(57)【要約】【課題】本発明は、ＢＣ２００ＲＮＡにターゲティングした単離アンチセンス分子を提供する。治療有効量の本発明のアンチセンス分子の投与による被験体の神経学的障害または癌の治療方法も提供する。有効量のＢＣ２００ＲＮＡの投与による患者の癲癇の治療方法も提供する。さらに、本発明のアンチセンス分子および薬学的に許容可能なキャリアを含むキットを提供する。【解決手段】本発明は、ＢＣｌＲＮＡおよびＢＣ２００ＲＮＡが共にキャップ依存性様式および内部侵入様式の両方における翻訳開始の特異的リプレッサーであることを明らかにした。特に、これらのＲＮＡは、４８Ｓ複合体アセンブリレベルでの開始の阻害によって翻訳を抑制すること、及びＢＣｌ媒介抑制がキャップ依存性翻訳開始だけでなくｅＩＦ４Ａ依存性内部開始においても有効であることを明らかにした。したがって、非翻訳ＢＣｌＲＮＡおよびＢＣ２００ＲＮＡは、神経細胞の局所タンパク質合成の翻訳調節で機能的役割を果たす。
2006515988.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載の配列にターゲティングしたヌクレオチド配列を含む単離アンチセンス分子。
【請求項２】
配列番号２に記載の配列にターゲティングしたヌクレオチド配列を含む単離アンチセンス分子。
【請求項３】
配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含む単離アンチセンス分子において、前記配列がＢＣ２００ＲＮＡのヌクレオチド１５６〜１８５と相補的である、単離アンチセンス分子。
【請求項４】
配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含む単離アンチセンス分子において、前記配列がＢＣ２００ＲＮＡのヌクレオチド１５８〜１７８と相補的である、単離アンチセンス分子。
【請求項５】
配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含む単離アンチセンス分子。
【請求項６】
ＢＣ２００ＲＮＡをコードするＤＮＡと相補的な配列番号６に記載のヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項７】
薬学的に許容可能なキャリアと混合した、請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の単離核酸分子。
【請求項８】
被験体のＢＣ２００ＲＮＡを下方制御する工程を含む、前記被験体の神経学的障害または癌の治療方法。
【請求項９】
前記被験体のＢＣ２００ＲＮＡを下方制御する工程が、治療有効量のＢＣ２００ＲＮＡまたは小干渉ＲＮＡのドミナントネガティブ変異体を投与することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＢＣ２００の下方制御が、治療有効量の配列番号１または配列番号２に記載のヌクレオチド配列にターゲティングしたアンチセンス分子を投与することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＢＣ２００の下方制御が、治療有効量の配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６の少なくとも１つを投与することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記神経学的障害が、アルツハイマー病、脆弱性Ｘ精神遅滞症候群、ダウン症候群、およびパーキンソン病の少なくとも１つである、請求項８から請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記癌が、舌および肺の扁平上皮癌、食道上皮癌、胃の環状腺癌、乳癌、肺癌、耳下腺の粘液性類表皮癌、皮膚の黒色腫、卵巣の乳頭腫、または子宮頸部の内皮腺癌の少なくとも１つである、請求項８から請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
患者のＢＣ２００ＲＮＡを上方制御する工程を含む、被験体の癲癇の治療方法。
【請求項１５】
前記上方制御が、治療有効量のＢＣ２００ＲＮＡを患者に投与することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記上方制御が、被験体の細胞中で機能するプロモーターに作動可能に連結されたＢＣ２００に対応するＤＮＡまたはＲＮＡを有する遺伝子治療構築物を患者に投与することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１から請求項６のいずれか１項に記載のアンチセンス分子および薬学的に許容可能なキャリアを含むキット。
【請求項１８】
前記アンチセンス分子が前記薬学的に許容可能なキャリアとは別に包装されている、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記アンチセンス分子が前記薬学的に許容可能なキャリアと混合されている請求項１７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ニューロンでは、シナプス樹状突起（ｓｙｎａｐｔｏｄｅｎｄｒｉｔｉｃ）マイクロドメインにおける局所タンパク質合成はシナプスの成長および可塑性に関与する。局所翻訳の必要条件は、樹状突起中の遠位側の合成部位へのＲＮＡ輸送のターゲティングおよび要求する時間まで合成を制限する翻訳調節機構である。ニューロンの翻訳調節は、一定の神経学的障害の発症にも関与する。
【背景技術】
【０００２】
種々のニューロンｍＲＮＡ型は、正しい位置で同族タンパク質に翻訳されると推測されるシナプス後樹状突起マイクロドメインなどの遠位標的部位に輸送される（概説については、（非特許文献１）；（非特許文献２）；（非特許文献３）；（非特許文献４）：（非特許文献５）；（非特許文献６）；（非特許文献７）を参照のこと）。非常に多数のシナプス結合を形成する非常に細長い樹状突起および軸索プロセスによって特徴づけられる神経細胞は、樹状突起中のそのモザイクシナプス後タンパク質レパートリーの有効な管理のための局所タンパク質合成に依存することが示唆されている。したがって、局所合成による経験に依存するシナプスタンパク質成分の部位特異的調整は、シナプスの形態および機能の長期継続的可塑性変化の基礎をなすと考えられる（非特許文献８）；（非特許文献９）。
【０００３】
【非特許文献１】Ｋｉｎｄｌｅｒ  Ｓ，Ｍｏｈｒ  Ｂ，Ｒｉｃｈｔｅｒ  Ｄ（１９９７）Ｑｕｏ  ｖａｄｉｓ：ｅｘｔｒａｓｏｍａｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｍＲＮＡｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏａｉｎｏｌ  １２８：７−１０．
【非特許文献２】Ｔｉｅｄｇｅ  Ｈ，Ｂｌｏｏｍ  ＦＥ，Ｒｉｃｈｔｅｒ  Ｄ（１９９９）ＲＮＡ，Ｗｈｉｔｈｅｒ  Ｃｏａｓｔ  Ｔｈｏｕ？  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：１８６−１８７，
【非特許文献３】Ｋｉｅｂｌｅｒ  ＭＡ，ＤｅｓＧｒｏｓｅｉｌｌｅｒｓ  Ｌ（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｍＲＮＡ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｌｏｃａｌ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｎｅｕｒｏｎ  ２５：１９−２８．
【非特許文献４】Ｇｒｅｅｎｏｕｇｈ  ＷＴ，Ｋｌｉｎｔｓｏｖａ  ＡＹ，Ｉｒｗｉｎ  ＳＡ，Ｇａｌｖｅｚ  Ｒ，Ｂａｔｅｓ  ＫＥ，Ｗｅｉｌｅｒ  ＩＪ（２００１）Ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  oｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｆｒａｇｉｌｅ  Ｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｉｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：７１０１−７１０６．
【非特許文献５】Ｊｏｂ  Ｃ，Ｅｂｅｒｗｉｎｅ  Ｊ（２００１ｂ）Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ  ａｎｄ  ａｘｏｎｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２：８８９−８９８．
【非特許文献６】Ｒｉｃｈｔｅｒ  Ｄ，ｅｄ（２００１）Ｃｅｌｌ  ｐｏｌａｒｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ＲＮＡ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．Ｒｏｚｈｄｅｓｔｖｅｎｓｋｙ  Ｔ，ｋｏｐｙｌｏｖ  Ａ，Ｂｒｏｓｉｕｓ  Ｊ，Ｈｕｔｔｅｎｈｏｆｅｒ  Ａ（２００１）Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ＢＣ１  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔＲＮＡ  ＡＩａ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎｔｏ  ａｎ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．ＲＮＡ  ７：１−９
【非特許文献７】Ｓｔｅｗａｒｄ  Ｏ，Ｓｃｈｕｍａｎ  ＥＭ（２００１  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｔ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｓｉｔｅｓ  ｏｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ．Ａｎｎｕ  ＲＥＶ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２４：２９９−３２５，
【非特許文献８】Ｔｉｅｄｇｅ  Ｈ，  Ｂｌｏｏｍ  ＦＥ，Ｒｉｃｈｔｅｒ  Ｄ（１９９９）ＲＮＡ，Ｗｈｉｔｈｅｒ  Ｃｏａｓｔ  Ｔｈｏｕ？  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：１８６−１８７，
【非特許文献９】Ｊｏｂ  Ｃ，Ｅｂｅｒｗｉｎｅ  Ｊ（２００１ｂ）Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ  ａｎｄ  ａｘｏｎｓ．Ｎａｔ  ＲＥＶ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２：８８９−８９８．
【０００４】
シナプス後翻訳の概念は、近年、樹状突起に選択的に局在化する種々の神経ＲＮＡの発見により強化された。樹状突起ｍＲＮＡは、異なるクラスに属するタンパク質（細胞質ゾルタンパク質、細胞骨格構成要素、ならびに膜結合タンパク質および膜組み込みタンパク質（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が含まれる）をコードする（概説については、（非特許文献１０）；（非特許文献１１）；（非特許文献１２）を参照のこと）。最近の評価によれば（非特許文献１３）、樹状突起ｍＲＮＡのファミリーは、数百個のメンバーから構成される。
【０００５】
【非特許文献１０】Ｋｉｅｂｌｅｒ  ＭＡ，ＤｅｓＧｒｏｓｅｉｌｌｅｒｓ  Ｌ（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｍＲＮＡ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｌｏｃａｌ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｎｅｕｒｏｎ  ２５：１９−２８．
【非特許文献１１】Ｊｏｂ  Ｃ，Ｅｂｅｒｗｉｎｗ  Ｊ（２００１ｂ）Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ  ａｎｄ  ａｘｏｎｓ．Ｎａｔ  ＲＥＶ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２：８８９−８９８．
【非特許文献１２】Ｒｉｃｈｔｅｒ  Ｄ，ｅｄ（２００１）Ｃｅｌｌ  ｐｏｌａｒｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ＲＮＡ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．Ｒｏｚｈｄｅｓｔｖｅｎｓｋｙ  Ｔ，Ｋｏｐｙｌｏｖ  Ａ，Ｂｒｏｓｉｕｓ  Ｊ，Ｈｕｔｔｅｎｈｏｆｅｒ  Ａ（２００１）Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ＢＣ１  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔＲＮＡ  ＡＩａ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎｔｏ  ａｎ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｓｔｅｍ-ｌｏｏｐ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．ＲＮＡ  ７：１−９
【非特許文献１３】Ｅｂｅｒｗｉｎｅ  Ｊ，Ｍｉｙａｃｈｉｒｏ  Ｋ，Ｋａｃｈａｒｍｉｎａ  ＪＥ，Ｊｏｂ  ｃ（２００１）Ｌｏｃａｌ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌａｓｓｅｓ  ｏｆ  ｍＲＮＡｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｏ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃｅｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：７０８０−７０８５．
【０００６】
翻訳機構の構成要素は、樹状突起ドメイン中で同定されている（（非特許文献１４）；（非特許文献１５）；（非特許文献１６）。物理的に単離された樹状突起（非特許文献１７）および培養ニューロン（非特許文献１８）における樹状突起翻訳が報告されている。局所翻訳がシナプス形成の要件であることも示されている（非特許文献１９）。最近のデータにより、樹状突起におけるタンパク質合成がニューロン活性、受容体活性化、および神経栄養作用による調整に影響し得ることがさらに示唆されている（非特許文献２０）Ｓｔｅｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｈａｌｐａｉｎ，１９９９；（非特許文献２１）；（非特許文献２２）；（非特許文献２３）；（非特許文献２４）；（非特許文献２５）。まとめると、利用可能な証拠は、ｍＲＮＡの選択群が樹状突起に輸送され、その後要求に応じて、同族タンパク質が必要とされる特異的シナプス後マイクロドメイン中でこれらを翻訳することができるモデルを支持する（（非特許文献２６）；（非特許文献２７）。
【０００７】
【非特許文献１４】Ｔｉｅｄｇｅ  Ｈ，Ｂｒｏｓｉｕｓ  Ｊ（１９９６）Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ  ｏｆ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １６：７１７１−７１８１．
【非特許文献１５】Ｔｏｒｒｅ  ＥＲ，Ｓｔｅｗａｒｄ  Ｏ（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ：ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｗｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ  ｏｆ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １６：５９６７−５９７８．
【非特許文献１６】Ｇａｒｄｉｏｌ  Ａ，Ｒａｃｃａ  Ｃ，Ｔｒｉｆｌｅｒ  Ａ（１９９９）Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ａｎｄ  ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １９：１６８−１７９．
【非特許文献１７】Ｔｏｒｒｅ  ＥＲ，Ｓｔｅｗａｒｄ  Ｏ（１９９２）Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｅｗ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｗｈｉｃｈ  ｐｅｒｍｉｔｓ  Ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｖｉｎｇ  ａｘｏｎｓ  ａｎｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅｉｒ  ｃｅｌｌ  ｂｏｄｉｅＳ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １２：７６２−７７２．
【非特許文献１８】Ｃｒｉｎｏ  Ｐｂ，Ｅｂｅｒｗｉｎｅ  Ｊ（１９９６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｃｏｎｅ：Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｍＲＮＡ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｌｏｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｎｅｕｒｏｎ  １７：１１７３−１１８７．
【非特許文献１９】Ｓｃｈａｃｈｅｒ  Ｓ，Ｗｕ  Ｆ（２００２）Ｓｙｎａｐｓｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｂｏｄｉｅｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２２：１８３１−１８３９．
【非特許文献２０】Ｓｔｅｗａｒｄ  ０，Ｈａｌｐａｉｎ  Ｓ（１９９９）Ｌａｍｉｎａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｃａｕｓｅｓ  ｄｏｍａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ＭＡＰ２  ａｎｄ  ＣＡＭ  ｋｉｎａｓｅ  １１．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １９：７８３４−７８４５
【非特許文献２１】Ｋａｃｈａｒｍｉｎａ  ＪＥ，Ｊｏｂ  Ｃ，Ｃｒｉｎｏ  Ｐ，Ｅｂｅｒｗｉｎｅ  Ｊ（２０００）Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｗｉｔｈｉｎ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ９７：１１５４５−１１５５０．
【非特許文献２２】Ｓｃｈｅｅｔｚ  ＡＪ，Ｎａｉｍ  ＡＣ，Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｅ−Ｐａｔｏｎ  Ｍ（２０００）ＮＭＤＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｓｙｎａｐｓｅｓ．Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３：２１１−２１６．
【非特許文献２３】Ａａｋａｌｕ  Ｇ，Ｓｍｉｔｈ  ＷＢ，Ｎｇｕｙｅｎ  Ｎ，Ｊｉａｎｇ  Ｃ，Ｓ  ｃｈｕｍａｎ  ＥＭ（２００１）Ｄｙｎａｍｉｃ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｎｅｕｒｏｎ  ３０：４８９−５０２
【非特許文献２４】Ｇｒｅｅｎｏｕｇｈ  ｗｔ，Ｋｌｉｎｔｓｏｖａ  ＡＹ，Ｉｒｗｉｎ  ＳＡ，Ｇａｌｖｅｚ  Ｒ，Ｂａｔｅｓ  ＫＥ，Ｗｅｉｌｅｒ  ＩＪ（２００１）Ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｆｒａｇｉｌｅ  Ｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｉｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：７１０１−７１０６．
【非特許文献２５】Ｊｏｂ  Ｃ，Ｅｂｅｒｗｉｎｅ  Ｊ（２００１ａ：）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｔｅｓ  ｆｏｒ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：１３０３７−１３０４２．
【非特許文献２６】Ｊｏｂ  Ｃ，Ｅｂｅｒｗｉｎｅ  Ｊ（２００１ｂ）Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ  ａｎｄ  ａｘｏｎｓ．Ｎａｔ  ＲＥＶ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２：８８９−８９８．
【非特許文献２７】Ｊｏｂ  Ｃ，Ｅｂｅｒｗｉｎｅ  Ｊ（２００１ｂ）Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ  ａｎｄ  ａｘｏｎｓ．Ｎａｔ  ＲＥＶ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２：８８９−８９８．
【０００８】
このモデルは魅力的であるが、取り組まれていない多数の前提に依存する。これらの前提のうち、翻訳調節が最も重要な問題である。間違った場所または間違った時間の不適切なタンパク質合成を防止するために、任意の樹状突起ｍＲＮＡの翻訳活性は、輸送のターゲティング、シナプス後局在化、および局所翻訳の調節の連続的工程において厳密に調節されなければならない（非特許文献２８）。これに関する重要な問題は、多数の樹状突起ｍＲＮＡがそのシナプス後標的部位に到達後に適切なシグナルを受け取るまで翻訳がサイレントなままであり得るという想定によって起こる。
【０００９】
【非特許文献２８】Ｊｏｂ  Ｃ，Ｅｂｅｒｗｉｎｅ  Ｊ（２００１ｂ）Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ  ａｎｄ  ａｘｏｎｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２：８８９−８９８．
【００１０】
ＢＣ２００ＲＮＡは、２００ヌクレオチド長の一般に霊長類（ヒトが含まれる）の神経系で発現する非翻訳ＲＮＡである。サル脳由来のＢＣ２００ＲＮＡの部分的ヌクレオチド配列が（非特許文献２９）によって報告されている。この１３８ヌクレオチド配列は、Ａｌｕ左単量体（ヒトおよび他の霊長類ゲノム全体で何度も繰り返される配列）に実質的な相同性を示した。ＢＣ２００ＲＮＡは、通常は生殖細胞以外の正常な非神経組織で検出可能な量で生じないが、種々の非神経ヒト腫瘍組織で大量に生じる。
【００１１】
【非特許文献２９】Ｗａｔｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７，３３２４−３３２７（１９８７）
【００１２】
ＢＣ２００ＲＮＡの一次配列を、３つの構造ドメインに細分することができる。ドメインＩは、ヌクレオチド１〜１２２であり、霊長類ゲノム中で高コピー数で見出されるＡｌｕ反復エレメントに実質的に相同である。しかし、この領域は、ＡｌｕまたはＳＲＰ−ＲＮＡで見出されない２つの塩基（すなわち、ＢＣ２００配列に特異的な増幅プライマーの開発に使用することができる４８位および４９位のヌクレオチド）を含む。ドメインＩＩは、ヌクレオチド１２３〜１５８からなるＡリッチ領域である。ドメインＩＩＩは、ヌクレオチド１５９〜２００からなり、組織中のＢＣ２００ＲＮＡを同定するために使用することができる他の公知のヒト配列に相同でない固有の配列を含む。
【００１３】
（特許文献１）（その内容が全て記載されるかのように本明細書中で参考として援用される）は、ヒトＢＣ２００ＲＮＡの完全な配列および乳癌の指標としてヒト乳房組織中のヒトＢＣ２００ＲＮＡの存在の特異的な検出に使用することができるポリヌクレオチドプローブの使用を開示する。（特許文献２）（その内容が全て記載されるかのように本明細書中で参考として援用される）は、アルツハイマー病の指標としてヒト脳組織中のヒトＢＣ２００ＲＮＡの存在の特異的な検出に使用することができるポリヌクレオチドプローブの使用を開示する。
【００１４】
【特許文献１】米国特許第５，６７０，３１８号
【特許文献２】米国特許第５，７３６，３２９号
【００１５】
本発明によれば、ＢＣ２００ＲＮＡおよびＢＣｌＲＮＡ（ＢＣ２００ＲＮＡのげっ歯類対応物）はキャップ依存性様式および内部侵入様式の両方における翻訳開始の特異的リプレッサーであることを発見した。したがって、非翻訳ＢＣｌおよびＢＣ２００ＲＮＡは、ニューロンにおける遺伝子発現の翻訳調節で機能的役割を果たす。本発明によれば、ＢＣｌＲＮＡレベルは癲癇様活動の誘導に応答して下方制御されることも発見された。したがって、本発明は、種々の癌および神経学的障害におけるＢＣ２００ＲＮＡレベルを減少させるためのアンチセンス分子として使用することができるオリゴヌクレオチドを提供する。さらに、本発明は、このような患者におけるＢＣ２００ＲＮＡ転写物レベルの下方制御による種々の癌および神経学的障害患者の治療方法を提供する。本発明はまた、ＢＣ２００ＲＮＡ転写物レベルの上方制御による癲癇患者の治療方法を提供する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、ＢＣ２００ＲＮＡにターゲティングした単離アンチセンス分子を提供する。特に、配列番号１および／または配列番号２に記載の配列にターゲティングしたヌクレオチド配列を含む単離アンチセンス分子を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明で提供される特異的アンチセンス分子は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６に記載のヌクレオチド配列を含む。薬学的に許容可能なキャリアと混合した少なくとも１つの本発明のアンチセンス分子またはＢＣ２００ＲＮＡ転写物を含む薬学的組成物も提供する。
【００１８】
本発明は、さらに、被験体の神経学的障害または癌の治療方法を提供する。この方法は、被験体のＢＣ２００ＲＮＡの下方制御を含む。被験体のＢＣ２００ＲＮＡの下方制御は、治療有効量のＢＣ２００ＲＮＡまたは小干渉ＲＮＡのドミナントネガティブ変異体を投与することを含み得る。さらに、ＢＣ２００ＲＮＡの下方制御は、配列番号１または配列番号２に記載のヌクレオチド配列にターゲティングした治療有効量のアンチセンス分子を投与することを含み得る。本発明の別の実施形態では、ＢＣ２００の下方制御は、治療有効量の少なくとも１つの配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６を投与することを含む。本発明の方法によって治療することができる神経学的障害の例には、アルツハイマー病、脆弱性Ｘ精神遅滞症候群、ダウン症候群、およびパーキンソン病が含まれるが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明によって治療することができる癌の例には、舌および肺の扁平上皮癌、食道上皮癌、胃の環状腺癌、乳癌、肺癌、耳下腺の粘液性類表皮癌、皮膚の黒色腫、卵巣の乳頭腫、または子宮頸部の内皮腺癌がふくまれるが、これらに限定されない。
【００２０】
本発明のさらに別の態様では、被験体の癲癇の治療方法を提供する。この方法は、被験体においてＢＣ２００ＲＮＡを上方制御する工程を含む。この文脈における上方制御の例は、治療有効量のＢＣ２００ＲＮＡまたは被験体の細胞中で機能するプロモーターに作動可能に連結されたＢＣ２００に対応するＤＮＡまたはＲＮＡを有する遺伝子治療構築物を患者に投与することを含む。
【００２１】
本発明はまた、少なくとも１つの本発明のアンチセンス分子および薬学的に許容可能なキャリアを含むキットを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明によれば、翻訳の特異的リプレッサーとしてＢＣｌＲＮＡおよびＢＣ２００ＲＮＡを同定した。ＢＣｌＲＮＡが樹状突起に特異的且つ迅速に輸送され（非特許文献３０）、海馬錐体細胞の樹状突起（ｓｏｍａｔｏｄｅｎｄｒｉｔｉｃ）のＢＣｌ発現レベルが活性依存性調整の影響を受ける（非特許文献３１）ことが以前に示されている。本発明によれば、ＢＣｌＲＮＡおよびＢＣ２００ＲＮＡが共にキャップ依存性様式および内部侵入様式の両方における翻訳開始の特異的リプレッサーであることを本発明で発見した。特に、これらのＲＮＡは、４８Ｓ複合体アセンブリレベルでの開始の阻害によって翻訳を抑制する。本発明によれば、ＢＣｌ媒介抑制がキャップ依存性翻訳開始だけでなくｅＩＦ４Ａ依存性内部開始においても有効であることが示された。したがって、非翻訳ＢＣｌＲＮＡおよびＢＣ２００ＲＮＡは、神経細胞の局所タンパク質合成の翻訳調節で機能的役割を果たす。
【００２３】
【非特許文献３０】Ｍｕｓｌｉｍｏｖ  ＩＡ，Ｓａｎｔｉ  Ｅ，Ｈｏｍｅｌ  Ｐ，Ｐｅｒｉｎｉ  Ｓ，Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｄ，Ｔｉｅｄｇｅ  Ｈ（１９９７）ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ：ａ  ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｉｓ  ｃｏｎｔａｉｎｅｄ  ｗｉｔｈｉｎ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ＢＣｌ  ＲＮＡ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １７：４７２２−４７３３．
【非特許文献３１】Ｍｕｓｌｉｍｏｖ  ＩＡ，Ｂａｎｋｅｒ  Ｇ，Ｂｒｏｓｉｕｓ  Ｊ，Ｔｉｅｄｇｅ  Ｈ（１９９８）Ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ＢＣｌ  ＲＮＡ  ｉｎ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４１：１６０１−１６１１．
【００２４】
小神経非コード転写物ＢＣ２００ＲＮＡの発現は厳格に調節される。ＲＮＡは、通常は非神経体細胞で検出されない。（特許文献３）および（特許文献４）に記載のように、ＢＣ２００発現の厳格なニューロン特異的調節は、種々の腫瘍（乳癌が含まれる）で調節解除される。ＢＣ２００ＲＮＡは、悪性腫瘍に会合し、正常な非神経体細胞組織または乳房の線維腺腫などの良性腫瘍で検出不可能である。乳房の癌性の腫瘍細胞によって発現されたＢＣ２００ＲＮＡ量は、腫瘍の型、病期、悪性度と相関する。ＢＣ２００ＲＮＡは、浸潤癌にて高レベルで発現する。
【００２５】
【特許文献３】米国特許第５，６７０，３１８号
【特許文献４】米国特許第５，７３６，３２９号
【００２６】
ＢＣ２００発現レベルは、アルツハイマー病患者の脳のいくつかの皮質領域でも劇的に増加する。例えば、（特許文献５）および（特許文献６）を参照のこと。本発明によれば、ＢＣｌＲＮＡは癲癇様活動の誘導に応答して下方制御されることも発見された。詳細には、ＢＣｌＲＮＡレベルは、同側ＣＡ３で有意に減少する。ＢＣｌＲＮＡ減少についての基本的機構は依然として知られていない（すなわち、減少が転写の減少および／または分解の減少によるのかどうか）。ＢＣｌ発現レベルの下方制御はシナプス樹状突起タンパク質合成を促進し、それにより癲癇発症を促進する機構である可能性が高い。
【００２７】
【特許文献５】米国特許第５，６７０，３１８号
【特許文献６】米国特許第５，７３６，３２９号
【００２８】
上記概説のこれらの発見に基づいて、本発明は、体細胞およびシナプス後ドメインなどのニューロンドメインならびに癌性組織中に存在するＢＣ２００ＲＮＡレベルの調整方法を提供する。癌患者およびアルツハイマー病患者の場合、遺伝子サイレンシング、アンチセンス、およびドミナント／ネガティブ変異体などの種々の周知の方法を使用してＢＣ２００ＲＮＡの下方制御を行うことができる。癲癇患者の治療に関して、治療有効量のＢＣ２００ＲＮＡの投与または遺伝子治療によってＢＣ２００ＲＮＡレベルを増加させることができる。本発明の文脈において、被験体内で複製することができるベクターは、ＢＣ２００ＲＮＡに対応するＤＮＡまたはＲＮＡを含み、ＤＮＡまたはＲＮＡは被験体の細胞中で機能するプロモーター配列に作動可能に連結されている。例えば、被験体がヒトの場合、ヒト細胞中でのＢＣ２００ＲＮＡまたはＤＮＡの発現を駆動するために使用することができる種々のプロモーターが存在する。したがって、ＢＣ２００転写物は被験体内で利用可能となる。ＢＣ２００ＤＮＡまたはＲＮＡの発現を駆動するプロモーターの調整により、神経特異的、腫瘍特異的、および／または脳特異的にＢＣ２００を発現することができる。例えば、ニューロン中にＢＣ２００ＲＮＡを発現させるために、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）またはＣａＭＫＩＩα（カルシウム−カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩαサブユニット）プロモーターを使用することができる。細胞型特異的プロモーターを使用して、被験体の新形成細胞中でＢＣ２００ＲＮＡ転写物を発現することができる。本発明を実施するために使用することもできる遺伝子治療で利用可能な情報が豊富に存在する。有用な引用文献の例には、（非特許文献３２）および（非特許文献３３）が含まれる。
【００２９】
【非特許文献３２】Ｓａｕｔｅｒ，Ｂｅｒｎｈａｒｄ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｅＳ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｉｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７（９）：４８０２−４８０７．
【非特許文献３３】Ｈａｌｌ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｔｈｅ  ｐｒｏｍｉｓｅ  ａｎｄ  ｒｅａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｍ．Ｊ，Ｈｕｍ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６１：７８５−７８９．
【００３０】
アンチセンスターゲティングがＢＣ２００を下方制御するためのＢＣ２００ＲＮＡ転写物レベルの好ましい干渉方法であるが、当業者に公知の他の方法を使用してＢＣ２００ＲＮＡを干渉することができる。これらには、ＲＮＡ干渉によって遺伝子発現を抑制することができる配列特異的試薬である小干渉ＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。このような方法は、例えば、（非特許文献３４）；（非特許文献３５）；（非特許文献３６）；（非特許文献３７）（それぞれの内容が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【００３１】
【非特許文献３４】Ｔｕｓｃｈｌ，Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２０，ｐｐ．４４６−４４８（Ｍａｙ  ２００２）
【非特許文献３５】Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ６  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｄｒｉｖｅｎ  ｓｉＲＮＡｓ  Ｗｉｔｈ  Ｆｏｕｒ  Ｕｒｉｄｉｎｅ  ３’Ｏｖｅｒｈａｎｇｓ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２０，ｐｐ．４９７−５００（Ｍａｙ  ２００２）
【非特許文献３６】Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ａｇａｉｎｓｔ  ＨＩＶ−１  ｒｅｖ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２０，ｐｐ．５００−５０５（Ｍａｙ  ２００２）
【非特許文献３７】Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２０，ｐｐ．５０５−５０８（Ｍａｙ  ２００２）
【００３２】
ドミナントネガティブ変異体の移入によってＢＣ２００ＲＮＡを中和することもできる。このような変異体の移入により、内因性ＢＣ２００ＲＮＡは一定の結合部位について内因性ＲＮＡと競合する変異ＢＣ２００ＲＮＡに直面するが、機能的に無能であるという結果が得られる。例えば、本明細書中に記載の実施例２は、げっ歯類ＢＣｌＲＮＡが真核生物開始因子４Ａ（ｅＩＦ４Ａ）およびポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）と同時に相互作用することを証明する。さらに、本明細書中に記載の実施例５は、この同時相互作用は翻訳抑制に必要であることを示す。２つの因子のうちの１つのみとの相互作用では抑制に不十分である。したがって、たった１つの因子と結合する変異体を操作することができる。この結合によって、内因性ＢＣｌＲＮＡとの相互作用からこの因子が遮断されるが、他の因子と相互作用することができないので、機能的に活性ではない。ＰＡＢＰはＢＣｌＲＮＡおよびＢＣ２００ＲＮＡの中心および３’部分中のＡリッチエレメントに結合するので、依然としてｅＩＦ４Ａに結合するがＰＡＢＰに結合しない変異体を作製するためにこれらのエレメントをランダム配列またはＵリッチエレメントに変異させることができる。
【００３３】
アンチセンステクノロジーを介したＢＣ２００の下方制御に関して、本発明は、神経学的障害および癌の両方の治療手段としてＢＣ２００にターゲティングしたオリゴヌクレオチド（すなわち、アンチセンス分子）を使用する。アンチセンステクノロジーの標的は、ＢＣ２００ＲＮＡ（正常な非神経体細胞組織または乳房の線維腺腫などの良性腫瘍で検出不可能な悪性腫瘍および一定の神経学的障害（アルツハイマー病が含まれる）に関連する非翻訳ＲＮＡマーカー）である。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用するための適切なオリゴヌクレオチドには、上記の（特許文献７）および（非特許文献８）に記載のプローブが含まれる。
【００３４】
【特許文献７】米国特許第５，６７０，３１８号
【特許文献８】米国特許第５，７３６，３２９号
【００３５】
本発明は、ＢＣ２００ＲＮＡをコードする核酸分子機能の調整で使用するためのオリゴマー化合物、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する。ＢＣ２００ＲＮＡをコードする１つまたは複数の核酸と特異的にハイブリッド形成するアンチセンス化合物の提供によってこれを行う。本明細書中で使用される、用語「標的核酸」および「ＢＣ２００ＲＮＡをコードする核酸」は、ＢＣ２００ＲＮＡをコードするＤＮＡ、このようなＤＮＡから転写されたＲＮＡ（プレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡが含まれる）（ＢＣ２００ＲＮＡ自体が含まれる）、およびこのようなＲＮＡ由来のｃＤＮＡを含む。オリゴマー化合物のその標的核酸との特異的ハイブリッド形成により、核酸の通常の機能が干渉される。核酸と特異的にハイブリッド形成する化合物による標的核酸機能のこの調整を、一般に、「アンチセンス」という。
【００３６】
ＤＮＡの干渉機能には、複製および転写が含まれる。ＲＮＡの干渉機能には、全ての生体機能、例えば、タンパク質の翻訳部位へのＲＮＡの転位置、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つまたは複数のｍＲＮＡ種を得るためのＲＮＡのスプライシング、およびＲＮＡに関与するかＲＮＡによって促進することができる触媒および他の（例えば、阻害）活性などが含まれる。このような標的核酸機能の全干渉効果は、ＢＣ２００ＲＮＡの発現の調整である。本発明の文脈では、「調整」は、遺伝子発現の増加（刺激）または減少（阻害）のいずれかを意味する。本発明の文脈では、阻害は遺伝子発現調整の好ましい形態であり、ＢＣ２００ＲＮＡは好ましい標的である。
【００３７】
（特許文献９）に示すように、ＢＣ２００ＲＮＡは以下の一次配列を有する２００ヌクレオチド長の非翻訳ＲＮＡである：
ＸＸＣＣＧＧＧＣＧＣ  ＧＧＵＧＧＣＵＣＡＣ  ＧＣＣＵＧＵＡＡＵＣ  ＣＣＡＧＣＵＣＵＣＡ  ＧＧＧＡＧＧＣＵＡＡ  ＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧ  ＧＡＵＡＧＣＵＵＧＡ  ＧＣＣＣＡＧＧＡＧＵ  ＵＣＧＡＧＡＣＣＵＧ  ＣＣＵＧＧＧＣＡＡＵ  ＡＵＡＧＣＧＡＧＡＣ  ＣＣＣＧＵＵＣＵＣＣ  ＡＧＡＡＡＡＡＧＧＡ  ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ  ＣＡＡＡＡＧＡＣＡＡ  ＡＡＡＡＡＡＡＡＵＡ  ＡＧＣＧＵＡＡＣＵＵ  ＣＣＣＵＣＡＡＡＧＣ  ＡＡＣＡＡＣＣＣＣＣ  ＣＣＣＣＣＣＣＵＵＵ（配列番号１）。１位および２位のＸは独立してＧであるか存在しない。
【００３８】
【特許文献９】米国特許第５，７３６，３２９号
【００３９】
好ましくは、本発明のアンチセンス化合物は、ＢＣ２００ＲＮＡの機能を阻害するように上記の配列番号１で同定されたＢＣ２００ＲＮＡの特異的部分にターゲティングされる。
【００４０】
より好ましくは、サンプル中のＢＣ２００ＲＮＡの阻害に使用されるアンチセンス化合物は、ヒトＢＣ２００ＲＮＡのドメインＩＩＩの固有の配列に相補的なオリゴヌクレオチドまたはその対応する染色体ＤＮＡ、すなわち、以下の配列の少なくとも一部に相補的である：
ＵＡＡＧＣＧＵＡＡＣ  ＵＵＣＣＣＵＣＡＡＡ  ＧＣＡＡＣＡＡＣＣＣ  ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＵ  ＵＵ  （配列番号２）。
【００４１】
このようなアンチセンス化合物は、約１０塩基から６０塩基までを含む線状オリゴヌクレオチドである。長さは、ＢＣ２００ＲＮＡとの結合が他のポリヌクレオチドへの結合よりも好ましいような妥当な特異性を得るのに十分でなければならない。
【００４２】
本発明の範囲内の１つのアンチセンス化合物は、ＢＣ２００ＲＮＡのヌクレオチド１５６〜１８５に相補的である。この３０ヌクレオチドのアンチセンス化合物は以下の配列を有する：
ＴＴＧＴＴＧＣＴＴＴ  ＧＡＧＧＧＡＡＧＴＴ  ＡＣＧＣＴＴＡＴＴＴ  （配列番号３）。
【００４３】
当業者が認識するように、アンチセンス化合物がＲＮＡの場合、上記配列（または本明細書中の任意の配列）の「Ｔ」（チミン）を、「Ｕ」（ウラシル）に置換する。
【００４４】
別の有用なアンチセンス化合物は、ヌクレオチド１５８〜１７８に相補的な２１ヌクレオチドプローブ、すなわち、以下である：
ＴＴＴＧＡＧＧＧＡＡ  ＧＴＴＡＣＧＣＴＴＡ  Ｔ（配列番号４）。
【００４５】
適切なアンチセンス化合物は、ドメインＩＩＩの外側のＢＣ２００ＲＮＡ部分と相補的であり得る。好ましくは、アンチセンス化合物はまた、特異性を得るのに十分な固有のドメインＩＩＩの一部（すなわち、少なくとも約１０塩基）と相補的である。アンチセンス化合物はまた、ドメインＩＩＩの一部のみと相補的であり得る。本発明のさらなる態様は、ヌクレオチド１４６〜１４８にわたるドメインＩＩの一部と相補的であるアンチセンス化合物の第２のクラスである。
【００４６】
本発明のなおさらなる態様では、ＢＣ２００ＲＮＡの４８位および４９位の２つの固有のヌクレオチドにわたるＡｌｕ反復配列の一部または対応するＤＮＡと相補的であり、且つ特異的にハイブリッド形成するアンチセンス化合物を使用することができる。このようなアンチセンス化合物の例は、以下である：
ＣＣＴＣＴＴＡＧＣＣ  ＴＣＣＣＴＧＡＧＡＧ  ＣＴ（配列番号５）（ＢＣ２００ＲＮＡと結合する特に有用なアンチセンス化合物および
ＣＣＡＧＣＴＣＴＣＡ  ＧＧＧＡＧＧＣＴＡＡ（配列番号６）（対応するＤＮＡ配列に結合するセンス化合物））。これらのアンチセンス化合物を、ＢＣ２００ＲＮＡの検出または阻害に使用することができる。
【００４７】
修飾がオリゴヌクレオチドのＢＣ２００に結合する能力に影響を与えない配列番号３〜６に記載のアンチセンス分子の修飾も本発明の範囲内である。このような修飾には、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失、および置換が含まれる。
【００４８】
アンチセンスの特異的核酸をターゲティングすることが好ましい。アンチセンス化合物の特定の核酸への「ターゲティング」は、本発明の文脈では、多工程プロセスである。プロセスは、通常、その機能が調整される核酸配列の同定から開始される。これは、例えば、その発現が特定の障害もしくは疾患に関連する細胞遺伝子（または遺伝子から転写されたＲＮＡ）または感染性因子由来の核酸分子であり得る。本発明では、標的は、ＢＣ２００ＲＮＡをコードする核酸分子、最も好ましくはＢＣ２００ＲＮＡ自体である。ターゲティングプロセスは、所望の効果（例えば、タンパク質発現の検出または調整）が得られるようなこの核酸内のアンチセンス相互作用を生じる部位の決定も含む。
【００４９】
一旦１つまたは複数の標的部位が同定されると、標的と十分に相補的な（すなわち、所望の効果を得るために十分にハイブリッド形成し、且つ十分な特異性を有する）オリゴヌクレオチドを選択する。
【００５０】
本発明の文脈では、「ハイブリッド形成」は、相補ヌクレオシド間またはヌクレオチド塩基間の水素結合を意味し、ワトソン−クリック、フーグスティーン、または逆フーグスティーン水素結合であり得る。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を介して対合する相補核酸塩基である。本明細書中で使用される、「相補的」は、２つのヌクレオチド間の正確な対合能力をいう。例えば、オリゴヌクレオチドの一定の位置のヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡ分子の同一の位置のヌクレオチドと水素結合を形成することができる場合、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡはその位置で互いに相補的であると見なされる。各分子中の十分な数の対応する位置が互いに水素結合することができるヌクレオチドで占められる場合、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡは互いに相補的である。したがって、「特異的にハイブリッド形成可能な」および「相補的な」は、オリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡ標的との間で安定且つ特異的に結合するような十分な程度の相補性または正確な対合を示すために使用される用語である。アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリッド形成可能なその標的核酸と１００％相補的である必要はないことが当該分野で理解される。標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子への化合物の結合によって標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能が干渉されて有用性を喪失する場合ならびに特異的結合が望ましい条件下（すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイまたは治療上の処置の場合の生理学的条件下およびｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの場合はアッセイが行われる条件下）で非標的配列へのアンチセンス化合物の非特異的結合を回避するのに十分な相補性が存在する場合、アンチセンス化合物は特異的にハイブリッド形成する。
【００５１】
標的とハイブリッド形成して標的の発現を阻害する本発明のアンチセンスおよび他の化合物を実験によって同定し、これらの化合物の配列は本発明の好ましい実施形態である。これらの好ましい配列が相補的な標的部位は、「活性部位」であるので、好ましいターゲティング部位である。したがって、本発明の別の実施形態は、これらの活性部位とハイブリッド形成する化合物を含む。
【００５２】
１つまたは複数のアンチセンス化合物で処置した細胞または組織内の発現パターンを、アンチセンス化合物で処置していない対照細胞または組織と比較し、例えば、これらのパターンが、試験する遺伝子の疾患との関連、シグナル伝達経路、細胞局在化、発現レベル、サイズ、構造、または機能に関連するので、得られたパターンを遺伝子発現の差分レベルについて分析する。刺激細胞または非刺激細胞に対しておよび発現パターンに影響を与える他の化合物の存在下または非存在下でこれらの分析を行うことができる。
【００５３】
当該分野で公知の遺伝子発現分析方法の例には、ＤＮＡアレイまたはマイクロアレイ（非特許文献３８）；（非特許文献３９）、ＳＡＧＥ（遺伝子発現の連続分析）（非特許文献４０）、ＲＥＡＤＳ（消化ｃＤＮＡの制限酵素増幅）（非特許文献４１）、ＴＯＧＡ（総遺伝子発現分析）（非特許文献４２）、タンパク質アレイおよびプロテオミクス（非特許文献４３）；（非特許文献４４）、発現配列タグ（ＥＳＴ）配列決定（非特許文献４５）；（非特許文献４６）、減法的（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ）ＲＮＡフィンガープリンティング（ＳｕＲＦ）（非特許文献４７）；（非特許文献４８）、減法的クローニング、ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）（非特許文献４９）、比較ゲノムハイブリッド形成（非特許文献５０）、ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成）技術（非特許文献５１）、および質量分析法（（非特許文献５２）に概説）が含まれる。
【００５４】
【非特許文献３８】Ｂｒａｚｍａ  ａｎｄ  Ｖｉｌｏ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０００，４８０，１７−２４
【非特許文献３９】Ｃｅｌｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０００，４８０，２−１６
【非特許文献４０】Ｍａｄｄｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ，２０００，５，４１５−４２５
【非特許文献４１】Ｐｒａｓｈａｒ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９９９，３０３，２５８−７２）
【非特許文献４２】Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，１９７６−８１
【非特許文献４３】Ｃｅｌｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０００，４８０，２−１６
【非特許文献４４】Ｊｕｎｇｂｌｕｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１９９９，２０，２１００−１０
【非特許文献４５】Ｃｅｌｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０００，４８０，２−１６
【非特許文献４６】Ｌａｒｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０００，８０，１４３−５７
【非特許文献４７】Ｆｕｃｈｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０００，２８６，９１−９８
【非特許文献４８】Ｌａｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２０００，４１，２０３−２０８
【非特許文献４９】Ｊｕｒｅｃｉｃ  ａｎｄ  Ｂｅｌｍｏｎｔ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０００，３，３１６−２１
【非特許文献５０】Ｃａｒｕｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．，１９９８，３１，２８６−９６）
【非特許文献５１】Ｇｏｉｎｇ  ａｎｄ  Ｇｕｓｔｅｒｓｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９９，３５，１８９５−９０４
【非特許文献５２】Ｔｏ，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ，２０００，３，２３５−４１
【００５５】
本発明の文脈では、用語「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマーもしくはポリマーまたはその模倣物をいう。この用語には、天然に存在する核酸塩基、糖、およびヌクレオシド間（骨格）共有結合から構成されるオリゴヌクレオチドならびに同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。このような修飾または置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、強化された細胞取り込み、核酸標的に体する強化された親和性、およびヌクレアーゼの存在下での安定性の増加などの所望の性質により、天然形態よりもしばしば好ましい。
【００５６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはアンチセンス化合物の好ましい形態であるが、本発明は他のオリゴマーアンチセンス化合物（オリゴヌクレオチド模倣物が含まれるが、これらに限定されない）を含む。本発明のアンチセンス化合物は、好ましくは、約８個から約５０個までの核酸塩基（すなわち、約８個から約５０個までの結合ヌクレオシド）を含む。特に好ましいアンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、さらにより好ましくは約１２個から約３０個までの核酸塩基を含むものである。アンチセンス化合物には、リボザイム、外部ガイド配列（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｇｕｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド（オリゴザイム）、および標的核酸とハイブリッド形成してその発現を調整する他の短い触媒ＲＮＡまたは触媒オリゴヌクレオチドが含まれる。
【００５７】
当該分野で公知のように、ヌクレオシドは塩基−糖組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常複素環塩基である。このような複素環塩基の２つの最も一般的なクラスは、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドについて、糖の２’、３’、および５’ヒドロキシル部分のいずれかにリン酸基を結合することができる。オリゴヌクレオチドの形成では、リン酸基は隣接するヌクレオシドと互いに共有結合して直鎖高分子化合物が形成される。その後この線状高分子構造の各末端がさらに結合して環状構造を形成するが、一般に開いた線状構造が好ましい。オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸基は、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド骨格の形成をいう。ＲＮＡおよびＤＮＡの通常の結合または骨格は、３’→５’ホスホジエステル結合である。
【００５８】
他のアンチセンス化合物には、修飾骨格または非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書中で使用される、修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格中にリン原子を保持するものおよび骨格中にリン原子を有さないものが含まれる。本明細書中の目的のためおよび当該分野でしばしば参照されるように、そのヌクレオシド骨格中にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオシドと見なすこともできる。
【００５９】
修飾オリゴヌクレオチド骨格には、例えば、正常な３’−５’結合を有するホスホロチオエート、キラルなホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホン酸（３’−アルキレンホスホン酸、５’−アルキレンホスホン酸、およびキラルなホスホン酸塩が含まれる）、ホスフィン酸塩、ホスホルアミデート（３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデートが含まれる）、チオアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、およびボラノホスフェート、ならびに、これらの２’−５’結合アナログ、および１つまたは複数のヌクレオチド間結合が３’−３’、５’−５’、または２’−２’結合である逆極性を有するものが含まれる。上記リン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、（特許文献１０）；（非特許文献１１）；（非特許文献１２）；（非特許文献１３）；（非特許文献１４）；（非特許文献１５）；（非特許文献１６）；（非特許文献１７）；（非特許文献１８）；（非特許文献１９）；（非特許文献２０）；（非特許文献２１）；（非特許文献２２）；（非特許文献２３）；（非特許文献２４）；（非特許文献２５）；（非特許文献２６）；（非特許文献２７）；（非特許文献２８）；（非特許文献２９）；（非特許文献３０）；（非特許文献３１）；（非特許文献３２）；（非特許文献３３）；（非特許文献３４）；（非特許文献３５）；（非特許文献３６）；（非特許文献３７）；（非特許文献３８）、および（非特許文献３９）（それぞれ本明細書中で参考として援用される）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６０】
【特許文献１０】米国特許第３，６８７，８０８号
【特許文献１１】同第４，４６９，８６３号
【特許文献１２】同第４，４７６，３０１号
【特許文献１３】同第５，０２３，２４３号
【特許文献１４】同第５，１７７，１９６号
【特許文献１５】同第５，１８８，８９７号
【特許文献１６】同第５，２６４，４２３号
【特許文献１７】同第５，２７６，０１９号
【特許文献１８】同第５，２７８，３０２号
【特許文献１９】同第５，２８６，７１７号
【特許文献２０】同第５，３２１，１３１号
【特許文献２１】同第５，３９９，６７６号
【特許文献２２】同第５，４０５，９３９号
【特許文献２３】同第５，４５３，４９６号
【特許文献２４】同第５，４５５，２３３号
【特許文献２５】同第５，４６６，６７７号
【特許文献２６】同第５，４７６，９２５号
【特許文献２７】同第５，５１９，１２６号
【特許文献２８】同第５，５３６，８２１号
【特許文献２９】同第５，５４１，３０６号
【特許文献３０】同第５，５５０，１１１号
【特許文献３１】同第５，５６３，２５３号
【特許文献３２】同第５，５７１，７９９号
【特許文献３３】同第５，５８７，３６１号
【特許文献３４】同第５，１９４，５９９号
【特許文献３５】同第５，５６５，５５５号
【特許文献３６】同第５，５２７，８９９号
【特許文献３７】同第５，７２１，２１８号
【特許文献３８】同第５，６７２，６９７号
【特許文献３９】同第５，６２５，０５０号
【００６１】
リン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間結合によって形成された骨格を有し得る。これらには、モルホリノ結合（一部ヌクレオシドの糖部分から形成されている）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；およびＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２の混合成分を有する他の骨格を有するものが含まれる。
【００６２】
上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、（特許文献４０）；（特許文献４１）；（特許文献４２）；（特許文献４３）；（特許文献４４）；（特許文献４５）；（特許文献４６）；（特許文献４７）；（特許文献４８）；（特許文献４９）；（特許文献５０）；（特許文献５１）；（特許文献５２）；（特許文献５３）；（特許文献５４）；（特許文献５５）；（特許文献５６）；（特許文献４７）；（特許文献４８）；（特許文献５９）；（特許文献６０）；（特許文献６１）；（特許文献６２）；（特許文献６３）；（特許文献６４）；（特許文献６５）；（特許文献６６）；（特許文献６７）、および（特許文献６８）（それぞれ本明細書中で参考として援用される）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６３】
【特許文献４０】米国特許第５，０３４，５０６号
【特許文献４１】同第５，１６６，３１５号
【特許文献４２】同第５，１８５，４４４号
【特許文献４３】同第５，２１４，１３４号
【特許文献４４】同第５，２１６，１４１号
【特許文献４５】同第５，２３５，０３３号
【特許文献４６】同第５，２６４，５６２号
【特許文献４７】同第５，２６４，５６４号
【特許文献４８】同第５，４０５，９３８号
【特許文献４９】同第５，４３４，２５７号
【特許文献５０】同第５，４６６，６７７号
【特許文献５１】同第５，４７０，９６７号
【特許文献５２】同第５，４８９，６７７号
【特許文献５３】同第５，５４１，３０７号
【特許文献５４】同第５，５６１，２２５号
【特許文献５５】同第５，５９６，０８６号
【特許文献５６】同第５，６０２，２４０号
【特許文献５７】同第５，６１０，２８９号
【特許文献５８】同第５，６０２，２４０号
【特許文献５９】同第５，６０８，０４６号
【特許文献６０】同第５，６１０，２８９号
【特許文献６１】同第５，６１８，７０４号
【特許文献６２】同第５，６２３，０７０号
【特許文献６３】同第５，６６３，３１２号
【特許文献６４】同第５，６３３，３６０号
【特許文献６５】同第５，６７７，４３７号
【特許文献６６】同第５，７９２，６０８号
【特許文献６７】同第５，６４６，２６９号
【特許文献６８】同第５，６７７，４３９号
【００６４】
他のオリゴヌクレオチド模倣物では、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合（すなわち、骨格）を新規の基と置換する。適切な核酸標的化合物とのハイブリッド形成のために塩基単位を維持する。１つのこのようなオリゴマー化合物（優れたハイブリッド形成特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物）を、ペプチド核酸（ＰＮＡ）という。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖−骨格をアミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格に置換する。核酸塩基を保持し、骨格のアミド部分のアザ窒素原子と直接または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、（特許文献６９）；（特許文献７０）；および（特許文献７１）（それぞれ本明細書中で参考として援用される）が含まれるが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物のさらなる教示を、（非特許文献５３）に見出すことができる。
【００６５】
【特許文献６９】米国特許第５，５３９，０８２号
【特許文献７０】同第５，７１４，３３１号
【特許文献７１】同第５，７１９，２６２号
【非特許文献５３】Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００
【００６６】
本発明で使用するための適切なオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を有するものであり、適切なオリゴヌクレオシドは、ヘテロ原子骨格、特に、上記で引用した（特許文献７２）の−−ＣＨ２−−ＮＨ−−Ｏ−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｏ−−ＣＨ−−（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として公知）、−−ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−  Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、および−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−（元のホスホジエステル骨格を、−−Ｏ−−Ｐ−−Ｏ−−ＣＨ２−−と示す）および上記で引用した（特許文献７３）のアミド骨格を有するものである。上記で引用した（非特許文献７４）のモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドもまた適切である。
【００６７】
【特許文献７２】米国特許第５，４８９，６７７号
【特許文献７３】米国特許第５，６０２，２４０号
【特許文献７４】米国特許第５，０３４，５０６号
【００６８】
修飾オリゴヌクレオチドはまた、１つまたは複数の置換糖部分を含み得る。このようなオリゴヌクレオチドは、２位に以下のうちの１つを含み得る：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−−、Ｓ−−、またはＮ−アルキル；Ｏ−−、Ｓ−−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−−、Ｓ−−、またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換Ｃｌ〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃｌ０アルケニルおよびアルキニルであり得る）。Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（式中、ｎおよびｍは１から約１０までである）が特に好ましい。他のオリゴヌクレオチドは、２’位に以下のうちの１つを含む：Ｃｌ〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル、Ｏ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ、ＯＣＦ、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入物、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するための基、オリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基、類似の特性を有する他の置換基。他の修飾には２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（２’−−Ｏ−−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても公知）（非特許文献５４）（すなわち、アルコキシアルコキシ基）が含まれる。さらなる修飾には、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ（すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（２’−ＤＭＡＯＥとしても公知）および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該分野で２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても公知）（すなわち、２’−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ２）２）が含まれ得る。
【００６９】
【非特許文献５４】Ｍａｒｔｉｎｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４
【００７０】
他の好ましい修飾には、２’水酸基が糖環の３’または４’炭素原子に結合し、それにより二環式糖部分が形成されるロックされた核酸（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）が含まれる。結合は、好ましくは、２’酸素原子および４’炭素原子を架橋するメチレン（−−ＣＨ２−−）ｎ基（式中、ｎは１または２である）である。ＬＮＡおよびその調製物は、（特許文献７５）および（特許文献７６）国際公開第９９／１４２２６号（その内容が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【００７１】
【特許文献７５】国際公開第９８／３９３５２号
【特許文献７６】国際公開第９９／１４２２６号
【００７２】
他の好ましい修飾には、２’−メトキシ（２’−Ｏ−−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−−ＣＨ２−−ＣＨ＝ＣＨ２）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が含まれる。２’修飾は、アラビノ（上）位またはリボ（下）位であり得る。好ましい２’−アラビノ修飾は、２’−Ｆである。オリゴヌクレオチドの他の位置（特に、３’末端ヌクレオチドまたは２’−５’結合オリゴヌクレオチド上の糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位）に類似の修飾を行うことができる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣物も有し得る。このような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、（特許文献７７）；（特許文献７８）；（特許文献７９）；（特許文献８０）；（特許文献８１）；（特許文献８２）；（特許文献８３）；（特許文献８４）；（特許文献８５）；（特許文献８６）；（特許文献８７）；（特許文献８８）；（特許文献８９）；（特許文献９０）；（特許文献９１）；（特許文献９２）；（特許文献９３）；（特許文献９４）；（特許文献９５）；（特許文献９６）；および（特許文献９７）（それぞれその全体が本明細書中で参考として援用される）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７３】
【特許文献７７】米国特許第４，９８１，９５７号
【特許文献７８】同第５，１１８，８００号
【特許文献７９】同第５，３１９，０８０号
【特許文献８０】同第５，３５９，０４４号
【特許文献８１】同第５，３９３，８７８号
【特許文献８２】同第５，４４６，１３７号
【特許文献８３】同第５，４６６，７８６号
【特許文献８４】同第５，５１４，７８５号
【特許文献８５】同第５，５１９，１３４号
【特許文献８６】同第５，５６７，８１１号
【特許文献８７】同第５，５７６，４２７号
【特許文献８８】同第５，５９１，７２２号
【特許文献８９】同第５，５９７，９０９号
【特許文献９０】同第５，６１０，３００号
【特許文献９１】同第５，６２７，０５３号
【特許文献９２】同第５，６３９，８７３号
【特許文献９３】同第５，６４６，２６５号
【特許文献９４】同第５，６５８，８７３号
【特許文献９５】同第５，６７０，６３３号
【特許文献９６】同第５，７９２，７４７号
【特許文献９７】同第５，７００，９２０号
【００７４】
オリゴヌクレオチドは、核酸塩基（当該分野でしばしば単純に「塩基」という）の修飾または置換も含み得る。本明細書中で使用される「非修飾」または「天然の」核酸塩基には、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核酸塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、アデニンおよびグアニン他のアルキル誘導体、２−プロピルおよびアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−−Ｃ≡Ｃ−−ＣＨ３）ウラシルおよびシトシン、ピリミジン塩基の他のアルキル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン、およびチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、および他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ（特に、５−ブロモ）、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどの他の合成および天然の核酸塩基が含まれる。さらなる修飾核酸塩基には、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリミドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’、２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）などのＧ−クランプなどの三環式ピリミジンが含まれる。修飾核酸塩基には、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環（例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、および２−ピリドン）に置換されたものも含まれ得る。さらなる核酸塩基には、（特許文献９８）に開示のもの、（非特許文献５５）に開示のもの、（非特許文献５６）に開示のもの、および（非特許文献５７）に開示のものが含まれる。オリゴマー化合物の結合親和性の増大に特に有用な核酸塩基には、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンが含まれる）が含まれる。５−メチルシトシン置換基は、核酸二本鎖安定性を０．６〜１．２℃増加させることが公知であり（非特許文献５８）、さらにより詳細には、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合、現在好ましい塩基置換基である。
【００７５】
【特許文献９８】米国特許第３，６８７，８０８号
【非特許文献５５】Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ  ８５８−８５９、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０
【非特許文献５６】Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３
【非特許文献５７】Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ  ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３
【非特許文献５８】Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）
【００７６】
一定の上記修飾核酸塩基および他の修飾核酸塩基の調製を教示する代表的な米国特許には、（特許文献９９）ならびに（特許文献１００）；（特許文献１０１）；（特許文献１０２）；（特許文献１０３）；（特許文献１０４）；（特許文献１０５）；（特許文献１０６）；（特許文献１０７）；（特許文献１０８）；（特許文献１０９）；（特許文献１１０）；（特許文献１１１）；（特許文献１１２）；（特許文献１１３）；（特許文献１１４）；（特許文献１１５）；（特許文献１１６）；（特許文献１１７）；（特許文献１１８）；（特許文献１１９）；（特許文献１２０）；および（特許文献１２１）（それぞれ本明細書中で参考として援用される）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７７】
【特許文献９９】米国特許第３，６８７，８０８号
【特許文献１００】米国特許第４，８４５，２０５号
【特許文献１０１】同第５，１３０，３０２号
【特許文献１０２】同第５，１３４，０６６号
【特許文献１０３】同第５，１７５，２７３号
【特許文献１０４】同第５，３６７，０６６号
【特許文献１０５】同第５，４３２，２７２号
【特許文献１０６】同第５，４５７，１８７号
【特許文献１０７】同第５，４５９，２５５号
【特許文献１０８】同第５，４８４，９０８号
【特許文献１０９】同第３０５，５０２，１７７号
【特許文献１１０】同第５，５２５，７１１号
【特許文献１１１】同第５，５５２，５４０号
【特許文献１１２】同第５，５８７，４６９号
【特許文献１１３】同第５，５９４，１２１号
【特許文献１１４】同第５，５９６，０９１号
【特許文献１１５】同第５，６１４，６１７号
【特許文献１１６】同第５，６４５，９８５号
【特許文献１１７】同第５，８３０，６５３号
【特許文献１１８】同第５，７５０，６９２号
【特許文献１１９】同第５，７６３，５８８号
【特許文献１２０】同第６，００５，０９６号
【特許文献１２１】同第５，６８１，９４１号
【００７８】
本発明のオリゴヌクレオチドの他の修飾は、オリゴヌクレオチドへのオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを強化する１つまたは複数のオリゴヌクレオチド部分または結合物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）に化学的に結合することを含み得る。本発明の化合物には、１級水酸基または２級水酸基などの官能基に共有結合した結合基（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｇｒｏｕｐ）が含まれ得る。本発明の結合基には、挿入物、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を強化する基、およびオリゴマーの薬物動態学的特性を強化する基が含まれる。典型的な結合基には、コレステロール、資質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素が含まれる。本発明の文脈では、薬力学的特性を強化する基には、オリゴマー取り込みを改良する基、オリゴマーの分解耐性を強化する基、および／またはＲＮＡとの配列特異的ハイブリッド形成を強化する基が含まれる。本発明の文脈では、薬物動態学的特性を強化する基には、オリゴマーの取り込み、分布、代謝、または排出を改良する基が含まれる。結合部分には、コレステロール部分などの脂質部分（非特許文献５９）、コール酸（非特許文献６０）、チオエーテル（例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール）（（非特許文献６１）；（非特許文献６２）、チオコレステロール（非特許文献６３）、脂肪族鎖（例えば、ドデカジオールまたはウンデシル残基）（非特許文献６４）；（非特許文献６５）；（非特許文献６６）、リン脂質（例えば、ジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート）（非特許文献６７）；（非特許文献６８）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（非特許文献６９）、アダマンタン酢酸（非特許文献７０）、パルミチル部分（非特許文献７１）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（非特許文献７２）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７９】
【非特許文献５９】Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３−６５５６
【非特許文献６０】Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３−１０６０）
【非特許文献６１】Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９
【非特許文献６２】Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）
【非特許文献６３】Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３−５３８）
【非特許文献６４】Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９１，１０，１１１１−１１１８
【非特許文献６５】Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７−３３０
【非特許文献６６】Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９−５４）
【非特許文献６７】Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４
【非特許文献６８】Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７−３７８３）
【非特許文献６９】Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９−９７３）
【非特許文献７０】Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４）
【非特許文献７１】Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９−２３７）
【非特許文献７２】Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３−９３７）
【００８０】
本発明のオリゴヌクレオチドを、活性な製剤原料（例えば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン、バルビツール酸、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌薬、または抗生物質）に抱合することもできる。
【００８１】
このようなオリゴヌクレオチド結合物の調製を教示する代表的な米国特許には、（特許文献１２２）；（特許文献１２３）；（特許文献１２４）；（特許文献１２５）；（特許文献１２６）；（特許文献１２７）；（特許文献１２８）；（特許文献１２９）；（特許文献１３０）；（特許文献１３１）；（特許文献１３２）；（特許文献１３３）；（特許文献１３４）；（特許文献１３５）；（特許文献１３６）；（特許文献１３７）；（特許文献１３８）；（特許文献１３９）；（特許文献１４０）；（特許文献１４１）；（特許文献１４２）；（特許文献１４３）；（特許文献１４４）；（特許文献１４５）；（特許文献１４６）；（特許文献１４７）；（特許文献１４８）；（特許文献１４９）；（特許文献１５０）；（特許文献１５１）；（特許文献１５２）；（特許文献１５３）；（特許文献１５４）；（特許文献１５５）；（特許文献１５６）；（特許文献１５７）；（特許文献１５８）；（特許文献１５９）；（特許文献１６０）；（特許文献１６１）；（特許文献１６２）；（特許文献１６３）；（特許文献１６４）；（特許文献１６５）；（特許文献１６６）；（特許文献１６７）；（特許文献１６８）；（特許文献１６９）；（特許文献１７０）；（特許文献１７１）；（特許文献１７２）；（特許文献１７３）；（特許文献１７４）；（特許文献１７５）；（特許文献１７６）；（特許文献１７７）；（特許文献１７８）；（特許文献１７９）、および（特許文献１８０）（それぞれ本明細書中で参考として援用される）が含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
【特許文献１２２】米国特許第４，８２８，９７９号
【特許文献１２３】同第４，９４８，８８２号
【特許文献１２４】同第５，２１８，１０５号
【特許文献１２５】同第５，５２５，４６５号
【特許文献１２６】同第５，５４１，３１３号
【特許文献１２７】同第５，５４５，７３０号
【特許文献１２８】同第５，５５２，５３８号
【特許文献１２９】同第５，５７８，７１７号
【特許文献１３０】同第５，５８０，７３１号
【特許文献１３１】同第５，５８０，７３１号
【特許文献１３２】同第５，５９１，５８４号
【特許文献１３３】同第５，１０９，１２４号
【特許文献１３４】同第５，１１８，８０２号
【特許文献１３５】同第５，１３８，０４５号
【特許文献１３６】同第５，４１４，０７７号
【特許文献１３７】同第５，４８６，６０３号
【特許文献１３８】同第５，５１２，４３９号
【特許文献１３９】同第５，５７８，７１８号
【特許文献１４０】同第５，６０８，０４６号
【特許文献１４１】同第４，５８７，０４４号
【特許文献１４２】同第４，６０５，７３５号
【特許文献１４３】同第４，６６７，０２５号
【特許文献１４４】同第４，７６２，７７９号
【特許文献１４５】同第５，０８２，８３０号
【特許文献１４６】同第４，８２４，９４１号
【特許文献１４７】同第４，８３５，２６３号
【特許文献１４８】同第４，８７６，３３５号
【特許文献１４９】同第４，９０４，５８２号
【特許文献１５０】同第４，９５８，０１３号
【特許文献１５１】同第５，０８２，８３０号
【特許文献１５２】同第５，１１２，９６３号
【特許文献１５３】同第５，２１４，１３６号
【特許文献１５４】同第５，０８２，８３０号
【特許文献１５５】同第５，１１２，９６３号
【特許文献１５６】同第５，２１４，１３６号
【特許文献１５７】同第５，２４５，０２２号
【特許文献１５８】同第５，２５４，４６９号
【特許文献１５９】同第５，２５８，５０６号
【特許文献１６０】同第５，２６２，５３６号
【特許文献１６１】同第５，２７２，２５０号
【特許文献１６２】同第５，２９２，８７３号
【特許文献１６３】同第５，３１７，０９８号
【特許文献１６４】同第５，３７１，２４１号
【特許文献１６５】同第５，３９１，７２３号
【特許文献１６６】同第５，４１６，２０３号
【特許文献１６７】同第５，４５１，４６３号
【特許文献１６８】同第５，５１０，４７５号
【特許文献１６９】同第５，５１２，６６７号
【特許文献１７０】同第５，５１４，７８５号
【特許文献１７１】同第５，５６５，５５２号
【特許文献１７２】同第５，５６７，８１０号
【特許文献１７３】同第５，５７４，１４２号
【特許文献１７４】同第５，５８５，４８１号
【特許文献１７５】同第５，５８７，３７１号
【特許文献１７６】同第５，５９５，７２６号
【特許文献１７７】同第５，５９７，６９６号
【特許文献１７８】同第５，５９９，９２３号
【特許文献１７９】同第５，５９９，９２８
【特許文献１８０】同第５，６８８，９４１号
【００８３】
本開示で有用なアンチセンス化合物を標識することができる。種々の酵素を使用して、放射性標識（ｄＮＴＰ前駆体を使用）をＤＮＡ末端に結合させることができる。二本鎖ＤＮＡの３’末端を、例えば、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントの使用によって標識することができる。平滑末端ＤＮＡまたは３’陥凹末端は適切な基質である。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを使用して、３’突出末端を標識することもできる。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して、３２Ｐ−リン酸基をＤＮＡの５’末端に導入することができる。この反応は、一本鎖オリゴヌクレオチドの標識に特に有用である。適切なクローン由来のプローブのＰＣＲ作製で標識核酸および／または標識プライマーを使用するＰＣＲ標識を介してプローブを標識することができる。（非特許文献７３）を参照のこと。
【００８４】
【非特許文献７３】Ｋｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３：３８１−３８８（１９９２）
【００８５】
本発明はまた、キメラ化合物であるアンチセンス化合物を含む。「キメラ」アンチセンス化合物または「キメラ」は、本発明の文脈では、２つまたはそれ以上の化学的に異なる領域を含み、それぞれが少なくとも１つの単量体単位（すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合、ヌクレオチド）から構成されるアンチセンス化合物（特に、オリゴヌクレオチド）である。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、オリゴヌクレオチドに増加したヌクレアーゼ分解耐性、増加した細胞取り込み、および／または標的核酸に対する増加した結合親和性を付与するようにオリゴヌクレオチドが修飾された少なくとも１つの領域を含む。さらなるオリゴヌクレオチド領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素の基質として作用することができる。例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮアーゼＨの活性化により、ＲＮＡ標的が切断され、それにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害効率が非常に強化される。したがって、キメラオリゴヌクレオチドを使用した場合、同一の標的領域とハイブリッド形成するホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチドと比較して、より短いオリゴヌクレオチドを使用して類似の結果をしばしば得ることができる。必要に応じて当該分野で公知の核酸ハイブリッド形成技術と組み合わせたゲル電気泳動によってＲＮＡ標的の切断を日常的に検出することができる。
【００８６】
本発明のキメラアンチセンス化合物を、上記の２つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、および／またはオリゴヌクレオチド模倣物の複合構造として形成することができる。このような化合物は、当該分野でハイブリッドまたはギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）とも呼ばれている。このようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許には、（特許文献１８１）；（特許文献１８２）；（特許文献１８３）；（特許文献１８４）；（特許文献１８５）；（特許文献１８６）；（特許文献１８７）；（特許文献１８８）；（特許文献１８９）；（特許文献１９０）；（特許文献１９１）；および（特許文献１９２）（それぞれ本明細書中で参考として援用される）が含まれるが、これらに限定されない。
【００８７】
【特許文献１８１】米国特許第５，０１３，８３０号
【特許文献１８２】同第５，１４９，７９７号
【特許文献１８３】同第５，２２０，００７号
【特許文献１８４】同第５，２５６，７７５号
【特許文献１８５】同第５，３６６，８７８号
【特許文献１８６】同第５，４０３，７１１号
【特許文献１８７】同第５，４９１，１３３号
【特許文献１８８】同第５，５６５，３５０号
【特許文献１８９】同第５，６２３，０６５号
【特許文献１９０】同第５，６５２，３５５号
【特許文献１９１】同第５，６５２，３５６号
【特許文献１９２】同第５，７００，９２２号
【００８８】
本発明の化合物を、例えば、取り込み、分布、および／または吸収を補助するために、リポソーム、受容体ターゲティング分子、経口、直腸、局所、または他の処方物として、他の分子、分子構造物、または化合物の混合物と混合、カプセル化、抱合、または会合することもできる。このような取り込み、分布、および／または吸収補助処方物の調製を教示する代表的な米国特許には、（特許文献１９３）；（特許文献１９４）；（特許文献１９５）；（特許文献１９６）；（特許文献１９７）；（特許文献１９８）；（特許文献１９９）；（特許文献２００）；（特許文献２０１）；（特許文献２０２）；（特許文献２０３）；（特許文献２０４）；（特許文献２０５）；（特許文献２０６）；（特許文献２０７）；（特許文献２０８）；（特許文献２０９）；（特許文献２１０）；（特許文献２１１）；（特許文献２１２）；（特許文献２１３）；（特許文献２１４）；（特許文献２１５）；（特許文献２１６）；（特許文献２１７）；（特許文献２１８）；（特許文献２１９）；（特許文献２２０）；および（特許文献２２１）（それぞれ本明細書中で参考として援用される）が含まれるが、これらに限定されない。
【００８９】
【特許文献１９３】米国特許第５，１０８，９２１号
【特許文献１９４】同第５，３５４，８４４号
【特許文献１９５】同第５，４１６，０１６号
【特許文献１９６】同第５，４５９，１２７号
【特許文献１９７】同第５，５２１，２９１号
【特許文献１９８】同第５，５４３，１５８号
【特許文献１９９】同第５，５４７，９３２号
【特許文献２００】同第５，５８３，０２０号
【特許文献２０１】同第５，５９１，７２１号
【特許文献２０２】同第４，４２６，３３０号
【特許文献２０３】同第４，５３４，８９９号
【特許文献２０４】同第５，０１３，５５６号
【特許文献２０５】同第５，１０８，９２１号
【特許文献２０６】同第５，２１３，８０４号
【特許文献２０７】同第５，２２７，１７０号
【特許文献２０８】同第５，２６４，２２１号
【特許文献２０９】同第５，３５６，６３３号
【特許文献２１０】同第５，３９５，６１９号
【特許文献２１１】同第５，４１６，０１６号
【特許文献２１２】同第５，４１７，９７８号
【特許文献２１３】同第５，４６２，８５４号
【特許文献２１４】同第５，４６９，８５４号
【特許文献２１５】同第５，５１２，２９５号
【特許文献２１６】同第５，５２７，５２８号
【特許文献２１７】同第５，５３４，２５９号
【特許文献２１８】同第５，５４３，１５２号
【特許文献２１９】同第５，５５６，９４８号
【特許文献２２０】同第５，５８０，５７５号
【特許文献２２１】同第５，５９５，７５６号
【００９０】
本発明のアンチセンス化合物は、任意の薬学的に許容可能な塩、エステル、もしくはこのようなエステルの塩、または動物（ヒトが含まれる）に投与した場合に（直接または間接的に）生物学的に活性な代謝産物もしくはその残基を得ることができる任意の他の化合物も含む。したがって、本発明の化合物のプロドラッグおよび薬学的に許容可能な塩、このようなプロドラッグの薬学的に許容可能な塩、ならびに他の生物等価物も開示する。
【００９１】
本開示で使用したアンチセンス化合物を、当該分野で公知の任意の種々の技術によって作製することができる。周知の固相合成技術によってこれらを都合よく且つ日常的に作製することができる。このような合成用の装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を含むいくつかの業者から販売されている。
【００９２】
当該分野で公知のこのような合成の他の手段を付加的または代替的に使用することができる。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製するために類似の技術を使用することが周知である。例えば、シアノエチルホスホラミダイドの化学的性質を使用して、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを産生することができる。
【００９３】
さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によってアンチセンス化合物を作製することができる。このアプローチでは、所望の配列を、最初に適切な転写ベクター（例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）にクローン化する。特定の位置で転写が終結するようにこのベクターを線状化し、ＳＰ６、Ｔ３、またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用して、このような線状化テンプレートからＲＮＡを転写する。アンチセンス化合物を、反応混合物への適切な放射性標識前駆体の添加によって３５Ｓまたは３Ｈで標識することができる。次いで、テンプレートＤＮＡを、ＤＮアーゼＩで消化する。ＲＮＡアンチセンス化合物をゲル濾過またはゲル電気泳動によってさらに精製することができる。
【００９４】
オリゴ標識によってアンチセンス化合物を作製することもできるが、この技術はより長い核酸ポリマーに適合する。この方法では、最初に二本鎖ＤＮＡを変性させる。次いで、ＤＮＡのテンプレート指示合成のためのプライマーとしてランダム配列オリゴヌクレオチドを使用する。この適用ではＥ．コリＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントが頻繁に使用される。テンプレートがＲＮＡである場合、逆転写酵素を使用することができる。放射性標識ヌクレオチドの組み込みによってアンチセンス化合物を標識する。
【００９５】
Ｍ１３バクテリオファージまたは類似のベクター由来のテンプレートから一本鎖ＤＮＡアンチセンス化合物を作製することができる。次いで、テンプレートの特異的セグメントに相補的なオリゴヌクレオチドプライマーをＥ．コリＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントと共に使用して、テンプレートに相補的な放射性標識された鎖を作製する。例えば、変性条件下でのゲル電気泳動によってアンチセンス化合物を精製する。
【００９６】
任意の所望の配列のオリゴヌクレオチドを化学合成することもできる。上記のように、オリゴヌクレオチドの自動化合成には固相法が日常的に使用される。
【００９７】
診断、治療、予防、ならびに研究試薬およびキットとして本発明のアンチセンス化合物を使用することができる。治療のために、ＢＣ２００ＲＮＡ発現の調整によって治療することができる疾患または障害を罹患していると疑われる動物（好ましくはヒト）を、本発明のアンチセンス化合物またはＢＣ２００ＲＮＡの投与によって治療する。本発明の化合物を、有効量のアンチセンス化合物またはＢＣ２００ＲＮＡの薬学的に許容可能な希釈剤またはキャリアへの添加によって薬学的組成物において使用することができる。アンチセンス化合物およびＢＣ２００ＲＮＡならびに本発明の方法の使用は、予防（例えば、疾患、炎症、または腫瘍形成の防止または遅延）にも有用であり得る。本明細書中で使用される、「被験体」または「患者」は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを含み得る。
【００９８】
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＢＣ２００ＲＮＡおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物および処方物も含む。当業者は、好ましい有効量に基づいて投薬量を容易に決定し、本発明の薬学的組成物に処方することができる。
【００９９】
本明細書中で使用される、「薬学的に許容可能なキャリア」には、被験体に無毒の任意および全ての溶媒、緩衝液、分散媒、コーティング、抗菌薬および抗真菌薬、ならびに等張化剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的活性物質のためのこのような溶剤および薬剤の使用は当該分野で周知である。任意の従来の溶剤または薬剤が本発明のオリゴヌクレオチドまたはＢＣ２００ＲＮＡと適合しない場合以外は、薬学的組成物中でのその使用が意図される。補助的有効成分を、組成物に組み込むことができる。
【０１００】
本発明の薬学的組成物を、局所または全身治療が望ましいかどうかということおよび治療領域に依存した多数の方法で投与することができる。投与は、局所（眼内および粘膜（膣内および直腸送達が含まれる）が含まれる）、肺内（例えば、粉末またはエアゾールの吸入または通気による（噴霧器が含まれる））、気管内、鼻腔内、上皮、および経皮、経口、または非経口であり得る。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内注射または注入、頭蓋内（例えば、髄腔内または脳室内）投与が含まれる。
【０１０１】
以下の実施例で詳述されるように、ＢＣｌおよびＢＣ２００ＲＮＡは樹状突起中の翻訳の特異的リプレッサーである。したがって、ＢＣ２００ＲＮＡレベルの上昇は、神経学的障害発症の役割を果たす。さらに、ＢＣ２００ＲＮＡレベル上昇は癌で認められた。したがって、好ましい実施形態では、本発明のアンチセンス化合物を、ＢＣ２００ＲＮＡレベルの増加によって特徴づけられる障害の治療薬として使用する。より好ましくは、癌および神経学的障害（アルツハイマー病、脆弱性Ｘ精神遅滞症候群、ダウン症候群、およびパーキンソン病が含まれるが、これらに限定されない）の治療にアンチセンス化合物を使用する。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは酵素的に安定であり、経口で吸収されることが示されている。さらに、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、静脈内投与によって有効用量を脳に送達させることができる。（非特許文献７４）。
【０１０２】
【非特許文献７４】Ａｇｒａｗａｌ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ，ｔｉｓｓｕｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｒａｔｓ  ｏｆ  ａ  ｈｙｂｒｉｄ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｏｒａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ＰｈａｒｍａｃｏＬ  ５０：５７１−５７６．
【０１０３】
本発明の文脈における被験体への本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＢＣ２００ＲＮＡの投与用量は、長期間被験体で有利な治療応答を示し、そして／または症状を緩和するのに十分であるべきである。したがって、本発明によれば、疾患の緩和、軽減、改善、治癒、または少なくとも部分的な症状および／または合併症の停止に十分な量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＢＣ２００を患者に投与する。これらの効果の少なくとも１つの達成に適切な量を、「治療有効量」または「治療有効用量」と定義する。
【０１０４】
治療有効量の本発明のオリゴヌクレオチドおよび／またはＢＣ２００ＲＮＡは、患者によって異なり、大部分が経験に基づく。年齢、体重、治療すべき障害の型（例えば、神経障害対癌）、癌の型、および疾患の悪性度の全てに基づいて考慮することができる。一般に、適切な投与量範囲は、単回用量で１ｍｌのキャリアあたり約１μｇ、約１，０００μｇ、約５，０００μｇ、約１０，２０００μｇ、約２５，０００μｇ、約５０，０００μｇのオリゴヌクレオチドが得られる範囲と述べることができる。好ましくは、投薬量は、０．０１μｇ〜１００ｇ／ｋｇ体重であり、患者の必要性に応じてこれを１日、１週間、１ヶ月、１年に１回または複数回またはそれ以下の回数で投与することができる。
【０１０５】
本発明の別の態様では、被験体のアルツハイマー病などの神経学的障害または癌の治療方法を提供する。この方法は、被験体のＢＣ２００ＲＮＡ転写物レベルを下方制御することを含む。例えば、ＢＣ２００ＲＮＡ転写物レベルを、上記投薬量でのドミナントネガティブ変異体ＢＣ２００ＲＮＡまたは小干渉ＲＮＡの投与を介して下方制御することができる。ＢＣ２００ＲＮＡ転写物レベルを、治療有効量の配列番号１または配列番号２の少なくとも１つに記載のヌクレオチド配列にターゲティングされたアンチセンス分子をこのような障害を罹患した被験体および／またはこのような治療を必要とする被験体に投与することによって下方制御することもできる。
【０１０６】
あるいは、被験体のアルツハイマー病などの神経学的障害または癌の治療方法は、有効量の配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含むアンチセンス分子をこのような障害を罹患した被験体および／またはこのような治療を必要とする被験体に投与する工程を含む。このようなアンチセンス分子は、ＢＣ２００ＲＮＡのヌクレオチド１５６〜１８５に相補的である。
【０１０７】
本発明のさらに別の実施形態では、アルツハイマー病などの神経学的障害または癌の治療方法は、有効量の配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むアンチセンス分子をこのような障害を罹患した被験体および／またはこのような治療を必要とする被験体に投与する工程を含む。このようなアンチセンス分子は、ＢＣ２００ＲＮＡのヌクレオチド１５８〜１７８に相補的である。
【０１０８】
さらなる実施形態では、被験体のアルツハイマー病などの神経学的障害または癌の治療方法は、有効量の配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含むアンチセンス分子をこのような障害を罹患した被験体および／またはこのような治療を必要とする被験体に投与する工程を含む。
【０１０９】
なおさらなる実施形態では、アルツハイマー病などの神経学的障害または癌の治療方法は、有効量の配列番号６に記載のヌクレオチド配列を含むアンチセンス分子をこのような障害を罹患した被験体および／またはこのような治療を必要とする被験体に投与する工程を含む。
【０１１０】
上記の方法によって治療することができる種々の型の神経学的障害（例えば、アルツハイマー病、脆弱性Ｘ精神遅滞症候群、ダウン症候群、およびパーキンソン病など）が存在する。
【０１１１】
上記の方法によって治療することができる種々の型の癌も存在する。例には、舌および肺の扁平上皮癌、食道上皮癌、胃の環状腺癌、乳癌、肺癌、耳下腺の粘液性類表皮癌、皮膚の黒色腫、卵巣の乳頭腫、および子宮頸部の内皮腺癌が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１２】
本発明はまた、患者の癲癇の治療方法を提供する。この方法は、被験体のＢＣ２００ＲＮＡを上方制御する工程を含む。このような上方制御は、治療有効量のＢＣ２００ＲＮＡをこのような治療を必要とする患者に投与することを含む。あるいは、ＢＣ２００ＲＮＡの発現を駆動するために被験体で機能するプロモーターに作動可能に連結されたＢＣ２００に対応するＤＮＡまたはＲＮＡを有する遺伝子治療構築物を患者に投与することができる。修飾によってＢＣ２００ＲＮＡが特徴的な翻訳開始抑制性を維持するＢＣ２００ＲＮＡ（配列番号１）のヌクレオチド配列の修飾は本発明の範囲内である。このような修飾には、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失、および置換が含まれる。
【０１１３】
本発明は、さらに、本発明を実施するためのキットを提供する。１つの実施形態では、キットは、少なくとも１つの本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび緩衝液または薬学的に許容可能なキャリアを含む。緩衝液または薬学的に許容可能なキャリアを、本発明のアンチセンス分子と個別に密封するか混合することができる。例えば、キットは、例えば凍結乾燥粉末として本発明のアンチセンス分子を含む第１のコンテナを含み得る。第２のコンテナは、被験体への投与に許容可能な投薬量の処方物を作製するためのアンチセンス分子との混合で使用するための薬学的に許容可能なキャリアを含み得る。キットは、好ましくは、前記投薬量範囲に到達するための処方に関する説明書も含む。キットは、本発明の実施に有用な他の材料（例えば、シリンジ、ニードルなど）も含み得る。
【０１１４】
（実施例）
本発明を、以下の特定の実施例によってさらに例示するが、これらは本発明の範囲を制限することを決して意図しない。
【０１１５】
（実施例）本発明によれば、ＢＣｌＲＮＡ（霊長類ＢＣ２００ＲＮＡのげっ歯類アナログ）を、樹状突起における特異的翻訳リプレッサーと同定した。（げっ歯類ＢＣｌＲＮＡと霊長類ＢＣ２００ＲＮＡとの間の配列類似性（非特許文献７５）は３’ドメインおよび中央のＡリッチドメインに制限されることに留意すべきである。）ＢＣｌＲＮＡは、タンパク質コード配列を含まない非翻訳小ニューロンＲＮＡである（非特許文献７６）；（非特許文献７７）に概説）。これは、シナプス後区画で豊富に存在することが見出された樹状突起に事前に局在化し（非特許文献７８）に概説）、樹状突起に選択的に送達されるニューロンｍＲＮＡのサブセットと同一の場所に存在する（非特許文献７９）。このＲＮＡは特異的且つ急速に樹状突起に輸送され（非特許文献８０）、海馬錐体細胞の樹状突起のＢＣｌ発現レベルは活性依存性調整に影響を受けることが以前に示されている（非特許文献８１）。このことは、このような証拠およびＢＣｌＲＮＡが翻訳モジュレーターとして機能すると仮定される他の証拠に基づいていた（非特許文献８２）。
【０１１６】
【非特許文献７５】Ｔｉｅｄｇｅ  Ｈ，Ｃｈｅｎ  Ｗ，Ｂｒｏｓｉｕｓ  Ｊ（１９９３）Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｎｅｕｒａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＢＣ２００  ＲＮＡ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １３：２３８２−２３９０．
【非特許文献７６】Ｂｒｏｓｉｕｓ  Ｊ．Ｔｉｅｄｇｅ  Ｈ（１９９５）Ｎｅｕｒａｌ  ＢＣＩ  ＲＮＡ：ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．Ｉｎ：Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ＲＮＡｓ（Ｌｉｐｓｈｉｔｚ  ｌｉＤ，ａｄ），ｐｐ  ２８９−３００．Ａｕｓｔｉｎ：Ｒ．Ｇ．Ｌａｎｄｅｓ．
【非特許文献７７】Ｂｒｏｓｉｕｓ．Ｊ．Ｔｉｅｄｇｅ  Ｈ（２００１）Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ＢＣＩ  ＲＮＡ：ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｉｎ：Ｃｅｌｌ  ｐｏｌａｒｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ＲＮＡ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ（Ｒｉｃｈｔｅｒ  Ｄ，  ｅｄ），ＰＰ  １２９−１３８．Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．
【非特許文献７８】Ｂｒｏｓｉｕｓ．Ｊ．Ｔｉｅｄｇｅ  Ｈ（２００１）Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ＢＣＩ  ＲＮＡ：ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｉｎ：Ｃｅｌｌ  ｐｏｌａｒｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ＲＮＡ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ（Ｒｉｃｈｔｅｒ  Ｄ，ｅｄ），ＰＰ  １２９−１３８．Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．
【非特許文献７９】Ｃｈｉｃｕｒｅｌ  Ｍｅ，Ｔｅｒｒｉａｎ  ＤＭ，Ｐｏｔｔｅｒ  Ｈ（１９９３）ｍＲＮＡ  ａｔ  ｔｈｅ  ｓｙｎａｐｓｅ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍａｌ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｉｎ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｓｐｉｎｅｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １３：４０５４−４０６３．
【非特許文献８０】Ｍｕｓｌｉｍｏｖ  ＩＡ，Ｓａｎｔｉ  Ｅ，Ｈｏｍｅｌ  Ｐ，Ｐｅｒｉｎｉ  Ｓ，Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｄ，Ｔｉｅｄｇｅ  Ｈ（１９９７）ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ：ａ  ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｉｓ  ｃｏｎｔａｉｎｅｄ  ｗｉｔｈｉｎ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ＢＣｌ  ＲＮＡ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １７：４７２２−４７３３．
【非特許文献８１】Ｍｕｓｌｉｍｏｖ  ＩＡ，Ｂａｎｋｅｒ  Ｇ，Ｂｒｏｓｉｕｓ  Ｊ，Ｔｉｅｄｇｅ  Ｈ（１９９８）Ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ＢＣｌ  ＲＮＡ  ｉｎ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４１：１６０１−１６１１．
【非特許文献８２】Ｂｒｏｓｉｕｓ．Ｊ．Ｔｉｅｄｇｅ  Ｈ（２００１）Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ＢＣＩ  ＲＮＡ：ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｉｎ：Ｃｅｌｌ  ｐｏｌａｒｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ＲＮＡ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ（Ｒｉｃｈｔｅｒ  Ｄ，ｅｄ），ｐｐ  １２９−１３８．Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．
【０１１７】
以下により詳細に記載するように、ＢＣｌＲＮＡはキャップ依存性および内部侵入様式の両方における翻訳開始の特異的リプレッサーである。データの組み合わせにより、非翻訳ＢＣｌＲＮＡはニューロンにおける遺伝子発現の翻訳調節で機能的役割を果たすことを示す。
【実施例１】
【０１１８】
（材料と方法）ＲＮＡ。上記のように、プラスミドｐＢＣＸ６０７を使用して、全長ＢＣｌＲＮＡを作製した（非特許文献８３）；（非特許文献８４）。記載のように、プラスミドｐＳＰ６−Ｕ４およびｐＳＰ６−Ｕ６（非特許文献８５）を、Ｕ４およびＵ６ｓｎＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のために使用した（非特許文献８６）。酵母ｔＲＮＡをＳｉｇｍａ（Ｓｒ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。プラスミドｐＴｕｂ−Ａ９８／ＴＡ２は、Ｄｒ．Ｊ．Ｂｒｏｓｉｕｓから提供を受けた。このベクターでは、全長α−チューブリンｃＤＮＡインサートの直後に９８Ａ残基の連続ストレッチが存在する。これを、ＸｂａＩまたはＸｈｏＩで線状化し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼでｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写して、３’に９８残基のポリ（Ａ）テールを含むか含まないα−チューブリンをコードするプログラミングｍＲＮＡを得た。
【０１１９】
【非特許文献８３】Ｃｈｅｎｇ  Ｊ−Ｇ，Ｔｉｅｄｇｅ  Ｈ，Ｂｒｏｓｉｕｓ  Ｊ（１９９６）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｎｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＢＣ１  ＲＮＰ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５：５４９−５５  ９．
【非特許文献８４】Ｍｕｓｌｉｍｏｖ  ＩＡ，Ｓａｎｔｉ  Ｅ，Ｈｏｍｅｌ  Ｐ，Ｐｅｒｉｎｉ  Ｓ，Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｄ，Ｔｉｅｄｇｅ  Ｈ（１９９７）ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ：ａ  ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｉｓ  ｃｏｎｔａｉｎｅｄ  ｗｉｔｈｉｎ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ＢＣｌ  ＲＮＡ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １７：４７２２−４７３３．
【非特許文献８５】Ｈａｕｓｎｅｒ  ＴＰ，Ｇｉｇｌｉｏ  ＬＭ，Ｗｅｉｎｅｒ  ＡＭ（１９９０）Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｂａｓｅ−ｐａｉｒｉｎｇ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｕ２  ａｎｄ  Ｕ６  ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ４：２１４６−２１５６．
【非特許文献８６】Ｍｕｓｌｉｍｏｖ  ＩＡ，Ｓａｎｔｉ  Ｅ，Ｈｏｍｅｌ  Ｐ，Ｐｅｒｉｎｉ  Ｓ，Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｄ，Ｔｉｅｄｇｅ  Ｈ（１９９７）ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ：ａ  ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｉｓ  ｃｏｎｔａｉｎｅｄ  ｗｉｔｈｉｎ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ＢＣｌ  ＲＮＡ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １７：４７２２−４７３３
【０１２０】
記載のように、プラスミドｐＢＤＣＧ（Ｄｒ．Ｊ．Ｃａｒｓｏｎより提供）を使用して、ポリアデニル化ＢＦＰ／ＥＭＣＶ−ＩＲＥＳ／ＧＦＰ（青色蛍光タンパク質／脳心筋炎ウイルス−内部リボゾーム侵入部位／緑色蛍光タンパク質）ジシストロン性ｍＲＮＡを産生した（非特許文献８７）。モノシストロン性バージョンを作製するために、セグメントｎｔ２８〜７５３を除去するためのＸｂａＩおよびＸｍａＩでの部分消化によってｐＢＤＣＧからプラスミドｐＭＣＧを誘導した。これを、ＳａｐＩで線状化し、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼで転写して、ポリアデニル化ＥＭＣＶ−ＩＲＥＳ／ＧＦＰｍＲＮＡを産生した。プラスミドｐＣＳＦＶ（１〜４４２）．ＮＳ’（Ａ）を使用して、ポリアデニル化ＣＳＦＶ−ＩＲＥＳ／ＮＳ’（古典的豚熱ウイルス−ＩＲＥＳ／短縮インフルエンザウイルス非構造タンパク質）プログラミングｍＲＮＡを作製した。１３０５位へのＡ９８−セグメントの挿入によってプラスミドｐＣＳＦＶ（１〜４４２）．ＮＳ’（非特許文献８８）を誘導し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のためにＥｃｏＲＩで線状化した。他で記載しない限り、全てのプログラミングｍＲＮＡをポリアデニル化して使用した。所望するときはいつでも、ｍＲＮＡを０．３ｍＭ  ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）の存在下でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によってキャッピングした。
【０１２１】
【非特許文献８７】Ｋｗｏｎ  Ｓ，Ｂａｒｂａｒｅｓｅ  Ｆ，Ｃａｒｓｏｎ  ＪＨ（１９９９）Ｔｈｅ  ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ  ＲＮＡ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｓｇｎａ１  ｆｒｏｍ  ｍｙｅｌｉｎ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍＲＮＡ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｏｇｎａｔｅ  ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ  ｈｎＲＮＰ  Ａ２  ｅｎｈａｎｃｅ  ｃａｐ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４７：２４７−２５６．
【非特許文献８８】Ｐｅｓｔｏｖａ  ＴＶ，Ｓｈａｔｓｋｙ  ＩＮ，Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  ＳＰ，Ｊａｃｋｓｏｎ  ＲＪ，Ｈｅｌｌｅｎ  ＣＵ（１９９８）Ａ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ−ｌｉｋｅ  ｍｏｄｅ  ｏｆ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｅｕｋａｉｙｏｔｉｃ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｃｏｄｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ａｎｄ  ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡｓ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １２：６７−８３．
【０１２２】
（組換えタンパク質の発現および精製）記載のように、エッセリシヤ・コリＢＬ２１（ＤＥ３）中でプラスミドｐＥＴ（Ｈｉｓ６−ｅＩＦ４Ａ）から組換えｅＩＦ４を発現させ、精製した（非特許文献８９）。ｐＥＴ２８（Ｈｉｓ６−ｅＩＦ４Ｇ６９７〜１０７６）から同様に組換えｅＩＦ４Ｇ（中央ドメイン、ａａ６９７〜１０７６）を作製した（非特許文献９０）。以前に記載のように、ベクターｐＥＴ３Ｂ．ＰＡＢＰ−Ｈｉｓから組換えポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）を作製した（非特許文献９２）。ベクターｐＧｅｘ２Ｔ．ＰＡＢＰａａ４６２〜６３３からポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）のＣ末端ドメイン（ａａ４６２〜６３３）を作製した（非特許文献９１）。同様に、ベクターｐＧｅｘ２Ｔ．ＰＡＢＰａａ１〜１８２からＲＮＡ組換えモチーフ（ＲＲＭ）ドメイン１および２を含むＰＡＢＰのＮ末端ドメイン（ａａ１〜１８２）を作製した。記載のように、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として発現させ、ＰＡＢＰドメインをグルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で精製した（非特許文献９３）。
【０１２３】
【非特許文献８９】Ｐｅｓｔｏｖａ  ＴＶ，Ｓｈａｔｓｋｙ  ＩＮ，Ｈｅｌｌｅｎ  ＣＵ（１９９６ｂ）Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｕｋａｚｙｏｔｉｃ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ４Ｆ：ｔｈｅ  ４Ａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ４Ｇ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｒｅ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｏ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｅｎｔｙ  ｏｆ  ４３５  ｐｒｅｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６：６８７０−６８７８．
【非特許文献９０】Ｌｏｍａｋｉｎ  ＩＢ，Ｈｅｌｌｅｎ  ＣＵ，Ｐｅｓｔｏｖａ  ＴＶ（２０００）Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ４Ｇ（ｅＩＦ４Ｇ）ｗｉｔｈ  ｅｌＦ４Ａ  ｓｔｒｏｎｇｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｅＩＦ４Ｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ  oｆ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０：６０１９−６０２９．
【非特許文献９１】Ｋｈａｌｅｇｈｐｏｕｒ  Ｋ  Ｋａｈｖｅｊｉａｎ  Ａ，Ｄｅ  Ｃｒｅｓｃｅｎｚｏ  Ｇ，Ｒｏｙ  Ｇ，Ｓｖｉｔｋｉｎ  ＹＶ，Ｉｍａｔａｋａ  Ｈ，Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ−ＭｃＣｏｕｒｔ  Ｍ，Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ  Ｎ（２００１）Ｄｕａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  Ｐａｉｐ２  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙ（Ａ）ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２１：５２００−５２１３．
【非特許文献９２】Ｉｍａｔａｋａ  Ｈ，Ｇｒａｄｉ  Ａ，Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ  Ｎ（１９９８）Ａ  ｎｅｗｌｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅＩＦ４Ｇ  ｂｉｎｄｓ  ｐｏｌｙ（Ａ）−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｒｉｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｏｌｙ（Ａ）−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ＥＭＢＯ  Ｊ  １７：７４８０−７４８９．
【非特許文献９３】Ｓｍｉｔｈ  ＤＢ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＫＳ（１９８８）Ｓｉｎｇ1ｅ-ｓｔｅｐ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  eｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｓ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０．
【０１２４】
（翻訳アッセイ）ウサギ網状赤血球溶解物をＡｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）またはＲｏｃｈｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入し、製造者の説明書に従ってｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳反応を行った。表示のように、溶解物、反応緩衝液、３５Ｓ−メチオニン（約１２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、および各プログラミングｍＲＮＡを、ＢＣｌＲＮＡまたは他の小ＲＮＡの存在下にて３０℃で１時間インキュベートした。反応混合物を、０．１ｍｇ／ｍｌＲＮアーゼＡで１０分間処理し、翻訳産物を１０％アクリルアミドゲルを使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ゲルを乾燥させ、タンパク質バンドを視覚化するためにオートラジオグラフィに供した。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを備えたＳｔｏｒｍ８６０リン光体画像診断（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して、バンドのシグナル強度を定量した。
【０１２５】
本研究で使用したプログラミングｍＲＮＡの強度を、３２Ｐ標識転写物を使用するが同一の反応条件下における経時変化実験で評価した。これらのいかなる対照実験においてもＲＮＡ分解は認められなかった。
【０１２６】
（リボゾーム複合体の分析）４８Ｓおよび８０Ｓ複合体を分析するために、以前に確立されたプロトコールにしたがってスクロース密度勾配遠心分離を使用した（（非特許文献９４）；（非特許文献９５））。反応混合物が最初にｍＲＮＡを含まず、且つメチオニンが放射性標識されていないこと以外は上記に記載のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳反応を行った。反応混合物を、翻訳インヒビターであるグアニリルイミドジホスフェート（ＧＭＰ−ＰＮＰ；１．２ｍＭ）またはシクロヘキシミド（０．８ｍＭ）と３０℃で１５分間プレインキュベーションした。６００ｎＭの小ＲＮＡ（例えば、ＢＣｌＲＮＡ、Ｕ４ＲＮＡ）を使用した。次いで、３２Ｐ標識プログラミングｍＲＮＡ（５０ｎｇ）を添加し、３０℃で５分間インキュベーションを継続した。ＢｅｃｋｍａｎＳＷ４１ローターを使用した５％〜２５％スクロース勾配を有するＳＧ緩衝液（１００ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ酢酸マグネシウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））による４℃、３時間の３０，０００ｒｐｍでの遠心分離によって複合体を分離した。チューブあたり底から始めて２５種の画分を回収した。Ｃｅｒｅｎｋｏｖカウンティングによって画分の放射能を測定した。
【０１２７】
【非特許文献９４】Ｇｒａｙ  Ｙ，Ｈｅｎｔｚｅ  ＭＷ（１９９４）Ｉｒｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ４３Ｓ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ＰＲＥ−ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔｏ  ｆｅｒｒｉｔｉｎ  ａｎｄ  ｅＡＬＡＳ  ｍＲＮＡ．ＥＭＢＯ  Ｊ  １３：３８８２−３８９１．
【非特許文献９５】Ｐａｓｔｏｖａ  ＴＶ，Ｈｅｌｌｅｎ  ＣＵ，Ｓｈａｔｓｋｙ  ＩＮ（１９９６ａ）Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６：６８５９−６８６９．
【０１２８】
（電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ））３２Ｐ標識ＲＮＡプローブ（反応あたり５０，０００ｃｐｍ、約１０ｎｇ）を７０℃で１０分間加熱し、室温で５分間冷却し、タンパク質と共に結合緩衝液（３００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＤＴＴ、５％グリセロール、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６））中にて室温で２０分間インキュベートした。非標識競合物ＲＮＡを使用する場合、これらを同様に処理するが、タンパク質と１０分間プレインキュベーションした後に標識ＲＮＡを反応物に添加した。１つを超えるタンパク質の同時結合を分析する場合、反応時間を４０分間に増加した。その後、記載のように、ＲＮＡ−タンパク質複合体を５％ポリアクリルアミドゲル（６０：１＝ポリアクリルアミド：ビス−アクリルアミド）で分離し、オートラジオグラフィにて分析した（非特許文献９６）（非特許文献９７）。
【０１２９】
【非特許文献９６】Ｇｕ  Ｗ，Ｈｅｃｈｔ  ＮＲ（１９９６）Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｅｓｔｉｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｕ／Ｚｎ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ（ＳＯＤ−Ｉ）ｍＲＮＡ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ６５−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｈｉｃｈ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ｉｔｓ  ５’ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６：４５３５−４５４３．
【非特許文献９７】Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＡＭ，Ｒｏｇｅｒｓ  ＪＴ，Ｗａｌｋｅｒ  ＣＥ，Ｓｔａｔｏｎ  ３Ｍ，Ｌｅｅｄｍａｎ  Ｐ３（１９９９）Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＲＮＡ  ｇｅｌ−ｓｈｉｆｔ  ａｎｄ  ＵＶ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ＲＮＡ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２７：１０３２−１０４２，
【０１３０】
（脳抽出物）成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから脳を解剖し、液体窒素中で急速冷凍した。２ｍｌ／脳で緩衝液Ａ（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭジチオスレイトール、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、０．５μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌアプロチニン、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））中に脳を再懸濁し、モーター駆動ホモジナイザー（Ｋｏｎｔｅｓ，Ｖｉｎｅｌａｎｄ，ＮＪ）にて氷上でゆっくりとホモジナイズした。ホモジネートを、５，０００ｇで１５分間遠心分離した。上清を、０．１倍体積の緩衝液Ｂ（２．５Ｍ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））と混合した。１４，０００ｇにて４℃で１時間のさらなる遠心分離後、上清を液体窒素中で急速冷凍し、−７０℃で保存した。
【０１３１】
（脳抽出物の免疫枯渇）脳抽出物（６０μｌ）を、２０μｌの抗ＧＳＴ−ＰＡＢＰ（ａａ４６２〜６３３；（非特許文献９８）と穏やかに回転させながら４℃で３時間インキュベートした。その後、１５μｌのタンパク質Ａアガロース（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）懸濁液を混合物に添加し、回転させながら４℃で一晩インキュベートした。複合体を、１２，０００ｇで２０秒間の遠心分離によって回収した（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。次いで、上記のように、免疫枯渇脳抽出物を、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）のために使用した。
【０１３２】
【非特許文献９８】Ｉｍａｔａｋａ  Ｈ，Ｇｒａｄｉ  Ａ，Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ  Ｎ（１９９８）Ａ  ｎｅｗｌｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅＩＦ４Ｇ  ｂｉｎｄｓ  ｐｏｌｙ（Ａ）−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｒｉｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｏｌｙ（Ａ）−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ＥＭＢＯ  Ｊ  １７：７４８０−７４８９．
【０１３３】
（スーパーシフトアッセイ）３２Ｐ標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＢＣｌＲＮＡ（反応あたり５０，０００ｃｐｍ、約１ｎｇ）を、７０℃で１０分間加熱し、室温で５分間冷却した。次いで、ＲＮＡを、脳抽出物（３０〜４０μｇ）または免疫枯渇化脳抽出物と共に結合緩衝液中にて室温で２０分間インキュベートした。競合実験では、結合反応の１０分前に非標識ＢＣｌＲＮＡ（２００倍過剰）を添加した。次いで、脳抽出物を含む混合物を、抗ＧＳＴ−ＰＡＢＰ抗体（ＰＡＢＰ（ａａ４６２〜６３３）を含む融合タンパク質に対して惹起した；（非特許文献９９）または抗ＧＳＴコントロール抗体と室温で３時間インキュベートした。非特異的結合を最小にするために、サンプルをヘパリン（５ｍｇ／ｍｌ）と室温で１０分間インキュベートした。ＥＭＳＡと同様に、複合体を、４％未変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、オートラジオグラフィによって分析した。
【０１３４】
【非特許文献９９】Ｉｍａｔａｋａ  Ｈ，Ｇｒａｄｉ  Ａ，Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ  Ｎ（１９９８）Ａ  ｎｅｗｌｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅＩＦ４Ｇ  ｂｉｎｄｓ  ｐｏｌｙ（Ａ）−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｒｉｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｏｌｙ（Ａ）−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ＥＭＢＯ  Ｊ  １７：７４８０−７４８９．
【０１３５】
（初代培養における海馬ニューロンを使用した免疫細胞化学）記載のように免疫細胞化学を行った（非特許文献１００）。以下の希釈率で一次抗体を使用した：抗ｅＩＦ４Ａ（５０倍）；抗ｅＩＦ４Ｇ（５０倍）、抗ＰＡＢＰ（５０倍）、抗シナプトフィジン（５００倍）。ポリクローナル抗ｅＩＦ４Ａ、抗ＰＡＢＰ、および抗ｅＩＦ４Ｇ抗体は以前に記載されており、その各特異性が確立されている（非特許文献１０１）。モノクローナル抗シナプトフィジン抗体を、Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから購入した。以下のように二次抗体を使用した：ビオチン化抗ウサギ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）（２００倍）；フルオレセインイソチオシアネートで標識した抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）（２５倍）。ビオチン化二次抗体を、ストレプトアビジン抱合ローダミン（５μｇ／ｍｌ，Ｊａｃｋｓｏｎ）で修飾した。非特異性バックグラウンド標識を確認するための対照実験を以下のように行った：（１）ポリクローナル抗体の場合、一次抗体を免疫前血清または非免疫血清に置換した；（２）ＧＳＴ融合タンパク質に指向する抗体の場合、一次抗体として抗ＧＳＴ抗体を使用した；（３）一次抗体の非存在下でのインキュベーションによってバックグラウンド標識をさらに確認した。Ａｘｉｏｓｋｏｐ２顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）に接続したＲａｄｉａｎｃｅ  ２０００  Ｐｌｕｓ共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を使用して共焦点顕微鏡画像を得た。
【実施例２】
【０１３６】
【非特許文献１００】Ｔｉｅｄｇｅ  Ｈ，Ｂｒｏｓｉｕｓ  Ｊ（１９９６）Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ  ｏｆ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １６：７１７１−７１８１．
【非特許文献１０１】Ｗａｋｉｙａｍａ  Ｗ，Ｉｍａｔａｋａ  Ｈ，Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ  Ｎ（２０００）Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅＩＦ４Ｇ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙ（Ａ）−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｏｏｃｙｔｅ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ，Ｃｕｆｆ  Ｂｉｏｌ  １０：１１４７−１１５０．
【０１３７】
（結果）（ＢＣｌおよびＢＣ２００ＲＮＡは翻訳の特異的リプレッサーである）ウサギ網状赤血球溶解物（ＲＲＬ）無細胞系を使用して、翻訳のモジュレーターとしてのＢＣｌＲＮＡの能力を探索した。未処理ＲＲＬ（すなわち、ヌクレアーゼによって除去されていない網状赤血球ｍＲＮＡ転写物）では、内因性ｍＲＮＡの翻訳は、濃度依存様式でＢＣｌＲＮＡによって阻害された（図１Ａ、Ｂ）。これらの実験結果をリン光体画像診断によって定量した。数回の実験の分析により、３２０ｎＭの濃度のＢＣｌＲＮＡの存在により翻訳効率が７０〜８０％減少することが示された。このような減少は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した全てのタンパク質バンドで認められ、結果は、ＢＣｌ媒介翻訳抑制は特定のｍＲＮＡに限定されないことを示す。しかし、ＢＣｌＲＮＡと明確に対照的に、類似またはより高い濃度で使用した他の小非翻訳ＲＮＡ（例えば、Ｕ４およびＵ６ｓｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ）では、翻訳効率に影響を与えなかった（図１Ｃ）。結果は、ＢＣｌＲＮＡがμＭ未満の濃度範囲で有効な特異的翻訳リプレッサーであることを証明する。
【０１３８】
翻訳実験前に内因性ＲＲＬ転写物をヌクレアーゼ処理によって除去した溶解物を使用してこれらの結果を確認した。これらの実験においてプログラミングｍＲＮＡとしてキャッピングおよびポリアデニル化したα−チューブリンｍＲＮＡを使用して、本発明者らは、ＢＣｌＲＮＡはキャップ依存性翻訳を上記と同程度且つ同一のμＭ未満の濃度範囲で阻害する（しかし、核Ｕ４ＲＮＡや他のコントロールＲＮＡでは阻害しない）ことを確証した（図１Ｄ）。非キャッピングまたは非アデニル化プログラミングｍＲＮＡは有効に翻訳されなかった；キャッピングされているがアデニル化されていないα−チューブリンｍＲＮＡの翻訳はキャッピングされており且つポリアデニル化されたプログラミングｍＲＮＡよりもＢＣｌ媒介阻害に対する感受性が低いが、これは全体的により低い翻訳効率により確実に確証することができなかった。したがって、他で記載しない限り、その後にポリアデニル化プログラミングｍＲＮＡを使用して実験を行った。さらに、同一のｎＭ濃度範囲を使用したＢＣ２００ＲＮＡ（げっ歯類ＢＣｌＲＮＡの霊長類対応物）（非特許文献１０２）は、ＢＣｌＲＮＡほどの有効性で翻訳を阻害することが見出された（図７を参照のこと）。
【０１３９】
【非特許文献１０２】Ｔｉｅｄｇｅ  Ｈ，Ｃｈｅｎ  Ｗ，Ｂｒｏｓｉｕｓ  Ｊ（１９９３）Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｎｅｕｒａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＢＣ２００  ＲＮＡ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １３：２３８２−２３９０．
【０１４０】
まとめると、上記データは、ＢＣｌＲＮＡおよびＢＣ２００ＲＮＡが翻訳の特異的リプレッサーとして作用することを示す。
【０１４１】
（ＢＣｌＲＮＡは４８Ｓ前開始複合体の形成を阻害する）真核生物翻訳を、開始、伸長、および終結の３つの連続する段階に細分することができる。頻繁に、翻訳調節機構でターゲティングされるのは開始段階である（非特許文献１０３）。
【０１４２】
【非特許文献１０３】Ｇｉｎｇｒａｓ  Ａ−Ｃ，Ｒａｕｇｈｔ  Ｂ，Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ  Ｎ（１９９９）ｅＩＦ４  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ：ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｔｏ  ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６８：９１３−９６３．
【０１４３】
翻訳抑制では、ＢＣｌＲＮＡは開始レベルで翻訳機構と相互作用すると仮定した。この仮定を以下のように試験した。
【０１４４】
キャップ依存性翻訳開始は、典型的には、４３Ｓ前開始複合体を形成するための４０Ｓ小リボゾームサブユニット、真核生物開始因子（ｅＩＦ）１Ａ、ｅＩＦ３、およびｅＩＦ２／ＧＴＰ／Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｉ複合体のアセンブリから開始される。次の工程では、４３Ｓ複合体はｍＲＮＡに補充され、ＡＵＧ開始コドンに転位置し（「スキャンし」）、そこで安定な４８Ｓ前開始複合体を形成する。この補充工程（しばしば開始時の律速段階であり、頻繁に調節の標的でもある）は、因子のｅＩＦ４群によって媒介される。ｍＲＮＡの５’末端のｍ７ＧｐｐＮキャップは、ｅＩＦ４ＦのｅＩＦ４Ｅサブユニットによって認識される。ｅＩＦ４Ｅは、ｅＩＦ４Ｇ（ｅＩＦ３およびｅＩＦ４Ａ（二次構造を解くＲＮＡヘリカーゼ）にも会合する中心的コーディネーター）に結合する。（ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｅ、およびｅＩＦ４Ｇのヘテロ三量体複合体はｅＩＦ４Ｆを構成する。）最後に、４８Ｓ前開始複合体からの開始因子の放出後、６０Ｓリボゾームサブユニットが結合して８０Ｓ複合体を形成する（概説については、（非特許文献１０４）；（非特許文献１０５）；（非特許文献１０６）；（非特許文献１０７）を参照のこと）。
【０１４５】
【非特許文献１０４】Ｇｉｎｇｒａｓ  Ａ−Ｃ，Ｒａｕｇｈｔ  Ｂ，Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ  Ｎ（１９９９）ｅＩＦ４  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ：ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｔｏ  ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６８：９１３−９６３．
【非特許文献１０５】Ｈｅｒｓｈｅｙ  ＪＷＢ，Ｍｅｒｒｉｃｋ  ＷＣ（２０００）Ｔｈｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉｎ：Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ  Ｎ，Ｈｅｒｓｈｅｙ  ＪＷＢ，Ｍａｔｈｅｗｓ  ＭＢ，ｅｄｓ），ｐｐ  ３３−８８．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，
【非特許文献１０６】Ｐｅｓｔｏｖａ  ＴＶ，Ｋｏｌｕｐａｅｖａ  ＶＧ，Ｌｏｍａｋｉｎ  ＩＢ，Ｐｉｌｉｐｅｎｋｏ  ＢＶ，Ｓｈａｔｓｋｙ  ＩＮ，Ａｇｏｌ  ＶＩ，Ｈｅｌｌｅｎ  ＣＵ（２００１  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：７０２９−７０３６．
【非特許文献１０７】Ｄｅｖｅｒ  ＴＥ（２００２）Ｇｅｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ  １０８：５４５−５５６．
【０１４６】
ＢＣｌＲＮＡと翻訳開始機構との機能的相互作用を分析するために、異なる翻訳開始段階をその段階の機構の停止によって視覚化し、その後スクロース密度勾配遠心分離によって安定な複合体を分離した。以前に記載のように（非特許文献１０８）、その後の開始因子解離工程（ｅＩＦ２に結合したＧＴＰの加水分解に依存する）が非加水分解ＧＴＰアナログであるグアニリルイミドジホスフェート（ＧＭＰ−ＰＮＰ）によって遮断される場合、補充した４３Ｓ前開始複合体はイニシエーターＡＵＧで停止し、それによって４８Ｓ複合体が蓄積する。同様に、伸長を阻害するためのシクロヘキシミドの使用によって８０Ｓリボゾーム開始複合体を検出することができ、リボゾームは開始部位で停止し、８０Ｓ複合体が蓄積する（略図については図２Ａを参照のこと）。
【０１４７】
【非特許文献１０８】Ｇｒａｙ  Ｙ，Ｈｅｎｔｚｅ  ＭＷ（１９９４）Ｉｒｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ４３Ｓ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｐｒｅ−ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔｏ  ｆｅｒｒｉｔｉｎ  ａｎｄ  ｅＡＬＡＳ  ｍＲＮＡ．ＥＭＢＯ  Ｊ  １３：３８８２−３８９１．
【０１４８】
シクロヘキシミドを使用して、α−チューブリンをコードするキャッピングプログラミングｍＲＮＡとの８０Ｓ複合体のアセンブリを視覚化した（図２Ｂ）。６００ｎＭで使用した全長ＢＣｌＲＮＡにより、８０Ｓ複合体形成が減少し、この工程または工程前に翻訳開始が阻害されることを示す。次いで、ＧＭＰ−ＰＮＰを使用して、４８Ｓ前開始複合体の形成を視覚化した。８０Ｓ複合体形成と同様に、６００ｎＭ  ＢＣｌＲＮＡの存在により、４８Ｓ複合体アセンブリが有意に減少した（平均８０％減少；図２Ｃ）。ＢＣｌＲＮＡと対照的に、同一濃度のＵ４ＲＮＡでは４８Ｓ複合体形成に影響を与えなかった（図２Ｄ）。これらのデータにより、開始複合体形成のＢＣｌ媒介阻害は特異的であることが確認される。最後に、プログラミングα−チューブリンｍＲＮＡがポリアデニル化されるかポリアデニル化されないかどうかに依存した４８Ｓ複合体形成のＢＣｌ媒介阻害範囲において相違は認められなかった（図２Ｅ）。これらの結果により、ＢＣｌＲＮＡによる翻訳開始の阻害がプログラミングｍＲＮＡのアデニル化状態に依存しないことが示唆される。
【０１４９】
まとめると、これらの結果は、ＢＣｌＲＮＡが４８Ｓ前開始複合体（したがって、８０Ｓ複合体）の形成を特異的に抑制し、ＢＣｌＲＮＡが４３Ｓ複合体のｍＲＮＡへの補充および／またはＡＵＧ開始部位へのその転位置を阻害するという考えと一致することを示す。
【０１５０】
（ＢＣｌＲＮＡはｅＩＦ４群の開始因子との相互作用を介して翻訳を抑制する）ＢＣｌＲＮＡが４８Ｓ前開始複合体のアセンブリを阻害することが示されると、４８Ｓ複合体を形成する翻訳開始経路の一部におけるＢＣｌＲＮＡの標的部位を同定した。異なる型のウイルス内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）翻訳開始機構を活用した機能試験を使用した。
【０１５１】
内部リボゾーム侵入により、キャップ依存性開始機構の代替機構が得られる。小リボゾームサブユニットは、末端依存様式でＡＵＧ開始コドンまたはその上流のいずれかでＩＲＥＳに結合する（（非特許文献１０９）；（非特許文献１１０）；（非特許文献１１１）に概説）。ウイルス内部リボゾーム侵入開始機構は、基準開始因子の必要に応じて互いに異なる。ウイルス内部侵入機構の２つの主要なサブタイプを区別することができる。第１のサブタイプの例は、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）および他のピコルナウイルスＩＲＥＳである。ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳでの４８Ｓ複合体の形成には、ｅＩＦ４Ｅ（キャップ結合タンパク質）以外のキャップ依存性機構と同一の基準開始因子組が必要である（（非特許文献１１２）；（非特許文献１１３））。翻訳はＩＲＥＳの３’境界のＡＵＧで開始されるので、スキャニングは必要ないが、有効なリボゾーム補充のためのｍＲＮＡ二次構造を融解するためにｅＩＦ４Ａが必要である。内部侵入の第２のサブタイプ（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＩＲＥＳならびに古典的豚熱ウイルス（ＣＳＦＶ）および関連ペスチウイルスＩＲＥＳ）は、より単純な機構を使用する（非特許文献１１４）。このＩＲＥＳ型は、いかなるｅＩＦ４群の因子も必要としない機構において４０Ｓリボゾームサブユニットに直接結合する。
【０１５２】
【非特許文献１０９】Ｊａｃｋｓｏｎ  ＲＪ（２０００）Ａ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｉｎ：Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  gｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ  Ｎ，Ｈｅｒｓｈｅｙ  ＪＷＢ，Ｍａｔｈｅｗｓ  ＭＢ，ｅｄｓ），ｐｐ  １２７１  ８３．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．
【非特許文献１１０】Ｈｅｌｌｅｎ  ＣＵ，Ｓａｒｎｏｗ  Ｐ（２００１）Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｍＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅＳ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １５：：１５９３−１６１２．
【非特許文献１１１】Ｐｅｓｔｏｖａ  ＴＶ，Ｋｏｌｕｐａｅｖａ  ＶＧ，Ｌｏｍａｋｉｎ  ＩＢ，Ｐｉｌｉｐｅｎｋｏ  ＢＶ，Ｓｈａｔｓｋｙ  ＩＮ，Ａｇｏｌ  ＶＩ，Ｈｅｌｌｅｎ  ＣＵ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：７０２９−７０３６．
【非特許文献１１２】Ｐａｓｔｏｖａ  ＴＶ，Ｈｅｌｌｅｎ  ＣＵ，Ｓｈａｔｓｋｙ  ＩＮ（１９９６ａ）Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６：６８５９−６８６９
【非特許文献１１３】Ｐｅｓｔｏｖａ  ＴＶ  Ｓｈａｔｓｋｙ  ＩＮ，Ｈｅｌｌｅｎ  ＣＵ（１９９６ｂ）Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｕｋａｚｙｏｔｉｃ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ４Ｆ：ｔｈｅ  ４Ａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ４Ｇ  sｕｂｕｎｉｔ  ａｒｅ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｏ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｅｎｔｙ  ｏｆ  ４３５  ｐｒｅｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６：６８７０−６８７８．
【非特許文献１１４】Ｐｅｓｔｏｖａ  ＴＶ，Ｓｈａｔｓｋｙ  ＩＮ，Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  ＳＰ，Ｊａｃｋｓｏｎ  ＲＪ，Ｈｅｌｌｅｎ  ＣＵ（１９９８）Ａ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ−ｌｉｋｅ  ｍｏｄｅ  ｏｆ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｅｕｋａｉｙｏｔｉｃ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｃｏｄｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ａｎｄ  ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡｓ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １２：６７−８３．
【０１５３】
２つの記載された内部侵入機構を、ＢＣｌＲＮＡによる翻訳開始抑制の機能分析に使用した。第１に、このような抑制がキャップ依存性であるかを決定するための実験を行った。内部侵入がＥＭＣＶ  ＩＲＥＳによって媒介される非キャッピングプログラミングｍＲＮＡ（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする）を使用した。ＢＣｌＲＮＡは、このｍＲＮＡの翻訳を有効に抑制した（図３Ａ）。６回の実験のリン光体画像診断による定量は、平均して、ＢＣｌＲＮＡが３２０ｎＭで翻訳効率を約７９％減少させることを示した（図３Ｂ）。この減少は、キャッピングプログラミングｍＲＮＡについて上記で認められた減少と範囲が非常に類似する。キャップ依存性翻訳と同様に、Ｕ４  ＲＮＡは、翻訳効率に影響を与えなかった（図３Ｃ）。他のプログラミングｍＲＮＡおよびジシストロン性構築物を使用して、類似の結果が得られた。図３Ｄに示した例では、第１のシストロンは５’キャップの後に存在し、第２のシストロンはＥＭＣＶＩＲＥＳの後に存在する。ＢＣｌＲＮＡは、この系においてキャップおよびＩＲＥＳ媒介翻訳の両方を阻害した。ＢＣｌＲＮＡの非存在下でより有効であるＩＲＥＳ依存性シストロン由来の翻訳はまた、ＢＣｌ媒介抑制により高い感受性を示した。したがって、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳは、ＢＣｌＲＮＡによって阻害される因子／活性により依存する。この文脈では、このＩＲＥＳによって媒介される翻訳はまたキャップ依存性翻訳よりもトランスドミナントｅＩＦ４Ａ変異体によって強く阻害されることに留意することが興味深い（非特許文献１１５）。最後に、ヒトＢＣ２００ＲＮＡを使用した類似の実験により、このＲＮＡが同一の様式で翻訳を非常に抑制することが明らかとなった。ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳでの内部侵入によって開始された翻訳は、２７０ｎＭのＢＣ２００ＲＮＡによって約７３％阻害された（図７を参照のこと）。
【０１５４】
【非特許文献１１５】Ｐａｕｓｅ  Ａ，Ｍｅｔｈｏｔ  Ｎ，Ｓｖｉｔｌｄｎ  Ｙ，Ｍｅｒｒｉｃｋ  ＷＣ，Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ  Ｎ（１９９４）Ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｌＦ−４Ａ  ｄｅｆｉｎｅ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｅＩＦ−４Ｆ  ｉｎ  ｃａｐ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  ｃａｐ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ．ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，ＥＭＢＯ  Ｊ  １３：１２０５−１２１５．
【０１５５】
ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ機構によって内部侵入を介して開始された翻訳は等しく阻害されるので、結果によりＢＣｌ媒介翻訳抑制はキャップ／ｅＩＦ４Ｅ依存性ではないことを示す。翻訳開始因子のｅＩＦ４ファミリーの他のメンバーがＣＳＦＶ  ＩＲＥＳ系を使用したＢＣｌ媒介翻訳抑制に必要であるかどうかを決定するために、さらなる実験を行った。図４Ａは、内部侵入がＣＳＦＶ  ＩＲＥＳによって媒介される場合、翻訳抑制においてＢＣｌＲＮＡは有効でないことを示す。リン光体画像診断による定量によって、漸増濃度のＢＣｌＲＮＡによって翻訳効率は有意に変化しないことが明らかとなった（図４Ｂ）。Ｕ４ＲＮＡなどのコントロールＲＮＡ（図４Ｃ）は等しく無効であった。したがって、ＣＳＦＶ  ＩＲＥＳ機構を使用した内部侵入による翻訳開始は、ＢＣｌ媒介翻訳抑制を有効に回避する。
【０１５６】
スクロース密度勾配遠心分離分析によってこれらの結果を確認した。ＣＳＦＶ  ＩＲＥＳで内部侵入が起こった場合、ＢＣｌＲＮＡは４８Ｓ複合体（図４Ｄ）または８０Ｓ複合体のいずれかの形成を抑制しないことが見出された。この結果により、ＣＳＦＶ  ＩＲＥＳ様式を介して開始された翻訳はＢＣｌ媒介抑制に無効であることが確認される。したがって、ＣＳＦＶ  ＩＲＥＳ様式およびＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ様式の両方に共通の機構を、ＢＣｌ媒介翻訳抑制の候補標的として除外することができる。これらには、伸長工程および終結工程ならびに開始経路におけるほとんどの工程（例えば、三つ組のｅＩＦ２／ＧＴＰ／Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｉ複合体（４８Ｓ複合体アセンブリの必須条件）など）が含まれる（（非特許文献１１６）；（非特許文献１１７）に概説）。
【０１５７】
【非特許文献１１６】Ｈｅｌｌｅｎ  ＣＵ，Ｓａｒｎｏｗ  Ｐ（２００１）Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｍＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅＳ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １５：：１５９３−１６１２．
【非特許文献１１７】Ｐｅｓｔｏｖａ  ＴＶ，Ｋｏｌｕｐａｅｖａ  ＶＧ，Ｌｏｍａｋｉｎ  ＩＢ，Ｐｉｌｉｐｅｎｋｏ  ＢＶ，Ｓｈａｔｓｋｙ  ＩＮ，Ａｇｏｌ  ＶＩ，Ｈｅｌｌｅｎ  ＣＵ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：７０２９−７０３６．
【０１５８】
ＣＳＦＶ  ＩＲＥＳによる開始は、いかなる因子のｅＩＦ４群メンバーも必要ないという点で、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ媒介開始およびキャップ依存性開始と異なる（非特許文献１１８）。これらの因子のうち、ｅＩＦ４ＧおよびｅＩＦ４Ａは、ＥＭＣＶ型内部侵入様式での４８Ｓ複合体アセンブリに必要であるが、ＣＳＦＶ型内部侵入様式には必要ない（（非特許文献１１９）；（非特許文献１２０））。さらに、ポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）はまた、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳによって媒介される開始を強化するので、潜在的ＢＣｌ標的として見なされる（（非特許文献１２１）；（非特許文献１２２））。
【０１５９】
【非特許文献１１８】Ｐｅｓｔｏｖａ  ＴＶ，Ｓｈａｔｓｋｙ  ＩＮ，Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  ＳＰ，Ｊａｃｋｓｏｎ  ＲＪ，Ｈｅｌｌｅｎ  ＣＵ（１９９８）Ａ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ−ｌｉｋｅ  ｍｏｄｅ  ｏｆ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｅｕｋａｉｙｏｔｉｃ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｃｏｄｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ａｎｄ  ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡｓ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １２：６７−８３．
【非特許文献１１９】Ｐａｓｔｏｖａ  ＴＶ，Ｈｅｌｌｅｎ  ＣＵ，Ｓｈａｔｓｋｙ  ＩＮ（１９９６Ａ）Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６：６８５９−６８６９
【非特許文献１２０】Ｐｅｓｔｏｖａ  ＴＶ，Ｓｈａｔｓｋｙ  ＩＮ，Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  ＳＰ，Ｊａｃｋｓｏｎ  ＲＪ，Ｈｅｌｌｅｎ  ＣＵ（１９９８）Ａ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ−ｌｉｋｅ  ｍｏｄｅ  ｏｆ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｅｕｋａｉｙｏｔｉｃ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｃｏｄｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ａｎｄ  ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡｓ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １２：６７−８３．
【非特許文献１２１】Ｍｉｃｈｅｌ  ＹＭ，Ｂｏｒｍａｎ  ＡＭ，Ｐａｕｌｏｕｓ  Ｓ，Ｋｅａｎ  ＫＭ（２００１）Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ４Ｇ−ｐｏｌｙ（Ａ）ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｐｏｌｙ（Ａ）ｔａｉｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｉｃｏｍａｖｉｒｕｓ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｅｇｍｅｎｔ−ｄｒｉｖｅｎ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｆｏｒ  Ｘ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２１：４０９７−４１０９．
【非特許文献１２２】Ｓｖｉｔｋｉｎ  ＹＶ，ＩｍａｔａｋｅＨ，Ｋｈａｌｅｇｈｐｏｕｒ  Ｋ，Ｋａｈｖｅｊｉａｎ  Ａ，Ｌｉｅｂｉｇ  ＨＤ，  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ  Ｎ（２００１）Ｐｏｌｙ（Ａ）−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｅｌＦ４Ｇ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ  ＩＲＥＳ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ＲＮＡ  7：１７４３−１７５２
【０１６０】
４８Ｓ前開始複合体は、ほとんどの環境下での翻訳開始における律速工程である（（非特許文献１２３）；（非特許文献１２４）に概説）。データは、任意の開始因子を必要としないＣＳＦＶ  ＩＲＥＳ機構による内部開始がこの抑制を有効に回避するので、ＢＣｌ媒介翻訳抑制は開始因子のｅＩＦ４ファミリーを介して操作されることを示す。４３Ｓ前開始複合体のｍＲＮＡへの補充における重要な因子は、ｅＩＦ４Ｆ（ｅＩＦ４Ｅ、キャップ結合タンパク質、ｅＩＦ４Ａ、ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼ、およびｅＩＦ４Ｇ（巨大足場タンパク質）から構成される複合体）である（（非特許文献１２５）；（非特許文献１２６）：（非特許文献１２７）で概説）。本明細書中に報告したデータは、ＢＣｌ媒介抑制はキャップ（それによりｅＩＦ４Ｅ）依存性であることを示す。
【０１６１】
【非特許文献１２３】Ｇｉｎｇｒａｓ  Ａ−Ｃ，Ｒａｕｇｈｔ  Ｂ，Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ  Ｎ（１９９９）ｅＩＦ４  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ：ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｔｏ  ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６８：９１３−９６３．
【非特許文献１２４】Ｈｅｒｓｈｅｙ  ＪＷＢ，Ｍｅｒｒｉｃｋ  ＷＣ（２０００）Ｔｈｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉｎ：  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ  Ｎ，Ｈｅｒｓｈｅｙ  ＪＷＢ，Ｍａｔｈｅｗｓ  ＭＢ，ｅｄｓ），ｐｐ  ３３−８８．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．
【非特許文献１２５】Ｇｉｎｇｒａｓ  Ａ−Ｃ，Ｒａｕｇｈｔ  Ｂ，Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ  Ｎ（１９９９）ｅＩＦ４  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ：ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｔｏ  ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６８：９１３−９６３．
【非特許文献１２６】Ｐｅｓｔｏｖａ  ＴＶ，Ｋｏｌｕｐａｅｖａ  ＶＧ，Ｌｏｍａｋｉｎ  ＩＢ，Ｐｉｌｉｐｅｎｋｏ  ＢＶ，Ｓｈａｔｓｋｙ  ＩＮ，Ａｇｏｌ  ＶＩ，Ｈｅｌｌｅｎ  ＣＵ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：７０２９−７０３６．
【非特許文献１２７】Ｐｅｓｔｏｖａ  ＴＶ，Ｋｏｌｕｐａｅｖａ  ＶＧ，Ｌｏｍａｋｉｎ  ＩＢ，Ｐｉｌｉｐｅｎｋｏ  ＢＶ，Ｓｈａｔｓｋｙ  ＩＮ，Ａｇｏｌ  ＶＩ，Ｈｅｌｌｅｎ  ＣＵ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：７０２９−７０３６．
【０１６２】
（ｅＩＦ４ＡおよびＰＡＢＰはＢＣｌＲＮＡと直接相互作用する）機能分析を使用して、翻訳開始経路におけるＢＣｌ媒介阻害の潜在的な標的部位（したがって、翻訳開始機構における潜在的ＢＣｌ相互作用因子）を絞った。その候補を使用したＢＣｌ−タンパク質の直接的分析のために生化学的方法を使用した。
【０１６３】
組換えタンパク質を使用した電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を使用して、ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｇ、およびＰＡＢＰへのＢＣｌＲＮＡの結合を探索した。ｅＩＦ４Ｇの中心ドメインがＥＭＣＶ  ＩＲＥＳに結合することが以前に示されているので（非特許文献１２８）、ＢＣｌＲＮＡのこのドメインとの潜在的相互作用を試験した。中心ｅＩＦ４ＧドメインへのＢＣｌＲＮＡの特異的結合は検出されなかった（ａａ６９７〜１０７６）。対照的に、ＥＭＳＡ分析により、ＢＣｌＲＮＡのｅＩＦ４Ａへの特異的結合が明らかとなった（図５Ａ）。非標識ＢＣｌＲＮＡとのプレインキュベーションにより移動度シフトが有効に排除されるという事実によって特異性が証明された。逆に、これらのアッセイにおいてランダム配列ベクターＲＮＡまたはｔＲＮＡなどの非標識無関係ＲＮＡは、結合についてのＢＣｌＲＮＡのｅＩＦ４Ａとの競合で有効でなかった（図５Ａ）。このような非競合ＲＮＡの存在下で、ｅＩＦ４Ａ誘導移動度シフトは二本鎖バンドとして分離された。この所見は、これらの条件下で、２つのＢＣｌ／ｅＩＦ４Ａ複合体がわずかに異なる移動度で移動することを示す。
【０１６４】
【非特許文献１２８】Ｐｅｓｔｏｖａ  ＴＶ  Ｓｈａｔｓｋｙ  ＩＮ，Ｈｅｌｌｅｎ  ＣＵ（ｉ９９６Ｂ）Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｕｋａｚｙｏｔｉｃ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ４Ｆ：ｔｈｅ  ４Ａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ４Ｇ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｒｅ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｏ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｅｎｔｙ  ｏｆ  ４３５  ｐｒｅｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６：６８７０−６８７８．
【０１６５】
さらに、ＢＣｌＲＮＡは、ＰＡＢＰに特異的に結合することが見出された（図５Ｂ）。また、ＥＭＳＡ競合実験において、非標識ＢＣｌＲＮＡは有効に結合を競合するのに対して無関係のＲＮＡは競合しなかったという特異性が確認された。ＥＭＳＡ実験におけるｅＩＦ４ＡおよびＰＡＢＰの両方へのＢＣｌＲＮＡの同時曝露により、ｅＩＦ４ＡまたはＰＡＢＰのいずれかのみへの曝露よりもシフトが大きく（図５Ｃ）、これら２つのタンパク質のＢＣｌＲＮＡへの結合は相互に排除されないことを示す。さらに、ＰＡＢＰに特異的な抗体を使用して、ラット脳抽出物においてＢＣｌＲＮＡと共に認められた移動度シフトは、さらに減少した移動度へ特異的に「スーパーシフト」した（５Ｄ）。逆に、同一の抗体を使用して脳抽出物のＰＡＢＰを免疫枯渇させた場合、ＢＣｌＲＮＡの移動度シフトは主に移動度の増加が認められた（５Ｄ）。まとめると、結果は、ＢＣｌＲＮＡはｅＩＦ４ＡおよびＰＡＢＰと特異的に相互作用することを示す。
【０１６６】
（ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｇ、およびＰＡＢＰは樹状突起中に局在する）ＢＣｌＲＮＡは樹状突起にターゲティングされるので、ｅＩＦ４ＡおよびＰＡＢＰの任意の相互作用は、明らかに樹状突起中にこれらのタンパク質の存在が必要である。さらに、ｅＩＦ４Ｇはまた、ｅＩＦ４ＡおよびＰＡＢＰの両方と相互作用する足場タンパク質のその役割で必要である（（非特許文献１２９）；（非特許文献１３０）；（非特許文献１３１）に概説）。培養物中の海馬ニューロンに対する共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）と組み合わせた免疫細胞化学を使用して、樹状突起中でのこれら３つのタンパク質の存在を探索した（非特許文献１３２）。図６に示した結果は、ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｇ、およびＰＡＢＰは実質的レベルで樹状突起中で検出可能であることを例示する。（いかなるこれらの因子についての軸索の幹（ｓｈａｆｔ）に沿った有意な標識も検出されなかった。）樹状突起全体で、３つ全てのタンパク質の標識パターンは変則的な特定の性質を示し、しばしば点状の外観を示した。平均して、このような標識クラスターの頻度は、近位セグメントと比較して遠位樹状突起セグメントではあまり頻繁に認められなかった。結果は、ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｇ、およびＰＡＢＰは、樹状突起に沿って変則的な集団様式で分布することを示す。
【０１６７】
【非特許文献１２９】Ｇｉｎｇｒａｓ  Ａ−Ｃ，Ｒａｕｇｈｔ  Ｂ，Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ  Ｎ（１９９９）ｅＩＦ４  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ：ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｔｏ  ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６８：９１３−９６３．
【非特許文献１３０】Ｊａｃｋｓｏｎ  ＲＪ（２０００）Ａ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｉｎ：  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ  Ｎ，Ｈｅｒｓｈｅｙ  ＪＷＢ，Ｍａｔｈｅｗｓ  ＭＢ，ｅｄｓ），ｐｐ  １２７１  ８３．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．
【非特許文献１３１】Ｄｅｖｅｒ  ＴＥ（２００２）Ｇｅｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ  １０８：５４５−５５６．
【非特許文献１３２】Ｔｉｅｄｇｅ  Ｈ，Ｂｒｏｓｉｕｓ  Ｊ（１９９６）Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ  ｏｆ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １６：７１７１−７１８１．
【０１６８】
これらの樹状突起クラスターがシナプス構造に関連するかどうかを決定するために、シナプトフィジンに対する抗体、シナプス小胞のマーカータンパク質、およびそれによるシナプス前特殊化（非特許文献１３３）を並行使用して、免疫細胞化学実験を二重標的様式で行った。この抗体により培養物中の成熟海馬ニューロンにおける個別の点としてシナプス前特殊化が同定されることが以前に示されている（（非特許文献１３４）；（非特許文献１３５））。ＣＬＳＭを使用して、このような点が樹状突起範囲に沿って著しく示され、より遠位のセグメントでは典型的にはその頻度が減少することが見出された（図６）。シナプトフィジンの点と空間的に関連して、ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｇ、およびＰＡＢＰ標識クラスターの小集団が認められた。このような関連は、過剰な重複による不明瞭な解像度によりクラスター密度があまり高くない遠位樹状突起で最も認められた（図６）。互いに並置した赤色（ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｇ、またはＰＡＢＰ）および緑色（シナプトフィジン）標識クラスターがしばしば認められ、後者は典型的にはより表面的外観を示した。並置した赤色／緑色点の対のいくつか（全てではない）はいくらかの程度で重複しているようであり、このことは狭い黄色の境界領域によって証明された。緑色点により軸索シナプス前特殊化が同定されたので、このような並置した赤色クラスターはシナプス前樹状突起区画と相関すると結論づけた。
【０１６９】
【非特許文献１３３】Ｊａｈｎ  Ｒ，Ｓｃｈｉｅｂｌｅｒ  Ｗ，Ｏｕｉｍｅｔ  Ｃ，Ｇｒｅｅｎｇａｒｄ  Ｐ（１９８５）Ａ  ３８，０００−ｄａｌｔｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉＮ（ｐ３８）Ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｉ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２：４１３１−４１４１．
【非特許文献１３４】Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  ＴＬ，Ｃａｍｅｒｏｎ  Ｐ，Ｄｅ  Ｃａｍｉｌｌｉ  Ｐ，Ｂａｎｋｅｒ  Ｇ（１９９４）Ｔｈｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｎａｐｓｉｎ  Ｉ  ａｎｄ  ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ  ｉｎ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １１：１６１７−１６２６．
【非特許文献１３５】Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  ＴＬ，Ｄｅ  Ｃａｍｉｌｌｉ  Ｐ，Ｂａｎｋｅｒ  Ｇ（１９９４）Ｓｙｎａｐｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ｔｈａｔ  ａｘｏｎｓ  ａｎｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ  ｂｅｃｏｍｅ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｔｏ  ｆｏｒｍ  ｓｙｎａｐｓｅｓ  ａｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｔａｇｅｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．J  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １４：６６９５−６７０６．
【０１７０】
まとめると、結果は、ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｇ、およびＰＡＢＰクラスターの樹状突起内局在の相違を示し、これらのクラスターのいくつかは、シナプス前軸索特殊化の下または周囲のシナプス後マイクロドメイン中に存在していた。樹状突起中のこのようなシナプス関連クラスターは、シナプス後区画で豊富な樹状突起タンパク質（ＣａＭＫＩＩαなど；（非特許文献１３６）の局所合成で作用し得る一方で、シナプス外ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｇ、およびＰＡＢＰクラスターは、シナプスに関連しない樹状突起タンパク質（ＭＡＰ２など；（非特許文献１３７）の合成に優先的に関与する。
【０１７１】
【非特許文献１３６】Ｂｕｒｇｉｎ  ＫＥ，Ｗａｘｈａｍ  ＭＮ，Ｒｉｃｋｌｉｎｇ  Ｓ，Ｗｅｓｔｇａｔｅ  ＳＡ，Ｍｏｂｌｅｙ  ＷＣ，Ｋｅｌｌｙ  ＰＴ（１９９０）Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａ２＋／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｒａｔ  ｂｒａｉｎ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １０：１７８８−１７９８．
【非特許文献１３７】Ｇａｒｎｅｒ  ＣＣ，Ｔｕｃｋｅｒ  ＲＰ，Ｍａｔｕｓ  Ａ（１９８８）Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ  ｆｏｒ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＭＡＰ２  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：６７４−６７７．
【０１７２】
内部リボゾーム侵入機構およびスクロース密度勾配遠心分離の実験での使用により、ＢＣｌ媒介抑制が開始レベルで翻訳をターゲティングすることが示された。詳細には、ＢＣｌＲＮＡは、４８Ｓ前開始複合体の形成（すなわち、ｍＲＮＡへの小リボゾームサブユニットの補充）を阻害した。しかし、開始因子のｅＩＦ４ファミリーと独立した４８Ｓ複合体形成は、ＢＣｌＲＮＡによる阻害に無効であることが見出された（ＢＣｌ抑制経路におけるこれらの因子の少なくとも１つが関与する結果）。生化学実験により、ＢＣｌＲＮＡのｅＩＦ４Ａ（ＲＮＡ巻き戻し因子）およびポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）との特異的相互作用が示された。両タンパク質は、シナプス樹状突起マイクロドメイン中に豊富に見出された。明らかに、ＢＣｌ媒介抑制は、キャップ依存性翻訳開始だけでなくｅＩＦ４依存性内部開始においても有効であることが示された。
【０１７３】
結果は、ＢＣｌＲＮＡが神経細胞中の局所タンパク質合成における翻訳調節メディエーターであることを示す。したがって、そのヒトアナログＢＣ２００ＲＮＡは、ＢＣ２００ＲＮＡレベルの増加によって特徴づけられる神経学的障害のアンチセンス処置のための適切な標的である。
【０１７４】
細胞の構造および機能における機能的な非翻訳ＲＮＡの重要性が認識されるにつれて、単なる情報の受動的キャリアとしてのＲＮＡの伝統的な見解は明らかに訂正する必要がある。非翻訳ＲＮＡは、種々の細胞機能に関与しており（非特許文献１３８）に概説）、例えば、マイクロＲＮＡは、ＢＣｌ経路と明らかに異なる機構でさえも翻訳調節に関与し得る。機能的ＲＮＡは、これまでの予想よりも遥かに多数存在する可能性があり、初期ＲＮＡ界のわずかな残存物とかけ離れて、このようなＲＮＡをコードする遺伝子は、真核生物種で産生され続ける可能性が高い（（非特許文献１３９）；（非特許文献１４０）；（非特許文献１４１）；（非特許文献１４２））。したがって、神経細胞中の非翻訳ＲＮＡは、ニューロンの機能性および可塑性の決定因子として機能するだけでなく、同時に神経種の多様化の原動力として作用する。
【実施例３】
【０１７５】
【非特許文献１３８】Ｓｔｏｒｚ  Ｇ（２００２）Ａｎ  ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｕｎｉｖｅｒｓｅ  ｏｆ  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：１２６０−１２６３  Ｓｕｔｕｌａ  Ｔ，Ｈｅ  ＸＸ，Ｃａｖａｚｏｓ  Ｊ，Ｓｃｏｔｔ  Ｇ（１９８８）Ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｂｎｏｒｍａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１，１４７−１１５０．
【非特許文献１３９】Ｂｒｏｓｉｕｓ  Ｊ，Ｔｉｅｄｇｅ  Ｈ（１９９６）Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｐｌａｓｔｉｃｉｌｙ．Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  １１：１６３−１７９．
【非特許文献１４０】Ｋｕｒｙｓｈｅｖ  ＶＹ，Ｓｋｒｙａｂｉｎ  ＢＶ，Ｋｒｅｍｅｒｓｋｏｔｈｅｎ  Ｊ，Ｊｕｒｋａ  Ｊ，Ｂｒｏｓｉｕｓ  Ｊ（２００１）Ｂｉｒｔｈ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ：ｌｏｃｕｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ＢＣ２００  ｓｎｍＲＮＡ  ｉｎ  ｔｈｒｅｅ  ｐｒｏｓｉｍｉａｎｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ＢＣ２００  ｐｓｅｕｄｏｇｅｎｅｓ  ａｓ  ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｎｔｈｒｏｐｏｉｄｅａ  ｌｉｎｅａｇｅ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０９：１０４９−１０６６．
【非特許文献１４１】Ｅｄｄｙ  ＳＲ（２００２）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｏｆ  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ  ｇｅｎｅｓ．Ｃｅｌｌ  １０９：１３７−１４０．
【非特許文献１４２】Ｗａｎｇ  Ｗ，Ｂｒｕｎｅｔ  ＦＧ，Ｎｅｖｏ  Ｆ，Ｌｏｎｇ  Ｍ（２００２）Ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｓｐｈｉｎｘ，ａ  ｙｏｕｎｇ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ＲＮＡ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：４４４８−４４５３．
【０１７６】
（材料と方法）（手術および電気生理学）標準的なｉｎ  ｖｉｖｏＬＴＰおよびキンドリングプロトコールを使用した（（非特許文献１４３）；（非特許文献１４４））。雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（全部で２２頭、３５０〜６００ｇ）を、ウレタン（１ｇ／ｋｇを腹腔内投与）で麻酔した。適切な麻酔レベルが達成された後、動物を定位フレームに入れ、頭皮を切開し、開創し、ラムダおよびブレグマを同一の水平面に置いた。動物に、先端を平らに切断した（直径６５μｍ）単一テフロンコーティングステンレススチールワイヤーから構成された単極刺激電極および記録電極を移植した。刺激電極および記録電極の両方は、頭蓋に移植したステンレススチール製のねじを基準とした。
【０１７７】
【非特許文献１４３】Ｃａｉｎ  ＤＰ，Ｂｏｏｎ  Ｆ，Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ  ＥＬ（１９９２）Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｏ  ｋｉｎｄｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｋｉｎｄｌｉｎｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ：ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＮＭＤＡ  ａｎｄ  ｕｒｅｔｈａｎｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  １１６：３３０−３３８．
【非特許文献１４４】Ｓｔｅｗａｒｄ  Ｏ，Ｗａｌｌａｃｅ  ＣＳ，Ｌｙｆｏｒｄ  ＧＬ  Ｗｏｒｌｅｙ  ＰＦ（１９９８）Ｓｙｎａｐｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｃａｕｓｅｓ  ｔｈｅ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＩＥＯ  ＡＲＣ  ｔｏ  ｌｏｃａｌｉｚｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｎｅａｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ  ｓｉｔｅｓ  ｏｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ．Ｎｅｕｒｏｎ  ２１：７４１−７５１．
【０１７８】
ＬＴＰ実験動物の穿孔路（ｐｅｒｆｏｒａｎｔ  ｐａｔｈ）および歯状回の両方に刺激電極および記録電極を片側の左側にそれぞれ移植した。穿孔路刺激座標は、ラムダ縫合から−０．５ｍｍ後方且つ４．５ｍｍ側方であり、歯状回記録座標はブレグマ縫合交点から−３．８ｍｍ後方且つ２．５ｍｍ側方であった。発作実験動物のＣＡ３およびＣＡ１の放射線維層に刺激電極および記録電極を片側の右側にそれぞれ移植した。ＣＡ３刺激座標は、ブレグマ縫合交点から−３．５ｍｍ後方且つ側方であり、ＣＡ１記録座標は、ブレグマ縫合交点から−３．８ｍｍ後方且つ２．５ｍｍ側方であった。
【０１７９】
生理学的制御下で全ての電極の最終的な深さでの位置づけを行い、適切な移植経路からの応答を至適化するようにセットした。誘発電位の記録を１００００倍に増幅し、帯域通過を１Ｈｚから１０ＫＨｚまでフィルタリングし（Ａ−Ｍ  Ｓｙｓｔｅｍｓモデル番号１７００の差動ＡＣ増幅器，Ｃａｒｌｓｂｏｒｇ，ＷＡ）、２０ＫＨｚでデジタル処理し、ＰＣにてディスクに保存した。脳波（ＥＥＧ）を同様に増幅するが、帯域通過を１Ｈｚから２００ＫＨｚまでフィルタリングし、４００ＫＨｚでデジタル処理した。興奮シナプス後電位（ｆＥＰＳＰ）勾配および集合スパイク振幅について誘発電位応答をオフラインで分析した。ｆＥＰＳＰ勾配を、集合スパイクの出現直前（初期勾配）の１ｍ秒セグメントの運転を超えた量として測定した。集合スパイク振幅を、集合スパイクの初期の振れから最大の振れまでのｍＶで示した距離として測定した。二次ＡＤは認められなかった。
【０１８０】
誘発電位試験パルスは、二相性であった（０．１ｍ秒／相、逆相リーディング（ｌｅａｄｉｎｇ））。一旦記録値が安定すると、入力／出力（Ｉ／Ｏ）曲線が得られ、これを使用して刺激電流のベースラインおよび強直誘発強度を決定した。移植およびＩ／Ｏ曲線の決定時に、試験パルスの周波数は約０．１Ｈｚであった。次いで、残りの実験記録のために、試験パルス周波数を０．０５Ｈｚに固定した。ＬＴＰ実験の試験パルスで使用した強度により、０．５〜３ｍＶの集合スパイクが誘発された（Ｉ／Ｏ曲線から得た約５０％の最大応答）（（非特許文献１４５）；（非特許文献１４６））。
【０１８１】
【非特許文献１４５】Ａｂｒａｈａｍ  ＷＣ，Ｍａｓｏｎ  ＳＥ，Ｄｅｍｍｅｒ  ＪＭ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＪＭ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ＣＬ，Ｔａｔｅ  ＷＰ，Ｌａｗｌｏｒ  ＰＡ，Ｄｒａｇｕｎｏｗ  Ｍ（１９９３）Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｏｆ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｐｏｔｅｎｌｉａｔｉｏｎ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５６：７１７−７２７．
【非特許文献１４６】Ｓｔｅｗａｒｄ  Ｏ，Ｗａｌｌａｃｅ  ＣＳ，Ｌｙｆｏｒｄ  ＧＬ，Ｗｏｒｌｅｙ  ＰＦ（１９９８）Ｓｙｎａｐｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｃａｕｓｅｓ  ｔｈｅ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＩＥＯ  ＡＲＣ  ｔｏ  ｌｏｃａｌｉｚｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｎｅａｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ  ｓｉｔｅｓ  ｏｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ．Ｎｅｕｒｏｎ  ２１：７４１−７５１．
【０１８２】
記載のようにＬＴＰ強直誘発を行った（（非特許文献１４７）。１０秒毎に１回４００Ｈｚを２０秒間連続して送達させた。一連のパルス内の各パルスは、使用強度以外は試験パルスと同一の形状であった。各実験に依存して１２０分間または１８０分間強直誘発を連続的に行った（それぞれ２時間および３時間の経時変化）。初期４００Ｈｚのパルスの送達時に、癲癇性ＡＤが生じたことを示す任意の変化についてＥＥＧを慎重にモニタリングした。これらの実験では何も認められなかった。強直誘発後、３０分間またはそれ以上ベースライン強度を記録し、その後すぐに動物を灌流まで放置した。さらに、いくつかの動物について、灌流直前の５〜１０分間記録した。動物を最初のパルスの送達から２〜３時間後に灌流固定した。体重および性別が適合した動物を麻酔し、平行して処置した。
【０１８３】
【非特許文献１４７】Ｓｔｅｗａｒｄ  Ｏ，Ｗａｌｌａｃｅ  ＣＳ，Ｌｙｆｏｒｄ  ＧＬ，Ｗｏｒｌｅｙ  ＰＦ（１９９８）Ｓｙｎａｐｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｃａｕｓｅｓ  ｔｈｅ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＩＥＯ  Ａｒｃ  ｔｏ  ｌｏｃａｌｉｚｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｎｅａｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ  ｓｉｔｅｓ  ｏｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ．Ｎｅｕｒｏｎ  ２１：７４１−７５１．
【０１８４】
最初の１秒間に６０Ｈｚのパルスを送達させる１ｍ秒の二相性パルスを使用して海馬ＡＤを誘発した（非特許文献１４８）。ＡＤが惹起されない場合、パルスの持続時間を増加させるか、強度を増加させて数分後に再度パルスを送達させた。少なくとも１０秒間持続するＡＤが惹起され、ＥＥＧから記録されるまで、この様式で強直誘発を繰り返した。このアプローチを使用して、少なくとも１０秒間持続する１回のＡＤまたは典型的には２番目のみのＡＤが少なくとも１０秒間持続する場合に２回のＡＤを得た。記録した海馬ＡＤの持続時間は、典型的には、１０秒と３０秒との間であった。ＡＤ誘導後に動物を２〜３時間灌流固定した。体重および性別が適合した動物を麻酔し、平行して処置した。
【０１８５】
【非特許文献１４８】Ｃａｉｎ  ＤＰ，Ｂｏｏｎ  Ｆ，Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ  ＥＬ（１９９２）Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｏ  ｋｉｎｄｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｋｉｎｄｌｉｎｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ：ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＮＭＤＡ  ａｎｄ  ｕｒｅｔｈａｎｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  １１６：３３０−３３８．
【０１８６】
（試料の調製）１５０ｍｌの新たに調製した４％ホルムアルデヒド（パラホルムアルデヒドから作製）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ；１３．７ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２７ｍＭ  ＫＣｌ、０．４３ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．１４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４））を用いて心灌流を行った。脳を氷冷ホルムアルデヒド溶液中に一晩置き、１２％、１６％、および２０％スクロース溶液に連続的に移し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  ＵＳＡ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）に包埋した。次いで、試料を顕微鏡スライド上で凍結切片にした（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）（非特許文献１４９）。本研究で使用した全ての組織切片は、（非特許文献１５０）のアトラスにおけるプレート番号３４〜３６に対応する等価な尾側吻側位に由来した。特に、比較可能性を確認するために、刺激電極周辺の狭領域から刺激した脳由来の切片を選択した。
【０１８７】
【非特許文献１４９】Ｌｉｎ  Ｙ，Ｂｒｏｓｉｕｓ  Ｊ，Ｔｉｅｄｇｅ  Ｈ（２００１）Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ＢＣ１  ＲＮＡ：ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｇｒｏｗｔｈ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−４３  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＥＮＡ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １０３：：４６５−４７９．
【非特許文献１５０】Ｐａｘｉｎｏｓ  Ｇ，Ｗａｔｓｏｎ  Ｃ（１９９８）Ｔｈｅ  ｒａｔ  ｂｒａｉｎ  ｉｎ  ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ．
【０１８８】
（ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成および免疫細胞化学）ＢＣｌＲＮＡに対するＲＮＡプローブをプラスミドｐＭＫ１から作製した（非特許文献１５１）。ＡｒｃｍＲＮＡに特異的なプローブを、３．３０２ｋｂのｃＤＮＡインサートを含むクローンから作製した（非特許文献１５２）。このプラスミドは、コード領域、３’ＵＴＲ、および５’ＵＴＲの一部を含む。全実験における正の対照としてＡｒｃｍＲＮＡを使用した。製造者（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）が推奨するようにＴ３またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用して、線状化テンプレートから３５Ｓ標識ＲＮＡプローブを転写した。記載のようにプレハイブリッド形成およびハイブリッド形成工程を行った（非特許文献１５３）。高ストリンジェンシー洗浄を５０℃で行った。
【０１８９】
【非特許文献１５１】Ｔｉｅｄｇｅ  Ｈ，Ｆｒｅｍｅａｕ  ＲＴ，Ｊｒ．，Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ  ＰＨ，Ａｒａｎｃｌｏ  Ｏ，Ｂｒｏｓｉｕｓ  Ｊ（１９９１）Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ＢＣＩ  ＲＮＡ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｉ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：２０９３−２０９７．
【非特許文献１５２】Ｌｙｆｏｒｄ  ＧＬ，Ｙａｍａｇａｔａ  Ｋ，Ｋａｕｆｍａｎｎ  ＷＥ，Ｂａｒｎｅｓ  ＣＡ，Ｓａｎｄｅｒｓ  ＬＫ，Ｃｏｐｅｌａｎｄ  ｎＧ，Ｇｉｌｂｅｒｔ  ＤＪ，Ｊｅｎｋｉｎｓ  ＮＡ，Ｌａｎａｈａｎ  ＡＡ，Ｗｏｒｌｅｙ  ＰＦ（１９９５）Ａｒｃ，ａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ，eｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ．Ｎｅｕｒｏｎ  １４：４３３−３４５．
【非特許文献１５３】Ｔｉｅｄｇｅ  Ｈ，Ｆｒｅｍｅａｕ  ＲＴ，Ｊｒ．，Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ  ＰＨ，Ａｒａｎｃｌｏ  Ｏ，Ｂｒｏｓｉｕｓ  Ｊ（１９９１）Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ＢＣＩ  ＲＮＡ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｉ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：２０９３−２０９７．
【０１９０】
免疫細胞化学のために、切片を融解直後に４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで再固定し、ＰＢＳで１５分間洗浄した。非特異的結合を５％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で１５分間ブロッキングした。切片を、抗シナプトフィジンモノクローナル抗体７．２（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（ＰＢＳで２００倍希釈）と４℃で２４時間インキュベートした。ビオチン化二次抗体（抗マウスＩｇＧ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を２時間適用し（１００倍希釈）、ストレプトアビジン−ローダミン抱合体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で修飾した。全工程において、切片をＰＢＳ中で３０分間洗浄した。切片をグリセロールにマウントし、その直後に蛍光顕微鏡によって試験した。組織切片の乾燥を防止するために、全手順を多湿大気を含むボックス中で行った。一次抗体混合物をＰＢＳに置換すること以外は同一の方法で対照切片を処理した。
【０１９１】
（乳濁液オートラジオグラフィ（Ｅｍｕｌｓｉｏｎ  Ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ））。以前に記載のように、乳濁液オートラジオグラフィを行った（Ｔｉｅｄｇｅ，１９９１）。簡単に述べれば、乾燥切片を、ＨＰＬＣグレードの水で２倍希釈したＮＴＢ２乳濁液（ＥａｓｔｍａｎＫｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に浸漬し、風乾し、４℃で３日間（ＢＣｌＲＮＡ）または７日間（ＡｒｃｍＲＮＡ）曝露した。写真の現像後（Ｄ−１９現像液（強度５０％）およびＲａｐｉｄ−Ｆｉｘ；Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ）、切片をクレシルバイオレットで染色し、脱水し、ＤＰＸ（Ｆｌｕｋａ，Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ，ＮＹ）にマウントした。
【０１９２】
（定量分析）切片を分析し、暗視野または落射蛍光を使用したＮｉｋｏｎ  Ｍｉｃｒｏｐｈｏｔ−ＦＸＡ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）で撮影した。Ｘ線オートラジオグラムを、Ｎｉｋｏｎ  ＭｉｃｒｏｐｈｏｔまたはＮｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ  ３００倒立顕微鏡を使用して分析した。ＳＯＮＹ  ＤＫＣ−５０００  ３ＣＣＤカメラを使用して画像を得た。記載のように、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して、発現レベルを測定した（（非特許文献１５４）；（非特許文献１５５））。オートラジオグラムの定量分析のために、ＣＡ３（放射線維層）、ＣＡｌ（放射線維層および錐体細胞層）、および歯状回（分子層）中の目的の領域（ＲＯＩ）を選択した。ランバート−ベールの法則を使用して、測定した光度値からＲＯＩ中の光学密度を計算した。ＲＮＡ発現の活性依存性変化を同定するために、３つ全てのＲＯＩについて同側および対側を個別に測定し、シグナル強度の比（同側／対側）としてプロットした。ハイブリッド形成シグナルの動物ごとの変動（およびより低い程度では、同一動物内の切片ごとの変動）により、定量分析が同一切片内での比較に制限された。オートラジオグラフィの銀粒子の定量分析のために、放射線維層および錐体細胞層の各ＲＯＩを選択し、ＲＯＩの光度からガラスのバックグラウンド光度を引くことによってＲＯＩ中のシグナル強度を計算した。細胞内ＲＮＡ分布の活性依存性変化を試験するために、刺激海馬および非刺激海馬の両方についての放射線維層／錐体細胞層比として値をプロットした。海馬の背中線領域の３つ〜６つの冠状断面を各動物から選択した。分散分析（一元配置ＡＮＯＶＡ）またはＩｎＳｔａｔソフトウェア（ｗｗｗ．ｒｄｇ．ａｃ．ｕｋ／ｓｓｃ／ｉｎｓｔａｔ／ｉｎｓｔａｔ．ｈｔｍｌ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｅａｄｉｎｇ，ＵＫ）を使用したスチューデントｔ検定によって結果を統計的に評価した。いずれかの場合、有意性レベルをＰ＜０．０５に設定した。
【実施例４】
【０１９３】
【非特許文献１５４】Ｌｅｈｒ  ＨＡ，Ｍａｎｋｏｆｆ  ＤＡ，Ｃｏｒｗｉｎ  Ｄ，Ｓａｎｔｅｕｓａｎｉｏ  Ｇ，Ｇｏｗｎ  ＡＭ（１９９７）Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ−ｂａｓｅｄ  ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  eｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ４５：１５５９−１５６５．
【非特許文献１５５】Ｌｅｈｒｈｒ  ＨＡ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｏｏｓ  ＣＭ，Ｔｅｅｌｉｎｇ  Ｐ，Ｇｏｗｎ  ＡＭ（１９９９）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｄｏｕｂｌｅ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔａｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ−ｂａｓｅｄ  ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉＳ，Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ４７：１１９−１２６．
【０１９４】
（結果）本研究の全ての目的は翻訳モジュレーターＢＣｌＲＮＡの発現自体が活性依存性調整に影響を受けるかどうかを確証することであった。この問題に取り組むために、ＬＴＰ誘導後および癲癇様活動の誘導後にＢＣｌ発現パターンを実験した。全ての実験において、ＢＣｌＲＮＡと同一の各動物中の正の対照としてＡｒｃｍＲＮＡを探索した。
【０１９５】
（ＬＴＰ誘導後に時空ＢＣｌ発現パターンは有意に変化しない）生きた動物におけるＬＴＰのタンパク質合成依存段階中のＢＣｌＲＮＡの発現および局在化を分析した。左穿孔路の刺激のためおよび同側歯状回の電場電位の記録のためにラットに電極を移植する。穿孔路の高周波刺激により歯状回顆粒細胞ならびにＣＡ３およびＣＡ１の錐体細胞中にＬＴＰが誘導されるので（非特許文献１５６）、全海馬領域中のＬＴＰ誘導の指標として歯状回からの記録を使用した。
【０１９６】
【非特許文献１５６】Ｂｅｒｇｅｒ  ＴＷ，Ｙｅｃｋｅｌ  ＭＰ（１９９１）Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｔｏｒｈｉｎａｌ  ａｆｆｅｒｅｎｔｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ：ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｔｒｉｓｙｎａｐｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｉｎ：Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ：Ａ  ｄｅｂａｔｅ  ｏｆ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｉｓｓｕｅｓ（Ｂａｕｄｉｙ  Ｍ，Ｄａｖｉｓ  ＪＬ，ｅｄｓ），ｐｐ  ３２７−３５６．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ：ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ．
【０１９７】
ＬＴＰを誘導するために、０．５〜３ｍＶの集合スパイク（ＰＳ）が誘導される強度で９０分間刺激を与えた。生理学的記録により、全ての実験においてこのような刺激によりＬＴＰが誘導されることが確認された。片側高周波刺激により、同側歯状回中に興奮シナプス後電位（ｆＥＰＳＰ）勾配およびＰＳの強い電位が得られた。図８は、代表的な実験におけるＬＴＰの誘導を示す。ｆＥＰＳＰ勾配およびＰＳは、高周波刺激後に明らかに増加し、記録期間中（最低３０分間）上昇したままであった。短時間の癲癇様活動でさえもＲＮＡ発現を変化させることができるので（例えば、（非特許文献１５７）を参照のこと）、全ての電気生理学的実験を通して海馬ＥＥＧをモニタリングした。任意のＬＴＰ実験中にＡＤは認められず、動物は、発作活動を示す高周波刺激期間後の誘発応答の低下を示さなかった。
【０１９８】
【非特許文献１５７】Ｉｓａｃｋｓｏｎ  ＰＪ，Ｈｕｎｔｓｍａｎ  ＭＭ，Ｍｕｒｒａｙ  ＫＤ，Ｇａｌｌ  ＣＭ（１９９１）ＢＤＮＦ  ｍＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｒａｔ  ｆｏｒｅｂｒａｉｎ  ａｆｔｅｒ  ｌｉｍｂｉｃ  ｓｅｉｚｕｒｅｓ：ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｆｒｏｍ  ＮＧＥ．Ｎｅｕｒｏｎ  ６：９３７−９４８．
【０１９９】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成によってＢＣｌ発現について刺激動物および対照動物の脳を分析した。任意の海馬領域の目視検査によって大きな変化は検出されなかった。刺激から２時間および３時間後に脳を分析し、異なる海馬形成領域中のＢＣｌ発現を定量した（図９Ａ〜Ｃ）。ＬＴＰの誘導により、いかなる分析領域においてもＢＣｌ発現レベルは有意に変化しなかった。樹状突起と体細胞層とのＢＣｌ発現比に有意な変化を得ることができなかった（図９Ｄ）。ＬＴＰ誘導から１時間後および４時間後に類似の結果が得られた（データ示さず）。本発明者らの刺激パラダイムの妥当性を確認するために、ＡｒｃｍＲＮＡ（ＬＴＰ誘導高周波刺激によって上方制御されることが公知のＲＮＡ）の発現を分析した（（非特許文献１５８）；（非特許文献１５９））。高周波刺激後、ＢＣｌＲＮＡについて探索した脳切片に隣接する脳切片中でこのＲＮＡを探索した。刺激歯状回の細胞体および樹状突起中でＡｒｃｍＲＮＡが強く上方制御され、数時間そのままであることが見出された。この結果により、本発明者らの実験デザインがＲＮＡ発現レベルの活動依存性変化の獲得および検出に適切であることが確認された。
【０２００】
【非特許文献１５８】Ｌｉｎｋ  Ｗ，Ｋｏｎｉｅｔｚｋｏ  Ｕ，Ｋａｕｓｅｌｍａｎｕ  Ｇ，Ｋｒｕｇ  Ｍ，Ｓｃｈｗａｎｋｅ  Ｂ，Ｆｒｅｙ  Ｕ，Ｋｕｈｌ  Ｄ（１９９５）Ｓｏｍａｔｏｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃｅｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：５７３４−５７３８
【非特許文献１５９】Ｌｙｆｏｒｄ  ＧＬ，Ｙａｍａｇａｔａ  Ｋ，Ｋａｕｆｍａｎｎ  ＷＥ，Ｂａｒｎｅｓ  ＣＡ，Ｓａｎｄｅｒｓ  ＬＫ，Ｃｏｐｅｌａｎｄ  ＮＧ，Ｇｉｌｂｅｒｔ  ＤＪ，Ｊｅｎｋｉｎｓ  ＮＡ，ＬａｎａｈａｎＡＡ，Ｗｏｒｌｅｙ  ＰＦ（１９９５）Ａｒｃ，ａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ，ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ．Ｎｅｕｒｏｎ  １４：４３３−３４５．
【０２０１】
まとめると、これらの結果は、ＬＴＰのタンパク質合成依存性段階中にＢＣｌ発現は有意に変化しないことを示す。したがって、ＬＴＰの維持のために、ＢＣｌ発現レベルの調整はこの実験パラダイムで必要ないようである。
【０２０２】
（癲癇様活動の誘導後にＢＣｌ発現レベルが下方制御される）大きなシナプス興奮によって発作事象が起こり、タンパク質合成の増加を伴う（（非特許文献１５６０）；（非特許文献１６１）；（非特許文献１６２）；（非特許文献１６３））。翻訳リプレッサーＢＣｌＲＮＡの発現がこのような条件下で調整されるかどうかを確証するために、生きた動物において癲癇様活動を誘導した。シェファー側副枝刺激および海馬ＥＥＧの記録のために動物の右海馬に電極を移植した。６０Ｈｚキンドリングプロトコールを使用して、１０〜３０秒の持続時間の単回海馬ＡＤを得た（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓを参照のこと）。
【０２０３】
【非特許文献１６０】Ｅｌｍｅｒ  Ｍ，Ｋｏｋａｉａ  Ｚ，Ｋｏｋａｌａ  Ｍ，Ｃａｒｎａｈａｎ  Ｊ，Ｎａｗａ  Ｈ，Ｌｉｎｄｖａｌｌ  Ｏ（１９９８）Ｄｙｎａｍｉｃ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｆｏｒｅｂｒａｉｎ  ａｆｔｅｒ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｎｄ  ｒｅｃｕｒｒｉｎｇ  ｋｉｎｄｌｉｎｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｅｉｚｕｒｅｓ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８３：３５１−３６１
【非特許文献１６１】Ｗａｌｌａｃｅ  ＣＳ，Ｌｙｆｏｒｄ  ＧＬ，Ｗｏｒｌｅｙ  ＰＦ，  Ｓｔｅｗａｒｄ  Ｏ（１９９８）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｏｆ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ  ｍＲＮＡｓ  ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １８：２６−３５．
【非特許文献１６２】Ｗａｔｋｉｎｓ  ＣＪ，ＰＥＩ  Ｑ，  Ｎｅｗｂｅｒｉｙ  ＮＲ（１９９８）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｎｖｕｌｓｉｖｅ  ｓｈｏｃｋ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍＲＮＡｓ  ｆｏｒ  ＮＲ２Ａ，ＮＲ２Ｂ  ａｎｄ  ｍＧｌｕＲ５ｂ．Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ６１：１０８−１１３．
【非特許文献１６３】Ｋｏｕｂｉ  Ｄ，Ｇｈａｒｉｂ  Ａ，Ｇａｇｎｏｎ  Ｊ，Ａｎｄｒｉｅｕ  ＪＰ，Ｂｏｂｉｌｌｉｅｒ  Ｐ．Ｓａｒｄａ  Ｎ（１９９９）Ｅａｒｌｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｂｒａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｎｖｕｌｓｉｖｅ  ｓｈｏｃｋ  ｉｎ  ｆｒｅｅ−ｍｏｖｉｎｇ  ｒａｔｓ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ８２１：１１１−１１６．
【０２０４】
図１０は、キンドリング融合ＡＤ中のラット脳の海馬ＥＥＧを示す。高周波刺激後に同調性神経活動が短期間起こり、典型的なＡＤパターンが明らかとなった。この活性化により、ＡｒｃｍＲＮＡ発現が強く誘導され（（非特許文献１６４）；（非特許文献１６５））、これを分子の正の対照として参照するために使用した（図１１Ｃ）。結果は、癲癇発射の誘導は樹状突起ＲＮＡの発現の調整に十分であることを示す。図１１Ａおよび１１Ｂのオートラジオグラムは、非刺激対照動物と比較した発作誘導後のＢＣｌＲＮＡの分布を示す。非刺激動物では（図１１Ｂ）、左海馬よりも高い右海馬のＢＣｌＲＮＡ発現が一貫して認められた。このような非対称の発現は、形態学の相違、片方の半球の好ましい使用、または種々の動物系で以前に報告されている他の脳機能の左右非対称性に起因し得る（（非特許文献１６６）；（非特許文献１６７）；（非特許文献１６８）；（非特許文献１６９））。右海馬における癲癇様活動の誘導により、同側のＢＣｌＲＮＡシグナルが著しく減少し、同側海馬および対側海馬における発現レベルが事実上同一になった（図１１Ａ）。ＢＣｌ発現の変化はＣＡ１ニューロンに制限されないが、同側海馬の至るところに認められた。定量分析により、ＣＡ３野でのＢＣｌ発現レベルの有意な減少ならびにＣＡ１および歯状回でのより小さな減少（統計的有意性に到達しない減少）が明らかとなった（図１２）。この文脈では、癲癇様事象は典型的にはその発作病巣部位に制限されないが、周辺組織に拡大し（非特許文献１７０）、それにより、ＡｒｃｍＲＮＡおよびＢＣｌＲＮＡの場合のように発現レベルの変化を誘発することができることに留意すべきである。画像分析により、ＣＡ３中のＢＣｌＲＮＡの空間的および層状の分布の相対的変化は認められないので（図１２、１３）、樹状突起および細胞体層におけるＢＣｌレベルの均一な減少が示唆される。この結果は、主要なＣＡ３ニューロンの至るところにおいて細胞幅様式（ｃｅｌｌ−ｗｉｄｅ  ｆａｓｈｉｏｎ）でＢＣｌＲＮＡレベルが下方制御されることを示す。したがって、癲癇様活動の誘導により、刺激海馬中の海馬錐体細胞の樹状突起のＢＣｌＲＮＡが著しく下方制御されるのに対して、同一動物の同一領域においてコントロールＲＮＡ（ＡｒｃｍＲＮＡ）は上方制御される。
【０２０５】
【非特許文献１６４】Ｌｉｎｋ  Ｗ，Ｋｏｎｉｅｔｚｋｏ  Ｕ，Ｋａｕｓｅｌｍａｎｕ  Ｇ，Ｋｒｕｇ  Ｍ，Ｓｃｈｗａｎｋｅ  Ｂ，Ｆｒｅｙ  Ｕ，Ｋｕｈｌ  Ｄ（１９９５）Ｓｏｍａｔｏｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃｅｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：５７３４−５７３８
【非特許文献１６５】Ｌｙｆｏｒｄ  ＧＬ，Ｙａｍａｇａｔａ  Ｋ，Ｋａｕｆｍａｎｎ  ＷＥ，Ｂａｒｎｅｓ  ＣＡ，Ｓａｎｄｅｒｓ  ＬＫ，Ｃｏｐｅｌａｎｄ  ＮＧ，Ｇｉｌｂｅｒｔ  ＤＪ，Ｊｅｎｋｉｎｓ  ＮＡ，Ｌａｎａｈａｎ  ＡＡ，Ｗｏｒｌｅｙ  ＰＦ（１９９５）Ａｒｃ，ａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ，ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ．Ｎｅｕｒｏｎ  １４：４３３−３４５．
【非特許文献１６６】Ｇｌｉｃｋ  ＳＤ，Ｒｏｓｓ  ＤＡ（１９８１）Ｌａｔｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｂｒａｉｎ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ４：１９６−１９９．
【非特許文献１６７】Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ＲＪ．Ｈｕｇｄａｈｌ  Ｋ（１９９４）Ｂｒａｉｎ  ａｓｙｍｍｅｔｒｙ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ：ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ．
【非特許文献１６８】Ｈｏｂｅｒｔ  Ｏ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＲＪ，Ｃｈａｎｇ  Ｓ（２００２）Ｌｅｆｔ−ｒｉｇｈｔ  ａｓｙｍｍｅｔｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ：ｔｈｅ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  ｍｏｄｅｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３：６２９−６４０．
【非特許文献１６９】Ｔｏｇａ  ＡＷ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＰＭ（２００３）Ｍａｐｐｉｎｇ  ｂｒａｉｎ  ａｓｙｍｍｅｔｒｙ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ４：３７−４８．
【非特許文献１７０】ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ  ＤＡ  Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  Ｄ（２００１）Ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｂａｓｅｓ  ｏｆ  ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ  ｓｅｉｚｕｒｅｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ６３：８１５−８４６．
【０２０６】
認められた減少は海馬組織の損傷または仮定上刺激後に起こり得る神経支配の喪失に起因することを正式に除外することができない。この可能性を制御するために、シナプトフィジン（シナプス前特殊化のマーカー）に特異的な抗体の使用によって発作を起こした動物の苔のような繊維状の末端の存在を探索した（非特許文献１７１）。免疫蛍光顕微鏡法では、個別の標識点のクラスターとしてこのような特殊化が視覚化される（非特許文献１７２）。ＣＡ３中のシナプトフィジン標識点の密度が片側キンドリング動物の両半球で類似していることが認められた（図１４）。実際、シナプトフィジン標識シグナルは刺激部位の淡明層で幾らかより強いようである（しかし、この所見の定量は試みなかった）。結果により、ＣＡ３錐体細胞の神経支配はキンドリング誘導ＡＤ後に負に影響されないことが確認された。クレシルバイオレット染色によって組織損傷のいかなる徴候も明らかにできなかった。したがって、ＡｒｃｍＲＮＡ発現について全ての発作動物および対照動物を試験した。全ての場合、発作海馬でＡｒｃｍＲＮＡが有意に上方制御されたので、遺伝子発現機構は海馬ニューロンに悪影響を与えないことが確認された。歯状回で最も顕著であるが、強い発作の誘導後にＣＡ３およびＣＡ１でＡｒｃｍＲＮＡの上方制御も認められた（図１４Ｃ）。これらの結果により、ＡＤが元の誘導部位から容易に拡大するというさらなる証拠が得られる。有意には、さらに、データは、細胞の生存および機能性はＡＤ誘導によって悪影響を受けないことを明確に示す。したがって、結果により、認められたＢＣｌ発現レベルの下方制御は特異的であり、且つ一般的な遺伝子発現の下方制御の結果ではないことがさらに確認される。
【０２０７】
【非特許文献１７１】Ｊａｈｎ  Ｒ，Ｓｃｈｉｅｂｌｅｒ  Ｗ，Ｏｕｉｍｅｔ  Ｃ，Ｇｒｅｅｎｇａｒｄ  Ｐ（１９８５）Ａ  ３８，０００−ｄａｌｔｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ｐ３８）Ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｉ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２：４１３１−４１４１．
【非特許文献１７２】Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  ＴＬ，Ｄｅ  Ｃａｍｉｌｌｉ  Ｐ，Ｂａｎｋｅｒ  Ｇ（１９９４）Ｓｙｎａｐｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ｔｈａｔ  ａｘｏｎｓ  ａｎｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ  ｂｅｃｏｍｅ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｔｏ  ｆｏｒｍ  ｓｙｎａｐｓｅｓ  ａｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｔａｇｅｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．J  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １４：６６９５−６７０６．
【０２０８】
まとめると、データにより、癲癇様活動の誘導後にＢＣｌ発現が特異的且つ有意に減少することが確証される。それ自体が翻訳リプレッサーであるＢＣｌＲＮＡはｉｎ  ｖｉｖｏでの強いシナプス活性化による調整の影響を受けると結論づけた。
【実施例５】
【０２０９】
（ＢＣｌ媒介翻訳抑制は、ｅＩＦ４ＡおよびＰＡＢＰとの同時機能的相互作用に依存する）ＢＣｌＲＮＡは、ｍＲＮＡへの小リボゾームサブユニットのｅＩＦ４媒介補充（因子のｅＩＦ４群に依存し、且つＰＡＢＰによって刺激される真核生物の重要な開始工程）による翻訳開始を抑制する。実施例２で証明するように、ＢＣｌＲＮＡは、ｅＩＦ４ＡおよびＰＡＢＰと結合する。本実施例では、このような直接的な物理的相互作用が翻訳リプレッサーとしてＢＣｌＲＮＡの機能的役割の基礎を形成するかどうかという問題を試験した。ＢＣｌ抑制翻訳をｅＩＦ４ＡもしくはＰＡＢＰまたはその化学量論的組み合わせを使用した逆適定によって「レスキュー」することができるかどうかを問うことによってこの問題に取り組む。
【０２１０】
ウサギ網状赤血球（ＲＲＬ）無細胞翻訳系で実施するこれらの実験のためにＩＲＥＳ媒介開始様式を選択した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｍＲＮＡで翻訳をプログラミングし、脳心筋炎（ＥＭＣＶ）サブタイプのＩＲＥＳから開始した。ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳからの開始には、キャップ結合タンパク質ｅＩＦ４Ｅ以外のｅＩＦ４ファミリーの全開始因子が必要である。実施例２でこの開始様式はＢＣｌ媒介抑制に特に感受性を示すことが証明された。ＢＣｌＲＮＡは、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳから開始された翻訳を有効に阻害した（１００ｎＭ  ＢＣｌＲＮＡで５０％抑制；図１５）。ｅＩＦ４Ａを使用した適定により、翻訳効率がわずかに増加するが、全ての試験濃度範囲（８０〜３２００ｎＭ）では、この増加は統計的有意性に達することができなかった（図１５；４００ｎＭ  ｅＩＦ４Ａを示す）。同様に、ＰＡＢＰでの逆適定において翻訳の小さいが有意でないレスキューが認められた（図１５）。しかし、明確に対照的に、ＢＣｌ抑制翻訳を、ｅＩＦ４ＡおよびＰＡＢＰでの同時化学量論的適定によってレスキューすることができる（図１５）。４００ｎＭの両因子では、翻訳効率は、標準（すなわち、非ＢＣｌ抑制）レベルのほぼ９０％に回復した。ｅＩＦ４ＡおよびＰＡＢＰによるＢＣｌ抑制翻訳のレスキューは、「過剰適定」によって翻訳効率を回復できないので、μＭ未満の濃度範囲のみで有効であった。
【０２１１】
上記結果は、ＢＣｌ抑制翻訳抑制の分子基盤がｅＩＦ４ＡおよびＰＡＢＰとの二重同時相互作用であるという考えを直接支持する。この場合翻訳はこの因子単独での逆適定によって回復することができなければならないので、２つの因子のうちの１つのみとの相互作用は機能的に不十分なようである。データは、おそらく因子は複合体中に含まれるので、ＢＣｌＲＮＡが両因子と同時に相互作用することを示す。
【図面の簡単な説明】
【０２１２】
【図１】リン光体画像診断（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｉｎｇ）の使用によるμＭ未満の濃度範囲の翻訳リプレッサーとしてのＢＣｌＲＮＡの効果を示す図である。タンパク質産物をＲＲＬ系を使用した３５Ｓ−メチオニン組み込みによって標識し、ＳＤＳＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィによって視覚化した。  図１Ａで認められるように、内因性ＲＲＬ  ｍＲＮＡの翻訳は漸増濃度のＢＣｌＲＮＡによって阻害された。主要バンドの相対シグナル強度をリン光体画像診断によって定量し、各レーンに列挙した。ＢＣｌＲＮＡの非存在下で得られたシグナル強度に相対値１を割り当てた。図１Ｂは、リン光体画像診断によって定量した３つの実験由来の結果であり、主要なタンパク質バンドシグナルが３２０ｎＭ  ＢＣｌＲＮＡによって７２％減少したことを示す（一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．００１；シェフェの多重比較後知恵解析（０ｎＭ  ＢＣｌＲＮＡコントロールとの比較）、４０ｎＭ  ＢＣｌＲＮＡについてはＰ＜０．０１（＊＊）、他の群についてはＰ＜０．００１（＊＊＊））。他のタンパク質バンドのシグナル強度も同様に７０〜８０％減少した。ｘ軸は指数であることに留意のこと。図１Ｃに示すように、コントロールＲＮＡ（Ｕ４およびＵ６ｓｎＲＮＡおよびｔＲＮＡが含まれる）の存在下での翻訳阻害は認められなかった。図１Ｄに記載するように、プログラミングｍＲＮＡとしてキャッピングおよびポリアデニル化したα−チューブリンｍＲＮＡを使用した場合、同一のＢＣｌ濃度範囲で同様に翻訳が阻害された。ＣおよびＤに示す各実験を、少なくとも２回行った。
【図２−Ａ】４８Ｓおよび８０Ｓ複合体を連続的に形成する翻訳開始工程をまとめた略図である。インヒビターＧＭＰ−ＰＮＰおよびシクロヘキシミドによってターゲティングされた工程を矢印で示す。ヘテロ三量体複合体ｅＩＦ４Ｆは、ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｅ、およびｅＩＦ４Ｇからなる。ｅＩＦ４Ａのヘリカーゼ活性は、ｅＩＦ４Ｂによって刺激される。さらに、ｅＩＦ４Ａはまた、遊離単量体形態で存在する。（翻訳開始経路のより詳細な図については、（非特許文献１７３）；（非特許文献１７４）；（非特許文献１７５）を参照のこと）。
【非特許文献１７３】Ｇｉｎｇｒａｓ  Ａ−Ｃ，Ｒａｕｇｈｔ  Ｂ，Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ  Ｎ（１９９９）ｅＩＦ４  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ：ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｔｏ  ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６８：９１３−９６３．
【非特許文献１７４】Ｈｅｒｓｈｅｙ  ＪＷＢ，Ｍｅｒｒｉｃｋ  ＷＣ（２０００）Ｔｈｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉｎ：Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ  Ｎ，Ｈｅｒｓｈｅｙ  ＪＷＢ，Ｍａｔｈｅｗｓ  ＭＢ，ｅｄｓ），ｐｐ  ３３−８８．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．
【非特許文献１７５】Ｄｅｖｅｒ  ＴＥ（２００２）Ｇｅｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ  １０８：５４５−５５６．
【図２−Ｂ】翻訳開始に対するシクロヘキシミドおよびＧＭＰ−ＰＮＰの効果およびＢＣｌＲＮＡがキャップ依存性開始において４８Ｓおよび８０Ｓ複合体アセンブリを阻害するという事実を示すグラフである。図２Ｂに示すように、８０Ｓ複合体を視覚化するために、３２Ｐ標識キャッピングおよびポリアデニル化α−チューブリンｍＲＮＡをシクロヘキシミドの存在下でプログラミングｍＲＮＡとして使用した。６００ｎＭのＢＣｌＲＮＡでは、８０Ｓ複合体形成は、６１％±５％減少することが見出された（リボ核タンパク質複合体ピークの勾配から測定；３実験）。
【図２−Ｃ】図１−Ｃに示すように、同様に、４８Ｓ前開始複合体のアセンブリをＧＭＰ−ＰＮＰの使用によって視覚化した。６００ｎＭのＢＣｌＲＮＡでは、４８Ｓ複合体形成が８１％±５％減少することが見出された（リボ核タンパク質複合体ピークの勾配から測定；３実験）。
【図２−Ｄ】図１−Ｄは、ＢＣｌＲＮＡと対照的に、同一濃度でのＵ４ＲＮＡでは４８Ｓ複合体アセンブリに対する効果はないことを証明する。図２Ｅは、ＢＣｌＲＮＡの存在下でポリアデニル化α−チューブリンｍＲＮＡに類似の範囲に非アデニル化α−チューブリンプログラミングｍＲＮＡ上の４８Ｓ複合体の形成を阻害することを立証する（図２Ｃと比較）。アセンブリした複合体を、スクロース密度勾配遠心分離によって分離した。沈殿は右から左であった。明確にするために勾配の上部由来の画分を除外した。Ｔｕｂ（Ａ）ｍＲＮＡ、ポリアデニル化（Ａ９８）α−チューブリンｍＲＮＡ；ＴｕｂｍＲＮＡ、非アデニル化α−チューブリンｍＲＮＡ。
【図３】ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳによって開始された翻訳のＢＣｌＲＮＡ阻害を示すリン光体画像診断の結果を示す図である。図３Ａ、３Ｃ、および３Ｄは、元のゲルであり、図３Ｂは６つのゲル（そのうちの１つを図３Ａの代表的な例として示す）のリン光体画像診断由来の結果を組み合わせたグラフである。図３Ａでは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）中にＥＭＣＶＩＲＥＳを含むプログラミングｍＲＮＡコードＧＦＰを非キャッピングで使用した。図３Ｂは、リン光体画像診断によって定量された６つの実験由来の結果であり、翻訳が３２０ｎＭ  ＢＣｌＲＮＡによって７９％抑制されることを示す（一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．００１；シェフェの多重比較後知恵解析（０ｎＭ  ＢＣｌＲＮＡコントロールとの比較）、全ての群についてはＰ＜０．００１（＊＊＊））。図３Ｃに示すように、対照として、Ｕ４ＲＮＡの存在下で同一のｍＲＮＡが翻訳された。図３Ｄは、ジシストロンプログラミングｍＲＮＡ由来のキャップ開始およびＩＲＥＳ開始翻訳の両方がＢＣｌＲＮＡによって抑制されることを証明する。第１のキャップ依存性シストロンは、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）をコードした。ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳは、第２のＧＦＰコードシストロンの前に存在した。
【図４】図４Ａおよび４Ｃは、リン光体画像診断のために得たゲルの例であり、その結果を図４Ｂにグラフで示す。図４Ｄは、ＣＳＦＶ  ＩＲＥＳによって媒介される翻訳および４８Ｓ複合体形成はＢＣｌＲＮＡによる抑制には無効であることを示すグラフである。キャッピングされないがポリアデニル化されたプログラミングｍＲＮＡはインフルエンザウイルス非構造タンパク質（ＮＳ’）の短縮バージョンをコードした。図４Ａおよび４Ｂで認められるように、翻訳効率は、漸増濃度のＢＣｌＲＮＡによって有意に変化しなかった（一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｐ＝０．９６９４、ｎ＝５）。図４Ｃは、核Ｕ４ＲＮＡはまた、ＣＳＦＶＩＲＥＳから開始された翻訳に影響を与えることができないことを証明する。図４Ｄに示すように、ＣＳＦＶ  ＩＲＥＳによって媒介された４８Ｓ複合体のアセンブリは、ＢＣｌＲＮＡによる阻害に無効であった（３実験）。上記のようにＧＭＰ−ＰＮＰの存在下で４８Ｓ複合体をアセンブリし、スクロース密度勾配遠心分離によって分離した（図２を参照のこと）。
【図５】転写因子ｅＩＦ４ＡおよびＰＡＢＰに対するＢＣｌＲＮＡの結合活性を示す図である。３２Ｐ標識ＢＣｌＲＮＡを使用して電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）実験を行った。図５Ａに示すように、ＢＣｌＲＮＡを非標識競合物ＲＮＡの存在下または非存在下でｅＩＦ４Ａとインキュベートした場合、非標識ＢＣｌＲＮＡはｅＩＦ４Ａへの結合を競合して移動度のシフトが有効に排除されたが、非標識ランダム配列（ＲＳ）ＲＮＡまたはｔＲＮＡではそうではなかった。図５Ｂは、ＢＣｌＲＮＡは全長ＰＡＢＰと共にバンドがシフトさせたことを証明する。非標識ＢＣｌＲＮＡで有効な競合が認められたが、非標識Ｕ４ＲＮＡまたはＵ６ＲＮＡでは認められなかった。図５Ｃに示すように、ＢＣｌＲＮＡとｅＩＦ４ＡおよびＰＡＢＰ（Ｎ末端セグメント）との同時インキュベーションにより、いずれかのタンパク質のみとのインキュベーションよりも実質的に移動度がシフトした。図５Ｄは、ラット脳抽出物において、ＢＣｌＲＮＡがより低い移動度の２つのバンドにシフトすることが認められることが確証される（レーン１）。ＰＡＢＰに特異的な抗体（レーン２）は、ＢＣｌＲＮＡとのスーパーシフト（ｓｕｐｅｒｓｈｉｆｔ）が認められるが、ＧＳＴに対するコントロール抗体（レーン３）では認められなかった。逆に、ＰＡＢＰを免疫枯渇した脳抽出物でＢＣｌＲＮＡの通常の移動度のシフトが減少した；主要なＢＣｌＲＮＡ複合体バンドの強度およびより高い移動度のバンドの外観の減少に留意のこと（レーン５）（ＢＥ、脳抽出物；ＩＤＢＥ、ＰＡＢＰ−免疫枯渇脳抽出物）。
【図６】培養における海馬ニューロンのシナプス神経突起マイクロドメイン中に因子ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｇ、およびＰＡＢＰが富化することを確証する免疫細胞化学的結果である。図６ＡではｅＩＦ４Ｇ、図６ＢではＰＡＢＰ、または図６ＣではｅＩＦ４Ａについてニューロンを標識した（赤色蛍光）。細胞を、シナプトフィジンに対する抗体で二重標識した（緑色蛍光）。ボックス内の樹状突起セグメントは、倍率を３倍にして挿入している。３つ全ての因子についての樹状突起標識シグナルが集合した外観を示すことに留意のこと。このようなクラスターはしばしば認められたが、常にシナプトフィジン点と同格で認められるわけではない。図６Ｄは、一次抗体とのインキュベートを省略したこと以外は同一の様式で実施した対照実験の結果を示す（スケールバーは１０μｍ）。
【図７】ヒトＢＣ２００ＲＮＡがそのげっ歯類対応物ＢＣ２００ＲＮＡと同一濃度範囲で翻訳を阻害することを証明するゲル写真である。３つの実験で使用したプログラミングｍＲＮＡは、図３Ａ／Ｂでも使用したＥＭＣＶ−ＩＲＥＳ／ＧＦＰｍＲＮＡであった。結果は、ヒトＢＣ２００ＲＮＡは、げっ歯類ＢＣｌＲＮＡと同様に、ＥＭＣＶ型の内部リボゾーム侵入によって翻訳開始が媒介される場合、翻訳の有効なリプレッサーであることを示す。
【図８】ＬＴＰ実験の代表的な電気生理学的記録を示す図である。歯状回におけるＬＴＰの経時変化を示す。動物の片側の貫通線維および歯状回に刺激電極および記録電極をそれぞれ移植した。各応答について、ＥＰＳＰ電場の初期勾配を測定した。反復刺激前後のベースラインの平均軌跡を挿入図に示す。斜線で示すように９０分間の刺激を印加した。各実験で少なくとも３０分間反復刺激後ベースラインを記録し、脳固定の直前に相乗作用の維持を評価した。
【図９】ＬＴＰ誘導後（図８に示す）のＢＣｌＲＮＡ発現のグラフを示す。各実験の使用動物数を示す（ｎ）。各動物について、３〜６切片を試験し、選択領域のシグナル強度を測定し、各領域の平均を確証した。（Ａ〜Ｃ）図は、実験群（２時間のＬＴＰおよび３時間のＬＴＰ）または対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）中の対応する側（ｓｉｄｅ）（左から右）における刺激海馬と非刺激海馬とのシグナル強度比を示す。Ａ、ＣＡ３（放射線維層）；Ｂ、ＣＡ１（放射線維層および錐体細胞層）；Ｃ、歯状回（分子層）。左（Ｌ）および右（Ｒ）海馬におけるＣＡ３放射線維層とＣＡ３錐体細胞層とのシグナル強度比をＤに示す（左側の刺激）。値を、平均±ｓｅｍ．で示す。分散分析（一元配置ＡＮＯＶＡ）により、いかなる比較領域間にも有意差は認められなかった（Ａ〜Ｄについてｐ＞０．１）。
【図１０】キンドリング実験の代表的な電気生理学的記録を示す図である。癲癇性ＡＤの誘導および発症を含む海馬ＥＥＧを示す。動物の片側のＣＡ３およびＣＡ１の放射線維層に刺激電極および記録電極をそれぞれ移植した。６０Ｈｚのトレーニングの後ＡＤを１０秒間供する。下のパネルは、より高い時間分解能でのＡＤを示す。海馬癲癇様活動の典型的な外観は、分極波上に示されたスパイクによって証明される（スパイクをこの図中にクリップする）。
【図１１】ＡＤ誘導後（図３に示す）のＢＣｌＲＮＡおよびＡｒｃｍＲＮＡの分布を示すオートラジオグラフィである。標識強度を、オートラジオグラフィシグナルの暗さで示す。示した脳領域は、海馬の背中線を含む。全ての実験において右側を刺激した。Ａ、ＡＤ誘導後のＢＣｌＲＮＡの発現；Ｂ、対照動物におけるＢＣｌＲＮＡの発現；Ｃ、ＡＤ誘導後のＡｒｃｍＲＮＡの発現。ＡｒｃｍＲＮＡ発現は、刺激歯状回（右半球）で強力に上方制御されるが、反対側も幾らか誘導される（Ｃ）。非刺激動物でＡｒｃｍＲＮＡの有意な発現は認められなかった（示さず）。Ａでは、刺激電極による穿刺を矢印で示す。ＣＡ３中の穿刺上に、新皮質を通過した電極の物理的挿入によるによるシグナルの減少線が認められた。対照動物では（Ｂ）、ＢＣｌ発現は、左半球よりも右半球で高い。ＡＤ誘導後、刺激（右側）海馬のＢＣｌ発現レベルは、非刺激（左側）のレベルに類似している（Ａ）。スケールバーは８００μｍ。
【図１２】対照および刺激動物におけるＢＣｌの発現および分布のヒストグラムであり、ＡＤ誘導により海馬のＣＡ３領域の海馬錐体細胞の樹状突起（ｓｏｍａｔｏｄｅｎｄｒｉｔｉｃ）のＢＣｌレベルが有意に減少する。図１２Ａ〜１２Ｃは、刺激海馬と非刺激海馬とのシグナル比または対照群中の対応する側（右から左）を反映するカラムを示す。対照動物は右海馬でより高いレベルのＢＣｌＲＮＡを発現することに留意のこと。刺激動物の海馬全体でＢＣｌ発現レベルが同側で減少するようであるが、このような減少はＣＡ３の放射線維層で統計的に有意であることが見出された（Ａ）。Ｄは、非刺激（左、Ｌ）および刺激（右、Ｒ）海馬側についてのＣＡ３放射線維層とＣＡ３錐体細胞層とのシグナル比を示す。分析動物数を（ｎ）で示す。各動物の４〜６切片（Ａ〜Ｃ）または３〜４切片（Ｄ）を試験した。Ａ、ＣＡ３；Ｂ、ＣＡ１；Ｃ、歯状回。Ａ〜Ｃについてスチューデントｔ検定を行った。ＣＡ３について有意差（１８％減少）が明らかとなったが（Ａ、ｐ＝０．０３１８）、ＣＡ１（Ｂ、ｐ＝０．０８０３）または歯状回（Ｃ、ｐ＝０．１７８１）では認められなかった。Ｄのデータ（ｐ＝０．５３４４）について分散分析（一元配置ＡＮＯＶＡ）を行った。有意性（ｐ＜０．０５）をアスタリスクで示す。
【図１３】ＡＤ誘導後の海馬のＣＡ３の中のＢＣｌＲＮＡの微視的分布を示す顕微鏡写真である。アスタリスクは、刺激側の電極移植によって穿刺された領域を示す。ＢＣｌ発現の放射線維層／錐体細胞層比は、ＡＤ誘導後に変化しなかった。Ｌｕｃ、淡明層；Ｐｙ、錐体細胞層；Ｒａｄ、放射線維層。スケールバーは２００μｍ。
【図１４】ＡＤの誘導によって組織が損傷しないことを確認するための対照実験で得られた顕微鏡写真である。Ａ、Ｂ、免疫細胞化学による痙攣動物のＣＡ３領域中のシナプス前特殊化（ｓｐｅｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）を視覚化した。Ｂは、刺激海馬中のシナプトフィジンの蛍光シグナル（赤）を示し、Ａは対照半球を示す。苔のような繊維状の末端は、刺激海馬および非刺激海馬の両方で豊富である。Ｃ、右半球のキンドリング後のＡｒｃｍＲＮＡの発現。刺激パラダイムは、本研究で使用した他のキンドリング実験と類似しているが、この場合、より一般的且つ両側のＲＮＡ誘導で得られた。電極穿刺周囲（矢印）を含む全海馬領域でＡｒｃｍＲＮＡ発現が誘導された。Ｌｕｃ、淡明層；Ｐｙ、錐体細胞層；Ｒａｄ、放射線維層。スケールバーは２５０μｍ（Ａ、Ｂ）、１０００μｍ（Ｃ）。
【図１５】図１５Ａは、プログラミングＥＭＣＶの翻訳の結果を示すゲルである。全長ｅＩＦ４Ａおよび／またはＰＡＢＰを使用してＲＲＬで適定した１００ｎＭＢＣｌＲＮＡの存在下でのＧＦＰｍＲＮＡ。ＧＦＰタンパク質バンドの相対シグナル強度を、リン光体画像診断によって定量し、各レーンについて列挙する。図１４Ｂは、３つの実験由来の結果のグラフであり、平均して、４００ｎＭのｅＩＦ４ＡおよびＰＡＢＰの両方の存在下での翻訳が非阻害翻訳の８６．７％に回復することを示す（一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．００１；シェフェの多重比較後知恵解析（レーン２との比較）、＊＊＊レーン１および４についてはＰ＜０．００１）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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