(57)【要約】本発明は、グリコシル化が減少したタンパク質を産生することができる遺伝子操作ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）株を提供する。特に、本発明の遺伝子操作株はα−１，２−マンノシダーゼ及びグルコシダーゼＩＩのいずれかまたは両方を発現することができる。本発明の遺伝子操作株を、ＯＣＨ１遺伝子を破壊するようにさらに改変することができる。このような遺伝子操作ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）株を使用したグリコシル化が減少した糖タンパク質の産生法も提供する。
2004501635.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチロトローフ酵母株におけるα−１，２−マンノシダーゼまたはその機能的部分を発現することができ、前記α−１，２−マンノシダーゼまたはその機能的部分をコードするヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【請求項２】
前記α−１，２−マンノシダーゼが、真菌種由来のタンパク質である、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記真菌類がトリコデルマレーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）である、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
前記α−１，２−マンノシダーゼが、哺乳動物種由来のタンパク質である、請求項１に記載のベクター。
【請求項５】
前記α−１，２−マンノシダーゼが、マウスα−１，２−マンノシダーゼＩＡまたはＩＢである、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
前記α−１，２−マンノシダーゼまたはその機能的部分がＥＲ保持シグナルでタグ化されている、請求項１に記載のベクター。
【請求項７】
前記ＥＲ保持シグナルがペプチドＨＤＥＬを含む、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
前記α−１，２−マンノシダーゼまたはその機能的部分をコードするヌクレオチド配列が、プロモーター及び３’末端配列に作動可能に連結されている、請求項１に記載のベクター。
【請求項９】
前記プロモーターが、ＡＯＸＩ、ＡＯＸＩＩ、ＧＡＰ、及びＦＬＤからなる群から選択される遺伝子のプロモーターである、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
ｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＨＤＥＬ、ｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＭｙｃＨＤＥＬ、ｐＰＩＣＺＢＭＦＭａｎＭｙｃＨＤＥＬ、ｐＧＡＰＺｍＭａｎＨＤＥＬ、ｐＧＡＰＺｍＭｙｃＭａｎＨＤＥＬ、ｐＰＩＣ９ｍＭｙｃＭａｎＨＤＥＬ、及びｐＧＡＰＺｍＭｙｃＭａｎＨＤＥＬからなる群から選択される、ベクター。
【請求項１１】
メチロトローフ酵母株におけるグルコシダーゼＩＩまたはその機能的部分を発現することができ、前記グルコシダーゼＩＩまたはその機能的部分をコードするヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【請求項１２】
前記グルコシダーゼＩＩが、真菌種由来のタンパク質である、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
前記真菌がサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
前記グルコシダーゼＩＩが哺乳動物種由来のタンパク質である、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１５】
前記グルコシダーゼＩＩまたはその機能的部分がＥＲ保持シグナルでタグ化されている、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１６】
前記ＥＲ保持シグナルがペプチドＨＤＥＬを含む、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】
前記α−１，２−マンノシダーゼまたはその機能的部分をコードするヌクレオチド配列がプロモーター及び３’末端配列に作動可能に連結されている、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１８】
前記プロモーターが、ＡＯＸＩ、ＡＯＸＩＩ、ＧＡＰ、及びＦＬＤからなる群から選択される遺伝子のプロモーターである、請求項１７に記載のベクター。
【請求項１９】
ｐＧＡＰＺＡＧＬＳＩＩ、ｐＰＩＣＺＡＧＬＳＩＩ、ｐＡＯＸ２ＺＡＧＬＳＩＩ、ｐＹＰＴＩＺＡＧＬＳＩＩ、ｐＧＡＰＡＤＥｇｌｓＩＩ、ｐＰＩＣＡＤＥｇｌｓＩＩ、ｐＡＯＸ２ＡＤＥｇｌｓＩＩ、ｐＹＰＴＩＡＤＥｇｌｓＩＩ、ｐＧＡＰＺＡｇｌｓＩＩＨＤＥＬ、及びｐＧＡＰＡＤＥｇｌｓＩＩＨＤＥＬという名称のベクター。
【請求項２０】
Ｏｃｈ１遺伝子の一部及び選択マーカー遺伝子を含み、前記Ｏｃｈ１遺伝子の一部及び選択マーカー遺伝子が前記メチロトローフ酵母株においてゲノムＯｃｈ１遺伝子を破壊するような方法で連結している、メチロトローフ酵母株においてＯｃｈ１遺伝子を破壊するためのベクター。
【請求項２１】
ｐＢＬＵＲＡ５’ＰｐＯＣＨ１という名称のベクター。
【請求項２２】
酵母を請求項１から２１に記載の任意の１つのベクターで形質転換する工程を含む、メチロトローフ酵母から産生されたタンパク質のグリコシル化を減少させる方法。
【請求項２３】
前記酵母がピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記酵母が、ＧＳ１１５（ＮＲＲＬ　Ｙ−１５８５１）、ＧＳ１９０（ＮＲＲＬ　Ｙ−１８０１４）、ＰＰＦ１（ＮＲＲＬ　Ｙ−１８０１７）、ＰＰＹ１２−ＯＨ、ｙＧＣ４から選択されるピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）株またはその誘導体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記酵母が異種タンパク質を発現するように遺伝子操作されている、請求項２２、２３、または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記株が請求項１から２１に記載の少なくとも１つのベクターで形質転換されている、遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株。
【請求項２７】
メチロトローフ酵母細胞を請求項１から請求項２１に記載の少なくとも１つのベクターで形質転換する工程と、前記形質転換細胞から糖タンパク質を産生する工程とを含む、メチロトローフ酵母から発現した異種糖タンパク質のグリコシル化を減少させる方法。
【請求項２８】
メチロトローフ酵母細胞を請求項１から請求項２１に記載の少なくとも１つのベクター及び前記酵母中で前記糖タンパク質を発現することができるヌクレオチド配列で形質転換する工程と、前記形質転換細胞から糖タンパク質を産生する工程とを含む、メチロトローフ酵母におけるグリコシル化が減少した糖タンパク質のグリコシル化を減少させる方法。
【請求項２９】
請求項２７または２８に記載の方法によって産生された、糖タンパク質。
【請求項３０】
前記糖タンパク質が前記メチロトローフ酵母の野生株から産生した糖タンパク質と比較して免疫原性が減少している、請求項２９に記載の糖タンパク質。
【請求項３１】
前記糖タンパク質がヒトへの治療に適切である、請求項２９に記載の糖タンパク質。
【請求項３２】
請求項１から２１に記載の任意のベクターを含む、キット。
【請求項３３】
メチロトローフ酵母株をさらに含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
請求項２６に記載のメチロトローフ酵母株を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、グリコシル化が減少した糖タンパク質を産生するためのメチロトローフ酵母のグリコシル化過程の遺伝子改変に有用な方法及びベクターに関する。本発明は、さらに、本発明の方法を使用して作製したメチロトローフ酵母株及びこのような遺伝子改変株から産生された糖タンパク質に関する。
【０００２】
（発明の背景）
ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）を含むメチロトローフ酵母は、商業的または医学的に重要な組換えタンパク質の産生に広く使用されている。しかし、いくつかの治療用糖タンパク質の産生及び医学への適用は、これらの酵母と哺乳動物被験体などの標的生物との間のタンパク質結合炭水化物生合成の相違によって妨害され得る。
【０００３】
タンパク質のＮグリコシル化は、ドリコール（脂質運搬中間体）上で組み立てられたＮ結合少糖類（Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２）を新生タンパク質の適切なＡｓｎに移行する小胞体（ＥＲ）で開始される。これは、全ての真核生物Ｎ結合糖タンパク質に共通の事象である。３つのグルコース残基及び１つの特定のα−１，２−結合マンノース残基がＥＲ中で特定のグルコシダーゼ及びα−１，２−マンノシダーゼによって除去されて少糖類のコア構造Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２が得られる。この糖コア構造を有するタンパク質が、ゴルジ装置に輸送され、糖部分が種々の修飾を受ける。酵母と高等真核生物との間でゴルジ装置での糖鎖修飾が有意に異なる。
【０００４】
哺乳動物細胞では、糖鎖修飾は付加されるタンパク質部分に依存した３つの異なる経路を介して進行する。したがって、（１）糖コア鎖が変化しない；（２）糖コア鎖中のマンノースの第６位へのＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）中のＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸部分（ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ）の付加及びその後のＧｌｃＮＡｃ部分の除去により糖コア鎖が変化し、糖タンパク質中に酸性糖鎖が形成される；（３）最初に、マンノシダーゼＩでの３つのマンノース残基の除去により糖鎖がＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に変換され；ＧｌｃＮＡｃの付加及び２つのさらなるマンノース残基の除去によりＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２がさらに修飾され、その後のＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース（Ｇａｌ）、及びＮ−アセチルノイラミン酸（シアリン酸（ＮｅｕＮＡｃ）とも呼ばれる）の連続的付加により種々のハイブリッドまたは複合体糖鎖が形成される（Ｒ．Ｋｏｒｎｆｅｌｄ　ａｎｄ　Ｓ．Ｋｏｒｎｆｅｌｄ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５４、６３１から６６４、１９８５；Ｃｈｉａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３、２６２９８から２６３０４、１９９８）。
【０００５】
酵母では、ゴルジ装置での糖鎖修飾は、異なるマンノシルトランスフェラーゼによる一連のマンノース残基の付加を含む（「外部鎖グリコシル化」）。外部鎖グリコシル化の構造は生物に特異的であり、典型的には、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）では５０個を超えるマンノース残基、最も一般的にはピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）ではＭａｎ１４ＧｌｃＮＡｃ２より小さな構造を有する。高マンノース型のこの酵母特異的外部鎖グリコシル化は、超グリコシル化とも示される。
【０００６】
超グリコシル化は、炭水化物組成及び分子量の両方において組換えタンパク質産物が不均一になり、タンパク質精製を複雑にし得るので、望ましくない場合がある。超グリコシル化酵素の比活性（単位／重量）は、炭水化物部分の増加によって減少し得る。さらに、外部鎖のグリコシル化は強力な免疫原性を示し、治療には望ましくない。さらに、より大きな外部糖鎖は、治療タンパク質の免疫決定基をマスクし得る。例えば、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）で発現したインフルエンザノイラミニダーゼ（ＮＡ）は、３０から４０個までのマンノース残基を含むＮ−グリカンでグリコシル化される。ＮＡ分子先端上の可変性且つ免疫優性の表面ループがＮ−グリカンでマスクされるので、マウスでは超グリコシル化ＮＡは免疫原性が減少する（Ｍａｒｔｉｎｅｔら、Ｅｕｒ　Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２４７、３３２から３３８、１９９７）。
【０００７】
したがって、一般に、タンパク質のグリコシル化を操作することができ、構造または機能が巨大Ｎ−グリカン側鎖に影響を及ぼされない組換えタンパク質を産生することができるメチロトローフ酵母株を遺伝子操作することが望ましい。
【０００８】
（発明の要約）
本発明は、グリコシル化が減少した糖タンパク質を産生するためのメチロトローフ酵母株におけるグリコシル化工程の遺伝子改変に有用な方法及びベクターに関する。本発明の方法及びベクターを使用して作製されたメチロトローフ酵母株ならびにこのような遺伝子改変株から産生された糖タンパク質もまた提供する。
【０００９】
１つの実施形態では、本発明は、グリコシル化が減少した糖タンパク質を産生することができる遺伝子操作メチロトローフ酵母株の作製に有用なベクターを提供する。
【００１０】
１つの態様では、本発明は、酵素活性によりメチロトローフ酵母株によって産生された糖タンパク質のグリコシル化が減少する１つまたは複数のタンパク質をメチロトローフ酵母株において発現することができる「ノックイン」ベクターを提供する。
【００１１】
好ましい実施形態では、本発明のノックインベクターは、α−１，２−マンノシダーゼまたはその機能的部分をコードするヌクレオチド配列を含み、メチロトローフ酵母株においてα−１，２−マンノシダーゼまたはその機能的部分を発現することができる。好ましいヌクレオチド配列は、真菌種のα−１，２−マンノシダーゼ、より好ましくはトリコデルマレーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）のα−１，２−マンノシダーゼをコードするヌクレオチド配列である。好ましくは、α−１，２−マンノシダーゼ発現ベクターを、ベクターから発現したα−１，２−マンノシダーゼまたはその機能的部分がＥＲ保持シグナルを含むように操作する。好ましいＥＲ保持シグナルはＨＤＥＬである。α−１，２−マンノシダーゼコード配列は、構成性または誘導プロモーター、及び３’末端配列に作動可能に連結することができる。ベクターは、組み込みベクターまたは複製ベクターであり得る。特に好ましいα−１，２−マンノシダーゼ発現ベクターには、ｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＨＤＥＬ、ｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＭｙｃＨＤＥＬ、ｐＰＩＣＺＢＭＦＭａｎＭｙｃＨＤＥＬ、ｐＧＡＰＺｍＭａｎＨＤＥＬ、ｐＧＡＰＺｍＭｙｃＭａｎＨＤＥＬ、ｐＰＩＣ９ｍＭｙｃＭａｎＨＤＥＬ、及びｐＧＡＰＺｍＭｙｃＭａｎＨＤＥＬが含まれる。
【００１２】
別の好ましい実施形態では、本発明のノックインベクターは、グルコシダーゼＩＩまたはその機能的部分をコードする配列を含み、メチロトローフ酵母株においてグルコシダーゼＩＩ及びその機能的部分を発現することができる。好ましいヌクレオチド配列は、真菌種、より好ましくはサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のグルコシダーゼＩＩをコードするヌクレオチド配列である。好ましくは、グルコシダーゼＩＩ発現ベクターを、ベクターから発現したグルコシダーゼＩＩまたはその機能的部分がＥＲ保持シグナルを含むように操作する。好ましいＥＲ保持シグナルはＨＤＥＬである。グルコシダーゼＩＩコード配列は、構成性または誘導プロモーター及び３’末端配列に作動可能に連結することができる。ベクターは組み込みベクターまたは複製ベクターであり得る。特に好ましいグルコシダーゼＩＩ発現ベクターには、ｐＧＡＰＺＡＧＬＳＩＩ、ｐＰＩＣＺＡＧＬＳＩＩ、ｐＡＯＸ２ＺＡＧＬＳＩＩ、ｐＹＰＴＩＺＡＧＬＳＩＩ、ｐＧＡＰＡＤＥｇｌｓＩＩ、ｐＰＩＣＡＤＥｇｌｓＩＩ、ｐＡＯＸ２ＡＤＥｇｌｓＩＩ、ｐＹＰＴＩＡＤＥｇｌｓＩＩ、ｐＧＡＰＺＡｇｌｓＩＩＨＤＥＬ、及びｐＧＡＰＡＤＥｇｌｓＩＩＨＤＥＬが含まれる。
【００１３】
α−１，２−マンノシダーゼ発現単位及びグルコシダーゼＩＩ発現単位の両方を含む発現ベクターもまた、本発明によって得られる。
【００１４】
別の態様では、本発明は、メチロトローフ酵母株に移入した場合、遺伝子を不活化するか破壊することによりメチロトローフ酵母株で産生された糖タンパク質のグリコシル化の減少を容易にする「ノックアウト」ベクターを提供する。
【００１５】
１つの実施形態では、本発明は、メチロトローフ酵母株に移入した場合、Ｏｃｈ１遺伝子を不活化するか破壊する「ノックアウト」ベクターを提供する。好ましいＯｃｈ１ノックアウトベクターは、ｐＢＬＵＲＡ５’ＰｐＯＣＨ１である。
【００１６】
本発明のさらに別の実施形態は、ノックイン単位及びノックアウト単位の両方を含むベクターを提供する。
【００１７】
さらに、本発明の任意のノックインまたはノックアウトベクターはまた、メチロトローフ酵母において目的の異種タンパク質を発現することができるヌクレオチド配列を含み得る。
【００１８】
本発明の別の実施形態は、本発明の１つまたは複数のベクターでの酵母の形質転換によるメチロトローフ酵母におけるグリコシル化の修飾法を提供する。
【００１９】
本発明の方法を使用して改変することができるメチロトローフ酵母株には、カンジダ属（Ｃｎａｄｉｄａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、及びピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）の酵母などのメタノールで増殖することができる酵母株が含まれるが、これらに限定されない。好ましいメチロトローフ酵母は、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）である。ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＧＳ１１５（ＮＲＲＬ　Ｙ−１５８５１）、ＧＳ１９０（ＮＲＲＬ　Ｙ−１８０１４）、ＰＰＦ１（ＮＲＲＬ　Ｙ−１８０１７）、ＰＰＹ１２０Ｈ、ｙＧＣ４、及びそれから誘導される株が特に好ましい。本発明の方法を使用して改変することができるメチロトローフ酵母株はまた、１つまたは複数の目的の異種タンパク質を発現するように操作されているメチロトローフ酵母株が含まれる。これらの先に遺伝子操作した株から発現した異種タンパク質のグリコシル化を、このような株の１つまたは複数の本発明のベクターでの形質転換によって減少させることができる。
【００２０】
本発明の方法の実施によって改変されるメチロトローフ酵母株は、本発明の別の実施形態によって得られる。
【００２１】
本発明のさらなる態様は、グリコシル化が減少した糖タンパク質の産生法に関する。
【００２２】
このような方法によれば、糖タンパク質を発現することができるヌクレオチド配列を、１つまたは複数の本発明のベクターで先に形質転換したメチロトローフ酵母株に移入することができる。あるいは、糖タンパク質を発現するように遺伝子操作したメチロトローフ酵母株を、１つまたは複数の本発明のベクターで形質転換することができる。しかし、メチロトローフ酵母株を目的の糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列または本発明の任意のベクターで形質転換しない場合、このような酵母株を糖タンパク質を発現することができるヌクレオチド配列及び１つまたは複数の本発明のベクターの両方で連続的または同時に形質転換することができる。さらに、メチロトローフ酵母株を、メチロトローフ酵母株内で糖タンパク質を発現することができるヌクレオチド配列も含む１つまたは複数の本発明のノックイン及び／またはノックアウトベクターで形質転換することができる。
【００２３】
本発明の方法の使用によって産生された糖タンパク質産物（すなわち、Ｎ−グリコシル化が減少した糖タンパク質）もまた、本発明の一部である。
【００２４】
１つまたは複数の本発明のベクターまたはグリコシル化が減少した糖タンパクを作製する様に改変された１つまたは複数の株もまた得られる。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）の小胞体（ＥＲ）から放出された糖タンパク質上のＮ−グリカンの体部分が、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖コア構造を有することが確立されている。タンパク質がＥＲからゴルジ装置に輸送された後、異なるマンノシルトランスフェラーゼによってさらなるマンノース残基がこのコア糖部分に付加され、巨大なマンノース側鎖を有する糖タンパク質が得られる。このような組換え糖タンパク質の超グリコシル化は、多くの例で望ましくない。したがって、本発明は、グリコシル化が減少した糖タンパク質を産生するための遺伝子改変メチロトローフ酵母株の産生法及びベクターを提供する。本発明の方法及びベクターを使用して作製したメチロトローフ酵母株及びこのような遺伝子改変株から産生した糖タンパク質もまた得られる。
【００２６】
１つの実施形態では、本発明は、グリコシル化が減少した糖タンパク質を産生するための遺伝子改変メチロトローフ酵母株に有用なベクターを提供する。
【００２７】
１つの態様では、本発明は、酵素活性によりメチロトローフ酵母株によって産生された糖タンパク質のグリコシル化が減少する１つまたは複数のタンパク質をメチロトローフ酵母株において発現することができる「ノックイン」ベクターを提供する。本発明によれば、このようなタンパク質には、例えば、α−１，２−マンノシダーゼ、グルコシダーゼＩＩ、またはその機能的部分が含まれる。
【００２８】
好ましい実施形態では、本発明のベクターには、α−１，２−マンノシダーゼまたはその機能的部分をコードするが含まれ、メチロトローフ酵母株においてα−１，２−マンノシダーゼまたはその機能的部分を発現することができる。
【００２９】
α−１，２−マンノシダーゼは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２の非還元末端でα−１，２結合マンノース残基を切断し、糖タンパク質上のこのコアオリゴ糖をＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に変換する。インビトロでは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は任意のピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）ゴルジマンノシルトランスフェラーゼの非常に不十分な基質である（すなわち、マンノース残基をこの糖構造に付加することができない）。それに対して、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は、哺乳動物Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩの受容体基質であり、哺乳動物糖タンパク質に特徴的なハイブリッド型及び複合体型糖鎖の中間体である。したがって、α−１，２−マンノシダーゼのピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）などのメチロトローフ酵母への移入法により、マンノースが減少した糖タンパク質を産生することができる。
【００３０】
本発明によれば、本発明の発現ベクターで使用するα−１，２−マンノシダーゼをコードするヌクレオチド配列は、任意の種由来であり得る。多数のα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子がクローン化されており、当業者が利用可能であり、例えば、マウスα−１，２−マンノシダーゼ（Ｈｅｒｓｃｏｖｉｃｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９、９８６４から９８７１、１９９４）、ウサギα−１，２−マンノシダーゼ（Ｌａｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９、９８７２から９８８１、１９９４）、またはヒトα−１，２−マンノシダーゼ（Ｔｒｅｍｂｌａｙら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、８、５８５から５９５、１９９８）をコードする哺乳動物遺伝子及び例えばコウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）α−１，２−マンノシダーゼ（ｍｓｄＳ遺伝子）、トリコデルマレーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）のα−１，２−マンノシダーゼ（Ｍａｒａｓら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７７、２５５から２６３、２０００）、またはサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα−１，２−マンノシダーゼをコードする遺伝子が含まれる。タンパク質配列分析により、現段階で同定されている真核生物α−１，２−マンノシダーゼの間には保存性が高いことが明らかとなっている。
【００３１】
好ましくは、本発明で使用されるヌクレオチド配列は、真菌α−１，２−マンノシダーゼ、より好ましくはトリコデルマレーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）のα−１，２−マンノシダーゼ、より詳細にはＭａｒａｓら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７７、２５５から６３、２０００に記載のトリコデルマレーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）のα−１，２−マンノシダーゼをコードする。
【００３２】
本発明によれば、ヌクレオチド配列はまた、α−１，２−マンノシダーゼの機能的部分のみをコードすることができる。
【００３３】
「機能的部分」は、実質的に全長タンパク質の酵素活性を保持するα−１，２−マンノシダーゼのポリペプチドフラグメントを意味する。「実質的に」は、少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも５０％またはそれ以上の全長α−１，２−マンノシダーゼの酵素活性を保持することを意味する。例えば、本発明で例示するように、マウスα−１，２−マンノシダーゼＩＢの触媒ドメインは、マウスα−１，２−マンノシダーゼＩＢの「機能的部分」を構成する。当業者は、当該分野で公知の技術の組み合わせを使用してα−１，２−マンノシダーゼの機能的部分を容易に同定及び作製することができる。酵素活性の付与に不可欠であるか十分であるα−１，２−マンノシダーゼ部分を、タンパク質配列分析に基づいて予想することができる。適切な発現系から発現及び精製された目的のα−１，２−マンノシダーゼの一部の活性を、以下に記載のインビトロまたはインビボアッセイを使用して評価することができる。
【００３４】
本発明によれば、メチロトローフ酵母株で発現されたα−１，２−マンノシダーゼまたはその機能的部分は、好ましくは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（α−１，２−マンノシダーゼの基質）が糖タンパク質上に既に形成されているが、さらなるマンノース残基で糖鎖を伸長させるゴルジグリコトランスフェラーゼに達していない分泌経路中の部位を標的とする。
【００３５】
したがって、本発明の好ましい実施形態では、α−１，２−マンノシダーゼ発現ベクターを、ベクターから発現したα−１，２−マンノシダーゼまたはその機能的部分がＥＲ保持シグナルを含むように操作する。
【００３６】
「ＥＲ保持シグナル」は、輸送すべきこのようなペプチド配列を有するタンパク質を支持し、ＥＲ中で保持されるペプチド配列をいう。このようなＥＲ保持配列は、ＥＲ中に存在して機能するタンパク質中でしばしば認められる。
【００３７】
当業者は多数のＥＲ保持シグナルの選択を利用可能である（例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＥＲタンパク質ＭＮＳ１の最初の２１アミノ酸残基）（Ｍａｒｔｉｎｅｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、２０、１１７１から１１７７、１９９８）。本発明で使用される好ましいＥＲ保持シグナルは、ペプチドＨＤＥＬ（配列番号１）である。多数の酵母タンパク質のＣ末端で見出されるＨＤＥＬペプチド配列は、ＥＲの保持／回復シグナルとして作用する（Ｐｅｌｈａｍ、ＥＭＢＯ　Ｊ．、７、９１３から９１８、１９８８）。ＨＤＥＬ配列を有するタンパク質は、膜結合受容体（Ｅｒｄ２ｐ）によって結合され、その後ゴルジ装置からＥＲへの回復のための逆行経路に入る。
【００３８】
本発明によれば、ＥＲ保持シグナルを、α−１，２−マンノシダーゼのタンパク質配列の任意の場所、しかし好ましくはα−１，２−マンノシダーゼのＣ末端に置くことができる。
【００３９】
本発明で使用されるα−１，２−マンノシダーゼを、例えば、抗体を利用可能なエピトープタグ（当該分野で周知のＭｙｃ、ＨＡ、ＦＬＡＧ、及びＨｉｓ６タグなど）の挿入によってさらに改変することができる。エピトープタグ化α−１，２−マンノシダーゼを都合よく精製するか、発現及び細胞内局在化の両方についてモニターすることができる。
【００４０】
ＥＲ保持シグナル及びエピトープタグを、当該分野で公知の任意の分子生物学的技術を使用したこのようなシグナルの目的のタンパク質をコードするヌクレオチドへの挿入によって目的のタンパク質に容易に移入することができる。
【００４１】
本発明の別の好ましい実施形態では、本発明は、グルコシダーゼＩＩまたはその機能的部分をコードする配列を含み、メチロトローフ酵母株においてグルコシダーゼＩＩまたはその機能的部分を発現することができる。
【００４２】
ＥＲ中のタンパク質上に移行された最初のＮ結合オリゴ糖（Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２）を、特異的グルコシダーゼによってＥＲ中で切断して、グルコース残基を除去し、マンノシダーゼによって切断して１つの特異的α−１，２結合マンノースを除去することが確立されている。ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）で発現したいくつかの組換えタンパク質が、このようなタンパク質がＥＲからゴルジ装置へ放出された場合に糖部分上に残存グルコース残基を有することが本発明で認められた。この糖構造上に存在する残存グルコース分子により、α−１，２−マンノシダーゼによる糖部分の完全な消化が防止され、外因性グルコシダーゼの移入により、これらのグルコース残基の除去を促進することができる。
【００４３】
本発明によれば、グルコシダーゼＩＩをコードするヌクレオチド配列は、任意の種に由来し得る。グルコシダーゼＩＩ遺伝子が、ラット、マウス、ブタ、及びヒトを含む多数の哺乳動物種からクローン化されている。これらの哺乳動物種由来のグルコシダーゼＩＩタンパク質は、αよびβサブユニットからなる。αサブユニットは約１１０ｋＤａであり、且つ酵素触媒活性を含み、βサブユニットはＣ末端ＨＤＥＬ　ＥＲ保持シグナルを有し、且つ酵素のＥＲ局在化に重要であると考えられている。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のグルコシダーゼＩＩ遺伝子がクローン化されている（第２番染色体上に存在するＯＲＦＹＢＲ２２９ｃ）。この遺伝子は、哺乳動物αサブユニットと高い相同性を示す約１１０ｋＤａのタンパク質をコードする。
【００４４】
本発明で使用される好ましいグルコシダーゼＩＩ遺伝子は、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの真菌種由来である。真菌グルコシダーゼＩＩ遺伝子の例は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グルコシダーゼＩＩαサブユニット遺伝子である。
【００４５】
本発明によれば、ヌクレオチド配列はまた、グルコシダーゼＩＩの機能的部分のみをコードすることができる。「機能的部分」は、実質的に全長タンパク質の酵素活性を保持するグルコシダーゼＩＩのポリペプチドフラグメントを意味する。「実質的に」は、少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも５０％またはそれ以上の全長グルコシダーゼＩＩの酵素活性を保持することを意味する。グルコシダーゼＩＩの機能的部分を同定し、当業者は当該分野で公知の種々の技術を使用して作製することができる。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態では、メチロトローフ酵母株をＥＲに標的化し、その中で機能を保持するようなＥＲ保持シグナルを含むようにグルコシダーゼＩＩタンパク質を操作する。ＥＲ保持シグナルは、上記に記載している（例えば、ＨＤＥＬペプチド配列）。
【００４７】
本発明で使用するグルコシダーゼＩＩを、例えば、抗体を利用可能なエピトープタグ（当該分野で周知のＭｙｃ、ＨＡ、ＦＬＡＧ、及びＨｉｓ６タグなど）の挿入によってさらに改変することができる。
【００４８】
本発明によれば、「ノックイン」ベクターは、α−１，２−マンノシダーゼコード配列及びグルコシダーゼＩＩコード配列のいずれかまたは両方を含み得る。
【００４９】
さらに、本発明によれば、発現すべき酵素（例えば、α−１，２−マンノシダーゼもしくはその機能的部分またはグルコシダーゼＩＩもしくはその機能的部分）をコードするヌクレオチド配列を、プロモーター及び３’末端配列への作動可能な結合中に置くことができる。
【００５０】
メチロトローフ酵母におけるタンパク質発現に適切なプロモーターは、構成性プロモーター及び誘導プロモーターの両方を含むことができる。構成性プロモーターには、例えば、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（「ＧＡＰプロモーター」）が含まれる。誘導プロモーターの例には、例えば、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）アルコールオキシダーゼプロモーター（ＡＯＸＩプロモーター）（米国特許第４，８５５，２３１）またはピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）ホルムアルデヒドデヒドロギナーゼプロモーター（「ＦＬＤプロモーター」）が含まれる（Ｓｈｅｎら、Ｇｅｎｅ、２１６、９３から１０２、１９９８）。
【００５１】
３’末端配列は、前記配列がポリアデニル化を誘発する配列などに作動可能に連結された遺伝子のｍＲＮＡ転写産物を安定化するように機能する構造遺伝子の終止コドンに対して３’の配列である。３’末端配列を、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）または他のメチロトローフ酵母から得ることができる。本発明の実施に有用なピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）の３’末端配列には、ＡＯＸ１遺伝子、ｐ４０遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子、及びＦＬＤ１遺伝子由来の末端配列が含まれる。
【００５２】
本発明のベクターは、好ましくは、選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカーは、メチロトローフ酵母に選択可能な表現型を付与し、且つ形質転換細胞を非形質転換細胞から同定及び選択可能な任意の遺伝子であり得る。選択マーカー系には、栄養要求性変異メチロトローフ酵母株及び宿主の欠失を補足する野生型遺伝子を含み得る。このような系の例には、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）のｈｉｓ４株の補足に使用することができるサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｒｏｒｉｓ）のＨＩＳ４遺伝子またはピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）のａｒｇ変異体の補足に使用することができるＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＡＲＧ４遺伝子が含まれる。ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）で機能する他の選択マーカー遺伝子には、ＺｅｏＲ遺伝子、Ｇ４１８Ｒ遺伝子などが含まれる。
【００５３】
本発明のベクターには、自律複製配列（ＡＲＳ）も含み得る。例えば、米国特許第４，８３７，１４８号は、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）における適切なプラスミドの維持手段を提供する自律複製配列を記載している。米国特許第４，８３７，１４８号の開示は、本明細書中で参考として援用される。
【００５４】
ベクターはまた、細菌中で機能する選択マーカー遺伝子ならびに細菌における複製及び染色体外維持を担う配列を含むことができる。細菌選択マーカー遺伝子の例には、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｅｔｒ）、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、及びゼオシン耐性遺伝子（ＺｅｏＲ）が含まれる。
【００５５】
本発明によれば、メチロトローフ酵母において発現されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、組み込みベクターまたは複製ベクター（複製環状プラスミドなど）に置くことができる。
【００５６】
組み込みベクターは、例えば、米国特許第４，８８２，２７９号（本明細書中で参考として援用される）で開示されている。組み込みベクターには、一般に、少なくとも第１の挿入可能なＤＮＡフラグメント、選択マーカー遺伝子、及び第２の挿入可能なＤＮＡフラグメントの連続的に配置された配列が含まれる。第１及び第２の挿入可能なＤＮＡフラグメントは、それぞれ約２００ヌクレオチド長であり、形質転換される種のゲノムＤＮＡのいびつに相同なヌクレオチド配列を有する。発現用の目的の構造遺伝子を含むヌクレオチド配列を、このベクター中のマーカー遺伝子の前後いずれかの第１と第２の挿入可能なＤＮＡフラグメントとの間に挿入する。組み込みベクターを酵母形質転換前に線状化して、目的にヌクレオチド配列の宿主細胞ゲノムへの組み込みを容易にすることができる。
【００５７】
α−１，２−マンノシダーゼコード配列またはグルコシダーゼＩＩコード配列のいずれかまたは両方を保有する複製ベクター及び組み込みベクターを、当業者に公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、「分子クローニング：実験マニュアル」または広く利用可能な組換えＤＮＡ技術についての任意の多数の実験マニュアルに見出される標準的技術によって構築することができる。
【００５８】
α−１，２−マンノシダーゼ発現配列を保有する本発明の好ましいベクターには、ｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＨＤＥＬ、ｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＭｙｃＨＤＥＬ、ｐＰＩＣＺＢＭＦＭａｎＭｙｃＨＤＥＬ、ｐＧＡＰＺｍＭａｎＨＤＥＬ、ｐＧＡＰＺｍＭｙｃＭａｎＨＤＥＬ、ｐＰＩＣ９ｍＭｙｃＭａｎＨＤＥＬ、及びｐＧＡＰＺｍＭｙｃＭａｎＨＤＥＬが含まれ、以下の実施例でさらに説明する。
【００５９】
グルコシダーゼＩＩ発現配列を保有する本発明の好ましいベクターには、ｐＧＡＰＺＡＧＬＳＩＩ、ｐＰＩＣＺＡＧＬＳＩＩ、ｐＡＯＸ２ＺＡＧＬＳＩＩ、ｐＹＰＴＩＺＡＧＬＳＩＩ、ｐＧＡＰＡＤＥ１ｇｌｓＩＩ、ｐＰＩＣＡＤＥ１ｇｌｓＩＩ、ｐＡＯＸ２ＡＤＥ１ｇｌｓＩＩ、ｐＹＰＴＩＡＤＥ１ｇｌｓＩＩ、ｐＧＡＰＺＡｇｌｓＩＩＨＤＥＬ、及びｐＧＡＰＡＤＥ１ｇｌｓＩＩＨＤＥＬが含まれる。
【００６０】
別の態様では、本発明は、メチロトローフ酵母株に移入した場合、遺伝子を不活化するか破壊することによりメチロトローフ酵母株で産生された糖タンパク質のグリコシル化の減少を容易にする「ノックアウト」ベクターを提供する。
【００６１】
１つの実施形態では、本発明は、メチロトローフ酵母株に移入した場合、Ｏｃｈ１遺伝子を不活化するか破壊する「ノックアウト」ベクターを提供する。
【００６２】
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＯＣＨ１遺伝子はクローン化されている（Ｎａｋａｙａｍａら、ＥＭＢＯ　Ｊ．、１１、２５１１から２５１９、１９９２）。これは、初期ゴルジ複合体中に存在し、Ｎ結合コアオリゴサッカリド（Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２及びＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２）へのα−１，６−ポリマンノース外部鎖添加の開始において機能的な膜結合α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼをコードする（Ｎａｋａｎｉｓｉ−Ｓｈｉｎｄｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８、２６３３８から２６３４５、１９９３）。
【００６３】
日本国特願平０７−１４５００５にＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＯＣＨ１に高い相同性を示すタンパク質をコードするピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）配列が記載されている。本発明の目的のために、本明細書中では、この配列を「ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）　ＯＣＨ１遺伝子」と命名する。当業者は、当該分野で周知の技術を使用して、他のメチロトローフ酵母からＯＨ１遺伝子を単離することができる。
【００６４】
本発明によれば、メチロトローフ酵母のＯＣＨ１遺伝子の破壊により、不活性タンパク質産物を産生することができるか産物を産生しない。破壊は、異種ＤＮＡ配列のコード配列への挿入及び／またはいくつかまたは全てのコード配列の欠失の形態を取ることができる。本質的にＲｏｔｈｓｔｅｉｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｗｕら編、第１０１巻、２０２から２１１、１９８３）に記載の相同組換えによって遺伝子を破壊することができる。
【００６５】
相同組換えによってＯｃｈ１遺伝子を破壊するために、選択マーカー遺伝子を含むような方法でＯｃｈ１ノックアウトベクターを構築することができる。選択マーカー遺伝子を、５’及び３’末端で相同組換えの媒介に十分な長さのＯｃｈ１遺伝子の一部に作動可能に連結する。選択マーカーは、宿主細胞の栄養要求性を補足するか抗生物質耐性が得られる任意の多数の遺伝子（ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、及びＨＩＳ３遺伝子を含む）のうちの１つであり得る。他の適切な選択マーカーには、酵母細胞にクロラムフェニコール耐性を付与するＣＡＴ遺伝子または活性β−ガラクトシダーゼ発現による青色コロニーが得られるｌａｃＺ遺伝子が含まれる。次いで、Ｏｃｈ１ノックアウトベクターの線状化ＤＮＡフラグメントを、当該分野で周知の方法を使用して宿主メチロトローフ酵母細胞に移入する。線状フラグメントのゲノムへの組み込み及びＯｃｈ１遺伝子の破壊を選択マーカーに基づいて同定し、例えば、サザンブロット分析によって評価することができる。
【００６６】
あるいは、Ｏｃｈ１ノックアウトベクターを、いかなるＯｃｈ１プロモーター配列も欠き、且つＯｃｈ１タンパク質をコードしないか不活性なフラグメントをコードする破壊すべきＯｃｈ１遺伝子の一部を含むような方法で構築することができる。「不活性フラグメント」は、好ましくは約１０％未満、より好ましくは０％の全長ＯＣＨ１タンパク質活性を有するＯｃｈ１タンパク質のフラグメントを意味する。このようなＯＣＨ１遺伝子の一部を、公知のプロモーター配列がＯＣＨ１配列に作動可能に連結されないが、終止コドン及び転写終結配列がＯｃｈ１遺伝子の一部に作動可能に連結されるような方法でベクター中に挿入する。その後、このベクターを、ＯＣＨ１配列の一部に線状化し、当該分野で公知の任意の方法を使用してメチロトローフ酵母株に形質転換する。１つの相同組換えにより、この線状化ベクターをＯＣＨ１遺伝子に組み込む。１つの相同組換えの結果として、染色体中に２つのＯｃｈ１配列が産生される。第１のＯｃｈ１配列は、ベクター由来のＯｃｈ１遺伝子一部であり、宿主メチロトローフ酵母のＯＣＨ１プロモーターの調節下にあり、さらに上記のように活性ＯＣＨ１タンパク質を産生することができないので、Ｏｃｈ１配列がＯＣＨ１タンパク質をコードしないかその不活性フラグメントをコードする。第２のＯｃｈ１配列は全長ＯＣＨ１コード配列であるが、任意の公知のプロモーター配列に作動可能に連結しておらず、活性ＯＣＨ１タンパク質の合成のために活性メッセンジャーが形成されないと予想される。好ましくは、不活性変異体を、ＯＣＨ１配列中の線状化ベクターの５’末端及びＯＣＨ１の転写開始コドンの３’末端に移入する。「不活性化変異」は、終止コドンが移入された変異、フレームシフト変異、または読み取り枠を破壊する任意の他の変異を意味する。このような変異を、当該分野で公知の任意の部位特異的変異誘発法を使用してＯｃｈ１配列に移入することができる。このような不活性化変異により、ノックアウトベクター中のＯｃｈ１配列の５’にいくつかのプロモーター配列が存在する場合でさえ、機能的ＯＣＨ１タンパク質を確実に形成することができない。
【００６７】
本発明の好ましいＯｃｈ１ノックアウトベクターは、ｐＢＬＵＲＡ５’ＰｐＯＣＨ１である。
【００６８】
所望ならば、マンノシダーゼ発現配列及びグルコシダーゼ発現配列のいずれかまたは両方を、ＯＣＨ１遺伝子を破壊して「ノックイン及びノックアウト」ベクターを作製するために使用する同一のプラスミド上に保有させることができる。
【００６９】
さらに、任意の上記のベクターは、メチロトローフ酵母株において目的の糖タンパク質を発現することができるヌクレオチド配列をさらに含み得る。
【００７０】
本発明の別の態様は、メチロトローフ酵母株によって産生されたタンパク質上のグリコシル化を減少させるようにメチロトローフ酵母株を改変する方法に関する。本発明の方法によれば、メチロトローフ酵母株を、これらの酵母株への１つまたは複数の（すなわち、少なくとも１つの）上記の本発明のノックイン及び／またはノックアウトベクターへの形質転換によって改変する。
【００７１】
本発明の方法を使用して改変することができるメチロトローフ酵母株には、カンジダ属（Ｃｎａｄｉｄａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、及びピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）の酵母などのメタノールで増殖することができる酵母が含まれるが、これらの限定されない。このクラスの酵母の例である種のリストを、Ｃ．Ａｎｔｈｏｎｙ、１９８２、ＴｈｅＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ、２６９に見出すことができる。ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキアメタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ　ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキアアノモラ（Ｐｉｃｈｉａ　ａｎｏｍｏｌａ）、ハンセヌラポリモーファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、及びカンジダボイジニ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｂｏｉｄｉｎｉｉ）は、本発明の実施に有用なメチロトローフ酵母の例である。好ましいメチロトローフ酵母は、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）のものである。ピキアパストリス（Ｐｈｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＧＳ１１５株（ＮＲＲＬ　Ｙ−１５８５１）；米国特許第４，８１８，７００号に開示のＧＳ１９０株（ＮＲＲＬ　Ｙ−１８０１４）；米国特許第４，８１２，４０５号に開示のＰＰＦ１株（ＮＲＲＬ　Ｙ−１８０１７）；ＰＰＹ１２０Ｈ及びｙＧＣ４株；ならびにこれらに由来する株が特に好ましい。
【００７２】
本発明の方法を使用して改変することができるメチロトローフ酵母株はまた、１つまたは複数の目的異種糖タンパク質を発現するように遺伝子操作されているメチロトローフ酵母株を含む。これらの先に操作した株から発現した異種糖タンパク質上のグリコシル化を、このような株の１つまたは複数の本発明のベクターでの形質転換によって減少させることができる。
【００７３】
本発明のベクターを、Ｃｒｅｇｇら、１９８５に記載のスフェロプラスト技術または欧州特許第３１２，９３４号に記載のピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）で使用するために改変したＩｔｏら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、４８、３４１の全細胞塩化リチウム酵母形質転換などの公知の方法を使用してメチロトローフ酵母株の細胞に移入することができる。プラスミドまたは線状ベクターの形質転換に有用な他の公表されている方法には、米国特許第４，９２９，５５５号；Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５、１９２９、１９７８；Ｉｔｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５３、１６３、１９８３；米国特許第４，８７９，２３１号；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら、Ｇｅｎｅ、５９、１１５、１９８７が含まれる。エレクトロポレーション及びＰＥＧ１０００全細胞形質転換法を使用することもできる。Ｃｒｅｇｇ　ａｎｄ　Ｒｕｓｓｅｌ、分子生物学法：ピキア属プロトコル（Ｐｉｃｈｉａ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、第３章、Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．、２７から３９、１９９８。
【００７４】
形質転換酵母を、任意の適切な技術（（細胞の栄養要求性によって）必要な生化学産物の非存在下での形質転換後の栄養要求細胞の培養、新規の表現型の検出、または形質転換体における耐性遺伝子の非存在下で酵母に有毒な抗生物質の存在下での培養が含まれるが、これらに限定されない）の使用によって選択することができる。形質転換体を、例えば、サザンブロットまたはＰＣＲ分析によって評価することができるゲノムへの発現カセットの組み込みによって選択及び／または評価することができる。
【００７５】
１つの実施形態では、メチロトローフ酵母株を、α−１，２−マンノシダーゼまたはその機能的部分をコードするヌクレオチド配列含むベクターで形質転換する。ヌクレオチド配列は、メチロトローフ酵母株においてα−１，２−マンノシダーゼまたは機能的部分を発現することができ、好ましくは、メチロトローフ酵母株に組み込まれる。
【００７６】
メチロトローフ酵母株に移入されたα−１，２−マンノシダーゼの発現を、例えば、ノーザンブロット分析によるｍＲＮＡレベル及びウェスタンブロット分析によるタンパク質レベルの両方で評価することができる。タンパク質の細胞内局在化を、細胞下分画及び免疫蛍光実験を含む多数の技術の使用によって分析することができる。α−１，２−マンノシダーゼのＥＲ局在化を、細胞下分画実験におけるこの酵素と公知のＥＲ常駐タンパク質（例えば、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ）との共沈によって同定することができる。ＥＲ局在化を、ＥＲ常駐タンパク質に特徴的な免疫蛍光染色パターン（典型的には、核周囲の染色パターン）によって同定することもできる。
【００７７】
メチロトローフ酵母株において発現したα−１，２−マンノシダーゼまたはその機能的部分はマンノーストリミング活性を有することが予想され、インビトロ及びインビボアッセイを使用することができる。典型的には、インビトロアッセイは、メチロトローフ酵母株から発現及び精製された酵素でのインビトロ合成基質（例えば、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２）の消化、及びこのような酵素のＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を例えばＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２にトリミングする能力の評価を含む。インビボアッセイでは、α−１，２−マンノシダーゼまたはその一部を、メチロトローフ酵母において、このような酵母中にＮ−グリカン保有末端α−１，２結合マンノース残基でグリコシル化されることが公知の糖タンパク質と同時発現させる。このようなα−１，２−マンノシダーゼまたはその一部の酵素活性を、糖タンパク質のＮ−グリカン構造中のα−１，２結合マンノース残基数の減少に基づいて測定することができる。インビトロ及びインビボアッセイの両方では、炭水化物基の組み合わせを、当該分野で周知の技術を使用して同定することができ、これを以下の実施例に例示する。
【００７８】
別の実施形態では、メチロトローフ酵母株を、グルコシダーゼＩＩまたはその機能的部分をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換する。ヌクレオチド配列は、メチロトローフ酵母株においてグルコシダーゼＩＩまたはその機能的部分を発現することができ、好ましくは、メチロトローフ酵母株のゲノムに組み込まれる。
【００７９】
形質転換メチロトローフ酵母株で発現したグルコシダーゼＩＩまたはその機能的部分の酵素活性を、種々のアッセイを使用して評価することができる。例えば、グルコシダーゼＩＩまたはその一部をコードする配列で形質転換したメチロトローフ酵母細胞を、グルコシダーゼ基質（例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドールイル−α−Ｄ−グルコピラノシドまたは４−ＭＵ−α−Ｄ−Ｇｌｃ）を含む固体培地上で増殖させるように設定することができる。酵素がピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）によって発現されて細胞外に分泌された場合、酵素によって基質が作用し、コロニー周囲に青色または蛍光発光などの検出可能なシグナルを発生する。あるいは、発現タンパク質分子を含む脂質培養培地を回収し、基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド）を含む試験管中でインキュベートすることができる。酵素活性を、放出された特定の生成物の測定によって同定することができる。さらに、グルコシダーゼＩＩが、酵母中でグルコース残基とＮ−グリコシル化することが知られている糖タンパク質（例えば、インフルエンザノイラミニダーゼ）と同時に発現する場合、インビボアッセイを使用することができる。グルコシダーゼＩＩの酵素活性を、糖タンパク質の糖鎖中のグルコース含量の減少に基づいて測定することができる。
【００８０】
本発明のさらに別の実施形態では、メチロトローフ酵母株を、Ｏｃｈ１ノックアウトベクターで形質転換する。ベクターの形質転換及び組み込みの結果として、酵母株中のゲノムＯｃｈ１遺伝子が破壊される。
【００８１】
本発明のさらなる実施形態では、メチロトローフ酵母株を、α−１，２−マンノシダーゼ発現ベクターと、グルコシダーゼＩＩ発現ベクターと、及びＯｃｈ１ノックアウトベクターとの任意の組み合わせで形質転換する。このような改変を、連続的形質転換（すなわち、一度に１つのベクターの移入）または同時形質転換（すなわち、ベクターの同時移入）によって行うことができる。
【００８２】
所望ならば、上記の改変メチロトローフ酵母株をさらに改変することができる。例えば、任意の他のピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子をさらに破壊することができる。所望ならば、哺乳動物酵素をコードする遺伝子を移入して、ハイブリッドまたは複合体型Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生することもできる。
【００８３】
本発明の方法の使用（すなわち、１つまたは複数の本発明のベクターでの形質転換）によって改変したメチロトローフ酵母株は、本発明の別の実施形態を形成する。
【００８４】
本発明の一定の態様、特に細胞内発現α−１，２−マンノシダーゼ活性の移入はまた、Ｏ結合グリカンが主にα−１，２−結合マンノース残基からなるので、メチロトローフ酵母で産生された糖タンパク質上のＯ結合グリカンのグリコシル化の減少に有用であると理解すべきである。本明細書中で使用されるＯ結合グリカンは、糖タンパク質のセリンまたはトレオニン残基に結合した炭水化物構造をいう。
【００８５】
本発明のさらなる態様は、メチロトローフ酵母におけるグリコシル化が減少した糖タンパク質、特に、メチロトローフ酵母と異種の糖タンパク質の産生法に関する。
【００８６】
本明細書中で使用される、「糖タンパク質」は、メチロトローフ酵母において、１つまたは複数のアスパラギン残基または１つまたは複数のセリンもしくはトレオニン残基、またはアスパラギン及びセリンもしくはトレオニン残基の両方がグリコシル化されたタンパク質をいう。
【００８７】
用語「グリコシル化の減少」は、野生型の未改変メチロトローフ酵母株と比較して本発明によって改変されているメチロトローフ酵母株において糖タンパク質が発現される場合、特により少ないマンノース残基を有する糖タンパク質上の炭水化物部分のサイズの減少をいう。
【００８８】
本発明によれば、グリコシル化が減少した目的の糖タンパク質の産生を、多数の方法で行うことができる。糖タンパク質を発現することができるヌクレオチド配列を、本発明にしたがって先に改変しているメチロトローフ酵母株（すなわち、１つまたは複数の本発明のベクターで形質転換された株）に移入し、グリコシル化が減少した糖タンパク質を産生することができる。あるいは、糖タンパク質を発現するように既に遺伝子操作されているメチロトローフ酵母株を、１つまたは複数の本発明のベクターで形質転換することができる。さもなければ、メチロトローフ酵母株が目的の糖タンパク質を発現せず、本発明の任意のベクターで形質転換された株でもない場合、このような酵素株を、連続的または同時に糖タンパク質を発現することができるヌクレオチド配列及び１つまたは複数の本発明のベクターで形質転換することができる。さらに、メチロトローフ酵母株を、メチロトローフ酵母株において糖タンパク質を発現することができるヌクレオチド配列もまた含む１つまたは複数の本発明のノックイン及び／またはノックアウトベクターで形質転換することができる。
【００８９】
メチロトローフ酵母において糖タンパク質を発現することができるヌクレオチド配列を、５’から３’方向に、プロモーター、糖タンパク質をコードする配列、及び３’末端配列を含むように作製することができる。糖タンパク質の発現に適切なプロモーター及び３’末端配列は、上記の任意のプロモーター及び３’末端配列を含み得る。
【００９０】
糖タンパク質発現用ヌクレオチド配列は、さらなる配列（例えば、タンパク質産物の分泌を所望する場合、一過性ペプチドをコードするシグナル配列）を含み得る。このような配列は、広く知られており、容易に利用可能であり、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα交配因子プレプロ（αｍｆ）、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）酸ホスファターゼ（ＰＨＯ１）シグナル配列などが含まれる。
【００９１】
糖タンパク質発現用のヌクレオチド配列を、複製ベクターまたは組み込みベクターに置くことができる。このようなベクターの選択及び構築は上に記載されている。
【００９２】
糖タンパク質を発現することができるヌクレオチド配列を、プラスミド保有α−１，２−マンノシダーゼまたはグルコシダーゼＩＩ発現単位と同一の複製プラスミド上に保有させることができる。あるいは、糖タンパク質コード配列を含むヌクレオチド配列を、別のプラスミドに保有させるか宿主ゲノムに組み込む。
【００９３】
産生された糖タンパク質を、従来の方法によって精製することができる。精製プロトコールを、精製すべき特異的タンパク質の性質によって同定することができる。このような同定は当業者の範囲内である。例えば、細胞培養培地を細胞から分離し、細胞から分泌されたタンパク質を沈殿、免疫吸着、分画、または種々のクロマトグラフィー法によって培地から単離することができる。
【００９４】
本発明の方法によって産生することができる糖タンパク質には、例えば、バシラスアミロリクファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のα−アミラーゼ、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼ、トリパノソーマクルーズ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｃｒｕｚｉ）のトランスシアリダーゼ、ＨＩＶエンベロープタンパク質、インフルエンザウイルスＡ血球凝集素、インフルエンザノイラミニダーゼ、ウシヘルペスウイルス１型糖タンパク質Ｄ、ヒトアンギオスタチン、ヒトＢ７−１、Ｂ７−２，及びＢ−７受容体ＣＴＬＡ−４、ヒト組織因子、成長因子（例えば、血小板由来成長因子）、組織プラスミノゲンアクチベーター、プラスミノゲンアクチベーターインヒビターＩ、ウロキナーゼ、ヒトリソソームタンパク質（α−ガラクトシダーゼなど）、プラスミノゲン、トロンビン、第ＸＩＩＩ因子、及び免疫グロブリンが含まれる。本発明の、遺伝子操作ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）株において発現することができるさらに有用な糖タンパク質については、Ｂｒｅｔｔｈａｕｅｒ　ａｎｄＣａｓｔｅｌｌｉｎｏ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３０、１９３から２００、１９９９及びＫｕｋｕｒｕｚｉｎｓｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５６、９１５から４４、１９８７を参照のこと。
【００９５】
本発明の方法によって産生された糖タンパク質（すなわち、グリコシル化が減少した糖タンパク質）は、本発明の一部である。
【００９６】
本発明のさらに別の態様は、上記の本発明の１つまたは複数のノックインベクター、ノックアウトベクター、またはノックイン・ノックアウトベクターを含むキットを提供する。より詳細には、本発明のキットは、メチロトローフ酵母においてαマンノシダーゼＩを発現することができるベクター、メチロトローフ酵母においてグルコシダーゼＩＩを発現することができるベクター、メチロトローフ酵母においてＯｃｈ１遺伝子を破壊することができるベクター、グルコシダーゼＩＩ及びαマンノシダーゼの両方を発現することができるベクター、Ｏｃｈ１遺伝子を破壊することができ、且つグルコースＩＩ及びα−マンノシダーゼのいずれかもしくは両方またはその組み合わせを発現することができるベクターを含む。
【００９７】
キットはまた、目的の異種糖タンパク質をコードし、発現することができるヌクレオチド配列を含み得る。このようなヌクレオチド配列を、上記のノックインまたはノックアウト用の配列を含む異なるベクター中または同一のベクターにおいて得ることができる。
【００９８】
さらに、キットは、目的の異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、その後メチロトローフ酵母における形質転換及び発現のために挿入することができるプラスミドベクターを含み得る。あるいは、キット中のノックインまたはノックアウトは、目的の異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列挿入に都合の良いクローニング部位を有する。
【００９９】
キットはまた、上記の任意のノックイン、ノックアウト、ノックイン・ノックアウトベクターでその後形質転換することができるメチロトローフ酵母株を含み得る。キットはまた、１つまたは複数のノックインまたはノックアウトベクターで形質転換されているメチロトローフ酵母株を含み得る。さらに、キットは、目的の異種糖タンパク質をコードし、且つ発現することができるヌクレオチド配列で形質転換されているメチロトローフ酵母株を含み得る。
【０１００】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示される。
【０１０１】
実施例１
ＥＲ−ゴルジ境界へのα−１，２−マンノシダーゼの移入
１．１　プラスミド
【表１】
2004501635.tif 000003
トリコデルマレーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）のα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子が単離されており、これはＭａｒａｓら（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７７、２５５から２６３、２０００）に記載されている。この遺伝子配列は、ＮＣＢＩＧｅｎｂａｎｋの受け入れ番号ＡＦ２１２１５３で利用可能である。構築フラグメントを、テンプレートとしてｐＰＩＣ９ＭＦｍａｎａｓｅプラスミド及び以下のオリゴヌクレオチドプライマー：５’−ＧＡＣＴＧＧＴＴＣＣＡＡＴＴＧＡＣＡＡＧＣ−３’（配列番号２）及び５’−ＡＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＡＡＣＴＣＧＴＣＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＴＧＧＣＣＧＣＣＣＣＧＴＣＧ−３’（配列番号３）を使用したＰＣＲによって作製した。得られた産物は、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＡＯＸＩプロモーターの３’末端、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα交配因子のプレプロシグナル配列、シグナル配列でインフレームでクローン化されたトリコデルマレーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）のα−１，２−マンノシダーゼの読み取り枠、ＨＤＥＬのコード配列、終止コドン、及びＸｂａＩ制限部位を含んでいた。このフラグメントを、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化し、マンノシダーゼＯＲＦまでの５’配列を除去し、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化したベクターｐＧＡＰＺαＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂａａｒｎ、Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）にクローン化し、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα交配シグナル配列と再び融合した。得られたプラスミドを、ｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＨＤＥＬと命名し、図１に図示する。ｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＨＤＥＬ中のＭＦＭａｎＨＤＥＬ融合物のＯＲＦ配列を、配列番号１４に示す。
【０１０２】
触媒ドメインとＨＤＥＬシグナルとの間にｃ−Ｍｙｃタグのコード配列を移入するために、Ｔ．レーセイ（Ｔ．ｒｅｓｓｅｉ）のα　−１，２−マンノシダーゼのＯＲＦの３’末端を、センスプライマー５’−ＣＣＡＴＴＧＡＧＧＡＣＧＣＡＴＧＣＣＧＣＧＣＣ−３’（配列番号４）（ＳｐｈＩ制限部位を含む）及びアンチセンスプライマーＧＴＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＡＡＣＴＣＧＴＣＧＴＧＣＡＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＴＧＴＴＣＡＧＣＡＡＧＧＴＧＧＣＣＧＣＣＣＣＧＴＣＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡ（配列番号５）（ｃ−Ｍｙｃタグ及びＨＤＥＬシグナルのコード配列、その後の終止コドン及びＸｂａＩ制限部位を含む）を使用してＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物を、ＳｐｈＩ及びＸｂａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で精製し、同一の制限酵素で切断したｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＨＤＥＬに挿入し、プラスミドｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＭｙｃＨＤＥＬを得た。誘導性ＡＯＸＩプロモーターの調節下でｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＭｙｃＨＤＥＬのＯＲＦを配置するために、全ＯＲＦを、ＢｓｔＢＩ及びＸｂａＩを用いてｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＭｙｃＨＤＥＬから遊離し、ｐＰＩＣＺＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂａａｒｎ、Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）にクローン化し、ｐＰＩＣＺＢＭＦＭａｎＭｙｃＨＤＥＬを得た。
【０１０３】
マウスｃＤＮＡライブラリー（シクロヘキシミド及びマウス腫瘍壊死因子で誘導したＬ９２９細胞株から単離したｍＲＮＡ、ｃＤＮＡライブラリーの平均挿入長は２０００ｂｐであった）のＰＣＲによって、Ｃ末端ＨＤＥＬ−タグのコード配列の同時付加でのマウスマンノシダーゼＩＢ触媒ドメインのクローニングを行った。使用したＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは以下であった：５’ＡＡＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＡＣＴＣＴＴＣＡＡＡＡＣＡＣＡＡＡＣＧＣ３’（配列番号６）及び５’ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＡＡＣＴＣＧＴＣＧＴＧＴＣＧＧＡＣＡＧＣＡＧＧＡＴＴＡＣＣＴＧＡ３’（配列番号７）。産物は、５’ＸｈｏＩ部位及びＣ末端ＨＤＥＬ部位、その後に終止コドン及び３’末端のＮｏｔＩ部位を含んでいた。産物を、ＰＣＲ産物及びベクター中でＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ部位を介してｐＧＡＰＺαＡにクローン化し、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα交配シグナル配列を有するマウスマンノシダーゼ触媒ドメインの融合物をインフレームで得た。作製された全読み取り枠の配列を、配列番号５に示す。
【０１０４】
１．２　酵母形質転換及びゲノム組み込み
【表２】
2004501635.tif 000004
ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）の全形質転換を、Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎの説明にしたがったエレクトロポレーションを用いて行った。ゼオシン耐性遺伝子を保有するベクターの形質転換体を、１００μｇ／ｍｌのゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂａａｒｎ、ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）及び１Ｍソルビトールを含むＹＰＤ上で選択した。ｐＰＩＣ９誘導体の形質転換体の選択を、ヒスチジンを欠き、且つ１Ｍソルビトールを含む最小培地で行った。発現カセットのゲノム組み込みを、酵母ミニプレップ法（Ｎｕｃｌｅｏｎ）を使用してピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）株から精製したゲノムＤＮＡに対するＰＣＲを使用して評価した。トリコデルマレーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）遺伝子融合に関する全ての場合、使用したプライマーは、マンノシダーゼＯＲＦの３’半分にアニーリングしたセンスプライマー５’−ＣＣＡＴＴＧＡＧＧＡＣＧＣＡＴＧＣＣＧＣＧＣＣ−３’（配列番号８）及び本発明者らの全ての構築物中に存在するＡＯＸＩ転写ターミネーターにアニーリングしたアンチセンスプライマー３’ＡＯＸＩ５’−ＧＣＡＡＡＴＧＧＣＡＴＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣＴ−３’（配列番号９）であった。マウスマンノシダーゼ導入遺伝子のゲノム組み込みの調節のために、ＧＡＰプロモーターにアニーリングしたセンスプライマー５’ＧＡＰ５’ＧＴＣＣＣＴＡＴＴＴＣＡＡＴＣＡＡＴＴＧＡＡ３’（配列番号１０）またはＡＯＸＩにアニーリングした５’ＡＯＸＩ　５’ＧＡＣＴＧＧＴＴＣＣＡＡＴＴＧＡＣＡＡＧＣ３’、及びアンチセンスプライマー３’ＡＯＸＩ（上記）を使用しＰＣＲを行った。Ｍｙｃタグ化トリコデルマレーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）α−１，２−マンノシダーゼ発現単位を含む発現構築物のために、プローブとして全ＭＦＭａｎＭｙｃＨＤＥＬ　ＯＲＦ（ＨｉｇｈＰｒｉｍｅ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍを使用して標識した３２Ｐ）を使用したサザンブロッティングを使用してゲノム組み込みのさらなる証拠を得た。
【０１０５】
１．３　α−１，２−マンノシダーゼ発現
インフルエンザウイルス赤血球凝集素を発現するＧＳ１１５株におけるα−１，２−マンノシダーゼ発現を、定量的ノーザンブロットによって評価した。ＰＰＹ１２０Ｈ株におけるα−１，２−マンノシダーゼ発現を、抗Ｍｙｃウェスタンブロットによって評価した。
【０１０６】
定量的ノーザンブロット−全ＲＮＡを、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）株から精製し、収量を分光学的に同定した。標準的な手順にしたがってノーザンブロッティングを行い、ロードしたＲＮＡの量をブロットのメチレンブルー染色の使用、ｒＲＮＡバンドの視覚化によって評価した。ブロットを、マンノシダーゼのＣｌａＩ／ＮａｒＩフラグメントで探索し、ＨｉｇｈＰｒｉｍｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して３２Ｐで標識した。
【０１０７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティング−全酵母細胞溶解物を、細胞のＰＢＳでの２回洗浄、その後の１倍体積の２×濃縮Ｌａｅｍｍｌｉローディング緩衝液中で５分間のボイルによって調製した。溶解物をゲルローディング前に遠心分離機で短時間スピンし、上清のみをロードした。成長培地に分泌されたタンパク質の分析のために、標準的な手順に従ったデオキシコール酸／トリクロロ酢酸を使用して、２００μｌのこれらの培地からタンパク質を沈殿させた。このペレットを２×濃縮Ｌａｅｍｍｌｉローディング緩衝液に再溶解し、溶液をＴｒｉｓを使用してｐＨを較正した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、その後セミドライエレクトロブロッティングによってニトロセルロース膜に移した。ウェスタンブロッティングのために、９Ｅ１０抗Ｍｙｃ及び抗ＨＡマウスモノクローナル（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を、１μｇ／ｍｌの濃度で使用し、ウサギ抗ＰＩ抗血清（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）を５００倍希釈で使用した。二次抗体は、モノクローナルについてはアルカリホスファターゼに接合したヤギ抗マウスＩｇＧであり、ポリクローナルについてはペルオキシダーゼに接合したヤギ抗ウサギＩｇＧであった（Ｓｉｇｍａの二次抗体）。アルカリホスファターゼについてはＮＢＴ／ＢＣＩＰシステム、ペルオキシダーゼについてはルネサンス基質（ＮＥＮＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して検出を行った。Ｌｕｍｉｌａｇｅｒ画像化装置（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）によって後者のブロットの画像化を行った。
【０１０８】
図４に示した結果は、強力構成性ＧＡＰプロモーターから発現した場合及び誘導性ＡＯＸＩプロモーターから発現した場合のいずれにおいても大部分のＨＤＥＬタグ化タンパク質は細胞内に保持されることを示す。
【０１０９】
１．４　α−１，２−マンノシダーゼの局在化
糖密度ショ糖密度勾配遠心分離−ＨＤＥＬタグ化マンノシダーゼの局在化を同定するために、強力構成性ＧＡＰプロモーター由来のマンノシダーゼ−Ｍｙｃ−ＨＤＥＬを発現する細胞を使用して細胞下分画を行った。
【０１１０】
簡単に述べれば、湿重量０．５ｇの酵母細胞を、１ｍｌの溶解緩衝液（０．６Ｍソルビトール、１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、及び５ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．５））中の４．５ｇのガラスビーズとの４×１分間のボルテックスを使用して溶解した。ボルテックスの合間に、混合物を氷上に５分間に置いた。上清を回収し、ガラスビーズを溶解緩衝液で１回洗浄し、この洗浄工程の上清を第１の上清に添加した。この溶解物を、分画遠心法に供した。Ｐ１００００ペレットを、溶解緩衝液に溶解した０．５ｍｌの６０％スクロース溶液中で溶解した。この溶液を、１４×８９ｍｍのＵｌｔｒａｃｌｅａｒ超遠心分離チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ）の底に置いた。次いで、１．５ｍｌの各スクロース溶液（５５、５０、４５、４２．５、４０、及び３７．５％）を、互いに伸長に重層した。チューブを、３５％スクロースで端まで満たした。Ｂｅｃｋｍａｎ　ＳＷ４１ローターを備えたＢｅｃｋｍａｎモデルＬ８−７０分離用超遠心分離機にて、１８０，０００ｇで１４時間糖密度ショ糖勾配遠心分離を行った。完了後、上部から１ｍｌの画分を回収し、過剰なスクロースで部分透析し、真空遠心分離で蒸発乾燥させた。Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液でのペレットの再溶解後、サンプルを３連でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ウェスタンブロットをそれぞれ抗ＨＡ、抗Ｍｙｃ、または抗ＰＤＩ（タンパク質ジスルフィドイソメラーゼについては「ＰＤＩ」）で処理した。
【０１１１】
結果は、ほぼ正確にタンパク質ジスルフィドイソメラーゼマーカータンパク質を有するＭＦＭａｎＭｙｃＨＤＥＬタンパク質の共沈を示した（ＨＤＥＬシグナル配列でも標的化している）（図５）。同一のアッセイでは、ＨＡタグ化ＯＣＨ１は、全勾配に分布し、画分中で最も豊富な存在量は、マンノシダーゼ及びＰＤＩを含む画分の存在量よりも低い密度であった。この結果は、マンノシダーゼがＨＤＥＬシグナルの付加によって予想される位置（ＥＲ−ゴルジ境界）に標的されたことを示す。それに対して、誘導性アルコールキナーゼＩプロモーター（ＧＡＰプロモーターと類似の強度である）から発現したＨＤＥＬを含まないマンノシダーゼは、約２０ｍｇ／ｌの高レベルで分泌された。
【０１１２】
免疫蛍光顕微鏡−マンノシダーゼ−Ｍｙｃ−ＨＤＥＬの標的化を正確に確認するために、免疫蛍光顕微鏡実験を行った。
【０１１３】
簡単に述べれば、酵母培養物を、ＹＰＤ（ｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＭｙｃＨＤＥＬについて）またはｐＰＩＣＺＢＭＦＭａｎＭｙｃＨＤＥＬについてはＹＰグリセロール成長期の後でＹＭＰ中でＯＤ６００まで増殖させた。酵母培養物に最終濃度４％のホルムアルデヒドを添加し、室温で１０分間インキュベートした。細胞をペレット化し、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２及び４％ホルムアルデヒドを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に再懸濁し、室温で２時間インキュベートした。ペレット化後、細胞を１ｍＭ　ＭｇＣｌ２及びＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）でＯＤ６００＝１０に再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液に、０．６μｌのβ−メルカプトエタノール及び２０μｌの２０，０００Ｕ／ｍｌザイモリアーゼ　１００Ｔ（ＩＣＮ）を添加し、その後穏やかに震盪しながら２５分間インキュベートした。細胞をインキュベーション緩衝液で２回洗浄し、ポリリジンコードカバースリップ（通常紙の穿孔の強化で使用される接着リングを使用してこれらを調製する）に添加した。過剰な液体を綿棒でブロットし、細胞を２０℃で乾燥させた。全てのブロッキング、抗体インキュベーション、及び洗浄工程を、０．０５％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ中で行う。２μｇ／μｌの一次抗体を使用し、５μｇ／μｌの発蛍光団（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｐｒｏｂｅｓ）に接合した二次抗体を使用した。各を核酸色素ＨＯＥＣＨＳＴ３３２５８で染色した。固定及び細胞壁透過化後、酵母細胞形態学の完全性を位相差顕微鏡でチェックし、免疫染色後、スライドを、Ｋｏｄａｋデジタルカメラを具備したＺｅｉｓｓ　Ａｘｉｏｐｈｏｔ蛍光顕微鏡で実験した。画像をＭｃｐｒｏｂｅ４．０ソフトウェアで処理し、Ｃｏｒｅｌ　Ｐｈｏｔｏｐａｉｎｔ９．０で調製した。
【０１１４】
ゴルジマーカータンパク質ＯＣＨ１−ＨＡにより、文献に記載の典型的なゴルジ染色パターン（スペックル様染色）が得られた。マンノシダーゼ−Ｍｙｃ−ＨＤＥＬを認識する９Ｅ１０モノクローナル抗Ｍｙｃ抗体での染色により、細胞質中のいくつかの異質染色を有する核周囲染色パターンが得られ、これはＥＲ標的を示す（図４）。
【０１１５】
上記実験に基づいて、トリコデルマレーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）マンノシダーゼ−Ｍｙｃ−ＨＤＥＬがＥＲ−ゴルジ境界に標的化されたと結論付けられる。
【０１１６】
実施例２
組換え糖タンパク質でのマンノシダーゼ−ＨＤＥＬの同時発現。
【０１１７】
トリパノソーマクルーズ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｃｒｕｚｉ）トランスシアリダーゼでのマンノシダーゼ−ＨＤＥＬの同時発現
Ｃ末端反復ドメインを含まない活性トランスシアリダーゼメンバーをコードするトリパノソーマクルーズ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｃｒｕｚｉ）トランスシアリダーゼ遺伝子のクローニングは、Ｌａｒｏｙら（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、２０、３８９、２０００）（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。トリパノソーマクルーズ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｃｒｕｚｉ）トランスシアリダーゼ遺伝子の配列は、ＮＣＢＩＧｅｎｂａｎｋの受け入れ番号ＡＪ２７６６７９で利用可能である。Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）での発現のために、全遺伝子を、ｐＨＩＬＤ２（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）にクローン化して、ｐＨＩＬＤ２−ＴＳを作製した。より良好に分泌させるために、トランスシアリダーゼを酵母α交配因子のプレプロ分泌シグナルに連結したｐＰＩＣ９−ＴＳを作製した。容易に検出及び精製するためにエピトープＥタグをトランスシアリダーゼのＣ末端に付加したプラスミドｐＰＩＣ９−ＴＳＥ及びｐＣＡＧＧＳ−プレプロ−ＴＳＥを作製した。ｐＨＩＬＤ２−ＴＳ、ｐＰＩＣ９−ＴＳＥ、及びｐＣＡＧＧＳ−プレプロ−ＴＳＥの構築は、Ｌａｒｏｙら（２０００）（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。構築で使用したベクターは、ｐＣＡＧＧＳについてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｅｌｓｐｏ．ｂｅ／ｂｃｃｍ／ｌｍｂｐ．ｈｔｍ＃ｍａｉｎ（番号ＬＭＢＰ２４５３）、ｐＨＩＬＤ２及びｐＰＩＣ９についてはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ならびにｐＣＡＮＴＡＢ−５ＥについてはＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈから利用可能であった。
【０１１８】
プラスミドｐＰＩＣ９−ＴＳＥをＳｓｔＩで線状化し、製造者の説明書に従ったエレクトロポレーションによって、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＳ１１５（ｈｉｓ４）株に形質転換した。形質転換体の１つを、プラスミドｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＨＤＥＬでさらに形質転換し、マンノシダーゼ−ＨＤＥＬ及びトリパノソーマクルーズ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｃｒｕｚｉ）トランスシアリダーゼを同時発現する株を確立した。
【０１１９】
発酵及びタンパク質精製を、Ｌａｒｏｙら（２０００）に記載の手順に従って行った。
【０１２０】
精製トランスシアリダーゼを、Ｃａｌｌｗａｅｒｔら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１１、４、２７５から２８１、２００１に従った炭水化物分析に供した。簡単に述べれば、糖タンパク質を、９６ウェルプレートのウェル中のＰＶＤＦ膜に結合させ、還元し、アルキル化し、ペプチド−Ｎ−グルコシダーゼＦ脱グリコシル化に供した。８−アミノ−１，３，６−ピレンスルホン酸を使用した還元的アミン化によってグリカンを誘導した。その後、過剰な遊離標識をＳｅｐｈａｄｅｘＧ１０パックスピンカラムを使用して除去し、グリカンをＡＢＩ３７７Ａ　ＤＮＡシークエンサーの３６ｃｍ配列決定ゲルでの電気泳動によって分析し、内蔵のアルゴンレーザーを使用して検出した。３ｍＵ／ｍｌの精製Ｔ．レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のα−１，２−マンノシダーゼでの消化（Ｍａｒａｓら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７７、２５５から６３、２０００に記載）もまた、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ＝５．０）中で行った。１μｇの精製組換え糖タンパク質由来のグリカンを、基質として使用した。１Ｕのα−１，２−マンノシダーゼを、３７℃でｐＨ＝５．０での１分あたりのパン酵母マンナンからの１μモルのマンノースを放出する酵素の量と定義する。
【０１２１】
図６で認められるように、パネルＢ、トランスシアリダーゼ上の主要なＮ−グリカンはＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（パネルＦと比較して、ウシＲＮＡｓｅＢのＮ−グリカン分析を示す。このプロフィール中の１つであるが最後のピークはＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２であり、最初のピークはＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２である）であった。インビトロでは、このグリカンは、αー１，２−マンノシダーゼでＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に消化可能であった（図６、パネルＣ）。マンノシダーゼ−ＨＤＥＬで同時発現したトランスシアリダーゼのＮ−グリカンプロフィールでは、主要ピークは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に対応する（図６、パネルＤ）。
【０１２２】
インフルエンザＡウイルス赤血球凝集素とのマンノシダーゼ−ＨＤＥＬの同時発現
インフルエンザＡウイルス赤血球凝集素は、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）において９から１２個のマンノース残基を含む高マンノースＮ−グリカンでグリコシル化することが知られていた（Ｓａｅｌｅｎｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２６０：１６６から１７５、１９９９）。赤血球凝集素のＮ−グリカンに対する同時発現マンノシダーゼの効果を、下記のＮ−グリカンプロファイリング法でアッセイした。さらに、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）酵素（至適温度６０℃）と至適温度３７℃の哺乳動物マンノシダーゼとの有効性を比較するために、マウスｃＤＮＡライブラリー由来のマウスマンノシダーゼＩＢの触媒ドメインをクローン化し、ＰＣＲ増幅によってＨＤＥＬシグナルでタグ化した。ＧＡＰプロモーターの存在下で、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα交配因子の後にプレプロシグナル配列このＯＲＦをクローン化した。ｍＲＮＡレベルでのマンノシダーゼ−ＨＤＥＬ導入遺伝子の発現を、定量的ノーザンブロッティングによって確認した。
【０１２３】
Ｋｕｌａｋｏｓｋｙら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、８、７４１から７４５、１９９８に記載の手順に従って、赤血球凝集素を、非マンノシダーゼ発現コントロール株及びトリコデルマレーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）マンノシダーゼ−ＨＤＥＬまたはマウスマンノシダーゼＩＢ−ＨＤＥＬを同時発現する株から発現及び精製した。精製赤血球凝集素を、Ｓａｅｌｅｎｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２６０、１６６から１７５、１９９９に記載のＰＮＧａｓｅＦ消化に供した。タンパク質及びグリカンを、３倍体積の氷冷アセトンで沈殿させ、グリカンを６０％メタノールでペレットから抽出した。真空蒸発後、グリカンを、１μｌの２０ｍＭ　ＡＰＴＳの１．２Ｍクエン酸溶液及び１Ｍ　ＮａＣＮＢＨ３のＤＭＳＯ溶液の１：１混合物の添加及び２５０μｌのＰＣＲチューブの底での３７℃で１６時間のインキュベーションによって８−アミノ−１，３，６−ピレントリスルホン酸で標識した。１０μｌの脱イオン水の添加によって反応を停止させ、混合物を１．２ｃｍのＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ１０ベッド上にロードし、スイングバケットローター中での遠心分離によってマイクロスピンカラム中で乾燥させて、平らな樹脂表面を得た。ローディング後、５０μｌの脱イオン水を樹脂ベッドに慎重に添加し、スピンカラムを卓上遠心分離機にて７５０ｇで５分間簡単に遠心分離した。溶出工程を２回繰り返し、全ての溶出物をプールし、Ｓｐｅｅｄｖａｃ真空遠心分離機（Ｓａｖａｎｔ）で蒸発乾燥させた。標識グリカンを、５０％ホルムアミド及び０．５μｌのＧｅｎｅｓｃａｎ５００（商標）を含む１．５μｌのゲルローディング緩衝液で再構成し、ローダミン（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で標識し、内部標準として使用した。この混合物を、１０％のアクリルアミド：ビスアクリルアミド（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）の１９：１混合物を含むＤＮＡ配列決定ゲル上にロードし、標準ＤＮＡ配列決定緩衝液（８９ｍＭ　Ｔｒｉｓ、８９ｍＭ　ホウ酸塩、２．２ｍＭ　ＥＤＴＡ）中で作製した。ゲルの重合を、２００μｌの１０％過硫酸アンモニウム水溶液及び２０μｌのＴＥＭＥＤの添加によって触媒した。標準的な３６ｃｍの読み取りやすい長さであり、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３７３Ａ　ＤＮＡ配列決定装置で運転した。１０００Ｖで１５分間、ゲルの試運転を行い、ローディング後、ゲルを１２５０Ｖで８時間非加熱の電気泳動を行った。この方法の検出限度は、ピークあたり１０ｆｍｏｌである。データを、Ｇｅｎｅｓｃａｎ３．０ソフトウェアで分析した。
【０１２４】
図７に示すように、トリコデルマレーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）のα−１，２−マンノシダーゼにおいては、Ｎ−グリカン上のα−１，２−マンノシダーゼ数がほとんど完全に減少した。マウスマンノシダーゼＩＢ−ＨＤＥＬによって処理したＮ−グリカンは、トリコデルマレーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）α−１，２−マンノシダーゼよりも有効性が低かった。
【０１２５】
赤血球凝集素のＮ−グリカンからのα−１，２−マンノシダーゼの有効な除去にもかかわらず、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は得られなかった。３ｍＵの精製トリコデルマレーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）のα−１，２−マンノシダーゼでのＮ−グリカンの消化後でさえも、最も小さな糖鎖としてＭａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２は得られなかった。これらの結果は、おそらく残存する残基は、ＯＣＨ１　α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ酵素活性の開始に由来する、α−１，６結合マンノースであることを示した。ＯＣＨ１はゴルジ装置の非常に初期の部分に局在し、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２前駆体のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２への完全な消化の前に赤血球凝集素のＮ−グリカンに作用し得る。したがって、グリカンがα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼによって有効に修飾されたタンパク質については、トランスフェラーゼをコードするＯＣＨ１遺伝子の不活化は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を得るために望ましい。
【０１２６】
実施例３
ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）　Ｏｃｈ１遺伝子の不活化
ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）配列は、Ｇｅｎｂａｎｋの受け入れ番号Ｅ１２４５６に見出され、日本国特願平０７−１４５００５（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。この配列は全てα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼの典型的な特徴を示し、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＯＣＨ１にほとんど相同であるので、本明細書中ではピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＯｃｈ１遺伝子と呼ぶ。
【０１２７】
第１に、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＯｃｈ１遺伝子の全長ＯＲＦをｐＵＣ１８にＰＣＲクローニングし、プラスミドｐＵＣ１８ｐＯｃｈ１を得た。ｐＵＣ１８ｐＯｃｈ１を、ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで平滑末端にし、ＸｂａＩで切断し、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＯｃｈ１遺伝子の５’部分を含むフラグメントを遊離させた。このフラグメントを、ＥｃｏＲＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで平滑末端にし、ＮｈｅＩで切断したベクターｐＢＬＵＲＡ　ＩＸ（Ｋｅｃｋ　Ｇｒａｄｕａｔｅ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｊａｍｅｓ　Ｃｒｅｇｇ博士、ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｋｇｉ．ｅｄｕ／ｈｔｍｌ／ｎｏｎｃｏｒｅ／ｆａｃｕｌｔｙ／ｃｒｅｇｇ／ｃｒｅｇｇ．ｈｔｍ）にライゲーションした。このライゲーションにより、図８に記載のｐＢＬＵＲＡ５’ＰｐＰＣＨ１が作製された。
【０１２８】
ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）ゲノム中でのこのピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）　ＯＣＨ１遺伝子の破壊を、図９に例示のように、ｐＢＬＵＲＡ５’ＰｐＯＣＨ１を使用した１つの相同組換えによって行った。１つの相同組換えの結果として、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）染色体上のＯｃｈ１遺伝子は、以下の２つのＯｃｈ１配列に置換された：一方は第１の１／３の長さのＯｃｈ１　ＯＲＦからなり、他方はプロモーターを含まない全長Ｏｃｈ１　ＯＲＦを有していた。１つの相同組換えを以下のように行った。ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）のｙＧＣ４株を、１つのカッターＢｓｔＢＩで線状化したｐＢＬＵＲＡ５’ＰｐＯＣＨ１を使用したエレクトロポレーションによって形質転換した。１Ｍソルビトール、ビオチン、アルギニン、アデニン、及びヒスチジンを含み、２７℃でインキュベートした最小培地に約５００個の形質転換体が得られた。これらの形質転換体のうちの３２個を取り出し、同一条件下で再選択した。ＰＣＲによってカセットの正確なゲノム組み込みについて１２個のクローンをさらに分析した。１２個のうち７個のＵＲＡ栄養要求性クローンが正しい遺伝子座中にカセットを含んでいた。
【０１２９】
１つのＯｃｈ１不活化クローンを、ｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＨＤＥＬで形質転換して、「超形質転換体」も作製した。Ｏｃｈ１不活化クローン及びＭａｎＨＤＥＬも発現する３つの超形質転換体の両方を、以下のように細胞壁グリカン分析で評価した。酵母細胞を１０ｍｌのＹＰＤでＯＤ６００＝２まで増殖させ、マンノタンパク質を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）中での１２０℃で９０分間の酵母細胞のオートクレーブ及び遠心分離での上清の回収によって調整した。タンパク質を、この上清から３倍体積の冷メタノールで沈殿させた。この方法で得たタンパク質調製物を、Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔら、２００１、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１１、２７５から２８１に記載のＤＳＡ−ＦＡＣＥを使用したＮ−グリカン分析に使用した。図１０に示すように、親ｙＧＣ４株と比較してＯｃｈ１不活化クローン中のＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２グリカン量が増加し、これはＯｃｈ１酵素活性の減少を示す。ＨＤＥＬタグ化α−１，２−マンノシダーゼも発現する３つ全ての超形質転換体では、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の産生が認められた。さらに、３ｍＵ／ｍｌの精製組換えトリコデルマレーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）のα−１，２−マンノシダーゼとのこのグリカン混合物消化の際、親株よりもｐＢＬＵＲＡ５’ＰｐＯＣＨ１で形質転換した株えより多くのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が形成された（図１１、パネル２及び３との比較）。
【０１３０】
これらの結果により、α−１，２−マンノシダーゼを発現する細胞由来の赤血球凝集素などの組換え作製タンパク質におけるＭａｎ５グリカンの産生の欠如はＯｃｈ１タンパク質の活性に起因することが確認された。これらの結果は、Ｍａｎ５グリカンでの糖タンパク質の産生を、Ｏｃｈ１遺伝子の不活化によって容易にすることができることをさらに示す。
【０１３１】
実施例４
ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）でのグルコシダーゼＩＩの発現
４．１　Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＧＬＳＩＩαサブユニットの増幅
Ｎｕｃｌｅｏｎキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＩＮＶＳ鎖（α、ｌｅｕ２−３、１１２　ｈｉｓ３Δ１、ｔｒｐｌ−２８９、ｕｒａ３−５２）からゲノムＤＮＡを調製した。テンプレートとしてのこのゲノムＤＮＡ及びＬＡ　ＴａＫａＲａポリメラーゼ（ＩｍＴｅｃ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、タッチダウンＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲプライマー配列は、以下の公知のＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＬＳＩＩＯＲＦ配列に基づいた：
【化１】
2004501635.tif 000005
４．２　ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現ベクターへのＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グルコシダーゼＩＩ　ＯＲＦのクローニング
グルコシダーゼＩＩ発現ベクターの構築−ＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩ／ＡｐａＩで消化し、ｐＧＡＰＺＡベクター（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）にライゲーションすることにより、ＧＡＰプロモーターの転写調節下にＯＲＦを置いた。このストラテジーを使用して、ｍｙｃ及びＨｉｓ６タグを、グルコシダーゼＩＩのＣ末端にインフレームで置き、ｐＧＡＰＺＡＧＬＳＩＩを作製した。次いで、ｐＧＡＰＺＡＧＬＳＩＩの完全なＯＲＦを配列決定して、ＰＣＲ反応物に変異が起こっていないことを確認した。ベクターｐＧＡＰＺＡＧＬＳＩＩ配列を、配列番号１８に示す。ｐＧＡＰＺＡＧＬＳＩＩ由来のＧＬＳＩＩＯＲＦを、ベクターｐＰＩＣＺＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化してｐＰＩＣＺＡＧＬＳＩＩを作製することにより、ＡＯＸＩプロモーターの転写調節下にＯＲＦを置いた。ｐＧＡＰＺＡＧＬＳＩＩベクター由来のＧＬＳＩＩ　ＯＲＦを、ベクターｐＡＯＸ２ＺＡにクローン化することにより、ＡＯＸ２プロモーターの転写調節下にＯＲＦを置いた。ベクターｐＡＯＸ２ＺＢのマルチクローニング部位のｐＰＩＣＺＡのマルチクローニング部位への置換によって、このベクターを作製した。ベクターｐＡＯＸ２ＺＢを、ｐＰＩＣＺＢのＡＯＸ１プロモーターのＡＯＸ２遺伝子のＡＯＸ２プロモーター起点の置換によって作製した（Ｍａｒｔｉｎｅｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、２１）。ＡＯＸ２プロモーター領域を、センスプライマー５’ＧＡＣＧＡＧＡＴＣＴＴＴＴＴＴＴＣＡＧＡＣＣＡＴＡＴＧＡＣＣＧＧ３’（配列番号２６）及びアンチセンスプライマー５’ＧＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＴＴＣＴＣＡＧＴＴＧＡＴＴＴＧＴＴＴＧＴ３’（配列番号２７）を使用したピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）ＤＮＡについてのＰＣＲによって作製した。ｐＧＡＰＺＧＬＳＩＩベクター由来のＧＬＳＩＩ　ＯＲＦをベクターｐＹＰＴ１ＺＡにクローン化して、ｐＹＰＴＩＺＡＧＬＳＩＩを作製することによって、ＹＰＴ１プロモーターの転写調節下にＯＲＦを置いた。ベクターｐＹＰＴＺＡを、ｐＰＩＣＺＡのＡＯＸ１プロモーターのプラスミドｐＩＢ３（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号ＡＦ０２７９６０）に存在するＹＰＴ１プロモーターへの置換によって作製した（Ｓｅａｒｓら、Ｙｅａｓｔ１４、７８３から７９０頁、１９９８）。全ての構築物は、フレオマイシン耐性遺伝子を含む。得られた最終発現ベクター（ｐＧＡＰＺＡＧＬＳＩＩ、ｐＡＯＸ２ＺＡＧＬＳＩＩ、ｐＰＩＣＺＡＧＬＳＩＩ、及びｐＹＰＴ１ＺＡＧＬＳＩＩ）を、図１２から図１５に示す。
【０１３２】
アンピシリン耐性マーカー及びピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）ＡＤＥ１選択マーカーを保有する類似の発現ベクターを構築した。原理的には、プラスミドｐＡＯＸ２ＺＡＧＬＳＩＩ、ｐＧＡＰＺＡＧＬＳＩＩ、及びｐＹＰＴ１ＺＡＧＬＳＩＩのゼオシン耐性発現カセットを、ベクターｐＢＬＡＤＥ　ＩＸ（Ｃｒｅｇｇ，Ｊ．Ｍ．）のアンピシリン及びピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）ＡＤＥＩカセットに置換して、ベクターｐＡＯＸ２ＡＤＥ１ｇｌｓＩＩ、ｐＧＡＰＡＤＥ１ｇｌｓＩＩ、及びｐＹＰＴ１ＡＤＥ１ｇｌｓＩＩを得た。ベクターｐＰＩＣＡＤＥ１ｇｌｓＩＩを、ベクターｐＢＬＡＤＥ　ＩＸ（Ｃｒｅｇｇ，Ｊ．Ｍ．）のマルチクローニング部位への挿入によってグルコシダーゼＩＩ読み取り枠の挿入によって得た。得られた最終発現ベクター（ｐＧＡＰＡＤＥ１ｇｌｓＩＩ、ｐＡＯＸ２ＡＤＥ１ｇｌｓＩＩ、ｐＰＩＣＡＤＥ１ｇｌｓＩＩ、及びｐＹＰＴ１ＡＤＥ１ｇｌｓＩＩ）を、図１６から図２０に示す。
【０１３３】
グルコシダーゼＩＩ発現ベクターへのＥＲ保持タグＨＤＥＬの付加−以下のプライマーを使用して、ＨＤＥＬ含有ＰＣＲフラグメントを作製した：
【化２】
2004501635.tif 000006
６０℃でＴａｑ　ｐｏｌを使用して、ｐＧＡＰＺＡＧＬＳＩＩについてＰＣＲを行った。２２５ｂｐのＰＣＲフラグメントを、ＳａｌＩ／ＳｐｌＩで切断し、ＳａｌＩ／ＳｐｌＩ開環ｐＧＡＰＺＡＧＬＳＩＩベクターにライゲーションして、プラスミドｐＧＡＰＺＡｇｌｓＩＩＨＤＥＬを作製した。プラスミドｐＧＡＰＺＡｇｌｓＩＩＨＤＥＬを、配列番号２４に示す。構築ストラテジー及び得られた最終発現ベクター（ｐＧＡＰＺＡｇｌｓＩＩＨＤＥＬ及びｐＧＡＰＡＤＥ１ｇｌｓＩＩＨＤＥＬ）を、図２０から図２１に示す。
【０１３４】
４．３　ピキアパストリス（Ｐｉｃｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）株の形質転換
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎに記載の従来のエレクトロポレーション技術を使用して、形質転換を行った。ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＰＹ１２−ＯＨ株の細胞を、１つのカッターＡｖｒＩＩで切断したｐＧＡＰＺＧＬＳＩＩで形質転換した。形質円歓待を、そのゼオシン耐性に基づいて選択した。
【０１３５】
形質転換体のゲノム分析−ゲノムＤＮＡを、いくつかのゼオシン耐性ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）形質転換体から調製した。ゲノムＤＮＡについてＰＣＲ反応を行って、グルコシダーゼＩＩ遺伝子が酵母ゲノムに組み込まれたかを同定した。Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｉｎｇｅｒ）（アニーリングのために２．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５５℃）を使用してＰＣＲを行った。プライマーは、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ゲノムＤＮＡのＯＲＦの増幅で使用したものと同一であった。ｐＧＡＰＺＡＧＬＳＩＩ形質転換体を、グルコシダーゼＩＩのＯＲＦを示す特異的ＰＣＲ産物の存在によって確認した。
【０１３６】
４．４　ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グルコシダーゼＩαサブユニットの発現及び分泌
転写レベルでの分析−ゲノム分析後に陽性と記録された形質転換体からＲＮＡを調製した。各サンプルから、１５μｇのＲＮＡをホルムアルデヒドアガロースゲルにロードした。電気泳動後、ＲＮＡをＨｙｂｏｎｄ　Ｎ膜にブロットした。膜を、グルコシダーゼＩＩ　ＯＲＦの３’領域に対応する３４４ｂｐのグルコシダーゼＩＩ特異的フラグメントからなる放射性プローブを使用してハブリッド形成させた。非形質転換株でシグナルは検出されなかったが、形質転換体では明白なシグナルが認められた。
【０１３７】
二重膜アッセイを使用したタンパク質レベルでの分析−ニトロセルロース膜を、緩衝化デキストロース培地（ＢＭＤＹ）に入れた。このニトロセルロース膜の上に、酢酸セルロース膜を置いた。ｐＧＡＰＺＡＧＬＳＩＩのピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）形質転換体を、酢酸セルロース上に画線し、数日間増殖させた。酵母細胞は酢酸セルロース上にとどまるが、分泌タンパク質はこの膜を通過する。したがって、分泌タンパク質がニトロセルロース膜上に捕獲された。数日後、酵母コロニーを含む酢酸セルロースを取り出した。ニトロセルロース膜を、抗ｍｙｃ抗体を使用してグルコシダーゼＩＩの存在について分析した。野生型（ＷＴ）の非形質転換株のかすかで目視が困難なシグナルと比較して、ほとんどの形質転換体は明白なシグナルを発生した。
【０１３８】
細胞外発現−構築物ｐＧＡＰＺＡＧＬＳＩＩ（ｍｙｃｈｉｓ６）のＰＰＹ１２−ＯＨ形質転換体（１２、１４、及び１８株）及び構築物ｐＧＡＰＺＡＧＬＳＩＩ（ｍｙｃ）ＨＤＥＬの形質転換体（Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３株）を、２×１０ｍｌのＢＭＤＹ培地上で２日間増殖させた。これらの６つの形質転換体は、ゲノムレベル（ｇＤＮＡのＰＣＲ）おおびＲＮＡレベル（ノーザンブロット）の両方でより早く陽性が記録された。培養培地を遠心分離によって回収し、ビバスピン（Ｖｉｖａｓｐｉｎ）カラムにて約１ｍｌに濃縮した。この濃縮物由来のタンパク質をＴＣＡで沈殿させ、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液で再懸濁し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のためにロードした。タンパク質を、ニトロセルロース膜にブロットした。ブロットを、抗ｍｙｃ抗体（Ａｂ）と共に一晩インキュベートした。二次抗体（Ａｂ）を、ペルオキシダーゼに結合させた。ルネッサンス発光検出キット（ＮＥＮ）及び感光フィルム（Ｋｏｄａｋ）を使用して、形質転換体１２、１４、及び１８において約１１０ｋＤａの強力なバンドが認められ、ＧＬＳＩＩが発現し、これらの形質転換体から分泌されたことを示す。形質転換体Ｈ１から３についてはシグナルは得られず、これは、ＧＬＳＩＩ　ＯＲＦにＣ末端を付加したＨＤＥＬタグによりタンパク質のＥＲ局在化が得られ、成長培地へのＧＬＳＩＩの分泌が阻止されたことを示す。
【０１３９】
細胞内発現−６つの形質転換体及びＷＴ株を、５００ｍｌのＢＭＤＹ中で２日間増殖させた。細胞を遠心分離によって回収し、洗浄し、最小体積（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５％グリセロール）に再懸濁し、ガラスビーズを使用して破壊した。細胞破片を、数回の遠心分離工程（低速遠心分離（２０００から３０００ｇ））によって除去した。超遠心分離による上清から膜を得た。ペレットをＬａｅｍｍｌｉ緩衝液に再懸濁し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のためにロードした。タンパク質を、ニトロセルロース膜上にブロットした。抗ｍｙｃ抗体（Ａｂ）及びペルオキシダーゼ接合二次抗体（Ａｂ）を使用して、細胞内ＧＬＳＩＩ発現をチェックした。発光検出後、ＧＬＳＩＩＨＤＥＬ形質転換体（Ｈ１及びＨ３、Ｈ２はわずかなシグナル）については約１１０ｋＤａのバンドが認められたが、ＷＴ及びＧＬＳＩＩ発現株については認められなかった。これらの結果は、Ｃ末端ＨＤＥＬタグで発現した場合に組換えＧＬＳＩＩが細胞内に存在することを示す。このタグが存在しない場合、ＧＬＳＩＩは検出されなかった。
【０１４０】
４．５　組換えグルコシダーゼＩＩαサブユニットの精製及び活性アッセイ
以下のようにＧＬＳＩＩアッセイを準備し、ポジティブコントロールとして市販の酵母α−グルコシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）を使用して試験した。
【０１４１】
組成：７０μｌの８０ｍＭリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ６．８）、７μｌの２５０ｍＭマンノース、３．５μｌの２５０ｍＭ　２−デオキシ−Ｄ−グルコース、０．８μｌの４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（１μＭ）。以下の３つのアッセイを行った：１単位の市販の酵素を使用したアッセイ、酵素を使用しないアッセイ、及び酵素を使用するが基質を使用しないアッセイ。アッセイ混合物を３０℃で一晩インキュベートした。ＵＶで発光した場合、酵素及び基質の両方を含む反応混合物は、蛍光を示した（図２２）。これは、アッセイはαグルコシダーゼ活性の検出に非常に特異的であることを示す。
【０１４２】
ＷＴＰＰＹ１２−ＯＨの１８株及びＨ３株を、２×１０ｍｌの成長培地で２日間増殖させた。細胞をスピンして沈殿させ、培地を３０ｍＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのイミダゾールで調整し、ビバスピン（Ｖｉｖａｓｐｉｎ）カラムで０．５から１ｍｌに濃縮した。培地をＮｉ−ＮＴＡスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）にロードし、製造者の説明にしたがって精製を行った。タンパク質を、２×１００μｌの溶出緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール（Ｈ８．０））にてカラムから溶出させた。各溶出物から、２０μｌをそのグルコシダーゼＩＩ活性についてアッセイした。２０μｌの溶出緩衝液で希釈した０．３３単位の市販の酵素を、ポジティブコントロールとして使用した。ポジティブコントロール及び１８株（培地に酵素が分泌された株）の溶出物で蛍光が認められた。これらの結果は、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）から分泌された組換えＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧＬＳＩＩαサブユニットが機能的に活性な酵素であることを示す。ＷＴ（非形質転換）株及びＧＬＳＩＩが細胞内で発現されなかったＨ３株では活性は認められなかった（図２３）。これらの結果はまた、βサブユニットは、タンパク質のα部分の機能性に必要ではないことを示す。
【０１４３】
実施例５
グルコシダーゼＩＩ及びマンノシダーゼの両方を発現するピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）株の作製。
【０１４４】
ＧＳ１１５株を、ｐＧＡＰＺＧＬＳＩＩ及びｐＧＡＰＺｇｌｓＩＩＨＤＥＬで形質転換した。形質転換体を、ＹＰＤＳｚｅｏ上で選択した。
【０１４５】
ｙＧＣ４株を、それぞれ以下の構築物で形質転換した。
【０１４６】
（１）ｐＧＡＰＡＤＥｇｌｓＩＩ及びｐＧＡＰＡＤＥｇｌｓＩＩＨＤＥＬ（アデニンを含まない合成ソルビトール培地での選択）、
（２）ｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＨＤＥＬ（ＹＰＤＳｚｅｏでの選択）、
（３）ｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＨＤＥＬ／ｐＧＡＰＡＤＥｇｌｓＩＩＨＤＥＬ（アデニン及びゼオシンを含まない合成ソルビトール培地での選択）。
【０１４７】
ＯＣＨ１ノックインを有し、且つＭＦマンノシダーゼＨＤＥＬを発現するｙＧＣ４株を、ｐＧＡＰＡＤＥｇｌｓＩＩ及びｐＧＡＰＡＤＥｇｌｓＩＩＨＤＥＬで形質転換した。形質転換体の選択を、アデニン及びウラシルを含まない合成ソルビトール培地で行った。
【０１４８】
全ての形質転換体について、クローンが得られた。ＰＣＲによって同定したゲノムに組み込まれた発現ベクターを含む形質転換対が得られた。これらのいくつかの形質転換体由来のＧＬＳＩＩ発現が認められた。
【０１４９】
【化３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１はＨＤＥＬタグ化トリコデルマレーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）α−１，２−マンノシダーゼ発現カセットを保有するベクター示し、これらのベクターを当該分野で公知の方法に従って構築する方法を説明している。構築スキームを通して使用した略語を以下に示す：５’ＡＯＸ１またはＡＯＸ１Ｐ：ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＡＯＸ１プロモーター配列；ＡｍｐＲ：アンピシリン耐性遺伝子；ＣｏｌＥ１：ＣｏｌＥ１複製起点；３’ＡＯＸ１：ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１遺伝子の３’配列；ＨＩＳ４：ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＨＩＳ４遺伝子；ＡＯＸ　ＴＴ：ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＡＯＸ１遺伝子の転写終止配列；ＯＲＦ：読み取り枠；Ｓ：分泌シグナル；Ｐ　ＴＥＦ１：サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）転写延長因子１遺伝子のプロモーター配列；Ｐ　ＥＭ７：合成構成原核生物プロモーターＥＭ７；Ｚｅｏｃｉｎ：ゼオシン耐性遺伝子；ＣＹＣ１　ＴＴ：Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　ＣＹＣ１遺伝子の３’末端；ＧＡＰ：ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター配列；ＰｐＵＲＡ３：ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ３遺伝子。この図で認められるように、トリコデルマレーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）α−１，２−マンノシダーゼをＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα交配因子分泌シグナル配列のコード配列に作動可能に連結させ、コード配列の３’末端でＨＤＥＬペプチドのコード配列にさらに作動可能に連結させた。全融合構築物を、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＡＯＸ１プロモーター（ｐＰＩＣ９ＭＦＭａｎＨＤＥＬ中）またはＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰプロモーター（ｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＨＤＥＬ中）のいずれかに作動可能に連結させた。
【図２】
図２はＨＤＥＬタグ化マウス（Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ）のα−１，２−マンノシダーゼＩＢ発現カセットを保有するベクターを示し、これらのベクターを当該分野で公知の方法に従って構築する方法を説明している。この図で認められるように、マウス（Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ）のα−１，２−マンノシダーゼＩＢをＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα交配因子分泌シグナル配列のコード配列に作動可能に連結させ、コード配列の３’末端でＨＤＥＬペプチドのコード配列にさらに作動可能に連結させた。全融合構築物を、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＡＯＸ１プロモーター（ｐＰＩＣ９ｍＭａｎＨＤＥＬ中）またはＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰプロモーター（ｐＧＡＰＺｍＭａｎＨＤＥＬ中）のいずれかに作動可能に連結させた。さらに、ｃＭｙｃエピトープタグのコード配列がＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα交配因子分泌シグナル配列のコード配列とマウス（Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ）のα−１，２−マンノシダーゼＩＢの触媒ドメインのコード配列との間に挿入された発現カセットの変異体を作製した。この発現カセットを、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＡＯＸ１プロモーター（ｐＰＩＣ９ｍＭｙｃＭａｎＨＤＥＬ中）またはＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰプロモーター（ｐＧＡＰＺｍＭｙｃＭａｎＨＤＥＬ中）のいずれかにも作動可能に連結させた。
【図３】
図３はＭｙｃＨＤＥＬタグ化トリコデルマレーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）のα−１，２−マンノシダーゼを保有するベクター及びこれらのベクターを得る方法を示す図である。得られた融合構築物物を、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＡＯＸ１プロモーター（ｐＰＩＣＺＢＭＦＭａｎＭｙｃＨＤＥＬ中）またはＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰプロモーター（ｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＭｙｃＨＤＥＬ中）のいずれかに再度作動可能に連結させた。
【図４】
図４はＭｙｃＨＤＥＬタグ化トリコデルマレーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）のα−１，２−マンノシダーゼの細胞内局在化及び免疫蛍光分析によるＥＲタグ化を示す図である。パネルＡ：ウェスタンブロッティング。酵母株を１０ｍｌ　ＹＰＧ培養にてＯＤ６００＝１０まで増殖させ、５倍希釈し、ＹＰＭ中で４８時間増殖させた。１／５０の培養培地及び１／６５の細胞を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びマウスモノクローナル９Ｅ１０抗Ｍｙｃ抗体を使用したウェスタンブロッティングで分析した。分子量マーカータンパク質の位置を、矢印で示す。レーン１から５：細胞溶解物。１，２；ｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＭｙｃＨＤＥＬ形質転換体。３：非形質転換ＰＰＹ１２ＯＨ（ネガティブコントロール）。４，５：ｐＰＩＣＺＢＭＦＭａｎＭｙｃＨＤＥＬ形質転換体。レーン６から１０：培養培地。６：非形質転換ＰＰＹ１２ＯＨ（ネガティブコントロール）。７，８：ｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＭｙｃＨＤＥＬ形質転換体。９，１０：ｐＰＩＣＺＢＭＦＭａｎＭｙｃＨＤＥＬ形質転換体。パネルＢ：免疫蛍光顕微鏡法。１：Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞（ｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＨＤＥＬで形質転換したＰＰＹ１２ＯＨ株）の位相差画像（１０００倍）。核は、細胞の右下の四分円中に楕円として認められる。２：１と同一であるが、Ｔ．レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）マンノシダーゼ−Ｍｙｃ−ＨＤＥＬタンパク質の局在化を示すために蛍光顕微鏡モードで示した細胞である。このタンパク質は、主に、小胞体の静止期分布に典型的な核周囲（核包膜）に円形に分布して局在化している。３：Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞（ｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＨＤＥＬで形質転換したＰＰＹ１２ＯＨ株）の位相差画像（１０００倍）。４：Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＰＹ１２ＯＨ株におけるゴルジマーカータンパク質ＯＣＨ１−ＨＡの局在化を示すための蛍光顕微鏡で示した同一の細胞。細胞あたり３から４個の点を含む細胞質を通した斑点様分布は、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるシスゴルジ分布に典型的である。
【図５】
図５はショ糖密度勾配遠心分離におけるマンノシダーゼ−ＭｙｃＨＤＥＬのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとの同時沈降を示す図である。上のパネルは、ＯＣＨ１−ＨＡゴルジマーカータンパク質のショ糖勾配の異なる画分での分布を示す。中央のパネルは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ小胞体マーカータンパク質の分布を示す。最後に、下のパネルは、同一の画分におけるＭｙｃＨＤＥＬタグ化トリコデルマレーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）α−１，２−マンノシダーゼの分布を示す。マンノシダーゼＭｙｃＨＤＥＬは、ＥＲマーカーＰＤＩの分布と正確に一致するので、主にピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　Ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母細胞のＥＲ中に存在すると結論付ける。
【図６】
図６はトリコデルマレーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）マンノシダーゼ−ＨＤＥＬと同時発現したトリパノソーマクルーズ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｃｒｕｚｉ）トランスシアリダーゼのＮ−グリカン分析を示す図である。パネルＡ：マルト−オリゴサッカリドのサイズ基準ラダー。グリカンのサイズを、その電気泳動移動度とこれらのマルト−オリゴサッカリドの移動度との比較によるグルコース単位（ＧＵ）で示す。パネルＢ：ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　Ｐａｓｔｏｒｉｓ）で発現した組換えトリパノソーマクルーズ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｃｒｕｚｉ）のトランス−シアリダーゼ由来のＮ−グリカン。ＧＵ＝９，２でのピークは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２に対応する。パネルＣ：パネル２と同一であるが、３Ｕ／ｍｌの精製組換えＴ．レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のα−１，２−マンノシダーゼでの一晩の処理後の分析。パネルＤ：ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）においてＴ．レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）マンノシダーゼ−ＨＤＥＬと同時発現した組換えトランス−シアリダーゼ由来のＮ−グリカン（ＧＡＰプロモーターの調節下）。ＧＵ＝７，６でのピークは、ＲＮアーゼＢのプロフィールにおけるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ピークに対応する（パネルＦ）。パネルＥ：パネルＤと同一であるが、３Ｕ／ｍｌの精製組換えＴ．レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のα−１，２−マンノシダーゼでの一晩の処理後の分析。パネルＦ：ウシＲＮアーゼＢ由来のＮ−グリカン。これらのグリカンは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２からなる。異なる異性体は分割され、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２のピーク数が計上される。
【図７】
図７はＨＤＥＬタグ化トリコデルマレーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）のα−１，２−マンノシダーゼ及びマウスα−１，２−マンノシダーゼＩＢのＨＤＥＬタグ化触媒ドメインによるインフルエンザ赤血球凝集素Ｎ−グリカンのプロセシングを示す図である。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２基準オリゴサッカリドは、本分析においてスキャン１８５０で運転する（示さず）。パネル１：マルト−オリゴサッカリドサイズ基準ラダー。パネル２：ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）で発現した組換えインフルエンザ赤血球凝集素由来のＮ−グリカン。スキャン２２５０でのピークは、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２に対応する。パネル３：ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）においてＴ．レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）マンノシダーゼ−ＨＤＥＬと同時発現した組換え赤血球凝集素由来のＮ−グリカン（ＧＡＰプロモーターの調節下）。スキャン１９５０でのピークは、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２に対応する。パネル４：パネル３と同一であるが、３０ｍＵの精製組換えＴ．レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のα−１，２−マンノシダーゼとの一晩の処理後の分析。パネル５：ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）においてマウスマンノシダーゼＩＢ−ＨＤＥＬと同時発現した組換え赤血球凝集素由来のＮ−グリカン（ＧＡＰプロモーターの調節下）。パネル６：パネル５と同一であるが、３０ｍＵの精製組換えＴ．レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のα−１，２−マンノシダーゼとの一晩の処理後の分析。
【図８】
図８はベクターｐＢＬＵＲＡ５’ＰｐＯＣＨ１及びその構築法を示す図である。
【図９】
図９はｐＢＬＵＲＡ５’ＰｐＯＣＨ１を使用した１つの相同組換えによるピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＯＣＨ１遺伝子破壊のスキームである。
【図１０】
図１０はＯｃｈ１不活化クローン及びｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＨＤＥＬでの形質添加によるこのＯｃｈ１不活化クローン由来の３つのクローンの細胞壁糖タンパク質Ｎ−グリカンの分析を示す図である。パネル１は、マルト−オリゴサッカリド混合物の分析を示し、その重合度を図の一番上に数字で示す。この分析は、他のパネルのサイズ基準として使用する。全てのパネルの縦軸に、相対蛍光単位におけるピーク強度を示す。パネル２から６：以下の株の細胞壁糖タンパク質Ｎ−グリカンの分析：パネル２、非操作Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ｙＧＣ４株；パネル３、ｐＢＬＵＲＡ５’ＰｐＯｃｈ１で形質転換したｙＧＣ４；４から６、ｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＨＤＥＬで補足的に形質転換した。パネル７：Ｍａｎ５−９ＧｌｃＮＡｃ２の混合物からなるウシＲＮアーゼＢ由来のＮ−グリカン。パネル２と３とパネル７の基準との比較から認められるように、ｐＢＬＵＲＡ５’ＰｐＯｃｈ１での形質転換により、ＯＣＨ１ｐのＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２基質Ｎ−グリカン（パネル２ではピーク１と呼ぶ）存在量が非常に増加する。ピーク２は、ＯＣＨ１ｐのＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２産物を示す。さらに、ｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＨＤＥＬの補足的形質転換の際、３つの独立したクローンの細胞壁糖タンパク質の主要なグリカンは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２基質のＴ．レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のα−１，２−マンノシダーゼ消化のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２最終生成物（パネル４のピーク３）である。
【図１１】
図１１は図１０と同一のグリカン混合物であるが、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ＝５．０）で一晩の３ｍＵ／ｍｌの精製トリコデルマレーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）　アルファ−１，２−マンノシダーゼでのインビトロ消化後の分析。軸の割り当ては、図１０と同一である。親株（パネル２）よりもｐＢＬＵＲＡ５’ＰｐＯｃｈ１形質転換株（パネル）の方がより多くのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を形成する。スキャン３９００前の全てのパネルのピークは汚染物質に由来し、分析では無視すべきである。
【図１２】
図１２は発現ベクターｐＧＡＰＺＡＧＬＳＩＩ（配列番号１８）を示す図である。Ｐ　ＴＥＦ１：Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）転写伸長因子遺伝子のプロモーター。Ｐ　Ｅｍ７：合成原核プロモーター。Ｚｅｏｃｉｎ：ゼオシン耐性マーカー遺伝子。ＣＹＣ１　ＴＴ：Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）シトクロムＣｌ遺伝子の転写ターミネーター。Ｃｏｌ　Ｅ１：細菌の複製起点。ＧＡＰ：Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｔｏｒｉｓ）　ＧＡＰ遺伝子のプロモーター。ＧＬＳ２：Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グルコースＩＩ遺伝子。ＡＯＸ１　ＴＴ：Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＡＯＸ１遺伝子の転写ターミネーター。
【図１３】
図１３は発現ベクターｐＡＯＸ２ＺＡＧＬＳＩＩ（配列番号１６）を示す図である。Ｐ　ＴＥＦ１：Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）転写伸長因子遺伝子のプロモーター。Ｐ　Ｅｍ７：合成原核プロモーター。Ｚｅｏｃｉｎ：ゼオシン耐性マーカー遺伝子。ＣＹＣ１　ＴＴ：Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）シトクロムＣｌ遺伝子の転写ターミネーター。Ｃｏｌ　Ｅ１：細菌の複製起点。ＡＯＸ２　Ｐ：Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＡＯＸ２遺伝子のプロモーター。ＧＬＳ２：Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グルコースＩＩ遺伝子。ＡＯＸ１　ＴＴ：Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＡＯＸ１遺伝子の転写ターミネーター。
【図１４】
図１４は発現ベクターｐＰＩＣＺＡＧＬＳＩＩ（配列番号２０）を示す図である。Ｐ　ＴＥＦ１：Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）転写伸長因子遺伝子のプロモーター。Ｐ　Ｅｍ７：合成原核プロモーター。Ｚｅｏｃｉｎ：ゼオシン耐性マーカー遺伝子。ＣＹＣ１　ＴＴ：Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）シトクロムＣｌ遺伝子の転写ターミネーター。Ｃｏｌ　Ｅ１：細菌の複製起点。ＡＯＸ１　Ｐ：Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＡＯＸ１遺伝子のプロモーター。ＧＬＳ２：Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グルコースＩＩ遺伝子。ＡＯＸ１　ＴＴ：Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＡＯＸ１遺伝子の転写ターミネーター。
【図１５】
図１５は発現ベクターｐＹＰＴ１ＺＡＧＬＳＩＩ（配列番号２２）を示す図である。Ｐ　ＴＥＦ１：Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）転写伸長因子遺伝子のプロモーター。Ｐ　Ｅｍ７：合成原核プロモーター。Ｚｅｏｃｉｎ：ゼオシン耐性マーカー遺伝子。ＣＹＣ１　ＴＴ：Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）シトクロムＣｌ遺伝子の転写ターミネーター。Ｃｏｌ　Ｅ１：細菌の複製起点。Ｐ　ＹＰＴ１：Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＹＰＴ１遺伝子のプロモーター。ＧＬＳ２：Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グルコースＩＩ遺伝子。ＡＯＸ１　ＴＴ：Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＡＯＸ１遺伝子の転写ターミネーター。
【図１６】
図１６は発現ベクターｐＧＡＰＡＤＥ１ｇｌｓＩＩ（配列番号１９）を示す図である。Ａｍｐ　Ｒ：アンピシリン耐性マーカー遺伝子。ＡＤＥ１：Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＡＤＥ１選択マーカー遺伝子。ＧＡＰ：Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｔｏｒｉｓ）　ＧＡＰ遺伝子のプロモーター。ＧＬＳ２：Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グルコースＩＩ遺伝子。ＡＯＸ１　ＴＴ：Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＡＯＸ１遺伝子の転写ターミネーター。
【図１７】
図１７は発現ベクターｐＡＯＸ２ＡＤＥ１ｇｌｓＩＩ（配列番号１７）を示す図である。Ａｍｐ　Ｒ：アンピシリン耐性マーカー遺伝子。ＡＤＥ１：Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＡＤＥ１選択マーカー遺伝子。ＡＯＸ２　Ｐ：Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＡＯＸ２遺伝子のプロモーター。ＧＬＳ２：Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グルコースＩＩ遺伝子。ＡＯＸ１　ＴＴ：Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＡＯＸ１遺伝子の転写ターミネーター。
【図１８】
図１８は発現ベクターｐＰＩＣＡＤＥ１ｇｌｓＩＩ（配列番号２１）を示す図である。Ａｍｐ　Ｒ：アンピシリン耐性マーカー遺伝子。ＡＤＥ１：Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＡＤＥ１選択マーカー遺伝子。ＡＯＸ１　Ｐ：Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＡＯＸ１遺伝子のプロモーター。ＧＬＳ２：Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グルコースＩＩ遺伝子。ＡＯＸ１　ＴＴ：Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＡＯＸ１遺伝子の転写ターミネーター。
【図１９】
図１９は発現ベクターｐＹＰＴ１ＡＤＥ１ｇｌｓＩＩ（配列番号２３）を示す図である。Ａｍｐ　Ｒ：アンピシリン耐性マーカー遺伝子。ＡＤＥ１：Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＡＤＥ１選択マーカー遺伝子。Ｐ　ＹＰＴ１：Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＹＰＴ１遺伝子のプロモーター。ＧＬＳ２：Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グルコースＩＩ遺伝子。ＡＯＸ１　ＴＴ：Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＡＯＸ１遺伝子の転写ターミネーター。
【図２０】
図２０は発現ベクターｐＧＡＰＺＡｇｌｓＩＩＨＤＥＬ（配列番号２４）を示す図である。Ａｍｐ　Ｒ：アンピシリン耐性マーカー遺伝子。ＡＤＥ１：Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＡＤＥ１選択マーカー遺伝子。ＧＡＰ：Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰ遺伝子のプロモーター。ＧＬＳ２：Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グルコースＩＩ遺伝子。ＡＯＸ１　ＴＴ：Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＡＯＸ１遺伝子の転写ターミネーター。
【図２１】
図２１は発現ベクターｐＧＡＰＡＤＥ１ｇｌｓＩＩＨＤＥＬ（配列番号２５）を示す図である。Ｐ　ＴＥＦ１：Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）転写伸長因子遺伝子のプロモーター。Ｐ　Ｅｍ７：合成原核プロモーター。Ｚｅｏｃｉｎ：ゼオシン耐性マーカー遺伝子。ＣＹＣ１　ＴＴ：Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）シトクロムＣｌ遺伝子の転写ターミネーター。ＣｏｌＥ１：細菌の複製起点。Ｃｏ１　Ｅ１：細菌の複製起点。ＧＡＰ：Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｔｏｒｉｓ）　ＧＡＰ遺伝子のプロモーター。ＧＬＳ２：Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グルコースＩＩ遺伝子。ＡＯＸ１　ＴＴ：Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＡＯＸ１遺伝子の転写ターミネーター。
【図２２】
図２２は市販の酵母α−グルコース（Ｓｉｇｍａ：カタログ番号Ｇ−５００３）を使用したＧＬＳＩＩ活性アッセイ試験を示す図である。アッセイ混合物は、リン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ６．８）、マンノース、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、基質４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシド、及びＳｉｇｍａのα−グルコシダーゼを含む。１：３７℃で一晩のインキュベーション後のＵＶ光で発光させたアッセイ混合物。２：１と同一であるが、アッセイ混合物はα−グルコシダーゼ３を欠く。３：１と同一であるが、この場合、アッセイ混合物は基質を欠く。
【図２３】
図２３はピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）から組換え発現したＧＬＳＩＩの活性の結果を示す図である。全てのアッセイ混合物を３７℃でインキュベートし、その後ＵＶ光で発光させた。１：酵母α−グルコシダーゼ（Ｓｉｇｍａ：カタログ番号Ｇ−５００３）を使用したあせい。２：株１８（ｐＧＡＰＺＡＧＬＳＩＩで形質転換したＰＰＹ１２−ＯＨ）の精製培地を使用したアッセイ。３：ＷＴ　ＰＰＹ１２−ＯＨ株の精製培地を使用したアッセイ。４：株Ｈ３（ｐＧＡＰＺＡｇｌｓＩＩＨＤＥＬで形質転換したＰＰＹ１２−ＯＨ）の精製培地を使用したアッセイ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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