(57)【要約】本発明は、植物の生長または発育を調節する方法に関連する。本発明は、植物またはその部分におけるRING-H2タンパク質またはその機能的断片の発現を調節する段階を含む、植物の発育移行を調節するための方法を提供する。
2004531222.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物またはその部分における、RINGフィンガーもしくはRING-H2のタンパク質またはその機能的断片の発現を調節する段階を含む、植物の発育移行を調節する方法。
【請求項２】
移行が、発芽、低温による春化、抽薹、花成または結実の開始、低温誘導による茎の伸長、休眠打破、球根誘導、開花期を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
植物の発育移行を調節する標的タンパク質のユビキチン化および／またはタンパク質分解を提供する段階を含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
標的タンパク質が発育調節タンパク質である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
調節タンパク質が、アブシジン酸非感受性3（ABI3）またはその相同体を含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
RINGフィンガーもしくはRING-H2のタンパク質またはその機能的断片が、C3HC4もしくはC3H2C3モチーフまたはそれと機能的に同等のモチーフを含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
RINGフィンガーもしくはRING-H2のタンパク質またはその機能的断片をコードする核酸を植物に提供する段階を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
核酸が一過的に提供される、請求項7記載の方法。
【請求項９】
核酸が図3に記載の配列と本質的に同等である、請求項7または8記載の方法。
【請求項１０】
植物が球根を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
移行を促進する段階を含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
移行を遅延させる段階を含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
RINGフィンガーもしくはRING-H2のタンパク質またはその機能的断片をコードする核酸により提供される、植物または植物細胞。
【請求項１４】
植物またはその部分におけるRINGフィンガーもしくはRING-H2の遺伝子産物またはその機能的断片の発現を決定する段階を含む、植物の発育移行段階または発育移行に至る段階を決定する方法。
【請求項１５】
RINGフィンガーもしくはRING-H2の遺伝子産物またはその機能的断片と相互作用するまたは関係する標的タンパク質のユビキチン化および／またはタンパク質分解を決定する段階を含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
RINGフィンガーもしくはRING-H2の遺伝子産物またはその機能的断片の発現を決定する段階を含む、発育の移行期にあることについて植物を選択する方法。
【請求項１７】
RINGフィンガーもしくはRING-H2の遺伝子産物またはその機能的断片と相互作用するまたは関係する標的タンパク質のユビキチン化および／またはタンパク質分解を決定する段階を含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
移行が、発芽、低温による春化、抽薹、花成または結実の開始、低温誘導による茎の伸長、休眠打破、球根誘導、開花期を含む、請求項11または12記載の方法。
【請求項１９】
請求項16記載の方法を用いて選択可能な植物。
【請求項２０】
植物またはその部分におけるRINGフィンガーもしくはRING-H2の遺伝子産物またはその機能的断片の発現を決定する段階を含む、発育移行に関連する望ましい品質および形質を有する植物またはその子孫を得る方法。
【請求項２１】
RINGフィンガーもしくはRING-H2の遺伝子産物またはその機能的断片と相互作用するまたは関係する標的タンパク質のユビキチン化および／またはタンパク質分解を決定する段階を含む、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
図3に記載の配列と少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、植物のRINGフィンガーもしくはRING-H2のタンパク質またはその機能的断片をコードする、単離および／または組換え核酸。
【請求項２３】
植物が球根を含む、請求項22記載の核酸。
【請求項２４】
請求項22または23記載の核酸を含むベクター。
【請求項２５】
請求項22もしくは23記載の核酸または請求項24記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２６】
植物細胞を含む、請求項25記載の細胞。
【請求項２７】
請求項26記載の細胞を含む植物またはその部分。
【請求項２８】
植物を調節する方法における、請求項22もしくは23記載の核酸または請求項24記載のベクターの使用。
【請求項２９】
方法が植物の発育移行を調節する段階を含む、請求項28記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の生長または発育を調節する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
昼夜の日周リズム、ならびに、水および養分の直接の利用可能性のような、短期的な環境要因を別にして、低温、湿度（欠乏）、または短い日長に曝される期間のような、長期的な環境要因は、多くの植物の生活環において重要な役割を果たす。周囲の光条件のような短期的な環境要因は、日々の形態形成に直接影響を及ぼす（例えば、明条件において生長させた実生は、短い胚軸および伸長した緑色の子葉によって特徴付けられ、暗条件下において生長させた実生は、黄化され、伸長した胚軸および閉じた子葉を有する）が、長期的な環境要因はしばしば、植物の発育におけるある期から他の期への移行を決定する、または移行に影響を及ぼす。特に、その発育における発育休止状態にある植物に影響を与える。
【０００３】
例えば、温帯において冬期に生じる低温の期間は、植物の多くの移行期に影響を及ぼす。典型的な移行事象は、茎の伸長（抽薹）、花成の開始、および果実の形成（結実）であり、その他には、休眠種子の打破事象、即ち発芽として認められるような事象がある。
【０００４】
ある植物種は、花成を誘導するために、長期の低温期間および／または少量の光または短い日長を含む発育休止を必要とする。そして、そうしなければそのような生産物が自然には入手できないような季節に、商業的に魅力のある植物体または植物の部分（実生、花または開花植物、果実）が得られるように、植物体、種子、実生、または球根の、早期抽薹、花成および／もしくは結実、または発芽を与えるために、春化と呼ばれる過程において、多くの植物については従来的に（促成のような）人工の方法が広く使用されている。
【０００５】
ある種においては、花成および茎の伸長を同時に誘導することができる。他の種は、茎の伸長を誘導するために低温の期間、即ち、本発明者らが抽薹としてさらに呼ぶ過程を必要とする。これらの種においては、花成誘導および形成の過程が、要求される低温期間に先立つため、2つの過程は暫定的に分けられる。長期的な環境要因（例えば低温または乾燥）によって影響されるなおも他の過程は、種子の休止、休眠、および発芽である。これらの長期的な環境要因または過程はしばしば、植物の発育を生長場所の季節および／または気候条件に同調させ、特定の植物または種が生長するような様々な条件に対する進化的な適応を反映している。
【０００６】
チューリップは、抽薹過程の研究[4]を介して、長期的な環境要因によって誘導される、植物の生長における変化のこれらの様々な局面について研究するためのモデルとして使用される種の一例である。低温がしばしば関与する別の過程は、種子の休眠である。低温によって誘導される茎の伸長は、休眠打破の一形態としてみなすことができ、樹木の芽の低温による覚醒、春化、および休眠打破は、低温によって促進される同様の過程である。シロイヌナズナの休眠種子の発芽における、休眠を打破するための低温要求性のみならず、チューリップの抽薹と休眠種子の発芽の間における他の類似点は、休眠が除かれた後の迅速な生長を可能にするために、全ての器官が保護構造内にて形成されること、貯蔵物質が特殊化した葉様の器官に（例えばシロイヌナズナの子葉においてデンプンの形態で、および同様に、チューリップの球根鱗茎においてデンプンの形態で）保存されること、および、休眠の間は水ポテンシャルが低いことである[5]。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、植物の発育の移行を調節し、それにより、例えば、発育休止の打破を与える方法を提供し、上記に議論されるような長期的な環境要因に本質的に依存しない方法であり、それにより、植物のある発育期から別の期への移行を調節する方法を提供する。特に、移行に、発芽、抽薹、花成または結実の開始が含まれるような、植物における発育移行を調節するための方法が提供される。本明細書においては、本発明者らは、発育調節因子と相互作用する（シロイヌナズナのような）他の植物のタンパク質との相同性を有する、チューリップに由来するRING-H2タンパク質のサブクラス、植物のRINGフィンガーの低温誘導性の発現産物の単離を示す。これが意味するものは、低温誘導のTGRING1の発現について本明細書にて示されるように、植物のRINGフィンガーまたはRING-H2のタンパク質の発現が、植物のABI3の相同体をタンパク質分解の標的とし、それにより、例えば休眠または休止の状態のような発育休止を終わらせ、植物をある発育期から別の発育期へ躍進（例えば超越）させ、その次なる発育状態に向かって生長させることである。RINGまたはRING-H2のタンパク質がユビキチン化またはタンパク質分解に関与するものとして以前に認識されている事実にも関わらず、植物の発育の変化におけるこれらのタンパク質の関与は、今までは示されてこなかった。これは、特に、発芽、低温による春化、抽薹、花成または結実の開始、低温誘導による茎の伸長、休眠打破、球根誘導、開花期に関連するもののような発育の変化については真実である。例えば、Stoop-Myerら[17]は、COP1のN末端断片がその機能性の部分を保持することを示している。彼らは、この断片が少なくとも2つの機能的ドメイン、RINGドメインおよびコイルドコイルドメインを有することを示している。しかし、重要なのは、彼らが、保持されている機能性とRINGドメインとを関連付けておらず、このドメイン単独の機能についての提案もしていないことである。さらに、McNellisら[18]は、COP1のN末端断片がその機能性の部分を保持することを示している。再度、彼らは、この断片が少なくとも2つの機能的ドメイン、RINGドメインおよびコイルドコイルドメインを有することを示している。再度、彼らは、保持されている機能性とRINGドメインとを関連付けていない。McNellisら[19]は、COP1の過剰発現によって、光形態形成におけるその役割を示している。彼らは、COP1が少なくとも3つの機能的ドメイン、RINGドメイン、コイルドコイルドメイン、およびWD-40反復ドメインを有することを示している。しかし、重要なのは、彼らが、COP1の機能性とRINGドメインとを関連付けておらず、このドメイン単独の機能についての提案もしていないことである。Kurupら[16]は、その論文において、AIP2がシロイヌナズナの発育調節因子ABI3と相互作用することを示している。彼らは、発育移行におけるAIP2および他のRING-H2タンパク質の役割を認識しておらず、それどころか、AIP2の転写活性化因子としての役割を提案している。Freemont[20]による論文は、ユビキチン化およびタンパク質分解の標的化におけるRINGドメインおよびRING-H2ドメインについての一般的な役割を提案する、最初に発表された論文である。彼の論文では、ある例外：PRT1を除いて、動物系に認められるRINGタンパク質に主に焦点を当てている[21]。���ロイヌナズナのPRT1タンパク質は明らかに、特定の種類の経路、即ち「N末端則」ユビキチン化経路に関与している。しかし、本論文も、Potuschakら[21]による論文も、植物における発育の変化を得る目的で、発育調節因子のタンパク質レベルを操作するために、RINGフィンガーまたはRING-H2のタンパク質を用いることには何ら言及していない。RINGまたはRING-H2のタンパク質が、ユビキチン化またはタンパク質分解に関与するものとして以前に認識された事実にも関わらず、植物の発育の変化におけるこれらのタンパク質の関与は以前には示されてこなかった。これは、特に、発芽、低温による春化、抽薹、花成または結実の開始、低温誘導による茎の伸長、休眠打破、球根誘導、開花期に関連するもののような発育の変化については真実である。Tamminen[22]は、ABI3の異所性発現は耐凍性における変化をもたらすことを例証している。本発明は、ユビキチン化によってそれらをタンパク質分解の標的とすることにより、ABI3または他の発育調節因子のタンパク質レベルを操作することによる、植物の発育移行のためのRINGまたはRING-H2のタンパク質の使用を提供する。Toriiら[23]の論文は、シロイヌナズナのタンパク質CIP8がシロイヌナズナの光形態形成調節因子COP1と相互作用することを示している。相互作用は、COP1のRINGドメインおよびCIP8のRING-H2ドメインによるものである。しかし、本論文は、ユビキチン化またはタンパク質分解におけるRINGドメインまたはRING-H2ドメインについての機能的な役割を示していない、または提案していない。それは単に、タンパク質とタンパク質との相互作用ドメインとしての役割を提案しているにすぎない。
【０００８】
望ましいRINGフィンガーモチーフまたはRING-H2モチーフを有する典型的な植物タンパク質は、図1Aおよび図1Bにおいて認められ、他は本明細書において示されるような簡単なアラインメントによって見出すことができる。好ましい態様においては、本発明は、植物またはその部分におけるRINGフィンガーもしくはRING-H2のタンパク質またはその機能的断片の発現を調節する段階を含む、植物の発育移行を調節するための方法であり、特に、この移行に発芽、低温による春化、抽薹、花成または結実の開始が含まれるような方法を提供する。本明細書において開示されるようなRINGフィンガーまたはRING-H2のタンパク質は、ある発育期から別の期への移行に関連する標的タンパク質（例えば、発育調節タンパク質）のユビキチン化および／またはタンパク質分解を提供し、それにより、例えば、関与する標的タンパク質（例えば調節タンパク質）のプロテアソーム仲介の分解および除去を与える。本明細書において使用されるような標的タンパク質は、植物の発育移行を調節できるタンパク質である。ここで言及される特定の調節タンパク質は、例えば、COP1、HY5、FLC、FRIGIDAおよびLDを含む。本明細書において好ましいのは、シロイヌナズナにおいてアブシジン酸非感受性3（abscisic acid-insensitive 3：ABI3）として知られる調節タンパク質またはその相同体の調節である。
【０００９】
本発明は、図1Aおよび図1Bにおいて示されるように、RINGフィンガーもしくはRING-H2のタンパク質またはその機能的断片が、ある植物のRINGフィンガーまたはRING-H2のタンパク質に少なくとも機能的に同等または相同であるような方法を提供する。RINGフィンガータンパク質の機能的断片は、例えば、RINGフィンガー（C3HC4）モチーフ：
2004531222.tif 000003
を含み、RING-H2タンパク質の機能的断片は、例えば、RING-H2（C3H2C3）モチーフ：
2004531222.tif 000004
または、それに対して機能的に同等なモチーフを含む。上記に使用されるコードは、IUPAC規則に従う：Cはシステインを、Hはヒスチジンを意味し、xは任意のアミノ酸をコードする。括弧の間の数は、反復数を示すため、例えば、x(9,39)は、各残基が任意のアミノ酸であり得る、9個から39個の一連のアミノ酸残基を意味する。TGRING1においては、このモチーフは、248〜288位のアミノ酸を含む。
【００１０】
本発明はまた、図3の配列に対して好ましくは少なくとも50〜60％相同な、より好ましくは70％相同な、およびさらにより好ましくは95％相同であり、ならびに類似の機能を保持するような[即ち、図3の配列に対して「本質的に同等」である]アミノ酸配列を含む、植物のRINGフィンガーもしくはRING-H2のタンパク質またはその機能的断片をコードする、単離および／または組換え核酸をも提供する。本明細書において使用されるような「本質的に同等である」とは、例えば、ポリペプチドの生物学的活性が保持される限り、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて意図的なアミノ酸置換を行い得るように、機能的に同等であることを意味する。相同性は一般に、本明細書において示される関連配列の全長に渡る。充分に理解されているように、アミノ酸レベルにおける相同性は一般に、アミノ酸の類似性または同一性に換算されたものである。類似性とは、「保存的変異」、即ち、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンの別のものへの置換のような、1つの疎水性残基の置換、または、リシンからアルギニン、アスパラギン酸からグルタミン酸、またはアスパラギンからグルタミンのような、1つの極性残基の別のものへの置換がなされるようなものである。意図的なアミノ酸置換は、ポリペプチドの生物学的活性が保持される限り、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。好ましい態様においては、本明細書において言及される全ての相同性パーセンテージは、配列同一性パーセンテージを指す。例えば、特定の参照配列に関するアミノ酸配列の同一性割合（％）は、いかなる保存的な置換も配列同一性の部分としては考慮せずに、最大の配列同一性割合（％）を達成するために、必要な場合、配列アラインメントおよびギャップ導入を行った後の、参照配列におけるアミノ酸残基と同一な、候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージであり得る。アミノ酸の類似性または同一性は、当技術分野において既知の遺伝学的プログラムによって決定することができる。
【００１１】
本発明は、RINGフィンガーまたはRING-H2のタンパク質が、ユビキチン-タンパク質リガーゼ（E3）またはそのような酵素のサブユニットとして作用するような方法を提供する。ユビキチン（Ub）の鎖による修飾は、それによってタンパク質がプロテアソームによる分解の標的とされる主要な機構をなしている。タンパク質のユビキチン化は、ユビキチン活性化酵素（E1）、ユビキチン結合酵素（E2）、および、ある場合においては、特異性を与えるユビキチンリガーゼ（E3）に関与する、複雑な過程を通して達成される。E1酵素は、最初に作用し、タンパク質基質（標的タンパク質）を標的とする準備ができているE2酵素にUbを渡す。核酸またはタンパク質の結合ドメインとして作用し得る、RINGフィンガーまたはRING-H2のタンパク質はまた、ユビキチンタンパク質リガーゼ（E3）またはそのような酵素のサブユニットとして作用する可能性がある。ユビキチンリガーゼE3は、基質の認識に寄与する、および、26Sプロテアソームによる分解のために標識する基質に対するポリユビキチンライゲーションを促進する、タンパク質またはタンパク質複合体として大まかに定義付けられている。E3酵素は、様々な調節タンパク質上にマルチユビキチン鎖を会合させ、それにより、それらを26Sプロテアソームによるタンパク質分解の標的とする。
【００１２】
本発明は、RINGフィンガーまたはRING-H2のタンパク質が、少なくともある標的タンパク質と、および／または、あるユビキチン結合酵素（E2）と、相互作用し、ユビキチン結合酵素から標的タンパク質にユビキチン残基を転移させることが可能であるような、本方法に従った方法を提供する。標的タンパク質の修飾以前に、E3はE2と相互作用し、ユビキチンとのチオエステル結合を形成させることが可能である。あるE3は、チオエステル中間体を形成するユビキチン担体としては作用しないが、代わりに、ユビキチンの転移に都合のよい環境を提供する、E2と標的タンパク質の間の架橋として作用する。RINGフィンガーまたはRING-H2のタンパク質は、UbをE2から標的リシンに直接転移させるような、E2との相互作用部位を提供することができる。この反応は、ユビキチンのC末端とタンパク質基質中のリシン残基のε-アミノ基の間のイソペプチド結合の形成をもたらす。付着されたユビキチン残基内のリシン残基は、受容体部位としての役割を果たし、結果的に、26Sプロテアソームのための認識シグナルとして機能し得る、マルチユビキチン鎖の会合をもたらすことが可能である。
【００１３】
RINGフィンガーまたはRING-H2のタンパク質は、E2のための結合部位を提供する以外に、ユビキチン化反応における他の役割を有する可能性がある。RINGフィンガーまたはRING-H2のタンパク質は、代わりに、E2のアロステリック活性化剤として機能し得る。本発明は、RINGフィンガーまたはRING-H2のタンパク質がユビキチン結合酵素（E2）のアロステリック活性化剤として作用するような、本発明に従った方法をさらに提供する。RINGフィンガーまたはRING-H2のタンパク質が、ユビキチン以外の経路またはユビキチン様経路において作用し、植物の発育移行を調節することは理解される。
【００１４】
特に、本発明は、球根に由来するような核酸を提供する。本明細書において使用されるような球根とは、芽が生長し始める際にエネルギーを供給する、多肉質に変形した葉または鱗茎に囲まれた1つまたは複数の芽を有する変形地下茎であり、例えば、タマネギやチューリップは球根を有する。さらに、本発明は、本発明に係る核酸を含むベクター、および、本発明に係る核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。そのようなベクターの一例は、例えばTGRING1タンパク質またはその機能的断片をコードするDNAの部分のようなDNAの部分を、植物のゲノムに送達するためにしばしば使用される、植物形質転換ベクターpBIN19である。形質転換体を調製するための手順または方法は、分子生物学、バイオテクノロジーおよび遺伝子操作の分野において使用される、従来的な技術に従って実行することができる。
【００１５】
好ましくは、そのような宿主細胞は、植物細胞を含み、本発明に係る核酸を含む植物体またはその部分を生じさせる。本明細書において使用されるような「植物細胞」は、とりわけ、種子、懸濁培養、胚、分裂組織部、カルス組織、プロトプラスト、葉、根、シュート、球根、配偶体、胞子体、花粉および小胞子を含む。標的植物は、例えば鑑賞植物、野菜、耕作用作物等のような、任意の単子葉植物種または双子葉植物種から選択することができる。「双子葉植物」（および同じ植物群を指す全ての科学的同等物）は、胚が2つまたはそれ以上の、独立した、または融合された子葉を有する顕花植物または被子植物の2つの門のうち1つを形成する。「単子葉植物」（および同じ植物群を指す全ての科学的同等物）は、胚が1つの子葉を有する顕花植物または被子植物の2つの門のうち1つを形成する。「被子植物」または顕花植物は、植物の特殊化した生殖器官としての花によって、および、子房を被う心皮によって特徴付けられる種子植物である。裸子植物もまた含まれる。裸子植物は、例えば木本植物のように、植物の特殊化した生殖器官としての球花によって、および、雄または雌の生殖器官を有する露出した胞子葉によって特徴付けられる種子植物である。
【００１６】
「鑑賞」植物は、例えばチューリップ（Tulipa）、フリージア（Freesia）、スイセン（Narcissus）、ヒヤシンス（Hyacinthus）等のような球根植物種のように、屋内にて切花または鉢植えとして、または戸外では人工の景観において、ヒトに都合よく貢献する、それらの形質、特殊な形状、（花、群葉またはさもなくば）色または他の特徴のために主に栽培される植物である。「野菜」は、群葉、塊茎、茎、果実、花またはその部分のヒトによる消費のために、意図的に選択されるまたは育種される、および、集約栽培管理を必要とする可能性がある植物である。「耕作用作物」は、一般に、例えばダイズ、ヒマワリ、トウモロコシ（corn）、ラッカセイ、トウモロコシ（maize）、コムギ、綿花、ベニバナおよびナタネのように、ヒトの様々な目的（直接的または間接的な消費、飼料、または繊維のような工業的な応用に渡る）のために意図的に育種される、または選択される。
【００１７】
特に、本発明は、植物を調節するための方法における、本発明に係る核酸またはベクターの使用を提供する。好ましくは、本方法は、植物の発育移行を調節する段階を含む。好ましくは、この調節は、RINGフィンガーもしくはRING-H2のタンパク質またはその機能的断片をコードする核酸を植物に提供することによって達成される。本発明は、例えば売り物としての早期花成球根を得るため、例えば、移行を促進する目的での植物の促成に置き換えるために有用と考えられるが、必要とされ得る植物においては、 移行を遅延させるためにも同様に、充分に適用することが可能である。
【００１８】
特定の態様においては、本発明は、RINGフィンガーまたはRING-H2のタンパク質をコードする核酸の一過的な発現を含む、例えばチューリップの球根のような球根の、インビトロの増殖において有用な方法を提供する。説明される本発明によって影響される、または調節される（促進されるまたは遅延される）可能性のある移行の他の例は、それによって核酸が同様に一過的に発現され得る、発芽、低温による春化、抽薹、花成の開始、結実、開花期、低温誘導による茎の伸長、休眠打破または球根誘導を含む。本発明は、RINGフィンガーもしくはRING-H2のタンパク質またはその機能的断片をコードする核酸を（望ましい場合は単に一過的に）与えられた植物を、付加的に提供する。
【００１９】
本発明はまた、植物もしくはその部分における、RINGフィンガーもしくはRING-H2の遺伝子産物（mRNAもしくはタンパク質またはその機能的断片）の発現を決定する段階を含む、および／または、RINGフィンガーもしくはRING-H2の遺伝子産物（mRNAもしくはタンパク質またはその機能的断片）と相互作用する、または関係する、標的タンパク質のユビキチン化および／もしくはタンパク質分解を決定する段階を含む、植物の発育移行段階または発育移行に至る段階を決定するための方法をも提供する。そのような方法は、例えば、植物が例えば発芽、低温による春化、抽薹、花成の開始、または結実のような明確な発育期にあるか、またはその発育期に近いかどうかを決定するためのように、植物またはその部分におけるRINGフィンガーもしくはRING-H2の遺伝子産物またはその機能的断片の発現を決定する段階を含む、発育の移行期にあることについて植物を選択するための方法において有用である。
【００２０】
本発明は、RINGフィンガーもしくはRING-H2の遺伝子産物またはその機能的断片の発現を決定する段階を含む、および／あるいは、RINGフィンガーもしくはRING-H2の遺伝子産物（mRNAまたはタンパク質またはその機能的断片）と相互作用する、または関係する標的タンパク質の、ユビキチン化および／もしくはタンパク質分解を決定する段階を含む、発育の移行期にあることについて植物を選択するための方法をさらに提供する。望ましい特徴を有する植物はここで容易に選択することができ、本明細書において提供もされる。
【００２１】
本発明はまた、植物もしくはその部分におけるRINGフィンガーもしくはRING-H2の遺伝子産物またはその機能的断片の発現を決定する段階を含む、および／あるいは、RINGフィンガーもしくはRING-H2の遺伝子産物（mRNAもしくはタンパク質またはその機能的断片）と相互作用する、または関係する標的タンパク質のユビキチン化、および／または、タンパク質分解を決定する段階を含む、発育移行に関連する望ましい品質や形質を有する植物またはその子孫を得るための方法をも提供する。
【００２２】
例えば、望ましい発育移行パターンを有する植物をより容易に選択または育種することがここで可能となる。例えば、花成のための低温要求性が低下したチューリップもしくは他の植物、または、種子の発芽が遅延されたかもしくは促進された植物を得るために、その品質（種子の発芽の低温要求性または時間）を調節する、RINGフィンガーもしくはRING-H2のmRNAもしくはタンパク質またはその機能的断片の発現レベルについて、異なる交雑の後代を調べることがここで可能となる。
【００２３】
本発明は、詳細な説明においてさらに説明されるが、それらに制限されることはない。
【００２４】
詳細な説明
植物の材料およびRNAの単離
チューリップの球根を夏季（7月）に収穫し、G期（9月）の少なくとも2週間後まで20℃において保存した。全ての保存処理は換気した暗室において行った。球根をその後、低温処理については5℃、または、17℃のいずれかに移動させた。
【００２５】
ディファレンシャルディスプレイ解析のために、5℃または17℃への移動後、4週、8週、および12週後に試料を採取した。温度処理期間中の示差的な発現のノーザンブロット解析を行うために別の年に同じことを行った。定植後の異なる器官におけるノーザンブロット解析のために、9月に球根を17℃に移動させ、12月末まで置き、その後、5℃に移動させて12週間置いた。23℃（12時間明条件／12時間暗条件）において定植および生長させた後、定植後の指示された日に器官試料を採取した。全ての試料は液体窒素中にて凍結させ、-80℃において保存した、または凍結乾燥させた。[3]に説明されるように、CTABを用いてRNAを単離した。[1]に説明されるように、ホルムアルデヒド／アガロースゲルを用いてノーザンブロット解析を行った。50％のホルムアミド緩衝液、および、α32P-CTP標識RNAプローブを用い、68℃においてハイブリダイゼーションを行った。
【００２６】
クローニングの手順
[2]に説明されるように、ディファレンシャルディスプレイPCR（DDRT-PCR）を行った。示差的なバンドを切り出し、dNTP濃度を100μMとしたことを除いては、DDRT-PCRにおけるものと同じ条件を用いて再増幅させた。PCR産物をクローニングした。全てのPCR産物のクローニングは、pGEM-Tベクター（Promega, Madison USA）において行った。配列決定後、断片特異的プライマーを用い、マラソン（Marathon）キット（ClonTech, Palo Alto USA）を使用し、2つのネスティド5'RACE（5'cDNA末端迅速増幅（Rapid Amplification of cDNA Ends））反応を行った。結果的に得られる断片をクローニングし、配列決定した。5'末端からの新しいプライマー
2004531222.tif 000005
および3'末端からの新しいプライマー
2004531222.tif 000006
を用い、およびプルーフリーディング酵素（KlenTaq, ClonTech）を用いて、総断片をここで再増幅およびクローニングした。双方の鎖について2つのクローンを配列決定し、同一であることを見出した。取り寄せたESTクローンもまた、双方の鎖について配列決定した。配列決定は、製造業者によって推奨されるキットを用い、自動化シーケンサー（ALFexpress, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）において行った。
【００２７】
配列解析
DNASIS（Hitachi Software, Olivet, France）およびGeneRunner（Hastings Software Inc., Hastings on Hudson, USA）ソフトウェアパッケージを用い、配列を解析した。データベースの検索は、NCBI Blastサーバー（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を用いて行った。標準の設定を用い、EBI ClustalWサーバー（http://www.ebi.ac.uk/clustalw/）において多重アラインメントを行った。Boxshade 3.2（ISREC, Epalinges s/Lausanne, Switzerland）を用い、アラインメントを配列整形（shade）した。
【００２８】
結果
TGRING-H2のクローニングおよび配列ならびに類似のEST配列
ディファレンシャルディスプレイを用い、17℃において保存されたものと比較して、5℃において乾燥保存されたチューリップ球根の基部節間においてより高いレベルにて発現されたmRNAについてスクリーニングを行った。218 bpの断片が示差的であることが認められ、クローニングされた。DDRT-PCR断片はしばしば非コード3'末端に由来するため、5'-RACE反応を行った。結果的に生じる断片を配列決定し、プルーフリーディング酵素を用いて全長cDNAを再増幅するために、新しい5'プライマーおよび3'プライマーを設計した。
【００２９】
結果的に生じる1222 bpのクローンは、予測される分子量36.7 kDを有する327アミノ酸からなるオープンリーディングフレームを含む。予測される開始コドンの前にインフレームの停止コドンが存在するため、cDNAは全長または全長に近いもののいずれかである。転写産物のサイズはまた、ノーザンブロット解析においても確証された（非表示）。コードされた酸性タンパク質（等電点5.02）は、非常に著しい特徴として、C末端のRING-H2ドメイン、変異RINGフィンガードメインを有する。それは細胞質に局在することが予測される（www PSORT-server: http://psort.nibb.ac.jp:8800/）。本タンパク質をさらに、TGRING1と呼ぶものとする。
【００３０】
データベース検索から、部分的に配列決定された2つのEST配列、および、公表されている1つのシロイヌナズナ配列、CIP8[COP-1相互作用タンパク質8；[13]]が、RING-H2ドメインを超えて著しい相同性を有することが明らかとなった。ESTクローン、イネのEST C10402、およびシロイヌナズナのEST TAI386を取り寄せ、全長を配列決定した。最近、シロイヌナズナのEST TAI386配列は、ABI3相互作用タンパク質であるAIP2として公表され[8]、そのようにさらに呼ぶものとする。イネのESTはOSRING1とさらに呼ぶものとする。
【００３１】
多重アラインメントから、タンパク質の全長に渡って、2つのEST配列がチューリップの配列に対して高度に相同であることが示される。OSRING1は、300アミノ酸に渡って、58％の同一性および72％の類似性を示し、AIP2は、301アミノ酸に渡って、51％の同一性および64％の類似性を示す。CIP8のTGRING1への相同性は、C末端部分において最も高いが、RING-H2ドメインを超えた領域に渡っている（図1A）。さらなるデータベースの研究により、あらゆる真核生物門に由来する多くの配列がRING-H2ドメインを含むにも関わらず、幾つかは、RING-H2ドメインのすぐN末端側に25〜40個のアミノ酸からなる保存的モチーフを有するようなRING-H2ドメインを含むことが明らかとなった。これらの伸長したRING-H2ドメインは、植物、動物、およびウイルス起源の配列において認められる（図1B）。
【００３２】
TGRING1の発現
基部節間におけるTGRING1の発現レベルは、対照処理と比較して、低温処理期間中により高い（図2A）。それは、処理の後期の段階よりも、処理の早期の部分においてより高い。TGRING1の発現を、球根の定植後に、異なる組織において調べた。節間における発現は、それらが急速に伸長し始めた時点において調べられ、花における発現は、それが最初の着色を示した時点で調べられる。根および葉は、急速な発育期を示さないため、発現は任意の時点において調べられる（図2B）。最高の発現は花の組織において検出され、最低の発現は葉において検出される。
【００３３】
本発明者らは、チューリップにおける低温誘導による茎の伸長の基礎にある機構の1つは、数ヶ月間の低温処理過程に渡る、基部節間におけるオーキシンに対する感受性における緩やかな変化であることを示した。これは、長期の低温処理後の、オーキシン誘導の節間の伸長、およびオーキシン誘導の主要オーキシン反応遺伝子の遺伝子発現の増加によって示された。ディファレンシャルディスプレイを使用することによって、本発明者らは、対照処理と比較して、低温処理期間中により高いレベルで発現されるcDNAクローンを単離した。それは、C末端のRING-H2ドメインを有するタンパク質をコードする。
【００３４】
これは、シロイヌナズナおよび他種の双方における、多くのタンパク質に共通の特徴であるにも関わらず、2つのシロイヌナズナの配列のみがTGRING1の全長に渡る相同性を示した。それらのうち、AIP2は、真に相同であるように充分に高度の相同性を有する。これはまた、単子葉植物起源であるためTGRING1と若干高い同一性および類似性を有するイネのOSRING1についても真実である。シロイヌナズナのCIP8はより関連性の低いタンパク質である。これら4つのタンパク質によって共有される伸長したRING-H2ドメインは、植物界を超えて保存されており、このドメインについての特殊な機能が示唆される。
【００３５】
シロイヌナズナのタンパク質AIP2およびCIP8は、発育調節因子と相互作用するタンパク質として単離される。CIP8は、CIP8のRING-H2ドメインとCOP1のRINGフィンガードメインとの特異的な相互作用を通してCOP1と相互作用する[13]。AIP2のABI3との相互作用は、RING-H2ドメインを含むAIP2のC末端側半分によって仲介される[8]。しかし、意外にも、RINGフィンガードメインを含まないABI3のB2ドメインおよびB3ドメインとそれは相互作用する。従って、RING-H2ドメインを含まないAIP2のC末端部分がABI3と相互作用するか、または、RING-H2ドメインが配列において高度に類似している（AIP2とCIP8のRING-H2ドメインの間には43％の同一性および71％の類似性が存在する）事実にも関わらず、RING-H2ドメインが、明らかな配列相同性を有さない異なるドメインと相互作用できるかのいずれかである。
【００３６】
低温誘導による茎の伸長は、休眠打破の一形態としてみなすことができる。樹木の芽の低温による覚醒、春化、および休眠打破は、低温によって促進される同様の過程である。ここで興味深いのは、TGRING1のシロイヌナズナ相同体AIP2が、ABI3相互作用因子であることである。シロイヌナズナのアブシジン酸非感受性3（abi3）突然変異体は最初、阻害濃度のアブシジン酸（ABA；[7]）の存在下において発芽するその能力について単離されたものであり、胚の成熟および休眠維持において一定の役割を有する[9]。最近の刊行物によって、ABI3が栄養生長停止過程においてもある役割を有することが示された。abi3-4突然変異体は、花成の急速な誘導を示し、ABI3は暗条件下において生長させた実生の頂部において発現される[8；11；12]。その他の最近の刊行物では、標的化ユビキチン仲介タンパク質分解におけるRINGフィンガードメインの機能について提案されている。RINGフィンガータンパク質はそこでE3ユビキチンタンパク質リガーゼとして作用する[6]。
【００３７】
これら全てのことを併せて、本明細書において、本発明者らは、低温誘導のTGRING1の発現が、チューリップのABI3相同体のタンパク質分解のための標的化においてある役割を担い、それにより、休眠状態を取り除き、都合のよい条件下においてその植物を生長させることを示す。種子の休眠およびチューリップにおける低温誘導の花成という類似した現象を解析する2つの全く異なるアプローチでもやはり、上記に説明されるRING-H2モチーフを有する相同なタンパク質のクローニングがもたらされることを考えれば、低温による覚醒および春化のような過程の期間中におけるシロイヌナズナのAIP2の解析、ならびにABI3タンパク質レベルに対するその影響の解析が、この現象をさらに示すための方法といえる。
【００３８】
冷湿処理期間中のAIP2の発現
実験の目的
種子の冷湿処理期間における、クローン化されたチューリップTGRING1のシロイヌナズナ相同体AIP2の発現パターンを決定する。
【００３９】
実験の設定
Cape Verdian ecotype（栽培品種、定植日6月21日、収穫日11月1日、実験開始日11月11日、全て2001年）のシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の乾燥種子を湿らせたろ紙上に播種し、20℃または4℃のいずれかの暗条件下に1日、3日、5日、または7日間置いた。発芽率を決定するために、各処理ごとに、処理後の種子の一部を20℃の明条件（16時間明条件／8時間暗条件）下に移動させた。；RNAの単離のために、残りの種子を液体窒素中にて凍結させ、-80℃において保存した。発芽率は、種子を20℃の明条件下に置いた7日後に決定した。チューリップの実験について説明されるように、RNAの抽出およびノーザンブロット解析を行った。
【００４０】
結果
図4aおよび図4bは、指示された日数の処理後の、AIP2の発現レベルを示す。AIP2プローブは、約1200 bpの1つのバンドにハイブリダイズした。発現レベルは、4℃におけるインキュベーションの1日後に、乾燥種子（12倍高い）、および、20℃においてインキュベートされた種子（5倍高い）の双方と比較して、著しく上昇している。発現は、低温処理の期間中、20℃処理と比較してより高いままである。
【００４１】
図3cは、異なる処理の後の種子の発芽率を示す。種子は著しい休眠状態にはなかったが、発芽率は、低温処理により、20℃において保存された種子と比較して増加した。発芽は、3日またはそれ以上の4℃処理の後では100％であった。本結果は、冷湿処理期間中にシロイヌナズナのAIP2 mRNAが著しくアップレギュレートされることを示す。これは、AIP2タンパク質は配列において保存されるのみならず、機能においても保存されること、さらに、それは、低温誘導が要求される異なる発育過程、即ち、チューリップにおける低温誘導による茎の伸長およびシロイヌナズナの種子の低温による春化においてさえも、機能的に保存されることを示す。冷湿処理期間中に増加した発現は、処理後の発芽率の増加と相関する。AIP2はABI3と相互作用し、RING-H2ドメインを有するため、休眠打破はユビキチン化を介したABI3タンパク質のタンパク質分解標的化によって起こり、それにより、休眠状態が取り除かれる可能性が高い。AIP2はその後、単量体型E3ユビキチンリガーゼとして作用する。相似によって、チューリップのTGRING1タンパク質は、休眠打破の一形態としてみなすことができる茎の伸長の低温誘導の過程において同じ機能を有する可能性がある。この実験は、AIP2および相同タンパク質が休眠打破の明らかなマーカーであることを示す。それはまた、チューリップにおける低温誘導による茎の伸長とは別の過程、即ち種子の低温による春化での休眠打破における、RINGドメインタンパク質の関与をも示す。
【００４２】
文献
参照リスト
2004531222.tif 000007
2004531222.tif 000008
2004531222.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】A．シロイヌナズナおよびイネに由来するTGRING1および相同タンパク質の多重アラインメント。残基は、残基の50％より多くが同一な場合には黒色、および、残基の50％より多くが類似している場合には灰色に影付けされる。完全に保存された残基は星印、保存的置換はコロン、半保存的置換は点によって示される。RING-H2ドメインには下線を施してあり、RING-H2ドメインのN末端伸長には破線で下線を施してある。B．動物、植物、およびウイルス起源のタンパク質の伸長したRING-H2ドメインの多重アラインメント。影付けは、Aについて示されるものと同様である。種は以下のように示される：Mmはマス・マスキュラス（Mus Musculus）（マウス）、Rrはラッタス・ラッタス（Rattus rattus）（ラット）、Atはアラビドプシス・セリアナ（Arabidopsis thaliana）（シロイヌナズナ）、Osはオリザ・サティバ（Oryza sativa）（イネ）、Hsはホモ・サピエンス（Homo sapiens）（ヒト）、Tgはトゥーリパ・ゲスネリアナ（Tulipa gesneriana）（チューリップ）、およびHhはヒトヘルペスウイルス。データベースアクセッション番号：PRAJA1 NP_032879、NDAP1 BAA06979、RHC2a AAC69860、os329 BAA88184、hs311 BAA91254、およびICPO P28284。
【図２】TGRING-1の発現パターン。A．対照処理（17℃）と比較した、低温処理（5℃）の期間中の、チューリップの基部節間におけるTGRING-1の発現。B．定植後の異なる組織におけるTGRING-1の発現。参照として、定植後0日目の、基部節間における発現レベルが示される。この発現レベルは、図2Aの5℃処理の12週目のものと同じである（図2Aと図2Bについては異なる露光時間が使用されている）。他の節間試料をそれらが急速に生長し始めた時点で採取した：葉および根は、指数成長期を示さず、任意の時点において試料を採取した；着色が始まった時点で花組織の試料を採取した。25μgの全RNAをレーンごとに使用した。臭化エチジウム染色によって等しい量が泳動されていることを確認した（非表示）。
【図３】TGRING-1の核酸配列。予測される327アミノ酸のオープンリーディングフレームは104〜1182位の塩基によってコードされ、上記の核酸配列に示される。RING-H2ドメインをコードする塩基には下線を施してある。
【図４】a．吸湿させた種子の、4℃または20℃のいずれかにおける処理期間中のAIP2の発現。AIP2 mRNA配列（GenBankアクセッション番号：ATH251087）の665〜1120位の塩基に相補的なRNAプローブを使用した。バンドは約1200 bpのサイズに相当する。8μgの全RNAを各レーンに流した；下図は、等しい量が泳動されていることを確証するためのブロットのメチレンブルー染色を示す。dsは乾燥種子を示す。b．図4aにおけるバンドの強度の数量化。c．指示された処理後の種子の発芽率。
【図１Ａ】
2004531222.tif 000010
【図１Ｂ】
2004531222.tif 000011
【図２】
2004531222.tif 000012
【図３】
2004531222.tif 000013
【図４Ａ】
2004531222.tif 000014
【図４Ｂ】
2004531222.tif 000015
【図４Ｃ】
2004531222.tif 000016
【国際公開パンフレット】
2004531222.tif 000017
2004531222.tif 000018
2004531222.tif 000019
2004531222.tif 000020
2004531222.tif 000021
2004531222.tif 000022
2004531222.tif 000023
2004531222.tif 000024
2004531222.tif 000025
2004531222.tif 000026
2004531222.tif 000027
2004531222.tif 000028
2004531222.tif 000029
2004531222.tif 000030
2004531222.tif 000031
2004531222.tif 000032
2004531222.tif 000033
2004531222.tif 000034
2004531222.tif 000035
2004531222.tif 000036
2004531222.tif 000037
2004531222.tif 000038
2004531222.tif 000039
2004531222.tif 000040
2004531222.tif 000041
2004531222.tif 000042
2004531222.tif 000043
2004531222.tif 000044
2004531222.tif 000045
2004531222.tif 000046
2004531222.tif 000047
2004531222.tif 000048
2004531222.tif 000049
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004531222.tif 000050
2004531222.tif 000051
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004531222.tif 000052
2004531222.tif 000053
【国際調査報告】
2004531222.tif 000054
2004531222.tif 000055
2004531222.tif 000056