(57)【要約】本発明は、全身性および／または粘膜経路で投与される凝集抗原に対する免疫応答を増強することができ、かつ強力な免疫応答を生成することができる、凝集した抗原性構造体を得る方法、および該方法の応用により得られる化学的構造体、該構造体から得られる製剤、およびその使用に関する。本方法は、粒子およびその異種凝集物から脂質を放出することができる、凝集性、脱脂性もしくは酸化性の物質または化合物を使用して、新規の凝集した抗原性構造体を得る方法であって、次に３０〜５００ｎｍの粒子サイズを有する凝集物が、分子排除プロセスにより選択される、上記方法を記載する。インキュベーション条件を変更することにより、酵母中に凝集状態を誘導することができる。生じる構造体は、アジュバントを加えるかまたはいくつかの抗原が導入できる製剤中で便利に使用することができ、得られる応答の免疫原性に関して、成分間の相乗作用が見られる。この調製物はまた、安定性および保存剤を含有してもよい、生じる抗原性構造体は、医薬品業界で、予防用または治療用ワクチン製剤として、ヒトおよび動物への使用で、および診断システムの一部として使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ）目的の抗原を選択する工程、
Ｂ）凝集能力を有する、化学物質、酸化剤、または他の成分のような、凝集プロセスを促進する媒体中へ、１種抗原または数種抗原の混合物を添加する工程、
Ｃ）該混合物をインキュベーションする工程、
Ｄ）分子排除クロマトグラフィー、透析ろ過、および透析等の、これら混合物の分子サイズを保持することが可能な方法により、３０〜５００ｎｍのサイズの粒子凝集物を選択する工程、及び
Ｅ）選択されたアジュバントの添加、及び他の抗原、安定剤および保存剤の任意の添加により、工程（Ｃ）で選択された抗原性構造体の混合物から、製剤を調製する工程、
を含む、高度に免疫原性を有する凝集抗原性構造体の製造方法。
【請求項２】
工程（Ｂ）で得られる構造体の一部である抗原中における、ウイルス性、細菌性、単一細胞性または多細胞性の病原体のリポタンパク質、リポペプチド、または脂質性抗原の存在を特徴とする、請求項１に記載の抗原性構造体の製造法。
【請求項３】
工程（Ｂ）で得られる構造体の一部である抗原は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原であり、この抗原によってのみ一体化されて凝集物を形成することを特徴とする、請求項１記載の抗原性構造体の製造法。
【請求項４】
工程（Ｂ）で得られる構造体の一部である抗原中に、疎水性または共有結合的な相互作用によりＢ型肝炎表面抗原に凝集することができる２つ以上の同種または異種抗原が存在し、異なる抗原の凝集物を生成していることを特徴とする、請求項１記載の抗原性構造体の製造法。
【請求項５】
工程（Ｂ）で得られる構造体の一部である抗原中に、Ｂ型肝炎ウイルスヌクレオカプシド及びＢ型肝炎ウイルス表面抗原が存在することを特徴とする、請求項１記載の抗原性構造体の製造法。
【請求項６】
工程（Ｂ）で得られる構造体の一部である抗原中に、Ｃ型肝炎ウイルスヌクレオカプシドとＢ型肝炎ウイルス表面抗原が存在することを特徴とする、請求項１記載の抗原性構造体の製造法。
【請求項７】
工程（Ｂ）で得られる構造体の一部である抗原中に、ヒト免疫不全症ウイルス１型または２型のヌクレオカプシドとＢ型肝炎ウイルス表面抗原が存在することを特徴とする、請求項１記載の抗原性構造体の製造法。
【請求項８】
工程（Ｂ）で得られる構造体の一部である抗原中に、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜タンパク質とＢ型肝炎ウイルスの表面抗原が存在することを特徴とする、請求項１記載の抗原性構造体の製造法。
【請求項９】
工程（Ｂ）の抗原が会合される媒体の一部である成分中に、β−シクロデキストリンが存在することを特徴とする、請求項１記載の抗原性構造体の製造法。
【請求項１０】
工程（Ｂ）の抗原が会合され、銅、鉄金属塩、または他の同じ凝集目的を持つ物質により増強される、媒体の一部の成分中に、１０〜５０μｍ濃度のアンモニウム塩が存在することを特徴とする、請求項１記載の抗原性構造体の製造法。
【請求項１１】
工程（Ｂ）の抗原が会合される媒体の一部の成分中に、自発的凝集を促進する能力を有する、ＨＢｃＡｇおよび他のウイルスヌクレオカプシド抗原のような凝集能力を示す抗原が存在することを特徴とする、請求項１記載の抗原性構造体の製造法。
【請求項１２】
工程（Ｂ）の抗原が会合される媒体の一部の成分中に、ＨＢｓＡｇへの自発的凝集を促進する能力を有する、ウイルス表面抗原誘導体、細菌外膜、または脂質誘導体のような疎水性抗原が存在することを特徴とする、請求項１記載の抗原性構造体の製造法。
【請求項１３】
工程（Ｂ）の抗原が会合される媒体の一部の成分中に、ＨＢｓＡｇへの自発的凝集を促進する能力を有する、部分的または完全に疎水性のアジュバントが存在することを特徴とする、請求項１記載の抗原性構造体の製造法。
【請求項１４】
工程（Ｂ）の抗原が会合される媒体の一部の成分中に、疎水性、共有結合性または静電結合性により、ＨＢｓＡｇの、またはこれと他の化学構造体との凝集を促進できる特性を有する化合物が存在することを特徴とする、請求項１記載の抗原性構造体の製造法。
【請求項１５】
工程（Ｃ）のインキュベーション時間は、選択される凝集手段に応じて１０分〜１週間であることを特徴とする、請求項１記載の抗原性構造体の製造法。
【請求項１６】
分子排除クロマトグラフィー、透析、透析ろ過、または３０〜５００ｎｍの分子サイズの保持を可能にする他の方法により、３０〜５００ｎｍの粒子凝集物を選択することを特徴とする、請求項１記載の抗原性構造体の製造法。
【請求項１７】
ミョウバンまたはカルシウム塩、油性または他の市販されているアジュバントで選択されたアジュバント、および他の抗原、安定剤または保存剤を用いて、工程（Ｃ）において選択された抗原性構造体の混合物から工程（Ｅ）で製剤を産生することを特徴とする、請求項１記載の抗原性構造体の製造法。
【請求項１８】
生じる製剤の免疫原性と、免疫系の特異的認識の上昇を促進する、請求項１記載の方法で得られる凝集抗原性構造体。
【請求項１９】
凝集物中に含有される抗原は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原である、請求項１８で得られる凝集抗原性構造体。
【請求項２０】
２以上の凝集抗原を含有することを特徴とする、請求項１８の凝集した抗原性構造体。
【請求項２１】
抗原は、ＨＢｓＡｇと他の疎水性粒子抗原の混合物でもよい、請求項１８の凝集した抗原性構造体。
【請求項２２】
抗原は、ＨＢｓＡｇとＨＢｃ−Ａｇｓの混合物であることを特徴とする、請求項２１の凝集した抗原性構造体。
【請求項２３】
抗原は、ＨＢｓＡｇとＨＣＶヌクレオカプシド抗原の混合物であることを特徴とする、請求項２１の凝集した抗原性構造体。
【請求項２４】
抗原は、ＨＢｓＡｇとＨＰＶ、ＨＣＶ、およびＨＩＶ１および２ヌクレオカプシド抗原の混合物であることを特徴とする、請求項２１の凝集した抗原性構造体。
【請求項２５】
抗原は、ＨＢｓＡｇと他のウイルス表面抗原の混合物であることを特徴とする、請求項２１の凝集した抗原性構造体。
【請求項２６】
抗原は、ＨＢｓＡｇと疎水性アジュバントの混合物であることを特徴とする、請求項２１の凝集した抗原性構造体。
【請求項２７】
抗原は、ＨＢｓＡｇとウイルスまたは細菌抗原およびそれらの誘導体の混合物であることを特徴とする、請求項２１の凝集した抗原性構造体。
【請求項２８】
抗原は、ＨＢｓＡｇと疎水性アジュバントの混合物であることを特徴とする、請求項２１の凝集した抗原性構造体。
【請求項２９】
他の粒子タンパク質またはアジュバントに結合した１つのウイルスまたはウイルス様粒子を含有する凝集した構造体を特徴とする、請求項１記載の凝集した抗原性構造体。
【請求項３０】
診断システムにおける請求項１８〜２９の抗原性構造体の使用。
【請求項３１】
予防および治療ワクチンにおける請求項１８〜２９の抗原性構造体の使用。
【請求項３２】
請求項１８〜２９のいずれかに記載の抗原性構造体、及びアジュバント、安定剤または保存剤を含む、ワクチン製剤。
【請求項３３】
全身投与または粘膜投与のための、請求項３２のワクチン製剤。
【請求項３４】
感染症、自己免疫疾患および癌の予防のための、請求項３２と３３のワクチン製剤の使用。
【請求項３５】
感染症、自己免疫疾患および癌の治療のための、請求項３２と３３のワクチン製剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、医学分野に関し、特に、新しいワクチン製剤の使用に関する。
【０００２】
本発明の技術的な目的は、全身性または粘膜経路で投与される現存する抗原の免疫原性を増強することができる、凝集した抗原性構造体、及びその製剤の製造法を開発することにある。
【０００３】
本発明における方法は、顆粒抗原の抗原性凝集構造、他の抗原、及び凝集性、脱脂性または酸化性の特性を有する成分の添加、３０〜５００ｎｍの凝集粒子の後選択、並びに生じた抗原性組成物の免疫原性を促進する、適当にアジュバントされたこれらの凝集物の製剤化を、生じる。
【０００４】
ＨＢｓＡｇは、有効な免疫原であるため、ヒトにおいて広範に使用可能な最初のワクチン候補物質となり、初めて認可された一般向け抗Ｂ型肝炎組換えワクチンである。ＨＢｓＡｇタンパク質は、自己集合性の２２ｎｍの粒子である（ヘアマン（Ｈｅｅｒｍａｎ ＫＨ）、ゲーリッヒ（Ｇｅｒｌｉｃｈ ＷＨ）、１９９１、Ｂ型肝炎ウイルスの表面タンパク質（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）、マクラクラン（Ａ． ＭｃＬａｃｈｌａｎ）編、シーアールシー・プレス（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）、ボカラートン（Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ）、アンハーバー（Ａｎｎ Ｈａｒｂｏｒ）、ボストン、ロンドン、１０９頁）。ＨＢｓＡｇに対する免疫応答の分子的、細胞的および遺伝子的基礎は、ハツカネズミのモデルで広範に研究されている（ミリチ（Ｍｉｌｉｃｈ， ＤＲ）、１９８７，Ｂ型肝炎ウイルス抗原のＴ細胞およびＢ細胞認識の遺伝的および分子的基礎、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ． ９９：７１）。従来は、表面抗原の種々の物理化学的性質が、ＭＨＣクラスＩで特定されるＴ細胞の免疫原性に、いかに影響を与えるかが研究されていた。ＭＨＣクラスＩで特定される細胞障害性Ｔリンパ球の有効な応答は、アジュバントを用いることなく、２２ｎｍの粒子化された天然抗原のたった一度の低量注入、または界面活性剤変性モノマーで生じることが証明されている（シャームベック（Ｓｃｈｉｒｍｂｅｃｋ， Ｒ）ら、１９９４，Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４：１０８８）。また、直径約１μｍの粒子を産生する、熱変性により得られるＨＢＶ表面抗原の凝集物からなる製剤の免疫原性も、研究されている。
【０００５】
生体内における抗原処理の種類は、主なＴ細胞応答能及び関与するＴ細胞のサブクラス範囲に重要な影響を及ぼす。ＭＨＣへのペプチドの提示において、ＭＨＣクラスＩＩＣＤ４＋制限Ｔ細胞と、ＭＨＣクラスＩＣＤ８＋制限Ｔ細胞について、明らかに別のプロセスが作用している（ジャーメイン（Ｇｅｒｍａｉｎ， ＲＮ）ら、１９９３， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１：４０３）。ＭＨＣクラスＩ制限エピトープを提示するための、外因性ＨＢｓＡｇ粒子処理の新しいエンドソーム経路が、記載されている。この熱変性した直径１μｍの外因性ＨＢｓＡｇ粒子の処理は、マクロファージでは起きるが、他の種類の細胞では起きず、処理マクロファージからの抗原性ペプチドの逆流を伴う。この外因性抗原ＭＨＣクラスＩ制限ペプチドの生成プロセスは、仮に食作用経路と呼ばれている。天然の２２ｎｍのＨＢｓＡｇ粒子は、主にエンドサイトーシス経路により処理され、１μｍ凝集物は食作用経路により処理される。これら２つのＨＢｓＡｇ外因性調製物は、異なるインビトロ処理に加え、これらがアジュバントなしで送られた場合には、クラスＩ細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に対する生体内での免疫原性が顕著に異なっていた。天然のＨＢｓＡｇ粒子は、免疫原性が高いが、変性した表面抗原凝集物は、免疫原性が低かった（シャームベック（Ｓｃｈｉｒｍｂｅｃｋ， Ｒ）ら、１９９５， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５５：４６７６−４６８４）。
【０００６】
蛍光偏光を使用して行われた他の研究は、ＨＢｓＡｇ粒子が、タンパク質凝集物と相互作用する脂質二重層として構成されることを示唆している（ソンボー（Ｓｏｎｖｅａｕｘ Ｎ．）、１９８５ Ｒｅｓ Ｖｉｒｏｌ １４６（１）：４３−５１）。
【０００７】
クロロホルム−メタノール（２：１、ｖ／ｖ）５０％  １，１’、３，３’−テトラメチル尿素によるＨＢｓＡｇ処理は、その脂質の大部分が放出されたにも拘らず、粒子の形態に影響を与えなかった（平均直径を維持した）。脱脂により、抗原性とＨＢｓＡｇポリペプチドの組成は、変化しなかった（ニューラス（Ｎｅｕｒａｔｈ ＡＲ）ら、１９７８ Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ １０（５）：２６５−７５）。粒子凝集物が、例えば、カオトロピック剤の存在、適度な温度、かつ高濃度溶液といった、ストレス条件下でのプロセスにおいて産生されないことを考慮して、組換えＢ型肝炎表面抗原の粒子凝集物の供給源が、免疫親和性と分子サイズ排除クロマトグラフィー法の組合せにより研究されている。分子排除クロマトグラフィーでＨＢｓＡｇに対応するピークのベースの上昇を引き起こす要因の研究は、ＨＢｓＡｇ粒子のサイズ変動性に加え、粒子凝集物の存在を証明した（トレウガブロバ（Ｔｌｅｕｇａｂｕｌｏｖａ Ｄ．） １９９８ Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ Ａｐｐｌ ７０７（１−２）：２６７−７３、トレウガブロバ（Ｔｌｅｕｇａｂｕｌｏｖａ Ｄ．） １９９７ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ ４５：３１７−３２０）。その結果、大きな粒子凝集物に対応する画分で凝集抗原が得られたが、天然のＨＢｓＡｇタンパク質は見つからず、この文献の他の結果は、凝集物が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるモノマーやダイマーとしてのみならず、正確に折り畳まれた表面抗原として泳動する、２２ｎｍ粒子により形成されることを証明している（トレウガブロバ（Ｔｌｅｕｇａｂｕｌｏｖａ Ｄ．） １９９８ Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ Ａｐｐｌ ７１６（１−２）：２０９−１９）。
【０００８】
発明の開示
本発明の対象の１つは、起源である抗原より高い免疫原性を有する凝集した抗原性構造体を得るための方法である。該方法は、以下の工程を含む：
Ａ）目的の抗原を選択する工程、
Ｂ）凝集プロセスを促進する媒体中への混合物の１の抗原または数種の抗原を添加する工程（該媒体は、凝集能力を有する、化学物質、酸化剤、または他の成分を含有してもよい。）、
Ｃ）混合物をインキュベーションする工程、
Ｄ）例えば、分子排除クロマトグラフィー、透析ろ過、および透析といった、これら混合物の分子サイズを保持できる方法により、３０〜５００ｎｍのサイズの粒子凝集物を選択する工程、
Ｅ）選択されたアジュバントの添加、並びに他の抗原、安定剤および保存剤の有効な添加により、工程（Ｃ）において選択された抗原性構造体を混合することにより製剤を調製する工程。
【０００９】
本発明の方法により、ＨＢＶの表面抗原のみを含有するいくつかの凝集物を、得ることができるが、本発明の方法により得られる凝集物は、表面抗原と、ウイルス性、細菌性、単一細胞性または多細胞性の病原体由来の他のリポタンパク質、リポペプチドまたは脂質の同族または異種の抗原との組合せをも含む。
【００１０】
本発明の方法において、工程（Ｂ）で得られる構造体の一部をなす抗原は、疎水性、静電性または共有結合性による相互作用により、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原に付加し、異なるサイズの凝集物を生成することができる。
【００１１】
抗原性構造体を得る方法は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原への、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、またはＨＩＶのヌクレオカプシド抗原の凝集を可能とし、また不活性化ウイルスまたは髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のような細菌病原体の外膜タンパク質といった、ウイルスや細菌からの抗原も凝集することができる。
【００１２】
凝集した抗原性構造体を得るために、本粒子の脱脂、膜結合および凝集を促進する化学物質として、β−シクロデキストリンを使用することができ、他の化学物質としては、銅及び鉄の金属塩並びに他の凝集を可能にする物質により強化された、１０〜５０ｎＭのアンモニア塩がある。
【００１３】
自発的に凝集活性をもたらす目的のために、その方法で、一緒にまたは単独で使用される他の成分は、ＨＢｓＡｇに対する凝集活性を示す同種または異種抗原であり、それらには、ウイルスヌクレオカプシド抗原、更には細菌外膜誘導体またはリポタンパク質若しくは疎水性物質からなるウイルスエンベロープがある。同じ性質のアジュバントは、ＨＢｓＡｇ凝集と、ＨＢｓＡｇとアジュバント自体との凝集を促進することも見出された。
【００１４】
一般に、本発明の方法は、選択された成分に応じて、１０分〜１週間のインキュベーションで、疎水性相互作用、静電的結合または共有結合を進展させることにより、ＨＢｓＡｇの凝集、またはＨＢｓＡｇと他の抗原若しくはアジュバントとの凝集を可能にする。
【００１５】
凝集物の分離は、分子サイズ排除法により行われ、そのような方法には、分子排除クロマトグラフィー、透析、透析ろ過、または３０〜５００ｎｍの分子サイズの保持を可能にする他の方法がある。
【００１６】
我々は、シャームベック（Ｓｃｈｉｒｍｂｅｃｋ）（シャームベック（Ｓｃｈｉｒｍｂｅｃｋ， Ｒ）ら、１９９５， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５５：４６７６−４６８４）により得られたものと同様に、非変性法（最高温度２８℃）により約１μｍのサイズの凝集物を生成することができたものの、体液性応答やＤＴＨを評価すると、これら凝集物は、低い免疫原性のままであった。ミョウバンでアジュバントされた、３０〜５００ｎｍの粒子凝集物のみが、天然の抗原による対照より、有意に高いＩｇＧレベルの生成を証明し、更に、ＤＴＨやＩｇＧ２ａ応答の顕著な上昇を示した。これはすべて、分子排除クロマトグラフィーによる抗原の後選択の重要性を示している。このような性能は、目的の抗原における異なった提示および／または処理によって発揮させることができる。
【００１７】
さらに本発明によれば、生じた構造体が、ミョウバンやカルシウム塩のようなアジュバント、または油性若しくは他の市販されているアジュバントへ吸着することが予測される。また、他の抗原、安定剤および保存剤を、最終製剤に加えることもできる。
【００１８】
本発明の他の対象は、既に記載された方法に従って得られる凝集した抗原性構造体であり、これは、生じる製剤の免疫原性の増強と、関与するエピトープの免疫系による特異な認識を促進する。該凝集した抗原性構造体は、単独または凝集物を形成する他の抗原との組合せにおいて、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原が存在することを特徴とする。これらの他の抗原としては、リポタンパク質または疎水性物質があり、中でも、ＨＢｃＡｇは、更に、疎水性結合によりこれらの間の凝集物形成を促進するという固有の性質を有する。他の疎水性のウイルスカプシドとリポタンパク質抗原は、この性能を示し、それらには、プロテオリポソーム小胞中の髄膜炎菌（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜および一部のウイルスエンベロープ抗原に加え、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、並びにＨＩＶ１及び２のヌクレオカプシド抗原がある。
【００１９】
本発明の抗原性構造体の中には、ＨＢｓＡｇと疎水性アジュバントとの会合が含まれ、これは、同じ前記の方法による凝集物の一部とすることができる。一般に、本発明の抗原性構造体は、記載の方法による少なくとも１つ、２つまたはそれ以上の疎水性粒子の凝集と少なくとも１つの粒子特性により得ることができ、実施例に記載のように電子顕微鏡により可視化することができる。これらの構造体の凝集は、一般的な方法で、免疫調節、特異的認識、および免疫原性増強を促進する。本発明の抗原性構造体におけるこれらの特徴によれば、全身および粘膜経路を通じて、予防および治療のためのヒト及び動物のワクチンを合理的に設計するために、それら構造体を使用することができ、更に、診断系においてそれら構造体を使用することができる。
【００２０】
この種の抗原を得るための方法の使用で生じる新たな製剤の利点には、免疫原性、新規アジュバントに対する共同捕捉能、免疫モジュレーター、及び凝集中の抗原の増加がある。
【００２１】
本発明の方法から得られる製剤は、接種経路と免疫される種に応じて、０．０１〜１０ｍｌの容量で使用することができ、抗原量は、最終ワクチン製剤中０．００１〜１ｍｇで変動させることができる。
【００２２】
【実施例】
実施例１
シクロデキストリンの使用により得られる凝集したＢ型肝炎ウイルスの表面抗原のワクチン製剤の調製
【００２３】
粒子は、粒子から脂質を低下させる活性の有る化合物を用いて、抗原を調節処理することにより、２２ｎｍの未変性の抗原から得、この際、１ｍｇ／ｍｌより高濃度のシクロデキストリンが使用された。その濃度に応じて、インキュベーション時間は、２４時間〜７日間で変化させた。この測定法で使用されるインキュベーション温度は２８℃であったが、より高温およびより低温でも凝集物を得ることが可能であることが観察されている。温度は、酸化及び脂質低下による部分的脱脂プロセスを促進する要因である。後に、ゲルろ過と電子顕微鏡により異なる凝集物を分析し、０．１ｎｍから沈降する程巨大なサイズまでの粒子を見出した。沈降した残渣を遠心分離して除去した後、抗原を、そのサイズにより選択して免疫化学分析を行い、これにより、タンパク質レベルに関連して脂質レベルが減少することが実証された。これらの凝集物は、保存期間中、高い安定性を有することが、ＨＰＬＣにより示された。抗原を、５〜１００μｇ／ｍｌのβ−シクロデキストリンを用いて１〜２４０時間、２０〜３７℃の温度で調製処理すると、免疫化学分析のための、溶出時間からなる後選択を可能にするサイズ範囲を得ることができた。
【００２４】
次に、凝集抗原を、最終濃度０．００２〜０．１ｍｇ／ｍｌのミョウバンに吸着させ、免疫原性分析に使用した。
異なる時間と温度でのシクロデキストリンとのインキュベーションには、リポ多糖およびサポニンといった免疫調節化合物を添加し、これは、ミョウバンに吸着された最終凝集物の一部となり、最終ワクチン製剤を産生した。
【００２５】
実施例２
酸化剤を使用するＢ型肝炎ウイルス表面積凝集物のワクチン製剤の調製
【００２６】
正常の抗原に酸化化学物質を加えると、シクロデキストリンを用いる方法と同様の、制御時間、温度および濃度の条件下で、脱脂が可能であった。９〜４４ｍＭの過酸化２硫酸アンモニウムのような塩は、２２ｎｍ抗原粒子から始まる脱脂抗原の生成を可能とし、粒子の融合によりサイズを上昇させることができた。最適粒子サイズは、ゲルろ過により選択した。Ｌａアジュバントの吸着は、ミョウバンで達成された。
【００２７】
実施例１と同様にして、インキュベーション中に異なる量の他のアジュバントと免疫モジュレーターを凝集物中に含めることができた。
【００２８】
実施例３
酵母のインキュベーション条件の変更により得られる、過剰粒子化学構造体からなるワクチン製剤の調製
【００２９】
粒子を、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母株から自然に得、その化学的特性によって精製プロセスの間に、抗原を選択した。抗原産生プロセスは、１００時間より長い永続的な培養時間で、酸ストレス条件で行なった。このプロセスは、抗原の一部を２２ｎｍの未変性状態で維持することを可能にするが、ゲルろ過から得られる異なるピークの試料に対してされた脂質とタンパク質の分析が示すように、細胞内酸化条件の増強により、重要な部分が凝集及び脱脂された。最後に、画分を、ＴＳＫＧ５０００カラムでＨＰＬＣゲルろ過により分離した。この物質は、実際に廃棄される総抗原の１０％まで達する。ミョウバンアジュバント吸着は、正常の抗原と同様の条件下で達成される。
【００３０】
両抗原の分析により、以下の表において、両抗原のリン脂質に対して示される全種の脂質の大幅な喪失を伴うプロセスで、ＨＢｓＡｇが凝集されることが証明された。
【００３１】
シリカゲルにより分離されたＨＢｓＡｇリン脂質（ＰＬ）の組成
2004529861.tif 000002
【００３２】
この実施例は、自然酸化プロセスや脱脂プロセスの後に、新たな過剰粒子化抗原が得られることを証明する。これらの凝集物の安定性は、疎水性領域を露出する粒子から脂質の除去する間、及びスルフヒドリル基が露出した時の粒子間のタンパク質重合により、生じると考えられる凝集プロセスに基づくであろう。
【００３３】
実施例４
凝集ＨＢｓＡｇ免疫原性の評価
【００３４】
粘膜経路のためにミョウバンに吸着されたかＰＢＳ中にある、実施例３で生じた凝集ＨＢｓＡｇの免疫原性を評価するために、０、１４および２８日目に接種し、４２日目に眼窩後方から採血する免疫スケジュールを実施し、１０〜１５週令のメスのＢａｌｂ／ｃマウスを、鼻腔内経路および筋肉内経路で免疫した。マウス１匹当たりの投与量をこの実施例の最後で表に示し、結果を図１Ａに示し、ＨＢｓＡｇ凝集物を図１Ｂに示す。
【００３５】
結果の統計解析は、スチューデント検定により行い、ｐ＜０．０５を有意差とみなした。
【００３６】
この実験から、正常の抗原では、同一条件において、粘膜経路または全身性経路で免疫した場合には、高いＨＢｓＡｇ  ＩｇＧ応答が得られることが証明された。同一の図において、ＤＴＨ応答（棒グラフ）に対する抗原の効果の比較を示したが、これもまた、凝集した変異抗原で有意に高い結果となった。
【００３７】
免疫群を以下の表に示す。
【００３８】
2004529861.tif 000003
【００３９】
実施例５
抗ＨＢｓＡｇ  ＩｇＧ応答の動態
抗ＨＢｓＡｇ  ＩｇＧ応答の動態を調べるために、１０〜１５週令のメスのＢａｌｂ／ｃマウスを免疫した。使用したスケジュールは以下の通りである：０、２および１８週に接種し、免疫前採取を４、６、８、１０、１２、１４、１６および２０週に行った。試験した群を以下の表に記載する：
【００４０】
2004529861.tif 000004
【００４１】
第５群と６群、第７群と８群、および第９群と１０群の抗原を、異なる時間及びシクロデキストリン濃度でインキュベートして得、異なる凝集度を得た。
【００４２】
ＤＴＨ実験では、測定を、１（１，３）、２（１’、３’）、３（１”、３”）、および５（１’’’，３’’’）日目に行った。
【００４３】
結果の統計解析は、スチューデント検定により行い、ｐ＜０．０５を有意差とみなした。
【００４４】
この実験で、凝集度の異なる脱脂したＨＢｓＡｇは、個々に異なる免疫学的特性を有することが証明された。抗体の発生動態によれば、実験の最後には、免疫原性の大きさは、より大きな凝集度を持つ変異体に対応していたが、より大きな免疫原性とＤＴＨ応答は、大きな抗原サイズではなく中間の抗原サイズに対応していた。しかし、ＰＢＳ中の抗原で免疫したものと比較して、ミョウバンアジュバントで免疫した群でＤＴＨ応答の有意な上昇が認められ、中間サイズの凝集抗原の群は、より大きな上昇を引き起こし、これは５６日目に有意になった。図２ａでは、すべての免疫群について５６日目の個々の力価を示す。また、この図は、２０μｌの接種量で右足に２０μｇのＨＢｓＡｇそして左足にＰＢＳを接種し、２２週の５日間に行ったＤＴＨ実験の結果を示す。実施例３に記載のようにして得られた、中間凝集レベルのミョウバンアジュバントされたＨＢｓＡｇを接種した第３群と比較して、すべての休止群は、右足と左足の直径の差に関して有意に低い応答を有した。実施例３において、過剰粒子構造体の場合の認識が、ＨＢｓＡｇで認識されるエピトープに関してより広く、この種類の構造体の良好な性能を示していることに注意されたい。第５群〜第１０群で、抗未変性ＨＢｓＡｇ反応性は、ほとんどの時間で未変性のＨＢｓＡｇで免疫して得られたものと類似していたが、凝集抗原中に存在する他のエピトープに対しても強い応答が得られる。例８、図４を参照されたい。
【００４５】
実施例６
ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比の評価
【００４６】
ＴＨ１／ＴＨ２応答の関係のために、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比の変動があるかどうかを調べるために、実施例４の免疫スケジュールのＤ群とＥ群の血清を、抗ＩｇＧ１とＩｇＧ２ａ抗体レベルについて試験した。分析は４２日目に採取した血清について行った。ミョウバンでアジュバント化した正常ＨＢｓＡｇと比較して、過剰粒子化抗原（５０〜５００ｎｍ）を免疫した群では、ＩｇＧ２ａ抗体レベルが有意に上昇し、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比はほとんど１になった（図４）。
【００４７】
ミョウバンで免疫した正常ＨＢｓＡｇ群のＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比は、中間サイズの脱脂ＨＢｓＡｇ群のＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比より６．２倍高かった。この実験から、表面抗原の異なる提示は、増強されたＩｇＧ型に関して量的な変化ばかりでなく質的な変化をも引き起こし、ＩｇＧサブクラスパターンのこれらの変化と細胞応答の増強との相関性は、ＤＴＨ評価結果を確認するものと、結論付けることができる。
【００４８】
実施例７
異なる抗原変異体で免疫したマウス血清の抗未変性ＨＢｓＡｇ反応性の試験
【００４９】
実施例１、２および３で得られた脱脂抗原でマウスを免疫後、これらの血清の反応性を、正常の抗原で免疫したマウスの血清と比較した。この実験の結果、異なる変異体で免疫したマウスの血清中に生じた免疫応答は、正常のＨＢｓＡｇ（２２ｎｍ）に対して異なる反応性を有し、主要な反応性は、正常の抗原で免疫したマウスの血清で示され、その一方で、脱脂の程度が異なるものでは、ＨＢｓＡｇに対する反応性も異なっていた、ことが認められた。それら自体の免疫原性に対して高力価を有するものであっても、高度に酸化された変異体で免疫したマウスの血清は、ＨＢｓＡｇを認識せず、異なる免疫原で作成された抗体の異なる認識を示し、新たに作成された構造体の異なる抗原性を証明している。従って、実施例５の結果は、最後の３つの抗原変異体について、同様の抗未変性ＨＢｓＡｇ応答が得られるが、未変性のＨＢｓＡｇで免疫することによっては認識されない他のＨＢｓＡｇタンパク質エピトープに対する応答も存在することを、考慮しなければならない。
【００５０】
実施例８
異なる抗原変異体で免疫したマウス血清による線状エピトープの認識
【００５１】
実施例２に記載の酸化変異体により得られた過剰粒子ＨＢｓＡｇにより示される抗体の認識を比較するために、線状のＨＢｓＡｇ配列（Ｓ領域）を含有するセルロース膜でマッピングを行い、それぞれが６つ重複して全タンパク質配列が完成する、１２のアミノ酸からなる３７のペプチドを合成した。
【００５２】
セルロース膜でのエピトープマッピングは、ロナルド・フランク（Ｒｏｎａｌｄ Ｆｒａｎｋ）（フランク（Ｆｒａｎｋ， Ｒ．）、１９９２ Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４８：９２１７−９２３２）に従って行った。血清試料は、１／１００希釈で測定した。
【００５３】
正常の抗原、及び同じ抗原の異なる凝集変異体を接種したマウスの血清で得られる結果は、両方の抗原の間に同様の線状エピトープ認識パターンが存在しないことを示し、そのことが、ＨＢｓＡｇ及びその凝集変異体の表面に存在するＢエピトープについて、異なる提示を生じている、ということを結論付けた（図４）。
【００５４】
実施例９
ＨＢｓＡｇとヌクレオカプシド抗原との凝集物の形成。免疫学的評価
【００５５】
０．１ｍｇ／ｍｌのＨＢｓＡｇとＨＢｃＡｇを含有する等量の２つの調製物を、４℃で一晩インキュベートし、次いで、ＨＰＬＣ  ＴＳＫ  Ｇ６０００分子排除クロマトグラフィーにより、凝集物を得た。これら凝集物の一の試料を、電子顕微鏡可視化技術のために処理し、他の試料を、電子顕微鏡により確認された凝集物及び別々の両抗原とともに、鼻腔内接種による、Ｂａｌｂ／ｃマウスおける一の免疫スケジュールでの、その免疫学的評価を行なうために使用した（図５Ａ）。
【００５６】
結果は、鼻腔内経路によって、両方の凝集抗原の混合物が、ＨＢｓＡｇに対する応答の増強を可能にすることを示した（図５Ｂ）。
【００５７】
図の群を以下の表に示す：
【００５８】
2004529861.tif 000005
【００５９】
他のカプシド抗原（例えば、Ｃ型肝炎およびＨＩＶ）を使用して混合物を調製した時も、同様の結果が得られた。
【図面の簡単な説明】
【図１】
（Ａ）３つの投与スケジュール（０、２および４週）。採取は、第６週に行った。最初の３群に、５０μｌを鼻腔内接種した。残りの２つの群には、１００μｌのミョウバンを筋肉内経路で接種した。
（Ｂ）凝集したＨＢｓＡｇ（メートル；２００ｎｍ）
【図２】
３つの投与スケジュール（０、２および８週）。すべての群に、１００μｌを筋肉内経路で接種した。抗体の値は、第８週に対応する（図２ａ）。第２２週の間、ＤＴＨ試験を行った。図２ｂは、５日間の第１群と３群のＤＴＨ値である。図２Ｃは、スケジュール中の力価上昇の動態を示す。
【図３】
図１の３つの投与スケジュール（０、２および４週）。第６週に採取したＤ群とＥ群の血清の分析。両方の群に、１００μｌのミョウバンを筋肉内経路で接種し、Ｄ群には脱脂ＨＢｓＡｇ（５０〜５００ｎｍ）、Ｅ群には正常のＨＢｓＡｇを同じ用量で投与した。グラフは、両群の各マウスのＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比の幾何平均値と間隔を示す。
【図４】
線状の配列を含有するセルロース膜でのＨＢｓＡｇのＳ領域の重複ペプチドのマッピング。１／１００希釈の血清プールを分析した：１、ＨＢｓＡｇ（正常）；２、ＨＢｓＡｇ（凝集）；（３〜５：凝集抗原で免疫して得られたモノクローナル抗体（ＭＡｂ）；３、クローン６；４、クローン７；５、クローン８）；６、無関係の血清；７、ＭＡｂ（Ｈｅｐ１）。４つのカラー強度は、ペプチドに対する応答を示す。ブランク：陰性応答、明るい灰色：わずかに陽性の応答、暗い灰色：陽性応答、黒：強い陽性の応答。
【図５】
（Ａ）ＨＢｓＡｇ凝集物とＨＢｃＡｇの電子顕微鏡。中央の高電子密度はＨＢｃＡｇに対応し、他はＨＢｓＡｇである。
（Ｂ）２つの投与スケジュール（０、１４日）。第２６日の血清の分析。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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