(57)【要約】バシラス・スリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｒｕｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）毒素に対する昆虫の抵抗性に関与する２つの遺伝子がクローン化され、その毒素に対する抵抗性のメカニズムが理解されるようになった。かかる理解により、Ｂｔ毒素抵抗性を防御または打破するために毒素を修飾するかまたは組み合わせる合理的な方法で作物保護を改善することが可能になる。
2004518616.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾されたＢｔ毒素の昆虫消化管への結合を促進するための修飾を含むＢｔ毒素の作物への適用または作物における発現を含んでなる作物の保護の方法。
【請求項２】
修飾が脂質修飾部位の付加を含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
修飾が炭水化物修飾部位の付加を含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
修飾が昆虫消化管の構造または表面エレメントに結合するタンパク質フラグメントの付加を含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
修飾が異なるＢｔ毒素からのレセプター結合ドメインの付加を含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項６】
修飾が無作為または直接変異誘発により導入される変異を含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項７】
重複しない抵抗性メカニズムを有する複数のＢｔ毒素の適用または発現を含んでなる作物の保護の方法。
【請求項８】
複数のＢｔ毒素を単一の植物において発現させる請求項７に記載の方法。
【請求項９】
複数のＢｔ毒素の少なくとも１つを植物において発現させ、複数のＢｔ毒素のもう１つを外来的に適用する請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
複数のＢｔ毒素が全て定常レベルで使用される請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
複数のＢｔ毒素の少なくとも１つが永続的に発現され、複数のＢｔ毒素のもう１つが断続的に発現される請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
複数のＢｔ毒素が同一の畑で異なる植物により発現される請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つのＢｔ毒素の適用または発現がＢｔ毒素以外のもので補充されることを含んでなる作物の保護の方法。
【請求項１４】
補充物質がグリコシル化インヒビターを含んでなる請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
補充物質を植物に断続的に適用する請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
殺虫剤抵抗性に関するモデル系としてＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）線虫を含んでなる農業害虫における抵抗性のメカニズムの同定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連特許）
本出願は２０００年８月１１日出願の米国仮出願番号第６０／２４４９４１号（その全てを出展明示により本明細書の一部とする）の優先権を主張する。
【０００２】
（省益）
本発明は付与番号第ＭＣＢ−９９８３０１３号の下で国立科学財団から政府支援を受けて行われた。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は殺虫剤に対する昆虫の作物害虫の抵抗性の遺伝メカニズム、及び作物保護を改善するための害虫抵抗性を妨害するかまたは回避するためのこれらのメカニズムの知識の使用に関する。
【０００４】
（発明の背景）
主要な生物学的合理殺虫剤バシラス・スリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｒｕｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（Ｂｔ）は、その成長サイクルの静止期に副胞子結晶を形成する汎存性グラム陽性、胞子形成細菌である。Ｂｔ細菌は昆虫病原体として同定され、その殺虫活性は大部分または完全にＣｒｙ遺伝子によりコードされる副胞子結晶に起因し、１００個以上のそのイソ型が知られている。この観察から鱗翅目、双翅目、及び鞘翅目のなかの特定の昆虫種の調節のため、Ｂｔ細菌に基づく生物殺虫剤の開発に至った。さらなる研究により昆虫のその他の目（膜翅目、同翅類、直翅目、及びハジラミ目）に対し、並びに線虫、ダニ及び原虫に対して活性な単離体が示された。Ｂｔ細菌及び毒素は商業的農業、林業経営、及び蚊の制御における合成化学殺虫剤の適用の有用な代替または補助物質である。
【０００５】
Ｂｔ細菌の種々の株がさまざまな環境で自生している。株は土壌、昆虫、貯蔵品の塵、並びに落葉樹及び針葉樹の葉などの多くの生息地から世界中で単離されている。株は高レベルの遺伝的多様性及び柔軟性のために非常に様々な毒素を産み出す。たいていのＣｒｙ遺伝子はプラスミドに存在し、しばしば可動性遺伝エレメントを含む複合構造の部分としてＤＮＡの環状セグメントを自律的に複製するようだ。プラスミドを含む多くの毒素は天然で接合性であり、Ｂｔ細菌株間でＣｒｙコード化配列の移動を可能にしているようだ。
【０００６】
Ｂｔ毒素は細菌の成長の静止期に発現され、胞子形成された細胞の乾燥重量の２０から３０％を占める。Ｂｔ毒素タンパク質は幼虫期の昆虫に対して毒性である。その作用メカニズムは昆虫の中腸でプロトキシン結晶の可溶化、中腸プロテアーゼによるプロトキシンのタンパク質溶解処理、Ｂｔ毒素の中腸レセプターへの結合、及び頂端膜に毒素を挿入してイオンチャネル細孔の形成に関与し、結果的に膜の完全性の喪失、腸細胞溶解及び昆虫の死に至る。これらの工程のいずれかの崩壊により毒性を不活性化でき、予測困難な抵抗性メカニズムを作製する。
【０００７】
Ｂｔ細菌の成長の静止期のみのＢｔ毒素遺伝子の発現により、殺虫剤調節のための元来の生物の利用があまり望ましくないものになる。製造に重要である生物の頻繁な再適用が必要とされる。Ｂｔ毒素遺伝子の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）への移入によりこの問題は部分的に打破された。天然の細菌宿主種の成長期限定特性を呈さないＢｔ毒素を発現する異種性細菌である（Ｓｃｈｎｅｐｆ、米国特許第４４６７０３６号）。しかしながら頻繁な再適用は依然必要とされた。実際に遺伝子の植物への有効な移入方法が開発され（Ｄｏｎｏｖａｎ、米国特許第５１８７０９１号；Ａｄａｎｇ、米国特許第５３８０８３１号；Ｆｉｓｃｈｈｏｆ、米国特許第５５００３６５号）、Ｂｔ毒素遺伝子は連続発現のために植物に移入された。
【０００８】
Ｂｔ毒素は農業において広く使用されている。１９９９年には、トウモロコシのおよそ３５％、綿の３０％、及びジャガイモの４％がＢｔ毒素を発現するトランスジェニック植物を用いて製造されている。アスパラガス、ブロッコリ、ニンジン、キュウリ、アルファルファ、大豆、リンゴ、洋ナシ、及びレンコンなどの多くのその他のＢｔ発現作物が使用されるようになってきている。トランスジェニック植物の使用は殺虫剤のスプレイの必要性を低減させ、その結果、環境への影響を低下させる。
【０００９】
害虫制御のためにいずれかの毒素に使用が広まっているので、害虫の毒素に対する抵抗性が広まるであろう。コナガのＢｔ毒素Ｃｒｙ１Ａ、１Ｂ及び１Ｃに対する抵抗性がこの分野で文献化されている。実験室では多くのその他の抵抗性が観察されている。Ｂｔ毒素抵抗性のメカニズムに関する理論が提起されているが、Ｂｔ毒素抵抗性遺伝子は同定されておらず、抵抗性のメカニズムは未知である。これは部分的には、農業害虫に関する詳細な情報が欠如していることによる。農業害虫の遺伝学についてはほとんど知られておらず、それを研究する方法は十分には確立されていない。このためにＢｔ毒素抵抗性の過程の理解が益々困難になっている。
【００１０】
Ｂｔ毒素の活性化には複数の工程が必要とされる；従って、害虫が毒素から逃れ得る多くのメカニズムが存在する。これには毒素の可溶化、過少または過剰タンパク質溶解を低減させる消化管ｐＨの変化、中腸表面のレセプターの変化、毒素レセプターの２次修飾の変化、細孔形成の妨害または細孔の填塞、上皮修復速度の増加、及び毒性植物の消費の低下に至る毒素認識などがある。異なるＢｔ毒素が異なる種の昆虫に対して有効であり、これは作用メカニズムに差異があることを示唆している。この理由で、複数のＢｔ毒素遺伝子を単一の植物に挿入すること、または同一の畑で異なるＢｔ毒素を発現する植物を育てることが害虫抵抗性を打破するための理想的な方法であることが論理的であると思われる。しかしながら、抵抗性メカニズムの知識がないのに合理的な方法で毒素を分類するのは不可能である。昆虫の単一のＢｔ毒素への暴露により毒素の複数のイソ型に対する抵抗を招くことができ、従って任意に組み合わせた毒素は毒素抵抗性の打破には役立たない。同様に、抵抗を回避するために個々の毒素を合理的に修飾する方法はない。
【００１１】
その活性が増強され、その宿主範囲が広げられた、修飾されたＢｔ毒素が開発されている。Ｅｎｇｌｉｓｈら（米国特許第６０６３５９７号）は、１つまたはそれ以上の点変異を含み、鞘翅目昆虫の殺虫剤として用いるための、種々の変異されたＣｒｙ３Ｂタンパク質及びタンパク質フラグメントの使用を教示している。Ｓｉｖａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら（米国特許第５３０６６２８号）は毒素の宿主範囲を増すためにウイルスまたはＢｔ毒素に融合した糖タンパク質からの昆虫中腸結合モチーフを含有するハイブリッド毒素の作製を教示している。これらの発明により提供される修飾された毒素は昆虫集団において発達するいくつかの抵抗性の打破において有用である；しかしながら、これらは毒素抵抗性を打破するための最良の毒素の選択方法、または毒素の組み合わせを教示していない。
【００１２】
（発明の要約）
本発明は害虫の制御のための、Ｂｔ毒素の合理的な修飾、組み合わせまたは補充からなる作物の保護のための方法である。抵抗メカニズムの理解により、害虫抵抗性の発達を防御するかまたはＢｔ毒素に対する既存の害虫抵抗性を打破するためにＢｔ毒素の使用に関する合理的な選択を行うことが可能になる。
【００１３】
本発明はモデル生物Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）を用いる遺伝的スクリーニングによる、Ｂｔ毒素Ｃｒｙ５Ｂに対する抵抗性に寄与する遺伝子のクローニングである。スクリーニングでは動物は変異誘発され、Ｂｔ毒素Ｃｒｙ５Ｂを発現する通常の栄養源である大腸菌において成長する能力に関して選別された。変異動物は５つの相補性群に入ることが見出され、バシラス毒素抵抗性変異体（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｏｘｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）からｂｒｅ変異体と命名した。毒素抵抗性に寄与する遺伝子のさらなる分析により遺伝子のうちの２つ、ｂｒｅ−３及びｂｒｅ−５が、同一のシグナル発生経路において同等に機能することが知られている既知のショウジョウバエ遺伝子、ｅｇｇｈｅａｄ及びｂｒａｉｎｉａｃに対して有意な相同性を有することが示された。広く発現されている遺伝子のＢｔ抵抗性における役割を見出すことにより抵抗性メカニズムの共通性及びモデル系の有用性が示される。
【００１４】
本発明はＢｔ毒素に対する抵抗性を合理的に打破する方法である。これは抵抗性害虫を殺すため及び作物保護を増強するためのＢｔ遺伝子の直接修飾により、及びＢｔ毒素と別のＢｔ毒素などのその他の化合物との組み合わせにより達成できる。例えば昆虫中腸におけるＢｔ毒素レセプターのグリコシル化の阻止による毒素結合の低下により毒素抵抗に至る。従って、グリコシル化非依存性消化管結合モチーフを毒素に付加することにより抵抗性を打破することができる。標準的な分子生物学技術を用いて、昆虫消化管結合モチーフのコード化配列を付加することができる。毒素の消化管への結合はタンパク質、脂質または炭水化物ドメインにより媒介され得る。
【００１５】
昆虫は単一の毒素に暴露された後、多くのＢｔ毒素に対して交差抵抗できるようになる。Ｂｔ毒素に対する抵抗性メカニズムの同定により、毒素に対する抵抗性メカニズムが重複しないような、植物における毒素の合理的なスタッキングの方法を提供できる。遺伝子の植物への挿入は重要であり、植物の成長に必要な空間及び時間から高速大量処理アッセイにおけるその使用が限定される。毒素の組み合わせの有効性、及び毒素の組み合わせに対する抵抗性を発達させる動物の能力を試験するために高速大量処理スクリーニングにおいて使用できる大腸菌に遺伝子を容易に挿入できる。スクリーニングを用いて異なる炭水化物修飾を介して中腸に結合するＢｔ毒素を容易に同定できる。昆虫における２つのグリコシル化またはシグナル発生経路の下方制御が昆虫の適合性を低下させるような毒素を互いに組み合わせて作物において使用でき、２つの毒素に対する抵抗性が不都合になるようにする。
【００１６】
Ｂｔ毒素に対する抵抗性はグリコシル化経路の修飾の結果である。グリコシル化経路における大きな変化により、利用できる抵抗性昆虫の感受性は新たになる。例えば、小用量のグリコシル化インヒビターはたいていの生物に対して毒性ではない。単一のグリコシル化インヒビターは全てのグリコシル化経路を阻止するわけではない；従ってたいていの動物は単一の経路の崩壊を補償できる。しかしながら、グリコシル化経路が下方制御されたかまたは排除された生物はグリコシル化インヒビターでの処置に対してさらに感じ易くなる。
【００１７】
本発明は抵抗性の発達を阻止するための毒素投与のレベル及び頻度に関する投与計画を開発する方法である。毒素を植物において構成的に同時発現させることができる。また別に、非抵抗性害虫における抵抗性を高めることなく抵抗性害虫の殺害を増加させるために、一方の毒素を植物に発現させ、他方をスプレイまたは別の周期的適用もしくは発現方法により加えることができる。毒素を構成性または誘導性のいずれかの異なるプロモーターの調節下におき、発現される毒素のレベル及び頻度を変化させることができる。
【００１８】
本発明は農業害虫におけるＢｔ毒素抵抗性のモデルとして線虫Ｃ．エレガンスを使用する。Ｂｔ毒素抵抗性遺伝子として昆虫の多くの種に共通の遺伝子の同定により抵抗性の一般的メカニズムの理解におけるＣ．エレガンスの有用性が示される。アッセイにおいて、動物は無作為な化学変異誘発に供し、線虫の通常の栄養源である大腸菌において発現されるＢｔ毒素に対する抵抗性に関して選別される。抵抗性動物は個々の培養に単離され、ここで両性生殖する。抵抗性遺伝子を相補性によりクローン化し、多くの十分に確立された方法により機能に関して分析する。Ｃ．エレガンスを用いて毒素抵抗性及び交差抵抗性のメカニズムを理解することもできる。
【００１９】
本発明は、添付の図面と組み合わせた以下の本発明の実施形態の詳細な説明からよりよく理解されよう。
【００２０】
（詳細な説明及び好ましい態様）
Ｂｔ毒素に対する昆虫抵抗性を打破するための有効な方法の開発において最大のハードルの１つは抵抗性メカニズムの理解の欠如である。本発明は昆虫のＢｔ毒素に対する抵抗性に関与する最初の２個の遺伝子のクローニングである。遺伝スクリーニングにおいてモデル生物Ｃ．エレガンスを用いて遺伝子をクローニングした。Ｃ．エレガンスは多くの生物学的過程を分析するためのモデルとして用いられている線虫である。変異動物のライブラリーを容易に作製し、選択の特性を単離するスクリーニング方法に供することができる。Ｃ．エレガンスは同系遺伝子型株の確立及び維持を促す両性株である。Ｃ．エレガンスの世代時間は短く（２０℃で３．５日）、世代あたり２００から３００の子孫が産生される。ゲノムは完全にシークエンシングされており、実験により遺伝子を機能性により群にまとめる。遺伝子マップ及び技術は十分に確立されている。
【００２１】
Ｂｔ毒素に対する抵抗性に関与する遺伝子を同定するための高速大量処理遺伝子スクリーニングが確立された。Ｃ．エレガンスは標準的な栄養源である大腸菌で成長し、ＥＭＳにより変異誘発に供した。２世代の間自家受精させた後、Ｃｒｙ５Ｂを発現する大腸菌のプレートに、またはＣｒｙ５Ｂを含有する９６ウェルプレートの各ウェルに移した。生存体を混合されたプレートから単離した。個々の株をさらなる分析のために展開させた。
【００２２】
前記の方法を用いて９００００以上の変異誘発されたＦ２動物をスクリーニングし、第１回目のラウンドで４０以上の変異体を単離した。連鎖マッピング、続いて３因子交雑を用いてゲノムの変異の位置決定を行った。変異動物が５つの相補性群に入ることが見出された。およそ４０ｋｂのＣ．エレガンス配列を担持するコスミドを注入して変異体がＣｒｙ５Ｂに対する感受性を付与するように補足した。補足用コスミドからのフラグメントを注入して抵抗性を付与する変異遺伝子を同定した。ＰＣＲにより動物から抵抗性遺伝子を増幅し、自動シークエンサーを用いてシークエンシングした。
【００２３】
ｂｒｅ変異体はＣ．エレガンスの異なる染色体にマッピングされ、ＬＧＩＶではｂｒｅ−１及びｂｒｅ−５、ＬＧＩＩＩではｂｒｅ−２及びｂｒｅ−３、並びにＬＧＩではｂｒｅ−４である。全て劣性変異であることが見出された。
【００２４】
ｂｒｅ−３がクローン化され、Ｃ．エレガンスシークエンシングプロジェクトにより定義されたオープン・リーディング・フレームＢ０４６４．４であるとこが見出された。この遺伝子またはＣ．エレガンスの遺伝子生成物に関してさらに別の情報はなかった。ＢＲＥ−３はアミノ酸レベルでドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｅｇｇｈｅａｄに６０％同一であることが見出された。Ｅｇｇｈｅａｄ／ＢＲＥ−３の機能は解明されていないが、疎水性親水性指標分析により少なくとも４個、恐らく５個の膜貫通性ドメインの存在が示された。ドロソフィラのＥｇｇｈｅａｄに関する研究により、これはたいていは糖トランスポーターまたはＢｒａｉｎｉａｃ炭水化物修飾に関するファシリテーターとして、Ｂｒａｉｎｉａｃを有するシグナル発生経路で機能することが示される。
【００２５】
ｂｒｅ−５変異体は今までに同定されていない、Ｃ．エレガンスシークエンシングプロジェクトでは予測されなかったコスミドＴ１２Ｇ３（Ｃ．エレガンスゲノム中心）のオープン・リーディング・フレームにより補足された。ＢＲＥ−５はアミノ酸レベルでドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｂｒａｉｎｉａｃに３５％同一であり、β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼのモチーフ特性を全て含有することが見出された。
【００２６】
推定β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼとしてのＢＲＥ−５の同定に基づいて、及びドロソフィラのＥｇｇｈｅａｄ及びＢｒａｉｎｉａｃが同一のシグナル発生経路において機能するという事実は、特定の炭水化物修飾の低減または排除がＢｔ毒素に対する抵抗性の発達において重要な役割を果たすということを示唆している。ＧａｌＮａｃがＢｔ毒素Ｃｒｙ１Ａｃの昆虫中腸に対する結合を特異的に阻止できたインビトロＢｔ毒素消化管結合アッセイはこの結論を支持する。
【００２７】
Ｃｒｙ１４Ａ及びＣｒｙ２１に対する交差抵抗性に関してｂｒｅ−５変異体を試験した。これはいずれの毒素に対しても十分には交差抵抗しないことが見出されており、これは毒素が異なるレセプターを介して中腸に結合することを示唆している。さらに興味深いことには、ｂｒｅ−５変異体は低レベルのＣｒｙ１４Ａには抵抗し、高レベルのＣｒｙ１４Ａには感受性があることが見出された。これは中腸におけるＣｒｙ１４Ａのための複数の結合部位の存在を示しており、ＧａｌＮａｃ炭水化物修飾を必要とするのが高親和性結合部位で、ＧａｌＮａｃ修飾を必要としないのが低親和性結合部位である。かかる研究により、１つの毒素のみに暴露した後の複数のＢｔ毒素に対する抵抗性の存在に関するメカニズムが提示される。さらにこれは、いずれか別の方法では見出されそうにない代替の結合部位の存在を示している。
【００２８】
Ｃｒｙ２１ＡがＣｒｙ１４ＡよりもＣｒｙ５Ｂによりよく類似しているので、この交差抵抗性のパターンは幾分驚くべきものであった。最近、３種のＢｔ毒素、Ｃｒｙ１Ａａ、Ｃｒｙ２Ａａ及びＣｒｙ３Ａの構造が決定された。タンパク質の全体の同一性は１７％ほどの低さであるが、これらは全て共通の構造エレメントであるβ−プリズムを含有する。この特異な構造は以前には２つの植物レシチンにしか見出されていない。β−プリズムは炭水化物、とりわけＧａｌ−β−１，３−ＢａｌＮａｃに結合する。このＢｔ毒素の共通の構造的特徴は、毒素の消化管結合のメディエーターの１つである可能性があり、全体的には相同性の低いＢｔ毒素に対する、昆虫において認められる交差抵抗性に関する合理的な説明を提供する。明確な消化管結合領域の存在により、抵抗性を打破するための合理的なＢｔ毒素の修飾部位が提供される。その領域を無作為変異誘発に供してドメインの結合特異性を修飾することもできる。プローブとして天然のリガンド以外の炭水化物を使用するファージディスプレイまたはアフィニティクロマトグラフィーなどの多くのライブラリースクリーニング法のいずれかを用いてかかるスクリーニングを実施できる。また別に、結合ドメインはモデュラーユニットであるので、これを除去して、残存毒素の機能を変化させることなく、グリコシル化に依存しない異なる消化管結合ドメインで置換することができる。
【００２９】
昆虫毒素抵抗性に関する仮説は可能なメカニズムとして２次タンパク質修飾経路における変異を提起したが、かかる経路における変異は毒素抵抗性の交換において動物の適合性の低減を招く。いくつかのｂｒｅ変異体では１腹子数の低下が認められたが、主要な異常は観察されなかった。スクリーニング方法によって適合性が有意に低下する抵抗性メカニズムは選択されず、天然の選択方法に類似している。しかしながら、２次タンパク質修飾経路における変化の結果として適合性コストを負わず、利用できる生物では不十分になることはありそうにない。毒素抵抗性に関与するメカニズムを同定せずにはかかる不十分さを活かすことはできない。
【００３０】
（実施例１）
Ｂｔ毒素への中腸結合モチーフの付加
消化管結合モチーフに融合されたＣｒｙ遺伝子を発現するハイブリッド毒素を用いて、グリコシル化経路における変化により抵抗性を回避できる。これは脂質修飾のための部位（例えばプレニル化部位）、複数のタンデム炭水化物修飾部位（例えばグリコシル化部位）、またはタンパク質モチーフ（例えば昆虫消化管の構造タンパク質に結合する異なる炭水化物、タンパク質に結合する異なるＢｔ毒素からの中腸結合モチーフ）などの多くのモチーフの付加により達成できる。かかるモチーフのコード化配列をＢｔ毒素のコード化配列に容易に組み込み、標準的な方法により植物に挿入できる。これにより消化管のレセプターの特定の炭水化物修飾の必要性が排除され、Ｂｔ毒素抵抗性の１つのオプションが除外される。
【００３１】
（実施例２）
抵抗性を打破するための毒素の無作為変異誘発
Ｂｔ毒素修飾のあまり直接的でない方法を用いて毒素に対する抵抗性を打破できる。例えば、誤りがちなＰＣＲ変異誘発などの多くの方法のいずれかによりＣｒｙ５Ｂを無作為変異誘発に供することができる。Ｃｒｙ５Ｂの末端または内部の配列にアニーリングするエンドヌクレアーゼ制限部位を有するプライマーを設計できる。ＰＣＲ産物消化し、適当なベクターにライゲートし、発現用に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換する。また別に、スクリーニングのための候補物質のプールをＭｉｎｓｈｕｌｌ及びＳｔｅｍｍｅｒ（タンパク質進化及び分子増殖、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：２８４−２９０（１９９９）；出展明示により本明細書の一部とする）のタンパク質進化法により作製できる。変異Ｃｒｙ５Ｂを発現する個々のコロニーを個々のコロニーとして培養し、ｂｒｅ動物の栄養源として使用するためにプレートに移す。ｂｒｅ動物を殺すことができる変異ｃｒｙ５Ｂクローンをシークエンシングする。このように、抵抗性動物を殺すことができるＣｒｙ５Ｂを同定できる。かかる毒素を単独でまたは野生型Ｃｒｙ５Ｂとスタッキングして害虫抵抗性を防御または打破することができる。
【００３２】
（実施例３）
抵抗性経路の発達の利用
１つのグリコシル化経路が下方制御されている昆虫は、植物または別の非抵抗性動物に損傷を与えるのに十分ではない低濃度のグリコシル化インヒビターに対して感受性がより高い。多くのグリコシル化インヒビターはマメ科植物の種子において発現する。これにはインドリジディンアルカロイド（スワインソニン［ＳＷＳ］及びカスタノスペルミン［ＣＳ］）、ポリヒドロキシル化ピロリジン及びピペリジン（Ｎ−メチルデオキシノジリマイシン［ＭｄＮ］及び１−デオキシマンノジリマイシン［ＤＭＭ］）及びミオイノシトール誘導体などがある。精製された化合物は市販により入手可能であるが、農業用には粗製調製物で十分である。かかる化合物を永続的または断続的に植物に適用して、グリコシル化経路を下方制御することによりＢｔ毒素に対する抵抗性を発達させている昆虫を殺害することができる。
【００３３】
（実施例４）
毒素の合理的組み合わせを決定するための合成致死スクリーニング
「合成致死」変異の概念は遺伝学において十分に確立されている。２つの別個の変異体は生物により耐容性が示されるが、単一の生物における２つの変異の組み合わせは死を招く。交差抵抗性を示さないＣ．エレガンス株を接合させて毒素抵抗性の合成致死組み合わせを同定することができる。双方の毒素に対する抵抗性の発達が動物の死を招くので、毒素を植物において同時発現させることができる。
【００３４】
（実施例５）
交差抵抗性スクリーニング
１つのＢｔ毒素に抵抗するＣ．エレガンス変異体を別のＢｔ毒素を発現する大腸菌で成長させることにより別のＢｔ毒素に対する本来の抵抗性に関してそれを試験できる。毒素の発現を誘導するプロモーターに依存して毒素を定常的に低または高レベルで、または断続的に発現することができる。毒素の低レベル発現では、細菌の混合集団を用いて一部の細菌のみが目的のＢｔ毒素を発現するようにできる。かかるプロモーターシステムは技術分野の技術者に公知である。
【００３５】
Ｃ．エレガンスが２次毒素に対する交差抵抗性を発達させる能力を、ｂｒｅ変異体を同定するのに用いたクリーニングと類似のスクリーニングにより試験することができる。例えばｂｒｅ−３動物をＥＭＳによる変異誘発に供し、Ｃｒｙ５Ｂを発現する大腸菌で２世代で自家受精させ、変異誘発の過程においてＣｒｙ５Ｂに再感作された動物を排除する。前記のアッセイにより決定されるように動物が本来交差抵抗性を有さない、Ｃｒｙタンパク質（例えばＣｒｙ１Ａ）を発現する大腸菌に動物を移す。高頻度で抵抗性動物が見出される場合、抵抗性は野生型において急速に発達する可能性がある。スクリーニングの繰り返しラウンドで抵抗性動物が全く見出されない場合、抵抗性の組み合わせは致死的であり、農業用の設定において有用であり得る可能性がある。
【００３６】
（実施例６）
消化管における複数のＢｔ毒素結合部位
種々の毒素を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での成長により、別のＣｒｙタンパク質に対する交差抵抗性に関してｂｒｅ−５動物を試験した。ｂｒｅ−５動物は低レベルのＣｒｙ１４に抵抗するが、高レベルのＣｒｙ１４には感受性がある。これはブラシ縁膜にＣｒｙ１４の２つのレセプターがあることを示している。毒素に結合するために高親和性レセプターは特異的β−１，３−ＧａｌＮａｃ修飾を必要とするが、低親和性レセプターは必要としない。先行技術では、異なる親和性を有する複数のレセプターの存在に関してはなんら示唆していない。かかる発見により植物において発現される毒素と組み合わせて第２の毒素を高用量で断続的に適用することを含む害虫制御の方法が示唆される。第２に、高用量の毒素を直接植物に適用するか、またはそれを誘導プロモーターの調節下に置くことができる。断続的発現のために誘導因子を植物に適用できる。スクリーニングの修飾版を用いて、複数の毒素抵抗性の発達頻度を最低にし、害虫を最大に殺害する第２の毒素の適用に最適な頻度を決定することができる。
【００３７】
（実施例７）
Ｂｔ毒素抵抗性に関与する必須遺伝子の同定
Ｂｔ毒素が宿主必須遺伝子を介して作用するメカニズムを発達させている可能性がある。指標として生存性を用いるスクリーニングは、抵抗性害虫集団において変異されているかもしれない宿主の生存能力及び生殖能力にも重要である抵抗性遺伝子を見出し損ねているかもしれない。毒素に対して抵抗性を産み出し得る必須遺伝子の類似のスクリーニングを、温度感受性変異体のホモ接合体（Ｆ２世代）であるＬ４（幼若）動物で実施できる。発達の完了後に容認されない温度へのシフトを生じる場合、必須遺伝子における変異はしばしば耐容性を示す。ホモ接合動物を容認される温度でＬ４段階まで成長させ、次いで容認されない温度に切り替え、毒性媒介タンパク質を不活性化する。次いで動物をＢｔ毒素を発現する大腸菌を含有するプレートに移し、抵抗性動物を回収し、容認される温度で維持する。これらの動物の子孫（Ｆ３世代）を生存能力及び生殖能力に関して温度感受性を試験する。次いで抵抗性表現型を有するこの欠損の連鎖に関してこれらを試験する。かかるアッセイにより、慣用されるスクリーニングでは検出できない必須遺伝子の同定が可能になる。従って、ｂｒｅ−３及びｂｒｅ−５変異体を同定するのに用いるスクリーニングにより抵抗性動物を見出すことができないＢｔ毒素をこのアッセイで試験して、どのように抵抗性の新規メカニズムが発達できるかを決定できる。抵抗性及び宿主適合性のどちらを取るかを理解することにより、どの抵抗性遺伝子座が最も変化する可能性が高く、毒素作用のどの工程が宿主媒介不活性化を最も受けやすいかの予測が可能になる。
【００３８】
本発明の実施形態を前記の実施例のみによって説明したが、本発明の範囲から逸脱することなく開示された実施形態に修飾を行うことができ、これは添付の請求の範囲により定義されることは技術分野の技術者に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１はＢＲＥ−５はＣ．エレガンス消化管でＢｔ毒素作用に必要とされる推定ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする。配列はＢＲＥ−５タンパク質のヒトｂ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチド５（ｈＢ３Ｔ５）；マウスｂ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチド３（ｍＢ３Ｔ３）；及びドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ＢＲＡＩＮＩＡＣ（Ｂｒｎ）とのＣＬＵＳＴＡＬＷ（バージョン１．８１）アラインメントである。推定膜貫通ドメインには下線を付している。ＤＸＤ及びＤＶＦＴＧモチーフは二重下線を付している。ｂｒｅ−５アレルで変異している２個のアルギニンの位置を示している。ｙｅ１０７は全てのｂ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼで保存されているアルギニンを変化させ、；ｙｅ１７は保存された（Ｅ／Ｄ）ＤＶガラクトシルトランスフェラーゼモチ−フの上流に停止コドンを導入する。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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