(57)【要約】部分的にフェリチン重鎖遺伝子座に基づいた、高発現遺伝子座ベクターが開示される。そのベクターは、フェリチン重鎖遺伝子座から誘導される遠位５’隣接配列および／または近位５’調節配列を含む。そのベクターは、異種配列の挿入のための部位、ならびに、近位３’調節配列および遠位３’隣接配列を含む。近位３’調節配列および遠位３’隣接配列は、必要に応じて、フェリチン重鎖遺伝子座から誘導される。ベクターで形質転換された細胞、およびベクターによってコードされた異種タンパク質を産生する方法もまた、開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞内での所望のタンパク質の、安定なトランスフェクションおよび発現のための遺伝子ベクターであって、以下（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）真核生物遺伝子座の遠位５’隣接配列；
（ｂ）真核生物遺伝子座の近位５’調節配列；
（ｃ）第一の異種コード配列に対する、少なくとも第一の挿入部位；および
（ｄ）真核生物遺伝子座の転写終結に対して効果的な、近位３’調節配列；
を含み、
ここで該配列は、隣接する配列の間に必要に応じてリンカー配列を用いて、５’から３’の配向で（ａ）〜（ｄ）の順番に作動可能に連結され；そして
（１）該遠位５’隣接配列が、フェリチン重鎖遺伝子座の転写開始部位の２０塩基対５’側の位置と１００，０００塩基対５’側の位置との間に見出されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、少なくとも１００塩基の配列を含むか；または
（２）該近位５’調節配列が、フェリチン重鎖遺伝子座の翻訳開始コドンの１塩基対５’側の位置と１０，０００塩基対５’側の位置との間に見出されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、少なくとも２０塩基の配列を含む、
遺伝子ベクター。
【請求項２】
真核細胞内での所望のタンパク質の、安定なトランスフェクションおよび発現のための遺伝子ベクターであって、以下（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）真核生物遺伝子座の遠位５’隣接配列；
（ｂ）真核生物遺伝子座の近位５’調節配列；
（ｃ）該所望のタンパク質をコードする、少なくとも第一の異種コード配列；および
（ｄ）真核生物遺伝子座の転写終結に対して効果的な、近位３’調節配列；
を含み、
ここで該配列は、隣接する配列の間に必要に応じてリンカー配列を用いて、５’から３’の配向で（ａ）〜（ｄ）の順番に作動可能に連結され；そして
（１）該遠位５’隣接配列が、フェリチン重鎖遺伝子座の転写開始部位の２０塩基対５’側の位置と１００，０００塩基対５’側の位置との間に見出されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、少なくとも１００塩基の配列を含むか；または
（２）該近位５’調節配列が、フェリチン重鎖遺伝子座の翻訳開始コドンの１塩基対５’側の位置と１０，０００塩基対５’側の位置との間に見出されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、少なくとも２０塩基の配列を含む、
遺伝子ベクター。
【請求項３】
前記遠位５’隣接配列がフェリチン重鎖遺伝子座から誘導される、請求項１〜２のいずれか一項に記載の遺伝子ベクター。
【請求項４】
前記近位５’調節配列がフェリチン重鎖遺伝子座から誘導される、請求項１〜２のいずれか一項に記載の遺伝子ベクター。
【請求項５】
前記近位５’調節配列および前記遠位５’隣接配列がフェリチン重鎖遺伝子座から誘導される、請求項１〜２のいずれか一項に記載の遺伝子ベクター。
【請求項６】
前記近位３’調節配列がフェリチン重鎖遺伝子座から誘導される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の遺伝子ベクター。
【請求項７】
フェリチン重鎖遺伝子座の遠位３’隣接配列をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の遺伝子ベクター。
【請求項８】
異種配列に対する前記挿入部位が、少なくとも一つの制限エンドヌクレアーゼ部位を含む、請求項１および３〜７のいずれか一項に記載の遺伝子ベクター。
【請求項９】
異種配列に対する前記挿入部位が、少なくとも二つの制限エンドヌクレアーゼ部位を含むポリリンカー部位である、請求項８に記載の遺伝子ベクター。
【請求項１０】
前記近位５’調節配列が、真核生物イントロン配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の遺伝子ベクター。
【請求項１１】
前記真核生物イントロン配列が、フェリチン重鎖遺伝子のイントロン１から誘導される、請求項１０に記載の遺伝子ベクター。
【請求項１２】
前記近位５’調節配列が、非翻訳エキソン配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の遺伝子ベクター。
【請求項１３】
前記遠位５’隣接配列および前記近位５’調節配列が、１，０００塩基と１０，０００塩基との間の全長を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子ベクター。
【請求項１４】
前記近位３’調節配列および任意の遠位３’隣接配列が、１，０００塩基と１０，０００塩基との間の全長を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子ベクター。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のベクターでトランスフェクトされた、真核細胞。
【請求項１６】
請求項１５に記載の真核細胞であって、前記ベクターが該細胞の染色体の中へ安定に組み込まれた、真核細胞。
【請求項１７】
請求項１５〜１６のいずれか一項に記載の真核細胞であって、前記第一コード配列が該細胞で発現される、真核細胞。
【請求項１８】
真核細胞であって、以下（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）真核生物遺伝子座の遠位５’隣接配列；
（ｂ）真核生物遺伝子座の近位５’調節配列；
（ｃ）少なくとも第一のコード配列；および
（ｄ）真核生物遺伝子座の転写終結に対して効果的な、近位３’調節配列；
を含み、
ここで該配列は、隣接する配列の間に必要に応じてリンカー配列を用いて、５’から３’の配向で（ａ）〜（ｄ）の順番に作動可能に連結され；そして
（１）該遠位５’隣接配列が、フェリチン重鎖遺伝子座の転写開始部位の２０塩基対５’側の位置と１００，０００塩基対５’側の位置との間に見出されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、少なくとも１００塩基の外因性配列を含むか；または
（２）該近位５’調節配列が、フェリチン重鎖遺伝子座の翻訳開始コドンの１塩基対５’側の位置と１０，０００塩基対５’側の位置との間に見出されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、少なくとも２０塩基の外因性配列を含む、
真核細胞。
【請求項１９】
真核細胞であって：
コード配列へ作動可能に連結されるフェリチン重鎖遺伝子座から誘導される外因性５’遠位隣接配列を含む、
真核細胞。
【請求項２０】
真核細胞中で所望のタンパク質を産生する方法であって、以下：
（ａ）請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の少なくとも一つの細胞、またはそれらの子孫を提供する工程；
（ｂ）該所望のタンパク質の高発現を可能にする条件下、培養物中で該細胞を維持する工程；および
（ｃ）該培養物から該所望のタンパク質を単離する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（技術分野）
本発明は、分子生物学の分野に関し、特に、形質転換細胞中での異種遺伝子配列の発現のためのベクターの開発および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の説明）
代表的な発現ベクターは、目的の遺伝子を駆動するプロモーター、および成熟転写物を生成するポリアデニル化シグナルを含む。プロモーター配列は、長さがほんの数百塩基対である傾向があり、および、一過性トランスフェクションによって決定されるような最適発現のための調節領域を、全部ではなかったとしても、大部分含む。しかし、これらの配列を含む発現構築物は、一過性トランスフェクションにおいて高機能であるが、安定なトランスフェクタントとして染色体の中へ組み込まれるときに、同様のレベルの発現を常に与えることができるわけではない。これは位置依存性発現のためであり、これは、発現のレベルに関して組み込み部位が、通常は負である優性な効果を有する現象である（Ｗｉｌｓｏｎ（１９９０），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６：６７９−７１４）。位置依存性発現の結果は、トランスフェクションスクリーニングの結果において明白であり、このトランスフェクションスクリーニングの中で、大部分の細胞株は産物をほとんど産生しないか、または産生しない。従って、単一の高発現クローンを同定するために、多くのトランスフェクタントをスクリーニングすることが、通常必要である。広範なスクリーニングの後でさえも、標準発現ベクターを用いて得られるトランスフェクタントは、代表的に、商業的力価目標を満たすには十分でない発現レベルを有する。
【０００３】
ＤＨＦＲ増幅の時間がかかり、かつ労働集約的なプロセスが、安定なトランスフェクタントにおいて発現レベルを増加させるために頻繁に用いられる。例えば、標準発現構築物の組込みコピーは、代表的に、（二つの対立遺伝子のみから）同様な強度のプロモーターを有する内因性遺伝子の発現のレベルに近づくために、１００コピーより大きい増幅を必要とする。標準発現ベクターと内因性遺伝子との間の相違は、プロモーターに対して５’側の配列の存在および／または内因性遺伝子のポリアデニル化シグナルに対して３’側の配列の存在による可能性が最も高く、このポリアデニル化シグナルは、発現に対してより好ましいクロマチン立体配置を与え得る。組み込み部位に拘わらず、好ましい位置依存性クロマチン立体配置を与え得る配列を含む発現構築物は、異種遺伝子を高度に発現する細胞株を生成することに対して、有利である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、フェリチン重鎖遺伝子由来の高発現「遺伝子座ベクター」の開発に部分的に依存する。「遺伝子座ベクター」の概念は、天然のクロマチンの状況において高度に発現される遺伝子に対して５’側および３’側に見出される領域が、異種遺伝子に対してより高度なレベルの発現を与え得るという観察に基づく。従って、本発明は、５’配列および３’配列を含むフェリチン重鎖遺伝子座ベクターを提供し、その５’配列および３’配列は、安定なトランスフェクタント中で、異種遺伝子へ高レベルの発現をもたらし得る。従って、本発明は、真核細胞内での所望のタンパク質の、安定なトランスフェクションおよび高レベルでの発現のための遺伝子ベクターを提供する。
【０００５】
一つの局面において、本発明は、真核細胞内での所望のタンパク質の、安定なトランスフェクションおよび発現のための遺伝子ベクターを提供し、その真核細胞は、（ａ）真核生物遺伝子座の遠位５’隣接配列；（ｂ）真核生物遺伝子座の近位５’調節配列；（ｃ）異種配列に対する少なくとも第一の挿入部位；および（ｄ）真核生物遺伝子座の転写終結に対して効果的な、近位３’調節配列；を含み、ここでこれらの配列は、隣接する配列の間に必要に応じてリンカー配列を用いて、５’から３’の配向で（ａ）〜（ｄ）の順番に作動可能に連結されており；そしてここで、（１）遠位５’隣接配列が、フェリチン重鎖遺伝子座の転写開始部位の２０塩基対５’側の位置と１００，０００塩基対５’側の位置との間に見出されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、少なくとも１００塩基の配列を含み；および／または、（２）近位５’調節配列が、フェリチン重鎖遺伝子座の翻訳開始コドンの１塩基対５’側の位置と１０，０００塩基対５’側の位置との間に見出されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、少なくとも２０塩基の配列を含む。
【０００６】
別の局面において、ベクターは、所望のタンパク質をコードする少なくとも第一の異種コード配列を含む。従って、本発明は、真核細胞内での所望のタンパク質の、安定なトランスフェクションおよび発現のための遺伝子ベクターを提供し、そのベクターは、（ａ）真核生物遺伝子座の遠位５’隣接配列；（ｂ）真核生物遺伝子座の近位５’調節配列；（ｃ）上記所望のタンパク質をコードする、少なくとも第一の異種コード配列；および（ｄ）真核生物遺伝子座の転写終結に対して効果的な、近位３’調節配列；を含み、ここでこれらの配列は、隣接する配列の間に必要に応じてリンカー配列を用いて、５’から３’の配向で（ａ）〜（ｄ）の順番に作動可能に連結されており；そしてここで、（１）遠位５’隣接配列が、フェリチン重鎖遺伝子座の転写開始部位の２０塩基対５’側の位置と１００，０００塩基対５’側の位置との間に見出されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、少なくとも１００塩基の配列を含み；および／または（２）近位５’調節配列が、フェリチン重鎖遺伝子座の翻訳開始コドンの１塩基対５’側の位置と１０，０００塩基対５’側の位置との間に見出されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、少なくとも２０塩基の配列を含む。
【０００７】
いくつかの実施形態において、遠位５’隣接配列は、フェリチン重鎖遺伝子座から誘導される。他の実施形態において、近位５’調節配列は、フェリチン重鎖遺伝子座から誘導される。さらに他の実施形態において、近位５’調節配列および遠位５’隣接配列の両方が、フェリチン重鎖遺伝子座から誘導される。
【０００８】
いくつかの実施形態において、近位３’調節配列は、フェリチン重鎖遺伝子座から誘導され、そしていくつかの実施形態において、ベクターは、フェリチン重鎖遺伝子座の遠位３’隣接配列をさらに含む。
【０００９】
本発明のある実施形態において、異種配列に対する挿入部位は、少なくとも一つの制限エンドヌクレアーゼ部位を含み、そして他の実施形態において、異種配列に対する挿入部位は、少なくとも二つの制限エンドヌクレアーゼ部位を含むポリリンカー部位である。
【００１０】
本発明のある実施形態において、近位５’調節配列は、真核生物イントロン配列を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、真核生物イントロン配列は、フェリチン重鎖遺伝子のイントロン１から誘導される。ある実施形態において、近位５’調節配列が、非翻訳エキソン配列を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、遠位５’隣接配列および近位５’調節配列は、１，０００塩基と１０，０００塩基との間の全長を有する。同様に、いくつかの実施形態において、近位３’調節配列および任意の遠位３’隣接配列は、１，０００塩基と１０，０００塩基との間の全長を有する。
【００１２】
別の局面において、本発明は、本発明の任意のベクターでトランスフェクトされた真核細胞を提供する。いくつかの実施形態において、このベクターは、上記細胞の染色体の中へ安定に組み込まれ、そしていくつかの実施形態において、第一の異種コード配列が、上記細胞中で発現される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本発明は、真核細胞を提供し、その真核細胞は、（ａ）真核生物遺伝子座の遠位５’隣接配列；（ｂ）真核生物遺伝子座の近位５’調節配列；（ｃ）少なくとも第一のコード配列；および（ｄ）真核生物遺伝子座の転写終結に対して効果的な、近位３’調節配列；を含み、ここでこれらの配列は、隣接する配列の間に必要に応じてリンカー配列を用いて、５’から３’の配向で（ａ）〜（ｄ）の順番に作動可能に連結されており；そして（１）遠位５’隣接配列は、フェリチン重鎖遺伝子座の転写開始部位の２０塩基対５’側の位置と１００，０００塩基対５’側の位置との間に見出されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、少なくとも１００塩基の外因性配列を含み；そして／または（２）近位５’調節配列は、フェリチン重鎖遺伝子座の翻訳開始コドンの１塩基対５’側の位置と１０，０００塩基対５’側の位置との間に見出されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、少なくとも２０塩基の外因性配列を含む。
【００１４】
別の局面において、本発明は、コード配列へ作動可能に連結されたフェリチン重鎖遺伝子座から誘導される外因性５’遠位隣接配列を含む真核細胞を提供する。
【００１５】
別の局面において、本発明は、真核細胞中で所望のタンパク質を産生する方法を提供し、この方法は、以下の工程：（ａ）本発明の少なくとも一つの細胞またはそれらの子孫を提供する工程；（ｂ）所望のタンパク質の高発現を可能にする条件下、培養物中で細胞を維持する工程；および（ｃ）培養物から所望のタンパク質を単離する工程、を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明のこれらおよび他の局面および利点は、続いての詳細な説明および実施例より、当業者にとって明白である。
【００１７】
以下の図面は本発明の実施形態の説明であり、特許請求の範囲によって包含されるような本発明の範囲を限定する意図はない。
【００１８】
（詳細な説明）
参照される本発明がなされた時点の当業者にとって入手可能であった特許刊行物、科学的刊行物および医学的刊行物を、本明細書中で確立された知識という。発行米国特許、公開されたおよび係属中の特許出願の全ての開示、および本明細書中で引用する他の参考文献は、本明細書中で参考として援用される。
【００１９】
（定義）
本明細書中で使用される全ての専門用語および科学用語は、以下で別に定義されない限り、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有することが意図され；本明細書中で使用される技術に対する参考文献は、当該分野で一般的に理解されるような技術を言及することが意図され、その技術は、当業者にとって明白である技術または均等な技術の置換に関するバリエーションを含む。本発明である主題をより明確に、かつより簡潔に記載するために、以下の定義が、明細書中および添付される特許請求の範囲の中で用いられるある用語に対し、提供される。
【００２０】
（真核生物遺伝子座）本明細書中で使用される場合、用語「真核生物遺伝子座」とは、適切な条件下において細胞中で発現され得るポリペプチドまたはＲＮＡ産物をコードする、真核細胞の任意の染色体遺伝子座をいう。ミトコンドリア遺伝子座は、本明細書中で使用される場合の用語「真核生物遺伝子座」の範囲から明白に排除される。
【００２１】
（遠位５’隣接配列）本明細書中で使用される場合、用語「遠位５’隣接配列」とは、遺伝子の近位５’調節配列の５’側にある隣接ヌクレオチド配列をいう。従って、クロマチン構造に対するそれらの効果のために、これらの配列は転写速度に関して効果を有し得るが、これらの配列は、概して、基本調節配列（例えば、オペレーター、プロモーター、リボソーム結合部位）の５’側の位置であり、近位５’調節配列よりも転写開始部位からさらに除去される。遠位５’隣接配列のサイズは、１００〜１００，０００塩基の間の範囲に及び得る。ある実施形態において、遠位５’隣接配列は、５００〜５０，０００塩基の間、７５０〜２５，０００塩基の間、または１，０００〜１０，０００塩基の間の塩基を含む。遠位５’隣接配列は、近位５’調節配列の５’側の任意の位置で始まり得、代表的には、転写開始部位の２０塩基５’側の位置、５０塩基５’側の位置、７５塩基５’側の位置、１００塩基５’側の位置、５００塩基５’側の位置、１，０００塩基５’側の位置、５，０００塩基５’側の位置、または１０，０００塩基５’側の位置で始まり得る。遠位５’隣接配列は、遺伝子のプロモーターおよび転写開始配列の実質的な距離の５’側の位置に広がり得、代表的には、転写開始部位の１００，０００塩基５’側の位置、５０，０００塩基５’側の位置、２５，０００塩基５’側の位置、または１０，０００塩基５’側の位置で終わる。
【００２２】
（近位５’調節配列）本明細書中で使用される場合、用語「近位５’調節配列」とは、遺伝子の５’末端近くに位置し、かつ、転写および翻訳に必要な基本調節エレメント（すなわち、プロモーター、および存在すれば、オペレーターおよびリボソーム結合配列）を含むヌクレオチド配列をいう。近位５’調節配列のサイズは、２０〜１０，０００塩基の間の範囲に及び得る。ある実施形態において、近位５’調節配列は、５０〜５，０００塩基の間、７５〜１，０００塩基の間、または１００〜５００塩基の間の塩基を含む。いくつかの実施形態において、近位５’調節配列の３’末端は、翻訳開始のすぐ近くの５’側の位置、またはコード領域の「開始」コドンのすぐ近くの５’側の位置として、定義され得る。あるいは、いくつかの実施形態において、近位５’調節配列は、イントロン配列を含め、遺伝子の内部の配列を含み得、従って、近位５’調節配列の３’末端は、イントロン配列まで広がり得る。さらに、いくつかの実施形態において、近位５’調節配列は、いくつかの５’コード配列（例えば、開始コドン、および／または短いＮ末端配列）を含み得る。近位５’調節配列は、転写開始部位の５’側に広がり、そして、転写開始部位の１０，０００塩基５’側の位置、５，０００塩基５’側の位置、１，０００塩基５’側の位置、５００塩基５’側の位置、１００塩基５’側の位置、７５塩基５’側の位置、５０塩基５’側の位置または２０塩基５’側の位置で終わり得る。
【００２３】
（近位３’調節配列）本明細書中で使用される場合、用語「近位３’調節配列」とは、遺伝子の３’末端近くに位置し、かつ、適切なｍＲＮＡプロセシングおよび翻訳終結にとって必要な基本調節エレメント（すなわち、翻訳終結コドン、ポリアデニル化シグナル、および転写ターミネーター）を含むヌクレオチド配列をいう。近位３’調節配列のサイズは、１０〜２，０００塩基の間の範囲に及び得る。ある実施形態において、近位３’調節配列は、２５〜１，０００塩基の間、５０〜７５０塩基の間、または７５〜５００塩基の間の塩基を含む。近位３’調節配列の５’末端は、翻訳終結コドンまたは「終止」コドン（すなわち、ＴＡＧ、ＴＴＡ、またはＴＧＡ）によって定義され得る。近位３’調節配列は、翻訳終結コドンの３’側に広がり、翻訳終結コドンの２，０００塩基３’側の位置、１，０００塩基３’側の位置、７５０塩基３’側の位置、または５００塩基３’側の位置で終わり得る。
【００２４】
（遠位３’隣接配列）本明細書中で使用される場合、用語「遠位３’隣接配列」とは、遺伝子の近位３’調節配列の３’側にある隣接ヌクレオチド配列をいう。従って、これらの配列は、適切なｍＲＮＡプロセシングおよび翻訳終結にとって必要な基本調節配列（すなわち、終止コドン、およびポリアデニル化シグナル）の３’側にあり、近位３’調節配列よりも転写終結部位からさらに消去されている。遠位３’隣接配列のサイズは、１００〜１００，０００塩基の間の範囲に及び得る。ある実施形態において、遠位３’隣接配列は、５００〜５０，０００塩基の間、７５０〜２５，０００塩基の間、または１，０００〜１０，０００塩基の間の塩基を含む。遠位３’隣接配列は、近位３’調節配列の３’側の任意の位置で始まり得、代表的には、翻訳終結コドンの５００塩基３’側の位置、７５０塩基３’側の位置、１，０００塩基３’側の位置、または２，０００塩基３’側の位置で始まり得る。遠位３’隣接配列は、遺伝子の転写終結コドンおよびポリアデニル化配列の実質的な距離３’側に広がり得、代表的には、転写終結コドンの１００，０００塩基３’側の位置、５０，０００塩基３’側の位置、２５，０００塩基３’側の位置、または１０，０００塩基３’側の位置で終わり得る。
【００２５】
（ベクター）本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」とは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオン等のような任意の遺伝子構築物であって、細胞間にて核酸を転移させ得る遺伝子構築物を意味する。ベクターは、複製、発現、組換え、挿入、または組込みのうちの一以上を可能にし得るが、これらの特性のそれぞれを保持する必要はない。従って、この用語は、クローニングベクターおよび発現ベクターを包含する。
【００２６】
（トランスフェクション）本明細書中で使用される場合、用語「トランスフェクション」とは、細胞の中、または生物体の中へのベクターの導入であって、そのベクターが、その細胞もしくは生物体のゲノムの中へ組み込むことの有り無しに関わらず、その細胞もしくは生物体の中で複製するか、またはその細胞もしくは生物体でポリペプチド配列を発現する、導入を意味する。用語「トランスフェクション」は、このようなベクターを導入する種々の方法の全てを包含するために使用され、この方法として、トランスフェクション、形質転換、形質導入、または遺伝子転移として当該分野で言及される方法が挙げられるがこれらに限定はされず、そして技術（例えば、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介エンドサイトーシス、リン酸カルシウム共沈、電気穿孔法、リポソーム媒介トランスフェクション、バリスティック（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）注入、ウイルス媒介トランスフェクション等）が挙げられる。トランスフェクションを受けた細胞または生物体は、本明細書中で「トランスフェクタント」といわれる。
【００２７】
（安定なトランスフェクション）本明細書中で使用される場合、用語「安定なトランスフェクション」は、トランスフェクトされる細胞または生物体のゲノムの中への、ベクターの全てまたは一部の組込みをもたらす、上で定義されるようなトランスフェクションを意味する。安定なトランスフェクションを受けた細胞または生物体は、本明細書中で「安定なトランスフェクタント」といわれる。
【００２８】
（作動可能に連結される）本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に連結される」とは、遺伝子調節エレメントおよび遺伝子コード領域の、共有結合的かつ機能的結合であって、ＲＮＡポリメラーゼによってコード領域がｍＲＮＡへと転写されることを引き起こし得、この調節エレメントのうちの一以上へ結合し得る、結合をいう。従って、ＲＮＡポリメラーゼが許容条件の下、調節領域の中のプロモーターに結合すること、およびコード領域のｍＲＮＡへの転写を引き起こすことが可能であるとき、調節エレメントを含め、調節領域は、コード領域へ作動可能に連結されている。この状況において、許容条件は、構成的プロモーターに対する標準的な細胞内条件、抑制／誘導プロモーターに対する標準条件およびリプレッサーの欠如またはインデューサーの存在、ならびにインビトロ転写系として当該分野で公知のような適切なインビトロ条件が挙げられる。
【００２９】
（異種）本明細書中で使用される場合、用語「異種」は、二つ以上の遺伝子配列に関して、これらの遺伝子配列が、天然では作動可能に連結されていないか、または天然では同じゲノムの中に自然に発生しないことを意味する。例えば、ベクターが一以上の調節エレメントへ作動可能に連結されているコード領域を含む場合、それらが天然で作動可能に連結されていないか、またはそれらが天然で同じゲノムに見出されなければ、これらの配列は互いに異種と考えられる。
【００３０】
（ヌクレオチド位置）本明細書中で使用される場合、全てのヌクレオチド位置は、「センス」配向にあるフェリチン重鎖遺伝子領域のエレメントを含むＤＮＡ鎖に関して指定される。状況から明白なように、数値的なヌクレオチド位置は、フェリチン重鎖遺伝子の開始コドンの位置に関してか、または配列表に含まれる配列のうちの一つの位置に関してか、いずれかで指定される。前者の場合では、開始コドン（ＡＴＧ）のアデノシンまたは「Ａ」は、１位として指定され、先行する位置は負に数えられる。後者の場合では、関連する配列番号が常に特定される。相対的なヌクレオチド位置は、センス鎖上の従来の５’および３’方向に関して記載される。
【００３１】
（ヌクレオチド配列同一性の百分率）本明細書中で使用される場合、二つのヌクレオチド配列間の配列同一性の百分率は、二つの配列の中のより小さい方に存在するヌクレオチドの数によって除算した、整列配列の間で同一である、残基の数に基づいて計算される。同一性百分率の計算の前に、デフォールト値でＣｌｕｓｔａｌＷプログラムのアルゴリズム（または均等なアルゴリズム）を用いて配列が整列される。ＣｌｕｓｔａｌＷは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＥＭＢＬ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）を通して入手可能であり、そして、Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９９４），「ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ：Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，  ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｈｏｉｃｅ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０に記載される。
【００３２】
（誘導される）本明細書中で使用される場合、用語「誘導される」は、ヌクレオチド配列の起源に関して使用されるとき、参照配列において限定された数の挿入、欠失または置換を行うことによって、参照配列から、直接的または間接的に、その配列が得られたかもしくは産生されたか、または、得られ得るかもしくは産生され得ることを意味する。従って、例えば、参照配列のサブセットである配列は、隣接配列を欠失することによって、参照配列から誘導され得る。同様に、参照配列における一以上のヌクレオチドの挿入、欠失および／または置換の組み合わせによって、配列は参照配列から誘導され得る。挿入、欠失および置換の数は、参照配列と誘導される配列との間の必要とされた同一性百分率によって限定され得る。
【００３３】
（数値範囲）本明細書中で使用される場合、変数に関する数値範囲の記載は、その範囲の中での任意の値と均等の変数を用いて本発明が実施され得ることを意味することを意図する。従って、本質的に不連続な変数に対し、この変数は、数値範囲の各整数値と等しくなり得、これは、その範囲の終点を含む。同様に、本質的に連続的である変数に関し、この変数は、数値範囲の各実際の値と等しくなり得、これは、その範囲の終点を含む。例として、０と２との間の値を有すると記載される変数は、本質的に不連続な変数に関しては０、１または２であり得、そして本質的に連続的な変数に関しては０．０、０．１、０．０１、０．００１、または任意の他の２以下の実際の値であり得る。
【００３４】
（または（もしくは））本明細書中で使用される場合、他で特に示されない限り、接続詞「または（もしくは）」は、「および／または」の「包括的な」意味で使用され、「いずれか／または」の「排他的な」意味で使用されない。
【００３５】
（一般的考察）
本発明は、部分的に、フェリチン重鎖遺伝子から誘導される高発現「遺伝子座ベクター」の開発に依存する。「遺伝子座ベクター」の概念は、天然のクロマチンの状況において高度に発現される遺伝子に対して５’側に見出される領域および３’側に見出される領域が、異種遺伝子に対してより高度なレベルの発現を与え得るという観察に基づく。従って、本発明は、５’配列および３’配列を含むフェリチン重鎖遺伝子座ベクターを提供し、その５’配列および３’配列は、安定なトランスフェクタント中で、異種遺伝子へ高レベルの発現をもたらし得る。従って、本発明は、真核細胞内での所望のタンパク質の、安定なトランスフェクションおよび高レベルでの発現のための遺伝子ベクターを提供する。
【００３６】
（フェリチン重鎖遺伝子）
ラットおよびヒトのゲノムは、フェリチン重鎖遺伝子の複数のプロセシングされた化シュード遺伝子を含む（Ｈｅｎｔｚｅら（１９８６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７２２６−７２３０７）。ラットフェリチン遺伝子は、三つのイントロン（すなわち、イントロン１〜イントロン３）により隔てられる四つのエキソン（すなわち、エキソン１〜エキソン４）から構成される。ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１８０５１、Ｍ１８０５２およびＭ１８０５３は、図１の部分Ａ、部分Ｂおよび部分Ｃで示される三つの遺伝子セグメントを開示する。これら三つのセグメントを一緒にすると、ラットフェリチン重鎖ゲノム配列の四つのエキソンが含まれる。図１（Ａ）は、１６８位に転写開始部位を含む５’非翻訳配列の１６８塩基対、続いてエキソン１およびイントロン１の５’末端の最初の１０４塩基対を示す。エキソン１は、開始コドンを含み、３８アミノ酸をコードする。図１（Ｂ）は、イントロン１の３’末端の最後の５０塩基対、続いてエキソン２およびイントロン２の５’末端の最初の３５塩基対を示す。図１（Ｃ）は、イントロン２の３’末端の最後の３３塩基対、続いてエキソン３、イントロン３、エキソン４、および３’非翻訳配列を示し、３’非翻訳配列は、終止コドンおよび終結コドンの１３２塩基対後ろのポリアデニル化シグナルを含む。
【００３７】
コスミドライブラリーの挿入物サイズが極めて大きいので、これらは十分な５’隣接配列および３’隣接配列を得るために選択された。特に、ラットコスミドライブラリーＣａｔａｌｏｇ＃ＲＬ１０３２ｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）が選択された。しかし、他のライブラリーもまた使用してもよく、または配列は合成的に調製してもよい。
【００３８】
コスミドライブラリーをスクリーニングするときにプロセシングされたシュード遺伝子のクローニングすることを避けるために、イントロン配列がプローブ鋳型として役立てるために選択された。これらのイントロンは、鋳型としてのラットゲノムＤＮＡ（Ｃａｔａｌｏｇ＃６７５０−１，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ならびに、ＧｅｎＢａｎｋからの関連ｃＤＮＡ、およびゲノム配列に基づくプライマーを用いるＰＣＲによりクローン化された。ビオチン化プローブは、鋳型としてイントロンを用いて調製され、そしてコスミドライブラリーはそのビオチン化プローブを用いてスクリーニングされた。一つのフェリチン重鎖遺伝子コスミド（１５Ａ）は、単離され、そして制限酵素でマッピングされた。ＧｅｎＢａｎｋからのラットゲノム配列の三つのセグメントは、コード領域を位置決定し、かつ高発現遺伝子座ベクターの産生を設計するためのガイドとして貢献した。
【００３９】
（フェリチン重鎖遺伝子高発現遺伝子座ベクターの産生）
本発明の高発現遺伝子座ベクターの産生は、多くの方法で達成され得る。例えば、ベクターを形成する配列は、単一のクローンから、または複数のクローンから得られ得る。配列は、ラットフェリチン重鎖遺伝子に完全に基づいてもよく、別の哺乳動物フェリチン重鎖に完全に基づいてもよく、または複数の哺乳動物フェリチン重鎖遺伝子に基づいてもよい。配列は、全ての天然由来配列、または天然由来配列および合成配列の混合物に基づき得る。さらに、遺伝子座ベクターは、第一に、フェリチン重鎖遺伝子領域の全てまたは一部を含む一以上の大きなゲノムフラグメントを得、次いで所望の配列を挿入しながらも、所望しない配列を欠失するか、もしくは不活性化することによって産生され得るか、または、フェリチン重鎖遺伝子領域の所望のフラグメントのみをクローニングもしくはサブクローニングし、次いでこれらを他の所望の配列と組み合わせることによって産生され得る。同様に、クローニング、サブクローニング、欠失、不活性化、および挿入を使用するこれらのアプローチの混合物が、所望の構築物に達するために使用され得る。とられるアプローチおよび種々の工程の順番は、本発明と無関係であり、当業者の自由裁量のうちである。
【００４０】
本発明の高発現遺伝子座ベクターは、５’から３’への順番で、（ａ）真核生物遺伝子座の遠位５’隣接配列；（ｂ）真核生物遺伝子座の近位５’調節配列；（ｃ）異種配列に対する少なくとも第一の挿入部位；および（ｄ）真核生物遺伝子座の転写終結に対して効果的な近位３’調節配列を含む。必要に応じて、リンカー配列がセグメント（ａ）〜セグメント（ｄ）の間に存在し得る。さらに、遠位５’隣接配列および近位５’調節配列のうちの少なくとも一つは、フェリチン重鎖遺伝子の対応する配列と実質的な同一性を有する。いくつかの実施形態において、遠位３’隣接配列もまた、ベクターの中に含まれる。
【００４１】
本発明の高発現遺伝子座ベクターの一つの実施形態である、以下に記載されるｐＦｅｒＸ８ベクターは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ１４７９３０に開示される。
【００４２】
（Ａ．遠位５’隣接配列および近位５’調節配列）
いくつかの実施形態において、遺伝子座ベクターの遠位５’隣接配列は、フェリチン重鎖遺伝子座の遠位５’隣接配列の中で見出されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％〜１００％の同一性を有する、１００〜１００，０００ヌクレオチドの配列を含む。従って、いくつかの実施形態において、遠位５’隣接配列は、フェリチン重鎖遺伝子座の遠位５’隣接配列の中で見出されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有する、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも７５０ヌクレオチド、少なくとも１，０００ヌクレオチド、少なくとも１０，０００ヌクレオチド、少なくとも２５，０００ヌクレオチド、少なくとも５０，０００ヌクレオチド、または少なくとも１００，０００ヌクレオチドを含み得る。以下の実施例に示されるように、遠位５’配列は、隣接配列のうちの１，０００〜１０，０００塩基対、２，０００〜９，０００塩基対、３，０００〜８，０００塩基対、または４，０００〜７，０００塩基対を含み得る。
【００４３】
他の実施形態において、遺伝子座ベクターの遠位５’隣接配列は、対応するフェリチン重鎖遺伝子配列と、より低い百分率の同一性を共有し、いくつかの実施形態において、遠位５’隣接配列は、任意の対応するフェリチン重鎖遺伝子配列と関連しない。
【００４４】
遠位５’隣接配列の下流で、本発明の高発現遺伝子座ベクターは近位５’調節配列を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子座ベクターの近位５’調節配列は、フェリチン重鎖遺伝子座の近位５’調節配列の中で見出されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％〜１００％の同一性を有する、少なくとも２０〜１０，０００ヌクレオチドの配列を含む。従って、いくつかの実施形態において、近位５’調節配列は、フェリチン重鎖遺伝子座の近位５’調節配列の中で見出されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有する、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも７５ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも１，０００ヌクレオチド、少なくとも５，０００ヌクレオチド、または少なくとも１０，０００ヌクレオチドを含み得る。
【００４５】
他の実施形態において、遺伝子座ベクターの近位５’調節配列は、対応するフェリチン重鎖遺伝子配列と、より低い百分率の同一性を共有し、いくつかの実施形態において、近位５’調節配列は、任意の対応するフェリチン重鎖遺伝子配列と関連しない。
【００４６】
全ての実施形態において、近位５’調節配列は、ベクター中へ挿入される異種コード領域の転写を開始するために効果的でなければならない。従って、近位５’調節配列が、対応するフェリチン重鎖遺伝子配列に基づく実施形態において、転写を開始することおよび促進することに関してこの配列が効果的でなくなる程度まで、近位５’調節配列は変化されるべきでない。従って、「ＴＡＴＡボックス」もしくはリボソーム結合部位のような特徴の保存、または均等の配列とのこれら特徴の置換は、発現ベクターの機能を維持するために必要である。一方、他の遺伝子からの機能的均等物によって、これらの配列を完全に置換することもまた容認でき、この均等物としては他の遺伝子からの任意の多くの公知近位５’調節配列が挙げられる。同様に、二つ以上の遺伝子の近位５’調節配列に基づくキメラ配列によって、これらの配列を置換することが容認できる。
【００４７】
いくつかの実施形態において、遠位５’隣接配列および近位５’調節配列の両方は、それぞれに、フェリチン重鎖遺伝子座の遠位５’隣接配列および近位５’調節配列の中で見出されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％〜１００％の同一性を有する、少なくとも１００〜１０００ヌクレオチドの配列を含む。いくつかのこれらの実施形態において、遠位５’隣接配列および近位５’調節配列は、フェリチン重鎖遺伝子座の中で見出される連続配列に対して７０％〜１００％の同一性を有する。
【００４８】
フェリチン重鎖遺伝子のイントロン１が正の調節エレメントを含み得、そしてＲＮＡプロセシングおよび輸送を補助し得るので、近位５’調節配列の一部としてイントロン１の全てまたは一部の維持を含む遺伝子座ベクターを作製することが、有利となり得る。これは、イントロン１配列の開始部に対して５’側にＡＴＧコドンを維持し、そして必要に応じて、さらなるコドンを維持することによって、達成され得る。ＡＴＧ以外のコドンが維持される場合、そのコドンは、フェリチン重鎖遺伝子エキソン１コード配列または任意の他のコード配列（合成配列もしくは人工配列を含む）から誘導され得、そして、異種コード配列を有する融合タンパク質のＮ末端をコードする。このようなＮ末端は、リーダー配列またはシグナル配列として、異種配列の発現を補助するために機能し得る。あるいは、他の実施形態において、種々のＮ末端配列（例えば、リーダー配列またはシグナル配列）をコードする配列が、意のままに挿入され得るように、さらなる異種配列挿入部位（例えば、単一の制限部位またはポリリンカー）は、イントロン１の開始部に対して５’側に挿入され得る。ＡＴＧコドンは、ベクターの一部として提供されてもよく、または挿入された異種配列の一部であってもよい。
【００４９】
しかし、ＡＴＧコドンまたは任意の他のコドンのいずれかをイントロン１より前に維持する必要はない。むしろ、いくつかの実施形態において、ＡＴＧコドンは、エキソン２の中に存在し得るか、または異種コード配列によって提供され得る。このような実施形態において、異種配列挿入部位は、エキソン２の中、またはイントロン１／エキソン２接合点に存在し、そしてＡＴＧコドンは、ベクターの一部として提供されてもよく、または挿入された異種配列の一部であってもよい。しかし、イントロン１がベクターの中に含まれる全ての事例において、イントロン配列は転写後に除去されるように、イントロン１のスプライスドナー配列およびスプライスアクセプター配列、または均等のスプライスドナー配列およびスプライスアクセプター配列は、維持されなければならない。本明細書中で記載されるように、イントロンの中の他の配列は欠失されても、もしくは変化してもよく、または、さらなる配列が挿入されてもよい。しかし、イントロン１が維持される構築物において、異種コード領域の挿入は、イントロン１の５’側または３’側のいずれかであろうと、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を破壊してはならないか、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を再構築しなければならないか、または均等のスプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を提供しなければならない。
【００５０】
最終的に、フェリチン重鎖遺伝子エキソン１もまた、鉄のレベルに依存して翻訳を負に制御するＡＴＧに対して３’側に（およそ−１３８位〜−１１１位にて）鉄調節性エレメント（ＩＲＥ）（Ｋｌａｕｓｎｅｒら（１９９３）、Ｃｅｌｌ  ７２：１９−２６に概説される）を含むので、遺伝子座ベクターの作製は、必要に応じて、近位５’調節配列からのＩＲＥの欠失を含み得る。
【００５１】
（Ｂ．フェリチン重鎖コード領域）
代表的に、遺伝子座ベクターは、フェリチン重鎖遺伝子からの任意のコード領域を含まない。しかし、ベクターを作製する方法に依存して、フェリチン重鎖コード領域は、意図的に、または人工物として含まれ得る。例えば、遠位５’隣接配列および／または近位５’調節配列（一緒で「５’フェリチン配列」）のみを用いることを意図して、ベクターの中へ完全なフェリチン重鎖遺伝子領域がクローン化される場合、コード領域は、意図的に完全に欠失され得る。あるいは、異種配列挿入部位（例えば、単一の制限部位またはポリリンカー）および近位３’調節配列（ならびに必要に応じて遠位３’隣接配列）は、コード領域を欠失することなく、５’フェリチン配列に対して３’側に接して挿入され得る。介在する挿入に起因して、コード領域は不活性化される。同様に、開始コドンを除く全てのコード領域が欠失され得るか、または、異種配列挿入部位および近位３’調節配列（ならびに必要に応じて遠位３’隣接配列）が、開始コドンに対して３’側に接して挿入され得る。さらに、融合タンパク質が産生され得るように、異種配列挿入部位および近位３’調節配列（ならびに必要に応じて遠位３’隣接配列）の挿入の前に、コード領域のより大きな部分が維持され得る。最終的に、介在配列の挿入によって、フェリチン重鎖コード領域が部分的に欠失され、そして部分的に不活性化されるように、前述のアプローチの組み合わせが使用され得る。しかし、いくつかの実施形態において、ベクターのサイズを縮小するために、不活性化配列および非翻訳配列が欠失される。
【００５２】
（Ｃ．異種配列挿入部位）
近位５’調節配列の下流で、本発明の高発現遺伝子座ベクターは異種配列についての挿入部位（例えば、ポリリンカー部位）を含む。異種配列挿入部位は、その配列の中へ、妥当な成功の見込みで機能的高発現遺伝子座ベクターの産生を許容するに十分に制御され、かつ予測可能な様式で異種配列が挿入され得る、任意の配列であり得る。異種配列に関する挿入部位としては、同組換え部位、部位特異的組込み部位（例えば、トランスポゾンもしくはウイルス性構築物を介する）、またはエンドヌクレアーゼ媒介制限部位が挙げられる。挿入部位の長さは、４塩基対（４塩基切断制限エンドヌクレアーゼについて使用するために）から１，０００塩基対または５，０００塩基対（相同組換え方法について使用するために）へ変化し得る。しかし、ある状況において、近位５’調節配列の３’末端および近位３’調節配列の５’末端は、これらの間にさらなるヌクレオチドの包含を必要とすることなく、挿入部位を形成し得る。従って、例えば、近位５’調節配列の最後の二つのヌクレオチドおよび近位３’調節配列の最初の二つのヌクレオチドは、異種配列に対する挿入部位として作用し得る４塩基対制限部位を形成し得る。あるいは、一つのみ、またはいくつかのヌクレオチドが、これらの配列の間に挿入部位を形成するために要求され得る。従って、挿入部位の長さは、０、１、２塩基対または３塩基対、および上で記載される４塩基対〜５，０００塩基対であり得る。
【００５３】
いくつかの実施形態において、異種配列挿入部位は、センス鎖またはアンチセンス鎖いずれかの上に一つ以上のヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列は、天然または人工のエンドヌクレアーゼに対する制限部位として作用する。これらの制限部位は、ベクターにおいて固有であり得、そして、種々の制限エンドヌクレアーゼを用いる使用のより大きな柔軟性を与えるために、挿入部位は、複数のこのような制限部位を含むポリリンカーであり得る。このようなポリリンカーの例が、実施例１および図３に提供される。
【００５４】
（Ｄ．近位３’調節配列）
異種配列に関する挿入部位の下流で、本発明の高発現遺伝子座ベクターは近位３’調節配列を含む。少なくとも、これらの配列はポリアデニル化シグナルを含む。いくつかの実施形態において、近位３’調節配列もまた転写終結シグナルを含む。いくつかの実施形態において、配列は、翻訳終結コドンまたは終止コドンを含み得、一方、他の実施形態において、終止コドンは異種配列挿入物に含まれる。
【００５５】
近位３’調節配列は、フェリチン重鎖遺伝子から誘導され得るが、その必要はない。例えば、いくつかの実施形態において、遺伝子座ベクターの近位３’調節配列は、フェリチン重鎖遺伝子座の近位３’調節配列の中で見出されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％〜１００％の同一性を有する、少なくとも１０〜２，０００塩基のヌクレオチドの配列を含む。従って、いくつかの実施形態において、近位３’調節配列は、フェリチン重鎖遺伝子座の近位３’調節配列の中で見出されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有する、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも７５０ヌクレオチド、少なくとも１，０００ヌクレオチド、または少なくとも２，０００ヌクレオチドを含み得る。他の実施形態において、近位３’調節配列は、本質的に、ポリアデニル化シグナルから構成され、これは、フェリチン重鎖遺伝子、異種配列、または合成配列もしくは人工配列から誘導され得る。
【００５６】
他の実施形態において、遺伝子座ベクターの近位３’調節配列は、対応するフェリチン重鎖遺伝子配列と、より低い百分率の同一性を共有し、いくつかの実施形態において、近位３’調節配列は、任意の対応するフェリチン重鎖遺伝子配列と関連しない。
【００５７】
（Ｅ．遠位３’隣接配列）
近位３’調節配列の下流で、本発明の高発現遺伝子座ベクターは、必要に応じて、遠位３’隣接配列を含む。遠位３’隣接配列は、フェリチン重鎖遺伝子から誘導され得るが、その必要はない。例えば、いくつかの実施形態において、遺伝子座ベクターの遠位３’隣接配列は、フェリチン重鎖遺伝子座の遠位３’隣接配列の中で見出されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％〜１００％の同一性を有する、少なくとも１００〜１００，０００ヌクレオチドの配列を含む。従って、いくつかの実施形態において、遠位３’隣接配列は、フェリチン重鎖遺伝子座の遠位３’隣接配列の中で見出されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有する、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも７５０ヌクレオチド、少なくとも１，０００ヌクレオチド、少なくとも１０，０００ヌクレオチド、少なくとも２５，０００ヌクレオチド、少なくとも５０，０００ヌクレオチド、または少なくとも１００，０００ヌクレオチドを含み得る。以下の実施例に示されるように、遠位３’隣接配列は、隣接配列のうちの１，０００〜１０，０００塩基対、２，０００〜９，０００塩基対、３，０００〜８，０００塩基対または４，０００〜７，０００塩基対を含み得る。
【００５８】
他の実施形態において、遺伝子座ベクターの遠位３’隣接配列は、対応するフェリチン重鎖遺伝子配列と、より低い百分率の同一性を共有し、いくつかの実施形態において、遠位３’隣接配列は、任意の対応するフェリチン重鎖遺伝子配列と関連しない。
【００５９】
以下の実施例は、本発明のいくつかの特定の実施形態を説明するが、本願発明の範囲を限定する意図はない。同様の結果を得るために、代替の材料および方法が利用され得る。
【実施例】
【００６０】
（実施例１：フェリチン重鎖遺伝子座ベクターの作製）
フェリチン重鎖遺伝子に基づく高発現遺伝子座ベクターを生成するために、三段階の開発を使用した：（１）実質的な５’領域および３’領域を有するフェリチン重鎖遺伝子のクローニング；（２）これらの遺伝子領域のうちの少なくとも一つに基づく発現ベクターの産生；（３）ベクターの最適化。上で指摘されるように、同じ遺伝子座ベクターまたは均等の遺伝子座ベクターを産生するために、多くの他のアプローチを使用し得ている。
【００６１】
第一に、コスミド１５Ａからフェリチン重鎖エキソンを含む領域を、Ｌｉｔｍｕｓ３８ベクター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）の中へサブクローン化して、プラスミドｐＦｅｒＸ１を生成した（図２）。ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩフラグメントをコスミド１５Ａから単離し、そしてＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化したＬｉｔｍｕｓ３８の中へ結合して、プラスミドｐＦｅｒＸ１を生成した。ここで留意すべきは、コスミド１５Ａをほんの部分的に配列決定したこと、およびいくつかの制限部位位置が制限マッピングに基づくことである。従って、いくつかの制限部位位置は、正確でないかもしれない。
【００６２】
図３は、プラスミドｐＦｅｒＸ２を生成するための、ｐＦｅｒＸ１からのエキソン２、エキソン３およびエキソン４を含むフラグメントの欠失、ならびにＡａｔＩＩ制限部位およびＳａｌＩ制限部位を含むポリリンカーの挿入を例示する。欠失したＨｐａＩフラグメントは、挿入物中のＨｐａＩ部位から、ｐＦｅｒＸ１におけるベクター中のＨｐａＩ部位へと広がっていた。ポリリンカーの５’末端は、ＨｐａＩ部位を再生したが、３’末端は再生しなかった。リンカーの配向のためのスクリーニングを、ＰＣＲを用いて行った。
【００６３】
エキソン１コード領域をｐＦｅｒＸ２から欠失し、ＡＴＧ開始コドンおよびそれに続くスプライスドナーをインタクトなまま残して、プラスミドｐＦｅｒＸ３を生成した。図４は、ｐＦｅｒＸ２からＢａｍＨＩ−ＢｓｐＨＩ（２５１５−２７１９）フラグメントおよびＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ（２８３０−２５１５）フラグメントを単離することによって、エキソン１コード領域の欠失を達成したことを例示する。ＢｓｐＨＩおよびＮｃｏＩは、得られたフラグメントが互いに連結されてｐＦｅｒＸ３を生成することを可能にする適合性突出部を生成する。この操作の結果として、ベクターのエキソン１は以下から：
【００６４】
【化１】
2006503583.tif 000002
以下：
【００６５】
【化２】
2006503583.tif 000003
へ変化した。
【００６６】
プラスミドｐＦｅｒＸ４を生成するために、ｐＦｅｒＸ３中のＳａｃＩＩ−ＥａｇＩ（２５７５−２６３９）フラグメントを、ＩＲＥを含まない（しかしスクリーニングのための５’ＫｐｎＩ部位を作製する）リンカーで置換することによって、エキソン１のＩＲＥの欠失を達成した。この操作の結果として、ベクターのエキソン１は、以下（ＩＲＥに下線を引く）から：
【００６７】
【化３】
2006503583.tif 000004
以下（リンカーを太字で示す）：
【００６８】
【化４】
2006503583.tif 000005
へ変化した。
【００６９】
フェリチン重鎖遺伝子の近位５’調節配列および近位３’調節配列を維持しつつ、ＳｗａＩおよびＮｏｔＩを含むポリリンカーでエキソン２〜４を置換する三つの工程手順で、ＰＣＲ融合産物を生成した。図５（Ａ）に示すように、第一のＰＣＲは、鋳型としてコスミド１５Ａ（図２）を用いた。プライマーＦｅｒ１およびプライマーＦｅｒ４に関するプライマー位置を、矢印によって示す。プライマーＦＮ１およびプライマーＦＮ２に関する「プライミング」領域もまた、棒線によって示す。図５（Ｂ）に示す第二の工程において、Ｆｅｒ１−ＦＮ２  ＰＣＲ産物を生成した。プライマーＳｗａ−２の「プライミング」領域の位置を示す。図５（Ｃ）に示す第三の工程において、ＦＮ１−Ｆｅｒ４  ＰＣＲ産物を生成した。プライマーＳｗａ−１の「プライミング」領域の位置を示す。図５（Ｄ）に示す第四および最後の工程において、鋳型としてＦｅｒ１−Ｓｗａ−２産物およびＳｗａ−１−Ｆｅｒ４産物、ならびにＦｅｒ１プライマーおよびＦｅｒ４プライマーを用いることによって、最終ＰＣＲ融合産物を生成した。ｐＦｅｒＸ４のＨｐａＩ部位およびＡａｔＩＩ部位の中へ挿入してプラスミドｐＦｅｒＸ５を生成するために、この産物から、ＨｐａＩ−ＡａｔＩＩフラグメントを単離した（図６を参照のこと）。ＳｗａＩ−ＮｏｔＩポリリンカーを生成するための第一の三つの工程で用いたＰＣＲ融合反応を、表１に示す。
【００７０】
【表１】
2006503583.tif 000006
ＰＣＲプライマーを以下に示し、ここでポリリンカー配列を太字で示し、そしてＦＮ１とＦＮ２との間の相補的配列、またはＳｗａ−１とＳｗａ−２との間の相補的配列を下線で示す。
【００７１】
【化５】
2006503583.tif 000007
ＳｗａＩを用いたプラスミドの平滑末端切断および以下の二本鎖オリゴの挿入によって、ｐＦｅｒＸ４のベクター骨格中のＳｗａＩ部位を除去して、プラスミドｐＦｅｒＸ４．１を生成した：
【００７２】
【化６】
2006503583.tif 000008
これは、ＡｓｃＩ部位を含む。上記のポリリンカー中のＳｗａＩ部位を唯一のものとするために、ＳｗａＩ部位をベクター骨格から消去した。
【００７３】
ｐＦｅｒＸ４．１のベクター骨格（ここで、図１５のＡｓｃＩオリゴの挿入は、ベクター骨格中のＳｗａＩ部位を破壊した）およびｐＦｅｒＸ５（これは、骨格およびポリリンカー中にＳｗａＩ部位を含んでいた）を、ＳａｃＩＩ−ＡａｔＩＩフラグメントを用いて交換して、プラスミドｐＦｅｒＸ５．１を生成した（図７）。ｐＦｅｒＸ５．１はポリリンカーを含んでいたが、骨格中にＳｗａＩ部位を欠き、ポリリンカー中でＳｗａＩ部位を唯一のものとした。
【００７４】
ポリリンカー
【００７５】
【化７】
2006503583.tif 000009
を、ｐＦｅｒＸ５．１のＳａｌＩ−ＡａｒＩＩ部位の中へ挿入して、プラスミドｐＦｅｒＸ６を生成した。このポリリンカーはＢｇｌＩＩ部位およびＢｓｔＢＩ部位の両方を含み、そしてフェリチン重鎖遺伝子の遠位３’隣接配列を受容するために設計された。
【００７６】
フェリチン重鎖遺伝子の遠位３’隣接配列（コスミド１５ＡからのＡａｔＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメント）を、ｐＦｅｒＸ６のＡａｔＩＩ−ＢｇｌＩＩ部位の中へ挿入して、プラスミドｐＦｅｒＸ７を生成した（図８）。
【００７７】
フェリチン重鎖遺伝子の遠位５’隣接配列（ｐＦｅｒＨ１からのＢａｍＨＩフラグメント、コスミド１５Ａのサブクローン、図２：ＢａｍＨＩ１０２６９−１５１７６）を、ｐＦｅｒＸ７のＢａｍＨＩ部位の中へ挿入して、プラスミドｐＦｅｒＸ８を生成した（図９）。
【００７８】
ｐＦｅｒＸ８を形成する種々の配列の起点を、図１０に示す。Ｌｉｔｍｕｓ３８骨格を、塗りつぶしたボックスによって示す。このプラスミドは、開始ＡＴＧコドンの前に＞６ｋｂの遠位５’隣接配列を含み、終結コドンに続いて約７ｋｂの遠位３’隣接配列を含む。ＳｗａＩクローニング部位およびＮｏｔＩクローニング部位は、それぞれ、１０２４０位および１０２５４位に位置する。スプライスアクセプターを再生し、続いて第二のアミノ酸を再生するために、ＳｗａＩ部位およびＮｏｔＩ部位の中へ挿入されたコード領域を、５’末端で平滑末端（ＳｗａＩ末端）化すべきであり、そして塩基ＣＡＧで始まるべきである。ＮｏｔＩ部位は、終結コドンに続いて３’末端に存在すべきである。
【００７９】
遠位５’隣接配列のさらなるセグメント（コスミド１５ＡからのＢｓｐＥＩフラグメント）を、ｐＦｅｒＸ８のＢｓｐＥＩ部位（６０３７）の中へ挿入して、プラスミドｐＦｅｒＸ９を生成した（図１１；ＢｓｐＥ１フラグメント６０３４−１４２１１）。この挿入は、遠位５’隣接配列の唯一のセグメントおよびｐＦｅｒＸ８にすでに存在する遠位５’隣接配列の繰り返す一つのセグメント（１０６９７−１３９９０は２５２０−５８１３と同じ）の両方を付加する。このプラスミドは完全には配列決定されず、いくつかの制限部位の位置を、制限フラグメントサイズに基づいて見積もる。
【００８０】
ｐＦｅｒＸ８プラスミドおよびｐＦｅｒＸ９プラスミドの転写された領域の配列を、図１２に示す。推定転写開始部を示す。イントロンを小文字で示す。推定ＴＡＴＡおよびポリアデニル化シグナルに下線を引く。開始コドンは第一のエキソン中にあり、そして第二のアミノ酸で始まる挿入された遺伝子を、ＳｗａＩ部位およびＮｏｔＩ部位の中へ挿入する。
【００８１】
（実施例２：異種配列の発現）
（Ａ．レポーター遺伝子）
レポーター遺伝子を、ｐＦｅｒＸ８プラスミドおよびｐＦｅｒＸ９プラスミド両方のポリリンカー中のＳｗａＩ−ＮｏｔＩ部位へ挿入した。産物に対する商業的に入手可能なアッセイ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）が簡単かつ迅速であるので、分泌性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をレポーター遺伝子として選択した。発現ベクターを、ｐＦｅｒＸ８ＳＥＡＰおよびｐＦｅｒＸ９ＳＥＡＰと命名した。
【００８２】
ベクターポリリンカーの配列、およびスプライスドナーを再生するために再度作製されることが必要なエキソン２の５’末端での本来の配列を、図５に示す。従って、天然スプライスドナー、続いて第二のアミノ酸で始まるコード領域を再度作製するために、５’プライマーは５’末端でＣＡＧを含むべきである（ＡＴＧは、エキソン１にすでに含まれている）。ＰＣＲ産物の５’末端は、ＳｗａＩ部位との連結のために平滑末端化したままにするべきである。例えば：
一般的５’プライマー：
【００８３】
【化８】
2006503583.tif 000010
ＳＥＡＰ例に関するプライマー：
【００８４】
【化９】
2006503583.tif 000011
３’プライマーは、ＮｏｔＩ部位、続いて終結コドン（対向する鎖）を含む遺伝子の３’末端を含むべきである。ポリリンカー中のＮｏｔＩ部位と適合する末端を生成するために、ＰＣＲ産物はＮｏｔＩで消化されるべきである。例えば：
一般的５’プライマー：
【００８５】
【化１０】
2006503583.tif 000012
ＳＥＡＰ例に関するプライマー（終結コドンは太字）：
【００８６】
【化１１】
2006503583.tif 000013
ＰＣＲ産物と（ＳｗａＩおよびＮｏｔＩで消化した）ベクターとの連結は、挿入物の５’末端にＳｗａＩ部位を再度作製しない。代わりに、連結された産物は、「ＳｗａＩ末端」で適切なスプライスアクセプターを含む。挿入された領域もまた、第二のアミノ酸から終結コドンまでのコード領域、続いて３’末端にＮｏｔＩ部位を含む。例えば：
一般的に連結後
【００８７】
【化１２】
2006503583.tif 000014
ＳＥＡＰについての例：
【００８８】
【化１３】
2006503583.tif 000015
（Ｂ．トランスフェクション）
トランスフェクションに使用した宿主はＣＨＯ  ＤＧ４４（Ｅ）細胞株（Ｕｒｌａｕｂら（１９８６），Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．１２：５５５−５６６）であり、この細胞株は、無血清培地中での増殖および生存のために選択されていた。この細胞株を、添加したヌクレオシドを有する、無血清培地が中に入ったスピナーフラスコ中で維持した。トランスフェクションに使用した細胞は、指数関数的に増殖した。２×１０６の細胞または５×１０６の細胞のいずれかを、各トランスフェクションに使用した。
【００８９】
レポータープラスミドを、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコードする、ｐＳＩ−ＤＨＦＲ．２と命名されたプラスミドで同時トランスフェクトしたので、安定なトランスフェクタントはＤＨＦＲ宿主中で選択され得た。ｐＳＩ−ＤＨＦＲ．２プラスミドは、選択可能なマーカー、および、ＳＶ４０エンハンサーを欠失されたＳＶ４０プロモーターによって駆動されるｄｈｆｒ遺伝子を含む（図１３）。
【００９０】
全てのＤＮＡを、Ｍｅｇａｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ  ＣＡ）によって調製した。トランスフェクションより前に、ＤＮＡをＥｔＯＨ沈殿させ、７０％ＥｔＯＨ洗浄し、乾燥させ、ＨＥＢＳ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．０５、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、０．７ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、６ｍＭデキストロース）中へ再懸濁させ、そしてトランスフェクションより前に定量した。正のコントロールとして、ＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを有するＳＥＡＰを発現するプラスミド（ｐＳＥＡＰ２，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用した。ネガティブコントロールは、レポーターコントロールとして空のｐＵＣ１８ベクター（ＡＴＣＣ＃３７２５３，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓｓａｓ，ＶＡ）、およびトランスフェクションコントロールとしての非ＤＮＡトランスフェクションを含んでいた。
【００９１】
各トランスフェクションは、５０μｇのレポータープラスミドおよび５μｇｐＳＩ−ＤＨＦＲ．２を含んでいた。等モル量ではなく、等量のプラスミド重量を選択した。モル濃度の視点から、コントロールレポーターとテストレポーターとの間でおよそ３倍〜５倍差異がある（表３）。各場合において、テストレポーターはコントロールレポーターより低かった。
【００９２】
【表３】
2006503583.tif 000016
細胞およびＤＮＡを、０．８ｍｌのＨＥＢＳ中、０．４ｃｍのキュベット（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を０．２８ｋＶおよび９５０μＦで用いて、電気穿孔法によってトランスフェクトした。電気穿孔法パルスの後、キュベット中で５〜１０分間室温で、細胞をインキュベートさせた。次いで、１０％ｄＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）とヌクレオシド（ＧＩＢＣＯ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）とを加えた１０ｍｌのα−ＭＥＭが中に入った遠心チューブへそれらを移し、１Ｋｒｐｍで５分間ペレット化した。再懸濁ペレットを、１０％ｄＦＢＳを含むがヌクレオシドを含まないα−ＭＥＭが中に入ったＴフラスコの中へまき、コロニーが形成されるまで、３６℃、５％ＣＯ２で、加湿インキュベーター中でインキュベートした。
【００９３】
表４は、実施した七つの実験を要約する。トランスフェクション１〜３を、３連で実施し、トランスフェクション４〜７を、それぞれ１回ずつ実施した。
【００９４】
【表４】
2006503583.tif 000017
（Ｃ．トランスフェクション効率）
トランスフェクションのおよそ２週間後、コロニーが形成された。安定なトランスフェクタントを、プールまたは単離物のいずれかとして分析した。全てのｐＳＩ−ＤＨＦＲ．２含有ランスフェクションは、コロニーを産生したが、フェリチン重鎖遺伝子座ベクターを含むトランスフェクションは、コントロールが産生したコロニーよりも少ないコロニーを産生した。遺伝子座ベクターが産物を発現したかどうかに拘らず、これは真実であった。同量のＤＮＡを各トランスフェクションに含めたので、これらの結果は驚くべきものであった。トランスフェクション効率における差異のために、複数のトランスフェクションを、トランスフェクタントの数の減少を説明するために行うことが推奨される。
【００９５】
（Ｄ．ＳＥＡＰアッセイ）
ＳＥＡＰ遺伝子を含むレポーター構築物を、Ｇｒｅａｔ  ＥｓｃＡｐｅＴＭ  ＳＥＡＰ  レポーターシステム３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて分析した。このアッセイは、馴化培地中でＳＥＡＰ活性を検出するために蛍光基質を用いる。このキットを、以下の例外以外は製造者の説明書に従って９６穴形式で使用した。全ての標準物質およびサンプルを、提供された希釈緩衝液でなく、新鮮な培地で希釈した。６０分後に一回読み取りを実施する代わりに、複数回の読み取りを１０〜２０分間隔で行い、そして一分間当たりの相対蛍光ユニット（ＲＦＵ／分）としてＳＥＡＰ活性を表現するために使用した。Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ  ＩＩプレートリーダーに関して入手可能な発光フィルターは、推奨された４４９ｎｍの代わりに４６０ｎｍであった。
【００９６】
以下のプールおよび単離物について生じたデータの全ては、ＳＥＡＰを発現するレポーター構築物に基づいた。報告された力価は、キットでの正のコントロールに基づいた。絶対値は得られなかったが、相対力価値が有用である。
【００９７】
比生産性を、培地を新鮮な培地で交換し、次いで２４時間後、この培地をサンプリングし、細胞を数えるというアッセイで評価した。産物力価が、２４時間アッセイの最後に、細胞数について正規化された。力価が相対的であったので、比生産性は相対値として表される。
【００９８】
【数１】
2006503583.tif 000018
（Ｅ．トランスフェクタントプール）
コロニーの出現の後、各トランスフェクションから細胞を集め、プールした。プールを、６穴プレートまたはＴフラスコの中へまき、そして２４時間アッセイの間ほぼコンフルエントに維持した。プールアッセイからの結果を、図１４に示す。五つのプールを、各構築物に関して分析した。五つのうち二つは実験１から（１Ａおよび１Ｂ）、三つは実験２から（２Ａ、２Ｂ、および２Ｃ）得たものである。全てのアッセイを、トランスフェクションの３〜４週間後に行った。ここで留意すべきは、ｐＦｅｒＸ８ＳＥＡＰを用いた実験２Ｃは、他のトランスフェクションと比較してかなり低いトランスフェクション効率を有したことである。
【００９９】
比生産性は、コントロール（ｐＳＥＡＰ２）とかなり一致したが、ｐＦｅｒＸ８ＳＥＡＰベクターおよびｐＦｅｒＸ９ＳＥＡＰベクターについては高度に可変であった。特に、フェリチンベクターは、コントロールよりも高い比生産性を有するプールを生成することが可能であった。
【０１００】
（Ｆ．トランスフェクタント単離物）
単離物を、トランスフェクション実験＃２からコロニーを「拾う」ことによって得た。５０μｌにセットしたＰ２００ピペットマンでコロニーを直接吸引することによって、「拾う」ことを達成した。十分な数の細胞があるとき、吸引されたコロニーを、第一に４８穴プレートへ移し、次いで６穴プレートへ移した。上で記載された２４時間アッセイを用いて、６穴プレート中、ほぼコンフルエントからコンフルエントな細胞密度で、比生産性を評価した。４０〜５０の単離物を、各構築物に関して分析した。その結果を図１５に示し、ここで単離物は、各ＳＥＡＰ発現構築物に関する、これらの比生産性の順番で提示されている。比生産性のスケールは、比較のためにパネル間で一致している。
【０１０１】
ｐＳＥＡＰ２トランスフェクションからの単離物の大部分（６３％）は、検出限界よりも高くは産物を発現しなかった。この実験におけるｐＳＥＡＰ２からの最も高い生産性は、一日当たり一細胞につき４６ユニット（比較のための相対値）であった。対照的に、ｐＦｅｒＸ８ＳＥＡＰトランスフェクションからの単離物のほんの２８％が、検出限界未満で産物を発現し、そして４４％が最も高いｐＳＥＡＰ２トランスフェクタントを超える生産性を有した。この実験におけるｐＦｅｒＸ８ＳＥＡＰからの最も高い生産性は、一日当たり一細胞につき２５９ユニットであって、ｐＳＥＡＰ２からの最も高い生産性よりも５倍以上高かった。ｐＦｅｒＸ９ＳＥＡＰ構築物は、ｐＳＥＡＰ２よりも良好に作動したが、ｐＦｅｒＸ８ＳＥＡＰほど良好には作動しなかった。
【０１０２】
（実施例３：ベクターサイズの縮小）
使用を簡略化するためベクターのサイズを縮小する目的で、ベクターの５’領域および／または３’領域を欠失した（表５）。これらの欠失を、従来どおり、レポーターとしてＳＥＡＰを用いてテストした。およそ３０個の単離物を、表５に示されるプラスミドのうちのそれぞれから、ならびにコントロール、ｐＳＥＡＰ２およびｐＵＣ１８（１０個の単離物）からテストした。
【０１０３】
【表５】
2006503583.tif 000019
ｐＦｅｒＸ１１ＳＥＡＰベクターは、ｐＦｅｒＸ８ＳＥＡＰベクターと同様に作動し、表５に記載される３’領域での約３．９ｋｂの欠失が有害ではなかったことを示している。ｐＦｅｒＸ１０ＳＥＡＰベクターおよびｐＦｅｒＸ１２ＳＥＡＰベクターは、ｐＦｅｒＸ８ＳＥＡＰほど良好には作動せず、表５に記載される約４．９ｋｂの５’欠失が機能に対して有害ではなかったことを示している。
【０１０４】
（等価物）
本発明のある特異的な実施形態に関して本発明が特に示され、記載されているが、形態および詳細に関する種々の変化が、添付された特許請求の範囲によって定義されるような本発明の精神および範囲から離れることなく、そこで成され得ることが、当業者によって理解される。当業者は、本明細書中で特異的に記載される本発明の特定の実施形態に対して多くの等価物を慣用実験にすぎない実験を用いて、認識するか、または確認し得る。このような等価物は、添付された特許請求の範囲中に包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】図１は、ラットフェリチン重鎖エキソン配列を示す。
【図２】図２は、Ｌｉｔｍｕｓ３８プラスミドの中への、フェリチン重鎖エキソンを含む領域のサブクローニングの一例を例示する。
【図３】図３は、プラスミドｐＦｅｒＸ２を生成する、ｐＦｅｒＸ１からエキソン２、エキソン３、およびエキソン４の欠失、ならびにポリリンカーの挿入を例示する。
【図４】図４は、プラスミドｐＦｅｒＸ３を生成するｐＦｅｒＸ２からのエキソン１コード領域の欠失、およびプラスミドｐＦｅｒＸ４を生成するＩＲＥの欠失を例示する。
【図５Ａ】図５Ａは、ＰＣＲ融合を用いる、コスミド１５Ａからのフェリチン重鎖遺伝子のエキソン２〜４の除去を例示する。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＰＣＲ融合を用いる、コスミド１５Ａからのフェリチン重鎖遺伝子のエキソン２〜４の除去を例示する。
【図６】図６は、プラスミドｐＦｅｒＸ５を生成する、ｐＦｅｒＸ４のＨｐａＩ部位およびＡａｔＩＩ部位の中への、図５のＰＣＲ融合産物の挿入を例示する。
【図７】図７は、プラスミドｐＦｅｒＸ５．１を生成する、ｐＦｅｒＸ５からＳｗａＩ部位の除去を例示する。
【図８】図８は、ｐＦｅｒＸ７を生成する、ｐＦｅｒＸ６への遠位３’隣接配列の付加を例示する。
【図９】図９は、プラスミドｐＦｅｒＸ８を生成する、ｐＦｅｒＸ７へのフェリチン重鎖遺伝子の遠位５’隣接配列の付加を例示する。
【図１０】図１０は、プラスミドｐＦｅｒＸ８の遺伝子地図を例示し、この遺伝子地図は、配列の供給源を含む。
【図１１】図１１は、プラスミドｐＦｅｒＸ９の遺伝子地図を例示し、この遺伝子地図は、配列の供給源を含む。
【図１２】図１２は、ｐＦｅｒＸ８プラスミドおよびｐＦｅｒＸ９プラスミドの転写領域の配列を例示する。
【図１３】図１３は、ＤＨＦＲ発現プラスミドの一つであるｐＳＩＤＨＦＲ．２遺伝子地図を例示する。
【図１４】図１４は、トランスフェクタントのプール中のレポーター遺伝子発現を測定する実験の結果を示す。
【図１５】図１５は、トランスフェクトされた単離物におけるレポーター遺伝子発現を測定する実験の結果を示す。
【図１】
2006503583.tif 000020
【図２】
2006503583.tif 000021
【図３】
2006503583.tif 000022
【図４】
2006503583.tif 000023
【図５Ａ】
2006503583.tif 000024
2006503583.tif 000025
【図６】
2006503583.tif 000026
【図７】
2006503583.tif 000027
【図８】
2006503583.tif 000028
【図９】
2006503583.tif 000029
【図１０】
2006503583.tif 000030
【図１１】
2006503583.tif 000031
【図１２】
2006503583.tif 000032
【図１３】
2006503583.tif 000033
【図１４】
2006503583.tif 000034
【図１５】
2006503583.tif 000035
【配列表】
2006503583000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年7月19日(2005.7.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
エキソン１コード領域をｐＦｅｒＸ２から欠失し、ＡＴＧ開始コドンおよびそれに続くスプライスドナーをインタクトなまま残して、プラスミドｐＦｅｒＸ３を生成した。図４は、ｐＦｅｒＸ２からＢａｍＨＩ−ＢｓｐＨＩ（２５１５−２７１９）フラグメントおよびＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ（２８３０−２５１５）フラグメントを単離することによって、エキソン１コード領域の欠失を達成したことを例示する。ＢｓｐＨＩおよびＮｃｏＩは、得られたフラグメントが互いに連結されてｐＦｅｒＸ３を生成することを可能にする適合性突出部を生成する。この操作の結果として、ベクターのエキソン１は以下：
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
【化１】
2006503583.tif 000036
（（配列番号１９）およびアミノ酸配列（配列番号２０）。相補鎖もまた示す（配列番号２１））から以下：
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
【化２】
2006503583.tif 000037
へ変化した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
プラスミドｐＦｅｒＸ４を生成するために、ｐＦｅｒＸ３中のＳａｃＩＩ−ＥａｇＩ（２５７５−２６３９）フラグメントを、ＩＲＥを含まない（しかしスクリーニングのための５’ＫｐｎＩ部位を作製する）リンカーで置換することによって、エキソン１のＩＲＥの欠失を達成した。この操作の結果として、ベクターのエキソン１は、以下（ＩＲＥに下線を引く）：
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
【化３】
2006503583.tif 000038
（配列番号２４〜配列番号２５。相補鎖を示す（配列番号２５））から以下（リンカーを太字で示す）：
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
【化４】
2006503583.tif 000039
（それぞれ、配列番号２６〜配列番号２７。相補鎖を示す（配列番号２７））へ変化した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
【化５】
2006503583.tif 000040
ＳｗａＩを用いたプラスミドの平滑末端切断および以下の二本鎖オリゴの挿入によって、ｐＦｅｒＸ４のベクター骨格中のＳｗａＩ部位を除去して、プラスミドｐＦｅｒＸ４．１を生成した：
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
【化７】
2006503583.tif 000041
を、ｐＦｅｒＸ５．１のＳａｌＩ−ＡａｔＩＩ部位の中へ挿入して、プラスミドｐＦｅｒＸ６を生成した。このポリリンカーはＢｇｌＩＩ部位およびＢｓｔＢＩ部位の両方を含み、そしてフェリチン重鎖遺伝子の遠位３’隣接配列を受容するために設計された。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
【化８】
2006503583.tif 000042
ＳＥＡＰ例に関するプライマー：
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
【化９】
2006503583.tif 000043
３’プライマーは、ＮｏｔＩ部位、続いて終結コドン（対向する鎖）を含む遺伝子の３’末端を含むべきである。ポリリンカー中のＮｏｔＩ部位と適合する末端を生成するために、ＰＣＲ産物はＮｏｔＩで消化されるべきである。例えば：
一般的５’プライマー：
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
【化１０】
2006503583.tif 000044
ＳＥＡＰ例に関するプライマー（終結コドンは太字）：
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
【化１１】
2006503583.tif 000045
ＰＣＲ産物と（ＳｗａＩおよびＮｏｔＩで消化した）ベクターとの連結は、挿入物の５’末端にＳｗａＩ部位を再度作製しない。代わりに、連結された産物は、「ＳｗａＩ末端」で適切なスプライスアクセプターを含む。挿入された領域もまた、第二のアミノ酸から終結コドンまでのコード領域、続いて３’末端にＮｏｔＩ部位を含む。例えば：
一般的に連結後
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
【化１２】
2006503583.tif 000046
ＳＥＡＰについての例：
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
【化１３】
2006503583.tif 000047
（Ｂ．トランスフェクション）
トランスフェクションに使用した宿主はＣＨＯ  ＤＧ４４（Ｅ）細胞株（Ｕｒｌａｕｂら（１９８６），Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．１２：５５５−５６６）であり、この細胞株は、無血清培地中での増殖および生存のために選択されていた。この細胞株を、添加したヌクレオシドを有する、無血清培地が中に入ったスピナーフラスコ中で維持した。トランスフェクションに使用した細胞は、指数関数的に増殖した。２×１０６の細胞または５×１０６の細胞のいずれかを、各トランスフェクションに使用した。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
【図１】図１は、ラットフェリチン重鎖エキソン配列（配列番号１、配列番号４および配列番号７）およびラットフェリチン重鎖エキソンアミノ酸配列（配列番号２、配列番号５、配列番号８および配列番号９）を示す。相補鎖もまた示す（配列番号３、配列番号６および配列番号１０）。
【図２】図２は、Ｌｉｔｍｕｓ３８プラスミドの中への、フェリチン重鎖エキソンを含む領域のサブクローニングの一例を例示する。
【図３】図３は、プラスミドｐＦｅｒＸ２を生成する、ｐＦｅｒＸ１からエキソン２、エキソン３、およびエキソン４の欠失、ならびにポリリンカー（配列番号４０〜４１）の挿入を例示する。
【図４】図４は、プラスミドｐＦｅｒＸ３を生成するｐＦｅｒＸ２からのエキソン１コード領域の欠失、およびプラスミドｐＦｅｒＸ４を生成するＩＲＥの欠失を例示する。
【図５Ａ】図５Ａは、ＰＣＲ融合を用いる、コスミド１５Ａからのフェリチン重鎖遺伝子（配列番号１１、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７）およびフェリチン重鎖アミノ酸配列（配列番号１２〜１４）のエキソン２〜４の除去を例示する。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＰＣＲ融合を用いる、コスミド１５Ａからのフェリチン重鎖遺伝子（配列番号１１、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７）およびフェリチン重鎖アミノ酸配列（配列番号１２〜１４）のエキソン２〜４の除去を例示する。
【図６】図６は、プラスミドｐＦｅｒＸ５を生成する、ｐＦｅｒＸ４のＨｐａＩ部位およびＡａｔＩＩ部位の中への、図５のＰＣＲ融合産物の挿入を例示する。
【図７】図７は、プラスミドｐＦｅｒＸ５．１を生成する、ｐＦｅｒＸ５からＳｗａＩ部位の除去を例示する。
【図８】図８は、ｐＦｅｒＸ７を生成する、ｐＦｅｒＸ６への遠位３’隣接配列の付加を例示する。
【図９】図９は、プラスミドｐＦｅｒＸ８を生成する、ｐＦｅｒＸ７へのフェリチン重鎖遺伝子の遠位５’隣接配列の付加を例示する。
【図１０】図１０は、プラスミドｐＦｅｒＸ８の遺伝子地図を例示し、この遺伝子地図は、配列の供給源を含む。
【図１１】図１１は、プラスミドｐＦｅｒＸ９の遺伝子地図を例示し、この遺伝子地図は、配列の供給源を含む。
【図１２】図１２は、ｐＦｅｒＸ８プラスミドおよびｐＦｅｒＸ９プラスミドの転写領域の配列（配列番号１８）を例示する。
【図１３】図１３は、ＤＨＦＲ発現プラスミドの一つであるｐＳＩＤＨＦＲ．２遺伝子地図を例示する。
【図１４】図１４は、トランスフェクタントのプール中のレポーター遺伝子発現を測定する実験の結果を示す。
【図１５】図１５は、トランスフェクトされた単離物におけるレポーター遺伝子発現を測定する実験の結果を示す。
【国際調査報告】
2006503583.tif 000048
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