(57)【要約】ヒトセロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプター（５−ＨＴ様ＧＰＣＲ）を調節する試薬およびヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲ遺伝子産物に結合する試薬は、ＣＯＰＤ、心疾患、癌、泌尿器系の疾患、肥満症、糖尿病、ＣＮＳ障害、喘息または血液疾患を含みこれに限定されない機能不全または疾患の予防、改善または是正において役割を果たすことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群から選択される単離されたポリヌクレオチド：
ａ）  配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約２７％同一なアミノ酸配列；および
配列番号２に示すアミノ酸配列
からなる群から選択される、セロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプターをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号１で示される配列を含むポリヌクレオチド；
ｃ）（ａ）および（ｂ）に明記したポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
ｄ）遺伝コードの縮重のため、その配列が（ａ）から（ｃ）に明記するポリヌクレオチド配列から逸脱し、セロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプターポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および、
ｅ）（ａ）から（ｄ）に明記したポリヌクレオチド配列の断片、誘導体またはアレル変異を表し、セロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプターポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項３】
請求項２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４】
請求項１に記載のポリヌクレオチドによりコードされている、実質上精製されたセロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプターポリペプチド。
【請求項５】
以下の工程：
ａ）請求項３に記載の宿主細胞を、セロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプターポリペプチドの発現に好適な条件下で培養し；そして、
ｂ）セロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプターポリペプチドを宿主細胞培養から回収する、
を含む、セロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプターポリペプチドを調製する方法。
【請求項６】
以下の工程：
ａ）請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドを生体試料の核酸材料とハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成し；そして、
ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体を検出する、
を含む、生体試料中の、セロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプターポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを検出するための方法。
【請求項７】
ハイブリダイゼーションの前に、生体試料の核酸材料を増幅させる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
生体試料を、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載のセロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプターポリペプチドと特異的に相互作用する試薬と接触させる工程、
を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載のセロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプターポリペプチドを検出するための方法。
【請求項９】
請求項６から８までのいずれかに記載の方法を実施するための診断キット。
【請求項１０】
被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドによりコードされる任意のセロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプターポリペプチドと接触させ；
セロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプターポリペプチドに対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含む、セロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプターの活性を低下させる物質をスクリーニングする方法であって、該ポリペプチドに結合する被験化合物を、セロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプターの活性を低下させる可能性ある治療物質として同定する方法。
【請求項１１】
被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドによりコードされるセロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプターポリペプチドと接触させ；そして、
該ポリペプチドのセロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプター活性を検出する工程、
を含む、セロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプターの活性を調節する物質をスクリーニングする方法であって、セロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプター活性を増大させる被験化合物を、セロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプターの活性を増大させる可能性ある治療物質として同定し、そして該ポリペプチドのセロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプター活性を低下させる被験化合物を、セロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプターの活性を低下させる可能性ある治療物質として同定する方法。
【請求項１２】
被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドと接触させ；そして、
該ポリヌクレオチドに対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含む、セロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプターの活性を低下させる物質をスクリーニングする方法であって、該ポリヌクレオチドに結合する被験化合物を、セロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプターの活性を低下させる可能性ある治療物質として同定する方法。
【請求項１３】
細胞を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載の任意のセロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプターポリペプチドに特異的に結合する試薬と接触させ、それによりセロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプターの活性を減少させる工程、
を含む、セロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプターの活性を減少させる方法。
【請求項１４】
請求項１０から１２のいずれかに記載の方法によって同定される、セロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプターポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を調節する試薬。
【請求項１５】
請求項２に記載の発現ベクターまたは請求項１４に記載の試薬および製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
【請求項１６】
疾患におけるセロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプターの活性を調節するための医薬の製造における、請求項２に記載の発現ベクターまたは請求項１４に記載の試薬の使用。
【請求項１７】
疾患がＣＯＰＤ、心疾患、癌、泌尿器系の疾患、肥満症、糖尿病、ＣＮＳ障害、喘息または血液疾患である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているｃＤＮＡ。
【請求項１９】
配列番号１を含む請求項１８に記載のｃＤＮＡ。
【請求項２０】
配列番号１より成る請求項１８に記載のｃＤＮＡ。
【請求項２１】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２２】
該ポリヌクレオチドが配列番号１より成る、請求項２１に記載の発現ベクター。
【請求項２３】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２４】
該ポリヌクレオチドが配列番号１より成る、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号２に示すアミノ酸配列より成る請求項２５に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項２８】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを調製する方法であって、該ポリペプチドをコードしている発現ベクターを含む宿主細胞を、該ポリペプチドが発現される条件下で培養し；そして該ポリペプチドを単離する工程を含む方法。
【請求項２９】
発現ベクターが配列番号１を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
配列番号１に記載の１１個の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを生体試料の核酸材料とハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成し；そして、
該ハイブリダイゼーション複合体を検出する、
工程を含む、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドのコード配列を検出する方法。
【請求項３１】
ハイブリダイズする工程の前に核酸材料を増幅する工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
配列番号１に記載の１１個の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；および、請求項３０に記載の方法のための使用説明書、
を含む、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドのコード配列を検出するためのキット。
【請求項３３】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを検出する方法であって、生体試料を該ポリペプチドに特異的に結合する試薬と接触させて試薬−ポリペプチド複合体を形成し；そして、この試薬−ポリペプチド複合体を検出する工程を含む方法。
【請求項３４】
該試薬が抗体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを検出するためのキットであって、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体；および、
請求項３３に記載の方法のための使用説明書、を含むキット。
【請求項３６】
被験化合物を、（１）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約２７％一致するアミノ酸配列、および（２）配列番号２に示すアミノ酸配列、より成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させ；そして、
該ポリペプチドに対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含む、セロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質の活性を調節できる物質をスクリーニングする方法であって、該ポリペプチドに結合する被験化合物をセロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質の活性を調節する可能性ある物質と同定する方法。
【請求項３７】
接触させる工程が細胞内においてである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
細胞がインビトロである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
接触させる工程が無細胞系においてである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
該ポリペプチドが検出可能な標識を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
被験化合物が検出可能な標識を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
被験化合物が該ポリペプチドに結合している標識リガンドに取って代わる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
該ポリペプチドが固体支持体に結合している、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
被験化合物が固体支持体に結合している、請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
被験化合物を、（１）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約２７％一致するアミノ酸配列、および（２）配列番号２に示すアミノ酸配列、より成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させ；そして、
該ポリペプチドの活性を検出する工程、
を含む、ヒトセロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質の活性を調節する物質をスクリーニングする方法であって、該ポリペプチドの活性を増大させる被験化合物を、ヒトセロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質の活性を増大させる可能性ある物質として同定し、そして該ポリペプチドの活性を低下させる被験化合物を、ヒトセロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質の活性を低下させる可能性ある物質として同定する方法。
【請求項４６】
接触させる工程が細胞においてである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
細胞がインビトロである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
接触させる工程が無細胞系においてである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
被験化合物を、配列番号１に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされている産物と接触させ；そして、
該産物に対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含む、ヒトセロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質の活性を調節する物質をスクリーニングする方法であって、該産物に結合する被験化合物をヒトセロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質の活性を調節する可能性ある物質として同定する方法。
【請求項５０】
該産物がポリペプチドである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
該産物がＲＮＡである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
細胞を、配列番号１に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされている産物に特異的に結合する試薬と接触させ、それによりヒトセロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質の活性を減少させる工程、
を含む、ヒトセロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質の活性を減少させる方法。
【請求項５３】
該産物がポリペプチドである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
該試薬が抗体である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
該産物がＲＮＡである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
該試薬がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
該試薬がリボザイムである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
細胞がインビトロである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
細胞がインビボである、請求項５２に記載の方法。
【請求項６０】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する試薬；および、製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
【請求項６１】
該試薬が抗体である、請求項６０に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
配列番号１に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの産物に特異的に結合する試薬；および、製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
【請求項６３】
該試薬がリボザイムである、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
該試薬がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
該試薬が抗体である、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている発現ベクター；および製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
【請求項６７】
発現ベクターが配列番号１を含む、請求項６６に記載の医薬組成物。
【請求項６８】
ＣＯＰＤ、心疾患、癌、泌尿器系の疾患、肥満症、糖尿病、ＣＮＳ障害、喘息または血液疾患からなる群から選択される、セロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプター機能不全に関連する疾患を処置する方法であって、ヒトセロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質の機能を調節する試薬の治療的有効量をそれを必要とする患者に投与し、それによりセロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプター機能不全に関連する疾患の症状を改善する工程を含む方法。
【請求項６９】
該試薬が請求項３６に記載の方法によって同定される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
該試薬が請求項４５に記載の方法によって同定される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
該試薬が請求項４９に記載の方法によって同定される、請求項６８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇタンパク質共役型レセプターの分野に関する。より具体的には、本発明はヒトセロトニン様Ｇタンパク質共役型レセプターおよびその調節に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇタンパク質共役レセプター
多くの医学的に重要な生体プロセスは、Ｇタンパク質を含むシグナル伝達経路により仲介されている（Lefkowitz, Nature 351, 353−354, 1991）。Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）のファミリーは、ホルモン、神経伝達物質、成長因子、およびウイルスに対するレセプターを包含している。ＧＰＣＲの具体的例には、ドーパミン、カルシトニン、アドレナリン作動性ホルモン、エンドセリン、ｃＡＭＰ、アデノシン、アセチルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、卵胞刺激ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子１、ロドプシン、臭気物質、サイトメガロウイルス、Ｇタンパク質自身、エフェクタータンパク質、例えばホスホリパーゼＣ、アデニルシクラーゼ、およびホスホジエステラーゼ、ならびにアクチュエータータンパク質、例えばプロテインキナーゼＡおよびプロテインキナーゼＣといったような多彩な物質のレセプターが包含される。
【０００３】
ＧＰＣＲは、少なくとも８個の異なる親水性ループを連結する、膜を貫通する７個の保存されたドメインを持っている。ＧＰＣＲ（７ＴＭレセプターとしても知られる）は、少なくとも８個の異なる親水性ループを連結する、約２０ないし３０のアミノ酸より成るこれら７個の保存された疎水性区間を含むものとして特徴付けられている。殆どのＧＰＣＲは、最初の二つの細胞外ループの各々に単一の保存されたシステイン残基を持っており、これがジスルフィド結合を形成し、機能的タンパク質構造を安定化させると考えられている。この７個の膜貫通領域はＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６、およびＴＭ７と呼ばれる。ＴＭ３はシグナル伝達に関わっている。
【０００４】
システイン残基の燐酸化および脂質化（パルミチル化またはファルネシル化）は、幾つかのＧＰＣＲのシグナル伝達に影響を及ぼし得る。殆どのＧＰＣＲは、第三細胞質ループおよび／またはカルボキシ末端内部に燐酸化の可能性ある部位を含んでいる。幾つかのＧＰＣＲ、例えばβ−アドレナリン作動性レセプターでは、プロテインキナーゼＡおよび／または特異的レセプターキナーゼによる燐酸化によってレセプターの脱感作が仲介される。
【０００５】
幾つかのレセプターについては、ＧＰＣＲのリガンド結合部位が、数個のＧＰＣＲ膜貫通ドメインにより形成された親水性ソケットを含むと考えられる。この親水性ソケットは、ＧＰＣＲの疎水性残基に取り囲まれている。各ＧＰＣＲ膜貫通ヘリックスの親水性側は、内側を向き、極性リガンド結合部位を形成していると仮定されている。ＴＭ３は、リガンド結合部位、例えばＴＭ３アスパラギン酸残基を持っている幾つかのＧＰＣＲと関連している。ＴＭ５のセリン、ＴＭ６のアスパラギン、およびＴＭ６またはＴＭ７のフェニルアラニンまたはチロシンもまたリガンド結合に関連している。
【０００６】
ＧＰＣＲは細胞内部でヘテロ三量体Ｇタンパク質により、種々の細胞内酵素、イオンチャンネルおよび輸送体と共役している（Johndon et al., Endoc.Rev. 10, 317−331, 1989を参照されたい）。種々のＧタンパク質αサブユニットは優先的に特定のエフェクターを刺激し、細胞の様々な生体機能を調整する。ＧＰＣＲの細胞質残基の燐酸化は、幾つかのＧＰＣＲの調節にとって重要な機構である。例えば、或る形のシグナル伝達においては、ホルモン結合の効果は、細胞内部での酵素アデニルシクラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素の活性化はヌクレオチドＧＴＰの存在に依存する。ＧＴＰはホルモン結合にも影響を及ぼす。Ｇタンパク質はホルモンレセプターをアデニルシクラーゼに結合させる。Ｇタンパク質はホルモンレセプターによって活性化されると、ＧＴＰを、結合したＧＤＰに交換する。すると、ＧＴＰを有する型が、活性化アデニルシクラーゼに結合する。Ｇタンパク質自身により触媒されるＧＴＰからＧＤＰへの加水分解が、Ｇタンパク質をその基本的な不活性型へと戻す。したがってＧタンパク質は、レセプターからエフェクターへとシグナルを中継する仲介物質としての、そしてシグナルの持続を制御する時計としての、二重の役割を果たしている。
【０００７】
過去１５年間にわたり、ＧＰＣＲレセプターを標的とする３５０近くの治療薬が成功裏に上市されてきた。この事は、これらのレセプターが治療薬として確立された折り紙付きの歴史を持っていることを示すものである。明らかに、細菌、真菌、原虫といった感染症、およびウイルス感染症、とりわけＨＩＶウイルスによる感染症、疼痛、癌、食欲不振、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧症、高血圧症、尿停留、骨粗鬆症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、良性前立腺肥大、および精神障害および神経学的障害（不安生、統合失調症、躁鬱病、幻覚症状、痴呆、いくつかの精神薄弱、およびジスキネジー、ハンチントン舞踏病およびトゥレット症候群など）を包含する（但しこれらに限定される訳ではない）機能不全または疾病の予防、改善または是正において役割を果たし得る、さらなるＧＰＣＲの同定および特徴づけに対する継続した需要がある。
【０００８】
セトロニン
セロトニンは、1つの、睡眠、欲求、移動、性行為および管の短縮のような種々様々の行動の機能を引き起こし調整することができる。40年以上前のセロトニン(5-セロトニン、5-HT)の発見以来、多くの種々の研究の累積的な結果は、哺乳類の身体の、両方の中枢神経系中の、および周辺のシステム中の機能際に、セロトニンが重要な役割を果たすことを示した。中枢神経系に関する形態論の研究は、セロトニン作動性のニューロン(それらは脳幹から起こる)が生ずることを示した、1つの、脳および脊髄(オブライアン、精神の異常1:41,1978のセロトニン; Steinbusch、「化学の神経解剖学のハンドブック」、部分II、68、1984年(ボリューム3); Andenら、Acta Physiologicaスカンジナビア67、313、1966年)のほとんどのエリアへ突き出るシステムを非常に拡散する。これらの研究は、5-HTの大きな集中を示す、生化学の証拠によって補足された、脳および脊髄(Steinbusch、1984年)に存在する。米国特許第5,698,444号を参照。
【０００９】
そのような拡散したシステムで、中枢神経系から起こる多くの振る舞い、生理学のレスポンスおよび疾病の表現に関係するとともに、5-HTが関係させられたことは驚くべきことではない。これらは、体温、コントロールする血圧、低下、精神分裂病および他の肉体の状態(フラー、セロトニン作動性の送信21、1982の生物学; Boullin、精神の異常1、316、1978年中のセロトニン; Barchasら、SEROTONIN AND BEHAVIOR、1973年)をコントロールして、眠っており食べて、知覚する苦痛のような種々のエリアを含んでいる。
【００１０】
セロトニンは、周辺のシステムに同様に重要な役割を果たする。例えば、身体のセロトニンのおよそ90%は胃腸のシステムで見つかります。また、セロトニンは、このシステムでの様々な収縮性のある結果、分泌の結果および電気生理学を用いた結果を解決させると分かりました。セロトニンに非常に敏感な周辺のネットワークの別の例は心臓血管系(さらに、それはセロトニン(つまり小板)のそれ自身の源を含んでいる)である。
【００１１】
身体内のセロトニンの広い分配を与えられて、セロトニン作動性のシステムに影響する薬へのtremen-dousな関心が存在することは理解し得ます。レセプターに特有の作動筋および敵は、心配、うつ病、高血圧症、片頭痛、強制的な病気、精神分裂病、自閉症、アルツハイマー病のような神経組織変成の病気、パーキンソン症候群およびハンチントン舞踏病を含む広範囲の病気および癌の治療に特に興味がある、化学療法に引き起こされた噴出すること(Gershonら、5-セロトニン246、1989のアクション;)Saxena、心血管の薬物学、補足7、990 15のジャーナルら。
【００１２】
セロトニンレセプター
セロトニンは、セル表面上の専門のレセプターに拘束することによりセルの生理学に対するその影響を生む。セロトニンを含むすべての神経伝達物質およびホルモンのために多数のタイプのレセプターが存在することは今認識される。多数で、構造上別個のセロトニンレセプターの存在は、サブタイプ選択的な薬理学の薬剤が生産される可能性を提供した。個々のレセプターサブタイプが中央の周辺のセロトニン作動性のシステムの異なる部分の特定のアクションに影響するために機能するかもしれないので、そのような合成物の開発は、より少数の副作用を持った新しく、ますます選択的な治療の薬剤に帰着するかもしれません。
【００１３】
そのような特異性の例は、例として脈管系を使用することにより実証することができます。ある血管では、平滑筋セル上の5-HT2レセプターの刺激が血管収縮を生産している一方、5-HT1の刺激はレセプター―のようにendo-thelialセル上で血管拡張を生産する。現在、セロトニンレセプター(5-HT1、5つのHT2、5つのHT3、5つのHT4、5つのHT5、5つのHT6および5-HT7)の主なクラスは、それらの薬学構造の違いに基づいて、形式的に分類された、18の別個のレセプターに約14を含んでいる(Glennonら、神経科学、および行動の調査14、35、1990年を参照)。
【００１４】
現在まで記述された5-HTレセプターは、イオン・チャンネル(5-HT3レセプター)に関連したレセプターの家族が、あるいはG蛋白質と対話し、それは7つの膜内外の領域を所有するレセプターの家族が所有している。さらに、アミノ酸シーケンスの分析は、G蛋白質と対話する5-HTレセプターが2つの別個のグループへ細分されるかもしれないことを示した:3つのショウジョウバエ5-HTレセプター、およびサブタイプ5-HT2および5つのHT1Cを含む5-HT2レセプターと同様に哺乳類のサブタイプ5-HT1A、5つのHT1Bおよび5-HT1Dを含む5-HT1レセプターも。薬学の研究は、サブタイプ5-HT1(「5-HT1のような」レセプター)と関係するいくつかのレセプターと同様に5-HT4レセプターのような他のサブタイプも明らかにした。更に、追加の分子生物学研究は、サブタイプ5-HT1B/1Dの内の異成分を明らかにした。
【００１５】
5-HT2レセプターはホスホリパーゼCによって作用し、中央と周辺のレベルにセロトニンの多数の生理学の活動の原因である。心血管のレベルでは、それらが、血管の短縮および小板の形態論の変更に関係する;中枢神経系では、それらが、触覚の刺激へのニューロンの増感に、およびdiethylamidelysergicな酸の、および関連するphenylisopropylaminesの幻覚を誘発する影響の仲裁に作用する。多数の研究は、今まで記述された5-HT2レセプターがそれらが起因するすべての特性を説明しないことを示する。周辺の平滑筋に対するセロトニンのある5-HT2型影響は、特に、変則的な結果(結果はそれに未知のレセプターによって解決すると思われる)として分類される。米国特許5,780,245を参照。
【００１６】
セロトニンの広範囲にわたる生物学的効果のために、そのレセプターを調節して治療効果をもたらすようなこのレセプターのファミリーのさらなる成員を同定することが当分野で必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
発明の要旨
本発明の目的は、ヒトセロトニン様Ｇタンパク質共役レセプター１を調節する試薬および方法を提供することである。本発明のこのおよびその他の目的は、下に記載する１またはそれ以上の態様によって提供する。
【００１８】
本発明の一つの態様は、
配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約２７％同一なアミノ酸配列；
配列番号２に示すアミノ酸配列
からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むセロトニン様Ｇタンパク質共役レセプターポリペプチドである。
【００１９】
本発明のさらに別の態様は、細胞外マトリックスの分解を減少させる物質をスクリーニングする方法である。被験化合物を、
配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約２７％同一なアミノ酸配列；
配列番号２に示すアミノ酸配列
からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むセロトニン様Ｇタンパク質共役レセプターポリペプチドと接触させる。
【００２０】
被験化合物とセロトニン様Ｇタンパク質共役レセプターポリペプチドとの結合を検出する。それにより、セロトニン様Ｇタンパク質共役レセプターポリペプチドに結合する被験化合物を、細胞外マトリックス分解を減少させる可能性のある物質として同定する。この物質はセロトニン様Ｇタンパク質共役レセプターの活性を減少させることによって作用し得る。
【００２１】
本発明の別の態様は、細胞外マトリックス分解を調節する物質をスクリーニングする方法である。被験化合物を、
配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％同一なヌクレオチド配列；および
配列番号１に示すヌクレオチド配列
からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む、セロトニン様Ｇタンパク質共役レセプターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと接触させる。
【００２２】
このポリヌクレオチドに対する化合物の結合を検出する。このポリペプチドに結合する試験化合物を、細胞外マトリックス分解を増大させる可能性のある物質として同定する。この物質は、セロトニン様Ｇタンパク質共役レセプターｍＲＮＡとの相互作用を介してセロトニン様Ｇタンパク質共役レセプターの量を減少させることによって作用し得る。
【００２３】
本発明のさらに別の態様は、細胞外マトリックス分解を調節する物質をスクリーニングする方法である。被験化合物を、
配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約２７％同一なアミノ酸配列；
配列番号２に示すアミノ酸配列
からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むセロトニン様Ｇタンパク質共役レセプターポリペプチドと接触させる。
【００２４】
ポリペプチドのセロトニン様Ｇタンパク質共役レセプター活性を検出する。ポリペプチドのセロトニン様Ｇタンパク質共役レセプター活性を、試験化合物不在下でのセロトニン様Ｇタンパク質共役レセプター活性と比較して増加させる試験化合物は、それにより、細胞外マトリックス分解を増大させる可能性のある物質として同定する。ポリペプチドのセロトニン様Ｇタンパク質共役レセプター活性を、その試験化合物の不在下でのセロトニン様Ｇタンパク質共役レセプター活性と比較して減少させる試験化合物は、それにより、細胞外マトリックス分解を減少させる可能性のある物質として同定する。
【００２５】
本発明のさらに別の態様は、細胞外マトリックス分解を減少させる物質をスクリーニングする方法である。被験化合物を、
配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％同一なヌクレオチド配列；
配列番号１に示すヌクレオチド配列；
からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドのセロトニン様Ｇタンパク質共役レセプター産物と接触させる。
【００２６】
このセロトニン様Ｇタンパク質共役レセプター産物に対する試験化合物の結合を検出する。このセロトニン様Ｇタンパク質共役レセプター産物と結合する試験化合物を、それにより、細胞外マトリックス分解を減少させる、可能性のある物質として同定する。
【００２７】
本発明のさらに別の態様は、細胞外マトリックス分解を減少させる方法である。細胞を、
配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％同一なヌクレオチド配列；
配列番号１に示すヌクレオチド配列；
からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む、セロトニン様Ｇタンパク質共役レセプターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合する物質または、そのポリヌクレオチドによってコードされる産物と接触させる。
【００２８】
細胞中のセロトニン様Ｇタンパク質共役レセプター活性は、それにより減少する。
【００２９】
このように、本発明は、そのレセプターの活性部位でアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得る試験化合物を同定するために用いることができるヒトセロトニン様Ｇタンパク質共役レセプターを提供する。ヒトセロトニン様Ｇタンパク質共役レセプターおよびその断片はまた、そのレセプターをブロックおよびリガンドの結合を効果的に阻止することができる特異的な抗体を惹起するのに有用でもある。
【００３０】
（発明の詳細な記載）
本発明は、以下からなる群から選択される単離されたポリヌクレオチドに関する：
ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約２７％同一なアミノ酸配列；
配列番号２に示すアミノ酸配列；
からなる群から選択されるアミノ酸を含むセロトニン様Ｇタンパク質共役レセプターポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号１に示す配列を含むポリヌクレオチド；
ｃ）（ａ）および（ｂ）に示すポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、セロトニン様Ｇタンパク質共役レセプターポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｄ）その配列が、遺伝コードの縮重のために（ａ）〜（ｃ）に示したポリヌクレオチド配列とは異なり、セロトニン様Ｇタンパク質共役レセプターポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
ｅ）（ａ）〜（ｄ）に示すポリヌクレオチド配列の断片、誘導体またはアレル変異を示し、セロトニン様Ｇタンパク質共役レセプターポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００３１】
さらに、本発明者によって、新規な５−ＨＴ様ＧＰＣＲ、特にヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲは、ＣＯＰＤ、心臓血管障害、癌、泌尿器系の障害、肥満症、糖尿病、ＣＮＳ障害、喘息または血液病を処置するための治療方法に用いることができることが発見された。ヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲは、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む。ヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲのコードは入れＴは、配列番号１に示す。この配列は、配列番号４に示すより長い配列の中に含まれる。この配列は、第２染色体に存在しており、ＧｅｎｅｓｃａｎまたはＧｅｎｅｉｄを用いて受託番号ＡＣ０６８０８１０のゲノム配列から構築された。
【００３２】
ヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲは、swiss|P28222|5H1B_ヒト5−ヒドロキシTRYPTアミン 1B レセプター (5−HT−1B) (セロトニンレセプター) (配列番号３) (図５)に対して２７２アミノ酸にわたって同一である。Ｐｆａｍによって、図１０に示す７回貫通膜貫通モチーフが検出された。
【００３３】
本発明のヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲは、これまでに同定されたセロトニンレセプターと同じ目的に有用であると考えられる。ヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲは、ＣＯＰＤ、心臓血管障害、癌、泌尿器系障害、肥満症、糖尿病、ＣＮＳ障害、喘息および血液病を処置するための治療方法において有用であると考えられる。ヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲはさらに、ヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲアクチベーターまたはインヒビターをスクリーニングするために用いることもできる。
【００３４】
５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチド
本発明の５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドには、配列番号２に示すアミノ酸配列で示されるアミノ酸配列または以下に定義するその生物学的に活性な変異体から選択される、少なくとも６、８ １０、１２、１５、１８、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、または３４７個の連続したアミノ酸を含む。したがって、本発明の５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドは、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドの一部、完全長の５−ＨＴ様ＧＰＣＲタンパク質、または５−ＨＴ様ＧＰＣＲの全部または一部を含む融合タンパク質であり得る。配列番号２のコード配列は、配列番号１に示される。
【００３５】
生物学的に活性な変異体
生物学的に活性な、即ちセロトニンまたはセロトニン様リガンドが結合して生物学的効果、例えばＡＭＰ形成、細胞内カルシウムの移動、またはホスホイノシチド代謝等、をもたらす能力を保持する５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチド変異体もまた、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドである。好ましくは、天然または非天然に存在するセロトニン様ＧＰＣＲポリペプチド変異体は、配列番号２に示すアミノ酸配列またはその断片と少なくとも約２７、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０％、好ましくは約７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％一致するアミノ酸配列を有する。推定される５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチド変異体と配列番号２のアミノ酸配列との一致パーセントは、管用の方法によって決定する。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603 (1986)、およびHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)を参照。簡潔には、２つのアミノ酸配列を、ギャップオープニングペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ１、およびHenikoff and Henikoff (ibid.)の「BLOSUM62」スコアリングマトリクスを用いてアライメントスコアが最適になるよう整列させる。当業者は、２つのアミノ酸配列を整列させるために用いることができる確立されたアルゴリズムが多く存在することを理解している。Pearson and Lipmanの「FASTA」類似性検索アルゴリズムは、本明細書に開示されたアミノ酸配列と推定の変異体のアミノ酸配列が共有する同一性のレベルを調べるための適当なタンパク質アライメント法である。FASTAアルゴリズムは、Pearson and Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444(1988)、およびPearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)に記載されている。簡潔には、FASTAは、最初に、保存的なアミノ酸置換、挿入または欠失を考慮することなく、照会する配列（即ち、配列番号２）および最も高い同一性の密度（ktup変数が１である場合）または同一の対（ktup＝２の場合）のいずれかを有する試験配列が共有する領域を同定することによって配列の類似性を特徴付ける。次いで、最も高い同一性の密度を有する１０の領域を、アミノ酸置換マトリクスを用いてすべての対のアミノ酸の類似性を比較することによって再スコア化し、その領域の末端を、最も高いスコア貢献する残基のみを含むように切り取る。「切り捨て（cutoff）」値（配列の長さとktup値に基づいて所定の式によって計算された）よりも大きいスコアを有する領域がいくつか存在する場合は、切取った最初の領域を調べ、その領域が連結してgapを有する近似アライメントを形成することができるかどうかを決定する。最後に、２つのアミノ酸配列の最も高いスコアの領域を、アミノ酸挿入および欠失を許容する、Needleman−Wunsch− Sellers algorithm (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol.48:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974))を用いて整列させる。FASTA分析に好ましいパラメーターは、以下のとおりである：ktup=1, ギャップオープニングペナルティ=10, ギャップ伸長ペナルティ=1、および置換マトリクス=BLOSUM62。これらのパラメータは、Appendix 2 of Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)において説明されているように、スコアリングマトリクスファイル（「SMATRIX」）に修飾を施してFASTAプログラムに導入することができる。FASTAは、上記の比率を用いて核酸分子の配列同一性を決定するために用いることもできる。ヌクレオチド配列の比較に関して、ktup値は、１〜６の範囲内であり得、好ましくは３〜６の範囲、最も好ましくは３であり、その他のパラメータは既定値である。
【００３６】
同一性の百分率における変化は、例えばアミノ酸置換、挿入または欠失に起因し得る。アミノ酸置換は１対１のアミノ酸の置き換えとして定義される。置換されたアミノ酸が類似の構造的および／または化学的性質を有する場合、置換は保存的である。保存的置換の例は、イソロイシンまたはバリンによるロイシンの置換、グルタミン酸塩によるアスパラギン酸塩の置換、またはセリンによるスレオニンの置換である。
【００３７】
アミノ酸挿入または欠失は、アミノ酸配列への、またはその内部での変化である。これらは典型的には約１ないし５アミノ酸の範囲で起こる。５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドの生物学的または免疫学的活性を廃絶することなく、どのアミノ酸残基が置換、挿入または欠失できるかを決定する際の指針は、当分野で周知のコンピュータープログラム、例えばDNASTARソフトウェアを用いて見出すことができる。或るアミノ酸変化が生物学的に活性な５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドを生成するか否かは、例えば、以下の特定の実施例に記載されているようにリガンドに対する結合をアッセイすることによりまたは機能的アッセイを行うことにより容易に決定できる。
【００３８】
融合タンパク質
融合タンパク質は、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドアミノ酸配列に対する抗体の作製に、そして様々な検定系での使用に有用である。例えば、融合タンパク質は、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドの一部と相互作用するタンパク質の同定に使用できる。タンパク質親和クロマトグラフィーまたはタンパク質−タンパク質相互作用のためのライブラリーに基づく検定、例えば酵母２−ハイブリッドまたはファージディスプレイ系をこの目的のために使用できる。このような方法は当分野で周知であり、薬物スクリーニングとしても使用できる。
【００３９】
５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチド融合タンパク質は、ペプチド結合により融合した２のポリペプチドセグメントを含んでいる。第一のポリペプチドセグメントは、配列番号２に示すアミノ酸配列または上記に記載したようなその生物学的に活性な変異体から選択される、６、８ １０、１２、１５、１８、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、または３４７の連続アミノ酸を含む。第一のポリペプチドセグメントはまた、完全長５−ＨＴ様ＧＰＣＲタンパク質を含むことができる。
【００４０】
第二のポリペプチドセグメントは、完全長タンパク質またはタンパク質断片であってよい。融合タンパク質の組み立てに一般的に使用するタンパク質は、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、自己蛍光タンパク質（青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を包含する）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を包含する。さらに、融合タンパク質の組み立てには、ヒスチジン（His）標識、ＦＬＡＧ標識、インフルエンザへマグルチニン（ＨＡ）標識、Ｍｙｃ標識、ＶＳＶ−Ｇ標識、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）標識を包含するエピトープ標識を使用する。その他の融合組み立て物は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−標識、Lex a ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合物、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物を包含する。融合タンパク質はさらに、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドコード配列とヘテロローガスタンパク質配列の間に位置する開裂部位を含むよう組み立てることができ、その結果、この５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドが開裂して、ヘテロローガス部分から精製することができる。
【００４１】
融合タンパク質は当分野で周知のように化学合成できる。好ましくは、融合タンパク質は二つのポリペプチドセグメントを共有結合で連結することにより、または分子生物学分野で標準的な方法により調製する。例えば、当分野で知られているように、第二のポリペプチドセグメントをコードしているヌクレオチドを有する適切なリーディングフレームに配列番号１から選ばれるコード配列を含む、ＤＮＡ組み立て物を作製し、このＤＮＡ組み立て物を宿主細胞で発現させる事による組換えＤＮＡ法を用いて、融合タンパク質を調製できる。融合タンパク質を組み立てるための多くのキットが、Promega Corporation(Madison, WI)、Stratagene(La Jolla, CA)、CLONTECH(Mountain View, CA)、Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)、MBL international Corporation(MIC; Watertown, MA)、およびQuantum Biotechnologies(Montreal, Canada; 1−888−DNA−KITS)といった企業から入手できる。
【００４２】
種相同体の同定
５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドのポリヌクレオチド（下記）を使用して他の種、例えばマウス、サル、または酵母由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングするために好適なプローブまたはプライマーを作製し、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドの相同体をコードしているｃＤＮＡを同定し、そして当分野で周知のようにこのｃＤＮＡを発現させて、ヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドの種相同体を得ることができる。
【００４３】
５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチド
５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であってよく、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドのコード配列またはこのコード配列の相補体を含んでいる。５−ＨＴ様ＧＰＣＲのコード配列は配列番号３に示す。
【００４４】
ヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている縮重ヌクレオチド配列、および、配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％、好ましくは約７５、９０、９６、もしくは９８％一致するホモローガスなヌクレオチド配列またはこれらの相補物もまた、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドである。二つのポリヌクレオチド配列間の配列一致パーセントは、ALIGNのようなコンピュータープログラムを用いて決定するが、これは、ギャップオープンペナルティー−１２およびギャップエクステンションペナルティー−２によるアフィンギャップ検索を用いるFASTAアルゴリズムを使用するものである。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子、種相同体および生物学的に活性な５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの変異体もやはり５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドである。配列番号１の少なくとも６、７、８、９、１０、１２、１５、１８、２０、または２５の連続したヌクレオチドまたはその相補物を含むポリヌクレオチドもまた５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドである。そのようなポリヌクレオチドを、例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いることができる。
【００４５】
５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの変異体および相同体の同定
上記の５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの変異体および相同体もまた５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドである。典型的には、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチド配列は、当分野で周知のように、ストリンジェントな条件下で候補ポリヌクレオチドを既知の５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドにハイブリダイズすることにより同定できる。例えば、以下の洗浄条件 −− ２Ｘ ＳＳＣ（０.３M ＮａＣｌ、０.０３Mクエン酸ナトリウム、pH７.０）、０.１％ＳＤＳ、室温  ２回、各々３０分間；次いで２Ｘ ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ、５０℃ １回、３０分間；次いで２Ｘ ＳＳＣ、室温 ２回、各々１０分間 −− を使用して、最大約２５−３０％の塩基対ミスマッチを含むホモローガス配列を同定できる。より好ましくは、ホモローガス核酸鎖は１５−２５％の塩基対ミスマッチを、さらに好ましくは５−１５％の塩基対ミスマッチを含む。
【００４６】
本明細書に開示する５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの種相同体はさらに、適当なプローブまたはプライマーを作製し、他の種、例えばマウス、サル、または酵母由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることによって同定できる。５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドのヒト変異体は、例えばヒトｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることにより同定できる。二本鎖ＤＮＡのＴmは相同性が１％低下する毎に１−１.５℃低下することがよく知られている（Bonner et al., J.Mol.Biol. 81,123(1973)）。故にヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの変異体または他の種の５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドは、推定のホモローガス５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドを、配列番号１のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはその相補物とハイブリダイズさせて被験ハイブリッドを作製することによって同定できる。被験ハイブリッドの融解温度を、完全に相補的なヌクレオチド配列を有する５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドを含むハイブリッドの融解温度と比較し、被験ハイブリッドの中の塩基対ミスマッチのパーセント数を算出する。
【００４７】
ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件に従い５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドまたはその相補物とハイブリダイズするヌクレオチド配列もまた５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドである。ストリンジェントな洗浄条件は当分野で周知且つ理解されており、例えばSambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d ed., 1989, 9.50−9.51頁に開示されている。
【００４８】
典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のためには、温度と塩濃度の組み合わせを、検討中のハイブリッドの理論的Ｔmよりおよそ１２−２０℃低くなるよう選択すべきである。配列番号３に示すヌクレオチド配列を有する５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドまたはその相同体と、それらのヌクレオチド配列のいずれか１つと少なくとも約５０、好ましくは約７５、９０、９６、または９８％一致するポリヌクレオチド配列とのハイブリッドのＴmは、例えばBolton and McCarthy, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 48,1390(1962)の式：
Ｔm＝８１.５℃−１６.６(log10[Ｎａ+])＋０.４１(％Ｇ＋Ｃ)−０.６３(％ホルムアミド)−６００／ｌ）、
[式中、ｌ＝塩基対で表したハイブリッドの長さ]
を用いて算出できる。
【００４９】
ストリンジェントな洗浄条件としては例えば、４Ｘ ＳＳＣ（６５℃）、または５０％ホルムアミド、４Ｘ ＳＳＣ（４２℃）、または０.５Ｘ ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ（６５℃）が挙げられる。高度ストリンジェントな洗浄条件は、例えば０.２Ｘ ＳＳＣ（６５℃）などである。
【００５０】
ポリヌクレオチドの調製
天然の５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドは、膜構成成分、タンパク質および脂質といった他の細胞成分を含まないよう単離できる。ポリヌクレオチドは細胞から調製でき、標準的核酸精製技術を用いて単離、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅技術を用いて合成、もしくは自動合成機を用いることによって調製できる。ポリヌクレオチドを単離する方法は常套的であり、当分野で知られている。ポリヌクレオチドを取得するためこのような任意の技術を用いて、単離された５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドを得ることができる。例えば、制限レセプターおよびプローブを用いて５−ＨＴ様ＧＰＣＲヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド断片を単離できる。単離したポリヌクレオチドは、他の分子を少なくとも７０、８０、または９０％含まない調製物である。
【００５１】
５−ＨＴ様ＧＰＣＲ ｃＤＮＡ分子は、５−ＨＴ様ＧＰＣＲ ｍＲＮＡを鋳型に用いて標準的分子生物学技術にて調製できる。その後５−ＨＴ様ＧＰＣＲ ｃＤＮＡ分子は、当分野で周知でありSambrook et al.(1989)のようなマニュアルに開示される分子生物学技術を用いて複製できる。ヒトゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型に使用して本発明に係るポリヌクレオチドのさらなるコピーを得るため、ＰＣＲのような増幅技術を用いることができる。
【００５２】
別法として、合成化学技術を用いて５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドを合成することもできる。遺伝コードの縮重は、例えば配列番号２に示すアミノ酸配列を有する５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドまたはその生物学的に活性な変異体をコードする、別のヌクレオチド配列の合成を可能にする。
【００５３】
ポリヌクレオチドの伸長
ＰＣＲに基づく様々な方法を用いて本明細書に開示の核酸配列を伸長させ、プロモーターおよび調節エレメントといった上流配列を検出することができる。例えば制限部位ＰＣＲは、既知の座に隣接する未知配列を回収するため、普遍的プライマーを使用する（Sarkar, PCR Methods Applic. 2,318−322,1993）。まず、ゲノムＤＮＡを、リンカー配列に対するプライマーおよび既知領域に対し特異的なプライマーの存在下で増幅する。次に、増幅させた配列を、同じリンカープライマーおよび最初のものの内部にある別の特異的プライマーを用いる第二回目のＰＣＲに付す。各回のＰＣＲの産物を適当なＲＮＡポリメラーゼで転写し、逆転写酵素を用いて配列決定する。
【００５４】
既知領域に基づく異なるプライマーを用いて配列を増幅または伸長するために、逆ＰＣＲを使用することもできる（Triglia et al., Nucleic Acids Res. 16,8186,1988）。OLIGO 4.06 Primer Analysisソフトウェア（National Biosciences Inc., Plymouth, Minn.）のような市販ソフトウェアを用いて、長さ２２−３０ヌクレオチド長、５０％またはそれ以上のＧＣ含有量を持ち、約６８−７２℃の温度で標的配列とアニーリングするプライマーを設計できる。この方法は、遺伝子の既知領域に適当な断片を作り出す幾つかの制限酵素を使用する。次いでこの断片を分子内ライゲーションにより環化し、ＰＣＲ鋳型として使用する。
【００５５】
使用できるもう一つの方法は、ヒトおよび酵母人工染色体ＤＮＡ中の既知配列に隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を含む、捕捉ＰＣＲである（Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1,111−119,1991）。この方法では、複数の制限酵素消化物とライゲーションを行って、作製したある二本鎖の配列を、ＰＣＲを行う前にそのＤＮＡ分子の未知断片中に入れることができる。
【００５６】
未知配列を回収するために使用できるもう一つの方法はParker et al., Nucleic Acids Res. 19,3055−3060,1991の方法である。加えて、ＰＣＲ、入れ子式(nested)プライマー、およびPROMOTERFINDERライブラリー（CLONTECH, Palo Alto, Calif.）を用いてゲノムＤＮＡを移動させることができる（CLONTECH, Palo Alto, Calif.）。このプロセスはライブラリーをスクリーニングする必要性を排除し、イントロン／エクソン接合点の発見に有用である。
【００５７】
完全長ｃＤＮＡに対してスクリーニングする場合、より大きなｃＤＮＡを含むようサイズ選択したライブラリーを使用するのが望ましい。遺伝子の５'領域を含む配列をより多く含んでいるという点で、無作為プライミングしたライブラリーが好ましい。無作為プライミングしたライブラリーの使用は、オリゴｄ(Ｔ)ライブラリーが完全長ｃＤＮＡを産生しない状況で特に好ましいであろう。ゲノムライブラリーは、配列を５'非転写調節領域へと伸長させるのに有用であり得る。
【００５８】
市販品が入手可能な毛細管電気泳動系を用いて、ＰＣＲまたは配列決定産物のサイズを分析、またはヌクレオチド配列を確認することができる。例えば、毛細管配列決定は、電気泳動分離用の流動性ポリマー、レーザー励起する４種の異なる蛍光色素（各ヌクレオチドにつき１種ずつ）、および電荷結合素子カメラによる放射された波長の検出を利用することができる。出力／光強度は適当なソフトウェア（例えばGENOTYPERおよびSequence NAVIGATOR、Perkin Elmer）を用いて電気信号に変換でき、試料のロードからコンピューター分析および電子的データ表示に至る全プロセスをコンピューター管理することができる。毛細管電気泳動は、特定の試料中に限られた量で存在するかも知れないＤＮＡの小片を配列決定するのに特に好ましい。
【００５９】
５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドの取得
５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドは、例えばヒト細胞からの精製によって、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの発現によって、または直接的化学合成によって取得できる。
【００６０】
タンパク質精製
ヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドは、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドでトランスフェクトした宿主細胞を包含する、該レセプターを発現する任意のヒト細胞から精製できる。精製された５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドは、細胞内の５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドに通常付随するその他の化合物、例えば或る種のタンパク質、炭水化物、または脂質から、当分野で周知の方法を用いて分離する。このような方法は、サイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム分画、イオン交換クロマトグラフィー、親和クロマトグラフィー、および調製用ゲル電気泳動を包含するが、これらに限定されない。
【００６１】
５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドは、以下の特定の実施例に記載するように、Ｇタンパク質が会合した複合体として便利に単離することができる、精製５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドの調製物は少なくとも８０％純粋であり、好ましくは該調製物は９０％、９５％、または９９％純粋である。調製物の純度はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような当分野で既知の任意の手段によって評価できる。
【００６２】
５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの発現
５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドを発現させるため、挿入されたコード配列の転写と発現に必要な要素を含む発現ベクター中に５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドを挿入することができる。５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列および適当な転写および翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを組み立てるため、当業者に周知の方法が利用できる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えがある。このような技術は、例えばSambrook et al.(1989)およびAusubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York., 1989に記載されている。
【００６３】
様々な発現ベクター／宿主系が、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列を含みそして発現させるために利用できる。これらには、微生物、例えば組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌；酵母発現ベクターにより形質転換された酵母、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）により感染させた昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）、もしくは細菌発現ベクター（例えばＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）により形質転換された植物細胞系、または動物細胞系が包含されるがこれらに限定される訳ではない。
【００６４】
調節エレメントまたは調節配列は、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写と翻訳を実行する、ベクターの非翻訳領域  エンハンサー、プロモーター、５'および３'非翻訳領域 である。このようなエレメントはその強さと特異性において異なっている。利用するベクター系および宿主に応じて、構成的および誘導的プロモーターを包含する、多数の好適な転写および翻訳エレメントを使用できる。例えば、細菌系でクローニングを行う場合、BLUESCRIPTファージミド（Stratagene, LaJolla，Calif.）またはpSPORT１プラスミド（Life Technologies）等のハイブリッドlacZプロモーターのような誘導的プロモーターを使用できる。バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターは昆虫細胞に使用できる。植物細胞のゲノムから（例えば熱ショック、RUBISCO、および貯蔵タンパク質遺伝子）、または植物ウイルスから（例えば、ウイルスプロモーターまたはリーダー配列）誘導したプロモーターまたはエンハンサーを該ベクター中にクローニングすることができる。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子由来の、または哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが好ましい。５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を複数コピー含むセルラインを作製する必要がある場合は、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターを適当な選択マーカーと共に使用することができる。
【００６５】
細菌および酵母発現系
細菌系では、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドに対して意図する用途に応じて数多くの発現ベクターを選択できる。例えば、抗体の誘導のため大量の５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドが必要である場合は、容易に精製できる融合タンパク質の高レベル発現を指令するベクターが使用できる。このようなベクターは、BLUESCRIPT(Stratagene)のような多機能E.coliクローニングおよび発現ベクターを包含するが、これに限定される訳ではない。BLUESCRIPTベクターにおいては、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列を、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔとこれに続く７残基の配列と共にフレーム内で該ベクター中にライゲーションすることができ、その結果ハイブリッドタンパク質が産生される。ｐＩＮベクター（Van Heeke & Schuster, J.Biol.Chem. 264,5503−5509,1989）またはｐＧＥＸベクター（Promega, Madison, Wis.）もまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を伴う融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるのに使用できる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、その後遊離グルタチオンの存在下で溶離することにより、溶菌させた細胞から容易に精製できる。このような系で調製したタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、または第Ｘａ因子プロテアーゼ開裂部位を含むよう設計でき、その結果、目的とするクローンポリペプチドをＧＳＴ部分から随意に解放することができる。
【００６６】
酵母Saccharomyces cerevisiaeにおいては、α因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨのような構成的または誘導的プロモーターを含む幾つかのベクターが使用できる。総説としてAusubel et al.(1989)およびGrant et al., Methods Enzymol. 153,516−544,1987を参照されたい。
【００６７】
植物および昆虫発現系
植物発現ベクターを使用する場合、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列の発現は、幾つかのプロモーターのうち任意のものにより駆動できる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターのようなウイルスプロモーターを、単独で、またはＴＭＶ由来のオメガリーダー配列と組み合わせて使用できる（Takamatsu, EMBO J. 6,307−311,1987）。別法として、RUBISCOの小サブユニットのような植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを使用することもできる（Coruzzi et al., EMBO J. 3,1671−1680,1984；Broglie et al., Science 224,838−843,1984；Winter et al., Results Probl.Cell Differ. 17,85−105,1991）。これらの組み立て物は、直接ＤＮＡ形質転換または病原体仲介トランスフェクションにより植物細胞中に導入できる。このような技術は幾つかの一般に入手可能な総説に記載されている（例えば、HobbsまたはMurray、MCGRAW HILL YEARBOOK OF SCIENCE AND TECHNOLOGY, McGraw Hill, New York, N.Y., pp191−196,1992）。
【００６８】
昆虫系もまた５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドの発現に使用できる。例えば、係る系の１つAutographa californica核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、Spodoptera frugiperda細胞またはTrichoplusiaの幼虫で外来遺伝子を発現させるベクターとして使用する。５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列を、ポリヘドリン遺伝子のような該ウイルスの非必須領域中にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの調節下に置くことができる。５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドをうまく挿入すると、ポリヘドリン遺伝子は不活性化し、コートタンパク質を欠く組換えウイルスが生成する。次いでこの組換えウイルスをS.frugiperda細胞またはTrichoplusiaの幼虫への感染に使用し、そこで５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドを発現させることができる（Engelhard et al., Proc.Nat.Acad.Sci. 91,3224−3227,1994）。
【００６９】
哺乳動物発現系
ウイルスに基づく多くの発現系を用いて哺乳動物宿主細胞で５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドを発現させることができる。例えば、発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列は、後期プロモーターおよび３部に分かれたリーダー配列を含むアデノウイルス転写／翻訳複合体中にライゲーションできる。該ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域における挿入を用いて、感染宿主細胞において５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドを発現できる生存ウイルスを取得できる（Logan & Shenk, Proc.Natl.Acad.Sci. 81,3655−3659,1984）。所望により、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーのような転写エンハンサーを用いて哺乳動物宿主細胞での発現を増大させることができる。
【００７０】
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）もまた、プラスミドが内包し発現するＤＮＡ断片よりも大きなＤＮＡ断片の運搬に使用できる。６Ｍないし１０ＭのＨＡＣを組み立て、常套的デリバリー法により細胞に到達させる（例えば、リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、または小胞）。
【００７１】
さらに、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列の、より効率的な翻訳を達成するために、特異的開始シグナルを使用できる。係るシグナルはＡＴＧ開始コドンおよび連続配列を包含する（Kozak配列）。５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列、その開始コドン、および上流配列を適当な発現ベクター中に挿入した場合、さらなる転写または翻訳調節シグナルは必要ないであろう。しかしながら、コード配列またはその断片のみを挿入した場合は、外因性の翻訳調節シグナル（ＡＴＧ開始コドンを包含する）を供給すべきである。開始コドンは挿入物全体を確実に翻訳させるために、正しいリーディングフレームになければならない。外因性翻訳エレメントおよび開始コドンは天然および合成両者の様々な起源であってよい。発現の効率は、使用する特定の細胞系に対し適切なエンハンサーを存在させることにより増強できる（Scharf et al., Results Probl.Cell Differ. 20,125−162,1994）。
【００７２】
宿主細胞
宿主細胞菌株は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現された５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドを所望の方法で処理できる能力を目的として選択できる。該ポリペプチドのこのような修飾には、アセチル化、カルボキシ化、グリコシル化、燐酸化、脂質化、およびアシル化が包含されるがこれらに限定されない。該ポリペプチドの「プレプロ」型を開裂する翻訳後プロセシングもまた、正しい挿入、折り畳み、および／または機能を促進するために使用できる。翻訳後活性のための特異的な細胞機構および特徴的メカニズムを持つ異なる宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、１３２１Ｎ１およびＷＩ３８）が、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ；10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110−2209）から入手でき、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実とするために選択できる。
【００７３】
組換えタンパク質の、長期高収量産生のために、安定な発現が好ましい。例えば、セルラインは、クローニングされた５−ＨＴ様ＧＰＣＲ ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ、ウイルス複製起点および／または内因性発現エレメント、および同じまたは別のベクター上にある選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを使用して、常套的トランスフェクション法、例えばリポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、小胞、電気穿孔、燐酸カルシウム等によって安定にトランスフェクトされ得る。該ベクターの導入に続いて、細胞を強化培地で１−２日間生育させた後、培地を選択培地に交換することができる。選択マーカーの目的は選択に対する抵抗性を付与することであり、その存在が、導入された５−ＨＴ様ＧＰＣＲ配列をうまく発現する細胞の生育と回収を可能にする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型にとって適当な組織培養技術を用いて増殖させることができる。例えば、ANIMAL CELL CULTURE, R.I.Freshney,ed.,1986を参照されたい。
【００７４】
幾つかの選択系を用いて、形質転換されたセルラインを回収できる。
【００７５】
これらには、それぞれtk-またはaprt-細胞で使用できる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler et al., Cell 11,223−32,1977）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy et al., Cell 22,817−23,1980）遺伝子が包含されるがこれらに限定される訳ではない。さらに、代謝拮抗物質、抗生物質、または除草剤耐性を選択の基準に用いることができる。例えば、dhfrはメソトレキサートに対する耐性を付与し（Wigler et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 77,3567−70,1980）nptはアミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を付与し（Colbere−Garapin et al., J.Mol. Biol. 150,1014,1981）、そしてalsおよびpatはそれぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与する（Murray, 1992,上記）。さらなる選択遺伝子が記載されている。例えば、trpBは細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用するようにさせ、hisDは細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用するようにさせる（Hartman & Mulligan, Proc.Natl.Acad.Sci. 85,8047−51,1988）。アントシアニンのような可視マーカー、β−グルクロニダーゼとその基質ＧＵＳ、およびルシフェラーゼとその基質ルシフェリンは、形質転換体を同定し、特異的ベクター系に帰すことのできる一過性または安定なタンパク質発現の量を定量するために使用できる（Rhodes et al., Methods Mol.Biol. 55,121−131,1995）。
【００７６】
発現の検出
マーカー遺伝子発現の存在は５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドもまた存在することを示唆しているが、その存在と発現は確認する必要がある。例えば、もし５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列がマーカー遺伝子配列内部に挿入されるならば、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の不在によって同定できる。これに代わり、マーカー遺伝子は、単一のプロモーターの調節下に５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列とタンデムに並べて位置させることもできる。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は、通常、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの発現を示す。
【００７７】
これとは別に、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドを含み５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドを発現する宿主細胞は、当業者に知られる様々な方法によって同定できる。これらの方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびタンパク質生検またはイムノアッセイ技術（核酸またはタンパク質の検出および／または定量のための膜、溶液、またはチップに基づく技術を包含する）が包含されるがこれらに限定されない。例えば、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列の存在は、プローブまたは断片または５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの断片を使用するＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたは増幅によって検出できる。核酸増幅に基づく検定は、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドを含む形質転換体を検出するための、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列から選択されるオリゴヌクレオチドの使用を含む。
【００７８】
５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドに対し特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかを使用して該ポリペプチドの発現を検出および測定するための様々なプロトコルが当分野で知られている。例として、酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）がある。５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチド上の２個の非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる、２部位のモノクローナルに基づくイムノアッセイが使用でき、または、競合的結合検定を使用することができる。これらのそしてその他の検定はHamptom et al., SEROLOGICAL METHODS: A LABORATORY MANUAL, APS Press, St.Paul, Minn., 1990およびMaddox et al., J.Exp.Med. 158,1211−1216,1983）に記載されている。
【００７９】
多岐にわたる標識およびコンジュゲーション技術が当業者に知られており、様々な核酸およびアミノ酸検定に使用できる。５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識化ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを調製する手段は、標識したヌクレオチドを使用する、オリゴ標識化、ニック翻訳、末端標識化、またはＰＣＲ増幅を包含する。これとは別に、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列を、ｍＲＮＡプローブの産生のためのベクター中にクローニングすることもできる。このようなベクターは当分野で既知であり、市販品が入手でき、標識化ヌクレオチドおよび適当なＲＮＡポリメラーゼ、例えばＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６を添加することによりインビトロでのＲＮＡプローブの合成に使用することができる。これらの方法は、市販の様々なキットを用いて実施できる（Amersham Pharmacia Biotech、 Promega、およびUS Biochemical）。検出を容易にするために使用できる適当なリポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、および蛍光、化学ルミネセント、または色素生成物質、ならびに基質、補助因子、インヒビター、磁性粒子などが包含される。
【００８０】
ポリペプチドの発現および精製
５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列で形質転換させた宿主細胞は、発現と、細胞培養からのタンパク質の回収に適した条件下で培養できる。形質転換細胞により産生されたポリペプチドは、その配列および／または使用したベクターに応じて分泌されまたは細胞内に貯留され得る。当業者には理解できるであろうが、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核または真核細胞膜を通った可溶性５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドの分泌を指令する、または膜結合５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドの、膜挿入を指令する、シグナル配列を含むよう設計できる。
【００８１】
上に論じたように、他の組み立て物を用いて、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードしているヌクレオチド配列と結合させることができる。このような精製促進ドメインは、金属キレート化ペプチド、例えば固定化金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするタンパク質Ａドメイン、およびFLAGS伸長／親和精製系で利用するドメインが包含されるが、これらに限定されない（Immunex Corp., Seattle, Wash.）。精製ドメインと５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドとの間に開裂可能リンカー配列、例えば第Ｘａ因子またはエンテロキナーゼに特異的なリンカー配列を入れること（Invitrogen, San Diego, CA）もまた、精製を促進するために利用できる。このような発現ベクターの１つは、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドと、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ開裂部位に先立つ６個のヒスチジン残基とを含む融合タンパク質の発現を提供する。このヒスチジン残基はＩＭＡＣ（Porath et al., Prot.Exp.Purif. 3,263−281,1992に記載の固定化金属イオン親和クロマトグラフィー）による精製を促進し、一方エンテロキナーゼ開裂部位は融合タンパク質からの５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドの精製手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターはKroll et al., DNA Cell Biol. 12,441−453,1993に開示されている。
【００８２】
化学合成
５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列は、その全体または一部を、当分野で周知の化学的方法を用いて合成できる（Caruthers et al., Nucl.Acids Res.Symp.Ser. 215−223,1980；Horn et al., Nucl.Acids Res.Symp.Ser. 225−232,1980）。これとは別に、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチド自身を、そのアミノ酸配列を合成するための化学的方法、例えば固相技術を用いる直接ペプチド合成を用いて調製できる（Merrifield, J.Am.Chem.Soc. 85,2149−2154,1963；Roberge et al., Science 269,202−204,1995）。タンパク質合成は手動技術またはオートメーションを用いて実施できる。自動化合成は、例えばApplied Biosystems 431Aペプチド合成機（Perkin Elmer）を用いて達成できる。所望により、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドの断片を別々に合成し、化学的方法を用いて合して完全長の分子を調製することもできる。
【００８３】
新たに合成したペプチドは、調製用高速液体クロマトグラフイー（例えばCreighton, PROTEINS: STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, WH Freeman and Co., New York, N.Y., 1983）により実質的に精製できる。合成５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドの組成はアミノ酸分析または配列決定により確認できる（例えばエドマン分解法；Creighton、上記を参照されたい）。さらに、直接合成中に５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドのアミノ酸配列の任意の部分を改変させ、そして／または化学的方法を用いて他のタンパク質由来の配列と合して、変異体ポリペプチドまたは融合タンパク質を調製することができる。
【００８４】
改変５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドの調製
当業者には理解できるであろうが、天然に存在しないコドンを有する５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドコード化ヌクレオチドを調製することは有利であり得る。例えば、特定の原核または真核宿主が好むコドンを選択して、タンパク質発現の速度を増大させ、または所望の性質、例えば天然に存在する配列から産み出される転写物の半減期より長い半減期を持つＲＮＡ転写物を調製することができる。
【００８５】
本明細書に開示するヌクレオチド配列は、当分野で一般的に知られる方法を用いて、該ポリペプチドまたはｍＲＮＡ産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を修飾する改変を包含する（但しこれらに限定される訳ではない）様々な理由で、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドコード配列を改変させるように設計できる。無作為断片化によるＤＮＡシャフリングと遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再集合を用いてヌクレオチド配列を設計できる。例えば、位置指定突然変異誘発を用いて、新たな制限部位を挿入し、グリコシル化パターンを変え、コドンの優先性を変え、スプライス変異体を調製し、突然変異を導入する等を実施できる。
【００８６】
抗体
当分野で知られているいかなる型の抗体も、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドのエピトープに特異的に結合するよう作製できる。本明細書で使用する「抗体」とは、無傷の免疫グロブリン分子、およびその断片、例えばＦａｂ、Ｆ(ａｂ')2、およびＦｖを包含し、これらは５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドのエピトープに結合できる。典型的には、エピトープを形成するためには少なくとも６、８、１０、または１２の連続するアミノ酸が必要である。しかしながら、非連続アミノ酸を含むエピトープはより多くの、例えば少なくとも１５、２５、または５０のアミノ酸を必要とするかも知れない。
【００８７】
５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドのエピトープに特異的に結合する抗体は治療に使用でき、そして免疫化学検定、例えばウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学検定、免疫沈降、またはその他の当分野で既知の免疫化学的検定に使用できる。所望の特異性を有する抗体の同定のため、様々なイムノアッセイが使用できる。競合的結合または免疫放射検定のための多数のプロトコルが当分野でよく知られている。このようなイムノアッセイは典型的には、免疫原と、その免疫原に特異結合する抗体との間の複合体形成の測定を含んでいる。
【００８８】
典型的には、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドに特異的に結合する抗体は、免疫化学検定に使用する時、他のタンパク質が提供する検出シグナルより少なくとも５、１０、または２０倍高い検出シグナルを提供する。好ましくは、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドに特異結合する抗体は、免疫化学検定で他のタンパク質を検出せず、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドを溶液から免疫沈降させることができる。
【００８９】
ヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドは、哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、またはヒトを免疫してポリクローナル抗体を産生させるのに使用できる。所望により、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドは、担体タンパク質、例えば牛血清アルブミン、チログロブリン、およびスカシガイヘモシアニンとコンジュゲートさせることができる。宿主の種に応じて、免疫学的反応を増大させるために種々のアジュバントを使用できる。このようなアジュバントは、フロイントアジュバント、鉱物性ゲル（例えば水酸化アルミニウム）、および界面活性物質（例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、スカシガイヘモシアニン、およびジニトロフェノール）を包含するがこれらに限定されない。ヒトに使用するアジュバントの中ではＢＣＧ（bacilli Calmette−Guerin）およびCorynebacterium parvumが特に有用である。
【００９０】
５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体は、培養中の連続的セルラインにより抗体分子の産生を提供する任意の技術を用いて調製できる。これらの技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術があるがこれらに限定されない（Kohler et al., Nature 256,495−497,1985; Kozbor et al., J.Immunol.Methods 81,31−42,1985; Cote et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 80,2026−2030,1983; Cole et al., Mol.Cell Biol. 62,109−120,1984）。
【００９１】
さらに、マウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子にスプライシングして適当な抗原特異性と生物活性を持つ分子を得る、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術が利用できる（Morrison et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 81,6851−6855,1984; Neuberger et al., Nature 312,604−608,1984; Takeda et al., Nature 314,452−454,1985）。モノクローナルおよびその他の抗体はまた、これを治療に使用した場合に患者が該抗体に対する免疫反応を起こすのを防ぐため、「ヒト化」することができる。このような抗体は、治療に直接使用できるほど配列が充分ヒトに類似しているかも知れず、または幾つかの重要残基の変更を必要とするかも知れない。齧歯類の抗体とヒト配列の間の配列相違は、個々の残基の位置指定突然変異誘発により、または相補性決定領域全体のgratingにより、ヒト配列内の残基と相違する残基を置き換えることによって最小化することができる。別法として、ヒト化抗体はGB2188638Bに記載のように組換え法を用いて調製できる。５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドに特異的に結合する抗体は、U.S.5565332に開示のように、部分的または完全にヒト化した抗原結合部位を含むことができる。
【００９２】
これに代わり、当分野で既知の方法を用いて、一本鎖抗体の調製のために記載した技術を適合させ、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドに特異結合する一本鎖抗体を調製することができる。関連する特異性を持つが別個のイディオタイプ組成を有する抗体を、無作為組み合わせ免疫グロブリンライブラリーから鎖シャフリングによって調製することができる（Burton, Proc.Natl.Acad.Sci. 88,11120−23,1991）。
【００９３】
一本鎖抗体はまた、ハイブリドーマｃＤＮＡを鋳型に用いて、ＰＣＲのようなＤＮＡ増幅法を用いて組み立てることができる（Thirion et al., 1996, Eur.J.Cancer Prev. 5,507−11）。一本鎖抗体は単一または二重特異性であり得、また、二価または四価であり得る。四価二重特異性一本鎖抗体の組み立ては例えばColoma & Morrison, 1997, Nat.Biotechnol. 15,159−63に教示されている。二価二重特異性一本鎖抗体の組み立てはMallender & Voss, 1994, J.Biol.Chem. 269,199−206に教示されている。
【００９４】
下記のように、一本鎖抗体をコードしているヌクレオチド配列を手動または自動ヌクレオチド合成を用いて組み立て、標準的組換えＤＮＡ法を用いて発現組み立て物中にクローニングし、そして細胞中に導入してコード配列を発現させることができる。別法として、一本鎖抗体を、例えば糸状ファージ技術を用いて直接調製することもできる（Verhaar et al., 1995, Int.J.Cancer 61,497−501; Nicholla et al., 1993, J.Immunol.Meth. 165,81−91）。
【００９５】
５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドに特異結合する抗体はまた、リンパ球集団においてインビボ産生を誘導することによって、または、文献に開示されている極めて特異的な結合試薬のパネルまたは免疫グロブリンライブラリーをスクリーニングすることによって調製することもできる（Orlandi et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 86,3833−3837,1989; Winter et al., Nature 349,293−299,1991）。
【００９６】
その他の型の抗体を、本発明方法において組み立て、治療に使用することができる。例えば、WO93/03151に開示のように、キメラ抗体を組み立てることができる。免疫グロブリンから誘導され多価且つ多重特異的である結合タンパク質、例えばWO94/13804に記載の「diabodies」もまた調製できる。
【００９７】
本発明に係る抗体は当分野で周知の方法により精製できる。例えば、抗体は、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドが結合しているカラムを通過させることにより親和精製できる。次いで、結合した抗体を、高い塩濃度の緩衝液を用いてカラムから溶出することができる。
【００９８】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に対し相補的なヌクレオチド配列である。いったん細胞中に導入されるとこの相補的ヌクレオチドは、該細胞が産生した天然配列と結合して複合体を形成し、転写または翻訳のいずれかを遮断する。好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも１１ヌクレオチド長であるが、少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０またはそれ以上のヌクレオチド長であってもよい。より長い配列もまた使用できる。アンチセンスオリゴヌクレオチド分子をＤＮＡ組み立て物に提供し、上記のように細胞中に導入して、その細胞における５−ＨＴ様ＧＰＣＲ遺伝子産物のレベルを低下させることができる。
【００９９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはこの両者の組み合わせであってよい。オリゴヌクレオチドは、１つのヌクレオチドの５'末端を、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロアミデート、燐酸エステル、カルバメート、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、カルボネート、および燐酸トリエステルといった非ホスホジエステルヌクレオチド間結合を有する別のヌクレオチドの３'末端と共有結合させることにより、手動で、または自動合成機によって合成できる。Brown, Meth.Mol. Biol. 20,1−8,1994; Sonveaux, Meth.Mol.Biol. 26,1−72,1994; Uhlmann et al., Chem.Rev. 90,543−583,1990を参照されたい。
【０１００】
５−ＨＴ様ＧＰＣＲ遺伝子の制御、５'、または調節領域と二本鎖を形成するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することにより、５−ＨＴ様ＧＰＣＲ遺伝子発現の修飾が得られる。転写開始部位、例えば開始部位から−１０および＋１０位の間から誘導されるオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、「三重らせん」塩基対合法を用いて阻害を達成できる。三重らせん対合は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子またはシャペロンの結合に足るほど開く能力の阻害を惹起するため、有用である。三本鎖ＤＮＡを用いる治療上の進歩が文献に記載されている（例えばGee et al., Huber & Carr, MOLECULAR AND IMMUNOLOGIC APPROACHES, Futura Publishing Co., Mt.Kisco, N.Y., 1994）。転写物がリボソームに結合するのを防ぐことによりｍＲＮＡの翻訳を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた設計できる。
【０１０１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドと５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの相補配列との間に好結果の複合体を形成させるためには、正確な相補性は必要ない。例えば５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドに対し正確に相補的である２、３、４、もしくは５またはそれ以上の長さの連続するヌクレオチドであって、その各々が、隣接する５−ＨＴ様ＧＰＣＲタンパク質ヌクレオチドとは相補的ではない連続するある長さのヌクレオチドによって隔てられているものを含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−ＨＴ様ＧＰＣＲタンパク質ｍＲＮＡに対する充分な標的化特異性を提供できる。好ましくは、相補的な連続ヌクレオチドの長さはそれぞれ少なくとも４、５、６、７もしくは８またはそれ以上のヌクレオチド長である。非相補的な介在配列は、好ましくは１、２、３、または４ヌクレオチド長である。当業者は、アンチセンス−センスの対の算出融点を容易に使用して、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドと特定の５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチド配列間で寛容されるミスマッチの程度を決定できるであろう。
【０１０２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドとハイブリダイズする能力に影響を及ぼすことなく修飾できる。これらの修飾は該アンチセンス分子の内部、または一端もしくは両端である。例えば、ヌクレオシド間の燐酸結合は、アミノ基と末端リボースの間にいろいろな数の炭素残基を有するコレステリルまたはジアミン部分を加えることによって修飾できる。修飾された塩基および／または糖、例えばリボースの代わりのアラビノース、または３'ヒドロキシ基または５'燐酸基が置換されている３',５'−置換オリゴヌクレオチドもまた修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドに使用できる。これらの修飾オリゴヌクレオチドは当分野で周知の方法により調製できる。例えば、Agrawal et al., Trends Biotechnol. 10,152−158,1992; Uhlmann et al., Chem.Rev. 90,543−584,1990; Uhlmann et al., Tetrahedron.Lett. 215,3539−3542,1987を参照されたい。
【０１０３】
リボザイム
リボザイムは触媒活性を有するＲＮＡ分子である。例えば、Cech, Science 236,1532−1539; 1987; Cech, Ann.Rev.Biochem. 59,543−568; 1990, Cech, Curr.Opin.Struct.Biol. 2,605−609; 1992, Couture & Stinchcomb, Trends Genet. 12,510−515, 1996を参照されたい。当分野で知られるように、リボザイムは、ＲＮＡ配列を開裂することにより遺伝子機能を阻害するのに使用できる（例えば、Haseloff et al., 米国特許5641673）。リボザイムの作用機構は、相補的標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、その後のendonucleolyticな開裂を含む。例には、特異的ヌクレオチド配列のendonucleolyticな開裂を特異的且つ効果的に触媒できる、設計されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子がある。
【０１０４】
５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドのコード配列、例えば配列番号３に示したヌクレオチド配列を用いて、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドから転写されたｍＲＮＡに特異結合するリボザイムを作製できる。他のトランスのＲＮＡ分子を極めて配列特異的に開裂できるリボザイムを設計し組み立てる方法が開発され、当分野で記載されている（Haseloff et al. Nature 334,585−591,1988）。例えば、リボザイムの開裂活性は、別個の「ハイブリダイゼーション」領域を該リボザイム中に組み入れることによって、特定のＲＮＡを標的とさせることができる。このハイブリダイゼーション領域は標的ＲＮＡに対し相補的な配列を含んでおり、したがってその標的と特異的にハイブリダイズする（例えばGerlach et al., EP321201を参照されたい）。
【０１０５】
５−ＨＴ様ＧＰＣＲＲＮＡ標的内部の特異的リボザイム開裂部位は、この標的分子を、以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣを包含するリボザイム開裂部位についてスキャンすることにより同定できる。同定できたならば、該開裂部位を含む標的ＲＮＡの領域に対応する、１５および２０の間のリボヌクレオチドを有する短いＲＮＡ配列を、標的を非機能的にし得る二次構造の特徴について評価できる。さらに、候補の５−ＨＴ様ＧＰＣＲタンパク質ＲＮＡ標的の適合性を、リボヌクレアーゼ防護検定を用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対する利用可能性を試験することによって評価できる。配列番号３に示すヌクレオチド配列およびその相補物は、適当なハイブリダイゼーション領域配列の供給源を提供する。より長い相補配列を用いて、標的に対するハイブリダイゼーション配列の親和性を増大させることができる。リボザイムのハイブリダイズおよび開裂する領域は、相補領域を介して標的ＲＮＡにハイブリダイズする時、リボザイムの触媒領域が標的を開裂し得るといったように、完全に相関している。
【０１０６】
リボザイムはＤＮＡ組み立て物の一部として細胞内に導入できる。マイクロ注入、リポソーム仲介トランスフェクション、電気穿孔、または燐酸カルシウム沈殿といった機械的方法を用いて、５−ＨＴ様ＧＰＣＲ発現の低下が望まれる細胞中にリボザイム含有ＤＮＡ組み立て物を導入することができる。これとは別に、細胞がＤＮＡ組み立て物を安定的に保持することが望まれる場合は、該組み立て物をプラスミド上で供給し、当分野で知られるように、別個のエレメントとして維持するか、または細胞のゲノム中に組み込むことができる。リボザイムコード化ＤＮＡ組み立て物は、細胞中のリボザイムの転写を調節するために、プロモーターエレメント、エンハンサーまたはＵＡＳエレメント、および転写ターミネーターシグナルといった転写調節エレメントを含み得る。
【０１０７】
Haseloff et al.,米国特許5641673に教示のように、リボザイムは、標的遺伝子の発現を誘導する因子に応答してリボザイムの発現が起こるように設計することができる。リボザイムはまた、追加レベルの調節を提供するよう設計でき、その結果、ｍＲＮＡの破壊はリボザイムと標的遺伝子の両者が細胞に誘導された時にのみ起こる。
【０１０８】
区別的に発現される遺伝子
遺伝子産物がヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドと相互作用する遺伝子の同定方法をここに記載する。このような遺伝子は、ＣＯＰＤ、心臓血管障害、癌、泌尿器系障害、肥満症、糖尿病、ＣＮＳ障害、喘息および血液病を包含する（但しこれらに限定されない）疾患において区別して（区別的に）発現される遺伝子を表し得る。さらに、係る遺伝子は、このような疾患の進行または治療に関連する操作に応答して区別的に調節される遺伝子を表し得る。加えて、このような遺伝子は、組織または生物の発生の異なる段階で増大または低下する、一時的に調節される発現を示すことができる。区別的に発現される遺伝子はまた、その発現を、対照対実験条件の下で調節させることができる。さらに、ヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチド遺伝子または遺伝子産物は、これ自体区別的発現について試験できる。
【０１０９】
発現が正常対疾病状態で相違する程度は、標準的特性決定技術、例えば区別的ディスプレイ技術によって視覚化されるに充分大きいというだけでよい。発現の相違を視覚化することのできる、その他のこのような標準的特性決定技術は、定量的ＲＴ（逆転写酵素）、ＰＣＲ、およびノーザン分析を包含するが、これらに限定されない。
【０１１０】
区別的に発現される遺伝子の同定
区別的に発現される遺伝子を同定するためには、目的とする組織から全ＲＮＡ、または好ましくはｍＲＮＡを単離する。例えば、ＲＮＡ試料は、実験対象の組織から、そして対照となる対象の対応組織から取得する。ｍＲＮＡの単離に対して不利に選択しない任意のＲＮＡ単離技術を、係るＲＮＡ試料の精製に利用できる。例えば、Ausubel et al., ed., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc. New York, 1987−1993を参照されたい。当業者に周知の技術、例えばChomczynski、米国特許4843155の一段階ＲＮＡ単離プロセスを用いて多数の組織試料を容易に処理することができる。
【０１１１】
区別的に発現される遺伝子が産生したＲＮＡを表す、集められたＲＮＡ試料内部の転写物は、当業者に周知の方法により同定する。これらには、例えば、ディファレンシャルスクリーニング（Tedder et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85,208−12,1988）、差引きハイブリダイゼーション（Hedrick et al., Nature 308,149−53; Lee et al., Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A. 88,2825,1984）、およびディファレンシャルディスプレイ（Liang & Pardee, Science 257,967−71,1992; 米国特許5262311）およびマイクロアレイが包含される。
【０１１２】
区別的発現の情報はこれ自体、ヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドの関与する疾病の治療のための関連法を示唆している。例えば、治療は、区別的に発現される遺伝子および／またはヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている遺伝子の発現の調節を包含し得る。区別的発現の情報は、区別的に発現される遺伝子もしくは遺伝子産物またはヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチド遺伝子もしくは遺伝子産物の活性または発現が、アップレギュレーションであるかダウンレギュレーションであるかを示すことができる。
【０１１３】
スクリーニング方法
本発明は、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドまたは５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドに結合する、またはその活性を調節する、被験化合物をスクリーニングするための検定を提供する。被験化合物は好ましくは５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する。より好ましくは、被験化合物は、５−ＨＴ様ＧＰＣＲが介在するセトロニンまたはセロトニンアナログの効果を、被験化合物の不在時と比較して少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％低下または増大させる。
【０１１４】
被験化合物
被験化合物は当分野で既知の薬理学的物質であってよく、または薬理活性を持っていることが前もって分かっていない化合物であってよい。この化合物は天然に存在する、または実験室で設計されたものであってよい。これらは、微生物、動物、または植物から単離されたものであってよく、そして組換え的に調製され、または当分野で既知の化学的方法により合成されたものであってよい。所望により被験化合物は、生物学的ライブラリー、空間的アドレス特定可能な並行固相または液相ライブラリー、デコンボルーションを要する合成ライブラリー法、「一ビーズ一化合物」ライブラリー法、および親和クロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を包含する（但しこれらに限定される訳ではない）当分野で既知の数多くの組み合わせライブラリー法のいずれかを用いて取得できる。生物学的ライブラリーアプローチはポリペプチドライブラリーに限定されているが、他の４種のアプローチはポリペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーに適用できる。Lam, Anticancer Drug Des. 12,145,1997を参照されたい。
【０１１５】
分子ライブラリーの合成法は当分野でよく知られている（例えば、DeWitt et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 90,6909,1993; Erb et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 91,11422,1994; Zuckermann et al., J.Med.Chem. 37,2678,1994; Cho et al., Science 261,1303,1993; Carell et al., Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 33,2059,1994; Carell et al., Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 33,2061; Gallop et al., J.Med.Chem. 37,1233,1994を参照されたい）。化合物のライブラリーは溶液で（例えば、Houghten, Biotechniques 13,412−421,1992）、またはビーズ(Lam, Nature 354,82−84,1991)、チップ（Fodor, Nature 364,555−556,1993）、細菌または胞子（Ladner、米国特許5223409）プラスミド（Cull et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 89,1865−1869,1992）、またはファージ（Scott & Smith, Science 249,386−390, 1990; Devlin, Science 249,404−406,1990）;Cwirla et al., Proc.Natl.Acad.Sci.97,6378−6382,1990; Felici, J.Mol.Biol. 222,301−310,1991; およびLadner、米国特許5223409）上に提供できる。
【０１１６】
ハイスループットスクリーニング
被験化合物は、高（ハイ）スループットスクリーニングを用いて、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する能力、または５−ＨＴ様ＧＰＣＲタンパク質活性もしくは５−ＨＴ様ＧＰＣＲ遺伝子発現に影響を及ぼす能力についてスクリーニングできる。ハイスループットスクリーニングを使用して、多くの個別的化合物を並行して試験でき、その結果多数の被験化合物を迅速にスクリーニングできる。最も広範に確立されている技術は９６ウェル微量定量プレートを利用するものである。この微量定量プレートのウェルは、典型的には５０ないし５００μlの範囲の検定容量を必要とする。このプレートに加えて、９６ウェルフォーマットに適合させた多くの機器、材料、ピペット、ロボット、プレート洗浄機、およびプレート読み取り機が市販されている。
【０１１７】
別法として、「自由フォーマット検定」、または試料間に物理的障壁を持たない検定が使用できる。例えば、組み合わせペプチドライブラリーのための、単純な均質検定で色素細胞（メラノサイト）を用いる検定が、Jayawickreme et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 19,1614−18(1994)に記載されている。ペトリ皿中のアガロースの下にこの細胞を入れ、次いで組み合わせ化合物を伴っているビーズをアガロースの表面に載せる。組み合わせ化合物はこのビーズから化合物を部分的に放出する。化合物がゲルマトリックス中へと局所的に拡散するにつれて活性化合物が細胞の色の変化を惹起するため、活性化合物を暗色色素領域として視覚化することができる。
【０１１８】
自由フォーマット検定のもう一つの例は、生体分子スクリーニング学会第１回年次総会（Philadelphia,Pa.、1995年11月7−10日）で報告されたChelsky、「組み合わせライブラリーのスクリーニングのための戦略：新規な、そして伝統的なアプローチ」により記載されている。Chelskyは、カルボニックアンヒドラーゼのための単純な均質酵素検定をアガロースゲルの内部に入れ、その結果ゲル中の酵素がゲル全体に色の変化を惹起するようにさせた。その後、光リンカーを介して組み合わせ化合物を持つビーズをゲル内部に入れ、すると該化合物はＵＶ光により部分的に放出された。酵素を阻害する化合物は、色の変化がより少ない局所阻害領域として観察された。
【０１１９】
さらに別の例がSalmon et al., Molecular Diversity 2,57−63(1996)に記載されている。この例では、組み合わせライブラリーを、寒天中で生育する癌細胞への細胞毒性効果を有する化合物についてスクリーニングした。
【０１２０】
もう一つのハイスループットスクリーニング法がBeutel et al.、米国特許5976813に記載されている。この方法では、被験試料を多孔性マトリックスに入れる。次に１またはそれ以上の検定成分を、マトリックス、例えばゲル、プラスチックシート、フィルター、またはその他の形の容易に操作できる固体担体の内部、上、または底に入れる。試料がこの多孔性マトリックスに導入されるとこれらは充分ゆっくりと拡散し、その結果、被験試料が混ざらずに検定が遂行できる。
【０１２１】
結合検定
結合検定については、被験化合物は好ましくは、例えば５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドの活性部位に結合してこれを占有し、それにより基質がリガンド結合部位に接近できなくさせ、その結果正常な生物活性が妨げられるような小分子またはペプチド様分子である。このような小分子の例は小ペプチドまたはペプチド様分子を包含するが、これらに限定される訳ではない。本発明のポリペプチドに結合する可能性のあるリガンドとしては、既知の５−ＨＴ様ＧＰＣＲの天然のリガンドおよびそのアナログもしくは誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２２】
結合検定では、被験化合物または５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドのいずれかが検出可能な標識、例えば蛍光、放射性同位元素、化学ルミネセント、または酵素標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼ）を含むことができる。そこで、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドに結合している被験化合物の検出は、例えば放射能の放出を直接計数することにより、またはシンチレーション計数により、または検出可能産物への適当な基質の変換を測定することにより、達成できる。
【０１２３】
別法として、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドへの被験化合物の結合を、反応体のいずれをも標識せずに測定することができる。例えば、マイクロフィジオメーターを用いて、被験化合物と５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドとの結合を検出できる。マイクロフィジオメーター（例えばサイトセンサー）とは、細胞がその環境を酸性化する速度を光アドレッサブル電位差センサー（ＬＡＰＳ）を用いて測定する分析機器である。この酸性化速度の変化は、被験化合物と５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドの相互作用の指標として使用できる（McConnell et al., Science 257,1906−1912,1992）。
【０１２４】
被験化合物が５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドに結合する能力の測定はまた、実時間Bimolecular Interaction Analysis（ＢＩＡ）のような技術を用いて達成できる（Sjolander & Urbaniczky, Anal.Chem. 63,2338−2345,1991、およびSzabo et al., Curr.Opin.Struct.Biol. 5,699−705,1995）。ＢＩＡは、いかなる反応体をも標識せずに、生体特異的相互作用を実時間で研究するための技術である（例えばBIAcore(登録商標)）。光学的現象表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の変化を、生体分子間の実時間反応の指標に使用できる。
【０１２５】
本発明のさらに別の態様では、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドを二ハイブリッド検定または三ハイブリッド検定（例えば、米国特許5283317; Zervos et al., Cell 72,223−232,1993; Madura et al., J.Biol.Chem. 268,12046−12054,1993; Bartel et al., Biotechniques 14,920−924,1993; Iwabuchi et al., Oncogene 8,1693−1696,1993; およびBrent WO94/10300）における「おとりタンパク質」として使用し、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドに結合またはこれと相互作用してその活性を調節する他のタンパク質を同定することができる。
【０１２６】
二ハイブリッド系は殆どの転写因子のモジュール的性格に基づくものであり、それは、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインから成っている。簡潔に述べると、この検定は二種の異なるＤＮＡ組み立て物を利用する。例えば、一方の組み立て物においては、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが、既知の転写因子のＤＮＡ結合ドメインをコードしているポリヌクレオチドに融合できる（例えばＧＡＬ−４）。別の組み立て物においては、未同定タンパク質（「餌」または「試料」）をコードしているＤＮＡ配列が、既知の転写因子の活性化ドメインをコードしているポリヌクレオチドに融合できる。もし「おとり」および「餌」タンパク質がインビボで相互作用してタンパク質依存複合体を形成できたならば、該転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインは極めて近位に招来される。この近位性が、転写因子に応答する転写調節部位と機能的に結合しているリポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写を可能にする。リポーター遺伝子の発現が検出でき、機能的転写因子を含む細胞コロニーを単離し、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドと相互作用するタンパク質をコードしているＤＮＡ配列取得に使用することができる。
【０１２７】
反応体の一方または両方の非結合型からの結合型の分離を促進するため、そして検定の自動化の便宜を図るため、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物のいずれかを固定化することが望ましいかも知れない。したがって、この５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物のいずれかを固体支持体に結合させることができる。好適な固体支持体は、ガラスまたはプラスチックスライド、組織培養プレート、微量定量ウェル、管、シリコンチップ、またはビーズ（ラテックス、ポリスチレン、またはガラスビーズを包含するがこれらに限定されない）のような粒子を包含するがこれらに限定されない。共有および非共有結合、受動吸収、またはそれぞれポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物に付着させた結合部分と固体支持体の対、の使用を包含する、当分野で既知の任意の方法を用いて５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物を固体支持体に付着させることができる。被験化合物は好ましくは整列して固体支持体に結合させ、その結果個々の被験化合物の位置を追跡することができる。５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチド（またはポリヌクレオチド）への被験化合物の結合は、反応体を入れるのに適した任意の容器で達成できる。係る容器の例には微量定量プレート、試験管、および微量遠沈管がある。
【０１２８】
一つの態様において、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドは、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドを固体支持体に結合させるドメインを含む融合タンパク質である。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical, St.Louis, Mo.）上またはグルタチオン誘導体化微量定量プレート上に吸着させ、次いでこれを被験化合物または被験化合物および非吸着５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドに合し；次にこの混合物を複合体形成が行われる条件下でインキュベートする（例えば、塩およびpHに関して生理的条件）。インキュベーションの後、ビーズまたは微量定量プレートのウェルを洗浄して未結合成分を除去する。反応体の結合は上記のように直接的または間接的に測定できる。別法として、複合体を固体支持体から解離させた後に結合を測定することもできる。
【０１２９】
本発明に係るスクリーニング検定には、タンパク質またはポリヌクレオチドを固体支持体上に固定化するためのその他の技術を使用することもできる。例えば、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物のいずれかを、ビオチンとストレプトアビジンのコンジュゲーションを利用して固定化できる。当分野で周知の技術（例えばビオチニル化キット、Pierce Chemicals, Rockford,Ill.）を用いて、ビオチニル化した５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物をビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジン被覆した９６ウェルプレート（Pierce Chemical）のウェルに固定化できる。別法として、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチド、ポリヌクレオチド、または被験化合物に特異的に結合するが、所望の結合部位、例えば５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドの活性部位に干渉しない抗体をプレートのウェルに誘導体化することができる。未結合の標的またはタンパク質が抗体コンジュゲーションによりウェル中に捕捉できる。
【０１３０】
ＧＳＴ−固定化複合体について上に記載した方法に加え、このような複合体を検出する方法には、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドまたは被験化合物に特異結合する抗体を用いる、複合体の免疫検出、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドの活性検出へと引き継がれる酵素結合検定、および非還元条件下でのＳＤＳゲル電気泳動がある。
【０１３１】
５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する被験化合物を求めるスクリーニングは、無傷の細胞で実施することもできる。５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む任意の細胞が、細胞に基づく検定系で使用できる。５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドは細胞中に天然に存在し、または上記のような技術を用いて導入できる。５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する被験化合物の結合は、上記のように測定する。
【０１３２】
機能検定
ケモカインポリペプチドの生物学的効果を増大または低下させる能力について被験化合物を試験できる。そのような生物学的効果は、下記の具体的実施例に記載の機能検定を用いて測定できる。機能検定は、精製した５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチド、細胞膜調製物、または無傷の細胞を被験化合物と接触させた後に実施できる。５−ＨＴ様ＧＰＣＲの機能的活性を少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％低下させる被験化合物を、５−ＨＴ様ＧＰＣＲ活性を減少させる可能性ある物質として同定する。５−ＨＴ様ＧＰＣＲ活性を少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％増大させる被験化合物を、５−ＨＴ様ＧＰＣＲ活性を増大させる可能性ある物質として同定する。
【０１３３】
このようなスクリーニング方法の１つは、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドを発現するようトランスフェクトしたメラニン保有細胞の使用を含む。係るスクリーニング技術は１９９２年２月６日公開のWO92/01810に記載されている。したがって、例えばこのような検定を使用して、該レセプターを含むメラニン保有細胞を、レセプターリガンド（例えば、セロトニンまたはセロトニンアナログ）と、スクリーニングされる被験化合物の両者に接触させることにより、レセプターポリペプチドの活性化を阻害する化合物を求めるスクリーニングができる。リガンドが生成するシグナルの阻害は、被験化合物がそのレセプターについての可能性あるアンタゴニストであること、即ち該レセプターの活性化を阻害することを示す。このスクリーニングは、係る細胞をスクリーニングすべき化合物と接触させることにより、レセプターを活性化する被験化合物を同定するために、そして各被験化合物がシグナルを生成するかどうか、即ちレセプターを活性化するかどうかを決定するために使用できる。
【０１３４】
その他のスクリーニング技術は、レセプター活性化により惹起される細胞外pH変化を測定する系においてヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドを発現する細胞（例えば、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞）を使用することを包含する（例えばScience 246,181-296,1989を参照されたい）。例えば、被験化合物をヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドを発現する細胞に接触させ、二次メッセンジャー反応、例えばシグナル伝達またはpH変化を測定して、被験化合物が該レセプターを活性化するか阻害するかを決定できる。
【０１３５】
別のこのようなスクリーニング技術は、ヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしているＲＮＡをXenopus卵母細胞内に導入し、該レセプターを一過性発現させることを含む。次いでトランスフェクトさせた卵母細胞をレセプターリガンドおよびスクリーニングすべき被験化合物に接触させ、その後、該レセプターの活性化を阻害すると思われる被験化合物についてスクリーニングする場合は、カルシウムシグナルの活性化または阻害の検出を行う。
【０１３６】
別のスクリーニング技術は、レセプターがホスホリパーゼＣまたはＤに結合している細胞でヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドを発現させることを含む。このような細胞には、内皮細胞、平滑筋細胞、胚性腎細胞などがある。スクリーニングは上記のように、ホスホリパーゼ活性の変化から該レセプターの活性化程度を定量することにより達成できる。
【０１３７】
上に記載のような機能検定の詳細は、下記の具体的実施例に記載する。
【０１３８】
５−ＨＴ様ＧＰＣＲ遺伝子発現
別の態様では、５−ＨＴ様ＧＰＣＲ遺伝子の発現を増大または減少させる被験化合物を同定する。５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドを被験化合物と接触させ、ＲＮＡまたは５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドのポリペプチド産物の発現を測定する。被験化合物存在下での適当なｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルを、該被験化合物不在下でのｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルと比較する。すると被験化合物が、この比較に基づく発現のモジュレーターとして同定できる。例えば、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、被験化合物の不在時よりも存在時により大きい場合は、この被験化合物を、該ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現の刺激物質または増強物質と同定する。そうではなく、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、被験化合物の不在時よりも存在時により小さい場合は、この被験化合物を、該ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現のインヒビターと同定する。
【０１３９】
細胞における５−ＨＴ様ＧＰＣＲｍＲＮＡまたはポリペプチド発現のレベルは、ｍＲＮＡまたはポリペプチドを検出するための当分野で周知の方法により決定できる。定性または定量的方法のいずれかが使用できる。５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドのポリペプチド産物の存在は、例えばラジオイムノアッセイのような免疫化学的方法、ウエスタンブロッティング、および免疫組織化学を包含する、当分野で周知の様々な技術を用いて決定できる。別法として、ポリペプチド合成は、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチド内への標識アミノ酸の取り込みを検出することにより、インビボで、細胞培養で、またはインビトロ翻訳系で決定できる。
【０１４０】
このようなスクリーニングは、無細胞検定系または無傷の細胞のいずれかで実施できる。５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドを発現するいかなる細胞も細胞に基づく検定系で使用できる。５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチドは細胞内に天然に存在するか、または上記のような技術を用いて導入することができる。一次培養または確立されたセルライン、例えばＣＨＯまたはヒト胚性腎２９３細胞のいずれかを使用できる。
【０１４１】
医薬組成物
本発明はさらに、治療効果を達成するために患者に投与できる医薬組成物を提供する。本発明に係る医薬組成物は、例えば５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチド、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリヌクレオチド、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドに特異的に結合する抗体、または類似体、アゴニスト、アンタゴニスト、または５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチド活性のインヒビターを含み得る。この組成物は単独で、または少なくとも１種類の他の物質、例えば安定化化合物と組み合わせて投与でき、これは、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、および水を包含する（但しこれらに限定されない）任意の無菌で生物学的適合性のある製薬的担体中で投与できる。この組成物は単独で、または他の物質、薬物またはホルモンと組み合わせて患者に投与できる。
【０１４２】
活性成分に加えてこれらの医薬組成物は、賦形剤および補助物質を含む適当な製薬的に許容し得る担体を含有でき、これらは、製薬的に使用できる調製物への活性化合物の処理を促進する。本発明に係る医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、非経口、局所、舌下、または直腸手段を包含する（但しこれらに限定されない）多くの経路により投与できる。経口投与用医薬組成物は、当分野で既知の製薬的に許容し得る担体を用いて経口投与に適した用量に調合できる。このような担体により、該医薬組成物を、患者が内服するための錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などに調合できる。
【０１４３】
経口使用のための医薬製剤は、活性化合物を、固体賦形剤と合し、得られた混合物を所望により粉砕し、そしてこの顆粒混合物を、所望ならば適当な補助物質を加えた後に処理して錠剤または糖衣剤核を得る。好適な賦形剤は炭水化物またはタンパク質増量剤、例えば乳糖、シュクロース、マンニトール、またはソルビトールを包含する糖；トウモロコシ、小麦、米、馬鈴薯、またはその他の植物由来の澱粉；セルロース、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム；アラビアゴムおよびトラガカントゴムを包含するゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質である。所望により崩壊剤または可溶化剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを添加できる。
【０１４４】
糖衣剤核は、濃縮糖溶液のような適当な被覆剤と共に使用でき、これはさらに、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、carbopolゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含むことができる。製品の同定のためまたは活性化合物の量、即ち用量をあらわすために染料または色素を錠剤または糖衣被覆剤に添加できる。
【０１４５】
経口的に使用できる医薬調合物は、ゼラチン製の押してはめ込むカプセル剤、ならびに、ゼラチンおよび被覆剤、例えばグリセロールまたはソルビトールでできた軟封入カプセル剤を包含する。押してはめ込むカプセル剤は、活性成分を、乳糖または澱粉のような増量剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および所望により安定剤と混合して含有できる。軟カプセル剤では、活性化合物を、安定剤を加えたまたは加えない適当な液体、例えば脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコールに溶解または懸濁できる。
【０１４６】
非経口投与に好適な医薬製剤は、水溶液、好ましくは生理学的適合性の緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的に緩衝化した食塩水中で調合できる。水性注射用懸濁剤は、該懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有できる。さらに、活性化合物の懸濁剤は適当な油性注射用懸濁剤として調製できる。好適な親油性溶媒または媒質は、胡麻油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを包含する。非脂質ポリカチオンアミノポリマーもまたデリバリーに使用できる。所望により懸濁剤は、化合物の溶解性を増し高濃縮溶液の調製を可能にするような適当な安定剤または物質を含むことができる。局所または鼻腔投与のためには、透過すべき特定の障壁に対し適当な浸透剤を製剤に使用する。このような浸透剤は当分野で一般に知られている。
【０１４７】
本発明に係る医薬組成物は当分野で既知の方法で、例えば常套的混合、溶解、顆粒化、糖衣剤製造、すりつぶし、乳化、カプセル化、捕捉、または凍結乾燥プロセスによって製造できる。この医薬組成物は塩として提供でき、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、琥珀酸などを包含する（但しこれらに限定されない）多くの酸を用いて調製できる。塩は、水性または他のプロトン性溶媒において、対応する遊離塩基型よりもより可溶性の傾向がある。別の場合には、好ましい調製物は、pH範囲４.５ないし５.５において以下のもの：１−５０mMヒスチジン、０.１％−２％シュクロース、および２−７％マンニトール、の全てまたは任意のものを含有できる凍結乾燥粉末であってよく、これを使用前に緩衝液と合する。
【０１４８】
調合と投与のための技術のさらなる詳細は、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES（Maack Publishing Co., Easton, Pa）の最新版に見出すことができる。医薬組成物を製造した後、これらを適当な容器に入れ、適応状態の治療のためにラベルを貼る。このようなラベル表示は、投与の量、頻度、および投与方法を包含する。
【０１４９】
治療上の適応および方法
ＧＰＣＲは、哺乳類宿主の至る所に存在し、多くの病状を含む多くの生物学的機能の原因となっている。したがって、一方では、ＧＰＣＲを刺激する化合物や薬物を見つけ出すことが望ましく、他方ではＧＰＣＲを阻害する化合物や薬物を見つけ出すことが望ましい。例えば、ＧＰＣＲを活性化する化合物を、喘息、パーキンソン病、急性心不全、尿閉、および骨粗鬆症等の治療目的で用いることができる。とりわけ、ＧＰＣＲを活性化する化合物は、例えば肺血流の欠如または高血圧等によって引き起こされるような、様々な心臓血管の病気の処置に有用である。さらに、これらの化合物は、体液や電解液ホメオスタシスの調節異常に関連する様々な生理学的障害や、アンギオテンシン誘発性アルドステロン分泌に伴う疾患の処置に用いることもできる。
【０１５０】
一般に、ＧＰＣＲの活性化を阻害する化合物は、様々な治療目的、例えば、低血圧および／または高血圧、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、良性前立腺肥大、および統合失調症、躁病性興奮、鬱、錯乱、痴呆または重度の精神薄弱を含む精神的および神経学的障害、ハンチントン病またはトゥーレット症候群等のジスキネジーの処置に使用することができる。なかでもＧＰＣＲを阻害する化合物は、内因性の拒食症の転換、過食症の管理、および過剰な肺血流または低血圧を含む様々な心臓血管の病気の処置にも使用することができる。特に、５−ＨＴ様ＧＰＣＲの調節は、不安、鬱、高血圧、片頭痛、強迫性障害、統合失調症、自閉症、アルツハイマー病、パーキンソニズム、およびハンチントン舞踏病等の神経変性障害、および癌化学療法によって引き起こされる嘔吐、並びに睡眠および摂食障害、疼痛管理、体温および血圧の調節が関係する障害の処置に使用することができる。
【０１５１】
糖尿病
ヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲを調節して糖尿病を処置することができる。  糖尿病  糖尿病は心臓血管系で、血糖中の異常な高台、脂質および異常(併発症)の変更、目、腎臓および神経系によって特徴づけられた共通の代謝異常である。糖尿病は2つの別個の疾病に分類される:タイプ1糖尿病（若年性の発症）(それは、インシュリンを作り分泌する細胞の損失に起因する)およびタイプ2糖尿病（成人性の発症） (インシュリン分泌の欠陥およびインシュリン反応の欠陥によって引き起こされる)。
【０１５２】
タイプ1糖尿病は、膵臓の小島で細胞(β細胞)を分泌するインシュリンを攻撃する、自己免疫の反応によって開始する。β細胞の破壊が始まるS前にこの反応が生じるのを防ぐか、反応を止める試薬は、この疾病用の潜在的な治療である。ベータ細胞増殖および再生を引き起こす他の試薬はさらに潜在的な治療である。
【０１５３】
タイプII糖尿病は2つの糖尿病の条件(人口の6%)に共通する。インシュリン分泌の欠陥は糖尿病の条件の重要な原因で、適切に、インシュリン放出を備えた血糖レベルの上昇に検知して応答するβ細胞の無力化に起因する。β細胞による反応をグルコースに増加させる治療は、この疾病の重要な新しい治療法を提示するであろう。
【０１５４】
タイプII糖尿病患者主題のインシュリン応答の欠陥は治療の介在の別の目標である。筋肉、肝臓および脂肪中のインシュリン受容体の活動を増加させる試薬は、血糖の減少および血しょう脂質の正常化を引き起こすでしょう。直接受容体を刺激するか、受容体からの細胞内の信号を増加させる試薬は受容体活動を増加させることができる。他の治療は、インシュリン状の結果を生成するために細胞の終了プロセス(つまりグルコース輸送、様々な酵素システム)を直接活性化することができる、したがって、1つの、有益な結果を重量超過の主題がタイプII糖尿病に対してより大きな感受性を有する体重を減少させるどんな試薬も可能な治療である。
【０１５５】
Ｉおよびタイプ糖尿病が扱うことができる両方の型のインシュリン応答を模倣する試薬あるいは血糖レベルの縮小により糖尿病の併発症を扱う。同様に、試薬、それは新しい血容器成長を縮小する、両方の疾病の中で発展する目併発症を扱うために使用することができる。
【０１５６】
肥満症
肥満症および過体重は、除脂肪体重と比較した体脂肪の過剰として規定される。カロリー摂取の増加またはエネルギー支出の減少、あるいはその両方が、脂肪として貯えられる余剰エネルギーを導く不均衡を生じさせ得る。肥満症は、重大な医療上の罹患率および死亡率の増加と関連している。肥満症の病因は十分に理解されておらず、遺伝的要因、環境要因またはその２つの組み合わせのために、正方向のエネルギーバランスが引き起され得る。対照的に、食欲不振症および悪液質は、エネルギー支出に対するエネルギー取り込みの不均衡によって特徴付けられ、負方向のエネルギーバランスを引き起こし、体重が減少する。エネルギー支出を増大させるか、および／またはエネルギー取り込み、吸収若しくは貯蔵を減少させる物質は、肥満症、過体重、および関連する同時羅患率を処置するのに有用であろう。エネルギー取り込みを増大させる、および／またはエネルギー支出を減少させる、あるいは痩せた組織(lean tissue)の量を増大させる物質は、悪液質、食欲不振症および萎縮病を処置するのに有用であろう。
【０１５７】
この遺伝子、翻訳されたタンパク質、及びこの遺伝子若しくはその遺伝子の一部又はその産物を調整する物質は、肥満症、過体重、食欲不振症、悪液質、萎縮病、食欲抑制、食欲増進、満腹感の増大若しくは減少、体重の調整、および／または過食症などの他の摂食障害を処置するのに有用である。また、この遺伝子、翻訳されたタンパク質、およびこの遺伝子またはその遺伝子産物若しくはその産物を調整する物質は、肥満症／高血圧症、糖尿病II型、環動脈疾患、高脂血症、脳卒中、胆嚢疾患、痛風、変形関節炎、睡眠時無呼吸および呼吸問題を含む過体重関連同時羅患率、幾つかのタイプの癌（子宮体癌、乳癌、前立腺癌および大腸癌を含む）、塞栓疾患、多嚢胞性卵巣症候群、減弱化受胎能、妊娠の合併症、月経不順、多毛症、ストレス尿失禁、及びうつ病、を処置するのに有用である。
【０１５８】
ＣＮＳ障害
処置できるＣＮＳ障害には、脳損傷、脳血管疾患及びこれらの予後、パーキンソン病、皮質基底核変性症、運動ニューロン疾患、痴呆（ＡＬＳ、多発性硬化症、外傷性脳損傷、脳卒中、脳卒中後、外傷後脳損傷および小血管性脳血管疾患を含む）が挙げられる。また、痴呆症、例えばアルツハイマー病、血管性痴呆、レビ小体痴呆、前頭側頭骨痴呆、及び第１７染色体に関連したパーキンソニズム、前頭側頭骨痴呆症（ピック病、進行性核麻痺(progressive nuclear palsy)、皮質基底核変性症、ハンチントン病、視床退縮(thalamic degeneration)、クロイツフェルト−ヤコブ病、ＨＩＶ性痴呆症、痴呆症を伴う統合失調症、及びコルサコフ精神病を含む）を処置できる。同様に、認知関連障害、例えば穏和な認知障害、加齢関連性記憶障害、加齢関係性認知減退、血管性認知障害、注意欠陥障害、注意欠陥多動性障害、及び学習障害を患った子供の記憶障害を、ヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲの活性を調節することによって処置できる。
【０１５９】
ＣＮＳ障害に関連する疼痛もまた、ヒト膜型セリンプロテアーゼの活性を調節することによって処置できる。処置できる疼痛には、中枢神経系障害と関連するもの、例えば多発性硬化症、脊髄損傷、坐骨神経痛、失敗した腰部手術(failed back surgery)症候群、外傷性脳損傷、癲癇、パーキンソン病、脳卒中後、及び脳や脊髄における血管破壊（例えば、梗塞、出血、血管新生異常）が挙げられる。非中枢神経因性疼痛には、乳房切除術後疼痛、反射性交感神経性ジストロフィー（ＲＤＳ）、三叉神経痛ラジオキュロパシー(trigeminal neuralgiaradio−culopathy)、術後の疼痛、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ関連疼痛、癌疼痛、代謝神経痛（例えば、糖尿病性神経障害、結合組織疾患に対する第２の血管炎神経障害）、例えば肺癌種、白血病、リンパ腫、前立腺、大腸若しくは胃癌種、三叉神経痛及び疱疹後神経痛と関連する腫瘍随伴性多発神経障害が挙げられる。癌及び癌処置と関連する疼痛もまた処置でき、頭痛（例えば前兆を伴う片頭痛、前兆を伴わない片頭痛、および他の片頭痛障害）、偶発性及び慢性緊張性頭痛、緊張型様頭痛、群発性頭痛や慢性発作性片頭痛も処置できる。
【０１６０】
心疾患には心臓及び血管系における疾患：うっ血性心不全、心筋梗塞、心臓の虚血疾患、全種類の心房性不整脈及び心室性不整脈、高血性血管疾患及び末梢血管疾患が含まれる。
【０１６１】
心不全は、心機能の異常が新陳代謝組織の要求に見合った割合で血液をポンプする心臓の機能不全が原因の病理学的状態として規定される。これには、ポンプ不全の全ての形態、例えば高拍出及び低拍出、急性及び慢性、右心系又は左心系、収縮期又は拡張期、根本原因とは無関係なものが含まれる。
【０１６２】
心筋梗塞（ＭＩ）は、動脈硬化症により狭くなった冠動脈の血栓性閉塞に続いて、一般的に冠血流量の急激な低下により発症する。ＭＩ予防法（１次予防及び二次予防）が含まれ、ＭＩの急性期処置及び合併症の予防が含まれる。
【０１６３】
虚血疾患は、冠流量が制限され、灌流が心筋の酸素要求量を補うには不十分となる状態を表す。この疾患群には、安定狭心症、不安定狭心症及び無症候性虚血が含まれる。
【０１６４】
不整脈には、心房性及び心室性頻脈性不整脈（心房頻脈、心房粗動、心房細動、心房−心室興奮回帰性(リエントラント)頻脈、早期興奮症候群、心室頻脈、心室粗動、心室細動）の全形態、並びに除脈性不整脈形態が含まれる。
【０１６５】
血管疾患は、原発性および全ての種の二次性動脈性高血圧症（腎性、内分泌性、神経性、その他）を包含する。ここに開示する遺伝子およびその産物は、高血圧症の治療および全合併症の防止のための薬物標的として使用できる。
【０１６６】
末梢血管疾患とは、動脈および／または静脈血流が減少し、その結果、血液供給と組織の酸素要求の間に不均衡が生じている血管疾患として定義する。これには、慢性末梢動脈閉塞疾患（ＰＡＯＤ）、急性動脈血栓症および塞栓症、炎症性血管疾患、レイノー現象、および静脈疾患が包含される。
【０１６７】
慢性閉塞性肺（又は気道）疾患（ＣＯＰＤ）は、慢性気管支炎による肺気腫及び末梢気道閉塞の併発が一般的な原因である、気流閉塞として生理的に定義される状態である（Senior＆Shapiro, Pulmonary Diseases and Disorders, 3d ed., New York, McGraw−Hill, 1998, pp. 659−681,1998; Barnes, Chest 117, 10S−14S, 2000）。肺気腫は、肺空気間隙の異常な拡張を引き起こす肺胞壁の破壊によって特徴付けられる。慢性気管支炎は、連続２年間それぞれに３ヶ月間の慢性多産咳(chronic productive cough)が見られるというように臨床的に定義される。ＣＯＰＤにおいては、気流閉塞は通常進行性であり、希に好転することがある。ＣＯＰＤの発症において、タバコの喫煙はかなり重要な危険因子であるが、この疾患は非喫煙者にも発症する。
【０１６８】
気道の慢性炎症は、ＣＯＰＤの鍵となる病態的特徴である（Senior＆Shapiro, 1998）。炎症細胞群には、増加した数の貪食細胞、好中球およびＣＤ+８リンパ球が含まれる。吸引した刺激物、例えばタバコの煙が、気道に常在する貪食細胞を活性化し、同様にケモカイン（例えば、インターロイキン−８）及び他の走化因子を放出することになる上皮細胞を活性化する。これらの走化因子が作用して、血液から肺組織及び気道へ輸送する好中球／単球を増加させる。気道に補充された好中球及び単球が、ダメージを与える可能性のある種々の媒介物、例えばタンパク質分解酵素や活性酸素種を放出し得る。マトリックス分解、並びに気道壁の肥大化、界面活性剤機能障害及び粘液過分泌を伴う肺気腫、これら全てが障害性気流及びガス交換を引き起こす炎症性応答となる可能性がある後遺症である。
【０１６９】
ＧＰＣＲとＣＯＰＤ
いくつかのＧＰＣＲはＣＯＰＤの病理と関連付けられている。例えば、ケモカインＩＬ−８はＣＸＣＲ１及びＣＸＣＲ２を通じて作用し、これらの受容体のアンタゴニストはＣＯＰＤの治療として研究されている。代謝調節型受容体のＰ２Ｙファミリーメンバーは、正常な肺機能において非常に重要な役割を果たし得る。特に、Ｐ２Ｙ2受容体は肺の粘膜毛様体排除機構の調節に関与すると考えられており、この受容体のアゴニストが慢性気管支炎を患っている患者の気道の粘液排除を刺激し得る（Yerxa Johnson, Drugs of the Future 24,759−769,1999）。従って、ＧＰＣＲはＣＯＰＤについての治療標的であり、既存のＧＰＣＲファミリー又は新規ＧＰＣＲの更なるメンバーを同定することで、より魅力的な標的を産出できる。
【０１７０】
癌
癌は、基本的に発癌性細胞形質転換によって発症する疾患である。形質転換細胞をそれらの正常な対応物から区別し、かつ癌の病態生理に基づく形質転換細胞の特徴は幾つかある。それらには、非制御型細胞性増殖、通常の死誘導シグナルに対する不応答（不死化）、増大した細胞運動性及び侵襲性、新たな血管新生の誘導を通じた血液供給を補充するための増大した能力（血管新生）、遺伝子の不安定性、並びに調節不全遺伝子発現が挙げられる。薬剤耐性の獲得とともに、これらの異常な生理機能の種々の組み合わせににより、最終的に臓器不全および患者の死となる難治性疾患状態に頻繁に陥る。
【０１７１】
最も一般的な癌治療は、細胞増殖を標的とし、形質転換細胞と正常細胞との間の効率に関するその特異な増殖能に基づいている。このアプローチは、幾つかの重要な正常細胞タイプもまた高増殖であり、かつ癌細胞が高頻度にこれらの物質に対して耐性となるという現実により妨げられている。従って、従来の抗癌治療についての治療指数は珍しく２.０を超えている。
【０１７２】
ゲノミクス誘導性分子の標的同定は、癌患者に安全で、かつより効率的な処置を提供できる治療介入のための新たな癌特異的標的を同定する可能性を開いた。従って、新たに発見される腫瘍関連遺伝子及びその産物を疾患におけるそれらの機能（群）について試験でき、そして革新的な治療を発見し、かつ開発するために道具として用いることができる。以上に概説した生理学的プロセスの多くに重要な働きがある遺伝子は、癌標的として特徴付けることができる。
【０１７３】
遺伝子は処置として使用できる。また、ゲノミクスを通じて同定される遺伝子又は遺伝子断片は、すぐに１つ又はそれ以上の非相同（ヘテローガス）発現系において発現させ、機能性組換えタンパク質を産生さ細胞ことができる。このタンパク質は、その生物学的機能についてインビトロで特徴付けられ、その後その生化学活性の化学修飾因子（モジュレーター）を同定するため、ハイスループット分子スクリーニングプログラムにおける道具として用いられる。標的タンパク質活性のアゴニスト及び／又はアンタゴニストをこの様式で同定し、次いで、細胞およびインビボ疾患モデルにて抗癌活性について試験する。生物学的モデルにおける反復試験や、詳細な薬物動態力学的分析及び中毒学的分析を用いたリード化合物の最適化により、薬物開発及び次のヒトでの試験についての基礎を形成する。
【０１７４】
アレルギーは、環境抗原により臨床的な副作用が引き起こされる複合過程である。アレルゲンと称される誘導性抗原は、一般に特異的なＩｇＥ応答を引き起こし、大抵の場合、アレルゲン自体には毒性がほとんどないか、あるいは全くないが、ＩｇＥ応答により次々とＩｇＥ依存性又はＴ細胞依存性の過敏反応が誘導され、病理が発症する。過剰反応は、局所的又は全身性の場合があり、以前にあるアレルゲンに対して敏感となった個体にそのアレルゲンを曝すと、典型的には数分以内に過剰反応を発症する。このアレルギーの過剰反応は、エフェクター細胞（例えば、肥満細胞、好塩基球または好酸球）表面の特異的な受容体と結合しているＩｇＥ抗体がアレルゲンを認識して、エフェクター細胞を活性化し、そして急性サイン及び応答の症状を起こす媒介物質を放出することにより発症する。アレルギー疾患には、喘息、アレルギー性鼻炎（枯草熱）、アトピー性皮膚炎及びアナフィキラシーが含まれる。
【０１７５】
喘息は、多くの遺伝子と環境因子との相互作用による結果として考えられており、以下の３つの主要な特性：１）気管支収縮、粘液生産増大、気道の狭小化を引き起こす気道壁の肥厚化により引き起こされる断続的かつ可逆的な気道閉塞、２）気道口径制御の低下により引き起こされる気道反応亢進、及び３）気道炎症、により特徴付けられる。特定の細胞は、喘息の炎症反応に重要であり、それらにはＴ細胞、及び抗原提示細胞、ＩｇＥを産生するＢ細胞、並びにＩｇＥと結合する肥満細胞、好塩基球、好酸球及び他の細胞が含まれる。これらのエフェクター細胞は、気道のアレルギー反応部位に蓄積しており、そして急性病状に及び最終的に該疾患に関連する組織破壊に関与する毒性産物を放出する。平滑筋細胞、肺上皮細胞、粘液生産細胞及び神経細胞などの他の常在(resident)細胞もまた喘息を患っている個体においては異常なものとなり得、病状に寄与し得る。臨床的に断続喘鳴及び呼吸不足などを示す喘息の気道閉塞は、一般に緊急処置が必要とされる疾患の多くの圧迫症状を引き起こすと同時に、該疾患と関連した炎症及び組織破壊は、最終的に喘息を長期管理が必要な身体障害とする不可逆変化を引き起こし得る。
【０１７６】
近年の喘息に対する病理理解の大きな進展にも拘わらず、この疾患の羅患率及び重傷度は増大しているようである（Gergen及びWeiss, Am. Rev. Respir. Dis. 146, 823−24,1992）。人口の３０〜４０％がアトピー性アレルギーに苦しんでおり、人口のうち子供１５％及び成人５％が喘息に苦しんでいる（Gergen及びWeiss, 1992）。従って、我々の医療財源に莫大な負担がかかっている。しかしながら、喘息の診断及び処置は困難である。肺組織炎症の重症度を測定するのは容易でなく、この疾患の症状はしばしば呼吸器感染症、慢性呼吸器炎症疾患、アレルギー性鼻炎又は他の呼吸性疾患から区別できない。原因となる環境因子を取り出すことが困難であるため、刺激性アレルゲンを決定できないことがしばしばである。現在の薬理学的処置はそれ自体の不利益さによる問題がある。一般に用いられる治療物質、例えばβアゴニストは、一時的に肺機能を改善する症状緩和物として作用し得るが、根本的な炎症には作用しない。根本的な炎症を低減させ得る物質、例えば抗炎症性ステロイドは、免疫抑制から骨喪失の範囲にまで及ぶという大きな欠点があり得る（Goodman及びGilman's THE PHARMACOLOGIC BASIS OF THERAPEUTICS, Seventh Edition, MacMillan Publishing Company, NY, USA, 1985）。さらに、コルチコステロイドを吸入するなどの現在の治療の多くは持続性が短く、使用に不便であり、そして症例によってはしばしば一生定期的に用いなければならない、重要な問題は患者が処置に応じるのを止めることで処置の有効性が低減することである。
【０１７７】
この従来の治療に関する問題のため、代わりとなる処置ストラテジーが評価されている。グリコホリンＡ（Chu及びSharom, Cell. Immunol. 145, 223−39,1992）、シクロスポリン（Alexanderら、Lancet 339, 324−28,1992）及びＩＬ−２のノナペプチド断片（Zav'yalovら、Immunol. Lett. 31, 285−88,1992）の全てはインターロイキン−２依存性Ｔリンパ球増殖を阻害するが、これらは多くの別の効果を示すことが知られている。例えば、シクロスポリンは臓器移植後の免疫抑制物質として使用される。これらの物質は、喘息の処置におけるステロイドの代替物に相当し得ると同時に、インターロイキン−２依存性Ｔリンパ球増殖及びホメオスタシスと関連する潜在的に重要な免疫機能を阻害する。気管支圧縮（bronchochonstriction）の媒介物質、例えばクロモン(cromones)又は抗ロイコトリエンの放出又は活性化をブロックする別の処置が穏和な喘息の処置に最近導入されたが、これらは非常に高価な上に、全ての患者に有効という訳でもなく、これらが喘息性炎症と関連する慢性変化に何らかの影響を及ぼすか否かについても明らかではない。喘息の発症に重要な経路において作用でき、該疾患の偶発的攻撃をブロックし、患者を免疫無防備状態にすることなく過剰反応アレルギー免疫応答を優先的に弱らせることのできる処置の同定が、当分野で必要とされている。
【０１７８】
気道平滑筋の収縮と炎症細胞の化学的誘引に関与する仲介物質の多くは、ＧＰＣＲ結合を介してそれらの効果を発揮する。平滑筋収縮の仲介物質には、ロイコトリエン、血小板活性化因子、エンドセリン−１、アデノシン、およびトロンボキサンＡ２がある。これら仲介物質の幾つかによるＧＰＣＲの活性化を遮断するレセプターアンタゴニストが喘息の治療薬として成功裏に使用されてきた。炎症細胞の化学的誘引物質には、ケモカイン、例えばエオタキシン、ＭＣＰ−４、RANTES、およびＩＬ−８がある。同様にケモカインレセプターアンタゴニストが喘息の治療薬として開発されている。Sarau et al., Mol.Pharmacol. 56,657−63,1999; Kitaura et al., J.Biol.Chem. 271,7725−30,1996; Ligget et al., Am.J.Respir.Crit.Care Med. 152,394−402,1995; Panettieri et al., J.Immunol. 154,2358−65,1995; Noveral et al., Am.J.Physiol. 263,L317−24,1992; Honda et al., Nature 349,342−46,1991。
【０１７９】
幾つかのＧＰＣＲの活性化は逆に喘息において有益な効果を持っている。例えば、β１−およびβ２−アドレナリン作動性ＧＰＣＲを活性化するレセプターアゴニストは、喘息発作の治療の際、収縮した気道平滑筋を弛緩させるために治療的に使用される。このように、正または負のやり方でのＧＰＣＲの調節が、喘息治療において重要な役割を果たし得る。
【０１８０】
血液疾患
グアニン−ヌクレオチド−結合（Ｇ−）タンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）は、様々な造血過程、例えば前駆体細胞の、増殖、分化、生存、造血およびリンパ組織への移動および定着（homing）、に関与している。ＧＰＣＲの機能不全は、血液細胞の不十分な産生につながり得、貧血、白血球減少、血小板減少または種々の様態の白血病をもたらす。
【０１８１】
ＧＰＣＲは、循環する白血球細胞の様々な機能、例えば、リンパ球における免疫応答の活性化、単球によるサイトカイン産生、および顆粒球の走化性、において役割を担っている。ＧＰＣＲ機能の調節不良は、免疫機能の低下、アレルギーおよび宿主の防御システムの他の病的状態の原因となり得る。
【０１８２】
循環血小板ＧＰＣＲは、血小板凝集および止血につながるメディエーターの分泌を引き起こす活性化を媒介する。薬理学的または分子遺伝子学的方法による、血小板におけるＧＰＣＲ機能の調節は血栓性疾患および出血性疾患における重要な役割を担っており、ＧＰＣＲは適当な治療薬物の標的となる。
【０１８３】
ＧＰＣＲは、小さな分子様セロトニンから高分子のペプチド様ケモカインまで、様々なクラスのリガンドと結合することにより活性化される。いくつかのＧＰＣＲは、タンパク質加水分かいによる切断、例えばトロンビンにより活性化される。リガンドが結合すると、ＧＰＣＲからのシグナルが、さらなる経路のシグナル伝達を決定するαサブユニットのクラスのヘテロ三量体のＧタンパク質により媒介される。
【０１８４】
同定されていないリガンドまたは未知の細胞内シグナル伝達経路（例えば新規なＧ−タンパク質）を伴う、「標準的でない」ＧＰＣＲをコードする遺伝子、またはこれまで造血または止血系と関連付けられていなかったクラスに属するＧＰＣＲが同定されることは考えられる。したがって、造血前駆体または循環血液細胞において特異的に発現するＧＰＣＲが、造血または止血の機能不全に治療滴介入の優れた標的であると予想することは無理もない。Yang M., Srikaiatkhachorn A, Antony M., Chong B.H.; Blood Coagul. Fibrinolysis 1996, 127-33; Arai H., Tsou C.L., Charo I.F.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 14495-14499, 1997; Aragay A.M., Quick M.W.; J. Biol. Chem. 274, 4807-4815, 1999; Davignon I., Catalina M.D., Smith D., Montgomery J., Croy J., Siegelman M., Wilkie T.M.; Mol. Cell. Biol. 20, 797-804, 2000; Wiesmann A., Spangrude G.J.; Exp. Hematol. 27, 946-955, 1999; Van Brocklyn J.R., Graler M.H., Bernhardt G., Hobson J.P., Lipp M., Spiegel S.; Blood 95, 2624-2629, 2000; Brass L.F.; J. Clin. Invest. 104, 1663-1665, 1999; Coughlin S.R.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 11023-11027, 1999を参照。
【０１８５】
泌尿器系の疾患
尿失禁
尿失禁は、不随意性の尿の排出である。ストレス尿失禁(SUI)(それは、尿道の閉鎖メカニズムの欠陥によって通常引き起こされる)ともに、尿失禁(UUI)が最も一般的なタイプのUIのうちの１つである。さらに、それは、そのような障害を持たない個人に生じるが、UUIは、痴呆、パーキンソン病、多発性硬化症、卒中および糖尿病のようなニューロンの損害を引き起こす神経学的障害あるいは疾病にしばしば関係している。UUIの通常の原因のうちの1つは、膀胱(OAB)の活動過剰(それは、排尿筋の収縮異常および不安定からくる頻繁で緊急の症状をいう病状である)である。
【０１８６】
主としてUUIの扱いを支援するために今日市場に出ている尿失禁のためのいくつかの薬物治療がある。OABのための治療は、抗コリン作用剤の開発に対する主な強調を含む、周辺の神経の管理機構に影響する薬、あるいは膀胱排尿平滑筋収縮に直接作用するもの焦点が当てられている。これらの薬剤は副交感神経(それらは膀胱をことをコントロールする)を阻害することができるか、あるいは膀胱の排尿筋に対する直接の鎮攣性の影響を働かせることができる。これは、膀胱内圧の減少、キャパシティーの増加、および膀胱短縮の周波数の縮小に帰着する。プロパンテリン(ProBanthine)、トルテロジン酒石酸塩(Detrol)およびオキシブチニン (Ditropan)のような経口で活性のある抗コリン作用性薬は、最も一般に処方される薬である。しかしながら、それらの最も重大な欠点は乾燥口、視覚異常、便秘および中枢神経系妨害のような絶えがたい副作用である。これらの副作用は貧弱な従順に結びつく。乾燥口の徴候だけは、オキシブチニンを備えた70%の非従順割合の原因である。現在の治療の不適当な点は、より少数の副作用を持っている斬新で特効があり、安全で、口頭で利用可能な薬の必要がある。
【０１８７】
セロトニンレセプター
無効にしている間、尿道の括約筋の正確に統合排尿弛緩および短縮は正常な膀胱充填物のために必要になる、反対を要する。この調和させられた調整は、脊髄、橋および前脳部にある頻尿センターの中で、刺激性の活動、抑制する活動および知覚神経活動の統合によって達成される。5-セロトニン(5-HT)、&#61543;アミノ酪酸、グリシン、ドーパミン、アセチルコリンおよびエンケファリンのようないくつかの神経伝達物質は、脊柱でsupraspinalなサイト(de Groatら、泌尿生殖器のシステムの神経質なコントロール、227-290、1993年)の頻尿反射道で識別される。
【０１８８】
中枢と末梢のメカニズム(Espey ＆ Downie、Eur J Pharmacol 287: 173-177、1995年)によって頻尿に5-HTが効果があることが認識される。
【０１８９】
ほとんどのよく特徴づけられた5-HTレセプターはG-蛋白質共役レセプター(レイモンドらおよびNaunyn SchmiedebergsアーチPharmacol 346: 127-137、1992年)である。5-HT1ファミリーは、酵素を禁じる特性を共有する5つのレセプター(5-HT1A、1B、1D、1Eおよび1F)から成る、セロトニンによって刺激された時シクラーゼをアデニル化する。5-HT1Eレセプター(それはCNSに制限されたように見える)を例外として、これらのレセプターはCNSおよび周囲の両方で見つかる。
【０１９０】
頻尿のコントロールにおける5-HT1Aの生理学の役割は解明された、5-HT1Aレセプターの使用、選択的な敵WAY100635、意識的なネズミ(Lecciら、J Pharmacol Exp Therap 262:)中の一貫して害する膀胱収縮性のない膀胱キャパシティーの麻酔をかけられたネズミおよび増加中のisovolumetricな膀胱短縮の印のあるブロックを示した。181-189、1992年.WAY100635の鞘内の管理による脊柱の5-HT1Aレセプターの封鎖は、脳橋の頻尿センターの電気的な刺激によって誘発された、それが、昇順の道に対する影響を示さなかった膀胱短縮によっても膀胱膨張によっても引き起こされた頻尿反射を阻害した。WAY100635の有効な鞘内の管理は、L6-S1脊髄レベル障壁&Eglen(FASEB J 10)に制限された:1398-1407、1996年.さらに、それは、選択的な作動筋8-OH-DPATが促進した、5-HT1Aレセプターのその鞘内の管理を示した、正常なネズミ中の頻尿反射および8-OH-DPATのその静脈内の管理は、慢性的に脊柱になったネズミ(カーンらおよび世界J Urol 17:255-260,1999)中の膀胱膨張によって引き起こされた反射の膀胱の短縮の振幅を増加させた。腰仙の脊髄レベルにこれらの結果5-HT1Aレセプターと一緒に得られて、頻尿反射道の強壮剤管理における重要な役割を持っている。5-HT1A敵には、活動し過ぎる膀胱を扱い、かつ尿失禁を促すために治療の長所があり得る。
【０１９１】
5-HT2ファミリーは、細胞内のphosphoinositide新陳代謝を増加させることによって作用する3つのレセプター(5-HT2A、2Bおよび2C)から成ります。5-HT4レセプターは、両方のCNSの中に、および周囲(ここでシクラーゼをアデニル化するためにそれは確かに連結される)の様々な組織についてある。シクラーゼをアデニル化する5-HT5レセプターの否定のカップリングがあるように見えます。5つのHT6および5-HT7レセプターは両方ともシクラーゼをアデニル化するために確かに連結される。5-HT7レセプターが中央と周辺の組織に位置している一方、5-HT6レセプターはCNSでのみ見つかります。配位子にゲート制御されたイオン・チャンネル上科のメンバーであるただ一つのセロトニンレセプターは、5-HT3レセプターである。セロトニンによって刺激された時、このレセプターはセルへ偏りをなくす陽イオン流れを導く。
【０１９２】
5-HT3あるいは5-HT4レセプターの活性化はアセチルコリン・リリース(TestaらおよびJ Pharmacol Exp Ther 290: 1258-1269、1999年. 5-HTレセプターは妨害(柿崎らはJ Physiolである、規定する、集成的、Physiol 280の伴奏をする:R1407-1413、2001年。したがって、5つのHT3敵あるいは5-HT4敵は活動し過ぎる膀胱の処理において有益かもしれない)に続く膀胱の中でupregulatedされる)を促進する。
【０１９３】
本発明は、上記のスクリーニング検定によって同定される新規物質の使用にさらに関する。従って、本明細書に記載するように同定される被験化合物を適当な動物モデルに使用することは、本発明の範囲内にある。例えば、本明細書に記載するように同定される物質（例えば、調節物質、アンチセンス核酸分子、特異的抗体、リボザイム又は５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチド結合分子）を、そのような物質を用いた処置の効果、毒性又は副作用を決定するために、動物モデルに用いることがある。あるいは、本明細書に記載するように同定された物質を、該物質の作用機構を決定するために、動物モデルに使用する場合がある。さらに、本発明は、本明細書に記載の処置に対する上記スクリーニング検定によって同定される新規物質の使用に関する。
【０１９４】
５−ＨＴ様ＧＰＣＲ活性に影響を及ぼす試薬を、５−ＨＴ様ＧＰＣＲ活性を低下させるために、インビトロ又はインビボのいずれかにおいてヒト細胞に投与することができる。試薬は、ヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲ遺伝子の発現産物と結合することが好ましい。その発現産物がタンパク質である場合、試薬は抗体であることが好ましい。生体外でのヒト細胞の処置については、抗体を、人体から取り出しておいた幹細胞の調製物に添加することができる。その後、その細胞を、当分野で周知のように、クローン増殖させるか、又はさせずに同じ又は別の人体に移すことができる。
【０１９５】
１つの態様においては、試薬を、リポソームを用いて送達する。リポソームは、投与した動物中にて、少なくとも約３０分間、より好ましくは少なくとも約１時間、さらにより好ましくは少なくとも約２４時間安定であることが好ましい。リポソームは、試薬、特にポリヌクレオチドを、動物（例えばヒト）の特定の部位に標的化することができる脂質組成物を含む。リポソームの脂質組成物は、動物の特有の器官、例えば肺、肝臓、脾臓、心臓、脳、リンパ節及び皮膚を標的化できることが好ましい。
【０１９６】
本発明に有用なリポソームは、標的化した細胞の原形質膜と融合でき、その内容物を細胞に送達できる脂質組成物を含む。好ましくは、リポソームのトランスフェクション効率は約１０6細胞に送達されるリポソーム１６ｎｍｏｌ当たりＤＮＡ約０.５μｇであり、より好ましくは約１０6細胞に送達されるリポソーム１６ｎｍｏｌ当たりＤＮＡ約１.０μｇであり、さらにより好ましくは約１０6細胞に送達されるリポソーム１６ｎｍｏｌ当たりＤＮＡ約２.０μｇである。好ましくは、リポソームは直径が、約１００〜５００ｎｍであり、より好ましくは約１５０〜４５０ｎｍであり、さらにより好ましくは約２００〜４００ｎｍである。
【０１９７】
本発明に用いるに適したリポソームは、例えば当業者に知られる遺伝子送達法に標準的に用いられるリポソームを含む。より好ましいリポソームは、ポリカチオン脂質組成物を有するリポソームおよび／またはポリエチレングリコールと連結されたコレステロールバックボーン（骨格鎖）を有するリポソームを含む。場合により、リポソームは、例えばリポソームの外側表面に曝される腫瘍細胞リガンドのような、リポソームを癌細胞に標的化することが可能な化合物、を包含する。
【０１９８】
リポソームを、試薬、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムと複合体化することは、当分野で標準的な方法 (例えば、米国特許5,705,151を参照のこと) を用いて達成することができる。好ましくは、ポリヌクレオチド約０.１μｇ〜約１０μｇをリポソーム約８ｎｍｏｌと組み合わせる、より好ましくはポリヌクレオチド約０.５μｇ〜約５μｇをリポソーム約８ｎｍｏｌと組み合わせる、さらにより好ましくはポリヌクレオチド約１０μｇをリポソーム約８ｎｍｏｌと組み合わせる。
【０１９９】
別の態様においては、抗体を、受容体媒介性標的化送達を用いて、インビボにて特定の組織に送達することができる。受容体媒介性ＤＮＡ送達技術は、例えばFindeisら、Trends in Biotechnol. 11, 202−05 (1993); Chiouら、GENE THERAPEUTICS: METHODS AND APPLICATIONS OF DIRECT GENE TRANSFER (J. A. Wolffら、) (1994); Wu ＆ Wu, J. Biol. Chem. 263, 621−24 (1988); Wuら、J. Biol. Chem. 269, 542−46 (1994); Zenkeら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 3655−59 (1990); Wuら、J. Biol. Chem. 266, 338−42 (1991) にて教示されている。
【０２００】
治療的有効量の決定
治療的有効量の決定は、充分当業者の能力の範囲内にある。治療的有効量とは、治療的有効量の不在下で起こる５−ＨＴ様ＧＰＣＲ活性に比較して５−ＨＴ様ＧＰＣＲ活性を増大させ、または低下させる活性成分の量を指す。
【０２０１】
いかなる化合物に関しても、治療的有効量は最初に細胞培養検定で、または動物モデル、通常マウス、ウサギ、イヌ、またはブタで見積もることができる。動物モデルは適当な濃度範囲および投与経路の決定にも使用できる。次にこのような情報を用いて人間での有用な用量と投与経路を決定できる。
【０２０２】
治療的有効性および毒性、例えばＥＤ50（集団の５０％で治療的に有効な用量）およびＬＤ50（集団の５０％で致死的な用量）は、細胞培養または実験動物における標準的薬学的方法により決定できる。治療効果に対する毒性効果の用量比が治療指数であり、比ＬＤ50／ＥＤ50で表すことができる。
【０２０３】
大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養検定および動物研究から得られるデータを、人間への使用のための用量範囲を処方する際に使用する。かかる組成物に含まれる用量は、好ましくは殆どまたは全く毒性を持たないＥＤ50を包含する循環濃度の範囲内である。この用量は、使用する用量型、患者の感受性、および投与経路に応じてこの範囲内で変わる。
【０２０４】
正確な用量は、治療を必要とする対象に関連する因子に照らして医師が決定する。用量および投与は、充分なレベルの活性成分を提供するよう、または所望の効果を保持するよう、調節する。考慮できる因子は、疾病状態の重篤度、対象の全身健康状態、年齢、体重、および対象の性別、食餌、投与の時間および頻度、薬物の組み合わせ、反応の感受性、および療法に対する寛容／応答を包含する。長時間作用性医薬組成物は、その製剤の半減期およびクリアランス率に応じて３から４日毎、毎週、または２週間に１回投与することができる。
【０２０５】
標準的な用量は投与経路に応じて０.１から１００,０００マイクログラムまで変えることができ、約１gまでの総用量とすることができる。特定の用量および送達方法についての指針は文献に提供されており、一般に当分野の医師が入手できる。当業者は、ヌクレオチド用にはタンパク質またはそれらのインヒビター用のものとは異なる製剤を使用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は特定の細胞、状態、場所などに特異的である。
【０２０６】
この試薬が一本鎖抗体である場合、この抗体をコードしているポリヌクレオチドを構築し、トランスフェリン−ポリカチオン−媒介ＤＮＡ転移、裸のまたはカプセル内核酸を用いるトランスフェクション、リポソームの媒介する細胞融合、ＤＮＡ被覆ラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、電気穿孔、「遺伝子銃」、およびＤＥＡＥ−または燐酸カルシウム−媒介トランスフェクションを包含する（但しこれらに限定される訳ではない）充分確立した技術を用いて、ex vivoまたはインビボで細胞内に導入できる。
【０２０７】
抗体の有効なインビボ用量は、約５μgから約５０μg/kg、約５０μgから約５mg/kg、約１００μgから約５００μg/kg（患者の体重）、および約２００から約２５０μg/kg（患者の体重）の範囲である。一本鎖抗体をコードしているポリヌクレオチドの投与のためには、有効なインビボ用量は、約１００ngから約２００ng、５００ngから約５０mg、約１μgから約２mg、約５μgから約５００μg、および約２０μgから約１００μgのＤＮＡの範囲である。
【０２０８】
発現産物がｍＲＮＡである場合、試薬は好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムである。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを発現するポリヌクレオチドは、上記のように多岐にわたる方法によって細胞中に導入できる。
【０２０９】
好ましくは、試薬は、５−ＨＴ様ＧＰＣＲ遺伝子の発現または５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドの活性を、該試薬の不在時と比較して少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％低下させる。５−ＨＴ様ＧＰＣＲ遺伝子の発現レベルまたは５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドの活性を低下させるよう選択した機構の有効性は、当分野で周知の方法、例えば５−ＨＴ様ＧＰＣＲ特異的ｍＲＮＡへのヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドの免疫学的検出、または５−ＨＴ様ＧＰＣＲ活性の測定を用いて評価できる。
【０２１０】
上記のいずれの態様においても、本発明に係る任意の医薬組成物は他の適当な治療薬と組み合わせて投与できる。併用療法に使用するための適当な物質の選択は、常套的製薬原理に従い、当業者により実施することができる。治療薬の組み合わせは、相乗的に働いて、上記の様々な疾患の治療または予防を奏効させる。このアプローチを用いて、より低い各物質の用量で治療効果を達成することができ、したがって有害な副作用の可能性を低減することができる。
【０２１１】
上記の治療方法のいずれも、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も好ましくはヒトといった哺乳動物を包含する、このような治療を必要とする任意の対象に適用することができる。
【０２１２】
診断方法
ＧＰＣＲは、ＧＰＣＲをコードする核酸配列における突然変異の存在に疾病および異常、または疾病および異常に対する感受性を検出する診断検定に使用できる。そのような疾患は、例えば、腫瘍および癌のような細胞の形質転換、高血圧および低血圧を含む様々な心疾患、並びに血流異常、アンギオテンシン誘発性のアルドステロンから起こる疾患、および体液および電解液ホメオスタシスの他の調節異常に関連する。
【０２１３】
疾病に罹患している個体と正常な個体とにおけるＧＰＣＲをコードしているｃＤＮＡまたはゲノム配列の間の相違を決定できる。もし罹患している個体の幾つかまたは全てに突然変異が観察され、正常な個体には観察されないならば、この突然変異がその疾病の原因であると思われる。
【０２１４】
レファレンス遺伝子および突然変異を有する遺伝子の間の配列相違は、直接ＤＮＡ配列決定法によって明らかにできる。加えて、クローニングしたＤＮＡセグメントを、特定のＤＮＡセグメントを検出するためのプローブとして使用できる。この方法の感受性はＰＣＲと組み合わせる時極めて増強される。例えば、二本鎖ＰＣＲ産物または修飾ＰＣＲにより調製された一本鎖鋳型分子と共に、配列決定プライマーを使用することができる。配列決定は、放射標識したヌクレオチドを用いる常套的方法によって、または蛍光標識を使用する自動配列決定法によって実施する。
【０２１５】
ＤＮＡ配列相違に基づく遺伝子試験は、変性させる物質を含むまたは含まないゲル中のＤＮＡ断片の電気泳動移動度の変化を検出することにより実施できる。小配列の欠失および挿入は、例えば高分解能ゲル電気泳動によって視覚化できる。異なる配列のＤＮＡ断片は変性させるホルムアミド勾配ゲル上で識別でき、ここでは、異なるＤＮＡ断片の移動度が、それらの特異的融解温度または部分的融解温度に従って、ゲル中の異なる位置で遅延する（例えば、Myersら、Science 230,1242,1985を参照されたい）。特定の位置での配列改変もまたヌクレアーゼ保護検定、例えばＲＮアーゼおよびＳ１保護または化学的開裂法によって明らかにすることができる（例えば、Cottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,4397−4401,1985）。即ち特異的ＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保護、化学的開裂、直接ＤＮＡ配列決定といった方法によって、または制限酵素とゲノムＤＮＡのサザンブロッティングを使用することによって実施できる。ゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定のような直接法に加えて、突然変異はin situ分析により検出することもできる。
【０２１６】
ＧＰＣＲのレベルの変化もまた種々の組織で検出できる。血液または組織生検のように、宿主から誘導した身体試料中の受容体ポリペプチドのレベルを検出するために用いる検定は、当業者に周知であり、ラジオイムノアッセイ、競合的結合検定、ウェスタンブロット分析、およびELISA検定を包含する。
【０２１７】
本明細書に引用する全ての特許および特許出願は、引用により特に本明細書の一部とする。上記の内容は本発明を一般的に記載するものである。より完全な理解は以下の具体的実施例を参照することによって得られ、それらの実施例は例示のみの目的で提供するものであり、本発明の範囲を限定する意図は無い。
【実施例】
【０２１８】
実施例１
５−ＨＴ様ＧＰＣＲ活性の検出
配列番号１に記載のポリヌクレオチドを発現ベクターｐＣＥＶ４に挿入し、得られた発現ベクターｐＣＥＶ４−５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドをヒト胚の腎臓２９３細胞にトランスフェクトする。培養フラスコから剥がした細胞を5ｍLのTris HCl, 5ｍＭEDTA, pH 7.5に加え、音波処理により溶解する。細胞リゼートを１０００ｒｐｍで５分間４℃にて遠心する。上清を３０,０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離する。そのペレットを、５０ｍＭ トリスＨＣｌ、５ｍＭ ＭｇＳＯ4、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌを含み、０.１％ ＢＳＡ、２μｇ/ｍｌアプロチニン、０.５ｍｇ／ｍLロイペプチンおよび１０μｇ／ｍLホスホラミドンを添加した結合バッファー（ｐＨ７.５）中に懸濁する。添加する放射性リガンド、即ち125Ｉ標識セロトニンの１０％未満と結合するのに必要とされるタンパク質濃度で規定される最適な膜懸濁希釈液を、リガンド、非標識化ペプチド、および結合バッファーを含む９６ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレートに添加し、最終量を２５０μLとする。
【０２１９】
平衡飽和結合検定において、膜調製物を125Ｉ標識リガンドの増大濃度（０.１ｎＭ〜４ｎＭ）の存在下でインキュベートする。
【０２２０】
結合反応混合物を３０℃で１時間インキュベートする。この反応を、０.５％ポリエチレンイミンを用いて処理したＧＦ/Ｂフィルターに通じてろ過し、反応を停止させ、細胞を回収する。放射活性をシンチレーション計数して計測し、データをコンピューターによる非線形回帰プログラムによって分析する。非特異的結合は、非標識化ペプチド１００ｎＭの存在下にて、膜タンパク質をインキュベートした後に残存する放射活性の量として規定される。タンパク質濃度を、標準的としてウシ血清アルブミンと共にBio−Rad Reagentを用いるBradford法により測定する。配列番号２のアミノ酸配列を含む５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドが示される。
【０２２１】
実施例２
放射性リガンド結合アッセイ
ヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲを発現するポリヌクレオチドでトランスフェクトしたヒト胚腎臓２９３細胞を培養フラスコから剥がし、トリスＨＣｌ５ｍｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７.５中で超音波処理して溶菌させる。細胞可溶化液を４℃にて１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。その上清を４℃にて３０,０００ｒｐｍ×２０分間遠心分離する。そのペレットを５０ｍＭ トリスＨＣｌ、５ｍＭ ＭｇＳＯ4、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７.５に０.１％ ＢＳＡ、２μｇ/ｍｌ アプロチニン、０.５ｍｇ/ｍｌ ロイペプチンと１０μｇ/ｍｌ ホスホラミドンを補助した結合バッファー中に懸濁する。添加した放射性リガンドの１０％未満と結合するのに必要とされるタンパク質濃度として規定される最適膜懸濁希釈液を、125Ｉ−標識化リガンド又は被験化合物、非標識化ペプチド及び結合バッファーを含む９６ウェル ポリプロピレンマイクロタイタープレートに、最終量が２５０μｌとなるまで加える。
【０２２２】
平衡飽和結合検定においては、膜調製物を増大濃度（０.１ｎＭ〜４ｎＭ）125Ｉ−標識化リガンド又は被験化合物（比放射能２２００Ｃｉ/ｍｍｏｌ）の存在下にてインキュベートする。種々の被験化合物の結合親和度は、各被験化合物の１２の異なる濃度の存在下で０.１ｎＭ 125Ｉ−ペプチドを用いる平衡的競合作用において決定する。
【０２２３】
結合反応混合液を３０℃で１時間インキュベートする。この反応は、細胞回収機を用い、０.５％ ポリエチレンイミンで処理したＧＦ/Ｂフィルターを通じて濾過することにより停止させる。放射活性は、シンチレーション計数により測定し、データをコンピューター処理非線型回帰プログラムにより分析する。
【０２２４】
非特異的結合は、１００ｎＭ 非標識化ペプチドの存在下で膜タンパク質をインキュベートした後に残存する放射活性量として規定される。タンパク質濃度は標準物としてウシ血清アルブミンを含むＢｉｏ−Ｒａｄ Ｒｅａｇｅｎｔを用いるブラッドフォード(Bradford)法により測定する。膜タンパク質の放射能を、試験化合物とインキュベーションしていない膜タンパク質の放射能に対して少なくとも１５％増加させる化合物をヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドに結合する化合物と同定する。
【０２２５】
実施例３
５−ＨＴ様ＧＰＣＲ媒介型サイクリックＡＭＰ形成における被験化合物の効果
ｃＡＭＰ形成の受容体媒介型阻害は、ヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲを発現する宿主細胞において検定することができる。細胞を９６ウェル プレートに移し、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ テオフィリン、２μｇ/ｍｌ アプロチニン、０.５ｍｇ/ｍｌ ロイペプチン、及び１０μｇ/ｍｌ ホスホラミドンを補助したダルベッコホスフェート緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、５％ ＣＯ2下にて３７℃で２０分間インキュベートする。被験化合物を加え、３７℃でさらに１０分間インキュベートする。培地を吸引し、１００ｍＭ ＨＣｌを加えてこの反応を停止させる。そのプレートを４℃で１５分間保存する。停止させた溶液中の内容物ｃＡＭＰを放射免疫測定により測定する。
【０２２６】
放射活性は、データ換算ソフトウェアーを備えたガンマ計数を用いて定量化する。被験化合物が存在しないウェル内容物中の放射活性と比較してウェル内容物中の放射活性を低下させる被験化合物を、ｃＡＭＰ形成を阻害する可能性のある物質（インヒビター）として同定する。被験化合物が存在しないウェル内容物中の放射活性と比較してウェル内容物中の放射活性を増大させる被験化合物を、ｃＡＭＰ形成を増進する可能性のある物質（エンハンサー）として同定する。
【０２２７】
実施例４
細胞内カルシウム流動化における被験化合物の効果
細胞内の遊離カルシウム濃度は、蛍光指示薬Ｆｕｒａ−２/ＡＭ染色を用いる顕微分光蛍光分析により測定できる(Bushら、J. Neurochem. 57, 562-74, 1991)。安定にトランスフェクトされた細胞を、ガラスカバースリップインサートを含む３５ｍｍ培養皿に蒔く。細胞をＨＢＳで洗浄し、被験化合物と共にインキュベートし、２０〜４０分間Ｆｕｒａ−２/ＡＭ溶液１００μｌを充填する。ＨＢＳで洗浄した後にＦｕｒａ−２/ＡＭ溶液を取り除き、細胞を１０〜２０分間ＨＢＳで平衡化する。その後、細胞をＬｅｉｔｚ Ｆｌｕｏｖｅｒｔ ＦＳマクロスコープの対物レンズ４０×の下で可視化する。
【０２２８】
励起波長を３４０ｎＭ〜３８０ｎＭの間で変更して、蛍光発光を５１０ｎＭで決定する。生蛍光データを、標準カルシウム濃度曲線と分析技術ソフトウェアーとを用いてカルシウム濃度に変換する。被験化合非存在下の蛍光と比較して蛍光を１５％増大させる被験化合物を、細胞内カルシウムを流動化させる化合物と同定する。
【０２２９】
実施例５
ホスホイノシチド代謝における被験化合物の効果
ヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲ ｃＤＮＡを安定して発現する細胞を９６ウェル プレートにプレーティングし、増殖させて密集させる。検定の前日に、増殖培地を１％血清及び０.５μＣｉ 3Ｈ−マイイノシトール(myinositol)を含む培地１００μｌに交換する。このプレートをＣＯ2インキュベーター（３７℃で５％ＣＯ2）中で一晩中インキュベートする。検定の直前に培地を除去し、１０ｍＭ ＬｉＣｌを含むＰＢＳ２００μｌに置き換え、そして細胞を新しい培地を用いて２０分間平衡化する。この間隔の間に、ＰＢＳ中の２０倍濃縮の一部１０μｌとして加えるアンタゴニストを用いて、細胞をさらに平衡化する。
【０２３０】
イノシトールリン脂質代謝由来の3Ｈ−イノシトールホスフェート蓄積は、被験化合物を含む溶液１０μｌを加えることで始まる。最初のウェルに１０μｌを加え、基礎蓄積を測定する。被験化合物の１１種の濃度を、その次の各プレート列の１１ウェルにて検定する。全ての検定は、２つの連続プレート列に等量を添加するして繰り返すことにより２回行なう。
【０２３１】
このプレートをＣＯ2インキュベーターにて１時間インキュベートする。この反応は、５０％ トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）１５μｌを加え、次いで４℃で４０分間インキュベートして停止させる。１Ｍ トリス４０μｌを用いてＴＣＡを中和した後、ウェル中の内容物をＤｏｗｅｘ ＡＧ１−Ｘ８（２００〜４００メッシュ、義酸塩形態）を含むマルチスクリーン(Multiscreen）ＨＶフィルタープレート（Millipore）に移す。このフィルタープレートは、各ウェルに対してＤｏｗｅｘ ＡＧ１−Ｘ８懸濁液(５０％ｖ/ｖ、水：樹脂) ２００μｌを加えて調製する。そのフィルタープレートを真空多岐管(vacuum manifold)に置き、樹脂床を洗うか、又は溶出する。それぞれのウェルを水２００μｌで２回洗い、５ｍＭ テトラホウ酸ナトリウム/６０ｍＭ ギ酸アンモニウム２００μｌで２回洗う。
【０２３２】
3Ｈ−ＩＰを１.２Ｍ ギ酸アンモニウム/０.１ ギ酸２００μｌを用いて空の９６-ウェルプレート中を溶出する。ウェル中の内容物をシンチレーションカクテル３ｍｌに加え、放射活性を液体シンチレーション計数により決定する。
【０２３３】
実施例６
受容体結合法
標準的結合検定。結合検定は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４、０.５％ ＢＳＡ及び５ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む結合バッファー中にて行なう。５−ＨＴ様ＧＰＣＲを含む膜断片と結合している放射性リガンドに対する標準検定を、９６ウェル マイクロタイタープレート（例えば、Dynatech Immulon II リムーバウェル(Removawe)llプレート）において以下のように行なう。放射性リガンドを結合バッファー＋ＰＭＳＦ/Ｂａｃｉ中に所望のｃｐｍ/５０μｌとなるように希釈した後、一部５０μｌをこのウェルに加える。非特異的結合試料について、４０μＭ 冷リガンド ５μｌをさらにウェルに加える。結合は、結合バッファー＋ＰＭＳＦ/Ｂａｃｉ中に所望の濃度（膜タンパク質１０〜３０μｇ/ウェル）に希釈した膜をウェル当たり１５０μｌ添加して開始させる。その後、プレートをＬｉｎｂｒｏマイラープレートシーラー（Flow Labs）で覆い、Dynatech MicroshakerIIに置く。結合は、室温で１〜２時間進行させ、そのプレートを２,０００×ｇで１５分間遠心分離することによって停止させる。その上清を棄て、膜ペレットを一度冷却結合バッファー２００μｌを加えて洗浄し、手短に攪拌し、再び遠心分離する。個々のウェルを１２×７５ｍｍチューブに置き、ＬＫＢ ガンママスター計数にて計数する（効率７８％）。この方法による特異的結合は、素早く（３〜５秒）ろ過すること、及びポリエチレンイミンコーティンググラスファイバーフィルターで洗浄することにより取り除いた場合に測定したものと一致する。
【０２３４】
さらに、この標準結合検定の変法も用いる。
１．冷リガンド対、125Ｉ−標識化リガンドの濃度範囲を用いる競合放射性リガンド結合検定は、上記のように改良を用いて実施する。検定するリガンドの全希釈物は、検定における最終濃度の４０倍濃度になるように４０×ＰＭＳＦ/Ｂａｃｉにて作製する。その後、ペプチド試料（各々５μｌ）をマクロタイターウェルごとに加える。膜及び放射性リガンドを、プロテアーゼ阻害物質を含まない結合緩衝液にて希釈する。放射性リガンドを加え、冷リガンドと混合し、次いでその結合は膜を添加することで開始する。
【０２３５】
２．受容体と放射性リガンドとの化学架橋結合は、標準検定と同一の結合工程の後に行なう。しかしながら、洗浄過程は、ＢＳＡと放射性リガンドとの非特異的架橋結合の可能性を低減させるため、ＢＳＡを抜いた結合バッファーを用いて行なわれる。架橋結合工程は、以下の記載のように行なわれる。
【０２３６】
３．受容体：リガンド複合体の可溶化研究用及び受容体精製用の膜ペレットを得るため、大量結合検定もさらに行なう。これらは、（ａ）結合を１〜２５０ｍｌ量のポリプロピレンチューブにて行なうこと、（ｂ）膜タンパク質濃度を常に０.５ｍｇ/ｍｌにすること、及び（ｃ）受容体精製において、結合バッファー中のＢＳＡ濃度を０.２５％にまで低下させ、かつ洗浄工程はＢＳＡ不含結合バッファーを用いて行なうことで、精製受容体におけるＢＳＡ混入を低減させることを除けば、標準法と同一である。
【０２３７】
実施例７
受容体に対する放射性リガンドの化学架橋結合
上記のように放射性リガンド結合の後に、膜ペレットをマイクロタイタープレート当たりＢＳＡ不含冷却結合バッファー２００μｌ中に再懸濁する。その後、ウェル当たり４ｍＭ Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド（ＡＮＢ−ＮＯＳ、Ｐｒｉｅｒｃｅ）５μｌを添加混合する。試料を氷上で維持し、距離５〜１０ｃｍでミネラライトＲ−５２Ｇランプ（UVP Inc., San Gabriel, Calif.）を用いて１０分間ＵＶ照射する。その後、試料をエッペンドルフチューブに移し、膜を遠心分離してペレット化し、上清を棄て、そして膜を、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）用のLaemmli ＳＤＳサンプルバッファー中に溶解させる。以下のようにＰＡＧＥを行なう。放射標識化タンパク質を、コダックＸＡＲフィルム及びDuPontイメージ増強スクリーンを用いて乾燥ゲルのオートラジオグラフィーにより可視化する。
【０２３８】
実施例８
膜可溶化
膜可溶化は、２５ｍＭ トリス、ｐＨ８、１０％ グリセロール（ｗ/ｖ）及び０.２ｍＭ ＣａＣｌ2を含む緩衝液（可溶化バッファー）において行なう。トリトンＸ−１００、デオキシコレート、デオキシコレート：リゾレシチン、ＣＨＡＰＳ及びzwittergentを含む高溶解界面活性剤は、可溶化バッファー中、１０％濃度にて用いられ、凍結部分として保存される。リゾレシチンは、凍結融解の際に不用化するため新たに作製し、ジギトニンはそのさらに限定された可溶性のため低濃度で新たに作製する。
膜を可溶化するため、結合工程後の洗浄ペレットを粒子が見えなくなるまで可溶化バッファー中でピペッティング及びボルテックスして再懸濁し、１００,０００×ｇで３０分間遠心分離する。その上清を取り出し、氷上にて維持し、ペレットを廃棄する。
【０２３９】
実施例９
可溶化受容体の検定
125Ｉ−リガンドを結合させ、界面活性剤を用いて膜を可溶化した後に、無傷のＲ:Ｌ複合体を４つの異なる方法で検定することができる。全ての方法は、氷上又は４〜１０℃の低温室にて行なう。
【０２４０】
１．カラムクロマトグラフィー(Knuhtsenら、Biochem. J 254, 641-647,1988)。Sephadex Ｇ-５０カラム(８×２５０ｍｍ)を、膜を可溶化するのに用いる濃度の界面活性剤及び１ｍｇ/ｍｌ ウシ血清アルブミンを含む可溶化バッファーを用いて平衡化する。可溶化膜の試料（０.２〜０.５ｍｌ）をカラムに充填し、流速約０.７ｍｌ/分で溶出する。試料（０.１８ｍｌ）を回収する。放射活性をガンマカウンターにて決定する。カラムの空隙容量はブルーデキストランの溶出量により決定される。空隙容量に溶出する放射活性を、タンパク質に対する結合とみなす。遊離125Ｉリガンドと同量の溶出後の放射活性を、非結合とみなす。
【０２４１】
２．ポリエチレングリコール沈殿（Cuatrecasas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 318-322,1972）。１２×７５ｍｍポリプロピレンチューブ中の可溶化膜試料１００μｌに対して、０.１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液中の１％（ｗ/ｖ）ウシガンマグロブリン（シグマ）０.５ｍｌを加え、次いで２５％（ｗ/ｖ）ポリエチレングリコール（シグマ）０.５ｍｌを加えて混合する。この混合物を氷上にて１５分間維持する。その後、０.１Ｍ リン酸ナトリウムｐＨ７.４を試料当たり３ｍｌ加える。この試料を素早く（１〜３秒）Ｗｈａｔｍａｎ ＧＦ/Ｂ グラスファイバーフィルターによりろ過し、ホスフェート緩衝液４ｍｌを用いて洗浄する。ＰＥＧ沈殿受容体：125Ｉ−リガンド複合体をフィルターのガンマ計数により決定する。
【０２４２】
３．ＧＦＢ/ＰＥＩフィルター結合（Brunsら、Analytical Biochem. 132, 74-81,1983）。Whatman ＧＦ/Ｂガラス繊維フィルターを０.３％ ポリエチレンイミン（PEI, Sigma）中に３時間浸す。可溶化膜の試料（２５〜１００μｌ）を１２×７５ｍｍ ポリプロピレンチューブに移す。その後、界面活性剤不含可溶化バッファーを試料当たり４ｍｌ加え、その試料を素早く（１〜３秒）ＧＦＢ/ＰＥＩフィルターに通じて、ろ過し、可溶化バッファー４ｍｌで洗浄する。フィルターに吸着している受容体：125Ｉ−リガンド複合体のＣＰＭをガンマ計数により決定する。
【０２４３】
４．チャコール/デキストラン（Paul及びSaid, Peptides 7[Suppl. 1], 147-149,1986）。デキストラン Ｔ７０(０.５ｇ、Pharmacia)を水１Ｌ中に溶解し、次いで活性化チャコール（Norit A, alkaline; Fisher Scientific）５ｇを加える。その懸濁液を１０分間室温にて攪拌した後、使用するまで４℃で維持する。Ｒ:Ｌ複合体を測定するため、チャコール/デキストラン懸濁液４部容量を可溶化膜１部容量に加える。この試料を混合し、氷上で２分間維持した後、ベックマン微量遠心管にて１１,０００×ｇで２分間遠心分離する。遊離放射性リガンドをチャコール/デキストランに吸着させ、ペレットを破棄する。上清中に受容体：125Ｉ−リガンド複合体が残留しており、ガンマ計数により決定する。
【０２４４】
実施例１１
受容体精製
ＧＨ4Ｃｌ膜に対するビオチン化受容体の結合は、上記のように行なう。室温で１時間インキュベートする。標準的な精製プロトコルでは、結合インキュベーションには１０ｎＭ Ｂｉｏ−Ｓ２９が含まれる。125Ｉ リガンドを、標的として５,０００〜１００,０００ｃｐｍ/膜タンパク質ｍｇレベルで加える。コントロール(対照)インキュベーションは、非ビオチン化受容体を用いて受容体を飽和させるための１０μＭ 冷リガンドが含まれる。
【０２４５】
さらに上記のように、０.２ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む可溶化バッファー中の０.１５％デオキシコール酸塩：リゾレクチンを用いて受容体:リガンド複合体の可溶化を行ない、可溶化Ｒ:Ｌ複合体を含む１００,０００×ｇ上清を得る。
【０２４６】
固定化ストレプトアビジン（６％ ビーズアガロースに対するストレプトアビジン架橋結合、Pierce Chemical Co.; 「ＳＡアガロース」）を可溶化バッファー中にて洗浄し、最終量の３０分の１の可溶化膜を加える。この混合物を、終始回転させて定常攪拌しながら、４〜１０℃で４〜５時間インキュベートする。次いで、その混合物をカラムに充填し、非結合物質を洗い出す。ＳＡアガロースに対する放射性リガンドの結合を、１００,０００×ｇ上清中のｃｐｍとＳＡアガロースに対する吸着後のカラム溶出中のｃｐｍとを比較することで決定する。最終的にカラムを、０.１５％ デオキシコール酸塩:リゾレシチンと１/５００（vol/vol）１００×４パセ(pase）を含む可溶化バッファー１２〜１５カラム容量を用いて洗浄する。
【０２４７】
ストレプトアビジンカラムを、０.１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１ｍＭ ＥＧＴＡ、０.１ｍＭ ＧＴＰ−ガンマ−Ｓ（シグマ）、０.１５％（wt/vol）デオキシコール酸塩:リゾレシチン、１/１０００（vol/vol）１００×４パセを含む可溶化バッファーを用いて溶出する。初め、カラムに溶出バッファー１カラム容量を通じ、流出を２０〜３０分間で止める。その後、さらに溶出バッファー３〜４カラム容量を通じる。全ての溶出物を集める。
【０２４８】
ストレプトアビジンカラム由来の溶出物を、固定化コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡアガロース、Vector Labs）と共に一晩中インキュベートし、ＷＧＡレクチンと共有結合炭化水素との相互作用を介して、この受容体を吸着させる。ストレプトアビジンカラム溶出物に対するＷＧＡ−アガロースの割合(vol/vol)は一般に１:４００である。また１:１０００〜１:２００の割合も用いることができる。結合工程の後、樹脂を遠心分離してペレット化し、その上清を取り出して保存し、その樹脂を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８、５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び０.１５％ デオキシコール酸塩：リゾレシチンを含む緩衝液中で３回（各約２分）洗浄する。ＷＧＡ結合受容体を溶出するため、樹脂を洗浄するのに用いたのと同じＨＥＰＥＳ緩衝液中の１０ｍＭ Ｎ-Ｎ'-Ｎ''-トリアセチルシトトリオースの３樹脂カラム容量を毎回用い、氷上にて１５〜３０分間かけて繰り返し混合（低速ボルテックス混合）することを３回行なって樹脂を抽出する。各溶出工程の後に、樹脂を遠心分離して、ＷＧＡアガロースペレットを含まないよう慎重に上清を取り出す。３回分の集めた溶出物には最終的な精製受容体が含まれる。ＷＧＡに非結合的な物質には、ストレプトアビジンカラムから特異的に溶出されるＧタンパクサブユニット及び非特異的混入物が含まれる。これら全てのフラクションを−９０℃で凍結保存する。
【０２４９】
実施例１１
５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドと結合する被験化合物の同定
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質を含み９６ウェル マイクロタイタープレートのグルタチオン誘導化ウェルに吸着した精製５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドを、生理緩衝溶液ｐＨ７.０の小分子ライブラリー由来の被験化合物と接触させる。５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む。被験化合物は蛍光標識を含む。この試料を５分間〜１時間インキュベートする。コントロール試料は、被験化合物の非存在下にてインキュベートする。
【０２５０】
被験化合物を含む緩衝液を、ウェルから洗い出す。５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドに対する被験化合物の結合を、ウェルの内容物の蛍光測定により検出する。被験化合物をインキュベートしていないウェルの蛍光と比較して少なくとも１５％ウェル中の蛍光を増大させる被験化合物を、５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドと結合する化合物と同定する。
【０２５１】
実施例１２
５−ＨＴ様ＧＰＣＲ遺伝子発現を低下させる被験化合物の同定
被験化合物を、ヒト胃細胞培養に投与し、３７℃で１０〜４５分間インキュベートする。同じタイプの細胞培養を、被験化合物を加えず同じ時間インキュベートし、ネガティブコントロールとする。
【０２５２】
ＲＮＡを、Chirgwinら、Biochem. 18, 5294-99,1979に記載のように２つの培養物から単離する。ノーザンブロットを全ＲＮＡ２０〜３０μｇを用いて調製し、エクスプレスハイブ(Expresshyb)（CLONTECH）にて６５℃で、32Ｐ−標識化５−ＨＴ様ＧＰＣＲ特異的プローブを用いてハイブリダイズさせる。このプローブは配列番号１より選ばれる少なくとも１１個の連続ヌクレオチドを包含する。被験化合物の非存在下にて得られるシグナルと比較して５−ＨＴ様ＧＰＣＲ特異的シグナルを低下させる被験化合物を、５−ＨＴ様ＧＰＣＲ遺伝子発現の阻害物質として同定する。
【０２５３】
実施例１３
組換えヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲの発現
ピキア パストリス(Pichia pastoris)発現ベクターｐＰＩＣＺＢ(Invitrogen, San Diego, CA) を用いて、大量の組換えヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドを酵母中に生産させる。ヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲコード化ＤＮＡ配列は配列番号１に示されるＤＮＡ配列から誘導する。ベクターｐＰＩＣＺＢ中に挿入する前に、ＤＮＡ配列を、その５'端に開始コドン、及び３'端にエンテロキナーゼ開列部位、Ｈｉｓ６レポータータグや終止コドンを含ませるといった周知の方法によって修飾する。さらに、その両末端に制限エンドヌクレアーゼの認識配列を加え、対応する制限酵素を用いてｐＰＩＣＺＢのマルチクローニングサイトを消化した後に、修飾ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をｐＰＩＣＺＢ中にライゲートする。この発現ベクターを、ピキア パストリスにて発現が酵母プロモーターにより誘導される誘導性発現用に設計する。得られたｐＰＩＣＺ／ｍｄ−Ｈｉｓ６ベクターを用いて、酵母を形質転換する。
【０２５４】
この酵母を、５リッター攪拌フラスコ中で通常の条件下にて培養し、組換え産物タンパク質を、８Ｍウレアの存在下で親和性クロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡ−樹脂）により培養物から単離する。結合したポリペプチドを、ｐＨ３.５の緩衝液を用いて溶出し、中性化する。Ｈｉｓ６レポータータグからのポリペプチドの分離は、製造元の指示に従い、エンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego, CA）を用いる部位特異的タンパク質分解により行なう。精製ヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドを得る。
【０２５５】
実施例１４
5−ＨＴ様ＧＰＣＲの組織特異的発現
種々の組織および組織における５−ＨＴ様ＧＰＣＲの定量的な発現パターンを逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって測定した（ＲＴ−ＰＣＲ）
【０２５６】
５−ＨＴ様ＧＰＣＲがＣＮＳ障害に関与することを実証するために、以下の組織をスクリーニングする：胎児および成人脳、筋肉、心臓、肺、腎臓、肝臓、胸腺、睾丸、結腸、胎盤、気管、膵臓、腎臓、胃粘膜、結腸、肝臓、小脳、皮膚、皮質 (アルツハイマー病のおよび正常な)、視床下部、皮質、扁桃、小脳、海馬、脈絡膜、神経叢、視床、および脊髄。
【０２５７】
５−ＨＴ様ＧＰＣＲが肥満症の疾患過程に関与することを実証するために、以下の組織において発現を測定する：皮下脂肪組織、腸間膜脂肪組織、副腎、骨髄、脳 (小脳、脊髄、大脳皮質、尾状核、髄質、黒質、および被殻)、結腸、胎児脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、乳腺、膵臓、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋 小腸、脾臓、胃、testes、胸腺、甲状腺 気管、および子宮。神経芽細胞腫細胞系ＳＫ−Ｎｒ−Ｂｅ(２)、Ｈｒ、Ｓｋ−Ｎ−Ａｓ、ＨＴＢ−１０、ＩＭＲ−３２、ＳＮＳＹ−５Ｙ、Ｔ３、ＳＫ−Ｎ−Ｄ２、Ｄ２８３、ＤＡＯＹ、ＣＨＰ−２、Ｕ８７ＭＧ、ＢＥ(２)Ｃ、Ｔ９８６、ＫＡＮＴＳ、ＭＯ５９Ｋ、ＣＨＰ２３４、Ｃ６(ｒａｔ)、ＳＫ−Ｎ−Ｆ１、ＳＫ−ＰＵ−ＤＷ、ＰＦＳＫ−１、ＢＥ(２)Ｍ１７、およびＭＣＩＸＣを５−ＨＴ様ＧＰＣＲ発現について試験する。最後のステップとして、正常な人の細胞における５−ＨＴ様ＧＰＣＲの発現を、肥満症の人から得られた細胞の発現と比較する。
【０２５８】
５−ＨＴ様ＧＰＣＲがＣＯＰＤの疾患過程に関与することを実証するために、初期発現パネルはＣＯＰＤに関連する呼吸器組織及び炎症細胞由来のＲＮＡ試料からなる：肺（成人及び胎児）、気管、新たに単離された肺胞型II細胞、培養されたヒト気管支上皮細胞、培養された小気道上皮細胞、培養された気管支平滑筋細胞、培養されたＨ４４１細胞（Ｃｌａｒａ様）、新たに単離された好中球及び単球、並びに培養された単球（マクロファージ様）。また、Clontechから購入した全ＲＮＡパネルを用いてボディマッププロファイリングも行う。組織は、副腎腺、骨髄、脳、大腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、乳腺、膵臓、唾液腺、骨格筋、小腸、脾臓、胃、精巣、胸腺、気管、甲状腺及び子宮である。
【０２５９】
５−ＨＴ様ＧＰＣＲが癌に関与していることを実証するために、以下の組織における発現を測定する：副腎、骨髄、脳、小脳、結腸、胎児脳、胎児肝臓、心臓、腎臓、肝臓、肺、乳腺、膵臓、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、気管、子宮、および末梢血液リンパ球。以下の癌細胞における発現も測定する: DU−145 (前立腺)、NCI−H125 (肺)、HT−29 (結腸)、COLＯ−205 (結腸)、A−549 (肺)、NCI−H460 (肺)、HT−116 (結腸)、DLD−1 (結腸)、MDA−MD−231 (乳房)、LS174T (結腸)、ZF−75 (乳房)、MDA−MＮ−435 (乳房)、HT−1080、MCF−7 (乳房)、およびU87。さらに、同一の患者から採取した癌組織と正常組織の対を調べる。
【０２６０】
５−ＨＴ様ＧＰＣＲが糖尿病に関与していることを実証するために、以下の全身パネルをスクリーニングして高いまたは比較的高い発現を示す：皮下および腸間膜脂肪組織、副腎、骨髄、脳、結腸、胎児脳、心臓、視床下部、腎臓、肝臓、肺、乳腺、膵臓、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脾臓、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、気管、および子宮。さらに、ヒト島細胞および島細胞ライブラリーを試験する。最後のステップとして、正常な人の細胞における５−ＨＴ様ＧＰＣＲの発現を、糖尿病の人から得られた細胞の発現と比較する。
【０２６１】
５−ＨＴ様ＧＰＣＲが喘息の疾患過程に関与していることを実証するために、以下の全身パネルをスクリーニングして肺または免疫組織における高いまたは比較的高い発現を示す：脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、気管、骨髄、結腸、小腸、脾臓、胃、胸腺、乳腺、骨格筋、前立腺、睾丸、子宮、小脳、胎児脳、胎児肝臓、脊髄、胎盤、副腎、膵臓、唾液腺、甲状腺、末梢血白血球、リンパ節、および扁桃腺。このことが一旦確立されれば、以下の肺および免疫系細胞をスクリーニングして、特定の細胞集団に発現を特定する: 肺微小血管内皮細胞、気管支/気管上皮細胞、気管支/気管平滑筋細胞、肺線維芽細胞、Ｔ細胞(Ｔｈ１、Ｔｈ２、ＮＫ Ｔ細胞、および細胞傷害性Ｔリンパ球)、Ｂ細胞、単核細胞 (単球およびマクロファージ)、肥満細胞、好酸球、好中球、および樹状細胞。最後のステップとして、正常な人の細胞における５−ＨＴ様ＧＰＣＲの発現を、喘息の人から得られた細胞の発現と比較する。
【０２６２】
定量的発現プロファイル。定量的発現プロファイルは、Higuchiら、BioTechnology 10, 413−17,1992、及びHiguchiら、BioTechnology 11, 1026−30,1993に初めて記載された、「速度論的解析」と呼ばれる定量的ＰＣＲ解析の方式により実施した。原理は、ＰＣＲの対数相内の任意に与えられたサイクルにおいて、産物の量が最初の鋳型のコピー数に比例するというものである。
【０２６３】
増幅を、標的配列に相補的な、クエンチングを内部に有する（internally quenched）蛍光オリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）の存在下で行なうと、プローブはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５'−３'エンドヌクレアーゼ活性により開裂され、媒体中に蛍光色素が放出される（Hollandら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 7276−80, 1991）。蛍光発光は、特異的な増幅産物の量に直接比例して増大するため、ＰＣＲ産物の対数増幅相を検出し、最初の鋳型濃度を決定するのに用いることができる（Heidら、Genome Res. 6, 986−94, 1996、及びGibsonら、Genome Res. 6, 995−1001, 1996）。
【０２６４】
内部対照の増幅を行って、反応物に添加したサンプルＲＮＡの量を標準化することができる。この種の実験では、選択した対照は１８ＳリボソームＲＮＡである。異なる染料で標識したプローブを用いれば、異なる放射スペクトルを有するレセプター染料が得られるため、標的と内部標準とを同じ試験管内で独立して定量することができる。
【０２６５】
蛍光のリアルタイムＰＣＲ測定はすべて、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００で行う。
【０２６６】
ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ調製
上記の組織から得た全ＲＮＡを発現の定量化に使用する。「剖検から得た」標識ＲＮＡを、ＴＲＩzol試薬（Life Technologies, MD）を用い、製造元のプロトコルにしたがって、剖検組織から抽出した。
【０２６７】
各ＲＮＡ５０μｇを、以下の反応混合物中、ＤＮａｓｅＩで３７℃にて１時間処理する：0.2 Ｕ／μL RNase不含DNase I (Roche Diagnostics, Germany); 0.4 Ｕ／μL RNase インヒビター(PE Applied Biosystems, CA); 10 mM Tris−HCl pH 7.9; 10 mM MgCl2; 50 mM NaCl; および1 mM DTT。
【０２６８】
インキュベーション後、ＲＮＡを１体積のフェノール：クロロホルム−イソアミールアルコール（２４：２４：１）で１回、クロロホルムで１回抽出し、１／１０体積の３Ｍ 酢酸ナトリウム（ pＨ５.２）および２体積のエタノールで沈殿させた。
【０２６９】
剖検組織から得た各ＲＮＡ５０μｇを、Ambion（Ambion, TX）から購入したＤＮＡ不含キットを用いてＤＮａｓｅ処理する。再懸濁および分光学的定量の後、各サンプルをTaqMan逆転写試薬（PE Applied Biosystems, CA）を用い、製造元のプロトコルにしたがって逆転写する。反応混合物中のＲＮＡの最終濃度は２００ｍg／μLである。逆転写は２.５μＭのランダムヘキサマープライマーを用いて行う。
【０２７０】
ＴａｑＭａｎ定量分析。特異的プライマー及びプローブは、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの推奨に基づいて設計する。ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）またはＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）プローブを用いる。定量実験は、それぞれの試料由来の逆転写ＲＮＡ１０ｎｇに対して行う。それぞれの測定は３回行なう。
【０２７１】
全ｃＤＮＡ含有量を、Pre−Developed TaqMan Assay Reagents (PDAR)コントロールキット （PE Applied Biosystems, CA）を用いて、１８ＳリボソームＲＮＡの同時定量（多重ＰＣＲ）により標準化する。
【０２７２】
検定反応混合物は以下のとおりである：１×最終ＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックス（２×ストック溶液から）（PE Applied Biosystems, CA）；１×ＰＤＡＲコントロール−１８Ｓ ＲＮＡ（２×ストック溶液から）；３００ｎＭ フォワードプライマー；９００ｎＭ リバースプライマー；２００ｎＭ プローブ；１０ｎｇ ｃＤＮＡ；及び水を加えて２５ｍLにする。
【０２７３】
以下の工程のそれぞれを一回行う：５０℃で２分間、そして９５℃で１０分間のプレ(前)ＰＣＲ。以下の工程は４０回行なう：９５℃で１５秒の変性、６０℃で１分のアニーリング／伸長。
【０２７４】
実験は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００シークエンス検出器（PE Applied Biosystems, CA）を用いて実施する。より良いバックグラウンド控除、並びに出発標的量に対する直線性を達成するために、この実施の最後に、ＰＣＲの間に得られた蛍光データを、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００使用者マニュアルに記載のように処理する。
【０２７５】
実施例１５
化合物／標的確証のインビボ試験
１．疼痛：
急性痛
急性痛は、主にラットについてはホットプレート（熱板）で測定される。ホットプレート試験の２つの変法を用いる：典型的な変法は、動物を熱表面（５２〜５６℃）に置き、動物が侵害防御機構行動、例えば、ステップ又は足舐めを見せるまでの潜伏時間を測定する。もう１つの変法は、実験動物を自然温度表面に置く温度上昇ホットプレートである。次いで、この表面を、動物が後足を舐め始めるまで連続的ではあるがゆっくり熱する。後足を舐め始めた時に達している温度を、疼痛の閾値の尺度とする。
【０２７６】
化合物を媒体処置コントロール群に対して試験する。物質適用は、疼痛試験前に、異なる適用経路（静脈内、腹腔内、経口、くも膜下腔内、脳室内、皮下、皮内、経皮的）を介して異なる時点で行なう。
【０２７７】
持続痛は、主にラットについてはホルマリン試験又はカプサイシン試験を用いて測定する。１〜５％ホルマリン又は１０〜１００μｇカプサイシン溶液を、実験動物の片方の後ろ足に注射する。ホルマリン又はカプサイシンを適用した後、その動物は、たじろぎ、患部の足を舐めたり、噛んだりして侵害防御応答を見せる。９０分までの期間内の侵害防御応答の数が、疼痛強度の尺度である。
【０２７８】
化合物を媒体処置コントロール群に対して試験する。物質適用は、ホルマリン投与又はカプサイシン投与の前に、異なる適用経路（静脈内、腹腔内、経口、くも膜下腔内、脳室内、皮下、皮内、経皮的）を介して異なる時点で行なう。
【０２７９】
神経因性疼痛は、主にラットにおいては片側坐骨神経損傷の種々の変法により誘導される。操作は感覚消失下で行なわれる。坐骨神経損傷の第一の変法は、共通の坐骨神経周辺を紐でゆるく締め付けることによって行なわれる。第二の変法は、共通の座骨神経の直径が約半分になるまできつく縛ることである。次の変法は、モデル群を用いて、Ｌ５とＬ６脊髄神経又はＬ５脊髄神経のみ、のいずれかをきつく縛ったもの又は切除したものを作製する。第四の変法は、坐骨神経の３つの末端分枝の２つ（脛骨神経及び共通腓骨神経）を軸索切除し、腓腹神経を無傷で残すことを包含するのに対し、最後の変法は、脛骨分枝のみを軸索切除し、腓腹神経及び共通神経を傷付けずに残すことを含む。コントロール動物は偽手術を用いて処置する。
【０２８０】
操作後に、神経損傷動物は、慢性機械的異痛症（アロディニア)、冷アロディニア及び温熱性痛覚過敏症を発症する。機械的アロディニアは、圧力変換法（electronic von Frey Anesthesiometer, IITC Inc.-Life Science Instruments, Woodland Hills, SA, USA; Electronic von Frey System, Somedic Sales AB, Hourby, Sweden）により測定する。温熱性痛覚過敏症は、患部の後足の侵害防御応答を疼痛強度の尺度として計数する放射熱源法（Plantar Test, Ugo Basile, Comerio, Italy）又は冷却プレート（５〜１０℃）により測定する。冷却誘導型疼痛の更なる試験は、患部の後肢にアセトンを足裏投与した後の侵害防御応答をカウントすること、又は侵害防御応答の期間である。一般に慢性痛は、活性のサーカディアンリズムを記録すること（Surjo及びArndt, Universit t zu Kouln, Cologne, Germany）、及び進行の差をスコアリングすること（フットプリントパターン; FOOTPRINTSプログラム, Klapdorら、1997. フットプリントパターン分析の低コスト法、J. Neurosci. Methods 75,49-54）により評価する。
【０２８１】
化合物を、偽手術コントロール群及び媒体処置コントロール群に対して試験する。物質適用は、疼痛試験前に、異なる適用経路（静脈内、腹腔内、経口、くも膜下腔内、脳室内、皮下、皮内、経皮的）を介して異なる時点で行なう。
【０２８２】
炎症痛
炎症痛は、主にラットにおいては一方の後足にカラゲナン０.７５ｍｇ又は完全フロインドアジュバンドを注射することによって引き起こす。動物は、機械的アロディニア及び温熱性痛覚過敏症を伴う浮腫を発症する。機械的アロディニアは、圧力変換器法（electronic von Frey Anesthesiometer, IITC Inc.-Life Science Instruments, Woodland Hills, SA, USA）により測定する。温熱性痛覚過敏症は、放射熱源法（Plantar Test, Ugo Basile, Comerio, Italy, Paw thermal stimulator, G. Ozaki, University of California, USA）により測定する。浮腫測定については、２つの方法を用いる。第一の方法は、動物を屠殺して、患部の後足を細分し、重量を測ることである。第二の方法は、プレチスモメーター（Ugo Basile, Comerio, Italy）における水の押しのけ容積を測定することによる足のボリューム（量）の差を含む。
【０２８３】
化合物を、非炎症コントロール群及び媒体処置コントロール群に対して試験する。物質適用は、疼痛試験前に、異なる適用経路（静脈内、腹腔内、経口、くも膜下腔内、脳室内、皮下、皮内、経皮的）を介して異なる時点で行なう。
【０２８４】
ストレプトゾトシン５０〜８０ｍｇ／ｋｇを単回腹腔内注射して処置したラットは、１〜３週間以内に超高血糖及び機械的アロディニアを発症する。機械的アロディニアは圧力変換器法（electronic von Frey Anesthesiometer, IITC Inc.-Life Science Instruments, Woodland Hills, SA, USA）により測定する。
【０２８５】
化合物を、糖尿病及び非糖尿病媒体コントロール群に対して試験する。物質適用は、疼痛試験前に、異なる適用経路（静脈内、腹腔内、経口、くも膜下腔内、脳室内、皮下、皮内、経皮的）を介して異なる時点で行なう。
【０２８６】
２．パーキンソン病
６−ヒドロキシドパミン（６−ＯＨ−ＤＡ）病変
ドーパミン作動性黒質線条体及び線条体淡蒼球経路の変性は、パーキンソン病における中心的な病理現象である。この疾患は、ラットにおいて６−ＯＨ−ＤＡを内側前脳束（ＭＦＢ）中に単回／逐次片側定位（sequential unilateral stereotaxic）注射して実験的に模倣した。
【０２８７】
実験開始時の体重が２００±２５０ｇの雄ウィスターラット（Harlan Winkelmann, Germany）を用いる。実験セッションにない場合、ラットは食料及び水を自由に得ることができ、昼／夜１２時間のサイクルのもと温度や湿度が制御された環境下で飼育する。以下のインビボプロトコールは、政府の権限により認可されている。苦しむ動物を最小限にし、用いる動物の数を減らし、及びインビボ技術の代替案を利用するあらゆる努力をする。
【０２８８】
動物に、モノアミンオキシダーゼによる６−ＯＨＤＡの代謝を阻害するためパージリン（Sigma, St. Louis, MO, USA; 腹腔内へ５０ｍｇ／ｋｇ）と、ノルアドレナリン作動性ターミナルによる６−ＯＨＤＡの取り込みを防止するためであるメチルイミプラミンＨＣｌ（Sigma; 腹腔内へ２５ｍｇ／ｋｇ）とを、外科手術の日に投与する。３０分後、そのラットをペントバービタルナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて麻酔し、定位固定フレームに移す。ＤＡ黒質線条体経路を損傷させるため、６−ＯＨＤＡ ＨＢｒ（Sigma）８μｇを含む０.０１％ アスコルビン酸塩４μｌを、左内側前脳側（十字縫合(ブレグマ)及び頭蓋骨表面に対して２.４ｍｍ 前側、１.４９ｍｍ 側方、−２.７ｍｍ 腹側）に１μｌ／分の割合で注射する。ニードル（針）は拡散させるために更に５分間、所定の位置に置く。
【０２８９】
ステッピング試験
前肢無動症（アキネジア）は、損傷設置後の３週間、改変ステッピング試験プロトコルを用いて評価する。簡単には、実験者が片手でこの動物の後肢を固定し、表面から一方の後足をわずかに持ち上げて、その動物を維持する。一方の足をはテーブルについており、初めはフォアハンド方向、その次はバックハンド方向へゆっくり側方移動させる（５秒で１ｍ）。調整ステップの数を、両足について移動のバックハンド方向及びフォアハンド方向においてカウントする。試験の順序は、右足フォアハンド及びバックハンド調整ステップ、その次に左足フォアハンド及びバックハンド方向である。この試験は、第1回目の試験に先立ち３日間の最初のトレーニングの後、連続して３日間で３回繰り返す。フォアハンド調整ステップは、損傷動物と健康なコントロール動物の間に一致した差がないことは明らかである。従って、分析はバックハンド調整ステップに限定される。
【０２９０】
バランス試験
ステッピング試験セッションの間に、姿勢検証後のバランス調整も測定する。ラットはステッピング試験に記載のように同じ位置で維持し、側方移動に変えて、実験者がテーブルについた足を前方向へ傾ける。この演習はバランスの喪失の結果となり、前肢移動でバランスを回復するラットの能力を０〜３の範囲スケールであるコアーする。スコアー０は正常な足設置に与えられる。前肢運動は遅れるが、姿勢バランスの回復が検出される場合は、スコアー１を与える。スコアー２は、バランス回復は成功していないが、筋肉収縮により証明されるように十分とは言えないが明らかな前肢反応を表し、スコアー３は行動の反応のないものに与える。この試験は、第１回目の試験に先立ち３日間の最初のトレーニングの後、３日間連続してそれぞれの側（足）で１日に３回繰り返す。
【０２９１】
階段試験（足到達）
初期又は第二の損傷設置後の３週間の足到達（リーチング）行動を評価するのに、階段試験の改良法を使用する。中心に台と両端に取り外し可能な階段のあるプレキシガラス試験ボックスを用いる。この器具は、それぞれの階段で同じ側の足のみを用い、独立して足の使用を測定できるように設計することができる。それぞれの試験において、動物を１５分間この試験ボックスに置く。各々の側のダブル階段を、７×３飼料の粒（Precision food pellets, formula : P, purified rodent diet, サイズ４５ｍｇ; Sandown Scientific）で満たす。それぞれの試験の後、各々の足について食べた粒（上手く回収した粒）の数と取得した粒（触ったが、落とした）の数、及びその成功率（食べた粒／取得した粒）を別々に計数する。３日間の食料不足（１日当たり１２ｇ／動物）後の動物を１１日間試験する。全ての分析は最後の５日間のみで行なう。
【０２９２】
ＭＰＴＰ処置
神経毒である１−メチル−４−フェニル−１,２,３,６−テトラヒドロ−ピリジン（ＭＰＴＰ）は、げっ歯類、ヒト以外の霊長類及びヒトにおいて中脳ドーパミン作動性（ＤＡergic）ニューロン変性を引き起すことで、多くのパーキンソン病症状を再現する。ＭＰＴＰは、ドーパミンレベル及びその代謝物レベル、並びに線条体におけるドーパミン作動性ターミナル数の顕著な減少を引き起こし、同様に黒質、パルス緻密質におけるチロシン ヒドロキシラーゼ（ＴＨ）−免疫応答細胞体の著しい喪失を引き起こす。
【０２９３】
重篤で、長期に及ぶ損傷を与え、かつ死亡率を減少させるために、ＭＰＴＰを動物に単回注射し、その後重症度について損傷の７〜１０日後に試験する。ＭＰＴＰの連続注射は、１、２及び３日目に投与する。１日に１度食塩水中のＭＰＴＰヒドロクロライド（シグマ）４ｍｇ／ｋｇを、動物に適用する。注射は全て腹腔内（i.p.）で行ない、ＭＰＴＰストック溶液は、注射と注射との間凍結しておく。動物を１１日目に断頭する。
【０２９４】
免疫組織化学
行動実験が終了した時点で、全ての動物をチオペンタール（腹腔内へ１ｇ／４０ｍｌ、Tyrol Parma）３ｍｌで麻酔する。マウスは、０.０１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ ７.４）で２分間、次いでＰＢＳ中の４％ パラホルムアルデヒド（Merck）で１５分間、経肛門的に還流する。その脳を取り出し、４％ パラホルムアルデヒド中に、４℃にて２４時間置く。その後、脱水のために、それを４℃の０.１Ｍ ＰＢＳ中の２０％ スクロース（Merck）溶液に移し、それらを染み込ませる。その脳を−２０℃のメチルブタン中で２分間凍結させ、−７０℃で保存する。スレッジマイクロトーム（mod. 3800-Frigocut, Leica）を用いて、２５μｍの切片を、脳梁（ＡＰ １.７ｍｍ）の膝部から海馬（ＡＰ ２１.８ｍｍ）まで、及びＡＰ２４.１６からＡＰ ２６.７２から得る。４６の切片をカットし、０.２５Ｍ トリスバッファー（ｐＨ ７.４）中に免疫組織化学について分類して保存する。
【０２９５】
一連の切片を、遊離−浮動性チロシンデヒドロキシラーゼ（ＴＨ）免疫組織化学についての処理する。０.１Ｍ ＰＢＳ中で３回すすいだ後、内因性のペルオキシダーゼ活性を、０.３％ Ｈ2Ｏ2±ＰＢＳ中で１０分間クエンチする。ＰＢＳ中であるすいだ後、切片を、ブロッキング物質として１０％ 正常ウシ血清（シグマ）中で５分間予めインキュベートし、一次抗ラットＴＨラビット抗血清（希釈率１：２０００）のいずれかに移す。
【０２９６】
一晩中室温でインキュベートした後、ＴＨ免疫応答に対する切片をＰＢＳ中であるすぎ（２×１０分）、ヤギで産生させたビオチン標識化抗ラビット免疫グロブリンＧ（希釈率１：２００）（Vector）中で９０分間インキュベートし、繰り返しすすぎ、そしてVectastain ＡＢＣ（Vector）溶液中に移し１時間置く。０.００５％ Ｈ2Ｏ2を加えた０.１Ｍ ＰＢＳ中の３,.３'−ジアミノベンジジン テトラヒドロクロリド（ＤＡＢ；Sigma）は、続く可視化反応における色素原として働く。切片を、ゼラチンコーティングスライドに盛り、乾燥させるために一晩中置き、上方（ascending）アルコール濃度中で脱水化し、かつブチルアセテート中で透明になるヘマトキシリンを用いて対比染色(counter-stained)する。
【０２９７】
ローターロッド試験
我々は、ＩＢＭ互換パソコン、ＣＩＯ−２４データ取得カード、コントロールユニット、及び４線ロータロッドユニットを含むＣＲ−１ Ｒｏｔａｍｅｘシステム（Columbus Instruments, Columbus, OH）を用いるRozasおよびLabandeira-Garcia(1997)が記載した手順の改良法を使用する。このロータロッドユニットは、回転軸（半径７.３ｃｍ）と、それぞれのマウスに対する個別のコンピューターとから成る。このシステムソフトウェアーは、回転スピードを変えるように（０〜８０ｒｐｍ）セッションプロトコールを予めプラグラムすることができる。赤外線ビームは、マウスがロータロッドの真下の底辺鉄柵（base grid）に落ちた時を検出するために用いる。このシステムでは、落下をマウスについての実験の終了として記録し、ローターロッドにおける全時間、並びに落下時間及び全組み立て(set-up)パラメーターを記録する。また、このシステムでは、トレーニングを目的として、微弱電流を底辺鉄柵を通じて流すことができる。
【０２９８】
３．痴呆
物体認識課題
物体認識課題は、げっ歯類の認識性能における実験操作の効果を評価するために設計した。ラットを、同一の物体が２個ある開けた空間に置く。ラットは、最初の対物認識課題試行の間中、両方の物体を調べる。２度目の試行では、例えば２４時間の保持間隔の後、最初の試行で用いた２個の物体の内の１個「知っている」物体と新しい物体とを、その開けた空間に置く。この物体それぞれを調べる時間を記録する。ＯＲ課題における基礎的な基準は、ラットが２度目の試行で２個の物体を探索するのにかけた時間である。保持の良さは、「知っている」物体よりも新たな物体に対する探索時間が長いことに反映される。
【０２９９】
最初の試行の前に推定される認識エンハンサーを投与することで、習得及び最終的な固定プロセスにおける効果を評価することができる。最初の試行後の被験化合物の投与は、固定プロセスにおける効果を評価できるのに対して、２度目の試行前の投与では、想起プロセスにおける効果を測定できる。
【０３００】
受動的回避課題
受動的回避課題により、ラット及びマウスにおける記憶性能を評価する。抑制的回避機器は、明区画と暗区画との２つの区画を持つ箱から成る。この２つの区画は、実験者が操作できるギロチンドアによって分けられている。ギロチンドアを上げた場合、２ｃｍの敷居で２つの区画は分けられている。ドアを開けた場合の暗区画の照度は約２luxである。明区画の中央の床の明度は約５００luxである。
【０３０１】
２４時間のセッション間間隔で分けられた２つの習慣セッション、１つのショックセッション及び保持セッションが与えられる。ラットは、習慣セッションと保持セッションにおいて３００秒間器具内を探索することができる。ラットをギロチンドアの反対の壁に頭を向けた状態で、明区画に置く。１５秒の適応時間の後、ギロチンドアを器具内の全領域を自由に動き回れるように開ける。通常、ラットはまぶしい明領域を避け、数秒の内に暗区画に入るであろう。
【０３０２】
ショックセッションにおいては、ラットが４本の足で暗区画に入るやいなや区画間のギロチンドアを下ろし、すぐさま１ｍＡのフットショックを２秒間与える。ラットを器具から取り出し、ホーム籠に戻す。保持セッション中の手順は、習慣セッションの手順と同じである。
【０３０３】
ステップ通過潜伏、すなわち保持セッション中に暗区画に入る最初の潜伏（秒）は、動物の記憶性能の指標である；暗区画に入る潜伏が長ければ長いほど、保持はよりよい。ショックセッションの３０分前に、スコポラミン１ｍｇ*ｋｇ-1と一緒に被験化合物を与える。スコポラミンは、２４時間後の保持セッション中の記憶性能を損なわせる。被験化合物が、スコポラミン処置コントロールと比較して侵入潜伏を増大させる場合、認識増進させる可能性があり得る。
【０３０４】
モーリス水脱出課題
モーリス水脱出課題により、げっ歯類における空間方向学習を測定する。ラット及びマウスの認知機能において推定される治療効果を調査するのに広く用いられている試験系である。動物のこの性能は、水面下約１ｃｍのところに沈んでいる避難用台のある円形水タンクにおいて評価する。避難用台は、水タンク中を泳いでいる動物には見えない。机、コンピューター設備、第二の水課題を備え、実験者が居る室内の備品及び優しく響く柵上のラジオにより、膨大な迷路外合図を与える。
【０３０５】
動物は、日々の獲得セッション５日の間に４回の試行を受ける。試行は、動物をプール中に置き、タンクの壁に頭を向けることによって始める。四分区画、北、西、南及び東の４つの開始位置のそれぞれは一連の４回の試行で１度は用いる（それらの順序は無作為である）。その避難用台はいつも同じ場所にある。試行は、初めにどんな出来事があっても、動物が避難用台に上った時か又は９０秒経過した時に終了する。その動物はその台上に３０秒間留まることができる。その後台から下し、次の試行を始める。動物が９０秒以内に台を見つけられなかった場合でも、実験者がその動物を台の上に置き、３０秒間そこに留まらせる。５日目の日々のセッションの第４回目の試行後に、探知試行として更なる試行を行なう：それは、台を取りだし、動物が４つの４分円内で過ごす時間を３０秒又は６０秒間測定する。この探知試行において、動物は全て、獲得セッションの間に避難用台が置いてあった４分円の反対側の同じ開始位置から始める。
【０３０６】
動物の性能を評価するため、獲得トレーニングの間に４つの異なる基準：避難潜伏、移動距離、台への距離及び水泳速度を得る。探知試行については以下の基準：４分円内における時間（秒）及び４つの４分円内での移動距離（ｃｍ）を評価する。この探知試行は、動物が避難用台の位置をどれくらい良く学習したかについての情報をさらに与える。動物が、獲得セッション中に台のあった４分円内で、その他の４分円における時間および距離よりも、より多くの時間を費やし、より多くの距離を泳いだ場合、これは結論として、台の位置をよく学習したことを示す。
【０３０７】
推定される認知増進化合物の効果を評価するために、認知機能を損なわせる特定の脳損傷を持つラット若しくはマウス、又は正常な学習を妨げるスコポラミン若しくはＭＫ−８０１などの化合物で処置した動物、又は認知欠損を患っている高齢動物を用いる。
【０３０８】
Ｔ迷路自発的択一課題
Ｔ迷路自発的択一課題（ＴｅＭＣＡＴ）により、マウスの空間認知性能を評価する。Ｔ迷路のスタートアームと２つのゴールアームは、実験者が手動で操作できるギロチンドアを備えている。トレーニングの開始時、マウスをスタートアーム置く。ギロチンドアは閉めてある。最初の試行、「強制試行」では、左又は右のいずれかのゴールアームはギロチンドアを下げてブロックする。マウスがスタートアームから離れた後、迷路を乗り越え、最終的に開いているゴールアームに入り、そしてスタート地点にもどり、そこでギロチンドアを下げることによって５秒間閉じ込められる。次に動物は、１４回の「自由選択」試行の間に左と右のゴールアームを自由に選ぶことができる（全てのギロチンドアは開いている）。マウスが一方のゴールアームに入るとすぐに、もう一方のゴールアームを閉じる。マウスは最終的にスタートアームに戻り、マウスはスタートアームに５秒間閉じ込められた後、望むいずれのゴールアームにも自由に向かうことができる。１回のセッション中１４回の自由選択試行が完了した後、動物を迷路から取り出す。トレーニングの間には、マウスに決して手を触れない。
【０３０９】
１４回後の試行の択一パーセントを計算する。このパーセントと最初の強制試行及び連続１４回の選択試行を完了するのに要した時間（秒）とを分析する。認知欠損は、通常、トレーニングセッションの開始３０分前にスコポラミンを注射することによって誘導する。スコポラミンは、択一パーセントレベルを偶然レベルか又はそれより低いレベルにまで下げる。通常トレーニング試行の前に投与される認知エンハンサーは、少なくとも部分的には偶発的択一率のスコポラミン誘導型低下を拮抗し得る。
【０３１０】
実施例１６
糖尿病：化合物／標的検証の in vivo 試験
１．グルコース産生
糖新生の速度の増大に起因する、肝臓によるグルコースの過剰産生は、糖尿病における空腹持の高血糖の主要な原因である。一晩絶食した正常なラットまたはマウスは、自由飲食させたストレプトゾトシン誘発性の糖尿病ラットまたはマウスと同様に糖新生の速度が増大した。ラットを４０mg／kgのストレプトゾトシンの１回の静脈内注射により糖尿病にし、Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪマウスには６０ｍｇ／ｋｇを５日間連続してi.p.投与する。血糖値を、尾先端の血液から測定し、化合物を異なる経路で投与する（p.o., i.p., i.v., s.c.）。種々の時間で血液を採取した後、グルコースを測定する。あるいは、化合物を数日間投与した後、動物を一晩絶食させる、血液を採取し、血漿グルコースを測定する。グルコース産生を阻害する化合物は、ビークル処置した対照群と比較して、血漿グルコースレベルを減少させるであろう。
【０３１１】
２．インスリン感受性
ｏｂ／ｏｂおよびｄｂ／ｄｂマウスならびに糖尿病Zuckerラットは高血糖、高インスリンおよびインスリン耐性である。動物を予め出血させ、それらのグルコースレベルを測定し、次いでこれらをグループ分けして、平均のグルコースレベルを各群で同じにする。q.dまたはb.i.d.のいずれか、異なる経路（p.o., i.p., s.c.）で７〜２８日間、化合物を毎日投与する。血液を種々の時間で採取し、血漿グルコースおよびインスリンレベルを測定する。これらのモデルにおいてインスリン感受性を改善する化合物は、ビークル処置した対照群と比較して、血漿グルコースおよびインスリンレベルの両方を減少させるであろう。
【０３１２】
３．インスリン分泌
膵臓からのインスリン分泌を増大させる化合物は、血漿インスリンレベルを増加させ、グルコースを導入する投与後、血漿グルコースの消失を改善するであろう。インスリンレベルを測定するとき、化合物を異なる経路（p.o., i.p., s.c.またはi.v.）で投与して、ラットまたはマウスを一晩絶食させる。適当な時点で静脈内にグルコースを投与し（０．４ｇ／kg）、血液を１分間後に採取する。血漿インスリンレベルを測定する。インスリン分泌を増加させる化合物は、グルコースのみを投与した動物と比較して、血漿インスリンレベルを増大させる。グルコース消失を測定したとき、化合物の投与後、動物を適当な時間で採血した後、グルコースを経口または腹腔内投与（１ｇ／kg）し、１５、３０、６０および９０分後に再び採血して、血漿グルコースレベルを測定する。インスリンレベルを増加させる化合物は、ビークル処置した対照群と比較して、グルコースレベルおよびグルコース曲線下の面積を減少させるであろう。
【０３１３】
膵臓からのインスリン分泌を増大する化合物は、グルコースの投与後、血漿インスリンレベルを増大させ、血漿グルコースの消失を改善するであろう。インスリンレベルを測定するとき、５−ＨＴ様GPCRを調節する試験化合物を異なる経路で投与する（p.o., i.p., s.c.またはi.v.）で投与して、ラットまたはマウスを一晩絶食させる。適当な時点で静脈内にグルコースを投与し（０．４ｇ／kg）、血液を１分間後に採取する。血漿インスリンレベルを測定する。インスリン分泌を増加させる化合物は、グルコースのみを投与した動物と比較して、血漿インスリンレベルを増大させる。グルコース消失を測定したとき、化合物の投与後、動物を適当な時間で採血した後、グルコースを経口または腹腔内投与（１ｇ／kg）し、１５、３０、６０および９０分後に再び採血して、血漿グルコースレベルを測定する。インスリンレベルを増加させる化合物は、ビークル処置した対照群と比較して、グルコースレベルおよびグルコース曲線下の面積を減少させるであろう。
【０３１４】
４．グルコース産生
糖新生の速度の増大に起因する、肝臓によるグルコースの過剰産生は、糖尿病における空腹持の高血糖の主要な原因である。一晩絶食した正常なラットまたはマウスは、自由飲食させたストレプトゾトシン誘発性の糖尿病ラットまたはマウスと同様に糖新生の速度が増大した。ラットを４０mg／kgのストレプトゾトシンの１回の静脈内注射により糖尿病にし、Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪマウスには６０ｍｇ／ｋｇを５日間連続してi.p.投与する。血糖値を、尾先端の血液から測定し、化合物を異なる経路で投与する（p.o., i.p., i.v., s.c.）。種々の時間で血液を採取した後、グルコースを測定する。あるいは、化合物を数日間投与した後、動物を一晩絶食させる、血液を採取し、血漿グルコースを測定する。グルコース産生を阻害する化合物は、ビークル処置した対照群と比較して、血漿グルコースレベルを減少させるであろう。
【０３１５】
５．インスリン感受性
ｏｂ／ｏｂおよびｄｂ／ｄｂマウスならびに糖尿病Zuckerラットは高血糖、高インスリンおよびインスリン耐性である。動物を予め出血させ、それらのグルコースレベルを測定し、次いでこれらをグループ分けして、平均のグルコースレベルを各群で同じにする。q.dまたはb.i.d.のいずれか、異なる経路（p.o., i.p., s.c.）で７〜２８日間、化合物を毎日投与する。血液を種々の時間で採取し、血漿グルコースおよびインスリンレベルを測定する。これらのモデルにおいてインスリン感受性を改善する化合物は、ビークル処置した対照群と比較して、血漿グルコースおよびインスリンレベルの両方を減少させるであろう。
【０３１６】
６．インスリン分泌
膵臓からのインスリン分泌を増大させる化合物は、血漿インスリンレベルを増加させ、グルコースを導入する投与後、血漿グルコースの消失を改善するであろう。インスリンレベルを測定するとき、化合物を異なる経路（p.o., i.p., s.c.またはi.v.）で投与して、ラットまたはマウスを一晩絶食させる。適当な時点で静脈内にグルコースを投与し（０．４ｇ／kg）、血液を１分間後に採取する。血漿インスリンレベルを測定する。インスリン分泌を増加させる化合物は、グルコースのみを投与した動物と比較して、血漿インスリンレベルを増大させる。グルコース消失を測定したとき、化合物の投与後、動物を適当な時間で採血した後、グルコースを経口または腹腔内投与（１ｇ／kg）し、１５、３０、６０および９０分後に再び採血して、血漿グルコースレベルを測定する。インスリンレベルを増加させる化合物は、ビークル処置した対照群と比較して、グルコースレベルおよびグルコース曲線下の面積を減少させるであろう。
【０３１７】
実施例１７
増殖阻害検定：アンチセンスオリゴヌクレオチドは癌細胞系の増殖を抑制する
試験に用いられる細胞系はヒト大腸癌細胞系ＨＣＴ１１６である。細胞は、１０〜１５％胎児ウシ血清を含むＰＲＭＩ−１６４０中、濃度１０,０００細胞／ｍｌ ０.５ｍｌ量にて３７℃、９５％空気／５％ＣＯ2雰囲気下で培養する。
【０３１８】
ホスホロチオネート オリゴリボヌクレオチドは、ホスホロアミデイト(phosphoroamidite)ケミストリーを用いる応用バイオシステム モデル３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザーにおいて合成する。配列番号１の１〜２４位置のヌクレオチドと相補的な２４塩基の配列を、被験オリゴヌクレオチドとして用いる。コントロールとして、他の（ランダム）配列：５'−ＴＣＡ ＡＣＴ ＧＡＣ ＴＡＧ ＡＴＧ ＴＡＣ ＡＴＧ ＧＡＣ−３'を用いる。アセンブリーと脱保護に次いで、オリゴヌクレオチドを、エタノール沈殿２回、乾燥、そしてリン酸緩衝液中に所望の濃度に懸濁する。オリゴヌクレオチドの純度は、キャピラリーゲル電気泳動及びイオン交換ＨＰＬＣによって試験する。精製オリゴヌクレオを、培養培地に７日間、１日ごとに１度１０μＭ濃度を加える。
【０３１９】
７日間の被験オリゴヌクレオチド添加により、ヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲの発現は、ウェスタンブロッティングにより決定されるように有意に低下する。この効果は、コントロールオリゴヌクレオチドでは観察されない。３〜７日の後、培養中の細胞の数を、自動細胞カウンターを用いて計数する。被験オリゴヌクレオチドで処理した培養中の細胞の数を、コントロールオリゴヌクレオチドで処理した培養中の細胞の数（１００％と表す）と比較する。被験オリゴヌクレオチドで処理した培養中の細胞の数は、コントロールの３０％を超えない、このことはヒト５−ＨＴ様ＧＰＣＲの阻害が、癌細胞において抗増殖効果を有することを示している。
【０３２０】
化合物／標的確証のインビボ試験
１．急性機械的検定
１.１．分裂促進血漿ホルモンレベルの低下
この非腫瘍検定では、内因性の循環ホルモンレベル又は生物学的刺激に応答して生産されるホルモンレベルのいずれかを低下させる化合物の能力を測定する。げっ歯類に被験化合物を投与（経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与）する。被験化合物投与後の所定時間に、血漿を採集する。目的のホルモンレベルについて、血漿を検定する。ホルモンの標準循環レベルが低すぎる、及び／又は可変過ぎて一致した結果が得られない場合は、生物学的刺激で前処理してホルモンレベルを亢進することができる（即ち、ＬＨＲＨ ３０ｎｇ／マウス用量をマウスに筋肉内注射して、テストステロン合成を群発させることができる）。血漿採集の時期を調整して、誘導したホルモン応答のピークを一致させることができよう。化合物効果を、媒体処置コントロール群と比較する。Ｆ試験は分散が一致するか、一致しないかを決定するために行ない、次いであるチューデントｔ試験を行なう。媒体コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である。
【０３２１】
１.２．活性検定の中空繊維メカニズム
中空繊維は、所望の細胞系（群）を用いて調製し、げっ歯類に腹腔内及び／又は皮下移植する。化合物は、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。繊維を、特定のげっ歯類検定プロトコル（遺伝子発現（ｄＤＮＡ、ＰＣＲ又はＴａｑｍａｎ）、特定の生化学活性（例えば、ｃＡＭＰレベル）についての検定を含み得る）に基づいて回収する。結果は、群間の分散をＦ試験によって比較し（媒体コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である）、スチューデントｔ試験又は順位和試験によって分析する。
【０３２２】
２．亜急性機能インビボ検定
２.１．ホルモン依存的組織量の低下
これは、ホルモン依存性組織（即ち、雄の精嚢及び雌の子宮）の質量を低下させる化合物の能力を測定する別の非腫瘍検定である。げっ歯類に、被験化合物を所定のスケジュールに基づき、所定の期間（即ち、１週間）投与（経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下）する。この実験の最後に、動物の体重を測り、標的器官を切除し、全ての体液を搾り出し、その器官の重量を記録する。また、血漿も回収できる。血漿は、目的のホルモンレベル又は被験物質レベルについて検定することができる。器官重量を直接比較するか、それらを動物の体重について標準化することができる。化合物の効果を、媒体処置コントロール群と比較する。Ｆ試験は分散が一致するか、一致しないかを決定するために行ない、次いであるチューデントｔ試験を行なう。媒体コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である。
【０３２３】
２.２．中空繊維増殖検定
中空繊維は、所望の細胞系（群）を用いて調製し、げっ歯類に腹腔内及び／又は皮下移植する。化合物は、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。繊維を、特定のげっ歯類検定プロトコルに基づいて回収する。細胞増殖は、細胞数マーカー（即ち、ＭＴＴ又はＬＤＨ）を測定することによって決定する。細胞数と出発接種材料からの細胞数の変化を、群間の分散をＦ試験（媒体コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である）によって比較した後、スチューデントｔ試験又は順位和試験によって分析する。
【０３２４】
２.３．抗血管新生モデル
２.３.１．角膜血管新生
成長因子を伴う若しくは伴わないヒドロンペレット又は細胞を、げっ歯類の角膜に外科的に作ったマイクロポケット中に移植する。化合物（ヒドロンペレット中に成長因子と混合した化合物）を、全身又は局所投与することができる。移植の７日後にコロイド性カーボンを心臓内注入した後すぐに、角膜を回収し、そして１０％ホルマリン中に固定する。読み取りは、定性的スコアリング及び／又はイメージ分析で行なう。定性的スコアを順位和試験により比較する。イメージ分析データは、血管新生領域（ピクセル内）を測定することによって評価し、群平均をスチューデントｔ試験（２テイル）によって比較する。成長因子又は細胞のみの群と比較して、有意性はｐ値０.０５以下である。
【０３２５】
２.３.２．マトリゲル(Matrigel)血管新生
細胞又は成長因子を含有するマトリゲルを、皮下注射する。化合物を、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。マトリゲルプラグを、所定の時点（群）で回収し、読み取りのために調製する。読み取りは、ヘモグロビン濃度及び／又は組織学試験についてのＥＬＩＳＡを基礎とする検定である（即ち、容器カウント、内皮表面マーカーの特殊染色：ＣＤ３１、因子−８）。読み取りは、群間の分散をＦ試験によって比較した後（媒体コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である）、スチューデントｔ試験によって分析する。
【０３２６】
３．原発性抗腫瘍効果
３.１．初期治療モデル
３.１.１．皮下腫瘍
腫瘍細胞又は破砕物（フラグメント）を、０日目に皮下移植する。媒体及び／又は化合物を、ある時、通常１日目に開始する所定のスケジュールに基づいて経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与し、次いでその能力について腫瘍重量(burden)を測定する。体重及び腫瘍測定を週に２、３回記録する。正味の体重及び腫瘍重量の平均を、それぞれのデータ収集日ごとに計算する。抗腫瘍効果は、既定の日に処置腫瘍のサイズ（Ｔ）及びコントロール腫瘍のサイズ（Ｃ）を、群間の分散をＦ試験により比較した後（有意性はｐ０.０５以下で決められる）、スチューデントｔ試験により比較することで最初に決定することができる。また、この実験は、腫瘍成長遅延をモニターし記録して腫瘍測定を継続する場合には、投与の終了後にも継続できる。腫瘍成長遅延は、予め定めたサイズに達したコントロール群の中央時間で、該サイズに達した処置群とコントロール群の中央時間を割ったものの差として表される。成長遅延は、評価サイズに達した個々の腫瘍についての時間からカプラン−マイヤー曲線を作成することによって比較する。有意性はｐ０.０５以下である。
【０３２７】
３.１.２．腹腔内／頭蓋内腫瘍モデル
腫瘍細胞を、０日目に腹腔内又は頭蓋内注射する。化合物を、１日目に開始する所定のスケジュールに基づき、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。羅患率及び／又は死亡率の観察を、１日に２回記録する。体重は１週間に２回測定し記録する。羅患率／死亡率のデータを、生存中央値の期間で表し、長期生存数は分けて示す。生存時間を用いて、カプラン−マイヤー曲線を作成する。この実験のコントロール群と比較した対数範囲試験による有意性はｐ０.０５以下である。
【０３２８】
３.２．疾患モデルの確立
腫瘍細胞又は破砕物を、皮下的に移植し、処置を開始するのに所望のサイズにまで成長させる。所定のサイズ範囲に達する、マウスを処置群に無作為に分ける。化合物を、所定のスケジュールに従い、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。腫瘍重量及び体重を、１週間に２〜３回測定し記録する。インキュベート後の幾日かに渡って全群の腫瘍重量の平均値を、比較のためにグラフにする。Ｆ試験は分散が一致するか、一致しないかを決定するために行ない、次いであるチューデントｔ試験を処置終了時点の処置群及びコントロール群の腫瘍サイズを比較するために行なう。コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である。腫瘍測定は、投与を止め腫瘍成長遅延をモニターした後に、記録することができる。腫瘍成長遅延は、所定のサイズに達したコントロール群の中央時間で、所定のサイズに達した処置群とコントロール群の中央時間を割ったのものの差として表される。成長遅延は、評価サイズに達した個々の腫瘍についての時間からカプラン−マイヤー曲線を作成することによって比較する。媒体コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である。
【０３２９】
３.３．同所性疾患モデル
３.３.１．哺乳類脂肪体検定
哺乳動物の腺癌起源の腫瘍細胞又は破砕物を、外科的に露出させて表出させ、げっ歯類の乳腺脂肪体(fat pad)に直接移植する。その脂肪体を元あった場所に戻し、外科部分を閉じる。また、ホルモンを、腫瘍の成長を補助するためにげっ歯類に投与することもできる。化合物を所定のスケジュールに基づき、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。腫瘍重量及び体重を、１週間に２〜３回測定し記録する。接種後の幾日かに渡って全群の腫瘍重量の平均値を、比較のためにグラフにする。Ｆ試験は分散が一致するか、一致しないかを決定するために行ない、次いであるチューデントｔ試験を処置終了時の処置群及びコントロール群の腫瘍サイズを比較するために行なう。コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である。
【０３３０】
腫瘍測定は、投与を止め腫瘍成長遅延をモニターした後に、記録することができる。腫瘍成長遅延は、所定のサイズに達したコントロール群の中央時間で、所定のサイズに達した処置群とコントロール群の中央時間を割ったのものの差として表される。成長遅延は、評価サイズに達した個々の腫瘍の中央時間からカプラン−マイヤー曲線を作成することによって比較する。媒体コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である。さらに、このモデルは、このタイプの腫瘍の自発的転移速度を増大させる機会を提供する。転移反応は、標的器官当たりの目視できる病巣（フォーカス）の数を計数すること、又は標的器官重量を測定することによって、この研究の最後に評価することができる。これらの終点の平均値を、Ｆ試験を行なった後（この実験のコントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である）、スチューデントｔ試験によって比較する。
【０３３１】
３.２.２．前立腺内検定
前立腺癌器官の腫瘍細胞又は破砕物を、外科的に露出させたげっ歯類の前立腺の背葉に直接移植する。移植組織が精嚢に侵入しないことを検証しながら、腫瘍を特に背葉に移植することができるので、腹部切除して前立腺を外面化する。上手く接種した前立腺を腹部に移し、腹部に沿った切開部及び皮膚を閉じる。また、ホルモンを、腫瘍の成長を助けるためにげっ歯類に投与することもできる。化合物を、所定のスケジュールに基づき、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。体重を１週間に２〜３回測定し記録する。所定の時点で実験を終了し、動物を解剖する。原発性腫瘍サイズを、解剖範囲に装着させるキャリパーミクロメーターや接眼マイクロメーターのいずれかを用いて三次元測定する。Ｆ試験は分散が一致するか、一致しないかを決定するために行ない、次いであるチューデントｔ試験を処置終了時の処置群及びコントロール群の腫瘍サイズを比較するために行なう。コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である。このモデルは、このタイプの腫瘍の自発的転移速度を増大させる機会を与える。転移反応は、標的器官（即ち、肺）当たりの目視できる病巣の数を計数すること、又は標的器官（即ち、局所的リンパ節）重量を測定することによって、この研究の最後に評価することができる。これらの終点の平均値を、Ｆ試験を行なった後（この実験のコントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である）、スチューデントｔ試験によって比較する。
【０３３２】
３.３.３．気管支内検定
肺器官の腫瘍細胞を、皮膚を切開し、気管を曝すことによって、気管支内に移植することができる。気管支は、斜端の２５ゲージニードルを用いて穴を開け、腫瘍細胞を、主要な気管支に屈曲９０°の平滑端の２７ゲージニードルを用いて接種する。化合物を、所定のスケジュールに基づき、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。体重を１週間に２〜３回測定し記録する。所定の時点で実験を終了し、動物を解剖する。原発性腫瘍サイズを、解剖範囲に装着させるキャリパーミクロメーターや接眼マイクロメーターのいずれかを用いて三次元測定する。Ｆ試験は分散が一致するか、一致しないかを決定するために行ない、次いであるチューデントｔ試験を処置終了時の処置群及びコントロール群の腫瘍サイズを比較するために行なう。コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である。このモデルは、このタイプの腫瘍の自発的転移速度を増大させる機会を与える。転移反応は、標的器官（即ち、反対側の肺）当たりの目視できる病巣の数を計数すること、又は標的器官重量を測定することによって、この研究の最後に評価することができる。これらの終点の平均値を、Ｆ試験を行なった後（この実験のコントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である）、スチューデントｔ試験によって比較する。
【０３３３】
３.３.４．盲腸内検定
胃腸器官の腫瘍細胞を、腹部の皮膚を切開し、腸を外面化することで盲腸内移植することができる。腫瘍細胞を、２７又は３０ゲージニードルを用いて、腸の管腔を貫通することなく、盲腸壁に接種することができる。化合物を、所定のスケジュールに基づき、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。体重を１週間に２〜３回測定し記録する。所定の時点で実験を終了し、動物を解剖する。原発性腫瘍サイズを、解剖範囲に装着させるキャリパーミクロメーターや接眼マイクロメーターのいずれかを用いて三次元測定する。Ｆ試験は分散が一致するか、一致しないかを決定するために行ない、次いであるチューデントｔ試験を処置終了時の処置群及びコントロール群の腫瘍サイズを比較するために行なう。コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である。このモデルは、このタイプの腫瘍の自発的転移速度を増大させる機会を与える。転移反応は、標的器官（即ち、肝臓）当たりの目視できる病巣の数を計数すること、又は標的器官重量を測定することによって、この研究の最後に評価することができる。これらの終点の平均値を、Ｆ試験を行なった後（エンドポイント両方の実験におけるコントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である）、スチューデントｔ試験によって比較する。
【０３３４】
４．続発性（転移性）抗腫瘍効果
４.１．自発転移
腫瘍細胞を皮下接種させ、腫瘍を肺又は肝臓への自発的転移研究のため予め定めた範囲にまで成長させる。次いで、この原発性腫瘍を切除する。腫瘍転移の初期段階を阻害することを目的とした治療を評価するために原発性腫瘍を切除するまでの期間を含むことある所定のスケジュールに従い、化合物を、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。罹患率及び／又は死亡率の観察を毎日記録する。１週間に２回、体重を測定し記録する。可能な指標（エンドポイント）には、生存時間、標的器官当たりの目視できる病巣の数、又は標的器官重量が挙げられる。生存時間をエンドポイントとして用いた場合、他の値は定まらない。生存データは、カプラン−マイヤー曲線を作成するのに用いる。この実験のコントロール群と比較して対数範囲試験による有意性はｐ０.０５以下である。解剖マイクロスコープの下で決定されるような目視できる腫瘍の病巣数の平均と、標的器官重量の平均値は、Ｆ試験を行なった後（エンドポイント両方の実験におけるコントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である）、スチューデントｔ試験によって比較する。
【０３３５】
４.２．強制的転移
腫瘍細胞を、尾静脈、門脈、又は心臓の左心室、実験用（強制的）肺、肝臓及び骨転移研究それぞれにおいて注射する。化合物を、所定のスケジュールに基づいて、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与する。罹患率及び／又は死亡率の観察を毎日記録する。１週間に２回、体重を測定し記録する。可能な指標には、生存時間、標的器官当たりの目視できる病巣の数、又は標的器官重量が挙げられる。生存時間をエンドポイントとして用いた場合、他の値は決定されない。生存データは、カプラン−マイヤー曲線を作成するのに用いる。この実験のコントロール群と比較して対数範囲試験による有意性はｐ０.０５以下である。解剖マイクロスコープの下で決定される目視できる腫瘍の病巣数の平均と、標的器官重量の平均値は、Ｆ試験を行なった後（両方エンドポイントの実験における媒体コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である）、スチューデントｔ試験によって比較する。
【０３３６】
実施例１９
Ｇi−、Ｇs−およびＧq−共役レセプターのスクリーニング
Ｇi−共役レセプター
細胞（ＣＨＯ細胞または一次細胞など）は適切なレセプターおよび誘発可能なＣＲＥ−−ルシフェラーゼ構築物で安定にトランスフェクトされる。細胞は、５０％Ｄｕｌｂｅｃｃｏの修飾イーグル培地／１０％ＦＢＳで補足された５０％Ｆ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）（３７℃、１０％のＣＯ2を含む加湿大気中）中で成長させ、２または３日ごとに定期的に１：１０に比で分割する。試験培養は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＦＢＳ中で適切な濃度（例えば３５μｌの細胞培養培地中１ウェルあたりの２０００個の細胞）で３８４−ウェルプレート中にシードされ、４８時間（細胞系によって〜２４から６０時間の範囲）成長させる。成長培地を次に、０，１％ＢＳＡを含む無血清培地（ＳＦＭ；例えば超ＣＨＯ）に対して交換する。
【０３３７】
ＤＭＳＯ中に溶解された試験化合物をＳＦＭで希釈し、試験培地（最大最終濃度１０μモル）へ移し、つづいて１０分後にＳＦＭ＋０，１％ＢＳＡ中フォルスコリン（〜１μモル、最終濃度）を添加する。両方をスクリーニングするアンタゴニストの場合、適当な濃度の作用物質、およびフォルスコリンを添加する。プレートを１０％ＣＯ2中、３７℃で３時間インキュベートする。次に、上清を除去し、細胞を溶解試薬（２５ミリモルのリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．８、２ミリモルのＤＤＴ、１０％グリセロールおよび３％のＴｒｉｔｏｎＸ１００を含む）で溶解させる。
【０３３８】
ルシフェラーゼ反応は基質−緩衝液（例えばルシフェラーゼ分析試薬、Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加によって開始され、発光をすぐに定量する（例えばＢｅｒｔｈｏｌｄ照度計またはＨａｍａｍａｔｚｕカメラシステム）。
【０３３９】
Ｇs結合レセプター
細胞（ＣＨＯ細胞または一次細胞など）は適切なレセプターおよび誘発可能なＣＲＥ−−ルシフェラーゼ構築物で安定にトランスフェクトされる。細胞は、５０％Ｄｕｌｂｅｃｃｏの修飾イーグル培地／１０％ＦＢＳで補足された５０％Ｆ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）（３７℃、１０％のＣＯ2を含む加湿大気中）中で成長させ、２または３日ごとに定期的に１：１０に比で分割する。試験培養は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＦＢＳ中で適切な濃度（例えば３５μｌの細胞培養培地中１ウェルあたりの１０００または２０００個の細胞）で３８４−ウェルプレート中にシードされ、４８時間（細胞系によって〜２４から６０時間の範囲）成長させる。０，１％ＢＳＡを含む無血清培地（ＳＦＭ；例えば超ＣＨＯ）に試験化合物を添加することにより分析を開始する。
【０３４０】
試験化合物をＤＭＳＯ中に溶解させ、ＳＦＭで希釈し、試験培地（最大最終濃度１０μモル、ＤＭＳＯ濃度＜０．６％）へ移す。プレートを１０％ＣＯ2中、３７℃で３時間インキュベートする。次に、１ウェルあたり１０μｌの試薬（２５ミリモルのリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．８、２ミリモルのＤＤＴ、１０％グリセロールおよび３％のＴｒｉｔｏｎＸ１００を含む）で溶解させる。
【０３４１】
ルシフェラーゼ反応は１ウェルあたり２０μｌ基質−緩衝液（例えばルシフェラーゼ分析試薬、Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加によって開始される。発光の定量をすぐに開始する（例えばＢｅｒｔｈｏｌｄ照度計またはＨａｍａｍａｔｚｕカメラシステム）。
【０３４２】
Ｇq結合レセプター
細胞（ＣＨＯ細胞または一次細胞など）は適切なレセプターで安定にトランスフェクトされる。細胞は、５０％Ｄｕｌｂｅｃｃｏの修飾イーグル培地／１０％ＦＢＳで補足された５０％Ｆ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）（３７℃、５％のＣＯ2を含む加湿大気中）中で成長させ、３または４日ごとに定期的に１：１０に比で分割する。試験培養は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＦＢＳ中で適切な濃度（例えば３５μｌの細胞培養培地中１ウェルあたりの２０００個の細胞）で３８４−ウェルプレート中にシードされ、４８時間（細胞系によって〜２４から６０時間の範囲）成長させる。成長培地を次に生理学的塩溶液（例えば、Ｔｙｒｏｄｅ溶液）に対して交換する。
【０３４３】
ＤＭＳＯ中に溶解させた試験化合物を、０．１％ＢＳＡを含むＴｙｒｏｄｅ溶液で希釈し、試験培地（最大最終濃度１０μモル）へ移す。レセプター特異性作用物質の添加後、結果後して得られるＧｑにより媒介される細胞内カルシウム増加を、適当な読みとりシステム（例えば、カルシウム感受性色素）を用いて測定する。
【０３４４】
実施例２０
プロモーター分析
プロモーター分析は、興味のある（例えば、甲状腺ホルモン）調節プロモーターの制御かで、ルシフェラーゼで安定にトランスフェクトされたヒト肝細胞ガン細胞ＨｅｐＧ２で開始された。トランスフェクションのために使用されたベクター２ｘＩＲＯｌｕｃは、ｔｋ最小プロモーターとルシフェラーゼの遺伝子の前に８ｂｐのスペーサーで分離された２つの１２ｂｐ逆パリンドローム配列の甲状腺ホルモン反応性エレメント（ＴＲＥ）を有する。
【０３４５】
試験培養物を、グルタミン、トリシン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、インシュリン、セレン、トランスフェリンで補足された無血清イーグル最小基本培地中、９６−ウェルプレート中に接種し、１０％ＣＯ2、３７℃で加湿された大気中、培養した。４８時間インキュベーションした後、試験化合物または参照化合物（例えば、ＬＴ３、Ｌ−Ｔ４）および適当ならば共同刺激因子（最終濃度１ｎＭ）の連続希釈を細胞培養物に添加し、最適時間（例えばさらに４−７２時間）インキュベーションを続けた。細胞を次に、ＴｒｉｔｏｎＸ１００およびルシフェリンを含む緩衝液の添加により溶解させ、Ｔ３によって誘発されたルシフェラーゼまたは他の化合物の発光は照度計で測定した。試験化合物のそれぞれの濃度について、４回の反復試験を行った。各試験化合物についてのＥＣ50値をＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｉｅｎｔｆｉｃソフトウェアの使用により計算した。
【０３４６】
発現プロファイリング
定量的ＰＣＲ法による遺伝子発現の詳細な分析のために、興味のあるゲノム領域に隣接するプライマーおよび中間をハイブリダイズする蛍光標識されたプローブを利用する。ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、フォスターシティー、ＣＡ、ＵＳＡ）のＰＲＩＳＭ７７００配列検出システムと蛍光リポーター色素およびクエンチャー色素の両方で標識されたオリゴヌクレオチドからなる螢光原プローブの技術を用いて、このような発現測定を行なうことができる。プローブ特異的生成物の増幅はプローブの開裂を引き起こし、リポーター蛍光の増加を生み出す。プライマーおよびプローブは、プライマーエクスプレスソフトウェアを使って選択されて、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＨＧ＿Ｕ９５Ａ−ＥまたはＨＧ−Ｕ１３３ＡＢＤＮＡチップの構築のために用いられるプローブ配列の相対的位置に従ってコーディング配列の３’領域または３’未翻訳領域（プライマーと調査連続のために表５参照）にほとんど局在化していた。すべてのプライマー対は慣用のＰＣＲ反応により特異性についてチェックされた。サンプルＲＮＡの量を標準化するために、ＧＡＰＤＨは分析されたサンプルにおいて差次的に調節されていないので、ＧＡＰＤＨを基準として選択した。ＴａｑＭａｎ確認実験が行われ、標的および対照増幅の効率はほぼ等しいことが示され、このことは当業者に公知の比較のΔΔＣT法による遺伝子発現の相対的定量化のために必須条件である。
ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒにより提供される技術と同様に、Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｃ．から得られるＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒまたはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．から得られるｉＣｙｃｌｅｒのような他の器具を用いることができる。
【０３４７】
発現プロファイリングは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ａｒｒａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを用いて行うことができる。ｍＲＮＡのこのようなＤＮＡアレイまたはＤＮＡチップとのハイブリダイゼーションによって、アレイのある特定の位置でのシグナルの強さによりそれぞれの転写物の発現値を同定することが可能である。通常、これらのＤＮＡアレイはｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはサブクローンされたＤＮＡ断片のスポッティングにより得られる。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ技術の場合、約４００．０００の個々のオリゴヌクレオチド配列が別個の位置においてシリコンウエハーの表面で合成された。オリゴマーの最小の長さは１２ヌクレオチド、好ましくは２５ヌクレオチド、または問題となる転写物の完全長である。発現のプロファイリングは、ナイロンまたはニトロセルロース膜に結合したＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドとのにハイブリダイゼーションにより行うことができる。ハイブリダイゼーションから得られるシグナルの検出は、比色、蛍光、電気化学的、電子、光学または放射性読出装置のいずれかにより得ることができる。アレイ構築の詳細な説明はすでに記載され、また引用された他の特許において記載されている。分析するために染色体領域における量的および質的な変化を決定するために、このようなゲノム改変を含んでいると思われる腫瘍組織から得られるＲＮＡを、全トランスクリプトム（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ）の発現プロファイリングに基づいて、良性組織（例えば上皮乳房組織、または顕微解剖された管組織）から抽出されたＲＮＡと比較しなければならない。わずかに改変して、サンプル調製プロトコルは、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐ発現分析マニュアル（サンタクララ、ＣＡ）に従った。良性組織、生検、細胞単離物または細胞を含む体液からの全ＲＮＡ抽出および単離は、ＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ、ロックビル、ＭＤ）およびＯｌｉｇｏｔｅｘｍＲＮＡ  Ｍｉｄｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を使って行うことができ、濃度を１ｍｇ／ｍｌにするためにエタノール沈降工程を行うべきである。第一のストランドｃＤＮＡ合成はＴ７−（ｄＴ２４）オリゴヌクレオチドを用いてプライムされた。ｃＤＮＡはフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させて、最終濃度１ｍｇ／ｍｌにすることができる。生成したｃＤＮＡから、Ｅｎｚｏ（Ｅｎｚｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）インビトロ転写キットを使ってｃＲＮＡを合成することができる。同じ工程の中で、ｃＲＮＡはビオチンヌクレオチドＢｉｏ−１１−ＣＴＰおよびＢｉｏ−１６−ＵＴＰ（ＥｎｚｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）で標識することができる。標識およびクリーンアップ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ（ドイツ））後、ｃＲＮＡを次に適当な細分緩衝液（例えば、４０ミリのＴｒｉｓ−酢酸塩、ｐＨ８．１、１００ｍＭ  ＫＯＡｃ、３０ｍＭのＭｇＯＡｃ、９４℃で３５分間）中で細分化する。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコルにより、細分化されたｃＲＮＡを、それぞれ約４０．０００のプローブされた転写物を含むＨＧ＿Ｕ１３３アレイ上で、２４時間、��０ｒｐｍで、４５℃のハイブリダイゼーションオーブン中でハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション工程後、チップ表面を洗浄し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘフルイディクスステーションにおいてストレプトアビジンフィコエリトリン（ＳＡＰＥ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で染色しなければならない。染色を増幅するために、第二の標識工程を導入することができ、これはされていないが、強制ではない。抗ストレプトアビジンビオチニル化抗体をＳＡＰＥ溶液に２回添加する。プローブアレイへのハイブリダイゼーションは、蛍光分析スキャニング（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ遺伝子アレイスキャナー；Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、パロアルト、ＣＡ）により検出できる。
【０３４８】
ハイブリダイゼーションとスキャニングの後に、ミクロアレイ像は、ハイブリダイゼーションシグナルにおける主要なチップ欠陥または異常を探して、品質管理のために解析することができる。そのためにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐ  ＭＡＳ  ５．０ソフトウェアまたは他のミクロアレイ画像解析ソフトウェアを利用することができる。基本データ分析は製造業者により提供されたソフトウェアによって実行されるべきである。
遺伝子分析の場合、本発明の１つの具体例において、基本データは別の生物情報手段ツールおよび追加のフィルター基準によって分析された。生物情報分析は以下に詳細に記述される。
【０３４９】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ測定技術（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｍａｎｕａｌ、サンタクララ、ＣＡ）に従って、１つのチップに関する一つの遺伝子発現測定により平均の差値と絶対の判定が得られる。それぞれのチップは、遺伝子またはｃＤＮＡクローンにつき１６から２０のオリゴヌクレオチドプローブ対を含む。これらのプローブ対は完全にマッチするセットおよびミスマッチするセットを含み、その双方が、完ぺきなマッチの強度からミスマッチの強度を引くことにより計算される、各プローブ対の強度さの尺度である、平均的差、または発現値の計算に必要である。これは、蛍光強度に影響を与えることができるプローブ対および他のハイブリダイゼーション人為要素間でのハイブリダイゼーションで変動性を考慮に入れる。平均の差は該遺伝子の発現値を表すと思われる数値である。絶対的コールは値「Ａ」（欠如している）、「Ｍ」（ほとんどない）、または「Ｐ」（存在する）をとることができて、一つのハイブリダイゼーションの質を示す。本発明者らは平均の差によって与えられた量的な情報と絶対的コールによって与えられた質的な情報の両方を、正常な集団からの生物学的サンプルに対して乳がんにかかった個人からの生物学的サンプルにおいて差次的に発現される遺伝子を識別するために使用した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ以外のアルゴリズムを用いて、本発明者らは比較により同じ発現値と発現差を表す異なった数の値を得た。
【０３５０】
較正ＣＴ値の計算
ＣＴ値を上に記載したとおり計算する。ＣＦ値は、以下のとおり計算する。
1.  cDNAサンプルについてハウスキーピング遺伝子 (HKG)を定量するためにPCR反応を設定する。
2.   CTHKG値を上記のとおり計算した。
3.   各ｃＤＮＡについてのすべてのHKGのCT平均値を計算する(n ＝HKGの数):
(CTHKG1値＋CTHKG2値＋CTHKG-X-値) / n ＝CTcDNA-X-平均値
(n ＝HKGの数)
4.  (CTcDNA-1-平均値＋CTcDNA-X-平均値) / y ＝CTpannel-平均値
(y ＝cDNAの数)
5.  CTpannel-平均値−CTcDNA-X-平均値＝CFcDNA-X
6.  CTcDNA-X＋CFcDNA-X ＝CTcor-cDNA-X
【０３５１】
定義：最も高い CTcor-cDNA-X ≠40 はCTcor-cDNA-X [高い]と定義する。
比発現量＝2e(CTcor-cDNA-X [高い] - CTcor-cDNA-Y)
結果を図１１〜１３に示す。ヒトセロトニン様ＧＰＣＲは種々の比と組織で発現する。セロトニンＧＰＣＲｍＲＮＡは、小脳、中心後回、後根神経節、赤血球、肺 COPD、食道、回腸慢性炎症、前立腺 BPH、およびペニスでの発現量が高い。
【０３５２】
セロトニン様ＧＰＣＲｍＲＮＡは、小脳、中心後回、後根神経節等の種々の脳組織において発現量が高い。上記組織における発現は、ヒトセロトニン様ＧＰＣＲと末梢および中枢神経系の疾患との関連を示唆している。
【０３５３】
セロトニン様ＧＰＣＲｍＲＮＡは、前立腺ＢＰＨおよびペニスでの発現量が高い。上記組織での発現は、ヒトセロトニン様ＧＰＣＲと生殖−泌尿器系の疾患との関連を示唆している。
【０３５４】
セロトニン様ＧＰＣＲｍＲＮＡは、肺ＣＯＰＤでの発現量が高い。上記組織での発現は、ヒトセロトニン様ＧＰＣＲと呼吸器系の疾患との関連を示唆している。
【０３５５】
セロトニン様ＧＰＣＲｍＲＮＡは、赤血球での発現量が高い。上記組織での発現は、ヒトセロトニン様ＧＰＣＲと血液の疾患との関連を示唆している。
【０３５６】
実施例２２
麻酔ラットにおける周期的な等積膀胱収縮の測定
（１）動物
雌性のSprague-Dawleyラット (200〜250 g / Charles River Japan)を用いる。
（２）カテーテル移植
ラットを１．２５ｇ／ｋｇのウレタン（Sigma）の腹腔内投与によって麻酔する。正中切開により開腹し、ポリウレタンカテーテル（BECTON DICKINSON, PE50）をドームを介して膀胱へ移植する。並行して、鼠径部を切開し、生理食塩水（Otsuka）を満たしたポリウレタンカテーテル（BECTON DICKINSON, PE50）を大腿静脈へ挿入する。
（３）膀胱収縮の測定
自発的な膀胱収縮が起こるまで、カテーテルを介して膀胱を増加体積の生理食塩水で満たす。膀胱腔内圧を圧力変換器で測定し、チャートレコーダーに継続的に表示する。大腿静脈に挿入したポリエチレンカニューレを介して静脈内投与した後、試験化合物の能力を調べる。
【０３５７】
コンシャスラットにおける膀胱内圧の測定
（１）動物
雌性のSprague-Dawleyラット (200〜250 g / Charles River Japan)を用いる。
（２）カテーテル移植
ラットをケタミン（７５mg／kg）およびキシラジン（１５mg／kg）の筋肉内投与によって麻酔する。正中切開により開腹し、ポリウレタンカテーテル（BECTON DICKINSON, PE50）をドームを介して膀胱へ移植する。カテーテルを、針（１４Ｇ）を用いて、ラットの皮下組織の下から首へとくぐらせる。並行して、鼠径部を切開し、生理食塩水（Otsuka）を満たしたポリウレタンカテーテル（BECTON DICKINSON, PE50）を大腿静脈へ挿入する。カテーテルを、針を用いて、ラットの皮下組織の下から首へとくぐらせる。
（３）膀胱内圧測定
Ｔ−チューブ（Viggo-Spectramed Pte Ltd, DT-XXAD）で膀胱のカテーテルを圧力変換器およびマイクロインジェクションポンプ(TERUMO)とを連結する。室温、１０mL／時間にて膀胱に生理食塩水を潅流させる。膀胱内圧を、チャート・ペン・レコーダー（Yokogawa）で継続的に記録する。試験化合物を投与する前に、少なくとも３回の再現性ある排尿周期を記録する。
（４）試験化合物の投与
エタノール、Tween 80 (ICN Biomedicals Inc.)および生理食塩水の混合物(1 : 1 : 8, v/v/v) 珥溶解した試験化合物をカテーテルを介して静脈内投与する。
【０３５８】
参考文献
1.  Human serotonin 1D receptor is encoded by a subfamily of two distinct genes: 5-HT1D alpha and 5-HT1D beta.  Proc Natl Acad Sci U S A 1992 Apr 15;89(8):3630-4
2.  Cloning and expression of the human 5-HT1B-type receptor gene.  Biochem Biophys Res Commun 1992 Jun 15;185(2):517-23
3.  Molecular cloning of a human serotonin receptor (S12) with a pharmacological profile resembling that of the 5-HT1D subtype.  J Biol Chem 1992 Apr 15;267(11):7553-62
4.  Human serotonin1B receptor expression in Sf9 cells: phosphorylation, palmito-ylation, and adenylyl cyclase inhibition.  Biochemistry 1993 Nov 2;32(43):11727-33
【図面の簡単な説明】
【０３５９】
【図１】５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図２】図１のＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】SwissProt受託番号No. P28222|5H1B_HUMAB5−HYDROXYTRYPTAMINE 1B RECEPTOR (5−HT−1B) (セロトニンレセプター)によって同定されるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。
【図４】５−ＨＴ様ＧＰＣＲポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号４）を示す。
【図５】swiss|P28222|5H1B_ヒト5−ヒドロキシTRYPTアミン１Ｂレセプター (5−HT−1B) (セロトニンレセプター) (配列番号３)に対する４１４（配列番号２）のBLASTP − アライメントを示す。
【図６】pfam|hmm|7tm_17 transmembrane レセプター (ロドプシンファミリー)に対する４１４（配列番号２）のHMMPFAM − アライメントを示す。
【図７】遺伝子スキャンの結果を示す。
【図８】推定アミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
【図９】SNP:1275729_867778に対する４１４（配列番号２）のBLASTN − アライメントを示す。
【図１０】配列番号２の膜貫通領域を示す。
【図１１】発現プロファイルを示す。
【図１２】発現プロファイルを示す。
【図１３】発現プロファイルを示す。
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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