(57)【要約】本発明は、心臓血管疾患、特に再狭窄およびアテローム性動脈硬化症の予防的または療法的治療のための組成物および方法に関する。これらの組成物は、内皮再形成の有効な促進剤、好ましくはプロブコールまたはその類似体、およびリポタンパク質酸化の阻害剤、好ましくはプロブコール由来ビスフェノールを含んでなる。あるいは、前記組成物は、内皮再形成促進およびリポタンパク質酸化阻害効果両方を所持する化合物を含んでなることが可能である。本発明はさらに、内皮再形成を促進する組成物および方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
内皮再形成の有効な促進剤およびリポタンパク質酸化の有効な阻害剤を含んでなる組成物。
【請求項２】
内皮再形成の促進剤がプロブコールまたはその類似体である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
リポタンパク質酸化の阻害剤が酸化防止補助剤である、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
酸化防止補助剤がプロブコール由来ビスフェノールである、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
前記プロブコール由来ビスフェノールが、以下の構造：
【化１】
2004501984.tif 000016
を有する、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
内皮再形成促進およびリポタンパク質酸化阻害活性両方を所持する化合物を含んでなる組成物。
【請求項７】
前記化合物が、メルカプトフェノールへの細胞内還元を可能にする「中央架橋」領域中に修飾を有する、プロブコール類似体である、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
類似体が、以下のまたは関連する構造：
【化２】
2004501984.tif 000017
を有する、請求項７記載の化合物。
【請求項９】
類似体がＰＤＡ４７４である、請求項８記載の化合物。
【請求項１０】
請求項８または請求項９記載の化合物を含んでなる薬剤組成物。
【請求項１１】
リポタンパク質酸化の１以上の有効な阻害剤をさらに含んでなる、請求項１０記載の薬剤組成物。
【請求項１２】
リポタンパク質酸化の阻害剤が酸化防止補助剤である、請求項１１記載の薬剤組成物。
【請求項１３】
心臓血管疾患の予防的または療法的治療法であって、こうした治療を必要とする被験者に、内皮再形成の有効な促進剤およびリポタンパク質酸化の有効な阻害剤を投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項１４】
内皮再形成の有効な促進剤およびリポタンパク質酸化の有効な阻害剤を同時に投与する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
内皮再形成の有効な促進剤およびリポタンパク質酸化の有効な阻害剤を、任意の順序で、連続して投与する、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
内皮再形成の促進剤がプロブコールまたはその類似体である、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
治療が、ｉｎ　ｖｉｖｏで、損傷を受けた管壁の内皮再形成を促進する、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
被験者にプロブコールおよびプロブコール由来ビスフェノールを投与する、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
心臓血管疾患の予防的または療法的治療法であって、こうした治療を必要とする被験者に、内皮再形成促進および有効なリポタンパク質酸化阻害活性両方を所持する化合物を投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項２０】
化合物が、以下のまたは関連する構造：
【化３】
2004501984.tif 000018
を有する、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
化合物がＰＤＡ４７４である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
化合物を、リポタンパク質酸化阻害活性を有する１以上の他の化合物と組み合わせて投与する、請求項２０または請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
リポタンパク質酸化阻害活性を有する化合物が酸化防止補助剤である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
酸化防止補助剤がプロブコール由来ビスフェノールである、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ｉｎ　ｖｉｖｏで、損傷を受けた管壁の内皮再形成を促進する治療法であって、こうした治療を必要とする被験者に、有効量の内皮再形成の促進剤およびリポタンパク質酸化の有効な阻害剤を投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項２６】
内皮再形成の促進剤がプロブコールまたはその類似体である、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
内皮再形成の促進剤およびリポタンパク質酸化の有効な阻害剤が、以下のまたは関連する構造：
【化４】
2004501984.tif 000019
を有する化合物である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
化合物がＰＤＡ４７４である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
心臓血管疾患の予防的または療法的治療法であって、こうした治療を必要とする被験者に、有効量のプロブコールまたはその類似体を投与して、内皮再形成を促進することを含んでなる、前記方法。
【請求項３０】
プロブコールまたはその類似体および薬学的に許容しうるキャリアーを含んでなる、内皮再形成組成物。
【請求項３１】
以下のまたは関連する構造：
【化５】
2004501984.tif 000020
を有する化合物を含んでなる、内皮再形成組成物。
【請求項３２】
化合物がＰＤＡ４７４である、請求項３１記載の内皮再形成組成物。
【請求項３３】
リポタンパク質酸化の１以上の有効な阻害剤をさらに含んでなる、請求項３０から３２いずれか１つに記載の内皮再形成組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、内皮再形成（ｒｅ−ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）を誘導し、そしてまたリポタンパク質の酸化を阻害する方法による、心臓血管疾患、特に再狭窄およびアテローム性動脈硬化症の予防的または療法的治療法に関する。本発明はさらに、好ましくは管壁において、内皮再形成を促進する方法も提供する。
【０００２】
背景技術
心臓疾患は、狭心症、脳卒中または心発作などの一般的に知られる異常として現れる可能性がある、心臓組織の劣った機能に関連する多くの要因から生じうる。心臓疾患の根底にある機構は、完全には理解されていない。しかし、コレステロールなどの脂質が積極的に関与していることが知られる。これらはすべて、アテローム性動脈硬化症、すなわち動脈を目詰まりさせ、そして次第に、沈着物をためて、最終的に心臓疾患を引き起こす異常に寄与しうる。
【０００３】
アテローム性動脈硬化症は、心発作、脳卒中を引き起こし、そしてオーストラリア人のほぼ５０％の死亡を導く。該疾患は、内膜肥厚および内皮下の空間における脂質（主に、低密度リポタンパク質、ＬＤＬ由来）沈着を伴う。病変が発展するにつれて、弾性ラミナが、中膜から内膜を分離し、平滑筋細胞が増殖して、内膜に浸潤し、そして増加した量の細胞外マトリックスを沈着することが可能になる。壊死コア（死細胞、脂質沈着およびコレステロール結晶で構成される）が発展する可能性があり、そして疾患はまた、中膜層も巻き込む可能性がある。アテローム性動脈硬化症は、症状なしに何年も静かに発展する可能性がある。アテローム性動脈硬化症の結果、既に部分的に遮断されている血管部位で、血塊がつかえると、しばしば深刻な事象を招く。
【０００４】
脂質沈着を誘発し、管の狭小化および最終的な閉塞（狭窄）を生じる要因を理解するための試みがなされてきている。アテローム性動脈硬化症の「酸化理論」によれば、ＬＤＬ（および他のリポタンパク質）の酸化は、主に、管壁の内皮下空間で起こる。酸化ＬＤＬは、細胞中の脂質の集積を促進し、内皮細胞の正常な血管制御機能を妨げ、内皮細胞および他の細胞に細胞傷害性であり、壊死コアの生成を仲介し、炎症性細胞の補充を促進し、そして血栓形成性組織因子および内皮細胞上の接着分子の発現を誘導することによって、アテローム生成促進性（ｐｒｏ−ａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃ）である。マクロファージによる脂質集積は、マトリックスメタロプロテイナーゼおよびサイトカイン（例えばＩＬ−８）の分泌を誘導することが可能である。酸化ＬＤＬのこれらの血栓、接着および炎症特性は、（間欠的でもまたは連続的でも）疾患進行に必須である可能性があり、そして内皮への偶発的な損傷を伴う可能性がある。
【０００５】
アテローム性動脈硬化症の傷害に対する反応仮説によれば、酸化ＬＤＬによって促進可能であるような、内皮細胞傷害は、それ自体、アテローム性動脈硬化症の発展を誘発するかまたはそれに寄与する可能性がある。
【０００６】
遮断された冠動脈は、一般的に、カテーテルを挿入し、そして狭窄部位でバルーンを膨らませて血流を回復する処置である、バルーン血管形成術（ＢＡ）によって治療する。優れた急性結果にもかかわらず、ＢＡの大きな限界は、治療した管の再閉塞（または再狭窄）であり、この事象は、処置後、およそ４０％で生じる。ＢＡは、限定されるわけではないが、内皮細胞層の露出を含む、管壁への損傷を引き起こす。こうした傷害に反応した、修飾平滑筋細胞による、過剰な新内膜増殖および細胞外マトリックス合成は、再狭窄の根底にある機構の重要な構成要素を代表すると考えられる。さらに、こうした損傷はまた、リポタンパク質の酸化および最終的にアテローム性動脈硬化症を増進することによって、損傷を悪化させる、炎症性マクロファージの補充も引き起こすことが可能である。暴露されたマトリックスはまた、血液構成要素と反応する傾向も有し、これが血塊を導き、そして急性心筋事象の発生率を増加させる。
【０００７】
ＷＯ９８／４２３２７（ＰＣＴ／ＣＡ９８／００２６９）に言及される最近の研究によって、再狭窄過程に随伴する寄与因子として、ＢＡ後の幾何的リモデリングが示唆される。リモデリングは、時間に渡る、総動脈または外部弾性膜横断面面積（ＣＳＡ）の変化と定義される。バルーン傷害後のこの幾何的リモデリングは二相性であるようであり、動脈ＣＳＡ血管において、最初に適応する増加（すなわち管の拡大に反映される陽性動脈リモデリング）があり、その後、管腔体積が減少する、収縮相（すなわち陰性動脈リモデリング）がある。
【０００８】
薬理学的または機械的アプローチによって、再狭窄過程を修飾する試みは、期待はずれであった。特に、スタチン（立証された抗アテローム性動脈硬化症活性を持つ脂質低下剤）は、再狭窄を減弱するのに無効である。管理した方式で試験し、そして陰性の結果を生じた他の剤には、カルシウムチャネル遮断剤、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、並びに抗血栓および抗増殖剤が含まれる。
【０００９】
これらの陰性の結果の例外が、酸化防止特性を持つ脂質低下薬剤で、そして心臓血管疾患の予防に実験的に用いられる、プロブコールである。
プロブコールは、以下の式：
【００１０】
【化６】
2004501984.tif 000002
【００１１】
を有する。
プロブコールの元来の使用は、ゴム産業における重合阻害剤としてのものであった。以来、脂質低下剤と共に、酸化防止剤であることが見出されてきた。実際、プロブコールは、特に経皮経管的冠動脈形成術（ＰＣＴＡ）後の再狭窄を予防するのに有効であることが示されてきた。したがって、ＰＣＴ／ＣＡ９８／００２６９に列挙される、いくつかの小規模臨床研究は、まず、ＢＡ４週間前に開始したプロブコールが、再狭窄を予防可能であると示唆した。続いて、大規模無作為化マルチビタミンおよびプロブコール（ＭＶＰ）試験は、単独で投与したプロブコールが、プラセボに比較して、血管造影管腔損失を６８％、区域あたりの再狭窄率を４７％、そして６ヶ月での反復血管形成術の必要性を５８％減少させることを示した。しかし、プロブコールがどのように作用してこれらの結果を生じるのか、そして血管リモデリングにおける組織過形成の阻害または改善を介して作用するのかどうかは不明である。
【００１２】
したがって、ＢＡ後の冠動脈再狭窄を予防することが示された最初の薬理学的剤の１つであるプロブコールに関して、その再狭窄阻害効果の根底にある機構は理解されていない。プロブコールのいくつかの活性が、通常、考慮される。これらのうち、最も重要なのは、その酸化防止活性であり、この活性がＬＤＬの酸化を妨げることによって、心臓血管疾患を減弱すると考えられる。しかし、我々は、リポタンパク質酸化の防止から再狭窄阻害を解離する証拠を得た。
【００１３】
さらに、プロブコールが、平滑筋細胞増殖を阻害することによって、再狭窄を阻害すると示唆されてきている（Ｔａｎａｋａら　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ　Ｄｒｕｇｓ　Ｔｈｅｒ　１９９８；１２，　１９−２８）。しかし、この研究は、プロブコールによる平滑筋細胞の観察された阻害が、直接かまたは間接的かを証明しなかった。また、平滑筋細胞は、斑に安定性を提供し、そしてそれによってそれ自体、臨床的事象を引き起こす重要な事象である、斑破裂のリスクを減少させるため、平滑筋細胞増殖の直接阻害は、常には好適でない可能性がある。
【００１４】
さらに、プロブコールは、内皮細胞増殖を促進することによって、再狭窄を阻害可能であると示唆されてきている（Ｋｏｍａｔｓｕら　Ｊ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｔｏｘｉｃａｌ　１９９９；４１：３３−４１）。この示唆は、完全にｉｎ　ｖｉｔｒｏ研究に基づいており、このｉｎ　ｖｉｖｏ関連性は未知のままである。例えば、Ｋｏｍａｔｓｕらは、ＢＡに影響を受ける動脈内皮細胞とは異なって反応することが知られる、静脈内皮細胞を用いた。
【００１５】
しかし、ＢＡからの回復および再狭窄の予防は、可能な限り迅速に、動脈の完全性を取り戻すことを伴う可能性がある。プロブコールは、主に、脂質低下剤およびＬＤＬの酸化を阻害する酸化防止剤としての評判を通じて、再狭窄予防に関連付けられてきている。平滑筋細胞増殖阻害に対する既知の効果を除いて、プロブコールは、ＢＡまたは類似の傷害後の動脈壁の完全性への寄与とは関連付けられていない。したがって、ＢＡまたは類似の傷害後の、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）動脈の回復を開始可能である化合物を得ることが望ましいであろう。
【００１６】
したがって、先行技術の問題のいくつかを克服するかまたは少なくとも軽減し、あるいは有用な代替法を提供することが、本発明の目的である。
【００１７】
発明の概要
第一の側面において、内皮再形成の有効な促進剤およびリポタンパク質酸化の有効な阻害剤を含んでなる組成物を提供する。
【００１８】
好ましくは、内皮再形成の促進剤はプロブコールまたはその類似体である。好ましくは、リポタンパク質酸化の阻害剤は、プロブコール由来ビスフェノールなどの酸化防止補助剤（ｃｏ−ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ）であるが、当業者は、リポタンパク質酸化の他の阻害剤もまた使用可能であることを理解するであろう。これに関連し、用語「リポタンパク質酸化の有効な阻害剤」は、本発明の文脈において、血管壁において、ｉｎ　ｖｉｖｏで有効なリポタンパク質酸化の阻害剤を含む。本明細書に提供する説明は、引用した参考文献を含め、適切な阻害剤をどのように同定するか、当業者を導く。
【００１９】
プロブコール由来ビスフェノールは、以下の構造：
【００２０】
【化７】
2004501984.tif 000003
【００２１】
を有する。
第二の側面において、内皮再形成促進およびリポタンパク質酸化阻害活性両方を所持する新規化合物を含んでなる組成物を提供する。
【００２２】
好ましい態様において、こうした新規化合物は、メルカプトフェノールへの細胞内還元を可能にするプロブコール「中央架橋」領域中に修飾を有する、プロブコール類似体であることが可能である。例えば、該類似体は、以下のまたは関連する構造：
【００２３】
【化８】
2004501984.tif 000004
【００２４】
を有することが可能である。
式（ＩＩＩ）の化合物は、そのままで処方可能であるし、またはリポタンパク質酸化の１以上の有効な阻害剤、例えばビスフェノールなどの酸化防止補助剤を含んでなるよう処方可能である。
【００２５】
第三の側面において、心臓血管疾患を治療する方法であって、こうした治療を必要とする被験者に、内皮再形成の有効な促進剤およびリポタンパク質酸化の有効な阻害剤を投与することを含んでなる、前記方法を提供する。
【００２６】
好ましくは、内皮再形成の促進剤はプロブコールまたはその類似体である。
好ましくは、本発明の組成物での治療は、ｉｎ　ｖｉｖｏで、損傷を受けた管壁の内皮再形成を促進する。やはり好ましいのは、プロブコールおよびそのビスフェノールを含んでなる組成物である。さらに、治療は、予防的でもまたは療法的でもよい。
【００２７】
好ましくは、プロブコールおよび阻害剤は、連続投与するが、これらは、望ましい効果を達成するのに、いかなる順序で連続投与してもよいことが理解されるであろう。
【００２８】
第四の側面において、心臓血管疾患を治療する方法であって、こうした治療を必要とする被験者に、内皮再形成促進および有効なリポタンパク質酸化阻害活性両方を所持する新規化合物を投与することを含んでなる、前記方法を提供する。
【００２９】
好ましい化合物は、上述のような式（ＩＩＩ）の化合物である。式（ＩＩＩ）の化合物は、リポタンパク質酸化阻害活性を有する別の化合物、例えばビスフェノールなどの酸化防止補助剤と組み合わせて投与可能である。
【００３０】
第五の側面において、ｉｎ　ｖｉｖｏで、損傷を受けた管壁の内皮再形成を促進する治療法であって、こうした治療を必要とする被験者に、有効量の内皮再形成の促進剤およびリポタンパク質酸化の有効な阻害剤を投与することを含んでなる、前記方法を提供する。
【００３１】
好ましくは、内皮再形成の促進剤はプロブコールまたはその類似体である。さらにより好ましいのは、上述のような式（ＩＩＩ）の化合物の投与である。
内皮再形成を促進する方法はまた、例えば内皮依存弛緩因子（すなわちｅＮＯＳに産生される一酸化窒素）を介した血管緊張の調節、平滑筋細胞によるマトリックスの沈着、および該細胞の増殖、炎症性血液細胞による管壁の浸潤、並びに凝血および血小板凝集の調節における、内皮機能障害に関連する症状を治療する方法にも拡張可能である。
【００３２】
第六の側面において、心臓血管疾患を治療する方法であって、こうした治療を必要とする被験者に、有効量のプロブコールまたはその類似体を投与して、内皮再形成を促進することを含んでなる、前記方法を提供する。
【００３３】
第七の側面において、プロブコールまたはその類似体および薬学的に許容しうるキャリアーを含んでなる、内皮再形成組成物を提供する。
第八の側面において、式（ＩＩＩ）の化合物を含んでなる、内皮再形成組成物を提供する。
【００３４】
内皮再形成組成物は、リポタンパク質酸化の１以上の有効な阻害剤、例えばビスフェノールなどの酸化防止補助剤をさらに含んでなるか、または該剤と組み合わせて用いることが可能である。
【００３５】
文脈が明らかに別のものを要求しない限り、説明および請求項全体で、語「含んでなる」、「含んでなること」およびそれらに匹敵するものは、独占的または網羅的意味と対照的に、包括的であると解釈されるべきであり；すなわち「限定されるわけではないが、含む」の意味である。
【００３６】
好ましい態様の説明
１つの側面において、本発明は、プロブコールまたはその類似体およびリポタンパク質酸化の有効な阻害剤を含んでなる組成物を提供する。
【００３７】
本発明の目的のためのリポタンパク質酸化の有効な阻害剤は、ｉｎ　ｖｉｖｏで血管壁において有効であるものである。その同一性は、ワタナベ遺伝性高脂血症（ＷＨＨＬ）ウサギ、アポＥ−／−マウス、またはコレステロールを与えたバルーン処置ニュージーランドホワイトウサギなどの適切な動物モデルを用いて、血管壁において、阻害剤の影響をｉｎ　ｖｉｖｏ解析することによって、日常的に確かめることが可能である。あるいは、これらは、例えば、本明細書に援用される、Ｊ　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１９９６，　３７：８５３−８６７に記載されるアッセイなどのこうした有効性を立証可能なｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイを通じて同定可能である。
【００３８】
リポタンパク質酸化の有効な阻害剤は、例えば、ＷＯ９７／３８６８１、Ｊ　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１９９６，　３７：８５３−８６７；Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　１９９５；２７０：５７５６−５７６３に記載されるような酸化防止補助剤であることが可能である。本発明の目的のため、「酸化防止補助剤」は、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　１９９５；２７０：５７５６−５７６３に詳細に記載されるような「古典的酸化防止剤」とは区別される。
【００３９】
本発明は、酸化防止補助剤などのリポタンパク質酸化阻害剤を伴うプロブコールまたはその類似体の組成物が、有益であることを示すが、古典的酸化防止剤を伴うプロブコールの組成物は、プロブコールの再狭窄阻害活性を無効にすることが示されている（Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ　１９９７；３３７：３６５−３７２）。プロブコール自体は、酸化防止補助剤ではない（Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　１９９５；２７０：５７５６−５７６３；Ｊ　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ　１９９６；３７：８５３−８６７）。適切な酸化防止補助剤には、限定されるわけではないが、ＷＯ９７／３８６８１；Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　１９９５；２７０：５７５６−５７６３；Ｊ　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ　１９９６，　３７：８５３−８６７に列挙される化合物が含まれる。
【００４０】
別の側面において、本発明は、内皮再形成促進およびリポタンパク質酸化阻害活性両方を所持する新規化合物を含んでなる組成物を提供する。こうした新規化合物は、「中央架橋」領域中に、ジスルフィドへの修飾を有する、プロブコール類似体であることが可能である。これは、メルカプトフェノールへの新規化合物の細胞内還元を可能にすることが可能である。例えば、類似体は、以下のまたは関連する構造：
【００４１】
【化９】
2004501984.tif 000005
【００４２】
を有することが可能である。
化合物は、当業者に知られる、標準的な合成計画によって調製可能である。フェノール環の各々で
【００４３】
【化１０】
2004501984.tif 000006
【００４４】
と示される置換基は、ｔ−ブチル基を表すよう意図する。
さらに別の側面において、本発明は、心臓血管疾患を治療する方法であって、こうした治療を必要とする被験者に、有効量のプロブコールまたはその類似体およびリポタンパク質酸化の有効な阻害剤を投与することを含んでなる、前記方法を提供する。
【００４５】
プロブコールおよび阻害剤は、同時にまたはいずれかの順序で連続して投与可能である。
本発明の組成物での治療は、ｉｎ　ｖｉｖｏで、損傷を受けた管壁の内皮再形成を促進する。有効な組み合わせは、プロブコールおよびリポタンパク質酸化阻害剤としてそのビスフェノールを含んでなる組成物であるが、本明細書に記載するかまたは引用する方法論によって同定される他の阻害剤もまた、使用可能である。さらに、治療は、予防的でもまたは療法的でもよい。
【００４６】
さらに別の側面において、本発明は、ｉｎ　ｖｉｖｏで、損傷を受けた管壁の内皮再形成を促進する治療法であって、こうした治療を必要とする被験者に、有効量のプロブコールまたはその類似体を投与することを含んでなる前記方法を提供する。
【００４７】
内皮再形成は、損なわれていない内皮細胞層が、先に露出した（すなわち脱内皮形成された）血管領域上に増殖しなおす過程である。一般的に、内皮細胞の再増殖は、より小さい管の分枝点で開始し、そしてその後、より大きい管に細胞増殖が進行する。内皮再形成は、内皮細胞増殖過程と同一ではない。前者は、先に損傷を受けた領域に限定されるが、内皮細胞増殖は、例えばそれ自体、アテローム性動脈硬化症を阻害するよりむしろ促進することが可能な血管形成に必要とされる、より一般的な過程である（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　１９９９；９９：１７２６−１７３２）。
【００４８】
内皮再形成は、ＢＡ（管の広い領域の内皮細胞層が除去される）後の再狭窄の予防に、特に重要である。例えば、血管内皮増殖因子（内皮細胞の増殖を特異的に促進する増殖因子）の局所搬送は、バルーン傷害ラット頚動脈において、内皮再形成を加速し、そして内膜過形成を減弱する（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　１９９５；９１：２７９３−２８０１）。内皮再形成はまた、例えば酸化ＬＤＬの集積および毒性特性の結果として、内皮細胞への傷害が起こるアテローム性動脈硬化症でも重要である可能性がある。
【００４９】
内皮は、心臓、血管およびリンパ管、並びに他の流体充填腔および腺におけるなど、内部体表面を裏打ちする細胞層である。内皮は、表面の完全性を維持しようとするならば、再増殖を誘導されるはずである。血管における内皮の完全性は、一般的に血管恒常性に、そして特に再狭窄およびアテローム性動脈硬化症に関連する過程に、主要な重要性を持つ。後者には、限定されるわけではないが、内皮依存弛緩因子（すなわちｅＮＯＳに産生される一酸化窒素）を介した血管緊張の調節、平滑筋細胞によるマトリックスの沈着、および該細胞の増殖、炎症性血液細胞による管壁の浸潤、並びに凝血および血小板凝集の調節が含まれる。平滑筋細胞増殖は、しばしば、再狭窄に関与する。増殖防止は、再狭窄進行を阻害するのに有効であった。しかし、例えば、平滑筋細胞増殖の防止は、斑の安定性を減少させ、そしてそれによって斑破裂を促進することにより、臨床的事象を促進するため、全体での平滑筋細胞増殖の直接の防止は、常には有益でない可能性がある。
【００５０】
内皮再形成を促進する方法は、管壁の完全性を維持するのに寄与する、多くの好適な結果を有する可能性がある。結果は、より優れた循環、および全体的な健康として現れる可能性がある。
【００５１】
内皮再形成を促進する方法はまた、例えば内皮依存弛緩因子（すなわちｅＮＯＳに産生される一酸化窒素）を介した血管緊張の調節、平滑筋細胞によるマトリックスの沈着、および該細胞の増殖、炎症性血液細胞による管壁の浸潤、並びに凝血および血小板凝集の調節における、内皮機能障害に関連する異常を治療する方法にも拡張可能である。
【００５２】
プロブコールの投与による内皮再形成の促進は、どの時点で行うことも可能である。例えば、内皮再形成は、血管形成術、ＰＴＣＡまたはＢＡの前または後で促進可能である。好ましくは、内皮再形成の促進は、露出（内皮細胞の除去）後に行う。しかし、プロブコールの投与は、露出前に行うことも可能である。好ましくは、投与は、ＢＡなどの露出事象前に行う。より好ましくは、プロブコールは、露出事象の３から４日前に投与する。
【００５３】
用語「管」には、本明細書において、内皮に裏打ちされる、体のすべての流体または空気充填管が含まれる。好ましくは、管は血管である。より好ましくは、管は動脈である。動脈は、アテローム性動脈硬化斑によって遮断される可能性が最も高く、罹患した斑を除去するのに血管形成術を必要とし、それによって内皮層が露出される。
【００５４】
管壁への損傷は、内皮の管を剥ぎ取るいかなる手段によって発生する可能性もあるが、好ましくは、動脈傷害である。損傷は、血管形成術、ＰＴＣＡ、またはＢＡによって引き起こされる可能性がある。
【００５５】
本発明にしたがった方法は、プロブコールまたはその類似体の投与を含んでなる。用語「その類似体」には、プロブコールと類似の方式で作用し、そしてプロブコールと類似の構造を有する分子が含まれる。
【００５６】
用語「有効量」は、本明細書において、損傷を受けた管において内皮再形成を促進するのに有効な量を記載する。プロブコールは、食餌中におよそ１％のプロブコールを提供する量で、投与可能である。あるいは、プロブコールは、動脈傷害前に、毎日２回、およそ５００ｍｇで投与可能である。
【００５７】
プロブコールを投与する方法は、内皮再形成を促進しようとする部位に応じるであろう。投与は、経口、静脈内、筋内、皮下、鼻内、皮内によっても、あるいは坐剤経路によってもよい。投与経路に応じて、プロブコールは、そのまま投与してもよいし、またはプロブコールの作用部位への搬送を促進する、１以上の活性分子と組み合わせて投与してもよい。例えば、リポソーム、グリセロール、ポリエチレングリコール、油または緩衝剤の混合物、錠剤を避けるかまたは錠剤用である食用キャリアー、カプセルが使用可能である。
【００５８】
本発明の別の側面において、心臓疾患を治療する方法であって、患者に有効量のプロブコールまたはその類似体を投与して、内皮再形成を促進することを含む、前記方法を提供する。
【００５９】
心臓疾患は、管機能に関連する心臓の異常いずれであることも可能である。例えば、管の完全性の損失は、劣った循環、アテローム性動脈硬化斑形成、再狭窄、狭心症、脳卒中または心発作を導く可能性がある。したがって、心臓疾患の治療は、これらの異常いずれの治療にも拡張される。好ましくは、心臓疾患はアテローム性動脈硬化症である。
【００６０】
本発明を、作用様式に関するいずれか１つの仮説に限定することは望ましくないが、血管形成術、ＰＴＣＡまたはＢＡ、アテローム性動脈硬化症、あるいは他の動脈傷害の結果、先に露出されている管壁領域で、内皮細胞再増殖を選択的に促進することによって、プロブコールが作用する可能性がある。
【００６１】
用語「治療すること」は、本明細書において、予防的（すなわち防御的）治療と共に、心臓疾患、好ましくはアテローム性動脈硬化症の影響を改善するように設計した治療を含むよう、最も広い意味で用いる。プロブコールの使用による治療は、内皮再形成を促進することを目的とする。こうすることによって、管壁の完全性が、健康な状態で維持されると考えられる。
【００６２】
本発明のさらに別の側面において、プロブコールおよび薬学的に許容しうるキャリアーを含んでなる、内皮再形成組成物を提供する。
キャリアーは、体に生理学的に許容しうる、いかなるキャリアーであってもよい。生理食塩水、緩衝生理食塩水溶液または水、あるいは内皮再形成を必要とする部位へのプロブコールの搬送を促進する化合物であることが可能である。
【００６３】
本発明は、ここで、以下の実施例に関連して、さらに完全に記載されるであろう。しかし、以下の説明は、例示のみであり、そして決して上述の本発明の一般性に対する制限と解釈してはならないことを理解しなければならない。
【００６４】
【実施例】
実施例１：アポリポタンパク質Ｅ遺伝子ノックアウトマウスにおいて、管壁におけるリポタンパク質酸化の阻害を伴わず、アテローム性動脈硬化症を阻害する、プロブコールの能力
（ａ）動物および食餌
破壊されたアポＥ遺伝子に関してホモ接合体である（アポＥ−／−）雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、１０週齢まで、標準的固形試料（Ｌａｂ−Ｆｅｅｄ、オーストラリア・シドニー）を与えた。続いて、マウスに、それぞれ１％プロブコール（重量／重量）を含みまたは含まず、２１．２および０．１５％（重量／重量）脂肪およびコレステロールを含有する、高脂肪食餌を無制限に与えた。高脂肪食餌（対照およびプロブコール補充）は、Ｈａｒｌａｎ　Ｔｅｋｌａｄ食餌ＴＤ８８１３７の規格にしたがって、調製した。対照固形試料は、検出可能な脂質ヒドロペルオキシドを含有しなかった。
【００６５】
（ｂ）血漿酸化およびリポタンパク質
血漿は、対照およびプロブコールマウスから得て、そして続く脂質の測定のため、アリコットを凍結した。別個のアリコットをメタリン酸（５％）で酸性化して、ビタミンＣを安定化した後、−８０℃で凍結しそして保存した。残りを適切にプールし、そしてＪ　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．　１９９９；４０：１１０４−１１１２に記載されるように、ペルオキシルラジカル発生剤ＡＡＰＨによって開始するｅｘ　ｖｉｖｏ酸化およびＵＶ２８０ｎｍ検出でのＦＰＬＣによるリポタンパク質分離のために用いた。
【００６６】
（ｃ）脂質および酸化防止剤の解析
脂溶性酸化防止剤および脂質は、ＦＡＳＥＢ　Ｊ．　１９９９；１３：６６７−６７５に記載されるように、ＨＰＬＣによって定量化した。アスコルベート解析には、凍結した酸性化試料を融解し、ＤＰＢＳで希釈してｐＨを７．４に調整し、そしてその後、すぐにＨＰＬＣに供した。血漿トリグリセリドは、酵素的に測定した（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、ドイツ・マンハイム）。
【００６７】
（ｄ）大動脈除去
Ｌｅｔｔｅｒｓ　ＪＭら（１９９９）に記載されるように、出血後、２０μＭ　ＢＨＴおよび１ｍＭ　ＥＤＴＡを含有するＤＰＢＳ（緩衝液Ａ）で５分間、マウスを引力灌流し（ｇｒａｖｉｔｙ−ｐｅｒｆｕｓｅｄ）、そして大動脈を除去した。簡潔には、心臓、上行および下行大動脈（大腿結合部を過ぎる）を摘出し、そして注意深く浄化した。組織像用に指定した大動脈（対照およびプロブコール群に関して、それぞれｎ＝１０および９）を、４％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドを含有する緩衝液Ａで灌流固定し、（付着した心臓と共に）ホルマリン中に移した。生化学用には、標準的固定法を用いると、付随する酸化が起こるため、大動脈（対照およびプロブコール群に関してｎ＝２２−２４）を固定しなかった。浄化したら直ちに、心組織を回避しつつ、すべての大動脈材料を含むように注意しながら、大動脈を心臓から分離した。ＨＰＬＣ解析に十分な材料（すなわち３０−４０ｍｇ湿重量組織）を得るには、７−８の大動脈をプールする必要があった。大動脈の別個のプールを両群に関して調製し、そしてその後、緩衝液Ａ中で直ちに凍結し、そして解析まで−８０℃で保存した。
【００６８】
（ｅ）大動脈ホモジネートの生化学
Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　１９９４；２３３：４６９−４８９に記載されるように、プールした大動脈は、液体窒素中で迅速凍結し（ｓｎａｐ　ｆｒｏｚｅｎ）、微粉砕し、緩衝液Ａ中に再懸濁し、ホモジナイズし、そしてその後、メタリン酸（アスコルベート用）で処理するか、または抽出し、そしてＨＰＬＣによって、脂溶性酸化防止剤、コレステロール（Ｃ）、コレステロールエステル（ＣＥ）、脂質ヒドロペルオキシド（ＬＯＯＨ）およびコレステロールエステル水酸化物（ＣＥ−ＯＨ）に関してヘキサン分画を解析した。ＬＯＯＨおよびＣＥ−ＯＨは、アポＥ−／−マウス由来のリポタンパク質が酸化を経る際に形成される一次的な、そして主要な酸化産物であるため、リポタンパク質脂質酸化のマーカーとして測定した。ビスフェノール、プロブコールおよびジフェノキノンは、勾配ＲＰ−ＨＰＬＣによって解析し、化合物は、それぞれ、〜９、１７および２７分で溶出した。すべての化合物は、真正標準とのピーク面積比較によって定量化し、そしてタンパク質を測定した。
【００６９】
（ｆ）形態計測
病変は、大動脈根、大動脈弓、下行胸大動脈、および近位腹大動脈における、大動脈に沿った４つの異なる部位で評価し、そして横断切片（２−３μｍ厚）を調製し、そしてワイゲルトのヘマトキシリン−ワン・ギーソンで染色した。
【００７０】
本実施例は、以下に記載するように、プロブコールの、ＬＤＬ酸化を阻害する酸化防止剤としての推定上の作用からの、抗アテローム性動脈硬化症活性の解離を確証する。
【００７１】
（ａ）大動脈形態計測
対照およびプロブコール治療群の代表的な横断切片を図１に示す。病変は、管のすべての部位および被覆する広い領域で見られ、例外は、病変がより小さく、そして分枝肋間動脈口周辺に位置する、下行胸大動脈であった。病変形態は、すべての領域で肉眼的に類似であり、コレステロール結晶を含有する壊死コアが、すべての部位で一様に観察された。表１は、観察される病変サイズを要約する。
【００７２】
表１．病変横断面面積（μｍ２ｘ１０−３）として測定した、アポＥ−／−マウスにおけるアテローム性動脈硬化病変の形成に対するプロブコールの部位特異的抗アテローム生成効果
【００７３】
【表１】
2004501984.tif 000007
【００７４】
１％（ｗ／ｗ）プロブコールの非存在下（対照）または存在下で、マウスに高脂肪食餌を２４週間与えた後、異なる部位で病変を評価した。
分散分析により、有意な相互作用項（Ｐ＝０．００１）によって示されるように、プロブコールは、有意に、しかし部位依存的に、病変サイズに影響を与えることが示された（表１）。直接比較によって、対照に対してプロブコール群において、大動脈弓および下行胸大動脈中、有意により小さい病変が示された（表１）。腹大動脈から得たいくつかの結果もまた、プロブコールの抗アテローム生成効果を示した。先の研究は、正常固形試料を与えた雌および雄アポＥ−／−マウスの大動脈根において、プロブコールが病変形成を増進することを報告した（Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ．　１９９７；９９：２８５８−２８６６；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．　１９９９；９９：１７３３−１７３９）。これと一致して、この部位での病変は、高脂肪固形試料を与えた対照雄マウスより、プロブコール群において、より大きかった（表１）が、この相違は、統計的有意性には達しなかった。表１はまた、先に報告されたプロブコールの病変増進効果が、大動脈根領域に限定されるだけでなく、プロブコールがまた、調べた部位のさらに遠位で、ますますより抗アテローム生成性になるよう変化したことも示す（表１）。腹大動脈で、プロブコールは、病変形成を有効に妨げた。
【００７５】
（ｂ）大動脈生化学
対照およびプロブコール処置マウスの全大動脈における脂質および酸化防止剤含量を測定した。アポＥ−／−マウスに高脂肪食餌を２４週間与えると、リノール酸コレステロール（Ｃ１８：２、主要な、容易に酸化可能な脂質）およびα−トコフェロール（ビタミンＥ）を含む、リポタンパク質由来脂質の大動脈含量が、実質的に増加した。表２および３は、高脂肪食餌２４週間後に得た、主要な脂質および酸化防止剤に関してタンパク質あたりで表した値を示す。かなりの量の酸化防止剤、ビタミンＥおよびＣの存在（表３）にも関わらず、大動脈はまた、非酸化脂質に加え、ＬＯＯＨおよびＣＥ−ＯＨも含有した（表２）。ＬＯＯＨの存在は、化学発光検出後、ＨＰＬＣによって確認し、化学発光陽性シグナルは、ホウ化水素処理によって除去した。全部で〜１％の大動脈脂質が酸化され（表２）、そして大動脈はまた、それぞれ、ユビキノール−１０およびα−トコフェロールの酸化型である、ユビキノン−１０およびα−トコフェリルキノンも含有した（表３）。
【００７６】
表２．処置２４週間後のアポＥ−／−マウスにおける大動脈および血漿脂質
【００７７】
【表２】
2004501984.tif 000008
【００７８】
大動脈および血漿を解析する前に、アポＥ−／−マウスには、対照またはプロブコール補充食餌いずれかを２４週間与えた。
【００７９】
表３．処置２４週間後のアポＥ−／−マウスにおける大動脈および血漿酸化防止剤
【００８０】
【表３】
2004501984.tif 000009
【００８１】
大動脈および血漿を解析する前に、アポＥ−／−マウスには、対照またはプロブコール補充食餌いずれかを２４週間与えた。
対照に比較して、プロブコールは、タンパク質あたりで表した脂質および脂溶性酸化防止剤の大動脈含量を、有意に減少させた（表２および３）。例えば、Ｃ、ビタミンＥおよび総ＣｏＱ（ユビキノールを加えたユビキノン）濃度は、それぞれ、５．６、２．９および２．５倍減少した。プロブコールによる大動脈脂質のこの減少は、既知の脂質低下活性および本研究の組織学的結果と一致する（表１、図１）。プロブコールはまた、タンパク質標準化ＣＥ−ＯＨおよび解析した場合、ＬＯＯＨの大動脈含量も、有意に減少させた（表２）。これが、プロブコールの脂質低下または酸化防止活性の結果であるのかどうか評価するため、我々は、ＣＥあたりの酸化脂質の大動脈含量を表した（表４）。プロブコールは、脂質で標準化した酸化脂質の含量に影響を与えず、該薬剤が、酸化防止剤よりむしろ、脂質低下剤として作用することを示した。しかし、プロブコールは、未知の理由によって、水溶性酸化防止剤アスコルベートの大動脈濃度を増加させた。プロブコールは、ビタミンＥより〜１１倍高い濃度で検出され、そして〜１１％の薬剤は、ビスフェノールまたはジフェノキノンに代謝された。
【００８２】
表４．処置２４週間後のアポＥ−／−マウスにおける、脂質で標準化した酸化脂質の大動脈含量
【００８３】
【表４】
2004501984.tif 000010
【００８４】
大動脈を解析する前に、アポＥ−／−マウスには、対照またはプロブコール補充食餌いずれかを２４週間与えた。
【００８５】
（ｃ）血漿脂質
プロブコール処置マウス由来の血漿は、有意により少ない脂質を有し（表２）、そしてビタミンＥは〜４倍減少したが、アスコルベートは〜１．４倍増加し、そして総補酵素Ｑは変化しないままだった（表３）。大動脈での状況と同様に、プロブコールは、ビタミンＥより〜１３倍高い濃度で存在し、そして〜８％の薬剤がビスフェノールまたはジフェノキノンに変換され、プロブコールの代謝が、管壁で行われていないことが示唆された。大動脈と比較し、血漿は少量のＣＥ−ＯＨしか含有せず、そして２群間に相違はなかった。さらに、ＬＯＯＨおよびα−トコフェリルキノンは存在せず（表３）、アポＥ−／−マウスにおけるリポタンパク質酸化は、循環よりむしろ管壁内で起こることが示された。サイズ排除クロマトグラフィーによって、プロブコールが誘導する脂質低下作用の大部分は、ＶＬＤＬの減少によるものであり、ＬＤＬおよびＨＤＬは、ほとんど変化しないままであることが示された（図２）。したがって、プロブコール群由来のＶＬＤＬ中のＣの含量は、血漿中の状況を反映して、対照値の２５％減少した（表２および５を参照されたい）。ＨＰＬＣ解析もまた、脂溶性酸化防止剤およびその代謝物が、リポタンパク質のコレステロール含量に、多かれ少なかれ比例して分布していることを示した（表５）。これは、プロブコールがなぜ血漿ビタミンＥを低下させるのかを説明する可能性がある。
【００８６】
表５．処置２４週間後のアポＥ−／−マウスの血漿から調製したリポタンパク質分画に存在する脂質および酸化防止剤
【００８７】
【表５】
2004501984.tif 000011
【００８８】
アポＥ−／−マウスに１％ｗ／ｗプロブコールを含まない（対照）または含む高脂肪食餌を２４週間与え、その後、血漿を得て、プールし、そしてサイズ排除ＦＰＬＣに供した。各々、３００μｌの未希釈血漿を使用した、２回の連続する分離を行った。対応する溶出物を両注入から収集し、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、ＬＤＬ，およびＨＤＬに加えてマウス血清アルブミンに対応する分画にしたがってプールし（図３を参照されたい）、そしてその後、抽出し、そして脂質および酸化防止剤に関して解析した。
【００８９】
（ｄ）血漿リポタンパク質酸化可能性
血漿リポタンパク質の酸化に対する耐性増進は、しばしば、酸化防止有効性の測定値として用いられる。したがって、対照および処置動物からプールした血漿のＡＡＰＨ誘導酸化を調べた。対照血漿をこの酸化剤に曝露した結果、アスコルベート（図３Ａ）、並びにユビキノール−９および１０（図３Ｂ）が時間依存性に、そして同時に消費された。出発濃度の増加から予期されるように、アスコルベート枯渇に要する時間は、プロブコール群で幾分増加し（図３Ａ）、そしてこれは、ユビキノールの完全消費に要する時間の増加に反映された（図３Ｂ）。アスコルベートおよびユビキノールが枯渇すると、ビスフェノール（図３Ｃ中、黒塗り正方形）は、ジフェノキノンに酸化された（未提示）。その後、血漿ビタミンＥ（図３Ｃ中、正方形）が、ＣＥ−Ｏ（Ｏ）Ｈの集積と同時に減少し（図３Ｄ）、その開始および初期速度は、ビタミンＥの濃度が４倍低いのにも関わらず、プロブコール処置マウス由来の血漿において、それぞれ、遅れ、そして減少した（図３Ｄ）。プロブコール（図３Ｃ中、クロスハッチングした正方形）は、調べた酸化期間中、変化しないままだった。これらの観察は、トコフェロール仲介過酸化に基づいて、容易に説明可能である。これらのデータを総合すると、アスコルベートの濃度増加およびプロブコールよりむしろビスフェノールの存在が、ＡＡＰＨに誘導されるｅｘ　ｖｉｖｏ酸化に対する血漿脂質の耐性増進を提供することが示される。
【００９０】
要約すると、脂質低下酸化防止剤プロブコールは、動物において、アテローム性動脈硬化症を、そしてヒトにおいて再狭窄を阻害することが可能である。しかし、プロブコールは、アポリポタンパク質Ｅ不全（アポＥ−／−）マウスの大動脈根で、アテローム性動脈硬化症を促進することが示された。本明細書において、１％（重量／重量）プロブコールを含まずまたは含み、２１．２％（重量／重量）脂肪および０．１５％（重量／重量）コレステロールを含有する食餌を与えたアポＥ−／−マウスの、動脈沿いの４部位での病変形成、並びに血漿および大動脈におけるリポタンパク質酸化、両方に対するプロブコールの影響を調べた。６ヵ月後、対照は、調べたすべての部位で、病変を発展させた。病変発展は、プロブコールによって強く（Ｐ＝０．０００１）影響を受けたが、この影響は均一ではなかった：病変サイズは、大動脈根で増加したが、大動脈弓、下行胸大動脈および近位腹大動脈では有意に減少した。プロブコール処置マウスの血漿および大動脈は、対照に比較して、高濃度のプロブコールおよびその代謝物（ビスフェノールおよびジフェノキノン）、増加したビタミンＣ、顕著に減少したＶＬＤＬ（しかしＬＤＬおよびＨＤＬはそうでない）、並びに減少したコレステロール、コレステロールエステル、トリグリセリド、ビタミンＥおよび酸化脂質を含有した。興味深いことに、プロブコール処置は、酸化された大動脈脂質の比率を減少させなかった。血漿ビタミンＣおよびビスフェノールは、ｅｘ　ｖｉｖｏ酸化から血漿脂質を保護したが、プロブコールは血漿脂質を保護しなかった。これらの結果は、他の種におけるのと同様、プロブコールが、アポＥ−／−マウスの大動脈のほとんどの部分で、病変形成を阻害可能であることを示す。この効果は、管壁内に局在する脂質酸化独立機構と共に脂質低下も伴う可能性がある。
【００９１】
実施例２：コレステロールを与えたバルーン処置ニュージーランドホワイトウサギにおいて、管壁におけるリポタンパク質酸化と独立に、プロブコールがアテローム性動脈硬化症／再狭窄を阻害する能力
本実施例は、ＬＤＬ酸化阻害およびプロブコールがアテローム性動脈硬化症／再狭窄を阻害する能力の解離を例示する。
【００９２】
１８匹のニュージーランドホワイトウサギ（１５週齢）に、１％（重量／重量）プロブコールを含まないまたは含む、２％（重量／重量）コレステロール強化食餌を６週間与えた。大動脈内皮露出は、膨らませた３Ｆフォガティバルーン塞栓摘出カテーテルを、大動脈全長で３回引き下ろすことによって、第３週に行った。研究開始時および終了時に、実施例１に記載したように、動物から血漿を得た。研究期間終了時に、実施例１におけるように、個々の大動脈を除去し、そしてＨＰＬＣ解析用に調製した。脂質、並びにプロブコールおよびその代謝物、ビスフェノールおよびジフェノキノンを含む、酸化防止剤は、先に記載したように、ＲＰ−ＨＰＬＣによって解析した。組織像用に指定した大動脈を、４％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドで灌流固定し、そしてホルマリン中に移した。横断切片（２−３μｍ厚）を調製し、そしてワイゲルトのヘマトキシリン−ワン・ギーソンで染色し、そして３切片に関して、内膜対中膜比を決定した。
【００９３】
かなりの濃度のプロブコールおよびその代謝物が、血漿および大動脈中で測定された。プロブコールは、各対照と比較して、血漿および大動脈脂質の含量、並びに酸化脂質の絶対量を有意に減少させた。しかし、酸化された大動脈脂質の比率は、プロブコールによって影響を受けなかった。プロブコールは、アテローム性動脈硬化症を有意に減少させ、アテローム性動脈硬化症に対する有意な防御効果を明示した。プロブコールが、アテローム生成の中核を成すと考えられる過程である、脂質酸化を阻害することによって、アテローム性動脈硬化症を阻害するという、広く抱かれている見解は、これらの知見によっては支持されない。
【００９４】
実施例３：コレステロールを与えた、および正常固形試料を与えた、バルーン処置ニュージーランドホワイトウサギにおいて、プロブコールが内皮再形成を促進する能力
本実施例は、プロブコールが、ｉｎ　ｖｉｖｏで内皮再形成を促進可能であり、そしてプロブコールがｉｎ　ｖｉｖｏで内皮再形成を促進する能力が、その脂質低下活性と独立であることを例示する。結果は、以下の表６に示す：
【００９５】
表６：コレステロールを与えた、および正常固形試料を与えた、バルーン処置ウサギにおける、内皮再形成
【００９６】
【表６】
2004501984.tif 000012
【００９７】
結果は、２つの別個の実験からであり、そして群あたり６匹（コレステロール食餌）および５匹の動物（正常食餌）の平均±ＳＤを表す。アスタリスクは、対応する対照と比較して、統計的に有意により高い値を示し、＊、＊＊、および＊＊＊に対して、ｐ値はそれぞれ０．００２、０．０１５および０．０２５である。図４もまた、対照およびプロブコール動脈における内皮再形成を例示する。
【００９８】
実施例４：動物の管壁において、酸化防止補助剤（ビスフェノール）がリポタンパク質酸化を阻害する能力
本実施例は、酸化防止補助剤が、ｉｎ　ｖｉｖｏ脂質酸化を阻害可能であることを例示する。
【００９９】
（ａ）動物
雄アポＥ−／−；ＬＤＬｒ−／−マウス（総数５９匹）は、離乳から８週齢まで、標準的Ｒ３固形試料上で維持した（若い対照、ｎ＝９）。その後、マウスに、ビスフェノールを補充した（ｎ＝２５）または補充しない（ｎ＝２５）Ｒ３固形試料をさらに１４週間与えた。標準的Ｒ３マウス固形試料は、０．０３％（ｗ／ｗ）のビスフェノールで強化し、この補充レベルは、パイロット実験で、この動物モデルにおいて、アテローム生成に対する酸化防止補助剤の効果を試験するのに適切とみなされる、〜２００μＭの循環薬剤濃度を提供することが示されたものである。２２週齢で、各群、１０および１５匹のマウスを、それぞれ、生化学的および組織学的解析のために用いた。サイズが小さいため、生化学的解析に十分な材料を得るには、大動脈をプールする必要があった。
【０１００】
（ｂ）血液試料採取、並びに血漿および血清の調製
対照および薬剤処置アポＥ−／−；ＬＤＬｒ−／−マウスから、直接心穿刺によって血液試料（〜１ｍｌ）を採取した。
【０１０１】
（ｃ）大動脈管の灌流および固定
マウス大動脈は以下のように摘出した：出血後、流れを可能にするように右側の心室を開き、左心室を通じて、１００μＭ　ＢＨＴおよび１ｍＭ　ＥＤＴＡを含有するダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水で、心臓を灌流した（最大圧８０ｍｍＨｇ）。組織学的試料のためのみ、脈管構造を続いてホルマール生理食塩水で固定した。すべての処置群から心臓および全大動脈を除去し、そして脂肪および結合組織を直ちに浄化した。生化学的解析用の大動脈は、ホルマリン固定なしに、直ちに凍結した（−７０℃）。
【０１０２】
（ｄ）アテローム性動脈硬化症の評価
大動脈病変は、下行胸大動脈中の肋間動脈枝の第三対周辺を中心とする区域で評価した。簡潔には、固定した大動脈をエタノール中で脱水し、キシレンできれいにし、そしてパラフィンに包埋した。連続切片（総数１０；各２−３μｍ厚および１００μｍ離れている）を切り出し、そしてワイゲルトのヘマトキシリン−ワン・ギーソンで染色した。大動脈肥厚は、対照試料に対してビスフェノール処置試料において、調べた区域中の内膜の総体積として評価した。
【０１０３】
大動脈体積は、横断切片画像上にコンピューターモニターの重ね合わせを可能にする、Ｌｅｉｔｚ　ＤＲＭ顕微鏡に取り付けた、Ｌｕｃｉｖｉｄ装置（ＭｉｃｒｏＢｒｉｇｈｔＦｉｅｌｄ、カナダ・バーモント州コルチェスター）を用いて、面積測定法によって測定した。
【０１０４】
（ｅ）大動脈ホモジネートの調製
浄化した大動脈区域を融解し、吸い取り、プールし（ｎ＝７または８）、重量測定し、ＢＨＴ（１００μＭ）およびＥＤＴＡ（１ｍＭ）を含有する、アルゴンでフラッシュしたリン酸緩衝生理食塩水２ｍｌに添加した（〜４０ｍｇ湿組織／ｍｌを得るように）。組織をはさみで細かく切り刻み、それぞれ、アスコルベートおよびビタミンＥ（α−ＴＱを含む）の内部標準として、イソアスコルベート（５μＭ）およびα−トコトリエノール（１μＭ）を添加し、そして試料をポリテトラフルオロエチレンで裏打ちしたガラス管に移して、そして５００ｒ．ｐ．ｍ．で回転するテフロンピストンを用いて、４℃で５分間ホモジナイズした。酸化脂質を回収するため、［３Ｈ］−Ｃｈ１８：２−ＯＨをヒトＬＤＬに取り込み、そしてホモジナイズ前に容器に添加した。スパイクしたホモジネートの解析によって、標識の９４±１．３％の回収が示された（２つの別個の実験の平均±範囲）。アスコルベート測定に関しては、未加工ホモジネート（５０μｌ）をメタリン酸（５％ｖ／ｖ、５０μｌ）に添加し、そしてドライアイス上で凍結した。ＨＰＬＣ解析の直前、アリコットを融解し、そしてリン酸緩衝液（５０μｌ、２５０ｍＭ、ｐＨ７．４）で希釈してｐＨを調整した。脂質の解析には、残ったホモジネート（〜１．８ｍｌ）を４ｘ４５０μｌのアリコットに分け、そして各々、冷メタノール（２ｍｌ）およびヘキサン（１０ｍｌ）で抽出した。ヘキサン相を合わせて、そして蒸発乾固し、そして残渣をイソプロパノール（２００μｌ）に再懸濁した。
【０１０５】
（ｆ）マウス血漿の酸化
３匹のマウスからプールした血漿の酸化は、ペルオキシルラジカル発生剤（最終濃度５ｍＭ）を添加し、そして空気下、３７℃で反応混合物をインキュベーションすることによって、行った。反応混合物のアリコット（５０μｌ）を除去し、メタノール／ヘキサン（１：５、ｖ／ｖ）で抽出し、そして酸化防止剤の消費および脂質酸化産物の集積を測定した。
【０１０６】
（ｇ）脂質および水溶性化合物の解析
酸化および非酸化脂質の解析は、いくつかの場合では、カラム後の化学発光検出よりもＵＶ２３４ｎｍを用いて、これらのクロマトグラフィー条件下では同様の保持時間を有する、Ｃ１８：２−ＯＯＨおよび対応する水酸化物（合わせてＣＥ−Ｏ（Ｏ）Ｈと称する）を測定したことを除いて、実施例１に記載するように、ＲＰ−ＨＰＬＣによって行った。α−ＴＱ、α−ＴＯＨ、α−トコトリエノール、Ｄ−イソアスコルベートおよびアスコルベートは、電気化学的検出を用いて、ＨＰＬＣによって測定した。血漿の酸化には、エステル化されていないコレステロール（これらの実験において、非酸化型のままである）を、解析したすべての多価不飽和、脂溶性構成要素の内部標準として使用した。ビスフェノールおよびジフェノキノンは、ＲＰ−ＨＰＬＣによって解析した：流速１．５ｍｌ／分、１００％溶媒Ａ（ＭｅＣＮ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ　１０：１０：３、ｖ／ｖ／ｖ）、０−１５分間、２７０ｎｍで監視、その後、５０％溶媒ＡおよびＢ（ＭｅＣＮ／ＭｅＯＨ　１：１、ｖ／ｖ）、１５−２２分間、２４２ｎｍ、そしてその後、１００％Ｂ、２２−２８分間、４２０ｎｍ。ビスフェノールおよびジフェノキノンは、それぞれ９および２７分で溶出した。すべての化合物は、真正標準とのピーク面積比較によって定量化した。示した箇所で、総コレステロールおよびトリグリセリドは、酵素的にアッセイした（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、ドイツ・マンハイム）。
【０１０７】
アポＥ−／−；ＬＤＬｒ−／−マウスは、標準的固形試料食餌わずか１５週間後に、検出可能な病変を容易に発展させ、これらの動物がアテローム生成の初期事象およびその阻害両方を研究するのに適していることが示される。表７は、対照またはビスフェノール強化食餌を与えたマウスにおける脂質、α−ＴＯＨおよびビスフェノールの血漿レベルを要約する。８および２２週齢の対照動物からのデータを比較することによって判断されるように、血漿総コレステロール、トリグリセリドおよびビタミンＥの年齢依存増加があった。１４週間の処置後、ジフェノキノンを加えたビスフェノールの血漿レベルは、２１６μＭに達した。年齢一致対照に比較して、ビスフェノールでの食餌の補充は、総血漿コレステロールを有意に増加させたが、トリグリセリドは不変であり、そしてビタミンＥレベルは有意に減少した（表７）。
【０１０８】
表７．アポＥ−／−；ＬＤＬｒ−／−マウスにおける血漿脂質、ビタミンＥおよび薬剤レベル‡
【０１０９】
【表７】
2004501984.tif 000013
【０１１０】
動物には、０．０３％ビスフェノールまたは対照として作用するビヒクルのみのいずれかを含有する、Ｌａｃｔａｍｉｎ　Ｒ３固形試料を与えた。若いおよび年齢一致対照動物は、それぞれ、８および１５週齢で屠殺した。
【０１１１】
ビスフェノール処置マウスからプールした血漿試料は、年齢一致対照と比較して、ペルオキシルラジカルが誘導するｅｘ　ｖｉｖｏ脂質過酸化に、顕著に耐性であった（図５）。したがって、３７℃で１２時間の酸化後であってさえ、α−ＴＯＨは改変されないままであり（図５Ａ）、＜１μＭ　ＣＥ−ＯＯＨが検出された。対照的に、対応する対照血漿において、〜７０％のα−ＴＯＨが消費され、そして＞３０μＭ　ＣＥ−ＯＯＨが集積し（図５Ｂ）、これは、トコフェロール仲介過酸化（ＴＭＰ）を介して進行する血漿脂質過酸化と完全に一致する。別個の研究によって、酸化期間中にα−ＴＯＨよりむしろビスフェノールが消費されるため、ペルオキシルラジカルが誘導するｅｘ　ｖｉｖｏ脂質過酸化に対するこの耐性は、直接ビスフェノールに起因しうることが示された。対応する酸化産物、ジフェノキノンは、抗ＴＭＰ指標が高く、そしてα−トコフェロキシルラジカルの減衰を引き起こせないことから判断されるように、酸化防止補助剤として作用することが不可能である（表８）。
【０１１２】
表８．ビスフェノール、ジフェノキノンおよびＢＨＴに関する、抗ＴＭＰおよびトコフェロキシルラジカル減弱能（ＴＲＡＡ）指標
【０１１３】
【表８】
2004501984.tif 000014
【０１１４】
＊抗ＴＭＰ指標の決定は、先に記載されている（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ　１９９５；２７０：５７５６−５７６３）。‡トコフェロキシルラジカル減弱能（ＴＲＡＡ）の評価は、Ｊ．　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ　１９９６；３７：８５３−８６７に記載されるように行った；ｋｏｂｓは、試験化合物の存在下（＋）または非存在下（−）で、−トコフェロキシルラジカルの減衰に関して測定された、観察された速度定数である。
【０１１５】
高感度検出のＨＰＬＣを使用したにも関わらず、生化学的解析には、多様な脂質および酸化防止剤を検出するのに十分な材料を得るため、大動脈をプールする必要があった。この限界の結果、組織パラメーターは、対照およびビスフェノール処置マウス各々の大動脈の２つの別個のプールに対する二つ組解析の平均として決定した。結果（表９）は、大動脈ホモジネートにおけるアスコルベート、未エステル化コレステロールおよびＣＥ濃度が、２つの処置群で同様であるが、高ビスフェノール血漿レベルを持つ薬剤処置マウスの下位群で、ＣＥのわずかな減少が見られたことを示す。対照的に、大動脈α−ＴＯＨのレベルは、年齢一致対照より、薬剤処置群で、より低かった。
【０１１６】
表９．アポＥ−／−；ＬＤＬｒ−／−マウス大動脈の水性および親油性パラメーター‡
【０１１７】
【表９】
2004501984.tif 000015
【０１１８】
別に言及しない限り、脂質および酸化防止剤レベルは、ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質として表す。ＬＨ、ビスアリル水素を含有する脂質。§値は、ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質として表す。タンパク質は、２．４−３．３ｍｇ／ｍｌの範囲であった。¶提供した値は、比ｘ１０３を表す。†マウスをビスフェノールの血漿濃度順に並べ、その後、血漿薬剤レベルに基づいて、対応する大動脈を７および８匹の群にプールし、２つの別個の群を生じた。低および高ビスフェノールは、それぞれ、１０６±４０および２１２±５０μＭに対応する。対照大動脈は、それぞれ、無作為に７および８の２群にプールした。
【０１１９】
重要なことに、対照マウスの大動脈組織は、かなりの量の酸化脂質を含有し、ＣＥのおよそ０．１５％がＣＥ−Ｏ（Ｏ）Ｈとして存在した（表９）。著しいことに、これらの酸化脂質のレベルは、特に、脂質パーセントあたりで表した場合、低および高ビスフェノール血漿レベルの薬剤処置動物由来の大動脈において、それぞれ、１０および１０００倍低かった（表８）。図６は、カラム後の化学発光検出のＨＰＬＣの典型的なトレースを示す。対照マウスの大動脈の有機抽出物中で検出されるが、ビスフェノール処置マウスで検出されないＣＥ−ＯＯＨは、８および１０分の間で溶出した。ホウ化水素ナトリウムで対照試料を処理すると、これらの化学発光陽性ピークが除かれ（未提示）、ヒドロペルオキシドとしてのこれらの性質が示される。生物学的脂質酸化のさらなるマーカー、α−ＴＱもまた、対照マウスに対してビスフェノールマウスの大動脈で減少した（表８）が、この阻害の度合いは、ＣＥに関して観察されるものより、はるかにより低かった。直線回帰解析によって、測定した血漿および組織パラメーターのいずれかの間で、有意な相関がない（Ｒ＜＋／−０．５）ことが示された。
【０１２０】
標準的固形試料を与えた対照アポＥ−／−；ＬＤＬｒ−／−マウスの下行胸大動脈における内膜体積は、８から２２週齢で、１０倍以上増加した（図７）。１４週間のビスフェノール投与は、年齢一致対照と比較した、大動脈体積の有意な減少から判断されるように、実質的に病変サイズを減少させたが、薬剤処置（より高年齢）の動物における内膜体積は、若い対照マウスに関して決定したものより高いままであった（図７）。
【０１２１】
要約すると、酸化防止剤は、動物においてアテローム性動脈硬化症を阻害可能であるが、これが、大動脈リポタンパク質脂質酸化の阻害のためであるかどうかは明らかでない。酸化防止補助剤は、トコフェロキシルラジカルの除去を通じて、リポタンパク質中の脂質のラジカル誘導、トコフェロール仲介過酸化を阻害する。本明細書において、アポＥ−／−；ＬＤＬｒ−／−マウスにおけるアテローム生成に対するビスフェノール性プロブコール代謝物および酸化防止補助剤ビスフェノールの影響、並びにこれが、特定のＨＰＬＣによって測定する大動脈脂質酸化にどのように関連するかを試験した。ビスフェノールでの食餌補充は、〜２００μＭの循環薬剤レベルを生じ、年齢一致対照マウスに比較して、血漿総コレステロールをわずかに増加させ、そして血漿および大動脈α−トコフェロールを有意に減少させた。ビスフェノールでの処置は、ペルオキシルラジカルが誘導するｅｘ　ｖｉｖｏ脂質過酸化の延長された阻害に示されるように、血漿の酸化防止剤容量を増加させた。対照アポＥ−／−；ＬＤＬｒ−／−マウス由来の大動脈組織は、脂質ヒドロ（ペル）オキシドおよびかなりのアテローム性動脈硬化病変を含有し、これらはどちらもビスフェノールを動物に補充することによって、強く減少した。結果は、酸化防止補助剤が、アポＥ−／−；ＬＤＬｒ−／−マウスにおいて、ｉｎ　ｖｉｖｏ脂質過酸化およびアテローム性動脈硬化症を有効に阻害することを示し、疾患のこのモデルにおいて、大動脈リポタンパク質脂質酸化およびアテローム性動脈硬化症の間の因果関係と一致するが、この関係を立証はしなかった。
【０１２２】
実施例５：プロブコールジチオ類似体による再狭窄の阻害
４７４の分子量を有するプロブコールジチオ類似体（ＩＩＩ）（ＰＤＡ４７４）が再狭窄を阻害する潜在能力を調べるため、動脈バルーン傷害（ＡＢＩ）後のウサギ大動脈において、内膜肥厚に対するその影響を試験した。ＰＤＡ４７４は、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，　Ｉｎｃ．（４００　Ｖａｌｌｅｙ　Ｒｏａｄ，　Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，　ＰＡ　１８９７６，　ＵＳＡ）によって合成され、そして純粋な形（９９％）で供給された。
【０１２３】
１２のニュージーランドホワイトウサギに、０．０２重量％　ＰＤＡ４７４（乾燥粉末型）を含む（ｎ＝６）または含まない（ｎ＝６）標準的ウサギ固形試料（１日あたり１００ｇ）を９週間与えた。最初の投薬量は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ研究に基づき、そして他の有用な投薬量は、同様のアプローチを用いて、容易に導き出すことが可能である。
【０１２４】
３週終了時、すべてのウサギの腹大動脈をＡＢＩによって傷害した。９週終了時、腎臓下腹大動脈を除去し、４％緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、切片作成し、そしてＶｅｒｈｏｅｆｆヘマトキシリンで染色した。内膜および中膜比（ＩＭＲ）は、その後、内膜および中膜面積をトレースし、そしてそれぞれの総ピクセル数を分配することによって決定した。より高いＩＭＲは、より大きい病変を示す。
【０１２５】
１匹の対照ウサギは、ＡＢＩ手術後に衰弱し、そして別の対照ウサギは、ＡＢＩ後、尿感染で死亡し、対照ウサギの数は、４に減少した。薬剤処置動物はすべて生き残り、そして解析およびデータ提示に含めた。期待されるように、ＡＢＩ後、６週間正常固形試料を与えた結果、腎臓下腹大動脈の実質的な内膜肥厚が生じた。０．０２％　ＰＤＡ４７４（図８の白抜きのバー）でウサギを処置した結果、対照ウサギ（空のバー、１．１５±０．０８、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４））に比較して、有意に（ｐ＜０．０５）より低いＩＭＲ（すなわち０．７６±０．１３、ｎ＝６）が生じた。薬剤処置動物で、ＩＭＲが３４％低いことは、ＰＤＡ４７４が再狭窄を阻害するという見解を支持する。
【０１２６】
この実施例は、ＰＤＡ４７４に例示されるようなプロブコールのジチオ類似体が、再狭窄を阻害するのに有効であることを立証する。
最後に、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に具体的に記載し、そして例示する実施例に、多様な修飾、改変および／または付加を行うことが可能であると理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、大動脈根（パネルａおよびｅ）、大動脈弓（パネルｂおよびｆ）、下行胸大動脈（パネルｃおよびｇ）および近位腹大動脈（パネルｄおよびｈ）を貫く横断切片を示す。対照およびプロブコール処置動物由来の切片を、それぞれパネルａからｄおよびｅからｈに示す。切片は、矢印で示す分枝血管に近接して取った。大動脈病変は、大動脈根の場合を除いて、対照マウスよりも、プロブコール処置マウスで、明らかにより小さかった。プロブコール処置マウスにおいて、大動脈根中のアテローム性動脈硬化症の大きな塊に反応して、全根が、対照に比較して、顕著に増大していることに注目されたい（パネルａ対ｅを参照されたい）。多くのマウスでは、プロブコールは、大動脈における病変形成をほぼ完全に消滅させた（例えばパネルｇ）。
【図２】図２は、１％プロブコールを含まないおよび含む高脂肪食餌を２４週間与えたアポリポタンパク質Ｅ遺伝子ノックアウト（アポＥ−／−）マウスの血漿リポタンパク質プロフィールを示す。個々のマウスから血漿を収集し、プールし、ＦＰＬＣに使用する緩衝液で１：１０に希釈し、そして３００μｌをサイズ排除クロマトグラフィーに供した。示したクロマトグラムは、独立のプールした血漿試料の２回の解析の典型である。水平のバーは、各リポタンパク質プールに関して収集した、対応する分画を示す。
【図３】図３は、プロブコールが、高脂肪食餌を与えたアポＥ−／−マウスから得た血漿脂質のｅｘ　ｖｉｖｏ酸化可能性を減少させることを示す。対照（白抜き記号）またはプロブコール処置（黒塗り記号）マウスから得たプール血漿を、５ｍＭの水性ペルオキシルラジカル発生剤ＡＡＰＨに曝露し、そして空気下、３７℃でインキュベーションした。示した時間で、反応混合物のアリコットを除去し、そしてＡ、アスコルベート（ひし形）；Ｂ、ユビキノール−１０を加えたユビキノール−９（逆三角）；Ｃ、α−トコフェロール（ＴＯＨ、正方形）、プロブコール（クロスハッチングした正方形）およびビスフェノール（黒塗り三角）；並びにＤ、コレステロールエステルのヒドロペルオキシドおよび水酸化物（ＣＥ−Ｏ（Ｏ）Ｈ、円）に関して解析した。示したデータは、プールした血漿を用いて、三つ組で行った単回の酸化実験の平均±ＳＤである。エラーバーを示していない場合、エラーは、記号より小さい。
【図４】図４は、コレステロールを与えたウサギにおける、バルーン傷害後のプロブコールによる内皮再形成を示す。ＴＡＡおよびＡＡは、それぞれ、胸大動脈および腹大動脈を示す。
【図５】図５は、水性ペルオキシルラジカルによって開始される脂質過酸化に対する、ビスフェノールを与えたアポリポタンパク質ＥおよびＬＤＬ受容体遺伝子ダブルノックアウト（アポＥ−／−；ＬＤＬｒ−／−）マウス由来の血漿の耐性を示す。対照食餌（円）またはビスフェノールを補った食餌（正方形）を与えた、少なくとも３匹のマウスから得たプール血漿を、５ｍＭ　ＡＡＰＨで処理し、そして３７℃でインキュベーションした。示した時間で、アリコットを除去し、そしてα−ＴＯＨ（Ａ）およびＣＥ−Ｏ（Ｏ）Ｈ（Ｂ）に関して解析した。１００％　α−ＴＯＨレベルは、それぞれ、対照およびＨ２１２／４３血漿に関して、２８±３および２０±２μＭに相当する。データは、平均±ＳＤを表す（ｎ＝４の独立実験）。
【図６】図６は、ビスフェノールを与えたアポＥ−／−；ＬＤＬｒ−／−マウスにおける、大動脈リポタンパク質脂質過酸化の阻害を示す。対照またはビスフェノール処置マウスから得た、７−８匹のマウスからプールした大動脈をホモジナイズし、脂質を抽出し、そしてＨＰＬＣに供し、コレステロールエステルヒドロペルオキシド（ＣＥ−ＯＯＨ）の解析のため、カラム後に化学発光検出した。クロマトグラムは、年齢一致対照（ａまたはｂ）あるいは低または高血漿レベルのビスフェノールで薬剤処置したマウス（それぞれｃおよびｄ）の大動脈に相当する。用いた条件下で、ＣＥ−ＯＯＨは、８および９．５分の間で溶出した。４および５．５分の間の化学発光陰性ピークは、トコフェロール類の溶出に相当する。
【図７】図７は、ビスフェノールを与えたアポＥ−／−；ＬＤＬｒ−／−マウスにおける、アテローム性動脈硬化症の阻害を示す。病変形成は、標準的固形試料を、それぞれ８および２２週間与えた、若いおよび年齢一致対照と比較した際の内膜体積の変化によって評価した。＊は、α＜０．０２５（ウィルコクソン検定）の統計的有意差を示す。
【図８】図８は、プロブコールジチオ類似体ＰＤＡ４７４を与えたウサギにおける再狭窄の阻害を示す。内膜および中膜比（ＩＭＲ）は、内膜および中膜面積をトレースし、そしてそれぞれの総ピクセル数を分配することによって決定した。より高いＩＭＲは、より大きい病変を示す。＊は、ｐ＜０．０５の統計的有意差を示す。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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