(57)【要約】本発明は、マルチマーカー平行検出の蛋白チップ及びその作製方法と使用方法に関する。当該蛋白チップには、固体基質とチップ自動スポットシステムを使用し、多種蛋白質を特定の順序で基質に固定し、マルチマーカー平行検出に用いる蛋白を含み、非固定化部位ではブロッキング液で遮断且つ凍結乾燥してから保存する。本発明は更に上述蛋白チップの検出システムに及んでいる。その中に蛋白チップ、過酸化酵素でラベルした多蛋白質混合液、希釈液、化学発光反応を発生させる化学組成物、洗濯液、標準品を含む。その原理は、いくつかの体内マーカーと特異的に結合できる蛋白Ａを結合した固相基質を、目標蛋白Ｂを含む測定を待つ液と接触させ、安定な複合体Ａ−Ｂを形成し、更に多蛋白混合液中のＡに対応するラベルした特異結合蛋白Ｃ−標識と反応し、安定なＡ−Ｂ−Ｃ−標識を形成する。標識は化学発光法の標識物であり、化学発光反応を発生させ、信号の検出を行う。当該蛋白チップは、検出の正確度を極大に向上させ、且つ信頼性が高く、検出の感度が高いなど優れた点を持ち、広範に分子生物学、生物医学、人類蛋白質グループ研究に応用し、特に臨床診断に応用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機基質と該有機基質に固定化した蛋白質を含む蛋白チップであって、該蛋白質は多種類の腫瘍マーカーと特異的に結合できる、蛋白チップ。
【請求項２】
有機基質は、酢酸セルロース膜、硝酸セルロース膜、ナイロン膜またはポリプロピレン膜である請求項１の蛋白チップ。
【請求項３】
最適の有機基質は硝酸セルロース膜である請求項２の蛋白チップ。
【請求項４】
有機基質に固定化した蛋白質の密度が２５ ｄｏｔ／ｃｍ２以上である請求項１の蛋白チップ。
【請求項５】
有機基質に固定化した蛋白質の量が０．１ ｎｇ／ｄｏｔ〜１０ ｎｇ／ｄｏｔの範囲内にある請求項１の蛋白チップ。
【請求項６】
蛋白チップの作製方法であって
１）固定化する各種蛋白質を、一定の濃度で被覆液に溶解し、
２）自動スポットシステムで、これら各種蛋白質を、密度範囲が２５−２００ ｄｏｔ／ｃｍ２で、量範囲が０．１−１０ ｎｇ／ｄｏｔで、有機基質に固定化し、
３）一定時間放置し、ブロッキング液で蛋白チップを遮断し、乾燥した後、４℃で保存する、
ことを含む蛋白チップの作製方法。
【請求項７】
ブロッキング液が、蔗糖、ＢＳＡ、Ｔｗｅｅｎ ２０、チロシンおよびプロシリン（ｐｒｏｃｌｉｎ）を含むＴＢＳ（０．７−０．９％ＮａＣｌ、１．０−１．５％Ｔｒｉｓ）溶液である請求項６の作製方法。
【請求項８】
ブロッキング液が０．１−０．５％Ｔｗｅｅｎ ２０、０．０２−０．３％チロシン、１−９％蔗糖、１−９％ＢＳＡおよび０．１−１％プロシリンを含む請求項７の作製方法。
【請求項９】
ブロッキング液の最適成分が、０．２％Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１％チロシン、４％蔗糖、５％ＢＳＡおよび０．５％プロシリンを含むＴＢＳ溶液である請求項８の作製方法。
【請求項１０】
被覆液がｐＨを９．０−１０．０とするＮａＨＣＯ３−Ｎａ２ＣＯ３緩衝液である請求項６の作製方法。
【請求項１１】
有機基質が、酢酸セルロース膜、硝酸セルロース膜、ナイロン膜またはポリプロピレン・フィルムである請求項６の作製方法。
【請求項１２】
有機基質が好ましくは硝酸セルロース膜である請求項１１の作製方法。
【請求項１３】
蛋白質は、抗原、抗体、受容体またはリガンドである請求項６の作製方法。
【請求項１４】
蛋白質は病気関連蛋白と特異的に結合できる請求項１３の作製方法。
【請求項１５】
蛋白質は腫瘍マーカーと特異的に結合できる請求項１４の作製方法。
【請求項１６】
化学発光反応を利用して体液における多種類生物分子の量を検出する、多種類マーカー平行検出のための蛋白チップ検出システムであって、
（１）多種類マーカー平行検出に用いる蛋白チップ、
（２）過酸化酵素で標識された多種類蛋白質混合物、
（３）体液試料の希釈に用いる希釈液、
（４）化学発光反応を発生させ且つ増強させる化学組成物、
（５）洗浄液、
（６）検出すべき蛋白質の一連の標準品、
を含む検出システム。
【請求項１７】
過酸化酵素はホースラディッシュ過酸化酵素である請求項１６の検出システム。
【請求項１８】
多種類蛋白質混合物が、過酸化酵素でラベルされ、体液中の標的蛋白質と特異的に結合でき、一定の濃度で混合されたものである請求項１６の検出システム。
【請求項１９】
洗浄液は、０．７−０．９％ＮａＣｌ、１．０−１．５％ Ｔｒｉｓおよび０．０５−０．２％Ｔｗｅｅｎ ２０を含み、ｐＨ値が６．０〜９．０である請求項１６の検出システム。
【請求項２０】
洗浄液の最適成分は、０．９％ＮａＣｌ、１．２１％ Ｔｒｉｓおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０を含み、ｐＨ値が７．５０である請求項１９の検出システム。
【請求項２１】
希釈液は、０．７−０．９％ＮａＣｌ、１．０−１．５％ Ｔｒｉｓ、０．０５−０．２％Ｔｗｅｅｎ ２０および０．０５−０．２％チロシンを含む請求項１６の検出システム。
【請求項２２】
希釈液の最適成分は、０．９％ＮａＣｌ、１．２１％ Ｔｒｉｓ、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０および０．１％チロシンを含む請求項２１の検出システム。
【請求項２３】
請求項１６の蛋白チップ検出システムを用いた検出方法であって、
（１）試料液中の対応する標的蛋白（Ａ）と特異的に結合できる各種蛋白（Ｂ）を結合した固相基質を、試料液と接触させ、安定な複合体Ｂ−Ａを形成すること、
（２）複合体Ｂ−Ａが、更に蛋白（Ａ）と特異的に結合できる対応する蛋白（標識化Ｃ）と反応し、安定な複合体標識化Ｂ−Ａ−Ｃを形成し、当該標識が化学発光マーカーであること、
（３）化学発光反応を発生させ、光信号を発生させる化学組成物を加えること、
（４）光信号を検出すること、
の工程を含む検出方法。
【請求項２４】
標識物がホースラデイッシュ過酸化酵素である請求項２３の方法。
【請求項２５】
過酸化酵素で標識化された多種類の蛋白混合物が、体液中の標的蛋白質と特異的に結合でき、一定の濃度で混合されている請求項２３の方法。
【請求項２６】
過酸化酵素がホースラデイッシュ過酸化酵素である請求項２４または２５の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、マルチマーカー平行検出を達成できる蛋白チップ、その作製方法およびその使用に関する。
【０００２】
（背景技術）
バイオチップ技術は、１９９０年代中期から起こった一つ新しいバイオテクノロジーであり、一回の反応で多種類情報の平行分析を行うことができるので、たくさんの研究者の注目を受け、迅速にいろいろな生物学分野にて応用された。
バイオチップ技術は、検出対象により分類される。主に遺伝子チップと蛋白チップの二種類に分けられている。遺伝子チップは、ヒトゲノム計画の研究作業に重要な役割を果たすので、当該技術は、僅か数年内に、急速な発展をとげた。現在、ヒトゲノム計画はまもなく完成し、生物科学の研究中心は、間もなくゲノムの研究からプロテオーム（ｐｒｏｔｅｏｍｅ）の研究へ転換する。従って、多くの技術を先導する実験室は、既に研究重点をヒトゲノム中の既知遺伝子に対する機能研究に転換した。
【０００３】
現在、同時に多種類蛋白質を研究するために、ｃＤＮＡアレイ技術が採用されている。蛋白質と蛋白質の間の特異作用は、主に抗原−抗体反応または受容体−リガンドの反応で、蛋白コンフォメーションの特異性を有し、ＤＮＡ配列特異性を持たないため、ｃＤＮＡアレイ技術により蛋白質を検出するには、多くの制限がある。より良い蛋白質と蛋白質機能を研究する手段は、蛋白チップ技術である。固相基質上に固定した多種類蛋白質が構成するマイクロアレイにより、直接に特定機能を持つ標識化蛋白を検出する。蛋白チップの作製は多いに難しいので、現在蛋白チップに対する研究と応用はまだ少ないのである。
既存の尿液、血清及びその他の体液の検出方法として、例えばＥＬＩＳＡ、放射性同位元素標識、金標識、蛍光、化学発光、時間分解蛍光等の多くはシングルマーカーの検出であり、情報量が少なく、且つ全て限定性を持っており、例えば標識化の手順が複雑で、計器と試剤の値段が高く、且つ操作が煩わしく、感度が低く、そして汚染しやすいのである。
【０００４】
（発明の内容）
本発明は、マルチマーカー平行検出を達成できる蛋白チップを提供することである。
更に、本発明は、上述蛋白チップの作製方法を提供することである。
更に、本発明は、上述蛋白チップの検出システムを提供することである。
更に、本発明、上述蛋白チップの検出システムの使用方法を提供することである。
本発明によるマルチマーカー平行検出に用いる蛋白チップの作製原理は、以下に基いている。
１）蛋白質は物理的吸着または共有結合の方式で固相基質に結合できるので、チップの自動スポットシステムを利用して、多種類蛋白質を、高密度に固相基質に固定することができる；
２）固相基質に蛋白を固定しない区域は、無作為に蛋白質及びその他の小分子を吸着することができ、蛋白チップの検出正確度に影響するので、特定のブロッキング液で、固相基質のこの区域を遮断する必要がある；
３）長期に蛋白の活性を保持するために、遮断後の固相基質は低温保存を必要とする。
【０００５】
本発明によるマルチマーカー平行検出に用いる蛋白チップの作製方法は：
１）固定化するそれぞれの蛋白質を、一定の濃度で被覆液に溶解する、
２）チップの自動スポットステムで、これら蛋白質を固相基質上に、２５−２００ ｄｏｔ／ｃｍ２の密度で、０．１−１０ ｎｇ／ｄｏｔの量で固定化する、
３）一晩放置する、
４）ブロッキング液で蛋白チップを遮断且つ凍結乾燥して、４℃で保存する、
工程を含む。
本発明によるマルチマーカー平行検出に用いる蛋白チップは、以下の特徴がある。
１）固相基質は無機基質または有機基質であり、無機基質は、半導体シリコンウエハー、ガラスプレート、微孔シリコンウエハー、微孔ガラス等を含み、ガラスプレートが好ましく選定される。有機基質は、酢酸セルロース膜、硝酸セルロース膜、ナイロン膜、ポリプロピレン・フィルム等を含み、硝酸セルロース膜が好ましく選定される。
２）蛋白質は、抗原、抗体、受容体、リガンド等であることができ、更に病気関連蛋白、特に腫瘍マーカーと特異的に結合する蛋白質を指す。その中の受容体は、細胞膜上または細胞内の生物活性分子であることができ、それらは、薬物、毒素、神経伝達物質、ホルモン、抗原、細胞粘着性分子等などの生物活性分子を識別でき、且つそれに結合できるものである。受容体は、生物活性分子により産生された情報をエフェクターへ伝達し、対応する生物効果を引起すことができる。これら生物分子の多くは蛋白質であり、その少しは糖脂質である。リガンドは受容体と特異的に結合をすることができる、薬物、毒素、神経伝達物質、ホルモン、抗原、細胞粘着性分子等の生物活性分子である。本発明による受容体とリガンドは蛋白質である。
【０００６】
３）事前にチップ上の蛋白質の濃度を調節して、多種類蛋白質が一連の反応により生成する化学発光信号を二つの隣接するマグニチュード・オーダー数量クラス内（最強信号の強度が、最弱信号の強度の１００倍未満とする）になるようにする。
４）被覆液は、ｐＨ ９．０−１０．０（一番良い９．６）のＣＢＳ（ＮａＨＣＯ３−Ｎａ２ＣＯ３）である。
被覆液の役割は一定のｐＨ範囲を提供し、蛋白質と固相基質の間の化学反応や物理吸着反応を液相にてより良く結合させる。
５）ブロッキング液は、０．１−０．５％Ｔｗｅｅｎ ２０、０．０２−０．３％チロシン、１−９％蔗糖、１−９％ＢＳＡ、０．１−１％プロシリン（ｐｒｏｃｌｉｎ）を含むＴＢＳ（０．７−０．９％ＮａＣｌ、１．０−１．５％Ｔｒｉｓ）で、一番良いのは、０．２％Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１％チロシン、４％蔗糖、５％ＢＳＡ、０．５％ｐｒｏｃｌｉｎを含むＴＢＳである。優れた点は、チロシンとＢＳＡが遮断作用を持ち、プロシリンが耐腐でき、蔗糖が不活性物質であり、空気と隔離することができ、ＢＳＡと蔗糖がフレーム構造を支持することができる。ブロッキング液の役割は、固相基質のその他の部位に、蛋白質を結合させなく、実験データの正確度を保持することができる。
【０００７】
本発明では、その他の幾つかのブロッキング液、ＴＴＢＳ緩衝液（０．１％（Ｖ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０のＴＢＳ）；１０％脱脂粉乳を含むＴＢＳ；０．２％カゼインを含むＴＴＢＳ（Ｂｅｊｕｒｒｕｍ ａｎｄ Ｓｃｈａｔｅｒ−Ｎｉｅｌｓｅｎ、１９８６；Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ ａｎｄ Ｈｕｄｓｐｅｔｈ、１９９１；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、１９８８；Ｓｃｈｎｅｐｐｅｎｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９１）；５％（Ｗ／Ｖ）脱脂粉乳のＰＢＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ ｅｄ）： Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ）などを試みた。
結果として、信号がノイズに対する比の分析を通じて、本発明が提供するブロッキング液は、上述のいずれよりも優れていると証明された。
６）本発明の検出対象は、各種体液であるので、材料の獲得が便利で、且つ患者に刺激が少ない。
以上の濃度単位は、特に説明がない限り、全てＷ／Ｖである。
【０００８】
本発明で提供される蛋白チップの検出原理は以下の通りである。
蛋白チップに固定化された各種蛋白質（Ｂという）は、特異的に体液、組織、細胞等に含まれる対応蛋白質（Ａという）と結合することができる。結合後の蛋白複合体（Ｂ−Ａ）は、対応蛋白質（Ａ）のもう一つの特異的に結合可能な蛋白（Ｃという）と結合できる。Ｃは既に過酸化酵素で標記されて（Ｃ−標識という）いるので、四連複合体（Ｂ−Ａ−Ｃ−標識）を形成する。該過酸化酵素は、化学発光反応を触媒でき、発生した光信号の強さは、特定の生物チップ検出器で定量的に検出されるので、被検出光信号の強さで、試料中に含まれた蛋白質（Ａ）の含有量を検出することができる。
本発明に示したマルチマーカー平行検出に用いる蛋白チップの検出システムには、
（１）マルチマーカー平行検出に用いる蛋白チップ、
（２）過酸化酵素で標識された多種類蛋白質混合物、
（３）体液試料の希釈に用いる希釈液、
（４）化学発光反応を発生させ且つ増強させる化学組成物、
（５）洗浄液、
（６）検出すべき蛋白質の一連の標準品
などを含む。
【０００９】
本発明によるマルチマーカー平行検出に用いる蛋白チップ検出システムの使用方法は、
１）希釈液で測定を待つ試料の上澄液を、５−２０倍に希釈する；
２）試料の上澄液を吸い取り、蛋白チップの表面上に約５００μｌ／ｃｍ２の密度で滴下し、２００−３００回転／分で２０−３７℃で、２０−３０分間を震動し、試料中の対応蛋白質（Ａ）に、蛋白質チップに固定された蛋白（Ｂ）と反応させ、安定的複合体Ｂ−Ａを形成する；
３）反応後、反応液を除き、蛋白質チップを２０−３７℃で洗浄液中に浸漬し、３−６分間を震動し、これらを繰り返す；
４）過酸化酵素でラベルした多種類蛋白質混合物（Ｃ−標識）を吸い取り、約５００μｌ／ｃｍ２の密度で蛋白チップの表面に滴下し、２００−３００回転／分で２０−３７℃で２０−３０分間を震動し、安定複合体Ｂ−Ａ中のＢ部分に、多蛋白質混合液中の対応する過酸化酵素でラベルした特異性結合蛋白（Ｃ−標識）と反応させ、安定な三量体Ｂ−Ａ−Ｃ−標識を形成する；
５）反応後、反応液を除き、蛋白チップを２０−３７℃で洗浄液中に浸漬し、３−６分間を震動し、これらを繰り返す；
６）室温で蛋白質チップを乾燥させ、チップ表面に、化学発光反応を発生させる化学組成物を１００μｌ／ｃｍ２で滴下し、２０−３７℃で３−５分間触媒反応を行う；
７）チップを取出し、特定の生物チップ検出器で光信号を検出する、
工程を含む。
【００１０】
本発明によるマルチマーカー平行検出に用いる蛋白チップ検出システムは、以下の幾つか特徴を持つ。以下の濃度単位は、特別に説明がある以外に、全てＷ／Ｖである。
１）多種類蛋白混合物は、過酸化酵素でラベルした多種類蛋白質混合物であり、体液試料中の蛋白質と特異的に結合が可能である。
２）標識物は、過酸化酵素であることができ、更に過酸化酵素はホースラディシュ過酸化酵素である。
３）洗浄液は、０．７−０．９％ＮａＣｌ、１．０−１．５％ Ｔｒｉｓ、０．０５−０．２％Ｔｗｅｅｎ ２０を含み、ｐＨ値を６．０〜９．０とする。その中に一番良い調合の度合は０．９％ＮａＣｌ、１．２１％ Ｔｒｉｓ、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０であり、ｐＨ値を７．５０とする。
４）希釈液には、０．７−０．９％ＮａＣｌ、１．０−１．５％ Ｔｒｉｓ、０．０５−０．２％Ｔｗｅｅｎ ２０、０．０５−０．２％チロシンを含む。その中に一番良い調合の度合は０．９％ＮａＣｌ、１．２１％ Ｔｒｉｓ、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１％チロシンである。
５）安定溶液の調合の度合は、７０−８０％ Ａ溶液（Ｖ／Ｖ）＋５−２０％エチレングリコール（Ｖ／Ｖ）＋１−９％蔗糖（Ｗ／Ｖ）＋０．１−１％ｐｒｏｃｌｉｎ（Ｖ／Ｖ）＋０．０５−０．５％ＥＤＴＡ×／ＦＯＮＴ＞２Ｎａ（Ａ溶液が４０−６０％ ０．０５ Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）と４０−６０％胎牛血清を含む）である。一番良い調合の度合は、８０％ Ａ溶液（Ｖ／Ｖ）＋１９％エチレングリコール（Ｖ／Ｖ）＋３％蔗糖（Ｗ／Ｖ）＋０．５％ ｐｒｏｃｌｉｎ（Ｖ／Ｖ）＋０．２％ＥＤＴＡ×／ＦＯＮＴ＞２Ｎａ（Ａ溶液が６０％ ０．０５ Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）と４０％胎牛血清を含む）である。
【００１１】
６）一連の標準品とは、多種違う異なった濃度の被検蛋白質の混合物で、蛋白チップにある蛋白質が結合する被検出蛋白質（体液から検出されること）で混合により調製したものを指す。当該標準品は、蛋白チップにある多種類蛋白と結合することができ、上述使用方法に示した反応手順により、蛋白チップにある各蛋白位置に、全て一定の光信号強さを検出することができる。例えば検出システム中の標準品を対照としたら、被検サンプルは、標準品に対し顕著な信号差異があり、当該指標が陽性だと表明する。標準品は使用前に、脱イオン水でリコンストラックションする。
７）化学発光反応には、化学発光反応（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）と増強型化学発光反応（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）の２種類がある。本発明で化学発光を発生させる化学組成物は、増強型化学発光反応に基くものである。反応に関わる試薬はルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン  ナトリウム塩）、Ｈ２Ｏ２（過酸化水素）、増強因子［Ｅｏｓｉｎ−（エオシン）またはＰＩＰ（ｐ−ヨードフェノール）］、過酸化酵素（例えばホースラデイシュ過酸化酵素、ＨＲＰ）であり、全てＳｉｇｍａ社から購入したものである。
【００１２】
本発明によるマルチマーカー平行検出に用いる蛋白チップの一つ顕著な優れた点は、同時に多種類の病気マーカーを検出するのに用いることができ、検出の正確度を大いに増加させるものである。病気関連マーカーの多くは、非特異的マーカーである。多種類のマーカーの量が同一の病気において同時に顕著に高まり、また、同一のマーカーの量が多種類の病気において高まることがある。このような情況は、病気診断上の難しさをもたらし、誤診に導く。腫瘍の検出に対し、広く使用されているマーカーは、全て非特異的マーカーであり、公認された原発性肝臓癌指標ＡＦＰ（フェトプロティン）さえ肝臓癌に対する検出率は僅か７０％ぐらいであり、且つＡＦＰは、睾丸癌、奇形腫、胃癌、膵臓癌等の多くの患者の血清にも顕著な向上がある。従って多種類マーカーを検出する必要性を見出した。例えば膵臓癌：ＣＡ１９−９検出率が約６０％で、その中にＣＡ１２５、ＣＡ５０及びＤＵ−ＰＡＮ−を加えたら、検出率が９０％以上に向上することができる。例えば肺癌：ＣＥＡだけで肺癌に対する診断は、既に高い特異性があったが、ＮＳＥ、シアル酸、ＣＥＡ、ＳＣＣを加えたら、その特異性がより高い。
【００１３】
本発明によるマルチマーカー平行検出に用いる蛋白チップのもう一つ優れた点は、感度が高く、化学発光反応と増強発光反応を利用し、本蛋白チップが、体液１ｍｌごとにわずか１ｐｇの目標蛋白質を検出できることがある。これは、特異性が高いが、体液に含有量が低い多くの蛋白質マーカーを臨床検査に用いることができ、臨床検査指標の選択範囲を拡大した。
蛋白チップは、その独特の優れた点により、現代医学診断学に高効率、便利、快速、正確な臨床検出手段を提供できる。難病に対する診断及び悪性病気（例えば腫瘍）に対する早期診断と適時の治療に、重大な意義がある。蛋白質は遺伝子により更に生命活動の物質層面に接近するので、蛋白チップは病気診断と治療、新型薬物開発、病気の分子機理等を探索する生命科学の関連分野に、遺伝子チップにより直接な応用前途がある。
【００１４】
臨床診断キットの技術評価において、本発明の蛋白チップ検出システムが達成する情況は以下の通りである。
感度：真陽性／（真陽性＋偽陰性）＞８０％。
対血清サンプルに対して検出下限は１０−１２ｇ／ｍＬ。
特異性：真陰性／（真陰性＋偽陽性）＞９５％。
安定性：４℃で安定に２年間放置でき、３７℃で安定に１週間放置できる。
簡便性：１．５時間内に実験を完成する。
安全性：無放射性、無汚染。
【００１５】
以下に、具体的実施例で、更に本発明を説明するが、本発明の範囲は限定されない。
実施例１      蛋白チップの作製
固相基質：硝酸セルロース膜。
固相基質に固定化する蛋白質：腫瘍マーカーに対するモノクローナル抗体。使用量が５ ｎｇで、密度が２５ ｄｏｔ／０．３６ｃｍ２である。
固定化蛋白質：Ａ１、Ａ２：ＣＡ１５３抗体、Ａ３、Ａ４：ＣＡ１９−９抗体、Ａ５：ネガテイブ対照、Ｂ１、Ｂ２：ＣＡ１２５抗体、Ｂ３、Ｃ４：ＡＦＰ抗体、Ｃ１、Ｃ２：ＣＡ１２５抗体、Ｃ３、Ｂ４：ｂｅｔａ−ＨＣＧ抗体、Ｂ５、Ｃ５：ＣＡ１９−５抗体、Ｄ１、Ｄ２：ＰＳＡ抗体、Ｄ３、Ｅ４：ＣＥＡ抗体、Ｅ１、Ｅ２：ＰＳＡ抗体、Ｅ３、Ｄ４：ＣＡ１５−３抗体、Ｄ５、Ｅ５：ＣＡ５４９抗体である。
抗体は、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ， ＣａｎＡｇから購入する。
ＡＦＰ：フェトプロティン、ＣＥＡ：癌胎児性抗原、ＰＳＡ：前立腺特異性抗原、ベータＨＣＧ：人絨毛性性腺刺激ホルモンベータサブユニット、ＣＡ：糖類抗原に総称し、ネガテイブ対照：何れものアプリケーションの物を加えない。
被覆液：ｐＨ ９．６のＣＢＳ（ＮａＨＣＯ３−Ｎａ２ＣＯ３）。
ブロッキング液：０．９％ＮａＣｌ、１．２１％Ｔｒｉｓ、０．２％Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１％チロシン、４％蔗糖、５％ＢＳＡ、０．５％ｐｒｏｃｌｉｎ。
【００１６】
作製手順：
１）蛋白チップに固定化する蛋白質を、被覆液に溶解し、その濃度を２５％とし、その後チップ自動スポットシステム（ＢｉｏＧｒｉｄ Ｔｏｔａｌ Ａｒｒａｙ Ｓｙｓｔｅｎ， ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ公司）で、これら蛋白質を、固相基質に固定化する。
２）一晩放置する。
３）ブロッキング液で蛋白チップを遮断且つ凍結乾燥し、４℃で保存する。
【００１７】
実施例２  蛋白の検出
正常人の血清（図１）と肝臓癌患者血清（図２）を、本発明蛋白チップにより検出した結果を比較する。
正常人血清と肝臓癌病人の血清は、全て上海市第八人民病院腫瘍科から来る。
蛋白質の固定化位置は、実施例１と同じである。
【００１８】
操作手順：
１）希釈液で測定を待つ血清の上澄液を５倍に希釈する。
２）希釈液を吸い取り、約５００μｌ／ｃｍ２の密度で蛋白チップの表面に滴下し、３００回転／分の頻度で３７℃で、２５分間を震動し、体液中の腫瘍マーカー蛋白を、蛋白チップに固定したモノクローナル抗体と反応させ、抗原−抗体複合体を形成する。
３）反応後に、反応液を除き、蛋白チップを洗浄液中に浸漬し、４分間震動し、三回繰り返す。
４）ホースラディシュ過酸化酵素でラベルした多種類モノクローナル抗体混合液（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ， ＣａｎＡｇ社から購入する）を吸い取り、約５００μｌ／ｃｍ２の密度で蛋白チップの表面に滴下し、３００回転／分の頻度で３７℃で、２５分間を震動し、抗原抗体複合体が、多種類モノクローナル抗体混合液中のほかの一つモノクローナル抗体と結合し、安定した三量体（抗体−抗原−ほかの一つモノクローナル抗体（標ＨＲＰ）複合体）を形成する。
５）反応後に反応液を除き、蛋白チップを洗浄液中に浸漬し、４分間を震動し、三回繰り返す。
６）室温で乾燥後のチップ表面に、化学発光反応を発生させる化学組成物を１００μｌ／ｃｍ２で滴下し、３７℃で３分間触媒反応する。化学組成物は、ルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン  ナトリウム塩）、Ｈ２Ｏ２（過酸化水素）、増強因子（Ｅｎｈａｎｃｅｒ）、ホースラデイッシュ過酸化酵素（ＨＲＰ）であり、すべてＳｉｇｍａ社から購入する。
７）チップを取り出し、１０分間で、光信号を検出する。光信号をレンズにより結像させ、更に光信号をデジタル信号に転換し、ソフトウエアで定量分析を行う。検出可能な最小信号を蛋白に転換する量は、１０−１２ｇである。
【００１９】
結果は図に示すように、（Ａ３，Ａ４）と（Ｂ３，Ｃ４）のところにて、肝臓癌患者の血清検出結果は、正常人血清の検出結果と強烈な信号差異があり、これらの位置に対応する検出された腫瘍マーカーがＣＡ１９−９とＡＦＰである。
【００２０】
（産業上の利用可能性）
本発明の蛋白チップは、検出の正確度を極大に向上させ、且つ信頼性が高く、検出の感度が高い等優れた点を持ち、広範に分子生物学、生物医学、人類蛋白質グループ研究に応用し、特に臨床診断に応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明の蛋白チップで標準血清を検出した結果の図である。
【図２】
図２は、本発明の蛋白チップで肝臓癌患者の血清を検出した結果の図である。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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