(57)【要約】本発明は、シアノカルボン酸エステルからジカルボン酸モノエステルを製造するための方法に関する。特に、さまざまな形態のＡｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４５）のニトリラーゼを酵素触媒として利用して、脂肪族または芳香族シアノカルボン酸エステルを変換率１００％という高い化学選択性で対応するジカルボン酸モノエステルに変換する。本発明の一実施形態では、高い化学選択性と高い位置選択性とを得るための方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）水性反応混合物中の脂肪族または芳香族シアノカルボン酸エステルを、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ由来の化学選択的なニトリラーゼ活性により特徴づけられる酵素触媒と接触させ、
（ｂ）（ａ）で生成する脂肪族または芳香族ジカルボン酸モノエステルを単離する
ことを含んでなる、脂肪族または芳香族シアノカルボン酸エステルからの脂肪族または芳香族ジカルボン酸モノエステル製造方法。
【請求項２】
脂肪族シアノカルボン酸エステルが、式
Ｒ３Ｏ２Ｃ（ＣＲ１Ｒ２）ｎＣＨ２ＣＮ
（式中、ｎは０〜１６であり、各（ＣＲ１Ｒ２）単位のＲ１およびＲ２は各々水素、ヒドロキシル、アルコキシル、アリールオキシル、未置換のもしくは置換されたアルキル、未置換のもしくは置換されたアルケニル、未置換のもしくは置換されたアルキリデン、未置換のもしくは置換されたアルキルアリール、未置換のもしくは置換されたアリール、アルコキシカルボキシル、およびアリールオキシカルボキシルよりなる群から選択され、Ｒ３は未置換のもしくは置換されたアルキル、アルキルアリール、およびアリールよりなる群から選択される）
を有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
芳香族シアノカルボン酸エステルが、式
【化１】
2004518408.tif 000011
（式中、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は各々水素、ヒドロキシル、アルコキシル、アリールオキシル、未置換のもしくは置換されたアルキル、未置換のもしくは置換されたアルケニル、未置換のもしくは置換されたアルキルアリール、未置換のもしくは置換されたアリール、アルコキシカルボキシル、およびアリールオキシカルボキシルよりなる群から選択され、Ｒ９は未置換のもしくは置換されたアルキル、アルキルアリール、およびアリールよりなる群から選択される）
を有する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
酵素触媒が、微生物細胞全体、浸透化処理した微生物細胞、微生物細胞抽出物の１もしくはそれ以上の成分、部分精製酵素（単数もしくは複数）または精製酵素（単数もしくは複数）の形態である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
酵素触媒が、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２−ＰＦ−１５（ＡＴＣＣ  ５５７４７）、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２−ＰＦ−１７（ＡＴＣＣ  ５５７４５）、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）、およびＡｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗニトリラーゼ活性を発現するように形質転換した微生物細胞全体よりなる群から選択される微生物細胞全体の形態である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗニトリラーゼ活性を持つ形質転換した微生物細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＳＳ１００１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７７）またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＳＷ９１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７５）である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
微生物細胞全体の形態である酵素触媒が、可溶性支持体または不溶性支持体の上または中に固定化されている請求項５に記載の方法。
【請求項８】
部分精製酵素または精製酵素の形態である酵素触媒が、可溶性支持体または不溶性支持体の上または中に固定化されている請求項４に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）水性反応混合物中で、式
Ｒ３Ｏ２Ｃ（ＣＲ１Ｒ２）ｎＣＨ２ＣＮ
（式中、ｎは０〜１６であり、各（ＣＲ１Ｒ２）単位のＲ１およびＲ２は各々水素、ヒドロキシル、アルコキシル、アリールオキシル、未置換のもしくは置換されたアルキル、未置換のもしくは置換されたアルケニル、未置換のもしくは置換されたアルキリデン、未置換のおよび置換されたアルキルアリール、未置換のもしくは置換されたアリール、アルコキシカルボキシル、またはアリールオキシカルボキシルよりなる群から選択され、Ｒ３は未置換のもしくは置換されたアルキル、アルキルアリール、およびアリールよりなる群から選択される）
を有する脂肪族シアノカルボン酸エステルを、化学選択的なニトリラーゼ活性により特徴づけられ且つ、
Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）、
Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２−ＰＦ−１５（ＡＴＣＣ  ５５７４７）、
Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２−ＰＦ−１７（ＡＴＣＣ  ５５７４５）、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＳＳ１００１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７７）、および
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＳＷ９１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７５）
よりなる群から選択される酵素触媒と接触させ、
（ｂ）（ａ）で生成する脂肪族ジカルボン酸モノエステルを単離する
ことを含んでなる、対応する脂肪族シアノカルボン酸エステルから脂肪族ジカルボン酸モノエステルを製造するための化学選択的方法。
【請求項１０】
（ａ）水性反応混合物中で、式
【化２】
2004518408.tif 000012
（式中、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は各々水素、ヒドロキシル、アルコキシル、アリールオキシル、未置換のもしくは置換されたアルキル、未置換のもしくは置換されたアルケニルと、未置換のもしくは置換されたアルキルアリール、未置換のもしくは置換されたアリール、アルコキシカルボキシル、およびアリールオキシカルボキシルよりなる群から選択され、Ｒ９は未置換のもしくは置換されたアルキル、アルキルアリール、およびアリールよりなる群から選択される）
を有する芳香族シアノカルボン酸エステルを、化学選択的なニトリラーゼ活性により特徴づけられ且つ、
Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）、
Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２−ＰＦ−１５（ＡＴＣＣ  ５５７４７）、
Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２−ＰＦ−１７（ＡＴＣＣ  ５５７４５）、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＳＳ１００１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７７）および、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＳＷ９１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７５）
よりなる群から選択される酵素触媒と接触させ、
（ｂ）（ａ）で生成する芳香族ジカルボン酸モノエステルを単離する
ことを含んでなる、対応する芳香族シアノカルボン酸エステルから芳香族ジカルボン酸モノエステルを製造するための化学選択的方法。
【請求項１１】
酵素触媒が、微生物細胞全体、浸透化処理した微生物細胞、微生物細胞抽出物の１もしくはそれ以上の成分、または部分精製酵素（単数もしくは複数）または精製酵素（単数もしくは複数）の形態である請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
酵素触媒が、可溶性支持体または不溶性支持体の上または中に固定化されている微生物細胞全体の形態である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
酵素触媒が、可溶性支持体または不溶性支持体の上または中に固定化されている部分精製酵素（単数もしくは複数）または精製酵素（単数もしくは複数）の形態である請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）１）位置選択的および化学選択的なニトリラーゼ活性および２）非位置選択的なニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性により特徴づけられるＡｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）細胞全体の懸濁液を、約３５℃〜７０℃の温度に１０〜１２０分間加熱し、それによって非位置選択的なニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性を破壊し且つ位置選択的なニトリラーゼ活性を保存し、
（ｂ）場合により、微生物細胞全体の触媒を可溶性支持体または不溶性支持体の上または中に固定化し、
（ｃ）水性反応混合物中で脂肪族または芳香族シアノカルボン酸エステルを微生物細胞全体の触媒と接触させ、
（ｄ）（ｃ）で生成する脂肪族または芳香族ジカルボン酸モノエステルを単離する
ことを含んでなる、脂肪族または芳香族シアノカルボン酸エステルから脂肪族または芳香族ジカルボン酸モノエステルを製造するための位置選択的および化学選択的方法。
【請求項１５】
（ａ）脂肪族シアノカルボン酸エステルが、式
Ｒ３Ｏ２Ｃ（ＣＲ１Ｒ２）ｎＣＨ２ＣＮ
（式中、ｎは０〜１６であり、各（ＣＲ１Ｒ２）単位のＲ１およびＲ２は各々水素、ヒドロキシル、アルコキシル、アリールオキシル、未置換のもしくは置換されたアルキル、未置換のもしくは置換されたアルケニル、未置換のもしくは置換されたアルキリデン、未置換のおよび置換されたアルキルアリール、未置換のもしくは置換されたアリール、アルコキシカルボキシル、またはアリールオキシカルボキシルよりなる群から選択され、Ｒ３は未置換のもしくは置換されたアルキル、アルキルアリール、およびアリールよりなる群から選択される）
を有し、
（ｂ）対応する脂肪族ジカルボン酸モノエステルを単離する、
脂肪族ジカルボン酸モノエステルを製造するための請求項１４に記載の位置選択的および化学選択的方法。
【請求項１６】
（ａ）芳香族シアノカルボン酸エステルが、式
【化３】
2004518408.tif 000013
（式中、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は各々水素、ヒドロキシル、アルコキシル、アリールオキシル、未置換のもしくは置換されたアルキル、未置換のもしくは置換されたアルケニル、未置換のもしくは置換されたアルキルアリール、未置換のもしくは置換されたアリール、アルコキシカルボキシル、およびアリールオキシカルボキシルよりなる群から選択され、Ｒ９は未置換のもしくは置換されたアルキル、アルキルアリール、およびアリールよりなる群から選択される）
を有し、
（ｂ）対応する芳香族ジカルボン酸モノエステルを単離する、
芳香族ジカルボン酸モノエステルを製造するための請求項１４に記載の位置選択的および化学選択的方法。
【請求項１７】
（ａ）場合により、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗのニトリラーゼ酵素活性を発現するように形質転換した微生物細胞全体の触媒を可溶性支持体または不溶性支持体の上または中に固定化し、
（ｂ）水性反応混合物中で脂肪族または芳香族シアノカルボン酸エステルを段階（ａ）の微生物細胞全体の触媒とを接触させ、
（ｃ）（ｂ）で生成する脂肪族または芳香族ジカルボン酸モノエステルを単離する
ことを含んでなる、脂肪族または芳香族シアノカルボン酸エステルから脂肪族または芳香族ジカルボン酸モノエステルを製造するための位置選択的および化学選択的方法。
【請求項１８】
（ａ）脂肪族シアノカルボン酸エステルが、式
Ｒ３Ｏ２Ｃ（ＣＲ１Ｒ２）ｎＣＨ２ＣＮ
（式中、ｎは０〜１６であり、各（ＣＲ１Ｒ２）単位のＲ１およびＲ２は各々水素、ヒドロキシル、アルコキシル、アリールオキシル、未置換のもしくは置換されたアルキル、未置換のもしくは置換されたアルケニル、未置換のもしくは置換されたアルキリデン、未置換のおよび置換されたアルキルアリール、未置換のもしくは置換されたアリール、アルコキシカルボキシル、またはアリールオキシカルボキシルよりなる群から選択され、Ｒ３は未置換のもしくは置換されたアルキル、アルキルアリール、およびアリールよりなる群から選択される）
を有し、
（ｂ）対応する脂肪族ジカルボン酸モノエステルを単離する、
対応する脂肪族シアノカルボン酸エステルから脂肪族ジカルボン酸モノエステルを製造するための請求項１７に記載の位置選択的および化学選択的方法。
【請求項１９】
（ａ）芳香族シアノカルボン酸エステルが、式
【化４】
2004518408.tif 000014
（式中、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は各々水素、ヒドロキシル、アルコキシル、アリールオキシル、未置換のもしくは置換されたアルキル、未置換のもしくは置換されたアルケニル、未置換のもしくは置換されたアルキルアリール、未置換のもしくは置換されたアリール、アルコキシカルボキシル、およびアリールオキシカルボキシルよりなる群から選択され、Ｒ９は未置換のもしくは置換されたアルキル、アルキルアリール、およびアリールよりなる群から選択される）
を有し、
（ｂ）対応する芳香族ジカルボン酸モノエステルを単離する、
対応する芳香族シアノカルボン酸エステルから芳香族ジカルボン酸モノエステルを製造するための請求項１７に記載の位置選択的および化学選択的方法。
【請求項２０】
Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗのニトリラーゼ酵素活性を発現するように形質転換した微生物細胞全体の触媒が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＳＳ１００１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７７）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＳＷ９１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７５）よりなる群から選択される請求項１７または１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、シアノカルボン酸エステルからジカルボン酸モノエステルを製造するための方法に関する。特に、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗのニトリラーゼが脂肪族または芳香族シアノカルボン酸エステルを変換率１００％という高い化学選択性で対応するジカルボン酸モノエステルに変える変換を触媒する。
【０００２】
背景技術
ニトリルはさまざまな化学プロセスで容易に対応するカルボン酸に変換されるが、これらのプロセスでは一般に強酸性または強塩性の反応条件と高い反応温度が必要であり、不要な副産物および／または大量の無機塩が不要な廃棄物として生成されてしまうのが普通である。ニトリルを化学的に加水分解する際に用いられる反応条件では、同じく分子内に存在するエステル官能基も加水分解されてしまうのが普通である。たとえば、テトラハロフタル酸による芳香族または脂肪族のシアノカルボン酸エステルの化学選択的な加水分解では対応するジカルボン酸モノエステルが５６％から６５％の収率で生成されるが、等モル量のテトラハロフタル酸を使用すると望ましくない副産物が生成された（Ｒｏｕｎｄｓら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．（１９８８）２９、６５５７）。酵素触媒によってニトリル含有基質を対応するカルボン酸に加水分解する方法のほうが化学的な方法より好ましいことが多い。酵素触媒による方法では、反応が１）周囲温度で実施されることが多く、２）強酸性または強塩基性の反応条件も必要とせず、３）選択性の高い所望の生成物が高い変換率で得られるためである。
【０００３】
ニトリラーゼ酵素は、アミドの中間体を形成せずに水性反応混合物中でニトリルを対応するカルボン酸およびアンモニアに直接変換する。Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓの立体特異的なニトリラーゼがキラルカルボン酸の製造時にラセミ体のニトリルの転換に用いられており、ニトリラーゼをコードする遺伝子がクローニングおよび発現されている（ＷＯ  ００／２３５７７）。また、脂肪族、芳香族および複素環式ニトリルの加水分解を触媒する好熱性細菌であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｌｌｉｄｕｓ株Ｄａｃ５２１からニトリラーゼが単離されている（Ａｌｍａｔａｗａｈら、Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ（１９９９）３：２８３〜２９１）。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＮＣＩＭＢ  ４０７５７またはＮＣＩＭＢ  ４０８３３のニトリラーゼを用いて、アクリロニトリルのアクリル酸アンモニウムへの変換も行われている（米国特許第５，９９８，１８０号）。さまざまな脂肪族ニトリルを対応するカルボン酸アンモニウム塩にする加水分解を触媒するＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  Ｋ２２から単離した脂肪族ニトリラーゼについて、Ｋｏｂａｙａｓｈｉらによる説明がある（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９０）４６、５５８７〜５５９０；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９９０）１７２、４８０７〜４８１５）。一定範囲の脂肪族α，ω−ジニトリルを対応するω−シアノカルボン酸アンモニウム塩またはジカルボン酸ジアンモニウム塩のいずれかに変換することができるＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉのニトリラーゼが単離されている（カナダ特許第２，１０３，６１６号；Ｓ．Ｌｅｖｙ−Ｓｃｈｉｌら、Ｇｅｎｅ（１９９５）１６１、１５〜２０）。
【０００４】
ニトリラーゼは、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＮＣＩＭＢ  １１２１６（Ｃ．Ｂｅｎｇｉｓ−Ｇａｒｂｅｒ、Ａ．Ｌ．Ｇｕｔｍａｎ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９８９）３２、１１；Ｍ．Ｌ．Ｇｒａｄｌｅｙ、Ｃ．Ｊ．Ｋｎｏｗｌｅｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔ．（１９９４）１６、４１）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＰＡ−３４（Ｂｈａｌｌａら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９２）３７、１８４）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．ｓｐ．ｍｅｌｏｎｉｓ（Ａ．Ｇｏｌｄｌｕｓｔ、Ｚ．Ｂｏｈａｋ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８９）１１、５８１）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＡＫ  ２２６（Ｋ．Ｙａｍａｍｏｔｏ、Ｋ．Ｋｏｍａｔｓｕ、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）５５、１４５９）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ８７５０（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．（１９９２）７３、４２５）およびＡｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（Ｇａｖａｇａｎら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）６３、４７９２）によっても生成される。
【０００５】
ニトリル官能基を化学選択的に対応するカルボン酸に変換する機能は、農業用化学製品および医薬品を製造する上での強力な手段である。このような産業ではニトリル以外の官能基の加水分解によって収率が低下するのを防ぐ必要がある。エステル、アセタールまたはエポキシドなどの他の加水分解性官能基の保護および脱保護をなくすことで、業界ではさらにメリットが得られることになろう。
【０００６】
プロパン二酸モノエチルエステル（一般に、マロン酸エチル水素またはマロン酸モノエチルとして知られている）が有用な二官能性ビルディングブロックのひとつである（たとえば、Ｐｏｌｌｅｔｔら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９７８）２、１４２〜１４３を参照のこと）。マロン酸モノエチルは、ニトリラーゼ活性を持つＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＧｏｒｄｏｎａまたはＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ細胞を用いてシアノ酢酸エチルエステルの加水分解によって製造されている（ＷＯ  ９８３７２１９）：Ｇ．ｔｅｒｒａｅ  ＭＡ−１を用いると、マロン酸モノエチルの収率８９．９％が得られた。この方法は、マロン酸ジエチルの化学的な加水分解とエステラーゼを用いるマロン酸ジエチルの酵素による位置選択的な加水分解のどちらと比べても収率およびコストの点で優れているというのが売りである。
【０００７】
（微生物細胞触媒に含まれているものであるか単離された酵素としての）ニトリルを加水分解する酵素がすべてシアノカルボン酸エステルニトリル基を化学選択的に加水分解して対応するジカルボン酸モノエステルを生成できるわけではない。このプロセスでは、エステルも加水分解されてしまったり、あるいは酵素の化学選択性が特定のシアノカルボン酸エステル反応物に対して特異的であったりということもある。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．の固定化された酵素製造物の持つシアノカルボン酸エステルに対する化学選択的な加水分解について検討がなされている（ｄｅ  Ｒａａｄｔら、Ｊ．Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎｓ  Ｔｒａｎｓ．Ｉ、（１９９２）１、１３７〜１４０）。ここでは、２−シアノエチルプロパン二酸ジエチルエステルが９２％の収率で化学選択的に１，１，３−プロパントリカルボン酸ジエチルエステルに加水分解した。一方、これと同一の条件で５−シアノペンタン酸メチルエステルはアジピン酸に対する化学選択性のない状態で完全に変換された（完全エステルおよびニトリル加水分解）。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＮＣＩＭＢ  １１２１６の休眠細胞によるシアノカルボン酸エステルの化学選択的な加水分解についても検討がなされて（Ｋｌｅｍｐｉｅｒら、Ｆｏｏｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９６）３４、６７〜７０）おり、この触媒を用いて、２−シアノエチルプロパン二酸ジエチルエステルが５６％の収率で化学選択的に１，１，３−プロパントリカルボン酸ジエチルエステルに変換された（２０％の２−シアノエチルプロパン二酸モノエチルエステルも生成された）。一方、これと同一の条件で５−シアノペンタン酸メチルエステルは５−シアノ吉草酸に対する化学選択性のない状態で完全に変換された（ニトリル加水分解を伴わない完全エステル加水分解）。４−シアノ安息香酸メチルおよびエチルエステルの加水分解については、Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＮＣＩＭＢ  １１２１６（上掲のＫｌｅｍｐｉｅｒら）によって１００％の変換時にそれぞれ７９％および４２％の収率で対応する１，４−ベンゼンジカルボン酸エステルが生成され、エステル加水分解生成物が残りの反応副産物を占めていた。
【０００８】
米国特許第５，８５８，７３６号には、微生物であるＡｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）のニトリラーゼ活性を、水性反応混合物中にて脂肪族α，ω−ジニトリルを対応するω−シアノカルボン酸およびアンモニアに加水分解するための触媒として利用することについて記載されている。ニトリラーゼは極めて位置選択的であるため、α−アルキル−α，ω−ジニトリルを加水分解してもω−シアノ基の加水分解によるω−シアノカルボン酸しか生成されないことが明らかになっている。米国特許第５，８１４，５０８号には、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）を適当な緩衝液に入れた懸濁液を５０℃で短時間加熱することで、所望のニトリラーゼ活性を大幅に低下させることなく細胞全体の触媒の望ましくないニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性を失活させる方法について記載されている。
【０００９】
解決すべき課題では、他の加水分解性官能基の存在下で、高収率かつ高い選択性で、必要な温度が低く廃棄物も少ないという利点をさらに兼ね備えた、ニトリル官能基を化学選択的に加水分解するための使いやすい酵素触媒が依然として存在しない。
【００１０】
発明の概要
脂肪族または芳香族シアノカルボン酸エステルから脂肪族または芳香族ジカルボン酸モノエステルを製造するための方法について開示する。本発明は、（ａ）水性反応混合物中で脂肪族または芳香族シアノカルボン酸エステルを、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ由来の化学選択的なニトリラーゼ活性により特徴づけられる酵素触媒と接触させ、（ｂ）（ａ）で生成する脂肪族または芳香族ジカルボン酸モノエステルを単離することを含んでなる。特に、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）のニトリラーゼを酵素触媒として用いて、脂肪族または芳香族シアノカルボン酸エステルを変換率１００％という高い化学選択性で対応するジカルボン酸モノエステルに変換する。
【００１１】
本発明の他の実施形態では、微生物細胞全体、浸透化処理した微生物細胞、微生物細胞抽出物の１もしくはそれ以上の成分および部分精製酵素（単数もしくは複数）または精製酵素（単数もしくは複数）の形態である、ニトリラーゼ活性を持つ酵素触媒を利用する。これらの異なる形態の酵素触媒を、当業者間で周知の手法を用いて可溶性支持体または不溶性支持体の表面または当該触媒中に固定化してもよい。ニトリラーゼ活性により特徴づけられ、この方法において有用な微生物としては、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）およびその変異体、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２−ＰＦ−１５（ＡＴＣＣ  ５５７４７）、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２−ＰＦ−１７（ＡＴＣＣ  ５５７４５）が挙げられる。さらに、Ａ．ｆａｃｉｌｉｓのニトリラーゼ活性を持つ、質転換された微生物細胞も本発明に含まれる。このような形質転換した微生物細胞の触媒の例にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＳＳ１００１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７７）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＳＷ９１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７５）がある。
【００１２】
本発明のさらに他の実施形態は、（１）位置選択的および化学選択的なニトリラーゼ活性および（２）非位置選択的なニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性により特徴づけられる微生物細胞全体、好ましくは上述したＡ．ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ株およびＡ．ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗのニトリラーゼ活性を持つ、形質転換した微生物細胞を、シアノカルボン酸エステルを対応するジカルボン酸モノエステルに変換するための酵素触媒として利用することである。この場合、触媒として利用する前に微生物細胞全体を約３５℃から７０℃の温度まで１０から１２０分間加熱し、これによって非位置選択的なニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性を破壊し、かつ、位置選択的なニトリラーゼ活性を保存する。形質転換した微生物細胞全体に非位置選択的なニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性がない場合は、熱処理工程は必要ない。非位置選択的なニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性のない形質転換した微生物細胞触媒の例にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＳＳ１００１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７７）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＳＷ９１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７５）がある。いずれの場合も、場合により、酵素触媒を可溶性支持体または不溶性支持体の上または中に固定化してもよい。
【００１３】
本発明のさらに他の実施形態では、式Ｒ３Ｏ２Ｃ（ＣＲ１Ｒ２）ｎＣＨ２ＣＮ（式中、ｎ＝０〜１６であり、各（ＣＲ１Ｒ２）単位のＲ１およびＲ２は各々水素、ヒドロキシル、アルコキシル、アリールオキシル（ａｒｙｌｏｘｙｌ）、未置換のもしくは置換されたアルキル、未置換のもしくは置換されたアルケニル、未置換のもしくは置換されたアルキリデン、未置換のもしくは置換されたアルキルアリール、未置換のもしくは置換されたアリール、アルコキシカルボキシル、またはアリールオキシカルボキシルよりなる群から選択され、Ｒ３は未置換のもしくは置換されたアルキル、アルキルアリールまたはアリールよりなる群から選択される）で表される脂肪族シアノカルボン酸エステルを利用する。
【００１４】
本発明のさらに他の実施形態では、式
【化５】
2004518408.tif 000002
（式中、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は各々水素、ヒドロキシル、アルコキシル、アリールオキシル、未置換もしくは置換されたアルキル、未置換もしくは置換されたアルケニル、未置換もしくは置換されたアルキルアリール、未置換もしくは置換されたアリール、アルコキシカルボキシルまたはアリールオキシカルボキシルよりなる群から選択され、Ｒ９は未置換のもしくは置換されたアルキル、アルキルアリールまたはアリールよりなる群から選択される）で表される芳香族シアノカルボン酸エステルを基質として利用する。
【００１５】
生物の寄託に関する簡単な説明
本願出願人らは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の定めにより、以下の生物の寄託を行った。
【００１６】
【表１】
2004518408.tif 000003
【００１７】
本願明細書において使用する「ＡＴＣＣ」とは、ＡＴＣＣ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９，ＵＳＡに所在する米国菌株保存機関の国際寄託当局を示す。「国際寄託の表示」とは、ＡＴＣＣでの寄託培養の受入番号を示す。
【００１８】
列挙した寄託物は、表記の国際寄託当局にて少なくとも３０年間保管され、これについて開示している特許の付与時に一般公開される。寄託物を利用できることがすなわち政府の措置により付与された特許権の適用範囲内で当該発明を実施するための実施許諾をなすものではない。
【００１９】
発明の詳細な記述
Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗのニトリラーゼ活性を利用する、対応するシアノカルボン酸エステルから脂肪族または芳香族ジカルボン酸モノエステルを高い収率で化学選択的に製造する方法を開発した。ニトリラーゼ酵素は、対応するアミド中間体を形成せずに脂肪族または芳香族のニトリルを対応するカルボン酸に直接変換する（式１）。
式１．
【化６】
2004518408.tif 000004
【００２０】
現時点では、酵素触媒作用を用いて得られる高い収率とジカルボン酸モノエステルに対する選択性とを得ることができる、シアノカルボン酸エステルの脂肪族または芳香族のシアノ基を化学選択的に加水分解するための酵素的な方法は存在しない。非酵素的なニトリルの加水分解反応では一般に、ニトリルの溶液を高温で加熱する（強い酸または塩基の存在下であることが多い）必要がある。これとは対照的に、本願明細書で説明する酵素触媒反応は、水性反応混合物中にて酸または塩基を加えることなく中性のｐＨで周囲温度にて実施されるものである。
【００２１】
本発明によって生成されるジカルボン酸モノエステルは、農業、材料産業、医薬品産業における価値の高い化学薬品用の前駆体として有用である。これらの前駆体が望ましい化合物を形成する上で有用であるだけでなく、本発明を用いることで、すでに知られている化学的な方法に関連した加工面における多数の利点も得られる。特許請求の範囲に記載の発明では廃棄物がほとんど生成されず、生成物を回収するための使いやすい方法が得られる。この方法では、水を溶媒として用いる場合で７０℃未満の温度にて高収率でジカルボン酸モノエステルが得られる。
【００２２】
Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）にあるニトリラーゼは、位置選択性が極めて高いだけでなく化学選択性も極めて高く、エステル官能基の存在下にてニトリル官能基を選択的に加水分解する目的で利用できることが明らかになっており、これは本発明の主題でもある。
【００２３】
Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）の懸濁液を約５０℃で１時間熱処理すると、極めて高い化学選択性で特定の基質を加水分解する微生物細胞全体の触媒が得られる。表１に示すように、シアノカルボン酸エステルの完全変換の時点で少なくとも９７％の収率で脂肪族ジカルボン酸モノエステルが生成され、少なくとも９４％の収率で芳香族ジカルボン酸モノエステルが生成される。
【００２４】
【表２】
2004518408.tif 000005
【００２５】
添付の実施例で説明するように、精製したＡ．ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗニトリラーゼ、Ａ．ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗの細胞抽出物、Ａ．  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗニトリラーゼ活性を持つ浸透化処理した細胞および形質転換した細胞を含むＡ．ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗの細胞全体を利用して、ジカルボン酸モノエステルも同様の収率で得られている。
【００２６】
Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）株の２種類の変異体が製造されている（米国特許第５，８５８，７３６号）が、この変異体では、脂肪族ジニトリルの非位置選択的なニトリル加水分解につながる望ましくないニトリルヒドラターゼ活性が極めて低いレベルでしか発生しない。これらの変異株であるＡｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２−ＰＦ−１５（ＡＴＣＣ  ５５７４７）およびＡｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２−ＰＦ−１７（ＡＴＣＣ  ５５７４５）では、脂肪族または芳香族シアノカルボン酸エステルを対応するジカルボン酸モノエステルに加水分解する触媒として使用する前に細胞を熱処理しなくてよい。これらの変異体は、化学選択的な本発明において作用的であると思われる。ニトリラーゼの位置選択性が不要な場合には、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）株を熱処理して非位置選択性のニトリルヒドラターゼ活性を失活させる必要はない（実施例３および４参照）。
【００２７】
ニトリラーゼ遺伝子の形質転換と発現
形質転換した宿主からニトリラーゼ活性を異種発現することに関する報告がある（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：２４７；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２０７４６；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、１９９２、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１：９０００〜９００７；米国特許第４，８１０，６４８号）。場合によっては、良好な酵素活性を発現させるために宿主を特異的に修飾しなければならないことがある（Ｌｅｖｙ−Ｓｃｈｉｌら、１９９５、Ｇｅｎｅ  １６１：１５〜２０；米国特許第５，８３０，６９３号；米国特許第５，６３５，３９１号）。良好なニトリラーゼ活性が見出された場合、形質転換した宿主で発現された酵素では手を加えていない酵素が持つニトリル水和活性が保たれている。Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗのニトリラーゼ活性を含むように形質転換した微生物（たとえば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＳＳ１００１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７７）またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＳＷ９１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７５）など）も本発明における触媒として有用な場合がある。
【００２８】
定義：
本件特許出願において、特に明記しない限り、以下の略語および定義を適用する。
【００２９】
以下、本願明細書中で用いる略語は、測定値、技術、特性または化合物の単位に相当する。「ｓｅｃ」は秒（単数もしくは複数）を意味し、「ｍｉｎ」は分（単数もしくは複数）を意味し、「ｈ」は時間（単数もしくは複数）を意味し、「ｄ」は日（単数もしくは複数）を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモル（単数もしくは複数）を意味し、「Ａｍｐｒ」はアンピシリン耐性を意味し、「Ａｍｐｓ」はアンピシリン感受性を意味し、「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｋｄ」はキロダルトンを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｗｔ」は重量を意味する。「ＯＲＦ」はオープンリーディングフレームを意味し、「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィを意味し、「ｃａ」は約を意味し、「Ｏ．Ｄ．」は指定波長での光学密度を意味し、「ＩＵ」は国際単位を意味し、「ｗｃｗ」は湿細胞重量を意味し、「ｄｃｗ」は乾燥細胞重量を意味する。
【００３０】
「ＰＭＳＦ」はフッ化フェニルメチルスルホニルを示す。
【００３１】
「酵素触媒」または「微生物細胞全体の触媒」とは、ニトリラーゼ活性により特徴づけられる触媒を示す。酵素触媒は、微生物細胞全体、浸透化処理した微生物細胞（単数もしくは複数）、微生物細胞抽出物の１またはそれ以上の細胞成分、部分精製酵素（単数もしくは複数）または精製酵素（単数もしくは複数）の形態であってもよい。
【００３２】
「化学選択的」とは、分子の１つの官能基（ニトリル基など）が１つまたはそれ以上の異なる官能基（エステル基および／またはエポキシド基など）の存在下で選択的に反応する反応を示す。化学選択性とは、化学的な試薬、触媒または酵素が、２つまたはそれ以上の異なる官能基のうちの１つと優先的に反応することである。限られた数の異なる官能基のうち１つでしか反応が起こらない場合、この試薬は化学選択性が極めて高いことになる。
【００３３】
「位置選択的な反応」とは、２つまたはそれ以上の構造異性体を生成できるが、一方のみを排他的または優先的に生成する反応を示す。区別が完全である場合に反応が完全に（１００％）位置選択的であるといい、ひとつのサイトにおける反応の生成物が他のサイトでの反応の生成物よりも優勢である場合は部分的に（ｘ％）位置選択的であるという。また、この区別を半定量的に位置選択性が高いまたは低いという。
【００３４】
「Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ」および「Ａ．ｆａｃｉｌｉｓ」という用語は同義に用いられる。
【００３５】
「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」および「Ｅ．ｃｏｌｉ」という用語は同義に用いられる。
【００３６】
好ましい実施形態の説明
方法および材料：
Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ株７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）の増殖
Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ株７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）の凍結したシードロットバイアル１つを解凍し、内容物１ｍＬを以下に列挙する滅菌種菌培地５００ｍＬに入れた。２リットル容のフラスコで２４〜３０時間、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃にて種菌を増殖させた。
【００３７】
【表３】
2004518408.tif 000006
【００３８】
【表４】
2004518408.tif 000007
【００３９】
振盪フラスコからの種菌を事前に滅菌して下記に列挙する発酵槽培地を入れたＢｒａｕｎ  Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｃ発酵槽に無菌状態で移した。増殖は以下の条件で行った。３２℃、ｐＨ６．８〜７．０、溶存酸素飽和度の２５％。接種時、発酵槽には発酵槽培地８．５リットルに加えてＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ溶液２１８ｇを入れ、開始濃度をグリセロール約７ｇ／Ｌとしておいた。Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ溶液には、その成分として、脱イオン水０．２５リットルに入れたリン酸二水素カリウム１９．６ｇ；硫酸マグネシウム七水和物３．３ｇに加えて硫酸４ｍＬを脱イオン水０．１５リットルに入れたもの；微量金属溶液６７ｍＬに加えてグリセロール４００ｇを脱イオン水０．８０リットルに入れたものを別々に滅菌して冷却後に混合して含む。接種後１８時間の時点で、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ溶液の供給を開始した。まず、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ溶液をフィード０．４ｇ／分（グリセロール０．１５ｇ／分）の速度で添加した。培養のＯＤ  ５５０は約８〜９であった。２６時間の時点で、供給速度をフィード０．９ｇ／分（グリセロール０．３ｇ／分）まで高めた。ＯＤ  ５５０は約１６〜１８時間であった。供給速度を最後にフィード１．８ｇ／分（グリセロール０．６ｇ／分）まで高める作業は３４時間の時点で行った。この速度を最後まで維持した（約４２時間）。最終的なＯＤ  ５５０は約６５〜７５であった。
【００４０】
発酵槽培地
成分：                                    最終濃度：
リン酸二水素カリウム                    ０．３９ｇ／Ｌ
リン酸一水素カリウム                    ０．３９ｇ／Ｌ
Ｄｉｆｃｏ酵母エキス                    ５．０ｇ／Ｌ
【００４１】
細胞ならびに細胞ペーストを遠心分離によって回収し、使用するまで冷凍保管した。凍結乾燥によって得た湿細胞ペーストの乾燥細胞重量は湿細胞重量で２４％が中心であった。生体触媒として利用するにあたり、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）細胞を触媒として利用する前に０．３５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中にて１時間で５０℃まで加熱し、ニトリルヒドラターゼ活性を失活させてもよい。
【００４２】
当業者間で周知の方法（トルエン、洗浄剤または凍結・解凍法での処理など）で細胞全体を浸透化処理し、細胞に出入りする材料の拡散率を改善するようにしてもよい。
【００４３】
細胞抽出物の製造とニトリラーゼタンパク質の精製
特に明記しない限り、この手順に含まれる工程についてはいずれも５℃およびｐＨ７．５で実施した。
【００４４】
２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、２．０ｍＭのジチオトレイトール中にて、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）湿細胞ペーストの２５ｗｔ％懸濁液を製造した。
【００４５】
従来技術において周知の方法に従ってフレンチプレス（米国メリーランド州シルバースプリングのアメリカンインスツルメント社）に通すことで上記懸濁液の抽出物を製造した。細胞片を除去するための２７，５００×ｇにて３０分間の遠心分離に続いて、抽出物の２０〜５５％硫酸アンモニウム分画物を製造し、続いて固体状の硫酸アンモニウムを飽和度の６５％まで加えた後に一晩沈殿させて濃縮した。２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）（緩衝液Ａ）を最低量で用いて濃縮タンパク質沈殿物を元に戻し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５樹脂（ファルマシア）の入ったＰＤ１０カラムで脱塩処理した。脱塩後、Ｑ−セファロースファーストフロー（ファルマシア）５０ｍＬの入ったカラムを用いる陰イオン交換クロマトグラフィで濃縮タンパク質抽出物を分画した。濃縮タンパク質抽出物をカラムに仕込んだ後、３カラム容量の緩衝液Ａを用いて流量２ｍＬ／分でカラムを洗浄し、吸着されなかったタンパク質を除去した。緩衝液Ａ中にて製造した０〜０．５ＭのＮａＣｌグラジエントを用いて、吸着されたタンパク質をカラムから溶出した。カラムからのタンパク質の溶出を２８０ｎｍでモニタリングした。
【００４６】
ベンゾニトリルが加水分解されて安息香酸が生成される過程を測定するアッセイ（Ｇａｖａｇａｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９）５２、６５４〜６５９）を用いて、精製の最初から最後までニトリラーゼ活性をモニタリングした。ニトリラーゼ活性は０．４ＭのＮａＣｌにおいて溶出した。１０〜１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで還元条件下（５％β−メルカプトエタノール）にてゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行い、０．４ＭのＮａＣｌタンパク質画分中のタンパク質成分を分離した。０．４ＭのＮａＣｌタンパク質画分のうち５０％を上回る画分がサブユニット分子量３９．７ｋｄのタンパク質で構成されていた。従来技術において周知の方法を用いて、ゲル濾過ＭＷ標準（ファルマシアＮｏ．１７−０４４２−０１）で較正したＨｉｌｏａｄ１６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ファルマシア）を用いて２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）中でゲル濾過クロマトグラフィを行い、手を加えていない状態でのニトリラーゼの分子量を求めたところ、５７０ｋｄであった。ゲル濾過後、ニトリラーゼタンパク質の純度は９０％を上回っていた。２−メチルグルタロニトリルを基質として２５℃で精製酵素の比活性を求めたところ、３５ＩＵ／ｍｇタンパク質であった。
【００４７】
脂肪族または芳香族シアノカルボン酸エステルの加水分解反応
シアノカルボン酸エステルと適当な酵素触媒の水性懸濁液とを混合することによって、脂肪族または芳香族シアノカルボン酸エステルを含有する水性反応混合物を製造する。この場合、浸透化処理または加熱などの前処理を何ら施すことなく微生物細胞全体を触媒として利用することが可能である。あるいは、このような細胞をポリマーマトリックス（アルギン酸ビーズまたはポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧ）粒子など）の中または可溶性支持体または不溶性支持体（セライトなど）の表面に固定化し、触媒の回収および再利用をしやすくすることも可能である。細胞をポリマーマトリックス中または可溶性支持体または不溶性支持体表面に固定化するための方法については広く報告がなされており、当業者間で周知である。また、細胞全体からニトリラーゼ酵素を単離して触媒として直接利用してもよいし、ニトリラーゼをポリマーマトリックス中または可溶性支持体または不溶性支持体表面に固定化してもよい。これらの方法についても広く報告されており、当業者間で周知である（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１巻：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ；  Ｇｏｒｄｏｎ  Ｆ．Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ編；  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、ＵＳＡ；１９９７）。
【００４８】
本発明において開始材料として用いる脂肪族または芳香族シアノカルボン酸エステルの中には、水に対してわずかに可溶性である程度のものがある。このようなエステルの溶解性は溶液の温度や水性相における塩（緩衝液）濃度にも左右される。この場合、最初は（酵素触媒と溶解した脂肪族または芳香族シアノカルボン酸エステルとを含有する）水性相と有機相（未溶解の脂肪族または芳香族シアノカルボン酸エステル）の二相で構成される反応混合物を用いると、開始時のシアノカルボン酸エステルの溶解限界を超える濃度で芳香族または脂肪族ジカルボン酸モノエステルを含有する水性反応混合物を生成することができる。反応が進むにつれて、脂肪族または芳香族シアノカルボン酸エステルが水性相に溶解し、最終的には単相の混合生成物が得られる。二相反応混合物の水性相には、少なくとも、ａ）脂肪族または芳香族シアノカルボン酸エステルを対応するジカルボン酸モノエステルに完全に変換し、ｂ）酵素触媒の加水分解活性を維持できる程度の量の水のみ含有することが可能である。ここでの反応については、酵素加水分解による反応速度とほぼ同じ速度で脂肪族または芳香族シアノカルボン酸エステルを反応混合物に加え、単相の水性反応混合物を維持し、かつ開始材料濃度が高い場合に酵素の基質阻害が起こる潜在的な問題を回避して実施してもよい。
【００４９】
対応する脂肪族または芳香族シアノカルボン酸エステルの完全変換時の混合生成物中における脂肪族または芳香族ジカルボン酸モノエステルの最終濃度は０．００１Ｍから脂肪族または芳香族ジカルボン酸モノエステルの溶解限界までの範囲であればよい。一般に、脂肪族または芳香族ジカルボン酸モノエステルの濃度を０．１０Ｍから２．０Ｍの範囲とする。（触媒の除去後に）濃ＨＣｌを加えて反応混合物のｐＨを２．０から２．５の間に調整し、得られる溶液を塩化ナトリウムで飽和させ、酢酸エチル、エチルエーテルまたはジクロロメタンなどの適当な有機溶媒を用いて脂肪族または芳香族ジカルボン酸モノエステルを抽出して、混合生成物から脂肪族または芳香族ジカルボン酸モノエステルを単離してもよい。この有機抽出物を混合し、好適な乾燥剤（硫酸マグネシウムなど）と一緒に攪拌し、濾過し、（ロータリーエバポレーションなどにより）溶媒を除去して、所望の生成物を高収率および高純度（一般に純度９８〜９９％）で生成する。必要であれば、この生成物を再結晶化または蒸留によってさらに精製してもよい。
【００５０】
反応混合物中における酵素触媒の濃度は酵素触媒ごとの触媒活性に左右され、所望の反応速度が得られるように選択される。加水分解反応で触媒として用いられる微生物細胞の湿細胞重量は一般に、総反応容量１ｍＬあたりの湿細胞で０．００１グラムから０．１００グラムの範囲であり、好ましくは１ｍＬあたりの湿細胞で０．００２グラムから０．０５０グラムの範囲である。微生物細胞の比活性（ＩＵ／グラム湿細胞ｗｔ．）については、微生物細胞触媒の既知の重量を利用して、シアノカルボン酸エステル基質の０．１０Ｍ溶液が２５℃で所望のジカルボン酸モノエステルに変換される率を測定して求める。酵素活性のＩＵは、毎分１マイクロモルの基質を生成物に変換するのに必要な酵素活性量と定義される。
【００５１】
反応速度および酵素触媒活性の安定性の両方を最適化できるように加水分解反応の温度を選択する。反応の温度は懸濁液の氷点（約０℃）を微妙に上回る温度から７０℃までの範囲であればよいが、好ましい反応温度の範囲は５℃から３５℃である。反応の初期ｐＨを５．０から１０．０の間に維持し、好ましくは６．０から８．０の間に維持する蒸留水または緩衝液の水性反応混合物中に細胞を懸濁させ、微生物細胞触媒の懸濁液を製造してもよい。反応が進むにつれて、シアノカルボン酸エステルの対応するニトリル官能基からカルボン酸のアンモニウム塩が形成されて反応混合物のｐＨが変化する場合がある。ｐＨを制御せずに反応を実施してシアノカルボン酸エステルの変換を完了させてもよいし、反応実施時に好適な酸または塩基を加えて所望のｐＨを維持するようにしてもよい。
【００５２】
以下の実施例は、本発明をさらに説明することを目的とするものであって、本発明を限定するものではない。この実施例では、微生物による加水分解反応時に形成される脂肪族シアノカルボン酸エステルの回収率（％）ならびに加水分解生成物の収率（％）はいずれも、反応混合物中に含まれる最初の脂肪族シアノカルボン酸エステルの量を基準にしたものであり、屈折率検出器およびＳｕｐｅｌｃｏｓｉｌ  ＬＣ−１８−ＤＢ  カラム（１５ｃｍ×直径４．６ｍｍ）を用いてＨＰＬＣによって求めた。微生物による加水分解反応時に形成される１，４−ベンゼンジカルボン酸モノメチルエステルおよび加水分解生成物の収率は、水性反応混合物中に含まれる最初の芳香族シアノカルボン酸エステルの量を基準にしたものであり、ＨＰ−５キャピラリーカラム（３０ｍ×内径０．３２ｍｍ、膜厚０．２５ミクロン）を用いてガスクロマトグラフィによって求めた。
【００５３】
実施例１
ブタン二酸モノメチルエステル
１０ｍＬ容のメスフラスコに、３−シアノプロパン酸メチルエステル０．４５８６ｇ（４．０５ｍｍｏｌ、０．４０５Ｍ）と、リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）９．０８ｍＬと、２２．９ｍｇ／ｍＬの（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）細胞から単離した）精製ニトリラーゼを２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５、１ｍＭのジチオトレイトールおよび０．１ｍＭのＥＤＴＡを含有）に加えた水溶液０．５０ｍＬとを入れ、得られた１０ｍＬの溶液を２５℃で攪拌した。試料（０．１００ｍＬ）を蒸留水０．３００ｍＬと混合し、遠心分離した後、１：４に希釈した上清０．３６０ｍＬを０．７５０ＭのＮ−メチルプロピオンアミド（ＨＰＬＣ外部標準液）０．０４０ｍＬと混合した。得られた溶液をＨＰＬＣによって分析した。６．０時間後に３−シアノプロパン酸メチルエステルの変換が完了したが、この時点で３−シアノプロピオン酸またはブタン二酸は生成されず、ブタン二酸モノメチルエステルの（ＨＰＬＣで求めた）収率は１００％であった。
【００５４】
実施例２
ブタン二酸モノメチルエステル
８２．２ｍｇ（乾燥細胞重量）／ｍＬの水性細胞抽出物（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）細胞から製造）を１００ｍＭのカリウム緩衝液（ｐＨ７．０、１ｍＭのジチオトレイトールと０．１ｍＭのＰＭＳＦとを含有）に加えたものを５０℃で２５分間加熱した後、２５℃まで冷却した。１０ｍＬ容のメスフラスコに、３−シアノプロパン酸メチルエステル０．４５７７ｇ（４．０５ｍｍｏｌ、０．４０５Ｍ）と、リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）９．２８ｍＬと、熱処理した８２．２ｍｇ（乾燥細胞重量）／ｍＬの細胞抽出液０．３０ｍＬとを加え、得られた１０ｍＬの溶液を２５℃で攪拌した。試料（０．１００ｍＬ）を蒸留水０．３００ｍＬと混合し、遠心分離した後、１：４に希釈した上清０．３６０ｍＬを０．７５０ＭのＮ−メチルプロピオンアミド（ＨＰＬＣ外部標準液）０．０４０ｍＬと混合した。得られた溶液をＨＰＬＣによって分析した。６．０時間後に３−シアノプロパン酸メチルエステルの変換が完了したが、この時点で３−シアノプロピオン酸またはブタン二酸は生成されず、ブタン二酸モノメチルエステルの（ＨＰＬＣで求めた）収率は１００％であった。
【００５５】
実施例３
ブタン二酸モノメチルエステル
１０ｍＬ容のメスフラスコに、３−シアノプロパン酸メチルエステル０．４５３６ｇ（４．０１ｍｍｏｌ、０．４０１Ｍ）と、リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）９．３８ｍＬと、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）細胞を０．３５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０、５０℃で１時間かけて事前に熱処理）に加えた５０ｗｔ％細胞懸濁液（湿細胞重量で０．１０ｇ、乾燥細胞重量で０．０２４ｇ）０．２０ｍＬとを入れ、得られた１０ｍＬの懸濁液を２５℃で攪拌した。試料（０．１００ｍＬ）を蒸留水０．３００ｍＬと混合し、遠心分離した後、１：４に希釈した上清０．１８０ｍＬを０．７５０ＭのＮ−メチルプロピオンアミド（ＨＰＬＣ外部標準液）０．０２０ｍＬと混合した。得られた溶液をＨＰＬＣによって分析した。４．０時間後に３−シアノプロパン酸メチルエステルの変換が完了したが、この時点で３−シアノプロピオン酸またはブタン二酸は生成されず、ブタン二酸モノメチルエステルの（ＨＰＬＣで求めた）収率は９９％であった。
【００５６】
実施例４
ブタン二酸モノメチルエステル
１０ｍＬ容のメスフラスコに、３−シアノプロパン酸メチルエステル０．４５１５ｇ（３．９９ｍｍｏｌ、０．３９９Ｍ）と、リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）９．３８ｍＬと、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）細胞を０．３５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０、添加前に５０℃での細胞懸濁液の熱処理を実施せず）に加えた５０ｗｔ％細胞懸濁液（湿細胞重量で０．１０ｇ、乾燥細胞重量で０．０２４ｇ）０．２０ｍＬとを入れ、得られた１０ｍＬの懸濁液を２５℃で攪拌した。試料（０．１００ｍＬ）を蒸留水０．３００ｍＬと混合し、遠心分離した後、１：４に希釈した上清０．１８０ｍＬを０．７５０ＭのＮ−メチルプロピオンアミド（ＨＰＬＣ外部標準液）０．０２０ｍＬと混合した。得られた溶液をＨＰＬＣによって分析した。５．０時間後に、３−シアノプロパン酸メチルエステルの変換が完了したが、この時点で３−シアノプロピオン酸またはブタン二酸は生成されず、ブタン二酸モノメチルエステルの（ＨＰＬＣで求めた）収率は１００％であった。
【００５７】
実施例５
ブタン二酸モノメチルエステル
１０ｍＬ容のメスフラスコに、３−シアノプロパン酸メチルエステル１．１３２ｇ（１０．０ｍｍｏｌ、１．００Ｍ）と、リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）８．７５２ｍＬと、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）細胞を０．３５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０、５０℃で１時間かけて事前に熱処理）に加えた５０ｗｔ％細胞懸濁液（湿細胞重量で０．１０ｇ、乾燥細胞重量で０．０２４ｇ）０．２０ｍＬとを入れ、得られた１０ｍＬの懸濁液を２５℃で攪拌した。試料（０．１００ｍＬ）を蒸留水０．９００ｍＬと混合し、遠心分離した後、１：１０に希釈した上清０．１８０ｍＬを０．７５０ＭのＮ−メチルプロピオンアミド（ＨＰＬＣ外部標準液）０．０２０ｍＬと混合した。得られた溶液をＨＰＬＣによって分析した。６．０時間後に３−シアノプロパン酸メチルエステルの変換が完了したが、この時点で３−シアノプロピオン酸またはブタン二酸は生成されず、ブタン二酸モノメチルエステルの（ＨＰＬＣで求めた）収率は１００％であった。
【００５８】
実施例６
ブタン二酸モノメチルエステル
１０ｍＬ容のメスフラスコに、３−シアノプロパン酸メチルエステル２．２６２ｇ（２０．０ｍｍｏｌ、２．００Ｍ）と、リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）６．９１ｍＬと、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）細胞を０．３５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０、５０℃で１時間かけて事前に熱処理）に加えた５０ｗｔ％細胞懸濁液（湿細胞重量で０．５０ｇ、乾燥細胞重量で０．１２ｇ）１．００ｍＬとを入れ、得られた１０ｍＬの懸濁液を２５℃で攪拌した。試料（０．１００ｍＬ）を蒸留水１．９００ｍＬと混合し、遠心分離した後、１：２０に希釈した上清０．１８０ｍＬを０．７５０ＭのＮ−メチルプロピオンアミド（ＨＰＬＣ外部標準液）０．０２０ｍＬと混合した。得られた溶液をＨＰＬＣによって分析した。２．０時間後に３−シアノプロパン酸メチルエステルの変換が完了したが、この時点で３−シアノプロピオン酸またはブタン二酸は生成されず、ブタン二酸モノメチルエステルの（ＨＰＬＣで求めた）収率は１００％であった。
【００５９】
実施例７
Ａ．ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗのカラギーナンビーズ中への固定化
マグネチックスターラーバーを取り付けた２５０ｍＬ容の培地瓶に５０℃の湯６４ｇを入れ、Ｐｒｏｎｏｖａ  ＩＳＡＧＥＬ  ＲＧ３００カラギーナン３．３８ｇを素早く攪拌しながら徐々に加えた。カラギーナンが完全に溶解するまで上記の混合物を素早く攪拌しながら７５〜８０℃まで加熱し、得られた溶液をサーモスタット付きの水浴中にて５５〜５６℃まで冷却（ゲル化温度約５２℃）した。Ａ．ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ細胞（ｗｃｗ、５．６２ｇ  ｄｃｗ）２３．４ｇを０．３５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）２１．５６ｇに加えた懸濁液を１時間で５０℃まで加熱し、ニトリルヒドラターゼを失活させた。次に、５０℃の細胞懸濁液を５５〜５６℃で攪拌しながらカラギーナン溶液に加えた後、オーバーヘッドスターラーを用いて５０℃のダイズ油４５０ｍＬに攪拌しながらすみやかに細胞／カラギーナン混合物を徐々に加えた。攪拌速度を制御することで所望の大きさ（直径約１〜３ｍｍ）の細胞／カラギーナン液滴を油中に生成した後、油の温度を３５℃まで下げて液滴をゲル化させ、得られたビーズから油をデカンテーションした。これらのビーズを２５℃にて０．２０Ｍの塩化カリウム（ｐＨ７．３）２５０ｍＬ中に懸濁させ、２５ｗｔ％のグルタルアルデヒド水溶液０．２５ｇを加え、ビーズを０．５時間混合した。次に、この混合物に１２．５ｗｔ％のポリエチレンイミン（平均Ｍｗ約７５０，０００）水溶液１．０ｇを加え、ビーズを２５℃でさらに１時間混合した。次に、反応混合物をデカンテーションしてビーズを回収し、０．３Ｍの重炭酸アンモニウム（ｐＨ７．０）中で５℃にて保管した。
【００６０】
実施例８
固定化Ａ．ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗを用いて生成したブタン二酸モノメチルエステル
オーバーヘッドスターラーを取り付けた１２５ｍＬ容のジャケット付き反応容器に、実施例７のようにして作製した固定化Ａ．ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ／カラギーナン触媒ビーズ５．０ｇと、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）９０．８ｍＬと、３−シアノプロパン酸メチルエステル４．１９ｍＬ（４．５２ｇ、０．４０Ｍ）とを入れ、混合物を２５℃で攪拌した。試料（０．１００ｍＬ）を蒸留水０．３００ｍＬと混合し、遠心分離した後、１：４に希釈した上清０．１８０ｍＬを０．７５０ＭのＮ−メチルプロピオンアミド（ＨＰＬＣ外部標準液）０．０２０ｍＬと混合した。得られた溶液をＨＰＬＣによって分析した。９．０時間後に３−シアノプロパン酸メチルエステルの変換が完了したが、この時点で３−シアノプロピオン酸またはブタン二酸は生成されず、ブタン二酸モノメチルエステルの（ＨＰＬＣで求めた）収率は１００％であった。
【００６１】
実施例９
ヘキサン二酸モノメチルエステル
１０ｍＬ容のメスフラスコに、５−シアノペンタン酸メチルエステル０．１６１６ｇ（１．０１ｍｍｏｌ、０．１０１Ｍ）と、リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）９．６５ｍＬと、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）細胞を０．３５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０、５０℃で１時間かけて事前に熱処理）に加えた５０ｗｔ％細胞懸濁液（湿細胞重量で０．１０ｇ、乾燥細胞重量で０．０２４ｇ）０．２０ｍＬとを入れ、得られた１０ｍＬの懸濁液を２５℃で攪拌した。試料（０．１００ｍＬ）を抜き取り、蒸留水０．３００ｍＬと混合し、遠心分離した後、１：４に希釈した上清０．１８０ｍＬを０．７５０ＭのＮ−メチルプロピオンアミド（ＨＰＬＣ外部標準液）０．０２０ｍＬと混合した。得られた溶液をＨＰＬＣによって分析した。４．０時間後に５−シアノペンタン酸メチルエステルの変換が完了したが、この時点で５−シアノペンタン酸は生成されず、ヘキサン二酸モノメチルエステルおよびヘキサン二酸の（ＨＰＬＣで求めた）収率はそれぞれ９９％および１％であった。
【００６２】
実施例１０
ヘキサン二酸モノメチルエステル
１０ｍＬ容のメスフラスコに、５−シアノペンタン酸メチルエステル１．４２５ｇ（１０．０ｍｍｏｌ、１．００Ｍ）と、リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）８．３８ｍＬと、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）細胞を０．３５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０、５０℃で１時間かけて事前に熱処理）に加えた５０ｗｔ％細胞懸濁液（湿細胞重量で０．１０ｇ、乾燥細胞重量で０．０２４ｇ）０．２０ｍＬとを入れ、得られた１０ｍＬの懸濁液を２５℃で攪拌した。試料（０．１００ｍＬ）を抜き取り、蒸留水０．９００ｍＬと混合し、遠心分離した後、１：１０に希釈した上清０．１８０ｍＬを０．７５０ＭのＮ−メチルプロピオンアミド（ＨＰＬＣ外部標準液）０．０２０ｍＬと混合した。得られた溶液をＨＰＬＣによって分析した。１２０時間後に５−シアノペンタン酸メチルエステルの変換が完了したが、この時点で５−シアノペンタン酸は生成されず、ヘキサン二酸モノメチルエステルおよびヘキサン二酸の（ＨＰＬＣで求めた）収率はそれぞれ９７％および３％であった。
【００６３】
実施例１１
プロパン二酸モノエチルエステル
１０ｍＬ容のメスフラスコに、シアノ酢酸エチルエステル０．１１７７ｇ（１．０２ｍｍｏｌ、０．１０２Ｍ）と、リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）９．６８９ｍＬと、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）細胞を０．３５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０、５０℃で１時間かけて事前に熱処理）に加えた５０ｗｔ％細胞懸濁液（湿細胞重量で０．１０ｇ、乾燥細胞重量で０．０２４ｇ）０．２０ｍＬとを入れ、得られた１０ｍＬの懸濁液を２５℃で攪拌した。試料（０．１８０ｍＬ）を０．７５０ＭのＮ−メチルプロピオンアミド（ＨＰＬＣ外部標準液）０．０２０ｍＬと混合した。得られた溶液をＨＰＬＣによって分析した。５時間後にシアノ酢酸エチルエステルの変換が完了したが、この時点でシアノ酢酸またはプロパン二酸は生成されず、プロパン二酸モノエチルエステルの（ＨＰＬＣで求めた）収率は１００％であった。
【００６４】
実施例１２
プロパン二酸モノエチルエステル
１０ｍＬ容のメスフラスコに、シアノ酢酸エチルエステル０．４６１９ｇ（４．００ｍｍｏｌ、０．４００Ｍ）と、リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）９．３７ｍＬと、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）細胞を０．３５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０、５０℃で１時間かけて事前に熱処理）に加えた５０ｗｔ％細胞懸濁液（湿細胞重量で０．１０ｇ、乾燥細胞重量で０．０２４ｇ）０．２０ｍＬとを入れ、得られた１０ｍＬの懸濁液を２５℃で攪拌した。試料（０．１００ｍＬ）を抜き取り、蒸留水０．３００ｍＬと混合し、遠心分離した後、１：４に希釈した上清０．１８０ｍＬを０．７５０ＭのＮ−メチルプロピオンアミド（ＨＰＬＣ外部標準液）０．０２０ｍＬと混合した。得られた溶液をＨＰＬＣによって分析した。２５．５時間後にシアノ酢酸エチルエステルの変換が完了したが、この時点でシアノ酢酸またはプロパン二酸は生成されず、プロパン二酸モノエチルエステルの（ＨＰＬＣで求めた）収率は１００％であった。
【００６５】
実施例１３
プロパン二酸モノプロピルエステル
１０ｍＬ容のメスフラスコに、シアノ酢酸プロピルエステル０．１２７１ｇ（１．００ｍｍｏｌ、０．１００Ｍ）と、リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）９．６８９ｍＬと、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）細胞を０．３５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０、５０℃で１時間かけて事前に熱処理）に加えた５０ｗｔ％細胞懸濁液（湿細胞重量で０．１０ｇ、乾燥細胞重量で０．０２４ｇ）０．２０ｍＬとを入れ、得られた１０ｍＬの懸濁液を２５℃で攪拌した。試料（０．１８０ｍＬ）を０．７５０ＭのＮ−メチルプロピオンアミド（ＨＰＬＣ外部標準液）０．０２０ｍＬと混合した。得られた溶液をＨＰＬＣによって分析した。５時間後にシアノ酢酸プロピルエステルの変換が完了したが、この時点でシアノ酢酸またはプロパン二酸は生成されず、プロパン二酸モノプロピルエステルの（ＨＰＬＣおよびＮＭＲで求めた）収率は１００％であった。
【００６６】
実施例１４
１，４−ベンゼンジカルボン酸モノメチルエステル
スターラーバーを取り付けた２０ｍＬ容のガラスバイアルに、４−シアノ安息香酸メチルエステル０．０２５２ｇ（０．１５５ｍｍｏｌ、０．０５２Ｍ）と、ピロリン酸カリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）２．６７ｍＬと、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）細胞を０．３５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０、５０℃で２０分間かけて事前に熱処理）に加えた５０ｗｔ％細胞懸濁液（湿細胞重量で０．１５５ｇ、乾燥細胞重量で３７．３ｍｇ）０．３０ｍＬとを入れ、得られた３ｍＬの懸濁液を２５℃で攪拌した。２５．５時間後、６．０ＮのＨＣｌを用いて反応混合物のｐＨを１．５から２．０の間に調整した後、アセトニトリル（４４％ｖ／ｖ）とメタノール（５６％ｖ／ｖ）との混合物９．０ｍＬを加え、得られた混合物を濾過し、ガスクロマトグラフィで分析した。４−シアノ安息香酸メチルエステルの変換が完了した時点で４−シアノ安息香酸は生成されず、１，４−ベンゼンジカルボン酸モノメチルエステルの（ＧＣで求めた）収率は９４％であった。
【００６７】
実施例１５
ブタン二酸モノメチルエステル
１０ｍＬ容のメスフラスコに、３−シアノプロパン酸メチルエステル０．４５３６ｇ（４．０１ｍｍｏｌ、０．４０１Ｍ）と、リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）９．３８ｍＬと、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＳＳ１００１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７７）細胞またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＳＷ９１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７５）細胞を０．０５０Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に加えた５０ｗｔ％細胞懸濁液（湿細胞重量で０．１０ｇ、乾燥細胞重量で０．０２４ｇ）０．２０ｍＬとを入れ、得られた１０ｍＬの懸濁液を２５℃で攪拌する。試料（０．１００ｍＬ）を蒸留水０．３００ｍＬと混合し、遠心分離した後、１：４に希釈した上清０．１８０ｍＬを０．７５０ＭのＮ−メチルプロピオンアミド（ＨＰＬＣ外部標準液）０．０２０ｍＬと混合する。得られた溶液をＨＰＬＣによって分析する。３−シアノプロパン酸メチルエステルが完全に変換された時点で、３−シアノプロピオン酸またはブタン二酸は生成されず、ブタン二酸モノメチルエステルの（ＨＰＬＣで求めた）収率は約１００％になると思われる。
【００６８】
【表５】
2004518408.tif 000008
【００６９】
【表６】
2004518408.tif 000009
【００７０】
【表７】
2004518408.tif 000010
【国際公開パンフレット】
2004518408.tif 000015
2004518408.tif 000016
2004518408.tif 000017
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2004518408.tif 000045
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004518408.tif 000046
【国際調査報告】
2004518408.tif 000047
2004518408.tif 000048
2004518408.tif 000049