(57)【要約】本発明は、細胞の接着、伸張、および剥離活性を示すペプチドおよびその誘導体に関する。特に、本発明は、機能的細胞受容体としてのα３β１インテグリンとの相互作用を通して細胞接着活性を促進し、細胞の接着および剥離活性にとって必須であるアスパラギン酸およびイソロイシンを含むペプチドＮＫＤＩＬおよびＥＰＤＩＭならびにその誘導体に関する。本発明におけるペプチドおよびその誘導体は、βｉｇ−ｈ３を含む様々な細胞外マトリクス蛋白質を通して媒介される細胞接着活性、創傷治癒、組織再生および転移の阻害に関する研究を行うために用いることができる。
2004511427.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＸＸＤＩＸによって示されるアミノ酸配列を含む、細胞接着、伸張、および剥離活性を有するペプチドおよびその誘導体。
【請求項２】
ペプチドおよびその誘導体が、アスパラギン酸およびイソロイシンを保存配列として含む、ＸＸＤＩＸによって示される、少なくとも５個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する、請求項１記載のペプチドおよびその誘導体。
【請求項３】
アミノ酸配列が配列番号：２のＮＫＤＩＬによって表される、請求項２記載のペプチドおよびその誘導体。
【請求項４】
アミノ酸配列が配列番号：３のＥＰＤＩＭによって表される、請求項２記載のペプチドおよびその誘導体。
【請求項５】
ペプチドおよびその誘導体がα３β１インテグリンを通して細胞接着および伸張活性を媒介する、請求項１記載のペプチドおよびその誘導体。
【請求項６】
ペプチドおよびその誘導体が、βｉｇ−ｈ３、フィブロネクチン、またはラミニンに対する細胞接着に対して阻害活性を示す、請求項１記載のペプチドおよびその誘導体。
【請求項７】
請求項１記載のペプチドまたはその誘導体を薬学的活性成分として含む、薬学的組成物。
【請求項８】
薬学的組成物が、生体材料および組織インプラントの生体界面を改善して、創傷治癒、組織再生、または癌転移抵抗性に関して治療的に有効である、請求項７記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細胞接着、伸張、および剥離活性を示すペプチドおよびその誘導体に関する。特に、本発明は、機能的細胞受容体としてのα３β１インテグリンとの相互作用を通して細胞接着活性を促進し、細胞の接着および剥離活性にとって必須であるアスパラギン酸およびイソロイシンを含む、ペプチドＮＫＤＩＬおよびＥＰＤＩＭならびにその誘導体に関する。
【０００２】
発明の背景
βｉｇ−ｈ３は、活性なＴＧＦ−βによるシグナル伝達の後に、その発現がヒト黒色腫細胞、哺乳類の上皮細胞、ケラチノサイト、および肺の繊維芽細胞を含む様々な細胞株において誘導される細胞外マトリクス蛋白質である。βｉｇ−ｈ３遺伝子は、ＴＧＦ−βによって処置されたヒト肺腺癌細胞株から作製されたｃＤＮＡライブラリのディファレンシャルハイブリダイゼーションスクリーニングによって初めて単離された。βｉｇ−ｈ３遺伝子は、種間で高度に保存されているアミノ酸６８３個の蛋白質をコードする。これは、Ｎ−末端の分泌型シグナルペプチドおよびＣ−末端にアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）モチーフを含む。細胞接着を調節するＲＧＤモチーフは、多くの細胞外マトリクス蛋白質において認められ、いくつかのインテグリンのリガンド認識配列として作用する。
【０００３】
βｉｇ−ｈ３遺伝子の発現は、様々な細胞株においてＴＧＦ−βによって増加し、その遺伝子は、その増殖速度がＴＧＦ−βによって制御される様々な細胞株において誘導されることから、βｉｇ−ｈ３は、ＴＧＦ−βのいくつかのシグナル伝達経路の媒介に関与すると考えられている。対照的に、βｉｇ−ｈ３の発現は、メロレオストーシスの局所的な骨化過剰症を有する皮膚病変から培養した繊維芽細胞、いくつかの腫瘍細胞、およびデキサメタゾン処置幹細胞において減少していることが報告されている。したがって、βｉｇ−ｈ３は、様々な組織において、形態形成および細胞と他の細胞外マトリクス蛋白質との相互作用において重要な役割を果たしている。
【０００４】
さらに、βｉｇ−ｈ３は、細胞の接着および剥離を媒介して、細胞接着分子として作用することが知られている。精製βｉｇ−ｈ３蛋白質は、皮膚線維芽細胞の接着および伸張を促進するが、血清不含培地においてＡ５４９、ＨｅＬａ、およびＷｉ−３８細胞の接着を阻害することが判明している。特に、βｉｇ−ｈ３は、腫瘍細胞増殖およびコロニー形成に対して阻害活性を有することが知られている。実際に、βｉｇ−ｈ３は、ヌードマウスにおけるＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞の増殖を顕著に抑制すると報告された。さらに、βｉｇ−ｈ３の薬学的有効量を創傷に適用すると、細胞、特に線維芽細胞を伸張させて、創傷部位に接着させるという知見に基づく創傷治癒方法が開発された。その結果、様々な細胞株においてＴＧＦ−βによって誘導された細胞接着分子であるβｉｇ−ｈ３は、細胞の増殖、細胞の分化、創傷治癒、形態形成および細胞接着において非常に重要な役割を果たしている。
【０００５】
βｉｇ−ｈ３は、内部相同性を有するアミノ酸１４０個の反復配列４個を含む。内部反復ドメインは、哺乳類、昆虫、ウニ、植物、酵母および細菌を含む様々な種の分泌型蛋白質または膜蛋白質において認められる非常に保存された配列を有する。ペリオスチン、ファシクリンＩ、ウニのＨＬＣ−２、藻類のＣＡＭおよび放線菌のＭＰＢ７０は、保存配列を含む例である。これらの蛋白質において保存されている相同性ドメイン（以降「ｆａｓ−１」と呼ぶ）は、それぞれがアミノ酸約１０個を有するＨ１およびＨ２という二つの非常に保存された分枝を有するアミノ酸約１１０〜１４０個からなる。四つのｆａｓ−１ドメインは、βｉｇ−ｈ３、ペリオスチン、およびファシクリンＩにおいて認められ、ＨＣＬ−２には二つのｆａｓ−１ドメインが存在し、ＭＰＢ７０にはｆａｓ−１ドメインは一つだけである。蛋白質の機能は明らかに解明されていないが、それらのいくつかは、細胞接着分子として作用することが知られている。例えば、βｉｇ−ｈ３、ペリオスチン、およびファシクリンＩはそれぞれ、線維芽細胞、骨芽細胞、および神経細胞の接着を媒介することが報告されている。同様に、藻類のＣＡＭは、藻類のボルボックスの胚に存在する細胞接着分子であることが開示されている。
【０００６】
βｉｇ−ｈ３の細胞接着活性は、ヒトの皮膚線維芽細胞において初めて発見され、その後、軟骨細胞、腹腔線維芽細胞およびヒトＭＲＣ５線維芽細胞において認められた。当初、βｉｇ−ｈ３の細胞接着活性は、Ｃ−末端のＲＧＤモチーフによって媒介されると考えられていた。しかし、いくつかの研究結果から、ＲＧＤモチーフは軟骨細胞の伸張を促進するために必要でないこと、およびそのＲＧＤモチーフがカルボキシ末端のプロセシングによって欠失している成熟可溶性βｉｇ−ｈ３が細胞接着を阻害できることが明らかになり、βｉｇ−ｈ３のＲＧＤモチーフはβｉｇ−ｈ３の細胞接着活性の媒介にとって重要ではないという結論が得られた。さらに、βｉｇ−ｈ３は、インテグリンのα１β１を通して線維芽細胞の伸張を促進するが、βｉｇ−ｈ３のＲＧＤモチーフはβｉｇ−ｈ３媒介細胞伸張にとって必要ではないことが最近報告されている。さらに、βｉｇ−ｈ３の保存されたペプチドＨ１およびＨ２は、βｉｇ−ｈ３媒介細胞接着を阻害せず、保存されたペプチドはβｉｇ−ｈ３媒介細胞接着にとって有効ではない。これらの結果を併せると、βｉｇ−ｈ３の細胞接着活性にとって必須のアミノ酸は、Ｈ１およびＨ２以外の領域に存在することを示している。他の蛋白質のｆａｓ−１ドメインと共にβｉｇ−ｈ３の反復ｆａｓ−１ドメインにおける相同性に関するコンピューター解析から、Ｈ１およびＨ２ペプチドの他にいくつかの高度に保存されたアミノ酸配列が存在することが開示され、保存されたアミノ酸配列が細胞接着活性に関与する可能性を示唆している。
【０００７】
発明の概要
本発明者らによって行われた細胞接着と細胞剥離活性に関与する保存されたモチーフに関する集中的な徹底した研究によって、βｉｇ−ｈ３の第二と第四のｆａｓ−１ドメインのそれぞれにおけるＨ２領域近傍の位置のアスパラギン酸とイソロイシンとが非常に高度に保存され、α３β１インテグリンを通して細胞接着を媒介するための機能的に必須の単位として同定される、という知見が得られ、それが本発明に至った。
【０００８】
したがって、細胞接着、伸張、および剥離活性にとって必須の保存されたアミノ酸配列を含むペプチドおよびその誘導体を提供することが本発明の目的である。
【０００９】
本発明のもう一つの目的は、創傷治癒、組織再生および癌の転移抵抗性において用いられる薬学的組成物を提供することである。
【００１０】
本発明の一つの態様に従って、以下の一文字コード：ＸＸＤＩＸによって表されるアミノ酸配列およびその誘導体を含む、細胞接着、伸張、および剥離活性を有するペプチドが提供され、式中Ｘは一般的なアミノ酸２０個のいずれかであり、Ｄはアスパラギン酸、およびＩはイソロイシンを表す。
【００１１】
本発明のもう一つの局面に従って、上記のペプチドまたはその誘導体を薬学的活性成分として含む薬学的組成物が提供される。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明において、第四のｆａｓ−１ドメインを含むβｉｇ−ｈ３のみならず、第二または第四のドメインのいずれか単独でも細胞接着活性を媒介することができるという知見に基づいて、細胞接着活性を媒介することが知られているβｉｇ−ｈ３のアミノ酸配列を用いて、細胞接着および伸張活性に対して必須である保存された配列を含むペプチドを調製する。
【００１３】
より詳細に説明すると、βｉｇ−ｈ３遺伝子の異なる四つの切断型ＤＮＡ断片、すなわち、第一から第四の内部反復ドメインをそれぞれコードするβｉｇ−ｈ３ Ｄ−Ｉ、βｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＩ、βｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＩＩ、およびβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶを、図１ａに示すように合成した。得られた四つの組換え蛋白質の細胞接着および伸張活性を示す定量的測定を行うと、図２に示すように、四つのｆａｓ−１ドメインの第二または第四のいずれかのみが、βｉｇ−ｈ３の細胞接着および伸張活性を媒介できることが示され、このことは細胞接着と伸張の媒介にとって必須であるアミノ酸が二つのドメインに存在することを示している。対照的に、βｉｇ−ｈ３の第一のドメインは、中間的な細胞接着および伸張活性を示すが、第三のドメインには細胞接着活性を認めない。
【００１４】
同様に、本発明に従って、α３β１インテグリンは、βｉｇ−ｈ３の第二および第四のドメインの機能的受容体であることが同定される。
【００１５】
そのそれぞれが細胞接着、伸張および剥離活性を示すβｉｇ−ｈ３の第二および第四のドメインを含む切断型蛋白質を用いて、本発明者らは、βｉｇ−ｈ３の受容体を調べた。第二および第四のｆａｓ−１ドメイン媒介細胞接着活性は、図３に示すように、α３およびβ１インテグリンサブユニットに対する抗体によってほぼ完全に抑制された。これらの結果は、第二および第四のｆａｓ−１ドメインはいずれも機能的受容体であるα３β１インテグリンに結合して、細胞接着活性を媒介し、細胞接着活性を媒介するために必須であるアミノ酸を有することを意味する。
【００１６】
本発明はまた、βｉｇ−ｈ３の細胞接着、伸張および剥離活性にとって必須である特徴的な保存されたアミノ酸配列、アスパラギン−イソロイシンを含み、このように第二および第四のドメインと同じ活性を示すペプチドを提供する。
【００１７】
βｉｇ−ｈ３の第二および第四のｆａｓ−１ドメインにおいて、細胞接着、伸張および剥離活性を独立して示す細胞接着に関与するアミノ酸配列を見つけだすために、βｉｇ−ｈ３の内部反復ｆａｓ−１ドメインのみならず、ｆａｓ−１ドメインを含む他の蛋白質においてもアミノ酸配列のアライメントを行った。その後、本発明者らは、Ｈ２領域付近の二つのアミノ酸、すなわちアスパラギン酸とイソロイシンが、図４に示されるように、様々な蛋白質のあいだで高度に保存されていることを発見した。
【００１８】
次に、細胞接着活性にとってアミノ酸配列アスパラギン酸およびイソロイシンが不可欠であることをなお確認しなければならない。この点において、βｉｇ−ｈ３の第四のｆａｓ−１ドメインを含む切断型蛋白質を、図５ａに示すように、プロリン、アスパラギン酸およびイソロイシンをそれぞれ、セリン、アラニンおよびセリンに置換することによって変異させた。アスパラギン酸とイソロイシンが置換された変異型蛋白質において、第四のｆａｓ−１ドメイン媒介細胞接着活性のほぼ完全な抑制が認められ、アミノ酸配列アスパラギン酸とイソロイシンがβｉｇ−ｈ３の細胞接着活性の媒介において非常に重要であることを確認する。
【００１９】
さらに、アスパラギン酸とイソロイシンはいずれも、高い細胞接着活性を有するβｉｇ−ｈ３の第二および第四のｆａｓ−１ドメインにおいて保存されているが、中間的な細胞接着活性を示す第一のｆａｓ−１ドメイン１ではアスパラギン酸のみが保存されている。細胞接着活性を示さない第三のｆａｓ−１ドメインに関して、これは二つのアミノ酸をいずれも有しない。それらの事実は、アスパラギン酸とイソロイシンが細胞の接着と伸張活性の媒介に必須であることを示すさらなる証拠である。
【００２０】
細胞接着活性に関してアスパラギン酸とイソロイシンが不可欠であることを確認した後、βｉｇ−ｈ３のｆａｓ−１ドメインＩ、ＩＩ、およびＩＶから、二つのアミノ酸を含む三つのペプチドをそれぞれ合成した。これらのペプチドは、βｉｇ−ｈ３のｆａｓ−１ドメインＩ、ＩＩおよびＩＶの保存された配列を有する。すなわち、図７に示すように、配列番号：１のＫＡＤＨＨ（アミノ酸２１９〜２２３位）、配列番号：２のＮＫＤＩＬ（アミノ酸３５４〜３５８位）、および配列番号：３のＥＰＤＩＭ（アミノ酸６１５〜６１９位）を有するように、ペプチドをデザインする。
【００２１】
当然のこととして、βｉｇ−ｈ３のｆａｓ−１ドメインに由来するこれらの合成ペプチドを、細胞接着および剥離活性に関して調べた。第二のｆａｓ−１ドメイン由来合成ペプチドＮＫＤＩＬおよび第四のｆａｓ−１ドメイン由来合成ペプチドＥＰＤＩＭは、図８ａに認められるように、細胞接着活性の有意な抑制を示して非常に優れた細胞剥離作用を示すことが測定された。一方、第一のｆａｓ−１ドメイン由来合成ペプチドＫＡＤＨＨでは、細胞接着のその弱い抑制のために、比較的非常に低い細胞剥離作用を認め、対照ペプチドＤＥＭＰＩは細胞接着活性がないために、細胞剥離活性を示すことができなかった。基質として第二および第四のｆａｓ−１ドメインを用いた場合に得られた細胞接着活性に対する抑制作用は、図８ｂに示すように、基質としてβｉｇ−ｈ３を用いた場合に得られた作用とほぼ同じであった。
【００２２】
図９ａに示すように、合成ペプチドＮＫＤＩＬおよびＥＰＤＩＭは、細胞接着を用量依存的に媒介することができる。その上、βｉｇ−ｈ３の表面受容体として知られているα３β１インテグリンは、図９ｂに認められるように、合成ペプチドＥＰＤＩＭおよびＮＫＤＩＬ媒介細胞接着の受容体として作用することが判明した。これらの理由から、ＮＫＤＩＬおよびＥＰＤＩＭは、図１０ａに示すように、α３β１相互作用分子と特異的に競合するように思われた。
【００２３】
本発明において、上記のように、細胞の接着および剥離活性にとって必須であって、βｉｇ−ｈ３の機能的受容体であるα３β１インテグリンを通しての細胞接着を誘導するために十分である、アスパラギン酸およびイソロイシンを含むペプチド、ＮＫＤＩＬおよびＥＰＤＩＭが提供される。これらのペプチド配列は、独立して細胞接着を誘導するｆａｓ−１ドメインＩＩおよびＩＶの保存配列に由来する。本発明のペプチドは、βｉｇ−３ｈを含む様々な細胞外マトリクス蛋白質を通して媒介される細胞接着活性を調べるため、かつ細胞の接着、伸張および剥離促進ペプチドを開発するために有用に用いることができる。
【００２４】
本発明のさらなる局面に従って、細胞接着および剥離活性を示すペプチドまたはその誘導体を、創傷治癒および組織再生活性、ならびに癌転移に対する抵抗性を付与する有効成分として含む薬学的組成物が提供される。
【００２５】
ペプチドまたはその誘導体は、経口または非経口投与によって投与可能であり、通常の剤形で用いてもよい。すなわち、ペプチドまたはその誘導体は、非経口投与のための様々な剤形に製剤化することができる。製剤化する場合、充填剤、濃化剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤等を含む薬学的に許容される希釈剤、手段、および／または担体を用いてもよい。非経口投与のための用途剤形には、滅菌水溶液、非水性溶媒、懸濁液、乳液、凍結乾燥剤、坐剤等が含まれる。非水性溶媒および懸濁液の製剤の場合では、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールのような植物油、またはオレイン酸エチルのような注射用エステルを用いてもよい。坐剤に関する基剤として、ウィテップゾール、マクロゴール、ツイーン６１、カカオバター、ラウリン酸、およびグリセロゼラチンが有用である。
【００２６】
さらに、ペプチドおよびその誘導体は、生物活性生理食塩液または有機溶媒のような薬学的に許容される担体と組み合わせて用いてもよい。同様に、ブドウ糖、蔗糖、およびデキストランのような糖質、アスコルビン酸およびグルタチオンのような抗酸化剤、キレート剤、低分子量蛋白質、またはその他の安定化剤を用いて、ペプチドの安定性または吸収を増加させてもよい。
【００２７】
ペプチドの全有効量を、ボーラスの投与剤形として投与してもよく、または比較的短期間の投与が望ましい場合には単回用量を注入によって投与してもよい。または、ペプチドの投与は分画した治療プロトコールに従って多数回投与様式に従ってもよい。患者の年齢、身体条件、および体重と共に投与経路および治療回数に応じて、本発明のペプチドの薬学的に有効な用量は、変更してもよく、当業者によって容易に決定されうる。
【００２８】
治療的に有効な成分としてペプチドまたはその誘導体を含む薬学的組成物は非経口的に投与されるため、それらは毒性に関して調べられなかった。
【００２９】
実施例
本発明のよりよい理解は、本発明を説明するために述べられ、本発明を制限すると解釈されない以下の実施例を参照して得られると思われる。
【００３０】
実施例１：組換えβｉｇ−ｈ３ Ｆａｓ−１ドメイン蛋白質の作製と細胞接着活性のアッセイ法
βｉｇ−ｈ３の細胞接着に対して必須のアミノ酸を見つけるために、四つの反復配列ｆａｓ−１ドメインのそれぞれがβｉｇ−３ｈの細胞接着を媒介するか否かを調べた。この目的のため、細胞接着活性アッセイ法に関して、四つの反復配列ｆａｓ−１ドメインを含む四つの組換え蛋白質を作製した。
【００３１】
１−１：四つの反復配列ドメインのそれぞれをコードする組換えβｉｇ−ｈ３ ｆａｓ−１蛋白質の産生
βｉｇ−ｈ３遺伝子の塩基１３３〜２３６位、２４２〜３７２位、３７３〜５０１位、および５０２〜６３２位にそれぞれ対応する第一から第四のドメインをコードする四つのＤＮＡ断片をＰＣＲによって作製して、ｐＥＴ−２９β（ノバゲン社（Ｎｏｖａｇｅｎ））にクローニングし、図１ａに示すように、βｉｇ−ｈ３ Ｄ−Ｉ、βｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＩ、βｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＩＩおよびβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶと呼ばれるｆａｓ−１ドメインに関する発現ベクターを構築した。６個の縦列反復ヒスチジン残基をＤＮＡ断片のＣ−末端に提供してヒスチジンタグを作製し、これはＮｉ−ＮＴＡ樹脂（キアゲン社（Ｑｕｉａｇｅｎ））を用いた発現蛋白質の精製にとって有用である。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＢＳ２１（ＤＥ３）を、組換え発現ベクターのそれぞれによって形質転換して、５０ μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地において培養した。組換えβｉｇ−ｈ３蛋白質は、１ｍＭ ＩＰＴＧの存在下で形質転換体を培養することによって誘導し、その後遠心した。ペレットを５０ ｍＭトリス塩酸（ｐＨ ８．０）、１００ ｍＭ ＥＤＴＡ、１％トライトンＸ−１００、１ｍＭ ＰＭＳＦ、および０．５ ｍＭ ＤＴＴからなる溶解緩衝液に浮遊させた後、超音波処理して細胞を溶解した。工程を５回繰り返した後、遠心を行って上清を分離すると、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を充填したカラムから関係する蛋白質が精製される。
【００３２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、組換え蛋白質βｉｇ−ｈ３ Ｄ−Ｉは１４．４ ｋＤａで検出されたが、組換え蛋白質βｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＩ、βｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＩＩおよびβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶは全て、図１ｂに示されるように、２１．５ ｋＤａで検出された。
【００３３】
１−２：組換えβｉｇ−ｈ３ ｆａｓ−１ドメインタンパク質の細胞接着活性アッセイ法
上記のように調製した組換えβｉｇ−ｈ３ ｆａｓ−１ドメイン蛋白質を、細胞接着活性に関してアッセイした。まず、組換えβｉｇ−ｈ３蛋白質を、３７℃で１時間インキュベートすることによって９６ウェルマイクロタイタープレート（ファルコン社（Ｆａｌｃｏｎ））の底に接着させ、０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳによってブロッキングした。ＨＣＥ細胞を培養培地に２×１０５個／ｍｌの密度で浮遊させた。細胞浮遊液０．１ ｍｌを、組換え蛋白質をコーティングしたプレートの各ウェルに加えた。３７℃で１時間インキュベートした後、非接着細胞をＰＢＳによる洗浄によって除去した。接着細胞を、ヘキソサミニナーゼ基質として３．７５ ｍＭ ｐ−ニトロフェノール−Ｎ−アセチル１−β−Ｄ−グリコサミニドおよび０．２５％トライトンＸ−１００を含む５０ ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ ５．０中で３７℃で１時間インキュベートした後、酵素活性をブロックするために５ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ １０．４を加えた。測定はマルチスキャンＭＣＣ／３４０マイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＭＣＣ／３４０ ｍｉｃｏｒｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）において４０５ ｎｍで行った。吸光度の結果を図２に示す。
【００３４】
図２のヒストグラムにおいて認められるように、ＨＣＥ細胞は、組換え第二のｆａｓ−１ドメイン蛋白質（βｉｇｈ３−Ｄ−ＩＩ）および組換え第四のｆａｓ−１ドメイン蛋白質（βｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ）によってコーティングした双方のプレートにおいて、野生型βｉｇ−ｈ３（βｉｇ３−ＷＴ）の活性と同等の細胞接着および伸張活性を示したが、組換え第一のｆａｓ−１ドメイン蛋白質（βｉｇｈ３−Ｄ−Ｉ）によってコーティングしたプレートでは弱い活性を示した。一方、組換えｆａｓ−１ドメインＩＩＩ蛋白質（βｉｇｈ３−Ｄ−ＩＩＩ）によってコーティングしたプレートでは、ほとんど活性が検出されなかった。
【００３５】
細胞接着および伸張を媒介するためには、第二または第四のｆａｓ−１ドメインのいずれかで十分であり、このことは、細胞接着および伸張に必須のアミノ酸が二つのドメインのそれぞれに存在することを示している。
【００３６】
１−３：βｉｇ−ｈ３ ｆａｓ−１ドメイン蛋白質の受容体の同定
それぞれが細胞接着および伸張活性を示す組換えβｉｇ−ｈ３の第二および第四のドメイン蛋白質を用いて、βｉｇ−ｈ３受容体を調べた。この点において、βｉｇ−ｈ３によってコーティングした表面に対するＨＣＥ細胞の接着に及ぼす、様々なインテグリンサブユニットに対する機能遮断性のモノクローナル抗体の作用を調べた。
【００３７】
詳細に説明すると、異なるタイプのインテグリンに対するモノクローナル抗体（５μｇ／ｍｌ）のそれぞれの存在下で、ＨＣＥをインキュベーション溶液（細胞３×１０５個／ｍｌ）において３７℃で３０分間プレインキュベートした。プレインキュベートした細胞をβｉｇ−ｈ３蛋白質によって予めコーティングしたプレートに移して、３７℃で１時間さらにインキュベートした後、実施例１〜２に記載のようにヘキソサミニダーゼ基質によって定量的に分析した。定量的な結果を図３に示し、この場合、値は、モノクローナル抗体の非存在下で接着した細胞数の割合として表記する。
【００３８】
図３に認められるように、第二または第四のｆａｓ−１ドメイン媒介細胞接着は、α３およびβ１インテグリンサブユニットに対する抗体の双方によってほぼ完全に阻害された。これらの結果は、第二および第四のｆａｓ−１ドメインの双方がα３β１インテグリンに会合して、細胞接着活性を媒介し、媒介に必須のアミノ酸を有することを示している。
【００３９】
実施例２：βｉｇ−ｈ３の細胞接着および伸張活性にとって必須のアミノ酸、アスパラギン酸とイソロイシン
２−１：ｆａｓ−１ドメインを含む様々な蛋白質のアミノ酸配列アライメント
それぞれが細胞接着および伸張活性を有するβｉｇ−ｈ３の第二および第四のｆａｓ−１ドメインから細胞接着に関与するアミノ酸を同定するために、βｉｇ−ｈ３の内部反復ｆａｓ−１ドメインのみならず、ｆａｓ−１ドメインを含む他の蛋白質のアミノ酸配列アライメントを行った。その結果、二つのアミノ酸、すなわち、アスパラギン酸とイソロイシンが、図４に示すように、様々な基質蛋白質におけるそれぞれのｆａｓ−１ドメインのＨ２領域近傍の部位で高度に保存されていることが判明した。全体として、アスパラギン酸とイソロイシンはいずれも、βｉｇ−ｈ３の第二および第四のｆａｓ−１ドメインを含む様々なｆａｓ−１ドメインにおいて保存されているが、第一のｆａｓ−１ドメインではアスパラギン酸のみが保存されている。第三のｆａｓ−１ドメインに関しては、これは二つのアミノ酸を有しなかった。
【００４０】
２−２：βｉｇ−ｈ３の第四のｆａｓ−１ドメインの置換変異体を含む組換え蛋白質の作製
βｉｇ−ｈ３の細胞接着活性に対してアスパラギン酸とイソロイシンが不可欠であることを調べるために、セリン、アラニンおよびセリンがそれぞれ６１６位のプロリン、６１７位のアスパラギン酸、および６１８位のイソロイシンの代わりに置換されている、βｉｇ−ｈ３の第四のドメインに由来する組換え蛋白質βｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶの変異体を作製した。得られた変異組換え蛋白質を、βｉｇｈ３ Ｄ−ＩＶ−ｓＤＩ、βｉｇｈ３ Ｄ−ＩＶ−ＰａＩ、βｉｇｈ３ Ｄ−ＩＶ−ＰＤｓ、およびβｉｇｈ３ Ｄ−ＩＶ−ｓａｓと命名した（図５ａ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、変異組換え蛋白質は全て、βｉｇｈ３ Ｄ−ＩＶと同じ位置で検出された（図５ｂ）。
【００４１】
２−３：βｉｇ−ｈ３の第四のｆａｓ−１ドメインの置換変異体を含む組換え蛋白質の細胞接着活性のアッセイ法
βｉｇｈ３ Ｄ−ＩＶの６１６位のプロリン、６１７位のアスパラギン酸、および６１８位のイソロイシンがそれぞれセリン、アラニン、およびセリンに組み合わせて置換されている変異蛋白質、すなわちβｉｇｈ３ Ｄ−ＩＶ−ｓＤＩ、βｉｇｈ３ Ｄ−ＩＶ−ＰａＩ、βｉｇｈ３ Ｄ−ＩＶ−ＰＤｓ、およびβｉｇｈ３ Ｄ−ＩＶ−ｓａｓの細胞接着活性を調べた。この目的のために、変異体蛋白質をコーティングしたプレートのウェルにおいて、ＨＣＥ細胞を３７℃で１時間インキュベートした後、実施例１〜２のように接着細胞をヘキソサミニダーゼ基質に加えた。結果を図６に示す。
【００４２】
図６に認められるように、Ｄ６１７Ａ（βｉｇｈ３ Ｄ−ＩＶ−ＰａＩ）と呼ばれるＡｓｐ６１７の代わりにアラニンを有する変異体蛋白質、およびＩ６１８Ｓ（βｉｇｈ３ Ｄ−ＩＶ−ＰＤｓ）と呼ばれるＩｌｅ６１８の代わりにセリンを有する変異体蛋白質は、細胞接着を有意に阻害したのに対し、Ｐ６１６Ｓ（βｉｇｈ３ Ｄ−ＩＶ−ｓＤＩ）と呼ばれるＰｒｏ６１６の代わりにセリンを有する変異体蛋白質は、野生型対照と同等の細胞接着活性を示すことが判明した。Ｐ６１６Ｓ／Ｄ６１７Ａ／Ｉ６１８Ｓ（βｉｇｈ３ ＤＩＶ−ｓａｓ）と呼ばれるアミノ酸３個が変異している変異体蛋白質では、その細胞接着活性も同様に対照よりかなり低かった。
【００４３】
Ａｓｐ６１７またはＩｌｅ６１８で変異している第一のｆａｓ−１ドメインでは、第一のｆａｓ−１ドメイン媒介細胞接着活性がないことは、６１７位のアスパラギン酸および６１８位のイソロイシンがβｉｇ−ｈ３の細胞接着活性を媒介するために非常に重要であることを示している。
【００４４】
これらの結果は、実施例１と一致する。実施例１の結果を再検討すると、細胞接着活性を媒介するために必須であると同定されたアスパラギン酸とイソロイシンは、細胞接着活性を示す第二および第四のｆａｓ−１ドメインの双方において保存されているが、弱い細胞接着活性を示す第一のｆａｓ−１ドメインではアスパラギン酸のみが保存されている。一方、細胞接着活性を示さない第三のドメインは、二つのアミノ酸を有しない。それによって、これらの結果は共に、Ａｓｐ６１７およびＩｌｅ６１８がβｉｇ−ｈ３の細胞接着および伸張活性を媒介するために非常に重要であることを証明している。
【００４５】
実施例３：細胞接着、伸張、および剥離活性を有するβｉｇ−ｈ３−媒介合成ペプチド
細胞接着活性に関してアスパラギン酸とイソロイシンが不可否であることを確認した後、二つのアミノ酸を含むペプチドを合成し、細胞接着および剥離活性に関してアッセイした。
【００４６】
３−１：βｉｇ−ｈ３ ｆａｓ−１ドメイン由来蛋白質の合成
βｉｇ−ｈ３の第一、第二、および第四のｆａｓ−１ドメインに由来するペプチドおよび対照ペプチドは、標準的な固相法によって自動多重ペプチドシンセサイザー（ＰＥ／ＡＢＤ４３３）を用いて合成し、それらを単離して、逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製した。βｉｇ−ｈ３の第一、第二、および第四のｆａｓ−１ドメインの保存された配列にそれぞれ対応する、配列番号：１のＫＡＤＨＨ（アミノ酸２１９〜２２３位）、配列番号：２のＮＫＤＩＬ（アミノ酸３５４〜３５８位）、および配列番号：３のＥＰＤＩＭ（アミノ酸６１５〜６１９位）を有するように、合成ペプチドをデザインして、対照ペプチドＤＥＭＰＩは、ペプチドＥＰＤＩＭと同じアミノ酸組成を有したが、図７に示すように、そのアミノ酸配列を変化させた。
【００４７】
３−２：合成ペプチドの細胞接着および剥離活性のアッセイ法
βｉｇ−ｈ３のｆａｓ−１ドメインの保存配列を含むペプチドがβｉｇ−ｈ３媒介細胞接着に及ぼす作用を、ＨＣＥ細胞において調べた。四つの合成ペプチドのそれぞれを１００ μＭ含む、またはペプチドを含まない培地中で細胞を３０分間プレインキュベートして、１０ μｇ／ｍｌ ＢＳＡまたは１０ μｇ／ｍｌβｉｇ−ｈ３によってコーティングしたプラスチック培養皿に移した。実施例１〜２に記載するように、接着細胞に定量的ヘキソサミニダーゼ分析を行った。結果を８ａに示す。
【００４８】
図８ａに示すように、それぞれが保存されたアスパラギン酸−イソロイシン残基の双方を含む合成ペプチドＮＫＤＩＬおよびＥＰＤＩＭは、βｉｇ−ｈ３に対するＨＣＥ細胞の接着を有意に阻害し、優れた細胞剥離活性を示したが、保存されたアスパラギン酸のみを含む合成ペプチドＫＡＤＨＨは、細胞接着を弱く阻害した。一方、保存されたアミノ酸残基を含まない対照ペプチドＤＥＭＰＩは、細胞接着に影響を及ぼさず、このように、低い細胞剥離活性を示した。
【００４９】
組換え蛋白質βｉｇｈ３ Ｄ−ＩＩおよびβｉｇｈ３ Ｄ−ＩＶに対するＨＣＥ細胞の接着もまた、合成ペプチドの存在下または非存在下において調べた。この目的のため、ＨＣＥ細胞を四つの合成ペプチド１００ μＭをそれぞれ含む、またはペプチドを含まない培地中で３０分間プレインキュベートした後、１０ μｇ／ｍｌβｉｇｈ３ Ｄ−ＩＩまたはＤ−ＩＶによってコーティングしたプラスチック培養皿に移した。インキュベーション後、接着細胞を、実施例１〜２に記載のようにヘキソサミニダーゼによって定量的に分析した。結果を図８ｂに示す。
【００５０】
図８ｂにおいて認められるように、第二および第四のｆａｓ−１ドメインを基質として用いた場合に得られた合成ペプチドの遮断作用は、βｉｇ−ｈ３を基質として用いた場合に得られた作用と類似であった。
【００５１】
３−３：合成ペプチドによってコーティングした表面に対するＨＣＥ細胞の接着
合成ペプチドのそれぞれが細胞接着を媒介できるか否かを決定するために実験を行った。ウェルプレートをそれぞれのペプチドの０ ｍＭ、２０ ｍＭ、４０ ｍＭ、６０ ｍＭ、８０ ｍＭ、１００ ｍＭ、および１２０ ｍＭ濃度によってコーティングした後、ＨＣＥ細胞と共に３７℃で一時間インキュベートした。接着した細胞を実施例１〜２に記載のようにヘキソサミニダーゼによって定量的に分析した。結果を図９ａに示す。
【００５２】
それぞれがアスパラギン酸とイソロイシンの双方を含む合成ペプチドＮＫＤＩＬおよびＥＰＤＩＭは、細胞の接着を用量依存的に媒介することが判明した。合成ペプチドＫＡＤＨＨはまた、細胞接着を用量依存的に媒介することができたが、ＮＫＤＩＬおよびＥＰＤＩＭと比較すると活性は低かった。予想されるように、二つのアミノ酸をいずれも有しない対照ペプチドは細胞接着において活性ではなかった。
【００５３】
３−４：合成ペプチドの細胞接着、伸張、および剥離活性を媒介するための受容体の同定
様々なインテグリンサブユニットに対するモノクローナル抗体を用いる機能遮断実験を行って、βｉｇ−ｈ３の表面受容体として知られるα３β１インテグリンが合成ペプチドＥＰＤＩＭおよびＮＫＤＩＬによって媒介される細胞接着に関与するか否かを調べた。ＨＣＥを異なるタイプのインテグリンに対するモノクローナル抗体（５μｇ／ｍｌ）のそれぞれの存在下で３７℃で３０分間プレインキュベートした。プレインキュベートした細胞を１００ μＭ ＥＰＤＩＭまたは１００μＭ ＮＫＤＩＬによって予めコーティングしたプレートに移した後、３７℃でさらに１時間インキュベートし、その後実施例１〜２に記載のように、ヘキソサミニダーゼ基質によって定量的に分析した。定量的な結果を図９ｂに示す。
【００５４】
図３において認められるように、第二または第四のｆａｓ−１ドメイン媒介細胞接着は、α３およびβ１インテグリンサブユニットに対する双方の抗体によってほぼ完全に阻害された。これらの結果は、第二および第四のｆａｓ−１ドメインがいずれもα３β１インテグリンに会合して細胞接着を媒介することを示している。
【００５５】
３−５：様々な細胞外マトリクスペプチドに対する細胞接着に及ぼす合成ペプチドの効果
細胞接着に対する合成ペプチドＥＰＤＩＭおよびＮＫＤＩＬの阻害活性がβｉｇ−ｈ３に対して特異的であるか否かを調べるために、様々なマトリクス蛋白質に対する細胞接着に及ぼす合成ペプチドの作用を調べた。ＨＣＥ細胞を、１００μＭの合成ペプチドＥＰＤＩＭまたはＮＫＤＩＬを加えた、またはそれらを加えない培地中でプレインキュベートした後、βｉｇ−ｈ３、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、Ｉ型およびＩＩ型コラーゲンを含む様々なマトリクス蛋白質によってコーティングしたプレートに加えた。１時間インキュベートした後、接着した細胞を、実施例１〜２に記載のようにヘキソサミニダーゼによって定量的に分析した。結果を図１０ａに示す。
【００５６】
図１０ａに示されるように、合成ペプチドＮＫＤＩＬおよびＥＰＤＩＭは、βｉｇ−ｈ３に対するのみならず、ラミニンに対する細胞接着も有効に遮断し、優れた細胞剥離活性を示した。しかし、フィブロネクチンに対するそれらの細胞接着の阻害は弱く、Ｉ型およびＩＩ型コラーゲンならびにビトロネクチンに対する細胞接着には全く影響を及ぼさなかった。したがって、結果は共に、合成ペプチドＮＫＤＩＬおよびＥＰＤＩＭが、α３β１インテグリン相互作用分子と特異的に競合することを示唆している。
【００５７】
合成ペプチドＮＫＤＩＬおよびＥＰＤＩＭによって遮断されることが判明したβｉｇ−ｈ３、ラミニン、およびフィブロネクチンに対する細胞接着を、ＥＰＤＩＭの様々な濃度で調べた。ＨＣＥ細胞を、０μＭ、２００μＭ、４００μＭ、６００μＭ、８００μＭ、１，０００μＭ、および１，２００μＭ濃度の合成ペプチドＥＰＤＩＭを含む培地においてインキュベートして、βｉｇ−ｈ３、フィブロネクチン、およびラミニンよってコーティングしたプレートに加えた。１時間インキュベートした後、接着細胞を、実施例１〜２に記載のようにヘキソサミニダーゼによって定量的に分析した。結果を図１０ｂに示す。
【００５８】
曲線から認められるように、βｉｇ−ｈ３、フィブロネクチン、およびラミニンに対する細胞接着は、合成ペプチドＥＰＤＩＭの濃度が増加するにつれて、弱くなった。すなわち、βｉｇ−ｈ３、フィブロネクチン、およびラミニンに対する細胞接着に及ぼすＥＰＤＩＭの作用は、用量依存的であった。
【００５９】
本発明において、上記のように、いずれも細胞接着と伸張活性にとって必須であるアスパラギン酸とイソロイシンとをその保存されたモチーフに含む合成ペプチドＮＫＤＩＬおよびＥＰＤＩＭを調製した。ペプチドは、βｉｇ−ｈ３の第二および第四のｆａｓ−１ドメインの保存された配列を含み、各ドメインは、細胞接着活性を示すことが判明し、それらは、機能的細胞受容体として知られるα３β１インテグリンを通して細胞接着を誘導する。トロンボスポンジン、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン等のようなα３β１インテグリンに結合することが知られている様々な細胞外マトリクス蛋白質の場合、その活性部位において相同性を有する特徴的な配列も、α３β１インテグリンに関する特徴的な保存された結合モチーフのいずれも、これまで発見されていない。しかし、それぞれが保存されたアミノ酸、アスパラギン酸とイソロイシンの双方を含む合成ペプチドＮＫＤＩＬおよびＥＰＤＩＭが、細胞接着活性を媒介するためにα３β１インテグリンに特異的に結合することを考慮すると、保存されたアスパラギン酸−イソロイシンは、本発明に従ってα３β１インテグリンの特徴的な保存された結合モチーフであると同定される。したがって、本発明のペプチドは、βｉｇ−ｈ３を含む様々な細胞外マトリクス蛋白質を通して媒介される細胞接着活性を調べるため、かつ細胞接着、伸張、および剥離促進ペプチドを開発するために有用に用いることができる。
【００６０】
工業的応用性
本発明に従って、細胞接着分子であるβｉｇ−ｈ３の四つのｆａｓ−１ドメインのうち、第二および第四のドメインは、細胞接着および剥離活性を示し、それぞれが細胞接着および剥離活性にとって必須である保存されたアスパラギン酸−イソロイシン配列を有することが開示される。これらの知見を考慮して、機能的アミノ酸残基を含み、α３β１インテグリンを通して細胞接着を誘導するペプチドＮＫＤＩＬおよびＥＰＤＩＭが調製される。本発明のペプチドは、βｉｇ−ｈ３を含む様々な細胞外マトリクス蛋白質を通して媒介される細胞接着活性を調べるため、かつ細胞接着、伸張、および剥離促進ペプチドを開発するために有用に用いることができる。
【００６１】
本発明は、説明的に記述してきたが、用いた用語は、制限するためではなく、説明するためであると理解すべきである。本発明の多くの改変および変更が上記の教示に照らして可能である。したがって、本発明は特に説明した以外の方法で実践してもよく、それらも添付の請求の範囲の範囲内であると理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】βｉｇ−ｈ３のｆａｓ−１ドメインに由来する組換え蛋白質を示す略図である。
【図１Ｂ】βｉｇ−ｈ３のｆａｓ−１ドメインに由来する組換え蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す写真である。
【図２】βｉｇ−ｈ３のｆａｓ−１ドメインに由来する組換え蛋白質の細胞接着活性を示すヒストグラムである。
【図３】βｉｇ−ｈ３のｆａｓ−１ドメインに由来する組換え蛋白質の細胞接着活性に対する抗インテグリン抗体の阻害活性を示すヒストグラムである。
【図４】ｆａｓ−１ドメインを含む様々なマトリクス蛋白質のアミノ酸配列を示す。
【図５Ａ】βｉｇ−ｈ３の第四のｆａｓ−１ドメインに由来する置換変異体を示す略図である。
【図５Ｂ】βｉｇ−ｈ３の第四のｆａｓ−１ドメインに由来する置換変異体の１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図６】βｉｇ−ｈ３の第四のｆａｓ−１ドメインに由来する置換変異体の細胞接着活性を示すヒストグラムである。
【図７】本発明の合成ペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図８Ａ】ＨＣＥ細胞接着に対する合成ペプチドの阻害活性を示すヒストグラムである。
【図８Ｂ】合成βｉｇ−ｈ３ペプチドによるβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＩまたはβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶに対するＨＣＥ細胞の接着の阻害を示すヒストグラムである。
【図９Ａ】本発明の合成ペプチドによるＨＣＥ細胞接着活性を示す曲線である。
【図９Ｂ】合成ペプチドＥＰＤＩＭおよびＮＫＤＩＬに対するＨＣＥ細胞の接着に対する抗インテグリン抗体の阻害を示すヒストグラムである。
【図１０Ａ】いくつかの細胞外マトリクス蛋白質に対するＨＣＥ細胞接着に及ぼす本発明の合成ペプチドの作用を示すヒストグラムである。
【図１０Ｂ】様々な濃度のＥＰＤＩＭの存在下で細胞外マトリクス蛋白質によって表面をコーティングしたＨＣＥ細胞接着の用量依存的阻害を示す曲線である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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