(57)【要約】複数のリガンド担持支持単位を有するコンビナトリアルライブラリーであって、リガンド担持支持単位は、（ａ）固体担体、（ｂ）固体担体と共有結合する１種類以上のリガンド、および（ｃ）支持単位上に含浸される１種類以上のコード化金属塩を含み、コード化金属カチオンの記分布によって、支持単位に結合する１種類以上のリガンドの同定のためのコードが与えられ、カチオンの不溶性または低溶解性塩を形成する１種類以上のアニオンで処理することによって、カチオンが溶解に対して安定化されるコンビナトリアルライブラリー。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンビナトリアルライブラリーであって、複数のリガンド担持支持単位を含み、前記リガンド担持支持単位が、（ａ）固体担体、（ｂ）前記固体担体に共有結合する１種類以上のリガンド、および（ｃ）前記支持単位上に含浸された１種類以上のコード化金属塩を含み、
（ａ）前記担体は、前記リガンドが共有結合する官能基を有する材料であり、前記官能基と前記リガンドは任意にリンカー基によって結合し、前記リンカー基は前記担体と前記リガンドの両方と共有結合する有機残基であり、
（ｂ）前記リガンドは、前記担体の前記官能基または前記リンカー基と共有結合する有機化合物であり、
（ｃ）前記コード化金属塩は、１種類以上のコード化金属カチオンを含み、前記コード化金属カチオンは天然同位体存在比または非天然同位体存在比で分布し、前記コード化金属カチオンの前記分布によって、前記支持単位に結合する１種類以上の前記リガンドの同定のためのコードが与えられ、さらに前記コード化金属塩は、前記コンビナトリアルライブラリーの調製に使用される１種類以上の溶媒中で前記コード化金属カチオンの不溶性または低溶解性塩を形成する１種類以上のアニオンも含むコンビナトリアルライブラリー。
【請求項２】
前記リガンドが、互いに共有結合する２つ以上のサブユニットを含む請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項３】
前記コード化金属カチオンの溶解性塩の溶液で前記支持単位を処理して、溶解性コード化金属塩を含む支持単位を形成し、次に前記溶解性コード化金属塩を含む前記支持単位を、前記コード化金属カチオンと混合されると不溶性または低溶解性塩を形成するアニオンを有する塩の溶液で処理することによって、前記支持単位上に前記コード化金属塩が含浸され、それによって安定化したコード化金属塩が形成され、前記塩が、前記支持単位からの溶出に対して安定化している請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項４】
前記固体担体が合成ポリマー化合物であり、前記支持単位が多孔質ビーズである請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項５】
前記ポリマー化合物が、場合によりジビニルベンゼンと架橋したポリスチレンであり、前記ポリスチレンは官能基を含み、前記リガンドまたは前記任意のリンカー基が前記ポリスチレンの前記官能基と結合する請求項４に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項６】
前記担体および／または前記任意のリンカー基が、前記コード化金属塩の取り込みおよび保持を向上させる１つ以上の部分を含む請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項７】
前記担体および／または前記任意のリンカー基の前記部分が、前記コード化金属カチオンと非共有結合するリガンドとして作用する請求項６に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項８】
溶解に対して安定化される前記コード化金属塩が、硝酸イオン、ヒドロキシドイオン、クロリドイオン、酢酸イオン、および硫酸イオンからなる群より選択される１種類以上のアニオンと溶解性塩を形成するコード化金属カチオンを含み、前記コード化金属カチオンが、スルフィドイオン、硫酸イオン、オキシドイオン、ヒドロキシドイオン、ハロゲン化物イオン、および炭酸イオンからなる群より選択される１種類以上のアニオン性基と不溶性または低溶解性塩を形成する請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項９】
硫化物塩の溶液で処理することによって、前記コード化金属塩が溶解に対して安定化する請求項８に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項１０】
前記コード化金属カチオンが、遷移金属、ランタニド、アクチニド、Ｓｒ、Ｂａ、Ｔｌ、Ｉｎ、Ｓｂ、およびＢｉからなる群より選択される請求項８に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項１１】
前記コード化金属カチオンが、ＶＩＩＩ族、ＩＢ族、およびＩＩＢ族遷移金属からなる群より選択される請求項８に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項１２】
前記コード化金属カチオンが、Ｐｄ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｔ、Ａｇ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｈｇ、およびそれらの個々の同位体からなる群より選択される請求項８に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項１３】
各支持単位が、（ａ）固体担体、（ｂ）前記固体担体と共有結合するか、あるいは前記固体担体に共有結合するリンカー基と共有結合する１種類以上のリガンド、および（ｃ）前記支持単位上に含浸される１種類以上のコード化金属塩を含み、前記コード化金属塩がコード化金属カチオンを含み、前記カチオンの分布によって、１種類以上のリガンドを同定するコードが与えられる、複数の支持単位を有するコンビナトリアルライブラリーにおいて、改良が、前記支持単位が、前記コンビナトリアルライブラリーの調製に使用される１種類以上の溶媒中で前記コード化金属カチオンの不溶性または低溶解性塩を形成する１種類以上のアニオンも含むコンビナトリアルライブラリー。
【請求項１４】
最初に前記コード化金属カチオンの溶解性塩の溶液で前記支持単位を処理して、溶解性コード化金属塩を含む支持単位を形成し、次に前記溶解性コード化金属塩を含む支持単位を、前記コード化金属カチオンと混合されると不溶性または低溶解性塩を形成するアニオンを有する塩の溶液で処理することによって、前記支持単位上に前記コード化金属塩が含浸され、それによって前記支持単位からの溶出に対して前記コード化金属塩が安定化される請求項１３に記載の改良。
【請求項１５】
前記コード化金属カチオンが、硝酸イオン、ヒドロキシドイオン、クロリドイオン、酢酸イオン、および硫酸イオンからなる群より選択される１種類以上のアニオンと溶解性塩を形成し、前記コード化金属カチオンが、スルフィドイオン、硫酸イオン、オキシドイオン、ヒドロキシドイオン、ハロゲン化物イオン、および炭酸イオンからなる群より選択される１種類以上のアニオン性基と不溶性または低溶解性塩を形成する請求項１３に記載の改良。
【請求項１６】
前記コード化金属カチオンが、遷移金属、ランタニド、アクチニド、Ｓｒ、Ｂａ、Ｔｌ、Ｉｎ、Ｓｂ、およびＢｉからなる群より選択される請求項１３に記載の改良。
【請求項１７】
前記コード化金属カチオンが、ＶＩＩＩ族、ＩＢ族、およびＩＩＢ族遷移金属からなる群より選択される請求項１３に記載の改良。
【請求項１８】
前記コード化金属カチオンが、Ｐｄ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｔ、Ａｇ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｈｇ、およびそれらの個々の同位体からなる群より選択される請求項１３に記載の改良。
【請求項１９】
前記アニオンが、スルフィドイオン、硫酸イオン、オキシドイオン、ヒドロキシドイオン、ハロゲン化物イオン、および炭酸イオンからなる群より選択される請求項１３に記載の改良。
【請求項２０】
前記アニオンがスルフィドアニオンである請求項１３に記載の改良。
【請求項２１】
前記支持単位が前記固体担体と共有結合するリンカー基を含み、前記リンカー基が、前記コード化金属カチオンの取り込みおよび保持を向上させる１つ以上の部分を含む請求項１３に記載の改良。
【請求項２２】
複数のリガンド担持支持単位を含むコード化コンビナトリアルライブラリーの調製方法であって、前記リガンド担持支持単位は、（ａ）固体担体、（ｂ）前記固体担体と共有結合する１種類以上のリガンド、および（ｃ）前記支持単位上に含浸される１種類以上のコード化金属塩を含み、前記金属塩によって前記リガンドを同定するためのコードが与えられ、
（１）官能基を有する固体担体を含む支持担体を提供するステップであって、前記官能基は任意にリンカー基と結合し、前記リンカー基は、前記固体担体の前記官能基と共有結合する有機残基であって前記リガンドと共有結合する官能基を有するステップと、
（２）リガンド、または２つ以上のサブユニットを有するリガンドの第１のサブユニットを、前記担体の前記官能基、または任意のリンカー基の前記官能基と共有結合させるステップであって、前記サブユニットが第２のサブユニットと共有結合する官能基を有するステップと、
（３）前記支持単位に１種類以上のコード化金属塩を含浸させるステップであって、前記塩は１種類以上のコード化金属カチオンからなり、前記コード化金属カチオンは天然同位体存在比または非天然同位体存在比で分布する１種類以上のコード化金属カチオンを含み、前記コード化金属カチオンによって、前記支持単位と結合する前記リガンドまたはサブユニットの同定のためのコードが与えられ、前記コード化金属カチオンの溶解性塩の溶液で前記支持単位を処理して、溶解性コード化金属塩を含む支持単位を形成し、次に前記溶解性コード化金属塩を含む前記支持単位を、前記コード化金属カチオンと混合されると不溶性または低溶解性塩を形成するアニオンを有する塩の溶液で処理することによって、前記支持単位上に前記コード化金属塩が含浸され、それによって安定化したコード化金属塩が得られ、前記塩が前記支持単位からの溶出に対して安定化されるステップと、を含み、
ステップ（３）はステップ（２）の前または後に実施したり、あるいはステップ（２）と同時に実施したりすることができる、複数のリガンド担持支持単位を有するコード化コンビナトリアルライブラリーの調製方法。
【請求項２３】
前記リガンドが２つ以上のサブユニットを含み、
（１）第２のサブユニットを前記第１のサブユニットの前記官能基と共有結合させるステップであって、前記第２のサブユニットは前記第１のサブユニットと同じであっても異なっていてもよく、前記第２のサブユニットは、第３のサブユニットを加えるために任意に使用可能な官能基を任意に有するステップと、
（２）前記支持単位に１種類以上のコード化金属塩を含浸させる工程であって、前記塩は１種類以上のコード化金属カチオンを含み、前記コード化金属カチオンは天然同位体存在比または非天然同位体存在比で分布し、前記コード化金属カチオンによって前記第２のサブユニットの同定のためのコードが与えられ、前記コード化金属カチオンの溶解性塩の溶液で前記支持単位を処理して、溶解性コード化金属塩を含む支持単位を形成し、次に前記溶解性コード化金属塩を有する支持単位を、前記コード化金属カチオンと混合されると不溶性または低溶解性塩を形成するアニオンを有する塩の溶液で処理することによって、支前記持単位上に前記コード化金属塩が含浸され、それによって安定化した安定化コード化金属塩が得られ、前記塩は前記支持単位からの溶出に対して安定化されるステップと、
（３）さらなるサブユニットを加えて複数のサブユニットを有するリガンドを形成するために前記ステップ（１）および（２）を任意に１回以上繰り返すステップであって、前記リガンドは、前記支持単位上の金属イオンの分布を測定することによって同定可能であるステップと、をさらに含み、
ステップ（１）と（２）のそれぞれの繰り返しにおいて、ステップ（１）はステップ（２）の前または後に実施したり、あるいはステップ（２）と同時に実施したりすることができる、請求項２２に記載の複数のリガンド担持支持単位を有するコード化コンビナトリアルライブラリーの調製方法。
【請求項２４】
複数のリガンド担持支持単位を有するコード化コンビナトリアルライブラリーの調製方法であって、前記リガンド担持支持単位が、（ａ）固体担体、（ｂ）前記固体担体と共有結合し２つ以上のサブユニットを含む１種類以上のリガンド、および（ｃ）前記支持単位上に含浸される複数種類のコード化金属塩を含み、前記金属塩によって前記リガンドの同定のためのコードが与えられ、
（１）官能基を有する固体担体を含む支持担体を提供するステップであって、前記官能基は任意にリンカー基と結合し、前記リンカー基は、前記固体担体の前記官能基と共有結合する有機残基であって前記リガンドと共有結合する官能基を有するステップと、
（２）第１のサブユニットを、前記担体の前記官能基、または前記任意のリンカー基の前記官能基と共有結合させるステップであって、前記サブユニットは第２のサブユニットと共有結合する官能基を有するステップと、
（３）前記支持単位に１種類以上のコード化金属塩を含浸させるステップであって、前記塩は１種類以上のコード化金属カチオンを含み、前記コード化金属カチオンは天然同位体存在比または非天然同位体存在比で分布し、コード化金属カチオンの組合せによって、前記支持単位と結合する前記サブユニットの同定のためのコードが与えられ、前記コード化金属カチオンの溶解性塩の溶液で前記支持単位を処理して、溶解性コード化金属塩を含む支持単位を形成し、次に前記溶解性コード化金属塩を有する支持単位を、前記コード化金属カチオンと混合されると不溶性または低溶解性塩を形成するアニオンを有する塩の溶液で処理することによって、前記支持単位上にコード化金属塩が含浸され、それによって前記支持単位からの溶出に対して安定化しコード化金属塩が得られるステップと、
（４）第２のサブユニットを前記第１のサブユニットの前記官能基と共有結合させるステップであって、前記第２のサブユニットは前記第１のサブユニットと同じであっても異なっていてもよく、前記第２のサブユニットは、第３のサブユニットを加えるために任意に使用可能な官能基を任意に有するステップと、
（５）前記支持単位に１種類以上のコード化金属塩を含浸させる工程であって、前記塩は１種類以上のコード化金属カチオンを含み、前記コード化金属カチオンは天然同位体存在比または非天然同位体存在比で分布し、前記コード化金属カチオンによって前記第２のサブユニットの同定のためのコードが与えられ、前記コード化金属カチオンの溶解性塩の溶液で前記支持単位を処理して、溶解性コード化金属塩を含む支持単位を形成し、次に前記溶解性コード化金属塩を有する支持単位を、前記コード化金属カチオンと混合されると不溶性または低溶解性塩を形成するアニオンを有する塩の溶液で処理することによって、前記支持単位上に前記コード化金属塩が含浸され、それによって前記支持単位からの溶出に対して安定化したコード化金属塩が得られるステップと、
（６）さらなるサブユニットを加えて複数のサブユニットを有するリガンドを形成するために前記ステップ（４）および（５）を場合により１回以上繰り返すステップであって、前記リガンドは、前記支持単位上の前記金属イオンの分布を測定することによって同定可能であるステップと、を含み、
ステップ（２）はステップ（３）の前または後に実施したり、あるいはステップ（３）と同時に実施したりすることができ、ステップ（４）はステップ（５）の前または後に実施したり、あるいはステップ（５）と同時に実施したりすることができ、ステップ（６）に記載のステップ（４）および（５）の連続する繰り返しでは、ステップ（５）の前または後に実施したり、あるいはステップ（５）と同時に実施したりすることができる、複数のリガンド担持支持単位を有するコード化コンビナトリアルライブラリーの調製方法。
【請求項２５】
前記固体担体が合成ポリマー化合物であり、前記支持単位が多孔質ビーズである請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリマー化合物が、ジビニルベンゼンと場合により架橋したポリスチレンであり、前記ポリスチレンは官能基を有し、前記リガンドまたは前記任意のリンカー基が前記ポリスチレンの前記官能基と共有結合する請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記コード化金属カチオンが、遷移金属、ランタニド、アクチニド、Ｓｒ、Ｂａ、Ｔｌ、Ｉｎ、Ｓｂ、およびＢｉからなる群より選択される請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記コード化金属カチオンが、ＶＩＩＩ族、ＩＢ族、およびＩＩＢ族遷移金属からなる群より選択される請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記コード化金属カチオンが、Ｐｄ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｔ、Ａｇ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｈｇ、およびそれらの個々の同位体からなる群より選択される請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記アニオンがスルフィドイオンである請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記ライブラリーがスプリット−プール合成によって調製される請求項２２から３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
各支持単位が（ａ）固体担体、（ｂ）前記固体担体と共有結合するか、あるいは前記固体担体と共有結合するリンカー基と共有結合する１種類以上のリガンド、および（ｃ）前記支持単位上に含浸される１種類以上のコード化金属塩を含み、前記コード化金属塩はコード化金属カチオンを含み、前記カチオンの分布によって、１種類以上の前記リガンドを同定するコードが与えられる、複数の支持単位を有するコンビナトリアルライブラリーにおいて、改良が、前記コンビナトリアルライブラリーの調製に使用される１種類以上の溶媒中で前記コード化金属カチオンの不溶性または低溶解性塩を形成する１種類以上のアニオンを含む溶液で前記支持単位を処理することによって、前記コード化金属カチオンが溶解に対して安定化され、そのため溶解に対して安定化されたコード化金属塩が得られるコンビナトリアルライブラリー。
【請求項３３】
前記コード化金属カチオンが、硝酸イオン、ヒドロキシドイオン、クロリドイオン、酢酸イオン、および硫酸イオンからなる群より選択される１種類以上のアニオンと溶解性塩を形成し、前記コード化金属カチオンが、スルフィドイオン、硫酸イオン、オキシドイオン、ヒドロキシドイオン、ハロゲン化物イオン、および炭酸イオンからなる群より選択される１種類以上のアニオン性基と不溶性または低溶解性塩を形成する請求項３２に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項３４】
前記コード化金属カチオンが、遷移金属、ランタニド、アクチニド、Ｓｒ、Ｂａ、Ｔｌ、Ｉｎ、Ｓｂ、およびＢｉからなる群より選択される請求項３２に記載の改良。
【請求項３５】
前記アニオンがスルフィドアニオンである請求項３２に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項３６】
前記コード化金属カチオンが、ＶＩＩＩ族、ＩＢ族、およびＩＩＢ族遷移金属からなる群より選択される請求項３２に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項３７】
前記コード化金属カチオンが、Ｐｄ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｔ、Ａｇ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｈｇ、およびそれらの個々の同位体からなる群より選択される請求項３２に記載のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項３８】
請求項２２から３７のいずれか１項に記載の方法で調製された生成物。
【請求項３９】
請求項１から２１または請求項３８のいずれか１項に記載のコンビナトリアルライブラリーの支持単位上に存在するリガンドの、前記金属イオンのコードに基づく分析方法であって、（１）支持単位を提供するステップと、（２）どの金属イオンがビーズ上に存在するかを分析するステップと、（３）金属イオンの含有率を保存されるコード情報と比較して、前記支持単位上にどんなリガンドが合成されたかを同定するステップと、を含む方法。
【請求項４０】
前記支持単位の前記金属イオン含有率が、誘導結合プラズマ質量分析を使用して分析される請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記支持単位の前記金属イオン含有率が、レーザーアブレーション誘導結合プラズマ質量分析を使用して分析される請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
一連の支持単位の前記金属イオン含有率が分析される請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、コンビナトリアルケミストリーに関し、より具体的には、ビーズと結合するまたは結合した化合物を同定するためのコードを付与する１種類以上の金属でそれぞれが標識される支持単位（粒子、ビーズなど）の形態の固体支持体を含むコンビナトリアルライブラリーに関する。
【０００２】
発明の背景
コンビナトリアルケミストリー分野では、受容体の作動作用または拮抗作用などの特定の用途に対してどの化合物が活性であるかを決定するスクリーニングのために化合物のライブラリーが作製される。通常、このスクリーニングは、ライブラリーの構成要素ごと、またはライブラリーの構成要素のグループごとに検定することで行われる。検定法によって決定された所望の活性を有する化合物は、次に、より徹底的に大規模の試験が行われる。
【０００３】
陽性検定後には検定による活性を有する化合物容易が同定可能となるように、これらの大量スクリーニングで試験される化合物の試験および追跡のために多くの方策が立てられている。これらの方策のうちの１つでは、各支持単位が１種類の化合物を有するように固体支持単位上に化合物（リガンドと呼ばれる場合も多い）が合成される。次にこれらの化合物のそれぞれは、化合物が支持単位と結合したまま、あるいはより一般的には支持単位から分離した後のいずれかで検定することができる。陽性の検定結果が得られた後でも、支持単位上にあるまたはあった化合物の同定は、現在でも困難が伴う。多数の支持単位が使用されるため（通常は数百または数千）、個々の支持単位が独立して取り扱われたり追跡されたりすることはない。例えば、スプリットプール合成では、支持単位は、各合成段階および検定においてグループとして合成され操作される。各支持単位にただ１種類のリガンドが結合するのみの場合でさえ、個々の支持単位は異なるリガンドが結合する多数の別の支持単位と混合される。この種のマススクリーニングでは、合成または検定されるときに個々のリガンドを追跡し続けることは実際的でなく不可能である。その結果、検定終了後、ビーズ上に存在し所望の活性を有するリガンドの同定をさらに行う必要がある。質量分析によってリガンドが分析可能であるか、あるいは結合しているまたは以前には結合していた支持単位に含まれる情報に基づいてリガンドを同定することができる。検定される化合物（リガンド）の分析をより容易にするために、化学的マーカーまたは「タグ」を支持単位上に配置し、これらのタグを使用して、支持単位上に最初合成された化合物（リガンド）を同定することによる支持単位のコード化（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）方法が開発されている。
【０００４】
これらの化学的マーカーには少なくとも２種類の形態がある。その１つでは、固有の配列が可能なポリヌクレオチドやポリペプチドオリゴマーなどのオリゴマーが、支持単位上にあり検査される化合物と並行して合成される。次に、陽性の検定結果を有する単位のヌクレオチドまたはペプチドの配列が分析され、検定で所望の活性を有する化合物が同定される。例えば、ＷＯ９３／０６１２１号、ブレンナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２），８９，５３８１、カー（Ｋｅｒｒ）ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ（１９９３），１１５，２５２９、ルブル（Ｌｅｂｌ），Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．（１９９３），６（３），１６１、およびルブル（Ｌｅｂｌ），Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９９６），９３，８１９４を参照されたい。この化学的コード化方法には、化学的マーカーとして機能するオリゴマーの第２の並行する複雑なライブラリーの合成が必要である。この方法は非常に非効率的となる場合があり、オリゴマー／化学的マーカーの合成は制限され、試験される分子は互いに相溶性である必要がある。
【０００５】
支持単位のマーキングのための第２の方法では、化学的マーカーの組合せが支持単位に取り付けられる。この方法では、支持単位を同定する情報は、どのマーカーが存在しどのマーカーが存在しないかの組合せにあり、マーカーの配列とは無関係である。それぞれの化学的マーカーはなんらかの方法で支持単位に直接結合させる場合もあるし、あるいは化学的マーカーを互いに結合させてから一群として支持単位に結合させる場合もある。支持単位上に合成された試験される化合物の同定に必要な情報は、マーカーの配列から得られるのではなく、どのマーカーが存在しどのマーカーが存在しないかを決定することによって得られる。この方法は本質的に容易である。なぜなら、個々のマーカーを支持体に取り付けてコード化した後に、取り付けた順序は調べずにどのマーカーが存在するかを決定するよりも、分子配列を形成した後に分析する方がはるかに時間がかかり困難であるからである。さらに、自動化方法を使用して決定可能な配列の種類は、ポリペプチドやポリヌクレオチドなどわずかである。
【０００６】
どの化学的マーカーが存在しどのマーカーが存在しないかに基づくコード（ｃｏｄｅ）の付与に、化学的マーカを使用することができる。非常に便利で効率的な種類のコードの１つは二進コードであり、この場合それぞれの化学的マーカーが二進数の数字で表され、そのマーカが存在するか存在しないかが二進数の２つの選択（すなわち「１」か「０」）で表される。この方法で使用されている有機化学的マーカーの例としてはアリールエーテルカルベンが挙げられ、これらはスプリットプール合成の各段階中に合成される分子よりも少ない量で支持単位に結合し、支持単位からアリールカルベン残基が開裂することによって解読され、続いてガスクロマトグラフィー分析が行われる。例えば、スティル（Ｓｔｉｌｌ）らの米国特許第５，５６３，３２４号、スティル（Ｓｔｉｌｌ）らのＷＯ９４／０８０５１号、スティル（Ｓｔｉｌｌ）らのＷＯ９５／２６６４０号、スティル（Ｓｔｉｌｌ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３），９０，１０９２２を参照されたい。有機マーカーを使用する二進コード化方法のもう１つの例は、Ｎ−アミドメチルポリグリシンとしてまとめられる第２級アミンに基づくものであるニー（Ｎｉ）ら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９６），１６０１、ギャロップ（Ｇａｌｌｏｐ）らの米国特許第５，８４６，８３９号）。
【０００７】
支持単位の別のコード化方法では、バーコードなどの物理的コード化を使用しており、例えばＷＯ９７／１５３９０号が挙げられる。無線周波数も、イロリ（ＩＲＯＲＩ）（Ａｎｇ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．（１９９５），３４（２０），２２８９）、オントジーン（Ｏｎｔｏｇｅｎｅ）（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９５），１１７，１０７８７、およびマンデッキ（Ｍａｎｄｅｃｋｉ）（ＷＯ９７／１９９５８号）などによって使用されている。その他のマーキング方法としては、蛍光コード化（例えば、ＷＯ　９５／３２４２５号、およびエグナー（Ｅｇｎｅｒ）ら，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ（１９９７），７３５）、および同位体比コード化（例えば、ガイゼン（Ｇｅｙｓｅｎ）ら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７），３（８），６７９、ガイゼン（Ｇｅｙｓｅｎ）らのＷＯ９７／３７９５３号、ワグナー（Ｗａｇｎｅｒ）ら，Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ　Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ（１９９８），１，１４３、およびワインストック（Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ）らのＷＯ９７／２９３７１号）が挙げられる。これらの方法のすべては、一般的なコンビナトリアルライブラリーへの使用が制限されている。
【０００８】
化学的コード化の変法では、固体支持体上のコンビナトリアルライブラリーのコード化に有機化合物残基ではなく金属イオンを使用する。リンク（Ｒｉｎｋ）らのＷＯ９６／３０３９２号（この記載内容全体を本明細書に援用する）を参照されたい。この方法では、支持単位に結合する有機化合物（リガンド）のスプリットプール合成の各段階で、支持単位にランタニド金属系列の溶解性塩（硝酸塩など）が吸収される。溶液中の金属塩が、溶媒に懸濁するビーズに加えられる。
【０００９】
スプリットプール合成のそれぞれの新しい段階の後で１種類以上の異なる金属塩を加えることができる。支持単位の金属の含有率を分析し、種々の金属が表すキーと比較することによって、化合物の同定が可能となる。
【００１０】
金属塩は支持単位と共有結合しないが、合成中はずっと溶解性塩の形態でビーズ中に維持されると報告されている。本発明の発明者らは、「驚くべきことに」その後の反応段階を通じてビーズ中に十分な量の溶解性金属塩が残留し、そのため金属塩が存在するか存在しないかは、全反射Ｘ線蛍光分光法（ＴＲＸＦ）、中性子活性化の後のγ線分光法、または質量分析、特に誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）などの元素また元素イオンの分析に従来使用される方法によって、工程の終了時に決定することができると報告している。
【００１１】
しかしながら、溶解性金属塩を使用すると、金属イオンの喪失および／または支持単位間の金属イオンのクロスオーバーが起こって分析が困難および／または不確実になる場合がある。これは理想的条件下でさえも発生する可能性があり、理想的ではない条件の場合、例えば、溶媒が加熱される場合、溶媒が金属イオンのリガンドを含有するまたは溶媒がリガンドとして機能しうる場合、あるいは金属塩の溶媒に対する溶解性が高い場合などではさらに可能性が高まる。本明細書に開示の実験に使用した塩では、塩の浸出および喪失ならびに他のビーズとのクロスオーバーが観察された。したがって、金属イオンまたはその他のマーカーで標識され、温度、有機試薬、および溶媒などの種々の条件に安定である支持単位、および支持単位の作製方法が必要である。
【００１２】
発明の要約
本発明では、支持単位の標識に使用される金属の損失を防止または軽減するために、溶解性塩溶液のアニオンが、支持単位の標識（「コード化」）に使用される金属カチオンと不溶性塩を形成する、溶解性塩溶液を、標識された支持単位に加える。金属の損失は、支持単位の標識に使用される金属の不溶性または低溶解性塩が形成されることによって防止されると考えられる。支持単位は、使用される固体支持体の個々の単位である。一般に支持単位はビーズであり、好ましくは多孔質ビーズである。
【００１３】
例えば、最初に支持単位を、溶液中の１種類以上の金属塩（例えば、水中のＡｇＮＯ３）で標識することができる。次に、金属標識された支持単位は、標識として使用される金属の不溶性塩（例えばＡｇ２Ｓ）を形成すると推測されるＮａ２Ｓ溶液で処理することができる。この方法が使用される場合、金属タグ（塩）で標識される支持単位は、金属標識を容易に失うことはない。標識された支持単位は、リガンドの合成または開裂に必要なことが多い過酷な反応条件（例えば、酢酸中７０℃で支持体を終夜加熱）に対してより安定性であり、金属タグの損失がない。
【００１４】
金属の保持を向上させるもう１つの方法は、標識金属と非共有結合を形成する硫黄などの部分を構造の一部として有するリンカー基を使用することである。リンカーは１つの分子または互いに共有結合する２つ以上の分子であり、リンカーはリガンドを支持単位の官能基と結びつける。一般にリンカーは２つの反応性官能基を有し、そのためこれらは支持単位と結合し、リガンドとも結合することができる。一般的に使用されるリンカーとしては、４−ヒドロキシメチル安息香酸（ＨＭＢＡ）および４−ヒドロキシメチルフェニル酢酸が挙げられる。これらのリンカーは、コンビナトリアルライブラリーの調製で通常使用される反応条件下で開裂に対して安定であるが、同時に特定の反応条件の組において容易に開裂するため、これらのリンカーが使用される。ＨＭＢＡなどの標準的な種類のリンカー分子は、１つ以上の硫黄含有分子と結合して、硫黄含有部分も有するリンカーを形成することによって、金属への結合を向上させることができ、リンカーに通常望まれる性質も得ることができる。
【００１５】
標識金属と非共有結合を形成する硫黄または別の部分が、リンカー分子や支持単位中の別の部分に存在すると、樹脂によるコード化金属塩の取り込みおよび保持が向上する。例えば、メチル化システインのトリペプチドのカルボキシル末端は、アミノメチルポリスチレンのアミン基と結合して「予備硫化樹脂」を形成することができ、この場合予備硫化樹脂はビーズの形態である。続いて、ヒドロキシメチル安息香酸（ＨＭＢＡ）分子はトリペプチドの遊離アミン基と結合することができ、リガンドのサブユニットは１つのサブユニットがＨＭＢＡのヒドロキシ末端と順番に結合して、支持単位上でリガンドを形成することができる。
【００１６】
金属カチオンでコード化された予備硫化樹脂からなるビーズまたは支持単位を使用することで、金属イオンの保持力が高まり、支持単位間の標識金属の相互汚染が減少し、ビーズまたは支持単位上に存在するコードの決定がより迅速かつ正確になる。
【００１７】
さらに、支持単位上の金属の上記２つの安定化方法、すなわち（１）硫黄含有リンカー分子の支持単位への結合、および（２）標識金属の低溶解性または不溶性塩を形成するアニオンの溶液での金属標識された支持単位の処理を組合わせることによって、標識金属の保持がより良好になって信頼性もより高くなり、現在のところ、この組合わせは、コンビナトリアルライブラリーのリガンドのコード化に金属カチオンを使用する最良の方法である。
【００１８】
支持体をコード化するこの方法は、ライブラリー合成に使用され得る化学試薬、溶媒、および条件の種類の制限が最小限になるという利点を有し、固体支持体の金属タグを開裂させずに迅速な解読も可能である。金属の解読は、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）などの質量スペクトル分析によって最も一般的に行われる。解読のために好ましい質量スペクトル法はレーザーアブレーションＩＣＰ−ＭＳ法である。この方法は、各ビーズの解読に非常に短時間（２０秒未満）しか必要としない。レーザーアブレーション装置は、プレート上に配列した多数のビーズを自動的に走査することができる。したがってこの方法では、ライブラリー全体を自動的に解読することができ、生物学的スクリーニングから詳細な構造−活性関係（ＳＡＲ）を得ることができる。従来使用されてきた他のほとんどのコード化−解読方法（ｅｎｃｏｄｉｎｇ−ｄｅｃｏｄｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ）は自動化が容易ではなく、そのため特定の検定において少数の活性ビーズの解読にのみ適しており、ライブラリー試料のそれぞれの新しい検定には異なる解読段階が必要になる。
【００１９】
本発明は、コンビナトリアルライブラリーの調製におけるコンビナトリアル支持単位のコード化のための金属塩の使用および安定化方法に関する。本発明は、コード化されたコンビナトリアルライブラリーの作製方法、およびどのリガンドが特定のビーズ上にあるかまたは特定の種類の活性を有するかを決定するためのコンビナトリアルライブラリーの解読方法にも関する。この方法を使用して作製されるコンビナトリアル支持単位およびライブラリーはすべて新規性を有する。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明のコンビナトリアルライブラリーは、複数のリガンド担持支持単位を有し、これらのリガンド担持支持単位は、後述のような（ａ）固体担体、（ｂ）固体担体と共有結合する１種類以上のリガンド、および（ｃ）支持単位上に含浸される１種類以上のコード化金属塩を有する。
【００２１】
（ａ）担体は支持単位を構成する材料であり、リガンドが共有結合する官能基を含有し、これらの官能基とリガンドは任意にリンカー基によって結合する。リンカー基は担体とリガンドを結合させる有機残基であり、固体担体およびリガンドの両方と共有結合する。
【００２２】
（ｂ）リガンドは、担体の官能基またはリンカー基と共有結合する有機化合物である。
【００２３】
（ｃ）コード化金属塩は、天然同位体存在比または非天然同位体存在比で分布する１種類以上のコード化金属カチオンを含み、コード化金属カチオンの分布によって、支持単位に結合する１種類以上のリガンドの同定のためのコードが与えられ、さらにコード化金属塩は、コンビナトリアルライブラリーの調製に使用される１種類以上の溶媒中でコード化金属カチオンの不溶性または低溶解性塩を形成する１種類以上のアニオンも含む。
【００２４】
標識として使用される金属は、その天然同位体存在比で使用してもよい。あるいは、人工的（非天然）であるその他の同位体存在比を使用してもよい。一般に、これは１種類の同位体であり、その場合には定量的な質量スペクトル測定がより容易になる。１種類の同位体の使用は、可能となる標識数が大きく増加するという利点も有する。
【００２５】
「不溶性」および「低溶解性」は一般的な意味で使用される。不溶性または低溶解性の塩は、カチオンとアニオンを含有する溶液を混合した場合に溶液から析出する。これらの塩はほとんど溶解しない。
【００２６】
上述のコンビナトリアルライブラリーでは、リガンドは、互いに共有結合する２つ以上のサブユニットで構成されてもよく、これらは一般には支持単位上に順番に結合する。リガンドは、化学的活性、生物学的活性、またはその他の活性が評価される有機化合物である。
【００２７】
このコンビナトリアルライブラリーでは、コード化金属カチオンの溶解性塩の溶液で支持単位を処理して、溶解性コード化金属塩で標識された支持単位を形成し、次に溶解性コード化金属塩を有する支持単位を、コード化金属カチオンと混合されると不溶性または低溶解性塩を形成するアニオンを有する塩の溶液で処理することによって、支持単位上にコード化金属塩が含浸される。これによって安定化したコード化金属塩が得られ、この塩は支持単位からの溶出に対して安定化している。
【００２８】
上述のコンビナトリアルライブラリーでは、一般に固体担体は合成ポリマー化合物であり、支持単位は通常ビーズの形態であり、特に多孔質ビーズの形態である。通常、ポリマー化合物は、任意にジビニルベンゼンと架橋したポリスチレンであり、この場合ポリスチレンは他の化合物と反応可能な官能基を有する。リガンドまたは任意のリンカー基はポリスチレンの官能基と結合する。
【００２９】
上述のコンビナトリアルライブラリーの好ましい実施形態では、担体および／または任意のリンカー基は、コード化金属塩の取り込みおよび保持を促進する１つ以上の部分を有する。好ましくは、これらの部分はリンカー基中に存在する。これらの部分は、コード化金属カチオンと非共有結合するリガンドとして作用することによって、固体支持体に最初に充填される金属イオン量を増加させ、コード化金属塩の溶解性または溶解速度を減少させる。
【００３０】
本発明のコンビナトリアルライブラリーでは、溶解に対して安定化されるコード化金属塩は、硝酸イオン、ヒドロキシドイオン、クロリドイオン、酢酸イオン、および硫酸イオンからなる群より選択される１種類以上のアニオンと溶解性塩を形成するコード化金属カチオンを含み、コード化金属カチオンは、スルフィドイオン、硫酸イオン、オキシドイオン、ヒドロキシドイオン、ハロゲン化物イオン、および炭酸イオンからなる群より選択される１種類以上のアニオン性基と不溶性または低溶解性塩を形成する。通常、コード化金属カチオンは、遷移金属、ランタニド、アクチニド、Ｓｒ、Ｂａ、Ｔｌ、Ｉｎ、Ｓｂ、およびＢｉからなる群より選択される。多くの場合、コード化金属カチオンは、ＶＩＩＩ族、ＩＢ族、およびＩＩＢ族遷移金属からなる群より選択される。好ましいコード化金属カチオンとしては、Ｐｄ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｔ、Ａｇ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｃｏ、およびＨｇが挙げられ、これらの金属のそれぞれの同位体も挙げられる。
【００３１】
多くの場合、スルフィド塩またはその場でスルフィドイオンを生成可能な前駆物質の溶液で処理することによって、コード化金属塩は溶解に対して安定化される。
【００３２】
本発明は、複数の支持単位を有するコンビナトリアルライブラリーの改良方法にも関し、各支持単位は（ａ）固体担体、（ｂ）固体担体と共有結合するか、あるいは固体担体と共有結合するリンカー基と共有結合する１種類以上のリガンド、および（ｃ）支持単位上に含浸される１種類以上のコード化金属塩を含み、コード化金属塩はコード化金属カチオンを有し、カチオンの分布によって、１種類以上のリガンドを同定するコードが与えられる。この改良点は、コンビナトリアルライブラリーの調製に使用される１種類以上の溶媒中でコード化金属カチオンの不溶性または低溶解性塩を形成する１種類以上のアニオンも支持単位が有することである。
【００３３】
最初にコード化金属カチオンの溶解性塩の溶液で支持単位を処理して、溶解性コード化金属塩で標識された支持単位を形成し、次に溶解性コード化金属塩を有する支持単位を、コード化金属カチオンと混合されると不溶性または低溶解性塩を形成するアニオンを有する塩の溶液で処理することによって、支持単位上にコード化金属塩が含浸され、それによって支持単位からの溶出に対してコード化金属塩が安定化されることで、コンビナトリアルライブラリーは改良される。
【００３４】
支持単位が、固体担体と共有結合するリンカー基を有し、これらのリンカー基が、コード化金属イオンの取り込みおよび保持を向上させる１対上の部分を有する場合にさらなる向上が得られる。例としては硫黄含有リンカー基が挙げられる。
【００３５】
さらに本発明は、複数のリガンド担持支持単位を有するコード化されたコンビナトリアルライブラリーの調製方法に関し、リガンド担持支持単位は（ａ）固体担体、（ｂ）固体担体と共有結合する１種類以上のリガンド、および（ｃ）支持単位上に含浸される１種類以上のコード化金属塩を含み、金属塩によってリガンドを同定するためのコードが与えられる。この方法は、
（１）官能基を有する固体担体を含む支持担体を提供するステップであって、官能基は任意にリンカー基と結合し、リンカー基は、固体担体の官能基と共有結合する有機残基でありリガンドと共有結合する官能基を有するステップと、
（２）リガンド、または２つ以上のサブユニットを有するリガンドの第１のサブユニットを、担体の官能基、または任意のリンカー基の官能基と共有結合させるステップであって、サブユニットは第２のサブユニットと共有結合する官能基を有するステップと、
（３）支持単位に１種類以上のコード化金属塩を含浸させるステップであって、この塩は天然同位体存在比または非天然同位体存在比で分布する１種類以上のコード化金属カチオンを含み、コード化金属カチオンによって、支持単位と結合するリガンドまたはサブユニットの同定のためのコードが与えられ、コード化金属カチオンの溶解性塩の溶液で支持単位を処理して、溶解性コード化金属塩で標識された支持単位を形成し、次に溶解性コード化金属塩を有する支持単位を、コード化金属カチオンと混合されると不溶性または低溶解性塩を形成するアニオンを有する塩の溶液で処理することによって、支持単位上にコード化金属塩が含浸され、それによって支持単位からの溶出に対して安定化した安定化コード化金属塩が得られるステップと、を含み、
ステップ（３）はステップ（２）の前または後に実施したり、あるいはステップ（２）と同時に実施したりすることができる。
【００３６】
リガンドが２つ以上のサブユニットを有する場合、上述の複数のリガンド担持支持単位を有するコード化されたコンビナトリアルライブラリーの調製方法は、
（１）第２のサブユニットを第１のサブユニットの官能基と共有結合させるステップであって、第２のサブユニットは第１のサブユニットと同じであっても異なっていてもよく、第２のサブユニットは、第３のサブユニットの結合に任意に使用可能な官能基を任意に有するステップと、
（２）支持単位に１種類以上のコード化金属塩を含浸させる工程であって、この塩は天然同位体存在比または非天然同位体存在比で分布する１種類以上のコード化金属カチオンを含み、このコード化金属カチオンによって第２のサブユニットの同定のためのコードが与えられ、コード化金属カチオンの溶解性塩の溶液で支持単位を処理して、溶解性コード化金属塩で標識された支持単位を形成し、次に溶解性コード化金属塩を有する支持単位を、コード化金属カチオンと混合されると不溶性または低溶解性塩を形成するアニオンを有する塩の溶液で処理することによって、支持単位上にコード化金属塩が含浸され、それによって支持単位からの溶出に対して安定化した安定化コード化金属塩が得られるステップと、
（３）さらなるサブユニットを加えて複数のサブユニットを有するリガンドを形成するためにステップ（１）および（２）を任意に繰り返すステップであって、リガンドは、支持単位上の金属イオンの分布を測定することによって同定可能であるステップと、をさらに含み、
ステップ（１）と（２）のそれぞれの繰り返しにおいて、ステップ（１）はステップ（２）の前または後に実施したり、あるいはステップ（２）と同時に実施したりすることができる。
【００３７】
リガンド担持支持単位が（ａ）固体担体、（ｂ）固体担体と共有結合し２つ以上のサブユニットを含む１種類以上のリガンド、および（ｃ）支持単位上に含浸される複数種類のコード化金属塩を含み、金属塩によって前記リガンドの同定のためのコードが与えられる、複数のリガンド担持支持単位を有するコード化されたコンビナトリアルライブラリーの調製方法は、
（１）官能基を有する固体担体を含む支持担体を提供するステップであって、官能基は任意にリンカー基と結合し、リンカー基は、固体担体の官能基と共有結合する有機残基でありリガンドと共有結合する官能基を有するステップと、
（２）リガンド、または２つ以上のサブユニットを有するリガンドの第１のサブユニットを、担体の官能基、または任意のリンカー基（互いに結合した２つ以上の分子で構成されてもよい）の官能基と共有結合させるステップであって、サブユニットは第２のサブユニットと共有結合する官能基を有するステップと、
（３）支持単位に１種類以上のコード化金属塩を含浸させるステップであって、この塩は天然同位体存在比または非天然同位体存在比で分布する１種類以上のコード化金属カチオンを含み、コード化金属カチオンによって、支持単位と結合するリガンドまたはサブユニットの同定のためのコードが与えられ、コード化金属カチオンの溶解性塩の溶液で支持単位を処理して、溶解性コード化金属塩で標識された支持単位を形成し、次に溶解性コード化金属塩を有する支持単位を、コード化金属カチオンと混合されると不溶性または低溶解性塩を形成するアニオンを有する塩の溶液で処理することによって、支持単位上にコード化金属塩が含浸され、それによって支持単位からの溶出に対して安定化した安定化コード化金属塩が得られるステップと、
（４）第２のサブユニットを第１のサブユニットの官能基と共有結合させるステップであって、第２のサブユニットは第１のサブユニットと同じであっても異なっていてもよく、第２のサブユニットは、第３のサブユニットの結合に任意に使用可能な官能基を任意に有するステップと、
（５）支持単位に１種類以上のコード化金属塩を含浸させる工程であって、この塩は天然同位体存在比または非天然同位体存在比で分布する１種類以上のコード化金属カチオンを含み、このコード化金属カチオンによって第２のサブユニットの同定のためのコードが与えられ、コード化金属カチオンの溶解性塩の溶液で支持単位を処理して、溶解性コード化金属塩で標識された支持単位を形成し、次に溶解性コード化金属塩を有する支持単位を、コード化金属カチオンと混合されると不溶性または低溶解性塩を形成するアニオンを有する塩の溶液で処理することによって、支持単位上にコード化金属塩が含浸され、それによって支持単位からの溶出に対して安定化したコード化金属塩が得られるステップと、
（６）さらなるサブユニットを加えて複数のサブユニットを有するリガンドを形成するために前記ステップ（４）および（５）を任意に１回以上繰り返すステップであって、リガンドは、支持単位上の金属イオンの分布を測定することによって同定可能であるステップと、を含み、
ステップ（２）はステップ（３）の前または後に実施したり、あるいはステップ（３）と同時に実施したりすることができ、ステップ（４）はステップ（５）の前または後に実施したり、あるいはステップ（５）と同時に実施したりすることができ、ステップ（６）に記載のステップ（４）および（５）の連続する繰り返しでは、ステップ（５）の前または後に実施したり、あるいはステップ（５）と同時に実施したりすることができる。
【００３８】
コード化された支持単位の作製方法の上記説明において、コード化ステップ、およびサブユニットが加えられるステップは一般にスプリット−プール合成の一部であり、これは上記のステップが、個々の支持単位ではなく支持単位の群に対して実施されることを意味する。また、標識とともにリガンドまたはリガンドサブユニットが加えられるステップの各組の後で、支持単位の群は別の支持単位または別の支持単位の群と組み合わせることができるか、あるいは支持単位の群はより小さな群に分割することができ、次にこれらのグループを次のステップの前に別の支持単位または別の支持単位の群と組み合わせることができることも意味する。
【００３９】
本発明は、複数のリガンド担持支持単位を有するコード化されたコンビナトリアルライブラリーの改良された調製方法にも関し、各支持単位は、（ａ）固体担体、（ｂ）固体担体と共有結合するか、あるいは固体担体と共有結合するリンカー基と共有結合する１種類以上のリガンド、および（ｃ）支持単位上に含浸される１種類以上のコード化金属塩を含み、前記コード化金属塩はコード化金属カチオンを含み、カチオンの分布によって、１種類以上のリガンドを同定するコードが与えられる。この改良点は、前記コンビナトリアルライブラリーの調製に使用される１種類以上の溶媒中で前記コード化金属カチオンの不溶性または低溶解性塩を形成する１種類以上のアニオンを含む溶液で支持単位を処理することによって、コード化金属カチオンが溶解に対して安定化され、そのため溶解に対して安定化されたコード化金属塩が得られることである。
【００４０】
上述の任意の方法で作製されたコンビナトリアルライブラリーも新規性を有する。
【００４１】
最後に、上述のコンビナトリアルライブラリーの支持単位上に存在するリガンドの分析方法では、金属標識にコード化された情報が使用される。１つの支持単位上のリガンドの同定方法は、（１）リガンドと金属標識を有する支持単位のライブラリーから１つの支持単位を提供するステップと、（２）どの金属イオンが支持単位上に存在するかを分析するステップと、（３）金属イオンの含有率をコード情報と比較して、支持単位上にどんなリガンドが合成されたかを同定するステップと、を含む。
【００４２】
支持単位の金属イオンの含有率は、誘導結合プラズマ質量分析、特にレーザーアブレーション誘導結合プラズマ質量分析（レーザーアブレーションＩＣＰ−ＭＳ）を使用して分析される。レーザーアブレーションＩＣＰ−ＭＳは大量の試料の迅速なスクリーニングを実施するために優れた方法であり、マイクロタイタープレートなどに見られる配列した試料のスクリーンに適合させることができる。マイクロタイタープレート上のビーズ配列の分析に適合した装置の例は、ＣＥＴＡＣのＬＳＸ−２００レーザーアブレーションユニットを取り付けたパーキン・エルマー・エラン（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｅｌａｎ）２０００　ＩＣＰ−ＭＳである。樹脂ビーズは試料ホルダーに配置され、レーザービームによる走査または穿孔のいずれかが行われる。
【００４３】
以下の実施例は、本発明の説明のために提供される。本発明は、これらの特定の実施例に制限されるように構成されているわけではない。本発明の範囲は請求項によって規定される。
【００４４】
実施例
実験方法および材料
実施例で使用される樹脂は、ＬＣＣエンジニアリング・アンド・トレーディングＧＭＢＨ（ＬＣＣ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎｄ　Ｔｒａｄｉｎｇ　ＧＭＢＨ）より購入したアミノメチル官能化ポリスチレンビーズ（ＨＡＴ−１０６−１．１ＡＭ）である。装入量は１．１ｍｍｏｌ／ｇである。
【００４５】
３当量の４−ヒドロキシメチル安息香酸（ＨＭＢＡ）、４当量のＨＯＢｔ、３当量のＤＩＣ、および触媒としての３％のＤＭＡＰを使用した標準的方法によってＨＭＢＡリンカーを樹脂に結合させた。すべての樹脂はＤＭＦ中で混合し、樹脂を混合する前にはＨＭＢＡ濃度は約０．４Ｍとなった。得られた樹脂懸濁液を室温で約３時間静置し、続いて洗浄し（ＤＭＦで４回、ＴＨＦ−ＤＣＭで３回）、減圧乾燥した。
【００４６】
予備硫化樹脂を使用する場合は、最初にＬＣＣアミノメチル官能化ポリスチレンビーズをペプチドとしてメチル化システインを使用して樹脂にトリペプチド配列を結合させることにより予備硫化樹脂を誘導した。この樹脂を、３当量のＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−ＯＨおよび３当量のＤＩＣを含有する濃度０．２５ＭのＤＭＦ溶液に懸濁させた。ＤＭＦ（３回）で洗浄後、樹脂をピペリジン／ＤＭＦ（２５％）で処理して、Ｆｍｏｃ保護基を解離させた。この手順をさらに２回繰り返して、Ｃｙｓ（Ｍｅ）−ＮＨ２トリペプチド樹脂を得た。次に、前述の通りにＨＭＢＡをＮＨ２末端基に結合させた。
【００４７】
実施例１
この実施例では、金属の吸収および保持に関して異なる能力を有する種々の官能基を有する樹脂を示す。樹脂の金属塩標識が、樹脂上に生成される生成物の収率または純度に影響しないことも示す。以下の表１は実験結果を示している。
【００４８】
この実施例では、フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）インドール合成を使用してポリスチレンビーズ上で３−置換−２−フェニルインドールを合成する。一例を以下の図式に示す。以下の図式では、４−ヒドロキシメチル安息香酸リンカー（ＨＭＢＡ）をアミン官能性を有するポリスチレンビーズのアミン基と結合させた後に、樹脂上でフィッシャーインドール合成が実施される。以下の表１は、金属塩標識およびポリスチレンビーズを使用した数種類の試験の結果を示している。以下の図式は、３−置換−２−フェニルインドールの合成を示しているが、その他の２−アリールインドールも同様の方法で合成可能である。同様に、その他の２−置換基も同様の方法で導入可能である。
【００４９】
【化１】
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【００５０】
表１の試料１Ａ、１ＡＡ、１Ｂ、および１ＢＢは、非官能化架橋ポリスチレンビーズから金属イオン（ＡｇおよびＮｉ）が急速に洗い落とされることを示す対照試料である。数種類の異なる処理をした後でジビニルベンゼンと架橋させたポリスチレンに関して、樹脂上に残留する金属塩（ＡｇおよびＮｉの硝酸塩）を示す。金属タグを加えタグを有する樹脂を洗浄した後（「洗浄１」）と、続いて、Ｎａ２Ｓで処理して２回目の洗浄を行なった後、あるいはＮａ２Ｓ処理を行わずに２回目の洗浄を行った後（「洗浄２」）の樹脂上に残留する塩の量を表１に示す。支持体のタグ付け、Ｎａ２Ｓの処理、および洗浄ステップの条件は、表１の脚注に示している。
【００５１】
試料１Ｃ、１ＣＣ、１Ｄ、および１ＤＤのデータは、アミン官能基によって樹脂の標識金属の吸収および保持に対する樹脂の親和性が増加することを示しており、金属に対する親和性がほとんどまたは全くない非官能化ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂（試料１Ａ、１ＡＡ、１Ｂ、および１ＢＢ）と非常に対照的である。これらの実施例について、金属タグを加えタグを有する樹脂を洗浄した後（「洗浄１」）と、続いて、Ｎａ２Ｓで処理して２回目の洗浄を行なった後、あるいはＮａ２Ｓ処理を行わずに２回目の洗浄を行った後（「洗浄２」）の樹脂上に残留する塩の量を表１に示している。Ｎａ２Ｓで処理した試料の場合、ＨＭＢＡリンカーは樹脂のアミン基と結合させ、フィッシャーインドール合成を行った。これらの各ステップの後の支持体の金属含有率を示す。
【００５２】
樹脂をＮａ２Ｓで処理することによって、樹脂の金属保持能力が向上することが分かる。これは溶解性金属塩（例えば硝酸塩）が不溶性の金属硫化物に変化したためと考えられる。したがってＮａ２Ｓ処理はコード化過程を成功させるために重要な要素であり、一方未処理の樹脂は後のステップで樹脂を失う（次の実施例を参照）。この実施例では、銀イオンの保持がニッケルイオンの保持よりもはるかに優れていることがわかる。
【００５３】
実施例１Ｅ、１ＥＥ、１Ｆ、および１ＦＦでは、ＨＭＢＡリンカーを結合させたアルコール末端ポリスチレン支持単位から出発して同じステップを実施している。金属タグをＨＭＢＡ官能化ビーズと結合させ、次に金属タグ付きビーズにＮａ２Ｓ処理を実施した。前の実施例と同様に、一部の金属タグ付きＨＭＢＡ官能化ビーズはＮａ２Ｓで処理せず、そのためＮａ２Ｓ処理ビーズを、Ｎａ２Ｓで処理していないビーズと比較することができた。これらの実施例では、ＨＭＢＡ官能化ビーズはポリスチレンよりも金属タグに対する親和性が高いが、ＨＭＢＡリンカーをアミン官能化ポリスチレンに結合させて作製したビーズほど親和性は高くない。実施例１Ａ、１ＡＡ、１Ｂ、および１ＢＢに示されるデータと比較すると、ポリスチレンをＮａ２Ｓで処理したかどうかとは無関係に、ポリスチレンと結合するある種の官能性が存在するにもかかわらずタグ金属はポリスチレンに接着しないことが分かる。前の実施例と同様に、Ｎａ２Ｓ処理後には金属タグはうまく保持され、Ｎａ２Ｓ処理後ではＡｇの方がＮｉよりもよく保持される。
【００５４】
最後に、金属イオンマーカーを使用しても使用しなくても、フィッシャーインドール合成で得た３−置換２−アリールインドール生成物は、同じ純度（＞９０％、ＨＰＬＣおよびＮＭＲより）および同じ収率であった。したがって、金属の存在は、支持される有機化合物の化学反応を妨害しないと思われる。
【００５５】
【表１】
2004502705.tif 000003
2004502705.tif 000004
【００５６】
実施例２
この実施例は、樹脂の予備硫化による金属イオンの吸収性向上効果を示す。二進コード化ライブラリーが得られるコード化方法の使用も示す。
【００５７】
コード化方法におけるＮａ２Ｓ処理の効果を確認できるようにするためと、リンカー基としてのＨＭＢＡへの硫黄含有基（３つのメチル化システイン単位）の導入の効果を確認できるようにするため、同じ構成単位を有する４つのライブラリーの組を合成した。リンカー中の硫黄含有基とＮａ２Ｓ処理の両方を合わせた効果も調べることができる。
【００５８】
ライブラリーはすべて同じ大きさの７×４×１であり、その構成単位は以下に示す。最初に７種類のＸ化合物のうちの１つを樹脂またはリンカー基と結合させ、次に４種類のＹ化合物のうちの１つを結合させ、最後にＺ１を結合させ、続いて環化させてインドールを得る。化合物およびリンカー基のビーズへの結合は、すべて標準的方法を使用して実施する。
【００５９】
【化２】
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【００６０】
４つのライブラリーは、Ｎａ２Ｓ処理の効果、リンカーの一部として（すなわちＢＭＢＡとポリスチレン樹脂の間）硫黄含有基を使用する効果、およびＮａ２Ｓ処理とリンカー中の硫黄含有基の両方を合わせた効果を比較するため、以下のように構成される。
【００６１】
２Ａ：ＰＳ−ＨＭＢＡ（リンカー中のＨＭＢＡの前に硫黄含有基なし）、ＸおよびＹコード化ステップの後のＮａ２Ｓ処理なし、
２Ｂ：ＰＳ−ＨＭＢＡ（リンカー中のＨＭＢＡの前に硫黄含有基なし）、両方のコード化ステップの後にＮａ２Ｓ処理を実施、
２Ｃ：ＰＳ−（Ｃｙｓ’）３−ＨＭＢＡ、Ｘコード化ステップ後にはＮａ２Ｓ処理を行ったが、Ｙコード化ステップ中にはＮａ２Ｓ処理を行わず、
２Ｄ：ＰＳ−（Ｃｙｓ’）３−ＨＭＢＡ、両方のコード化ステップ後にＮａ２Ｓ処理を実施。
【００６２】
コード化の表および条件は、
【００６３】
【表２】
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【００６４】
金属はすべて溶解性硝酸塩として加えた。最初の２つの構成単位をそれぞれ結合させた後に樹脂ビーズをタグ溶液混合物（ＤＭＦ：Ｈ２Ｏ＝９：１）で１時間処理し、続いてＤＭＦ：Ｈ２Ｏ（９：１）で３回洗浄した。タグ付けステップの後、一部のビーズは、ＤＭＦ：Ｈ２Ｏ（４：１）中０．１ＭのＮａ２Ｓを含有する溶液で１時間処理した。Ｎａ２Ｓで処理したビーズ、およびＮａ２Ｓで処理しなかったビーズはすべてＤＭＰ：Ｈ２Ｏ（９：１）で３回洗浄し、次にＤＭＦとＤＭＦ：１Ｎ　ＨＣｌ（９：１）とで交互に３回洗浄し、続いてＤＭＦで３回洗浄し、最後にＴＨＦ−ＤＣＭで３回洗浄した。
【００６５】
Ｙ方向のコード化の後、各ライブラリーの樹脂を１つに合わせて、次に０．５ＭのＰｈＮＨＮＨ２・ＨＣｌ−ＺｎＣｌ２／ＨＯＡｃを使用し終夜７０℃に維持する条件でフィッシャーインドール環化反応を実施した。得られた樹脂は洗浄し、乾燥させた。
【００６６】
各ライブラリーの樹脂の一部（２Ａ〜２Ｄ）を開裂させ、２−アリールインドールの混合物を得た。これらの生成物の収率および純度を記録した。次に樹脂ビーズに硝酸を加えて温浸し、全体の金属含有率についてＩＣＰ−ＭＳ装置で分析した。以下の表に結果を示す。
【００６７】
【表３】
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【００６８】
ライブラリー２Ａの樹脂ビーズは、合成終了時に金属コードの同定に十分なコード化金属が残留していないことが明らかである。両方のコード化ステップでＮａ２Ｓで処理した同様のライブラリー２Ｂでは、リガンド開裂後も有医療の金属タグが残留した。Ｙ方向のコード化でＮａ２Ｓ処理を行わなず、そのためＣｏ含有率が低かった２Ｃを除けば、メチルシステイントリペプチドがリンカー中に存在する樹脂の場合には金属含有率が高かった。
【００６９】
ビーズのＮａ２Ｓ処理も行った実験におけるライブラリー１Ｂ、１Ｃ、および１Ｄの１つのビーズの分析を表に示す。
【００７０】
各ライブラリーの多数のビーズをそれぞれ開裂させ（５μｌの１０％ＴＥＡ／ＭｅＯＨ、５０℃で１５時間）、１つのビーズ当たり１種類の化合物を得た。過剰の試薬は減圧留去し、化合物を５μｌのＤＭＳＯで抽出した。この化合物のＤＭＳＯ溶液を次にＨ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮ（２：１）で２５μｌまで希釈し、構造を同定するためにＬＣ−ＭＳで分析を行った次に樹脂ビーズの金属含有率を分析するためにＥＴＶ−ＩＣＰ−ＭＳ（電熱気化ＩＣＰ−ＭＳ）を実施した。ライブラリー中の各金属の相対的強度を測定するときに、閾値を超える値はコード化金属が存在することを示し、閾値未満であればコード化金属が存在しないことを示す閾値を選択した。二進数１はコード化金属が存在することを表し、０はコード化金属が存在しないことを示す。コード化が失敗した場合には、閾値を設定しなくてもうよい。各ライブラリーの結果を以下の表に示す。
【００７１】
【表４】
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【００７２】
２Ｂの金属コードは、Ｒｈデータが読み取りできないことを除けば、全体的に読み取り可能である。反応中にＲｈタグが失われることによって、いくつかの実験ではＲｈ含有率の読み取りに失敗した。２Ｂにおけるすべての失敗は、Ｒｈコード化ビーズからＲｈが失われたことが原因である。ＰＳ−ＨＭＢＡ樹脂の場合にＲｈタグで信頼性のあるデータを得るためには、Ｒｈタグ濃度をより高くする必要がある。
【００７３】
【表５】
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【００７４】
ライブラリー２Ｃは、タグ取り付けステップ後のＮａ２Ｓ処理の重大な影響を示している。Ｘ方向のコード化方法では、タグ金属は溶解性の低い金属硫化物にけんかした。すべてのＸ方向コードは読み取り可能であり、そのため金属の存在を示す閾値を調整することによって誤差の補正が可能である。Ｙ方向のコード化では、Ｎａ２Ｓ処理ステップが省略され、Ｙ方向コードは読み取りできない。Ｃｏの場合、Ｎａ２Ｓが使用されないことで、ゆるく結合したＣｏは完全にビーズから洗い流されてしまった。Ｒｕの場合、コード化されたビーズからコード化されていないビーズへのタグ金属の移行の問題が生じている。
【００７５】
【表６】
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【００７６】
ライブラリー２Ｄはコード化に成功している。開裂させ分析したビーズについて、番のビーズ（Ｒｈの閾値をわずかに下げる（例えば相対強度＝５０）と補正される）を除けば、解読したすべての構造はＬＣ−ＭＳによる構造と一致した。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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