(57)【要約】本発明は、外来ＤＮＡを含有および発現し、哺乳動物細胞への遺伝子移入、ワクチンおよび遺伝子治療に役立つアデノウイルスベクターの効率的なおよび信頼性の高い作成のための方法に関する。本発明は、ウイルス遺伝子のすべてまたはほとんどを除去したアデノウイルスベクター（ヘルパー依存ベクターすなわちＩＩＤＶ）の増殖および精製を提供する。本明細書に記載されたベクターシステムは、単独でまたはヘルパー依存ベクター調製物へのヘルパーウイルスの混入のレベルを制限することが知られている他の方法と組み合わせて、ヘルパーウイルスＤＮＡをエンドヌクレアーゼで切断することにより、最終的なＨＤＶ調製物からヘルパーウイルスを除去するように設計された新しい方法である。開示された方法および組成物は遺伝子発現の制御された調節も提供する。
2004501602.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ） エンドヌクレアーゼ認識部位はアデノウイルスゲノム中の他の部分を切断せず、該エンドヌクレアーゼ認識部位は、アデノウイルスにおいてパッケージングシグナルの３’側の位置に配置されており；および
（ｂ） 埋め込まれたＩＴＲは該アデノウイルスにおいて該エンドヌクレアーゼ認識部位の３’側の位置に配置されている：
パッケージングシグナル、エンドヌクレアーゼ認識部位、および埋め込まれた逆位反復配列（ＩＴＲ）を含むアデノウイルス。
【請求項２】
アデノウイルスがリコンビナーゼに接触すると、パッケージングシグナルが切除されるように、該パッケージングシグナルの両側に該リコンビナーゼの認識部位が隣接している、請求項１記載のアデノウイルス。
【請求項３】
リコンビナーゼの認識部位がｌｏｘＰ部位であり、リコンビナーゼがＣｒｅであるか、またはリコンビナーゼの認識部位がＦＲＴ部位であり、リコンビナーゼがＦＬＰである、請求項２記載のアデノウイルス。
【請求項４】
アデノウイルスがリコンビナーゼに接触すると、エンドヌクレアーゼ認識部位が切除されるように、該エンドヌクレアーゼ認識部位の両側に該リコンビナーゼの認識部位が隣接している、請求項１記載のアデノウイルス。
【請求項５】
リコンビナーゼの認識部位がｌｏｘＰ部位であり、リコンビナーゼがＣｒｅであるか、またはリコンビナーゼの認識部位がＦＲＴ部位であり、リコンビナーゼがＦＬＰである、請求項４記載のアデノウイルス。
【請求項６】
アデノウイルスがリコンビナーゼに接触すると、パッケージングシグナルおよびエンドヌクレアーゼ認識部位が切除されるように、該パッケージングシグナルおよび該エンドヌクレアーゼ認識部位の両側に該リコンビナーゼの認識部位が隣接している、請求項１記載のアデノウイルス。
【請求項７】
リコンビナーゼの認識部位がｌｏｘＰ認識部位であり、リコンビナーゼがＣｒｅであるか、またはリコンビナーゼの認識部位がＦＲＴ部位であり、リコンビナーゼがＦＬＰである、請求項６記載のアデノウイルス。
【請求項８】
エンドヌクレアーゼ認識部位がエンドヌクレアーゼＳｃｅＩの認識部位である、請求項１記載のアデノウイルス。
【請求項９】
さらにアデノウイルスｐＩＸ遺伝子産物をコードする配列に欠失または修飾を含む、請求項１記載のアデノウイルス。
【請求項１０】
（Ａ） （ｉ） エンドヌクレアーゼ認識部位はアデノウイルスゲノム中の他の部分を切断せず、該エンドヌクレアーゼ認識部位は、アデノウイルスにおいてパッケージングシグナルの３’側の位置に配置されており；および
（ｉｉ） 埋め込まれたＩＴＲは該アデノウイルスにおいて該エンドヌクレアーゼ認識部位の３’側の位置に配置されている、パッケージングシグナル、エンドヌクレアーゼ認識部位、および埋め込まれた逆位反復配列（ＩＴＲ）を含むアデノウイルス；ならびに
（Ｂ） 細胞中にヘルパー依存アデノウイルスベクターと該アデノウイルスとが同時に導入されると、該ヘルパー依存アデノウイルスベクターが効率良くパッケージされるために十分な核酸配列、アデノウイルス左ＩＴＲ、アデノウイルス右ＩＴＲ、およびアデノウイルスパッケージングシグナルを含むヘルパー依存アデノウイルスベクター：
を含むヘルパー依存アデノウイルスベクターの生産のためのシステム。
【請求項１１】
アデノウイルスのパッケージングシグナルの両側にリコンビナーゼ認識部位が隣接する、請求項１０記載のシステム。
【請求項１２】
リコンビナーゼの認識部位がｌｏｘＰ認識部位であり、リコンビナーゼがＣｒｅであるか、またはリコンビナーゼの認識部位がＦＲＴ部位であり、リコンビナーゼがＦＬＰである、請求項１１記載のシステム。
【請求項１３】
さらに上記エンドヌクレアーゼを発現する細胞を含む、請求項１１記載のシステム。
【請求項１４】
さらに上記エンドヌクレアーゼおよび上記Ｃｒｅを発現する細胞を含む、請求項１１記載のシステム。
【請求項１５】
さらにアデノウイルスＥ１によってコードされるアデノウイルス遺伝子産物を発現する細胞を含む、請求項１１記載のシステム。
【請求項１６】
上記アデノウイルスがアデノウイルスｐＩＸ遺伝子産物をコードする配列中に欠失または修飾を含む、請求項１１記載のシステム。
【請求項１７】
さらにアデノウイルスｐＩＸ遺伝子産物を発現する細胞を含む、請求項１６記載のシステム。
【請求項１８】
（Ａ） エンドヌクレアーゼを介するアデノウイルスパッケージングシグナルの切断単独、もしくは該パッケージングシグナルの位置指定組み換え切除との組み合せによるアデノウイルスパッケージングシグナルの欠失、アデノウイルスｐＩＸコード配列の欠失もしくは修飾によって誘導されるゲノムパッケージングのサイズ制限、またはその両方のために、感染性のあるアデノウイルスビリオンにパッケージングされる能力のないゲノムを持つ、ヘルパーアデノウイルスを作製する段階；
（Ｂ） ヘルパー依存アデノウイルスベクターの複製を可能にする細胞中で該ヘルパー依存アデノウイルスベクターを増殖させる段階：
を含む、ヘルパー依存アデノウイルスベクター調製物の作製方法。
【請求項１９】
ヘルパー依存アデノウイルスベクターの上記増殖段階が、ヘルパー依存アデノウイルスベクターおよびヘルパーウイルスを、該ヘルパーアデノウイルスからのアデノウイルスパッケージングシグナルのエンドヌクレアーゼを介する切断を誘導するエンドヌクレアーゼを発現する細胞に、同時に導入する行為を含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
細胞がさらにパッケージングシグナルの位置指定組み換え切除を誘導するリコンビナーゼを発現する、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
細胞がさらに、ヘルパーウイルス中のアデノウイルスｐＩＸコード配列の欠失または修飾によって誘導されるゲノムパッケージングのサイズ制限を補完するために十分なアデノウイルスｐＩＸを発現する、請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
ヘルパー依存アデノウイルスベクターおよびヘルパーウイルスを、アデノウイルスｐＩＸを発現しない細胞に同時に導入する段階を含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
ＳｃｅＩおよびＣｒｅまたはＦＬＰを発現する細胞。
【請求項２４】
さらにアデノウイルスＥ１を発現する、請求項２３記載の細胞。
【請求項２５】
アデノウイルスｐＩＸを発現する細胞。
【請求項２６】
さらにＥ１を発現する、請求項２５記載の細胞。
【請求項２７】
ＳｃｅＩおよびアデノウイルスｐＩＸを発現する細胞。
【請求項２８】
ＳｃｅＩおよびＥ１を発現する細胞。
【請求項２９】
（ａ） エンドヌクレアーゼの認識部位がパッケージングシグナルの３’（右側）に存在し、該エンドヌクレアーゼ部位の３’（右側）にさらに逆位反復配列の全体または一部を含むＤＮＡ部分が挿入され、および宿主細胞がさらに第１のアデノウイルスベクターの該認識部位を切断するエンドヌクレアーゼを発現する、修飾された初期領域（Ｅ１）を持つ第１のアデノウイルスベクター；ならびに
（ｂ） （ｉ） ウイルスゲノムの最高約３５，０００ ｂｐの大きな部分の欠失を含むが、左右のＩＴＲおよびパッケージングシグナルを含め、ウイルスＤＮＡの複製およびウイルスＤＮＡのビリオンへのパッケージングにシスで必要とされる配列を保持しており、および
（ｉｉ） サイズが最高約３５，０００ ｂｐの外来ＤＮＡ断片の挿入を含む、第２のベクター：
が同時に感染した宿主細胞を含む、外来遺伝子の発現のための組み換えアデノウイルスベクターシステム。
【請求項３０】
宿主細胞がエンドヌクレアーゼＳｃｅＩを発現し、エンドヌクレアーゼ部位がＳｃｅＩによって認識および切断される、請求項２９記載の組み換えアデノウイルスベクターシステム。
【請求項３１】
ＳｃｅＩを発現するヒト細胞。
【請求項３２】
ＳｃｅＩおよびアデノウイルスＥ１を発現する哺乳類細胞。
【請求項３３】
細胞がヒト細胞である、請求項３２記載の細胞。
【請求項３４】
（Ａ） エンドヌクレアーゼを介するアデノウイルスパッケージングシグナルの切断単独、もしくは該パッケージングシグナルの位置指定組み換え切除との組み合せによるアデノウイルスパッケージングシグナルの欠失、アデノウイルスｐＩＸコード配列の欠失もしくは修飾によって誘導されるゲノムパッケージングのサイズ制限、またはその両方のために、感染性のあるアデノウイルスビリオンにパッケージングされる能力のないゲノムを持つ、ヘルパーアデノウイルスを作製する段階；および
（Ｂ） 該ヘルパーアデノウイルスを細胞中に導入することによって、ヘルパー依存アデノウイルスベクターの複製を可能にする細胞中で該ヘルパー依存アデノウイルスベクターを増殖させる段階：
を含む方法によってアデノウイルスベクターが生産される、実質的にヘルパーアデノウイルスを含まないアデノウイルスベクターの細胞への導入を含む、受容細胞中で遺伝子発現を行う方法。
【請求項３５】
エンドヌクレアーゼ認識部位がアデノウイルスゲノム中で他の部分を切断しないエンドヌクレアーゼの認識部位で、該エンドヌクレアーゼ認識部位がアデノウイルス中でパッケージングシグナルの５’および３’の位置に配置されている、エンドヌクレアーゼ認識部位に隣接されるパッケージングシグナルを含むアデノウイルス。
【請求項３６】
パッケージングシグナルが部位特異的リコンビナーゼの認識部位によって隣接される、請求項３５記載のアデノウイルス。
【請求項３７】
部位特異的リコンビナーゼの認識部位が、ＣｒｅリコンビナーゼまたはＦＬＰリコンビナーゼの認識部位である、請求項３６記載のアデノウイルス。
【請求項３８】
埋め込まれたＩＴＲがアデノウイルス中で３’エンドヌクレアーゼ認識部位の３’の位置に配置されている、請求項３５記載のアデノウイルス。
【請求項３９】
Ｅ１、ＳｃｅＩ、Ｃｒｅ、ＦＬＰ、ｐＩＸ、またはその任意の組み合せを発現する細胞。
【請求項４０】
外来ＩＴＲおよび内在ＩＴＲの間のＤＮＡ配列の複製にともなうウイルスゲノムのパッケージングを予防するためのスタッファー核酸および内在ＩＴＲを含むヘルパーウイルス。
【請求項４１】
隣接するｌｏｘ部位またはＦＲＴ部位と組み合せてＳｃｅＩ部位によって隣接されるパッケージングシグナルを含むヘルパーウイルス。
【請求項４２】
ＳｃｅＩ部位、隣接ｌｏｘ部位およびＦＲＴ部位を含む、請求項４１記載のヘルパーウイルス。
【請求項４３】
特異的な制限ヌクレアーゼ、部位特異的リコンビナーゼ、またはその両方を発現する細胞にヘルパーウイルスが導入されると、ヘルパーウイルスゲノムのパッケージングが該ヘルパーウイルスからのｐＩＸの削除によって制御され、該ヘルパーウイルスが特異的な制限ヌクレアーゼ認識部位、部位特異的リコンビナーゼ認識部位、またはその両方に隣接されるｐＩＸ遺伝子を含む、ヘルパーウイルスシステム。
【請求項４４】
部位特異的制限ヌクレアーゼがＩ−ＳｃｅＩ、部位特異的リコンビナーゼがＣｒｅまたはＦＬＰまたは両方、および部位特異的リコンビナーゼ認識部位がｌｏｘ部位、ＦＲＴ部位、または両方である、請求項４３記載のヘルパーウイルス。
【請求項４５】
発現カセットのｃＤＮＡの発現が、インビボでＤＮＡの切除とＤＮＡ断片の再結合によって調節さるような分子スイッチの制御下にある発現カセット。
【請求項４６】
発現カセットがプラスミド、ウイルス、または脊椎動物ゲノム内に位置する、請求項４５記載の発現カセット。
【請求項４７】
最適化されたＫｏｚａｋ配列のコード配列および制限エンドヌクレアーゼＳｃｅＩのコード配列を含む、アデノウイルス。
【請求項４８】
左ＩＴＲおよび内在ＩＴＲ配列の間にクローニングスタッファー配列を含むために、該左ＩＴＲおよび該内在ＩＴＲ配列の間のＤＮＡ配列が複製されるとウイルスゲノムが大きすぎてパッケージングできないような、該左ＩＴＲおよび該内在ＩＴＲを含む、再配列された組み換えヘルパーアデノウイルスゲノムのパッケージング予防方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願における相互参照
本出願は、１９９９年２月１８日に出願され、係属中の米国特許出願第０９／２５０，９２９号の一部継続出願であり、これは１９９５年の６月７日に出願された米国特許出願第０８／４７３，１６８号、現在、米国出願第５，９１９，６７６号の一部継続出願であり、これは１９９４年５月３１日に出願された、継続中の米国特許出願第０８／２５０，８８５号の一部継続出願であり、これは１９９３年６月２４日に出願され、放棄された米国特許出願第０８／０８０，７２７号の一部継続出願であった。これらの出願の各々の優先権は本明細書において主張されており、これらの出願の各々の開示は参照として本明細書に組み入れられている。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ヘルパーウイルスＤＮＡをエンドヌクレアーゼで切断することにより、ＨＤＶ調製物からヘルパーウイルスを除去し、ヘルパーアデノウイルスおよびヘルパー依存アデノウイルスベクター（ＨＤＶ）を生産する新しい方法である。ＨＤＶ調製物のヘルパーウイルスの混入レベルを最小限にするために、本発明はＣｒｅ／ｌｏｘもしくは他のヘルパーウイルス封じ込み系とは独立に使用することまたは、Ｃｒｅ／ｌｏｘもしくは他のヘルパーウイルス封じ込み系と組み合わせて使用することが可能である。
【０００３】
発明の背景
参照として本明細書に組み入れられる、国際公開公報第９６／４０９５５号として公開された米国特許出願第０８／４７３，１６８号（‘１６８出願）、現米国特許第５，９１９，６７６号において、ヘルパー依存アデノウイルスベクターおよびヘルパーアデノウイルスを作製するためのシステムが開示された。このシステムはアデノウイルスのパッケージングシグナルに隣接してｌｏｘＰ部位を有するヘルパーウイルスが導入された細胞により発現された（すなわち、パッケージング配列が「ｆｌｏｘｅｄ（フロックスされた）」）、Ｃｒｅのようなリコンビナーゼを用いたものであった。宿主細胞により発現されたリコンビナーゼにより、ヘルパーアデノウイルスのパッケージングシグナルは切り出され、それによりヘルパーウイルスのパッケージングが制限される。パッケージングシグナルを含むヘルパー依存性の組換え体アデノウイルスベクター（ＨＤＶ）を共に導入させることにより、効率的にパッケージされたヘルパー依存ウイルスが単離される。しかし、当業者により理解されるように、このシステムのいかなる「漏出」も、ヘルパー依存アデノウイルスベクター調製物へのヘルパーウイルスの混入という結果をもたらす。本発明は、パッケージされたヘルパーウイルスの混入レベルがエンドヌクレアーゼにより低減された、ＨＤＶ調製物を生産する方法およびヘルパーウイルスの構築物を示すものである。本明細書に開示される構築物および技術は、国際公開公報第９６／４０９５５号に従って記載されているＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムとは独立に用いることが可能である。また、本明細書に開示する技術はそのシステムの有効性を増加させるために使用することが可能である。
【０００４】
さらに、当業者には理解されるであろうが、本明細書にて提供される開示に基づき、本明細書に参照として組み入れられる、もとの特許出願第０８／７１９，２１７号、国際公開公報第９８／１３５１０号として公開された海外での相等物に開示されたようなシステムは、本明細書において開示され主張されるシステムにより増強することが可能である。国際公開公報第９８／１３５１０号のシステムにおいては、ヘルパーアデノウイルスはｐＩＸ遺伝子が欠損し機能を失ったものとして記載されている。このような改変されたアデノウイルスにおいては、機能的なパッケージングシグナル、Ψの有無にかかわらず、ｐＩＸ欠損を補うだけのヘルパーウイルスが細胞内において増殖されない限り、約３５ｋｂより大きなゲノムは有効にパッケージされない。もしＣｒｅ／ｌｏｘＰ組換えシステムも使用すると、本発明との組み合わせにより、二重三重に機能を失ったヘルパーウイルスが生産され、それは依然として、トランスに、ヘルパー依存アデノウイルスベクター（ＨＤＶ）の複製を支援するために必要な全ての機能を提供することができる。
【０００５】
当業者は、核酸の断片における特定の標的配列の切断における、内在的に発現された、または外部供給源から導入されたエンドヌクレアーゼやその使用法を熟知している。
【０００６】
また当業者には理解されるように、アデノウイルスはゲノムの両末端に逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含み、これはアデノウイルスの複製に必須である。ＩＴＲ（ウイルスゲノムの最末端の約１００〜２００ｂｐに相当する）はシスにウイルスＤＮＡの複製に必要とされる唯一のＡｄ ＤＮＡ配列であり、ウイルスＤＮＡをウイルス粒子キャプシドにパッケージするために必要であるパッケージングシグナル（Ψ）は、ウイルス粒子生産に必要とされる唯一の付加的なシスに作用する配列である。そのため、トランスにＨＤＶの複製に必要な他の全ての要因を提供するために、適切なヘルパーウイルスが使用できる。さらに、ゲノム中に組み込まれたＩＴＲを含むアデノウイルスは、外部のＩＴＲが除去されても、修復の過程を通して複製可能であることが知られている（例えば、Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５３：２２−３４（１９８６）を参照のこと）。しかし、ヘルパーウイルスおよび実質的にウイルス混入のないヘルパー依存ウイルス調製物の生産においてこの知見を適応することはこれまでに示されていない。
【０００７】
発明の概要
本発明は外来ＤＮＡを含有および発現し、哺乳動物細胞への遺伝子移入やワクチンおよび遺伝子治療に役立つアデノウイルスベクターの効率的なおよび信頼性の高い作成のための方法に関する。本発明は、ウイルス遺伝子のすべてまたはほとんどを除去したアデノウイルスベクター（ヘルパー依存ベクターすなわちＨＤＶ）の増殖および精製を提供する。本明細書に記載されたベクターシステムは、ヘルパーウイルスＤＮＡをエンドヌクレアーゼで切断することにより、最終的なＨＤＶ調製物からヘルパーウイルスを除去するように設計された新しい方法である。
【０００８】
したがって、ヘルパー依存アデノウイルスベクターを増殖および精製でき、ヘルパーウイルスの混入が著しく低減される、または除去されるような、簡単で有用なシステムを提供するのが、本発明の１つの目的である。
【０００９】
本発明の他の目的は、ヘルパー依存アデノウイルスベクター調整物へのヘルパーアデノウイルスの混入を低減することが達成される、またはそれが増強される方法を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、ベクターが導入される宿主細胞において複製可能なウイルスが実質的に除去されたヘルパー依存ベクター調製物のように、実質的にヘルパーウイルスのない、ヘルパー依存アデノウイルスベクター調製物を提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、ワクチンおよび遺伝子治療への適用における有用性を増強させた方法および組成物を提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、全開示の概観および添付の請求項より明らかとなる。
【００１３】
好ましい態様における詳細な説明
本発明の属する従来技術をより完全に説明するよう、本明細書に参照として組み入れられる全ての文献が本明細書の一部を構成する。
【００１４】
本発明を理解する上で、特に明記しない限り、本明細書中の全ての技術的及び科学的用語が当業者により通常理解されるのと同じ意味を有することに留意すべきである。また、ここで用いられる技術も、特に明記しない限り、当業者に公知のものである。
【００１５】
特定の緩衝液、培地、試薬、細胞、培養条件等についての言及、または、それらのより下位の分類についての言及は、限定的なものではなく、それについて論じられている部分における特定の文脈からその対象、または有用なものとして当業者により理解される全ての関連の材料が含まれるものとして捉えられるべきである。例えば、示された方法、材料、または組成物の使用により定められた結果と同じ結果が達成されるよう、或る緩衝液系、または、培養培地はしばしば別のものと入れ換え、代わりに別の公知の方法を用いることが可能である。
【００１６】
本明細書中で使用される用語は、発明を限定することを目的とするものではない。例えば、「遺伝子」という用語には、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドが含まれる。「外因性遺伝子」とは、その遺伝子が発現される生物体または細胞型とは異なる生物体、または細胞型から得られた遺伝子を指す。また、同じ生物体中で、ゲノム中の正常部位から転位（トランスロケーション）された遺伝子も意味する。本明細書中において「核酸」、「ＲＮＡ」、「ＤＮＡ」等の用語を使用する場合、特定の工程中で用いることができる化学的な構造を限定することを意図しているわけではない。例えば、ＤＮＡを一般的にＲＮＡに代えることができることが当業者には周知であるので、「ＤＮＡ」の用語が用いられている場合、このような置換が含まれると解釈すべきである。さらに、多様な核酸アナログ、及び誘導体が本発明の範囲に含まれることが理解される。遺伝子、または核酸の「発現」には、細胞での遺伝子発現だけではなく、クローニング系、並びに他のいずれかの状況下での核酸の転写、及び翻訳を包含する。「リコンビナーゼ」という用語には、組換えを誘導、媒介、または促進する酵素、及び、核酸配列の再配列、または、第一の核酸配列の第二の核酸配列から、若しくは、第二の核酸配列中への除去または挿入を起こすか、媒介するか、または促進するその他の核酸改変酵素を包含する。リコンビナーゼの「標的部位」とは、リコンビナーゼにより認識（例えば、特異的に結合）、及び／または作用される（除去、切断、または組換えが誘導される）核酸配列若しくは領域のことである。「遺伝子産物」との用語は、主に他の核酸（例えば、ｔＲＮＡ、ｓＲＮＰ等の非コード、及び制御ＲＮＡ）によりコードされるタンパク質及びポリペプチドを指す。「発現の制御」という用語は、或る遺伝子産物の合成、分解、有効性、または活性を増加、若しくは減少させる事象、または、分子を指す。
【００１７】
本発明はまた、本明細書中で使用される細胞型、及び細胞系に限定されるわけではない。本発明において、異なる組織（乳上皮、結腸、リンパ球等）、または異なる種（ヒト、マウス等）由来の細胞もまた有用である。
【００１８】
本発明において組換え核酸、並びにそれによりコードされる遺伝子産物の産生、及び発現を検出することが重要である。ここで使用される検出方法には、例えば、クローニング及び配列決定、オリゴヌクレオチドのライゲーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、及びそのバリエーションの利用（例えば、７−ｄｅａｚａＧＴＰを用いるＰＣＲ）、単一ヌクレオチドプライマーによる増幅分析（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）の利用、或るストリンジェントな条件下で相補的配列と優先的に結合する標的特異的オリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーション技術、並びに、サンドイッチ型ハイブリダイゼーション法が含まれる。
【００１９】
配列決定は、標識プライマー若しくは標識ターミネータ−を利用する市販の自動配列決定装置、または配列決定ゲルを利用した方法を用いて行うことができる。配列分析はまた、標的ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子上で互いにすぐ横に隣接してアニーリングするオリゴヌクレオチド配列のライゲーションに基づく方法（Ｗｕ及びＷａｌｌａｃｅ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０−５６９ （１９８９）；Ｌａｎｄｒｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ８７：８９２３−８９２７ （１９９０）；Ｂａｒａｎｙ Ｆ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ． ８８：１８９−１９３ （１９９１））により行うこともできる。リガーゼ媒介共有連結（ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）は、オリゴヌクレオチドが正確に塩基対形成された場合にのみ起こる。標的増幅に耐熱性Ｔａｑリガーゼを用いたリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、後期発症型糖尿病（ｌａｔｅ ｏｎｓｅｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ）変異座を探すのに特に有用である。上昇された反応温度は、高いストリンジェンシーの連結反応を可能とする（Ｂａｒａｎｙ Ｆ、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １：５−１６ （１９９１））。
【００２０】
ハイブリダイゼーション反応は、標的各線をニトロセルロース膜またはナイロン膜に固定し、オリゴヌクレオチドプローブにより試験する、膜を利用した形式で行うことができる。サザンブロット、スロットブロット（ｓｌｏｔ ｂｌｏｔｓ）、「逆向き（ｒｅｖｅｒｓｅ）」ドットブロット、溶液ハイブリダイゼーション、固相上のサンドイッチ型ハイブリダイゼーション、並びに、ビーズ、シリコンチップ、及びマイクロタイターウェルを用いたハイブリダイゼーション法を含む何れかの公知のハイブリダイゼーション法を用いることができる。
【００２１】
検出用オリゴヌクレオチドプローブの大きさは１０〜１，０００塩基の範囲内である。検出用オリゴヌクレオチドプローブを用いて目的標的反応物を得るため、ハイブリダイゼーション反応は通常、２０〜６０℃、そして最も好ましくは３０〜５０℃の間で行われる。当業者に知られるように、完全一致、及び、ミスマッチの二本鎖分子の最適の区別は、温度、及び／または、塩濃度、または、ストリンジェントな洗浄におけるホルムアミドを入れるか、入れないかにより操作することにより達成される。
【００２２】
本明細書中に記載されるクローニングベクター、及び発現ベクターは、細胞、または組織に当分野において知られる多様な方法のいずれかにより導入される。このような方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９２））、及び、Ａｕｓｕｂｅｌらの「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， ＭＤ （１９８９））に記載される。これらの文献は、本明細書の一部を構成する。これらの方法には、例えば、安定性または一過性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトポレーション、及び、組換えウイルスベクターによる感染が含まれる。
【００２３】
組換え及び非組換えコード配列のタンパク質産物は免疫技術を用いて分析することができる。例えば、タンパク質、またはその断片をアジュバントと共に宿主動物へ注射し、免疫応答を起こさせる。組換え断片に結合する免疫グロブリンを血清の形で回収し、場合によりさらにアフィニティークロマトグラフィー、またはその他の方法により精製する。さらに、免疫したマウス宿主より脾臓細胞を採取し、ミエローマ細胞と融合させ、抗体分泌ハイブリドーマ細胞バンクを作製する。野生型タンパク質と予め吸着させることにより、または、変異ポリペプチドとは結合するが野生型ポリペプチドとは結合しない特定のイディオタイプについてハイブリドーマ細胞系をスクリーニングすることにより、変異ポリペプチドと結合するが、野生型ポリペプチドとはほとんど、若しくは全く結合しない免疫グロブリンを分泌するクローンについて、ハイブリドーマバンクをスクリーニングする。所望の変異ポリペプチドを最終的に発現させることができる核酸配列は、多様な種々のポリヌクレオチド（ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、合成オリゴヌクレオチド等）から、また、多様な種々の技術により形成される。
【００２４】
ＤＮＡ配列は、発現調節配列に該配列が操作可能に（即ち、その作動が保証されるように位置）連結された後、宿主中で発現される。これらの発現ベクターは、典型的には宿主生物体中でエピソームとして、または、宿主染色体ＤＮＡ中の一部として複製可能である。通常、発現ベクターは選択マーカー（例えば、テトラサイクリン耐性、またはハイグロマイシン耐性に基づくマーカー）を含み、所望のＤＮＡ配列と共に形質転換された細胞の検出、及び／または選択が可能である。さらなる詳細については、米国特許第４，７０４，３６２号に記載されている。
【００２５】
変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、コードされるポリペプチド産物が産生されるようにコード配列の転写（配列の発現）及び翻訳を促進するような配列を含む。このようなポリヌクレオチドの構築は、当分野において周知である。例えば、このようなポリヌクレオチドはプロモーター、転写終結部位（真核性発現宿主においてはポリアデニル化部位）、リボソーム結合部位、場合により真核性発現宿主で使用するためのエンハンサー、及び、ベクターの複製に必要とされる配列を含む。
【００２６】
大腸菌は、本発明のＤＮＡ配列を特にクローニングするのに有用な原核性の宿主である。その他の使用に適する微生物宿主には、枯草菌等のバチルス属、サルモネラ、セラチア、及び種々のシュードモナス等の他の腸内細菌が含まれる。発現ベクターはこれらの原核性宿主内で作られ、典型的には宿主細胞に適合する発現調節配列（例えば、複製起点）を含む。さらに、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（Ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、または、λファージのプロモーター系等の多様な周知のプロモーターが必要なだけ使用される。場合によりオペレーター配列を有し、リボソーム結合部位配列を持つプロモーターにより、転写及び翻訳が開始され、完了されるように発現は調節される。
【００２７】
その他、酵母等の微生物が発現に用いられる。サッカロマイセス属は好ましい宿主であり、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、または他の糖酵素を含むタンパク質のプロモーター、複製起点、終止配列等の発現調節配列を所望により有する適当なベクターが存在する。
【００２８】
微生物に加え、哺乳動物組織細胞が本発明のポリペプチドを発現・生産するのに用いられる。当業界において、無傷のヒトタンパク質を分泌できる数多くの適した宿主細胞株が開発されているので、真核細胞が好ましく、ＣＨＯ細胞株、ＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ミエローマ細胞株、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞などが含まれる。これらの細胞のための発現ベクターは、複製開始点、プロモーター、エンハンサーといった発現調節配列、リボゾーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位といった必須情報処理部位、および転写終結配列を含む。好ましい発現調節配列は、イムノグロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなど由来のプロモーターである。興味の対象となるＤＮＡ断片（例えば、変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を含むベクターは、よく知られた方法で宿主細胞に移入される。その方法は、細胞性宿主のタイプによって変わる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは原核細胞のために一般的に用いられるが、リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションは他の細胞性宿主のために有用である。
【００２９】
本方法は、診断に用いるための試験キットの製剤化に直ちに役に立つ。このようなキットは、一つまたはそれ以上の容器を近くに閉じこめて収納するように区画されたキャリアー（ｃａｒｒｉｅｒ）を含み、最初の容器は、酵素基質のようなラベルされたプローブの局在化に有用な試薬を含む。更に他の容器は、制限酵素、緩衝液などを、使用説明書と共に含む。
【００３０】
本明細書において記載される組換えＡｄベクターは、以前に記載された作製物とは有意に異なる。それらは、ウイルス遺伝子の全てまたはほとんどを欠失したベクターの使用を、ベクターウイルスとの共感染に用いたとき、ベクターの成長を相補できるが、感染性ウイルス粒子にウイルスＤＮＡを充填することはできないように設計されたヘルパーウイルスと結びつける。このようにして、ベクターウイルスを、実質的にヘルパーウイルスなしに調製することができる。
【００３１】
ウイルスＤＮＡの複製およびウイルス粒子へのウイルスＤＮＡの充填にはウイルスＤＮＡのわずか３つの領域がシスに必要であることが知られている。これらは、左逆方向終端反復すなわちＩＴＲ（塩基対１からおよそ１０３）、充填シグナル（およそ１９４から３５８塩基対）（Ｈｅａｒｉｎｇ ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ， １９８３， Ｃｅｌｌ ３３： ６９５−７０３； Ｇｒａｂｌｅ ａｎｄ Ｈｅａｒｉｎｇ １９９２， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６４： ２０４７−２０５６）および右ＩＴＲである。ウイルスゲノムの他の全ての領域は、ウイルスの複製および感染性ウイルスの生産を許容するようにトランスで作用するウイルス産物を生産することにのみ必要であると思われる。このように、もし、必須なウイルスタンパク質およびＲＮＡがヘルパーウイルスによって提供できるならば、ウイルスＤＮＡの複製および充填にシスに必要な上記の配列を除いてウイルスＤＮＡのほとんどを欠失したベクターを設計および作製できる。
【００３２】
本発明により提供される特異的な進歩は、ヘルパー依存性アデノウイルス・ベクター調製物のヘルパー・アデノウイルス混入のレベルを制限するために重要であることが認識されよう。この目的のため、Ａｄゲノムにおいて認められず、かつ十分に長いためヒトゲノムには存在しないと予測されるか、又はヒトゲノムには低頻度に出現するであろうＤＮＡ配列を認識し、特異的に切断する、メガヌクレアーゼ（ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅ）Ｉ−ＳｃｅＩ（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ ＭＡＮＮＨＥＩＭより商業的に入手可能なＯｍｅｇａ−ｎｕｃｌｅａｓｅ、カタログ番号１４９７２３５及び１３６２３９９）（以後、ＳｃｅＩ又はＩ−ＳｃｅＩと呼ぶ）のようなエンドヌクレアーゼが存在することを、当業者は理解するであろう。従って、該ヌクレアーゼは、有害な効果なしに、ヒト細胞において構成性発現されうる。哺乳動物細胞ＤＮＡにおける二本鎖破壊の修復は極めて効率的であるため、ヒトゲノム内の数個の部位の存在は、ＳｃｅＩのようなヌクレアーゼを発現する細胞にとって致命的ではない。従って、ＳｃｅＩにより誘導された二本鎖破壊は「治癒」し、ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ等のエンドヌクレアーゼを発現し続ける生存細胞が単離されうる。ＳｃｅＩが単なる例であり、本発明を制限するものではないことを、当業者は認識するであろう。長く、かつ低頻度に発現される認識部位を有するという条件を満たすエンドヌクレアーゼが、その他にも存在する。さらに、新規なエンドヌクレアーゼが発見され続けており、そのようなエンドヌクレアーゼ及びそれらの特異的認識部位も、同様に、本発明に従い利用されうる。
【００３３】
アデノウイルスゲノムが哺乳動物細胞において複製される過程のため、逆方向末端反復配列ＩＴＲがＡｄゲノム内部の部位に挿入されうる。そして、そのような内部ＩＴＲは、内部ＩＴＲがＡｄ ＤＮＡ複製の開始において使用される真の末端又は機能的ＩＴＲとなるよう、 Ａｄ ＤＮＡ複製中の「修復」過程において使用されうる（”Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ５ ｍｕｔａｎｔ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ（埋め込み逆方向末端反復配列を保持する５型アデノウイルス変異体の特徴決定）”，Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ，Ｙ．ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１５３，２２−３４，１９８６の図６（この目的のため参照として本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。本明細書に記載された発明は、ＳｃｅＩのような低頻度切断エンドヌクレアーゼの特性を、前記のアデノウイルスの特性と組み合わせ、ヘルパーウイルス混入が実質的にないＨＤＶ調製物の作製のための新規な系を提供する。
【００３４】
本発明の必須要素は、図１及び２を参照することにより最も明快に理解されうる。本明細書においてＡｄＳｃｅＩｃｕｔと呼ばれるヘルパーウイルスは、ＳｃｅＩ等のエンドヌクレアーゼの認識部位が、ヘルパーウイルスのパッケージング・シグナル（ψ）の右方に配置されるよう構築される。図１に示されるように、内部ＩＴＲ配列が、エンドヌクレアーゼ認識部位の右方に挿入される。好ましくは、ヘルパーウイルスＡｄＳｃｅＩｃｕｔは、Ｅ１配列の欠失を含む。これは、Ｅ１欠失ウイルスの複製を支持する２９３細胞又はその他の任意の宿主細胞におけるヘルパーウイルス増殖を促進するであろう。場合によって、ヘルパーウイルスは、ＳｃｅＩ部位及び内部ＩＴＲの右方にＥ１を保持していてもよい。
【００３５】
２９３ＳｃｅＩ細胞のようなＳｃｅＩを発現する細胞の感染は、ＳｃｅＩ部位におけるＳｃｅＩエンドヌクレアーゼによる分解をもたらす。複製には分子の両端のＩＴＲが必要であるため、結果として、ＤＮＡ複製に関してＤＮＡ分子が不活化されるであろう。しかしながら、エンドヌクレアーゼ認識部位の右方に内部ＩＴＲが挿入されているために、該内部ＩＴＲとＤＮＡの右端の外部ＩＴＲとのアニーリングにより、ヘルパーウイルスは修復され、分子の左端における機能的ＩＴＲの形成がもたらされる。このようにして、ウイルスＤＮＡ複製能を有するＤＮＡ分子が効率的に生成する。得られた分子は複製能を有するが、ビリオンの産生にとって必要なパッケージング・シグナルを欠いている。従って、図２に図示されているように、ＳｃｅＩ部位のような適当なエンドヌクレアーゼ認識部位を含有するヘルパー・アデノウイルス（例えば、ＡｄＳｃｅＩｃｕｔ）は、ヘルパーを実質的に含まないヘルパー依存性アデノウイルス・ベクター（ＨＤＶ）の作製のための有用なヘルパーウイルスとして用いられる。
【００３６】
本発明のさらなる態様において、ＨＤＶ調製物中のヘルパーウイルス混入の程度をさらに減少させるため、前記のエンドヌクレアーゼ系は、米国特許第５，９１９，６７６号により開示されたＣｒｅ／ｌｏｘ系と組み合わせられる。Ｃｒｅ及びＳｃｅＩの両方を発現する２９３細胞のような、Ｃｒｅ及び適当なエンドヌクレアーゼの両方を発現する細胞が、好ましくは、この目的のため利用される。本発明のこの態様によると、ｌｏｘ部位がパッケージング・シグナルの両側に位置しているヘルパーウイルスが構築される。埋め込みＩＴＲは、内側のｌｏｘ部位の右方に置かれる。適当なエンドヌクレアーゼ認識部位が、パッケージング・シグナルの右方であって、２個のｌｏｘ部位の間か、又はより内側のｌｏｘ部位の右方であるが、埋め込みＩＴＲよりは左方のいずれかである場所に置かれる。又は、ＳｃｅＩ部位及び隣接内部ＩＴＲの両方が、パッケージング・シグナルと内側ｌｏｘＰ部位との間に置かれる。このように、Ｃｒｅ／ｌｏｘ系が「漏出」し、パッケージング・シグナルを含有するヘルパーウイルスがＨＤＶ調製物に混入した場合には、エンドヌクレアーゼ認識部位の存在が、パッケージング・シグナルを含有する残存ヘルパーウイルスがビリオンを形成することを防止する「フェイルセイフ（ｆａｉｌ−ｓａｆｅ）」機構を提供する。そのような組み合わせにおいて使用するための適当なヘルパーウイルスの例が、図３に図示されている。本発明のこの態様において、ＳｃｅＩ部位はｌｏｘＰ部位の間に位置しており、ｌｏｘＰ部位はパッケージング・シグナルをはさんでいる。図の右下に示されているように、Ｃｒｅの作用により切り出されなかったパッケージング・シグナルを有するヘルパーウイルスゲノムは、ＳｃｅＩ分解に対して感受性である。従って、ψのＣｒｅ媒介切り出しを回避する少数のヘルパーウイルスゲノムは、ＳｃｅＩ分解によりさらに減少する。
【００３７】
ＳｃｅＩ分解により生成するＤＮＡ断片は、驚くべき程高い効率で様々な方法で接合されうることを、本発明者らは見出したため、本開示に基づき、ＳｃｅＩ分解のための多数の可能性のある使用が可能となることを、当業者は理解するであろう。第一に、図２６の断片Ａ及びＣの接合により形成されるウイルスＤＮＡ種は、豊富に存在する種であるため、そして、この分子はパッケージング・シグナルを欠いているため、ＳｃｅＩ部位にはさまれたパッケージング・シグナルを含有するヘルパーウイルスが、本発明の好ましい態様であることが分かるであろう。ヘルパーウイルスは、場合によって、Ａ／Ｃ接合の非存在下で、図２６の右部分に図示されたパンハンドル形成及び修復が、複製能を有するＤＮＡ分子を生成させうるよう、内部ＩＴＲを保持していてもよい。第二に、ウイルスゲノム中の任意のＤＮＡ断片がＳｃｅＩ部位にはさまれていてもよく、ＳｃｅＩ部位にはさまれた断片の左右に由来するウイルスＤＮＡ断片の再接合をもたらすＳｃｅＩ分解及びそれに続く二本鎖破壊修復の過程が、効率的にはさまれた断片の切り出しをもたらすことが、分かるであろう。従って、アントン及びグラハム（Ａｎｔｏｎ，Ｍ．ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ： ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｗｉｔｃｈ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．（Ｃｒｅリコンビナーゼ・タンパク質を発現するアデノウイルス・ベクターにより媒介される部位特異的組換え：遺伝子発現の調節のための分子スイッチ）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６９：４６００−４６０６，１９９５）及び１９９５年６月７日出願の米国特許出願第０８／４８６，５４９号に記載されたＣｒｅ−ｌｏｘ組換えに基づくものと機能的に実質的に同一であるが、Ｃｒｅ−ｌｏｘではなくＳｃｅＩにより媒介される切り出しに依存する、遺伝子発現の制御のための分子スイッチを作出することが可能である。一例が図２８に図示されているが、これは本発明を制限するものではない。この例においては、Ｉ−ＳｃｅＩ媒介切断及びそれに続く左側及び右側のウイルスＤＮＡ断片の再接合が、β−ガラクトシダーゼの産生のための機能的発現カセットを含有するウイルスゲノムをもたらす。そのようなカセットは、Ｅ１領域に位置している必要はなく、ウイルスゲノム内のＥ３又はその他の場所においても同様に操作されうる。ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、ポックスウイルス等のようなその他のウイルスも、同様に操作されうる。
【００３８】
さらに、Ｉ−ＳｃｅＩを発現するアデノウイルス又はその他のウイルス又はプラスミドＤＮＡを、ＳｃｅＩ感受性部位を含有するゲノムを有する細胞又は動物に輸送することもでき、Ｉ−ＳｃｅＩの発現は該部位の分解をもたらすであろう。ＤＮＡ端の接合による修復は、図２９に図示された構造を有する染色体をもたらしうる。ここでは、ＳｃｅＩ分解及びそれに続く二本鎖破壊修復が、効率的にＤＮＡ断片の切り出しをもたらし、そして、示された例においては、β−ガラクトシダーゼ又はその他の任意の遺伝子のような遺伝子の発現をオン又はオフに切り替える。二本鎖破壊修復機構は完全ではないため、ＳｃｅＩ分解部位は、稀にしか再生されず、従って、反応は本質的に不可逆的であろう。
【００３９】
Ｉ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ又はＳｃｅＩ部位を使用する箇所においてはいつでも、哺乳動物細胞において発現されうる、そしてＤＮＡ内の特異的配列を切断するために使用されうる他の任意の部位特異的エンドヌクレアーゼを使用しうることを、本開示に基づき、当業者は理解するであろう。従って、Ｉ−ＳｃｅＩを用いた例は、本発明を制限するものではない。同様に、Ｃｒｅ−ｌｏｘを使用する箇所においては、ＦＬＰ−ＦＲＴ等の部位特異的リコンビナーゼ系を使用することができる。
【００４０】
本発明を一般的に記載してきたが、さらなる説明を提供し、そして開示された発明の特定の態様を可能にするために、以下に実施例を記載する。しかしながら、本発明がこれらの実施例の細部により制限されると解釈すべきではない。むしろ、本発明の範囲は、完全な開示及び添付の請求の範囲から決定されるべきである。
【００４１】
実施例
実施例１
ヘルパーウイルスのエンドヌクレアーゼ分解
図１は、パッケージング・シグナルψの右方に位置付けられたＳｃｅＩ部位を、ウイルスゲノムの左端近傍に含有するアデノウイルスを示しており、ＳｃｅＩ分解及びＩＴＲ修復の効果を図示している。２９３ＳｃｅＩ細胞の感染は、ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ活性の結果として、ＤＮＡの二本鎖破壊をもたらす。隣接する埋め込みＩＴＲがパンハンドル（ｐａｎｈａｎｄｌｅ）形成（右側ＩＴＲとのアニーリング）により修復されるため、複製能を有するが、パッケージング・シグナルは欠いており、従ってビリオンへとパッケージングされえない機能的ＤＮＡ分子が形成される。
【００４２】
実施例２
ヘルパー依存性アデノウイルス・ベクターの増殖及びエンドヌクレアーゼ分解によるヘルパーウイルス混入の排除
図２は、ウイルス遺伝子の全部又は大部分が欠失し、外来ＤＮＡ及び「スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）」ＤＮＡで置換されているヘルパー依存性Ａｄベクターの増殖を図示している。スタッファーＤＮＡは、パッケージング効率を最大化するために最適なベクターのゲノムのサイズを維持するために使用される。ベクター及びヘルパーによる２９３ＳｃｅＩ細胞の共感染は、示されているように、ヘルパーウイルスＤＮＡのＳｃｅＩ媒介分解をもたらす。ＳｃｅＩ部位の右方に位置する内部ＩＴＲが修復され、その結果、複製され、かつ増幅されるＤＮＡ分子がもたらされる。しかしながら、パッケージング・シグナルが欠如しているため、ヘルパーウイルスＤＮＡはビリオンへとパッケージングされえない。複製はするがパッケージング能は有しないヘルパーウイルスＤＮＡは、（ウイルス遺伝子の全部又は大部分を欠いているが、ＤＮＡ複製及びパッケージングにとってシスで必要なウイルスＤＮＡ配列は保持している）ベクターの複製、及びビリオン粒子の形成にとって必要な全てのトランス作用性機能を提供する。その後、ＡｄＳｃｅＩヘルパーウイルスが共感染した２９３ＳｃｅＩ細胞におけるベクターの増幅により、ヘルパーを含まないヘルパー依存性ベクターが大量に産生される。
【００４３】
実施例３
ヘルパー依存性アデノウイルス・ベクターの作製のための組み合わせＣＲＥ／ＬＯＸエンドヌクレアーゼ系
図３は、ヘルパーを含まないヘルパー依存性ベクターの作製のための、エンドヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ標的配列、及び埋め込みＩＴＲと組み合わせられたＣｒｅ／ｌｏｘ系を含むヘルパーウイルスの使用を図示している。このウイルスを構築するためには、ＳｃｅＩ等のエンドヌクレアーゼの認識部位を、パッケージング・シグナルをはさむｌｏｘ部位の間に置き、内部ＩＴＲを第二のｌｏｘ部位の右方に挿入する。好ましい態様においては、ＳｃｅＩ部位をパッケージング・シグナルの右方、第二のｌｏｘＰ部位よりは左方に置く。又は、エンドヌクレアーゼ認識部位を内部ｌｏｘ部位の右方、内部ＩＴＲよりは左方に置くか、又はＳｃｅＩ部位及び埋め込みＩＴＲの両方をパッケージング・シグナルと右側ｌｏｘＰ部位との間に位置付ける。効率的ではあるが完全ではないパッケージング・シグナルの切り出しをもたらす２９３Ｃｒｅ細胞の感染は、Ｃｒｅ媒介切り出しを「回避」するヘルパーウイルスを少数ではあるが有意な数、与える。Ｃｒｅ及びＳｃｅＩの両方を発現する２９３細胞の使用は、ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼの作用により、パッケージングされうる残存ヘルパーウイルスの数を最小限に抑える。
【００４４】
実施例４
エンドヌクレアーゼ認識部位及び埋め込みＩＴＲ部位を含有するシャトル・プラスミドの構築
図４は、パッケージング・シグナルの隣にＳｃｅＩ認識部位が導入され、続いてＩＴＲ配列が挿入されたｐΔＥ１ＳＰＩＡ由来のシャトル・プラスミドの構築を図示している。ｐΔＥ１ＳＰＩＡ（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより商業的に入手可能）は、ゲノムの左端由来のＡｄ配列（左側ＩＴＲ及びパッケージング・シグナルを含む、およそｎｔ１〜３５４）、ＥｃｏＲＶ部位、ＥｃｏＲＩ部位、及びＳａｌＩ部位を含むポリクローニング部位、並びにおよそｎｔ３５４０〜５７９０の付加的なＡｄ配列を含有するシャトル・プラスミドであり、Ａｄゲノムの左端への遺伝子又は変異のレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）にとって有用である。図示されているように、ＳｃｅＩ認識部位を含有する合成オリゴヌクレオチド（図４ａ）を、ＥｃｏＲＶ部位に挿入して、ｐＮＧ２０を生成させた。その後、ＰＣＲ増幅したＩＴＲ（図５）をＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ部位へと挿入することにより、ｐＮＧ２０ＩＴＲを構築した。
【００４５】
実施例５
本発明に係るヘルパーウイルスの構築において有用なオリゴヌクレオチド
図４ａは、ｐＮＧ１５（図６）及びｐＮＧ２０（図４）の中にＳｃｅＩ認識部位を生成させるために使用されたオリゴヌクレオチドの配列、アデノウイルスＩＴＲ（図５）のＰＣＲ増幅のために使用されたオリゴヌクレオチドの配列、並びにハイグロマイシン耐性遺伝子（図９）のＰＣＲ増幅のために使用されたオリゴヌクレオチドの配列を図示している。太字で示されたＳｃｅＩ認識部位を作出するため、オリゴヌクレオチドＡＢ１４２６５（配列番号１）及びＡＢ１４２７０（配列番号２）をハイブリダイズさせた。イタリック体で示されたＡｆｌＩＩ部位（５’ＣＴＴＡＡＧ３’）は、ＳｃｅＩ認識部位を保持する組換えプラスミドのスクリーニングを促進するために含まれた。オリゴヌクレオチドＡＢ１５１３６（配列番号３）及びＡＢ１５１３７（配列番号４）、ｐＮＧ２０（図４）へとクローニングするためのＩＴＲ（図５）を作製するために使用された。オリゴヌクレオチドＡＢ１５０５１（配列番号５）及びＡＢ１５０５２（配列番号６）は、ｐＮＧ１５（図６）へのクローニングのためのＩＴＲ（図５）を作製するために使用された。オリゴヌクレオチドＡＢ１４９０５（配列番号７）及びＡＢ１４９０６（配列番号８）は、ハイグロマイシン耐性遺伝子（図９）のＰＣＲ増幅のために使用された。
【００４６】
実施例６
ヘルパーアデノウイルスへの埋め込み挿入のためのＩＴＲのＰＣＲ作製
図５は、プラスミドｐＡｄＨＶ１ＨｅｒｐｅｒｐＩＸからアデノウイルスＩＴＲを増幅するためのＰＣＲの使用を図示している。
【００４７】
（Ａ）プライマー
2004501602.tif 000003
を用いて、プラスミドｐＡｄＨＶ１ＨｅｒｐｅｒｐＩＸから完全な野生型ＩＴＲを増幅するため、ＰＣＲを使用した。プラスミドｐＡｄＨＶ１ＨｅｒｐｅｒｐＩＸは、Ｅ１、ｐＩＸ、及びＥ３が欠失しており、ＰａｃＩ消化により遊離されうるＩＴＲを有するＡｄゲノミック・プラスミドである（Ａｎｄｙ Ｂｅｔｔ，Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｃ．により構築）。完全なＩＴＲを保持する任意のプラスミドを、ＰＣＲ増幅のためのＩＴＲ源として同様に用いてもよいし、又はアデノウイルスＤＮＡを同様に使用してもよいことを、当業者は理解するであろう。１６５ｂｐのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで消化し、プラスミドｐＮＧ２０のＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ部位へとクローニングして、ｐＮＧ２０ＩＴＲ（図４）を生成させた。
【００４８】
（Ｂ）プライマー
2004501602.tif 000004
を使用して、１６８ｂｐのＰＣＲ産物を作製し、その後それをＰｓｔＩ及びＨｉｎｃＩＩで消化し、プラスミドｐＮＧ１５のＰｓｔＩ／ＨｉｎｃＩＩ部位へとクローニングして、ｐＮＧ１５ＩＴＲ（図６）を生成させた。
【００４９】
実施例７
フロックス（ｆｌｏｘｅｄ）パッケージング・シグナル、エンドヌクレアーゼ認識部位、及び埋め込みＩＴＲを含有するヘルパーウイルスの構築
図６は、フロックス・パッケージング・シグナルの隣にＳｃｅＩ認識部位が導入され、続いて第二のｌｏｘ部位の右方にＩＴＲ配列が挿入されたｐＬＣ８由来のシャトル・プラスミドの構築を図示している（ｐＬＣ８は、Ｐａｒｋｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｃｈｅｎ，Ｌ．，Ａｎｔｏｎ，Ｍ．，Ｓａｎｋａｒ，Ｕ．，Ｒｕｄｎｉｃｋｉ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．Ａ ｎｅｗ ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｓｙｓｔｅｍｓ：ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｈｅｌｐｅｒ ｖｉｒｕｓ ｂｙ Ｃｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉａｌ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ（新規なヘルパー依存性アデノウイルス・ベクター系：ウイルス・パッケージング・シグナルのＣｒｅ媒介切り出しによるヘルパーウイルスの除去），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．９３：１３５６５−１３５７０，１９９６（この目的のため、参照として本明細書に組み込まれる）に記載されている）。オリゴＡＢ１４２６５／ＡＢ１４２７０（図４ａ）（配列番号１及び２）をＳｗａＩ消化ｐＬＣ８へとライゲートさせることにより、ｎｅｏ遺伝子を保持するｐＬＣ８のＳｗａＩ断片を、ＳｃｅＩ認識部位を含有するオリゴヌクレオチドと交換して、ｐＮＧ１５を生成させた。次いで、ＰＣＲ増幅したＩＴＲ（図５）をｐＮＧ１５のＨｉｎｃＩＩ／ＰｓｔＩ部位へと挿入することにより、プラスミドｐＮＧ１５ＩＴＲを得た。
【００５０】
実施例８
エンドヌクレアーゼ認識部位及び埋め込みＩＴＲ部位を含有するシャトルベクターを使用したヘルパーウイルスの構築
図７は、ｐＢＨＧ１０ｌｕｃと図４及び６のシャトル・プラスミドとによる２９３細胞の共トランスフェクションにより導出された新規ヘルパーウイルスの構造を図示している。ヘルパーウイルスＡｄＬＣ８ｃｌｕｃは、シャトル・プラスミドｐＬＣ８ｃとＡｄゲノミック・プラスミドｐＢＨＧ１０ｌｕｃとによる２９３細胞の共トランスフェクションにより生成したものであり、他で詳細に記載されている（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。ｐＡｄＬＣ８ｃｌｕｃ内のパッケージング・シグナル（ψ）はｌｏｘＰ部位にはさまれている。ヘルパーウイルスＡｄＮＧ１５は、シャトル・プラスミドｐＮＧ１５とｐＢＨＧ１０ｌｕｃとによる２９３細胞の共トランスフェクションにより生成した。ＡｄＮＧ１５の構造は、パッケージング・シグナルの直ぐ右方にＳｃｅＩ認識部位が存在することを除き、ＡｄＬＣ８ｃｌｕｃと同一である。ＡｄＮＧ１５ＩＴＲは、シャトル・プラスミドｐＮＧ１５ＩＴＲとｐＢＨＧ１０ｌｕｃとによる２９３細胞の共トランスフェクションにより生成した。ＡｄＮＧ１５ＩＴＲの構造は、右側ｌｏｘＰ部位の直ぐ３’側にＩＴＲが存在することを除き、ＡｄＮＧ１５と同一である。ヘルパーウイルスＡｄＮＧ２０ＩＴＲは、ｐＮＧ２０ＩＴＲとｐＢＨＧ１０ｌｕｃとによる２９３細胞の共トランスフェクションにより生成した。ＡｄＮＧ２０ＩＴＲにおいては、パッケージング・シグナルの直ぐ下流にＩ−ＳｃｅＩ認識部位が存在し、続いてＩＴＲが存在する。
【００５１】
実施例９
エンドヌクレアーゼ認識系が機能性であることの証明
図８は、Ａ５４９細胞におけるＡｄＮＧ１５のＩ−ＳｃｅＩ分解の分析を提供する。
【００５２】
（Ａ）ＡｄＭＳｃｅＩは、エンドヌクレアーゼＳｃｅＩを発現するＡｄベクターである。ＡｄＮＧ１５は、パッケージング・シグナル（ψ）に隣接するＳｃｅＩ認識部位（いずれもｌｏｘＰ部位にはさまれている）を保持するヘルパーウイルスである（図７）。ＡｄＭＳｃｅＩゲノムの左端は、４１７２ｂｐのＢｓｔ１１０７Ｉ断片に含まれている。ＡｄＮＧ１５ゲノムの左端は、アガロースゲル電気泳動によりＡｄＭＳｃｅＩの対応する左端断片から容易に分離可能な２８３０ｂｐのＢｓｔ１１０７Ｉ断片に含まれている。
【００５３】
（Ｂ）ＡｄＮＧ１５ゲノム内のＳｃｅＩ認識部位がインビボでＳｃｅＩ分解に対して感受性であるか否かを決定するため、Ａ５４９細胞のセミコンフルエントの単層にｍｏｉ＝１０でＡｄＭＳｃｅＩを感染させた。２４時間後（図８においては０ｈｒを表す）、単層にｍｏｉ＝１０でＡｄＮＧ１５を感染させた。対照として用いるため、単独のＡｄＭＳｃｅＩ又はＡｄＮＧ１５のいずれかもＡ５４９細胞に感染させた。感染後の示された時点で、ウイルスＤＮＡを感染細胞から抽出し、Ｂｓｔ１１０７Ｉで消化し、プローブ断片Ｂ（ｐＸＣＪＬ１（Ｂｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）由来の１１５７ｂｐのＢｓｔＸＩ／Ｂｓｔ１１０７Ｉ断片）を用いたサザンブロッティングにより分析し、ＡｄＮＧ１５がＳｃｅＩにより分解されているか否かを決定した。ＳｃｅＩによるＡｄＮＧ１５の分解は、２．８ｋｂのＢｓｔ１１０７Ｉ断片を２．４ｋｂのＩ−ＳｃｅＩ／ Ｂｓｔ１１０７Ｉ断片へと変換すると予想される。予想された２．４ｋｂの断片は、予めＡｄＭＳｃｅＩを感染させた細胞においてはＡｄＮＧ１５感染後の極初期ですら明白に可視であるが、単一感染細胞由来のＤＮＡには存在しない。従って、ウイルスＡｄＭＳｃｅＩにより発現されるＳｃｅＩが、ＡｄＮＧ１５のＳｃｅＩ部位を分解しうることは明白である。
【００５４】
実施例１０
ＳＣＥＩエンドヌクレアーゼおよび細胞の形質転換のためのハイグロマイシン抵抗性を発現するプラスミドの構築
図９に示すように、プラスミドｐＥＭ２は、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳを含むＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；図９ａを参照のこと。）のＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ 部位にクローニングすることにより構築された。プラスミドｐＭＨ４ＳｃｅＩは、ＳｃｅＩ遺伝子、ｐＣＭＶ−Ｉ−ＳｃｅＩ（Ｒｏｕｅｔ Ｐ、Ｓｍｉｔｈ Ｆ、Ｊａｓｉｎ Ｍ 「部位特異性エンドヌクレアーゼの発現は哺乳動物細胞において相同組換えを刺激する（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９４， Ｊｕｎ ２１；９１（１３）：６０６４−６０６８）を含むプラスミドから、Ｉ−ＳｃｅＩ遺伝子を含む８５３ ｂｐ ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ断片をｐＭＨ４（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可）のＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ部位へクローニングすることにより構築された。プラスミドｐＮＧ１８は、Ｋｌｅｎｏｗ 処理をした、ｐＭＨ４ＳｃｅＩからの１３９３ ｂｐのＸｂａＩ／ＳａｌＩ断片をｐＥＭ２のＳｍａＩ部位にクローニングすることにより構築された。ハイグロマイシンをコードする配列およびＴＫ ｐｏｌｙＡは、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から１４１５ ｂｐのＰＣＲ産物を得るために、プライマー
2004501602.tif 000005
を用いたＰＣＲにより増幅された。ＰＣＲ産物は、ｐＮＧ１９を得るためにＢｓｐＨＩ／ＳａｌＩにより切断された後、ｐＮＧ１８のＮｃｏＩ／ＳａｌＩ部位にクローニングされた。プラスミドｐＮＧ１９−１Ｆは、ｐＮＧ１９からの１３２７ ｂｐのＢｓｍＢＩ／ＳａｌＩ断片を、ｐＣＥＰ４からの１４８１ ｂｐの ＢｓｍＢＩ／ＳａｌＩ断片と置換することにより構築された。
【００５５】
図９ａ。ＥＭＣＶ ＩＲＥＳクローニング用シャトルプラスミドの構築。示されるように、ＰＥＭ２（図９に示されるクローニングに使用した）はＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ プラスミドｐＢＳＫＳ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ならびに、プラスミドｐＣＩＴＥ−１およびｐＣＩＴＥ−２ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ，米国特許第４，９３７，１９０号）を含むＥＭＣＶ ＩＲＥＳ（Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ）から構築された。
【００５６】
実施例１１
同時に起こる３つの機構によるヘルパーウイルスパッケージングの制限による、実質的にヘルパーウイルス混入のないヘルパー依存アデノウイルスベクターの調製
図１０は、実質的にヘルパーウイルスのないヘルパー依存ベクターの生産のために、国際公開公報第９６／４０９５５として公開された、同時係属中の特許出願第０８／４７３，１６８のＣｒｅ／ｌｏｘＰシステム（参照として本明細書に組み入れられ、名称は「Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ 組換えからなるアデノウイルスベクターシステム」）、国際公開公報第９８／１３５１０として公開された、同時係属中の特許出願第０８／７１９，２１７のｐＩＸシステム（参照として本明細書に組み入れられ、名称は「ヘルパーウイルスおよびヘルパー依存ベクターより生み出された、改善されたアデノウイルスベクター」）、および、本発明のエンドヌクレアーゼシステムを組み合わせる方法を示す。
【００５７】
本発明のこの局面に従い、約３５ ｋｂより大きく約３７ ｋｂより小さなゲノムからなり（必要であれば、示すように「スタッファー（詰め物）」ＤＮＡを挿入する）、前述の実施例および説明文に説明されているように、アデノウイルスパッケージングシグナルの３’側に挿入されたＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ認識部位を含む、ＡｄＬＣ８ΔｐＩＸＳｃｅＩというヘルパーウイルスが生産される。前述の実施例および国際公開公報第９６／４０９５５号に説明されるように、該パッケージングシグナルおよび該エンドヌクレアーゼ認識部位のいずれの側にも、ＣｒｅリコンビナーゼのためのｌｏｘＰ認識部位を挿入する。上述の通り、組み込まれた ＩＴＲは、パッケージングシグナルおよび左側のＩＴＲの除去に引き続く修復を起こさせるために、内部のｌｏｘＰ部位の３’側に挿入される。加えて、国際公開公報第９８／１３５１０に説明されているように、ｐＩＸ遺伝子産物をコードするアデノウイルス遺伝子における欠失がヘルパーアデノウイルスゲノムに導入される。
【００５８】
該アデノウイルスゲノムにおける機能的なｐＩＸ遺伝子の欠如に関わらず、３５ ｋｂより大きなゲノムを有するヘルパーウイルスが有効にパッケージされるように、ヘルパーウイルスの欠損を補うためｐＩＸおよびＥＩを発現する細胞を作製する。アデノウイルスにおけるＥＩの欠損を補う２９３細胞が知られている。加えて、ＶＫ−２−２０（ｐＩＸ＋）細胞系列のような細胞が生産され、ｐＩＸ欠損を補うことが示されている。そのような細胞は本明細書に説明されるように構築され、ヘルパーアデノウイルスの増殖およびレスキューに使用される。
【００５９】
ＡｄＬＣ８ΔｐＩＸＳｃｅＩヘルパーウイルスをプラスミドの形態で、約２０〜３５ｋｂの間のゲノムを有するヘルパー依存アデノウイルスベクターと、２９３ＣｒｅＳｃｅＩ（ｐＩＸ−）細胞に共に感染する、またはトランスフェクションする。そのような細胞はＣｒｅリコンビナーゼおよび薬剤耐性をコードするプラスミドのトランスフェクションにより、次いで薬剤耐性細胞の選抜および安定してＣｒｅリコンビナーゼを発現する細胞のスクリーニングにより２９３細胞から生産される。ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼを安定して発現する細胞系列を確立するために同じ方法が用いられる。
【００６０】
共感染または共トランスフェクションもしくはエレクトロポレーションされた細胞は、ヘルパーウイルスからのパッケージング配列を約９０％の有効率で切り出し、これにより約９０％の効率で、ヘルパーウイルスがウイルス粒子にパッケージされることを防止する。パッケージングシグナルに隣接するｌｏｘＰ部位の欠如により、ヘルパー依存ベクターは影響されない。
【００６１】
ヘルパーアデノウイルスゲノムの過剰なサイズ、およびウイルスゲノムまたは細胞のいずれかからの利用可能なｐＩＸ遺伝子産物の欠如によって、パッケージングシグナルのＣｒｅの仲介による切り出しを免れるいかなるヘルパーウイルスもパッケージングされることを防止される。
【００６２】
最終的に、Ｃｒｅ−仲介の切り出しを免れ、さもなければパッケージされている可能性のあるあらゆるヘルパーウイルス、例えば約３５ ｋｂ長より小さいゲノムを産生するゲノムの欠失によるもの等は、パッケージングシグナルのＳｃｅＩ切断を受け、ヘルパー依存ベクターの複製およびパッケージングに必要な機能の連続したトランスな供給のためのＩＴＲ修復を受ける。ゆえに、２９３ＣｒｅＳｃｅＩ細胞における再増幅によるものを含む、生産される唯一のウイルス粒子はヘルパー依存ベクターの構築物である。
【００６３】
実施例１２
転移するパッケージングシグナルを有するヘルパーアデノウイルスの生産および使用
ヒアリングおよびシェンク（Ｈｅａｒｉｎｇ，Ｐ． ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ，Ｔ．，Ｃｅｌｌ ３３：６９５−７０３（１９８３））の手順に従い、パッケージングシグナル、本明細書において説明されるエンドヌクレアーゼ認識シグナル、およびｌｏｘＰ、ＦＲＴ、またはＣｒｅ、ＦＬＰの認識部位のようなもの、またはリコンビナーゼのようなものの各々をヘルパーアデノウイルスゲノムの右末端または他の位置に転移させて、ヘルパーアデノウイルスを生産する。本明細書にて開示される方法およびヘルパーアデノウイルスの構築物に基づいて、これらの要因の相対的な方向性を維持することにより、エンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼおよび本明細書にて説明されるｐＩＸヘルパーウイルスパッケージングコントロールシステムの同様の活性が期待される。したがって、アデノウイルスベクター調製物の技術分野における当業者には、本開示に基づき、本明細書にて開示される、パッケージされたヘルパーアデノウイルスが実質的に混入していないヘルパー依存アデノウイルスベクター調整物の生産のための方法の機能性に悪影響を与えずに、ヘルパーアデノウイルスを構成する様々な要素の正確な位置に関する多様な改変が可能であることが理解されるであろう。
【００６４】
実施例１３
エンドヌクレアーゼを発現する細胞の生産
本発明に従った使用のために適切なエンドヌクレアーゼを発現する細胞の生産に多くの技術が利用可能であることが当業者には理解されるであろう。そのような方法は抗生物質または他の耐性マーカーの使用によることが可能である。本発明者らは、コードされるベクターのコピー数を増加させ、またそのためにＳｃｅＩの発現レベルを上昇させるためには、変異を含む、または、弱まった耐性マーカー遺伝子の使用が望ましいことを見出した。また本発明に従って使用される細胞は２９３細胞に限らないことが理解されるであろう。例えばＥ１を相補する他のいかなる細胞と同様、２９３ Ｃｒｅ細胞が使用可能である。本発明に従って使用可能なことが当技術分野において知られている細胞は、エンドヌクレアーゼをコードする発現可能な配列の導入により、限定しないが、ＰＥＲ−Ｃ６細胞（Ｆａｌｌａｕｘら、「新しいヘルパー細胞および適合する初期領域１―欠失アデノウイルスベクターは複製を競合するアデノウイルスの発生を抑制する（Ｎｅｗ Ｈｅｌｐｅｒ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｍａｔｃｈｅｄ Ｅａｒｌｙ Ｒｅｇｉｏｎ １−Ｄｅｌｅｔｅｄ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｐｒｅｖｅｎｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ）」，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．１９９８，Ｓｅｐｔ．１；９（１３）：１９０９−１９１７）および９１１細胞（Ｆａｌｌａｕｘら、「９１１の特徴付け：初期領域１―欠失アデノウイルスベクターのタイター測定および増殖のための新しいヘルパー細胞系列（Ａ Ｎｅｗ Ｈｅｌｐｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅａｒｌｙ Ｒｅｇｉｏｎ １−Ｄｅｌｅｔｅｄ Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ）」，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．１９９６，Ｊａｎ．２０；７（２）：２１５−２２２）を含む。
【００６５】
実施例１４
Ｉ−ＳｃｅＩを発現する細胞系列
ｐＮＧ１９−１Ｆを構築し２９３細胞および２９３Ｃｒｅ細胞を形質転換するために使用し、多くの形質転換された細胞系列を確立し特徴付けした後、本発明者らは、該系列におけるＩ−ＳｃｅＩ活性は検出可能であるが低いことを見出した。その理由を決定するため、本発明者らはｐＮＧ１９−１Ｆ およびそのもととなったｐＭＨ４ＳｃｅＩのＩ−ＳｃｅＩ発現カセットの塩基配列を解析し（図９）、Ｉ−ＳｃｅＩ構築物は、５’末端にフレームシフトを導入する突然変異や、望ましいＩ−ＳｃｅＩの発現レベルよりも結果的に低くなるような翻訳終結突然変異を有することを見出した。ｐＭＨ４ＳｃｅＩの関連する部位の構造および問題となるその領域の配列は図１１に示してある。プラスミドｐＣＭＶ−Ｉ−ＳｃｅＩはジャシン（Ｍ Ｊａｓｉｎ）、スローン・ケッタリング（Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ）から提供され、同様のフレームシフト突然変異を含むことが見出された（Ｊａｓｉｎおよび共同研究者らがＩ−ＳｃｅＩをコードする配列の５’末端において遺伝子操作した核局在化シグナル（ｎｌｓ）の１０個の連続したＡにおけるＡの欠失）。本発明者らが得た全ての活性はおそらくＡＴＧ下流における翻訳の再開始か、ｎｌｓの連続したＡの翻訳過程におけるリボソームのスリップによるものであった。いずれの場合も、本発明者らは、突然変異を修正すれば、形質転換された細胞系列におけるＩ−ＳｃｅＩの活性レベルを改善することが可能であると結論付け、同時に、元のＪａｓｉｎの構築物は最適なＫｏｚａｋ配列ではなかったため、Ｋｏｚａｋ配列を改善することにした。その結果のプラスミドｐＮＧ２６ｉ（図１２Ａ）を２９３Ｃｒｅ４細胞（米国特許第５，９１９，６７６号およびＣｈｅｎ，Ｌ．，Ａｎｔｏｎ，Ｍ．，およびＧｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．，「部位特異的リコンビナーゼＣｒｅを発現するヒト２９３細胞系列の生産および特徴付け（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ２９３ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ Ｃｒｅ．）」，Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４７７−４８８，１９９６）を形質転換するために使用し、また、ハイグロマイシン耐性細胞系列を単離し（図１３）、ＳｃｅＩ部位を含むウイルスＤＮＡのＩ−ＳｃｅＩによる切断を測定する機能解析においてＩ−ＳｃｅＩ発現を解析し（図１４）、Ｉ−ＳｃｅＩタンパク質の産生をウエスタンブロット解析により直接測定した（図１５）。数種の形質転換された細胞系列はＩ−ＳｃｅＩの充分なレベルを発現し、このうちの２系列、２−１６および４−７をさらなる実験に用いるために選択した。２９３細胞をｐＮＧ２４ｉ（図１２Ａ）およびｐＢＨＧ１０と共にトランスフェクションすることにより、本発明者らは修正されたＤＮＡ配列をもつＩ−ＳｃｅＩ遺伝子および、最適化されたＫｏｚａｋ配列をＡｄ発現ベクター（ＡｄＮＧ２４ｉ）にレスキューした。いずれの細胞系列およびベクターも、フレームシフト変異体Ｉ−ＳｃｅＩ構築物をもつそれらの対照物よりも、より高いレベルの機能的Ｉ−ＳｃｅＩを発現した。
【００６６】
実施例１５
ヘルパーウイルス
本明細書の図７は左末端にＳｃｅＩ部位を含む数種のヘルパーウイルスゲノムの構造を示す。これらはＩ−ＳｃｅＩ切断に感受性であることが示されており、またＡｄＮＧ１５ＩＴＲおよびＡｄＮＧ２０ＩＴＲの内部のＩＴＲは、パンハンドルフォーメーション（平鍋の柄型構造の形成）（ＩＴＲ アニーリング）によるＩ−ＳｃｅＩ切断およびＩＴＲ修復後（図１）、機能的末端を産生することが示されている。しかし、２９３細胞におけるこれらヘルパーの増殖中に、内部のＩＴＲもまた、元のゲノムの最末端と内部のＩＴＲの間でＤＮＡ断片のタンデム増幅をもたらすような再編成を引き起こすことを本発明者らは見出した。これは図１６に示すような機構を通して起こり得、その結果、図１７に表示したような変異ウイルスゲノムが生じ得る。図１７においては、ヘルパーウイルスＡｄＮＧ２０ＩＴＲが２９３細胞中で増殖し、図１６に示すようなパンハンドルフォーメーションおよびその伸長が連続して繰り返し起きる結果、ＩＴＲ、パッケージングシグナル、およびＳｃｅＩ部位を含むＤＮＡ断片の様々なタンデムな反復をもつウイルスが生じる。同様の反復がゲノムの右末端にも存在するが、図には示していない。ヘルパーウイルスＤＮＡの完全な切断を保証するためにＩ−ＳｃｅＩ酵素レベルを増加させる必要が生じるため、多コピーのパッケージングシグナルおよびＩ−ＳｃｅＩ部位および内部のＩＴＲを有する変異ウイルスの形成は望ましくないと考えられた。ゆえに、本発明者らはヘルパーウイルスを末端ＤＮＡ断片の重複を避けるように再設計した。これは、結果的に生じるＤＮＡ断片の重複がウイルス粒子にパッケージされるには大きすぎるウイルスゲノムになるように、Ψと内部のＩＴＲの間に「スタッファー」ＤＮＡ配列を導入することにより達成された（実施例は図１８および１９に示されるものに制限することを意図するものではない）。図２０に示される実験は図１７に図示するタンデム反復の証拠を提供し、ヘルパーウイルスＡｄＮＧＵＳ２０ＩＴＲ２およびＡｄＮＧＵＳ１４−１は変異した子孫を産生しなかったことから、スタッファー配列の使用は成功した方法である証拠を提供する。したがって、２９３細胞における増殖中に図１６および図１７に示したような再編成を受けない傾向があるため、またはより正確には、そのような再編成を受けた、いかなるウイルスＤＮＡ分子もパッケージされない、ゆえに増殖しないことから、左端ＩＴＲと内部のＩＴＲの間にスタッファー配列をもつヘルパーウイルスは、本発明の好ましい態様である。
【００６７】
これらの実験と続いて行われた実験において用いられた様々なヘルパーウイルスは図２１に示され、その構築方法は図２２に表されている。本発明者らはΨと２つのＳｃｅＩ部位をもつλＤＮＡスタッファーに隣接させ、λＤＮＡスタッファーと内部ＩＴＲ（ＡｄＮＧＵＳ２０ＩＴＲ２）の間の幾つかの異なる位置にＳｃｅＩ認識部位を配置すること、またはＳｃｅＩ部位を外部のＩＴＲとパッケージングシグナルの間に配置することによる効果を試験した。他の構築物は容易に作製できるものであり、これらの実施例はその制限を意図するものではない。例えば、ＳｃｅＩ部位をΨとスタッファーの間に配置することにより、またはパッケージングシグナルのみをＳｃｅＩ部位と隣接させることにより作製可能である。図２１に示される、改変された左末端を有するシャトルプラスミドは、図２２および図２３に示すように、標準法を用いて構築され、Ａｄゲノムプラスミドとの共トランスフェクションによりウイルスにレスキューされる（Ｂｅｔｔ，Ａ．Ｊ．，Ｈａｄｄａｒａ，Ｗ．，Ｐｒｅｖｅｃ，Ｌ．，およびＧｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．，「初期領域１および３に挿入および欠失を有するアデノウイルスベクターの構築のための効率的で融通自在のシステム（Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ ｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｒｅｇｉｏｎｓ １ ａｎｄ ３．）」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ ９１：８８０２−８８０６，１９９４、Ｐａｒｋｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｃｈｅｎ，Ｌ．，Ａｎｔｏｎ，Ｍ．，Ｓａｎｋａｒ，Ｕ．，Ｒｕｄｎｉｃｋｉ，Ｍ．Ａ．，およびＧｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．，「新しいヘルパー依存アデノウイルスベクターシステム：Ｃｒｅ仲介のウイルスパッケージングシグナルの切り出しによるヘルパーウイルスの除去（Ａ ｎｅｗ ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ：ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｈｅｌｐｅｒ ｖｉｒｕｓ ｂｙ Ｃｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ．）」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ ９３：１３５６５−１３５７０，１９９６）。
【００６８】
実施例１６
Ｉ−ＳｃｅＩを介するヘルパーウイルスＤＮＡの切断形質
転換された２９３Ｃｒｅ４細胞株２−１６および４−７によって構成的に発現されたＩ−ＳｃｅＩがヘルパーウイルスＤＮＡのＳｃｅＩ部位を切断する有効性を調べるために、これらの細胞および親２９３Ｃｒｅ４細胞にヘルパーウイルスＡｄＮＧＵＳ２０ＩＴＲ２、ＡｄＮＧＵＳ４１およびＡｄＮＧＵＳ４３を感染させ、図２１に示すように、内在ＩＴＲおよびＢｓｔ１１０７１Ｉ部位の間のＡｄ ＤＮＡ配列にハイブリダイズするプローブを用いて、サザンブロットハイブリダイゼーション分析によって左端ＤＮＡ配列を分析した。結果は図２４に示されている。親ウイルスには約４．４？４．５ ｋｂの左端Ｂｓｔ１１０７１Ｉ断片が含まれており、これは感染した２９３Ｃｒｅ４細胞由来のＤＮＡを含むレーン１、４、および７に容易に見られる。これとは対照的に、ＳｃｅＩ切断後にパンハンドル形成およびＩＴＲ修復が起きれば、図２５にＡｄＮＧＵＳ２０ＩＴＲ２で示した約２．４ ｋｂのより小さな断片が見られるはずである。期待されるサイズの断片は、Ｉ−ＳｃｅＩを発現する感染細胞２−１６および４−７で高い効率で生成しており、同時に親４．４ ｋｂ断片の量は低下している。しかし、予想外の約２．７ ｋｂおよび８．６ ｋｂの別の断片がレーン５および６に観察され、約８．４ ｋｂの別の断片がレーン８および９に観察される。図２６および２７は、Ｉ−ＳｃｅＩを発現するヘルパーウイルス感染細胞でこれらの新規の断片が生成するメカニズムを示す。ＳｃｅＩ切断後のウイルスＤＮＡの末端の結合（脊椎動物細胞で効率の高いことが知られている二重鎖破壊の修復の一形態）によって、観察された断片を生じる構造が得られる。図２６では、断片ＡおよびＣの結合により、２．７ ｋｂの左端Ｂｓｔ１１０７１Ｉ断片およびパッケージングシグナルの欠失したＤＮＡが生じる。図２４のサザンブロットハイブリダイゼーションの結果で、レーン５および６のバンドの強度から、この再結合反応の効率が高いことが分かる。これらのレーンには親ＤＮＡがほとんど見えない、すなわち４．５ ｋｂ断片がほとんどまたは全くないので、本開示に基づいて、パッケージングシグナルにＳｃｅＩ部位を隣接させ、Ｉ−ＳｃｅＩ発現宿主に感染させることは、ヘルパーウイルスゲノムの複製能力を保持しながら、パッケージング可能なヘルパーウイルスＤＮＡを除去するための効果的な方法であることが、当業者には理解できるだろう。図２４のレーン５および６ならびに８および９に見られる８．４？８．６ ｋｂの大きな断片は、図２６および２７の下に示すこれらの断片を生じる種では、パッケージングシグナルが内在し、したがって非機能的であるため、パッケージング不能なウイルスＤＮＡを示す。この縦列の結合によって形成されるウイルスゲノムも、機能的なパッケージングシグナルを含んでいたとしても、大きすぎてパッケージされない。
【００６９】
パッケージングシグナルおよびλＤＮＡスタッファーを含むＤＮＡ部分の欠失を生じる、図２６に示される破壊の再結合反応は、米国特許第５，９１９，６７６号およびＰａｒｋｓ， Ｒ．Ｊ．， Ｃｈｅｎ， Ｌ．， Ａｎｔｏｎ， Ｍ．， Ｓａｎｋａｒ， Ｕ．， Ｒｕｄｎｉｃｋｉ， Ｍ．Ａ．およびＧｒａｈａｍ， Ｆ． Ｌ、新しいヘルパー依存アデノウイルスベクターシステム：Ｃｒｅを介するウイルスパッケージングシグナルの切除によるヘルパーウイルスの除去（Ａ ｎｅｗ ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ； ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｈｅｌｐｅｒ ｖｉｒｕｓ ｂｙ Ｃｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｘｃｉｓｉｏｎｏｆ ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ．） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ　９３． １３５６５−１３５７０，１９９６に記述される、相当するＤＮＡ部分にｌｏｘ部位が隣接するウイルスを２９３Ｃｒｅ細胞株に感染させた結果と、操作的には類似している。１つの主要な違いは、破壊再結合反応は、事実上不可逆であるが、Ｃｒｅリコンビナーゼを介する切除は、原理的には可逆的であるということである。ＳｃｅＩ二重鎖破壊修復経路が事実上、一方向性である理由は、二重鎖破壊修復にはエラーが生じやすく、再結合部位で小さな欠失が生じるためである。さらに、これは必ずしも本質的ではないが、ＡｄＮＧＵＳ４１のＳｃｅＩ部位は逆方向（ＳｃｅＩ認識配列は、パリンドロームではない）に向いているため、この部位の再結合は単なる粘着末端の結合反応ではなく、古典的な二重鎖破壊修復を必要とし、必然的にＳｃｅＩ認識部位を含まない結合部が生じる。
【００７０】
Ｉ−ＳｃｅＩを発現する細胞を用いてプラーク形成アッセイにおいてウイルスの力価測定を行った表Ｉに示される結果は、図２１に示されるような、Ｉ−ＳｃｅＩを介する切除がヘルパーウイルスの感染した細胞からヘルパーウイルスを除去する有効性のさらなる例証を提供する。２９３細胞と比較したＩ−ＳｃｅＩ発現細胞での力価の低下は、ヘルパーウイルスＤＮＡのビリオンへのパッケージングを予防する効果を示す。興味深いことに、力価の低下（８００倍以上）は、パッケージングシグナルに２つのＳｃｅＩ部位が隣接するＡｄＮＧＵＳ４１ウイルスで最大で、検出可能な親ヘルパーウイルスＤＮＡがほとんどまたは全く見られなかった図２４に示すサザンブロットハイブリダイゼーション分析の結果と一致していた。重要なことに、２９３Ｃｒｅ４細胞由来のＳｃｅＩ発現細胞株２−１４、４−３、４−４、６−３および８−４は、ｆｌｏｘｅｄパッケージングシグナルを含むＡｄＬＣ８ｌｕｃウイルスの力価の低下で示されるように、まだＣｒｅリコンビナーゼを発現している。さらに、ＳｃｅＩ部位を含むヘルパーウイルスの力価の低下は、２９３細胞と比較した２９３Ｃｒｅ４細胞における、Ｃｒｅ作用によるＡｄＬＣ８ｃｌｕｃウイルスの減少と同程度あるいはそれ以上であることが分かり、これは、ヘルパーウイルスのパッケージングの予防のための本新規システムは、米国特許第５，９１９，６７６号のＣｒｅ−ｌｏｘシステムと少なくとも同程度有効であることを示す。本明細書に開示される、Ｉ−ＳｃｅＩを含み、発現する新しい細胞株もＣｒｅの発現を継続するという事実から、Ｃｒｅ−ｌｏｘの使用と新しいＳｃｅＩシステムを組み合せてヘルパー依存ベクター調製物におけるヘルパーウイルスの混入レベルを最大限に減少させることができるのは、当業者に明らかだろう。ｌｏｘ部位およびＳｃｅＩ部位の両方を含むヘルパーウイルスの例は、図７および図１９に示されているが、これらに限定されるわけではない。ＳｃｅＩ部位および埋め込まれたＩＴＲ （ＡｄＮＧＵＳ２０ＩＴＲ２） を含むヘルパーウイルスが、ヘルパー依存ベクターを増幅する有効性の実証は、図３１に提供されている。増幅効率は、Ｃｒｅ−ｌｏｘシステムで得られる効率に匹敵することが分かる。
【表１】
様々な細胞系におけるＳｃｅＩ部位を含有するＡｄウイルスの力価測定ａ
2004501602.tif 000006
ａ示されたウイルスは、２９３、２９３Ｃｒｅ４、並びに２９３Ｃｒｅ４由来Ｉ−ＳｃｅＩ発現細胞系２−１４、４−３、４−４、６−３、及び８−４において力価測定された。
ｂ２９３細胞及び２９３Ｃｒｅ４細胞と比較して平均１０２倍の力価減少がＩ−ＳｃｅＩ発現細胞において観察された。
ｅ２９３細胞と比較して８９倍の力価減少が２９３Ｃｒｅ４細胞において観察された。２９３と比較して平均１４９倍の力価減少が２９３Ｃｒｅ４由来Ｉ−ＳｃｅＩ発現細胞において観察された。
ｆ様々な細胞系のプラーク形成効率を比較するために使用された対照ウイルス（Ｃｒｅ又はＩ−ＳｃｅＩにより影響を受けない）。
【００７１】
実施例１７
複数の用途におけるＤＮＡ切断−再結合過程の使用
本明細書に開示されるＩ−ＳｃｅＩを介する切断で生じるウイルスＤＮＡ断片の結合効率が驚くほど高く、この過程がＣｒｅ−ｌｏｘを介する切除と操作が類似していることは、ＳｃｅＩをヘルパー依存ベクターシステムにおいてヘルパーウイルスの除去に使用する以外にも、いくつもの用途があることが示唆している。たとえば、図２８に示すように、本開示に基づき、ＳｃｅＩ切断およびＤＮＡ再結合がｃＤＮＡの発現を阻害しているＤＮＡ断片（「スペーサー」）の切除を生じるような、ＳｃｅＩ依存分子スイッチによって、ｃＤＮＡの発現が調節される発現カセットを含むベクターを当業者は容易に作製できる。たとえば、発現カセットのプロモーターにＳｃｅＩ部位を隣接させるか、ｃＤＮＡにＳｃｅＩ部位を隣接させることによって、発現がＩ−ＳｃｅＩの存在によって止められるようなスイッチを設計および作製できることが当業者には理解できるので、この例は制限を加えるものではない。さらに、Ｉ−ＳｃｅＩを介する切断と効率的なＤＮＡ断片の再結合の組み合せた利用は、アデノウイルスベクターに限ったものではなく、プラスミドＤＮＡのトランスフェクションのような、ＤＮＡの哺乳類細胞への送達のための任意のシステムまたは他のウイルスベクターでも同様に使用できる。
【００７２】
酵素Ｉ−ＳｃｅＩは上述の宿主細胞によって構成的に発現される必要はない。ＡｄＭＨ４５ｃｅｌおよびＡｄＮＧ２４ｉのようなベクターを用いて、Ｉ−ＳｃｅＩ発現カセットを哺乳類細胞に送達し、その中の酵素の発現させることもできる。この酵素は、種々の方法で哺乳類細胞に送達できるプラスミドＤＮＡから発現したり、他のウイルスベクターから発現することもできる。二重鎖破壊修復過程は、他の脊椎動物細胞でも効率が高いので、本明細書に提供される例は、哺乳類細胞に限定されるわけではない。
【００７３】
図２８に示される発現カセットは、ＳｃｅＩ依存分子スイッチが働くために、ウイルスゲノム上に位置している必要はない。そのようなカセットまたは適切に設計された種々のカセットを哺乳類細胞のゲノムに導入し、プラスミドＤＮＡのトランスフェクションまたはＩ−ＳｃｅＩ遺伝子を持つ発現カセットを含むウイルスベクターの感染によってＩ−ＳｃｅＩ遺伝子を送達して、その細胞中でＩ−ＳｃｅＩ発現を誘導するか、またはＩ−ＳｃｅＩ遺伝子を細胞の染色体に組み込ませ、切除と二重鎖破壊修復過程およびその結果としてのＳｃｅＩ依存発現カセットのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションの開始のために必要に応じてＩ−ＳｃｅＩ生産が誘導されるように、その発現を調節することができる。図２９は、ＳｃｅＩ感受性の分子スイッチの制御下の遺伝子を含むゲノムを持つトランスジェニック動物に、Ｉ−ＳｃｅＩを発現するベクターを感染させる例を示すが、これに限定するものではない。Ｉ−ＳｃｅＩの発現およびその後の二重鎖破壊修復によって、ＤＮＡの切除がおこり、二重鎖破壊修復後に、この例では、βガラクトシダーゼの発現が生じる。この例においてトランスジェニック動物を使用したのは限定するためではなく、当業者は、切断の再結合反応によって調節される同様な発現カセットを含む培養細胞を確立できることが理解できるだろう。
【００７４】
ＳｃｅＩ切断および二重鎖破壊修復の利用には、ｐＩＸコード配列の切除がｐＩＸ発現を停止させる図３０に一例を示すような他の応用にも向いており、ヘルパーウイルスのないヘルパー依存ベクターの生産方法を導く。
【００７５】
染色体ＤＮＡのＳｃｅＩ部位におけるＳｃｅＩ切断を示す例は図３２に示されており、ここでは、ＳｃｅＩ部位を含むＤＮＡで形質転換された細胞株（２９３．１細胞のような）に、ＳｃｅＩを発現するＡｄベクター（ＡｄＭＳｃｅＩ）を感染させ、そのＳｃｅＩ部位でＤＮＡ切断が生じている。
【図面の簡単な説明】
【図１】ウイルスゲノムの左端付近に、およびアデノウイルス充填シグナルΨの右に位置するエンドヌクレアーゼ認識切断部位（ＳｃｅＩ）を含むヘルパーアデノウイルスを表す図であり、エンドヌクレアーゼによる切断およびＩＴＲ修復の効果を表す。
【図２】ウイルス遺伝子の全てまたはほとんどが欠失または外来ＤＮＡで置換されたヘルパー依存Ａｄベクター（ＨＤＶ）を増殖させるための方法を表す図である。
【図３】ヘルパーを含まないヘルパー依存ベクターの改善された生産のためのヘルパーウイルスを生産するためにＣｒｅ／ｌｏｘシステムをＳｃｅＩシステムと組み合わせるための方法を表す図である。
【図４】ｐΔＥ１ＳＰ１Ａ由来のシャトルプラスミドの作成を表す図である。ＳｃｅＩ認識部位は充填シグナルに隣接して導入され、ＩＴＲ配列の挿入が引き続く。
【図４ａ】様々なクローニング手順において用いられるオリゴヌクレオチドの配列を示す図である。
【図５】プラスミドｐＡｄＨＶ１ＨｅｌｐｅｒｐＩＸからアデノウイルスＩＴＲを増幅するためのＰＣＲの使用を表す図である。
【図６】ｐＬＣ８由来のシャトルプラスミドの作成を表す図である。ＳｃｅＩ認識部位はｌｏｘが隣接する充填シグナルに隣接して導入され、ＩＴＲ配列の、二番目のｌｏｘ部位の右への挿入が引き続く。
【図７】２９３細胞の、ｐＢＨＧ１０ｌｕｃならびに図４および６のシャトルプラスミドによる共トランスフェクションにより得られた新しいヘルパーウイルスの構造を表す図である。
【図８】Ａ５４９細胞の、ゲノム（ＡｄＮＧ１５）の左端付近にＳｃｅＩ部位を含むウイルスおよびＳｃｅＩエンドヌクレアーゼを発現する二番目のウイルスＡｄＭＳｃｅＩによる共感染により生成した切断産物のサザンブロットハイブリダイゼーション解析を表す図である。
【図９】細胞の形質転換のための、ＳｃｅＩおよびハイグロマイシン耐性を発現するプラスミドの作成を表す図である。
【図９ａ】図９のプラスミドを作成するときに用いるための、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ配列を含むプラスミドの作成を表す図である。
【図１０】国際公開公報第９６／４０９５５として公開された同時継続特許出願第０８／４７３，１６８号（本明細書に参照として組み入れられる。名称は「Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ組換えを含むアデノウイルスベクターシステム」）のＣｒｅ／ｌｏｘＰシステム、国際公開公報第９８／１３５１０として公開された同時継続特許出願第０８／７１９，２１７号（本明細書に参照として組み入れられる。名称は「ヘルパーウイルスから生成された改良されたアデノウイルスベクターおよびヘルパー依存ベクター」）のｐＩＸシステム、および本発明のエンドヌクレアーゼシステムを、実質的にヘルパーウイルスを含まないヘルパー依存ベクターの生産のために組み合わせる方法を表す図である。
【図１１】Ｉ−ＳｃｅＩ遺伝子の修正および最適化を表す図である。プラスミドｐＭＨ４ＳｃｅＩ（Ｍ． ＡｎｇｌａｎａおよびＳ． Ｂａｃｃｈｅｔｔｉからの贈与）は、Ｉ−ＳｃｅＩ遺伝子を含むプラスミドｐＣＭＶ−Ｉ−ＳｃｅＩ（Ｒｏｕｅｔ Ｐ， Ｓｍｉｔｈ Ｆ， Ｊａｓｉｎ Ｍ 部位特異的エンドヌクレアーゼの発現は哺乳動物細胞における相同組換えを刺激する Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９４ Ｊｕｎ ２１； ９１（１３）： ６０６４−６０６８）から、Ｉ−ＳｃｅＩ遺伝子を含む８５３ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ断片をｐＭＨ４（マイクロビックスバイオシステムズから入手可能）のＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ部位にクローニングすることによって作成した。配列解析（Ａ）は、ｐＭＨ４ＳｃｅＩ中のＩ−ＳｃｅＩ遺伝子が、核局在化シグナル（配列ラダーにおける挿入図、核酸については配列番号：９および１０、ペプチド配列については１１および１２を見よ）における一塩基対欠失（１０個の代わりにヌクレオチド１７３から１８１までの間の９個のＡ）を含み、ＴＡＧのすぐ下流における翻訳の成熟前の終結が生じることを示した。Ｉ−ＳｃｅＩの開始コドンに関係するコザックコンセンサス配列の位置も最適化されていなかった。よって、Ｉ−ＳｃｅＩコード配列の５’端の配列は修正および最適化された（新しい配列は（Ｂ）に示した。この改変は、図１２Ａに記載したように合成オリゴヌクレオチドＡＢ１６７５１およびＡ１６７５２（核酸については配列番号：１３および１４、ペプチド配列については１５および１６）を用いて遂行された）。
【図１２】安定にＩ−ＳｃｅＩを発現する細胞株の生成のためのプラスミドの作成を表す図である。（Ａ）コザックコンセンサス配列、核局在化シグナル（ｎｌｓ）およびインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープを持つ
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を、ｈＣＭＶプロモーターを置換したｐｈＣＭＶ−１Ｉ−ＳｃｅＩ（Ｃｈｏｕｌｉｋａら、１９９５ ＭＣＢ １５：１９６８）のＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩ部位に挿入して、ｐｋｎｌｓＨＡ−ＳｃｅＩを生成した。ｐｋｎｌｓＨＡ−ＳｃｅＩからの８４９ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ断片をｐＭＨ４（Ａｄｄｉｓｏｎら、１９９７）のＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩに挿入して、ｐＮＧ２４を生成した。イントロン（Ｍａｔｈｅｗｓら、１９９９）を持つ、ｐＭＨ４（Ｉ）からの２６９塩基対のＥｃｏＲＩ断片をｐＮＧ２４のＥｃｏＲＩ部位に挿入して、ｐＮＧ２４ｉを生成した。ウイルスＡｄＮＧＵＳ２４ｉは、２９３細胞への共トランスフェクションに続くｐＮＧ２４ｉおよびｐＪＭ１７間のインビボ相同組換えにより生成した。（Ｂ）ｐＮＧ２４ｉからの９８０塩基対のＰａｃＩ／ＢｓｔＥＩＩ断片をｐＮＧ１９のＰａｃＩおよびＢｓｔＥＩＩ部位にクローニングし、ｐＮＧ２６ｉを生成した。安定にＩ−ＳｃｅＩを発現する細胞株は、２９３Ｃｒｅ４細胞をｐＮＧ２６ｉでトランスフェクションすることにより生成した。
【図１３】Ｉ−ＳｃｅＩを発現する細胞株の開発を表す図である。２９３Ｃｒｅ４細胞（Ｃｈｅｎ， Ｌ．， Ａｎｔｏｎ， Ｍ．およびＧｒａｈａｍ， Ｆ． Ｌ． 部位特異的リコンビナーゼＣｒｅを発現するヒト２９３細胞株の生産および特性 Ｓｏｍａｔ． Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ． ２２： ４７７−４８８， １９９６）のセミコンフルエント単層の１００ｍｍシャーレを、リン酸カルシウム共沈（Ｇｒａｈａｍ， Ｆ． Ｌ．およびｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ．， Ａ． Ｊ． ヒトアデノウイルス５ＤＮＡの感染能の検定法のための新しい技術 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２， ４５６−４６７， １９７３）により５μｇのｐＮＧ２６ｉ（図１２Ｂ）でトランスフェクトした。トランスフェクションの三日後、ハイグロマイシンを２００、４００、６００または８００μｇ／ｍｌの濃度で培地に加えた。選択に引き続き、個々のハイグロマイシン耐性コロニーを単離・増幅し、Ｉ−ＳｃｅＩ発現についてサザン（図１４）およびウエスタンブロットハイブリダイゼーション（図１５）により解析した。
【図１４】ｐＮＧ２６ｉで形質転換した２９３Ｃｒｅ４細胞におけるＩ−ＳｃｅＩ活性の解析を表す図である。表示したトランスフォーメーションされた細胞株の３５ｍｍシャーレをｍｏｉ １でＡｄＮＧＵＳ２０ＩＴＲ２（図２１に記載）によって感染させた。感染４８時間後、ウイルスＤＮＡを増幅し、Ｂｓｔ１１０７Ｉによる消化に引き続き、プローブ断片Ｂによるサザンブロットハイブリダイゼーションにかけた。Ｉ−ＳｃｅＩ切断の存在下では、ＡｄＮＧＵＳ２０ＩＴＲ２の４．４ｋｂのＢｓｔ１１０７Ｉフラグメントは、２．４ｋｂのＢｓｔ１１０７Ｉフラグメントに変換されていると予想される。
【図１５】ウェスタンブロット解析で決定された、ｐＮＧ２６ｉで形質転換された２９３Ｃｒｅ４細胞におけるＩ−ＳｃｅＩの発現を表す図である。ウェスタンは、ｍｏｉ ５でのＡｄＮＧＵＳ２４ｉによる感染の２４時間後の２９３細胞における（レーン１）、またはｐＮＧ２６ｉで安定に形質転換した様々な２９３Ｃｒｅ４細胞における（レーン３から１４）Ｉ−ＳｃｅＩタンパク質（３１ｋＤａ）を表す。レーン２は陰性対照として２９３Ｃｒｅ４細胞抽出液を含む。全タンパク質は、放射免疫沈殿検定緩衝液で３０分間、氷上にて細胞をインキュベートすることにより抽出した。サンプルを遠心し、上清の全タンパク質を定量的呈色測定（マイクロＢＣＡ試薬キット、ピアス）を用いて決定した。２．５μｇのタンパク質を１０％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分画し、トランスブロットセル（バイオラド）を用いて、イモビロンＰポリビニリデンジスルフィド膜（ミリポア）へ移した。ＨＡ−付きＩ−ＳｃｅＩタンパク質は約３０．７ｋＤａと予想され、抗ＨＡ高親和性ラットモノクローナル抗体（クローン３Ｆ１０、ＰＢＳ緩衝スキムミルク（５％）中１００ｎｇ／ｍｌ、ロッシュ）およびペルオキシダーゼ結合アフィニティー精製ロバ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＰＢＳ緩衝スキムミルク（５％）中１６０ｎｇ／ｍｌ、ジャクソン免疫研究実験室）を用いて検出された。ＥＣＬウェスタンブロット検出キット（アマシャム）およびＸＡＲ５フィルム（イーストマンコダック社）を用いた化学発光は、ペルオキシダーゼ反応をモニターするために用いられた。分子量（ｋＤａ、レインボーマーカー、アマシャム）を右側に示す。レーン１における６６ｋＤａから９７．４ｋＤａの間のバンドはアデノウイルスに感染した細胞に特異的であり、ハイブリダイゼーションで用いられたＡｂのうちの一つに結合するウイルスタンパク質を表すのかもしれない。
【図１６】パンハンドルフォーメーションおよび様々な修復様式による、Ａｄ ＤＮＡの末端に対する改変を表す図である。アデノウイルスＤＮＡの複製における中間段階は、一本鎖ＤＮＡの末端ＩＴＲの対形成を通じて起こり、パンハンドル構造を生成する。（Ａ）に示したように内部のＩＴＲを持つウイルスについては、２つの可能なＩＴＲ対形成が起こりうる：二つの末端ＩＴＲの間での対形成または内部のＩＴＲと最も右側のＩＴＲとの対形成。前者の場合においては、ＤＮＡの複製は、親ＤＮＡと同一の子分子を生じるだろう。後者の場合においては、どちらも親分子とは異なる２つの可能な子が生じるかもしれない：４つのＩＴＲを持つものおよび２つのＩＴＲを持つもの。２つのＩＴＲを持つ分子（Ｂ）は複製できるが、充填シグナル（Ψ）を欠くためにウイルス粒子には充填されえず、このようにして理想的なヘルパーゲノムを表す。もし、ウイルスＤＮＡが、（Ａ）に示したように、左側ＩＴＲと内部ＩＴＲとの間にＳｃｅ−Ｉ部位を持っていたら、この種はＩ−ＳｃｅＩ切断、それに引き続くパンハンドル形成および修復によっても生成することができる。対照的に、４つのＩＴＲを持つ種（Ｃ）は充填されうる上に複製できる。この種は、どの２つのＩＴＲのパンハンドル形成を通じても、更なる再配置を受けて、多くの異なる種を生成する可能性がある。このような変異体の増殖はその大きさによってのみ制限される。
【図１７】パンハンドル形成によるＤＮＡ断片の重複化の後の左端構造を表す図である。ＡｄＮＧ２０ＩＴＲの左端は２．８ｋｂのＢｓｔ１１０７Ｉ断片上に存在する。Ｉ−ＳｃｅＩ切断およびそれに引き続く内部ＩＴＲを用いた修復は２．４ｋｂの断片を生じる。Ｉ−ＳｃｅＩ切断の非存在下では、ＡｄＮＧ２０ＩＴＲのゲノムは、図１６に示したように内部ＩＴＲを介した再配置を受けるかもしれない。これら再配置は４２８塩基対の倍数でゲノムの左端に拡張することができ、３．２ｋｂ、３．７ｋｂなどのＢｓｔ１１０７Ｉ断片を生じる。同様に、ゲノムの右端も拡張することができる（示さず）。
【図１８】内部ＩＴＲを持つ再配置されたウイルスの増殖を妨げるための戦略を表す図である。内部ＩＴＲの存在によって再配置されたウイルスの増殖を妨げるための簡単な戦略は、再配置された産物を、充填されるには大きすぎるようにすることである。このために、スタッファー断片を、示したように、ウイルスゲノムの最も左側と内部のＩＴＲに導入することができる。この改変は再配置を妨げない一方で、これらのウイルス変異体のゲノムは充填の上限を超えるので、再配置された産物が増殖するのを妨げる。
【図１９】内部ＩＴＲを持つ再配置されたウイルスの増殖を妨げるための戦略を表す図である。示したように、ウイルスゲノム中にｌｏｘＰ部位が存在している点を除いて、図１８と同じである。
【図２０】内部ＩＴＲを介して再配置されたゲノムの増殖を妨げるときのスタッファーの効果を表す図である。２９３細胞の３５ｍｍシャーレをｍｏｉ １で、表示したウイルスによって感染させた。感染４８時間後、ウイルスＤＮＡを増幅し、Ｂｓｔ１１０７Ｉによる消化に引き続き、プローブ断片Ｂによるサザンブロットハイブリダイゼーションによって解析した。示したように、２．８ｋｂのＢｓｔ１１０７Ｉ断片（レーン２の黒三角）は、図１７で示したＡｄＮＧ２０ＩＴＲの再配置されたゲノムから予想される。しかし、より高分子サイズ側の付加的なバンド（レーン２の白三角）も観察される。これらは、図１７で示した内部ＩＴＲを介した再配置の産物に対応する。これらのバンドの強度は再配置された種が増殖でき、更なる再配置に寄与していると予想できることを示唆する。レーン３は、二番目のヘルパーウイルスＡｄＮＧ１５ＩＴＲについての同様の解析の結果を表し、変異ウイルスの形成が、内部ＩＴＲを持つウイルスについての一般的な現象であることを示している。このような再配置されたウイルスの増殖は、ＡｄＮＧＵＳ２０ＩＴＲ２の場合のように（レーン４）、スタッファー断片を含めることによって実質的に排除される。なぜならば、親ウイルスから期待される４．４ｋｂのＢｓｔ１１０７Ｉ断片だけが観察されるからである。同様に、ＡｄＮＧ１５ＩＴＲの再配置産物の増殖が観察されたが（レーン３の白三角）、レーン５および６でＡｄＮＧＵＳ１４−１について示したように、スタッファー断片を含めることによって実質的に排除された。
【図２１】１つまたは２つのＳｃｅＩ認識部位を持つヘルパーウイルスを表す図である。ヘルパーウイルスＡｄＮＧＵＳ２０ＩＴＲ２、ＡｄＮＧＵＳ４１およびＡｄＮＧＵＳ４３は、Ｉ−ＳｃｅＩ認識部位の数および位置を除いて同一である。これらのウイルスに共通の必須な特徴は、Ｉ−ＳｃｅＩ切断ヘルパーゲノムＤＮＡのウイルスＤＮＡの複製を許容する内部ＩＴＲ、およびＤＮＡ複製の間に内部ＩＴＲを用いたパンハンドル形成により生成される再配置されたウイルスゲノムの充填を阻害する２つの左端ＩＴＲの間に挿入されたバクテリオファージλＤＮＡの１５６０塩基対の断片である。ＡｄＮＧＵＳ２０ＩＴＲ２は、λＤＮＡスタッファーと充填シグナル（Ψ）との間に位置する１つのＳｃｅＩ部位を含む。ＡｄＮＧＵＳ４１は、Ψに隣接する２つのＳｃｅＩ部位およびλＤＮＡを含む。ＡｄＮＧＵＳ４３は、最も左側のＩＴＲとλＤＮＡスタッファーとの間に位置する１つのＳｃｅＩ部位を含む。
【図２２】部位を持ったヘルパーウイルスのレスキューのためのシャトルプラスミドの作成を表す図である。（Ａ）Ｉ−ＳｃｅＩ認識部位を持つオリゴヌクレオチド（ＡＢ１４２６５＋ＡＢ１４２７０、配列番号：１９および２０）を、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子と入れ替えて、ｐＬＣ８（Ｐａｒｋｓら、１９９６）のＳｗａＩ部位に挿入し、ｐＮＧ１４を生成した。ｐＮＧ１４からのＳｃｅＩおよびｌｏｘＰ部位を持つ１６８塩基対のＸｂａＩ断片をｐＧＥＭ７（ｆ＋）（プロメガ）のＸｂａＩ部位にクローニングして、ｐＧＥＭ７−ＮＧ１４ｂを生成した。ＩＴＲをプライマー
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でｐＡｄＨＶ１ｐＩＸ−（Ａｎｄｙ Ｂｅｔｔから贈与）からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をＰｓｔＩおよびＨｉｎｃＩＩで消化し、１６８塩基対の断片をｐＧＥＭ７−ＮＧ１４ｂのＰｓｔＩおよびＨｉｎｃＩＩ部位にクローニングして、ｐＧＥＭ７−ＮＧ１４ｂＩＴＲを生成した。（Ｂ）プラスミドｐＧＥＭ７−ＮＧ１４ｂＩＴＲをＸｈｏＩおよびＣｌａＩで消化し、クレノーで末端を改変し、自己連結させて、１つのＢｓｔＢＩ部位を持つｐＧＥＭ７−ＮＧ１４ｂＩＴＲΔを生成した。ラムダＤＮＡからの１５６０塩基対のＢｓａＨＩ断片をｐＧＥＭ７−ＮＧ１４ｂＩＴＲΔのＢｓｔＢＩ部位に挿入して、ｐＧＥＭ７−ＮＧＵＳ１４ｂＩＴＲ１を生成した。ＢａｍＨＩ消化によってｌｏｘＰ部位をｐＧＥＭ７−ＮＧＵＳ１４ｂＩＴＲ１から除去し、それに引き続いて連結を行って、ｐＮＧ２９を生成した。ＡｖａＩおよびＡｆｌＩＩ消化によってＳｃｅＩ部位をｐＮＧ２９から除去し、クレノーで末端を改変し、それに引き続く自己連結によりｐＮＧ４２を生成した。プラスミドｐＮＧ２７−２を、ＳｃｅＩ部位を持つオリゴヌクレオチド（ＡＢ１４２６５＋ＡＢ１４２７０）をｐＬＣ４のＢａｍＨＩ部位に挿入することにより生成した。プラスミドｐＮＧ４１を、ｐＮＧ２９からの１８１８塩基対のＸｂａＩ断片をｐＮＧ２７−２のＸｂａＩ部位に挿入することにより生成した。ｐＮＧ４１は、ｐＵＭＡ７１（Ｐａｒｋｓら、１９９６）による２９３細胞への共トランスフェクションに引き続くインビボ相同組換えにより、ヘルパーウイルスＡｄＮＧＵＳ４１を生成するために使われた。プラスミドｐＮＧ４３を、ｐＮＧ４２からの１７７３塩基対のＸｂａＩ断片をｐＮＧ２７−２のＸｂａＩ部位に挿入することにより生成した。ｐＮＧ４３は、ｐＵＭＡ７１による２９３細胞への共トランスフェクションに引き続くインビボ相同組換えにより、ヘルパーウイルスＡｄＮＧＵＳ４３を生成するために使われた。（Ｄ）プラスミドｐＮＧ１５ＩＴＲを、ｐＮＧ１５における１６８塩基対のＸｂａＩ断片をｐＧＥＭ７−ＮＧ１５ｂＩＴＲからの３１２塩基対のＸｂａＩ断片で置換することにより作成した。プラスミドｐＮＧ１５をｐＮＧ１４と同じ方法により（図２２Ａを見よ）作成したが、ｐＮＧ１４とはＳｃｅＩオリゴの向きだけが異なる。プラスミドｐＧＥＭ７−ＮＧ１５ｂＩＴＲをｐＧＥＭ７−ＮＧ１４ｂＩＴＲと同じ方法により（図２２Ａを見よ）作成したが、ｐＧＥＭ７−ＮＧ１４ｂＩＴＲとはＳｃｅＩオリゴの向きだけが異なる。ヘルパーウイルスＡｄＮＧ１５ＩＴＲ（図１９）を、２９３細胞への共トランスフェクションに引き続く、ｐＮＧ１５ＩＴＲとｐＵＭＡ７１との間のインビボ相同組換えにより生成した。プラスミドｐＮＧＵＳ１４−１を、ｐＮＧ１５ＩＴＲにおける３１２塩基対のＸｂａＩ断片をｐＧＥＭ７−ＮＧＵＳ１４ｂＩＴＲ１（図２２Ｂ）からの１８７２塩基対のＸｂａＩ断片で置換することにより作成した。ヘルパーウイルスＡｄＮＧＵＳ１４−１（図１９）を、２９３細胞への共トランスフェクションに引き続く、ｐＮＧＵＳ１４−１とｐＵＭＡ７１との間のインビボ相同組換えにより生成した。
【図２３】Ｉ−ＳｃｅＩ部位を持ったヘルパーウイルスのレスキューのためのシャトルプラスミドの作成を表す図である。ＳｃｅＩ部位を持つオリゴヌクレオチド（ＡＢ１４２６５＋ＡＢ１４２７０）を、ｐΔＥ１ＳＰ１ＡのＥｃｏＲＶ部位に挿入し、ｐＮＧ２０を生成した。ＩＴＲをプライマーＡＢ１５０５１およびＡＢ１５０５２でｐＡｄＨＶ１ｐＩＸ−からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、１６５塩基対の断片をｐＮＧ２０のＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニングして、ｐＮＧ２０ＩＴＲを生成した。ラムダＤＮＡからの１５６０塩基対のＢｓａＨＩ断片をｐＮＧ２０ＩＴＲのＣｌａＩ部位に挿入して、ｐＮＧＵＳ２０ＩＴＲ２を生成した。ヘルパーウイルスＡｄＮＧＵＳ２０ＩＴＲ２を、２９３細胞への共トランスフェクションに引き続く、ｐＮＧＵＳ２０ＩＴＲ２とｐＵＭＡ７１との間のインビボ相同組換えにより生成した。
【図２４】様々なヘルパーウイルスで感染させた２９３ＳｃｅＩ細胞から抽出したウイルスＤＮＡのサザン解析を表す図であり、インビボでのＩ−ＳｃｅＩ切断の効率および変異ウイルスＤＮＡ分子の生成を示す。表示した細胞株（親である２９３Ｃｒｅ４細胞株ならびにＩ−ＳｃｅＩを発現する２９３Ｃｒｅ４誘導体、２−１６および４−７）の３５ｍｍシャーレ中での培養物を、ｍｏｉ １にて、図２１で示したようなＳｃｅＩ認識部位を持つ様々なヘルパーウイルスで感染させた。感染４８時間後、ウイルスＤＮＡを抽出し、Ｂｓｔ１１０７Ｉによる消化に引き続き、プローブ断片Ｂ（図２１を見よ）によるサザンブロットハイブリダイゼーションにより解析した。ウイルスＡｄＮＧＵＳ２０ＩＴＲ２、ＡｄＮＧＵＳ４１およびＡｄＮＧＵＳ４３について、Ｉ−ＳｃｅＩ切断の非存在下では（図２１）、Ｂｓｔ１１０７Ｉ切断は、それぞれ分子量４．４ｋｂ、４．５ｋｂ、４．４ｋｂを持つ断片を生成すると予測される。Ｉ−ＳｃｅＩ切断に引き続き、これらの断片は全て、ＤＮＡ複製の間に内部ＩＴＲを用いたパンハンドル修復の結果、２．４ｋｂのＢｓｔ１１０７Ｉ断片（黒三角で表示）に変換されると予想される。しかし、ＡｄＮＧＵＳ２０ＩＴＲ２ではなく、ＡｄＮＧＵＳ４１およびＡｄＮＧＵＳ４３の場合、Ｉ−ＳｃｅＩ発現細胞の感染に引き続き、約８．４から８．６ｋｂの予想外のバンド（白丸で表示）が存在する。ＡｄＮＧＵＳ２０ＩＴＲ２ではなく、ＡｄＮＧＵＳ４１およびＡｄＮＧＵＳ４３に共通の１つの特徴は、Ψの左側のＳｃｅＩ部位の存在である。図２６および２７に示したように、この特徴は、約８．４から８．６ｋｂの新規なバンドの存在を説明するかもしれない。更に、ＡｄＮＧＵＳ４１の場合、約２．７ｋｂの予想外のバンド（白三角で表示）も存在する。このバンドの存在の原因である可能なメカニズムを図２６に示した。
【図２５】ＳｃｅＩを発現する２９３Ｃｒｅ細胞の感染に引き続く、ＡｄＮＧＵＳ２０ＩＴＲヘルパーウイルスゲノムのインビボＩ−ＳｃｅＩ切断および再配置を表す図である。ＡｄＮＧＵＳ２０ＩＴＲ２のＩ−ＳｃｅＩ切断はΨの除去によりゲノムを充填不可能にする。生じたゲノムは依然複製でき、それゆえ、内部ＩＴＲを用いたパンハンドル形成により、ヘルパー機能を提供する。この過程は、Ｂｓｔ１１０７Ｉ消化およびサザンブロットハイブリダイゼーションに引き続き、図１２において黒三角で示した断片を生産するウイルスゲノムを生じる。残存する４．４ｋｂの親バンドが相対的に少ないので、複製するウイルスＤＮＡを生成するための、Ｉ−ＳｃｅＩによる切断および内部ＩＴＲの使用は高効率であることが理解できる。
【図２６】Ｉ−ＳｅｃＩを発現する２９３Ｃｒｅ細胞の感染後のＡｄＮＧＵＳ４１ヘルパーウイルスゲノムのインビボＩ−ＳｅｃＩ分解及び再編成を示す図である。ＡｄＮＧＵＳ４１のＩ−ＳｅｃＩ分解は、３個の断片をもたらす。内部ＩＴＲを使用したパンハンドル修復により、ゲノムは複製しヘルパー機能を提供することができるようになるが、得られたゲノムは、ψの欠如のためにパッケージング能は有しない（図の右部分）。Ｂｓｔ１１０７Ｉ消化は、２．４ｋｂの断片（図２４の黒三角）をもたらす。図２４のレーン５及び６に示された予想外の２．７ｋｂ断片（白三角により示されている）は、Ｉ−ＳｅｃＩ分解後の断片Ａ及びＣの接合の結果として生じうる。部位の２つの半分の不適合性のため、この接合によりＩ−ＳｅｃＩ部位が再生される可能性は低く、そのため、この種はＩ−ＳｅｃＩによる再分解に対して耐性であり、それが、２．７ｋｂバンドの比較的高い強度の理由となりうる。図２４に見られる予想外の約８．６ｋｂバンド（レーン５及び６に白丸で示されている）は、あるゲノムの断片Ｂ及びＣともう一つのゲノムの同断片との接合により生成しうる。このバンドの比較的高い強度は、それがＳｅｃＩ部位を含まないことを示唆している。この過程が例示している二本鎖破壊の修復は、数ヌクレオチドの損失をもたらす頻度が多いため、ＳｅｃＩ部位の損失は予想外のものではない。図の下部に示されている得られたＤＮＡ分子は、複製能を有し、従ってヘルパー機能を提供しうるが、ψを保持しているものの、ゲノム末端からψが離れているためパッケージング能は有しないと予想される。サザンブロット上の様々なバンドの強度から分かるように、ＳｅｃＩ分解及び断片再接合は、驚くべき程効率的である。レーン５及び６には、プロセシングされていない親ウイルスＤＮＡがほとんど存在しないことが観察され（４．４〜４．５ｋｂのバンドが存在しない）、このことから、パッケージング可能な親ウイルスゲノムは事実上１００％排除されていることが示唆される。従って、ＳｅｃＩ部位にはさまれたパッケージングシグナルを有し、場合によって、内部ＩＴＲを有するヘルパーウイルスは、好ましい態様となりうる。
【図２７】Ｉ−ＳｅｃＩを発現する２９３Ｃｒｅ細胞の感染後のＡｄＮＧＵＳ４３ヘルパーウイルスゲノムのインビボ分Ｉ−ＳｅｃＩ解及び再編成を示す図である。ＡｄＮＧＵＳ４３は左端ＩＴＲの非存在下では複製することができないために、ＡｄＮＧＵＳ４３のＩ−ＳｅｃＩ分解により非感染性となるが、内部ＩＴＲを使用したパンハンドル形成の後にパッケージング能は回復されうる。図２４に示された予想外の約８．４ｋｂのバンド（レーン８及び９に白丸で示されている）は、ある分解されたゲノムの断片Ｂともう一つの分解されたゲノムの同断片との接合により生成しうる。この種はＳｅｃＩ部位を欠いている可能性が高い。頭部同士の接合により生成したウイルスＤＮＡ分子は、複製能は有するが、図２６に示された同様の種と同じく、ウイルスＤＮＡ分子の末端の近傍に位置するパッケージングシグナルのみが機能性であるため、パッケージング能は有しない。
【図２８】Ａｄベクターにおける、分子スイッチからの遺伝子発現を調節するためのＳｃｅＩによる切り出しと二本鎖切断修復の図解。ｃＤＮＡが、カセットの発現を阻害するスペーサーＤＮＡによってプロモーターと隔離されており、該スペーサーＤＮＡが、ＳｃｅＩ部位に隣接しているというＡｄベクターは、容易に構築することができる。図示したように、Ｉ−ＳｃｅＩによる切断、および左右のウイルスＤＮＡ断片の連結は、本明細書に示した実施例において、効果的にスペーサーを切除し、かつβ−ガラクトシダーゼ発現のスイッチをオンにした。
【図２９】Ｉ−ＳｃｅＩ依存型分子スイッチによる、遺伝子組換え動物の細胞における遺伝子発現の調節を図解したもの。発現カセットからの遺伝子発現を、Ｉ−ＳｃｅＩによるＤＮＡ切断、およびその後の二本鎖切断修復によって調節することができるよう、該カセットを簡単に細胞または遺伝子組換え動物の中に組み込むことができる。このような「分子スイッチ」は、Ｉ−ＳｃｅＩ認識部位の配置によって、遺伝子発現のスイッチがオンになったりオフになったりするように設計することもできる。例えば、細胞または動物の中に発現を組み込み、プロモーターと、タンパク質をコードする配列の間にスペーサーＤＮＡを配置することによって、例えば、β−ガラクトシダーゼをコードするタンパク質の発現を阻害することができる。Ｉ−ＳｃｅＩによるＤＮＡ切断、およびその後の二本鎖切断修復は、スペーサーの切り出しと発現のスイッチオンをもたらす。または、例えば、β−ガラクトシダーゼをコードするｃＤＮＡにＳｃｅＩ部位を隣接させれば、ＳｃｅＩによるＤＮＡ切断、および二本鎖切断修復によって、発現のスイッチオフがもたらされる。ＳｃｅＩによるＤＮＡ切断とＤＮＡ断片の再結合が、遺伝子発現を制御するＤＮＡ再編成を生じさせるように、ＳｃｅＩ部位を細胞ＤＮＡの中に導入する方法はたくさんあり、制限はない。例えば、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、サイトカイン、や酵素などさまざまなタンパク質をコードする遺伝子のような内在遺伝子は、本明細書に記載する方法によって制御することが可能である。
分子スイッチによって調節される遺伝子発現
【図３０】ｐＩＸに基づく系における、ＳｃｅＩ切断および二本鎖切断修復の使用、またはヘルパー依存型ベクターを産生するためのＣｒｅ−ｌｏｘによる切除。本例においては、ヘルパーウイルスのｐＩＸコード配列の隣に、ＳｃｅＩ部位またはｌｏｘ部位にいずれかがあり、それぞれ、Ｉ−ＳｃｅＩまたはＣｒｅリコンビナーゼを発現する細胞に感染させることによって、ｐＩＸが切り出されてｐＩＸ発現の消滅をもたらすようになっている。その結果、生じたウイルス粒子（ｐＩＸをもたない）のパッケージング能力が減少するため、ヘルパーウイルスのゲノムはウイルス粒子になるためのパッケージングができなくなる。これに対して、ヘルパー依存型ベクターのゲノムは、十分な小ささに設計してあるため、簡単にｐＩＸウイルス粒子にパッケージされて、ヘルパー依存型ベクターの濃度が高くなっているウイルス調製液ができる。
【図３１】ヘルパー依存型ベクターＡｄＲＰ１０５０の増幅速度。
図に示された細胞株とヘルパーウイルスの組合せを用い、（Ｐａｒｋｓら、１９９６）の記載にしたがって、ＡｄＲＰ１０５０の増幅を行なった。Ｂｆｕ、青色形成単位（ｂｌｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔｓ）； Ｔ、トランスフェクション；Ｐ１、継代１回目；Ｐ２、継代２回目；Ｐ３、継代３回目；Ｐ４、継代４回目。
【図３２】ＡｄＭＳｃｅＩがコードされているＩ−Ｓｃｅは、複製許容細胞の染色体内にある認識部位を、生体内で効率よく切断することができる。ＡｄＭＳｃｅＩに感染した２９３．１細胞、Ａｄｄｌ７０−３に感染した細胞、または模擬感染させた細胞から抽出したゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素消化して、ｎｅｏプローブを用いたサザンハイブリダイゼーションによって解析した。（Ａ）組み込まれたｍＭＡ２の構造。四角い棒はプラスミドＤＮＡを表し、ｎｅｏプローブによって検出された領域を黒く塗ってある。細い線は、染色体の配列を示し、矢印は、テロメア配列をその方向とともに示したものである。ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）およびＩ−ＳｃｅＩ（Ｓ）（２ ｋｂ）、または（Ｈ）のみ（３ ｋｂ）で切断した産物を示す。（Ｂ）ＭＯＩと分子量（ｋｂで）を示す。切断活性を、各レーンの下に切断された分子の割合で示した。模擬−は、模擬感染させた細胞を（Ｈ）で制限酵素消化したＤＮＡを意味し、模擬＋は、（Ｈ）および市販のＩ−ＳｃｅＩで制限酵素消化したＤＮＡを意味する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図９Ａ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004501602.tif 000143
2004501602.tif 000144
【国際調査報告】
2004501602.tif 000145
2004501602.tif 000146
2004501602.tif 000147
2004501602.tif 000148