(57)【要約】発明者は、リソスタフィン活性を有する酵素が洗濯物から悪臭を削減できることを見出した。従って、リソスタフィン活性を有する酵素と洗濯物とを接触せしめることを含んで成る方法；及び界面活性剤、及びリソスタフィン活性を有する酵素を含んで成る組成物が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リソスタフィン活性を有する酵素と洗濯物とを接触せしめることを含んで成る方法。
【請求項２】
前記酵素がリソスタフィンである請求項１記載の方法。
【請求項３】
洗濯物から悪臭を削減するための方法である請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記“悪臭指数（48時間）”が、リソスタフィン活性を有する酵素と接触されていない選択物に比較して、10％低められる請求項３記載の方法。
【請求項５】
界面活性剤、及びリソスタフィン活性を有する酵素を含んで成る組成物。
【請求項６】
前記酵素がリソスタフィンである請求項５記載の組成物。
【請求項７】
洗濯物から悪臭を削減するためへの酵素の使用。
【請求項８】
洗濯物から悪臭を削減するためへのリソスタフィン活性を有する酵素の使用。
【請求項９】
洗濯物から悪臭を削減するためへのリソスタフィンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、洗濯物からの悪臭の酵素的削減に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、スポーツ活動のために、又は他の手段において使用される衣類は、使用の間、着用者からの発汗に暴露され、洗濯機における洗浄にゆだねられる場合、汗の臭気及び他の身体の臭気（悪臭）の点から清浄するためには時々、困難である。
【０００３】
発明の要約：
発明者は、リソスタフィン活性を有する酵素が洗濯物から悪臭を削減できることを見出した。従って、本発明は、リソスタフィン活性を有する酵素と洗濯物とを接触せしめることを含んで成る方法を提供する。
第２の観点においては、界面活性剤、及びリソスタフィン活性を有する酵素を含んで成る組成物が提供される。
もう１つの観点においては、酵素が洗濯物における悪臭を削減するために使用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００４】
リソスタフィン：
酵素リソスタフィンは、酵素分類E．C．3．4．24．75からのグリシル−グリシンエンドペプチダーゼである。それは、スタフィロコーカス（Staphylococcal）細胞壁ペプチドグリカンを連結するポリグリシンペプチド間結合における−Gly−Gly−結合を加水分解する。リソスタフィンは、いくつかの製造業者、例えばSigma−Aldrich，Inc. から市販されている。
リソスタフィン活性を有する酵素は、アミノ酸置換又は欠失が導入されている、リソスタフィンの天然又は合成変異体であり得る。それはまた、任意には、１又は複数の他のタンパク質に融合される、リソスタフィン活性を有するアミノ酸フラグメントでもあり得る。
【０００５】
リソスタフィン活性：
１単位のリソスタフィン活性は、初期吸光度が、pH7.5及び37℃での10分後、約0.250である場合、スタフィロコーカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）(AtCC6538) の懸濁液の濁り度（620nmでの吸光度）を、50％低めるであろう。
【０００６】
悪臭：
着用の間、布は、微生物の基質として作用する、皮脂性脂質、汗及び死亡皮膚細胞と共に、ヒト皮膚からの微生物により汚染さる。特に、軽い洗浄条件下で、それらの微生物は、洗濯を生存する。家庭用洗濯を生存する微生物の結果が、布における悪臭生成である。本発明者は、それらの微生物が主にスタフィロコーカス種であることを見出した。
【０００７】
従って、本発明の方法の悪臭は、ヒト皮膚との接触に起因する洗濯物に存在するすべての身体臭気を含んで成る。１つの態様においては、悪臭は、スタフィロコーカス種（例えば、S．アウレウス、S．エピダーミス（S．epidermis），S．インテルメジウス（S．intermedius）, S. サプロフィチカス（S. saprophyticus）及びS．ヒルカス（S．hylcus））の活性に起因する。
さらにもう1つの態様においては、悪臭は、わきのしたと接触した布に起因する。
【０００８】
悪臭の評価：
湿った洗濯物スワッチが、スナップ蓋付きの色を着けられた200mlのガラス製品に置かれた。訓練された検知調査員（10人）が、湿った製品上のヘッドスペースを鼻でにおいをかぎ、そして合計の臭気の強さを示すことによって臭気を評価する。臭気の強さは、０〜15の尺度で示される、ここで０は“悪臭なし”に等しく、そして15は“非常に強い悪臭”に等しい。すべての評価は、２度（二重決定）行われる。スワッチは、約24時間後及び48時間後に評価される（スワッチはすべての時間でガラス製品において維持される）。すべての20の評価（10人がそれぞれ２度、評価する）の平均は、24及び48時間後に計算される。それらの平均値は、“悪臭指数（24時間）”及び“悪臭指数（48時間）”として言及される。
【０００９】
洗濯物：
本発明の方法の洗濯物は、衣服として使用されるために、又はヒト皮膚との接触を含んで成る他の手段における個人使用のために適切なすべての種類の織物品目又は布を包含する。
【００１０】
方法及び使用：
リソスタフィン活性を有する酵素と洗濯物とを、本発明の方法に定義されるようにして、接触せしめることによって、上記で定義されるような“悪臭指数（48時間）”は、リソスタフィン活性を有する酵素と接触されなかった洗濯物に比較して、少なくとも10％（好ましくは、20％、より好ましくは30％、最も好ましくは40％及び特に50％）、低められ得る。
【００１１】
本発明の方法はまた、洗濯物における微生物細胞の殺害又はその増殖の阻害をもたらす。１つの態様においては、微生物細胞は、細菌、例えばスタフィロコーカス種である。もう１つの態様においては、本発明の方法は、少なくとも25％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも90％及び最も好ましくは少なくとも99％の生存微生物細胞の数の低下をもたらすことができる。
【００１２】
本発明においては、用語“微生物細胞の増殖の阻害”とは、細胞が非増殖状態にあり、すなわちそれらが増殖しないことを意味する。用語“微生物細胞”とは、細菌細胞（例えば、スタフィロコーカス）、菌類細胞又は藻類を示し、そして用語“微生物”とは、菌類（酵母を包含する）又は細菌を示す。
本発明は、洗濯物品目から悪臭を低めるための酵素の使用を包含する。１つの態様においては、酵素はリソスタフィン活性を有することができる。本発明はまた、洗濯物における生存細菌の数を低めるために；洗濯物におけるアレルゲンを低めるために；又は洗濯物を殺菌するためにも使用され得る。
【００１３】
洗剤組成物：
リソスタフィンは、洗剤組成物に添加され得、そして従って、洗剤組成物の成分になることができる。
本発明の洗剤組成物は、手動又は機械洗濯用洗剤組成物、例えば染色された布の前処理のために適切な洗濯用添加剤組成物及びすすぎ用布ソフトナー組成物として配合され得、又は一般的な家庭用硬質表面洗浄操作における使用のための洗剤組成物として配合され得、又は手動又は機械皿洗い操作のために配合され得る。
【００１４】
特定の観点においては、本発明は、本発明のサブチラーゼ酵素を含んで成る洗剤添加剤を提供する。前記洗剤添加剤及び洗剤組成物は、１又は複数の他の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カーボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えばラッカーゼ及び/又はポロキシダーゼを含んで成ることができる。
一般的に、選択された酵素の性質は、選択された洗剤と適合できるべきであり（すなわち、他の酵素及び非酵素の成分、等とのpH−最適適合性）、そして酵素は効果的な量で存在すべきである。
【００１５】
プロテアーゼ：適切なプロテアーゼは、動物、植物又は微生物起源のものを包含する。微生物起源が好ましい。化学的に修飾された、又はタンパク質構築された変異体が含まれる。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ又は金属プロテアーゼ、好ましくはアルカリ微生物プロテアーゼ又はトリプシン−様プロテアーゼであり得る。アルカリプロテアーゼの例は、スブチリシン、特にバチルスに由来するそれらのもの、例えばスブチリシンNovo、スブチリシンCarlsberg、スブチリシン309、スブチリシン147及びスブチリシン168（WO89/06279号に記載される）である。トリプシン−様プロテアーゼの例は、トリプシン（例えば、ブタ又はウシ起源のもの）、及びWO89/06270号及びWO94/25583号に記載されるフサリウムプロテアーゼである。
【００１６】
有用なプロテアーゼの例は、WO92/19729号、WO98/20115号、WO98/20116号及びWO98/34946号に記載される変異体、特に１又は複数の次の位置での置換を有する変異体である：27, 35, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235及び274。
好ましい市販のプロテアーゼ酵素は、AlcalaseTM, SavinaseTM, PrimaseTM, DuralaseTM, EsperaseTM及びKannaseTM(Novo Nordisk A/S), MaxataseTM, MaxacalTM, MaxapemTM, ProperaseTM, PurafectTM, Purafect OxPTM, FN2TM及びFN3TM(Genencor International Inc.) を包含する。
【００１７】
リパーゼ：適切なリパーゼは、細菌又は菌類起源のそれらのものを包含する。化学的に修飾された又はタンパク質構築された変異体が包含される。有用なリパーゼの例は、ヒューミコラ（別名、サーモミセス）、例えばヨーロッパ特許第258068号及び第305216号に記載のようなヒューミコラ・ラウギノサ（T.ラウギノサ）、又はWO96/13580号に記載のようなヒューミコラ・インソレンス、P.アルカリゲネス又はP.プソイドアルカリゲネス（ヨーロッパ特許第218272号）、P.セパシア（ヨーロッパ特許第331376号）、P.スツゼリ（P.stutzeri）(イギリス特許第1,372,034号)、P.フルオレセンス、プソイドモナスsp. SD705株（WO75/06720号及びWO96/27002号）、P.ウイスコンシネンシス（WO96/12012号）からのリパーゼ、バチルスリーパーゼ、例えばB.スブチリス（Dartoisなど. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360）、B. ステアロサーモフィラス（日本特許64/744992）又はB.プミラス（WO91/16422号）からのリーパーゼを包含する。
【００１８】
他の例は、リパーゼ変異体、例えばWO92/05249号、WO94/01541号、ヨーロッパ特許第407225号、ヨーロッパ特許第206105号、WO95/35381号、WO96/00292号、WO95/30744号、WO94/25576号、WO95/14783号、WO95/22615号、WO97/04079号及びWO97/0720号に記載されるものを包含する。
好ましい市販のリパーゼ酵素は、LipolaseTM及びLipolase UltraTM(Novo Nordisk A/S) を包含する。
【００１９】
アミラーゼ：適切なアミラーゼ（α−及び/又はβ）は、細菌又は菌類起源のそれらのものを包含する。化学的に修飾された又はタンパク質構築された変異体が包含される。アミラーゼは、バチルス、例えばイギリス特許第1,296,839号により詳細に記載される、B.リケニルホルミスの特許株から得られるα−アミラーゼを包含する。
有用なアミラーゼの例は、WO94/02597号、WO94/18314号、WO96/23873号及びWO/43424号に記載される変異体、特に１又は複数の次の位置での置換を有する変異体である：15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408及び444。
市販のアミラーゼは、DuramylTM, TermamaylTM, FungamylTM及びBAMTM(Novo Nordisk A/S), RapidaseTM及びPurastarTM(Genencor International Inc.)である。
【００２０】
セルラーゼ：適切なセルラーゼは、細菌又は菌類起源のそれらのものを包含する。化学的に修飾された又はタンパク質構築された変異体が包含される。適切なセルラーゼは、バチルス、ヒューミコラ、フサリウム、チエラビア、アクレモニウム属からのセルラーゼ、例えばアメリカ特許第4,435,307号、アメリカ特許第5,648,263号、アメリカ特許第5,691,178号、アメリカ特許第5,776,757号及びWO89/09259号に開示されるヒューミコラ・インソレンス、マイセリオプソラ・サーモフィラ/オキシスポラムから生成される菌類セルラーゼを包含する。
【００２１】
特に適切なセルラーゼは、色彩保護有益性を有するアルカリ又は中性セルラーゼである。そのようなセルラーゼの例は、ヨーロッパ特許第0495257号、ヨーロッパ特許第0531372号、WO96/11262号、WO96/29397号、WO98/08940号に記載されるセルラーゼである。例の例は、WO94/07998号、ヨーロッパ特許第0531315号、アメリカ特許第5,457,046号、アメリカ特許第5,685,593号、アメリカ特許第5,763,254号、WO95/24471号、WO98/12307号及びPCT/DK98/0299号に記載されるそれらのものである。
市販のセルラーゼは、CelluzymeTM及びCarezymeTM(Novo Nordisk A/S), ClazinaseTM及びPuradex HATM(Genencor International Inc.) 及びKAC−500 (B)TM(Kao Corporation) を包含する。
【００２２】
ペルオキシダーゼ/オキシダーゼ：適切なペルオキシダーゼ/オキシダーゼは、植物、細菌又は菌類起源のそれらのものを包含する。化学的に修飾された又はタンパク質構築された変異体が包含される。有用なペルオキシダーゼの例は、コプリナス、例えばコプリナス・シネレウス、及びWO93/24618 号、WO95/10602号及びWO98/15257号に記載されるそれらのようなそれらの変異体からのペルオキシダーゼを包含する。
【００２３】
洗剤酵素は、１又は複数の酵素を含む別々の添加剤を添加することにより、又はそれらの酵素のすべてを含んで成る組合された添加剤を添加することにより洗剤組成物に包含され得る。本発明の洗剤添加剤、すなわち別々の添加剤又は組合された添加剤が、例えば粒質物、液体、スラリー、等として配合され得る。好ましくは洗剤添加剤配合物は、粒質物、特に非−ダスチング粒質物、液体、特に安定された液体又はスラリーである。
【００２４】
非−ダスチング粒質物は、アメリカ特許第4,106,991号及び第4,661,452号に開示のようにして生成され得、そして任意には、当業界において知られている方法により被覆され得る。蝋被覆材料の例は、1000〜20,000の平均モル重量を有するポリ（酸化エチレン）生成物（ポリエチレングリコール、PEG）；16〜50の酸化エチレン単位を有する、エトキシル化されたノニルフェノール；12〜20個の炭素原子を有するアルコールを有し、そして15〜80の酸化エチレン単位を有する、エトキシ化された脂肪アルコール；脂肪アルコール、脂肪酸；及び脂肪酸のモノ−、ジ−及びトリグリセリドである。
【００２５】
流動層技法による適用のために適切なフィルム形成被覆材料の例は、イギリス特許第1483591号に与えられている。例えば、液体酵素調製物は、確立された方法に従って、ポリオール、例えばプロピレングリコール、糖又は糖アルコール、硫酸又は硼酸を添加することによって、安定化される。保護された酵素は、ヨーロッパ特許第238,216号に開示される方法に従って調製され得る。
【００２６】
本発明の洗剤組成物は、いずれかの便利な形、例えば棒状、錠剤、粉末、顆粒、ペースト又は液体の形で存在することができる。液体洗剤は、水性であり、典型的には、70％までの水及び０〜30％の有機溶媒を含み、又は非水性であり得る。
洗剤組成物は、非イオン性、例えば半−極性及び/又はアニオン性及び/又はカチオン性及び/又は両性イオンであり得る１又は複数の界面活性剤を含んで成る。界面活性剤は典型的には、0.1〜6.0重量％のレベルで存在する。
【００２７】
そこに含まれる場合、洗剤は通常、約１％〜約40％のアニオン性界面活性剤、例えば線状アルキルベンゼンスルホネート、α−オレフィンスルホネート、アルキルスルフェート（脂肪酸スルフェート）、アルコールエトキシスルフェート、第二アルカンスルホネート、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−又はアルケニル琥珀酸又は石鹸を含むであろう。
【００２８】
そこに含まれる場合、界面活性剤は通常、約0.2％〜約40％の非イオン性界面活性剤、例えばアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化された脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミンのN−アシルN−アルキル誘導体（“グルコサミド”）を含むであろう。
【００２９】
洗剤は、０〜65％の洗剤ビルダー又は錯生成剤、例えばゼオライト、ジホスフェート、三リン酸、ホスホネート、カーボネート、シトレート、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン六酢酸、アルキル−又はアルキニル琥珀酸、可溶性シリケート又は層化されたシリケート（例えばHoechstからのSKS−６）を含むことができる。
洗剤は、１又は複数のポリマーを含んで成る。例としては、カルボキシメチルセルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピリジン−N−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリカルボキシレート（例えばポリアクリレート、マレイン酸/アクリル酸コポリマー及びラウリルメタクリレート/アクリル酸コポリマーを含んで成る。
【００３０】
洗剤は、H2O2源を含んで成る漂白システム、例えば過酸形成漂白活性化剤、例えばテトラアセチルエチレンジアミン又はノナノイルオキシベンゼンスルホネートと共に組合され得る過硼酸塩又は過炭酸塩を含むことができる。他方では、漂白システムは、例えばアミド、イミド又はスルホン型のペルオキシ酸を含むことができる。
本発明の洗剤組成物の酵素は、従来の安定剤、例えばポリオール、例えばプロピレングリコール又はグリセロール、糖又は糖アルコール、乳酸、硼酸又は硼酸誘導体、例えば芳香族硼酸エステル又はフェニル硼素酸誘導体、例えば４−ホルミルフェニル硼素酸を用いて安定化され得、そして前記組成物は、例えばWO92/19709号及びWO92/19708号に記載のようにして配合され得る。
【００３１】
洗剤はまた、他の従来の洗剤組成物、例えば布コンディショナー、例えばクレー、泡増強剤、石鹸泡抑制剤、抗腐蝕剤、土壌懸濁剤、抗−土壌再沈着剤、染料、殺菌剤、蛍光増白剤、ヒドロトロープ、曇りインヒビター、又は香料を含むことができる。
洗剤組成物においては、いずれかの酵素、特にリソスタフィンは、洗浄液体１L当たり0.01−100mgの酵素タンパク質、好ましくは洗浄液体１L当たり0.05−10mgの酵素タンパク質、よりこのましくは洗浄液体１L当たり0.1−５mgの酵素タンパク質、及び最も好ましくは洗浄液体１L当たり0.1−1mgの酵素タンパク質に対応する量で添加され得ることが、現在企画される。
【００３２】
リソスタフィンはさらに、引用により本明細書に組込まれるWO97/07202号に開示される洗剤配合物に組込まれ得る。
本発明はさらに、次の例により例示されるが、それらは本発明を制限するものではない。
【実施例】
【００３３】
次の例に使用される化学薬品は、少なくとも試薬品種の商品であった。
Molthus Flexi M2060測定器は、Malthus Instruments Limited, England から入手できる。
トリプトンダイズブイヨン（TSB）は、Oxoid, Englandから入手できる。
CFU：コロニー形成単位、
【００３４】
例１．ヒトわきのしたの汗及び皮脂により汚されたスワッチにおける臭気の評価
リソスタフィンの臭気削減効果を、サーモスタットを備えたTerg-O-tometer (United States Tasting Co., 1415 Park Ave, Hoboken NJ07030から入手できる)において行われる１−サイクル洗浄試験により試験する。
【００３５】
実験条件：
汚損：
100％ポリエステル又は100％綿のスワッチ（10×14cm；溶媒抽出（ポリエステルについてヘキサン、綿についてクロロホルム）により、Soxhletを用いて前もって清浄された）を過度の運動の後、男性ランナーのわきのした及び上半身からのヒト男性わきのしたの汚れ及び皮脂を適用することによって汚す。
【００３６】
２枚のスワッチ（10×14cm；１つのスワッチは100％ポリエステルから製造され、そして他の１つのスワッチは100％綿から製造される）を、個々の男性のために使用する。左側のわきのした及び上半身及び上半身の左側部分を1つのスワッチによりふき取り、そして右側のわきのした及び上半身の右側部分を、運動の後、他のスワッチによりふき取る。この方法を、洗浄の前、２度行う、洗浄の前、個々のスワッチを12の等しいサイズの片に切断し、そして４個のTerg−O−tometer洗浄用ビーカー間に分配する。綿及びポリエステル織物は別々に維持される。
【００３７】
洗浄：
洗浄を、リン酸緩衝液（0.05M, pH7.5）を用いて、Terg−O−tometerにおいて行う：
温度：32℃
リソスタフィン用量：5mg/l（Sigma L4402）
洗浄時間：12分
洗浄液体：洗浄ビーカー当たり1000ml
すすぎ：水道水において15分
【００３８】
感覚的評価：
洗浄の後、湿ったスワッチを評価し、そして“悪臭指数（24時間）及び”悪臭指数（48時間）を計算する。その結果は、より低い“悪臭指数（48時間）”がリソスタフィンにより洗浄されなかったそれらに比較して、リソスタフィンにより洗浄されたスワッチにより得られることを示す。
【００３９】
例２．リソスタフィンによる織物からの細菌の除去
スタフィロコーカス・アウレウス（ATCC6538）を一晩、増殖し（TSB：トリプトンダイズブイヨン）、そして希釈されたTBS（１：１）において約103個のコロニー形成単位/ml（CFU/ml）まで接種する。殺菌した綿スワッチを、織物上でのS.アウレウスの増殖を可能にする、希釈されたTSBにおいて一晩、接種する。スワッチを無菌水により30秒間すすぎ、そして30分間、無菌空気乾燥する。スワッチを、５mg/lのリソスタフィン（Sigma L4402）の添加を伴なって及びそれを伴なわないで、リン酸緩衝液（0.05M, pH7.5）又は市販型の液体U.S.洗剤（0.75g/l）のいずれかにより、32℃で20分間、撹拌しながら、ピーカーにおいて洗浄する。
【００４０】
３枚のスワッチを、個々のビーカーとにおいて洗浄する。洗浄の後、すべてのスワッチを、無菌水により10分間、そして無菌空気において乾燥する。スワッチ上の生存S.アウレウスの数を、CASO培地（Merch 1.05459）と共にスワッチをMalthus管においてのインキュベーションにより決定した。細菌活性を、Malthusにおけるインキュベーションにより決定した。Malthus計測器により測定される検出時間（dt）を、検量曲線によりCFU/スワッチに転換した（Johansenなど., 1999, Methods in Enzymology, vol. 310, p. 353-360）。
【００４１】
直接的なMalthus測定値を、合計生存数を列挙する場合に使用した。直接的な測定値によれば、細胞代謝は増殖基質における電導測定値により決定された。スワッチを、酵素処理の後、Malthus細胞に移した。織物に付着される細胞が増殖するのにつれて、細胞代謝は、増殖培地において電導度を変えるであろう。電導度の変化がMalthusにより測定できる場合、検出時間（dt）が記録されるであろう。Dtが、CFU/スワッチをdtに関連づける検量曲線の使用によりコロニー係数に転換された。
結果：
【００４２】
【表１】
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【００４３】
リソスタフィンは、約10〜102CFU/スワッチの微生物細胞数の低下をもたらした。細胞数の低下はまた、洗剤におけるリソスタフィン処理の後、決定されるが、しかしながら正確な細胞数の決定は、Malthusを用いることによって可能ではなかった。しかし、微生物の増殖の遅延は、リソスタフィンを含む洗剤により洗浄されたスワッチからは可視的に観察され、この遅延は、リソスタフィンなしに洗浄されたスワッチに比較して、スワッチ上の低い細胞数に対応する。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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2004527603.tif 000017
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