(57)【要約】微小管を安定化させる化合物および組成物が開示される。さらにまた、微小管形成または微小管機能を抑制し、妨げ、調節し、減弱させ、安定化させまたは影響を及ぼす方法も開示される。クマリンなどの微小管安定化剤を投与することによって、微小管形成または微小管機能またはその両方に付随する疾患および異常を治療し、予防しまたは抑制する方法もまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのクマリン化合物またはその誘導体を対象に投与することを含む対象内の微小管を安定させる方法。
【請求項２】
前記対象が細胞または生物である請求項１の方法。
【請求項３】
前記生物が哺乳類である請求項２の方法。
【請求項４】
前記哺乳類がヒトである請求項３の方法。
【請求項５】
前記クマリン化合物が、クマリン、ジクマロール、７−ヒドロキシクマリン（ウンベリフェロン）、６，７−ジヒドロキシクマリン（エスクレチン）、３，６，７−トリヒドロキシクマリン、ワルファリン、またはワルファリンナトリウムである請求項１の方法。
【請求項６】
少なくとも１つのクマリン化合物またはその誘導体を対象に投与することを含む対象内の微小管を調節する方法。
【請求項７】
前記対象が細胞または生物である請求項６の方法。
【請求項８】
前記生物が哺乳類である請求項７の方法。
【請求項９】
前記哺乳類がヒトである請求項８の方法。
【請求項１０】
前記クマリン化合物が、クマリン、ジクマロール、７−ヒドロキシクマリン（ウンベリフェロン）、６，７−ジヒドロキシクマリン（エスクレチン）、３，６，７−トリヒドロキシクマリン、ワルファリン、またはワルファリンナトリウムである請求項９の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つのクマリン化合物またはその薬学的に許容できる塩もしくはプロドラッグ、少なくとも１つの追加化合物、および薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１２】
前記追加化合物が抗腫瘍薬、抗増殖薬、抗炎症薬、または抗真菌剤である請求項１１の医薬組成物。
【請求項１３】
前記追加化合物がタキソール、エストラムスチン、タキソテール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ジスコデルモリド、グリセオフルヴィンまたはアンホテリシンＢである請求項１１の医薬組成物。
【請求項１４】
治療上有効な量の少なくとも１つのクマリン化合物またはその誘導体を対象に投与することを含む、対象の微小管形成または微小管機能に付随する疾患または異常を治療、予防または抑制する方法。
【請求項１５】
前記疾患または異常が過剰増殖疾患または嚢胞性疾患である請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記疾患または異常が癌、アルツハイマー病、アテローム性硬化症、再狭窄または痛風である請求項１４の方法。
【請求項１７】
さらに、抗腫瘍薬、抗増殖薬、抗炎症薬、または抗真菌剤を投与することを含む請求項１４の方法。
【請求項１８】
さらに追加化合物を投与することを含む請求項１４の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つのクマリン化合物またはその誘導体を細胞に投与することを含む、細胞の細胞周期を調節する方法。
【請求項２０】
治療上有効な量の少なくとも１つのクマリン化合物またはその誘導体および少なくとも１つの抗腫瘍薬を対象に投与することを含む、対象の癌を治療、予防または抑制する方法。
【請求項２１】
前記抗腫瘍薬が、タキソール、エストラムスチン、タキソテール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはジスコデルモリドである請求項２０の方法。
【請求項２２】
治療的に有効な量の少なくとも１つのクマリン化合物を対象に投与することを含み、前記クマリン化合物が、クマリン、７−ヒドロキシクマリン、ワルファリン、またはワルファリンナトリウムではない、対象の癌を治療、予防または抑制する方法。
【請求項２３】
抗腫瘍薬、抗増殖薬、抗炎症薬または抗真菌剤の少なくとも１回投与量と一緒に包装されてある少なくとも１つのクマリン化合物の少なくとも１回投与量を含む、微小管形成または微小管機能に付随する疾患または異常を治療、予防または抑制するキット。
【請求項２４】
骨格構造についての基本構造式を有しそのベンゼン環、ピロンまたはその両者がさらに少なくとも１つの置換基を含んでいてもよい少なくとも１つのクマリン化合物、の治療上有効な量を対象に投与することを含む、対象の微小管形成または微小管機能に付随する疾患または異常を治療、予防または抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互引用
本出願は、米国仮特許出願第60/283,366号（2001年4月13日出願）および米国仮特許出願第60/265,576号（2001年2月2日出願）の権利を請求する。両出願は共同発明者としてRobert S. Jacobs, Leslie Wilson および Hamta Madariの名を挙げる。さらに前記は参照により本明細書に含まれる。
連邦政府支援研究または開発に関する記載
本発明はグラント番号R/MP-81（National Oceanic & Atmospheric Administration (NOAA) California Sea Grant）により政府の補助を受けて達成された。連邦政府は本発明に関し一定の権利を有する。
本発明は一般に微小管安定化剤およびその使用方法に関する。具体的には、本発明は微小管安定化剤としてのクマリン化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
全ての真核細胞に存在する微小管は、正常な細胞活動、例えば細胞分裂、運動性、固着、細胞内小器官の間での輸送、細胞外分泌プロセス、細胞表面レセプターと増殖因子との相互作用の調節、および細胞内シグナル伝達に必要である。（以下を参照されたい：Dustin et al.（1980）Sci. AM. 243:66-76。）微小管は、微小管可溶性タンパク質サブユニットであるαおよびβチューブリンヘテロダイマーとの動的平衡状態にある。
【０００３】
これらの動的なタンパク質線維は細胞分裂に必須である。細胞分裂時に、細胞はそのＤＮＡおよび内部成分を２つに複製し、それらを分離させて両娘細胞内の２つの核を形成しなければならない。続いて、これらの新しい核が分離したとき前記細胞は２つの新しい娘細胞に分裂する。有糸分裂は細胞複製時のプロセスで、このとき複製される遺伝物質の規則化および再配置が行われ、染色体は２つの新しい細胞に等しく分配される。細胞が有糸分裂を開始するとき、微小管ネットワークが壊れ、二極性微小管紡錘体が中心体から組み立てられる。紡錘体の微小管は染色体に付着し、それらを紡錘体の極に移動させる。微小管の動的不安定性、急速な伸長および短縮化は染色体の分配に必要である。前記の迅速な動的変化は、抗有糸分裂薬に対して高い感受性を有する。天然の生成物に由来する多くの物質がチューブリンまたは微小管に結合し、紡錐体微小管に作用して細胞分裂を抑制する。したがって、微小管は細胞の複製に密接に関係し、腫瘍細胞の微小管形成が妨げられるならば、染色体は分配されず、細胞は複製できなくなり腫瘍は増殖することができない。
【０００４】
種々の疾患および異常が、微小管の集合、分解、機能またはそれら作用の組み合わせと密接に関連する。例えば、細胞増殖（例えば癌）、真菌性疾患（例えばカンジダおよびアスペルギルス）、嚢胞、神経変性疾患および異常（例えばアルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化（ＡＬＳ）、パーキンソン病のピック型および種々の型、痛風、マラリア、アテローム性硬化症、再狭窄、慢性炎症、慢性関節リウマチ、乾癬、糖尿病性網膜症など）は微小管の機能と密接に関係する。
微小管の集合、分解および機能に影響を与えるいくつかの薬剤が知られている。その様な薬剤にはビンブラスチン、ビンクリスチン、コルヒチン、アロコルヒチン、チオコルヒチン、パクリタキセル（タキソール（Taxol）（登録商標））、メイタンシン、リゾキシン、トリチルシステイン、エポチロン、ジスコデルモリド(discodermolide)、エストラムスチン、ノコダゾール、タキソテール（taxotere）（登録商標）（ドセタキセル（docetaxel））などが含まれる。前記薬剤の大半は微小管の脱安定化および分解をもたらすが、前記は、例えばアルツハイマー病のような微小管の異常な脱安定化および分解に関連する疾患および異常の治療には望ましくない。
【０００５】
しかしながら、タキソールは微小管の形成を促進し、有糸分裂および細胞増殖に必要な微小管の動的再組織化を抑制する。（以下を参照されたい：P.B. Schiff  et al. (1979) Nature 277:665およびP.B. Schiff et al. (1981) Biochemistry 20:3247。）タキソールは、微小管の長軸に沿って結合し直接キャップ部を変化させることなく速度論的に微小管の動的変化を安定化させる。（以下を参照されたい：L. Wilson et al. (1985) Chemistry & Biology 2:569-573; Derry et al. (1995) Biochemistry 34(7):2203-2211。）したがって、タキソールは、薬剤無反応性腫瘍（例えば卵巣癌および乳癌）に有効であることが示された。（以下を参照されたい：Hawkins (1992) Oncology 6:17-23; Horwitz (1992) Trends Pharmacol. Sci. 13:134-146およびRowinsky (1990) J. Natl. Cancer Inst. 82:1247-1259。）残念ながら、いくつかのアレルギー反応がタキソールの投与後に観察された。（以下を参照されたい：R.B. Weiss et al. (1990) J. Clin. Oncol. 8:1263。）さらに、タキソール投与で患者の約５％および約４０％にそれぞれ不整脈および洞性徐脈が付随する。さらにまた、タキソールは細胞毒性薬剤であり、さらに大量服用、長期間服用またはその両方において有毒である。
したがって、微小管形成または微小管機能に付随する疾患および異常の治療、予防または抑制を目的とする薬剤であって、タキソールおよびタキソール様化合物と比較した場合により毒性の少ない微小管安定化剤が希求される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は一般にクマリン化合物およびその誘導体に関する。
いくつかの実施態様では、本発明は、対象に少なくとも１つのクマリン化合物またはその誘導体を投与することを含む、対象の微小管を安定させるか、または調節する方法を提供する。前記対象は細胞または生物である。好ましくは、前記対象は哺乳類であり、より好ましくは、前記対象はヒトである。
好ましい実施態様では、前記クマリン化合物は、クマリン、ジクマロール、７−ヒドロキシクマリン（ウンベリフェロン）、６，７−ジヒドロキシクマリン（エスクレチン）、３，６，７−トリヒドロキシクマリン、ワルファリン、またはワルファリンナトリウム（クマジン）である。
【０００７】
いくつかの実施態様では、本発明は，少なくとも１つのクマリン化合物またはその医薬的に許容できる塩もしくはプロドラッグ、少なくとも１つの追加化合物および医薬的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物を提供する。前記追加化合物は抗腫瘍薬、抗増殖薬、抗炎症薬または抗真菌剤であろう。好ましくは前記追加化合物は、タキソール、エストラムスチン、タキソテ−ル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ジスコデルモリド、グリセオフルヴィンまたはアンホテリシンＢである。
いくつかの実施態様では、本発明は、対象に治療的に有効な量の少なくとも１つのクマリン化合物またはその誘導体を投与することを含む、対象の微小管形成または微小管機能に付随する疾患または異常を治療、予防または抑制する方法を提供する。好ましい実施態様では、前記疾患または異常は過剰増殖疾患または嚢胞性疾患である。より好ましくは、前記疾患または異常は、癌、アルツハイマー病、アテローム性硬化症、再狭窄または痛風である。抗腫瘍薬、抗増殖薬、抗炎症薬または抗真菌剤もまた投与できる。
【０００８】
いくつかの実施態様では、本発明は、少なくとも１つのクマリン化合物またはその誘導体を細胞に投与することを含む、細胞周期を調節する方法を提供する。
いくつかの実施態様では、本発明は、対象に治療的に有効な量の少なくとも１つのクマリン化合物またはその誘導体および少なくとも１つの抗腫瘍薬を投与することを含む、対象の癌を治療、予防または抑制する方法を提供する。好ましくは、前記抗腫瘍薬は、タキソール、エストラムスチン、タキソテール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはジスコデルモリドである。
いくつかの実施態様では、本発明は、対象に治療的に有効な量の少なくとも１つのクマリン化合物を投与することを含む、対象の癌を治療、予防または抑制する方法を提供する。ただ１つのクマリン化合物が投与される場合、前記クマリン化合物は、クマリン、７−ヒドロキシクマリン、ワルファリン、またはワルファリンナトリウムではない。
【０００９】
本発明はまた、対象における微小管形成または微小管機能に付随する疾患または異常を治療、予防または抑制するキットを提供する。前記キットは、抗腫瘍薬、抗増殖薬、抗炎症薬または抗真菌剤の少なくとも１回投与量と一緒に包装されてある少なくとも１つのクマリン化合物の少なくとも１回投与量を含む。前記キットはさらに、使用についての指示、皮下注射針のような薬剤の送達装置、またはその両者を含んでいてもよい。
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明はどちらも例示的、また説明上のものであり、請求の範囲で示した本発明の更なる説明を提供しようとするものであることが理解されなければならない。添付の図面は本発明の更なる理解を提供するために包含され、本明細書の部分を構成し、本発明のいくつかの実施態様を示し、本明細書の記載と併せて本発明の原理を説明するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
最近になって、クマリン化合物は、微小管の分解を抑制、防止、若しくは調節し、チューブリンの重合若しくは微小管の集合を促進し、またはそれらの組合せをもたらすことが見出されてきた。したがって、本発明は、微小管の形成、機能、もしくはその組み合わせを調節する方法を提供する。本発明はまた、微小管形成、微小管機能またはその両者に関連する疾患および異常を治療、予防または抑制する方法を提供する。微小管形成、微小管機能またはその両者に関連する疾患および異常には、癌、真菌性疾患（例えばカンジダおよびアスペルギウス）、嚢胞、アルツハイマー病、痛風、マラリア、アテローム性硬化症、再狭窄、慢性炎症、慢性関節リウマチ、乾癬、糖尿病性網膜症、慢性塞栓性肺疾患、結核、慢性胆嚢炎、変形性関節症、リウマチ性心臓炎、気管支拡張症、橋本甲状腺炎等が含まれる。本明細書で用いられるように、「付随する」または「関連する」という語句は、微小管形成、微小管機能もしくはその組合せに対し、影響を与えるかまたは調節を及ぼすことによって治療、予防または抑制できる疾患または異常を指す。
【００１１】
微小管の重合も促進するタキサン以外の、よく調べられている抗有糸分裂剤（例えばコルヒチン、ビンカアルカロイド、クリプトフィシン）は、高濃度で微小管の集合を抑制する。（参照により本明細書に含まれるWilson et al. (1995) Chemistry & Biology 2:569-573を参照されたい）タキソールは、微小管にその長軸に沿って直接結合することによって機能し、微小管を安定化させ、さらにまた可溶性チューブリンを集合させて微小管を形成させる。
【００１２】
チューブリンタンパク質と相互作用する抗有糸分裂剤は、ヒトの新生物疾患および炎症性疾患の治療に使用できる可能性ゆえに興味深い。ポリマーの分解を妨げる薬剤（パクリタキセルおよびドセタキセル）の臨床的な成功によって、同様な作用メカニズムをもつ薬剤に対する興味が高まった（参照により本明細書に含まれるRwoinsky & Donehower (1995) N. Engl. J. Med. 332(15):1004-1014、を参照されたい）。一方、ジクマロールの作用はタキソールと類似するが、ジクロマロールのチューブリンとの結合の分子的詳細は独特である。両化合物は、短縮速度を顕著に抑制し、減衰に費やされる時間を増やすことによって微小管の動的変化を安定化させ、カタストロフィ頻度を減少させ、また伸長速度に対しては顕著な影響を与えない。前記のような安定な微小管は脱重合することができず、したがって有糸分裂および細胞分裂に必要な正常な動的組織化が破壊される。しかしながら、タキソールと比較して、微小管に対する作用において、ジクマロールがタキソールと顕著に異なる点は、タキソールはチューブリン二量体ではなく微小管に優先的に結合するという点である（Sackett & Fojo (1997) Cancer Chemother. Biol. Response Modif. 17:59-79、この文献は参照により本明細書に含まれる）。一方、ジクマロールは遊離チューブリンサブユニットと結合する。さらに、タキソールは効果的に重合核を形成し、微小管の集合を強化するが、一方ジクマロールはそうではない。このことは、ジクマロールが微小管安定化においてタキソールとは異なる作用メカニズムを有することを示しており、組合せ治療法を生み出す上で有用となりうる。
【００１３】
最近の臨床試験は、公知の抗有糸分裂剤の組合せによって抗腫瘍活性が増加し毒性が減少することを示した。（以下を参照されたい：Hudes et al. (1997) J. Clin. Oncol. 15(9)3156-3163; Hudes et al. (1992) J. Clin. Oncol. 10(11):1754-1761; およびSeidman et al. (1992) J. Urol. 147(3 Pt 2):931-934、これらの文献は参照により本明細書に含まれる。）異なるメカニズムによって微小管の動的変化を安定化させる薬剤の組合せ療法は、反応を改善し個々の薬剤の副作用を最小限にできるかもしれない。このことは、アリウム＝サティブム（Allium sativum）の根の先端の分裂組織細胞に対してパクリタキセルとクマリンとの組合せは抗有糸分裂活性を増加させ、細胞毒性および染色体異常誘発はパクリタキセル単独使用時よりも低いことを示した実験によって支持される。（以下を参照されたい：Zobel & Schellenberger (2000) Pharmaceutical Biology 38(3):192-196、本文献は参照により本明細書に含まれる）。パクリタキセルとクマリンとの組合せによる抗有糸分裂活性の増加は、これら薬剤が協調的に機能し、化学療法剤として使用できる可能性を有することを示唆している。クマリンは毒性が低く単純な化学構造を有するので、クマリン化合物は他の化学療法剤および／または生物学的薬剤と組合せて、抗有糸分裂活性が所望される種々の治療の有効性を改善することができる。したがって、少なくとも１つのクマリン化合物と他の微小管安定化剤との組合せが臨床上所望される。
【００１４】
本明細書で述べるように、クマリン化合物もまた微小管を安定化させ、微小管集合反応を強化するが、クマリン化合物は公知の他のいかなる微小管標的薬剤とも異なる態様で微小管に作用すると考えられる。したがって、クマリン化合物は、微小管を安定化させ、微小管集合反応を強化する新規な種類の化合物を代表する。
クマリン化合物は、ピロンと結合したベンゼン環を含むベンゾピロン類に属する天然に存在する有機化合物である。（以下を参照されたい：Coumarins: Biology, Applications and Mode of Action. Eds, O' Kennedy and Thornes, John Wiley & Sons, NY (1997)、この文献は参照により全体が本明細書に含まれる）。本明細書で用いられるように、本発明のクマリン化合物は、ベンゾ−α−ピロンまたはα−ピロンと結合したベンゼン環を含む化合物である。クマリン化合物は広範囲の植物で共通に見出される。クマリン化合物の生合成経路は多くの植物および微生物で異なり、シキミ酸−フェニルアラニン経路、ポリケタイド経路およびヒドロキシ桂皮酸塩経路が含まれる。クマリン化合物はまた様々な種において異なる様式で代謝される。例えば、ヒトでの主要な代謝経路は、チトクロームＰ４５０酵素であるＣＹＰ２Ａ６によって触媒される７−ヒドロキシル化であり、ラットでは肝臓による７−ヒドロキシル化はほとんど見られない。
【００１５】
クマリンは単純な分子で、その誘導体の多くが疾患を防ぎ、増殖系および防御系を調節することが報告されているが、植物および動物の生体におけるそれらの役割は完全には解明されていない。タキソールと異なり、７−ヒドロキシクマリンなどのクマリン化合物は毒性が低い（Cox et al. (1989) Human Toxicology 8(6):501-506; D. Egan et al. (1990) Drug Metab. Rev. 22:503-529; M.E. Marshall et al. (1989) Cancer Chemother. Pharmacol. 24:65-66、これらの文献は参照により本明細書に含まれる）。例えば、本明細書に開示するように、クマリン化合物は、タキソール様化合物ほどには強力ではないか、またはタキソール様化合物ほどには毒性が強くないことが判明した。したがって、クマリン化合物は、タキソールおよび微小管形成、微小管機能またはその両方に影響を与えるその他の薬剤に代わって、またはこれらの薬剤と組み合わせて、微小管形成または微小管機能に関連する疾患および異常を治療、予防または抑制するために用いることができる。クマリン化合物は、癌並びに他の増殖性疾患および異常の治療、予防または抑制のための補助治療として用いることができる。
【００１６】
さらに、タキソール療法の期間はタキソールの毒性により制限されるので、クマリン化合物の投与と組み合わせることで、より低い投与量のタキソールを用いてより長い期間にわたる治療を実施することができる。したがって、微小管形成または微小管機能に付随する疾患または異常をもつ対象は通常は、所定の期間、所定の量の対象にとって毒性を示す化合物で治療されるが、クマリン化合物とより低用量の前記所定の化合物とを併用して前記所定の期間もしくはさらに長い期間治療することが可能であり、またはクマリン化合物と前記所定の化合物とを用量を変えないでより短期間併用することも可能である。
【００１７】
例えば、癌に罹患している対象は、通常はタキソール約４００ｍｇから約７０００ｍｇ／日／ｋｇ体重で約２週間または３週間毎に処置される。重篤な好中球減少症または神経障害をもつ対象のタキソール投与量は一般に約２０％減らされる。減少量のタキソールで治療される対象にはある量の、ジクマロールなどのクマリン化合物を投与することが可能で、タキソールとクマリン化合物の併用により、通常のタキソールのみを通常量で用いた場合の治療効果と同様の治療効果が得られる。あるいは、クマリン化合物と併用しながら量を減らしたタキソールで２週間または３週間毎よりも高い頻度で対象を治療できる。タキソール単独を通常量用いる場合に処方される治療期間よりも長い期間にわたって、タキソールおよびクマリン化合物の両者で対象を治療することもできる。したがって、癌などの慢性疾患は、タキソールなどの抗腫瘍薬とクマリン化合物を用いて約１日から一生涯のような長期間に及ぶ時間範囲の中で治療することができる。
癌の対象が通常の化学療法を受けているか、または受けていた場合にクマリン化合物を投与する方法では、前記クマリン化合物は、抗凝固特性を示さないが、微小管形成または微小管機能の抑制、防止、調節、減弱、安定化を行うか影響を及ぼす、７−ヒドロキシクマリンなどの化合物であることが好ましい。
【００１８】
クマリン化合物の抗有糸分裂特性に関する予備実験では、いくつかのクマリン化合物（クマリン、ジクマロール、７−ヒドロキシクマリンおよびワルファリン）は、Ｓ．プルプラツス（S. purpuratus）の胚の第一回目の卵割を抑制した（図１−４参照）。卵割の５０％最大抑制に必要な濃度は、ジクマロールの約４μＭから７−ヒドロキシクマリンの約４０μＭまでばらつく（図１−４参照）。これらの実験から、クマリン化合物は、第一回の有糸分裂に必須である微小管に作用することによって細胞分裂を抑制できることを示している。
受精したウニ卵は薬剤の作用メカニズムを研究するための有用な実験モデルである。同時に受精した卵は多数の高度に同調した卵割（一般に薬剤で誘発された哺乳類細胞培養よりも優れている）を行い、それによって薬剤に誘発された細胞周期の進行の遅れを迅速に特定できる。さらに、ウニ培養系における最初の細胞周期は、紡錘体の毒物に対してきわめて高い薬理学的選択性を示すが、一方他の一般的な抑制メカニズムによって作用する薬剤に対しては比較的感受性が低い。
【００１９】
ジクマロールが細胞周期の特定の時期に作用するのかどうかを決定するために、ウニの胚を受精後、段階的な経過時点でジクマリンに暴露した。前記方法を用いて、細胞周期のいずれの相もクマリン化合物に対して感受性または非感受性であるかを特定できる。紡錘体に対する毒物同様、細胞の有糸分裂を阻害するジクマロールの能力を調べた。最初の有糸分裂は典型的には受精後約７０分から約９０分で生じ、細胞質分裂は通常約１２０分の時点で終了して２つの割球を生じる。最初の卵割が完了する以前の種々の時間に受精胚にジクマロールを添加することによって、最初の細胞分裂を抑制するジクマロールの能力はジクマロールが中期（９０分）の後で添加された場合は阻止されることが見出された（図５参照）。これらの結果は、ジクマロールなどのクマリン化合物は、有糸分裂の前中期／中期で細胞周期の進行を選択的に抑制し、Ｍ期開始前のいかなる出来事もクマリン化合物の活性に必須ではないことを示唆している。
【００２０】
したがって、代表的なクマリン化合物である、クマリン、７−ヒドロキシクマリン、ジクマロール、エスクレチンおよびワルファリンについて、in vitroでのチューブリン重合による微小管形成に対するそれらの影響、さらに個々の微小管の伸長および短縮動態に対するそれらの影響をさらに調べた。チューブリンおよび微小管をビデオ顕微鏡法によって観察し評価したが、光散乱アッセイや沈降アッセイなどの当技術分野で公知の他の方法を用いてもよい。これらの実験によって、クマリン化合物はチューブリンおよび微小管の重合をin vitroで刺激することが示された。
例えば下記の表１に示すように、約０．１μＭのジクマロールが１１の個々の微小管の伸長および短縮動態に影響を与える。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
具体的には、１μＭのジクマロールでは、平均短縮速度は、約１８．５μｍ／分から約７．８μｍ／分に約５８％顕著に減少し、さらに短縮の変位の長さは、約２．３μｍから約１．４μｍまで約４０％減少した（図６参照）。以前の結果は、平均短縮速度は、約１８．５μｍ／分から約５．２μｍ／分に約７２％顕著に減少し、さらに短縮の変位の長さは、約２．３μｍから約１．６μｍまで約３０％減少することを示した。定常状態での短縮速度に対するこの強力な抑制は、ジクマリンなどのクマリン化合物は短縮速度を抑制することによって微小管を安定化させることを示している。短縮速度は、微小管の長軸に沿ってまたは微小管の末端でチューブリンに結合したクマリン化合物に誘発される構造的変化によって、チューブリンサブユニットと近傍のプロトフィラメントとの間の側面での相互作用を強化することによって抑制することができる。
【００２３】
微小管は、不安定なチューブリン−ＧＤＰコアと微小管末端の安定なチューブリン−ＧＴＰ（またはＧＤＰ−Ｐｉ）キャップを含む。キャップの消失は不安定なコアを露出させ、微小管は容易に分解する。カタストロフィ頻度およびレスキュー頻度は、微小管末端での安定化ＧＴＰキャップまたはＧＤＰ−Ｐｉキャップの喪失または獲得を反映させる重要なパラメーターである。伸長または減衰から短縮への移行は“カタストロフィ”と呼ばれ、短縮から伸長又は減衰への移行は“レスキュー”と呼ばれる（Walker et al.(1988) J. Cell Biol. 107:1437-1448、この文献は参照により本明細書に含まれる）。図７に示すように、ジクマロールは、約０．１μＭという低い濃度で約０．６２μｍから約０．２２μｍに約６５％カタストロフィー頻度を減少させ、さらに約０．１μＭの濃度で休止（減衰）状態にある時間全体のパーセンテージを約６３％増加させる。前記の休止とは、微小管末端の伸長または短縮が検出されない時間である。
【００２４】
以前の実験で、ジクマロールは、約０．１μＭという低い濃度でカタストロフィ頻度を約６２μｍから約０．３１μｍに約５０％減少させ、さらに約０．１μＭの濃度で減衰状態の時間全体のパーセンテージを約６４％増加させることが示された。以前の実験ではまた、ジクマロールは、カタストロフィ頻度を約０．７５μｍから約０．２１μｍに約７２％減少させ、レスキュー頻度は約２７％減少させ、さらに休止（減衰）状態の時間全体のパーセンテージを約３３．８％から約４７．２４％に増加させることが示された。
【００２５】
カタストロフィはチューブリン−ＧＤＰ−Ｐｉまたはチューブリン−ＧＴＰの最後の分子が失われるときに発生し、レスキューは、１つまたは数分子のチューブリン−ＧＴＰが迅速に短縮している微小管の末端の好ましい領域に結合することによって開始されうる。ジクマロールは、ＧＴＰの加水分解後のＰｉ放出速度を低下させるか、またはチューブリン−ＧＤＰの分解速度と比較して複合体−ＧＤＰの分解速度を低下させることによって、またはその両方によってカタストロフィ頻度を低下させたのではないかと考えられる。そのような作用は、クマリン化合物の結合によってチューブリンに誘発された構造的変化によるものであろう。したがって、ジクマロールは、安定化ＧＴＰまたはＧＤＰ−Ｐｉキャップに直接作用しているかもしれない。ジクマロールはレスキュー頻度を顕著には変化させず、したがって、ジクマロールは失われたキャップの再獲得には直接影響を与えないと考えられる。これは、微小管末端におけるジクマロールの存在またはジクマロールの結合による立体的妨害のためにＧＴＰ−チューブリンの付加が抑制され、キャップの再獲得を妨げるためかもしれない。
【００２６】
カタストロフィ頻度に対する強い影響は、ジクマロールなどのクマリン化合物は、ＧＴＰ加水分解またはＰｉ遊離の速度を低下させることによってキャップに直接作用することを示している。したがって、チューブリン−ＧＤＰ結合ジクマロールは、ジクマロールにより誘発される、安定化チューブリン−ＧＴＰキャップの構造に類似するチューブリン構造への変化のために、非結合チューブリン−ＧＤＰよりもゆっくりと分解するのかもしれない。タキソール様化合物はキャップを直接変化させることはないので、クマリン化合物は、タキソール様化合物とは異なる様式で微小管を安定化させている可能性が高い。したがって、クマリン化合物は、タキソールと併用して二重の効果または協調効果を提供することができよう。
【００２７】
種々のジクマロール濃度では、平均伸長速度または伸長の長さに顕著な変化はなかった。したがって、ジクマロールは、微小管の短縮速度および短縮される長さを強く低下させるが、微小管の伸長速度または伸長の長さには影響しない。さらに、動的変化性は、約０．１μＭのジクマロール濃度で、約５７％減少した（以前の結果では約６４％であった）（図８参照）。“動的変化性（Dynamicity）”とは、微小管末端のチューブリンサブユニットの獲得と消失（出入）の合計であり、動的不安定性全体の尺度である。動的不安定性は、減衰状態で費やされる時間を含む検出可能な全ての伸長および短縮の挙動から計算される（以下を参照されたい：Toso et al. (1993) Biochem. 32(5):1285-1293; Panda et al. (1994) PNAS USA 91(24):11358-11362、これら両文献は参照により本明細書に含まれる）。したがって、１μＭでは、微小管が短縮する挙動の速度および短縮される長さは抑制され、休止時間のパーセンテージは増加し、微小管の全体的な動的変化性は抑制された。ジクマロールは、微小管が減衰（休止）状態で費やす時間のパーセンテージを約６４％（約０．１μＭ）顕著に増加させ、短縮期で費やされる時間のパーセンテージを減少させ、伸長期で費やされる時間のパーセンテージを減少させた。したがって、ジクマロールのようなクマリン化合物は、微小管の伸長および短縮の動的変化を抑制、防止または調節する。
【００２８】
ジクマロールの微小管集合に対する影響は図９に示されている。ジクマロールの存在下では（０μＭ−８０μＭ）、チューブリン（１２μＭ）が重合する速度および程度は、濃度に依存して増加するようである。濁度は徐々に増加し、インキュベーション４５分後にも定常状態に達しなかった。電子顕微鏡による解析を実施し、ジクマロールの存在下１０、２０および４５分で重合プロセスにより形成されたポリマーの形態を調べた。ジクマロール含有サンプルでは、１０および２０分重合後に微小管は形成されなかった。多様なサイズの広範囲のチューブリン凝集物をみることができただけであった。しかしながら、重合を４５分まで延長させた場合は１００μＭのジクマロールの存在下で微小管が生成した。軸糸種（axonemal seeded）微小管を用いて電子顕微鏡による解析を繰返した。結果は、微小管集合反応を誘導する能力は顕著には増加しないことを示した。しかしながら、軸糸種をもつ微小管の存在下でジクマロールを用いて形成されたポリマーの電子顕微鏡写真は、２０μＭの濃度で実際の微小管の構造を示した。これらの結果は、ジクマロールは微小管の重合核構造の存在下または非存在下で微小管の重合を弱く誘導することを示している。
【００２９】
ジクマロールによるチューブリンの集合誘導を、種々のジクマロール濃度において軸糸種をもつ微小管の沈降アッセイを行いさらに調べた（図１０参照）。低濃度（１０μＭ未満）のジクマロールの存在下での微小管の重合は、コントロールと比較して、形成されるポリマー質量に顕著な影響は与えなかった。５０μＭのジクマロールでは、ポリマー質量は約１６％増加した。１００μＭを超えるジクマロール濃度では重合の顕著な誘導がみられた。微小管が「軸糸種」の存在下で重合した場合にも同様な結果が得られた。
具体的には、ポリマー質量アッセイを用いることによって、ジクマロールの存在下３７℃で精製ウシ脳チューブリンを集合させてポリマー質量の定常状態を得た。「定常状態」とは、集合微小管と平衡状態のチューブリンの濃度である。純粋なチューブリンは３７℃においてマグネシウムとＧＴＰが存在すれば、試験管内で重合して微小管を形成する。重合は、臨界濃度（定常状態）に達するまで持続し、この濃度で遊離チューブリンの最終濃度はプラトーに達し、重合と脱重合の速度が均衡する。続いて、微小管を非重合チューブリンから沈降によって分離し、上清のタンパク質濃度（遊離チューブリン）をブラッドフォード法（M.M. Bradford (1976) Anal. Biochem. 72:248-354、この文献は参照により本明細書に含まれる）によって決定した。
【００３０】
興味深いことには、微小管重合を刺激するジクマロールの能力は、微小管の動的変化を安定化させるその能力に較べて比較的弱い。ジクマロールの濁度および沈降アッセイはポリマー質量に対する影響がほとんど無いことを示した。電子顕微鏡写真は、高濃度のジクマロール（１００μＭ）では軸糸の非存在下でチューブリン凝集物が形成され、実際の微小管構造はほとんど観察されないことを示した。これらのデータは、ジクマロールのチューブリン集合促進効果（重合核形成）は弱いが、微小管の動的変化を強力に安定化させ、したがってポリマーの分解を防止することを示唆している。ジクマロールがin vitroと同じように細胞内で微小管の動的変化を抑制するならば、この速度論的安定化は紡錘体微小管が動原体に到達し、それらを中期板に整列させるのを妨げるかもしれない。
【００３１】
微小管の動的変化のこの抑制の性質を調べるために、細胞内における微小管の形態に対するジクマロールの影響を調べた。微小管の動的変化は、細胞が間期から有糸分裂に移行するに際して２０から１００倍増加する（Saxton et al.(1984) J. Cell Biol. 99(6):2175-2186、この文献は参照により本明細書に含まれる）。有糸分裂の前中期では、紡錘体極を重合核とする微小管は、細胞質内を探索し、染色体の動原体と接触するために、伸長期および短縮期を経る（Hayden et al.(1990) J. Cell Biol. 111(3):1039-1045、この文献は参照により本明細書に含まれる）。中期から後期への移行には、十分な張力または適切な数の微小管と動原体との結合が必要であり、微小管に結合していな動原体はいずれも、後期に進行する前に有糸分裂が終了するのを妨げる拡散性シグナルを生成する。ジクマロールが微小管の動的変化を細胞内においてもin vitroの場合と同じように抑制するならば、この速度論的安定性は、紡錘体微小管が動原体に到達し、それらを中期板に整列させるのを妨げるかもしれない。ＦＩＴＣ共役チューブリン抗体およびＤＡＰＩ染色を用いて微小管と染色体の構造を調べることによって、ジクマロール処理胚の染色体および紡錘体微小管は顕著に変化することが示された。これらの細胞の微小管はコントロールと比較してはるかに長かった。さらに、染色体は中期板に集まらず、無傷の核エンベロープ内に留まっているようであった。
【００３２】
クマリン化合物はまた紡錘体の組織化をもたらすことが見出された。具体的には、約２０時間一定範囲の濃度のジクマロールと共に培養されたＨｅＬａ細胞は、有糸分裂を中期から後期の移行時で停止した。続いてこれらの細胞を固定し、蛍光顕微鏡用に処理し、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ；核、ＤＮＡ染色）を用いてクロマチンまたは染色体の配置を、さらに抗チューブリン免疫蛍光抗体を用いて微小管の配置を決定した。微小管の間接免疫蛍光染色およびクロマチンの４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール染色を用いて、細胞の細胞周期分布並びに中期紡錘体における微小管および染色体の構造に対するクマリン化合物の影響を調べた。ＦＩＴＣ共役チューブリン抗体染色による微小管の構造についての調査は、ジクマロールは低濃度では間期細胞質微小管の構造に識別可能な変化を生じないことを示した。高濃度（約１０μＭ）では、ジクマロールは、ＨｅＬａ細胞で紡錘体微小管の異常な組織化をもたらした（図１１Ｃ参照）。コントロール細胞では、中期紡錘体は二極性で、凝縮染色体で構成された密集赤道板を含んでいた（図１１Ａおよび１１Ｂ参照）。約１０μＭのジクマロールでは、多くの紡錘体の構造は異常であった。例えば、紡錘体は三極性または多極性であり、中期板に集合せず紡錘体極の近傍に配置された染色体を含んでいた（図１１Ｄ参照）。中期板に集合できないのは、微小管が動原体を捕捉できないか、または染色体集合時に適切に伸長できないことによるのであろう。
【００３３】
これらの実験から、ビンブラスチンおよびタキソールの作用と比較して、ジクマロールなどのクマリン化合物の微小管に対する作用は顕著に異なることが観察された。ビンブラスチンおよびタキソールとは異なり、高濃度のジクマロールは微小管束の形成またはチューブリンの疑似結晶の形成を誘発しない。このことは、ジクマロールなどのクマリン化合物は、ビンブラスチンおよびタキソールとは異なる様式で微小管に影響を与えるかまたは相互作用することを示唆している。
ジクマロールの結合はチューブリンの蛍光特性を利用して決定した。チューブリンはトリプトファン含有タンパク質である。励起されたとき、チューブリンは典型的なトリプトファン発光スペクトルを示す。励起波長は、チューブリンのトリプトファン残基を特異的に励起させるように選ばれた。相対的蛍光強度を測定し、緩衝液ブランクを全ての測定値から差し引いた。チューブリンを種々の濃度のジクマロールとともにインキュベートすることによって、ジクマロールの結合とチューブリンの蛍光消光（クエンチング）との間に濃度依存性があるか否かを決定した（Panda et al.(1992) Eur. J. Biochem. 204:783-787; Panda et al.(1997) PNAS USA 94:10560-10564; およびPanda et al,(1997) J. Biol. Chem. 272:7681-7687、これらの文献は参照により本明細書に含まれる）。
【００３４】
下記の実施例５で詳細に説明するように、ジクマロールの結合とチューブリンの蛍光消光は濃度依存的であると決定された。データを分析し、１／アルファ対１／遊離薬剤としてプロットして（アルファ＝結合部位の占有度）、勾配を求め、ジクマロールの解離定数Ｋdとして８．７２μＭを得た（図１２参照）。
本明細書で述べるように、クマリン化合物は、チューブリンポリマーを安定化させ、微小管の集合反応を強化する、独自の構造を持つ新規の化合物群の代表である。クマリン類は、in vitroでチューブリンの重合を誘導し微小管を形成することについてはタキソール様化合物に似ていない。本明細書で説明されるように、タキソール化合物と同じように、クマリン化合物は微小管を安定化させるが、しかしながら安定化はおそらくタキサン類とは異なる様式で行われる。本明細書で開示するように、クマリン化合物は、紡錘体を適切に集合させ、中期／後期のチェックポイントを通過して子孫細胞を産生する癌細胞などの細胞の能力に影響を与える態様で、微小管の動的変化を抑制し、阻止し、または調節する。微小管の伸長および短縮の動的変化のクマリン化合物による抑制は、両紡錘極から発する微小管が動原体に到達できないために、いくつかの染色体が中期板に集合できなくする可能性があるので、クマリン化合物は、微小管形成、微小管機能またはその両方に関連する疾患または異常の治療、予防または抑制に用いることができる。
【００３５】
したがって、本発明は、微小管形成および微小管機能に付随する疾患および異常を治療する方法において、そのコア構造または骨格構造として下記の基本構造式を有するクマリン化合物を提供する。
【００３６】
【化１】
2004527478.tif 000003
【００３７】
式中、ベンゼン環、ピロンまたはその両方は、少なくとも１つの置換基を含むことができる。好ましいクマリン化合物には、クマリン、ジクマロール、ウンベリフェロン、エスクレチン、ワルファリン、７−ヒドロキシクマリン、３，６，７−トリヒドロキシクマリンおよびその誘導体が含まれる。本明細書で用いられるように、クマリン化合物の「誘導体」には、クマリン骨格（ベンゾ−α−ピロン）を含む化合物が含まれる。
本明細書で用いられる用語および略語は、特に指定しないかぎり通常の意味を有する。本明細書を通して用いたいくつかの用語は下記に記載する。
当技術分野で一般的に用いられるように、下記の記号は、部分または置換基とコア構造または骨格構造との付着点である結合を表すために本明細書の構造式で用いられる：
【００３８】
【化２】
2004527478.tif 000004
【００３９】
化学構造内にキラル炭素が含まれる場合は、特に配向が示されていないかぎり、両立体異性体が包含される。
「アルキル基」は、飽和および／または不飽和炭素原子および水素原子で構成された直鎖または分枝鎖の一価ラジカル、例えばメチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、プロピル（Ｐｒ）、イソプロピル（ｉ−Ｐｒ）、ブチル（Ｂｕ）、イソブチル（ｉ−Ｂｕ）、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、エテニル、ペンテニル、ブテニル、プロペニル、エチニル、ブチニル、プロピニル、ペンチニル、ヘキシニルなどを意味し、これらアルキル基は置換されてなくても（すなわち炭素および水素のみを含む）、または下記に定義する１つまたは２つ以上の置換基（例えば１つまたは２つ以上の、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩなどのハロゲンであり、ＦおよびＣｌが好ましい）で置換されていてもよい。「低級アルキル基」は１つから８つの炭素原子をその鎖内に有するアルキル基を指す。
【００４０】
「シクロアルキル基」は、３−１４の炭素環原子を含む非芳香族一価の単環式、二環式、または三環式ラジカルを指し、どれも飽和でも不飽和でもよく、さらに前記は置換されてなくても、また下記に定義されるような１つまたは２つ以上の適切な置換基によって置換されていてもよく、さらに、それら自身置換されてなくても１つまたは２つ以上の置換基で置換されていてもよい１つまたは２つ以上のヘテロシクロアルキル基、アリール基、またはヘテロアリール基が縮合していてもよい。シクロアルキル基を例示すれば、以下の部分が含まれる：
【００４１】
【化３】
2004527478.tif 000005
【００４２】
「ヘテロシクロアルキル基」は、３−１８個の原子を環の要素として含む、飽和または不飽和の非芳香族一価の単環式、二環式、または三環式ラジカルを指し、ここでこのラジカルは窒素、酸素および硫黄から選択される１−５個のヘテロ原子をふくみ、置換されてなくても、また下記に定義される１つまたは２つ以上の適切な置換基によって置換されていてもよく、それ自身置換されてなくても１つまたは２つ以上の適切な置換基で置換されていてもよい１つまたは２つ以上のシクロアルキル基、アリール基、またはヘテロアリール基が縮合していてもよい。ヘテロシクロアルキル基を例示すれば、以下の部分が含まれる：
【００４３】
【化４】
2004527478.tif 000006
【００４４】
“アリール基”は、６、１０、１４または１８個の環構成炭素を含む芳香族一価の単環式、二環式または三環式ラジカルを指し、ここでこのラジカルは置換されてなくても、また下記に定義される１つまたは２つ以上の適切な置換基によって置換されていてもよく、さらにそれ自身置換されてなくても１つまたは２つ以上の適切な置換基で置換されていてもよい１つまたは２つ以上のシクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、またはヘテロアリール基が縮合していてもよい。したがって、“アリール基”にはベンジル基（Ｂｚｌ）が含まれる。アリール基を例示すれば、以下の部分が含まれる：
【００４５】
【化５】
2004527478.tif 000007
【００４６】
“ヘテロアリール基”は、４−１８個の原子を環の要素として含む、芳香族一価の単環式、二環式、または三環式ラジカルを指し、ここでこのラジカルは窒素、酸素および硫黄から選択される１−５個のヘテロ原子をふくみ、置換されてなくても下記に定義される１つまたは２つ以上の適切な置換基によって置換されていてもよく、さらにそれ自身置換されてなくても１つまたは２つ以上の適切な置換基で置換されていてもよい１つまたは２つ以上のシクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、またはアリール基が縮合していてもよい。ヘテロアリール基を例示すれば、以下の部分が含まれる：
【００４７】
【化６】
2004527478.tif 000008
【化７】
2004527478.tif 000009
【００４８】
「複素環」とは、ヘテロアリール基またはヘテロシクロアルキル基を指す（どちらも上記で定義したように場合によっては置換されている）。
「アリール」（Ａｒ）および「ヘテロアリール」という用語は単環式および多環式不飽和環構造または芳香環構造を指し、「アリール」は炭素環であるものを指し、「ヘテロアリール」は複素環であるものを指す。芳香環構造の例には、フェニル、ナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、フリル、チエニル、ピロリル、ピリジル、ピリジニル、ピラゾリル、イミダゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、１，２，３−トリアジニル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、１−Ｈ−テトラゾール−５−イル、インドリル、キノリニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル（チアナフテニル）などが含まれる。
「アシル基」は、−Ｃ（Ｏ）−Ｒaラジカルを意味する（式中Ｒaは、下記に定義する適切な置換基である）。
「チオアシル基」は、−Ｃ（Ｓ）−Ｒaラジカルを意味する（式中Ｒaは、下記に定義する適切な置換基である）。
「スルホニル基」は、−ＳＯ2−Ｒaラジカルを意味する（式中Ｒaは、下記に定義する適切な置換基である）。
【００４９】
「ヒドロキシル基」はラジカル−ＯＨを意味する。
「アミノ基」はラジカル−ＮＨ2を意味する。
「アルキルアミノ基」は−ＮＨＲaラジカルを意味する（式中Ｒaはアルキル基である）。
「ジアルキルアミノ基」はＮＲaＲbラジカルを意味する（式中ＲaおよびＲbは各々独立にアルキル基である）。
「アルコキシル基」は−ＯＲaラジカルを意味する（式中Ｒaはアルキル基である）。典型的なアルコキシル基には、メトキシ、エトキシ、プロポキシなどが含まれる。
「アルコキシカルボニル基」は、ラジカル−Ｃ（Ｏ）ＯＲaを意味する（式中Ｒaはアルキル基である）。
「アルキルスルホニル基」は、ラジカル−ＳＯ2Ｒaラジカルを意味する（式中Ｒaはアルキル基である）。
「アルキルアミノカルボニル基」は、ラジカル−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲaを意味する（式中Ｒaはアルキル基である）。
「ジアルキルアミノカルボニル基」は、ラジカル−Ｃ（Ｏ）ＮＲaＲbを意味する（式中ＲaおよびＲbは各々独立にアルキル基である）。
「メルカプト基」はラジカル−ＳＨである。
「アルキルチオ基」は−ＳＲaラジカルを意味する（式中Ｒaはアルキル基である）。
「カルボキシル基」はラジカル−Ｃ（Ｏ）ＯＨを意味する。
「カルバモイル基」は、ラジカル−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2を意味する。
「アリールオキシ基」は、ラジカル−ＯＲcを意味する（式中Ｒcはアリール基である）。
「ヘテロアリールオキシ基」は、ラジカル−ＯＲdを意味する（式中Ｒdはヘテロアリール基である）。
「アリールチオ基」は、ラジカル−ＳＲcを意味する（式中Ｒcはアリール基である）。
「ヘテロアリールチオ基」は、ラジカル−ＳＲdを意味する（式中Ｒdはヘテロアリール基である）。
【００５０】
「脱離基」（Ｌｖ）は、置換反応によって置き換えられる任意の適切な基である。当業者は強酸の共役塩基はどれも脱離基として機能できることを知っているであろう。適切な脱離基を例示すれば、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、塩化アルキル基、臭化アルキル基、ヨウ化アルキル基、アルキルスルホン酸基、アルキルベンゼンスルホン酸基、アルキルｐ−トルエンスルホン酸基、アルキルメタンスルホン酸基、トリフレート、および重硫酸イオン、メチル硫酸イオンまたはスルホン酸イオンを有する任意の基が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
「保護基」は、１つまたは２つ以上の内在する官能基を不適切な反応から保護する基を指す。当業者は、官能性および化合物構築に用いられる特定の化学手法を考慮して適切な保護基を定型的に選択することができる。適切な保護基の例は、例えば以下の文献に記載されている：Greene & Wultz, Protecting Groups in Organic Synthesis, 2ndedition, John Wiley and Sons, New York, New york (1991)。
「適切な有機部分」という用語は、当業者が例えば定型的な検査によって本発明の化合物の抑制活性に悪影響を与えないと認識できる任意の有機部分を意味する。適切な有機部分を例示すれば、ヒドロキシル基、アルキル基、オキソ基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アシル基、スルホニル基、メルカプト基、アルキルチオ基、アルコキシ基、カルボキシル基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルバモイル基、アリールチオ基、ヘテロアリールチオ基等が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００５１】
一般に、前記式で表される多様な化合物に対応する多様な部分又は官能基は、１つまたは２つ以上の「置換基」によって「場合によって置換」されていてもよい。「置換基」または「適切な置換基」という用語は、例えば定型的な試験により当業者が認識または選択することができる任意の適切な置換基を意味する。有用な置換基の例は、以下の例示化合物で見出されるものの他に、ハロゲン（クロロ、ヨード、ブロモ、またはフルオロ）；Ｃ1-6−アルキル；Ｃ1-6−アルケニル；Ｃ1-6−アルキニル；ヒドロキシル；Ｃ1-6−アルコキシ；アミノ；ニトロ；チオール；チオエーテル；イミン；シアノ；アミド；ホスホナート；ホスフィン；カルボキシル；カルボニル；アミノカルボニル；チオカルボニル；スルホニル；スルホンアミン；スルホンアミド；ケトン；アルデヒド；エステル；酸素（＝Ｏ）；ハロアルキル（例えばトリフルオロメチル）；炭素環式シクロアルキル（単環式でも、縮合していても非縮合多環式でもよい（例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、またはシクロヘキシル））、またはヘテロシクロアルキル（単環式でも、縮合していても非縮合多環式でもよい（例えばピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニルまたはチアジニル））；炭素環式または複素環式の、単環または縮合したまたは非縮合多環式のアリール（例えばフェニル、ナフチル、ピロリル、インドリル、フラニル、チオフェニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、ピリジニル、キノリニル、イソキノリニル、アクリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチオフェニル、またはベンゾフラニル）；（第一、第二または第三）アミノ；ニトロ；チオール；チオエーテル、Ｏ−低級アルキル；Ｏ−アリール、アリール；アリール−低級アルキル；ＣＯ2ＣＨ3；ＣＯＮＨ2；ＯＣＨ2ＣＯＮＨ2；ＮＨ2；ＳＯ2ＮＨ2；ＯＣＨＦ2；ＣＦ3；ＯＣＦ3などである。そのような部分はまた、縮合環構造または架橋、例えばＯＣＨ2−Ｏによって場合により置換されていてもよい。前記置換基はいずれも場合によって例えば以下の基から選択される置換基でさらに置換されていてもよい：ヒドロキシル基、ハロゲン、オキソ基、アルキル基、アシル基、スルホニル基、メルカプト基、アルキルチオ基、アルキルオキシ基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、カルボキシル基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルバモイル基、アリールオキシ基、ヘテロアリールオキシ基、アリーリチオ基、ヘテロアリールチオ基など。
【００５２】
「場合によって置換される」という用語は、指定された基が置換されていないか、または（任意の置換基が明示的にに指定されていないかぎり）１つもしくは２つ以上の適切な置換基で置換されることを明示し、置換基が明示的に指定される場合は指定された置換基が置換されていないか、またはその指定された置換基で置換されていることを意味する。先に定義したように、（例えば指定された基は置換されないことを表示することによって）特に指定されないかぎり、種々の基は置換されていなくても、置換されていてもよい（すなわちそれらは場合によって置換される）。
【００５３】
本明細書の一般構造式を有するクマリン化合物は互変異性を示しうるが、本明細書中ではありえる互変異性形のうちの１つについての構造式のみを明示していることは理解されよう。したがって、本明細書中の構造式は表示された化合物が有する全ての互変異性形を表すよう意図したものであり、構造式によって示された特定の化合物形状のみに限定されることを意図したものでないことは理解されるなければならない。
さらにまた、前記構造式は、表示された化合物の有する全ての立体配置形を表すことを意図し、構造式によって表示された特定の化合物形状のみに限定されるものではないことも理解されよう。
クマリン化合物のいくつかは、単一の立体異性体として（すなわち他の立体異性体を本質的に含まない）、ラセミ体として、または鏡像体混合物、ジアステレオマー混合物もしくはその両方の混合物として存在することができる。前記全ての単一立体異性体、ラセミ体およびそれらの混合物は本発明の範囲内に包含される。好ましくは、光学的に活性なクマリン化合物は光学的に純粋な形態で用いられる。
【００５４】
当業者に一般的に理解されているように、１つのキラル中心（すなわち１つの不整炭素）を有する光学的に純粋な化合物は、本質的に２つの可能な鏡像体のうちの１つから成り（すなわち鏡像体として純粋であり）、さらに２つ以上のキラル中心を有する光学的に純粋な化合物は、ジアステレオマーとしても鏡像体としても純粋な化合物である。好ましくは、本発明の化合物が合成される場合、それらの用いられる形態は、光学的に少なくとも９０％純粋な形態、すなわち少なくとも９０％の単一異性体を含む形態（８０％の鏡像体過剰（ｅ．ｅ．）または８０％のジアステレオマー過剰（ｄ．ｅ．））、より好ましくは少なくとも９５％（９０％ｅ．ｅ．またはｄ．ｅ．）、さらに好ましくは少なくとも９７．５％（９５％ｅ．ｅ．またはｄ．ｅ．）、さらに好ましくは少なくとも９９％の単一異性体を含む形態（９８％ｅ．ｅ．またはｄ．ｅ．）である。
【００５５】
さらにまた、本明細書の構造式は、クマリン化合物の非溶媒和物の他に溶媒和物（存在する場合は）も包含することを意図している。「溶媒和物」とは、その化合物の生物学的効能を保持している、特定の化合物の薬学的に許容できる溶媒和形態を意味する。溶媒和物の例には、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、酢酸、エタノールアミン、またはアセトンと組み合わされたクマリン化合物が含まれる。さらに、溶媒和物混合物の混和性製剤、例えばアセトンおよびエタノール混合物と混合させた本発明の化合物も含まれる。したがって、構造式には、非水和の形態の表示された構造を有する化合物と共に、水和の形態の表示された構造を有する化合物が含まれる。
先に示したように、本発明の化合物はまた、クマリン化合物の活性な互変異性および立体異性形を含み、これらは当技術分野で公知の技術を用いて容易に得ることができる。例えば、光学的に活性な（Ｒ）および（Ｓ）異性体は、例えばキラルシントンおよびキラル試薬を用いて立体特異的合成により製造するか、またはラセミ混合物を通常の技術を用いて分離させてもよい。
【００５６】
本発明の医薬組成物は、クマリン化合物とは別にまたはクマリン化合物に加えて、活性な成分として薬学的に許容できる塩、プロドラッグまたはそれらの活性な代謝物を含むことができる。そのような化合物、塩、プロドラッグおよび代謝物は、本明細書ではときに包括的に「微小管安定化剤」と称される。このような非ペプチド薬剤は、良好な生体分布および生理的酵素による分解に対する耐性を与えるので、しばしばペプチド薬剤よりも薬学的に有利である。
「薬学的に許容できる塩」とは、特定の化合物の遊離酸および遊離塩基が有する実質的な生物学的効能を少なくとも保持し、さらに生物学的にまたは別の点で望ましくないものではない塩を指す。本発明の化合物は、十分に酸性、十分に塩基性の官能基またはその両方の官能基を有していてもよく、その場合したがって多数の無機または有機塩基および多数の無機および有機塩基と反応して、薬学的に許容できる塩を生成する。典型的な薬学的に許容できる塩には、本発明の化合物と鉱酸もしくは有機酸または無機塩基との反応によって調製される塩が含まれる。この様な塩には、例えば硫酸塩、ピロ硫酸塩、硫酸水素塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、蟻酸塩、アクリル酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオール酸塩、シュウ酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−二酸塩、ヘキシン−１，６−二酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、γ−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタン−スルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、およびマンデル酸塩などが含まれる。
【００５７】
クマリン化合物が塩基である場合は、望ましい薬学的に許容できる塩は、当技術分野で利用可能な任意の適切な方法、例えばクマリン化合物の遊離塩基と無機酸（例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など）または有機酸（例えば酢酸、リンゴ酸、コハク酸、マンデル酸、フマル酸、マロン酸、ピルビン酸、シュウ酸、グリコール酸、サリチル酸、ピラノシジル酸（例えばグルクロン酸またはガラクツロン酸）、アルファ−ヒドロキシ酸（例えばクエン酸または酒石酸）、アミノ酸（例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸）、芳香族酸（例えば安息香酸またはシンナミン酸）、スルホン酸（例えばｐ−トルエンスルホン酸またはエタンスルホン酸など）との処理によって製造できる。
クマリン化合物が酸の場合、望ましい医薬的に許容できる塩は、任意の適切な方法、例えばクマリン化合物の遊離酸と無機または有機塩基、例えば（第一、第二または第三）アミン、アルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物などとの処理によって調製できる。適切な塩の例には、アミノ酸（例えばグリシンおよびアルギニン）、アンモニア、第一、第二および第三アミン、並びに環状アミン（例えばピペリジン、モルフォリンおよびピペラジン）から誘導される有機塩、並びにナトリウム、カルシウム、カリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、アルミニウムおよびリチウムから誘導される無機塩が含まれる。
【００５８】
固体の安定化剤の場合、クマリン化合物および塩は種々の結晶または多形相として存在できることは当業者には理解されるが、それらの形態はいずれも本発明の範囲内に含まれる。
クマリン化合物の、微小管またはレセプターなどの標的との親和性は、好ましくはキャリアー成分によって提供される足場を用いることによって、極めて接近した状態で多数のリガンドコピーを提供することによって強化できる。クマリン化合物の活性形のそのような多価形態またはマルチマー形態は本明細書では“マルチマー”と称される。種々のサイズの、すなわち種々のコピー数のクマリン化合物を保持するマルチマーをテストして、標的との相互作用または結合に関して最適なサイズのマルチマーを得ることができる。レセプター結合部分同士の間隔を最適なものにしてある、活性なレセプター結合化合物のそのような多価形態を提供することによって、レセプターとの結合を強化することができる（Lee et al.(1984) Biochem. 23:4255）。当業者は、適切なキャリアー部分またはリンカーユニットを選択することによって価数および空間配置を制御できる。有用な部分には、本発明の活性化合物に付随する官能基と反応することができる多数の官能基を含む分子支持体が含まれる。多様なキャリアー部分を用いて、高度に活性なマルチマーを構築できる。その様なキャリアー部分には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）またはＨＡＳなどのタンパク質、ペンタペプチド、デカペプチド、ペンタデカペプチドなどのペプチドの他に、吸収性、輸送および標的器官内の残留性に対するその有益な作用のために選択される非生物学的化合物が含まれる。本発明の化合物との適切な結合、固定される化合物間の最適な間隙、および最適な生物学的特性を得るよう、アミノ、スルフヒドリル、ヒドロキシル、およびアルキルアミノ基などの、キャリアー部分の官能基を選択することが可能である。
【００５９】
「薬学的に許容できるプロドラッグ」とは、生理学的条件下でまたは加溶媒分解によって特定の化合物またはその薬学的に許容できる塩に変換させることができる化合物である。
「薬学的に活性な代謝物」とは、特定の化合物またはその塩が体内で代謝されて生じた薬理学的に活性な生成物を意味する。
ある化合物のプロドラッグおよび活性な代謝物は当技術分野で公知の定型的な技術によって特定できる（G. Bertolimi et al.(1997) J. Med. Chem. 40:2011-2016; D. Shan et al. J. Pharm. Sci. 86(7):765-767; K. Bagshawe (1995) Drug Dev. Res. 34:220-230; N. Bodor (1984) Advances in Drug Res. 13:224-331; H. Bundgaard "Design of Prodrugs" (Elsvier Press, 1985); Laesen, I or II. K., "Design and Application of  Prodrugs, Drug Design and Development. Krogsgaard-Larsen et al., eds., Harwood Academic Publishers (1991)等を参照のこと）。
微小管形成または微小管機能を抑制し、阻止し、調節し、減弱させ、安定化させまたは影響を与えるクマリン化合物および組成物が望ましく、本発明の好ましい実施態様の１つである。本発明はさらに、本発明の微小管安定化剤を投与することによって、微小管形成または微小管機能を抑制し、阻止し、調節し、減弱させ、安定化させまたは影響を与える方法を目的とする。
【００６０】
本発明の微小管安定化剤は、対象の微小管形成または微小管機能に付随する疾患および異常の治療に有用である。好ましくは、前記対象は哺乳類であり、より好ましくはヒトである。微小管形成または微小管機能に付随する疾患および異常には、癌、真菌性疾患（例えばカンジダおよびアスペルギウス）、嚢胞、アルツハイマー病、痛風、マラリア、アテローム性硬化症、再狭窄、慢性炎症、慢性関節リウマチ、乾癬、糖尿病性網膜症、慢性塞栓性肺疾患、結核、慢性胆嚢炎、変形性関節症、リウマチ性心臓炎、気管支拡張症、橋本甲状腺炎等が含まれる。
クマリン化合物の微小管安定化剤としての活性は、当技術分野で利用可能な任意の方法によって測定できる。前記方法には、例えば下記の実施例で説明するin vivoおよび／またはin vitroアッセイが含まれる。
【００６１】
本発明の微小管安定化剤は活性を有する補足化合物と併用して、または微小管形成もしくは微小管機能に付随する疾患または異常をもつ対象の治療の代用として用いることができる。例えば、クマリン化合物は単独で用いても活性をもつ補足化合物（例えば癌治療のための抗腫瘍薬、マラリア治療のための抗マラリア薬など）と併用してもよい。本発明のクマリン化合物は、単独で用いてもまたは別の微小管安定化剤（例えばアルツハイマー病の治療、予防または抑制のためのタキソール、または第二のクマリン化合物）と併用して用いてもよい。タキソールによるアルツハイマー病の治療方法については参照により本明細書に含まれる米国特許第5,580,898号を参照されたい。他の補足化合物には、種々の癌、真菌症および寄生虫感染症の治療のためのアルコイド類、ビストビン、エストラムスチン、アンホテリシンＢ、およびグリセオフルヴィンが含まれる。
特定ののクマリン化合物、特定の補足化合物またはその両者を、ある疾患または異常を選択的に治療するために選択できる。例えば特定のクマリン化合物、例えば３，６，７−トリヒドロキシクマリンは、哺乳類細胞（好ましくはヒトの細胞）よりも真菌細胞の微小管に強い親和性を有するであろう。したがって、３，６，７−トリヒドロキシクマリンは真菌症を治療するための好ましいクマリン化合物であろう。真菌症の治療に併用療法が所望される場合、抗真菌剤である補足化合物、例えばグリセオフルヴィンが好ましいであろう。癌患者の治療の場合、化学療法はしばしば患者を出血し易くするので、抗凝固特性を示さないクマリン化合物、例えば７−ヒドロキシクマリンが好ましいであろう。
【００６２】
本発明の微小管安定化剤は、治療上有効な量で哺乳類（例えばヒト）に投与することができる。本発明の微小管安定化剤の治療上有効な量を用いて、微小管形成または微小管機能を抑制し、阻止し、調節し、減弱させ、安定化させまたは影響を与えることができる。「有効な量」とは、細胞または生物に投与したとき、微小管形成または微小管機能を抑制し、阻止し、調節し、減弱させ、安定化させまたは影響を与えるために十分な薬剤の量を意味する。例えば、クマリン化合物、またはその塩、プロドラッグもしくは活性な代謝物または前記代謝物の塩の治療上有効な量は、前記細胞または生物内の微小管の形成または機能を抑制し、阻止し、調節し、減弱させ、安定化させまたは影響を与えるために十分な量である。前記の量に対応するある薬剤の量は、個々のクマリン化合物、用いられる薬剤または化合物、薬物の処方、および投与経路、並びに治療される対象またはホストが何であるかのような因子によって変動するが、それにもかかわらず当業者は定型的に決定することができる。
【００６３】
例えば、本発明の化合物の治療上有効な量は、約０．０１から約５０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１から約２５００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約１から約１０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。好ましい局所濃度は、例えば処方軟膏中において約０．１％から約１５％、より好ましくは約５％から約１０％などである。
ある種の因子が、効果的に対象を治療するために必要な投与量に影響を与えることは当業者には理解されよう。その様な因子には、疾患または異常の重篤度、治療歴、一般的健康状態および／または対象の年齢および他の疾患の有無が含まれる。
さらにまた、治療上有効な量の微小管安定化剤による対象の処置は、１回の処置または好ましくは連続した処置を含むことができる。
好ましい実施例では、対象は、約０．１から約５０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量のクマリン化合物で、約１週間から約１０週間、好ましくは約２週間から約８週間、より好ましくは約４週間から約６週間の間、週に１回以上の頻度で処置される。いくつかの条件下では、長期的投与が要求されるであろう。
【００６４】
さらにまた、治療に用いられる化合物の有効な投与量は一つの治療においても経過によって増減し得ることは理解されよう。有効な投与量の変更は当技術分野で公知の標準的な診断アッセイによって検知することができる。例えば、約１０ｍｌの食塩水中に調製された約１０ｍｇのクマリン化合物の溶液を１日１回約０．１ｍｇ／ｋｇから約０．１５ｍｇ／ｋｇの投与量で対象に静注によって投与できる。血液学的反応（例えば白血球減少症）が約７から１０日間にわたって観察され、その際投与量は結果に応じて調節される。毎日の投与量は、毒性が観察されるまで徐々に（約０．０５ｍｇ／ｋｇで）増加してもよい。
本発明の医薬組成物は、所望の投与態様に適した一回量剤形で製造できる。本発明の組成物は、治療のために任意の適切なルート（経口、直腸、鼻腔、局所（頬側および舌下を含む）、膣および非経口（皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む）を含む）によって投与することができる。好ましいルートは、受容者の状態および年齢、治療されるべき症状の性質、および選択される活性化合物によって変動するであろう。
【００６５】
本発明の組成物に用いられる薬剤の実際の投与量は、使用される特定の複合体、処方される特定の組成物、投与態様、および治療される特定の部位、ホストおよび疾患に応じて変動することは理解されよう。ある１組の条件についての最適の投与量は、所与のクマリン化合物の実験データを考慮し通常の投与量決定検査を用いて当業者によって確定されうる。プロドラッグの投与量は、完全な活性形の重量レベルと化学的に等しい重量レベルでありうる。
本発明の薬剤は下記に述べるように医薬組成物に製剤化できる。本発明の医薬組成物は、有効量のクマリン化合物および不活性な薬学的に許容できる担体または希釈剤を含む。医薬組成物のある実施態様では、有効レベルの微小管安定化剤は、微小管形成または微小管機能を抑制し、阻止し、調節し、減弱させ、安定化させまたは影響を与えることに関連する治療上の利点を与えるために提供される。「有効レベル」とは、細胞または生物の重合チューブリンまたは微小管の質量をコントロールに較べて増加または安定化させることができるレベルを指す。これらの組成物は、投与態様（例えば非経口または経口投与）に適した一回量剤形で製造される。
【００６６】
微小管安定化剤は種々の適切なルートのいずれか、例えば経口、直腸、経皮、皮下、静脈内、筋肉内または鼻内投与によって投与することができる。薬剤は、投与される前に所望のルートに適した組成物に製剤化される。そのような製剤は当技術分野では周知で、例えば以下を参照されたい：Remington: The Science & Practice of Pharmacy, 20thed. Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD(2000)。
微小管安定化剤は好ましくは活性成分として治療的に有効な量の少なくとも１つの本発明の微小管安定化剤を、適切な医薬担体または希釈剤とともに通常の方法にしたがって一体化させて製造される通常の投与剤形で投与される。前記の方法は、所望の調製物に適切なように前記成分を混合し、顆粒化し、さらに圧縮するかまたは溶解することを含んでいても良い。
【００６７】
本発明の医薬組成物または調製物は、有効量の少なくとも１つの活性成分（本発明の少なくとも１つの微小管安定化剤を含む）および医薬的に許容できる担体（例えば前記薬剤のための希釈剤または賦形剤）を含む。他の活性成分には所与の疾患または異常を治療し予防しまたは抑制するために用いられる医薬および化合物が含まれる。活性な成分にはまた、微小管形成または微小管機能を抑制し、妨げ、調節し、減弱させ、安定化させまたは影響を与える医薬または化合物が含まれる。例えば、本発明の医薬組成物は、タキソール療法には良好に応答しない対象の癌を治療し、予防しまたは抑制するために、活性成分として本明細書に開示した少なくとも１つの微小管安定化剤およびタキソールを含みうる。
【００６８】
担体が希釈剤として機能するときは、前記担体は、活性成分のためのビヒクル、賦形剤または媒体として機能する固体、半固体、あるいは液体物質でもよい。本発明の組成物は、活性成分を担体と混合するか、または活性成分を担体で希釈するか、または活性成分を担体内に封入もしくは被包化（カプセル、サシェ（Ｓａｃｈｅｔ、一回分の分量を入れたプラスチック等の袋）、紙容器等の形態）することによって製造することができる。例示的な成分は、１つまたは２つ以上の細胞周期制御剤および任意の他の活性成分以外に、アビセル（Avicel）（微晶質セルロース）、澱粉、ラクトース、硫酸カルシウム二水和物、白土、シュクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ピーナツ油、オリーブ油、グリセリルモノステアレート、トゥイーン８０（ポリソルベート８０）、１，３−ブタンジオール、ココアバター、蜜ろう、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、リン酸水素二ナトリウム、塩化ナトリウムおよび水を含む。
【００６９】
前記組成物は、所望の投与態様に適した多様な形態のいずれに調製されてもよい。例えば、医薬組成物は、錠剤、ピル、散剤、ロゼンジ、サシェ、カシェ、エリキシル、懸濁液、乳化液、溶液、シロップ、エアロゾル（固体または液体媒体中）、軟膏（例えば１０重量％までの細胞周期制御剤を含む）、軟質ゼラチンおよび硬質ゼラチンカプセル、座薬、滅菌注射溶液、滅菌パッケージ散剤などの形態に製造できる。
同様に、担体または希釈剤は、当技術分野で公知の徐放性または定時放出性物質、例えばグリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートを単独でまたはろう、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルメタクリレートなどと一緒に含むことができる。
種々の剤形を用いることができる。したがって、固形担体が用いられる場合は、調製物は打錠するか、硬質ゼラチンカプセルに散剤もしくはペレットとして入れるか、またはトローチもしくはロゼンジの形態であってもよい。固形担体の量は変動しうるが、一般的には約２５ｍｇから約１ｇであろう。液体担体が用いられる場合には、調製物はシロップ、乳化液、軟質ゼラチンカプセル、アンプルもしくはバイアルに入れた滅菌注射溶液または懸濁液、または非水性液体懸濁液でもよい。
【００７０】
安定な水溶性の投与形態を得るために、薬剤の薬学的に許容できる塩を有機または無機酸の水溶液（例えば０．３Ｍのコハク酸またはクエン酸溶液）に溶解させることができる。可溶性塩が利用できない場合は、薬剤は適切な補助溶媒または補助溶媒の混合物に溶解させることができる。適切な補助溶媒の例には、総容積の０−６０％の範囲の濃度の、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール３００、ポリソルベート８０、グリセリンなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。例示的な実施態様では、クマリン化合物はＤＭＳＯに溶解され、さらに水で希釈される。組成物はまた、適切な水性ビヒクル（例えば水または等張食塩水もしくはデキストロース溶液）中の活性成分の塩溶液でもよい。
本発明の組成物は、医薬組成物の製造のために一般的に知られている方法で、例えば混合、溶解、顆粒化、糖衣錠製造、研和、乳化、カプセル封入、被包化または凍結乾燥のような通常の技術を用いて製造できる。医薬組成物は、１つまたは２つ以上の生理学的に許容できる担体を用いて通常の方法で製剤化できる。前記担体は、活性化合物を薬学的に用いることができる調製物に加工するのを助ける賦形剤および補助剤から選択できる。
適切な製剤は選択される投与ルートに左右される。注射のためには、本発明の薬剤は、水溶液、好ましくは生理学的に適合する緩衝液（例えばハンクス液、リンガー液）または生理的食塩緩衝液に製剤化できる。経粘膜投与のためには、透過されるべき障壁に適した浸透剤が製剤中に用いられる。その様な浸透剤は当技術分野では公知である。
【００７１】
経口投与のためには、化合物は、活性化合物を薬学的に許容できる当技術分野で公知の担体と混合することによって容易に製剤化できる。そのような担体は、治療対象の患者が経口摂取できるように、錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、リキッド、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などに本発明の化合物を容易に製剤化させることができる。経口使用用医薬調製物は、活性成分（活性薬剤）と混和した固形賦形剤を用い、場合によって得られた前記混合物をすり潰し、さらに所望の場合は適切な補助剤を添加した後で顆粒混合物を加工して錠剤または糖衣錠コアを得ることができる。適切な賦形剤には、糖類（ラクトース、シュクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む）およびセルロース調製物（例えばトウモロコシ澱粉、コムギ澱粉、コメ澱粉、ジャガイモ澱粉、ゼラチン、ゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムまたはプロピルビニルピロリドン（ＰＶＰ）など）、などのフィラーが含まれる。所望の場合は、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸もしくはその塩（例えばアルギン酸ナトリウム）が含まれる。
【００７２】
糖衣錠コアは適切なコーティングとともに提供される。この目的のために、濃縮糖溶液を用いることができる。前記濃縮溶液は、場合によってアラビアゴム、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル（Carbopol gel）、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタニウム、ラッカー溶液および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含むことができる。活性成分の種々の組合せを識別するために、または特徴を付与するために染料または色素を錠剤または糖衣錠コーティングに加えてもよい。
経口的に使用できる医薬調製物には、ゼラチン製のプッシュフィットカプセルの他にゼラチンおよび可塑剤（例えばグリセロールまたはソルビトール）で製造された軟質の封入カプセルも含まれる。プッシュフィットカプセルは、フィラー（例えばラクトース）、結合剤（例えば澱粉）および／または滑沢剤（例えばタルクまたはステアリン酸マグネシウム）、および場合によって安定化剤との混和した活性成分を含むことができる。軟質カプセルでは、活性成分は適切な液体（例えば脂肪油、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコール）に溶解または懸濁させることができる。さらに安定化剤を添加してもよい。経口投与のための製剤はいずれもそのような投与に適した用量でなければならない。頬側投与のためには組成物は、通常の方法で製剤化された錠剤またはロゼンジの形態をとってもよい。
【００７３】
鼻内投与または吸入投与の場合には、本発明にしたがって使用される化合物は、加圧パックまたはネブライザーから適切な噴射剤（例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガス）を使用して提供されるエアロゾルスプレーの形態で便利に送達することができる。加圧エアロゾルの場合、一回投与量は、バルブを設けて計測された量を送達するようにすることで決定することができる。吸入器または散布器などで使用されるゼラチンカプセルまたはカートリッジは化合物の粉末混合物および適切な粉末基剤（例えばラクトースまたは澱粉）を含むように製剤化できる。
本発明の化合物は、注射による（例えばボーラス注射または連続輸液による）非経口投与用に製剤化できる。注射用製剤は、添加保存料を含む一回量剤形（例えばアンプルまたはマルチドーズ容器中）を取ってもよい。本組成物は、油性または水性ビヒクル中の、懸濁液、溶液または乳化液などの形態を有してもよく、さらに製剤化のための懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの薬剤を含むことができる。
【００７４】
非経口投与用医薬製剤には、水溶性形態の活性化合物の水溶液が含まれる。さらに、適切な油性の注射用懸濁剤として、前記活性な薬剤の懸濁液を調製することができる。適切な親油性溶媒またはビヒクルには脂肪油（例えばゴマ油）、または合成脂肪酸エステル（例えばオレイン酸エチルまたはトリグリセリド）、またはリポソームが含まれる。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁液の粘度を高める物質を含むことができる。場合によって、懸濁剤はまた、適切な安定化剤または、化合物の溶解性を高めて高濃縮溶液の調製を可能にする薬剤を含むことができる。
眼に投与する際は、微小管安定化剤は薬学的に許容できる眼科用ビヒクル中で送達され、微小管安定化剤は、角膜および眼の内部領域（例えば前眼房、後眼房、硝子体、眼房水、硝子体水、角膜、虹彩／毛様体、水晶体、脈絡膜／網膜および強膜を含む）に浸透するのに十分な時間、眼の表面と接触する。薬学的に許容できる眼科用ビヒクルは、軟膏、植物油、またはカプセル化物質でもよい。また微小管安定化剤を硝子体水および眼房水に直接注射してもよい。
【００７５】
また、活性成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば無菌的なパイロジェン非含有水）と共に構成される粉末形であってもよい。本化合物はまた、直腸用組成物、例えば座薬または停留浣腸（例えばココアバターまたは他のグリセリド類の様な通常の座薬用基剤を含む）として製剤化できる。
上記の製剤の他に、本化合物はデポ剤調製物として製剤化できる。そのような長期作用製剤は、（例えば皮下、筋肉内または眼内に）移植するか、または筋肉内注射によって投与できる。したがって、例えば本化合物は、適切なポリマー性もしくは疎水性物質とともに、例えば許容可能な油中、またはイオン交換樹脂中の乳化液として、または難溶性誘導体として（例えば難溶性塩として）製剤化できる。
【００７６】
疎水性化合物のための医薬担体は、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水に混和性の有機ポリマーおよび水相を含む補助溶媒系である。前記補助溶媒系はＶＰＤ補助溶媒系でもよい。ＶＰＤは、３％ｗ／ｖのベンジルアルコール、８％ｗ／ｖの非極性界面活性ポリソルベート８０、および６５％ｗ／ｖのポリエチレングリコール３００の溶液で、容積は無水エタノールで調整される。ＶＰＤ補助溶媒系（ＶＰＤ：５Ｗ）は、５％デキストロース水溶液で１：１に希釈されたＶＰＤを含む。この補助溶媒系は疎水性化合物を良好に溶解させ、全身投与に際してそれ自体の毒性が低い。もちろん、補助溶媒系の割合は、その溶解能力および毒性に関する性質を損なうことなく顕著に変動させうる。さらにまた、補助溶媒の個々の成分は変更することができる。例えば、他の毒性の低い非極性界面活性剤をポリソルベート８０の代わりに用いてもよく、ポリエチレングリコールの分画サイズを変更してもよい、ポリビニルピロリドンなどの他の生体適合性ポリマーをポリエチレングリコールの代わりに用い、他の糖類または多糖類をデキストロースの代わりに用いてもよい。
【００７７】
また、疎水性医薬化合物のための他の送達系を用いることができる。リポソームおよび乳化液は、疎水性薬剤のための公知の送達ビヒクルあるいは担体の例である。ジメチルスルホキシドのようなある種の有機溶媒もまた用いることができるが、通常は毒性が高いことが問題である。さらに本化合物は徐放系、例えば治療薬剤を含む疎水性固形ポリマーの半透過性マトリックスを用いて送達することができる。種々の徐放性材料が確立され当業者には公知である。徐放性カプセルは、それらの化学的性質にしたがって、数週間から１００日を越える期間にわたって化合物を放出させることができる。治療薬剤の化学的性質および生物学的安定性に応じて、タンパク質の安定化のためにさらに別の方法を利用することができる。
医薬組成物はまた、適切な固相もしくはゲル相担体または賦形剤を含むことができる。そのような担体または賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、糖類、澱粉、セルロース誘導体、ゼラチンおよびポリエチレングリコールのようなポリマーが含まれる。
【００７８】
本発明の化合物のいくつかは、薬学的に適合する対イオンとの塩として提供できる。医薬的に適合できる塩は、多くの酸（塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを含む）を用いて生成できる。塩は、その対応する遊離塩基形よりも水性媒体または他のプロトン性溶媒に対する溶解性がより高い傾向がある。
本発明の薬剤は、容易に入手できる出発物質を用い当技術分野で公知の技術を利用して、下記に記載する反応経路および合成工程を用いて調製することができる。他の微小管安定化剤も、上に示されたおおまかな手順、または本明細書の実施例に記載した具体的な方法と同様な方法で調製できる。
クマリン化合物の調製は本明細書に詳細に記載されているが、記載の化学反応を用いて本発明の他の多くの微小管安定化剤を調製できることは当業者には理解されよう。例えば、例示されなかった本発明の化合物の合成は、当業者にとって明白な改変によって、例えば干渉する基を適切に保護することによって、当技術分野で公知の他の適切な試薬に変更することによって、または反応条件の定型的な改変によって実施することができる。また別には、本明細書に開示した、または当技術分野で公知の、他の反応は、本発明の他の化合物の調製に応用できるものであることは理解されよう。
【００７９】
本発明のクマリンは生合成経路で製造できる。例えば、高等植物では、クマリンは一般にシキメート−コリスメート生合成経路を介してシンナミン酸の誘導体として生成する。シンナミン酸は他の多くの天然生成物の前駆体である。シキミ酸−コリスミ酸経路はまた芳香族アミノ酸の生成に関わっている。ＡＴＰからホスホリル基の移動とそれに続く求核置換は、シキミ酸から３−エノールピルビル−シキミ酸−５−リン酸の生成をもたらし、さらにリン酸の除去によってコリスミ酸が生成する。酵素、コリスミ酸ムターゼは続いてコリスミ酸の再構成を触媒してプレフェン酸を生じ、前記は１，４脱離によってフェニルピルビン酸に変換される。グルタミン酸依存アミノ基転移反応はフェニルアラニンの生成をもたらす。続いてフェニルアラニンは、ＮＨ３+を除去するフェニルアラニンアンモニアリアーゼ酵素の作用によってトランス−シンナミン酸に変換される。
【００８０】
これ以降、Ｃ−７位で酸化された単純なクマリンは、Ｃ−７位で酸化されていないものと異なる生合成経路にしたがう。後者の場合には、トランス−シンナミン酸は先ず２’−ヒドロキシル化され、続いてグルコース化されてトランス２’−グルコシルオキシシンナミン酸を生じる。トランス２’−グルコシルオキシシンナミン酸は続いてシス−異性体に変換される。シス−２’−グルコシルオキシシンナミン酸（またはクマリニルグルコシド）は結合形で、この形態でクマリンは植物内に存在する。トランス−シンナミン酸のヒドロキシル化およびグルコース化は酵素による触媒される反応である。トランス−シス異性化はＵＶ光によって仲介される。７位で酸化された単純なクマリンは、オルト−ヒドロキシル化ではなくパラ−ヒドロキシル化の結果として生じる。先の反応工程のようにグルコース化反応が起こり、ＵＶ依存トランス−シス異性化がこれに続く。
【００８１】
本発明のクマリンは化学合成によって製造できる。例えば、パーキン反応はクマリン生成のための古典的な反応で、酢酸ナトリウムと無水酢酸とともに１８０℃でｏ−ヒドロキシベンズアルデヒドを加熱することを含む。メトキシまたはヒドロキシ基をもつ単純なクマリンの合成は、収量は低いがパーキン反応によって達成できる。ピロン環の形成はいくつかのクマリン化合物の化学合成で重要な工程であり、クマリンの基本構造に官能基を導入するためにいくつかの方法が開発された。合成方法の１つは、ピロン環を形成する前にクマリンの所望の置換基を含むフェノールを製造することを含む。また別には、基本的なクマリン構造を先ず初めに合成し、さらにＣ−またはＯ−アルキル化または核の酸化を用いて所望の化合物を生成することができる。Coumarins: Biology, Applications and Mode of Action. R.O' Kennedy and R.D. Thornes. 1997. John Wiley and Sons. Chichesterを参照のこと。
３，６，７−トリヒドロキシクマリンは藻類から単離できる。例えば、天然の生息地から得たイソスギナ（Dasycladalus vermicularis）および純培養のイソスギナの藻類サンプルを蒸留水で簡単に水洗いした。ティッシュペーパーで余分な水を除去した後、前記藻類を秤量し、５０％のアセトンと５０％のメタノールの溶液に浸漬した。前記サンプルの約１００ｇ（取り出したばかりの重量）をアセトンに集め、細片に刻み、乳鉢の石英砂で十分に磨り潰した。参照により本明細書に含まれるD. Menzel et al. (1983) Botanica Marina 26:23-29を参照されたい。抽出物をろ過し、1リットルのアセトンを用いるまで残留物質を繰返し抽出した。
【００８２】
全ての親油性色素が沈澱し約１ｍｌから約２ｍｌの清澄な黄色の水性抽出物が残るまで、一緒にした抽出物を３０℃で真空中で濃縮する。０．５ＮのＨＣｌ（最終濃度）を用いて約１００℃で約５から約３０分加水分解を実施する。クロロホルムまたは酢酸エチルを用いてクマリン化合物を加水分解混合物から抽出し、乾燥するまで蒸発させる。続いてセルロースの薄層プレートでクロマトグラフィーを実施し、二重溶媒系で展開させ最大の単離および分解能を達成する。クマリン化合物の存在が確認されたら、高い分解能を有する分離および単離を得るために、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いる。フェノール化合物の同時決定プロトコルはAndradeら（J. Liquid Chromatography & Related Technologies 21(18):2813-2820 (1998)、この文献は参照により本明細書に含まれる）によって確立されており、このプロトコルを用いてもよい。種々の単純なクマリン前駆体および類似体の構造は質量分析によって、さらに必要な場合にはＨ1ＮＭＲ（D. Menzel et al.(1983) Botanica Marina 26:23-29）によって決定できる。
以下の実施例では全ての試薬はシグマ（Sigma, St. Louis, MO）から入手した。
【実施例１】
【００８３】
分割ウニ胚に対するクマリン化合物の作用
Ａ．細胞分割の抑制
エゾバフンウニ属のストロンギロセントロツス＝プルプラツス（Strongylocentrotus purpratus）またはＳ．フランシスカヌス（S. franciscanus）の雌雄に、口部表面の軟組織から体腔に０．５ＭのＫＣｌを注射し、続いて当技術分野で一般的な方法を用いてろ過海水中で培養した（例えば以下を参照されたい：E.T. O' Brien et al.(1989) Mol. Pharmacol. 35:635-642;およびJ.S. Jacobs & L. Wilson (1986) Drugs Pharm. Sci. 27:481-493、これらの文献は参照により本明細書に含まれる）。配偶子がろ過海水中に放出された。卵を含む液を攪拌して、１５０ｍｍのナイテックスメッシュ（Nitex mesh, Tekto, Inc., Elmsford, NY）に３回通してゼリー被覆を除去し沈澱させた。海水を吸引して除き、続いて卵を３１０ｒｐｍで４分遠心した。前記卵をろ過海水に再懸濁させ（１％ｖ／ｖ）、これを傍らに取り置く。新鮮な精子をオスのウニの反口極側の表面から採集した。約１滴の濃縮精子を試験管に集め、１ｍｌの海水を添加した。卵懸濁液１００ｍｌに対し精子溶液の１ｍｌを添加し直ちに混合した。
【００８４】
受精後１分してから、約１ｍｌの胚溶液を顕微鏡スライドに置き、光学顕微鏡で１０倍の倍率で受精パーセンテージを調べた。視認できる受精膜によって未受精卵と受精卵を識別することができる。続いて受精胚を最初の受精後５分以内にクマリン化合物とインキュベートした。胚を約１５℃から約１７℃で約２時間、またはコントロール胚が最初の卵割を完了し２細胞期になるまでインキュベートした。卵割量は、光学顕微鏡を用いて約４０μｌの少量のサンプルにおける卵割胚対未卵割胚を計数することによって、各テストサンプルについて算出した。
卵割の定量は、コントロール胚が最初の卵割の終わりまで進んだ後（受精後約１２０分）で、卵割胚と非卵割胚の数を計数することによって実施した。約５０μＭの濃度で５０％以上最初の卵割を抑制する化合物を、微小管重合アッセイの更なる実験に用いた。
図１−４に示したように、クマリン、７−ジクマロール、ウンベリフェロンおよびワルファリンは、エゾバフンウニ（S. purpuratus）の胚の最初の卵割を抑制した。ジクマロールはもっとも強力で、約４μＭで約５０％最初の卵割を抑制し、卵割は約２０μＭ以上の濃度で完全に阻止された。ジクマロール処理胚は、溶解または形態変化を示さなかった。リテキヌス＝ピクツス（Lytechinus pictus）およびＳ．フランシスカヌスで得た用量−反応曲線はＳ．プルプラツスを用いて得たものと同一で、したがってジクマロールの活性は特定の種の棘皮動物胚に限定されないことを示唆している。
【００８５】
Ｂ．細胞周期分析
受精後１０分間隔でウニ胚の部分標本にジクマロールを添加し、最初の卵割が抑制されるパーセンテージを観察することによって、細胞周期の種々の段階におけるジクマロールなどのクマリン化合物の作用を決定した。具体的には、部分標本をＴ−１０、Ｔ−２０．．．．Ｔ−１２０と称し、受精後１０分で５０μＭのジクマロールをＴ−１０と称する部分標本に添加し、受精後２０分で５０μＭのジクマロールをＴ−２０と称する部分標本に添加し、以降のサンプルも同様にして作製した。
図５に示したように、細胞分割の抑制は、ジクマロールを受精後９０分で添加したとき急速に低下した。よってこのことは、ジクマロールは有糸分裂の前中期または中期で細胞をブロックすることによって細胞分割を抑制し、発生の最初の９０分に生じる、ＤＮＡ合成などの事象には影響を与えない様式で作用することを示唆した。
【実施例２】
【００８６】
紡錘体および染色体の組織化に対するクマリン化合物の影響
紡錘体微小管の組織化および染色体の組織化に対するクマリン化合物の影響を決定するために、ウニ胚およびＨｅＬａ細胞を調べた。
Ａ．ウニ胚アッセイ
実施例１にしたがって調製したウニ胚を用い、チューブリンに対する特異抗体による免疫蛍光顕微鏡検査法で紡錘体微小管の組織化および染色体の組織化に対するクマリンの影響を調べた。クロマチンの可視化にはＤＡＰＩを用いた。２つの異なるウニ胚アッセイプロトコルを用いた。下記のＡ１項に記載するホーレンベックとカンデ（Hollenbeck & Cande）の改変プロトコルの信頼性は低く、したがって下記Ａ２項に記載するバルクゾンとシャッテン（Balczon & Schatten）の改変法がより望ましいことが判明した。
Ａ１．改変ホーレンベックとカンデの方法
免疫蛍光顕微鏡検査法のための胚の固定および染色はホーレンベックとカンデの方法（Hollenbeck and Cande (1985) European Journal of Cell Biology 37:140-148）にE.T. O' Brienら（Molecular Pharmacology 35:635-642(1989)）の以下の改変を加えた変法にしたがって実施した（前記両文献は参照により本明細書に含まれる）。風乾したポリリジン被覆（１ｍｇ／ｍｌ）カバーガラスに胚を静かにピペットで移し、約2分吸着させた。このカバーガラスから液体を除き、直ちに２ｍｌのＰＩＰＥＳ抽出緩衝液を含む小さな秤皿に静置した。このＰＩＰＥＳ抽出緩衝液は、５０ｍＭのＰＩＰＥＳ、１０ｍＭのＥＧＴＡ、および６ｍＭのＭｇＳＯ4を含む溶液で、さらに０．４％のトリトンＸ−１００を含んでおり、ｐＨは６．８である。
【００８７】
約４分から約５分後に、ＰＩＰＥＳ抽出緩衝液中の１％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド、１％（ｗ／ｖ）グルタールアルデヒドでカバーガラスを１０分固定した。カバーガラスを３回ＰＢＳ（１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．７ｍＭ塩化カリウム、８ｍＭリン酸ナトリウム、１．５ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５））で洗浄し、続いて４ｍｇ／ｍｌの水素化ホウ素ナトリウムのＰＢＳ溶液による５分間洗浄を２回行い、アルデヒドの蛍光を減少させた。続いてカバーガラスをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳで１／１００に希釈された２５μｌのマウス抗αチューブリンモノクローナル抗体を各カバーガラスに添加した。前記カバーガラスを３７℃で６０分インキュベートし、さらに３回ＰＢＳで洗浄した。続いて２５μｌの二次染色溶液を添加した。この二次染色溶液は、微小管を染色するために抗マウスＩｇＧに結合したフルオレセインイソチオシアネート（ＰＢＳ中１／２５）、アクチンフィラメントを染色するためにローダミン結合ファロイジン（ＰＢＳ中１／２０）（分子プローブ）、およびクロマチンおよび染色体を染色するためにＤＡＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）を含んでいた。続いて、カバーガラスを３７℃でさらに６０分インキュベートし、３回ＰＢＳで洗浄した。前記カバーガラスを０．１Ｍのホウ酸ナトリウム溶液（ｐＨ８．０）とともにスライドに載せ、透明ネイルエナメルで封入した。前記スライドは使用まで４℃で暗所に保存した。
固定し染色した胚はツァイスのフォトマイクロスコープＩＩＩでプラン−ネオフルアー（Plan-Neofluor）の２５倍および４０倍の対物レンズを用いて観察した。胚の写真はコダックテクニカルパンフィルムを用い２００または８００ＡＳＡフィルムスピードで撮影した。
【００８８】
Ａ２．改変バルクゾンとシャッテンのアッセイ
免疫蛍光顕微鏡法のための胚の固定および染色はバルクゾンとシャッテンの方法（Balczon and Schatten (1983) Cell Motility 3:213-226）の改変された方法にしたがって実施した（前記両文献は参照により本明細書に含まれる）。１０μｌの５ｍＭジクマロールを（５０μＭのジクマロールの最終濃度が得られるまで）添加した後、種々の時間（６０、７０、８０、９０、１００および１１０分）に、実施例１にしたがって調製したＳ．フランシスカヌスの胚の濃縮懸濁液を静かにピペットで１２Ｘ７５ｍｍのガラスの試験管に移し、海水を０．５５ｍＭ塩化マグネシウム，１０ｍＭのＥＧＴＡ、２５ｍＭのＭＥＳ、２５％グリセロール、１％ノニデットＰ−４０および２５μＭのＰＭＳＦを含むｐＨ６．７の抽出緩衝液と置き換えた。４５分抽出した後、−１０℃のメタノールで胚を６分間固定した。メタノール固定の後、細胞を５分間ＰＢＳ中で洗浄し、続いて２５μｌの、抗αチューブリンモノクローナル抗体を含む（１：１００）２％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳを添加した。
【００８９】
胚を３７℃で約６０から約７５分インキュベートし、さらにＰＢＳ中で２０分洗浄し、その後２５μｌの、抗マウスＩｇＧ結合フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（ＰＢＳ中１：１００）およびＤＡＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）を含む二次染色溶液を添加した。続いて胚を３７℃で６０分インキュベートし、続いて２０分ＰＢＳ中で洗浄した。ベクタシールド（Vectashield（登録商標））（Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA）の溶液を用いてカバーガラスをスライド上に載せ、ネイルエナメルで封入した。前記スライドは更に使用されるときまでまで４℃で暗所で保存した。
固定し染色した胚はツァイスのフォトマイクロスコープＩＩＩでプラン−ネオフルアー（Plan-Neofluor）の２５倍および４０倍の対物レンズを用いて観察した。胚の写真はコダックテクニカルパンフィルムを用い２００または８００ＡＳＡフィルムスピードで撮影した。
微小管の組織化を調べた結果、中期板に凝縮した密な染色体をもつ二極性紡錘体を含む中期のコントロール細胞が示された（図１３および１４参照）。図１５は有糸分裂時の細胞の微小管に対するジクマロールの影響を示している。５０μＭのジクマロールでは、有糸紡錘体の微小管は二極性であるが、より長く、さらに無傷の核エンベロープの外側に存在するようにみえた。ジクマロール処理細胞は、中期板に集合していない未組織化染色体を含んでいた（図１６参照）ジクマロール処理ウニ胚細胞の微小管および染色体は、９０、１００および１１０分で同じように見えた。
【００９０】
Ｂ．ＨｅＬａ細胞アッセイ
ＨｅＬａ細胞はホルマリンで続いてメタノールで固定した。チューブリンは、ＨｅＬａ細胞抽出物中のｂ−チューブリンに特異的なマウスのモノクローナル抗体を用いて検出し、染色体はＤＡＰＩ（４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール）で染色した。第二抗体はフルオレセインイソチオシアネート結合ヤギ抗マウスＩｇＧおよびローダミン結合ヤギ抗ヒトＩｇＧであった。ＤＡＰＩとその後の抗チューブリン免疫蛍光による二重染色調製物について中期で停止した細胞のパーセンテージを計数した。検査した各薬剤濃度につき少なくとも４００個の細胞を数えた。中期での停止を誘発するために十分である約１μＭから約１００μＭまでの種々の薬剤濃度で、中期は、特徴的な染色体の凝縮した中期板の存在によって有糸分裂の他の時期から明瞭に区別できた。顕微鏡写真は、参照により本明細書に含まれるJordan et al.(1991) Cancer Res. 51(8):2212-2222の記載にしたがって、エピ−フルオレセンスコンデンサーおよび１００倍のオリンパスＵＶＦＬ油浸対物レンズを備えたツァイスのフォトマイクロスコープＩＩＩを用いて得た。
【実施例３】
【００９１】
微小管ポリマー質量の検出
ウシ脳微小管タンパク質およびホスホセルロース精製チューブリンを単離し−７０℃で凍結ペレットとして保存した。具体的には、微小管タンパク質は、in vitroで加温重合および低温脱重合を３サイクル行いウシの脳から単離した（Farrell & Wilson (1984) Biochem. 23:3741-3748参照のこと、この文献は参照により本明細書に含まれる）。哺乳類細胞の微小管は、in vitroで約１０℃より低い温度で解離し、さらにＧＴＰおよびマグネシウムイオンの存在下で生理的温度でチューブリンから再構成される。
低温により誘導される微小管分解が可逆的であるため、チューブリンは、微小管懸濁液の冷却、高速遠心による非微小管物質の分離、ＧＴＰおよびマグネシウムの添加後の再加温、および再集合微小管の沈降、を含む温度依存分解／集合サイクルによって精製できる。。３回繰返した後で、チューブリンの純粋な調製物が得られる。
チューブリンは、１リットルの０．５Ｎ ＮａＯＨホスホセルロース（ＰＣ）カラムを用いてホスホセルロースクロマトグラフィーによって微小管タンパク質から精製した。チューブリン溶液を液体窒素中で滴下物として急速凍結し、使用まで−７０℃で保存した。タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを標準物質としてブラッドフォード法によって決定した（参照により本明細書に含まれるM.M. Bradford (1976) Anal. Biochem. 72:248-354を参照のこと）。
【００９２】
チューブリンペレットを融解し、エゾバフンウニ（Stronglycocentrotus purpuratus）の鞭毛の軸糸種を含むＰＭＭＥ緩衝液（８７ｎＭの１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）、３６ｍＭの２−モルホリノエタンスルホン酸（Ｍｅｓ）、１．８ｍＭのＭｇＣｌ2、および１ｍＭのＥＧＴＡからなる、ｐＨ６．８）、および２ｍＭのＧＴＰと混合し、続いて３７℃で約３５分から約４５分インキュベートして定常状態になるまで重合させた。軸糸種は参照により本明細書に含まれるToso et al.(1993) Biochem. 32(5):1285-1293にしたがって調製した。重合させた後、１５００００ｇで１時間遠心して微小管を未重合チューブリンから分離した。遠心後の上清のタンパク質濃度をブラッドフォード法によって決定した。１ｍＭ（最終濃度）のＧＴＰによって沈降した場合の上清タンパク質濃度と比較することによって、沈降した微小管タンパク質の量を決定した。
低濃度のジクマロールの存在下での（約１０μＭ未満）微小管の重合は、コントロールと比較して形成されるポリマー質量に顕著な影響を与えなかった。５０μＭのジクマロールでは、ポリマー塊は約１６％増加した（図１０）。１００μＭを越える濃度のジクマロールは重合を顕著に誘発することが判明した。種々の濃度のジクマロールは、しかしながら軸糸種の存在を顕著には増加させなかった。
【実施例４】
【００９３】
濁度（重合）アッセイ
被検化合物の微小管重合（濁度の変化）を促進または抑制する能力の速度および程度を決定するために、クマリン化合物を約１ｍｇ／ｍｌの微小管タンパク質を含むキュベットに添加する。加熱ユニットを備えた分光光度計で前記キュベットを３７℃で４５分インキュベートし、約３４０ｎｍでの吸収を測定する。吸収の変化を４５秒間隔で４５分間にわたって測定し、１ｍＭのＧＴＰで誘発される吸収変化と比較する。
具体的には、１．２ｍｇ／ｍｌの微小管タンパク質を、濃度のジクマロールを含む１００ｍＭのＰＥＭ緩衝液（１００ｍＭのＰＩＰＥＳ、１ｍＭのＭｇＣｌ2および１ｍＭＥＧＴＡ）並びに１ｍＭのグアノシン５’−トリホスフェートと混合した。微小管重合は、３７℃で、ギルフォードレスポンス（Gilford Response）分光光度計を用い３５０ｎｍでの光散乱によってモニターされた。
図９に示すように、ジクマロールはチューブリン重合（１２μＭ）の速度および程度を濃度依存的に増加させた。濁度は徐々に増加し、約１時間のインキュベーション後でも定常状態に達しなかった。
【００９４】
濁度／光散乱アッセイを実施している間に、分光光度計で経過を観察されている混合物から、１０、２０および４５分の時点で１０μｌの部分標本を採取し、２００メッシュの炭素で被覆したフォーマーバー（Formavar）処理銅グリッド（Ted Pella, Inc., Redding, CA）に塗りつけた。続いてサンプルに数滴の０．５％酢酸ウラニルを滴下し、余分な液体をろ紙で除いた。続いてグリッドをツァイスの電子顕微鏡モデル１０ＣＡで調べた。
微小管の長さを決定するために、何度でも所望するだけ、１０μｌの部分標本を採取し、３０℃で０．２％のグルタールアルデヒドで４０倍に希釈し、さらに微小管を銅グリッド（Ted Pella, Inc., Redding, CA）上のコロイジオンフィルムに３０秒吸着させる。前記グリッドを０．１％のチトクロームＣ溶液で１５秒処理し、水で洗浄し、さらに１％酢酸ウラニルでネガティブ染色を実施した。写真プリントは最終倍率６０００倍で実施した。ＭＯＰ−３画像プロセッサを用い、長さのデータを蓄積し処理し、各サンプルの微小管の長さを算出する。
【実施例５】
【００９５】
蛍光測定による結合アッセイ
ジクマロールのチューブリンに対する結合定数を決定するために、パーキン−エルマー（Perkin-Elmer）のＬＳ５０Ｂ蛍光分析計を用いて蛍光測定を実施した。スペクトルをマルチスキャンにより採取し、緩衝液ブランクを全ての測定値から差し引いた。内部フィルターの影響は、参照により本明細書に含まれるD.L. Sackett (1995) Biochemistry 34:7010-7019、前記文献は）に記載されたように補正し、さらにジクマロールの存在下でチューブリン濃度と等しいトリプトファン溶液の蛍光強度の変化を測定することによって実験的に補正した（J.C. Lee et al.(1975) J. Biol. Chem. 250:9276-9282を参照のこと、この文献は参照により本明細書に含まれる）。内部フィルターの影響の補正した結果、ジクマロールは溶液中のトリプトファンの蛍光を消光しなかった。励起波長および発光波長はそれぞれ２９５ｎｍおよび３３６ｎｍであった。
【００９６】
具体的には、２μＭのチューブリンを種々の濃度のジクマロール（０、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０および５０μＭ）と３４℃で３０分５０ｍＭのＰＥＭ緩衝液中でインキュベートし、続いて分析した。ジクマロールで占有された結合部分（β）分画を以下の関係を用いて決定した：β＝（Ｆ0−Ｆ）／（Ｆ0−Ｆm）、式中Ｆ0はジクマロールの非存在下でのチューブリンの蛍光強度で、Ｆはチューブリンおよびジクマロールが平衡にあるときの補正蛍光強度で、Ｆmはリガンドで飽和した状態のチューブリンの算出蛍光強度である。Ｆmは１／（Ｆ0−Ｆ）対１／Ｌ（Ｌ＝総リガンド濃度）をプロットし、１／Ｌ＝０を外挿することによって決定した。会合定数、Ｋaは以下の関係を用いて決定した：Ｋa＝（β／１−β）×１／ＬＦ、式中Ｌｆ＝Ｌ[C]で[Ｃ]は、チューブリンダイマーにつき結合部位は１つと仮定した場合のリガンド結合部位の全体の濃度である。
ジクマロールは濃度依存的にチューブリンの固有蛍光を消光することが判明した。ジクマロールのチューブリンに対する結合定数は８．７２と算出され、したがってジクマロールはチューブリンダイマーに強力に結合することが示された。
【実施例６】
【００９７】
微小管へのクマリン結合の化学量論
微小管へのクマリン化合物結合の化学量論を決定するために、微量の[3H]クマリンを含む種々の濃度のクマリンの存在下で、約１３μMのチューブリンを軸糸種の末端で重合させる。未結合クマリンを５０％シュクロースクッションを通して１９００００ｇ、３７℃で７５分遠心して微小管から分離する。微小管ペレットを、８７ｍＭのＰＩＰＥＳ、３６ｍＭのＭＥＳ（２−[Ｎ−モルフォリノ]エタンスルホン酸）、１．４ｍＭのＭｇＣｌ2および１ｍＭのＥＧＴＡを含む０℃、ｐＨ６．８のＰＭＭＥ緩衝液で溶解する。ペレットのチューブリン濃度を決定し、微小管に結合したクマリンの量をシンチレーション計数によって決定する。微小管のチューブリンダイマー１モル当たりに結合したクマリンのモル量を、クマリン濃度をポリマー中のチューブリン濃度で割って決定する。微小管の平均の長さはビデオ顕微鏡法によって決定し、微小管１本当たりの結合クマリン分子の数は、「チューブリンダイマー１６９０個／微小管長１μｍ」の値を用いて計算した。結合の化学量論は、懸濁液中の微小管の数に対して計算し、逆数対逆数プロット（double-reciprocal plot）としてデータを作図する。微小管へのクマリン結合の最大結合量が低いことはクマリンが微小管の末端で結合することを示唆している。
【実施例７】
【００９８】
ポリマーへの[3Ｈ]パクリタキセル結合の抑制
どのようにしてクマリン化合物がタキソールのチューブリンポリマーへの結合に影響を与えるかを決定するために、以下の競合抑制アッセイを実施することができる。全ての結合実験について、チューブリンポリマーは、予定のクマリン化合物の非存在下で、約２μＭチューブリン、約２０μＭのｄｄＧＴＰおよび約０．７５Ｍのグルタミン酸一ナトリウムを含む反応混合物中で３７℃で３０分予備形成される。一つのクマリン化合物と種々の濃度の[3Ｈ]パクリタキセルとの混合物を前記予備形成ポリマーに添加し、３７℃で約３０分インキュベートする。反応混合物をエッペンドルフチューブに入れ、室温で約２０分１４０００ｒｐｍで遠心することによって、結合した[3Ｈ]パクリタキセルを遊離パクリタキセルから分離する。上清および（０．１ＭのＮａＯＨに一晩溶解し０．１ＭのＨＣｌで中和された）ペレットのタンパク質および放射能標識をローリー法および液体シンチレーションカウンターによって定量する。[3Ｈ]パクリタキセルのポリマーへの結合に対する競合抑制剤の場合は、異なるインヒビター濃度における同傾向の曲線群がヘーンズフォーマットによりプロットした際に得られるであろう。タキソールのチューブリンポリマーへの結合をあるクマリン化合物が競合的に抑制するならば、そのクマリン化合物とタキソールは共通のチューブリンポリマー結合部位を有するであろう。
【実施例８】
【００９９】
クマリン化合物存在下でのチューブリン集合の臨界濃度
あるクマリン化合物存在下でのチューブリン集合の臨界濃度は、約１０μＭの前記クマリン化合物、４％のジメチルスルホキシド、０．１ＭのＭＥＳ（ｐＨ６．９）、および１００μＭのＧＴＰ、並びにｍｇ／ｍｌで表した濃度でチューブリンのの半分の濃度のＭＡＰ（微小管結合タンパク質）を含む反応混合物中で測定できる。臨界濃度は、濁度をチューブリン濃度に対してプロットした場合の３５０ｎｍにおける最終的濁度の読みから決定される。臨界濃度は濃度軸上の切片として得られる。
微小管ポリマーは、サブユニット濃度が核形成に必要な濃度を越えた場合にのみ安定であると考えられ、安定な核の形成に必要なサブユニット濃度は臨界サブユニット濃度と名付けられる。臨界濃度は、ポリマーが存続する最少サブユニット濃度または定常状態のサブユニット濃度のどちらかである。臨界濃度は、総タンパク質濃度の関数としてポリマー含有量を測定し、さらにポリマー含有量０に外挿したタンパク質濃度を臨界濃度として用いることで決定される。
具体的には、例えば１．２ｍｇ／ｍｌの量の微小管タンパク質を種々の濃度のジクマロール（例えば０μＭ、１０μＭ、２０μＭ、５０μＭおよび１００μＭ）とを、１００ｍＭのＰＩＰＥＳ、１ｍＭのＭｇＣｌ2および１ｍＭのＥＧＴＡ（１００ｍＭのＰＥＭ緩衝液）並びに１ｍＭのグアノシン５’−トリホスフェート中で混合する。微小管重合反応を３５０ｎｍでの光散乱によって３７℃で、ギルフォードレスポンス（Gilford Reponse）分光光度計などの当技術分野で一般的な分光光度計を用いてモニターする。
【実施例９】
【０１００】
ＤＩＣビデオ顕微鏡法による個々の微小管の定常状態における動的不安定性パラメーターの分析
参照により本明細書に含まれるWalker et al.(1988) J. Cell Biol. 107:1437-1448;およびPanda et al.(1995) Biochem. 34:9921-9929に記載されたように、定常状態時における個々の微小管の動的不安定性による挙動を、リアルタイムＤＩＣビデオ顕微鏡撮影を用いて分析した。ハママツ（Hamamatsu）Ｃ２４００ニュービコン（Newvicon）ビデオカメラを用いて微小管像を捕捉した。画像はハママツＤＶ３０００デジタル画像プロセッサーを用いて増強された。長さの変化の分析は、N. Gilksman（University of North Carolina）がデザインしたビデオ分析ソフトを用いて実施した。
微小管をウニ鞭毛軸糸フラグメント（種）の末端で伸長させ、プラスおよびマイナス末端が識別した。微小管は約３０分以内にポリマー質量に関して定常状態に達し、定常状態の動的変化の分析を約３０分から約４５分実施し、この間微小管には変性または検出可能な動的変化は認められなかった。個々の動的不安定性パラメーターを定量的に分析した。前記パラメーターには伸長および短縮速度、微小管が伸長および短縮する時間の長さ、各伸長または短縮事象の平均の長さ、伸長もしくは減衰状態から短縮への、または短縮から伸長もしくは減衰もしくは休止状態への移行頻度、微小管が伸長、短縮または減衰状態で費やす合計時間のパーセンテージ、および全体的な動的変化性（単位時間における観察可能な伸長と短縮を合計したもの）が含まれる（以下を参照されたい：R.J. Kowalski et al.(1993) 26(4):282-290、この文献は参照により本明細書に含まれる）。
【０１０１】
チューブリンペレットを融解し、４℃で遠心して凝集または変性チューブリンを全て除去した。精製チューブリンを軸糸種と混合し、１ｍＭのＧＴＰを含むＰＭＭＥ緩衝液（８７ｍＭのＰＩＰＥＳ、３６ｍＭのＭＥＳ、１．４ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＥＧＴＡ、ｐＨ６．８）中で、クマリン化合物の存在下または非存在下で重合させた。また、１．５ｍＭのＧＴＰを含むＰＭＥ緩衝液（７５ｍＭのＰＩＰＥＳ、１．８ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＥＧＴＡ、ｐＨ６．８）中のエゾバフンウニ（S. purpuratus）の鞭毛軸糸種に精製チューブリン（１７μＭ）を添加し、３７℃で種々の濃度（約０．０４μＭから約５０μＭ）のジクマロールの存在下または非存在下で、定常状態になるまで約３５から約４５分、インキュベートした。
前記軸糸種の濃度は顕微鏡の視野当たり約３から約６個となるように調節した。３５分のインキュベーションの後、微小管懸濁液サンプル（２．５μｌおよび２．０μｌ）をビデオ顕微鏡観察のために調製し、個々の微小管の動的変化を以前（Panda et al.(1995) Biochem. 34:9921-9929、この文献は参照により本明細書に含まれる）に報告されたように３７℃で記録した。
【０１０２】
定常状態に達した後最大４５分間微小管を観察した。微小管が＞０．１５μｍ／分の速度で＞０．２μｍの長さ分、増大した場合に微小管は伸長相であるとし、＞０．３μｍ／分の速度で＞０．２μｍの長さ分、微小管が短縮した場合に微小管は短縮相であると決定した。６つのデータ点の間を通して、長さの変化が０．２μｍ以内の場合は減衰相であるとした。全ての実験で同じチューブリン調製物を用い、予備実験については、約１０から約１５の微小管の平均を各実験条件について測定し、表１に提供した結果については、約２０から約３０の微小管を各実験条件について分析した。
カタストロフィー頻度（伸長または減衰状態から短縮への移行）は、個々の条件について全微小管に関して、伸長＋減衰状態で費やされた全時間の合計でカタストロフィーの数を割ることによって算出した。レスキュー頻度（短縮から伸長または減衰への移行、軸糸種からの新規な伸長は除外する）は、個々の条件について全微小管に関して、短縮で費やされた全時間でレスキュー事象の総数を割ることによって算出した。コントロールの微小管では伸長と短縮相が交互に入れ替わるが、低いパーセンテージの時間が減衰状態でも費やされた。
【０１０３】
微小管のプラス末端にクマリン化合物が存在する予備実験では、図１７に示したように、マイクロモル濃度のジクマロールが動的不安定性挙動を安定化させることが判明した。図１７Ａに示すように、個々のコントロール微小管の伸長および短縮の時間による軌跡が５つ存在する。各記号は個々の微小管を示している。６つの微小管個々の伸長および短縮の動的変化に対する１μＭのジクマロールの影響は図１７Ｂに示されている。
更なる実験によって、ジクマロールは微小管のプラス末端の動的変化を顕著に抑制することが確認された。動的不安定性パラメーターに対する０．０４μＭから５０μＭの範囲のジクマロールの濃度の影響は、ジクマロールが濃度依存的に微小管短縮の速度および程度を抑制することを示した。
【０１０４】
具体的には、１μＭのジクマロールの添加は、平均短縮速度を約１８．５μｍ／分から約７．８μｍ／分へ約５８％顕著に減少させ、さらに短縮される長さを約２．３μｍから約１．４μｍに約４０％減少させた。短縮速度および長さに対するジクマロールの強力な作用とは対照的に、種々のジクマロール濃度で伸長の平均速度または長さには顕著な変化はなかった。０．１μＭの低い濃度では、減衰状態時間の全体のパーセンテージを６３％顕著に増加させた。対照的に、伸長に費やされる総時間には顕著な影響はなかった。ジクマロールは、０．１μＭの低い濃度でカタストロフィー頻度を約６５％（０．６２から０．２２μｍ）減少させた。ジクマロールはまた動的変化性を０．１μＭの濃度で約５７％減少させた。
したがって、ジクマロールなどのクマリン化合物は、主として微小管の短縮速度および程度を抑制し、カタストロフィー頻度を減少させることによって微小管の動的変化を顕著に減少させる。
【実施例１０】
【０１０５】
チューブリンによる放射能標識ＧＴＰの交換
可溶性チューブリンは、β−チューブリンの交換可能部位で可逆的にＧＴＰと結合し、さらにＧＴＰは、チューブリンが伸長微小管末端に取り込まれるとき交換不能な状態でＧＤＰとして取り込まれるので、以下の方法を用いて、チューブリン交換の動的変化を分子レベルで分析することができる。この場合分析は、[3Ｈ]ＧＴＰを用いて結合微小管末端で実施するか、または二重標識方法を用い動的不安定性ではなくトレッドミリングが支配的な挙動である条件下で両微小管末端で同時に実施される（例えば参照により本明細書に含まれるFarrell et al.(1987) J. Cell Biol. 184:1035-1046、を参照のこと）。
分析に際しては、微小管の平均の長さおよび長さの分布を電子顕微鏡またはＤＩＣ顕微鏡による決定することを併せて行い、それによって微小管末端当たりの交換の速度または程度を分析することが可能になる。放射能標識ＧＤＰの取り込みおよび微小管のタンパク質含有量は、微小管を安定化させ、さらに微小管をシュクロースクッションまたはグリセロールクッションを通して沈降させることによりグラスファイバーフィルター上に迅速にろ過した後定量される。この分析は微小管懸濁液中で行われるので、この測定によって、個々の微小管の末端における速度または程度ではなく、懸濁液に存在する全ての微小管の末端における平均的取り込み速度もしくは消失速度または程度が明らかになる。具体的には、定常状態の微小管集団が放射能標識ＧＴＰでパルス標識されるとき、最初の速度論的に急激な放射能標識の取り込みの後ではるかにゆっくりとした直線的速度での標識の取り込みが続く。放射能標識ＧＴＰの存在下で微小管を先ず集合させ定常状態にし、続いて過剰な非標識ＧＴＰでチェイスした場合も、同様な放射能標識の急激な低下とそれに続くはるかにゆっくりとした直線的な標識低下速度が観察される。最初の放射能標識の急激な獲得または低下は、微小管末端での動的不安定性挙動の程度の尺度であり、一方、放射能標識ＧＴＰパルスの間のゆっくりとした直線的な取り込み速度または完全に標識された微小管からのゆっくりとした放射能標識の消失はトレッドミル速度の尺度である。
【０１０６】
本発明の開示の理解または完結に必要なように、本明細書に記載した全ての刊行物、特許および特許出願は、その各々を個々に明示的に参照により明細書に含めた場合と同様に、参照により明示的に本明細書に含まれる。
上記のように本発明の典型的な実施態様を述べてきたが、記載の実施例は単なる例示であり、種々の他の選択肢、応用および改変が本発明の範囲内で可能であることは当業者に理解されなければならない。したがって、本発明は、本明細書に例示された具体的な実施態様に限定されず、以下の請求の範囲によってのみ制限される。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】図１は、クマリンによるS. purpuratus細胞の分裂の抑制を示す。
【図２】図２は、ジクマロールによるS. purpuratus細胞の分裂の抑制を示す。
【図３】図３は、７−ヒドロキシクマリンによるS. purpuratus細胞の分裂の抑制を示す。
【図４】図４は、ワルファリンナトリウムによるS. purpuratus細胞の分裂の抑制を示す。
【図５】図５は、受精後種々の時間における卵割の％抑制を表す。
【図６】図６は、平均伸長速度および平均短縮速度に対して種々の濃度のジクマロールが及ぼす影響を示す。
【図７】図７は、カタストロフィ頻度に対して種々の濃度のジクマロールが及ぼす影響を示す。
【図８】図８は、種々の濃度のジクマロールによる動的変化性の抑制を示す。
【図９】図９は、種々のジクマロール濃度における光散乱アッセイの結果を示す。
【図１０】図１０は、定常状態における微小管質量に対する種々の濃度のジクマロールによる影響を示す。
【図１１】図１１Ａは、有糸分裂中のＨｅＬａコントロール細胞の微小管を示す。図１１Ｂは、有糸分裂中のＨｅＬａコントロール細胞の染色体を示す。図１１Ｃは、５０μＭのジクマロールで処理した有糸分裂中のＨｅＬａ細胞の微小管を示す。図１１Ｄは、５０μＭのジクマロールで処理した有糸分裂中のＨｅＬａ細胞の染色体を示す。
【図１２】図１２は、ジクマロールのチューブリンに対する結合定数を示すグラフである。
【図１３】図１３は、５０、７０、８０、９０、１００および１１０分におけるウニ胚コントロール細胞の微小管を示す。
【図１４】図１４は、７０、８０、９０、１００および１１０分におけるウニ胚コントロール細胞の染色体を示す。
【図１５】図１５は、５０μＭのジクマロールで処理したウニ胚細胞の微小管を示  す。
【図１６】図１６は、５０μＭのジクマロールで処理したウニ胚細胞の染色体を  示す。
【図１７】図１７Ａは、プラス末端における個々のコントロール微小管の長さの変化を示す。図１７Ｂは、ジクマロール存在下でのプラス末端における個々の微小管の長さの変化を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１７】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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