(57)【要約】本発明は、乳腺癌の診断マーカーであるポリヌクレオチドおよびポリペプチドを提供する。さらに、これらのマーカーに免疫特異的な抗体が提供される。これらのマーカーを産生するためのベクター、宿主細胞および方法、ならびに、これらのマーカーを乳腺癌の検出、診断、モニタリング、ステージング、予後判定、イメージングおよび処置に用いるための方法およびツールもまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０、
（ｂ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の、少なくとも１５個の連続した核酸塩基の断片、
（ｃ）遺伝コードの縮重に起因して、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０に比べヌクレオチド配列中に変化を含むが、依然として同一タンパク質をコードする核酸配列、または、
（ｄ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のアンチセンス配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列、
を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドにハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターを発現している宿主細胞。
【請求項５】
ポリヌクレオチドの発現を促進する条件下で請求項４に記載の宿主細胞を培養すること、および該細胞に発現されたポリペプチドを単離することを含む、ＭＳＧポリペプチドを製造するための方法。
【請求項６】
適切な培養条件下で、細胞がＭＳＧポリペプチドを発現するように、細胞を請求項３に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトすることを含む、ＭＳＧポリペプチドを発現する細胞を生産するための方法。
【請求項７】
請求項１に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
【請求項８】
請求項７に記載のポリペプチドに免疫特異的な抗体。
【請求項９】
請求項１に記載のポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを含む、乳腺癌を診断するためのＭＳＧ。
【請求項１０】
患者における乳腺癌の存在を診断する方法であって、
（ａ）患者における細胞、組織または体液における請求項９に記載のＭＳＧのレベルを測定すること、および
（ｂ）正常ヒト対照由来の細胞、組織または体液における請求項９に記載のＭＳＧのレベルと、測定されたＭＳＧレベルとを比較すること、ここで、正常ヒト対照に対する患者における測定ＭＳＧレベルの変化は、乳腺癌の存在に関連する、
を含む、前記方法。
【請求項１１】
患者における乳腺癌の転移を診断する方法であって、
（ａ）転移したことがわかっていない乳腺癌を有する患者を同定すること、
（ｂ）該患者由来の細胞、組織または体液の試料中の、請求項９に記載のＭＳＧのレベルを測定すること、および
（ｃ）正常ヒト対照の細胞、組織または体液における請求項９に記載のＭＳＧのレベルと、測定ＭＳＧレベルとを比較すること、ここで、正常ヒト対照に対する患者における測定ＭＳＧレベルの増加は、転移した癌に関連する、
を含む、前記方法。
【請求項１２】
乳腺癌を有する患者における乳腺癌をステージングする方法であって、
（ａ）乳腺癌を有する患者を同定すること、
（ｂ）患者由来の細胞、組織または体液の試料中の請求項９に記載のＭＳＧのレベルを測定すること、および
（ｃ）正常ヒト対照の細胞、組織または体液における請求項９に記載のＭＳＧのレベルと、測定ＭＳＧレベルとを比較すること、ここで、正常ヒト対照に対する患者における測定ＭＳＧレベルの増加は、進行している癌に関連し、測定ＭＳＧレベルの減少は、消退または寛解している癌に関連する、
を含む、前記方法。
【請求項１３】
転移の発症に関して、患者における乳腺癌をモニタリングする方法であって、
（ａ）転移したことがわかっていない乳腺癌を有する患者を同定すること、
（ｂ）患者由来の細胞、組織または体液の試料中の請求項９に記載のＭＳＧのレベルを定期的に測定すること、および
（ｃ）正常ヒト対照の細胞、組織または体液における請求項９に記載のＭＳＧのレベルと、定期的に測定したＭＳＧレベルとを比較すること、ここで、正常ヒト対照に対する患者において定期的に測定したＭＳＧレベルのいずれか１つの増加は、転移した癌に関連する、
を含む、前記方法。
【請求項１４】
患者における乳腺癌のステージの変化をモニタリングする方法であって、
（ａ）乳腺癌を有する患者を同定すること、
（ｂ）患者由来の細胞、組織または体液における請求項９に記載のＭＳＧのレベルを定期的に測定すること、および
（ｃ）正常ヒト対照の細胞、組織または体液における請求項９に記載のＭＳＧのレベルと、定期的に測定したＭＳＧレベルとを比較すること、ここで、正常ヒト対照に対する患者において定期的に測定したＭＳＧレベルのいずれか１つの増加は、ステージが進行している癌に関連し、減少は、ステージが後退または寛解している癌に関連する、
を含む、前記方法。
【請求項１５】
乳腺癌のイメージングおよび処置における使用のための潜在的治療薬を同定する方法であって、請求項９に記載のＭＳＧに結合する能力に関して分子をスクリーニングすることを含む、ここで、ＭＳＧに結合する分子の能力は、該分子が乳腺癌のイメージングおよび処置において有用であることを示す、前記方法。
【請求項１６】
請求項８に記載の抗体を患者に投与することを含む、患者における乳腺癌のイメージング方法。
【請求項１７】
抗体が、常磁性イオンまたは放射性同位体で標識される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
患者に請求項８に記載の抗体を投与することを含む、患者において乳腺癌を処置する方法。
【請求項１９】
抗体が細胞毒性剤と結合している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項７に記載のＭＳＧポリペプチドを阻害するまたは作働させる化合物を同定するための方法であって、
（ａ）請求項７に記載のＭＳＧポリペプチドを発現する細胞または請求項７に記載のＭＳＧポリペプチドを発現している細胞膜を候補化合物と接触させること、
（ｂ）候補化合物に接触していない細胞または細胞膜に比したＭＳＧポリペプチドの活性または結合の変化について細胞をモニタリングすること、
とを含む、前記方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法により同定されたＭＳＧポリペプチドアゴニスト。
【請求項２２】
請求項２０に記載の方法により同定されたＭＳＧポリペプチドアンタゴニスト。
【請求項２３】
哺乳類において、ＭＳＧポリペプチドに対する免疫応答を誘発する、ＭＳＧポリペプチドまたはＭＳＧポリペプチドを発現したベクターを含むワクチン。
【請求項２４】
哺乳類に請求項２３に記載のワクチンを投与することを含む、哺乳類において、ＭＳＧポリペプチドに対する免疫応答を誘発する方法。
【請求項２５】
請求項２３に記載のワクチンを患者に投与することを含む、患者における乳腺癌を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、一部は、新規に同定されたポリヌクレオチド及びそれによりコードされるポリペプチド、ならびにこれらのポリヌクレオチド及びポリペプチドを製造し及び使用するための方法に関する。これらのポリペプチドに免疫特異的である抗体もまた、記載されている。新規に同定されたポリヌクレオチド及びそれによりコードされるポリペプチドのレベルは、乳腺癌組織において、または乳腺癌組織特異的に上方調節されている。これらの新規なポリヌクレオチド及びポリペプチドは、本明細書中で、乳腺癌特異遺伝子またはＭＳＧと呼ばれ、癌、特に乳腺癌の検出、診断、モニタリング、ステージング、予後判定及び処置のためのアッセイに有用と思われる。
【０００２】
発明の背景
アメリカでは９人の女性のうち１人は、８５歳の寿命を基準とした生涯のある時期に乳腺癌を発症するであろうと予測されている。毎年、アメリカ合衆国の１８０，０００人を超える女性が乳腺癌と診断され、約４６，０００人がこの病気により亡くなっている。あらゆる女性が乳腺癌の危険にさらされている。しかしながら、女性のこの癌を発症する可能性は年をとるにつれ増加し、すべての癌の８０パーセントが、５０歳を超える女性に見られる。女性の乳腺癌を発症する可能性を増加させ得る幾つかの危険要因もまた存在する。これらは、乳腺癌の家族歴、子供がいないことまたは３０歳を過ぎてから第１子を持つこと、および月経の早期開始を含む。しかしながら、乳腺癌を発症する女性の７０％以上は、危険要因がわかっていない。１０パーセント未満の乳腺癌の症例は、１９９４年に発見されたＢＲＣＡ１遺伝子に関連すると思われる。研究者は現在では、この婦人科の癌の発症における栄養、アルコール、運動、喫煙、および経口避妊薬等の他の要因の役割を研究している。乳房撮影または胸部の特殊Ｘ線は、すべての癌の９０％以上を検出することができる。
【０００３】
乳腺癌の検出、診断、モニタリング、ステージング、および予後判定に用いられる手順は、患者の予後にとって決定的に重要である。早期に診断された患者は、一般的に、遠隔転移性乳腺癌と診断された患者の５年生存率と比較して、ずっと高い５年生存率を有する。乳腺癌を早期に検出するための、より感受性が高く特異的な新たな診断方法が明らかに必要である。
【０００４】
初期治療後およびアジュバント療法中に、乳腺癌患者を綿密にモニタリングして、治療に対する応答を測定し、持続性もしくは再発性の疾患または転移を検出する。したがって、乳腺癌再発を検出する際に、より感受性が高く特異的な癌マーカーもまた明らかに必要である。
【０００５】
乳腺癌を管理する際の別の重要な工程は、患者の疾患のステージを決定することである。ステージの決定は、潜在的な予後判定価値を有し、最適治療を設計するための基準を提供する。一般に、癌の病理学的ステージングは、より正確な予後判定を与えるため、臨床的ステージングよりも好ましい。しかしながら、臨床的ステージングは、病理学的評価用組織を得るための侵襲的方法によらないので、少なくとも病理学的ステージングと同程度に正確である場合には好ましいであろう。癌のステージングは、異なる浸潤のステージを識別することができる、細胞、組織または体液における新規マーカーを検出することにより改良されるであろう。
【０００６】
本発明は、本明細書中で乳腺癌特異遺伝子またはＭＳＧと呼ばれる新規に同定されたポリヌクレオチド及びそれによってコードされたポリペプチド、ならびに該ポリペプチドに免疫特異的な抗体に関する。本発明はまた、乳腺癌の検出、診断、モニタリング、ステージング、予後判定、イメージング及び処置におけるこれらのＭＳＧの使用のための方法にも関する。本発明に関して、ＭＳＧは、中でも、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子によって発現されたネイティブタンパク質を表す。
【０００７】
本明細書中では、ＭＳＧはまた、遺伝コードの縮重に起因して、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０に比べヌクレオチド配列中に変化を含むが、依然として同一タンパク質をコードするポリヌクレオチドを意味する。あるいは、本明細書中で用いられるＭＳＧが意味するものは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子にコードされるネイティブｍＲＮＡ、または配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のアンチセンス配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションが可能なポリヌクレオチドを意味する。
【０００８】
本発明の他の目的、特徴、利点および側面は、以下の説明より当業者に明らかになるだろう。しかしながら、以下の説明および具体的な例は、発明の好ましい態様を示すものではあるが、例示のみを目的として与えられたものであることが理解されるべきである。以下の記述を読むことにより、そして本開示のその他の部分を読むことにより、開示された発明の精神および範囲内での各種変更および改良は当業者にとって容易に明らかになるだろう。
【０００９】
発明の概要
これらの目的、およびその他の問題に対し、本発明の目的は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の少なくとも１５個の連続した核酸塩基を含む配列の断片または部分、遺伝コードの縮重に起因して、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０に比べポリヌクレオチド配列中に変化を含むが、依然として同一タンパク質をコードする核酸配列、及び配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のアンチセンス配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションが可能な核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド配列を提供することである。本発明はさらに、上記のポリヌクレオチドによってコードされる単離されたポリペプチドに関する。これらのポリヌクレオチド及び／またはそれによってコードされるポリペプチドは、本明細書中で一般的に乳腺癌特異遺伝子またはＭＳＧと呼ばれる。
【００１０】
本発明の他の目的は、ＭＳＧポリヌクレオチドを含むベクター、及びそれによりコードされるＭＳＧポリペプチドの発現及び回収のための宿主細胞を提供することである。
本発明の他の目的は、ＭＳＧポリペプチドに免疫特異的な抗体を提供することである。
本発明の他の目的は、ＭＳＧの検出のためのツールを提供することである。このようなツールは、限定されることなく、ＭＳＧに特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド及びＭＳＧに免疫特異的な抗体を含む。
【００１１】
本発明の別の目的は、細胞、組織または体液中のＬＳＣレベルの変化を、正常ヒト対照の、好ましくは同種類の細胞、組織または体液中のＭＳＧのレベルと比較して分析することにより、乳腺癌の存在を診断する方法であって、正常ヒト対照に対する患者におけるＭＳＧレベルの変化が乳腺癌に関連する方法を提供することである。
【００１２】
さらに、転移した乳腺癌を有することが疑われるヒト患者を同定し、かかる患者由来の細胞、組織または体液試料をＭＳＧについて分析し、かかる細胞、組織または体液中のＭＳＧレベルを正常ヒト対照の、好ましくは同種類の細胞、組織または体液中のＭＳＧレベルと比較することにより、転移をしたことがわかっていない乳腺癌を有する患者における転移性の癌を診断する方法であって、正常ヒト対照に対する患者におけるＭＳＧレベルの増加が、転移をした乳腺癌に関連する方法が適用される。
【００１３】
本発明はまた、乳腺癌を有するヒト患者を同定し、かかる患者由来の細胞、組織または体液試料を分析し、かかる細胞、組織または体液中のＭＳＧレベルを、正常ヒト対照試料の、好ましくは同種類の細胞、組織または体液中のＭＳＧレベルと比較することにより、乳腺癌を有するヒトにおける乳腺癌をステージングする方法であって、正常ヒト対照に対する患者におけるＭＳＧレベルの増加が、進行中の癌に関連し、そしてＭＳＧレベルの低下が消退または寛解している癌に関連する方法を提供する。
【００１４】
さらに、転移の発生について、乳腺癌を有するヒトの乳腺癌をモニタリングする方法が提供される。この方法は、転移したことがわかっていないこのような癌を有する患者を同定すること、かかる患者由来の細胞、組織または体液試料をＭＳＧについて定期的に分析することと、かかる細胞、組織または体液中のＭＳＧレベルを、正常ヒト対照試料の、好ましくは同種類の細胞、組織または体液中のＭＳＧレベルと比較することとを含み、ここで、正常ヒト対照に対する患者におけるＭＳＧレベルの増加が、転移した癌に関連している。
【００１５】
さらに、乳腺癌を有するヒトのこのような癌のステージの変化を、このような癌を有するヒトにおけるＭＳＧレベルを観察することによりモニタリングする方法が提供される。この方法は、このような癌を有するヒト患者を発見すること、かかる患者由来の細胞、組織または体液試料をＭＳＧについて定期的に分析すること、このような細胞、組織または体液中のＭＳＧレベルを、正常ヒト対照試料の、好ましくは同種類の細胞、組織または体液中のＭＳＧレベルと比較することとを含み、ここで、正常ヒト対照に対する患者におけるＭＳＧレベルの増加が、進行している癌に関連し、ＭＳＧレベルの減少が、消退または寛解している癌に関連する。
【００１６】
さらに、乳腺癌などのＭＳＧに関係する疾患のイメージングおよび処置に使用するための、新たな治療薬及びＭＳＧを標的とする治療薬を同定する方法が提供される。例えば、一態様では、ＭＳＧを標的とする抗体、またはかかる抗体の断片などの治療薬を用い、疾患もしくは状態を検出または診断することを目的とし、患者におけるＭＳＧの局在を検出またはイメージングすることができる。かかる抗体は、ポリクローナル、モノクローナルまたはオムニクローナル（ｏｍｎｉｃｌｏｎａｌ）であってもよく、あるいは分子生物学的技術により調製できる。
【００１７】
本発明において、および本明細書全体にわたって用いられる場合、「抗体」という用語はまた、ＳＥＬＥＸと呼ばれる、当業者によく知られているｉｎ ｖｉｔｒｏ進化プロトコルに由来するようなアプタマーおよび一本鎖オリゴヌクレオチドを含むとされる。抗体は放射性同位体および常磁性金属を含むが、これらに限定されない各種の検出可能なラベルで標識することができる。ＭＳＧの濃度および／または活性を下げる、小分子または抗体またはその断片などの治療薬もまた、ＭＳＧの発現を特徴とする疾患の処置に使用できる。これらの用途において、抗体は放射性同位体、酵素、毒素、薬剤またはプロドラッグなどの細胞毒性剤へ誘導体化して、または誘導体化せずに用いることができる。本発明の治療薬はまた、ＭＳＧポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニスト、及びＭＳＧポリペプチドに対し免疫応答を誘発する能力のあるワクチンを含む。かかる薬剤は本明細書中の教示に従い容易に同定できる。
【００１８】
本発明の他の目的、特徴、利点および側面は、以下の説明から当業者に明らかになるだろう。しかしながら、以下の説明および具体的な例は、発明の好ましい態様を示しているが、例示のみを目的としていると理解されるべきである。以下の説明を読むこと、および本開示の他の部分を読むことにより、開示された発明の精神および範囲内の各種変更および改良は当業者に容易に明らかになるだろう。
【００１９】
用語集
以下の例示的な説明は本明細書中に頻繁に使用されるある種の用語の理解を助けるために提供される。説明は、便宜的に提供されるものであり、発明を限定するものではない。
ＤＮＡの「消化」とは、ＤＮＡ中のある配列のみに作用する制限酵素でＤＮＡを触媒的に開裂させることを指す。本明細書中に参照される各種制限酵素は市販されており、それらの反応条件、補因子および使用に関するその他の要件は当業者に既知かつ日常的である。
【００２０】
分析を目的とする場合、典型的にはプラスミドまたはＤＮＡ断片１μｇは、約２０μｌの反応緩衝液中で、約２単位の酵素で消化される。プラスミドの構築のためのＤＮＡ断片の単離の場合には、典型的には５〜５０μｇのＤＮＡがそれに比例したより大きい容積中で、２０〜２５０単位の酵素で消化される。
特定制限酵素に関する適切な緩衝液および基質量は、以下に参照されるような標準的研究室マニュアル中に記載されており、それらはサプライヤーによって明記されている。
【００２１】
３７℃で、約１時間のインキュベーション時間が通常用いられるが、条件は標準的方法、サプライヤーの取扱説明書および反応の細目により変化し得る。消化後、当業者にとって日常的である既知の方法を用いて、反応物は分析され、断片はアガロースまたはポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動法により精製され得る。
遺伝的要素とは一般に、ポリペプチドをコードする領域、または宿主細胞における転写または翻訳またはポリペプチドの発現にとって重要な他のプロセスを調節する領域を含むポリヌクレオチド、あるいはポリペプチドをコードする領域、およびそれに作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結された、発現を調節する領域の両方を含むポリヌクレオチドを意味する。
【００２２】
遺伝的要素はエピソーム要素として、すなわち宿主細胞ゲノムとは物理的に独立した分子として複製するベクター内に含まれ得る。それらは真核生物細胞でのメトトレキサート選択によるトランスフェクトされたＤＮＡの増幅中に生じるような、ミニ染色体内に含まれてもよい。遺伝的要素はまた自然状態ではなく、むしろ、とりわけ、単離、クローニングおよび精製ＤＮＡの形態での宿主細胞への導入などの操作により、またはベクター中で、宿主細胞ゲノム中に含まれてもよい。
【００２３】
単離された、とは、その自然状態から「人工的」に変更されること、すなわち自然界で生じる場合、それはその本来の環境から変更されたか、または取り出されたか、あるいはその両方を意味する。
その用語が本明細書中で使用されるように、例えば、生きている動物に、その自然な状態で自然に存在しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離された」ものではないが、その自然状態の共存物質から分離された同一ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離された」ものである。例えば、ポリヌクレオチドに関しては、単離されたという用語は、それが天然に存在する染色体および細胞から分離されていることを意味する。
【００２４】
単離の一部として、または単離に続いて、かかるポリヌクレオチドを、例えば、突然変異誘発、融合タンパク質を形成させること、および宿主内での増殖または発現のために、ＤＮＡなどの他のポリヌクレオチドに結合することができる。単独またはベクターのような他のポリヌクレオチドと結合させて、単離ポリヌクレオチドは、培養液または生体全体にて、宿主細胞に導入することができる。培養液または生体全体にて、宿主細胞へ導入する場合、その用語が本明細書中で用いられるように、かかるＤＮＡは、自然の形態または環境にないことから、それでもなお単離されているだろう。同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、培地配合物、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの、例えば細胞への導入用の溶液、化学反応または酵素反応のための組成物もしくは溶液であって、例えば自然に存在する組成物ではないものなどの組成物中に現れてもよく、そこでは、依然として本明細書中で用いられるような用語の意味での単離ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。
【００２５】
連結は、最も多くは二本鎖ＤＮＡである、２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド間にホスホジエステル結合を形成するプロセスである。連結に関する技術は当該技術分野で既知であり、連結のプロトコルは例えば以下に引用されるＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， ２ｎｄ Ｅｄ．； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（１９８９）、およびＭａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， ｐｇ．１４６のような標準的研究室マニュアルおよび参考資料に記述されている。
【００２６】
オリゴヌクレオチド（単数または複数）は、約８〜約５０個の核酸塩基の比較的短いポリヌクレオチドを指す。多くの場合、この用語は一本鎖デオキシリボヌクレオチドを指すが、とりわけ、同様に一本鎖または二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、および二本鎖ＤＮＡも指すことができる。
一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、しばしば自動オリゴヌクレオチド合成装置にて実行されるものなどの化学的方法により合成される。しかしながら、オリゴヌクレオチドは、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ媒介技術を含む各種のその他の方法、ならびに細胞および生体でのＤＮＡ発現により作製することができる。
【００２７】
まず化学的に合成したＤＮＡは、典型的に、５’ホスフェートなしで得られる。かかるオリゴヌクレオチドの５’末端は、組換えＤＮＡ分子形成に典型的に用いられるＤＮＡリガーゼを使用する連結反応によるホスホジエステル結合形成の基質ではない。かかるオリゴヌクレオチドの連結が望ましい場合には、キナーゼおよびＡＴＰを使用するような標準的技術によりホスフェートを付加することができる。
化学的に合成したオリゴヌクレオチドの３’末端は、遊離の水酸基を一般的に有しており、Ｔ４ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼの存在下にて、容易に別のオリゴヌクレオチドなどの別のポリヌクレオチドの５’ホスフェートとホスホジエステル結合を形成するだろう。周知の様に、この反応は、所望する場合、連結前に他のポリヌクレオチド（単数または複数）の５’リン酸を除去することで選択的に阻止することができる。
【００２８】
本明細書中ではプラスミドは一般に、当業者には慣用である標準的命名法にしたがって、一般に小文字の「ｐ」で始まり、および／またはその後大文字および／もしくは数字が続く形で命名される。本明細書に開示した開始プラスミドは、市販されているか、非制限的に公的に入手可能であるか、または入手可能なプラスミドから既知の公開された方法をルーチンに応用して構築できる。本発明により使用可能な多くのプラスミドならびにその他のクローニングおよび発現ベクターは、当業者に既知であり、容易に入手できる。さらに、当業者は、本発明での使用に適切な任意の多くのその他プラスミドを容易に構築し得る。本発明でのかかるプラスミドならびにその他のベクターの特性、構造および使用は、本開示より当業者に容易に明らかになるだろう。
【００２９】
ポリヌクレオチド（単数または複数）は一般に、未修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る、任意のポリリボヌクレオチドあるいはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。従って、例えば、本明細書中で用いるポリヌクレオチドは、とりわけ一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡであり得るか、あるいはより一般的には二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を表す。さらに、本明細書中で用いるポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三重鎖領域を指す。かかる領域内の鎖は同一分子または異なる分子由来であってもよい。この領域には、１つまたはそれ以上の分子全てを含んでもよいが、より一般的には分子の一部の領域のみが含まれる。三重らせん領域の分子の１つは、オリゴヌクレオチドであることが多い。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドという用語には、１つまたはそれ以上の修飾塩基を含有する上記ＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。従って、安定性またはその他の理由から修飾された主鎖を持つＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書中でその用語が意味するような「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシンのような稀な塩基あるいはトリチル化塩基のような修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡも、２例のみ挙げたが、本明細書中でその用語が使用されるようなポリヌクレオチドである。
【００３１】
当業者に既知の有益な用途を提供する様々な修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに対してなされることが理解されるだろう。本明細書中で使用されるポリヌクレオチドという用語には、化学的、酵素的または代謝的に修飾された形のポリヌクレオチド、ならびにとりわけ単純および複雑な細胞を含む、ウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態が包含される。
【００３２】
ポリペプチドは、本明細書中で使用される場合、以下に記載の全てのポリペプチドが含まれる。ポリペプチドの基本構造は既知であり、当該分野の多くの教本およびその他の刊行物に記載されている。この情況では、本明細書中ではその用語は、ペプチド結合により直鎖状に相互に結合された２個または３個以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を指すのに用いられる。本明細書中で用いる場合、その用語は一般には例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称される短鎖型、および当該分野において一般にタンパク質と呼ばれる、多くの型がある長鎖型の両方を指す。
【００３３】
ポリペプチドが、一般に２０種類の天然アミノ酸と呼ばれる２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸を含むことが多々あること、および末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸が既定のポリペプチドにおいて、プロセシングやその他の翻訳後修飾などの自然のプロセス、または当該技術分野で既知の化学的修飾技術によって修飾されてもよいことが理解されるだろう。ポリペプチド中に自然に生ずる一般的修飾でさえ、あまりに多すぎて、本明細書中にその全体を列挙することはできないが、それらは基礎的テキスト、および詳細なモノグラフ、ならびに多くの研究文献に十分に記載されており、それらは当業者にとって既知である。
【００３４】
本発明のポリペプチド中に存在し得る既知の修飾は、幾つかを例示すると、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋形成、システイン形成、ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニン化（ａｒｇｉｎｙｌａｔｉｏｎ）のようなタンパク質への転移ＲＮＡを介したアミノ酸付加、およびユビキチン化を含む。
【００３５】
かかる修飾は当業者に既知であり、科学文献に詳細記載されている。幾つかの特に一般的な修飾、例えばグリコシル化、脂質付着（ｌｉｐｉｄ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化は、最も基本的なテキスト、例えばタンパク質構造および分子特性（ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ）， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９３）に記載されている。
【００３６】
例えば、タンパク質の翻訳後共有修飾（ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ）， Ｂ． Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８３）の中の、Ｗｏｌｄ， Ｆ、翻訳後タンパク質修飾（Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）：展望と予想（Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ）， ｐｇｓ， １−１２、Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， タンパク質修飾および非タンパク質性補因子の分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ）， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２： ６２６−６４６ （１９９０）、およびＲａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．， タンパク質合成：翻訳後修飾とエージング（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ）， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａａｃｄ． Ｓｃｉ． ６６３：４８−６２ （１９９２）のような、多くの詳しいレビューが本件に利用できる。
【００３７】
ポリペプチドは必ずしも完全な直線ではないということは、よく知られており、また上記のように、理解されるであろう。例えば、ポリペプチドはユビキチン化の結果により分枝され、それらは、一般に自然のプロセシング現象および自然には起こらない人工的な操作によりもたらされる現象を含む翻訳後事象の結果として、分枝を伴う、または伴わない、環状であってもよい。環状、分枝状、および分枝環状ポリペプチドは、非翻訳的自然プロセスにより、および完全な合成的方法によっても合成され得る。
【００３８】
修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含むポリペプチド中のいかなる場所でも起こり得る。実際に、共有結合的修飾によるポリペプチド中のアミノまたはカルボキシル基、あるいは両方の遮蔽は天然および合成ポリペプチドにおいて一般的であり、かかる修飾は、本発明のポリペプチド中にも同様に存在し得る。例えば、タンパク質分解プロセシング前に大腸菌で作られたポリペプチドのアミノ末端残基は、大部分が不変的にＮ−ホルミルメチオニンであろう。
【００３９】
ポリペプチド中に見られる修飾は、多くの場合それが作製される条件を反映するであろう。例えば、宿主内でクローンニングした遺伝子を発現することにより作製されたポリペプチドでは、大部分の修飾の性質および程度が宿主細胞の翻訳後修飾能力およびポリペプチドのアミノ酸配列中に存在する修飾シグナルにより決定されるであろう。例えば、周知のように、グリコシル化は大腸菌のような細菌性宿主ではたいてい起こらない。したがって、グリコシル化が望まれる場合には、ポリペプチドはグリコシル化用宿主、一般には真核生物細胞で発現させるべきである。しばしば昆虫細胞は、哺乳動物細胞と同一の翻訳後グリコシル化を行うことから、とりわけ自然なパターンのグリコシル化を有する哺乳動物タンパク質を効率的に発現させるために、昆虫細胞発現系が開発されている。他の修飾にも同様の考察が適用される。
【００４０】
同一型の修飾は、所定のポリペプチド中の複数の部位にて同一程度または様々な程度で存在し得ることが理解されるだろう。また所定のポリペプチドは多くの型の修飾を含んでもよい。
一般に、本明細書中で使用される場合には、ポリペプチドという用語は、かかる全ての修飾、特に宿主細胞中にてポリヌクレオチドを発現させることにより合成されたポリペプチド中に存在する修飾を包含する。
【００４１】
本明細書中で用いられる場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体（単数または複数）は、それぞれ参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。この意味での変異体は以下、または本開示中の他所に詳述される。
変異体は、別の参照ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なるポリヌクレオチドを含んでもよい。一般にその差は、参照と変異体のヌクレオチド配列が全体としては極めて類似しており、多くの領域で同一であるように制限される。
【００４２】
以下記載するように、変異体のヌクレオチド配列の変化はサイレント（ｓｉｌｅｎｔ）であり得る。すなわち、それらはポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸を変化させない。変化がこの型のサイレントな変化に限定される場合、変異体は参照と同一のアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードする。同様に以下に記載するように、変異体のヌクレオチド配列中の変化は、参照ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を改変してもよい。かかるヌクレオチドの変化は、以下に記載するように、参照配列によりコードされるポリペプチド中にアミノ酸の置換、付加、欠失、融合および切断を生じ得る。
【００４３】
変異体は、別の参照ポリペプチドとアミノ酸配列が異なるポリペプチドを含んでもよい。一般にその差は、参照と変異体の配列が全体としては極めて類似しており、多くの領域で同一であるように制限される。
変異体と参照ポリペプチドは、１つまたはそれ以上の、置換、付加、欠失、融合および切断によりアミノ酸配列が異なってもよく、それらは、いかなる組み合わせで存在してもよい。
【００４４】
本明細書中で用いる受容体分子は、本発明のＭＳＧポリペプチドと特異的に結合または相互作用する分子を指し、好ましい典型的な受容体だけでなく、発明のポリペプチドと特異的に結合または相互作用するその他分子も包含する（それらはまたそれぞれ「結合分子」および「相互作用分子」、ならびに「ＭＳＧ結合または相互作用分子」とも呼ばれる）。
【００４５】
発明のポリペプチドと、受容体または結合分子もしくは相互作用分子を含むかかる分子との結合は、発明のポリペプチドに限定され得る（それは非常に好ましい）か、または発明のポリペプチドに高度に特異的であり得る（それは非常に好ましい）か、または本発明のポリペプチドを含むタンパク質のグループに高度に特異的であり得る（それは好ましい）か、あるいはその内の少なくとも１つが発明のポリペプチドを含むタンパク質の複数のグループに特異的であり得る。
受容体はまた、発明のポリペプチドに結合する、抗体および抗体由来試薬のように、非天然でもあってもよい。
【００４６】
発明の詳細な説明
ポリヌクレオチド及びポリペプチド
本発明は、乳腺癌組織において上方調節される、または乳腺癌組織特異的な、新規に同定された単離ポリヌクレオチド及びそれによりコードされるポリペプチドに関する。これらのポリヌクレオチド及びそれによりコードされるポリペプチドは、癌、特に乳腺癌の診断マーカーとして有用と考えられる。該ポリヌクレオチド及びポリペプチドはまた、癌、特に乳腺癌のイメージング剤及び治療薬の開発にも有用である。
【００４７】
本発明に関して、ポリヌクレオチドは、１本鎖及び２本鎖ＤＮＡ、１本鎖及び２本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本鎖及び２本鎖ＲＮＡまたはそれらのハイブリッドを含む単離核酸配列を含むとされ、ここでは配列は配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の少なくとも１５の連続した核酸塩基を含む配列の断片、遺伝コードの縮重に起因して、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０に比べポリヌクレオチド配列中に変化を含むが、依然として同一タンパク質をコードする核酸配列、及び配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のアンチセンス配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な核酸配列を含む。
【００４８】
ストリンジェントな条件とは、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在する場合のみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを意味する。ＲＮＡ配列はｍＲＮＡの形態であってもよく、一方ＤＮＡ配列は、クローニングにより得られた、または、化学合成技術により製造された、またはそれらの組み合わせによるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの形態であってもよい。本明細書中で用いる場合、ポリヌクレオチドの用語は、上記のように、１個または２個以上の修飾された塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡをも含む。修飾された塩基の例は、安定性を増すための主鎖の修飾及びイノシンまたはトリチル化塩基などの普通でない塩基の組込みを含むが、これらに限定されない。
【００４９】
本発明に関して、ポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のポリヌクレオチドによりコードされたアミノ酸配列を有する組換え、天然及び合成ポリペプチド、または、それらの断片または変異体であって、本発明のポリヌクレオチドによってコードされたアミノ酸配列と同様の活性及び／または癌性組織における同様のレベルを有するものを含むとされる。
【００５０】
好ましい変異体としては、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０によりコードされるポリペプチドから、保存的アミノ酸置換により変異したものがある。保存的アミノ酸置換は、典型的にはＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅなどの脂肪族アミノ酸、ヒドロキシル残基であるＳｅｒ及びＴｈｒ、酸性残基であるＡｓｐ及びＧｌｕ、アミド残基であるＡｓｎ及びＧｌｎ、塩基性残基であるＬｙｓ及びＡｒｇ、及び芳香族残基であるＰｈｅ及びＴｙｒの相互の置換を含む。
【００５１】
抑制的サブトラクションハイブリダイゼーションを用いることにより、ここで、これらのポリヌクレオチド及びそれらにコードされるポリペプチドが乳腺癌組織中で上方調節されていること、または乳腺癌組織に特異的であることが見出された。従って、本明細書中で乳腺癌特異遺伝子またはＭＳＧと呼ばれるこれらのポリヌクレオチド及びポリペプチドが、乳腺癌の診断マーカーとして、本明細書中の他の記載と同様に有用であることが考えられる。
【００５２】
断片
また本発明のこの側面の好ましい別態様としては、ＭＳＧの断片、ならびにＭＳＧの変異体および誘導体の断片を含むポリペプチドがある。
この観点では、断片は配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のＭＳＧによってコードされるアミノ酸配列の変異体または誘導体のアミノ酸配列と部分的には完全に同一であるが、全てが同一ではないアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００５３】
かかる断片は、「独立体（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」（すなわち他のアミノ酸またはポリペプチドの一部でもなく、融合されてもない）であってもよく、またそれらが大型ポリペプチドの中に含まれてもよく、それらは、その大型ポリペプチドの一部または領域を形成する。大型ポリペプチド内に含まれる場合には、本明細書中に記載の断片は最も好ましくは単一連続領域を形成する。しかしながら、複数の断片が単一の大型ポリペプチド内に含まれてもよい。
【００５４】
例えば、ある好ましい態様は、宿主内での発現用に設計した前駆体ポリペプチド内に含まれ、ＭＳＧ断片アミノ末端に融合された異種のプレおよびプロポリペプチド領域、および該断片のカルボキシル末端に融合されたさらなる領域を有する本発明のＭＳＧポリペプチドの断片に関する。したがって、本明細書中に意図する意味の一側面の断片は、本発明のＭＳＧに由来する融合ポリペプチドまたは融合タンパク質の１つまたは２つ以上の部分に関する。
本発明のポリペプチド断片の代表例としては、約１５〜約１３９個のアミノ酸を有する上記断片が存在し得る。
【００５５】
この情況においては、「約」とは、特に引用された範囲、および一方の極値または両極値においていくつか、数個、５、４、３、２または１個のアミノ酸だけ広い、または狭い範囲を含む。この観点において非常に好ましいものは、引用範囲から一極値または両極値が５アミノ酸程度増減する範囲である。特に非常に好ましいものは、引用範囲から一極値または両極値が３アミノ酸程度増減する範囲である。とりわけ好ましいものは、引用範囲から一極値または両極値が１アミノ酸増減する範囲である。この観点においてすべてのうち最も非常に好ましいのは、約１５〜約４５アミノ酸からなる断片である。
【００５６】
発明の特に好ましい断片としては、ＭＳＧの切断突然変異体がある。切断突然変異体としては、アミノ末端を含む連続残基（すなわち連続領域、部分、または一部）またはカルボキシル末端を含む連続残基の欠失、あるいは二重切断突然変異体の場合には、一方がアミノ末端を含み、もう一方がカルボキシル末端を含む２つの連続残基の欠失を除く、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０によりコードされるＭＳＧポリペプチド、またはそれらの変異体もしくは誘導体が挙げられる。上述のサイズ範囲を有する断片もまた、切断断片の好ましい態様であり、一般には断片の中で特に好ましい。
【００５７】
また本発明のこの側面において好ましいのは、ＭＳＧの構造的または機能的特質を特徴とする断片である。この観点で本発明の好ましい態様は、ＭＳＧのアルファへリックスおよびアルファへリックス形成領域（「アルファ領域」）、ベータシートおよびベータシート形成領域（「ベータ領域」）、回転および回転形成領域（「回転領域）、コイルおよびコイル形成領域（「コイル領域）、親水性領域、疎水性領域、アルファ両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、フレキシブル領域、表面形成領域および高抗原性指数領域を含む断片を包含する。
【００５８】
ガルニエ−ロブソン（Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ）アルファ領域、ベータ領域、回転領域およびコイル領域、チョウ−ファスマン（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ）アルファ領域、ベータ領域および回転領域、カイト−ドリトル（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）親水性領域および疎水性領域、アイゼンベルク（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）アルファおよびベータ両親媒性領域、カルパス−シュルツ（Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ）フレキシブル領域、エミニ（Ｅｍｉｎｉ）表面形成領域およびジャムセン−ウォルフ（Ｊａｍｓｅｎ−Ｗｏｌｆ）高抗原性指数領域が特に好ましい。
【００５９】
この観点において非常に好ましい断片としては、上記特徴の幾つかのような複数の構造的特徴を組み合わせるＭＳＧの領域を含む断片である。かかる領域は、大型ポリペプチド内に含まれてもよく、または上記のような本発明の好ましい断片そのものでもよい。この項で用いられる「約」という用語は、断片に関して一般的に記載した上記の意味を有することが理解されるであろう。
【００６０】
さらに好ましい領域は、ＭＳＧの活性を媒介する領域である。この観点における最も非常に好ましいのは、同様の活性または改良された活性を有するか、あるいは望ましくない活性が低減された断片を含む、ＭＳＧの化学的、生物学的、またはその他の活性を有する断片である。この観点において非常に好ましいのは、乳腺特異結合タンパク質を含む、関連ポリペプチドの活性領域に関し、配列または位置にて、あるいはその両方にて、相同的である領域を含む断片である。これら観点において特に好ましい断片としては、上記の切断突然変異体がある。
【００６１】
本発明はまたとりわけ、上記断片をコードするポリヌクレオチド、断片をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、特にストリンジェントな条件下にハイブリダイズするポリヌクレオチド、およびＰＣＲプライマーのような、断片をコードするポリヌクレオチドを増幅するためのポリヌクレオチドに関することが理解されるであろう。これらの観点において、好ましいポリヌクレオチドは上記好ましい断片に対応するものである。
【００６２】
ベクター、宿主細胞、発現
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生にも関する。
【００６３】
宿主細胞は、ポリヌクレオチドを組み込み、本発明のポリペプチドを発現するように遺伝的に操作することができる。例えば、ポリヌクレオチドは、感染、形質導入、トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）および形質転換の周知技術を用いて、宿主細胞内に導入され得る。ポリヌクレオチドは、単独または他のポリヌクレオチドとともに導入されてもよい。かかる他のポリヌクレオチドは、単独で導入されてもよく、共導入されてもよく、または本発明のポリヌクレオチドと結合して導入されてもよい。
【００６４】
したがって、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、例えば哺乳動物における、コトランスフェクションおよび選択に関する標準的技術を用いて、選択可能マーカーをコードする他の分離したポリヌクレオチドを用いて、宿主細胞内にトランスフェクトされてもよい。この場合、ポリヌクレオチドは一般に、宿主細胞ゲノム内に安定的に組み込まれるであろう。
【００６５】
あるいは、ポリヌクレオチドは、宿主内での増殖用の選択可能マーカーを含むベクターに結合されてもよい。ベクター構築物は、上記技術により宿主細胞内に導入されてもよい。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物のような沈殿物中に、または荷電脂質との複合体中にて、ＤＮＡとして導入される。エレクトロポレーションもまた宿主内へのポリヌクレオチド導入に利用され得る。ベクターがウイルスの場合には、それはｉｎ ｖｉｔｒｏでパッケージングされてもよく、またはパッケージング細胞内に導入され、パッケージングされたウイルスが細胞内に形質導入されてもよい。
【００６６】
本発明のこの側面によるポリヌクレオチドの作製およびポリヌクレオチドの細胞内導入に適切な非常に多様な技術が、当業者に既知であり、日常的である。かかる技術は、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ ａｌ． に詳細に参照されているが、これはこれらの技術を詳述する多くの研究用マニュアルの例示である。本発明のこの側面によれば、ベクターは、例えばプラスミドベクター、一本鎖または二本鎖ファージベクター、または一本鎖または二本鎖ＲＮＡあるいはＤＮＡウイルスベクターであり得る。
【００６７】
かかるベクターは、細胞内へのＤＮＡおよびＲＮＡ導入に関する既知の技術により、細胞内にポリヌクレオチドとして、好ましくはＤＮＡとして導入され得る。ベクターは、ファージおよびウイルスベクターの場合、好ましくは、感染および形質導入に関する既知の技術によりパッケージされたウイルス、またはカプシド形成されたウイルスとして細胞内に導入される。ウイルスベクターは、複製適格性または複製欠損性であり得る。後者の場合、ウイルスの増殖は一般に、補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）宿主細胞内でのみ生ずる。
【００６８】
ある観点において、ベクターのうちで好ましいものは、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に適したものである。一般に、かかるベクターは、発現されるべきポリヌクレオチドに作動可能に連結された、宿主細胞での発現に効果的なシス作用性の制御領域を含む。適切なトランス作用性因子は、宿主により供給されるか、補完ベクターにより供給されるか、または宿主導入時にベクター自体により供給される。
【００６９】
この観点において、ある好ましい態様では、ベクターは特異的発現を提供する。かかる特異的発現は、誘発性発現またはある型の細胞でのみの発現、もしくは誘発性および細胞特異的発現の両方であり得る。誘発性ベクターのうち特に好ましいのは、温度および栄養添加物などの操作が容易である環境因子により発現が誘発できるベクターである。原核生物および真核生物宿主での使用のための構成的および誘発的発現ベクターを含めた本発明のこの態様に適切な各種ベクターは既知であり、当業者により常法として使用されている。
【００７０】
操作された宿主細胞は、通常の栄養培地中で培養でき、培地はとりわけプロモーターを活性化すること、形質転換体を選択すること、または遺伝子を増幅することに関して適切なように改良してもよい。発現のために選択された宿主細胞とともに従来使用される温度、ｐＨ等の培養条件は、当業者にとって明らかであろうように、本発明のポリペプチドの発現に適切であろう。
【００７１】
本発明のポリペプチドの発現には非常に多様な発現ベクターが使用可能である。かかるベクターには、染色体、エピソームおよびウイルス由来ベクター、例えばバクテリアプラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体要素、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルスに由来するベクター、およびそれらの組合せに由来するベクター、例えばプラスミドと、コスミドおよびファージミドなどのバクテリオファージ遺伝的要素とに由来するベクターが含まれ、これらは全て本発明のこの態様による発現に使用され得る。一般に、宿主内でポリペプチドを発現させるためのポリヌクレオチドの維持、増殖、または発現に適切ないかなるベクターもこの観点での発現に使用してもよい。
【００７２】
適切なＤＮＡ配列は、各種既知の、かつ日常的な技術のいずれかによりベクター内に挿入される。一般に発現のためのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列および発現ベクターを１つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで切断し、次にＴ４ＤＮＡリガーゼを使い制限断片を一つに結合させることで、発現ベクターに結合される。この目的に使用できる制限および結合の手法は当業者にとって既知かつ常法である。この観点に適切な手法、および別の方法を用い発現ベクターを構築する手法は、当業者にとって既知かつ常法であり、本明細書の他所に引用したＳａｍｂｒｏｏｋらに詳細記載されている。
【００７３】
発現ベクター内のＤＮＡ配列は、例えばｍＲＮＡ転写に対するプロモーターを含む適切な発現制御配列（複数可）に作動可能に連結されている。かかるプロモーターの代表としてよく知られているものを幾つか列挙すると、ファージラムダＰＬプロモーター、大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターが挙げられる。発明のこの側面での使用に適切である多くの記載外のプロモーターが既知であり、本発明での論議および例に例示される様式によって当業者により容易に使用され得ることが理解されるだろう。
【００７４】
一般に発現構築物は転写の開始および終止に関する部位、および転写領域内には翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。構築物により発現される成熟転写体のコード部分は、開始部位に翻訳を開始するＡＵＧを、および翻訳されるポリペプチドの末端に適切に位置する終止コドンを含む。
さらに構築物は発現を制御しかつ発現をもたらす制御領域を含んでもよい。一般には、多くの一般的に実施されている手法によれば、かかる領域は、とりわけリプレッサー結合部位やエンハンサーのように、転写を制御することで作動するであろう。
【００７５】
増殖および発現用のベクターは、一般には選択マーカーを含むだろう。かかるマーカーはまた増幅にも適切であり、あるいはベクターはこの目的のためのさらなるマーカーを含んでもよい。この観点では、好ましくは発現ベクターは１つまたはそれ以上の選択マーカー遺伝子を含み、形質転換した宿主細胞の選択に関する表現型の特徴を提供する。好ましいマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸還元酵素あるいはネオマイシン耐性を、大腸菌やその他の細菌の培養についてテトラサイクリンあるいはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【００７６】
本明細書の他所に記載のような適切なＤＮＡ配列、ならびに適切なプロモーター、およびその他の適切な制御配列を含むベクターは、その中での所望ポリペプチドの発現に適切である各種既知の技術を用い、適切な宿主内に導入される。適切な宿主の代表例としては、大腸菌、放線菌およびネズミチフス菌細胞のような細菌細胞、酵母細胞のような真菌細胞、ショウジョウバエＳ２およびハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）ｓｆ９細胞のような昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳおよびボーズ黒色腫細胞などの動物細胞、ならびに植物細胞が挙げられる。非常に多様な発現構築物のための宿主がよく知られており、当業者は本開示により発明のこの側面によりポリペプチドを発現させるのに適した宿主を容易に選択することができるだろう。
【００７７】
より具体的には本発明はまた、発現構築物などの１つまたはそれ以上の上記配列を含む組換え構築物も包含する。構築物には、本発明のかかる配列が挿入されている、プラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターが含まれる。配列は前向き、または逆向きに挿入され得る。この観点に関し、ある好ましい態様では、構築物は、例えばプロモーターのような配列に作動可能に連結された制御配列をさらに含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者に知られており、本発明での使用に適切なベクターが多く市販されている。
【００７８】
以下市販のベクターを例示する。細菌での使用にとりわけ好ましいベクターは、Ｑｉａｇｅｎで市販されているｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより入手可能なｐＢＳベクター、ファージスクリプト（Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ）ベクター、ブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、およびＰｈａｒｍａｃｉａより入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５である。とりわけ好ましい真核細胞ベクターは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより入手可能なＰＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ、およびＰｈａｒｍａｃｉａより入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬである。これらベクターは、本発明のこの側面での使用に関し、当業者が利用可能な多くの市販されている既知のベクターを例示することのみを目的とし掲載されている。例えば宿主内での、発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの形質導入、維持、増殖または発現に適切なその他のプラスミドまたはベクターは、本発明のこの側面に使用できることが理解されるであろう。
【００７９】
プロモーター領域は、プロモーター領域を欠くレポーター転写単位、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（「ｃａｔ」）転写ユニット、候補プロモーター断片、すなわちプロモーターを含み得る断片を導入するために、１または２以上の下流制限部位などを含むベクターを用いて、所望遺伝子より選択することができる。周知のように、ｃａｔ遺伝子の上流にある制限部位の、プロモーターを含む断片をベクターに導入すると、標準的なＣＡＴアッセイにより検出することができるＣＡＴ活性が発生する。この目的に適切なベクターは既知であり、容易に入手できる。かかる２種類のベクターはｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。したがって、本発明のポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターには、既知、かつ容易に入手可能なプロモーターだけでなく、レポーター遺伝子を使用した上記技術により容易に入手可能なプロモーターも含まれる。
【００８０】
とりわけ知られている、本発明によるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に適切な細菌プロモーターは、大腸菌ｌａｃｉとｌａｃＺプロモーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラムダＰＲ、ＰＬプロモーター、およびｔｒｐプロモーターである。本観点に適切な、とりわけ知られている真核生物プロモーターは、ＣＭＶ最初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）のようなレトロウイルスのＬＴＲプロモーター、およびマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターのようなメタロチオネインプロモーターである。
【００８１】
宿主細胞での発現に適切であるベクターおよびプロモーターを選択することは既知の手法であり、発現ベクター構築、宿主内へのベクターの導入および宿主での発現に必要な技術は、当該技術分野で日常の技術である。
本発明はまた、上記構築物を含む宿主細胞にも関する。宿主細胞は哺乳動物細胞のような高等真核生物細胞、または酵母細胞のような下等真核生物細胞であるか、あるいは宿主細胞は細菌細胞のような原核細胞である。
【００８２】
宿主細胞内への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、陽イオン性脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染またはその他の方法により実行できる。かかる方法は、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， 分子生物の基礎的方法（ＢＡＳＩＣ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ）， （１９８６）などの標準的研究室マニュアルに記載されている。
宿主細胞内の構築物は従来の様式で用いられ、組換え配列にコードされる遺伝子産物を産生できる。あるいは、発明のポリペプチドは従来のペプチド合成装置により合成的に作製ことができる。
【００８３】
成熟タンパク質は、適切なプロモーターの制御下において、哺乳動物細胞、酵母、細菌またはその他の細胞中で発現させることができる。無細胞翻訳系は、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを利用することで、かかるタンパク質の産生に利用することができる。原核生物および真核生物宿主とともに使用することに適したクローニングおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， 分子クローニング：研究室マニュアル（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ）， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）に記載されている。
【００８４】
一般に、組換え発現ベクターは複製起点、下流の構造配列の転写を指示するための高発現遺伝子由来プロモーター、およびベクター暴露後にベクター含有細胞を単離できるようにする選択マーカーを含むだろう。特に適切なプロモーターは、とりわけ３−ホスホグリセレートキナーゼ（「ＰＧＫ」）のような糖分解酵素、ａ−因子、酸性ホスファターゼ、および熱ショックタンパク質をコードする遺伝子に由来するプロモーターである。選択マーカーとしては、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｔｒｐｌ遺伝子が挙げられる。
【００８５】
高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター内にエンハンサー配列を挿入することで高められる。エンハンサーはＤＮＡのシス作用性要素であり、通常約１０〜３００ｂｐであり、所定の宿主細胞型においてプロモーターの転写活性を高める。エンハンサーの例としては、ｂｐ１００ないし２７０にある複製起点の後方に位置するＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後方にあるポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【００８６】
発明のポリペプチドの異種構造配列をコードする発明のポリヌクレオチドは、標準的技術を用いることで、発現のためのプロモーターと作動可能に連結されるようにベクター内に挿入されるだろう。ポリヌクレオチドは、転写開始部位がリボソーム結合部位に対しほぼ５’側に位置するように配置される。リボソーム結合部位は発現されるべきポリペプチドの翻訳を開始するＡＵＧに対して５’側になる。一般に通常ＡＵＧである１つの開始コドンから開始し、リボソーム結合部位と開始ＡＵＧの間に存在するような他のオープンリーディングフレームは存在しない。また一般にポリペプチドの末端には翻訳停止コドンがあり、さらに転写領域の３’末端に適切に配置されたポリアデニル化シグナルおよび転写終止シグナルが存在するだろう。
【００８７】
小胞体内腔内、細胞周辺腔、または細胞外環境に翻訳タンパク質を分泌するためには、発現ポリペプチド中に適切な分泌シグナルを組み込むことができる。シグナルはポリペプチドに対し同種でも、あるいは異種シグナルでもよい。
【００８８】
ポリペプチドは融合タンパク質のような修飾型として発現されてもよく、分泌シグナルだけでなくさらなる異種機能領域を含んでもよい。すなわち、例えば宿主細胞内、精製中、あるいはその後の取り扱いや保存中での安定性および持久性を改善するために、さらなるアミノ酸領域、特には荷電アミノ酸をポリペプチドのＮ末端に付加してもよい。さらに、精製を容易にするためにポリペプチドに領域を付加してもよい。かかる領域は、ポリペプチドの最終調製前に取り除かれるだろう。分泌または排出を起こさせるために、あるいは安定性を向上させ、とりわけ精製を容易にするために、ポリペプチドにペプチド部分を加えることは、当該分野に一般的であり、日常的な技術である。
【００８９】
発明によるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの増殖、維持または発現に適切な原核動物宿主には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）やネズミサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）が挙げられる。シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の数種はこの観点における適切な宿主である。さらに、当業者に既知のその他の多くの宿主も、この観点において使用できるだろう。
【００９０】
例示の代表的であるが、非限定例としては、細菌での応用に有用な発現ベクターは、選択マーカーおよび既知のクローニングベクターであるｐＢＲ３２２の遺伝要素を含む市販プラスミド由来の細菌複製起点を含むことができる。かかる市販ベクターとしては、例えばｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．， ＵＳＡ）が挙げられる。これらのｐＢＲ３２２「主鎖」部分は適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と合わせられる。
【００９１】
適切な宿主株を形質転換し、宿主株を選択したプロモーターが誘発可能な適切な細胞密度まで増殖させた後に、適切な手段でプロモーターを誘発し（例えば温度変化、または化学的誘発物質への暴露）、細胞はさらなる期間培養される。
次に細胞は一般には、遠心分離により集められ、物理的または化学的手段により破壊され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。タンパク質の発現に用いた微生物細胞は凍結融解サイクリング、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む任意の従来の方法により破壊することができ、かかる方法は当業者に既知である。
【００９２】
同様に、発現には様々な哺乳動物細胞培養系が使用できる。哺乳動物発現系の例としては、Ｇｌｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ２３： １７５ （１９８１）に記載されている、サル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７細胞系が含まれる。適合性ベクターを発現させることができるその他の細胞系には、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ヒト腎臓２９３およびＢＨＫ細胞系が挙げられる。
哺乳動物発現ベクターは複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、さらに発現に必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終止配列、および５’フランキング非転写配列を含むだろう。この観点におけるある好ましい態様では、ＳＶ４０スプライス部位に由来するＤＮＡ配列およびＳＶ４０ポリアデニル化部位がこれらの型の必須非転写遺伝要素として利用される。
【００９３】
ＭＳＧポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む、既知の方法により組換え細胞培養物より回収および精製され得る。最も好ましくは、精製には高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が用いられる。単離または精製中にポリペプチドが変性させられた場合には、活性立体構造を再生するためにタンパク質のリフォールディングに関する既知の技術が利用されるてもよい。
【００９４】
本発明のポリペプチドには、天然精製産物、化学合成産物、および例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物を含む原核生物または真核生物宿主から組換え技術により生産された産物が含まれる。組換え体の産生手法に用いた宿主に応じて、本発明のポリペプチドはグリコシル化されていてもよく、あるいはグリコシル化されていなくてもよい。さらに、発明のポリペプチドはさらに幾つかの例では宿主媒介性プロセスの結果である初期修飾メチオニン残基を含んでもよい。
【００９５】
ＭＳＧポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、本発明によれば、各種用途、特にＭＳＧの化学的および生物学的に特性を利用する用途に使用され得る。さらなる用途は、細胞、組織および生物体の障害の診断および治療に関する。これらの発明の側面は、以下の論議によってさらに例示される。
【００９６】
抗体
本発明のＭＳＧポリペプチドまたはそれらの断片またはその変異体、またはそれらを発現する細胞は、ＭＳＧポリペプチドに免疫特異的な抗体を生産するための免疫原として使用することができる。「免疫特異的」という用語は、抗体が従来技術における他の関連するポリペプチドに対する親和性に比べ、本発明のポリペプチドに対し実質的に大きな親和性を有することを意味する。これらの抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであることができる。加えて、「抗体」という用語は、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体及び完全ヒト抗体、ならびに、ＦａｂフラグメントまたはＦａｂ発現ライブラリーの産物を含むとされる。
【００９７】
ＭＳＧポリペプチドに対し生成された抗体は、動物、好ましくは非ヒト動物に、常法の手順を用いて、ポリペプチドまたはエピトープ担持断片、変異体または細胞を投与することにより得ることができる。モノクローナル抗体の調製では、連続細胞系培養により産生された抗体を提供する技術が使用できる。例としては、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ．， Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５−４９７ （１９７５））、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４： ７２（１９８３））およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， モノクローナル抗体と癌治療（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ）， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ ． ｐｇ．７７−９６ （１９８５））が挙げられる。
【００９８】
一本鎖抗体の製造技法（米国特許第４，９４６，７７８号）もまた、本発明のポリペプチドに対する１本鎖抗体の製造に適用することができる。また、トランスジェニックマウス、または他の哺乳類を含む他の生物も、ヒト化抗体を発現するために用いることができる。
上記の抗体は、ポリペプチドを発現するクローンの単離または同定、または、アフィニティクロマトグラフィによるポリペプチドの精製にも用いることができる。
ＭＳＧポリペプチドに対する抗体はまた、中でも、乳腺癌の治療に用いることができる。
【００９９】
診断ツール
本発明はまた、ＭＳＧに免疫特異的な抗体またはＭＳＧにハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチドプローブなどの診断ツールにも関する。
ＭＳＧに免疫特異的な抗体は、前節に詳細に記載されている。
本発明のポリペプチドの部分にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、自動オリゴヌクレオチド合成装置により化学的に合成することができ、または、ｉｎ ｖｉｔｒｏの組換えＤＮＡ誘導技法などの代替的な方法を介し、細胞及び生物中でＤＮＡを発現させることにより生産することができる。多くの場合、オリゴヌクレオチドは一本鎖デオキシリボヌクレオチドを含む。しかしながら、オリゴヌクレオチドはまた、一本鎖または二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、及び二本鎖ＤＮＡを含んでもよい。
【０１００】
使用方法
本発明はまた、ヒト患者のＭＳＧのレベルを正常ヒト対象のＭＳＧレベルと比較することにより、癌を検出、診断、モニタリング、ステージング及び予後判定するための量的及び質的両方のアッセイ及び方法にも関する。本発明に関して、「ＭＳＧレベル」は、なかでも、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０を含むポリヌクレオチド配列により発現するネイティブタンパク質を意味する。
【０１０１】
「ＭＳＧ」はまた、本明細書中では、遺伝コードの縮重に起因して、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０に比べヌクレオチド配列中に変化を含むが、依然として同一タンパク質をコードするポリヌクレオチドを意味する。検出されるネイティブタンパク質は、全体、分解産物、分子の複合体、または化学的に修飾されたものであってもよい。
【０１０２】
あるいは、「ＭＳＧ」は、本明細書中では、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子によってコードされたネイティブｍＲＮＡ、または、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のアンチセンス配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを意味する。
【０１０３】
かかるレベルは、好ましくは細胞、組織及び／または体液の少なくとも１つにおいて決定され、正常および異常レベルの決定を含む。従って、例えばＭＳＧタンパク質の、正常対照体液、細胞又は組織試料に比較した過剰発現を診断するための本発明の診断アッセイは、乳腺癌の存在の診断に用いてもよい。
本発明の全ての方法は、随意的に、ＭＳＧと同様に、他の癌マーカーのレベルを決定することを含んでもよい。ＭＳＧ以外の、本発明に有用な他の癌マーカーは試験される癌に依存し、当業者に知られている。
【０１０４】
診断アッセイ
本発明は、好ましくは正常ヒト対照由来の同種類の細胞、組織または体液中のＭＳＧレベルと比較した、細胞、組織または体液中のＭＳＧレベルの変化を分析することにより、癌、特に乳腺癌の存在を診断する方法であって、正常ヒト対照に対する患者におけるＭＳＧレベルの増加が、乳腺癌の存在に関連する方法を提供する。
【０１０５】
本発明を限定するものではないが、典型的に、定量的診断アッセイにおいて、試験される患者が癌を有することを示す陽性の結果は、ＭＳＧなどの癌マーカーの細胞、組織または体液レベルが、正常ヒト対照の好ましくは同種の細胞、組織または体液中により、少なくとも２倍高く、最も好ましくは少なくとも５倍高い結果である。
本発明はまた、転移の発症に関して、いまだ転移していない乳腺癌を有する患者での、転移性乳腺癌を診断する方法も提供する。本発明の方法では、転移した乳腺癌を持つと疑われる（しかしそれまでに転移したことはわかっていない）ヒト癌患者が同定される。このことは当業者に既知の各種手段により達成される。
【０１０６】
本発明では、細胞、組織または体液中のＭＳＧレベルの存在を決定することは、特に転移をしていない乳腺癌と転移をしている乳腺癌とを区別するのに有用である。従来技術は、転移をしている乳腺癌と転移をしていない乳腺癌とを区別することが難しく、適切な治療選択はかかる知識に依存することが多い。
【０１０７】
本発明では、かかる細胞、組織または体液にて測定される癌マーカーレベルはＭＳＧであり、正常ヒト対照の好ましくは同種類の細胞、組織または体液中のＭＳＧレベルと比較される。すなわち、観察される癌マーカーが血清中のＭＳＧである場合、このレベルは好ましくは、正常ヒト対照の血清中のＭＳＧレベルと比較される。正常ヒト対照に対する患者におけるＭＳＧの増加は、転移した乳腺癌に関連する。
【０１０８】
本発明を限定するものではないが、典型的に、定量的診断アッセイにおいて試験またはモニターされる患者における癌が転移していることを示す陽性結果は、ＭＳＧなどの癌マーカーの細胞、組織または体液レベルが、正常患者の好ましくは同種の細胞、組織または体液中よりも、少なくとも２倍高く、最も好ましくは少なくとも５倍高い結果である。
【０１０９】
本明細書中で用いる正常ヒト対照には、癌を持たないヒト患者および／または患者由来の非癌性試料が含まれる。転移を診断またはモニタリングする方法では、正常ヒト対照はまた、好ましくは、信頼性の高い方法により転移していない乳腺癌を有することが決定されているヒト患者由来の試料を含んでもよい。
【０１１０】
ステージング
本発明はまた、ヒト患者における乳腺癌をステージングする方法も提供する。この方法は、かかる癌を持つヒト患者を同定することと、かかるヒト患者由来の細胞、組織または体液をＭＳＧについて分析することとを含む。次に、患者において決定されたＭＳＧレベルを、正常ヒト対照の好ましくは同種類の細胞、組織または体液中のＭＳＧレベルと比較し、ここで、正常ヒト対照に対するヒト患者のＭＳＧレベルの増加が進行している癌に関連し、ＭＳＧレベルの低下（それでも真の正常レベルよりは高い）が、消退または寛解している癌に関連する。
【０１１１】
モニタリング
さらにかかる癌を持つヒト患者において、転移の発症に関して乳腺癌をモニタリングする方法が提供される。この方法は、転移していることがわかっていないかかる癌を持つヒト患者を同定することと、かかる患者由来の細胞、組織または体液を定期的にＭＳＧレベルについて分析することと、ヒト患者において決定されたＭＳＧレベルを、正常ヒト対照の好ましくは同種類の細胞、組織または体液中のＭＳＧレベルと比較することとを含み、ここで正常ヒト対照に対するヒト患者のＭＳＧレベルの増加が、転移している癌に関連する。この方法では、正常ヒト対照試料にはまた以前の患者試料も含まれ得る。
【０１１２】
さらに本発明は、乳腺癌のステージの変化を、かかる癌を有するヒト患者においてモニタリングする方法を提供する。この方法は、かかる癌を有するヒト患者を同定することと、かかるヒト患者由来の細胞、組織または体液をＭＳＧについて定期的に分析することと、ヒト患者において決定されたＭＳＧレベルを、正常ヒト対照の好ましくは同種類の細胞、組織または体液中のＭＳＧレベルと比較することとを含み、ここで正常ヒト対照に対するヒト患者におけるＭＳＧレベルの増加が、ステージにおいて進行している癌に関連し、ＭＳＧレベルの減少が、ステージが後退しているまたは寛解している癌に関連する。この方法では、正常ヒト対照試料には、以前の患者試料も含まれ得る。
【０１１３】
転移の発症に関し患者をモニタリングすることは、定期的であり、好ましくは４半期ごとに実施される。しかしながら、これは、癌、特定患者および癌のステージに依存して、より高頻度で、またはより低頻度で実施されてもよい。
【０１１４】
予後試験および臨床試験モニタリング
本明細書中に記載の方法はさらに、ＭＳＧレベル増加に関連した疾患または障害を発症する対象、またはその危険性を有する対象を同定するための予後アッセイとしても利用できる。本発明は、試験試料をヒト患者より得て、ＭＳＧを検出する方法を提供する。正常ヒト対照に比べ高レベルのＭＳＧの存在は、癌、特に乳腺癌を発症する危険性があるヒト患者のための診断である。
【０１１５】
本発明のＭＳＧの発現または活性を低下させる治療薬の有効性は、臨床試験中における、またはヒト細胞におけるようなｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイにおける、ヒト患者のＭＳＧの発現レベルを分析することによりモニタリングすることもできる。このようにして、遺伝子発現パターンは、ヒト患者、場合によっては細胞の、試験される薬剤に対する生理学的応答を示すマーカーとして利用できる。
【０１１６】
遺伝子損傷および突然変異の検出
本発明の方法はまた、ＭＳＧにおける遺伝子損傷、または突然変異の検出にも使用することができ、これにより遺伝子損傷を持つヒトが乳腺癌に対する危険性を有するか、または乳腺癌を有するかどうかを決定することができる。遺伝子損傷は例えば、本発明のＭＳＧからの１つまたはそれ以上のヌクレオチドの欠失、および／または付加および／または置換の存在、ＭＳＧの染色体再配列、ＭＳＧの異常修飾（例えばゲノムＤＮＡのメチル化パターン）、ＭＳＧのｍＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、ＭＳＧの対立遺伝子により検出することができる。本発明のＭＳＧにおけるかかる損傷を検出する方法は、当業者に既知である。
【０１１７】
アッセイ技術
患者由来の試料における、本発明のＭＳＧのような遺伝子の発現（タンパク質レベルを含む）レベルを決定するのに使用可能なアッセイ技術は、当業者に既知である。かかるアッセイ方法としては、ラジオイムノアッセイ、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ、免疫組織化学アッセイ、インサイチュハイブリダイゼーションアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡアッセイおよびプロテオミクスアプローチ、二次元ゲル電気泳動法（２Ｄ電気泳動）およびマススペクトロメトリーまたはタンパク質相互作用プロファイリングなどの非ゲルベースのアプローチが挙げられるが、これらに限定されない。これらの中でも、ＥＬＩＳＡは生物学的液体中の遺伝子の発現タンパク質の診断に好まれることが多い。
【０１１８】
ＥＬＩＳＡアッセイはまず、市販のソースから容易に入手できない場合には、ＭＳＧに特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製することを含む。さらにＭＳＧに特異的に結合するレポーター抗体が一般には調製される。レポーター抗体は、検出可能な試薬、例えば放射性、蛍光または酵素試薬（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素あるいはアルカリホスファターゼ）に結合される。
【０１１９】
ＥＬＩＳＡを実施するには、ＭＳＧに特異的な抗体を、抗体を結合する固体支持体、例えばポリスチレンディッシュ上でインキュベートする。次に、ディッシュの上のフリーなタンパク質結合部位をウシ血清アルブミンのような非特異的タンパク質とインキュベートすることにより覆う。次に、分析する試料をこのディッシュにてインキュベートし、その間にＭＳＧはポリスチレンディッシュに結合した特異抗体に結合する。
【０１２０】
未結合試料は、緩衝液で洗い流す。ＭＳＧに特異的に指向し、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの検出可能な試薬と連結されたレポーター抗体をディッシュに設置し、その結果、ＭＳＧに結合した任意のモノクローナル抗体にレポーター抗体が結合する。次に未結合のレポーター抗体が洗い流される。次に、比色基質を含むペルオキシダーゼ活性用試薬をディッシュに添加する。ＭＳＧ抗体に結合した固定化ペルオキシダーゼが着色反応産物を生ずる。所定時間中に発色した色の量は、試料中に存在するＭＳＧタンパク質の量に比例する。定量的な結果は典型的に、標準曲線を参照することで得られる。
【０１２１】
競合アッセイもまた使用されるが、この場合ＭＳＧに特異的な抗体は、固体支持体に結合され、標識ＭＳＧおよび宿主由来の試料を固体支持体の上を通過させる。固体支持体に結合した検出される標識量は試料中のＭＳＧ量に相関する。
【０１２２】
また、本発明のＭＳＧの核酸配列の全て、または一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用して、核酸法を、乳腺癌に関するマーカーとしてのＭＳＧのｍＲＮＡの検出に使用することもできる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびその他の核酸法、例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）および核酸配列ベースの増幅法（ＮＡＳＢＡ）は、各種悪性腫瘍の診断およびモニタリングについて悪性細胞を検出することに使用できる。
【０１２３】
例えば、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、数千の他のｍＲＮＡ種の複雑な混合物中において特異的なｍＲＮＡ集団の存在を検出するのに使用可能な強力な技術である。ＲＴ−ＰＣＲでは、ｍＲＮＡ種はまず、酵素、逆転写酵素を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写され、次にｃＤＮＡは標準的ＰＣＲ反応で増幅される。したがって、ＲＴ−ＰＣＲは増幅することにより、単一のｍＲＮＡ種の存在を示すことができる。したがって、ｍＲＮＡがそれを産生する細胞に非常に特異的である場合、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、特定型の細胞の存在を同定することができる。
【０１２４】
固体支持体上に配列された（すなわちグリッディング）クローンまたまオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションは、その遺伝子の発現の検出、およびその発現レベルの定量化の両方に使用できる。このアプローチでは、ＭＳＧ遺伝子をコードするｃＤＮＡは、基板上に固定される。この基板はガラス、ニトロセルロース、ナイロンまたはプラスチックを含むが、これらに限定されない任意の適切な型であり得る。ＭＳＧ遺伝子をコードするＤＮＡの少なくとも一部がこの基板に結合され、次にＲＮＡまたはＲＮＡの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）コピーであり得る、当該組織から単離された検体とインキュベートされる。
【０１２５】
基板に結合したＤＮＡと分析体との間のハイブリダイゼーションは、検体の放射性標識または蛍光標識、またはハイブリッドを検出するために設計した二次分子を含むが、これらに限定されない複数の手段により検出および定量化することができる。遺伝子発現レベルの定量化は、分析体からのシグナル強度を既知の標準物質から決定されたシグナル強度と比較することで実施できる。標準物質は標的遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により得ることができ、その収量を定量化し、次にその物質を使って標準曲線を作成する。
【０１２６】
プロテオミクスアプローチのうち、２Ｄ電気泳動法が当業者に既知の技術である。血清などの試料からの個別のタンパク質の単離は、通常ポリアクリルアミドゲル上で、異なる特性によりタンパク質を順次分離することで達成される。まずタンパク質は、電流を用いて大きさにより分離される。電流は全てのタンパク質に均一に作用し、その結果小型のタンパク質ほど大型のタンパク質に比べゲル上を遠くへ移動する。
【０１２７】
第二の次元は、第一の次元に対し垂直方向に電流を作用させ、タンパク質の大きさに基づいてではなく、各タンパク質の持つ特異的電荷により分離する。異なる配列を持つ２つのタンパク質は、大きさと電荷の両方に基づいて、同一であることはないので、２Ｄ分離の結果は、各タンパク質が特有のスポットを占有する方形のゲルである。このスポットの化学的または抗体プローブによる分析、あるいはそれに引き続くタンパク質のマイクロシークエンシングにより、試料中の所定のタンパク質の相対量を明らかにし、および該タンパク質を同定することができる。
【０１２８】
上記試験は各種細胞、体液および／または組織抽出物（例えば患者より得たホモジネートまたは可溶化組織）由来の試料について実施できる。組織抽出物は、組織生検および剖検材料から常法により得られる。本発明に有用な体液には、血液、尿、唾液またはそれらの任意の他の体分泌物または派生物が含まれる。血液とは、全血、血漿、血清または血液の任意の派生物を含むことを意味している。
【０１２９】
ＭＳＧのｉｎ ｖｉｔｒｏターゲティング／乳腺癌治療
このＭＳＧの同定はまた、癌、特に乳腺癌のイメージングおよび治療のための新規治療物質の合理的設計において有用である。例えば、一側面では、ＭＳＧに特異的に結合する抗体を産生し、乳腺癌を患うことが疑われる患者にｉｎ ｖｉｖｏで使用することができる。ＭＳＧを特異的に結合する抗体は、診断および／または治療目的で乳腺癌が疑われる患者に注射することができる。したがって、本発明の別の側面は、ヒト患者に対し有効量の抗体を投与することにより、かかる治療を必要としている患者の乳腺癌の発症を防止し、治療するための方法に関する。
【０１３０】
「有効量」とは、腫瘍上に発現した標的抗原に結合し、外科的除去のための腫瘍の退縮または腫瘍の消失をもたらすのに必要な抗体量または濃度を意味する。過剰発現されたＭＳＧへの抗体の結合は、かかるＭＳＧを発現する癌細胞に死をもたらすと考えられる。ｉｎ ｖｉｖｏ診断および治療のための抗体の調製および使用は、当該技術分野で既知である。例えば、インジウム−１１１で標識された抗体−キレーターは、癌胎児抗原発現腫瘍のラジオイムノシンチグラフィイメージングでの使用について記載されている（Ｓｕｍｅｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． １９９０ １７：２４７−２５４）。
【０１３１】
特に、これらの抗体−キレーターは、再発性結腸直腸癌が疑われる患者における腫瘍検出に使用されている（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃ． １９９１ ９：６３１−６４０）。磁気共鳴イメージングにおける使用のための標識として常磁性イオンを持つ抗体も記載されている（Ｌａｕｆｆｅｒ， Ｒ． Ｂ． Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９１ ２２： ３３９−３４２）。ＭＳＧに対する抗体は、同様に使用することができる。ＭＳＧを特異的に結合する標識抗体は、患者の疾患状態の診断またはステージングを目的として、乳腺癌が疑われる患者に注射することができる。
【０１３２】
使用される標識は、使用すべきイメージング様式に応じ選択されるであろう。例えば、インジウム−１１１、テクネチウム−９９ｍまたはヨウ素−１３１などの放射性標識体が平面スキャンまたは単光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）に使用できる。フッ素−１９のような陽電子放射標識は、陽電子放射断層撮影法に使用できる。ガドリニウム（ＩＩＩ）またはマンガン（ＩＩ）のような常磁性イオンは、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）に使用できる。正常組織のイメージングと比べた標識の存在から、癌の広がりを決定することができる。器官または組織内の標識量からはまた、その器官または組織中の癌の有無を決定できる。
【０１３３】
ｉｎ ｖｉｖｏの方法で使用可能な抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびオムニクローナル抗体、ならびに分子生物学的技術により調製される抗体が含まれる。抗体断片およびアプトマー、ならびにＳＥＬＥＸと呼ばれる、当業者に既知のインビトロ進化プロトコルより得た一本鎖オリゴヌクレオチドも利用できる。
【０１３４】
ワクチン
本発明の別の側面は、哺乳類において免疫応答を誘発するための組成物および方法に関する。１つの態様では、哺乳類に、ＭＳＧポリペプチドに対する抗体の産生および／またはＴ細胞性の免疫応答を惹起するのに適切な量で、ＭＳＧポリペプチド、またはその断片または変異体を接種する。他の態様では、ｉｎ ｖｉｖｏでＭＳＧポリヌクレオチドの発現を指向するベクターを、このような免疫応答を誘発するため、および抗体を産生するために用いる。ＭＳＧポリペプチドに対する免疫応答は、哺乳類を疾患、特に乳腺癌から保護することが期待される。
【０１３５】
従って、本発明はまた、免疫学的／ワクチン製剤（組成物）であって、哺乳類に導入された場合、該哺乳類においてＭＳＧポリペプチドに対し免疫応答を誘発し、ここで該組成物がＭＳＧポリペプチド、その断片または変異体、またはＭＳＧ遺伝子またはその断片を発現しているベクターを含むものにも関する。ワクチン製剤は、さらに好適な担体を含んでも良い。
【０１３６】
ＭＳＧポリペプチドは胃で分解され得るので、ワクチン製剤は、好ましくは、皮下、筋肉内、静脈内または皮内注射を介して非経口的に投与される。非経口投与に好適な製剤は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤および製剤をレシピエントの血液と等張にする溶質を含んでもよい水性および非水性無菌注射溶液、および懸濁化剤または増粘剤を含んでもよい水性および非水性無菌懸濁液を含む。
【０１３７】
製剤は、単位用量または多用量の容器で、例えば、密封アンプルおよびバイアルとして提示されてもよく、使用直前に無菌液体担体の添加のみを要する凍結乾燥条件下で保管してもよい。ワクチン製剤はまた、該製剤の免疫原性を増強するための、油中水システムおよび当該技術分野で知られている他のシステムなどの、アジュバントシステムを含んでもよい。用量は、ワクチンの具体的な活性に依存し、常法による実験により容易に決定できる。
【０１３８】
スクリーニングアッセイ
本発明のＭＳＧポリペプチドはまた、本発明のＭＳＧポリペプチドを活性化し（アゴニスト）または阻害する（アンタゴニスト、または、さもなければ阻害剤と呼ばれる）化合物のためのスクリーニング方法に用いることができる。従って、本発明のポリペプチドは、例えば、細胞、細胞非含有調製物、化学ライブラリーおよび天然産物混合物から、アゴニストまたはアンタゴニストを同定するのに用いることができる。これらのアゴニストまたはアンタゴニストは、場合によっては、本発明のポリペプチドの天然または修飾された基質、リガンド、レセプター、酵素などであってもよく、または、本発明のポリペプチドの構造的または機能的類似物であってもよい。Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １ （２）： Ｃｈａｐｔｅｒ ５ （１９９１）を参照。
【０１３９】
ＭＳＧポリペプチドは、乳腺癌などの病態を含む、様々な生物学的機能の原因である。従って、一方で、ＭＳＧポリペプチドを刺激する化合物（アゴニスト）を、他方でＭＳＧポリペプチドの機能を阻害できる化合物（アンタゴニスト）を同定することが望まれている。アゴニストおよびアンタゴニストは、乳腺癌などの状態の治療および予防の目的で用いることができる。
【０１４０】
一般的に、このようなスクリーニング手順は、ＭＳＧポリペプチドを発現するまたは本発明のＭＳＧポリペプチドに反応する適切な細胞を用いることを伴う。このような細胞は、哺乳類、酵母、ショウジョウバエおよび大腸菌からのものを含む。ＭＳＧポリペプチドを発現する細胞（または発現したポリペプチドを含む細胞膜）、または、ＭＳＧポリペプチドに反応する細胞を、次に、候補化合物と接触させ、結合、または機能的な反応の刺激または阻害を観察する。候補化合物と接触させた細胞のＭＳＧ活性を、候補化合物と接触させなかった同種の細胞のＭＳＧ活性と比較する。
【０１４１】
アッセイは、候補化合物の結合を単純に試験してもよく、ここで、ＭＳＧポリペプチドを担持する細胞への接着が、候補化合物に直接または間接に結合した標識により、または標識競合物による競合を伴うアッセイにおいて、検出される。さらに、これらのアッセイは、ＭＳＧポリペプチドを担持する細胞に適切な検出系を用いて、候補化合物が、ＭＳＧポリペプチドの活性化により発生したシグナルをもたらすかどうかを試験することができる。活性化の阻害剤は、一般的に既知のアゴニストの存在下でアッセイされ、アゴニストによる活性化への候補化合物の効果が観察される。
【０１４２】
あるいは、アッセイは、候補化合物をＭＳＧポリペプチドを含む液と混合し、混合物を形成する工程、ＭＳＧ活性を該混合物中で測定する工程、そして、混合物のＭＳＧ活性を標準物質と比較する工程を含んでもよい。
【０１４３】
ＭＳＧポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび該ポリペプチドに免疫特異的な抗体はまた、細胞中のＭＳＧｍＲＮＡおよびポリペプチドの産生に対する、添加化合物の効果を検出するためのアッセイを設定することに用いることができる。例えば、分泌されたまたは細胞に結びついたＭＳＧポリペプチドのレベルを測定するための、モノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡは、当該技術分野に知られた標準的な方法により構築することができる。そして、該ＥＬＩＳＡは、適切に操作された細胞または組織からのＭＳＧ産生を阻害または増強し得る剤を発見するために使用することができる。これらのスクリーニングアッセイを遂行する標準的な方法は、当該技術分野でよく理解されている。
【０１４４】
ＭＳＧポリペプチドはまた、場合によっては、当該技術分野で知られた標準的な受容体結合技法を介して、膜結合または可溶性受容体の同定に用いることができる。これらは、限定されることなく、リガンド結合および架橋アッセイを含み、ここで、ＭＳＧは放射性同位体（例えば、１２５Ｉ）で標識され、化学的に修飾され（例えばビオチン化）、または検出または精製に好適なペプチド配列に融合され、そして、推定される受容体（細胞、細胞膜、細胞上清、組織抽出物、体液）のソースとインキュベートされる。他の方法は、表面プラスモン共鳴法および分光法などの生物物理学的技法を含む。受容体の精製およびクローニングに用いられるほか、これらの結合アッセイは、ＭＳＧのレセプターへの結合と競合するＭＳＧのアゴニストおよびアンタゴニストの同定に用いることができる。これらのスクリーニングアッセイを遂行する標準的な方法は、当該技術分野でよく理解されている。
【０１４５】
潜在的なＭＳＧポリペプチドのアンタゴニストの例は、抗体、ＭＳＧに深く関係するオリゴヌクレオチドまたはタンパク質、ＭＳＧポリペプチドのリガンド、基質、受容体、および酵素、これらのリガンド、基質、受容体および酵素の断片、および、本発明のポリペプチドに結合し、該ポリペプチドの活性を抑制する小分子を含むが、これらに限定されない。
【０１４６】
従って、本発明はまた、ＭＳＧポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素など、または、ＭＳＧポリペプチドの産生を減少または増強させる化合物を同定するためのスクリーニングキットにも関する。かかるキットは、好ましくは、ＭＳＧポリペプチド、ＭＳＧポリペプチドを発現している組換え細胞、またはＭＳＧポリペプチドを発現している細胞膜、およびＭＳＧポリペプチドに対する抗体を含む。
【０１４７】
予防および治療方法
本発明はまた、ＭＳＧポリペプチド活性の過剰および不充分な量のＭＳＧポリペプチド活性の両方に関係する、乳腺癌などの異常な状態を処置する方法にも関する。
ＭＳＧポリペプチドの活性が過剰な場合、複数のアプローチが可能である。１つのアプローチは、対象に上述の阻害化合物（アンタゴニスト）を、薬学的に許容し得る担体とともに、例えば、リガンド、基質、酵素、レセプターなどの結合を遮断することにより、または、二次的シグナルを阻害することによりＭＳＧポリペプチドの機能を阻害するための十分な量で投与し、それにより異常な状態を軽減することを含む。他のアプローチでは、内因性のＭＳＧポリペプチドと競合し、リガンド、基質、酵素、受容体などと依然結合することができるＭＳＧポリペプチドの可溶形態を投与することができる。このような競合体の典型的な態様は、ＭＳＧポリペプチドの断片を含む。
【０１４８】
さらに別のアプローチでは、発現阻止（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｌｏｃｋｉｎｇ）技法を用いて、内因性ＭＳＧポリペプチドをコードする遺伝子の発現を阻害することができる。既知の阻止技法は、内部で生成した、または、別個に投与されたアンチセンス配列の使用を伴う。例えば、「遺伝子発現のアンチセンス阻害剤としてのオリゴデオキシヌクレオチド」のＯ’Ｃｏｎｎｏｒ， Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ （１９９１） ５６：５６０， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ （１９９８）を参照。あるいは、遺伝子と３重らせんを形成するオリゴヌクレオチドが提供できる。例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ （１９７９） ６：３０７３、Ｃｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８８） ２４１：４５６、Ｄｅｒｖａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９１） ２５１：１３６０を参照。これらのオリゴマーは、それ自身投与されることができ、または、関係するオリゴマーはｉｎ ｖｉｖｏで発現されることができる。
【０１４９】
また、複数のアプローチが、ＭＳＧおよびその活性の過少発現に関する異常な状態を処置するために使用可能である。１つのアプローチは、対象に、ＭＳＧポリペプチドを活性化する化合物、つまり上述のアゴニストを、治療に有効な量で、薬学的に許容し得る担体と組み合わせて投与し、それにより異常な状態を軽減することを含む。あるいは、対象内の関係する細胞によるＭＳＧの内因性の産生をもたらすために遺伝子療法を用いることができる。
【０１５０】
例えば、本発明のポリヌクレオチドは、複製欠損レトロウイルスベクターなどのウイルスベクター内での発現のために操作され得る。次にレトロウイルス発現構築物が単離され、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入されたパッケージング細胞内に、そのパッケージング細胞が次に所望遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生するように導入され得る。
【０１５１】
これらの産生細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞を操作し、ｉｎ ｖｉｖｏにてポリペプチドを発現させることを目的として、対象に投与され得る。遺伝子療法の概要は、Ｔ ＳｔｒａｃｈａｎおよびＡ Ｐ Ｒｅａｄ、ヒト分子遺伝学、ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｔｄ （１９９６）の第２０章「遺伝子療法およびその他の分子遺伝学に基づく治療アプローチ」（およびそこに引用されている参考文献）を参照。他のアプローチは、好適な薬学的担体と組み合わせて治療量のＭＳＧポリペプチドを投与することである。
【０１５２】
製剤および投与
ＭＳＧポリペプチドの可溶性形態などのペプチド、およびアゴニストおよびアンタゴニストペプチドまたは小分子は、好適な薬学的担体との様々な組合せで製剤することができる。これらの製剤は、治療的に有効な量のペプチドまたは小分子、および薬学的に許容し得る担体または賦形剤を含む。このような担体は、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。製剤は、投与方法に従って選択され、当該技術の範囲内である。本発明は、さらに前述の本発明の組成物の１種または２種以上の成分が満たされた１個または２個以上の容器を含む薬学的パックおよびキットに関する。
【０１５３】
本発明の組成物は、単独で、または、他の治療化合物などの他の化合物とともに用いることができる。
これらの医薬組成物の全身投与の好ましい形態は、注射、典型的には静脈内注射を含む。皮下、筋肉内または腹腔内などの他の注射経路もまた、用いることができる。全身投与のための代替的な手段は、胆汁酸塩またはフシジン酸または他の界面活性剤などの浸透剤を用いた経粘膜および経皮投与を含む。加えて、経腸製剤またはカプセル製剤に適正に製剤された場合、経口投与も可能となり得る。これらの組成物はまた、軟膏、ペースト、ゲルなどの形態で局所的に投与することもできる。
【０１５４】
要求される用量範囲は、組成物、投与経路、製剤の性質、対象の状態の性質、および主治医の判断に依存する。しかしながら、好適な用量は、一般的に対象１ｋｇあたり０．１〜１００μｇのペプチドまたは小分子の範囲である。しかしながら、入手可能な化合物の多様性、および種々の投与経路の異なる効率を考慮すると、必要な容量の大きな変化が予想される。例えば、経口投与は、静脈内注射による投与よりも高い容量を要することが予想される。これらの容量レベル内の変化は、当該技術でよく理解されているように、最適化のための標準的で経験的な常法を用いて調整することができる。
【０１５５】
処置に用いられるポリペプチドはまた、上述のとおり、しばしば「遺伝子療法」と呼ばれる処置様式において、対象内で内因性に生成されることもできる。従って、例えば、対象からの細胞を、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの本発明のＭＳＧポリヌクレオチドにより、体外でポリペプチドをコードするように、そして例えば、レトロウイルス性プラスミドベクターの使用によりｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドをコードするように操作してもよい。次に、これらの細胞を対象に導入する。
【０１５６】
例
本発明を以下の例によりさらに詳細に説明する。例は具体的な態様を参照することで発明を例示するためにのみ提供される。これらの例示は発明のある特定の側面を記述するものの、開示された発明の範囲を限定あるいは制限するものではない。
例は、特に詳細記載された場合を除き、当業者にとって既知、かつ日常的である標準的な技術を用いて実施した。以下の例の日常的な分子生物学的技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， 分子クローニング；ラボラトリーマニュアル（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ）， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）などの標準的な実験室マニュアルに記載されたとおりに実施した。
【０１５７】
例１：抑制サブストラクションハイブリダイゼーション（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｕｂｓｔｒａｃｔｉｖｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ＰＣＲ−ＳＥＬＥＣＴ）
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ＰＣＲ−ＳＥＬＥＣＴは、２種類のｍＲＮＡ集団の間で異なって発現されたｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡについて、選択的に富化するために設計されたＰＣＲベースのサブストラクションハイブリダイゼーション法である（Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， Ｖｏｌ． ９３， ｐｐ． ６０２５−６０３０， １９９６）。
【０１５８】
この方法において、ｃＤＮＡは比較すべき２種のｍＲＮＡ集団から調製する（テスター：差別的に発現されたメッセージが探索されるｃＤＮＡ集団、および、ドライバー：差別的に発現された転写物がないかまたは少ないｃＤＮＡ集団）。テスター試料は、２つの部分に分けられ、５’末端に異なるＰＣＲアダプターが連結される。それぞれのテスターは、別々に、過剰のドライバーとアニーリング（第１アニーリング）した後プールされ、再度過剰のドライバーとアニーリングさせる（第２アニーリング）。
【０１５９】
第１アニーリングの最中、両集団に共通の配列がアニーリングする。さらに、大量または少量のメッセージの濃度は、ハイブリダイゼーションの２次元動態により、豊富な分子についてアニーリングが早いため、標準化される。第２アニーリングの最中、テスターにユニークなまたはテスターに対し過剰なｃＤＮＡが一緒にアニーリングすることができる。このような分子は、その末端に異なるアダプターを有する。
【０１６０】
第２アニーリングの最中に追加のドライバーを添加すると、所望の差別的に発現された配列の富化が増強される。引き続くＰＣＲの最中に、各末端に異なるアダプターを有する分子は、指数関数的に増幅される。同一のアダプターを有するか、または１末端にだけアダプターを有するか、またはアダプターを有さない分子（ドライバー配列）は、増幅されないか、または、線形性に増幅される。最終的な結果は、差別的に発現された（テスターにユニークかまたはテスターで上方調節された）メッセージに対応するｃＤＮＡの富化である。
【０１６１】
この技法は、乳腺組織にユニークな転写物または乳腺癌で過剰発現されているメッセージの同定に使用した。同一の患者から単離した対応（ｍａｔｃｈｅｄ）試料の組、癌試料および同種の組織からの「正常」隣接組織を用いた。癌組織からのｍＲＮＡを「テスター」として、そして、非ガン性ｍＲＮＡを「ドライバー」として用いた。非癌性「ドライバー」は、癌試料と同一の個体および組織からのものである（対応）。あるいは、「ドライバー」は、異なる個体だが腫瘍試料と同種の組織からのものであることができる（非対応）。いくつかのケースでは、癌組織の種類とは異なる種類の非癌性組織に由来するｍＲＮＡの混合物を「ドライバー」として用いた。このアプローチにより、その発現が、分析した癌組織の種類に特異的な、または、そこで上方調節されている転写物の同定が可能になる。
【０１６２】
複数のサブストラクションライブラリーが乳腺から生成される。サブストラクション実験の産物をｃＤＮＡライブラリーの作成に用いた。これらのｃＤＮＡライブラリーは、乳腺癌に特異的な遺伝子、または乳腺で上方調節されている遺伝子からの発現配列タグ（ＥＴＳ）を含む。各ｃＤＮＡ ＰＣＲ Ｓｅｌｅｃｔライブラリーからの選択されたクローンの配列を決定し、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０として表した。
【０１６３】
例２：遺伝子発現の相対的定量
蛍光タックマン（Ｔａｑｍａｎ）プローブを用いたリアルタイム定量ＰＣＲは、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性を利用する定量検出システムである。この方法は、５’をレポーター色素で、下流の３’をクエンチャー色素で標識した内部蛍光オリゴヌクレオチドプローブ（Ｔａｑｍａｎ）を用いる。ＰＣＲの間にＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性がレポーターを放出し、次にその蛍光をモデル７７００シークエンス検出システム（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ， ＵＳＡ）のレーザー検出器により検出することができる。
【０１６４】
内因性対照の増幅を使用し、反応に添加された試料ＲＮＡの量が標準化され、逆転写酵素（ＲＴ）の効率が正規化される。シクロフィリン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、または１８ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）のいずれかがこの内部対照として用いられる。研究される全試料間の相対定量化を計算するために、１つのサンプル試料のための標的ＲＮＡレベルを結果比較のための基準（キャリブレーター）として用いた。「キャリブレーター」に対する定量化は、標準曲線法または比較法（Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃２：ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００シークエンス検出システム）を用いて得ることができる。
【０１６５】
標的遺伝子の組織分布およびレベルを、正常組織および癌組織の全ての試料について評価した。全ＲＮＡは、正常組織、癌組織、および癌とそれに対応する対応隣接組織から抽出された。続いて逆転写酵素を用いて第１鎖ｃＤＮＡが調製され、各標的遺伝子に特異的なプライマーとタックマンプローブとを用いてポリメラーゼ連鎖反応が行われた。結果は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００シークエンス検出装置を用いて分析された。無名数は、キャリブレーター組織と比較した場合の特定組織中にある標的遺伝子の相対発現レベルである。
【０１６６】
リアルタイム定量ＰＣＲを用いて評価されたリード（ｌｅａｄｓ）は、後ろに番号が続く「ｍａｍ」と命名した（例えば：ｍａｍ０２８）。
比較のために、同様のｍＲＮＡ発現分析を、診断マーカーＰＳＡ（前立腺特異抗原）およびＰＬＡ２（ホスホリパーゼＡ２）をコードする遺伝子について行なった。ＰＳＡは、臨床検査室で入手可能な唯一の癌スクリーニングマーカーである。正常プール組織のパネルを分析すると、ＰＳＡは前立腺において非常に高レベルに発現されており、乳房および精巣での発現は非常に低かった。
【０１６７】
１４の異なる組織からの５５より多い対応サンプルを分析した後、正常組織試料に関してみた、データの組織特異性が確認された。前立腺組織の１２の対応試料の癌および正常隣接組織におけるＰＳＡの発現もまた対比した。ＰＳＡの相対レベルは、１０個の癌試料で高かった（８３％）。最近得られた臨床データは、遅いステージの前立腺癌のステージングマーカーとしてのＰＬＡ２の使用を支持している。
【０１６８】
これらの実験からのｍＲＮＡ発現データは、分析した１２個の前立腺対応試料のうち８個においてｍＲＮＡの過剰発現を示した（６６％）。ＰＬＡ２の組織特異性は、ＰＳＡについて記載されたものほどは良くなかった。前立腺の他、小腸、肝臓および膵臓も、ＰＬＡ２について高いレベルのｍＲＮＡの発現を示した。
【０１６９】
例３：半定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＳＱ−ＰＣＲ）
ＳＱ−ＰＣＲは、エンドポイントＰＣＲを連続希釈ｃＤＮＡ試料に用い、複数の試料において対象となる遺伝子の相対発現パターンを決定する方法である。ランダムヘキサマープライムド（ｒａｎｄｏｍ ｈｅｘａｍｅｒ ｐｒｉｍｅｄ）逆転写によりｃＤＮＡパネルが、総ＲＮＡ試料から作成される。次に、デュプリケートした４段階１０倍連続希釈ｃＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法により断片を増幅するために、遺伝子特異的プライマーを用いた。
【０１７０】
０、１、１０、１００および１０００の相対発現レベルを、遺伝子発現の評価に用いた。最も希釈された試料における陽性反応は、最も高い相対発現値を示す。これは、試料反応を２〜４％のアガロースゲル上で分析することにより決定する。用いた組織試料は、１２個の正常試料、１２個の癌試料および６組の組織特異的癌および対応試料を含む。この方法により評価されたリードは、後に番号が続くｓｑｍａｍと命名した（例えば：ｓｑｍａｍ０２２）。
【０１７１】
【表１】
2004501613.tif 000002
【０１７２】
配列番号１、クローンＩＤ：Ｍａｍｃ０００００３８５（Ｍａｍ０２１）
以下のプライマーを用い、リアルタイム定量ＰＣＲを行なった。
Ｍａｍ０２１フォワード：
５’ＣＣＡＴＣＧＴＣＴＴＣＣＴＴＴＡＴＣＣＡＡＣＴ　３’（配列番号２１）
Ｍａｍ０２１リバース：
５’ＴＧＧＧＴＧＡＴＴＴＣＡＧＡＧＡＡＣＴＧＣＴ　３’（配列番号２２）
Ｑ−ＰＣＲプローブ
５’ＴＣＡＡＴＴＡＴＡＧＧＣＡＡＡＧＧＡＡＣＴＣＡＣＡＧＡＡＧＡＡＡＡＣ　３’（配列番号２３）
【０１７３】
表１は、２５種の異なる組織からの３６個の正常試料におけるｍａｍ０２１の相対発現レベルである、無名数を示す。全ての数値は、正常精巣（キャリブレータ）と比較されている。これらのＲＮＡ試料は、異なる個体からの特定の組織の試料をプールすることにより作成された、商業的に入手可能なプールである。ただし、血液試料は、単一の個体からの正常試料である。
【０１７４】
【表２】
2004501613.tif 000003
【０１７５】
【表３】
2004501613.tif 000004
【０１７６】
表１の発現の相対レベルは、ｍａｍ０２１ｍＲＮＡの発現が、少数の分析された正常組織のプールで検出されたことを示す。
表１の無名数は、血液試料を除き、異なる個体からの特定の組織の試料のプールを分析することにより得た。これらは、表２の単一の個体からの組織試料から得たＲＮＡに由来する無名数と比較することができない。
【０１７７】
表２は、７８組の対応試料におけるｍａｍ０２１の相対発現レベルである無名数を示す。全ての数値は、正常精巣（キャリブレータ−）と比較されている。対応ペアは、特定組織の癌試料からのｍＲＮＡ、および同一個体の同一組織の正常隣接試料からのｍＲＮＡで形成される。さらに、１個の非対応癌試料（卵巣由来）および１個の非対応正常試料（卵巣由来）もまた試験した。
【０１７８】
【表４】
2004501613.tif 000005
【０１７９】
【表５】
2004501613.tif 000006
【０１８０】
【表６】
2004501613.tif 000007
【０１８１】
表２は、１７種の異なる組織における１５８個の試料を表している。表１および表２は、合わせて２７種のヒト組織における１９４個の試料を表している。
同一個体からの乳癌試料および正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現レベルの比較は、表２に示してある。Ｍａｍ０２１は正常隣接組織に比べ、３１個の癌試料中２１個で（６８％）高レベルに発現されていた（乳腺１、３〜５、９〜１１、１３〜１５、１７〜２１、２３、２６、２８〜３１）。特に、Ｍａｍ０２１は、６個の小葉癌のうち５個（８３％）で過剰発現を示した（乳腺２６、２８〜３１）。
染色体位置：ヒトゲノムデータベースに対するＢＬＡＳＴの結果は、ｍａｍ０２１の配列（配列番号１）が、第１６染色体の配列と９５〜１００％の同一性を有することを示した。
【０１８２】
配列番号４、クローンＩＤ：Ｍａｍ６００３６９４３４Ｆ１（ｍａｍ０１９）
以下のプライマーを用い、リアルタイム定量ＰＣＲを行なった。
Ｍａｍ０１９フォワード：
５’ＧＴＧＧＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＴＣＣＣＴＣＡＧ３’（配列番号２４）
Ｍａｍ０１９リバース：
５’ＣＧＣＡＧＡＧＡＧＡＣＡＡＣＣＣＡＡＧＡ３’（配列番号２５）
Ｑ−ＰＣＲプローブ
５’ＡＣＣＴＧＣＴＧＴＴＧＣＴＣＣＴＧＧＣＴＡＧＴＣＴＴＧ３’（配列番号２６）
【０１８３】
表３は、２５種の異なる組織からの３６個の正常試料におけるｍａｍ０１９の相対発現レベルである無名数を示す。全ての数値は、正常子宮（キャリブレータ）と比較されている。これらのＲＮＡ試料は、異なる個体からの特定の組織の試料をプールすることにより作成した、商業的に入手可能なプールである。ただし、血液試料は、単一の個体からの正常試料である。
【０１８４】
【表７】
2004501613.tif 000008
【０１８５】
表３の発現の相対レベルは、ｍａｍ０１９ｍＲＮＡの発現が、分析されたほとんどの正常組織のプールで検出されたことを示しており、肺および乳腺が最も高く発現した。単一の個体からの血液試料は、１．５９〜１１．５９の範囲の発現レベルを示した。
表３の無名数は、血液試料を除き、異なる個体からの特定の組織の試料のプールを分析することにより得た。これらは、表４の単一の個体からの組織試料から得たＲＮＡに由来する無名数と比較することができない。
【０１８６】
表４は、７８組の対応試料におけるｍａｍ０１９の相対発現レベルである無名数を示す。全ての数値は、正常子宮（キャリブレータ−）と比較されている。対応ペアは、特定組織の癌試料からのｍＲＮＡ、および同一個体の同一組織の正常隣接試料からのｍＲＮＡで形成される。さらに、１個の非対応癌試料（卵巣由来）および１個の非対応正常試料（卵巣由来）もまた試験した。
【０１８７】
【表８】
2004501613.tif 000009
【０１８８】
【表９】
2004501613.tif 000010
【０１８９】
【表１０】
2004501613.tif 000011
【０１９０】
表４は、１７種の異なる組織における１５８個の試料を表している。表３および表４は、合わせて２６種のヒト組織における１９４個の試料を表している。
同一個体からの乳癌試料および正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現レベルの比較は、表４に示してある。Ｍａｍ０１９は正常隣接組織に比べ、３１個の癌試料中１１個で（３５％）高レベルに発現されていた（乳腺１、４、６、１０、１３、１８、１９、２５、２９〜３１）。小葉癌のみを考慮に入れた場合、５０％の組織が、正常隣接組織に比べ癌組織において過剰発現を示した（乳腺２９〜３１）。
染色体位置：ヒトゲノムデータベースに対するＢＬＡＳＴの結果は、ｍａｍ０１９について以下に挙げた配列（配列番号４）が、第１０染色体の配列と９５〜１００％の同一性を有することを示した。
【０１９１】
配列番号１７、クローンＩＤ：Ｍａｍ６００３５６２６５Ｆ１（ｍａｍ０１８）
以下のプライマーを用い、リアルタイム定量ＰＣＲを行なった。
Ｍａｍ０１８フォワード：
５’ＴＣＣＡＴＣＴＣＣＡＣＧＡＧＧＴＴＧＴＧ　３’（配列番号２７）
Ｍａｍ０１８リバース：
５’ＧＣＣＴＴＧＣＣＴＧＴＣＴＣＡＣＣＡＴ　３’（配列番号２８）
Ｑ−ＰＣＲプローブ
５’ＴＧＴＣＴＡＡＣＴＧＡＴＧＧＣＴＣＴＣＡＴＧＣＴＧＴＡＧＴＧ　３’（配列番号２９）
【０１９２】
表５は、２５種の異なる組織からの３６個の正常試料におけるｍａｍ０１８の相対発現レベルである無名数を示す。全ての数値は、正常筋肉（キャリブレータ）と比較されている。これらのＲＮＡ試料は、異なる個体からの特定の組織の試料をプールすることにより作成した、商業的に入手可能なプールである。ただし、血液試料は、単一の個体からの正常試料である。
【０１９３】
【表１１】
2004501613.tif 000012
【０１９４】
表５の発現の相対レベルは、ｍａｍ０１８ｍＲＮＡの発現が、少数の分析された正常組織のプールで検出されたことを示している。
表５の無名数は、血液試料を除き、異なる個体からの特定の組織の試料のプールを分析することにより得た。これらは、表６の単一の個体からの組織試料から得たＲＮＡに由来する無名数と比較することができない。
【０１９５】
表６は、７３組の対応試料におけるｍａｍ０１８の相対発現レベルである無名数を示す。全ての数値は、正常筋肉（キャリブレータ−）と比較されている。対応ペアは、特定組織の癌試料からのｍＲＮＡ、および同一個体の同一組織の正常隣接試料からのｍＲＮＡで形成される。さらに、１個の非対応癌試料（卵巣由来）および１個の非対応正常試料（卵巣由来）もまた試験した。
【０１９６】
【表１２】
2004501613.tif 000013
【０１９７】
【表１３】
2004501613.tif 000014
【０１９８】
【表１４】
2004501613.tif 000015
【０１９９】
表６は、１７種の異なる組織における１４８個の試料を表している。表５および表６は、合わせて２７種のヒト組織における１８４個の試料を表している。
同一個体からの乳癌試料および正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現レベルの比較は、表６に示してある。Ｍａｍ０１８は正常隣接組織に比べ、３１個の癌試料中１３個で（４２％）高レベルに発現されていた（乳腺３、４、６、８〜１０、１２、１５〜１８、および３０）。
染色体位置：ヒトゲノムデータベースに対するＢＬＡＳＴの結果は、ｍａｍ０１８について以下に挙げた配列（配列番号１７）が、第２染色体の配列と９５〜１００％の同一性を有することを示した。
【０２００】
配列番号１８、クローンＩＤ：Ｍａｍ６００３７０５６８Ｆ１（ｍａｍ０２８）
以下のプライマーを用い、リアルタイム定量ＰＣＲを行なった。
Ｍａｍ０２８フォワード：
５’ＡＧＡＧＧＣＴＡＡＡＡＧＣＡＡＣＴＴＧＴＣＣ　３’（配列番号３０）
Ｍａｍ０２８リバース：
５’ＧＧＡＡＡＡＡＣＴＣＴＣＡＧＣＡＡＡＣＣＴＴ　３’（配列番号３１）
Ｑ−ＰＣＲプローブ
５’ＡＧＣＣＧＴＡＡＡＣＴＴＴＣＴＣＡＴＡＣＡＣＴＴＴＧＴＣＣＡ　３’（配列番号３２）
【０２０１】
表７は、２４種の異なる組織からの２４個の正常試料におけるｍａｍ０２８の相対発現レベルである無名数を示す。全ての数値は、正常脾臓（キャリブレータ）と比較されている。これらのＲＮＡ試料は、異なる個体からの特定の組織の試料をプールすることにより作成した、商業的に入手可能なプールである。
【０２０２】
【表１５】
2004501613.tif 000016
【０２０３】
表７の発現の相対レベルは、ｍａｍ０２８ｍＲＮＡの発現が、少数の分析された正常組織のプールで検出されたことを示している。
表７の無名数は、血液試料を除き、異なる個体からの特定の組織の試料のプールを分析することにより得た。これらは、表８の単一の個体からの組織試料から得たＲＮＡに由来する無名数と比較することができない。
【０２０４】
表８は、４９組の対応試料におけるｍａｍ０２８の相対発現レベルである無名数を示す。全ての数値は、正常脾臓（キャリブレータ−）と比較されている。対応ペアは、特定組織の癌試料からのｍＲＮＡ、および同一の個体の同一の組織の正常隣接試料からのｍＲＮＡで形成される。さらに、１個の非対応癌試料（卵巣由来）および１個の非対応正常試料（卵巣由来）もまた試験した。
【０２０５】
【表１６】
2004501613.tif 000017
【０２０６】
【表１７】
2004501613.tif 000018
【０２０７】
表８は、１５種の異なる組織における１００個の試料を表している。表７および表８は、合わせて２５種のヒト組織における１２４個の試料を表している。
同一個体からの乳癌試料および正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現レベルの比較は、表８に示してある。Ｍａｍ０１９は正常隣接組織に比べ、２１個の癌試料中１３個で（６２％）高レベルに発現されていた（乳腺３、４、６、８〜１２、１５、１８〜２１）。小葉癌のみを考慮に入れた場合、８０％の試料が、正常隣接組織に比べ癌組織において過剰発現を示した（乳腺１８〜２１）。
染色体位置：ヒトゲノムデータベースに対するＢＬＡＳＴの結果は、ｍａｍ０２８について以下に挙げた配列（配列番号１８）が、第６および第１５染色体の配列と９５〜１００％の同一性を有することを示した。
【０２０８】
配列番号１１、クローンＩＤ：Ｍａｍ６００３７２１９２Ｆ１（ｓｑｍａｍ０２２）
以下のプライマーを用い、半定量ＰＣＲを行なった。
ｓｑｍａｍ０２２フォワード：
５’ＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＣＴＡＡＴＡＴＣＣ　３’（配列番号３３）
ｓｑｍａｍ０２２リバース：
５’ＧＣＴＴＧＴＧＴＧＡＧＡＧＴＧＴＧＣＣＴＡＡＴ　３’（配列番号３４）
【０２０９】
表９は、１２種の異なる組織からの１２個の正常試料におけるｓｑｍａｍ０２２の相対発現レベルである無名数を示す。これらのＲＮＡ試料は、異なる個体からの特定の組織の試料をプールすることにより作成した、商業的に入手可能なプールである。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を用いて、デュプリケートした４段階１０倍連続希釈ｃＤＮＡから発現レベルを分析した。遺伝子発現を評価するために、０、１、１０、１００および１０００の相対発現レベルを用いた。最も希釈された試料における陽性反応が、最も高い相対発現値を示す。
【０２１０】
【表１８】
2004501613.tif 000019
【０２１１】
表９の発現の相対レベルは、正常精巣が最も高いｓｑｍａｍ０２２の発現を示し、次いで乳房、大腸および前立腺が続くことを示している。
表１０は、１２種の異なる組織からの１２個の癌試料におけるｓｑｍａｍ０２２の発現の相対レベルである無名数を示す。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を用いて、デュプリケートした４段階１０倍連続希釈ｃＤＮＡから発現レベルを分析した。遺伝子発現を評価するために、０、１、１０、１００および１０００の相対発現レベルを用いた。最も希釈された試料における陽性反応が、最も高い相対発現値を示す。
【０２１２】
【表１９】
2004501613.tif 000020
【０２１３】
表１０の発現の相対レベルは、ｓｑｍａｍ０２２が、乳癌、肝癌および精巣癌で発現していることを示す。
表１１は、６個の乳腺癌対応試料におけるｓｑｍａｍ０２２の発現の相対レベルである無名数を示す。対応ペアは、特定組織の癌試料からのｍＲＮＡ、および同一個体の同一組織の正常隣接試料からのｍＲＮＡで形成される。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を用いて、デュプリケートした４段階１０倍連続希釈ｃＤＮＡから発現レベルを分析した。遺伝子発現を評価するために、０、１、１０、１００および１０００の相対発現レベルを用いた。最も希釈された試料における陽性反応が、最も高い相対発現値を示す。
【０２１４】
【表２０】
2004501613.tif 000021
【０２１５】
表１１の発現の相対レベルは、ｓｑｍａｍ０２２が、６個の乳腺癌試料のうち４個で発現されており、対応正常隣接組織（ＮＡＴ）には発現していないことを示している。このアッセイは、ｓｑｍａｍ０２２が、分析した対応試料の６７％で上方調節されていることを示している。
染色体位置：ヒトゲノムデータベースに対するＢＬＡＳＴの結果は、ｓｑｍａｍ０２２について以下に挙げた配列（配列番号１１）が、第１１染色体の配列と９５〜１００％の同一性を有することを示した。
【０２１６】
配列番号１５、クローンＩＤ：Ｍａｍ６００３７０７２７Ｆ１（ｓｑｍａｍ０２３）
以下のプライマーを用い、半定量ＰＣＲを行なった。
ｓｑｍａｍ０２３フォワード：
５’ＴＴＣＣＡＡＴＴＡＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＴＧＣＴＣ　３’（配列番号３５）
ｓｑｍａｍ０２３リバース：
５’ＡＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＡＴＧＴＣＴＡＧＴＧ　３’（配列番号３６）
【０２１７】
表１２は、１２種の異なる組織からの１２個の正常試料におけるｓｑｍａｍ０２３の相対発現レベルである無名数を示す。これらのＲＮＡ試料は、異なる個体からの特定の組織の試料をプールすることにより作成した、商業的に入手可能なプールである。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を用いて、デュプリケートした４段階１０倍連続希釈ｃＤＮＡから発現レベルを分析した。遺伝子発現を評価するために、０、１、１０、１００および１０００の相対発現レベルを用いた。最も希釈された試料における陽性反応が、最も高い相対発現値を示す。
【０２１８】
【表２１】
2004501613.tif 000022
【０２１９】
表１２の発現の相対レベルは、正常乳房が最も高いｓｑｍａｍ０２２の発現を示し、次いで肝臓、前立腺および子宮が続くことを示している。
表１３は、１２種の異なる組織からの１２個の癌試料におけるｓｑｍａｍ０２３の発現の相対レベルである無名数を示す。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を用いて、デュプリケートした４段階１０倍連続希釈ｃＤＮＡから発現レベルを分析した。遺伝子発現を評価するために、０、１、１０、１００および１０００の相対発現レベルを用いた。最も希釈された試料における陽性反応が、最も高い相対発現値を示す。
【０２２０】
【表２２】
2004501613.tif 000023
【０２２１】
表１３の発現の相対レベルは、ｓｑｍａｍ０２３が、乳癌、次いで肝癌で高く発現していることを示す。
表１４は、６の乳腺癌対応試料におけるｓｑｍａｍ０２３の発現の相対レベルである無名数を示す。対応ペアは、特定組織の癌試料からのｍＲＮＡ、および同一の個体の同一の組織の正常隣接試料からのｍＲＮＡで形成される。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を用いて、デュプリケートした４段階１０倍連続希釈ｃＤＮＡから発現レベルを分析した。遺伝子発現を評価するために、０、１、１０、１００および１０００の相対発現レベルを用いた。最も希釈された試料における陽性反応が、最も高い相対発現値を示す。
【０２２２】
【表２３】
2004501613.tif 000024
【０２２３】
表１４の発現の相対レベルは、ｓｑｍａｍ０２３が、６個の乳腺癌試料のうち３個で過剰発現されており、対応正常隣接組織（ＮＡＴ）には発現していないか、または、低く発現していることを示している。このアッセイは、ｓｑｍａｍ０２２が、分析した対応試料の５０％で上方調節されていることを示している。
染色体位置：ヒトゲノムデータベースに対するＢＬＡＳＴの結果は、ｓｑｍａｍ０２３について以下に挙げた配列（配列番号１５）が、第１０染色体の配列と９５〜１００％の同一性を、そして、同じ染色体の別の配列と８５〜９０％の同一性を有することを示した。
【国際公開パンフレット】
2004501613.tif 000025
2004501613.tif 000026
2004501613.tif 000027
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2004501613.tif 000123
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004501613.tif 000124
【国際調査報告】
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