(57)【要約】細胞内標的分子Ｔおよび／または細胞内でＴと直接または間接的に相互に作用する細胞内構成成分Ｃの特性を特異的に変調する方法であり、この方法はキメラ分子、いわゆる「標的に向けられるエフェクター」を細胞中に導入するステップを含み、上記標的に向けられるエフェクターは、台との共有結合によって立体配座的に束縛された、長さがアミノ酸５〜６０個、好ましくはアミノ酸１０〜４０個のペプチドＶを含む認識部分Ｒと、この認識部分Ｒに共有結合で結合したエフェクター部分Ｅとを含む。上記認識部分Ｒは、細胞内で細胞内標的分子Ｔ上の部位と特異的に相互に作用する能力を有し、その相互作用は親和力Ａ１で起こる。また上記エフェクター部分Ｅは、少なくとも１個の分子に対して効果を発揮する初期能力を有し、かつＲと共有結合により結合すると細胞内標的分子Ｔに対して効果を発揮する能力を獲得する分子またはそのタンパク質である。上記標的に向けられるエフェクターはＴと第二の親和力Ａ２で相互に作用し、親和力Ａ１またはＡ２は１×１０−８ Ｍ未満のＫｄ値に対応する。Ｔおよび／またはＣの特性はエフェクター部分Ｅによって特異的に変調される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内標的分子Ｔおよび／または細胞内でＴと直接または間接的に相互に作用する細胞構成成分Ｃの特性を特異的に変調する方法であって、前記方法が
（１）台との共有結合によって立体配座的に束縛され、長さがアミノ酸５〜６０個、好ましくは１０〜４０個のペプチドＶを含む認識部分Ｒであって、前記認識部分Ｒが細胞内で細胞内標的分子Ｔ上の部位と特異的に相互に作用する能力を有し、Ｔとの前記相互作用が親和力Ａ１で行われる、Ｒと、
（２）前記認識部分Ｒと共有結合したエフェクター部分Ｅであって、Ｅが少なくとも１個の分子Ｍに対して効果を発揮する初期能力を有し、かつＲと共有結合すると細胞内標的分子Ｔに対して効果を発揮する能力を獲得する分子またはそのタンパク質である、Ｅ
とを含むキメラ分子、いわゆる「標的に向けられるエフェクター」を細胞中に導入するステップを含み、
前記標的に向けられるエフェクターが第二の親和力Ａ２でＴと相互に作用し、親和力Ａ１または親和力Ａ２ のＫｄが１×１０−８ Ｍ未満に対応し、またＴおよび／またはＣの特性がエフェクター部分Ｅによって特異的に変調される、方法。
【請求項２】
ペプチドＶの長さがアミノ酸６〜４０個である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ペプチドＶがランダムペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
台がタンパク質を含むか、またはタンパク質からなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
台がペプチドＶに関して異型である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ペプチドＶが台に組み込まれる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記台がチオレドキシン（ＴＲＸ）またはＴＲＸに似たタンパク質である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
結合親和力Ａ１が１×１０−９ Ｍと１×１０−１２Ｍの間に含まれるＫｄに対応する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
Ｒが親の認識部分Ｒａの突然変異体であり、前記親の認識部分Ｒａが前記細胞内標的分子Ｔ上の部位と特異的に相互に作用する能力を有し、ＲａとＴの間の相互作用が親和力Ａ３で行われ、Ａ３に対応するＫｄがＡ１に対応するＫｄを超す、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
Ｅが、Ｍに対してｉｎ ｃｉｓおよび／またはｉｎ ｔｒａｎｓで効果を発揮する初期能力を有し、かつＲと共有結合するとＴに対してｉｎ ｔｒａｎｓで効果を発揮する能力を獲得する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
エフェクター部分Ｅが酵素、補因子、アドレッシングシグナル、転写調節タンパク質、トレーサータンパク質、治療または診断特性を有する分子、第二認識部分、標的に向けられる第二のエフェクター、放射性核種、化学修飾因子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
エフェクター部分Ｅが、細胞内で細胞内標的分子Ｔ２上の部位と特異的に相互に作用する能力を有する第二の認識部分Ｒ２を含み、Ｔ２がＴとは異なる標的分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
エフェクター部分Ｅが転写活性化因子ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
エフェクター部分Ｅが認識部分Ｒのアミノまたはカルボキシ末端と共有結合する、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
Ｔおよび／またはＣのアイデンティティーが予め決められる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
標的分子Ｔまたは細胞構成成分Ｃがタンパク質、核酸、炭水化物、リン酸化分子、脂質、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項１または１５に記載の方法。
【請求項１７】
標的タンパク質Ｔおよび／または細胞構成成分Ｃが細胞にとって内因性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
標的タンパク質Ｔが少なくとも２つの機能的に異なるタンパク質ドメインＴａおよびＴｂを含み、かつ認識部分ＲがドメインＴａと特異的に結合し、エフェクター部分ＥがドメインＴｂに対して効果を発揮する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
Ｒが細胞内でＴなどの標的分子の予め決められた範囲の部位と特異的に相互に作用する能力を有し、かつエフェクター部分ＥがＲと共有結合すると細胞中で細胞内標的分子の前記予め決められた範囲に対してｉｎ ｔｒａｎｓで効果を発揮する能力を獲得する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
Ｒが、Ｔ上にのみ細胞内に生じる部位と相互に作用する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
エフェクター部分Ｅの欠けた認識部分Ｒが標的タンパク質Ｔの機能に関して中立である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
Ｅによって変調されるＴおよび／またはＣの特性が、化学的、生化学的、物理的、および／または機能上の特性である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
標的タンパク質Ｔまたは細胞構成成分Ｃの化学的、生化学的、物理的、および／または機能上の特性の変調が細胞または生物体の中の表現型の変化を引き起こし、前記表現型の変化が任意選択で選択可能または検出可能である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
Ｔおよび／またはＣの化学的特性の変化が、共有結合または非共有結合の形成または切断を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
Ｔおよび／またはＣの物理的特性の変化が、立体配座の変化または細胞下局在化の変化を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
Ｔおよび／またはＣの機能上の特性の変化が、Ｔおよび／またはＣの１または複数の機能の効率の向上または低下、あるいは機能の廃絶、あるいは新機能の創出を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
変調が
（ａ）ＴまたはＣのホモまたはヘテロ二量体化、
（ｂ）ＴまたはＣのホモまたはヘテロ二量体化の阻害、
（ｃ）ＴまたはＣの分解、
（ｄ）ＴまたはＣの安定化、
（ｅ）ＴまたはＣの標識化、
（ｆ）ＴまたはＣが新しい相手と相互に作用する能力、
（ｇ）ＴまたはＣが細胞中で普通なら輸送されない細胞下画分へのＴまたはＣの局在化、
（ｈ）ＴまたはＣが細胞中で普通ならより低水準でしか輸送されない細胞下画分へのＴまたはＣの局在化、
（ｉ）細胞膜でのＴまたはＣの露出、
（ｊ）ＴまたはＣのインターナリゼーション、
（ｋ）天然の細胞内の相手とのＴまたはＣの会合の誘発、
（ｌ）天然の細胞内の相手とのＴまたはＣの会合の妨害、
（ｍ）ＴまたはＣの切断、
（ｎ）ＴまたはＣの分泌、
（ｏ）細胞周期活力の変調、
の１または複数の効果を引き起こす、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
細胞が真核細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
細胞が原核細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
標的に向けられるエフェクターが、前記標的に向けられるエフェクターをエンコードするＤＮＡ配列の発現によって融合タンパク質として細胞中に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
標的に向けられるエフェクターが、タンパク質形質導入ドメイン（Ｐ． Ｔ． Ｄ）などの細胞透過性物質を用いて精製された形で細胞中に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
細胞中の所定の一組の条件においてエフェクター部分Ｅは、Ｅが認識部分と共有結合している場合はＴに対して効果を発揮する能力を有するが、Ｅが認識部分と共有結合していない場合は前記条件でＴまたはＣに前記効果を発揮することができない、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
エフェクター部分Ｅが認識部分と共有結合により結合していない場合にＥが細胞中でＴまたはＣに対して効果を発揮することができないことがＥまたはＴの固有の特異性のせいである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
エフェクター部分Ｅが酵素であり、前記酵素の固有の特異性が、Ｅが認識部分と共有結合により結合していない場合に標的タンパク質ＴがＥの基質として作用するのを妨げる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
エフェクター部分Ｅが認識部分と共有結合により結合していない場合にＥが前記細胞中でＴまたはＣに対して前記効果を発揮することができないことが、Ｅと、Ｔおよび／またはＣとの共発現がないせいである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
Ｔおよび／またはＣは、Ｅが認識部分Ｒと共有結合により結合していない場合、エフェクター部分Ｅと標的分子Ｔが互いに会合するのを妨げる時間的または空間的特異性を示す、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
エフェクター部分Ｅが最初ｉｎ ｃｉｓの細胞内分子Ｍを予め決められた細胞下画分に向ける能力を有し、かつＥがＲと共有結合により結合するとｉｎ ｔｒａｎｓの標的分子Ｔを前記細胞下画分に向ける能力を獲得する、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
細胞内標的分子Ｔおよび細胞内でＴと直接または間接的に相互に作用する細胞構成成分Ｃの特性を特異的に変調する能力をもつ標的に向けられるエフェクター部分の生成方法であって、前記方法が
ａ）ペプチド、いわゆる認識部分Ｒのランダムプールを生成するステップと、
ｂ）Ｔと相互に作用することができる認識部分Ｒの識別を可能にするのに適した条件で、ａ）で生成されたランダムプールを細胞中のＴと突き合わせてスクリーニングするステップと、
ｃ）任意選択で、前記部分のそれぞれの特異性範囲を決定し、また所望の特異性範囲を有する部分を識別するためにｂ）で選択された部分をＴとは別のタンパク質と接触させるステップと、
ｄ）認識部分Ｒをエフェクター部分Ｅと共有結合により結合するステップであって、最初Ｅが少なくとも１個の細胞内構成成分Ｍに対して予め決められた効果を発揮する能力を有し、ステップｄ）がステップｂ）の前またはステップｅ）の後のいずれかに実施される、ステップと、
ｅ）認識部分ＲがＴと相互に作用する親和力Ａ１、または標的に向けられるエフェクターがＴと相互に作用する親和力Ａ２を検証するステップと、
ｆ）Ａ１とＡ２の両方が１×１０−８ Ｍを超えるＫｄ値に対応する場合、Ｋｄが１×１０−８ Ｍ 未満になるようにＴと選択された部分との間の相互作用の結合親和力を調整するために認識部分の結合領域を改変するステップ、
とを含む方法。
【請求項３９】
ステップｂ）が、未知の内因性の標的Ｔとの相互作用を介して起こる、またはステップｄ）がステップｂ）の前に実施される場合はＥによるＴの修飾を介して起こる検出可能なまたは選択可能な表現型の変化に関して細胞中のランダムペプチドのプールをスクリーニングするステップを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
さらに、選択された認識部分を、前記表現型の変化を引き起こす能力を有することが分かっている分子と突き合わせてスクリーニングすることによってＴのアイデンティティーを決定するステップを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
さらに、餌としてＲまたは標的に向けられるエフェクターＲ−Ｅを用いてツーハイブリッドスクリーニングを行うことによってＴのアイデンティティーを決定するステップを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
ステップｂ）が、Ｔとの相互作用が検出可能または選択可能な変化を引き起こす、周知の標的分子Ｔと突き合わせて細胞中のランダムペプチドのプールをスクリーニングするステップを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
ステップｂ）が、候補の標的タンパク質が細胞中で認識部分と共発現する、ツーハイブリッド相互作用捕捉システムにおけるリポーター遺伝子の転写を検出するステップを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
細胞内タンパク質Ｔあるいは直接または間接的にＴと相互に作用する細胞内構成成分Ｃの特性を特異的に変調する能力をエフェクター部分Ｅに付与する方法であって、前記方法が
ｉ）エフェクター部分Ｅを認識部分Ｒと共有結合により結合するステップであって、Ｒが細胞内で細胞内標的分子Ｔ上の部位と特異的に相互に作用する能力を有する分子を含み、Ｔとの前記相互作用が１×１０−８ Ｍ未満のＫｄ値に対応する親和力Ａ１で起こり、またＥは少なくとも１個の分子Ｍに対して効果を発揮する初期能力を有し、かつＲと共有結合により結合すると細胞内標的分子Ｔに対して効果を発揮する能力を獲得する分子である、ステップと、
ｉｉ）任意選択で、Ｒの結合領域の化学組成を変えることによってＴとＲの間の相互作用の親和力を最適化して所望の範囲の親和力を与えるステップ
とを含む、方法。
【請求項４５】
キメラ分子、いわゆる「標的に向けられるエフェクター」であって、前記標的に向けられるエフェクターが、
ａ）台との共有結合によって立体配座的に束縛された、長さがアミノ酸５〜６０個、好ましくはアミノ酸１０〜４０個のペプチドＶを含むタンパク質認識部分Ｒであって、前記認識部分Ｒが細胞内で細胞内標的分子Ｔ上の部位と特異的に相互に作用する能力を有し、Ｔとの前記相互作用が親和力Ａ１で起こる、Ｒと、
ｂ）Ｒと共有結合により結合したエフェクター部分Ｅであって、Ｅが少なくとも１個の分子Ｍに対して効果を発揮する初期能力を有し、かつＲと共有結合により結合すると細胞内標的分子Ｔに対して効果を発揮する能力を獲得する分子であり、前記標的に向けられるエフェクターがＴと親和力Ａ２で相互に作用し、親和力Ａ１または親和力Ａ２が１×１０−８ Ｍ未満のＫｄ値に対応する、Ｅ
とを含む、キメラ分子。
【請求項４６】
ペプチドＶがランダムペプチドを含む、請求項４５に記載のキメラ分子。
【請求項４７】
台がタンパク質を含むかまたはタンパク質からなる、請求項４５または４６に記載のキメラ分子。
【請求項４８】
台がペプチドＶに関して異型である、請求項４７に記載のキメラ分子。
【請求項４９】
前記台がチオレドキシン（ＴＲＸ）またはＴＲＸに似たタンパク質である、請求項４８に記載のキメラ分子。
【請求項５０】
結合親和力Ａ１が１×１０−９ Ｍ未満のＫｄ値に対応する、請求項４５に記載のキメラ分子。
【請求項５１】
エフェクター部分Ｅが酵素、補因子、アドレッシングシグナル、転写調節タンパク質、トレーサータンパク質、治療または診断特性を有する分子、第二の認識部分、標的に向けられる第二のエフェクター、放射性核種、化学的修飾因子を含む、請求項４５〜５０のいずれか一項に記載のキメラ分子。
【請求項５２】
エフェクター部分Ｅが細胞内で細胞内標的分子Ｔ２上の部位と特異的に相互に作用する能力を有する第二の認識部分Ｒ２を含み、Ｔ２がＴとは別の標的分子である、請求項５１に記載のキメラ分子。
【請求項５３】
真核細胞中で発現するための調節配列と作動可能に結合した請求項４５に記載のキメラタンパク質をエンコードする核酸。
【請求項５４】
請求項５３に記載の核酸を原核または真核細胞中に安定して導入することができるベクター。
【請求項５５】
請求項４５に記載のキメラ分子または請求項５３に記載の核酸を含有する細胞。
【請求項５６】
真核細胞である請求項５５に記載の細胞。
【請求項５７】
原核細胞である請求項５５に記載の細胞。
【請求項５８】
請求項４５に記載のキメラ分子または請求項５３に記載の核酸を薬学的に許容できる賦形剤と共に含む医薬組成物。
【請求項５９】
療法に用いられる請求項４５に記載のキメラ分子。
【請求項６０】
療法に用いられる請求項５３に記載の核酸。
【請求項６１】
１）ウィルス感染症および真菌感染症などの微生物感染症、
２）免疫学的障害、
３）神経病学的障害、
４）代謝性障害、
５）神経障害、
６）筋障害、
７）遺伝的障害、
８）癌、
９）心臓血管障害、
１０）歯科的障害、および
１１）美容的障害
の治療用薬物の製造における請求項４５に記載のキメラタンパク質または請求項５３に記載の核酸の使用。
【請求項６２】
細胞内標的分子Ｔおよび／またはＴと細胞内で直接または間接的に相互に作用する細胞構成成分Ｃの特性を特異的に変調するために請求項４５〜５２に記載のキメラタンパク質または請求項５３に記載の核酸の使用。
【請求項６３】
台と共有結合によって立体配座的に束縛されたタンパク質認識ドメインを含む細胞内認識分子Ｒであって、前記認識分子Ｒが細胞内で予め決められた細胞内標的分子Ｔ上の部位と特異的に相互に作用する能力を有し、Ｔとの前記相互作用が５×１０−９ Ｍ以下のＫｄ値に対応する親和力で起こる、細胞内認識分子Ｒ。
【請求項６４】
認識ドメインがアミノ酸５〜６０個、好ましくはアミノ酸１０〜４０個の長さを有するペプチドを含むかまたはそれから成る、請求項６３に記載の細胞内認識分子Ｒ。
【請求項６５】
ペプチド認識ドメインがランダムペプチドを含む、請求項６４に記載の細胞内認識分子Ｒ。
【請求項６６】
台がタンパク質を含むかまたはタンパク質から成る、請求項６３〜６５のいずれか一項に記載の細胞内認識分子Ｒ。
【請求項６７】
台が認識ドメインに関して異型である、請求項６４または６６に記載の細胞内認識分子Ｒ。
【請求項６８】
前記台がチオレドキシン（ＴＲＸ）またはＴＲＸに似たタンパク質である、請求項６７に記載の細胞内認識分子Ｒ。
【請求項６９】
Ｔとの相互作用の親和力が１×１０−９ Ｍと１×１０−１４ Ｍの間に含まれるＫｄ値に対応する、請求項６３〜６９のいずれか一項に記載の細胞内認識分子。
【請求項７０】
Ｒがそれと特異的に相互に作用する能力を有する細胞内標的分子Ｔがサイクリン依存性キナーゼ、すなわちプロアポトーシス性タンパク質から選択される、請求項６３〜６９のいずれか一項に記載の細胞内認識分子。
【請求項７１】
細胞内標的分子ＴがＣｄｋ２である、請求項７０に記載の細胞内認識分子。
【請求項７２】
ペプチド認識ドメインがアミノ酸配列ＱＶＷＳＬＷＡＬＧＷＲＷＬＲＲＹＧＷＮＭの突然変異体を含むか、またはそれから成り、前記突然変異体が前記配列に関してアミノ酸が１〜５個、好ましくは１〜３個変化している、請求項７１に記載の細胞内認識分子。
【請求項７３】
ペプチド認識ドメインがアミノ酸配列ＱＶＷＳＳＷＡＬＧＷＲＷＬＲＲＹＧＷＧＭを含むか、またはそれから成る、請求項７２に記載の細胞内認識分子。
【請求項７４】
細胞内標的分子ＴがＢａｘである、請求項７０に記載の細胞内認識分子。
【請求項７５】
ペプチド認識ドメインがアミノ酸配列ＰＲＧＡＰＭＷＭＲＷＶＣＱＭＬＥＴＭＦＬの突然変異体を含むか、またはそれから成り、前記突然変異体が前記配列に関してアミノ酸が１〜５個、好ましくは１〜３個変化している、請求項７４に記載の細胞内認識分子。
【請求項７６】
ペプチド認識ドメインがアミノ酸配列ＰＲＧＡＰＭＷＬＲＣＶＣＱＭＬＥＴＫＦＬを含むか、またはそれから成る、請求項７２に記載の細胞内認識分子。
【請求項７７】
請求項６３に記載の細胞内認識分子Ｒを２〜４個含むオリゴマー細胞内認識分子であって、前記認識分子が直接またはリンカーを介して互いに共有結合により結合している、分子。
【請求項７８】
細胞内認識分子Ｒを２個含む、請求項７７に記載のオリゴマー細胞内認識分子。
【請求項７９】
共有結合により結合した２個の細胞内認識分子Ｒ１およびＲ２を含む二量体細胞内認識分子であって、
細胞内で予め決められた細胞内標的分子Ｔ１上の部位と特異的に相互に作用する能力を有するＲ１と、細胞内で予め決められた細胞内標的分子Ｔ２上の部位と特異的に相互に作用する能力を有するＲ２とがそれぞれ台と共有結合によって立体配座的に束縛された、アミノ酸５〜６０個の長さを有する認識ドメインＶを含み、
Ｒ１とＲ２は同じでも異なっていてもよく、かつＴ１とＴ２は異質である、分子。
【請求項８０】
Ｒ１およびＲ２が同一であり、この細胞内認識分子が２個の同一だが独立した標的分子Ｔ１およびＴ２と特異的かつ同時に結合する、請求項７９に記載の二量体細胞内認識分子。
【請求項８１】
Ｒ１およびＲ２が異なっており、この細胞内認識分子が２個の異なる独立した標的分子Ｔ１およびＴ２と特異的かつ同時に結合する、請求項７９に記載の二量体細胞内認識分子。
【請求項８２】
標的分子Ｔ１およびＴ２が認識分子の欠けた状態で細胞中で検出可能に互いに相互に作用しない、請求項８０または８１に記載の二量体細胞内認識分子。
【請求項８３】
２個の標的分子Ｔ１とＴ２の間、および／または細胞中でＴ１またはＴ２と直接または間接的に相互に作用する細胞構成成分Ｃとの間の相互作用を強制する能力を有する二量体認識部分の識別方法であって、前記方法が
ａ）ペプチド、いわゆる認識部分Ｒのランダムプールを生成するステップと、
ｂ）Ｔ１またはＴ２と相互に作用することができる認識部分Ｒの識別を可能にするのに適した条件で細胞中のＴ１およびＴ２に関してａ）で生成したランダムプールをスクリーニングするステップと、
ｃ）任意選択で、ｂ）で選択された部分をＴ１およびＴ２とは別のタンパク質と接触させて前記分子部分のそれぞれの特異性範囲を決定し、また所望の特異性範囲を有する分子部分を識別するステップと、
ｄ）２個のこうして識別された認識部分Ｒ１およびＲ２を互いに共有結合により結合して二量体認識部分を形成するステップと、
ｅ）二量体認識部分をスクリーニングして同時にＴ１およびＴ２と相互に作用することができる分子部分を識別するステップ
とを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、細胞内化合物を標的とする修飾を用いて細胞生理の変調を制御する方法に関する。また本発明はそのような標的に向けた修飾を引き起こすことができる分子に関する。
【０００２】
細胞内分子の特異的ターゲッティングは、細胞の機能および生理を変える有力な手段を提供する。高い特異性を有する所与の標的タンパク質を細胞内で結合させる能力を有する分子を用いてこの目的を達成する試みがなされた。このような特異的結合分子は、広範な複雑なライブラリー、例えばペプチドアプタマー（参考資料１）、または数多くのさまざまな合成化合物、例えば組合せ化学によって生じたもの、または既知のタンパク質の結合ドメインの変異型をスクリーニングすることによって識別されてきた。合理的設計の手法もまた用いることができ、それによって標的および結合の両方の分子の構造の知識を用いてＰＤＺドメイン（参考資料３６）の変異型などの合理的な誘導体を構築する。更なる例は、単一ポリペプチドとして合成される免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の可変ドメインを含む細胞内抗体すなわち「体内物質（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）」によって与えられる（参考文献４１）。
【０００３】
一般にこれらの細胞内「認識」分子を標的化合物と結合させることにより、例えば活性部位の閉鎖、他の細胞構成成分との相互作用（例えばタンパク質−タンパク質またはタンパク質−ＤＮＡの相互作用）の遮断または安定化、あるいは標的の活性または不活性な立体配座への固定の結果としてその標的の機能の修飾が引き起こされる。
【０００４】
かなりの数のさまざまな効果をこれらターゲッティング分子を用いて達成することができるが、それにもかかわらずこの方法で行うことができる実用的な操作の程度には限界がある。実際には変調は、認識分子をその標的と結合させることによって達成することができるものに必然的に限定される。内因性の標的の共有結合による修飾、標的の特定の酵素との接触、標的の分解、または標的の所定の細胞下画分への輸送などの多くの望ましい細胞内変化を既存の認識分子のみを用いて達成することは不可能である。
【０００５】
周知のシステムの更なる限界は、人工タンパク質認識分子のそれら標的分子との結合親和性である。この親和力は、ペプチドアプタマーではより高い可能性があるが、往々にしてミクロモルの範囲内にある。この範囲の結合親和力はいくつかの細胞の標的にとっては十分であるが、多くの細胞内タンパク質はより高い親和力を有するそれらの固有の標的と結合する。人工の認識分子によるこのような相互作用の拮抗的阻害は、以前に報告されたものよりも高い結合親和力を必要とする。
【０００６】
したがって達成することができる修飾の種類および標的分子との相互作用の強さの両方の点で、細胞内ターゲッティング分子による生物学的プロセスの制御能力を広げる必要性がある。
【０００７】
本発明者等は、周知のターゲッティング分子の限界を克服するシステムを開発した。
【０００８】
本発明の第一の態様によれば、１×１０−６Ｍ未満、好ましくは１×１０−８Ｍ未満の親和力でその標的と相互に作用する細胞内認識分子は、所望の効果を発揮することができるエフェクター分子と共有結合により結合する。この認識モジュールはエフェクターモジュールをその特定の細胞内標的に向け、そこで組み合わされた認識およびエフェクターモジュールは、特異的なやり方でまた適切な程度まで所望の変化を引き起こすのに十分高い親和力で所望の効果を発揮することができる。
【０００９】
こうして本発明の特定のターゲッティング分子は、２つの機能上の実在物からなり、その第一番目は「Ｒ」と呼ぶことにする認識部分であり、第二番目は「Ｅ」と呼ぶことにするエフェクター部分である。この分子部分「Ｒ」と「Ｅ」は、直接またはリンカー要素を介して互いに共有結合により結合し、全体として「標的に向けられるエフェクター」と呼ばれる。
【００１０】
本発明によれば、標的に向けられるエフェクターが細胞中に導入され、そこで認識部分がエフェクター部分に必要な特異性と親和性を与え、それによって特定の変化が標的分子Ｔ上で、あるいは直接または関連する複合体を介して標的分子Ｔと相互に作用する細胞構成成分Ｃ上で引き起こされる。
【００１１】
本発明の手法は、標的に向けられるエフェクター（すなわち認識部分とエフェクター部分の共有結合により会合したもの）と標的の間の相互作用の親和力が、エフェクター部分に融合する前の認識部分の親和力に正比例することが分かった点で特に有利である。これは、細胞内認識分子と他の実在物との融合が結合親和力のかなりの低下を招くことになるということを示唆した以前の報告を考慮すると特に驚くべきことである。
【００１２】
また、認識部分とエフェクター部分の複合作用によって引き起こされる変化の度合いが、標的に対する認識部分の親和力に比例することが本発明の脈絡において発見された。したがって本発明によれば、細胞内変化の性質を適切なエフェクター部分の使用によって制御することができるだけでなく、変化の度合いもまたその標的にとって適切な結合親和力を有する認識部分の選択によって調節することができる。
【００１３】
驚くべきことに本発明者等はまた、その標的に対する認識部分の特異性が、エフェクター部分との融合によって悪影響を受けないことを立証した。エフェクター部分が認識部分とは異なる固有の特異性を有する場合でさえ、その認識部分との共有結合によってエフェクター部分は、標的分子Ｔに対してその効果を発揮する能力を獲得することが観察された。こうして本発明は、エフェクター分子の細胞内特異性を転送することを可能にする。
【００１４】
一般に本発明は、標的分子Ｔの特性、および／またはＴと直接的または間接的に相互に作用する構成成分Ｃの特性を特異的に変調する方法に関するもので、この方法はＴを、
（１）標的分子Ｔ上の部位と特異的に相互に作用する能力を有する認識部分Ｒであって、このＲがＴと第一親和力Ａ１で相互に作用する、Ｒと、
（２）上記認識部分Ｒと共有結合により結合したエフェクター部分Ｅであって、Ｅが、少なくとも１個の分子Ｍに対して効果を発揮する初期能力を有し、またＲと共有結合により結合すると標的分子Ｔに対して特異的に対して効果を発揮する能力を獲得する分子またはその部分である、Ｅ、
とを含むキメラ分子、いわゆる「標的に向けられるエフェクター」と接触させるステップを含み、この標的に向けられるエフェクターは第二の親和力Ａ２を有するＴと相互に作用し、親和力Ａ１または親和力Ａ２は１×１０−８Ｍ未満のＫｄに対応し、またＴおよび／またはＣの特性はエフェクター部分Ｅによって特異的に変調される。
【００１５】
本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで使用するのに適している。細胞内標的Ｔ、および／またはＴと細胞内で直接または間接的に相互に作用する細胞構成成分Ｃの特性を変調させるため、本発明の方法は
（１）細胞内で細胞内標的分子Ｔ上の部位と特異的に相互に作用する能力を有する認識部分Ｒであって、ＲがＴと第一親和力Ａ１で相互に作用する、Ｒと、
（２）上記認識部分Ｒと共有結合により結合したエフェクター部分Ｅであって、Ｅが、少なくとも１個の分子Ｍに対して効果を発揮する初期能力を有し、またＲと共有結合により結合すると標的分子Ｔに対して効果を発揮する能力を獲得する分子またはその部分である、Ｅ、
とを含むキメラ分子、いわゆる「標的に向けられるエフェクター」を細胞中に導入するステップを含み、この標的に向けられるエフェクターはＴと第二の親和力Ａ２で相互に作用し、親和力Ａ１または親和力Ａ２は１×１０−８Ｍ未満のＫｄに対応し、またＴおよび／またはＣの特性はエフェクター部分Ｅによって特異的に変調される。
【００１６】
こうして本発明は、細胞内標的分子ＴまたはＴと細胞内で相互に作用する分子Ｃの特性の制御された変調を可能にする。
【００１７】
上記の広く規定した方法は、その認識部分が異型の台との共有結合によって立体配座的に束縛されたペプチドから構成される標的に向けられるエフェクターを用いて行う場合には特に有利である。
【００１８】
本発明の脈絡において次の用語は、下記の意味を包含する。
（１）分子ＴまたはＣの「特性の変調」とは、ＴまたはＣの化学的、生化学的、物理的、および／または機能上の特性の１または複数の修飾を意味する。
（２）分子ＴまたはＣの「化学特性」とは、分子の化学組成から生じる特性である。ＴまたはＣの化学特性の修飾には、１または複数の共有結合あるいは非共有結合の形成あるいは切断、および原子、官能基、または残基の取込み、喪失、または交換が含まれる。
（３）分子ＴまたはＣの「生化学特性」とは、生きている生物、すなわち細胞または組織の一部としての分子の化学的性質から生じる特性、例えば細胞中の他の物質によりＴまたはＣがその分子と結合する、またはその分子に作用する、またはその作用を受ける能力である。
（４）分子ＴまたはＣの「物理的特性」とは、その分子の物理的すなわち物質的状態、そのエネルギー、その時間と空間に関する特性、例えば細胞中でのＴまたはＣの細胞下の局在化、その細胞表面における露出、そのインターナリゼーション、立体配座、オリゴマー化の状態などを一緒にして定義する特性である。
（５）分子ＴまたはＣの「機能上の特性」とは、ＴまたはＣの機能のいずれか１つまたは複数、具体的には細胞中で、例えば任意の決まった発生段階で、または決まった細胞の区画中で、または決まった一組の環境条件の中で示される機能を意味する。Ｔおよび／またはＣの機能上の特性の修飾には、機能の効率の向上または低下、あるいは機能の廃絶または創出がある。本発明に従って変調することができる機能の例は、ＴまたはＣがタンパク質または核酸などの細胞構成成分と相互に作用する能力であり、それは酵素または補因子として作用する、遺伝子の発現を調節する、細胞内構成成分を輸送する、細胞構成成分を合成するなどの分子の能力の顕著な変化をもたらす。細胞内標的Ｔまたは構成成分Ｃの化学的、生化学的、および物理的特性は通常、分子の機能と直接関係する。その結果、化学的、生化学的、および／または物理的特徴の修飾は、その分子の機能の変化を引き起こす可能性がある。
【００１９】
（６）結合分子は、その結合分子が標的分子と非共有結合により結合する場合、標的と「相互に作用する」という。タンパク質−タンパク質およびタンパク質−ＤＮＡの相互作用は、この種の結合の典型的なものである。相互作用は、結合分子の結合ドメインと或る正確な部位、すなわち標的分子上の「エピトープ」との間で起こる。
【００２０】
（７）結合分子が標的分子上の部位と相互に作用する能力を持つだけ、すなわち結合分子の結合ドメインがいずれの他の部位とも相互に作用できない場合、その結合分子はその部位と「特異的に」相互に作用するという。考察の対象の部位（すなわち「エピトープ」）は複数種の標的分子上で生ずる可能性があり、その場合は結合分子はいろいろな標的分子を特異的に認識し、それは「汎相互作用」分子とみなすことができる。あるいはエピトープは１種類の標的分子上に限って生ずることができ、したがってその結合分子はその標的のみを認識することができる。場合によっては結合分子は決まったエピトープと高い親和力で結合する能力を有し、そして別のエピトープとはまたより低い親和力で結合する能力を有する。そのような場合、結合分子と標的部位の間の相互作用は、結合親和力が少なくともミクロモルの範囲（すなわち解離定数Ｋｄが１×１０−６Ｍ以下、好ましくは１×１０−７Ｍ以下、最も好ましくは１×１０−８Ｍ以下）にあるとき「特異的」であるという。
【００２１】
（８）ペプチドアプタマーは特に指示がない限り、台Ｐとの共有結合によって立体配座的に束縛された１または複数個のペプチド認識領域「Ｖ」を含む認識部分を意味する。ペプチドＶはまた、この領域はアプタマーの数が変わる可能性があるので可変領域として知られる。
【００２２】
本発明によれば認識部分Ｒは標的Ｔと親和力Ａ１で相互に作用し、また標的に向けられるエフェクターはＴと親和力Ａ２で相互に作用する。
【００２３】
本発明に従って結合親和力「Ａ」は、平衡状態においてｉｎ ｖｉｔｒｏ で測定されるＫｄｓとして表される。Ｋｄｓは、解離速度定数（ｓ−１）を会合速度定数（Ｍ−１ｓ−１）で除すなど任意の従来の手段により計算することができる。したがって結合親和力Ａが高いほど対応するＫｄは低い。
【００２４】
Ａ１ またはＡ２のいずれか一方、あるいはＡ１ およびＡ２の両方が１×１０−８Ｍ未満のＫｄ値を有することが本発明の好ましい特徴である。Ａ１は実質上Ａ２に等しくてもよく、またＡ２より小さくてもよい。好ましくはＡ１のＫｄ値は１×１０−８Ｍ未満、最も好ましくは５×１０−９Ｍ未満、例えば１×１０−９Ｍ未満である。本発明の好ましい実施形態によれば、結合親和力Ａ１ およびＡ２の一方または両方が、１×１０−９Ｍと１×１０−１４Ｍの間、例えば１×１０−９Ｍと１×１０−１２Ｍの間または１×１０−９Ｍと１×１０−１１Ｍの間に含まれるＫｄ値に対応する。
【００２５】
認識部分および標的に向けられるエフェクターの結合親和力は、当業界で知られている任意の適切な手段を用いて、例えば下記の実施例中および参考資料１中に記述されているものなどのＳ． Ｐ． Ｒ．または減衰波実験を行うことによってｉｎ ｖｉｔｒｏ で測定することができる。この種の方法は一般に、本発明に従って結合親和力Ａ１、すなわち共有結合で融合したエフェクター部分Ｅなしに「裸の」認識部分ＲのＫｄｓを求めるために用いられる。しかしながらまた、エフェクター部分Ｅの性質次第ではいくつかのケースでこの方法を用いて結合親和力Ａ２、すなわち標的に向けられるエフェクターのＫｄｓを求めることもできる。
【００２６】
認識部分Ｒまたは標的に向けられるエフェクターと標的Ｔとの相互作用が検出可能な表現型を生じさせる場合、結合親和力Ａ１および／またはＡ２はまた、結合の強さの表れとしての表現型の相互作用の程度を用いて評価することもできる。
【００２７】
「裸の」認識部分ＲのＫｄが、融合した標的に向けられるエフェクターのＫｄと密接に相互に関係する限り、Ａ１とＡ２の両方を定量的に求めることは絶対に必要ではない。これらＫｄ値の一方が１×１０−８Ｍ未満である限り、標的に向けられるエフェクターの結合および変調の特性は本発明の方法を実施するのに適しているはずである。
【００２８】
本発明の特殊な変形態様によれば、ＲとＴの間の相互作用の結合親和力は、例えば突然変異誘発ＰＣＲなどの適切な手法を用いた突然変異誘発によりＲの結合領域の化学組成を修飾し、こうして得られた突然変異体を望ましい結合特性を有する変異株についてスクリーニングすることによって改良することができる。
【００２９】
本発明のこの態様の第一の変形態様によれば、認識部分Ｒを突然変異させて突然変異体認識部分Ｒｍ、すなわちＲとＴ（Ａ１）の間の相互作用の親和力よりも強い親和力Ａｍで細胞内標的分子Ｔ上の部位と特異的に相互に作用する能力を有するＲｍを得る。Ｋｄによって表わす場合、Ａｍに対応するＫｄ値はＡ１に対応するＫｄ値よりも小さい。
【００３０】
別法で本発明のこの態様の第二の変形態様によれば、認識部分Ｒがすでに親の認識部分Ｒｐ、すなわちＲとＴ（Ａ１）の間の相互作用の親和力ほど強くない親和力Ａｐで細胞内標的分子Ｔ上の部位と特異的に相互に作用するＲｐの突然変異体であってもよい。Ｋｄによって表わす場合、ＡｐのＫｄ値はＡ１のＫｄ値、すなわち１×１０−８Ｍより大きい。
【００３１】
本発明者等は突然変異誘発の手法を用いて認識部分Ｒ、特に１×１０−８Ｍ未満、具体的には約５×１０−９Ｍ以下の結合親和力を有するペプチドアプタマーを調製することに成功した。この手法を用いて１×１０−１２Ｍまたは１×１０−１３Ｍもある親和力を有するペプチドアプタマー認識部分を生成することができる。親分子の結合親和力の向上は、一般に突然変異誘発および選別後、約１０倍〜約２０ないし２５倍である。
実施例に示すようにＲの結合ドメインの突然変異誘発は、Ｒの特異性の特徴を変えずに残すことができる。別法では突然変異誘発はＲの特異性に影響を及ぼし、それを拡大または縮小させることもできる。例えば第一認識部分Ｒの結合ドメインは最初、標的Ｔ上の第一標的部位Ｓ１とのみ相互に作用させることができる。結合ドメインを突然変異誘発させると突然変異した認識部分Ｒｍは、同じ標的分子Ｔ上に存在するが、以前はＲの標的ではなかった別の分子上にもまた存在する第二結合部位Ｓ２と結合する能力を獲得することができる。
【００３２】
認識部分の結合挙動の修飾は、結合親和力の最適化が行われる場合、特異性のふるいによって容易に検出することができる。求められている目的に応じて、有利に特異性の変化を活用することもでき、または当初の特異性を保存するが高い親和力を有するものを識別するために突然変異体を選別によってふるい落とすこともできる。
【００３３】
本発明により高い親和力を有する認識部分Ｒは、エフェクター部分と共有結合により結合し、特に高い親和力、例えば１×１０−９Ｍ未満の親和力をもつ標的に向けられるエフェクターを提供する。
【００３４】
認識部分Ｒは一般に、細胞内で高い特異性と親和力で標的Ｔと相互に作用する能力を有する任意の分子である。好ましくは認識部分Ｒはタンパク質またはペプチドであるかあるいはそれを含み、それにはタンパク質／非タンパク質複合体がある。認識部分は、タンパク質の結合領域、またはその修飾バージョン、または抗体の抗原結合ドメインを含むことができる。別法ではＲは、ランダムにまたは合理的設計により生成した完全に合成された分子であってもよい。
【００３５】
特に好ましい実施形態によれば認識部分Ｒは、ランダムに生成したペプチドまたはその一部を含むかまたはそれから構成される。ランダムに生成したペプチドとは、アミノ酸残基のランダム配列を有するペプチドを意味する。このようなペプチドは、オリゴシンセサイザーにより生成することができるようなランダムＤＮＡ配列によってエンコードされる。ランダム配列は、配列の組成中に著しい偏りを全く持たない。ランダムペプチドは、既知のタンパク質類または天然に産出するタンパク質結合ドメインと相同性を示してもまた示さなくてもよい。このようなペプチドは組合せライブラリーから選択することができ、有望な認識分子の巨大なプールを提供する。好ましくはランダムペプチドは、天然に産出するペプチドと顕著な相同性を持たない。
【００３６】
認識部分Ｒはまた、既知のペプチドの相互作用表面を含むかまたはそれから構成されてもよい。
【００３７】
認識ペプチドＲは一般にサイズが比較的小さく、若干の事例ではこれよりも大きいかまたは小さいかも知れないが、例えばアミノ酸５〜１５０個、好ましくはアミノ酸約５〜１２０個、最も好ましくはアミノ酸５〜６０個、またさらに一層好ましくはアミノ酸６〜４０個である。理想的にはペプチド認識部分は、細菌の細胞中および哺乳類の細胞中で容易に発現し、精製される。
【００３８】
有利には認識部分Ｒは少なくとも１個の認識領域を含み、立体配座的に束縛された形で台「Ｐ」中に表示される。適切な認識特性を提供するために認識領域「Ｖ」の組成を変え、一方台「Ｐ」は一定のまま残すことができる。認識領域は、本明細書では「可変領域」または「Ｖ」と呼ぶことにする。台Ｐ中に立体配座的に束縛された１または複数個の可変認識領域「Ｖ」を含む認識部分は、「アプタマー」と呼ぶことにする。そのような認識部分中に可変領域Ｖのその１または複数個がペプチドを含む場合、その分子を「ペプチドアプタマー」と呼ぶことにする。
【００３９】
可変領域「Ｖ」は、また骨格として知られる台Ｐ中に立体配座的に束縛される。これは、Ｖの柔軟性が低いことを意味し、すなわちその腕の少なくとも１つが台と共有結合により結合しているため、限られた数の立体配座を引き受けることができる。好ましくは「Ｖ」は二重に束縛される、すなわち可変領域の両方の腕が台と共有結合により結合している。例えばペプチドアプタマーの場合、「Ｖ」のＮ末端およびＣ末端の両方の腕が台と共有結合により結合している。一般には可変領域は、骨格の中央部分または「活性部位の輪状構造」中に挿入され、最適な相互作用特性の達成を可能にする。あるいは、またはこれに加えて可変領域の腕は、それらを共有結合により結びつけることによって、例えばジスルフィドブリッジによって立体配座的に束縛することもできる。
【００４０】
Ｒの立体配座による束縛は、ジスルフィドブリッジの形成を伴ってもまた伴わなくてもよい。
【００４１】
可変領域「Ｖ」は、アミノ酸を約５￣約６０個、好ましくはアミノ酸を１０〜４０個、例えばアミノ酸を２０個またはその前後を有するペプチドであることが好ましい。
【００４２】
台Ｐ（または「骨格」としても知られる）は、「Ｖ」が引き受けることができる立体配座の数を共有結合を介して減らすことが可能な任意の分子であることができる。立体配座束縛性骨格の例には、タンパク質およびペプチド、例えばチオレドキシンおよびチオレドキシンに似たタンパク質、ヌクレアーゼ（例えばＲＮアーゼＡ）、プロテアーゼ（例えばトリプシン）、プロテアーゼ阻害剤（例えばエグリンＣ）、抗体またはその構造的に剛性なフラグメント、ＧＦＰまたはＹＦＰなどの蛍光タンパク質、およびコノトキシンがある。立体配座束縛性ペプチドは、任意の適切な長さ、例えばアミノ酸５〜１５０個、好ましくは５〜４０個または５〜６０個のものであってよい。アミノ酸残基のもっと短い領域でさえ、立体配座による束縛を形成することができる。その他の好適な台分子には、セファロース、磁気ビーズ、蛍光ビーズ、またはゴールドビーズなどの炭水化物がある。台Ｐは、線状分子または、例えば閉じて輪状構造を形成した環状分子であってもよい。
【００４３】
台は、一般にペプチドＶに対して異型である。これは例えば、台がＶペプチドと同じ起源のものでないことを意味する。台とＶの会合は、通常は自然界に存在しない。
【００４４】
立体配座による束縛における役割に加えて台はまた、タンパク質分解による崩壊などのないように保護を与えること、また望ましい溶解度特性などを与えることができるかも知れない。
【００４５】
チオレドキシン（ＴＲＸ）およびチオレドキシンに似た（ＴＲＸに似た）タンパク質は、本発明の台として特に好ましい。チオレドキシンに似たタンパク質は本明細書では、アミノ酸８０個のアミノ酸配列の長さにわたってＥ． ｃｏｌｉチオレドキシンのアミノ酸配列と少なくとも１８％、好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも７５％相同のタンパク質と定義する（参考資料４３）。チオレドキシンに似た分子にはまた、ヒトまたはＥ． ｃｏｌｉのチオレドキシン、例えばグルタレドキシンとほぼ類似の三次元構造を有するペプチドが含まれる（参考資料４４）。特に好ましいチオレドキシンの台はヒトのチオレドキシンである。
【００４６】
ＴＲＸまたはＴＲＸに似た認識部分において可変領域「Ｖ」は通常、ＴＲＸまたはＴＲＸに似たタンパク質の活性部位の輪状構造に挿入される。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態によれば、前述のペプチドアプタマーは、Ａｃｔなどの活性化ドメインもまた担持するアプタマー誘導体と、餌としてのＬｅｘＡなどのＤＮＡ結合ドメインと融合した所望の標的タンパク質とを用いたツーハイブリッド法によって組合せライブラリーから選択される。このような選択はアプタマーがｉｎ ｖｉｖｏで作用することを保証する。ペプチドアプタマーは、一般にそれらの標的に対して約１×１０−７Ｍ〜１×１０−８ＭのＫｄｓを示す（参考資料１）。これら分子は、タンパク質ファミリーの親密で同族のメンバーの間（参考資料１）、またタンパク質の異なる対立遺伝子形の間（参考資料２、また下記実施例）でさえ区別することができる。ペプチドアプタマーは標的分子上の特異的な部位に結合し、したがって標的が全てではなく１つの相互作用の相手と相互に作用するのを阻害することができる。したがって細胞内標的の機能的変調をきわめて正確なやり方で行うことができる。
【００４８】
ペプチドアプタマーはｉｎ ｖｉｖｏで、ある定まったタンパク質の相互作用を乱すことができることが示された（参考資料１０中の概説）。例えば、抗Ｃｄｋ２アプタマーは、Ｃｄｋ２がその基質の１つと相互に作用するのを拮抗的に阻害し、ヒト細胞中で発現すると細胞周期全体にわたって進行を遅らせる（参考資料３）。同様に抗Ｅ２Ｆ、抗ＨＰＶ Ｅ６、および抗Ｒａｓアプタマーは哺乳類細胞中でそれらのタンパク質標的の機能を乱し（参考資料４、５）、また抗Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｃｄｃ２およびＣｄｃ２ｃアプタマーは成虫盤中でそれらの標的の機能を阻害する（参考資料６）。最終的に、表現型を生じさせるためにアプタマーを優性遺伝子物質として使用し、次のツーハイブリッド検定でそのタンパク質およびそれらが目標とする相互作用を識別することができることが示された（参考資料７、８、９）。したがって、これらの物質は本発明に従って細胞生理の制御された変調を行うのにうってつけである。
【００４９】
本発明によれば、好ましくはペプチドアプタマーである認識部分Ｒは、エフェクター部分Ｅと共有結合により結合して標的に向けられるエフェクターを形成する。エフェクター部分Ｅは、任意の分子または分子の一部であり、少なくとも１種類の分子Ｍに対して効果を発揮する初期能力を有し、それによってＭの化学的、生化学的、物理的、または機能的特性に影響を及ぼす。
【００５０】
本発明に従ってＥはＭに対して効果を発揮する「初期」能力を持つと云われる。この意味合いでは「初期」能力とはＥが認識部分Ｒと共有結合により結合する以前にこの能力を持っていることを意味する。Ｍに対して効果を発揮するＥの「初期」能力は固有の能力であってもよく、または例えば熱もしくは光などの外部の刺激に応答して誘発される能力であってもよい。「初期」能力はまたＥに人工的に与えられた、例えば分子Ｅの修飾によって与えられた能力であってもよい。
【００５１】
一般にＥはＭ上のｉｎ ｃｉｓおよび／またはｉｎ ｔｒａｎｓで効果を発揮する初期能力を有し、Ｒと共有結合により結合するとＥは標的Ｔ上のトランス内で同じ効果を発揮する能力を獲得する。Ｅは、Ｒとの融合の後にＭに作用するようにその能力を保持してもまた保持しなくてもよい。
【００５２】
本発明によれば、分子Ｍに対して「ｉｎ ｔｒａｎｓ」で効果を発揮する初期能力を有するエフェクター部分Ｅは、それが認識分子Ｒと共有結合で結合していない場合、Ｅと、またはＥを含む分子と共有結合で結合していない分子Ｍに作用するか、またはその作用を受ける能力を有する分子である。同様に分子Ｍに対して「ｉｎ ｃｉｓ」で効果を発揮する固有の能力を有するエフェクター部分Ｅは、それが認識分子Ｒと共有結合で結合していない場合、それ自体に作用する、またはそれ自体が作用を受ける、またはＥを含む分子Ｍに作用する能力を有する分子である。
【００５３】
Ｅが最初それに対して効果を発揮する能力を有する分子Ｍは、細胞内分子でも細胞外分子でもよい。それは、認識部分Ｒの標的である分子Ｔと同じでも異なっていてもよい。
【００５４】
本発明者等はいくつかのケースにおいて、普通はｉｎ ｃｉｓで効果を発揮する、すなわちエフェクターと共有結合により結合している分子に対して効果を発揮するエフェクター部分が、認識部分の標的Ｔに対してｉｎ ｔｒａｎｓで同じ効果を発揮する能力を獲得することを立証した。したがってこのｃｉｓ効果は、標的分子との共有結合なしで発揮することができるものに変換される。
【００５５】
標的に向けられるエフェクター中でＥは、例えばＲのアミノまたはカルボキシ末端と直接、あるいはそれ自体がまた特定の機能を提供する連鎖配列を介して共有結合により認識部分Ｒと結合している。またＥは、可変領域Ｖの機能がその挿入によって乱されないならばＲ内に挿入されてもよい。したがってＥは、一端または両末端で立体配座的に束縛されてもよい。
【００５６】
Ｅは、好ましくはタンパク質またはペプチドであるか、あるいはタンパク質またはペプチドを含むが、必ずしもそれには限らない。例えばエフェクター部分Ｅは、酵素、その触媒ドメイン、補因子、アドレッシングシグナル、転写調節タンパク質、トレーサータンパク質、治療または診断特性を有する分子、第二の認識部分、標的に向けられる第二のエフェクター、放射性核種、化学的修飾因子、それ自身に対して作用することができる酵素などを含むか、またはそれから構成されてもよい。Ｅがペプチドであるかまたはそれを含む場合、そのサイズはアミノ酸２〜３個からアミノ酸残基数百個以上まで変えることができる。典型的なサイズはアミノ酸約２０〜２００個、例えば３０〜１００個の範囲である。
【００５７】
最初トランスに作用するエフェクター部分の例は、酵素、転写因子またはその構成成分、酵素の基質、補因子などである。最初シスに作用するエフェクター部分の例は、アドレッシングシグナルまたは細胞内輸送体、標識、遺伝標識などである。
【００５８】
本発明の特に好ましい実施形態によればエフェクター部分Ｅは、Ｔとは異なる標的分子である細胞内標的分子Ｔ２上の部位と細胞内で特異的に相互に作用する能力を有する第二認識部分Ｒ２を含む。したがって標的に向けられるエフェクターは二量体分子である。
【００５９】
本発明者等は、エフェクター部分Ｅを認識部分Ｒと結合した場合、ＥがＲの特異性を獲得する、すなわちそれが細胞中でＲと同じ範囲の細胞内標的に作用する能力を獲得することを立証した。この効果は、ＥがＲとは異なる固有の特異性を有する分子の場合、特に驚くべきことである。例えば本発明者等は、ある特定の細胞内標的Ｔと普通は相互に作用することができない酵素が、認識部分に接合されるとＴに対してその通常の酵素活性を発揮する能力を獲得することに気づいた。したがってエフェクター部分の特異性を本発明により転送することができる。Ｒの特異性を獲得することに加えて、共有結合により結合したＥはまた、いくつかのケースにおいてその最初の相手Ｍに対して効果を発揮する能力を保存することができる。ＥがＭに作用する能力を維持するかどうかは、Ｅ、Ｍ、およびＲの性質、ならびにその細胞の性質による。さらにエフェクター部分Ｅが細胞中に内因性の片割れを有する分子の場合、その内因性の片割れの特異性は、転送される特異性を有するＥを持つ標的に向けられるエフェクターが細胞中に存在することによって影響されない。
【００６０】
本発明の標的に向けられるエフェクターは１または複数個のエフェクター部分、例えば２または３個を持つことができる。２個以上のエフェクター部分が存在する場合、それらは機能的に連係して働いてもよく、またはその機能が互いに両立するならば機能的に独立であってもよい。機能的に連係して働くエフェクター部分の例は、標的Ｔを特定の細胞下分画に向ける役割を担う第一エフェクター部分Ｅ１と、標的Ｔに作用することができる第二エフェクター部分Ｅ２、またはいったんそれがその細胞分画中に入ると別の分子、によって与えられる。このタイプの系の例は、Ｅ１が核局在化シグナルであり、Ｅ２がモジュール転写因子の構成成分であり、かつ標的Ｔがモジュール転写因子の第二構成成分を含む細胞質タンパク質である場合である。標的に向けられるエフェクターは、細胞質の標的Ｔと相互に作用することによってモジュール転写因子を再構成し、同時に細胞質の標的分子を核種中に運ぶ。次いで転写因子がそのＤＮＡの標的と結合し、転写を調節することができる。
【００６１】
標的に向けられるエフェクターが２つ以上のエフェクター部分を持っている場合、それらすべてが最初トランスに作用してもよく、またはすべてが最初シスに作用してもよく、または一部がトランス、一部がシスに作用してもよい。さらにエフェクター部分の一部またはすべてが最初トランスとシスの両方に作用してもよい。
【００６２】
エフェクター部分Ｅは、いったん所望の細胞内変調が行われたとき、その標的に向けられるエフェクターの破壊または不活性化を引き起こす分子でもよく、またそれを含んでもよい。長命の認識分子が細胞内で望ましくない相互作用を引き起こさなくするために、このようなエフェクター部分を用いることができる。標的分子を修飾することができ、また認識部分を破壊することができるエフェクター部分の例はユビキチンリガーゼである。
【００６３】
本発明の更なる変形態様によれば、エフェクター部分が転写活性化因子とは別の分子である。
本発明の特に有利な実施形態は、「修飾因子」、「輸送体」、および「強制相互作用因子」の実施形態である。これらの変形態様について下記に述べることにする。
【００６４】
本発明の修飾因子の実施形態は、細胞内標的中で変化を引き起こす、具体的には共有結合の生成を引き起こすために標的に向けられるエフェクターを使用することを含む。それは好ましくは、通常はその標的に作用することができないが、認識部分にそれらを結合することによって作用する能力を獲得するエフェクター部分を使用することを含む。言い換えればこの変形態様は好ましくは、転送される特異性をもつエフェクター部分による細胞内標的の特異的修飾を含む。
【００６５】
より詳細には修飾因子の実施形態によればエフェクター部分Ｅは、それが認識部分と共有結合により結合していると細胞中で標的Ｔに対して効果を発揮する能力を有するが、それが認識部分と共有結合により結合していないと同じ時間的および空間的環境において同じ細胞中でＴまたはＣに対してこの効果を発揮することができない。本発明の「修飾因子」の変形態様によれば、好ましくはＥは最初トランスに作用する。
【００６６】
この実施形態によれば、それが認識部分と共有結合により結合していない場合にエフェクター部分Ｅが細胞中でＴまたはＣに対して効果を発揮する能力がないのは一般にＥまたはＴの固有の特異性のせいであり、例えば酵素のケースではそれが認識部分と共有結合により結合していない場合、その固有の特異性は標的タンパク質ＴがＥの基質として作用するのを妨げる。
【００６７】
あるいはエフェクター部分Ｅは、それが認識部分と共有結合により結合していない場合、ＥおよびＴが互いに会合しないようにするＴおよび／またはＥの時間的または空間的特異性のために細胞中で最初ＴまたはＣに対して効果を発揮することができない可能性がある。同様にＥとＴまたはＣが細胞中で共発現しない場合、ＥはＴおよび／またはＣに対して効果を発揮することができないはずである。
【００６８】
エフェクター部分Ｅと認識部分Ｒの共有結合による会合は、ＥがＴに対して最初効果を発揮することができないことを克服することを可能にする。
別の可能性は、エフェクター部分Ｅが認識部分と共有結合により結合した場合、Ｍに対してその効果を発揮する能力を失うことである。
【００６９】
本発明の輸送体の実施形態によればエフェクター部分Ｅは、ｉｎ ｃｉｓの細胞内分子Ｍを予め決められた細胞下画分に輸送する初期能力を有する。ＥをＲに共有結合により接合すると、Ｅは標的分子Ｔを上記細胞下画分に向ける能力を獲得する。したがってこの実施形態によれば、ＥはＮＬＳ、分泌シグナルなどの輸送体分子またはアドレッシングシグナルである。エフェクター部分と認識部分の共有結合による会合は、Ｅが認識部分の標的Ｔに対してｉｎ ｔｒａｎｓでその効果を発揮することを可能にする。
【００７０】
好ましくは標的がそこへエフェクター部分によって輸送される細胞下画分は、標的が普通なら向けられないか、または特殊な条件においてのみ向けられるか、またはきわめて限られた程度までしか向けられないはずのものである。その結果、輸送体は標的に向けられるエフェクターによって「押し込まれる」。
【００７１】
本発明の「強制相互作用因子」の変形態様によれば、オリゴマーの、特に二量体の標的に向けられるエフェクターを用いて通常なら検出可能なレベルでは互いに相互作用しない２つの標的の間の相互作用を誘発する。
【００７２】
通常なら相互に作用しない２つのタンパク質を互いに近づける能力が、それらの相互作用を可能にする。２つのタンパク質の一方が酵素活性を持っている状態では、この活性が通常は基質ではないもう一方のタンパク質に作用する可能性があると考えられる。相互作用を引き起こす能力を用いて上記相互作用の生理学的機能を解明し、また細胞の機能を修飾することができる。
【００７３】
新規な相互作用を創り出すことによって本発明の二量体分子は、分子調節回路網に使うことができる操作の範囲を増す。
【００７４】
より詳細には本発明のオリゴマー細胞内認識分子は、上記で定義したように直接またはリンカーを介して互いに共有結合により結合した認識分子Ｒを２〜４個、好ましくは２個含む。
【００７５】
好ましくは二量体を構成する各単量体は、１×１０８Ｍ未満に対応するＫｄを有する親和力でその標的と相互に作用するが、必ずしもそれには限らない。この二量体は一般に、その構成成分の単量体と同程度の結合親和力を有する。
【００７６】
ペプチドアプタマー二量体が特に好ましい。この好ましい実施形態によれば、本発明の二量体細胞内認識分子は共有結合により結合した２個の細胞内認識分子Ｒ１およびＲ２を含み、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ共有結合により台と結合することによって立体配座的に束縛された、長さがアミノ酸５〜６０個のペプチドである認識ドメインＶを有し、Ｒ１は細胞内で予め決められた細胞内標的分子Ｔ１上の部位と特異的に相互に作用する能力を有し、またＲ２は細胞内で予め決められた細胞内標的分子Ｔ２上の部位と特異的に相互に作用する能力を有し、Ｒ１とＲ２は同じでも異なっていてもよく、Ｔ１とＴ２は異なっている。
【００７７】
好ましい実施形態によれば二量体Ｒ１およびＲ２の単量体単位は同一であり、細胞内認識分子は２個の同一だが独立した標的分子Ｔ１およびＴ２と特異的かつ同時に結合する。したがってこれは２個の独立した通常は非相互作用性の同一の標的と相互に作用するホモ二量体である。この二量体によって引き起こされる強制相互作用は、標的分子のクラスター化（または非共有結合による「二量体化」）などの結果を招く可能性がある。このタイプの二量体を図１６Ｅに図示する。
【００７８】
別の好ましい実施形態によれば二量体Ｒ１およびＲ２の単量体単位は異なっており、細胞内認識分子は２個の異なる独立の標的分子Ｔ１およびＴ２と特異的かつ同時に結合する。したがってこれは２個の独立した通常は非相互作用性の同一でない標的と相互に作用するヘテロ二量体である。この二量体によって引き起こされる強制相互作用は、標的分子のクラスター化（または非共有結合による「二量体化」）、または一般にエフェクター部分と関連する上記に列挙した結果のいずれかを招く可能性がある。このタイプの二量体を図１６Ａに図示する。
【００７９】
アプタマー二量体の単量体単位は、直接融合または可変性リンカーを介して互いに共有結合により結合している。好適なリンカーの例は下記の実施例中で与えられる。
【００８０】
本発明者等は、さまざまな二量体の形状と関連する位置効果に注目した。例えばいくつかの状態では二量体構造物中のアプタマーは、それがＮ末端位置にある場合、その標的とよりしっかり結合することに気づいた。二量体の形状はこのことを考慮して設計することができる（下記実施例を参照されたい）。
【００８１】
二量体はすでに二量体の形で細胞中に導入することができ、また別法では例えばロイシンジッパーなどによって細胞内で形成することもできる。
【００８２】
本発明はまた、所望の「強制相互作用」能力を有する二量体アプタマーを調製し識別する方法に関する。より詳細には本発明のこの態様は、２個の標的分子Ｔ１とＴ２、および／または細胞中でＴ１またはＴ２と直接または間接的に相互に作用する細胞構成成分Ｃとの間の相互作用を強制する能力を有する二量体認識部分の識別方法に関し、この方法は
ａ）ペプチド、いわゆる認識部分Ｒのランダムプールを生成するステップ、
ｂ）Ｔ１またはＴ２と相互に作用することができる認識部分Ｒの識別を可能にするのに適した条件で、細胞中のＴ１およびＴ２に関してａ）で生成したランダムプールをスクリーニングするステップ、
ｃ）任意選択で、ｂ）で選択された分子部分をＴ１およびＴ２とは別のタンパク質と接触させて上記分子部分のそれぞれの特異性範囲を決定し、また望ましい特異性範囲を有する分子部分を識別するステップ、
ｄ）２個のこうして識別された認識部分Ｒ１およびＲ２を互いに共有結合により結合して二量体認識部分を形成するステップ、および
ｅ）二量体認識部分をスクリーニングしてＴ１およびＴ２と同時に相互に作用することができる分子部分を識別するステップ、
を含む。
【００８３】
次に細胞内標的分子Ｔに話を変えると、この分子は任意の細胞内分子であることができる。それは細胞にとって内因性でもよく、また細胞にとって異型、例えば組換えタンパク質でもよい。それはまたトランスメンブレン分子であってもよい。
【００８４】
Ｔは、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、リン酸化分子、脂質、またはこれらのいずれかの組合せ、例えばタンパク質／ＤＮＡ複合体であることができる。標的Ｔは、細胞中の或る条件下でのみ存在する分子、例えば空間的または時間的特異性の許で発現するタンパク質である。Ｔは細胞区画のいくつかまたはすべての中に、例えば細胞質または核に存在するか、あるいは細胞全体にわたって均一に分布してもよい。
【００８５】
いくつかの例において標的タンパク質Ｔは、少なくとも２つの機能的に異なるタンパク質ドメインＴａおよびＴｂを含むタンパク質、例えば細胞中で人工的に生成される合成融合タンパク質、または異なる機能が異なるドメインにマッピングしている天然に産出する内因性のタンパク質であることができる。このようなケースでは本発明の認識部分Ｒは第一機能ドメインＴａ上の部位と特異的に結合し、またエフェクター部分Ｅは第二機能ドメインＴｂに対して構造上または機能上の調節効果を発揮することができる。これは、他を修飾しながら標的Ｔの機能の１つの保存が望ましい場合、特に有利である。
【００８６】
いくつかのケースでは標的に向けられるエフェクターがその効果を発揮する細胞内分子は、直接的に標的分子Ｔではなくて、Ｔが直接または間接的に相互に作用する別の細胞内構成成分Ｃである可能性がある。Ｃは任意の細胞内構成成分、例えばタンパク質、核酸、脂質、リン酸塩、炭水化物などであることができる。
標的に向けられるエフェクターの標的Ｔまたは細胞内構成成分Ｃとの相互作用は、多くの異なる化学的、生化学的、物理的、および／または機能上の変化のいずれか１つまたは複数を引き起こす。このような修飾の例には、
１）Ｔ中またはＣ中の１または複数の共有結合もしくは非共有結合の形成もしくは破壊などの化学的変化、
２）ＴまたはＣの高次構造の修飾、細胞下画分へのあるいは細胞の内側または外側の細胞膜へのＴまたはＣの輸送、ＴまたはＣの標識化などの物理的変化、
３）ＴまたはＣの１または複数の機能の効率の向上または低下、あるいは或る機能の廃絶または創出などの機能上の変化、
が含まれる。
【００８７】
標的Ｔまたは細胞構成成分Ｃの化学的、生化学的、物理的、または機能的特性の変調は、細胞または生物体中の表現型の変化を引き起こす可能性がある。この表現型の変化は選択可能または検出可能であってもなくてもよい。
【００８８】
標的に向けられるエフェクターによって生じた変調の結果（修飾因子、輸送体、および強制相互作用因子）は下記の効果の１または複数を含むことができる。
１）ＴまたはＣのホモまたはヘテロ二量体化、
２）ＴまたはＣのホモまたはヘテロ二量体化の阻害、
３）ＴまたはＣの破壊、
４）ＴまたはＣの安定化、
５）ＴまたはＣの標識化、
６）新規な相手とのＴまたはＣの相互に作用する能力、
７）細胞中の普通ならＴまたはＣが輸送されない細胞下画分へのＴまたはＣの局在化、
【００８９】
８）細胞中の普通ならもっと低水準でしかＴまたはＣが輸送されない細胞下画分へのＴまたはＣの局在化、
９）細胞膜におけるＴまたはＣの露出、
１０）ＴまたはＣの取込み、
１１）自然の細胞内の相手とのＴまたはＣの会合の誘発、
１２）自然の細胞内の相手とのＴまたはＣの会合の妨害、
１３）ＴまたはＣの切断、
１４）ＴまたはＣの分泌。
【００９０】
本発明の好ましい実施形態によれば、エフェクター部分Ｅが欠けた状態の認識部分Ｒは、標的Ｔの化学的、生化学的、物理的、または機能的特性に何の影響もない、すなわちＲは標的タンパク質Ｔに関して中立である。このようなケースでは標的に向けられるエフェクターによって引き起こされる変調は、完全にエフェクター部分Ｅのせいである。このタイプの相互作用は、例えばペプチドアプタマーにより可能である。なぜならばそれらが標的上の特定のはっきり区切られた部位またはエピトープと相互に作用するためである。したがって所望の標的分子Ｔと相互に特異的に作用するが、Ｔの或る特定の機能にはたまたま影響しないアプタマーを選択することが可能である。前述のようにアプタマーが可変領域の突然変異誘発を受けて結合親和力が最適化される場合、アプタマーの選択性のわずかな修飾を誘発する可能性がある。このような特異性の制御された修飾を用いて標的Ｔの機能に関して中立の高親和性アプタマーを創り出すことができる。
【００９１】
本発明によれば認識部分Ｒの標的Ｔとの相互作用によりＴの機能の修飾を引き起こすこともまた可能である。このようなケースでは標的Ｔ上のエフェクター部分の最終の効果は、認識部分の作用とエフェクター部分の作用との複合作用である。
【００９２】
別の変形態様によればエフェクター部分Ｅは、標的Ｔまたは構成成分Ｃの機能に影響しない。このようなケースではＥは、例えばただ単に標的用の標識を提供することができる。
【００９３】
本発明のプロセスは細胞中で行われる。細胞は原核細胞でも真核細胞でもよい。真核細胞が特に好ましく、例えばヒトまたは非ヒトの細胞を含む哺乳類の細胞、昆虫細胞、植物細胞、魚の細胞、鳥の細胞、酵母細胞などである。細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏの培養物中の細胞であってもよく、またはｉｎ ｖｉｖｏの完全な生物体の細胞であってもよく、または完全な生物体から採り、ｅｘ ｖｉｖｏで処理されてもよい。
【００９４】
標的に向けられるエフェクターは、複数の異なる方法で細胞中に導入することができる。例えばそれはエフェクター部分と認識部分からなる融合タンパク質の形態の標的に向けられるエフェクターをエンコードするＤＮＡ配列の発現によって細胞中へ導入することができる。この方法は、細胞または生物体の遺伝子操作が可能な場合、また標的に向けられるエフェクターがタンパク質の場合、一般的に適用される。このようなケースでは標的に向けられるエフェクターは、発現に必要なすべての制御配列を含む適切なベクター中の細胞に導入される。
【００９５】
別法では標的に向けられるエフェクターは、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、例えばペネトラチンなどの細胞浸透剤を用いて精製した形で細胞に導入される。この方法は、個体の遺伝子の修飾が望ましくない場合の治療に特に好都合である。別の選択肢は、標的に向けられるエフェクターを細胞中へ微小注入することである。
【００９６】
本発明はまた、高親和性の細胞内ターゲッティング分子の生成方法に関する。
具体的には本発明のこの態様は、細胞内標的分子Ｔ、および／または直接または間接的に細胞中でＴと相互に作用する細胞構成成分Ｃの特性を特異的に変調する能力を有する標的に向けられるエフェクターの生成プロセスに関し、このプロセスは、
ａ）ペプチド、いわゆる認識部分Ｒのランダムプールを生成するステップ、
ｂ）Ｔと相互に作用することができる認識部分Ｒの識別を可能にするのに適した条件で細胞中のＴに関してａ）で生成したランダムプールをスクリーニングするステップ、
【００９７】
ｃ）任意選択で、ｂ）で選択された分子部分をＴとは別のタンパク質と接触させて上記分子部分のそれぞれの特異性範囲を決定し、また所望の特異性範囲を有する分子部分を識別するステップ、
ｄ）認識部分Ｒを、最初少なくとも１個の細胞内構成成分Ｍに対して予め決められた効果を発揮する能力を有する分子であるエフェクター部分Ｅと共有結合により結合させるステップであり、このステップｄ）はステップｂ）の前、またはステップｅ）の後に行われる、
【００９８】
ｅ）認識部分ＲがＴと相互に作用する親和力Ａ１、または標的に向けられるエフェクターがＴと相互に作用する親和力Ａ２を検証するステップ、および
ｆ）Ａ１とＡ２の両方が１×１０−８Ｍを超えるＫｄ値に対応する場合、Ｋｄ値が１×１０−８Ｍ未満になるようにＴと選択された分子部分の間の相互作用の結合親和力を調整するためにエフェクター部分の結合領域を変えるステップ、
を含む。
【００９９】
上記プロセス中のステップｂ）は、細胞中のランダムペプチドのプールを未知または既知の内因性標的分子Ｔに関してスクリーニングするステップを含んでもよく、このステップではＴとの相互作用が検出可能または選択可能な表現型の変化を引き起こす。次いでしかるべき場合には上記表現型の変化を引き起こす能力を持つことが知られている分子に関してその選択された認識部分をスクリーニングし、Ｔのアイデンティティーを推定することによってＴのアイデンティティーを決定することができる。標的に向けられるエフェクターを生成し、特徴を調べるこの方法は、エフェクター部分の性質が古典的なツーハイブリッド相互作用捕捉システムの使用を妨げる場合に採用することができる。別法ではツーハイブリッド相互作用検定における「餌」としてＲまたは標的に向けられるエフェクターＲ−Ｅを使用し、ライブラリーから可能性「Ｔ′ｓ」を探ることによってＴのアイデンティティーを決定することができる。
【０１００】
別法ではステップｂ）は、細胞中のランダムペプチドのプールを既知の人工的標的分子Ｔに関してスクリーニングするステップを含んでもよく、そのステップではＴとの相互作用が検出可能または選択可能な表現型の変化を引き起こす。このタイプのスクリーニングの例は、ツーハイブリッド検定およびそれから派生した方法である。この方法によればステップｂ）はリポ−ター遺伝子の転写の検出を伴い、そこでは人工の候補標的タンパク質が認識部分を有する細胞中で共発現する。
【０１０１】
本発明はまた、標的に向けられるエフェクター自体に関する。より詳細には本発明のこの態様は、
１）細胞内標的分子Ｔ上の部位と細胞内で特異的に相互に作用する能力を有し、そのＴとの相互作用が親和力Ａ１で起こる認識部分Ｒ、および
２）Ｒと共有結合により結合し、少なくとも１個の分子Ｍに対して効果を発揮する初期能力を有し、またＲと共有結合により結合した場合、細胞内標的分子Ｔに対して特異的に効果を発揮する能力を獲得するエフェクター部分Ｅ、
を含み、この標的に向けられるエフェクターが親和力Ａ２でＴと相互に作用し、親和力Ａ１または親和力Ａ２が１×１０−８Ｍ未満のＫｄ値に対応するキメラ分子に関する。
【０１０２】
好ましくは結合親和力Ａ１は１×１０−９Ｍ以下、例えば１×１０−９Ｍと１×１０−１３Ｍの間に含まれ、例えば１×１０−１０Ｍ未満、または１×１０−１１Ｍ未満、または１×１０−１２Ｍ未満である。
【０１０３】
本発明はまた、高親和性の「裸の」認識部分「Ｒ」に関する。本発明のこの態様は、より詳細には台の中に表れる立体配座的に束縛された認識ドメインから構成される細胞内認識分子Ｒに関するものであって、この認識分子は予め決められた細胞内標的分子Ｔ上の部位と細胞内で相互に特異的に作用する能力を有し、そのＴとの相互作用が１×１０−９Ｍ以下のＫｄ値に対応する親和力で起こる。
【０１０４】
好ましくは裸の認識部分ＲはＴと、１×１０−９Ｍと１×１０−１３Ｍの間、例えば１×１０−９Ｍと１×１０−１２Ｍの間に含まれるＫｄ値に対応する親和力で相互に作用する。裸の認識部分の特徴は、上記で「Ｒ」に関して詳細に記述されている。
【０１０５】
本発明はまた医薬品として許容できる賦形剤と関連して、本発明の標的に向けられるエフェクターを含む医薬組成物、またはそのような標的に向けられるエフェクターをエンコードする核酸に関する。
【０１０６】
本発明の標的に向けられるキメラエフェクターおよびこの標的に向けられるエフェクターをエンコードする核酸を療法に用いることができる。例えばこの標的に向けられるエフェクターまたは核酸を治療法または下記の疾病の治療用薬物の調製に用いることができる。
１）ウィルス感染症および真菌感染症などの微生物感染症
２）免疫学的障害
３）神経病学的障害
４）代謝性障害
５）神経障害
６）筋障害
７）遺伝的障害
８）癌
９）心臓血管障害
１０）歯科的障害
【０１０７】
下記の実施例で詳細に述べることになる本発明の好ましい実施形態は、ｉｎ ｖｉｖｏで標的タンパク質の局在性を共有結合により修飾し変化させるペプチドアプタマー誘導体である。本発明に従ってこのアプタマーは、まずより高親和性の突然変異体、例えば抗Ｃｄｋ２アプタマーを生成し、既存のアプタマーの可変領域の突然変異を誘発させ、比較的影響を受けにくいツーハイブリッドリポーター遺伝子を用いてより強固に結合した突然変異体をスクリーニングすることによって作製された。この変異型は親和力が顕著に増加し、２と５ｎＭの間のＫｄを示した。一層影響を受けにくいリポーター遺伝子の使用（参考資料２８）および／またはそれらのオペレーターに対して低い親和性を有するＬｅｘＡ突然変異体（参考資料２９）および／またはアプタマーライブラリー上のより弱い活性化ドメインの置換が、１回の手順で超微小量以下の親和力を有する突然変異体アプタマーの識別を可能にするはずである。
【０１０８】
修飾因子、すなわちｉｎ ｖｉｖｏで標的タンパク質を共有結合により変えるタンパク質を構築するために、ユビキチン化、すなわちユビキチン分子をタンパク質上のリシン残基と結合させることを利用した。これらの修飾因子はＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２標的をユビキチン化した。さらにこの結果は、チオレドキシンの台の表面に露出したリシン残基上における自己ユビキチン化により修飾因子が自分自身を破壊したことを示唆する。この観察は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで天然のＲｓｐ５タンパク質が、そのｈｅｃｔドメインの外側のタンパク質のアミノ末端部分に存在する恐らくリシン残基上で自分自身をユビキチン化する（参考資料２３、３０）という事実とも一致している。
【０１０９】
本発明は、標的に向けられるタンパク質の、転送される特異性の酵素による修飾について初めてのｉｎ ｖｉｖｏでの証明を提供する。しかしながらこれらのアプタマー−ｈｅｃｔ融合体は余分のリシン残基を含有しているものでさえ、それらのＣｄｋ２標的を破壊しなかった。Ｃｄｋ２の場合、より活性なエフェクタードメインが仲介するユビキチン化は不安定化を招くことになる可能性がある。この考えと一致するがＧｏｓｉｎｋ等は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ａタンパク質のＩｇ結合ドメインなど異なるタンパク質結合ペプチドをＵｂｃカルボキシ末端と融合することによって、２種類の植物Ｅ２ユビキチン複合酵素Ｕｂｃ１およびＵｂｃ２の特異性を転送した（参考資料３１）。この著者達はｉｎ ｖｉｔｒｏでコグネイト基質のユビキチン化および標的に向けられるＩｇＧの部分的分解を観察した。しかしながらユビキチン化したＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２融合体の安定性に対するほぼ間違いのない説明は、単純にＣｄｋ２がユビキチンの仲介するタンパク質加水分解に対して抵抗力があるということである。実際、その結合相手のいくつかはこの手段によって分解されるが、Ｃｄｋはユビキチンによるタンパク質加水分解を受けないことが知られている（参考資料３２）。Ｈ２Ａ（参考資料２４）、特定の細胞周期相中のサイクリン（参考資料３３）、およびそのユビキチン化がプロテアソームと関係することなくエンドサイトーシスの信号を送るいくつかの膜受容体（参考資料３４）など、いくつかの他のタンパク質もまた分解されることなくユビキチン化される。
【０１１０】
また、核局在化配列と融合したペプチドアプタマーを「輸送体」として用いた。核局在化シグナルを運んだ抗Ｃｄｋ２および抗Ｓｔｅ５アプタマーは、それらの標的を核中に蓄積させた。この結果は、それらのタンパク質の標的を他の細胞下画分に転送する他のタンパク質部分、すなわち小胞体（参考資料３６）、ミトコンドリア膜（参考資料３７）、または原形質膜（参考資料３８）で輸送体を構築できるはずであることを示唆する。これら輸送体中のアプタマーはすべて、それらの標的タンパク質の活性を妨げたが、抗Ｓｔｅ５アプタマーを含有するＮＬＳのケースで言及したように不活性化は、その相手との相互作用を妨げることによってではなく実際は核局在化を強いることによって引き起こされる可能性がある（参考資料７）。アプタマーの輸送は、それ自体のプロモーターの制御下で発現する標的に向けられるタンパク質の不正な局在化を許すので、輸送体が細胞機能中で誘発する摂動は、アドレッシング配列と融合した標的タンパク質の過剰発現により引き起こされる摂動よりも激しくないはずである。
【０１１１】
別の機能モジュールから構成された新規なタンパク質の構造が多くの種類のタンパク質について報告されており（参考資料２８、３９）、これら方法の成功を進化の間にエキソンがタンパク質中でシャフリングされる現在の状況を支えるために利用することができる（参考資料４０）。ペプチドアプタマーは、別の機能を有する別のエフェクタードメインを備えたキメラタンパク質中の有用な多目的認識部分を意味する。細胞および完全な生物体中でこのような「修飾因子」および「輸送体」の発現を空間的および時間的に制御することができることは、タンパク質の修飾、不活性化、および局在化をより細かく制御することを容易にするはずである。さらにタンパク質の対立変異型を区別するアプタマーを選択できることは、個々のアレレの活性の選択的修飾を可能にするはずである。新規なペプチドアプタマー誘導体の生成および使用は、調節経路の高分解能の調査を容易にするはずであり、また新規な治療戦略において役立つ可能性がある。
【０１１２】
本発明の別の実施形態は、サイクリン依存性キナーゼおよびプロアポトーシス性タンパク質から選択される標的と特異的に相互に作用する能力を有する標的に向けられる特定のエフェクター分子、好ましくはアプタマーに関する。
【０１１３】
好ましくはサイクリン依存性キナーゼはＣｄｋ２である。このようなアプタマーは、アミノ酸配列ＱＶＷＳＬＷＡＬＧＷＲＷＬＲＲＹＧＷＮＭの突然変異体である「Ｖ」配列を有し、この突然変異体は上記配列に関してアミノ酸が１〜５個、好ましくは１〜３個変わっている。特に好ましい抗Ｃｄｋ２アプタマーは、アミノ酸配列ＱＶＷＳＳＷＡＬＧＷＲＷＬＲＲＹＧＷＧＭを含むかまたはこの配列からなるペプチド認識ドメインを有する。
【０１１４】
好ましいプロアポトーシス性分子としてＢａｘが挙げられる。本発明の抗Ｂａｘアプタマーは、アミノ酸配列ＰＲＧＡＰＭＷＭＲＷＶＣＱＭＬＥＴＭＦＬの突然変異体を含むかまたはこの配列からなるペプチド認識ドメインを有し、この突然変異体は上記配列に関してアミノ酸が１〜５個、好ましくは１〜３個変わっている。好ましくはこのペプチド認識ドメインは、アミノ酸配列ＰＲＧＡＰＭＷＬＲＣＶＣＱＭＬＥＴＫＦＬを含むかまたはこの配列からなる。
【０１１５】
これらの抗Ｃｄｋ２および抗Ｂａｘアプタマーを用いた単量体または二量体アプタマー構築物を下記実施例で記述する。抗Ｃｄｋ２および抗Ｂａｘアプタマーのヘテロ二量体が特に好ましい。
【０１１６】
本発明のいろいろな態様が図示される。
【０１１７】
表１、ＧＦＰ相互作用表現型およびＫｄｓ：
背景上の酵母の平均緑色蛍光は、４つの独立の実験においてＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２とアプタマー２、３、５、８、１０、１１との間の相互作用により生じた。以前に測定されたＫｄｓ（参考資料１）を、測定した蛍光と対照させてプロットした（図１ｃ）。グラフは、式Ｋｄ＝１０ ｅｘｐ−（ｆｌｕｏ ＋ １２３．７ ／ ２１．９）と一致した。この式を用いた補間法によってアプタマー１０Ｍに対する２ｎＭ Ｋｄを計算した。
【０１１８】
実施例
下記の実施例では誘導ペプチドアプタマーが、それらの標的タンパク質の細胞下局在化を共有結合により修飾または変更することを述べる。まず、親和性が改良されたペプチドアプタマーをその標的用に選択することについて述べる。この改良されたアプタマーその他を用いて２つのタイプのキメラタンパク質、すなわちそれらの標的タンパク質をユビキチン化する「修飾因子」、およびそれらの標的の細胞下局在化を変える「輸送体」を構築する。
またアプタマー二量体の構築についても述べ、押し込まれたタンパク質−タンパク質の相互作用を引き起こすためにそれらを使用することについて具体的に説明する。
下記の実施例に用いられる材料および方法は、「材料および方法」の項で詳細に記述する。
【０１１９】
結果
実施例１、高親和性抗Ｃｄｋ２アプタマーの生成および識別：
高親和を有するアプタマーを選択するために既存の抗Ｃｄｋ２アプタマーの突然変異を誘発させた。出発分子のアプタマー１０の測定Ｋｄは１．０５×１０−７Ｍであった（参考資料１）。ランダムＰＣＲ突然変異誘発をアプタマー１０Ｖ領域上で行い、ＰＣＲ産物をライブラリーベクターｐＪＭ−１中へ再導入した。このベクターは、酵母ＧＡＬ１プロモーターの許でＳＶ４０核局在化配列、Ｂ１１２活性化ドメイン、およびＨＡエピトープ標識と融合したアプタマーの発現を誘導する（参考資料１）。
【０１２０】
１５，０００個の突然変異体のプールを創った。ＰＣＲ突然変異誘発の効率の尺度を得るために、このプールから採った２種類のクローンのＶ領域の配列を決めた。配列決定は、これらが３つおよび４つの突然変異を持っており、それぞれ１個および３個のアミノ酸の変化をもたらすことを明らかにした。このプールからより密結合した変異型を識別するために、異なる感度を有する異なるＬｅｘＡオペレーターリポーター遺伝子の存在を利用した。ＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２餌を発現した、かつｐＲＢ１８４０を担持する菌株、すなわち単一の合成ＬｅｘＡオペレーターを有する比較的感度の鈍いｌａｃＺリポーター（参考資料１３）を最初に用いた。このリポーターはアプタマー１０によって活性化されない（図１ａ）。ＰＣＲで突然変異を誘発したプラスミドのプールをこの菌株中へ導入し、青色コロニーを生じた形質転換細胞を識別した。こうして識別された７個のプラスミドのＶ領域は同一のヌクレオチド変化を持っており、したがってそれらは多分無関係ではない。ヌクレオチド変化は、Ｖ領域の５位でＬｅｕからＳｅｒへ、また１９位でＡｓｎからＧｌｙへ２個のアミノ酸の変化をもたらした（図１ｄ）。
【０１２１】
アプタマー１０：ＱＶＷＳＬＷＡＬＧＷＲＷＬＲＲＹＧＷＮＭ
アプタマー１０Ｍ：ＱＶＷＳＳＷＡＬＧＷＲＷＬＲＲＹＧＷＧＭ
【０１２２】
この突然変異体は、Ｃｄｋファミリーと関係のないタンパク質、ＭａｘおよびＲｂとは相互に作用しなかった（図示していない）。突然変異体アプタマーは「１０Ｍ」と呼ぶ。
【０１２３】
Ｃｄｋに対する１０Ｍおよび１０の親和性を相互作用接合により比較した。リポーター、すなわちｐＳＨ１８−３４、ｐＪＫ１０３、およびｐＲＢ１８４０はそれぞれ、高親和性オペレーターを８個、高親和性オペレーターを２個、および低親和性オペレーターを１個含有する（図１ａ）。ｐＳＨ１８−３４リポーター由来の青色により判定されるようにアプタマー１０Ｍはアプタマー１０よりわずか大きい親和力を有するにすぎないが、ｐＪＫ１０３およびｐＲＢ１８４０由来の青色は１０ＭがＬｅｘＡ−Ｃｄｋをより強く結びつけることを示した。この見掛けの高親和性がアプタマー１０Ｍの発現および／または安定性の増大のせいではないことを検証するために、ウェスタンブロット実験を行い、アプタマー１０、アプタマー１０Ｍ、および対照用アプタマーの定常状態のレベルが同一であることを示した（図１ｂ）。
【０１２４】
親和力の増加は、２つの異なる手段で測定した。第一はＬｅｘＡｏｐ−ＧＦＰリポーター遺伝子を用いて抗Ｃｄｋ２アプタマーとＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２の間の相互作用を定量化した。各相互作用から得られた平均蛍光を、減衰波実験（参考資料１）で測定したＫｄｓに対してプロットした。このグラフは対数式に追従した（表１および図１ｃ）。この式を用いて、それが与えた蛍光からＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２とアプタマー１０Ｍの間の相互作用のＫｄを計算した（表１）。また減衰波実験を精製したアプタマー１０ＭおよびＨｉｓ６−Ｃｄｋ２で行った（参考資料１２）。測定されたＫｄは５ｎＭであり（図示されない）、ＧＦＰデータから計算した２ｎＭ Ｋｄにかなり近かった。
【０１２５】
【表１】
2004516848.tif 000002
【０１２６】
Ｖ領域の変化の親和力増加への寄与を評価するために、本発明者等は両方の残基を別々に野生型へ突然変異させ、相互作用接合により単一突然変異体を分析した（データは示していない）。これらの実験は、Ｖ領域の５番目の残基（Ｌｅｕ〜Ｓｅｒ）が親和力の増加に寄与するが、突然変異体の１９番目の残基（Ａｓｎ〜Ｇｌｙ）は寄与しないことを示した。
【０１２７】
１０Ｍの親和力の増加がそのＣｄｋ２との接触が変わることによって引き起こされるかどうかを決めるために、１０Ｍなどすべての既存抗Ｃｄｋ２アプタマーと、Ｃｄｋ２突然変異体の集まり、このタンパク質ファミリーの関係のあるメンバー、および対照用タンパク質（図示されない）との結合を試験した。図２はさきに観察したようにこれらアプタマーのいくつかが、Ｃｄｋタンパク質の中に保存されている異なるエピトープを認識することを示す（参考資料１）。しかしながら以前の研究で単離されたアプタマーと対照してみると、アプタマー１０Ｍは他のＣｄｋタンパク質に対して異なる交差反応性を示した。Ｃｄｋファミリーメンバーとのこの相互作用は、３つの考えと矛盾しない。第一に、Ｌｅｕ〜Ｓｅｒの変化は可変領域と、試験したＣｄｋタンパク質の中に保存されている残基との間の直接の接触を生み出した可能性がある。第二に、その変化は可変領域の立体配座を変えることによって間接的に接触を生み出した可能性がある。第三に、たとえＬｅｕがＳｅｒよりも二平面的に束縛されているとしても、Ｓｅｒへの変更が可変領域内で新しい内部接触を生み出し、それによってその立体配座エントロピーを減じた可能性がある。
【０１２８】
実施例２、標的に向けられる細胞内タンパク質修飾因子：
アプタマー１０Ｍその他を用いてｉｎ ｖｉｖｏで標的タンパク質をユビキチン化したタンパク質誘導体を作製した。この設計は、Ｅ２酵素から受け取ったユビキチンを接合し、それをタンパク質基質に送るｈｅｃｔドメイン含有ユビキチンリガーゼの構造的組織化に基づいている（参考資料２２）。これら酵素のアミノ末端の基質認識領域は大きく変わり、一方カルボキシ末端領域、すなわち触媒活性を持つｈｅｃｔドメインはファミリーメンバーの間で、また進化全体を通して保存される（参考資料２３）。この分子構造は、ｈｅｃｔドメインをペプチドアプタマーと融合し、設計された特異性を有するユビキチンリガーゼを創り出すことができることを示唆する（図３ａ）。
【０１２９】
したがって酵母タンパク質Ｒｓｐ５固有のｈｅｃｔドメインを用いてさまざまなアプタマー−ｈｅｃｔ融合体を構築した。これらは、それら推定上のＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２標的と一緒に酵母中で発現させた。
【０１３０】
ユビキチン化の能力によって間接的に評価されるアプタマー−ｈｅｃｔ融合体の特異性は、ｈｅｃｔなしの対応するアプタマーを用いて酵母検定中に生じた相互作用マトリックス中で観察されたものを反映することが分かった。アプタマー−ｈｅｃｔ融合体は、Ｃｄｋ２およびＣｄｋ３などの密接に関係する標的分子の間で区別することができた。
【０１３１】
これら融合タンパク質の運命を試験した。図３ｂは、可変領域を欠く対照用ＴｒｘＡ−ｈｅｃｔ融合体はウェスタン分析によって検出可能であったが、抗Ｃｄｋ２アプタマー−ｈｅｃｔ融合体はいずれも検出できなかったことを示す。この結果は、ＴｒｘＡアプタマーをｈｅｃｔドメインに付着させることによりそのアプタマーが不安定化することを示す。しかしながら抗Ｃｄｋ２アプタマー−ｈｅｃｔ融合体の発現は、より高分子量形態のＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２のラダーの出現をもたらし、低レベルの発現でさえ依然としてこれらキネマタンパク質が標的のユビキチン化を引き起こすことを示唆する。より高分子量のＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２形態のラダーは、１０Ｍ−ｈｅｃｔ融合体が発現した場合に最も明らかであり、標的に対する修飾因子の親和性が標的の修飾の程度に影響したことを示唆する。ウェスタン（図３ｂ）およびパルスチェイス実験（図示されない）から決定されるように修飾は分解を招かず、これら修飾の発現はＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２の安定性または半減期になんの影響も及ぼさなかった。
【０１３２】
より高分子量の化学種のラダーがＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２−ユビキチン接合体に対応することを確かめるために２つの異なる実験を行った。第一は、銅誘発性プロモーターの制御下において条件付きでＭｙｃにより標識したユビキチンを発現させた酵母菌株（参考資料１５）を使用し、上記実験を繰り返した。このユビキチン誘導体は天然のユビキチンよりも大きく、これを含有する接合体は高分子量を有する（参考資料１５）。ＣｕＳＯ４を培地に加えると高分子量のラダー上のバンドが非誘発型培地中のものより高い方へシフトした（図３ｃ）。第二は、ユビキチンとチオエステル結合を形成するシステイン残基をアラニンに変えることによって抗Ｃｄｋ２アプタマー−ｈｅｃｔ融合体の機能の喪失を引き起こした（参考資料２３）。本発明者等は、この突然変異体融合体を発現した細胞中にはＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２のラダーを目にしなかったが、ここで始めて酵素により死んだアプタマー−ｈｅｃｔ誘導体を確認した（図３ｂ）。この事実は、活性なアプタマー−ｈｅｃｔ誘導体が自己ユビキチン化後のタンパク質加水分解を受けやすいかも知れないことを示唆する。この考えは２つの系列の証拠によって裏付けられる。第一に、ユビキチン化はリシン上で起こり（参考資料２４）、アプタマー５−ｈｅｃｔ、８−ｈｅｃｔ、１０−ｈｅｃｔ、および１０Ｍ−ｈｅｃｔ融合体と対照させると、それらのＶ領域にリシンを含有するアプタマー２−ｈｅｃｔおよび１１−ｈｅｃｔ融合体は、たとえそれらがＣｄｋ２を他と同じようにしっかり結合させた（図２）としてもＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２をユビキチン化しなかった（図示していない）。この事実は、それらのＶ領域のユビキチン化がそれらの結合を妨げるという考えと合致する。第二に、本発明者等がＴｒｘＡ上の溶剤にさらした５種類のリシン（Ｋ１９、３７、５３、７０、８３）（参考資料２５）のさまざまな組合せをアルギニンに変えた変異型アプタマー−ｈｅｃｔ融合体は、抗ＴｒｘＡ抗血清により検出可能なタンパク質をもたらした（データは示していない）。これらの観察は、アプタマー−ｈｅｃｔ融合体がそれら自身のｈｅｃｔ部分によるユビキチン化に無防備であり、続いてタンパク質加水分解されるが、きわめて低い定常状態で発現したとしてもそれらの標的をユビキチン化することができることを示唆する。
【０１３３】
最後に、ＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２をユビキチン受容体として過剰のリシンをその中に導入することによってユビキチンによるタンパク質加水分解に対して高感度にすることができるかどうかを試験した。この目的のために酵母中でＬｅｘＡとＣｄｋ２部分の間に７個のリシンを持つＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２誘導体を発現させた。このＬｅｘＡ−Ｌｙｓ７−Ｃｄｋ２標的をＴｒｘＡ−ｈｅｃｔ、８−ｈｅｃｔ、および１０Ｍ−ｈｅｃｔ修飾因子とともに共発現させ、上記のように抗ＬｅｘＡ抗体で視覚化した。図３ｄは、「固有の」ＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２標的と比較した場合、実験用標的上の追加のリシンは、高分子量のＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２誘導体の量を増加させ、かつ少なくとも１種類の新しいさらに高分子量の接合体を出現させてそのユビキチン化を改善した。しかしながらその定常状態レベルにより判定されるように、このＬｅｘＡ−Ｌｙｓ７−Ｃｄｋ２標的のユビキチン化の増大はそれを不安定化しなかった（図３ｄ）。
【０１３４】
実施例３、標的に向けられる細胞内タンパク質輸送体：
ｉｎ ｖｉｖｏでそれらのタンパク質標的の局在性を変えるために誘導アプタマーを用いる可能性を調べた。元のライブラリーベクターにおいてアプタマーをＳＶ４０核局在化配列（ＮＬＳ）と融合させた酵母中で発現させた。核局在化シグナルを欠くＬｅｘＡ融合タンパク質は酵母細胞内に均一に分布した（参考資料２６、本調査）。また、核に向けられた抗Ｃｄｋ２アプタマーが核中にＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２を集中させるかどうかを試験した。免疫蛍光実験によって示されるようにＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２は、キメラＢ１１２−ＮＬＳ−アプタマーおよびＢ１１２−ＮＬＳ−アプタマーが発現しない細胞中に均一に分布する。同様にＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２は、対照用キメラＢ１１２−ＮＬＳ−ＴｒｘＡが発現する細胞内に一様に分布する。しかしながらＢ１１２−ＮＬＳ−抗Ｃｄｋ２アプタマーが発現する細胞ではＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２が核中に集中する（図４ａ）。試験した融合体はすべて、それらのＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２標的のかなりの核局在化を引き起こした。
【０１３５】
核中のＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２の集中がアプタマーのそれらの標的との結合のどの他の局面でもなく、ペプチドアプタマーの核のトランスロケーションのせいであったことを確かめるために、ＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２をアプタマーまたはＮＬＳ−アプタマーと一緒に発現させ、ＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２が明らかに細胞核であった酵母の割合を求めた。その結果は、ＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２の核局在化が核局在化配列を含有するペプチドアプタマーの発現に左右されることを示している（図４ｂ）。最後に別のタンパク質、すなわちＳｔｅ５（参考資料７）に対比して作製されたＮＬＳ含有アプタマーを用いて、ＮＬＳ−アプタマー融合体が大部分細胞質と考えられるタンパク質（参考資料２７）の核局在化を引き起こすことができるかどうかを決定した。何もアプタマーが発現しない場合、または非核局在型アプタマーが発現した場合、ＬｅｘＡ−Ｓｔｅ５は圧倒的な細胞質の局在化を示した。しかしながらＮＬＳ−アプタマーが発現した場合、ＬｅｘＡ−Ｓｔｅ５は核中の明確な集中を示した（図４ｃ、ｄ）。
【０１３６】
実施例４、高親和性抗Ｂａｘアプタマーの生成および識別：
抗Ｃｄｋ２アプタマーについて上記で述べてものと類似の実験をアプタマー「Ｂ１６」、すなわちＮｒ１３ｔｒをもまた認識するＢａｘと相互に作用するペプチドアプタマー、すなわち同一機能のファミリーに属するタンパク質を用いて行った。
Ｂ１６アプタマーの構造は、以前に記述されたもの（参考資料１）と同様である。アプタマーＢ１６はＮＬＳおよびツーハイブリッド相互作用検定におけるリポーター遺伝子の転写活性化のためのＡｃｔ部分を担持する。
【０１３７】
前述の突然変異誘発ＰＣＲを用いて可変ドメインの突然変異誘発を行った。更なる検討のために１０個のＢ１６突然変異体を選択した。
【０１３８】
親和性と特異性のマトリックスの結果を図５、６、および７に示す。これら３つ図すべてが相互作用マトリックスを示す。餌タンパク質を発現させ、Ｌａｃ Ｚリポーター遺伝子を含有する酵母菌株は横に筋を付け、またアプタマーを発現させる酵母菌株は縦に筋を付けてある。
Ｃｄｋ２実験とは対照的に、この場合はＢａｘに対するより強い親和性および変わらない特異性、またはそれらの標的に対するずっと大きな親和性さえ有するアプタマーを生成することができた。
【０１３９】
実施例５、ペプチドアプタマーの二量体：
アプタマー二量体は、通常ならば相互に作用しない２種類のタンパク質、すなわちＣｄｋ２およびＢａｘが近接するように設計された。二量体のその標的タンパク質との高親和性結合が、ツーハイブリッド検定においてＣｄｋ２とＢａｘの間の測定可能な相互作用を引き起こす。
【０１４０】
ａ）二量体の設計
ここで例示するアプタマー二量体は、同じポリペプチド鎖内の２個のペプチドアプタマーの融合体からなる。これら２個のペプチドアプタマーは、ペプチド性リンカーによって分離されるかまたはリンカーなしに互いに直接結合するかのいずれかである（材料および方法の項、ならびに図１３〜１５を参照されたい）。下記の４つの型の介在配列をリンカーとして用いた。すなわち
【０１４１】
１、グリシン５個
２、（グリシン４個−セリン１個）×３
３、エピトープ標識ＨＡ
４、なし
【０１４２】
上記リンカー１および２はよく知られている可変性配列である。
概念を立証するためにここで用いた２種類のペプチドアプタマーは、Ｃｄｋ２およびＢａｘに対してそれぞれ選択されたアプタマー「１０Ｍ」（上記実施例１参照）および「Ｍ１０３」（材料および方法の項参照）である。これら２種類のタンパク質は相互に作用することが分かっておらず、またＢａｘはＣｄｋ２の既知の基質ではない。両アプタマーは、相互作用性アプタマーから出発するｉｎ ｖｉｖｏの進化手順により選択された。Ｃｄｋ２に対する１０Ｍの親和力が測定され（Ｋｄ＝５ｎＭ）、一方Ｂａｘに対するＭ１０３の親和力は定量化されなかったが、少なくとも１０Ｍの親和力と同じくらいすぐれているようにみえる。
８種類の二量体を構築し、それによってリンカーの組合せおよびこの２つのペプチドアプタマーの相対位置を完全にカバーした（下記の表および図１３、１４、および１５参照）。
【０１４３】
【表２】
2004516848.tif 000003
【０１４４】
ｂ）二量体の特性
ｉ）二量体結合に関する試験
二量体の特性の検討の第一段階として二量体中に含有されているアプタマーが、それらのコグネイト標的タンパク質（Ｃｄｋ２およびＢａｘ）との相互作用の性質を保存しているかどうかを決定した。これは実は求められている「強制相互作用」活性にとっての必要条件であった。
【０１４５】
この問題に取り組むためにツーハイブリッド検定を行った。二量体をクローン化してｐＬＧ４−５、すなわち「犠牲餌」の誘導発現を指示する酵母ベクターにした。これらがＣｄｋ２およびＢａｘと相互に作用できることを相互作用接合検定で試験した（図８および９）。この検定は、二量体が別々にＣｄｋ２およびＢａｘと相互に作用することを立証した。興味深いことに相互作用表現型（相互作用マトリックス中の青色のレベルによって評価される）は、相互作用性アプタマーが二量体の１位（すなわちＮ末端）に存在した場合により強く現れた（特に餌としてＢａｘを用いた場合に観察された）。現在、位置の影響の理由は明らかでない。両方のアプタマーの間の結合部における部分的なタンパク質加水分解による切断をウェスタンブロット実験によって除外した（図示されない）。
【０１４６】
それらのコグネイト餌用モノマーとして発現したアプタマーの見掛けの親和性は、どちらかの単独の餌に対する二量体の見掛けの親和性よりもわずかに高いこともまた知ることができる。この親和性の違いは単量体アプタマーと比較して二量体の発現レベルが低いことによって説明することはできない（ウェスタンブロット実験は図示されない）。
【０１４７】
ｉｉ）強制相互作用に関する試験
二量体がＣｄｋ２およびＢａｘの間の相互作用を強制する能力を有するかどうかを確証するために、餌および犠牲餌に加えて第三のタンパク質を発現させるツーハイブリッド検定の精巧なバージョンが用いられた（図１２）。
【０１４８】
これらの実験では４種類の二量体をクローン化してｐＢＣ１０４、すなわち核局在化配列と融合したタンパク質に誘導発現を指示する酵母ベクターにした。Ｃｄｋ２（およびその他の対照用タンパク質）を餌（ＬｅｘＡと融合した）および犠牲餌としてのＢａｘ（核局在化配列および活性化ドメインと融合した）として発現させた。強制相互作用活性を相互作用接合検定で試験した（図１０）。ＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２およびＡｃｔ−Ｂａｘと共発現させた場合、４種類の二量体はすべて相互作用表現型をはっきり顕在化させた。これら２種類のタンパク質は、その２種類の単量体アプタマーが存在すると相互作用表現型を示さなかった。４種類の二量体は、関係のない餌（ＬｅｘＡ−Ｍａｘ）をＡｃｔ−Ｂａｘとともに発現させた場合、いずれも相互作用表現型を誘発しなかった。
【０１４９】
ｉｉｉ）更なる実験
Ｃｄｋ２とＢａｘの間の強制相互作用を別の方法によって確かめることができる。免疫沈降実験を図１０に用いた酵母菌株を使って行う。酵母が相互作用表現型を示す場合は必ず犠牲餌の餌との共沈降（またはその逆）が可能なはずである。
さらにＣｄｋ２がＢａｘに対してそのキナーゼ活性を発揮する（推定上のＣｄｋ２リン酸化部位を分枝する）可能性があるという仮説については、ウェスタンブロット実験をまた実施して、リン酸化を暗示する可能性のある推定上の移動のより遅い形態のＢａｘを試験することができる。
【０１５０】
材料および方法：
この項は上記実施例に用いた材料および方法について詳述する。
（ａ）高親和性変異型の識別
抗Ｃｄｋ２アプタマー１０のＶ領域を、記述（参考資料１１）のように突然変異誘発ＰＣＲ実験計画に従って元のライブラリーベクターから増幅した（参考資料１）。精製した増幅産物を結合させ、Ｇａｌ１プロモーターの制御下でそれらの条件的発現を指示するＰｓｒＩＩカットライブラリーベクター、すなわちｐＪＭ−１（参考資料１）にし、その連鎖反応混合物をＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α中に導入した。プラスミドＤＮＡを１５，０００個の独立コロニーのプールから調製した。このプールを形質転換（参考資料１２）してＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２（参考資料１）およびｐＲＢ１８４０（参考資料１３）を含有するＥＧＹ４８にし、Ｕｒａ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−グルコース培養皿上で４０，０００個の形質転換細胞を得た。これらの形質転換細胞をＵｒａ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−グルコース／ＸｇａｌおよびＵｒａ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−ガラクトース／Ｘｇａｌ培養皿上でレプリカ平板培養した。３０℃で２日後、青色を示した１６個のコロニーをＵｒａ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−グルコース培養皿上に移した。これらのマスタープレートをＵｒａ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−グルコース／ＸｇａｌおよびＵｒａ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−ガラクトース／Ｘｇａｌ培養皿上でレプリカ平板培養し、最初の１６個のコロニーのうち１２個が再びガラクトースによる青色を示した。アプタマーをエンコードするプラスミドをこれら菌株から救い出し（参考資料１４）、このプラスミドをＥＧＹ４８中に再導入した。これら１２個のプラスミドのうち７個がグルコース含有培地上ではなくガラクトース含有培地上で相互作用表現型を形成した。
【０１５１】
（ｂ）融合タンパク質の構築
〔修飾因子〕： ＰＣＲによる酵母ＲＳＰ５のｈｅｃｔドメインをエンコードするＤＮＡをオリゴヌクレオチド
【化１】
2004516848.tif 000004
を用いて分離した。これらはそれぞれＸｈｏＩ部位、およびＢａｘとＳａｌＩ部位を含有する。ｐＪＧ４−４（ｈｅｃｔ）を生み出すためにこのＰＣＲ産物をサブクローニングしてＸｈｏＩカットｐＪＧ４−４にした（参考資料４２）。これはＴｒｐ１遺伝標識および２μ複製起点を含有し、Ｇａｌ１プロモーターの制御下で固有タンパク質の発現を指示する。ＴｒｘＡおよびペプチドアプタマーをオリゴヌクレオチド
【化２】
2004516848.tif 000005
を用いて増幅した。これは、それぞれＥｃｏＲＩ部位とその後に続くＫｏｚａｋコンテキスト中の開始コドン、およびＸｈｏＩ部位を含有する。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩカットｐＪＧ４−４（ｈｅｃｔ）中に挿入した。ｈｅｃｔドメインのみを発現させるために５′オリゴヌクレオチド
【化３】
2004516848.tif 000006
を用いた。これは、ＲＳＰ５由来のｈｅｃｔドメインをＰＣＲするために上記３′オリゴヌクレオチドとともにＥｃｏＲＩ部位およびＫｏｚａｋコンテキスト中に開始コドンを含有する。このフラグメントをＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩカットｐＪＧ４−４中に導入した。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から得たＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒキットを使用し、その製造業者の手引書に従って突然変異オリゴヌクレオチド
【化４】
2004516848.tif 000007
を用いて突然変異体ｈｅｃｔドメインを構築し、ｈｅｃｔ活性部位のシステインをアラニンに変え、また選択オリゴヌクレオチド
【化５】
2004516848.tif 000008
を用いてベクター上のＸｈｏＩ部位をＡｖｒＩＩ部位に変えた。
【０１５２】
Ｍｙｃで標識したユビキチンに関する実験の場合、修飾因子を別のベクターから発現させた。この目的のために本発明者等はオリゴヌクレオチド
【化６】
2004516848.tif 000009
を用いて上記の５−ｈｅｃｔ、８−ｈｅｃｔ、および１０Ｍ−ｈｅｃｔ融合体を増幅した。
この増幅産物をＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩカットｐＢ１０３、すなわちＵｒａ３遺伝標識、２μ複製起点、およびＧＡＬ１プロモーターを保持するプラスミド中に導入した。
【０１５３】
〔Ｍｙｃ−ユビキチン〕：Ｙｅｐ１０５はＴｒｐ１遺伝標識および２μ複製起点を含有し、銅誘発性ＣＵＰ１プロモーターの制御下においてＭｙｃで標識した合成酵母ユビキチン遺伝子の発現を指示する（参考資料１５）。
〔ＬｅｘＡ−７Ｌｙｓ−Ｃｄｋ２〕：出発には餌プラスミドをエンコードするＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２（参考資料１）を用いた。オリゴヌクレオチド
【化７】
2004516848.tif 000010
をアニールすることによって、リシン７個の領域をエンコードするＤＮＡを構築し、このジュプレックスを餌プラスミドのＥｃｏＲＩ部位中に導入した。この連鎖反応混合物をＥｃｏＲＩで処理し、それをＥ． Ｃｏｌｉ ＸＬ−１ブルー中に導入し、その挿入断片を含有するプラスミドを載せた細胞をＰＣＲによって識別した。
【０１５４】
〔輸送体〕：ＴｒｘＡおよび抗Ｃｄｋ２ペプチドアプタマーを「修飾因子」で述べたと同様に増幅した。そのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩカットｐＢ１０３（前述）およびｐＢＣ１０４中に導入した。これもまたＵｒａ３遺伝標識、２μ複製起点、およびＧＡＬ１プロモーター、およびそれぞれＮＬＳアプタマーの合成を指示するものを保持する。ｐＪＭ−Ｃ６、ｐＪＭ−Ｃ７、ｐＪＭ−Ｎ２、およびｐＪＭ−Ｎ３、すなわち非ＮＬＳで標識した、またＮＬＳで標識した抗Ｓｔｅ５アプタマーの合成を指示するプラスミドについては別の場所で記述されている（参考資料７）。
【０１５５】
（ｃ）酵母の操作
犠牲餌用のＥＧＹ４８菌株と、餌およびリポータープラスミド用のＥＧＹ４２（参考資料１７）とを用いて記述（参考資料１６）に従って相互作用接合検定を行った。図１ａではプラスミドｐＳＨ１８−３４、ｐＪＫ１０３、およびｐＲＢ１８４０（それぞれＧａｌ１−ｌａｃＺ融合遺伝子の上流にＬｅｘＡオペレーターを８個、２個、および１個を保持する）を、図１ｃではｐＳＨ１８−３４から誘導されたＬｅｘＡｏｐ−ＧＦＰリポーター（Ｄｉｓｐｌａｙ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）を、また図２ではｐＳＨ１８−３４を用いた。
【０１５６】
ＬｅｘＡｏｐ−ＧＦＰリポーター遺伝子を有する相互作用表現型を測定するために、Ｕｒａ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐガラクトース液状培地中で液状培養物を二倍体の外接合体から夜通し成長させた。２個のアルゴンレーザーを４８８ｎｍおよび多線ＵＶに設定した状態で照らされるＦＡＣＳｔａｒ ｐｌｕｓ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて蛍光を測定した。記録は、酵母の蛍光を測定するために５３０±１５ｎｍフィルターで行った。相互作用表現型を示さなかった酵母を用いてＦＬ３−２電圧（バックグラウンド）を設定した。各相互作用について３０，０００個の細胞を分析し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアパッケージ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてバックグラウンドを上回る酵母集団の平均の蛍光を求めた。
【０１５７】
修飾因子検定を行うために、標的およびアプタマー−ｈｅｃｔ融合体のさまざまな組合せを用いてＥＧＹ４８酵母菌株を形質転換した（参考資料１２）。形質転換細胞をＨｉｓ−Ｔｒｐ−グルコース培養皿上で培養し、次いでコロニーを４ｍｌのＨｉｓ−Ｔｒｐ−ガラクトース培地中で夜通し成長させた。Ｍｙｃ−ユビキチンに関する実験の場合、ＥＧＹ４８をアプタマー−ｈｅｃｔ融合体およびＹｅｐ１０５で形質転換し、またＥＧＹ４２をＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２およびｐＳＨ１８−３４で形質転換した。得られた菌株を接合し、二倍体の外接合体をＵｒａ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕグルコース培地上で選択した。液状培養物を、１００μＭ ＣｕＳＯ４の添加または非添加Ｕｒａ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕガラクトース液状培地に接種した。
【０１５８】
ウェスタン分析（下記）については等量の酵母を対数増殖期にペレット化し、ペレット化した酵母を１Ｍソルビトール、０．５Ｍクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＤＴＴ、１Ｍリン酸カリウム、および０．１Ｍ ＰＭＳＦからなる溶液５０□ｌに溶かしたザイモリアーゼ（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ Ｌｔｄ．）１ｍｇ／ｍｌで３０℃において１時間処理し、ＳＤＳ ＰＡＧＥ試料用緩衝液で溶解した。
【０１５９】
（ｄ）免疫検定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いてウェスタンブロットを、記述（参考資料１８）に従ってウサギの抗ＬｅｘＡ血清（参考資料１９）、またはアルカリ性ホスファターゼと結合させたウサギの抗ＴｒｘＡ血清（参考資料２０）、および基質としてＮＢＴとＢＣＩＰを用いて行った。そのブロットを光学スキャナーで走査した。Ｍｙｃ−ユビキチン実験についてはＥＣＦ基質（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用し、ブロットをリン酸画像装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）で走査した。免疫蛍光についてはガラクトース中で３時間成長させることによってアプタマーの発現を誘発し、その細胞を培地にホルムアルデヒドを９０分間加える（最終濃度３．７％）ことによって固定した。試料を多クローン性ウサギ抗ＬｅｘＡ抗体（ＵＢＩ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）でプローブし、続いてテキサスレッド接合またはフルオレセイン接合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， ＰＡ）を基本的には記述（参考資料２０）に従って親和精製した。
【０１６０】
（ｅ）アプタマー二量体の構築
下記のＰＣＲ反応はすべて、鋳型としてＣｄｋ２アプタマー１０ＭまたはＢａｘアプタマーＢ１６ｍ１０３（本明細書ではまたＭ１０３とも呼ぶ）のコード配列を含有するアプタマーライブラリープラスミドｐＪＭ−１を用いて高い忠実度のＶｅｎｔポリメラーゼにより行った。
【０１６１】
〔高親和性ＢａｘアプタマーＢ１６ｍ１０３の選択〕：親のＢａｘアプタマーＢ１６の選択については実施例４に記載されている。 アプタマーＢ１６は以前の記述（参考資料１）のようにチオレドキシンの台中に示されるアミノ酸２０個の可変領域を含む。Ｂ１６の可変領域はアミノ酸配列
【化８】
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を有する。突然変異誘発ＰＣＲをＣｄｋ２アプタマーに関する記述と同様にＢ１６の可変領域上で行った。得られた突然変異体の中でアプタマーＢ１６ｍ１０３をＢａｘに対する高親和性および高選択性に基づいて選択した（図５、６、および７）。抗ＢａｘアプタマーＢ１６Ｍ１０３（また「Ｍ１０３」とも呼ばれる）は、以前の記述（参考資料１）のようにチオレドキシンの台中に組み込まれた下記に示すアミノ酸配列を有する可変領域を含む。
【化９】
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〔リンカーのない二量体の調製〕：１位に定められたアプタマーをエンコードするＤＮＡを、オリゴヌクレオチドｏｌＨＡａｐｔｓｅｎｓおよびｏｌＴｒｘｅｎｄ１を用いてＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩで消化した。２位に定められたアプタマーをエンコードするＤＮＡを、オリゴヌクレオチドｏｌＮｏｌｉｎｋおよびｏｌＴｒｘｅｎｄ２を用いてＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ産物をＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで消化した。犠牲餌ベクターｐＪＧ４−５（参考資料１７）をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、消化された両方のＰＣＲ産物と混ぜた。１ステップ連鎖反応を行った（図１５参照）。
【０１６２】
〔ＨＡリンカーを有する二量体〕：１位に定められてたアプタマーをエンコードするＤＮＡを、オリゴヌクレオチドｏｌＨＡａｐｔｓｅｎｓおよびｏｌＴｒｘｅｎｄ１を用いてＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩで消化した。２位に定められたアプタマーをエンコードするＤＮＡを、オリゴヌクレオチドｏｌＮｏｌｉｎｋＨＡおよびｏｌＴｒｘｅｎｄ２を用いてＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ産物をＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで消化した。消化された両方のＰＣＲ産物をｐＪＧ４−５中へ組み込む連鎖反応を上記の記述と同様に行った（図１４参照）。
【０１６３】
〔５Ｇｌｙまたは（４ Ｇｌｙ−１Ｓｅｒ）×３リンカーを有する二量体〕：上記の記述と同様に１位に定められたアプタマーをエンコードするＤＮＡを得た。２位に定められてたアプタマーをエンコードするＤＮＡを、オリゴヌクレオチドｏｌＡｐｔ２およびｏｌＴｒｘｅｎｄ２を用いてＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化した。５ＧｌｙリンカーをエンコードするＤＮＡを、オリゴヌクレオチドｏｌＰｏｌｙ５ＧｌｙとｏｌＰｏｌｙ５Ｇｌｙｒｅｖのハイブリッドを形成することによって得た。（４ Ｇｌｙ−１Ｓｅｒ）×３リンカーをエンコードするＤＮＡを、オリゴヌクレオチドｏｌＧｌｙ４ＳｅｒとｏｌＧｌｙ４Ｓｅｒｒｅｖのハイブリッドを形成することによって得た。得られたジュプレックスは、それらの５′末端にＮｈｅＩ付着末端、またそれらの３′末端にＮｃｏＩ付着末端を含有する。ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩカットｐＪＧ４−５、消化された両方のＰＣＲ産物、およびリンカーをエンコードするどちらか一方のジュプレックスの１ステップ連鎖反応を行った（図１３参照）。
【０１６４】
【化１０】
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〔アプタマー二量体の相互作用接合検定〕：
ｉ）結合測定法：図８および９に示した相互作用接合検定の実験手順は、上記「酵母の操作」中に記述されている。二量体を含有するすべての実験（図８、９、および１０）において使用したリポータープラスミドはｐＳＨ１８−３４Ｔである。このプラスミドは、ｌａｃＺメッセンジャーを安定化するためにＡＤＨターミネーターがｌａｃＺ遺伝子の後ろに位置しているｐＳＨ１８−３４である。したがってｐＳＨ１８−３４Ｔは、ｐＳＨ１８−３４よりもっと感受性の強いリポータープラスミドである。
【０１６５】
ｉｉ）強制相互作用検定：上記アプタマー二量体プラスミドはすべて（ＨＡリンカーを含有するものを除いて）ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化され、連結反応してＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩカットｐＢＣ１０４にした。ＨＡリンカーを含有するこの２種類の二量体は、それらをｐＪＧ４−５に組み込むのと同じやり方でｐＢＣ１０４に組み込んだ（上記参照）。１０ＭおよびＢ１６ｍ１０３アプタマーをエンコードするＤＮＡは、「修飾因子」中で述べたと同様にＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、連結反応してＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩカットｐＢＣ１０４にした。
【０１６６】
ＥＧＹ４２菌株を餌プラスミドおよびｐＳＨ１８−３４Ｔリポータープラスミドで形質転換した。この菌株をＢａｘ犠牲餌プラスミドおよびさまざまなｐＢＣ１０４構築物で形質転換した。相互作用接合検定は記述（参考資料１６）に従って行った。
【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
その標的に対して高い親和力を有する突然変異体アプタマーを示す図であって、
（ａ）は３種類の異なる感度のＬｅｘＡｏｐ−ＬａｃＺリポーターを用いたＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２と、アプタマー１０、アプタマー１０Ｍ を担持する２種類の菌株、および非相互作用性アプタマーＣ４との間の相互作用接合検定を示す図であり、
（ｂ）は抗ＴｒｘＡ抗体を用いたウェスタンブロット検定（二倍体の外接合体をガラクトース含有培地中で増殖し、タンパク質を抽出し、抗ＴｒｘＡ抗体を用いたウェスタンブロット分析にかけた）を示す図であり、
（ｃ）は減衰波実験で測定したＫｄｓと対照させてプロットしたＬｅｘＡｏｐ−ＧＦＰリポーター由来の蛍光（蛍光値は任意の単位（ａ．ｕ．））によって求められる相互作用表現型の強さを示す図であり、
（ｄ）はアプタマー１０および１０Ｍの可変領域の配列を示す図である。
【図２】
元のアプタマーによって境界が定められるＣｄｋ２上のマッピング部位およびアプタマー１０Ｍのマッピング部位を示す図である。別の場所（参考資料３）に記述されているＣｄｋ２突然変異体の餌タンパク質、Ｃｄｋ３、およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｃｄｃ２とＣｄｃ２ｃ（参考資料１６）を集めてある。この実験においてはＴｒｘＡ、初めに選択した１４種類の異なるアプタマー（参考資料１）、およびアプタマー１０Ｍを犠牲餌として発現させた。酵母を接合させて相互作用マトリックスを作成した（参考資料１６）。
【図３】
ＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２を標的とするアプタマー−ｈｅｃｔ融合体によるユビキチン化を示す図であって、
（ａ）はユビキチンリガーゼを含有するｈｅｃｔドメインの構造によって触発される「修飾因子」の設計を示す図であり、
（ｂ）はそれぞれ抗ＬｅｘＡおよび抗ＴｒｘＡ を用いた、ＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２（上側のパネル）およびＴｒｘＡ−ＬｅｘＡ（下側のパネル）のウェスタンブロット分析を示す図であり、
（ｃ）はＣｕＳＯ４を含有するまたは含有しない培地、およびＭｙｃで標識したユビキチンを発現するまたは発現しない培地中で夜通し増殖することによってアプタマー−ｈｅｃｔ融合体を発現させた場合のＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２のウェスタン分析を示す図であり、
（ｄ）は抗ＬｅｘＡ 抗体を用いてＴｒｘＡ−ｈｅｃｔ融合体、８−ｈｅｃｔ融合体、および１０Ｍ−ｈｅｃｔ融合体を発現させた場合のＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２およびＬｅｘＡ−７Ｌｙｓ−Ｃｄｋ２のウェスタンブロット分析を示す図である。
【図４】
ＮＬＳ−アプタマー誘導体を相互に作用させることによるＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２およびＬｅｘＡ−Ｓｔｅ５の核転位を示す図であって、
（ａ）は酵母の顕微鏡写真（左側のパネルは抗ＬｅｘＡ抗体を用いたＬｅｘＡ−Ｃｄｋ２タンパク質の間接免疫蛍光法、右側のパネルはＤＡＰＩを用いたＤＮＡ染色法によるものであり、Ｇａｌ／ ＴｒｘＡではＴｒｘＡが発現しており、Ｇａｌ／ＡｐｔＣ４では制御アプタマーＣ４が発現しており、Ｇａｌ／Ａｐｔ１４では抗Ｃｄｋ２アプタマー１４が発現している）であり、
（ｂ）は核に向けられたアプタマーの存在下または不在下においてはっきりした核の免疫蛍光を示す酵母の割合を示す図（黒の棒線は核と細胞質の染色、白の棒線は核の染色を表し、各検定に対して少なくとも５０個の細胞を観察した）である。
（ｃ）は酵母の顕微鏡写真であり（左側のパネルは抗ＬｅｘＡ抗体を用いたＬｅｘＡ−Ｓｔｅ５融合タンパク質の間接免疫蛍光法によるものであり、中央のパネルはＤＡＰＩを用いたＤＮＡ染色法によるものであり、右側のパネルはノマルスキー型光学器械を用いて観察されたものであって、Ｇａｌ／ＡｐｔＣ６では非ＮＬＳアプタマーＣ６が発現しており、Ｇｌｕ／Ｃ６では非ＮＬＳアプタマーＣ６が発現せず、Ｇａｌ／ＡｐｔＮ２ではＮＬＳアプタマーＮ２が発現しており、Ｇｌｕ／Ｎ１ではＮＬＳアプタマーＮ２が発現しない）、
（ｄ）は核に向けられたまたは向けられないさまざまなアプタマーの存在下において細胞質＋核または純粋な細胞質の染色を示す酵母の割合を示す図である（黒の棒線は細胞質の染色、また白の棒線は細胞質と核の染色を表し、各検定に対して少なくとも１００個の細胞を観察した）。
【図５】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで進化したアプタマーの親和性を示す図である。このマトリックスは親のアプタマー（Ｂ１６）と比較した１０個の突然変異体の改良された親和性を示しており、左側にはこれらを発現させるために用いた餌タンパク質およびプロモーターが示され、右側にはｌａｃＺリポーター遺伝子が示される。ガラクトース培地上のＡＤＨおよびＧＡＬプロモーターのそれぞれの強度を考慮して、２Ｈ検定の感度は最小から最大の感度模様まで下記のように位置づけることができる。
ＡＤＨｐ／１ｏｐ
ＧＡＬｐ／１ｏｐ
ＧＡＬｐ／８ｏｐ
このマトリックスは、すべての突然変異体がＢ１６よりもしっかりＢａｘと結合することをはっきり示している。また、いくつかの突然変異体はＮｒ１３とよりしっかり結合するが、その他は少なくとも検出可能なレベルではもはやＮｒ１３と結合しないことを示している。
【図６】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで進化したアプタマーの特異性を示す図である。図７は、図５でなされた観察を裏付ける。どの突然変異体アプタマーも検出可能なレベルでは親のアプタマーと同様、Ｂａｘ以外に抗アポトーシス性タンパク質（Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘ１など）と結合しない。図６は、プロアポトーシス性タンパク質（Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｏｋなど）を示す。たとえすべてではないとしても大部分の突然変異体が親のアプタマーと同様、これらのタンパク質のいずれとも結合しないことを知ることができる。餌タンパク質として発現したＢｏｋはそれ自体がレポーター遺伝子の転写を活性化するのではっきり決めることはできないが、２つの突然変異体はＢｏｋと結合する能力を獲得した可能性がある。
【図７】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで進化したアプタマーの特異性を示す図である。図７は、図５でなされた観察を裏付ける。どの突然変異体アプタマーも検出可能なレベルでは親のアプタマーと同様、Ｂａｘ以外に抗アポトーシス性タンパク質（Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘ１など）と結合しない。図６は、プロアポトーシス性タンパク質（Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｏｋなど）を示す。たとえすべてではないとしても大部分の突然変異体が親のアプタマーと同様、これらのタンパク質のいずれとも結合しないことを知ることができる。餌タンパク質として発現したＢｏｋはそれ自体がレポーター遺伝子の転写を活性化するのではっきり決めることはできないが、２つの突然変異体はＢｏｋと結合する能力を獲得した可能性がある。
【図８】
抗Ｃｄｋ２（１０Ｍ）および抗Ｂａｘアプタマー（Ｍ１０３）からなるアプタマー二量体の標的タンパク質Ｃｄｋ２およびＢａｘとの結合を検出するためのツーハイブリッド相互作用接合検定を示す図であって、図８は、５Ｇｌｙおよび（４Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｘリンカーを持つ二量体を用いて得られたマトリックスを示す図であり、また図９は、ＨＡを持つかまたはリンカーのない二量体を用いて得られたマトリックスを示す図である（ＤＮＡ結合ドメインＬｅｘＡと融合した餌を横書きで、また転写活性化因子Ａｃｔと融合したアプタマーの犠牲餌を縦書きで示し、培地の組成は左右のパネルの下に示す）。
【図９】
抗Ｃｄｋ２（１０Ｍ）および抗Ｂａｘアプタマー（Ｍ１０３）からなるアプタマー二量体の標的タンパク質Ｃｄｋ２およびＢａｘとの結合を検出するためのツーハイブリッド相互作用接合検定を示す図であって、図８は、５Ｇｌｙおよび（４Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｘリンカーを持つ二量体を用いて得られたマトリックスを示す図であり、また図９は、ＨＡを持つかまたはリンカーのない二量体を用いて得られたマトリックスを示す図である（ＤＮＡ結合ドメインＬｅｘＡと融合した餌を横書きで、また転写活性化因子Ａｃｔと融合したアプタマーの犠牲餌を縦書きで示し、培地の組成は左右のパネルの下に示す）。
【図１０】
アプタマー二量体によって誘発された標的分子間の強制相互作用を検出するための３成分系を用いた相互作用検定を示す図である。ＤＮＡ結合ドメインＬｅｘＡと融合した餌を横書きで示す。犠牲餌タンパク質は転写活性化因子Ａｃｔと融合したＢａｘからなる（縦に筋を付けたすべての菌株で発現した）。餌と犠牲餌の間の仲立ちとして作用することができるアプタマー二量体をパネルの上部に横書きで示す。培地の組成は左右のパネルの下に示す。餌と犠牲餌の間の相互作用の証拠を提供するリポーター遺伝子の転写は黒く染めた酵母として示される。
【図１１】
二量体結合に関するツーハイブリッド検定（図８および９に示す）の概略図である。アプタマーの犠牲餌を転写活性化因子Ａｃｔと融合させる。餌は、ＤＮＡ結合ドメインＬｅｘＡと融合したＢａｘ（図１１Ａおよび１１Ｂ）またはＣｄｋ２（図１１Ｃおよび１１Ｄ）のいずれかを含む。４つのパネルＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、二量体内の抗Ｂａｘ（１０３Ｍ）または抗Ｃｄｋ２（１０Ｍ）アプタマーの位置に応じて異なる起こりうる構成を表す。
【図１２】
アプタマー二量体によって引き起こされる２種類の標的タンパク質Ｃｄｋ２とＢａｘの間の強制相互作用（図１０に示す）に関するツーハイブリッド検定の概略図である。パネルＡおよびＢは、Ｃｄｋ２（パネルＡ）に対して、またはＢａｘ（パネルＢ）に対して単量体アプタマーが用いられる場合、強制相互作用がないことを示す。パネルＣは、アプタマー二量体Ｍ１０３−１０Ｍによって引き起こされるＣｄｋ２ とＢａｘの間の強制相互作用を示す。
【図１３】
アプタマー二量体の構造を示す図であって、
図１３は５−グリシンおよび（４−グリシン、１−セリン）Ｘ３型のリンカーを示す図であり、
【図１４】
図１４はＨＡ型のリンカーを示す図であり、
【図１５】
図１５は介在リンカー分子のない単量体アプタマーの直接融合を示す図である。
【図１６】
本発明によるアプタマーへテロ二量体（パネルＡ）およびホモ二量体（パネルＢ）の概略図である。Ａは二重特異性アプタマー二量体を示す。大きな円として示される表示用の台と小さな円として示される可変領域とを含むアプタマーＲ１は第一のタンパク質上のエピトープを特異的に認識し、またアプタマーＲ２は第二のタンパク質上のエピトープを特異的に認識する。またＢは単一特異性のモノパラトープアプタマー二量体を示す。アプタマーＲ１は第一のタンパク質１上のエピトープを特異的に認識し、アプタマーＲ２はアプタマーＲ１と同一である。したがって二量体アプタマーは、２つの飛び飛びのタンパク質１の標的分子を特異的に認識する能力を有する。二本線はアプタマー間の共有結合を表し、両方向を指し示す矢印はアプタマー二量体によって生じる標的分子１と２の間の相互作用を表す。
【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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