(57)【要約】１またはそれ以上の以下の位置： １１、１２、１６、２２、２３、２４、２５、２７、３０、３３、３４、３５、３６、または３７位が修飾されているグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）化合物を開示する。これらＧＬＰ−１化合物の処置方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１（配列番号１）：
2004501162.tif 000013
で示されるアミノ酸配列を含むＧＬＰ−１化合物
［式中、Ｘａａ８は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
Ｘａａ１１は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓである。
Ｘａａ１２は、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、またはＴｙｒである。
Ｘａａ１６は、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、またはＡｌａである。
Ｘａａ２２は、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｃｙｓ、またはシステイン酸である。
Ｘａａ２３は、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、またはＡｒｇである。
Ｘａａ２４は、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ａｌａ、またはＬｙｓである。
Ｘａａ２６は、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、またはＨｉｓである。
Ｘａａ２７は、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、またはＬｙｓである。
Ｘａａ３０は、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、またはＨｉｓである。
Ｘａａ３３は、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、またはＧｌｕである。
Ｘａａ３４は、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、またはＡｓｐである。
Ｘａａ３５は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＧｌｕである。
Ｘａａ３６は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、またはＨｉｓである。
Ｒは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、−ＮＨ２、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、またはＧｌｙ−Ｐｒｏ−ＮＨ２であるかまたは欠失している（ただし、ＧＬＰ−１化合物は、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨまたはＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２の配列を有さず、ＧＬＰ−１化合物は、Ｇｌｙ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｇｌｙ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｌｅｕ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｌｅｕ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｉｌｅ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｉｌｅ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｓｅｒ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｓｅｒ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｔｈｒ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、またはＴｈｒ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ａｌａ１１−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ａｌａ１１−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ａｌａ１６−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ａｌａ１６−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ａｌａ１８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ａｌａ１８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ａｌａ２７−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ａｌａ２７−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ａｌａ３３−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、またはＡｌａ３３−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２ではない）］。
【請求項２】
式ＩＩ（配列番号２）：
2004501162.tif 000014
で示されるアミノ酸配列を含むＧＬＰ−１化合物
［式中、Ｘａａ８は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
Ｘａａ１２は、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、またはＴｙｒである。
Ｘａａ１６は、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、またはＡｌａである。
Ｘａａ２２は、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｃｙｓ、またはシステイン酸である。
Ｘａａ２３は、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、またはＧｌｎである。
Ｘａａ２６は、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、またはＨｉｓである。
Ｘａａ３０は、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、またはＨｉｓである。
Ｘａａ３５は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＧｌｕである。
Ｒは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、−ＮＨ２、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、またはＧｌｙ−Ｐｒｏ−ＮＨ２であるかまたは欠失している（ただし、ＧＬＰ−１化合物は、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨまたはＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２の配列を有さず、ＧＬＰ−１化合物は、Ｇｌｙ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｇｌｙ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｌｅｕ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｌｅｕ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｉｌｅ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｉｌｅ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｓｅｒ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｓｅｒ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｔｈｒ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｔｈｒ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、またはＡｌａ１６−Ｇｌｐ−１（７−３６）ＮＨ２ではない）。
【請求項３】
式ＩＩＩ（配列番号３）：
2004501162.tif 000015
で示されるアミノ酸配列を含むＧＬＰ−１化合物
［式中、Ｘａａ８は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
Ｘａａ２２は、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｃｙｓ、またはシステイン酸である。
Ｘａａ２３は、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、またはＧｌｎである。
Ｘａａ２７は、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、またはＬｙｓである。
Ｘａａ３０は、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、またはＨｉｓである。
Ｒは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、−ＮＨ２、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、またはＧｌｙ−Ｐｒｏ−ＮＨ２であるかまたは欠失している（ただし、ＧＬＰ−１化合物は、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨまたはＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２の配列を有さず、ＧＬＰ−１化合物は、Ｇｌｙ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｇｌｙ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｌｅｕ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｌｅｕ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｉｌｅ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｉｌｅ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｓｅｒ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｓｅｒ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｔｈｒ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｔｈｒ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ａｌａ１６−Ｇｌｐ−１（７−３７）ＯＨ、Ａｌａ１６−Ｇｌｐ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｇｌｕ２７−Ｇｌｐ−１（７−３７）ＯＨ、またはＧｌｕ２７−Ｇｌｐ−１（７−３６）ＮＨ２ではない）］。
【請求項４】
ＧＬＰ−１化合物中のわずか６アミノ酸がＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨまたはＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２中の対応するアミノ酸と異なる請求項１、２または３のいずれかに記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項５】
ＧＬＰ−１化合物中のわずか５アミノ酸がＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨまたはＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２中の対応するアミノ酸と異なる請求項４記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項６】
ＧＬＰ−１化合物中のわずか４アミノ酸がＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨまたはＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２中の対応するアミノ酸と異なる請求項５記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項７】
ＧＬＰ−１化合物中のわずか３アミノ酸がＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨまたはＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２中の対応するアミノ酸と異なる請求項６記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項８】
ＧＬＰ−１化合物中のわずか２アミノ酸がＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨまたはＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２中の対応するアミノ酸と異なる請求項７記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項９】
Ｘａａ８がグリシンまたはバリンである請求項１〜８のいずれかに記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項１０】
Ｘａａ８がグリシンまたはバリンであり、Ｘａａ３０がアラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、またはヒスチジンである請求項４〜８のいずれかに記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項１１】
Ｘａａ３０がグルタミン酸である請求項１０記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項１２】
Ｘａａ８がグリシンまたはバリンであり、Ｘａａ３７がヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アルギニン、またはリジンである請求項４〜８のいずれかに記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項１３】
Ｘａａ３７がヒスチジンである請求項１２記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項１４】
Ｘａａ８がグリシンまたはバリンであり、Ｘａａ２２がアスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、リジン、アルギニン、システイン、またはシステイン酸である請求項４〜８のいずれかに記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項１５】
Ｘａａ２２がアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、またはアルギニンである請求項１４記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項１６】
Ｘａａ２２がグルタミン酸である請求項１５に記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項１７】
Ｘａａ８がグリシンまたはバリンであり、Ｘａａ２２がグルタミン酸またはリジンであり、Ｘａａ２３がグルタミン酸またはリジンである請求項４〜７のいずれかに記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項１８】
Ｘａａ８がグリシンまたはバリンであり、Ｘａａ２２がグルタミン酸であり、Ｘａａ２７がアラニンである請求項４〜７のいずれかに記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項１９】
８位にアラニン以外のアミノ酸と２２位にグリシン以外のアミノ酸を有するグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）化合物。
【請求項２０】
８および２２位のアミノ酸に加え、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２またはその断片中の対応するアミノ酸と異なるわずか３アミノ酸を含む請求項１９記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項２１】
８および２２位のアミノ酸に加え、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２またはその断片中の対応するアミノ酸と異なるわずか２アミノ酸を含む請求項２０記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項２２】
８および２２位のアミノ酸に加え、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２またはその断片中の対応するアミノ酸と異なるわずか１アミノ酸を含む請求項２１記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項２３】
ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、またはその断片中の対応するアミノ酸と異なるアミノ酸がＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、またはその断片中の対応するアミノ酸の保存的置換である請求項２０〜２２のいずれかに記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項２４】
２２位のアミノ酸側鎖が少なくとも２個の炭素原子と極性または荷電官能基を含む請求項１９〜２３のいずれかに記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項２５】
ａ）８位のアミノ酸がグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、フェニルアラニン、チロシン、ヒスチジンまたはトリプトファンであり、
ｂ）２２位のアミノ酸がアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミンまたはヒスチジンである請求項１９〜２３のいずれかに記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項２６】
２２位のアミノ酸が２〜６個の炭素原子を含み、荷電官能基で置換された直鎖または分岐鎖アルキル側鎖を有する請求項１９〜２３のいずれかに記載のグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）化合物。
【請求項２７】
２２位のアミノ酸がアスパラギン酸、グルタミン酸、リジンまたはアルギニンである請求項２６記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項２８】
８位のアミノ酸がグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニンまたはメチオニンである請求項１９〜２３のいずれかに記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項２９】
８位のアミノ酸がグリシンまたはバリンである請求項２８記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項３０】
２２位にスルホン酸基を含む側鎖を有するアミノ酸を有する請求項１９〜２３のいずれかに記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項３１】
側鎖を有するアミノ酸がシステイン酸であり、８位のアミノ酸がアラニンではない請求項２９記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項３２】
配列番号４：
2004501162.tif 000016
で示されるアミノ酸配列を含むＧＬＰ−１化合物
［式中、Ｘａａ７は、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、およびα−メチルヒスチジンである。
Ｘａａ８は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはトレオニンである。
Ｘａａ２２は、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、リジン、アルギニン、システイン、またはシステイン酸である。
ＲはＮＨ２またはＧｌｙ（ＯＨ）である。］。
【請求項３３】
Ｘａａ８は、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはトレオニンである請求項３２記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項３４】
Ｘａａ２２がリジン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはアルギニンである請求項３３記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項３５】
Ｘａａ７がＬ−ヒスチジンであり、Ｘａａ８がグリシンまたはバリンであり、ＲがＧｌｙ（ＯＨ）である請求項３４記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項３６】
ＧＬＰ−１化合物がａ）Ｖａｌ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号５）、ｂ）Ｖａｌ８−Ａｓｐ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号６）、ｃ）Ｖａｌ８−Ａｒｇ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号７）、およびｄ）Ｖａｌ８−Ｌｙｓ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号８）からなる群から選ばれる請求項３４記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項３７】
ＧＬＰ−１化合物が、ａ）Ｇｌｙ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号９）、ｂ）Ｇｌｙ８−Ａｓｐ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号１０）、ｃ）Ｇｌｙ８−Ａｒｇ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号１１）、およびｄ）Ｇｌｙ８−Ｌｙｓ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号１２）からなる群から選ばれる請求項３４記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項３８】
該ＧＬＰ−１化合物が二価金属カチオンと複合体を形成している請求項１−３７のいずれかに記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項３９】
該ＧＬＰ−１化合物が二価亜鉛カチオンと複合体を形成している請求項３８記載のＧＬＰ−１化合物。
【請求項４０】
ＧＬＰ−１レセプターの刺激を必要とする対象のＧＬＰ−１レセプターを刺激する方法であって、有効量の請求項１−３９のいずれかに記載のＧＬＰ−１化合物を該対象に投与する工程を含む方法。
【請求項４１】
該対象がインスリン非依存性糖尿病の治療を受けている請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
該対象がインスリン非依存性糖尿病の予防的治療を受けている請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
該対象が肥満、卒中、心筋梗塞、外科手術後の異化変化、または過敏性大腸症候群の治療を受けている請求項４０記載の方法。
【請求項４４】
インスリン非依存性糖尿病治療用の医薬を製造するための請求項１〜３９のいずれかに記載のＧＬＰ−１化合物の使用。
【請求項４５】
肥満、卒中、心筋梗塞、外科手術後の異化変化、または過敏性大腸症候群を治療するための医薬を製造するための請求項１〜３９のいずれかに記載のＧＬＰ−１化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）は、食物消化に反応して小腸のＬ−細胞により分泌される３７アミノ酸ペプチドである。それはインスリン分泌を刺激（インスリノトロピック作用）することにより、細胞によるグルコース取込みと血清グルコースレベルの低下を生じることがわかっている（例えば、Ｍｏｊｓｏｖ、Ｓ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４０： ３３３−３４３（１９９２）参照）。しかしながら、ＧＬＰ−１（１−３７）は活性が不充分であり、ＧＬＰ−１より生物学的にはるかに有力なトランケーテッド（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）類似体（ＧＬＰ化合物と呼ぶ）に注目が集まってきている。例としてＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ１（７−３６）ＮＨ２、Ｇｌｙ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、およびＳｅｒ３４−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨが含まれる。そのインスリン分泌刺激能により、ＧＬＰ化合物は糖尿病、肥満、および関連病状の治療剤として大いに有望である。
【０００２】
ＧＬＰ−１化合物は少なくとも２つの異なる形で存在し得る。第１の形は生理学的に活性であり、生理学的ｐＨ（７．４）で容易に水性溶液に溶解する。これに対し、第２の形はほとんどまたはまったくインスリノトロピック活性がなく、ｐＨ７．４で水に実質的に不溶性である。残念なことに、不活性形は水性ＧＬＰ−１溶液を撹拌するか、疎水性表面に暴露するか、または該溶液が大きな空気／水界面を有するとき容易に生じる。不溶形に変換する傾向は市販量の活性ＧＬＰ−１化合物の生産をかなり複雑にするが、それはポンプを介する混合操作や連続運転はバルク製造工程における共通操作であり、これら操作は撹拌、空気／水界面、そして／または不溶形を生じる疎水性表面との接触を生じるからである。不活性形への変換は貯蔵時または患者に投与後にも生じることがあり、これら化合物の薬剤としての使用をさらに複雑にする。したがって、現在利用可能なＧＬＰ−１化合物より容易には不溶形に変換しない生物学的に活性なＧＬＰ−１類似体の必要性が大いにある。
【０００３】
１またはそれ以上の以下の位置： １１、１２、１６、２２、２３、２４、２６、２７、３０、３３、３４、３５、３６または３７位が修飾されている多くのＧＬＰ−１類似体がＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨに比べて著しく低下した凝集傾向を示すことが現在わかっている。
これらの類似体の多くは既知のＧＬＰ−１化合物、例えばＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨおよびＶａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨに匹敵し、場合によりそれより大きいＧＬＰ−１レセプター活性化を保持する。例えば、Ｖａｌ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ（７−３７）ＯＨの凝集時間は２０倍以上大きく、そのＧＬＰ−１レセプター活性化はＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨより約２５％大きい。これらの発見に基づく新規ＧＬＰ−１化合物および新規ＧＬＰ−１化合物を用いる治療方法を本明細書に開示する。
【０００４】
本発明のある態様は、式Ｉ（配列番号１）：
2004501162.tif 000002
で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである
［式中、Ｘａａ８は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
Ｘａａ１１は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓである。
Ｘａａ１２は、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、またはＴｙｒである。
Ｘａａ１６は、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、またはＡｌａである。
Ｘａａ２２は、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｃｙｓ、またはシステイン酸である。
Ｘａａ２３は、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、またはＧｌｎである。
Ｘａａ２４は、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、またはＬｙｓである。
Ｘａａ２６は、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、またはＨｉｓである。
Ｘａａ２７は、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、またはＬｙｓである。
Ｘａａ３０は、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、またはＨｉｓである。
Ｘａａ３３は、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、またはＧｌｕである。
Ｘａａ３４は、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、またはＡｓｐである。
Ｘａａ３５は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＧｌｕである。
Ｘａａ３６は、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、またはＨｉｓである。
Ｒは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、−ＮＨ２、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、またはＧｌｙ−Ｐｒｏ−ＮＨ２であるかまたは欠失している（ただし、該ポリペプチドはＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨまたはＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２の配列を有さず、該ポリペプチドはＧｌｙ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｇｌｙ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｌｅｕ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｌｅｕ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｉｌｅ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｉｌｅ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｓｅｒ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｓｅｒ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｔｈｒ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、またはＴｈｒ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ａｌａ１１−Ｇｌｐ−１（７−３７）ＯＨ、Ａｌａ１１−Ｇｌｐ−１（７−３６）ＮＨ２、Ａｌａ１６−Ｇｌｐ−１（７−３７）ＯＨ、Ａｌａ１６−Ｇｌｐ−１（７−３６）ＮＨ２、Ａｌａ２７−Ｇｌｐ−１（７−３７）ＯＨ、Ａｌａ２７−Ｇｌｐ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｇｌｕ２７−Ｇｌｐ−１（７−３７）ＯＨ、Ｇｌｕ２７−Ｇｌｐ−１（７−３６）ＮＨ２、Ａｌａ３３−Ｇｌｐ−１（７−３７）ＯＨ、またはＡｌａ３３−Ｇｌｐ−１（７−３６）ＮＨ２ではない）。］。
【０００５】
本発明の別の態様は、式ＩＩ（配列番号２）：
2004501162.tif 000003
で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである
［式中、Ｘａａ８は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
Ｘａａ１２は、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、またはＴｙｒである。
Ｘａａ１６は、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、またはＡｌａである。
Ｘａａ２２は、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｃｙｓ、またはシステイン酸である。
Ｘａａ２３は、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、またはＧｌｎである。
Ｘａａ２６は、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、またはＨｉｓである。
Ｘａａ３０は、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、またはＨｉｓである。
Ｘａａ３５は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＧｌｕである。
Ｒは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、−ＮＨ２、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、またはＧｌｙ−Ｐｒｏ−ＮＨ２であるかまたは欠失している（ただし、該ポリペプチドはＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨまたはＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２の配列を有さず、該ポリペプチドはＧｌｙ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｇｌｙ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｌｅｕ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｌｅｕ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｉｌｅ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｉｌｅ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｓｅｒ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｓｅｒ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｔｈｒ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｔｈｒ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ａｌａ１６−ＧＬＰ（７−３７）ＯＨ、またはＡｌａ１６−Ｇｌｐ−１（７−３６）ＮＨ２ではない）。］。
【０００６】
本発明の別の態様は、式ＩＩＩ（配列番号３）：
2004501162.tif 000004
で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである
［式中、Ｘａａ８は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
Ｘａａ２２は、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｃｙｓ、またはシステイン酸である。
Ｘａａ２３は、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、またはＧｌｎである。
Ｘａａ２７は、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、またはＬｙｓである。
Ｘａａ３０は、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、またはＨｉｓである。
Ｒは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、−ＮＨ２、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、またはＧｌｙ−Ｐｒｏ−ＮＨ２であるかまたは欠失している（ただし、該ポリペプチドは、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨまたはＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２の配列を有さず、該ポリペプチドは、Ｇｌｙ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｇｌｙ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｌｅｕ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｌｅｕ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｉｌｅ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｉｌｅ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｓｅｒ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｓｅｒ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｔｈｒ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｔｈｒ８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、Ａｌａ１６−Ｇｌｐ−１（７−３７）ＯＨ、Ａｌａ１６−Ｇｌｐ−１（７−３６）ＮＨ２、Ｇｌｕ２７−Ｇｌｐ−１（７−３７）ＯＨ、またはＧｌｕ２７−Ｇｌｐ−１（７−３６）ＮＨ２ではない）。］。
【０００７】
本発明の別の態様は、式ＩＶ（配列番号４）：
2004501162.tif 000005
で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである
［式中、Ｘａａ７は、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジンまたはα−メチル−ヒスチジンである。
Ｘａａ８は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはトレオニンである。好ましくは、Ｘａａ８は、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはトレオニンである。
Ｘａａ２２は、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、リジン、アルギニン、システイン、またはシステイン酸である。
Ｒは−ＮＨ２またはＧｌｙ（ＯＨ）である。］。
【０００８】
本発明の別の態様は、８位にアラニン以外のアミノ酸と２２位にグリシン以外のアミノ酸を有するグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）化合物である。
【０００９】
本発明の別の態様は、ＧＬＰ−１レセプターの刺激を必要とする対象のＧＬＰ−１レセプターを刺激する方法である。該方法は、有効量の本明細書に記載のＧＬＰ−１化合物または配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを対象に投与する工程を含む。
【００１０】
本発明のさらに別の態様は、ＧＬＰ−１レセプターの刺激を必要とする対象のＧＬＰ−１レセプターを刺激するのに用いる本明細書に記載のＧＬＰ−１化合物または配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００１１】
本発明のＧＬＰ−１化合物はＧＬＰ−１レセプター活性化能を保持し、さらに、他のＧＬＰ−１化合物に比べて凝集傾向が減少している。結果として、これら化合物の溶液は、不溶性の不活性形への変換を最小限にして撹拌することができる。この利点は製造方法を大いに簡単にする。さらに、患者に投与した後にほとんどまたはまったくｉｎ ｖｉｖｏで凝集が起きず、これにより活性が増大し、有害反応の可能性を最小限にするものと予想される。さらに、これらＧＬＰ−１化合物はジアミノペプチダーゼＩＶ分解に耐性であり、亜鉛と結合するため、ｉｎ ｖｉｖｏでの作用時間の延長をもたらすものと考えられる。
【００１２】
図１は、Ｖａｌ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号５）、Ｖａｌ８−Ａｓｐ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号６）、Ｖａｌ８−Ａｒｇ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号７）、およびＶａｌ８−Ｌｙｓ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号８）のアミノ酸配列を示す。
【００１３】
図２は、Ｇｌｙ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号９）、Ｇｌｙ８−Ａｓｐ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号１０）、Ｇｌｙ８−Ａｒｇ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号１１）、およびＧｌｙ８−Ｌｙｓ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号１２）のアミノ酸配列を示す。
【００１４】
図３は、Ｖａｌ８−Ｇｌｕ３０−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号１３）、Ｇｌｙ８−Ｇｌｕ３−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号１４）、Ｖａｌ８−Ｈｉｓ３７−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号１５）、およびＧｌｙ８−Ｈｉｓ３７−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号１６）のアミノ酸配列を示す。
【００１５】
図４は、Ｖａｌ８−Ｇｌｕ２２−Ａｌａ２７−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号１７）、およびＶａｌ８−Ｌｙｓ２２−Ｇｌｕ２３−ＧＬＰ１（７−３７）ＯＨ（配列番号１８）のアミノ酸配列を示す。
【００１６】
ＧＬＰ−１化合物は約２５〜約３９個の天然のまたは非天然のアミノ酸を有するポリペプチドであり、インスリノトロピック活性を有するようにＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨと十分な相同性を有する。非天然のアミノ酸の例には、α−メチルアミノ酸（例えば、α−メチルアラニン）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（例えば、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジンおよびα−メチル−ヒスチジン）、側鎖中に余分なメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）、および側鎖中のカルボン酸官能基がスルホン酸基（例えば、システイン酸）で置換されているアミノ酸が含まれる。しかしながら、好ましくは本発明のＧＬＰ−１化合物は、特記しない限り天然のアミノ酸のみを含む。
【００１７】
典型的には、ＧＬＰ−１化合物はＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨのアミノ酸配列を有するポリペプチド、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの類似体、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの断片またはＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ類似体の断片を含む。ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨは、配列番号１９：
2004501162.tif 000006
で示されるアミノ酸配列を有する。
【００１８】
当該分野の習慣により、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨのアミノ末端を残基番号７に、またカルボキシ末端を番号３７に割り当てている。該ポリペプチド中の他のアミノ酸には配列番号１９に示すように連続番号を付す。例えば、１２位はフェニルアラニンであり、２２位はグリシンである。特定しないときは、Ｃ−末端は伝統的カルボキシル形である。
【００１９】
「ＧＬＰ−１断片」は、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨまたはＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ類似体のＮ−末端および／またはＣ−末端から１またはそれ以上のアミノ酸のトランケーション後に得られたポリペプチドである。ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨを説明するのに用いた名称はＧＬＰ−１断片に繰り越す。例えば、ＧＬＰ−１（９−３６）ＯＨはＮ末端から２アミノ酸およびＣ末端から１アミノ酸をトランケーションして得られたＧＬＰ−１断片を表す。該断片中のアミノ酸はＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの対応するアミノ酸と同じ番号で示される。例えば、ＧＬＰ−１（９−３６）ＯＨのＮ−末端グルタミン酸は９位であり、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨと同様、１２位をフェニルアラニンが占め、２２位をグリシンが占める。
【００２０】
「ＧＬＰ−１化合物」は、１またはそれ以上のアミノ酸がＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨまたはその断片のＮ−末端および／またはＣ−末端に付加されたポリペプチドも含む。このタイプのＧＬＰ−１化合物は、約３９個までのアミノ酸を有する。「伸張」ＧＬＰ−１化合物中のアミノ酸はＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ中の対応するアミノ酸と同じ番号で示される。例えば、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨのＮ末端に２個のアミノ酸を付加して得られたＧＬＰ−１化合物のＮ末端アミノ酸は５位であり、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨのＣ末端に１個のアミノ酸を付加して得られたＧＬＰ−１化合物のＣ末端アミノ酸は３８位である。すなわち、これら「伸張」ＧＬＰ−１化合物の両方では、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨと同様に１２位をフェニルアラニンが占め、２２位をグリシンが占める。伸張ＧＬＰ−１化合物のアミノ酸１−６は、好ましくはＧＬＰ−１（１−３７）ＯＨの対応する位置のアミノ酸と同じであるかまたはその保存的置換である。伸張ＧＬＰ−１化合物のアミノ酸３８−４５は、好ましくはグルカゴンまたはエクセンジン（ｅｘｅｎｄｉｎ）−４の対応する位置のアミノ酸と同じであるかまたはその保存的置換である。
【００２１】
「ＧＬＰ−１類似体」は、該類似体がインスリノトロピック活性を有するようにＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨまたはＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの断片と十分な相同性を有する。好ましくは、ＧＬＰ−１類似体は１、２、３、４、または５個のアミノ酸がＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨまたはＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの断片の対応する位置のアミノ酸と異なるように修飾されたＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨまたはその断片のアミノ酸配列を有する。本明細書でＧＬＰ−１化合物を表すのに用いた名称において、置換アミノ酸とその位置を親構造の前に示す。例えば、Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨは、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの２２位に通常みられるグリシンがグルタミン酸で置換されているＧＬＰ−１化合物を表し、Ｖａｌ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨは、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの８位に通常みられるアラニンおよび２２位に通常見られるグリシンがそれぞれバリンおよびグルタミン酸で置換されているＧＬＰ−１化合物を表す。
【００２２】
ＧＬＰ−１化合物のＮ−末端は一般に置換されていないが、アルキル化またはアシル化されていることもあり得る（好ましくはＣ１−Ｃ２０）。−ＮＨ２、−ＮＨＲまたはＮＲＲ’でアミド化されるかまたは−ＯＲ”でエステル化されたＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの場合と同様に該Ｃ−末端は置換されていないことがあり得る。ＲおよびＲ’は、独立してアルキルまたはアシル基（好ましくはＣ１−Ｃ２０）である。Ｒ”はアルキル（Ｃ１−Ｃ２０）である。ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２は、「アミド化ＧＬＰ化合物」の例である。好ましくは、本発明のＧＬＰ−１化合物は−ＮＨ２で置換されているかまたは置換されていないＣ末端を有する。
【００２３】
好ましくは本発明のＧＬＰ−１化合物には、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体の断片（ここで、そのような類似体または断片のバックボーンは８位にアラニン以外のアミノ酸を含む（８位類似体））が含まれる。該バックボーンは、７位にＬ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、またはヒスチジンの修飾形、例えばデスアミノヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、またはα−メチルヒスチジンを含んでいてもよい。これら８位類似体は天然のＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの対応するアミノ酸と比べて１１、１２、１６、２２、２３、２４、２６、２７、３０、３３、３４、３５、３６、および３７位に１またはそれ以上のさらなる変化を含むことが好ましい。これら８位類似体は天然のＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの対応するアミノ酸と比べて１２、１６、２２、２３、２６、３０、３５、および３７位に１またはそれ以上のさらなる変化を含むことがより好ましい。これら８位類似体は天然のＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの対応するアミノ酸と比べて２２、２３、２７、３０、および３７位に１またはそれ以上のさらなる変化を含むことがさらにより好ましい。
【００２４】
これら類似体は天然のＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの対応するアミノ酸に比べて６またはそれ以下の変化を有することも好ましい。より好ましい類似体は、天然のＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの対応するアミノ酸と比べて５またはそれ以下の変化を有するかまたは天然のＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの対応するアミノ酸と比べて４またはそれ以下の変化を有する。これら類似体は天然のＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの対応するアミノ酸と比べて３またはそれ以下の変化を有することがさらにより好ましい。これら類似体は天然のＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの対応するアミノ酸と比べて２またはそれ以下の変化を有することが最も好ましい。
【００２５】
これら置換は、ＧＬＰ−１化合物の凝集および不溶形発生の傾向を減少させることがわかった。本発明のＧＬＰ−１化合物は一般に、例えば、実施例３に記載の凝集アッセイにより評価したときＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨより少なくとも約５倍遅く、好ましくは少なくとも２０倍遅く、より好ましくは少なくとも４０倍遅く、より好ましくは少なくとも約５０倍遅く、さらにより好ましくは約６０倍遅く、さらにより好ましくは少なくとも約６５倍遅く凝集する。好ましくは、本明細書に記載のＧＬＰ−１化合物はＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２またはＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの類似体である。
【００２６】
好ましい態様において、本発明のＧＬＰ−１化合物の２２位のアミノ酸は少なくとも２個の炭素原子と極性または荷電官能基を含む側鎖を有する。メチレンおよびカルボキシル炭素を有するアスパラギン酸が含まれる。より好ましくは、２２位のアミノ酸の側鎖は、２〜６個の炭素原子および荷電官能基、例えば、カルボン酸、アミン、グアニジノ基またはスルホン酸基を有する直鎖または分岐鎖アルキル基である。すなわち、２２位の好ましいアミノ酸の例には、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびリジンが含まれる。２２位がアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニンまたはリジンであるときは、８位は好ましくはグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン（ｉｓｏｌｅｃｉｎｅ）、セリン、トレオニンまたはメチオニン、より好ましくはバリンまたはグリシンである。側鎖にスルホン酸基を有するアミノ酸の例はシステイン酸（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＳＯ３）−ＣＯ−、「Ｃｙａ」と略す）。２２位がスルホン酸、例えばシステイン酸であるときは、８位は好ましくはグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン（ｉｓｏｌｅｃｉｎｅ）、セリン、トレオニンまたはメチオニン、より好ましくはバリンまたはグリシンである。
【００２７】
別の好ましい態様において、８位のアミノ酸は好ましくはグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、またはメチオニン、より好ましくはバリンまたはグリシンであり、３０位はグルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、またはヒスチジン、より好ましくはグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍａｔｉｃ ａｃｉｄ）である。
【００２８】
別の好ましい態様において、８位のアミノ酸は、好ましくはグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、またはメチオニン、より好ましくはバリンまたはグリシンであり、３７位は、ヒスチジン、リジン、アルギニン、トレオニン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、より好ましくはヒスチジンである。
【００２９】
別の好ましい態様において、８位のアミノ酸は、好ましくはグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、またはメチオニン、より好ましくはバリンまたはグリシンであり、２２位はグルタミン酸、リジン、アスパラギン酸、またはアルギニン、より好ましくはグルタミン酸またはリジンであり、２３位はリジン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびヒスチジン、より好ましくはリジンまたはグルタミン酸である。
【００３０】
別の好ましい態様において、８位のアミノ酸は好ましくはグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、またはメチオニン、より好ましくはバリンまたはグリシンであり、２２位はグルタミン酸、リジン、アスパラギン酸、またはアルギニン、より好ましくはグルタミン酸またはリジンであり、２７位はアラニン、リジン、アルギニン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、またはヒスチジン、より好ましくはアラニンである。
【００３１】
別の好ましい態様において、本発明のＧＬＰ−１化合物は、天然のＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの対応する位置のアミノ酸と異なる８位のアミノ酸および１１位、１２位、１６位、２２位、２３位、２４位、２６位、２７位、３０位、３３位、３４位、３５位、３６位、および３７位からなる群から選ばれる１、２、または３個のアミノ酸を有する。
別の好ましい態様において、本発明のＧＬＰ−１化合物は８位の該アミノ酸に加え、天然のＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの対応する位置のアミノ酸と異なる１１位、１２位、１６位、２２位、２３位、２４位、２６位、２７位、３０位、３３位、３４位、３５位、３６位、および３７位からなる群から選ばれる１または２個のアミノ酸を有する。
【００３２】
先に記載のごとく、本発明のＧＬＰ−１化合物は、８、１１、１２、１６、２２、２３、２４、２６、２７、３０、３３、３４、３５、３６、および３７位の該アミノ酸に加え、ＧＬＰ−１（７−３７）またはＧＬＰ１（７−３７）の断片の対応する位置のアミノ酸と異なるアミノ酸を有し得る。 ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの対応する位置のアミノ酸と異なるＧＬＰ化合物中の８、１１、１２、１６、２２、２３、２４、２６、２７、３０、３３、３４、３５、３６、および３７位のアミノ酸以外のアミノ酸は、好ましくは保存的置換であり、より好ましくは高度に保存的な置換である。
【００３３】
好ましくは、本発明のＧＬＰ−１化合物は８および２２位の該アミノ酸に加え、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨまたはＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ断片の対応する位置のアミノ酸と異なる０、１、２または３個のアミノ酸を有する。ある例では、８および２２位のアミノ酸に加え、ＧＬＰ−１化合物の７、２１、および２７位の１またはそれ以上のアミノ酸がＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨまたはＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ断片の対応するアミノ酸と異なる。
【００３４】
好ましくは、７、８、および２２位のみがＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（またはその断片）の対応する位置のアミノ酸と異なる。減少した凝集特性を有する他の改良されたＧＬＰ−１化合物は、これら化合物の２２位のグリシンおよび好ましくは８位のアラニンを本明細書に記載の適切なアミノ酸で置換することにより既知の生物学的に活性なＧＬＰ−１化合物から得ることができると予期される。既知の生物学的に活性なＧＬＰ−１化合物は、Ｈｏｆｆｍａｎｎらの米国特許５，９７７，０７１、Ｂｕｃｋｌｅｙらの米国特許５，５４５，６１８、ＡｄｅｌｈｏｒｓｔらのＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６９：６２７５（１９９４）に開示されている（これらの内容は本明細書の一部を構成する）。
【００３５】
「保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）置換」とは、あるアミノ酸を同じ正味電子荷電およびほぼ同じサイズと形状を有する別のアミノ酸と置換することである。脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、その側鎖中の異種原子および炭素総数がわずか約４個だけ異なるときほぼ同じサイズを有する。それらは、その側鎖中の枝の数がわずか１つだけ異なるときほぼ同じ形状を有する。その側鎖中にフェニルまたは置換フェニル基を有するアミノ酸は、ほぼ同じサイズと形状を有すると考えられる。以下に５グループのアミノ酸を示す。ＧＬＰ−１化合物中のアミノ酸を同じグループの別のアミノ酸で置換すると保存的置換が生じる。
【００３６】
グループＩ： グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、およびＣ１−Ｃ４脂肪族またはＣ１−Ｃ４ヒドロキシル置換脂肪族側鎖（直鎖または単（モノ）分枝）を有する非天然のアミノ酸。
【００３７】
グループＩＩ： グルタミン酸、アスパラギン酸、およびカルボン酸置換Ｃ１−Ｃ４脂肪族側鎖（非分枝または１分枝点）を有する非天然のアミノ酸。
【００３８】
グループＩＩＩ： リジン、オルニチン、アルギニン、およびアミンまたはグアニジノ置換Ｃ１−Ｃ４脂肪族側鎖（非分枝または１分枝点）を有する非天然のアミノ酸。
【００３９】
グループＩＶ： グルタミン、アスパラギン、およびアミド置換Ｃ１−Ｃ４脂肪族側鎖（非分枝または１分枝点）を有する非天然のアミノ酸。
【００４０】
グループＶ： フェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシン、およびトリプトファン。
特記しない限り、保存的置換は天然のアミノ酸でなされるのが好ましい。
【００４１】
「高度に保存的な置換」は、あるアミノ酸が側鎖に同じ官能基を有し、ほぼ同じサイズと形状を有する別のアミノ酸で置換されていることである。脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、その側鎖中の異種原子および炭素総数がわずか２個だけ異なるときほぼ同じサイズを有する。それらは側鎖中に同数の分枝を有するときほぼ同じ形状を有する。高度に保存的な置換の例には、ロイシンに対するバリン、セリンに対するトレオニン、グルタミン酸に対するアスパラギン酸、フェニルアラニンに対するフェニルグリシンが含まれる。高度に保存的でない置換の例には、バリンに対するアラニン、セリンに対するアラニン、およびセリンに対するアスパラギン酸が含まれる。
【００４２】
本発明のＧＬＰ−１化合物の１例は配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。好ましい例において、ＧＬＰ−１化合物はＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨであるが、ただし、Ｘａａ８はＧｌｙまたはＶａｌであり、Ｘａａ２２はＧｌｕまたはＬｙｓであり、Ｘａａ２３はＧｌｕまたはＬｙｓである。別の例において、ＧＬＰ−１化合物はＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨであるが、ただし、Ｘａａ８はＧｌｙまたはＶａｌであり、Ｘａａ３０はＧｌｕである。さらなる例は、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（ただし、Ｘａａ８がＧｌｙまたはＶａｌであり、Ｘａａ３７がＨｉｓである）であるＧＬＰ−１化合物である。
【００４３】
本発明のＧＬＰ−１化合物の別の例は配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。好ましい例において、配列番号４中のＸａａ７はＬ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、およびα−メチル−ヒスチジンであり、Ｘａａ８はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、またはトレオニン、好ましくはグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、またはトレオニンであり、Ｒは−ＮＨ２またはＧｌｙ（ＯＨ）であり、Ｘａａ２２はリジン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンである。より好ましい例において、Ｘａａ７はＬ−ヒスチジンであり、Ｘａａ８はグリシンまたはバリンであり、Ｘａａ２２はリジン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンであり、ＲはＧｌｙ（ＯＨ）である。あるいはまた、配列番号４中のＸａａ７、Ｘａａ８、およびＲは前記と同意義であり、Ｘａａ２２はスルホン酸基、例えばシステイン酸を含む側鎖を有するアミノ酸である。
【００４４】
本発明のＧＬＰ−１化合物の別の例において、２２位のアミノ酸が Ｃ１−Ｃ２アルキル側鎖、Ｃ１−Ｃ２ヒドロキシル化アルキル側鎖、またはＣ１−Ｃ２チオール化アルキル鎖（例えば、システイン）を有するとき、８位のアミノ酸はＤ−アミノ酸ではなく、グリシン、セリン、トレオニン、システインまたはβ−アラニンの側鎖を有しない。本発明のＧＬＰ−１化合物の好ましい例において、２２位のアミノ酸がＣ１−Ｃ４アルキル側鎖、Ｃ１−Ｃ４ヒドロキシル化アルキル側鎖またはＣ１−Ｃ４チオール化アルキル鎖を有するときは、８位のアミノ酸はＤ−アミノ酸ではなく、グリシン、セリン、トレオニン、システインまたはβ−アラニンの側鎖を有しない。
【００４５】
本発明のＧＬＰ−１化合物の別の実施例において、８位のアミノ酸は、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、フェニルアラニン、チロシン、ヒスチジンまたはトリプトファンであり、２２位のアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミンまたはヒスチジンである。
【００４６】
本発明のＧＬＰ−１化合物の特定の例には、Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号２０）、Ａｓｐ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号２１）、Ａｒｇ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号２２）、Ｌｙｓ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号２３）、Ｃｙａ２２− ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号２４）、Ｖａｌ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号５）、Ｖａｌ８−Ａｓｐ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号６）、Ｖａｌ８−Ａｒｇ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号７）、Ｖａｌ８−Ｌｙｓ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号８）、Ｖａｌ８−Ｃｙａ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号２５）、Ｇｌｙ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号９）、Ｇｌｙ８−Ａｓｐ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号１０）、Ｇｌｙ８−Ａｒｇ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号１１）、Ｇｌｙ８−Ｌｙｓ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号１２）、Ｇｌｙ８−Ｃｙａ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号２６）、Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２（配列番号２７）、Ａｓｐ２２−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２（配列番号２８）、Ａｒｇ２２−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２（配列番号２９）、Ｌｙｓ２２−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２（配列番号３０）、Ｃｙａ２２−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２（配列番号３１）、Ｖａｌ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２（配列番号３２）、Ｖａｌ８−Ａｓｐ２２−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２（配列番号３３）、Ｖａｌ８−Ａｒｇ２２−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２（配列番号３４）、Ｖａｌ８−Ｌｙｓ２２−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２（配列番号３５）、Ｖａｌ８−Ｃｙａ２２−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２（配列番号３６）、Ｇｌｙ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２（配列番号３７）、Ｇｌｙ８−Ａｓｐ２２−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２（配列番号３８）、Ｇｌｙ８−Ａｒｇ２２−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２（配列番号３９）、Ｇｌｙ８−Ｌｙｓ２２−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２（配列番号４０）、およびＧｌｙ８−Ｃｙａ２２−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２（配列番号４１）、Ｖａｌ８−Ｌｙｓ２３−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号４２）、Ｖａｌ８−Ａｌａ２７−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号４３）、Ｖａｌ８−Ｇｌｕ３０−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号４４）、Ｇｌｙ８−Ｇｌｕ３０−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号４５）、Ｖａｌ８−Ｈｉｓ３５−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号４６）、Ｖａｌ８−Ｈｉｓ３７−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号４７）、Ｖａｌ８−Ｇｌｕ２２−Ｌｙｓ２３−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号４８）、Ｖａｌ８−Ｇｌｕ２２−Ｇｌｕ２３−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号４９）、Ｖａｌ８−Ｇｌｕ２２−Ａｌａ２７−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号５０）、Ｖａｌ８−Ｇｌｙ３４−Ｌｙｓ３５−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号５１）、Ｖａｌ８−Ｈｉｓ３７−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号５２）、Ｇｌｙ８��Ｈｉｓ３７−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号５３）が含まれる。
【００４７】
本明細書で用いている用語「ＧＬＰ−１化合物」には、本明細書に記載の化合物の医薬的に許容される塩も含まれる。本発明のＧＬＰ−１化合物は、十分な酸性基、十分な塩基性基、または両官能基を有し得るので、多くのあらゆる無機塩基、ならびに無機酸および有機酸と反応して塩を形成する。酸付加塩を形成するのに通常用いる酸は無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸など、および有機酸、例えばｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、蓚酸、ｐ−ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、琥珀酸、クエン酸、安息香酸、酢酸などである。そのような塩の例には、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、クロリド、ブロミド、ヨード、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオール酸塩、蓚酸塩、マロン酸塩、琥珀酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−ジオエート、ヘキシン−１，６−ジオエート、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、γ−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、マンデレートなどが含まれる。
【００４８】
塩基付加塩には、無機塩基、例えば水酸化アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび重炭酸アンモニウム、またはアルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物、カーボネートおよびビカーボネートなどが含まれる。すなわち、本発明の塩を製造するのに有用なそのような塩基には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウムなどが含まれる。
【００４９】
ＧＬＰ−１化合物は、種々の疾患および病状を有する対象を治療するのに用いることができる。ＧＬＰ−１化合物は、本発明のものを含め「ＧＬＰ−１レセプター」と呼ばれるレセプターに作用することによりその生物学的効果を発揮すると考えられる（Ｔｈｏｒｒｅｎｓの米国特許５，６７０，３６０参照）。したがって、ＧＬＰ−１レセプターの刺激またはＧＬＰ−１化合物の投与に好都合に反応する病気および／または病状を有する対象を本発明のＧＬＰ−１化合物で治療することができる。これら対象は「ＧＬＰ−１化合物を用いる治療が必要である」かまたは「ＧＬＰ−１レセプターの刺激が必要」といわれる。インスリン非依存性糖尿病、インスリン依存性糖尿病、卒中（ＥｆｅｎｄｉｃのＷＯ ００／１６７９７参照）、心筋梗塞（ＥｆｅｎｄｉｃのＷＯ ９８／０８５３１参照）、肥満（ＥｆｅｎｄｉｃのＷＯ ９８／１９６９８参照）、外科手術後の異化変化（Ｅｆｅｎｄｉｃの米国特許６，００６，７５３参照）、機能的消化不良、および過敏性大腸症候群（ＥｆｅｎｄｉｃのＷＯ ９９／６４０６０参照）を有する対象が含まれる。ＧＬＰ−１化合物での予防的治療が必要な対象、例えば、インスリン非依存性糖尿病を発現する危険性がある対象（ＷＯ ００／０７６１７参照）も含まれる。グルコース耐性障害または絶食時グルコース障害の対象、体重が、対象の身長および体格に対する標準体重より約２５％以上重い対象、部分膵切除を受けた対象、１またはそれ以上のインスリン非依存性糖尿病の親を持つ対象、妊娠性糖尿病にかかった対象、および急性または慢性膵炎にかかった対象にはインスリン非依存性糖尿病が発生する危険性がある。
【００５０】
ＧＬＰ−１化合物の「有効量」は、ＧＬＰ−１レセプターの刺激が必要な対象に投与したときに許容できない副作用を生じることなく所望の治療および／または予防効果を生じる量である。「所望の治療効果」には１またはそれ以上の以下のものが含まれる： １） 該病気または病状と関連した症状の軽減、２） 該病気または病状と関連した症状の発現遅延、３）該治療を行わない場合に比べて寿命増加、および４） 該治療を行わない場合に比べてクオリティーオブライフの向上。例えば、糖尿病を治療するためのＧＬＰ−１化合物の「有効量」は、治療しない場合より大きな血中グルコース濃度調節をもたらすことにより、網膜症、ニューロパシー、または腎臓病のような糖尿病の合併症の発現の遅延をもたらすであろう量である。糖尿病を予防するためのＧＬＰ−１化合物の「有効量」は、治療しない場合より抗低血糖剤、例えばスルホニル尿素、チアゾリジンジオン、インスリンおよび／またはビスグアニジンを用いる治療が必要な血中グルコースレベルの上昇の発現を遅らせるであろう量である。
【００５１】
対象に投与するＧＬＰ−１化合物の「有効量」は、病気の種類と重症度、および対象の特性、例えば一般健康状態、年齢、性別、体重、および薬剤に対する耐性にも依存するであろう。当業者は、これらおよび他の因子に応じた適切な用量を決定することができるであろう。典型的には、ＧＬＰ−１化合物の治療的有効量は、成体で約０．０１ ｍｇ／日〜約１０００ ｍｇ／日で変化し得る。好ましくは、該用量は約０．１ｍｇ／日〜約１００ｍｇ／日、より好ましくは約１．０ｍｇ／日〜約１０ｍｇ／日で変化する。
【００５２】
本発明のＧＬＰ−１化合物は、例えば、経口的、経鼻投与、吸入、または非経口的に投与することができる。非経口的投与は、例えば筋肉内、静脈内、皮下もしくは腹腔内注射のような全身投与を含み得る。ＧＬＰ−１化合物は、上記病気を治療するための医薬組成物の部分として医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に対象に投与することができる。該医薬組成物は、下記のような溶液剤、または非経口的に投与する場合はＧＬＰ−１化合物のサスペンジョン剤または二価の金属カチオンと複合体を形成したＧＬＰ−１化合物のサスペンジョン剤であり得る。適切な医薬的担体は、ペプチドまたはペプチド誘導体と相互作用しない不活性成分を含んでよい。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡに記載のような標準的医薬製剤技術を用いてよい。非経口投与に適した医薬的担体には、例えば無菌水、生理食塩水、静菌生理食塩水（約０．９％ ｍｇ／ｍｌベンジルアルコール含有生理食塩水）、リン酸緩衝生理食塩水、ハンクス溶液、リンゲルラクテートなどを含む。適切な賦形剤の例には、乳糖、デキストロース、ショ糖、トレハロース、ソルビトール、およびマンニトールが含まれる。
【００５３】
「対象」は、哺乳動物、好ましくはヒトであるが、動物、例えばコンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、乳牛、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、および実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモットなど）でもあり得る。
【００５４】
本発明のＧＬＰ−１化合物は適切な二価金属カチオンと複合体を形成し得る。ＧＬＰ−１化合物の二価金属複合体は一般的にほぼ生理学的ｐＨの水性溶液に不溶性である。したがって、これら複合体をサスペンジョン剤として皮下投与し、ｉｎ ｖｉｖｏでの放出速度の減少を示すことにより、該化合物の時間作用を延長することができる。適切な二価金属カチオンの例には、Ｚｎ＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｆｅ＋＋、Ｃａ＋＋、Ｃｏ＋＋、Ｃｄ＋＋、Ｎｉ＋＋などが含まれる。Ｚｎ＋＋が好ましい。
【００５５】
本発明のＧＬＰ−１化合物と二価金属カチオンの複合体を得るには、ＧＬＰ−１を金属塩の存在下で適切な緩衝液に溶解する。混合物を周囲温度でインキュベーションして複合体を沈殿させる。適切な緩衝液は、混合物を約３．０〜約９．０の範囲のｐＨに維持し、複合体形成反応と緩衝しない緩衝液である。例には、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、およびＧｏｏｄｅの緩衝液、例えばＨＥＰＥＳ、トリス、およびトリスアセテートが含まれる。適切な金属塩は、金属が複合体の形成に利用可能なものである。適切な亜鉛塩の例には、塩化亜鉛、酢酸亜鉛、酸化亜鉛、および硫酸亜鉛が含まれる。好ましくは、二価金属カチオン塩、例えば塩化亜鉛を過剰に供給してＧＬＰ−１化合物の各分子について約５０分子までのモル比の二価金属カチオンを提供する。
【００５６】
「インスリノトロピック活性」は、グルコースレベルの上昇に反応してインスリン分泌を刺激し、細胞によるグルコース取込みと血清グルコースレベルの低下を生じることをいう。インスリノトロピック活性は、ｉｎ ｖｉｖｏ実験、およびＧＬＰ−１レセプターバインディング活性またはレセプター活性化を測定するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、例えば膵アイレット細胞またはインスリノーマ細胞を用いるアッセイ（それぞれＧｅｌｆａｎｄらのＥＰ６１９，３２２および米国特許５，１２０，７１２に記載）の使用を含む当該分野で知られた方法により評価することができる。これらの内容は本明細書の一部を構成する。
【００５７】
本発明のＧＬＰ−１化合物は、固相ペプチド合成技術の標準的方法を用いて製造することができる。ペプチド合成装置は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）から市販されているものを利用可能である。固相合成用の試薬は、例えばＭｉｄｗｅｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｆｉｓｈｅｒｓ、ＩＮ）から市販されているものを利用可能である。固相ペプチド合成装置を製造業者の指示書に従って用い、干渉基をブロックし、反応すべきアミノ酸を保護し、カップリングし、脱カップリングし、非反応アミノ酸をキャッピングすることができる。
【００５８】
典型的には、樹脂上の成長しつつあるペプチド鎖のα−Ｎ−カルバモイル保護アミノ酸およびＮ−末端アミノ酸を、カップリング試薬、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドおよび１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、および塩基、例えばジイソプロピルエチルアミンの存在下で不活性溶媒、例えばジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドンまたは塩化メチレン中、室温でカップリングする。試薬、例えばトリフルオロ酢酸またはピペリジンを用いてα−Ｎ−カルバモイル保護基を得られるペプチド樹脂から除去し、該ペプチド鎖に加える次の所望のＮ−保護アミノ酸とのカップリング反応を反復する。適切なアミン保護基は当該分野でよく知られており、例えば、ＧｒｅｅｎおよびＷｕｔｓ、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９１に記載されている（この内容は本明細書の一部を構成する）。例には、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）およびフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）が含まれる。
【００５９】
該ペプチドは、適切な側鎖保護を有するｔ−ブトキシカルボニル−またはフルオレニルメトキシカルボニル−α−アミノ酸を用い、標準的自動化固相合成プロトコールを用いても合成される。合成完結後、標準的フッ化水素法を用いて同時に側鎖を脱保護しながらペプチドを固相支持物から開裂させる。次に、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中のアセトニトリル勾配を用い、Ｖｙｄａｃ Ｃ１８カラム逆相クロマトグラフィーを用いて粗ペプチドをさらに精製する。アセトニトリルを除去するために、ペプチドを０．１％ ＴＦＡ、アセトニトリル、および水を含む溶液から凍結乾燥する。分析的逆相クロマトグラフィーにより純度を証明することができる。ペプチドの同一性は質量分析法により証明することができる。ペプチドを中性ｐＨの水性緩衝液に可溶化することができる。
【００６０】
以下の実施例により本発明を例示するが、これらは何ら限定を意図するものではない。
【００６１】
実施例１　固相ｔ−Ｂｏｃ化学による本発明のＧＬＰ−１化合物の製造
約０．５−０．６グラム（０．３８−０．４５ｍｍｏｌ）Ｂｏｃ Ｇｌｙ−ＰＡＭ樹脂を標準的６０ｍＬ反応容器中に入れ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ ＡＢＩ４３０Ａ ペプチド合成装置で二重カップリングを行った。以下の側鎖保護アミノ酸（Ｂｏｃアミノ酸の２ｍｍｏｌカートリッジ）をＭｉｄｗｅｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｆｉｓｈｅｒｓ、ＩＮ）から得、合成に用いた： Ａｒｇ−トシル（ＴＯＳ）、Ａｓｐ−δ−シクロヘキシルエステル（ＣＨＸＬ）、Ｇｌｕ−δ−シクロヘキシル（ｃｙｃｏｈｅｘｙｌ）エステル（ＣＨＸＬ）、Ｈｉｓ−ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）、Ｌｙｓ−２−クロロベンジルオキシカルボニル（２Ｃｌ−Ｚ）、Ｍｅｔ−スルホキシド（Ｏ）、Ｓｅｒ−Ｏ−ベンジルエーテル（ＯＢｚｌ）、Ｔｈｒ−Ｏ−ベンジルエーテル（ＯＢｚｌ）、Ｔｒｐ−ホルミル（ＣＨＯ）、およびＴｙｒ−２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２Ｂｒ−Ｚ）、およびＢｏｃ Ｇｌｙ ＰＡＭ樹脂。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、ＤＭＦ中の０．５Ｍヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、およびジクロロメタン中の０．５Ｍジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）はＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から購入した。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ−Ｂｕｒｄｉｃｋ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ）、およびジクロロメタン（ＤＣＭ−Ｍａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ）はＭａｙｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入した。
【００６２】
共にＤＣＣを用いて形成した対称無水物またはＨＯＢｔエステルのいずれかを用い標準的二重カップリングを行った。第二セットの二重カップリング（ＴＦＡ脱保護なし）をＴｒｐ３１、Ｔｈｒ１３、およびＴｈｒ１１に行った。合成完結時にＮ−末端 Ｂｏｃ基を除去し、ペプチジル樹脂をＤＭＦ中の２０％ ピペリジンで処理してＴｒｐ側鎖を脱ホルミル化した。ＤＣＭで洗浄後、樹脂をＴＥＦＬＯＮ反応容器に移し、減圧下で乾燥した。
【００６３】
Ｍｅｔを含有する類似体については、樹脂上還元（ｏｎ−ｔｈｅ−ｒｅｓｉｎ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）をＴＦＡ／１０％ジメチルスルフィド（ＤＭＳ）／２％濃ＨＣｌを用いて行った。反応容器をＨＦ（フッ化水素酸）装置（Ｐｅｎｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に取り付けることにより開裂を行った。１ｍｌ ｍ−クレゾール／グラム／樹脂を加え、１０ｍｌ ＨＦ（ＡＧＡ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮから購入）を予め冷却した容器中で縮合させた。メチオニンが存在するときは１ｍｌ ＤＭＳ／グラム樹脂を加えた。反応液を氷浴中で１時間撹拌し、ＨＦを減圧下で除去した。残渣をエチルエーテルに懸濁し、固体をろ過し、エーテルで洗浄した。各ペプチドを水性酢酸中で抽出し、凍結乾燥するかまたは逆相カラムに直接ロードした。
【００６４】
緩衝液Ａ（水中の０．１％トリフルオロ酢酸、Ｂ：アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ）中の２．２ ｘ ２５ｃｍ ＶＹＤＡＣ Ｃ１８カラムを用いて精製を行った。２８０ｎｍ（４．０Ａ）のＵＶでモニターしながら、１０ｍｌ／分で１２０分間、２０％〜９０％ Ｂの勾配をＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）にかけ、１分間の分画を回収した。適切な分画を混合し、凍結し、次いで凍結乾燥した。乾燥生成物をＨＰＬＣ（０．４６ ｘ １５ｃｍ ＭＥＴＡＳＩＬ ＡＱ Ｃ１８）およびＭＡＬＤＩ質量分析法により分析した。
【００６５】
実施例２　固相Ｆ−Ｍｏｃ化学による本発明のＧＬＰ−１化合物の製造
約１１４ｍｇ（５０ｍｍｏｌ）のＦＭＯＣ Ｇｌｙ ＷＡＮＧ樹脂（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡから購入）を、９６ウェル反応ブロックの各プログラムウェルに入れ、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ３９６ペプチド合成装置を用いて二重カップリングを行った。７５ｍｇ（５０μｍｏｌ）のＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＡＭ樹脂（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）を用いてＣ−末端アミドを有する類似体を製造した。
【００６６】
以下のＦＭＯＣアミノ酸は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ＫＹ）、ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、およびＭｉｄｗｅｓｔ ＢｉｏＴｅｃｈ（Ｆｉｓｈｅｒｓ、ＩＮ）から購入した： Ａｒｇ−２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルフォニル（Ｐｂｆ）、Ａｓｎ−トリチル（Ｔｒｔ）、Ａｓｐ−β−ｔ−ブチルエステル（ｔＢｕ）、Ｇｌｕ−δ−ｔ−ブチルエステル（ｔＢｕ）、Ｇｌｎ−トリチル（Ｔｒｔ）、Ｈｉｓ−トリチル（Ｔｒｔ）、Ｌｙｓ−ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、Ｓｅｒ−ｔ−ブチルエーテル（ＯｔＢｕ）、Ｔｈｒ−ｔ−ブチルエーテル（ＯｔＢｕ）、Ｔｒｐ−ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、Ｔｙｒ−ｔ−ブチルエーテル（ＯｔＢｕ）。
【００６７】
溶媒、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ−Ｂｕｒｄｉｃｋ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ−Ｂｕｒｄｉｃｋ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ−Ｍａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ）はＭａｙｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入した。
ヒドロキシベンゾトリゾール（ＨＯＢｔ）、ジ−イソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、ジ−イソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、およびピペリジン（Ｐｉｐ）は、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）から購入した。
【００６８】
すべてのアミノ酸をＮＭＰ中の０．４５Ｍ ＨＯＢｔに溶解し、２０％ Ｐｉｐ／ＤＭＦを用いて２０分間脱保護した後、５０分間ＤＩＣ／ＨＯＢｔ活性化カップリングを行った。脱保護およびカップリング後、各樹脂をＤＭＦで洗浄した。最終カップリングおよび脱保護後、ペプチジル樹脂をＤＣＭで洗浄し、反応ブロック中で減圧乾燥した。
【００６９】
適切に反応／開裂ブロックアセンブリーを用い、２ｍｌの試薬Ｋを各ウェルに加え、開裂反応液を２時間混合した［試薬Ｋ＝ ０．７５ｇｍフェノール、０．５ｍｌチオアニソール、０．２５ｍｌエタンジチオール、０．５ｍｌ水／１０ｍｌトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、すべてＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩから購入］。ＴＦＡろ液を４０ｍｌエチルエーテルに加え、沈渣を２０００ｒｐｍで２分間遠心した。上清をデカントし、ペレットを４０ｍｌエーテルに再度懸濁し、再度遠心し、再度デカントし、窒素下次いで減圧下で乾燥した。
【００７０】
０．３−０．６ｍｇの各生成物を１ｍｌ ０．１％ ＴＦＡ／アセトニトリル（ＡＣＮ）に溶解し、２０ｕｌをＨＰＬＣで分析した［０．４６ ｘ １５ｃｍ ＭＥＴＡＳＩＬ ＡＱ Ｃ１８、１ｍｌ／ｍｉｎ、４５Ｃ°、２１４ｎＭ（０．２Ａ）、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ ＡＣＮ。勾配＝５０％Ｂ〜９０％Ｂ、３０分間かけて］。
緩衝液Ａ（水中の０．１％トリフルオロ酢酸、Ｂ： アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ）中の２．２ ｘ ２５ｃｍ ＶＹＤＡＣ Ｃ１８カラムを用いて精製を行った。２０％〜９０％Ｂの勾配を１０ｍｌ／分で１２０分間かけてＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）に流し、２８０ｎｍのＵＶでモニターしながら（４．０Ａ）１分間分画を回収した。適切な分画を混合し、凍結し、次いで凍結乾燥した。乾燥生成物をＨＰＬＣ（０．４６ ｘ １５ ｃｍ ＭＥＴＡＳＩＬ ＡＱ Ｃ１８）およびＭＡＬＤＩ質量分析法で分析した。
【００７１】
実施例３　ＧＬＰ凝集アッセイ
本発明のＧＬＰペプチドの溶液中で凝集する可能性について分析した。一般的には、溶液中のペプチドを適切な緩衝液中、上昇した温度で撹拌しながら、濁度を３５０ｎｍで時間の機能として記録した。凝集が発現するまでの時間を測定し、これらストレス条件下における特定ＧＬＰ分子の凝集可能性を定量した。
【００７２】
プロトコール：
ＧＬＰ−１化合物を最初にアルカリ条件（ｐＨ１０．５）下で３０分間溶解してあらゆる前凝集物質を溶解した。次に、該溶液をｐＨ ７．４に調整し、ろ過した。具体的には、４ ｍｇの凍結乾燥ＧＬＰ−１化合物を３ｍｌの１０ｍＭリン酸塩（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）／１０ｍＭクエン酸塩（ｃｉｔｒａｔｅ）に溶解した。ｐＨを１０．０−１０．５に調整し、３０分間保った。該溶液をＨＣｌでｐＨ ７．４に調整し、適切なフィルター、例えばＭｉｌｌｅｘ ＧＶ シリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）でろ過した。次に、この溶液を希釈して１０ｍＭクエン酸塩、１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中に０．３ ｍｇ／ｍＬタンパク質を含む最終試料とした（ｐＨ ７．４〜７．５に調整）。試料を水晶キュベット中で３７℃でインキュベーションした。５分毎に溶液の濁度をＡＶＩＶ Ｍｏｄｅｌ １４ＤＳ ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計（Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）を用い３５０ｎｍで測定した。測定前３０秒間および測定中、Ｓｔａｒｎａ Ｃｅｌｌｓ、Ｉｎｃ．（Ａｔａｓｃａｄｅｒｏ、ＣＡ）の磁石撹拌棒を用いて撹拌した。３５０ｎｍでのＯＤの増加は、ＧＬＰ−ペプチドの凝集を示す。凝集までの時間をＤｒａｋｅ法（Ａｒｖｉｎｔｅ Ｔ、Ｃｕｄｄ Ａ、およびＤｒａｋｅ ＡＦ．（１９９３）、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ． ２６８，６４１５−６４２２）に従って前成長期および成長期に対する線形フィットの交点により概算した。
【００７３】
キュベットは実験と実験の間に苛性石鹸溶液（例えばＣｏｎｔｒａｄ−７０）で洗浄した。
本発明の多くのＧＬＰ−１化合物の結果は、該化合物が凝集するのに必要な時間（時間）で表１に報告する。本発明の化合物は当該分野で知られたＧＬＰ−１化合物より凝集時間の大きな増大を示す。
【００７４】
実施例４　本発明ＧＬＰ−１化合物によるＧＬＰ−１レセプターの活性化
本発明のＧＬＰ−１化合物のＧＬＰ−１レセプター活性化能をＧｅｌｆａｎｄらのＥＰ６１９，３２２および米国特許５，１２０，７１２にそれぞれ記載されているようなｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを用いて評価した。これら参考文献に記載のすべての内容は本明細書の一部を構成する。ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの活性との相対的なこれらの化合物の活性を表１に示す。これらの結果からわかるように、本発明のＧＬＰ−１化合物の活性は一般にＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨとほぼ同じかまたはそれよりよい。
【００７５】
表１
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【００７６】
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【００７７】
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【００７８】
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＊３０℃で測定した凝集時間
【００７９】
実施例５　ＧＬＰ−１化合物の亜鉛沈殿
個々のＧＬＰ−１化合物は実施例１または２に記載のごとく製造した。３ｍｇの個々の凍結乾燥ＧＬＰ分子を３ｍｌの ０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ１０．５に溶解した。次に、得られた溶液のｐＨを０．２Ｎ ＮａＯＨで１０．０〜１０．５に調整した。該溶液を周囲温度で３０分間撹拌し、次いで該溶液を０．２Ｎ ＨＣｌでｐＨ７．４に調整した。該溶液を適切なシリンジフィルター、例えばＭｉｌｌｅｘ ＧＶシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）でろ過し、ＧＬＰ−１化合物の濃度を、分光光度計、例えばＢｅｃｋｍａｎ ＤＵ６４０を用いて２８０ｎｍの吸光度を測定することにより見積もった。次に、タンパク質濃度をＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）で２００μＭに調整した。
【００８０】
ろ過したＧＬＰ−１溶液（１００μｌ）をＥＬＩＳＡプレート（例えばＦａｌｃｏｎ Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ（登録商標）９６）中で、種々の濃度の塩化亜鉛を含む１００μｌの０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）で希釈し、種々の濃度の塩化亜鉛と１００μＭ ＧＬＰ−１化合物を含む溶液２００μｌを得た。これら溶液を周囲温度（２２℃）で１８時間インキュベーションし、次いで例えばマイクロプレートアダプターを有するＪｏｕａｎ ＣＲ４１２遠心機で遠心した。次に、遠心後の上清１５０μｌをＵＶリーダブルＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート（例えばＣｏｓｔａｒ ＵＶプレート）に移し、ＯＤ２８０をマイクロタイターリーダー（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ ＰＬＵＳ、ＳＯＦＴｍａｘ ＰＲＯ）で測定した。実験結果を表２に示す。Ａ２８０値は２回の独立した測定の結果である。
【００８１】
表２
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【００８２】
表２（続き）
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これらの結果は、種々のＧＬＰ−１化合物のかなりの部分と複合体を形成し、これら希釈溶液から沈殿させるのに必要な亜鉛は少量だけであることを示す。
【００８３】
等価物
本発明をその好ましい態様に関して詳細に示し、記載したが、添付した請求の範囲に記載した本発明の精神および範囲を離れることなく形態および詳細の種々の変更を行ってよいことを当業者は理解するであろう。当業者はただ日常的実験を用いるだけで、本明細書に具体的に記載した本発明の特定の態様に対する多くの等価物を認識するか、または確認することができるであろう。そのような等価物は本請求の範囲に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｖａｌ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号５）、Ｖａｌ８−Ａｓｐ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号６）、Ｖａｌ８−Ａｒｇ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号７）、およびＶａｌ８−Ｌｙｓ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号８）のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】Ｇｌｙ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号９）、Ｇｌｙ８−Ａｓｐ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号１０）、Ｇｌｙ８−Ａｒｇ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号１１）、およびＧｌｙ８−Ｌｙｓ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号１２）のアミノ酸配列を示す図である。
【図３】Ｖａｌ８−Ｇｌｕ３０−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号１３）、Ｇｌｙ８−Ｇｌｕ３−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号１４）、Ｖａｌ８−Ｈｉｓ３７−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号１５）、およびＧｌｙ８−Ｈｉｓ３７−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号１６）のアミノ酸配列を示す図である。
【図４】Ｖａｌ８−Ｇｌｕ２２−Ａｌａ２７−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号１７）、およびＶａｌ８−Ｌｙｓ２２−Ｇｌｕ２３−ＧＬＰ１（７−３７）ＯＨ（配列番号１８）のアミノ酸配列を示す図である。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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