(57)【要約】アルツハイマー病（ＡＤ）の診断方法が開示される。方法は、血液または血液製剤が望ましい体液において、具体的にはヒトグルタミン合成酵素である生化学マーカーの存在を直接検出することを含む。検出はヒトグルタミン合成酵素に特異な抗体を免疫学的検定法によって組み込む。さらに、ＡＤ性痴呆と非ＡＤ性痴呆とを識別する方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類のアルツハイマー型痴呆を診断し識別する方法であって、
前記哺乳類から体液検体を採取するステップと、
アルツハイマー病の生化学マーカーに特異的に結合する少なくとも１つの抗体に前記検体を接触させるステップと、
前記検体中の前記生化学マーカーの存在を判定するステップと、
前記生化学マーカーの存在をアルツハイマー型痴呆の発現と関連付けるステップと、
を含む方法。
【請求項２】
痴呆を示す臨床症状を示す哺乳類においてアルツハイマー型痴呆を非ＡＤ型痴呆と識別する方法であって、
前記哺乳類から体液検体を採取するステップと、
アルツハイマー病の生化学マーカーに対して特異的結合特性を有する少なくとも１つの抗体に前記検体を接触させるステップと、
前記検体中の前記生化学マーカーのレベルを測定するステップと、
前記生化学マーカーの前記測定したレベルをアルツハイマー型痴呆及び非アルツハイマー型痴呆を示す統計的有意水準と関連付けるステップと、
を含み、
それによってＡＤ型痴呆と非ＡＤ型痴呆とが鑑別診断されることを特徴とする方法。
【請求項３】
前記生化学マーカーがヒトグルタミン合成酵素であることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記体液検体が血液または血液製剤であることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
前記抗体がヒトＧＳに対して特異的な少なくとも１つの単クローン抗体であることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項６】
前記検体の前記測定が免疫学的検定技術によることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項７】
アルツハイマー型痴呆の進行の診断及び観察用診断キットであって、
アルツハイマー型痴呆を示す少なくとも１つのマーカーに対して特異的である少なくとも１つの抗体を含み、前記抗体又はマーカーは固定票上で固定されており、
前記キットは前記マーカーに結合される少なくとも１つの標識を付された抗体をさらに含み、
それによってマーカー、それ対して特異的な抗体、又はそれらの免疫学的に検出可能な断片の存在を判定する少なくとも１つの分析が体液検体で実施されることを特徴とするキット。
【請求項８】
前記マーカーはヒトグルタミン合成酵素であり、前記抗体はそれに対して特異的な少なくとも１つの単クローン抗体であることを特徴とする請求項７記載のキット。
【請求項９】
前記体液検体は血液または血液製剤であることを特徴とする請求項７記載のキット。
【請求項１０】
診断及び観察が単一の体液検体について実施されることを特徴とする請求項７記載のキット。
【請求項１１】
診断及び観察が複数の体液検体について実施され、少なくとも１つの分析が第１の体液検体で実施され、少なくとももう１つの分析が第２の体液検体で実施されることを特徴とする請求項７記載のキット。
【請求項１２】
前記第１及び第２の体液検体は異なる期間に採取されることを特徴とする請求項１１記載のキット。
【請求項１３】
寄託番号ＰＴＡ−３３３９下でアメリカンタイプカルチャコレクションに寄託されているハイブリドーマ細胞株１Ｇ３。
【請求項１４】
寄託番号ＰＴＡ−３３３９下でアメリカンタイプカルチャコレクションに寄託されているハイブリドーマ細胞株１Ｇ３から作成された単クローン抗体。
【請求項１５】
寄託番号ＰＴＡ−３３３９下でアメリカンタイプカルチャコレクションに寄託されているハイブリドーマ細胞株１Ｇ３から作成された単クローン抗体を用いて検体中のヒトグルタミン合成酵素を検出する方法であって、前記検体を前記単クローン抗体に接触させて前記検体中の前記グルタミン合成酵素と前記単クローン抗体との間に免疫反応を生じさせるステップと、前記免疫反応を検出するステップと、を含む方法。
【請求項１６】
寄託番号ＰＴＡ−３３４０下でアメリカンタイプカルチャコレクションに寄託されているハイブリドーマ細胞株５Ｇ４。
【請求項１７】
寄託番号ＰＴＡ−３３４０下でアメリカンタイプカルチャコレクションに寄託されているハイブリドーマ細胞株５Ｇ４から作成された単クローン抗体。
【請求項１８】
寄託番号ＰＴＡ−３３４０下でアメリカンタイプカルチャコレクションに寄託されているハイブリドーマ細胞株５Ｇ４から作成された単クローン抗体を用いて検体中のヒトグルタミン合成酵素を検出する方法であって、前記検体を前記単クローン抗体に接触させて前記検体中の前記グルタミン合成酵素と前記単クローン抗体との間に免疫反応を生じさせるステップと、前記免疫反応を検出するステップと、を含む方法。
【請求項１９】
少なくとも１つの動物宿主においてヒトグルタミン合成酵素に対して作成された多クローン抗体。
【請求項２０】
ヒトグルタミン合成酵素又は免疫学的に検出可能なその断片に特異的に結合する抗体。
【請求項２１】
単クローン抗体である請求項２０記載の抗体。
【請求項２２】
多クローン抗体である請求項２０の抗体。
【請求項２３】
抗体の断片である請求項２０記載の抗体。
【請求項２４】
請求項２０記載の抗体を含む診断キット。
【請求項２５】
アルツハイマー型痴呆の進行の診断及び観察用診断キットであって、
アルツハイマー型痴呆を示す少なくとも１つの脳関連マーカーに対して特異的であるヒトグルタミン合成酵素に対して作成された少なくとも１つの抗体を含み、前記抗体又はマーカーは固定票上で固定されており、
前記キットは前記マーカーに結合する少なくとも１つの標識を付された抗体をさらに含み、
それによって、前記マーカー、それに特異的な抗体、又はそれらの免疫学的に検出可能な断片の存在を判定する少なくとも１つの分析が体液検体で実施されることを特徴とするキット。
【請求項２６】
アルツハイマー型痴呆の進行の診断及び観察用キットであって、
アルツハイマー型痴呆を示す少なくとも１つの脳関連マーカーに対して特異的であるヒトグルタミン合成酵素に対して作成された少なくとも１つの抗体を含み、前記抗体又はマーカーは固定票上で固定されており、
前記キットは前記マーカーに結合する少なくとも１つの標識を付された抗体をさらに含み、
それによって前記マーカー、それに特異的な抗体、又はそれらの免疫学的に検出可能な断片の存在を判定する少なくとも１つの分析が血液検体又は血液製剤検体で実施されることを特徴とするキット。
【請求項２７】
アルツハイマー型痴呆の進行の診断及び観察用診断キットであって、
アルツハイマー型痴呆を示す少なくとも１つの脳関連マーカーに対して特異的であるヒトグルタミン合成酵素に対して作成された少なくとも１つの単クローン抗体を含み、前記抗体又はマーカーは固定票上で固定されており、
前記キットは前記マーカーに結合する少なくとも１つの標識を付された抗体をさらに含み、
それによって前記マーカー、それに特異的な抗体、又はそれらの免疫学的に検出可能な断片の存在を判定する少なくとも１つの分析が体液検体で実施されることを特徴とするキット。
【請求項２８】
アルツハイマー型痴呆の進行の診断及び観察用診断キットであって、
アルツハイマー型痴呆を示す少なくとも１つの脳関連マーカーに対して特異的であるヒトグルタミン合成酵素に対して作成された少なくとも１つの単クローン抗体を含み、前記抗体又はマーカーは固定票上で固定されており、
前記キットは前記マーカーに結合する少なくとも１つの標識を付された抗体をさらに含み、
それによって前記マーカー、それに特異的な抗体、又はそれらの免疫学的に検出可能な断片の存在を判定する少なくとも１つの分析が血液検体又は血液製剤検体で実施されることを特徴とするキット。
【請求項２９】
アルツハイマー型痴呆の進行の診断及び観察用診断キットであって、
脳関連ヒトグルタミン合成酵素に対して特異的であるヒトグルタミン合成酵素に対して作成された少なくとも１つの抗体を含み、前記抗体又は脳関連ヒトグルタミン合成酵素は固定票上で固定されており、
前記キットは前記脳関連ヒトグルタミン合成酵素に結合する少なくとも１つの標識を付された抗体をさらに含み、
それによってヒトグルタミン合成酵素、それに特異的な抗体、又はそれらの免疫学的に検出可能な断片の存在を判定する少なくとも１つの分析が体液検体で実施されることを特徴とするキット。
【請求項３０】
アルツハイマー型痴呆の進行の診断及び観察用診断キットであって、
脳関連ヒトグルタミン合成酵素に対して特異的である少なくとも１つの抗体を含み、前記抗体又は脳関連ヒトグルタミン合成酵素は固定票上で固定されており、
前記キットは前記ヒトグルタミン合成酵素に結合する少なくとも１つの標識を付された抗体をさらに含み、
それによってヒトグルタミン合成酵素、それに特異的な抗体、又はそれらの免疫学的に検出可能な断片の存在を判定する少なくとも１つの分析が血液検体又は血液製剤検体で実施されることを特徴とするキット。
【請求項３１】
アルツハイマー型痴呆の進行の診断及び観察用診断キットであって、
約４４ｋＤａの重量を有する単量体脳関連ヒトグルタミン合成酵素に対して特異的である少なくとも１つの抗体を含み、前記抗体又は脳関連ヒトグルタミン合成酵素は固定票上で固定されており、
前記キットは前記ヒトグルタミン合成酵素に結合する少なくとも１つの標識を付された抗体をさらに含み、
それによって約４４ｋＤａの重量を有する単量体脳関連ヒトグルタミン合成酵素、それに特異的な抗体、又はそれらの免疫学的に検出可能な断片の存在を判定する少なくとも１つの分析が体液検体で実施されることを特徴とするキット。
【請求項３２】
アルツハイマー型痴呆の進行の診断及び観察用診断キットであって、
約４４ｋＤａの重量を有する単量体脳関連ヒトグルタミン合成酵素に対して特異的である少なくとも１つの抗体を含み、前記抗体又は脳関連ヒトグルタミン合成酵素は固定票上で固定されており、
前記キットは前記ヒトグルタミン合成酵素に結合する少なくとも１つの標識を付された抗体をさらに含み、
それによって約４４ｋＤａの重量を有する単量体脳関連ヒトグルタミン合成酵素、それに特異的な抗体、又はそれらの免疫学的に検出可能な断片の存在を判定する少なくとも１つの分析が血液検体又は血液製剤検体で実施されることを特徴とするキット。
【請求項３３】
アルツハイマー型痴呆の進行の診断及び観察用診断キットであって、
約４４ｋＤａの重量を有する単量体脳関連ヒトグルタミン合成酵素に対して特異的である少なくとも１つの単クローン抗体を含み、前記抗体又は脳関連ヒトグルタミン合成酵素は固定票上で固定されており、
前記キットは前記ヒトグルタミン合成酵素に結合する少なくとも１つの標識を付された抗体をさらに含み、
それによって約４４ｋＤａの重量を有する単量体脳関連ヒトグルタミン合成酵素、それに特異的な抗体、又はそれらの免疫学的に検出可能な断片の存在を判定する少なくとも１つの分析が体液検体で実施されることを特徴とするキット。
【請求項３４】
アルツハイマー型痴呆の進行の診断及び観察用診断キットであって、
約４４ｋＤａの重量を有する単量体脳関連ヒトグルタミン合成酵素に対して特異的である少なくとも１つの単クローン抗体を含み、前記抗体又は脳関連ヒトグルタミン合成酵素は固定票上で固定されており、
前記キットは前記ヒトグルタミン合成酵素に結合する少なくとも１つの標識を付された抗体をさらに含み、
それによって約４４ｋＤａの重量を有する単量体脳関連ヒトグルタミン合成酵素、それに特異的な抗体、又はそれらの免疫学的に検出可能な断片の存在を判定する少なくとも１つの分析が血液検体又は血液製剤検体で実施される方法。
【請求項３５】
哺乳類のアルツハイマー型痴呆及びその進行を診断し識別する方法であって、
前記哺乳類から体液検体を採取するステップと、
Ｓ−１００タンパク質のベータイソ型、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、及びグルタミン合成酵素又は免疫学的に検出可能なその断片から成るグループから選択される少なくとも１つの生化学マーカータンパク質に対して特異的結合特性を有する抗体から成るグループから選択される少なくとも１つの抗体又は抗体の断片に前記検体を接触させるステップと、を含み、前記抗体は固定票上で固定されることが可能であり、
前記方法は少なくとも１つの標識を付された抗体に前記検体をさらに接触させるステップをさらに含み、前記標識を付された抗体の各々は前記選択された生化学マーカータンパク質の１つに対して親和性を有することを特徴としており、
それによって前記マーカーの各々、それに特異的な抗体、又はそれらの免疫学的に検出可能な断片の存在を判定し計測する少なくとも１つの分析が体液検体で実施され、
前記検体中の前記各選択された生化学マーカータンパク質の存在を判定し、
前記選択された生化学マーカータンパク質のそれぞれの存在をアルツハイマー型痴呆の発現と関連付けることを特徴とする方法。
【請求項３６】
痴呆を示す臨床症状を示す哺乳類においてアルツハイマー型痴呆を非ＡＤ型痴呆と識別する方法であって、
前記哺乳類から体液検体を採取するステップと、
Ｓ−１００タンパク質のベータイソ型、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、及びグルタミン合成酵素（ＧＳ）又は免疫学的に検出可能なその断片から成るグループから選択される少なくとも１つの生化学マーカータンパク質に対して特異的結合特性を有する抗体から成るグループから選択される少なくとも１つの抗体又は抗体の断片に前記検体を接触させるステップと、を含み、前記抗体は固定票上で固定されることが可能であり、
前記方法は、前記検体中の前記選択された生化学マーカータンパク質のレベルを測定するステップと、
前記選択された生化学マーカータンパク質の前記測定したレベルをアルツハイマー型痴呆及び非アルツハイマー型痴呆を示す統計的有意水準に関連付けるステップと、
をさらに含み、
それによってＡＤ型痴呆と非ＡＤ型痴呆とが鑑別診断されることを特徴とする方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの生化学マーカータンパク質がヒトグルタミン合成酵素であることを特徴とする請求項３５または３６記載の方法。
【請求項３８】
前記体液検体が血液または血液製剤であることを特徴とする請求項３５または３６記載の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも１つの抗体がヒトＧＳに対して特異的である単クローン抗体であることを特徴とする請求項３５または３６記載の方法。
【請求項４０】
前記検体の前記計測が免疫学的検定技術によるものであることを特徴とする請求項３５または３６記載の方法。
【請求項４１】
アルツハイマー型痴呆の進行の診断及び観察用診断キットであって、
３つの異なるマーカータンパク質の各々に対して特異的であって、固定票上で固定され得る１つから３つの抗体を含み、
ａ．  第１のマーカータンパク質がＳ１００のベータイソ型であり、第１抗体または抗体の断片がそれに対して特異的であり、
ｂ．  第２のマーカータンパク質がニューロン特異的エノラーゼであって、第２抗体または第２抗体の断片がそれに対して特異的であり、
ｃ．  第３のマーカータンパク質がグルタミン合成酵素（ＧＳ）であって、第３の抗体または第３の抗体の断片がそれに対して特異的である、ことを特徴とし、
前記キットは、
ｄ．  １つから３つの標識を付された抗体から、前記マーカータンパク質の１つに結合している前記標識を付された抗体の各々と、
ｅ．  前記３つのマーカータンパク質の各々を前記マーカータンパク質のそれぞれの固有しきい値と比較して、正常レベルより上の少なくともおよそ２標準偏差の統計的に明らかなその濃度の存在を判定する手段と、
をさらに含み、
それによって、少なくとも１つのマーカー、それに特異的な抗体、又はそれらの免疫学的に検出可能な断片の存在を判定する少なくとも１つの分析が体液検体で実施され、
前記３つのマーカーを比較する前記ステップがアルツハイマー型痴呆の発生を確認することを特徴とするキット。
【請求項４２】
前記第３のマーカータンパク質はヒトグルタミン合成酵素であり、前記抗体または抗体の断片はそれに対して特異的な少なくとも１つの単クローン抗体であることを特徴とする請求項４１記載のキット。
【請求項４３】
前記体液検体が血液又は血液製剤であることを特徴とする請求項４１記載のキット。
【請求項４４】
前記診断及び観察が単一の体液検体で実施されることを特徴とする請求項４１記載のキット。
【請求項４５】
前記診断及び観察が複数の体液検体で実施され、少なくとも１つの分析が第１の体液検体で実施され、少なくとももう１つの分析が第２体液検体で実施されることを特徴とする請求項４１記載のキット。
【請求項４６】
前記第１及び第２の体液検体は異なる時期に採取されることを特徴とする請求項４５記載のキット。
【請求項４７】
グルタミン合成酵素検出用の前記抗体は、寄託番号ＰＴＡ−３３４０下でアメリカンタイプカルチャコレクションに寄託されているハイブリドーマ細胞株５Ｇ４から作成された単クローン抗体または抗体の断片であることを特徴とする請求項３５記載のアルツハイマー型痴呆及びその進行の診断及び識別方法。
【請求項４８】
グルタミン合成酵素検出用の前記抗体は、寄託番号ＰＴＡ−３３４０下でアメリカンタイプカルチャコレクションに寄託されているハイブリドーマ細胞株５Ｇ４から作成された単クローン抗体または抗体の断片であることを特徴とする請求項３６記載の痴呆を示す臨床症状を示す哺乳類においてアルツハイマー型痴呆と非アルツハイマー型痴呆とを識別する方法。
【請求項４９】
グルタミン合成酵素検出用の前記抗体は、寄託番号ＰＴＡ−３３４０下でアメリカンタイプカルチャコレクションに寄託されているハイブリドーマ細胞株５Ｇ４から作成された単クローン抗体または抗体の断片であることを特徴とする請求項４１記載のアルツハイマー型痴呆の進行の診断及び観察用診断キット。
【請求項５０】
グルタミン合成酵素検出用の前記抗体は、寄託番号ＰＴＡ−３３３９下でアメリカンタイプカルチャコレクションに寄託されているハイブリドーマ細胞株１Ｇ３から作成された単クローン抗体または抗体の断片であることを特徴とする請求項３５記載のアルツハイマー型痴呆及びその進行の診断及び識別方法。
【請求項５１】
グルタミン合成酵素検出用の前記抗体は、寄託番号ＰＴＡ−３３３９下でアメリカンタイプカルチャコレクションに寄託されているハイブリドーマ細胞株１Ｇ３から作成された単クローン抗体または抗体の断片であることを特徴とする請求項３６記載の痴呆を示す臨床症状を示す哺乳類においてアルツハイマー型痴呆と非アルツハイマー型痴呆とを識別する方法。
【請求項５２】
グルタミン合成酵素検出用の前記抗体は、寄託番号ＰＴＡ−３３３９下でアメリカンタイプカルチャコレクションに寄託されているハイブリドーマ細胞株１Ｇ３から作成された単クローン抗体または抗体の断片であることを特徴とする請求項４１記載のアルツハイマー型痴呆の進行の診断及び観察用診断キット。
【請求項５３】
前記哺乳類がヒトであることを特徴とする請求項３５記載の方法。
【請求項５４】
前記哺乳類がヒトであることを特徴とする請求項３６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明はアルツハイマー型痴呆（ＡＤ）の診断方法に関する。特に本発明は、アルツハイマー型痴呆に関する少なくとも１つの生化学マーカーの存在を定量化する処理に関する。さらに具体的には、本発明は特有の抗体を利用する治療時の免疫学的検定法に関し、アルツハイマー型痴呆対非アルツハイマー型痴呆の鑑別診断を可能にする。
【発明の背景】
【０００２】
アルツハイマー病は、アルツハイマー型痴呆またはＡＤとも呼ばれ、進行性神経変性障害であり、記憶障害及び重大な精神機能低下を引き起こす。診断医は、頭脳組織の組織病理学検査に反対して、痴呆性患者の生存期間中に、決定的にＡＤを特定する手段を切望してきた。組織病理学検査はＡＤの最終的な診断を下すことが可能な現在唯一の手段である。ＡＤは痴呆の最も良くある形態であり、全痴呆の半分以上を数え、４万人のアメリカ人及び世界中で１５０万人近くの人々が冒されている。痴呆は軽い記憶障害及び混乱状態から始まるが、知的能力及び社会的能力の深刻な障害に至る時に進む。６５歳でのＡＤ罹患率は１％から２％の間である。７５歳までにその数字は７％に上昇し、８５歳までに１８％となる。６５歳を越える全ての人々における痴呆の罹患率は８％である。施設に居住する人々では、罹患率はあらゆる年齢層で約５０％である。
【０００３】
この病気の社会的影響は大きなものであり、とりわけ病気の最終局面において介護者が負う負担が原因となる。実質的な経済費用は対症療法及び施設への入院に主として関係する。社会における高齢者の急増はＡＤに罹患する人の数が飛躍的に増加することを意味する。それゆえ、ＡＤの早期の正確な診断及び治療法を発見することが世界的に重要な問題になってきている。
【０００４】
ある人にＡＤの疑いがあるとき、いくつかの推奨検査が行われる。
（１）簡易精神状態鑑定（ＭＭＳＥ）−質疑応答（ＦＡＱ）の形式で機能自律性の程度を検査する診察室での精神測定検査、（２）臨床検査−完全血球算定、甲状腺刺激ホルモン、血清電解質、血清カルシウム、及び血清グルコース値の測定、（３）神経結像−最も一般的に用いられるのはコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）であり、血管性痴呆（ＶａＤ）、腫瘍、正常圧水頭症、又は硬膜下血腫などの痴呆のある種の原因を検出する役割を有する。しかしながら、神経結像は、ＡＤまたは他の皮質痴呆を通常の老化と区別することにおいてほとんど効果がない。初期治療の設定において、ＣＴは非定型の患者に限定され得ると提案する人もいるが、型通りのスキャニングを推奨する人もいる。磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）は、今のところたいていの痴呆の場合においてＣＴを上回る何等の利点ももたらさない。
【０００５】
アルツハイマー痴呆は痴呆の最も良くある形式であって症例の少なくとも６０％を数えるが、痴呆の正確な原因を判定する診断手順は、８０を越える異なる種類にあって、いくらよく見ても難しいものである。さらに、現在行われている検査はＡＤを他の型の痴呆と区別するのに不十分である。
【０００６】
他の疾病領域と比較して、痴呆分野は診断の価値について問題を提起する。なんとなれば、今のところ可能な何等の治療剤や有効治療がないからである。痴呆において、全ての他の医薬部門においてみられるように、診断の確実性は患者の治療に重大な影響を与える。現在の所ＡＤは治療できないが、対処療法が可能であり、認識及び行動の一時的な改善のために最初に投与される薬（アセチルコリネステラス抑制剤）がＵ．Ｓ．フード・アンド・ドラッグアドミニストレーション社に現在認可されている。他の薬は臨床試験の様々な段階にある。（１）ＡＤにおける衰退を防げる薬−デスフェリオキサミン、ＡＬＣＡＲ、抗炎症薬、老化防止剤、エストロゲン、（２）神経栄養因子：ＮＧＦ、（３）ワクチン：シェンク氏その他による近年最も刺激的な報告書（ネイチャー誌１９９９年；４００：１７３−７）においてＡＤ用ワクチンの見込みが取り上げられている。
【０００７】
このように様々な治療の特異性によって、治療法の成功を保証するために、ＡＤに対して高感度である高度な診断方法が必要とされている。
【０００８】
現在のところ、ＡＤ診断を助ける数々の可能な検査がある。しかしながら、唯一の真の既存の診断は、痴呆の病歴に関連して死後の脳組織の病理学検査によって成される。この診断は、神経原線維変化及び老人斑が脳組織に存在することに基づいていて、臨床痴呆と相関関係がある。老人斑はアミロイドベータと呼ばれる通常無害のタンパク質で構成される。ニューロンが死に始め症状が進展するより前に、血小板の沈着物が疾患過程の早い時期にニューロン間にできる。神経原線維変化は正常で対になった糸状体から成るニューロン内集合体であり、いくつかの異なるタンパク質から構成されていると思われる。脳ニューロンの内部支持構造はタウと呼ばれるタンパク質の正常機能に依存する。アルツハイマー病では、タウタンパク質の繊維が繊維にねじれを引き起こす交替を被る。神経組織病理学的識別並びに神経症斑及び神経原線維変化の計数にはいくつかの脳の部分の染色及び顕微鏡検査を必要とする。しかしながら、この方法の結果は、広範囲に変化し、時間がかかり、かつ大きな労働力を要する。
【０００９】
アルツハイマー型痴呆の初期及び／または進行を食い止めかつ／または改善する現在と将来の両方の薬理学的治療の能力を考えると、ＡＤの早期診断は患者の介護をよりよく行うことに役立つだろう。非ＡＤ型痴呆がＡＤ型痴呆と間違われるケースが多くある。係る例には、脳に流れる血液を一時的に遮断する小さな気付かれない発作が含まれる。臨床的には鬱病患者やパーキンソン病の人々も記憶の欠落を経験し得る。多くの高齢者は様々な投薬を受けており、副作用として、単独で又は連動して、それらの人々の認知作業遂行能力を損なう。
【００１０】
よって、ＡＤを早期に弁別する診断技術が提供されると、医者はより一層の能力を実現してこの病気の病因の初期段階で適正な治療法を処方するだろう。
【００１１】
ＡＤに対する様々な生化学マーカーは公知であり、かかるマーカーの判定のための分析技術が先行技術において開示されてきた。ここに用いられたように、用語「マーカー」、「生化学マーカー」、又は「マーカータンパク質」は酵素、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、その同位体、その免疫学的検出可能断片、又はＡＤ病因の過程で脳から放出される他の分子のいずれかを言う。係るマーカーは、特に脳に関係する特有のタンパク質またはそのイソ型を含むが、これらに限定されない。
【００１２】
グルタミン合成酵素（ＧＳ）は、脳損傷の後に過剰に発現するアンモニア及びグルタミン酸の代謝調整に関与する星状細胞固有酵素として認知されている（ノーレンベルグ及びマルチネックス・ヘルナンデス氏による「Brain Res」１９７９年、１６１：３０３）。グルタミン合成酵素の臨床上の役割に関するいくつかの研究が報告されている。ガンナーセン及びヘイリー氏（「Proc Natl Acad Sci」、 1992年、８９：１１９４９）は３９個のＡＤ脳脊髄液（ＣＳＦ）検体のうち３８個において単量体ＧＳタンパク質を発見した。チュマニ氏その他（「Arch Neurol」、１９９９年、５６（１０）：１２４１）は、ＡＤ患者の腰椎ＣＳＦにおけるＧＳの濃度がはっきりとしかし非特定的（即ち、ＶａＤ、統合失調症、及びＡＬＳでも増加する）に増加するということを説明している。１２４４頁の左側コラムで、チュマニ氏はＧＳは血清中に発見されなかったと述べている。
【００１３】
ニューロン特異的ガンマエノラーゼ（ＮＳＥγγ）及びＳ１００Ｂタンパク質は、脳内に豊富にあり、脳損傷の範囲を判断するための有用なマーカーでもある。ＮＳＥγγはニューロン損傷に対し、Ｓ１００Ｂは星状細胞損傷に対する。脳皮質領域からのＮＳＥタンパク質及びＳ１００Ｂタンパク質の濃度は酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）を用いて検査されてきた。ＡＤ患者の前頭皮質におけるこれらのタンパク質のレベルは、明らかに増加されるということが発見された(カトウ氏その他による「J Mol Neurosci」、１９９１年、３（２）：９５)。Ｓ１００Ｂを過剰発現する活性化星状細胞はＡＤのβアミロイド斑に緊密に結びつけて考えられてきた（シェン氏その他による「J Neurosci Res」、１９９４年、３９：３９８、ムラク氏その他による「J Neuropathol Exp Neurol」、１９９６年、５５：２７３）。
【００１４】
ＡＤ鑑定におけるバイオマーカーに対しては多くの様々な潜在的使用法がある。各々の使用法は異なる１つのマーカー又は１組のマーカーを含むだろう。係る使用法にはＡＤと痴呆の他の原因とを区別するマーカーの使用法が含まれるが、これに限定されない。即ち、老化による非病理学的影響と痴呆とを区別すること、臨床的症状が顕著になった後の病気の進行を観察すること、ＡＤに対する来るべき治療の効果を観察するための代用物の利用、及びＡＤに対するリスク評価要因として有用性を有するマーカーを分離すること、及び脳内で起きる初期の生物学的変化及び病気の進行につれて起きる他の変化の両方を識別すること、が含まれる。単一のマーカーを分離して高度の感度及び特異性ですべての要件を実行することが望ましく理想的である。しかしながら、これは実状にそぐわないゴールであるかもしれない。個々のマーカーは、適用される予定の臨床症状のタイプに対する感度、特異性、及び有効性によって評価されることが必要である。あるマーカーは痴呆の別の原因とＡＤとを区別するのが得意でないが、それでも疾患過程の進行または治療への反応を観察することに優れたマーカーであるだろう。
【００１５】
診断装置に関して、生物製剤マーカーを利用する臨床評価及び治療時の検査の使用がリスクを評価し、病気の進行を観察し、治療行為を導くための有用なツールである。診断ツールとして生物製剤マーカーの使用から生まれる利点には、臨床的診断の確実性を高めること、痴呆の他の原因とＡＤとを区別すること、及び病気の重症度及び進行の速度を分類することが含まれる。さらに、生物製剤マーカーを用いる試験は、迅速で、非侵襲性で、実行するのに容易であって、かつ費用のかからないものでなければならない。
【００１６】
先行技術に不足していることは、比較的非侵襲性であって、その結果生存している患者のアルツハイマー型痴呆を明確に診断することに有効な方法及びそのための装置である。さらに、ＡＤを進行の危険性を評価する明確な方法が大いに必要とされている。
【先行技術の説明】
【００１７】
ヘイリー氏による米国特許第５，４４５，９３７号はアルツハイマー病の診断方法及び他の病気の診断及び鑑別手段を開示する。これは、病気特異的生化学マーカー、グルタミン合成酵素（ＧＳ）、及びそのそれぞれの光親近性標識またはＧＳの結合部位でＧＳに対して特異的な標識付けされた抗体を用いて成される。第９３７号特許は、髄液（ＣＳＦ）を検査して光親近性標識、または標識付けされた抗体、ヌクレオチド結合タンパク質の存在を検出することに注目し、続いて起こるレベルをＡＤの存在に関係付ける。ヘイリー氏は係る方法を実行する様々な免疫学的検定技術を開示している。ヘイリー氏は検体として血液を用いる診断方法の予言的な有用性に関し仮定をたて、単クローン抗体及び／または多クローン抗体が免疫学的検定が開発されるとさらに提案した。そうは言っても彼は、実行して何れを減じることもできなかった。よって、第９３７号特許は髄液を利用する診断試験を開示することだけに有益である。髄液の検体を得ることは患者にかなり不愉快である侵襲性技術を伴い、実施するには長時間を要する。さらに、ヘイリー氏によって提案された唯一の多クローン抗体及び／または単クローン抗体は、ここで今開示されるようなＧＳのヒト組み換え型に対して、羊の脳のＧＳへの特異性を有するものである。
【００１８】
米国特許第５，５０８，１６７号において、ロゼス氏その他はアポリポタンパク質Ｅタイプ４（ＡｐｏＥ４）イソ型またはＤＮＡコード化ＡｐｏＥ４に関係するＡＤ診断方法を開示する。この方法は血清検体を用いることができ、免疫化学的検定法によって分析される。血清検体は随意に還元剤と結びつけられて、システイン残基におけるジスルフィド結合を対応する活性スルフヒドリル基に分解する。ロゼス氏その他はＡｐｏＥ４イソ型の検出用キットをさらに開示する。この検査は三大ＡｐｏＥイソ型のアミノ酸配列差に基づいている。この検査はヒトＧＳに対して特異的でなく、ＡＤ型痴呆対非ＡＤ型痴呆を区別して診断することに敏感でもない。
【００１９】
チュマニ氏その他（「Arch. Neurol.」、１９９９年、５６、１２４１乃至１２４６頁）はＣＳＦにおけるＧＳレベル及び血清検査を検査し、ＧＳがＡＤ診断における有用な生化学マーカーであるかどうかを判定する。分析はＥＬＩＳＡにより、羊の脳のＧＳに対して示されたビオチン標識単クローン抗体が利用される。ＧＳ濃度の正常範囲は、人間のＣＳＦにおいて４ｐｇ／ｍＬであり、人間の血清において３６ｐｇ／ｍＬと報告されている。 ＡＤ患者のＣＳＦ検体は２０±１２ｐｇ／ｍＬの平均ＧＳ濃度レベルで上昇し、１３±１３ｐｇ／ｍＬでＡＬＳ患者であり、平均上昇レベル１３±７ｐｇ／ｍＬで血管性痴呆（ＶａＤ）患者である。血管性痴呆患者及びＡＬＳ患者はわずかに低い増加を示す。ＡＤ患者は血清中に１１１±５３ｐｇ／ｍＬの平均レベルが測定される。しかしながら、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）患者及び血管性痴呆患者も血清中にそれぞれ１１６±６２ｐｇ／ｍＬと７２±５９ｐｇ／ｍＬの平均上昇レベルを示す。よって、ＡＤ型痴呆に関する明確な診断、又はＡＤと非ＡＤ型痴呆との間の鑑別診断はこれらの検定法から説明されないだろう。
【００２０】
ガンナーセンとヘイリー（「Proc. Natl. Acad. Sci.」、１９９２年、８９、１１９４９乃至１１９５３頁）は、健常対照被験者や他の病気を有する対照群のＣＳＦにおいてではなくＡＤ患者のＣＳＦにおいて検出されたＧＳの証拠を示す。考慮される他の病気はてんかん、ＡＬＳ、及びパーキンソン病である。ＡＤ患者に加えてＡＬＳまたはピック病の患者は、ＧＳがＡＤに特異的であることを示す肯定的な結果を示すが、一方ＡＬＳ患者は肯定的な結果を示さない。他の刊行物と同様に、非ヒトＧＳに対する抗体がＧＳ検出のために利用される。
【００２１】
概して、ほとんどの技術論文がペプチド、β−アミロイドに注目する傾向がある。なんとなれば、それがＡＤの主要な決定因子であると仮定されているからである。このことは家族性ＡＤ変異体のある形がβ―アミロイド、特に短形よりも容易に凝集する長形（Ｉ−４２）の生産過剰という結果になるという観察によって裏付けられる。ヘンスリー氏その他（「Proc. Natl. Acad. Sci.」、１９９４年、９１、３２７０乃至３２７４頁）は凝集状態におけるペプチドβ−アミロイドによって遊離基族に基づく神経毒性を検査する。ペプチドのいくつかの合成断片が結果として生じる神経毒性に対して検査される。酸素が基族に対する要件であると思われ、グルタミン合成酵素及びクレアチンキナーゼ・エンザイムが酸化感受性バイオマーカーであるという事実に基づくと、これらの酵素の不活性化が、これらの断片化されたβ−アミロイド会合体による生体分子への能動的攻撃の指標として利用される。
【発明の概要】
【００２２】
本発明はアルツハイマー型痴呆（ＡＤ）の診断方法に関する。特にアルツハイマー型痴呆を他の型の痴呆と区別して診断する方法に関し、特に血液、血液製剤、尿、唾液などの体液においてアルツハイマー病に対する特定の生化学マーカーの存在を検査することによる。本発明はさらにアルツハイマー型痴呆に関する少なくとも１つの生化学マーカーの存在を定量化する処理に関する。さらに詳しくは、本発明は治療時の免疫学的検定に関し、固有の抗体を利用してアルツハイマー型痴呆対非アルツハイマー型痴呆の鑑別診断を可能にする。
【００２３】
本発明はアルツハイマー病を診断し、サブタイプ分けし、観察する多くの方法及びＥＬＩＳＡシステムに関する。本発明はＳ１００Ｂ、ＮＳＥγγ、及びＧＳタンパク質は脳から放出され、脳外の体液中で検出され得るという発見に基づいている。
【００２４】
ヒトＧＳ組み替え体の生成及び精製が説明される。これらのＧＳタンパク質は、単クローン抗体または多クローン抗体を生成するために用いられて、次には免疫学的検定において用いられ得るかもしれない。免疫学的検定において抗体は免疫反応に入り、観察され、かつ／または定量化されて、疑わしい個体において循環ＧＳタンパク質を検出する。代わりに、ＧＳタンパク質自身が免疫学的検定において用いられてかかる個体における循環抗体を検出してもよい。アルツハイマー型痴呆の発生は体液中の特定の生化学マーカーのレベルの認知によって特徴付けられ、そのレベルは、ＭＭＳＥ検査によって定量化されるようにアルツハイマー型痴呆の症状の兆候に対応する。リスク評価試験として、アルツハイマー型痴呆の進行を示すかかるマーカーのレベルの認知は熟練開業医に提供される診断能力をさらに増強する。
【００２５】
従って、比較的非侵襲性でかつ高感度のアルツハイマー病の明確な診断方法を提供することが本発明の目的である。
【００２６】
患者の少なくとも１の体液の分析を含む方法を提供してＡＤ対非ＡＤ型痴呆の少なくとも１つのマーカーの存在を判定することが本発明のさらなる目的である。
【００２７】
本発明による方法によって識別されるような、ニューロン関連のタンパク質に特異的な抗体を提供することが本発明のさらなる目的である。
【００２８】
１以上の人間の体液におけるニューロン特異タンパク質の認知に効果的な免疫学的検定法を提供することが本発明のまたさらなる目的である。
【００２９】
ヒトグルタミン合成酵素に特異的な精製された単クローン抗体を提供することが本発明のまた別の目的である。
【００３０】
血液または血液製剤から成る検体を利用して実行され得る非侵襲性治療検査から成るＡＤ診断用検査キットを提供することが本発明のまたさらなる目的である。
【００３１】
本発明の他の目的及び利点は、図及び説明として、本発明のいくつかの実施例を示す添付図面に関係して取り込まれた以下の説明から明らかになるだろう。図面はこの明細書の一部を成し、本発明の模範的実施例を含み、その様々な目的及び特徴を説明する。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の方法に従って分析されるマーカーは血液循環中に放出され、例えば低張緩衝液又は浄化剤、希釈物及びその製剤で処理を施された血液又は血漿、血清、細胞化された血液などの血液製剤、及びＣＳＦ、唾液、尿、リンパ液などの他の体液において存在するかもしれない。別の好適実施例において、ＣＳＦにおけるマーカーの濃度が測定されるかもしれない。
【００３３】
用語「正常値よりも高い」及び「カットオフよりも高い」は、脳事象、即ち脳の変性や萎縮が進行中でない正常人において観察されるマーカーのレベルより高いマーカーのレベルに言及するために用いられる。いくつかのマーカーについて、マーカーの大変低いレベルが個体の血液中に普通に現れるかもしれない。本発明に従って分析された他のマーカーについて、検出可能なレベルが血液中に普通に現れるかもしれない。それゆえ、これらの用語は正常人において検出される正常レベルよりも著しく高いレベルを示す。用語「著しく」または「統計的に有意な」は統計的優位性を言い、正常またはより高いマーカー濃度よりも大きい２標準偏差（ＳＤ）を一般的に意味する。マーカータンパク質に対する分析を実行する評価方法は、マーカーのレベルを検出することができる感度でなくてはならない。マーカーのレベルは当該濃度範囲を超えて現れ、また大いに特異的でなければならない。
【００３４】
診断ツールとして価値を評価されて比較される３つのマーカーは、脳事象の間に脳内の特定の細胞が損傷を受けるときにこれらの細胞によって放出されるタンパク質である。例えばタンパク質などであるこれらのマーカーは、そのままの形であり得るし、若しくは、例えばタンパク質分解によって生じる免疫学的に検出可能なタンパク質の断片であるかもしれない。「免疫学的に検出可能な」ことは、マーカーの断片に検定法によって用いられた抗体の試薬によって明確に認知されるエピトープが含まれることを意味する。
【００３５】
本発明の方法に従って分析されるマーカーは特定の細胞型である。酵素エノラーゼは解糖経路において２ホスホグリセリン酸塩及びホスホエノールピルビン酸塩の相互転化を触媒する。酵素は各々が別個の遺伝子の生成物である３つのイソプロテイン中に存在する。遺伝子座はＥＮＯ１、ＥＮＯ２、及びＥＮＯ３を指定される。ＥＮＯ１の遺伝子産物は非ニューロンエノラーゼ（ＮＮＥまたはα）であって、様々な哺乳類の細胞組織中に広く分布する。ＥＮＯ２の遺伝子産物は筋肉特異エノラーゼ（ＭＳＥまたはβ）であって、主として心臓及び横紋筋に限局される。一方、ＥＮＯ３遺伝子の産物はニューロン特異エノラーゼ（ＮＳＥまたはγ）であり、ニューロン及び神経内分泌細胞内で主として検出される。自然酵素は、３つの免疫学的に異なるサブユニットα、β、及びγから成るホモ又はヘテロ二量体イソ型として検出される。各サブユニット（α、β、及びγ）はそれぞれ１６ｋＤａ、４４ｋＤａ、４６ｋＤａの分子量を有する。
【００３６】
αγ及びγγエノラーゼイソ型は、ニューロン特異エノラーゼとして指定されており、各々が８０，０００ダルトンまでの分子量を有する。ＣＳＦ及び血液中のＮＳＥ濃度が脳損傷（例えば脳卒中や頭部外傷）後に高くなり、損傷を受けた脳組織からのＣＳＦ及び血液循環中へのＮＳＥの放出は脳組織への損傷範囲に反映するということが示されてきた。ＮＳＥは４８時間までの生物学的半減期を有する。
【００３７】
Ｓ１００タンパク質は、脳の灰白質、主として星状膠細胞及びシュワン細胞において主に検出される細胞質酸性カルシウム結合タンパク質である。該タンパク質は、いくつかのホモ二量体イソ型又は２つの免疫学的に異なるサブユニットであるＡ１（ＭＷ１０，４００ダルトン）及びＢ（ＭＷ１０，５００ダルトン）から成るヘテロ二量体イソ型に存在する。中枢神経系（ＣＮＳ）において、ホモ二量体Ｓ１００Ｂ−Ｂ（２１，０００ダルトン）及びヘテロ二量体Ｓ１００Ａ１−Ｂ（２０，９００ダルトン）はＳ１００総量の９５％を越えて構成している（磯部氏その他による「Biochem Int」、１９８３年、６；４１９、ジンマー氏その他による「Brain Res Bull」、１９９５年、３７；４１７）。Ｓ１００Ｂの高率が脳内で検出されるので、多くの研究において脳損傷のマーカーとしてこのタンパク質が検査されてきた。Ｓ１００Ｂの生物学的半減期は１１３分である（ウスイ氏その他による「Clin Chem」、１９８９年、３５：１９４２）。Ｓ１００Ｂ血中濃度を繰り返し計測することは神経障害の原因を観察するのに有用である。
【００３８】
グルタミン合成酵素（ＧＳ）は遍在酵素であり、窒素源としてアンモニアを用いてグルタミンへのグルタミン酸塩のＡＴＰ依存転化を触媒する。ＧＳは肝臓、筋肉、腎臓、及び脳内に高濃度で存在する（デ・グート氏その他による「Biochim Biophys Acta」、１９８７年、９０８：２３１）。人間の脳内のＧＳは、潜在的神経毒グルタミン酸塩及びアンモニアのグルタミンへの転化を経てニューロンを保護することに関与する星状細胞特異酵素である。
【００３９】
ＧＳの2価陽イオン部位はＧＳの酸化に対して非常に敏感にする。
【００４０】
ＡＤ患者の脳の老人斑高密度領域は高酸化的ストレス環境を意味し、ＡＤ患者の脳内のそのタンパク質は対照物のタンパク質よりもより酸化されている。老人斑とともに広範囲に現れる反応性小神経膠細胞は脳内のオキシラジカルの原因として提案されている。
【００４１】
ＧＳの３つの異なるタイプが公知である。即ち、ＧＳＩ、ＧＳＩＩ、ＧＳＩＩＩである。ＧＳＩ及びＧＳＩＩＩの遺伝子はバクテリアにおいて検出された。ヒトＧＳ遺伝子はＧＳＩＩタイプに属する（ブラウン氏その他による「J Mol Evol」、１９９４年、３８：５６６）。脳内のＧＳは３６０，０００乃至４００，０００ダルトンの分子量とともに８量体構造として存在すると考えられる（チュマニ氏その他による「Immunol Meth」、１９９５年、１８８：１５５）。しかしながら、血液循環において、タンパク質はモノマー形式でＭＷ４４±１ｋＤａを有すると考えられる（ボクシャ氏その他による「J Neurochem」、２０００年、７５：２５７４）。ＧＳの高濃度がＡＤ患者から腰椎ＣＳＦにおいて報告された（ガンナーセンとヘイリー氏による「Proc Natl Acad Sci USA」、１９９２年、８９：１１９４９、チュマニ氏その他による「Arch Neurol」、１９９９年、５６：１２４１）。
【００４２】
ＣＳＦにおける高ＧＳ濃度に至る正確なメカニズムは不明のままである。反応性アストロサイトにおけるＧＳの過剰発現及びそれに続く細胞外液への放出が提案されている（チュマニ氏その他による「Arch Neurol」、１９９９年、５６：１２４１）。
【００４３】
本発明のさらなる検討された実施例において、体液検体は継続中の分析に対して１時点で、若しくは異なったいくつかの時点で患者から採取されるかもしれない。概して、最初の検体はＡＤの発現し得る症状が現れしだい患者から採取され、本発明に従って分析される。続いて、例えば最初の発現後約３−６ヶ月などの発現後のいくらかの期間後、第２検体が本発明に従って採取され分析される。データはＡＤを診断し、ＡＤを阻止し、ＡＤ型痴呆と非ＡＤ型痴呆との間の識別のために用いられ得る。
【００４４】
患者の体液中で検出された３つの特異マーカーのうちのいずれか１つ又は全てのレベルは単一の検体から測定されたが、１つ又はより多くの個別のマーカーが１つの検体中で測定され得る。「検体」は血液又はＣＳＦなどの体液を意味する。全てのマーカーは１つの検定装置で、若しくは、同じ検体のアリコートが用いられ得るケースにおいて各マーカーに対して別個の検定装置を用いて、測定され得る。分析が単一の分析装置又は別個の装置において行われるかどうかに関係なく、同じ単一の検体において３つのマーカーまでの各々が計測され、単一の検体に同時に現れる各々のマーカーのレベルが用いられて意味のあるデータを与え得ることが望ましい。
【００４５】
各々のマーカーの存在は、マーカーのそれぞれに対して特異な抗体を用いて、各々の抗体のそのそれぞれのマーカーへの特異的結合を検出して測定される。適切な直接又は間接の検定方法が用いられ、市販されて本発明に従って測定される特定のマーカーのそれぞれのレベルを測定する検定方法を含むかもしれない。検定法は競合アッセイ、サンドイッチアッセイであるかもしれない。その標識は放射免疫測定、蛍光または化学発光分析免疫検定、又は免疫ＰＣＲ技術などの公知の標識群から選択されるかもしれない。公知の免疫検定技術の広範囲に及ぶ論考はここでは必要でない。なんとなれば、これらは当業者に公知だからである。Ｓ１００Ｂ検定法については高橋氏その他を参照せよ（「Clin Chem」、１９９９年、４５（８）：１３０７）。
【００４６】
検体中のマーカータンパク質のレベルを測定する二抗体またはサンドイッチ・イライザから成る免疫検定法を、これに限定はされないが、この例においては用いた。この方法によると、抗体の１方は、固相上に固定化されている「捕獲」抗体であり、もう１方は例えば酵素を示す標識をつけた「検出」抗体である。検出抗体は捕獲抗体に結合したマーカータンパク質に結合してサンドイッチ構造を形成する。３つのマーカーの各々の検定法に対して、マーカータンパク質基準が用いられて吸光対マーカータンパク質濃度の基準又は較正曲線を作成する。この方法は重要である。なんとなれば、好適実施例の利点に加えて、付加マーカーであるＮＳＥ及びＳ１００Ｂはそれぞれ、ニューロンの進行中の破壊を知らせること及び脳内の深刻な事象を監視することに関与するからである。
【００４７】
マーカータンパク質を測定するために用いられる検定方法は、十分な感度を示して、各々のタンパク質を正常人において検出される正常値から病気の人々における高レベルまで、即ち正常及びそれより高い濃度範囲を越える２ＳＤ（＝切り捨て）の濃度範囲で測定し得るべきである。ＧＳタンパク質に対しては、切り捨てで０．０２２ｎｇ／ｍｌ、ＮＳＥ＝８．３４ｎｇ／ｍｌ、及びＳ１００Ｂ＝０．０２ｎｇ／ｍｌである。
【００４８】
検定法は様々な形式で実行され、バッチモードで検定法を実行することが望ましいマイクロタイター・プレート形式を含むかもしれない。検定法は、公知技術である自動分析器で実行されるかもしれない。本発明に従って用いられ得る別の検定形式は、いかなる治療場所でも処理され得る手動の簡易検査である。概して、係る装置は、切り上げ又は切り捨てした結果、即ち半定量的な結果を設けるだろう。
【００４９】
ｒｈＧＳの発現及び単クローン抗体の分離
ヒトグルタミン合成酵素（ヒト組み替え型ＧＳまたはｒｈＧＳ）に対する特有結合特性を備えた抗体を分離するために、ｒｈＧＳのｃＤＮＡをＡＴＣＣから購入した。ｒｈＧＳのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の全体はｐＥＴ２８ａ（Ｎｄｅｌ／Ｓｈｏｌ）におけるＰＣＲ及びサブクローニングによって得られた。構成はｒｈＧＳ  ＯＲＦのＮ末端で多ヒスチジン標識を含み、Ｃ末端で付加的な配列を含まなかった。タンパク質はリストローム氏その他（「Biochem J」、１９９７年、３２８：１５９）によって開示された技術に従って大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）へ発現させられる。尿素／アルカリ処理から成る不溶性発現生成物の可溶化同様に粗製細胞抽出物の準備がモリーノ氏その他（「J Comp Neurol」、１９９４年、３５０：２６０）による方法に従って実施された。アフィニティー精製が供給者の提案に従ってＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーによって実施された。
【００５０】
単クローン抗体の作成：
本発明の単クローン抗体はポリエチレン・グリコール（ＰＥＧ）媒介細胞溶融法によって作成された。
【００５１】
免疫細胞の作成：  Ｂａｌｂ／ｃ系の複数マウス、即ちカナダ国ケベック州セント・コンスタント市チャールズ・リバー・カナダの生後７−９週のメスからのＨ−２dハプロタイプを備えた菌株が、最初の注入に対する完全フロインドアジュバント（ＦＣＡ）及び、その後２−４週間間隔を空けたそれに続く注入に対するフロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）におけるいずれとも等しいＧＳの２５−１００μｇの量で乳化されたｒｈＧＳで免疫性を与えられた。免疫性を与えられた複数マウスは、ｐＨ７．４のリン酸塩緩衝化生理食塩水緩衝液（ＰＢＳ）において静脈内及び／又は腹膜組織内のいずれかへの最後の免疫付与の後３−４日で死んだ。
【００５２】
ハイブリドーマの作成：  ＧＳタンパク質及びＳｐ２／０細胞で免疫性を与えられた複数マウスからの脾臓細胞が、フューラー、ＳＡ、高橋、Ｍアンドハレル、ＪＧＲ（「単クローン抗体の作成（Preparation of Monoclonal Antibodies）」、インディアナ州：サスベル  Ｆ、ブレント  Ｂ、キングストン  Ｒ．、その他、ｅｄｓ、「分子生物学における最新手順（Current Protocols in Molecular Biology）」、ニューヨーク、グレーンパブリッシング・アソシエーツ、１９８７年、ユニット１１）によって開示された方法に従って、４２％ＰＥＧの存在下で溶融された。結果として生じた溶融細胞はＨＡＴ選択培地の中で懸濁され、フューラー氏その他（上記参照を参照せよ）によって開示されたように、支持細胞、即ち腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）を前もって接種された４つの９６ウェルプレート上に培養される。
【００５３】
ＧＳ特異抗体分泌ハイブリドーマ検査：
ハイブリドーマ培地の検査が２つの方法で実施された。（１）固相ＥＬＩＳＡ法−ＥＬＩＳＡ検査−１：密集ハイブリドーマ培養上清が、１００ｍＭのｐＨ９．６炭酸緩衝液に２μｇ／ｍｌでｒｈＧＳを被膜した９６ウェルマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ社ＭｕｘｉＳｏｒｐ、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）に追加された。過剰結合部位はｐＨ７．４のＰＢＳにおいてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によって阻害された。０．０５％トウィーン２０（ＷＢ）を含むＰＢＳでプレートを洗浄した後に、単クローン抗体を含む１００μＬ培養上清は３７℃で１時間固定化抗原で培養された。洗浄後、ペルオキシダーゼ共役ヤギ（goat）抗マウスＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch Lab, Inc.、ペンシルヴァニア州ウェスト・グラブ）が加えられ、軌道攪拌器上で室温（ＲＴ）で３０分間培養された。洗浄後、ＴＭＢ基質溶液（シグマ）が加えられた。暗闇の中でＲＴで５分間培養された後、反応は１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止し、光学的濃度は４５０nmと読み取れた。選択された陽性の培地はフューラー氏その他（上記参照を参照せよ）によって開示されたような限界希釈法によるクローン作成を条件とした。ＥＬＩＳＡ検査及びクローン作成手順は、培地の安定度及びクローン化が得られるまで繰り返された。（２）ＥＬＩＳＡ検査−２：第２の方法では、ハイブリドーマ培養上清における単クローン抗体がＥＬＩＳＡプレートの固相上で固定化されたヤギ抗マウスＩｇＧFc（Jackson ImmunoResearch社）経由で捕捉された。３７℃で１時間の培養後、プレートは方法１についてと同様に洗浄された。次に、０．５％ＢＳＡを有するＰＢＳにおいて１／２０００希釈で希釈されたビオチン化ＧＳ（製造者の勧告に従ってベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim）社からのビオチン標識キットを用いて作成した）が各々のウェルに加えられた。攪拌器上でＲＴで３０分間培養後、プレートは洗浄され、１０，０００分の１でＨＲＰ共役ストレプトアビジン（ベーリンガー・マンハイム社）が加えられてＲＴで３０分間培養された。洗浄後、ＴＭＢ基質溶液が加えられ、反応が方法１についてと同様に読みとられた。
【００５４】
ＥＬＩＳＡ検定法を展開するために、１Ｇ３及び５Ｇ４として指定されている２つのクローンが選択された。これらのクローンはブダペスト条約に基づいて、２００１年４月２５日、２０１１０−２２０９バージニア州マナッサス市ユニバーシティ・ブルバード１０８０１のアメリカンタイプカルチャコレクション（American Type Culture Collection）に、それぞれ受け入れ番号ＰＴＡ−３３３９及びＰＴＡ−３３４０下で預託された。３７ＣＦＲ１．８０８に基づいて、預託物の公共の可用性に課されたすべての制限は特許付与に関して取り消し不能に移転されるだろう。
【００５５】
単クローン抗体の作成：
ＧＳ特異単クローン抗体は腹水を用いて作成される。腹水は、ｐＨ７．４の０．２５−０．５ｍｌのＰＢＳで１−５χ１０6ハイブリドーマ細胞を腹膜内に注入することによってあらかじめ０．２５ｍｌプリスタンで処理したＢａＩｂ／ｃマウスにおいて作成された。１０から１４日後、腹水が収集された。腹水からの単クローン抗体は、公知の手順を用いて、アフィニティー・カラム（Ｇタンパク質、A VIDAL）上で精製された。生成された単クローン抗体は免疫化学的研究に対して用いられた。
【００５６】
多クローン抗体作成及び精製
ヤギはフロインドアジュバントにおいて乳化された精製ｒｈＧＳ２５０−５００μｇの筋肉注射及び／または皮下注射で隔週に免疫性を与えられた。滴定濃度は半サンドウィッチＥＬＩＳＡ法によって血清を検査することによって定期的に観察された。次にＧＳに特異的な多クローン抗体（ＰＡｂ）が、組み替え型ＧＳに結合した臭化シアン活性化セファロース−４Ｂ（ファーマシア社）を用いて、アフィニティー精製によってヤギの血清から精製された。精製された多クローン抗体は、限外ろ過によって濃縮され−２０℃で保存された１０ｍＭのｐＨ７．４ＰＢＳで透析された。
【００５７】
生体検体における診断分析検査及びＧＳの検出
本発明の別の目的は、アルツハイマー病に冒されている個々人からＧＳを検出する診断分析検査において用いられる試薬を提供することである。
【００５８】
本実施例の１つの形態において、本発明のＧＳはＡＤに冒されている個々人の検出のための免疫学的検定における抗原として用いられるだろう。タンパク質、即ち本発明のＧＳは、以下を含むがこれらに限定されない従来技術において公知の免疫学的測定装置で用いられるかもしれない。即ち、放射免疫測定法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、「サンドウィッチ」検定法、沈降反応、ゲル拡散免疫拡散法、凝集反応、蛍光免疫学的検定、ＡまたはＧタンパク質免疫測定法及び免疫電気泳動法である。本発明に基づくと、ヒトＧＳに対して作成された単クローン又は多クローン抗体は、血液又は、血清、血漿などの血液製剤、脊髄液又は例えば唾液、尿、リンパ液などの他の体液などの検体上の免疫学的検定においてＡＤに冒された患者を診断するのに有効である。アルツハイマー型痴呆は、ヒトグルタミン合成酵素に対して特異的である個々の又は結合した単一の単クローン抗体又は複数の単クローン抗体を利用して診断されるだろう。
【００５９】
抗体はいかなるタイプの免疫学的検定においても用いられ得る。このことは、従来の結合タンパク競合測定法はもちろん、２部位サンドイッチ検定法及び非競合型単部位免疫検定法の両方を含む。
【００６０】
検出の容易さ及び単純さ、及びその定量的性質のために、多くの変化形が存在しそのすべてが本発明によって意図されているサンドウィッチ法又は２重抗体法が特に望ましい。例えば、代表的なサンドウィッチ法において、標識を付されていない抗体は、例えば、マイクロタイター・プレートなどの固相上で固定され、検査されるべき検体が追加される。抗体−抗原錯体の形成を可能にするある培養時間の後に、検出信号を含み得るリポーター分子の標識を付された第２抗体が追加され、培養が継続されて異なる部位で抗原と結合する十分な時間が可能になり、結果として抗原―抗体−標識を付された抗体の形成となる。抗原の存在は信号を観察し公知の抗体量を含む対照実験検体と比較して定量化されて判定される。
【００６１】
臨床研究：
予想観察試験的研究が３つの高齢者用医療機関で行われた。研究では、診療機関に来て、簡易精神状態鑑定（ＭＭＳＥ）検査及び他の所定の検査が行われた３８人の患者が評価された。これらの患者たちの内、２４人はＡＤと診断され、１４人はＡＤ以外の他の型の痴呆と診断された。アルツハイマー型痴呆を示す患者の平均年齢は約７９歳で、５４歳から８７歳の年齢幅にあった。簡易精神状態鑑定（ＭＭＳＥ）の成績が記録された。血液検体が採取され、凝固後、検体は遠心分離されて、血清のアリコートが凍結され、Ｓ１００、ＮＳＥ、及びＧＳ分析が行われるまで７０℃で保存された。
【００６２】
実験対照には、１５３人の健康な献血者（１８−８７歳の年齢幅、年齢の中央値７１．０３歳±９．９５歳）を含み、その血液検体が用いられてＳ１００、ＮＳＥ、及びＧＳの濃度に対する参照値が決定された。
【００６３】
アルツハイマー病は進行性疾患の経過として認識され、基礎的新皮質において始まり、海馬に広がり、最終的には全ての皮層領域を冒す。病気進行中に寛解はない（ブラアク及びブラアク氏による「Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ」、１９９７年、１８（４）：３５１）。このことは、ＡＤは疾患過程であって単に老化産物でないと言うことを示す。ＮＳＥはＡＤに対して特異性は有さないが、マーカーはニューロンの進行中の破壊の指標として寄与する。ヒトＧＳに対してここに開示される単クローン抗体を利用すると、ＡＤに対する的確で敏感で特異的な検査法が、タンパク質が非ＣＳＦ体液において分析されるときに可能になる。これは、マーカーが非ヒトＧＳに特異的であり、血清又は他の非ＣＳＦ体液から決定的なデータが何等抽出され得なかった従来技術の検査法とは異なる。Ｓ１００は感度を有さないが有効なマーカーであって、ＡＤの目標母集団である年輩者の間の共通事象である脳内の重大事象（例えば、ＴＩＡ，脳卒中、虚血事象に至る低酸素症、その他）を観察する。
【００６４】
全ての参照値は平均±２ＳＤとして報告されている。３つのマーカーに対する参照値は、ＧＳ＝０．０２２ｎｇ／ｍｌ、ＮＳＥ＝８．３４ｎｇ／ｍｌ、及びＳ１００＝０．０２ｎｇ／ｍｌである。
【００６５】
Ｓ１００及びＮＳＥのレベルは、それぞれカナダ国オンタリオ州ミシサーガのシン−Ｘファーマ株式会社から市販されているＳＭＡＲＴ  Ｓ１００及びＳＭＡＲＴ  ＮＳＥ  ＥＬＩＳＡ検査キットを用いて分析された。ＧＳ検査法のために、抗体試薬及び較正器（即ち、組み替え型ヒトＧＳ）がシン−Ｘファーマ社で製造され、ＥＬＩＳＡ検査法が上記で説明したように展開された。
【００６６】
図３の僅差棒グラフは年齢に基づいて分類された健康体のＧＳタンパク質の血中濃度の分析を示す。興味深いことに、６０代の個々体は他のより若い年齢のグループに比較して明らかに血液中にＧＳのより高いレベルを示している。しかしながら、７０＋の個人の血清中の平均ＧＳレベルは２０代及び４０代において観察された平均ＧＳレベルと同様に低下する。同様のパターンがＳ１００タンパク質で観察される。他方、ＮＳＥ血中濃度の年齢構成は他の２つのマーカーと異なり、明らかにより高濃度が１４歳から４０歳の年齢層において観察された。これら３つのタンパク質の血中濃度は性別に関係がなかった。特定の論理と結びつけられることを望まなかったが、６０代の高ＧＳ（及び／またはＳ１００）を有する人々が実際既に脳損傷が進行しつつあると仮定された。７０代の係る個人は「患者」に分類され、残りのいわゆる「健康な」個人は健康に関してうまくあてはまって、これらのたんぱく質マーカーの低レベルを示す。よって、６０代の年齢層におけるＧＳレベルに焦点をあてることがリスク評価研究用診断として特に価値があるということが結論付けられた。
【００６７】
２４個のＭＭＳＥに基づくＡＤ血清検体のうち、２０個は軽度のＡＤ症例だった。４個は中程度だった（図１を参照せよ）。３つのマーカー、即ち、ＧＳ、ＮＳＥ、及びＳ１００Ｂの感度はそれぞれ１００％、３３％、及び８％だった。ＧＳレベルはＡＤの感度、即ちＭＭＳＥの成績と密接な相関関係がある。一方、同様の相関関連はＮＳＥで観察されない。Ｓ１００の感度は大変低いが、しかしながら、このマーカーが上昇すると、深刻な事象による脳内の星状細胞の進行中の損傷の標識となるかもしれない。
【００６８】
１４個の非ＡＤ型痴呆検体のうち、ただ１個の検体だけがＧＳとＳ１００との両方において高レベルを示している。一方、７個の検体はカットオフレベルより高いＮＳＥ濃度を示す（図２参照）。このことはＧＳ及びＳ１００がＡＤに対して極めて特異的なマーカーであることを示す。
【００６９】
この明細書中で挙げたすべての特許及び刊行物は、本発明が関連する技術の当業者のレベルを示す。全ての特許及び刊行物は、各々の刊行物が具体的にかつ個別に指示されて参照として組み込まれるているかのように、同程度に参照されることによってここに組み込まれている。本発明のある形式が説明されるが、ここに説明され示された特定の形式又は各部分の配置に限定されないということが理解されるべきである。様々な変化形が本発明の目的から乖離することなく成され、本発明は本明細書及び図面において示され説明されたことに限定されて考えられるべきでない、ということが当業者に明らかだろう。
【００７０】
当業者は、本発明が目的を達成し、そこで特有のものだけでなく記載した結果及び利点を得ることによく適合するということをすぐに認めるだろう。ここに記載したオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関係する化合物、方法、手順、及び技術は、好適実施例を目下代表し、模範的であることが意図されており、目的を制限することは意図されていない。本発明の精神の範囲内に包含され添付の請求項の目的によって定義される本発明における変化形及び他の使用法を、当業者は思いつくだろう。本発明は特定の好適実施例に関連して説明されているが、請求項に係る発明は係る特定の実施例に必要以上に限定されるべきでないということが理解されるべきである。事実、本発明を実行するために記載した形態の様々な変化形は当業者に明らかであって以下の請求項の目的の範囲内にあることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】アルツハイマー型痴呆にかかっていると臨床的に判断された一団の患者の血液中のＧＳ、ＮＳＥ、及びＳ１００に対する統計的有効数字の比較である。
【図２】非アルツハイマー型痴呆にかかっていると臨床的に判断された一団の患者の血液におけるＧＳ、ＮＳＥ、及びＳ１００に対する統計的有効数字の比較である。
【図３】正常人における老化に関するＧＳの僅差棒グラフを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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