(57)【要約】腫瘍壊死因子及びそれらの受容体は、基礎研究において及び治療剤として有用であることがわかっている。本発明は、“Ｚｔｎｆｒ１２”と称する新規ヒト腫瘍壊死因子受容体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ配列のアミノ酸残基７−７１を含んで成る単離されたポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基１−７１を含んで成る請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸配列を含んで成る請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸配列から成るアミノ酸配列を有する請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
（ａ）配列番号２のアミノ酸残基７−７１のアミノ酸配列、（ｂ）配列番号２のアミノ酸残基１−７１のアミノ酸配列、及び（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列、から成る群から選択されたアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子。
【請求項６】
配列番号２のアミノ酸残基７−７１を含んで成るアミノ酸配列をコードする請求項５記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
配列番号１のヌクレオチド２７−５７８、又は配列番号１のヌクレオチド４５−２９９のヌクレオチド配列を含んで成る請求項５記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
請求項７記載の単離された核酸分子を含んで成るベクター。
【請求項９】
配列番号２のアミノ酸残基７−７１を含んで成るポリペプチドをコードする核酸分子、転写プロモーター及び転写ターミネーターを含んで成り、ここで前記プロモーターが前記核酸分子と作用可能に結合されており、そして前記核酸分子が前記転写ターミネーターと作用可能に結合されていることを特徴とする発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９記載の発現ベクターを含んで成る、細菌、酵母細胞、鳥類細胞、菌類細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞及び植物細胞から成る群から選択された組換え宿主細胞。
【請求項１１】
配列番号２のアミノ酸残基７−７１を含んで成るポリペプチドの生成方法であって、請求項９記載の発現ベクターを含んで成り、そして前記ポリペプチドを生成する組換え宿主細胞を培養することを含んで成る方法。
【請求項１２】
前記培養された組換え宿主細胞から前記ポリペプチドを単離することをさらに含んで成る請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
請求項４記載のポリペプチドと特異的に結合する、抗体又は抗体フラグメント。
【請求項１４】
（ａ）ポリクローナル抗体、（ｂ）ネズミモノクローナル抗体、（ｃ）（ｂ）由来のヒト化抗体、及び（ｄ）ヒトモノクローナル抗体から成る群から選択される請求項１３記載の抗体。
【請求項１５】
請求項１記載のポリペプチドを含んで成る融合タンパク質。
【請求項１６】
配列番号２のアミノ酸残基１〜７１を含んで成る請求項１５記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
免疫グロブリン成分をさらに含んで成る請求項１５又は１６記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野：
本発明は一般的に、ヒト細胞により発現される新規タンパク質に関する。特に、本発明は、“Ｚｔｎｆｒ１２”と称する受容体をコードする新規遺伝子、及びＺｔｎｆｒ１２ポリペプチドをコードする核酸分子に関する。
【０００２】
発明の背景：
サイトカインは、多くの細胞型の増殖及び分化の調節を包含する種々の生物学的効果を仲介する可溶性の小さなタンパク質である（例えば、Ａｒａｉなど．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５６： ７８３ （１９９０）； Ｍｏｓｍａｎｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３：３１１ （１９９１）； Ｐａｕｌ ａｎｄ Ｓｅｄｅｒ， Ｃｅｌｌ ７６： ２４１ （１９９４） を参照のこと）。サイトカイングループを構成するタンパク質は、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子及び他の調節分子を包含する。例えば、ヒトインターロイキン−１７は、インターロイキン−６、細胞内付着分子１、インターロイキン−８、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の発現、及びプロスタグランジンＥ２発現を刺激し、そしてＣＤ３４＋造血前駆体の好中球への選択的成熟において役割を演じるサイトカインである。（Ｙａｏなど．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５５： ５４８３ （１９９５）； Ｆｏｓｓｉｅｚ など．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８３： ２５９３ （１９９６））。
【０００３】
サイトカインを結合する受容体は典型的には、高い親和性でサイトカインを結合し、そしてこの結合現象を、一定の受容体サブユニットの細胞質部分を通して細胞にトランスダクションする１又は複数の膜内在性タンパク質から構成される。サイトカイン受容体は、それらの細胞外リガンド結合ドメインにおける類似性に基づいて、いくつかのクラスに分類されている。例えば、インターフェロンの結合及び／又はその効果のトランスダクションを担当する受容体鎖は、特徴的な２００個の残基の細胞外ドメインに基づいて、タイプＩＩサイトカイン受容体ファミリーのメンバーである。
【０００４】
免疫応答の間に生じる細胞相互作用は、いくつかの細胞表面受容体ファミリー、例えば腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーのメンバーにより調節される。ＴＮＦＲファミリーは、多くの膜内在性糖タンパク質から成り、それらの多くは、それらのそれぞれのリガンドと共に、異なった造血細胞系間での相互作用を調節する（例えば、Ｃｏｓｍａｎ， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １２： ４４０ （１９９４）； Ｗａｊａｎｔなど．， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ． １０：１５ （１９９９）； Ｙｅｈなど．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． １６９： ２８３ （１９９９）； Ｉｄｒｉｓｓ ａｎｄ Ｎａｉｓｍｉｔｈ， Ｍｉｃｒｏｓｃ． Ｒｅｓ． Ｔｅｃｈ． ５０： １８４ （２０００）を参照のこと）。
【０００５】
１つのそのような受容体は、ＴＡＣＩ、トランスメンブラン活性化因子及びＣＡＭＬ相互作用体である（ｖｏｎ Ｂｕｌｏｗ ａｎｄ Ｂｒａｍ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８： １３８ （１９９７）； ＰＣＴ公開ＷＯ９８／３９３６１号）。ＴＡＣＩは、２種のシステインに富んでいる擬似反復体を含む細胞外ドメイン、トランスメンブランドメイン及びＣＡＭＬ（カルシウムモジュレーター及びシクロフィリンリガンド）と相互作用する細胞質ドメインを有する膜結合受容体、すなわちＪｕｒｋａｔ細胞において過剰発現される場合、ＮＦ−ＡＴ活性化の同時インジューサーである、細胞内小胞に位置する膜内在性タンパク質である。ＴＡＣＩは、Ｂ細胞、及びＴ細胞のサブセットにより会合される。
【０００６】
腫瘍壊死因子受容体の明らかにされたインビボ活性は、他のそのような受容体、及び腫瘍壊死因子受容体アゴニスト及びアンタゴニストの臨床学的可能性、及びそれについての必要性を示す。
【０００７】
発明の簡単な要約：
本発明は、“Ｚｔｎｆｒ１２”と称する新規腫瘍壊死因子受容体を提供する。本発明はまた、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチド及びＺｔｎｆｒ１２融合タンパク質、並びにそのようなポリペプチド及びタンパク質をコードする核酸分子、及びそれらの核酸分子及びアミノ酸配列の使用方法を提供する。
【０００８】
発明の特定の記載：
１．概観
ＺＴＮＦ４は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドファミリーのメンバーである（配列番号５）。この分子はまた、“ＢＡＦＦ”、“ＢｌｙＳ”、“ＴＡＬＬ−１”及び“ＴＨＡＮＫ”としても命名されている（Ｍｏｏｒｅなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５： ２６９ （１９９９）； Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４： １５９７８ （１９９９）； Ｓｃｈｎｏｉｄｅｒなど．，Ｊ．Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８９： １７４７ （１９９９）； Ｓｈｕなど．，Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃ． Ｂｉｏｌ． ６５： ６８０ （１９９９））。ＺＴＮＦ４と結合する次の２種の受容体が同定されている：トランスメンブラン活性化因子及びＣＡＭＬ相互作用体（ＴＡＣＩ）及びβ−細胞成長因子（ＢＣＭＡ）（Ｇｒｏｓｓなど．， Ｎａｔｕｒｅ ４０４： ９９９ （２０００））。
【０００９】
ビオチニル化されたＺＴＮＦ４が、このリガンドのための可能性ある新規受容体を同定するために使用された。それらの研究においては、一群の腫瘍細胞へのビオチニル化されたＺＴＮＦ４の結合が、流動細胞計測法を用いて測定された。驚くべきことには、ＺＴＮＦ４は、ＴＡＣＩに対するモノクローナル抗体又はＢＣＭＡに対するポリクローナル抗体のいずれかによる細胞の結合がほとんど存在しない場合でさえ、ヒトＢ−リンパ前駆体細胞系（ＲＥＨ細胞）に結合することが見出された。類似する結果が、ヒトリンパ腫に由来するＢＪＡＢ細胞により見出された。それらの観察は、ＺＴＮＦ４がＴＡＣＩ又はＢＣＭＡ以外の受容体と結合したことを示した。
【００１０】
さらにこの可能性を調査するために、１２５Ｉ−ラベルされたＺＴＮＦ４がＢ−リンパ前駆体細胞に結合し、そして細胞表面分子に交差された。抗−ＺＴＮＦ４ポリクローナル抗体による処理は放射性沈殿物を生成したが、ところが抗−ＴＡＣＩ又は抗−ＢＣＭＡポリクローナル抗体による処理は放射性沈殿物を生成しなかった。従って、このデータは、新規受容体が細胞へのＺＴＮＦ４の結合の原因である仮説を支持した。“Ｚｔｎｆｒ１２”として命名された前記受容体が、例１に記載記載のようにして単離された。結合研究は、その新規受容体がＺＴＮＦ４を結合したが、しかし”ＺＴＮＦ２“として命名されたリガンド（配列番号６）を結合しなかったことを示した。ＺＴＮＦ２はまた“ＡＰＲＩＬ”及び“ＴＮＲＦ死亡リガンド−１”としても命名されている（Ｈａｈｎｅなど．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８８： １１８５ （１９９８）； Ｋｅｌｌｙなど．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６０： １０２１ （２９９９））。
【００１１】
Ｚｔｎｆｒ１２の結合特性がまた、組換え宿主細胞を用いて調べられた。子供のハムスター腎臓細胞が、Ｚｔｎｆｒ１２コード配列を含んで成る発現ベクターによりトランスフェクトされ、そしてそのトランスフェクトされた細胞が１２５Ｉ−ラベルされたＺＴＮＦ４による結合研究に使用された。結合研究及びスキャッチャード分析は、Ｚｔｎｆｒ１２に対するＺＴＮＦ４のＫｄが１．０ｎＭであり、これは、ＴＡＣＩ発現ベクターによりトランスフェクトされた子供ハムスター腎臓細胞により発現されるＴＡＣＩ受容体に対するＺＴＮＦ４のＫｄ（１．２５ｎＭ）に匹敵できることを示した。トランスフェクトされた細胞は、細胞当たり約１５０×１０６のＺｔｎｆｒ１２細胞表面受容体を発現した。
【００１２】
ＺＴＮＦ４は、実質的にすべての成熟ＣＤ１９＋末梢Ｂ細胞に対して結合し、骨髄における未成熟Ｂ細胞に対して弱く結合し、そしてほとんどの形質転換されたＢ細胞に対して結合するように思える。しかしながら、いくつかのＢリンパ腫、ＲＥＨ及びＢＪＡＢは例えば、ＺＴＮＦ４を結合するが、しかし適切なレベルのＴＡＣＩ又はＢＣＭＡのいずれも発現しない。さらに、ＴＡＣＩ及びＢＣＭＡ表面発現及びＺＴＮＦ４結合が、流動細胞計測法を用いて、扁桃、末梢血液及び骨髄から単離された細胞に対して決定された。その結果は、ＴＡＣＩ及びＢＣＭＡがヒト扁桃及び末梢血液におけるほとんどの未成熟Ｂ細胞集団、すなわちＩｇＭ＋ＩｇＤ−上で最高レベルで発現されることを示す。
【００１３】
両受容体の発現レベルは、より成熟したＩｇＭ＋ＩｇＤ＋Ｂ細胞の表面上で低下し、そしてＩｇＭ−ＩｇＤ＋Ｂ細胞、すなわちＢ細胞成熟の最も成熟した段階を表す集団上で非常に低いレベルで見出される。しかしながら、ＺＴＮＦ４リガンドは、実質的にすべての成熟Ｂ細胞に、高レベルで結合する。一緒に考慮すると、それらのデータは、いくつかのＢ細胞腫瘍及び末梢ヒトＢ細胞上でのＺＴＮＦ４のための追加の受容体の存在を包含する。それらのデータは、Ｚｔｎｆｒ１２がほとんどの成熟ＩｇＭ−ＩｇＤ＋Ｂ細胞上で最高レベルで発現され、そしてこの集団への最高レベルのｚＴＮＦ４結合の原因であり得ることを示す。
【００１４】
Ｚｔｎｆｒ１２をコードする例示のヌクレオチド配列は、配列番号１により提供される。そのコードされるポリペプチドは、次のアミノ酸配列を有する：ＭＲＲＧＰＲＳＬＲＧ ＲＤＡＰＡＰＴＰＣＶ ＰＡＥＣＦＤＬＬＶＲ ＨＣＶＡＣＧＬＬＲＴ ＰＲＰＫＰＡＧＡＳＳ ＰＡＰＲＴＡＬＱＰＱ ＥＳＶＧＡＧＡＧＥＡ ＡＬＰＬＰＧＬＬＦＧ ＡＰＡＬＬＧＬＡＬＶ ＬＡＬＶＬＶＧＬＶＳ ＷＲＲＲＱＲＲＬＲＧ ＡＳＳＡＥＡＰＤＧＤ ＫＤＡＰＥＰＬＤＫＶ ＩＩＬＳＰＧＩＳＤＡ ＰＡＰＡＷＰＰＰＧＥ ＤＰＧＴＴＰＰＧＨＳ ＶＰＶＰＡＴＥＬＧＳ ＴＥＬＶＴＴＫＴＡＧ ＰＥＱＱ（配列番号２）。Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドの特徴は、配列番号２のアミノ酸残基１−６９又は配列番号２のアミノ酸残基１−７９を含んで成る細胞外ドメイン、配列番号２のアミノ酸残基７０−１００又は配列番号２のアミノ酸残基８０−１００を含んで成るトランスメンブランドメイン、及び配列番号２のアミノ酸残基１０１−１８４での細胞内ドメインを包含する。
【００１５】
Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子を含むヌクレオチド配列は、配列番号９により提供される。Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子は３個のエキソンを含んで成る。配列番号２のアミノ酸に関しては、エキソン１はアミノ酸残基１〜アミノ酸４６のためのコドンの第１ヌクレオチドをコードし、エキソン２はアミノ酸４６の残り〜アミノ酸１２３のためのコドンの第１ヌクレオチドをコードし、そしてエキソン３はアミノ酸１２３の残り〜アミノ酸１８４をコードする。３’−未翻訳領域は配列番号９のヌクレオチド２４０５〜約５７２０を含む。表１はこのヌクレオチド配列のさらなる特徴を提供する。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子は染色体２２ｑ１３．２に存在し、そしてＺｔｎｆｒ１２はほとんどのリンパ組織（例えばリンパ節組織）、Ｂ−細胞腫瘍及び胚中心Ｂ−細胞において発現される。ノザン及びドットブロット分析は、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子発現が脾臓、リンパ節、末梢血液リンパ球、腎臓、心臓、肝臓、骨格筋、膵臓、副腎、精巣、脳、子宮、胃、骨髄、気管、胸腺、胎盤、胎児肝臓及びＲａｊｉ細胞において検出できることを示した。最も強いシグナルは、脾臓及びリンパ節組織と結合されるが、ところが弱いシグナルは脳、子宮及び胎盤組織により結合される。従って、Ｚｔｎｆｒ１２抗体及び核酸プローブは、それらの組織間で分化するために使用され得る。
【００１８】
下記のように、本発明は、（ａ）配列番号２のアミノ酸残基７−６９、（ｂ）配列番号２のアミノ酸残基７−７９、（ｃ）配列番号２のアミノ酸残基７−３９、（ｄ）配列番号２のアミノ酸残基１９−３５、（ｅ）配列番号２のアミノ酸残基１−６９、（ｆ）配列番号２のアミノ酸残基１−７９、（ｇ）配列番号２のアミノ酸残基１−３９、（ｈ）配列番号２のアミノ酸残基１−７１、（ｉ）配列番号２のアミノ酸残基７−７１、（ｊ）配列番号２のアミノ酸残基７０−１００、（ｋ）配列番号２のアミノ酸残基８０−１００、（ｌ）配列番号２のアミノ酸残基１０１−１８４、及び（ｍ）配列番号２のアミノ酸配列から成る群から選択された対照アミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んで成る、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号１０のアミノ酸配列のいずれかから成るポリペプチドと特異的に結合する抗体と特異的に結合する単離されたポリペプチドを提供する。
【００１９】
一定のＺｔｎｆｒ１２ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列から成るポリペプチドと特異的に結合する抗体と特異的に結合する。一定のＺｔｎｆｒ１２ポリペプチドは、ＺＴＮＦを特異的に結合し、そして他のポリペプチドは、ＺＴＮＦ４を特異的に結合するが、しかしＺＴＮＦ２を特異的に結合しない。例示的なＺｔｎｆｒ１２ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基７−６９、配列番号２のアミノ酸残基７−７９、配列番号２のアミノ酸残基７−３９、配列番号２のアミノ酸残基１９−３５、配列番号２のアミノ酸残基１−６９、配列番号２のアミノ酸残基１−７９、配列番号２のアミノ酸残基１−７１、配列番号２のアミノ酸残基７−７１、配列番号２のアミノ酸残基１−３９、配列番号２のアミノ酸残基８０−１００、配列番号２のアミノ酸残基７０−１００、配列番号２のアミノ酸残基１０１−１８４、及び配列番号２のアミノ配列を含んで成るか又はそれらから成るポリペプチドを包含する。
【００２０】
本発明はまた、配列番号２のアミノ酸残基７−６９、配列番号２のアミノ酸残基７−７９、配列番号２のアミノ酸残基７−３９、配列番号２のアミノ酸残基１９−３５、配列番号２のアミノ酸残基１−６９、配列番号２のアミノ酸残基１−７９、配列番号２のアミノ酸残基１−７１、配列番号２のアミノ酸残基７−７１、配列番号２のアミノ酸残基１−３９の少なくとも１５個、又は少なくとも３０個の連続アミノ酸残基を含んで成る単離されたポリペプチドを提供する。
【００２１】
本発明はさらに、少なくとも１つのＺｔｎｆｒ１２エキソンによりコードされるポリペプチドを提供する。例えば、そのようなポリペプチドは、配列番号２の次のアミノ酸から成ることができる：アミノ酸残基１−４５、アミノ酸残基４７−１２２、及びアミノ酸残基１２４−１８４。
【００２２】
本発明はまた、変異体Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドを包含し、ここで前記変異体ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性又は９５％以上の同一性から成る群から選択された、配列番号２のアミノ酸残基７−６９、配列番号２のアミノ酸残基７−７９、配列番号２のアミノ酸残基７−３９、配列番号２のアミノ酸残基１９−３５、配列番号２のアミノ酸残基１−６９、配列番号２のアミノ酸残基１−７９、配列番号２のアミノ酸残基１−３９、配列番号２のアミノ酸残基１−７１、配列番号２のアミノ酸残基７−７１、又は配列番号２のアミノ酸残基１−１８４との同一性を共有し、そして前記変異体ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号２のアミノ酸配列との間のいずれかの差異は１又は複数の保存性アミノ酸置換によるものである。
【００２３】
本発明はさらに、そのようなポリペプチドと特異的に結合する抗体及び抗体フラグメントを提供する。典型的な抗体は、ポリクローナル抗体、ネズミモノクローナル抗体、ネズミモノクローナル抗体に由来するヒト化抗体及びヒトモノクローナル抗体を包含する。例示的な抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２， Ｆ（ａｂ）２， Ｆａｂ’， Ｆａｂ ，Ｆｖ， ｓｃＦｖ及び最少認識単位を包含する。本発明はさらに、キャリヤー、及び本明細書に記載されるペプチド、ポリペプチド、抗体又は抗−イディオタイプ抗体を含んで成る組成物を提供する。
【００２４】
本発明はまた、（ａ）配列番号３のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子、（ｂ）配列番号２のアミノ酸残基７−６９、配列番号２のアミノ酸残基７−７９、配列番号２のアミノ酸残基７−３９、配列番号２のアミノ酸残基１９−３５、配列番号２のアミノ酸残基１−６９、配列番号２のアミノ酸残基１−７９、配列番号２のアミノ酸残基１−３９、配列番号２のアミノ酸残基１−７１、配列番号２のアミノ酸残基７−７１、又は配列番号２のアミノ酸残基１−１８４を含んで成るアミノ酸配列をコードする核酸分子、及び（ｃ）配列番号１のヌクレオチド２７−５７８のヌクレオチド配列、配列番号１のヌクレオチド２７−２３３のヌクレオチド配列、配列番号１のヌクレオチド２７−５７８の相補体、又は配列番号１のヌクレオチド２７−２３３の相補体を含んで成る核酸分子に対して、緊縮洗浄条件下でハイブリダイズされたまま存続する核酸分子から成る群から選択された、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。例示的な核酸分子は、核酸分子（ｃ）によりコードされるアミノ酸配列と配列番号２のその対応するアミノ酸配列との間のいずれかの差異が保存性アミノ酸置換のためであるそれらの核酸を包含する。
【００２５】
本発明はさらに、配列番号１のヌクレオチド２７−５７８（配列番号２のアミノ酸残基１−１８４をコードする）、配列番号１のヌクレオチド２７−２３３（配列番号２のアミノ酸残基１−６９をコードする）、配列番号１のヌクレオチド２７−２６３（配列番号２のアミノ酸残基１−７９をコードする）、配列番号１のヌクレオチド４５−２３３（配列番号２のアミノ酸残基７−６９をコードする）、配列番号１のヌクレオチド４５−２６３（配列番号２のアミノ酸残基７−７９をコードする）、配列番号１のヌクレオチド４５−１４３（配列番号２のアミノ酸残基７−３９をコードする）、配列番号１のヌクレオチド８１−１３１（配列番号２のアミノ酸残基１９−３５をコードする）、配列番号１のヌクレオチド２７−２３９（配列番号２のアミノ酸残基１−７１をコードする）、配列番号１のヌクレオチド４５−２３９（配列番号２のアミノ酸残基７−７１をコードする）、配列番号１のヌクレオチド３２７−５７８（配列番号２のアミノ酸残基１０１−１８４をコードする）を含んで成る単離された核酸分子を企画する。
【００２６】
本発明はまた、Ｚｔｎｆｒ１２エキソン又はイントロンのヌクレオチド配列から成る核酸分子を提供する。それらのエキソン及びイントロのヌクレオチド配列が表１に同定される。
【００２７】
本発明はまた、そのような核酸分子を含んで成るベクター及び発現ベクターを包含する。そのような発現ベクターは、転写プロモーター及び転写ターミネーターを含んで成り、ここで前記プロモーターが前記核酸分子と作用可能に結合され、そして前記核酸分子が前記転写ターミネーターと作用可能に結合される。本発明はさらに、それらのベクター及び発現ベクターを含んで成る組換え宿主細胞及び組換えウィルスを包含する。例示的な宿主細胞は、細菌、鳥類、酵母、菌類、昆虫、哺乳類及び植物を包含する。そのような発現細胞を含んで成る組換え宿主細胞は、発現ベクターを含んで成り、そしてＺｔｎｆｒ１２タンパク質を生成するそのような組換え宿主細胞を培養し、そして任意には、培養された組換え宿主細胞からＺｔｎｆｒ１２タンパク質を単離することによって、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドを生成するために使用され得る。本発明はさらに、そのような方法の生成物を包含する。
【００２８】
本発明はまた、配列番号１３のアミノ酸残基１−６９を含んで成るポリペプチド、配列番号１３のアミノ酸残基１−６９の少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５又は少なくとも３０個の連続したアミノ酸残基を含んで成るポリペプチド、配列番号１３のアミノ酸残基２１−３８を含んで成るポリペプチド、配列番号１３のアミノ酸残基１−６９を含んで成る融合タンパク質、そのようなアミノ酸配列をコードする核酸分子、そのような核酸分子を含んで成る発現ベクター、及びそのような発現ベクターを含んで成る組換え宿主細胞を提供する。本発明はさらに、そのような組換え宿主細胞を用いてネズミＺｔｎｆｒ１２ポリペプチドを生成するための方法を包含する。
【００２９】
ＴＡＣＩ， ＢＣＭＡ， ヒトＺｔｎｆｒ１２及びネズミＺｔｎｆｒ１２のアミノ酸配列の一列整列は、細胞外ドメインの次のモチーフ：
Ｃ［ＮＶＰＳ］［ＱＰＥ］［ＴＡＥＮ］［ＥＱ］［ＣＹ］［ＦＷ］Ｄ［ＰＬＳ］Ｌ［ＶＬ］［ＲＧＨ］［ＮＨＴＡ］Ｃ［ＶＭＩ］［ＳＡＰ］Ｃを表し、ここで所定の位置についての許容できるアミノ酸が角型括弧内に示される（配列番号４６）。本発明は、このモチーフから成るアミノ酸配列を有する、ＺＴＮＦ４を結合するポリペプチドを包含する。本発明はまた、このモチーフから成るアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する抗体を包含する。
【００３０】
さらに、本発明は、医薬的に許容できるキャリヤー、及び発現ベクター又はそのような発現ベクターを含んで成る組換え２ウィルスの少なくとも１つを含んで成る医薬組成物を提供する。本発明はさらに、医薬的に許容できるキャリヤー及び本明細書に記載されるポリペプチドを含んで成る医薬組成物を包含する。
【００３１】
本発明はまた、生物学的サンプルにおけるＺｔｎｆｒ１２ ＲＮＡの存在を検出するための方法を提供し、ここで前記方法は、（ａ）Ｚｔｎｆｒ１２核酸プローブと、（ｉ）前記生物学的サンプルから単離された試験ＲＮＡ分子、又は（ｉｉ）前記単離されたＲＮＡ分子から合成された核酸分子のいずれかとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触せしめ、ここで前記プローブが、配列番号１のヌクレオチド配列の一部、又はその相補体から成るヌクレオチド配列を含んで成り；そして（ｂ）前記核酸プローブ、及び前記試験ＲＮＡ分子又は合成された核酸分子のいずれかのハイブリッドの形成を検出し、ここで前記ハイブリッドの存在が前記生物学的サンプルにおけるＺｔｎｆｒ１２ ＲＮＡの存在を示す。例えば、適切なプローブは、次のヌクレオチドから成る：配列番号１のヌクレオチド２７−５７８及び配列番号１のヌクレオチド２７−２３３。他の適切なプローブは、それらのヌクレオチド配列の相補体、又は本明細書に記載されるようなヌクレオチド配列又はそれらの相補体の一部から成る。
【００３２】
本発明はさらに、生物学的サンプルにおけるＺｔｎｆｒ１２の存在を検出するための方法を提供し、ここで前記方法は、（ａ）前記生物学的サンプルと、配列番号２のアミノ酸配列から成るポリペプチドと特異的に結合する抗体、又は抗体フラグメントとを接触せしめ、ここで前記接触が、前記生物学的サンプルへの前記抗体又は抗体フラグメントの結合を可能にする条件下で行われ、そして（ｂ）前記結合された抗体又は結合された抗体フラグメントのいずれかを検出する段階を含んで成る。そのような抗体又は抗体フラグメントはさらに、放射体同位体、蛍光ラベル、化学ルミネセントラベル、酵素ラベル、生物ルミネセントラベル及びコロイド状金から成る群から選択された検出できるラベルを含んで成る。
【００３３】
本発明はまた、それらの検出方法を行うためのキットを提供する。例えば、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子発現の検出のためのキットは、核酸分子を含んで成る容器を含んで成り、ここで前記核酸分子は、（ａ）配列番号１のヌクレオチド２７−２３３のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子、（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド２７−２３３の相補体を含んで成る核酸分子、及び（ｃ）少なくとも８個のヌクレオチドから成る（ａ）又は（ｂ）のフラグメントである核酸分子から成る群から選択される。そのようなキットはまた、核酸分子の存在を示すことができる１又は複数の試薬を含んで成る第２容器を含んで成る。他方では、Ｚｔｎｆｒ１２タンパク質の検出のためのキットは、配列番号２のアミノ酸配列から成るポリペプチドと特異的に結合する、抗体又は抗体フラグメントを含んで成る容器を含んで成る。
【００３４】
本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列から成るポリペプチドを特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントを特異的に結合する、抗−イディオタイプ抗体又は抗−イディオタイプ抗体フラグメントも企画する。典型的な抗−イディオタイプ抗体は、配列番号２のアミノ酸残基１−６９、配列番号２のアミノ酸残基１−７９、配列番号２のアミノ酸残基７−６９、配列番号２のアミノ酸残基７−７９、配列番号２のアミノ酸残基１−７１、又は配列番号２のアミノ酸残基７−７１から成るポリペプチドを特異的に結合する抗体と結合する。
【００３５】
本発明はまた、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチド及び免疫グロブリン成分を含んで成る融合タンパク質を提供する。そのような融合タンパク質においては、免疫グロブリン成分は、免疫グロブリンＨ鎖不変領域、例えばヒトＦｃフラグメントであり得る。本発明はさらに、そのような融合タンパク質をコードする単離された核酸分子を包含する。
【００３６】
本発明はさらに、Ｚｔｎｆ１２（例えば、、ＺＴＮＦ４）を結合するリガンドの活性を、哺乳類において阻害するための方法を包含し、ここで前記方法は、（ａ）可溶性Ｚｔｎｆｒ受容体、（ｂ）Ｚｔｎｆｒ１２の細胞外ドメインと特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント、及び（ｃ）Ｚｔｎｆｒ１２の細胞外ドメインを含んで成る融合タンパク質の少なくとも１つを含んで成る組成物を、前記哺乳類に投与することを含んで成る。例示として、そのような組成物は、Ｂリンパ球、活性化されたＢリンパ球、又は休止Ｂリンパ球に関連する障害及び疾病を処理するために使用され得る。
【００３７】
本明細書に記載される分子により処理され得るＢ細胞リンパ腫の例は、バーキットリンパ腫、非バーキットリンパ腫、非ホドキンリンパ腫、多発性骨髄腫、小胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、大細胞リンパ腫、周縁領域リンパ腫、被膜細胞リンパ腫、大細胞リンパ腫（例えば、免疫芽球性リンパ腫）、小リンパ性リンパ腫及び他のＢ細胞リンパ腫を包含する。そのような組成物はまた、Ｔ細胞リンパ腫、例えばリンパ芽球性リンパ腫、退性大細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、血管性免疫芽球リンパ腫、血管中枢リンパ腫、腸Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病及び同様のものを処理するために使用され得る。
【００３８】
例えば、本発明は、腫瘍細胞（例えば、Ｂ細胞リンパ腫細胞又はＴ細胞リンパ腫細胞）の増殖を阻害するための方法を包含し、ここで前記方法は、（ａ）可溶性Ｚｔｎｆｒ受容体、（ｂ）Ｚｔｎｆｒ１２の細胞外ドメインと特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント、及び（ｃ）Ｚｔｎｆｒ１２の細胞外ドメインを含んで成る融合タンパク質の少なくとも１つを含んで成る組成物を、前記腫瘍細胞に投与することを含んで成る。そのような生成物は、インビトロで培養される細胞に投与され得る。他方では、前記組成物は、医薬組成物であり得、そして前記医薬組成物は、腫瘍を有する対象に投与される。
【００３９】
融合タンパク質の１つの例は、Ｚｔｎｆｒ１２の細胞外ドメイン、配列番号２のアミノ酸１−６９を含んで成るポリペプチドのフラグメントを含んで成るＺｔｎｆｒ１２ポリペプチド、及び免疫グロブリンの不変領域を含んで成る免疫グロブリン成分を含んで成るＺｔｎｆｒ１２−免疫グロブリン融合タンパク質である。例示的な免疫グロブリン成分は、Ｈ鎖不変領域を含んで成る。Ｚｔｎｆｒ１２−免疫のグロブリン融合タンパク質は、下記で論じられるように、モノマー、ダイマー又は他の配列のものであり得る。
【００４０】
もう１つの例においては、抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体成分を含んで成る組成物は、細胞の増殖を阻害するために腫瘍細胞に投与される。前記組成物はインビトロで培養される細胞に投与され得、又は腫瘍を有する対象において投与される医薬組成物であり得る。そのような組成物は、裸のＺｔｎｆｒ１２抗体である抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体成分を含んで成り、又はそのような組成物は裸のＺｔｎｆｒ１２抗体フラグメントである抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体成分を含んで成る。さらに、組成物は、抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体成分及び治療剤を含んで成る免疫接合体を含むことができる。例示的な治療剤は、化学療法剤、細胞毒素、イムノモジュレーター、キレート化剤、硼素化合物、光活性剤、光活性色素及び放射性同位体を包含する。
【００４１】
そのような組成物は、抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体成分、及びイムノモジュレーター又は細胞毒素ポリペプチドのいずれかを含んで成る抗体融合タンパク質を含んで成ることができる。組成物のいずれかの形は、抗−Ｚｔｎｆｒ１２裸抗体成分、及び少なくとも１つの抗−ＢＣＭＡ裸抗体成分、並びに抗−ＴＡＣＩ裸抗体成分を含んで成る多特異的抗体である。例示的な多特異的抗体組成物は、Ｚｔｎｆｒ１２、及びＢＣＭＡ及びＴＡＣＩの少なくとも１つを結合する二特異的抗体を含んで成る。多特異的抗体組成物はさらに、治療剤を含んで成る。さらに、多特的抗体組成物は、（ａ）イムノモジュレーター又は細胞毒性ポリペプチドのいずれかを含んで成る抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体融合タンパク質、及び（ｂ）抗−ＢＣＭＡ抗体成分又は抗−ＴＡＣＩ抗体成分の少なくとも１つを含んで成ることができる。
【００４２】
Ｚｔｎｆｒ１２細胞外ドメイン又は抗―Ｚｔｎｆｒ１２抗体のいずれかを含んで成るポリペプチドは、自己免疫疾患を処理するために使用され得る。自己免疫疾患の例は、全身性エリテマートデス、重症筋無力症、多発性硬化症、インスリン依存性真性糖尿病及びリウマチ様関節炎を包含する。Ｚｔｎｆｒ１２細胞外ドメイン又は抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体を含んで成るポリペプチドはまた、ぜん息、気管支炎、気腫、及び最終段階腎不全又は腎疾患を処理するためにも使用され得る。例示的な腎疾患は、糸球体腎炎、脈管炎、慢性リンパ白血病、腎炎及び腎盂腎炎を包含する。Ｚｔｎｆｒ１２細胞外ドメイン又は抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体を含んで成るポリペプチドはさらに、腎新生物、多発性骨髄腫、リンパ腫、Ｌ鎖ニューロパシー又はアミロイド症を処理するために使用され得る。
【００４３】
本発明はまた、ＺＴＮＦ４活性がエフェクターＴ細胞に関連される、ＺＴＮＦ４活性を阻害するための方法も包含する。関連する方法においては、ＺＴＮＦ４活性が免疫応答の調節に関連される。もう１つの方法においては、ＺＴＮＦ４活性が、免疫抑制に関連される。さらにもう１つの方法においては、免疫抑制は、移植片拒絶、対宿主性移植片病又は炎症に関連される。さらにもう１つの方法においては、免疫抑制は自己免疫疾患に関連される。例示としての自己免疫患者はインスリン−依存性真性糖尿病又はクローン病であり得る。さらに他の方法においては、免疫抑制は炎症に関連している。そのような炎症は、例えば関節痛、腫張、貧血又は敗血性ショックに関連している。
【００４４】
本発明はまた、（ａ）対象の生物学的サンプルから単離されたゲノムＤＮＡから、（ｉ）少なくとも１つのＺｔｎｆｒ１２エキソン１〜３をコードするヌクレオチド配列を含んで成るか、又は（ｉｉ）前記（ｉ）の相補体であるヌクレオチド配列を含んで成るいずれかである核酸分子を増幅し、そして（ｂ）前記増幅された核酸分子における突然変異（この突然変異の存在が染色体２２ｑ１３．２異常を示す）を検出することによって、対象における染色体２２ｑ１３．２異常性を検出するための方法を包含する。それらの方法の変法においては、検出段階は、配列番号１又は９のヌクレオチド配列に対して、増幅された核酸分子のヌクレオチド配列を比較することによって行われる。
【００４５】
本発明はさらに、（ａ）対象の生物学的サンプルから単離されたゲノムＤＮＡから、少なくとも１つのイントロン１及びイントロン２のヌクレオチド配列、又は少なくとも１つのイントロン１及びイントロン２の相補的ヌクレオチド配列のいずれかを含んで成るＺｔｎｆｒ１２のセグメントを増幅し、そして（ｂ）前記増幅された核酸分子における突然変異（この突然変異の存在が染色体２２ｑ１３．２異常を示す）を検出することを含んで成る、対象における染色体２２ｑ１３．２異常性を検出するための方法を提供する。それらの方法の変法においては、検出段階は、前記増幅されたＺｔｎｆｒ１２遺伝子セグメントを膜に結合し、そして前記膜と核酸プローブとを、高い緊縮条件下で接触せしめることによって行われ、ここでハイブリッドの不在がＺｔｎｆｒ１２の発現に関連する異常性、又は染色体２２ｑ１３．２における突然変異を示す。例示としての適切な核酸プローブは、イントロン１及び２のいずれか１つのヌクレオチド配列（又はそのヌクレオチド配列の補体）を含んで成ることができる。
【００４６】
Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子又はその遺伝子生成物の突然変異又は変更の例は、点突然変異、欠失、挿入及び転移を包含する。Ｚｔｎｆｒ１２に遺伝子突然変異のもう１つの例は、異数性である。本発明はまた、本明細書に記載される検出方法を用いての、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子の第１エキソンの上流の領域（例えば、配列番号９のヌクレオチド１−１０００内）における変更の同定を含んで成る、対象における染色体２２ｑ１３．２異常性を検出するための方法を包含する。
本発明のそれらの及び他の観点は、次の特定の記載に基づいて明らかになるであろう。さらに、種々の文献が下記に同定される。
【００４７】
２．定義
次の記載においては、多くの用語が広範囲に使用される。次の定義は、本発明の理解を促進するために提供される。
【００４８】
本明細書において使用される場合、“核酸”又は“核酸分子”とは、ポリヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により生成されるフラグメント、及び連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用及びエキソヌクレアーゼ作用のいずれかにより生成されるフラグメントを言及する。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（例えばＤＮＡ及びＲＮＡ）、又は天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば天然に存在するヌクレオチドのα−鏡像異性体形）、又は両者の組み合わせであるモノマーから構成され得る。
【００４９】
修飾されたヌクレオチドは、糖成分において、及び／又はピリミジン又はプリン塩基成分において変更を有することができる。糖修飾は、ハロゲン、アルキル基、アミン及びアジド基による１又は複数のヒドロキシル基の置換を包含し、又は糖はエーテル又はエステルとして機能され得る。さらに、全糖成分は、立体的に及び電子的に類似する構造体、例えばアザ−糖及びカルボン酸糖類似体により置換さえ得る。塩基成分における修飾の例は、アルキル化されたプリン及びピリミジン、アシル化されたプリン又はピリミジン、又は他の良く知られている複素環式置換基を包含する。
【００５０】
核酸モノマーは、ホスホジエステル結合又はそのような結合の類似体により結合さえ得る。ホスホジエステル結合の類似体は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニリデート、ホスホラミデート、及び同様のものを包含する。用語“核酸分子”とはまた、いわゆる、ポリアミド主鎖に結合される天然に存在するか又は修飾された核酸塩基を含んで成る“ペプチド核酸”も包含する。核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれかであり得る。
【００５１】
用語“核酸分子の相補体”とは、相補的ヌクレオチド配列、及び対照ヌクレオチド配列に比較して逆の配向を有する核酸分子である。例えば、配列５’ ＡＴＧＣＡＣＧＧＧ ３’ は、５’ ＣＣＣＧＴＧＣＡＴ ３’に対して相補的である。
用語“ｃｏｎｔｉｇ ”とは、他の核酸分子に対する一連の連続した同一の又は相補的な配列を有する核酸分子を示す。連続した配列とは、核酸分子の全体において、又はその一部に沿って、一定の長さの核酸分子を“オーバーラップ”すると言われる。
【００５２】
用語“縮重ヌクレオチド配列”とは、１又は複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列（ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチドに比較して）を示す。縮重コドンは、ヌクレオチドの異なったトリプレットを含むが、しかし同じアミノ酸残基をコードする（すなわち、ＧＡＵ及びＧＡＣトリプレットはそれぞれＡｓｐをコードする）。
用語“構造遺伝子”とは、特定のポリペプチドの特徴のアミノ酸の配列に翻訳されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＣ）に転写される核酸分子を言及する。
【００５３】
“単離された核酸分子”とは、生物のゲノムＤＮＡに組み込まれない核酸分子である。例えば、細胞のゲノムＤＮＡから分離された成長因子をコードするＤＮＡ分子が、単離されたＤＮＡ分子である。単離された核酸分子のもう１つの例は、生物のゲノムに組み込まれない、化学的に合成された核酸分子である。特定の種から単離された核酸分子は、その種からの染色体の完全なＤＮＡ分子よりも小さい。
“核酸分子構造体”とは、天然においては存在しない配置で組み合わされ、そして並置された核酸のセグメントを含むようヒト介在を通して修飾された−本鎖又は二本鎖の核酸分子である。
【００５４】
“線状ＤＮＡ”とは、遊離５’及び３’及び末端を有する非環状ＤＮＡ分子を示す。線状ＤＮＡは、閉環ＤＮＡ分子、例えばプラスミドから、酵素消化又は物理的な破壊により調製され得る。
“相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）”とは、逆転写酵素によりｍＲＮＡ鋳型から形成される一本鎖ＤＮＡ分子である。典型的には、ｍＲＮＡの一部に対して相補的なプライマーは、逆転写の開始のために使用される。当業者はまた、そのような一本鎖ＤＮＡ分子及びその相補的ＤＮＡ鎖から成る二本鎖ＤＮＡ分子を言及するために用語“ｃＤＮＡ”を用いる。用語“ｃＤＮＡ”はまた、ＲＮＡ鋳型から生成されたｃＤＮＡ分子のクローンも言及する。
【００５５】
“プロモーター”とは、構造遺伝子の転写を方向づけるヌクレオチド配列である。典型的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位に最も近い、遺伝子の５’非コードに領域位置する。転写の開始において機能するプロモーター内の配列要素は、しばしば、コンセンサスヌクレオチド配列により特徴づけられる。
【００５６】
それらのプロモーター要素は、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、ＴＡＴＡ配列、ＣＡＡＴ配列、分化−特異的要素（ＤＳＥ：ＭｃＧｅｈｅｅなど．， Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ７： ５１１ （１９９３））、サイクリックのＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）、血清応答要素（ＳＲＥ：Ｔｒｅｉｓｍａｎ， Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ． １： ４７ （１９９０））、グルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）及び他の転写因子のための結合部位、例えばＣＲＥ／ＡＴＦ（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７： １９９３８ （１９９２））、ＡＰ２ （Ｙｅなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９： ２５７２８ （１９９４））， ＳＰ１， ｃＡＭＰ応答要素結合タンパク質（ＣＲＥＢ；Ｌｏｅｋｅｎ， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ． ３： ２５３ （１９９３））、及びオクタマー因子（一般的には、Ｗａｔｓｏｎなど．， ｅｄｓ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ， ４ｔｈ ｅｄ． （Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｋｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｉｎｃ． １９８７）， ａｎｄ Ｌｅｍａｉｇｒｅ ａｎｄ Ｒｏｕｓｓｅａｕ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３０３： １ （１９９４））を包含する。プロモーターが誘発プロモーターである場合、転写の速度は誘発剤に応答して上昇する。対照的に、転写の速度は、プロモーターが構成プロモーターである場合、誘発剤により調節されない。抑制できるプロモーターはまた知られている。
【００５７】
“コアプロモーター”は、ＴＡＴＡボックス及び転写の開始を包含するプロモーター機能のための必須ヌクレオチド配列を含む。この定義によれば、コアプロモーターは、活性を増強し又は組織特異的活性を付与することができる特定の配列の不在下で検出できる活性を有しても又は有さなくても良い。
“調節要素”は、コアプロモーターの活性を調節するヌクレオチド配列である。例えば、調節要素は、特定の細胞、組織又はオルガネラにおいて独占的に又は選択的に転写を可能にする細胞因子と結合するヌクレオチド配列を含むことができる。それらのタイプの調節要素は通常、“細胞−特異的”、“組織−特異的”、又は“オルガネラ−特異的”態様で発現される遺伝子に結合されている。
“エンハンサー”は、転写の開始部位に対してエンハンサーの距離又は配向に関係なく、転写の効率を高めることができるタイプの調節要素である。
【００５８】
“異種ＤＮＡ”とは、所定の宿主細胞内に天然において存在しない、ＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子の集団を言及する。特定宿主細胞に対して異種であるＤＮＡ分子は、宿主ＤＮＡが非宿主ＤＮＡ（すなわち、外来性ＤＮＡ）と組み合わされる限り、宿主細胞種（すなわち、内因性ＤＮＡ）に由来するＤＮＡを含むことができる。例えば、転写プロモーターを含んで成る宿主ＤＮＡセグメントに作用可能に連結されるポリペプチドをコードする非宿主ＤＮＡセグメントを含むＤＮＡ分子は、異種ＤＮＡ分子であると思われる。逆に言えば、異種ＤＮＡ分子は、外来プロモーターと作用可能に連結される内因性遺伝子を含むことができる。もう１つの例として、野生型細胞に由来する遺伝子を含んで成るＤＮＡ分子は、そのＤＮＡ分子が野生型遺伝子を欠いている突然変異細胞中に導入される場合、異種ＤＮＡであると思われる。
【００５９】
“ポリペプチド”とは、天然又は合成的に生成されても、ペプチド結合により連結されるアミノ酸残基のポリマーである。約１０個よりも少ないアミノ酸残基のポリペプチドは通常、“ペプチド”として言及される。
“タンパク質”は、１又は複数のポリペプチド鎖を含んで成る高分子である。タンパク質はまた、非ペプチド成分、例えば炭水化物基を含むことができる。炭水化物及び他の非ペプチド置換基は、タンパク質が生成される細胞により付加され、そして細胞型により変化するであろう。タンパク質は、それらのアミノ酸主鎖により本明細書において定義され；置換基、例えば炭水化物基は一般的に、特定されないが、しかしそれにもかかわらず、存在することができる。
【００６０】
非宿主ＤＮＡ分子によりコードされるペプチド又はポリペプチドは“異種”ペプチド又はポリペプチドである。
“組み込まれた遺伝子要素”とは、その要素がヒトによる操作を通して細胞中に導入された後、宿主細胞の染色体中に組み込まれているＤＮＡのセグメントである。本発明においては、組み込まれた遺伝子要素は通常、エレクトロポレーション又は他の技法により細胞中に導入される線状化されたプラスミドに由来する。組み込まれた遺伝子要素は、元の宿主細胞からその子孫に通過される。
【００６１】
“クローニングベクター”は、宿主細胞において自律的に複製する能力を有する、核酸分子、例えばプラスミド、コスミド、又はバクテリオファージである。クローニングベクターは典型的には、ベクターの必須の生物学的機能を失わないで、決定できる態様で核酸分子の挿入を可能にする１又は少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、及びクローニングベクターにより形質転換された細胞の同定及び選択への使用のために適切であるマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。マーカー遺伝子は典型的には、テトラサイクリン耐性又はアンピシリン耐性を付与する遺伝子を含む。
【００６２】
“発現ベクター”は、宿主細胞において発現される遺伝子をコードする核酸分子である。典型的には、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子及び転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は通常、プロモーターの制御下に配置され、そしてそのような遺伝子はプロモーターに“作用可能に結合される”と言われる。同様に、調節要素及びコアプロモーターは、調節要素がコアプロモーターの活性を調節する場合、作用可能に連結される。
【００６３】
“組換え宿主”とは、異種核酸分子、例えばクローニングベクター又は発現ベクターを含む細胞である。本明細書においては、組換え宿主の例は、発現ベクターからＺｔｎｆｒ１２を生成する細胞である。対照的に、Ｚｔｎｆｒ１２は、Ｚｔｎｆｒ１２の“天然源”であり、そして発現ベクターを欠いている細胞により生成さえ得る。
“インテグレイティブ組換え体”は、異種ＤＮＡが細胞ゲノムＤＮＡ中に組み込まれるようになる組換え宿主細胞である。
【００６４】
“融合タンパク質”は、少なくとも２つの遺伝子のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子により発現されるハイブリッドタンパク質である。例えば、例えば、Ｚｔｎｆｒ１２−免疫グロブリン融合タンパク質は、Ｚｔｎｆｒ１２受容体成分及び免疫グロブリン成分を含んで成る。本明細書において使用される場合、“Ｚｔｎｆｒ１２受容体成分”とは、ＺＴＮＦ２又はＺＴＮＦ４の少なくとも１つを結合するＺｔｎｆｒ１２受容体の細胞外ドメインの一部である。用語“免疫グロブリン”とは、免疫グロブリンの不変領域を含んで成るポリペプチドを言及する。例えば、免疫グロブリン成分は、Ｈ鎖不変領域を含んで成る。用語“Ｚｔｎｆｒ１２−Ｆｃ”融合タンパク質とは、免疫グロブリン成分が免疫グロブリンＨ鎖不変領域ＣＨ２及びＣＨ３を含んで成る、Ｚｔｎｆｒ１２−免疫グロブリン融合タンパク質を言及する。
【００６５】
用語“受容体”とは、“リガンド”と称する生物活性分子に結合する、細胞結合されたタンパク質を示す。この相互作用は、細胞に対するリガンドの効果を介在する。Ｚｔｎｆｒ１２受容体においては、用語“特異的に結合する”、又は“特異的結合”とは、受容体と競争して結合するリガンドの能力を言及する。例えば、ＺＴＮＦ４はＺｔｎｆｒ１２受容体と特異的に結合し、そしてこれは、検出可能的にラベルされたＺＴＮＦ４とラベルされていないＺＴＮＦとの間でのＺｔｎｆｒ１２受容体についての競争を観察することによって示され得る。
【００６６】
受容体は、膜結合されたシトソール又は核；モノマー（例えば、胸腺刺激性ホルモン受容体、β−アドレナリン作用受容体）又はマルチマー（例えば、ＰＤＧＦ受容体、成長ホルモン受容体ＩＬ−３受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、エリトロポエチン受容体及びＩＬ−６受容体）であり得る。膜結合された受容体は、細胞外リガンド−結合ドメイン、及び典型的には、シグナルトランスダクションに関与する細胞内エフェクタードメインを含んで成る多−ドメイン構造により特徴づけられる。一定の膜結合された受容体においては、細胞外リガンド−結合ドメイン及び細胞内エフェクタードメインは、完全な機能的受容体を含んで成る別々のポリペプチドに位置する。
【００６７】
一般的に、受容体へのリガンドの結合は、細胞の代謝における変更を導く、細胞におけるエフェクタードメインと他の分子との間の相互作用を引き起こす受容体のコンホメーション変化をもたらす。受容体−リガンド相互作用にしばしば連結される代謝現象は、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、サイクリックＡＭＰを生成の上昇、細胞カルシウムの代謝、膜脂質の代謝、細胞付着、イノシトール脂質の加水分解及びリン脂質の加水分解を包含する。
【００６８】
用語“分泌シグナル配列”とは、それが合成される細胞の分泌路を通してより大きなポリペプチドを、より大きなポリペプチドの成分として方向づけるペプチド（“分泌ペプチド”）をコードするＤＮＡ配列を示す。前記のより大きなポリペプチドは、分泌路を通しての移動の間、分泌ペプチドを除去するために通常分解される。
【００６９】
“単離されたポリペプチド”は、汚染性細胞成分、例えば炭水化物、脂質又は天然においてポリペプチドに関連している他のタンパク質性不純物を実質的に含まないポリペプチドである。典型的には、単離されたポリペプチドの調製物は、高く精製された形で、すなわち少なくとも約８０％の純度、少なくとも約９０％の純度、少なくとも約９５％の純度、９５％以上の純度、又は９９％以上の純度でポリペプチドを含む。特定のタンパク質調製物が単離されたポリペプチドを含むことを示すための１つの手段は、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びゲルのクーマシーブルー染色によるシングルバンドの出現によるものである。しかしながら、用語“単離された”とは、他の物理形、例えばダイマー又は他のグリコシル化された又は誘導体化された形での同じポリペプチドの存在を排除しない。
【００７０】
用語“アミノ−末端”及び“カルボキシル−末端”とは、ポリペプチド内の位置を示すために本明細書において使用される。その情況が可能である場合、それらの用語は、接近性又は相対的位置を示すためにポリペプチドの特定の配列又は一部に関して使用される。例えば、ポリペプチド内の対象配列のカルボキシル末端側に位置する一定の配列は、その対照配列のカルボキシル末端に隣接して位置するが、しかし完全なポリペプチドのカルボキシル末端では必ずしも必要ではない。
【００７１】
用語“発現”とは、遺伝子生成物の生合成を言及する。例えば、構造遺伝子においては、発現はｍＲＮＡへの構造遺伝子の転写及び１又は複数のポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳を包含する。
【００７２】
用語“スプライス変異体”とは、遺伝子から転写されるＲＮＡの二者択一の形を示すために、本明細書において使用される。スプライス変異は、転写されたＲＮＡ分子内の、又は通常低いが、別々に転写されたＲＮＡ分子間の二者択一のスプライシング部位の使用を通して天然において生じ、そして同じ遺伝子から転写されるいくつかのｍＲＮＡをもたらすことができる。スプライス変異体は、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語スプライス変異体はまた、遺伝子から転写されるｍＲＮＡのスプライス変異体によりコードされるポリペプチドを示すために本明細書において使用される。
【００７３】
本明細書において使用される場合、用語“イムノモジュレータ−”とは、サイトカイン、幹細胞成長因子、リンフォトキシン、同時−刺激分子、造血因子及びそれらの分子の合成類似体を包含する。
【００７４】
用語“相補体／抗−相補体対”とは、適切な条件下で、非共有的に会合される安定した対を形成する非同一性成分を示す。例えば、ビオチン及びアビジン（又はストレプタビジン）は、相補体／抗−相補体対の基本型メンバーである。他の典型的な相補体／抗−相補体対は、受容体／リガンド対、抗体／抗原（又はハプテン又はエピトープ）対、センス／アンチセンス  ポリヌクレオチド対、及び同様のものを包含する。相補体／抗−相補体対の続く解離が所望される場合、その相補体／抗−相補体対は好ましくは、＜１０９Ｍ−１の結合親和性を有する。
【００７５】
“抗−イディオタイプ抗体”とは、免疫グロブリンの可変領域ドメインと結合する抗体である。本明細書においては、抗−イディオタイプの抗体は、抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体の可変領域と結合し、そして従って、抗−イディオタイプ抗体はＺｔｎｆｒ１２のエピトープを模倣する。
“抗体フラグメント”は、抗体の一部、例えばＦ（ａｂ’）２， Ｆ（ａｂ）２， Ｆａｂ’， Ａａｂ及び同様のものである。構造に関係なく、抗体フラグメントは、損なわれていない抗体により認識される同じ抗原と結合する。例えば、抗−Ｚｔｎｆｒ１２モノクローナル抗体フラグメントは、Ｚｔｎｆｒ１２のエピトープと結合する。
【００７６】
用語“抗体フラグメント”はまた、特定の抗原に結合する、合成の又は遺伝的に構築されたポリペプチド、例えばＬ鎖可変領域から成るポリペプチド、Ｈ及びＬ鎖の可変領域から成る“Ｆｖ”フラグメント、Ｌ及びＨ鎖可変領域がペプチドリンガーにより連結されている組換え一本鎖ポリペプチド分子（“ｓｖＦｖタンパク質”）、及び超可変領域を模倣するアミノ酸残基から成る最少認識単位を包含する。
“キメラ抗体”は、囓歯動物抗体に由来する種々のドメイン及び相補的決定領域を含む組換えタンパク質であるが、ところが抗体分子の残りはヒト抗体に由来する。
【００７７】
“ヒト化抗体”は、モノクローナル抗体のネズミ相補的決定領域がネズミ免疫グロブリンのＨ及びＬ可変鎖からヒト可変ドメインに移行されている組換えタンパク質である。
本明細書において使用される場合、“治療剤”は、治療のために有用である接合体を生成するために抗体成分に接合される分子又は原子である。治療剤の例は、薬剤、毒素、イムノモジュレーター、キレート化剤、硼素化合物、光活性剤又は染料、及び放射生同位体を包含する。
“検出できるラベル”は、診断のために有用な分子を生成するために抗体成分に接合され得る分子又は原子である。検出できるラベルの例は、キレート化剤、光活性剤、放射性同位体、蛍光剤、常磁性イオン又は他のマーカー成分を包含する。
【００７８】
“親和性標識”とは、第２ポリペプチドの精製又は検出を提供し、又は基質への第２ポリペプチドの結合のための部位を供給するために、第２ポリペプチドに結合され得るポリペプチドセグメントを示すために本明細書において使用される。主に、抗体又は、他の特異的結合剤が利用できるいずれかのペプチド又はタンパク質が親和性標識として使用され得る。親和性標識は、ポリ−ヒスチジン系、すなわちプロテインＡ （Ｎｉｌｓｓｏｎ など．，  ＥＭＢＯ Ｊ． ４： １０７５， １９８５； Ｎｉｌｓｓｏｎ など．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９８： ３， １９９１）， グルタチオンＳ  トランスフェラーゼ（Ｓｍｉｔｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｇｅｎｅ ６７； ３１， １９８８）， Ｇｌｕ−Ｇｌｕ親和性標識 （Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒなど．，  Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２： ７９５２−４， １９８５）， 物質Ｐ、すなわちＦｌａｇＴＭ ペプチド（Ｈｏｐｐなど．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： １２０４−１２１０， １９８８）、ストレプタビジン結合ペプチド、又は他の抗原性エピトープ又は結合ドメインを包含する。
【００７９】
一般的に、Ｆｏｒｄ など．， Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２：９５−１０７， １９９１を参照のこと。親和性標識をコードする核酸分子は、商品供給者（例えばＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ； Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ， Ｎｅｗ Ｈｅｖｅｎ， ＣＴ； Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）から入手できる。
【００８０】
“裸の抗体”は、抗体フラグメントに対立するものとして、治療剤により接合されない完全な抗体である。裸の抗体は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、並びに一定の組換え抗体、例えばキメラ性及びヒト化抗体を包含する。
“二特異的抗体”とは、単一抗体分子内に２種の異なった抗原のための結合部位を有する。
“多特異的抗体組成物”とは、２種の異なった抗体のための結合部位を有する抗体成分を含んで成る。例えば、多特異的抗体組成物は二特異的抗体成分を含んで成ることができ、又は多特異的抗体組成物は、異なった抗原と結合する少なくとも２種の抗体成分を含んで成ることができる。
【００８１】
本明細書において使用される場合、用語“抗体成分”は、完全な抗体及び抗体フラグメントの両者を包含する。
“免疫接合体”は、治療剤又は検出できるラベルと抗体成分との接合体である。
本発明において使用される場合、用語“抗体融合タンパク質”とは、抗体成分及びＺｔｎｆｒ１２ポリペプチド成分を含んで成る組換え分子を言及する。抗体融合タンパク質の例は、Ｚｔｎｆｒ１２細胞ドメイン、及びＦｃドメイン又は抗原−結合領域のいずれかを含んで成るタンパク質を包含する。
【００８２】
“標的ポリペプチド”又は“標的ペプチド”は、少なくとも１つのエピトープを含み、そして標的細胞、例えば腫瘍細胞、又は感染剤抗原を担持する細胞上で発現されるアミノ酸配列である。Ｔ細胞は、標的ポリペプチド又は標的ペプチドに、主要組織適合性複合体分子により提供されるペプチドエピトープを認識し、そして典型的には、標的細胞を溶解し、又は標的細胞の例に他の免疫細胞を補充し、それにより標的細胞を殺害する。
【００８３】
“抗原性ペプチド”は、Ｔ細胞により認識されるＭＨＣ−ペプチド複合体を形成するために、主要組織適合複合体分子を結合し、それにより、Ｔ細胞への提供に基づいて細胞毒性リンパ球応答を誘発するペプチドである。従って、抗原性ペプチドは、適切な主要組織適合性複合体分子に結合し、そして細胞毒性Ｔ細胞応答、例えば抗原を結合するか又は発現する標的細胞に対する細胞溶解又は特異的サイトカイン開放を誘発することができる。抗原性ペプチドは、抗原提供細胞又は標的細胞上に、クラスＩ又はクラスＩＩ主要組織適合性複合体分子に関して結合され得る。
【００８４】
真核生物においては、ＲＮＡポリメラーゼＩＩは、ｍＲＮＡを生成するために構造遺伝子の転写を触媒する。核酸分子はＲＮＡポリメラーゼＩＩ鋳型を含むより企画され、ここでＲＮＡ転写体は特定のｍＲＮＡの配列に対して相補的である配列を有する。ＲＮＡ転写体は、“アンチセンスＲＮＡ”と呼ばれ、そしてアンチセンスＲＮＡをコードする核酸分子は“アンチセンス遺伝子”と呼ばれる。アンチセンスＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ分子に結合することができ、ｍＲＮＡ翻訳の阻害をもたらす。
【００８５】
“Ｚｔｎｆｒ１２に対して特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド”又は“Ｚｔｎｆｒ１２アンチセンスオリゴヌクレオチド”は、（ａ）Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子の一部と共に安定した三量体を形成できるか、又は（ｂ）Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子のｍＲＮＡ転写体の一部と共に安定した二量体を形成できる配列を有するオリゴヌクレオチドである。
“リボザイム”は、触媒中心を含む核酸分子である。この用語は、ＲＮＡ酵素、自己スプライシングＲＮＡ、自己分解性ＲＮＡ及びそれらの触媒機能を行う核酸分子を包含する。
“外部案内配列”（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、細胞内ｍＲＮＡの特定種に内因性リボザイム、すなわちＲＮアーゼＰを方向づけ、ＲＮアーゼＰによるｍＲＮＡの分解をもたらす核酸分子である。外部案内配列をコードする核酸分子は、“外部案内配列遺伝子”と呼ばれる。
【００８６】
用語“変異体Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子”は、配列番号２の修飾であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子を言及する。そのような変異体は、天然に存在する多型現象のＺｔｎｆｒ１２遺伝子、及び配列番号２のアミノ酸配列の保存性アミノ酸置換を含む合成遺伝子を包含する。Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子の追加の変異体形は、本明細書に記載されるヌクレオチド配列の挿入又は欠失を含む核酸分子である。変異体Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子は、その遺伝子が配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子、又はその補体と、緊縮条件下でハイブリダイズするかどうかを決定することによって同定され得る。
【００８７】
他方では、変異体Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子は、配列−比較により同定さえ得る。２つのアミノ酸配列は、その２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が、最大の応答により整列される場合、同じである場合、“１００％のアミノ酸配列同一性”を有する。配列比較は、標準のソフトウェアプログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲ（Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）により製造されるＬＡＳＥＲＧＥＮＥ生物情報コンピューターサイトに包含されるそれらのプログラムを用いて行われ得る。
【００８８】
最適な整列を決定することによって、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列を比較するための他の方法は、当業者に良く知られている（例えば、Ｐｅｒｕｓｋｉ ａｎｄ Ｐｅｒｕｓｋｉ， Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎｅｔ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９７）， Ｗｕ など． （ｅｄｓ．）， “Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｕｐｅｒｈｉｇｈｗａｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．” Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｐａｇｅｓ １２３−１５１ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ． Ｉｎｃ． １９９７）， 及びＢｉｓｈｏｐ （ｅｄ．）， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９８） を参照のこと）。配列同一性を決定するための特定の方法は下記に記載される。
【００８９】
変異体Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子又は変異体Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチド、変異体遺伝子又はそれによりコードされるポリペプチドは、抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体に対して特異的に結合する能力、ＺＴＮＦ４を特異的に結合する能力、又はＺＴＮＦ４を特異的に結合するが、しかしＺＴＮＦ２を特異的に結合しない能力により機能的に特徴づけられる。
【００９０】
用語“対立遺伝子変異体”とは、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の複数の遺伝子の二者択一形のいずれかを示すために、本明細書において使用される。対立遺伝子変異は、突然変異を通して天然では生じ、そして集団内の表現型多型現象をもたらすことができる。遺伝子突然変異は、サイレントであり（コードされたポリペプチドにおける変化がない）、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語、対立遺伝子変異体はまた、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書において使用される。
【００９１】
用語“オルト体（ｏｒｔｈｏｌｏｇｙ）”とは、異なった種からのポリペプチド又はタンパク質の機能的相対物である、１つの種から得られるポリペプチド又はタンパク質を示す。オルト体間の配列の差異は、特定化の結果である。
“パラ体（ｐａｒａｌｏｇｓ）”とは、生物によって製造される、異なっているが，しかし構造的に関連するタンパク質である。パラ体は、遺伝子重複を通して生じると思われる。例えば、α−グロビン、β−グロビン及びミオグロビンは、お互いパラ体である。
【００９２】
本発明は、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子の機能的フラグメントを包含する。本発明においては、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子の“機能的フラグメント”は、本明細書に記載されるドメインであるＺｔｎｆｒ１２ポリペプチドの一部をコードする核酸分子を言及するか、又は抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体に対して特異的に結合する能力、ＺＴＮＦ４を特異的に結合する能力、及びＺＴＮＦ４を特異的に結合するが、しかしＺＴＮＦ２を特異的に結合しない能力により機能的に特徴づけられる。
標準分析法の不正確さのために、ポリマーの分子量及び長さは、おおよその値であることが理解される。そのような値が“約”Ｘ又は“およそ”Ｘとして表される場合、Ｘの言及された値は、±１０％で正確であると理解されるであろう。
【００９３】
３．Ｚｔｎｆｒ１２をコードする核酸分子の生成
ヒトＺｔｎｆｒ１２遺伝子をコードする核酸分子は、配列番号１及び９に基づいてのポリヌクレオチドプローブを用いて、ヒトｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。それらの技法は、標準であり、そして十分に確立されている。
【００９４】
例示されるように、ヒトＺｔｎｆｒ１２遺伝子をコードする核酸分子は、ヒトｃＤＮＡライブラリーから単離され得る。この場合、第１段階は、当業者に良く知られている方法を用いて、例えば胚中心Ｂ−細胞又はリンパ節組織からＲＮＡを単離することによって、ｃＤＮＡライブラリーを調製することである。一般的に、ＲＮＡ単離技法は、細胞を分解するための方法、ＲＮＡのＲＮアーゼ指図された分解を阻害するための手段、及びＤＮＡ、タンパク質及び多糖類汚染物からＲＮＡを分離する方法を提供すべきである。
【００９５】
例えば、全ＲＮＡは、液体窒素において組織を凍結し、その凍結された組織を乳針及び乳棒により粉砕し、細胞を溶解し、フェノール／クロロホルムの溶液により前記粉砕された組織を抽出し、タンパク質を除き、そして塩化リチウムによる選択的沈殿によりＲＮＡを残る不純物から分離することによって単離され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ など．， （ｅｄｓ．）， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｐａｇｅｓ４−１〜４−６  （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆ Ｓｏｎｓ １９９５ ）［“Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５）”］； Ｗｕなど．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｐａｇｅｓ３３−４１ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９７ ） ［“Ｗｕ（１９９７）”］を参照のこと）。
【００９６】
他方では、全ＲＮＡは、粉砕された組織をグアニジニウムイソチオシアネートにより抽出し、有機溶媒により抽出し、そしてＲＮＡを汚染物から示差遠心分離により分離することによって単離され得る（例えば、Ｃｈｉｒｇｗｉｎなど．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８： ５２ （１９７９）； Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５） Ｐ．４−１〜４−６； Ｗｕ （１９９７） Ｐ．３３−４１ を参照のこと）。
【００９７】
ｃＤＮＡライブラリーを構成するために、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡが全ＲＮＡ調製物から単離されるべきである。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、オリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィーの標準技法を用いて、全ＲＮＡから単離され得る（例えば、Ａｖｉｖ ａｎｄ Ｌｅｄｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ６９： １４０８ （１９７２）； Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５） Ｐ． ４−１１〜４−１２を参照のこと）。
【００９８】
二本鎖ｃＤＮＡ分子は、当業者に良く知られている技法を用いて、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡから合成される（例えば、Ｗｕ （１９９７） Ｐ．４１−４６を参照のこと）。さらに、市販のキットが、二本鎖ｃＤＮＡ分子を合成するために使用され得る。例えば、そのようなキットは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． （Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）， ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． （Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）， Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ （Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ） 及びＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ （Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ） から入手できる。
【００９９】
種々のクローニングベクターが、ｃＤＮＡライブラリーの構成のために適切である。例えば、ｃＤＮＡライブラリーは、バクテリオファージに由来するベクター、例えばλｇｔ１０バクターにおいて調製され得る。例えば、Ｈｕｙｎｈなど．， “Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｉｎ λｇｔ１０ ａｎｄ λ１１” ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｖｏｌ． Ｉ， Ｇｌｏｖａｒ （ｅｄ．）， ｐａｇｅ ４９ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９８５）； Ｗｕ （１９９７） ａｔ ｐａｇｅｓ ４７−５２ を参照のこと。
【０１００】
他方では、二本鎖ｃＤＮＡ分子は、プラスミドベクター、例えばＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ；Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）， ＬＡＭＤＡＧＥＭ−４ （Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．） 又は他の市販のベクター中に挿入され得る。適切なクローニングベクターはまた、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （Ｍａｎａｓｓａｓ． ＶＡ） から入手できる。
クローン化されたｃＤＮＡ分子を増幅するために、ｃＤＮＡライブラリーが、標準技法を用いて、原核宿主中に挿入される。例えば、ｃＤＮＡライブラリーは、例えばＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． （Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ） から得られるコンピテントＥ．コリＤＨ５細胞中に導入され得る。
【０１０１】
ヒトゲノムライブラリーは、当業界において良く知られている手段により調製され得る（例えばＡｕｓｕｂｅｌ （１９９５） ｐ． ５−１〜５−６； Ｗｕ （１９９７） ｐ． ３０７−３２７を参照のこと）。ゲノムＤＮＡは、界面活性剤Ｓａｒｋｏｓｙｌにより組織を溶解し、その溶解物をプロテイナーゼＫにより消化し、不溶性残骸を溶解物から遠心分離により清浄し、イソプロパノールを用いて溶解物から核酸を沈殿し、そして塩化セシウム密度グラジエント上で再懸濁されたＤＮＡを精製することによって単離され得る。
【０１０２】
ゲノムライブラリーの生成のために適切であるＤＮＡフラグメントは、ゲノムＤＮＡのランダム剪断により、又は制限エンドヌクレアーゼによるゲノムＤＮＡの部分消化により得られる。ゲノムＤＮＡフラグメントは、従来の技法、例えば適切な末端を供給するために制限酵素消化の使用、ＤＮＡ分子の所望しない連結を回避するためにアルカリホスファターゼ処理の使用、及び適切がリガーゼによる連結に従って、ベクター、例えばバクテリオファージ又はコスミドベクター中に挿入され得る。そのような操作のための技法は当業界において良く知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５） ｐ． ５−１〜５−６； Ｗｕ （１９９７） ｐ． ３０７−３２７ を参照のこと）。
【０１０３】
他方では、ゲノムライブラリーは、市販源、例えばＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃ （Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ＡＬ） 及びＡＴＣＣ （Ｍａｒａｓｓａｓ， ＶＡ） から得られる。
ｃＤＮＡ又はゲノムクローンを含むライブラリーは、標準方法を用いて、配列番号１及び４に基づかれる１又は複数のポリヌクレオチドプローブによりスクリーンされ得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５） ｐ． ６−１〜６−１１を参照のこと）。
【０１０４】
ヒトＺｔｎｆｒ１２遺伝子をコードする核酸分子はまた、本明細書に記載されるように、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子のヌクレオチド配列に基づくヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーによるポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いて得られる。ＰＣＲによるライブラリーのスクリーニングの一般的方法は、例えば、Ｙｕなど．， “Ｕｓｅ ｏｆ Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｈａｇｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ”． Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １５： ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｗｈｉｔｅ （ｅｄ．）， ｐ．２１１−２１５ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９３）により提供される。
【０１０５】
さらに、関連する遺伝子を単離するためへのＰＣＲの使用の技法は、例えばＰｒｅｓｔｏｎ， “Ｕｓｅ ｏｆ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｌｏｎｅ Ｇｅｎｅ Ｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒｓ，” ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １５： ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｗｈｉｔｅ （ｅｄ．）， ｐａｇｅｓ ３１７−３３７ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９３） により記載される。
【０１０６】
下記のようにして生成された抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体はまた、ｃＤＮＡライブラリーからのＺｔｎｆｒ１２遺伝子をコードするＤＮＡ配列を単離するためにも使用され得る。例えば、抗体はλｇｔ１１発現ライブラリーをスクリーンするために使用され、又は抗体はハイブリッド選択及び翻訳に続くイムノスクリーニングのために使用され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）ｐ．６−１２〜６−１６； Ｍａｒｇｏｌｉｓ など．， “Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ λ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｗｉｔｈ ｕｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｂｅｓ” ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２： Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｇｌｏｖｅｒ など （ｅｄｓ．） ｐ． １−１４ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５） を参照のこと）。
【０１０７】
他に、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子は、お互いプライムする長いオリゴヌクレオチド、及び本明細書に記載されるヌクレオチド配列を用いて、核酸分子を合成することによって得られる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５） ｐ．８−８〜８−９を参照のこと）。ポリメラーゼ鎖反応を用いての確立された技法は、少なくとも２ｋｂの長さのＤＮＡ分子を合成する能力を提供する（Ａｄａｎｇ など．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ２１： １１３１ （１９９３）． Ｂａｍｂｏｔ など．， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ２：２６６ （１９９３）， Ｄｉｌｆｏｎ など．， “Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｒａｐｉｄ Ｃｏｎｓｔｒａｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅｓ，” ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １５： ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｗｈｉｔｅ （ｅｄ．）， Ｐａｇｅｓ ２６３−２６８． （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ． Ｉｎｃ． １９９３）， 及びＨｏｌｏｗａｃｈｕｋなど．， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ． ４： ２９９ （１９９５））。
【０１０８】
本発明の核酸分子はまた、ホスホラミジット方法のようなプロトコールを用いて、“遺伝子機会”により合成され得る。化学的に合成される二本鎖ＤＮＡが遺伝子又は遺伝子フラグメントの合成のような用途のために必要とされる場合、個々の相補的鎖は別々に製造される。短い遺伝子（６０〜８０の塩基対）の生成は技術的に簡単であり、そして相補的鎖を合成し、そして次にそれらをアニーリングすることによって達成され得る。しかしながら、長い遺伝子（３００以上の塩基対）の生成に関しては、化学的ＤＮＡ合成の間、個々のサイクルのカップリング効率はめったに１００％ではないので、特殊な手段が必要とされる。
【０１０９】
この問題を克服するために、合成遺伝子（二本鎖）が、２０〜１００個の長さのヌクレオチドである一本鎖フラグメントからモジュラー形でアセンブルされる。ポリヌクレオチド合成の再考のためには、例えば、Ｇｌｉｃｋ ａｎｄ Ｐａｓｔｅｒｎａｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ （ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ １９９４）， Ｉｔａｋｕｒａ など．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５３： ３２３ （１９８４）， などＣｌｉｍｉｅ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７： ６３３ （１９９０） を参照のこと。
【０１１０】
Ｚｔｎｆｒ１２ ｃＤＮＡ又はＺｔｎｆｒ１２ゲノムフラグメントの配列は、標準の方法を用いて決定され得る。本明細書に開示されるＺｔｎｆｒ１２ポリヌクレオチド配列はまた、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子の５’側の非−コード領域をクローン化するためのプローブ又はプライマーとして使用され得る。Ｚｔｎｆｒ１２遺伝からのプロモーター要素は、例えばリンパ節組織、例えばトランスジェニック動物、又は遺伝子治療を受けている患者において異種遺伝子の発現を方向づけるために使用され得る。そのようなプロモーター要素は、配列番号９のヌクレオチド１−１０００のうち５０， １００， ２００， ４００又は６００個のヌクレオチドから成るフラグメントにより提供され得る。他方では、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子プロモーターは、配列番号９のヌクレオチド１−１０００により提供され得る。Ｚｔｎｆｒ１２プロモーター又は調節要素を含むゲノムフラグメントの同定は、十分に確立された技法、例えば欠失分析を用いて達成され得る（一般的には、Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５） を参照のこと）。
【０１１１】
５’側フランギング配列のクローニングはまた、アメリカ特許第５，６４１，６７０号に開示される方法に従って、“遺伝子活性化”によるＺｔｎｆｒ１２タンパク質の生成を促進する。手短くに言及すれば、細胞における内因性Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子の発現は、少なくとも標的配列、調節配列、エキソン、及び対になっていないスプライスドナー部位を含んで成るＤＮＡ構造体を、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子座中に導入することによって変更される。標的配列は、内因性Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子座を有する構造体の相同組換えを可能にするＺｔｎｆｒ１２ ５’側非コード配列であり、それにより、前記構造体内の配列は内因性Ｚｔｎｆｒ１２コード配列により作用可能に連結されるようになる。この場合、内因性Ｚｔｎｆｒ１２プロモーターが、他の調節は列により置換されるか又はそれにより補充され、増強された組織特異的、又は他方では、調節された発現が提供される。
【０１１２】
４．Ｚｔｎｆｒ１２変異体の生成
本発明は、本明細書に開示されるＺｔｎｆｒ１２ポリペプチドをコードする種々の核酸分子、例えばＤＮＡ及びＲＮＡ分子を提供する。当業者は、遺伝子コードの縮重の観点から、相当の配列変動がそれらのポリヌクレオチド分子間で可能であることを容易に認識するであろう。配列番号３は、それぞれ配列番号２のＺｔｎｆｒ１２ポリペプチドをコードするすべての核酸分子を包含する縮重ヌクレオチド配列である。当業者は、配列番号３の縮重配列がまた、Ｔに代わってＵを置換することによって、それぞれ配列番号２をコードするすべてのＲＮＡ配列を提供することを認識するであろう。従って、本発明は、配列番号１のヌクレオチド２７−５７８、及びそれらのＲＮＡ同等物を含んで成るＺｔｎｆｒ１２ポリペプチド−コード核酸分子を企画する。
【０１１３】
表２は、縮重ヌクレオチド位置を示すために、配列番号３内に使用される１文字コードを示す。“解”は、コード文字により示されるヌクレオチドである。“相補体”とは、相補的ヌクレオチドのためのコードを示す。例えば、コードＹはＣ又はＴのいずれかを示し、そしてその補体ＲはＡ又はＧを示し、ＡはＴに対して相補的であり、そしてＧはＣに対して相補的である。
【０１１４】
【表２】
2004516826.tif 000003
【０１１５】
所定のアミノ酸についてのすべての可能なコドンを包含する、配列番号３に使用される縮重コドンが表３に示される。
【０１１６】
【表３】
2004516826.tif 000004
【０１１７】
当業者は、いくらかのあいまいさが、個々のアミノ酸をコードするすべての可能なコドンの代表である縮重コドンの決定において導入されることを理解するであろう。例えば、セリン（ＷＳＮ）のための縮重コドンは、ある環境下で、アルギニン（ＡＧＲ）をコードすることができ、そしてアルギニン（ＭＧＮ）のための縮重コドンは、ある環境下で、セリン（ＡＧＹ）をコードすることができる。類似する関係が、フェニルアラニン及びロイシンをコードするコドン間に存在する。従って、縮重配列により包含されるいくつかのポリヌクレオチドは、変異体アミノ酸配列をコードすることができるが、しかし当業者は、配列番号２のアミノ酸配列への参照によりそのような変異体配列を容易に同定することができる。変異体配列は、本明細書に記載のようにして官能性について容易に試験され得る。
【０１１８】
異なった種は“選択的コドン使用法”を示すことができる。一般的には、Ｇｒａｎｔｈａｍ，など．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ８： １８９３−９１２， １９８０； Ｈａａｓ， など．， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ６： ３１５−２４， １９９６；  Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ、など．，Ｇｅｎｅ  １３：３５５−６４，１９８１；Ｇｒｏｓｊｅａｎ  ａｎｄ  Ｆｉｅｒａ，Ｇｅｎｅ  １８：１９９−２０９、１９８２；Ｈｏｌｍ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：３０７５−８７、１９８６；Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５８：５７３−９７，１９８２、Ｓｈａｒｙｐ ａｎｄ Ｍａｔａｓｓｉ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖ． ４： ８５１ （１９９４）， Ｋａｎｅ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６： ４９４（１９９５）， 及びＭａｋｒｉｄｅｓ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ６０： ５１２（１９９６） を参照のこと。
【０１１９】
本明細書において使用される場合、用語、“選択的コドン使用法”又は“選択的コドン”とは、一定の種の細胞に最も頻繁に使用され、従って個々のアミノ酸をコードする可能なコドンの１又は少数の代表を好むタンパク質翻訳コドンを言及する技術的用語である（表２を参照のこと）。例えば、アミノ酸トレオニン（Ｔｈｒ）は、ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、又はＡＣＴによりコードされるが、しかし哺乳類細胞においては、ＡＣＣが最も通常に使用されるコドンであり；他の種においては、例えば昆虫細胞、酵母、ウィルス又は細菌においては、異なったＴｈｒコドンが好ましい。
【０１２０】
特定の種のための選択的コドンは、当業界において知られている種々の方法により、本発明のポリヌクレオチド中に導入され得る。例えば、組換えＤＮＡ中への選択的コドン配列の導入は、特定の細胞型又は種内でタンパク質の翻訳により効果的にすることによって、そのタンパク質の生成を増強する。従って、配列番号３に開示される縮重コドン配列は、当業界において通常使用され、そして本明細書において開示される種々の細胞型及び種においてポリペプチドの発現を最適化するための鋳型として作用する。選択コドンを含む配列は、種々の種における発現について試験され、そして本明細書に開示される官能性について試験され得る。
【０１２１】
本発明はさらに、他の種（オルト体）からの相対物を表すポリペプチド及び核酸分子を供給する。それらの種は、哺乳類、鳥類、両性類、ハ虫類、魚類、昆虫及び他の脊椎及び無脊椎動物種を包含するが、但しそれらだけには限定されない。例示のように、配列番号１２， １３及び１４は、それぞれネズミＺｔｎｆｒ１２のヌクレオチド、アミノ酸及び宿主ヌクレオチド配列を提供する。ネズミＺｔｎｆｒ１２ポリペプチドの特徴は、配列番号１３のアミノ酸残基１−６９での細胞外ドメイン、配列番号１３のアミノ酸残基７０−９６でのトランスメンブランドメイン、配列番号１３のアミノ酸残基９７−１７５での細胞内ドメイン、及び配列番号１３のアミノ酸残基２１−１３８でのｃｙｓに富んでいる領域を包含する。
【０１２２】
特に興味あるものは、他の哺乳類種、例えばネズミ、ブタ、羊、ウシ、犬、ネコ、馬及び他の霊長類リガンドからのＺｔｎｆｒ１２ポリペプチドである。ヒトＺｔｎｆｒ１２ポリペプチドのオルト体は、従来のクローニング技法と組合して、本発明により供給される情報及び組成物を用いてクローン化され得る。例えば、Ｚｔｎｆｒ１２ ｃＤＮＡは、Ｚｔｎｆｒ１２を発現する組織又は細胞型から得られるｍＲＮＡを用いてクローン化され得る。ｍＲＮＡの適切な源は、本明細書に開示される配列から企画されたプローブによりノザンブロットをプローブすることによって同定され得る。次に、ライブラリーが陽性の組織又は細胞系のｍＲＮＡから調製される。
【０１２３】
Ｚｔｎｆｒ１２コードのｃＤＮＡが種々の方法、例えば完全な又は部分的なｃＤＮＡにより、又は前記開示される配列に基づく１又は複数の変性プローブにより、プローブすることによって単離され得る。ｃＤＮＡはまた、本明細書に開示される代表的なＺｔｎｆｒ１２配列から企画されたプライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応を用いてもクローン化され得る。さらに、ｃＤＮＡライブラリーが、宿主細胞を形質転換し、又はトランスフェクトするために使用され、そして興味あるｃＤＮＡの発現がＺｔｎｆｒ１２ポリペプチドに対する抗体により検出され得る。
【０１２４】
当業者は、配列番号１に開示される配列がヒトＺｔｎｆｒ１２の単一の対立遺伝子を表し、そして対立遺伝子変動及び交互のスプライシングが生じることが予測されることを認識するであろう。本明細書に開示されるヌクレオチド配列の対立遺伝子変異体は、標準の方法に従って、異なった個人からのｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。本明細書に開示されるヌクレオチド配列の対立遺伝子変異体、例えばサイレント突然変異を含むそれらの変異体及び突然変異がアミノ酸配列変更をもたらすそれらの変異体は、本明細書に開示されるアミノ酸配列の対立遺伝子変異体であるタンパク質のように、本発明の範囲内である。
【０１２５】
Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドの性質を保持する、もう１つのスプライスされたｍＲＮＡから生成されるｃＤＮＡは、そのようなｃＤＮＡ及びｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドと同じように、本発明の範囲内に包含される。それらの配列の対立遺伝子変異体及びスプライス変異体は、当業界において知られている標準の方法に従って、異なった個人又は組織からのｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。
【０１２６】
本発明の好ましい態様においては、単離された核酸分子は、本明細書に開示されるヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子に対して、緊縮条件下でハイブリダイズするであろう。例えば、そのような核酸分子は、緊縮条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子、配列番号１のヌクレオチド２７−５７８のヌクレオチド配列から成る核酸分子、又は配列番号１に対して相補的なヌクレオチド配列又は配列番号１のヌクレオチド２７−５７８を含んで成る核酸分子にハイブリダイズすることができる。一般的に、緊縮条件は、定義されたイオン強度及びｐＨで、特定の配列のための熱溶融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くあるよう選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が好ましく適合されたプローブに対してハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度及びｐＨ下で）である。
【０１２７】
１対の核酸分子、例えばＤＮＡ−ＤＮＡ， ＲＮＡ−ＲＮＡ及びＤＮＡ−ＲＮＡは、ヌクレオチド配列がいくらかの程度の相補性を有する場合、ハイブリダイズすることができる。ハイブリッド二重ヘリックスにおけるミスマッチ塩基対を許容できるが、しかしハイブリッドの安定性はミスマッチの程度により影響される。ミスマッチハイブリッドのＴｍは、１〜１．５％の塩基対ミスマッチごとに１℃低下する。ハイブリダイゼーション条件の緊縮性の変更は、ハイブリッドに存在するであろうミスマッチの程度に対する制御を可能にする。
【０１２８】
緊縮性の程度は、ハイブリダイゼーション温度が上昇し、そしてハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度が低下するにつれて、上昇する。緊縮ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリッドの熱溶融点（Ｔｍ）よりも約５〜２５℃低い温度、及び１ＭまでのＮａ＋を有するハイブリダイゼーション緩衝液を包含する。より低い温度でのより高い温度の緊縮性は、緩衝溶液における個々の１％ホルムアミドについて約１℃、ハイブリッドのＴｍを低めるホルムアミドの添加により達成され得る。一般的に、そのような緊縮条件は、２０〜７０℃の温度、及び６×ＳＳＣ及び０〜５０％のホルムアミドを含むハイブリッド緩衝液を包含する。
【０１２９】
高い程度の緊縮性は、４０〜７０℃の温度で及び４×ＳＳＣ及び０〜５０％のホルムアミドを有するハイブリダイゼーション緩衝液により達成され得る。高い緊縮条件は典型的には、４２〜７０℃の温度、及び１×ＳＳＣ及び０〜５０％のホルムアミドを有するハイブリダイゼーション緩衝液を包含する。異なった程度の緊縮液が、標的配列への最大の特異的結合を達成するために、ハイブリダイゼーション、及び洗浄の間、使用され得る。典型的には、ハイブリダイゼーションに続く洗浄は、ハイブリダイズされた複合体からハイブリダイズされていないポリヌクレオチドプローブを除去するために、上昇する程度の緊縮性で行われる。
【０１３０】
上記条件は、ガイドとして作用することを意味し、そしてそれは特定のポリペプチドハイブリッドとの使用のためのそれらの条件を適合するために、十分に当業者の能力の範囲内である。特定の標的配列についてのＴｍは、標的配列の５０％が完全に適合されたプローブ配列にハイブリダイズするであろう温度（定義された条件下での）である。Ｔｍに影響を及ぼすそれらの条件は、ポリヌクレオチドプローブのサイズ及び塩基対含有率、ハイブリダイゼーション溶液のイオン温度、及びハイブリダイゼーション溶液における不安定化剤の存在を包含する。
【０１３１】
Ｔｍを計算するための多くの等式は当業界において知られており、そして種々の長さのＤＮＡ、ＲＮＡ及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド及びポリヌクレオチドプローブ配列に対して特異的である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ など．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ １９８８）； Ａｕｓｕｂｅｌ など．， （ｅｄｓ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９８７）； Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ （ｅｄｓ．）， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９８７）； 及びＷｅｔｍｕｒ， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６：２２７ （１９９０）を参照のこと）。
【０１３２】
配列分析ソフトウェア、例えばＯＬＩＧＯ６．０（ＬＳＲ； Ｌｏｎｇ Ｌａｋｅ， ＭＮ）及びＰｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ４．０ （Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｂｉｏｓｏｆｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ； Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）， 並びにインターネット上のサイトが所定の配列を分析し、そして使用者の定義された基準に基づいてＴｍを計算するための手段を入手できる。そのようなプログラムはまた、定義された条件下で所定の配置を分析し、そして適切なプローブ配列を同定することができる。典型的には、５０以上の塩基対の長いポリヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションは、計算されたＴｍよりも約２０〜２５℃低い温度で行われる。５０以下の塩基対の小さなプローブに関しては、ハイブリダイゼーションは典型的には、Ｔｍ又はそれよりも５〜１０℃以下で行われる。これは、ＤＮＡ−ＤＮＡ及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに関して、最大速度のハイブリダイゼーションを可能にする。
【０１３３】
ヌクレオチド配列の長さは、ハイブリッド形成の速度及び安定性に影響を及ぼす。小さなプローブ配列、すなわち５０個以下の塩基対は、相補的配列との平衡化にすばやく達するが、しかし安定したハイブリッドは形成されない。インキュベーション時間（およそ分〜時）が、ハイブリッド形成を達成するために使用され得る。より長いプローブ配列はよりゆっくりと平衡化するが、しかし低い温度でさえ、より安定した複合体を形成する。インキュベーションは、一晩又はそれ以上の間、進行せしめられる。一般的に、インキュベーションは、計算されたコット時間の３倍に等しい期間、行われ得る。コット時間、すなわちポリヌクレオチド配列が再会合するのにかかる時間は、当業界において知られている方法により、特定の配列について計算され得る。
【０１３４】
ポリヌクレオチド配列の塩基対組成が、ハイブリッド複合体の熱安定性をもたらし、それにより、ハイブリダイゼーション温度の選択及びハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度に影響を及ぼす。Ａ−Ｔ対は、塩化ナトリウムを含む水溶液においてＧ−Ｃ対よりも低い安定性である。従って、Ｇ−Ｃ含有率が高いほど、ハイブリッドはより安定する。配列内のＧ及びＣ残基の平等な分布がまた、ハイブリッド安定性に正に寄与する。
【０１３５】
さらに、塩基対組成は、所定の配列のＴｍを変えるために操作され得る。例えば５−メチルデオキシシヂンは、デオキシシスチジンより置換され得、そして５−ブロモデオキシウリジンは、デオキシシチジンにより置換され得、そして５−ブロモデオキシウリジンはＴｍを高めるためにチミジンにより置換され、そして７−デアズ−２’−デオキシグアノシンは、Ｔｍに対する依存性を低めるためにグアノシンにより置換され得る。
【０１３６】
ハイブリダイゼーション緩衝液のイオン濃度はまた、ハイブッリドの安定性に影響お及ぼす。ハイブリダイゼーション緩衝液は一般的にブロッキング剤、例えばＤｅｎｈａｒｄｔ溶液（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）、変性されたサケ精子ＤＮＡ、粉乳（ＢＬＯＴＴＯ）、ヘパリン又はＳＤＳ、及びＮａ＋源、例えばＳＳＣ（１×ＳＳＣ：０．１５：ＮのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸ナトリウム）又はＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥ：１．８ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．７）を含む。典型的には、ハイブリダイゼーション緩衝液は、１０ｍＭ〜１ＭのＮａ＋を含む。
【０１３７】
不安定剤又は変性剤、例えば、ホルムアミド、テトラアルキルアンモニウム塩、グアニジウムカチオン又はチオシアネートカチオンのハイブリダイゼーション溶液への添加が、ハイブリッドのＴｍを変更するであろう。典型的には、ホルムアミドが、より便利で且つ低い温度でのインキュベーションの実施を可能にするために、５０％までの濃度で使用される。ホルムアミドはまた、ＲＮＡプローブを用いる場合、非特異的バッググラウンドを低めるためにも作用する。
【０１３８】
例示のように、変異体Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドをコードする核酸分子が、配列番号１のヌクレオチド配列（又はその相補体）を有する核酸分子により、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ 溶液（１００×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ 溶液：２％（ｗ／ｖ）のＦｉｃｏｌｌ ４００， ２％ （ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドン及び２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン）、１０％の硫酸デキストラン及び２０μｇ／ｍｌの変性され、剪断されたサケ精子ＤＮＡを含んで成る溶液において、４２℃で一晩ハイブリダイズされ得る。
【０１３９】
当業者は、それらのハイブリダイゼーション条件の変動性を考慮することができる。例えば、ハイブリダイゼーション混合物は、ホルムアミドを含まない溶液において、高度で、例えば約６５℃でインキュベートされ得る。さらに、予備混合されたハイブリダイゼーション溶液が入手でき（例えば、ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． からのＥＸＰＲＥＳＳＨＹＢ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ），そしてハイブリダイゼーションは製造業者の説明書に従って行われ得る。
【０１４０】
ハイブリダイゼーションに続いて、核酸分子は、緊縮条件下で、又は高い緊縮条件下で、ハイブリダイズされなかった核酸分子を除去するために洗浄され得る。典型的な緊縮洗浄条件は、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む０．５×〜２×ＳＳＣ溶液による５５〜６５％での洗浄を包含する。すなわち、変異体Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドをコードする核酸分子は、緊縮洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド２７−５７８のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズし、ここで前記洗浄緊縮性は、５５〜６５℃での、０．１％ＳＤＳを含む０．５×〜２×ＳＳＣ溶液、例えば５５℃での、０．１％ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ溶液、又は６５℃での０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ溶液に等しい。当業者は、例えば洗浄溶液におけるＳＳＣをＳＳＰＥにより置換することによって同等の条件を容易に製造することができる。
【０１４１】
典型的な高い緊縮洗浄条件は、５０〜６５℃での０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む０．１×〜０．２×ＳＳＣの溶液による洗浄を包含する。例えば、変異体Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドをコードする核酸分子は、高い緊縮洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド２７−５７８のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズし、ここで前記洗浄緊縮性は、５０〜６５℃での、０．１％ＳＤＳを含む０．１×〜０．２×ＳＳＣ溶液、例えば５０℃での、０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ溶液、又は６５℃での０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ溶液に等しい。
【０１４２】
本発明はまた、配列番号２のポリペプチド又はそれらのオルト体に対して実質的に類似する配列同一性を有する単離されたＺｔｎｆｒ１２ポリペプチドも提供する。用語“実質的に類似する配列同一性”とは、配列番号２で示される配列又はそれらのオルト体に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９５％以上の配列同一性を有するポリペプチドを示すために本明細書において使用される。
【０１４３】
本発明はまた、２種の次の基準を用いて同定され得るＺｔｎｆｒ１２変異体核酸分子を企画する：配列番号２のアミノ酸配列とコードされたポリペプチドとの間の類似性の決定、及びハイブリダイゼーションアッセイ。そのようなＺｔｎｆｒ１２変異体は、（１）５５〜６５℃での０．１％ＳＤＳを含む０．５×〜２×ＳＳＣ溶液に等しい緊縮洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド２７−５７８のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズし、そして（２）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％，少なくとも８０％，少なくとも９０％，少なくとも９５％又は９５％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。
【０１４４】
他方では、Ｚｔｎｆｒ１２変異体は、（１）５０〜６５℃での０．１％ＳＤＳを含む０．１×〜０．２×ＳＳＣ溶液に等しい、高い緊縮洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド２７−５７８のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズし、そして（２）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％，少なくとも８０％，少なくとも９０％，少なくとも９５％又は９５％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子として特徴づけられ得る。
【０１４５】
％配列同一性は、従来の方法により決定される。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌなど．， Ｂｕｌｌ． Ｍａｔｈ． Ｂｉｏ． ４８ ： ６０３−６１６， １９８６及びｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｕｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９ ：１０９１５−１０９１９， １９９２を参照のこと。手短に言及するば、２種のアミノ酸配列が、１０のギャップ開始ペナルティー、１のギャップ拡張ペナルティー、及び表４（アミノ酸は標準の１文字コードにより示される）に示されるようなＨｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ （前記）の“ＢＬＯＳＵＭ６２”評点マトリックスを用いて、その整合評点を最適化するために整合される。次に、％同一性が次のようにして計算される：（［同一の適合するものの合計数］／［より長い配列の長さ＋  ２種の配列を整合するためにそのより長い配列中に導入されるギャップの数］）（１００）。
【０１４６】
【表４】
2004516826.tif 000005
【０１４７】
当業者は、２種のアミノ酸配列を整列するために多くの確立されたアルゴリズムが存在することを理解している。Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎの“ＦＡＳＴＡ”類似性調査アルゴリズムは、本明細書に開示される１つのアミノ酸配列及び推定上のＺｔｎｆｒ１２変異体のアミノ酸配列により共有される同一性のレベルを試験するための適切なタンパク質整列方法である。前記ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ２４４４ （１９８８）， 及びＰｅａｒｓｏｎ， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８３： ６３ （１９９０） により記載される。手短には、ＦＡＳＴＡがまず、問題の配列（例えば、配列番号２）及び保存性アミノ酸置換、挿入又は欠失を考慮しないで、最高密度の同一性（ｋｔｕｐ変数が１である場合）又は対の同一性（ｋｔｕｐ＝２である場合）のいずれかを有する試験配列により共有される領域を同定することによって配列を特徴づける。
【０１４８】
次に、最高密度の同一性を有する１０の領域が、アミノ酸置換マトリックスを用いて、すべての対合されたアミノ酸の類似性を比較することによって再評価され、そして前記領域の末端が、最高の評点に寄与するそれらの残基のみを含むよう“整えられる”。“カットオフ”値（配列の長さ及びｋｔｕｐ値に基づいて予定された式により計算される）よりも高い評点を有するいくつかの領域が存在する場合、その整えられた初期領域が、その領域がギャップとのおおよその一列配列を形成するために結合され得るかどうかを決定するために試験される。
【０１４９】
最終的に、２種のアミノ酸配列の最高評点領域が、アミノ酸挿入及び欠失を可能にする、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ ｗｉｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４４， １９７０； Ｓｅｌｌｅｒｓ， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２６： ７８７， １９７４）の変法を用いて整列される。ＦＡＳＴＡ 分析のための好ましいパラメーターは次のものである：ｋｔｕｐ＝１、ギャップ開始ペナルティー＝１０、ギャップ拡張ペナルティー＝１及び置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。それらのパラメーターは、Ａｐｐｅｎｄｉｘ ２ ｏｆ Ｐｅａｒｓｏｎ， １９９０ （前記）に説明されるように、評点マトリックスを調節することによってＦＡＳＴＡプログラム中に導入され得る。
【０１５０】
ＦＡＳＴＡはまた、上記に開示されるような割合を用いて、核酸分子の配列同一性を決定するためにも使用され得る。ヌクレオチド配列比較のためには、ｋｔｕｐ値は、上記に設定される他のパラメーターを伴なって、１〜６、好ましくは３〜６、最も好ましくは３であり得る。
【０１５１】
本発明は、本明細書に開示されるアミノ酸配列に比較して、１又は複数の保存性アミノ酸変更を有するポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。例えば、配列番号２の１又は複数のアミノ酸置換を含む変異体が得られ、ここでアルキルアミノ酸がＺｔｎｆｒ１２アミノ酸配列におけるアルキルアミノ酸に代わって置換され、芳香族アミノ酸がＺｔｎｆｒ１２アミノ酸における芳香族アミノ酸に代わって置換され、硫黄含有アミノ酸がＺｔｎｆｒ１２アミノ酸配列における硫黄含有アミノ酸に代わって置換され、ヒドロキシ含有アミノ酸Ｚｔｎｆｒ１２アミノ酸配列におけるヒドロキシ含有アミノ酸に代わって置換され、酸性アミノ酸がＺｔｎｆｒ１２アミノ酸配列における酸性アミノ酸に代わって置換され、塩基性アミノ酸がＺｔｎｆｒ１２アミノ酸配列における塩基性アミノ酸に代わって置換され、又は二塩基性モノカルボン酸アミノ酸Ｚｔｎｆｒ１２アミノ酸配列における二塩基性モノカルボン酸アミノ酸に代わって置換される。
【０１５２】
通常のアミノ酸の中で、“保存性アミノ酸置換”は、次のグループの個々内のアミノ酸間の置換により示される：（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン、（３）セリン及びトレオニン、（４）アスパラギン酸及びグルタミン酸、（５）グルタミン及びアスパラギン、及び（６）リシン、アルギニン及びヒスチジン。
【０１５３】
ＢＬＯＳＵＭ６２表は、関連するタンパク質の５００以上のグループの高く保存された領域を表す、タンパク質配列セグメントの約２，０００の局部の複数整列に由来するアミノ酸置換マトリックスである［Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： １０９１５ （１９９２） ］。従って、ＢＬＯＳＵＭ６２置換頻度は、本発明のアミノ酸配列中に導入され得る保存性アミノ酸置換を定義するために使用され得る。単に化学的性質に基づいてのアミノ酸置換を企画することが可能であるが（上記で論じられたように）、用語“保存性アミノ酸置換”とは、−１よりも大きなＢＬＯＳＵＭ６２値により表される置換を言及する。例えば、アミノ酸置換は、その置換が０，１，２又は３のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴づけられる場合、保存性である。このシステムによれば、好ましい保存性アミノ酸置換は、少なくとも１（例えば、１，２又は３）のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴づけられ、ところがより好ましくは保存性置換は、少なくとも２（例えば、２又は３）のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴づけられる。
【０１５４】
一定の保存性アミノ酸置換が、ヒト及びネズミＺｔｎｆｒ１２アミノ酸配列を一列整列することによって同定され得る。例えば、一列整列は、配列番号２のヒトＺｔｎｆｒ１２アミノ酸配列における次のアミノ酸置換、すなわちＡｌａ１５のＶａｌ１５への、Ａｒｇ３９のＨｉｓ３９への、及びＡｌａ７１のＬｅｕ７１への置換を示す。そのような一列整列は、ヒトＺｔｎｆｒ１２アミノ酸配列の他の保存性アミノ酸置換、又はネズミＺｔｎｆｒ１２アミノ酸配列の保存性アミノ酸置換を同定する。
【０１５５】
Ｚｔｎｆｒ１２の特定の変異体が、その対応するアミノ酸配列（すなわち、配列番号２）に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は９５％以上の配列同一性を有することによって特徴づけられ、ここでアミノ酸配列の変動は、１又は複数のアミノ酸置換による。
【０１５６】
Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子における保存性アミノ酸変化が、配列番号１のいずれか１つに列挙されるヌクレオチドに代わってヌクレオチドを置換することによって導入され得る。そのような“保存性アミノ酸”変異体は、例えばオリゴヌクレオチド指図された突然変異誘発、リンカー走査突然変異誘発、ポリメラーゼ鎖反応を用いての突然変異誘発及び同様の方法により得られる（Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）ｐａｇｅｓ８−１０〜８−２２； 及びＭｃＰｈｒｓｏｎ（ｅｄ．）， Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９９１） を参照のこと）。変異体Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドが、抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体を特異的に結合する能力により同定され得る。
【０１５７】
本発明のタンパク質はまた、天然に存在しないアミノ酸残基を含んで成る。天然に存在しないアミノ酸は、トランス−３−メチルプロリン、２，４−メタプロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−メチルグリシン、アロ−トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン、３，３−ジメチルプロリン、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、及び４−フルオロフェニルアラニンを包含する。
【０１５８】
天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質中に導入するためのいくつかの方法が当業界において知られている。例えばナンセンス突然変異が化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを用いて抑制されるインビトロシステムが使用され得る。アミノ酸を合成し、そしてｔＲＮＡをアミノアシル化するための方法は、当業者において知られている。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写及び翻訳は、Ｅ．コリＳ３０抽出物及び市販の酵素及び他の試薬の含んで成る細胞フリーシステムにおいて実施される。タンパク質は、クロマトグラフィーにより精製される。例えば、Ｒｏｖｅｒｔｓｏｎなど．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１３：２７２２， １９９１； Ｅｌｌｍａｎ など．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０２： ３０１，１９９１； Ｃｈｕｎｇ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９： ８０６−０９， １９９３； 及びＣｈｕｎｇなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： １０１４５−４９， １９９３を参照のこと。
【０１５９】
第２の方法においては、翻訳は、突然変異誘発されたｍＲＮＡ及び化学的にアミノアミル化されたサプレッサ−ｔＲＮＡのマイクロインジェクションによりアフリカツメガエル卵母細胞において行われる（ Ｔｕｒｃａｔｔｉ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： １９９１−９８， １９９６ ）。 第３の方法においては、Ｅ．コリ細胞が、置換される予定である天然のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の不在下で及び所望する天然に存在しないアミノ酸（例えば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン又は４−フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養される。
【０１６０】
天然に存在しないアミノ酸は、その天然の相対物の代わりにタンパク質中に導入される。Ｋｏｉｄｅ など．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３３： ７４７０−４６， １９９４を参照のこと。天然に存在するアミノ酸残基は、インビトロ化学的に修飾により天然に存在しない種に転換され得る。化学的修飾は、置換の範囲をさらに拡張するために特定部位の突然変異誘発と組み合わされ得る（Ｗｙｎｎ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ２： ３９５−４０３， １９９３）。
【０１６１】
限定された数の非保存性アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、及び不自然なアミノ酸が、Ｚｔｎｆｒ１２アミノ酸により置換され得る。
【０１６２】
本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−走査突然変異誘発により同定され得る（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４： １０８１−１０８５， １９８９； Ｂａｓｓなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ｓｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８： ４４９８−５０２， １９９１）， Ｃｏｏｍｂｓ ａｎｄ Ｃｏｒｅｙ， “Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ” ，ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ， Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ（ｅｄ．） Ｐｐａｇｅｓ ２５９−３１１（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９８））。後者の技法においては、単一のアラニン突然変異が分子中のあらゆる残基で導入され、そして得られる変異体分子が、前記分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するために、下記に開示されるようして、生物学的活性について試験される。また、Ｈｉｌｔｏｎなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： ４６９９−５７０８， １９９６を参照のこと。
【０１６３】
配列分析はＺｔｎｆｒ１２受容体結合部位を同定するために使用され得るが、Ｚｔｎｆｒ１２受容体結合ドメインの位置はまた、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異と共に、核磁気共鳴、結晶学、電子回折又は光親和性ラベリングのような技法により決定されるように、構造体の物理的分析によっても決定され得る。例えば、ｄｅ Ｖｅｓ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５： ３０６ （１９９２）， Ｓｍｉｔｈ など．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４： ８９９ （１９９２）， 及びＷｌｏｄａｖｅｒ など．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３０９：５９ （１９９２） を参照のこと。
【０１６４】
複数アミノ酸置換は、突然変異誘発及びスクリーニングの既知方法、例えばＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ （ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１： ５３−５７， １９８８）又はＢｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ（ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８６：２１５２−２１５６，１９８９ ）により開示される方法を用いて行われ、そして試験される。手短に言及すれば、それらの著者は、ポリペプチドにおける複数の位置を同時ランダム化し、機能的ポリペプチドをスクリーンし、そして次に個々の位置での可能な置換の範囲を決定するために、突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定するための方法を開示する。
【０１６５】
使用され得る他の方法は、ファージ表示（例えば、Ｌｏｗｍａｎ など．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３０ ： １０８３２−１０８３７，１９９１； Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，２２３，４０９号； Ｈｕｓｅ， ＷＩＰＯ公開ＷＯ ９２／０６２０４号）、及び領域−指図された突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ など．， Ｇｅｎｅ ４６ ： １４５， １９８６； Ｎｅｒ など．， ＤＮＡ ７ ： １２７， １９８８ ）を包含する。さらに、ビオチン又はＦＩＴＣによりラベルされたＺｔｎｆｒ１２は、新規Ｚｔｎｆｒ１２リガンドの発現クローニングのために使用され得る。
【０１６６】
開示されるＺｔｎｆｒ１２ヌクレオチド及びポリペプチド配列の変異体は、Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３７０ ： ３８９−９１， １９９４， Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： １０７４７−５１， １９９４及びＷＩＰＯ公開ＷＩ９７／２００７８により開示されるように、ＤＮＡ  シャフリングを通して生成され得る。手短に言及すれば、変異体ＤＮＡ分子が、ランダムに導入された点突然変異をもたらす、親ＤＮＡのランダム断片化、続く、ＰＣＲを用いてのアセンブリーによるインビトロ相同組換えにより生成される。この技法は、前記工程中に追加の変動性を導入するために、親ＤＮＡのファミリー、例えば異なった種からの対立遺伝子変異体又はＤＮＡを用いて改良され得る。所望する活性の選択又はスクリーニング、突然変異誘発及びアッセイの続くさらなる相互作用が、有害な変化に対して同時に選択しながら、所望する突然変異について選択することによって、配列の急速な“進化”を提供する。
【０１６７】
本明細書に開示されるような突然変異誘発方法は、宿主細胞におけるクローン化された突然変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するために高処理量の自動化されたスクリーニング方法と組み合わされ得る。生物学的に活性のポリペプチド又は抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体と結合するポリペプチドをコードする突然変異誘発されたＤＮＡ分子が、宿主細胞から回収され、そしてすぐに、近代的装置を用いて配列され得る。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の急速な決定を可能にし、そして未知の構造のポリペプチドに適用され得る。
【０１６８】
本発明はまた、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドの“機能的フラグメント”及びそのような機能的フラグメントをコードする分子を包含する。核酸分子の通常の欠失分析は、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドをコードする核酸分子の機能的フラグメントを得るために行われ得る。例示されるように、配列番号１のヌクレオチド２７−５７８のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子は、一連の欠失を得るためにＢａｌ３ Ｔヌクレアーゼにより消化され得る。
【０１６９】
次に、フラグメントが正しい読み取り枠を整合して発現ベクター中に挿入され、そして発現されたポリペプチドが単離され、そして細胞−細胞相互作用について、又はＺｔｎｆｒ１２抗体を結合する能力について試験される。エキソヌクレアーゼ消化のための１つの方法は、欠失を導入するためにオリゴヌクレオチド−指図された突然変異誘発を使用し、又は所望するフラグメントの生成を特定するために停止コドンを使用することである。他方では、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子の特定のフラグメントは、ポリメラーゼ鎖反応を用いて合成され得る。機能的フラグメントの例は、Ｚｔｎｆｒ１２の細胞外ドメイン（すなわち、配列番号２のアミノ酸残基１−６９、又は配列番号２のアミノ酸残基１−７９）である。
【０１７０】
この一般的アプローチは、インターフェロンのいずれかの又は両末端での切断に基づいての研究が、Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｄｉ Ｍａｒｃｏ， ｐｈａｒｍａｃ． Ｔｈｅｒ． ６６： ５０７ （１９９５） により要約されることにより例示される。さらに、タンパク質の機能的分析のための標準技法は、例えばＴｒｅｕｌｔｅｒなど．， Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２４０： １１３ （１９９３）， Ｃｏｎｔｅｎｔ など．， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓｉ ｏｆ ｔｈｅ ４２ ｋＤａ ２−５Ａ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ”， ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ＩＳＩＲ−ＴＮＯ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｃａｎｔｅｌｌ （ｅｄ．）， Ｐａｇｅｓ ６５−７２ （Ｎｉｊｈｏｆｆ １９８７）， Ｈｅｒｓｃｈｍａｎ， “Ｔｈｅ ＥＧＦ Ｅｎｚｙｍｅ”， ｉｎ Ｃｏｒｔｒｏｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ， Ｖｏｌ． １， Ｂｏｙｎｔｏｎ など．， （ｅｄｓ．） ｐａｇｅｓ １６９−１９９ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）， Ｃｏｕｎａｉｌｌｅａｕ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： ２９２７０ （１９９５）； Ｆｕｋｕｎａｇａ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： ２５２９１ （１９９５）； Ｙａｍａｇｕｃｈｉ など．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５０： １２９５ （１９９５）； 及びＭｅｉｓｅｌなど．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ３０： １ （１９９６）により記載される。
【０１７１】
本発明はまた、本明細書に開示されるアミノ配列に比較して、アミノ配列変化を有するＺｔｎｆｒ１２遺伝子の機能的フラグメントも企画する。変異体Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子は、上記のように、開示されるヌクレオチド及びアミノ酸配列との同一性のレベルを決定することにより、構造体に基づいて同定され得る。構造体に基づいて変異体遺伝子を同定するもう１つのアプローチは、可能性ある変異体Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子をコードする核酸分子が、上記のように、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズすることができるかどうかを決定することである。
【０１７２】
本発明はまた、本明細書に記載されるＺｔｎｆｒ１２ポリペプチドのエピトープ−担持の部分を含んで成るポリペプチドフラグメント又はペプチドも提供する。そのようなフラグメント又はペプチドは、完全なタンパク質が免疫原として使用される場合、抗体応答を誘発するタンパク質の一部である“免疫原性エピトープを含んで成る。免疫原性エピトープ−担持のペプチドは、標準方法を用いて同定され得る。（例えば、Ｇｅｙｓｅｎなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ８１： ３９８８， １９８３を参照のこと）。
【０１７３】
対照的に、ポリペプチドフラグメント又はペプチドは、抗体が特異的に結合することができるタンパク質分子の領域である“抗原性エピトープ”を含んで成る。一定のエピトープは、線状又は連続した範囲のアミノ酸から成り、そしてそのようなエピトープの抗原性は、変性剤により破壊されない。タンパク質のエピトープを模倣する比較的短い合成ペプチドがタンパク質に対する抗体の生成を刺激するために使用され得ることは、当業界において知られている（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９： ６６０， １９８３を参照のこと）。従って、本発明の抗原性エピトープ−担持のペプチド及びポリペプチドは、本明細書に記載されるポリペプチドと結合する抗体を生ぜしめるために有用である。
【０１７４】
抗原性エピトープ−担持のペプチド及びポリペプチドは好ましくは本明細書に開示されるアミノ酸配列の少なくとも４〜１０個のアミノ酸、少なくとも１０〜１５個のアミノ酸、又は約１５〜約３０個のアミノ酸を含む。そのようなエピトープ−担持のペプチド及びポリペプチドは、本明細書に記載されるように、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドのフラグメント化又は化学的ペプチド合成により生成され得る。さらに、エピトープは、ランダムペプチドライブラリーのファージ表示により選択され得る（例えば、Ｌａｎｅ ａｎｄ Ｓｔｅｐｈｅｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５： ２６８， １９９３， 及びＣｏｒｔｅｓｅ など．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７： ６１６， １９９６を参照のこと）。
【０１７５】
エピトープを含んで成る小さなペプチドからエピトープを同定し、そして抗体を生成するための標準の方法は、例えばＭｏｌｅ， “Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ，” ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １０， Ｍａｎｓｏｎ （ｅｄ．）， Ｐａｇｅｓ １０５−１６ （Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９２）， Ｐｒｉｃｅ， “Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，” ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｒｉｔｔｅｒ ａｎｄ Ｌａｄｙｍａｎ （ｅｄｓ．）， ｐａｇｅ ６０−８４ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）， 及びＣｏｌｉｇａｎ など． （ｅｄｓ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ｐａｇｅｓ ９．３．１−９．３．５ ａｎｄ ｐａｇｅｓ ９．４．１−９．４．１１ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９７）により記載される。
【０１７６】
上記の使用の他に、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、遺伝子学及び分子生物学、タンパク質化学及び抗体生成及び分析に関連する過程のための実験室用実施キットにおける教育手段として有用である。そのユニークなポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のために、Ｚｔｎｆｒ１２の分子は試験目的のための標準として、又は“未知のもの”として使用され得る。
【０１７７】
例えば、Ｚｔｎｆｒ１２ポリヌクレオチドは、Ｚｔｎｆｒ１２が発現されるべき遺伝子である、融合構成体を包含する、細菌、ウィルス又は哺乳類発現のための発現構成体をいかにして調製するか、生徒に教授するための；ポリヌクレオチドの制限エンドヌクレアーゼ分解部位の決定のための；組織におけるＺｔｎｆｒ１２ポリヌクレオチドのｍＲＮＡ及びＤＮＡ局在化の決定のための（すなわち、ノザン及びサザンブロット、及びポリメラーゼ鎖反応による）；及び核酸ハイブリダイゼーションにより関連するポリヌクレオチド及びポリペプチドの同定のための助剤として使用され得る。例示として、学生は、配列番号１のヌクレオチド２７−５７８のヌクレオチド配列から成る核酸分子のＰｓｔＩ消化が約１７４塩基対及び３７８塩基対の２種のフラグメントを提供し、そしてＨｉｎｆＩ消化が約１８２塩基対、２２６塩基対、及び１４４塩基対のフラグメントを生成することを見出すであろう。
【０１７８】
Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドは、抗体の調製の教授のための；ウェスターンブロットによるタンパク質の同定のための；タンパク質精製のための；発現される合計タンパク質に対する比率としての発現されるＺｔｎｆｒ１２ポリペプチドの重量を決定するための；ペプチド分解部位の同定のための；アミノ及びカルボキシル末端標識のカップリングのための；アミノ酸配列分析のための；及び天然及び標識されたタンパク質の両者の生物学的活性（すなわち、プロテアーゼ阻害）のインビトロ及びインビボでのモニターのための助剤として使用され得る。例えば、学生は、エンドペプチダーゼＬｙｓ Ｃによるグリコシル化されていないＺｔｎｆｒ１２の消化が４３７０， ７６９１， ８８３， ４７５８及び７２９のおおよその分子量を有する５種のフラグメントを生成し、そしてＢＮＰＳ又はＮＣＳ／ウレアによるグリコシル化されていないＺｔｎｆｒ１２の消化が１０２７９， ４７４０及び３８７７のおおよその分子量を有するフラグメントを生成することを見出すであろう。
【０１７９】
Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドはまた、分析熟練、例えば、特に４種のαヘリックスのコンホメーションを決定するために質量分光学、円二色性を、原子的に詳細に立体構造を決定するためにＸ−線結晶学を、溶液でのタンパク質の構造を表すために核磁気共鳴分光学を教授するためにも使用され得る。例えば、Ｚｔｎｆｒ１２を含むキットは、分析する学生に与えられ得る。アミノ酸配列は教授によっては知られているので、すなわちタンパク質は、学生の熟練を決定するか、又は学生の熟練を開発するための試験として学生に与えられるので、教授は、学生がポリペプチドを正しく分析したか又はしなかったかを知るであろう。あらゆるポリペプチドはユニークであるので、Ｚｔｎｆｒ１２の教育学的利用性はそれ自体ユニークであろう。
【０１８０】
Ｚｔｎｆｒ１２に対して特異的に結合する抗体は、Ｚｔｎｆｒ１２を精製するために親和製クロマトグラフィーカラムをいかにして調製するかを、学生に教授するための教授助剤として、抗体をコードするポリヌクレオチドをクローニングし、そして配列決定するための教授助剤として、及び従って、ヒト化抗体をいかにして企画するか、学生を教授するための実習課目として使用され得る。Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子、ポリペプチド又は抗体は、試薬会社によりパッケージングされ、そして学生が分子生物学の熟練を得るために教育機関に市販されている。個々の遺伝子及びタンパク質はユニークであるので、個々の遺伝子及びタンパク質は実験実習課目における学生のためのユニークな挑戦及び学習経験を創造する。Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子ポリペプチド又は、抗体を含むそのような教育用キットは、本発明の範囲内にあると思われる。
【０１８１】
変異体及び融合タンパク質を包含するいずれかのＺｔｎｆｒ１２ポリペプチドに関しては、当業者は、上記表１及び２に示される情報を用いて、その変異体をコードする十分な縮重ポリヌクレオチド配列を容易に生成することができる。さらに、当業者は、本明細書に記載されるヌクレオチド及びアミノ酸配列に基づいて、種々のＺｔｎｆｒ１２変異体に標準のソフトウェアを使用することができる。従って、本発明は、次の配列、すなわち配列番号１、２及び３の少なくとも１つの配列を提供するデータ構造によりコードされるコンピューターに読み取り可能媒体を包含する。
【０１８２】
適切な形のコンピューター読み取り可能媒体は、磁気媒体及び光学的読み取り可能な媒体包含する。磁気媒体の例は、ハード又は固定されたドライブ、ランダムアクセス記憶（ＲＡＭ）チップ、フロッピーディスク、デジタルリニアーテープ（ＤＬＴ）、ディスクカーシ及びＺＩＰディスクを包含する。光学的読み取り可能な媒体は、コンパクトディスク（例えば、ＣＤ−読み取りのみ記憶（ＲＯＭ）、ＣＤ−再書き込みできる（ＲＷ）及びＣＤ−再記録できる）、及びデジタル可転性／ビデオディスク（ＤＶＤ）（例えば、ＤＶＤ−ＲＯＭ， ＤＶＤ−ＲＡＭ及びＤＶＤ＋ＲＷ）により例示される。
【０１８３】
５．Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドの生成
十分な長さのポリペプチド、機能的フラグメント及び融合タンパク質を包含する本発明のポリペプチドは、従来の技法に従って、組換え宿主細胞において生成され得る。Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子を発現するためには、ポリペプチドをコードする核酸分子が、発現ペプチドにおいて転写発現を制御し、そして次に、宿主細胞中に導入される調節配列に作用可能に連結されるべきである。転写調節配列、例えばプロモーター及びエンハンサーの他に、発現ベクターは、翻訳調節配列、及び発現ベクターを担持する細胞の選択のために適切なマーカー遺伝子を包含することができる。
【０１８４】
真核細胞において外来性タンパク質の生成のために適切である発現ベクターは、典型的には、（１）細胞宿主における発現ベクターの増殖及び選択を提供するための細菌複製起点及び抗生物質耐性マーカーをコードする真核ＤＮＡ要素；（２）転写の開始を制御する真核ＤＮＡ要素、例えばプロモーター；及び（３）転写体のプロセッシングを制御するＤＮＡ要素、例えば転写終結／ポリアデニル化配列を含む。上記で論じられたように、発現ベクターはまた、異種ポリペプチドを、宿主細胞の分泌経路中に方向づける分泌配列コードするヌクレオチド配列を包含する。例えば、Ｚｔｎｆｒ１２発現ベクターは、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子、及びいずれかの分泌された遺伝子に由来する分泌配列を含むことができる。
【０１８５】
Ｚｔｎｆｒ１２の発現は、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子の非コード部分を包含するか又は包含しない核酸分子を用いて達成され得る。しかしながら、一定の組換え宿主細胞からのより高い生成効率が、少なくとも１つのＺｔｎｆｒ１２イントロン配列が発現ベクターに包含される場合に得られる。
【０１８６】
本発明のＺｔｎｆｒ１２タンパク質は、哺乳類細胞において発現され得る。適切な哺乳類宿主細胞の例は、アフリカミドリザル腎細胞（Ｖｅｒｏ； ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８７）、ヒト胚腎細胞（２９３−ＨＥＫ； ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）、子供のハムスター腎細胞（ＢＨＫ−２１， ＢＨＫ−５７０；ＡＴＣＣ ＣＲＬ８５４４， ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０３１４）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ；ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１； ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１； ＣＨＯ ＤＧ４４ ［Ｃｈａｓｉｎなど．， Ｓｏｍ． Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ． １２： ５５５ （１９８６）］、ラット下垂体細胞（ＣＨ１；ＡＴＣＣ ＣＣＬ８２）、ＨｅＬａ Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２．２）、ラット肝癌細胞（Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ；ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５４８）、ＳＶ４０−形質転換されたモンキー腎細胞（ＣＯＳ−１；ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０）及びネズミ胚細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３；ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５８）を包含する。
【０１８７】
哺乳類宿主に関しては、転写及び翻訳シグナルは、ウィルス源、例えばアデノウィルス、ウシ乳頭腫ウィルス、サルウィルス又は同様のものに由来することができ、ここで調節するシグナルは、高レベルの発現を有する特定の遺伝子に関連している。適切な転写及び翻訳調節配列はまた、哺乳類遺伝子、例えばアクチン、コラーゲン、ミコシン及びメタロチオネイン遺伝子から得られる。
【０１８８】
転写調節配列は、ＲＮＡ合成の開始を方向づけるために十分なプロモーター領域を含む。適切な真核プロモーターは、マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Ｈａｍｅｒなど．， Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． １： ２７３ （１９８２））、ヘルペスウィルスのＴＫプロモーター（Ｍｃｋｎｉｇｈｔ， Ｃｅｌｌ ３１ ： ３５５ （１９８２））、ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔなど．， Ｎａｔｕｒｅ ２９０： ３０４ （１９８１））、Ｒｏｕｓ肉腫ウィルスプロモーター（Ｇｏｒｍａｎなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９： ６７７７ （１９８２））、サイトメガロウィルスプロモーター（Ｆｏｅｃｋｉｎｇなど．， Ｇｅｎｅ ４５： １０１ （１９８０））及びマウス乳腫瘍ウィルスプロモーター（一般的には、Ｅｔｃｈｅｖｅｒｒｙ， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”， ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｃｌｅｌａｎｄ など．， （ｅｄｓ．）， ｐ． １６３−１８１ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９９６）を参照のこと）を包含する。
【０１８９】
他方では、原核プロモーター、例えばバクテリオファージＴ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、その原核プロモーターが真核プロモーターにより調節される場合、哺乳類細胞におけるＺｔｎｆｒ１２遺伝子発現を制御するために使用され得る（Ｚｈｏｕなど．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０： ４５２９ （１９９０）， 及びＫａｕｋａｍａｎなど．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９： ４４８５ （１９９１） を参照のこと）。
【０１９０】
発現ベクターは、種々の標準の技法、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、リポソーム−介在性トランスフェクション、マイクロプロジェクト−介在性供給、エレクトロポレーション及び同様のものを用いて、宿主細胞中に導入され得る。好ましくは、トランスフェクトされた細胞が選択され、そして増殖され、宿主細胞ゲノムに安定して組み込まれる発現ベクターを含んで成る組換え宿主細胞が供給される。真核細胞中にベクターを導入するための技法、及び優性選択マーカーを用いてのそのような安定した形質転換体を選択するための技法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ （１９９５） 及びＭｕｒｒａｙ （ｅｄ．）， Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９９１） により記載される。
【０１９１】
例えば、１つの適切な選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性を付与する遺伝子である。この場合、選択は、ネオマイシン型薬物、例えばＧ−４１８又は同様のもの存在下で実施される。“増幅”として言及される方法である選択システムは、興味ある遺伝子の発現レベルを高めるためにも使用される。増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトランスフェクタントを培養し、そして次に、導入された遺伝子の生成物を高レベルで生成する細胞を選択するために選択剤の量を高めることによって実施される。
【０１９２】
好ましい増幅可能選択マーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼである。他の耐薬物性遺伝子（例えば、ヒグロマイシン耐性、複数薬物耐性、ピューロマイシン  アセチルトランスフェラーゼ）もまた、使用され得る。変更された表現型を導入する他のマーカー、例えば緑色蛍光タンパク質、又は細胞表面タンパク質、例えばＣＤ４，  ＣＤ８，クラスＩ  ＭＨＣ、胎盤アルカリホスファターゼが、ＦＡＣＳ分類又は磁気ビース分離技法のような手段により、トランスフェクトされていない細胞とトランスフェクトされた細胞とを分類するために使用され得る。
【０１９３】
Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドはまた、ウィルス供給システムを用いて、培養された哺乳類細胞により生成され得る。この目的のための典型的なウィルスは、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス及びアデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）を包含する。アデノウィルス、すなわち二本鎖ＤＮＡウィルスは現在、異種核酸の供給のための最も研究されている遺伝子トランスファーベクターである（Ｂｅｃｋｅｒ など．， Ｍｅｔｈ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ． ４３： １６１−８９， １９９４； 及びＪ． Ｔ． Ｄｏｕｇｌａｓ ａｎｄ Ｄ．Ｔ． Ｃｕｒｉｅｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４： ４４−５３， １９９７ を参照のこと）。アデノウィルスシステムの利点は、比較的大きなＤＮＡ挿入体の収容、高い力価に増殖する能力、広範囲の哺乳類細胞型を感染する能力、及び異なったプロモーターを含む多数の入手できるベクターとの使用を可能にする柔軟性を包含する。
【０１９４】
アデノウィルスゲノムの一部を欠失することによって、異種ＤＮＡの大きな挿入体（７ｋｂまでの）が収容され得る。それらの挿入体は、直接的な連結により、又はトランスフェクトされたプラスミドによる相同組換えにより、ウィルスＤＮＡ中に導入され得る。ＥＩ遺伝子が宿主細胞により供給されない場合、複製の無能性をもたらす、ウィルスベクターからの必須ＥＩ遺伝子を欠失することは任意である。例えば、アデノウィルスベクター−感染されたヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ−１５７３， ４５５０４， ４５５０５）は、有意な量のタンパク質を生成するために比較的高い細胞密度で、付着細胞として、又は懸濁培養物において増殖され得る（Ｇａｒｎｉｅｒなど．， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５： １４５ （１９９４） を参照のこと）。
【０１９５】
Ｚｔｎｆｒ１２はまた、他の高等真核細胞、例えば鳥類、菌類、昆虫、酵母、又は植物細胞においても発現され得る。バキュロウィルスシステムは、昆虫細胞中に、クローン化されたＺｔｎｆｒ１２遺伝子を導入するための効果的な手段を提供する。適切な発現ベクターは、オートグラファ・カリホルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ） 核多角体病ウィルス（ＡｃＭＮＰＶ）に基づかれており、そして良く知られているプロモーター、例えばショウジョウバエ熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）７０プロモーター、オートグラファ・カルホルニカ核多角体病ウィルス即時−初期遺伝子プロモーター（ｉｅ−Ｉ）及び遅延された初期３９Ｋ プロモーター、バキュロウィルスｐ１０プロモーター及びジョウジョウバエメタロチオネインプロモーターを含む。
【０１９６】
組換えバキュロウィルスを製造するための第２の方法は、Ｌｕｃｋｏｗ （ Ｌｕｃｋｏｗ， ＶＡ， など．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ６７： ４５６６−７９， １９９３ ） により記載されるトランスポゾンに基づくシステムを利用する。トランスファーベクターを利用するこのシステムは、Ｂａｃ−ｔｏ−ＢａｃＴＭキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）として市販されている。このシステムは、“ｂａｃｍｉｄ”  と呼ばれる大きなプラスミドとして、Ｅ．コリに維持されるバキュロウィルスゲノム中に、Ｚｔｎｆｒ１２リガンドポリペプチドをコードするＤＮＡを移動せしめるために、Ｔｎ７トランスポゾンを含むトランスファーベクター、ｐＦａｓｔＢａｃＩ ＴＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ）を利用する。Ｈｉｌｌ−Ｐｅｒｋｉｎｓ， Ｍ．Ｓ． ａｎｄ Ｐｏｓｓｅｅ， Ｒ．Ｄ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７１： ９７１−６， １９９０； Ｂｏｎｎｉｎｇ， Ｂ．Ｃ． など．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７５： １５５１−６， １９９４； 及びＣｈａｚｅｎｂａｌｋ， Ｇ． Ｄ．， ａｎｄ  Ｒａｐｏｐｏｒｔ， Ｂ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７０： １５４３−９，１９９５ を参照のこと。
【０１９７】
さらに、トランスファーベクターは発現されたＺｔｎｆｒ１２ポリペプチドのＣ−又はＮ−末端でエピトープ標識、例えばＧｌｕ−Ｇｌｕ  エピトープ標識をコードするＤＮＡとのイン−フレーム融合体を含むことができる（Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒ， Ｔ． など．， Ｐｅｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８２： ７９５２−６， １９８５）。当業界において知られている技法を用いて、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子を含むトランスファーベクターにより、Ｅ．コリが形質転換され、そして組換えバキュロウィルスの表示である断続的ｌａｃＺ遺伝子を含むｂａｃｍｉｄａ についてスクリーンされる。組換えバキュロウィルスゲノムを含むｂａｃｍｉｄ ＤＮＡ が、通常の技法を用いて単離される。
【０１９８】
例示的なＰＦＡＳＴＢＡＣベクターは、相当の程度まで修飾され得る。例えば、前記ポリヒドリンプロモーターは、除去され、そしてバキュロウィルス感染において早めに発現され、そして分泌されたタンパク質を発現するために好都合であることが知られているバキュロウィルス塩基性タンパク質プロモーター（また、Ｐｃｏｒ， ｐ６．９又はＭＰプロモーターとしても知られている）により置換され得る。Ｈｉｌｌ−Ｐｅｒｋｉｎｓ， Ｍ．Ｓ． ａｎｄ Ｐｏｓｓｅｅ， Ｒ．Ｄ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７１： ９７１−６， １９９０； Ｂｏｎｎｉｎｇ， Ｂ．Ｃ． など．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７５： １５５１−６， １９９４； 及びＣｈａｚｅｎｂａｌｋ， Ｇ． Ｄ．， ａｎｄ  Ｒａｐｏｐｏｒｔ， Ｂ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７０： １５４３−９，１９９５ を参照のこと。
【０１９９】
そのようなトランスファーベクター構造体においては、塩基性タンパク質プロモーターの短いか又は長いバージョンが使用され得る。さらに、昆虫タンパク質に由来する分泌シグナル配列により天然のＺｔｎｆｒ１２分泌シグナル配列を置換しているトランスファーベクターが構成さえ得る。例えば、エクジステロイド・グルコシルトランスフェラーゼ（ＥＧＴ）、ミツバチＭｅｌｉｔｔｉｎ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ） 又はバキュロウィルスｇｐ６７（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｍ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）からのシグナル配列は、生来のＺｔｎｆｒ１２分泌シグナル配列を置換するために、構造体に使用され得る。
【０２００】
組換えウィルス又はバクミド（ｂａｃｍｉｄ）は、宿主細胞をトランスフェクトするために使用される。適切な昆虫宿主細胞は、ＩＰＬＢ−Ｓｆ−２１に由来する細胞系、スポドプテラフルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）さなぎ卵巣細胞系、例えばＳｆ９ （ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）、Ｓｆ２１ＡＥ及びＳｆ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ； Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）、及びショウジョウバエＳｃｈｎｅｉｄｅｒ−２細胞、並びにトリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）に由来するＨＩＧＨ ＦＩＶＥＯ 細胞系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を包含する（アメリカ特許第５，３００，４３５号）。
【０２０１】
市販の血清フリー培地が、細胞の増殖及び維持のために使用され得る。適切な培地は、Ｓｆ９細胞に関しては、Ｓｆ９００ＩＩＴＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ） 又はＥＳＦ９２１ＴＭ （Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）；及びトリコプルシア・ニ細胞に関しては、Ｅｘ−ｃｅｌｌＯ４０５ＴＭ （ＪＲＨ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅｓ， Ｌｅｎｅｘａ， ＫＳ） 又はＥｘｐｒｅｓｓ ＦｉｖｅＯＴＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を包含する。組換えウィルスが使用される場合、細胞は典型的には、組換えウィルスストックが０．１〜１０、より典型的には、約３の感染の多重度（ＭＯＩ）で添加される地点で、約２〜５×１０５個の細胞１〜２×１０６個の細胞の接種密度で触媒される。
【０２０２】
バキュロウィルスでの組換えタンパク質を生成するための確立された技法は、Ｂａｉｌｅｙなど．， “Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ”， ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ ７： Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｍｕｒｒａｙ （ｅｄ．）， Ｐ． １４７−１６８ （Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， （ｎｃ． １９９１） により、Ｐａｔｅｌ など．， “Ｔｈｅ ｂｕｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ”， ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｉｎｇ２： Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｇｌｏｖｅｒ など．， （ｅｄｓ．） ｐ．２０５−２４４ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５） により、Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５） ｐ．１６−３７〜１６−５７により、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ （ｅｄ．）， Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｏｃｏｌｓ （Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９５） により、及びＬｕｃｋｎｏｗ， “Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”， ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ． Ｃｌｅｌａｎｄ など． （ｅｄｓ．）， ｐ．１８３−２１８ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９９６） により提供される。
【０２０３】
菌類細胞、例えば酵母細胞はまた、本明細書に開示される遺伝子を発現するためにも使用され得る。これに関して、特に興味ある酵母種は、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）， ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びピチア・メタノリカ（ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ） を包含する。酵母における発現のための適切なプロモーターは、ＧＡＬ１（ガラクトース）、ＰＧＫ（ホスホグリセリンキナーゼ）、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）、ＡＯＸ１（アルコールオキシダーゼ）、ＨＩＳ４（ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ）及び同様のものからのプロモーターを包含する。
【０２０４】
外因性ＤＮＡによりＳ．  セレビシアエ細胞を形質転換し、そしてそれから組換えポリペプチドを生成するための方法は、例えばＫａｗａｓａｋｉ， アメリカ特許第４，５９９，３１１号；Ｋａｗａｓａｋｉ など．， アメリカ特許第４，９３１，３７３号；Ｂｒａｋｅ， アメリカ特許第４，８７０，００８号；Ｗｅｌｃｈなど．， アメリカ特許第５，０３７，７４３号；及びＭｕｒｒａｙ など．， アメリカ特許第４，８４５，０７５号により開示される。形質転換された細胞は、選択マーカー、通常、耐薬物性、又は、特定の栄養物（例えばロイシン）の不在下で増殖する能力により決定される表現型により選択される。
【０２０５】
サッカロミセス・セレビシアエへの使用のための好ましいベクターシステムは、グルコース含有培地における増殖により形質転換された細胞の選択を可能にする、Ｋａｗａｓａｋｉ など． （アメリカ特許第４，９３１，３７３号）により開示されるＰＯＴ１ベクターシステムである。酵母への使用のための適切なプロモーター及びターミネーターは、解糖系酵素遺伝子（例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ， アメリカ特許第４，５９９，３１１号；Ｋｉｎｇｓｍａｎなど．， アメリカ特許第４，６１５，９７４号；及びＢｉｔｔｅｒ， アメリカ特許第４，９７７，０９２ 号を参照のこと）及びアルコール  デヒドロゲナーゼ遺伝子からのものを包含する。また、アメリカ特許第４，９９０，４４６ 号；第５，０６３，１５４号；第５，１３９，９３６ 号；及び第４，６６１，４５４号を参照のこと。
【０２０６】
他の酵母、例えばハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（ Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ）、クルイベリミセス・ラクチス（ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ）、クルイベリミセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ ）、ウスチラゴ・マイジス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ ）、ピチア・パストリス（ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア・グイレルモンジ（ Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ ）、及びカンジタ・マルトサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ ）のための形質転換システムは、当業界において知られている。
【０２０７】
例えば、Ｇｌｅｅｓｏｎ など．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １３２： ３４５９−３４６５， １９８６ 及びＣｒｅｇｇ， アメリカ特許第４，８８２，２７９ 号を参照のこと。アスペルギラス細胞は、Ｍｃｋｎｉｇｈｔ など．，アメリカ特許第４，９３５，３４９号の方法に従って使用され得る。アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）を形質転換するための方法は、Ｓｕｍｉｎｏ ．， アメリカ特許第５，１６２，２２８号により開示される。ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）を形質転換するための方法は、Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ， アメリカ特許第４，４８６，５３３号により開示される。
【０２０８】
例えば、組換えタンパク質の生成のための宿主としてのピチア・メタノリカの使用は、Ｒａｙｍｏｎｄ、アメリカ特許第５，７１６，８０８号、Ｒａｙｍｏｎｄ、アメリカ特許第５，７３６，３８３号、Ｒａｙｍｏｎｄなど．，Ｙｅａｓｔ １４： １１−２３ （１９９８）、及びＷＩＰＯ公開ＷＯ９７／１７４５０， ＷＯ９７／１７４５１、ＷＯ９８／０２５３６及びＷＯ９８／０２５６５に開示される。Ｐ．メタノリカの形質転換に使用するためのＤＮＡ分子は通常、形質転換の前、好ましくは線状化される、二本鎖の環状プラスミドとして調製されるであろう。Ｐ．メタノリカにおけるポリペプチド生成のためには、プラスミドにおけるプロモーター及びターミネーターは、Ｐ．メタノリカ遺伝子、例えばＰ．メタノリカ  アルコール利用遺伝子（ＡＵＧ１又はＡＵＧ２）のものであることが好ましい。
【０２０９】
他の有用なプロモーターは、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＨＡＳ）、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＭＤ）、及びカタラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子のものを包含する。宿主染色体中へのＤＮＡの組み込みを促進するためには、宿主ＤＮＡ配列を両端に有するプラスミドの完全な発現セグメントを有することが好ましい。ピチア  メタノリカへの使用のための好ましい選択マーカーは、アデニンの不在下でａｄｅ２宿主細胞の増殖を可能にする、ホスホリボシル−５−アミノイミダゾールカルボキシラーゼ（ＡＩＲＣ； ＥＣ． ４．１．１．２１）をコードするＰ．メタノリカＡＤＥ２遺伝子である。メタノールの使用を最少にすることが所望される大規模産業方法のためには、両メタノール利用遺伝子（ＡＵＧ１及びＡＵＧ２）が欠失されている宿主細胞を使用することが好ましい。
【０２１０】
分泌されたタンパク質の生成のためには、液胞プロテアーゼ遺伝子（ＰＥＰ４及びＰＲＢ１）を欠いている宿主細胞が好ましい。エレクトロポレーションが、Ｐ．メタノリカ細胞中への、興味あるポリペプチドをコードするＤＮＡを含むプラスミドの導入を促進するために使用される。２．５〜４．５ｋＶ／ｃｍ，好ましくは約３．７５ｋＶ／ｃｍの電場の強さ、及び１〜４０ｍ秒、最も好ましくは約２０ｍ秒の時定数（ｔ）を有する、指数的に減衰する、パルスされた電場を用いて、エレクトロポレーションによりＰ．メタノリカ細胞を形質転換することが好ましい。
【０２１１】
発現ベクターはまた、植物プロトプラスト、損なわれていない植物組織又は単離された植物細胞中にも導入され得る。植物組織中に発現ベクターを導入するための方法は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、マイクロプロジェクティル−介在性供給、ＤＮＡ注射、エレクトロポレーション及び同様のものによる植物組織の直接的な感染又はそれらと共にｓ植物細胞の同時培養を包含する。例えば、Ｈｏｒｓｃｈなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：１２２９ （１９９５）、Ｋｌｅｉｎなど．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０： ２６８ （１９９２） 及びＭｉｋｉなど．， “Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｉｎｔｏｄｕｃｉｎｇ Ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ ｉｎｔｏ Ｐｌａｎｔｓ”， ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｇｌｉｃｋ など． （ｅｄｓ．）， Ｐ．６７−８８ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９３） を参照のこと。
【０２１２】
他方では、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子は、原核宿主細胞において発現され得る。原核細胞においてＺｔｎｆｒ１２ポリペプチドを発現するために使用され得る適切なプロモーターは、当業者に良く知られており、そしてＴ４， Ｔ３， Ｓｐ６及びＴ７ポリメラーゼを認識できるプロモーター、バクテリオファージλのＰＲ及びＰＬプロモーター、Ｅ．コリのｔｒｐ， ｒｅｃＡ， 熱ショック、ｌａｃＵＶ５， ｔａｃ， ｌｐｐ−ｌａｃＳｐｒ， ｐｈｏＡ及びｌａｃＺプロモーター、Ｂ．スブチリスのプロモーター、バチルスのバクテリオファージのプロモーター、ストレプトミセスプロモーター、バクテリオファージλのｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ３２２のｂｌａプロモーター及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターを包含する。原核プロモーターは、Ｇｌｉｃｋ， Ｊ． Ｉｎｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １： ２７７ （１９８７）， Ｗａｔｓｏｎなど．， ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ， ４ｔｈ Ｅｄ． （Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｃｕｍｍｉｎｓ １９８７）， 及びＡｕｓｕｂｅｌなど． （１９９５） により再考されている。
【０２１３】
適切な原核宿主は、Ｅ．コリ及びバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を包含する。Ｅ．コリの適切な株は、ＢＬ２１ （ＤＥ３）， ＢＬ２１ （ＤＥ３） ｐＬｙｓＳ， ＢＬ２１ （ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ， ＤＨ１， ＤＨ４， ＤＨ５， ＤＨ５１， ＤＨ５１Ｆ， ＤＨ５１ＭＣＲ， ＤＨ １０Ｂ， ＤＨ１０Ｂ／ｐ３， ＤＨ１１Ｓ， Ｃ６００， ＨＢ１０１， ＪＭ１０１， ＪＭ１０５， ＪＭ１０９， ＪＭ１１０， Ｋ３８， ＲＲ１， Ｙ１０８８， Ｙ１０８９， ＣＳＨ１８， ＥＲ１４５１及びＥＲ１６４７を包含する（例えば、Ｂｒｏｗｎ （ｅｄ．）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｆａｘ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９１） を参照のこと）。バチルス・スブチリスの適切な株は、ＢＲ１５１、ＹＢ８８６、ＭＩ１１９、ＭＩ１２０及びＢＩ７０を包含する（例えば、Ｈａｒｄｙ， “Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ”， ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｃｌｏｖｅｒ （ｅｄ．） （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８５） を参照のこと。
【０２１４】
細菌、例えばＥ．コリにおいてＺｔｎｆｒ１２ポリペプチドを発現する場合、そのポリペプチドは、典型的には不溶性顆粒として細胞質に保持され得、又は細菌の分泌配列により細胞周辺腔に向けられ得る。前者の場合、細胞は溶解され、そして顆粒が回収され、そして例えばグアニジンイソチオシアネート又はウレアを用いて変性される。次に、変性されたポリペプチドが再生され、そして例えばウレア、及び還元された及び酸化されたグルタチオンの組み合わせの溶液に対する透析、続く緩衝溶液に対する透析により、前記変成体を希釈することによってニ量体化され得る。後者の場合、ポリペプチドは、細胞周辺腔の内容物を開放するために細胞を破壊し（例えば、音波処理又は浸透ショックにより）、そしてタンパク質を回収することによって、細胞周辺腔から可溶性及び機能性形で回収され、それにより、変性及び再生のための必要性を回避することができる。
【０２１５】
原核宿主においてタンパク質を発現するための方法は、当業者に良く知られている（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓなど．， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｓｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ” ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２： Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｇｌｏｖｅｒ など． （ｅｄｓ．）， Ｐ．１５ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）， Ｗａｒｄ など．， “Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ” ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐ． １３７ （Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． １９９５）， 及びＧｅｏｒｇｉｏｕ， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａ”， ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ； Ｃｌｅｌａｎｄ など． （ｅｄｓ．）， ｐ１０１ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９９６） を参照のこと）。
【０２１６】
細菌、酵母、昆虫及び植物細胞中に発現ベクターを導入するための標準方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５） により提供される。
哺乳類細胞系により生成される外来性タンパク質を発現し、そして回収するための一般的方法は、例えばＥｔｃｈｅｖｅｒｒｙ， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ “ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｌｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｃｌｅｌａｎｄ など． （ｅｄｓ．）， ｐ１６３ （Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． １９９６） により提供される。
【０２１７】
細菌系により生成されるタンパク質を回収するための標準技法は、例えばＧｒｉｓｓｈａｍｍｅｒ など．， “Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｖｅｒ−Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｅ．ｃｏｌｉ ｃｅｌｌｓ “ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２： Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｇｌｏｖｅｒ など． （ｅｄｓ．）， ｐ．５９−９２ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５） により提供される。バキュロウィルス系から組換えタンパク質を単離するための確立された方法は、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ （ｅｄ．）， Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９５） により記載される。
【０２１８】
他方では、本発明のポリペプチドは、独占的固相合成、部分固相方法、フラグメント縮合又は従来の溶液合成により合成され得る。それらの合成方法は、当業者に良く知られている（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５： ２１４９ （１９６３）， Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．， “Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ” （２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）， （Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． １９８４）， Ｂａｙｅｒ ａｎｄ Ｒａｐｐ， Ｃｈｅｍ． Ｐｅｐｔ． ３．３ （１９８６）． Ａｔｈｅｒｔｏｎ など．， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８９）． Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｃｏｌｏｗｉｃｋ， “Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．” Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ２８９ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７）， 及び  Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ など．， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９７）を参照のこと）。
【０２１９】
全体的な化学合成方法、例えば“生来の化学的連結”及び“発現されたタンパク質連結”における変動性もまた標準である（例えば、Ｄａｗｓｏｎなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６： ７７６ （１９９４）， Ｈａｃｋｅｎｇなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ９４： ７８４５ （１９９７）， Ｄａｗｓｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２８７： ３４ （１９９７）， Ｍｕｉｒ など．， ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ９５： ６７０５ （１９９８），及び Ｓｅｖｅｒｉｎｏｖ ａｎｄ Ｍｕｉｒ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３： １６２０５ （１９９８）を参照のこと）。
【０２２０】
本発明のペプチド及びポリペプチドは、配列番号２の少なくとも６個、少なくとも９個又は少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基を含んで成る。例示として、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基１−６９、配列番号２のアミノ酸残基１−７９、配列番号２のアミノ酸残基７−６９、又は配列番号２のアミノ酸残基７−７９のアミノ酸残基の少なくとも６、少なくとも９又は少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基を含んで成る。本発明の１つの態様においては、ポリペプチドは、それらのアミノ酸配列の２０個，３０個，４０個，５０個，１００個又はそれ以上の連続した残基を含んで成る。
【０２２１】
例えば、ポリペプチドは、次のアミノ酸残基から成る群から選択されたアミノ酸配列の少なくとも３０個の連続したアミノ酸残基を含んで成る：（ａ）配列番号２のアミノ酸残基１−１８４、（ｂ）配列番号２のアミノ酸残基１−６９、（ｃ）配列番号２のアミノ酸残基１−７９、（ｄ）配列番号２のアミノ酸残基７−６９、及び（ｅ）配列番号２のアミノ酸残基７−７９。そのようなペプチド及びポリペプチドをコードする核酸分子は、ポリメラーゼ鎖反応プライマー及びプローブとして有用であり、そしてそれらのペプチド及びポリペプチドはＺｔｎｆｒ１２に対する抗体を生成するために有用である。
【０２２２】
６．Ｚｔｎｆｒ１２融合タンパク質及び接合体の生成
１つの一般的な種類のＺｔｎｆｒ１２類似体は、本明細書に開示されるアミノ酸配列の突然変異であるアミノ酸配列を有する変異体である。もう１つの一般的種類のＺｔｎｆｒ１２類似体は、下記のように、抗−イディオタイプ抗体及びそのフラグメントにより供給される。さらに、抗−イディオタイプの可変ドメインを含んで成る組換え抗体が、類似体として使用され得る（例えば、Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉなど．， ｐｒｏｃ． Ａｓｓｏｃ． Ａｍ． Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ １０８： ４２０ （１９９６） を参照のこと）。抗−イディオタイプＺｔｎｆｒ１２抗体の可変ドメインはＺｔｎｆｒ１２を模倣するので、それらのドメインは、Ｚｔｎｆｒ１２結合活性を提供することができる。、抗−イディオタイプ触媒性抗体を生成するための方法は、当業者に知られている（例えば、Ｊｏｒｏｎなど．， Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６７２：２１６（１９９２）， Ｆｒｉｂｏｕｌｅｔなど．， Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４７：２２９（１９９４），及びＡｖａｌｌｅなど．， Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．８６４：１１８（１９９８）を参照のこと）。
【０２２３】
Ｚｔｎｆｒ１２類似体を同定するもう１つのアプローチは、結合ライブラリーの使用により提供される。ファージ表示及び他の結合ライブラリーを構成し、そしてスクリーニングする方法は、例えばＫａｙなど．， Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９６）， Ｖｅｒｄｉｎｅ， アメリカ特許第５，７８３，３８４号、Ｋａｙ， など．， アメリカ特許第５，７４７， ３３４号及びＫａｕｆｆｍａｎなど．， アメリカ特許第５，７２３，３２３号により提供される。
【０２２４】
Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドは、インビボ及びインビトロの両者において使用される。例示として、Ｚｔｎｆｒ１２の可溶形が、培養された細胞により生成されるか、又は試験培地に添加されるＺｔｎｆｒ１２の効果を阻害するために、細胞培養培地に添加され得る。
【０２２５】
Ｚｔｎｆｒ１２の融合タンパク質は、組換え宿主においてＺｔｎｆｒ１２を発現するために、そして発現されたＺｔｎｆｒ１２を単離するために使用され得る。下記に記載されるように、特定のＺｔｎｆｒ１２融合タンパク質はまた、診断及び治療にも使用される。１つのタイプの融合タンパク質は、組換え宿主細胞からのＺｔｎｆｒ１２ポリペプチドを案内するペプチドを含んで成る。Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドを、真核細胞の分泌経路中に方向づけるためには、分泌シグナル配列（また、シグナルペプチド、リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）が、Ｚｔｎｆｒ１２発現ベクターに供給される。
【０２２６】
分泌シグナル配列はＺｔｎｆｒ１２に由来するが、適切なシグナル配列はまた、もう１つの分泌されたタンパク質から誘導されるか、又は新たに合成され得る。分泌シグナル配列は、Ｚｔｎｆｒ１２−コード配列に作用可能に連結され、すなわち２つの配列は正しく読み取り枠を整合して連結され、そして宿主細胞の分泌経路中に新しく合成されたポリヌクレオチドを方向づけるように配置される。分泌シグナル配列は通常、興味あるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’ 側に位置するが、但し一定の分泌シグナル配列は、興味あるヌクレオチド配列の他の場所に位置することもできる（例えば、Ｗｅｌｃｈなど．，アメリカ特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄなど．， アメリカ特許第５，１４３，８３０号を参照のこと）。
【０２２７】
Ｚｔｎｆｒ１２又は哺乳類細胞により生成されるもう１つのタンパク質（例えば、アメリカ特許第５，６４１，６５５号に記載されるような組織タイプのプラスミノーゲン活性化因子シグナル配列）は、組換え哺乳類宿主におけるＺｔｎｆｒ１２の発現のために有用であるが、酵母シグナル配列は、酵母細胞における発現のために有用である。適切な酵母シグナル配列の例は、酵母対合現象α−因子（ＭＦα１遺伝子によりコードされる）、インバーターゼ（ＳＵＣ２遺伝子によりコードされる）又は酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ遺伝子によりコードされる）に由来するそれらのものである。例えば，Ｒｏｍａｎｏｓ など．， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｎｅｄ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ” ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｈａｍｅｓ （ｅｄｓ．）， ｐ．１２３−１６７ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５） を参照のこと。
【０２２８】
細菌細胞においては、毒性を低め、安定性を高め、そして発現されたタンパク質の回収性を高めるために、異種タンパク質を融合タンパク質として発現することが、しばしば所望される。例えばＺｔｎｆｒ１２は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼポリペプチドを含んで成る融合タンパク質として発現され得る。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質は、典型的には、可溶性であり、そして固定されたグルタチオンカラム上でＥ． コリ融解物から容易に精製できる。類似するアプローチにおいては、マルトース結合タンパク質ポリペプチドを含んで成るＺｔｎｆｒ１２融合タンパク質は、アミロース樹脂カラムにより単離され得、そして切断されたタンパク質Ａ遺伝子のＣ−末端を含んで成る融合タンパク質は、ＩｇＧ−セファロースを用いて精製され得る。
【０２２９】
細菌細胞において異種ポリペプチドを、融合タンパク質として発現するために確立された技法は、Ｗｉｌｌｉａｍｓなど．， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ Ｕｓｉｎｇ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”， ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｈａｍｅｓ （Ｅｄｓ．）， ｐ．１５−５８ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５） により記載される。さらに、市販の発現システムが利用できる。例えば、ＰＩＮＰＯＩＮＴ Ｘａタンパク質精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）は、アビジンを含んで成る樹脂により、発現の間、ビオチニル化されるポリペプチドを含んで成る融合タンパク質を単離するための方法を提供する。
【０２３０】
原核又は真核細胞により発現される異種ポリペプチドを単離するために有用であるペプチド標識は、ポリヒスチジン標識（ニッケル−キレート化樹脂に対する親和性を有する）、ｃ−ｍｙｃ標識、カルモジュリン結合タンパク質（カルモジュリン親和性クロマトグラフィーにより単離される）、物質Ｐ， ＲＹＩＲＳ 標識（抗−ＲＹＩＲＳ抗体と結合する）、Ｇｌｎ−Ｇｌｎ標識及びＦＬＡＧ標識（抗−ＦＬＧ抗体と結合する）を包含する。例えば、Ｌｕｏなど．， Ｓｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３２９： ２１５ （１９９６）， Ｍｏｒｇａｎｔｉ など．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３： ６７ （１９９６）， 及びＺｈｅｎｇなど．， Ｇｅｎｅ １８６： ５５ （１９９７） を参照のこと。そのようなペプチド標識コードする核酸分子は、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ （Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ） から入手できる。
【０２３１】
もう１つの形の融合タンパク質は、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチド、及び２又は３個の複領域ドメイン及びヒンジ領域を含むが、しかし可変領域を欠いている免疫グロブリンＨ鎖不変領域、典型的なＦｃフラグメントを含んで成る。Ｚｔｎｆｒ１２成分及びＦｃ成分を含んで成る融合タンパク質は、インビトロアッセイ手段として使用され得る。例えば生物学的サンプルにおけるＺｔｎｆｒ１２リガンドの存在は、Ｚｔｎｆｒ１２−免疫グロブリン融合タンパク質を用いて検出され得、ここでＺｔｎｆｒ１２成分は、前記リガンド、及び高分子、例えばタンパク質Ａ又は抗−Ｆｃ抗体を結合するために使用され、すなわち固体支持体に融合タンパク質を結合するために使用される。さらに、そのようなシステムは、Ｚｔｎｆｒ１２リガンドのその受容体への結合を妨害するアゴニスト及びアンタゴニストを同定するために使用され得る。
【０２３２】
例示のように、Ｃｈａｎｇ など．， （アメリカ特許第５，７２３，１２５号） は、ヒトインターフェロン及びヒト免疫グロブリンＦｃフラグメントを含んで成る融合タンパク質を記載する。インターフェロンのＣ−末端は、ペプチドリンカー成分によりＦｃフラグメントのＮ−末端に連結される。ペプチドリンカーの例は、免疫学的に不活性であるＴ細胞不活性配列を主に含んで成るペプチドである。典型的なペプチドリンカーは、アミノ酸配列：ＧＧＳＧＧ ＳＧＧＧ ＳＧＧＧＧ Ｓ （配列番号４） を有する。融合タンパク質においては、好ましいＦｃ成分は、溶液において安定性であり、そして活性を活性化する補体をほとんど有さないか又は完全に有さないヒトγ鎖である。
【０２３３】
従って、本発明はＺｔｎｆｒ１２成分及びヒトＦｃフラグメントを含んで成るＺｔｎｆｒ１２融合タンパク質を企画し、ここで前記Ｚｔｎｆｒ１２成分のＣ−末端は、ペプチドリンカー、例えば配列番号４のアミノ酸配列から成るペプチドを通してＦｃフラグメントのＮ−末端に結合される。Ｚｔｎｆｒ１２成分は、Ｚｔｎｆｒ１２分子又はそのフラグメントであり得る。例えば、融合タンパク質は、Ｆｃフラグメント（例えば、ヒトＦｃフラグメント）、配列番号２のアミノ酸残基１−６９、及び配列番号２のアミノ酸残基１−７９を含んで成ることができる。
【０２３４】
もう１つの態様においては、Ｚｔｎｆｒ１２融合タンパク質は、ＩｇＧ配列、ＩｇＧ Ｚｔｎｆｒ１２のアミノ酸末端に共有結合されるＺｔｎｆｒ１２成分、及びＺｔｎｆｒ１２のアミノ酸末端に共有結合されるシグナルペプチドを含んで成り、ここで前記ＩｇＧ配列は、次の順序での次の要素から成る：ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン。従って、ＩｇＧ配列はＣＨ１ドメインを欠いている。Ｚｔｎｆｒ１２成分は、本明細書に記載されるように、Ｚｔｎｆｒ１２活性、例えばＺｔｎｆｒ１２リガンドと結合する能力を示す。抗体及び非抗体部分の両者を含んで成る融合タンパク質を生成するこの一般的なアプローチは、ＬａＲｏｃｈｅｌｌｅなど．， ヨーロッパ特許第７４２８３０号（ＷＯ９５／２１２５８号）により記載されている。
【０２３５】
例４は、ＩｇＧ由来の免疫グロブリンが一定の突然変異を含む、Ｚｔｎｆｒ１２融合タンパク質の構成を記載する。５種の免疫グロブリンＩｇＧ， ＩｇＡ， ＩｇＭ， ＩｇＤ及びＩｇＥが高等脊椎動物において同定されている。ＩｇＧ， ＩｇＤ及びＩｇＥタンパク質は、２種の同一のＨ鎖及び２種の同一のＬ鎖からなる、特徴的にジスルフィド結合されたヘテロテトラマーである。典型的には、ＩｇＭはテトラマーのペンタマーとして見出され、そしてＩｇＡはテトラマーのダイマーとして存在する。
【０２３６】
ＩｇＧは、それが血漿に見出される第２の最も多くのタンパク質として通常、存在する場合、主用クラスを包含する。ヒトにおいては、ＩｇＧは、ＩｇＧ１， ＩｇＧ２， ＩｇＧ３及びＩｇＧ４と称する４種のサングラスから成る。図１に示されるように、個々の免疫グロブリンＨ鎖は、所定のサブクラスのために不変である不変領域タンパク質ドメイン（ＣＨ１、ビンジ、ＣＨ２及びＤＨ３）から成る不変領域を有する。ＩｇＧクラスのＨ鎖不変領域は、ギリシア記号γにより同定される。例えば、ＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンは、γ１Ｈ鎖不変領域を含む。
【０２３７】
Ｆｃフラグメント又はＦｃドメインは、ジスルフィド結合されたＨ鎖ヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインから成る。免疫グロブリン融合タンパク質においては、ＩｇＧ１サングラスのＦｃドメインは、ＩｇＧ１が血清タンパク質のいずれかの最長の血清半減期を有するので、しばしば免疫グロブリン成分として使用される。長い血清半減期は、動物研究及び可能性あるヒト治療使用のための特徴的な所望するタンパク質であり得る。さらに、ＩｇＧ１サブクラスは、抗体介在性エフェクター機能を実施する最長の効力を有する。
【０２３８】
免疫グロブリン融合タンパク質において最も有用であり得る主要エフェクター機能は、抗体依存性細胞毒性を介在するＩｇＧ１抗体についての能力である。他方では、これは、主要機能がアンタゴニストとして存在する融合タンパク質の所望しない機能であり得る。ＩｇＧ１サングラスにおける抗体不変領域介在性活性のために重要である特異的アミノ酸残基のいくつかが同定されている。従って、それらの特異的アミノ酸の包含又は排除は、特異的免疫グロブリン不変領域介在活性の包含又は排除を可能にする。
【０２３９】
例４は、Ｚｔｎｆｒ１２−Ｆｃ融合タンパク質を創造するために生成された、修飾されたヒトＩｇＧ１ Ｆｃの２種のバージョンを記載する。Ｆｃ４及びＦｃ５は、ＦｃγＲＩ結合及び補体Ｃ１ｑ結合を低めることによって、Ｆｃにより介在されるエフェクター機能を低めるための突然変異を含む。特に、３種のアミノ酸置換が、ＥｃγＲ１結合を低めるために導入された。それらは、ＥＵインデックス位置２３４及び２３７（野生型免疫グロブリンγＩ領域の配列である、配列番号１７のアミノ酸残基３８、 ３９及び４１）での置換である。それらの位置での置換は、ＦｃγＲＩへの結合を低めることが示されている（Ｄｕｎｃａｎなど．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２： ５６３ （１９８８））。それらのアミノ酸置換はまた、ＦｃγＲＩＩａ結合、及びＦｃγＲＩＩＩ結合も低めることができる（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎなど．， Ｎａｔｕｒｅ ４０６： ２６７ （２０００）； ｗｉｎｅｓなど．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６４： ５３１３ （２０００））。
【０２４０】
いくつかのグループが、補体Ｃ１ｑ結合及び続く補体固定におけるＥＵインデックス位置３３０及び３３１（配列番号１７のアミノ酸残基１３４及び１３５）の適切性を記載している（Ｃａｆｉｅｌｄ ａｎｄ Ｍｉｒｒｉｓｏｎ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７３： １４８３ （１９９１）； Ｔａｏなど．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７８： １６６１ （１９９３））。それらの位置でのアミノ酸置換は、補体固定化を低めるためにＦｃ４において導入された。Ｆｃ４のＣＨ３ドメインは、その対応する野生型ポリペプチドにおいて見出されるそのドメインと同一であるが、但しクローン化されたＤＮＡがｄａｍ＋Ｅ．コリの株において増殖される場合、可能性あるｄａｍメチル化部位を排除するためにＴＧＡからＴＡＡに変更される停止コドンを除く。
【０２４１】
Ｆｃ５においては、ＥＵインデックス位置２１８でのアルギニン残基は、ＢｇｌＩＩクローニングスキームがこの特定のＦｃを含む融合タンパク質において使用されなかったので、リシンに突然変異された。Ｆｃ５配列の残りは、Ｆｃ４についての上記の記載に適合する。
【０２４２】
他の有用なＦｃ変異体は、Ｆｃ６、Ｆｃ７及びＦｃ８を包含する。Ｆｃ６はＦｃ５と同一であるが、但し、カルボキシル末端リシンコドンが排除されていることを除く。成熟免疫グロブリンのＣ末端リシンはしばしば、Ｂ細胞からの分泌の前、成熟免疫グロブリンから後−翻訳的に除去されるか、又は血清循環の間、除去される。従って、Ｃ末端リシン残基は典型的には、循環抗体上では見出されない。上記Ｆｃ４及びＦｃ５に関しては、Ｆｃ６配列における停止コドンは、ＴＡＡに変更されている。
【０２４３】
Ｆｃ７は野生型γ１ Ｆｃと同一であるが、但しＣＨ２ドメインに位置するＥＵインデックス位置２９７でのアミノ酸置換を除く。ＥＵインデックス位置Ａｓｎ−２９７（配列番号１７のアミノ酸残基１０１）は、Ｎ−連結された炭水化物結合の部位である。Ｎ−結合された炭水化物は、その炭水化物構造における可能性あるバッチからバッチへの変動のために、組換え発現されたタンパク質への可能性ある変動性の源を導入している。この可能性ある変動性を排除する試みにおいては、Ａｓｎ−２９７が、その残基位置でＮ−結合された炭水化物の結合を妨げるためにグルタミン残基に突然変異誘発された。残基２９７での炭水化物はまた、ＦｃγＲＩＩＩに結合するＦｃにも包含される（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎなど．， Ｎａｔｕｒｅ ４０６： ２６７ （２０００））。従って、炭水化物の除去は、融合タンパク質を含む組換えＦｃ７のＦｃγＲへの結合を一般的に低める。上記のように、Ｆｃ７配列のおける停止コドンは、ＴＡＡに突然変異誘発された。
【０２４４】
Ｆｃ８は、配列番号１７に示される野生型免疫グロブリンγ１領域と同一であるが、但し、ＥＵインデックス位置２２０でのシステイン残基（配列番号１７のアミノ酸残基２４）がセリン残基により置換されている。この突然変異は、免疫グロブリンＬ鎖不変領域と通常、ジスルフィド結合するシステイン残基を排除した。
【０２４５】
本発明は、配列番号２のアミノ酸残基７−６９、配列番号２のアミノ酸残基７−７９、配列番号２のアミノ酸残基７−３９、配列番号２のアミノ酸残基１９−３５、配列番号２のアミノ酸残基１−６９、配列番号２のアミノ酸残基１−７９、配列番号２のアミノ酸残基１−７１、配列番号２のアミノ酸残基７−７１、又は配列番号２のアミノ酸残基１−３９から成るＺｔｎｆｒ１２受容体成分を含んで成るＺｔｎｆｒ１２−免疫グルブリン融合タンパク質を企画する。より一般的には、本発明は、Ｚｔｎｆｒ１２−免疫グロブリン融合タンパク質を包含し、ここで前記Ｚｔｎｆｒ１２受容体成分は、配列番号２のアミノ酸残基１−６９、配列番号２のアミノ酸残基１−７１、配列番号２のアミノ酸残基７−７１、又は配列番号２のアミノ酸残基１−７９のフラグメントから成り、そして前記Ｚｔｎｆｒ１２受容体成分はＺＴＮＦ４で結合する。
【０２４６】
本明細書に記載される融合タンパク質の免疫グロブリン成分は、免疫グロブリンの少なくとも１つの不変領域を含んで成る。好ましくは、免疫グロブリン成分は、ヒト免疫グロブリンのセグメントを表す。ヒト免疫グルブリン配列は、上記で論じられたアミノ酸突然変異の少なくとも１つを有する、野生型アミノ酸配列、又は修飾された野生型アミノ酸配列であり得る。
【０２４７】
ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列はまた、既知のアロタイプ決定基の特徴である１又は複数の突然変異を有することによって野生型とは異なることができる。表５は、ヒトＩｇＧγＩ不変領域のアロタイプ決定基を示す（Ｐｕｔｍａｎ， Ｔｈｅ Ｐｌａｓｍａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｖｏｌ． Ｖ． Ｐａｇｅｓ４９ ｔｏ １４０ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９８７））。ＥＵインデックス位置２１４， ３５６， ３５８及び４３１は、既知のＩｇＧγ１アロタイプを定義する。位置２１４は、ＩｇＧγ１不変領域のＣＨ１ドメインに存在し、そして従って、Ｆｃ配列以内に存在しない。配列番号１７の野生型Ｆｃ配列は、Ｇｌｍ（１）及びＧｌｍ（２−）アロタイプを包含する。しかしながら、ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質のＦｃ成分は、それらのアロタイプのいずれかの組み合わせを表すために修飾され得る。
【０２４８】
【表５】
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【０２４９】
本明細書において開示されるＺｔｎｆｒ１２−Ｆ２タンパク質の例は、ヒトＩｇＩ不変領域を開示する。しかしながら、適切な免疫グロブリン成分はまた、少なくとも１つの不変領域、例えば次の免疫グロブリンのいずれか、すなわちＩｇＧ２， ＩｇＧ２， ＩｇＧ４， ＩｇＡ１， ＩｇＡ２， ＩｇＤ， ＩｇＥ及びＩｇＭからのＨ鎖不変領域を含んで成るプロペプチドを包含する。本発明はまた、Ｚｔｎｆｒ１２ダイマー及びマルチマーを生成するために、上記のようなＺｔｎｆｒ１２受容体成分、及びアルブミン又はβ２−マイクログロブリンのいずれか、及び同様のものを含んで成る融合タンパク質にも関する。Ｚｔｎｆｒ１２融合タンパク質ダイマー及びマルチマーを生成するために適切な追加のタンパク質の成分は、当業者に知られている。
【０２５０】
一定の状態の処理においては、Ｚｔｎｆｒ１２−免疫グルブリン融合タンパク質と、ＴＡＣＩ−免疫グロブリン融合タンパク質及びＢＣＭＡ−免疫グロブリン融合タンパク質の少なくとも１つとを組合すことは好都合である。この組合せ療法は、種々のタイプの免疫グロブリン融合タンパク質を、例えばダイマーとして投与することによって、又はＺｔｎｆｒ１２−免疫グロブリン、ＴＡＣＩ−免疫グロブリン及びＢＣＭＡ−免疫グロブリン融合タンパク質のへテロダイマーを投与することによって達成され得る。
【０２５１】
本発明の融合タンパク質は、一本鎖ポリペプチド、ダイマー、トリマー、又は複数のダイマー又はトリマーの形を有することができる。ダイマーは、ホモダイマー又はヘテロダイマーであり得、そしてトリマーはホモトリマー又はヘテロトリマーであり得る。ヘテロダイマーの例は、Ｚｔｎｆｒ１２−免疫グロブリンポリペプチド及びＢＣＭＡ−免疫グロブリンポリペプチドのダイマー、Ｚｔｎｆｒ１２−免疫グロブリンポリペプチド及びＴＡＣＩ−免疫グロブリンポリペプチドのダイマー、及びＢＣＭＡ−免疫グロブリンポリペプチド及びＴＡＣＩ−免疫グルブリンポリペプチドのダイマーを包含する。
【０２５２】
ヘテロポリマーの例は、Ｚｔｎｆｒ１２−免疫グロブリンポリペプチド及び２種のＢＣＭＡ−免疫グロブリンポリペプチドのトリマー、Ｚｔｎｆｒ１２−免疫グロブリンポリペプチド及び２種のＴＡＣＩ−免疫グロブリンポリペプチドのトリマー、ＢＣＭＡ−免疫グロブリンポリペプチド及び２種のＺｔｎｆｒ１２−免疫グロブリンポリペプチドのトリマー、２種のＴＡＣＩ−免疫グロブリンポリペプチド及びＢＣＭＡ−免疫グロブリンポリペプチドのトリマー、１つのＴＡＣＩ−免疫グロブリンポリペプチド及び２種のＺｔｎｆｒ１２−免疫グロブリンポリペプチドのトリマー、２種のＢＣＭＡ−免疫グロブリンポリペプチド及びＴＡＣＩ−免疫グロブリンポリペプチドのトリマー、及びＴＡＣＩ−免疫グロブリンポリペプチド、ＢＣＭＡ−免疫グロブリンポリペプチド及びＺｔｎｆｒ１２−免疫グロブリンポリペプチドのトリマーを包含する。
【０２５３】
そのような融合タンパク質においては、ＴＡＣＩ受容体成分は、配列番号８の次のアミノ酸配列の少なくとも１つを含んで成ることができる：アミノ酸残基３０−１５４、アミノ酸残基３４−６６、アミノ酸残基７１−１０４、アミノ酸残基４７−６２及びアミノ酸残基８６−１００。ＢＣＭＡ受容体成分は、配列番号７の次のアミノ酸配列の少なくとも１つを含んで成ることができる：アミノ酸残基１−４８、アミノ酸残基８−４１及びアミノ酸残基２１−３７。Ｚｔｎｆｒ１２受容体成分は、配列番号２の次のアミノ酸配列の少なくとも１つを含んで成ることができる：アミノ酸残基７−６９、アミノ酸残基１９−３５、アミノ酸残基１−６９、アミノ酸残基７−７９、アミノ酸残基１−７１、アミノ酸残基７−７１又はアミノ酸残基１−３９。
【０２５４】
免疫グロブリン融合タンパク質は、標準の方法を用いて生成され得る。例示として、例４は、例示的なＺｔｎｆｒ１２−Ｆｃ５融合タンパク質を構成するために使用され得るＰＣＲ方法の使用を記載する。
抗体融合タンパク質の他の例は、抗原−結合ドメイン、及びＺｔｎｆｒ１２細胞外ドメインを含むＺｔｎｆｒ１２フラグメントを含んで成るポリペプチドを包含する。そのような分子は、Ｚｔｎｆｒ１２結合活性の有益性のための特定の組織を標的化するために使用され得る。
【０２５５】
本発明はさらに、種々の他のポリペプチド融合体を提供する。例えば、生物学的機能を付与するドメインの一部又はすべては、腫瘍壊死因子受容体ファミリーの他のメンバーからの機能的に同等のドメインにより本発明のＺｔｎｆｒ１２間で置換され得る。ポリペプチド融合体は、Ｚｔｎｆｒ１２融合類似体を生成するために、組換え宿主細胞において発現され得る。Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドは、複数の成分又はドメイン、例えば精製の親和性標識及び標的化ドメインに融合され得る。ポリペプチド融合体はまた、特にドメイン間での１又は複数の切断部位を含むことができる。例えば、Ｔｕａｎなど．， Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４； １（１９９６） を参照のこと。
【０２５６】
融合タンパク質は、その融合タンパク質の個々の成分を調製し、そしてそれらを化学的に接合することによって、当業者に知られている方法により調製され得る。他方では、正しく読み取り枠を整合して融合タンパク質の両成分をコードするポリヌクレオチドは、既知の技法を用いて生成され、そして本明細書に記載される方法により発現され得る。融合タンパク質の酵素的及び化学分解のための一般的な方法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ（１９９５）、ｐ． １６−１９〜１６−２５により記載される。
【０２５７】
Ｚｔｎｆｒ１２はＺｔｎｆｒ１２以外のリガンドを結合することができる。Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドはそのような追加の、可能性あるＺｔｎｆｒ１２リガンドを同定し、そして単離するために使用される得る。例えば、本発明のタンパク質及びペプチドが、カラム上に固定され、そしてカラム上で作動する生物学的サンプルからのリガンドを結合するために使用され得る（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎなど． （ｅｄｓ．）， Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｐ． １９５−２０２ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９２））。
【０２５８】
受容体リガンドとして、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドの活性が、受容体結合及び続く生理学的細胞応答に関連する、細胞外酸性化速度又はプロトン排泄を測定する、珪素に基づくバイオセンサーのマイクロフィジオメーターにより測定され得る。典型的な装置は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡにより製造されるＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒＴＭ マイクロフィジオメーターである。種々の細胞応答、例えば細胞増殖、イオン輸送、エネルギー生成、炎症応答、調節及び受容体活性化及び同様のものが、この方法により測定され得る。
【０２５９】
例えば、ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ， Ｈ．Ｍ．など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：１９０６−１９１２， １９９２； Ｐｉｔｃｈｆｏｒｄ， Ｓ． など．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２２８： ８４−１０８， １９９７： Ａｒｉｍｉｌｌｉ， Ｓ． など．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ２１２： ４９−５９， １９９８； Ｖａｎ Ｌｉｅｆｄｅ， Ｉ． など．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３４６： ８７−９５， １９９８を参照のこと。さらに、マイクロフィジオメーターは、付着性又は非付着性真核又は原核細胞をアッセイするために使用され得る。時間にわたっての細胞培地における細胞外酸性化変化を測定することによって、マイクロフィジオメーターは、種々の刺激に対する細胞応答、例えばＺｔｎｆｒ１２のアゴニスト、リガンド又はアンタゴニストを直接的に測定する。
【０２６０】
例えば、マイクロフィジオメーターは、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドを発現しない対照の真核宿主に比較して、Ｚｔｎｆｒ１２−発現真核細胞の応答を測定するために使用され得る。Ｚｔｎｆｒ１２−調節刺激に対して応答性の適切な細胞は、Ｚｔｎｆｒ１２発現バクターを含んで成る組換え宿主細胞、及び天然においてＺｔｎｆｒ１２を発現する細胞を包含する。細胞外酸性化は、Ｚｔｎｆｒ１２−調節された細胞応答についての１つの測定を提供する。さらに、このアプローチは、Ｚｔｎｆｒ１２リガンド、そのアゴニスト及びアンタゴニストを同定するために使用され得る。例えば、分子は、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドを発現する細胞を供給し、前記細胞の第１部分を、試験化合物の不在下で培養し、前記細胞の第２部分を、試験化合物の存在下で培養し、そして前記第１部分と比較して、前記第２部分が細胞応答を示すかどうかを決定することによって、Ｚｔｎｆｒ１２リガンドのアゴニストとして同定され得る。
【０２６１】
他方では、固相システムが、Ｚｔｎｆｒ１２リガンド、ＺＴＮＦ４のアゴニスト又はアンタゴニストを同定するために使用され得る。例えば、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチド又はＺｔｎｆｒ１２融合タンパク質が、市販のバイオセンサー装置の受容体チップの表面上に固定され得る（ＢＬＡＣＯＲＥ， Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ； ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）。この装置の使用は、例えばｋａｒｌｓｓｏｎ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １４５：２２９ （１９９１）、及びＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２３４：５５４ （１９９３） により開示される。
【０２６２】
手短には、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチド又は融合タンパク質は、流動細胞内の金フィルムに結合されるデキストラン繊維に、アミン又はスルフヒドリル化学を用いて、共有結合される。次ぎに、試験サンプルが、細胞を通して通される。リガンドがサンプルに存在する場合、それは固定されたポリペプチド又は融合タンパク質に結合し、培地の屈折率の変化を引き起こし、これが金フィルムの表面プラスモン共鳴の変化として検出される。このシステムは、結合親和性が計算され得るオン−及びオフ−速度の測定、及び結合の化学量論の評価を可能にする。このシステムはまた、抗体−抗原相互作用、及び他の補体／抗−補体対の相互作用を試験するためにも使用され得る。
【０２６３】
Ｚｔｎｆｒ１２結合ドメインはさらに、Ｚｔｎｆｒ１２リガンドアゴニストの推定上の接触部位アミノ酸の突然変異に関連して、核磁気共鳴、結晶学、電子回折又は光親和性ラベリングのような技法により決定されるように、耕造体の物理的分析により特徴づけられ得る。例えば、ｄｅ Ｖｏｓなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６ （１９９２）， Ｓｍｉｔｈなど．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４：８９９ （１９９２）， 及びＷｌｏｄａｖｅｒなど．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３０９： ５９ （１９９２） を参照のこと。
【０２６４】
本発明はまたＺｔｎｆｒ１２ポリペプチドがポリマーにより連結される、化学的に修飾されたＺｔｎｆｒ１２組成物を企画する。例示的なＺｔｎｆｒ１２ポリペプチドは、機能的なトランスメンブランドメインを欠いている可溶性ポリペプチド、例えば配列番号２のアミノ酸残基１−６９から成るポリペプチド、又は配列番号２のアミノ酸残基１−７９から成るポリペプチドである。典型的には、前記ポリマーは、Ｚｔｎｆｒ１２結合体が水性環境、例えば生理学的環境において沈殿しないよう水溶性である。適切なポリマーの例は、単一の反応基、例えばアシル化のための活性エステル、又はアルキル化のためのアルデヒドを有する修飾されている１つのポリマーである。
【０２６５】
この場合、重合化の程度は調節され得る。反応性アルデヒドの例は、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、又はモノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ、又はそれらのアリールオキシ誘導体である（例えば、Ｈａｒｒｉｓなど．， アメリカ特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。ポリマーは枝分かれ鎖であっても、又は枝分かれ鎖でなくても良い。さらに、ポリマーの混合物がＺｔｎｆｒ１２接合体を生成するために使用され得る。
【０２６６】
治療のために使用され得るＺｔｎｆｒ１２接合体は、医薬的に許容できる水溶性ポリマー成分を含むことができる。適切な水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ＰＥＧ、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−ＰＥＧ、アリールオキシ−ＰＥＧ、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ＰＥＧ、トレシルモノメトキシＰＥＧ、ＰＥＧプロピオンアルデヒド、ビス−スクシンイミジルカーボネートＰＥＧ、プロピレングリコールホモポリマー、酸化ポリプロピレン／酸化エチレンコポリマー、ポリオキシエチル化されたポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、デキストラン、セルロース又は他の炭水化物基材のポリマーを包含する。適切なＰＥＧは、約６００〜約６０，０００、例えば５，０００、１２，０００及び２５，０００の分子量を有することができる。Ｚｔｎｆｒ１２接合体はまた、そのような水溶性ポリマーの混合物も含むことができる。
【０２６７】
Ｚｔｎｆｒ１２接合体の１つの例は、Ｚｔｎｆｒ１２成分、及びＺｔｎｆｒ１２成分のＮ−末端に結合される酸化ポリアルキル成分を含んで成る。ＰＥＧは、１つの適切な酸化ポリアルキルである。例示として、Ｚｔｎｆｒ１２は、ＰＥＧ、すなわち“ＰＥＧ化”として知られている方法により修飾され得る。Ｚｔｎｆｒ１２のＰＥＧ化は、当業界において知られているＰＥＧ化反応のいずれかにより行われ得る（例えば、ヨーロッパ特許第０１５４３１６号、Ｄｅｌｇａｄｏなど．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ ９： ２４９ （１９９２）， Ｄｕｎｃａｎ ａｎｄ Ｓｐｒｅａｆｉｃｏ， Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ． ２７： ２９０ （１９９４） 及びＦｒａｎｃｉｓ など．， Ｉｎｔ， Ｊ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ６８： １ （１９９８） を参照のこと）。
【０２６８】
例えば、ＰＥＧ化は反応性ポリエチレングリコール分子によるアシル化反応又はアルキル化反応により行われ得る。他のアプローチにおいては、Ｚｔｎｆｒ１２接合体は、ＰＥＧの末端ヒドロキシ又はアミノ基が活性化されたリンカーにより置換されている活性化されたＰＥＧを縮合することによって形成される（例えば、Ｋａｒａｓｉｅｗｉｃｚなど．， アメリカ特許第５，３８２，６５７号を参照のこと）。
【０２６９】
アシル化によるＰＥＧ化は典型的には、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドとＰＥＧの活性エステル誘導体との反応を必要とする。活性化されたＰＥＧエステルの例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドにエステル化されたＰＥＧである。本明細書において使用される場合、用語“アシル化”とは、Ｚｔｎｆｒ１２と水溶性ポリマー間のタイプの結合を包含する：アミド、カルバメート、ウレタン及び同様のもの。アシル化によるＰＥＧ化されたＺｔｎｆｒ１２の調製方法は、典型的には、（ａ）Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドとＰＥＧ（例えば、ＰＥＧのアルデヒド誘導体の反応性エステル）とを、１又は複数のＰＥＧ基がＺｔｎｆｒ１２に結合する条件下で反応せしめ、そして（ｂ）その反応生成物を得る段階を含んで成る。一般的に、アシル化反応のための最適な反応条件は、既知のパラメーター及び所望する結果に基づいて決定されるであろう。例えば、ＰＥＧ：Ｚｔｎｆｒ１２の比が高いほど、ポリＰＥＧ化されたＺｔｎｆｒ１２生成物の％が高くなる。
【０２７０】
アシル化によるＰＥＧ化の生成物は典型的には、リシンε−アミノ基がアシル結合を通してＰＥＧ化されるポリＰＥＧ化されたＺｔｎｆｒ１２生成物である。典型的には、その得られるＺｔｎｆｒ１２は、少なくとも９５％、モノ−、ジ−又はトリ−ペルギレートされるが、但し高い程度のＰＥＧ化を有するいくつかの種は、その反応条件に依存して形成され得る。ＰＥＧ化された種は、標準の精製方法、例えば透析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー及び同様のものを用いて、接合されていないＺｔｎｆｒ１２ポリペプチドから分離され得る。
【０２７１】
アルキル化によるＰＥＧ化は一般的に、還元剤の存在下で、Ｚｔｎｆｒ１２と、ＰＥＧの末端アルデヒド誘導体との反応を包含する。ＰＥＧ基は好ましくは、−ＣＨ２−ＮＨ基を通してポリペプチドに結合される。
【０２７２】
モノＰＥＧ化された生成物を生成するためへの還元性アルキル化を通しての誘導体化は、誘導体化のために利用できる異なったタイプの第１アミノ基の示差反応性を利用する。典型的には、前記反応は、リシン残基のε−アミノ基とタンパク質のＮ−末端残基のα−アミノ基との間のｐＫａ差異の利用を可能にするｐＨで行われる。そのような選択的誘導体化により、反応性基、例えばアルデヒドを含む水溶性ポリマーのタンパク質への結合が調節される。ポリマーとの接合は、他の反応性基、例えばリシン側鎖アミノ基の有意な修飾を伴なわないで、タンパク質のＮ−末端で優先的に生じる。本発明は、Ｚｔｎｆｒ１２モノポリマー接合体の実質的な調製物を提供する。
【０２７３】
モノポリマーＺｔｎｆｒ１２接合体分子の実質的に均質な集団を生成するための還元性アルキル化は、（ａ）Ｚｔｎｆｒ１２のアミノ末端でのα−アミノ基選択的修飾を可能にするために適切なｐＨでの還元性アルキル化条件下で反応性ＰＥＧとンＺｔｎｆｒ１２ポリペプチドとを反応せしめ、そして（ｂ）反応生成物を得る段階を含んで成る。還元性アルキル化のために使用される還元剤は、水溶液において安定性であり、そして好ましくは、還元性アルキル化の初期工程において形成されるＳｃｈｉｆｆ塩基のみを還元できるべきである。好ましくは還元剤は、硼水素化ナトリウム、シアノ硼水素化ナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン及びビリジンボランを包含する。
【０２７４】
モノポリマーＺｔｎｆｒ１２接合体の実質的に均質な集団に関しては、還元性アルキル化反応条件は、Ｚｔｎｆｒ１２のＮ−末端への水溶性ポリマーの成分の結合を可能にするそれらの条件である。そのような反応条件に、Ｎ−末端でのα−アミノ基とリシンアミノ基との間のｐＫａ差異を提供する。ｐＨはまた、使用されるポリマー：タンパク質の比にも影響を及ぼす。一般的に、ｐＨが低い場合、タンパク質よりも過剰量のポリマーが、Ｎ−末端α−基が反応性であるほど、より多くのポリマーが最適な条件を達成するために、必要とされるので、所望される。ｐＨが高い場合、ポリマー：Ｚｔｎｆｒ１２は、より多くの反応性基が利用できるので、高くある必要はない。典型的には、ｐＨは、３〜９又は３〜６の範囲内であろう。
【０２７５】
考慮すべきもう１つの因子は、水溶性ポリマーの分子量である。一般的に、ポリマーの分子量が高いほど、より少数のポリマー分子がタンパク質に結合され得る。ＰＥＧ化反応に関しては、典型的な分量は、約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ又は約１２ｋＤａ〜約２５ｋＤａである。水溶性ポリマー：Ｚｔｎｆｒ１２のモル比は、一般的に、１：１〜１００：１の範囲であろう。典型的には、水溶性ポリマー：Ｚｔｎｆｒ１２のモル比は、ポリＰＥＧ化に関して、１：１〜２０：１であり、そしてモノＰＥＧ化に関しては、１：１〜５：１であろう。
【０２７６】
ポリペプチド及び水溶性ポリマー成分を含んで成る接合体を生成するための一般的な方法は当業界において知られている。例えば、Ｋａｒａｓｉｅｗｉｃｚなど．， アメリカ特許第５，３８２，６５７号、Ｇｒｅｅｗａｌｄなど．， アメリカ特許第５，７３８，８４６号、Ｎｉｅｆｏｒｔｈなど．， Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． ５９： ６３６ （１９９６）， Ｍｏｎｋａｒｓｈ など．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４７： ４３４ （１９９７） を参照のこと。
【０２７７】
本発明は、本明細書に記載されるペプチド又はポリペプチドを含んで成る組成物を企画する。そのような組成物はさらに、キャリヤーを含むことができる。前記キャリヤーは、従来の有機又は無機キャリヤーであり得る。キャリヤーの例は、水、緩衝液、アルコール、ポリエチレングリコール、マクロゲル、ゴマ油、トウモロコシ油及び同様のものを包含する。
【０２７８】
さらに、組成物は、キャリヤー、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチド、及びＴＡＣＩポリペプチド又はＢＣＭＡポリペプチドの１つを含んで成ることができる。一定の組成物は、それらの受容体の可溶性形を含んで成る。そのような組成物の例は、キャリヤー、配列番号２のアミノ酸残基７−６９（例えば、配列番号２のアミノ酸残基１−７９， １−６９， １−７９， １−７１又は７−７１から成るポリペプチドを含んで成るＺｔｎｆｒ１２ポリペプチド、及び（１）配列番号７のアミノ酸残基１−５１を含んで成るＢＣＭＡポリペプチド、（２）配列番号８のアミノ酸残基１−１６６を含んで成るＴＡＣＩポリペプチド又は（３）配列番号７のアミノ酸残基１−５１を含んで成るＢＣＭＡポリペプチド、及び配列番号８のアミノ酸残基１−１６６を含んで成るＴＡＣＩポリペプチドを含んで成る組成物を包含する。
【０２７９】
７．Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチド及び融合タンパク質についてのアッセイ
Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチド及びＺｔｎｆｒ１２−免疫グロブリン融合タンパク質の機能が、ＺＴＮＦ４を融合する融合タンパク質の能力を評価するために種々のアプローチを用いて試験され得る。例えば、１つのアプローチは、１２５Ｉ−ラベルされたＺＴＮＦ４の結合についてＺｔｎｆｒ１２−被覆されたプレートと競争するＺｔｎｆｒ１２ポリペプチド又はＺｔｎｆｒ１２−免疫グロブリン融合タンパク質の能力を測定する。例示のように、５０μｇのＺＴＮＦ４が、単一ＩＯＤＯ−ＢＥＡＤ（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）を用いて、４ｍＣｉの１２５Ｉによりラベルされ得る。その反応がウシ血清アルブミンの０．２５％溶液により急冷され、そして遊離１２５ＩがＰＤ−１０カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてのゲル濾過により除去される。
【０２８０】
１２５Ｉ−ＺＴＮＦ４調製物の比放射能が、脱塩段階の前及び後、トリクロロ酢酸沈殿により決定される。“Ｚｔｎｆｒ１２−Ｎ”として命名された、Ｚｔｎｆｒ１２受容体のＮ−末端フラグメントが、９６−ウェルプレートに添加され（例えば、０．１μｇ／ｍｌで１００μｌ）、そして４℃で一晩インキュベートされる。プレートが洗浄され、ＳＵＰＥＲＢＬＯＣＫ（Ｐｉｅｒｃｅ）によりブロックされ、そして再び洗浄される。０〜約１２ｎｇ／ｍｌの範囲の種々の濃度でのＺｔｎｆｒ１２ポリペプチド又はＺｔｎｆｒ１２−Ｆｃ構成体が、固定された濃度の１２５Ｉ−ＺＴＮＦ４と共に混合され、そしてＺｔｎｆｒ１２−Ｎにより被覆されたプレート上で３７℃で約２時間インキュベートされる。対照は、溶液でのＺｔｎｆｒ１２を含むか、又はＺｔｎｆ１２ポリペプチド又はＺｔｎｆｒ１２−Ｆｃ構成体を欠いている。インキュベーションの後、プレートは洗浄され、そして計数される。
【０２８１】
もう１つのアプローチにおいては、上昇する濃度の１２５ＩラベルされたＺＴＮＦ４が、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチド又はＺｔｎｆｒ１２−Ｆｃ構成体と共にインキュベートされ、そして沈殿されたＺＴＮＦ４−Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチド複合体又はＺＴＮＦ４−Ｚｔｎｆｒ１２−Ｆｃ複合体に関連する放射能が測定される。例示のように、約０．０５ｎＭのＺｔｎｆｒ１２ポリペプチド又はＺｔｎｆｒ１２−Ｆｃ構成体が、約０．４ｐＭ〜約１．５ｎＭの１２５Ｉ−ＺＴＮＦ４と共に、管当たり０．２５ｍｌの合計体積で、３０分間、室温でインキュベートされ得る。
【０２８２】
Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ （Ｓｔａｐｈ Ａ） 懸濁液が個々の管に添加され、そして１５分後、サンプルが遠心分離され、２度洗浄され、そしてペレットが計数される。非特異的結合が、１２５Ｉ−ＺＴＮＦ４／Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドミックス、又は１２５Ｉ−ＺＴＮＦ４／Ｚｔｎｆｒ１２−Ｆｃミックスへの１３０ｎＭのラベルされていないＺＴＮＦ４の添加により決定される。特異的結合が、個々の濃度の１２５Ｉ−ＺＴＮＦ４で結合される合計ｃｐｍからラベルされていないＺＴＮＦ４の存在下で結合されたｃｐｍを控除することによって計算される。
【０２８３】
他方では、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチド及びＺｔｎｆｒ１２−免疫グロブリン融合タンパク質が、Ｇｒｏｓｓなど．， 国際公開番号ＷＯ ００／４０７１６号により記載のようにして、可溶性ＺＴＮＦ４によるヒトＢ細胞の刺激を阻害する能力により特徴づけられ得る。手短には、ヒトＢ細胞が、ＣＤ１９磁気ビーズ及びＶａｒｉｏＭａｃｓ磁気分離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ； Ａｕｂｕｒｎ， ＣＡ）を用いて、製造業者の説明書に従って、末梢血液単核細胞から単離される。精製されたＢ細胞は、可溶性ＺＴＮＦ４（２５ｎｇ／ｍｌ）及び組換えヒトＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ， Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に混合され、そして細胞がウェル当たり１×１０５個の細胞で丸底９６ウェルプレート上にプレートされる。
【０２８４】
Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチド又はＺｔｎｆｒ１２−免疫グロブリンタンパク質が約５μｇ／ｍｌ〜約６ｎｇ／ｍｌに希釈され、そしてウェル当たり１μＣｉの３Ｈ−チミジンにより４日目、一晩パルスしながら、Ｂ細胞と共に５日間インキュベートされる。対照として、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチド又はＺｔｎｆｒ１２−免疫グロブリンタンパク質がまた、ＡＴＮＦ４を伴なわないで、Ｂ細胞及びＩＬ−４と共にインキュベートされ得る。プレートが、Ｐａｃｋａｒｄプレート収穫機を用いて収穫され、そしてＰａｃｋａｒｄリーダーを用いて計算される。
【０２８５】
十分に確立された動物モデルが、一定の疾病状態におけるＺｔｎｆｒ１２ポリペプチド又はＺｔｎｆｒ１２−免疫グロブリンタンパク質のインビボ効能を試験するために入手できる。例えば、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチド又はＺｔｎｆｒ１２−免疫グロブリンタンパク質は、多くの自己免疫疾患の動物モデル、例えばＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）のモデルとして作用するＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ又はＮＺＢ×ＮＺＷ Ｆ１コンジェニックマウス株において試験され得る。そのような動物は、当業界において知られている（例えば、Ｃｏｈｅｎ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ （Ｅｄｓ．）， Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９４を参照のこと）。
【０２８６】
Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｂｌａｃｋ （ＮＺＢ） マウスとＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ （ＮＺＷ） マウスとの間の交雑の子孫が、ヒトにおけるＳＬＥに密接に類似するＳＬＥの自発形を成長せしめる。ＮＺＢＷとして知られているそれらの子孫マウスは、生後１ヶ月でＴ−細胞に対してＩｇＭ自己抗体を成長し始め、そして生後５〜７ヶ月までに、抗−ＤＮＡ自己抗体は優性免疫グロブリンである。ポリクローナルＢ−細胞過活性は、自己抗体の過生成を導く。それらの自己抗体、特に一本鎖のＤＮＡに対して向けられたそれらの抗体の沈着は、タンパク尿、窒素血症及び腎不全からの死亡として臨床学的に明白である糸球体腎炎の進行に関連している。
【０２８７】
腎不全は、自発性ＳＬＥにより影響されるマウスにおいて死の腫瘍原因であり、そしてＮＺＢＷ株においては、この工程は慢性及び閉塞性である。前記疾病は雄よりも雌においてより急速且つ重症であり、そして平均生存日は雄の４０６日に比較して、雌はわずか２４５日である。雌マウスの多くは、生後７〜９ヶ月まで症候性（タンパク尿性）であるが、それらの何匹かは、それらが徴候を進行する場合、より若いか又は年をとっている。ＮＺＢＷマウスに見られる致命的な腎炎は、ヒトＳＬＥにおいて見られる糸球体腎炎に非常に類似し、この自発的ネズミモデルを、可能性あるＳＬＥ治療の試験のために非常に魅力的にする（Ｐｕｔｔｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｎａｐａｒｓｔｅｋ， “Ｍｕｒｉｎｅ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｌｕｐｕｓ Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ”， ｉｎ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ， Ｐａｇｅｓ ２１７−２３４ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９４）； Ｍｏｈａｎ など．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５４： １４７０ （１９９５）； 及びＤａｉｋｈなど．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５９： ３１０４ （１９９７））。
【０２８８】
Ｇｒｏｓｓなど．， 国際公開番号ＷＯ ００／４０７１６号により記載されるように、ＺＴＮＦ４を結合するＴＡＣＩ−免疫グロブリンタンパク質が、平均して、Ｂ−細胞自己抗体生成がＮＺＢＷマウスにおいて高いレベルで存在すると思われる場合、５週間にわたってＢ細胞に対するその抑制効果をモニターするためにＮＺＢＷマウスに投与され得る。この方法は、Ｚｔｎｆｒ１２−免疫グロブリン融合タンパク質のＺｔｎｆｒ１２ポリペプチドの効能を決定するために適用され得る。手短には、１００匹の生後８週目の雌（ＮＥＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスが、１５匹のマウスの６種のグループに分けられ得る。
【０２８９】
処理の前、マウスはタンパク尿について１ヶ月に１度モニターされ、そして血液がＣＢＣ及び血清バンクのために採血される。タンパク尿は糸球体腎炎の典型的な徴候であるので、尿タンパクレベルが、研究の期間にわたって、規則的な間隔で計量棒によりモニターされる。処理は、マウスが生後、約５ヶ月である場合に開始される。マウスは、ビークルのみ（リン酸緩衝液）又はヒト免疫グロブリン（対照タンパク質）、又はＺｔｎｆｒ１２−免疫グロブリンタンパク質（例えば、用量当たり２０〜１００μｇの試験タンパク質）を、５週間、３度受ける。類似する研究がＺｔｎｆｒ１２にポリペプチドにより行われ得る。
【０２９０】
血液は、処理の間、２度、採血され、そして処理の後、少なくとも２度、採血されるであろう。タンパク尿においての尿計量棒値及び体重が、処理の開始の後、２週ごとに測定される。血液、尿計量棒値及び体重が、安楽死の時点で取られる。脾臓及び胸腺が、蛍光活性化された細胞分類分析及び組織学のために分けられる。下顎下唾液腺、腸間膜リンパ節鎖、肝臓葉及び胆嚢、盲腸及び大腸、胃、小腸、膵臓、右腎臓、副腎、舌（及び気管及び食道）、心臓及び肺がまた、組織研究のために収集される。
【０２９１】
実験用アレルギー性脳脊髄炎についてのネズミモデルが、免疫介在性疾病の機構、及び可能性ある治療介入方法の両者を調べるための手段として使用されて来た。このモデルはヒト多発性硬化症に類似し、そして神経タンパク質、例えばミエリン基本タンパク質又はタンパク脂質タンパク質へのＴ−細胞活性化の結果として脱髄を生成する。抗原による接種は、ＣＤ４＋、クラスＩＩ ＭＨＣ−制限されたＴ−細胞（Ｔｈ１）の誘発を導く。実験用アレルギー性脳脊髄炎についてのプロトコールの変化は、モデルの急性、慢性−再発性又は受動性−トランスファー変異体を生成することができる（Ｗｅｉｎｂｅｒｇなど．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６２： １８１８ （１９９９）；Ｍｉｊａｂａなど．， Ｃｅｌｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８６：９４ （１９９９）； 及びＧｌａｂｉｎｓｋｉ， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍ． ２８８： １８２ （１９９７））。
【０２９２】
Ｇｒｏｓｓなど．， 国際公開番号ＷＯ ００／４０７１６号は、実験のアレルギー性脳脊髄炎に関連する徴候の改善におけるＴＡＣＩ−免疫グロブリンタンパク質の効能の評価への１つのアプローチを記載する。手短には、２５匹の雌ＰＬｘＳＪＬ Ｆ１マウス（生後１２週）は、完全フロイントアジュバントに配合された抗原（エミリンタンパク質、ＰＬＰ， 残基１３９−１５１）を１２５μｇ／マウスで皮下注射される。マウスは、５匹のマウスの５種のグループに分けられる。百日咳毒素（４００ｎｇ）の腹腔内注射が、０及び２日目に与えられる。グループは、１倍、１０倍又は１００倍用量のＴＡＣＩ−免疫グロブリンタンパク質を与えられ、１つのグループはビークルのみを受け、そして１つのグループは処理を受けないであろう。予防療法は、０日目に開始し、介入療法は７日目に、又は臨床学的徴候の開始で始まる。
【０２９３】
疾病の徴候、体重の低下及び麻痺が約１０〜１４日で明白であり、そして約１週間、続く。動物は、体重を計量し、そしてそれらの徴候の程度に対応する臨床学的評点を割り当てることによって毎日、評価される。実験のアレルギー性脳脊髄炎の臨床学的徴候は、接種の１０〜１４日以内に現れ、そして約１週間、続く。研究の最後で、すべての動物は、ガスの過剰投与により安楽死され、そして検死される。脳及び脊椎が組織研究のために収集され、又はｍＲＮＡ分析のために凍結される。体重及び臨床学的評点のデータが個人及びグループによりプロットされる。このアプローチは、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチド又はＺｔｎｆｒ１２−免疫グロブリン融合タンパク質を試験するために使用され得る。
【０２９４】
コラーゲン−誘発された関節炎モデルにおいては、マウスは、ヒトリウマチ様関節炎に密接に類似する慢性炎症性関節炎を進行する。コラーゲン−誘発された関節炎はリウマチ様関節炎と、免疫学的及び病理学的特徴を共有するので、これは、可溶性あるヒト抗炎症性化合物をスクリーニングするための理想的モデルにする。コラーゲン−誘発された関節炎モデルを用いることのもう１つの利点は、病因の機構が知られていることである。
【０２９５】
ＩＩ型コラーゲン上のＴ及びＢ細胞エピトープは同定されており、そして免疫−介在性関節炎に関連する、種々の免疫学的（遅延された型の過毎性及び抗−コラーゲン抗体）及び炎症性（サイトカイン、ケモカイン及びマトリックス−分解性酵素）パラメーターは決定されており、そしてモデルにおける試験化合物効能を評価するために使用され得る（Ｗｏｏｌｅｙ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｒｈｅｕｍ． ３：４０７（１９９９）；Ｗｉｌｌｉａｍｓなど．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８９： ９７８４ （１９９２）； Ｍｙｅｒｓなど．， Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ６１： １８６１ （１９９７）； 及びＷａｎｇなど．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９２： ８９５５ （１９９５））。
【０２９６】
Ｇｒｏｓｓなど．， 国際公開番号ＷＯ ００／４０７１６号は、コラーゲン−誘発された関節炎に関連する徴候の改善におけるＴＡＣＩ−免疫グロブリンタンパク質の効能を評価するための方法を記載する。手短には、生後８週の雄のＤＢＡ／１Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）が、５匹のマウス／グループのグループに分けられ、そして３週間融で、１ｍｇ／ｍｌのコラーゲン（ニワトリ又はウシ起源）５０〜１００μｌの２回の皮下注射を与えられる。１つの対照は、コラーゲン注射を受けない。第１回目の注射は、完全フロイントアジュバントにおいて配合され、そして第２回目の注射は、不完全フロイトアジュバントにおいて配合される。
【０２９７】
ＴＡＣＩ−免疫グロブリンタンパク質が、２回目の注射の時点で又はその前、又は動物が少なくとも２４時間、持続する、２又はそれ以上の臨床学的評点を進行した後、予防的に投与される。動物は、通常２〜３週以内に、第２回目のコラーゲン注射に続いて、関節炎の症状を示し始める。例えば、ＴＡＣＩ−Ｆｃ、対照タンパク質、ヒトＩｇＦｃ又はリン酸緩衝溶液（ビークル）が、第２回目の注射の７日前（−７日目）、予防的に投与され得る。タンパク質は、１００μｌの腹腔内注射として週３度、与えられ、そして４週間、続けられる。
【０２９８】
疾病の程度が、足の厚さを測定するためにカリパスを用い、そして個々の足に臨床学的評点を割り当てることにより個々の足において評価される。例えば、“０”の臨床学的評点は正常なマウスを示し、“１”の評点は、１又は複数の足指が赤くはれ上がることを示し、“３”の評点は、中位の足の炎症を示し、そして“４”の評点は重度の足の炎症を示す。動物は、疾病が設定期間、通常７日間、確立された後、安楽死される。足が組織研究又はｍＲＮＡ分析のために集められ、そして血清が免疫グロブリン及びサイトカインアッセイのために収集される。コラーゲン−誘発された関節炎モデルは、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチド又はＺｔｎｆｒ１２免疫グロブリン融合タンパク質を試験するために使用され得る。
【０２９９】
重症筋無力症は、ネズミモデルが利用できるもう１つの自己免疫疾患である。重症筋無力症は、ニコチン様アセチルコリン受容体に対して向けられた自己抗体の生成を包含する、神経筋肉伝達の障害である。この疾病は、運動に対する異常な虚弱及び疲労を包含する臨床学的特徴を獲得するか、又は受け継がれる。
【０３００】
重症筋無力症のネズミモデルは確立されている（Ｃｈｒｉｓｔａｄｏｓｓなど．， “Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｍｙａｓｃｈｅｎｉａ ｇｒａｖｉｓ Ｗｈｉｃｈ Ｍｉｍｉｃｓ Ｈｕｍａｎ Ｍｙａｓｈｅｎｉａ ｇｒａｖｉｄ Ｐｈａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ”， ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＶＩＩＩ， Ａｔａｓｓｉ ａｎｄ Ｂｉｘｌｅｒ （Ｅｄｓ．）， Ｐａｇｅｓ １９５−１９９ （１９９５））。実験の自己免疫重症筋無力症は、アセチルコリン受容体に対する抗体の存在により特徴づけられる抗体介在性疾病である。それらの抗体は、筋肉の虚弱さをもたらす、欠陥性神経筋肉電気的衝撃を導く受容体を破壊する。
【０３０１】
実験の自己免疫重症筋無力症モデルにおいては、マウスがニコチン様アセチルコリン受容体により免疫化される。重傷筋肉無力症の臨床学的徴候は、二次免疫化の後、数週で明らかになる。実験の自己免疫重症筋無力症は、ラジオイムノアッセイによるアセチルコリン受容体抗体の血清レベルの測定（Ｃｈｒｉｓｔａｄｏｓｓ ａｎｄ Ｄａｕｐｈｉｎｅｅ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３６： ２４３７ （１９８６）； Ｌｉａｄｓｔｒｏｍなど．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ７４： ４３２ （１９８１））、筋肉アセチルコリン受容体の測定を包含するいくつかの方法、又は筋電図検査（Ｃｏｌｉｇａｎ など． （Ｅｄ．）， ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ． Ｖｏｌ． ３， ｐａｇｅ１５．８．１ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９７））により評価される。
【０３０２】
実験の自己免疫重症筋無力症に対するＺｔｎｆｒ１２ポリペプチド又はＺｔｎｆｒ１２−免疫グロブリン融合タンパク質の効果は、Ｂ６マウスにおける臨床学的重症筋無力症の進行の間、融合タンパク質を投与することによって決定され得る。例えば、１００匹のＢ６マウスが、０及び３０日目、完全フロイントアジュバント中、２０μｇのアセチルコリン受容体により免疫化される。約４０〜６０％マウスが、アセチルコリン受容体による追加免疫化の後、中位（等級２）〜重度（等級３）の臨床学的重症筋無力症を進行するであろう。
【０３０３】
等級２及び３の臨床学的疾病を有するマウスが、３種のグループ（等しい等級の虚弱性を有する）に分けられ、そして計量され（虚弱性を有するマウスはまた、それらが食物及び水の消費において困難性を有するので、体重が低下する）、そして血清（前処理抗−アセチルコリン受容体抗体及びイソタイプレベルについて）のために放血される。グループＡは、リン酸緩衝溶液によりＩ．Ｐ．注射され、グループＢは対照タンパク質（１００μｇ）としてヒトＩｇＧ−Ｆｅにより腹腔内に注射され、そしてグループＣは１００μｇのＺｔｎｆｒ１２ポリペプチド又はＺｔｎｒ１２−免疫グロブリン融合タンパク質により４週間、週３度、注射される。
【０３０４】
マウスは、週２度、臨床学的筋肉虚弱性についてスクリーンされ、そして計量され、そして処理の開始の１５及び３０日後、血清のために放血される。完全な血液が、マーカーＢ２２０及びＣＤ５を用いて、蛍光活性化された細胞分類分析によりＴ／Ｂ細胞比を決定するために、１５日目に採血される。生存するマウスは、処理の開始の３０〜４５日後に殺害され、そしてそれらの死体は、筋肉アセチルコロン受容体の損失、すなわち重症筋無力症における腫瘍病理学を決定するために、筋肉アセチルコロン受容体の後での抽出のために凍結される（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎなど： （Ｅｄｓ．）， Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． Ｖｏｌ．３， ｐａｇｅ １５． ８． １ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９７） を参照のこと）。
【０３０５】
マウス筋肉アセチルコリン受容体に対する血清抗体が、確立されたラジオイムノアッセイにより決定され、そして抗−アセチルコリン受容体抗体イソタイプ（ＩｇＭ， ＩｇＧ１， ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ２ｃ）がＥＬＩＳＡにより測定される。そのような方法は知られている。進行性臨床学的重症筋無力症、抗−アセチルコリン受容体抗体及びイソタイプレベル、及び筋肉アセチルコロン受容体損傷に対するＺｔｎｆｒ１２ポリペプチド又はＺｔｎｆｒ１２−免疫グロブリン融合タンパク質の効果が決定される。
【０３０６】
約１００匹マウスが、０日及び３０日目、完全フロイントアジュバント中、２０μｇのアセチルコリン受容体により免疫化され得る。臨床学的重症筋無力症を有するマウスは４種のグループに分けられる。グループは、１００μｇの対照Ｆｃにより腹腔内注射され、グループＢは２０μｇの対照Ｆｃにより注射され、グループＣは１００μｇのＺｔｎｆｒ１２ポリペプチド又はＺｔｎｆｒ１２又はＺｔｎｆｒ１２−免疫グロブリン融合タンパク質により注射され、そしてグループＤは２０μｇのＺｔｎｆｒ１２ポリペプチド又はＺｔｎｆｒ１２−免疫ブリン融合タンパク質により４週間、週３度、注射される。マウスが計量され、そして処理の開始の前、及び１５及び３０日で、血清のために放血される。血清は、上記のようにして、抗−アセチルコリン受容体及びイソタイプについて試験される。筋肉アセチルコリン受容体損失がまた、測定される。
【０３０７】
それらのインビトロ及びインビボアッセイがまた、Ｚｔｎｆｒ１２抗体成分、抗体融合タンパク質、免疫接合体及び同様のものを評価するために使用され得る。Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチド、Ｚｔｎｆｒ１２−免疫グロブリン融合タンパク質又はＺｔｎｆｒ１２抗体成分の他の適切なアッセイは、当業者により決定され得る。
【０３０８】
８．Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドの単離
本発明のポリペプチドは、汚染性高分子、特に他のタンパク質及び核酸に対して、少なくとも約８０％の純度、少なくとも約９０％の純度、少なくとも約９５％の純度、又は９５％以上の純度に精製することが好ましく、そして感染性及び発熱性剤を有さない。本発明のポリペプチドはまた、９９．９％以上の純度である医薬的に純粋な状態に精製され得る。特定の製剤においては、精製されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に有さない。
【０３０９】
分別及び／又は従来の精製方法は、天然源（例えば、リンパ節組織）から精製されたＺｔｎｆｒ１２、合成Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチド、及び組換え宿主細胞から精製された組換えＺｔｎｆｒ１２ポリペプチド及び融合Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドの調製物を得るために使用され得る。一般的に、硫酸アンモニウム沈殿及び酸又はカオトロピック剤抽出は、サンプルの分別のために使用される。典型的な精製段階は、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、ＦＰＬＣ及び逆相高性能液体クロマトグラフィーを包含する。適切なクロマトグラフィー用媒体は、誘導体化されたデキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特別なシリカ及び同様のものを包含する。ＰＥＩ、ＤＥＡＥ、ＱＡＥ及びＱ誘導体が好ましい。
【０３１０】
典型的なクロマトグラフィー用媒体は、フェニル、ブチル又はオクチル基により誘導体化されたもの、例えばフェニル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ｐｈａｒｍａｃｉａ），Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ブチル６５０（Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ， Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ， ＰＡ）、オクチル−Ｓｅｐｈａｒｒｏｓｅ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）及び同様のもの；又はポリアクリル樹脂、例えばＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ７１ （Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ）及び同様のものを包含する。適切な固体支持体は、ガラスビーズ、シリカ基材の樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋されたアガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋されたポリアクリルアミド樹脂及びそれらが使用される条件下で不溶性である同様のものを包含する。それらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基及び／又は炭水化物成分によるタンパク質の結合を可能にする反応性基より変性され得る。
【０３１１】
カップリング化学物質の例は、臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化及びカルボジイミド  カップリング化学物質のためのカルボキシル及びアミノ誘導体を包含する。それらの及び他の固体媒体は当業界において良く知られており、そして広く使用されており、そして商業的供給者から入手できる。ポリペプチド単離及び精製の特定方法の選択は、通常のことであり、そして選択された支持体の性質により一部決定される。例えば、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ， １９８８、及びＤｏｏｎａｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９９６）を参照のこと。
【０３１２】
Ｚｔｎｆｒ１２単離及び精製における追加の変動は、当業者により調節され得る。例えば、下記のようにして得られる抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体は、免疫親和性精製により多量のタンパク質を単離するために使用され得る。
【０３１３】
本発明のポリペプチドは、アニオン及びカチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除、及び親和性クロマトグラフィーを包含する方法の組み合わせより単離され得る。例えば、固定された金属イオン吸着（ＩＭＡＣ）クロマトグラフィーが、ヒスチジンに富んでいるタンパク質、及びポリヒスチジン標識を含んでなるそれらのタンパク質を精製するために使用され得る。手短に言及すれば、ゲルがまず、二価金属イオンにより荷電され、キレートが形成される（ Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３： １−７， １９８５）。
【０３１４】
ヒスチジンに富んでいるタンパク質が、使用される金属イオンに依存して、異なった親和性を有するこのマトリックスに吸着され、そして競争溶出、ｐＨの低下、又は強いキレート化剤の使用により溶出されるであろう。他の精製方法は、レクチン親和性クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化されたタンパク質の精製を包含する（Ｍ． Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ， （ｅｄ．）， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２， ５２９（１９９０））。本発明のさらなる態様においては、興味あるポリペプチド、及び親和性標識（例えばマルトース−結合タンパク質、ＦＬＡＧ標識、Ｇｌｕ−Ｇｋｕ標識、免疫グロブリンドメイン）の融合体が、精製を促進するために構成され得る。
【０３１５】
Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチド又はそのフラグメントはまた、下記のようにして、化学合成を通して調製され得る。Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドは、モノマー又はマルチマーであり得；グリコシル化されても、又はグリコシル化されなくても良く；ＰＥＧ化されても、又はＰＥＧ化されなくても良く；そして初期メチオニンアミノ酸残基を含むことができるか、又は含まなくても良い。
【０３１６】
９．Ｚｔｎｆｒ１２タンパク質に対する抗体の生成
Ｚｔｎｆｒ１２に対する抗体は、例えば抗原として、Ｚｔｎｆｒ１２発現ベクターの生成物又は天然源から単離されたＺｔｎｆｒ１２を用いて得られる。特に有用な抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体は、Ｚｔｎｆｒ１２を、“特異的に結合する”。抗体は、その抗体が次の２つの性質の少なくとも１つを示す場合、特異的に結合すると思われる：（１）抗体が限界レベルの結合活性を伴って、Ｚｔｎｆｒ１２に結合し、そして（２）抗体がＺｔｎｆｒ１２に関連するポリペプチドと有意に交差反応しない場合。
【０３１７】
第１の特徴に関しては、抗体は、それらが、１０６Ｍ−１又はそれ以上、好ましくは１０７Ｍ−１又はそれ以上、より好ましくは１０８Ｍ−１又はそれ以上、及び最も好ましくは１０９Ｍ−１又はそれ以上の結合親和性（Ｋａ）を伴なって、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチド、ペプチド又はエピトープに結合する場合、特異的に結合する。抗体の結合親和性は、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ 分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ， Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ５１： ６６０ （１９４９））により、当業者により容易に決定され得る。第２の特徴に関しては、抗体は、それらが、標準のウェスターンブロット分析を用いて、Ｚｔｎｆｒ１２を検出するが、しかし現在知られているポリペプチドを検出しない場合、関連するポリペプチドと有意に交差反応しない。既知の関連するポリペプチドの例は、既知の腫瘍壊死因子受容体を包含する。例えば、一定の抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体は、Ｚｔｎｆｒ１２と結合するが、しかしＴＡＣＩ又はＢＣＭＡとは結合しない。
【０３１８】
抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体は、抗原性Ｚｔｎｆｒ１２エピトープ−担持ペプチドを用いて生成され得る。本発明の抗原性エピトープ−担持ペプチド及びポリペプチドは、配列番号２内に含まれる、少なくとも９個、又は１５〜約３０個のアミノ酸の配列、又は本明細書に開示されるもう１つのアミノ酸配列を含む。しかしながら、３０〜５０個のアミノ酸、又は本発明のポリペプチドの全アミノ酸配列までのいずれかの長さのアミノ酸を含む、本発明のアミノ酸配列の大きな部分を含んで成るペプチド又はポリペプチドはまた、Ｚｔｎｆｒ１２と結合する抗体を誘発するためにも有用である。所望には、エピトープ担持ペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒において実質的な溶解性を提供するよう選択される（すなわち、前記配列は、比較的親水性の残基を包含し、そして疎水性残基は好ましくは、回避される）。さらに、プロリン残基を含むアミノ酸配列がまた、抗体生成のために所望される。
【０３１９】
例示のように、Ｚｔｎｆｒ１２における可能性ある抗原性部位が、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ（ＤＮＡＳＴＡＲ；Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）のＰＲＯＴＥＡＮプログラム（バージョン３．１４）により実効されるように、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ ｍｅｔｈｏｄ， Ｊａｍｅｓｏｎ ａｎｄ Ｗｏｌｆ， ＣＡＢＩＯＳ ４： １８１， （１９８８） を用いて、同定された。デフォールトパラメーター（ｄｅｆａｕｌｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒ）が、この分析に使用された。
【０３２０】
Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ方法は、タンパク質構造予測のために６種の主要サブルーチンを組合すことによって、可能性ある抗原決定基を予測する。手短には、Ｈｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓ方法、Ｈｏｐｐなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８： ３９２４ （１９８１） が最初に、最大の局部親水性の領域を表すアミノ酸配列を同定するために使用された（パラメーター：平均７個の残基）。第２段階においては、Ｅｍｉｎｉ方法、Ｅｍｉｎなど．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌｇｙ ５５： ８３６ （１９８５） が、表面確立を計算するために使用された（パラメーター：表面決定限界値（０．６）＝１）。第３に、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｔｚ方法、Ｋａｒｐｌｕｓ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ， Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ ７２： ２１２ （１９８５） が、主鎖柔軟性を予測するために使用された（パラメーター：柔軟性限界値（０．２）＝１）。
【０３２１】
分析の第４及び第５段階においては、二次構造の予測が、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎの方法、Ｃｈｏｕ， “Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｌａｓｓｅｓ ｆｒｏｍ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ”， ｉｎ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ， Ｆａｓｍａｎ （ｅｄ．）， ｐ．５４９−５８６ （１９７８） を用いて、データに適用された（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ パラメーター：コンホメーション表＝６４タンパク質；β領域限界値＝１０５；Ｇｒｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎパラメーター：α及びβ決定パラメーター＝０）。
【０３２２】
第６のサブルーチンにおいては、柔軟性パラメーター及び水治療／溶媒接近性因子が、“抗原指数”として呼ばれる表面輪郭値を決定するために組合された。最終的に、ピーク拡大機能が、抗原指数に適用され、内部領域に対する表面領域の移動度に由来する追加の自由エネルギーを計算するために、それぞれのピーク値の２０， ４０， ６０又は８０％を付加することによって主用表面ピークを拡大する。しかしながら、この計算は、ヘリカル領域がほとんど柔軟性になる傾向がないので、ヘリカル領域に存在するいずれかの主用ピークにも適用されなかった。
【０３２３】
この分析の結果は、配列番号２の次のアミノ酸配列が適切な抗原性分子を提供することを示した：アミノ酸１−１７、アミノ酸、アミノ酸１０２−１２９、アミノ酸１３５−１４２、アミノ酸１４６−１５９及び、アミノ酸１７４−１８２。本発明は、Ｚｔｎｆｒ１２に対する抗体を生成するためにそれらのアミノ酸配列のいずれか１つの使用を企画する。本発明はまた、それらの抗原性分子の少なくとも１つを含んで成るポリペプチドを企画する。
【０３２４】
同様に、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析の結果は、配列番号１３の次のアミノ酸配列が適切な抗原性分析を提供することを示した：アミノ酸１０−２６、アミノ酸４５−６９、アミノ酸１０６−１１３及びアミノ酸１３９−１５１。本発明は、ネズミＺｔｎｆｒ１２に対する抗体を生成するためへのそれらの抗原性アミノ酸配列のいずれか１つの配列の使用を企画する。本発明はまた、それらの抗原性分子の少なくとも１つを含んで成るポリペプチドにも関する。
【０３２５】
有用な抗体はまた、ヒト遺伝子の少なくとも１つのＺｔｎｆｒ１２エキソンを含んで成る抗原性分子を用いて生成され得る。例えば、そのような抗原性分子は、配列番号２の次のアミノ酸配列から成るポリペプチドを含んで成ることができる：アミノ酸残基１−４５、アミノ酸残基４７−１２２、及びアミノ酸残基１２４−１８４。
【０３２６】
ＺＴＮＦ４によるシグナルトランスダクションを阻止する抗体は、治療用途において有用であり得る。抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体の阻止は、例えば、腫瘍細胞系上のＺｔｎｆｒ１２へのビオチン−ＺＴＮＦ４結合のそれらの阻害により同定され得る。Ｚｔｎｆｒ１２細胞内ドメインと結合する抗体はまた、ＺＴＮＦ４−誘発されたシグナルトランスダクションを阻止するためにも使用され得る。そのような抗体は、配列番号２のアミノ酸残基１０１−１８４内のＺｔｎｆｒ１２の細胞内ドメインを結合することができる。さらに、可能性あるＴＲＡＦ結合ドメインが、配列番号２のアミノ酸残基１５９−１７８で存在する。従って、一定のシグナル−阻止抗体は、この領域内のＺｔｎｆｒ１２の細胞内ドメインを結合することができる。本発明は、配列番号２のアミノ酸残基１５９−１７８内のＺｔｎｆｒ１２を結合する抗体を包含する。標準の方法は、細胞の細胞内企画への抗体の導入のために利用できる。例えば、そのような抗体は、リポソームに封入され得る。
【０３２７】
シグナル−誘発性抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体はまた有用である。Ｚｔｎｆｒ１２受容体に結合することによってシグナルを誘発する抗体はまた、転写レポーター要素及びＺｔｎｆｒ１２を含む適切なレポーター細胞系を用いて同定され得る。例示のように、Ｚｔｎｆｒ１２を発現する、構築された哺乳類細胞系（例えば、Ｊｕｒｋａｔ）、及び転写レポーター遺伝子は、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）の転写を刺激するそれらの能力について、抗−Ｚｔｎｆ１２モノクローナル抗体を試験するために使用され得る。
【０３２８】
組換えＺｔｎｆｒ１２タンパク質、又は天然源から単離されたＺｔｎｆｒ１２に対するポリクローナル抗体は、当業者に良く知られている方法を用いて調製され得る。例えば、Ｇｒｅｅｎ など．， “Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ，” ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｃｏｌｓ （Ｍａｎｓｏｎ， ｅｄ．）， ｐａｇｅｓ １−５ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９９２）， 及びＷｉｌｌｉａｍｓ など．， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ ｕｓｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，” ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２： Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｇｌｏｖｅｒ など．， （ｅｄｓ．）， ｐａｇｅ １５ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｐｒｅｓｓ １９９５を参照のこと。Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドの免疫原性は、アジュバント、例えばみょうばん（水酸化アルミニウム）又はフロイント完全又は不完全アジュバントの使用を通して高められ得る。
【０３２９】
免疫化のために有用なポリペプチドはまた、融合ポリペプチド、例えばＺｔｎｆｒ１２又はその一部と、免疫グロブリンポリペプチド又はマルトース結合タンパク質との融合体を包含する。ポリペプチド免疫原は、十分な長さの分子又はその一部であり得る。ポリペプチド部分が“ハプテン−様”である場合、そのような部分は好都合には、免疫化のために高分子キャリヤー（例えば、カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又は破傷風トキソイド）に結合されるか又は連結され得る。
【０３３０】
ポリクローナル抗体は典型的には、動物、例えば馬、牛、犬、鶏、ラット、マウス、ウサギ、テンジュクネズミ、ヤギ又は羊において生ぜしめられるが、本発明の抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体はまた、ヒトに近い霊長類抗体から誘導され得る。ヒヒにおいて診断的に及び治療的に有用な抗体を生ぜしめるための一般的な技法は、例えばＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇなど．， 国際特許出願番号ＷＯ９１／１１４６５号及びＬｏｓｍａｎなど．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ４６： ３１０， １９９０に見出され得る。
【０３３１】
他方では、モノクローナル抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体が生成され得る。特定抗原に対する囓歯動物モノクローナル抗体は、当業者に知られている方法により得られる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ など．， Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５ （１９７５）， Ｃｏｌｉｇａ など．， （ｅｄｓ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １， ｐａｇｅ ２．５．１−２．６．７ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９１）， Ｐｉｃｋｓｌｅｙ など．， “Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ，” ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２： Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｇｌｏｖｅｒ など． （ｅｄｓ．）， ｐａｇｅ ９３ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５を参照のこと）。
【０３３２】
手短には、モノクローナル抗体は、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子生成物を含んで成る組成物をマウスに注射し、血清サンプルを除去することにより抗体生成の存在を確かめ、Ｂ−リンパ球を得るために脾臓を除去し、ハイブリドーマを生成するために前記リンパ球を骨髄腫細胞により融合し、ハイブリドーマをクローニングし、抗原に対する抗体を生成する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を生成するクローンを培養し、そしてハイブリドーマ培養物から抗体を単離することに得られる。
【０３３３】
さらに、本発明の抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体は、ヒトモノクローナル抗体から誘導され得る。ヒトモノクローナル抗体は、抗原攻撃に応答して特定のヒト抗体を生成するよう構築されたトランスジェニックマウスから得られる。この技法においては、ヒトＨ鎖及びＬ鎖遺伝子座の要素が、内因性Ｈ鎖及びＬ鎖遺伝子座の標的化された破壊を含む胚幹細胞系に由来するマウス株中に導入される。トランスジェニックマウスは、ヒト抗原に対して特異的なヒト抗体を合成することができ、そして前記マウスはヒト抗体−分泌性ハイブリドーマを生成するために使用され得る。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、Ｇｒｅｅｎなど．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ７： １３， １９９４， Ｌｏｎｂｅｒｇ など．， Ｎａｔｕｒｅ ３６８： ８５６， １９９４， 及びＴａｙｌｏｒなど．， Ｉｎｃ． Ｉｍｍｕｎ． ６： ５７６， １９９４により記載される。
【０３３４】
モノクローナル抗体は、種々の十分に確立された技法により、ハイブリドーマ培養物から単離され、そして精製され得る。そのような単離技法は、プロテイン−Ａセファロースによる親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーを包含する（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ， ｐａｇｅ ２．７．１−２．７．１２及びｐａｇｅ ２．９．１＾２．９．３； Ｂａｉｎｅｓなど．，” Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ （ＩｇＧ）”， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ， １０， ｐ． ７９−１０４ （Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９２） を参照のこと）。
【０３３５】
特定の用途に関しては、抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体のフラグメントを調製することが所望される。そのような抗体フラグメントは、例えば抗体のタンパク質加水分解により得られる。抗体フラグメントは、従来の方法による完全な抗体のペプシン又はパパイン消化により得られる。例示のように、抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２として示される５Ｓフラグメントを供給するためにペプシンによる抗体の酵素分解により生成され得る。このフラグメントはさらに、３．５Ｓ Ｆａｂ’ 単価フラグメントを生成するためにチオール還元剤を用いて分解され得る。
【０３３６】
任意には、その分解反応は、ジスルフィド結合の分解に起因するスルフヒドリル基に関するブロッキング基を用いて行われ得る。他の手段としては、ペプシンを用いての酸素分解が２種の単位Ｆａｂフラグメント及びＦｃフラグメントを直接的に生成する。それらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ， アメリカ特許第４，３３１，６４７号、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ など．， Ａｒｃｇ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ８９： ２３０， １９６０， Ｐｏｒｔｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ７３： １１９， １９５９， Ｅｄｅｌｍａｎ など．， ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ． １， ｐ． ４２２ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９６７）， 及びＣｏｌｉｇａｎ， ｐ． ２．８．１−２．８．１０及び２．１０−２．１０．４により記載される。
【０３３７】
抗体を分解する他の方法、例えば単価Ｌ−Ｈ鎖フラグメントを形成するためへのＨ鎖の分解、フラグメントの追加の分解、又は他の酵素的、化学的又は遺伝的技法がまた、そのフラグメントが損なわれていない抗体により認識される抗原に結合する限り、使用され得る。
例えば、Ｆｖフラグメントは、ＶＨ及びＶＬ鎖の会合を含んで成る。この会合は、Ｉｎｂａｒ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ６９： ２６５９， １９７２により記載のように、非共有的であり得る。他方では、可変鎖は、分子間ジスルフィド結合により連結され、又は化学物質、例えばグルテルアルデヒドにより交差結合され得る（例えば、Ｓａｎｄｈｕ， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｗ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １２： ４３７， １９９２を参照のこと）。
【０３３８】
Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーにより連結されるＶＨ及びＶＬ鎖を含んで成る。それらの一本鎖抗原結合タンパク質（ｓｃＦｖ）は、オリゴヌクレオチドにより連結されるＶＨ及びＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含んで成る構造遺伝子を構成することによって調製される。構造遺伝子が、続いて、宿主細胞、例えばＥ．コリ中に導入される発現ベクター中に挿入される。組換え宿主細胞は、２種のＶドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単鎖ポリペプチドを合成する。ＳｃＦｖを生成するための方法は、例えばＷｈｉｔｌｏｗ など．， Ｍｅｔｈｏｄｓ： Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｅｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：９７， １９９１により記載される。Ｂｉｒｄ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３， １９８８， Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第４，９４６，７７８号、Ｐａｃｋなど．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１： １２７１， １９９３及びＳａｎｄｈｕ， 前記も参照のこと。
【０３３９】
例示のように、ｓｃＦｖは、インビトロで、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドにリンパ球を暴露し、そしてファージ又は類似するベクターにおける抗体表示ライブラリーを選択すること（例えば、固定された又はラベルされたＺｔｎｆｒ１２タンパク質又はペプチドの作用を通して）によって得られる。可能性あるＺｔｎｆｒ１２ポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ（ファージ表示）又は細菌、例えばＥ．コリ上に表示されるランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、多くの手段、例えばランダム突然変異誘発及びランダムポリヌクレオチド合成を通して得られる。それらのランダムペプチド表示ライブラリーは、タンパク質又はポリペプチドであり得る既知の標的物、例えばリガンド又は受容体、生物学的又は合成高分子、又は有機又は無機物質と相互作用するペプチドについてスクリーンするために使用され得る。
【０３４０】
そのようなランダムペプチド表示ライブラリーを創造し、そしてスクリーニングするための技法は、当業界において知られており（Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，２２３，４０９ 号； Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第４，９４６，７７８ 号；Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，４０３，４８４ 号及びＬａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，５７１，６９８ 号、及びＫａｙなど．， Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｕｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９６））、そしてランダムペプチド表示ライブラリー及びそのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ （Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ． （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ． （Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ） 及びＰｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ． （Ｐｉｃｃａｔａｗａｙ， ＭＪ） から市販されている。ランダムペプチド表示ライブラリーは、Ｚｔｎｆｒ１２に結合するタンパク質を同定するために、本明細書に開示されるＺｔｎｆｒ１２配列を用いてスクリーンされ得る。
【０３４１】
抗体フラグメントのもう１つの形は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（“最小認識単位”）は、興味ある抗体のＤＣＲをコードする遺伝子を構成することによって得られる。そのような遺伝子は、例えば抗体−生成細胞のＲＮＡから可変領域を合成するためにポリメラーゼ鎖反応を用いることによって調製される（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ など．， Ｍｅｔｈｏｄｓ： Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１０６， （１９９１）， Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ−Ｌｕｃｋ， “Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，” ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｒｉｔｔｅｒ など．， （ｅｄｓ．）， ｐａｇｅ １６６ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）， 及びＷａｒｄ など．， “Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，” ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｂｉｒｃｈ など．， （ｅｄｓ．）， ｐａｇｅ １３７ （Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． １９９５）を参照のこと）。
【０３４２】
もう１つの有用な抗−受容体抗体はキメラ抗体である。キメラ抗体は、可変ドメイン、及び囓歯動物抗体に由来する相補性決定領域を含んで成り、そして抗体分子の残りはヒト抗体に由来する。例えば、Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｂｏｌｅｔｉ， “Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”， ｉｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｇｅｏｒｇｅ ａｎｄ Ｕｒｃｈ （Ｅｄｓ．）， Ｐａｇｅｓ ３５−５２ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． ２０００） を参照のこと。
【０３４３】
他方では、抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体は、“ヒト化”（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）モノクローナル抗体から誘導され得る。ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンＨ及びＬ可変鎖からのマウス相補性決定領域を、ヒト可変ドメイン中に移行することにより生成される。次に、ヒト抗体の典型的な残基がネズミ対応物の骨格領域において置換される。ヒト化モノクローナル抗体に由来する抗体成分の使用は、ネズミ不変領域の免疫原性に関連する可能性ある問題を回避する。ネズミ免疫グロブリン可変ドメインをクローン化するための一般的な技法は、例えば、Ｏｒｌａｎｄｉなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ３８３３， １９８９により記載される。
【０３４４】
ヒト化モノクローナル抗体を生成するための技法は、例えば、Ｊｏｎｅｓ など．， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２， １９８６， Ｃａｒｔｅｒ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： ４２８５， １９９２， Ｓａｎｄｈｕ， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｙ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １２： ４３７， １９９２， Ｓｉｎｇｅｒ など．， Ｊ． Ｔｍｍｕｎ． １５０： ２８４４， １９９３， Ｓｕｄｈｉｒ （ｅｄ．）， Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９５）， Ｋｅｌｌｅｙ， “Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，” ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｃｌｅｌａｎｄ など． （ｅｄｓ．）， ｐａｇｅｓ ３９９−４３４ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９９６）， 及びＱｕｅｅｎ など．， アメリカ特許第５，６９３，７６２号（１９９７）により記載される。
【０３４５】
本発明は、Ｚｔｎｆｒ１２細胞外領域を結合する抗体成分、及びＴＡＣＩ細胞外領域及びＢＣＭＡ細胞外領域の少なくとも１つを結合する抗体成分を含んで成る組織物の使用を包含する。例えば、そのような“多特異的抗体組成物”は、異種抗体混合物（すなわち、異なった結合特異性をそれぞれ有する、少なくとも２つの抗体成分の集合体）、二特異的抗体（すなわち、２つの異なった結合部位を有する抗体成分）、単鎖二特異的ポリペプチド、及び同様のものを含んで成ることができる。
【０３４６】
二特異的抗体は、種々の従来の方法により製造され得る。例示としては、二特異的抗体は、異なった抗体の還元性切断に起因するＦａｂ’フラグメントの酸化切断により調製されて来た。例えば、Ｗｉｎｔｅｒなど．， Ｎａｔｕｒｅ ３４９： ２９３ （１９９１） を参照のこと。これは、２種の異なった抗体のペプシン消化、Ｆａｂ’フラグメントの混合を形成するための還元性切断、続いて、元のエピトープの個々に対して特異的なＦａｂ’部分を含む二特異的抗体を包含するＦ（ａｂ’）２フラグメントの混合物を生成するためにジスルフィド結合の酸化再形成により生成される２種の異なったＦ（ａｂ’）２フラグメントを混合することによって行われ得る。そのような二特異的抗体の調製のための一般的技法は、例えばＮｉｓｏｎｈｏｆｆなど．， Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ９３： ４７０ （１９６１）， Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ など．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １２８： １４６１ （１９６８） 及びアメリカ特許第４，３３１，６４７号に見出され得る。
【０３４７】
他方では、結合は、異種二官能価リンカー、例えばマレイミド−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いることによって達成され得る。抗体又はフラグメントと前記エステルとの反応は前記抗体又はフラグメント上のアミン基を誘導体化し、そして次に、その誘導体は遊離スルヒドリル基を有する抗体Ｆａｂフラグメント（又は、例えばＴｒａｕｔの試薬によりそれに付加されるスルフヒドリル基を有する大フラグメント又は損なわれていない抗体）と反応せしめられ得る。そのようなリンカーは、同じ抗体における基をたぶんほとんど架橋せず、そして結合の選択性を改良する。
【０３４８】
もう１つの例示として、二特異的Ｆ（ａｂ’）２抗体は、二官能価架橋剤ｏ−フェニレンジマレイミドを用いて、それらのヒンジ領域ＳＨ基を通して２種のＦａｂ’フラグメントを連結することによって生成され得る。例えば、Ｔｓｏ， “Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｆ（ａｂ’）２” ｉｎ Ｃｈａｍｏｗ ａｎｄ Ａｓｈｋｅｎａｚｉ （Ｅｄｓ．）， Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｐａｇｅｓ １２７−１５０ （Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． １９９９）， ａｎｄ ｆｒｅｎｃｈ， “Ｈｏｗ ｔｏ Ｍａｋｅ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”， ｉｎ Ｇｅｏｒｇｅ ａｎｄ Ｕｒｃｈ （Ｅｄｓ．）， Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｐａｇｅｓ ３３３−３３９ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． ２０００） を参照のこと。
【０３４９】
抗原結合部位から遠く離れた部位で抗体又はフラグメントを結合することは好都合である。これは、例えば、上記に示されるように、切断された鎖間スルフヒドリル基への連結により達成され得る。もう１つの方法は、酸化された炭水化物部分を有する抗体と、少なくとも１つの遊離アミン機能を有するもう１つの抗体とを反応せしめることを包含する。これは、例えば最終複合体を形成するために、硼水素化合物還元による第二アミンへの還元により安定化され得る初期シッフ塩基（イミン）結合をもたらす。そのような部位特異的結合は、小さな分子に関しては、アメリカ特許第４，６７１，９５８号に開示され、そして大きな付加物に関しては、アメリカ特許第４，６９９，７８４号に開示されている。
【０３５０】
他方では、二特異的抗体は、２種のハイブリドーマ細胞系（１つの細胞系は抗−Ｚｔｎｆｒ１２モノクローナル抗体を生成し、そしてもう１つの細胞系は抗−ＢＣＭＡモノクローナル抗体又は抗―ＴＡＣＩモノクローナル抗体のいずれかを生成する）を融合することによって生成され得る。テトラドーマを生成するための技法は、例えばＭｉｌｓｔｅｉｎなど．， Ｎａｔｕｒｅ ３０５： ５３８ （１９８３） 及びＰｏｈｌなど．， Ｉｎｃ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ５４： ４１８ （１９９３） により記載される。
【０３５１】
二特異的抗体はまた、遺伝子工学により生成され得る。例えば、抗−Ｚｔｎｆｒ１２モノクローナル抗体の可変ドメインをコードするＤＮＡを含むベクターが、抗−ＴＡＣＩ抗体又は抗−ＢＣＭＡ抗体を分泌するハイブリドーマ中に導入され得る。その得られる形質転換体は、Ｚｔｎｆｒ１２、及びＢＣＭＡ又はＴＡＣＩのいずれかを結合する二特異的抗体を生成する。他方では、抗−Ｚｔｎｆｒ１２結合ドメイン、及び少なくとも１つの抗−ＢＣＭＡ結合ドメイン又は抗―ＴＡＣＩ結合ドメインをコードするキメラ遺伝子が企画され得る。
【０３５２】
二特異的抗体を生成するための種々の遺伝的方法が当業者に入手できる。１つのアプローチにおいては、例えば二特異的Ｆ（ａｂ’）２がロイシンジッパーを用いて生成され得る。例えばＴｓｏ， “Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｆ（ａｂ’）２” ｉｎ Ｃｈａｍｏｗ ａｎｄ Ａｓｈｋｅｎａｚｉ （Ｅｄｓ．）， Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ｐａｇｅｓ １２７−１５０ （Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． １９９９） を参照のこと。遺伝子工学により二特異的抗体を生成するための一般的技法は、例えばＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉなど．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １６４： ２７１ （１９８９）， Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒなど．， ＥＭＢＯ Ｊ． １０： ３６５５ （１９９１） 及びＷｅｉｎｅｒなど．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７： ４０３５ （１９９１） により記載される。
【０３５３】
本発明の二特異的分子はまた、一本鎖二特異的分子、例えば一本鎖二特異的抗体、一本鎖抗体及び結合決定基を含んで成る一本鎖二特異的分子、又は２種の結合決定基を含んで成る一本鎖二特異的分子であり得る。
二特異的抗体は、標準技法、例えば二特異的ＥＬＩＳＡを用いてスクリーンされ得る。
【０３５４】
本発明はさらに、標準技法を用いて、抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体又は抗体フラグメントにより動物を免疫化することによって調製され得るポリクローナル抗−イディオタイプ抗体を包含する。例えば：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｍａｄｉｓｏｎ （ｅｄ．）， Ｐａｇｅｓ １−１２ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９９２） 及びＣｏｌｉｇａｎ， ｐａｇｅｓ ２． ４． １−２． ４． ７を参照のこと。
【０３５５】
他方では、モノクローナル抗−イディオタイプ抗体は、上記の技法により、抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体又は抗体フラグメントを免疫原として用いて調製され得る。もう１つの方法として、ヒト化抗−イディオタイプ抗体又は人間に近い霊長類抗−イディオタイプ抗体が、上記技法を用いて調製され得る。抗−イディオタイプ抗体を調製するための方法は、例えばＩｒｉｅ， アメリカ特許第５，２０８，１４６号， Ｇｒｅｅｎｅなど．， アメリカ特許第５，６３７，６７７号、及びＶａｒｔｈａｋｏｖｉ ａｎｄ Ｍｉｎｏｃｈａ， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ ７７： １８７５， １９９６により記載される。
【０３５６】
本発明の抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体成分及び抗−インディオタイプ抗体は、プレ−Ｂ又はＢ−細胞白血病、例えば血漿細胞白血病、慢性又は急性リンパ球白血病、骨髄腫、例えば多発生骨髄腫、血漿細胞骨髄腫、内皮骨髄腫及び巨細胞骨髄腫、及びリンパ腫、例えば非−ホドキンスリンパ腫（Ｚｔｎｆｒ１２リガンド、例えばＺＴＮＦ４の上昇に関連する）を処理するためにＺｔｎｆｒ１２リガンド（例えば、ＺＴＮＦ４）の効果を中和するのに有用である。本明細書に記載される分子により処理され得るＢ細胞リンパ腫の追加の例は、バーキットリンパ腫、非バーキットリンパ腫、小胞性リンパ腫、急性リンパ芽白血病、大細胞型リンパ腫、境界領域リンパ腫、被膜細胞リンパ腫、大細胞型リンパ腫（例えば、免疫芽球性リンパ腫）、小リンパ球性リンパ腫及び他のＢ細胞リンパ腫を包含する。
【０３５７】
１０．遺伝子発現及び遺伝子構造を検出するためへのＺｔｎｆｒ１２ヌクレオチド配列の使用
核酸分子は、生物学的サンプルにおけるＺｔｎｆｒ１２遺伝子の発現を検出するために使用され得る。適切なプローブ分子は、配列番号１のヌクレオチド配列、又はその一部を含んで成る二本鎖核酸分子、及び配列番号１のヌクレオチド配列の補体、又はその一部を有する１本鎖核酸分子を包含する。本明細書において使用される場合、用語“一部”とは、少なくとも８個のヌクレオチド〜少なくとも２０個又はそれ以上のヌクレオチドを言及する。例示的なプローブは、他の腫瘍壊死因子受容体遺伝子における相当の領域に対して低い配列類似性を有する、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子の領域と結合する。
【０３５８】
基本的アッセイにおいては、一本鎖プローブ分子が、プローブと標的Ｚｔｎｆｒ１２ ＲＮＡ種との間の塩基対合を促進する、温度及びイオン強度の条件下で、生物学的サンプルから単離されたＲＮＡと共にインキュベートされる。末結合のプローブをハイブリダイズされた分子から分離した後、ハイブリッドの量が検出される。
【０３５９】
ＲＮＡ検出の十分に確立されたハイブリダイゼーション方法は、ノザン分析及びドット／スロット  ブロットハイブリダイゼーションを包含する（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ 前記、ｐ４−１〜４−２７、及びＷｕなど． （ｅｄｓ．）、”Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ＲＮＡ Ｌｅｖｅｌ”， ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｐ． ２２５−３９， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９７を参照のこと）。核酸プローブは、放射性同位体、例えば３２Ｐ又は３５Ｓにより検出できるようラベルされ得る。他方では、Ｚｔｎｆｒ１２ ＲＮＡは、非放射性ハイブリダイゼーション方法により検出され得る（例えば、Ｉｓａａｃ （ｅｄ．）， Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９３を参照のこと）。典型的には、非放射能性検出は、クロモゲン又は化学ルミネセンス基質の酵素転換により達成される。例示的な非放射性成分は、ビオチン、フルオレセイン及びジゴキシゲニンを包含する。
【０３６０】
Ｚｔｎｆｒ１２オリゴヌクレオチドプローブはまた、インビボ診断のためにも有用である。例示として、１６Ｆ−ラベルされたオリゴヌクレオチドが対象に投与され、そして陽電子射出断層撮影法により可視可され得る（Ｔａｖｉｔｉａｎ など．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ４： ４６７， １９９８）。
【０３６１】
多くの診断方法は、検出方法の感度を高めるために、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を利用する。ＰＣＲを実施するための標準技法は良く知られている（一般的には、Ｍａｔｈｅｗ （ｅｄ．）， Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９１； Ｗｈｉｔｅ （ｅｄ．）， ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９３； Ｃｏｔｔｅｒ （ｅｄ．）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９６； Ｈａｎａｕｓｅｋ ａｎｄ Ｗａｌａｓｚｅｄ （ｅｄｓ．）， Ｔｕｍｏｒ Ｍａｒｋｅｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９８； Ｌｏ （ｅｄ．）， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＰＣＲ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９８及びＭｅｌｔｚｅｒ （ｅｄ．）， ＰＣＲ ｉｎ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９８を参照のこと）。
【０３６２】
ＰＣＲプライマーは、他のタンパク質、例えば、他の腫瘍壊死因子受容体タンパク質における相当の領域に対して低い配列類似性を有するＺｔｎｆｒ１２遺伝子の一部を増幅するよう企画される。
【０３６３】
診断アッセイについてのＰＣＲの１つの変法は、逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）である。ＲＴ−ＰＣＲ技法においては、ＲＮＡが生物学的サンプルから単離され、ｃＤＮＡに逆転写され、そしてそのｃＤＮＡがＺｔｎｆｒ１２プライマーと共にインキュベートされる（例えば、Ｗｕなど． （ｅｄｓ．）， “Ｒａｐｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃＤＮＡ ｏｒ Ｇｅｎｅｓ ｂｙ ＰＣＲ”， ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｐ． １５−２８， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９７を参照のこと）。次に、ＰＣＲが行われ、そして生成物が標準技法を用いて分析される。
【０３６４】
例示のように、ＲＮＡは、例えば上記グアニジニウム−チオシアネート細胞溶解を用いて、生物学的サンプルから単離される。他方では、固相技法が、細胞溶解物からｍＲＮＡを単離するために使用され得る。逆転写反応は、ランダムオリゴヌクレオチド、ｄＴの短いホモポリマー、又はＺｔｎｆｒ１２アンチセンスオリゴマーを用いて、単離されたＲＮＡにより感作され得る。オリゴ−ｄＴプライマーは、対照の標的配列を提供することができる種々のｍＲＮＡヌクレオチド配列が増幅される利点を提供する。Ｚｔｎｆｒ１２配列は、典型的には２０個の長さの塩基である２種のフランキングオリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼ鎖反応により増幅される。
【０３６５】
ＰＣＲ増幅方法は、種々のアプローチを用いて検出され得る。例えば、ＰＣＲ生成物は、ゲル電気泳動により分別され、そして臭化エチジウム染色により可視化される。他方では、分別されたＰＣＲ生成物は、膜に移行され、検出できるようにラベルされたＺｔｎｆｒ１２プローブによりハイブリダイズされ、そしてオートラジオグラフィーにより試験され得る。追加の他のアプローチは、化学ルミネセンス検出及びＣ−ＴＲＡＫ比色アッセイを提供するために、ジゴキシゲニンによりラベルされたデオキシリボ核酸三ミリ酸の使用を包含する。
【０３６６】
Ｚｔｎｆｒ１２発現の検出のためのもう１つのアプローチは、サイクリングプローブ技法（ＣＤＴ）であり、ここで一本鎖ＤＮＡ標的物が過剰のＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡキメラプローブと結合し、複合体を形成し、ＲＮＡ部分がＲＮアーゼＨにより分化され、そして分解されたプローブの存在が検出される（例えば、Ｂｅｇｇｓなど．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３４： ２９８５， １９９６， 及び  Ｂｅｋｋｕｏｕｉなど．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２０： ２４０， １９９６を参照のこと）。Ｚｔｎｆｒ１２配列の検出のための他の方法は、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、交差ハイブリダイゼーションによる鋳型の協同増幅（ＣＡＴＣＨ）及びリガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）のようなアプローチを利用することができる（例えば、Ｍａｒｓｈａｌｌなど．， アメリカ特許第５，６８６，２７２号（１９９７）、Ｄｙｅｒなど．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ６０： １６１， １９９６； Ｅｈｒｉｃｈｔなど．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４３： ３５８， １９９７； 及びＣｈａｄｗｉｃｋなど．， Ｊ． Ｖｉｒｏ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ７０：５９， １９９８を参照のこと）。他の標準方法も当業者に知られている。
【０３６７】
Ｚｔｎｆｒ１２プローブ及びプライマーはまた、組織サンプルにおけるＺｔｎｆｒ１２遺伝子発現を検出し、そして位置決定するためにも使用され得る。そのような現場ハイブリダイゼーションのための方法は、当業者に良く知られている（例えば、Ｃｈｏｏ （ｅｄ．）， Ｉｎ ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９４； Ｗｅ など． （ｅｄｓ．）， “Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＤＮＡ ｏｒ Ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｏｆ ｍＲＮＡ ｂｙ Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ （ＲＩＳＨ）， “ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｐａｇｅｓ ２５９−２７８， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９７； 及びＷｕなど． （ｅｄｓ．）， “Ｌｏｃａｌｉｚａｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｏｒ Ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｏｆ ｍＲＮＡ ｂｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ （ＲＩＳＨ），” ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｐａｇｅｓ ２７９−２８９， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９７を参照のこと）。
【０３６８】
種々の追加の診断アプローチも当業者に良く知られている（例えば、Ｍａｔｈｅｗ （ｅｄ．）， Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９１； Ｃｏｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｔｓｏｎｇａｌｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９６； 及びＥｌｌｅｓ， ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， １９９６を参照のこと）。適切な試験サンプルは、血液、尿、唾液、組織、生検及び検死を包含する。
【０３６９】
Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子は、染色体２２ｑ１３．２、すなわち、疾病及び障害、例えばＦｅｃｈｔｎｅｒ症候群、Ｓｏｒｓｂｙ下部ジストロフィー、難聴、及び好中球免疫欠損症候群に関連する領域に存在する。さらに、サイトカイン受容体の突然変異は特定の疾病に関連している。例えば、サイトカイン受容体の多形現象は、肺胞タンパク質症、家族性周期性発熱及び赤白血病に関連している。従って、Ｚｔｎｆｒ１２ヌクレオチド配列は、種々の疾病についての連鎖に基づく試験において、及び対象の染色体がＺｔｎｆｒ１２遺伝子に突然変異を含むかどうかを決定するために使用され得る。Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子座での検出できる染色体逸脱は、異数性、遺伝子コピー数変化、挿入、欠失、制限部位変化及び転位を包含するが、但しそれらだけには限定されない。Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子を不活性化する遺伝子変更が特に興味の対象である。
【０３７０】
Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子座に関連する逸脱は、分子遺伝子技法、例えば制限フラグメント長さ他型現象分析、ＰＣＲ技法を用いる短いタンデム反復体分析、増幅−不応性突然変異システム分析、一本鎖コンホメーション多型現象検出、ＲＮアーゼ切断方法、変性グラジエントゲル電気泳動、蛍光−助力のミスマッチ分析、及び当業界において知られている他の遺伝子分析により、本発明の核酸分子を用いて検出され得る（例えば、Ｍａｔｈｅｗ （ｅｄ．）， Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ． Ｉｎｃ． １９９１）， Ｍａｒｉａｎ， Ｃｈｅｓｔ １０８：２５５ （１９９５）， Ｃｏｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｔｓｏｎｇａｌｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃｓ （Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９６）， Ｅｌｌｅｓ （ｅｄ．） Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９６）， Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ （ｅｄ．）， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９６）， Ｂｕｒｒｅｎ など． （ｅｄｓ．）， Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｖｏｌ． ２： Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９９８）， Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ など． （ｅｄｓ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９８）， 及びＲｉｃｈａｒｄｓ ａｎｄ Ｗａｒｄ， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｔｅｓｔｉｎｇ，” ｉｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｐａｇｅｓ ８３−８８ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓａ． Ｉｎｃ． １９９８） を参照のこと）。
【０３７１】
例示として、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子における大きな欠失は、サザンハイブリダイゼーション分析又はＰＣＲ増幅を用いて検出され得る。特定のＺｔｎｆｒ１２エキソンにおける欠失は、エキソンを両端に有するＰＣＲプライマーを用いて検出され得る。表１は、配列番号１及び９のヌクレオチド配列に存在するＺｔｎｆｒ１２エキソンの位置を提供する。この情報は、特定のエキソンを増幅するプライマーを企画するために使用され得る。
【０３７２】
突然変異はまた、正常なＺｔｎｆｒ１２配列を含んで成るオリゴヌクレオチドプローブを、サザンブロット又は膜結合されたＰＣＲ生成物にハイブリダイズすることによって検出され得る。識別は、高い緊縮性の条件下でハイブリダイズするか、又は種々の緊縮条件下で洗浄することによって達成され得る。この分析は、特定のコード配列に標的化され得る。他方では、このアプローチは、疾病原因の突然変異がしばしば位置する、即時フランキングイントロン配列におけるスプライス−ドナー又はスプライス−受容体部位を試験するために使用される。適切なオリゴヌクレオチドは、表１、及び配列番号１及び９に提供される情報を用いて、選択のエキソン中に配列を延長することによって企画され得る。
【０３７３】
遺伝子のすべて又は一部の重複は、その重複された物質が遺伝子の読み取り枠中に挿入され、そして翻訳の未熟終結を引き起こす場合、障害を引き起こすことができる。重複及び挿入は、標準方法、及びサザンハイブリダイゼーション、蛍光現場ハイブリダイゼーション、パルスされたフィールドゲル分析、又はＰＣＲにより対象のゲノムＤＮＡを分析することによって直接的に試験され得る。さらに、重複の効果は、下記に記載されるタンパク質切断アッセイにより検出され得る。
【０３７４】
点突然変異は、Ｚｔｎｆｒ１２機能の変更、又はアミノ酸コドンの停止コドンへの変化をもたらす非保存性変化を導くことができる。点突然変異がイントロン内で生じる場合、その突然変異はスプライシングの適合性に影響を及ぼすことができる。点突然変異は、標準技法、例えばサザンハイブリダイゼーション分析、ＰＣＲ分析、配列決定、連結鎖反応及び他のアプローチを用いて検出され得る。一本鎖配座多形現象分析においては、ＰＣＲにより増幅されたフラグメントが一本鎖に分離され、そして変性条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析される。
【０３７５】
ゲルを通しての移動速度が、塩基配列に依存する配座の関数である。突然変異は１つの又は両者の一本鎖の移動速度を変更することができる。化学的分析アプローチにおいては、ハイブリッド分析が試験ＤＮＡと対照ＤＮＡ（例えば、配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ）との間で生成される。突然変異による塩基対ミスマッチの部位が誤って対合され、そして鎖はそれらの部位での化学的分析に対して敏感になるであろう。
【０３７６】
タンパク質切断試験はまた、翻訳−終結突然変異がコードされたタンパク質の一部のみを生成する、遺伝子の不活性化を検出するために有用である（例えば、Ｓｔｏｐｐａ−Ｌｙｎｎｅｔ など．， Ｂｌｏｏｄ ９１： ３９２０ （１９９８） を参照のこと）。このアプローチによれば、ＲＮＡが生物学的サンプルから単離され、そしてｃＤＮＡを合成するために使用される。次に、ＰＣＲが、Ｚｔｎｆｒ１２標的物配列を増幅し、そしてＲＮＡポリメラーゼプロモーター、翻訳開始配列及びインフレ−ムＡＴＧトリプレットを導入するために使用される。ＰＣＲ生成物が、ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写され、そして転写体がＴ７−結合された網様体溶解物システムによりインビトロで翻訳される。次に、翻訳生成物が、その翻訳生成物の長さを決定するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分別される。タンパク質切断試験は、例えば、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉなど． （ｅｄｓ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ｐ．９．１１．１−９．１１．１８ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９８） により記載される。
【０３７７】
他のアプローチにおいては、突然変異は、配列ミスマッチの部位でＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を分解するであろう、リボヌクレアーゼＡを用いて検出され得る。手短には、対象のＺｔｎｆｒ１２遺伝子又はｃＤＮＡのＰＣＲ−増幅された配列が、一般的集団から選択された正常で健康な個人のＤＮＡから調製された、インビトロで転写された、ラベルされたＲＮＡプローブによりハイブリダイズされる。ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドが、リボヌクレアーゼＡにより消化され、そして変性ゲル電気泳動を用いて分析される。２本の鎖間の配列ミスマッチは保護されたフラグメントの分析を引き起こし、そして小さな追加のフラグメントは、突然変異誘発されたＺｔｎｆｒ１２遺伝子を有する対象に由来するサンプルにおいて検出されるであろう。突然変異の部位は、分解生成物のサイズから推定され得る。
【０３７８】
Ｚｔｎｆｒ１２ポリヌクレオチド配列を用いての染色体ＤＮＡの分析は、染色体２２ｑ、 特に染色体２２ｑ１３．２に位置する異常性と疾病とを関連づけるために有用である。１つの態様においては、本発明の方法は、（ａ）個人からのサンプルからＺｔｎｆｒ１２  ＲＮＡを獲得し、（ｂ）Ｚｔｎｆｒ１２ ｃＤＮＡをポリメラーゼ鎖反応により生成し、そして（ｃ）配列番号１に示されるような核酸配列に、前記Ｚｔｎｆｒ１２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を比較することを含んで成る、前記サンプルにおける染色体２２ｑ１３．２異常性を検出するための方法を提供する。さらなる態様においては、サンプルにおけるＺｔｎｆｒ１２ ｃＤＮＡ又はＺｔｎｆｒ１２遺伝子の配列と配列番号１又は９に示されるようなＺｔｎｆｒ１２配列との間の差異が、染色体２２ｑ１３．２異常性を示す。
【０３７９】
もう１つの態様においては、本発明は、（ａ）個人からのサンプル中の核酸分子と配列番号１のヌクレオチド配列、その補体又はフラグメントから成る核酸分子に緊縮条件下でハイブリダイズする核酸プローブとを接触せしめ、そして（ｂ）前記サンプルにおける核酸分子との前記プローブのハイブリダイゼーションの存在を検出し、ここで前記ハイブリダイゼーションの染色体２２ｑ１３．２異常性、例えばＺＴＮＦ４に対する応答の低下を引き起こす異常性を表す段階を含んで成る、ＺｔＮＦ４活性の変更に関連する染色２２ｑ１３．２異常性を前記サンプルにおいて検出するための方法を提供する。
【０３８０】
本発明はまた、（ａ）個人からのサンプルからＺｔｎｆｒ１２をコードする核酸分子を単離し、そして（ｂ）前記単離されたＺｔｎｆｒ１２コードの配列のヌクレオチド配列と配列番号１のヌクレオチド配列とを比較することを含んで成る、ＺＴＮＦ４活性における変更に関連するＺｔｎｆｒ１２遺伝子異常性を、前記サンプルにおいて検出する方法を提供し、ここで前記単離されたＺｔｎｆｒ１２コードの配列、又は前記単離されたＺｔｎｆｒ１２コードの配列から生成されたＺｔｎｆｒ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、配列番号１のヌクレオチド配列との間の差異が、個人における疾病又は疾病に対する感受性に関連するＺｔｎｆｒ１２遺伝子異常性、例えばＺＴＮＦ４に対する応答性の低下を引き起こす異常性を表す。
【０３８１】
本発明はまた、（ａ）個人からのサンプルからＺｔｎｆｒ１２ ＲＮＡを獲得し、（ｂ）前記Ｚｔｎｆｒ１２ ＲＮＡからポリメラーゼ鎖反応によりＺｔｎｆｒ１２ ｃＤＮＡを生成し、そして（ｃ）前記Ｚｔｎｆｒ１２ ｃＤＮＡのヌクレオチドと配列番号１のヌクレオチド配列とを比較することを含んで成る、疾病又は疾病に対する感受性に関連するＺｔｎｆｒ１２遺伝子の発現の異常性を、前記サンプルにおいて検出する方法を提供し、ここで前記Ｚｔｎｆｒ１２ ｃＤＮＡの配列と、配列番号１のヌクレオチド配列との差異が、疾病又は疾病に対する感受性に関連するＺＴＮＦＲ１２遺伝子の発現の異常性を表す。
【０３８２】
他の観点においては、本発明は、（ａ）サンプル核酸分子と、配列番号１のヌクレオチド配列、その補体又はフラグメントを有する核酸分子に緊縮条件下でハイブリダイズする核酸プローブとを接触せしめ、そして（ｂ）ハイブリダイゼーションの存在又は不在を検出することを含んで成る、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子異常性を、前記サンプルにおいて検出するための方法を提供し、ここで前記ハイブリダイゼーションの存在がＺｔｎｆｒ１２異常性を示す。
【０３８３】
現場ハイブリダイゼーションは、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子異常性を同定するためのもう１つのアプローチを提供する。このアプローチによれば、Ｚｔｎｆｒ１２プローブが、当業界において知られているいずれかの方法に従って、検出できるマーカーによりラベルされる。例えば、プローブは、ランダムプライミング、末端ラベリング、ＰＣＲ、又はニック翻訳により直接的にラベルされ得る。適切な直接的ラベルは、放射性ラベル、例えば３２Ｐ， ３Ｈ及び３５Ｓ， 及び非放射性ラベル、例えば蛍光マーカー（例えば、フルオレセイン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ， ＡＭＣＡブルー（７−アミノ−４−メチル−クマリン−３−アセテート）、ルシファーイエロー、ローダミン、等）、シアニン染料（可視光により検出できる）、酵素及び同様のものを包含する。
【０３８４】
酸素によりラベルされたプローブは、その酵素のための基質を提供することによって比色反応を通して検出され得る。種々の基質の存在下で、異なった色彩が反応により生成され、そしてそれらの色彩は、所望により、複数のプローブを別々に検出するために可視化され得る。アルカリホスファターゼのための適切な基質は、５−ブロモ−５−クロロ−３−インドリルホスフェート及びニトロブルーテトラゾリウムを包含する。ホースラディシュペルオキシダーゼのための１つの適切な基質はジアミノベンゾエートである。
【０３８５】
現場ハイブリダイゼーションによる染色体異常性を検出するための例示的方法は、Ｗａｎｇなど．， アメリカ特許第５，８５６，０８９号により記載される。このアプローチに従って、例えば対象から得られた固定された組織サンプルから細胞における染色体構成異常性を検出するためのＺｔｎｆｒ１２プローブによる現場ハイブリダイゼーションを行うための方法は、
（１）患者からの固定された組織サンプルを獲得し、
（２）段階（１）において得られた固定された組織サンプルを、亜硫酸水素イオン組成物により前処理し、
（３）前記固定された組織サンプルをプロテイナーゼにより消化し、
【０３８６】
（４）段階（３）の消化された、固定された組織サンプルから得られる細胞に対して、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子に対して特異的にハイブリダイズするプローブにより現場ハイブリダイゼーションを行い、ここでハイブリダイズされたプローブのシグナルパターンが得られ、
（５）興味ある正常な決定的染色体領域を有する細胞に対する現場ハイブリダイゼーションを行う場合に得られるハイブリダイズされたプローブの予定されたシグナルパターンに、段階（４）でのハイブリダイズされたプロ−グのシグナルパターンを比較し、そして
（６）段階（４）で得られたシグナルパターンと前記予定されるシグナルパターンとの間の差異を検出することによって、前記患者の細胞における染色体構造異常性を検出する段階を含んで成る。Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子異常性の例は、欠失、増幅、トランスロケーション、逆位及び同様のものを包含する。そのようなアッセイは、例えばＺＴＮＰ４に対する変更された応答性に関連する疾病又は障害を有すると思われる対象からの組織を試験するために使用され得る。
【０３８７】
本発明はまた、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子発現のための診断アッセイを行うための又はＺｔｎｆｒ１２遺伝子における突然変異を検出するためのキットも企画する。そのようなキットは、核酸プローブ、例えば配列番号１のヌクレオチド２７−５７８のヌクレオチド配列、配列番号１のヌクレオチド２７−２３３のヌクレオチド配列、又はその一部を含んで成る二本鎖分子、及び配列番号１のヌクレオチド２７−５７８のヌクレオチド配列、配列番号１のヌクレオチド２７−２３３のヌクレオチド配列、又はその一部を有する一本鎖核酸分子を含んで成る。プローブ分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド及び同様のものであり得る。キットは、ＰＣＲを行うための核酸プライマーを含んで成る。
【０３８８】
そのようなキットは、上記核酸診断アッセイを行うためのすべての必要な要素を含むことができる。キットは、Ｚｔｎｆｒ１２プローブ又はプライマーを含んで成る少なくとももう１つの容器を含むであろう。キットはまた、Ｚｔｎｆｒ１２配列の存在を示すことができる１又は複数の試薬を含んで成る第２容器を含むことができる。そのようなインジケーター試薬の例は、検出できるラベル、例えば放射性ラベル、蛍光色素、化学ルミネセント剤、及び同様のものを包含する。
【０３８９】
キットはまた、Ｚｔｎｆｒ１２プローブ及びプライマーがＺｔｎｆｒ１２遺伝子発現を検出するために使用される、使用者に知られるための手段を含んで成る。例えば、文書の説明書は、封入されている核酸分子が、Ｚｔｎｆｒ１２をコードする核酸分子、又はＺｔｎｆｒ１２コードのヌクレオチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を有する核酸分子のいずれかを検出するために使用され得ることを記載する。その文書の材料は、容器に直接的に適用され、又は文書の材料は、パッケージング挿入体の形で提供され得る。
【０３９０】
１１．Ｚｔｎｆｒ１２を検出するためへの抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体の使用
本発明は、Ｚｔｎｆｒ１２の存在についてインビトロで生物学的サンプルをスクリーンするためへの抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体の使用を企画する。１つのタイプのインビトロアッセイにおいては、抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体が液相において使用される。例えば、生物学的サンプルにおけるＺｔｎｆｒ１２の存在は、生物学的サンプルと、微量のラベルされたＺｔｎｆｒ１２及び抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体とを、Ｚｔｎｆｒ１２とその抗体との間の結合を促進する条件下で混合することによって試験され得る。サンプルにおけるＺｔｎｆｒ１２及び抗−Ｚｔｎｆｒ１２の複合体が、前記複合体を、抗体、例えばＦｃ抗体又はスタフィロコーカスタンパク質Ａと結合する同定されたタンパク質とを接触することによって、反応混合物から分離され得る。生物学的サンプルにおけるＺｔｎｆｒ１２の濃度は、抗体に結合されるラベルされたＺｔｎｆｒ１２の量に反比例し、そして遊離ラベルにされたＺｔｎｆｒ１２の量に直接的に関連する。例示的な試験サンプルは、血液、尿、唾液、組織生検及び検死材料を包含する。
【０３９１】
他方では、抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体が固相キャリヤーに結合されるインビトロアッセイが行われ得る。例えば、抗体が、不溶性支持体、例えばポリマー−被覆されたビーズ、プレート又は管に抗体を結合するために、ポリマー、例えばアミノデキストランに結合され得る。他の適切なインビトロアッセイは、当業者に明らかであろう。
【０３９２】
もう１つのアプローチにおいては、抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体が、生検検体から調製された組織切片においてＺｔｎｆｒ１２を検出するために使用され得る。そのような免疫化学的検出が、比較的多くのＺｔｎｆｒ１２を決定するために、及び試験される組織におけるＺｔｎｆｒ１２の分布を決定するために使用され得る。一般的な免疫化学的技法は、十分に確立されている（例えば、Ｐｏｎｄｅｒ， “Ｃｅｌｌ Ｍａｒｋｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．”ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｍｏｎｋ （ｅｄ．）， ｐａｇｅｓ １１５−３８ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８７）， Ｃｏｌｉｇａｎ ａｔ ｐａｇｅｓ ５．８．１−５．８．８， Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５） ａｔ ｐａｇｅｓ １４．６．１ ｔｏ １４．６．１３ （Ｗｉｌｅｙ ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ １９９０）， ａｎｄ Ｍａｎｓｏｎ （ｅｄ．）， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｖｏｌ． １０： Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｏｃｏｌｓ （Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ． Ｉｎｃ． １９９２） を参照のこと）。
【０３９３】
免疫化学的検出は、生物学的サンプルと抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体とを接触し、そして次に、前記生物学的サンプルと、抗体に結合する検出できるラベルされた分子とを接触せしめることによって行われ得る。例えば、前記検出できるラベルされた分子は、抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体に結合する抗体成分を含んで成る。他方では、抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体は、アビジン／ストレプタビジン（又はビオチン）により接合され、そして検出できるラベルされた分子はビオチン（又はアビジン／ストレプタビジン）を含むことができる。この基本的技法の多くの変法は、当業者に良く知られている。
【０３９４】
他方では、抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体が、抗−Ｚｔｎｆｒ１２免疫接合体を形成するために、検出できるラベルにより接合され得る。適切な検出できるラベルは、例えば放射生同位体、蛍光ラベル、化学ルミネセンスラベル、酵素ラベル、生物ルミネセンスラベル又はコロイド状金を包含する。そのような検出できるラベルされた免疫接合体の製造及び検出方法は、当業者に良く知られており、そして下記により詳細に記載される。
【０３９５】
検出できるラベルは、オートラジオグラフィーにより検出される放射性同位体であり得る。本発明のために特に有用である同位体は、３Ｈ， １２５Ｉ， １３１Ｉ， ３５Ｓ及び１４Ｃである。
【０３９６】
抗−Ｚｔｎｆｒ１２免疫接合体はまた、蛍光化合物によりラベルされ得る。蛍光ラブルされた抗体の存在は、適切な波長の光に免疫接合体を暴露し、そして得られる蛍光を検出することによって決定される。蛍光ラベル化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド及びフルオレサミンを包含する。
【０３９７】
他方では、抗−Ｚｔｎｆｒ１２免疫接合体は、化合物ルミネセンス化合物に抗体化合物を接合することによって、検出的にラベルされ得る。化学ルミネセンス−標識された免疫接合体の存在は、化学反応の間に生じるルミネセンスの存在を検出することによって決定される。化学ルミネセンスラベリング化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びオキサレートエステルを包含する。
【０３９８】
同様に、化学ルミネセンス化合物は、本発明の抗−Ｚｔｎｆｒ１２免疫接合体をラベルするために使用され得る。生物発光は、触媒タンパク質が化学ルミネセンス反応の効率を高める生物学的システムに見出されるタイプの化学ルミネセンスである。生物ルミネセンスタンパク質の存在は、ルミネセンスの存在を検出することによって決定される。ラベリングのために有用である生物ルミネセンス化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンを包含する。
【０３９９】
他方では、抗−Ｚｔｎｆｒ１２免疫接合体は、酵素に抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体化合物を接合することによって検出できるようラベルされ得る。抗−Ｚｔｎｆｒ１２−酵素接合体が適切な基質の存在下でインキュベートされる場合、酵素成分は、分光光度、蛍光又は可視手段により検出され得る化学成分を生成するために基質と反応する。多くの特異的免疫接合体を検出できるようにラベルするために使用され得る酵素の例は、β−ガラクトシダーゼ、グルコオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼを包含する。
【０４００】
当業者は、本発明に従って使用され得る他の適切なラベルを知っているであろう。抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体へのマーカー成分の結合は、当業界において知られている標準技法を用いて達成され得る。これに関しての典型的な方法論は、Ｋｅｎｎｅｄｙなど．， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ ７０：１ （１９７６）， Ｓｃｈｕｒｓなど．， Ｃｌｉｍ． Ａｃｔａ ８１：１ （１９７７）， Ｓｈｉｈなど．， Ｉｎｔ’ｌ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ４６：１１０１ （１９９０）， ｓｔｅｉｎなど．， Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ． ５０：１３３０ （１９９０）， 及びＣｏｌｉｇａｎ、前記により記載される。
【０４０１】
さらに、免疫化学的検出の便利さ及び多様性は、アビジン、ストレプタビジン及びビオチンにより接合された抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体を用いることによって増強され得る（例えば、Ｗｉｌｃｈｅｋ． など．， （ｅｄｓ．）， “Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，” Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １８４ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９０）， ａｎｄ Ｂａｙｅｒなど．， “Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，” ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １０， Ｍａｎｓｏｎ （ｅｄ．） ｐａｇｅｓ １４９−１６２ （Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ． Ｉｎｃ． １９９２） を参照のこと）。
【０４０２】
イムノアッセイを行うための方法は十分に確立されている。例えば、Ｃｏｏｋ ａｎｄ Ｓｅｌｆ， “Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｄｉａｇｏｎｏｓｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，” ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｒｉｔｔｅｒ ａｎｄ Ｌａｄｙｍａｎ （ｅｄｓ．）， Ｐａｇｅｓ １８０−２０８． （Ｃａｍｂｒｉｄｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９５）， Ｐｅｒｒｙ， “Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｏｏｇｙ”， ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ； Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｂｉｒｃｈ ａｎｄ Ｌｅｎｎｏｘ （ｅｄｓ．）， ｐａｇｅｓ １０７−１２０ （Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． １９９５）， ａｎｄ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ， Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９６ を参照のこと。
【０４０３】
本発明はまた、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子発現についての免疫学的診断アッセイを行うためのキットも企画する。そのようなキットは、抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体又は抗体フラグメントを含んで成る少なくとも１つの容器を含んで成る。キットはまた、Ｚｔｎｆｒ１２抗体又は抗体フラグメントの存在を示すことができる１又は複数の試薬を含んで成る第２容器を含むことができる。そのようなインジケーター試薬の例は、検出できるラベル、例えば放射性ラベル、蛍光ラベル、化学ルミネセンスラベル、酵素ラベル、生物ルミネセンスラベル、コロイド状金及び同様のものを包含する。
【０４０４】
キットはまた、Ｚｔｎｆｒ１２抗体又は抗体フラグメントが、Ｚｔｎｆｒ１２タンパク質を検出するために使用される、使用者に伝達するための手段を含んで成る。例えば、文書の説明書は、封入される抗体又は抗体フラグメントが、Ｚｔｎｆｒ１２を検出するために使用され得ることを言及する。文書の材料は容器に直接的に適用され、又は文書の材料は、パッケージング挿入体の形で提供され得る。
【０４０５】
１２．Ｚｔｎｆｒ１２活性を有するポリペプチドの治療的使用
Ｚｔｎｆｒ１２活性を有するアミノ酸配列は、Ｚｔｎｆｒ１２リガンド（例えば、ＺＴＮＦ４）を結合し、そして従って、Ｚｔｎｆｒ１２リガンドの結合を内因性Ｚｔｎｆｒ１２受容体により妨げることにより、免疫系を調節するために使用され得る。従って、本発明は、Ｚｔｎｆｒ１２活性を有するタンパク質、ポリペプチド及びペプチド（例えば、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチド（例えば、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチド、Ｚｔｎｆｒ１２類似体（例えば、抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗−イディオタイプ抗体）、及びＺｔｎｆｒ１２融合タンパク質））の、適切な量のＺｔｎｆｒ１２ポリペプチドを欠いているか、又は過剰のＺＴＮＦ４を生成する対象への使用を包含する。
【０４０６】
対照的に、Ｚｔｎｆｒ１２アンタゴニスト（例えば、抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体）が、過剰のＺＴＮＦ４又はＺｔｎｆｒ１２を生成する対象を処理するために使用され得る。それらの分子は、処理の必要ないずれかの対象に投与され、そして本発明は、獣医学的及びヒト治療使用を企画する。例示的対象は、哺乳類対象、例えば農業用動物、家畜及びヒト患者を包含する。ヒト又はネズミＺｔｎｆｒ１２ポリペプチドが、それらの用途のために使用され得る。
【０４０７】
Ｚｔｎｆｒ１２活性を有する分子は、自己免疫疾患、Ｂ細胞癌、免疫調節、ＩＢＤ及びいずれかの抗体介在性病理学（例えば、ＩＴＣＰ、重症筋無力症及び同様のもの）、腎疾患、間接的Ｔ細胞免疫応答、移植片拒絶及び対宿主移植片病の処理のために使用され得る。本発明ポリペプチドは、免疫応答の間、Ｂ細胞応答を特異的に調節するために標的化され得る。さらに、本発明のポリペプチドは、Ｂ細胞の成長、他の細胞の成長、抗体生成及びサイトカイン生成を調節するために使用され得る。本発明のポリペプチドはまた、ＺＴＮＦ４の増殖効果を中和することによって、Ｔ細胞及びＢ細胞伝達を調節することができる。
【０４０８】
本発明のＺｔｎｆｒ１２ポリペプチドは、ＺＴＮＦ４ポリペプチドの上昇が関与する、プレ−Ｂ又はＢ−細胞白血病、例えば血漿細胞白血病、慢性又は急性リンパ球性白血病、骨髄腫、例えば多発性骨髄腫、血漿細胞骨髄腫、内皮骨髄腫及び巨大細胞骨髄腫、及びリンパ腫、例えば非ホドキンスリンパ腫を処理するためにＺＴＮＦ４の効果を中和するために有用である。本明細書に記載される分子により処理され得るＢ細胞リンパ腫の追加の例は、バーキットリンパ腫、非バーキットリンパ腫、小胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、大細胞リンパ腫、周辺領域リンパ腫、被膜細胞リンパ腫、大細胞型リンパ腫（例えば、免疫芽球性リンパ腫）、小リンパ性リンパ腫、及び他のＢ細胞リンパ腫を包含する。
【０４０９】
ＺＴＮＦ４は、ＣＤ８＋細胞、単球、樹状突起細胞、活性化された単球において発現され、このことは、一定の自己免疫疾患においては、細胞毒性Ｔ−細胞がＺＴＮＦ４の過剰生成を通してＢ−細胞生成を刺激することを示す。Ｂ−リンパ球の作用を選択的に阻止する免疫抑制リンパ質が、疾病の処理に使用される。自己抗体生成は、いくつかの自己免疫疾患に共通し、そして疾病の組織破壊及び悪化に寄与する。自己抗体はまた、免疫複合体沈着合併症の発生を導き、そして全身性エリテマトーデス、例えば腎不全、神経痛症状及び死の多くの症状を導く。
【０４１０】
細胞応答に無関係な調節抗体生成はまた、多くの疾病状態において有益である。Ｂ細胞はまた、リウマチ様関節炎における関節炎原性（ａｒｔｈｒｉｔｏｇｅｎｉｃ）免疫グロブリンの分泌において役割を演じることが示されている。ＺＴＮＦ４−刺激された抗体生成の阻害は、自己免疫疾患、例えば重症筋無力症及びリウマチ様関節炎の処理において有益である。免疫抑制剤、例えばＢ−リンパ球の作用を選択的に阻止するか又は中和する可溶性Ｚｔｎｆ１２は、そのような目的のために有用である。
【０４１１】
本発明は、自己免疫疾患に関連するか又は関連しない、最終段階腎臓疾患に関連するＢ−細胞の作用を選択的に阻止するか又は中和するためにＺｔｎｆｒ１２ポリペプチド、融合体、アゴニスト又はアンタゴニストを使用する方法を提供する。そのような方法はまた、免疫学的腎疾患のためにも有用である。そのような方法は、疾病、例えば膜ネフロパシー、ＩｇＡネフロパシー又はＢｅｒｇｅｒ’ｓ病に関連する糸球体腎炎、ＩｇＭネフロパシー、Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ’ｓ病、後−感染性糸球体腎炎、糸球体間質増殖性疾患、慢性リンパ性白血病、微少変化ネフローゼ症候群を処理するために有用である。
【０４１２】
そのような方法はまた、狼瘡、多発性動脈炎、Ｈｅｎｏｃｈ−Ｓｃｈｏｎｌｅｉｎ， 硬皮症、ＨＩＶ−関連疾患、アミロイド症、又は溶血性尿毒症候群のような疾病に関連する二次糸球体腎炎又は処理するための治療用途として作用する。本発明の方法はまた、慢性腎盂腎炎に関連する介在性腎炎又は腎盂腎炎、無痛性乱用、腎石炭、他の剤により引き起こされるネフロパシー、腎石症又は慢性又は急性介在性腎炎を処理するための治療用途の一部としても有用である。
【０４１３】
本発明の方法はまた、高血圧性又は大血管疾患、例えば腎動脈狭窄又は閉塞、及びコレステロール塞栓又は腎塞栓の処理へのＺｔｎｆｒ１２ポリペプチド、融合体、抗体又はアンタゴニストの使用も包含する。
本発明はまた、腎又は泌尿器新生物、多発性骨髄腫、リンパ腫、Ｌ鎖ニューロパシー又はアミロイドーシスの処理のための方法を提供する。
本発明はまた、ぜん息及び他の慢性気道疾患、例えば気管支炎及び気腫の処理のために、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチド、融合体、抗体、アゴニスト又はアンタゴニストを用いて、活性化されたＢ細胞を阻止し、又は阻害するための方法を提供する。
【０４１４】
免疫抑制への使用のために、特に対宿主性移植片病及び移植片拒絶に関してのそのような治療使用のために、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチド、融合体、抗体、アゴニスト又はアンタゴニストを用いて、エフェクターＴ細胞応答を阻害するか又は応答を阻害するか又は中和するための方法もまた提供される。さらに、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチド、融合体、抗体、アゴニスト又はアンタゴニストは、そのような自己免疫疾患、例えばインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）及びクローン病の処理のための治療プロトコールにおいて有用である。本発明の方法は、慢性炎症性疾患を処理するために、特に関節痛、腫張、貧血及び他の関連する症状を低めるために、及び敗血性ショックを処理するために追加の治療価値を有する。
【０４１５】
Ｚｔｎｆｒ１２アゴニストとして同定される化合物はまた、体液性免疫応答を増強するためにも有用である。Ｂ細胞応答は、感染性疾病、例えば細菌、ウィルス、原生動物及び寄生性感染の攻撃において重要である。感染性微生物に対する抗体は、抗原に結合することによって病原体を固定し、続いて補体介在性溶菌又は細胞介在性攻撃を伴なう。Ｚｔｎｆｒ１２アゴニストは、体液性応答を増強するよう作用し、そして感染性疾病又は免疫無防備状態の危険性の個人のための有用な治療剤であり、又はワクチン接種へのサプリメントとして有用である。
【０４１６】
十分に確立された動物モデルは、ある疾病状態における本発明の可溶性Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドのインビボ効能を試験するために利用できる。特に、可溶性Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチド及びポリペプチドフラグメントは、自己免疫疾患の多くの動物モデル、例えばＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）のモデルとして作用する、ＭＲＬ−ｌｐｒｌｌｐｒ又はＮＺＢ×ＮＺＷ Ｆ１近交系マウス株においてインビボで試験され得る。そのような動物モデルは、当業者において知られており、そして例示的モデル、例えばＳＬＥの自発形を進行するＮＺＢＷマウス、実験用アレルギー性脳脊髄炎のためのネズミモデル、コラーゲン誘発性関節炎ネズミモデル、ネズミ実験用自己免疫重症筋無力症、及び同様のものが上記に記載されている。
【０４１７】
一般的に、投与されるＺｔｎｆｒ１２（又はＺｔｎｆｒ１２類似体又は融合タンパク質）の用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、一般的な医学的状態及びこれまでの医学的歴史のような要因に依存して変化するであろう。典型的には、約１ｐｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ（剤の量／患者の体重）の範囲でのＺｔｎｆｒ１２の用量（但し、それよりも低いか又は高い用量もまた、環境が指図する場合、投与され得る）を、受容体に供給することが所望される。
【０４１８】
Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプイドの対象への投与は、局部カテーテルを通しての灌流によるか又は直接的な病変内注入による、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、鞘内投与であり得る。注射により治療用タンパク質を投与する場合、投与は連続的注入によるか、又は一回又は複数回のボーラスによることができる。
【０４１９】
投与の追加経路は、経口、粘膜、肺及び経皮を包含する。経口供給は、ポリエステル微小球、ゼイン微小球、プロテイノイド微小球、ポリシアノアクリレート微小球及び脂質基剤システムのために適切である（例えば、ＤｉＢａｓｅ ａｎｄ Ｍｏｒｒｅｌ， “Ｏｒａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ”， ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ： Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｓａｎｄｅｒｓ ａｎｄ Ｈｅｎｄｒｅｎ （ｅｄｓ．）， ｐ．２５５−２８８ （Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９７７） を参照のこと）。鼻腔内供給の実行可能性は、インスリン投与のそのような態様により例示される（例えば、Ｈｉｎｃｈｃｌｉｆｆｅ ａｎｄ Ｉｌｌｕｍ， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． ３５： １９９ （１９９７） を参照のこと）。Ｚｔｎｆｒ１２を含んで成る乾燥又は液体粒子は、乾燥−粉末分散機、液体エーロゾル発生器又はネブライザーの助けにより調製され、そして吸入され得る（例えば、Ｐｅｔｔｉｔ ａｎｄ Ｇｏｍｂｏｔｚ， ＴＩＢＴＥＣＨ １６： ３４３ （１９９８）； Ｐａｔｔｏｎ など．， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． ３５： ２３５ （１９９９） を参照のこと）。
【０４２０】
このアプローチは、エーロゾル化されたインスリンを肺に供給する電動吸入器であるＡＥＲＸ糖尿病治療システムにより例示される。研究によれば、４８，０００ｋＤａほどの大きなタンパク質が、経皮投与の実行可能性を例示する、低周波超音波の助けにより治療濃度で皮膚を通して供給されることが示された（Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９： ８５０ （１９９５））。エレクトロポレーションを用いての経皮供給は、Ｚｔｎｆｒ１２活性を有する分子を投与するもう１つの手段を提供する（Ｐｏｔｔｓなど．， Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０： ２１３ （１９９７））。
【０４２１】
Ｚｔｎｆｒ１２結合活性を有するタンパク質、ポリペプチド又はヘプチドを含んで成る医薬組成物は、医薬的に有用な組成物を調製する既知の方法に従って配合され得、それによれば、治療用タンパク質が医薬的に許容できるキャリヤーと共に混合される。組成物は、その投与が受容体患者により許容され得る場合、“医薬的に許容できるキャリヤー”であると言われる。無菌リン酸緩衝溶液は、医薬的に許容できるキャリヤーの１つの例である。他の適切なキャリヤーは、当業者に良く知られている。例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ （ｅｄ．）， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９５） を参照のこと。
【０４２２】
治療のためには、Ｚｔｎｆｒ１２活性を有する分子及び医薬的に許容できるキャリヤーが、治療的に有効な量で患者に投与される。Ｚｔｎｆｒ１２活性を有するタンパク質、ポリペプチド又はペプチド、及び医薬的に許容できキャリヤーの組み合わせは、その投与される量が生理学的に有意である場合、“治療的に有効な量”で投与されると言われる。剤は、その存在が受容体患者の生理学において検出される変化をもたらす場合、生理学的に有意である。例えば、炎症を処理するために使用される剤は、その存在が炎症応答を緩和する場合、生理学的に有意である。もう１つの例として、腫瘍細胞の増殖を阻害するために使用される剤は、その剤の投与が腫瘍細胞の数の低下、低められた転位、固形腫瘍のサイズの低下、又は腫瘍の高められた壊死をもたらす場合、生理学的に有意である。
【０４２３】
Ｚｔｎｆｒ１２（又はＺｔｎｆｒ１２類似体又は融合タンパク質）を含んで成る医薬組成物は、液体形、エーロゾル、又は固体形で維持され得る。液体形は、注射用溶液及び経口懸濁液により例示される。典型的な固体形は、カプセル、錠剤及び調節された開放形を包含する。後者の形は、ミニ浸透ポンプ及び移植体により例示される（Ｂｒｅｍｅｒ など．， Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０：２３９ （１９９７）： Ｒａｎａｄｅ． “Ｉｍｐｌａｎｔｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，” ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｒａｎａｄｅ ａｎｄ Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ （ｅｄｓ．）， ｐａｇｅｓ ９５−１２３ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９５）； Ｂｒｅｍｅｒ など．， “Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｗｉｔｈ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｐｕｍ−ｓ，” ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ： Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｓａｎｄｅｒｓ ａｎｄ Ｈｅｎｄｒｅｎ （ｅｄｓ．）， Ｐａｇｅｓ ２３９−２５４ （Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９９７）； Ｙｅｗｅｙ など．， “Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ａ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｉｍｐｌａｎｔ，” ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ： Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｓａｎｄｅｒｓ ａｎｄ Ｈｅｎｄｒｅｎ （ｅｄｓ．）， Ｐａｇｅｓ ９３−１１７ （Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９９７））。
【０４２４】
リポソームは、治療用ポリペプチドを、患者に、静脈内、腹膜内、鞘内、筋肉内、皮下、又は経口、吸入又は鼻腔内供給するための１つの手段を提供する。リポソームは、水性区画を取り組む１又は複数の脂質二層から成る微小ビークルである（一般的には、Ｂａｋｋｅｒ Ｗｏｕｄｅｎｂｅｒｇ など．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １２ （Ｓｕｐｐｌ． １）： Ｓ６１ （１９９３）， Ｋｉｍ Ｄｒｕｇｓ ４６：６１８ （１９９３）， ａｎｄ Ｒａｎａｄｅ， “Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｕｓｉｎｇ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｓ Ｃａｒｒｉｅｒｓ，” ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｒａｎａｄｅ ａｎｄ組生Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ （ｅｄｓ．）， ｐａｇｅｓ ３−２４ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９５）を参照のこと）。
【０４２５】
リポソームは、組成において細胞膜に類似し、そして結果として、リポソームは安全に投与され、そして生分解性である。調製方法に依存して、リポソームは、単層又は多層性であり得、そしてリポソームは０．０２μｍ〜１０μｍ以上の範囲の直径でサイズ的に変化することができる。種々の剤がリポソームに封入され得る：疎水性剤は二層に分割され、そして親水性剤は内部水性空間内に封入される（例えば、Ｍａｃｋｙ など．， Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ （Ｊｏｈｎ Ｌｉｂｂｅｙ １９８７）， 及びＯｓｔｒｏなど．， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊ． Ｈｏｓｐ． Ｐｈａｒｍ． ４６： １５７６ （１９８９） を参照のこと）。さらに、リポソームサイズ、二層の数、脂質組成、及びリポソームの電荷及び表面性質を変えることにより、封入される剤の治療利用性を調節することが可能である。
【０４２６】
リポソームは、実質的にいずれかのタイプの細胞に吸着することができ、そして次に、封入された剤をゆっくりと開放する。他方では、吸収されたリポソームは、食細胞性である細胞によりエンドサイト−シス化され得る。エンドサイト−シスに続いて、リポソーム脂質のリソソーム内分解が伴ない、そして封入された剤が開放される（Ｓｃｈｅｒｐｈｏｆ など．， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ４４６： ３６８ （１９８５））。静脈内投与の後、小さなリポソーム（０．１〜１．０μｍ）は、典型的には、肝臓及び脾臓に主として位置する網内細胞系の細胞により摂取されるが、ところが３．０μｍよりも大きなリポソームは肺に沈着される。網内細胞系の細胞による小さなリポソームのこの好ましい摂取は、マクロファージ及び肝臓の腫瘍に化学治療剤を供給するために使用されて来た。
【０４２７】
網内細胞系は、いくつかの方法、例えば多量のリポソーム粒子による飽和、又は薬理学的手段による選択的マクロファージ不活性化により回避され得る（Ｃｌａａｓｓｅｎなど．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ８０２： ４２８ （１９８４））。さらに、リポソーム膜中への糖脂質−又はポリエチレングリコール−誘導されたリン脂質の組み込みは、網内細胞系による有意に低められた摂取をもたらすことが示されている（Ａｌｌｅｎ など．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １０６８：１３３ （１９９１）； Ａｌｌｅｎ など．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １１５０： ９ （１９９３））。
【０４２８】
リポソームはまた、リン脂質組成を変えることによって、又はリポソーム中に受容体又はリガンドを挿入することによって、特定の細胞又は器官を標的化するためにも調製され得る。例えば、高い含有率の非イオン性界面活性剤により調製されたリポソームが、肝臓を標的化するために使用されて来た（Ｈａｙａｋａｗａなど．， 日本特許０４−２４４，０１８号；Ｋａｔｏなど．， Ｂｉｏｌ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． １６：９６０ （１９９３））。それらの配合物は、メタノールにおいて、大豆ホスファチジルコリン、α−トコフェロール及びエトキシル化され、水素付加されたヒマシ油（ＨＣＯ−６０）を混合し、前記混合物を真空下で濃縮し、そして次に、前記混合物を水により再構成することによって調製された。大豆由来のステリルグルコシド混合物（ＳＧ）及びコレステロール（Ｃｈ）と共にジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）のリポソーム配列物はまた、肝臓を標的化することが示されている（Ｓｈｉｍｉｚｕなど．， Ｂｉｏｌ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ２０：８８１（１９９７））。
【０４２９】
他方では、種々の標的化リガンドが、リポソーム、例えば抗体、抗体フラグメント、炭水化物、ビタミン及び輸送タンパク質の表面に結合され得る。例えば、リポソームは、肝臓細胞の表面上で独占的に発現されるアシアログリコプロテイン（ガラクトース）受容体標的化するために、枝分かれ型のガラクトシル脂質誘導体により変性され得る（Ｋａｔｏ ａｎｄ Ｓｕｇｉｙａｍａ， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒ． Ｄｒｕｇ． Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ． １４： ２８７ （１９９７）； Ｍｕｒａｈａｓｈｉなど．， Ｂｉｏｌ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ２０：２５９ （１９９７））。同様に、Ｗｕなど．， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２７： ７７２ （１９８８） は、アジアロフェチュインによるリポソームのラベリングが短くされたリポソーム結晶半減期を導き、そしてアジアロフェチュイン−ラベルされたリポソームの肝細胞による摂取を非常に高めたことを示している。
【０４３０】
他方では、枝分かれ型のガラクトシル脂質誘導体を含んで成るリポソームの肝臓蓄積が、アジアロフェチュインの前注入により阻害され得る（Ｍｕｒａｈａｓｈｉなど．， Ｂｉｏｌ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ２０： ２５９ （１９９７））。ポリアコニチル化されたヒト血清アルブミンリポソームは、肝臓細胞へのリポソームの標的化のためのもう１つのアプローチを提供する（Ｋａｍｐｓ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４： １１６８１ （１９９７））。さらに、Ｇｅｈｏなど．， （アメリカ特許第４，６０３，０４４号）は、肝臓の特殊化された代謝細胞に関連する肝胆管受容体に対する特異性を有する、肝細胞−指図されたリポソーム小胞供給システムを記載する。さらに、抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体成分は、Ｚｔｎｆｒ１２発現細胞、例えばＢ細胞起源の腫瘍細胞にリポソームを方向づけるために使用され得る。
【０４３１】
組織標的化へのより一般的なアプローチにおいては、標的細胞は、標的細胞により発現されるリガンドに対して特異的な、ビオチニル化された抗体によりプレラベルされる（Ｈａｒａｓｙｍなど．， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． ３２： ９９ （１９９８））。遊離抗体の血漿排除の後、ストレプタビジン−接合されたリポソームが投与される。もう１つのアプローチにおいては、標的化抗体は、リポソームに直接的に結合される（Ｈａｒａｓｙｍなど．， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ． Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． ３２： ９９ （１９９８））。
【０４３２】
Ｚｔｎｆｒ１２活性を有するポリペプチドは、タンパク質のマイクロカプセル封入の標準技法を用いて、リポソーム内に封入され得る（例えばＡｎｄｅｒｓｏｎなど．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ３１： １０９９ （１９８１）， Ａｎｄｅｒｓｏｎなど．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５０： １８５３ （１９９０）， ａｎｄ Ｃｏｂｅｎなど．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １０６３：９５ （１９９１）， Ａｌｖｉｎｇ など．， “Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ，” ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｖｏｌ． ＩＩＩ， Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ （ｅｄ．）， ｐａｇｅ ３１７ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９３）， Ｗａｓｓｅｆ など．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １４９： １２４ （１９８７）を参照のこと）。上記に示されるように、治療的に有用なリポソームは、種々の成分を含むことができる。例えば、リポソームは、ポリ（エチレングリコール）の脂質誘導体を含むことができる（Ａｌｌｅｎなど．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １１５０： ９ （１９９３））。
【０４３３】
分解性ポリマー微小球が、治療用タンパク質の高い全身レベルを維持するため企画された。微小球は、分解性ポリマー、例えばポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（オルトエステル）、モノ生分解性エチルビニルアセテートポリマー（タンパク質がポリマー封入される）から調製されるＧｏｍｂｏｔｚ ａｎｄ Ｐｅｔｔｉｔ， Ｂｉｏｃｏｎｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ６：３３２ （１９９５）； Ｒａｎａｄｅ， “Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．” Ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｒａｎａｄｅ ａｎｄ Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ （ｅｄｓ．）， ｐａｇｅｓ ５１−９３ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９５）； Ｒｏｓｋｏｓ ａｎｄ Ｍａｓｋｉｅｗｉｃｚ， “Ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，” ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ： Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｓａｎｄｅｒｓ ａｎｄ Ｈｅｎｄｒｅｎ （ｅｄｓ．）， ｐａｇｅｓ ４５−９２ （Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９９７）； Ｂａｒｔｕｓ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：１１６１ （１９９８）； Ｐｕｔｎｅｙ ａｎｄ Ｂｕｒｋｅ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：１５３ （１９９８）； Ｐｕｔｎｅｙ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２：５４８ （１９９８））。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）被覆された超微小球はまた、治療用タンパク質の静脈内投与のためのキャリヤーを提供することができる（例えば、Ｇｒｅｆなど．， Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０：１６７ （１９９７） を参照のこと）。
【０４３４】
本発明はまた、上記で論じられたように、ポリペプチドがポリマーにより結合されている、Ｚｔｎｆｒ１２活性を有する化学的に変性されたポリペプチド及びＺｔｎｆｒ１２アンタゴニストを企画する。さらに、本発明は、上記で論じられるように、キャリヤー、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチド、及びＢＣＭＡポリペプチド及びＴＡＣＩポリペプチドの少なくとも１つを含んで成る組成物、例えば医薬組成物に関する。
【０４３５】
他の用量形は、例えば、Ａｎｓｅｔ ａｎｄ Ｐｏｐｏｖｉｃｈ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ． ５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ １９９０）， Ｇｅｎｎａｒｏ （ｅｄ．）， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ． １９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９５） により、及びＲａｎａｄｅ ａｎｄ Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ， Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９６） により示されるように、当業者により考案され得る。
【０４３６】
例示のように、医薬組成物は、Ｚｔｎｆｒ１２細胞外ドメイン又はＺｔｎｆｒ１２アンタゴニスト（例えば、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドを結合する抗体又は抗体フラグメント）と共に１つのポリペプチドを含んで成る容器を含んで成るキットとして供給され得る。治療用ポリペプチドは、単一又は複数回の用量のための注射用溶液の形で、又は注射の前、再構成されるであろう無菌粉末として供給され得る。他方では、そのようなキットは、治療用ポリペプチドの投与のための乾燥粉末分散機、液体エーロゾル発生機又はネブライザーを包含することができる。そのようなキットはさらに、医薬組成物の指示及び使用法に対する文書での情報を包含する。さらに、そのような情報は、Ｚｔｎｆｒ１２組成物が、Ｚｔｎｆｒ１２に対する既知の過敏性を有する患者に禁忌を示される提示も包含することができる。
【０４３７】
１３．Ｚｔｎｆｒ１２ヌクレオチド配列の治療的使用
本発明は、Ｚｔｎｆｒ１２を、そのような処理の必要な対象に供給するためへのＺｔｎｆｒ１２ヌクレオチド配列の使用を包含する。Ｚｔｎｆｒ１２活性の増強は、免疫抑制疾患の処理の一部として有用であリ得る。さらに、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子発現を阻害する治療用発現ベクター、例えばアンチセンス分子、リボザイム又は外部案内配列分子が供給され得る。ＺＴＮＦ４活性の阻害は、ＺＴＮＦ４を結合せず、又はＺＴＮＦ４との結合に続いてシグナルを生成しない（例えば、Ｚｔｎｆｒ１２細胞内ドメインにおける突然変異のために）Ｚｔｎｆｒ１２受容体の形をコードする発現ベクターを導入することによって達成され得る。家畜治療用途又はヒト治療用途に関しては、そのような核酸分子は、上記で論じられるように、障害又は疾病を有する対象に投与され得る。上記で論じられた１つの例として、Ｚｔｎｆｒ１２−免疫グロブリン融合タンパク質をコードする核酸分子は、全身性エリトマトーデスの長期治療のために使用され得る。
【０４３８】
Ｚｔｎｆｒ１２を発現する組換え宿主細胞の使用、Ｚｔｎｆｒ１２をコードする裸の核酸の供給、Ｚｔｎｆｒ１２をコードする核酸分子と共にカチオン性脂質キャリヤーの使用、及びＺｔｎｆｒ１２を発現するウィルス、例えば組換えレトロウィルス、組換えアデノ−関連ウィルス、組換えアデノウィルス、及び組換えヘルペス単純ウィルス（ＨＳＶ）の使用を包含する、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子を対象に導入するための多くのアプローチが存在する（例えば、Ｍｕｌｌｉｇａｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０： ９２６ （１９９３）， Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２： １５７５ （１９８８）， ＬａＳａｌｌｅ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０： ９８８ （１９９３）， Ｗｏｌｆｆなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７： １４６５ （１９９０）， Ｂｒｅａｋｆｉｅｌｄ ａｎｄ Ｄｅｌｕｃａ， Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ３： ２０３ （１９９１） を参照のこと）。エクスビボアプローチにおいては、細胞が対象から単離され、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子を発現するベクターによりトランスフェクトされ、そして次に、対象中に移植される。
【０４３９】
Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子の発現をもたらすために、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子をコードするヌクレオチド配列が、遺伝子転写を制御するために、コアプロモーター及び任意には、調節要素に作用可能に連結される発現ベクターが構成される。発現ベクターの一般的な必要性は、上記に記載されている。
【０４４０】
他方では、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子は、組換えウィルスベクター、例えばアデノウィルスベクター（例えば、Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｔｅｒ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： １１４９８ （１９９３）， Ｋｏｌｉｓ など．， ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： ２１５ （１９９４）， Ｌｉなど．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ４；４０３ （１９９３）， Ｖｉｎｃｅｎｔ など．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ５：１３０ （１９９３）， ａｎｄ Ｚａｂｎｅｒ など．， Ｃｅｌｌ ７５： ２０７ （１９９３））、アデノウィルス−関連ウィルスベクター（Ｆｌｏｔｔｅなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： １０６１３ （１９９３））、アルファウィルス、例えば“Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ ウィルス及びＳｉｎｄｂｉｓウィルス（Ｈｅｒｔｚ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ， Ｊ． Ｖｉｒ． ６６： ８５７ （１９９２）， Ｒａｊｕ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ， Ｊ．ｖｉｒ． ６５：２５０１ （１９９１）， 及びＸｉｏｎｇなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３： １１８８ （１９８９））、ヘルペスウィルスベクター（Ｋｏｅｒｉｎｇなど．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ． Ｔｈｅｒａｐ． ５： ４５７ （１９９４））、
【０４４１】
ポックスウィルスベクター（Ｏｚａｋｉなど．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １９３： ６５３ （１９９３）， Ｐａｎｉｃａｌｉ ａｎｄ Ｐａｏｉｅｔｔｉ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９： ４９２７ （１９８２））、ポックスウィルス、例えばカナリヤポックスウィルス又はワクシニアウィルス（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈなど．， Ｐｒｏｃ． Ｈａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ３１７ （１９８９） 及びＦｌｅｘｎｅｒ など．， Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ５６９： ８６ （１９８９））、及びレトロウィルス（Ｂａｂａ など．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ ７９： ７２９ （１９９３）， Ｒａｍ など．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３：８３ （１９９３）， Ｔａｋａｍｉｙａなど．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｒｅｓ． ３３： ４９３ （１９９２）， Ｖｉｌｅ ａｎｄ Ｈａｒｔ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３： ９６２ （１９９３）， Ｖｉｌｅ ａｎｄ Ｈａｒｔ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３： ３８６０ （１９９３） 及びＡｎｄｅｒｓｏｎなど．， アメリカ特許第５，３９９，３４６号）を用いて供給され得る。種々の態様においては、ウィルスベクター自体又はウィルスベクターを含むウィルス粒子のいずれかが、下記に記載される方法及び組成物に使用され得る。
【０４４２】
１つシステムの例示として、アデノウィルス、すなわち二本鎖ＤＮＡウィルスは、異種核酸分子の供給のための十分に特徴づけられた遺伝子トランスファーベクターである（Ｂｅｃｋｅｒなど．， Ｍｅｔｈ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ４３：１６１ （１９９４）； Ｄｏｕｇｌａｓ ａｎｄ Ｃｕｒｉｅｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：４４ （１９９７））。アデノウィルスシステムは、次のいくつかの利点を提供する：（ｉ）比較的大きなＤＮＡ挿入体を収容する能力、（ｉｉ）高い力価に増殖する能力、（ｉｉｉ）広範囲の哺乳類細胞型を感染する能力、及び（ｉＶ）多くの異なったプロモーター、例えば遍在性で、組織特異的な、及び調節できるプロモーターと共に使用される能力。さらに、アデノウィルスは、そのウィルスが血流において安定しているので、静脈内注射により投与され得る。
【０４４３】
アデノウィルスゲノムの一部が欠失されているアデノウィルスベクターを用いて、挿入体は、直接的な連結により、又は同時トランスフェクトされたプラスミドによる相同組換えにより、ウィルスＤＮＡ中に組み込まれる。典型的なシステムにおいては、必須Ｅ１遺伝子がウィルスベクターから欠失され、そしてウィルスは、Ｅ１遺伝子が宿主細胞により供給されない場合、複製しないであろう。損なわれていない動物に静脈内供給される場合、アデノウィルスは主に、肝臓を標的化する。Ｅ１遺伝子欠失を有するアデノウィルス供給システムが宿主細胞において複製しない場合、宿主の組織は、コードされた異種タンパク質を発現し、そしてプロセッシングするであろう。宿主細胞はまた、その対応する遺伝子が分泌シグナル配列を含む場合、異種タンパク質を分泌するであろう。分泌されたタンパク質は、異種遺伝子を発現する組織（例えば、高く血管化された肝臓）から循環に侵入するであろう。
【０４４４】
さらに、ウィルス遺伝子の種々の欠失を含むアデノウィルスベクターは、そのベクターに対する免疫応答を低めるか又は排除するために使用され得る。そのようなアデノウィルスは、Ｅ１−欠失され、そしてさらに、Ｅ２Ａ又はＥ４の欠失を含む（Ｌｕｓｋｙなど．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ２０２２ （１９９８）； Ｒａｐｅｒ など．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９： ６７１ （１９９８））。Ｅ２ｂの欠失はまた、免疫応答を低めることが報告されている（Ａｍａｌｆｉｔａｎｏなど．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：９２６ （１９９８））。完全なアデノウィルスゲノムを欠失することによって、異種ＤＮＡの非常に大きな挿入体が収容され得る。すべてのウィルス遺伝子が欠失されている、いわゆる“不活性（ｇｕｔｌｅｓｓ）”アデノウィルスの生成は、異種ＤＮＡの大きな挿入体の挿入のために特に好都合である（Ｙｅｈ ａｎｄ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ， ＦＡＳＥＢ Ｊ． １１： ６１５ （１９９７） を参照のこと）。
【０４４５】
治療用遺伝子を発現できる組換えウィルスの高い力価のストックが、標準方法を用いて、感染された哺乳類細胞から得られる。例えば、組換えＨＳＶは、Ｖｅｒｏ細胞において、Ｂｒａｎｄｔなど．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ２０４３ （１９９１）， Ｈｅｒｏｌｄ など．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７５：１２１１ （１９９４）， Ｖｉｓａｌｌｉ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｔ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８５：４１９ （１９９１）， Ｇｒａｕなど．， Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ． ３０： ２４７４ （１９８９）， Ｂｒａｎｄｉなど．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈ． ３６：２０９ （１９９２）， 及びＢｒａｗｎ ａｎｄ ＭａｃＬｅａｎ （ｅｄｓ．）， ＨＳＶ Ｖｉｒｕｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ １９９７） により記載のようにして、調製され得る。
【０４４６】
他方では、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子を含んで成る発現ベクターは、リポソームを用いてのインビボリポフェクションにより、対象の細胞に導入され得る。合成カチオン脂質が、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製するために使用され得る（Ｆｅｌｇｎｅｒ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４： ７４１３−１７， １９８７； 及びＭａｃｋｅｙ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ８０２７−３１， １９８８）。インビボで特定の器官中に外因遺伝子を導入するためへのリポフェクションの使用は、一定の実際的な利点を有する。特定細胞型へのトランスフェクションの方向づけが、細胞異質性を有する組織、例えば膵臓、肝臓、腎臓及び脳において特に好都合であることは明白である。脂質は、標的化のために他の分子に化学的に得られる。標的化されたペプチド（例えば、ホルモン又は神経伝達物質）、タンパク質、例えば抗体又は非ペプチド分子は、化学的にリポソームに結合され得る。
【０４４７】
エレクトロポレーションは、投与のもう１つの態様である。例えば、Ａｉｈａｒａ ａｎｄ Ｍｉｙａｚａｋｉ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６： ８６７ （１９９８） は、筋肉中への遺伝子トランスファーのためへのインビボエレクトロポレーションの使用を示している。
遺伝子療法へのもう１つのアプローチにおいては、治療用遺伝子は、Ｚｔｎｆｒ１２の発現を阻害するＺｔｎｆｒ１２アンチセンスＲＮＡをコードすることができる。アンチセンス分子のための適切な配列は、本明細書に開示されるＺｔｎｆｒ１２のヌクレオチド配列から誘導され得る。
【０４４８】
他方では、調節要素がリボザイムをコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結される発現ベクターが構成され得る。リボザイムは、ｍＲＮＡ分子における一定の標的配列に向けられるエンドヌクレアーゼ活性を発現するよう企画され得る（例えば、Ｄｒａｐｅｒ ａｎｄ Ｍａｃｅｊａｋ， アメリカ特許第５，４９６，６９８号、ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ， アメリカ特許第５，５２５，４６８号、Ｃｈｏｗｒｉｒａ ａｎｄ ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ， アメリカ特許第５，６３１，３６９号及びＲｏｂｅｒｔｓｏｎ ａｎｄ Ｇｏｌｄｂｅｒｇ， アメリカ特許第５，２２５，３３７号を参照のこと）。本発明においては、リボザイムはＺｔｎｆｒ１２ ｍＲＮＡと結合するヌクレオチド配列を包含する。
【０４４９】
もう１つのアプローチにおいては、調節要素がＺｔｎｆｒ１２遺伝子をコードするｍＲＮＡ分子のＲＮアーゼＰ−介在性切断を促進できるＲＮＡ転写体の生成を方向づける発現ベクターが構成され得る。このアプローチによれば、外部案内配列が、細胞リボザイムにより続いて切断される、特定種の細胞内ｍＲＮＡに内因性リボザイム、すなわちＲＮアーゼＰを向けるために構成され得る（例えば、Ａｌｔｍａｎなど．， アメリカ特許第５，１６８，０５３号、Ｙｕａｎなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３： １２６９ （１９９４）， Ｐａｃｅなど．， ＷＯ９６／１８７３３号、Ｇｅｏｒｇｅなど．， ＷＯ９６／２１７３１号及びＷｅｍｅｒなど．， ＷＯ９７／３３９９１号を参照のこと）。例えば、前記外部案内配列は、Ｚｔｎｆｒ１２ ｍＲＮＡに対して相補的な１０〜１５個のヌクレオチド配列、及び３’−ＮＣＣＡヌクレオチド配列（ここで、Ｎは好ましくはプリンである）を含んで成る。外部案内配列転写体は、ｍＲＮＡと相補的外部案内配列との間での塩基対の形成により、標的化されたｍＲＮＡ種に結合し、従って、前記塩基対合された領域の５’側に位置するヌクレオチドでのＲＮアーゼＰによるｍＲＮＡの切断を促進する。
【０４５０】
一般的に、Ｚｔｎｆｒ１２ヌクレオチド酸配列を有する治療用ベクター、例えば組換えウィルスを含んで成る組成物の用量は、対照の年齢、体重、身長、性別、一般的な医学的状態及びこれまでの医学的歴史のような要因に依存して変化するであろう。治療用ベクターの適切な投与経路は、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、腫瘍内注射、及び腫瘍を含む腔中への注射を包含する。例示のように、Ｈｏｒｔｏｎなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６： １５５３ （１９９９）は、インターフェロン−αをコードするプラスミドＤＮＡの筋肉内注射がネズミモデルにおいて一次及び転移性腫瘍に対する可能性ある抗腫瘍効果を生成することを示す。
【０４５１】
本発明のウィルスベクター、非ウィルスベクター又はウィルス及び非ウィルスベクターの組み合わせを含んで成る組成物は、医薬的に有用な組成物を調製するための既知方法に従って配合され得、それによれば、ベクター又はウィルスは、医薬的に許容できるキャリヤーと共に混合される。上記で示されるように、組成物、例えばリン酸緩衝溶液は、その投与が受容体対象により許容され得る場合、“医薬的に許容できるキャリヤー”であると言われる。他の適切なキャリヤーは、当業者に良く知られている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １９ｔｈ Ｅｄ． （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． １９９５）， 及びＧｉｌｍａｎ’ｓ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ７ｔｈ Ｅｄ． （ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． １９８５） を参照のこと）。
【０４５２】
治療のためには、治療用遺伝子ベクター、又はそのようなベクターを含んで成る組換えウィルス、及び医薬的に許容できるキャリヤーが、治療的有効量で対象に投与され得る。発現ベクター（又はウィルス）及び医薬的に許容できるキャリヤーの組み合わせは、投与される量が生理学的に有意である場合、“治療的有効量”で投与されると言われる。剤は、その存在が受容体対象の生理学において検出できる変化をもたらす場合、生理学的に有意である。例えば、炎症を処理するために使用される剤は、その存在が炎症応答を緩和する場合、生理学的に有意である。もう１つの例として、腫瘍細胞の増殖を阻害するために使用される剤は、その剤の投与が腫瘍細胞の数の低下、低められた転移、固形腫瘍のサイズの低下、又は腫瘍の低められた壊死をもたらす場合、生理学的に有意である。
【０４５３】
治療用遺伝子発現ベクター又は組換えウィルスにより処理される対象がヒトである場合、治療は好ましくは、体細胞遺伝子治療である。すなわち、治療用遺伝子発現ベクター又は組換えウィルスによるヒトの好ましい処理は、ヒト生殖細胞系の一部を形成し、そして次の世代に通され得る核酸分子を細胞中に導入すること（すなわち、ヒト生殖系遺伝子治療）を必要としない。
【０４５４】
１４．治療的に有用な免疫接合体
本発明は、上記で論じられたように、裸抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体（又はその裸抗体フラグメント）の使用、及び種々の疾病、例えばＢ−細胞悪性疾患の処理をもたらすためへの免疫接合体の使用に関する。免疫接合体は、標準技法を用いて調製され得る。例えば、免疫接合体は、抗体成分に治療剤を間接的に接合することによって生成され得る（例えば、Ｓｈｉｈなど．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ４１： ８３２−８３９ （１９８８）； Ｓｈｉｈなど．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ４６： １１０１−１１０６ （１９９０）； 及びＳｈｉｈなど．， アメリカ特許第５，０５７，３１３号を参照のこと。
【０４５５】
手短には、１つの標準アプローチは、酸化された炭水化物部分を有する抗体成分と、少なくとも１つの遊離アミン機能を有し、そして多くの薬剤、トキシン、キレート化剤、硼素付加物又は他の治療材を負荷されているキャリヤーポリマーとを反応せしめることを包含する。この反応は、最終接合体を形成するために第二アミンへの還元により安定化され得る初期シェフ塩基（イミン）連結をもたらす。
【０４５６】
前記キャリヤーポリマーは、他の実質的に同等のポリマーキャリヤーがまた使用され得るが、少なくとも５０個のアミノ酸残基のアミノデキストラン又はポリペプチドであり得る。好ましくは、最終免疫接合体は、投与の容易性及び治療への使用のためへの効果的標的化のために、水溶液、及び哺乳類血清に可溶性である。従って、キャリヤーポリマー上の安定化官能基は、最終免疫接合体の血清溶解を増強するであろう。
【０４５７】
ポリペプチド治療剤を含んで成る免疫接合体を生成するための他のアプローチにおいては、治療剤は、グルタアルデヒド縮合により、又はポリペプチド上の活性化されたカルボキシ基とアミノデキストラン上のアミンとの反応によりアミノデキストランに結合される。キレート化剤は、放射性金属又は磁気共鳴エンハンサーを含んで成る免疫接合を調製するために抗体成分に結合され得る。例示的キレート化剤は、エチレンジアミン四酢酸及びジエチレントリアミン五酢酸の誘導体を包含する。硼素付加物、例えばカルボランは従来の方法により抗体成分に結合され得る。
【０４５８】
免疫接合体はまた、治療剤と抗体成分とを直接的に接合することによって調製され得る。その一般的方法は、間接的接合方法に類似し、但し治療剤は酸化された抗体成分に直接的に結合されている。
【０４５９】
さらなる例示として、治療剤は、ジスルフィド結合形成を通して、還元された抗体分分のヒンジ領域で結合され得る。例えば、テタヌストキシンペプチドは、抗体成分にペプチドを結合するために使用される単一のシステイン残基により構成され得る。他の手段として、そのようなペプチドは、ヘテロ二官能価架橋剤、例えばＮ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオーネートを用いて、抗体成分に結合され得る。
【０４６０】
そのような接合についての一般的技法は、当業界において知られている。例えば、Ｗｏｎｇ， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９１）； Ｕｐｅｓｌａｃｉｓなど．， “ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ” ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ； Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｂｉｒｃｈなど． （ｅｄｓ．）， ｐａｇｅｓ１８７−２３０ （Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． １９９５）； Ｐｒｉｃｅ， “Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ” ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｒｉｔｔｅｒなど．， （ｅｄｓ．）， Ｐａｇｅｓ ６０−８４ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５） を参照のこと。
【０４６１】
上記のように、抗体のＦｃ領域における炭水化物成分は、治療剤を接合するために使用され得る。しかしながら、Ｆｃ領域は、抗体フラグメントが免疫接合体の抗体成分として使用され得る場合、不在である。それにもかかわらず、抗体又は抗体フラグメントのＬ鎖可変領域中に炭水化物成分を導入することが可能である。例えば、Ｌｅｕｎｇなど．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５４： ５９１９ （１９９６）； Ｈａｎｓｅｎ など．， アメリカ特許第５，４４３，９５３号（１９９５）を参照のこと。次に、構築された炭水化物成分が、治療剤を結合するために使用される。
【０４６２】
さらに、当業者は、接合方法の多くの可能性ある変法を認識するであろう。例えば、炭水化物成分は、血液、リンパ又は他の細胞外流体における損なわれていない抗体又はその抗原−結合フラグメントの半減期を拡張するために、ポリエチレングリコールを結合するために使用され得る。さらに、炭水化物成分又は遊離スルフヒドリル基に治療剤を結合することによって、二価の免疫接合体を構成することが可能である。そのような遊離スルフヒドリル基は、抗体成分のヒンジ領域に位置することができる。
【０４６３】
１つのタイプの免疫接合体は抗体成分及びポリペプチド細胞毒素を含んで成る。適切なポリペプチド細胞毒素の例は、リボソーム不活性化タンパク質である。Ｉ型リボソーム不活性化タンパク質は一本鎖タンパク質であり、そしてＩＩ型リボソーム不活性化タンパク質は、ジスルフィド結合により連結される非同一のサブユニット（Ａ及びＢ鎖）から成る（再考のためには、Ｓｏｒｉａなど．， Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｉａｇｎ． Ｔｈｅｒ． ７： １９３ （１９９２） を参照のこと）。
【０４６４】
有用なＩ型リボソーム不活性化タンパク質は、次のものを包含する：サポナリア・オフィシナリス（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）（例えば、サポリン−１、サポリン−２、サポリン−３、サポリン−６）、モモルジカ・カランチア（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）（例えば、モモルジン）、ビロニア・ジオイカ（Ｂｙｒｏｎｉａ ｄｉｏｉｃａ）（例えば、ブリオジン、ブリオジン−２）、トリコサンテス・キリロウイ（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ ｋｉｒｉｌｏｗｉｉ）（例えば、トリコサンチン、トリコキリン）、ゲロニウム・ムルチフロラム（Ｇｅｌｏｎｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ）（例えば、ゲロニン）、フィトロカ・アメリカナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）（例えば、ヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質、アマゴボウ抗ウィルスタンパク質−ＩＩ、抗ウィルスタンパク質）、及び同様のものからのポリペプチド。リボソーム不活性化タンパク質は、例えばアメリカ特許５，６３５，３８６号（Ｗａｌｓｈなど．，）により記載される。
【０４６５】
適切なＩＩ型リボソーム不活性タンパク質は、リシナス・コムニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（例えば、リシン）、アブラス・プレカトリウム（Ａｂｒｕｓ ｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓ）（例えば、アブリン）、アデニア・ディジタタ（Ａｄｅｎｉａ ｄｉｇｉｔａｔａ）（例えば、モデシン）、及び同様のものからのポリペプチドを包含する。ＩＩ型リボソーム不活性化タンパク質は、ガラクトシドを結合するＢ鎖、及びアデンソインを浄化する毒性Ａ鎖を包含するので、ＩＩ型リボソーム不活性化タンパク質接合体はＡ鎖を包含するべきである。
【０４６６】
追加の有用なリボソーム不活性化タンパク質は、ボウガニン（ｂｏｕｇａｎｉｎ）、クラビン、トウモロコシリボソーム不活性化タンパク質、バカリア・ピラミダタ（Ｖａｃｃａｒｉａ ｐｙｒａｍｉｄａｔａ）リボソーム不活性化タンパク質、ニグリンｂ， 塩基性ニグリン１、エブリン、ラセモシンｂ、ルフィン−ａ、ルフィン−ｂ、ルフィン−Ｓ及び当業者に知られている他のリボソーム不活性化タンパク質を包含する。
【０４６７】
例えば、Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ ａｎｄ Ｓｔｒｉｐｅによる国際公開番号ＷＯ９８／５５６２３号、Ｃｏｌｎａｇｈｉなどによる国際出願番号ＷＯ９７／４９７２６号、Ｈｅｙなどによるアメリカ特許第５，６３５，３８４号、Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ ａｎｄ Ｓｔｒｉｐｅによる国際公開番号ＷＯ９５／０７２９７号、Ａｒｉａｓなどによる国際公開番号ＷＯ９４／２０５４０号、Ｗａｔａｎａｂｅなど．， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０６： ６９７７ （１９８９）； Ｉｓｌａｍ など．， Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ５５： ２２９ （１９９１）， 及びＧａｏなど．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３４７： ２５７ （１９９４） を参照のこと。
【０４６８】
天然に存在するリボソーム不活性化タンパク質はまた、本明細書に記載される標的化組成物のためにも適切であり、そしてそのようなタンパク質は当業者に知られている。リボソーム不活性化タンパク質は、公的に入手できるアミノ酸及びヌクレオチド配列を用いて生成され得る。例示のように、サポリン−６をコードするヌクレオチド配列は、Ｌｏｒｅｎｚｅｔｔｉなど．， アメリカ特許第５，５２９，９３２号により開示され、そしてＷａｌｓｈなど．， アメリカ特許第５，６３５，３８４号は、トウモロコシ及び大麦リボソーム不活性化タンパク質ヌクレオチド及びアミノ酸配列を記載する。さらに、リボソーム不活性化タンパク質はまた市販されている。
【０４６９】
追加のポリペプチド細胞毒素は、リボヌクレアーゼ、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ジフテリア毒素、シュードモナスエキソトキシン及びシュードモナスエンドトキシンを包含する。例えば、Ｐａｓｔａｎなど．， Ｃｅｌｌ ４７： ６４１ （１９８６）， 及びＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ， ＣＡ Ａ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ ４４： ４３ （１９９４） を参照のこと。他の適切なトキシンは、当業者に知られている。
【０４７０】
もう１つの一般的なタイプの有用な細胞毒素は、チロシンキナーゼインヒビターである。チロシンキナーゼによる増殖の活性化は腫瘍の進行及び経過において役割を演じることが示されているので、この活性化は、チロシンキナーゼインヒビターを供給するＺｔｎｆｒ１２抗体成分により阻害され得る。適切なチロシンキナーゼインヒビターは、イソフラボン、例えばゲニステイン（５， ７， ４’−トリヒドロキシイソフラボン）、ダイゼン（７， ４’−ジヒドロキシイソフラボン）及びビオカニンＡ（４−メトキシゲニステイン）及び同様のものを包含する。成長因子にチロシンインヒビターを接合する方法は、例えばアメリカ特許第５，９１１，９９５号（Ｕｃｋｕｎ）により記載される。
【０４７１】
もう１つのグループの有用なポリペプチド細胞毒素は、免疫モジュレーターを包含する。本明細書に使用される場合、“免疫モジュレーター”とは、サイトカイン、幹細胞成長因子、リンフォトキシン、同時刺激分子、造血因子及び同様のもの、並びにそれらの分子の合成類似体を包含する。免疫モジュレーターの例は、壊死因子、インターロイキン（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２〜ＩＬ−２１）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球−コロニー刺激因子及び顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、−β、−γ、−ω及び−τ）、“Ｓ１因子”と称する幹細胞成長因子、エリトロポエチン及びトロンボポエチンを包含する。例示的な免疫モジュレーター成分は、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、インターフェロン−γ、ＴＮＦ−α及び同様のものを包含する。
【０４７２】
免疫モジュレーターを含む免疫接合体は、免疫モジュレーターを標的細胞に供給するための手段を提供し、そして腫瘍細胞に対して特に有用である。免疫モジュレーターの細胞毒性効果は、当業者に良く知られている。例えば、Ｋｌｅｇｅｒｍａｎなど、“Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ｍｏｎｏｋｉｎｅｓ”， ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｐｅｓｓｕｔｏなど． （ｅｄｓ．）， ｐａｇｅｓ ５３−７０ （Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ １９９３） を参照のこと。例示のように、インターフェロンは、種々の細胞の表面上でのクラスＩ組織適合性抗原の高められた発現を誘発することによって細胞増殖を阻害し、そして従って、細胞毒性Ｔリンパ球による細胞の破壊速度を増強する。さらに、腫瘍壊死因子、例えば腫瘍壊死因子−αは、ＤＮＡ断片化を誘発することによって、細胞毒性効果を生成すると思われる。
【０４７３】
本発明はまた、細胞毒素をコードする核酸分子を含んで成る免疫接合体を包含する。このアプローチの例として、Ｈｏｇａｎｓｏｎなど．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９： ２５６５ （１９９８） は、サポリン遺伝子を含んで成る発現ベクターにより縮合されたＦＧＦ−２−ポリリシン接合体を生成することによって、サポリン遺伝子のＦＧＦ−２介在性供給を記載する。
他の適切な毒素は、当業者に知られている。
【０４７４】
細胞毒性ポリペプチド及び抗体成分の接合体は、ポリペプチドを接合するための標準の技法を用いて調製され得る。例えば、Ｌａｍ ａｎｄ Ｋｅｌｌｅｈｅｒ， アメリカ特許第５，０５５，２９１号は、ジフテリア毒素フラグメントＡ又はリシン毒素のいずれかにより接合される抗体の生成を記載する。一般的なアプローチはまた、Ｌａｐｐｉなど．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １６０： ９１７ （１９８９）， Ｓｏｒｉａ など．， Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｉａｇｎ． Ｔｈｅｒ． ７： １９３ （１９９２）， Ｂｕｅｃｈｌｅｒなど．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３４： ７０６ （１９９５）， Ｂｅｈａｒ−Ｃｏｈｅｎなど．， Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ． ３６： ２４３４ （１９９５）， Ｌａｐｐｉ ａｎｄ Ｂａｉｒｄ， アメリカ特許第５，１９１，０６７号、Ｃａｌａｂｒｅｓｉなど．，アメリカ特許第５，４７８，８０４号、及びＬａｐｐｉ ａｎｄ Ｂａｉｒｄ， アメリカ特許第５，５７６，２８８号により記載されるように、サポリンによる線維芽細胞成長因子の接合方法により例示される。
【０４７５】
また、Ｇｈｅｔｉｅ ａｎｄ Ｖｉｔｔｅｔａ， “Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ”， ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｔｉｎｇ： Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｆｒａｎｃｉｓ ａｎｄ Ｄｅｌｇａｄｏ （Ｅｄｓ．）， ｐａｇｅｓ １−２６ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． ２０００）， Ｈａｌｌ （Ｅｄ．）， Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． ２０００）， 及びＮｅｗｔｏｎ ａｎｄ Ｒｙｂａｋ， “Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ”， ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ： Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ， ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｆｒａｎｃｉｓ ａｎｄ Ｄｅｌｇａｄｅ （Ｅｄｓ．）， ｐａｇｅｓ ２７−３５ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． ２０００） を参照のこと。
【０４７６】
一方では、抗体成分及び細胞毒素ポリペプチドを含んで成る融合タンパク質は、標準の方法を用いて生成され得る。細胞毒素ポリペプチド成分を含んで成る融合タンパク質を調製するための方法は、抗体−毒素融合タンパク質生成の業界において良く知られている。例えば、インターロイキン−２成分を含んで成る抗体融合タンパク質は、Ｂｏｌｅｔｉなど．， Ａｎｎ． Ｏｎｃｏｌ． ６： ９４５ （１９９５）， Ｎｉｃｏｌｅｔなど．， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２： １６１ （１９９５）， Ｂｅｃｋｅｒなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３： ７８２６ （１９９６）， Ｈａｎｋなど．， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２： １９５１ （１９９６）， 及びＨｕなど．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６： ４９９８ （１９９６） により記載されている。さらに、Ｙａｎｇなど．， Ｈｕｍ． Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ６： １２９ （１９９５） は、Ｆ（ａｂ’）２ フラグメント及び腫瘍壊死因子−α成分を含む融合タンパク質を記載する。
【０４７７】
抗体−シュ−ドモナスエキソトキシンＡ融合タンパク質は、Ｃｈａｕｄｈａｒｙなど．， Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３９４（１９８９）、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８： ８６１６ （１９９１）， Ｂａｔｒａなど．， ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： ５８６７ （１９９２）， Ｆｒｉｅｄｍａｎなど．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０： ３０５４ （１９９３）， Ｗｅｌｓ など．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎ． ６０： １３７ （１９９５）， Ｆｏｍｉｎａｙａなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： １０５６０ （１９９６）， Ｋｕａｎ など．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５： ２８７２ （１９９６）， 及びＳｃｈｍｉｄｔなど．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎ． ６５： ５３８ （１９９６） により記載されている。
【０４７８】
ジフテリア毒素成分を含む抗体−毒素融合タンパク質は、Ｋｒｅｉｔｍａｎなど．， ｋｅｕｋｅｍｉａ ７： ５５３ （１９９３）， Ｍｉｃｈｏｌｌｓなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８： ５３０２ （１９９３）， Ｔｈｏｍｐｓｏｎなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： ２８０３８ （１９９５）， 及びＶａｌｌｅｒａなど．， Ｂｌｏｏｄ ８８： ２３４２ （１９９６） により記載されている。Ｄｅｏｎａｒａｉｎなど．， Ｔｕｍｏｒ Ｔａｒｇｅｔｔｉｎｇ １： １７７ （１９９５） はＲＮアーゼ成分を有する抗体−毒素融合タンパク質を記載しており、そしてＬｉｎａｒｄｏｕなど．， Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２４−２５： ２４３ （１９９４） は、ＤＮアーゼＩ成分を含んで成る抗体−毒素融合タンパク質を生成した。
【０４７９】
ゲロニンは、Ｂｅｔｔｅｒなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： １４９５１ （１９９５） の抗体−毒素融合タンパク質における毒素成分として使用された。さらなる例として、Ｄｏｈｌｓｔｅｎなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： ８９４５ （１９９４） は、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａを含んで成る抗体−毒素融合タンパク質を報告している。また、Ｎｅｗｔｏｎ ａｎｄ Ｒｙｂａｋ， “Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｒｎａｓｅ Ｓｉｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”， ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ： Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｆｒａｎｃｉｓ ａｎｄ Ｄｅｌｇａｄｏ （Ｅｄｓ．）， ｐａｇｅｓ ７７−９５ （Ｈｕｍａｎａ ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． ２０００） を参照のこと。
【０４８０】
ポリペプチド細胞毒性に代わるものとして、免疫接合体は、細胞毒素成分として放射性同位体を含むことができる。例えば、免疫接合体は、抗−Ｚｔｎｆｒ１２成分及びα−放射性同位体、β−放射性同位体、γ−放射性同位体、Ａｕｇｅｒ電子エミッター、α−粒子を放射する中性子捕獲剤、及び電子保護により崩壊する放射性同位体を含むことができる。適切な放射性同位体は次のものを包含する：１９８Ａｕ， １９９Ａｕ， ３２Ｐ， ３３Ｐ， １２５Ｉ， １３１Ｉ， １２３Ｉ， ９０Ｙ， １８６Ｒｅ， １８８Ｒｅ， ６７Ｃｕ， ２１１Ａｔ， ４７Ｓｃ， １０３Ｐｂ， １０９Ｐｄ， ２１２Ｐｂ， ７１Ｇｅ， ７７Ａｓ， １０５Ｒｈ， １１３Ａｇ， １１９Ｓｂ， １２１Ｓｎ， １３１Ｃｓ， １４３Ｐｒ， １６１Ｔｂ， １７７Ｌｕ， １９１Ｏｓ， １９３ＭＰｔ， １９７Ｈｇ及び同様のもの。
【０４８１】
放射性同位体は、抗体成分に、キレート化剤を通して直接的に、又は間接的に接合され得る。例えば、β−粒子及びγ−線を供給する放射性同位体であると思われる６７Ｃｕは、キレート化剤、すなわちｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミノ四酢酸を用いて、抗体成分に接合され得る。（Ｃｈａｓｅ ａｎｄ Ｓｈａｐｉｒｏ， “Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅｓ”， ｉｎ ｇｅｎｎａｒｏ （ｅｄ．）， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ｐ． ９４３−８６５ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９５））。
【０４８２】
他のものとして、エネルギッシュなβ−粒子を放射する９０Ｙはジエチレントリアミン五酢酸を用いて、抗体成分に結合され得る。さらに、１３１Ｉによる抗体成分の直接的な放射性ラベリングのための典型的な適切な方法は、Ｓｔｅｉｎなど．， Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊ． Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ． ４： ７０３ （１９９１） により記載される。他方では、硼素添加物、例えばカルボランが、標準技法を用いて、抗体成分に結合され得る。
【０４８３】
免疫接合体の調製のためのもう１つの型の適切な細胞毒素は、化学療法薬物である。例示的な化学療法薬物は、窒素マスタード、アルキルスルホネート、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、抗生物質、エピポドフィロトキシン、白金配位錯体、及び同様のものを包含する。化学療法薬物の特定の例は、メトトレキサート、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シトシンアラビノシド、シス−プラチン、ビンデシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、メルファラン、クロラムブシル、マイタンシノイド、カリケアマイシン、タキサノール及び同様のものを包含する。適切な化学療法剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １９ｔｈ Ｅｄ． （Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． １９９５）， 及びＧｏｏｄｍａｎ ａｎｄ ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ７ｔｈ Ｅｄ． （ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． １９８５） に記載される。他の適切な化学治療剤は、当業者に知られている。
【０４８４】
もう１つのアプローチにおいては、免疫接合体は、抗体成分に光活性剤又は色素を接合することにより調製される。蛍光及び他の色原体、又は例えば可視光に対して敏感なポルフィリンは、病変に対して適切な光を向けることによって、病変を検出し、そして処理するために使用されて来た。このタイプの“光放射線”、“光治療”又は“光力学”療法は、例えばＭｅｗなど．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３０； １４７３ （１９８３）， Ｊｏｒｉなど． （ｅｄｓ．）， Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ （Ｌｉｂｒｅｒｉａ Ｐｒｏｇｅｔｔｏ １９８５）， ｏｓｅｒｏｆｆなど．， ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３： ８７４４ （１９８６）， ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇｈ， Ｃｈｅｍ． Ｂｒｉｔａｉｎ ２２： ４３０ （１９８８）， Ｈａｓａｎなど．， ｐｒｏｇ． Ｃｌｉｎ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｓ． ２８８： ４７１（１９８９）， Ｔａｔｓｕｔａなど．， Ｌａｓｅｒｓ Ｓｕｒｇ． Ｍｅｄ． ９： ４２２ （１９８９）， 及びＰｅｌｅｇｒｉｎなど．， Ｃａｎｃｅｒ ６７： ２５２９ （１９９１） により記載される。
【０４８５】
治療のために使用される免疫接合体は、医薬的に許容できる水溶性ポリマー成分を含んで成ることができる。そのようなポリマーを結合するための方法は、当業者に知られており、そしてそれまで記載されて来た。
上記アプローチはまた、免疫接合体を含んで成る多特異的抗体組成物を調製するためにも使用され得る。ポリペプチド細胞毒素はまた、抗体成分への接合の前又は後、上記方法を用いて、適切なポリマーにより接合され得る。可溶性ポリマーはまた、抗体融合タンパク質により接合され得る。
【０４８６】
一般的に、抗−Ｚｔｎｆｒ１２免疫接合体は、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチドの治療使用に関して前で論じられたようにして投与され得る。裸抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体又は抗体フラグメントは、免疫接合体又は抗体融合タンパク質投与により補充され得る。１つの変法においては、裸抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体（又は裸抗体フラグメント）は、低用量の放射性ラベルされた抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体又は抗体フラグメントと共に投与される。第２の変法として、裸抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体（又は抗体フラグメント）は、低用量の放射性ラベルされた抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体−サイトカイン免疫接合体と共に投与される。
【０４８７】
第３の変法として、裸抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体（又は抗体フラグメント）は、放射性ラベルされていない抗−Ｚｔｎｆｒ１２−サイトカイン免疫接合体と共に投与される。“低用量”の１３１Ｉ−ラベルされた免疫接合体に関しては、好ましい用量は、１５〜４０ｍＣｉであり、そして最も好ましい範囲は２０〜３０ｍＣｉである。対照的に、好ましい用量の９０Ｙ−ラベルされた免疫接合体は１０〜３０ｍＣｉであり、そして最も好ましい範囲は１０〜２０ｍＣｉである。同様に、二特異的抗体成分は、免疫接合体又は抗体融合タンパク質投与により補充される。
【０４８８】
熱中性子活性化治療のための硼素添加された−負荷キャリヤーを有する免疫接合体は通常、類似する手段でもたらされるであろう。しかしながら、中性子照射が行われる前、標的化されていない免疫接合体がクリアランスになるまで待つことが好都合である。クリアランスは、免疫接合体に結合する抗体を用いて促進され得る。この一般的原理の記載については、アメリカ特許第４，６２４，８４６号を参照のこと。
【０４８９】
本発明はまた、免疫モジュレーターが、正常細胞及び特に造血細胞の放射線−誘発された、又は薬剤−誘発された毒性を妨げるか、移動せしめるか又は逆転するために投与される処理方法にも関する。付加的免疫モジュレーター療法は、受容体哺乳類の高められた耐性のために、より高い用量の細胞毒性剤の投与を可能にする。さらに、付加的免疫モジュレーター療法は、用量制限の骨髄毒性を妨げるか、軽減するか又は逆転することができる。付加的療法のための適切な免疫モジュレーターの例は、顆粒球−コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子、トロンボポイエチン、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−１２及び同様のものを包含する。付加的免疫モジュレーター治療方法は、アメリカ特許第５，１２０，５２５号（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ）により開示される。
【０４９０】
抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体及び免疫接合体は、Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチド及びＺｔｎｆｒ１２融合タンパク質の評価について上記に記載される、インビトロアプローチ及び動物モデルを用いて試験され得る。
【０４９１】
抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体療法の効能は、本明細書に記載される免疫接合体及び他の形の補充療法により裸抗体成分を補充することによって増強され得る。そのような多様レジメにおいては、補充治療組成物は、裸抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体の投与の前、それと同様に又はその後、投与され得る。本発明の多様性療法はさらに、抗−Ｚｔｎｆｒ１２免疫接合体の投与により補充される補抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体成分による免疫治療を包含する。もう１つの形の多様性治療においては、対象は、裸抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体及び標準の癌化学療法を受ける。
【０４９２】
医薬組成物は、抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体成分又は二特異的抗体成分を含んで成る容器を含んで成るキットとして供給され得る。治療分子は、単一又は複数回用量のための注射用溶液の形で、又は注射の前、再構成される無菌粉末として提供され得る。他方では、そのようなキットは、抗−Ｚｔｎｆｒ１２抗体成分の投与のための乾燥−粉末分散器、液体エアロゾル発生器又はネブライザーを包含することができる。そのようなキットはさらに、医薬組成物の表示及び使用法についての文章情報を含んで成る。さらに、そのような情報は、前記組成物が外因性抗体に対して既知の過敏性を有する患者において禁忌を示される言明を包含することができる。
【０４９３】
１５．トランスジェニックマウスの生成
トランスジェニックマウスは、すべての組織において、又は組織−特異的又は組織に好ましい調節要素の制御下で、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子を過剰発現するよう構築され得る。Ｚｔｎｆｒ１２のそれらの過剰生成体は、過剰発現に起因する表現型を特徴づけるために使用され得、そしてトランスジェニック動物は過剰Ｚｔｎｆｒ１２により引き起こされるヒト疾病のためのモデルとして作用することができる。Ｚｔｎｆｒ１２を過剰発現するトランスジェニックマウスはまた、大きな動物の乳汁又は血液におけるＺｔｎｆｒ１２、例えば可溶性Ｚｔｎｆｒ１２の生成のためのモデル生物反応体を提供する。
【０４９４】
トランスジェニックマウスを生成するための方法は、当業者に良く知られている（例えば、Ｊａｃｏｂ， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ，” ｉｎ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｏｆ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ， Ｊａｃｏｂ （ｅｄ．）， Ｐａｇｅｓ １１１−１２４ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｔｄ． １９９４）， Ｍｏｎａｓｔｅｒｓｋｙ ａｎｄ Ｒｏｂｌ （ｅｄｓ．）， Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ （ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ １９９５）， ａｎｄ Ａｂｂｕｄ ａｎｄ Ｎｉｌｓｏｎ， “Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｉｃ Ｍｉｃｅ，” ｉｎ Ｇｅｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ： ｕｓｉｎｇ Ｎａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｒｔ ｏｆ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ａｎｄ Ｈｏｅｆｆｌｅｒ （ｅｄｓ．）， ｐａｇｅｓ ３６７−３９７ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９９）を参照のこと）。
【０４９５】
例えば、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを生成するための方法は、成熟した受精能雄（種マウス）（Ｂ６Ｃ３ｆ１， 生後２−８ヶ月（Ｔａｃｏｍｉｃ Ｆａｒｍｓ， Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ， ＮＹ））、精管切除された雄（ｄｕｄｓ）（Ｂ６Ｄ２ｆ１， ２−８ヶ月（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ））、 思春期直前受胎能雌（ドナー）（Ｂ６Ｃ３ｆ１， ４−５週（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ））、及び成熟した受胎能雌（受容体）（Ｂ６Ｄ２ｆ１， ２−４ヶ月（ｔａｃｏｎｉｃ ｆａｒｍｓ））により開始することができる。ドナーは、１週間、気候順応化され、そして次に、約８ＩＵ／マウスのＰｒｅｇｎａｎｔ Ｍａｒｅ’ｓ Ｓｅｒｕｍ ゴナドトロピン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）Ｉ．Ｐ． により、及び４６−４７時間後、８ＩＵ／マウスのヒトＣｈｏｒｉｏｎｉｃ Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ （ｈＣＧ （Ｓｉｇｍａ）） Ｌ．Ｐ． により注射され、過剰排卵を誘発された。ドナーが、ホルモン注射に続いて、種マウスにより交配される。排卵は一般的に、ｈＣＧ注射の１３時間以内に生じる。交接は、交配の次の朝、膣栓の存在により確認される。
【０４９６】
受精された卵を手術用スコープ下で集める。卵管を集め、そして卵を、ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）を含む尿検査用スライド中に開放する。卵を、１度、アヒルロニダーゼにより洗浄し、そして２度、Ｗｈｉｔｔｅｎ’ｓ Ｗ６４０ 媒体（Ｍｅｎｉｎｏ ａｎｄ Ｏ’ｃｌｏｒａｙ， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ７７： １５９ （１９８６）， 及びＤｉｅｎｈａｒｔ ａｎｄ Ｄｏｗｎｓ， Ｚｙｇｏｔｅ ４： １２９ （１９９６） により記載される）により洗浄し、これを５％ＣＯ２、５％Ｏ２及び９０％Ｎ２と共に３７℃でインキュベートする。次に、卵を、マイクロインジェクションまで、３７℃／５％ＣＯ２のインキュベーターに貯蔵する。
【０４９７】
Ｚｔｎｆｒ１２コード配列を含むプラスミドＤＮＡ１０〜１２μｇを、線状化し、ゲル精製し、そしてマイクロインジェクションのために５−１０ｎｇ／μｌの最終濃度で、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ （ｐＨ７．４）， ０．２５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液に再懸濁する。例えば、Ｚｔｎｆｒ１２コード配列は、配列番号２のアミノ酸残基１−６９、配列番号２のアミノ酸残基１−７９又は配列番号１３のアミノ酸残基１−６９をコードすることができる。
【０４９８】
プラスミドＤＮＡを、暖かな、ＣＯ２平衡化された鉱油により被覆された１度のＷ６４０媒体に含まれる、収穫された卵中にマイクロインジェクトする。ＤＮＡを注射用針中に吸い込み（０．７５ｍｍのＩＤ， １ｍｍのＯＤ硼珪酸塩ガラス細管から引き抜かれる）、そして個々の卵中に注入する。注射用針により、個々の卵の、ハプロイド前核の１つ又は両者中に貫通する。
数ピコリットルのＤＮＡを前核中に注入し、そして注射用針を、核と接触しないよう引き抜く。前記方法を、すべての卵が注入されるまで、反復する。都合良くマイクロインジェクトされた卵を、前もってガス抜きされたＷ６４０媒体を有する器官組織−培養皿中に移し、３７℃／５％ＣＯ２のインキュベーターにおいて一晩、貯蔵する。
【０４９９】
次の日、２細胞の胚を、偽妊娠受容体中に移す。受容体は、精管切除されたｄｕｄｓとの交接の後、膣栓の存在により同定される。受容体に麻酔をし、そして背面左側上の毛を剃り、そして手術用顕微鏡に移す。切開を、皮膚において、及び胸郭、背部及び後脚により概略される腹部の中央、すなわち膝と脾臓との間の中途まで筋肉壁を通して行う。生殖器官を、小さな手術用ドレープ上に切除する。脂肪パッドを、手術用ドレープ上に広げ、そして子供用止血小鉗子（Ｒｏｂｏｚ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）を、脂肪パットに取り付け、そしてマウスの背部上をつるし、器官が腹部にスライドすることを防ぐ。
【０５００】
鉱油、続いて交互にＷ６４０及び空気気泡を含む精巧なトランスファーピペットにより、前日の注入からの１２〜１７個の健康な２−細胞胚を、受容体中に移す。膨張した膨大部を位置決定し、そしてその膨大部と包との間の卵管を保持し、卵管の刻み目を前記包に隣接して、２８ｇの針により行い、膨大部又は包を裂かないことを確かめる。
【０５０１】
ピペットを、卵管における刻み目に移し、そして胚を吹き込み、最初の空気気泡のピペットからの除去を可能にする。脂肪パッドを軽く、腹膜中に押し込み、そして生殖器官を滑り込ませる。腹膜壁を、１つの縫合により閉じ、そして皮膚を傷口用クリップにより閉じる。マウスは、少なくとも４時間、３７℃の暖かなスライド上で回復した。
【０５０２】
受容体を、対でカゴに戻し、そして１９−２１日の妊娠を可能にする。誕生後、１９−２１日の産後を、離乳の前に可能にする。離乳子供の性別を鑑別し、そして別々の性別のカゴに入れ、そして０．５ｃｍの生検（遺伝子型識別のために使用される）を、尾から、無菌のハサミにより取る。
【０５０３】
ゲノムＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ ＤＮＥＡＳＹキットを用いて、その製造業者の説明書に従って、切り取られた尾から調製する。ゲノムＤＮＡを、同じプラスミドに導入されたＺｔｎｆｒ１２遺伝子又は選択マーカー遺伝子を増幅するために企画されたプライマーを用いて、ＰＣＲにより分析する。動物がトランスジェニックであることが確かめられた後、それらは、トランスジェニック雌を野生型雄と共に、又はトランスジェニック雄を１又は複数の野生型雌と共に配置することによって、近交系に戻し交雑する。子供が生まれ、そして離乳され、性別を分け、そしてそれらの尾を、遺伝子型識別のために切り取る。
【０５０４】
生存動物におけるトランスジーンの発現について調べるために、部分肝切除を行う。手術準備を、ｚｙｐｈｏｉｄ工程下で直接的に上部腹部に行う。無菌技法を用いて、小さな１．５−２ｃｍの切開を、胸骨下で行い、そして肝臓の左側葉を取り出す。４−０絹糸を用いて、下部葉を体腔外に確保するために、その下部葉の回りを縛る。クランプを用いて、その結び目を保持し、そして吸収性Ｄｅｘｏｎ （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ； Ｗａｙｎｅ， Ｎ． Ｊ．） の第２ループを、最初の結び目に隣接して配置する。遠位切断をＤｅｘｏｎ結び目から行い、そして約１００ｍｇの切除された肝臓組織を、無菌ペトリ皿に配置する。
【０５０５】
切除された肝臓切片を、１４ｍｌのポリプロピレン丸底管に移し、そして液体窒素において凍結し、そして次に、ドライアイス上に貯蔵する。手術部位を、縫合及び傷口用クリップにより閉じ、そして動物のカゴを、３７℃で加熱されるパッド上に、手術の後、２４時間、配置する。動物を手術の後、毎日調べ、そして傷口用クリップを、手術の７−１０日後に取り除く。Ｚｔｎｆｒ１２  ｍＲＮＡの発現レベルを、ＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーションアッセイ又はポリメラーゼ鎖反応を用いて、個々のトランスジェニックマウスについて試験する。
【０５０６】
Ｚｔｎｆｒ１２を過剰発現するトランスジェニックマウスを生成する他に、その遺伝子を異常に低く発現するか、又はまったく発現しないトランスジェニックマウスを構築することは有用である。そのようなトランスジェニックマウスは、Ｚｔｎｆｒ１２の欠失に関連する疾病のための有用なモデルを提供する。上記で論じられたように、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子発現は、アンチセンス遺伝子、リボザイム遺伝子、又は外部案内配列遺伝子を用いて阻害され得る。Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子を過少発現するトランスジェニックマウスを生成するためには、そのような阻害配列がＺｔｎｆｒ１２ ｍＲＮＡに標的化される。特定の遺伝子の異常に低い発現をトランスジェニックマウスを生成するための方法は、当業者に知られている（例えば、Ｗｕなど．， “Ｇｅｎｅ Ｕｎｄｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌｓ ｂｙ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＤＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ” ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｐ． ２０５−２２４ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９７） を参照のこと）。
【０５０７】
Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子発現をほとんどか又はまったく有さないトランスジェニックマウスを生成するための他のアプローチは、非官能性Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子により置換された、少なくとも１つの正常Ｚｔｎｆｒ１２対立遺伝子を有するマウスを生成することである。非官能性Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子を企画する１つの方法は、もう１つの遺伝子、例えば選択マーカー遺伝子を、Ｚｔｎｆｒ１２をコードする核酸分子内に挿入することである。いわゆるそれらの“ノックアウトマウス”を生成するための標準の方法は、当業者に知られている（例えば、Ｊａｃｏｂ， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ，” ｉｎ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｏｆ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ， Ｊａｃｏｂ （ｅｄ．）， Ｐａｇｅｓ １１１−１２４ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｔｄ， １９９４）， 及びＷｕなど．， “Ｎｅｗ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ，” ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｐａｇｅｓ ３３９−３６５ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９７）を参照のこと）。
【０５０８】
一般的に記載されて来た本発明は、次ぎの例により容易に理解されるであろう。但し、それらの例は、本発明を制限するものではない。
【０５０９】
実施例
例１．Ｚｔｎｆｒ１２をコードする核酸分子の単離
この研究は、“Ｒｅｈ”（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ−８２８６）と称するヒトＢ−リンパ前駆体細胞系を使用した。ｃＤＮＡライブラリーを、Ｒｅｈ細胞から調製し、そして１６個の９６−ウェルプレートを用いてアッセイした。個々のウェルは、約２５０個のＥ．コリコロニーを含み、そして個々のコロニーは、１つのｃＤＮＡクローンを含む。ＤＮＡ ｍｉｎｉｐｒｅｐｓを、Ｑｉａｐｒｅｐ ９６ Ｔｕｒｂｏキット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ， ； Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）を用いて、９６−ウェル形で調製した。次に、ＤＮＡを、それぞれ３０００個のクローンを表した１２８のプールに分けた。それらのプールを、１２−ウェルプレートにおけるＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトし、そして陽性プールを、細胞−表面ＺＴＮＦ４結合により決定した。
【０５１０】
ＣＯＳ細胞トランスフェクションを次の通りにして行った。５μｌのプールされたＤＮＡ（約０．５−１．０μｇ）及び５μｌのリポフェクタミンを、９２μｌの血清フリーＤＭＥＭ培地（５００ｍｇのＤＭＥＭ中、５５ｍｇのピルビン酸ナトリウム、１４６ｍｇのＬ−グルタミン、５ｍｇのトランスフェリン、２．５ｍｇのインスリン、１μｇのセレニウム及び５ｍｇのフェチュイン）において混合し、室温で３０分間インキュベートし、そして次に、４００μｌの血清フリーＤＭＥＭ培地を添加した。この混合物５００μｌを、１２−ウェルのフィブリネクチン−前処理された組織培養プレート上にプレートされた１．５×１０５個の細胞／ウェルに添加し、そして細胞を３７℃で５時間インキュベートした。次に、５００μｌの２０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地（５００ｍｌのＤＭＥＭ中、１００ｍｌのＦＢＳ、５５ｍｇのピルビン酸ナトリウム及び１４６ｍｇのＬ−グルタミン）を、ウェル当たりに添加し、そして細胞を一晩インキュベートした。
【０５１１】
細胞表面結合アッセイを、次の通りにして、ビオチニル化されたＦＬＡＧ−標識されたＺＴＮＦ４を用いて行った。培地を、１％ＢＳＡ／ＰＢＳにより細胞からすすぎ、そして細胞を、ＴＮＢ（水中、０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ、０．１５ＭのＮａＣｌ及び０．５％ブロッキング試薬−ＮＥＮ Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ ＴＳＡ−Ｄｉｒｅｃｔ Ｋｉｔ Ｃａｔ ＃ ＮＥＬ７０１）により１時間ブロックした。次に、細胞を、ＴＮＢ中、３μｇ／ｍｌのビオチニル化されたＦＬＡＧ−標識されたＺＴＮＦ４と共に１時間インキュベートした。細胞を、１％ＢＳＡ／ＰＢＳにより洗浄し、そして次に、ＴＮＢ中、１：３００に希釈されたストレプタビジン−ＨＰＰ（ＮＥＮキット）と共にさらに１時間インキュベートした。
【０５１２】
細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳにより洗浄し、そして次に、ＰＢＳ中、１．８％ホルムアルデヒドにより１５分間、固定した。次に、細胞を、ＴＮＴ（水中、０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ、０．１５ＭのＮａＣｌ、及び０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）により洗浄した。結合を、希釈緩衝液により１：５０に希釈されたフルオレセインチラミド試薬と共に４〜５分間、細胞をインキュベートすることによって検出した（ＮＥＮキット）。細胞をＴＮＴにより洗浄し、そしてＴＮＴにより１：５に希釈されたＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉａ （Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ； Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ） により保存した。細胞を、蛍光顕微鏡上でＦＩＴＣフィルターを用いて可視化した。
【０５１３】
１つの陽性ＤＮＡプール、すなわち“１０Ａ１１”と、上記方法を用いて同定した。プール１０Ａ１１のＤＮＡを、Ｅ．コリＤＨ１０Ｂ中にエレクトロポレートし、そしてコロニーをフィルターにより持ち上げ、そして洗浄した。Ｅ．コリから単離されたＤＮＡを、ＣＯＳ中にトランスフェクトし、そして陽性プールＤＮＡ“４Ｄ”を、ＺＴＮＦ４結合アッセイを用いて同定した。プール４Ｄのコロニーを、９６−ウェル中にトランスファーし、そしてＤＮＡを、Ｑｉａｐｒｅｐ９６Ｔｕｒｂｏキットを用いて単離した。陽性クローン４Ｄ２Ｈ−６を上記方法を用いて同定した。ＺＴＮＦ４結合の特異性を試験するために、４Ｄ２Ｈ−６クローンＤＮＡを、ＣＯＳ細胞中にトランスファーし、そしてＺＴＮＦ４及びＺＴＮＦ２の結合を試験した。ＺＴＮＦ４は４Ｄ２Ｈ−６ ＤＮＡによりトランスフェクトされたＣＯＳ細胞に結合するが、ＺＴＮＦ２は前記細胞と結合しなかった。対照的に、ＺＴＮＦ４及びＺＴＮＦ２の両者は、ＴＡＣＩ ＤＮＡによりトランスフェクトされたＣＯＳ細胞に結合した。
【０５１４】
例２．ヒト及びネズミ組織におけるＺｔｎｆｒ１２遺伝子発現
ノザンブロット分析を、Ｈｕｍａｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂｌｏｔｓ （ＭＴＮ Ｉ， ＭＴＮ ＩＩ及びＭＴＮ ＩＩＩ） （ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａ）， Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｙｓｔｅｍ ブロット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、Ｈｕｍａｎ正常ｍＲＮＡブロット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａ）及びＨｕｍａｎ Ｆｅｔａｌ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂｌｏｔｓ （ＣＬＯＮＴＥＣＨ） を用いて行った。５７０塩基対ヒトプローブを、次の反応条件下で、オリゴヌクレオチド３７５５０（５’ＧＣＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＧＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧＣＧＡＧＧＧ３’）（配列番号１０）及び３７５４９（５’ＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＣＧＧＣＴＣＣＣＴＧＣＴＡＴＴＧＴＴＧ３’）（配列番号１１）によるＰＣＲにより生成した：９４℃で２分；９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒（３５サイクル）；続いて、７２℃で５分。
【０５１５】
ＰＣＲフラグメントを、ＱＩＡＱＵＩＣＫゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ． ； Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｉｔａ， Ｃａ）を用いて、ゲル精製した。プローブを、ＲＥＤＩＰＲＩＭＥ ＩＩ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ システム（ＡＭＥＲＳＨＡＭ， Ｉｎｃ．； ＵＫ）を用いて、製造業者の規格に従って、３２Ｐにより放射性ラベルした。プローブを、ＮＵＣＴＲＡＰプッシュカラム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ； Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａ）を用いて精製した。ＥＸＰＲＥＳＳＨＹＢ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）溶液を、ブロットのためのハイブリダイズ溶液のために使用した。ハイブリダイゼーションは６５℃で一晩で生じた。
【０５１６】
次に、ブロットを、室温で２×ＳＣＣ及び０．０５％ＳＤＳにより４度、続いて、５０℃で０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳにより２度、洗浄した。１つの転写体サイズを、約４．４ｋｂで検出した。
【０５１７】
腫瘍ブロットをまた、ヒト子宮腫瘍ブロット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａ）、ヒト腫瘍パネルブロット４及び５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ； Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａ）、ヒトリンパブロット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ヒト癌細胞系ブロット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）及びヒト白血病ブロットにより試験した。ドットブロットをまた、Ｈｕｍａｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｂｌｏｔ （ＣＬＯＮＴＥＣＨ） 及びＨｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｂｌｏｔ （Ｂｉｏｃｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｉｎｃ．； Ｈａｙｗａｒｄ， Ｃａ） を用いて分析した。ドットブロット分析のための方法及び条件は、上記に開示される複数組織ブロットについてと同じであった。
【０５１８】
Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子発現を、脾臓、リンパ節、末梢血液リンパ球、腎臓、心臓、肝臓、骨格筋、膵臓、副腎、精巣、脳、子宮、胃、骨髄、気管支、胸腺、胎盤、胎児肝臓及びＲａｊｉ細胞において観察した。最強のシグナルは、脾臓組織、リンパ節組織及び末梢血液に関連された。
【０５１９】
例３．細胞系におけるＺｔｎｆｒ１２遺伝子発現
ＴＡＱＭＡＮ ＲＴ−ＰＣＲ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ； Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ） を用いて、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子、及びＴＡＣＩ及びＢＣＭＡ遺伝子の発現をさらに試験した。それらの研究においては、内因性ヒトβ−グルクロニダーゼ又はグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの発現を、対照として使用した。Ｚｔｎｆｒ１２、ＴＡＣＩ及びＢＣＭＡ ＲＮＡレベルを、それらの対照遺伝子のＲＮＡレベルに対して比較した。
【０５２０】
表６に示されるように、その結果は、Ｚｔｎｆｒ１２が主にＢ系細胞上で独占的に発現されることを示した。特に、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子発現を、形質転換されたＢリンパ腫細胞系、例えばＢｕｒｋｉｔｔ’ｓ リンパ腫由来の細胞（例えば、ＲＡＭＯＳ細胞、ＤＡＵＤＩ細胞、ＲＡＪＩ細胞、ＢＪＡＢ細胞、及びＨＳ Ｓｕｌｔａｎ細胞）、非Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ リンパ腫由来の細胞（ＲＬ細胞）、Ｂ−細胞リンパ芽球性白血病細胞（ＩＭ９， ＳＵＰ−Ｂ１５及びＲＥＨ細胞）、及びＢ−細胞リンパ腫細胞系、ＤＯＨＨ−２及びＷＳＵ−ＮＨＬにおいて観察した。対照的に、Ｚｔｎｆｒ１２遺伝子発現は、急性Ｔリンパ腫細胞（Ｊｕｒｋａｔ）、単級白血病細胞（ＴＨＰ−１及びＵ９３７）、前骨髄球性白血病細胞（ＨＬ−６０）及び慢性骨髄性白血病細胞（Ｋ５６２）においては検出できなかった。
【０５２１】
それらの結果は、Ｚｔｎｆｒ１２タンパク質が、Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓリンパ腫、非Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓリンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、及び種々の他のＢ−細胞リンパ腫に対して、モノクローナル抗体治療においては、有用な標的物を提供することを示す。Ｚｔｎｆｒ１２発現は、類似する受容体の発現レベルに比較して、それらの細胞系の多くにおいて相当に高い。例えば、ＢＣＭＡは、血漿細胞上で主に発現されると思われる。
【０５２２】
【表６】
2004516826.tif 000007
【０５２３】
例４．Ｚｔｎｆｒ１２−Ｆｃ融合タンパク質の構成及び発現
Ａ．Ｉｇγ１フラグメントの作製
Ｚｔｎｆｒ１２−Ｆｃ融合タンパク質を調製するために、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域（ヒンジ領域、及びＣＨ２及びＤＨ３ドメイン）を修飾し、Ｆｃγ１受容体（ＦｃγＲ１）及び補体（Ｃ１ｑ）結合機能を除去した。ヒトＩｇＧ１Ｆｃのこの修飾されたバーションを、“Ｆｃ４”と命名した。
【０５２４】
Ｆｃ領域を、ヒト胎児肝臓ライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ＰＣＲから、次のオリゴプライマーを用いて単離した：５’ＡＴＣＡＧＣＧＧＡＡ ＴＴＣＡＧＡＴＣＴＴ ＣＡＧＡＣＡＡＡＡＣ ＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣ ＣＣＡＣ３’（配列番号１５）及び５’ＧＧＣＡＧＴＣＴＣＴ ＡＧＡＴＣＡＴＴＴＡ ＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡ ＧＧＧＡＧ３’（配列番号１６）。野生型ヒトγ不変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１７及び１８で表される。Ｆｃ領域内の突然変異を、ＰＣＲにより導入し、ＦｃγＲ１結合を低めた。ＦｃγＲＩ結合部位（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ；ＥＵインデックス位置２３４〜２３７に対応する配列番号１８のアミノ酸残基３８−４１）を、Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａに突然変異誘発し、ＦｃγＲＩ結語を減じた（例えば、Ｄｕｎｃａｎなど．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２： ５６３ （１９８８）； Ｂａｕｍなど．， ＥＭＢＯ Ｊ． １３： ３９９２ （１９９４） を参照のこと）。
【０５２５】
オリゴヌクレオチドプライマー：５’ＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧ ＣＡＣＣＴＧＡＡＧＣ ＣＧＡＧＧＧＧＧＣＡ ＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴ ＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣ Ｃ３’（配列番号１９）及び５’ＧＧＡＴＴＣＴＡＧＡ ＴＴＡＴＴＴＡＣＣＣ ＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧ Ａ３’（配列番号２０）を用いて、突然変異を導入した。５７０ｎｇのＩｇＦｃ鋳型、５μｌの１０×Ｐｆｕ反応緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、８μｌの１．２５ｍＭのｄＮＴＰ， ３１μｌの蒸留水、２μｌの２０ｍＭのオリゴヌクレオチドプライマーを添加し、５０μｌの最終体積にした。
【０５２６】
等体積の鉱油を添加し、そして反応を９４℃に１分間、加熱した。Ｐｆｕポリメラーゼ（２．５単位、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を添加し、続いて、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分（２５サイクル）、続いて７２℃での７分間の延長を行った。反応生成物を、電気泳動により分別し、そして約６７６塩基対の予測されるサイズに対応するバンドを検出した。このバンドを、ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡＱＵＩＣＫ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ） を用いて、製造業者の説明書に従って、ゲルから切除し、そして回収した。このフラグメントを、ＦｃγＲＩ結合部位突然変異誘発されたＩｇＦｃ配列として命名した。
【０５２７】
ＰＣＲをまた用いて、ＡｌａのＳｅｒ（ＥＵインデックス位置３３０に対応する、配列番号１８のアミノ酸残基１３４）への突然変異及びＰｒｏのＳｅｒ（ＥＵインデックス位置３３１に対応する、配列番号１８のアミノ酸残基１３５）への突然変異を導入し、補体Ｃ１ｑ結合又は補体固定を減じた（Ｄｕｎｃａｎ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３３２： ７８８ （１９８８））。２種の第１回目の反応を、鋳型としてＦｃγＩ結合部位−突然変異誘発されたＩｇＦｃ配列を用いて行った。
【０５２８】
１μｌのＦｃγＲＩ結合部位−突然変異誘発されたＩｇＦｃ鋳型、５μｌの１０×Ｐｆｕ反応緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、８μｌの１．２５ｍＭのｄＮＴＰ、 ３１μｌの蒸留水、２μｌの２０ｍＭの５’ＧＧＴＧＧＣＧＧＣＴ ＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧ ＴＣＣＴＧＴＣＣＧＡ ＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴ ＴＣＡＧＡＣＡＡＡＡ ＣＴＣＡＣ３’（配列番号２１）、すなわち配列番号１７のヌクレオチド３６で開始する５’プライマー、及び２μｌの２０ｍＭの５’ＴＧＧＧＡＧＧＧＣＴ ＴＴＧＴＴＧＧＡ３’（配列番号２２）、すなわち配列番号１７のヌクレオチド４０５の補体で開始する３’プライマーを添加し、５０μｌの最終体積にした。
【０５２９】
第２反応は、ＡｌａからＳｅｒへの突然変異誘発、ＸｂａＩ制限部位及び停止コドンを導入するために、オリゴヌクレオチドプライマー５’ＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧ ＣＣＣＴＣＣＣＡＴＣ ＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧ ＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴ ＣＣ３’（配列番号２３）、すなわち配列番号１７のヌクレオチド３８８で開始する５’プライマー及び５’ＧＧＡＴＧＧＡＴＣＣ ＡＴＧＡＡＧＣＡＣＣ ＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴ ＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧ ＧＴＧＧＣＧＧＣＴＣ ＣＣＡＧＡＴＧ３’（配列番号２４）、すなわち３’プライマーの２０ｍＭの原液をそれぞれ２μｌを含んだ。等体積の鉱油を添加し、そして反応を９４℃に１分間、加熱した。
【０５３０】
Ｐｆｕポリメラーゼ（２．５単位、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を添加し、続いて、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分（２５サイクル）、続いて７２℃での７分間の延長を行った。反応生成物を、電気泳動により分別し、そして約３７０及び約３９５塩基対の予測されるサイズに対応するバンドを検出した。このバンドを、ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡＱＵＩＣＫ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ） を用いて、製造業者の説明書に従って、ゲルから切除し、そして抽出した。
【０５３１】
上記フラグメントを連結し、そして５’ＢａｍＨＩ制限部位、及びヒト免疫グロブリンＪＢＬ ２’ＣＬＨ鎖可変領域からのシグナル配列を付加するために、第２回目の反応を行った（Ｃｏｇｎｅなど．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８： １４８５ （１９８８））。３０μｌの蒸留水、８μｌの１．２５ｍＭのｄＮＴＰ， ５μｌの１０×Ｐｆｕポリメラーゼ反応緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及び２種の第１回目のＰＣＲ反応物の個々の１μｌを添加し、５０μｌの最終体積にした。等体積の鉱油を添加し、そして反応を９４℃に１分間、加熱した。Ｐｆｕポリメラーゼ（２．５単位、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を添加し、続いて、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で２分（５サイクル）、ＰＣＲ反応を行った。
【０５３２】
温度を９４℃に再び上げ、そして５’ＧＧＡＴＧＧＡＴＣＣ ＡＴＧＡＡＧＣＡＣＣ ＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴ ＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧ ＧＴＧＧＣＧＧＣＴＣ ＣＣＡＧＡＴＧ３’（配列番号２５）、すなわちＢａｍＨＩ制限部位を導入する、配列番号１７のヌクレオチド１で開始する５’プライマー、及び５’ＧＧＡＴＴＣＴＡＧＡ ＴＴＡＴＴＴＡＣＣＣ ＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧ Ａ３’（配列番号２６）の２０ｍＭの原液それぞれ２μｌを添加し、続いて、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で２分及び７２℃で最終７分の拡張（２５サイクル）を行った。前記反応の一部を、ゲル電気泳動を用いて可視化した。
【０５３３】
予測されるサイズに対応する７８９塩基対バンドを検出した。突然変異誘発されたＦｃ ＰＣＲフラグメントの残りを、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩにより消化した。消化されたフラグメントをクローン化し、そして配列分析により確かめた。突然変異誘発されたＦｃを、“Ｆｃ４”と命名した。Ｆｃ４のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２７及び２８として提供されている。
【０５３４】
“Ｆｃ５”と称するＩｇ融合セグメントを、次のオリゴヌクレオチドプライマーによりＦｃ４ Ｉｇ融合セグメントを増幅するためにＰＣＲを用いることによって生成した：５’ＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴ ＣＴＴＣＡＧＡＣＡＡ ＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡ ＴＧＣＣＣＡ３’（配列番号２９）及び５’ＴＡＡＴＴＧＧＣＧＣ ＧＣＣＴＣＴＡＧＡＴ ＴＡＴＴＴＡＣＣＣＧ ＧＡＧＡＣＡ３’（配列番号３０）。ＰＣＲ増幅の条件は次の通りであった。２３６ｎｇのＦｃ４鋳型、５μｌの１０×Ｐｆｕ反応緩衝液、４μｌの２．５ｍＭのｄＮＴＰ、１μｌのそれぞれ２０μＭのプライマー及び１μｌのＰｆｕポリメラーゼ（２．５単位、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を添加し、５０μｌの最終体積にした。
【０５３５】
増幅熱プロフィールは、９４℃で１５秒、４２℃で２０秒、７２℃で４５秒（５サイクル）、９４℃で１５秒、７２℃で１分２０秒（２０サイクル）、続いて７２℃での７分の拡張から成った。反応生成物を、分離用アガロースゲル上で電気泳動処理し、そして７１８ｂｐの予測されるサイズに対応するバンドを検出した。ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡＱＵＩＣＫ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ） を用いて、製造業者の説明書に従って、バンドをゲルから切除し、そして回収した。突然変異誘導されたＦｃフラグメントをクローン化し、そして配列分析により確かめた。Ｆｃ５のヌクレオチド及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３１及び３２として提供する。
【０５３６】
Ｂ．Ｚｔｎｆｒ１２−Ｆｃ５発現ベクターの作製
Ｚｔｎｆｒ１２−ｔｃｓ−Ｆｃ５のための発現カセットをコードするタンパク質を、ＰＣＲ鋳型としてマウス免疫グルブリンＨ鎖可変領域（ＩｇＶＨ）シグナル配列ｃＤＮＡ、Ｚｔｎｆｒ１２ ｃＤＮＡ及びＦｃ５ ＤＮＡフラグメントを用いて、オーバーラップＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎなど．， Ｇｅｎｅ ７７： ６１ （１９８９））により生成した。用語“ｔｃｓ“とは、Ｚｔｎｆｒ１２セグメントをＦｃ５セグメントとのトロンビン分解部位の存在を示す。
第１回目のＰＣＲ増幅は、第２回目のオーバーラップＰＣＲに使用される４種のＰＣＲ生成物（第１回目のＰＣＲ生成物１，２，３及び４として命名される）を生成する４種の別々の反応から成った。
【０５３７】
第１回目のＰＣＲ生成物１，２，３及び４を、異なったオリゴヌクレオチドプライマー及びＤＮＡ鋳型を用いて、別々に生成した。約２ｎｇの鋳型ＤＮＡ、２．５μｌの１０×Ｐｆｕポリメラーゼ反応緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、２μｌの２．５ｍＭのｄＮＴＰ， ２．５μｌのＲｅｄｉｌｏａｄ（ＲｅＧｅｎ； Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ＡＬ）、２０ｐモルの個々の５’オリゴヌクレオチド及び３’オリゴヌクレオチドプライマー（下記を参照のこと）、及び０．５μｌのＰｆｕポリメラーゼ（２．５単位、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を添加し、それぞれ２５μｌの最終体積にした。第１回目のＰＣＲ生成物４を生成する反応はまた、２．５μｌのＧＣ−Ｍｅｌｔ試薬（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の添加を包含した。ＰＣＲ増幅に使用される鋳型及びプライマーに対する情報は、表７及び８に提供される。
【０５３８】
【表７】
2004516826.tif 000008
【０５３９】
【表８】
2004516826.tif 000009
【０５４０】
増幅熱プロフィールは、９４℃で３分、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分（３０サイクル）、続いて７２℃での４分の拡張から成った。反応生成物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分別し、そして予測されるサイズに対応するバンドを、ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡＱＵＩＣＫ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ） を用いて、製造業者の説明書に従って、ゲルから切除し、そして回収した。
【０５４１】
第２回目のＰＣＲ増幅、又はオーバーラップＰＣＲ増幅反応を、ＤＮＡ鋳型として前記第１回目のＰＣＲからのゲル精製されたフラグメントを用いて行った。第２回目のＰＣＲ増幅の条件は次の通りであった。１μｌの個々の第１回目のＰＣＲ生成物１，２，３及び４、５μｌの１０×Ｐｆｕポリメラーゼ反応緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、４μｌの２．５ｍＭのｄＮＴＰ， ５μｌのＲｄｉｌｏａｄ （ＲｅｓＧｅｎ）， ５μｌのＧＣ−Ｍｅｌｔ試薬（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、約４０ｐモルの個々のＺＣ３８，９８９， ＺＣ３８，８７４及び０．５μｌのＰｆｕ ポリメラーゼ（２．５単位、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を添加し、５０μｌの最終体積にした。増幅熱プロフィールは、９４℃で３分、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３分（３５サイクル）、続いて７２℃で６分の拡張から成った。“Ｚｔｎｆｒ１２−ｔｃｓ−Ｆｃ５ ＰＣＲ”と称する反応生成物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分別し、そして予測されるサイズに対応するバンドを、ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡＱＵＩＣＫ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ） を用いて、製造業者の説明書に従って、ゲルから切除し、そして回収した。
【０５４２】
Ｚｔｎｆｒ１２−ｔｃｓ−Ｆｃ５ ＰＣＲ生物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ’ｓ ＺＥＲＯＢＬＵＮＴ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ を用いて、製造業者の推薦されるプロトコールに従ってクローン化し、そしてそのＤＮＡ配列を確かめた。Ｚｔｎｆｒ１２−ｔｃｓ−Ｆｃ５のヌクレオチド及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号４１及び４２として提供する。配列番号４２においては、ネズミＶＨ２６−１０シグナル配列は、アミノ酸残基１−１９により表され、Ｚｔｎｆｒ１２細胞外ドメインは、アミノ酸残基２０−９０（すなわち、配列番号２のアミノ酸残基１−７１）により表され、トロンビン分解部分は、アミノ酸残基９１−９６により表され、そしてＦｃ５免疫グロブリン成分はアミノ酸残基９７−３２８により表される。
【０５４３】
配列を確認されたＺｔｎｆｒ１２−ｔｅｓ−Ｆｃ５をコードするプラスミドを、ＦｓｅＩ及びＡｃｃＩにより消化し、そのコードセグメントを開放した。ＦｓｅＩ−ＡｓｃＩフラグメントを、サイトメガロウィルスプロモーター（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０ポリＡセグメント及びネズミジヒドロ破壊レダクターゼ遺伝子を含む哺乳類発生ベクター中に連結した。
【０５４４】
例５．チャイニーハムスター卵巣細胞によるＺｔｎｆｒ１２−Ｆｃタンパク質の生成
Ｚｔｎｆｒ１２−Ｆｃ５発現構成体を用いて、動物タンパク質フリーの培地において増幅された、懸濁−適合されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）ＤＧ４４細胞を、エレクトロポレーションを通してトランスフェクトした（Ｕｒｌａｎｂなど．， Ｓａｍ． Ｃｅｌｌ． Ｍａｌｅｃ． １２：５５５（１９８６））。ＣＨＯ ＤＧ４４細胞は、両ジヒドロ葉酸レダクターゼ染色体位置での欠失のために、機能的ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を欠いている。高められた濃度のメトトレキセートの存在下での細胞の増殖は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子の増幅、及び発現構成体上での連結された組換えタンパク質コード遺伝子の増幅をもたらす。
【０５４５】
ＣＨＯ ＤＧ４４細胞を、ＰＦＣＨＯ培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌｅｎｅｘａ， ＫＳ）、４ｍＭのＬ−グルタミン（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及び１×ヒポサンキシン−チミジンサプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において継代し、そして細胞を、回転振盪プラットフォーム上で１２０ＲＰＭで、Ｃｏｒｎｉｎｇ振盪フラスコにおいて３７℃及び５％ＣＯ２下でインキュベートした。細胞を、線状化された発現プラスミドにより別々にトランスフェクトした。
【０５４６】
滅菌を確かめるために、単一のエタノール沈殿段階を、２０μｌの剪断されたサケ精子キャリヤーＤＮＡ（５’→３’Ｉｎｃ， Ｂｏｕｌｄｅｒ， Ｃｏ， １０ｎｇ／ｍｌ）、 ２２μｌの３ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）及び４８４μｌの１００％エタノール（Ｇｏｌｄ Ｓｈｉｅｌｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｈａｙｗａｒｄ， ＣＡ）と共に、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管において２００μｇのプラスミドＤＮＡを組合すことによって、２５分間、氷上で行った。インキュベーションの後、管を、４℃の部屋に配置された遠心分離機において１４，０００ＲＰＭで遠心分離し、上清液を除去し、そしてペレットを７０％エタノール０．５ｍｌにより２度、洗浄し、そして空気乾燥せしめた。
【０５４７】
ＤＮＡペレットを、２５ｍｌの円錐形遠心分離管において９００ＲＰＭで５分間、合計１０６個の細胞（１６．５ｍｌ）を遠心分離することによって乾燥しながら、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞を調製した。ＣＨＯ ＤＧ４４細胞を、合計体積３００μｌのＰＦＣＨＯ増殖培地中に再懸濁し、そして０．４ｃｍの電極ギャップを有するＧｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ Ｃｕｖｅｔｔｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に配置した。約５０分の乾燥時間の後、ＤＮＡを、５００μｌのＰＦＣＨＯ増殖培地中に再懸濁し、そして合計体積が８００μｌを越えないよう、キュベットにおける細胞に添加し、そして室温で５分間、静置し、泡の形成を低めた。キュベットを、０．２９６ｋＶ（キロボルト）及び０．９５０ＨＣ（高キャパシタンス）で設定されたＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩユニットに配置し、そしてすぐにエレクトロポレートした。
【０５４８】
細胞を室温で５分間インキュベートし、その後、ＣｏＳｔａｒ Ｔ−７５フラスコにおける合計２０ｍｌの体積のＰＦＣＨＯ培地に配置した。フラスコを、３７℃で５％ＣＯ２下に４８時間、配置し、次に細胞を、トリパンブルー排除を用いて血球計数計により計算し、そしてヒポサンキシン−チミジンサプリメントを含まないが、２０ｍＭのメトトレキセートを含むＰＦＣＨＯ選択培地（Ｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ）中に配置した。メトトレキセート選択工程の回復に基づいて、選択されたＺｔｎｆｒ１２−Ｆｃ５タンパク質を含むならし培地を、ウェスターンブロット分析により試験した。
【０５４９】
１つの研究においては、融合タンパク質を次の通りにして精製した。ＣＨＯ細胞からのならし培地１０Ｌを透明にし、そして０．２２μｍのフィルターを通して無菌濾過した。次に、濾過された培地サンプルを、Ｚｔｎｆｒ１２−Ｆｃ５標的分子の捕獲のために７２ｍｌのプロテインＡカラム（Ｐｏｒｏｓ ５０Ａ）に適用した。元の適用からの流動材料を、プロテインＡカラム上で２度、再処理し、最大の回収性を増強した。非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は、この段階で回収された結合材料がマルチマー及びダイマーの両者であることを示した。還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分別の後、３６ｋＤの分子量を有するモノマー融合タンパク質のみが観察された。次に、Ｚｔｎｆｒ１２−Ｆｃ５種の回収された混合物を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００サイズ除去クロマトグラフィーカラム（３１８ｍｌ）に適用し、前記材料をさらに精製し、そして緩衝液−交換した。この段階は、マルチマー材料からのダイマー材料の分解を提供した。
【０５５０】
例６．Ｚｔｎｆｒ１２−Ｆｃ融合タンパク質の特性決定
エドマン分解を行い、Ｚｔｎｆｒ１２−Ｆｃ融合タンパク質のＮ−末端を同定した。この結果は、Ｎ−末端が消化され、そして最初のアミノ酸がＳｅｒ７であることを示す。
Ｚｔｎｆｒ１２−Ｆｃを、標準技法を用いて、トロンビンにより消化した。手短に言及すれば、トロンビン消化を、トロンビンをタンパク質に１：２５の重量比で添加し、そして室温で６０分間インキュベートすることによって行った。反応を、分析のＬＣ分離部分のために、逆相ＨＰＬＣカラム上へのすぐの注入により停止した。逆相カラムからの溶出液を、ＬＣＱ質量分光計に向け、そしてＭＳ及びＭＳ／ＭＳデータを集めた。個々の消化物を、還元を伴って及びそれを伴なわないで分析し、そして特異的に回収されたことが観察されたピークを、可能な場合、質量適合及び配列（ＭＳ／ＭＳ）確認分析により同定した。タンパク質のトロンビン消化は、構築された部位の他に、Ｚｔｎｆｒ１２ドメインにおける次の２種の切断部位の存在を同定した：Ａｒｇ３９−Ｔｈｒ４０及びＡｒｇ５４−Ｔｈｒ５５。
【０５５１】
Ｆｃドメインのプロテアーゼ耐性のために、グルコシル化修飾は、タンパク質のその部分については観察されなかった。単一の予測されるＮ−結合された炭水化物は、Ａｓｎ１５９でＦｃドメインに存在する。
【０５５２】
しかしながら、多くの異種Ｏ−グリカンがＺｔｎｆｒ１２ドメインに結合されることが観察された。それらのＯ−グリカンの十分に形成された構造は、ＣＨＯ細胞において組換え的に生成されるタンパク質上に見出される、前に特徴づけられたＯ−グリカンと一致し、そしてテトラ−サッカリドの形、すなわち（Ｎ−アセチルヘキソサミン）−（Ｎ−アセチルノイラミン酸（すなわち、シアル酸））−（ヘキソース）−（Ｎ−アセチルノイラミン酸）である。観察される最も優性形は、トリ−サッカリド、すなわち（Ｎ−アセチルヘキソサミン）−（ヘキソース）−（Ｎ−アセチルノイラミン酸）であった。
【０５５３】
個々の部位は、単一のＮ−アセチルヘキソサミン〜十分に形成されたテトラ−サッカリドの範囲の複数形の炭水化物により部分的に及び異種的に占有されることが観察された。炭水化物の異種性及びこの分析の不完全な性質のために、％部位占有率の明確な割り当ては不可能であった。いくらかのレベルで修飾されることが観察された残基は、Ｔｈｒ１７， Ｔｈｒ４０， Ｓｅｒ４９， Ｓｅｒ５０， Ｔｈｒ５５及びＳｅｒ６２であった。それらの炭水化物修飾は、Ｆｃドメインに単一のＮ−結合された炭水化物のみを有するこの融合タンパク質とＴＡＣＩ−Ｆｃとを区別する。
【０５５４】
Ｚｔｎｆｒ１２−Ｆｃ５を、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ Ｆｃにより被覆されたプレートに固定し、そしてＺＴＮＦ４−ビオチンと共にインキュベートした。この研究の結果は、Ｚｔｎｆｒ１２−Ｆｃ５がＺＴＮＦ４を結合することを示した。追加の研究は、Ｚｔｎｆｒ１２−Ｆｃ５が、可溶性ＺＴＮＦ４及び組換えヒトＩＬ−４により同時活性化されたヒト末梢血液細胞の増殖を阻害し、そしてＺｔｎｆｒ１２−Ｆｃ５が可溶性ＴＡＣＩ受容体へのＺＴＮＦ４−ビオチン結合を阻害したことを示した。
【０５５５】
例７．可溶性Ｚｔｎｆｒ１２のバキュロウィルスでの発現
発現ベクターｐＺＢＶ３７Ｌ： ｓＴＮＦＲ１２ｃｅｅを、単一ペプチドの分解の後、Ｃ−末端“ＥＥ”標識（ＥＹＭＰＭＤ；配列番号４５）を有する可溶性Ｚｔｎｆｒ１２ポリペプチド（配列番号２のアミノ酸残基１−７１）を発現するよう企画した。
【０５５６】
Ａ．ｐＺＢＶ３７Ｌ： ｓＴＮＦＲ１２ｃｅｅの構成
それぞれ５’及び３’末端上にＢｓｐｅＩ及びＸｂａＩ制限部位を含む、２５７塩基対のｓＴＮＦＲ１２ｃｅｅフラグメントを、次のプライマーを用いて、Ｚｔｎｆｒ１２ ｃＤＮＡを含むプラスミドからのＰＣＲ増幅により生成した：５’ＡＴＧＣＡＴＴＣＣＧ ＧＡＡＴＧＡＧＧＣＧ ＡＧＧＧＣＣＣＣＧＧ ＡＧＣＣＴＧ３’（配列番号４３）及び５’ＡＴＧＣＡＴＴＣＴＡ ＧＡＴＣＡＧＴＣＣＡ ＴＣＧＧＣＡＴＧＴＡ ＴＴＣＣＧＣＣＧＣＣ ＴＣＧＣＣＧＧＣＣＣ ＣＣＧＣ３’（配列番号４４）。ＰＣＲ反応条件は、１０％ＤＭＳＯを含む１００μｌの体積の反応について、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ） を用いて、次の通りであった：９４℃で２分（１サイクル）；９４℃で１５秒、５０℃で３０秒、及び７２℃で４５秒（３５サイクル）；７２℃で５分（１サイクル）；続いて、４℃でのソーキング。
【０５５７】
５μｌの反応混合物を、ゲル電気泳動（１％ＭｕＳｉｅｖｅアガロース）により可視化した。反応混合物の残りを、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを通して、製造業者の説明書に従って精製し、そして３０μｌの水に溶出した。ｃＤＮＡを、３７℃で１時間、適切な緩衝液条件下でＢｓｐｅＩ及びＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）を用いて３５μｌの体積において消化した。消化されたＰＣＲ生成物バンドを、１％アガロースＴＡＥゲルを通して試験し、切除し、ＱＩＱＵＩＣＫ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出し、そして３０μｌの水に溶出した。精製され、消化されたｓＴＮＦＲ１２ｃｅｅ ＰＣＲ生成物を、前に調製され、そして制限酵素消化された（ＢｓｐｅＩ及びＸｂａＩ）ベクターｐＺＢＶ３７ＬのＭＣＳ中に連結した。
【０５５８】
ｐＺＢＶ３７Ｌベクターは、ポリへドロンプロモーターが除去され、そして複数クローニング部位の上流の後期活性化Ｂａｓｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ及びＥＧＴリーダーシグナル配列により置換されている、ＰＦＡＳＴＢＡＣ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の修飾体である。５μｌの制限消化されたｓＴＮＦＲ１２ｃｅｅ及び約５０ｎｇのその対応するｐＺＢＶ３７Ｌベクターを、適切な緩衝液条件下で２０μｌの体積において１６℃で一晩、連結した。５μｌの連結混合物を用いて、２ｍｍのギャップエレクトロポレーションキュベット（ＢＴＸ）において、４００オーム、２Ｖ及び２５μＦでのエレクトロポレーションにより、５０μｌのＥＬＥＣＴＯＭＡＸ ＤＨ１２Ｓ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を形質転換した。形質転換された細胞を、３５０μｌのＳＯＳ培地（２％ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ， ０．５％ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ， １０ｍｌの１ＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＳＯ４及び２０ｍＭのグルコース）により希釈し、３７℃で１時間インキュベートし、そして５０μｌの希釈溶液を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上にプレートした。
【０５５９】
クローンをＰＣＲ及び制限消化により分析した。陽性クローンを選択し、プレートし、そして配列決定のために提供した。正しい配列が確かめられると、２５ｎｇの陽性クローンＤＮＡを用いて、４２℃での熱ブロックにおける４５秒間の熱ショックにより、１００μｌのＤＨ１０ＢＡＣ ＭＡＸ ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹコンピテント細胞（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を形質転換した。形質転換されたＤＨ１０ＢＡＣ細胞を、９００μｌのＳＯＣ培地（１％Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎ， ０．５％Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ， １０ｍｌの１ＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＫＣｌ， １０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＳＯ４及び２０ｍＭのグルコース）により希釈し、３７℃で１時間インキュベートし、そしてその１００μｌを、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、７μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、４０μｇ／ｍｌのＩＰＴＧ及び２００μｌ／ｍｌのＢＬＵＯ−ＧＡＬ（５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含むＬｕｒｉａ寒天プレート上にプレートした。プレートを３７℃で４８時間インキュベートした。
【０５６０】
色彩選択を用いて、転移されたウィルスＤＮＡ（“ｂａｃｍｉｄ”として言及される）を有するそれらの細胞を同定した。白色のそれらのコロニーを採取した。陽性の白色コロニー（所望するｂａｃｍｉｄをふくむ）を、増殖及び続くｂａｃｍｉｄ ＤＮＡ精製のために選択した。スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９）細胞を、培養増殖及びｂａｃｍｉｄ単離の後、トランスフェクトした。
【０５６１】
Ｂ．Ｓｆ９細胞のトランスフェクション
Ｓｆ９細胞を、６−ウェルプレートに、１×１０６個の細胞／ウェルで接触し、そして２７℃で１時間、付着せしめた。約５μｇのｂａｃｍｉｄ ＤＮＡを、１００μｌのＳｆ−９００ＩＩ ＳＦＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ） により希釈した。２０μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１００μｌのＳｆ−９００ＩＩ ＳＦＭにより希釈した。ｂａｃｍｉｄ ＤＮＡ及び脂質溶液を軽く混合し、そして室温で４５分間インキュベートした。８００μｌのＳｆ−９００ＩＩ ＳＦＭを、前記脂質−ＤＮＡ混合物に添加した。培地をウェルから吸引し、そして１ｍｌのＤＮＡ−脂質混合物を細胞に添加した。細胞を２７℃で一晩インキュベートした。ＤＮＡ−脂肪混合物を吸引し、そして２ｍｌのＳｆ−９００ＩＩ培地を個々のプレートに添加した。プレートを、２７℃、９０％湿度で、約７日間インキュベートし、そしてウィルスを収穫した。
【０５６２】
Ｃ．増幅
Ｓｆ９細胞を、２ｍｌのＳＦ−９００ＩＩを含む６−ウェルプレートに、１×１０６個の細胞／ウェルで接種した。トランスフェクションプレートからの５００μｌのウィルスを、ウェルにプレートし、そしてプレートを、２７℃、９０％湿度で９６時間インキュベートし、この後、ウィルスを、一次増幅のために収穫した。追加の増幅を、次の方法を用いて達成することができる。
【０５６３】
第２回目の増幅を、次の通りに進行することができる：Ｓｆ９細胞を、２ｍｌのＳＦ−９００ＩＩを有する６−ウェルプレートに、１×１０６個の細胞／ウェルで接種する。一次増幅プレートからのウィルス１００μｌをウェルにプレートし、そしてプレートを２７℃、９０％湿度で９６時間インキュベートし、そして次に、ウィルスを二次増幅を完結するために収穫した。
追加の増幅を行うことができる。Ｓｆ９細胞を、２５０ｍｌの振盪フラスコにおける５０ｍｌのＳｆ−９００ＩＩ ＳＦＭにおいて、１×１０６個の細胞／ｍｌのおおよその密度まで増殖する。次に、それらを上記プレートからの５００μｌのウィルス原液により感染せしめ、そして２７℃で３時間インキュベートし、この後、ウィルスを収穫する。
【０５６４】
このウィルス原液を、増殖阻害曲線により滴定し、そして１のＭＯＩを示す滴定培養物を合計４８時間、進行せしめる。上清液を、ｚＶｅｇｆ４（Ｅ３５９５）のＧＦＤに対して特異的な一次モノクローナル抗体、及びＨＲＰ接合されたヤギ抗体−Ｍｕ二次抗体を用いて、非還元ウェスターンにより分析する。結果は、約７９ｋＤａのダイマーバンド及び追加の高分子量種のバンドを示すべきである。上清液をまた、活性分析のために使用することができる。
【０５６５】
多量のウェルス原液を次の方法により生成する：Ｓｆ９細胞を、２８００ｍｌの振盪フラスコにおける１ＬのＳｆ−９００ＩＩ ＳＦＭにおいて、１×１０６個の細胞／ｍｌのおおよその密度まで増殖する。次に、それらを、最後の増殖からのウィルス原液１０ｍｌにより感染し、そして２７℃で９６時間インキュベートし、この後、ウィルスを収穫する。
大規模感染を完結し、下流の精製のための材料を供給することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンの図である。ＣＬ：Ｌ鎖不変領域；ＣＨ１， ＣＨ２， ＣＨ３： Ｈ鎖不変領域；ＶＬ：Ｌ鎖可変領域；ＶＨ：Ｈ鎖可変領域；ＣＨＯ：炭水化物；Ｎ：アミノ末端；Ｃ：カルボキシル末端。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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