(57)【要約】Ｔｈ１に偏向した（Ｔｈ１−ｂｉａｓｅｄ）齧歯類におけるモノクローナル抗体の作成方法が開示される。モノクローナル抗体は治療剤、診断薬剤または研究試薬として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）Ｔｈ２アゴニストと組み合わせてＴｈ１アンタゴニストを齧歯類に投与すること；ｂ）抗原をコードしている核酸により齧歯類を免疫化すること；および
ｃ）抗原特異的モノクローナル抗体を単離すること、
の段階を含む、Ｔｈ１に偏向した齧歯類においてモノクローナル抗体を作成する方法。
【請求項２】
ａ）Ｔｈ２アゴニストと組み合わせてＴｈ１アンタゴニストを齧歯類に投与すること；ｂ）抗原をコードしている核酸により齧歯類を免疫化すること；
ｃ）外来のアジュバントなしに抗原を投与すること；および
ｄ）抗原特異的モノクローナル抗体を単離すること、
の段階を含む、Ｔｈ１に偏向した齧歯類においてモノクローナル抗体を作成する方法。
【請求項３】
齧歯類がマウスである、請求項１または２の方法。
【請求項４】
マウスがＣ５７ＢＬ／６マウスである、請求項３の方法。
【請求項５】
齧歯類がラットである、請求項１または２の方法。
【請求項６】
Ｔｈ１アンタゴニストが核酸またはタンパク質である、請求項１または２の方法。
【請求項７】
Ｔｈ１アンタゴニストが、Ｔｈ１の発生を妨げるモノクローナル抗体である、請求項６の方法。
【請求項８】
Ｔｈ１アンタゴニストが抗ＩＬ−１２、抗ＩＦＮ−γもしくは抗ＩＬ−１８抗体である、請求項７の方法。
【請求項９】
Ｔｈ２アゴニストがその半減期を延ばすように改変される、請求項１または２の方法。
【請求項１０】
Ｔｈ２アゴニストがｐｅｇ化した（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）ＩＬ−４、ｐｅｇ化したＩＬ−５もしくはｐｅｇ化したＩＬ−６である、請求項９の方法。
【請求項１１】
抗原をコードしている核酸が皮内に投与される、請求項１または２の方法。
【請求項１２】
モノクローナル抗体がヒトである、請求項１または２の方法。
【請求項１３】
抗原が皮内に投与される、請求項２の方法。
【請求項１４】
ａ）抗ＩＬ−１２モノクローナル抗体と組み合わせてｐｅｇ化したＩＬ−４をマウスに投与すること；
ｂ）抗原をコードしている核酸を皮内に投与することによってマウスを免疫化すること；ｃ）外来のアジュバントなしに皮内に抗原を投与すること；および
ｄ）抗原特異的モノクローナル抗体を単離すること、
の段階を含む、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてヒト・モノクローナル抗体を作成する方法。
【請求項１５】
ａ）抗ＩＬ−１２モノクローナル抗体と組み合わせてｐｅｇ化したＩＬ−４をマウスに投与すること；
ｂ）抗原をコードしている核酸を皮内に投与することによってマウスを免疫化すること；および
ｃ）抗原特異的モノクローナル抗体を単離すること、
の段階を含む、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてヒト・モノクローナル抗体を作成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＴｈ１に偏向した（Ｔｈ１−ｂｉａｓｅｄ）齧歯類におけるモノクローナル抗体の作成に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は種々のヒト疾病の処置のための実体として証明されている。その上、ｍＡｂは種々の疾病の免疫病原論において良好な理解を得るために強力な道具を演じることができる。ｍＡｂの作成の標準的方法は、免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスから採取したリンパ節細胞もしくは脾細胞と骨髄腫細胞とを融合させることからなる（非特許文献１；非特許文献２）。ＢＡＬＢ／ｃマウスは容易に利用することができ、そして外来のＴ依存性抗原により感作されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける免疫応答は、Ｔｈ２様表現型に向かったそれらのＴ細胞由来のサイトカイン産生の偏りを特徴とするので、ＢＡＬＢ／ｃマウスはｍＡｂを惹起するために選ばれる宿主を代表する（非特許文献３参照）。このＴｈ２様応答は高レベルの抗原特異的ＩｇＧ１抗体の生成を伴い（非特許文献４）、これは抗原特異的Ｂ細胞クローンの頻度における増大と相関する。
【０００３】
トランスジェニックおよび遺伝子ノックアウトマウスモデルにおける進歩は、ほとんど免疫原性のないｍＡｂを作成するため、そして免疫媒介応答という生物学を研究するための新しい道筋を提供してきた。例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖についてトランスジェニックであるマウスが、治療学的用途のヒトｍＡｂを作成するために使用できる。しかしながら、トランスジェニックおよびノックアウトマウスはＢＡＬＢ／ｃバックグラウンド由来ではない。かくして、これらのマウスにおいてｍＡｂを作成するニーズが存在する。
【０００４】
トランスジェニックおよびノックアウトマウスは、一般に、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）バックグラウンドに由来する（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｃａｔａｌｏｇ，２００１）。不幸にも、Ｂ６の遺伝的バックグラウンドは、ｍＡｂ作成のための最適な免疫環境には相当しない。このことは、抗原感作したＢ６マウスにおける免疫応答がＴｈ１に偏っているという事実に基づいていて、これは、古典的なＴｈ１／Ｔｈ２ライシュマニア・マヨール（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）モデルにおいて例証されるように、強い細胞性応答と弱い体液性応答を特徴とする（非特許文献３）。したがって、Ｔｈ１に偏向したＢ６マウスから採取されるＢ細胞を使用するｍＡｂの作成は、低頻度の抗原特異的Ｂ細胞クローンによって妨げられる。かくして、Ｂ６マウスにおける免疫応答をＴｈ２様表現型の方向にゆがめる方法のニーズが存在する。そのような方法は、Ｔｈ２に偏向した宿主においてより高い頻度の抗原特異的Ｂ細胞クローンによるｍＡｂの作成という一層効率的な方法をもたらすであろう。
【非特許文献１】Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７（１９７５）
【非特許文献２】Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，５１１（１９７６）
【非特許文献３】Ｒｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｃｋｓｌｅｙ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３，１５１（１９９５）
【発明の開示】
【０００５】
本発明の１つの態様は、Ｔｈ２アゴニストと組み合わせてＴｈ１アンタゴニストを齧歯類に投与すること；抗原をコードしている核酸により齧歯類を免疫化すること；および抗原特異的モノクローナル抗体を単離することを含む、Ｔｈ１に偏向した齧歯類においてモノクローナル抗体を作成する方法である。
【０００６】
本発明のその他の態様は、Ｔｈ２アゴニストと組み合わせてＴｈ１アンタゴニストを齧歯類に投与すること；抗原をコードしている核酸により齧歯類を免疫化すること；外来のアジュバントなしに抗原を投与すること；および抗原特異的モノクローナル抗体を単離することの段階を含む、Ｔｈ１に偏向した齧歯類においてモノクローナル抗体を作成する方法である。
【０００７】
本発明のなおその他の態様は、抗ＩＬ−１２モノクローナル抗体と組み合わせてｐｅｇ化した（ｐｅｇｌｙａｔｅｄ）ＩＬ−４をマウスに投与すること；抗原をコードしている核酸を皮内に投与することによってマウスを免疫化すること；外来のアジュバントなしに皮内に抗原を投与すること；および抗原特異的モノクローナル抗体を単離することの段階を含む、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてヒトモノクローナル抗体を作成する方法である。［発明の詳細な記述］
限定されるものではないが本明細書に引用される特許および特許出願を含むすべての公表物は、完全な記述として引用によって本明細書に組み入れられている。
【０００８】
本明細書および特許請求範囲で使用される用語「組み合わせて（ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ）」は、本明細書に記述されるＴｈ１アンタゴニストおよびＴｈ２アゴニストが、混合物において一緒に、単一薬剤として同時に、またはいかなる順序でも単一薬剤として連続して、齧歯類に投与することができることを意味する。
【０００９】
本発明はＴｈ１に偏向した齧歯類においてｍＡｂを作成する方法を提供する。免疫化前にＴｈ１に偏向した齧歯類に対してＴｈ２アゴニストと組み合わせてＴｈ１アンタゴニストを投与することは、Ｂ細胞の増殖および分化を最適化するＴｈ２様表現型を誘引する。本発明の方法は、Ｔｈ１に偏向した齧歯類、例えばラットおよびマウスにおける抗原特異的ＩｇＧ１ｍＡｂの作成において有用である。本発明の方法によって作成されたｍＡｂは、治療剤、診断薬剤もしくは研究試薬として有用である。
【００１０】
トランスジェニックもしくは遺伝子ノックアウトマウスは本発明の方法において使用することができる。例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックなマウス、例えばＨｕＭａｂ−ｍｏｕｓｅ（Ｒ）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）またはＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｒ）（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）は、ヒト抗体を作成するために使用できる。遺伝子ノックアウトマウスは、標的タンパク質の免疫寛容を回避することによってマウスタンパク質に対してオートロガスなｍＡｂを効率的に作成するために使用できる。特に、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドを有するマウスが使用されてもよい。
【００１１】
Ｔｈ１の発生を妨げる薬剤は本発明のＴｈ１アンタゴニストとして有用である。Ｔｈ１アンタゴニストは、限定されるものではないが、すべての抗体、フラグメントもしくは疑似物、すべての可溶性レセプター、フラグメントもしくは疑似物、すべての低分子アンタゴニスト、またはすべてのそれらの組み合わせ物を含む。特に、抗ＩＬ−１２、抗ＩＦＮ−γもしくは抗ＩＬ−１８はＴｈ１アンタゴニストとして使用することができる。当業者は投与すべきＴｈ１アンタゴニストの量を容易に決定できる。例えば、腹腔内に注射されるマウス１匹当たり抗ＩＬ−１２約０．５ｍｇ〜約１ｍｇがＴｈ１発生を阻止するために使用できる。
【００１２】
Ｔｈ２型応答を促進する薬剤は本発明のＴｈ２アゴニストとして有用である。これらの薬剤は核酸もしくはタンパク質であってもよい。特に、半減期を増加するよう改変されたＩＬ−４、ＩＬ−５もしくはＩＬ−６が使用できる。ｐｅｇ化したＩＬ−４、ＩＬ−５もしくはＩＬ−６は本発明の方法において特に有用である。参照、Ｐｅｐｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９７，１０５９（２００１）およびＭｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４，５７０４（２０００）。当業者は投与すべきＴｈ２アゴニストの量を容易に決定できる。例えば、腹腔内に注射されるマウス１匹当たりｐｅｇ化したＩＬ−４約５μｇがＴｈ２免疫応答を推進するために使用できる。
【００１３】
Ｔｈ２アゴニストと組み合わせてのＴｈ１アンタゴニストの投与時期は、好ましくは、免疫化前、例えば免疫化前日（−１日目）である。
【００１４】
Ｔｈ２アゴニストと組み合わせてＴｈ１アンタゴニストの投与後、齧歯類は抗原をコードしている核酸により免疫化される。関心のある抗原をコードするＤＮＡによる齧歯類の免疫化は、ネイティブタンパク質標的を認識する高タイターの抗原に特異的なＩｇＧ抗体を生成する非常に有効な方法である。参照、Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆａｓｅｂ  Ｊ．１２，１６１１（１９９８）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．４，５４９（１９９９）およびＤｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９５，４３（１９９８）。アジュバント分子の有無によらず抗原をコードしている核酸を含有するのに有用な代表的プラスミドベクターは、強力なプロモーター、例えばＨＣＭＶ即時型エンハンサー／プロモーターもしくはＭＨＣクラスＩプロモーター、転写物のプロセッシングを増進するイントロン、例えばＨＣＭＶ即時型遺伝子イントロンＡ、およびポリアデニル化（ポリＡ）シグナル、例えば後期ＳＶ４０ポリＡシグナルを含む。プラスミドは、両抗原およびアジュバント分子の発現を可能にするようマルチシストロン性であってもよく、あるいは抗原とアジュバントを別々にコードする複数のプラスミドが使用されてもよい。代表的なアジュバントはＩＬ−４であり、その他はＩＬ−６、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＣＤ４０を含む。
【００１５】
強力なＢ細胞の活性化および分化を誘導するための抗原をコードしている核酸を投与することが望ましい。樹状細胞はＤＮＡワクチン注射後に免疫応答を開始する主要な細胞である（Ｃａｓａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６，１４８１（１９９７）、Ａｋｂａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９，１６９（１９９９）およびＹｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１，３７０４（２００１））ので、皮膚ランゲルハンス細胞が有効なＴおよびＢ細胞初回感作のための有用な標的である。したがって、抗原をコードしている核酸は、皮内に、特に、弱い免疫原とともに投与することができる。代表的な免疫化スケジュールは、０日および１４日目における抗原をコードしている核酸約１０μｇの皮内投与である。１０μｇの抗原をコードしている核酸による２８日および４２日目における皮内の追加的免疫化が投与されてもよい。
【００１６】
齧歯類の免疫化後、不死化したＢ細胞のクローン集団が熟練技術者には既知の技術によって調製される。抗原特異的ｍＡｂは、ペプチドディスプレイライブラリーまたは他の当業者には既知の技術を使用することによって関心のある抗原に対する結合および／または生物学的活性についてのスクリーニングによって同定できる。
【００１７】
本発明のその他の実施態様では、齧歯類はＴｈ２アゴニストと組み合わせてＴｈ１アンタゴニストを投与され、抗原をコードしている核酸により免疫化され、次いで、ブースターとして外来アジュバントなしの抗原を投与される。この方法は、別の弱い免疫原に対して高タイターの抗原特異的ＩｇＧを作成するのに有用である。外来アジュバントは本発明の方法においてポリクローナル抗体応答を誘導するためには必要ではない。本発明のこの実施態様のための代表的免疫化スケジュールは、０日および１４日目における１０μｇの抗原をコードしている核酸の皮内注射と、それに続く約１０μｇ〜約５０μｇの精製抗原タンパク質による２８日および４２日目における皮下の追加的免疫化である。したがって、本発明の方法は、外来アジュバントの存在下で破壊されるかもしれないこれらのＢ細胞エピトープに対するｍＡｂの作成のために特に有用である。
【００１８】
本発明は次に示す特定の、非限定的な実施例に関してここに記述される。
【実施例１】
【００１９】
Ｂ６マウスにおける抗ＭＣＰ−１ｍＡｂの作成
抗体は、表１に示すように、弱い免疫原ＭＣＰ−１（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２４４，４８７（１９８９））に対して一連の種々のＢ６マウス処置群において作成された。使用した免疫化スケジュールは図１に示される。一般に、８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスが、Ｔｈ２様応答を推進するために最初のＤＮＡ注射前１日目に、５μｇのｐｅｇ化したマウスＩＬ−４（ｐｅｇＩＬ−４）および１ｍｇの中和抗マウスＩＬ−１２抗体Ｃ１７．８（Ｗｙｓｏｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５，６７２（１９９５））により処置された。０日および１４日目に、ＨＣＭＶ即時型エンハンサー／プロモーター、ＨＣＭＶ即時型遺伝子イントロンＡおよび後期ＳＶ４０ポリＡシグナルを有するＭＣＰ−１をコードするＭＣＰ−１プラスミドＤＮＡ  １０μｇがマウスに投与された。マウスは２８日および９１日目に、いかなる外来アジュバントも含まない１５μｇのＭＣＰ−１タンパク質により追加免疫された。タンパク質の追加免疫後、種々の時点において血清が回収され、そしてＭＣＰ−１−およびβ−ガラクトシダーゼ−特異的ＩｇＧ抗体のレベルが標準ＥＬＩＳＡによって決定された。
【００２０】
ｐｅｇ化したＩＬ−４は次のように調製された。マウスＩＬ−４（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ）１ｍｇがＰＢＳ  １ｍｌ中に溶解され、そしてｍＰＥＧ（２０Ｋ）−ＳＰＡ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）１０ｍｇがＩＬ−４溶液７００μｌに添加された。反応は室温で３時間インキュベートされ、そして水中Ｔｒｉｓ１０ｍｇ／ｍｌの２４μｌで停止された。Ｔｒｉｓの添加後、反応混合液は、２４ｍｌのカラム容積をもつＳｕｐｅｒｏｓｅ−１２ゲル濾過カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上にローディングされた。カラムは０．５ｍｌ／ｍｉｎにおいてＰＢＳを用いて溶出され、そして１ｍｌのフラクションが回収された。フラクション２６−３１がプールされて、ｐｅｇ化したＩＬ−４  ４５０μｇが得られた。
【００２１】
【表１】
2006515154.tif 000002
【００２２】
結果は、筋肉内経路を用いてＤＮＡにより感作されたマウスが、試験した全時点において１／１００の抗原特異的平均ＩｇＧタイターを生成したことを示している。図２は、水平バーが抗原特異的ＩｇＧ抗体の平均値を表す処置群１からのデータを示す。類似の結果が処置群３，４および５におけるマウスにより得られた。
【００２３】
処置群２では、皮内経路を用いてプラスミドＤＮＡにより感作されたマウスの５０％（２／４）が、また抗原特異的ＩｇＧ抗体を生成した（図３）。皮内経路は、より高いレベルの抗体をもたらした。第２のタンパク質ブースト後の抗原特異的抗体レベルの急速な誘導によって例証されるように、このアプローチが強力なＢ細胞記憶応答の惹起をもたらしたことがまた観察された。
【００２４】
また結果は、ｐｅｇＩＬ−４および抗ＩＬ−１２により処置された群において生成されたｍＡｂのすべてがＩｇＧ１アイソタイプを有することを示した。
【００２５】
本発明はここに完全に記述されたが、それに対して多くの変更および改変が、付随する請求項の精神または範囲から逸脱することなく作成できることは、当業者にとっては明白である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス免疫スケジュールを示す。
【図２】図２は、プラスミドＤＮＡにより筋肉内に感作されたＢ６マウスにおけるＭＣＰ−１特異的終点タイター（日）のグラフである。
【図３】図３は、プラスミドＤＮＡにより皮内に感作されたＢ６マウスにおけるＭＣＰ−１特異的終点タイター（日）のグラフである。
【図１】
2006515154.tif 000003
【図２】
2006515154.tif 000004
【図３】
2006515154.tif 000005
【国際調査報告】
2006515154.tif 000006
2006515154.tif 000007