(57)【要約】本発明は、ワクチンにより開始される免疫応答を増幅するために、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）を使用する方法を提供する。ＨＳＰは、ワクチンの投与の前、同時、または後に、被験体に導入することができる。ＨＳＰはまた、抗原提示細胞を活性化するのに使用することができ、これは次に、ワクチンとともに被験体に導入される。本発明の方法で使用されるＨＳＰは、ワクチンとは無関係のペプチドに、結合していないかまたは共有結合または非共有結合で結合することができる。被験体は、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。例えば、本明細書において例として、ＨＳＰは、サイトカインの分泌、抗原提示細胞と同時刺激分子の表面発現を誘導することが示される。本発明はまた、被験体の癌および感染症の治療と予防方法を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体で免疫応答を生成させる方法であって：
被験体で成分に対する免疫応答を生成させるように
（ａ） それに対する免疫応答を誘導することが好ましい成分を含むワクチン組成物を、被験体に投与する工程、および
（ｂ） 熱ショックタンパク質調製物を被験体に投与する工程であって、熱ショックタンパク質調製物は成分の免疫原性を示さない工程、と含んでなる、
、方法。
【請求項２】
被験体でワクチン組成物により免疫応答を誘導する方法であって：
被験体で成分に対する免疫応答が誘導されるように
（ａ） 熱ショックタンパク質調製物を被験体に投与する工程、および
（ｂ） それに対する免疫応答を誘導することが好ましい成分を含むワクチン組成物を、被験体に投与する工程であって、ワクチン組成物は、工程（ａ）が無い場合は成分に対して免疫原性以下の量である工程、とを含んでなり、
熱ショックタンパク質調製物は成分の免疫原性を示さない、方法。
【請求項３】
被験体の感染症を治療または予防する方法であって：
（ａ） 感染症を引き起こす感染性物質の抗原性を示す成分を含むワクチン組成物を、被験体に投与する工程、および
（ｂ） 工程（ａ）と組合せて、被験体で成分に対する免疫応答を誘導するかまたは上昇させるのに有効な量の熱ショックタンパク質調製物を、被験体に投与する工程、とを含んでなり、熱ショックタンパク質調製物は成分の免疫原性を示さない、方法。
【請求項４】
被験体の癌を治療または予防する方法であって：
（ａ） 癌細胞の抗原性を示す成分を含むワクチン組成物を、被験体に投与する工程、および
（ｂ） 被験体で免疫応答を誘導するかまたは上昇させるのに有効な量の熱ショックタンパク質調製物を、被験体に投与する工程、とを含んでなり、熱ショックタンパク質調製物は成分の免疫原性を示さない、方法。
【請求項５】
成分に対して被験体で生成する免疫応答は、工程（ｂ）の非存在下の被験体の、成分に対する免疫応答と比較して上昇している、請求項１記載の方法。
【請求項６】
熱ショックタンパク質調製物は、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｇｐ９６、カルレチキュリン、およびこれらの組合せよりなる群から選択される熱ショックタンパク質を含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
熱ショックタンパク質調製物は、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｇｐ９６、カルレチキュリン、およびこれらの組合せよりなる群から選択される熱ショックタンパク質を含む、請求項２記載の方法。
【請求項８】
熱ショックタンパク質調製物は、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｇｐ９６、カルレチキュリン、およびこれらの組合せよりなる群から選択される熱ショックタンパク質を含む、請求項３記載の方法。
【請求項９】
熱ショックタンパク質調製物は、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｇｐ９６、カルレチキュリン、およびこれらの組合せよりなる群から選択される熱ショックタンパク質を含む、請求項４記載の方法。
【請求項１０】
熱ショックタンパク質調製物は、熱ショックタンパク質−ペプチド複合体を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
熱ショックタンパク質調製物は、熱ショックタンパク質−ペプチド複合体を含む、請求項２記載の方法。
【請求項１２】
熱ショックタンパク質調製物は、熱ショックタンパク質−ペプチド複合体を含む、請求項３記載の方法。
【請求項１３】
熱ショックタンパク質調製物は、熱ショックタンパク質−ペプチド複合体を含む、請求項４記載の方法。
【請求項１４】
熱ショックタンパク質調製物は、精製された熱ショックタンパク質を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
熱ショックタンパク質調製物は、精製された熱ショックタンパク質を含む、請求項２記載の方法。
【請求項１６】
熱ショックタンパク質調製物は、精製された熱ショックタンパク質を含む、請求項３記載の方法。
【請求項１７】
熱ショックタンパク質調製物は、精製された熱ショックタンパク質を含む、請求項４記載の方法。
【請求項１８】
熱ショックタンパク質調製物は、熱ショックタンパク質−ペプチド複合体と精製された熱ショックタンパク質を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
熱ショックタンパク質調製物は、熱ショックタンパク質−ペプチド複合体と精製された熱ショックタンパク質を含む、請求項２記載の方法。
【請求項２０】
熱ショックタンパク質調製物は、熱ショックタンパク質−ペプチド複合体と精製された熱ショックタンパク質を含む、請求項３記載の方法。
【請求項２１】
熱ショックタンパク質調製物は、熱ショックタンパク質−ペプチド複合体と精製された熱ショックタンパク質を含む、請求項４記載の方法。
【請求項２２】
被験体はヒトであり、熱ショックタンパク質調製物は、哺乳動物熱ショックタンパク質を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
被験体はヒトであり、熱ショックタンパク質調製物は、哺乳動物熱ショックタンパク質を含む、請求項２記載の方法。
【請求項２４】
被験体はヒトであり、熱ショックタンパク質調製物は、哺乳動物熱ショックタンパク質を含む、請求項３記載の方法。
【請求項２５】
被験体はヒトであり、熱ショックタンパク質調製物は、哺乳動物熱ショックタンパク質を含む、請求項４記載の方法。
【請求項２６】
熱ショックタンパク質は、ワクチン組成物の投与の前に投与される、請求項１、２、３、または４記載の方法。
【請求項２７】
熱ショックタンパク質は、ワクチン組成物の投与と同時に投与される、請求項１、２、３、または４記載の方法。
【請求項２８】
熱ショックタンパク質は、ワクチン組成物の投与の後に投与される、請求項１、２、３、または４記載の方法。
【請求項２９】
熱ショックタンパク質は、ワクチン組成物の投与の前に投与される、請求項６、７、８、または９記載の方法。
【請求項３０】
熱ショックタンパク質は、ワクチン組成物の投与と同時に投与される、請求項６、７、８、または９記載の方法。
【請求項３１】
熱ショックタンパク質は、ワクチン組成物の投与の後に投与される、請求項６、７、８、または９記載の方法。
【請求項３２】
熱ショックタンパク質は、ワクチン組成物の投与の前に投与される、請求項１０、１１、１２、または１３記載の方法。
【請求項３３】
熱ショックタンパク質は、ワクチン組成物の投与と同時に投与される、請求項１０、１１、１２、または１３記載の方法。
【請求項３４】
熱ショックタンパク質は、ワクチン組成物の投与の後に投与される、請求項１０、１１、１２、または１３記載の方法。
【請求項３５】
熱ショックタンパク質は、ワクチン組成物の投与の前に投与される、請求項１４、１５、１６、または１７記載の方法。
【請求項３６】
熱ショックタンパク質は、ワクチン組成物の投与と同時に投与される、請求項１４、１５、１６、または１７記載の方法。
【請求項３７】
熱ショックタンパク質は、ワクチン組成物の投与の後に投与される、請求項１４、１５、１６、または１７記載の方法。
【請求項３８】
熱ショックタンパク質は、ワクチン組成物の投与の前に投与される、請求項１８、１９、２０、または２１記載の方法。
【請求項３９】
熱ショックタンパク質は、ワクチン組成物の投与と同時に投与される、請求項１８、１９、２０、または２１記載の方法。
【請求項４０】
熱ショックタンパク質は、ワクチン組成物の投与の後に投与される、請求項１８、１９、２０、または２１記載の方法。
【請求項４１】
熱ショックタンパク質調製物とワクチン組成物は、同じ日に投与される、請求項１８、１９、２０、または２１記載の方法。
【請求項４２】
ワクチン組成物は、生きたワクチン、弱毒化ワクチン、サブユニットワクチン、ＤＮＡワクチン、またはＲＮＡワクチンである、請求項１、２、３、４、５、２２、２３、２４、または２５記載の方法。
【請求項４３】
請求項３記載の方法であって、感染症は、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、水痘ウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、単純ヘルペスＩＩウイルス、牛疫ウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス（ｅｃｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、おたふくかぜウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全症ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）、ヒト免疫不全症ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）、マイコバクテリア、リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア、レギオネラ、リーシュマニア、コクジヂオア（ｋｏｋｚｉｄｉｏａ）、トリパノソーマ、およびクラミジアよりなる群から選択される、方法。
【請求項４４】
請求項４記載の方法であって、癌は、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起細胞腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽細胞腫；白血病、例えば、急性リンパ性白血病と急性骨髄性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病および赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病）；および真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、および重鎖病よりなる群から選択される、方法。
【請求項４５】
感染症を予防するための方法である、請求項３記載の方法。
【請求項４６】
癌を治療するための方法である、請求項４記載の方法。
【請求項４７】
癌を予防するための方法である、請求項４記載の方法。
【請求項４８】
以下を含むキット：
（ａ） それに対する免疫応答が好ましいワクチン組成物の成分に対する、ワクチン組成物により誘発される免疫応答を上昇させるのに有効な量の熱ショックタンパク質調製物を含有する第１の容器；および
（ｂ） （ａ）の熱ショックタンパク質調製物の投与前、同時、または後に投与されたときに、成分に対する免疫応答を誘導するのに有効な量のワクチン組成物を含有する第２の容器。
【請求項４９】
熱ショックタンパク質調製物は、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｇｐ９６、カルレチキュリン、およびこれらの組合せよりなる群から選択される熱ショックタンパク質を含む、請求項４８のキット。
【請求項５０】
熱ショックタンパク質調製物は、熱ショックタンパク質−ペプチド複合体を含む、請求項４８のキット。
【請求項５１】
熱ショックタンパク質調製物は、精製された熱ショックタンパク質を含む、請求項４８のキット。
【請求項５２】
熱ショックタンパク質調製物は、熱ショックタンパク質−ペプチド複合体と精製された熱ショックタンパク質とを含む、請求項４８のキット。
【請求項５３】
熱ショックタンパク質調製物は、哺乳動物熱ショックタンパク質を含む、請求項４８のキット。
【請求項５４】
第２の容器中のワクチン組成物の量は、第１の容器中の熱ショックタンパク質調製物の投与が無い場合に、被験体で免疫応答を誘導するのには不充分である、請求項４８のキット。
【請求項５５】
被験体で免疫応答を生成させる方法であって：
（ａ） それに対する免疫応答を誘導することが好ましい成分を含むワクチン組成物を、被験体に投与する工程、および
（ｂ） 活性化された抗原提示細胞を含む組成物を被験体に投与する工程であって、抗原提示細胞は熱ショックタンパク質調製物と接触されられており、熱ショックタンパク質調製物は成分の免疫原性を示さない工程、とを含んでなり、
こうして、被験体で成分に対する免疫応答を生成させる、方法。
【請求項５６】
被験体でワクチン組成物により免疫応答を誘導する方法であって：
（ａ） 活性化された抗原提示細胞を含む組成物を被験体に投与する工程であって、抗原提示細胞は、抗原提示細胞に熱ショックタンパク質調製物を接触させることにより活性化されている工程；および
被験体で成分に対する免疫応答が誘導されるように
（ｂ） それに対する免疫応答を誘導することが好ましい成分を含むワクチン組成物を、被験体に投与する工程であって、ワクチン組成物は、工程（ａ）が無い場合は成分に対して免疫原性以下の量である工程、とを含んでなり、
熱ショックタンパク質調製物は成分の免疫原性を示さない、方法。
【請求項５７】
被験体の感染症を治療または予防する方法であって：
（ａ） 感染症を引き起こす感染性物質の抗原性を示す成分を含むワクチン組成物を、被験体に投与する工程、および
（ｂ） 活性化された抗原提示細胞を含むある量の組成物を被験体に投与する工程であって、抗原提示細胞は、抗原提示細胞に熱ショックタンパク質調製物を接触させることにより活性化されており、活性化された抗原提示細胞を含む組成物の量は、工程（ａ）と組合せて、被験体で成分に対する免疫応答を誘導するかまたは上昇させるのに有効であり、熱ショックタンパク質調製物は、成分の免疫原性を示さない工程、とを含んでなる方法。
【請求項５８】
被験体の癌を治療または予防する方法であって：
（ａ） 癌細胞の抗原性を示す成分を含むワクチン組成物を、被験体に投与する工程、および
（ｂ） 活性化された抗原提示細胞を含むある量の組成物を被験体に投与する工程であって、抗原提示細胞は、抗原提示細胞に熱ショックタンパク質調製物と接触させることにより活性化されており、活性化された抗原提示細胞を含む組成物の量は、工程（ａ）と組合せて、被験体で成分に対する免疫応答を誘導するかまたは上昇させるのに有効であり、熱ショックタンパク質調製物は、成分の免疫原性を示さない工程、とを含んでなる方法。
【請求項５９】
熱ショックタンパク質調製物は、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｇｐ９６、カルレチキュリン、およびこれらの組合せよりなる群から選択される熱ショックタンパク質を含む、請求項５５記載の方法。
【請求項６０】
熱ショックタンパク質調製物は、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｇｐ９６、カルレチキュリン、およびこれらの組合せよりなる群から選択される熱ショックタンパク質を含む、請求項５６記載の方法。
【請求項６１】
熱ショックタンパク質調製物は、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｇｐ９６、カルレチキュリン、およびこれらの組合せよりなる群から選択される熱ショックタンパク質を含む、請求項５７記載の方法。
【請求項６２】
熱ショックタンパク質調製物は、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｇｐ９６、カルレチキュリン、およびこれらの組合せよりなる群から選択される熱ショックタンパク質を含む、請求項５８記載の方法。
【請求項６３】
被験体はヒトであり、熱ショックタンパク質調製物は哺乳動物熱ショックタンパク質を含む、請求項５５記載の方法。
【請求項６４】
被験体はヒトであり、熱ショックタンパク質調製物は哺乳動物熱ショックタンパク質を含む、請求項５６記載の方法。
【請求項６５】
被験体はヒトであり、熱ショックタンパク質調製物は哺乳動物熱ショックタンパク質を含む、請求項５７記載の方法。
【請求項６６】
被験体はヒトであり、熱ショックタンパク質調製物は哺乳動物熱ショックタンパク質を含む、請求項５８記載の方法。
【請求項６７】
活性化された抗原提示細胞は、ワクチン組成物の投与の前に投与される、請求項５５、５６、５７、または５８記載の方法。
【請求項６８】
活性化された抗原提示細胞は、ワクチン組成物の投与と同時に投与される、請求項５５、５６、５７、または５８記載の方法。
【請求項６９】
活性化された抗原提示細胞は、ワクチン組成物の投与の後に投与される、請求項５５、５６、５７、または５８記載の方法。
【請求項７０】
ワクチン組成物は、生きたワクチン、弱毒化ワクチン、サブユニットワクチン、ＤＮＡワクチン、またはＲＮＡワクチンである、請求項５５、５６、５７、または５８記載の方法。
【請求項７１】
請求項５７記載の方法であって、感染症は、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、水痘ウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、単純ヘルペスＩＩウイルス、牛疫ウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス（ｅｃｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、おたふくかぜウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全症ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）、ヒト免疫不全症ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）、マイコバクテリア、リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア、レギオネラ、リーシュマニア、コクジヂオア（ｋｏｋｚｉｄｉｏａ）、トリパノソーマ、およびクラミジアよりなる群から選択される、方法。
【請求項７２】
請求項５８記載の方法であって、癌は、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起細胞腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽細胞腫；白血病、例えば、急性リンパ性白血病と急性骨髄性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病および赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病）；および真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、および重鎖病よりなる群から選択される、方法。
【請求項７３】
被験体で免疫応答を生成させる方法であって：
（ａ） それに対する免疫応答を誘導することが好ましい成分を含むワクチン組成物を、被験体に投与する工程；
（ｂ） 第１の熱ショックタンパク質調製物を被験体に投与する工程であって、第１の熱ショックタンパク質調製物は成分の免疫原性を示さない工程；および
（ｃ） 活性化された抗原提示細胞を含むある量の組成物を被験体に投与する工程であって、抗原提示細胞は、抗原提示細胞に、成分の免疫原性を示さない第２の熱ショックタンパク質調製物を接触させることにより活性化されている工程、とを含んでなり、
こうして、被験体で成分に対する免疫応答を生成させる、方法。
【請求項７４】
被験体でワクチン組成物により免疫応答を誘導する方法であって：
被験体で成分に対する免疫応答が誘導されるように
（ａ） 第１の熱ショックタンパク質調製物を被験体に投与する工程；
（ｂ） 活性化された抗原提示細胞を含むある量の組成物を被験体に投与する工程であって、抗原提示細胞は、抗原提示細胞に第２の熱ショックタンパク質調製物を接触させることにより活性化されている工程；および
（ｃ） それに対する免疫応答を誘導することが好ましい成分を含むワクチン組成物を、被験体に投与する工程であって、ワクチン組成物は、工程（ａ）および／または工程（ｃ）が無い場合は成分に対して免疫原性以下の量である工程、とを含んでなり、
第１と第２の熱ショックタンパク質調製物は成分の免疫原性を示さない、方法。
【請求項７５】
被験体の感染症を治療または予防する方法であって：
被験体で成分に対する免疫応答を生成させるように
（ａ） 感染症を引き起こす感染性物質の抗原性を示す成分を含むワクチン組成物を、被験体に投与する工程；
（ｂ） 工程（ａ）および／または工程（ｃ）と組合せて、被験体で成分に対する免疫応答を誘導するかまたは上昇させるのに有効な量の第１の熱ショックタンパク質調製物を、被験体に投与する工程であって、第１の熱ショックタンパク質調製物は成分の免疫原性を示さない工程；および
（ｃ） 工程（ａ）および／または工程（ｂ）と組合せて、被験体で成分に対する免疫応答を誘導するかまたは上昇させるのに有効な量の活性化された抗原提示細胞を含む組成物を、被験体に投与する工程であって、抗原提示細胞は、抗原提示細胞に、成分の免疫原性を示さない第２の熱ショックタンパク質調製物を接触させることにより活性化されている工程、とを含んでなる、
方法。
【請求項７６】
被験体の癌を治療または予防する方法であって：
被験体で成分に対する免疫応答を生成させるように
（ａ） 癌細胞の抗原性を示す成分を含むワクチン組成物を、被験体に投与する工程、および
（ｂ） 工程（ａ）および／または工程（ｃ）と組合せて、被験体で成分に対する免疫応答を誘導するかまたは上昇させるのに有効な量の第１の熱ショックタンパク質調製物を、被験体に投与する工程であって、第１の熱ショックタンパク質調製物は成分の免疫原性を示さない工程；および
（ｃ） 工程（ａ）および／または工程（ｂ）と組合せて、被験体で成分に対する免疫応答を誘導するかまたは上昇させるのに有効な量の活性化された抗原提示細胞を含む組成物を、被験体に投与する工程であって、抗原提示細胞は、抗原提示細胞に、成分の免疫原性を示さない第２の熱ショックタンパク質調製物を接触させることにより活性化されている工程、とを含んでなる、
方法。
【請求項７７】
第１の熱ショックタンパク質調製物と第２の熱ショックタンパク質調製物はそれぞれ、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｇｐ９６、カルレチキュリン、およびこれらの組合せよりなる群から選択される熱ショックタンパク質を含む、請求項７３、７４、７５、または７６記載の方法。
【請求項７８】
被験体はヒトであり、熱ショックタンパク質調製物は哺乳動物熱ショックタンパク質を含む、請求項７３、７４、７５、または７６記載の方法。
【請求項７９】
治療法を受けている被験体に、哺乳動物熱ショックタンパク質調製物を投与することを含んでなる、被験体の治療法を利用して治療の結果を改善する方法であって、治療法はワクチンではない方法。
【請求項８０】
治療法は、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、化学療法剤、および放射線照射である、請求項７９記載の方法。
【請求項８１】
被験体はヒトであり、熱ショックタンパク質調製物はヒト熱ショックタンパク質を含む、請求項７９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
１．　緒言
本発明は、癌または感染症の予防または治療用のワクチンに対する、被験体の免疫応答を上昇させる免疫原物質を調製するための組成物と方法に関する。腫瘍と感染性物質に対する被験体の免疫応答を増強するために、ＨＳＰ（特に限定されないが、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、およびｇｐ９６を含む）は、単独でまたは互いに組合せて、ワクチンと一緒に投与される。
【０００２】
２．　発明の要約
本明細書において文献の引用または考察は、決して、これらが本発明の先行技術であることを認めるものではないことを理解されたい。
【０００３】
２．１．　ワクチン
ワクチン接種は、多くの国でポリオ、破傷風、水痘、麻疹などのいくつかの疾患を撲滅させた。このアプローチは、免疫系が感染症に抵抗しこれを予防する能力を利用している。
【０００４】
ワクチンの従来の製造法は、不活性化または弱毒化病原体を使用する。病原性微生物を適切に不活性化すると、これを無害にするが、その免疫原性は破壊しない。これらの「死滅した」粒子を宿主に注入すると、生きた微生物による将来の感染を予防することができる免疫応答を誘発するであろう。しかし、不活性化病原体をワクチンとして使用する大きな問題は、すべての微生物を不活性化できないことである。これが達成された時でも、死滅病原体はその宿主中で増殖しないため、または他の不明の理由のために、達成された免疫はしばしば不完全で短命あり、複数回の免疫が必要である。最後に、不活性化法は、微生物の抗原を変化させることがあり、これらを免疫原として無効にする。
【０００５】
弱毒化とは、基本的にその疾患発生能力を失った病原性微生物株の産生を意味する。これを達成する１つの方法は、微生物を通常とは異なる増殖条件に付すかおよび／または細胞培養で継代を繰り返すことである。次に、病原性を失っているが免疫応答を誘発することができる変異体を選択する。弱毒化病原体は宿主細胞中で実際に複製し、長期に持続する免疫を誘発するため、しばしば良好な免疫原となる。しかし、生きたワクチンの使用にはいくつかの問題があり、最もやっかいな問題は、弱毒化が不充分で病原性に復帰するリスクがあることである。
【０００６】
上記問題に対する代替法は、サブユニットワクチンを使用することである。これは、関連する免疫学的物質を含有する成分でのみ免疫することである。新しい有望な代替法は、ＤＮＡまたはＲＮＡのワクチンとしての使用である。そのような遺伝的ワクチンは、アイデアの段階から、臨床試験で研究されるところまで進展している（ＷｅｉｎｅｒとＫｅｎｎｅｄｙ、１９９９年７月、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ、５０〜５７頁参照）。
【０００７】
ワクチンはしばしば、種々のアジュバントとともに調製および接種されている。アジュバントは、少量の抗原で、すなわち免疫原が単独で投与される場合よりより少ない投与量で、より持続性のある高レベルの免疫を達成することを助ける。アジュバント作用の機構は、予測不可能であり、複雑で、完全には理解されていない（Ｓｕｚｕｅら、１９９６、Ｂａｓｅｌ：Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、４５４−５５参照）。
【０００８】
不活性化および弱毒化病原体が引き起こすリスクのために、最小量のワクチンに対する免疫応答を増強または増幅する能力は、理想的で有利であろう。さらに、アジュバントの機構は完全には理解されておらず、いまだに予測不可能なため、現在のワクチン接種法で被験体の免疫応答を増強する代替法が、非常に好ましい。
【０００９】
２．２．　免疫応答
生体の免疫系は、病原体または他の有害物質に対して２種類の応答により反応する−体液性応答と細胞性応答（Ａｌｂｅｒｔｓ， Ｂ．ら、１９９４， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ， １１９５−９６）。休止Ｂ細胞が抗原により活性化されて、増殖し抗体分泌細胞に成熟すると、これらは、ユニークな抗原結合部位を有する抗体を産生し分泌する。この抗体分泌反応は、体液性応答として知られている。一方、Ｔ細胞の多様な応答は、まとめて細胞性免疫応答と呼ばれる。Ｔ細胞には２つのクラスがあり、細胞障害性Ｔ細胞とヘルパーＴ細胞である。細胞障害性Ｔ細胞は、ウイルスまたは他の細胞内微生物で感染された細胞を直接死滅させる。これに対して、ヘルパーＴ細胞は、他の細胞の応答を刺激することを助ける：これらは、例えばマクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞の活性化を助ける（Ａｌｂｅｒｔｓ， Ｂ．ら、１９９４， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ， １２２８参照）。細胞障害性Ｔ細胞とヘルパーＴ細胞の両方とも、標的細胞中の外来タンパク質抗原の分解により生成するペプチド断片の形の抗原を認識し、従って、両方とも主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に依存し、これは、これらの断片に結合して、細胞表面まで運び、そこでこれらをＴ細胞に提示する（Ａｌｂｅｒｔｓ， Ｂ．ら、１９９４， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ， １２２８）。ＭＨＣ分子は、一般に抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に豊富に存在する。
【００１０】
２．３．　抗原提示
マクロファージや樹状細胞のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、先天的および適応免疫応答の主要な成分である。抗原は一般に、他の細胞（ＡＰＣ）の表面上のＴ細胞またはＢ細胞に「提示される」。ＡＰＣは、リンパ由来抗原および血液由来抗原を捕捉することができ、次にインターナリゼーションと分解後、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の細胞表面分子に結合した抗原性ペプチド断片を、Ｔ細胞に提供する。次にＡＰＣはＴ細胞を活性化（細胞性応答）してクローン拡張させ、これらの娘細胞は、成長して細胞障害性Ｔ細胞またはヘルパーＴ細胞になり、これは次に、同じＭＨＣ結合抗原でＢ細胞（体液性応答）を活性化してクローン拡張させ、特異抗体が産生される（Ａｌｂｅｒｔｓ， Ｂ．ら、１９９４， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ， １２３８−４５参照）。
【００１１】
２種類の抗原処理機構が知られている。第１のタイプは、ＡＰＣによるエンドサイトーシスによるタンパク質の取込み、小胞内の抗原断片化、クラスＩＩＭＨＣ分子との結合、および細胞表面上の発現を含む。この複合体は、ＣＤ４を発現するヘルパーＴ細胞により認識される。他のタイプは、細胞内に合成されるウイルス抗原のようなタンパク質について用いられ、細胞質中のタンパク質断片化を含むと考えられる。こうして産生されるペプチドは、クラスＩ ＭＨＣ分子に結合し、ＣＤ８を発現する細胞障害性Ｔ細胞により認識される（Ａｌｂｅｒｔｓ， Ｂ．ら、１９９４， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ， １２３３−３４参照）。
【００１２】
Ｔ細胞の刺激は、Ｔ細胞とＡＰＣの両方により発現される多くの付属分子が関与する。同時刺激分子は、Ｔ細胞の増殖と活性化を促進する付属分子である。刺激すると、同時刺激分子は、インターロイキン１（ＩＬ−１）またはインターロイキン２（ＩＬ−２）、インターフェロンなどのサイトカインの放出を誘導し、これは表面受容体のＴ細胞増殖と発現を促進する（Ｐａｕｌ， １９８９， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． １０９−１０参照）。
【００１３】
通常ＡＰＣは休止しており、その機能を示すには活性化する必要がある。ＡＰＣを活性化するシグナルの本体が決定的に重要かつ未解決の問題である（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、１９９８， Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２４５−２５２；Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖら、１９９８， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０：１２−１５参照）。
【００１４】
２．４．　熱ショックタンパク質
熱ショックタンパク質（ストレスタンパク質としても知られている）は、豊富に存在する、可溶性の高度に保存された細胞内分子である。細胞内シャペロンとしてＨＳＰは、ストレスや通常の細胞ホメオスタシス中に、活性のあるタンパク質成熟や機能の多くの生化学的経路に参加する（Ｍｉｚｚｅｎ， １９９８， Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ １０：１７４ 参照）。多くのストレスは、細胞タンパク質の３次元構造または折り畳みを破壊することがある。間違って折り畳まれたタンパク質は放置すると、凝集して最終的に細胞を死滅させることがある。ＨＳＰはこうした傷害されたタンパク質に結合し、再折り畳みにより正しいコンフォメーションを取ることを助ける。通常の（ストレスの無い）細胞ホメオスタシスでは、ＨＳＰは細胞の代謝にとって必要である。ＨＳＰは、新たに合成されたポリペプチドが折り畳まれることを助け、こうして他のタンパク質との早期の相互作用を防止する。またＨＳＰは、細胞の種々のコンパートメントへのタンパク質の輸送を手伝う。
【００１５】
主要なＨＳＰは、ストレスを受けた細胞で非常に高レベルまで蓄積するが、ストレスを受けていない細胞では、低レベル〜中レベルで存在する。例えば、高度に誘導性の哺乳動物ｈｓｐ７０は、通常の温度ではほとんど検出できないが、熱ショックを受けると、細胞中の最も活発に合成されるタンパク質の１つになる（Ｗｅｌｃｈら、１９８５， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０１：１１９８−１２１１参照）。これに対してｈｓｐ９０とｈｓｐ６０タンパク質は、通常の温度でほとんどの（必ずしもすべてではない）哺乳動物細胞に存在し、さらに熱により誘導される（Ｌａｉら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４：２８０２−２８１０；ｖａｎ Ｂｅｒｇｅｎ ｅｎ Ｈｅｎｅｇｏｕｗｅｎら、１９８７， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １：５２５−５３１）。
【００１６】
ＨＳＰは、免疫学的性質と抗原的性質を有することがわかっている。特定の腫瘍から単離されたｇｐ９６またはｐ８４／８６でマウスを免疫すると、その腫瘍に対してマウスは免疫になったが、抗原的に明確な腫瘍に対してはそうではなかった（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ， Ｐ．Ｋ．ら、１９８８， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ２８：２０５−２０７；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ， Ｐ．Ｋ．ら、１９９１， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６７：１０９−１２３）。さらにｈｓｐ７０は、そこからｈｓｐ７０が単離された腫瘍に対する免疫を誘発することが証明されたが、抗原的に明確な腫瘍はそうではなかった。しかし、ｈｓｐ７０が枯渇したペプチドは、その特異的免疫原活性を失うことががわかった（Ｕｄｏｎｏ， Ｍ．とＳｔｒｉｖａｓｔａｖａ， Ｐ．Ｋ．， １９９３， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７８：１３９１−１３９６）。これらの観察結果は、熱ショックタンパク質自体は抗原性ではないが、抗原性ペプチドと非共有結合複合体を形成し、この複合体が抗原性ペプチドに対する特異的免疫を誘発することを示唆している（Ｓｔｒｉｖａｓｔａｖａ， Ｐ．Ｋ．， １９９３， Ａｄｖ． Ｃａｎｖｅｒ Ｒｅｓ． ６２：１５３−１７７；Ｕｄｏｎｏ， Ｈ．ら、１９９４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５２：５３９８−５４０３；Ｓｕｔｏ， Ｒ．ら、１９９５， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６９：１５８５−１５８８）。最近、ｈｓｐ６０とｈｓｐ７０は、単球、マクロファージ、または細胞障害性Ｔ細胞により、ＴＮＦαやＩＬ−６のような炎症促進性サイトカインの産生を促進することがわかった（Ｂｒｅｌｏｅｒら、１９９９， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６２：３１４１−３１４７；Ｃｈｅｎら、１９９９， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６２：３２１２−３２１９；Ｏｈａｓｈｉら、２０００， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６４：５５８−５６１；Ａｓｅａら、２０００， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ６：４３５−４４２；Ｔｏｄｒｙｋら、１９９９， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６３：１３９８−１４０８）。ｈｓｐ７０はまた、未成熟樹状細胞を標的とし、これらが抗原を捕捉することをより可能にすることがわかった（Ｔｏｄｒｙｋら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：１３９８−１４０８）。例えば細胞死滅によるｈｓｐ６０やｈｓｐ７０の放出または発現の誘導は、免疫反応を増強すべきであるというシグナルとして機能するかも知れないと言われている（Ｃｈｅｎら、１９９９， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６２：３２１２−３２１９；Ｏｈａｓｈｉら、２０００， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６４：５５８−５６１；Ｔｏｄｒｙｋら、１９９９， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６３：１３９８−１４０８）。
【００１７】
癌の治療または予防のために、癌細胞から精製されたＨＳＰおよびペプチドの非共有結合複合体の使用は、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，７５０，１１９、５，８３７，２５１、および６，０１７，５４０に記載されている。
【００１８】
養子免疫療法で使用されるｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原提示細胞を感作するためのＨＳＰ−ペプチド複合体の使用は、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，９８５，２７０および５，８３０，４６４に記載されている。
【００１９】
ＨＳＰ−ペプチド複合体はまた、病原体に感染された細胞から単離することができ、その病原体（例えば、ウイルス、ならびに細菌、原生動物、真菌および寄生体を含む他の細胞内病原体）により引き起こされる感染の治療と予防に使用される（米国特許第５，９６１，９７９および６，０４８，５３０を参照）。
【００２０】
免疫原性ＨＳＰ−ペプチド複合体はまた、ＨＳＰと抗原性ペプチドとのｉｎ ｖｉｔｒｏ複合体形成により調製することができ、癌や感染症の治療と予防のためのそのような複合体の使用は、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，９３５，５７６および６，０３０，６１８に記載されている。癌や感染症の治療のための明確な抗原と組合せた熱ショックタンパク質の使用もまた、ＰＣＴ公報ＷＯ９７／０６８２１（１９９７年２月２７日）に記載されている。
【００２１】
細胞溶解物からのＨＳＰ−ペプチド複合体の精製は、すでに例えばＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，７５０，１１９および５，９９７，８７３に記載されている。
【００２２】
３．　発明の要約
本発明は、ＨＳＰを使用するワクチンにより誘発される免疫応答を生成または上昇させる方法を提供する。ＨＳＰの供給源は、好ましくは真核生物であり、最も好ましくは哺乳動物である。
【００２３】
本発明のある実施形態において免疫応答を生成する方法は、それに対して免疫応答を誘導することが好ましい成分を含むワクチン組成物を被験体に投与し、そして熱ショックタンパク質調製物を被験体に投与することを含み、ここで成分に対する免疫応答は、ワクチン組成物の投与が無い場合には誘発されない。熱ショックタンパク質調製物は、成分の免疫原性を示さない。熱ショックタンパク質単独では、ワクチン組成物の投与の無い場合は、成分に対する免疫応答を誘発することができない。この方法は、被験体に熱ショックタンパク質調製物を投与することが無い場合に得られるものと比較して、目的の成分に対する免疫応答の程度を上昇させることができる。
【００２４】
別の実施形態において本発明は、免疫原性量以下のワクチン組成物により免疫応答を誘導する方法であって、ＨＳＰ調製物が、本来、単独で使用した時は免疫応答を誘導するのに不充分である量のワクチン組成物により、免疫応答の誘導を促進する、方法を提供する。特に、この方法は、（ａ） ある量の熱ショックタンパク質調製物を被験体に投与する工程、および（ｂ） 工程（ａ）が無い場合は免疫原性量以下の、それに対する免疫応答が誘導されることが好ましい成分を含むワクチン組成物を、被験体に投与しする工程であって、こうして該成分に対する免疫応答が被験体で誘導され、熱ショックタンパク質調製物が成分の免疫原性を示さない、方法を誘導する。熱ショックタンパク質調製物は、ワクチン組成物の投与の無い場合は、該成分に対する免疫応答を誘発することは無い。
【００２５】
さらに別の実施形態において本発明は、感染症を引き起こす感染性物質の抗原性を示す成分を含むワクチン組成物を被験体に投与し、そしてワクチン組成物と組合せて、被験体で成分に対する免疫応答を誘導するかまたは上昇させるのに有効な量の熱ショックタンパク質調製物を、被験体に投与することを含む、被験体の感染症の治療または予防方法を提供する。熱ショックタンパク質調製物は、成分の免疫原性を示さない。
【００２６】
さらに別の実施形態において本発明は、癌細胞の抗原性を示す成分を含むワクチン組成物を被験体に投与し、そして被験体で成分に対する免疫応答を誘導するかまたは上昇させるのに有効な量の熱ショックタンパク質調製物を被験体に投与することを含む、被験体の癌の治療または予防方法であって、熱ショックタンパク質調製物は、成分の免疫原性を示さない、方法を提供する。
【００２７】
さらに別の実施形態において本発明は、熱ショックタンパク質調製物を被験体に投与し、そして、それに対する免疫応答を誘導することが好ましい成分を含むワクチン組成物を、被験体に投与することを含む、ワクチン組成物により被験体の免疫応答を誘導する方法であって、ワクチン組成物は、ワクチン組成物が無い場合、成分に対して免疫原性量以下である、方法を提供する。熱ショックタンパク質調製物は、成分の免疫原性を示さない。
【００２８】
さらに別の実施形態において本発明は、ＡＰＣに熱ショックタンパク質調製物を接触させることを含む、抗原提示細胞を活性化する方法を提供する。特に、抗原提示細胞は個体から得られ、ＡＰＣは任意拡張および／または精製され、ｅｘ ｖｉｖｏで熱ショックタンパク質調製物で処理される。処理されたＡＰＣは次に、それに対する免疫応答を誘導することが好ましい成分を含むワクチン組成物の投与と同時に、その前に、または後に、被験体に投与することができる。患者は、本発明により、ワクチン組成物を用いて、かつ活性化ＡＰＣおよび／またはＨＳＰ調製物を用いて処理される。
【００２９】
本発明のこれらの上記実施形態において、熱ショックタンパク質は、ワクチン組成物の投与が無い場合は、成分に対する免疫応答を誘発しない。熱ショックタンパク質は、ワクチン組成物中の成分の免疫原性を示さない。熱ショックタンパク質調製物の免疫原性は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで、当該分野で公知の任意の方法（例えば、特に限定されないが、セクション５．５．に記載の方法）により試験することができる。
【００３０】
種々の実施形態において、ＨＳＰは、ワクチン組成物の投与前に被験体に投与される。あるいはＨＳＰは、ワクチン組成物の投与と同時に被験体に投与される。ＨＳＰはまた、ワクチン組成物の投与後に被験体に投与することもできる。好ましくは被験体は哺乳動物であり、さらに詳しくはヒトである。
【００３１】
本発明はさらに、ワクチンではない治療法を受けている被験体の治療の結果を改善する方法を提供する。この方法は、その治療法の前、同時、または後に、被験体に哺乳動物の熱ショックタンパク質調製物を投与することを含む。
【００３２】
理論には拘束されないが、ＨＳＰ濃度の上昇は、サイトカインの分泌、抗原提示性および同時刺激性分子の表面発現を誘導する。ＣＤ１１ｂ＋ 細胞活性化を用いる本出願人の実験は、細胞外環境中のＨＳＰの存在が、インターロイキン−１β分泌とＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現を誘導することを示している。ＡＰＣの活性化は、ワクチンとＴ細胞の表面上のＴ細胞抗原表面受容体（ＴＣＲ）から生じる抗原−ＭＨＣ複合体の親和性を上昇させる。従って、被験体に投与されたＨＳＰ調製物は、抗原提示の効率と有効性を上昇させることにより、ワクチンの有効性を増強することができる。
【００３３】
本発明の方法で使用されるＨＳＰ調製物は、いかなる分子にも結合していない遊離のＨＳＰ、および他の分子（例えばペプチド）とＨＳＰの分子複合体を含むことができる。ＨＳＰ−ペプチド複合体は、ペプチドに共有結合または非共有結合したＨＳＰからなる。本発明の方法は、被験体への投与前に、特定の抗原または抗原性ペプチドへの共有結合または非共有結合を必要とはしない。
【００３４】
また本発明には、それに対する免疫応答が好ましいワクチン組成物の成分に対する、ワクチン組成物により誘発される免疫応答を上昇させるのに有効な量の熱ショックタンパク質を含有する１つ以上の容器と、（ａ）の熱ショックタンパク質調製物の投与の前、同時、または後に投与されると、成分に対する免疫応答を誘導するのに有効な量のワクチン組成物を含有する１つ以上の容器とを含む、キットが包含される。
【００３５】
４．　図面の簡単な説明
図１Ａ−１Ｄ。図１Ａ。ｇｐ９６、ｈｓｐ９０、およびｈｓｐ７０の精製調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。ＨＳＰは、セクション６．１．に記載のようにＣ５７ＢＬ／６マウスの肝臓から精製した。各ＨＳＰ調製物の２μｇを、各レーンに適用した。図１Ｂ。プリスタンを腹腔内注射したＣ５７ＢＬ／６マウスから得られた腹腔細胞を、ＣＤ１１ｂ＋細胞について陽性選択した。細胞（５×１０４）を、５％胎児牛血清のみを有する完全ＲＰＭＩ培地またはｇｐ９６（図１Ｂ）、またはすでに記載したようにＣ５７ＢＬ／６マウスの肝臓から精製したｈｓｐ９０もしくはｈｓｐ７０（図１Ｃ）の、同じ培地中の増加する濃度の均一調製物で、３７℃で２０時間インキュベートした。上清を採取し、ＥＬＩＳＡによりＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＬ−１βおよびＢＭ−ＣＳＦについて測定した。ＣＤ１１ｂ＋細胞の培養物をまた、ヒストン、オバルブミンおよびインスリンのような非ＨＳＰとともに同様にインキュベートし、上清をＴＮＦ−αについて試験した（図１Ｄ）。
【００３６】
図２。ｇｐ９６のＡＰＣ刺激活性は、ＬＰＳ−低応答性マウス株では制限される。セクション６．１．に記載するようにマウスのＣ３Ｈ／ＨｅＮまたはＣ３Ｈ／ＨｅＪ株から単離したＣＤ１１ｂ＋細胞（５×１０４）を、５％胎児牛血清のみを有する完全ＲＰＭＩ培地でインキュベートしたか、または同じ培地中の記載の量のｇｐ９６で、３７℃で２０時間処理した。上清を採取し、記載のようにＥＬＩＳＡによりＩＬ−１βとＴＮＦ−αについて測定した。
【００３７】
図３Ａ−３Ｃ。混入しているＬＰＳからは、ｇｐ９６のＡＰＣ刺激活性は得られない。図３Ａ。記載のようにＣ５７ＢＬ／６マウスから単離したＣＤ１１ｂ＋細胞（５×１０４）を、５％胎児牛血清のみを有する完全ＲＰＭＩ培地でインキュベートしたか、または同じ培地中の記載の量のｇｐ９６、ＬＰＳまたはＢＳＡで３７℃で２０時間処理した。上清を採取し、記載のようにＥＬＩＳＡによりＩＬ−１βとＴＮＦ−αについて測定した。図３Ｂ。Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離したＣＤ１１ｂ＋細胞（５×１０４）を、５％胎児牛血清（ＬＢＰの供給源として）有りまたは無しの完全ＲＰＭＩ培地でインキュベートしたか、または上記培地中の記載の量のｇｐ９６またはＬＰＳで３７℃で２０時間処理した。上清を採取し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１βについて測定した。図３Ｃ。ロードシュードモナス・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ）（２μｇ／ｍｌ）から得られるＬＰＳアンタゴニストＲｓｌｐを、記載のようにＬＰＳ（２μｇ／ｍｌ）またはｇｐ９６（９０μｇ／ｍｌ）のサイトカイン分泌アッセイに加えた。
【００３８】
図４。ＨＳＰは、ＣＤ１１ｃ＋細胞を刺激して、抗原提示分子および同時刺激分子を発現させる。骨髄由来のＤＣ培養物を、培地、ＨＳＰ（４００μｇ／ｍｌ）またはＬＰＳ（２μｇ／ｍｌ）に２０時間暴露し、採取し、記載の細胞表面分子の発現について分析した。これらを培地単独、またはｇｐ９６、またはＬＰＳ、またはアルブミンで処理した時、ＤＣ培養物中にＧＭ−ＣＳＦは存在しなかった。記載のパーセントは、記載の表面マーカーについても陽性であったＣＤ１１ｃ＋細胞である。細胞は、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ラホヤ、カリホルニア州）を使用するフローサイトメトリーにより分析した。生きた細胞を、ＦＳＣ／ＳＳＣプロフィールに基づいてゲーティングした。
【００３９】
図５。ｇｐ９６は、ＮＦｋＢシグナル伝達経路を介してＡＰＣと相互作用する。（Ａ） ＤＣ（１×１０６細胞）を、記載の時点についてｇｐ９６（１００μｇ／ｍｌ）またはＬＰＳ（４μｇ／ｍｌ）でパルスした。パルスしていない培養物またはパルスした培養物の核抽出物を調製し、方法に記載のようにＮＦｋＢ特異的オリゴマーへの結合に使用した。複合体を、未変性ＰＡＧＥで解析し、オートラジオグラフィーを行った。（Ｂ） 線形の露出条件下でゲルをスキャンして（Ａ）からのデータを定量化し、プロットした。
【００４０】
図６Ａ−６Ｂ。壊死細胞へのＤＣの暴露により、ＤＣが成熟し、ＮＦｋＢの核移動が起きるが、アポトーシス細胞ではそうではない。（Ａ） 未成熟ＤＣ（２×１０６）の培養物を、培地単独、または壊死もしくはアポトーシスＥ．Ｇ７細胞のそれぞれの１０６細胞同等物、またはＬＰＳ（陽性対照として）を、２０時間パルスした。ＤＣ培養物を、記載のように表面マーカーの発現について追跡した。（Ｂ） ＤＣ培養物を、培地単独、または壊死もしくはアポトーシスＥ．Ｇ７細胞に１５分間暴露し、図５の凡例に記載のようにＮＦｋＢの移動について分析した。
【００４１】
５．発明の詳細な説明
本発明は、ワクチン組成物により誘発される免疫応答を生成させるかまたは上昇させる方法であって、ワクチン組成物の投与とともに熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）を投与することを含む方法を提供する。
【００４２】
現在、いくつかのワクチン化法では、弱毒化ウイルスおよび細菌株または死滅させた細胞全体を使用して、感染症または癌の治療または予防が好ましい被験体における免疫応答が誘導される。しかし、これらの方法は、弱毒化株が、宿主ＤＮＡと遺伝的に結合して病原性株に変化するというリスクがある。すなわち、これらのワクチンを用いて請求項に記載された方法を使用して被験体の免疫応答を増強または上昇させる能力が、好ましくかつ有利である。さらに、一般に弱いワクチンを用いて請求項に記載された方法を使用して被験体の免疫応答を増強または増幅する能力は、より多量の弱いワクチンの使用の、より安全で実現性のある代替法である。本発明の方法はまた、単独で使用した時は免疫応答を誘導するのに不充分な量のワクチン組成物による、免疫応答の誘導を助けることができる。本発明の方法は、それに対して免疫応答が好ましい成分を含む任意の種類のワクチン組成物（特に限定されないが、生きたワクチン、弱毒化ワクチン、サブユニットワクチン、ＤＮＡワクチン、およびＲＮＡワクチンを含む）で使用することができる。ワクチン組成物はアジュバントを含有してもよい。ワクチン組成物は、１つ以上のアジュバントとともに投与してもよい。
【００４３】
本発明において、ＨＳＰ調製物は、ＡＰＣが、好ましくはワクチン組成物中の抗原（それに対して免疫応答を誘導することが好ましい分子成分）に出会うことが予測される部位で、ワクチン組成物の投与の前、同時、または後に、被験体に投与される。本発明のＨＳＰ調製物は、ＡＰＣを活性化し、従って、抗原提示の有効性および／または効率を上昇させる。従って本発明は、ワクチン組成物により誘発される被験体の免疫応答を上昇させる、ＨＳＰ調製物を使用する方法を提供する。ＨＳＰ調製物によるＡＰＣのｅｘ ｖｉｖｏ活性化、および以後の活性化ＡＰＣの投与は、本発明に包含される。そのような活性化ＡＰＣの投与は、ワクチン組成物投与の前、同時、または後に行われ、このワクチン組成物および活性化ＡＰＣは、本発明の方法のＨＳＰ調製物投与の前、同時、または後に投与してもよい。従って、患者は、ワクチン組成物を用いて、および活性化ＡＰＣおよび／またはＨＳＰ調製物を用いて、本発明により治療される。投与されるＨＳＰ調製物と同じかまたは異なるＨＳＰ調製物は、ＡＰＣを活性化するために使用することができる。
【００４４】
理論や機構に拘束されるつもりはないが、本出願人は、ＨＳＰ調製物はある部位でＡＰＣと接触すると、ＡＰＣの細胞表面の同時刺激分子の発現をアップレギュレートし、サイトカイン産生を増加させると考えている。この機構に限定されないが、被験体の免疫応答の上昇または増幅は、同時刺激分子およびＡＰＣ上の抗原提示に必要な他の分子（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、およびＭＨＣクラスＩＩ）のＨＳＰアップレギュレーションと、その後の、細胞間の相互作用を仲介する可溶性分子であるサイトカインの産生の上昇により誘導される可能性があり、しばしば免疫細胞の増殖と分裂を促進する。同時刺激分子のＨＳＰ誘導性刺激により、請求項に記載された方法は一般に、Ｔ細胞活性化を増強し、被験体の免疫応答を上昇させる。その結果、より多くの活性化ＡＰＣ（免疫学的時間枠内で投与されるワクチン中に存在するものを含む）を、Ｔ細胞抗原を提示するのに利用できる。ＡＰＣを活性化するＨＳＰの能力は、被験体に明確な免疫学的利点を付与する。しかし、本発明の範囲は、決して本明細書に記載の機構により限定されるものではないことを理解されたい。
【００４５】
本発明の目的においてＨＳＰ調製物は、他の分子（例えば、ペプチド）に結合していないかまたは結合したＨＳＰを含む組成物である。ＨＳＰは好ましくは精製されている。ＨＳＰ調製物は、ＨＳＰを含む粗細胞溶解物を含有してもよく、溶解物の量は、１００〜１０６細胞相当量に対応する。ペプチドがＨＳＰに結合している時、ペプチドは任意のペプチドであり、これは、ＨＳＰに非共有結合または共有結合することができる。従来法ではＨＳＰは、ほとんどの細胞供給源から、ＨＳＰに非共有結合した異なるペプチドの複合体の集団として、精製することが便利である。ペプチドは、ワクチン組成物、または問題の疾患もしくは障害に無関係でもよい。ＨＳＰは、低ｐＨおよび／またはアデノシン三リン酸に暴露することにより、または当該分野で公知の他の方法により、非共有結合ペプチドから分離することができる。一般に、ＨＳＰ調製物は、ワクチン組成物とは別に投与される。便宜上またはレシピエントの苦痛を緩和するために、ＨＳＰ調製物は、投与直前にワクチン組成物と混合することができる。特異的免疫応答を誘発するために、ＨＳＰ調製物をワクチン組成物とともに使用しない時は、ＨＳＰ調製物単独の投与は、ワクチン組成物により誘導されたであろう抗原特異的免疫応答を誘導しない。
【００４６】
種々の実施形態において、ＨＳＰの供給源は好ましくは、真核生物、さらに好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。従って本発明の方法により使用されるＨＳＰ調製物には、真核生物ＨＳＰ、哺乳動物ＨＳＰ、およびヒトＨＳＰがある。そこからＨＳＰ調製物が得られる真核生物供給源と、ＨＳＰ調製物を投与される被験体は、好ましくは同じ種である。
【００４７】
ある実施形態においてＨＳＰ調製物は、ワクチンと同時に被験体に投与することが妥当である。この方法は、１分未満から約５分の時間枠内で、または互いに約６０分まで、例えば同じ医師への訪問時に、２回の投与を行うことを意味する。
【００４８】
別の実施形態においてＨＳＰ調製物は、ワクチンの投与後１時間〜２４時間の時間枠内で、被験体に投与される。除放性または持続放出性のワクチンを使用するなら、この時間枠は、数日またはそれ以上に延長することができる。この方法は、ワクチンの存在によりまだ活性化されていない投与部位またはその近傍に存在するＡＰＣを活性化することを助けると考えられる。
【００４９】
さらに別の実施形態においてＨＳＰ調製物は、ワクチン投与前の約１〜約２４時間の時間枠内で、被験体に投与される。この方法は、ワクチンと出会う前に被験体のＡＰＣをあらかじめ活性化すると考えられる。
【００５０】
異なる代替治療法も提供される。この実施形態では、例えば被験体がワクチンではない治療法を受けている時のように、被験体のＡＰＣが活性化状態にあることが好ましい時に、哺乳動物（好ましくはヒト）のＨＳＰ調製物が被験体に投与される。哺乳動物のＨＳＰ調製物は、例えば、毎日から数週間の期間に定期的に投与することができ、これは、非ワクチン治療法の前でも、重複していても、および／または後でもよい。ＨＳＰ調製物は、治療法の投与と同時、前、または後に投与することができる。治療法の例には、特に限定されないが、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌化合物、化学療法剤、および放射線照射がある。ＨＳＰ調製物は、治療法の治療的利点を増強し、治療の結果を改善することができる。理論や機構に拘束されないが、被験体への哺乳動物ＨＳＰ調製物の投与は、例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の数を増加させるか、および／または樹状細胞の成熟を加速させることにより、被験体の非特異的免疫機構の応答性を増強することができる。
【００５１】
上記のように本発明の好適な実施形態において、ＨＳＰ調製物およびワクチンを投与される被験体は、ヒトである。
【００５２】
さらに別の実施形態において本発明は、免疫原性量以下のワクチン組成物が使用される、ワクチン組成物により被験体の免疫応答を誘導する方法を提供する。本明細書において免疫原性量以下のワクチン組成物とは、ＨＳＰ調製物と無関係にワクチン組成物が投与されると、免疫応答を誘導するのには不充分な量を意味する。この方法は、ワクチン組成物の量が、被験体の免疫応答を有効に誘導するような、ある量の熱ショックタンパク質調製物を、ワクチン組成物投与の前、同時、または後に投与することを含む。
【００５３】
さらに別の実施形態において本発明は、ＡＰＣに熱ショックタンパク質調製物を接触させることを含む、抗原提示細胞の活性化法を提供する。熱ショックタンパク質調製物で処理してＡＰＣを活性化する前に、細胞を、場合により濃縮するかまたは精製し、および／または当該分野で公知の方法によりｅｘ ｖｉｖｏで拡張する。ＡＰＣは、被験体、好ましくは処理されたＡＰＣが再投与される（すなわち、自己ＡＰＣが使用される）同じ被験体から得られるが、非自己ＡＰＣを使用することもできる。非自己ＡＰＣは、同系（すなわち、活性化ＡＰＣが投与される個体の一卵性双子）でも、または同種異系（すなわち、活性化ＡＰＣが投与される個体と少なくとも１つの共通ＭＨＣ対立遺伝子を共有する個体）でもよい。
【００５４】
ＡＰＣの活性化は、当該分野で公知の方法（特に限定されないが、ＣＤ１１ｂ＋細胞を試験するためのセクション６に記載の方法）により追跡することができる。上記の種々の実施形態において、ＨＳＰ調製物の代わりに、活性化ＡＰＣを被験体に投与して同様の結果を得ることができる。従って具体的な実施形態において、活性化ＡＰＣをｉｎ ｖｉｖｏで使用して、妥当に同時に被験体に投与されるワクチン組成物により誘発される免疫応答を、生成または上昇させることができる。活性化ＡＰＣはまた、ワクチン組成物投与前後の１〜２４時間の時間枠内で、または除放性または持続放出性のワクチンの使用の数日以上後に、投与することができる。好ましくは、処理されたＡＰＣは、ワクチン調製物の投与部位またはその近傍に投与される。活性化ＡＰＣの投与は、当該分野で公知の任意の方法により行われる。
【００５５】
本発明の種々の実施形態においてＨＳＰ調製物には、特に限定されないが、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｇｐ９６の単独、または互いに組合せがある。
【００５６】
種々の実施形態において本発明の方法は、治療用または予防用ワクチンが存在する疾患または障害、すなわち免疫応答の増強による治療または予防が可能な疾患または障害を治療または予防するのに使用される。具体的な実施形態において疾患は、感染症または癌である。熱ショックタンパク質調製物または処理されたＡＰＣは、一般にワクチン組成物とは別に投与される。
【００５７】
本発明は、それに対する免疫応答を誘導することが好ましい成分を含むワクチン組成物を、被験体に投与し、そして、被験体に熱ショックタンパク質調製物を投与することを含む、免疫応答を生成する方法であって、熱ショックタンパク質調製物は、ワクチン組成物を投与しない場合は、成分に対する免疫応答を誘発しない、方法を含む。
【００５８】
本発明は、被験体の感染症を治療または予防する方法であって、感染症を引き起こす感染性物質の抗原性を示す成分（原因感染性物質に対する抗原の免疫原性量）を含むワクチン組成物を被験体に投与する工程、そしてワクチン組成物と組合せて、成分に対する被験体の免疫応答を誘導するかまたは上昇させるのに有効な量の熱ショックタンパク質調製物を、被験体に投与する工程とを、任意の順序で含み、ここで、熱ショックタンパク質調製物は、ワクチン組成物を投与しない場合は成分に対する免疫応答を誘発しない、方法を包含する。
【００５９】
本発明は、被験体の癌または転移を治療または予防する方法であって、癌細胞の抗原性を示す成分（特に限定されないが、腫瘍特異抗原、腫瘍関連抗原、またはその抗原性を示す分子などの、癌に対する抗原の免疫原性量）を含むワクチン組成物を、被験体に投与する工程、そしてワクチン組成物と組合せて、成分に対する被験体の免疫応答を誘導するかまたは上昇させるのに有効な量の熱ショックタンパク質調製物を、被験体に投与する工程とを、任意の順序で含み、ここで、熱ショックタンパク質調製物は、ワクチン組成物を投与しない場合は成分に対する免疫応答を誘発しない、方法を包含する。
【００６０】
分子量に基づいて、ＨＳＰの３つの主要なファミリーが同定されている。このファミリーは、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ７０、およびｈｓｐ９０（ここで、数字は、これらのストレスタンパク質のおよその分子量をキロダルトンで表したものである）と呼ばれる。後に、これらのファミリーの多くのメンバーは、他のストレス刺激（特に限定されないが、栄養枯渇、代謝破壊、酸素ラジカル、および細胞内病原体による感染を含む）に応答して誘導されることがわかった（Ｗｅｌｃｈ， １９９３年５月、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ５６−６４；Ｙｏｕｎｇ， １９９０， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８：４０１−４２０；Ｃｒａｉｇ， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１９０２−１９０３；Ｇｅｔｈｉｎｇら、１９９２， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：３３−４５；およびＬｉｎｄｑｕｉｓｔら、１９８８， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２２：６３１−６７７）。シャペロン機能に関与すると考えられている多くのタンパク質は、小胞体（ＥＲ）管腔に存在し、例えば、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ；Ｇｅｔｈｉｎｇら、１９９２， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：３３−４５）、カルレチキュリン（Ｈｅｒｂｅｒｔら、１９９７， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １３９：６１３−６２３）、ｈｓｐ９０に関連するＧｒｐ９４またはＥＲｐ９９（ＳｏｒｇｅｒとＰｅｌｈａｍ， １９８７， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９４：（２） ３４１−４）、ｈｓｐ７０に関連するＧｒｐ７８またはＢｉＰ（Ｍｕｎｒｏら、１９８６， Ｃｅｌｌ ４６：２９１−３００；ＨａａｓとＷｅｂｌ， １９８３， Ｎａｔｕｒｅ ３０６：３８７−３８９）がある。これらの３つのファミリーのすべてに属するＨＳＰ（そのようなＨＳＰの断片を含む）は、本発明の実施に使用することができる。
【００６１】
熱ショックタンパク質は、存在する最も高度に保存されているタンパク質の１つである。例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）からのｈｓｐ７０であるＤｎａＫは、すりきずからのｈｓｐ７０タンパク質と５０％のアミノ酸配列同一性を有する（Ｂａｒｄｗｅｌｌら、１９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：８４８−８５２）。ｈｓｐ６０とｈｓｐ９０ファミリーはまた、同様の高レベルのファミリー内保存を示す（Ｈｉｃｋｅｙら、１９８９， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ９：２６１５−２６２６；Ｊｉｎｄａｌ， １９８９， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ９：２２７９−２２８３）。さらに、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ７０、およびｈｓｐ９０ファミリーは、ストレスタンパク質と配列が関連したタンパク質からなり、例えば３５％より大きいアミノ酸同一性を有するが、その発現は、ストレスにより変化しないことが発見されている。従って、本明細書において、ストレスタンパク質の定義は、細胞内のその発現がストレス刺激に応答して増強される、３つのファミリーのメンバーと少なくとも３５％〜５５％、好ましくは５５％〜７５％、最も好ましくは７５％〜８５％のアミノ酸同一性を有する、他のタンパク質、ムテイン、類似体、およびこれらの変種を包含すると考えられる。これらの３つのファミリーに属するストレスタンパク質の精製を、以下に記載する。
【００６２】
さらに、ＨＳＰは、免疫学的および抗原性性質を有することがわかっている。ＨＳＰは現在、免疫制御において必須の役割を果たすことが理解されている（Ｍｉｚｚｅｎ， １９９８， Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ １０：１７４参照）。例えば、以前の実験は、ＨＳＰが、ＨＳＰに共有結合または非共有結合した抗原性ペプチドに対して、強くかつ長期に持続性の特異的免疫応答を刺激することを証明した。特異的ペプチドを使用することにより、生成される免疫応答は、そのペプチドに対して「特異的」であり、これを標的としている。
【００６３】
しかし、本発明において、ＨＳＰ−ペプチド複合体が使用される場合、ペプチドは、問題の条件に対して抗原性であるかまたは関連する必要は無い。この例において本発明の目的は、結合したペプチドに対する特異的免疫応答を誘発するために、ＨＳＰ−ペプチド複合体を使用しないことである。本発明のＨＳＰ調製物は、一般に被験体におけるすべての種類の抗原（特に、ワクチン組成物中で被験体に投与されるもの）の提示を助ける。
【００６４】
５．１．　熱ショックタンパク質の調製
本発明において、精製した非結合ＨＳＰ、または特異的ペプチドもしくは非特異的ペプチドに共有結合もしくは非共有結合したＨＳＰ（本明細書においてまとめてＨＳＰ−ペプチド複合体と呼ぶ）、およびこれらの組合せが使用される。複合体形成または非複合体形成型のＨＳＰの精製は、以下のサブセクションに記載される。さらに、当業者は、組換え発現またはペプチド合成によりＨＳＰを合成することができ、これらも以下に記載される。
【００６５】
５．１．１．　ｈｓｐ７０またはｈｓｐ７０−ペプチド複合体の調製と精製
ｈｓｐ７０−ペプチド複合体の精製は、例えば Ｕｄｏｎｏら、１９９３， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７８：１３９１−１３９６にすでに記載されている。使用可能な方法には、特に限定されないが、以下がある。
【００６６】
まず、ヒトまたは哺乳動物細胞を、５ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ７）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＣｌ２および１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）からなる３倍量の１×溶解バッファーに懸濁する。次に顕微鏡観察で＞９９％の細胞が溶解されるまで、ペレットを、氷上で超音波処理する。超音波処理の代わりに、機械的剪断により細胞を溶解してもよく、このアプローチでは、細胞は、一般に３０ｍＭ重炭酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＰＭＳＦに再懸濁され、氷上で２０分インキュベートされ、次に＞９５％の細胞が溶解するまで、ダウンス（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザーでホモジナイズされる。
【００６７】
次に溶解物を、１，０００ｇで１０分遠心分離して、破壊されていない細胞、核および他の細胞破片を除去する。生じる上清を、１００，０００ｇで９０分間再度遠心分離し、上清を採取し、次に２ｍＭ Ｃａ２＋と２ｍＭ Ｍｇ２＋を含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化させたＣｏｎＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）と混合する。細胞を機械的剪断により溶解する時、上清は、等量の２×溶解バッファーで希釈後ＣｏｎＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）と混合する。次に上清を、４℃で２〜３時間ＣｏｎＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）に結合させる。結合しない物質を採取し、１０ｍＭ トリス−酢酸（ｐＨ７．５）、０．１ ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＰＭＳＦに対して３６時間透析する（３回、各回１００容量）。次に透析液を１７，０００ｒｐｍ（ソーバルＳＳ３４ロータ）で２０分間遠心分離する。次に、生じる上清を採取し、２０ｍＭ トリス−酢酸（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１５ｍＭ ２−メルカプトエタノールで平衡化させたＭｏｎｏ Ｑ　ＦＰＬＣ（登録商標）イオン交換クロマトグラフィーカラム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））に適用する。次にカラムを２０ｍＭ〜５００ｍＭ ＮａＣｌ勾配で展開し、次に溶出した画分を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分画し、適切な抗ｈｓｐ７０抗体（例えば、ＳｔｒｅｓｓＧｅｎからのクローンＮ２７Ｆ３−４）を使用して免疫ブロッティングにより解析する。
【００６８】
抗ｈｓｐ７０抗体と強く免疫反応する画分をプールし、ｈｓｐ７０−ペプチド複合体を硫酸アンモニウムで沈殿させ、具体的には５０〜７０％硫酸アンモニウムで沈殿させる。次に、生じる沈殿物を１７，０００ｒｐｍ（ＳＳ３４ソーバルロータ）で遠心分離して採取し、７０％硫酸アンモニウムで洗浄する。次に、洗浄した沈殿物を可溶化し、残存している硫酸アンモニウムを、セファデックス（登録商標）Ｇ２５カラム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））でゲル濾過して除去する。必要であれば、こうして得られたｈｓｐ７０調製物は、上記したようにＭｏｎｏ Ｑ　ＦＰＬＣ（登録商標）イオン交換クロマトグラフィーカラム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を通して再精製することができる。
【００６９】
ｈｓｐ７０−ペプチド複合体は、この方法を使用して見かけ上均一になるまで精製することができる。一般には、１ｇの細胞／組織から１ｍｇのｈｓｐ７０−ペプチド複合体を精製することができる。
【００７０】
ｈｓｐ７０−ペプチド複合体の改良された精製法は、溶解物中のｈｓｐ７０が、ＡＤＰまたは加水分解不可能なＡＴＰの類似体に結合できるように、固体支持体に結合したＡＤＰまたは加水分解不可能なＡＴＰの類似体を、細胞タンパク質に接触させ、そして結合したｈｓｐ７０を溶出させることを含む。好適な方法は、固体基質（例えば、ＡＤＰ−アガロース）に結合したＡＤＰを用いるカラムクロマトグラフィーを使用する。生じるｈｓｐ７０調製物は、純度が高く、混入ペプチドが無い。あるいは、ＡＤＰの代わりに、加水分解不可能なＡＴＰの類似体を用いるクロマトグラフィーを、ｈｓｐ７０−ペプチド複合体の精製のために使用することができる。例えば、特に限定されないが、ＡＤＰ−アガロースクロマトグラフィーによるｈｓｐ７０−ペプチド複合体の精製は、以下のように行われる：
Ｍｔｈ Ａ肉腫細胞（５億個の細胞）を、低張バッファー中でホモジナイズし、溶解物を１００，０００ｇで４℃で９０分間遠心分離する。上清をＡＤＰ−アガロースカラムに適用する。カラムをバッファーで洗浄し、５カラム容量の３ｍＭ ＡＤＰで溶出する。ｈｓｐ７０−ペプチド複合体は、溶出する全１５画分の画分２〜画分１０で溶出する。溶出した画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。この方法を使用して、ｈｓｐ７０−ペプチド複合体を見かけ上均一になるまで精製することができる。
【００７１】
ｈｓｐ７０−ペプチド複合体からのＨＳＰの分離は、ＡＴＰの存在下または低ｐＨで行われる。これらの２つの方法は、ｈｓｐ７０−ペプチド複合体からペプチドを溶出するのに使用される。最初のアプローチは、ＡＴＰの存在下でｈｓｐ７０−ペプチド複合体調製物をインキュベートする。他のアプローチは、ｈｓｐ７０−ペプチド複合体調製物を低ｐＨバッファーでインキュベートする。これらの方法および当該分野で公知の他の方法を適用して、ＨＳＰ−ペプチド複合体から、ＨＳＰとペプチドを分離してもよい。
【００７２】
５．１．２．　ｈｓｐ９０またはｈｓｐ９０−ペプチド複合体の調製と精製
使用可能な方法には、特に限定されないが、以下がある。
【００７３】
まず、ヒトまたは哺乳動物細胞を、５ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ７）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＣｌ２および１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）からなる３倍量の１×溶解バッファーに懸濁する。次に顕微鏡観察で＞９９％の細胞が溶解されるまで、ペレットを、氷上で超音波処理する。超音波処理の代わりに、機械的剪断により細胞を溶解してもよく、このアプローチでは、細胞は、一般に３０ｍＭ重炭酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＰＭＳＦに再懸濁され、氷上で２０分インキュベートされ、次に＞９５％の細胞が溶解するまで、ダウンス（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザーでホモジナイズされる。
【００７４】
次に溶解物を、１，０００ｇで１０分遠心分離して、破壊されていない細胞、核および他の細胞破片を除去する。生じる上清を、１００，０００ｇで９０分間再度遠心分離し、上清を採取し、次に２ｍＭ Ｃａ２＋と２ｍＭ Ｍｇ２＋を含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化させたＣｏｎＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）と混合する。細胞を機械的剪断により溶解する時、上清は、等量の２×溶解バッファーで希釈後ＣｏｎＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）と混合する。次に上清を、４℃で２〜３時間ＣｏｎＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）に結合させる。結合しない物質を採取し、１０ｍＭ トリス−酢酸（ｐＨ７．５）、０．１ ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＰＭＳＦに対して３６時間透析する（３回、各回１００容量）。次に透析液を１７，０００ｒｐｍ（ソーバルＳＳ３４ロータ）で２０分間遠心分離する。次に、生じる上清を採取し、溶解バッファーで平衡化させたＭｏｎｏ Ｑ　ＦＰＬＣ（登録商標）イオン交換クロマトグラフィーカラム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））に適用する。次にタンパク質を２００ｍＭ〜６００ｍＭ ＮａＣｌの塩勾配で溶出する。
【００７５】
溶出した画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、ｈｓｐ９０−ペプチド複合体を含有する画分を、３Ｇ３（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ）のような抗ｈｓｐ９０抗体を使用して免疫ブロッティングにより同定する。この方法を使用して、ｈｓｐ９０−ペプチド複合体を見かけ上均一になるまで精製することができる。一般的には、１ｇの細胞／組織から１５０〜２００μｇのｈｓｐ９０−ペプチド複合体を精製することができる。
【００７６】
ｈｓｐ９０−ペプチド複合体からのＨＳＰの分離は、ＡＴＰの存在下または低ｐＨで行われる。これらの２つの方法は、ｈｓｐ９０−ペプチド複合体からペプチドを溶出するのに使用される。最初のアプローチは、ＡＴＰの存在下でｈｓｐ９０−ペプチド複合体調製物をインキュベートする。他のアプローチは、ｈｓｐ９０−ペプチド複合体調製物を低ｐＨバッファーでインキュベートする。これらの方法および当該分野で公知の他の方法を適用して、ＨＳＰ−ペプチド複合体から、ＨＳＰとペプチドを分離してもよい。
【００７７】
５．１．３．　ｇｐ９６とｇｐ９６−ペプチド複合体の調製と精製
使用可能な方法には、特に限定されないが、以下がある。
【００７８】
ヒトまたは哺乳動物細胞のペレットを、３０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ７）と１ｍＭ ＰＭＳＦからなる３倍量のバッファーに再懸濁し、細胞を氷上で２０分間膨潤させる。次に細胞ペレットを、＞９５％の細胞が溶解するまで、ダウンス（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザー（ホモジナイザーの適当なクリアランスは、各細胞の種類で異なる）でホモジナイズする。
【００７９】
溶解物を、１，０００ｇで１０分遠心分離して、破壊されていない細胞、核および他の細胞破片を除去する。次に、この遠心分離工程からの上清を、１００，０００ｇで９０分間再度遠心分離する。１００，０００ペレットからまたは上清から、ｇｐ９６−ペプチド複合体を精製することができる。
【００８０】
上清から精製する時、上清は、等量の２×溶解バッファーで希釈し、上清を、２ｍＭ Ｃａ２＋と２ｍＭ Ｍｇ２＋を含有するＰＢＳで平衡化させたＣｏｎＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）と、４℃で２〜３時間混合する。次に、スラリーをカラムに充填し、ＯＤ２８０がベースラインに落ちるまで、１×溶解バッファーで洗浄する。次に、２ｍＭ Ｃａ２＋と２ｍＭ Ｍｇ２＋を含有するＰＢＳに溶解した１０％α−メチルマンノシド（α−ＭＭ）の１／３カラムベッド容量で洗浄し、カラムをパラフィルム片で密封し、３７℃で１５分間インキュベートする。次にカラムを室温まで冷却し、カラムの底からパラフィルムを取り出す。５カラム容量のα−ＭＭバッファーをカラムに適用し、溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。一般に、生じる物質の純度は６０〜９５％であるが、これは、使用される細胞の種類と組織対溶解バッファー比に依存する。次にサンプルを、５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）で平衡化させたＭｏｎｏ Ｑ　ＦＰＬＣ（登録商標）イオン交換クロマトグラフィーカラム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））に適用する。次にカラムから０〜１Ｍ ＮａＣｌ勾配でタンパク質を溶出すると、ｇｐ９６画分は４００ｍＭ〜５５０ｍＭ ＮａＣｌで溶出する。
【００８１】
しかし、見かけ上均一なｇｐ９６−ペプチド複合体を一貫して産生するために、この方法を、２つの追加の工程（単独または組合せて使用される）により変更してもよい。１つの任意の工程は、硫酸アンモニウム沈殿後にＣｏｎ Ａ精製工程を行い、他の１つはＣｏｎ Ａ精製工程後であるがＭｏｎｏ Ｑ　ＦＰＬＣ（登録商標）工程前にＤＥＡＥ−セファロース（登録商標）精製を行う。
【００８２】
最初の任意工程では、例えば以下のように、１００，０００ｇ遠心分離工程から生じる上清に、硫酸アンモニウムを添加して最終濃度を５０％硫酸アンモニウムにする。硫酸アンモニウムは、氷水のトレイに入れたビーカー中の溶液を静かに攪拌しながら、ゆっくり加える。溶液を、４℃で約１／２〜１２時間攪拌し、生じる溶液を６，０００ｒｐｍ（ソーバルＳＳ３４ロータ）で遠心分離する。この工程から生じる上清を取り、硫酸アンモニウム溶液を添加して７０％硫酸アンモニウム飽和とし、６，０００ｒｐｍ（ソーバルＳＳ３４ロータ）で遠心分離する。この工程から生じるペレットを採取し、７０％硫酸アンモニウムを含有するＰＢＳに懸濁して、ペレットをリンスする。この混合物を６，０００ｒｐｍ（ソーバルＳＳ３４ロータ）で遠心分離し、ペレットを、２ｍＭ Ｃａ２＋とＭｇ２＋を含有するＰＢＳに溶解する。溶解しない物質を、１５，０００ｒｐｍ（ソーバルＳＳ３４ロータ）で遠心分離して除去する。次に、溶液にＣｏｎＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）を混合し、前記したように操作する。
【００８３】
第２の任意工程では、例えば以下のように、Ｃｏｎ Ａカラムから溶出したｇｐ９６含有画分をプールし、透析により５ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）、３００ｍＭ ＮａＣｌにバッファーを交換するか、または好ましくはセファデックスＧ２５カラムでバッファー交換する。バッファー交換後、溶液を、５ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）、３００ｍＭ ＮａＣｌですでに平衡化したＤＥＡＥ−セファロース（登録商標）と混合する。タンパク質溶液とビーズを、静かに１時間混合し、カラムに注ぐ。次に、２８０ｎｍの吸光度がベースラインに下がるまで、カラムを５ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）、３００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄する。次に結合タンパク質を、５容量の５ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）、７００ｍＭ ＮａＣｌを用いてカラムから溶出する。タンパク質含有画分をプールし、５ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）で希釈して、塩濃度を１７５ｍＭまで下げる。次に、生じる物質を、５ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）で平衡化させたＭｏｎｏ Ｑ　ＦＰＬＣ（登録商標）イオン交換クロマトグラフィーカラム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））に適用し、Ｍｏｎｏ Ｑ　ＦＰＬＣ（登録商標）イオン交換クロマトグラフィーカラム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））に結合するタンパク質を、上記したように溶出する。
【００８４】
しかし、当業者はルーチンの実験により、精製プロトコールに第２の任意工程を取り込む利点を評価できると理解される。さらに、各任意工程を加える利点は、出発物質の供給源に依存することも理解される。
【００８５】
１００，０００ｇペレットからｇｐ９６画分を単離する時は、ペレットを、１％デオキシコール酸ナトリウムまたは１％オクチルグルコピラノシドを含有する（しかし、Ｍｇ２＋とＣａ２＋は含有しない）５容量のＰＢＳに懸濁し、氷上で１時間インキュベートする。懸濁液を、２０，０００ｇで３０分間遠心分離し、生じる上清を、ＰＢＳ（Ｍｇ２＋とＣａ２＋を含有しない）を数回交換して透析して、界面活性剤を除去する。透析液を１００，０００ｇで９０分間遠心分離し、上清を採取し、上清にカルシウムとマグネシウムを加えて、最終濃度をそれぞれ２ｍＭとする。次にサンプルを、非修飾法または修飾法により精製して、上記のように１００，０００ｇ上清からｇｐ９６−ペプチド複合体を単離する。
【００８６】
この方法を使用して、ｇｐ９６−ペプチド複合体は見かけ上均一になるまで精製することができる。１ｇの細胞／組織から、約１０〜２０μｇのｇｐ９６を単離することができる。
【００８７】
ｇｐ９６−ペプチド複合体からのＨＳＰの分離は、ＡＴＰの存在下または低ｐＨで行われる。これらの２つの方法は、ｇｐ９６−ペプチド複合体からペプチドを溶出するのに使用される。最初のアプローチは、ＡＴＰの存在下でｇｐ９６−ペプチド複合体調製物をインキュベートする。他のアプローチは、ｇｐ９６−ペプチド複合体調製物を低ｐＨバッファーでインキュベートする。これらの方法および当該分野で公知の他の方法を適用して、ＨＳＰ−ペプチド複合体から、ＨＳＰとペプチドを分離してもよい。
【００８８】
５．１．４．　ＨＳＰの組換え発現
当該分野で公知の方法を使用して、ＨＳＰを組換え産生することができる。宿主細胞中で増殖と発現をさせるために、熱ショックタンパク質をコードする核酸配列を発現ベクターに挿入することができる。
【００８９】
本明細書において発現構築体とは、適切な宿主細胞中でのＨＳＰの発現を可能にする１つ以上の制御領域に、機能的に結合しているＨＳＰをコードするヌクレオチド配列を意味する。「機能的に結合している」とは、制御領域と発現すべきＨＳＰ配列が、転写、および最終的には翻訳を可能にするように、連結し位置している結合を意味する。
【００９０】
ＨＳＰの転写に必要な制御領域は、発現ベクターにより提供される。その同種の開始コドンが欠如したＨＳＰ遺伝子配列が発現されるなら、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）も提供される。適合性のある宿主構築体システムでは、ＲＮＡポリメラーゼのような細胞転写因子は、発現構築体上の制御領域に結合して、宿主生物中の修飾ＨＳＰ配列の転写を開始するであろう。遺伝子発現に必要な制御領域の正確な性質は、宿主細胞毎に異なる。一般に、ＲＮＡポリメラーゼに結合でき、機能的に結合している核酸配列の転写を促進することができるプロモーターが必要である。そのような制御領域は、転写と翻訳に関与する５’非コード配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などを含有してもよい。コード配列の３’の非コード領域は、転写停止制御配列、例えばターミネーターおよびポリアデニル化部位を含有してもよい。
【００９１】
プロモーターのような制御機能を有するＤＮＡ配列をＨＳＰ遺伝子配列に結合させるために、またはＨＳＰ遺伝子配列をベクターのクローニング部位に挿入するために、適切な適合性のある制限部位を与えるリンカーまたはアダプターを、当該分野で公知の方法（Ｗｕら、１９８７， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５２：３４３−３４９）によりｃＤＮＡの末端に連結してもよい。制限酵素を用いる切断後に、修飾して、逆消化するか、または１本鎖ＤＮＡ末端を充填してから連結することにより、平滑末端を作成することができる。あるいは、所望の制限酵素部位を含有するプライマーを用いるＰＣＲを使用して、ＤＮＡを増幅することにより、ＤＮＡの断片中に所望の制限酵素部位を導入することができる。
【００９２】
制御領域に機能的に結合しているＨＳＰ配列を含む発現構築体は、さらにクローニングすることなくＨＳＰ−ペプチド複合体の発現と産生のために、適切な宿主細胞中に直接導入することができる。例えば、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，５８０，８５９を参照されたい。発現構築体はまた、例えば相同的組換えを介して、宿主細胞のゲノム中へのＨＳＰ配列の組み込みを促進するＤＮＡ配列を含有することができる。この場合、宿主細胞中でＨＳＰを増やし発現するために、適切な宿主細胞に適した複製開始点を含む発現ベクターを使用する必要は無い。
【００９３】
種々の発現ベクターが使用でき、例えば、特に限定されないが、プラスミド、コスミド、ファージ、ファジミド、または改変ウイルスがある。一般には、そのような発現ベクターは、適切な宿主細胞中でのベクターの増殖のための機能性複製開始点、ＨＳＰ遺伝子配列の挿入のための１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つ以上の選択マーカーを含有してもよい。発現ベクターは、原核生物または真核生物由来の適合性のある宿主細胞とともに使用する必要があり、これには、特に限定されないが、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物およびヒトがある。
【００９４】
正しく処理されたＨＳＰまたはＨＳＰ−ペプチド複合体の長期間の高収率の産生のために、哺乳動物細胞中の安定な発現が好ましい。ＨＳＰまたはＨＳＰ−ペプチド複合体を安定に発現する細胞株は、選択マーカーを含有するベクターを使用して作成することができる。例えば、特に限定されないが、発現構築体の導入後に、作成した細胞を、強化倍地中で１〜２日間増殖させ、次に選択培地に切り替える。発現構築体中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞が、その染色体中に発現構築体を組み込み、培養で増殖し、拡張されて細胞株になることを可能にするのに最適である。そのような細胞は、ＨＳＰを連続的に発現しながら、長期間培養することができる。
【００９５】
組換え細胞は、標準的条件の温度、インキュベーション時間、光学密度、および培地組成で培養される。しかし、組換え細胞の増殖のための条件は、ＨＳＰや抗原性タンパク質の発現のための条件とは異なってよい。ＨＳＰの産生を増強するために、修飾した培養条件や培地を使用してもよい。例えば、同種のプロモーターを有するＨＳＰを含有する組換え細胞を、熱または他の環境ストレス、または化学ストレスに暴露してもよい。当該分野で公知の任意の技術を応用して、ＨＳＰまたはＨＳＰ−ペプチド複合体を産生するための最適条件を確立することができる。
【００９６】
５．１．５．　ペプチド合成
ＨＳＰ産生のための組換え法の代替法は、ペプチド合成である。例えば、全ＨＳＰまたはＨＳＰの一部に対応するペプチドを、ペプチド合成機を使用して合成することができる。従来のペプチド合成または当該分野で公知の他の合成プロトコールを使用してもよい。
【００９７】
ＨＳＰまたはその一部のアミノ酸配列を有するペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， １９６３， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８５：２１４９に記載の方法と類似の方法を使用して、固相ペプチド合成により合成してもよい。合成中、保護された側鎖を有するＮ−α−保護アミノ酸を、Ｃ末端により不溶性ポリマー支持体（すなわち、ポリスチレンビーズ）に結合した増殖するポリペプチド鎖に、段階的に加える。Ｎ−α−保護アミノ酸のアミノ基を、ジシクロヘキシルカルボジイミドのような試薬と反応させることにより活性化してある、Ｎ−α−保護アミノ酸のα−カルボキシル基に結合させることにより、ペプチドを合成することができる。活性化カルボキシルへの遊離のアミノ基の結合により、ペプチド結合が形成される。最も一般的に使用されるＮ−α−保護基は、酸不安定性であるＢｏｃと塩基不安定性であるＦｍｏｃがある。適切な化学、樹脂、保護基、保護アミノ酸および試薬の詳細は当該分野で公知であり、本明細書では詳細に考察はしない（Ａｔｈｅｒｔｏｎら、１９８９， Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｊ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， およびＢｏｄａｎｓｚｋｙ， １９９３， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ， 第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇを参照）。
【００９８】
生じるＨＳＰの精製は、従来法（例えば、ゲル透過を使用する分取ＨＰＬＣ、分配および／またはイオン交換クロマトグラフィー）を使用して行われる。適切なマトリックスとバッファーの選択は、当該分野で公知であり、従って本明細書においては詳述しない。
【００９９】
５．２．　熱ショックタンパク質とともに使用できるワクチン
本発明のＨＳＰまたはＨＳＰ−ペプチド複合体とともに使用可能なワクチンには、特に限定されないが、生ワクチン、不活性化ワクチン、弱毒化ワクチン、サブユニットワクチン、および核酸に基づくワクチンが含まれる。サブユニットワクチンは、多価でもまたは１価でもよく、例えば精製した病原体抗原（例えば、単離されたウイルスコートタンパク質、および細菌細胞壁分子など）を含有してもよい。多価ワクチンは、２つ以上の抗原の発現を指令する組換えウイルスから作製される。最近まで、ワクチンは一般に、感染症に対する予防のために使用されてきた。しかし、種々のタイプの癌の治療または予防のために、腫瘍抗原に基づくワクチン（例えば、腫瘍特異抗原または腫瘍関連抗原を含有する）が開発されている。ワクチン組成物で使用可能な腫瘍抗原の非限定的な例には、ＫＳ１／４汎癌（ｐａｎ−ｃａｒｃｉｎｏｍａ）抗原（ＰｅｒｅｚとＷａｌｋｅｒ， １９９０， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４２：３６６２−３６６７；Ｂｕｍａｌ， １９８８， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ７（４）：４０７−４１５）；卵巣癌抗原（ＣＡ１２５）（Ｙｕら、１９９１， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５１（２）：４６８−４７５）；前立腺酸性ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（Ｔａｉｌｅｒら、１９９０， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８（１６）：４９２８）；前立腺特異的抗原（ＨｅｎｔｔｕとＶｉｈｋｏ， １９８９， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １６０（２）：９０３−９１０；Ｉｓｒａｅｌｉら、１９９３， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３：２２７−２３０）；黒色腫関連抗原ｐ９７（Ｅｓｔｉｎら、１９８９， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８１（６）：４４５−４４６）；黒色腫抗原ｇｐ７５（Ｖｉｊａｙａｓａｒｄａｈｌら、１９９０， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７１（４）：１３７５−１３８０）；高分子量黒色腫抗原（Ｎａｔａｌｉら、１９８７， Ｃａｎｃｅｒ ５９：５５−６３）、抗原のＭＡＧＥファミリー（Ｈｕら、１９９６， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６：２４７９−２４８３；Ｍａｒｃｈａｎｄら、１９９５， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ６３：８８３−８８５）、および前立腺特異的膜抗原が含まれうる。本発明のＨＳＰまたはＨＳＰ−ペプチド複合体はまた、そのような癌ワクチンとともに使用することができる。本発明の方法で使用できる癌ワクチンは、種々の刊行物に概説されており、例えばＰａｒｄｏｌｌ， ２０００， Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９５（１ Ｐｔ ２）；Ｓ４４−６２ およびＳｔｅｖｅｎｓｏｎ， １９９９， Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ． １０：１４１３−８がある（これらの内容は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１００】
ワクチンを導入するのに多くの方法が使用でき、これらには、特に限定されないが、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内経路、および乱切法（例えば二又針を使用して、皮膚の表層をひっかく）が含まれる。
【０１０１】
ワクチンが投与される患者は、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトであるが、また非ヒト動物でもよく、特に限定されないが、霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、トリ（例えば、ニワトリ）、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウスおよびラットが挙げられる。
【０１０２】
本発明のＨＳＰまたはＨＳＰ−ペプチド複合体とともに使用可能なワクチン組成物の例には、特に限定されないが、カルメット‐ゲラン杆菌ワクチン、ブルセラ（ｂｒｕｃｅｌｌａ）株１９ワクチン、コレラワクチン、ジフテリア−破傷風トキソイド−百日咳ワクチン、口蹄疫ワクチン、ハフキン（Ｈａｆｆｋｉｎｅ’ｓ）ワクチン、種々の肝炎ウイルスワクチン、ヒト二倍体細胞狂犬病ウイルス、ポリオウイルスワクチン、インフルエンザウイルスワクチン、はしかワクチン、麻疹−ムンプス−風疹混合ワクチン、プラークワクチン、肺炎球菌ワクチン、リケッチアワクチン、セービンワクチン、センプルワクチン、天然痘ワクチン、ブドウ球菌ワクチン、腸チフスワクチン、チフスワクチン、百日咳ワクチン、および黄熱病ワクチンが含まれる。本発明の方法で使用可能なワクチンは、種々の刊行物で概説されており、例えば Ｔｈｅ Ｊｏｒｄａｎ Ｒｅｐｏｒｔ ２０００， Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓが挙げられる（この内容は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１０３】
ワクチン組成物は、アジュバントを含むか、または１つ以上のアジュバントとともに投与されてよい。使用可能なアジュバントには、特に限定されないが、鉱物塩アジュバント、または鉱物塩ゲルアジュバント、粒状アジュバント、微粒子アジュバント、粘膜アジュバント、および免疫刺激性アジュバントが含まれる。アジュバントの例には、特に限定されないが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムゲル、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、スクアレンまたはスクアラン水中油型アジュバント製剤、生分解性および生体適合性ポリエステル、重合リポソーム、トリテルペノイドグリコシドまたはサポニン（例えば、ＱｕｉｌＡおよびＱＳ−２１、また商標名ＳＴＩＭＵＬＯＮ、ＩＳＣＯＰＲＥＰで販売されている）、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（トレオニル−ＭＤＰ、商標名ＴＥＲＭＵＲＴＩＤＥで販売されている）、ＬＰＳ、モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＬＡ、商標名ＭＰＬで販売されている）が含まれる。
【０１０４】
５．３．　キット、投与処方計画、投与および製剤
本発明のワクチン接種方法を実施するためのキットも提供される。特定の実施形態において、キットは、それに対する免疫応答が所望されるワクチン組成物の成分に対する、ワクチン組成物により誘発される免疫応答を上昇させるのに有効な量の熱ショックタンパク質調製物を含有する第１の容器；および第１の容器中の熱ショックタンパク質調製物の投与の前、同時、または後に投与されると、成分に対する免疫応答を誘導するのに有効な量のワクチン組成物を含有する第２の容器とを含む。
【０１０５】
容器中に、疾患または障害を治療または予防するのに有効な量のワクチン組成物を含み；別の容器に、ワクチンにより誘発される免疫応答を上昇または増強するのに有効な量の熱ショックタンパク質調製物を含む、本発明のキットが提供される。ある実施形態において、容器中に存在するワクチン組成物の量は、他の容器中の熱ショックタンパク質調製物とは独立に投与されると、被験体中で免疫応答を誘導するには不充分である。キットは、随時説明書を伴う。
【０１０６】
投与されるＨＳＰ調製物の投与量はほとんど、治療される被験体の症状と大きさ、ならびに投与されるワクチン組成物の量、治療の頻度および投与経路に依存する。治療の継続の処方計画（部位、用量、および頻度を含む）は、最初の応答と臨床的判断により管理されうる。
【０１０７】
投与経路とＨＳＰ調製物中のＨＳＰのタイプに依存して、ＨＳＰ調製物中のＨＳＰの量は、例えば投与当たり０．１〜１０００μｇの範囲でありうる。ｇｐ９６またはｈｓｐ７０の好適な量は、投与当たり１０〜６００μｇの範囲であり、ＨＳＰ調製物が皮内に投与される場合には、０．１〜１０μｇである。ｈｓｐ９０については、好適な量は、投与当たり約５０〜１０００μｇであり、皮内投与については約５〜５０μｇである。
【０１０８】
好適な一実施形態において、ＨＳＰ調製物は、ワクチンの投与と同時に投与される。ＨＳＰ調製物とワクチンの同時投与は、ＨＳＰまたはＨＳＰ−ペプチド複合体が、ワクチンと妥当に同時に与えられることを意味する。この方法は、２つの投与が、１分未満〜約５分、または互いから約６０分までの時間枠内、例えば医師への同じ訪問で、実施されることを提供する。
【０１０９】
ＨＳＰ調製物の投与のために、被験体の免疫応答を誘発するのに必要なワクチンの量はより少ない。特定の実施形態において、ワクチン組成物の量の約１０％、２０％、３０％、４０％、および５０％の低下を達成することができる。適切な量のＨＳＰ調製物が一緒に使用されるなら、免疫原性量以下のワクチン組成物を使用することができる。ＨＳＰ調製物とともに使用されるワクチン組成物の量（免疫原性量以下の範囲の量を含む）は、当技術分野で公知の方法により、動物モデルで行われる用量応答実験により決定することができる。
【０１１０】
溶解度とワクチン接種部位は、本発明のＨＳＰ調製物の投与経路を選択する時に考慮すべき要因である。投与様式は変更してもよく、例えば、特に限定されないが、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮内または粘膜が挙げられる。粘膜経路はさらに、経口、直腸、および鼻内投与の形態をとることができる。上記要因を考慮して、ワクチン接種部位と同じかまたは近傍の部位に、ＨＳＰを投与することが好ましい。
【０１１１】
本発明の実施形態において、ＨＳＰは、任意の所望の投与経路を使用して投与されうる。皮内投与の利点には、それぞれより低い用量の使用と迅速な吸収が含まれる。皮下または筋肉内投与の利点には、それぞれある不溶性懸濁液および油性懸濁液に適していることが含まれる。粘膜投与経路には、特に限定されないが、経口、直腸、および鼻内投与が含まれる。粘膜投与用調製物は、後述の種々の製剤に適している。
【０１１２】
好適な実施形態において本発明は、特に限定されないが、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０およびｇｐ９６を単独または互いに組合せて含むＨＳＰ調製物を、被験体にワクチンの投与と同時に、同じ部位または近傍の部位に導入する方法を提供する。
【０１１３】
ＨＳＰ調製物が水溶性である場合、これは、適切なバッファー、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、または他の生理学的に適合する溶液（好ましくは無菌である）中で製剤化されうる。あるいは、生じる複合体が、水性溶媒中での溶解度が低い場合、これは、非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎまたはポリエチレングリコール）とともに製剤化されうる。すなわち、化合物とそれらの生理学的に許容される溶媒は、吸入または吹送（口または鼻を介して）による投与、または経口、口腔、非経口、もしくは直腸投与により、または腫瘍の場合は、直接充実性腫瘍中に注射されるように、製剤化されうる。
【０１１４】
経口投与用には医薬調製物は、液体形態、例えば、溶液、シロップ剤もしくは懸濁液であるか、または使用前に水または他の好適なビヒクルで再構成される医薬製品として提供されてよい。そのような液体調製物は、従来の手段で、製薬上許容される添加物、例えば懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、または分留植物油）；および保存剤（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）を用いて調製されうる。医薬調製物は、従来の手段で、例えば、製薬上許容される賦形剤、例えば結合剤（例えば、α化（ｐｒｅｇｅｌａｔｉｎｉｚｅｄ）トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、乳糖、微結晶セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン、またはグリコール酸ナトリウムデンプン）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）を用いて調製される、錠剤またはカプセル剤の形態を取ってよい。錠剤は、当技術分野で公知の方法により被覆されうる。
【０１１５】
経口投与用のＨＳＰ調製物は、活性化合物の制御放出を与えるために、好適に製剤化されうる。
【０１１６】
口腔投与用に、調製物は、従来法で製剤化される錠剤またはトローチ剤の形態を取ってよい。
【０１１７】
調製物は、注射による非経口投与用（例えば、ボーラス注射または連続注入により）に製剤化されうる。注射用製剤は、単位剤形、例えばアンプルまたは多数回用量容器中で、保存剤を添加して提供されうる。調製物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンの形態を取ってもよく、懸濁剤、安定剤および／または分散剤のような調製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）を含有してもよい。あるいは、活性成分は、使用前に好適なビヒクル（例えば、無菌の発熱性物質非含有水）で再構成するための粉末形態でもよい。
【０１１８】
調製物はまた、例えば、従来の坐剤基剤（例えば、カカオ脂または他のグリセリド）を含有する坐剤または保持浣腸のような直腸調製物に製剤化してもよい。
【０１１９】
前記した製剤以外に、調製物はまたデポ製剤としても製剤化されうる。そのような長期作用性製剤は、移植（例えば、皮下または筋肉内）により、または筋肉内注射により投与されうる。すなわち、例えば調製物は、好適なポリマーまたは疎水性物質（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂とともに、または可溶性の乏しい誘導体（例えば、可溶性の乏しい塩）として製剤化してもよい。リポソームおよびエマルジョンは、親水性薬物のための送達ビヒクルまたは担体の周知の例である。
【０１２０】
吸入による投与用に、本発明に従って使用される調製物は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適な気体）を用いて、加圧パックまたはネブライザーからエアゾル噴霧提示の形態で、送達されることが有利である。加圧エアゾル剤の場合、投与量単位は、計量を送達するバルブを提供することにより、決定されうる。化合物と好適な粉末基剤（例えば、乳糖またはデンプン）の粉末混合物を含有する吸入器または吹き付け器で使用される例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジを製剤化してもよい。
【０１２１】
所望であれば調製物は、ＨＳＰ調製物を含有する１つ以上の単位剤形を含有しうるパックまたはディスペンサー器具で提供されうる。パックは、例えば金属またはプラスチック箔（例えば、ブリスターパック）を含んでよい。パックまたはディスペンサー器具は、投与のための説明書を伴ってよい。
【０１２２】
５．４．　抗原提示細胞の活性化と投与
ＡＰＣは、当技術分野で公知の任意の種々の方法により、得られ、維持され、および／または拡張されうる。一実施形態において、抗原提示細胞（特に限定されないが、マクロファージ、樹状細胞、およびＢ細胞を含む）は、Ｉｎａｂａ， Ｋ．ら、１９９２， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７６：１６９３−１７０２により記載されるように、ヒト末梢血または骨髄由来の幹細胞および前駆細胞から、ｉｎ ｖｉｔｒｏ産生で得ることができる。別の実施形態において、ヒトの血液細胞から得られたヒトマクロファージが使用される。例えば、特に限定されないが、マクロファージは以下のように得ることができる：
単核細胞は、患者（好ましくは、治療すべき患者）の末梢血から、フィコール−ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）勾配遠心分離により単離される。
【０１２３】
組織培養ディッシュを、患者自身の血清で、または他のＡＢ＋ヒト血清でプレコートし、３７℃で１時間インキュベートする。非接着細胞をピペッティングで除去する。ディッシュ中に残った接着細胞に、リン酸緩衝生理食塩水中の冷（４℃）１ｍＭ ＥＤＴＡを加え、ディッシュを室温で１５分放置する。細胞を採取し、ＲＰＭＩバッファーで洗浄し、ＲＰＭＩバッファーに懸濁する。マクロファージの数の増加は、３７℃でマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）とインキュベートすることにより達成できる。好適な実施形態において、樹状細胞の数の増加は、Ｉｎａｂａ， Ｋ．ら、１９９２， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７６：１６９３−１７０２により詳述されるように、顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）とインキュベートすることにより達成することができる。
【０１２４】
５．４．１．　ＨＳＰ調製物を用いる抗原提示細胞の活性化
ＡＰＣは、本発明のＨＳＰ調製物を用いて、細胞を複合体とｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートすることにより活性化することができる。好ましくはＡＰＣは、ＨＳＰ調製物を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｈｓｐ−複合体と３７℃で１５分〜２４時間インキュベートすることにより活性化される。例えば、特に限定されないが、４×１０７ 個のマクロファージを、１ｍｌ当たり１０μｇのｇｐ９６または１ｍｌ当たり１００μｇのｈｓｐ９０とともに、３７℃で１５分〜２４時間、１ｍｌのプレーンＲＰＭＩ培地でインキュベートすることができる。細胞を３回洗浄し、好ましくは無菌の生理学的培地に、有利な濃度（例えば、１×１０７／ｍｌ）で、患者に注入するために、再懸濁する。好ましくは、感作ＡＰＣが注入される患者は、元々ＡＰＣが単離された患者である（自己由来の実施形態）。
【０１２５】
５．４．２．　活性化ＡＰＣの再注入
活性化されたマクロファージと他のＡＰＣは、従来の臨床的方法（例えば、特に限定されないが、静脈内、皮下、皮内、および腹腔内投与）により被験体に再注入することができる。これらの活性化細胞は、好ましくは自己由来の患者に全身性投与により、再注入される。被験体は一般に、被験体の状態に応じて、約１０６〜約１０１２個の感作マクロファージを供与される。
【０１２６】
５．５．　ＨＳＰ処理後のワクチンの免疫原性の測定
随時の方法では、本発明のＨＳＰ調製物とともに使用されるワクチンの免疫原性の産生または上昇は、当技術分野で公知の種々の方法を使用して評価できる。
【０１２７】
一方法では、ワクチンとＨＳＰ調製物の免疫原性は、応答して産生される抗体を、抗体アッセイ（例えば、酵素結合免疫吸収法（ＥＬＩＳＡ）アッセイ）により測定することにより、決定される。そのようなアッセイ方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙのセクション２．１、Ｃｏｌｉｇａｎら（編）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９９７ を参照）。例えば、マイクロタイタープレート（９６ウェルイムノプレートＩＩ、Ｎｕｎｃ）を、ＰＢＳ中の癌細胞または感染細胞の０．７５μｇ／ｍｌ抽出物または溶解物の５０μｌ／ウェルで、４℃で１６時間および２０℃で１時間被覆する。ウェルを空にして、２００μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔ−ＢＳＡ（０．０５％（ｖ／ｖ）のＴＷＥＥＮ ２０と１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ）で、２０℃で１時間ブロッキングし、次にＰＢＳ−Ｔで３回洗浄する。ワクチン接種動物（例えば、ＨＳＰ調製物の投与の有るまたは無いモデルマウスまたはヒト患者）からの５０μｌ／ウェルの血漿またはＣＳＦを、２０℃で１時間適用し、プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄する。次に、適宜、ＰＢＳ−Ｔ−ＢＳＡで１：１，５００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートした５０μｌ／ウェルのヒツジ抗マウスまたは抗ヒト免疫グロブリンと、５０μｌのｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）−Ｈ２Ｏ２基質溶液を用いて、２０℃で１時間インキュベート後、抗原抗体活性を比色法で測定する。５分後、１５０μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させ、吸光度を、光度計中で４９２ｎｍ（参照、６２０ｎｍ）で標準的技法を使用して測定する。
【０１２８】
別の方法では、「テトラマー染色」アッセイ（Ａｌｔｍａｎら、１９９６， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９４−９６）を使用して、抗原特異的Ｔ細胞を同定してもよい。例えば、一実施形態では、特異的ペプチド抗原（例えば、腫瘍特異抗原）を含有するＭＨＣ分子をマルチマー化して、可溶性ペプチドテトラマーを作製し、例えばストレプトアビジンと複合体化させることによって標識する。次に、ＭＨＣ−ペプチド抗原複合体をワクチンとＨＳＰ調製物で処理した患者から得られたＴ細胞の集団と混合する。次にビオチンを使用して、目的の腫瘍特異抗原を発現するＴ細胞を染色する。
【０１２９】
さらに、混合リンパ球標的培養アッセイを使用して、Ｔ細胞の細胞傷害性を４時間の５１Ｃｒ−放出アッセイ（Ｐａｌｌａｄｉｎｏら、１９８７， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４７：５０７４−５０７９）で試験することができる。このアッセイでは、混合リンパ球培養物を標的細胞懸濁液に加えて、異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比（通常１：１〜４０：１）を得る。標的細胞を、５００μＣｉ／ｍｌの５１Ｃｒを含有する培地中で１×１０６ 個の標的細胞を、３７℃で１時間インキュベートすることにより前もって標識する。細胞を標識後に３回洗浄する。各アッセイ点（Ｅ：Ｔ比）を三重測定で行い、適切な対照を組み込んで、自然の５１Ｃｒ放出（アッセイにリンパ球を加えてない）と１００％の放出（界面活性剤で溶解した細胞）を測定する。細胞混合物を４時間インキュベートした後、細胞を２００ｇで５分遠心分離してペレットにする。上清中に放出された５１Ｃｒの量を、ガンマカウンターで測定する。細胞傷害性パーセントを、（試験サンプル中のｃｐｍ−自然に放出されたｃｐｍ）を（界面活性剤で放出された総ｃｐｍ−自然に放出されたｃｐｍ）で割ったものとして測定する。ＭＨＣクラスＩカスケードを阻止するために、Ｋ−４４ハイブリドーマ細胞から誘導された濃縮ハイブリドーマ上清（抗ＭＨＣクラスＩハイブリドーマ）を、最終濃度１２．５％になるように試験サンプルに加える。
【０１３０】
あるいは、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して、ワクチンとＨＳＰ調製物で刺激後の細胞傷害性Ｔ細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏのサイトカイン放出を測定することができる。サイトカイン放出は、特定のサイトカイン、例えばインターロイキン−２、腫瘍壊死因子αまたはインターフェロン−γに特異的な抗体により検出される（例えば、Ｓｃｈｅｉｂｅｎｂｏｇｅｎら、１９９７， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ７１：９３２−９３６参照）。このアッセイは、Ｔ細胞により分泌されるサイトカインを捕捉する、目的のサイトカインに特異的な抗体で前もって被覆されているマイクロタイタープレート中で行われる。被覆ウェル中でＴ細胞を２４〜４８時間インキュベートした後、細胞傷害性Ｔ細胞を取り出し、サイトカイン上の異なるエピトープを認識する第２の標識抗体と交換する。充分洗浄して非結合抗体を除去した後、発色反応産物を産生する酵素基質をプレートに加える。サイトカイン産生細胞の数を、顕微鏡下で計数する。この方法は、アッセイ時間が短く、大量の細胞傷害性Ｔ細胞の必要性が無く感度が高いという利点を有する。
【０１３１】
５．６．　感染症の治療および予防
本発明の方法と一緒にワクチン組成物を使用して治療または予防できる感染症は、特に限定されないが、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、および寄生虫を含む感染性物質により引き起こされる。感染症に対する一般に使用されるワクチン組成物のいくつかは、セクション５．２．に記載されている。他の例は、Ｔｈｅ Ｊｏｒｄａｎ Ｒｅｐｏｒｔ ２０００， Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ（この内容は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１３２】
本発明の方法と一緒にワクチン組成物を使用して治療または予防できるウイルス疾患には、特に限定されないが、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、水痘ウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、単純ヘルペスＩＩウイルス、牛疫ウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス（ｅｃｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、おたふくかぜウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全症ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）、およびヒト免疫不全症ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）により引き起こされるものが含まれる。
【０１３３】
本発明の方法と一緒にワクチン組成物を使用して治療または予防できる細菌疾患は、特に限定されないが、マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、リケッチア（ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、マイコプラズマ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ナイセリア（ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、およびレジオネラ（ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）を含む細菌により引き起こされる。
【０１３４】
本発明の方法と一緒にワクチン組成物を使用して治療または予防できる原生動物疾患は、特に限定されないが、リーシュマニア（ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、コクジジオア（ｋｏｋｚｉｄｉｏａ）、およびトリパノソーマを含む原生動物により引き起こされる。
【０１３５】
本発明の方法と一緒にワクチン組成物を使用して治療または予防できる寄生虫疾患は、特に限定されないが、クラミジアおよびリケッチアを含む寄生虫により引き起こされる。
【０１３６】
５．７．　癌の治療
黒色腫、膵臓癌、乳癌、前立腺癌の治療のための多くの癌ワクチンが、現在臨床試験中である。各タイプの癌の治療と予防のために、そのような癌ワクチンとともに、ＨＳＰ調製物を使用することができる。本発明の方法とともに使用できる癌ワクチンの例は、種々の刊行物、例えばＰａｒｄｏｌｌ， ２０００， Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９５（１ Ｐｔ ２）；Ｓ４４−６２およびＳｔｅｖｅｎｓｏｎ， １９９９， Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ． １０：１４１３−８に記載されている。
【０１３７】
本発明の方法と一緒にワクチン組成物を使用して治療することも可能な癌には、特に限定されないが、以下のタイプの癌が含まれる：ヒト肉腫および癌、例えば繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起細胞腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽細胞腫；白血病、例えば、急性リンパ性白血病と急性骨髄性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病および赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病）；および真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、および重鎖病。
【０１３８】
６．　実施例：熱ショックタンパク質は抗原提示細胞を活性化する
抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージ）は、先天性および適応免疫応答の主成分である。これらは通常、静止しており、機能するには活性化が必要である。従って、ＡＰＣを活性化するシグナルの本体は、決定的に重要な問題である。明らかに、壊死細胞死は、ＨＳＰを放出させるが、アポトーシス細胞死はそうではない。このセクションで示すＣＤ１１ｂ＋細胞を用いた本出願人の実験は、ＡＰＣが存在する細胞外環境中のＨＳＰの濃度の上昇は、サイトカインの分泌を誘導し、抗原提示および補助的刺激分子（特に限定されないが、Ｂ７−１、Ｂ７−２、およびＭＨＣクラスＩＩを含む）の表面発現をアップレギュレートすることを明らかにする。ＨＳＰは、保存されたＮＦκＢ経路を介してこれらのＡＰＣと相互作用する。抗原提示の間、Ｂ７−１、Ｂ７−２、およびＭＨＣクラスＩＩと会合するＴ細胞上の相補的リガンドは、それぞれＣＤ２８、ＣＤ２８、およびＣＤ４を有するＴ細胞抗原表面受容体（ＴＣＲ）である（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２４７参照）。すなわち、ＨＳＰは、ＡＰＣ活性化のシグナルを構成すると確定されている。
【０１３９】
６．１．　材料と方法
ＨＳＰと抗体。ｈｓｐ９０、ｈｓｐ７０、およびｇｐ９６を、記載されているように（８）、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肝臓から同時に精製した。ＦＡＣＳ分析のためのＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ８６（Ｂ７−２）、ＣＤ４０、ＣＤ１１ｂ、およびＭＨＣ ＩＩに対する抗体は、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）から購入した。
【０１４０】
ＬＰＳ含量のアッセイ。ＬＰＳ含量は、ＬＡＬアッセイにより測定した（ＬＡＬキットＱＣＬ−１０００、ＢＩＯＷＨＩＴＴＡＫＥＲ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ）。
【０１４１】
壊死細胞とアポトーシス細胞の調製。壊死を模倣するために、液体窒素−室温処理を４サイクル行って、細胞を凍結融解した。細胞に放射線照射（７，５００ｒａｄｓ）して、アポトーシスを開始させた。
【０１４２】
骨髄由来ＤＣの生成。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨と脛骨を取り出した。骨から培地を用いて骨髄を追い出し、得られた白血球を記載されているように培養した（Ｌｕｔｚら、１９９９， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２２３：７７−９２）。
【０１４３】
サイトカインアッセイ。９６ウェル平底プレート中で、５％の胎児牛血清、または増加する量のＨＳＰを有する完全培地中で、細胞（５×１０４）を３７℃で２０時間インキュベートした。上清を採取し、ＥＬＩＳＡによりＴＮＦ−α、ＩＬ１２、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦおよびインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）についてアッセイした。ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γキットは、Ｅｎｄｏｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ）から購入し、ＩＬ１２キットは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）から購入した。
【０１４４】
核抽出物の調製と電気泳動移動度シフトアッセイ。ＡＰＣをＰＢＳ（ＬＰＳを含まない）で洗浄し、０．１％のＮＰ４０を有する冷溶解バッファー［バッファーＡ：１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、１μＭ アプロチニン、１μＭ ペプスタチンおよび１４μＭ ロイペプチン］に再懸濁し、氷上で３０分インキュベートした。核を１４０００ｒｐｍで４℃で２分でペレットにした。上清を採取し、タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイにより測定した。Ｄｉｇｎａｍら（１９８３， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １１：１４７５−８９）が記載したように、κＢ ＤＮＡプローブ（５’−ＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣ−３’）を使用して、標準的ＤＮＡ結合反応を行った。
【０１４５】
６．２．　壊死細胞はＨＳＰを放出するがアポトーシス細胞はＨＳＰを放出しない
細胞死は、様々な方法で達成できるが、一般的には２つに分類される：アポトーシスと壊死。本発明者らは、これらの２つの形態の死滅のどちらが、主要なＨＳＰ（ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、カルレティキュリン（ＣＲＴ）およびｇｐ９６）を放出させうるかを調べた。方法に記載したように、Ｅ．Ｇ７細胞を、壊死模倣プロセスとして凍結−融解方法に供するか、またはアポトーシス模倣プロセスの１つの形態として放射線照射した。顕微鏡下で、壊死について細胞を視覚的にチェックし、アポトーシスについてはホスファチジルセリン（アネキシンＶを用いる染色により検出される）の外面化と、カスパーゼによるＰＡＲＰの分解（Ｓｃｈｌｅｔｔｅｒら、１９９５， Ａｒｃｈ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １６４：３８３−９）によりチェックした。いずれかの方法による処理直後または処理の２４時間後に、処理した細胞の上清を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと４つのＨＳＰに対する抗体を用いる免疫ブロッティングにより分析した。壊死細胞は４つのＨＳＰすべてを放出させるが、アポトーシス死は放出させないことが観察された。死滅の２４時間後でも、アポトーシス細胞の上清にはＨｓｐは検出されなかった。
【０１４６】
６．３．　熱ショックタンパク質によるＣＤ１１ｂ＋細胞の活性化
３つの代表的ＨＳＰであるｈｓｐ９０および（ｈｓｐ９０ファミリーの）ｇｐ９６およびｈｓｐ７０を、抗原提示細胞を活性化する能力について試験した。ｈｓｐ９０とｈｓｐ７０は、サイトゾルタンパク質であるが、ｇｐ９６は小胞体に局在化している。３つのＨＳＰは、哺乳動物細胞の最も多量の可溶性成分（総タンパク質の＞２％）を構成する。２〜５×１０８細胞から、約３０μｇのｇｐ９６、２００μｇのｈｓｐ７０、および４００μｇのｈｓｐ９０を精製形態で単離することができる。後述するようにＣ５７ＢＬ／６マウスの肝臓から精製した３つのＨＳＰは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（図１Ａ）により均一であることが示され、各モノクローナル抗体を用いる免疫ブロッティングにより同定された。記載したようにナイーブなマウスまたはあらかじめペリスタンを腹腔内注入したマウスからの腹膜細胞を、ＣＤ１１ｂ＋細胞について陽性選択し、次にｉｎ ｖｉｔｒｏで、増加する量のｇｐ９６と３７℃で２０時間培養した。上清を採取し、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２およびインターフェロン−γ（陰性対照として）の存在について、ＥＬＩＳＡにより試験した（図１Ｂ）。陽性選択中またはその後の抗ＣＤ１１ｂ抗体による処理は、細胞を活性化しなかった。ｇｐ９６は、インターフェロン−γ以外の試験したすべてのサイトカインの分泌を、力価測定可能に活性化することがわかった。ｈｓｐ９０とｈｓｐ７０を用いて、同様の結果が得られた（図１Ｃ）。ｇｐ９６は、匹敵するタンパク質量で４つのサイトカインの最も強力なインデューサーであったが、試験したＨＳＰのうちでは最も少ない。ｈｓｐ９０がＨＳＰの内で最も豊富であることを考慮すると、ｈｓｐ９０は、細胞当量あたりで、最も有意な刺激物質のようである。さらに、非ＨＳＰ（例えば、ヒストン、オボアルブミン、およびインスリン）の能力をまた、ＨＳＰ（ｇｐ９６、ｈｓｐ９０またはｈｓｐ７０）と同じバッファー中で試験した。これらの非ＨＳＰにより、サイトカイン放出の刺激は誘発されなかった（図１Ｄ）。
【０１４７】
６．４．　ＣＤ１１ｂ＋細胞を活性化する能力はＬＰＳに由来しない
ＬＰＳは、ＡＰＣの公知の強力な刺激物質であり、かつＬＰＳはバッファーに混入してる場合があるため、図１に示した実験で使用されたＨＳＰ調製物は、清潔な条件下で哺乳動物源から単離されたが、混入しているＬＰＳが、観察された効果に関与しうる可能性を試験した。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ株のマウスは、ＬＰＳに対して低応答性であることが知られており、これらのマウス由来のＣＤ１１ｂ＋細胞およびＬＰＳ応答性対照物（Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス）由来のものの能力を試験した。ＬＰＳと同様に、ｇｐ９６調製物は、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ株由来のＣＤ１１ｂ＋細胞を刺激してＴＮＦ−αまたはＩＬ−１βを分泌させることは無いことが観察された（図２）。一目で、これらの観察結果は、ＨＳＰ調製物のＡＰＣ活性化活性が、混入ＬＰＳに由来したことを示唆した。
【０１４８】
ＬＰＳの寄与をより厳しく調べるために、ＬＰＳを含まない試薬と米国食品医薬品局の医薬品適性製造基準（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）を計画的に使用してＨＳＰを精製し、生じるＨＳＰ調製物を試験し、カブトガニ変形細胞溶解物（Ｌｉｍｕｌｕｓ ａｍｅｂｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ， ＬＡＬ）アッセイにより、検出可能なレベルのＬＰＳを含まない（＜０．０２ｅ．ｕ．）ことを示した。図３Ａに示すように、ＬＰＳを含まないＨＳＰ調製物でも、ＣＤ１１ｂ＋細胞を刺激して、サイトカインを分泌させた。本発明者らが手にしているＬＡＬアッセイのＬＰＳの検出下限は０．０２ ｅ．ｕ．であったため、この量のＬＰＳと１０倍多い量のＬＰＳを、ＡＰＣを活性化する能力について試験した。これらの量は、ＡＰＣを刺激して、試験した２つのサイトカインのいずれかを放出させるには低すぎることがわかった（図３Ａ）。本発明者らの実験で使用した条件下では、ＣＤ１１ｂ＋細胞を刺激するのに、より多量のＬＰＳ、すなわち１０００ｅ．ｕ．／ｍｌが必要であった。これは、それ自体多量のＬＰＳではなく、ＡＰＣの活性化のために以前の研究で使用された量に匹敵する。さらなる対照として、増加する量のｇｐ９６が、増加するレベルのＴＮＦ−αとＩＬ−βの放出を誘導した条件下（すなわち、アッセイの線形条件下）では、ｇｐ９６と同じバッファーで調製した血清アルブミンの最も多い量の２倍は、いずれのサイトカインの検出可能なレベルの放出を導かなかった（図３Ａ）。
【０１４９】
ＬＰＳの効果を別の方法で試験した。ＬＰＳによるＡＰＣの活性化は、通常血清中に存在するＬＰＳ−結合タンパク質（ＬＢＰ）の存在に依存する。ＬＢＰはＬＰＳを濃縮し、これを、ＡＰＣ表面上のＣＤ１４分子に送達し、こうして比較的低濃度のＬＰＳがＡＰＣを活性化することを可能にする。ＬＢＰ依存性は、高濃度のＬＰＳではあまり顕著ではないかまたは不在である。ＡＰＣ活性化におけるＬＰＳとＨＳＰの役割を区別するために、各活性の血清依存性を試験した。血清の存在下または不在下で、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＰＥＣ（９０％を超えるＣＤ１１ｂ＋）の接着画分を、ｇｐ９６またはＬＰＳ調製物の力価測定した量で刺激し、上清をＩＬ−βの存在について試験した。ＬＰＳ調製物は、血清の存在に大きく依存するが、ＡＰＣを刺激してＩＬ−βを分泌させるｇｐ９６調製物の能力は、血清にまったく影響を受けないことが観察された（図３Ｂ）。これらの検討結果は、ＨＳＰ調製物によるＣＤ１１ｂ＋細胞の観察された活性化は、調製物中のＬＰＳ混入物によるものではなく、ＨＳＰ自体に固有なものである可能性を排除した。
【０１５０】
さらに別の方法で、ＬＰＳの効果を、ロドシュードモナス・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ）（Ｈｅｎｒｉｃｓｏｎら、１９９２， Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．， ６０：４２８５−９０）由来のＬＰＳのアンタゴニスト（競合的インヒビター）（Ｒｓｌｐ）を使用して試験した。このインヒビターは、ＩＬ−１βの分泌を刺激するＬＰＳの能力を＞７５％低下させたが、ｇｐ９６の能力は低下させなかった。実際、ｇｐ９６の活性は、Ｒｓｌｐの存在下では、より大きかった（図３Ｃ）。
【０１５１】
６．５．　ＨＳＰは抗原提示および補助的刺激分子の発現を刺激する
樹状細胞（ＤＣ）の成熟へのＨＳＰの効果を調べた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肝臓から、均一な、ＬＰＳを含まないＨＳＰ（ｇｐ９６およびｈｓｐ７０）の調製物を得た。ＧＭ−ＣＳＦ含有培地中で培養することにより得られた骨髄由来ＤＣに、ｇｐ９６、ｈｓｐ７０、またはＬＰＳ（陽性対照として）または血清アルブミン（陰性対照として）をパルス（ｐｕｌｓｅｄ）した。パルスしたＤＣを、ＭＨＣ ＩＩ、Ｂ７．１、Ｂ７．２、およびＣＤ４０分子の表面発現について試験した。ＬＰＳは、試験したすべてのマーカーの発現を誘導した。ｇｐ９６（４００μｇ／ｍｌ）は、ＭＨＣ ＩＩと補助的刺激分子Ｂ７．２の高度の発現を誘導するが、Ｂ７．１とＣＤ４０の発現を誘導しないことが観察された（図４）。一方ｈｓｐ７０（４００μｇ／ｍｌ）は、Ｂ７．２の表面発現のわずかな刺激を誘発したが、Ｂ７．１、ＭＨＣ ＩＩ、およびＣＤ４０の表面発現の刺激を誘発しなかった。ｇｐ９６またはｈｓｐ７０によるＣＤ４０発現の刺激が完全に欠如しているため、本発明者らは、この現象をさらに詳細に、かつＨＳＰの濃度範囲（４０〜４００μｇ／ｍｌ）で試験したが、試験したいずれの濃度でもＣＤ４０発現は誘導されなかった。ＨＳＰと同じバッファー中の血清アルブミン（４００μｇ／ｍｌ）は、試験したマーカーのいずれの発現も誘導しなかった。
【０１５２】
６．６．　ＨＳＰはＮＦ−ＫＢのトランスロケーションを活性化する
いくつかのサイトカインと他の免疫学的に重要な分子の主要な転写レギュレーターであることがすでに示されているＮＦ−κＢ経路（Ｇｈｏｓｈら、１９９８， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６：２２５−２６０）の活性化を参照して、ｇｐ９６がＡＰＣと相互作用する機構を調べた。この経路はまた、ＬＰＳに応答して活性化され、樹状細胞の成熟に関与することが示されている（Ｒｅｓｃｉｇｎｏら、１９９８， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８８：２１７５−２１８０）。ＣＤ１１ｃ＋細胞の一次培養物に、ｇｐ９６またはＬＰＳをパルスし、種々の時間間隔で細胞を採取した。ＮＦκＢ特異的オリゴマーへの結合について、サンプルからの核抽出物を使用して、未変性ＰＡＧＥにより分析した。ｇｐ９６はシグナル伝達経路を活性化し、ＬＰＳの反応速度論とは顕著に異なる反応速度論によりこれを行うことが観察された（図５）。ＮＦκＢの核トランスロケーションは、パルス後１５分ですでにｇｐ９６処理樹状細胞（ＤＣ）中に見られ、シグナルは小さくなって、１２０分までにバックグランドレベルになる。これに対して、ＬＰＳ処理ＤＣ中のトランスロケーションは、初期の反応速度論がより遅い。ここで見られるｇｐ９６とＬＰＳとの間のＮＦκＢトランスロケーションの反応速度論の差は、いずれの物質の量の関数でもない。それぞれの段階的量にＤＣを暴露させると、同じ反応速度論の差を示す。ＨＳＰがＡＰＣを活性化する機構の重要な情報を与える以外に、これらの研究は、ＡＰＣに及ぼすＬＰＳとＨＳＰの効果は類似しているが異なる程度を示す。
【０１５３】
図５に示すデータを考慮し、かつＧａｌｌｕｃｃｉら（１９９９， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ５：１２４９−５５）とＳａｕｔｅｒら（２０００， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９１：４２３−４３４）による、壊死細胞はＤＣの成熟に介在するがアポトーシス細胞は介在しないという最近の証明を考慮して、本発明者らは、ＤＣを壊死細胞またはアポトーシス細胞に暴露すると、ＮＦκＢの核へのトランスロケーションが起きるかどうかを試験した。未成熟ＤＣの培養物を、壊死細胞またはアポトーシスＥ．Ｇ７細胞（方法に記載のように調製した）に暴露し、ＭＨＣ ＩＩ、Ｂ７．１、Ｂ７．２、およびＣＤ４０の発現についてモニターした。壊死細胞へのＤＣの暴露は、ＤＣ上のいくつかの成熟マーカーの発現を誘発し（図６Ａ）、ＮＦκＢの核へのトランスロケーションも誘発した（図６Ｂ）が、アポトーシス細胞はそうではなかった。
【０１５４】
６．７．　考察
ＨＳＰは細胞内分子であり、これらがＡＰＣを活性化する能力の生理学的妥当性は、直ちに明らかではないだろう。しかし、ＨＳＰは最も多量に存在する可溶性の細胞内分子であるため、細胞外環境でのＨＳＰの存在は、細菌およびウイルス感染症または機械的傷害の結果としてであろうと、周囲の細胞の生理的傷害に対してＡＰＣを警戒させる優れたメッセージとなるであろう。従って、このシグナルがＡＰＣを活性化する能力は、生物に免疫学的利点および従って生存の利点を付与することは容易に考えることができる。癌の抗原性レパートリーにおける先行する変化無しで、誘導性ｈｓｐ７０のより高レベルの発現を用いて、種々の癌の免疫原性を同時分離することは、適例である（１９９５， Ｍｅｎｏｒｅｔら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５５：７４０−７；１９９８， Ｍｅｌｃｈｅｒら、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， ５：５８１−７）。逆に、そのようなシグナルが欠如すると、ＦｕｃｈｓとＭａｔｚｉｎｅｒ（１９９６， Ｓｅｍｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ８：２７１−８０）が提唱したように、「危険」有りおよび無しで、抗原の存在を区別する機構を提供しうる。ここでｉｎ ｖｉｔｒｏでＡＰＣを刺激するのに必要であると示されているＨＳＰの量は、ｉｎ ｖｉｖｏの細胞溶解の結果として局所的に放出されると予測される範囲内にある。典型的には、１ｇの組織は約３０μｇのｇｐ９６、２００μｇのｈｓｐ７０、および４００μｇのｈｓｐ９０を与える。これらの回収率は、ほぼ２５％の範囲である。すなわち、１ｇの組織は約２．５ｍｇのＨＳＰを含有する。ｉｎ ｖｉｖｏの組織溶解は、溶液ではなく半流動体の物理状態で存在すると、妥当に推定できることを考慮すると、１ｍｇという少ない細胞（細胞の種類に応じて約１０５〜１０６個の細胞）の溶解は、約１〜２μｌまたはそれより少ない容量中で約２μｇのＨＳＰを放出するであろう。これは、１〜２ｍｇ／ｍｌの濃度である（記載したｉｎ ｖｉｔｒｏの研究で使用したものより高い濃度）。従って、量の考慮は、ＡＰＣの活性化におけるＨＳＰのｉｎ ｖｉｖｏの役割と一致する。
【０１５５】
ＤＣにより放出されるサイトカインのレベル、またはＨＳＰを用いる刺激によるＤＣ上の成熟マーカーの誘導の程度を調べることにより、ＬＰＳにより付与される刺激と比較して、ＨＳＰはわずかな程度でＤＣを刺激することが示される。このため、本発明者らは、１０回もの実験で繰り返して観察結果を試験し、これらが一貫していることを見出した。本発明者らは、ＤＣの内因性アクチベーター（この場合ＨＳＰ）は、以下の生理学的理由のために、ＬＰＳのような外部アクチベーターよりはるかに遅いアクチベーターであると推測する：内部シグナルに対する応答は、外部シグナルに対する応答よりはるかにモジュレートされて、より力価測定可能でなければならないため、内因性シグナルのより低い「比活性」は、より調節された活性を可能にする。
【０１５６】
本明細書で引用されたすべての文献は、あたかも個々の刊行物または特許または特許出願が、すべての目的のために、参照することによりその全体が特定してかつ個別に組み込まれることが示されているかと同程度に、すべての目的のために参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５７】
当業者には明らかなように、その精神と範囲を逸脱することなく、本発明の多くの改変および変更を行うことができる。本明細書に記載の特定の実施形態は、例示のためだけに提供されるものであり、本発明は、添付の特許請求の範囲の用語と、そのような特許請求の範囲が与えられる等価物の完全な範囲によってのみ限定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａは、ｇｐ９６、ｈｓｐ９０、およびｈｓｐ７０の精製調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す図である。ＨＳＰは、セクション６．１．に記載のようにＣ５７ＢＬ／６マウスの肝臓から精製した。各ＨＳＰ調製物の２μｇを、各レーンに適用した。
図１Ｂは、プリスタンを腹腔内注射したＣ５７ＢＬ／６マウスから得られた腹腔細胞を、ＣＤ１１ｂ＋細胞について陽性選択し、細胞（５×１０４）を、５％胎児牛血清のみを有する完全ＲＰＭＩ培地またはｇｐ９６の、同じ培地中の増加する濃度の均一調製物で、３７℃で２０時間インキュベートし、上清を採取し、ＥＬＩＳＡによりＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＬ−１βおよびＢＭ−ＣＳＦについて測定した結果を示す図である。
図１Ｃは、プリスタンを腹腔内注射したＣ５７ＢＬ／６マウスから得られた腹腔細胞を、ＣＤ１１ｂ＋細胞について陽性選択し、細胞（５×１０４）を５７ＢＬ／６マウスの肝臓から精製したｈｓｐ９０もしくはｈｓｐ７０（図１Ｃ）の、同じ培地中の増加する濃度の均一調製物で、３７℃で２０時間インキュベートした結果を示す図である。
図１Ｄは、ＣＤ１１ｂ＋細胞の培養物をまた、ヒストン、オバルブミンおよびインスリンのような非ＨＳＰとともに同様にインキュベートし、上清をＴＮＦ−αについて試験した結果を示す図である。
【図２】セクション６．１．に記載するようにマウスのＣ３Ｈ／ＨｅＮまたはＣ３Ｈ／ＨｅＪ株から単離したＣＤ１１ｂ＋細胞（５×１０４）を、５％胎児牛血清のみを有する完全ＲＰＭＩ培地でインキュベートしたか、または同じ培地中の記載の量のｇｐ９６で、３７℃で２０時間処理し、上清を採取し、記載のようにＥＬＩＳＡによりＩＬ−１βとＴＮＦ−αについて測定した結果を示す図である。
【図３】図３Ａは、混入しているＬＰＳからは、ｇｐ９６のＡＰＣ刺激活性は得られない。図３Ａ。記載のようにＣ５７ＢＬ／６マウスから単離したＣＤ１１ｂ＋細胞（５×１０４）を、５％胎児牛血清のみを有する完全ＲＰＭＩ培地でインキュベートしたか、または同じ培地中の記載の量のｇｐ９６、ＬＰＳまたはＢＳＡで３７℃で２０時間処理し、上清を採取し、記載のようにＥＬＩＳＡによりＩＬ−１βとＴＮＦ−αについて測定した結果を示す図である。
図３Ｂは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離したＣＤ１１ｂ＋細胞（５×１０４）を、５％胎児牛血清（ＬＢＰの供給源として）有りまたは無しの完全ＲＰＭＩ培地でインキュベートしたか、または上記培地中の記載の量のｇｐ９６またはＬＰＳで３７℃で２０時間処理し、上清を採取し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１βについて測定した結果を示す図である。
図３Ｃは、ロードシュードモナス・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ）（２μｇ／ｍｌ）から得られるＬＰＳアンタゴニストＲｓｌｐを、記載のようにＬＰＳ（２μｇ／ｍｌ）またはｇｐ９６（９０μｇ／ｍｌ）のサイトカイン分泌アッセイに加えた結果を示す図である。
【図４】骨髄由来のＤＣ培養物を、培地、ＨＳＰ（４００μｇ／ｍｌ）またはＬＰＳ（２μｇ／ｍｌ）に２０時間暴露し、採取し、記載の細胞表面分子の発現について分析した結果を示す図である。記載のパーセントは、記載の表面マーカーについても陽性であったＣＤ１１ｃ＋細胞である。細胞は、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ラホヤ、カリホルニア州）を使用するフローサイトメトリーにより分析した。生きた細胞を、ＦＳＣ／ＳＳＣプロフィールに基づいてゲーティングした。
【図５】図５Ａは、ＤＣ（１×１０６細胞）を、記載の時点についてｇｐ９６（１００μｇ／ｍｌ）またはＬＰＳ（４μｇ／ｍｌ）でパルスし、パルスしていない培養物またはパルスした培養物の核抽出物を調製し、方法に記載のようにＮＦｋＢ特異的オリゴマーへの結合に使用し、さらに複合体を、未変性ＰＡＧＥで解析し、オートラジオグラフィーを行った結果を示す図である。
図５Ｂは、線形の露出条件下でゲルをスキャンして図５Ａに示実験からのデータを定量化し、プロットした結果を示す図である。
【図６】図６Ａは、未成熟ＤＣ（２×１０６）の培養物を、培地単独、またはネクローシスもしくはアポトーシスＥ．Ｇ７細胞のそれぞれの１０６細胞同等物、またはＬＰＳ（陽性対照として）を、２０時間パルスした。ＤＣ培養物を、記載のように表面マーカーの発現について追跡した結果を示す図である。
図６Ｂは、ＤＣ培養物を、培地単独、またはネクローシスもしくはアポトーシスＥ．Ｇ７細胞に１５分間暴露し、図５の凡例に記載のようにＮＦｋＢの移動について分析した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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