(57)【要約】高分子バイオポリマーを検出するための方法に従って、高分子バイオポリマーを固定化するための少なくとも１つのユニットが使用される。このユニットは、スカベンジャー分子を備え、スカベンジャー分子は、一方において、高分子バイオポリマーに結合し得、そして他方において、検出可能なシグナルを生成し得る標識を有し得る。本発明の方法に従って、試験されるサンプルは、高分子バイオポリマーを固定化するために使用される少なくとも１つのユニットと接触されて、試験されるサンプルが、検出されるべき高分子バイオポリマーを含み得る。次いで、試験されるサンプル中に含まれる高分子バイオポリマーは、スカベンジャー分子に結合される。その後、検出されるべき高分子バイオポリマーが結合していないスカベンジャー分子は、除去され、そして高分子バイオポリマーがこの標識を使用することによって検出される。
2004531706.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子バイオポリマーを固定化するための少なくとも１つのユニットを使用することによって高分子バイオポリマーを検出するための方法であって、該方法は、以下：
高分子バイオポリマーを固定化するための少なくとも１つのユニットに、スカベンジャー分子を提供する工程であって、該スカベンジャー分子が、高分子バイオポリマーに結合することが可能であり、そして該スカベンジャー分子が、検出可能なシグナルを生成し得る標識を有する、工程、
研究されるサンプルを、高分子バイオポリマーを固定化するための少なくとも１つのユニットと接触させる工程であって、該研究されるサンプルが、検出されるべき高分子バイオポリマーを含み得る、工程、
研究されるサンプル中に存在する高分子バイオポリマーを、該スカベンジャー分子に結合する工程、
検出されるべき高分子バイオポリマーが結合してないスカベンジャー分子を除去する工程、
該標識を使用することによって該高分子バイオポリマーを検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
ここで、前記標識が、シグナルを生成する、
方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、
ここで、前記標識が、蛍光色素、化学発光色素、放射性同位体、酵素および酵素リガンドからなる群より選択される、
方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、
ここで、前記検出される高分子バイオポリマーが、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、または核酸およびタンパク質の複合体である、
方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、
ここで、前記検出される高分子バイオポリマーが、タンパク質またはペプチドであり、
ここで、前記使用されるスカベンジャー分子が、該タンパク質またはペプチドに特異的に結合し得るリガンドである、
方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、
ここで、未結合リガンドが、材料と前記固定化のための少なくとも１つのユニットとを接触させることによって、該固定化のための少なくとも１つのユニットから除去され、該材料が、該リガンドと該固体化のためのユニットとの間の化学結合を加水分解し得る、
方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、
ここで、前記固定化のための少なくとも１つのユニットと接触する材料が、酵素である、
方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、
ここで、前記固定化のための少なくとも１つのユニットと接触する酵素が、カルボン酸エステル加水分解酵素（エステラーゼ）である、
方法。
【請求項９】
請求項４に記載の方法であって、
ここで、前記検出される高分子バイオポリマーが、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である、
方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、
ここで、前記検出される高分子バイオポリマーが、所定のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ１本鎖であり、
ここで、前記使用されるスカベンジャー分子が、該所定のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡプローブ分子である、
方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、
ここで、未結合ＤＮＡプローブ分子が、ヌクレアーゼ活性を有する酵素と前記固定化のためのユニットとを接触させることによって、該固定化のための少なくとも１つのユニットから除去される、
方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、
ここで、前記使用されるヌクレアーゼ活性を有する酵素が、以下の物質：
リョクトウ由来のヌクレアーゼ、
ヌクレアーゼＰ１、
ヌクレアーゼＳ１、
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性または３’→５’エキソヌクレアーゼ活性に起因して、１本鎖ＤＮＡを切断し得るＤＮＡポリメラーゼ、
のうちの少なくとも１つである、
方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法であって、
ここで、前記固定化のための少なくとも１つのユニットが、電極またはフォトダイオードに適用される、
方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法であって、
ここで、前記固定化のためのユニットが、ナノ粒子の配列である、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高分子バイオポリマーを固定化するための少なくとも１つのユニットを用いることによって、高分子バイオポリマーを検出するためのデバイスおよび方法に関する。
【０００２】
［１］〜［４］は、電極の配置に基づくバイオセンサが検出のために使用される、ＤＮＡ分子を検出するための方法を開示する。
【０００３】
図２ａおよび図２ｂは、［１］および［４］に記載される種類のセンサを示す。センサ２００は、金製の２つの電極２０１、２０２を有し、これらの電極は、絶縁材料で作られた絶縁層２０３中に埋め込まれている。電極端子２０４、２０５は、電極２０１、２０２に接続され、電極２０１、２０２に供給される電位が、これらの電極端子に対して伝えられ得る。電極２０１、２０２は、平面電極として配置される。ＤＮＡプローブ分子２０６は、各電極２０１、２０２に固定される（図２ａを参照のこと）。この固定は、いわゆる金−硫黄カップリングに従って実行される。試験される分析物（例えば、電解質２０７）は、電極２０１、２０２に適用される。
【０００４】
電解質２０７が、ＤＮＡプローブ分子２０６の配列に相補的な配列を有するＤＮＡ鎖２０８を含む場合、これらの鎖２０８は、ＤＮＡプローブ分子２０６とハイブリダイズする（図２ｂを参照のこと）。
【０００５】
ＤＮＡプローブ分子２０６とＤＮＡ鎖２０８のハイブリダイゼーションは、特定のＤＮＡプローブ分子２０６の配列および対応するＤＮＡ鎖２０８の配列が、互いに相補的である場合にのみ生じる。こうでない場合、ハイブリダイゼーションは生じない。従って、予め決定された配列を有するＤＮＡプローブ分子は、各場合において、特定のＤＮＡ鎖（すなわち、各々の相補配列を有する鎖）に対してのみ結合（すなわち、ハイブリダイズ）し得る。
【０００６】
ハイブリダイゼーションが生じる場合、図２ｂから理解され得るように、電極間のキャパシタンスは変化する。キャパシタンスにおけるこの変化は、ＤＮＡ分子を検出するための測定変数として使用され得る。
【０００７】
［５］は、予め決定された配列を有するＤＮＡ鎖の存在について電解質を研究するための別の手順を開示する。この手順において、所望の配列のＤＮＡ鎖は、蛍光色素で標識され、そしてそれらの存在は、標識された分子の反射特性に基づいて決定される。この目的のために、電解質は、可視波長範囲の光で照射され、そして電解質によって反射された光（特に、検出される標識ＤＮＡ鎖による）が、検出される。反射挙動に起因して（すなわち、特に検出される反射された光ビームに起因して）、相応して予め決定された配列を有するＤＮＡ鎖（これが、検出される）がその電解質中に存在するか否かが決定される。
【０００８】
この手順は、非常に複雑である。なぜなら、この手順は、対応するＤＮＡ鎖の反射挙動に関する非常に正確な知識を要求し、さらに、このプロセスの前にＤＮＡ鎖の標識を必要とするからである。さらに、反射光のビームを検出する手段は、反射光のビームを少しでも検出し得るために、非常に正確に調整される必要がある。
【０００９】
従って、上記の手順は、高価であり、複雑であり、そして妨害作用に対して非常に感受性であり、そしてその結果として、測定結果を非常に容易に歪めてしまう可能性がある。
【００１０】
分析物中のペプチドおよびタンパク質（例えば、酵素）を特異的に結合するために、固定された低分子量分子（特に、高い特異性および高い親和性のリガンド）を使用することは、アフィニティークロマトグラフィー（［６］を参照のこと）からさらに知られている。
【００１１】
固相系に基づく抗原または抗体についての検出方法（例えば、「ＥＬＩＳＡ」試験）において、２つの反応パートナーのうちの一方が、固相（例えば、マイクロタイタープレート）に結合されることもまた、さらに知られている。抗体−抗原反応が生じた後、それは標識された反応パートナーによって検出される（［７］を参照のこと）。より正確には、このような抗体捕捉アッセイは、第１に、抗原を固体支持体に結合させる工程を包含する。第２に、溶液中に存在する標識された抗体が、抗原と反応する。未結合の抗体を洗い落とした後、定性的な応答または定量的な応答は、結合した抗体上の標識を測定することによって得られる（［８］および［９］を参照のこと）。
【００１２】
［２］および［３］はさらに、高分子バイオポリマーを検出するための還元／酸化再循環方法を開示する。
【００１３】
還元／酸化再循環方法（本明細書の以後では、レドックス再循環方法とも称する）は、本明細書の以後の図４ａ〜図４ｃに基づいて、より詳細に例示される。
【００１４】
図４ａは、絶縁層としての基材４０３に適用される第１電極４０１および第２電極４０２を有する、バイオセンサ４００を示す。
【００１５】
保持領域（保持層４０４として形成される）は、金製の第１電極４０１に適用される。この保持領域は、ＤＮＡプローブ分子４０５を第１電極４０１上に固定するように作用する。
【００１６】
このような保持領域は、第２電極上には提供されない。
【００１７】
ＤＮＡプローブ分子４０５の配列に相補的である配列を有するＤＮＡ鎖がバイオセンサ４００によって検出される場合、このセンサ４００は、調査される溶液４０６中に存在し得かつＤＮＡプローブ分子４０５の配列に相補的な配列を有する任意のＤＮＡ鎖がハイブリダイズし得るような様式で、調査される溶液４０６（例えば、電解質）と接触される。
【００１８】
図４ｂは、調査される溶液４０６が、ＤＮＡプローブ分子４０５にハイブリダイズした検出されるＤＮＡ鎖４０７を含む場合を示す。
【００１９】
調査される溶液中のＤＮＡ鎖４０７は、酵素４０８で標識され、この酵素４０８は、以下に記載される分子を部分分子に切断することを可能にする。
【００２０】
提供されるＤＮＡプローブ分子４０５の数は、通常、決定されるＤＮＡ鎖４０７（これは、調査される溶液４０６中に存在する）の数よりもかなり多い。
【００２１】
調べられる溶液４０６中に存在し得かつ酵素４０８を有するＤＮＡ鎖４０７が固定されたＤＮＡプローブ分子とハイブリダイズした後、バイオセンサ４００はリンスされ、それによってハイブリダイズしていないＤＮＡ鎖を除去し、そして調べられる溶液４０６のバイオセンサ４００を清澄する。
【００２２】
ハイブリダイズしたＤＮＡ鎖４０７上の酵素によって、負の第１電荷の第１部分分子および正の第２電荷の第２部分分子へと切断され得る分子を含む電気的に非荷電の物質は、リンスのために使用されるリンス溶液に添加されるか、またはさらなる相においてこの目的のために特に供給されるさらなる溶液４１２に添加される。
【００２３】
図４ｃに示されるように、負に荷電された部分分子は、図４ｃにおいて矢印４１１によって示されるように、正に荷電されたアノードに誘引される。
【００２４】
負に荷電された第１部分分子４１０は、正の電気ポテンシャルを有する第１電極４０１（アノードとして）において酸化され、そして（酸化された部分分子４１３として）負に荷電されたカソード（すなわち、第２電極４０２）に誘引され、これらはここで、再度還元される。
【００２５】
還元された部分分子４１４は、次に、第１電極４０１（すなわち、アノード）に向かって移動する。
【００２６】
このようにして、電流サイクルが発生し、これは、酵素４０８によって各場合において生成される荷電した電荷担体の数に比例する。
【００２７】
本方法において評価される電気パラメーターは、図５において図解５００において示されるように、時間ｔの関数としての電流ｄＩ／ｄｔにおいて変化する。
【００２８】
高分子バイオポリマーを検出するための上記の方法は、共通して、検出される高分子バイオポリマーが実際の検出方法を実行する前に標識されるということを有する。これは、複雑であり、そして例えば、（例えば、調べられるサンプルの一部または定量的でない標識プロセスの一部を）もしかすると損失する危険性と関連するだけでなく、他の不都合も有し得る。例を挙げれば、例えば、蛍光色素で標識されるＤＮＡ分子の場合、その蛍光標識は、ＤＮＡ分子の移動性を低下させ得、ゆえに、検出プロセスを減速させる。
【００２９】
［１５］は、さらに、リガンドの化学ライブラリーを使用することによる、標的−リガンド相互作用をスクリーニングするための方法を開示する。この方法は、その標的の添加前または添加後に、固相上に固定されたリガンドの化学ライブラリーの少なくとも１つの蛍光特性を、各リガンドに結合されている分子蛍光センサを用いて、測定する工程を包含する。
【００３０】
さらに、［１６］は、その骨マトリックスのタンパク質の転写産物が、マウス組織細胞において検出された、インサイチュハイブリダイゼーション法を開示する。
【００３１】
［１７］は、さらに、自己位置決定可能な微小電子デバイスを開示し、このデバイスは、分子生物学的な多段階反応を能動的に導き得、そして顕微鏡形式で反応を多重化し得る様式で、設計されている。
【００３２】
［１８］は、最終的に、検出系を開示し、この系は、例えば、生化学的研究または薬学的研究において使用され得、そして固定された少なくとも１つの結合成分Ａと、この結合成分Ａに結合し得る少なくとも１つの検出種Ｂとを有し、この成分Ａは、この検出種Ｂについての少なくとも１つの結合部位を備える。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３３】
本発明の目的は、高分子バイオポリマーを検出するための、代替的な方法およびデバイスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００３４】
この課題は、独立特許請求項に従う特徴を有する、方法およびデバイスにより解決される。
【００３５】
高分子バイオポリマーを記録するためのこのような方法は、高分子バイオポリマーを固定するための少なくとも１つのユニットを使用する。
【００３６】
これに関して、高分子バイオポリマーを固定するための少なくとも１つのユニットは、（まず）スカベンジャー（ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）分子を備え、このスカベンジャー分子は、まず、高分子バイオポリマーに結合し得、次いで、標識を有し得る。この標識は、検出可能なシグナルを生成し得る。この方法において、研究されるべきサンプルは、その後、高分子バイオポリマーを固定するためのこの少なくとも１つのユニットと接触される。研究されるべき上記サンプルが、検出されるべき高分子バイオポリマーを含むことが可能である。この後、研究されるべきサンプル中に存在する高分子ポリマーが、そのスカベンジャー分子に結合する。その後、検出されるべき高分子バイオポリマーが結合しなかったスカベンジャー分子が除去され、そして高分子バイオポリマーが、標識を使用することにより検出される。
【００３７】
簡単に述べると、本発明の方法は、検出されるべき高分子バイオポリマーが、以前のようには標識を備えていないが、スカベンジャー分子が固定前に標識を備えるという知見に基づく。このことは、研究されるべきサンプルが、そのサンプルの一部またはおそらくサンプル全体が失われ得るかまたは標識が完全ではない標識反応に、もはや供される必要がないという利点を有する。
【００３８】
本明細書中に開示される高分子バイオポリマーを検出するためのデバイスは、高分子バイオポリマーを固定するための少なくとも１つのユニットと、検出ユニットとを有する。このデバイスにおいて、高分子バイオポリマーを固定するための少なくとも１つのユニットは、スカベンジャー分子を備え、このスカベンジャー分子は、高分子バイオポリマーに結合し得、かつ検出可能なシグナルを生成可能な標識を有する。このデバイス中の検出ユニットは、スカベンジャー分子に結合した標識高分子バイオポリマーによって検出するような様式で、構成されている。
【００３９】
１つの実施形態において、このデバイスは、高分子バイオポリマーを固定するための複数のユニットを、規則正しい配置（アレイ）状態で有する。このデバイスにおいて、固定するための少なくとも１つのユニットまたはそのユニットの規則正しい配置は、好ましくは、ＣＭＯＳカメラまたはＣＣＤに適用される。
【００４０】
本明細書中に記載される方法において、その標識は、シグナルを生成する。１つの構成において、そのようなシグナルは、電子回路である。別の構成において、そのシグナルは、可視光またはＵＶ光である。そのシグナルはまた、放射線またはＸ線からなり得る。
【００４１】
このことから、以下の本明細書中でレポーター基とも呼ばれる種々の型の標識をこの方法において使用することが可能であることが、明らかである。
【００４２】
最後に、その標識は、高分子バイオポリマーを検出するために使用され得るシグナルを直接生成可能である、（化学）化合物または基であり得る。そのシグナルの生成は、外部から誘導され得るが、この標識が、外部刺激を伴わずにシグナルを出すこともまた、可能である。第１の場合、その標識は、例えば、蛍光色素（発蛍光団）または化学発光色素であり、第２の場合、その標識は、例えば、放射性同位体である。
【００４３】
第２に、その標識は、高分子バイオポリマーを記録するためのシグナルを間接的にしか発生しない物質（すなわち、そのシグナルの発生を引き起こす物質）であり得る。そのようなレポーター基は、例えば、化学反応を触媒する酵素であり得、その酵素は、その後、上記バイオポリマーを検出するために使用される。そのような酵素の例は、アルカリホスファターゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼである。これらの酵素は、有色最終産物を生じる適切な基質を切断可能であるか、または、例えば、上記の還元／酸化リサイクル法において使用され得る化合物を切断可能である。高分子バイオポリマーを検出するために使用され得るシグナルを間接的にしか発生しない標識の基は、さらに、タンパク質に結合するためのリガンドおよび酵素の基質を含む。その標識は、一般的に、本明細書中で酵素リガンドと呼ばれる。標識として使用され得るそのような酵素リガンドの例は、ビオチン、ジゴキシゲニン、および上記の酵素の基質である。
【００４４】
本発明に従う検出すること（工程）とは、研究されるべき分析物における高分子バイオポリマーの定性的検出および定量的検出の両方を意味する。このことは、用語「検出すること（工程）」はまた、その分析物中の高分子バイオポリマーの非存在を決定することも包含することを、意味する。
【００４５】
本発明に従う「固定のため（固定するため）のユニット」とは、スカベンジャー分子が固定され得る表面（すなわち、物理的相互作用または化学的相互作用によってスカベンジャー分子が結合し得る、表面）を有する配置を意味する。これらの相互作用としては、疎水性相互作用またはイオン性（静電性）相互作用、および共有結合が挙げられる。固定のための少なくとも１つのユニットのために使用され得る適切な表面材料の例は、金属（例えば、金または銀）、プラスチック（例えば、ポリエチレンまたはポリプロピレン）および無機物質（例えば、二酸化ケイ素（例えば、ガラス形態））である。
【００４６】
スカベンジャー分子の固定を生じる物理的相互作用の例は、表面への吸着である。この型の固定は、例えば、固定手段が、マイクロタイタープレートの作製のために使用されるプラスチック材料（例えば、ポリプロピレン）である場合に、生じ得る。しかし、スカベンジャー分子を、固定するためのユニットに共有結合することが、優先される。なぜなら、これによって、スカベンジャー分子の方向を制御することが可能であるからである。その共有結合は、適切な任意のリンカー化学を介してもたらされ得る。
【００４７】
この方法の１つの実施形態において、固定するための少なくとも１つのユニットは、電極またはフォトダイオードに適用される。
【００４８】
別の実施形態において、高分子バイオポリマーを固定するための少なくとも１つのユニットは、ナノ粒子である。
【００４９】
本発明に従うナノ粒子は、「ナノ構造生成法」によって入手され得る粒子を意味する。適切な基材上にそのようなナノ粒子を生成するために使用され得るナノ構造生成法は、例えば、［１２］および「１３］に記載される、構造化（ｓｔｒｕｃｔｕｒｉｚａｔｉｏｎ）マスクとしてのブロックコポリマーミクロエマルジョンの使用、ならびに［１４］に記載される、構造化（ｓｔｒｕｃｔｕｒｉｚａｔｉｏｎ）マスクとしてのコロイド状粒子の使用である。［１４］に記載される方法は、原理的には、基材構造化（ｓｔｒｕｃｔｕｒｉｚａｔｉｏｎ）の領域で一般的に使用され得るリソグラフ法と類似する。従って、本発明に従うナノ粒子は、本明細書中に例として記載される方法のいずれかによって得られる粒子に、結果的には限定されないことが、ここで強調されるべきである。むしろこのようなナノ粒子は、直径がナノメートル範囲（すなわち、通常は、２〜５０ｎｍの範囲、好ましくは、５〜２０ｎｍの範囲、特に好ましくは５〜１０ｎｍの範囲）である、任意の粒子である。
【００５０】
従って、以下の本明細書中でナノ粒子形状ユニットとも呼ばれる「ナノ粒子である、固定のためのユニット」は、スカベンジャー分子が固定され得る表面を有する（すなわち、その表面の性質が、物理的相互作用または化学的相互作用によって、スカベンジャー分子がその表面に結合し得るようである）、上記のナノ粒子である。これらの相互作用としては、疎水性相互作用またはイオン性（静電性）相互作用、および共有結合が、挙げられる。
【００５１】
固定のための少なくとも１つのナノ粒子様ユニットのために使用され得る適切な表面材料の例は、金属（例えば、金または銀）、半導体材料（例えば、ケイ素）、プラスチック（例えば、ポリエチレンまたはポリスチレン）、または二酸化ケイ素（例えば、ガラス形態）である。プラスチックおよび二酸化ケイ素から作製されたナノ粒子様ユニットは、［１４］に記載されるコロイド状マスク法を使用することによって得られる。半導体材料（例えば、ケイ素）から作製されたナノ粒子様ユニットはまた、例えば、Ｓｔｒａｎｓｋｉ−Ｋｒａｎｓｔａｎｏｖ法によっても作製され得る。さらに、ケイ素から作製されたそのようなナノ粒子の酸化によって二酸化ケイ素から作製されたナノ粒子様ユニットを得ることが、可能である。
【００５２】
上記の調製方法により、固定化のためのナノ粒子様ユニット（適切な基板表面（保持領域）（例えば、フォトダイオードまたは電極）に適用される）は、規則的な方法で基板上に配置され、互いの距離は、数十ナノメートル（例えば、約１０〜３０ｎｍ）の範囲である。配置の型、およびナノ粒子間の距離、ならびにナノ粒子のサイズは、上記ナノ粒子を形成する特定の方法に依存する。
【００５３】
固定化のためのナノ粒子形ユニットを使用する場合の１つの利点は、上記ナノ粒子上に正確に規定された数のスカベンジャー分子を固定化する可能性である。これは、本発明の方法により高分子バイオポリマーを定量的に検出するために特に有利である。固定化のためのユニットとしてナノ粒子を使用する場合の別の利点は、以下の事実により提供される：ナノ粒子間の距離（すなわち、スカベンジャー分子の空間的分離）が、ナノ粒子に結合している高分子バイオポリマーへのこのスカベンジャー分子のより良好な空間的接近可能性を提供し、従って相互作用の可能性を増大させる。さらに、このナノ粒子設計は、有効表面積を増加させる。
【００５４】
本明細書において、高分子バイオポリマーとは、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子のような核酸、または１０〜２０塩基対（ｂｐ）を有するオリゴヌクレオチドのようなより短い核酸を意味する。核酸は、二本鎖であり得るか、少なくとも一本鎖領域を有し得るか、もしくは、例えばそれらの検出のための先行する熱変性（鎖分離）に起因して、一本鎖として存在し得る。この点について、検出されるべき核酸の配列は、少なくとも部分的かまたは完全に、予め決定され得る（すなわち既知であり得る）。他の高分子バイオポリマーは、タンパク質またはペプチドである。これらは、通常タンパク質に見出される２０種のアミノ酸から構成され得るが、非天然のアミノ酸もまた含み得、または例えば、糖残基（オリゴサッカリド）により改変され得るか、または翻訳後修飾を含み得る。さらに、いくつかの異なる高分子バイオポリマーの複合体（例えば、核酸およびタンパク質の複合体）を検出することも可能である。
【００５５】
検出されるべき高分子バイオポリマーがタンパク質またはペプチドである場合、使用される好ましいスカベンジャー分子は、その検出されるタンパク質またはペプチドに特異的に結合し得るリガンドである。このスカベンジャー分子／リガンドは、好ましくは、共有結合により固定化のための手段に連結される。
【００５６】
タンパク質およびペプチドのための適切なリガンドは、低分子量の酵素アゴニストまたは酵素アンタゴニスト、薬物、糖もしくは抗体またはタンパク質またはペプチドに特異的に結合し得る任意の分子である。
【００５７】
所定のヌクレオチド配列のＤＮＡ分子（核酸またはオリゴヌクレオチド）は、本明細書に記載される方法により検出され、これらは、好ましくは一本鎖形態で検出され、すなわち、これらのＤＮＡ分子は、適切な場合、検出の前に、上述のように変性により一本鎖へと変換される。この場合、次いで、使用されるスカベンジャー分子は、好ましくはこの一本鎖領域に相補的な配列を有するＤＮＡプローブ分子である。このＤＮＡプローブ分子が、今度は、オリゴヌクレオチド、または（より長いヌクレオチド配列が保護されるべき核酸分子とのプローブ分子のハイブリダイゼーションを妨げるどんな分子間構造も形成しないかぎり）より長いヌクレオチド配列を有し得る。しかし、スカベンジャー分子としてＤＮＡ結合タンパク質または因子を使用することも可能である。
【００５８】
本発明の方法により、単一セットの測定において単一の種類のバイオポリマーだけでなく、複数の高分子バイオポリマーを同時かまたは連続して検出することも当然可能であることに留意すべきである。この目的のために、いくつかの型のスカベンジャー分子（これらの各々は、検出されるべき特定のバイオポリマーについての（特異的）結合親和性を有する）がユニット上に結合され得、そして／または固定化のためのいくつかのユニットが使用され得、この固定化のためのユニットの各々には、ただ一つの型のスカベンジャー分子が固定されている。これらの多重決定において、他の標識と区別可能である標識は、好ましくは、検出されるべき高分子バイオポリマーの各々について使用される。例えば、標識として、各々特定の励起波長および発光波長を好ましくは有する２つ以上の発蛍光団を使用することが可能である。
【００５９】
方法の最初の工程において、固定化のための少なくとも１つのユニットに、検出可能なシグナルを生成し得る標識を有するスカベンジャー分子が提供される。
【００６０】
研究されるサンプル（好ましくは電解質のような液体媒体）を、次いで、固定化のためのユニットと接触させる。これは、高分子バイオポリマーがスカベンジャー分子に結合し得るような方法で実行される。媒体が、複数の検出されるべき高分子バイオポリマーを含有する場合、その条件は、このバイオポリマーが、各場合において、その対応するスカベンジャー分子に同時かまたは連続して結合し得るような様式で選択される。
【００６１】
高分子バイオポリマーが、対応するスカベンジャー分子（単数または複数）に結合し得るために適切な時間の間待った後、結合していないスカベンジャー分子を、それらが位置している固定化のためのユニット（単数または複数）から除去する。
【００６２】
検出される高分子バイオポリマーがタンパク質またはペプチドである場合、スカベンジャー分子として使用される結合していないリガンドは、少なくとも１つの固定化のためのユニットと、リガンドと固定化のためのユニットとの間の化学結合を加水分解し得る物質とを接触させることにより、少なくとも１つの固定化のためのユニットから除去される。
【００６３】
スカベンジャー分子が低分子量リガンドである場合もまた、結合していない場合は、酵素により除去され得る。
【００６４】
この目的のために、リガンドは、酵素により切断可能な連結を介して（例えば、エステル結合を介して）、固定化のためのユニットに共有結合で連結される。
【００６５】
この場合、未結合のリガンド分子を除去するために、例えば、カルボン酸エステル化水分解酵素（エステラーゼ）を使用することが可能である。この酵素は、固定化のためのユニットと、ペプチドまたはタンパク質により結合されていない特定のリガンド分子との間の特定のエステル結合を加水分解する。対照的に、固定化のためのユニットと、ペプチドまたはタンパク質と結合相互作用した分子との間のエステル結合は、その結合したペプチドまたはタンパク質の空間占有から生じる減少した立体的接近可能性に起因してインタクトなままである。
【００６６】
スカベンジャー分子がＤＮＡ鎖である場合、未結合のプローブ分子は、酵素により（例えば、ヌクレアーゼ活性を有する酵素の補助により）除去される。使用されるヌクレアーゼ活性を有する酵素は、好ましくは一本鎖ＤＮＡを選択的に分解する酵素である。この点について、一本鎖ＤＮＡに対する分解酵素の選択性は、考慮に入れなければならない。ハイブリダイズしていないＤＮＡ一本鎖を分解するために選択される酵素がこのような選択性を有していない場合、プローブ分子との二本鎖ハイブリッドの形態で存在する検出されるべきＤＮＡは、おそらく、そして望ましくなく、また同様に分解され得る。
【００６７】
未結合のＤＮＡプローブ分子をそれぞれの電極から除去するために、ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、リョクトウ（ｍｕｎｇ  ｂｅａｎ）由来のヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＰ１またはヌクレアーゼＳ１）を使用することは、特に可能である。同様に、その５’→３’エキソヌクレアーゼ活性またはその３’→５’エキソヌクレアーゼ活性に起因して、一本鎖ＤＮＡを分解し得るＤＮＡポリメラーゼを使用することが可能である。
【００６８】
未結合のスカベンジャー分子を除去した後、高分子バイオポリマーは、標識を使用して検出される。この目的のために、標識により自発的に放出されるシグナル（例えば、放射線放射）、または外部刺激により生じたシグナル（例えば、発光した蛍光放射）のいずれかが測定される。
【００６９】
測定されたシグナルが、発光した蛍光放射である場合、例えば、固定化のためのユニットを、測定のために使用されるフォトセルに直接適用し、そしてこのフォトセルを対応する評価ユニットへと接続することにより、直接センサ上で空間分解様式で測定を行うような様式でバイオセンサを設計し得る。このことの利点は、単純化された測定構成である。このような測定構成は、例えば、従来のＣＭＯＳカメラまたはＣＣＤを使用して作製され得る。しかし、もちろん、発光した蛍光放射を検出するための外部ユニットを使用することも可能である。
【００７０】
使用される標識および測定方法に依存して、スカベンジャー分子を含有する高分子バイオポリマーを固定化するための少なくとも１つのユニットを提供する前または後にシグナルを測定することもまた可能である。この場合、シグナルの２回の測定から決定される値が互いに比較される。測定された値のシグナル強度が、決定された値の間の差異が所定の閾値より大きい様式において異なる場合、高分子バイオポリマーがスカベンジャー分子に結合し、それによりレシーバーにより受け取られたシグナルの強度を変化させたと仮定される。
【００７１】
図１は、本明細書中に記載の方法の第１の例示的実施形態を行うために使用され得るバイオセンサ１００の断面図を示す。
【００７２】
図１ａは、絶縁材料から作成された絶縁層１０３に配置された第１のフォトダイオード１０１および第２のフォトダイオード１０２を有するバイオセンサ１００を示す。
【００７３】
第１のフォトダイオード１０１および第２のフォトダイオード１０２は、それぞれ、第１の電子端子１０４および第２の電子端子１０５を介して、評価ユニット（示されず）に接続される。２つのフォトダイオード１０１、１０２は、それぞれ、酸化物層１０６ならびに高分子バイオセンサを固定化するための第１のユニット１０７、および高分子バイオポリマーを固定化するための第２のユニット１０８がさらに設けられる。固定化するためのユニット１０７および１０８は、金から調製される。
【００７４】
あるいは、固定化するためのユニット１０７、１０８は、シリコン酸化物から調製され、スカベンジャー分子を固定化するために適切な材料でコーティングされる。
【００７５】
例えば、以下のような公知のアルコキシシラン誘導体を使用することが可能である：
・３−グリシドキシプロピルメトキシシラン
・３−アセトキシプロピルトリメトキシシラン
・３−アミノプロピルトリエトキシシラン
・４−（ヒドロキシブチルアミド）プロピルトリエトキシシラン
・３−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノプロピルトリエトキシシラン
またはそれらの一端とシリコン酸化物の表面と共有結合を形成し、反応のためのエポキシ、アセトキシ、アミンまたはヒドロキシラジカルのような化学的反応性基と固定化されるプローブ分子を提供し得る他の関連する材料。
【００７６】
固定化されるスカベンジャー分子がこの種の活性化された基と反応する場合、このスカベンジャー分子は、共有結合リンカーとして選択された材料を介して、固定化するためのユニット上のコーティングの表面に結合される。
【００７７】
ＤＮＡプローブ分子１０９、１１０は、１０７および１０８を固定化するためのユニットにスカベンジャー分子として適用される。
【００７８】
この関係において、所定の第１のＤＭＡ配列に相補的な配列を有する第１のＤＮＡプローブ分子１０９は、ユニット１０７により第１のフォトダイオード１０１に適用される。このＤＮＡプローブ分子１０９は、各場合において、第１の発蛍光団１１１で標識される。
【００７９】
使用される発蛍光団は、例えば、フルオレセインであり得る。スカベンジャー分子１０９は、適切に標識されたヌクレオチド（例えば、ＣｈｒｏｍａＴｉｄｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−１２−ｄＵＴＰ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ，製品番号Ｃ−７６０４）をオリゴヌクレオチド（スカベンジャー分子）１０９に酵素的に組み込むことにより（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼまたはクレノウポリメラーゼのような適切なポリメラーゼにより）標識され得る（［１０］を参照のこと）。
【００８０】
所定の第２のＤＮＡ配列に相補的な配列を有する第２のＤＮＡプローブ分子１１０は、第２のフォトダイオード１０２に適用される。このＤＮＡプローブ分子１１０は、各場合において、第２の発蛍光団１１２で標識される。使用される標識１１２は、例えば、発蛍光団「Ｏｒｅｇｏｎ  ＧｒｅｅｎＴＭ４８８」であり得、これは、ＤＮＡ分子１１０に酵素的に組み込まれるｄＵＴＰ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ，製品番号Ｃ−７６３０）のようなヌクレオチドに同様に結合される。
【００８１】
ＤＮＡ鎖の配列（これは、各場合に、プローブ分子の配列に相補的である）は、上記の標識の場合において、ピリミジン塩基アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ）に、またはシトシン（Ｃ）に、通常の様式にて、すなわち、ＡとＴ（またはＵ）との間およびＣとＧとの間の水素結合による塩基対合によりハイブリダイズし得る。
【００８２】
図１ａは、フォトダイオード１０１、１０２およびＤＮＡプローブ分子１０８、１０９と接触する電解質１１３を示す。
【００８３】
図１ｂは、バイオセンサ１００を示す。この場合に、電解質１１３は、第１のＤＮＡプローブ分子１０９の配列に相補的な所定の第１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ鎖１１４を含む。
【００８４】
この場合に、第１のＤＮＡプローブ分子１０９に相補的なＤＮＡ分子１１４は、第１のフォトダイオード１０１に適用されている第１のＤＮＡプローブ分子１０９とハイブリダイズする。
【００８５】
ＤＮＡ鎖の配列は、各場合に特異的な相補配列とのみハイブリダイズするので、第１のＤＮＡプローブ分子に相補的なＤＮＡ鎖は、第２のＤＮＡプローブ分子１１０とハイブリダイズしない。
【００８６】
図１ｂから見られ得るように、ハイブリダイゼーションが生じた後の結果は、ハイブリダイズした分子が位置する、すなわち、二本鎖ＤＮＡ分子が、第１のフォトダイオード１０１上に固定化されることである。第２のＤＮＡプローブ分子１１０のみが、なお一本鎖分子として、第２のフォトダイオード１０２上に存在する。
【００８７】
さらなる工程において、第２のフォトダイオード１０２上での一本鎖ＤＮＡプローブ分子１１０の加水分解が、生化学的方法により（例えば、電解質１１３にＤＮＡヌクレアーゼを添加することにより）もたらされる。
【００８８】
ここで、一本鎖ＤＮＡに対する分解酵素の選択性が考慮に入れられなければならない。ハイブリダイズしなかったＤＮＡ一本鎖を破壊するために選択された酵素がこの選択性を有さない場合、検出される核酸（これは、二本鎖ＤＮＡとして存在する）は、おそらく、同様に（望ましくないことに）破壊され、このことは、測定の結果のひずみを引き起こす。
【００８９】
一本鎖ＤＮＡプローブ分子、すなわち、第２のフォトダイオード１０２上の第２のＤＮＡプローブ分子１１０を除去した後、検出されるＤＮＡ分子１１４およびこれに相補的な第１のＤＮＡプローブ分子１０９のハイブリッドのみが存在する（図１ｃを参照のこと）。
【００９０】
第２のフォトダイオード１０２（すなわち、固定のための第２のユニット）上の未結合一本鎖ＤＮＡプローブ分子１１０を除去するために、以下の基質のうちの１つが添加され得、例えば：
・リョクトウ由来のヌクレアーゼ、
・ヌクレアーゼＰ１、または
・ヌクレアーゼＳ１。
【００９１】
この目的で、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性または３’→５’エキソヌクレアーゼ活性に起因して、一本鎖ＤＮＡを分解し得るＤＮＡポリメラーゼを使用することが、同様に可能である。
【００９２】
一本鎖プローブ分子の分解の後に、電解質が、適切である場合、フォトダイオード１０１および１０２から除去され得る。これによって、引き続く蛍光測定についてのコントラストが増加する（すなわち、バックグラウンドが低下する）。
【００９３】
次いで、レーザー（図示せず）を使用して、矢印１１５によって印される、第１の発蛍光団１１１および第２の発蛍光団１１２に蛍光を発生させるために適切な波長を有する光を照射する。発蛍光団の型に依存して、異なる波長を、同時にかまたは連続してのいずれかで使用することもまた可能である。
【００９４】
この照射される光は、第１のＤＮＡプローブ分子１０９に位置する発蛍光団１１１のみを発光させる。なぜなら、発蛍光団１１２を含む未結合の第２のＤＮＡプローブ分子１１０は、ヌクレアーゼ処理によって、第２のフォトダイオード１０２から除去されているからである（図１ｃを参照のこと）。矢印１１６によって印される蛍光の放射（これは、発蛍光団１１１によって発光される）は、第１のフォトダイオード１０１によって検出される。しかし、第２のフォトダイオード１０２は、いずれの蛍光放射をも検出しない。
【００９５】
この様式で、ＤＮＡ分子１１４の存在が決定される。本明細書中に記載される、バイオセンサ１００の使用は、空間的に分解された検出を可能にし、そして測定装置全体の明らかな単純化を与える。なぜなら、蛍光放射を検出するための外部ユニットに対する必要性がないからである。
【００９６】
図３は、ナノ粒子の形態での固定のための少なくとも１つのユニットを備えて構成され、そして本明細書中に記載される方法の別の実施形態を実施するために使用され得る、バイオセンサ３００の断面を示す。
【００９７】
バイオセンサ３００は、第１のフォトダイオード３０１および第２のフォトダイオード３０２を有し、これらのダイオードは、シリコンのような絶縁材料から作製される絶縁層３０３に配置される。バイオセンサ３００は、酸化物層３０４およびその上の第２の層３０５をさらに有する。第２の層３０５は、高分子バイオポリマーの固定に適切ではない金属からなる。層３０５は、例えば、白金から構成され得る。層３０５の上に、高分子バイオポリマーを固定するためのユニット（これは、ナノ粒子の形態を有する）が、以下の方法によって製造される。
【００９８】
０．５重量％のブロックコポリマー（一般式ＰＳ（ｘ）−ｂ−Ｐ２ＶＰ（ｙ）のポリスチレン（ＰＳ）−ブロック−ポリ（２−ビニルピリジン）（Ｐ２ＶＰ））の溶液を、［１２］および［１３］に記載されるように、ピリジン１ユニットあたり０．５当量のＨＡｕＣｌ４・Ｈ２Ｏと混合して、単分散（ミセル状に溶解した）金粒子を形成する。この式において、ｘおよびｙは、単量体と開始剤との間の比に従う塩基単位の数を示す。
【００９９】
均一なミセルの形成後、金で作製されたナノ粒子の単分子層を、［１２］および［１３］に記載されるように、この溶液から層３０５上へと、ヒドラジンでの還元によって、沈澱させる。続いて、沈澱したミセルの有機成分（すなわち、ブロックポリマー）が、プラズマエッチングによって、酸素プラズマによって、層３０５から除去される（［１３］を参照のこと）。高分子バイオポリマーを固定するためのユニットとして働く金粒子３０６は、このプラズマでの処理の間インタクトなままであり、そして図３ｂの断面図および図３ｃの上面図に示されるように、層３０５の上に規則的な配置を形成する（［１２］を参照のこと）。金ナノ粒子３０６間の距離は、通常、数１０ｎｍであり、例えば、約２０〜３０ｎｍである。これらのナノ粒子の大きさは、好ましくは、約５〜１０ｎｍの範囲である。
【０１００】
もちろん、ナノ粒子を形成するために、上述のブロックコポリマーとは別に、他のブロックコポリマーを使用することもまた可能である。
【０１０１】
あるいは、ナノ粒子の形態で固定するためのユニット３０６は、［１４］に記載されるように、コロイド粒子からナノ構造を作製するためのマスクを、まず層３０５の上に形成し、次いで金粒子を、例えば真空蒸着によって蒸着させることによって、バイオセンサ上に作製され得る。
【０１０２】
金で作製されたナノ粒子３０６を適用した後に、センサ３００は、白金で作製された層３０５（固定のためのユニット３０６を含む）が、図３ｄの断面図および図３ｅの上面図が示すように、フォトダイオード３０１、３０２の上に位置する領域のみに残るような様式で、構成される。この構成は、例えば、任意の適切な馴染み深い化学エッチング法の補助によって、可能である。
【０１０３】
この様式で設計されたバイオセンサ３００の補助によって、第１の例示的な実施形態に記載される、高分子バイオポリマーを検出するための方法を実施することが可能である。図３ｆは、金−硫黄カップリングによって金ナノ粒子３０６上に固定された、ＤＮＡスカベンジャー分子３０７を示す。
【０１０４】
バイオセンサ３００を使用することにより、ユニット３０５が固定し、ナノ粒子の形態で存在し、正確に規定された数のスカベンジャー分子を固定することを可能にする利点を提供する。従って、高分子バイオポリマーの定量的検出のためにバイオセンサ３００を使用することに対して、優先が与えられる。
【０１０５】
図６は、本発明の方法の別の例示的な実施形態に従う、酸化還元リサイクルプロセスを実施するために使用され得る、バイオセンサ６００を示す。
【０１０６】
バイオセンサ６００は、３つの電極（第１の電極６０１、第２の電極６０２、および第３の電極６０３）を有する。
【０１０７】
電極６０１、６０２、６０３は、絶縁層６０４のような絶縁材料によって、互いから電気的に絶縁されている。
【０１０８】
高分子バイオポリマーを結合し得る、プローブ分子を保持するための保持領域６０５が、第１の電極６０１に提供される。この保持領域は、固定のための均一なユニットとして構成され得るが、この保持領域を、ナノ粒子の形態で固定するためのユニットで設計することもまた可能である。
【０１０９】
この例示的な実施形態によるプローブ分子（スカベンジャー分子）６０６（これは、保持領域に固定されている）は、ＤＮＡプローブ分子であり、これに、このＤＮＡプローブ分子の配列に相補的な配列を有するＤＮＡ鎖がハイブリダイズし得る。プローブ分子６０６は、それらの５’末端において、標識６０７としてビオチン基を有し、このビオチン基は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡからの「ＦｌｕｏＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ｂｉｏｔｉｎ−Ｘ−Ｃ５  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ」（製品番号Ｆ−６０９５）（１１を参照のこと）を使用することによって、この位置に結合され得る。
【０１１０】
ＤＮＡプローブ分子６０６は、金で作製された第１の電極６０１に、公知の金−硫黄カップリングによって固定される。プローブ分子を結合するために異なる材料を使用する場合、この材料は、適切なコーティング材料を備え、このコーティング材料の上に、このプローブ分子が固定され得る。
【０１１１】
第１の電極６０１へのＤＮＡプローブ分子の固定の間に、異なる電位が電極に印加され、その結果、ＤＮＡプローブ分子の固定が第１の電極６０１においてのみに可能であり、そして第２の電極６０２および／または第３の電極６０３においては防止されるような様式で、電極間の電場が発生する。
【０１１２】
先行技術による方法に類似して、上記のように（図４を参照のこと）、さらなる工程において、研究されるべき溶液６０９（例えば、電解質であり、検出されることが可能な高分子バイオポリマー（すなわち、ＤＮＡプローブ分子とハイブリダイズし得るＤＮＡ鎖）を含む）が、バイオセンサ６００（すなわち、特に、第１の電極６０１およびその上に位置する標識されたＤＮＡプローブ分子６０６）と接触される。このことは、研究されるべき溶液中に存在し得るＤＮＡ鎖６０８が、ＤＮＡプローブ分子６０６とハイブリダイズし得るような様式で、実施される。
【０１１３】
続いて、検出されるべきＤＮＡ鎖がハイブリダイズしなかったスカベンジャー分子６０６が除去される。このことは、電解質６０６についての上記第１の例示的な実施形態において言及された、ＤＮＡヌクレアーゼを添加することによって、実施され得る。この場合もまた、一本鎖ＤＮＡプローブ分子６０６を加水分解するために、以下の基質のいずれかが使用され得る：
・リョクトウ由来のヌクレアーゼ、
・ヌクレアーゼＰ１、
・ヌクレアーゼＳ１、または
・５’→３’エキソヌクレアーゼ活性もしくは
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性
に起因して、一本鎖ＤＮＡを分解し得るＤＮＡポリメラーゼ。
【０１１４】
ヌクレアーゼ処理の後、検出されるべき標識スカベンジャー分子６０６とＤＮＡ分子６０８とのハイブリッドのみが、バイオセンサ上に存在する。この段階は、図６ａに示される。
【０１１５】
この段階において、バイオセンサ６００は、リンス溶液によってリンスされ（図示せず）、すなわち、ハイブリダイズしていないＤＮＡ鎖のフラグメントおよび研究すべき溶液が、除去される。
【０１１６】
次の工程において、別の溶液（図示せず）が、バイオセンサ６００、特に第１電極６０１と接触される。
【０１１７】
上記他の溶液は、酵素６１０を含み、この酵素は、ハイブリダイズしたＤＮＡプローブ分子６０６を標識６０７に結合し、そして別の溶液６１１に添加される、以下に例示した分子を切断し得る。
【０１１８】
この例示的な実施形態に従って使用され得る酵素６１０の例は、以下である：
α−ガラクトシダーゼ、
β−ガラクトシダーゼ、
β−グルコシダーゼ、
α−マンノシダーゼ、
アルカリホスファターゼ、
酸性ホスファターゼ、
オリゴサッカリドデヒドロゲナーゼ
グルコースデヒドロゲナーゼ、
ラッカーゼ、
チロシナーゼ、または、
関連酵素。
【０１１９】
本発明において、酵素６１０は、アビジン結合体の形態で使用される。この理由は、アビジンは、例によって本明細書中で使用されるビオチン標識６０７と、特異的な結合を形成するからである（図６ｂ）。
【０１２０】
ここで、低分子量の酵素は、最も高い変換効率を確実にし得、それによって、酸化還元の循環に作用する酵素として使用される場合、最も高い感受性もまた確実にすることに留意すべきである。
【０１２１】
他の溶液６１１は、分子６１２を含み、この分子は、酵素６１０によって、負電荷を有する第１部分分子６１３と正電荷を有する第２部分分子とに切断され得る（図６ｂを参照のこと）。
【０１２２】
使用され得る、切断可能な分子６１２の例は、特に以下である：
ｐ−アミノフェニルヘキシルピラノシド、
ｐ−アミノフェニルホスフェート、
ｐ−ニトロフェニルヘキソピラノシド、
ｐ−ニトロフェニルホスフェート、または、
以下の適切な誘導体：
ジアミン、
カテコールアミン、
Ｆｅ（ＣＮ）６４−、
フェロセン、
ジカルボン酸、
フェロセンリジン、
オスミウムビピリジル−ＮＨ、もしくは、
ＰＥＧ−フェロセン２。
【０１２３】
この実施形態において、次いで、各場合において、電極６０１、６０２、６０３に電位を印加する。
【０１２４】
第１電位Ｖ（Ｅ１）を、第１電極６０１に印加し、第２電位Ｖ（Ｅ２）を、第２電極６０２に印加し、そして第３電位Ｖ（Ｅ３）を、第３電極６０３に印加する。
【０１２５】
上記のように、先行技術の手順と類似の様式の原理で生じる、実際に測定した位相間で、引く続きこの電位の電位勾配（この電位勾配は、電荷の符号に依存する）を、各場合において、以下のような方法で電極６０１、６０２、６０３に印加する：
Ｖ（Ｅ３）＞Ｖ（Ｅ１）＞Ｖ（Ｅ２）。
【０１２６】
例えば、第３電極６０３が正電位Ｖ（Ｅ３）を有する場合、この第３電極６０３は、バイオセンサ６００の電極６０１、６０２、６０３のうちで最も高い電位を有する。
【０１２７】
これは、負電荷を有する第１部分分子６１３が、正に荷電された第３電極６０３に付着して生じ、先行技術に従った場合、もはや第１電極６０１には付着しない（これは、第３電極６０３に印加されたこの最も高い電位Ｖ（Ｅ３）に起因する）ことに起因する。
【０１２８】
結果的に、この第１電極６０１は、プローブ分子を保持するために電極を保持する場合にも、特定の部分分子を酸化または還元するために電極を測定する場合にも、この例示的な実施形態においてもはや使用されない。むしろ電極６０１は、このプローブ分子またはプローブ分子の複合体および高分子バイオポリマーを固定化して、検出するためのみに作用する。
【０１２９】
ここで、第３電極６０３は、生成した部分分子の酸化または還元を起こす電極の機能を担う。
【０１３０】
このことは、例示によって、第１電極６０１は、第３電極６０３によって、切断された部分分子から保護されることを意味する。
【０１３１】
この方法において、およびこの実施形態の別の利点として、ＤＮＡプローブ分子６０６での第１電極の被覆は、かなり増加され得る。
【０１３２】
負に荷電された部分分子６１３は、第３電極６０３にて酸化され、そしてこの酸化された第１部分分子６１４は、第２電極６０２に付着される。なぜなら、後者が、バイオセンサ６００の全ての電極６０１、６０２、６０３のうちで最も低い電位Ｖ（Ｅ２）を有するからである。
【０１３３】
この酸化された部分分子は、第２電極６０２にて還元され、そしてこの還元された部分分子６１５は、次いで、第３電極６０３に付着され、ここで、これらは再度酸化される。
【０１３４】
この方法において、先行技術で既知の様式と類似して、本発明は、既知の様式で同様に検出される回路電流を生じる。従って、ここで得られる信号はまた、この回路電流の時間経過でもある。このことから、次いで、（標識６０７を介して結合した酵素６１０によって）ハイブリダイズしたＤＮＡ鎖６０６の数、従って検出されるべきＤＮＡ分子６０８の数を算出することが可能であり、これは、酵素６１０によって生成される荷電キャリアの数に比例する回路電流に起因する。
【０１３５】
しかしながら、ここで、本発明に従うこの酸化還元の循環方法はまた、図４に従う既知の「２−電極配置」を使用しても行われ得ることに留意すべきである。しかしながら、この場合において、固定化電極としての電極６０１の配置に起因して、先行技術による既知の配置よりも高い被覆密度を可能にする、本明細書中に記載されるバイオセンサ６００の利点を使用することは不可能である。
【０１３６】
以下の刊行物は、本明細書中で引用される：
［１］  Ｒ．Ｈｉｎｔｓｃｈｅら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ  Ｍａｄｅ  ｉｎ  Ｓｉ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｉｃｓ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ、Ｆ．Ｗ．Ｓｃｈｅｌｌｅｒら編、Ｄｉｒｋ  Ｈａｕｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂａｓｅｌ，２６７−２８３頁，１９９７
［２］  Ｒ．Ｈｉｎｔｓｃｈｅら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ  ｍａｄｅ  ｉｎ  Ｓｉ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｉｃｓ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ、Ｆ．Ｗ．Ｓｃｈｅｌｌｅｒら編、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｃｈｗｅｉｚ，１９９７
［３］  Ｍ．Ｐａｅｓｃｈｋｅら、Ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｉｃ  Ｍｕｌｔｉｃｈａｎｎｅｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  Ａｒｒａｙｓ，Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ、第７巻、第１号、１−８頁、１９９６
［４］  Ｐ．ｖａｎ  Ｇｅｒｗｅｎ，Ｎａｎｏｓｃａｌｅｄ  Ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  Ａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｅｎｓｏｒｓ，ＩＥＥＥ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｓｏｌｉｄ−Ｓｔａｔｅ  Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ，Ｃｈｉｃａｇｏ、９０７−９１０頁、１９９７年６月１６日−１９日
［５］  Ｎ．Ｌ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｂ．Ｃ．Ｌａｇｅｒｈｏｌｍ，Ｔｏｔａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第８巻、５８−６４頁、１９９７Ｐ．
［６］  Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ，Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第３６巻，２９−８９頁，１９７２
［７］  Ｒｏｍｐｐ−Ｌｅｘｉｋｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ，Ｇｅｎｔｅｃｈｎｉｋ，２８０頁，１９９９  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，第２版。
［８］  Ｒｏｍｐｐ−Ｌｅｘｉｋｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ，Ｇｅｎｔｅｃｈｎｉｋ，３９７頁，１９９９  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，第２版。
［９］  Ｊ．Ｄｏｄｔら、Ｓｃｒｉｐｔ  ｆｏｒ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｃｏｕｒｓｅ  ＩＩｄ（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），ＥＬＩＳＡ，ｐ．１，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｆｕｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ，Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ  Ｈｏｃｈｓｃｈｕｌｅ  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，１９９２年２月１０日−２８日。
［１０］  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，１５７−１６０頁，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ，１９９６
［１１］  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，８３−８４頁，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ，１９９６
［１２］  Ｊ．Ｐ．Ｓｐａｔｚら、Ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ａ  Ｂｌｏｃｋ  Ｇｏｌｄ  Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  Ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎ，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，第２巻，１５５２−１５５５頁，１９９６
［１３］  Ｊ．Ｐ．Ｓｐａｔｚら、Ｏｒｄｅｒｅｄ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｆｒｏｍ  Ｍｉｃｅｌｌａｒ  Ｂｌｏｃｋ  Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  Ｆｉｌｍｓ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第１６巻，４０７−４１５頁，２０００
［１４］  Ｆ．Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒら、Ｍｉｔ  Ｋａｐｉｌｌａｒｋｒａｆｔｅｎ  ｚｕ  Ｎａｎｏｓｔｒｕｋｔｕｒｅｎ，Ｐｈｙｓｉｋａｌｉｓｃｈｅ  Ｂｌａｔｔｅｒ，第３６巻，４９−５１頁，２０００
［１５］  ＤＥ  １９９  ２５  ４０２  Ａ１
［１６］  Ｍｅｄｌｉｎｅ  Ａｂｓｔｒａｃｔ，Ｋｉｔａｚａｗａ，Ｓらに対する、ＤＮ  ９９１２８０６８。Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ−ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅ  ａｎｄ  Ｓｌ  ｎｕｃｌｅａｓｅ；Ｈｉｓｔｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１１（１），７−１２頁，１９９９
［１７］  ＵＳ  ６，０１７，６９６
［１８］  ＤＥ  １９７  ４１  ７１６  Ａ１
本発明の例示的実施形態は、以下に詳細に例示され、図面に記載される。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】図１ａ〜１ｃは、例示される本発明の例示的実施形態に従う方法に基づいて異なる方法段階におけるバイオセンサを示す。
【図２】図２ａおよび２ｂは、２つの平坦電極の略図を示す。これらの電極は、電解質（図２ａ）または電解質が存在しないもの（図２ｂ）において検出されるＤＮＡ鎖の存在を検出するために使用され得る。
【図３】図３ａ〜３ｆは、本明細書中に記載される方法の別の実施形態を行うために使用され得るバイオセンサを示す。
【図４】図４ａ〜４ｃは、先行技術に従うバイオセンサの略図であり、先行技術に基づいて、酸化還元再循環プロセスの一部として個々の状態が説明される。
【図５】図５は、酸化還元再循環プロセスの一部として、先行技術に従う回路電流の関数曲線を示す。
【図６】図６ａおよび６ｂは、この方法のさらなる実施形態として、酸化還元再循環プロセスを行うために使用され得るバイオセンサを示す。
【符号の説明】
【０１３８】
１００  バイオセンサ
１０１  フォトダイオード
１０２  フォトダイオード
１０３  絶縁体
１０４  電気的端子
１０５  電気的端子
１０６  酸化物層
１０７  固定化のためのユニット
１０８  固定化のためのユニット
１０９  ＤＮＡプローブ分子
１１０  ＤＮＡプローブ分子
１１１  標識
１１２  標識
１１３  電解質
１１４  ＤＮＡ鎖
１１５  矢印
１１６  矢印
２００  センサ
２０１  電極
２０２  電極
２０３  絶縁体
２０４  電極端子
２０５  電極端子
２０６  ＤＮＡプローブ分子
２０７  電解質
２０８  ＤＮＡ鎖
３００  バイオセンサ
３０１  フォトダイオード
３０２  フォトダイオード
３０３  絶縁体
３０４  酸化物層
３０５  高分子バイオポリマーを固定するのに適切ではない材料の層
３０６  固定化のためのナノ粒子様ユニット
３０７  ＤＮＡスカベンジャー分子
４００  バイオセンサ
４０１  第１電極
４０２  第２電極
４０３  絶縁体層
４０４  第１電極の保持領域
４０５  ＤＮＡプローブ分子
４０６  電解質
４０７  ＤＮＡ鎖
４０８  酵素
４０９  切断可能分子
４１０  負に荷電された第１部分分子
４１１  矢印
４１２  他の溶液
４１３  酸化された第１部分分子
４１４  還元された第１部分分子
５００  図
５０１  電流
５０２  時間
５０３  電流  対  時間の過程
５０４  この電流のオフセットなプロフィール
６００  バイオセンサ
６０１  第１電極
６０２  第２電極
６０３  第３電極
６０４  絶縁体層
６０５  保持領域
６０６  ＤＮＡプローブ分子
６０７  標識
６０８  ＤＮＡ鎖
６０９  電解質
６１０  酵素
６１１  他の溶液
６１２  切断可能な分子
６１３  負に荷電された第１部分分子
６１４  酸化された第１部分分子
６１５  還元された第１部分分子
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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