(57)【要約】本発明は、大量の食品中に混入する微生物の高速かつ特異的な同定を達成する具体的方法に関する。ランダムゲノム断片またはZipcodeオリゴヌクレオチドおよびDNAマイクロアレイ技術に基づいて、全ゲノムDNA-DNAハイブリダイゼーションの欠点を克服する方法を開発した。具体的には本発明は、サンプル中に存在する可能性がある微生物を特徴付けするための方法であって、存在すれば該微生物を収集する段階、該微生物から核酸を抽出する段階、該核酸を特異的に増幅し、これにより増幅型の標的核酸を含む増幅核酸混合物を提供する段階、および増幅核酸混合物を解析し、これにより存在すれば該微生物を特徴付けする段階を含む方法を提供する。さらに本発明は、当該方法におけるフィルター、マイクロアレイおよび増幅段階の使用ならびにこれらを含むキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の微生物の存在を判定するための方法であって、以下の段階を含む方法：
（a）存在すれば該微生物を捕獲する段階、
（b）該微生物から核酸を抽出する段階、該核酸は標的核酸を含む、
（c）以下の段階を含む、該標的核酸に対するリガーゼ検出反応（LDR）を実施する段階：
（c1）第一核酸プローブおよび第二核酸プローブペアを提供する段階、該第一核酸プローブは該標的核酸の特徴的部分に相補的な、3'に位置する標的特異的配列Iを含み、ならびに該第二核酸プローブは、該標的特異的配列Iに本質的に隣接し、かつその3'側に位置する、該標的核酸の第二部分に相補的な、5'に位置する標的特異的配列IIを含み、この場合、該第一核酸プローブは、5'に位置するプライマー結合セクションI（PBS（I））および場合によりスタッファーをさらに含み、ならびに該第二核酸プローブは、3'に位置するプライマー結合セクションII（PBS（II））および場合によりスタッファーを含み；ならびにこの場合、第一核酸プローブまたは第二核酸プローブは、（I）マイクロアレイ上の捕獲プローブの対応する領域に本質的に相補的で、かつ（II）該標的核酸に本質的に非相補的で、かつ（iii）標的特異的配列およびプライマー結合セクションの中間に位置する領域（ZipComcode）をさらに含む；
（c2）相補的核酸のハイブリダイゼーションを許容する条件下で該標的核酸を該第一核酸プローブおよび該第二核酸プローブとインキュベートする段階、
（c3）任意の本質的に隣接するプローブを連結する段階、
（c4）少なくとも1セットの2つのプライマーを提供する段階、この場合、第一プライマー（プライマーI）はプライマー結合セクションIに本質的に同一であり、ならびに第二プライマー（プライマーII）はプライマー結合セクションIIに本質的に相補的であり、この場合該第一または該第二プライマーを標識し、ただし：
-ZipComcodeが第一核酸プローブ上に位置する場合、プライマーIIを標識する、
-ZipComcodeが第二核酸プローブ上に位置する場合、プライマーIを標識するか、あるいは
-ZipComcodeが第一核酸プローブ上に位置する場合、プライマーIを標識する、
（c5）任意の連結されたプローブ核酸を増幅する段階、この場合、プライマー結合セクションに特異的な核酸プライマーの結合によって増幅を開始する、
これにより増幅された標的核酸を提供する、
（d）段階（c）で増幅された標的核酸を捕獲プローブにハイブリダイズさせる段階、該捕獲プローブはマイクロアレイ上に存在し、ZipComcodeに本質的に相補的な領域（Zipcode）を含む、および、
（e）段階（d）でハイブリダイズした標的核酸を検出し、これにより微生物の存在を判定する段階。
【請求項２】
前記第一核酸プローブおよび／または前記第二核酸プローブが遺伝子マーカーにハイブリダイズする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一核酸プローブの4変異体を提供し、該4変異体は、各4変異体が3'最終末端に異なるヌクレオチドを含有し、ならびに各4変異体が異なるプライマー結合部位Ｉを含有することを除き実質的に同一である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも2群の第一および第二核酸プローブペアを提供し、この場合各群の第一および第二核酸プローブは特異的標的核酸にハイブリダイズし、ならびに特異的プライマー結合部位Iおよび／またはIIを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも2群の第一および第二核酸プローブペアを提供し、この場合各群の第一および第二核酸プローブは特異的標的核酸にハイブリダイズし、ならびに各群の第一核酸プローブは特異的ZipComcodeを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記微生物が、真核性、原核性および／またはウイルス性の微生物からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記微生物が、食物媒介性および水媒介性の微生物からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記微生物が、Escherichia、Salmonella、Shigella、Mycobacterium、Lactobacillus、Lactococcus、Listeria、Leuconostoc、Bacillus、Staphylococcus、Clostridium、Vibrio、Enterococcus、Enterobacter、Yersinia、Legionella、Campylobacter、Streptococcus、Micrococcus、Pseudomonas、Flavobacterium、Alcaligenes、Microbacterium、Acinetobacter、Enterobacteriaceae/Coliforms、Aspergillus、Neurospora、Geotrichum、Blakeslea、Penicillium、Rhizomucor、Rhizopus、Trichoderma、Kluyveromyces、Candida、Hansenula、Rhodotorula、Torulopsis、TrichosporonおよびSaccharomycesからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記段階（a）に先行して、以下の段階を含む微生物の増菌を行う、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法：
（a）選択培地上での該微生物の培養、または
（b）非選択培地上での該微生物の培養。
【請求項１０】
前記段階（a）に先行して、微生物を濃縮することを含む微生物の集積を行う、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
微生物の前記捕獲段階が、以下からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法：
（a）水性溶液のろ過、これによりふるいサイズより大きいすべての粒子を捕獲する、
（b）抗体による微生物の捕獲、
（c）リガンドによる微生物の捕獲、
（d）遠心分離、
（e）沈降、
（f）静電力、
（g）凝固、および
（h）凝集。
【請求項１２】
前記ろ過が、約0.15〜1.4μmの範囲、好ましくは約0.5〜1.2μmの範囲の細孔サイズを有するフィルターの使用を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ろ過が、中空繊維セラミック膜または窒化ケイ素を含むフィルターの使用を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ろ過が、Aquamarijn（登録商標）フィルターまたはCEPAration（登録商標）フィルターの使用を含む、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記捕獲後にサンプルの残りの部分から微生物を分離する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記微生物からの核酸の抽出が該微生物を溶解することを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記溶解が、リゾチーム、ペクチン分解剤、またはグアニジンチオシアン酸塩での処理または機械的処理、例えば超音波処理またはビーズビーターの使用による処理、加熱フェノール中への該微生物の注入による処理、および液体窒素中で該微生物をスナップフリーズした後の機械的処理からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
RNA分解酵素を不活性化することをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸が、DNA、rRNA、tRNA、mRNA、トータルRNAおよびtmRNAからなる群から選択される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ZipComcodeが第一核酸プローブ上の標的特異的配列Iおよびプライマー結合配列Iの中間に位置する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第一核酸プローブの5'末端を、場合によりスタッファー領域を介して、前記第二核酸プローブの3'末端に共役させる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記連結段階（c3）がリガーゼの使用を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記rRNA、tRNA、mRNA、トータルRNA、またはtmRNAをcDNAに変換する、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
PCRおよびLCR、からなる群から選択される増幅技術を使用して前記核酸または前記cDNAを増幅する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
増幅標的核酸を標識する、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
増幅標的核酸を増幅中に標識する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記増幅が多重増幅である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記第一プライマーの5'末端を標識する、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記標識が蛍光またはリン光標識である、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記蛍光またはリン光標識が、FAM、TET、JOE、NED、HEX、（ET-）ROX、FITC、Cy2、Cy3、Cy5、テキサスレッド、TAMRA、Alexa、fluor488TM、BiodipyTMFL、ローダミン123、R6G、Biodipy 530、AlexafluorTM 532およびIRDyesTMからなる群から選択される、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記捕獲プローブが、前記増幅された標的核酸に特異的にハイブリダイズする、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記捕獲プローブが、対応するZipComcodeに本質的に相補的なZipcodeを含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記Zipcodeが、対応するZipComcodeに特異的にハイブリダイズする、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記捕獲プローブが前記マイクロアレイ上で空間的にアドレス可能である、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記マイクロアレイがフロースルーマイクロアレイである、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記マイクロアレイがPamchip（登録商標）である、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
特異的に増幅された核酸を捕獲プローブにハイブリダイズさせた後にシグナルを検出する、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記シグナルが蛍光またはリン光シグナルであり、ならびに前記蛍光またはリン光シグナルをCCDカメラまたはレーザー走査、例えばFD10 system（登録商標）またはPamalyzer（登録商標）によって検出する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
少なくとも2サンプル由来の増幅された標的核酸を、単一マイクロアレイ上に存在する捕獲プローブにハイブリダイズさせる、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
マイクロアレイ上の対応する捕獲プローブにハイブリダイズした増幅標的核酸がハイブリダイゼーションパターンを生じさせる、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ハイブリダイゼーションパターンを、データバンクに保存されているハイブリダイゼーションパターンと比較する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
コンピュータ可読媒体に保存された、サンプル中の微生物の存在を判定するための演算ルーチンであって、以下の段階を含むルーチンを含むコンピュータプログラム：
-請求項１〜３９のいずれか１項に記載のいずれかの方法によって得られるハイブリダイゼーションパターンを受け取る段階、および
-該ハイブリダイゼーションパターンを、データバンクに保存されているハイブリダイゼーションパターンと比較する段階；
これにより微生物の存在を判定（同定）する。
【請求項４３】
請求項４１に記載の方法を実施可能なコンピュータ可読媒体を含むコンピュータ。
【請求項４４】
請求項４１に記載の方法を実施可能なコンピュータプログラムを含むコンピュータ可読媒体。
【請求項４５】
サンプル中の微生物の存在を判定するためのキットであって、フィルター、微生物を捕獲するための手段、該微生物から核酸を抽出するための手段、請求項１で規定されるプローブおよびプライマーを含む、該核酸を特異的に増幅するための手段、Zipcodesを有する捕獲プローブを含むマイクロアレイ、増幅された核酸を解析するための手段、および指示マニュアルを含むキット。
【請求項４６】
前記マイクロアレイがフロースルーマイクロアレイである、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法における、請求項１〜５のいずれか１項で規定される少なくとも1ペアの第一核酸プローブおよび第二核酸プローブの使用。
【請求項４８】
請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法における、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のフィルターの使用。
【請求項４９】
請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法における、請求項２８〜３０のいずれか１項で規定される少なくとも1セットの2つのプライマーの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食物サンプル中の微生物の存在を判定するための高速かつ効率的な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品、例えば乳製品、飲料およびビール醸造に関する製造者連鎖では、飲料および乳製品の安全性および品質を検証する微生物学的制御およびモニタリングが極めて重要である。同配慮が水質に関しても適用される。ゆえに、微生物の検出、同定、および特徴付けは分析的および食物の微生物学ならびに水質管理における重要な目標である。
【０００３】
多数の実験室および研究所で、微生物を検出またはスクリーニングする新規検査方法が開発中である（非特許文献１および２）。
【０００４】
これらの開発では、時間を節約するための種々のインキュベーションおよびプレインキュベーション段階／方法に関する代替法が重要視されている。多数の新規方法、例えばLight-cycler（Roche Diagnostics Corp. Basel, Switzerland）を使用するリアルタイムPCRによって総スクリーニング時間が5日から1日に減少するが、より高速な方法および特に、研究対象の微生物のタイプに対して、より選択的および識別力が高い方法が必要とされる。
【０００５】
特に食物産業は、消費用に加工される大量の製品中の微量の混入微生物を検出および同定することについての問題に直面している。大量の製品およびその関連コストを考慮して、混入微生物を高速に検出および同定しなければならないことが必須である。明らかに、好ましくは製品が消費者に到達する前に混入物質を検出しなければならない。好ましくは、製品の流通を継続的にモニターする必要がある。したがって別の目標は、安価な検出用検査を提供することである。マイクロアレイは非常に効率的かつ信頼できるが、概してモニタリングコストが高い。ゆえに、種々の検査に使用することができ、マイクロアレイおよび／または検査当たりのコストがより低い、多用途のマイクロアレイが必要とされる。
微生物の検出同定および特徴付けは分析的な微生物学における重要な目標である。培養非依存的な技術は、細菌群を研究する高速かつ適応性のある手段である。微生物集団を特徴付けする最も包括的なストラテジーは、おそらく16S-23S rDNAクローンシークエンシングおよび系統発生的再構築にある（非特許文献３および４）。16Sまたは23S rRNAに相補的な群−特異的核酸プローブの使用により、複雑な系中の微生物集団を研究する仕組みが提供されている。真核生物の微生物、例えば酵母および真菌を、同様に、例えば18Sおよび28S rRNAを特徴付けすることによって同定してよい。
【０００６】
しかしRNAは周知のように不安定である。結果的に、RNAの特性を保つために極端な品質基準に従う必要がある。
【０００７】
一方、DNAはより安定であると考えられる。さらに、全ゲノムDNA-DNAハイブリダイゼーションは、微生物種を決定する土台とされている。しかし、全ゲノムDNA-DNAハイブリダイゼーションは広く使用されてはいない。その理由は容易に実施できないからである。
【０００８】
数百の諸種が混入微生物とみなされるであろう。最も重要なのは、混入微生物を正確に同定することである。
【非特許文献１】McCabe et al., 1999, Mol Genet Met 66: 205-211
【非特許文献２】Cockerill and Thomas, 2002, ASM News 68 No 2: 77-83
【非特許文献３】Weissburg et al., 1991, J. Bacteriol. 173: 697-703
【非特許文献４】Anthony et al., 2000, J. Clin. Microbiol. 38:781-788
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、大量の食品中の混入微生物の高速かつ特異的な同定を達成するための具体的方法を提供することである。本発明のさらに別の目的は、該方法におけるフィルターおよびマイクロアレイの使用、ならびにサンプル中の微生物の存在を判定するためのキットである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の要旨
本発明は、大量の食品中の混入微生物の高速かつ特異的な同定を達成する具体的方法に関する。種特異的および／または菌株特異的ヌクレオチド配列の検出に基づく方法を開発した。この場合、該ヌクレオチドを固有に同定および増幅し、次いでアドレス可能な（addressable）ZipcodeオリゴヌクレオチドおよびDNAマイクロアレイ技術を使用してマイクロアレイ上で検出する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、食品中で、および水の管理において混入微生物を収集および同定するための方法に関する。
【００１２】
特に本発明は、サンプル中の微生物の存在を判定（測定）するための方法であって、以下の段階を含む方法に関する：
（a）存在すれば該微生物を捕獲する段階、
（b）該微生物から核酸を抽出する段階、該核酸は標的核酸を含む、
（c）以下の段階を含む、該標的核酸に対するリガーゼ検出反応（LDR）を実施する段階：
（c1）第一核酸プローブおよび第二核酸プローブペアを提供する段階、該第一核酸プローブは該標的核酸の特徴的部分に相補的な、3'に位置する標的特異的配列Iを含み、ならびに該第二核酸プローブは、該標的特異的配列Iに本質的に隣接し、かつその3'側に位置する、該標的核酸の第二部分に相補的な、5'に位置する標的特異的配列IIを含み、この場合、該第一核酸プローブは、5'に位置するプライマー結合セクションI（PBS（I））および場合によりスタッファー（stuffer）をさらに含み、ならびに該第二核酸プローブは、3'に位置するプライマー結合セクションII（PBS（II））および場合によりスタッファーを含み；および任意的に、この場合、第一核酸プローブおよび／または第二核酸プローブは、（I）マイクロアレイ上の捕獲プローブの対応する領域に本質的に相補的で、かつ（II）該標的核酸に本質的に非相補的な領域（ZipComcode）をさらに含み、ならびにこの領域は標的特異的配列およびプライマー結合セクションの中間に位置する；
（c2）相補的核酸のハイブリダイゼーションを許容する条件下で該標的核酸を該第一核酸プローブおよび該第二核酸プローブとインキュベートする段階、
（c3）任意の本質的に隣接するプローブを連結する段階、および
（c4）任意の連結されたプローブ核酸を増幅し、これにより増幅された標的核酸を提供する段階、この場合、プライマー結合セクションに特異的な核酸プライマーの結合によって増幅を開始する、
（d）段階（c）で増幅された標的核酸を捕獲プローブにハイブリダイズさせる段階、捕獲プローブはフロースルー（flow-through）マイクロアレイ上に存在し、任意的にZipComcodeに本質的に相補的な領域（Zipcode）を含む、および、
（e）段階（d）でハイブリダイズした標的核酸を検出し、これにより微生物の存在を判定する段階。
【００１３】
本明細書および特許請求の範囲では、文脈から明らかに別の形式でない限り、単数形の「a」、「an」、および「the」には複数への言及が含まれ、また逆も真である。特に規定されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術および科学用語は、通常の当業者によって一般に理解される意味と同一の意味を有する。
【００１４】
一般に、点検用に提供されるか、あるいは全体の品質についての証拠として示される製造対象の任意の物質、例えば食品、乳製品、飲料およびビールの部分であるサンプルまたは検体を採取する。
【００１５】
本方法は、食品、乳製品、ビールおよび他の飲料に混入（を汚染）することが既知である微生物、例えば表１に挙げられる微生物に適用可能である。このように本発明は、サンプル中の微生物の存在を判定するための方法であって、存在すれば該微生物を収集する段階、該微生物から核酸を抽出する段階、該核酸を特異的に増幅する段階、および増幅された核酸を解析し、これにより該微生物の存在を判定する段階を含む方法に関する。さらに本発明は、サンプル中の微生物の存在を判定するための方法であって、存在すれば該微生物を収集する段階、該微生物から核酸を抽出する段階、およびこの核酸を解析し、これにより該微生物の存在を判定する段階を含む方法に関する。
【００１６】
以後明らかになるように、本発明は、該微生物が真核性および／または原核性の微生物ならびにウイルスからなる群から選択される、本明細書中に記載の方法に関する。微生物は、藻類（algae）、古細菌（archaea）、細菌（bacteria）、ウイルス（viruses）、線形動物（nematodes）、原生動物（protozoa）、微胞子虫目（microsporidae）および真菌（fungi）、例えば酵母（yeasts）、カビ（moulds）および菌根（mycorrhizae）を含む群から選択してよい。
【００１７】
同様に、本発明は、該微生物が食物媒介性および水媒介性の微生物からなる群から選択される、本明細書中に記載の方法に関することが理解されよう。
【００１８】
この点において本発明は、当該微生物が、Escherichia、Salmonella、Shigella、Mycobacterium、Lactobacillus、Lactococcus、Listeria、Leuconostoc、Bacillus、Staphylococcus、Clostridium、Vibrio、Enterococcus、Enterobacter、Yersinia、Legionella、Campylobacter、Streptococcus、Micrococcus、Pseudomonas、Flavobacterium、Alcaligenes、Microbacterium、Acinetobacter、およびEnterobacteriaceae/Coliformsからなる細菌群およびカビAspergillus、Neurospora、Geotrichum、Blakeslea、Penicillium、Rhizomucor、RhizopusおよびTrichoderma、および酵母Kluyveromyces、Candida、Hansenula、Rhodotorula、Torulopsis、TrichosporonおよびSaccharomycesから選択される、本明細書中に記載の方法に関する。さらに本発明は、当該微生物が、属Escherichia、Salmonella、Shigella、Mycobacterium、Lactobacillus、Lactococcus、Listeria、Leuconostoc、Bacillus、Staphylococcus、Clostridium、Vibrio、Enterococcus、Enterobacter、Yersinia、Legionella、Campylobacter、Micrococcus、Pseudomonas、Flavobacterium、Alcaligenes、Microbacterium、Acinetobacter、Enterobacteriaceae/Coliforms、およびStreptococcus、およびカビAspergillus、Neurospora、Geotrichum、Blakeslea、Penicillium、Rhizomucor、RhizopusおよびTrichoderma、および酵母Kluyveromyces、Candida、Hansenula、Rhodotorula、Torulopsis、TrichosporonおよびSaccharomyces由来の（亜）種からなる群から選択される、本明細書中に記載の方法に関する。この（亜）種は例えば表1に記載されるものである。
【００１９】
サンプル中に存在する微生物の量を増加させるために、存在すれば、該微生物を培地上で培養してよい。したがって本発明は、当該方法、例えば上記の段階（a）に先行して、（I）該微生物を選択培地上で培養するか、あるいは（II）該微生物を非選択培地上で培養することを含む、微生物の増菌（enrichment）を行う、本明細書中に記載の方法に関する。該微生物を選択培地上で培養することは目的の微生物の増殖に好都合であり、一方、非選択培地上での培養はほとんどの微生物の増殖を持続させ、例えば特に特定の微生物の増殖に好都合なわけではない。
【００２０】
大量の溶液または固形物質中の微生物を収集するための標準的な実験室技術は多くの時間を必要とする。AOAC（Association of Analytical Communities）によって提唱されるような標準的実験室技術に基づくこれらの時間浪費型のプレ増菌（pre-enriching）段階を回避するために、本発明では、混入微生物を濃縮することによって該微生物を即時に収集する。したがって本発明は、当該方法、例えば上記の段階（a）に先行して、微生物を濃縮することを含む、該微生物の集積（enrichment）を行う、本明細書中に記載の方法に関する。当該収集および捕獲は、遠心分離、ろ過、例えばふるいサイズより大きいすべての粒子を捕獲するための水性または液状溶液のろ過、沈降、静電力、凝固、凝集、抗体による微生物の捕獲、および／またはリガンドによる微生物の捕獲によって実施してよい。
【００２１】
さらに本発明の方法では、混入微生物を収集または捕獲するための精密ろ過、例えばMicro Analytical Screen（MAS）法を適用してよい。膜精密ろ過における最終的な目標は、ろ過膜の低い粘性（flowresistance）、高い耐化学性および十分に制御された細孔サイズ分布を達成して、高い操作上の流動率、長い存続期間（例えばマイクロシーブの長い寿命／作動期間）および良好な分離挙動を取得することである。好ましくは、本発明のマイクロシーブフィルターは、均一サイズの細孔を有する薄膜層を特徴とする。ほとんどの適用では、支持体によって膜層を支持する。マクロ多孔性支持体上の高い細孔密度および狭い細孔サイズ分布を伴う相対的に薄いろ過またはふるい層を有するマイクロシーブは、満足〜良好な、あるいはそれどころではなく非常に優れた分離挙動および高い流速を示す。非常に希薄な懸濁液では、粒子の種類および濃度を高速に決定することが重要である。例えば微生物が混入したフルーツジュースの場合である。マイクロシーブの低い粘性により、短時間に大量の液体がフィルターを通過することが許容され、これにより（存在すれば）混入微生物が非常に狭い表面積（20〜100mm2）上に濃縮される。この混入微生物の高速濃縮により、これらの微生物の以後の分析が平易かつ良質になる。
【００２２】
この関連で本発明は、Daufin et al.（2001）によって報告されるクロスフロー（cross-flow）精密ろ過法に関する。これは引用により明示的に本明細書中に包含される（Daufinetal.(2001) Trans Ichem E, 79:89-102）。クロスフロー精密ろ過を使用して、多数の異なる液体から微粒子、例えば混入微生物を除去してよい。したがってクロスフロー精密ろ過は、食物、水およびバイオプロセスにおいて産業上適用することができる。
【００２３】
また本発明は、特許出願WO 02/43937（Aquamarijn Holding Ltd.の特許出願）に記載されている新規精密ろ過技術を適用する。この技術は引用により明示的に本明細書中に包含される。さらに本発明は、CEPAration B.V.（Helmond、The Netherlands）によって開発された新規精密ろ過技術を適用する。CEPArationは、精密ろ過から高温ガス分離にわたる適用のための中空繊維セラミック膜およびモジュールを製造開発している。これらの製品は、ポリマー性中空繊維膜の利点とセラミック膜の耐久性（outstanding and durable properties）を組み合わせる。CEPArationはその生産開発拠点をオランダのヘルモントに構える（http://www.ceparation.com）。
【００２４】
したがって本発明は、Aquamarijn（登録商標）フィルターまたはCEPAration（登録商標）フィルターを使用して当該ろ過を実施する、本明細書中に記載の方法に関する。例えば、窒化ケイ素を膜として使用してよく、ならびにケイ素（silicium）を担体として使用してよく、あるいはフィルターは中空繊維セラミック膜を含んでよい。細孔のサイズは、例えば0.5〜1.2ミクロンの範囲または0.15〜1.4ミクロンの範囲であってよい。
【００２５】
本発明は、当該濃縮後にサンプルの残りの部分から微生物を分離する、本明細書中に記載の方法に関することが理解されよう。さらに、濃縮と分離は同時に実施してよい。
【００２６】
多種多様な着色および／または染色技術を使用して、マイクロシーブ表面上の微生物の認識を向上させることができる。マイクロシーブは好ましくは不活性であり、これによりマイクロシーブ表面を着色または攻撃することなく現存のすべての染色剤および化学物質を使用することが可能になる。該マイクロシーブを再使用してよい。
【００２７】
上記Micro Analytical Screen（MAS）法は、特に混入微生物、例えばCryptosporidium、Escherichia coliおよびLegionellaの存在に関して一般水および飲料水の品質管理に適用してもよい。また食肉産業では、MAS法を適用して、混入微生物、例えばCampylobacterおよびSalmonella混入を追跡することができる。
【００２８】
混入微生物を特徴付けするために、本発明では、問題になっている微生物の核酸を同定する既知の技術を使用してよい。本発明は、好ましくは以下に記載の多重増幅および標識化技術に関する。
【００２９】
本明細書中で使用される用語「核酸」とは、ヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから構成されるポリマーを意味する。本明細書中で使用される用語「リボ核酸」および「RNA」とは、リボヌクレオチドから構成されるポリマーを意味する。本明細書中で使用される用語「デオキシリボ核酸」および「DNA」とは、デオキシリボヌクレオチドから構成されるポリマーを意味する。本明細書中で使用される用語「オリゴヌクレオチド」、「プライマー」および「プローブ」とは、約10〜約100ヌクレオチド長の一本鎖ヌクレオチドマルチマーを意味する。本明細書中で使用される用語「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドモノマーから構成される、約10〜約100ヌクレオチド長の、通常は約100ヌクレオチド長より大きく約1000ヌクレオチド長までの一本鎖または二本鎖ポリマーを表す。
【００３０】
本発明は、当該核酸が、DNA、rRNA、tRNA、mRNA、トータルRNAおよびtmRNA（tRNA様およびmRNA様の二重の性質；10Sa RNAまたはSsrAとしても知られる）からなる群から選択される、本明細書中に記載の方法に関することが理解されよう。
【００３１】
混入微生物由来の核酸、すなわち標的核酸を特徴付けするために、混入微生物を収集または捕獲した後に該微生物から該核酸を標準的に単離する。一般に、微生物から核酸を単離するには第一段階の1つとして該微生物の溶解を必要とする。使用される細胞溶解ストラテジーは混入微生物の性質に依存することが明らかであろう。一般に、リゾチーム、ペクチン分解剤（pectinolytic）での処理、または機械的処理、例えば超音波処理またはビーズビーター（beadbeater）を使用して細胞を溶解することができる。通例の手順は、Selinger et al.（2000, Nature Biotechnol. 18,1262-1268）に記載されるような加熱フェノール溶液内への細菌サンプルの直接注入である。これは引用により本明細書中に包含される。あるいは、細胞を液体窒素中で急速に凍結し、機械的に砕いた後に酸フェノール溶液を用いて単離することができる。酵素分解、有機抽出およびアルコールおよび／または塩析の組み合わせに関する従来の核酸単離法は、当技術分野で周知であり、本発明によって考慮される。この関連で、Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Co, USAに記載のリボ核酸の単離技術は、引用により本明細書中に特に包含される。また本発明は、臨床サンプルからのDNAおよびRNAの高速小規模精製に関する。後者の方法は、Boometal.（1999;J. Clin. Microbiol. 37: 615-619）に記載のように、カオトロピック剤であるグアニジンチオシアン酸塩（guanidinum thiocyanate）（GuSCN）の溶解およびヌクレアーゼ不活性化特性およびこの薬剤の存在下におけるシリカ粒子または珪藻（diatoms）の核酸結合性に基づくものであってよい。
【００３２】
ほとんどの微生物のmRNA種は数分の半減期しか有さない。その原因は主にRNA分解酵素の活性である。したがって、RNA集団を安定化し、すなわちRNA分解を抑止または減少させるのに必要な速度が重要になる。この点において、リボヌクレアーゼ活性の種々の阻害剤、例えばジエチルピロカルボナート、アウリントリカルボン酸、等をRNA単離手順中に使用してよい。これらの阻害剤はRNAの単離に関する共通の、一般的知識に属し、本明細書中に包含される。当該混入微生物の溶解は、核酸集団を安定化する前または安定化した後に実施してよい。また本発明は、エタノールおよびフェノールを含有する停止液に関する。この停止液はE.coliからのトータルRNAの単離に関して報告されている（Ye et al., 2001, J. Microbiol. Methods 47, 257-272）。該停止液を他のグラム陰性菌に首尾良く使用してよい。さらに本発明は、RNAlater（登録商標）溶液（AmbionおよびQiagen）の使用を考慮する。後者の溶液の主な利点はmRNA集団の高速安定化であり、これによりRNA単離前にサンプルを適切な条件下で長期間保存することが可能になる。これはRNAを即時に単離することが不可能な場合のサンプルの収集に特に有用である。
【００３３】
したがって本発明は、前記微生物から核酸を抽出する段階が該微生物を溶解することを含む、本明細書中に記載の方法に関する。
【００３４】
また本発明は、RNA分解酵素を不活性化することをさらに含む、本明細書中に記載の方法に関する。
【００３５】
ほとんどの細菌mRNAはポリA+尾部を有さず、したがってトータルRNAから分離することが困難であるので、濃縮（enrichment）段階を使用してよい。本発明は、Affymetrix（http://www.affymetrix.com/index.affx）に記載のリボソームRNAの除去に基づくmRNAの濃縮段階に関する。さらに本発明は、Wendisch et al.（Wendisch et al. (2001) Anal. Biochem. 290: 205 - 213）に記載のように、粗製の細胞抽出物中でE.coli由来のポリＡ＋ポリメラーゼＩを用いてE.coli mRNAをポリアデニル化し、これをオリゴ−dTクロマトグラフィによって精製することによって該mRNAを単離する方法を包含する。この文献は引用により本明細書中に包含される。
【００３６】
種々のRNA単離キットが市販の諸供給元、例えばAmbion、Qiagen、Sigma-Aldrich等から入手可能である。このようなキットを本発明の方法において首尾良く使用してよい。
【００３７】
RNAの単離に関して上に記載されるのと同様に、DNAの単離において微生物を溶解する方法は、微生物のタイプ、例えばカビ、真菌、酵母、グラム陰性またはグラム陽性菌に依存する。この関連で、Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Co, USAに記載のDNA単離技術は、引用により本明細書中に特に包含される。好都合な方法は、細胞を沸騰水に浸すことである。例えば、Lactobacillusのようなグラム陽性生物の場合、バッファー、例えばＳＴＥバッファー（100 mM NaCl、50 mM Tris-HCl、10 mM EDTAナトリウム、pH 7.5）中に細胞を懸濁し、37℃で適切な時間、例えば15分間リゾチーム（例えば10 mg/ml）とインキュベートしてよい。例えばSalmonellaのようなグラム陰性生物の場合、Genomic DNAバッファーセット（Qiagen）を使用するGenomicチップ（Qiagen）を使用してサンプルからゲノムDNAを抽出精製してよい。例えばAspergillusのようなカビまたは真菌の場合、OM−バッファー中に細胞を懸濁し、ペクチノ溶解剤、例えばGlucanex（登録商標）（Novozymes, Denmark）で処理してよい。したがって本発明は、当該溶解が、リゾチーム、ペクチノ溶解剤、またはグアニジンチオシアン酸塩での処理または機械的処理、例えば超音波処理またはビーズビーターの使用による処理、加熱フェノール中への微生物の注入による処理、および液体窒素中で微生物をスナップフリーズした後の機械的処理からなる群から選択される、本明細書中に記載の方法に関する。
【００３８】
種々のゲノムDNA単離キットが市販の諸供給元、例えばGentra、Promega、Qiagen等から入手可能である。このようなキットを本発明の方法において首尾良く使用してよい。
【００３９】
単離された核酸の濃度は260 nmでの分光測定によって評価してよい。
【００４０】
混入微生物から核酸を単離した後、該核酸を解析する必要がある。一般に、微量の混入微生物しか存在しない。したがって、単離された核酸またはその特定部分、すなわち標的核酸を増幅してよい。標的核酸がRNAである場合、該RNAをまずcDNAに変換した後に解析してよい。本発明を通して使用される用語「増幅（増幅された）（増幅対象の）核酸（amplified nucleic acids）」および「増幅（増幅された）（増幅対象の）核酸混合物（amplified nucleic acid mixture）」は本質的に同一の意味を有することが理解されよう。
【００４１】
したがって本発明は、当該核酸が、rRNA、tRNA、mRNA、トータルRNA、またはtmRNAであり、ならびに該rRNA、tRNA、mRNA、トータルRNA、またはtmRNAを例えば逆転写酵素の活性によって当技術分野で周知のようにcDNAに変換する、本明細書中に記載の方法に関する。
【００４２】
DNAおよび／またはcDNAを増幅する種々の技術が当業者に既知である。これらのすべての技術は本発明によって考慮される。したがって本発明は、当該核酸がDNAおよび／またはcDNAであり、ならびに増幅技術、例えばbDNA、ハイブリッド捕獲、SDA、TMA、PCR、LCR、TAS、3SR、NASBAおよびQβ増幅を使用してVersalovic and Lupski 2002, Trends Microbiology 10: S15-S21に説明されるように該DNAおよび／またはcDNAを増幅する、本明細書中に記載の方法に関する。この文献は引用により本明細書中に包含される。
【００４３】
本発明は特に多重増幅、例えば多重PCRを考慮する。多重増幅、例えば多重PCRにより、2種またはそれ以上の標的を同時に増幅し、したがって解析することが可能である。遺伝子（遺伝学的）スクリーニング、ミクロサテライト解析、および単一反応においていくつかの産物を増幅することが必要な他の適用に関して、この増幅技術を使用する。通常の実験によって、当業者は反応条件を最適化することができる。この最適化では、単一反応において複数のプライマーペアを有し、これによりプライマー二量体および、特異的産物の増幅を妨害する可能性がある他の非特異的産物の存在可能性が増加するであろうことを考慮する。さらに、個々のプライマーペアの濃度を最適化する必要があることが多い。その理由は種々の複数のアンプリコンが種々の効率で増幅されることが多く、また複数のプライマーペアは反応において互いに競合し得るからである。当業者は同様の配慮を持って、上記の他の増幅技術に関する条件を多重増幅、すなわち1種以上の標的の増幅に最適化する。
【００４４】
さらに本発明は、RNAの直接増幅、例えば修飾Tyras法による増幅であって、RNAポリメラーゼ認識部位および標的核酸に相補的な認識部位を含むプライマー／プローブを使用する増幅に関する。
【００４５】
標的核酸を単離した後、プローブおよび／またはプライマーを該標的核酸にハイブリダイズさせる。該プライマーを使用して該標的核酸を増幅してよい。あるいは、該プローブをライゲートしてよく、また該プローブ上の領域を特異的に認識するプライマーを用いて増幅してよい（以下参照）。該プローブおよび／またはプライマーを標識してよい。また標識は、増幅段階中に包含させてよく、あるいは増幅後に結合させてよい。したがって本発明は、増幅対象の核酸を標識する、本明細書中に記載の方法に関する。検出可能で、定量化可能なシグナルを発生させ、かつ増幅対象の核酸に結合可能な実質的に任意の標識を本発明の方法およびアレイとともに使用することができる（以下参照）。適切な標識には、例示的かつ非限定的に、放射性同位元素、フルオロフォア、発色団、化学発光部分、等が含まれる。増幅対象の核酸に標識を結合させる実施態様では、核酸の任意の部分、例えば遊離末端または1または複数の塩基に標識を結合させることができる。好ましくは標識の位置は、標識された核酸のハイブリダイゼーション、検出または他のハイブリダイゼーション後の修飾を妨害しない。種々の諸プロトコールを使用して、当技術分野で既知のように、標識された核酸を作成してよい。このような方法は、典型的に、初期プライマーおよび鋳型核酸を使用して酵素的に標識核酸を作成することに基づく。標識されたプライマーを使用して、標識された増幅核酸を作成することができる。あるいは、第一鎖合成中または以後の合成、標識化または増幅段階中に核酸内へ標識を包含させ、標識された増幅核酸を製造することができる。反応性標識誘導体を用いるRNAの化学修飾または標識された基質を使用する酵素による修飾を使用して、標識をmRNAに直接包含させることもできる。標識された増幅核酸を製造する代表的な方法は米国出願番号第：08/859,998；08/974,298；09/225,998号に開示されている。これらの文献の開示内容は引用により本明細書中に包含される。
【００４６】
例えば上記標識および技術によって増幅核酸を標識してよい。あるいは、当技術分野で既知の任意の他の技術によってこれらを標識してよい。好ましい技術には、直接化学標識法および酵素による標識法、例えばキナーゼ処理（kinasing）およびニックトランスレーションが含まれる。したがって本発明は、増幅対象の標的核酸を増幅中に標識してよく、あるいは増幅対象の標的核酸を増幅後に標識してよい、本明細書中に記載の方法に関する。
【００４７】
種々の諸標識を使用してよい。このような標識には、蛍光標識、リン光標識、同位元素標識、酵素標識、微粒子標識、等が含まれる。例えば適切な標識には、蛍光色素（fluorochromes）、例えばフルオレセインイソチオシアナート（fluoresceinisothiocyanate）（FITC）、ローダミン（rhodamine）、例えばローダミン123（rhodamine123）、R6G、IRDyesTM、テキサスレッド（TexasRed）、フィコエリトリン（phycoerythrin）、アロフィコシアニン（allophycocyanin）、6−カルボキシフルオレセイン（6-carboxyfluorescein）（6−FAM）、2'，7'−ジメトキシ−4'，5'−ジクロロ−6−カルボキシ−フルオレセイン（2',7'-dimethoxy-4',5'-dichloro-6-carboxy-fluorescein）（JOE）、6−カルボキシ−X−ローダミン（6-carboxy-X-rhodamine）（ROX）、TET、JOE、NED、（ET−）ROX、6−カルボキシ−2'，4'，7'，4，7−ヘキサクロロ−フルオレセイン（6-carboxy-2',4',7',4,7-hexachloro-fluorescein）（HEX）、5−カルボキシフルオレセイン（5-carboxyfluorescein）（5−FAM）またはN,N,N',N'−テトラメチル−6−カルボキシ−ローダミン（N,N,N',N'-tetramethyl-6-carboxy-rhodamine）（TAMRA）、fluor488TM、シアニン色素（cyaninedyes）、例えばCy5、Cy3、Cy2、BODIPY色素、例えばBiodipyTM630/650、Biodipy530、BiodipyTMFL、Alexa、例えばAlexa542、AlexafluorTM532、等が含まれる。適切な同位元素標識には、放射性標識、例えば32P、33P、35S、3Hが含まれる。他の適切な標識には、光散乱、蛍光性を有するか、あるいは包括された複数のフルオロフォアを含有するサイズ粒子が含まれる。標識は2段階システムであってよい。この場合、高親和性結合パートナー、例えばアビジン、特異的抗体、等を有するビオチン、ハプテン、等にプライマーおよび／またはプローブを共役する。この結合パートナーは、検出可能な標識、例えば基質を色原性産物に変換可能な酵素標識、蛍光標識、同位元素標識、等に共役されている。
【００４８】
このような場合、特定の実施態様では、異なる標的核酸を標的にするプライマーを区別して標識してよい。「区別して標識」および「異なる標識を含有」とは、異なる標的核酸を標的にするプライマーを互いに異なって標識し、これらを互いに同時識別することができるようにすることを意味する。
【００４９】
本発明の実施態様は、（1）多重リガーゼ検出反応（Ligase Detection Reaction）（LDR）および（2）多重ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction）（PCR）の組み合わせに関する。リガーゼ検出反応（LDR）は一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphisms）（SNP）検出用の高感度アッセイである。該アッセイはFavis et al.,（2000, Nature Biotechnology 18: 561 - 564）に記載されている。当該文献は引用により本明細書中に包含される。16S rRNA沿いの単一ヌクレオチド差を使用して、異なる微生物の配列同士を区別してよい。これはBusti et al.（2002, BMC Microbiology 2: 27-39）に記載されている。当該文献は引用により本明細書中に包含される。同様に、18S、23Sまたは28Sr RNA沿いの単一ヌクレオチド差を使用して、異なる微生物の配列同士を区別してよい。2つのプローブ（プローブIおよびII）のセットは、検出対象の標的配列であって少なくともその部分が既知である配列に基づいて設計してよい。両プローブは、標的配列の既知のセクションにハイブリダイズ可能な領域を末端（それぞれプローブIおよびIIの3'および5'末端）に含有する。換言すれば、一方のプローブ（プローブI）は、標的領域に特異的にハイブリダイズする領域Irを含む。この領域IrはプローブIの3'最終末端に位置する。該プローブIは、領域Irの5'側に位置するプライマー結合セクション（PBS（I））をさらに含む。該プローブIおよび／またはIIはスタッファー領域を含有してよい。例えば、プローブI上の該スタッファー領域は領域IrおよびPBS（I）の間に位置してよい。プローブIIは、標的領域と特異的にハイブリダイズする領域IIrを含む。該領域IIrはプローブIIの5'最終末端に位置する。該プローブIIは、領域IIrの3'側に位置するプライマー結合セクション（PBS（II））をさらに含む。プローブIまたはプローブIIは、それぞれ領域IrおよびPBS（I）の中間または領域IIrおよびPBS（II）の中間に位置するZipComcodeをさらに含んでよい。ZipComcode（ZCc）は最終増幅産物を同定するための固有の配列である。ZCcは、例えばマイクロチップ上に存在するその相補配列であるZipcode（捕獲プローブ；以下参照）にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションすると、プローブIの標的領域IrはプローブIIの標的領域IIrに隣接して位置する。ZCcおよびPBSはプローブの末端に位置し、標的配列にハイブリダイズ可能ではない。両プローブが標的配列にハイブリダイズし、互いに隣接して位置すると、リガーゼ、例えばPfuDNAリガーゼを使用してプローブをライゲートすることができる。ライゲーション後、プライマー結合セクションにハイブリダイズ可能な少なくとも1プライマーを使用して、ライゲート後のプローブを増幅してよい。好ましくは、PBS（II）を有するプローブIIと異なるPBS（I）を有するプローブIを使用するPCRによって増幅を実施する。ゆえに、PBS（I）によって特徴付けられる領域に結合するプライマーIはPBS（II）によって特徴付けられる領域に結合するプライマーIIと異なる。プライマーIがPBS（I）に実質的に相補的な配列を含む場合、プライマーIIはPBS（II）と実質的に同一の配列を含み、またその逆も真であり、プライマーIがPBS（I）と実質的に同一の配列を含む場合、プライマーIIはPBS（II）に実質的に相補的な配列を含むことが理解されよう。一方のプライマーの例えば5'末端を標識してよい。好ましくは、第一プライマーの5'末端を標識する。また、第二プライマーは、5'末端に位置するZipComcodeを含んでよい。このように本方法は、多重形式で、例えばPBS（I）にハイブリダイズする1共通プライマー、および例えばPBS（II）にハイブリダイズする1プローブ特異的プライマーを使用して作動してよい。共通プライマーはPBS（II）にハイブリダイズし、一方プローブ特異的プライマーはPBS（I）にハイブリダイズしてよいことが理解されよう。別の実施態様では、プローブIは標識を含有する。
【００５０】
ゆえに本発明の方法では、当該核酸および／またはcDNAはリガーゼ検出反応を使用して増幅してよく、該反応は当該標的核酸の特徴的部分に相補的な第一核酸プローブおよび該標的核酸の該特徴的部分に本質的に隣接して位置する該標的核酸の第二部分に相補的な第二核酸プローブを含み、この場合該第一核酸プローブは、5'に位置するプライマー結合セクションおよび場合によりスタッファーをさらに含み、ならびに該第一または該第二核酸プローブは、該標的核酸に本質的に非相補的な3'に位置するZipComcodeタグおよびプライマー結合セクションを含み、該第二核酸プローブの場合、このセクションはZipComcodeの3'側に位置する。本方法は、該核酸および／またはcDNAをインキュベートして、相補的核酸のハイブリダイゼーションを許容し、任意の本質的に隣接するプローブを（ライゲーションによって）連結し、ならびに任意の連結されたプローブ核酸を増幅し、この場合、プライマー結合セクションに特異的な核酸プライマーの結合によって増幅を開始させることをさらに含む。
【００５１】
したがって本発明は、当該連結段階が、リガーゼ、例えばT4リガーゼ、または熱安定リガーゼ、例えばTaq DNAリガーゼ、Pfu DNAリガーゼ、Tth DNAリガーゼまたはAmpligaseTMの使用または活性を含む、本明細書中に記載の方法に関する。
【００５２】
ライゲートされたプローブの典型的な構造を以下に挙げる：
I：5'−PBS（I）−［スタッファー］−標的特異的領域I−−−標的特異的領域II−［スタッファー］−［ZCc］−［スタッファー］−PBS（II）−3'、または
II：5'−PBS（I）−［スタッファー］−［ZCc］−［スタッファー］−標的特異的領域I−−−標的特異的領域II−［スタッファー］−PBS（II）−3'。
増幅後のライゲートされたプローブの典型的な構造を以下に挙げる：
I：5'−［標識］−PBS（I）−［スタッファー］−標的特異的領域I−−−標的特異的領域II−［スタッファー］−［ZCc］−［スタッファー］−PBS（II）−3'、および
II：5'−PBS（I）−［スタッファー］−［ZCc］−［スタッファー］−標的特異的領域I−−−標的特異的領域II−［スタッファー］−PBS（II）−［標識］−3'。
（角括弧間の領域は任意的である）
【００５３】
したがって本発明は、該プローブIおよび／またはプローブIIがスタッファー領域を含む、本明細書中に記載の方法に関する。この関連でスタッファー領域は、構造上の領域、例えばPBS、ZCc、IrまたはIIrを分け、それにより立体障害を回避または最小化することを意図するものである。
【００５４】
上に既述のように、少なくとも1つのプライマーおよび／またはプローブに標識を結合させてよく、あるいは別法では、増幅中に標識を包含させてよいことが理解されよう。標識は例えば蛍光標識である。したがって本発明は、少なくとも1プライマーが標識、および好ましくは蛍光標識を含有する、本明細書中に記載の方法に関する。
【００５５】
RNA-DNAハイブリッドはT4 DNAリガーゼの基質として作用できることが理解されよう。これはCharani Ranasinghe and Andrew A. Hobbs Affiliations in Elsevier Trends JouRNAls Technical Tips Online,[Tip]01519"A simple method to obtain the 5' ends of mRNA sequences by direct ligation of cDNA-RNA hybrids to a plasmid vector"に記載されている。この文献は引用により本明細書中に包含される。
【００５６】
別法では、プローブIまたはIIまたはプライマーの1つがRNAポリメラーゼ結合部位を含有する。その後、RNAポリメラーゼ、例えばT4-、T7-またはSP6RNAポリメラーゼの活性によって、ライゲート後のプローブを増幅する。
【００５７】
遺伝子マーカー（genetic markers）とは、種または近縁種のゲノムにおける特有の遺伝子座（の位置をマークするもの）を表す。これらのマーカー遺伝子座で異なっている遺伝子型をサンプリングすると遺伝的変異が明らかになる。その後、マーカー遺伝子座の遺伝的変異を報告し、診断学等に適用することができる。種間の遺伝的変異はDNAまたは16S、18S、23Sおよび／または28S rRNA中の一塩基置換に起因するであろう。プローブの標的結合領域を相応に作り変えてよい。例えば、各プローブが異なる3'最終末端ヌクレオチドを含む4つのプローブIのセットを提供してよい。例えば、それぞれ3'末端にヌクレオチドA、C、GおよびTを含有するプローブI-A、プローブI-C、プローブI-GおよびプローブI-Tである。そしてこれは、各プローブIのPBSが特有であり、かつ該最終末端ヌクレオチドに対応する場合に有益である。換言すれば、各プローブIのPBSは異なるプライマーIにハイブリダイズする。ゆえに本発明は、PBS（I-A）を有するプローブI-A、このプローブは対応するプライマーI-Aにハイブリダイズする；PBS（I-C）を有するプローブI-C、このプローブは対応するプライマーI-Cにハイブリダイズする；PBS（I-G）を有するプローブI-G、このプローブは対応するプライマーI-Gにハイブリダイズする；およびPBS（I-T）を有するプローブI-T、このプローブは対応するプライマーI-Tにハイブリダイズする、を考慮する。該各プライマーI-A、I-C、I-GおよびI-Tは異なる標識を含んでよい。このテーマに関するバリエーション、例えば遺伝子マーカーがプローブの標的領域内、またはプローブIIの5'最終末端上に位置する場合が考えられることが当業者に理解されよう。遺伝子マーカーがプローブII中に位置する場合、プローブIに関して上に記載されるようにPBS（II）を作り変えてよい。さらにまた、PBS、すなわちPBS（I）およびPBS（II）は同一または異なっていてよい。
【００５８】
したがって本発明は、プローブI、すなわち当該第一核酸プローブ、および／またはプローブII、すなわち当該第二核酸プローブが遺伝子マーカーに特異的にハイブリダイズする、本明細書中に記載の方法に関する。
【００５９】
したがって本発明は、プローブI、すなわち該第一核酸プローブの4変異体を提供し、各4変異体が3'最終末端に異なるヌクレオチドを含有することを除き該4変異体は実質的に同一である、本明細書中に記載の方法に関する。また本発明は、該各4変異体が異なるプライマー結合セクションＩを含有する、本明細書中に記載の方法に関する。別の実施態様では、本発明は、少なくとも2群の第一および第二核酸プローブペアを提供し、この場合各群の第一および第二核酸プローブは特異的標的核酸にハイブリダイズし、ならびに特異的プライマー結合部位Iおよび／またはIIを含む、本明細書中に記載の方法に関する。別の側面では、本発明は、少なくとも2群の第一および第二核酸プローブペアを提供し、この場合各群の第一および第二核酸プローブは特異的標的核酸にハイブリダイズし、ならびに各群の第一核酸プローブは特異的ZipComcodeを含む、本明細書中に記載の方法に関する。その場合、ZipComcodeは第一核酸プローブ上の標的特異的配列Iおよびプライマー結合配列Ｉの中間に位置してよい。別の側面では、第一核酸プローブの5'末端を該第二核酸プローブの3'末端に、場合によりスタッファー領域を介して、結合または共役させる（例えば、一般化された概念を提供する図４を参照のこと）。標的特異的配列Ｉを標的特異的配列ＩＩにライゲートした後に環状プローブが生じることが理解されよう。
【００６０】
したがって本発明は、該4変異体の異なるプライマー結合セクションIの各々に結合する各プライマーが異なる蛍光標識を含有する、本明細書中に記載の方法に関する。
【００６１】
したがって本発明は、上に規定される微生物に関して2つの隣接するプローブからなるセットを提供する、本明細書中に記載の方法に関する。これらのプローブを共役させてもよい。
【００６２】
本明細書中に記載の方法は、（多重の）混入微生物の存在を同定および／または特徴付けするように特別に設計された少なくとも1セット、好ましくは1以上のセットの2つのプローブを提供することによって、種々の混入微生物を同時検出することに関する。異なるセットのプローブは好ましくは交差ハイブリダイズしないべきであろう。他方、異なるセットのプローブ／プライマーの融解温度Tmはほぼ類似し、例えば最高で約12℃しか変化しない。一般に利用可能なコンピュータプログラム、例えばProbe Match, Michigan State University, East Lansing, Michigan USA、Oligo 5.0ソフトウェア（PEBiosystems, Foster City, California, USA）、およびClustal Wアルゴリズムを使用して、特異的プローブの設計を容易にしてよい。好ましくはプライマー／プローブは、約37〜85℃、または50〜80℃、または55〜75℃、または60〜72℃の範囲の融解温度Tmを有する。その場合、また本発明は多重増幅に関する（上記参照）。
【００６３】
別の側面では、本発明は、少なくとも1セットの2つのプライマーを提供し、この場合第一プライマー（プライマーA）は、5'に位置する標識および第一標的核酸領域に特異的にハイブリダイズする領域Aを含み、該領域ＡはプライマーAの3'最終末端に位置し、ならびに第二プライマー（プライマーB）は、3'に位置するZipComcodeおよび第二標的核酸領域に特異的にハイブリダイズする領域Ｂを含み、該領域BはプライマーBの5'最終末端に位置する；第一標的核酸領域標的領域は第二標的核酸領域の3'に隣接して位置する；相補的核酸のハイブリダイゼーションを許容する条件下で該標的核酸を該プライマーAおよび該プライマーBとインキュベートし；任意の本質的に隣接するプライマーを連結し；ならびに連結されたプライマーを捕獲プローブにハイブリダイズさせること、この捕獲プローブはZipComcodeに本質的に相補的な領域を含み、ならびにフロースルーマイクロアレイ上に存在する、を含む、本明細書中に記載の方法に関する。その場合、該プライマーAは遺伝子マーカーに特異的にハイブリダイズしてよい。別の側面では、プライマーAの4変異体を提供し、各4変異体が3'最終末端に異なるヌクレオチドを含有し、ならびに各4変異体が異なる蛍光標識を含有することを除き該4変異体は実質的に同一である。
【００６４】
混入微生物を収集し、その核酸を単離し、そして増幅した後に、増幅された核酸または増幅された核酸混合物を解析してよい。該増幅された核酸または該増幅された核酸混合物を解析する好都合な方法はその配列を決定することに基づく。核酸の配列を決定する技術は当技術分野で周知である。したがって本発明は、解析が、増幅された核酸混合物の配列を決定することを含む、本明細書中に記載の方法に関する。該配列は酵素的、化学的または物理的手段によって決定してよい。混入生物についての決定された配列をデータバンクに保存されている配列と比較してよい。またサンプル中に存在する可能性がある微生物を本発明にしたがって特徴付けする本方法の解析段階は、ヌクレオチド配列に基づいて微生物を特徴付けするデータベースを有するコンピュータ出力データを保持するコンピュータ可読媒体を提供し、コンピュータ出力データを処理して微生物を決定するコンピュータおよびアルゴリズムを提供することを含んでよい。
【００６５】
混入微生物を特徴付けする別の好都合な方法は増幅断片長多型解析（AFLP）を実施することに基づく。これは例えば、Vos et al.（1995 Nucleic Acids Research 23: 4407-4414）に記載されている。この文献は引用により本明細書中に明示的に包含される。一実施態様では、AFLPを使用して増幅核酸を区別して同定し、次いでこの核酸を多型にマップするポリヌクレオチドプローブに変換する。差を示して増幅されたAFLPDNAをポリヌクレオチドプローブに変換する。該変換は、AFLP増幅産物中の断片の混合物から個々の多型AFLP断片を単離し、次いで固定されたDNA増幅産物とのハイブリダイゼーションにおいて単離断片をポリヌクレオチドプローブとして使用することに基づく。AFLPを同定する別の代表的な方法は国際出願番号第：WO98/30721号に開示されている；この出願の開示内容は引用により本明細書中に包含される。
【００６６】
また、ハイスループットスクリーニングによる微生物の検出および同定は使用が容易な種特異的マーカーを必要とする。したがって本発明は、ゲノムDNAを1種または複数の制限酵素で消化することによるゲノム断片（多型AFLP断片）生成を介したAFLP解析を考慮する。これらのゲノム断片はサイズによって区別してよい。例えばクローニングおよび配列決定によって目的の多型AFLP断片を選択および解析してよい。得られた断片をいくつかのデータベース、例えばIECB University of Vienna：（www.probebase.net）、TIGR（www.tigr.org/tdb/mdb/mdbcomplete.html）またはGenbank（www.ncbi.nlm.nih.gov）データベースに対してブラスト（blast）してよい。得られた配列のうち、内部または外部ホモロジーを示し、かつ所望のＴｍ範囲、例えば50〜80℃に入らないすべての配列を排除する。残りの種特異的配列を「サイン配列／タグ」と命名する。増幅段階およびマイクロアレイでの同定においてプライマーならびに捕獲プローブの両者としてこれらのサイン配列／タグを適用することができる。
【００６７】
したがって本発明は、該核酸がDNAであり、ならびに該DNAをAFLPに付する、本明細書中に記載の方法に関する。
【００６８】
植物および微生物における遺伝子地図作成用のAFLP（商標）マーカーを本発明において使用してよく、そしてゲノム解析を促進してよいことが当業者には理解されよう。好ましくは、ハイスループットスクリーニングによる食物および／または水媒介性微生物の検出および同定は、使用が容易な種特異的マーカーによって実施してよい。
【００６９】
本発明の別の実施態様は、増幅された核酸の解析に関する、アレイ、例えばマイクロアレイの使用に関する。アレイは何千ものDNAスポットを含有してよい。単一アレイは広い同定能の潜在能力を有する。すなわち1マイクロアレイ上の1回の実行で多数の諸混入微生物が解析されるであろう。さらに本発明の方法は、骨の折れる交差ハイブリダイゼーションを必要とせず、またハイブリダイゼーションプロファイルのオープンデータベースを提供するであろう。これにより従来のDNA-DNAハイブリダイゼーションの制限が回避される。
【００７０】
完全に適合する鋳型の存在下で、DNAリガーゼの作用によりプローブをライゲートしてよい。ライゲーション後に、該プローブを増幅してよい。次いで、増幅しても、あるいは増幅しなくてもよいライゲート後のプローブを、ハイブリダイズ用条件下で捕獲プローブと接触させる。ハイブリダイズ用条件は当技術分野で周知であり、あるいは困難を伴うことなく当業者が決定してよい。例えば「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第二版（Sambrook et al.,1989）および「Current Protocols in Molecular Biology」（F. M. Ausubel et al., eds., 1987, および定期的な改訂）を参照のこと。該捕獲プローブは、標的核酸配列、またはその部分、例えばZCcに対する相補的配列を含む。捕獲プローブはマイクロアレイ上に配置してよい。ゆえに、マイクロアレイは標的核酸配列の相補的配列、すなわち捕獲プローブを含む。マイクロアレイ上の捕獲プローブの位置は既知である。
【００７１】
したがって本発明は、該解析が、増幅された核酸または該増幅された核酸混合物を捕獲プローブにハイブリダイズさせることを含み、該捕獲プローブは該増幅された核酸または該増幅された核酸混合物に特異的にハイブリダイズする、本明細書中に記載の方法に関する。用語「特異的にハイブリダイズ」とは、分析物の領域、例えば増幅産物のZCc、およびマイクロアレイ上の捕獲プローブ間の完全な適合に関する。当業者に既知であるように、特異的なハイブリダイゼーションでは、長さ、G/C含量およびハイブリダイゼーション条件、例えば塩および温度を考慮する。
【００７２】
したがって本発明は、前記捕獲プローブをマイクロアレイ上に配置する、本明細書中に記載の方法に関する。該捕獲プローブはマイクロアレイ上で空間的にアドレス可能（spatially addressable）である。
【００７３】
本発明のマイクロアレイは、2スポット〜106スポットまたはさらにそれ以上の、任意の所望のサイズであってよい。基板のサイズに関する上限および下限は、極端に小さい基板または大きい基板で作業することについての実施上の配慮によってのみ決定される。
【００７４】
既定の基板サイズに関する上限は、マイクロアレイ中のスポットの作成および検出能によってのみ決定される。一般にマイクロアレイ上の好ましいスポット数はマイクロアレイが使用される具体的用途に依存する。例えば、ハイブリダイゼーションに基づくシークエンシングは概して大きいアレイを必要とし、一方、変異検出は小さいアレイしか必要としないであろう。一般にマイクロアレイは、2〜約106スポット、または約4〜約105スポット、または約8〜約104スポット、または約10〜約2000スポットの範囲、または約20〜約200スポットを含有する。
【００７５】
さらにまた、マイクロアレイ上のすべてのスポットが固有である必要はない。実際、多数の適用において、内部標準として機能するためにスポットは重複しているのが望ましい。
【００７６】
ポリヌクレオチドのアレイを合成および／または固定するための種々の技術が報告されている。例えば、ポリヌクレオチドを基板表面上で直接合成するin situ合成（例えばFodor,et al. U. S. Pat. No. 5,744,305を参照のこと）およびあらかじめ合成されたポリヌクレオチドを基板表面に離散した位置で結合させること（例えばWO98/31836を参照のこと）がある。WO98/31836の特に41〜45および47〜48ページには別の方法が記載されている。本発明は、これらの現在利用可能な技術または後に開発される技術のうち任意のものとともに使用するのに適している。
【００７７】
あらかじめ合成されたポリヌクレオチドを異なる空間的アドレスで固定すると、配列がその空間的アドレスによって同定可能なポリヌクレオチドのアレイが得られる。
【００７８】
ポリヌクレオチドのin situ合成を含む実施態様では、ポリヌクレオチドをその通常の様式で合成する。この合成スキームにより、配列がその空間的アドレスによって同定可能なポリヌクレオチドのアレイが得られる。
【００７９】
固形基板の性質および形状は、種々の要因、例えば、特に、アレイのタイプ（例えば一次元、二次元または三次元）および結合様式（例えば共有結合性または非共有結合性）に依存する。一般に基板は、捕獲プローブ、例えばポリヌクレオチドの固定を許容し、ならびに捕獲プローブを結合させる、例えば核酸をハイブリダイズおよび／または変性させるのに使用される条件下で融解しないか、あるいは別の様式で実質的に分解しない任意の材料から構成され得る。さらに、共有結合による固定が考慮される場合、固定対象の捕獲プローブと共有結合を形成可能な反応基で基板を活性化すべきであろう。
【００８０】
本発明における基板としての使用に適した他の典型的材料には金属酸化物が含まれる。金属酸化物によって、高いチャネル密度および高い多孔性（porosity）をともに有し、高密度アレイがサンプル適用に関して単位表面当たりに種々の第一結合物質を含むことを可能にする基板が提供される。さらに、金属酸化物は可視光に関して非常に透過性である。金属酸化物は、典型的な微細加工技術の使用を全く必要とせず、ならびに基板の表面全体の液体分布に対する改善された制御を提供する比較的安価な基板であり、例えば電気化学的に製造される金属酸化物膜である。金属シートの電気化学的エッチングによってスルーゴーイング（through-going）配向チャネル（oriented channels）を有する金属酸化物膜を製造することができる。考慮される金属酸化物は、特に、タンタル、チタン、およびアルミニウムの酸化物、ならびに2種またはそれ以上の金属酸化物の合金およびドープ金属酸化物および金属酸化物を含有する合金である。金属酸化物膜は、特に湿性の場合に透過性であり、これにより種々の光学的技術を使用するアッセイが可能である。該膜は、十分に制御された直径および有用な化学的表面特性を有する配向スルーゴーイングチャネルを有する。特許出願EP-A-0975427はこの関連の典型例であり、これは明示的に本発明に包含される。
【００８１】
したがって本発明は、該マイクロアレイがフロースルー（flow-through）マイクロアレイである、本明細書中に記載の方法に関する。また本発明は、該基板が多孔性基板であり、該基板が電気化学的に製造される金属酸化物膜であってよい、本明細書中に記載の方法に関する。好ましくは、該基板は酸化アルミニウムを含む。
【００８２】
したがって本発明は、該マイクロアレイがPamChip（登録商標）である、本明細書中に記載の方法に関する。
【００８３】
固定される捕獲プローブの組成は重要な意味を持つものではない。唯一の必要条件は、これらが、相補的配列を有する標的核酸、例えば増幅された核酸が存在すればそれらにハイブリダイズ可能であることである。例えば捕獲プローブは、すべて天然のまたはすべて合成のヌクレオチド塩基、または両者の組み合わせから構成されるであろう。本発明とともに使用するのに適した修飾塩基の非限定的な例は、例えばPractical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, G. Fasman, Ed., CRC Press,1989, pp.385-392に記載されている。ほとんどの場合、このポリヌクレオチドはすべて天然の塩基（A、C、G、TまたはU）から構成されるが、特定の環境では合成塩基の使用が好ましいこともある。
【００８４】
さらに、捕獲プローブの主鎖はすべて「天然の」ホスホジエステル結合から構成されるのが典型的であるが、これらは1または複数の修飾結合、例えば1または複数のホスホロチオアート、ホスホルアミダイトまたは他の修飾結合を含有してよい。具体的な例として、1または複数の固定されるポリヌクレオチドはペプチド核酸（PNA）であってよい。これはアミド連結結合（interlinkage）を含有する。本発明とともに使用することができる修飾塩基および主鎖の別の例、ならびにその合成方法は、例えばUhlman & Peyman,1990, Chemical Review 90(4): 544-584；Goodchild, 1990, Bioconjugate Chem.1 (3):165-186；Egholm et al., 1992, J. Am. Chem. Soc.114: 1895-1897；Gryaznov et al., J. Am. Chem. Soc. 116: 3143-3144、ならびに上記すべての文献で引用される文献中に見出せる。
【００８５】
このような場合、捕獲プローブはリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドのポリマーを含んでよく、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドは、5'-3'結合によって、ともに連結される。本発明の捕獲プローブは、リボ核酸、例えばセンスまたはアンチセンスリボ核酸、完全長cRNAまたはその部分断片、完全長mRNAまたはその部分断片、および／またはリボオリゴヌクレオチドであってよい。あるいは、本発明の捕獲プローブはデオキシリボ核酸、好ましくは対応するmRNAをエンコードする一本鎖の完全長配列またはその断片であってよい。捕獲プローブの形式は、サンプル中の増幅された標的核酸および／またはライゲートされたプローブに相補的であり、これらと適切なワトソン・クリック水素結合を形成するように選択されるであろう。
【００８６】
上記のように、捕獲プローブは合成ヌクレオチドアナログのポリマーであってよい。このような捕獲プローブをアッセイ条件下でのその優れた安定性に基づいて特定の実施態様で利用してよい。天然構造の修飾、例えば主鎖、糖または複素環式塩基の変化により、細胞内安定性および結合親和性が増加することが示されている。主鎖化学における有用な変化には、ホスホロチオアート；ホスホロジチオアート、この場合、両非架橋性酸素はイオウで置換されている；ホスホロアミダイト；アルキルホスホトリエステルおよびボラノホスファイト（boranophosphates）がある。アキラル（A-chiral）ホスファイト誘導体には、3'−O−5'−S−ホスホロチオアート、3'−S−5'−O−ホスホロチオアート、3'−CH2−5'−O−ホスホナートおよび3'−NH−5'−O−ホスホロアミダートが含まれる。ペプチド核酸では全リボースホスホジエステル主鎖がペプチド結合で置き換わっている。固定された核酸は糖部分の高次構造についての追加の安定性を提供する。該安定性はデオキシリボースの2'−カルボキシルおよび5'カルボキシルまたは4'-カルボキシル基間の追加の結合に起因する。また、安定性および親和性を向上させるのに糖の修飾が使用される。デオキシリボースのa−アノマーを使用してよい。この場合、塩基は天然のp−アノマーに関して反転される。リボース糖の2'−OHを変化させて、2'−O−メチルまたは2'−O−アリル糖を形成させてよい。これにより、親和性を含まずに、分解に対する耐性が提供される。本発明の方法での使用を見出せる複素環式塩基の修飾は、適切な塩基対合が可能なものである。いくつかの有用な置換には、デオキシチミジンの代わりにデオキシウリジン；デオキシシチジンの代わりに5−メチル−2'−デオキシシチジンおよび5−ブロモ−2'−デオキシシチジンの置換が含まれる。5−プロピニル−2'−デオキシウリジンおよび5−プロピニル−2'−デオキシシチジンは、それぞれデオキシチミジンおよびデオキシシチジンの代わりに置換された場合、親和性および生物学的活性を増加させることが示されている。
【００８７】
塩基対合関係を形成可能な非天然存在の塩基の例には、非限定的に、アザ−およびデアザ−ピリミジンアナログ、アザ−およびデアザ−プリンアナログ、および他の複素環式塩基アナログ、この場合、プリンおよびピリミジン環の1または複数の炭素および窒素原子はヘテロ原子、例えば酸素、イオウ、セレン、リン、等によって置換されている、が含まれる。
【００８８】
固定された捕獲プローブは、わずか4、または何百もの、またはさらにそれ以上の、ヌクレオチド長であってよい。本発明によって捕獲プローブとして考慮されるのは、当技術分野で典型的にオリゴヌクレオチドと称される核酸であり、また、核酸と称されるものでもある。したがって本発明のアレイは、増幅された標的核酸またはライゲートされたプローブを比較的短い（例えば、約6、8、10、20、40、60、80、または100ヌクレオチド長を有する）捕獲プローブが固定されたアレイにハイブリダイズさせる適用においてばかりでなく、比較的短い捕獲プローブを標的核酸が固定されたアレイにハイブリダイズさせる適用においても有用である。アレイの捕獲プローブは任意の所望の配列であり得る。
【００８９】
別の実施態様では、本発明のマイクロアレイは、対応するZipComcode（ZCc）に本質的に相補的なZipcode配列を含む捕獲プローブを含む。Zipcode配列を含む捕獲プローブをスポットしてよく、あるいは該捕獲プローブをマイクロアレイ上の指定位置上で合成してよい。Zipcode配列は特有の識別子配列であり、該配列は、核酸の増幅に使用されたプローブのZipComcode配列に相補的である。本発明は、特に、多孔性三次元基板に既知の位置で連結されたZipcodesと称される特有の20〜30塩基オリゴヌクレオチド、例えば20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30塩基オリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイおよびその使用に関する。これはvanBeuningen et al.,（2001, Clinical Chemistry 47: 1931-1933）に記載されている。この文献は引用により明示的に本明細書中に包含される。これらのZipcodesは、Zipcodesに相補的な配列、すなわちZipComcodesを含有する分子に特異的にハイブリダイズする。ライゲーション−増幅反応によってこれらのZipComcodesを蛍光性プライマーに連結することによって、Zipcodeマイクロアレイを使用して微生物、例えば微生物の検体を検出および同定してよい。Zipcodesは特有の人工配列であるため、単純にZipComcodesに連結される遺伝子特異的配列を変化させることによってZipcodesを含むマイクロアレイを分子認識用の汎用プラットフォームとして使用することができる。
【００９０】
マイクロアレイ、例えばPamchip上の指定位置上で標識が検出されると、ライゲート産物およびマイクロアレイ上のZipcode配列間のハイブリダイゼーション産物の存在が示される。
【００９１】
したがって本発明は、該捕獲プローブが対応するZipComcodeに特異的にハイブリダイズする、本明細書中に記載の方法に関する。増幅標的核酸または核酸群をマイクロアレイ上の対応する捕獲プローブまたはプローブ群にハイブリダイズさせると、ハイブリダイゼーションパターンが生じるであろう。ハイブリダイゼーションの強度を含めてこのハイブリダイゼーションパターンは特定の微生物に特徴的であろう。
【００９２】
本発明は、特異的に増幅された核酸またはライゲートされたプローブを捕獲プローブにハイブリダイズさせた後にシグナルを検出する、本明細書中に記載の方法に関することが明らかであろう。該シグナルは好ましくは蛍光またはリン光シグナルであり、CCDカメラまたはレーザー走査、例えばFD10system（登録商標）（Olympus）またはPamalyzer（登録商標）（PamGeneNV）によって該蛍光またはリン光シグナルを検出してよい。
【００９３】
上に既述のように、マイクロアレイの価格は試験当たりの高いコストを示す。試験当たりの価格を減少させるために、同時に1サンプルより多くのサンプルを用いてマイクロアレイを調査することができる。その場合、個々の各サンプルをハイブリダイゼーション段階まで本発明の方法に付することが考慮され、すなわち個々の各サンプルから、微生物を捕獲し（段階a）、その後核酸を抽出し（段階b）、次いでこれをリガーゼ検出反応に付する。次いで、すべての試験サンプル由来の増幅された標的核酸（段階c）をまとめて単一マイクロアレイ上の捕獲プローブにハイブリダイズさせ（段階d）、そしてハイブリダイズした標的核酸を検出する（段階e）。サンプルごとに使用されるプローブペアは同一であってよく、例えば同一標的核酸を検出し、あるいはサンプルごとに異なっていてよく、例えば種々の標的核酸を検出する。しかし、種々のサンプル由来の増幅標的核酸同士または単一サンプル由来の種々の増幅標的核酸同士を識別するため、各プローブおよび結果的に増幅標的核酸は個別に割り当て可能でかつ検出可能である必要がある。ゆえに各プローブは、マイクロアレイ上の固有の捕獲プローブに相補的な固有かつ個別に同定可能なタグ、例えば特有のZipComcodeを含む。核酸プローブペアは種々のサンプル中の同一標的核酸を検出するであろうが、各サンプル由来の各増幅標的核酸は、マイクロアレイ上の特定アドレスに対応するその個別のタグによって追跡可能である。別の実施態様では、プローブはタグを含まないが、増幅に使用されるプライマーのみが固有かつ個別に同定可能なタグ、例えばZCcを含む。タグはサンプルごとに、および／またはプローブごとに異なり、これにより個々の各サンプルおよび／またはプローブを同定可能にすべきであろう点において、明らかに上記と同一の配慮が適用される。したがって本発明は、少なくとも2サンプル由来の増幅標的核酸を単一マイクロアレイ上に存在する捕獲プローブにハイブリダイズさせる、本明細書中に記載の方法に関する。
【００９４】
本発明の方法によって得られたデータを場合により自動様式でさらに解析してよい。例えば、得られたハイブリダイゼーションパターンをデータバンクに保存されているハイブリダイゼーションパターンと比較してよい。また、この関連で本発明は、得られたハイブリダイゼーションパターンとデータバンクに保存されているハイブリダイゼーションパターンの比較を実施可能な、コンピュータ可読媒体に保存されているコンピュータプログラムに関する。したがって本発明は、上記方法を実施可能な、コンピュータ可読媒体を含むコンピュータに関する。また本発明は、上記方法を実施可能なコンピュータプログラムを含むコンピュータ可読媒体に関する。さらにまた本発明は、前記方法の使用を可能にする、遠隔のコンピュータ上でウェブページを表示可能なコンピュータプログラムに関する。
【００９５】
別の実施態様では、本発明はサンプル中の微生物の存在を判定するのためのキットであって、本発明の方法の本質的要素を含むキットに関し、例えば該キットはフィルター、場合により該微生物から核酸を抽出するための手段、該核酸を特異的に増幅するための手段、場合により増幅された核酸を解析するための手段、例えばマイクロアレイ、例えばフロースルーマイクロアレイ、場合によりバッファーおよび／または指示マニュアルを含んでよい。
【００９６】
混合性の微生物集団についての特徴付けは、現行の方法によって容易に達成できるものではなく、ゆえに広い適用可能性を有する。細菌が見出されるほとんどの環境において、局所条件または時間の進行に応じて変化するであろう種の複合混合物が存在する。概して従来の微生物学的方法はこれらの系の研究にあまり適していない。その理由はこれらの方法が培養およびその後の個々のコロニーの単離に基づくからである。この方法では、存在する種の部分を回復するだけであろうし、また多数の単離体を生じさせ、それらを特徴付けしなければならない。複合集団から保存遺伝子を増幅し、次いでそれらをクローニングおよびシークエンシング、すなわちハイブリダイゼーションによって特徴付けすることを含む分子的方法は、培養の代替法を提供するが、依然として複雑である。さらに当該増幅段階はバイアスを導入する可能性もある。
【００９７】
活発に生育する細胞集団において、各細胞はリボソームRNAの多数のコピーを含有し、その特定配列は細菌種の同定に広く使用される（Woese 1987, Microbiol. Rev. 51:221-271）。活性な細胞内の該配列のこの天然の「増幅」のおかげで、該配列を増幅せずに検出することが可能である（Small J. et al. 2001 App. Environ. Micro. 67:4708-4716,）。本明細書中では、三次元アレイ表面上でリボソームRNAを抽出および直接同定するための方法が提供される。これにより、酵素による増幅または標識化を必要とせずにサンプル中の広範囲の種を高速かつ並行して同定することが可能になるかもしれない。本明細書中で提供される方法は、多数の分野での適用を有する、ほぼリアルタイムでの複合細菌群のモニタリングが可能であることを実証する。
【００９８】
ゆえに、本発明は、該解析段階が、スタッキングプローブを核酸、核酸混合物および／またはcDNAにハイブリダイズさせ、該スタッキングプローブは16S、18S、23Sまたは28SrRNAの領域に関して相補的であり、これにより核酸／スタッキングプローブ複合体を提供することを含む、上記方法に関することが理解されよう。該解析段階は、該核酸／スタッキングプローブ複合体を捕獲プローブにハイブリダイズさせることをさらに含んでよく、該捕獲プローブは核酸／スタッキングプローブ複合体とは別の核酸の領域に相補的である。該捕獲プローブは微生物に特異的であってよい。スタッキングプローブを標識してよい。16S、18S、23Sまたは28SrRNAの領域は（種を超えて）保存されていてよい。
【００９９】
本発明は、本発明の方法における本明細書中に記載のフィルターおよびマイクロアレイの使用に関することが当業者には明らかであろう。したがって本発明は、本発明の方法における、上に規定される少なくとも1ペアの第一核酸プローブおよび第二核酸プローブ、例えば共役プローブの使用、上記フィルターの使用、および上に規定される少なくとも1セットの2つのプライマーの使用に関する。
【０１００】
対象発明をさらに説明する前に、本発明は、本明細書中に記載される本発明の具体的実施態様に限定されないことが理解されるべきであろう。その理由は、具体的実施態様にバリエーションを施してよく、そしてバリエーションが依然として特許請求の範囲内であるからである。また、使用される用語は具体的実施態様を説明するためのものであり、限定的であることを意図しないことが理解されるべきであろう。それに代わり、本発明の範囲は特許請求の範囲によって確立される。
【０１０１】
以下、実施例および図面を提供するが、これらは限定のためではなく説明のために提供される。とは言え、該実施例および図面の内容は本発明の概念において一般化されるであろう。
【実施例１】
【０１０２】
マイクロシーブを使用する液体からの微生物の蓄積
本発明のMicro Analytical Screen（MAS）法を精密に作成し、実験室規模でのAquamarijnマイクロシーブの性能および3種の諸パイロットプラントを調査した。
【０１０３】
1．乳製品プラントでは、乳粒子の寸法に応じて、約0.5〜1.2ミクロンの細孔直径を有するマイクロシーブを適用する。10 mbarの圧力で、2000 l/m2h（リットル／m2膜表面積／時間）の平均の流動を測定する。乳中の微生物の除去に本方法のプロセスを適用する場合、乳中の最大部分のカゼインはマイクロシーブ膜を通過し、透過物中に入る。（種々の数のコロニー形成単位（cfu）のBacillussubtilisを接種された）「スパイクされた（spiked）」脱脂乳および0.5ミクロンマイクロシーブを用いる実験において、発明者らは、乳1リットル当たり1cfuのBacillussubtilisを収集および検出することができた。
【０１０４】
2．飲料プラントでは、該飲料の性質に応じて、約0.5〜1.2ミクロンの細孔直径を有するマイクロシーブを適用する。10 mbarの圧力で、3500 l/m2h（リットル／m2膜表面積／時間）の平均の流動を測定する。これらのマイクロシーブを適用した場合、発明者らは、品質を劣化させる飲料中の微生物を除去することができた。（種々の数のコロニー形成単位（cfu）のAspergillusnigerを接種された）「スパイクされた」飲料（beverages/drinks）および0.8ミクロンマイクロシーブを用いる実験において、発明者らは、ジュース1リットル当たり1 cfuのAspergillusnigerを収集および検出することができた。
【０１０５】
3．ビール醸造所では、ビールの性質に応じて、約0.5〜1.2ミクロンの細孔直径を有するマイクロシーブを適用する。20 mbarの圧力で、2500 l/m2h（リットル／m2膜表面積／時間）の平均の流動を測定する。これらのマイクロシーブを適用した場合、発明者らは、品質を劣化させる飲料中の微生物を除去することができた。（種々の数のコロニー形成単位（cfu）のKluyveromyceslactisを接種された）「スパイクされた」ビールおよび0.8ミクロンマイクロシーブを用いる実験において、発明者らは、ビール1リットル当たり1 cfuのKluyveromyceslactisを収集および検出することができた。
【０１０６】
新規解析技術、例えばMAS法を導入する場合、これらの技術、すなわち（viz. a viz.）共通に使用される技術を検証することが重要である。したがって、このMAS法を「プレートカウント」（PC）法（JECFA）と比較する。
【０１０７】
発明者らの実験では、両方法を使用して諸酵母細胞濃度を有するサンプルを解析した。得られた結果では、MAS技術を用いて、PC法の場合より多数の酵母細胞がカウントされることが示された。MAS技術では、コロニーを形成するすべての個々の細胞をカウントすることができるのに対し、PC法では、これらの細胞をまとめて、培養後の1単一細胞としてカウントする事実によって、この結果を説明することができる。またMAS検出では、寒天培地上で増殖できなかったであろう、ゆえに「プレートカウント」法では観察されない低生存性の細胞がカウントされる。
【０１０８】
MAS技術を使用して収集された微生物を、微生物の分子生物学ツールを適用することにより、さらに特徴付けおよび同定することができる。以下の実施例を参照のこと。
【実施例２】
【０１０９】
サンプルからの核酸の単離
RNAの単離
必要に応じて、RNAを単離する最も適切な手順を選択する。発明者らは、微生物からトータルRNAを単離する種々の手順を使用および比較している。従来の手順は、細菌サンプルを加熱フェノール溶液に直接注入するものである（Selinger et al., 2000, Nature Biotechnol. 18, 1262-1268）。あるいは、細胞を液体窒素中で急速に凍結し、機械的に砕いた後に酸フェノール溶液を用いて単離する。
【０１１０】
グラム陽性生物の細胞をドライアイス中で凍結し、解凍し、そしてマイクロチップ超音波処理装置で10秒間3回超音波処理する。パワーを約30Wにセットする。透明な細胞懸濁液により溶解が示される。
【０１１１】
上記方法はRNAの単離に好都合である。
【０１１２】
その後、発明者らはRNAlater（登録商標）溶液（AmbionおよびQiagen）を試験した。具体的に発明者らは、諸微生物種、例えばSaccharomyces、Lactococcus、LeuconostocおよびLactobacillusに関してRNAlater（登録商標）の浸透性を調査した。これらの4種に関して得られた結果は十分〜良好の範囲であった。
【０１１３】
さらに、市販の諸供給元（Ambion、Qiagen、Sigma-Aldrich等）から入手可能な種々のRNA単離キットが試験され、好都合であるとみなされる。
【０１１４】
DNAの単離
微生物を溶解する方法は微生物のタイプに応じて変化する。
【０１１５】
マイクロシーブの表面から微生物を取り出した後、少なくとも20秒間ボルテックスにかけて300〜500μlの滅菌蒸留水中に細胞を懸濁した。試験管を沸騰水に10分間浸して細胞を溶解した後にDNAを抽出した。遠心分離（13 krpm 10秒間）によって細胞片をペレットし、DNAを含有する上清を取り出して新たな試験管に移した。
【０１１６】
別の方法は、カオトロピック剤であるグアニジンチオシアン酸塩（GuSCN）の溶解およびヌクレアーゼ不活性化特性、およびこの薬剤の存在下におけるシリカ粒子または珪藻の核酸結合性に基づくものであった。これはBoom et al.（Boom et al.,1990, J. Clin. Microbiol 28:495-503）に記載されている。
【０１１７】
グラム陽性生物、例えばLactobacillusの場合、500μlのSTEバッファー（100 mM NaCl、50 mM Tris-HCl、10 mM EDTAナトリウム、pH7.5）に細胞を懸濁し、100μlのリゾチーム（10 mg/ml）と37℃で15分間インキュベートした。リゾチームで処理された細胞をQIAgenDNeasyTissueキット（Westburg, Leusden, the Netherlands）の指示書にしたがってさらにプロセスした。
【０１１８】
グラム陰性生物、例えばSalmonellaの場合、Genomicチップ（Qiagen）とGenomicDNAバッファーセット（Qiagen）、またはWizardTMゲノムDNA精製キット（Promega）を使用してサンプルからゲノムDNAを抽出し、精製した。
【０１１９】
カビまたは真菌、例えばAspergillusの場合、500μl OM（Osmotic Medium：1.2 M MgSO4、8.4mM Na2HPO4、1.6 mM NaH2PO4、pH 5.8）に細胞を懸濁し、50μl Glucanex（登録商標）（Novozymes, Denmark）と30℃で15〜30分間インキュベートした。ペクチノ溶解剤で処理された細胞をQIADNAミニプレップキット、またはPuregeneゲノムDNA単離キット（Gentra）の指示書にしたがってさらにプロセスした。
【０１２０】
種々の手順にしたがって単離されたDNAの濃度を260 nmでの分光測定によって評価した（Gene Quant II RNA/DNA calculator（登録商標）, Amersham Pharmacia Biotech, Woerden, the Netherlands）。
【実施例３】
【０１２１】
汎用捕獲DNAマイクロアレイの設計
発明者らは204通りの（20量体）Zipcode DNA配列のセットを設計した（Gerry et al., 1999, J. Mol.Biol. 292: 251-262）。以下に挙げるデータベースの支援によりこれらのすべてのZipcodesをブラストした：
-TIGR微生物データベース:  www.tigr.org/tdb/mdb/mdbcomplete.html, または
-Genbank ;                www.ncbi.nlm.nih.gov.
-IECB University of Vienna: www.probebase.net.
【０１２２】
さらに、内部または外部ホモロジーを示すすべてのZipcodes、所望のTm範囲（60〜72℃）に入らないすべてのZipcodesおよびその合成が困難なZipcodes、例えば5またはそれ以上のdGTPの並びを以後の解析から排除した。
【０１２３】
残り180通りのZipcodesが供給元Proligo（Paris, France）、Eurogentec（Liege, Belgium）、またはMetabion（Martinsried, Germany）によって合成され、提供された。
【０１２４】
特許WO 99/02266に記載されるように、修飾オリゴヌクレオチドを共有結合によって固定するように設計されたPAMチップを使用してマイクロアレイを製造した。
【０１２５】
非接触圧電駆動分配システム（non-contact piezo driven dispensing system）（Bio Chiparrayer Packard, Perkin Elmer）を使用して180通りの修飾Zipcodeオリゴヌクレオチド（20量体）のスポットを実施した。
【０１２６】
またポジティブおよびネガティブコントロールのオリゴヌクレオチドをZipcodes含有マイクロアレイ上にスポットした。
【０１２７】
マイクロアレイ上にスポットされる180通りの選択Zipcodesから導かれる、相補的配列、すなわちZipComcodeを含むオリゴヌクレオチドを供給元Proligo（Paris, France）、Eurogentec（Liege, Belgium）、またはMetabion（Martinsried, Germany）から入手した。
【０１２８】
これらのZipComcodeオリゴヌクレオチドを実施例4に記載のSNPWaveTM反応において使用した。
【０１２９】
この汎用捕獲DNAマイクロアレイを用いて得られた結果を実施例６に示す。
【実施例４】
【０１３０】
単離された標的配列／核酸の多重増幅および標識化
rDNAに特異的なLDR用のプローブを設計した。研究対象の細菌群の16Sまたは23S配列、ならびに研究対象の酵母および真菌群の18Sまたは28S配列に特異的なプローブを設計した。これらの各群に関して、相当な数のrDNA配列を評価し、亜群にアセンブリし、そしてClustalWアルゴリズムを使用してアライメントした。これにより、各群の共通配列が75％のカットオフで得られた（測定された4配列のうちの3配列が既定位置で共通配列を有したことを意味する）。
【０１３１】
この場合、共通プローブII、すなわち研究対象のすべての細菌群、酵母群または真菌群に共通のプローブを使用した。識別用プローブIによって特異的同定を達成した。ProbeMatchツールを用いて各セットのプローブペアの特異性を精査し、プローブ間ならびにプローブおよび標的配列間で交差ハイブリダイゼーションが生じないことを保証した。
【０１３２】
すべてのプライマーは、対応するプローブとの融解温度（Tm）値が60〜72℃の範囲であるように設計した。5'末端位置のCy3分子を有する識別用プライマーI（PBSIと同一の配列を含む）、さらに5'末端位置のZipComcodeおよびリン酸基を含む共通プライマーII（PBSIIに相補的な配列を含む）を購入した。
【０１３３】
以下の物質を含有する最終容量20μl中でLDR反応を実施した：20 mM KCl、10 mM MgCl2、20 mM Tris-HCl（pH7.5）、0.1％ NP40、0.01 mM ATP、1 mM DTT、2 pmolの各識別用プローブI、2 pmolの各共通プローブIIおよび1〜500 fmolの単離されたDNA産物／標的配列（実施例2を参照のこと）。
【０１３４】
この反応混合物を94℃で2分間予熱し、Eppendorf micro-centrifugeにおいて20秒間遠心分離し、次いで1μlの4 U/μlPfu DNAリガーゼ（Stratagene, La Jolla, California）を加えた。LDRは、PCR Expressサーマルサイクラー（Hybaid, United Kingdom）において94℃で30秒間および64℃で4分間の40ラウンドをサイクルした。
【０１３５】
LDR反応産物をPamchip−マイクロアレイとハイブリダイズさせた。このアレイには、ZipComcodesに相補的なZipcode配列がスポットされている。
【実施例５】
【０１３６】
AFLP断片の種特異的「サイン」配列への変換
Qiagen genomicキット（Westburg, Leusden, the Netherlands）を使用して、以下の微生物（表1参照）からゲノムDNAを単離精製した。制限酵素EcoRIおよびMse1を使用して一次鋳型DNAを作成した。
【０１３７】
Vos et al.の上記文献に記載されるようにAFLP解析を実施した。例外はストレプトアビジンビーズ選択を除外したことである。各2セットのプライマー由来のプライマーペアを使用してPCRを実施した。EcoRIセット中のプライマーはすべて以下のコア配列Eを含むものであった：
5' - GACTGCGTACCAATTC- 3'［配列番号１］（1または3塩基対の伸長あり）。
MseIセットのプライマーは以下の配列Mを有する：
5' - GATGAGTCCTGAGTAA - 3'［配列番号２］(1または3塩基対の伸長あり)。
プライマーの組み合わせ（EAおよびMC）および（ECおよびMA）を使用して、一次微生物鋳型をプレ増幅した。AFLP断片数を減少させるため、プライマー当たり3選択ヌクレオチドを使用して二次鋳型からAFLP断片を作成した。AFLPバンドを放射性プローブで標識した。この標識化は製造元の指示書（Amersham Pharmacia）にしたがって行った。標識されたAFLPバンドを6％（w/v）ポリアクリルアミド変性シークエンシングゲル上で電気泳動することによって分離し、そしてX線フィルムをこの乾燥ゲルに曝露することによって視覚化した。AFLP断片の単離およびオートラジオグラフでの標的AFLPバンドのクローニングをゲル中の対応する領域に合わせ、そして20〜250ヌクレオチドの範囲の適切なAFLP断片を乾燥ゲルから切り出した。該バンドを100μlの蒸留水中、4℃で1時間インキュベートすることによってゲルから溶出させた。
【０１３８】
各種に関して、20〜250ヌクレオチドの範囲の5バンドをランダムに選択し、AFLPバンドに関して記載されるように単離し、増幅し、そして適切なPCRベクター、例えばpGEM-T（Promega, Leiden, The Netherlands）またはpCR2, 1-TOPO（Invitrogen, Carlsbad, Ca, USA）内へクローニングした。
【０１３９】
Escherichia coli K12宿主においてクローニングした後に、Sequenaseバージョン2.0 DNAシークエンシングキット（United States Biochemical, Cleveland, Ohio, USA）を使用して5コロニーの各選択形質転換バンドをシークエンシングした。E.coliK12クローンのDNA配列の決定により、Oligo5.0ソフトウェア（PEBiosystems, Foster City, California, USA）を使用して、各特有のDNA配列に関するPCRプライマーを設計することができた。PCR産物を4％（w/v）Metaphorアガロースゲル（FMC, Rockland, Me, USA）上で解析した。
【０１４０】
AFLPTM実験から得られたすべてのDNA配列を、Genbank（www.ncbi.nlm.nih.gov）、TIGR（www.tigr.org/tdb/mdb/mdbcomplete.html）またはIECB University of Vienna：www.probebase.netデータベースの支援を受けてブラストした。さらに、内部または外部ホモロジーを示し、かつ所望のTm範囲（50〜75℃）に入らない、AFLPTM実験から得られたすべてのDNA配列を排除した。
【０１４１】
残りの種特異的配列を「サイン配列／タグ」と命名した。20〜60ヌクレオチドの範囲の適切なサイン配列／タグが供給元によって合成された（Proligo, Paris, FranceまたはEurogentec, Liege, Belgium、またはMetabion, Martinsried, Germany）。
【０１４２】
これらのサイン配列／タグを使用して、多重増幅および／またはマイクロアレイ分類を展開した。
【０１４３】
WO 95/11755の教示内容にしたがって修飾オリゴヌクレオチドを共有結合によって固定するように設計されたPAMチップを使用してマイクロアレイを作成した。該作成は実施例３に記載のように行った。
【実施例６】
【０１４４】
AFLP技術とPamgene技術の組み合わせによる微生物の検出および同定
ポジティブおよびネガティブコントロール配列を伴って、汎用Zipcodeマイクロアレイを実施例3に記載のように設計する。
【０１４５】
研究対象のDNA／RNAサンプルを、実施例４に記載のLDRプロトコールにしたがって適切なプライマーの存在下で増幅および標識する。SNPWaveTM反応産物の半分をMegaBACEステーションで解析する。SNPWaveTM反応産物の残りの半分をZipcodeマイクロアレイにハイブリダイズさせる。
【０１４６】
ハイブリダイゼーションプロトコール
サーモスタットで制御された、1チップを保持するインキュベーター中でインキュベーションを実施する。1チップは4マイクロアレイからなる。各マイクロアレイをサンプルにハイブリダイズさせる。当該ハイブリダイゼーションは、Microlab500シリンジポンプ（Hamilton, Nevada, USA）を使用し、10秒当たり20μlの割合でマイクロアレイ基板の細孔を通して標的溶液を前後にパルスすることによって行う。8ビットCCDカメラ（Kappa Opto Electronics GmbH, Germanyおよび付属のキャプチャプログラム）を装備したOlympus BX41またはFD10顕微鏡（Olympus, Tokyo, Japan）を用いて反応をリアルタイムモニタリングすることが可能である。
【０１４７】
0.1％ Tween 20（Sigma）を加えた25μlのPBSでの2回の洗浄（ポンプ使用）で各アレイをあらかじめ湿らせ、次いで25μlの0.6 x SSCで30秒間2回すすいだ後にハイブリダイゼーションを行う。25μl容量の0.6 x SSC中でアレイを通して上下に混合物を継続的にポンプしてハイブリダイゼーションおよび検出を実施する。標的、PCRサイクラーに直接由来する95℃のPCR産物5μl（約0.2 pmol）または0.5 pmolの適切な標的をアレイ上のハイブリダイゼーション溶液に加える。アレイ上のハイブリダイゼーションバッファーに標的を加えた後、ハイブリダイゼーションを55℃の設定温度で20分間継続させ、ハイブリダイゼーションを平衡に到達させる。混合サイクル中の、ハイブリダイゼーション溶液がアレイの下側である時点で、Microsoft Windows（登録商標）ビットマップ（BMP）画像をキャプチャし、次いで2分毎に約1℃ずつ温度を上げる。温度が1℃増加するごとに、別の画像をキャプチャする。
【０１４８】
画像解析
ArrayProソフトウェア（Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA）を使用して画像を解析する。各スポットに関してローカルコーナーバックグラウンド除去（local corners background removal）を使用して中央値シグナルを算出し、そして以後の解析用にデータをExcel（Microsoft）にエクスポートする。
【実施例７】
【０１４９】
フロースルーマイクロアレイ基板上でのrRNAの直接検出および同定方法
Staphylococcal種の同定および特徴付け
リボソームRNAの単離に至る任意の核酸手順を使用することができる。本事例では、Boom法（上記参照）を使用して、最初にリソスタフィンによって酵素的に細菌細胞壁を分解した後、S.aureus（289）およびS.epidermidis（286）の培養からDNAおよびRNAを抽出した。0.5 mlの培養液から遠心分離よって当該細菌を回収し、100μlの水に再懸濁した。1μlの1 mg/mlリソスタフィン溶液を加え、懸濁液を室温で20分間インキュベートした。
【０１５０】
この抽出物の2μlアリコートを1μlの1μM標識蛍光プローブ（Staph 23Sスタッキングプローブ）溶液の存在下で2分間加熱した。該プローブはStaphylococcal23S rRNAの領域に関して相補的である（図１）。
【０１５１】
加熱サンプルプローブ混合物を、湿らせたPamChip（van Beuningen et al. Clin. Chem. 47:1931-1933）に即時に加えた。該チップには、異なるStaphylococcal種に特異的な3オリゴヌクレオチドがスポットされ（Anthony et al. (2000) J. Clin. Microbiol. 38:781-788）、55℃の0.6 x SSC溶液25μlを含有する。PamChipを通して30秒ごとに1回ハイブリダイゼーション溶液をポンプしながら、該チップを蛍光顕微鏡下でモニターし、任意のシグナルを記録した。1分以内にシグナルを検出した。ハイブリダイゼーションを10分間継続させ、その時点以後、シグナルは非常に強かった（図２）。PamChipを65℃に加熱して、蛍光シグナルの任意の減少をモニターすることにより、検出された任意の配列のアイデンティティーを確認した（図３）。rRNAの抽出元の種に対応するスポットから特異的シグナルを検出した。
【０１５２】
結論
本実験は、酵素による標識化または増幅を必要としない、高速で、並行的で、直接的で、かつ特異的な細菌の同定が実施可能であることを実証する。
【実施例８】
【０１５３】
細菌株の説明およびDNAの単離
以下20のSalmonella菌株を解析用に選択した：
1. Salmonella enterica ssp. enterica血清型Agona
2. Salmonella enterica ssp. enterica血清型Anatum
3. Salmonella enterica ssp. enterica血清型Bovismorbificans
4. Salmonella enterica ssp. enterica血清型Braenderup
5. Salmonella enterica ssp. enterica血清型Brandenburg
6. Salmonella enterica ssp. enterica血清型DT104
7. Salmonella enterica ssp. enterica血清型Dublin
8. Salmonella enterica ssp. enterica血清型Enteritidis
9. Salmonella enterica ssp. enterica血清型Goldcoast
10. Salmonella enterica ssp. enterica血清型Hadar
11. Salmonella enterica ssp. enterica血清型Heidelberg
12. Salmonella enterica ssp. enterica血清型Infantis
13. Salmonella enterica ssp. enterica血清型Livingstone
14. Salmonella enterica ssp. enterica血清型Muenchen
15. Salmonella enterica ssp. enterica血清型Newport
16. Salmonella enterica ssp. enterica血清型Oranieenburg
17. Salmonella enterica ssp. enterica血清型Panama
18. Salmonella enterica ssp. enterica血清型Saintpaul
19. Salmonella enterica ssp. enterica血清型Thyphimurium
20. Salmonella enterica ssp. enterica血清型Virchow
【０１５４】
純粋培養を栄養培養液内へ接種して、37℃でo/n培養した。1 mlのこのo/n培養を使用してDNAを単離した。この単離は、Qiagen genomicDNA単離キットを製造元（Qiagen, Westburg, Leusden, the Netherlands）が推奨する手順にしたがって使用して行った。
【実施例９】
【０１５５】
Salmonella菌株のAFLPフィンガープリント
Vos et al., Nucleic Acids Research 23(21), (1995), 4407-4414に記載のようにプライマーの組み合わせNlaIII-TaqIを使用してAFLP解析を実施した。一方はTaqI-および一方はNlaIII-AFLPプライマー由来のプライマーペアを使用してPCRを実施した。NlaIIIに関するAFLPプライマーはすべて以下のコア配列を含んでいた：
5'- GACTGCGTACACTAG-3'（2塩基対の伸長を伴う）。
TaqIに関するAFLPプライマーはすべて以下のコア配列を含んでいた：
5'-GATGAGTCCTGAGCGA-3'（2塩基対の伸長を伴う）。
【０１５６】
4種のNlaIIIプライマー+2を4種のTaqIプライマー+2と組み合わせて使用し、16通りのプライマーの組み合わせを得た（可能なすべてのペアの組み合わせ）。5'OHを33P-ATPでリン酸化することによってNlaIIIプライマーを末端標識した。当該標識化は、Vos et al., Nucleic Acids Research 23(21), (1995), 4407-4414に記載されるように行った。16通りのAFLPプライマーの組み合わせを使用して、「実施例８」に記載の全20のSalmonella血清型に関してAFLPフィンガープリントを作成した。使用されたAFLPプライマーの組み合わせを以下に示す。
NlaIIIプライマー                          TaqIプライマー
NlaIII-AC                                 TaqI-AC
NlaIII-AG                                 TaqI-AG
NlaIII-TC                                 TaqI-TC
NlaIII-TG                                 TaqI-TG
【０１５７】
Vos et al., Nucleic Acids Research 23(21), (1995), 4407-4414に記載されるように、AFLP断片を6％（w/v）ポリアクリルアミド変性シークエンシングゲル上で電気泳動することによって分離した。電気泳動後にゲルをWhatman3MMペーパー（Whatmanplc, Kent, U.K.）にトランスファーし、BIORAD（Biorad inc., Hercules, CA, U.S.A.）スラブゲルドライヤー上で乾燥した。乾燥ゲルをX線フィルム（Eastman Kodak, New Haven, CT, U.S.A.）に曝露することによってAFLPフィンガープリントを視覚化した。
【実施例１０】
【０１５８】
AFLP断片の特徴付け
「実施例８」由来のSalmonella菌株についてのAFLPフィンガープリントのオートラジオグラフ画像を、有用である可能性があるAFLP断片に関して検査した。この検査では、諸菌株間で異なるAFLP断片を重要視した。トータルで50種の潜在的に興味深い断片を、対応する乾燥ゲルから切り出し、50μlの10 mM Tris.HCl、1 mM EDTA pH 8.0中で2時間再水和した。こうしてAFLP断片を水性溶液中へ溶出させる。次いで、10μlの各AFLP溶出液を使用して、E.coliにおける組換えクローンを作成した。この作成では、「HTP Zero Blunt TOPO PCR Cloning Hit for Sequencing」を製造元Invitrogen（Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA, U.S.A.）によって提供される指示書にしたがって使用した。Birnboim & Doly（NucleicAcids Research 7[6], 1979, 1513-1523）のアルカリプラスミドDNA単離法を使用して、50クローニングイベントの各々についての2クローンからプラスミドDNAを単離し、100プラスミドDNA調製物を得た。MegaBACE1000キャピラリーDNAシーケンサー（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, U.S.A.）で「DYEnamic ETDye Terminator Kit」（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, U.S.A.）を使用して、100プラスミドDNAの各々についてのAFLP断片挿入物をシークエンシングした。
【実施例１１】
【０１５９】
AFLP断片とSalmonella thyphymurium LT2全ゲノム配列の適合
50 AFLP断片の配列をSalmonella thyphymurium LT2の完全ゲノム配列（McCleland et al., Nature413, [2001], 852-856；genbankアクセッション番号16421550）に適合させた。すべての断片をゲノム配列にさかのぼって追跡することができた。ゲノム全体にわたって均一に広がる36の対応するゲノムセグメントを以後の解析用に選択した。
【実施例１２】
【０１６０】
Salmonella菌株のゲノムDNA断片のPCR増幅およびシークエンシング
ソフトウェアパッケージOLIGO-6（MedProbe, Oslo, Norway）を使用して、「実施例１１」の36のゲノムDNAセグメントをゲノムDNA調製物から直接増幅するためのPCRプライマーセットを選択した。元のAFLP断片およびさらに少なくとも50塩基対の上流および下流の配列を含む配列を増幅するプライマーセットを選択した。さらにまた、OLIGO-6パッケージを使用して、全36PCRプライマーペアのPCR産物を2方向でダイレクトシークエンシングするためのシークエンシング用プライマーを選択した。4つの選択Salmonella血清型（実施例８）に関して全36プライマーペアを用いる増幅反応を実施した。該増幅は、トータルで50μlの反応容量中で10 pMolの各プライマーを使用したことを除き、「実施例９」のAFLP解析と同一のPCR条件を使用して行った。36プライマーペアのうち27がこれらの4つのゲノムSalmonellaDNAに関して良好かつ均一のPCR産物を提供した。次いでこれらの27プライマーペアを使用して、「実施例８」の全20 Salmonella血清型に関するPCR産物を作成した。
【０１６１】
MegaBACE 1000キャピラリーDNAシーケンサー（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, U.S.A.）で「DYEnamicETDyeTerminator Kit」（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, U.S.A.）を使用して、PCR断片をシークエンシングした。OLIGO-6ソフトウェアパッケージによって選択されたシークエンシング用プライマーを使用して、2方向で断片をシークエンシングした。
【実施例１３】
【０１６２】
一塩基多型の同定および選択
27の各ゲノムセグメントに関して、ClustalWソフトウェアパッケージ（European Bioinformatics Institute, www.ebi.org, Hinxton, U.K.から無料で入手可能）を使用して全20 PCR産物の配列をアライメントした。このような多数の配列アライメントのうちの3例を図６に示す。27セグメント中、一塩基多型（SNP）を有する可能性があるトータルで222の位置を同定した。この関連でのSNPとは、その位置で少なくとも1塩基がすべての他の塩基と異なっているヌクレオチド位置であると定義される（図６）；ほとんどの場合、2つの配列変異体が被験個体に一定のパーセンテージで存在し、該パーセンテージは対立遺伝子頻度と定義される。約50％の対立遺伝子頻度を有するSNPが一般に最も情報価値のあるものである。対立遺伝子頻度に加えて、SNP周囲の配列状況はSNP選択に関する重要な側面である。SNPコレクションからのライゲーションプローブ設計では、以下の主な判定基準を適用した：
・対立遺伝子頻度約50％；
・SNPの25ヌクレオチド上流および下流に追加のSNPなし；
・SNPの25ヌクレオチド上流および下流における40〜60％の平均G-C含量。
【実施例１４】
【０１６３】
ライゲーション−増幅プローブの設計
ライゲーション−増幅プローブは以下のデザイン（5'-3'）を有するものであった。このプローブは5'末端から3'末端方向にセグメントa、b、c、d、eを有する（図４Ａ）：
1．標的配列に相補的な20〜30ヌクレオチドのセグメントa（図４Ａ、cSeq1）；
2．増幅プライマー2に相補的な19 ヌクレオチドのセグメントb（図４Ａ、cMse）；
3．増幅プライマー1と同一の19ヌクレオチドのセグメントc（図４Ａ、Eco）；
4．ZipComcode配列を含む24ヌクレオチドのセグメントd（図４Ａ、ZIP）；
5．標的配列に相補的で、かつセグメントaのすぐ下流に位置する20〜30ヌクレオチドのセグメントe（図４Ａ、cSeq2）
すべてのプローブをMetabion GmbH（Martinsried, Germany）に注文した。
【実施例１５】
【０１６４】
ライゲーション−増幅反応（図４Ｂ１〜４Ｂ４）
増幅プライマーは以下の配列を有するものであった：
プライマー1（Eco）：5'-FAM-GTAGACTGCGTACCAATTC-3'
プライマー2（Mse）：5'-GACGATGAGTCCTGAGTAA-3'
プライマーはMetabion GmbH（Martinsried, Germany）に注文した；FAMは、プライマー1の5'末端に共有結合によって結合されている蛍光色素の名称であり、増幅産物を標識するのに使用される。
【０１６５】
以下の物質を含有する10μl容量中でライゲーション反応を実施した：
1.0 fMolの各ライゲーション−増幅プローブオリゴヌクレオチド、
104分子の解析対象の生物の標的DNA、
5単位のTaq DNAリガーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA, U.S.A.）、
1.0μlの10 x Taq DNAリガーゼバッファー（New England Biolabs, Beverly, MA, U.S.A.）、
最終容量10μlまでの滅菌水。
【０１６６】
Biorad「iCycler」（Biorad, Hercules, CA, U.S.A.）においてライゲーション反応物を98℃で30秒間、次いで55℃で20時間インキュベートした。
【０１６７】
ライゲーション後、エキソヌクレアーゼ処理を実施して、すべての未反応プローブを除去した。この目的で、20 mM Tris.HCl pH 8.5中の5単位のエキソヌクレアーゼIおよび5単位のエキソヌクレアーゼIIIを含有する溶液10μlを加えた。37℃で30分間、次いで80℃で30分間、反応物をインキュベートした。
【０１６８】
最後に増幅反応を実施した。この目的で、20 mM Tris.HCl pH 8.5中の10 pMolのプライマー1、10 pMolのプライマー2、0.5単位のAmplitaqDNAポリメラーゼ（Applied Biosystems, Foster City, CA, U.S.A.）、0.35 mM dNTP（25 mM dNTP-mix由来, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, U.S.A.）を含有する溶液30μlを加えた。Vos et al., Nucleic Acids Research 23(21), (1995), 4407-4414に記載の増幅条件を使用してPCRを実施した。
【実施例１６】
【０１６９】
FD10ハイブリダイゼーションステーション上での増幅産物の検出
サーモスタットで制御された、1チップを保持するインキュベーター中でインキュベーションを実施する。1チップは4マイクロアレイからなる。各マイクロアレイをサンプルにハイブリダイズさせる。このハイブリダイゼーションは、Microlab500シリンジポンプ（Hamilton, Nevada, USA）を使用し、10秒当たり20μlの割合でマイクロアレイ基板の細孔を通して標的溶液を前後にパルスすることによって行う。8ビットCCDカメラ（Kappa Opto Electronics GmbH, Germanyおよび付属のキャプチャプログラム）を装備したOlympus BX41またはFD10顕微鏡（Olympus,Tokyo, Japan）を用いて反応のリアルタイムモニタリングが可能である。
【０１７０】
50μlの0.6 x SSPE（1 x SSPE = 150 mM NaCl、15 mM NaH2PO4、1mM EDTA、pH 6.8）で3回洗浄して（ポンプ使用）各アレイをあらかじめ湿らせる。（例えば実施例15の）5μlの反応産物を含有する50μl容量の0.6x SSPE中で、アレイを通して上下に混合物を継続的にポンプして、ハイブリダイゼーションおよび検出を実施する。55℃で10分間ハイブリダイゼーションを実施する。10分間のハイブリダイゼーションの終了時点で12ビットMicrosoftTIFF画像をキャプチャする。
【０１７１】
ArrayProソフトウェア（Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA）を使用して画像を解析する。各スポットに関してローカルコーナーバックグラウンド除去（local corners background removal）を使用して中央値シグナルを算出し、以後の解析用にデータをExcel（Microsoft）にエクスポートする。
【実施例１７】
【０１７２】
ZIPコード配列
E.coliのバクテリオファージラムダを使用して（48,501塩基対）、49 ZIP配列のセットを選択した。ソフトウェアパッケージOLIGO-6（MedProbe, Oslo, Norway）を使用して該バクテリオファージのDNAゲノムを走査し、24量体の配列を選択した。該配列は、150 mM NaCl、100 pMプローブで約60℃のTm、40〜60％のGC含量、および最小の内部塩基対合を有する。例として、10種のこのようなラムダ由来ZIP配列を以下に示す。
【０１７３】
【表１】
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【実施例１８】
【０１７４】
Salmonella血清型の検出
1．実施例８に記載の20細菌株からDNAを単離した；
2．諸血清型の識別用に17 SNPのセットを選択した（実施例９、１０、１１、１２および１３）；
3．実施例１７由来の49 ZIP配列（ZCc）のうちの17種を使用して、実施例１４に記載のようにライゲーション−増幅プローブを設計した；
4．実施例１５に記載のようにライゲーション−増幅反応を実施した；
5．PAMチップを利用するマイクロアレイを製造した。該アレイには、4セットの49オリゴヌクレオチドを使用する14 x 14形式に合わせて196オリゴヌクレオチドを共有結合により固定した：オリゴヌクレオチド（Zipcodes）の7 x 7アレイを4通りにスポットした。オリゴヌクレオチド番号2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18および19は段階3のライゲーション−増幅プローブの17ZIPComcode配列に相補的であった。コントロールの目的でオリゴヌクレオチド1、8、20および21を使用した。
6．実施例１６に記載のように、段階4のPCR産物のアリコートを段階5のマイクロアレイにハイブリダイズさせた；
7．実施例１６に記載のようにマイクロアレイ画像を解析した（図５を参照のこと）。
【０１７５】
図５はPCR産物がPAMチップに（4通りに）ハイブリダイズした結果を示す。該マイクロアレイは血清型ごとに固有のパターンを提供し、これにより検出および同定が可能である。ハイブリダイゼーション自体によって、ならびにハイブリダイゼーションの強度によって前記パターンを特徴付けする。
【実施例１９】
【０１７６】
複数の食品サンプル中でのSalmonella血清型の検出
1．2サンプルを採取した。一方は粉乳由来であり、一方は鶏肉由来であった。サンプル100 gを採取し、次いでこれを250 mlのEEB（Entero-bacteriaceae Enrichment Broth）内へ移し、37℃で16時間インキュベートした。国内用途の標準的な肉粉砕機を使用して鶏肉を砕いた後にEEB培地に移した；
2．インキュベーション後、1 mlの両サンプルを採取し、実施例８に記載のように2サンプルからDNAを単離した；
3．実施例１８に記載のように諸血清型の識別用に17 SNPのセットを選択した。
4．実施例１４に記載のようにライゲーション−増幅プローブを設計した：実施例１７由来の49 ZIP配列のうちの34種を使用して各17プローブ（ZIPComcodes）の2セットを設計した。これらのプローブセットはそのZIPComcode配列を除いて同一であった。ZIPComcode配列は完全に異なっていた；
5．実施例１５に記載のようにライゲーション−増幅反応を実施した；粉乳起源のサンプル1に関してプローブセット1を使用し、鶏肉起源のサンプル2に関してプローブセット2を使用した；
6．実施例１８に記載のようにPAMチップを利用するマイクロアレイを製造した。プローブセット1の17 ZIPComcodesに相補的な17オリゴヌクレオチド（Zipcodes）をPAMチップの左手側に2通りに配置した；プローブセット2の17 ZIPComcodesに相補的な17オリゴヌクレオチド（ZIPcodes）をPAMチップの右手側に2通りに配置した；
7．実施例１７に記載のように、それぞれサンプル1およびサンプル2についての2アリコートの段階5のPCR産物を混合し、段階6のマイクロアレイにハイブリダイズさせた；
8．実施例１７に記載のようにマイクロアレイ画像を解析した（図７を参照のこと）。
【０１７７】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】図１はStaphylococcal種の配列アライメントである。T尾部を含むStaphylococcalプローブはマイクロアレイ（チップ）に結合している。S. aureus、S. epidermidisおよびS. sapprophiticusに共通の配列を含むスタッキングプローブが描写されている。これは3'末端に標識を含有する。
【図２】図２は、55℃におけるPamChip上の諸Staphylococcal種のハイブリダイゼーションシグナルである。
【図３】図３は、65℃におけるPamChip上の諸Staphylococcal種のハイブリダイゼーションシグナルである。
【図４】図４はリガーゼ検出反応と、その後のPCR増幅である。A：標的領域に特異的にハイブリダイズする2領域cSeq1およびcSeq2、2プライマー結合領域cMseおよびEco、およびZipComcode（ZIP）を含むプローブ。B1：系統1では、cSeq1およびcSeq2を有するプローブを標的領域のその相補的配列Seq1およびSeq2にそれぞれ特異的にハイブリダイズさせ、その後、一本鎖（ss）ニックをライゲートする。系統2では、cSeq1およびcSeq2を有するプローブを標的領域のその相補的配列Seq 1およびSeq2にそれぞれハイブリダイズさせる。しかし、cSeq2の3'部位の変異のせいで、cSeq2および標的領域のSeq2の間にミスマッチが存在する。したがって、一本鎖（ss）ニックをライゲートすることができない。B2：系統1では、ssニックのライゲーションにより環状プローブが生じる。      系統2では、プローブは線状のままである。B3：系統1では、Mseに相補的なプライマーを用いるハイブリダイゼーションにより、例えばPCRによって、このプライマーの伸長が可能になり、そして次の領域順序、5'-Mse-Seq1-Seq2-cZIP-cEco-3'を有し、Aのプローブに相補的な鋳型が生じる。      系統2では、Mseに相補的なプライマーを用いてハイブリダイゼーションを行っても、例えばPCRによって、このプライマーの制限された伸長しか可能でない。これにより、Aのプローブに相補的であり、ならびに次の領域順序、5'-Mse-Seq1-3'を有し、したがって領域Seq2、cZIPおよびcEcoを失った短縮化された鋳型が生じる。B4：系統1では、段階B3の鋳型の領域cEcoに相補的な、標識されたプライマーEcoを伸長させる。段階B3およびB4を反復し、指数関数的な増幅を生じさせることができる。標識された伸長産物は、例えばそのZipComcode（ZIP）領域を有する該産物をマイクロアレイ上の相補的捕獲プローブにハイブリダイズさせることによって、検出することができる。      系統2では、標識されたプライマーEcoは鋳型にハイブリダイズすることができず、伸長されない。結果的に、Mseプライマーを用いるリニアな増幅しか可能でない。
【図５】図５は諸S. enterica ssp enterica血清型の検出産物の比較である。
【図６】図６は諸S. enterica ssp enterica血清型に関する典型的なプローブ領域のリストである。
【図７】図７は、単一PAMチップを使用して、それぞれ粉乳（左手側）および鶏肉（右手側）において検出されたS. enterica ssp enterica血清型パターンの比較である。
【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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