胞膜を横切るカリウムイオン流を観察しながら、工程（ａ）の卵母細胞を物質にさらすこと、
（ｃ）アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞内で機能的ｇｂ１ｃヘテロマーを形成するようｇｂ１ｃおよびｇｂ２を発現しＫｉｒをも発現するアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞を準備すること、
（ｄ）該卵母細胞膜を横切るカリウムイオン流を観察しながら、工程（ｃ）の卵母細胞を該物質にさらすことを含んでなり、
該物質への該卵母細胞の曝露が、工程（ｂ）ではカリウムイオン流の増加を引き起こすが工程（ｄ）では該増加を引き起こさない場合には、該物質が、ｇｂ１ｃヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質である、方法。
【請求項５６】
（ｉ）工程（ａ）の卵母細胞が、ｇｂ１ａ、ｇｂ２およびＫｉｒをコードするＲＮＡを微量注入されており、
（ｉｉ）工程（ｃ）の卵母細胞が、ｇｂ１ｃ、ｇｂ２およびＫｉｒをコードするＲＮＡを微量注入されている、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
工程（ｂ）および（ｄ）の観察をパッチクランプ記録により行う、請求項５５または５６記載の方法。
【請求項５８】
ｇｂ１ｃヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）物質がｇｂ１ａ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定すること、
（ｂ）該物質がｇｂ１ｃ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定することを含んでなり、
該物質がｇｂ１ａ細胞においてはＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するが、ｇｂ１ｃにおいては該応答を活性化しない場合には、該物質が、ｇｂ１ｃヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的である、方法。
【請求項５９】
該機能的応答が細胞内カルシウムレベルの減少である、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
細胞内カルシウムレベルの減少をカルシウム指示色素の使用により測定する、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
該カルシウム指示色素が、フルオ−３、フラ−２、フルオ−４、フルオ−５、エクオリン、カルシウムグリーン−１、オレゴングリーン、４８８　ＢＡＰＴＡ、ＳＮＡＲＦ−１およびインド−１よりなる群から選ばれる、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
ｇｂ１ｃヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）ｇｂ１ａ細胞を準備すること、
（ｂ）該ｇｂ１ａ細胞にカルシウム指示色素を装填すること、
（ｃ）物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ａ細胞における該カルシウム指示色素の蛍光特性を測定すること、
（ｄ）ｇｂ１ｃ細胞を準備すること、
（ｅ）該ｇｂ１ｃ細胞にカルシウム指示色素を装填すること、
（ｆ）該物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ｃ細胞における該カルシウム指示色素の蛍光特性を測定することを含んでなり、
該物質の不存在下と比較した場合の該物質の存在下での蛍光特性の変化が工程（ｃ）では測定されるが、工程（ｆ）では測定されない場合には、該物質が、ｇｂ１ｃヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質である、方法。
【請求項６３】
該カルシウム指示色素が、フルオ−３、フラ−２、フルオ−４、フルオ−５、エクオリン、カルシウムグリーン−１、オレゴングリーン、４８８　ＢＡＰＴＡ、ＳＮＡＲＦ−１およびインド−１よりなる群から選ばれる、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
蛍光特性の変化が蛍光発光最大の強度の増加、発光最大の波長のシフト、または吸収最大の波長のシフトである、請求項６２記載の方法。
【請求項６５】
ｇｂ１ｃヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）物質が、ｇｂ１ａ受容体を発現するがｇｂ１ｃ受容体を発現しないメラノトローフ細胞系においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定すること、
（ｂ）該物質がｇｂ１ｃ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定することを含んでなり、
該物質が該メラノトローフ細胞系においてはＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するが、該ｇｂ１ｃにおいては該応答を活性化しない場合には、該物質が、ｇｂ１ｃヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的である、方法。
【請求項６６】
該メラノトローフ細胞系が、ｍＩＬ３９細胞およびｍＩＬ−ｔｓＡ５８細胞よりなる群から選ばれる、請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
該機能的応答が、イオンチャンネルの活性の調節、カルシウム濃度の変化、アゴニストと該ＧＡＢＡＢ受容体との相互作用により誘導されるプロモーターにより発現が制御されるレポーター遺伝子からのシグナルの変化、および膜電流の変化よりなる群から選ばれる、請求項６５記載の方法。
【請求項６８】
膜電流の変化が、内向き整流性カリウム電流の活性の調節または電位依存性カルシウムチャンネルの活性の調節により生じる、請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
該ｇｂ１ｃ細胞が、いずれのＧＡＢＡＢ受容体サブユニットをも天然では発現しない細胞であり、機能的ｇｂ１ｃ受容体を形成するようｇｂ１ｃサブユニットおよびｇｂ２サブユニットをコードする発現ベクターで形質転換された細胞である、請求項６７記載の方法。
【請求項７０】
ｇｂ１ｃヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）アポエクオリンを発現するｇｂ１ａ細胞を準備すること、
（ｂ）該ｇｂ１ａ細胞内でエクオリンが形成されるよう、該ｇｂ１ａ細胞にセレンテラジンを装填すること、
（ｃ）物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ａ細胞においてカルシウムと該エクオリンとの相互作用により生じた発光を測定すること、
（ｄ）アポエクオリンを発現するｇｂ１ｃ細胞を準備すること、
（ｅ）該ｇｂ１ｃ細胞内でエクオリンが形成されるよう、該ｇｂ１ｃ細胞にセレンテラジンを装填すること、
（ｆ）該物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ｃ細胞においてカルシウムと該エクオリンとの相互作用により生じた発光を測定することを含んでなり、
該物質の不存在下より該物質の存在下で少ない発光が、工程（ｃ）では測定されるが、工程（ｆ）では測定されない場合には、該物質が、ｇｂ１ｃヘテロマーと対比してｇｂ１ａヘテロマーに特異的である、方法。
【請求項７１】
ｇｂ１ｂサブタイプ特異的アゴニストの同定方法であって、
（ａ）物質がｇｂ１ａ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定すること、
（ｂ）該物質がｇｂ１ｂ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定すること、
（ｃ）該物質がｇｂ１ｃ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定することを含んでなり、
該物質が該ｇｂ１ｂ細胞においてはＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するが、該ｇｂ１ａ細胞においてもｇｂ１ｃ細胞においても該応答を活性化しない場合には、該物質がｇｂ１ｂサブタイプ特異的アゴニストである、方法。
【請求項７２】
ｇｂ１ｃサブタイプ特異的アゴニストの同定方法であって、
（ａ）物質がｇｂ１ａ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定すること、
（ｂ）該物質がｇｂ１ｂ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定すること、
（ｃ）該物質がｇｂ１ｃ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定することを含んでなり、
該物質が該ｇｂ１ｃ細胞においてはＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するが、該ｇｂ１ａ細胞においてもｇｂ１ｂ細胞においても該応答を活性化しない場合には、該物質がｇｂ１ｃサブタイプ特異的アゴニストである、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ｇｂ１ａおよびｇｂ２サブユニットのヘテロマーであるＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストであるがｇｂ１ｂおよびｇｂ２サブユニットまたはｇｂ１ｃおよびｇｂ２サブユニットのヘテロマーであるＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストではない物質の同定方法を提供する。該物質は、ｇｂ２サブユニットと共に他の代替的ｇｂ１アイソフォームを含むＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストでもない。
【０００２】
（発明の背景）
ＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）は、脊椎動物の中枢神経系における最も広範に分布しているアミノ酸抑制性神経伝達物質である。神経軸におけるＧＡＢＡの主な生理的役割はシナプス抑制である。
【０００３】
ＧＡＢＡの生物活性は、３つのタイプのＧＡＢＡ受容体（イオンチャンネル型ＧＡＢＡＡ受容体、代謝型ＧＡＢＡＢ受容体およびイオンチャンネル型ＧＡＢＡＣ受容体）により媒介される。ＧＡＢＡＡ受容体は、ベンゾジアゼピン、バルビツール酸誘導体および神経ステロイドによりアロステリック調節されるシナプス後塩素イオンコンダクタンスを活性化することにより、速いシナプス抑制を伝達する（Ｍｏｄｙら，１９９４，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：５１７−５２５）。ＧＡＢＡＢ受容体は、海馬長期電位、徐波睡眠に関与する、より遅い、より長く持続するシナプス抑制作用を媒介する（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９２：２−７およびそれに記載の参考文献）。ＧＡＢＡＢ受容体は、Ｇタンパク質を介したＧＡＢＡによる遅いシナプス抑制を媒介することにより、遅い抑制性シナプス後電位（ＩＰＳＰ）の媒介において何らかの役割を果たしている。これは、Ｋ＋チャンネルの活性化から生じると考えられている（Ｍｏｄｙら，１９９４，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：５１７−５２５）。シナプス前ＧＡＢＡＢ受容体活性化は、一般には、Ｃａ２＋コンダクタンスの抑制を引き起こし、神経伝達物質の誘発遊離の減少を招くと報告されている（Ａｎｄｒａｄｅら，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３４：１２６１−１２６５；Ｔａｋａｈａｓｈｉら，１９９８，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：３１３８−３１４６）。ＧＡＢＡＢ受容体の生理的役割の多くは、シナプス前受容体によるＰ／Ｑ型（α１Ａ、α２δ、β１サブユニット）およびＮ型（α１Ｂ、α２δ、β１サブユニット）電位依存性カルシウムチャンネル（ＶＤ−ＣＣ）の調節、ならびにシナプス後ＧＡＢＡＢ受容体による内向き整流性Ｋ＋チャンネル（ＧＩＲＫ）の調節によるものであると考えられる（Ｂｏｗｅｒｙ　＆　Ｅｎｎａ，２０００，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９２：２−７およびそれに記載の参考文献）。薬理学的に異なる受容体サブタイプがシナプス前およびシナプス後作用を媒介することが示唆されているが（Ｗｏｊｃｉｋ　＆　Ｎｅｆｆ，１９８４，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２５：２４−２８；Ｂｏｎａｎｎｏら，１９９７，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２０：６０−６４：Ｂｏｎａｎｎｏ　＆　Ｒａｉｔｅｒｉ，１９９３，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２６５：７６５−７６８；総説としてはＫｅｒｒ　＆　Ｏｎｇ，１９９５を参照されたい）、これは、現在までの分子的研究では明らかにされていない。
【０００４】
ＶＤ−ＣＣ機能のＧＡＢＡＢ受容体調節は、膜Ｃａ２＋コンダクタンスの抑制および神経伝達物質放出の減少（Ｄｏｚｅら，１９９５，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．７４：４３−５３；Ｗｕ　＆　Ｓａｇｇａｕ，１９９７，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０：２０４−２１２）を引き起こす膜限定メカニズムを介したＧタンパク質βγサブユニットにより媒介されると考えられている（Ｈｅｒｌｉｔｚｅら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ　３８０：２５８−２６２；Ｉｋｅｄａら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ　３８０：２５５−２５８）。ＶＤ−ＣＣに負に共役したシナプス前ＧＡＢＡＢ受容体の活性化は、おそらく、脊髄切片におけるカルシトニン遺伝子関連ペプチドおよびサブスタンスＰのような疼痛伝達物質の遊離を抑制すると報告されている原型非選択的ＧＡＢＡＢ受容体アゴニストであるバクロフェンおよびＧＡＢＡの抗痛覚効果の基礎をなすメカニズムであろう（Ｍａｌｃａｎｇｉｏ　＆　Ｂｏｗｅｒｙ，１９９３，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２６６：１４９０−１４９６）。バクロフェンは、脳卒中または脊髄損傷後の中枢痛の治療のために鞘内に投与された場合にも有効であると報告されている（Ｌｏｕｂｓｅｒ　＆　Ａｋｍａｎ，１９９６，Ｐａｉｎ　Ｓｙｍｐｔ．Ｍｇｍｔ．１２：２４１−２４７）。しかし、より広範なその臨床的用途は、効力のために必要な用量（ｐ．ｏ．）が弛緩状態および筋緊張低下を伴うため、限定されたものとなっている。
【０００５】
ＧＡＢＡＢ受容体は、ニューロン性Ｋ＋またはＣａ２＋チャンネルに共役した７回膜貫通伸長Ｇタンパク質共役受容体のスーパーファミリーに属する。ＧＡＢＡＢ受容体の活性化はＫ＋コンダクタンスを増加させ、あるいはＣａ２＋コンダクタンスを減少させ、また、刺激されたアデニリルシクラーゼ活性を抑制または増強する。ＧＡＢＡＢ受容体の発現は、哺乳類神経軸（例えば、前頭皮質、海馬、小脳、視床、脊髄、背根神経節）内に広範に分布し、多数の末梢器官においても観察されている（Ｂｅｌｌｅｙら，１９９９，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．７：２６９７−２７０４）。
【０００６】
多数の薬理学的活性はＧＡＢＡＢ受容体の活性化によるものだと考えられている（例えば、無痛覚症；低体温症；緊張病；低血圧；記憶の固定および保持の減少；およびインスリン、成長ホルモンおよびグルカゴンの放出の刺激）（総説としては、Ｂｏｗｅｒｙ，１９８９，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１０：４０１−４０７を参照されたい）。ＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストおよびアンタゴニストは、強直人間症候群、胃食道逆流、ニューロパシー的疼痛、失禁ならびに咳およびコカイン中毒のような適応症において薬理学的に有用であることが十分に認められている。例えば、ＧＡＢＡＢ受容体アゴニストである、（＋）バクロフェンとのラセミ混合物の一部としての（−）バクロフェン（これはＧＡＢＡの構造類似体である）は、臨床的に有効な筋弛緩剤である（Ｂｏｗｅｒｙ　＆　Ｐｒａｔｔ，１９９２，Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈ．／Ｄｒｕｇ　Ｒｅｓ．４２：２１５−２２３）。（±）バクロフェンは、ＬＩＯＲＥＳＡＬ（登録商標）の名称で筋弛緩剤として１９７２年から米国で販売されている。
【０００７】
機能的ＧＡＢＡＢ受容体は、代謝型グルタミン酸受容体に類似した特徴を有する２つのタンパク質サブユニット（すなわち、シグナルペプチド配列、およびそれに続く、細菌ペリプラズム　ロイシン、イソロイシン、バリン結合ＬＩＶ−ＢＰタンパク質に対する構造的類似性を共有するリガンド結合ポケットに相当すると考えられる大きなＮ末端ドメイン）の共発現の後に生じる。この推定細胞外リガンド結合ドメインは７つの膜貫通伸長ドメインに先行する。代謝型グルタミン酸受容体およびＧＡＢＡＢ受容体タンパク質はほとんどのＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）より相当に大きいが、特徴的な７つの膜貫通伸長ドメインはＧＰＣＲに典型的なものである。それらの２つのＧＡＢＡＢ受容体ｇｂ１およびｇｂ２サブユニットタンパク質の組換え発現は、一緒になって又は単独で、両方のタンパク質が十中八九はヘテロ二量体として同一細胞内で発現された場合にのみ、機能的ＧＡＢＡＢ受容体が形成されることを示した（Ｊｏｎｅｓら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ　３９６：６７４−６７９；Ｗｈｉｔｅら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ　３９６：６７９−６８２；Ｋａｕｐｍａｎら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ　３９６：６８３−６８７；Ｋｕｎｅｒら，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８３：７４−７７；Ｎｇら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：７６０７−７６１０；および国際特許公開ＷＯ９９／４０１１４）。
【０００８】
ＧＡＢＡＢ受容体ヘテロ二量体は、ＧＡＢＡＢＲ１ａとして公知のサブユニット（またはＧＡＢＡＢＲ１ｂとして公知のスプライス変異体）（Ｋａｕｐｍａｎｎら，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ　３８６：２３９−２４６）と、ＧＡＢＡＢＲ２（Ｗｈｉｔｅ，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ　３９６：６７９−６８２；およびＪｏｎｅｓら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ　３９６：６７４−６７９）、ＧＢＲ２（Ｋｕｎｅｒら，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８３：７４−７７）、ｇｂ２（Ｎｇら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４；７６０７−７６１０）またはＨＧ２０（国際特許公開ＷＯ９９／４０１１４）の様々な名称で知られているサブユニットとから構成される。ＧＡＢＡＢＲ１ａの第３のスプライス変異体が、Ｎｇら，２００１，Ｍｏｌ　Ｐｈａｒｍ．５９：１４４−１５２に報告されている。この第３の変異体は、ＧＡＢＡＢＲ１ａがｇｂ１ａと称されＧＡＢＡＢＲ１ｂがｇｂ１ｂと称されるＮｇらにより使用されている命名法により、ｇｂ１ｃとして公知である。ＧＡＢＡＢ受容体ヘテロ二量体は、一般には、機能的ＧＡＢＡＢ受容体であると認められている。しかし、ＧＡＢＡＢ受容体の単量体またはホモ二量体が或る細胞環境中に存在する場合に機能的であるという可能性が、尚も残されている（Ｋｕｎｅｒら，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８３：７４−７７；Ｋａｕｐｍａｎｎら，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ　３８６：２３９−２４６；Ｋａｕｐｍａｎｎら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ　３９６：６８３−６８７）。
【０００９】
ガバペンチン（ｇａｂａｐｅｎｔｉｎ）（ＮＥＵＲＯＮＴＩＮ（登録商標）、１−（アミノメチル）シクロヘキサン酢酸）は、痙直の治療および多シナプス性脊髄反射の軽減のために、ＧＡＢＡの脳浸透性構造類似体として開発された（Ｂｒｙａｎｓ　＆　Ｗｕｓｔｒｏｗ，１９９９，Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１９：１４９−１７７およびそれに記載の参考文献に概説されている）。ガバペンチンは、難治性部分発作および続発性全汎性強直間代発作の治療に使用される抗痙攣剤である。それは気分安定化特性を有すると提示されており、糖尿病性神経障害、ヘルペス後神経痛などの或る種の神経障害において有用でありうる。ガバペチン単独療法は、糖尿病性末梢性神経障害に関連する疼痛および睡眠障害の治療に有効であるらしく、気分および生活の質に対して正の効果を示す（Ｒｏｗｂｏｔｈａｍら，１９９８，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｎ．２８０：１８３７−１８４２）。有効な治療を多数の患者において逃れる帯状ヘルペス（帯状疱疹）後のしばしば難治性である神経障害性疼痛の症候群であるヘルペス後神経痛（ＰＨＮ）の治療にも、ガバペンチンが有効である。ＰＨＮ患者の気分および生活の質も、ガバペンチン療法で改善される（Ｒｏｗｂｏｔｈａｍら，１９９８，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｎ．２８０：１８３１−１８３６）。
【００１０】
ガバペンチンは、薬物耐性部分てんかんの患者における部分発作の数の減少に有効であることが示されている（Ｕ．Ｋ．Ｇａｂａｐｅｎｔｉｎ　Ｓｔｕｄｙ　Ｇｒｏｕｐ，１９９０，Ｌａｎｃｅｔ，３３５：１１１４−１１１７）。ガバペンチンは、神経変性障害、例えば筋萎縮性側索硬化症、コカイン中毒および種々の精神医学的障害、例えば双極性異常での使用に関して研究されており、不安寛解剤として有用でありうる（Ｂｒｙａｎｓ　＆　Ｗｕｓｔｒｏｗ，１９９９，Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１９：１４９−１７７およびそれに記載の参考文献に概説されている）。それは炎症痛モデルにおいて抗痛覚過敏作用を有することが示されている（Ｆｉｅｌｄら，１９９７，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２１：１５１９−１５２２）。
【００１１】
ガバペンチンは、ＶＤ−ＣＣの抑制を介して新皮質シナプトソーム内のＫ＋誘発性Ｃａ２＋上昇を抑制し（Ｆｉｎｋら，２０００，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３０：９００−９０６；Ｓｔｅｆａｎｉら，１９９８，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　３７：８３−９１）、新皮質および海馬切片からのＫ＋誘発性グルタミン酸放出を減少させる（Ｄｏｏｌｅｙら，２０００，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔｓ．２８０：１０７−１１０）と報告されている。ガバペンチンはまた、脊髄後角における興奮性神経伝達物質放出を抑制すると報告されている（Ｓｈｉｍｏｙａｍａら，２０００，Ｐａｉｎ　８５：４０５−４１４；Ｐａｔｅｌら，２０００，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３０：１７３１−１７３４）。最近、ガバペンチンは、ｇｂ１ｂ−ｇｂ２またはｇｂ１ｃ−ｇｂ２サブタイプにおける部分アゴニストまたはアンタゴニスト活性を伴わないＧＩＲＫに共役したニューロンＧＡＢＡＢ受容体および組換えｇｂ１ａ−ｇｂ２へテロ二量体における選択的アゴニストであることが報告された（Ｎｇら，２００１，Ｍｏｌ　Ｐｈａｒｍ．５９：１４４−１５２）。
【００１２】
ガバペンチンの作用機構は、これまでに多くの研究の対象とされてきたが、一致した見解は得られていない。種々の仮説が提案されている。例えば、Ｔａｙｌｏｒら，１９９８，Ｅｐｉｌｅｐｓｙ　Ｒｅｓ．２９：２３３−２４９は以下の可能性を挙げている：（１）ガバペンチンは、特異的アミノ酸輸送体（Ｌ系）を介して体内のいくつかの膜関門を通過し、輸送に関してロイシン、イソロイシン、バリンおよびフェニルアラニンと競合する；（２）ガバペンチンは、脳内のＧＡＢＡの濃度、および恐らくはその合成速度を増加させる；（３）ガバペチンは、電位感受性カルシウムチャンネルの補助サブユニットに関連した脳組識内の結合部位に高いアフィニティーで結合する；（４）ガバペンチンは、いくつかのモノアミン神経伝達物質の放出を減少させる；（５）ガバペンチンは、電位活性化ナトリウムチャンネルを阻害する；（６）ガバペンチンは、神経行動的作用に関連している可能性があるヒト全血中のセロトニン濃度を増加させる；および（７）ガバペンチンは神経死を防ぐ。また、ガバペンチンの考えられうる作用機構を考察している他の参考文献に関しては、Ｔａｙｌｏｒ，１９９７，Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｌ．（Ｐａｒｉｓ）１５３（Ｓｕｐｐｌ）１：Ｓ３９−Ｓ４５およびＢｒｏｗｎ　＆　Ｇｅｅ，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２５４５８−２５４６５を参照されたい。
【００１３】
ガバペンチンは、電位依存性カルシウムチャンネル（ＶＤ−ＣＣ）の補助α２δサブユニットにナノモルのアフィニティーで結合すると報告されている（Ｇｅｅら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：５７６８−５７７６）。しかし、現在のところ、この結合に対する直接的な機能的相関性は報告されておらず、これがガバペンチンの抗痙攣作用、抗痛覚過敏作用および抗侵害受容作用を説明するものであるかどうかは明らかではない（Ｔａｙｌｏｒら，１９９８，Ｅｐｉｌｅｐｓｙ　Ｒｅｓ．２９：２３３−２４９）。ガバペンチンは、培養げっ歯類ニューロンにおける（Ｒｏｃｋら，１９９３，Ｅｐｉｌｅｐｓｙ　Ｒｅｓ．１６：８９−９８）および側頭葉てんかんの患者からの急性解離ヒト歯状回顆粒細胞（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら，１９９８，Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ　３９：３５５−３６３）におけるＶＤ−ＣＣに何ら影響を及ぼさないと報告されている。しかし、ガバペンチンは、単離されたラット新皮質、線条体および淡蒼球ニューロンにおける主にＬ型カルシウム電流を抑制すると報告されている（Ｓｔｅｆａｎｉら，１９９８，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　３７：８３−９１）。つい最近、ガバペンチンは、ラット新皮質および海馬切片からのＫ＋誘発性グルタミン酸放出を抑制することが判明した（Ｆｉｎｋら，２０００，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３０：９００−９０６；Ｄｏｏｌｅｙら，２０００，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔｓ．２８０：１０７−１１０）。しかし、これらのガバペンチンの作用の基礎をなすメカニズムは解明されなかった。
【００１４】
ガバペンチンがＧＡＢＡＢ受容体を介して作用するのではないと考えられていることは、注目に値する。Ｔｈｅ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　ａｎｄ　Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ，第３３版，１９８８，ｐｐ．１１０１−１１０２，Ｃａｎａｄｉａｎ　Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｏｔｔａｗａ，ＯＮ，ＣＡを参照されたい。この刊行物には、ガバペンチンは「ＧＡＢＡ受容体とは相互作用しない」と記載されている。また、Ｒｏｗｂｏｔｈａｍら，１９９８，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｎ，２８０：１８３７−１８４２，ｐ．１８３８を参照されたい。この文献には、「その（すなわち、ガバペンチンの）作用機構は未だ完全には解明されていないが、ＧＡＢＡ受容体への結合には関与しないらしい（Ｇｏａ　＆　Ｓｏｒｋｉｎ，１９９３，Ｄｒｕｇｓ　４６：４０９−４２７を引用）」と記載されている。Ｆｉｅｌｄら，１９９７，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２１：１５１３−１５２２は、「ガバペンチンは元々は、ＣＮＳ内に浸透するＧＡＢＡ類似体として設計されたが、それはＧＡＢＡＡまたはＧＡＢＡＢ受容体のいずれとも相互作用しない・・・」と記載している。
【００１５】
（発明の概要）
本発明は、ｇｂ１ａおよびｇｂ２サブユニットのヘテロマーであるＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストである物質の同定方法に関する。ここで、該物質は、ｇｂ１ｂおよびｇｂ２サブユニット、ｇｂ１ｃおよびｇｂ２サブユニットまたは他のｇｂ１−ｇｂ２ヘテロマーサブタイプのヘテロマーであるＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストではない。該物質は、シナプス前カルシウム電流を抑制し、シナプス後カリウム電流を活性化し、細胞体（ｓｏｍａｔｉｃ）カルシウム電流を抑制する。該物質は、マウス中葉下垂体腫瘍に由来するメラノトローフ細胞系（メラニン細胞刺激ホルモン産生細胞系）およびＨＥＫ−２９３細胞のような異種発現系における電位依存性カルシウムチャンネルに負に共役したＧＡＢＡＢ受容体ならびにツメガエル卵母細胞における内向き整流性Ｋ＋チャンネルに共役したＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストである。該物質はまた、ラット海馬ニューロンおよび脊髄ニューロンにおける電位依存性カルシウムチャンネルに負に共役したＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストである。該物質は、ＧＡＢＡＡ受容体のアゴニストではなく、バクロフェンと比較してエフェクター経路に対する高い選択性および異なる活性化メカニズム（すなわち、ＧＡＢＡＢ受容体における迅速な脱感作）を示す。
【００１６】
前記に概説した特徴の組合せは、ガバペンチンにより所有されており、本発明の方法により同定された物質が、精神医学的障害、例えば双極性異常、社会恐怖症および不安；てんかん及び他の痙攣性障害；胃食道逆流；コカイン中毒；神経変性障害、例えば筋萎縮性側索硬化症；および多発性慢性疼痛状態、例えば糖尿病性神経障害またはヘルペス後神経痛のような状態の治療においてガバペンチンと同様に有用であると予想される物質のクラスを代表することを示している。
【００１７】
（図面の簡単な記載）
図１Ａは、ヒトｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂ、ｇｂ１ｃアイソフォームの細胞外Ｎ末端ドメインのアミノ酸アライメントを示す。ｇｂ１の提案されているシグナルペプチド切断部位が、はさみで示されている。推定Ｎグリコシル化部位（▼）が示されており、矢印（→）はスシドメイン（ＳＵ）の境界を定める。矢印（→）は、ＬＩＶ−ＢＰ様ドメインの開始部位を示す。間隙（．．．）は、アライメントを最大にするために導入した。示されているｇｂ１ａ配列は配列番号２の一部である。示されているｇｂ１ｃ配列は配列番号８の一部である。示されているｇｂ１ｂ配列は配列番号６の一部である。図１Ｂは、ＧＡＢＡＢヘテロマーアゴニストであるＧＡＢＡおよびバクロフェンならびにｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストであるガバペンチンの構造を示す。
【００１８】
図２Ａ〜Ｆは、種々のｇｂ１／ｇｂ２ヘテロマーによるツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞におけるＫｉｒ３．１／３．２の調節を示す。卵母細胞を−８０ｍＶに保持することにより、電流を測定した。各軌跡における黒の棒線は、ＫＤ−９８溶液での卵母細胞の潅流から１００μＭ　ＧＡＢＡ含有溶液への変化を示す。白の棒線は、１００μＭ　ガバペンチンでの潅流の開始を示す。ヒトｇｂ２とマウスｇｂ１ａ（図２Ａ）、ヒトｇｂ１ａ（図２Ｂ）、ｇｂ１ｂ（図２Ｃ）またはｇｂ１ｃ（図２Ｄ）との共発現。対照軌跡：Ｋｉｒ３．２と共発現させたＭ２ムスカリン受容体（図２Ｅ）またはβ２ＡＲ（図２Ｆ）。β２アドレナリン作動性受容体の場合には、ウシＧｓαサブユニットも共発現させることが必要であった。矢印は、ＧＡＢＡ媒介性またはガバペンチン媒介性受容体活性化に関する異なるパターンの脱感作を示す。各軌跡は、異なる卵母細胞上で行った少なくとも４つの独立した実験の代表例である。
【００１９】
図３Ａ〜Ｂは、ガバペンチンが、ｇｂ１ａ受容体ヘテロマーを介した場合にのみ、Ｋｉｒ３．１／３．２を調節することを示している。図３Ａは、基礎電流（１．０に設定）に対するガバペンチンまたはＧＡＢＡによるＫｉｒ３．１／３．２電流の刺激倍率を示している。刺激倍率は、ＫＤ−９８溶液中で測定した基礎電流で最大リガンド刺激電流を割り算することにより計算した。ＧＡＢＡ（同一濃度におけるもの）の効果は、常に、ガバペンチンの場合より有意に大きいことに注目すべきである。図３Ｂは、ｇｂ１ａ／ｇｂ２におけるＧＡＢＡＢリガンドに関する用量反応関係を示す。マウスｇｂ１ａとヒトｇｂ２との共発現は、用量依存的にＫｉｒ３．１／３．２における調節を引き起こす。電流を、ＧＡＢＡ、ガバペンチンまたはバクロフェンの種々の用量において測定し、該基礎電流に対して正規化した。多数の実験（３つの用量反応曲線上の各点に関して少なくともｎ＝４）からの平均データを集め、ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍ　ｖ２．０を使用してヒル式にあてはめた。陽性対照として、Ｍ２ムスカリン受容体（１μＭ　カルバコール、ｎ＝６）に対する又はβ２アドレナリン作動性受容体（Ｇｓαと共発現したもの、１μＭ　イソプロテレノール、ｎ＝１７）に対するＫｉｒ３．２（Ｋｉｒ３．１の不存在下で発現したもの）の反応を測定した。
【００２０】
図４は、ガバペンチンが、ｉｎ　ｓｉｔｕでＣＡ１錐体細胞におけるＧＡＢＡＢ受容体を介してカリウム電流を活性化することを示している。（Ａ）ガバペンチンにさらされたビオシチンで満たされたＣＡ１錐体ニューロンの顕微鏡写真。目盛り記号、１００μｍ。（Ｂ）対照であるＡＣＳＦにおいて及び１ｍＭ　ガバペンチンの存在下（Ｇｐ，Ｂ１）、−６０から−１６０ｍＶへの電圧傾斜において、Ｉ−Ｖ関係を得た。対照ＡＣＳＦにおけるＩ−Ｖ関係からの電流をガバペンチンの存在下の電流から差し引くことにより、ガバペンチン電流（Ｂ２）を分離した。Ｂ２における１ｍＭ　ガバペンチンにより誘発された電流を、Ｂ１に示す軌跡から得た。ガバペンチンは、−６０〜−１００ｍＶの膜電位において外向き電流を誘発した。同じ細胞において、ガバペンチン電流の大きさは用量の増加（０．１〜１ｍＭ）と共に増加した。（Ｃ）２〜２０μＭ　バクロフェンの浴（バス）適用は、ＣＡ１錐体細胞において、比較しうる逆転電位で、同様のカリウム電流を誘発した。（Ｄ）バクロフェンおよびガバペンチン電流の平均索（ｃｈｏｒｄ）コンダクタンス（−８０ｍＶで測定した）は、用量依存的に増加した（各棒グラフの上の数字は被検細胞数を示す）。ガバペンチンの用量反応関係は、バクロフェンの場合より約１０倍高くシフトした。ガバペンチン（１ｍＭ）およびバクロフェン（２０μＭ）カリウム電流の平均索コンダクタンスはＧＡＢＡＢアンタゴニストＣＧＰ５５８４５（それぞれ４および１μＭの濃度）により遮断された。
【００２１】
図５は、海馬におけるＧＡＢＡシナプス伝達のシナプス前ＧＡＢＡＢ抑制：ガバペンチンの無効性およびバクロフェンの有効性を示す。（Ａ）錐体細胞からのホールセル電位固定（ボルテージクランプ）記録中の、グルタミン酸シナプス伝達のブロッカー（２０μＭ　ＣＮＱＸおよび５０μＭ　ＡＰ５）の存在下での放線状層における抑制性繊維の電気的刺激による単シナプスの速いＧＡＢＡＡ　ＩＰＳＣの誘発のための実験配置。（Ｂ）静止膜電位では、刺激は、対照ＡＣＳＦ（ＣＮＱＸおよびＡＰ５を伴う）において、速い外向きＩＰＳＣを誘発した。ＩＰＳＣは、２０μＭ　バクロフェンの浴適用中に抑制された。（Ｃ）これとは対照的に、１ｍＭ　ガバペンチンの浴適用中では、ＩＰＳＣは、対照と比較して最小限の影響を受けたに過ぎなかった。（Ｄ）バクロフェンによるＩＰＳＣの平均減少は用量依存的であり（２〜２０μＭ）、２０μＭ　バクロフェンのシナプス前作用は１μＭのＧＡＢＡＢアンタゴニストＣＧＰ５５８４５により完全に拮抗された。ガバペンチンは、０．１〜１ｍＭの濃度で、ＩＰＳＣ振幅におけるそのような減少を引き起こさなかった。棒グラフの上の数字は、各条件における被検細胞数を示す。ガバペンチンの存在下の小さな平均減少は、対照ＡＣＳＦ（ＣＮＱＸおよびＡＰ５を伴う；斜線の棒グラフ）の反復適用または４μＭ　ＣＧＰ５５８４５の適用中に認められたものと有意には異ならなかった。
【００２２】
図６Ａ〜Ｂは、ヒトｇｂ１ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２２５０２８）のｃＤＮＡ配列（配列番号１）を示し、図６Ｃは、ヒトｇｂ１ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２２５０２８）のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【００２３】
図７Ａ〜Ｂは、マウスｇｂ１ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１１４１６８）のｃＤＮＡ配列（配列番号３）を示し、図７Ｃは、マウスｇｂ１ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１１４１６８）のアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【００２４】
図８Ａは、ヒトｇｂ１ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２２５０２９）のｃＤＮＡ配列（配列番号５）を示し、図８Ｂは、ヒトｇｂ１ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２２５０２９）のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【００２５】
図９Ａは、ヒトｇｂ１ｃ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ０１２１８７）のｃＤＮＡ配列（配列番号７）を示し、図９Ｂは、ヒトｇｂ１ｃ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ０１２１８７）のアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【００２６】
図１０Ａ〜Ｂは、ヒトｇｂ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０５８７９５）のｃＤＮＡ配列（配列番号９）を示し、図１０Ｃは、ヒトｇｂ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０５８７９５）のアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。
【００２７】
図１１は、ｇｂ１ａヘテロマーを内因的に発現するｍＩＬ細胞におけるＶＤ−ＣＣの高Ｋ＋誘発性活性化に対するＧＡＢＡＢリガンドの薬理学的作用を示す。パネルＡは、高い細胞外Ｋ＋濃度による脱分極に応答した［Ｃａ２＋］の急激な増加、およびそれに続く、より遅い第２のピークまたはショルダーを示している。パネルＢは、バクロフェン（１μＭ）が該一次応答を減少させることを示している。パネルＣは、バクロフェンの効果（１μＭ）が３μＭ　ＣＧＰ５５８４５の添加により完全に逆転されることを示している。ＣＰＧ５５８４５（３μＭ）は、脱分極に対するｍＩＬ細胞の応答に対して何ら有意な影響を及ぼさない（パネルＤ）。パネルＥは、１μＭ　ガバペンチンが、１μＭ　バクロフェンと同様に細胞の一次Ｃａ２＋応答を減少させること（中央のパネル）、およびこの減少がまた、１μＭ　ＣＧＰ５５８４５により遮断されること（パネルＦ）を示している。各パネルにおいては、６〜８個の細胞の個々のＣａ２＋応答が示されている。
【００２８】
図１２は、高Ｋ＋脱分極後のＣａ２＋の流入を抑制するガバペンチンの能力の用量反応研究を示している。ｍＩＬ細胞を、示されている用量のガバペンチンで１〜５分間処理し、ついで実施例６に記載のとおりに高いＫ＋で脱分極させた。棒線は、挿入的に示された細胞数に関する標準誤差を示す。ＧｒａｐｈＰａｄを使用して該データをあてはめた後、ＥＣ５０を求めた。
【００２９】
図１３は、１μＭ　ガバペンチンによるＫ＋誘発性カルシウム動員の抑制が、３０ｎＭ〜３μＭ　ＣＧＰ５５８４５で用量依存的に遮断されることを示している。該グラフにおいては、ＣＧＰ５５８４５およびガバペンチンは、それぞれＣＧＰおよびＧＢＰと略称されている。誤差を示す各棒線は１ＳＥＭを示す。分析した細胞数は括弧内に示されている。
【００３０】
図１４は、ｍＩＬ細胞における内因性ＧＡＢＡＢ　ｇｂ１ａサブユニットのアンチセンス抑制が、ＶＤ−ＣＣのＫ＋脱分極および活性化後の［Ｃａ２＋］ｉの一次増加のガバペンチン誘発性抑制の遮断を引き起こすことを示している。分散分析により比較した場合、対照値および種々のＡＤＮ処理に関する値のいずれにおいても、有意な相違は何ら認められなかった。したがって、該結果は、１００％と定められた高Ｋ＋脱分極に関する値（柱状グラフＡ）に対して正規化されたものとして示されている。１０μＭおよび３０μＭの両方のガバペンチンが、細胞内［Ｃａ２＋］の脱分極誘発性上昇を抑制した（ＡをＢおよびＣと比較されたい）。デオキシヌクレオチド処理自体はいずれも、細胞内Ｃａ２＋の脱分極誘発性上昇に影響を及ぼさなかった（Ａ、Ｄ、ＧおよびＪを比較されたい）。ｇｂ１ａ　ＡＤＮ処理は、［Ｃａ２＋］ｉの上昇を抑制するガバペンチンの能力を完全に遮断し（ＢおよびＣをＤ、ＥおよびＦと比較されたい）、一方、試験した２つの濃度のｇｂ１ｂ　ＡＤＮは、そのような影響をガバペンチンに及ぼさず、対照値から区別できなかった（Ａ、ＢおよびＣとＧ、ＨおよびＩとを比較されたい）。ｇｂ１ａ　ミスセンスプローブでの処理も、対照値と比較した場合に無効であり（Ａ、ＢおよびＣとＪ、ＫおよびＬとを比較されたい）、ｇｂ１ｂ　ＡＤＮ処理（柱状グラフＨおよびＩ）と同様に、該Ｃａ２＋チャンネルのガバペンチン抑制に有意な影響を及ぼさなかった。誤差を示す各棒線はＳＥＭを示す。分析した細胞の数が括弧内に示されている。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；対照との比較。
【００３１】
図１５は、海馬ニューロンにおける細胞体Ｃａ２＋応答のガバペンチンおよびバクロフェン（ＢＡＣＬＯ）による抑制を示している。（Ａ）ラインスキャン（ｌｉｎｅｓｃａｎ）のためのライン（ｌｉｎｅ）位置での錐体ニューロンの二光子共焦点イメージ。目盛り線：１０μｍ。（Ｂ）ＴＴＸ（０．５μＭ）の存在下、細胞体電流注入（Ｉ）は、電流固定記録（Ｖｍ）におけるＣａ２＋スパイク、およびＣａ２＋上昇（ＬＳおよび％ΔＦ／Ｆ）を誘発した。１ｍＭ　ガバペンチンは、亜閾値（ｓｕｂ−ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（Ｃ）および超閾値（ｓｕｐｒａ−ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（Ｄ）誘発性細胞体Ｃａ２＋応答を減少させたが（軌跡２対１）、細胞体電流注入を増加させた場合にはＣａ２＋スパイクの生成を妨げなかった（軌跡３）。同様に、バクロフェンはＣａ２＋応答；亜閾値（Ｅ）、超閾値（Ｆ）を減少させた。
【００３２】
図１６は、ガバペンチンがＣａ２＋応答を用量依存的に抑制することを示している。亜閾値（Ａ，Ｂ）および超閾値（Ｃ，Ｄ）電流注入に関する膜脱分極（Ａ，Ｃ）およびＣａ２＋応答（Ｂ，Ｄ）の両方に対するガバペンチン（１００μＭ〜１ｍＭ）の作用の用量／反応ヒストグラム。１ｍＭ　ガバペンチンの存在下、細胞体電流注入を増加させた場合には、細胞は尚もＣａ２＋スパイクを生成することが可能であった。これらの条件においては、膜脱分極およびＣａ２＋応答は共に、対照と有意には異ならなかった。（Ｃ，Ｄ）亜閾値（Ｅ，Ｇ）および超閾値（Ｆ，Ｈ）応答に対するバクロフェン（４０μＭ）効果を要約したヒストグラム。ヒストグラム上の棒線はＳＥＭを表す。
【００３３】
図１７は、ＧＡＢＡＢ受容体活性化を介したＣａ２＋応答のガバペンチンおよびバクロフェンによる抑制を示す。ＧＡＢＡＢ受容体アンタゴニストＣＧＰ５５８４５（４μＭ）の存在下では、ガバペンチン（２ｍＭ；Ａ，Ｂ）およびバクロフェン（４０μＭ；Ｃ，Ｄ）は、亜閾値（Ａ，Ｃ）または超閾値（Ｂ，Ｄ）電流注入により誘発された応答を抑制しなかった。ＣＧＰ５５８４５の不存在下および存在下における亜閾値（Ｅ）および超閾値（Ｆ）刺激により誘発された応答に対するガバペンチン（２ｍＭ）およびバクロフェン（４０μＭ）の効果を要約したヒストグラム。
【００３４】
（発明の詳細な記載）
本発明を説明する目的においては、「ｇｂ１ａ」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２２５０２８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ０１２１８５も参照されたい）で見出されうるアミノ酸配列（配列番号２）を有する、Ｋａｕｐｍａｎｎら，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９５：１４９９１−１４９９６においてはＧＡＢＡＢＲ１ａとして公知のヒトＧＡＢＡＢ受容体サブユニット、およびその哺乳類オルソログを意味する。ｇｂ１ａのマウスオルソログのアミノ酸配列（配列番号４）はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１１４１６８で見出される。ｇｂ１ａは、前記の２つの文に記載のアミノ酸配列からの小さな変化をアミノ酸配列内に有する他のＧＡＢＡＢ受容体サブユニットをも意味する。ただし、それらの他のＧＡＢＡＢ受容体サブユニットは、前記の２つの文に記載のサブユニットと実質的に同じ生物活性を有する。
【００３５】
「ｇｂ１ｂ」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２２５０２９で見出されうるアミノ酸配列（配列番号６）を有する、Ｋａｕｐｍａｎｎら，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９５：１４９９１−１４９９６においてはＧＡＢＡＢＲ１ｂとして公知のヒトＧＡＢＡＢ受容体サブユニット、およびその哺乳類オルソログを意味する。ｇｂ１ｂは、前記の文に記載のアミノ酸配列からの小さな変化をアミノ酸配列内に有する他のＧＡＢＡＢ受容体サブユニットをも意味する。ただし、それらの他のＧＡＢＡＢ受容体サブユニットは、前記の文に記載のサブユニットと実質的に同じ生物活性を有する。
【００３６】
「ｇｂ１ｃ」は、ヌクレオチド配列配列番号７を有するＤＮＡにコードされるアミノ酸配列配列番号８を有するヒトＧＡＢＡＢ受容体サブユニット、およびその哺乳類オルソログを意味する。ヒトｇｂ１ｃのＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＡＪ０１２１８７である。ｇｂ１ｃは、前記の２つの文に記載のアミノ酸配列からの小さな変化をアミノ酸配列内に有する他のＧＡＢＡＢ受容体サブユニットをも意味する。ただし、それらの他のＧＡＢＡＢ受容体サブユニットは、前記の２つの文に記載のサブユニットと実質的に同じ生物活性を有する。
【００３７】
「ｇｂ２」は、ヌクレオチド配列配列番号１０を有するＤＮＡにコードされるアミノ酸配列配列番号９を有するヒトＧＡＢＡＢ受容体サブユニット、およびその哺乳類オルソログを意味する。ｇｂ２のラットオルソログのアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０５８７９５で見出される。ｇｂ２は、前記の２つの文に記載のアミノ酸配列からの小さな変化をアミノ酸配列内に有する他のＧＡＢＡＢ受容体ｇｂ２サブユニットをも意味する。ただし、それらの他のＧＡＢＡＢ受容体サブユニットは、前記の２つの文に記載のサブユニットと実質的に同じ生物活性を有する。例えば、Ｃｌａｒｋら，２０００，Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．８６０：４１−５２は、ラットにおける２つの追加的なｇｂ２　ｃ末端変異体を開示している。また、ヒトｇｂ２配列はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０５６０８５で見出される。
【００３８】
「ｇｂ１ａヘテロマー」は、ｇｂ１ａサブユニットとｇｂ２サブユニットとを含むがｇｂ１ｂサブユニットもｇｂ１ｃサブユニットも含まないＧＡＢＡＢ受容体を意味する。好ましくは、該ｇｂ１ａヘテロマーは、ｇｂ１ａサブユニットとｇｂ２サブユニットとのヘテロ二量体である。
【００３９】
「ｇｂ１ｂヘテロマー」は、ｇｂ１ｂサブユニットとｇｂ２サブユニットとを含むがｇｂ１ａサブユニットもｇｂ１ｃサブユニットも含まないＧＡＢＡＢ受容体を意味する。好ましくは、該ｇｂ１ｂヘテロマーは、ｇｂ１ｂサブユニットとｇｂ２サブユニットとのヘテロ二量体である。
【００４０】
「ｇｂ１ｃヘテロマー」は、ｇｂ１ｃサブユニットとｇｂ２サブユニットとを含むがｇｂ１ａサブユニットもｇｂ１ｂサブユニットも含まないＧＡＢＡＢ受容体を意味する。好ましくは、該ｇｂ１ｃヘテロマーは、ｇｂ１ｃサブユニットとｇｂ２サブユニットとのヘテロ二量体である。
【００４１】
「ｇｂ１ａ細胞」は、ｇｂ１ａヘテロマーを発現するがｇｂ１ｂヘテロマーもｇｂ１ｃヘテロマーも発現しない細胞を意味する。
【００４２】
「ｇｂ１ｂ細胞」は、ｇｂ１ｂヘテロマーを発現するがｇｂ１ａヘテロマーもｇｂ１ｃヘテロマーも発現しない細胞を意味する。
【００４３】
「ｇｂ１ｃ細胞」は、ｇｂ１ｃヘテロマーを発現するがｇｂ１ａヘテロマーもｇｂ１ｂヘテロマーも発現しない細胞を意味する。
【００４４】
ｇｂ２ポリペプチドが天然ｇｂ２（すなわち、配列番号１０）と「実質的に同じ生物活性」を有するのは、そのポリペプチドが、配列番号１０に対して少なくとも約８０％同一である、好ましくは少なくとも約９５％同一である、より好ましくは少なくとも約９７％同一である、最も好ましくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有し、ｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃポリペプチドとヘテロマーを形成して機能的ＧＡＢＡＢ受容体を形成しうる場合である。
【００４５】
「機能的ＧＡＢＡＢ受容体」は、ｇｂ２とｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃとの共発現により形成されて最も好ましくはｇｂ２とｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃのいずれかとのヘテロ二量体を与えるＧＡＢＡＢ受容体を意味し、ここで、該機能的ＧＡＢＡＢ受容体は、ＧＡＢＡＢ受容体アゴニストであるＧＡＢＡにさらされた場合に少なくとも１つの機能的応答を媒介する。機能的応答の具体例としては、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）黒色素胞における色素凝集、ｃＡＭＰレベルの負の調節、内向き整流性カリウムチャンネルとの共役、ニューロンにおける遅い抑制性シナプス後電位の媒介、カリウムコンダクタンスの増加、カルシウムコンダクタンスの減少、ＭＡＰキナーゼの活性化、細胞外ｐＨの酸性化、およびＧタンパク質共役受容体に典型的な他の機能的応答が挙げられる。ＧＡＢＡＢ受容体などのＧタンパク質共役受容体の機能的応答を測定する種々の方法が当業者に公知であろう（例えば、Ｌｅｒｎｅｒ，１９９４，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：１４２−１４６［黒色素胞細胞における色素分布の変化］；Ｙｏｋｏｍｉｚｏら，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ　３８７：６２０−６２４［ｃＡＭＰまたはカルシウム濃度の変化；走化性］；Ｈｏｗａｒｄら，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７３：９７４−９７７［ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞における膜電流の変化］；ＭｃＫｅｅら，１９９７，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１：４１５−４２３［エクオリンアッセイを用いて測定されるカルシウム濃度の変化］；Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ　＆　Ｓｉｍｏｎ，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５１７５−１５１８０［イノシトールリン酸レベルの変化］を参照されたい）。ｇｂ２とｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃのいずれかとのヘテロ二量体が発現される細胞、従って、そのようにして形成された機能的ＧＡＢＡＢ受容体が共役するＧタンパク質に応じて、そのような何らかの方法が、そのような機能的ＧＡＢＡＢ受容体の機能的応答の測定に適したものとなりうる。ある与えられた実験系に関する機能的応答を測定する適切な方法を選択することは、当業者の能力の範囲内に含まれる。
【００４６】
ｇｂ１ａポリペプチドが天然ｇｂ１ａポリペプチドと「実質的に同じ生物活性」を有するのは、そのポリペプチドが、配列番号２に対して少なくとも約８０％同一である、好ましくは少なくとも約９５％同一である、より好ましくは少なくとも約９７％同一である、最も好ましくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有し、かつ、（１）アミノ酸（特に、中性および分枝状のアミノ酸、例えばロイシン、イソロイシン、バリンなど）、アミノ酸類似体（例えば、γ−ヒドロキシブチラートまたはホスフィン酸）、ＧＡＢＡＢ受容体アゴニスト（例えば、（Ｒ，Ｓ）バクロフェン、ガバペンチンまたは同様の３−親油性基置換ＧＡＢＡ類似体または（Ｌ）−グルタミン酸）またはＧＡＢＡＢ受容体アンタゴニスト（例えば、ＣＧＰ７１８７２、サクロフェンまたはファクロフェン）に関して該ｇｂ１ａポリペプチドが有するＫｄまたはＥＣ５０が、同じアミノ酸、アミノ酸類似体、ＧＡＢＡＢ受容体アゴニストまたはＧＡＢＡＢ受容体アンタゴニストに関する天然ｇｂ１ａポリペプチドのＫｄまたはＥＣ５０よりせいぜい５倍大きいに過ぎないか、または（２）ｇｂ２ポリペプチドとヘテロマーを形成して機能的ＧＡＢＡＢ受容体を形成しうる場合である。天然ｇｂ１ａポリペプチドには、配列番号４として示されるマウスｇｂ１ａ配列；Ｋａｕｐｍａｎｎら，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ　３８６：２３９−２４６に開示されているラットｇｂ１ａポリペプチド；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２２５０２８に開示されているヒトｇｂ１ａ配列（配列番号２）；およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｙ１１０４４において開示されているＤＮＡ配列にコードされるタンパク質が含まれる。
【００４７】
ｇｂ１ｂポリペプチドが天然ｇｂ１ｂポリペプチドと「実質的に同じ生物活性」を有するのは、そのポリペプチドが、配列番号６に対して少なくとも約８０％同一である、好ましくは少なくとも約９５％同一である、より好ましくは少なくとも約９７％同一である、最も好ましくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有し、かつ、（１）アミノ酸（特に、中性および分枝状のアミノ酸、例えばロイシン、イソロイシン、バリンなど）、アミノ酸類似体（例えば、γ−ヒドロキシブチラートまたはホスフィン酸）、ＧＡＢＡＢ受容体アゴニスト（例えば、（Ｒ，Ｓ）バクロフェン、ガバペンチンまたは同様の３−親油性基置換ＧＡＢＡ類似体または（Ｌ）−グルタミン酸）またはＧＡＢＡＢ受容体アンタゴニスト（例えば、ＣＧＰ７１８７２、サクロフェンまたはファクロフェン）に関して該ｇｂ１ｂポリペプチドが有するＫｄまたはＥＣ５０が、同じアミノ酸、アミノ酸類似体、ＧＡＢＡＢ受容体アゴニストまたはＧＡＢＡＢ受容体アンタゴニストに関する天然ｇｂ１ｂポリペプチドのＫｄまたはＥＣ５０よりせいぜい５倍大きいに過ぎないか、または（２）ｇｂ２ポリペプチドとヘテロマーを形成して機能的ＧＡＢＡＢ受容体を形成しうる場合である。天然ｇｂ１ｂポリペプチドには、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２２５０２９に開示されているヒトｇｂ１ｂ配列（配列番号６、およびＫａｕｐｍａｎｎら，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ　３８６：２３９−２４６に開示されているラットｇｂ１ｂポリペプチドが含まれる。
【００４８】
ｇｂ１ｃポリペプチドが天然ｇｂ１ｃポリペプチドと「実質的に同じ生物活性」を有するのは、そのポリペプチドが、配列番号８に対して少なくとも約８０％同一である、好ましくは少なくとも約９５％同一である、より好ましくは少なくとも約９７％同一である、最も好ましくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有し、かつ、（１）アミノ酸（特に、中性および分枝状のアミノ酸、例えばロイシン、イソロイシン、バリンなど）、アミノ酸類似体（例えば、γ−ヒドロキシブチラートまたはホスフィン酸）、ＧＡＢＡＢ受容体アゴニスト（例えば、（Ｒ，Ｓ）バクロフェン、ガバペンチンまたは同様の３−親油性基置換ＧＡＢＡ類似体または（Ｌ）−グルタミン酸）またはＧＡＢＡＢ受容体アンタゴニスト（例えば、ＣＧＰ７１８７２、サクロフェンまたはファクロフェン）に関して該ｇｂ１ｃポリペプチドが有するＫｄまたはＥＣ５０が、同じアミノ酸、アミノ酸類似体、ＧＡＢＡＢ受容体アゴニストまたはＧＡＢＡＢ受容体アンタゴニストに関する天然ｇｂ１ｃポリペプチドのＫｄまたはＥＣ５０よりせいぜい５倍大きいに過ぎないか、または（２）ｇｂ２ポリペプチドとヘテロマーを形成して機能的ＧＡＢＡＢ受容体を形成しうる場合である。天然ｇｂ１ｃポリペプチドには、配列番号８に示すアミノ酸配列が含まれる。
【００４９】
物質が、細胞の表面上の機能的ＧＡＢＡＢ受容体と相互作用することにより「機能的応答を活性化する」のは、該細胞が該物質にさらされると該機能的応答のレベルの増加が生じる場合である。例えば、該機能的応答がＫｉｒチャンネルの活性化である場合には、ＧＡＢＡＢ受容体の「機能的応答」を活性化する物質は、該Ｋｉｒチャンネルを介してカリウムイオン流の増加を引き起こすよう該ＧＡＢＡＢ受容体においてアゴニストとして作用する物質である。
【００５０】
「同類アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基が、化学的に類似した別のアミノ酸残基により置換されることを意味する。そのような同類置換の具体例としては、疎水性残基（イソロイシン、ロイシン、バリンまたはメチオニン）間での置換、極性残基を同じ電荷の別の極性残基で置換すること（例えば、リシンからアルギニンへの、アスパラギン酸からグルタミン酸への置換）が挙げられる。
【００５１】
本発明は、該ＧＡＢＡＢ受容体のサブタイプ特異的アゴニストである物質を同定するための方法を提供する。特に、該物質は、ｇｂ１ａサブユニットとｇｂ２サブユニットとのヘテロマーであるＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストとして機能する。該物質は、ｇｂ１ｂサブユニットとｇｂ２サブユニットとのヘテロマーであるＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストではなく、また、ｇｂ１ｃサブユニットとｇｂ２サブユニットとのヘテロマーであるＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストでもない。ラット海馬切片のＣＡ１錐体ニューロンにおいては、該物質は、シナプス後カリウム電流を活性化するが、ＧＡＢＡ抑制性シナプス後電流をシナプス前で抑制しない。該物質はＧＡＢＡＡ受容体のアゴニストではない。該物質は、ＨＥＫ２９３細胞、マウス中葉下垂体腫瘍に由来するメラノトローフ細胞系およびラット海馬ニューロンまたは脊髄ニューロンにおいて電位依存性カルシウムチャンネルに負に共役したＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストである。
【００５２】
現在、ＧＡＢＡＢ受容体ｇｂ１サブユニットの３つの公知アイソフォーム、すなわち、ｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂおよびｇｂ１ｃが存在する。ｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂおよびｇｂ１ｃは、それぞれ９６１、８４４および８９９アミノ酸のタンパク質であり、細菌ペリプラズムロイシン結合タンパク質に相同なドメインに先行するそれらのリガンド結合細胞外Ｎ末端の部分においてのみ異なる（Ｎｇら，２００１，Ｍｏｌ．Ｐｈａｍ．５９：１４４−１５２；Ｋａｕｐｍａｎｎら，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ　３８６：２３９−２４６；Ｇａｌｖｅｚら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１３３６２−１３３６９）（図１Ａ）。該ｇｂ１ａ特異的Ｎ末端配列は、Ｋａｕｐｍａｎｎら，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９５：１４９９１−１４９９６に記載の、第１のドメインがＴ２６−Ｒ９８に対応し第２のドメインがＫ１０２−Ｎ１６０に対応する、〜６０アミノ酸の２つのタンパク質−たんぱく質相互作用性スシ（Ｓｕｓｈｉ）リピート（ショートコンセンサスリピートとしても公知である）ドメインから主として構成される。ｇｂ１ａの最初の１６４アミノ酸が４７個の異なるアミノ酸により置換されている点で、ｇｂ１ｂはｇｂ１ａとは異なる。したがって、ｇｂ１ｂは、両方のＮ末端スシリピートを欠く。該ｇｂ１ｃアイソフォームは、一方のスシリピートのインフレームな６２アミノ酸が欠失および除去されて単一のスシリピート相互作用モジュールが残されている点で、ｇｂ１ａとは異なる。
【００５３】
ニューロン性ＧＡＢＡＢ受容体の活性化は、シナプス後部位に関連したＫ＋膜コンダクタンスの増加につながる（Ｓｏｄｉｃｋｓｏｎ　＆　Ｂｅａｎ，１９９８，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：８１５３−８１６２）。ｇｂ１ａおよびｇｂ１ｂは、それぞれ、差次的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）なシナプス後およびシナプス前局在を示すと報告されている（Ｂｅｎｋｅら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２７３２３−２７３３０；Ｆｒｉｔｓｃｈｙら，１９９９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１：７６１−７６８）。これらの２つのサブユニットおよびｇｂ１ｃアイソフォームを試験して、ホモマーまたはｇｂ２とのヘテロマーとして発現された場合に、それらが、ＧＰＣＲ活性化内向き整流体を研究するための確立されたモデルであるツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞においてＫｉｒ３．１／３．２と共役しうるか否かが判定された（Ｋｉｒチャンネル；Ｄａｓｃａｌ，１９９７，Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌ．９：５５１−５７３）。ヒトまたはマウスｇｂ１ａ、ヒトｇｂ１ｂおよびヒトｇｂ１ｃアイソフォームは、別々に発現された場合には不活性である（データは示していない）。Ｋｉｒ３．１／３．２チャンネルに共役しうる及びＧＡＢＡにより活性化される構造的に異なる機能的ＧＡＢＡＢ受容体を形成するためには、全３種のｇｂ１アイソフォームはｇｂ２との共発現を要する（図２）。しかし、ガバペンチン（１００μＭ）は、ｇｂ１ａヘテロマーを介してＫｉｒ３．１／３．２チャンネルを活性化しうるに過ぎなかった（図２）。ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞におけるＫｉｒ３．１／３．２とのヒトｇｂ１ａおよびｇｂ２の共発現は、１００μＭ　ＧＡＢＡに応答してＫｉｒ電流の有意な刺激を引き起こした（−８０ｍＶで測定した場合に対照電流に対して２９７＋／−３０．５％の増加、ｎ＝６）。これは該マウスｇｂ１ａヘテロマーにおいて確認され（−８０ｍＶで測定した場合に対照電流に対して２９０＋／−４０％の増加、ｎ＝６）、最大刺激は該ヒトｇｂ１ａヘテロマーと同様であった。該ｇｂ１ａヘテロマーにおけるガバペンチン作動性は、ＧＡＢＡＢアンタゴニストである１μＭ　ＣＧＰ７１８７２により遮断することができた（データは示していない）。ＧＡＢＡ媒介応答は同じ卵母細胞において常に検出されたが、ｇｂ１ａヘテロマーで得られた結果とは対照的に、ｇｂ１ｂ（ｎ＝９）またはｇｂ１ｃ（ｎ＝４）ヘテロマーの刺激後には、ガバペンチンに対する応答は検出されなかった（ｎ＝６）（図２、図３Ａ）。これは、ガバペンチンのｇｂ１ａサブタイプ特異的効果を示している。
【００５４】
ＧＡＢＡに対する応答とガバペンチンに対する応答とのもう１つの相違は、ガバペンチンが連続的に存在する間のガバペンチンに対する応答の迅速かつ一貫した脱感作（１分間の刺激中に基礎電流レベルへの回復を実質的に引き起こした）により明らかとなった（図２）。ＧＡＢＡ（図２）またはバクロフェン（データは示していない）に対する応答では、顕著に減少した脱感作が、時々検出可能であった。ＧＡＢＡによるＧＡＢＡＢ受容体の刺激の場合と同様に、Ｍ２−またはβ２ＡＲアゴニストによる刺激中には、あまり著しくはない電流脱感作が検出されたに過ぎなかった（図２）。これは、該卵母細胞発現系を使用した文献報告と一致している（Ｄｏｕｐｎｉｋら，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９４：１０４６１−１０４６６；Ｆｉｄｌｅｒ−Ｌｉｍら，１９９５，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０５：４２１−４３９）。
【００５５】
ｇｂ１ａヘテロマーにおける用量依存性の研究は、以下の効力の順位付けを示した：ＧＡＢＡ＞バクロフェン＞ガバペンチン（それらのＥＣ５０値はそれぞれ１．１、１．９および１９μＭ）（図３Ｂ）。このアッセイにおけるＧＡＢＡの効力に合致して、ＧＡＢＡのシナプス濃度は５μＭまで達すると報告されている（Ｍｏｄｙら，１９９４，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：５１７−５２５）。また、該ｇｂ１ａヘテロマーにおけるガバペンチンの約２０μＭの効力は、てんかん又はニューロパシー（神経障害）の治療における単独療法としてのその治療量（３．６ｇ／日まで投与した後の脳における１０〜１００μＭ）に一致している（Ｂｒｙａｎｓ　＆　Ｗｕｓｔｒｏｗ，１９９９，Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１９：１４９−１７７；Ｂａｃｋｏｎｊａら，１９９８，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｎ．２８０：１８３１−１８３６；Ｒｏｗｂｏｔｈａｍら，１９９８，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｎ．２８０：１８３７−１８４２）。このことは、ガバペンチンがその治療作用を発揮する１つのメカニズムが、ｇｂ１ａサブタイプ特異的ＧＡＢＡＢ受容体作動性を介したものであることを示唆している。
【００５６】
１０μＭの最終濃度のガバペンチンおよびバクロフェンは、ラット脳皮質ＧＡＢＡＡ塩素イオンチャンネル部位への［３Ｈ］ＴＢＯＢ特異的結合を、それぞれ１８％および５％抑制した。しかし、組換えＧＡＢＡＡ受容体における機能アッセイにおいては、ガバペンチンは不活性であった（１００μＭまで）（データは示していない）。ガバペンチンおよびバクロフェンは、ラット小脳ＧＡＢＡＢ受容体における特異的［３Ｈ］ＧＡＢＡ結合に、それぞれ２４〜２６％および２２％取って代わったが、このことは、ガバペンチンが、バクロフェンと同様に、ニューロンＧＡＢＡＢ受容体と相互作用することを示唆している。
【００５７】
ガバペンチンを試験して、それがラット海馬切片のＣＡ１錐体ニューロンにおける天然ＧＡＢＡＢ受容体において活性であるか否かを判定した（Ｌｕｓｃｈｅｒら，１９９７，Ｎｅｕｒｏｎ　１９：６８７−６９５）（図４；実験の詳細に関しては実施例４を参照されたい）。バクロフェンおよびガバペンチンの浴適用により誘発された電流を、全細胞（ホールセル）パッチクランプ記録中の電位傾斜および差し引き法を用いて分離した（Ｎｕｒｓｅ　＆　Ｌａｃａｉｌｌｅ，１９９９，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．３８：１７３３−１７４２）。全細胞膜電流は、−４０ｍＶから−１４０ｍＶまでの電位傾斜中に測定した。対照ＡＣＳＦにおけるＩ−Ｖ関係から得た電流をバクロフェンまたはガバペンチンのいずれかの存在下のものから差し引いて（図４Ｂ）、薬物活性化電流を分離した。これらの電流に関する電流−電圧関係は、１ｍＭ　ガバペンチンが、静止電位に近い膜電位において外向き電流を活性化したことを示している（図４Ｂ）。これらのガバペンチン電流は、この調製物におけるＫ＋の平衡電位に近い−１００ｍＶ近く（平均Ｅｒｅｖ＝−１０１．０±２．２ｍＶ，ｎ＝７細胞）で逆転し内向きになった。これらの結果は、ガバペンチンがＣＡ１錐体ニューロンにおいてカリウム電流を活性化したことを示している。ガバペンチン電流は用量依存的であり、それらの平均索（ｃｈｏｒｄ）コンダクタンスは０．０１〜１ｍＭの用量と共に増加した（図４Ｂおよび４Ｄ）。２〜２０μＭ　（−）バクロフェンの浴適用は、静止電位に近い膜電位において外向きであり−１００ｍＶ近く（平均Ｅｒｅｖ＝−１０１．５±２．６ｍＶ，ｎ＝６細胞）で逆転し用量依存的である同様のカリウム電流を惹起した（図４Ｃおよび４Ｄ）。１ｍＭ　ガバペンチンおよび２０μＭ　バクロフェンにより活性化されたカリウム電流はＧＡＢＡＢ受容体に共役していた。なぜなら、それらは、ＧＡＢＡＢ受容体アンタゴニストＣＧＰ５５８４５（それぞれ４および１μＭ、図４Ｄ）での前処理により、それぞれ８９％および８４％減少したからである。これらの結果が示すところによれば、ガバペンチンは、ＣＡ１錐体細胞におけるシナプス後ＧＡＢＡＢ受容体に関連したカリウム電流を活性化し、ガバペンチンのこれらの作用はバクロフェンのシナプス後作用に類似している。
【００５８】
ニューロンＧＡＢＡＢ受容体はシナプス前にも位置し、そのようなシナプス前ＧＡＢＡＢ受容体は伝達物質の放出の抑制に共役しているため（Ｂｏｗｅｒｙ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３３：１０９−１４７）、ｉｎ　ｓｉｔｕで海馬ニューロンにおいてＧＡＢＡ放出を抑制するシナプス前ＧＡＢＡＢ受容体をガバペンチンが活性化するか否かを評価することに関心が持たれた（Ｄａｖｉｅｓら，１９９０，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ（Ｌｏｎｄｏｎ）４２４：５１３−５３１；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，１９９４，Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．４２：５７５−６０９）。グルタミン酸シナプス伝達のブロッカー（それぞれ非ＮＭＤＡおよびＮＭＤＡグルタミン酸受容体のアンタゴニストであるＣＮＱＸおよびＡＰ５）の存在下の放線状層の電気的刺激により、ＣＡ１錐体細胞において、速い単シナプスＧＡＢＡ抑制性シナプス後電流（ＩＰＳＣ）が誘発された（図５Ａ）。静止膜電位近くで記録されたこれらの速い外向きＩＰＳＣはＧＡＢＡＡ受容体により媒介された。なぜなら、それらは、２５μＭ　ビククリンにより完全に拮抗されたからである（ｎ＝１１細胞、データは示していない）。速いＧＡＢＡＡ　ＩＰＳＣは、２０μＭ　バクロフェンの浴適用により、可逆的に７５％減少した（図５Ｂ）。バクロフェンによるこのシナプス前抑制は用量依存的であり（２〜２０μＭ）、ＧＡＢＡＢ受容体アンタゴニストＣＧＰ５５８４５（１μＭ；図５Ｄ）により拮抗された。これとは対照的に、ガバペンチン（０．０１〜１ｍＭ）は、同じ細胞において外向き電流を誘発した浴適用中でさえ（示されていない）、ＧＡＢＡＡ　ＩＰＳＣを有意には抑制しなかった（図５Ｃおよび５Ｄ）。ガバペンチン（６〜１３％）の存在下で観察されるＩＰＳＣ振幅における小さい可変的な減少は、対照ＡＣＳＦの反復適用中（７％）またはＧＡＢＡＢアンタゴニストＧＰ５５８４５（１６％）での前処理後（１６％）に観察される減少とは有意には異ならなかった（図５Ｄ）。したがって、この僅かな減少はガバペンチンの効果からは生じない。これらの結果が示しているところによると、バクロフェンはシナプス前ＧＡＢＡＢ受容体を活性化しＧＡＢＡ放出を抑制したが、ガバペンチンはそうではなかった。したがって、ガバペンチンは、ＣＡ１海馬において、バクロフェンと同様のシナプス前作用を有さない。さらに、組換えＧＡＢＡＡ　α１β３γ２、α３β３γ２およびα４β３γ２受容体サブタイプにおける機能アッセイにおいては、ガバペンチンは１００μＭまで不活性であった（データは示していない）。また、組換えＮＭＤＡ　ＮＲ２Ｂ受容体における機能アッセイにおいては、ガバペンチンは１００μＭまで不活性であった（示していない）。
【００５９】
また、ガバペンチンでの更なる研究は、ＧＡＢＡＢ受容体がラット海馬ニューロンにおいて電位依存性カルシウムチャンネル（ＶＤ−ＣＣ）に負に共役することを示した。ｉｎ　ｓｉｔｕでの海馬ニューロンにおけるホールセル記録と多光子Ｃａ２＋イメージングとの組合せの実施中、ガバペンチンは、亜閾値細胞体脱感作およびＣａ２＋応答（細胞体電流注入により誘発されたもの）を用量依存的に有意に抑制した。さらに、ガバペンチンは、Ｃａ２＋活動電位およびＣａ２＋応答（超閾値電流注入により誘発されたもの）をほぼ完全に遮断した。しかし、より大きな電流注入はＣａ２＋活動電位のこの抑制に打ち勝った。このことは、ガバペンチンが優先的にはＬ型Ｃａ２＋チャンネルに影響を及ぼさなかったことを示唆している。Ｃａ２＋応答に対するガバペンチンの抑制効果は、ニューロンＧＡＢＡＢ受容体の活性化に共役していた。なぜなら、それらはＣＧＰ５５８４５により遮断され、バクロフェンが同様の効果をもたらしたからである。したがって、ＶＤ−ＣＣに負に共役したニューロンｇｂ１ａヘテロマーのガバペンチン活性化は、潜在的には、細胞体系における神経伝達物質放出の抑制に関連づけられうるガバペンチンの重要な治療作用機構である。
【００６０】
本明細書に開示する結果は更に、ガバペンチンが、ＧＡＢＡＢ受容体に関連した複数の抗痙攣作用を有しうることを示している。シナプス後過分極を引き起こすＧＩＲＫに共役したｇｂ１ａヘテロマーのその選択的活性化に加えて、ガバペンチンは、ＶＤ−ＣＣに負に共役したシナプス後ｇｂ１ａヘテロマーのその活性化を介した発作またはバースト放出（ｂｕｒｓｔ　ｄｉｓｃｈａｒｇｅ）中のＣａ２＋流入の抑制を引き起こしうる。したがって、海馬ニューロンに対するガバペンチン作用は、該ｇｂ１ａヘテロマーサブタイプにおけるその選択的活性だけではなく、これらの受容体が細胞内に見出される細胞ドメインによっても決定されることに注目することは興味深い。ガバペンチン感受性ＧＡＢＡＢ受容体は、ＶＤ−ＣＣ（図１５〜１７）およびＧＩＲＫ（図４）に共役した細胞体および樹状突起領域に存在する。これに対して、該ｇｂ１ｂおよびｇｂ１ｃヘテロマーサブタイプは、海馬ニューロンのグルタミン酸およびＧＡＢＡ軸索末端に存在すると考えられ、同様にＶＤ−ＣＣに負に共役しているが、ガバペンチンに不感受性である。これは、組換え受容体を使用して定められるサブタイプ選択的アゴニスト活性（図２および３）、および海馬におけるシナプス伝達に対するガバペンチンのシナプス前効果の欠如（図５）に符合する。
【００６１】
最近、ガバペンチンは脊髄後角における興奮性アミノ酸神経伝達を抑制することが報告された（Ｐａｔｅｌら，２０００，Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３０：１７３１−１７３４；Ｓｈｉｍｏｙａｍａら，２０００，Ｐａｉｎ　８５：４０５−４１４）。ＶＤ−ＣＣに共役したＧＡＢＡＢ受容体に対するアゴニスト　ガバペンチンの効果が、これらの効果を説明しうるものであろう。なぜなら、シナプス前ニューロンＧＡＢＡＢ受容体の十分に確認された生理的役割は、Ｐ／ＱおよびＮ型ＶＤ−ＣＣならびに伝達物質放出の抑制だからである（Ｂｏｗｅｒｙ　＆　Ｅｎｎａ，２０００，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９２：２−７；Ｗｕ　＆　Ｓａｇｇａｕ，１９９７，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０：２０４−２１２；Ｍｅｎｏｎ−Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら，１９９３，Ｐｆｌｕｇｅｒｓ　Ａｒｃｈ．４２５：３３５−３４３）。この結論は、神経軸におけるいくつかのシナプス前要素へのｇｂ１ａヘテロマーの解剖学的局在にも符合している（Ｂｅｎｋｅら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２７３２３−２７３３０；Ｂｉｌｌｉｎｔｏｎら，１９９９，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２６：１３８７−１３９２；Ｔｏｗｅｒｓら，２０００，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２：３２０１−３２１０）。腰部脊髄および背根神経節におけるＧＡＢＡＢ受容体分布研究は、ｇｂ１ａ　ｍＲＮＡが、求心性繊維細胞体における全ｇｂ１　ｍＲＮＡのうちの優勢な種（〜９０％を占める）であることを示した。このことは、ｇｂ２（これはｇｂ１ａと同等の密度を示す）と一緒になったｇｂ１ａサブユニットが、主要求心性末端上にシナプス前ＧＡＢＡＢ受容体を含むことを示唆している（Ｔｏｗｅｒｓら，２０００，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２：３２０１−３２１０）。実際のところ、この報告では、免疫細胞化学的分析は、浅後角における、より密なｇｂ１ａの標識および神経網における存在を示しており、一方、それに比べて、ｇｂ１ｂは、この領域の細胞体に付随した。
【００６２】
バクロフェン（Ｈａｍｍｏｎｄ　＆　Ｄｒｏｗｅｒ，１９８４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０３：１２１−１２５；Ｓａｗｙｎｏｋ　＆　Ｄｉｃｋｓｏｎ，１９８５，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　３１：２４８−２５９；Ｈｅｎｒｙ，１９８２，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　２１：１０８５−１０９３）およびガバペンチン（Ｘｉａｏ　＆　Ｂｅｎｎｅｔ，１９９６，Ａｎａｌｇｅｓｉａ　２：２６７：２７３；Ｐａｔｅｌら，２０００，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３０：１７３１−１７３４；Ｓｈｉｍｏｙａｍａら，２０００，Ｐａｉｎ　８５：４０５−４１４）の抗侵害受容効果が前シナプス的に媒介されることを示唆している研究と共に、侵害受容性一次求心性繊維が終結する浅板におけるｇｂ１ａヘテロマーの優勢な発現は、少なくとも部分的には、ガバペンチンの抗痛覚過敏、抗異疼痛および抗侵害受容効果が、脊髄後角におけるＶＤ−ＣＣに共役した前シナプスｇｂ１ａヘテロマーの選択的活性化に帰されうることを示唆している。さらに、前シナプスｇｂ１ａヘテロマーの選択的作動性が、尿失禁の治療におけるバクロフェンのようなＧＡＢＡＢアゴニストの効力の基礎になっている可能性がある。
【００６３】
ＧＡＢＡＢ受容体サブタイプ間の薬理学的相違の構造的基礎は、ｇｂ１ｂおよびｇｂ１ｃサブユニットには存在しないスシリピート（Ｋ１０２−Ｎ１６０）を主に含むｇｂ１ａ特異的配列によるものであると考えられる。ＧＡＢＡＢ受容体に結合するアゴニストは、ヒンジ領域により分離された２つのローブ（葉）に細胞外ドメインが折りたたまれる細菌ペリプラズムアミノ酸結合タンパク質に類似していることが、最近提示されたモデルから示唆されている（Ｇａｌｖｅｚら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１３３６２−１３３６９）。ｇｂ１ａ特異的スシドメインは、それがガバペンチンに結合するが他のｇｂ１受容体サブタイプは結合できないよう、この「ハエジゴク（Ｖｅｎｕｓ　Ｆｌｙｔｒａｐ）」様ドメインの閉鎖を調節している可能性がある。ＧＡＢＡＢ受容体サブタイプ間の薬理学的相違に関するもう１つの可能な説明は、ＧＡＢＡＢ受容体におけるガバペンチン活性にも要求されうる細胞環境からの追加的なタンパク質の存在にあるであろう。そのような要求性は、機能的ＣＧＲＰ受容体にＣＲＬＲおよびＲＡＭＰが要求されるＣＧＲＰ受容体の場合に類似したものであろう。この補助タンパク質は、ガバペンチン感受性ＧＡＢＡＢ受容体発現細胞内には存在するが、ガバペンチン不感受性ＧＡＢＡＢ受容体発現細胞内には存在しないであろう。
【００６４】
ＣＮＳにおけるＧＡＢＡ抑制は複数のメカニズムが関与している。これらは、ＧＡＢＡＡ受容体塩素イオンチャンネルの活性化を介した速いシナプス後抑制、ＧＡＢＡＢ受容体およびＧタンパク質調節内向き整流性カリウムチャンネルの活性化を介した遅いシナプス後抑制、ならびにグルタミン酸およびＧＡＢＡの放出を減少させるシナプス前末端におけるＣａ２＋チャンネルの負の調節を介したシナプス前抑制を含む（Ｎｉｃｏｌｌら，１９９０，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７０：５１３−５６５；Ｓｉｖｉｌｏｔｔｉら，１９９１，Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．３６：３５−９２；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，１９９４，Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｌ．４２：５７５−６０９）。速いシナプス後ＧＡＢＡＡ応答は単一のシナプスにおける活性から生じ、より遅いＧＡＢＡＢ応答は複数のシナプス前繊維の同時活性化を必要とする（Ｄｕｔａｒら，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ　３３２：１５６−１５８；Ｏｔｉｓら，１９９２，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．６７：２２７−２３５）。また、シナプス後ＧＡＢＡＢ受容体は、損なわれた抑制ＧＡＢＡＡの存在下、てんかん様活性を減少させるのに重要であるらしい（Ｍａｌｏｕｆら，１９９０，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　３５：５３−６１；Ｓｃａｎｚｉａｎｉら，１９９１，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄｏｎ）４４４：３７５−３９６）。海馬ニューロンにおいては、シナプス後ＧＡＢＡＢ受容体の活性化は、内向き整流性カリウムチャンネルにより媒介された膜過分極を招く（Ｌｕｓｃｈｅｒら，１９９７，Ｎｅｕｒｏｎ　１９：６８７−６９５）。さらに、細胞下局在化研究は、１つの研究が異なる結論づけをしているものの（Ｂｉｌｌｉｎｔｏｎら，１９９９，Ｂｒ．Ｊ．Ｐａｒｍａｃｏｌ．１２６：１３８７−１３９２）、ｇｂ１ａが主としてシナプス後にあり、ｇｂ１ｂは大部分がシナプス前にあることを示している（Ｂｅｎｋｅら，１９９９．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２７３２３−２７３３０；Ｆｒｉｔｓｃｈｙら，１９９９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１：７６１−７６９）。本データは、ガバペンチンがＧＡＢＡＢ　ｇｂ１ａヘテロマーサブタイプ特異的アゴニストであり、海馬におけるシナプス後ＧＡＢＡＢ受容体に選択的であることを初めて示すものであり、構造的および薬理学的に異なるシナプス前およびシナプス後ＧＡＢＡＢ受容体サブタイプの最初のｉｎ　ｓｉｔｕでの証拠を与えるものである。
【００６５】
したがって、本研究は、ガバペンチンが、以下の特徴の特定の組合せを有する薬理学的物質のクラスのメンバーであることを示している：
・それらは、ｇｂ１ａおよびｇｂ２サブユニットのヘテロマーであるＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストである。
・それらは、ｇｂ１ｂおよびｇｂ２サブユニットのヘテロマーであるＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストではない。
・それらは、ｇｂ１ｃおよびｇｂ２サブユニットのヘテロマーであるＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストではない。
・それらはシナプス後カリウム電流を活性化する。
・それらは、ＧＡＢＡ抑制性シナプス後電流を前シナプス的には抑制しない
・それらは、ＧＡＢＡＡ受容体のアゴニストではない。
・それらは、該共役受容体において、バクロフェンと比較して異なる活性化メカニズムおよび迅速な脱感作を示す。
・それらは、異種発現系、例えばＨＥＫ−２９３細胞、マウス中葉下垂体腫瘍に由来するメラノトローフ細胞系、およびラット海馬ニューロン、背根神経節ニューロンおよび脊髄後角ニューロンにおける電位依存性カルシウムチャンネルに負に共役したＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストである。
【００６６】
この特徴の組合せ又はこの組合せの部分的組合せのいくつかが、ガバペンチンの治療的有効性をもたらすと考えられる。したがって、この特徴の組合せ又はこの組合せの部分的組合せを共有する他の物質を同定することに大きな関心が持たれるであろう。本発明は、そのような物質の同定方法を提供する。
【００６７】
本発明は、ＧＡＢＡＢ受容体のｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストの同定方法であって、（ａ）物質が、ｇｂ１ａサブユニットを含むＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストであることを判定すること、（ｂ）該物質が、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃサブユニットを含むＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストではないことを判定することを含んでなる方法を提供する。
【００６８】
所望により、該方法は、該物質がシナプス後カリウム電流を活性化するがＧＡＢＡ抑制性シナプス後電流をシナプス前では抑制しないことを判定することを含んでいてもよい。また、該方法は、所望により、該物質がＧＡＢＡＡ受容体のアゴニストではないことを判定すること、および／または、該物質が、異種発現系、例えばＨＥＫ−２９３細胞、マウス中葉下垂体腫瘍に由来するメラノトローフ細胞系、およびラット海馬ニューロン、背根神経節ニューロンおよび脊髄後角ニューロンにおける電位依存性カルシウムチャンネルに負に共役したＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストであることを判定することを含んでいてもよい。
【００６９】
ｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストでありうる物質を同定する１つの方法は、ｇｂ１ａヘテロマーには結合しうるがｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃヘテロマーには結合し得ない物質を同定することである。これは、３つのタイプの細胞（各タイプの細胞は、ｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃヘテロマーのいずれかを発現する）に対して化合物群をスクリーニングし、各タイプの細胞に結合する各化合物の量を測定することにより行うことができる。該ｇｂ１ａヘテロマーを発現する細胞に（ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃヘテロマーを発現する細胞と比較した場合に）少なくとも３倍、好ましくは少なくとも１０倍、より一層好ましくは少なくとも５０倍多くの化合物が結合する化合物は、ｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストである可能性がある。もちろん、続いて、そのような化合物を本明細書に記載の機能アッセイにおいて試験して、それらが実際に、アンタゴニストではなくアゴニストであるのか、あるいは機能に影響を及ぼすことなく単に結合するに過ぎない化合物であるのかを確認することになるであろう。
【００７０】
したがって、本発明は、ｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストである物質の同定方法であって、
（ａ）物質をｇｂ１ａ細胞、ｇｂ１ｂ細胞およびｇｂ１ｃ細胞に別々にさらすこと、
（ｂ）該ｇｂ１ａ細胞、ｇｂ１ｂ細胞およびｇｂ１ｃ細胞への該物質の結合を定量すること、
ここで、該ｇｂ１ａ細胞への該物質の結合の量が、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃ細胞への該物質の結合の量より少なくとも３倍大きい場合には、
（ｃ）該物質がｇｂ１ａヘテロマーの機能的応答を活性化するか否かを判定することを含んでなり、
該物質がｇｂ１ａヘテロマーの機能的応答を活性化する場合には、該物質がｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストである、方法を含む。
【００７１】
ｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストの同定は、ガバペンチンの使用により促進されうる。新規ｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストは、ｇｂ１ａヘテロマーへの結合に関してガバペンチンと競合しうると考えられる。これは、そのような競合に基づきｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストを同定するためのアッセイの開発を可能にする。さらに、プレガバリン（（Ｓ）−３−イソブチルギャバ）は、ガバペンチンに構造的に関連した化合物であり、脳膜への［３Ｈ］ガバペンチンの結合を抑制し（Ｔａｙｌｏｒら，１９９３，Ｅｐｉｌｅｐｓｙ　Ｒｅｓ．１４：１１−１５）、モデル動物において類似した疼痛緩和効果を有することが判明している（Ｆｉｅｌｄら，１９９９，Ｐａｉｎ　８０：３９１−３９８）。それらの２つの化合物の間のこの類似性を考慮すると、本発明の或る実施形態においてガバペンチンではなくプレガバリンを利用することは本発明の範囲内である。また、他の３’置換ＧＡＢＡ類似体の利用も本発明の範囲内である。
【００７２】
したがって、本発明は、ｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストの同定方法であって、
（ａ）ｇｂ１ａ細胞を準備すること、
（ｂ）物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ａ細胞をガバペンチンまたはプレガバリンにさらすこと、
（ｃ）該物質の存在下および不存在下の該ｇｂ１ａ細胞へのガバペンチンまたはプレガバリンの結合を測定すること、
ここで、ガバペンチンまたはプレガバリンの結合の量が、該物質の不存在下より該物質の存在下で少ない場合には、
（ｄ）該物質がｇｂ１ｂ細胞およびｇｂ１ｃ細胞に結合するか否かを判定すること、
ここで、該物質がｇｂ１ｂ細胞およびｇｂ１ｃ細胞に結合しない場合には、
（ｅ）該物質がｇｂ１ａ受容体の機能的応答を活性化するか否かを判定することを含んでなり、
該物質がｇｂ１ａ受容体の機能的応答を活性化する場合には、該物質がｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストである、方法を含む。
【００７３】
当業者は、本明細書に記載の方法における種々の時点で対照を使用するのが一般に有益であると認識するであろう。例えば、直前に記載の方法においては、通常、該細胞へのガバペンチンまたはプレガバリンの結合がｇｂ１ａヘテロマーの存在に左右されることが示される工程（ｃ）に対照を使用することが有用であろう。これは、ｇｂ１ａヘテロマーを欠くこと以外は工程（ｃ）の細胞と実質的に同じである細胞へのガバペンチンまたはプレガバリンの結合を測定することにより行うことができる。これを行うための１つの方法は、ｇｂ１ａヘテロマーを組換え的に発現する細胞を使用することである。その場合には、該非組換え親細胞が対照として用いられるであろう。もう１つの対照は、本明細書に記載の方法により同定された物質を選択し、ｇｂ１ｂヘテロマーまたはｇｂ１ｃヘテロマーであるＧＡＢＡＢ受容体における機能的応答を該物質が活性化しないことを確認することである。
【００７４】
また、本明細書に記載の方法における「結合しない」なる表現は相対的な意味を有すると当業者は認識するであろう。この表現は、非特異的である（すなわち、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃの存在によるものではない）何らかの低レベルの些細な結合を除外するものではない。そのような非特異的結合は、種々の対照を使用することにより評価することができる。さらには、この表現は、該物質がｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃに結合するが、ｇｂ１ａへのその結合と比較して些細な量で結合するに過ぎない場合にも適用されうる。この文脈においては、些細な量は、例えば、５％、１％または０．１％またはそれ未満であろう。
【００７５】
本発明は、ｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストである物質の同定方法であって、
（ａ）ｇｂ１ａを発現するがｇｂ１ｂをもｇｂ１ｃをも発現しない細胞を準備すること、
（ｂ）工程（ａ）の細胞を物質にさらすこと、
（ｃ）工程（ａ）の細胞への該物質の結合を定量すること、
（ｄ）ｇｂ１ｂを発現するがｇｂ１ａをもｇｂ１ｃをも発現しない細胞を準備すること
（ｅ）工程（ｄ）の細胞を該物質にさらすこと
（ｆ）工程（ｄ）の細胞への該物質の結合を定量すること
（ｇ）ｇｂ１ｃを発現するがｇｂ１ａをもｇｂ１ｂをも発現しない細胞を準備すること
（ｈ）工程（ｇ）の細胞を該物質にさらすこと
（ｉ）工程（ｇ）の細胞への該物質の結合を定量すること
ここで、工程（ａ）の細胞への該物質の結合の量が、工程（ｄ）の細胞および工程（ｇ）の細胞への該物質の結合の量より少なくとも３倍大きい場合には、
（ｊ）該物質がｇｂ１ａヘテロマーの機能的応答を活性化するか否かを判定することを含んでなり、
該物質がｇｂ１ａヘテロマーの機能的応答を活性化する場合には、該物質がｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストである、方法を含む。
【００７６】
工程（ａ）、（ｄ）および（ｇ）の細胞は、ｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂおよびｇｂ１ｃの発現におけるそれらの相違以外は実質的に同じであるべきである。そのような細胞を得る１つの方法は、ｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃを天然では発現しない細胞系においてｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃを組換え的に発現させることである。
【００７７】
本明細書に記載の方法の好ましい実施形態では、種々のＧＡＢＡＢ受容体サブユニットの発現を指令する発現ベクターを含有する組換え細胞を使用する。したがって、本発明は、ｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストの同定方法であって、　（ａ）ｇｂ２をコードする発現ベクターとｇｂ１ａをコードする発現ベクターとを含む細胞を準備すること、
（ｂ）ｇｂ２およびｇｂ１ａが発現されｇｂ１ａヘテロマーが形成される条件下で該細胞を培養すること、
（ｃ）物質の存在下または不存在下、該細胞をガバペンチンまたはプレガバリンにさらすこと、
（ｄ）該物質の存在下および不存在下での該ｇｂ１ａヘテロマーへのガバペンチンまたはプレガバリンの結合を測定すること、
ここで、ガバペンチンまたはプレガバリンの結合の量が、該物質の不存在下より該物質の存在下で少ない場合には、
（ｅ）該物質がｇｂ１ｂ細胞およびｇｂ１ｃ細胞に結合するか否かを判定すること、
ここで、該物質がｇｂ１ｂ細胞およびｇｂ１ｃ細胞に結合しない場合には、
（ｆ）該物質がｇｂ１ａヘテロマーの機能的応答を活性化するか否かを判定することを含んでなり、
該物質がｇｂ１ａヘテロマーの機能的応答を活性化する場合には、該物質がｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストである、方法を含む。
【００７８】
工程（ｅ）のｇｂ１ｂ細胞およびｇｂ１ｃ細胞は、３つのタイプの細胞におけるｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂおよびｇｂ１ｃの発現における相違以外は互いに及び工程（ａ）の細胞と実質的に同じであるべきである。そのような細胞の製造方法の１つは、ｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃのいずれをも発現しない親細胞系から開始し、ｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂおよびｇｂ１ｃをコードする発現ベクターを該親細胞内に別々に形質転換し、それにより、ｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂおよびｇｂ１ｃのうちの１つだけを各細胞系が発現する３つの細胞系を得る。
【００７９】
本明細書に記載の方法における「ガバペンチンまたはプレガバリンの結合の量が、該物質の不存在下より該物質の存在下で少ない場合」なる表現は、絶対的ではなく相対的な意味を有すると当業者は認識するであろう。本明細書に記載の方法により同定された関心のある物質は、ガバペンチンまたはプレガバリンの結合を、自明でない様態で、より少なくする。そのような物質は、例えば、ガバペンチンまたはプレガバリンの結合を少なくとも約５０％、好ましくは約７５％、より好ましくは約９５％、より一層好ましくは約９９％減少させるであろう。
【００８０】
そのような競合アッセイを本明細書に記載のとおりに実施する場合には、使用する種々の化合物および物質の相対量が適切であることが重要であると当業者は理解するであろう。例えば、直前に記載した方法においては、ガバペンチンまたはプレガバリンに対して大過剰（例えば、１，０００倍モル過剰）の物質を使用して該物質によるガバペンチンまたはプレガバリンまたは該結合の競合的置換を検出することは試みないであろう。好ましくは、該物質と該ガバペンチンまたはプレガバリンとを、ほぼ等しいモル濃度で使用する。
【００８１】
本発明は、ｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストの同定方法であって、
（ａ）物質がｇｂ１ａ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定すること、
（ｂ）該物質がｇｂ１ｂ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定すること、
（ｃ）該物質がｇｂ１ｃ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定することを含んでなり、
該物質がｇｂ１ａ細胞においてはＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するが、ｇｂ１ｂ細胞においてもｇｂ１ｃ細胞においても該応答を活性化しない場合には、該物質がｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストである、方法を含む。
【００８２】
本明細書に記載の方法の特定の実施形態においては、該機能的応答は、イオンチャンネルの活性の調節、カルシウム濃度の変化、ＧＡＢＡＢ受容体とのアゴニストの相互作用により誘導されるプロモーターにより発現が制御されるレポーター遺伝子からのシグナルの変化、および膜電流の変化よりなる群から選ばれる。特定の実施形態においては、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞において膜電流の変化を測定する。他の実施形態においては、膜電流の変化は、内向き整流性カリウム電流の活性の調節により生じる。
【００８３】
他の実施形態においては、膜電流の変化は、電位依存性カルシウムチャンネル（ＶＤ−ＣＣ）の活性の調節により生じる。ＧＡＢＡＢ受容体の活性化は、ＶＤ−ＣＣを介したイオン流の抑制を引き起こすことが公知である（Ｄｏｌｐｈｉｎ，１９９５，Ｅｘｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．８０：１−３６；Ｆｉｌｉｐｐｏｖら，２０００，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０：２８６７−２８７４）。したがって、ＶＤ−ＣＣのそのような抑制から生じる細胞内カルシウムレベルの変化を、ＧＡＢＡＢ受容体におけるアゴニストの活性の代替尺度として用いることが可能である。該機能的応答が細胞内カルシウム濃度の変化である場合には、そのような変化は、適切な指示色素（例えば、フラ−２、フルオ−３、インド−１、カルシウムグリーン（Ｃａｌｃｉｕｍ　Ｇｒｅｅｎ）；Ｖｅｌｉｃｅｌｅｂｉら，１９９９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２９４：２０−４７を参照されたい）および適切な検出装置を使用することにより観察することができる。ＶＤ−ＣＣに共役したＧＡＢＡＢ受容体における活性を検出するために、電気生理学的尺度を用いることも可能であろう。
【００８４】
指示色素は、カルシウムとの結合に際して蛍光特性の変化、例えば、蛍光強度の著しい増加および／または蛍光スペクトルの変化（すなわち、発光または励起最大の変化）を示す物質である。フルオ−３、フラ−２およびインド−１は、高選択性カルシウムキレーターであるエチレン　グリコール−ビス（β−アミノエチル　エーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）および１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）の構造類似体として設計された一般に使用されているカルシウム指示色素である。フルオ−３からの蛍光強度は、カルシウムが結合すると１００倍以上増加する。該未結合色素は非常に僅かな蛍光しか示さないが、カルシウムが結合したフルオ−３は５２６ｎｍにおける強力な蛍光発光を示す。フラ−２は、カルシウムが結合するとその蛍光スペクトルの変化を示す色素の一例である。未結合状態では、フラ−２は３６２ｎｍの励起最大を有する。発光最大の変化は何ら生じないが、この励起最大は、カルシウムが結合すると３３５ｎｍにシフトする。フラ−２へのカルシウムの結合は、その２つの励起最大における励起により、および３３５ｎｍにおける励起後の蛍光発光の量と比較した３６２ｎｍにおける励起後の蛍光発光の量の比を測定することにより、観察することができる。より小さな比（すなわち、３６２ｎｍにおける励起後の、より小さな発光）は、より多くのフラ−２がカルシウムに結合したこと、したがって、該細胞内の、より高い内部カルシウム濃度を示す。
【００８５】
カルシウム指示色素の使用は、該色素を細胞に装填することを伴い、この過程は、該色素の膜透過性アセトキメチルエステルに細胞をさらすことにより達成することができる。該細胞の細胞膜内に入ると、細胞内エステラーゼが該エステルを切断し、該遊離色素中の負電荷を露出させる。これは、該遊離色素が該細胞膜を通過するのを妨げて、該遊離色素を該細胞内に捕捉する。ついで該色素からの蛍光の測定を行い、内部カルシウム濃度が変化するよう（例えば、ｇｂ１ａ細胞をｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストにさらすことにより）該細胞を処理し、再び蛍光測定を行う。
【００８６】
該指示色素からの蛍光は、ルミノメーターまたは蛍光イメージャーで測定することができる。１つの好ましい検出装置は、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｐｌａｔｅ　Ｒｅａｄｅｒ（ＦＬＩＰＲ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）である。ＦＬＩＰＲは、本発明の方法を用いるハイスループットスクリーニングに好適である。なぜなら、それは、９６または３８４ウェルのマイクロタイタープレートに同時にピペッティングしうる統合された液体処理、および荷電結合素子イメージングカメラに接続されたアルゴンレーザーを使用する迅速な速度論的検出を含むからである。このアプローチを用いる場合には、プロミスカス（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）Ｇタンパク質およびＧＡＢＡＢ受容体に共役したカルシウムチャンネルを組換え的に発現させるために、使用する細胞を改変することが望ましいかもしれない。
【００８７】
カルシウム指示色素の使用のための典型的なプロトコールは、ｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂおよびｇｂ１ｃ細胞を、透明な平底黒壁９６ウェルプレート内（例えば、ＰａｃｋａｒｄからのＣｏｓｔａｒまたはＶｕｅ−プレートにより製造されたもの）にプレーティングし、標準的な組織培養条件（例えば、５％　ＣＯ２，３７℃）で該細胞を一晩増殖させることを含むであろう。該細胞は、一般には、適切な増殖培地中、約１０，０００〜１００，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングする。該アッセイの当日、増殖培地を除去し、色素装填培地を該ウェルに加える。
【００８８】
該カルシウム指示色素がフルオ−３である場合には、例えば、色素装填培地は、５０μｇのフルオ−３−ＡＭエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ　Ｆ−１２４２）を２２μｌのＤＭＳＯに可溶化して２ｍＭ　色素ストックを得ることにより調製されうるであろう。該細胞に装填する直前に、２２μｌの２０％　プルロン酸（ｐｌｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ　Ｐ−３０００）を該色素に加える。該色素を含有するチューブをボルテックスミキサーで混合し、４２ｍｌの該色素／プルロン酸溶液を、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ　Ｃａ＃　１５６０−０８０）、２．５ｍＭ　プロベネシド（Ｓｉｇｍａ　Ｃａｔ＃　Ｐ−８７６１）および１％　ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ　Ｃａｔ＃　２６１４０−０８７；ＢＳＡではない）を含有する２０ｍＭ　１０．５ｍｌのハンクス平衡塩類溶液（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ　Ｃａｔ＃　１４０２５−０７６）に加える。該色素と該装填培地とを、反復反転により混合する（最終色素濃度は約４μＭ）。
【００８９】
増殖培地は、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ　Ｃａ＃　１５６０−０８０）、２．５ｍＭ　プロベネシド（Ｓｉｇｍａ　Ｃａｔ＃　Ｐ−８７６１）および０．１％　ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇａｍ　Ｃａｔ＃　Ａ−９６４７；ＦＢＳではない）を含有するＤｅｎｌｅｙ　Ｃｅｌｌｗａｓｈ（洗浄培地はハンクス平衡塩類溶液（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ　Ｃａｔ＃　１４０２５−０７６））で、容積設定を「Ｆ」で３回および最後の１回を容積設定「０」で洗浄することにより、該細胞から除去することが可能であり、その４回の洗浄後に１００μｌの残留培地が該ウェル中に残る。ついで該装填培地中の１００μｌの色素を１２チャンネルピペッターで各ウェルに加える。該細胞プレートを該ＣＯ２インキュベーター中に戻して、６０分間装填する。
【００９０】
色素装填の後、ｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニスト活性に関して試験する物質に該細胞をさらす前に、該細胞の蛍光測定を行う。ついで該細胞を該物質にさらし、該色素の蛍光特性の変化を引き起こす物質を同定する。該測定装置は、ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）のような蛍光プレートリーダーでありうる。該ｇｂ１ａ細胞においては蛍光特性の変化を引き起こすがｇｂ１ｂ細胞においてもｇｂ１ｃ細胞においても該変化を引き起こさない物質が、ｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストである。
【００９１】
前記に概説した方法の詳細は例示であると意図される。当業者は、個々の関連実験変数（例えば、使用する細胞のタイプ、使用する色素の種類）に応じて通常の実験により、実験パラメーター（細胞数、色素濃度、色素装填時間、インキュベーション温度、細胞洗浄条件および装置設定）を最適化しうるであろう。使用しうる実験プロトコールの具体例のいくつかは、Ｖｅｌｉｃｅｌｅｂｉら，１９９９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２９４：２０−４７に記載されている。
【００９２】
本発明は、ｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストの同定方法であって、
（ａ）ｇｂ１ａ細胞を準備すること、
（ｂ）該ｇｂ１ａ細胞にカルシウム指示色素を装填すること、
（ｃ）物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ａ細胞における該カルシウム指示色素の蛍光特性を測定すること、
（ｄ）ｇｂ１ｂ細胞を準備し、
（ｅ）該ｇｂ１ｂ細胞にカルシウム指示色素を装填すること、
（ｆ）該物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ｂ細胞における該カルシウム指示色素の蛍光特性を測定すること、
（ｇ）ｇｂ１ｃ細胞を準備すること、
（ｈ）該ｇｂ１ｃ細胞にカルシウム指示色素を装填すること、
（ｉ）該物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ｃ細胞における該カルシウム指示色素の蛍光特性を測定することを含んでなり、
該物質の不存在下と比較した場合の該物質の存在下での蛍光特性の変化が工程（ｃ）では測定されるが、工程（ｆ）および工程（ｉ）では測定されない場合には、該物質がｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストである、方法を提供する。
【００９３】
特定の実施形態においては、該カルシウム指示色素は、フルオ−３、フラ−２、フルオ−４、フルオ−５、エクオリン、カルシウムグリーン−１、オレゴングリーン、４８８　ＢＡＰＴＡ、ＳＮＡＲＦ−１およびインド−１よりなる群から選ばれる。
【００９４】
特定の実施形態においては、蛍光特性の変化は蛍光発光最大の強度の増加である。他の実施形態においては、蛍光特性の変化は吸収最大（吸収極大）の波長のシフトである。
【００９５】
特定の実施形態においては、該細胞は、ＧＡＢＡＢ受容体および／またはカルシウムチャンネルの両方を天然で発現する。他の実施形態においては、該細胞は、ＧＡＢＡＢ受容体および／またはカルシウムチャンネル天然では発現しないが、その代わりに、該細胞がＧＡＢＡＢ受容体および／またはカルシウムチャンネルを組換え的に発現するようＧＡＢＡＢ受容体および／またはカルシウムチャンネルをコードする発現ベクターで形質転換されている。
【００９６】
特定の実施形態においては、該細胞は、１つの特定のｇｂ１アイソフォーム、すなわち、ｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃのいずれかをコードする発現ベクターで形質転換されていて、該形質転換化細胞がｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂおよびｇｂ１ｃのうちの１つを発現するようにされている。ある実施形態においては、該細胞を更に、ｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃのいずれかとｇｂ２との機能的ヘテロマーが該細胞内で形成されるよう、ｇｂ２をコードする発現ベクターで発現ベクターで形質転換する。
【００９７】
特定の実施形態においては、該細胞は、電位依存性カルシウムチャンネル（ＶＤ−ＣＣ）サブユニットをコードする発現ベクターで形質転換されている。好ましい実施形態においては、該サブユニットは、機能的Ｎ型またはＰ／Ｑ型ＶＤ−ＣＣを形成する。Ｎ型またはＰ／Ｑ型ＶＤ−ＣＣは、α１サブユニット、α２δサブユニット、そして通常は、少なくとも１つのβサブユニットから構成される。したがって、Ｎ型またはＰ／Ｑ型α１サブユニット、α２δサブユニットおよびβサブユニットをコードする発現ベクターで該細胞を形質転換するのが有利であろう。
【００９８】
本発明の方法においては、ＶＤ−ＣＣとＧＡＢＡＢ受容体とを発現する細胞系を使用することができる。ＶＤ−ＣＣは細胞膜の脱分極により活性化される。この脱分極は、細胞外Ｋ＋のレベルの上昇、例えば、該細胞を浸している浴（バス）へのＫＣｌの添加により引き起こされうる。ＫＣｌのこの添加は、ＶＤ−ＣＣの活性化、該細胞内への細胞外Ｃａ２＋の流入、およびそれに伴う［Ｃａ２＋］ｉの上昇を引き起こす。この［Ｃａ２＋］ｉの上昇は、適切なカルシウム指示色素を使用することにより測定することができる。該指示色素からの読み取りは、一般には、該ＶＤ−ＣＣの活性化後の最初の約１０秒以内に行われる。なぜなら、これが、該ＶＤ−ＣＣを介するＣａ２＋の流入がピークになる時点だからである。その後、［Ｃａ２＋］ｉは、細胞内貯蔵からのＣａ２＋の放出により上昇する。したがって、細胞内Ｃａ２＋のこの放出からの干渉を最小限に抑えることが望ましい。
【００９９】
ＶＤ−ＣＣをコードする発現ベクターの構築に使用するＶＤ−ＣＣをコードするＤＮＡは、当技術分野でよく知られた方法により得ることができる。例えば、ＶＤ−ＣＣをコードするｃＤＮＡ断片は、適切なプライマーペアを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることにより適切なｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。そのようなプライマーペアは、得ることを望むＶＤ−ＣＣの公知ＤＮＡ配列に基づき選択することができる。適切なｃＤＮＡライブラリーは、該ＶＤ−ＣＣをコードするｍＲＮＡを含有することが知られている細胞または組織源から作製することができる。当業者は、公開されているＶＤ−ＣＣ配列を使用してＰＣＲプライマーを設計し、ＶＤ−ＣＣ発現の公開されている研究成果を用いて、該ＶＤ−ＣＣをコードするＤＮＡを得るためにｃＤＮＡライブラリーを作製するための適切な源を選択しうるであろう。この点においては、以下の刊行物が有用かもしれない。
【０１００】
米国特許第５，８７４，２３６号および米国特許第５，４２９，９２１号は、ヒト電位依存性カルシウムチャンネルの種々のα１およびβサブユニットを記載している。
【０１０１】
米国特許第５，４０７，８２０号および米国特許第５，７１０，２５０号は、ヒト電位依存性カルシウムチャンネルのα２サブユニットを記載している。
【０１０２】
国際特許公開ＷＯ９８／１３４９０は、脳特異的Ｐ／Ｑ型ヒト電位依存性カルシウムチャンネルを記載している。
【０１０３】
前記のようなカルシウム指示色素の使用の代替として、ＶＤ−ＣＣのＧＡＢＡＢ受容体媒介抑制を観察するためにエクオリン系が使用される。該エクオリン系はタンパク質アポエクオリンを利用するものであり、これは、親油性発色団セレンテラジンに結合して、エクオリンとして公知である、アポエクオリンとセレンテラジンとの複合体を形成する。アポエクオリンは３つのカルシウム結合部位を有し、カルシウムが結合すると、エクオリンのアポエクオリン部分がその立体構造が変化する。この立体構造変化により、セレンテラジンが酸化されて、セレンテラミド、ＣＯ２、および青色光（４６６ｎｍ）の光子になる。この光子は、適切な装置で検出することができる。
【０１０４】
アポエクオリンをコードする遺伝子は既にクローニングされているため（米国特許第５，５４１，３０９号；米国特許第５，４２２，２６６号；米国特許第５，７４４，５７９号；Ｉｎｏｕｙｅら，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：３１５４−３１５８；Ｐｒａｓｈｅｒら，１９８５，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１２６：１２５９−１２６８）、アポエクオリンは、細胞内カルシウム濃度を測定することを望む細胞において組換え的に発現させることができる。あるいは、組換えアポエクオリンを安定に発現する既存の細胞を使用することができる。ＨＥＫ−２９３細胞およびＣＨＯ−Ｋ１細胞に由来するそのような細胞は、Ｂｕｔｔｏｎ　＆　Ｂｒｏｗｎｓｔｅｉｎ，１９９３，Ｃｅｌｌ　Ｃａｌｃｉｕｍ　１４：６６３−６７１に記載されている。例えば、ＨＥＫ２９３／ａｅｑ１７細胞系は、以下のとおりに使用することができる。
【０１０５】
ＨＥＫ２９３／ａｅｑ１７細胞系を、１０％　ウシ胎仔血清（熱不活化）、１ｍＭ　ピルビン酸ナトリウム、５００μｇ／ｍｌ　ジェネティシン、１００μｇ／ｍｌ　ストレプトマイシン、１００単位／ｍｌ　ペニシリンを含有するダルベッコ変法培地（ＤＭＥＭ，ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）中で増殖させる。所望のＧＡＢＡＢ受容体サブユニット、カルシウムチャンネルサブユニットおよびＧタンパク質サブユニットをＨＥＫ２９３／ａｅｑ１７細胞系内で発現させるために、所望の組合せのＧＡＢＡＢ受容体サブユニット（ｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂ、ｇｂ１ｃ（またはラットｇｂ１ａ−１ｅ）、ｇｂ２）および所望のカルシウムチャンネルサブユニット（α１Ａ、α１β、α１Ｃ、α１Ｄ、α１Ｅ、α２δ、β１、β２、β３、β４）、そして恐らくはＧタンパク質サブユニット（Ｇｉ、Ｇｏ）をコードする発現ベクターを、標準的な方法によりＨＥＫ２９３／ａｅｑ１７細胞系内に形質転換することができる。該細胞をＤＭＥＭ＋０．１％　ウシ胎仔血清で１回洗浄し、ついで、８μＭ　セレンテラジンｃｐ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）と３０μＭ　グルタチオンとを含有するＤＭＥＭ中、３７℃／５％　ＣＯ２で１時間チャージ（ｃｈａｒｇｅ）する。ついで該細胞をＶｅｒｓｅｎｅ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）で１回洗浄し、Ｅｎｚｙｍｅフリー・セリソーシエーション（ｃｅｌｌｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）・バッファー（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いて解離させ、ＥＣＢ（０．３ｍＭ　ＣａＣｌ２、２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．３、０．１％　ウシ胎仔血清を含有するＨａｍ’ｓ　Ｆ１２栄養混合物（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ））中に希釈する。該細胞懸濁液を５００×ｇで５分間遠心分離する。該上清を除去し、該ペレットを１０ｍｌのＥＣＢに再懸濁する。該細胞密度を、血球計算盤で計数することにより求め、５００，０００細胞／ｍｌ（ＥＣＢ中）に調節する。被検物質をＥＣＢ中で所望の濃度に希釈し、アッセイプレート中に、好ましくは３重に、０．１ｍｌ／ウェルでアリコート化する。該細胞懸濁液を０．１ｍｌ／ウェルで注入し、ルミノメーター（Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ　Ａｓｃｅｎｔ，Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ　Ｏｙ，Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して読み取り、合計４００個の読み取り値を積分する。ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　３．０（ＧｒａｈＰａｄ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、データを解析する。
【０１０６】
前記の方法は、実施することを望む特定の実験の具体的な詳細を考慮して種々の工程および変数が或る程度修正されうる一般的な指針であると当業者に理解されるであろう。例えば、半合成セレンテラジンを使用することが可能であり（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ，１９８９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６１：９１３−９２０；Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら，１９９３，Ｃｅｌｌ　Ｃａｌｃｉｕｍ　１４：３７３−３７８）、セレンテラジンと共に細胞をインキュベートする時間を或る程度変化させることが可能であり、それより或る程度多い又は少ない細胞数／ウェルを用いることが可能であるなどである。
【０１０７】
エクオリンの使用に関する総説としては、Ｃｒｅｔｏｎら，１９９９，Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　４６：３９０−３９７；Ｂｒｉｎｉら，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９８９６−９９０３；Ｋｎｉｇｈｔ　＆　Ｋｎｉｇｈｔ，１９９５，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４９：２０１−２１６を参照されたい。また、エクオリンを発現する哺乳類細胞にセレンテラジン補因子を加えることによる哺乳類細胞における細胞内カルシウムの測定方法を記載している米国特許第５，７１４，６６６号にも関心が持たれるかもしれない。
【０１０８】
本発明により提供されるもう１つのタイプのアッセイは、ＧＡＢＡＢ受容体サブユニットと内向き整流性カリウムチャンネル（Ｋｉｒ）とをコードするＲＮＡがマイクロインジェクションされたアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞を利用するものである。該卵母細胞を電位固定し、ついで、膜電流を観察しながら、該細胞を物質にさらす。該物質がＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストである場合には、ＧＡＢＡＢ受容体の活性化およびＫｉｒへの該ＧＡＢＡＢ受容体の共役の結果として、該卵母細胞膜を横切るカリウムイオン流の変化が認められるであろう。該物質が、ｇｂ１ａヘテロマーを発現する卵母細胞におけるカリウム電流の改変を引き起こすが、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃヘテロマーを発現する卵母細胞におけるカリウム電流の改変を引き起こさない場合には、該物質はｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストである。
【０１０９】
もう１つの実施形態においては、該ＧＡＢＡＢ受容体サブユニットおよび該Ｋｉｒを、マイクロインジェクションではなく卵母細胞発現ベクター（例えば、ＰＴ７ＴＳ）により、該卵母細胞内で発現させる。
【０１１０】
したがって、本発明は、該ＧＡＢＡＢ受容体のｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストの同定方法であって、
（ａ）アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞内で機能的ｇｂ１ａヘテロマーを形成するようｇｂ１ａおよびｇｂ２を発現しＫｉｒをも発現するアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞を準備すること、
（ｂ）該卵母細胞膜を横切るカリウムイオン流を観察しながら、工程（ａ）の卵母細胞を物質にさらすこと、
（ｃ）アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞内で機能的ｇｂ１ｂヘテロマーを形成するようｇｂ１ｂおよびｇｂ２を発現しＫｉｒをも発現するアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞を準備すること、
（ｄ）該卵母細胞膜を横切るカリウムイオン流を観察しながら、工程（ｃ）の卵母細胞を該物質にさらすこと、
（ｅ）アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞内で機能的ｇｂ１ｃヘテロマーを形成するようｇｂ１ｃおよびｇｂ２を発現しＫｉｒをも発現するアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞を準備すること、
（ｆ）該卵母細胞膜を横切るカリウムイオン流を観察しながら、工程（ｅ）の卵母細胞を該物質にさらすこと、を含んでなり、
該物質への該卵母細胞の曝露が、工程（ｂ）ではカリウムイオン流の増加を引き起こすが工程（ｄ）および（ｆ）では該増加を引き起こさない場合には、該物質が該ＧＡＢＡＢ受容体のｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストである、方法を含む。
【０１１１】
ｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストを同定するために使用しうる特定のタイプの機能的アッセイには、転写に基づくアッセイが含まれる。転写に基づくアッセイは、受容体とリガンドとの相互作用により引き起こされる例えば細胞内カルシウムレベルの変化などの特定の細胞内事象により活性が調節される誘導性プロモーターにより転写が駆動されるレポーター遺伝子の使用を含む。転写に基づくアッセイは、Ｒｕｔｔｅｒら，１９９８，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＆　Ｂｉｏｌｏｇｙ　５：Ｒ２８５−Ｒ２９０に概説されている。本発明の転写に基づくアッセイは、ｇｂ２とｇｂ１ａとのヘテロマー（該ヘテロマーは機能的ＧＡＢＡＢ受容体を形成する）とガバペンチンなどのｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストとの相互作用により引き起こされる細胞内事象の結果として転写が活性化または抑制されるレポーター遺伝子の発現に基づく。
【０１１２】
非常に高感度な転写に基づくアッセイが、Ｚｌｏｋａｒｎｉｋら，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７９：８４−８８（Ｚｌｏｋａｒｎｉｋ）に、また、米国特許第５，７４１，６５７号に開示されている。Ｚｌｏｋａｒｎｉｋおよび米国特許第５，７４１，６５７号に開示されているアッセイは、誘導性プロモーターの制御下でβ−ラクタマーゼをコードするプラスミドを使用するものである。このプラスミドを、アゴニストを同定することが望まれる受容体をコードするプラスミドと共に、細胞内に形質転換する。該β−ラクタマーゼに関する誘導性プロモーターは、アゴニストが該受容体に結合した際に生成される少なくとも１つの細胞内シグナルに該プロモーターが応答するように選択される。したがって、受容体へのアゴニストのそのような結合の後、該形質転換化細胞内のβ−ラクタマーゼのレベルが増加する。β−ラクタマーゼのこの増加は、β−ラクタマーゼによる切断の基質である細胞透過性色素で該細胞を処理することにより測定される。該色素は２つの蛍光部分を含有する。元のままの色素においては、それらの２つの蛍光部分は物理的に連結されており、したがって、それらの間で蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）が生じうる程度に互いに十分に接近している。該色素がβ−ラクタマーゼにより２つの部分へと切断された後は、それらの２つの蛍光部分は、異なる部分上に位置し、したがって離ればなれになりうる。これは、それらの蛍光部分の間の距離を増加させて、それらの間で生じうるＦＲＥＴの量を減少させる。該アッセイで測定されるのは、ＦＲＥＴにおけるこの減少である。
【０１１３】
アゴニストとＧＡＢＡＢ受容体との相互作用により生成される細胞内シグナルにより活性化される誘導性プロモーターをβ−ラクタマーゼを駆動するために使用することにより、ＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストを同定するためのアッセイを構築するために、Ｚｌｏｋａｒｎｉｋおよび米国特許第５，７４１，６５７号に記載のアッセイを改変することができる。このアッセイのもう１つの変法においては、β−ラクタマーゼを駆動するプロモーターの活性化を引き起こす物質で細胞を処理する。この活性化は、アゴニストと該ＧＡＢＡＢ受容体との相互作用により生成されるシグナルにより抑制される。該アッセイのこの別法の一例では、ＣＲＥプロモーターにより駆動されるβ−ラクタマーゼを使用することが可能であり、この場合、アデニリルシクラーゼのフォルスコリン刺激はＣＲＥプロモーターを活性化して、該細胞内のβ−ラクタマーゼの濃度を増加させ、ＣＲＥプロモーターのこの活性化は、アゴニストと該ＧＡＢＡＢ受容体との相互作用により抑制される。
【０１１４】
該ＧＡＢＡＢ受容体を得るためには、ｇｂ２をコードするプラスミドと、ｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃのいずれかをコードするプラスミドとを、該細胞内に形質転換する。該細胞を細胞透過性色素にさらし、ついで、該ＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストであると疑われる物質にさらす。ＦＲＥＴの減少を引き起こす物質は、実際に該ＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストであると考えられる。
【０１１５】
該物質をｇｂ１ａ細胞に対して、ついでｇｂ１ｂおよびｇｂ１ｃ細胞に対して試験することにより、ｇｂ１ａ細胞のみにおいてアゴニストである物質を同定することができる。そのような物質はｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストである。
【０１１６】
したがって、本発明は、ＧＡＢＡＢ受容体のｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストの同定方法であって、
（ａ）ｇｂ１ａ細胞を準備すること、ここで該細胞は、
（１）該ｇｂ１ａ細胞内でのｇｂ２の発現を指令する発現ベクター、
（２）該ｇｂ１ａ細胞内でのｇｂ１ａの発現を指令する発現ベクター、
（３）アゴニストと該ＧＡＢＡＢ受容体との相互作用により生成される細胞内シグナルにより活性化される誘導性プロモーターの制御下、該ｇｂ１ａ細胞内でのβ−ラクタマーゼの発現を指令する発現ベクターを含む、
（ｂ）２つの蛍光部分を含有する細胞透過性色素であるβ−ラクタマーゼの基質に該ｇｂ１ａ細胞をさらすこと、ここでこれらの２つの蛍光部分は該色素の異なる部分上に存在し、β−ラクタマーゼによる該色素の切断は、それらの２つの蛍光部分を離ればなれにする、
（ｃ）物質の不存在下および存在下で該ｇｂ１ａ細胞における蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の量を測定して、該ｇｂ１ａ細胞に関する該物質の存在下のＦＲＥＴの量に対する該物質の不存在下のＦＲＥＴの量の比率を求めること、　（ｄ）ｇｂ１ｂ細胞を準備すること、ここで該細胞は、
（４）該ｇｂ１ｂ細胞内でのｇｂ２の発現を指令する発現ベクター、
（５）該ｇｂ１ｂ細胞内でのｇｂ１ｂの発現を指令する発現ベクター、
（６）アゴニストと該ＧＡＢＡＢ受容体との相互作用により生成される細胞内シグナルにより活性化される誘導性プロモーターの制御下、該ｇｂ１ｂ細胞内でのβ−ラクタマーゼの発現を指令する発現ベクターを含む、
（ｅ）２つの蛍光部分を含有する細胞透過性色素であるβ−ラクタマーゼの基質に該ｇｂ１ｂ細胞をさらすこと、ここでこれらの２つの蛍光部分は該色素の異なる部分上に存在し、β−ラクタマーゼによる該色素の切断は、それらの２つの蛍光部分を離ればなれにする、
（ｆ）該物質の不存在下および存在下で該ｇｂ１ｂ細胞における蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の量を測定して、該ｇｂ１ｂ細胞に関する該物質の存在下のＦＲＥＴの量に対する該物質の不存在下のＦＲＥＴの量の比率を求めること、
（ｇ）ｇｂ１ｃ細胞を準備すること、ここで該細胞は、
（７）該ｇｂ１ｃ細胞内でのｇｂ２の発現を指令する発現ベクター、
（８）該ｇｂ１ｃ細胞内でのｇｂ１ｃの発現を指令する発現ベクター、
（９）アゴニストと該ＧＡＢＡＢ受容体との相互作用により生成される細胞内シグナルにより活性化される誘導性プロモーターの制御下、該ｇｂ１ｃ細胞内でのβ−ラクタマーゼの発現を指令する発現ベクターを含む、
（ｈ）２つの蛍光部分を含有する細胞透過性色素であるβ−ラクタマーゼの基質に該ｇｂ１ｃ細胞をさらすこと、ここでこれらの２つの蛍光部分は該色素の異なる部分上に存在し、β−ラクタマーゼによる該色素の切断は、それらの２つの蛍光部分を離ればなれにする、
（ｉ）該物質の不存在下および存在下で該ｇｂ１ｃ細胞における蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の量を測定して、該ｇｂ１ｃ細胞に関する該物質の存在下のＦＲＥＴの量に対する該物質の不存在下のＦＲＥＴの量の比率を求めること、を含んでなり、
該ｇｂ１ａ細胞に関する該物質の存在下のＦＲＥＴの量に対する該物質の不存在下のＦＲＥＴの量の比率が、該ｇｂ１ｂ細胞および該ｇｂ１ｃに関する該物質の存在下のＦＲＥＴの量に対する該物質の不存在下のＦＲＥＴの量の比率より大きい場合には、該物質がｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストである、方法を含む。
【０１１７】
工程（ａ）の小工程（１）〜（３）、工程（ｄ）の小工程（４）〜（６）、および工程（ｇ）の小工程（７）〜（９）は、任意の順序で実施することができる。３つの工程（ａ）〜（ｃ）、（ｄ）〜（ｆ）、および（ｇ）〜（ｉ）の群は、任意の順序で実施することができる。すなわち、該方法は、例えば、まず、工程（ｄ）〜（ｆ）を実施し、ついで（ｇ）〜（ｉ）を実施し、ついで（ａ）〜（ｃ）を実施することができる。
【０１１８】
特定の実施形態においては、該ｇｂ１ａ細胞に関する該物質の存在下のＦＲＥＴの量に対する該物質の不存在下のＦＲＥＴの量の比率は、該ｇｂ１ｂ細胞および該ｇｂ１ｃ細胞に関する該物質の存在下のＦＲＥＴの量に対する該物質の不存在下のＦＲＥＴの量の比率より少なくとも約５０％、好ましくは約１００％、より好ましくは約２００％、より一層好ましくは約５００％大きい。
【０１１９】
前記方法の特定の実施形態においては、該誘導性プロモーターは、膜電流の変化（例えば、カリウム電流の変化）により活性化されるプロモーターである。他の実施形態においては、該誘導性プロモーターは転写因子ＮＦＡＴにより活性化される。あるいは該誘導性プロモーターは、キメラＧｑタンパク質により伝達されるシグナル、またはプロテインキナーゼＣ活性により生成される若しくは細胞内カルシウムレベルの変化により生成されるシグナルにより活性化される。特定の実施形態においては、該誘導性プロモーターは、ＮＦ−κＢまたはＮＦＡＴにより活性化または抑制されるプロモーター、例えば、インターロイキン２プロモーター（Ｍａｔｔｉｌａら，１９９０，ＥＭＢＯ　Ｊ．９：４４２５−４４３３）、ＭＡＰＫＩＮＡＳＥ誘導性プロモーター、あるいはｃＡＭＰレベルにより調節されるプロモーター、例えば、ＣＲＥプロモーター（Ｃｈｅｎら，１９９５，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２６：３４９−３５４）である。
【０１２０】
また、アゴニストと該ＧＡＢＡＢ受容体との相互作用により生成される細胞内シグナルが細胞内カルシウムレベルの増加である場合には、プロミスカスＧタンパク質、例えば、Ｇ１５／１６またはＧｑｉ５またはＧｑｏ５をコードするベクターで該細胞を形質転換することができる。
【０１２１】
本明細書に記載の方法の特定の実施形態においては、レポーター遺伝子および／または該ＧＡＢＡＢ受容体とアゴニストとの相互作用により生成される少なくとも１つの細胞内シグナルによる活性化される誘導性プロモーターの制御下でｇｂ２、ｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂ、ｇｂ１ｃ、β−ラクタマーゼの発現を指令する発現ベクターで、安定に又は一過性に細胞を形質転換する。他の実施形態においては、また、プロミスカスＧタンパク質、例えば、Ｇ１５／１６またはＧｑｉ５またはＧｑｏ５をコードするベクターで、該細胞を形質転換する。
【０１２２】
種々のβ−ラクタマーゼが当技術分野において公知であり、本方法での使用に適している。１つの特に詳細に研究されている形態のβ−ラクタマーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＡｍｐｒ遺伝子の産物であるＴＥＭ−１　β−ラクタマーゼである（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７５：３７３７−３７４１）。ＴＥＭ−１が細胞質内に蓄積するようそのシグナル配列が欠失したＴＥＭ−１の修飾体が、Ｋａｄｏｎａｇａら，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：２１４９−２１５４に開示されている。β−ラクタマーゼは種々の細菌により産生され、多数のβ−ラクタマーゼが詳細に研究されている。例えば、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｌｙｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）はＰＣ１　β−ラクタマーゼを産生し、バシラス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ）は、β−ラクタマーゼＩとして公知のβ−ラクタマーゼを産生し、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）はＲＴＥＭ　β−ラクタマーゼを産生する（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ．２６６：８５３−８６１）。個々のβ−ラクタマーゼが本発明での使用に適したものとなるための全要件は、それが蛍光基質を切断して、切断後に、該基質の、２つの蛍光部分が、お互いから離ればなれになりうるということである。これは容易に試験することができ、したがって、個々のβ−ラクタマーゼの適合性は容易に判定することができる。
【０１２３】
種々の適切なβ−ラクタマーゼのアミノ酸配列が、Ａｍｂｌｅｒ，１９８０，Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．（Ｓｅｒ．Ｂ．）２８９：３２１−３３１に開示されている。当業者は、これらのβ−ラクタマーゼをコードする合成ＤＮＡ配列を容易に合成することが可能である。あるいは、これらのβ−ラクタマーゼは天然源からクローニングされうる。β−ラクタマーゼをコードするＤＮＡ配列を適切な発現ベクター内に配置し、本発明の方法での使用のために細胞内に形質転換することができる。本発明の方法において使用しうる個々のβ−ラクタマーゼをコードするＤＮＡ配列は米国特許第５，７４１，６５７号の配列番号１に示されており、対応するアミノ酸配列は米国特許第５，７４１，６５７号の配列番号２として示されている。このＤＮＡを含有するプラスミド（ｐＴＧ２ｄｅｌ１）は、Ｋａｄｏｎａｇａら，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：２１４９−２１５４に記載されている。
【０１２４】
Ｍｏｏｒｅら，１９９７，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４７：２０３−２０９は、真核細胞により細胞内に維持されるＲＴＥＭ　β−ラクタマーゼの形態を改変するための方法を記載している。ＲＴＥＭ１　β−ラクタマーゼの天然シグナル配列をコードするＤＮＡを除去し、メチオニンコドンで置換する。真核生物において最適な翻訳効率を与える配列を、ＰＣＲによりこのメチオニンの直上流に配置する。ついで、この修飾β−ラクタマーゼコード配列を、発現ベクターｐＲｃ−ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）内にクローニングする。これは、ヒト中間（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）初期サイトメガロウイルスプロモーターの制御下に該コード配列を配置し、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列を付与する。ｐＣＭＶ−ＢＬとして公知のこの構築物は、哺乳類細胞の細胞質内で活性β−ラクタマーゼの発現を指令することが可能であった。
【０１２５】
本発明の好ましい実施形態では、Ｚｌｏｋａｒｎｉｋら，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７９：８４−８８に記載の転写活性化に関するアッセイにおいて使用される蛍光β−ラクタマーゼ基質を利用する。この基質はＣＣＦ２／ＡＭとして公知であり、以下の構造を有する。
【０１２６】
【化１】
2004501375.tif 000003
【０１２７】
ＣＣＦ２／ＡＭはいくつかのエステル官能基を含有する。これらのエステルは、ＣＣＦ２／ＡＭを膜透過性にする。この膜透過性のため、ＣＣＦ２／ＡＭは、培地への添加後に、組織培養内で増殖中の細胞により取り込まれる。取り込み後、細胞内エステラーゼが該エステルを切断して、ＣＣＦ２を与え、それはその多数の負電荷のため細胞内に捕捉される。ＣＣＦ２の構造は以下のとおりである。
【０１２８】
【化２】
2004501375.tif 000004
【０１２９】
ＣＣＦ２は、セファロスポリン部分の７位にＦＲＥＴ供与体としての７−ヒドロキシクマリンを含有する。該７−ヒドロキシクマリンは、ＣＣＦ２のｐＫａを５．１に低下させて６以上のｐＨ値において蛍光をｐＨから独立したものとするための６−クロロ置換基、および該クマリンと該セファロスポリン部分との間のグリシンスペーサーを有する。該蛍光受容体はフルオレセインであり、これは、チオエーテル結合を介して該セファロスポリン部分の７’位に結合している。
【０１３０】
４０９ｎｍにおける無傷ＣＣＦ２のクマリン供与体の励起は、５２０ｎｍにピークを有する該フルオレセイン受容体からのＦＲＥＴ放出を引き起こす。ＣＣＦ２が切断され、該クマリンと該フルオレセインとが分離された後、該クマリン供与体の励起は、４４７ｎｍにピークを有する該クマリンからの蛍光発光を引き起こす。もちろん、前記した厳密な波長において励起が生じたり励起を測定する必要はない。例えば、３９５ｎｍで励起させ、５３０ｎｍおよび４６０ｎｍで発光を測定することが可能であろう。
【０１３１】
原則として、（ａ）該供与体の吸収波長における刺激後の該供与蛍光試薬の発光の減少、および／または（ｂ）該供与体の吸収波長における刺激後の該受容体試薬の発光の増加を観察することにより、ＦＲＥＴの量を測定することが可能であろう。実際には、ＦＲＥＴは、発光比率測定（ｅｍｉｓｓｉｏｎ　ｒａｔｉｏｉｎｇ）により、最も有効に測定される。発光比率測定は、該受容体による発光と該供与体による発光との比率の測定を意味する。１つの実施形態においては、それは、生じているＦＲＥＴの量を測定するために求める受容体発光に対する供与体発光の比率である。低い比率は無傷ＣＣＦ２構造を示し、これは、β−ラクタマーゼがほとんど存在せず従って大量のＦＲＥＴが生じていることを意味する。高い比率は、ＣＣＦ２がβ−ラクタマーゼにより切断されていることを示し、これは、比較的大量の酵素が存在し従って少量のＦＲＥＴが生じていることを意味する。
【０１３２】
もう１つの実施形態においては、それは、生じているＦＲＥＴの量を測定するために求める供与体発光に対する受容体発光の比率である。低い比率は、ＣＣＦ２がβ−ラクタマーゼにより切断されていることを示し、これは、比較的大量の酵素が存在し従って少量のＦＲＥＴが生じていることを意味する。高い比率は無傷ＣＣＦ２構造を示し、これは、β−ラクタマーゼがほとんど存在せず従って大量のＦＲＥＴが生じていることを意味する。
【０１３３】
発光比率は、共焦点レーザースキャン顕微鏡を使用することにより測定することができる。発光比率測定は、好ましくは、二色鏡（ｄｉｃｈｒｏｉｃ　ｍｉｒｒｏｒ）でサンプルからの発光を分裂させ、２つの検出器で２つの波長帯（供与体および受容体の発光波長に対応する）を同時に測定することにより行う。あるいは、単一の検出器で（適切なフィルターを使用することにより）各波長で連続的に該発光をサンプリングすることができる。いずれの場合にも、ＦＲＥＴを測定するこれらの及び他の方法は当技術分野でよく知られている。
【０１３４】
本方法において発光比率測定を用いると、そうしなければ正確な定量を混乱させうる多数の変数（例えば、細胞サイズ、細胞数、プローブ濃度および光強度）が排除させる。本発明の方法は、蛍光顕微鏡またはプレートリーダーで容易に観察される。本発明は、９６ウェルマイクロタイタープレート中、さらには、より高密度のウェルプレート中での使用に容易に適合させることができ、ハイスループットスクリーニングプログラムにおけるその使用を可能にする。
【０１３５】
ＣＣＦ２は、本発明において使用する或る好ましい基質を例示するものであると意図される。本発明は、他の蛍光基質でも実施することができる。本発明での使用に適したβ−ラクタマーゼの蛍光基質の一般式は、以下のとおりである。
【０１３６】
【化３】
2004501375.tif 000005
［式中、ＸおよびＹのうちの一方は、蛍光供与体部分、または該蛍光供与体部分のエステル誘導体であり、他方は、蛍光受容体、または該蛍光受容体部分のエステル誘導体である；ここで、蛍光共鳴エネルギー転移は、該蛍光供与体部分と該蛍光受容体部分との間で生じうる；
Ｒ’は、Ｈ、低級アルキルおよび（ＣＨ２）ｎＯＨ（ここで、ｎは、０、または１〜５の整数である）よりなる群から選ばれる；
Ｒ’’は、Ｈ、生理的に許容される金属およびアンモニウムカチオン、−−ＣＨＲ２ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−−ＣＨＲ２ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３、−アシルチオメチル、−アシルオキシ−α−ベンジル、−δ−ブチロラクトニル、−メトキシカルボニルオキシメチル、−フェニル、−メチルスルフィニルメチル、−β−モルホリノエチル、−ジアルキルアミノエチル、−アシルオキシアルキル、−ジアルキルアミノカルボニルオキシメチルおよび−アルキルよりなる群から選ばれる（ここで、Ｒ２は、Ｈおよび低級アルキルよりなる群から選ばれ、ｎは０、または１〜５の整数である）；Ａは、Ｓ、Ｏ、ＳＯ、ＳＯ２およびＣＨ２よりなる群から選ばれる；Ｚ’およびＺ’’は、該蛍光供与体および受容体部分のリンカーである］。
【０１３７】
好ましくは、Ｚ’は、直接的結合、−−（ＣＨ２）ｎＣＯＮＲ２（ＣＨ２）ｍ−−、−−（ＣＨ２）ｎＮＲ２ＣＯ（ＣＨ２）ｍ−−、−−（ＣＨ２）ｎＮＲ２ＣＯＮＲ２（ＣＨ２）ｍ−−、−−（ＣＨ２）ｎＮＲ３ＣＳＮＲ２（ＣＨ２）ｍ−−、−−（ＣＨ２）ｎＣＯＮＲ３（ＣＨ２）ｐＣＯＮＲ２（ＣＨ２）ｍ−−、−−（ＣＨ２）ｎ−−、−−（ＣＨ２）ｎＮＲ３ＣＯ（ＣＨ２）ｐＳ（ＣＨ２）ｍ−−、−−（ＣＨ２）ｎＳ（ＣＨ２）ｍ−−、−−（ＣＨ２）ｎＯ（ＣＨ２）ｍ−−、−−（ＣＨ２）ｎＮＲ２（ＣＨ２）ｍ−−、−−（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＮＲ２（ＣＨ２）ｍ−−、−−（ＣＨ２）ｎＣＯ２（ＣＨ２）ｍ−−、
【化４】
2004501375.tif 000006
（ここで、Ｒ２は、Ｈおよび低級アルキルよりなる群から選ばれ、Ｒ３は、水素および低級アルキルよりなる群から選ばれ、ｎ、ｍおよびｐのそれぞれは、独立して、０および１〜４の整数よりなる群から選ばれる）よりなる群から選ばれる。
【０１３８】
好ましくは、Ｚ’’は、Ｙ中のヘテロ原子への直接的結合、−−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−−、−−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−−、−−ＮＲ２（ＣＨ２）ｎ−−、−−Ｎ＋Ｒ２２（ＣＨ２）ｎ−−、−−ＯＣＯＮＲ２（ＣＨ２）ｎ−−、−−Ｏ２Ｃ（ＣＨ２）ｎ−−、−−ＳＣＳＮＲ２（ＣＨ２）ｎ−−、−−ＳＣＳＯ（ＣＨ２）ｎ−−および
【化５】
2004501375.tif 000007
（ここで、Ｒ２は、Ｈおよび低級アルキルよりなる群から選ばれ、ｎおよびｍのそれぞれは、独立して、０および１〜４の整数よりなる群から選ばれる）よりなる群から選ばれる。
【０１３９】
本明細書に記載のβ−ラクタマーゼ基質のための適切な蛍光部分、および本明細書に開示されているβ−ラクタマーゼ基質の製造方法は、米国特許第５，７４１，６５７号（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている。
【０１４０】
β−ラクタマーゼにより切断される蛍光基質中のリンカーは、好ましくは、セファロスポリンである。これは、セファロスポリンの３’置換基に化学的に結合されうる任意の分子（例えば、蛍光部分）が、β−ラクタマーゼによる該セファロスポリンのβ−ラクタム環の切断に際して遊離されるからである（Ａｌｂｒｅｃｈｔら，１９９１，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３４：６６９−６７５）。したがって、該３’置換基に結合した蛍光部分は、切断に際して遊離され、該基質の残部に結合したままのもう１つの蛍光部分から離ればなれになる。
【０１４１】
前記方法の特定の実施形態においては、該細胞はプロミスカスＧタンパク質（例えば、Ｇα１５またはＧα１６）を発現する。他の実施形態においては、該細胞は、Ｇタンパク質サブユニットの発現を指令する発現ベクターで形質転換されている。
【０１４２】
該ＧＡＢＡＢ受容体のｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストを同定するためには、転写に基づく他のアッセイを用いることができる。そのような他のアッセイは、誘導性プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子（β−ラクタマーゼ以外）の使用に基づく。該誘導性プロモーターは、アゴニストと該ＧＡＢＡＢ受容体との相互作用により生成される細胞内シグナルにより活性化される。該レポーター遺伝子を含有するｇｂ１ａ細胞を候補アゴニストにさらし、該レポーター遺伝子からのシグナルの量を測定する。該候補アゴニストが（適切な対照と比較して）シグナルの減少を引き起こす場合には、該候補アゴニストを更に、該レポーター遺伝子を含有するｇｂ１ｂ細胞およびｇｂ１ｃ細胞に対して試験する。ｇｂａ細胞においてｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃ細胞より少なくとも約３倍、好ましくは約５倍、より好ましくは約１０倍大きいレポーターシグナルの増加を引き起こす候補アゴニストは、ｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストである。
【０１４３】
したがって、本発明は、ｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストの同定方法であって、
（ａ）アゴニストと該ＧＡＢＡＢ受容体との相互作用により生成される細胞内シグナルにより活性化される誘導性プロモーターの制御下にレポーター遺伝子を含有するｇｂ１ａ細胞を準備すること、
（ｂ）該ｇｂ１ａ細胞を物質にさらすこと、
（ｃ）該ｇｂ１ａ細胞を該物質にさらした後の該レポーター遺伝子からのシグナルの量を測定すること、
（ｄ）アゴニストと該ＧＡＢＡＢ受容体との相互作用により生成される細胞内シグナルにより活性化される誘導性プロモーターの制御下にレポーター遺伝子を含有するｇｂ１ｂ細胞を準備すること、
（ｅ）該ｇｂ１ｂ細胞を該物質にさらすこと、
（ｆ）該ｇｂ１ｂ細胞を該物質にさらした後の該レポーター遺伝子からのシグナルの量を測定すること、
（ｇ）アゴニストと該ＧＡＢＡＢ受容体との相互作用により生成される細胞内シグナルにより活性化される誘導性プロモーターの制御下にレポーター遺伝子を含有するｇｂ１ｃ細胞を準備すること、
（ｈ）該ｇｂ１ｃ細胞を該物質にさらすこと、
（ｉ）該ｇｂ１ｃ細胞を該物質にさらした後の該レポーター遺伝子からのシグナルの量を測定すること、を含んでなり、
工程（ｃ）におけるシグナルの量が、工程（ｆ）における及び工程（ｉ）におけるシグナルの量の少なくとも３倍である場合には、該物質がｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストである、方法を提供する。
【０１４４】
適切なレポーター遺伝子の具体例としては、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼが挙げられる。
【０１４５】
本発明はまた、ｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストを同定するための、第１蛍光色素と第２蛍光色素との間のＦＲＥＴに基づくアッセイを含む。該第１色素は、ｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃヘテロマーを発現する細胞の細胞膜の一方の側に結合し、該第２色素は、膜電位の変化に応答して該膜の一方の面から他方の面へ自由に移動できる。ある実施形態においては、該第１色素は該細胞の細胞膜に不透過性であり、主に該細胞膜の細胞外表面に結合する。該第２色素は該細胞膜内に捕捉されるが、該膜内に自由に拡散できる。該膜の通常の（すなわち、負の）静止電位においては、該第２色素は主に該細胞膜の細胞外面の内部表面に結合し、したがって該第２色素は該第１色素に接近して位置する。この接近性は、それらの２つの色素の間の大量のＦＲＥＴの生成を可能にする。膜の脱分極の後、該第２色素は該膜の細胞外面から細胞内面に移動し、それらの色素の間の距離が増加する。この距離の増加は、ＦＲＥＴの減少およびそれに対応した、該第１色素に由来する蛍光発光の増加、およびそれに対応した、該第２色素からの蛍光発光の減少につながる。Ｇｏｎｚａｌｅｚ　＆　Ｔｓｉｅｎ，１９９７，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＆　Ｂｉｏｌｏｇｙ　４：２６９−２７７の図１を参照されたい。また、Ｇｏｎｚａｌｅｚ　＆　Ｔｓｉｅｎ，１９９５，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６９：１２７２−１２８０および米国特許第５，６６１，０３５号も参照されたい。
【０１４６】
ある実施形態においては、該第１色素は、蛍光供与体として作用する蛍光性レクチンまたは蛍光性リン脂質である。そのような第１色素の具体例としては、クマリン標識ホスファチジルエタノールアミン（例えば、Ｎ−（６−クロロ−７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボキサミドアセチル）−ジミリストイルホスファチジル−エタノールアミン）またはＮ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン）；蛍光標識レクチン（例えば、フルオレセイン標識コムギ胚芽凝集素）が挙げられる。ある実施形態においては、該第２色素は、蛍光受容体として作用するオキソノールである。そのような第２色素の具体例としては、ビス（１，３−ジアルキル−２−チオバルビツラート）トリメチンオキソノール（例えば、ビス（１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツラート）トリメチンオキソノール）またはペンタメチンオキソノール類似体（例えば、ビス（１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール）；またはビス（１，３−ジブチル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール）が挙げられる。本発明での使用に適した種々の色素の合成方法に関しては、Ｇｏｎｚａｌｅｚ　＆　Ｔｓｉｅｎ，１９９７，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＆　Ｂｉｏｌｏｇｙ　４：２６９−２７７を参照されたい。ある実施形態においては、該アッセイは、一重項酸素による光力学損傷を軽減するための天然カロテノイド（例えば、アスタキサンチン）を含みうる。
【０１４７】
本発明は、ＧＡＢＡＢ受容体の活性化が内向き整流性カリウムチャンネルに共役される方法を含む。該ＧＡＢＡＢ受容体の活性化は、カリウムチャンネル（例えば、Ｋｉｒチャンネル）を発現する細胞の細胞膜を横切るカリウム電流の増加をもたらす。この電流の増加は細胞膜の過分極を引き起こし、そのような過分極は、より大きなＦＲＥＴを引き起こすため、前記のとおりのＦＲＥＴに基づく色素または膜電位またはチャンネル色素の使用により或いは電位固定またはパッチクランブ技術により電気生理学的に検出されうる。
【０１４８】
したがって、本発明は、ｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストの同定方法であって、
（ａ）ｇｂ１ａ細胞を準備すること、ここにおいて該細胞は、
（１）ｇｂ２の発現を指令する発現ベクター、
（２）ｇｂ１ａの発現を指令する発現ベクター、
（３）内向き整流性カリウムチャンネルの発現を指令する発現ベクター、
（４）細胞膜の一方の側に結合している第１蛍光色素、および
（５）膜電位の変化に応答して該細胞膜の一方の面から他方の面へ自由に移動できる第２蛍光色素を含む、
（ｂ）物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ａ細胞における蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の量を測定して、該ｇｂ１ａ細胞に関する該物質の存在下のＦＲＥＴに対する該物質の不存在下のＦＲＥＴの比率を求めること、
（ｃ）ｇｂ１ｂ細胞を準備すること、ここにおいて該細胞は、
（６）ｇｂ２の発現を指令する発現ベクター、
（７）ｇｂ１ｂの発現を指令する発現ベクター、
（８）内向き整流性カリウムチャンネルの発現を指令する発現ベクター、
（９）細胞膜の一方の側に結合している第１蛍光色素、および
（１０）膜電位の変化に応答して該細胞膜の一方の面から他方の面へ自由に移動できる第２蛍光色素を含む、
（ｄ）該物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ｂ細胞におけるＦＲＥＴの量を測定して、該ｇｂ１ｂ細胞に関する該物質の存在下のＦＲＥＴに対する該物質の不存在下のＦＲＥＴの比率を求めること、
（ｅ）ｇｂ１ｃ細胞を準備すること、ここにおいて該細胞は、
（１１）ｇｂ２の発現を指令する発現ベクター、
（１２）ｇｂ１ｃの発現を指令する発現ベクター、
（１３）内向き整流性カリウムチャンネルの発現を指令する発現ベクター、
（１４）細胞膜の一方の側に結合している第１蛍光色素、および
（１５）膜電位の変化に応答して該細胞膜の一方の面から他方の面へ自由に移動できる第２蛍光色素を含む、
（ｆ）該物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ｃ細胞におけるＦＲＥＴの量を測定して、該ｇｂ１ｃ細胞に関する該物質の存在下のＦＲＥＴに対する該物質の不存在下のＦＲＥＴの比率を求めること、を含んでなり、
該ｇｂ１ａ細胞に関する該物質の存在下のＦＲＥＴに対する該物質の不存在下のＦＲＥＴの比率が、該ｇｂ１ｂ細胞および該ｇｂ１ｃ細胞に関する該物質の存在下のＦＲＥＴに対する該物質の不存在下のＦＲＥＴの比率より少なくとも約５０％大きい場合には、該物質がｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストである、方法を提供する。
【０１４９】
特定の実施形態においては、該ｇｂ１ａ細胞に関する該物質の存在下のＦＲＥＴに対する該物質の不存在下のＦＲＥＴの比率は、該ｇｂ１ｂ細胞および該ｇｂ１ｃ細胞に関する該物質の存在下のＦＲＥＴに対する該物質の不存在下のＦＲＥＴの比率より少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約１００％、より一層好ましくは少なくとも約２００％大きい。
【０１５０】
もちろん、当業者は、小工程（ａ）（１）〜（２）に列挙した事項の少なくとも１つを欠く細胞を該物質にさらしＦＲＥＴを測定する対照アッセイを行なうべきであると認識するであろう。これらの対照アッセイにおいてそのようにして測定したＦＲＥＴの量は、前記工程（ｂ）において該物質の存在下で測定したＦＲＥＴの量より少ないはずである。これは、該物質が、該ｇｂ１ａヘテロマーに無関係なメカニズムにより作用するのではないことを保証するであろう。一般に、測定された効果が物質と該ｇｂ１ａヘテロマーとの相互作用を介して生じることを保証するためには、対照アッセイが本明細書に記載のアッセイに望ましいかもしれないと、当業者は理解するであろう。一般に望ましいもう１つのタイプの対照アッセイは、ｇｂ１ｂ細胞およびｇｂ１ｃ細胞における機能的ＧＡＢＡＢ受容体応答をＧＡＢＡが増強しうるか否かを判定することにより、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃヘテロマーである機能的ＧＡＢＡＢ受容体の存在に関してｇｂ１ｂ細胞およびｇｂ１ｃ細胞を試験することである。当業者は、当技術分野において一般的に公知の知見と組合された本明細書の教示に基づき、そのような対照アッセイの設計方法を理解するであろう。
【０１５１】
本発明の方法における使用に適した内向き整流性カリウムチャンネルは、例えば、Ｍｉｓｇｅｌｄら，１９９５，Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．４６：４２３−４６２；Ｎｏｒｔｈ，１９８９，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．９８：１３−２３；Ｇａｈｗｉｌｅｒら，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８２：１５５８−１５６２；Ａｎｄｒａｄｅら，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３４：１２６１に開示されている。
【０１５２】
前記方法の特定の実施形態においては、該第１蛍光色素は、蛍光性レクチン、蛍光性リン脂質、クマリン標識ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−（６−クロロ−７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボキサミドアセチル）−ジミリストイルホスファチジル−エタノールアミン）、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン）、およびフルオレセイン標識コムギ胚芽凝集素よりなる群から選ばれる。
【０１５３】
前記方法の特定の実施形態においては、該第２蛍光色素は、蛍光受容体として作用するオキソノール、ビス（１，３−ジアルキル−２−チオバルビツラート）トリメチンオキソノール、ビス（１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツラート）トリメチンオキソノール）、ビス（１，３−ジアルキル−２−チオバルビツラート）クワトラ（ｑｕａｔｒａ）メチンオキソノール、ビス（１，３−ジアルキル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール、ビス（１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール、ビス（１，３−ジブチル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール、およびビス（１，３−ジアルキル−２−チオバルビツラート）ヘキサメチンオキソノールよりなる群から選ばれる。
【０１５４】
該ＧＡＢＡＢ受容体は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）として公知のタンパク質のクラスに属する。ＧＰＣＲは、リガンドが結合すると細胞膜越しにシグナルを伝達する。リガンドが結合したＧＰＣＲは、ヘテロ三量体Ｇタンパク質と相互作用して、Ｇタンパク質のＧαサブユニットをＧβおよびＧγサブユニットから解離させる。ついで該Ｇαサブユニットは種々の第２メッセンジャー系を活性化し続けうる。いくつかの場合には、該第２メッセンジャー系を活性化するのは、ＧβまたはＧγサブユニットである。
【０１５５】
一般に、ある特定のＧＰＣＲは、ある特定のタイプのＧタンパク質のみと共役するにすぎない。したがって、該ＧＰＣＲからの機能的応答を観察するためには、該ＧＰＣＲを含有する系内に適切なＧタンパク質が存在することを保証する必要がある。しかしながら、「プロミスカス」である或るＧタンパク質が存在することが判明している。これらのプロミスカスＧタンパク質は、実質的に任意のＧＰＣＲと共役して、それからの機能的シグナルを伝達するであろう。Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ　＆　Ｓｉｍｏｎ，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５１７５−１５１８０（Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ）を参照されたい。Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓは、多数のＧＰＣＲのうちの１つの発現とプロミスカスＧタンパク質Ｇα１５またはＧα１６の１つの発現とをもたらす発現ベクターで細胞が形質転換される系を記載している。形質転換細胞にＧＰＣＲのアゴニストを加えると、該ＧＰＣＲは活性化され、Ｇα１５またはＧα１６を介して、ホスホリパーゼＣのβアイソフォームを活性化して、該細胞内のイノシトールリン酸レベルの増加を引き起こすことが可能であった。Ｏｆｆｅｒｍａｎｓにより記載されているＧタンパク質に加えて、Ｇｑｉ５などのキメラＧタンパク質も、該ホスホリパーゼＣ経路とのＧＰＣＲのプロミスカス共役を示す。したがって、本発明は、プロミスカスＧタンパク質の代わりにキメラＧタンパク質を使用すること以外は、プロミスカスＧタンパク質を使用する本明細書に記載のアッセイと実質的に同じであるアッセイを含む。キメラＧタンパク質は、例えば、Ｊｏｓｈｉら，１９９９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１：３８３−３８８に記載されている。
【０１５６】
これらのプロミスカスＧタンパク質を利用することにより、ＧＡＢＡＢ受容体がインビボで共役するＧタンパク質が未知であったとしても、ｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストの同定のための機能的アッセイを設計することが可能である。ＧＡＢＡＢ受容体に関してプロミスカスＧタンパク質を利用する１つの可能性には、ｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストの同定方法であって、
（ａ）ｇｂ２、ｇｂ１ａおよびプロミスカスＧタンパク質を発現するｇｂ１ａ細胞を準備すること、ここで、ｇｂ２とｇｂ１ａとは、機能的ＧＡＢＡＢ受容体に相当するヘテロマーを形成する、
（ｂ）該ｇｂ１ａ細胞におけるイノシトールリン酸のレベルを測定すること、
（ｃ）該ｇｂ１ａ細胞の一部を物質にさらすこと
（ｄ）該物質にさらされたｇｂ１ａ細胞におけるイノシトールリン酸のレベルを測定すること、
（ｅ）工程（ｂ）で測定したイノシトールリン酸のレベルに対する工程（ｄ）で測定したイノシトールリン酸のレベルの比率を求めること、
（ｆ）ｇｂ２、ｇｂ１ｂおよびプロミスカスＧタンパク質を発現するｇｂ１ｂ細胞を準備すること、ここで、ｇｂ２とｇｂ１ｂとは、機能的ＧＡＢＡＢ受容体に相当するヘテロマーを形成する、
（ｇ）該ｇｂ１ｂ細胞におけるイノシトールリン酸のレベルを測定すること、
（ｈ）該ｇｂ１ｂ細胞の一部を物質にさらすこと
（ｉ）該物質にさらされたｇｂ１ｂ細胞におけるイノシトールリン酸のレベルを測定すること、
（ｊ）工程（ｇ）で測定したイノシトールリン酸のレベルに対する工程（ｉ）で測定したイノシトールリン酸のレベルの比率を求めること、
（ｋ）ｇｂ２、ｇｂ１ｃおよびプロミスカスＧタンパク質を発現するｇｂ１ｃ細胞を準備すること、ここで、ｇｂ２とｇｂ１ｃとは、機能的ＧＡＢＡＢ受容体に相当するヘテロマーを形成する、
（ｌ）該ｇｂ１ｃ細胞におけるイノシトールリン酸のレベルを測定すること、
（ｍ）該ｇｂ１ｃ細胞の一部を物質にさらすこと
（ｎ）該物質にさらされたｇｂ１ｃ細胞におけるイノシトールリン酸のレベルを測定すること、
（ｏ）工程（ｌ）で測定したイノシトールリン酸のレベルに対する工程（ｎ）で測定したイノシトールリン酸のレベルの比率を求めること、を含んでなり、
工程（ｅ）で測定した比率が、工程（ｊ）および（ｏ）で測定した比率より少なくとも５０％大きい場合、該物質がｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストである、方法が含まれる。
【０１５７】
特定の実施形態においては、工程（ｅ）で測定した比率は、工程（ｊ）および（ｏ）で測定した比率より少なくとも１００％、２００％または５００％大きい。
【０１５８】
イノシトールリン酸のレベルは、カルシウムの動員を観察することにより測定することができる。細胞内カルシウムの動員は、典型的には、蛍光色素を使用して顕微鏡下で全細胞において又はエクオリンアッセイを用いてルミネセンスにより細胞懸濁液において分析する。あるいは、カルシウムレベルを測定するための本明細書に記載の又は当技術分野で公知の他のアッセイを用いることができる。
【０１５９】
前記の方法に関連した方法においては、ＧＡＢＡＢ受容体機能の指標としてイノシトールリン酸のレベルの変化を用いる代わりに、カリウム電流を測定する。ＧＡＢＡＢ受容体は、他の代謝型受容体と同様に、カリウムチャンネルと共役するため、これが実施可能である。例えば、卵母細胞においてＧＩＲＫ１、ＧＩＲＫ２、ＧＩＲＫ３、ＧＩＲＫ４または他のカリウムチャンネルと共役するＧＡＢＡＢ受容体を測定することが可能であろう。ＧＩＲＫ、卵母細胞の操作方法、ならびに卵母細胞およびＨＥＫ２９３細胞におけるカリウムチャンネル活性の測定方法は、Ｇｏｌｄｉｎ，１９９２，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０７：２６６−２７９；Ｑｕｉｃｋ　＆　Ｌｅｓｔｅｒ，１９９４，Ｍｅｔｈ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：２６１−２７９；Ｓｍｉｔｈら，１９９８，Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．２７３：２３３２１−２３３２６；Ｋｕｂｏら，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ　３６４：８０２−８０６；Ｋｒａｐｉｖｉｎｓｋｙら，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ　３７４：１３５−１４１；Ｄａｓｃａｌら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：１０２３５−１０２３９；Ｊｏｎｅｓら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ　３９６：６７４−６７９，Ｗｈｉｔｅら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ　３９６：６７９−６８２；Ｋａｕｐｍａｎｎら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ　３９６：６８３−６８７；Ｋｕｎｅｒら，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８３：７４−７７；およびこれらにおいて引用されている参考文献に記載されている。
【０１６０】
前記方法の特定の実施形態においては、該プロミスカスＧタンパク質は、Ｇα１５、Ｇα１６およびキメラＧタンパク質、例えばＧｑｉ５よりなる群から選ばれる。Ｇα１５またはＧα１６を含有する発現ベクターは当技術分野において公知である。例えば、Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ　＆　Ｓｉｍｏｎ，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５１７５−１５１８０；Ｂｕｈｌら，１９９３，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．３２３：１３２−１３４；Ａｍａｔｒｕｄａら，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１０１３９−１０１４４を参照されたい。
【０１６１】
本発明は、ｇｂ２とｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃとを共発現してｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃヘテロマーであるＧＡＢＡＢ受容体の形成をもたらす細胞を使用する。ＧＡＢＡＢ受容体を通常は発現しない細胞を、ｇｂ２とｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃとをコードする発現ベクターで形質転換し、ついで、ｇｂ１ａ／ｇｂ２、ｇｂ１ｂ／ｇｂ２、またはｇｂ１ｃ／ｇｂ２の機能的ＧＡＢＡＢ受容体ヘテロマーが形成される条件下で該細胞を培養することにより、そのような細胞は一般に製造される。このようにして、機能的ＧＡＢＡＢ受容体を発現する組換え宿主細胞が製造される。いくつかの実施形態においては、本発明はまた、ＧＡＢＡＢ受容体を天然に発現する小脳または皮質に由来する細胞系を使用しうる。動物脳、例えばラットＣＡ１錐体ニューロンから誘導された初代細胞も、本発明での使用に適している。
【０１６２】
組換え宿主細胞は原核性または真核性でありうる。それらには、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌、酵母などの真菌細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類由来の細胞系など（これらに限定されるものではない）の哺乳類細胞、およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）およびカイコに由来する細胞系などの昆虫細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。組換え発現に適した細胞および細胞系の多くは商業的に入手可能であり、それらには、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　１．２）、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　１７１）、メラノトローフ細胞系（例えば、ｔａＡ５８［Ｃｈｒｏｎｗａｌｌら，２０００，ｔｈｅ　３０ｔｈ　Ａｎｎｕａｌ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｍｅｅｔｉｎｇ（Ｎｏｖ．２０００），Ｎｅｗ　Ｏｒｌｅａｎｓ，ＬＡからのＡｂｓｔｒａｃｔ　６２２．９］；ｍＩＬ３９［Ｈｎａｓｋｏら，１９９７，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１３８：５５８９−５５９６］）、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）黒色素胞、およびツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１６３】
好ましい実施形態においては、該形質転換サブユニットの効果を識別するのを容易にするためには、該宿主細胞は、ＧＡＢＡＢ受容体を天然では発現しないものとする。
【０１６４】
本発明での使用に特に適した細胞は、ｇｂ２とｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃとを共発現しｇｂ２がｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃのいずれかと機能的ヘテロマーを形成しているツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞である。そのような細胞における機能的ヘテロマーの存在は、内向き整流性カリウムチャンネル（特に、Ｋｉｒ３ファミリー）への機能的ＧＡＢＡＢ受容体の共役を測定するアッセイの使用により判定することができる。ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞の場合、ｇｂ２とｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃとの共発現は、しばしば、ｇｂ２とｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃとをコードする発現ベクターで該卵母細胞を形質転換する代わりに、ｇｂ２をコードするＲＮＡとｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃをコードするＲＮＡとを該卵母細胞内に微量注入することにより行われる。該ＲＮＡにコードされるタンパク質を発現させるためのツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞内へのＲＮＡのマイクロインジェクションは、当技術分野でよく知られている。
【０１６５】
ｇｂ１ａヘテロマーを発現するがｇｂ１ｂヘテロマーもｇｂ１ｃヘテロマーも発現しない、動物から単離された細胞系も、本発明での使用に適している。１つの可能性は、マウス下垂体腫瘍からそのような細胞系を誘導することである。そのような細胞系は、プロオピオメラノコルチンプロモーター（Ｌｏｗら，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２４９６７−２４９７５）の制御下でＳＶ４０ラージＴ抗原を発現するトランスジェニックマウスから得ることができる。このプロモーターの使用は、マウス下垂体内での該ラージＴ抗原の組織特異的発現、および中葉下垂体腫瘍の発生を引き起こす。そのような腫瘍から、メラノトローフ細胞系を単離することができる（例えば、Ｈｎａｓｋｏら，１９９７，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１３８：５５８９−５５９６に記載のｍＩＬ３９細胞系を参照されたい）。これらのメラノトローフ細胞系の多くは、ｇｂ１ａ受容体を発現するが、ｇｂ１ｂ受容体をもｇｂ１ｃ受容体をも発現しない。したがって、それらは、本発明の方法における使用に適している。この方法の変法においては、ＳＶ４０ラージＴ抗原は、ｔｓＡ５８として公知の温度感受性体でありうる（例えば、Ｃｈｒｏｎｗａｌｌら，２０００，ｔｈｅ　３０ｔｈ　Ａｎｎｕａｌ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｍｅｅｔｉｎｇ（２０００年１１月），Ｎｅｗ　ＯｒｌｅａｎｓからのＡｂｓｔｒａｃｔ　６２２．９に記載のｍＩＬ−ｔｓＡ５８細胞系を参照されたい）。
【０１６６】
前記のメラノトローフ細胞系がｇｂ１ａ受容体を発現するがｇｂ１ｂ受容体をもｇｂ１ｃ受容体をも発現しないことを確認するためには、ｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃに特異的な抗血清を使用することができる。そのような抗血清は、本明細書に記載のｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃアミノ酸配列に特有のペプチドを免疫原として使用する標準的な方法により産生させることができる。あるいは、ウエスタンブロット上でサブユニットを識別するために、サブユニットの分子量の相違に基づき２以上のＧＡＢＡＢ受容体サブユニットを認識する抗血清を使用することができる。ｇｂ１ａおよびｇｂ１ｂを認識する抗血清を使用するそのような手法の一例については、Ｋａｕｐｍａｎｎら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ　３９６：６８３−６８７を参照されたい。本明細書に記載の方法での使用に適したメラノトローフ細胞系のウエスタンブロッティングは、約１３０ｋＤａの分子量のｇｂ１ａに対応するバンドの存在を示すが、ｇｂ１ｂ（約１００ｋＤａ）に相当する対応バンドをもｇｂ１ｃ（約１２５ｋＤａ）に相当する対応バンドをも示さないはずである。
【０１６７】
本明細書に記載のデータ（実施例１１を参照されたい）は、ガバペンチン（ＥＣ５０＝２μＭ）が、マウス下垂体中葉メラノトロープ（ｍｅｌａｎｏｔｒｏｐｅ）クローン性ｍＩＬ−ｔｓＡ５８細胞系において、電位依存性カルシウムチャンネル（ＶＤ−ＣＣ）を介した全Ｋ＋誘発性Ｃａ２＋流入の７０〜８０％までを抑制したことを示している。ｔｓＡ５８ｍＩＬ細胞はｇｂ１ａヘテロマーのみを内因的に発現し、また、ｇｂ１ｂヘテロマーをもｇｂ１ｃヘテロマーをも発現しない。さらに、ｔｓＡ５８細胞におけるアゴニスト　ガバペンチンの活性は、ＧＡＢＡＢ受容体アンタゴニストＣＧＰ５５８４５により用量依存的かつ完全に遮断され、原型ＧＡＢＡＢ受容体アゴニスト　バクロフェンの活性と、度合および効力においてほぼ同一であった。また、ｇｂ１ａのアンチセンス抑制はガバペンチン活性を完全に遮断し、ｇｂ１ｂアンチセンスおよび対照オリゴヌクレオチドは何ら影響を及ぼさなかったが、このことは、これらのｍＩＬ細胞における膜Ｃａ２＋動員のガバペンチン抑制が機能的ｇｂ１ａヘテロマー受容体に基づくものであったことを示している。
【０１６８】
ガバペンチンは、ＧＩＲＫに共役した組換え及びニューロンＧＡＢＡＢ　ｇｂ１ａ−ｇｂ２ヘテロマーサブタイプの選択的アゴニストであること、ならびにそれは半アゴニストではなく、ｇｂ１ｂ−ｇｂ２およびｇｂ１ｃ−ｇｂ２ヘテロマーにおいてＧＡＢＡ活性を遮断しないことが、最近報告された（Ｎｇら，２００１，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．５９：１４４−１５２）。ＶＤ−ＣＣに負に共役したＧＡＢＡＢ受容体の選択的ガバペンチン活性化は、Ｋ＋誘発性Ｃａ２＋依存性応答におけるガバペンチンの作用を説明するものであるかもしれない。そして、この見解はまた、いくつかの中枢ニューロンにおける電位感受性カルシウム電流に対するガバペンチンの抑制作用に符合する（Ｓｔｅｆａｎｉら，１９９８，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　３７：８３−９１）。実際のところ、本明細書に記載のデータは、ガバペンチンが、ｍＩＬ細胞内で内因的に発現された脳ＧＡＢＡＢ　ｇｂ１ａ−ｇｂ２ヘテロマー受容体におけるアゴニストであり、ＶＤ−ＣＣ機能の、原型ＧＡＢＡＢ受容体アゴニスト　バクロフェンの場合に類似した強固な用量依存性抑制を媒介することを示している。ガバペンチンのこれらの効果は該ＧＡＢＡＢ受容体における選択的活性に帰されうる。なぜなら、それらは、該ｇｂ１ａサブユニットにおける選択的アンチセンス抑制およびＧＡＢＡＢ受容体アンタゴニストにより遮断されうるからである。このことは、Ｎｇら，２００１，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．５９：１４４−１５２により報告されている、組換えＧＡＢＡＢ受容体における選択的活性と符合する。
【０１６９】
組換えＧＡＢＡＢ受容体ヘテロマーは、培養ＮＧ１０８−１５細胞および交換神経細胞においてカルシウムチャンネルに共役すること（Ｅａｓｔｅｒら，２０００，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５２３Ｐ：１９２Ｐ；Ｆｉｌｉｐｐｏｖら，２０００，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０：２８６７−２８７４）、およびラット下垂体メラノトロープおよび背根感覚ニューロンにおける天然受容体の活性化はカルシウム電流の抑制を招くこと（Ｈａｎｄら，２０００，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔｓ．２９０：４９−５２；Ｍｏｒｒｉｓら，１９９８，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７１：１３２９−１３３２）が示されている。また、本明細書に記載の結果は、ｉｎ　ｓｉｔｕで海馬ニューロンにおいて、ガバペンチンが、Ｎおよび／またはＰ／Ｑ型ＶＤ−ＣＣに負に共役したＧＡＢＡＢ受容体を活性化することを示している。しかし、本明細書に記載のデータは、Ｌ型Ｃａ２＋チャンネルに対するガバペンチンの優勢な作用を支持していない。なぜなら、ガバペンチンは、亜閾値Ｃａ２＋応答を抑制したが、本実験においては、Ｃａ２＋活動電位を妨げなかったからである。ＶＤ−ＣＣに共役したニューロンＧＡＢＡＢ受容体に対するガバペンチンの作用は、海馬ニューロンにおけるバクロフェンの従来報告されている作用に一致している（Ｓｃｈｏｌｚ　＆　Ｍｉｌｌｅｒ，１９９１，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄ．）４４４：６６９−６８６；Ｌａｍｂｅｒｔ　＆　Ｗｉｌｓｏｎ，１９９６，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄ．）４９２：１１５−１２７）。前記で引用した研究および本明細書に記載のデータは、ＶＤ−ＣＣが、ニューロンＧＡＢＡＢ受容体に関する主要かつ生理的に重要なエフェクターの１つであることを強調している。
【０１７０】
本発明は、ｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストの同定方法であって、
（ａ）物質が、ｇｂ１ａ受容体を発現するがｇｂ１ｂ受容体をもｇｂ１ｃ受容体をも発現しないメラノトローフ細胞系においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定すること、
（ｂ）該物質がｇｂ１ｂ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定すること、
（ｃ）該物質がｇｂ１ｃ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定すること、を含んでなり、
該物質が該メラノトローフ細胞系においてはＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するが、該ｇｂ１ｂ細胞においても該ｇｂ１ｃ細胞においても該応答を活性化しない場合には、該物質がｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストである、方法を含む。
【０１７１】
特定の実施形態においては、該メラノトローフ細胞系は、ｍＩＬ３９細胞およびｍＩＬ−ｔｓＡ５８細胞よりなる群から選ばれる。
【０１７２】
特定の実施形態においては、該機能的応答は、イオンチャンネルの活性の調節、カルシウム濃度の変化、アゴニストと該ＧＡＢＡＢ受容体との相互作用により誘導されるプロモーターにより発現が制御されるレポーター遺伝子からのシグナルの変化、および膜電流の変化よりなる群から選ばれる。特定の実施形態においては、膜電流の変化は、内向き整流性カリウム電流の活性の調節により生じる。他の実施形態においては、膜電流の変化は、電位依存性カルシウムチャンネルの活性の調節により生じる。
【０１７３】
特定の実施形態においては、該ｇｂ１ｂ細胞およびｇｂ１ｃ細胞は、いずれのＧＡＢＡＢ受容体サブユニットをも天然では発現しない細胞であり、機能的ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃ受容体を形成するようｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃサブユニットおよびｇｂ２サブユニットをコードする発現ベクターで形質転換された細胞である。
【０１７４】
特定の実施形態においては、該物質が、ＧＡＢＡＢ受容体を介したメラノトローフ細胞系における該機能的応答の活性化をもたらすことは、ＧＡＢＡＢ受容体の特異的インヒビター（例えば、ＣＧＰ５５８４５）での該メラノトローフ細胞の処理により該機能的応答が阻止または減弱されることを示すことにより確認される。
【０１７５】
ＳＶ４０ラージＴ抗原発現によりトランスジェニックマウスにおいて誘発された腫瘍から開発されたＧＴ１ニューロン細胞系（Ｍａｒｔｉｎｅｚ　ｄｅ　ｌａ　Ｅｓｃａｌｅｒａら，１９９４，Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　５９：４２０−４２５；Ｍｅｌｌｏｎら，１９９０，Ｎｅｕｒｏｎ　５：１−１０）も、本発明での使用に適している。これらの細胞においては、ＧＡＢＡＢ受容体の刺激（例えば、ムシモールまたはベンゾジアゼピンのようなＧＡＢＡＢ受容体特異的アゴニストでの該細胞の処理によるもの）は、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）の分泌を招く。Ｍａｒｔｉｎｅｚ　ｄｅ　ｌａ　Ｅｓｃａｌｅｒａら，１９９４，Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　５９：４２０−４２５を参照されたい。ｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストでのこれらの細胞の刺激は、ＧｎＲＨ放出の抑制を招くであろう。
【０１７６】
ｇｂ２、ｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂおよびｇｂ１ｃに関して本明細書に開示されているアミノ酸配列と類似しているが完全には同じでないアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する細胞も、本発明での使用に適している。単一のアミノ酸の置換は通常はタンパク質の生物活性を改変しないことが、一般に認められている（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ，Ｗａｔｓｏｎら，１９８７，第４版，Ｔｈｅ　Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，ｐ．２２６；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ　＆　Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４：１０８１−１０８５を参照されたい）。したがって、本発明の実施のための適切な細胞には、本明細書に開示するｇｂ２、ｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃアミノ酸配列において１つのアミノ酸置換が施されており天然ｇｂ２、ｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂおよびｇｂ１ｃと実質的に同じ生物活性を依然として保有するポリペプチドを含有する細胞が含まれる。本発明はまた、本明細書に開示するｇｂ２、ｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃアミノ酸配列において２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のアミノ酸置換が施されており天然ｇｂ２、ｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃと実質的に同じ生物活性を依然として保有するポリペプチドの使用を含む。特に、本発明は、前記置換が同類置換である実施形態を含む。特に、本発明は、前記置換がＨＧ２０のリガンド結合ドメイン内に存在しない実施形態を含む。特に、本発明は、前記置換がｇｂ２、ｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃのリガンド結合ドメイン内には存在しない実施形態を含む。特に、本発明は、進化的には保存されていないｇｂ２、ｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃの位置においてアミノ酸の変化が施されている実施形態を含む。ｇｂ２、ｇｂ１ａまたはｇｂ１ｂのいずれの位置が進化的に保存されていないかに関する指針として、当業者は、Ｋｕｎｅｒら，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８３：７４−７７の図１Ａ；Ｋａｕｐｍａｎｎら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ　３９６：６８３−６８７の図１ａ；Ｊｏｎｅｓら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ　３９６：６７４−６７９の図１ａ；またはＷｈｉｔｅ，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ　３９６：６７９−６８２の図１の開示を参照することができる。そのような図においては、ｇｂ２のアミノ酸配列がｇｂ１ａまたはｇｂ１ｂのアミノ酸配列と比較されている。ｇｂ２がｇｂ１ａまたはｇｂ１ｂと同じアミノ酸を共有しない位置は、進化的に保存されていない位置である。進化的に保存されていないｇｂ１ｃのアミノ酸配列の位置を決定するために、ｇｂ２とｇｂ１ｃとの間の同様の比較を容易に行うことが可能である。
【０１７７】
ｇｂ２とｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃのいずれかとを共発現する前記細胞を製造するために、ｇｂ２、ｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂおよびｇｂ１ｃをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを該細胞内に形質転換することができる。ｇｂ２、ｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂおよびｇｂ１ｃは、それぞれの独立した発現ベクターで別々に形質転換されうる。あるいは、ｇｂ２とｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂまたはｇｂ１ｃの１つとの両方をコードする単一の発現ベクターを使用することができる。形質転換は、該細胞内に発現ベクターを導入するための当技術分野において公知の任意の方法を包含する意である。例えば、形質転換には、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムに媒介される形質転換、リポフェクション、レトロウイルス構築物での感染、およびエレクトロポレーションが含まれる。また、β−ラクタマーゼ、レポーター遺伝子および／またはプロミスカスＧタンパク質の発現は、これらのタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形質転換により行うことができる。
【０１７８】
組換えｇｂ２、ｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂ、ｇｂ１ｃ、β−ラクタマーゼ、レポーター遺伝子および／またはプロミスカスＧタンパク質を発現させるためには、種々の発現ベクターを使用することができる。商業的に入手可能な適切な発現ベクターには、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡＩおよびｐｃＤＮＡＩａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ　３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ　３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ　３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ　３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ　３７１９８）、ｐＣＩ．ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＴＲＥ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ｐＩＲＥＳｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ｐＳＣ１１、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ　３７１４６）およびＰＴ７ＴＳ卵母細胞発現ベクター（またはグロビン５’ＵＴＲおよびグロビン３’ＵＴＲを含有する同様の発現ベクター）が含まれるが、これらに限定されるものではない。ベクターの選択は、使用する細胞型、所望の発現レベルなどに左右されるであろう。
【０１７９】
本明細書に記載の方法における検出の便宜を図るために、該物質を標識（例えば、放射能標識、酵素標識、蛍光標識など）することができる。
【０１８０】
本明細書に記載の方法の特定の実施形態においては、ｇｂ２とｇｂ１ａとのヘテロマーに対するｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストの結合アフィニティー（ＫＤ）を測定する。特定の実施形態においては、そのような結合アフィニティーは１ｎＭ〜２００ｍＭであり、好ましくは５ｎＭ〜１ｍＭであり、より好ましくは１０ｎＭ〜１００μＭであり、より一層好ましくは１０ｎＭ〜１００ｎＭである。
【０１８１】
本明細書に記載の方法において細胞が物質にさらされる条件は、タンパク質−リガンド相互作用の研究のために当技術分野で典型的に用いられる条件（例えば、生理的ｐＨ；例えば、ＰＢＳなどの一般に使用されるバッファーに典型的な又は組織培養培地における塩条件；約４℃〜約５５℃の温度；数分間〜数時間のインキュベーション時間）である。一般には、該細胞を懸濁培養または浮遊培養内で増殖させ、所望により最初に該培地を洗い落とした後、該物質を該細胞に直接加える。卵母細胞を使用する実施形態では、一般には、該卵母細胞を単離し、浴内に維持し、それに該物質を適切な時点で加える。
【０１８２】
該ＧＡＢＡＢ受容体のサブユニットをコードするＤＮＡは、該サブユニットをコードするｃＤＮＡを適切なｃＤＮＡライブラリーから単離することにより得ることができる。適切なｃＤＮＡライブラリーは、例えば、成人ヒト小脳ｃＤＮＡライブラリーであろう。そのようなライブラリーは、当技術分野でよく知られた方法により製造することができる。そのようなライブラリーからサブタイプ特異的ｃＤＮＡを単離するのに使用する適切なオリゴヌクレオチドは、本明細書に開示するｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂ、ｇｂ１ｃおよびｇｂ２をコードするＤＮＡ配列に基づいて、あるいは科学文献に開示されているこれらのサブユニットをコードするＤＮＡ配列に基づいて設計することができる。
【０１８３】
前記方法の特定の実施形態においては、ｇｂ２は、
配列番号１０、
配列番号１０の９−９４１位、
配列番号１０の３５−９４１位、
配列番号１０の３６−９４１位、
配列番号１０の３８−９４１位、
配列番号１０の３９−９４１位、
配列番号１０の４２−９４１位、
配列番号１０の４４−９４１位、
配列番号１０の４６−９４１位、
配列番号１０の５２−９４１位、
配列番号１０の５７−９４１位、
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０５６０８５におけるアミノ酸配列、
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ０１２１８８におけるアミノ酸配列、
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０５８７９５におけるアミノ酸配列、および
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＳＦ０７４４８２において寄託されているＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列
よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【０１８４】
前記方法の特定の実施形態においては、ｇｂ２はキメラｇｂ２タンパク質である。キメラｇｂ２タンパク質は、非ｇｂ２タンパク質のポリペプチド配列にインフレームで融合したｇｂ２の連続的ポリペプチド配列を意味する。例えば、Ｇタンパク質にインフレームでＣ末端において融合したｇｂ２のＮ末端ドメインおよび７個の膜貫通伸長ドメインはキメラｇｂ２タンパク質である。キメラｇｂ２タンパク質のもう１つの例は、配列番号１０のアミノ酸５２−９４１のアミノ末端においてインフレームで融合したＦＬＡＧエピトープを含むポリペプチドである。キメラｇｂ２タンパク質の特に好ましい形態は、ｇｂ２のＮ末端の部分が非ｇｂ２ポリペプチドで置換されたものである。
【０１８５】
本発明においては、キメラｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂおよびｇｂ１ｃタンパク質も使用することができる。特定の実施形態においては、該キメラｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂおよびｇｂ１ｃタンパク質は、非ｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂおよびｇｂ１ｃタンパク質のポリペプチド配列にインフレームで融合した、シグナル配列を除くｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂおよびｇｂ１ｃの全コード領域を含む。
【０１８６】
特定の実施形態においては、ｇｂ２をコードする発現ベクターは、
配列番号９の２９３−３，１１５位、
配列番号９の３１７−３，１１５位、
配列番号９の３９５−３，１１５位、
配列番号９の３９８−３，１１５位、
配列番号９の４０４−３，１１５位、
配列番号９の４０７−３，１１５位、
配列番号９の４１６−３，１１５位、
配列番号９の４２２−３，１１５位、
配列番号９の４２８−３，１１５位、
配列番号９の４４６−３，１１５位、および
配列番号９の４６１−３，１１５位
よりなる群から選ばれる。
【０１８７】
前記方法の特定の実施形態においては、ｇｂ１ａは、
配列番号２、
配列番号４、および
Ｋａｕｐｍａｎｎら，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ　３８６：２３９−２４６；：２３９−２４６に報告されているＧＡＢＡＢＲ１ａアミノ酸配列
よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【０１８８】
前記方法の特定の実施形態においては、ｇｂ１ｂは、ラットｇｂ１ｂであり、Ｋａｕｐｍａｎｎら，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ　３８６：２３９−２４６に報告されているＧＡＢＡＢＲ１ｂとして公知のアミノ酸配列を有するか、あるいはヒトｇｂ１ｂであり、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２２５０２９もしくはＡＪ０１２１８６で寄託されているＤＮＡ配列にコードされるアミノ酸配列を有するか、または配列番号６である。
【０１８９】
前記アッセイは、ｇｂ１ａサブタイプ特異的インバースアゴニストを同定するために修飾することが可能であろう。そのようなアッセイにおいては、ｇｂ１ａサブタイプ特異的インバースアゴニストは、アゴニストで認められる変化の反対の、アッセイされているシグナルの変化により同定されるであろう。例えば、β−ラクタマーゼレポーター遺伝子を使用するアッセイにおいては、ｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストがβ−ラクタマーゼ活性の増加を招く条件下では、ｇｂ１ａサブタイプ特異的インバースアゴニストはβ−ラクタマーゼ活性の減少を招くであろう。同様に、ｇｂ１ａサブタイプ特異的インバースアゴニストは、ｃＡＭＰレベルの減少を観察する機能アッセイを修飾することにより同定することができる。ｇｂ１ａサブタイプ特異的インバースアゴニストに関するアッセイの場合には、ｃＡＭＰレベルの増加が認められるであろう。
【０１９０】
本明細書に記載の方法のいくつかを修飾することが可能であり、この場合、全細胞を物質にさらす代わりに、該細胞から膜を調製し、それらの膜を該物質にさらすことができる。細胞の代わりに膜を使用するそのような修飾は、細胞への該物質の結合の測定を伴う方法に特に適している。
【０１９１】
物質が、該ｇｂ１ｂヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的なアゴニストであることを確認するので時には十分であり、ｇｂ１ｃヘテロマーに対する該アゴニストの有り得る効果をも確認する必要はないかもしれない。そのような場合、本明細書に記載の方法は、該ｇｂ１ｃヘテロマーに対する該物質の効果を確認する工程を行わない以外はｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストの同定に関して前記したのと実質的に同じ様態でそれらを行うよう修飾することができる。
【０１９２】
したがって、本発明はまた、以下の方法を含む。
【０１９３】
該ｇｂ１ｂヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）物質が、ｇｂ１ａサブユニットを含むＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストであることを判定すること、
（ｂ）該物質が、ｇｂ１ｂサブユニットを含むＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストではないことを判定することを含んでなる方法。
【０１９４】
特定の実施形態においては、該方法は更に、以下の工程、すなわち、
（ｃ）該物質がシナプス後カリウム電流を活性化することを判定する工程、
（ｄ）該物質がＧＡＢＡ抑制性シナプス後電流を前シナプス的には抑制しないことを判定する工程、
（ｅ）該物質がＧＡＢＡＡ受容体のアゴニストではないことを判定する工程、
（ｆ）該物質が、電位依存性カルシウムチャンネルに負に共役したＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストであることを判定する工程の１以上を含む。
【０１９５】
該ｇｂ１ｂヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）物質をｇｂ１ａ細胞およびｇｂ１ｂ細胞に別々にさらすこと、
（ｂ）該ｇｂ１ａ細胞およびｇｂ１ｂ細胞への該物質の結合を定量することを含んでなり、
該ｇｂ１ａ細胞への該物質の結合の量が、該ｇｂ１ｂ細胞への該物質の結合の量より少なくとも３倍大きい場合には、該物質が、該ｇｂ１ｂヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質である、方法。
【０１９６】
該ｇｂ１ｂヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）ｇｂ１ａ細胞を準備すること、
（ｂ）物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ａ細胞をガバペンチンまたはプレガバリンにさらすこと、
（ｃ）該物質の存在下および不存在下の該ｇｂ１ａヘテロマーへのガバペンチンまたはプレガバリンの結合を測定すること、
ここで、工程（ｃ）におけるガバペンチンまたはプレガバリンの結合の量が、該物質の不存在下より該物質の存在下で少ない場合には、
（ｄ）該物質がｇｂ１ｂ細胞に結合するか否かを判定することを含んでなり、　該物質がｇｂ１ｂ細胞に結合しない場合には、該物質が、該ｇｂ１ｂヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質である、方法。
【０１９７】
特定の実施形態においては、
該ｇｂ１ａ細胞は、ｇｂ２をコードする発現ベクターと、ｇｂ１ａをコードする発現ベクターとを含み、該ｇｂ１ａ細胞を、ｇｂ２およびｇｂ１ａが発現されｇｂ１ａヘテロマーが形成される条件下で培養する；および
該ｇｂ１ｂ細胞は、ｇｂ２をコードする発現ベクターと、ｇｂ１ｂをコードする発現ベクターとを含み、該ｇｂ１ｂ細胞を、ｇｂ２およびｇｂ１ｂが発現されｇｂ１ｂヘテロマーが形成される条件下で培養する。
【０１９８】
特定の実施形態においては、該方法は更に、該ｇｂ１ｂヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質が、ｇｂ１ａ受容体の機能的応答を活性化するか否かを判定することを含む。
【０１９９】
該ｇｂ１ｂヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞内で機能的ｇｂ１ａヘテロマーを形成するようｇｂ１ａおよびｇｂ２を発現しＫｉｒをも発現するようアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞を準備すること、
（ｂ）該卵母細胞膜を横切るカリウムイオン流を観察しながら、工程（ａ）の卵母細胞を物質にさらすこと、
（ｃ）アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞内で機能的ｇｂ１ｂヘテロマーを形成するようｇｂ１ｂおよびｇｂ２を発現しＫｉｒをも発現するアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞を準備すること、
（ｄ）該卵母細胞膜を横切るカリウムイオン流を観察しながら、工程（ｃ）の卵母細胞を該物質にさらすこと、を含んでなり、
該物質への該卵母細胞の曝露が、工程（ｂ）においてはカリウムイオン流の増加を引き起こすが工程（ｄ）においては該増加を引き起こさない場合には、該物質が、該ｇｂ１ｂヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質である、方法。
【０２００】
特定の実施形態においては、
（ｉ）工程（ａ）の卵母細胞は、ｇｂ１ａ、ｇｂ２およびＫｉｒをコードするＲＮＡでマイクロインジェクションされており、
（ｉｉ）工程（ｃ）の卵母細胞は、ｇｂ１ｂ、ｇｂ２およびＫｉｒをコードするＲＮＡでマイクロインジェクションされている。
【０２０１】
特定の実施形態においては、工程（ｂ）および（ｄ）の観察をパッチクランプ記録法により行う。
【０２０２】
該ｇｂ１ｂヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）物質がｇｂ１ａ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定すること、
（ｂ）該物質がｇｂ１ｂ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定する、ことを含んでなり、
該物質がｇｂ１ａ細胞においてはＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するがｇｂ１ｂにおいては該応答を活性化しない場合には、該物質が、該ｇｂ１ｂヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質である、方法。
【０２０３】
特定の実施形態においては、該機能的応答は細胞内カルシウムレベルの減少である。
【０２０４】
特定の実施形態においては、細胞内カルシウムレベルの減少は、カルシウム指示色素を使用することにより測定する。
【０２０５】
特定の実施形態においては、該カルシウム指示色素は、フルオ−３、フラ−２、フルオ−４、フルオ−５、エクオリン、カルシウムグリーン−１、オレゴングリーン、４８８　ＢＡＰＴＡ、ＳＮＡＲＦ−１およびインド−１よりなる群から選ばれる。
【０２０６】
該ｇｂ１ｂヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）ｇｂ１ａ細胞を準備すること、
（ｂ）該ｇｂ１ａ細胞にカルシウム指示色素を装填すること、
（ｃ）物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ａ細胞における該カルシウム指示色素の蛍光特性を測定すること、
（ｄ）ｇｂ１ｂ細胞を準備すること、
（ｅ）該ｇｂ１ｂ細胞にカルシウム指示色素を装填すること、
（ｆ）該物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ｂ細胞における該カルシウム指示色素の蛍光特性を測定すること、を含んでなり、
該物質の不存在下と比較した場合の該物質の存在下での蛍光特性の変化が、工程（ｃ）では測定されるが、工程（ｆ）では測定されない場合には、該物質が、該ｇｂ１ｂヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質である、方法。
【０２０７】
特定の実施形態においては、該カルシウム指示色素は、フルオ−３、フラ−２、フルオ−４、フルオ−５、エクオリン、カルシウムグリーン−１、オレゴングリーン、４８８　ＢＡＰＴＡ、ＳＮＡＲＦ−１およびインド−１よりなる群から選ばれる。
【０２０８】
特定の実施形態においては、蛍光特性の変化は蛍光発光最大の強度の増加、発光最大の波長のシフト、または吸収最大の波長のシフトである。
【０２０９】
該ｇｂ１ｂヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）物質が、ｇｂ１ａ受容体を発現するがｇｂ１ｂ受容体を発現しないメラノトローフ細胞系においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定すること、
（ｂ）該物質がｇｂ１ｂ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定すること、を含んでなり、
該物質が該メラノトローフ細胞系においてはＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するが、該ｇｂ１ｂ細胞においては該応答を活性化しない場合には、該物質が、該ｇｂ１ｂヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質である、方法。
【０２１０】
特定の実施形態においては、該メラノトローフ細胞系は、ｍＩＬ３９細胞およびｍＩＬ−ｔｓＡ５８細胞よりなる群から選ばれる。
【０２１１】
特定の実施形態においては、該機能的応答は、イオンチャンネルの活性の調節、カルシウム濃度の変化、アゴニストと該ＧＡＢＡＢ受容体との相互作用により誘導されるプロモーターにより発現が制御されるレポーター遺伝子からのシグナルの変化、および膜電流の変化よりなる群から選ばれる。
【０２１２】
特定の実施形態においては、膜電流の変化は、内向き整流性カリウム電流の活性の調節、または電位依存性カルシウムチャンネルの活性の調節により生じる。
【０２１３】
特定の実施形態においては、該ｇｂ１ｂ細胞は、いずれのＧＡＢＡＢ受容体サブユニットをも天然では発現しない細胞であり、機能的ｇｂ１ｂ受容体を形成するようｇｂ１ｂサブユニットおよびｇｂ２サブユニットをコードする発現ベクターで形質転換された細胞である。
【０２１４】
該ｇｂ１ｂヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）アポエクオリンを発現するｇｂ１ａ細胞を準備すること、
（ｂ）該ｇｂ１ａ細胞内でエクオリンが形成されるよう、該ｇｂ１ａ細胞にセレンテラジンを装填すること、
（ｃ）物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ａ細胞においてカルシウムと該エクオリンとの相互作用により生じた発光を測定すること、
（ｄ）アポエクオリンを発現するｇｂ１ｂ細胞を準備すること、
（ｅ）該ｇｂ１ｂ細胞内でエクオリンが形成されるよう、該ｇｂ１ｂ細胞にセレンテラジンを装填すること、
（ｆ）該物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ｂ細胞においてカルシウムと該エクオリンとの相互作用により生じた発光を測定すること、を含んでなり、
該物質の不存在下より該物質の存在下で少ない発光が、工程（ｃ）では測定されるが、工程（ｆ）では測定されない場合には、該物質が、該ｇｂ１ｂヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質である、方法。物質が、該ｇｂ１ｃヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的なアゴニストであることを判定するのが時には十分であり、該ｇｂ１ｂヘテロマーに対する該アゴニストの有り得る効果をも判定する必要はないかもしれない。そのような場合、本明細書に記載の方法は、該ｇｂ１ｂヘテロマーに対する該物質の効果を判定する工程を行わない以外はｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストの同定に関して前記したのと実質的に同じ様態でそれらを行うよう修飾することができる。
【０２１５】
したがって、本発明はまた、以下の方法を含む。
【０２１６】
該ｇｂ１ｃヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）物質が、ｇｂ１ａサブユニットを含むＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストであることを判定すること、
（ｂ）該物質が、ｇｂ１ｃサブユニットを含むＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストではないことを判定することを含んでなる方法。
【０２１７】
特定の実施形態においては、該方法は更に、以下の工程の１以上を含む：
（ｃ）該物質がシナプス後カリウム電流を活性化することを判定する工程、
（ｄ）該物質がＧＡＢＡ抑制性シナプス後電流を前シナプス的には抑制しないことを判定する工程、
（ｅ）該物質がＧＡＢＡＡ受容体のアゴニストではないことを判定する工程、　（ｆ）該物質が、電位依存性カルシウムチャンネルに負に共役したＧＡＢＡＢ受容体のアゴニストであることを判定する工程。
【０２１８】
該ｇｂ１ｃヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）物質をｇｂ１ａ細胞およびｇｂ１ｃ細胞に別々にさらすこと、
（ｂ）該ｇｂ１ａ細胞およびｇｂ１ｃ細胞への該物質の結合を定量することを含んでなり、
該ｇｂ１ａ細胞への該物質の結合の量が、該ｇｂ１ｃ細胞への該物質の結合の量より少なくとも３倍大きい場合には、該物質が、該ｇｂ１ｃヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質である、方法。
【０２１９】
該ｇｂ１ｃヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）ｇｂ１ａ細胞を準備すること、
（ｂ）物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ａ細胞をガバペンチンまたはプレガバリンにさらすこと、
（ｃ）該物質の存在下および不存在下の該ｇｂ１ａヘテロマーへのガバペンチンまたはプレガバリンの結合を測定すること、
ここで、工程（ｃ）におけるガバペンチンまたはプレガバリンの結合の量が、該物質の不存在下より該物質の存在下で少ない場合には、
（ｄ）該物質がｇｂ１ｃ細胞に結合するか否かを判定し、
ここで、該物質がｇｂ１ｃ細胞に結合しない場合には、該物質が、該ｇｂ１ｃヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質である、方法。
【０２２０】
特定の実施形態においては、
該ｇｂ１ａ細胞は、ｇｂ２をコードする発現ベクターと、ｇｂ１ａをコードする発現ベクターとを含み、該ｇｂ１ａ細胞を、ｇｂ２およびｇｂ１ａが発現されｇｂ１ａヘテロマーが形成される条件下で培養する；および
該ｇｂ１ｃ細胞は、ｇｂ２をコードする発現ベクターと、ｇｂ１ｃをコードする発現ベクターとを含み、該ｇｂ１ｃ細胞を、ｇｂ２およびｇｂ１ｃが発現されｇｂ１ｃヘテロマーが形成される条件下で培養する。
【０２２１】
特定の実施形態においては、該方法は更に、該ｇｂ１ｃヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質が、ｇｂ１ａ受容体の機能的応答を活性化するか否かを判定することを含む。
【０２２２】
該ｇｂ１ｃヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞内で機能的ｇｂ１ａヘテロマーを形成するようｇｂ１ａおよびｇｂ２を発現しＫｉｒをも発現するようアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞を準備すること、
（ｂ）該卵母細胞膜を横切るカリウムイオン流を観察しながら、工程（ａ）の卵母細胞を物質にさらすこと、
（ｃ）アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞内で機能的ｇｂ１ｃヘテロマーを形成するようｇｂ１ｃおよびｇｂ２を発現しＫｉｒをも発現するアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞を準備すること、
（ｄ）該卵母細胞膜を横切るカリウムイオン流を観察しながら、工程（ｃ）の卵母細胞を該物質にさらすこと、を含んでなり、
該物質への該卵母細胞の曝露が、工程（ｂ）においてはカリウムイオン流の増加を引き起こすが工程（ｄ）においては該増加を引き起こさない場合には、該物質が、該ｇｂ１ｃヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質である、方法。
【０２２３】
特定の実施形態においては、
（ｉ）工程（ａ）の卵母細胞は、ｇｂ１ａ、ｇｂ２およびＫｉｒをコードするＲＮＡを微量注入されており、
（ｉｉ）工程（ｃ）の卵母細胞は、ｇｂ１ｃ、ｇｂ２およびＫｉｒをコードするＲＮＡを微量注入されている。
【０２２４】
特定の実施形態においては、工程（ｂ）および（ｄ）の観察をパッチクランプ記録法により行う。
【０２２５】
該ｇｂ１ｃヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）物質がｇｂ１ａ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定すること、
（ｂ）該物質がｇｂ１ｃ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定すること、を含んでなり、
該物質がｇｂ１ａ細胞においてはＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するがｇｂ１ｃにおいては該応答を活性化しない場合には、該物質が、該ｇｂ１ｃヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質である、方法。
【０２２６】
特定の実施形態においては、該機能的応答は細胞内カルシウムレベルの減少である。
【０２２７】
特定の実施形態においては、細胞内カルシウムレベルの減少は、カルシウム指示色素を使用することにより測定する。
【０２２８】
特定の実施形態においては、該カルシウム指示色素は、フルオ−３、フラ−２、フルオ−４、フルオ−５、エクオリン、カルシウムグリーン−１、オレゴングリーン、４８８　ＢＡＰＴＡ、ＳＮＡＲＦ−１およびインド−１よりなる群から選ばれる。
【０２２９】
該ｇｂ１ｃヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）ｇｂ１ａ細胞を準備すること、
（ｂ）該ｇｂ１ａ細胞にカルシウム指示色素を装填すること、
（ｃ）物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ａ細胞における該カルシウム指示色素の蛍光特性を測定すること、
（ｄ）ｇｂ１ｃ細胞を準備すること、
（ｅ）該ｇｂ１ｃ細胞にカルシウム指示色素を装填すること、
（ｆ）該物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ｃ細胞における該カルシウム指示色素の蛍光特性を測定すること、を含んでなり、
該物質の不存在下と比較した場合の該物質の存在下での蛍光特性の変化が、工程（ｃ）では測定されるが、工程（ｆ）では測定されない場合には、該物質が、該ｇｂ１ｃヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質である、方法。
【０２３０】
特定の実施形態においては、該カルシウム指示色素は、フルオ−３、フラ−２、フルオ−４、フルオ−５、エクオリン、カルシウムグリーン−１、オレゴングリーン、４８８　ＢＡＰＴＡ、ＳＮＡＲＦ−１およびインド−１よりなる群から選ばれる。
【０２３１】
特定の実施形態においては、蛍光特性の変化は蛍光発光最大の強度の増加、発光最大の波長のシフト、または吸収最大の波長のシフトである。
【０２３２】
該ｇｂ１ｃヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）物質が、ｇｂ１ａ受容体を発現するがｇｂ１ｃ受容体を発現しないメラノトローフ細胞系においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定すること、
（ｂ）該物質がｇｂ１ｃ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定すること、を含んでなり、
該物質が該メラノトローフ細胞系においてはＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するが、該ｇｂ１ｃ細胞においては該応答を活性化しない場合には、該物質が、該ｇｂ１ｃヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質である、方法。
【０２３３】
特定の実施形態においては、該メラノトローフ細胞系は、ｍＩＬ３９細胞およびｍＩＬ−ｔｓＡ５８細胞よりなる群から選ばれる。
【０２３４】
特定の実施形態においては、該機能的応答は、イオンチャンネルの活性の調節、カルシウム濃度の変化、アゴニストと該ＧＡＢＡＢ受容体との相互作用により誘導されるプロモーターにより発現が制御されるレポーター遺伝子からのシグナルの変化、および膜電流の変化よりなる群から選ばれる。
【０２３５】
特定の実施形態においては、膜電流の変化は、内向き整流性カリウム電流の活性の調節、または電位依存性カルシウムチャンネルの活性の調節により生じる。
【０２３６】
特定の実施形態においては、該ｇｂ１ｃ細胞は、いずれのＧＡＢＡＢ受容体サブユニットをも天然では発現しない細胞であり、機能的ｇｂ１ｃ受容体を形成するようｇｂ１ｃサブユニットおよびｇｂ２サブユニットをコードする発現ベクターで形質転換された細胞である。
【０２３７】
該ｇｂ１ｃヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質の同定方法であって、
（ａ）アポエクオリンを発現するｇｂ１ａ細胞を準備すること、
（ｂ）該ｇｂ１ａ細胞内でエクオリンが形成されるよう、該ｇｂ１ａ細胞にセレンテラジンを装填すること、
（ｃ）物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ａ細胞においてカルシウムと該エクオリンとの相互作用により生じた発光を測定すること、
（ｄ）アポエクオリンを発現するｇｂ１ｃ細胞を準備すること、
（ｅ）該ｇｂ１ｃ細胞内でエクオリンが形成されるよう、該ｇｂ１ｃ細胞にセレンテラジンを装填すること、
（ｆ）該物質の存在下および不存在下、該ｇｂ１ｃ細胞においてカルシウムと該エクオリンとの相互作用により生じた発光を測定すること、を含んでなり、
該物質の不存在下より該物質の存在下で少ない発光が、工程（ｃ）では測定されるが、工程（ｆ）では測定されない場合には、該物質が、該ｇｂ１ｃヘテロマーと対比して該ｇｂ１ａヘテロマーに特異的な物質である、方法。
【０２３８】
該ＧＡＢＡＢ受容体のｇｂ１ｂサブタイプ特異的またはｇｂ１ｃサブタイプ特異的アゴニストである物質を同定することが時には望ましいであろう。そのような場合には、そのようなｇｂ１ｂサブタイプ特異的またはｇｂ１ｃサブタイプ特異的アゴニストを同定するよう本明細書に記載のアッセイを修飾しうることが当業者に明らかであろう。一般には、これは、ｇｂ１ａ細胞に該物質を加える場合ではなくｇｂ１ｂ細胞またはｇｂ１ｃ細胞に該物質を加える場合にアゴニスト活性（例えば、機能的応答の活性化）に関して探ること以外は同じアッセイを実施することにより行うことができる。
【０２３９】
例えば、ｇｂ１ｂサブタイプ特異的アゴニストの同定に関心がある場合には、以下のようなアッセイを行いうるであろう：
（ａ）物質がｇｂ１ａ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定すること、
（ｂ）該物質がｇｂ１ｂ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定すること、
（ｃ）該物質がｇｂ１ｃ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定すること、
該物質がｇｂ１ｂ細胞においてはＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するが、ｇｂ１ａ細胞においてもｇｂ１ｃ細胞においても該応答を活性化しない場合には、該物質がｇｂ１ｂサブタイプ特異的アゴニストである。
【０２４０】
同様に、ｇｂ１ｃサブタイプ特異的アゴニストの同定に関心がある場合には、以下のようなアッセイを行いうるであろう：
（ａ）物質がｇｂ１ａ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定すること、
（ｂ）該物質がｇｂ１ｂ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定すること、
（ｃ）該物質がｇｂ１ｃ細胞においてＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するか否かを判定すること、
該物質がｇｂ１ｃ細胞においてはＧＡＢＡＢ受容体機能的応答を活性化するが、ｇｂ１ａ細胞においてもｇｂ１ｂ細胞においても該応答を活性化しない場合には、該物質がｇｂ１ｃサブタイプ特異的アゴニストである。
【０２４１】
本明細書に記載の方法のいくつかは、該ＧＡＢＡＢ受容体におけるアゴニスト活性に関する他のアッセイ方法を用いるように修飾することができる。アゴニストおよびインバースアゴニストは、機能的ＧＡＢＡＢ受容体のインターナリゼーションまたはトラフィッキングに影響を及ぼしうる。例えば、β２−アドレナリン作動性受容体の場合には、アゴニストの曝露は受容体のインターナリゼーションを引き起こす。ＧＡＢＡＢ受容体トラフィッキングはアゴニストにより同様に調節される可能性がある。したがって、細胞内プールと細胞膜との間の受容体トラフィッキングの測定が、アゴニスト活性のアッセイとみなされうる。したがって、ＧＡＢＡＢ受容体トラフィッキングを観察することにより、アゴニスト活性を同定することが可能であろう。そのようなトラフィッキングは、全細胞免疫組織化学および共焦点顕微鏡観察により又は表面および細胞内受容体標識およびフローサイトメトリーにより観察することができる。
【０２４２】
さらに、該機能的ＧＡＢＡＢ受容体はヘテロ二量体でありうるため、アゴニストおよびインバースアゴニストは単量体に対するヘテロ二量体の比率を改変すると予想されうる。したがって、ヘテロ二量体の破壊または出現は追加的なスクリーニングアッセイとみなされうる。この場合、受容体の二量体化または消失の観察を、ＦＲＥＴの出現または破壊により行なうことができる。該単量体のそれぞれは、接近性がＦＲＥＴの生成を可能にするように発蛍光団で標識される。アゴニストが結合すると、二量体の破壊を示すＦＲＥＴの破壊、またはアゴニスト活性化の経過中の二量体化の増加を示すＦＲＥＴの増加が認められうるであろう。
【０２４３】
もう１つの可能性は、アゴニスト活性を観察するためにマイクロフィジオメーター（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）を使用することである。多数の受容体経路の活性化は細胞外または細胞内ｐＨの変化に関連している。したがって、ＧＡＢＡＢ受容体アゴニストは、ＧＡＢＡＢ受容体を発現する細胞が候補アゴニストにさらされた場合のそのような変化を検出するためにマイクロフィジオメーターを使用して同定されうると考えられる。マイクロフィジオメーターの使用はＮｇら，１９９９，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：５１７−５２７およびＦｉｓｃｈｅｒら，１９９９，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１６８：３９−４５に記載されている。
【０２４４】
前記方法は、明示的には、「ある１つの」物質が該ＧＡＢＡＢ受容体のｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストであるか否かの試験に関するものであるが、そのような方法は、物質の集合体、例えばコンビナトリアルライブラリー、天然物の集合体、医化学リード最適化プログラムなどを試験してそのような集合体のいずれかのメンバーがｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストであるか否かを判定するのに一般に用いられることが、当業者に明らかであろう。したがって、前記方法における物質として物質の集合体またはそのような集合体の個々のメンバーを使用することは本発明の範囲内に含まれる。
【０２４５】
本発明の方法は、第１細胞および第２細胞、またはｇｂ１ａ細胞、ｇｂ１ｂ細胞またはｇｂ１ｃ細胞を利用するものとして一般に記載されている。単数としての表現は説明の明瞭化のためである。細胞を組織培養内で増殖させ次い該方法において使用する場合には、該方法は通常は、複数の、しばしば何千または更には数百万の細胞で実施される、と当業者は理解するであろう。
【０２４６】
「物質」は、薬品開発過程中に製薬産業において一般にスクリーニングされる任意の物質でありうる。例えば、物質は、低分子量有機化合物（例えば、約１，０００ダルトン未満の分子量を有するもの）、ＲＮＡ、ＤＮＡ、抗体、ペプチドまたはタンパク質でありうる。
【０２４７】
本明細書に記載の方法の特定の実施形態においては、該物質は、医化学の方法によりガバペンチンの構造を修飾することにより製造される化合物である。当技術分野においてよく知られているとおり、特定の薬理学的活性を有する「リード」化合物（例えば、ガバペンチン）の官能基（例えば、アミン基、メチル基、カルボキシル基、フェノール基、アジド基など）を異なる官能基で逐次的に置換し、そのような置換が該化合物の薬理学的特性にどのような影響を及ぼすかを判定するために該修飾化合物を試験することにより、該「リード」化合物を修飾することは一般的なことである。そのようにして、改善された薬理学的特性（例えば、より高い標的特異性、より強力なアゴニストまたはアンタゴニスト活性、またはより低い毒性）を有する化合物を開発することができる。そのような修飾化合物の構造と該修飾化合物の薬理学的特性との比較は、最適な特性を有する化合物に到達するために保存されるべき化合物部分および変化されるべき部分の示唆において特に有用でありうる。例えばこのような医化学の方法をガバペンチンに適用することが可能であり、そのようにして製造された修飾ガバペンチン様化合物を、それらが望ましい特性（例えば、ｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストである特性）を有するか否かを判定するために本明細書に記載の種々の方法において試験することができる。
【０２４８】
本明細書に記載の方法の特定の実施形態においては、該物質は３−アルキル置換ＧＡＢＡ類似体である。
【０２４９】
前記方法により同定されたｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストは、他のｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニスト（例えば、ガバペンチン）と同様に有用である。ガバペンチンは、てんかんの治療薬としてＮＥＵＲＯＮＴＩＮ（登録商標）の名称で米国で１９９４年から販売されており、臨床試験において、糖尿病性神経障害およびヘルペス後神経痛の治療に有用であることが示されている。ガバペンチンにより示される広範な有用性を考慮すると、本発明の方法により同定されたｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストが薬理学的に有用であると当業者にみなされることは明らかである。
【０２５０】
特に、本発明の方法により同定されたｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストは、精神医学的障害、例えば双極性異常、社会恐怖症および不安；てんかん及び他の痙攣性障害；失禁；胃食道逆流；コカイン中毒；神経変性障害、例えば筋萎縮性側索硬化症；および多発性慢性疼痛状態、例えば糖尿病性神経障害またはヘルペス後神経痛のような状態の治療において有用であろう。
【０２５１】
ガバペンチンおよびガバペンチン様化合物の製造方法は、米国特許第４，０２４，１７５号および米国特許第４，１５２，３２６号に記載されている。
【０２５２】
本発明を更に例示するために、以下に非限定的な実施例を記載する。
【０２５３】
実施例１
受容体発現構築物
Ｇｅｎｂａｎｋに受託されているｇｂ１ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＪ２２５０２８）およびｇｂ１ｂ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ａ２２５０２９）ｍＲＮＡ配列に基づくプライマーとＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＨＦ（登録商標）ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）とを使用するＰＣＲクローニングにより、ヒト小脳ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）から、ヒトｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂおよびｇｂ１ｃアイソフォームを得た。ヒトｇｂ２受容体ＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ０６９７５５）のクローニングは他の文献に報告されている（Ｎｇら，１９９９，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　５６：２８８−２９５）。修飾インフルエンザ血球凝集素シグナル配列（ＭＫＴＩＩＡＬＳＹＩＦＣＬＶＦＡ；配列番号１１）およびそれに続く抗原性ＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号１２）エピトープをコードするｇｂ２構築物（本明細書中ではＦＬＡＧ−ｇｂ２と称される）、またはウシＧＡＢＡＡ　α１シグナル配列（ＭＫＫＳＰＧＬＳＤＹＬＷＡＷＴＬＦＬＳＴＬＴＧＲＳＹＧＱＰＳＬＱＤ；配列番号１３）およびそれに続くｃ−ｍｙｃエピトープ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮ；配列番号１４）をコードするｇｂ２構築物（本明細書中ではｃｍｙｃ−ｇｂ２と称される）を、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞内での一過性発現のために使用した。すべてのＧＡＢＡＢ受容体ＤＮＡをｐＴ７ＴＳツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞発現ベクター（Ｐａｕｌ　Ｋｒｉｅｇ博士から提供された）内にサブクローニングした。他のツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞発現ベクターの使用も同様の結果をもたらすと考えられる。Ｍ２ムスカリン受容体およびＧｓα　ｃＤＮＡは、ＢｉｏＳｉｇｎａｌ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）により快く提供していただいたものである。
【０２５４】
実施例２
材料
ＮＥＵＲＯＮＴＩＮ（登録商標）カプセル（４００ｍｇのガバペンチンを含有する１０カプセル）から、沸騰エタノール中でガバペンチンを抽出した。セライトにより濾過した後、該固体をイソプロパノール（３０ｍｌ）中でトリチュレーションして、８５％　ガバペンチンと１５％　デキストロースとを含有する３．２１ｇの固体を得た。沸騰メタノール中での該セライトケークの抽出、該軽懸濁液の室温での濾過、およびエーテル中での該残渣のトリチュレーションにより１．００ｇの白色固体を得ることにより、純粋なガバペンチンを得た。オンライン　マススペクトロメトリー検出と共に分取ＨＰＬＣを用いて、該白色固体を更に精製した。集めたピーク体を蒸発乾固させ、ＮＭＲ分析用に再構成させた。該質量スペクトルおよびＮＭＲデータはガバペンチンと一致した。また、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から商業的にガバペンチンを入手した。ガバペンチンを−２０℃で保存し、新たに調製し、直ちに該機能アッセイにおいて使用した。ＧＡＢＡ、すなわち活性エナンチオマー（Ｒ）−バクロフェン、およびＣＧＰ５５８４５は、それぞれ、ＳｉｇｍａおよびＴｏｃｒｉｓ　Ｃｏｏｋｓｏｎから購入した。ＣＧＰ７１８７２は、既に報告されているとおりに合成した（Ｂｅｌｌｅｙら，１９９９，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ　Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．７：２６９７−２７０４）。
【０２５５】
インド−１　ＡＭ、インド−１五カリウム塩、カルボキシＳＮＡＲＦ−１　ＡＭ、カルボキシＳＮＡＲＦ−１、プルロニックＦ−１２７およびＣａ２＋校正キットはＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から購入した。ＰＴＸ、Ｐｅｎ／ＳｔｒｅｐおよびジメチルスルホキシドはＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。該ＤＭＥおよび該Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ無トリプシンバッファーはＬｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から購入した。他の化学物質および試薬はＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。
【０２５６】
実施例３
ツメガエル卵母細胞発現
以下の修飾を施す以外は既に記載されているとおりに（Ｎｇら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：７６０７−７６１１；Ｈｅｂｅｒｔら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｒｏｙａｌ　Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ，Ｓｅｒｉｅｓ　Ｂ　２５６：２５３−２６１）、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞を単離し、記録を行った。　１２５ｍＭ　リン酸カリウム（ｐＨ６．５）での短い（１０分間）高張性ショックの後、卵母細胞を１〜２時間にわたりＢａｒｔｈ溶液中に回収した。種々のＫｉｒ（Ｋｉｒ３．１またはＫｉｒ３．２）チャンネルアイソフォーム、ヒトｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂおよびｇｂ１ｃ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ｇｂ２、マウスｇｂ１ａおよびｆｌａｇ−ｇｂ２構築物、ヒトＭ２ムスカリン受容体、ヒトα２阿蘇レナリン作動性受容体ならびにウシＧｓαのｃＤＮＡ構築物を制限酵素により線状化し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ（Ｂｉｏ　１０１）を使用して精製した。Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼおよびｍＭｅｓｓａｇｅ　ｍＭａｃｈｉｎｅ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、キャップ化ｍＲＮＡを作製した。変性ホルムアルデヒドアガロースゲル上に合成反応のアリコートを装填することにより、チャンネルおよび受容体構築物のｍＲＮＡ合成を確認した。種々のマウスまたはヒトＧＡＢＡＢ受容体サブユニットおよびヒトＫｉｒ３．１／３．２をコードする５〜１０ｎｇ（２５〜５０ｎＬ中）のＲＮＡを、あるいはＫｉｒ３．２と共に共発現されたα２ＡＲ／ＧｓαまたはＭ２ムスカリン受容体を、個々の卵母細胞に注入した。４８時間後、電流を記録した。特に示さない限り、標準的な記録用溶液はＫＤ−９８、９８ｍＭ　ＫＣｌ、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５ｍＭ　Ｋ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）であった。微小電極に３Ｍ　ＫＣｌを満たした。これは、電圧および電流電極に関してそれぞれ１〜３ＭΩおよび０．１〜０．５ＭΩの抵抗を有していた。また、記載されているとおりに（Ｈｅｂｅｒｔら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｒｏｙａｌ　Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ，ＳｅｒｉｅｓＢ　２５６：２５３−２６１）、電流電極を１％　アガロース（３Ｍ　ＫＣｌ中）で埋め戻して（ｂａｃｋｆｉｌｌ）漏出を防いだ。Ｇｅｎｅｃｌａｍｐ　５００増幅器（Ａｘｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して室温で記録を行なった。卵母細胞を電位固定し、種々の記録用溶液で連続的に潅流した。内向き整流性カリウム電流に関して試験するために−１４０から６０ｍＶへ２０ｍＶの増加量で送り出される−１０ｍＶ保持電位からの５００ｍｓｅｃの電圧設定により、電流を誘発させた。データを−８０ｍＶの保持電位で記録し、薬物を高速潅流系で該浴（バス）に加えた。ｐＣＬＡＭＰ　ｖ６．０（Ａｘｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）およびＯｒｉｇｉｎ　ｖ４．０（ＭｉｃｒｏＣａｌ）ソフトウェアを使用して、データの収集および解析を行なった。内因性および漏出電流を差し引くために、ＮＤ−９６、９６ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＫＣｌ、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５ｍＭ　Ｎａ−ＨＥＰＥＳにおいて記録を得、更なる解析の前に、これらをＫＤ−９８における記録から差し引いた。
【０２５７】
実施例４
海馬切片および全細胞記録
既に記載されているとおりに（Ｏｕａｒｄｏｕｚ　＆　Ｌａｃａｉｌｌｅ，１９９７，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．７７：１９３９−１９４９：Ｃｈａｐｍａｎ　＆　Ｌａｃａｉｌｌｅ，１９９９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：８６３７−８６４５）、横断海馬切片を雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（生後２９〜４０日）から得た。断頭前に、動物をハロタンで麻酔した。脳を該頭蓋から摘出し、９５％　Ｏ２および５％　ＣＯ２で飽和された冷ＡＣＳＦ（１２４ｍＭ　ＮａＣｌ，２．５ｍＭ　ＫＣｌ，１．２５ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４，２ｍＭ　ＭｇＳＯ４，２ｍＭ　ＣａＣｌ２，２６ｍＭ　ＮａＨＣＯ３および１０ｍＭ　デキストロース）に浸けた。海馬切片（３００μｍ）を、既に記載されているとおりに（Ｏｕａｒｄｏｕｚ　＆　Ｌａｃａｉｌｌｅ，１９９７，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．７７：１９３９−１９４９）ビブラトーム（ｖｉｂｒａｔｏｍｅ）で切断し、記録前に少なくとも１時間、保持チャンバーに移した。ホールセル（全細胞）記録の場合には、個々の切片を、正立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ　Ａｘｉｏｓｋｏｐ）上にマウントされたチャンバーに浸け、ＡＣＳＦで２．５〜３．０ｍｌ／分の流速で潅流した。すべての溶液は室温で適用した。ＤＩＣおよび赤外ＣＣＤカメラ（Ｃｏｈｕ　６５００）を使用して、ＣＡ１錐体ニューロンを可視化した。パッチピペット（４〜８ＭΩ）に、１４０　グルコン酸Ｋ、５　ＮａＣｌ、２　ＭｇＣｌ２、１０　ＨＥＰＥＳ、０．５　ＥＧＴＡ、２　ＡＴＰ−Ｔｒｉｓ、０．４　ＧＴＰ−Ｔｒｉｓ、１　ホスホクレアチン、０．１％　ビオシチン（ｐＨはＫＯＨで７．２〜７．３に調節）（単位はｍＭ）を満たした。１０ｋＨｚでのローパスフィルタリングと共にＡｘｏｐａｔｃｈ　２００増幅器（Ａｘｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、ホールセル電圧固定記録を行った。さらなる分析のために、電流をデジタル化し保存した（ｐＣｌａｍｐ，Ａｘｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。液間電位に関して電圧測定値を補正した（Ｎｅｈｅｒ，１９９２，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０７：１２３−１３１）。すべての薬物は浴（バス）適用した。膜電位傾斜および差し引き法を用いて既に記載のとおりに（Ｎｕｒｓｅ　＆　Ｌａｃａｉｌｌｅ，１９９９，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．３８：１７３３−１７４２）、バクロフェンおよびガバペンチン電流を得た。錐体ニューロンに非常に近い放線状層に超微小同心円状双極電極（ｕｌｔｒａ−ｓｍａｌｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃ　ｂｉｐｏｌａｒ　ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ　Ｈａｅｒ　１６−７５−３）を配置し、一定の電流パルス（０〜２００μＡ，０．０５ｍｓ）を適用することにより、単シナプスの速いＧＡＢＡ　ＩＰＳＣを誘発した。グルタミン酸作動性非ＮＭＤＡおよびＮＭＤＡ　ＥＰＳＣを、それぞれ２０μＭ　ＣＮＱＸ（ＲＢＩ）および５０μＭ　ＡＰ５（ＲＢＩ）を含有するＡＣＳＦを該切片に潅流することにより遮断した。（−）バクロフェン（ＲＢＩ）、ガバペンチン（Ｓｉｇｍａ）およびＧＡＢＡＢアンタゴニストＣＧＰ５５８４５（Ｔｏｃｒｉｓ）を浴適用した。
【０２５８】
ＧＡＢＡＢアゴニスト　（−）バクロフェンを、Ｖｈｏｌｄ＝−６０ｍＶで浴適用した。まず、対照ＡＣＳＦにおいて、ついで薬物の存在下、８００ｍｓの時間にわたる−６０から−１６０ｍＶへの膜電位傾斜において、Ｉ−Ｖ関係を得た。各条件における３つの連続的応答から、平均電流を得た。該アゴニストの存在下の電流から対照ＡＣＳＦにおける電流を、差し引くことにより、アゴニスト電流を分離した（Ｉａｇｏｎｉｓｔ＝ＩＩ−Ｖ，ａｇｏｎｉｓｔ−ＩＩ−Ｖ，ａｃｓｆ）。式：Ｇｍ＝Ｉ／（Ｖｍ−Ｅｒｅｖ）（式中、Ｅｒｅｖは、該アゴニストに関する実測平均逆転電位）を用いて、アゴニスト電流に関してＶｍ＝−８０ｍＶで索（ｃｈｏｒｄ）コンダクタンス測定値を得た。式：ＥＫ＝ＲＴ／Ｆ＊１ｎ［Ｋ］ｏ／［Ｋ］ｉを用いて、該理論ＥＫを計算した。２０μＭ　ＣＮＱＸ（ＲＢＩ）および５０μＭ　ＡＰ５（ＲＢＩ）でのそれぞれ非ＮＭＤＡおよびＮＭＤＡシナプス伝達の遮断中、一定の電流パルス（１５〜９０μＡ，０．５ｍｓ）を使用し、錐体ニューロンに非常に近い放線状層に超微小同心円状双極電極（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ　Ｈａｅｒ）で、単シナプスの速いＧＡＢＡＡ　ＩＰＳＣを誘発した。スチューデントのｔ検定（有意水準はα＝５に設定）を用いて、２つの群間の相違を比較した。データは、特に示さない限り、平均±標準偏差として表されている。
【０２５９】
ビオシチンで満たされた細胞を表示するための歴史的手法は、既に記載されているとおりであった（Ｃｈａｐｍａｎ　＆　Ｌａｃａｉｌｌｅ，１９９９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：８６３７−８６４５）。簡単に説明すると、切片を０．１Ｍ　リン酸バッファー中の４％　パラホルムアルデヒド中で固定し、リンスし、４℃で保存した。切片を１％　Ｈ２Ｏ２で処理し、２．５％　ジメチルスルホキシドおよび０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ（０．１Ｍ　リン酸バッファー中）中で洗浄し、アビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣキット，Ｖｅｃｔｏｒｓ　ｌａｂ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ　ＣＡ）中でインキュベートした。リンス後、トリス緩衝食塩水中の０．０５％　３’３−ジアミノベンジジン　４ＨＣｌ、０．０２％　ＮｉＳＯ４、０．１Ｍ　イミダゾールおよび０．００１％　Ｈ２Ｏ２中で切片をインキュベートした。ついで切片をリンスし、キシレン中で清澄化した。十分に満たされた細胞の軸索の及び樹状突起の分枝を、ＣＣＤカメラを備えた光学顕微鏡で検査した。データは、特に示さない限り、平均±ｓｅｍとして表されている。
【０２６０】
実施例５
ｍＩＬ−ｔｓＡ５８細胞および培養条件
ｍＩＬ−ｔｓＡ５８細胞をマウス中葉腫瘍から単離した。簡単に説明すると、プロオピオメラノコルチンプロモーター−シミアンウイルス４０ラージＴ抗原（温度感受性Ａ５８突然変異体）融合遺伝子のメラノトロープ特異的発現のために下垂体腫瘍を発生するトランスジェニックマウスの系統を作製した。これらのマウスの表現型は、野生型が該ｔｓＡ５８突然変異体Ｔ抗原に置換されているものの、既に記載されているもの（Ｌｏｗら，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２４９６７−２４９７５）に類似していた。別のメラノトロープ細胞系に関して報告されているもの（Ｈｎａｓｋｏ，１９９７，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１３８：５５８９−５５９６）に類似した方法を用いて、該ｍＩＬ−ｔｓＡ５８細胞を単一の腫瘍から単離した。それらはＰＯＭＣ遺伝子およびドーパミンＤ２受容体を発現する。該細胞の増殖速度および形態学的特徴は、ｔｓＡ５８の許容温度である３３℃と３７℃とにおいて類似していた。これらの細胞は、６０継代を超えた後で、正常なマウス核型を示す。それらは、固く会合した細胞の自由浮遊球として増殖するか、またはプラスチックに付着しうる（それらはこの条件下でも集塊化したままである）。独立した細胞は培養内ではほとんど見出されす、該細胞を破壊せずに該集塊を酵素的に解離させることは困難である。
【０２６１】
１０％　ウマ血清、２．５％　ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌ　ＰｅｎＳｔｒｅｐ（１ｍｌ当たり１０，０００単位のペニシリンおよび１０ｍｇのストレプトマイシン）、２ｍＭ　グルタミンおよび０．１ｍＭ　非グルタミン必須アミノ酸で補足されたＤＭＥＭ中、５％　ＣＯ２下、３７℃で、該ｍＩＬ細胞を維持した。
【０２６２】
実施例６
［Ｃａ２＋］速度論の測定
既に記載されている特製超微光マルチイメージングビデオ顕微鏡を使用して（Ｂｅａｔｔｙら，１９９３，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１３３：９７２−９８４；Ｍｏｒｒｉｓら，１９９４，Ｉｎ：Ｎｕｃｃｉｔｅｌｌｉ　Ｒ（編）Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　Ｃａ２＋　ｉｎ　Ｌｉｖｉｎｇ　Ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４０：１８３−２２０）、細胞内カルシウム（［Ｃａ２＋］ｉ）およびｐＨ（ｐＨｉ）を同時に測定した。ＤＭＥＭ、１２．５％　ジメチルスルホキシドおよび０．０４％（ｗ／ｗ）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ−１２７中、１０％　ＣＯ２下の湿潤インキュベーター中、３７℃で３０分間にわたり、＃００カバーガラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）上で増殖した細胞に５μＭ　インド−１／ＡＭと５μＭ　ＳＮＡＲＦ−１／ＡＭ（細胞浸透性アセトキシメチル（ＡＭ）エステル）とを同時に装填した。インキュベーション後、該細胞を洗浄し、完全培地中、１０％　ＣＯ２下、３７℃で３０分間の回収時間にわたり放置し、該エステラーゼで該色素をそれらの活性不浸透性形態に切断させた。該回収時間後の９０分以内に細胞を検査した。
【０２６３】
色素が装填された細胞を含有するカバーガラスを、３７℃に維持された顕微鏡ステージ潅流チャンバー中の１．０ｍｌの標準平衡塩類溶液（１３８ｍＭ　ＮａＣｌ，２ｍＭ　ＫＣｌ，２ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，５．５ｍＭ　グルコース，２ｍＭ　ＣａＣｌ２および５０μＭ　ＥＧＴＡ，ｐＨ７．４）中に配置した。該細胞の位相差および蛍光イメージを４０５ｎｍ、４７５ｎｍ、５７５ｎｍおよび６４０ｎｍで同時に得た。これらのイメージを手がかりとして使用して、それぞれ単細胞に相当する８個までの関心領域（ＲＯＩ）をＣａ２＋（４０５および４７５ｎｍイメージ）に関して、そして８個の対応領域をｐＨ（５７５および６４０ｎｍ）に関して定めた。［Ｃａ２＋］ｉおよびｐＨｉベースライン活性の３０秒〜６０秒間のビデオ記録の後、１．０ｍｌの等浸透性高Ｋ＋脱分極液（１０ｍＭ　ＮａＣｌ，１３０ｍＭ　ＫＣｌ，２ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ　ＨＥＰＳ，５．５ｍＭ　グルコースおよび２ｍＭ　ＣａＣｌ２，ｐＨ７．４）を加えて、最終的な細胞外［Ｋ＋］を６６ｍＭとした。記録中、他の化学物質または薬物の添加を１００倍過剰で該浴に直接行って、示されている最終濃度を得た。すべての場合において、これらの物質の添加により浸透圧モル濃度は１％未満の変化をもたらした。該細胞の生存性および該蛍光色素の応答性を確保するために、いくつかの実験の終了時に、Ｃａ２＋イオノホアであるイノマイシン（１μＭ）を加えた。ある場合には、Ｋ＋への該細胞の曝露ならびに［Ｃａ２＋］ｉおよびｐＨｉの測定の５分前に、バクロフェン、ガバペンチンまたはＧＡＢＡＢ受容体アゴニストＣＧＰ５５８４５を、またはＫ＋への該細胞の曝露ならびに［Ｃａ２＋］ｉおよびｐＨｉの測定の１０〜１４時間前に、百日咳毒素を加えた
【０２６４】
ＧＡＢＡＢ受容体アゴニストおよびアンタゴニストの効果を以下のとおりに試験した。該ベースライン記録の開始の５分前に、薬物を該浴に加えて、示されてる最終濃度にした。ＧＡＢＡＢ受容体アゴニストおよびアンタゴニストの両方を試験する場合には、該アンタゴニストを最初に加えた。ベースライン記録の後、前記のとおりに該細胞を高Ｋ＋で脱分極させた。
【０２６５】
実施例７
アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの合成および投与
該受容体のＧＡＢＡＢＲ１ａ（ｇｂ１ａ）またはＧＡＢＡＢＲ１ｂ（ｇｂ１ｂ）アイソフォームに対する２つのアンチセンスデオキシヌクレオチド（ＡＤＮ）を設計し、合成した。該ｇｂ１ａ　ＡＤＮはＧＡＢＡＢＲ１ａの塩基５’−ＣＡＣ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＣＡＧ−３’（配列番号１１の一部）（塩基４−２２、受託番号ＡＪ１０２１８５）に対するアンチセンスであり、該ｇｂ１ｂ　ＡＤＮはＧＡＢＡＢＲ１ｂの塩基５’−ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＴＣＣ  ＣＣＣ  ＣＧＧ  ＧＣＣ−３’（配列番号１２の一部）（塩基４−２２、受託番号ＡＪ０２１８６）に対するアンチセンスである。ＮＩＨ  ＢＬＡＳＴ検索エンジンを使用した場合、これらのアンチセンス配列は、他の種からのＧＡＢＡＢＲ１ａおよびＧＡＢＡＢＲ１ｂ受容体配列に対しては広範な重複を示したが、２０００年１２月現在、他のｃＤＮＡの配列に対しては有意な重複は有していない。該ｇｂ１ａ　ＡＤＮと同じヌクレオチド塩基含量を含有するがランダムに割り当てられた塩基を有するミスセンスプローブを対照として使用した。このミスセンスプローブ５’　ＣＣＡ　ＧＣＡ　ＧＡＣ　ＡＣＧ　ＣＡＧ　ＣＡＧ−３’（配列番号１３）は、ｇｂ１ａアンチセンスプローブに対して８個の重複を有し、他の配列に対する公知相補性は有さない。すべてのヌクレオチド配列は、ホスホロチオアート化誘導体としてＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）により合成された。
【０２６６】
ＡＤＮ実験には、該ｍＩＬ細胞をヌクレオチドに合計４日間にわたりさらし、ついで蛍光ビデオ顕微鏡検査によりＣａ２＋チャンネル活性に関して試験した。該細胞をまず、Ｔ２５フラスコ中で１〜２日間培養した。ついで該培養を５ｍｌの無血清培地中に配置し、５μｌの１．０ｍＭ　該試験ＡＤＮまたはミスセンスオリゴデオキシヌクレオチド溶液（１０μＭの最終濃度）で処理した。５％　ＣＯ２下、３７℃で２時間のインキュベーションの後、５００μｌのウマ胎仔血清および１２５μｌのウシ胎仔血清を各フラスコに加えた。５μｌのヌクレオチド溶液を各フラスコに２および３日の培養時点で加えた。細胞を第３日に無血清培地中に回収し、ついで１２ウェルプレート中のカバーガラス上に配置した。該細胞を、５％　ＣＯ２下、３７℃で３０分間にわたり血清枯渇させて該カバーガラスへの付着を促進させ、ついでヌクレオチドを１０μＭの最終濃度まで加えた。血清を更に３０分後に加え、Ｃａ２＋チャンネル活性を２４時間後に試験した。
【０２６７】
実施例８
［Ｃａ２＋］ｉおよびｐＨｉ測定のデータ解析
結果は、リアルタイムで又はビデオテープ記録から解析した。２５個の連続的フレームをリアルタイムで平均し、ついで該顕微鏡視野のＣａ２＋およびｐＨ比率イメージ（バックグラウンドまたはシェージング誤差に関して未補正）を毎秒１イメージでＲＧＢディスプレイ上に表示した。同時に、８個までの関心領域（ＲＯＩ）の積分グレイレベルを２５フレーム平均イメージから抽出し、更なる解析のために該データをＡＳＫＩＩファイル上に保存した。また、Ｃａ２＋およびｐＨに関する該未補正比率値をＶＧＡスクリーン上にプロットし、細胞生存性と、処理がＣａ２＋およびｐＨに及ぼす効果との即時評価を可能にした。また、バックアップとして、および該ビデオフィールド（ｖｉｄｅｏ　ｆｉｅｌｄ）における他の細胞の解析を可能にするために、該実験を３／４インチのＵ−ｍａｔｉｃビデオテープ上に記録した。なぜなら、同じデータ表示およびデータ抽出法がオフラインで適用可能であったからである。一般的な細胞内ｐＨ、標準化、データ整理解析および統計的方法を用いる［Ｃａ２＋］ｉの補正は、既に記載されている（Ｍｏｒｒｉｓら，１９９４，Ｉｎ：Ｎｕｃｃｉｔｅｌｌｉ　Ｒ（編）Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　Ｃａ２＋　ｉｎ　Ｌｉｖｉｎｇ　Ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４０：１８３−２２０）。
【０２６８】
ｍＩＬ細胞のＫ＋脱分極は［Ｃａ２＋］ｉの２相増加を引き起こす。速い相は、約１０秒以内にピークに達するが、これは、高電位活性化Ｃａ２＋チャンネルを介した流入によるものである。第２の遅いほうの相は、はるかに遅く（３０〜６０秒）にピークに達する、より低い振幅を有するが、これは、細胞内貯蔵からの遊離によるものである。したがって、膜チャンネル活性によるＣａ２＋レベルの変化を、［Ｃａ２＋］ｉの変化率（％）＝（Ｍａｘ　Ｃａ２＋−Ｍｉｎ　Ｃａ２＋）／（Ｍｉｎ　Ｃａ２＋　×１００）（式中、Ｍａｘ　Ｃａ２＋＝脱分極後１０秒以内に得られた最大［Ｃａ２＋］ｉ値；Ｍｉｎ　Ｃａ２＋＝初期静止［Ｃａ２＋］ｉ）として測定した。
【０２６９】
実施例９
脳切片における海馬ニューロンの電気生理学およびカルシウムイメージング
２５〜２８日齢の雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットからの厚さ３００μｍの海馬切片におけるＣＡ１錐体ニューロン上で実験を行った（Ｎｕｒｓｅ　＆　Ｌａｃａｉｌｌｅ，１９９９，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．３８：１７３３−１７４２）。切片は、使用前に少なくとも１時間にわたり回復させた。該記録チャンバーに、１２４　ＮａＣｌ、２．５　ＫＣｌ、２．５　ＣａＣｌ２、２６　ＮａＨＣＯ３、１．２５　ＮａＨ２ＰＯ４、２　ＭｇＳＯ４、１０　グルコース（単位はｍＭ）（ｐＨ７．３５〜７．４）を含有する酸素化（９５％　Ｏ２／５％　ＣＯ２）人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）を連続的に潅流した。実験は、電位依存性Ｎａ＋チャンネルを遮断するために０．５μＭ　テトロドトキシン（ＴＴＸ）の存在下で行った。記録されるニューロンにおけるＫ＋チャンネルを遮断するために、パッチピペット（４〜８ＭΩ）を、ＣｓＯＨでｐＨ７．２５〜７．２８に滴定された１４０　ＣｓＭｅＳＯ３、１　ＭｇＣｌ２、５　ＮａＣｌ、２　ＡＴＰ、０．４　ＧＴＰ、１０　ＨＥＰＥＳ（単位はｍＭ）および１００μＭのＣａ２＋指示試薬Ｏｒｅｇｏｎ　Ｇｒｅｅｎ　ＢＡＰＴＡ−Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ　ＯＲ　ＵＳＡ）を含有するＣｓベースの溶液で満たした。４０×長距離水浸対物レンズ（開口数０．８）を備えた多光子共焦点レーザースキャン顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，ＬＳＭ５１０）およびＡｘｏｐａｔｃｈ　２００Ｂ増幅器（Ａｘｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、ホールセル電流クランプ記録と共焦点カルシウムイメージングとの組合せをＣＡ１錐体ニューロンから行った。
【０２７０】
該ホールセル配置を得た後、少なくとも２０分間を該発蛍光団の細胞内拡散にあてた。二光子共焦点イメージングには、７８０ｎｍにおける調整可能なモードロックされたＴｉ：Ｓａｐｐｈｉｒｅレーザーを使用した（５Ｗ　ＶｅｒｄｉアルゴンイオンレーザーおよびＭｉｒａ　９００，Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）。発光は、ロングパスフィルター（カットオフ５０５ｎｍ）を介して検出し、ＬＳＭ　５１０ソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を使用してＰＣに記録した。該共焦点開口は、完全に開けておいた。３．８ｍｓ／ラインの割合で、１２秒の総スキャン時間にわたり、細胞体からラインスキャンをとった（図５Ａ１）。該記録ピペットを介した体細胞脱分極電流注入により、錐体細胞を活性化した（図５Ａ２）。該実験の全体にわたり、直列抵抗を観察し、補正した。ラインスキャンには、該蛍光強度（Ｆｌｉｎｅ）を、該細胞体を横断するラインの関心領域にわたり平均した。蛍光の変化を、刺激前の平均ベースライン蛍光（Ｆｒｅｓｔ）に基づき各ラインに関して計算し、％ΔＦ／Ｆ＝［（Ｆｌｉｎｅ−Ｆｒｅｓｔ）／Ｆｒｅｓｔ］×１００として表した。ついで該値を、速い過渡応答を除去するためのローパスデジタルフィルター（Ｉｇｏｒ　Ｐｒｏ，Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ，Ｌａｋｅ　Ｏｓｗｅｇｏ，ＯＲ）で処理し、該ピークカルシウム応答を各ラインスキャンに関して求めた。ラインスキャンおよび電気生理学的記録は手動で開始した。該ラインスキャンの開始時間における小さな変動に関して補正するために、電気生理学的およびＣａ２＋応答を目測により一時的に整列させた（図５Ａ２）。
【０２７１】
実施例１０
統計分析
平均間の相違に関する有意水準を、フィッシャー検定または分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびそれに続くボンフェロニ後検定（ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔ）（ＧｒａｐｈＰａｄ　ＩｎＳｔａｔ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により測定した。
【０２７２】
実施例１１
ガバペンチンはメラノトローフ細胞系におけるＶＤ−ＣＣを抑制する
図１１Ａは、高細胞外Ｋ＋濃度による脱分極に応答した個々のｍＩＬ細胞の細胞内Ｃａ２＋レベルの典型的変化を示す。ＶＤ−ＣＣの脱分極および活性化に起因する［Ｃａ２＋］ｉの急激かつ大きな増加、ならびにそれに続く、細胞内貯蔵からの遊離による、より遅い第２のピークまたはショルダーが認められ、これは、メラノトロプにおける従来の知見（Ｍｏｒｒｉｓら，１９９８，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７１：１３２９−１３３２）に合致する。図１１Ｂは、原型非選択的ＧＡＢＡＢ受容体アゴニストであるバクロフェン（１μＭ）が該一次Ｃａ２＋応答を減少させることを示している。図１１Ｃは、バクロフェンの効果が、ＧＡＢＡＢ受容体アンタゴニストであるＣＰＧ５５８４５（３μＭ）の添加により逆転されることを示している（上中および右パネルを比較されたい）。ＣＰＧ５５８４５は、脱分極に対する応答に有意な影響を及ぼさない（図１１Ａと図１１Ｃとを比較されたい）。図１１Ｄは、１μＭ　ガバペンチンの作用が１μＭ　バクロフェンの場合とほぼ同一であることを示している（図１１Ｂと比較されたい）。該ガバペンチン効果もまた、３μＭ　ＣＧＰ５５８４５により完全に遮断される（図１１Ｄと図１１Ｅとを比較されたい）。図１２は、Ｋ＋誘発性カルシウム動員のガバペンチン抑制に関する用量反応曲線を示し、ここで、ＥＣ５０は２μＭであり、全チャンネル活性の７０〜８０％が１ｍＭで抑制される。図１３は、細胞内Ｃａ２＋のＶＤ−ＣＣ依存的上昇が１μＭ　ガバペンチンにより遮断されること、および該ガバペンチン活性がＧＡＢＡＢ受容体アンタゴニストＣＧＰ５５８４５により完全かつ用量依存的（３０ｎＭ〜３μＭ）に遮断されうることを示している。カルシウム動員のガバペンチン抑制は、規模（７０〜８０％）および効力においてバクロフェン（ＥＣ５０　１μＭ）に類似しており、このことは、ガバペンチン作用が、天然ｇｂ１ａヘテロマーへの結合により媒介されたことを示唆している。
【０２７３】
カルシウム動員の抑制が内因性ｇｂ１ａヘテロマー選択的活性化によるものであり、該内因性ＶＤ−ＣＣに対するガバペンチンの活性（例えば、該α２δサブユニットへの結合）によるものではなかったことを確認するために、本発明者らは、ＡＤＮ処理が細胞内Ｃａ２＋のＫ＋誘発性増加に対するガバペンチンの効果を選択的に無効にしうるか否かを試験した。
【０２７４】
ｍＩＬ細胞を、ｇｂ１ａまたはｇｂ１ｂ　ＡＤＮあるいはｇｂ１ａミスセンスターゲッティング配列で４日間にわたり処理した（実施例７を参照されたい）。これらの条件は、ミスセンス対照アンチセンスではなくｇｂ１またはｇｂ２サブユニットの選択的抑制が該標的（ターゲッティング化）遺伝子産物のタンパク質発現の選択的減少を招くこと、および、どちらの場合も、ＶＤ−ＣＣ機能におけるＧＡＢＡＢ受容体で開始される減少の完全な喪失を招くことを示した従来の研究で用いられた条件と同一であった。この一連の実験においては、１０および３０μＭ　ガバペンチンが、全Ｋ＋誘発性ＶＤ−ＣＣ活性の７０〜８０％の抑制を媒介した（図１４において、ＡをＢおよびＣと比較されたい）。ｍＩＬ細胞におけるｇｂ１ａのアンチセンス抑制は、１０および３０μＭ　ガバペンチン活性の完全な遮断を引き起こした（図１４において、柱状グラフＢおよびＣをＥおよびＦと比較されたい）。一方、ｇｂ１ｂ　ＡＤＮまたは該ｇｂ１ａミスセンスヌクレオチドでの処理は、１０μＭおよび３０μＭのどちらの濃度のガバペンチンに対しても無効であった（柱状グラフＢおよびＣをそれぞれＨおよびＩ、ＫおよびＬと比較されたい）。総合すると、これは、ｍＩＬ細胞におけるカルシウム動員のガバペンチン抑制が、ガバペンチン感受性内因性発現ｇｂ１ａ−ｇｂ２ヘテロマーの活性化によるものであったことを示している。
【０２７５】
実施例１２
ｉｎ　ｓｉｔｕでのラット海馬ニューロンにおけるニューロンＧＡＢＡＢ受容体を介したＶＤ−ＣＣのガバペンチン抑制
ｉｎ　ｓｉｔｕでＶＤ−ＣＣに共役したニューロンＧＡＢＡＢ受容体におけるガバペンチンによる刺激を確認するために、本発明者らは、錐体細胞のホールセル電流固定記録を多光子共焦点カルシウムイメージング（図１５Ａ１−２）と組合せ、ラット海馬切片のＣＡ１錐体ニューロンにおける体細胞電流注入により誘発されたカルシウム応答に対するガバペンチンの効果を調べた。ＴＴＸおよびＫ＋チャンネルブロッカー（細胞内Ｃｓ）の存在下、正電流パルスを該記録電極を介して該錐体細胞体に適用し、該誘発カルシウム応答を電気生理学的（膜電位）および光学的（蛍光）に記録した（図１５Ａ２）。亜閾値刺激によりＣａ２＋応答を（図１５Ｂ１および１５Ｃ１）、そして超閾値刺激によりＣａ２＋スパイクを誘発するために（図１５Ｂ２および１５Ｃ２）、該電流パルスの振幅を様々に変化させた。亜閾値電流注入は、小さな振幅および短い持続時間のＣａ２＋応答を誘発し（図１５Ｂ１および１５Ｃ１）、超閾値電流注入は、該細胞体において、より大きく、より長く持続するＣａ２＋応答を誘発した（図１５Ｂ２および１５Ｃ２）。本発明者らの実験条件では、細胞体電流注入により誘発されたこれらの応答は、専らＣａ２＋により媒介された。なぜなら、それらは、Ｃａ２＋を含有しないａＣＳＦにおいては完全に遮断されたからである（ｎ＝２　細胞、データは示していない）。
【０２７６】
与えられた亜閾値電流注入の場合、該膜脱分極およびその付随Ｃａ２＋応答（図１５Ｂ１における軌跡１）は、１ｍＭ　ガバペンチンの存在下で有意に抑制された（図１５Ｂ１における軌跡２）。ガバペンチンのこれらの効果は可逆的であった（データは示していない）。該錐体細胞においてＣａ２＋スパイクを誘発するよう該電流パルス振幅を調節した場合、ガバペンチン（１ｍＭ）の存在下の同じ電流パルスはＣａ２＋スパイクを誘発せず（図１５Ｂ２における軌跡２）、専ら亜閾値脱分極および非常に小さなＣａ２＋応答を誘発したに過ぎなかった。しかし、細胞は尚も、ガバペンチンの存在下でＣａ２＋スパイクを生成する能力を有していた。なぜなら、より大きな電流注入は、該細胞体において、Ｃａ２＋スパイクおよびそれに付随する大きい且つ長く持続するＣａ２＋応答を誘発したからである（図１５Ｂ２における軌跡３）。該Ｃａ２＋スパイクのピーク振幅と、ガバペンチンの存在下、より大きな刺激により誘発されたＣａ２＋応答とは共に、対照条件における場合と有意には異ならなかった（ガバペンチンにおいては、それぞれ７６．３±４．７ｍＶおよび１６５．３±２７％　ΔＦ／Ｆであり、一方、対照においては、それぞれ８２．９±３ｍＶおよび２１８．７±２４％　ΔＦ／Ｆであった；ｎ＝４、図１５Ｂ２）。
【０２７７】
ガバペンチンで観察されたのと同様に、バクロフェン（４０μＭ）は、亜閾値および超閾値の両方の細胞体電流注入により誘発された膜脱分極およびＣａ２＋応答を可逆的に抑制した（図１５Ｃ）。ガバペンチンの場合と同様に、バクロフェンの存在下で該細胞体電流注入を増加させると、Ｃａ２＋スパイクおよびＣａ２＋応答の両方が、対照の場合と同様のレベルにまで戻った（バクロフェンにおいては、７１．９±５．６ｍＶおよび１６７．９±６１．４％　ΔＦ／Ｆであり、一方、対照条件においては、７６．９±２．５ｍＶおよび２５４．１±２８．６％　ΔＦ／Ｆであった；ｎ＝３、図１５Ｃ２および１６Ｄ）。
【０２７８】
ガバペンチンによるＣａ２＋応答の抑制は用量依存的であった。図１６Ａ〜Ｂのグラフは、亜閾値および超閾値電流注入により誘発された膜脱分極およびＣａ２＋応答に対する種々の濃度のガバペンチン（１００μＭ〜１ｍＭ）の効果を示す。Ｃａ２＋応答に対するガバペンチンの抑制作用がＧＡＢＡＢ受容体の活性化により媒介されたのか否かを試験するために、本発明者らは、ガバペンチン作用に対するＧＡＢＡＢ受容体アンタゴニストＣＧＰ５５８４５の効果を調べた。ガバペンチン（２ｍＭ）は、亜閾値および超閾値の両方の細胞体電流注入により誘発された膜脱分極およびＣａ２＋応答を有意に減少させた（図１７ＣおよびＤ）。ガバペンチンのこの抑制効果は、亜閾値（図１７Ａ１およびＣ）および超閾値（図１７Ａ２およびＤ）のどちらの電流注入に関しても、４μＭ　ＣＧＰ５５８４５の存在下では遮断された。同様に、バクロフェンによるＣａ２＋応答の抑制もまた、ＣＧＰ５５８４５により遮断された（図１７Ｂ〜Ｄ）。これらの結果は、ガバペンチンが、ｉｎ　ｓｉｔｕで海馬錐体ニューロンにおいてＧＡＢＡＢ受容体を介してＶＤ−ＣＣに負に共役していることを示している。ｍＩＬ細胞内の内因性脳ＧＡＢＡＢ受容体におけるガバペンチンに関して示されている選択的活性化と併せて考えると、本発明者らの結果は、ガバペンチンがそのＣＮＳ治療作用を発揮する１つの考えられうるメカニズムが、ＶＤ−ＣＣに共役したニューロンｇｂ１ａ−ｇｂ２　ＧＡＢＡＢ受容体ヘテロ二量体の選択的活性化によるものであることを示唆している。
【０２７９】
本発明の範囲は、本明細書に記載の特定の実施形態により限定されるものではない。実際のところ、本明細書に記載のものに加えて本発明の種々の修飾が、前記の説明から当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾も、特許請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。
【０２８０】
本明細書中には種々の刊行物が引用されているが、それらの開示の全体を参照により本明細書に組み入れることとする。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
図１Ａは、ヒトｇｂ１ａ、ｇｂ１ｂ、ｇｂ１ｃアイソフォームの細胞外Ｎ末端ドメインのアミノ酸アライメントを示す。
【図１Ｂ】
図１Ｂは、ＧＡＢＡＢヘテロマーアゴニストであるＧＡＢＡおよびバクロフェンならびにｇｂ１ａサブタイプ特異的アゴニストであるガバペンチンの構造を示す。
【図２Ａ】
種々のｇｂ１／ｇｂ２ヘテロマーによるツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞におけるＫｉｒ３．１／３．２の調節を示す。
【図２Ｂ】
種々のｇｂ１／ｇｂ２ヘテロマーによるツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞におけるＫｉｒ３．１／３．２の調節を示す。
【図２Ｃ】
種々のｇｂ１／ｇｂ２ヘテロマーによるツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞におけるＫｉｒ３．１／３．２の調節を示す。
【図２Ｄ】
種々のｇｂ１／ｇｂ２ヘテロマーによるツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞におけるＫｉｒ３．１／３．２の調節を示す。
【図２Ｅ】
種々のｇｂ１／ｇｂ２ヘテロマーによるツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞におけるＫｉｒ３．１／３．２の調節を示す。
【図２Ｆ】
種々のｇｂ１／ｇｂ２ヘテロマーによるツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞におけるＫｉｒ３．１／３．２の調節を示す。
【図３Ａ】
図３Ａ〜Ｂは、ガバペンチンが、ｇｂ１ａ受容体ヘテロマーを介した場合にのみ、Ｋｉｒ３．１／３．２を調節することを示す図である。
【図３Ｂ】
図３Ａ〜Ｂは、ガバペンチンが、ｇｂ１ａ受容体ヘテロマーを介した場合にのみ、Ｋｉｒ３．１／３．２を調節することを示す図である。
【図４Ａ】
ガバペンチンがｉｎ　ｓｉｔｕでＣＡ１錐体細胞におけるＧＡＢＡＢ受容体を介してカリウム電流を活性化することを示すための、ガバペンチンにさらされたビオシチンで満たされたＣＡ１錐体ニューロンの顕微鏡写真である。
【図４Ｂ−１】
ガバペンチンがｉｎ　ｓｉｔｕでＣＡ１錐体細胞におけるＧＡＢＡＢ受容体を介してカリウム電流を活性化することを示し、対照であるＡＣＳＦにおいて及び１ｍＭ　ガバペンチンの存在下（Ｇｐ，Ｂ１）、−６０から−１６０ｍＶへの電圧傾斜における、Ｉ−Ｖ関係を示す。
【図４Ｂ−２】
ガバペンチンがｉｎ　ｓｉｔｕでＣＡ１錐体細胞におけるＧＡＢＡＢ受容体を介してカリウム電流を活性化することを示し、対照ＡＣＳＦにおけるＩ−Ｖ関係からの電流をガバペンチンの存在下の電流から差し引くことにより、１ｍＭ　ガバペンチンにより誘発された電流を示す。
【図４Ｃ】
ガバペンチンがｉｎ　ｓｉｔｕでＣＡ１錐体細胞におけるＧＡＢＡＢ受容体を介してカリウム電流を活性化することを示し、２〜２０μＭ　バクロフェンの浴（バス）適用による、ＣＡ１錐体細胞におけるカリウム電流の誘発を示す。
【図４Ｄ】
ガバペンチンがｉｎ　ｓｉｔｕでＣＡ１錐体細胞におけるＧＡＢＡＢ受容体を介してカリウム電流を活性化することを示し、バクロフェンおよびガバペンチン電流の平均索（ｃｈｏｒｄ）コンダクタンス（−８０ｍＶで測定した）を示す。
【図５Ａ】
海馬におけるＧＡＢＡシナプス伝達のシナプス前ＧＡＢＡＢ抑制：ガバペンチンの無効性およびバクロフェンの有効性を示し、錐体細胞からのホールセル電位固定（ボルテージクランプ）記録中の、グルタミン酸シナプス伝達のブロッカー（２０μＭ　ＣＮＱＸおよび５０μＭ　ＡＰ５）の存在下での放線状層における抑制性繊維の電気的刺激による単シナプスの速いＧＡＢＡＡ　ＩＰＳＣの誘発のための実験配置を示す。
【図５Ｂ】
海馬におけるＧＡＢＡシナプス伝達のシナプス前ＧＡＢＡＢ抑制：ガバペンチンの無効性およびバクロフェンの有効性を示し、静止膜電位では、刺激は、対照ＡＣＳＦ（ＣＮＱＸおよびＡＰ５を伴う）において、速い外向きＩＰＳＣを誘発し、２０μＭバクロフェンの浴適用中に抑制された。
【図５Ｃ】
海馬におけるＧＡＢＡシナプス伝達のシナプス前ＧＡＢＡＢ抑制：ガバペンチンの無効性およびバクロフェンの有効性を示し、１ｍＭ　ガバペンチンの浴適用中では、ＩＰＳＣは、対照と比較して最小限の影響を受けたに過ぎなかった。
【図５Ｄ】
海馬におけるＧＡＢＡシナプス伝達のシナプス前ＧＡＢＡＢ抑制：ガバペンチンの無効性およびバクロフェンの有効性を示し、バクロフェンによるＩＰＳＣの平均減少は用量依存的であり（２〜２０μＭ）、２０μＭ　バクロフェンのシナプス前作用は１μＭのＧＡＢＡＢアンタゴニストＣＧＰ５５８４５により完全に拮抗された。ガバペンチンは、０．１〜１ｍＭの濃度で、ＩＰＳＣ振幅におけるそのような減少を引き起こさなかった。
【図６Ａ】
ヒトｇｂ１ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２２５０２８）のｃＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図６Ｂ】
ヒトｇｂ１ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２２５０２８）のｃＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図６Ｃ】
ヒトｇｂ１ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２２５０２８）のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図７Ａ】
マウスｇｂ１ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１１４１６８）のｃＤＮＡ配列（配列番号３）を示す。
【図７Ｂ】
マウスｇｂ１ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１１４１６８）のｃＤＮＡ配列（配列番号３）を示す。
【図７Ｃ】
マウスｇｂ１ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１１４１６８）のアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図８Ａ】
ヒトｇｂ１ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２２５０２９）のｃＤＮＡ配列（配列番号５）を示す。
【図８Ｂ】
ヒトｇｂ１ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２２５０２９）のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図９Ａ】
ヒトｇｂ１ｃ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ０１２１８７）のｃＤＮＡ配列（配列番号７）を示す。
【図９Ｂ】
ヒトｇｂ１ｃ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ０１２１８７）のアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【図１０Ａ】
ヒトｇｂ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０５８７９５）のｃＤＮＡ配列（配列番号９）を示す。
【図１０Ｂ】
ヒトｇｂ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０５８７９５）のｃＤＮＡ配列（配列番号９）を示す。
【図１０Ｃ】
ヒトｇｂ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０５８７９５）のアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。
【図１１Ａ】
ｇｂ１ａヘテロマーを内因的に発現するｍＩＬ細胞におけるＶＤ−ＣＣの高Ｋ＋誘発性活性化に対するＧＡＢＡＢリガンドの薬理学的作用を示し、高い細胞外Ｋ＋濃度による脱分極に応答した［Ｃａ２＋］の急激な増加、およびそれに続く、より遅い第２のピークまたはショルダーを示している。
【図１１Ｂ】
ｇｂ１ａヘテロマーを内因的に発現するｍＩＬ細胞におけるＶＤ−ＣＣの高Ｋ＋誘発性活性化に対するＧＡＢＡＢリガンドの薬理学的作用を示し、バクロフェン（１μＭ）が図１１Ａの一次応答を減少させることを示している。パネルＣは、バクロフェンの効果（１μＭ）が３μＭ　ＣＧＰ５５８４５の添加により完全に逆転されることを示している。
【図１１Ｃ】
ｇｂ１ａヘテロマーを内因的に発現するｍＩＬ細胞におけるＶＤ−ＣＣの高Ｋ＋誘発性活性化に対するＧＡＢＡＢリガンドの薬理学的作用を示し、図１１Ｂのバクロフェンの効果（１μＭ）が３μＭ　ＣＧＰ５５８４５の添加により完全に逆転されることを示している。
【図１１Ｄ】
ｇｂ１ａヘテロマーを内因的に発現するｍＩＬ細胞におけるＶＤ−ＣＣの高Ｋ＋誘発性活性化に対するＧＡＢＡＢリガンドの薬理学的作用を示し、ＣＰＧ５５８４５（３μＭ）は、脱分極に対するｍＩＬ細胞の応答に対して何ら有意な影響を及ぼさないことを示している。
【図１１Ｅ】
ｇｂ１ａヘテロマーを内因的に発現するｍＩＬ細胞におけるＶＤ−ＣＣの高Ｋ＋誘発性活性化に対するＧＡＢＡＢリガンドの薬理学的作用を示し、１μＭ　ガバペンチンが、１μＭ　バクロフェンと同様に細胞の一次Ｃａ２＋応答を減少させること（中央のパネル）、およびこの減少がまた、１μＭ　ＣＧＰ５５８４５により遮断されること（パネルＦ）を示している。
【図１１Ｆ】
ｇｂ１ａヘテロマーを内因的に発現するｍＩＬ細胞におけるＶＤ−ＣＣの高Ｋ＋誘発性活性化に対するＧＡＢＡＢリガンドの薬理学的作用を示し、図１１Ｅの減少がまた、１μＭ　ＣＧＰ５５８４５により遮断されること（パネルＦ）を示している。
【図１２】
高Ｋ＋脱分極後のＣａ２＋の流入を抑制するガバペンチンの能力の用量反応研究を示している。
【図１３】
１μＭ　ガバペンチンによるＫ＋誘発性カルシウム動員の抑制が、３０ｎＭ〜３μＭ　ＣＧＰ５５８４５で用量依存的に遮断されることを示している。
【図１４】
ｍＩＬ細胞における内因性ＧＡＢＡＢ　ｇｂ１ａサブユニットのアンチセンス抑制が、ＶＤ−ＣＣのＫ＋脱分極および活性化後の［Ｃａ２＋］ｉの一次増加のガバペンチン誘発性抑制の遮断を引き起こすことを示している。
【図１５Ａ】
海馬ニューロンにおける細胞体Ｃａ２＋応答のガバペンチンおよびバクロフェン（ＢＡＣＬＯ）による抑制を示し、ラインスキャン（ｌｉｎｅｓｃａｎ）のためのライン（ｌｉｎｅ）位置での錐体ニューロンの二光子共焦点イメージを示す。
【図１５Ｂ】
海馬ニューロンにおける細胞体Ｃａ２＋応答のガバペンチンおよびバクロフェン（ＢＡＣＬＯ）による抑制を示し、ＴＴＸ（０．５μＭ）の存在下、細胞体電流注入（Ｉ）は、電流固定記録（Ｖｍ）におけるＣａ２＋スパイク、およびＣａ２＋上昇（ＬＳおよび％ΔＦ／Ｆ）を誘発した。
【図１５Ｃ】
海馬ニューロンにおける細胞体Ｃａ２＋応答のガバペンチンおよびバクロフェン（ＢＡＣＬＯ）による抑制を示し、１ｍＭ　ガバペンチンは、亜閾値誘発性細胞体Ｃａ２＋応答を減少させた。
【図１５Ｄ】
海馬ニューロンにおける細胞体Ｃａ２＋応答のガバペンチンおよびバクロフェン（ＢＡＣＬＯ）による抑制を示し、１ｍＭ　ガバペンチンは、超閾値誘発性細胞体Ｃａ２＋応答を減少させた。
【図１５Ｅ】
海馬ニューロンにおける細胞体Ｃａ２＋応答のガバペンチンおよびバクロフェン（ＢＡＣＬＯ）による抑制を示し、バクロフェンはＣａ２＋応答；亜閾値を減少させた。
【図１５Ｆ】
海馬ニューロンにおける細胞体Ｃａ２＋応答のガバペンチンおよびバクロフェン（ＢＡＣＬＯ）による抑制を示し、バクロフェンはＣａ２＋応答；超閾値（Ｆ）を減少させた。
【図１６Ａ】
ガバペンチンがＣａ２＋応答を用量依存的に抑制することを示し、亜閾値（Ａ，Ｂ）および超閾値（Ｃ，Ｄ）電流注入に関する膜脱分極（Ａ，Ｃ）およびＣａ２＋応答（Ｂ，Ｄ）の両方に対するガバペンチン（１００μＭ〜１ｍＭ）の作用の用量／反応ヒストグラムを示す。
【図１６Ｂ】
ガバペンチンがＣａ２＋応答を用量依存的に抑制することを示し、亜閾値（Ａ，Ｂ）および超閾値（Ｃ，Ｄ）電流注入に関する膜脱分極（Ａ，Ｃ）およびＣａ２＋応答（Ｂ，Ｄ）の両方に対するガバペンチン（１００μＭ〜１ｍＭ）の作用の用量／反応ヒストグラムを示す。
【図１６Ｃ】
ガバペンチンがＣａ２＋応答を用量依存的に抑制することを示し、亜閾値（Ａ，Ｂ）および超閾値（Ｃ，Ｄ）電流注入に関する膜脱分極（Ａ，Ｃ）およびＣａ２＋応答（Ｂ，Ｄ）の両方に対するガバペンチン（１００μＭ〜１ｍＭ）の作用の用量／反応ヒストグラムを示す。
【図１６Ｄ】
ガバペンチンがＣａ２＋応答を用量依存的に抑制することを示し、亜閾値（Ａ，Ｂ）および超閾値（Ｃ，Ｄ）電流注入に関する膜脱分極（Ａ，Ｃ）およびＣａ２＋応答（Ｂ，Ｄ）の両方に対するガバペンチン（１００μＭ〜１ｍＭ）の作用の用量／反応ヒストグラムを示す。
【図１６Ｅ】
バクロフェン（４０μＭ）の、亜閾値電流注入に関する脱分極に対する効果を要約したヒストグラムである。
【図１６Ｆ】
バクロフェン（４０μＭ）の、亜閾値電流注入に関するＣａ２応答に対する効果を要約したヒストグラムである。
【図１６Ｇ】
バクロフェン（４０μＭ）の、超閾値電流注入に関する脱分極に対する効果を要約したヒストグラムである。
【図１６Ｈ】
バクロフェン（４０μＭ）の、超閾値電流注入に関するＣａ２応答に対する効果を要約したヒストグラムである。
【図１７Ａ】
ＧＡＢＡＢ受容体活性化を介したＣａ２＋応答のガバペンチンおよびバクロフェンによる抑制を示し、ＧＡＢＡＢ受容体アンタゴニストＣＧＰ５５８４５（４μＭ）の存在下では、ガバペンチン（２ｍＭ；Ａ，Ｂ）およびバクロフェン（４０μＭ；Ｃ，Ｄ）は、亜閾値（Ａ，Ｃ）または超閾値（Ｂ，Ｄ）電流注入により誘発された応答を抑制しなかった。
【図１７Ｂ】
図１７は、ＧＡＢＡＢ受容体活性化を介したＣａ２＋応答のガバペンチンおよびバクロフェンによる抑制を示し、ＧＡＢＡＢ受容体アンタゴニストＣＧＰ５５８４５（４μＭ）の存在下では、ガバペンチン（２ｍＭ；Ａ，Ｂ）およびバクロフェン（４０μＭ；Ｃ，Ｄ）は、亜閾値（Ａ，Ｃ）または超閾値（Ｂ，Ｄ）電流注入により誘発された応答を抑制しなかった。
【図１７Ｃ】
ＧＡＢＡＢ受容体活性化を介したＣａ２＋応答のガバペンチンおよびバクロフェンによる抑制を示し、ＧＡＢＡＢ受容体アンタゴニストＣＧＰ５５８４５（４μＭ）の存在下では、ガバペンチン（２ｍＭ；Ａ，Ｂ）およびバクロフェン（４０μＭ；Ｃ，Ｄ）は、亜閾値（Ａ，Ｃ）または超閾値（Ｂ，Ｄ）電流注入により誘発された応答を抑制しなかった。
【図１７Ｄ】
ＧＡＢＡＢ受容体活性化を介したＣａ２＋応答のガバペンチンおよびバクロフェンによる抑制を示し、ＧＡＢＡＢ受容体アンタゴニストＣＧＰ５５８４５（４μＭ）の存在下では、ガバペンチン（２ｍＭ；Ａ，Ｂ）およびバクロフェン（４０μＭ；Ｃ，Ｄ）は、亜閾値（Ａ，Ｃ）または超閾値（Ｂ，Ｄ）電流注入により誘発された応答を抑制しなかった。
【図１７Ｅ】
ＧＡＢＡＢ受容体活性化を介したＣａ２＋応答のガバペンチンおよびバクロフェンによる抑制を示し、ＣＧＰ５５８４５の不存在下および存在下における亜閾値（Ｅ）および超閾値（Ｆ）刺激により誘発された応答に対するガバペンチン（２ｍＭ）およびバクロフェン（４０μＭ）の効果を要約したヒストグラムを示す。
【図１７Ｆ】
ＧＡＢＡＢ受容体活性化を介したＣａ２＋応答のガバペンチンおよびバクロフェンによる抑制を示し、ＣＧＰ５５８４５の不存在下および存在下における亜閾値（Ｅ）および超閾値（Ｆ）刺激により誘発された応答に対するガバペンチン（２ｍＭ）およびバクロフェン（４０μＭ）の効果を要約したヒストグラムを示す。
【図１Ａ】
2004501375.tif 000008
【図１Ｂ】
2004501375.tif 000009
【図２Ａ】
2004501375.tif 000010
【図２Ｂ】
2004501375.tif 000011
【図２Ｃ】
2004501375.tif 000012
【図２Ｄ】
2004501375.tif 000013
【図２Ｅ】
2004501375.tif 000014
【図２Ｆ】
2004501375.tif 000015
【図３Ａ】
2004501375.tif 000016
【図３Ｂ】
2004501375.tif 000017
【図４Ａ】
2004501375.tif 000018
【図４Ｂ−１】
2004501375.tif 000019
【図４Ｂ−２】
2004501375.tif 000020
【図４Ｃ】
2004501375.tif 000021
【図４Ｄ】
2004501375.tif 000022
【図５Ａ】
2004501375.tif 000023
【図５Ｂ】
2004501375.tif 000024
【図５Ｃ】
2004501375.tif 000025
【図５Ｄ】
2004501375.tif 000026
【図６Ａ】
2004501375.tif 000027
【図６Ｂ】
2004501375.tif 000028
【図６Ｃ】
2004501375.tif 000029
【図７Ａ】
2004501375.tif 000030
【図７Ｂ】
2004501375.tif 000031
【図７Ｃ】
2004501375.tif 000032
【図８Ａ】
2004501375.tif 000033
【図８Ｂ】
2004501375.tif 000034
【図９Ａ】
2004501375.tif 000035
【図９Ｂ】
2004501375.tif 000036
【図１０Ａ】
2004501375.tif 000037
【図１０Ｂ】
2004501375.tif 000038
【図１０Ｃ】
2004501375.tif 000039
【図１１Ａ】
2004501375.tif 000040
【図１１Ｂ】
2004501375.tif 000041
【図１１Ｃ】
2004501375.tif 000042
【図１１Ｄ】
2004501375.tif 000043
【図１１Ｅ】
2004501375.tif 000044
【図１１Ｆ】
2004501375.tif 000045
【図１２】
2004501375.tif 000046
【図１３】
2004501375.tif 000047
【図１４】
2004501375.tif 000048
【図１５Ａ】
2004501375.tif 000049
【図１５Ｂ】
2004501375.tif 000050
【図１５Ｃ】
2004501375.tif 000051
【図１５Ｄ】
2004501375.tif 000052
【図１５Ｅ】
2004501375.tif 000053
【図１５Ｆ】
2004501375.tif 000054
【図１６Ａ】
2004501375.tif 000055
【図１６Ｂ】
2004501375.tif 000056
【図１６Ｃ】
2004501375.tif 000057
【図１６Ｄ】
2004501375.tif 000058
【図１６Ｅ】
2004501375.tif 000059
【図１６Ｆ】
2004501375.tif 000060
【図１６Ｇ】
2004501375.tif 000061
【図１６Ｈ】
2004501375.tif 000062
【図１７Ａ】
2004501375.tif 000063
【図１７Ｂ】
2004501375.tif 000064
【図１７Ｃ】
2004501375.tif 000065
【図１７Ｄ】
2004501375.tif 000066
【図１７Ｅ】
2004501375.tif 000067
【図１７Ｆ】
2004501375.tif 000068
【国際公開パンフレット】
2004501375.tif 000069
2004501375.tif 000070
2004501375.tif 000071
2004501375.tif 000072
2004501375.tif 000073
2004501375.tif 000074
2004501375.tif 000075
2004501375.tif 000076
2004501375.tif 000077
2004501375.tif 000078
2004501375.tif 000079
2004501375.tif 000080
2004501375.tif 000081
2004501375.tif 000082
2004501375.tif 000083
2004501375.tif 000084
2004501375.tif 000085
2004501375.tif 000086
2004501375.tif 000087
2004501375.tif 000088
2004501375.tif 000089
2004501375.tif 000090
2004501375.tif 000091
2004501375.tif 000092
2004501375.tif 000093
2004501375.tif 000094
2004501375.tif 000095
2004501375.tif 000096
2004501375.tif 000097
2004501375.tif 000098
2004501375.tif 000099
2004501375.tif 000100
2004501375.tif 000101
2004501375.tif 000102
2004501375.tif 000103
2004501375.tif 000104
2004501375.tif 000105
2004501375.tif 000106
2004501375.tif 000107
2004501375.tif 000108
2004501375.tif 000109
2004501375.tif 000110
2004501375.tif 000111
2004501375.tif 000112
2004501375.tif 000113
2004501375.tif 000114
2004501375.tif 000115
2004501375.tif 000116
2004501375.tif 000117
2004501375.tif 000118
2004501375.tif 000119
2004501375.tif 000120
2004501375.tif 000121
2004501375.tif 000122
2004501375.tif 000123
2004501375.tif 000124
2004501375.tif 000125
2004501375.tif 000126
2004501375.tif 000127
2004501375.tif 000128
2004501375.tif 000129
2004501375.tif 000130
2004501375.tif 000131
2004501375.tif 000132
2004501375.tif 000133
2004501375.tif 000134
2004501375.tif 000135
2004501375.tif 000136
2004501375.tif 000137
2004501375.tif 000138
2004501375.tif 000139
2004501375.tif 000140
2004501375.tif 000141
2004501375.tif 000142
2004501375.tif 000143
2004501375.tif 000144
2004501375.tif 000145
2004501375.tif 000146
2004501375.tif 000147
2004501375.tif 000148
2004501375.tif 000149
2004501375.tif 000150
2004501375.tif 000151
2004501375.tif 000152
2004501375.tif 000153
2004501375.tif 000154
2004501375.tif 000155
2004501375.tif 000156
2004501375.tif 000157
2004501375.tif 000158
2004501375.tif 000159
2004501375.tif 000160
2004501375.tif 000161
2004501375.tif 000162
2004501375.tif 000163
2004501375.tif 000164
2004501375.tif 000165
2004501375.tif 000166
2004501375.tif 000167
2004501375.tif 000168
2004501375.tif 000169
2004501375.tif 000170
2004501375.tif 000171
2004501375.tif 000172
2004501375.tif 000173
2004501375.tif 000174
2004501375.tif 000175
2004501375.tif 000176
2004501375.tif 000177
2004501375.tif 000178
2004501375.tif 000179
2004501375.tif 000180
2004501375.tif 000181
2004501375.tif 000182
2004501375.tif 000183
2004501375.tif 000184
2004501375.tif 000185
2004501375.tif 000186
2004501375.tif 000187
2004501375.tif 000188
2004501375.tif 000189
2004501375.tif 000190
2004501375.tif 000191
2004501375.tif 000192
2004501375.tif 000193
2004501375.tif 000194
2004501375.tif 000195
2004501375.tif 000196
2004501375.tif 000197
2004501375.tif 000198
2004501375.tif 000199
2004501375.tif 000200
2004501375.tif 000201
2004501375.tif 000202
2004501375.tif 000203
2004501375.tif 000204
2004501375.tif 000205
2004501375.tif 000206
2004501375.tif 000207
2004501375.tif 000208
2004501375.tif 000209
2004501375.tif 000210
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004501375.tif 000211
【国際調査報告】
2004501375.tif 000212
2004501375.tif 000213
2004501375.tif 000214