(57)【要約】本明細書中に開示されるのは、哺乳動物幹細胞が、β２ミクログロブリン（β２ｍ）を発現しないという知見である。本発明は、β２ｍを発現しない細胞から、β２ｍを発現する細胞を、この細胞サンプルから選別する工程を包含する、幹細胞を単離する方法を開示する。次いで、β２ｍを発現しない細胞集団から幹細胞を選択する。これは、既知マーカー（例えば、主要組織適合遺伝子複合体をコードする遺伝子によって発現されるタンパク質）を発現する細胞を選択することによって達成される。単離された幹細胞および他の幹細胞を同定するための方法と同様に、単離された幹細胞が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の幹細胞の単離のための方法であって、該方法は、以下：
該哺乳動物から細胞サンプルを得る工程；
該サンプルから、β２−ミクログロブリンを発現する細胞と、β２−ミクログロブリンを発現しない細胞とを選別する工程；
該β２−ミクログロブリンを発現しない細胞サンプルから幹細胞を選択する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記選別する工程が、蛍光活性化細胞選別によって選別することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記選別する工程が、磁気ビーズ細胞選別によって選別することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記選別する工程が、二重磁気ビーズ細胞選別によって選別することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記幹細胞を選択する工程が、前記β２−ミクログロブリンを発現しない細胞サンプルから、前記幹細胞マーカーを発現しない細胞と、幹細胞マーカーを発現する細胞とを選別する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルから幹細胞を選択する工程が、該サンプルから多能性幹細胞を選択することをさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルから幹細胞を選択する工程が、該サンプルから胚性幹細胞を選択することをさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記幹細胞マーカーが、主要組織適合遺伝子複合体をコードする１以上の遺伝子によって発現されるタンパク質である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記１以上の遺伝子が、ヒト白血球抗原をコードする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記マーカーが、Ｔｈｙ−１である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記マーカーが、ＲＴ１Ａ、ＲＴ１Ｂ、およびＲＴ１Ｄからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記マーカーが、ｆｌｔ−３、ＣＤ  ３４、ｃ−Ｋｉｔ、およびＣＤ３８からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記幹細胞を選択する工程が、蛍光活性化細胞選別によって選別することをさらに包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
前記幹細胞を選択する工程が、磁気ビーズ細胞選別によって選別することをさらに包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
前記幹細胞を選択する工程が、二重磁気ビーズ細胞選別によって選別することをさらに包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞サンプルが、成体哺乳動物から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞サンプルが、胎児から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞サンプルが、骨髄から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞サンプルが、哺乳動物の肝臓から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞サンプルが、哺乳動物の脳から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
哺乳動物の幹細胞の単離のための方法であって、該方法は、以下：
該哺乳動物から細胞サンプルを得る工程；
該サンプルから、β２−ミクログロブリンを発現する細胞と、β２−ミクログロブリンを発現しない細胞とを選別する工程；
該β２−ミクログロブリンを発現しない細胞サンプルから、幹細胞マーカーを発現する細胞と、幹細胞マーカーを発現しない細胞とを選別する工程
を包含する、方法。
【請求項２２】
前記選別する工程が、蛍光活性化細胞選別によって選別することを包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記選別する工程が、磁気ビーズ細胞選別によって選別することを包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記選別する工程が、二重磁気ビーズ細胞選別によって選別することを包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記幹細胞マーカーが、主要組織適合遺伝子複合体をコードする１以上の遺伝子によって発現されるタンパク質である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記１以上の遺伝子が、ヒト白血球抗原をコードする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記マーカーが、Ｔｈｙ−１である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記マーカーが、ＲＴ１Ａ、ＲＴ１Ｂ、およびＲＴ１Ｄからなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記マーカーが、ｆｌｔ−３、ＣＤ  ３４、ｃ−Ｋｉｔ、およびＣＤ３８からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞サンプルが、成体哺乳動物から得られる、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞サンプルが、胎児から得られる、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞サンプルが、骨髄から得られる、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞サンプルが、哺乳動物の肝臓から得られる、請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞サンプルが、哺乳動物の脳から得られる、請求項２１に記載の方法。
【請求項３５】
幹細胞マーカーを発現する細胞が、多能性幹細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３６】
幹細胞マーカーを発現する細胞が、胚性幹細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３７】
β２ｍを発現しない、単離された幹細胞。
【請求項３８】
前記細胞が、Ｔｈｙ−１を発現する、請求項３７に記載の単離された幹細胞。
【請求項３９】
前記細胞が、哺乳動物の骨髄に由来する、請求項３８に記載の単離された幹細胞。
【請求項４０】
前記細胞が、哺乳動物の肝臓に由来する、請求項３８に記載の単離された幹細胞。
【請求項４１】
前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項３７に記載の単離された幹細胞。
【請求項４２】
前記幹細胞が、胚性幹細胞である、請求項３７に記載の単離された幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０００年５月１０日に出願された、仮出願番号６０／２０２，９７９（その内容が、本明細書中で参考として援用される）の米国特許法第１１９（ｅ）条に基づく優先権の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明の実施形態は、細胞集団をＭＨＣ／ＨＬＡ遺伝子産物マーカーで免疫標識することによって、この細胞集団から哺乳動物幹細胞を単離するための方法に関する。本発明のさらなる実施形態は、そのように単離された細胞の精製および濃縮に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
神経から血液〜骨に至る、動物の体内のほとんど全ての細胞は、幹細胞の恩恵を受けて存在している。幹細胞とは、通常、以下の細胞として定義される：（ｉ）それ自体が再生し得る細胞；および（ｉｉ）非対称性の細胞分裂によって、１つよりも多くの型の細胞（すなわち、分化された細胞）を生じ得る細胞。Ｆ．Ｍ．ＷａｔｔおよびＢ．Ｌ．Ｍ．Ｈｏｇａｎ、「Ｏｕｔ  ｏｆ  Ｅｄｅｎ：Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｎｉｃｈｅｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４，１４２７〜１４３０（２０００）。幹細胞は、前駆体細胞と呼ばれる幹細胞の型を生じ；この前駆体細胞は、次いで増殖して、身体内に存在している（ｐｏｐｕｌａｔｅ）分化細胞となる。
【０００４】
先行技術は、身体全体にわたる種々の組織の、幹細胞から分化細胞までの、発達を記載している。米国特許第５，８１１，３０１号（この開示は、本明細書中で参考として援用される）は、例えば、造血プロセス（血液を含む種々の細胞の発達）を記載している。このプロセスは、多能性幹細胞であり得るもの（生物体のあらゆる細胞を生じ得る細胞）で始まる（多能性幹細胞よりも高い発達的柔軟性を示す細胞は、たった１個しか存在しない；これは、受精卵であり、受精卵は、単一の全能性幹細胞であり、子宮内に移植された場合、生物体全体を生じ得る）。多能性幹細胞は、骨髄性幹細胞を生じる。特定の成熟促進ポリペプチドによって、この骨髄性幹細胞は、分化して前駆（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）細胞となり、次いで、この前駆細胞は、分化して種々の前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）細胞となる。増殖して、種々のリンパ球、好中球、マクロファージ、および身体の血液組織を構成する他の細胞となるのは、前駆細胞である。
【０００５】
造血についてのこの記述は、もちろん、かなり不完全であり、生物学は、血液の全ての細胞に対する完全な系列をなお決定しなければならず（例えば、生物学は、骨髄性幹細胞とそれが生じる前駆体細胞との間の全ての前駆細胞をなお同定しなければらならない）、かつ骨髄性細胞がどのように分化して前駆細胞になるのかまたはなぜ分化して前駆細胞になるのかを正確に、なおも決定しなければらならない。たとえそうであっても、造血は、特に十分に研究される（他の器官系の発達についてはよりいっそう知られていない）。脳および脳の発達に関して、例えば、米国特許第６，０４０，１８０号（この開示は、本明細書中で参考として援用される）は、「脳の発達の間の組織発生についての、現在の理解の欠如」を記載しており、米国特許第５，８４９，５５３号（この開示もまた、本明細書中で参考として援用される）は、「神経冠細胞の発達的潜在能に関する、当該分野における不確実性」を記載している。
【０００６】
幹細胞の同定および単離は、何十年間にもわたって研究者を悩ませてきた。現在まで、個々の神経幹細胞も造血幹細胞も同定されていない。Ｆ．Ｈ．Ｇａｇｅ、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７，１４３３〜１４８８（２０００）。２つの主な困難性が存在する。第一に、幹細胞は、希少である。例えば、骨髄（ここで造血が生じる）において、数十億個の全ての骨髄細胞に対して、幹細胞はたった１個しか存在しない。Ｇ．Ｖｏｇｅｌ、「Ｃａｎ  Ｏｌｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｌｅａｒｎ  Ｎｅｗ  Ｔｒｉｃｋｓ？」、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７，１４１８〜１４１９（２０００）。第二に、そしてより重要な点で、研究者らは、幹細胞に対して特有である分子マーカーを今まで同定することができていない（代表的な免疫アッセイに対して、ほとんどの幹細胞は、任意の他の細胞のように見える）。同書。この問題を複雑にするのは、始原（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ）幹細胞が休止状態であり得ることである。結果として、これらは、分子マーカーをほとんど発現していないかもしれない。Ｆ．Ｈ  Ｇａｇｅ、前出。
【０００７】
幹細胞を同定しかつ効果的に単離するための方法は、非常に重要な方法である。研究者らは、ヒト胎児から神経変性疾患を有する成人患者に対して、神経幹細胞を含むと推定される未成熟ニューロンをすでに移植している。この手順は、１つの研究において、パーキンソン病を有する患者の５０％までの症状を低下させた。Ｍ．Ｂａｒｉｎａｇａ、「Ｆｅｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｎ  Ｇｒａｆｔｓ  Ｐａｖｅ  ｔｈｅ  Ｗａｙ  ｆｏｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７，１４２１〜１４２２（２０００）。この手順の欠点の多く（胎児由来の物質を使用することの、倫理的困難性および実用的困難性を含む）は、単離された幹細胞、または成体個体から得られる幹細胞の培養物を使用することによって、対応され得る。
【０００８】
精製された造血性幹細胞の移植は、骨髄移植にとって代わり得る。このような幹細胞には、癌細胞が混入しておらず、ドナー器官または組織移植片の生涯の寛容を誘導し得る。Ｉ．Ｌ．Ｗｅｉｓｓｍａｎ、「Ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃ：Ｂａｒｒｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７，１４４２〜１４４６（２０００）。島幹細胞の移植は、インスリンにとって代わり得る：骨格筋幹細胞移植は、筋ジストロフィーに伴って生じ得るような、生命を危うくする筋肉損失を有する患者を処置し得；そして心筋幹細胞の移植は、心筋梗塞によって破壊された筋を再生するために使用され得る。同書。さらに重要な多くの用途が存在するが、調査および適用され得る前に、出発物質（これらの使用を可能にする、幹細胞）を最初に有さなければならない。本明細書中に記載される本発明は、この出発物質を初めて提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の詳細な説明）
本発明者らは、多くの幹細胞（例えば、肝臓、脾臓、およびニューロン幹細胞が挙げられる）がβ２ミクログロブリン（「β２ｍ」）を発現しないことを発見した。このことは、驚くべきことである。なぜなら、β２ｍは、天然において、最も多型が少なくかつ最も保存された免疫分子だからである。これは、核を有する全ての細胞上（すなわち、全ての鳥類、哺乳動物、および他の全ての動物の細胞上）に現れる。ほんのわずかな細胞（例えば、精子および胎芽の内部細胞膜に存在する特定の細胞）のみが、それを欠失していることが知られている。β２ｍが主要組織適合複合体（「ＭＨＣ」）のクラスＩの分子とともに現れる場合、それは、これらの分子のα鎖を安定化しかつ抗原輸送を容易にするように、機能する。それに関する他の役割は、知られていない。しかし、ほとんどのβ２ｍは、クラスＩ分子を有さずに細胞表面上で発現される。従って、その機能は、未知である。
【００１０】
本発明の方法は、細胞のサンプルを獲得し、次いでこのサンプルから、β２ｍを発現する細胞とβ２ｍを発現しない細胞とを選別することによって、幹細胞を同定する。β２ｍを発現するサンプルを、β２ミクログロブリンポジティブ（β２ｍ＋）といい、β２ｍを発現しないサンプルを、β２ミクログロブリンネガティブ（β２ｍ−）という。幹細胞を含んでいるのは、β２ｍ−のサンプルである。
【００１１】
本発明者らは、β２ｍ−細胞が最も初期の幹細胞であり、「究極の（ｕｌｔｉｍａｔｅ）」幹細胞（研究者らが、単離に成功することなく、何年にもわたって捜し求めてきた、真の単離された胚性幹細胞）であり得ることを発見した。このような細胞は、成熟した成人の生物体内で活性化されるまで、発達の間中潜伏したままであり得る。
【００１２】
本発明の方法に従って、最初に、細胞の集団から、β２ｍ−である細胞とβ２ｍ＋である細胞を選別することによって、幹細胞を同定する。次いで、β２ｍ−細胞から、目的の幹細胞を選択する；これは、既知の細胞マーカーの発現によって細胞を選別することによって、行われる。幹細胞に関連することが公知である任意のマーカーが、使用され得る。このような好ましいマーカーは、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）またはＭＨＣ（主要組織適合複合体）遺伝子によってコードされるタンパク質である。これらとしては、例えば、以下が挙げられる：ＨＬＡマーカー（例えば、ＲＴ１Ａ、ＲＴ１Ｂ、ＲＴ１Ｄ）、および造血細胞マーカー（例えば、Ｔｈｙ−１、ｆｌｔ−３、ＣＤ３４、ｃ−Ｋｉｔ、およびＣＤ３８）。Ｔｈｙ−１が、特に好ましい；本発明者らは、Ｔｈｙ−１が肝細胞幹細胞に対して特異的であることを発見した。米国特許第６，１２７，１３５号；同第６，０９０，６２２号；および同第５，６４３，７４１号（これらの開示は、本明細書中で参考として援用される）は、なおさらなる幹細胞マーカーを記載している。これらのマーカーのいずれかを使用して、β２ｍ−細胞の集団から、目的の幹細胞を選択し得る。好ましいマーカーのリストは、表１に示される。
【００１３】
（表１：肝臓幹細胞およびニューロン幹細胞を同定するために使用されるマーカー）
【００１４】
【表１】
2004527257.tif 000002
2004527257.tif 000003
2004527257.tif 000004
2004527257.tif 000005
2004527257.tif 000006
2004527257.tif 000007
2004527257.tif 000008
幹細胞が見出され得ると推測される細胞集団は、本明細書中の方法に従って選別され得る。好ましくは、細胞は、非胎性動物の骨髄から得られ、そして最も好ましくは、ヒト胎性細胞もまた、使用され得る；本発明の方法は、例えば、このような細胞から胎性ニューロン幹細胞を得るために使用され得る。米国特許第６，２０４，０５３号および同第５，８２４，４８９号（これらの開示は、本明細書中で参考として援用される）は、幹細胞を含有するかまたは幹細胞を含有すると考えられる細胞のさらなる供給源を同定する；これらの細胞のいずれかが、本発明の方法に従って選別され得る。
【００１５】
細胞選別は、細胞を選別する分野において公知の任意の方法である。好ましい選別手順は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）である。磁気ビーズ細胞選別（ＭＡＣＳ）、および本発明者らが開発したその改良型（二重磁気ビーズ細胞選別（Ｄ／ＭＡＣＳ））が、特に好ましい。従来型のＭＡＣＳ手順は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉら、「Ｈｉｇｈ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＭＡＣＳ」、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １１：２３１〜２３８（１９９０）によって記載されている。ＭＡＣＳによって細胞を選別するために、細胞を磁気ビーズで標識し、そしてその細胞を、常磁性分離カラムに通す。この分離カラムは、強い永久磁石内に配置され、それによって、カラム内に磁場が生じる。磁気的に標識された細胞は、カラム内に捕捉され；標識されない細胞は、カラムを通過する。次いで、この捕捉された細胞をカラムから溶出させる。
【００１６】
本発明者らのＤ／ＭＡＣＳ手順において、細胞サンプルを、β２ｍ＋に対する抗体を有する磁気ビーズで標識する。最初の選別工程において、サンプルをＬＤ（ｍｍ）カラムに通すことによって、β２ｍ＋細胞をこのサンプルから取り尽くす。第二の選別工程において、サンプルをＬＳカラムに通すことによって、目的のマーカー（例えば、ＨＬＡ／ＭＨＣ遺伝子産物マーカー（例えば、Ｔｈｙ−１））を有する細胞を確実に選択する。従来のＭＡＣＳ手順において使用される場合、同じ緩衝液を使用し得る（０．０１％のアジ化ナトリウム溶液を加えて、表面抗原−抗体複合体を覆う場合を除く）。この手順の最後において、選別された細胞を、中程度の等張性塩溶液で１回洗浄し、次いで、無血清ＰＢＳで３回洗浄して、非特異的アルブミン染色を防止する。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態において、本発明の方法を使用して、肝細胞幹細胞（実施例ＩおよびＩＩ）およびニューロン幹細胞（実施例ＩＩＩ）を同定する。条件的（ｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅ）前駆体細胞（例えば、卵細胞）は、肝臓内に存在し、そして成熟幹細胞の増殖が発癌物質で抑制される場合、肝損傷の後に増殖が誘導され得る。Ｒ．Ｐ．Ｅｖａｒｔｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９，１５４１−７（１９８９）。しかし、卵細胞および肝臓を発達させそして修復する他の肝臓前駆体細胞の性質、起源および役割は、不明確なままである。長年、卵細胞および他の肝臓前駆体細胞は、ヘーリング管に存在する細胞から生じるか、または胆管の近位に位置付けられた芽様細胞から生じると考えられた。Ｊ．Ｗ．ＧｒｉｓｈａｍおよびＳ．Ｓ．Ｔｈｏｒｇｅｉｒｓｓｏｎ、「Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｃ．Ｓ．Ｐｏｔｔｅｎ，Ｅｄ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９７）；Ｐ．Ｍ．ＮｏｖｉｋｏｆｆおよびＡ．Ｙａｍ，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １４８，１４７３−９２（１９９６）。
【００１８】
近年、Ｐｅｔｅｒｓｅｎらによって実施された、異性（ｃｒｏｓｓ−ｓｅｘ）および異種系統（ｃｒｏｓｓ−ｓｔｒａｉｎ）の骨髄移植、ならびに全肝臓移植の実験は、骨髄が肝細胞の供給源であり得、そして成熟肝細胞マーカー（例えば、アルブミン、ＣＫ１８およびＣＡＭ５．２）を発現する細胞を生じることを示した。Ｂ．Ｅ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４，１１６８−７０（１９９９）；Ｍ．Ｒ．Ａｌｉｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０６，２５７（２０００）；および、Ｎ．Ｄ．Ｔｈｅｉｓｅら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３２，１１−６（２０００）。骨髄由来の肝細胞幹細胞（「ＢＤＨＳＣ」）の存在についてのさらなる証拠は、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼ（ＦＡＨ」）欠乏性マウスを用いたＬａｇａｓｓｅらによる近年の研究から得られている。Ｅ．Ｌａｇａｓｓｅら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ６，１２２９−３４（２０００）。ＦＡＨは、本質的にフェニルアラニンを代謝し；ＦＡＨを有さない場合、毒性フェニルアラニン代謝産物が肝臓内で増加して、肝臓を破壊する。Ｌａｇａｓｓｅらは、ＦＡＨを欠くマウス内の、移植した成熟骨髄細胞（これは、造血性幹細胞を含有する）が肝臓の生化学的機能を回復することを示した。
【００１９】
骨髄および肝臓の両方の肝細胞前駆体を単離する以前の試みは、造血性前駆体細胞と肝臓前駆体細胞の混合物を生じ、これら２つを区別する手段はない。これは、これらの細胞全てが共通の細胞表面レセプターおよび抗原（ＣＤ３４、Ｔｈｙ−１、ｃ−Ｋｉｔ、ｆｌｔ−３および全ての公知の卵細胞抗原）を共有することに起因する。Ｅ．Ｌａｇａｓｓｅら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ６，１２２９−３４（２０００）；Ｂ．Ｅ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２７，４３３−４５（１９９８）；Ｍ．Ｏｍｏｒｉら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １５０，１１７９−８７（１９９７）；Ｋ．Ｆｕｊｉｏら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ７０，５１１−６（１９９４）；および、Ｓ．Ｂｒｉｌｌら、Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ２０４，２６１−９（１９９３）。今日まで、骨髄から肝細胞前駆体は明示的に単離されておらず、詳細に関連付けられてもいない。
【００２０】
卵細胞のような幹細胞は、悪性形質転換についての理想的な標的であり、かつＭＨＣ／ＨＬＡの変性物であると考えられ、発現は、多くの型の癌細胞において、ならびに再生および分化が見出される病変した肝臓において顕著である。例えば、Ｈ．Ｋｕｂｏｔａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７，１２１３２−７（２０００）およびＫ．Ｎ．Ｌｏｗｅｓら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １５４，５３７−４１（１９９９）を参照のこと。
【００２１】
実施例ＩおよびＩＩに記載される方法は、ＢＤＨＳＣ細胞を特徴付けかつこの細胞を特異的に単離することが報告された最初の方法である。本発明者らは、先述された発明の方法を使用して、このような細胞が、一般的な表面抗原（β２ｍ−／Ｔｈｙ−１＋）（これは、骨髄において、ならびに再生した肝臓および悪性の肝臓において芽様細胞に連結する）の新規の組み合わせであることを発見した。これらの実施例は、本発明の方法が、培地中でこれらの自己肝細胞幹細胞を単離および伝播するために使用され得ることが、比較的容易であることを示す。本発明の方法は、ＢＤＨＳＣが、肝細胞および／または胆汁上皮細胞内において、培地中での増殖後の上皮系統を分化および回復する能力をさらに示す。このことは、肝臓幹細胞の研究において新たな展望を開き、そしてＢＤＨＳＣの直接的な研究のための手段を提供する。本発明の方法はさらに、自己様式でこれらの細胞を単離および使用するのを可能にし；このことは、免疫抑制の必要性を排除し、それによって、肝不全を有する患者に対する本発明の治療的利点が増大される。
【実施例】
【００２２】
本明細書中に引用される全ての参考文献は、その全体が本明細書中に参考として援用される。以下の実施例は、本発明の方法に従って幹細胞を単離するために用いられ得る手順の代表である。これらの実施例の改変は、本実施例で考察する幹細胞とは異なる幹細胞を同定しようと望む当業者に明らかである。
【００２３】
（実施例Ｉ：ヒトおよびラットの肝臓からの肝細胞の単離）
本発明者らは、ＭＨＣ（ＨＬＡ、ＲＴ１Ａ、ＲＴ１Ｂ、ＲＴ１Ｄ）、造血幹細胞マーカー（Ｔｈｙ−１、ｆｌｔ−３、ＣＤ  ３４、ｃ−ＫｉｔおよびＣＤ３８）、ならびに肝臓関連マーカー（ＡＬＢ、ＡＦＰ、ＣＫ８、１８、１９、およびＣ／ＥＢＰα）の発現について、パラフィン包埋した組織由来の切片および細胞遠心分離（ｃｙｔｏ−ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）後の懸濁した単離細胞の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色のための特異抗体を用いて、種々の組織を調べた。免疫組織化学および免疫蛍光を、ＡＢＣ方法（ＶＥＣＴＯＲ研究所）を利用して実施した。組織標本を固定し、そしてパラフィンブロック中に配置し、懸濁した細胞全体単離物を、スライド上に細胞スピン（ｃｙｔｏ−ｓｐｕｎ）した。全ての標本を、グリオキサール中で固定した。免疫蛍光の解析を、三次元共焦点顕微鏡法を用いて行った。
【００２４】
ヒト組織標本（３人の異なる個体由来、全体として１８の異なる標本）を、外科生検または診断生検から得た。これらは、以下を含んでいた：１）肝細胞癌の外科標本；２）肝臓再生応答に関連することが公知の肝臓疾患（例えば、ａ）原発性硬化性胆管炎；ｂ）原発性胆汁性肝硬変；ｃ）アルコール性肝炎および劇症肝臓不全）を有する患者由来の標本；３）流産児の産物由来の胎児肝臓；ならびに４）悪性細胞株ＨｅｐＧ２およびＨｅｐ３Ｂ。Ｎ．Ｆａｕｓｔｏら，Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ，２０４，２３７−４１（１９９３）およびＶ．Ｊ．Ｄｅｓｍｅｔ，Ｐｒｏｇ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ  １０，８９−１２１（１９９２）は、これらの標本および関連する標本を記載する。
【００２５】
ラット標本は、以下を含んでいた：総胆管結紮を受けて肝臓損傷を誘導して、再生応答をもたらした２１匹のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから得た肝臓（Ｎ．Ｆａｕｓｔｏら，Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ２０４，２３７−４１（１９９３）を参照のこと）および成体ラット肝臓の非実質細胞画分（すなわち、細胞）から確立された培養物由来の「小肝細胞」（これは、方向付けられた肝細胞前駆体として広く認識されている）（Ｔ．Ｍｉｔａｋａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２１４，３  １０−７（１９９５）によって記載されるとおり）。細胞全体の単離を、正常な成体雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（ｎ＝９）および胆管結紮（ｎ＝２１）成体雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットについて実施した。細胞の採取を、最初の総胆管結紮後１０日目に、標準的二段階コラゲナーゼ灌流法によって実施した。最終的な細胞懸濁物を、パーコール（ｐｅｒｃｏｌｌ）密度勾配を用いてさらに処理し、９５％を超える最終生存率が一貫して達成された。
【００２６】
ラット標本はまた、１２匹の新生仔由来の肝臓を含んでいた。新生仔ラット（１日、４日および２４日）からの二段階の非灌流肝細胞単離を実施した。肝臓を１回に３つ取り出し、切り裂き、そして０．９％生理食塩水中に配置して血液を除去し、次いで水浴中、３８℃でＥＤＴＡ中でミンチにして振盪した。上清を捨て、そして０．０５％カルシウム富化コラゲナーゼＩＶを有するＬｅｆｆｅｒｔ緩衝液中に肝臓組織を懸濁した。この手順の後、１０分間（１０−ｍｍ）のインキュベーションを振盪水浴中で３８℃で３回行った。各消化の最後に、上清を収集し、そして新鮮なコラゲナーゼ溶液を添加した。分散させた細胞を、１０％  ＦＢＳを含みかつ１００μｍメッシュを通して濾過された氷冷ＤＭＥＭ中に再懸濁した。得られた細胞懸濁物を４℃で２分間にわたって遠心分離し、１０％  ＦＢＳを有するＤＭＥＭ中にペレットを再懸濁し、そして氷上に配置した。細胞生存率（ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）は、９５％より高かった（トリパンブルー排除）。
【００２７】
染色したスライド（ＩＨＣ）についての定量的分析を、２つの異なる実験者によって独立して実施した。各染色を、種々の標本について３回繰り返し、そして２０個のランダムな視野を調べた。全ての数を、Ｊａｎｄｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  １．０ソフトウェアを用いて計算した。示された場合、肝臓細胞の量を、体重の４％からなると見積もった（例えば、２５０ｇのラットについては７×１０８個の肝細胞）。
【００２８】
全ての供給源材料における顕著な知見は、ごくわずかの細胞小器官しか含まない、核が小さく、細胞質に乏しい（核対細胞質の比が高い）、小さい（直径５〜８μｍ）の芽様細胞の存在であった（図１）。これらの細胞は、他の全ての有核細胞とは対照的に、β２ｍを発現しなかった。正常なラット肝臓では、これらの細胞は、門脈管の付近にたまに見られ、そしてラット肝臓細胞の量の０．０１±０．００１％未満に達した。対照的に、罹患ラット肝臓においては、これらは、多数（４．５±１．５％）であり、頻繁に小さなクラスターとなっており、そして明らかにゾーン−１からゾーン−２へと「流動」していた。これらは、肝腺房のゾーン−３においては決して観察されなかった。
【００２９】
この「移動」の間に、細胞は、形態学的に分化して成熟肝細胞となり、細胞質の粒度の増大を示し、ＡＦＰの発現を失い、そしてＡＬＢの発現を維持した（図１Ｅ）。これらのβ２ｍ−細胞が発現する造血幹細胞マーカーを同定するために、総胆管結紮から得られたラット肝臓を、ＭＡＣＳを用いてβ２ｍ＋集団とβ２ｍ−集団とに分けた。造血幹細胞マーカー（Ｔｈｙ−１、ｆｌｔ−３、ＣＤ  ３４、ｃ−ＫｉｔおよびＣＤ３８）が、免疫組織化学分析によって同定された。これらのなかでも、Ｔｈｙ−１は、総胆管結紮ラット肝臓の細胞全体の調製物から得られたβ２ｍ−画分の９９±２．０％において発現された（図１Ｆ）。さらに、総胆管ラット肝臓の細胞全体の調製物由来のβ２ｍ−／Ｔｈｙ−１＋画分および三重免疫組織化学染色技術を用いて、本発明者らは、これらの細胞（β２ｍ−／Ｔｈｙ−１＋細胞）がまた、ＡＦＰ、ＡＬＢおよびＣＫ８を発現するが、ＣＫ１８もＣＫｌ９も発現しないことを見出した。これらの知見は、骨髄由来の肝細胞幹細胞が、潜在的に、肝臓芽または卵形細胞よりも早期の発生段階にあることを示唆する。肝臓芽および卵形細胞の説明に関して、Ｓ．Ｓ．Ｔｈｏｒｇｅｉｒｓｓｏｎ，Ｆａｓｅｂ  Ｊ  １０，１２４９−５６（１９９６）を参照のこと。これらのデータは、β２ｍ−／Ｔｈｙ−１＋細胞が、方向付けられた肝細胞前駆体であることを示す。
【００３０】
（実施例ＩＩ：骨髄からの肝細胞幹細胞の単離）
先述のＤ／ＭＡＣＳ手順を用いて、β２ｍ−細胞を、３匹の総胆管結紮ラットの骨髄から単離した。この細胞集団から、本発明者らは、以下の５つの異なるサブ集団を選択した：ＣＤ３４＋、ｃ−Ｋｉｔ＋、ｆｌｔ−３＋、Ｔｈｙ−１−およびＴｈｙ−１＋。次いで、本発明者らは、選別した種々の細胞をＡＬＢに関して染色した。５〜１０％を有したｃ−Ｋｉｔ＋と比較し、そしてアルブミンを発現しなかったＴｈｙ−１−細胞とは対照的に、これらの５つのサブ集団の中でも、Ｔｈｙ−１＋のみが、ほぼ完全なポジティブアルブミンシグナルを有した（９９．９±１．２％）。これらの結果に基づいて、本発明者らは、総骨髄のうちのβ２ｍ−／Ｔｈｙ−１＋画分が、骨髄由来肝細胞幹細胞に相当すると仮定した。
【００３１】
さらに９匹のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに総胆管結紮を施し、そして骨髄を１０日後に収集した。β２ｍ−／Ｔｈｙ−１＋画分を得て、そして細胞をスライド上に細胞スピンし、そしてＡＬＢ、ＡＦＰ、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９およびＣ／ＥＢＰαについて染色した。さらなる細胞を、細胞溶解緩衝液中に直接的に選別し、そして１工程の１細胞ＲＴ−ＰＣＲを実施した。全てのＲＴ−ＰＣＲ手順を、ＱＩＡＧＥＮからの装置においてホットスタート１細胞１工程技術を用いて実施した。タンパク質レベルで、これらのβ２ｍ−／Ｔｈｙ−１＋骨髄由来肝細胞幹細胞は、ＡＬＢ、ＡＦＰ、ＣＫ８およびＣ／ＥＢＰαを発現し（それぞれ、９８．９±１％、７５±１０．０％、９５＋３．０％および９９±０．５％）（図２Ａ〜図２Ｄ）、そしてｍＲＮＡレベルでは、これらの細胞は、ＡＬＢ、Ｃ／ＥＢＰα、ｐ４５０（Ｃｙｐ３Ａ２）、ＨＮＦ−４を発現するがＨＮＦ−１を発現しない（図２Ｅ）。定量的に、正常骨髄（ｎ＝７）から得られたβ２ｍ−画分は、骨髄中の総細胞量の０．４５％±０．６０％に相当し、一方、総胆管結紮ラットの骨髄（ｎ＝７）から得られた同じ画分は、３．６６±０．１％に相当した。これらの画分のうち、骨髄由来肝細胞幹細胞（β２ｍ−／Ｔｈｙ−１＋）は、それぞれ、総非赤血球骨髄細胞量の１．９±１．６％および５．５±２．３％、すなわち、８．５×１０−５および２．０×１０−３に相当した。
【００３２】
同じ磁気ビーズ細胞選別手順を利用して、β２ｍ−／Ｔｈｙ−１＋画分を、６個の正常ヒト骨髄サンプルから抽出した。試験したサンプルの全ては、ＡＬＢおよびその転写因子Ｃ／ＥＢＰαをｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方で発現した（図２Ｆ〜図２Ｈ）。これらの研究の制度を確実にするために、４つの異なるβ２ｍ抗体、３つのアルブミン抗体および２つのＴｈｙ−１抗体を用いた。さらに、本発明者らは、発見の感度および特異性を増大させるためのネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーを含め、２つの異なるアルブミンプライマーセットを用いた。
【００３３】
新鮮に単離したＢＤＨＳＣは、ＡＬＢ、ＡＦＰ、ＣＫ８、Ｃ／ＥＢＰαおよびＨＮＦ−４の発現によって評価した場合、肝細胞前駆体として特徴付けられ得る。培養後、これらの細胞は、成熟肝細胞へと明らかに分化し、この成熟肝細胞は、アンモニアからの尿素形成を示し、そしてＡＬＢ、Ｃ／ＥＢＰα、ＣＡＭ５．２を発現し、さらにＨＮＦ−Ｉをデノボ発現した。これらの効果は、胆汁うっ滞を有するラットから得た自己肝細胞および血清と共存培養した後に数倍増強される。
【００３４】
骨髄由来肝細胞幹細胞の肝臓的性質を確立するために、本発明者らは、インビトロでそれらの機能的特徴を調べた。培養系を、インビボでの胆汁うっ滞再生応答／シグナルをシミュレートするように設計した（図３Ａ）。この培養系を、半透性膜（孔サイズ０．４μｍ）によって分離された２つのチャンバから構築した。上のチャンバは、コラーゲンＩ型でコーティングされており、そして総胆管結紮ラット肝臓から単離した肝細胞を含んでいた。下のチャンバは、「ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）」、コラーゲンＩＶ型、ＴＮＦ−βおよびａＦＧＦを含有するラミニンでコーティングされており、そして６個の異なる大腿骨から抽出された骨髄に由来する対応する自己ＢＤＨＳＣを含んでいた。改変培地は、５％自己「毒性」血清を含んでいた。この血清は、自己総胆管結紮ラットから得られ、そしてＢＤＨＳＣが増殖し、分化し、そして損傷した肝臓へと移動するようにシグナル伝達する際に役割を有する体液性因子を含むと考えられる。デキサメタゾンおよびＩＬ３を７２時間後にこの培地に添加して、分化および増殖を増強した。ＢＤＨＳＣを、Ｃｏｓｔａｒ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ＣＯＬインレー（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて自己肝細胞とともに共存培養した。このインレーに、５０，０００個の肝細胞／ｃｍ２を播種し、そしてＭａｔｒｉｇｅｌでコーティングした（２５μｇ／ｃｍ２）下の区画は、ＢＤＨＳＣを含んでいた。ＨＧＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）および自己血清（５％）を、Ｍｉｔａｋａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２１４，３  １０−７（１９９５）によって記載されたとおりのレギュラー小肝細胞培養培地に添加した。
【００３５】
チャンバを分離し、そして３日目、５日目および７日目に新鮮な無血清培地中に配置した。次いで、１２個の細胞コロニーの各々に、８時間にわたって１．５ｍＭアンモニアをチャレンジした。アンモニアクリアランスおよび尿素形成を、比色アッセイを用いて測定した。アンモニアクリアランスおよび尿素形成を、酵素的比色試験（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）によって決定した。結果を、ＡＮＯＶＡおよびＦｉｓｈｅｒ正確度検定（Ｊａｎｄｅｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ｖｅｒｓｉｏｎ  １．０）によって分析し、そして統計的に有意であることが見出された。これらの結果を図３Ｂに示す。
【００３６】
本実施例に記載される機能的研究は、ＢＤＨＳＣが、胆汁うっ滞肝臓から単離された損傷肝細胞および自己「毒性」血清との共存培養後に、アンモニアを尿中に代謝し得る（非常に特異的な肝細胞機能）ことを示した。この機能は、Ｓ．Ｇ．Ｐｏｗｅｒｓ−ＬｅｅおよびＡ．Ｍｅｉｓｔｅｒ，「Ｕｒｅａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｍｍｏｎｉａ  Ｍｅｔｈａｂｏｌｉｓｍ」，Ｉ．Ｍ．Ａｒｉａｓら編，Ｔｈｅ  Ｌｉｖｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ発行、第二版，１９８８）に記載される。
【００３７】
いくつかの報告は、マクロファージによる尿素形成を記載する。しかし、マクロファージは、Ｌ−アルギニンを基質として必要とし、Ｌ−アルギニンは、本実施例の培養培地から排除された物質である。ラットマクロファージに特異的なモノクローナル抗体での染色後のネガティブシグナルは、本発明者らの細胞がマクロファージではないことをさらに示唆する。６個の異なる大腿骨から得られた骨髄から精製したＢＤＨＳＣおよび肝細胞について行った１８の異なる実験からのデータは、ＢＤＨＳＣが、自己肝細胞によって生成される４６μｇの尿と比較して、１０６細胞／時間あたり２９μｇの尿を生成したことを示した。これらの結果を、３匹の異なる動物から抽出した正常な骨髄全体からなりかつ同じ様式で培養されたコントロールから得られたデータに対して比較した。顕著なことに、コントロールの骨髄は、アンモニアを尿素へと代謝しなかった（ｐ＜０．０５）。さらに、３匹のさらなる動物由来のコントロールを、正常な動物由来のＢＤＨＳＣ単独および非胆汁うっ滞自己肝細胞とともに共存培養したＢＤＨＳＣを用いて実施した（図３Ｂ）。これらの実験からの結果は、ＢＤＨＳＣが単独で、アンモニア代謝細胞へと効率的には分化しないが、これらは、わずかな程度の尿素形成を示すことを実証した。対照的に、正常な動物から単離した自己肝細胞とともに共存培養した同じ細胞（ＢＤＨＳＣ）は、デノボ尿素形成を発現した（ｐ＜０．００３）（図３Ｂ）。このことは、ＢＤＨＳＣが、完全に分化して機能性の肝細胞となるには、（おそらく胆汁うっ滞血清に含まれる）未だ未規定の体液性因子を必要とすることを示唆する（ｐ＜０．０５）。
【００３８】
これらのＢＤＨＳＣのさらなる特徴付けを、７日目に実施した。二重免疫蛍光研究は、これらの培養物において、ＢＤＨＳＣが肝細胞マーカーＣＡＭ５．２（Ｔ．Ｓ．Ｌａｉ  ＹＳら，Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ，１１３，１３４−１３８（１９８９）によって記載されるとおり）およびアルブミンの両方を発現することを示した。三次元共焦点顕微鏡法は、ＡＬＢシグナルおよびＣＡＭ５．２シグナルの両方の、ＢＤＨＳＣの細胞質への同時局在を示した（図４Ａ〜図４Ｂ）。ＡＬＢの発現をさらに確認するために、ＡＬＢ遺伝子発現を、１細胞１工程ＲＴ−ＰＣＲを利用してｍＲＮＡレベルで調べた。この結果、ＡＬＢの発現、その転写因子Ｃ／ＥＢＰαの発現およびＨＮＦ−１のデノボ発現が確認された。興味深いことに、これらの細胞は、培養後、ＨＮＦ−４の発現を失った（図４Ｃ）。
【００３９】
７日間の培養後、各ディッシュは、いくつかの細胞凝集物を含んでおり、この細胞凝集物は、肝細胞と形態学的に似ていた（図４Ｄ〜図４Ｅ）。透過電子顕微鏡法を用いて、これらの細胞の超微細構造を調べた。得られた顕微鏡写真は、肝細胞の形態を実証した（図４Ｆ）。いくつかのＢＤＨＳＣは、方向付けられた肝細胞へと形態学的に変形したが、残りの細胞は、形態学的に変化せず、大量増殖した。培養物を、５×１０４細胞／ディッシュで最初にプレーティングした。７日目に、１．５〜２．０×１０６細胞／ディッシュまでの増大が生じた。これは、５〜６回の細胞分裂または２４時間あたり約１回の細胞周期を示す。注目すべきことに、正常な動物から得られた自己肝細胞とともに共存培養したＢＤＨＳＣのコントロールディッシュにおいては、同様の細胞凝集物および増殖応答は観察されなかったが、細胞は、ずっと少ない程度とはいえ、アンモニアを尿へと代謝した。
【００４０】
本実施例において行った観察は、成体（ヒトおよびラット）骨髄が、幹細胞様の特性を有する細胞のサブ集団を含むこと、およびこれらの細胞が適切な刺激によって肝細胞として機能し得ることを実証する。損傷肝細胞とＢＤＨＳＣとの間の相互作用の必要性は、体液性因子を介してと同様に、ＢＤＨＳＣを、非毒性血清を伴ってかつ損傷肝細胞を伴わずに増殖させた場合の肝臓特異的機能（アンモニア代謝および尿素形成）の欠如によって実証された（図３Ｂ）。この知見は、胚形成の間に見られた知見（ここでは、原始肝臓の方向付けられた内胚葉細胞と間葉成分との相互作用が、適切な系列の発生および分化のために決定的であるようであること）と類似する。次いで、これは、本発明者らの研究において実証したように、成体骨髄の上皮幹細胞様の肝細胞前駆細胞が、胎児肝臓の肝芽細胞（ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔ）に表現型的に類似し得ることに従う。さらに、小葉下尿素形成遺伝子発現の区画型分帯化は、Ｈａｕｓｓｉｎｇｅｒによって記載され、本発明者らの知見（門脈周囲の領域における、より高濃度のこれらのＢＤＨＳＣ、およびそれらがアンモニアから尿を生成する能力）に対してさらなる信用をもたらした。
【００４１】
提示された証拠は、これらのＢＤＨＳＣが、卵形細胞よりも、肝芽細胞よりも、より早期の発生段階にあることを示唆する。それゆえ、これらの細胞は、より早期のまたはより大きな、多能性能力を保有し得る。早期肝臓発生は、ＨＮＦ−４およびＨＮＦ−１のような肝細胞富化転写因子（ＨＥＴＦ）のサブセットの発現を伴う。Ｆ．Ｍ．Ｓｌａｄｅｋ，Ｒｅｃｅｐｔｏｒ４，６４（１９９４）；Ｍ．Ｏｔｔら，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ  ８，１７５−８６（１９９９）。ＨＥＴＦは、方向付けられた肝臓系列であると認識される細胞の出現の前に発現され、そしてこれらの遺伝子（特に、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質Ｃ／ＥＢＰα）の発現は、早期肝臓細胞の決定および特徴付けにおいて重大である。ＡＬＢ、ＡＦＰ、ＨＮＦ−４及びＨＮＦ−１を発現する肝芽細胞は、発生中の胚において、最も早期の、方向付けられた肝臓細胞に相当する。ＢＤＨＳＣは、ＨＮＦ−１を早期には発現しない。しかし、推定の体液性因子（おそらく、胆汁うっ滞ラット由来の「毒性」血清中に含まれる）との培養後、これらの細胞は、肝細胞へと、そしていくつかはおそらく胆管細胞（ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃｙｔｅ）へと明らかに分化して、ＨＮＦ−１およびＣＫｌ９の発現を獲得し、一方、ＡＦＰの発現を失う。本実施例は、インビトロにおける有意な増殖活性、ならびにこれらのＢＤＨＳＣにおける形態学的特徴の発現および肝臓特異的分化機能の発現を実証した。
【００４２】
（実施例ＩＩＩ：天然の幹細胞の単離）
天然の前駆体を、２４週齢のヒト流産胎児脳の中脳領域、線条体領域および皮質領域から収集した。この組織を、無菌のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ，ｐｈ  ７．４，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でメスを用いて０．５ｃｍの小片に切り分けた。次いで、これを、Ｖｅｒｓｅｎｅ中０．２５％のＴｒｙｐｓｉｎ溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１５ｍｌを含む５０ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎチューブ中に移した。この組織を、１０分間にわたって、３７℃でインキュベートし、続いて１５ｍｌのトリプシン中和溶液（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）を添加した。次いで、この組織を、ガラスピペットを用いて機械的に解離し、そして１０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を吸引し、そして捨てた。
【００４３】
解離した細胞を含むペレットを、Ｂ２７増殖培地（さらなる栄養素混合物Ｆ１２−Ｈａｍ（１：１）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁し、これに、２μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）およびペニシリン−ストレプトマイシン溶液（それぞれ、１００μ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した。解離した細胞を、約１００，０００細胞／ｍｌの密度でプレーティングし、そしてコーティングしていないＴ７５（Ｆａｌｃｏｎ，ＵＳＡ）プラスチックフラスコで、さらなるヒトｂＦＧＦおよびＬＩＦ（各々２０ｎｇ／ｍｌ，ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を含むＢ２７培地中で増殖させた。この細胞は、浮遊クラスター（「ニューロスフェア（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）」）として増殖し、そして毎日フラスコを穏やかに弾くことによって付着が防止された。ニューロスフェアを７日毎に機械的に解離し、そして５×１０５細胞／ｍｌの密度が達成されたら、細胞を新たなフラスコへと増殖させた。
【００４４】
約１００，０００細胞を、ＦＡＣＳ（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡ）によって選別されるべきニューロスフェアとして採取した。ニューロスフェアを、０．２５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中で５分間インキュベートし、次いでＢ２７培地に移した。その後、ニューロスフェアを（機械的に）さらに解離して単一の細胞にした。次いで、この細胞を、３００ｇで５分間遠心分離した。上清を捨て、そして細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＰＢＳ中に再懸濁して、１×１０８細胞／ｍｌの濃度を達成した。一次抗体を、５０μｌの細胞懸濁物あたり１０μｌ添加し、そして３０分間、４℃でインキュベートした。β２ｍに対する抗体を１：１７５の比（１７５部ごとの細胞懸濁物に対して１部のβ２ｍ）で添加し、そしてＨＬＡクラスＩＩに対する抗体を１：２００の比で添加した。１０倍容積のＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＰＢＳを添加し、そして細胞を５分間洗浄した。細胞を３００ｇで５分間遠心分離し、そして上清を捨てた。
【００４５】
二次ＦＩＴＣ結合体化抗体（１：５０）を、５０μｌの細胞懸濁物あたり５０μｌ添加した。細胞を４℃で３０分間インキュベートした。１０倍容積のＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＰＢＳを添加し、そしてこの細胞を５分間洗浄した。細胞を３００ｇで５分間遠心分離し、そして上清を捨てた。細胞を４００μｌのＤＭＥＭ中に再懸濁し、そしてＦＡＣＳ機械に移した。
【００４６】
ＦＡＣＳによって選別した細胞を、ラミニン（４０ｍｇ／ｍｌ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）でコーティングしたガラススライドにこれらをプレーティングすることによって分化させた。オール−トランスレチノイン酸（１０−６Ｍ、Ｓｉｇｍａ）、ジブチリルサイクリックＡＭＰ（１ｍＭ，Ｓｉｇｍａ）、および脳由来神経栄養因子（２０ｎｇ／ｍｌ，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を増殖培地に添加した。この細胞を５日間および１０日間分化させ、次いで特異的ニューロンマーカー（β−ＩＩＩチューブリンならびにＭＡＰ２  ａおよびｂ）について染色した。
【００４７】
クラスＩおよびβ２ｍ発現は、ニューロン前駆細胞の細胞表面において低くかつ不均一であることが見出された。分化後、クラスＩ発現は有意に減少し、そしてβ２ｍ発現は、より分化した細胞において高くかつ均一になった。未分化の前駆体は、ＴＡＰもクラスＩＩも発現せず、一方、分化は、両方の発現を刺激した。ＣＬＩＰおよびクラスＩＩ／ＤＭ発現は、刺激後に有意に増加した。上記は、ＨＬＡのクラスＩ産物およびクラスＩＩ産物の発現が、不均一なニューロン前駆体の間で予測可能でかつ特異的な様式で広範に変化し、それによって、真のニューロン前駆細胞と他の前駆細胞（例えば、乏突起神経膠細胞、星状細胞など）との間を、それらのＨＬＡ発現パターンに従って選別することを可能にすることを実証する。
【００４８】
当業者は、慣用実験にすぎない実験を用いて、上記の実施例についてのバリエーションを認識するかまたは決定し得、これにより、本明細書中に記載された幹細胞以外の他の多くの幹細胞を同定することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、パラフィン肝臓切片および肝臓全体の細胞調製物由来の細胞スピン（ｃｙｔｏ−ｓｐｕｎ）細胞の、β２ミクログロブリン（β２ｍ）についての免疫組織化学染色を示す。黒矢印は、骨髄由来の肝細胞幹細胞を同定する。
【図１Ａ】図１Ａは、２４日齢のラットからの全細胞単離物において、β２ｍについて染色された細胞を示す。この青色変色は、β２ｍ（β２ｍ−）を発現しない細胞を表す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、総胆管結紮に供して１０日目のラット由来の全細胞単離後に細胞スピンしたβ２ｍ−細胞を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、総胆管結紮に供して２１日目のラット由来の全細胞単離後に細胞スピンしたβ２ｍ−細胞を示す。これらの細胞は、卵形の形状を有し、図１Ａに示される小さな高密度の細胞とは異なる。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ヒト肝臓のパラフィン切片（ＰＳＣ）由来のβ２ｍ−細胞を示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、総胆管結紮に供して２１日目のラット由来の全細胞単離後の、β２ｍ−細胞のポジティブＴｈｙ−１染色を示す。これらの細胞はまた、卵形の形状を有し、図１Ａに示される小さな高密度の細胞とは異なる（図１Ｅに示される細胞について使用される染料は、図１Ｃに示される細胞について使用される染料と同じである）。
【図１Ｆ】図１Ｆは、総胆管結紮を受けたラットから２１日後に調製された肝細胞において、門脈管から「流動した」β２ｍ−細胞を示す。
【図２】図２は、２工程磁気ビーズ細胞選別手順（Ｄ／ＭＡＣＳ）を利用して骨髄（ヒトおよびラット）から精製されたβ２ｍ−／Ｔｈｙ−１＋細胞（骨髄由来の肝細胞幹細胞）についての、ＲＴ−ＰＣＲの結果および免疫組織化学研究の結果を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ＡＬＢについてポジティブに染色された骨髄由来の肝細胞幹細胞を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＡＦＰについてポジティブに染色された骨髄由来の肝細胞幹細胞を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＣＫ８についてポジティブに染色された骨髄由来の肝細胞幹細胞を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＣＩＥＢＰαについてポジティブに染色された骨髄由来の肝細胞幹細胞を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、１０日目に骨髄から精製された骨髄由来の肝細胞幹細胞についてのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。骨髄を、総胆管結紮を受けたラットから得た。ＡＬＢ、ＣＩＥＢＰα、ＨＮＦ−４の発現が見られたが、ＩＩＮＦ−１の発現は見られなかった。「ＭＷ  ＳＴＤ」とは、分子量標準をいう。β−アクチンを、ポジティブ系統的コントロールとして使用し、正常肝細胞を、遺伝子特異的ポジティブコントロールとして使用した。
【図２Ｆ】図２Ｆは、ＡＬＢについてポジティブに染色された骨髄由来の肝細胞幹細胞を示す。
【図２Ｇ】図２Ｇは、ヒト正常骨髄から精製された骨髄由来の肝細胞幹細胞についてのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。ＡＬＢおよびＣＩＥＢＰの発現が見られる。ラットアルブミンプライマーを用いる、ネガティブコントロールを使用した。
【図３】図３は、肝臓再生性応答環境を刺激する細胞培養系を例示する。
【図４】図４は、培養中の骨髄由来の肝細胞幹細胞の特徴付けを例示する。
【図４Ａ】図４Ａは、共焦点顕微鏡法を利用した、骨髄由来の肝細胞幹細胞（この細胞は、培養物から顕微解剖され、免疫蛍光研究のためにスライド上にプレーティングされる）の三次元デジタル再構成である。赤色は、ＣＡＭ５．２を示し、そして緑色は、アルブミンを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、培養中の骨髄由来の肝細胞幹細胞の免疫蛍光を示す；緑色は、アルブミンを示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、アルブミン、ＨＮＦ−１およびＣＥＢＰ／αを発現する培養中の骨髄由来の肝細胞幹細胞についてのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、１時間培養した新鮮な骨髄由来の肝細胞幹細胞を示す。
【図４Ｅ】図４Ｅは、培養７日後の骨髄由来の肝細胞幹細胞を示す。
【図４Ｆ】図４Ｆは、電子顕微鏡検査法の結果を示す。これは、培養中の骨髄由来の肝細胞幹細胞の肝細胞超構造を示す。黒矢印は、絨毛を指しており；白矢印は、グリコゲン顆粒を指している。
【図２Ｅ】
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【図２Ｇ】
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【図３】
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【図４Ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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