(57)【要約】定義されるような配列からなる超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３Ｒを含む免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を少なくとも１つ含み、ＭＣＰ−１またはエオタキシンを介する疾患または障害の処置に利用されるＭＣＰ−１結合分子が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列中に超可変領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３であって；当該ＣＤＲ１がアミノ酸配列Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒを有し、当該ＣＤＲ２がアミノ酸配列Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙを有し、そして当該ＣＤＲ３がアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを有する領域を含む免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ） ；およびその直接的に等価ものを少なくとも１つ含む抗原結合部位を含む、ＭＣＰ−１結合分子。
【請求項２】
配列中に超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’であって；当該ＣＤＲ１’がアミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａを有し、当該ＣＤＲ２’がアミノ酸配列Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒを有し、当該ＣＤＲ３’がアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏを有する領域を含む免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ） ；およびその直接的に等価なものを少なくとも１つ含む抗原結合部位を含む、ＭＣＰ−１結合分子。
【請求項３】
重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）可変ドメインの双方を含むＭＣＰ−１結合分子であって：
ａ）配列中に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３であって；当該ＣＤＲ１がアミノ酸配列Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒを有し、当該ＣＤＲ２がアミノ酸配列Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙを有し、そして当該ＣＤＲ３がアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを有する領域を含む免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）配列中に超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’であって；当該ＣＤＲ１’がアミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａを有し、当該ＣＤＲ２’がアミノ酸配列Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒを有し、そして当該ＣＤＲ３’がアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏを有する領域を含む免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
を含む抗原結合部位；
およびその直接的に等価なものを少なくとも１つ含む、ＭＣＰ−１結合分子。
【請求項４】
ヒト抗体である、請求項１、２または３に記載のＭＣＰ−１結合分子。
【請求項５】
１位のアミノ酸で開始し、１２２位のアミノ酸で終了する配列番号１に示される配列とほぼ同等のアミノ酸配列を有する第１のドメインか、あるいは先に記載された第１のドメインのいずれかと、１位のアミノ酸で開始し、１０９位のアミノ酸で終了する配列番号２に示される配列とほぼ同等のアミノ酸配列を有する第２のドメインを含む抗原結合部位を少なくとも１つ含む、ＭＣＰ−１結合分子。
【請求項６】
重鎖またはそのフラグメントをエンコードする第１のＤＮＡ構築物であって、
ａ）代替としてフレームワークおよび超可変領域を含む可変ドメインをエンコードする第１部分であって、当該超可変領域が、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる配列ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３中にあり；この第１部分が可変ドメインの最初のアミノ酸をエンコードするコドンで開始し、可変領域の最後のアミノ酸をエンコードするコドンで終了する部分、および
ｂ）重鎖定常部分またはそのフラグメントをエンコードする第２部分であって、重鎖の定常部分の最初のアミノ酸をエンコードするコドンで開始し、その定常部分またはフラグメントの最後のアミノ酸をエンコードするコドンで終了し、その後に停止コドンが続く部分を含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項７】
軽鎖またはそのフラグメントをエンコードする第２のＤＮＡ構築物であって、
ａ）代替としてフレームワークおよび超可変領域を含む可変ドメインをエンコードする第１部分であって、当該超可変領域が、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる配列ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’中にあり；この第１部分が可変ドメインの最初のアミノ酸をエンコードするコドンで開始し、可変領域の最後のアミノ酸をエンコードするコドンで終了する部分、および
ｂ）軽鎖定常部分またはそのフラグメントをエンコードする第２部分であって、軽鎖の定常部分の最初のアミノ酸をエンコードするコドンで開始し、その定常部分またはフラグメントの最後のアミノ酸をエンコードするコドンで終了し、その後に停止コドンが続く部分を含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項８】
原核細胞または真核細胞において複製可能であって、請求項６または請求項７に記載のＤＮＡ構築物を少なくとも１つ含む、発現ベクター。
【請求項９】
（ｉ）請求項８に記載の発現ベクターを用いて形質転換した組織を培養し、そして（ｉｉ）その培地からＭＣＰ−１結合分子を回収することを含む、ＭＣＰ−１結合分子の産生法。
【請求項１０】
エオタキシンと交差反応する、ＭＣＰ−１に対する抗体。
【請求項１１】
ｉ）ＭＣＰ−１およびエオタキシンのレセプターへの結合を阻害可能なエオタキシンと交差反応するＭＣＰ−１に対する抗体の、ＭＣＰ−１またはエオタキシンを介する疾患または障害の処置への使用；
ｉｉ）エオタキシンと交差反応し、そしてＭＣＰ−１およびエオタキシンのレセプターへの結合を阻害可能であるＭＣＰ−１に対する抗体を有効量患者に投与することを含む、患者におけるＭＣＰ−１またはエオタキシンを介する疾患または障害の処置法；
ｉｉｉ）エオタキシンと交差反応し、そしてＭＣＰ−１およびエオタキシンのレセプターへの結合を阻害可能であるＭＣＰ−１に対する抗体を含み、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と組み合わせた、医薬組成物；および
ｉｖ）エオタキシンと交差反応し、そしてＭＣＰ−１およびエオタキシンのレセプターへの結合を阻害可能であるＭＣＰ−１に対する抗体の、ＭＣＰ−１またはエオタキシンを介した疾患または障害の処置用の薬物調製への使用。
【請求項１２】
ＭＣＰ−１への結合に対して約５０ｐＭまたはそれより少ないＫＤを有する、ＭＣＰ−１に対する抗体。
【請求項１３】
ＭＣＰ−１の２４位にアルギニン残基を含むＭＣＰ−１の抗原性エピトープに結合する、ＭＣＰ−１に対する抗体。
【請求項１４】
実質的には後述、特に実施例を参照して示されようなすべての新規な化合物、製造法、方法、使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、ヒト単球遊走性タンパク質（ＭＣＰ）−１に対する抗体、および単球およびＴ細胞の遊走および活性化が関与する疾患および障害、例えば炎症性疾患の処置への当該抗体の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
公開された日本特許出願ＪＰ０５２７６９８６号（住友電気工業株式会社）には、ＭＣＰ−１を決定して、マクロファージの浸潤が関与する疾患を処置および治療するのに有益なヒトＭＣＰ−１に対するげっ歯類のモノクローナル抗体の調製法が記載されている。公開された日本特許出願ＪＰ０９０６７３９９号（三井東圧）には、炎症の治療に使用されるＥＢＶ形質転換ヒト末梢血細胞由来のヒトＭＣＰ−１に対するヒトモノクローナル抗体を記載されている。公開された日本特許出願ＪＰ１１０６０５０２号（帝人）には、ＭＣＰ−１インヒビター、特に脳梗塞の処置のためのヒト抗ＭＣＰ−１抗体の使用が記載されている。
我々は、今や単球およびＴ細胞の遊走および活性化が関与する疾患および障害の治療に使用されるヒトＭＣＰ−１に対する改良型の抗体を作成した。
【０００３】
従って本発明は、配列中に超可変領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３であって；当該ＣＤＲ１がアミノ酸配列Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒを有し、当該ＣＤＲ２がアミノ酸配列Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙを有し、そして当該ＣＤＲ３がアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを有する領域を含む免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ） ；およびその直接的に等価なものを少なくとも１つ含む抗原結合部位を含むＭＣＰ−１結合分子を提供する。
【０００４】
従って本発明は、配列中に超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’であって；当該ＣＤＲ１’がアミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａを有し、当該ＣＤＲ２’がアミノ酸配列Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒを有し、当該ＣＤＲ３’がアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏを有する領域を含む免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ） ；およびその直接的に等価なものを少なくとも１つ含む抗原結合部位を含むＭＣＰ−１結合分子にもまた提供する。
【０００５】
本発明の第１の態様は、上述で定義されるような重鎖可変ドメイン（ＶＨ）からなる単離した免疫グロブリンの重鎖を含むシングルドメインＭＣＰ−１結合分子を提供する。
【０００６】
本発明の第２の態様は、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）可変ドメインの双方を含むＭＣＰ−１結合分子であって、当該ＭＣＰ−１結合分子が：
ａ）配列中に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３であって；当該ＣＤＲ１がアミノ酸配列Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒを有し、当該ＣＤＲ２がアミノ酸配列Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙを有し、そして当該ＣＤＲ３がアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを有する領域を含む免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
ｂ）配列中に超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’であって；当該ＣＤＲ１’がアミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａを有し、当該ＣＤＲ２’がアミノ酸配列Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒを有し、そして当該ＣＤＲ３’がアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏを有する領域を含む免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
を含む抗原結合部位；
およびその直接的に等価なものを少なくとも１つ含む結合分子もまた提供する。
【０００７】
特に明記されないかぎり、いかなるポリペプチド鎖も、本明細書においてはＮ末端部で開始してＣ末端部で終了するアミノ酸配列を有するものとして示されている。
抗原部位がＶＨおよびＶＬドメインの双方を含む場合、これらが同じポリペプチド分子上に配置されていてもよく、あるいは好ましくは各ドメインが異なる鎖状にあって、ＶＨドメインが免疫グロブリンの重鎖またはそのフラグメントの一部分であってもよく、そしてＶＬが免疫グロブリンの軽鎖またはそのフラグメントの一部分であってもよい。
【０００８】
「ＭＣＰ−１結合分子」より、単独または他の分子を伴ってＭＣＰ−１抗原への結合が可能である任意の分子を意味する。結合反応は、特異性が無関係の抗体ではあるが好ましくは同じアイソタイプの抗体が使用されるネガティブコントロールテストを基準として、例えばレセプター、すなわちケモカインレセプター（ＣＣＲ）−２、例えばＣＣＲ２ＢへのＭＣＰ−１結合の阻害を定量するバイオアッセイ、または任意の結合アッセイを含む常法（定性アッセイ）により示され得る。有利には、本発明のＭＣＰ−１結合分子のＭＣＰ−１への結合が、例えばＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおいて示され得る。
例えば抗原結合分子としては、Ｂ細胞またはハイブリドーマにより産生されるような抗体、およびキメラのＣＤＲ移植またはヒト抗体、あるいはそのフラグメント、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂフラグメント、ならびに１本鎖またはシングルドメイン抗体が挙げられる。
【０００９】
１本鎖抗体は、通常１０〜３０個のアミノ酸、好ましくは１５〜２５個のアミノ酸でからなるペプチドリンカーにより共有結合した抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインから構成される。そのため、その構造は、重鎖および軽鎖の定常部分を含まず、小ペプチドのスペーサーは定常部分全体よりも抗原性が低くなるはずであると考えられる。「キメラ抗体」より、軽鎖若しくは重鎖、あるいはその双方の定常領域がヒト起源である一方で、重鎖および軽鎖の双方の可変ドメインがヒト以外（例えばマウス）起源、またはヒト起源ではあるが異なるヒト抗体に由来することを意味する。「ＣＤＲ移植抗体」より、超可変領域（ＣＤＲｓ）がヒト以外（例えばマウス）抗体または異なるヒト抗体といったドナー抗体由来である一方で、免疫グロブリンの抗体他の部分の全てまたはほぼ全て、例えば定常領域および可変ドメインの高度に保存された部分、すなわちフレーム領域がアクセプター抗体、例えばヒト起源の抗体であることを意味する。しかしながらＣＤＲ移植抗体は、フレームワーク中、例えば超可変領域に隣接するフレームワーク領域の一部分に、ドナー配列のうち数個のアミノ酸を含んでいてもよい。「ヒト抗体」より、重鎖および軽鎖の双方の定常領域および可変領域が全てヒト起源、またはヒト起源の配列とほぼ同等であるが、必ずしも同じ抗体由来のものではなく、そして例えば、ヨーロッパ特許第０５４６０７３ Ｂ１号、米国特許第５５４５８０６号、米国特許第５５６９８２５号、米国特許第５６２５１２６号、米国特許５６３３４２５号、米国特許第５６６１０１６号、米国特許５７７０４２９号、ヨーロッパ特許第０ ４３８４７４ Ｂ１号およびヨーロッパ特許第０ ４６３１５１ Ｂ１号中に一般用語で記載されるようにマウス免疫グロブリンの可変および定常部分遺伝子がヒトにおいて対応するものにより置き換えられたマウスから産生される抗体を包含する。
【００１０】
本発明の特に好ましいＭＣＰ−１結合分子は、これ以降実施例中に示されるようなヒト抗体、特にはＡＡＶ２９３、ＡＡＶ２９４およびＡＢＮ９１２抗体である（ＡＡＶ２９３抗体は、ヒトＩｇＧ３／κ抗体であり、ＡＢＮ９１２は、ヒトＩｇＧ４／κ抗体であるが、その他の点においては本質的に同等である。これ行以降実施例において示されるように、ＡＡＶ２９４抗体はヒトＩＧ１／κ抗体であり、ＶＨのＦＲ１、ＣＤＲ２およびＦＲ３と、ＶＬのＣＤＲ１’およびＦＲ３’における単一のアミノ酸変化を除いて、ＡＡＶ２９３と同等の可変ドメインを有する。
【００１１】
従って、好ましいキメラ抗体において、重鎖および軽鎖双方の可変ドメインはヒト起源であり、例えば配列番号１および配列番号２で示されるＡＢＭ９１２抗体の可変ドメインである、定常領域ドメインも、好ましくは例えば“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”， Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ． ｅｔ ａｌ． ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈに記載されるような好適なヒト定常領域ドメインを含む。
【００１２】
超可変領域は、好ましくはヒト起源ではあるけれども、任意の種類のフレームワーク領域を伴ってもよい。好適なフレームワーク領域は、前述のＫａｂａｔ Ｅ．Ａ．らの文献に記載されている。好ましい重鎖のフレームワークは、ヒトの重鎖フレームワーク、例えば配列番号１に示されるＡＢＮ９１２抗体のフレームワークである。それは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４領域からなる配列で構成される。同様に、配列番号２配列は、配列においてＦＲ１’、ＦＲ２’、ＦＲ３’およびＦＲ４’領域から構成される好ましいＡＢＮ９１２軽鎖フレームワークを示す。代替のフレームワーク領域は、好ましくはヒトフレームワーク領域が、例えば前述のＫａｂａｔ Ｅ．Ａ．らの文献中に記載されるように、配列番号１および配列番号２に示されるフレームワークに対して使用されてもよい。フレームワーク領域、特には超可変領域に隣接するフレームワークの一部分の数個のアミノ酸残基が、例えば結合特性に影響を及ぼす相対的に定義されたフレーム領域とは異なっていてもよい。
【００１３】
従って本発明はまた、１位のアミノ酸で開始し、１２２位のアミノ酸で終了する配列番号１に示される配列とほぼ同等のアミノ酸配列を有する第１のドメインかあるいは上述に記載されるような第１のドメインのいずれかと、１位のアミノ酸で開始し、１０９位のアミノ酸で終了する配列番号２に示される配列とほぼ同等のアミノ酸配列を有する第２のドメインを含む抗原結合部位を少なくとも１つ含むＭＣＰ−１結合分子もまた提供する。
【００１４】
すべてヒトにおいて自然発生的に見出されるタンパク質に対してもたらされるモノクローナル抗体が、典型的には非ヒト系、例えばマウスにおいて開発されている。この直接の結果の１つとして、ヒトに投与される場合にハイブリドーマにより産生されるような異種発生抗体が、主に異種発生免疫グロブリンの定常部分により介される所望でない免疫反応を引き起こす。このことから、長期間にわたり投与することができないように抗体の使用が明らかに制限される。従って、ヒトに投与する場合には、実質的に同種反応をもたらさないよいような１本鎖、シングルドメイン、キメラ、ＣＤＲ移植、または特にはヒト抗体を使用するのが特に好ましい。
【００１５】
前述の観点から、本発明の好ましいＭＣＰ−１結合分子は、
ａ）（ｉ）配列中に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む可変ドメインおよび（ｉｉ）ヒト軽鎖の定常部分またはそのフラグメントを含む免疫グロブリンの重鎖またはそのフラグメントであって；当該ＣＤＲ１がアミノ酸配列Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒを有し、当該ＣＤＲ２がアミノ酸配列Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙを有し、そして当該ＣＤＲ３がアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ有するもの、および
ｂ）（ｉ）ＣＤＲ３’超可変領域および任意でＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’超可変領域を含む可変ドメインおよび（ｉｉ）ヒト軽鎖の定常部分またはそのフラグメントを含む免疫グロブリンの軽鎖またはそのフラグメントであって；当該ＣＤＲ１’がアミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａを有し、当該ＣＤＲ２’がアミノ酸配列Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒを有し、そして当該ＣＤＲ３’がアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏを有するものを少なくとも１つ含むヒト抗ＭＣＰ−１抗体；
およびその直接的に等価なものから選択される。
【００１６】
代替として、本発明のＭＣＰ−１結合分子は、
ａ）超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を配列中に含む第１のドメインであって、当該超可変領域が配列番号１に示されるようなアミノ酸配列を有するもの
ｂ）超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含む第２のドメインであって、当該超可変領域が配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有するもの、および
ｃ）第１のドメインのＮ末端部と第２のドメインのＣ末端部か、あるいは第１のドメインのＣ末端部と第２のドメインのＮ末端部かのいずれかに結合するペプチドリンカーを含む抗原結合部位を含む１本鎖結合分子；
その直接的に等価なものから選択されてもよい。
【００１７】
周知のように、１個、２〜３個、または更に数個のアミノ酸の欠失、付加、または置換といったアミノ酸配列の小さな変化は、ほぼ同等の特性を有するオリジナルのタンパク質の対立形質をもたらし得る。
【００１８】
従って「その直接的に等価なもの」なる用語により、任意のＭＣＰ−１結合分子（分子Ｘ）であって、
（ｉ）全体としてみなされる超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、配列番号１に示されるような超可変領域と少なくとも８０％相同し、好ましくは少なくとも９０％相同し、より好ましくは少なくとも９５％相同し、そして
（ｉｉ）分子Ｘと同等のフレームワーク領域を有するが、配列番号１に示されるのと同等の超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を有する基準分子とほぼ同程度までＭＣＰ−１のレセプターへの結合を阻害可能であるものか、
あるいは結合部位当たり少なくとも２つのドメインを有する任意のＭＣＰ−１結合分子（分子Ｘ’）であって、
（ｉ）全体としてみなされる超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ’３が、配列番号１および２に示されるような超可変領域と少なくとも８０％相同し、好ましくは少なくとも９０％相同し、より好ましくは少なくとも９５％相同し、そして
（ｉｉ）分子Ｘ’と同等のフレームワーク領域および定常部分を有するが、配列番号１および２に示されるのと同等の超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を有する基準分子とほぼ同程度までＭＣＰ−１のレセプターへの結合を阻害可能であるもの、
のいずれかを意味する。
【００１９】
本発明の記載において、配列が同等でない残基として数えられるアミノ酸配列中のギャップまたは挿入部分を最適に整列化された場合、同様の位置に少なくとも８０％同等のアミノ酸残基を有するならば、アミノ酸配列は相互に少なくとも８０％相同となる。
【００２０】
ＭＣＰ−１のレセプターへの結合の阻害は、本明細書のこれ以降に示されるようなアッセイを含む種々のアッセイにおいて簡単に検定され得る。「同程度まで」なる用語により、基準の等価な分子が、上述に示されるアッセイの１つにおいて、統計的な基準において本質的同様のＭＣＰ−１結合阻害曲線を呈することを意味する。例えば、本発明のＭＣＰ−１結合分子は、典型的にはＭＣＰ−１のレセプター（ＣＣＲ２Ｂ）への結合の阻害に対して、上述のようなアッセイを実施した場合に、相応する基準分子のＩＣ５０の＋／‐５倍、好ましくはほぼ同じであるＩＣ５０を有する。
例えば、利用されるアッセイは、膜結合ＭＣＰ−１レセプター（ＣＣＲ２Ｂ）および本発明のＭＣＰ‐１結合分子によるＭＣＰ‐１結合の競合阻害アッセイ、例えばこれ以降、実施例で性召されるようなＳＰＡ法を用いるアッセイであってもよい。
【００２１】
より好ましくは、ヒトＭＣＰ−１抗体が少なくとも
ａ）１位のアミノ酸で始まり１２２位のアミノ酸で終了する配列番号１に示されるものとほぼ同等のアミノ酸配列を有する可変ドメインとヒト重鎖の定常部分を含む１つの重鎖；および
ｂ）１位のアミノ酸で始まり１０９位のアミノ酸で終了する配列番号２に示されるものとほぼ同等のアミノ酸配列を有する可変ドメインとヒト軽鎖の定常部分を含む１つの軽鎖
を含む。
【００２２】
ヒト重鎖の定常部分は、γ１、γ２、γ３、γ４、μ、α１、α２、δまたはε型からなるものであってもよく、好ましくはγ型、より好ましくはγ４型である一方、ヒト軽鎖の定常部分はκまたはλ型（λ１、λ２およびλ３サブタイプを含む）であってもよいが、好ましいのはκ型である。これらすべての定常部分のアミノ酸配列は、前述のＫａｂａｔ Ｅ．Ａ．らの文献において提供されている。
本発明のＭＣＰ−１結合分子は、組み換えＤＮＡ技術により産生され得る。この点から、該結合分子をエンコードする１以上のＤＮＡ分子が、構築され、適当なコントロール配列下に配置され、そして発現用の好適な宿主組織中に移入されなければならない。
【００２３】
従って非常に一般的には、
（ｉ）本発明のシングルドメインのＭＣＰ−１結合分子、本発明の１本鎖のＭＣＰ−１結合分子、その重若しくは軽鎖またはフラグメント、あるいは本発明のＭＣＰ−１結合分子をエンコードＤＮＡ分子、および
（ｉｉ）組み換え法による本発明のＭＣＰ−１結合分子の産生への本発明のＤＮＡ分子の使用が提供されている。
【００２４】
本発明の現状は、情報、すなわち超可変領域のアミノ酸配列およびそれらに対してコードされるＤＮＡ配列が本明細書において提供されると、当業者が本発明のＤＮＡ分子を合成できるようなものである。可変ドメイン遺伝子を構築する方法は、例えばヨーロッパ特許公報２３９ ４００号に記載されており、以下に示すように簡単に要約され得る：特異性が何であってもＭＡｂの可変ドメインをエンコードする遺伝子をクローニングする。そのフレームワークおよび超可変領域をエンコードするＤＮＡセグメントを決定して、フレームワーク領域をエンコードするＤＮＡセグメントが結合部で好適な制限部位と一緒に融合されるように超可変領域をエンコードするＤＮＡセグメントを除去する。常法によりＤＮＡ分子を突然変異誘発して適当な位置で、制限部位が産生され得る。２本鎖の合成ＣＤＲカセットを、請求項１または２で提供される配列に従ってＤＮＡ合成により調製する。これらのカセットは、フレームワークの結合部でリゲート可能であるような粘着性の末端部と一緒に提供される。
【００２５】
さらに、本発明のＭＣＰ−１結合分子に対してコードされるＤＮＡ構築物を得るために産生するハイブリドーマ細胞株からｍＲＮＡにアクセスする必要がない。従って、ＰＣＴ国際出願番号、ＷＯ９０／０７８６１号は、遺伝子のヌクレオチド配列についてのみの記述の情報が提供して、組み換えＤＮＡ技術による抗体産生に対する十分な教示を提供している。その方法は、多数のオリゴヌクレオチドの合成、ＰＣＲ法によるそれらの増幅、および所望のＤＮＡ配列を与えるためのスプライシングを含む。
【００２６】
重鎖および軽鎖定常部分をエンコードする好適なプロモーターまたは遺伝子を含む発現ベクターは、公的に利用可能である。従って本発明のＤＮＡ分子をいったん調製すると、それを適当な発現ベクターに簡単に移入し得る。１本鎖抗体をエンコードするＤＮＡ分子もまた、例えば国際特許ＷＯ８８／１６４９号において示されるように常法により調製され得る。
既述の観点から、どのハイブリドーマまたは細胞株の寄託も十分に記述の範囲に準拠している必要はない。
【００２７】
特定の実施態様において、本発明は以下に示すようなＭＣＰ−１の産生用の第１および第２ＤＮＡ構築物を含む：
第１のＤＮＡ構築物は、重鎖またはそのフラグメントをエンコードして、
ａ）代替としてフレームワークおよび超可変領域を含む可変ドメインをエンコードする第１部分であって、当該超可変領域が、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる配列ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３中にあり；この第１部分が可変ドメインの最初のアミノ酸をエンコードするコドンで開始し、可変領域の最後のアミノ酸をエンコードするコドンで終了する部分、および
ｂ）重鎖定常部分またはそのフラグメントをエンコードする第２部分であって、重鎖の定常部分の最初のアミノ酸をエンコードするコドンで開始し、その定常部分またはフラグメントの最後のアミノ酸をエンコードするコドンで終了し、その後に停止コドンが続く部分を含む。
【００２８】
第１部分は、１位のアミノ酸で開始して１２２位のアミノ酸で終了する配列番号１に示されるようなアミノ酸配列とほぼ同等のアミノ酸配列を有する可変ドメインをエンコードするのが好ましい。第１部分は、１位のヌクレオチドで開始して３６６位のヌクレオチドで終了する配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を有するのがより好ましい。また、第２部分は、ヒト重鎖の定常部分をエンコードするのが好ましく、ヒトγ４鎖の定常部分がより好ましい。この第２部分は、ゲノム起源（イントロンを含む）またはｃＤＮＡフラグメント（イントロンは除く）のＤＮＡフラグメントであってもよい。
【００２９】
第２のＤＮＡ構築物は、軽鎖またはそのフラグメントをエンコードして、
ａ）代替としてフレームワークおよび超可変領域を含む可変ドメインをエンコードする第１部分であって、当該超可変領域が、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる配列ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’中にあり；この第１部分が可変ドメインの最初のアミノ酸をエンコードするコドンで開始し、可変領域の最後のアミノ酸をエンコードするコドンで終了する部分、および
ｂ）軽鎖定常部分またはそのフラグメントをエンコードする第２部分であって、軽鎖の定常部分の最初のアミノ酸をエンコードするコドンで開始し、その定常部分またはフラグメントの最後のアミノ酸をエンコードするコドンで終了し、その後に停止コドンが続く部分を含む。
【００３０】
第１部分は、１位のアミノ酸で開始して１０９位のアミノ酸で終了する配列番号２に示されるようなアミノ酸配列とほぼ同等のアミノ酸配列を有する可変ドメインをエンコードするのが好ましい。第１部分は、１位のヌクレオチドで開始して３２７位のヌクレオチドで終了する配列番号２に示されるようなヌクレオチド配列を有するのがより好ましい。また、第２部分は、ヒト軽鎖の定常部分をエンコードするのが好ましく、ヒトκ鎖の定常部分がより好ましい。
【００３１】
本発明はまた、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’またはＣＤＲ３’残基のうちの１以上、典型的には２、３個だけが、配列番号１および２に示される残基から；例えば突然変異、例えば相応するＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発により変更されたＭＣＰ−１結合分子を含む。本発明は、そのように変更されたＭＣＰ−１結合分子に対してコードされるＤＮＡ配列を含む。本発明はまた、フレームワーク領域の残基のうちの１以上、典型的には２、３個だけが、配列番号１および第２に示される残基から変更された結合分子を含む。
【００３２】
第１および第２のＤＮＡ構築物において、第１および第２部分は、イントロンによって分離されてもよく、そして簡単に第１および第２部分の間のイントロン中にエンハンサーが配置されてもよい。このような転写されるが翻訳されないエンハンサーの存在により、効率的な転写が支援され得る。特定の実施態様において、第１および第２のＤＮＡ構築物は、有利なことにヒト起源の重鎖遺伝子のエンハンサーを含む。
【００３３】
各ＤＮＡ構築物を、好適な発現コントロール配列の制御下、特には好適なプロモーターの制御下に配置する。ＤＮＡ構築物が発現のために移入される宿主組織と適合するのであれば、いかなる種類のプロモーターも利用され得る。しかしながら、発現が哺乳類の細胞中で起こるのであれば、免疫グロブリン遺伝子のプロモーターを利用するのが特に好ましい。
【００３４】
所望の抗体を、培養細胞またはトランスジェニック動物中で産生してもよい。好適なトランスジェニック動物は、卵へのマイクロインジェクション法を含む常法により得ることができ、第１および第２のＤＮＡ構築物を、そのように調製された卵を適当な偽妊婦中に移入して所望の抗体を発現している子孫を選択する、好適なコントロール配列下に配置する。
【００３５】
抗体鎖を培養細胞中で産生する場合、そのＤＮＡ構築物は１つの発現ベクターまたは２つの分離しているが適合する発現ベクターのいずれかに挿入されなければならず、後者である方が好ましい。
従って、本発明は、上述のＤＮＡ構築物のうち少なくとも１つを含む原核または真核細胞株中で複製可能である発現ベクターもまた提供する。
【００３６】
ＤＮＡ構築物を含む各発現ベクターを、その後好適な宿主組織中に移入する。そのＤＮＡ構築物が２つの発現ベクター上に別々に挿入されれば、別々すなわち、細胞対して１種類のベクターに移入、またはに同時移入ができ、後者である方が好ましい。好適な宿主組織は、バクテリア、酵母、または哺乳類の細胞株であってもよく、後者の方が好ましい。哺乳類の細胞株がリンパ球、例えばミエローマ、ハイブリドーマ、または正常な不死化Ｂ細胞起源であって、いかなる内因性の重または軽鎖も発現しないもの、例えば２／０細胞株が特に好ましい。
【００３７】
哺乳類細胞での発現において、配列をコードするＭＣＰ−１結合分子は、ＭＣＰ−１結合分子の高度な発現を可能として支持する座位内で宿主細胞ＤＮＡ中に統合される。配列をコードするＭＣＰ−１結合分子が当該有利な座位中に統合された細胞が、細胞を発現するＭＣＰ−１結合分子量を基準として同定され、そして選択され得る。いかなる好適な選択可能マーカーも、ＭＣＰ−１結合分子コード化配列を含有する宿主細胞の調製に利用され得；例えばｄｈｆｒ遺伝子／メトトレキサートまたは同等の選択系が利用され得る。本発明のＭＣＰ−１結合分子の発現用の系としては、ヨーロッパ特許第０２５６０５５ Ｂ号、ヨーロッパ特許第０３２３９９７ Ｂ号、およびヨーロッパ特許出願第８９３０３９６４．４号において示されるようなＧＳベースの増幅／選択系が挙げられる。
【００３８】
本発明の更なる態様において、（ｉ）既述で定義されるような発現ベクターと一緒に形質転換される組織を培養して（ｉｉ）その培地からＭＣＰ−１結合分子を回収することを含むＭＣＰ−１結合分子の生産法が提供される。
本発明のＭＣＰ−１結合分子がヒト抗体、例えばＡＡＶ２９３、ＡＡＶ２９４またはＡＢＮ９１２抗体であるのがより好ましく、そして相応するハイブリドーマ細胞株の培養により、あるいは好ましくは抗体のアイソタイプまたは他の抗体機能若しくは特性を変えるために変更されたＤＮＡを含むヒト抗体に対してコードされるＤＮＡを含む組み換え細胞株から産生されて得る。
【００３９】
本発明により、ＡＡＶ２９４および特にはＡＡＶ２９３およびＡＢＮ９１２抗体が、組み換えヒトエオタキシン１と交差反応することが見出された。従ってこれら抗体は、ＭＣＰ−１のみならずエオタキシン１と有利に相互作用することができ、ＭＣＰ−１のレセプターへの結合の阻害に加えてエオタキシン１のレセプターへの結合を阻害するために利用され得る。エオタキシン分泌は、アレルギーおよび炎症性の気管支疾患、例えば喘息を含むアレルギー性疾患および障害に関与するものである。抗体、特にはキメラおよびＣＤＲ移植抗体、および特にはＭＣＰ−１およびエオタキシンに対する結合特異性を有するヒト抗体、例えばヒトＭＣＰ−１およびヒトエオタキシン、およびＭＣＰ−１またはエオタキシンにより介される疾患の処置へのそのような抗体の使用は、本発明の範疇に含まれる。
【００４０】
従って、本発明の更なる態様は、エオタキシンと交差反応するＭＣＰ−１に対する抗体を含む。
有利なことに本発明のこの態様の抗体は、ＭＣＰ−１のレセプターへの結合を阻害可能であり、そしてエオタキシンのレセプターへの結合を阻害可能である。
【００４１】
さらに更なる態様において、本発明は：
ｉ）ＭＣＰ−１およびエオタキシンのレセプターへの結合を阻害可能なエオタキシンと交差反応するＭＣＰ−１に対する抗体のＭＣＰ−１またはエオタキシンを介する疾患または障害の処置への使用；
ｉｉ）エオタキシンと交差反応し、そしてＭＣＰ−１およびエオタキシンのレセプターへの結合を阻害可能であるＭＣＰ−１に対する抗体を有効量患者に投与することを含む、ＭＣＰ−１またはエオタキシンを介する疾患または障害の患者の処置法；
ｉｉｉ）エオタキシンと交差反応し、そしてＭＣＰ−１およびエオタキシンのレセプターへの結合を阻害可能であるＭＣＰ−１に対する抗体を含み、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と組み合わせた医薬組成物；そして
ｉｖ）エオタキシンと交差反応し、そしてＭＣＰ−１およびエオタキシンのレセプターへの結合を阻害可能であるＭＣＰ−１に対する抗体の、ＭＣＰ−１またはエオタキシンを介した疾患または障害の処置用の薬物調製への使用
を含む。
これらの更なる態様において、ＭＣＰ−１抗体は、好ましくはエオタキシン１と交差反応し、エオタキシンを介した疾患は、好ましくはエオタキシン１を介した疾患である。
【００４２】
本明細書に示す目的で、抗体がＭＣＰ−１およびエオタキシンのレセプターへの結合がＡＡＶ２９４、ＡＡＶ２９３またはＡＢＮ９１２とほぼ同程度まで阻害可能であり、「同程度まで」が上述で定義されるような意味を有するならば、抗体は「ＭＣＰ−１およびエオタキシンのレセプターへの結合を阻害可能」となる。
【００４３】
本発明の記述において、「ＭＣＰ−１を介する疾患」および「エオタキシンを介する疾患」なる用語は、ＭＣＰ−１またはエオタキシン、特にはエオタキシン１が、直接的であっても間接的であっても疾患または病状の因果関係、発生、進行、持続、または病態を含む、疾患または病状に影響を及ぼす疾患および病状を包含する。
【００４４】
本発明の記述において、「処置」または「処置する」なる用語は、病気にかかる病気にかかりそうな危険性のある処置ならびに病気であるまたは疾患または病状にかかっていると診断された患者の処置を含み、予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ、ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）処置ならびに治療または疾患を緩和する処置の両方を意味し、病気の再発の抑制を含むものである。
【００４５】
ＡＡＶ２９３およびＡＢＮ９１２抗体は、ＭＣＰ−１に対して、既に報告されている抗ＭＣＰ−１抗体、例えば抗ヒトＭＣＰ−１抗体に対する親和性よりも高い結合親和性を有する。従ってＡＢＮ９１２は、ＭＣＰ−１への結合に対して約５０ｐＭよりも小さい、例えば４３ｐＭの解離平衡定数ＫＤを有する。この高い結合親和性によりＡＢＮ９１２は特には治療的適用に適切となる。
従ってさらに更なる態様において、本発明は、ＭＣＰ−１への結合に対して５０ｐＭ以下のＫＤを有する抗体を提供する。本発明のこの態様はまた、上述のエオタキシンと交差反応するＭＣＰ−１に対する抗体に対して示されるような、高親和性抗体に対する使用および組成物が挙げられる。
【００４６】
更に、本発明に従って、ＡＢＮ９１２抗体がＭＣＰ−１の２４位にアルギニン残基を含むＭＣＰ−１の抗原性エピトープに結合することが見出された。従ってＡＢＮ９１２抗体が、ＭＣＰ−１のレセプター（ＣＣＲ２Ｂ）への結合を直接阻害可能であるのが有利であり；Ａｒｇ２４は、ＭＣＰ−１のＣＣＲ２Ｂへの結合に対するＭＣＰ−１の重要な残基である。更に、ＡＢＮ９１２結合部位は、ＭＣＰ−１のＡｒｇ１８、およびＬｙｓ４９残基を含む。
【００４７】
従って、さらに更なる態様において本発明は、ＭＣＰ−１の２４位のアルギニン残基を含むＭＣＰ−１の抗原性エピトープに結合するＭＣＰ−１に対する抗体を含む。その抗原性エピトープがまた、ＭＣＰ−１の１８位にアルギニン、および４９位にリジン残基を含むが好ましい。同様に本発明の態様は、上述でエオタキシンと交差反応するＭＣＰ−１に対する抗体について示されるような使用、方法、および組成物を含む。
【００４８】
上述で定義されるようなＭＣＰ−１結合分子、特には本発明の第１および第２の態様によるＭＣＰ−１結合分子；エオタキシンと交差反応するＭＣＰ−１に対する抗体、特にはＭＣＰ−１およびエオタキシンのレセプターへの結合を阻害可能な抗体；ＭＣＰ−１への結合に対して約５０ｐＭまたはそれ以下のＫＤを有するＭＣＰ−１に対する抗体；そしてＭＣＰ−１の２４位のアルギニン残基を含むＭＣＰ−１の抗原性エピトープへ結合する抗体が、これ以降では「本発明の抗体」として示される。
本発明の抗体が、本発明の第１および第２の態様によるＭＣＰ−１結合分子であるのが好ましい。本発明の抗体がヒト抗体であるのが有利であり、最も好ましいのＡＢＮ９１２抗体またはその直接的に等価なものである。
【００４９】
本発明の抗体は、標的細胞上でＭＣＰ−１の効果を阻害し、従ってＭＣＰ−１を介する疾患および障害の処置における使用が指摘される。本発明の抗体のこれらおよび他の薬理学的特性は、標準的な検定法、例えば下に示すように示され得る：
１．ＭＣＰ−１のＣＣＲ２Ｂ発現細胞への結合の阻害
ＭＣＰ−１のシグナル伝達およびエフェクター機能に対する必須条件は、ＭＣＰ−１のレセプターＣＣＲ２Ｂとの相互作用である、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）技術が、本発明の抗体がＭＣＰ−１の当該レセプターを発現する細胞膜への結合を阻害するのを示すために利用される。
ＣＣＲ２Ｂ発現ＣＨＯ細胞の膜を濃度範囲のある標的抗体（例えば１０−１４Ｍ〜１０−８Ｍ）とインキュベートし、（１２５−Ｉ）ＭＣＰ−１の残りの結合を小麦胚凝集素ビーズを用いてＳＰＡにより測定する。本発明の抗体は、典型的には約０．１〜約１０ｎＭの範囲、特にこのアッセイで検定したときは約０．５ｎＭ（例えば４６１±２０６ｐＭ）のＩＣ５０を有する。
【００５０】
２．ＭＣＰ−１を介したシグナル伝達の阻害
ＭＣＰ−１により誘発される本発明の抗体の生理的影響を阻害する能力は、抗体の存在および非存在中でのＭＣＰ−１誘発性の細胞内Ｃａ２＋の流動を測定することにより決定される。
カルシウム反応の測定は、安定にトランスフェクションされたＣＣＲ２Ｂ発現ＣＨＯ細胞株およびＴＨＰ−１細胞により、本明細書の後述の実施例に示されるような蛍光色素およびＦＡＣＳ分析を利用して実施される。本発明の抗体は、典型的には約０．０５〜約１０ｎＭ、特にこのアッセイで検定した場合は約０．５ｎＭ（例えば３９０±２０ｐＭ）のＩＣ５０を有する。
【００５１】
本発明の抗体は、有利なことにエオタキシン、特にはエオタキシン１と交差反応し、そのため有利なことに標的細胞上でエオタキシンの効果を阻害し得、従って更にエオタキシンを介した疾患および障害の処置における使用が指摘される。本発明の抗体のエオタキシンとの交差反応性は、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）（Ｋａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． １９９１； １４５： ２２９−２４０）のような最適なバイオセンサー技術を用いて検定され得る。
【００５２】
上述のアッセイにおいて示されるように、本発明の抗体はＭＣＰ−１のその効果を強力に阻害し、好ましくはエオタキシンと交差反応する。従って本発明の抗体は、以下に示すような薬学的有用性を有する：
本発明の抗体は、ＭＣＰ−１またはエオタキシンが介する疾患または病状の予防および処置に対して有益である。ＭＣＰ−１は、白血球輸送、特には炎症部位への単球遊走において重要な役割を果たす。本発明の抗体は、例えば炎症性の症状、アレルギーおよびアレルギー症状、自己免疫疾患、移植の拒絶反応、白血球の浸潤が関与する癌、狭窄または再狭窄、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、および骨粗鬆症において単球の遊走を阻害するために利用され得る。
【００５３】
本発明の抗体で処置し得る疾患または症状としては以下のものが挙げられる：
呼吸器アレルギー疾患、喘息、アレルギー性鼻炎、ＣＯＰＤ、過敏性肺疾患、間質性肺疾患（ＩＬＤ）、（例えば特発性灰線維症、またはＲＡ、ＳＬＥ等のような自己免疫疾患と関係するＩＬＤ）を含む炎症性またはアレルギー症状；アナフィラキシーまたは過敏性反応、薬物アレルギー（例えばペニシリンまたはセファロスポリンに対する）、および虫刺されアレルギー；クローン病および潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患；脊椎関節症、内臓悪性腫瘍；皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、蕁麻疹、血管炎のような乾癬および炎症性皮膚疾患；自己免疫疾患、特には骨喪失、炎症性痛覚、過敏症（気道性過敏症および皮膚性過敏症の双方を含む）およびアレルギーを含む、関節炎（例えば関節リウマチ、進行性慢性リウマチ、乾癬性関節炎および変形性関節炎）およびリウマチ性疾患のような炎症性成分を含む病因のある自己免疫疾患。
【００５４】
本発明の抗体が利用され得る特定の自己免疫疾患としては、自己免疫血液障害（例えば、溶血性貧血、再性不良性貧血、真正赤血球性貧血および特発性血小板減少症を含む）、全身性エリテマトーデス、多発性軟骨炎、内臓悪性腫瘍、ヴェグナー肉芽腫症、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、乾癬、スティーブンジョンソン症候群、特発性スプルー、自己免疫炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病および過敏性腸症症候群を含む）、自己免疫甲状腺炎、ベーチェット病、内分泌系眼障害、グレーブス病、サルコイドーシス、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、若年性製糖尿病（Ｉ型糖尿病）、ブドウ膜炎（前部および後部）、乾性角結膜炎および春季角結膜炎、間質性肺線維症、および糸球体腎炎（例えば特発性ネフローゼ症候群または微小変化型腎症を含むネフローゼ症候群を伴なうものおよび伴わないもの）；同種移植の拒絶反応または異種移植の拒絶反応を含む移植の拒絶反応（例えば、心臓、肺、心肺コンビネーション、肝臓、腎臓、膵臓、皮膚、または角膜移植を含む移植）または移植片体宿主病、および臓器移植による動脈硬化症；アテローム性動脈硬化症；皮膚または臓器の白血球浸潤を伴なう癌；血管系インターベンション、ならびに新生内膜の過形成の結果引き起こされる狭窄または再狭窄を含む微小血管系、特に動脈、例えば冠動脈の狭窄または再狭窄；および再灌流障害、血管系悪性腫瘍、サイトカインによる毒性（例えば敗血性ショックまたはエンドトキシンショック）、多発性筋炎、皮膚筋炎、および肉芽腫病（サルコイドーシスを含む）を含む炎症性反応が関与する他の疾患または障害が挙げられる。
【００５５】
本発明の抗体は、特に骨関節炎および他の炎症性関節炎疹、例えば関節リウマチを含む骨および軟骨の代謝の疾患、そして加齢に伴なう骨喪失を含む一般的な骨喪失、特に歯周病の処置に有益である。
上述の適応症に対して、もちろん適用量は、例えば、特には使用される本発明の抗体、宿主、投与形態、および処置されるべき症状の性質および重症度によって変動する。しかしながら予防的使用において、体重のキログラム当たり約０．０５ｍｇ〜約１０ｍｇ、通常では体重のキログラム当たり約０．１ｍｇ〜約５ｍｇの用量で有効な結果が得られると一般的には示されている。予防的利用に対する服用頻度は、通常は１週間にほぼ１回〜３ヶ月ごとにほぼ１回の範囲であり、通常では、２週間ごとにほぼ１回〜１０週間ごとにほぼ１回、例えば４または８週間ごとに１回である。本発明の抗体は、経口で、静注（例えば前腕前部または他の末梢の血管中に）で、例えば筋注で、または皮下に簡単に投与可能である。例えば予防的処置は、典型的には本発明の抗体を１ヶ月ごとに１回〜２、３ヶ月ごとに１回、またはそれより少ない頻度で投与することを含む。
【００５６】
本発明の医薬組成物は、従来法で製造してもよい。本発明による組成物は、凍結乾燥した状態で提供されるのが好ましい。迅速に投与するために、それを水溶性の担体、例えば注射用滅菌水または滅菌濾過生理食塩水中に溶解させる。もし、大量瞬時投与ではなくてむしろ注入による投与のために大容量の溶液とするのが望ましいとみなされれば、製剤時にヒト血清アルブミンまたは患者自身のヘパリン処置した血液を生理食塩水中に取り込むのが有利である。そのような生理的に不活性なタンパク質が過剰に存在することにより、注入溶液に利用される容器およびチューブの壁上への吸着による抗体のロスが回避される。アルブミンが使用されるのであれば、好適な濃度は、生理食塩水の量の０．５〜４．５％である。
【００５７】
本発明は、以下に示す添付の図面を参照する実施例においてのみ説明することにより更に示される。
図１Ａは、処置または未処置のアカゲザル由来の種々のパンチ生検に対する好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）活性を示すグラフであり；
図１Ｂは、その生検に対するミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性を示す同様のグラフであり；
図２は、ＡＢＮ９１２およびＢＣＧＰ４４２９０（コントロール抗体）での処置前および後の両方における４頭のアカゲザルからの組織試料に対する好酸球染色を示す写真であり；
図３は、種々の処置法に対するヒト皮膚移植のＴｈ細胞遊走（％）を示すグラフであり；そして
図４は、ＭＣＰ−１の結合に対するＡＢＮ９１２変異体の相対的結合親和性を示すグラフである。
【００５８】
実施例
マウス免疫グロブリン能の代わりにヒトＩｇＧ／κ能を発現するように作成されたトランスジェニックマウス（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４， ８４５−８５１）を、ヒトＭＣＰ−１に対する抗体を産生するために使用する。これらマウス由来のＢ細胞は、標準的なハイブリドーマ技術により不死化させて、ヒトＩｇＧ３／κ抗体ＡＡＶ２９３を分泌するマウスのハイブリドーマ細胞を得る。
【００５９】
実施例１：マウスの免疫化とハイブリドーマ細胞株の産生
免疫化
４匹のＭｅｄａｒｅｘマウス（マウス番号第１６１９４−１６１９７番、Ｍｅｄａｒｅｘ Ｉｎｃ． Ａｎｎａｄａｌｅ， ＮＪ， ＵＳＡ）を、組み換えヒトＭＣＰ−１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ， ＵＳＡ）で０および１４（ｉ．ｐ．）および２６（ｉ．ｖ．）日目に、完全フロイントアジュバント中にマウス当たり１００μｇのタンパク質を用いて免疫する。更にマウスをｒｈＭＣＰ−１で、０および４９および６５日目に皮下投与で不完全フロイントアジュバント中にマウス当たり１００μｇのタンパク質を用いて免疫する。１０６日目にアッセイするときに、マウスのうちの１匹（マウス番号第１６１９４番）において実質的な抗ＭＣＰ−１抗体価を検定する。このマウスを、融合前に更に７回追加免疫する：１０６日目（ｉ．ｐ．）、１１９日目（ｓ．ｃ．）および１３５（ｉ．ｖ．）日目に生理食塩水中にマウス当たり１００μｇと、融合４日前（ｉ．ｖ．とｉ．ｐ．を２回）、３日前および２日前（両方ともｉ．ｐ．）に生理食塩水中にマウス当たり２５μｇ。
【００６０】
融合およびハイブリドーマ選択
融合時にマウス１６１９４番をＣＯ２吸入により屠殺して、すべての脾臓細胞（４．８ｘ１０７）をＰＥＧ４０００を用いて常法により、ＰＡＩ−Ｏ細胞（５ｘ１０７）、マウスの細胞株に融合する。ＲＰＭＩ１６４０、１０％ 熱不活性化ウシ胎仔血清、５ｘ１０−５Ｍ β−メルカプトエタノール、５０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシンを補充したＨＡＴにおいて、マウス腹腔細胞（Ｂａｌｂ／ｃマウス）のフィーダー層を含有する７２０ウェル（１ｍｌ／ウェル）中に、融合細胞をプレーティングする。培養培地は４日ごとに交換し、１４日以降はＨＡＴ培地をＨＴ培地に交換した（すなわちアミノプテインを除いた）。プレーティングした最初の７２０ウェルのうち、４６１ウェル（６４％）が陽性のハイブリドーマ成長である。上清を回収して、ＭＣＰ−１反応性モノクローナル抗体についてＥＬＩＳＡでスクリーニングする。ＩｇＧサブクラスの７つのモノクローナル抗体が同定される。４ｘ９６ウェルのマイクロタイタープレートを用いて、ウェル当たり０．５細胞／１００μｌでプレーティングして、クローニングを実施する。クローンは、８日後に顕微鏡でチェックして、成長培地を１００μｌ添加して、上清を次の日にＥＬＩＳＡで検定する。最も反応性の高いハイブリドーマである、クローン１４９を更にクローニングして特性評価するために選択する。ＩｇＧ３／κ抗体生成物、ＡＡＶ２９３のｒｈＭＣＰ−１依存カルシウム代謝アッセイにおける阻害活性に基づいて、ハイブリドーマサブクローン１４９−１２を選択する。
【００６１】
重鎖および軽鎖の純度および部分アミノ酸配列
アミノ酸配列決定
精製した抗体ＡＡＶ２９３の軽鎖および重鎖を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離して、エドマン分解によりアミノ末端のアミノ酸を決定する。重鎖および軽鎖可変ドメインに対してコードされるｃＤＮＡ配列は、クローニングしたハイブリドーマ由来のｍＲＭＡから得られるｃＤＮＡのＰＣＲ増幅により得られ、そして完全に配列決定される。重鎖および軽鎖可変ドメインおよび相応するＤＮＡ配列のアミノ末端アミノ酸配列は、以下の配列番号１および配列番号２に示され、配列中ＣＤＲが太字で示されている。
【表１】
2004502421.tif 000002
【表２】
2004502421.tif 000003
【００６２】
更なる抗ＭＣＰ−１モノクローナル抗体、ＩｇＧ１／κモノクローナル抗体生成物、ＡＡＶ２９４も、上述で示すように得られる。この抗体は、ＡＡＶ２９３抗体の３分の１の親和性でＭＣＰ−１に結合して、ＶＨＡＡＶ２９４において、２４位のＡｌａの位置にＶａｌ、６０位のＴｙｒの位置にＰｈｅおよび７４位のＡｓｎの位置にＳｅｒを有し、そしてＶＬＡＡＶ２９４において、３０位のＳｅｒの位置にＴｙｒおよび６９位のＰｒｏの位置にＴｈｒを有することを除いては、ＡＡＶ２９３抗体と同等のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を有することが見出されている。
【００６３】
重鎖および軽鎖に対する発現ベクターの構築
クローニングされたＶＬおよびＶＨを、エンコードする配列をＰＣＲで増幅して、免疫グロブリンプロモーター、ＲＦＴ２抗体（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４３， ３５８９−９７）由来のリーダー配列、Ｊセグメントの一部分およびスプライスドナー部位を備えたカセットベクター中に、適当な制限部位を介して挿入する。分泌に対してＶＬ領域全体、プロモーターおよびリーダー配列を含有する軽鎖カセットを、ヒトＣｋ遺伝子、免疫グロブリン重鎖エンハンサー、およびメトトレキサート（ＭＴＸ）により選択される変異型マウスｄｈｆｒ ｃＤＮＡを含有する発現ベクター中に移入する。
従って重鎖カセットは、ヒトＩｇＧ４遺伝子、免疫グロブリン重鎖エンハンサー、および選択されたネオマイシン耐性遺伝子をエンコードする発現ベクター中に移入される。
【００６４】
重鎖および軽鎖は双方とも発現ベクター中では、高度な発現に欠かせないと考えられている再配置した免疫グロブリン遺伝子のゲノム構造に似た構造となる。
抗体産生のために、上述のベクターを、適当な宿主細胞株、例えばＳＰ２／０細胞株中に同時形質移入する。そのベクター配列を含む細胞を、メトトレキサート選択により選択し、選択された細胞株を培養してＡＢＮ９１２抗体（ヒトＩｇＧ４／κ抗ヒトＭＣＰ−１抗体）を発現させる。
【００６５】
ＮＶＰ−ＡＢＮ９１２の重鎖および軽鎖遺伝子をそれぞれ保有する発現ベクターを線形化して、ＳＰ２／０細胞をエレクトロポレーション法によりトランスフェクトした。そのトランスフェクトされた細胞は、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を有する非選択的ＲＰＭＩ培地中で２０時間成育して、Ｇ４１８選択を１．４ｍｇ／ｍｌで４８−７２時間適用した。トランスフェクションしたプールを、一般的に使用される添加剤（ピルビン酸塩、グルタミン、ヒト血清アルブミン、トランスフェリン、インシュリン）を含有するＦＣＳフリーのＲＰＭＩ培地に適応させた。高生産クローンを２００ｎＭおよび１μＭのメトトレキサートを用いた２段階増幅後に単離した。クローンおよびサブクローンの生産安定性は、４〜５ヶ月の継続培養の期間にわたってＴ１７５培地中で、攪拌実験を追加して評価した。高生産クローンに対して、実験室規模からバイオリアクターまでスケールアップして実施した。ＡＢＮ９１２の産生に有益な７種の高生産細胞株が得られた。過剰成育培地中で得られる最大の累計生産量は、５０４ｍｇ／ｌであった。
【００６６】
実施例２：生化学的および生物学的データ
ヒトモノクローナル抗体、ＡＢＮ９１２は、ヒトＭＣＰ−１に結合して、インビトロではその機能が失われる。Ｂｉａｃｏｒｅ分析およびシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）分析による２つの別々の生化学的方法により、組み換えヒトＭＣＰ−１への結合に対して、該モノクローナル抗体を更に特性評価する。他のＣＣ−ケモカインまたは非ヒトＭＣＰ−１に対するＡＢＮ９１２抗体の特異性をＢＩＡｃｏｒｅにより評価し、ＡＢＮ９１２によるＭＣＰ−１のＣＣＲ２Ｂ発現細胞への結合の阻害をＳＰＡにより示す。組み換えおよび自然発生的に産生されるＭＣＰ−１に対するＡＢＮ９１２の生物学的活性は、ＣＣＲ２Ｂ発現細胞におけるＣａ２＋代謝アッセイにより示す。天然の標的細胞、ヒト末梢血単球（ｈＰＢＭＣｓ）に対するＡＢＮ９１２の活性は、ＭＣＰ−１による走化能アッセイにより示す。
【００６７】
２．１　ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ
組み換えヒトＭＣＰ−１の固定化ＡＢＮ９１２への結合に対する結合速度定数および解離速度定数をＢＩＡｃｏｒｅ分析により決定して、Ｋｄ値を導き出す。ＡＢＮ９１２をセンサーチップの表面に固定して、組み換えＭＣＰ−１の結合を表面プラズモン共鳴法（ＢＩＯＣＯＲＥ ２０００ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， Ｍａｒｃｈ １９９９（Ｖｅｒｓｉｏｎ ＡＣ）；ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｂｉａｃｏｒｅ．ｃｏｍ）により測定する。得られた結果を下の表に示す。
【表３】
2004502421.tif 000004
ＡＢＮ９１２は、非常に高い親和性で組み換えヒトＭＣＰ−１に結合する。
【００６８】
２．２．　ケモカイン選択性と種特異性プロファイル
ＭＣＰ−１のＡＢＮ９１２との相互作用の特異性を検定するために、いくつかの非ヒトＭＣＰ−１およびＣＣ−ケモカインを、ＡＢＮ９１２との相互作用の潜在能力についてＢＩＡｃｏｒｅにより評価する。
【００６９】
２．２．１　非哺乳類ＭＣＰ−１との相互作用
ＡＢＮ９１２抗体への結合について、研究室で一般的に利用される種由来の一連のＭＣＰ−１を評価する。定量は、ＡＢＮ９１２で前もってロードしたＢＩＡｃｏｒｅフローセル中に５ｎＭ ケモカイン溶液を注入することにより実施する。８分後、検定された各ケモカインについて結合したケモカイン量を定量する。得られた結果は、組み換えヒトＭＣＰ−１（１００％）と比較した各ケモカインの結合％として下の表に示す。
【表４】
2004502421.tif 000005
ＡＢＮ９１２はヒトＭＣＰ−１特異的であり、試験された他のいかなる種のＭＣＰ−１とも交差反応しない。
【００７０】
２．２．２　組み換えケモカインとの相互作用
ＡＢＮ９１２の他のＣＣ−ケモカインとの交差反応性のプロファイルを検定するために、それらの抗体に対する結合潜在性を、上述の方法により評価する。組み換えヒトＭＣＰ−１（１００％）と比較した各ケモカインの結合％を下の表に示す。
【表５】
2004502421.tif 000006
ＡＢＮ９１２は、ヒトＭＣＰ−１特異的であり、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＬＥＣ、ＰＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βとは交差反応しないが、ヒトエオタキシン、すなわちヒトエオタキシン−１とは有意に交差反応する。ＡＡＶ１９４もまた、エオタキシンと有意に交差反応することが見出されている。
【００７１】
２．３　ＭＣＰ−１のＣＣＲ２Ｂ発現細胞への結合の阻害
ＡＢＮ９１２抗体がＭＣＰ−１がＣＣＲ２Ｂレセプターを発現している細胞膜に結合するのを阻害することを示すために、ＳＰＡ（シンチレーション近接アッセイ）技術が利用される。ＣＣＲ２Ｂ発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ＃８４、下記参照）の細胞膜を１０−１４Ｍ〜１０−８Ｍの濃度範囲でＡＢＮ９１２とインキュベーションして、放射活性（１２５−Ｉ）−ＭＣＰ−１の残りの結合を小麦胚凝集素ビーズを用いてＳＰＡにより測定する。３回別々の試験により得られる平均ＩＣ５０［Ｍ］は、（４６１±２０６）ｘ１０−１２である。ＡＢＮ９１２は、ＭＣＰ−１のＣＣＲ２Ｂレセプターを発現する細胞膜への結合を阻害する。
【００７２】
２．４　ＭＣＰ−１を介した情報伝達の阻害
ＭＣＰ−１による情報伝達の初期事象は細胞内Ｃａ２＋の代謝であり、これは蛍光色素を用いて測定可能である。
カルシウム応答の測定は、細胞株ＣＨＯ＃８４、すなわちトランスフェクションしてケモカインレセプターＣＣＲ２Ｂを発現させたＣＨＯ細胞株を用いて実施する。ＣＨＯ＃８４細胞をリボヌクレアーゼおよびデオキシリボヌクレアーゼを含まないで、１０％ 透析ＦＣＳ、２００Ｕ／ｍｌ ペニシリン／ストレプトマイシンおよび選択剤として８０ｎＭ メトトレキサートを補充したｇｌｕｔａｍａｘ−１を有するＭＥＭアルファ培地中で培養する。培養細胞が密ではあるが集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）となる前に細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡと短時間（最大１分）インキュベーションして剥離する。
【００７３】
ＣＨＯ＃８４細胞を、２５０ｇで７分間遠心分離してＲＰＭＩ中で１回洗浄し、０．０４％ ｐｌｕｒｏｎ酸、１．０μＭ ｆｕｒａ レッドおよび０．３μＭ ｆｌｕｏ−３を含有するＨｅｐｅｓ緩衝液０．５％ ＢＳＡ中に３．５ｘ１０６細胞／ｍｌで再懸濁する。細胞をこれらの蛍光カルシウムプローブで１時間、暗室中室温で時々（６〜８回）ゆっくりと攪拌しながらロードする。その後細胞を、遠心分離によりＨｅｐｅｓ緩衝液０．５％ ＢＳＡ中で２回回収し、そしてペレットをＨｅｐｅｓ緩衝液０．５％ ＢＳＡ中、１．５〜２ｘ１０６細胞／ｍｌで再懸濁させる。これで細胞は刺激およびカルシウム代謝の準備ができており、使用まで暗室中室温で保存される。
【００７４】
抗体およびケモカイン（ＭＣＰ−１、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ， ＵＳＡ）は両方とも、２０倍濃縮溶液として調製され、細胞へ添加する５〜８分前に室温で一緒に混合される。フローサイトメーター（ＦＡＣＳ、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて緑および赤の両方の蛍光を時間に対して定量する。各細胞試料について、蛍光Ｃａプローブで予めロードした細胞の蛍光を、ベースライン値を得るために最初に１５秒間記録する。データ獲得は、少量の刺激物（抗体を伴なうまたは伴わない１０倍濃度のケモカイン）の添加により細胞を刺激するために短期間中断して蛍光測定を再開する。蛍光測定はトータルで５１秒間持続する。
【００７５】
用いたＣａ＋インジケーターは、蛍光強度においてカルシウムへの結合に対して相反したシフトを呈し；ｆｕｒａレッドは蛍光が減少する一方でｆｌｕｏ−３の蛍光は上昇する。各試験について、赤および緑の蛍光を記録し、緑と赤との蛍光の比を計算して、時間に対してプロットする。「ベースライン比」および「刺激の割合」は、それぞれ刺激直前に得られる比の平均値および刺激後に得られる最大の割合の平均値として定義される。反応強度は、「刺激の割合」を「ベースライン比」で割って得られる刺激指標（Ｓ．Ｉ．）により数値化する。抗体の存在中で得られる刺激指標は、溶媒のみの存在中で得られるＳ．Ｉ．の％として示される。
溶媒Ｓ１中での抗体Ａ１の阻害（％）は式：
１００−［Ｓ．Ｉ．Ａ１ｘ１００／Ｓ．Ｉ．Ｓ１］
で与えられる。
【００７６】
ＡＢＮ９１２による阻害を、その前駆体抗体、ＡＡＶ２９３、および流通により入手可能な無関係の抗ＭＣＰ−１マウス抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）の阻害と比較する。また、ＡＡＶ２９３をもたらすために使用される免疫原が、大腸菌由来の非グリコシル化組み換えヒトＭＣＰ−１であることから、ＴＮＦα誘導ＨＵＶＥＣ（臍帯静脈内皮細胞）由来のＭＣＰ−１上清もまた、ＣＨＯ＃８４細胞を刺激するために利用し、ＡＢＮ９１２のＣａ２＋代謝に対する拮抗効果は、上述のように測定する。得られた結果を下の表に示す。
【表６】
2004502421.tif 000007
ＡＢＮ９１２は、ＣＨＯ＃８４細胞中でＭＣＰ−１によるＣａ２＋代謝を特異的に阻害し、大腸菌由来のＭＣＰ−１およびＵＶＥＣ由来のＭＣＰ−１の双方についても同様の効能を有する。
【００７７】
２．５　ＭＣＰ−１誘発走化能の阻害
ＡＢＮ９１２のｈＰＢＭＣ（ヒト末梢血単球細胞）に対するＭＣＰ−１の走化効果を阻害する能力は、走化能アッセイをベースにしたボイデンチャンバー中で測定される。ＨＰＢＭＣをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（登録商標）を用いて調製して、ｍｌ当たり２ｘ１０６の単球をインプットとして使用する。ＡＢＮ９１２または無関係の抗体（ネガティブコントロール）をチャンバーの底および先端のコンパートメントに指示されたモル比で添加する。チャンバー底において５．７ｎＭ 組み換えヒトＭＣＰ−１または１ｎＭ ｆＭＩＦＬ（ネガティブコントロール）により走化を誘発する。細胞は、チャンバーの先端からチャンバーの底まで室温で９０分間遊走可能とする。遊走した細胞の数を染色およびカウントにより測定する。ＡＢＮ９１２は、ＭＣＰ−１誘発性のｈＰＢＭＣｓの走化を用量依存的に阻害する。ＡＢＮ９１２のＭＣＰ−１誘発性の走化に対する効果は特異的であり；無関係の抗体は効果がなく、ＡＢＮ９１２はｆＭＩＦＬ誘発性の走化に対しては効果がない。
【００７８】
２．６　アカゲザルにおける白血球遊走の阻害
この機構モデルは、アカゲザルの白血球の皮膚中へのＭＣＰ−１誘発性の遊走が、ＮＶＰ−ＡＢＮ９１２を静注の大量瞬時投与で投与した場合に阻害可能であるかどうかを検定するために利用される。
白血球数を増やして最適に白血球を補充するための内皮細胞を準備するために、雄性成体アカゲザルに３０μｇ／ｋｇ ＩＬ−３を１３日間（１日に２回の静注）投与した。１３日目に、サルを麻酔して、ＭＣＰ−１（１０μｇ）を、胸部および腹部の右側に３回腹腔内投与した。４時間後、サルを再度麻酔してＭＣＰ−１投与部位からパンチ生検を採取した。その後、ＮＶＰ−ＡＢＮ９１２またはアイソタイプに適合する癌胎児性抗原に対するヒト化ネガティブコントロール抗体（ＣＧＰ４４２９０）を、静注の大量瞬時投与で投与すると５ｍｇ／ｋｇの用量に達した。これらの投与部位はこれまでの投与に対して対称な位置とした。４時間後、サルを麻酔して、ＭＣＰ−１投与部位からパンチ生検を採取した。すべてのパンチ生検を半分に切り取って、その半分のうちの１つを酵素分析用に液体窒素中で冷凍した。半分のもう一方は、後の組織像用にホルマリン中に保存した。好酸球および好中球に対する酵素アッセイは、それぞれ好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）活性およびミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性である。ＰＢＳ投与およびコントロールおよび細胞浸潤を刺激するために投与なしのコントロールを、各サルに対して並行して実施した。どちらのコントロールでも抗体を介した有意な効果は見られなかった。
【００７９】
ＮＶＰ−ＡＢＮ９１２およびＣＧＰ４４２９０（ＩｇＧ４、アイソタイプ適合ネガティブコントロール）による処置前および後のＭＣＰ−１投与部位での酵素活性を、それぞれ平均値±ＳＤで示す。各条件についてどのサルにも複数の投与部位（３）を用いた。２回の別々に実施した試験を組み合わせたデータが、図１Ａの好酸球遊走および図１Ｂの好中球遊走で示される。
抗体による処置前（ＭＣＰ−１未処置、１００％）および処置後のパンチ生検における正規化したＥＰＯ（Ａ）またはＭＰＯ（Ｂ）活性を、平均値±ＳＤで示す。
【００８０】
白血球の遊走は、１０μｇのＭＣＰ−１によりアカゲザルの皮膚で誘発され、抗体処置前の白血球の遊走と比べて、ＮＶＰ−ＡＢＮ９１２の存在中では、好酸球遊走の８５．５％および好中球遊走の８１．４％の阻害が見られた。ＣＧＰ４４２９０を適用したときには、両方の細胞種に対して約２０％の阻害しか定量されなかった。ＰＢＳ投与だけでは１０μｇのＭＣＰ−１を用いて見られる応答の１３．０％（好酸球）および２２．７％（好中球）しか補充されなかったことを考慮すると、ＮＶＰ−ＡＢＮ９１２の投与は、ＰＢＳ刺激により見られるバックグランド量まで白血球遊走量を減少させる。ＮＶＰ−ＡＢＮ９１２とコントロール抗体との間に統計的に高い有意差（ｐ＜０．０１）が見られ、この効果の大きさを考慮すると、生物学的関連性があるようにも思われる、好酸球遊走の代表的な組織像は、図２に示されている。
【００８１】
ＭＣＰ−１による遊走試験からのパンチ生検の組織像が４頭のサル（２２７９、２２８０、２２８１および２２８２）について示されている。
（Ａ）、（Ｂ）、（Ｅ）、（Ｆ）は、それぞれサル２２７９、２２８０、２２８１および２２８２の抗体による処置の前に染色した好酸球。
（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｇ）、（Ｈ）は、それぞれサル２２７９、２２８０、２２８１および２２８２の抗体による処置の後に染色した好酸球。
【００８２】
サル２２７９および２２８０は、アイソタイプ適合ネガティブコントロール抗体ＣＧＰ４４２９０（５ｍｇ／ｋｇ）で処置し、そしてサル２２８１および２２８２は、ＮＶＰ−ＡＢＮ９１２（５ｍｇ／ｋｇ）で処置した。好酸球を赤（白黒では濃いスポットとして見える）に染色し、パネル中の矢印（Ｇ）および（Ｈ）は、２頭のＮＶＰ−ＡＢＮ９１２処置サル中に存在する僅かな好酸球を強調して示している。
ＣＧＰ４４２９０では処置の前と後との間には差が見られなかったものの、ＮＶＰ−ＡＢＮ９１２で処置したサルにおいては好酸球遊走のほぼ完全な阻害が見られた。
【００８３】
２．７　ＳＣＩＤ−ｈｕマウス中におけるＴ細胞浸潤の阻害
この機構モデルは、ＭＣＰ−１によるＴｈ細胞のＳＣＩＤ−ｈｕマウスの皮膚への浸潤が、ＮＶＰ−ＡＢＮ９１２をｉ．ｐ．投与することにより阻害可能であるかどうかを検定するために利用される。
ＳＣＩＤマウスに、成人のヒト皮膚（ＳＣＩＤ−ｈｕ皮膚）の２つの小片を移植した。この移植片の特性を移植後５〜６週間の間モニターして、その後移植が成功したマウス（一般的に＞８５％）をインビボでの遊走試験に選択した。ケモカインによる遊走について、ＰＢＭＣを軟膜試料から標準的な密度勾配分離により単離して、２つのヒト皮膚片（上背の右および左側）で先に移植された（５−８週間）ＳＣＩＤ−ｈｕ皮膚中任意でに移入した（ｉ．ｐ．、１ｘ１０８細胞／マウス、容量５００μｌ）。細胞移入は０日目に実施した。試験１、２、４および６日目にヒト移植片中に、ＭＣＰ−１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）およびＰＢＳを皮内投与した。コントロールマウス（ＣＧＰ４４２９０処置）は、５００ｎｇ ＭＣＰ−１を右の皮膚移植片中に、および等量のＰＢＳ（３０μｌ）を左の皮膚移植片中に得た。ＮＶＰ−ＡＢＮ９１２処置マウスに、左右両方の皮膚移植片に５００ｎｇ ＭＣＰ−１を投与した。０日目（細胞移入の５時間前）と試験の２および５日目に、ＮＶＰ−ＡＢＮ９１２およびそのアイソタイプコントロールＣＧＰ４４２９０をｉ．ｐ．（１００μｇ／マウス、４ｍｇ／ｋｇ、容量５００μｌ）で投与し、すべてのマウスを屠殺してヒト皮膚移植片を更なる分析用に回収した。各ヒト皮膚移植片の単一細胞懸濁液を、ＤＡＫＯ Ｍｅｄｉｍａｃｈｉｎｅ（登録商標）を取扱説明書に従って用いて調製した。これらの細胞懸濁液を、ＦＩＴＣおよびＰＥと共役したヒト抗ＣＤ３および抗ＣＤ４ｍＡｂで染色して、ＦＡＣｃａｌｉｂｕｒ フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）中で分析した。その結果を図３に示している。ＡＢＮ９１２処置群（５例のマウス、ｎ＝１０）においては、相応するＣＰＧ４４２９０処置群（３例のマウス、ｎ＝３）において見られる３．７３±１．０１％と比較すると、注入したヒトＴｈ細胞の０．７３±０．１５％が皮膚移植片を浸潤した。細胞遊走がＰＢＳによって誘発されるマウスにおいては、Ｔｈ細胞の０．３４±０．１７％がヒト皮膚移植片（３例のマウス、ｎ＝３）を浸潤した。
Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ 多重比較検定（ｐｏｓｔ ｈｏｃ）に従って一元配置分散分析により統計的分析を実施した。ＡＢＮ９１２対ＣＧＰ４４２９０処置動物におけるＴｈ細胞の浸潤の減少は、それぞれ有意差が高い（ｐ＜０．０１＊＊）。
【００８４】
ＡＢＮ９１２結合エピトープのヒトＭＣＰ−１に対する特性評価と活性形態
ＮＶＰ−ＡＢＮ９１２のＦａｂフラグメントを有するＭＣＰ−１複合体の３次元構造をＸ線結晶学により決定した。
ＮＶＰ−ＡＢＮ９１２のＦａｂフラグメントを、抗体全体からタンパク質分解により切断して作成して、プロテインＡクロマトグラフィーに続きサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。Ｆａｂと組み換えヒトＭＣＰ−１との間の複合体をプロテインＧおよびサイズ排除クロマトグラフィーにより精製して、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．１Ｍ ＮａＣｌ中、限外濾過により２６ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。結晶を蒸気拡散法により懸滴中、２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４，０００、１０％（ｖ／ｖ）イソプロパノール、０．１Ｍ Ｎａ、Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５において室温で成長させた。それらは、単位セル寸法がａ＝６３．９０Å、ｂ＝８６．０８Å、ｃ＝３２１．６４Åである空間群ｐ２１２１２１中にあり、非対称的単位当たり３つの複合体である。データ収集の前に１つの結晶を、１７％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４，０００、８．５％（ｖ／ｖ）イソプロパノール、１５％ グリセロール、８５ｍＭ Ｎａ、Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５において約３分間浸漬した。次にこの結晶をナイロン製のＣｒｙｏＬｏｏｐ中にマウントして、１２０Ｋの窒素気流中、そのまま冷凍した。回折データは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ ＦａｃｉｌｉｔｙのＳＮＢＬビームライン（λ＝０．９０Å）で、ＭＡＲ３４５画像プレートシステムを用いて測定した。全部で２４２，６１７の所見において、６８，９４８に相当する固有反射（Ｒｓｙｍ＝０．０５０）が２０．０〜２．３３Åの間の解像度（８９．３％の完全性）で回収された。その構造を、開始モデルとして３Ｄ６モノクローナル抗体（ＲＣＳＢ ｅｎｔｒｙ １ＤＦＢ；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２）およびヒトＭＣＰ−１（ＲＣＳＢ ｅｎｔｒｙ １ＤＯＬ；Ｌｕｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７）のＦａｂフラグメントのＸ線構造を用いて、分子置換により決定した。その構造は、ＣＮＸプログラムを用いてねじれ角のダイナミクスおよびエネルギー最小化により純化すると、２０〜２．３３Åのすべての反射に対して最終的なＲ因子が０．２２４（Ｒｆｒｅｅ＝０．２６１）となった。最終モデルとしては、ＡＢＮ９１２のＬ１〜Ｌ２１４とＨ１〜Ｈ２２２、およびヒトＭＣＰ−１の１０〜７１残基が挙げられる。それは、結合長さに対しては０．００６Åであり、結合角に対しては１．３６°のｒｍｓ偏差である良好なジオメトリーを有する。
【００８５】
ＮＶＰ−ＡＢＮ９１２ Ｆａｂ／ヒトＭＣＰ−１複合体は、幾つかの鍵となる静電相互作用のみならず多くの疎水性かつ極性相互作用が関与する大きな結合界面（１，５９０Å２の結合埋め込み面）を示す。抗体との主な接触はＮＶＰ−ＡＢＮ９１２の長いＨ−ＣＤＲ３ループであり、これは抗原連結部位の中央で折り畳まれており、複合体中に深く埋め込まれている。ヒトＭＣＰ−１上の結合エピトープは、アミノ酸残基Ａｓｎ１４、Ｔｈｒ１６、Ａｓｎ１７、Ａｒｇ１８、Ｌｙｓ１９、Ｉｌｅ２０、Ｓｅｒ２１、Ｇｌｎ２３、Ａｒｇ２４、Ｌｙｓ４９、Ｇｌｕ５０、Ｉｌｅ５１およびＣｙｓ５２を含む。Ａｒｇ１８、Ａｒｇ２４およびＬｙｓ４９は、抗体残基Ｇｌｕ Ｌ５５、Ａｓｐ Ｈ９９およびＧｌｕ Ｈ１０１との静電相互作用、そしてＴｙｒ Ｌ９４、Ｔｒｐ Ｈ３３、Ａｓｎ Ｈ５０、Ｇｌｕ Ｈ５３、Ａｓｐ Ｈ９９およびＴｙｒ Ｈ１０８とのＨ結合型相互作用に関与する。更に、ＭＣＰ−１のＡｒｇ１８およびＡｒｇ２４からなるグアニジニウム部分は、それぞれＴｒｐ Ｈ３３およびＴｙｒ Ｈ３２の芳香環に対してπスタッキングしている。ＮＶＰ−ＡＢＮ９１２と抗原のＴｙｒ１３、Ｇｌｎ１７、Ｓｅｒ２１、Ｌｙｓ１９、Ａｒｇ２４およびＧｌｕ５０との間の更なる相互作用は、タンパク質界面中に埋め込まれた８個の水分子に媒介される。ＭＣＰ−１のＴｙｒ１３およびＡｒｇ２４が、ＣＣＲ２Ｂケモカインレセプター（Ｈｅｍｍｅｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３８； １３０１３−１３０２５）への結合と関係していることから、ＮＶＰ−ＡＢＮ９１２は、アンタゴニスト結合に対してレセプターと直接競合するものと思われる。
【００８６】
２．９　部位特異的突然変異誘発によるＭＣＰ−１上でのＡＢＮ９１２エピトープのマッピング
ＮＶＰ−ＡＢＮ９１２による認識に対してＭＣＰ−１上の機能的に重要な残基を決定するために、アラニンスキャニング変異誘発試験を実施した（Ｃｕｎｎｉｇｈａｍ， Ｂ． Ｃ． ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｊ． Ａ． （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４， １０８１−１０８５）。第１に、ＭＣＰ−１の３次元構造（Ｈａｎｄｅｌ， Ｔ．Ｍ． ａｎｄ Ｄｏｍａｉｌｌｅ， Ｐ．Ｊ． （１９９６） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５， ６５６９−６５８４； Ｌｕｂｋｏｗｓｋｉ， Ｊ．， Ｂｕｊａｃｚ， Ｇ．， Ｂｏｑｕｅ， Ｌ．， Ｄｏｍａｉｌｌｅ， Ｐ． Ｊ．， Ｈａｎｄｅｌ， Ｔ． Ｍ． ａｎｄ Ｗｌｏｄａｗｅｒ， Ａ． （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ４， ６４−６９）を表面に露出された残基を同定するためにＷｅｂＬａｂ Ｖｉｅｗｅｒソフトウェアを用いて視察した。ＡＢＮ９１２と強力に相互作用可能な３９残基全部を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ キット（Ｐａｐｗｏｒｔｈ， Ｃ．， Ｂａｕｅｒ， Ｊ． Ｃ．， Ｂｒａｍａｎ， Ｊ． ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔ， Ｄ． Ａ． （１９９６） Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ９（３）， ３−４）を用いて個々にアラニンまたはリジン（Ｄ３Ｋ、Ａ４８Ｋ）へ変異させた。Ｇｅｎｅｐｏｒｔｅｒトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いてＭＣＰ−１変異配列を保有する発現プラスミド２μｇと一緒に細胞に最初にトランスフェクションすることにより、その結果生成する変異遺伝子をＨＥＫ．ＥＢＮＡ細胞中で発現させた。トランスフェクション後、細胞を３日間３７℃でインキュベートして、次にその上清を回収し、５分間遠心分離してアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。変異型ＭＣＰ−１の濃度を、精製ＭＣＰ−１を標準物質として用いるプロテインアッセイ（Ｂｉｏｒａｄ）により決定した。典型的には、３ｍｌの培地から４０μｇの精製ヒトＭＣＰ−１またはＭＣＰ−１変異体が得られた。
【００８７】
ＭＣＰ−１および変異型ＭＣＰ−１のＮＶＰ−ＡＢＮ９１２に対する親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅの取扱説明書（ＢＩＡｃｏｒｅ）によるプラズモン共鳴法により測定した。第１に、取扱説明書にあるセンサーチップ表面を活性化して、３０μｇ／ｍｌ 抗Ｆｃγ溶液をチップに共有結合するためにインジェクションした。ＮＶＰ−ＡＢＮ９１２抗体を、抗Ｆｃγ修飾表面上に５μｇ／ｍｌ 溶液をインジェクションして蓄積させた。ＭＣＰ−１およびＭＣＰ−１変異体の希釈液を、最終濃度が０．７５〜４ｎＭとなるように調製して、そのセンサーチップ表面上の固定化ＮＶＰ−ＡＢＮ９１２に結合させるためにインジェクションした。表面プラズモン共鳴シグナルを記録する５分間で結合および解離がおこった。次にＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．０ソフトウェア（Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｉｎｓｔａｌｌａｔｉｏｎ； Ｈａｎｄｂｏｏｋ カタログ番号ＢＲ−１００２−２９番；７−９７版）を用いて分析した。結果は図４に示され、これはＭＣＰ−１およびＭＣＰ−１変異体のＮＶＰ−ＡＢＮ９１２への結合を示している。
【００８８】
上述で特定されるように、ＭＣＰ−１に関してＮＶＰ−ＡＢＮ９１２認識のための主要な決定因子は、残基Ｔ１６、Ｒ１８、Ｒ２４およびＫ４９である。Ｔ１６、Ｒ１８およびＲ２４のアラニンへの変異により、ＮＶＰ−ＡＢＮ９１２への結合が完全に阻害される一方、Ｋ４９のアラニンへの変異の結果、親和性が１３３分の１に減少する。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】処置または未処置のアカゲザル由来の種々のパンチ生検に対する好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）活性を示すグラフである。
【図１Ｂ】処置または未処置のアカゲザル由来の様々なパンチ生検に対するミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性を示すグラフである。
【図２】ＡＢＮ９１２およびＢＣＧＰ４４２９０（コントロール抗体）での処置前および後の両方における４頭のアカゲザルからの組織試料に対する好酸球染色を示す写真である。
【図３】種々の処置法に対するヒト皮膚移植のＴｈ細胞遊走（％）を示すグラフである。
【図４】ＭＣＰ−１の結合に対するＡＢＮ９１２変異体の相対的結合親和性を示すグラフである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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