(57)【要約】本発明は、対象における、アテローム性動脈硬化症の高発生率と関連するＬｐ−ＰＬＡ２多型変種の存在を測定するのに適する診断方法およびキットに、ならびにかかる方法およびキットの使用に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるアテローム性動脈硬化症を診断する方法、または対象のアテローム性動脈硬化症に対する罹病性を予想する方法であって、対象から単離されたＬｐ−ＰＬＡ２をエンコードするポリヌクレオチドのコドン３７９における一塩基多型（ＳＮＰ）の存在または不在を決定すること（ここでＳＮＰを含むコドンはバリン以外のアミノ酸をエンコードする）を含む、方法。
【請求項２】
ＳＮＰを含むコドン３７９がアミノ酸アラニンをエンコードする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＳＮＰがコドン３７９を構成するヌクレオチドのトリプレットの二番目のヌクレオチド位置、すなわち、配列番号：１のＬｐ−ＰＬＡ２ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド残基１１７３に対応する位置にあるシトシン残基である請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＤＮＡ増幅法を含む請求項１ないし３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか一つに記載の方法を実行するための診断キット。
【請求項６】
１）配列番号：１の１１７３位にあるＣヌクレオチドまでの（それを含む）Ｌｐ−ＰＬＡ２配列のＤＮＡ配列に対して相補的である「３’プライマー」；および
２）Ｃ１１７３多型が個々のゲノムにおける少なくとも一つのコピーにおいて存在する場合、増幅条件下、２つのプライマーの間のＤＮＡが増幅されるような、３’プライマーの５’に適宜位置付けた配列番号：１のＬｐ−ＰＬＡ２配列の一部の直接コピーである「５’プライマー」
を含む請求項５記載の診断キット。
【請求項７】
配列番号：１の１１７３位にあるＴヌクレオチドまでの（それを含む）Ｌｐ−ＰＬＡ２配列のＤＮＡ配列に対して相補的である付加的な３’プライマーをさらに含む請求項６記載の診断キット。
【請求項８】
配列番号：１の１１７３位にある多型ヌクレオチドと隣接するプライマーを含む請求項５記載の診断キット。
【請求項９】
プライマーがＶ３７９ＡＦおよびＶ３７９ＡＲである請求項８記載の診断キット。
【請求項１０】
対象において：
ａ）アテローム性動脈硬化症を発症する可能性を予測するか；
ｂ）アテローム性動脈硬化症状態の進行を予測して、それに応答するか；
ｃ）薬剤治療に対する反応を予測して、それに応答するか；または
ｄ）疾患の結果を予測する、
ための請求項１ないし４のいずれか一つに記載の方法の使用。
【請求項１１】
アテローム性動脈硬化症の治療において使用する可能性を有する治療用化合物に関する臨床試験を行うための患者群を選択するための請求項１ないし４のいずれか一つに記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、リポタンパク結合ホスホリパーゼＡ２（Ｌｐ−ＰＬＡ２）の多型変異体であって、様々な形態を有する患者におけるアテローム性硬化症の高い発症率に関連するものに関する。本発明は、患者における前記Ｌｐ−ＰＬＡ２多型変異体の存在を決定するための好適な診断法およびキット、ならびにかかる方法およびキットの使用に関する。
【０００２】
（背景技術）
疾患の予防または疾患の早期治療は、健康管理団体、医療従事者、そしてもちろん患者自身が切望する目標である。早期治療的介入は、予防、結果の向上および／または治療期間および費用の減少をもたらし得る。かかる早期介入は、特定の疾患にかかる危険性のある患者の正確な確認を必要とする。伝統的に、危険性のある患者は、表現型パラメータ（しばしば表現型異常が現れた後）に従って、または場合によっては疾患状態の履歴を有する家族の一員である場合には遺伝学的に確認されてきた。しかしながら、最近、さらに早い段階で、表現型の手がかりまたは家族の履歴に頼る必要なしに、危険性のある患者を正確に確認することが可能になってきた。必要なのは患者の血液のサンプルだけであり、例えば、これを次いで遺伝子型決定して、個人が特定の疾患に関連することが知られている特定の遺伝的多型を有するかどうかを確定できる。
かかる表現型決定は、明らかに遺伝的多型と疾患状態間の関連性の情報を必要とする。かかる関係の確認は、現在、非常に活発に研究が行われている分野である。
【０００３】
本明細書において用いられる場合、遺伝的多型なる語は、生物のＤＮＡ配列において天然に存在する多様性と定義され、この結果、表現型が多様になる場合もあるし、ならない場合もある。「表現型」は、組み合わされた生物の身体的特性と定義され、（排他的ではないが）ヒトにおける疾患状態を包含する。多型は、２つの主な種類：単塩基置換（一塩基多型またはＳＮＰと称する）、および欠失／挿入事象に分類することができる。
ＳＮＰは、ＤＮＡ配列内の特定のヌクレオチド位置が研究されている集団において２以上の状態を有する場合に生じる。すなわち、異なる個体を比較する場合に、異なるヌクレオチドが所定の位置に存在する。ＳＮＰは遺伝子内で生じ得る（「遺伝子」とは、特定の蛋白を生じる全体的コーディングおよび調節領域と定義される）。かかる遺伝子内多型は遺伝子または蛋白の機能に直接影響を及ぼしても、及ぼさなくてもよい。ＳＮＰはまた遺伝子の外側（遺伝子外）にあってもよい。
【０００４】
欠失／挿入多型は、別のものと比較して、１以上のヌクレオチドが１個体において存在しない場合に生じる。遺伝的分析において用いられる最も一般的な種類の挿入／欠失多型はタンデム繰り返し配列であり、ここにおいてゲノム内のＤＮＡの特定の範囲は、一列に並んで繰り返されるモチーフからなる。かかる配列は、繰り返しの数において多様性（多型）を示し、その結果、異なる個体におけるＤＮＡフラグメントの長さが異なる。タンデム繰り返し多型は、繰り返し単位を含むヌクレオチドの数（ｎ）に応じて２つの種類に分類することができる。２つの種類とは、異なるタンデム反復回数（ＶＮＴＲ）（ｎ＞４）およびシンプルタンデム反復（ＳＴＲ）（ｎ＜５）である。ＶＮＴＲおよびＳＴＲはどちらも遺伝的対合分析に用いることができる。タンデム反復は、典型的には遺伝子の外側にあるが、遺伝子内にも生じ得る。
遺伝子内および遺伝子外多型はどちらも、表現型での遺伝的対合の同定に用いることができる。遺伝子内多型は、遺伝子発現のレベルまたはその結果として得られる蛋白の構造を変更することにより表現型に直接影響を及ぼし得る。別法として、直接機能的結果を有さない遺伝子内または遺伝子外多型は、機能的に有意な第二の多型性と物理的に結合させることができ、機能的変異体自体の知識がなくても間接的に表現型と関連させて試験できる。
【０００５】
危険性のある患者を同定するために遺伝的多型を使用することに加えて、かかる遺伝子型の知識は臨床試験のために患者群を選択するために用いることができ、かかる試験の結果を説明するためにも用いることができる。本質的に、治療に対する反応に影響を及ぼし得る予知因子の適当な知識が研究デザインの一部として含まれるならば、治療薬の効力を明らかにするための臨床試験の統計値は向上され得る。
遺伝的多型が臨床試験において予知因子として用いることができる限り、かかる多型の知識および分析はこれらの研究を費用に対してさらに有効にする可能性がある。遺伝子予知因子を含むことがより少数の患者についての効力を明らかにするために等価な統計値に変換されるならば、このことが当てはまり、かくして所定の研究の費用が減少する。
【０００６】
Ｌｐ−ＰＬＡ２は、成長ホスホリパーゼＡ２超科の分泌されたカルシウム依存性メンバーである（Ｔｅｗら（１９９６）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ　Ｔｈｒｏｍｂ　Ｖａｓｃ　Ｂｉｏｌ．１６（４）：５９１−９；Ｔｊｏｅｌｋｅｒら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ　３７４（６５２２）：５４９−５３）。これは、単球、マクロファージ、およびリンパ球により産生され、ヒト血漿において主にＬＤＬ（約８０％）と結合しているのが見いだされている。酵素は、ＰＡＦを含む極性リン脂質を開裂させ、ＰＡＦアセチルヒドロラーゼとも呼ばれる（Ｔｊｏｅｌｋｅｒら（１９９５）前掲）。
多くの観察により、天然の未修飾リポ蛋白と比較した場合に、酸化されたＬＤＬの炎症性活性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）が示されている。ＬＤＬ酸化における早期事象の一つは、酸化的に修飾されたホスファチジルコリンの加水分解であり、実質的な量のリソホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）および酸化された脂肪酸をもたらす。この加水分解はＬｐ−ＰＬＡ２によってのみ媒介される。ｌｙｓｏ−ＰＣが炎症性およびアテローム性メディエーターであることを支持する証拠が相当量蓄積されている。より高い濃度で細胞毒性であることに加えて、これは単球およびＴ−リンパ球化学走性を刺激でき、またより中程度の濃度で接着分子および炎症性サイトカインを誘発できる。ｌｙｓｏ−ＰＣは、アテローム性動脈硬化症の炎症性に寄与する特性であるＬＤＬの抗原性に関与する酸化ＬＤＬの成分として同定されている。さらに、ｌｙｓｏ−ＰＣはマクロファージ増殖を促進し、様々な動脈支持構造における内皮機能不全を誘発する。ｌｙｓｏ−ＰＣと共に放出される酸化脂肪酸も単球走化性誘起作用物質であり、多くのより関連性のある生物学的活性（例えば、細胞シグナル化）を有する。かくして、Ｌｐ−ＰＬＡ２の抑制は炎症性細胞局在化、活性化、炎症性機能および死を妨害することによりアテローム性動脈硬化症を遅らせる。
【０００７】
Ｌｐ−ＰＬＡ２は、酸化修飾を非常に受けやすい低密度ＬＤＬ（ｓｍａｌｌ　ｄｅｎｓｅ　ＬＤＬ）の高アテローム発生性リポ蛋白サブフラクションが豊富であることが判明している。さらに、酵素レベルは、高脂質血症、発作、１型および２型糖尿病の患者、ならびに閉経期後の女性において増大する。従って、血漿Ｌｐ−ＰＬＡ２レベルは、加速されたアテローム性動脈硬化症および臨床的心血管事象を発症する危険性があると考えられる個人において高くなる傾向にある。
アテローム性動脈硬化症の現行の一次治療は、強引に血漿コレステロールを下げることであり、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤、スタチンの使用により抑制される。全体的に、心血管疾患の患者の５０％が高コレステロール血症である。しかしながら、多くの場合において、かかる治療の有効性は、例えば状態の診断の遅れにより非常に損なわれ得る。かくして、患者は治療を開始する前にすでにアテローム斑が進行している場合があり、治療成果の見込みが減少する。加えて、早期診断により、予防的手段、例えばアテローム性動脈硬化症の発生の非遺伝的危険因子であることが知られているライフスタイルおよび食事における変化を適切に行うことが可能になる。従って、新しく、有効な診断法の開発が必要であり、実際、アテローム性動脈硬化症および高コレステロール血症の新規で有効な治療法が必要とされることは明らかである。しかしながら、これらの新規で有効な治療法は、新規で有用な遺伝子および／または蛋白標的であって、疾患との関連性が立証されているものの同定に依存する。アテローム性動脈硬化症の治療において有用な化合物を同定するために、これらの標的は単離でき、スクリーンを開発できる。
【０００８】
本発明は、Ｌｐ−ＰＬＡ２遺伝子のある多型変異体はヒトにおけるアテローム性動脈硬化症の発生の増加と関連するという知見に基づく。
第一の態様において、本発明は、患者においてアテローム性動脈硬化症を診断するか、またはアテローム性動脈硬化症についての患者のかかりやすさを予想する方法であって、患者から単離されたＬｐ−ＰＬＡ２をエンコードするポリヌクレオチドのコドン３７９における一塩基多型（ＳＮＰ）の存在または不在を決定することを含み、ＳＮＰを含むコドンがバリン以外のアミノ酸をエンコードする方法を提供する。
好ましい具体例において、ＳＮＰを含むコドン３７９はアミノ酸アラニンをエンコードする。
さらに好ましい具体例において、ＳＮＰはコドン３７９を構成するヌクレオチドのトリプレットの第二のヌクレオチド位置、すなわち、配列番号：１のＬｐ−ＰＬＡ２ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド残基１１７３に対応する位置にあるシトシン残基である。「〜に対応する位置」とは、本発明に関しては、配列番号：２のポリペプチド配列における３７９位で示されるアミン酸残基をエンコードするコドンにおける第二のヌクレオチド位置と定義される。
【０００９】
配列番号：１のＬｐ−ＰＬＡ２ｃＤＮＡは、リンパ腫ライブラリー（Ｔｅｗら（１９９６）前掲）由来であり、ヌクレオチド位置１１７３にシトシン残基（Ｃ）を有し、その結果、配列番号：２のポリペプチド配列において示されるようなアラニンをエンコードするＧＣＡコドンが得られる。別の変異体は、この位置にチミン（Ｔ）残基を有することが知られており、その結果、ＧＴＡ（バリンをエンコードする）コドンが得られる（Ｔｊｏｅｌｋｅｒら（１９９５）前掲）。
配列番号：３のポリヌクレオチド（図１に注釈）は、エクソン１１（ｎｔ２７１１〜２８６０）を示すＬｐ−ＰＬＡ２のゲノム配列の一部であり、ここにおいてアミン酸３７９のコドンが、フランキングイントロン配列とともにある。この配列において、多型塩基は２８０７位にあり、「ｙ」として記載される（すなわち、ピリミジン；ＣまたはＴ）。当業者には、配列番号：１のｃＤＮＡ配列の１１７３位の変異ヌクレオチドは、配列番号：３のゲノムＤＮＡ配列における２８０７位の変異ヌクレオチドと同じであることは明らかであろう。
【００１０】
ヌクレオチドの違いが、コドン３７９以外の位置、例えばコドン２７９であり（ＷＯ９５／０９９２１、ＩＣＯＳ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、変異体がこの位置にフェニルアラニンまたはバリンを有するＬｐ−ＰＬＡ２の他の多型変異体が知られている。２７９位のフェニルアラニンは酵素の活性に強く影響を及ぼすことが判明しており、喘息の子供における重度の呼吸器症状と関連すると考えられている。
本発明の多型は、任意の他のＬｐ−ＰＬＡ２多型と独立して考えられる。かくして、本発明の診断法は、さらに他のＬｐ−ＰＬＡ２多型が患者のＬｐ−ＰＬＡ２遺伝子において存在するかどうかにかかわらず、コドン３７９での多型のみを検出するように設計される。
好ましくは、本発明の診断法は、ＤＮＡ増幅法、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくＤＮＡ増幅法を含む。
【００１１】
一具体例において、検出される多型変異体に対して特異的なＰＣＲプライマーが提供される。本明細書において記載したような診断目的のかかるプライマーの設計は当該分野においてよく知られている。従って、例えば、２つのプライマーの一方は３’末端に該変異体に対する相補塩基を有するので、２つのプライマー間のＤＮＡ増幅は、本発明のＤＮＡにおいて変異体ヌクレオチドが存在する場合にだけ達成される。この位置に別の（典型的には「通常の」）ヌクレオチドを有する対照プライマーは、正の対照として含まれる。もちろん、ヒトが各遺伝子配列の２コピーを有し（ＸおよびＹ染色体上に遺伝子の一つのコピーしか有さない男性を除く）、従って特にヒト患者において、多型変異体は、該患者が保有しているＬｐ−ＰＬＡ２遺伝子のどちらにおいても存在しないか、一方または両コピーにおいて存在することは当該分野においてよく知られている。遺伝子の同じコピーを有する患者は、該遺伝子のホモ接合体であると記載される。２つのコピーが異なる場合、例えば、一方のコピーがＬｐ−ＰＬＡ２−Ａ３７９多型を有し、他方のコピーがＬｐ−ＰＬＡ２−Ｖ３７９形態を有する場合、患者はヘテロ接合体である。ＤＮＡ増幅産物がゲル上またはクロマトグラフィー、例えば、ＨＰＬＣにより分離される場合、前記のように設計されたプライマーを用いたＤＮＡバンドパターンは、試験される患者がいずれかの多型変異体に対してホモ接合体であるかまたはヘテロ接合体であるかによって異なるであろう。ＤＮＡバンドパターンの解釈は、当業者には周知である。
【００１２】
好ましい具体例において、診断法は次のように設計されたＰＣＲプライマーの使用を含む：
１）「３’プライマー」は長さが１０から３０ヌクレオチドの間であり、好ましくは１５から２５、最も好ましくは２０であり、配列番号：１の１１７３位にあるＣヌクレオチドまでの（それを含む）Ｌｐ−ＰＬＡ２配列のＤＮＡ配列と完全に相補的である（したがって、プライマーにおけるほとんどの３’相補性ヌクレオチドはＧである）；
２）「５’プライマー」は３’プライマーと同様の長さであり、１０〜３０ヌクレオチド長の間、好ましくは１５〜２５ヌクレオチド、最も好ましくは２０ヌクレオチドであり、第一プライマーの５’に適宜位置付けた配列番号：１のＬｐ−ＰＬＡ２配列の関連する部分の直接コピーであり、したがって増幅条件下で、２つのプライマー間のＤＮＡは、個々のゲノムにおける少なくとも一つのコピーにおいてＣ１１７３多型が存在する場合に増幅される；
３）かかる試験において、（２）の共通の５’プライマーとともに第二の独立した反応において用いられる第二の３’プライマーを提供するのが一般的であり、これはそのほとんどの３’相補性ヌクレオチドとして、別の多型ヌクレオチドを有するように設計される（このケースＡにおいて、これは配列番号：１のＴ１１７３に対して相補性ヌクレオチドである）。
【００１３】
これらの３’プライマーを用いた診断試験の結果は次の通りである：
ａ）Ｃ対立遺伝子（ａｌａ３７９）ホモ接合体は、３’プライマー（１）を用いたＰＣＲバンドを提供するが、３’プライマー（３）ではバンドを提供しない；
ｂ）Ｔ対立遺伝子（ｖａｌ３７９）ホモ接合体は、３’プライマー（３）を用いてＰＣＲバンドを提供するが、３’プライマー（１）ではバンドを提供しない；
ｃ）Ｃ／Ｔ（ａｌａ／ｖａｌ３７９）ヘテロ接合体は、両３’プライマー（１）および（３）の反応でバンドを提供する。
前記の場合において、３’末端で多型ヌクレオチド１１７３を有するプライマーは３’プライマーである。３’末端で多型ヌクレオチド１１７３を有するプライマーは５’プライマーであることは当業者には理解されるであろう。
【００１４】
もう一つの診断法は、隣接するが、多型ヌクレオチドと重複しないプライマー対の使用を含む。この試験において、プライマーは多型ヌクレオチドを含むＬｐ−ＰＬＡ２配列のフラグメントを増幅し、その後、増幅されたＤＮＡの電気泳動移動度における違いを検出する。例えば、Ｃ１１７３対立遺伝子を有するＤＮＡフラグメントは、Ｔ１１７３対立遺伝子を有するものと異なって移動するであろう。多型変異体の検出は、例えば、ｄＨＰＬＣを用いて行うことができる（Ｏ’Ｄｏｎｏｖａｎ、ＭＣら（１９９８）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，５２（１）：４４−４９；Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ、ＰＡら（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．７（１０）：９９６−１０００５）。好ましい具体例において、プライマーは図１においてＶ３７９ＡＦ（ヌクレオチド２６４０から２６５８までからなる順プライマー）およびＶ３７９ＡＲ（ヌクレオチド２９６４から２９４１までからなる逆プライマー）として示すような配列を有する。図１はエクソン１１配列（ヌクレオチド２７１１ないし２８６０）およびフランキングイントロン配列を示し、変異塩基（２８０７）を「ｙ」として表示し、前記プライマー配列に下線を施した。
【００１５】
本発明の方法を実施するためには、Ｌｐ−ＰＬＡ２ポリヌクレオチドを含むサンプルを患者から単離しなければならない。診断用核酸は、患者の細胞、例えば、血液、尿、唾液、組織バイオプシーまたはオートプシー物質から得ることができる。ゲノムＤＮＡは直接検出に用いてもよいし、あるいはＰＣＲ、好ましくはＲＴ−ＰＣＲ、または他の増幅技術を分析前に用いて酵素により増幅してもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡも同様に用いることができる。多型変異体は、増幅されたＤＮＡを標識されたＬｐ−ＰＬＡ２−Ａ３７９またはＬｐ−ＰＬＡ２−Ｖ３７９ヌクレオチド配列とハイブリッド形成させることにより同定することができる。完全にマッチした配列をミスマッチした二本鎖分子からＲＮａｓｅ消化によるか、または融点の違いにより区別することができる。ＤＮＡ配列の差は、変性剤を用いるかまたは用いないで、ゲルにおけるＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度の変更により、あるいは直接ＤＮＡ配列決定により、検出することができる（例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１２４２）。特定の位置での配列の変化は、ヌクレアーゼ保護分析、例えば、ＲＮａｓｅおよびＳ１保護、または化学的開裂法により明らかにできる（Ｃｏｔｔｏｎら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９８５）８５：４３９７−４４０１参照）。
【００１６】
さらにもう一つの態様において、本発明は：
（ａ）本発明のポリヌクレオチド、好ましくは配列番号：１、配列番号：３のヌクレオチド配列、フラグメントまたはそのＲＮＡ転写物；および
（ｂ）（ａ）と相補性であるヌクレオチド配列
を含む本発明の方法を実施するための診断キットに関する。
好ましくは、診断キットのポリヌクレオチド（ａ）および（ｂ）は、前記のＰＣＲ反応において用いるオリゴヌクレオチドプライマーである。
最も好ましくは、診断キットは、２以上のプライマーを含み、少なくとも一つのプライマーは３’ヌクレオチドとして多型ヌクレオチド１１７３を含む。さらにより好ましくは、キットは、２つのプライマーが３’ヌクレオチド以外は同じであり、これらのプライマーの一方がＣ１１７３対立遺伝子（ａｌａ３７９を提供する）に対応し、他方がＴ１１７３対立遺伝子（ｖａｌ３７９を提供する）に対応する３プライマーを含む。
【００１７】
もう一つの態様において、診断キットは、１１７３（配列番号：３における２０８３／図１）で多型ヌクレオチドに隣接する２つのプライマーを含む。好ましくは、ＰＣＲプライマーは図１においてＶ７３９ＡＦ（ヌクレオチド２６４０から２６５８までからなる順プライマー）およびＶ３７９ＡＲ（ヌクレオチド２９６４から２９４１までからなる逆プライマー）として示される配列を有する。
本発明の診断法および診断キットは、患者において
ａ）アテローム性動脈硬化症を発症する可能性の予測；
ｂ）アテローム性動脈硬化症の症状の進行の予測および対応；
ｃ）薬剤治療に対する反応の予測および対応；または
ｄ）疾患結果の予測
のために用いることができる。
さらにもう一つの態様において、本発明の診断法および診断キットは、アテローム性動脈硬化症の治療における使用に関して可能性を有する治療化合物に関する臨床試験を行うために患者群を選択するためにも用いることができる。
本発明を次の実施例により説明する。
【００１８】
実施例
実施例１　ヒト患者および研究設計
アメリカ合衆国出身の白人を、ＥＢＣＴ、血漿ｃＬＤＬ、ＨＤＬおよびＬｐ−ＰＬＡ２を用いて冠動脈石灰化（ＣＡＣ）について試験した。冠動脈性心疾患（少なくとも早発性ＣＨＤに関して軽度）の家族歴を有し、一般的な危険因子を有さない患者を選択した。アテローム性動脈硬化症を測定する技術、電子ビームコンピューター断層撮影法（ＥＢＣＴ）は、感受性で、特異的な冠動脈石灰化の測定器具であり、アテローム斑の非挿入定量化について有用である（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　９３：１９５１−５３；１９９６；Ｍａｙｏ　Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ　７１：３６９−７７；１９９６）。
【００１９】
実施例２　遺伝子型決定
Ｌｐ−ＰＬＡ２遺伝子のエクソン１１においてＶａｌ３７９Ａｌａ変異体に隣接するビオチニル化ＰＣＲ産物を産生するためにプライマーを用いてＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ技術を用いたシーケンシング・バイ合成（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（Ａｈｍａｄｉａｎ、Ａら（２０００）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８０（１）：１０３−１１０；Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ、Ｔら（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１（２）：１０７−１１２）を行った。ＰＣＲは次の条件を用いて行った：１０ピコモルの各プライマー、１Ｕ　ＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）、０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１５ｍＭ　Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ　ｐＨ８．０、５０ｍＭ　ＫＣｌ、２．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２溶液＋５０ｍｇのＤＮＡを含む２０μｌの反応物中９５℃で１０分間、それぞれ９５℃で３０秒、５５℃で６０秒および７２℃で６０秒を５０サイクル、続いて７２℃で１０分の最終サイクル。４３℃で３０分間撹拌することにより、１２５μｇのＤｙｎａｂｅａｄｓを５ピコモルのＰＣＲ産物とともにインキュベートすることにより、ビオチニル化ＰＣＲ産物をストレプトアビジンでコートされたＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｍ２８０−ストレプトアビジン、Ｄｙｎａｌ）に固定化した。ＤｙｎａｂｅａｄｓをＬｕｃＰｌａｔｅ９６に移し、洗浄後、０．３Ｍ　ＮａＯＨ中５分間ＤＮＡを変性させた。固定化された鎖を洗浄し、４０μｌのアニーリング緩衝液中９５℃で１分間、１５ピコモルのシーケンシングプライマーでアニールし、続いて室温で冷却した。パイロシーケンシングプロトコルに従って、ＬｕｃＫｉｔ　ＳＮＰ９６試薬をＬｕｃ９６カセットに入れた。磁気ビーズと固定化された一本鎖ＤＮＡにアニールされたプライマーを含むカセットおよびＬｕｃ９６プレートをシーケンシング・バイ合成のためにＬｕｃ９６装置に入れた。Ｌｕｃ９６装置により得られるパイログラムにおける一つのピークからヌクレオチド配列を決定した。Ｌｐ−ＰＬＡ２遺伝子におけるＶａｌ３７９Ａｌａ多型を調査するために用いられるオリゴヌクレオチドは次の通りである：
Ｖ３７９Ａ　Ｆ５’　ＴＣＣＴＴＡＣＡＣＴＣＴＡＡＣＴＡＡＡＡ、
５’ビオチン標識逆オリゴＶ３７９Ａ　Ｒ　５’ＴＡＡＡＣＣＡＡＣＴＧＧＡＡＡＴＡＧＴＴ、および
シーケンシングプライマーＶ３７９Ａ　５’ＧＧＡＧＡＣＡＴＡＧＡＴＴＣＡＡＡＴＧ。
【００２０】
実施例３　血漿中のＬＤＬおよびＨＤＬレベルの測定
血漿中のＬＤＬおよびＨＤＬレベルを、標準的脂質調査臨床プロトコルの修正法により行った（米国保健教育福祉省、脂質研究臨床プログラム：実験操作のマニュアル第１巻：脂質およびリポ蛋白分析（公開番号（ＮＩＨ）７５〜６２８）Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ：国立衛生研究所、１９７５）。
結果
【表１】
2004512841.tif 000003
【表２】
2004512841.tif 000004
【表３】
2004512841.tif 000005
【表４】
2004512841.tif 000006
【００２１】
Ｖａｌ３７９Ａ多型は、臨床終点に関連して次のことを示すことが見いだされた：
３７９位でのアラニンについてのホモ接合性はＣＡＣを有さない患者（３．６％）よりもＣＡＣを有する患者（８．２％）でより一般的であった。Ａｌａ／Ａｌａホモ接合体は：
→バリンキャリア（Ａｌａ／ＶａｌおよびＶａｌ／Ｖａｌ（ｐ＜０．０２））よりも１５％高いＬｐ　ＰＬＡ２レベル
→バリンキャリアよりも２６％（男性）〜４５％（女性）高いＬＤＬ／ＨＤＬ比（ｐ＜０．０１）
→バリンキャリアよりも高いＣＡＣレベル（統計的に有意でないが、他の結果と一致）
を有することが見いだされた。
【００２２】
さらに別の実験において、モデルにおける有意な影響は性別であり、喫煙状態およびＢＭＩを注記した。遺伝子型とＨＤＬレベル間には有意な関係があった（ｐ＜０．０５）。２つの各遺伝子型の比較も優位であった（Ｖａｌ／Ｖａｌ対Ａｌａ／Ａｌａ、ｐ＜０．０５およびＶａｌ／Ａｌａ対Ａｌａ／Ａｌａ、Ｐ＜０．０２）。両方の場合において、Ａｌａ／Ａｌａホモ接合体の平均ＨＤＬ（モデルにおける他の因子について調節）は、他の群のものよりも低かった（図２参照）。Ｖａｌ／Ｖａｌの平均ＨＤＬ対Ｖａｌ／Ａｌａの平均ＨＤＬの間には統計的に有意な差はなかった。
バリンキャリア状態とＨＤＬレベル間に統計的に有意な関連性があった（ｐ＜０．０４）。これは、４２．９ｍｇ／ｄｌのバリンキャリアについての平均ＨＤＬ（モデルにおける他の因子について調節）とＡｌａ／Ａｌａホモ接合体についての５０．０ｍｇ／ｄｌの平均値に対応する。ロジスティック回帰を用いて同様の分析を行った。同じ因子が分析モデルに含まれていた。遺伝子型の添加は有意であった（ｐ＜０．０３）。対立遺伝子の添加も有意であった（ｐ＜０．０５）。
この結果をさらに調査するために、異なる遺伝子型の平均ＨＤＬを比較するためにｔ−テストを行った。Ｖａｌ／Ｖａｌ対Ａｌａ／Ａｌａの平均ＨＤＬ（ｐ＜０．００３）とＶａｌ／Ａｌａ対Ａｌａ／Ａｌａの平均ＨＤＬ（ｐ＜０．００５）において有意な差があった。Ｖａｌ／ＶａｌおよびＡｌａ／Ａｌａ群の平均間に差はなかった。Ｖａｌ／ＶａｌおよびＶａｌ／Ａｌａデータが組み合わせられる場合、この群の平均ＨＤＬとＡｌａ／Ａｌａ群の平均の間に有意な差はない（ｐ＜０．００２）。ｔ−テストは他の因子を調節しないことに留意することは重要である。
【図面の簡単な説明】
【図１】エクソン１１（ｎｔ２７１１〜２８６０）を表すＬｐ−ＰＬＡ２のゲノム配列の一部を示す。ここにおいてアミン酸３７９のコドンが、フランキングイントロン配列とともにある。
【図２】遺伝子型とＨＤＬレベルの間の関連性を示す。
【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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