(57)【要約】本発明のプロドラッグは、治療剤の変性された形であり、そして治療剤、３個のアミノ酸のオリゴペプチド、安定化基及び任意には、リンカー基を含んで成る。プロドラッグは、トロウラーゼ、例えばチメットオリゴペプチダーゼにより分解できる。また、プロドラッグの製造方法、及び使用方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）標的細胞に導入できる治療剤、
（２）式 ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ＡＡ１は、ロイシン、フェニルアラニン、イソロイシン、アラニン、グリシン、チロシン、２−ナフチルアラニン、及びセリンから成る群から選択され、
ＡＡ２は、アラニン、ロイシン、チロシン、グリシン、セリン、３−ピリジルアラニン、２−チエニルアラニン、アミノイソ酪酸、トレオニン又はフェニルアラニンから成る群から選択され、そして
ＡＡ３は、ロイシン、サルコシン、チロシン、フェニルアラニン、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン、ｐ−ニトロフェニルアラニン、バリン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、トリプトファン、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、３−ピリジルアラニン、アラニン、グリシン、２−チエニルアラニン、メチオニン、又はプロリンから成る群から選択される］で表されるオリゴペプチド、
（３）安定化基、及び
（４）任意には、ＴＯＰにより分解できないリンカー基、
を含んで成る化合物であって、
ここで前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第１の結合部位で前記安定化基に直接的に結合され、そして前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第２結合部位で前記治療剤に直接的に結合されるか、又は治療剤に前記リンカー基を通して間接的に結合され、
前記安定化基は全血（Ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）に存在する酵素により前記オリゴペプチドの分解を妨げ、そして
前記化合物がＴＯＰにより分解できる、
ことを特徴とする化合物。
【請求項２】
前記オリゴペプチドが、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１）、Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号２）、Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号３）、Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ（配列番号４）、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号５）、Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号６）、Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ（配列番号７）、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ（配列番号８）、Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号９）、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号１０）、Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１１）、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号１２）、及びＬｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ（配列番号１３）から成る群から選択される請求項１記載の化合物。
【請求項３】
前記オリゴペプチドが、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕである場合、前記安定化基はスクシニルではなく、又は前記治療剤はダウロルビシンではない請求項１記載の化合物。
【請求項４】
前記安定化基が、ジカルボン酸又は高級カルボン酸である請求項１記載の化合物。
【請求項５】
前記安定化基が、琥珀酸、アジピン酸、グルタル酸、フタル酸、ジグリコール酸、フマル酸、ナフタレンジカルボン酸、ピロクルタミン酸、酢酸、１−ナフチルカルボン酸、２−ナフチルカルボン酸、１，８−ナフチルジカルボン酸、アコニット酸、カルボキシ桂皮酸、トリアゾールジカルボン酸、グルコン酸、４−カルボキシフェニルボロン酸、ポリエチレングリコール酸、ブタンジスルホン酸、ニペコット酸、イソニペコット酸、及びマレイン酸から成る群から選択される、請求項１記載の化合物。
【請求項６】
前記安定化基が、４個又はそれよりも多くの炭素原子を有する、遺伝的にコードされないアミノ酸である請求項１記載の化合物。
【請求項７】
前記安定化基が、アスパラギン酸のβ−カルボキシ基で前記オリゴペプチドに結合されるアスパラギン酸、又はグルタミン酸のγ−カルボキシ基で前記オリゴペプチドに結合されるグルタミン酸の１つである請求項１記載の化合物。
【請求項８】
前記安定化基が、負に荷電されているか又は中性である請求項１記載の化合物。
【請求項９】
前記安定化基が、患者に投与される場合、前記化合物と、血管の内部をおおう内皮細胞との間の相互作用を低める請求項１記載の化合物。
【請求項１０】
前記ＴＯＰが、オリゴペプチドのＡＡ３とＡＡ２との間の結合を分解する請求項１記載の化合物。
【請求項１１】
前記化合物が、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ及び治療剤の接合体から成る、実験条件下でのＴＯＰによる試験標準に対して試験される標準分解速度の１０〜８０％の試験分解速度で実験条件下でＴＯＰにより分解される請求項１記載の化合物。
【請求項１２】
前記試験分解速度が、前記標準分解速度の３０〜６５％である請求項１１記載の化合物。
【請求項１３】
前記治療剤が、アルキル化剤、抗増殖剤、チューブリン結合剤、ビンカアルカロイド、エネジイン、ポドフィロトキシン又はポドフィロトキシン誘導体、プテリジン類の薬物、タキサン、アントラサイクリン、ドラスタチン、トポイソメラーゼインヒビター、マイタニソイド及び白金配位錯体化学療法剤、前記の誘導体及び類似体から成る群から選択される請求項１記載の化合物。
【請求項１４】
前記治療剤が、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、カリケアミシン、エトポシド、エトポシドホスフェート、ＣＣ−１０６５、ズオカルマイシン、ＫＷ−２１８９、メトトレキセート、メトプテリン、アミノプテリン、ジクロロメトトレキセート、ドセタキセル、パクリタキセル、エピチオロン、コンブレタスタチン、コンブレタスタチンＡ４ホスフェート、ドラスタチン１０、ドラスタチン１１、ドラスタチン１５、トポテカン、カンフォテシン、マイトマイシンＣ、ポルフィロマイシン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、フルダラビン、タモキシフェン、シトシンアラビノシド、アデノシンアラビノシド、コルヒチン、カルボプラチン、シスプラチン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、メルファラン、クロロキン、シクロポリンＡ、マイタンシン、及び前記の誘導体及び類似体から成る群から選択される請求項１記載の化合物。
【請求項１５】
前記標的細胞が、腫瘍又は炎症細胞である請求項１記載の化合物。
【請求項１６】
活性部分を有するプロドラッグであり、前記プロドラッグの活性部分が、ＴＯＰによる分解の前よりもＴＯＰによる分解の後、前記標的細胞により一層侵入することができ、前記活性部分が少なくとも前記治療剤を含む請求項１記載の化合物。
【請求項１７】
前記プロドラッグの活性部分が、治療剤から成る請求項１６記載の化合物。
【請求項１８】
前記プロドラッグの活性部分が、前記治療剤及び少なくとも前記リンカー基を包含する請求項１６記載の化合物。
【請求項１９】
前記プロドラッグの活性部分が、前記治療剤及び前記オリゴペプチドのＡＡ１を包含する請求項１６記載の化合物。
【請求項２０】
前記プロドラッグの活性部分が、ＡＡ１に結合されるオリゴペプチドのＡＡ２をさらに含んで成る請求項１９記載の化合物。
【請求項２１】
前記オリゴペプチドが、前記治療剤に直接的に結合される請求項１記載の化合物。
【請求項２２】
前記オリゴペプチド配列が、アミノカプロン酸、ヒドライド基、エステル基、エーテル基及びスルフィドリル基から成る群から選択されたリンカー基を通して、前記オリゴペプチドの第２結合部位で治療剤に間接的に結合される請求項１記載の化合物。
【請求項２３】
前記化合物が、Ｇ１−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ， Ｓｕｃ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｄｎｒ， Ｓｕｃ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ，　Ｓｕｃ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｄｎｒ， Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘ， Ｐｙｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ， Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ， Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ， Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ， Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ， Ｓｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ， Ｓｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｄｎｒ， Ｓｕｃ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｄｎｒ， Ｓｕｃ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ， Ｓｕｃ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｄｎｒ， 及びＳｕｃ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒからなる群から選択される請求項１記載の化合物。
【請求項２４】
前記化合物が、ＣＤ１０による分解に対して耐性である請求項１記載の化合物。
【請求項２５】
（１）標的細胞に導入できる治療剤、
（２）式 ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチド、
（３）安定化基、ここで前記安定化基は、
（ａ）ジカルボン酸又は高級カルボン酸、
（ｂ）４個又はそれよりも多くの炭素原子を有する、遺伝的にコードされないアミノ酸、又は
（ｃ）アスパラギン酸のβ−カルボキシ基で前記オリゴペプチドに結合されるアスパラギン酸、又はグルタミン酸のγ−カルボキシ基で前記オリゴペプチドに結合されるグルタミン酸の１つから選択される、及び
（４）任意には、ＴＯＰにより分解できないリンカー基、
を含んで成る化合物であって、
ここで前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第１の結合部位で前記安定化基に直接的に結合され、そして前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第２の結合部位で、前記治療剤に直接的に結合されるか、又は治療剤に前記リンカー基を通して間接的に結合され、
前記安定化基は全血（Ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）に存在する酵素により前記オリゴペプチドの分解を妨げ、そして
前記化合物がＴＯＰにより分解できる、
ことを特徴とする化合物。
【請求項２６】
前記安定化基が、琥珀酸、アジピン酸、グルタル酸、フタル酸、ジグリコール酸、フマル酸、ナフタレンジカルボン酸、ピロクルタミン酸、酢酸、１−ナフチルカルボン酸、２−ナフチルカルボン酸、１，８−ナフチルジカルボン酸、アコニット酸、カルボキシ桂皮酸、トリアゾールジカルボン酸、グルコン酸、４−カルボキシフェニルボロン酸、ポリエチレングリコール酸、ブタンジスルホン酸、ニペコット酸、イソニペコット酸、及びマレイン酸から成る群から選択される、請求項２５記載の化合物。
【請求項２７】
前記化合物が、ＣＤ１０による分解に対して耐性である請求項２５記載の化合物。
【請求項２８】
式ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表す］で表される、ＴＯＰにより分解できるオリゴペプチド。
【請求項２９】
ＡＡ１が、ロイシン、フェニルアラニン、イソロイシン、アラニン、グリシン、チロシン、２−ナフチルアラニン、及びセリンから成る群から選択される請求項２８記載の化合物。
【請求項３０】
ＡＡ２が、アラニン、ロイシン、チロシン、グリシン、セリン、３−ピリジルアラニン、２−チエニルアラニン、アミノイソ酪酸、トレオニン又はフェニルアラニンから成る群から選択される請求項２８記載の化合物。
【請求項３１】
ＡＡ３が、ロイシン、サルコシン、チロシン、フェニルアラニン、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン、ｐ−ニトロフェニルアラニン、バリン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、トリプトファン、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、３−ピリジルアラニン、アラニン、グリシン、２−チエニルアラニン、メチオニン、又はプロリンから成る群から選択される請求項２８記載の化合物。
【請求項３２】
（１）（ａ）標的細胞に導入できる治療剤、
（ｂ）式 ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ＡＡ１は、ロイシン、フェニルアラニン、イソロイシン、アラニン、グリシン、チロシン、２−ナフチルアラニン、及びセリンから成る群から選択され、
ＡＡ２は、アラニン、ロイシン、チロシン、グリシン、セリン、３−ピリジルアラニン、２−チエニルアラニン、アミノイソ酪酸、トレオニン又はフェニルアラニンから成る群から選択され、そして
ＡＡ３は、ロイシン、サルコシン、チロシン、フェニルアラニン、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン、ｐ−ニトロフェニルアラニン、バリン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、トリプトファン、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、３−ピリジルアラニン、アラニン、グリシン、２−チエニルアラニン、メチオニン、又はプロリンから成る群から選択される］で表されるオリゴペプチド、
（ｃ）安定化基、及び
（ｄ）任意には、ＴＯＰにより分解できないリンカー基を含んで成る化合物、
ここで前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第１の結合部位で前記安定化基に直接的に結合され、そして前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第２結合部位で、前記治療剤に直接的に結合されるか、又は治療剤に前記リンカー基を通して間接的に結合され、
前記安定化基は全血（Ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）に存在する酵素により前記オリゴペプチドの分解を妨げ、そして
前記化合物がＴＯＰにより分解される；並びに
（２）医薬的に許容できるキャリヤー；
を含んで成る医薬組成物。
【請求項３３】
患者を処理するための方法であって、
（１）標的細胞に導入できる治療剤、
（２）式 ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチド、
（３）安定化基、ここで前記安定化基は、
（ａ）ジカルボン酸又は高級カルボン酸、
（ｂ）４個又はそれよりも多くの炭素原子を有する、遺伝的にコードされないアミノ酸、又は
（ｃ）アスパラギン酸のβ−カルボキシ基で前記オリゴペプチドに結合されるアスパラギン酸、又はグルタミン酸のγ−カルボキシ基で前記オリゴペプチドに結合されるグルタミン酸の１つから選択され、及び
（４）任意には、ＴＯＰにより分解できないリンカー基を含んで成り、
ここで前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第１の結合部位で前記安定化基に直接的に結合され、そして前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第２結合部位で、前記治療剤に直接的に結合されるか、又は治療剤に前記リンカー基を通して間接的に結合され、
前記安定化基は全血（Ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）に存在する酵素により前記オリゴペプチドの分解を妨げ、そして
前記化合物がＴＯＰにより分解できることを特徴とする化合物を、前記患者に投与することを含んで成る方法。
【請求項３４】
前記化合物が、静脈内投与される請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記患者が、癌、新形成疾患、腫瘍、炎症性疾患及び感染性疾患から成る群から選択された医学的状態について処理される請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
患者への投与のためのプロドラッグを企画するための方法であって、
（１）３個のアミノ酸のオリゴペプチドを選択し、
（２）安定化基に前記オリゴペプチドの第１の結合部位でそのオリゴペプチドを連結し、
（３）前記オリゴペプチドの第２の結合部位で治療剤にそのオリゴペプチドを直接的に又は間接的に連結し、
ここで段階（２）及び（３）はいずれかの順序で又は同時に行われ得、そしてさらに、接合体が段階（１）〜（３）の実施により形成され、
（４）ＴＯＰによる分解について前記接合体を試験し、そして
（５）接合体が完全な血液において安定できるかどうかを試験し、そして
（６）前記接合体がＴＯＰにより分解され、そして、完全な血液において安定できる場合、その接合体をプロドラッグとして選択することを含んで成る方法。
【請求項３７】
前記段階（４）が実験条件下でのＴＯＰによる試験分解速度について前記接合体をさらに試験することを含んで成り、そして前記段階（６）が、前記試験分解速度が、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ及び治療剤の接合体から成る、実験条件下でのＴＯＰによる試験標準に対して試験される標準分解速度の１０〜８０％である場合、プロドラッグとして前記接合体を選択することをさらに含んで成る請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記接合体の試験分解速度が、前記標準分解速度の３０〜６５％である請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記第１の結合部位が、前記オリゴペプチドのＮ−末端である請求項３６記載の方法。
【請求項４０】
前記第２の結合部位が、前記オリゴペプチドのＣ−末端である請求項３６記載の方法。
【請求項４１】
前記第１の結合部位が、前記オリゴペプチドのＣ−末端である請求項３６記載の方法。
【請求項４２】
前記第２の結合部位が、前記オリゴペプチドのＮ−末端である請求項３６記載の方法。
【請求項４３】
請求項３６記載の方法により企画されるプロドラッグ。
【請求項４４】
患者への投与のために意図される治療剤の毒性を低めるための方法であって、
ＴＯＰにより分解できるオリゴペプチドを、このオリゴペプチドの第１の結合部位で安定化基に結合し、そして前記治療剤を前記オリゴペプチドの第２の結合部位で直接的に又は間接的に結合することによって、プロドラッグを共有的に形成し、ここで前記オリゴペプチドが式ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表す］を有し、そして
Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ及び治療剤の接合体から成る、実験条件下でのＴＯＰによる試験標準に対して試験される標準分解速度の１０〜８０％の試験分解速度での実験条件下でのＴＯＰによる分解について前記プロドラッグを試験し、
それにより前記プロドラッグが、それが前記試験分解速度内にある場合に患者に投与される場合、接合されていない治療剤に対して、前記治療剤の低められた毒性を提供することを特徴とする方法。
【請求項４５】
（１）（ａ）マーカー、
（ｂ）式 ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ＡＡ１は、ロイシン、フェニルアラニン、イソロイシン、アラニン、グリシン、チロシン、２−ナフチルアラニン、及びセリンから成る群から選択され、
ＡＡ２は、アラニン、ロイシン、チロシン、グリシン、セリン、３−ピリジルアラニン、２−チエニルアラニン、アミノイソ酪酸、トレオニン又はフェニルアラニンから成る群から選択され、そして
ＡＡ３は、ロイシン、サルコシン、チロシン、フェニルアラニン、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン、ｐ−ニトロフェニルアラニン、バリン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、トリプトファン、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、３−ピリジルアラニン、アラニン、グリシン、２−チエニルアラニン、メチオニン、又はプロリンから成る群から選択される］で表されるオリゴペプチド、
（ｃ）安定化基、及び
（ｄ）任意には、ＴＯＰにより分解できないリンカー基を含んで成る化合物、
ここで前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第１の結合部位で前記安定化基に直接的に結合され、そして前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第２結合部位で前記治療剤に直接的に結合されるか、又は治療剤に前記リンカー基を通して間接的に結合され、
前記安定化基は全血（Ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）に存在する酵素により前記オリゴペプチドの分解を妨げ、そして
前記化合物がＴＯＰにより分解される；並びに
（２）任意には、前記マーカーの検出において有用な少なくとも１つの試薬；
を含んで成る診断又はアッセイのための製品。
【請求項４６】
前記化合物が、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ及びマーカーの接合体から成る、実験条件下でのＴＯＰによる試験標準に対して試験される標準分解速度の１０〜８０％の試験分解速度で実験条件下でＴＯＰにより分解される請求項４５記載の製品。
【請求項４７】
プロドラッグの製造において、遊離治療剤を除去するための方法であって、
（１）任意に保護された安定化基−オリゴペプチド接合体を遊離治療剤によりカップリングし、
（２）段階（１）の後に残存する遊離治療剤を結合し、及び治療剤−ポリマー樹脂複合体を形成するために、ポリマー樹脂と段階（１）の反応体とを接触し、そして
（３）前記治療剤−ポリマー樹脂複合体を除去することを含んで成る方法。
【請求項４８】
前記ポリマー樹脂が、ポリスチレンメチルイソシアネート又はポリスチレンスルホニルクロライドである請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
前記任意に保護された安定化基−オリゴペプチド接合体が、式ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチドを包含する請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
（１）アルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチド−治療剤接合体を製造するために、活性化剤の存在下で、アルキル又はアリルエステル保護された安定化基、オリゴヌクレオチド及び治療剤をカップリングし、
（２）前記カップリング段階の後に残存するカップリングされなかった治療剤を除去し、そして
（３）安定化基−オリゴペプチド−治療剤プロドラッグ化合物を製造するために、前記アルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチド−治療剤接合体を保護解除する段階を含んで成る、式：安定化基−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１−治療剤のプロドラッグ化合物の製造方法。
【請求項５１】
ＡＡ１が、ロイシン、フェニルアラニン、イソロイシン、アラニン、グリシン、チロシン、２−ナフチルアラニン、及びセリンから成る群から選択され、ＡＡ２が、アラニン、ロイシン、チロシン、グリシン、セリン、３−ピリジルアラニン、２−チエニルアラニン、アミノイソ酪酸、トレオニン又はフェニルアラニンから成る群から選択され、そしてＡＡ３が、ロイシン、サルコシン、チロシン、フェニルアラニン、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン、ｐ−ニトロフェニルアラニン、バリン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、トリプトファン、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、３−ピリジルアラニン、アラニン、グリシン、２−チエニルアラニン、メチオニン、又はプロリンから成る群から選択される請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
アルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチド及び治療剤は、２：１〜１：１のモル比で存在する請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
前記モル比が１．７５：１〜１．５：１である請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
前記カップリング段階が、
（ａ）ＤＭＦにおいてアルキル又はアリルエステル保護された安定化基、オリゴペプチド及び治療剤を組合し、
（ｂ）ＤＩＥＡを添加し、
（ｃ）接合体を形成するために活性剤の存在下で、アルキル又はアリルエステル保護された安定化基、オリゴペプチド及び治療剤を反応せしめ、そして
（ｄ）沈殿物を形成するために、ブライン溶液を添加することによって前記接合体を沈殿することを含んで成る請求項５１記載の方法。
【請求項５５】
前記治療剤が、アントラサイクリンである請求項５１記載の方法。
【請求項５６】
前記アントラサイクリンが、ドキソルビシンである請求項５４記載の方法。
【請求項５７】
前記活性剤が、ＨＡＴＵである請求項５４記載の方法。
【請求項５８】
ＤＩＥＡ及びアルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチドが、３：１〜１．５：１のモル比で存在する請求項５４記載の方法。
【請求項５９】
前記モル比が、２．５：１〜２：１である請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
前記反応段階が、０℃で行われる請求項５４記載の方法。
【請求項６１】
前記反応段階が、３０分間、行われる請求項５４記載の方法。
【請求項６２】
前記活性剤及びアルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチドが、１．５：１〜１：１のモル比で存在する請求項５４記載の方法。
【請求項６３】
前記ブライン溶液が、水中、２０％（ｗ／ｖ）〜４０％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌである請求項５４記載の方法。
【請求項６４】
前記ブライン溶液が、水中、２５％（ｗ／ｖ）〜３５％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌである請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
前記ブライン溶液が、水中、３０％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌである請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
前記沈殿段階が、５．０〜７．０のｐＨで行われる請求項５４記載の方法。
【請求項６７】
前記ｐＨが、５．８〜６．０である請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
前記除去段階が、
（ａ）ＤＭＦに前記接合体を溶解し、
（ｂ）無水ＤＭＦにスキャベンジャー樹脂を溶解し、
（ｃ）接合体−樹脂混合物を形成するために、前記スキャベンジャ−樹脂に、前記カップリング段階で形成される、アルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチド−治療剤接合体を添加し、
（ｄ）前記混合物を、０℃〜３０℃で２〜２４時間、維持し、ここでカップリングされていない治療剤が前記樹脂と反応し、
（ｅ）前記混合物から樹脂を除去し、そして
（ｆ）アルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチド−治療剤接合体の沈殿物を形成するために、ブライン溶液を添加することによって前記残存物を沈殿せしめることを含んで成る請求項５１記載の方法。
【請求項６９】
前記スキャベンジャー樹脂が、イソシアネート、チオイソシアネート、塩化スルホニル、及びベンズアルデヒドから成る群から選択される請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
前記スキャベンジャー樹脂が、ＰＳ−イソシアネートである請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
前記保護解除段階がさらに、酵素により保護解除することを含んで成る請求項５１記載の方法。
【請求項７２】
前記酵素が、エステラーゼである請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
前記エステラーゼが、ブタ肝臓エステラーゼ、カンジダ・アンタルチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｔｉｃａ）Ｂリパーゼ、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼ、プソイドモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）リパーゼ、ＣＬＥＣ−ＣＡＢ（カンジダ・アンタルチカＢリパーゼ）、ＣＬＥＣ−ＣＲ（カンジダ・ルゴサリパーゼ）、及びＣＬＥＣ−ＰＣ（プソイドモナス・セパシアリパーゼ）から成る群から選択される請求項７２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
序説：
技術分野：
本発明は、プロドラッグとして有用な新規化合物類、及びそれらの製造方法に関する。そのようなプロドラッグは、患者における疾病、特に腫瘍の処理のために使用され得る。
【０００２】
背景：
多くの治療剤、例えばアントラサイクリン及びビンカアルカロイドは、癌の処理のために特に効果的である。しかしながら、それらの分子はしばしば、急性毒性、特に骨髄及び粘膜毒性、及びアントラサイクリンの場合、慢性心臓毒性及びビンカアルカロイドの場合、慢性神経学的毒性によりインビボで特徴づけられる。同様に、メトトレキセートは、炎症反応、例えばリウマチ患者の処理のために使用され得るが、しかしその高い毒性がその適用を制限する。より特異的で且つ安全な抗腫瘍剤の開発が、腫瘍細胞に対する高い有効性、及びそれらの生成物の副作用（毒性、非腫瘍細胞の破壊、等）の数及び重症度の低下のために所望される。より特異的に抗炎症剤の開発がまた所望される。
【０００３】
毒性問題を最少にするために、治療剤は好都合には、プロドラッグの形で患者に提供される。プロドラッグは、それらの構造の化学的又は酵素的修飾により、インビボで、薬物（活性治療化合物）に転換できる分子である。毒性を低めるためには、この転換は、循環システム又は非標的組織よりもむしろ作用又は標的組織の部位に制限されるべきである。しかしながら、プロドラッグはしばしば、血液及び血清において低い安定性により特徴づけられる。これは、プロドラッグが患者の身体内の所望する部位に達する前、そのプロドラッグを分解し、そして従って活性化することができる、血液及び血清における酵素の存在による。
【０００４】
そのような問題を克服する所望する種類のプロドラッグは、特許協力条約国際発行ＷＯ９６／０５８６３号及びアメリカ特許第５，９６２，２１６号（それらは引用により本明細書に組み込まれる）に開示されている。しかしながら、さらに有用なプロドラッグ化合物及びそのようなプロドラッグの製造方法が所望される。
権利不在状態で存在する類似する構造（特に、最も接近した構造）のプロドラッグに対して、血液において高い作用特異性、低められた毒性及び改良された安定性を示すプロドラッグが特に所望される。
【０００５】
発明の要約：
本発明の化合物は、安定化基に結合される、３個のアミノ酸のオリゴペプチドに直接的に又は間接的に接合される治療剤のプロドラッグ形である。本発明のプロドラッグは、高い作用特異性、低められた毒性、血清及び血液における改良された安定性を示し、そして標的細胞関連の酵素により活性化されなければ、標的細胞中に最少に移動する。さらに、前記化合物は好ましくは、トロウアーゼ、例えばＴＯＰにより、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの分解速度の一部である分解速度で分解される。
【０００６】
本発明はまた、本発明の化合物及び任意には、医薬的に許容できるキャリヤー、アジュバント、ビークル又は同様のものを含んで成る医薬組成物にも関する。本発明のプロドラッグを含んで成る製品もまた、記載される。従って、本発明は、本発明の化合物を用いる診断又はアッセイキットを包含する。
【０００７】
さらに、プロドラッグの企画方法、及びプロドラッグを創造するために治療剤を変性することによって毒性を低め、そして安全性指数を改良する方法が開示される。そのような変性は、遊離治療剤に比較して、プロドラッグの改良された治療指数を提供する。本発明のプロドラッグのいくつかの製造方法もまた、記載される。
本発明はさらに、本発明のプロドラッグを、治療的有効量で患者に投与することによって、医学的状態を処理するための方法を包含する。
【０００８】
特定の記載：
略語：
ＡＣＮ＝アセトニトリル；Ａｉｂ＝アミノイソ酪酸；Ａｌｌ＝アリル；Ａｌｏｃ＝アリルオキシカルボニル；Ａｍｂ＝４−（アミノメチル）安息香酸；ＡＡＰ＝３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸；ＤＣＣ＝Ｎ， Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド；Ｂｏｃ＝ｔ−ブチルオキシカルボニル；Ｃａｐ＝アミノカプロン酸； ＤＢＮ＝１，５−ジアザビシクロ［４． ３． ０］ノン−５−エン；ＤＢＯ＝１，４−ジアザビシクロ［２． ２． ２］オクタン；ＤＢＵ＝１，８−ジアザビシクロ［５． ４． ０］ウンデク−７−エン；ＤＣＭ＝ジクロロメタン；ＤＩＣ＝Ｎ， Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド；ＤＩＥＡ＝ジイソプロピルエチレンアミン；Ｄｇ＝ジグリコール酸；ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド；Ｄｎｒ＝ダウノルビシン；Ｄｏｘ＝ドキソルビシン； Ｅｔ２Ｏ＝ジエチルエーテル；
【０００９】
Ｆｍｏｃ＝９−フルオレニルメチルオキシカルボニル；Ｇｌ＝グルタル酸； ＨＡＴＵ＝Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート；ＨＢＴＵ＝２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート；ＨＥＰＥＳ＝ヒドロキシエチルピペリジン；ＨＯＢｔ＝Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール；ＨＰＬＣ＝高圧液体クロマトグラフィー；ＭｅＯＨ＝メタノール；ＭｅＯＳｕｃ＝メチルヘミスクシネート／メチルヘミスクシニル； ＭＴＤ＝最大耐性用量；ＮＡＡ＝３−アミノ−４，４−ジフェニル酪酸；ＮａＩ＝２−ナフチルアラニン；Ｎａｐｈ＝１，８−ナフタレンジカルボン酸；ＮＩｅ＝ノルロイシン；ＮＭＰ＝Ｎ−メチルピロリジン；Ｎｖａ＝ノルバリン；ＰＡＭ樹脂＝４−ヒドロキシメチルフェニルアセトアミドメチル；
【００１０】
ＰＥＧ： ポリエチレングリコール； Ｐｙｇ＝ピログルタミン酸；Ｐｙｒ＝３−ピリジルアラニン；ＲＤ＝反復用量； ＲＤ−ＭＴＤ＝反復用量−最大許容用量；ＲＴ，ｒｔ＝室温；ＳＤ＝単一用量；ＳＤ−ＭＴＤ＝単一用量−最大許容用量； Ｓｕｃ＝琥珀酸／スクシニル；ＴＣＥ＝トリクロロエチル；ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸；ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン；Ｔｈｉ＝２−チエニルアラニン；Ｔｈｚ＝チアゾリジン−４−カルボン酸；Ｔｉｃ＝テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸；ＴＯＰ＝チメット（Ｔｉｍｅｔ）オリゴペプチダーゼ。
【００１１】
本発明の化合物は、治療剤のプロドラッグ形である。それらの治療剤は、安定化基に結合される、３個のアミノ酸のオリゴペプチドに直接的に又は間接的に結合される。本発明のプロドラッグは、高い作用特異性、低められた毒性、血清及び血液における改良された安定性を示し、そして標的細胞関連の酵素により活性化されなければ、標的細胞中に最少に移動する。標的細胞により結合される酵素は好ましくは、トロウアーゼ（ｔｒｏｕａｓｅ）であり、そしてより好ましくは、チメット（Ｔｈｉｍｅｔ）オリゴペプチダーゼ又は“ＴＯＰ”である。
【００１２】
プロドラッグ：
本発明のプロドラッグは、治療剤の変性された形であり、いくつかの部分、例えば
（１）治療剤、
（２）オリゴペプチド、及び
（３）安定化基、及び
（４）任意には、リンカー基を含んで成る。
プロドラッグの部分の個々は、下記により詳細に論じられる。プロドラッグのそれらの部分の典型的な配向は次のとおりである：
（安定化基）−（オリゴペプチド）−（任意のリンカー基）−（治療剤）。
【００１３】
安定化基は、オリゴペプチドの第１の結合部位でそのオリゴペプチドに直接的に連結される。オリゴペプチドは、そのオリゴペプチドの第２の結合部位で治療剤に直接的に又は間接的に連結される。オリゴペプチド及び治療剤が間接的に連結される場合、リンカー基が存在する。
【００１４】
プロドラッグの２種の部分の直接的な結合は、それらの２種の部分間に存在する共有結合を意味する。従って、安定化基及びオリゴペプチドは、オリゴペプチドの第１結合部位、典型的いはオリゴペプチドのＮ−末端で共有化学結合を通して直接激に結合される。オリゴペプチド及び治療剤が直接的に結合される場合、それらはオリゴペプチドの第２の結合部位でもう１つのものに共有結合される。オリゴペプチドの第２の結合部位は典型的には、オリゴペプチドのＣ−末端であるが、しかしオリゴペプチド上の他の位置ででもあり得る。
【００１５】
プロドラッグの２つの部分の間接的結合は、その２つの部分の個々がリンカー基に共有結合されることを意味する。他の態様においては、プロドラッグは、治療剤へのオリゴペプチドの間接的結合を有する。従って、典型的には、オリゴペプチドは、治療剤に共有結合されるリンカー基に共有結合される。
【００１６】
本発明のプロドラッグは、そのオリゴペプチド部分内で分解できる。プロドラッグを効果的にするためには、プロドラッグは、典型的には、インビボ変性を受け、そしてプロドラッグの活性部位、すなわち輸送−成分部分が標的細胞に侵入する。プロドラッグのオリゴペプチド部分内の第１の分解は、分解生成物の１つとして、プロドラッグの活性又は輸送成分部分を残すことができる。他方では、１又は複数のペプチダーゼによるさらなる分解は、細胞に侵入することができるプロドラッグの一部をもたらすために必要とされる。
【００１７】
プロドラッグの活性部分は、少なくとも治療剤を有し、そして直接的に、又は標的細胞内のさらなる転換に基づいて治療効果を発揮するために標的細胞内に侵入できるプロドラッグのその部分である。従って、前記化合物は活性部分を有し、そして活性部分は、標的細胞により結合される酵素による分解の前よりも、標的細胞により結合される酵素による分解の後、標的細胞により侵入することができる。
【００１８】
安定化基及びオリゴペプチドの構造は、血液又は非標的組織に存在できる酵素によるプロドラッグのクリアランス及び代謝を制限するよう選択され、そしてさらに、細胞中へのプロドラッグの輸送を制限するよう選択される。安定化基は、プロドラッグの分解を阻止し、そしてプロドラッグの好ましい電荷又は他の物理的特性の提供において使用することができる。オリゴペプチドのアミノ酸配列は、標的細胞により結合される酵素、より特定には、トロウアーゼ酵素、及びさらにより特定には、ＴＯＰによる特定の分解を確保するよう企画される。
【００１９】
プロドラッグ形への治療剤の変性により不活性化される、治療剤、特に抗腫瘍及び／又は抗炎症性治療剤を製造することが所望される。本発明によれば、標的細胞は通常、腫瘍細胞又は炎症反応に関与する細胞、特にリウマチ性疾患に関連するそれらの細胞、例えばマクロファージ、好中球及び単球である。治療剤のプロドラッグ形への変性は、治療剤の副作用をいくらか減じる。
【００２０】
標的細胞においては、治療剤（任意には、１又は２つのアミノ酸及びたぶんまた、リンカー基に結合される）は、その特定の細胞内作用部位に対して直接的に作用するか、又は細胞内プロテアーゼによる修飾の後、標的細胞を殺害するか、又はその増殖を阻止する。正常細胞はインビボでＴＯＰをほとんどか又はまったく放出しないので、本発明の化合物は不活性を維持し、そして正常細胞に侵入しないか又は比較的少量で侵入する。ＴＯＰは身体において広く分布されると思われるが、それは典型的には、細胞内酵素として存在する。従って、それは一般的に、循環においてペプチドプロドラッグに接近できない。腫瘍の環境下で、ＴＯＰは壊死組織から放出されると思われる。
【００２１】
プロドラッグは、患者に投与され、安定形で血流を通して運ばれ、そして標的細胞の付近にある場合、トロウアーゼ、例えばＴＯＰにより作用を及ぼされる。酵素活性は正常細胞の細胞外付近内に最少に存在するので、プロドラッグは維持され、そしてその活性部分（治療剤を包含する）は最少に正常細胞中に侵入する。しかしながら、腫瘍又は他の標的細胞付近において、局部環境における相当する酵素の存在は、プロドラッグの分解を引き起こす。図２に示される例は、細胞外分解され、そして標的細胞中に侵入する、Ｎ−キャップされたプロドラッグ、及び輸送−成分又は活性部分を示す。標的細胞内で、それは、例えば標的細胞を殺害するか又はその増殖を阻止することによって、治療効果を提供するためにさらに変性され得る。プロドラッグの一部は時折、たぶん有害な正常細胞に再び接近するが、プロドラッグの輸送−成分部分は主に標的細胞付近で開放される。従って、正常細胞に対する毒性が最少にされる。
【００２２】
この方法は、標的組織が正常細胞又は組織により開放されない酵素を放出する場合、標的細胞破壊のために特に有用であり、そしてそのために企画される。本明細書において、“正常細胞”とは、その意図される使用のために適切な態様で、プロドラッグの投与に基づいてプロドラッグにより遭遇される非標的細胞を意味する。
【００２３】
他の態様においては、プロドラッグの配向は、逆転され、その結果、安定化基がオリゴペプチドのＣ−末端に結合され、そして治療剤がオリゴペプチドのＮ−末端に直接的に又は間接的に結合される。従って、他の態様においては、第１の結合部位は、オリゴペプチドのＣ−末端であり得、そしてオリゴペプチドの第２の結合部位は、オリゴペプチドのＮ−末端であり得る。本発明のもう１つの態様は、一次態様と同じ態様で機能する。
【００２４】
特許協同条約国際公開番号ＷＯ９６／０５８６３号及びアメリカ特許第５，９６２，２１６号においては、一定の有用なプロドラッグが開示されている。本発明は、そこに開示されるプロドラッグとは異なる。従って、オリゴペプチドがＬｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕである場合、安定化基はスクシニルではなく、又は治療剤はダウノルビシンではない。
下記に詳細に記載されるように、本発明のプロドラッグは、
（１）標的細胞に導入できる治療剤、
（２）式 ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチド、
（３）安定化基、及び
（４）任意には、ＴＯＰにより分解できないリンカー基を含んで成り、
【００２５】
ここで前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第１の結合部位で前記安定化基に直接的に結合され、そして前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第２結合部位で前記治療剤に直接的に結合されるか、又は治療剤に前記リンカー基を通して間接的に結合され、
前記安定化基は全血（Ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）に存在する酵素により前記オリゴペプチドの分解を妨げ、そして
前記化合物がＴＯＰにより分解できることを特徴とする化合物である。
【００２６】
標準分解速度の１０〜８０％の試験分解速度での実験条件下でＴＯＰにより分解される本発明のプロドラッグが特に有用である。標準分解速度は、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ及び治療剤の接合体から成る、実験条件下でのＴＯＰによる試験標準に対して試験される。本明細書において使用される場合、“〜により分解できる”とは、生理学的条件下で分解できることを意味する。
【００２７】
この論議のためには、化合物は、所定の酵素の精製された調製物による分解速度が興味ある化合物と同じ治療剤にカルボキシ末端を通して接合されるＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕの分解速度の１５％以下、好ましくは５％以下、及び理想的には１％以下である場合、所定の酵素による分解に対して耐性である。前記速度は、同じアッセイ条件下で比較されるべきである。化合物は、１０％／時以上、好ましくは５０％／時以上が、化合物及び酵素の混合物により、生理学的条件、特に標的細胞の外部の条件を表す実験条件下で分解される場合、所定の酵素により分解できる。実験におけるその所定の酵素の濃度は、標的組織の細胞外環境下でのその所定の酵素の濃度の代表である。
【００２８】
標的細胞関連酵素：
本発明のプロドラッグは、患者の身体内の標的化される部位で、又はその近くで、標的細胞により結合される酵素との相互作用を通しての選択的活性化を利用するよう企画される。引用により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ９９／３０３９３号により詳細に記載されるトロウアーゼは、標的細胞関連酵素の種類である。
【００２９】
トロウアーゼ（ｔｒｏｕａｓｅ）は、標的組織でプロドラッグを活性化すると思われる。トロウアーゼは、オリゴペプチド分解部位のカルボキシ側でのロイシンとイソロイシンとの間の著しい程度の区別を示す種類のエンドペプチダーゼである。適切なアッセイ条件下で、トロウアーゼはＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒを容易に分解するが、しかしそれは、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒとは、少なくとも２０倍低い活性を有することを特徴とする。
【００３０】
トロウアーゼ（ｔｒｏｕａｓｅ）は、標的細胞により会合されると思われる。たぶん、トロウアーゼは、標的細胞により、又は標的細胞により結合される正常細胞、例えば、基質細胞、好中球、マクロファージ又はＢ細胞により生成される。その結果、例えば、トロウアーゼは、細胞外表面により結合されるか、又はその表面（少なくとも活性部位）上に結合され、分泌され、開放され、又は標的細胞の細胞外付近に他の態様で存在することができる。多くの場合、本発明のプロドラッグは、癌の処理のための治療剤を含み、そして標的細胞は腫瘍細胞である。従って、トロウアーゼは腫瘍細胞により細胞外に分泌され得、又はそれは、例えば腫瘍により結合される細胞溶解物が存在するので、細胞外に存在することができる。細胞溶解物はまた、炎症性組織、すなわちもう１つの標的細胞部位により結合される。
【００３１】
しかしながら、トロウアーゼ活性は、ヒト血漿において低い。トロウアーゼ活性は、癌細胞抽出物、及び培養された癌細胞、赤血球細胞及び種々のヒト組織、特に腎臓からのならし培地において観察されている。ＨｅＬａ（頸部癌）細胞均質物の超遠心分離（１４５，０００倍、３０分）上清液からのトロウアーゼの部分精製スキームは、次の通りに４種の段階から成る：
【００３２】
１．２０ｍＭのトリエチルアミンクロライド、ｐＨ７．２、０．０１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００中、０〜０．５ＭのＮａＣｌ線状グラジエントにより溶解される１５Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてのアニオン交換クロマトグラフィー；
２．ＣｏＣｌ２により予備充填され、そして１０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２、０．０１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００， ０．０２％のＮａＮ３中、０〜２００ｍＭのイミダゾール線状グラジエント溶解されるＣｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ） を用いての親和性クロマトグラフィー；
３．分離用電気泳動；及び
４．０．３ｍｌ／分で５０ｍＭのリン酸カリウム、２００ｍＭの硫酸カリウム（ｐＨ７．０）により溶出される７．８ｍｍ×６０ｃｍのＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇ−３０００ＳＷＸＬ（ＴｏｓｏＨａａｓ）を用いてのゲル濾過高性能液体クロマトグラフィー。
【００３３】
トロウアーゼ分解の後に開放されるプロドラッグの一部のさらなる分解は、たぶん、アミノ−エキソペプチダーゼにより、細胞内又は細胞外で生じ得る。インビトロ実験は、広い特異性のアミノ−エキソペプチダーゼがヒト血液及び癌細胞環境において存在することを示す。
証拠は、ＴＯＰがトロウアーゼの例であることを示す。ＨｅＬａ細胞抽出物から単離され、そしてＭＣＦ−７／６ヒト癌細胞からのならし培地又は均質物において研究されたトロウアーゼは、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの初期分解を触媒する。それらの源から単離されたトロウアーゼは、ＴＯＰであると思われる。構造的及び機能的証拠は、ＴＯＰが癌細胞において見出されるトロウアーゼであることを示す。
【００３４】
文献によれば、ＴＯＰ又はＥＣ３． ４． ２４． １５は、６〜１７個のアミノ酸を有する種々のオリゴペプチドの内部（エンド）分解を触媒するエチール活性化された亜鉛メタロペプチダーゼである（Ｄａｎｄｏ、など．， “Ｈｕｍａｎ ｔｈｉｍｅｔ ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ”， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２９４： ４５１−４５７ （１９９３））。それはまた、Ｐｚ−ペプチダーゼ、コラゲナーゼ様ペプチダーゼ、キナーゼＡ、アミロイジンプロテアーゼ、及びメタロエンドペプチダーゼとしても言及される。
【００３５】
前記酵素は、鶏胚（Ｍｏｒａｌｅｓ， など．， “ＰＺ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ｃｈｉｃｋ ｅｍｂｒｙｏｓ． Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ａｎｄ ａｃｔｉｏｎ ｏｎ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ”， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５２： ４８５５−４８６０ （１９９７））、鶏肝臓（Ｂａｒｒｅｔｔ，など．， “Ｃｈｉｃｋｅｎ ｌｉｖｅｒ ＰＺ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅ， ａ ｔｈｉｏｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｔａｌｌｏ−ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ”， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２７１： ７０１−７０６ （１９９０））、ラット精巣（Ｏｒｌｏｗｓｋｉ． など．， “Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ２４．１５ ｆｒｏｍ ｒａｔ ｔｅｓｔｅｓ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｔｏｗａｒｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ”， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２６１： ９５１−９５８ （１９８９））、及びヒト赤血球（Ｄａｎｄｏ， など．， “Ｈｕｍａｎ ｔｈｉｍｅｔ ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ”， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２９４： ４５１−４５７ （１９９３））から単離されて来た。
【００３６】
この酵素のための遺伝子は、クローン化され、そしてＤＮＡ配列はヒト脳（Ｄｏｖｅｙなど．， ＷＯ９２／０７０６８号）、ラット精巣（Ｐｉｅｒｏｔｔｉなど．， “Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ−２４．１５ ｉｎ ｒａｔ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ／ｐｉｔｕｉｔａｒｙ／ｇｏｎａｄａｌ ａｘｉｓ”， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ７６： ９５−１０３ （１９９１））、及びブタ肝臓（Ｋａｔｏなど．， “Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｔｈｉｍｅｔ ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ． Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｓｏｌｕｂｌｅ ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ”， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２１： １５９−１６５ （１９９４））から得られた。ＴＯＰは、ＨｅＬａ（Ｋｒａｕｓｅなど．， “Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ａｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ （Ｍｏｐ） （ＥＣ ３． ４． ２４． １６） ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ｈｅｌａ”， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６６： ２９７−３０８ （１９９７））；
【００３７】
ＡＴ−２０細胞（Ｃｒａｃｋなど．， “Ｔｈｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＥＣ ３． ４． ２４． １５ ａｔ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｒａｒ ｓｕｒｆｅｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＡｔＴ−２０ Ｃｅｌｌ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ”， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ８３５： １１３−１２４ （１９９９）； Ｆｅｒｒｏなど．， “Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ２４． １５ （ＥＣ ３． ４． ２４． １５）”， ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １８： ７８１−７８９ （１９９９）； Ｇａｒｒｉｄｏなど．， “Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｉｍｅｔ ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ （ＥＣ ３． ４． ２４． １５） ａｎｄ ｎｅｕｒｏｌｙｓｉｎ （ＥＣ ３． ４． ２４． １６） ｉｎ ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐａｔｈｗａｙ”， ＤＮＡ Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １８： ３２３−３３１ （１９９９））； Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞（Ｏｌｉｖｅｉｒａなど．， “Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｉｏｌ−， ａｓｐａｒｔｙｌ−， ａｎｄ ｔｈｉｏｌ−ｍｅｔａｌｌ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ｍａｄｉｎ−ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ”， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７６： ４７８−４８８ （２０００））； 及び前立腺癌細胞系（など．， “Ｎｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎ ｉｓ ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｄ ｂｙ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｉｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ”， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １９： ２５３−２５８ （１９９８））の抽出物において免疫学的に又は官能的に同定されている。
【００３８】
ＴＯＰに関しては（Ｂａｒｒｅｔｔなど．， “Ｃｈｉｃｋｅｎ ｌｉｖｅｒ ＰＺ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅ， ａ ｔｈｉｏｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｔａｌｌ−ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ”， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２７１： ７０１−７０６ （１９９０）；Ｌｅｗ， など．，”Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｒａｔ ｔｅｓｔｅｓ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＥＣ ３．４．２４．１５ ａｎｄ ｔｈｅ ｎａｔｉｖｅ ｂｒａｉｎ ｅｎｚｙｍｅ”， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２０９： ７８８−７９５（１９９５））、癌細胞トロウアーゼは、メタロペプチダーゼインヒビターＥＤＴＡ及び１，１０−フェナントロリンにより阻害されるが、しかしセリン、チオール、又は酸プロテイナーゼインヒビター、例えばアミノエチルベンゼン−スルホネート、Ｅ６４、ペプスタチン、ロイペプチン、アプロチニン、ＣＡ０７４又はフマギリンによっては阻害されない。ＴＯＰについて報告されるように、ＥＤＴＡ処理された癌細胞トロウアーゼは、Ｃｏ２＋（５０〜１００μＭ）又はＭｎ２＋（５０〜１００μＭ）により再活性化される。
【００３９】
ＥＤＴＡ−不活性化された鶏（Ｂａｒｒｅｔｔなど．， “Ｃｈｉｃｋｅｎ ｌｉｖｅｒ ＰＺ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅ， ａ ｔｈｉｏｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｔａｌｌｏ−ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ”， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２７１： ７０１−７０６ （１９９０））、又はラット（Ｏｒｌｏｗｓｋｉなど．， “Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ２４． １５ ｆｒｏｍ ｒａｔ ｔｅｓｔｅｓ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｔｏｗａｒｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ”， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２６１： ９５１−９５８（１９８９））を再活性化することもまた可能である。ＴＯＰはまた、Ｚｎ２＋により再活性化されるが、しかしながら、Ｚｎ２＋再活性化は、ＥＤＴＡ−処理されたＭＣＦ−７／６細胞均質物に関してはみられない。
【００４０】
ＥＤＴＡ処理及び除去のために使用される特定の方法は、癌細胞トロウアーゼによる結果に影響を及ぼすことができる。１００μＭほどの低い濃度のＺｎ２＋がＴＯＰに対して阻害性である事実はまた、１つの要因でもあり得る。１００μＭでのＺｎ２＋は、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘのＨｅｌａ細胞画分１による加水分解を完全に阻害する。ＥＤＴＡにより不活性化された癌細胞トロウアーゼは、第二銅イオンにより再活性化され得ない。
【００４１】
ＴＯＰ活性は、空気−不活性化された調製物のチオール活性化により示されるように、酵素添加された溶液（例えば、血液）において阻害され、そして軽い還元（低酸素性）環境において活性化され得る（Ｓｈｒｉｍｐｔｏｎなど．， “Ｔｈｉｏｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＥＣ ３． ４． ２４． １５． Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ”， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２： １７３９５−１７３９９ （１９９７））。従って、それは、低酸素性環境、例えば腫瘍組織において活性化されるプロドラッグを選択するのための良好な候補体である。従って、それは、標的細胞結合のプロドラッグ活性化酵素の選択のための一般的なアプローチの例である。
【００４２】
ＣＤ１０（ＣＡＬＬＡ、ネプリリシン、中性エンドペプチダーゼ、ＥＣ ３． ４． ２４． １１）は、限定された数の癌腫瘍タイプを包含する多くの細胞の外側の細胞膜に結合されるオリゴペプチダーゼである（Ｔｕｒｎｅｒ ＡＪ （１９９８） Ｎｅｐｒｉｌｙｓｉｎ． Ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ， Ｂａｒｒｅｔｔ ＡＪ， Ｒａｗｌｉｎｇｓ ＮＤ， Ｗｏｅｓｓｎｅ ＪＦ （ｅｄｓ） ｐｐ．１１０８−１１１１． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ： Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ） 。それはまた、近位腎臓細管の刷子縁において高濃度で、及び結腸組織及び多数の免疫系細胞、例えばＢ−リンパ球において低レベルで存在するので、それはペプチジルプロドラッグの全身性活性化に寄与することができる。この付与された全身性活性化は、ＣＤ１０基質でないペプチジルプロドラッグに比較される場合、正常組織に高められた毒素を導くことができた。
【００４３】
ＣＤ１０は、グリシン又はアラニンがＰ１’分解部位に存在する場合、不十分に分解するが、しかしＬｅｕがＰ１’部位に存在する場合、十分に分解する（Ｐｏｚｇａｙなど．， “Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ａｎｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ−ｌｉｋｅ Ｎｅｕｔｒａｌ Ｍｅｔａｌｌｏｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｆｒｏｍ ｋｉｄｎｅｙ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ”， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５： １２９２−１２９５ （１９８６））、従って、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘは、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｄｏｘに比較して、 ＣＤ１０により不十分に分解されることが予測される。この結果は例１５に示される。マウスが等モル用量を与えられる場合、その得られる血漿Ｄｏｘ暴露は、２種の化合物のトロウアーゼ（又はＴＯＰ）による加水分解速度がほぼ同じである（例２）事実にもかかわらず、ＣＤ１０分解化合物に関して、より低かった（例１０）。
【００４４】
低い血漿Ｄｏｘ暴露から予測されるように、非−ＣＤ１０分解ペプチジルプロドラッグはまた、平均許容用量研究において試験される場合、より安全であった（例５及び６）。従って、非−ＣＤ１０含有腫瘍を処理する場合、本発明の好ましい態様は、ＣＤ１０、例えばＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘではなく、ＴＯＰにより活性化される化合物である。
【００４５】
安定化基：
プロドラッグの重要な部分は、プロドラグが患者に投与される場合、循還血液におけるプロドラッグ化合物の分解を保護するよう作用し、そして比較的損なわれていない標的細胞の付近へのプロドラッグの到達を可能にする安定化基である。安定化基は典型的には、血液、血清及び正常組織に存在するプロテイナーゼ及びペプチダーゼによるプロドラッグの分解を保護する。特に、好ましい態様においては、安定化基はオリゴペプチドのＮ−末端をキャップし、そして従って、時々、Ｎ−キャップ又はＮ−ブロックとして言及され場合、その安定化基、他方では、プロドラッグが敏感であるペプチダーゼに対して保護するよう作用する。
【００４６】
理想的には、安定化基は、それが、ヒト血液において３７℃で２時間のプロドラッグ化合物の貯蔵により試験される場合、変性、すなわち分解からプロドラッグを保護するよう作用し、そして所定のアッセイ条件下で、ヒト血液に存在する酵素によるプロドラッグの分解を、２０％以下、好ましくは２％以下もたらす場合、本発明のプロドラッグにおいて有用である。
【００４７】
より特定には、安定化基は、
（１）アミノ酸以外であるか、又は
（２）（ｉ）４又はそれ以上の炭素原子を有する遺伝的にコードされないアミノ酸であるか、又は（ｉｉ）アスパラギン酸のβ−カルボキシル基又はグルタミン酸のγ−カルボキシル基で、オリゴペプチドのＮ−末端に結合されるアスパラギン酸又はグルタミン酸であるアミノ酸である。
【００４８】
例えば、ジカルボン酸（又は高級カルボン酸）又は医薬的に許容できるその塩が、安定化基として使用され得る。複数のカルボン酸を有する化学基はまだ、安定化基として使用され得る。複数のカルボン酸を有する化学基がまた、プロドラッグの一部として許容されるので、ジカルボン酸（又は高級カルボン酸）を有する末端基は、典型的なＮ−キャップである。従って、Ｎ−キャップは、アミドがペプチドのアミノ末端に結合され、そして残るカルボン酸が遊離し、そして結合されていない、複数のカルボン酸を有する化学基のモノアミド誘導体であり得る。
【００４９】
このためには、Ｎ−キャップは好ましくは、琥珀酸、アジピン酸、グルタミン酸又はフタル酸であり、そして琥珀酸が最も好ましい。本発明のプロドラッグ化合物において有用なＮ−キャップの他の例は、ジグリコール酸、フマル酸、ナフタレンジカルボン酸、ピログルタミン酸、酢酸、１−又は２−ナフチルカルボン酸、１，８−ナフチルジカルボン酸、アコニット酸、カルボキシ桂皮酸、トリアゾールジカルボン酸、グルコン酸、４−カルボキシフェニルホウ素酸、（ＰＥＧ）ｎ−類似体、例えばポリエチレングルコール酸、ブタンジスルホン酸、マレイン酸、イソニペコチン酸及びニペコチン酸を包含する。
【００５０】
いくつかの場合、マウスにおける凝集する正に荷電されたプロドラッグの静脈内投与は、急性毒性をもたらした。しかしながら、そのような毒性は、このプロドラッグ上の荷電が、負に荷電された安定化基による誘導体化により逆転される場合、観察されなかった。多くの細胞毒性化合物は本来、低い溶解性を有する。例えば、正に荷電されたアントラサイクリンは、高濃度で凝集体を形成し、そしてそれらの凝集体は、静脈内投与される場合、静脈内凝固を誘発する。多くのペプチドは生理学的ｐＨで、暴露される正に荷電されたアミノ末端を有するので、それらの凝集体はインビボで、多陽性的に荷電された表面を形成し、そして投与の数分以内で、凝固カスケード及び死を誘発する。これは、凝集体を形成する正に荷電されたプロドラッグを、治療使用のために不適切にしるための可能性を有する。
【００５１】
ＰＣＴ／ＵＳ９９／３０３９３号により詳細に記載されるように、そのような可能性ある危険な障害と取り組む１つの手段は、負に荷電されるか、又は中性の官能価のペプチド鎖Ｎ−末端上に安定化基を使用することである。例えば、プロドラッグ上での安定化基としてのスクシニルの使用は、プロドラッグの急性毒性を緩和する。安定化基は、化合物と血管の内面をおおう内皮細胞との間の相互作用を低める。これは、ヒトにおける静脈内使用のための実質的な治療剤としてのペプチドプロドラッグの使用における重要な問題を解決する。
【００５２】
オリゴペプチド：
オリゴペプチドは一般的に、短い長さのポリペプチドとして定義される。本発明のプロドラッグにおいて有用なオリゴペプチドは、３個の長さのアミノ酸である。
オリゴペプチドは、ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１（式中、個々のＡＡは独立して、いずれかのアミノ酸を表す）で表される式又は配列（典型的なアミノ末端からカルボキシ末端の配向で示される）を有する。これは、位置配列Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’に対応する。トロウアーゼは、Ｐ１とＰ１’位置との間を、すなわちオリゴペプチドのＡＡ３とＡＡ２との間の結合を分離すると思われる。
【００５３】
オリゴペプチドは、右側でカルボキシル末端（又はＣ末端）及び左側でアミノ末端（又はＮ末端）により、従来の態様で書かれる。従って、上記に記載される式においては、ＡＡ１はカルボキシル末端である。
ＰＣＴ／ＵＳ９９／３０３９３号の発明においては、記載されるプロドラッグのオリゴペプチド部分は、上記の番号付けスキームに従って、オリゴペプチド配列のＡＡ４又は位置配列の位置Ｐ２として、ブロッキング性、非遺伝的コード配列を包含した。本発明のトリペプチドプロドラッグは、そのようなブロッキングアミノ酸も、位置ＡＡ４でのいずれかの他のアミノ酸も必要としない。本明細書に記載されるオリゴペプチド部分の短い長さにもかかわらず、トロウアーゼによるプロドラッグの分解のための選択性が維持される。
【００５４】
好ましいアミノ酸：
特にことわらない限り、すべてのアミノ酸は、Ｌ配置で存在する。いずれのアミノ酸でも、プロドラッグのオリゴペプチド部分に存在することができるが、一定のアミノ酸が好ましい。
Ｐ１又はＡＡ３位置においては、次のアミノ酸の１つが最も好ましい：ロイシン、サルコシン、チロシン、フェニルアラニン、ｐ−Ｃ１−フェニルアラニン、ｐ−ニトロフェニルアラニン、バリン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、トリプトファン、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、３−ピリジルアラニン、アラニン、グリシン又は２−チエニルアラニン。Ｐ１位置においては、メチオニン、又はプロリンがまた好ましい。
【００５５】
Ｐ１’位置においては、ＡＡ２は、最も好ましくは次のアミノ酸から選択される：アラニン、ロイシン、チロシン、グリシン、セリン、３−ピリジルアラニン、又は２−チエニルアラニン。この位置においては、アミノイソ酪酸、トレオニン及びフェニルアラニンがまた好ましい。
Ｐ２又はＡＡ１位置においては、次のアミノ酸の１つが最も好ましくは存在する：ロイシン、フェニルアラニン、イソロイシン、アラニン、グリシン、チロシン、２−ナフチルアラニン、又はセリン。Ｐ２’位置におけるβ−アラニンがまた好ましい。
【００５６】
本発明のプロドラッグにおいて特に有用なオリゴペプチドは、表１に示されるそれら、特に次のものの１つを包含する：Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ、Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、及びＬｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
ＴＯＰによるスクリーニング：
ＴＯＰは、さらなる使用のためのオリゴペプチドを選択するために使用され得る重要な酵素であり、そして従って、本発明のもう１つの観点は、式ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表す］で表されるで表される、ＴＯＰにより分解できるオリゴペプチドである。前記オリゴペプチドは、ＴＯＰによる分解性について試験する場合、治療剤及び／又は安定化基に結合され得る。
【００５９】
治療剤：
本発明に従ってプロドラッグに変性するために特に好都合である治療剤は、狭い治療窓を有するそれらの剤である。狭い治療窓を有する薬剤又は治療剤は、その毒性が一般的な医学的基準により明らかである用量が、効能が明らかである用量に非常に接近するものである。
【００６０】
本発明のプロドラッグを形成するために、安定化基及びオリゴペプチド、及び任意には、リンカー基に接合される治療剤は、癌、炎症性疾患、又はいくつかの他の医学的状態の処理のために有用であり得る。好ましくは、治療剤は、次の種類の成分から選択される：
アルキル化剤、抗増殖剤、チューブリン結合剤、ビンカアルカロイド、エネジイン、ポドフィロトキシン又はポドフィロトキシン誘導体、プテリジン種類の薬物、タキサン、アントラサイクリン、ドラスタチン、トポイソメラーゼインヒビター、及び白金錯体化学療法剤。
【００６１】
特に、治療剤は、好都合には、次の化合物又はその誘導体又は類似体から選択される：ドキソルビシン、ダウノルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、カリケアミシン、エトポシド、エトポシドホスフェート、ＣＣ−１０６５、ズオカルマイシン、ＫＷ−２１８９、メトトレキセート、メトプテリン、アミノプテリン、ジクロロメトトレキセート、ドセタキセル、パクリタキセル、エピチオロン、コンブレタスタチン、コンブレタスタチンＡ４ホスフェート、ドラスタチン１０、ドラスタチン１１、ドラスタチン１５、トポテカン、カンフォテシン、マイトマイシンＣ、ポルフィロマイシン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、フルダラビン、タモキシフェン、シトシンアラビノシド、アデノシンアラビノシド、コルヒチン、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、メルファラン、クロロキン、シクロポリンＡ、クロロキン、メイタンシン又はシスプラチン。
【００６２】
誘導体とは、命名された化合物ともう１つの化学的成分との反応に起因し、そして前記命名された化合物の医薬的に許容できる塩、酸、塩基又はエステルを包含する化合物を意味する。類似体とは、前記命名された化合物に類似する構造及び機能性質、例えば生物学的活性を有する化合物を意味する。
【００６３】
リンカー基：
オリゴペプチドと治療剤との間のリンカー基は、例えば次のような理由のために好都合であり得る：
１．ＡＡ１アミノ酸の酵素的開放又は他の酵素的活性化段階を促進するために立体的な考慮のためのスペーサーとして；
２．治療剤とオリゴペプチドとの間に適切な結合化学を提供するために；
３．プロドラッグ接合体を製造する合成方法を改良するために（例えば、収率又は特異性を増強するために、接合の前、リンカー基により治療剤又はオリゴペプチドを予備誘導体化することによって）；
４．プロドラッグの物性を改良するために；
５．薬剤の細胞内開放のための追加の機構を提供するために。
【００６４】
リンカー構造は、必要とされる官能性により指図される。可能性あるリンカー化学の例は、ヒドラジド、エステル、エーテル及びスルフヒドリルである。アミノカプロン酸は、二官能価リンカー基の例である。アミノカプロン酸がリンカー基に使用される場合、それは、オリゴペプチドの番号付けスキームにおいてアミノ酸として数えられない。
任意に存在するリンカー基は、ＴＯＰにより分解できず、すなわちそれは、生理学的条件下でＴＯＰにより分解できない。
【００６５】
プロドラッグのスクリーニング：
前で言及されたように、合成されたプロドラッグは理想的には、治療剤又はマーカーに接合されるＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕから成る試験標準に対して試験されるべきである。プロドラッグ化合物を製造するために使用されるその同じ治療剤又はマーカーは、試験標準を製造するためにＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕに接合されるべきである。合成されたトリペプチドプロドラッグ及び試験標準のトロウアーゼによる加水分化速度が、共通する実験条件下で比較される。下記例２は、この試験を行うための典型的なスキームを提供する。本発明のトリペプチドプロドラッグは好ましくは、試験標準についての標準分解速度の一部である速度で分解される。本発明の最も有用なプロドラッグは、試験標準の分解速度の１０〜８０％に等しい割合で分解する。さらにより好ましくは、本発明のプロドラッグは、試験標準の分解速度の３０〜６５％である速度で分解する。
【００６６】
本明細書に教授されるトリペプチドプロドラッグの製造及び使用の開示は、プロドラッグ企画のこれまでの教授の有用な二者択一を提供する。下記例に示されるように、本発明のプロドラッグは、動物モデルにおいてインビボで効果的且つ十分に許容できる。プロドラッグ自体は、治療において都合よく使用される。
特に有用な態様は、トロウアーゼにより分解できるが、しかしＣＤ１０又は他の全身性又は血液酵素による分解に対しては耐性である化合物である。
【００６７】
プロドラッグの設計：
プロドラッグの企画方法は、本発明のもう１つの観点であり、そして上記に記載されるように、最初に、オリゴペプチドの同定を必要とする。次に、オリゴペプチドが、そのオリゴペプチドの第１の結合部位で、安全な血液に存在する酵素によるオリゴペプチド分解を妨げる安定化基に結合され、そしてオリゴペプチドの第２の結合部位で治療剤に直接的に又は間接的に結合される。治療剤及び安定化基へのオリゴペプチドの結合は、いずれの順序でも又は同時にでも行われ得る。その得られる接合体は、ＴＯＰによる分解性について試験される。得られる接合体はまた、トロウアーゼ、例えばＴＯＰにより分解性について試験され得る。
【００６８】
好ましくは、その得られる接合体は、所定の実験条件下で分解について試験され、そして接合体は、試験分解速度が標準の分解速度の１０〜８０％、又はより好ましくは３０〜６５％である場合、プロドラッグとして選択される。標準分解速度は、その同じ所定の実験条件下でトロウアーゼにより試験標準に対して試験される。試験標準は、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ及び治療剤（又は下記製品の場合、マーカー）の接合体から成る。得られる接合体はまた、完全な血液における安定性について試験され得る。
【００６９】
第１の結合部位は通常、オリゴペプチドのＮ末端であるが、しかしオリゴペプチドのＣ末端、又はオリゴペプチドのもう１つの部分でもあり得る。第２の結合部位は通常、オリゴペプチドのＣ末端であるが、しかしオリゴペプチドのＮ末端又はオリゴペプチドのもう１つの部分でもあり得る。そのような方法により企画されるプロドラッグはまた、本発明の一部である。
【００７０】
さらに、本発明は、患者への投与のために意図される治療剤の毒性を低めるための方法を包含する。特に、治療剤の変性されたプロドラッグ形は、トロウアーゼにより分解できるか、又はより特定には、ＴＯＰにより分解できる、３個のアミノ酸のオリゴペプチドに治療剤を直接的に又は間接的に結合することによって形成される。オリゴペプチドはまた、安定化基にも結合される。この用にして形成されたプロドラッグは、下記のように、試験標準に起因する標準分解速度の１０〜８０％、又はより好ましくは３０〜６５％である試験分解速度でトロウアーゼにより選択されるべきである。前記プロドラッグは、患者に投与される場合、治療剤の低められた毒性を提供する。この態様での治療剤の変性はまた、接合されていない形での治療剤の用量に対して、患者への治療剤の高められた用量の投与を可能にする。
【００７１】
医薬組成物：
本発明はまた、本発明の化合物、特にプロドラッグ化合物、及び任意には、医薬的に許容できるキャリヤー、例えば、アジュバント又はビークル、又は同様のものを含んで成る医薬組成物を包含する。
本発明はまた、医薬的状態の処理のために指図される医薬製品の調製のためへの前記医薬組成物の使用にも関する。
【００７２】
例えば、医薬組成物は、患者に非経口、特に静脈内、筋肉内又は腹腔内投与され得る。非経口投与のための本発明の医薬組成物は、無菌の水性又は非水性溶液、懸濁液又はエマルジョンを包含する。医薬的に許容できる溶媒又はビールとして、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、注射できる有機エステル、例えばエチルオレエート、又はシクロデキストリンが使用され得る。等張塩溶液は、医薬組成物の一部であり得る。それらの組成物はまた、湿潤剤、乳化剤及び／又は分散剤を含むことができる。
【００７３】
殺菌は、いくつかの手段で、例えば細菌学的フィルターを用いて、組成物に殺菌剤を導入することにより、又は照射により行われ得る。それらはまた、無菌水又はいずれか他の無菌の注射用媒体への使用の時点で溶解され得る無菌の固体組成物の形で調製され得る。
医薬組成物はまた、当業界において良く知られており、そしてそれらが投与される医学的状態の処理を改良し、そして延長するために、本発明の化合物を組合して使用され得るアジュバント（例えば、ビタミンＣ、酸化防止剤、等）を含んで成る。
【００７４】
本発明の化合物の患者への投与のための用量は一般的に、Ｂｒｕｃｅ Ａ． Ｃｈａｂｎｅｒ ａｎｄ Ｊｅｒｒｙ Ｍ． Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｅｄ．， ＩＳＢＮ ０−３９７−５０９００−６ （１９９０） に記載される、当業界において知られている治療剤の少なくとも通常の用量であり、又はそれらは、プロドラッグ製剤の卓越した有効性、又は処理される患者の特定の環境を適合するために、処理する医者の判断内で調節され得る。従って、投与される用量は、本発明の化合物の調製のために使用される治療剤に従って変化する。
【００７５】
プロドラッグ化合物による患者の処理：
治療的有効用量の医薬組成物を患者に、特に非経口及びより好ましくは静脈内投与することを包含する、医薬的状態の治療的処理のための方法はまた、本発明の範囲内である。従って、前記方法は一般的に、治療的有効量の
（１）標的細胞に挿入できる治療剤、
（２）式 ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチド、
（３）安定化基、及び
（４）任意には、ＴＯＰにより分解できないリンカー基を含んで成る化合物であって、
【００７６】
ここで前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第１の結合部位で前記安定化基に直接的に結合され、そして前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第２結合部位で前記治療剤に直接的に結合されるか、又は治療剤に前記リンカー基を通して間接的に結合され、
前記安定化基は全血（Ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）に存在する酵素により前記オリゴペプチドの分解を妨げ、そして
前記化合物がＴＯＰにより分解できることを特徴とする化合物を、前記患者に投与することを包含する。
【００７７】
最も有用な化合物は、所定の実験条件下での標準分解速度の１０〜８０％の試験分解速度をもたらす。標準分解速度は、同じ実験条件下でトロウアーゼによる試験標準に対して試験され、そして前記試験標準は、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ及び治療剤の接合体から成る。より好ましくは、化合物の試験分解速度は、標準分解速度の３０〜６５％である。
【００７８】
プロドラッグ化合物は、多くの医学的状態、例えば癌、新形成性疾患、腫瘍、炎症性患者及び感染性疾患の処理のために有用である。好ましくは疾病の例は、乳癌、結腸直腸癌、肝臓癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、脳癌及び膵臓癌である。医薬的に許容できるビークル（例えば、等張塩溶液）に配合されるプロドラッグ化合物は、０．０５ｍｇ／ｋｇ／用量／日〜３００ｍｇ／ｋｇ／用量／日の範囲の静脈内用量で動物又はヒトに投与され得る。それはまた、静脈内点滴又は他の遅い注入方法を通して投与され得る。
ヒト患者は本発明のプロドラッグの通常の受容体であるが、但し獣医学的使用もまた企画される。
【００７９】
診断又はアッセイ：
診断又はアッセイのために製品、例えばキットはまた、本発明の範囲内である。そのような製品は好ましくは、上記のような化合物を使用するが、但し、マーカー例えばクマリンが治療剤の代わりにオリゴペプチド及び安定化基に接合されている。マーカーは、オリゴペプチドに接合され得、そして当業界において知られているいずれかの方法により容易に検出できるいずれかの成分を意味する。マーカーの検出において有用な少なくとも１つの試薬が典型的には、キットの一部として包含される。従って、製品は、化合物及び任意には、マーカーの検出において有用な少なくとも１つの試薬を包含する。
【００８０】
より特定には、前記化合物は、
（１）マーカー、
（２）式 ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチド、
（３）安定化基、及び
（４）任意には、ＴＯＰ又はもう１つのトロウアーゼにより分解できないリンカー基を含んで成り、
【００８１】
ここで前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第１の結合部位で前記安定化基に直接的に結合され、そして前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第２結合部位で前記マーカーに直接的に結合されるか、又はマーカーに前記リンカー基を通して間接的に結合され、
前記安定化基は全血（Ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）に存在する酵素により前記オリゴペプチドの分解を妨げ、そして
前記化合物がトロウアーゼにより分解できることを特徴とする化合物を含んで成る。
【００８２】
前記のように、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ及びマーカーの接合体から成る、同じ実験条件下でのトロウアーゼによる試験標準に対して試験される標準分解速度の１０〜８０％の試験分解速度で分解するそれらの化合物が最も有用である。製品は例えば、腫瘍を診断し、又はプロドラッグ治療による処理に対して敏感な患者を同定するために患者サンプルにより使用され得る。
【００８３】
加工化学の一般的方法：
オリゴペプチド：ペプチドの合成のための一般的方法：
本発明のプロドラッグ接合体におけるペプチド又はオリゴペプチド配列は、固相ペプチド合成（Ｂｏｃ又はＦｍｏｃ化学のいずれかを用いて）方法により、又は溶液相合成により合成され得る。一般的なＢｏｃ及びＦｍｏｃ方法は広く使用され、そして次の文献に記載されている：Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８８： ２１４８ （１９６３）； Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ａｎｄ Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ｔｈｅ Ｐｒｅｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｙ， Ｂｅｒｌｉｎ， ７−１６１ （１９９４）； Ｓｔｅｗａｒｔ， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｐｒｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， （１９８４）。
【００８４】
一般的なＦｍｏｃ固相方法：
好ましい固相合成方法（自動又は手動）を用いて、所望する長さ及び配列のペプチドが、固体樹脂に結合される成長する鎖へのアミノ酸の段階的付加を通して合成される。有用なＦｍｏｃ　適合性樹脂の例は、Ｗａｎｇ樹脂、ＨＭＰＡ−ＰＥＧＡ樹脂、Ｒｉｎｋ酸樹脂又はヒドロキシエチル−フォトリンカー樹脂を包含するが、但しそれらだけには限定されない。ペプチド鎖のＣ末端はポリマー樹脂に共有結合され、そして保護されたα−アミノ酸が、カップリング試薬と共に段階的態様で添加された。好ましいα−アミノ保護基は、カップリング条件に対して安定し、そして軽いアルカリ性条件下で容易に除去され得るＦｍｏｃ基である。反応溶媒は好ましくは、ＤＭＦ、ＮＭＰ、ＤＣＭ、ＭｅＯＨ及びＥｔＯＨであるが、しかしそれらだけには限定されない。
【００８５】
カップリング剤の例は、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵである。Ｎ−末端保護基の分解は、０〜４０℃でＤＭＦ中、１０〜１００％のピペリジンにおいて達成され、そして温度は周囲温度が好ましい。合成の最後で、最終Ｆｍｏｃ保護基が、上記Ｎ−末端分解方法を用いて除去される。樹脂上の残るペプチドは、酸性条件下で樹脂を処理することによって、いずれかの酸感受性側鎖保護基と共に樹脂から分解される。例えば、酸性分解条件は、ジクロロメタン中、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の混合物である。ヒドロキシエチル−フォトリンカー樹脂が使用される場合、分解を誘発するための適切な波長は、λ３６５ｎｍの紫外線である。この工程の図示は、図３に与えられる。
【００８６】
固相合成を通しての一般的Ｎ−キャップ方法：
Ｎ−末端誘導体化されたペプチドの調製は便利には、固相上で達成される。ペプチド合成が完結する場合、末端Ｆｍｏｃが除去され、そしてペプチドはまだ、固体支持体上に存在する。次に、選択のＮ−キャップが、ペプチドのＮ−末端上に、標準のペプチドカップリング条件を用いてカップリングされる。Ｎ−キャップのカップリングの完結に基づいて、ペプチドが、上記方法を用いて、樹脂から分解される。
【００８７】
一般的なＢｏｃ固相方法：
Ｂｏｃ化学を用いての固相方法に関しては、Ｍｅｒｒｉｖｉｅｌｄ樹脂又はＰＡＭ樹脂が有用である。アミノ酸は、カップリング剤により活性化されたＢｏｃ−保護されたアミノ酸の連続的付加により、固相上の成長鎖にカップリングされる。カップリング剤の例は、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵである。反応溶媒は、ＤＭＦ、ＤＣＭ、ＭｅＯＨ及びＮＭＰであり得る。Ｂｏｃ保護基の分解は、０〜４０℃で、ＤＣＭ中、１０〜１００％のＴＦＡにおいて達成され、温度に関しては、周囲温度が好ましい。ペプチド鎖アセンブリーの完結に基づいて、Ｎ末端保護基（通常、Ｂｏｃ）が上記のようにして除去される。ペプチドは、ジクロロメタン中、液体ＨＦ又はトリフルオロメタンスルホン酸を用いて、樹脂から除去される。
【００８８】
溶液相合成によるＦｍｏｃオリゴペプチドの一般的調製方法：
他方では、プロドラッグペプチド中間体は、Ｂｏｃ又はＦｍｏｃ化学を用いて、溶液相合成を通して製造され得る。この方法の図示（図４）においては、Ｃ−末端Ｌｅｕテトラペプチドが一般的に例として使用されるが、しかし類似する反応が他のＣ−末端テトラペプチドにより行われ得ることが理解されるであろう。このペプチドは、固相方法に類似する段階的アセンブリー（Ｎ−末端方向又はＣ−末端方向に）により、又は単一のアミノ酸によるジペプチドのカップリングを通して増大され得る。
【００８９】
溶液相合成の１つの方法は、図４に示される、Ｆｍｏｃ化学を用いてのプロドラッグペプチド中間体の段階的増大である。そのＣ−末端は、副生成物の形成を低めるために保護されるべきである。図４におけるＣ−末端Ｒ基は、Ｍｅ， ｔＢｕ， ベンジル又はＴＣＥである。（Ｎ−キャプがメチルスクシニルである場合、Ｃ−末端Ｒ基はメチルであり得ないことを注意すること。）ＤＭＦは溶媒として与えられるが、他の溶媒、例えばＤＭＳＯ、ＣＨ３ＣＮ又はＮＭＰ（又はそれらの混合物）がそれと置換され得る。ピリジン、Ｅｔ３Ｎ又は他の塩基が成長するペプチド鎖保護のアミノ末端の保護解除において、ピペリジンにより置換され得る。
【００９０】
同様に、ＨＢＴＵは活性剤として上記図に与えられるが、他の活性剤、例えばＤＣＣ、ＤＩＣ、ＤＣＣ＋ＨＯＢｔ、Ｏｓｕ、活性化されたエステル、アジド又はトリフェニルホスホリルアジドが使用され得る。さらに、保護されたペプチド酸クロライド又は酸ブロミドが、アミノ酸又はペプチドフラグメントに直接的にカップリングするために使用され得る。オリゴペプチドアセンブリーの完結に基づいて、Ｎ−末端保護解除された及びＣ−末端保護されたペプチドは所望するＮ−キャップに容易に受容される。
【００９１】
溶液相合成を通してのＮ−キャップオリゴペプチドの一般的調製方法：
溶液相合成により、Ｎ−キャップされたオリゴペプチドを構成する場合、Ｎ−キャップはわずかに改良された方法により合成される必要がある（図５）。最初に、ＦｍｏｃオリゴペプチドのＣ−末端は、Ｎ−キャップ上のＣ−末端の選択的保護解除に適合できる、酸不安定性又は水素化感受性保護基により保護される必要がある。次に、Ｆｍｏｃ保護基は、Ｎ−末端を表すためにオリゴペプチドから除去される必要がある。保護解除されたＮ−末端及び保護されたＣ−末端を有するオリゴペプチドは、所望するＮ−キャップの活性化されたヘミエステルと反応せしめられる。Ｎ−キャップは、塩基及び適切な溶媒においてアミノ酸、例えばＤＣＣ又はＨＡＴＵを活性化するための方法を用いて活性化され得る。
【００９２】
他方では、メチル−ヘミスクシネートが使用される場合、カップリングはまた、有機又は無機塩基、例えばＤＩＥＡ、トリエチルアミン又はＣｓ２ＣＯ３の存在下で不活性溶媒を用いて、メチルヘミスクシニルクロライド（又は他の酸ハロゲン化物）を通して行われ得る。そのような合成の１つの例は、メチル−ヘミスクシネート及びＭｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕベンジルエステルを反応することによってであり得る。カップリング方法は、一般的に当業界において使用される方法のいずれか１つの方法であり得る（例えば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ｍ．， Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， １８５ （１９８４）； Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ｍ．， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， １５９ （１９８４） を参照のこと）。
【００９３】
次に、ベンジル基が、オリゴペプチドの所望するＮ−キャップメチル−スクシニル形を提供する触媒水素化により除去され得る。適切な、選択的に除去できるＣ−末端保護基の他の例は、ｔＢｕ、アルコキシ−メチル及びＴＣＥであり得るが、但しそれらだけには限定されない。この段階を達成するための他の方法は、文献に記載される。
反応条件は、当業界において良く知られており、そして与えられる引例に記載される。上記方法の利点は、溶液相合成により生成される生成物の容易な精製である。
【００９４】
プロドラッグ接合体：
接合及び保護解除段階のための一般的方法：
本明細書に記載されるプロドラッグは、ペプチド合成に使用される標準の活性化試薬のいずれかを用いて、ダウノルビシン、ドキソルビシン又はいずれかの適切な治療剤によりオリゴペプチドのＦｍｏｃ形（ＦｍｏｃがオリゴペプチドのＮ−末端に結合されることを意味する）をカップリングすることにより合成され得る（図５）。溶媒は、トルエン、酢酸エチル、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＣＨ３ＣＮ、ＮＭＰ、ＴＨＦ、ＤＣＭ又は当業界において知られているようないずれかの他の不活性溶媒であり得、そして試薬はそこに溶解できる。好ましい溶媒は、ＤＭＦ及びＮＭＰである。適切な温度範囲は−２５〜＋２５℃であり、そして周囲温度が好ましい。
【００９５】
活性化剤は、次のものの１つから選択され得る：ＰｙＢＯＰ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＥＤＣ、ＤＩＣ、ＤＣＣ、ＤＣＣ＋ＨＯＢＴ、ＯＳｕ、活性化されたエステル、アジド又はトリフェニルホスホリルアジド。ＨＢＴＵ又はＨＡＴＵが好ましい活性化剤である。他方では、保護されたペプチドの酸クロライド又は酸ブロミドがまた、このカップリング反応のために使用され得る。２〜４当量、好都合には２〜２．５当量の塩基が、カップリング反応のために必要とされる。塩基は、無機塩基、例えばＣｓＣＯ３、Ｎａ２又はＫ２ＣＯ３、又は有機塩基、例えばＴＥＡ、ＤＩＥＡ、ＤＢＵ、ＤＢＮ、ＤＢＯ、ピリジン、置換されたピリジン、Ｎ−メチル−モルホリン、等、好ましくはＴＥＡ又はＤＩＥＡから選択され得る。反応は、−１５°〜５０℃、好都合には−１０℃〜１０℃の温度で行われ得る。反応時間は、５〜９０分であり、そして好都合には、２０〜４０分である。
【００９６】
生成物は、反応混合物を水中に注ぎ、そして形成される沈殿物を濾過することによって単離される。粗生成物は、ＤＣＭ、ＴＨＦ、酢酸エチル、又はアセトニトリル、好ましくはジクロロメタン又はアセトニトリルからの再結晶化により、さらに精製され得る。次に、（オリゴペプチド）−（治療剤）接合体の単離されたＦｍｏｃ形が、１０〜１００倍過剰の塩基を用いて、−１０〜５０℃の温度で、２〜９０分間、好ましくは３〜８分間、保護解除される。理想的には、５〜６０当量の塩基が好ましい。ピペチジンは、Ｆｍｏｃ基を保護解除するための好ましい塩基である。（オリゴペプチド）−（治療剤）接合体の保護解除されたアミノ末端は、オリゴペプチド−治療剤の最終Ｎ−キャップ形を得るために、活性化されたヘミ−エステルとして無水二酸によりアシル化される。
【００９７】
他方では、最終プロドラッグは、オリゴペプチドの保護されたＮ−キャップ形、例えばスクシニル−Ｎ−キャップオリゴペプチドのメチル−ヘミエステルから同様にして調製され、そして治療剤に接合され得る。この方法は図６に例示される。
（保護されたＮ−キャップ）−（オリゴペプチド）−（治療剤）接合体は、治療剤の安定性に適合できる方法により保護解除される。例えば、アントラサイクリンは、メチル基により保護され、そしてエステラーゼにより保護解除され得る。他の治療剤に関しては、ベンジル保護基及び触媒水素化が保護解除するために選択され得る。
【００９８】
負に荷電された（Ｎ−キャップ）−（オリゴペプチド）−（治療剤）の塩形への転換は、次の群から選択された溶媒により行われ得る：アルコール（例えば、メタノール、エタノール又はイソプロパノール）、水、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジグリメ（ｄｉｇｌｙｍｅ）又は他の極性溶媒。ナトリウム源は、１モル当量のＮａＨＣＯ３、ＮａＯＨ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＯＡｃ、ＮａＯＣＨ３（一般的に、ナトリウムアルコキシド）又はＮａＨである。Ｎａ＋（例えば、強い又は弱いイオン交換体）により荷電されたイオン交換カラムはまた、適切な場合、（Ｎ−キャップ）−（オリゴペプチド）−（治療剤）の塩形を製造するこの最後の段階のためにも有用である。ナトリウムは、単に例として記載される。
【００９９】
一般的に、プロドラッグは、そのプロドラッグの溶解性を改良するために、医薬的に許容できる塩形に転換され得る。（Ｎ−キャップ）−（オリゴペプチド）−（治療剤）は、医薬的に許容できる塩、例えばＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＯＨ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、ＣａＣＯ３、ＮＨ４ＯＨ、ＣＨ３ＮＨ２、（ＣＨ３）２ＮＨ、（ＣＨ３）３Ｎ、アセチルトリエチルアンモニウムにより中和される。プロドラッグの好ましい塩形は、ナトリウムであり、そして好ましい中和化塩はＮａＨＣＯ３である。
【０１００】
アントラサイクリン型分子、例えばドキソルビシン及びダウノルビジンが、非常に低い濃度で有機溶媒においてゲルを形成することは記載されている（Ｍａｔｚａｎｋｅなど．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０７： ７４７−５５ （１９９２）； Ｃｈａｉｒｅｓ など．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１： ３９２７−３２（１９８２）；Ｈａｙａｋａｗａなど．， Ｃｈｅｍ． ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ３９： １２８２−６ （１９９１）。これは、ペプチドアントラサイクリン接合体を製造する場合、高収率の汚染されていない生成物を得るためには相当の障害であり得る。ゲル形成は、所望しない副反応の形成に寄与する。
【０１０１】
この問題を最少にするための１つの手段は、カップリング反応のために非常に希釈した溶液（１〜２％）を使用することであるが、しかしながらそれは工程の環境（多量の廃棄物、複雑な単離）において実際的でない。この問題を克服するためには、ウレア又は他のカオトロピック剤が、ゲルを形成する強い疎水性及び水素結合力を破壊するために使用され得る。従って、カップリング反応がウレア含有溶媒、好都合には、ＤＭＦ又はＮＭＰ中、ウレアの２０％〜飽和溶液において行われる場合、副反応は、反応の濃度が１０％を超える場合でさえ、２％以下に維持され得る。これは、高濃度での接合段階を実際的にし、そして良好な収率を生成する。
【０１０２】
一般的な酵素方法：
酸又は塩基により触媒される十分なＮ−キャップ化合物への保護されたＮ−キャップ−オリゴペプチド治療剤の加水分解は、適度な酸性又は塩基性条件下でさえ、多くの治療剤の不安定性のために、複数な反応混合物を誘導する。酵素は基質又は生成物を破壊しないで、加水分解を促進することができる。この反応のために適切な酵素は、エステラーゼ又はリパーゼであり得、そしてそれらの性質的には、水溶性形で存在するか、又は交差カップリング又は結合により、市販の固体支持体材料に固定され得る。評価される可溶性酵素のうち、カンジダ　アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）“Ｂ”リパーゼ（Ａｌｔｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）が特に有用である。
【０１０３】
交差カップリングにより固定される酵素の例は、ＣｈｉｒｏＣＬＥＣ−ＰＣＴＭ （Ａｌｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ） である。カンジダ　アンタルクチカ“Ｂ”リパーゼ（Ａｌｔｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）は、ＮＨＳ活性化ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）との反応により固定され得る。加水分解の間、その反応混合物のｐＨは、注意して調節され、そしてＮａＨＣＯ３溶液の調節された添加を通して、５．５〜７．５、好都合には５．７〜６．５のｐＨ−開始により維持される。反応が完結される場合、生成物は、濾過された反応混合物の凍結乾燥により単離される。固定された酵素は、フィルターケーク上に存続し、そして所望により、再使用され得る。
【０１０４】
一般的なアリル又はアルキルエステル方法：
プロドラッグはまた、治療剤によりＮ−キャップオリゴペプチドのアリル−ヘミエステル又はアルキル−ヘミエステル形をカップリングし、そして接合体から遊離酸形を生成することにより調製され得る。図８は、スクシニル−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ及びドキソルビシンによるこの工程を例示する。
ドキソルビシンによるアリル−スクシニル−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕのカップリングは、オリゴペプチド接合方法のいずれか１つの方法により行われ得る。
【０１０５】
アリル−スクシニル−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ドキソルビシンはまた、ドキソルビシンへの保護されたテトラペプチド前駆体のカップリングが図５に示される前記方法に記載されるように、類似して、Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕと、既知方法（Ｃａｓｉｍｉｒなど．， Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ． ３６： ３４０９ （１９９５））を通して調製されたアリルヘミスクシネートとを反応せしめることによって合成され得る。適切な不活性溶媒は、ＴＨＦ、ジクロロメタン、酢酸エチル、トルエン、好ましくは反応が進行するにつれて、生成物酸形が沈殿するＴＨＦである。単離された酸は、前記のようにして、そのナトリウム塩に転換される。反応時間は、０〜６０℃、好ましくは１５〜３０℃の温度で、１０〜１８０分、好都合には１０〜６０分である。
【０１０６】
アリル又はアルキル基の除去は、当業界において良く知られており、そして専門文献に記録されているように、受容体分子へのアリル又はアルキル基のＰｄ（０）， 又はＮｉ（０）， 好都合にはＰｄ（０）促進された移行により行われ得る（Ｇｅｎｅｔなど．， Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ． ５０： ４９７ （１９９４）； Ｂｒｉｃｏｕｔ など．， Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ． ５４： １０７３ （１９９８）； Ｇｅｎｅｔなど．， Ｓｙｎｌｅｔｔ ６８０ （１９９３）； Ｗａｌｄｍａｎｎなど．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ７： ７４９ （１９９８）； Ｓｈａｐｈｉｒｏなど．， Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ． ３５： ５４２１ （１９９４））。触媒の量は、基質に対して０．５〜２５モル％であり得る。
【０１０７】
一般的なトリチル又は置換されたトリチル方法：
プロドラッグはまた、図７に示される方法により合成され得る。このアプローチは、Ｒ’−オリゴペプチド（ここで、Ｒ’はトリチル又は置換されたトリチルである）を利用する。治療剤によるＲ’−オリゴペプチドのカップリングは、治療剤による保護されたオリゴペプチドの接合についての前記方法のいずれか１つの方法により、０〜２０℃で３０〜１２０分間、行われ得る。
【０１０８】
トリチル又は置換されたトリチル基の除去は、正に荷電されたプロドラッグを得るために、酸性条件下で達成され得る。この正に荷電されたプロドラッグは、図４に示され、そして前述のように、Ｎ−キャップされる。トリチル保護解除は、酢酸、蟻酸及び希塩酸により達成され得る。
プロドラッグは、無水琥珀酸又は無水グルタミン酸との反応により、（スクシニル又はグルタリル）−（オリゴペプチド）−（治療剤）接合体に転換され得る。カップリング段階のための溶媒、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＣＨ３ＣＮ、ＮＭＰ、又はいずれかの他の適切な溶媒は、当業界において知られている。スクシニル又はグルタリルオリゴペプチド治療剤は、いずれかの医薬的に許容できる塩に転換され得る。
【０１０９】
一般的な逆方向固相接合方法：
本発明のプロドラッグ化合物は、“段階的様式”の逆方向（Ｎ−末端からＣ−末端の方向）方法を通して、固相化学を用いることによって合成され得る。
１つの手段は、スクシニル−ヘミエステル、例えばスクシニル−ベンジルエステル又は−アリルエステルを固定するために樹脂を使用することである。選択される樹脂の例は、“Ｗａｎｇ樹脂”（Ｗｏｎｇ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ， ９５： １３２８ （１９７３）； Ｚｈａｎｇなど．， Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ． ３７： ５４５７ （１９９６））、“Ｒｉｎｋ樹脂”（Ｒｉｎｋ， Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ． ２８： ３７８７ （１９８７））、“トリチル−、又は置換された−トリチル樹脂”（Ｃｈｅｎなど．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１６： ２６１１ （１９９４）； Ｂａｒｔｏｓなど．， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｐｒｏｃ． ２２ｎｄ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐａｓｉｕｍ （１９９２）； Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ａｎｄ Ｅｂｅｒｌｅ （Ｅｄｓ．）， Ｅｓｃｏｍ Ｌｅｉｄｅｎ． Ｐｐ． ２８１ （１９９３））である。
【０１１０】
次に、固定されたエステルが保護解除され、そして例えば、同様にＣ−末端保護されたメチオニンと反応せしめられる。次に、それらの段階が、アラニン及び最終的にロイシンエステルにより反復され、続いて、固定されたスクシニル−トリペプチドへのドキソルビシンのカップリングを行う。次に、分子が、遊離プロドラッグ、例えば、遊離Ｓｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを形成するために、軽い酸性条件を用いることによって樹脂から生成されるこの方法論は、図９のスキーム上に表される。もう１つのバージョンの相合成は、固定されたスクシニルオリゴペプチドエステルを用いる。次に、これがＣ−末端保護解除され、続いてドキソルビシン又は他の治療剤へのカップリング段階を伴ない、そして最終的に、図９のスキーム上に表されるように、樹脂から生成される。次に、プロドラッグ分子の酸形が最終的に、上記のようにして、そのナトリウム塩に転換され得る。
【０１１１】
一般的な大規模化合物合成：
プロドラッグ化合物は、（１）アルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチド−治療剤接合体を製造するために、活性化剤の存在下で、アルキル又はアリルエステル保護された安定化基、オリゴヌクレオチド及び治療剤をカップリングし、（２）前記カップリング段階の後に残存するカップリングされなかった治療剤を除去し、そして（３）安定化基−オリゴペプチド−治療剤プロドラッグ化合物を製造するために、前記アルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチド−治療剤接合体を保護解除する、本発明の単純且つ効果的な３−段階方法を用いて合成され得る。
【０１１２】
第１段階は、治療剤へのアルキル−エステル保護されたオリゴペプチドフラグメントのカップリングを包含する。第１段階の好ましい態様は、アルキル又はアリルエステル保護された安定化基オリゴペプチド治療剤接合体、例えばＭｅＯＳｕｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅ−Ｄｏｘを得るために、活性化剤、例えばＨＡＴＵを用いて、治療剤、例えばドキソルビシンによるアルキル又はアリルエステル保護された安定化基オリゴペプチド、例えばＭｅＯＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨのカップリングを包含する。この段階の焦点は、加水分解段階が純度に対して有意な影響を有さないことが見出されているので、メチルエステルの純度及びその収率に対してである。好ましくは、アルキル又はアリルエステル保護された安定化基オリゴペプチド：治療剤のモル比は、２：１〜１：１の間であろう。より好ましくは、モル比は１．７５：１〜１．５：１である。最も好ましくは、モル比は１．６６：１である。
【０１１３】
アルキル又はアリルエステル保護された安定化基オリゴペプチド及び治療剤のカップリングは、（ａ）ＤＭＦにおいてアルキル又はアリルエステル保護された安定化基、オリゴペプチド及び治療剤を組合し、（ｂ）ＤＩＥＡを添加し、（ｃ）接合体を形成するために活性剤の存在下で、アルキル又はアリルエステル保護された安定化基、オリゴペプチド及び治療剤を反応せしめ、そして（ｄ）沈殿物を形成するために、ブライン溶液を添加することによって前記接合体を沈殿することによって行われる。好ましくは、ＥＩＥＡ及びアルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチドのモル比は、３：１〜１．５：１である。より好ましくは、モル比は、２．５：１〜２：１である。
【０１１４】
最も好ましくは、モル比は２．１８：１である。反応段階は好ましくは、０℃で３０分間、行われる。好ましくは、活性化剤及びアルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチドのモル比は、１．５：１〜１：１である。より好ましくは、モル比は１．１：１である。前記ブライン溶液は、このましくは、水中、２０％（ｗ／ｖ）〜４０％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌである。より好ましくは、前記ブライン溶液は、好ましくは、水中、２５％（ｗ／ｖ）〜３５％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌである。最も好ましくは、前記ブライン溶液は、水中、３０％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌである。接合体は好ましくは、ブライン溶液において沈殿され、ここでｐＨは、５．０〜７．０である。最も好ましくは、接合体は、５．８〜６．０のｐＨで沈殿される。
【０１１５】
多くの治療剤は毒性物質であるので、カップリングされた生成物からいずれかの遊離治療剤を排除することが好ましい。除去段階は好ましくは、（ａ）ＤＭＦに前記接合体を溶解し、（ｂ）無水ＤＭＦにスキャベンジャー樹脂を溶解し、（ｃ）接合体−樹脂混合物を形成するために、前記スキャベンジャ−樹脂に、前記カップリング段階で形成される、アルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチド−治療剤接合体を添加し、（ｄ）前記混合物を、０℃〜３０℃で２〜２４時間、維持し、ここでカップリングされていない治療剤が前記樹脂と反応し、（ｅ）前記混合物から樹脂を除去し、そして（ｆ）アルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチド−治療剤接合体の沈殿物を形成するために、ブライン溶液を添加することによって前記残存物を沈殿せしめることによって行われる。
【０１１６】
好ましくは、スキャベンジャー樹脂は、ポリスチレン−イソシアネート（ＰＳ−イソシアネート）、ＰＳ−メチルイソシアネート、ＰＳ−チオイソシアネート、ＰＳ−メチルチオイソシアネート、ＰＳ−塩化スルホニル、ＰＳ塩化メチルスルホニル又はＰＳ−ベンズアルデヒドである。最も好ましくは、スキャベンジャー樹脂は、ＰＳ−イソシアネートである。除去段階は好ましくは、アントラサイクリンである遊離治療剤を除去するために行われる。
【０１１７】
第３段階は、好ましくは、少なくとも９０％の最終純度を伴なって良好な収率でプロドラッグ化合物を直接的に付与する、酵素による加水分解を通して、より好ましくはエステラーゼによる加水分解を通して、アルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチド−治療剤接合体を保護解除する。例えば、第３段階は、高い純度を伴なって定量的収率でＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘのナトリウム塩を直接的に付与する、酵素、例えばＣＬＥＣ ＣＡＢ（架橋されたカンジダ　アンタルチカＢリポ−ゼ）による、ＭｅＯＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘにおけるメチルエステル基の加水分解であり得る。
【０１１８】
酵素は好ましくは、固体支持体上に架橋されるか又は固定される。エステラーゼは、ブタ肝臓エステラーゼ、カンジダ　アンタルチカＢリパーゼ、カンジダ　ルゴサリパーゼ、シュードモナス　セパシアリパーゼ、セファロース上に固定されたブタ肝臓エステラーゼ、セファロース上に固定されたカンジダ　アンタルチカＢリパーゼ、ＣＬＥＣ−ＰＣＴＭ （シュードモナス セパシアリパーゼ）、ＣＬＥＣ−ＣＡＢ（カンジダ　アンタルチカＢリパーゼ）又はＣＬＥＣ−ＣＲ（カンジダ　ルゴサリパーゼ）であり得る。
【０１１９】
酵素による加水分解を通しての保護解除は、（ａ）遊離酵素を除去するために前記酵素を洗浄し、（ｂ）前記洗浄された酵素を、アルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチド−治療剤接合体に添加し、（ｃ）前記安定化基−オリゴペプチド−治療剤プロドラッグ化合物を創造するために、前記酵素と前記接合体とを、１５℃〜４０℃で、５．０〜８．０のｐＨで、少なくとも１８時間、反応せしめ、そして（ｄ）前記プロドラッグ化合物から前記酵素を分離することにより行われる。最も好ましくは、追加の洗浄される、架橋されるか又は固定された酵素が、プロドラッグ化合物から酵素を分解する前、酵素と接合体とを反応せしめる段階の後に添加される。
【０１２０】
遊離治療剤の除去：
接合されていない治療剤は、プロドラッグの製造段階の後期に存在することができる。例えば、治療剤としてドキソルビシンを用いての（安定化基）−（オリゴペプチド）接合体のカップリング段階の間、多くの場合、反応は完全には進行しなかったことが見出された。カップリングされた生成物に残存する約２〜４％の残留ドキソルビシンが存在した。酸洗浄により生成物からドキソルビシンを完全に除去するために初期試みは、完全な除去をもたらさなかった。遊離治療剤の完全な除去は、スキャベンジング樹脂又はビーズを用いる、例２９及び図１７に概略される工程によりもたらされた。
【０１２１】
中間体及び残留ドキソルビシンを含む粗生成物がＤＭＦに溶解され、そしてポリスチレンメチルイソシアネート又はポリスチレンスルホニルクロライド樹脂又はビーズが添加された。反応は６０分間、撹拌された。ドキソルビシンの遊離アミノ基が、ウレア又はスルホンアミド誘導体を形成するために、ビーズ上のイソシアネート又はスルホニルクロライド基と反応する。次に、固体ビーズに結合されるドキソルビシンを有するそれらのビーズが、濾過により、所望の生成物から分離された。所望する生成物は、ＤＭＦ溶液に残存する。このアプローチは、生成物から残留治療剤を除去するための非常に穏かで且つ効果的な方法であると思われる。
【０１２２】
従って、本発明は、
（１）式 Ｆｍｏｃ−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表す］で表されるＦｍｏｃ−保護されたオリゴペプチドを選択し、
（２）Ｆｍｏｃ−保護されたオリゴペプチド−治療剤接合体を形成するために、治療剤の存在下で活性化剤によりＦｍｏｃ−保護されたオリゴペプチドを活性化することによって、治療剤に前記Ｆｍｏｃ−保護されたオリゴペプチドをカップリングし、
（３）オリゴペプチド−治療剤接合体を形成するために、前記Ｆｍｏｃ−保護されたオリゴペプチド−治療剤接合体を、それと塩基とを接触することによって保護解除し、そして
（４）化合物を形成するために、安定化基に前記オリゴペプチド−治療剤接合体をカップリングすることを含んで成る、化合物の製造方法を包含する。
【０１２３】
他方では、化合物の製造方法は、次の段階：
（１）式 ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチドを選択し、
（２）アルキルエステル−保護された安定化基−オリゴペプチド接合体を形成するために、前記オリゴペプチドをアルキルエステル−保護された安定化基にカップリングし、
（３）アルキルエステル−保護された安定化基−オリゴペプチド−治療剤接合体を形成するために、アルキルエステル−保護された安定化基−オリゴペプチド接合体を、治療剤の存在下で活性剤により活性化することによって、治療剤にアルキルエステル−保護された安定化基−オリゴペプチド接合体をカップリングし、そして
（４）化合物を形成するために、前記アルキルエステル−保護された安定化基−オリゴペプチド治療剤接合体を保護解除する段階を含んで成る。
【０１２４】
本発明の化合物はまた、次の段階：
（１）式 ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチドを選択し、
（２）アリルエステル−保護された安定化基−オリゴペプチド接合体を形成するために、前記オリゴペプチドをアリルエステル−保護された安定化基にカップリングし、
（３）アリルエステル−保護された安定化基−オリゴペプチド−治療剤接合体を形成するために、アリルエステル−保護された安定化基−オリゴペプチド接合体を、治療剤の存在下で活性剤により活性化することによって、治療剤にアリルルエステル−保護された安定化基−オリゴペプチド接合体をカップリングし、そして
（４）化合物を形成するために、前記アリルエステル−保護された安定化基−オリゴペプチド治療剤接合体を保護解除する段階により製造される。
【０１２５】
本発明の化合物のさらにもう１つの製造方法は、次の段階：
（１）式 トリチル−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表す］で表されるトリチル−保護されたオリゴペプチドを選択し、
（２）トリチル−保護されたオリゴペプチド−治療剤接合体を形成するために、治療剤の存在下で活性化剤によりトリチル−保護されたオリゴペプチドを活性化することによって、治療剤に前記トリチル−保護されたオリゴペプチドをカップリングし、
（３）オリゴペプチド−治療剤接合体を形成するために、前記トリチル−保護されたオリゴペプチド−治療剤接合体を、酸性条件下で保護解除し、そして
（４）化合物を形成するために、安定化基に前記オリゴペプチド−治療剤接合体をカップリングすることを含んで成る。
【０１２６】
それらの方法のいずれかに関するもう１つの可能な段階は、スキャベンジング樹脂又はビーズの使用により、カップリングされていない治療剤を除去することである。さらに、化合物は、所望により、医薬的に許容できる塩により中和され得る。
【０１２７】
特定の化合物：
本発明の化合物は、プロドラッグ、すなわちＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｇｌ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｄｎｒ， Ｓｕｃ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ，　Ｓｕｃ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｄｎｒ， Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘ， Ｐｙｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ， Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ， Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ， Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ， Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ， Ｓｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ， Ｓｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｄｎｒ， Ｓｕｃ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｄｎｒ， Ｓｕｃ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ， Ｓｕｃ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｄｎｒ， 又はＳｕｃ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒを包含する。
【０１２８】
さらに、本発明のプロドラッグの調製方法において主要な次の中間化合物は本発明の一部である：
トリチル−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ
ジフェニルメチル−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ
ベンジルオキシカルボニル−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−ＯＢｎ
Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＢｎ
メチル−スクシニル−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＢｎ
メチル−スクシニル−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ
【０１２９】
Ｆｍｏｃ− Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ
Ｆｍｏｃ− Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ
Ｇ１− Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ
Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘラクテート
アリル−スクシニル−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ
Ｓｕｃ− Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ
Ｓｕｃ− Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕのメチルエステル
Ｆｍｏｃ− Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ
メチル−スクシニル−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、及び
アリル−ヘミスクシネート。
【０１３０】
実施例
例１．トロウアーゼ及びヒト血液による可能性あるプロドラッグのスクリーニング
改良された治療指数を有するプロドラッグのための良好な候補体を、完全なヒト血液において比較的安定性である癌細胞により活性化する。３種の異なった癌調製物を用いて、種々の試験化合物をスクリーンした。それらの３種の調製物は次の通りであった：
（ａ）ＭＣＦ７／６（乳癌）細胞ホモジネート；
（ｂ）ＭＣＦ７／６（乳癌）ならし培地；及び
（ｃ）ＨｅＬａ（頸部癌）細胞抽出物アニオン交換画分プール。
【０１３１】
単一の及び／又はジ−アミノ酸毒素接合体（すなわち、ＡＡ１−治療剤及び／又はＡＡ２−ＡＡ１−治療剤）に加水分解される化合物をさらに、完全なヒト血液において安定性について試験した。完全な血液を、市販の酸緩衝されたクエン酸完全血液収集管（Ｄｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて集めた。
【０１３２】
（ａ）ＭＣＦ７／６細胞ホモジュネートの調製：
ＭＣＦ７／６細胞を、ＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）、５０ｍｇ／ｌのウシ血清アルブミン、ＩＴＳ−Ｘ（１０ｍｇ／ｌのインスリン、５．５ｍｇ／ｌのトランスフェリン、６．７μｇ／ｌの亜セレン酸ナトリウム、２ｍｇ／ｌのエタノールアミン）、及び脂質濃縮物（Ｇｉｂｃｏ＃２１９００−０３０）を含む血清フリー培地において集密性まで増殖した。１００ｍｌの細胞を、４℃で１０，０００×ｇで２０分間、遠心分離し、そして上清液をデカントすることによって収穫した。ペレットを、２ｍｌのリン酸緩衝溶液（Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁し、そして１８，０００×ｇで１０分間、遠心分離した。上清液をデカントした後、細胞（約３００μｌの湿潤物）を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）（ナトリウム塩）１０ｍｌにおいて粉砕することによって均質化した。そのホモジュネートを、４℃で１８，０００×ｇで５分間、遠心分離し、そして上清液をアリコートし、そして化合物のスクリーニングへの続く使用のために−２０℃以下で貯蔵した。
【０１３３】
（ｂ）ＭＣＦ７／６ならし培地の調製：
ＭＣＦ７／６細胞を、１０％ウシ胎児血清、０．０５％（ｗ／ｖ）のＬ−グルタミン、２５０ＩＵ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）において集密性まで増殖した。次に、細胞を、リン酸緩衝溶液により２度、洗浄し、そしてＭＤＥＭ／Ｆ１２（１：１）、０．０２％のＢＳＡ、ＩＴＳ−Ｘ（１０ｍｇ／ｌのインスリン、５．５ｍｇ／ｌのトランスフェリン、６．７μｇ／ｌの亜セレン酸ナトリウム、２ｍｇ／ｌのエタノールアミン）において、５％のＣＯ２下で、３７℃で２４時間インキュベートした。次に前記ならし培地をデカントし、そしてＹＭ１０（１０，０００ＭＷのカットオフ）限外濾過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を備えた、撹拌された細胞装置を用いて、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）により１度、交換し、そして２０倍に濃縮した。この溶液を、化合物のスクリーニングへの使用のために、−２０℃で、アリコートで貯蔵した。
【０１３４】
（ｃ）ＨｅＬａ細胞アニオン交換画分プールの調製：
商業的に生成された３０×１０１０個のＨｅＬａ細胞（ヒト頚部癌、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｓｅｎｅｆｆｅ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）を、１０８ｍｌのリシン水溶液において、音波処理機及びＤｏｕｎｃｅホオジナイザーにより均質化した。そのリシン溶液は、０．０２％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．０４％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム、及びプロテアーゼのインヒビターのカクテル（２つの錠剤／５０ｍｌのＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ， ＥＤＴＡ−フリーの錠剤、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含んだ。細胞ホモジネートを、５０００×ｇで４℃で３０分間、遠心分離し、そしてペレットを、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを用いて、第２の１０８ｍｌのリシン溶液において均質化し、そして前記のように遠心分離した。上清液を組合し、そして１４５，０００×ｇで４℃で９０分間、遠心分離した。
【０１３５】
その超遠心分離上清液の一部を、０．０１％（ｗ／ｖ）のＸ−１００及び０．０２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含む、２０ｍＭのトリエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）緩衝液（平衡化緩衝液）により２倍に希釈した。約１８０ｍｇのタンパク質に対応する前記の得られる溶液３０ｍｌを、２．６×９．４ｃｍのＳｏｕｒｃｅＴＭ １５Ｑ （Ａｍｅｒｓｈｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） 低圧アニオン交換クロマトグラフィーカラム上に４℃で負荷した（１ｍｌ／分）。次に、カラムを２５０ｍｌの平衡化緩衝液により、１ｍｌ／分の流速で洗浄した。タンパク質を、ＮａＣｌ線状濃度グラジエント（平衡化緩衝液において０〜０．５Ｍ；グラジエントの合計体積は１０００ｍｌであった）において、３ｍｌ／分の流速で溶出した。
【０１３６】
２分の画分を集め、そして基質としてβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを用いて、酵素活性決定に使用した。Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘへのその転位を、アントラサイクリン成分の蛍光検出を用いて、逆相高性能クロマトグラフィーにより定量化した。最高の活性レベルを含む画分をプールし（画分＃４３〜４６；約０．１３ＭのＮａＣｌ）、プロテアーゼインヒビター（ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ， ＥＤＴＡ−フリー錠剤、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を補充し、そして−８０℃でアリコートとして貯蔵した。
【０１３７】
（ｄ）分解アッセイ：
試験化合物を、癌酵素の３種の異なった調製物及びクエン酸ナトリウム上に集められた完全なヒト血液と共に、ｐＨ７．２の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＣｏＣｌ２又は１００ｍＭのＭｎＣｌ２において、１２．５μｇ／ｍｌの濃度で３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、３体積のアセトニトリルを添加し、反応を停止し、そして混合物からタンパク質を除去した。サンプルを、１８，０００ｇで５分間、遠心分離し、そして上清液１００μｌを、ＨＰＬＣによる分析の前、３００μｌの水と共に混合した。ＨＰＬＣ分析のために、５０μｌのサンプルを、４．６×５０ｍｍの２μＴＳＫ Ｓｕｐｅｒ−ＯＤＳクロマトグラフィーカラム上に４０℃で注入し、そして２０ｍＭの水性酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．５）中、２６％〜６８％のアセトニトリルの３分の線状グラジエントにより２ｍｌ／分で溶出した。検出は、２３５ｎｍの励起波長及び５６０ｎｍの発光波長を用いての蛍光によった。
【０１３８】
所定の条件下でトロウアーゼにより分解され、そして血液において安定する試験化合物が表２に示されている。少数の例外を伴なって、癌酵素分解についての結果は、Ｈｅｌａ細胞、ＭＦＣ ７／６細胞均質物及びＭＣＦ ７／６ならし培地からの部分的に精製された画分についてと同じであった。
【０１３９】
【表２】
2004501875.tif 000003
【０１４０】
例２．好ましい分解速度を有するトリペプチド薬物の同定
試験化合物を、例１（Ｃ）において調製されるようにして、ＨｅＬａ細胞アニオン交換画分（Ｆ１）と共に、１２．５μｇ／ｍｌの濃度で、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、３体積のアセトニトリルを添加し、反応を停止し、そして混合物からタンパク質を除去した。サンプルを、１８，０００ｇで５分間、遠心分離し、そして上清液１００μｌを、ＨＰＬＣによる分析の前、３００μｌの水と共に混合した。ＨＰＬＣ分析のために、５０μｌのサンプルを、４．６×５０ｍｍの２μＴＳＫ Ｓｕｐｅｒ−ＯＤＳクロマトグラフィーカラム上に４０℃で注入し、そして２０ｍＭの水性酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．５）中、２６％〜６８％のアセトニトリルの３分の線状グラジエントにより２ｍｌ／分で溶出した。検出は、２３５ｎｍの励起波長及び５６０ｎｍの発光波長を用いての蛍光によった。
【０１４１】
個々の試験化合物の分解の量を、同じ条件下でＦ１により分解された標準のＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−治療剤接合体の量と比較した。その標準における治療剤（Ｄｏｘ又はＤｎｒ）は、試験化合物において同じであった。表３は、いくつかのトリペプチドプロドラッグの相対的分解速度を提供する。
【０１４２】
【表３】
2004501875.tif 000004
【０１４３】
例３．ＬＮＣａＰ、ＨＴ−２９及びＰＣ−３細胞に対する腫瘍活性化されたプロドラッグ活性
粘着細胞、ＬＮＣａＰ（前立腺癌）、ＨＴ−２９（結腸癌）及びＰＣ−３（前立腺癌）を、１０％の熱不活性化されたウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ培地において培養した。研究の日、細胞を、トリプシン溶液によりプレートから分離した。集められた細胞を洗浄し、そして１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭにおいて、０．２５×１０６個の細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレートに添加し、そしてプレートを３時間インキュベートし、細胞の付着を可能にした。このインキュベーションに続いて、ドキソルビシン又は試験化合物の一連の希釈溶液（３倍の増加）を製造し、そして１００μｌの化合物をウェル当たり添加した。
【０１４４】
次に、プレートを２４時間インキュベートし、１０μｌの１００μＣｉ／ｍｌの３Ｈ−チミジンによりパルスし、そしてさらに２４時間インキュベートした（４８時間の合計インキュベーション時間）。プレートを、９６ウェルＨａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて収穫し、そしてＰａｃｋａｒｄ Ｔｏｐ Ｃｏｕｎｔ Ｃｏｕｎｔｅｒ上で計数した。４パラメーターのロジスティック曲線を、ＩＣ５０値を決定するために、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、薬剤モル濃度の関数として、３Ｈ−チミジン組み込みに適合せしめた。
【０１４５】
【表４】
2004501875.tif 000005
【０１４６】
前立腺癌細胞、ＬＮＣａＰ及びＰＣ−３細胞又は結腸癌細胞ＨＴ−２９を、上昇する濃度の示される化合物と共に４８時間インキュベートし、そして細胞増殖を３Ｈ−チミジンアッセイを用いて測定した。正の対照であるドキソルビシンのＩＣ５０は、使用される細胞系において０．０２〜０．０８μＭであった。そのデータは、複数の細胞系、例えばＰＣ−３及びＨＴ２９が上記に示されるプロドラッグを分解しないことを示す。対照的に、ＬＮＣａＰ細胞に存在する酵素は、いくつかのトリペプチドプロドラッグを分解する。最も可能性ある類似体は、ＬＮＣａＰ細胞に対して約１μＭのＩＣ５０を有する、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘにより例示される。
【０１４７】
例４．Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘはドキソルビシンよりもインビボでより良好に許容される
単一用量最大許容用量（ＭＴＤ）研究においては、５匹の健康な若い雌マウスのグループに、それぞれ０， １４， ２８， ４２， ５６及び７０ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンに相等する、０， ２３， ４７， ７０， ９３及び１１７ｍｇ／ｋｇのＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを静脈内投与した。Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは非常に良好に許容され、そして２８日の研究にわたって死亡は観察されず、そしてわずかな体重の低下が高い用量グループにおいて初期で観察されたが、続いて回復した。従って、プロドラッグは、約４〜８ｍｇ／ｋｇの等用量のドキソルビシンの安全な投与を可能にした。Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの単一用量ＭＴＤはこの実験においては達成されず、そして従って、１１７ｍｇ／ｋｇよりも高い。
【０１４８】
しかしながら、化合物の後−分析は、それらが、水含有及び不純性のために、約４７％の活性化合物を含むことを示した。その結果、上記に言及される用量は、投与される化合物の量を過大評価した。データの再計算は、プロドラッグが、約１６ｍｇ／ｋｇのＭＴＤを有するドキソルビシンのみにより可能にされるよりも、約３．３倍高い、７０ｍｇ／ｋｇの等用量のドキソルビシンの安全な投与を可能にすることを示した。
【０１４９】
上記実験を反復し、そして次の結果を得た。Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの１用量ＭＴＤを、約５９ｍｇ／ｋｇ（３５ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンに等しい）であることが決定され、それはドキソルビシンのみ（１６ｍｇ／ｋｇ）よりも少なくとも１．２倍高い。より適切な比較は、ＳＤは効果的でないので、反復用量（ＲＤ）のＭＴＤである。Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの反復用量ＭＴＤは、約５２ｍｇ／ｋｇのＱ７Ｄｘ５であった（例１２における効能研究に基づいて、３１ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンに等しく、これはドキソルビシンの（４ｍｇ／ｋｇ）の反復用量ＭＴＤよりも６．８倍高かった）。
【０１５０】
例５．Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘはドキソルビシンよりもインビボで良好に許容される
本発明の典型的なトリペプチドプロドラッグＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、マウスにおいて良好に許容される。第２の単一用量の最大許容用量（ＳＤ−ＭＴＤ）研究においては、５匹の正常ＩＣＲマウスのグループが、ボーラス用量のＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを静脈内投与された。マウスを毎日、４９日間、観察し、そして体重を週２度、測定した。試験される用量レベルは、それぞれ、０， ２８， ３５， ４２， ５６， ７０， ８４又は９８ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンに等しい、０， ４７， ５９， ７１， ９４， １１７， １４０又は１６４ｍｇ／ｋｇであった。２４時間以内に急性毒素は存在しなかった。毒性の用量及び時間依存性徴候が、この研究の間、観察された。
【０１５１】
毒性、例えば部分的な後脚の麻痺及び有意な体重の低下（それらの初期体重の２０％以上）が、９４及びそれよりも高いの用量グループにおいて観察された。４９日での生存率及び毒性の徴候の欠失に基づいて、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘについてのＳＤ−ＭＴＤは、７１ｍｇ／ｋｇ（４２ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンに相当する）であることが決定された。従って、ＳＤ−ＭＴＤは、ドキソルビシンのみについてのＳＤ−ＭＴＤ（１６ｍｇ／ｋｇ）よりも、モル濃度に基づいて約２．６倍、高かった。表５を参照のこと。これは、試験される範囲にわたって７又は１４ｍｇ／ｋｇのドキソルビシン等量の増分での用量の範囲に基づいてのおおよそのＳＤ−ＭＴＤ決定である。
【０１５２】
【表５】
2004501875.tif 000006
【０１５３】
例６．Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘはドキソルビシンよりもインビボで良好に許容される
第２の単一用量の最大許容用量（ＳＤ−ＭＴＤ）研究においては、５匹の正常ＩＣＲマウスのグループが、ボーラス用量のＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘを静脈内投与された。マウスを毎日、４９日間、観察し、そして体重を週２度、測定した。試験される用量レベルは、それぞれ、０， ５６， ７０， ８４， ９８， １１２， １２６又は１４１ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンに等しい、０， ８８， １１０， １３２， １５４， １７６， １９８又は２２０ｍｇ／ｋｇであった。いずれの用量レベルにおいても、２４時間以内に急性毒素は存在しなかった。
【０１５４】
Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘ は非常に許容され、そしていずれの用量レベルにおいても、４９日にわたって、死亡性、罹病性又は有意な体重の低下は観察されなかった。Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＤｏｘのＳＤ−ＭＴＤはこの実験においては達成されず、そして従って、少なくとも試験される最高の用量である。４９日での生存率及び毒性の徴候の欠失に基づいて、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＤｏｘについてのＳＤ−ＭＴＤは、２２０ｍｇ／ｋｇ（１４１ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンに相当する）であり、これは、ドキソルビシンのみについてのＳＤ−ＭＴＤ（１６ｍｇ／ｋｇ）よりも、モル濃度に基づいて約８．８倍、高かった。表６を参照のこと。
【０１５５】
【表６】
2004501875.tif 000007
【０１５６】
例７．Ｓｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘはドキソルビシンよりもインビボで良好に許容される
単一用量最大許容用量（ＭＴＤ）研究においては、５匹の健康な若い雌マウスのグループに、それぞれ１４， ２８， ４２， ５６及び７０ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンに相等する、２４， ４８， ７１， ９６及び１２０ｍｇ／ｋｇのＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを静脈内投与した。Ｓｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの投与に続いて、急性毒性の兆候は観察されなっかたが、２種の最高用量のグループにおけるいくつかの動物が、投与の後２５日ぐらいで有意な体重の低下及び罹病性を受けた。
【０１５７】
低い用量グループのグループ平均体重は、ビークル処理された対照グループとは有意に異ならなかった。毒性（麻酔及び罹病性）の徴候は、ドキソルビシンの典型であった。２８日で生存する単一用量ＭＴＤ値は、約７１ｍｇ／ｋｇ（約４０ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンに相当する）で確立された。Ｓｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの単一用量ＭＴＤは、ドキソルビシンのみで可能にされるよりも、約１．５倍高いドキソルビシンの用量を提供する。
【０１５８】
例８．Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びその代謝物は急速にクリアランスされる
プロドラッグ化合物の代謝及びクリアランスを、１１７ｍｇ／ｋｇで１回の静脈内用量のＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを与えられた健康な若い雌マウスにおいて研究した。血漿サンプルを１及び４時間で得た。１００μｌの血漿サンプルを、マイクロ遠心分離管（１．５ｍｌ）に移し、そしてダウノルビシンの内部標準（０．５ｍｇ／ｍｌでの２０μｌ）を、アセトニトリル（４００μｌ）と共に添加した。管をキャップし、そして短時間かきまぜ、続いて１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。個々の管から４２０μｌを除き、そして真空乾燥した。個々のサンプルを、タンデム質量分光測定と組合しての逆相液体クロマトグラフィー（ＬＣ ＭＳ／ＭＳ）による分析の前、アセトニトリル（２０％）を含む、２０ｍＭの水性蟻酸アンモニウム（ＡＭ）（ｐＨ４．５）６５μｌにおいて再構成した。
【０１５９】
尿を、投与後２及び２４時間で、代謝ケージにおける１対のマウスから集めた。尿サンプルを、アセトニトリル（２０％）を含むＡＦ緩衝液により希釈し、ＬＣ ＭＳ／ＭＳアッセイの実際範囲内での標的分析物濃度を得た。３０μｌの個々の希釈されたサンプルを、マイクロ遠心分離管（１．５ｍｌ）に入れ、そして内部標準のダウノルビシン（０．５ｍｇ／ｍｌで２０μｌ）を、アセトニトリル（２０％）を含むＡＦ緩衝液５０μｌと一緒に添加した。次に個々のサンプルを、ＬＣ ＭＳ／ＭＳにより分析した。
【０１６０】
ＤＡＤ検出器及びＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰ１１００ＨＰＬＣを、エレクトロスプレーイオン源を備えたＰＥ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ３６５質量分光計に連結した。ＨＰＬＣを、ＨＡＩＧＵＡＲＤ Ｃ１８ガードディスク（Ｈｉｇｇｉｎｓ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）及びステンレス鋼フリット（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えた、ＴＳＫ−Ｇｅｌ Ｓｕｐｅｒ ＯＤＳ， ２ｍｍ， ４．６×５０ｍｍ（Ｔｏｓｏｈａａｓ）逆相カラム上で行った。クロマトグラフィー処理は、室温で行われた。流速は０．５ｍｌ／分であった。注入体積は５０μｌであった。グラジエント溶離を、上昇する量のアセトニトリルを含むＡＦ緩衝液の移動相を用いて行った。ＡＰＩ３６を、特定の分析物％−娘イオン対をモニターするために設定された複反応モニターモードで、３６５℃で操作した。クロマトグラムの積算を、ＭａｃＱｕａｎソフトウェア（ＰＥ Ｓｃｉｅｘ）、及び前に得られた検量線への比較により得られた個々の分析物の定量化により行った。ダウノルビシンは、すべての場合、内部標準として使用された。
【０１６１】
親化合物Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、循環から非常にすばやくクリアランスされた。投与の後、１．４９％（１時間）及び０．０１％以下（４時間）のその投与された用量が血漿において検出され得た（図１０）。２及び２４時間で、尿はそれぞれ、９．３１及び２．１１％の投与された用量を含んだ（図１１）。低レベルの重要ペプチド代謝物、すなわちＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、並びにＤｏｘが血漿において検出され得た。Ｌｅｕ−Ｄｏｘは特に、尿に検出され、そして他の代謝部部に関しては、１及び４時間での血漿におけるよりも、２及び２４時間でが高かった。遊離ドキソルビシンは、いずれの時点でも、血液又は尿においてほとんど存在しなかった。
【０１６２】
【表７】
2004501875.tif 000008
【０１６３】
水において検出されるプロドラッグ及びその代謝物のレベルは、腎臓が排泄の主要器官であることを示す。対照的に、ドキソルビシンは、肝−胆管を通して主にクリアランスされることが知られている。Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘのクリアランス及び代謝プロフィールは、正常なマウスの循環又は組織に非常に少量のプロドラッグの分解及び活性化が存在することを示唆する。プロドラッグ及び代謝物は尿において急速に出現し、そしてＬｅｕ−Ｄｏｘは尿及び血漿に検出される主要代謝物種である。
【０１６４】
正常な動物においては、不活性Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及び代謝物形のクリアランスは、毒性ドキソルビシンへの分解よりも卓越しているように思える。クリアランス／代謝の結果は、毒性研究において観察される良好な安全性プロフィールと一致する。なぜならば、たぶん、正常なマウスにおいては、プロドラッグ、及び低レベルの形成される代謝物は循環から急速にクリアランスされ、そして尿を通して排泄されるからである。従って、正常な組織に対して毒性である遊離ドキソルビシンを開放するプロドラッグは、循環においてほとんど存続しない。
【０１６５】
例９．Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びその代謝物は急速にクリアランスされる
プロドラッグ化合物の代謝及びクリアランスを、１２０ｍｇ／ｋｇで１回の静脈内用量のＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを投与された健康な若い雌マウスにおいて研究した。血漿サンプルを、１又は４時間で得、そして尿を、投与後、２及び２４時間で集めた。プロドラッグ及び代謝物のレベルを、ドキソルビシンのＵＶ検出を伴なって、ＬＣ−ＭＳにより測定した。
【０１６６】
Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを非常に低いレベルで血漿において検出し、そしてそれそれ、投与された用量のわずか約０．１％及び０．００１％が検出された（図１２）。２及び２４時間で、尿は、プロドラッグの投与された用量の６．６％及び１．４％を含んだ（図１３）。低レベルの主用ペプチド代謝物、すなわちＡｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びＬｅｕ−Ｄｏｘ並びにＤｏｘが血漿いおいて検出され得た。血漿においては、Ｌｅｕ−Ｄｏｘレベルには、１及び４時間で、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘよりも約１０倍高く、そして２時間まで、尿に有意に蓄積した。それらの結果は、メチオニン含有プロドラッグの有意な分解が存在したことを示唆する。遊離ドキソルビシンは血漿にはほとんど存在せず、そして尿レベルは２及び２４時間で、より高く、このことは、血漿からのプロドラッグの急速な消出が活性代謝物、すなわちドキソルビシンへの分解のためで一部あり得ることを示唆する。
【０１６７】
【表８】
2004501875.tif 000009
【０１６８】
尿に検出されるプロドラッグ及びその代謝物のレベルは、腎臓が排泄の主要器官であることを示す。対照的に、ドキソルビシンは、肝−胆管を通して主にクリアランスされることが知られている。Ｓｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘのクリアランス及び代謝研究は、血漿に対しての高い尿代謝物に基づいて、正常なマウスにおいて、たぶん腎臓においてプロドラッグの相当の全身性又は組織分解及び活性化が存在したことを示唆する。Ｌｅｕ−Ｄｏｘは細胞により摂取され、そして活性毒性ドキソルビシン化合物に分解されることが知られているので、有意なレベルのＬｅｕ−Ｄｏｘ及びドキソルビシンは、Ｓｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの十分に許容される安全性プロフィールと一致する。正常なマウスにおける血漿及び尿におけるドキソルビシンの定常レベルはまた、この化合物の遅い運動学と一致する。
【０１６９】
例１０．マウスにおける比較代謝
４つのグループのＩＣＲ正常雌マウスに、約１００μモル／ｋｇのＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの１回のＩＶボーラス用量を投与し、そしてＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ 、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘ 又は１０μモル／ｋｇのドキソルビシン（Ｄｏｘ）に比較した。血漿を、５分、１，２，４又は６時間で、個々のグループにおける３匹の個々の動物から得た。親、ジペプチジル−ドキソルビシン（ＡＬ−Ｄｏｘ）、α−アミノ−ドキソルビシン（Ｌ−Ｄｏｘ）及びドキソルビシン濃度を、蛍光検出（λｅｘ＝４８０ｎｍ，λｅｍ＝５６０）を用いて、逆相グラジエントＨＰＬＣにより、血漿サンプルの抽出物において分析した。標準が入手できなかったので、Ｇ−Ｄｏｘの場合のピーク保持時間は確かめられなかった。量を、マウスの血漿における１０〜２０００ｎｇ／ｍｌのドキソルビシン溶液の測定値に対する線状標準曲線適合性を用いて決定した。
【０１７０】
濃度時間経過は、代謝パターンが、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘを除いて、他のすべての化合物に関して類似した。特に、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘを除いて、Ｌ−Ｄｏｘが最初の２時間、主要代謝物であり、そしてジペプチジル−接合体ＡＬ−Ｄｏｘが、Ｌ−Ｄｏｘとほぼ同じ時間で形成されるよりマイナーな生成物であった。ドキソルビシンは、後で出現し、そしてその血漿濃度は、現在及び前に測定されたドキソルビシン薬物動力学プロフィールから（Ｔａｂｒｉｚｉ−Ｆａｒｄなど．， “Ｅｖａｌｕａｔｕｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ Ｐｒｏｄｒｕｇ ｉｎ Ｆｅｍａｌｅ ＩＣＲ （ＣＤ１（商標）） Ｍｉｃｅ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ”， Ｐｒｏｃ． Ａｍｅｒ． Ａｓｓｏｃ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４２： ２３４ （２００１））及びドキソルビシン対照グループにより予測されるような他の代謝物よりも、時間にわたってよりゆっくり低下する。
【０１７１】
観察される分解パターンは、Ｐ２−Ｐ１間で、又はＰ１及びＰ１’アミノ酸間で作用するエンドペプチダーゼによるトリペプチドプロドラッグの初期活性化である。ドキソルビシンは、プロドラッグの保護されていないペプチド−ドキソルビシン代謝中間体のエキソペプチダーゼ分解の後、上昇する。血漿濃度時間曲線下の面積は、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘを投与される場合、ＣＤ１０により分解されることが予測されない唯一のペプチジル−接合体が、２種の分解できるトリペプチジル−ドキソルビシン化合物又はＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘよりも正常動物において相当に（１０倍）低い全身性ドキソルビシン暴露をもたらしたことを示す。ＴＯＰ分解性トリペプチド（Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ）は、等モル用量のテトラペプチド（Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ）により観察される暴露に比較して、約半分のドキソルビシン暴露（ＡＵＣ）を生成した。
【０１７２】
それらの化合物の投与の後、相対的ドキソルビシン暴露（表９）は、マウス安全性研究において最大の許容される用量として発現される相対的安全性と一致し、そしてＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘは、３倍までのモル当用量を試験する場合、有意に低い毒性であったことが注目されるべきである。Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びドキソルビシンよりも良好に許容された。従って、トリペプチドプロドラッグは、１０倍高のモル等用量の投与に続いて、血漿分解の後、ドキソルビシンの全射性暴露からマウスを有意に保護する。トリペプチド、特にＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙは、低い全身性暴露をもたらした。従って、トリペプチド、特にＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙは、所望しない全身毒性からのより一層の保護を導く。
【０１７３】
【表９】
2004501875.tif 000010
【０１７４】
例１１．Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、腫瘍担持のマウスにおいて十分に許容される
Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘプロドラッグはまた、腫瘍担持のヌードマウスにおいて、３１及び３９ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンに等しい、５２又は６３ｍｇ／ｋｇで、５日ごとに５回、静脈内投与される場合、反復−用量条件下で安全であった。それぞれ８又は１０匹のマウスのグループによる２種の別々の研究において、毒性の急性徴候は、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの反復投与に続いて観察されなかった。
【０１７５】
１つの研究においては、個々の用量グループ（ｎ＝８）における１匹の動物が、それぞれ低及び高用量グループにおいて、日５８及び５７で、研究における後での可能な薬剤関連毒性死亡として終結された。化合物の安定性は、生存動物において、６０日の観察期間の間、高又は低用量グループにおいて少々の体重低下（初期体重の５％以下）により明確にされた（図１４）。他の研究においては、高及び低用量の両者は、十分に許容された。高用量グループ（ｎ＝１０）における１匹の動物のみが、研究の最後で（日６１）、１５％以上の体重の低下を有した。
【０１７６】
例１２．Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｃは、腫瘍異種移植モデルにおいて効果的である　２匹のマウス異種移植研究は、ヒト結腸癌（ＬＳ１７４Ｔ）の増殖に対するＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの効力、及び長期生存性における結果を示した。健康な若い雌ヌードマウスに、ＬＳ１７４Ｔの部分を皮下移植した。腫瘍が約５０〜１００ｇに達した場合、０．５２又は６３ｍｇ／ｋｇのＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘのいずれかによる、８又は１０匹のマウスのグループの５日ごとでの５回の処理を開始した。腫瘍サイズ及び体重を、６０までの間、週２度、測定した。
【０１７７】
マウスの生存性における用量−依存性上昇が観察された。生存平均日は、処理されたグループにおいて２０及び３２日に高められたが、ビークル対照のグループにおいては、１８日であった（図１５）。Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、ビークル対照グループに対して腫瘍増殖速度を相当に低めた（図１６）。未処理の対照よりも多くの場合、処理された動物の腫瘍は、増殖又は退行を停止するように見えた。前記化合物は十分に許容され、このことは、投与される用量が反復−用量ＭＤ以下であったことを示す。
【０１７８】
腫瘍効力の研究においては、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、用量−依存性効力、腫瘍増殖の遅延及び高まる生存を示し、そしてそれは非常に良好に許容された。それは、ドキソルビシンのみによるよりも、ドキソルビシン−不感受性異種移植物モデルにおいて有意により効果的であった。親化合物Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの急速な排泄にもかかわらず、腫瘍担持のマウスにおいて、それは、低い前身性毒性であるか、高い用量レベルのドキソルビシンを供給する、驚くべき強い抗腫瘍活性を有する。従って、それは、ドキソルビシンが単独では実質的に不活性である、ドキソルビシン−不感受性モデルにおいて、生存性を延長し、そして腫瘍増殖を遅延できる効果的なプロドラッグである。
【０１７９】
しかしながら、化合物の後−分析は、それらが水含有及び不純性のために、約４７％の活性化合物を含むことを示した。その結果、上記で言及される用量は、投入される化合物の量を過大評価した。データの再計算は、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘがビークル対照グループよりも腫瘍増殖速度を遅延したことを示した。腫瘍効力研究においては、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、用量−依存性効力、腫瘍増殖の遅延及び生存性の上昇を示し、そして十分に許容された。それは、ドキソルビシンのみよりも、このドキソルビシン不感受性異種移植モデルにおいてより効果的であった。
【０１８０】
例１３．Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘは、腫瘍異種移植モデルにおいて効果的である　マウス異種移植研究は、ヒト結腸癌（ＨＴ−２９）の増殖、及び長期の生存性に関する結果に対するＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｏｘの効力を示した。健康な若い雌のヌードマウスに、５億個のＨＴ−２９細胞を皮下注入した。腫瘍が約１００ｍｇの重量に達した場合、ビークル、４ｍｇ／ｋｇのドキソルビシン、４０又は６７ｍｇ／ｋｇのＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘによる、８，１０又は１２匹のグループの５回の１週ごとの処理を開始した。腫瘍サイズ及び体重を、６０日までの間、週２度測定した。
【０１８１】
マウスの生存における用量−依存性上昇が観察された。４０ｍｇ／ｋｇ及び６７ｍｇ／ｋｇ（４２ｍｇ／ｋｇ及び７０ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンに等しい濃度）で与えられるＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘは、非常に良く許容され、そして腫瘍担持のマウスの生存性を非常に延長した。ドキソルビシンにより処理されたマウスは、３０日のＭＤＳを有した。平均生存日数は、ビークル対象グループにおける２６日に比較して、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘによる処理グループにおいて、３９及び４１日に高められた（表１０）。高い用量のＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘは、ビークル対照グループよりも、腫瘍増殖速度を有意に低めた（表１０）。化合物は非常に良好に許容され、このことは、投与される用量が反復−用量ＭＴＤ以下であったことを示す。
【０１８２】
【表１０】
2004501875.tif 000011
【０１８３】
例１４．接合されていない治療剤に対するプロドラッグの利点
本発明のプロドラッグは、その接合されない形での治療剤よりも処理利点を提供する。
単一用量最大許容用量（ＳＤ−ＭＴＤ）研究においては、正常なマウスグループが、ポーラス用量のプロドラッグの静脈内投与を受けた。マウスは、６０日間、毎日観察され、そして体重が週２度、測定された。ＳＤ−ＭＴＤは、６０日後、マウスの死を生成しなかった最高の用量に等しいことが推定された。表１１に示されるように、プロドラッグの単一の用量ＭＴＤは、ドキソルビシンのみのそのＭＴＤよりも、１０倍〜少なくとも１６倍高い範囲である。
【０１８４】
【表１１】
2004501875.tif 000012
【０１８５】
腫瘍担持のマウスにおける反復−用量研究においては、１０匹のマウスのグループに、５日又は１週間の間隔で、合計５回の用量で種々の量のプロドラッグを投与した。６０日間の時おりの観察の後、許容できる毒性限界内であることがわかっており、そして腫瘍サイズの減少を生成する用量を、最適効力反復用量として同定した。表１１に見られるように、プロドラッグの最適効力反復用量は、ドキソルビシンのみのその用量よりも約９倍高い。従って、プロドラッグは、全体として、身体への、及び従って、標的細胞の近くへの多くの量の治療剤の供給を可能にする。
【０１８６】
驚くべきことには、インビトロ酵素アッセイ（例えば、例１及び２を参照のこと）において、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘよりも完全に分解されるトリペプチドプロドラッグＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、等用量でインビボ投与される場合、有意に良好に許容され、そしてより効果的である。それらの条件下で、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、そのＭＴＤに近い、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘについての７日間の用量スケジュールに比較して、５日間の用量スケジュールに基づいて反復して与えられる場合、十分に許容され、そしてそのＭＴＤ限界値以下であった。Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの低い毒性は、代謝研究の結果と一致する。Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの有力な血漿代謝物は、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びＬｅｕ−Ｄｏｘである。これは、トロウアーゼにより分解されるＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘと同じ代謝パターンである。しかしながら、血漿に検出される代謝の相対的用量は、トリペプチドに関して、より少ない。
【０１８７】
ＭＴＤ値における上方へのシフトの類似するパターンは、比較的高い用量で十分に許容され、そしてトロウアーゼにより不良に分解されるもう１つのトリペプチドＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘに関して観察された。
Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの実質的に高いＭＴＤ値は、トリペプチドがテトラペプチドＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘに比較して、酵素分解のための良好な基質として存在しないインビトロ証拠と一致する。
【０１８８】
その得られる遅い分解速度は低いレベルの全身性ドキソルビシン及び従って、低い毒性を生成する。Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘについての予測できない良好な効力結果は、腫瘍の近くで、トリペプチドの分解が、バックグラウンドレベルの全身性分解よりもより効果的であると思われることを示す。Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘにより観察される良好な治療窓に基づいて、身体の残よりも腫瘍組織に対してトリペプチドの著しい選択性が存在すると思われる。この、及びドキソルビシンと比較して、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの改良された治療窓の考慮は、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘが腫瘍の臨床学的処理のために特に有用であるべきであることが推定され得る。
【０１８９】
しかしながら、化合物の後−分析は、それらが水含有及び不純性のために約４７％の活性化合物を含むことを示した。その結果、上記に言及される用量は、投与される化合物の量を過大評価した。上記実験からの結果を、再分析した。Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘについての再分析されたデータ及び新しいデータが、表１２に示される。
【０１９０】
【表１２】
2004501875.tif 000013
【０１９１】
データの再計算は、プロドラッグの単一用量ＭＴＤがドキソルビシンのみのＭＴＤよりも、０．８倍〜少なくとも７．８倍高い範囲であることを示した。６０日間にわたっての時おりの観察の後、許容できる毒性限界内にあることがわかっている用量は、最大の許容される反復用量として同定された。表１２に見出されるように、プロドラッグのＲＤ−ＭＴＤは、ドキソルビシンのみのＲＤ−ＭＴＤよりも約６．８倍高い。それらのＲＤ−ＭＴＤでの又はそれよりも低いプロドラッグの反復用量は、ＬＳ１７４ｔ又はＨＴ−２９腫瘍担持のマウスの生存性を延長し、そしてドキソルビシンのそれは無効果である。表１２に見出されるように、プロドラッグの最適効力反復用量は、ドキソルビシンのみのその用量よりも約６倍高い。
【０１９２】
ＭＴＤ値における上方へのシフトの類似するパターンが、比較的高い用量で十分に許容され、そしてトロウアーゼにより不良に分解されるトリペプチドＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘに関して観察された。
【０１９３】
Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘのより高いＭＴＤ値は、トリペプチドが、テトラペプチドＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘに比較して、酵素分解のための良好な基質ではないインビトロ証拠と一致する。その得られる遅い分解速度は、低いレベルの全身性ドキソルビシン及び従って、低い毒性を生成する。Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘがＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘについての予測できない良好な効力結果は、腫瘍の近くで、トリペプチドの分解がバックグラウンドレベルの全身性分解よりもより効果的であると思われることを示す。
【０１９４】
Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘにより観察される良好な治療窓に基づいて、身体の残よりも腫瘍組織に対してトリペプチドの著しい選択性が存在すると思われる。この、及びドキソルビシンと比較して、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘの改良された治療窓の考慮は、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘが腫瘍の臨床学的処理のために特に有用であるべきであることが推定され得る。
【０１９５】
例１５．精製されたＣＤ１０による加水分解
等量の精製されたブタ腎臓ＣＤ１０（Ｅｌａｓｔｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｍｐａｎｙ）を、１２．５μｇ／ｍｌの種々のペプチジルドキソルビシン化合物と共に、ｐＨ７．４の５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００において３７℃で１０時間までの間インキュベートした。反応生成物を、蛍光検出を用いて、ＨＰＬＣにより分析した。加水分解率は、インキュベーション期間で実質的に直線的であった。観察される生成物は、Ｌｅｕ−ドキソルビシンであった。表１３は、１０時間にわたって加水分解された個々の試験化合物の％を提供する。さらに、それらの結果は、標準の試験化合物、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘに対して表される。
【０１９６】
【表１３】
2004501875.tif 000014
【０１９７】
例１６．Ｂａｌｌ−１、Ｒａｍｏｓ及びＮａｍａｌｗａ細胞に対する腫瘍−活性化されたプロドラッグ活性
ＬＮＣａＰの他に、多くのＢ−細胞系、例えばＲａｍｏｓ及びＮａｍａｌｗａ細胞はＣＤ１０（ＣＤ１０ｐｏｓ）細胞）を発現する。しかしながら、もう１つのＢ−細胞系、すなわちＢＡＬＬ−１細胞はＣＤ１０を発現せず、そしてＣＤ１０陰性細胞系（Ｃｄｎｅｇ細胞）として作用する。　懸濁細胞、すなわちＢＡＬＬ−１、Ｒａｍｏｓ及びＮａｍａｌｗａ細胞を、１０％の熱不活性化されたウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ培地において培養した。研究の日、細胞を集め、洗浄し、そして０．５×１０６個の細胞／ｍｌの濃度で、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩに再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液を、９６ウェルプレートに添加した。ドキソルビシン又は試験化合物の一連の希釈溶液（３倍の増量）を製造し、そして１００μｌの化合物をウェル当たりに添加した。
【０１９８】
最終的に、１０μｌの１００μＣｉ／ｍｌの３Ｈ−チミジンをウェル当たりに添加し、そしてプレートを２４時間インキュベートした。プレートを９６ウェルＨａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて収穫し、そしてＰａｃｋａｒｄ Ｔｏｐ Ｃｏｕｎｔカウンター上で計算した。４パラメーターのロジスチック曲線を、ＩＣ５０値を決定するために、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、薬剤モル濃度の関数として３Ｈ−チミジン組み込みに適合せしめた。
最も選択的な類似体は、ＣＤ１０ｐｏｓ及びＣＤ１０ｎｅｇ細胞間に約３０〜３５倍の差異を有するＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘであった（表１４）。
【０１９９】
【表１４】
2004501875.tif 000015
　従って、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、ＣＤ１０により分解されるが、しかしＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘは分解されない。
【０２００】
残る例についての分析方法：
固相又は溶液相アプローチを用いて合成されるペプチド配列は、分析用ＨＰＬＣ（方法Ａ， Ｂ ＆ Ｄ）が８０％以上の純度である粗生成物を示す場合、さらに精製しないで使用された。そうでなければ、材料は分離用ＨＰＬＣ方法Ｃを用いて精製された。
【０２０１】
ＨＰＬＣ方法Ａ：
分析用ＨＰＬＣ分析は、溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ）及び溶媒Ｂ（０．１％ＴＦＡ／ＡＣＮ）のグラジエントにより溶離するＣ−１８カラム（４μｍ， ３．９×１５０ｍｍのＩＤ、１ｍｌ／分の流速）を用いてＷａｔｅｒｓ ２６９０上で行われ、そしてデータはＷａｔｅｒ Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍシステムを用いてλ２５４ｎｍで処理された。分析用ＨＰＬＣグラジエントは、９０％の溶媒Ａで開始し、そして１４分間にわたって（線状）の１００％の溶媒Ｂで終結した。この方法及び次の方法についての化合物の純度は、ピークの曲線下での相対的％領域として評価された。
【０２０２】
ＨＰＬＣ方法Ｂ：
分析用ＨＰＬＣ分析は、溶媒Ａ（８０％の２０ｍＭの蟻酸アンモニウム及び２０％のアセトニトリル）及び溶媒Ｂ（２０％の２０ｍＭの蟻酸アンモニウム及び８０％のアセトニトリル）のグラジエントにより溶離するＣ−１８カラム（３．５μｍ， ４．６×１５０ｍｍのＩＤ、１ｍｌ／分の流速）を用いてＷａｔｅｒｓ ２６９０上で行われ、そしてデータはＷａｔｅｒ Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍシステムを用いてλ２５４ｎｍで処理された。分析用ＨＰＬＣグラジエントは、１００％の溶媒Ａで開始し、そして１４分間にわたって（線状）の１００％の溶媒Ｂで終結した。
【０２０３】
ＨＰＬＣ方法Ｃ：
粗生成物の分離用精製は、溶媒Ａ（Ｈ２Ｏ）及び溶媒Ｂ（ＭｅＯＨ）のグラジエントにより溶離するＣ−４カラム（１５μｍ， ４０×１００ｍｍのＩＤ、３０ｍｌ／分の流速）を用いて、Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐｒｅｐ ４０００システムにより達成された。分離用ＨＰＬＣグラジエントは、８０％の溶媒により開始し、そして７０分間にわたって１００％の溶媒Ｂに進行する（線状）。データは、Ｗａｔｅｒｓ Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｓｙｓｔｅｍを用いてλ２５４ｎｍで処理された。
【０２０４】
ＨＰＬＣ方法Ｄ：
分析用ＨＰＬＣは、ＴＳＫ ｓｕｐｅｒＯＤＳカラム（ＴｏｓｏＨａａｓ）を用いて、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ装置上で達成された；溶媒Ａ（水中、０．１％のＴＦＡ）；溶媒Ｂ（アセトニトリル中、０．１％のＴＦＡ）；グラジエント：２分での３０〜３６％のＢ、１０分での３６〜４１％のＢ、３分での４１〜９０％のＢ、５分での９０％のＢ、検出波長λ２５４ｎｍ。
【０２０５】
ＮＭＲ及びＭＳ：
追加の構造決定は、ＮＭＲ及びＭＳ技法により行われ、そして結果は、本発明の化合物を支持した。
ＴＬＣ方法：
ＴＬＣ分析は、溶出のためのＤＣＭ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ／８８％の蟻酸（８５／１５／１／２）を用いて、シリカゲル６０Ｆ−２５４ｎｍ−０．２５ｍｍプレート（Ｍｅｒｃｋ）上で行われた。
【０２０６】
ニンヒドリン試験：
数ミリグラムの生成物を試験に導入し、そして２滴の溶液Ａ（エタノール中、５０ｍｇ／ｍｌのニンヒドリン）、２滴の溶液Ｂ（エタノール中、４ｍｇ／ｍｌのフェノール）、次に、２滴の溶液Ｃ（１００ｍｌのピリジン中、２ｍｌの０．０１ＭのＫＳＣＮ）を添加した。その混合物を、煮沸水浴に５分間放置した。遊離アミンの存在下で、溶液は紫色になる。
【０２０７】
特異的オリゴペプチド合成例：
市販の試薬源：
ドキソルビシン及びダウノルビシンはＭｅｉｊｉ（Ｊａｐａｎ）により、Ｐｄ （ＰＰｈ３）４はＳｔｒｅｍ Ｃｈｅｍ （Ｎｅｗｂｕｒｙｐｏｒｔ， ＭＡ） により、ＰＥＧはＳｈｅａｒｗａｔｅｒ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ａｌａｂａｍａ）により、溶媒ＨＡＴＵはＡｌｄｒｉｃｈ （Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， ＷＩ） により供給され；すべての樹脂及びアミノ酸は、ＡＢＩ （Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）， Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）， Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｒｎＴｅｃｈ （Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ， ＫＹ）， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ （Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌ， ＫＹ） 又はＳｙｎＰｅｐ（Ｄｕｂｌｉｎ， ＣＡ）により供給された。
【０２０８】
例１７．Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨの合成
トリペプチド（Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨ）を、標準のＦｏｍｃ化学と共に固相ペプチド合成を用いて合成した。典型的な合成は、Ｗａｎｇのアルコキシ樹脂（０．６０ｍモル／ｇ負荷量）を使用した。Ｆｏｍｃ−保護されたアミノ酸を、固相ペプチド合成のために使用した。樹脂上での１ｍＭのペプチドの規模に関しては、３当量のアミノ酸を、２当量のＤＩＥＡと共に樹脂に添加される５分前、活性剤としてのＨＢＴＵにより予備活性化した。カップリング反応を２時間、行い、そして次に、ＤＭＦ（２５ｍｌ×３）及びＤＣＭ（２５ｍｌ×３）により洗浄した。カップリング反応を、類似する条件下で２当量のアミノ酸を用いて反復した。反応の進行を、ニンヒドリン試験を用いてモニターし、そしてニンヒドリン試験が２時間後、不完全な反応を示す場合、カップリング段階を３度、反復した。
【０２０９】
保護解除を、ＤＭＦ中、２０％ピペリシンを用いて、１５〜２０分間、行った。カップリング段階を、所望するペプチドが樹脂上にアセンブリーされるまで、次のアミノ酸により反復した。樹脂からのペプチドの最終分解を、９５％のＴＦＡ及び５％の水の溶液により樹脂を処理することによって達成した。反応混合物を室温で２時間、撹拌した後、樹脂を減圧下で濾過し、そしてＴＦＡにより２度、洗浄した。濾液を組合し、そしてペプチドを、４００ｍｌの冷エーテルを添加することによって沈殿した。ペプチドを減圧下で濾過し、そして乾燥し、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨ（方法Ａによる９２％のＨＰＬＣ純度）を得た。粗ペプチドを、ＬＣ／ＭＳにより特徴づけ、そしてさらに精製しないで、次の段階のために使用した。
【０２１０】
例１８．Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨの合成
トリペプチド（Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨ）を、標準のＦｏｍｃ化学と共に固相ペプチド合成を用いて合成した。典型的な合成は、Ｗａｎｇのアルコキシ樹脂（０．６０ｍモル／ｇ負荷量）を使用した。Ｆｏｍｃ−保護されたアミノ酸を、固相ペプチド合成のために使用した。樹脂上での１ｍＭのペプチドの規模に関しては、３当量のアミノ酸を、２当量のＤＩＥＡと共に樹脂に添加される５分前、活性剤としてのＨＢＴＵにより予備活性化した。カップリング反応を２時間、行い、そして次に、ＤＭＦ（２５ｍｌ×３）及びＤＣＭ（２５ｍｌ×３）により洗浄した。カップリング反応を、類似する条件下で２当量のアミノ酸を用いて反復した。
【０２１１】
反応の進行を、ニンヒドリン試験を用いてモニターし、そしてニンヒドリン試験が２時間後、不完全な反応を示す場合、カップリング段階を３度、反復した。保護解除を、ＤＭＦ中、２０％ピペリシンを用いて、１５〜２０分間、行った。カップリング段階を、所望するペプチドが樹脂上にアセンブリーされるまで、次のアミノ酸により反復した。樹脂からのペプチドの最終分解を、９５％のＴＦＡ及び５％の水の溶液により樹脂を処理することによって達成した。反応混合物を室温で２時間、撹拌した後、樹脂を減圧下で濾過し、そしてＴＦＡにより２度、洗浄した。濾液を組合し、そしてペプチドを、４００ｍｌの冷エーテルを添加することによって沈殿した。ペプチドを減圧下で濾過し、そして乾燥し、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨ（方法Ａによる９０％のＨＰＬＣ純度）を得た。粗ペプチドを、ＬＣ／ＭＳにより特徴づけ、そしてさらに精製しないで、次の段階のために使用した。
【０２１２】
例１９．Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの合成
ダウノルビシン・ＨＣｌ（２．３４ｇ， ４．０３ｍモル）及びＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（２．４ｇ， ４．４８ｍモル）を、室温で無水ＤＭＦ（１５０ｍｌ）に溶解した。この急速に撹拌された溶液に、ＤＩＥＡ（１．５６ｍｌ， ８．６９ｍモル）を、１回で添加し、そしてその反応混合物を室温で１５分間、撹拌した。その反応混合物を、氷浴を用いて０℃に冷却し、そして１．８４ｇ（４．９２ｍモル）のＨＡＴＵを、１０分間にわたってゆっくりと添加した。反応混合物を、室温でさらに６０分間、撹拌した。氷冷却された水（２００ｍｌ）を、反応混合物に添加し、赤色の沈殿物の形成をもたらした。沈殿物を、粗フリット上に集め、３×５０ｍｌの水及び３×５０ｍｌのジエチルエーテルにより洗浄し、そして減圧下で乾燥し、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを得た（８９％の収率、方法Ａによる９４％のＨＰＬＣ純度）。この生成物を、ＭＳにより特徴づけ、そしてさらに精製しないで、次の段階のために使用した。
【０２１３】
例２０．Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの合成
ダウノルビシン・ＨＣｌ（２．２６ｇ， ３．８９ｍモル）及びＦｍｏｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨ（２．４ｇ， ４．３３ｍモル）を、室温で無水ＤＭＦ（１５０ｍｌ）に溶解した。この急速に撹拌された溶液に、ＤＩＥＡ（１．５６ｍｌ， ８．６９ｍモル）を、１回で添加し、そしてその反応混合物を室温で１５分間、撹拌した。その反応混合物を、氷浴を用いて０℃に冷却し、そして１ｇ（２．６４ｍモル）のＨＡＴＵを、１０分間にわたってゆっくりと添加した。反応混合物を、室温でさらに６０分間、撹拌した。
【０２１４】
氷冷却された水（２００ｍｌ）を、反応混合物に添加し、赤色の沈殿物の形成をもたらした。沈殿物を、粗フリット上に集め、３×５０ｍｌの水及び３×５０ｍｌのジエチルエーテルにより洗浄し、そして減圧下で乾燥し、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを得た（８６％の収率、方法Ａによる９３％のＨＰＬＣ純度）。この生成物を、ＭＳにより特徴づけ、そしてさらに精製しないで、次の段階のために使用した。
【０２１５】
例２１．Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの合成
２０ｍｌの無水ＤＭＦ中、Ｆｍｏｃ− Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（４．４ｇ、４．１３ｍモル）の溶液に、ピペリジン（２０．４ｍｌ、２０６ｍモル）を一度に添加し、赤色から紫色への色彩変化をもたらした。その反応混合物を、室温で５分間、撹拌し、そして次に、ドライアイス／アセトン浴を用いて−２０℃に冷却した。次に２１．２ｍｇ（２１０ｍモル）の無水琥珀酸を、前記冷却された混合物に一度に添加した。反応を−５℃で５分間、次に室温でさらに９０分間、急速に撹拌した。７５０ｍｌの無水ジエチルエーテルを反応混合物に添加し、赤色の沈殿物をもたらした。この沈殿物を中位のガラスフリット上で単離し、２×５０ｍｌのジエチルエーテルにより洗浄し、そして減圧下で乾燥し、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを得た（８０％の収率、方法Ｂによる８８％のＨＰＬＣ純度）。ＬＣ／ＭＳは、９３９の分子量（９４０の予測される分子量）を与えた。
【０２１６】
例２２．Ｓｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの合成
５０ｍｌの無水ＤＭＦ中、Ｆｍｏｃ− Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（４ｇ、３．７ｍモル）の溶液に、ピペリジン（１８．７２ｍｌ、１８５ｍモル）を一度に添加し、赤色から紫色への色彩変化をもたらした。その反応混合物を、室温で５分間、撹拌し、そして次に、ドライアイス／アセトン浴を用いて−２０℃に冷却した。次に１９ｍｇ（１８９ｍモル）の無水琥珀酸を、前記冷却された混合物に一度に添加した。反応を−５℃で５分間、次に室温でさらに９０分間、急速に撹拌した。７５０ｍｌの無水ジエチルエーテルを反応混合物に添加し、赤色の沈殿物をもたらした。この沈殿物を中位のガラスフリット上で単離し、２×５０ｍｌのジエチルエーテルにより洗浄し、そして減圧下で乾燥し、Ｓｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを得た（７８％の収率、方法Ｂによる８９％のＨＰＬＣ純度）。ＬＣ／ＭＳは、９３９の分子量（９４０の予測される分子量）を与えた。
【０２１７】
例２３．Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＢｎの合成
Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕを、ＤＭＦ及び磁気撹拌機と共に丸底フラスコ中に添加した。テトラペプチドを溶解した後、臭化ベンジル、続いて炭酸セシウムを、前記溶液に撹拌しながら添加した。その反応混合物を室温で１．５時間、撹拌した。次に、反応混合物を、氷冷却された水を含むフラスコ中にゆっくりと注いだ。沈殿物を吸引濾過により集めた。生成物Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＢｎを水により洗浄し、そして真空デシケーターに配置した。
【０２１８】
例２４．Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＢｎの合成
丸底フラスコにおいて、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＢｎを、無水ＤＭＦ５ｍｌに溶解した。ピペリジンを前記溶液に添加し、そしてその混合物を室温で２５分間、撹拌した。反応を水により停止し、そして酢酸エチルにより抽出した。組合された有機層をさらに、水、ブラインにより洗浄し、そして硫酸ナトリウム上で乾燥した。固形物Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＢｎを、溶媒の除去の後に得た。
【０２１９】
例２５．ＭｅＯＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＢｎの合成
丸底フラスコにおいて、メチルヘミスクシネートを、無水ＤＭＦ　に溶解した。ＤＩＥＡ、続いてＨＢＴＵを前記溶液に添加した。その混合物を室温で４５分間、撹拌した。この混合物に、無水ＤＭＦ中、Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＢｎ（粗）の溶液を添加した。その混合物を、室温で２．５時間、連続して撹拌した。次に、その反応混合物を、氷冷却された水を有するフラスコ中に、撹拌しながらゆっくりと注いだ。多量の白色固形物が沈殿し、これを酢酸エチルにより抽出した。組合された有機層をさらに、水、ブラインにより洗浄し、そして硫酸ナトリウム上で乾燥した。固形物ＭｅＯＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＢｎを、溶媒の除去の後に得た。
【０２２０】
例２６．ＭｅＯＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕの合成
ＭｅＯＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＢｎを、メタノール１００ｍｌを含む三角フラスコ中に添加した。メタノール５０ｍｌを添加した。その溶液を水素化反応容器中に移した。この容器に、Ｐｄ−Ｃを添加した。室温で２時間の水素化の後、反応を停止し、そして触媒を濾過した。固形物ＭｅＯＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕを、溶媒の除去の後に得た。
【０２２１】
例２７．“ウレア方法”をもちいてのＭｅＯＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ及びドキソルビシンのカップリング
無水窒素雰囲気下で、ＭｅＯＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、及びドキソルビシン塩酸塩を、８００ｍｌの無水ウレア−飽和（約３０％ｗ／ｖ）ＤＭＦ及びＤＩＥＡに懸濁し／溶解した。この混合物を、約２５分間にわたって、０〜３℃に冷却した。この点で、ＨＡＴＵを、約１００ｍｌのウレア飽和ＤＭＦにおける溶液として、１０分間にわたって添加した（この溶液の体積は最少に維持されるべきである）。反応混合物を−２〜２℃で１０分間、撹拌し、そして２％（ｖ／ｖ）の酢酸を含む氷冷却されたブライン４０００ｍｌ中に、激しく撹拌しながら、約５分間にわたって注いだ。生成物を、中位の多孔性ガラス濾過器上で濾過し、水により十分に洗浄し、そして減圧下で乾燥した。
【０２２２】
例２８．ＭｅＯＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤の合成の合成
丸底フラスコにおいて、ＭｅＯＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ及びドキソルビシンを、無水ＤＭＦに溶解した。その混合物を５分間撹拌した後、ＤＩＥＡ、続いてＨＡＴＵを前記溶液に添加た。その混合物を室温で４時間、撹拌した。ＤＭＦを回転蒸発器により除去し、そして残留物を１：１の塩化メチレン：メタノール４．０ｍｌに採取した。この溶液に、４０ｍｌのエーテルを、撹拌しながら、ゆっくりと添加した。沈殿物を、吸引濾過によりそれを集めた。固形物ＭｅＯＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘをエーテル（２×１０ｍｌ）により洗浄し、そして真空デシケーターにおいて乾燥した。
【０２２３】
例２９．ＭｅＯＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘからの遊離ドキソルビシンの除去
ＭｅＯＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、ＤＩＥＡ及び無水ＤＭＦを、磁気撹拌棒を備えた５０ｍｌのフラスコに配置した。ＭｅＯＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘが完全に溶解した場合、イソシアネート樹脂（５ｍｌのジクロロメタンにおいて５分間、予備膨潤された）を添加し、そして得られる溶液を室温で２時間、定期的なＨＰＬＣモニターを伴なって、撹拌した。ＨＰＬＣ追跡が、Ｄｏｘが完全に除去されたことを示した場合、反応混合物をフリットを通して濾過し、樹脂を除去した。
【０２２４】
樹脂を１０ｍｌのＤＭＦにより洗浄し、そしてそのＤＭＦ洗浄物を、前記濾過された反応混合物と組合した。次に、濾過された反応混合物を、高い真空ポンプ及び３０℃の水浴を備えた回転蒸発機上で濃縮した。残留物を、５ｍｌのＤＭＦに懸濁し、そして次に、その溶液を、急速に撹拌された無水ジエチルエーテル溶液中にゆっくりと添加した。次に生成物を、フリット上で濾過し、ジエチルエーテルにより洗浄し、そして減圧下で乾燥し、ＭｅＯＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを得た。
【０２２５】
例３０．架橋された酵素の使用によるＭｅＯＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの加水分解
ＭｅＯＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤及び１００ｍｌのＤＭＦを、５００ｍｌのフラスコに配置した。その懸濁液を磁気撹拌機により激しく撹拌した。ＭｅＯＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤が完全に溶解した場合、４００ｍｌの脱イオン水を添加し、そしえ得られる溶液を３５℃で撹拌した。１ｇの洗浄されたＣＬＥＣ−ＰＣ（Ａｌｔｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）固定された酵素のスラリーを、３アリコートの脱イオン水によりすすぎ、次に使用の前、２０％の水性ＤＭＦ１０ｍｌに再懸濁した。得られる懸濁液を、定期的なＨＰＬＣモニターを伴なって、３５℃で撹拌した。すべてのＭｅＯＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤が消費された場合、その反応混合物を、０．４５μＭのナイロン膜フィルターを通して濾過し、ＣＬＥＣ−ＰＣ酵素を除去した。
【０２２６】
ＣＬＥＣ−ＰＣケークを、３×１０ｍｌのメタノールにより洗浄し、そしてメタノール洗浄物を、前記濾過された反応混合物と組合した。次に、濾過された反応混合物及びメタノール洗浄物を、高い真空ポンプ及び３０℃での水浴を備えた回転蒸発器上で濃縮した。次に、濃縮物を、室温で５０ｍｌの脱イオン水に懸濁し、そして機械的撹拌機を通して激しく撹拌した。この懸濁液に、１００ｍｌの脱イオン水中、７７．８ｍｇ（０．９２６ｍモル、０．９５当量）の炭酸水素ナトリウムの溶液を、２分間にわたって添加した。その懸濁液を室温で２０分間、撹拌した。反応混合物を、０．４５μＭのナイロン膜フィルターを通して濾過し、そしてＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ凍結乾燥した。
【０２２７】
例３１．可溶性酵素の使用によるＭｅＯＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの加水分解
ＭｅＯＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤を、ＨＰＬＣ品種の水８００ｍｌに懸濁し、そしてＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘ Ｔ８ホモジナイザーにより６０分間、均質化し、細かく分割された懸濁液を生成した。この懸濁液を３５℃で撹拌し（５００ｒｐｍ）、そして７６ｍＭの水性炭酸水素ナトリウムによりｐＨ＝６．０５に調節した。次に、１．０ｇのＣ．アンタルクチカ“Ｂ”リパーゼ（Ａｌｔｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を添加し、そして反応混合物を３５℃で４８時間、撹拌した。４８時間の反応時間の間、ｐＨを、７６ｍＭの炭酸水素ナトリウムの定期的な添加による５．３〜６．２の間に維持し、そして反応をＨＰＬＣにより定期的にモニターした。
【０２２８】
反応がほぼ完結である場合、反応混合物を７６ｍＭの水性炭酸水素ナトリウムによりｐＨ＝７に調節し、そしてセライト５２１のパッドを通して濾過した。次に、透明にされた反応混合物を、５ｍｌの氷酢酸により約３のｐＨに酸性化た。沈殿物をセライト５２１濾過、セライトパッドのメタノールによる続くすすいだ。メタノール溶液を１０〜２０μＭのガラス濾過器を通して濾過しそして回転蒸発により蒸発した。この生成物を、７０ｍｌの７６ｍＭの炭酸水素ナトリウム（０．９５当量）における溶解によりナトリウム塩に転換し、そして凍結乾燥した。生成物は、例２４のものと同一であった。
【０２２９】
例３２．ＭｅＯＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの固定されたカンジダ　アンタルクチカ“Ｂ”リパーゼ加水分解
３０．０ｇのカンジダ　アンタルクチカ“Ｂ”リパーゼ（Ａｌｔｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を、３００ｍｌの水に溶解し、そして３×４Ｌの５０ｍＭの水性炭酸水素ナトリウム（ｐＨ＝６．４）に対して透析した。３６０ｍｌのＦｈａｒｍａｃｉａ ＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを、粗ガラス濾過器に置き、そして５×４５０ｍｌの氷冷却された１ｍＭの水性ＨＣｌによりすすいだ。そのすすがれたＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを、前記透析された酵素溶液と組合した。得られる懸濁液を、周囲温度（約２２℃）で２．０時間、撹拌した。セファロース／酵素接合体を、粗ガラス濾過器上で単離し、そして次に、１０００ｍｌの１００ｍＭの水性ＴＲＩＳ（ｐＨ＝７．４５）において１５分間、撹拌した。
【０２３０】
この懸濁液を濾過し、そしてもう１つの１０００ｍｌの１００ｍＭの水性ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４５）と共に４℃で一晩インキュベートした。朝、固定された酵素を濾過し、そして水による洗浄の後、２０００ｍｌの三ツ首丸底フラスコに配置した。４３ｇのＭｅＯＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤を添加し、そして固形物を８００ｍｌの脱イオン水に懸濁した。フラスコに、オーバーヘッド撹拌機、及び注射器ポンプを調節することによって反応混合物のｐＨを５．９〜６．２に維持するよう設定されたｐＨ−安定装置を固定した。注射器ポンプを、０．１Ｍの炭酸水素ナトリウムにより充填した。反応の進行をＨＰＬＣにより追跡した。反応がほぼ完結した後、固定された酵素を濾過し、そして溶液相を凍結乾燥した。次に、乾燥固形物を約１１ｍｌの無水ＴＨＦに懸濁し、そして濾過した。
【０２３１】
例３３．Ｎ−キャップアリル−ヘミスクシネートの合成
この分子を、Ｃａｓｉｍｉｒ， Ｊ．Ｒなど．， Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ．３６ （１９）： ３４０９， （１９９５） の方法に従って調製した。１０．０７ｇ（０．１モル）の無水琥珀酸及び５．８０８ｇ（０．１モル）のアリル−アルコールを、１００ｍｌのトルエンにおいて６時間、環流した。その反応混合物を減圧下で濃縮した（１５．５ｇ；９８％）。得られる材料は、続く反応への使用のために十分な純度であった。半固形生成物の純度及び同一性を、１Ｈ ＮＭＲ及び１３Ｃ ＮＭＲ， 並びにＬＣ／ＭＳにより確かめた。
【０２３２】
例３４．アリル−スクシニル−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの合成
丸底フラスコにおいて、Ｎ−キャップ−アリールヘミスクシニル形のＭｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ及びドキソルビシンを、無水ＤＭＦに溶解した。その混合物を５分間撹拌した後、ＤＩＥＡ、続いてＨＡＴＵを前記溶液に添加し、その混合物を室温で２時間、撹拌した。ＤＭＦを回転蒸発器により除去し、そして残留物を１：１のＤＣＭ：ＭｅＯＨ（４．０ｍｌ）に採取した。この溶液に、１００ｍｌのエーテルを、撹拌しながら、ゆっくりと添加した。赤色の沈殿物が形成され、そして吸引濾過によりそれを集めた。固形物をエーテル（２×２ｍｌ）により洗浄し、そして真空デシケーターにおいて乾燥し、アリル−スクシニル−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤を得た。
【０２３３】
例３５．アリル−スクシニル−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘからのＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの調製
ＴＨＦ２ｍｌ中、アリル−スクシニル−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの撹拌溶液に、窒素雰囲気下で、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウムを固形物として添加した。１０分後、反応の間に形成される沈殿物を濾過し、ＴＨＦにより洗浄したその固形物は、Ｓｕｃ− Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘである。
【０２３４】
例３６．Ｇｌ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘのナトリウム塩の合成
ピペリジン（４３６μｌ、４．４１３ｍモル）を、ＤＭＦ（４．５ｍｌ）中、Ｆｍｏｃ形のＭｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（９５ｍｇ、０．０８８ｍモル）の溶液に添加した。室温での５分間の撹拌の後、反応混合物を、−５℃に冷却し、そして無水グルタル酸（６２４ｍｇ、５．４７２ｍモル）をすぐに添加した。冷浴を、色彩が変化するとできるだけすぐに除去し、その混合物を室温で１０分間、撹拌した。ＤＭＦを回転蒸発により除去し、そして残留物をクロロホルム（２．５ｍｌ）に溶解した。
【０２３５】
ジエチルエーテル（１４ｍｌ）をすばやく添加し、そして沈殿物を濾過した。フィルターケークを、ジエチルエーテルにより洗浄し、空気乾燥し、そしてつぎに、水（１１４ｍｌ）に再懸濁した。ナトリウム塩を、０．０２５ＭのＮａＯＨ（４ｍｌ、０．１０ｍモル）を前記懸濁液に、完全な溶解まで、滴下することにより形成した。次に、溶液を凍結乾燥し、グルタリル−Ｎ−キャップ形のオリゴペプチド３８−Ｄｏｘ治療剤のナトリウム塩を得た（９７％の収率；及び方法Ｄによる８７％のＨＰＬＣ純度）。
【０２３６】
例３７．メチルスクシニル−Ｎ−キャップのＬｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤の大規模合成
１２０ｍモルのドキソルビシン・ＨＣｌ及び１９９ｍモルのＭｅＯＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕを、窒素下で無水ＤＭＦ（１０Ｌ）に溶解した。７６ｍｌのＤＩＥＡ（４３４ｍモル）を、反応混合物に添加し、そしてその反応混合物を、室温で、窒素下で１０分間、撹拌した。次に、反応混合物を、１０分にわたって０℃に冷却した。別々のフラスコにおいて、ＤＭＦ（５００ｍｌ）中、８６４ｇＨＡＴＵ（２２０ｍモル）の溶液を分離した。そのＨＡＴＵ溶液を、前記反応混合物に、その混合物を０℃で維持しながら、２０分間にわたってゆっくりと添加した。反応混合物を３０分間、０℃で撹拌した。
【０２３７】
水（２５Ｌ）中、ＮａＣｌ（７．５ｋｇ、少なくとも３０％ｗ／ｖ）の溶液を分離し、そして０℃に冷却した。次に、反応混合物を、冷却されたブライン溶液に、撹拌しながら１２０分間にわたってゆっくりと添加した。前記溶液の色は赤色を維持し、青色の溶液は、ｐＨが酢酸の添加により、５．８〜６．０にすぐに調節する必要があることを示した。温度を、約５℃で維持した。赤色の沈殿物を、中位の多孔性ガラス濾過器上で濾過し、水により洗浄し、そしてＰ２Ｏ５上で真空下を乾燥し、ＭｅＯＳｕｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを得た。
【０２３８】
例３８．微量のドキソルビシンを除去するためにＰｓ−イソシアネートビーズによるＭｅＯＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの処理
１４６．４のＰＳ−イソシアネートビース（２４０ｍモル；Ａｒｇｏｎａｕｔ Ｌａｂ， Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ， ＣＡにより供給される）を、１．５Ｌの無水ＤＭＦに溶解し、そして室温で５〜１０分間、膨潤した。膨潤されたビーズを、ガラス濾過器を通して濾過し、そして追加の５００ｍｌの無水ＤＭＦにより洗浄した。１１２ｍモルのＭｅＯＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを、１０００ｍｌの無水ＤＭＦに溶解し、そして１２ｍモルのＤＩＥＡ、続いて膨潤されたＰＳ−イソシアネートビーズを添加した。反応混合物を室温で撹拌し、そしてドキソルビシンピークの量が０．１％以下になるまで、ＨＰＬＣを用いてモニターした。
【０２３９】
ＨＰＬＣ分析を、Ｗａｔｅｒ ２６９０カラムを用いて行った：Ｗａｔｅｒ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ ｓｈｉｅｌｄ Ｃ８ ３．５μＭ ４．６×１５０ｍｍ（カタログ番号ＷＡＴ０９４２６９）、溶媒：Ａ−８０％の２０ｍＭの蟻酸アンモニウム（ｐＨ＝４．５）、２０％アセトニトリル、溶媒：Ｂ−２０％蟻酸アンモニウム（ｐＨ＝４．５）、８０％アセトニトリル。カラム温度：調節された室温、サンプル温度；４℃、運転時間：３７．５分、検出器：２５４ｎｍ， 流速：１．０ｍｌ／分、注入量１０μｇ（０．５ｍｇ／ｍｌ×０．０２ｍｌ）、移動相Ａ及びＢ．グラジエント：１００％移動相〜１００％移動相Ｂの３７．５分の線状グラジエント（７．５分の平衡化遅延を伴なう）。
【０２４０】
ドキソルビシンピークの量が０．１％以下である場合、反応混合物を、粗ガラス濾過を通して濾過し、ビーズを除いた。３．５ｌの水中、１．１ｋｇのＮａＣｌのブライン溶液（少なくとも３０％ｗ／ｖ）を調製し、そして０℃に冷却した。次に、濾過された反応混合物を、冷却されたブライン溶液に撹拌しながら４５分間にわたってゆっくりと添加した。溶液の色彩は赤のままであり、青色の溶液は、ｐＨが酢酸の添加により５．８〜６．０にすぐに調節する必要があることを示した。赤色の沈殿物を中位のガラス濾過器を通して濾過し、水により洗浄し、そしてＰ２Ｏ５上で減圧下で乾燥し、いずれの残留ドキソルビシンも有さないＭｅＯＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを得た。
【０２４１】
ＭｅＯＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを、ＩＬのＭｅＯＨに溶解し、そして次に、メタノール溶液を、撹拌しながら、６０分間にわたって、１４Ｌの冷却されたエチルエーテルにゆっくりと添加した。赤色の沈殿物を、中位のガラス濾過器を通して濾過し、エーテル（１Ｌ）により洗浄し、そして真空下で乾燥し、ＭｅＯＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを得た。純度は、例４４に記載のようにして、ＨＰＬＣにより決定された。
【０２４２】
例３９．Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを生成するためにＭｅＯＳｕｃ−−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの酵素的加水分解
ＣＬＥＣ−ＣＡＢ（Ｃａｎｄｉｄａ Ａｎｔａｒｔｉｃａ “Ｂ” リパーゼ）酵素を、溶液形で購入し（Ａｌｔｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ．， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡから）、ここで酵素の濃度は溶液１ｍｌ当たりの乾燥酵素の重量により定義される。粗酵素懸濁液を数分間、振盪し、均質溶液を得た。５０４ｍｌ（３２８ｍモル）のこの均質溶液をフラスコにアリコートした。２．５Ｌの脱イオン水を添加し、そしてこのスラリーを、磁気撹拌機を用いて１０分間、撹拌した。酵素溶液を粗ガラス濾過器を用いて、酵素を乾燥しないで濾過した。酵素をフラスコに戻した。酵素を水に懸濁し、そしてさらに３度、濾過した。
【０２４３】
酵素ケークを、５５０ｍｌの脱イオン水に再懸濁し、そしてＲＢフラスコに移した。この懸濁液に、ＭｅＯＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（１０６ｍモル）を添加し、そしてその反応混合物を室温（２５℃）で撹拌した。反応混合物のｐＨを、１ＮのＮａＨＣＯ３溶液により充填された注射器ポンプを備えたｐＨ−装置により、５．８〜６．１に維持した。反応の進行を、例４４に記載のようにして、定期的なＨＰＬＣモニターにより追跡した。反応は、それがＨＰＬＣにより決定される場合、完全であると思われるまで、続けられた。
【０２４４】
反応を早めるために、追加のＣＬＥＣ酵素を、反応が完結である場合、必要とした。追加のＣＬＥＣ酵素（均質溶液）を、上記のようにカラム型で洗浄した。酵素ケークを、１．１Ｌの脱イオン水に再懸濁し、そして反応混合物に添加した。反応混合物を、定義的にＨＰＬＣによりモニターしながら、室温で撹拌し、そしてｐＨを、５．８〜６．１に維持した。
ＣＬＥＣ酵素を、０．２μＭのフィルターを通しての濾過により反応混合物から除去し、そして５００ｍｌの脱イオンによりすすいだ。次に、濾液を凍結乾燥し、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ・Ｎａを得た。
【０２４５】
本明細書に言及されるすべての出版物及び特許出願は、個々の出版物又は特許出願が特異的に且つ個々に引用により組み込まれていることを示されているかのように、同じ程度に引用により本明細書に組み込まれる。
本発明は現在、十分に記載されているが、多くの変更及び修飾が本発明の範囲内で行われ得ることは、当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａ−１Ｄは、略語、名称及び構造の表である。
【図２】図２は、標的細胞の細胞外付近及び標的細胞内での本発明のプロドラッグの分解の典型的なスキームである。
【図３】図３は、本発明の典型的な中間体であるＦｍｏｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕの合成を示す。
【図４】図４は、本発明の典型的な中間体であるメチル−スクシニル−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕの“Ｆｍｏｃ−路”合成を示す。
【図５】図５は、本発明の典型的な化合物であるＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸの塩形の“Ｆｍｏｃ−路”合成を示す。
【図６】図６は、本発明の典型的な化合物であるＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸの塩形の“エステル−路”合成を示す。
【図７】図７は、本発明の典型的な中間体であるアミノ保護されたＭｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸの合成を示す。
【図８】図８は、本発明の典型的な化学であるＳｕｃ− Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸの塩形の“アリルエステル路”を示す。
【図９】図９は、本発明の典型的な化合物であるＳｕｃ− Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸの“樹脂路”を示す。
【図１０】図１０は、単一ボーラス用量のプロドラッグの静脈投与後、１及び４時間でのＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びその代謝物の血漿レベルのグラフである。
【図１１】図１１は、単一ボーラス用量のプロドラッグの静脈投与後、０〜２及び２〜２４時間で集められた尿に存在するＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びその代謝物の量のグラフである。
【図１２】図１２は、単一ボーラス用量のプロドラッグの静脈投与後、１及び４時間でのＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びその代謝物の血漿レベルのグラフである。
【図１３】図１３は、単一ボーラス用量のプロドラッグの静脈投与後、０〜２及び２〜２４時間で集められた尿に存在するＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びその代謝物の量のグラフである。
【図１４】図１４は、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘにより処理されたマウス、又はビークル対照を受けるマウスのいずれかの％体重変化のグラフである。
【図１５】図１５は、ビークル対照を与えられたマウスと比較して、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘにより処理されたマウスにおける平均生存日（ＭＤＳ）の上昇を示すグラフである。
【図１６】図１６は、ビークル対照を与えられたか又はＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘにより処理されたＬＳ１７４Ｔ異種移植されたマウスにおける腫瘍増殖の速度のグラフである。
【図１７】図１７は、スキャベンジャ−樹脂又はビーズの使用を通しての遊離治療剤の除去を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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