(57)【要約】本発明は、標的菌株に特異的な酵素（エステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ）と反応する色原性または蛍光原性基質を含む生化学的手段による生物分析用培地に関する。本発明の目的は、このような検出／識別培地の感度、初期半透明度、安定性および使用の容易さを改善することである。この目的は、安定な直ちに使用できる液体またはゲル状で、脂肪酸ソルビタンエステル／脂肪酸タイプの少なくとも１種類の乳化安定化剤および少なくとも１種類の溶媒（ジメチルスルホキシド）を含む本発明の培地により達成される。この培地は、エステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ基質を溶媒中に含むストック溶液と乳化安定化剤を培養培地のいくつかの成分と混合することにより得られる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ活性から選択される酵素活性を有する微生物、特にバクテリアおよび／または酵母の検出／識別用培地であって、特に反応培地と、少なくとも１種の色原性または蛍光原性のエステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ基質を含むタイプであり（ただし、４―［２―（４―オクタノイルオキシ―３，５―ジメトキシフェニル）ビニル］キノリニウム―１―（プロパン―３―イル―カルボン酸）カチオンおよびアニオンを含む基質を除く）、この検出／識別は、本質的に、エステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ活性の存在を明らかにすることに基づいており、前記培地は、
＊安定な、すぐに使用できる液体状またはゲル状であり、かつ、
＊乳化安定化剤として、少なくとも１種類の脂肪酸ソルビタンエステル（ＦＡＳＥ）または少なくとも１種類の脂肪酸（ＦＡ）またはＦＡＳＥ／ＦＡ混合物および、
場合によっては少なくとも１種類の溶媒（Ｓ）
を含む培地。
【請求項２】
基質を溶媒Ｓ中に含む少なくとも１種類のストック溶液を、ＦＡＳＥ、ＦＡまたはＦＡＳＥ／ＦＡ混合物および培養培地の少なくともいくつかの成分と混合することにより得られることを特徴とする請求項１に記載の培地。
【請求項３】
ＦＡＳＥが以下のもの：
―エチレンオキシド（ＥＯ）を２０単位含むポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）；
―ポリエトキシル化ソルビタンモノパルミテート（２０ＥＯ）（ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０）；
―ポリエトキシル化ソルビタンモノステアレート（２０ＥＯ）（ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０）；
―ポリエトキシル化ソルビタントリステアレート（２０ＥＯ）（ＴＷＥＥＮ（登録商標）６５）；
―ポリエトキシル化ソルビタンモノオレエート（２０ＥＯ）（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）；
―ポリエトキシル化ソルビタンセスキオレエート（２０ＥＯ）（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８３）；
―ポリエトキシル化ソルビタントリオレエート（２０ＥＯ）（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８５）；および
―これらの混合物
を含む群から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の培地。
【請求項４】
ＦＡがＣ４〜Ｃ２０の飽和または不飽和脂肪酸、好ましくはＣ６〜Ｃ１１飽和または不飽和脂肪酸、特に好ましくはＣ８〜Ｃ９脂肪酸、およびこれらの混合物を含む群から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の培地。
【請求項５】
さらに、少なくとも１種類のアニオン界面活性剤、好ましくは、７―エチル―２―メチル―４―ウンデシルハイドロジェンスルフェートまたはその塩類、特にそのナトリウム塩類（ＴＥＲＧＩＴＯＬ―４（登録商標））を含むことを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の培地。
【請求項６】
色原性または蛍光原性基質が、酵素の標的部分および発色団または蛍光団部分からなり、その標的部分が特に下記のもの：
―蛍光団または発色団部分の水酸基にαまたはβ位置で結合している単糖、二糖および／または多糖単位からなる配糖体；
―α―アミノ酸またはペプチド；
――Ｏ―ＣＯ（ＣＨ２）ｎ―ＣＨ３（式中、ｎは０と２０の間）などの有機酸；および
―硫酸塩、燐酸塩、ピロ硫酸塩、ピロ燐酸塩およびホスホジエステル
を含む群から選択され、
その発色団または蛍光団部分が特に下記のもの：
―キノン／アントラキノンおよび誘導体、特にジヒドロキシアントラキノン（アリザリン）；
―アミノ―およびヒドロキシ―クマリンおよび誘導体；
―フルオレセインおよび誘導体；ならびに
―インドキシルおよび誘導体
を含む群から選択されることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の培地。
【請求項７】
溶媒Ｓが以下のもの：
―アルコール、好ましくはメタノール、エタノールおよびメトキシエタノール；
―アミド、好ましくはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）；
―含硫黄溶媒、好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；
―水性溶媒、好ましくは水および緩衝水溶液；ならびに
―これらの混合物
を含む群から選択されることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の培地。
【請求項８】
脂肪酸ソルビタンエステル（ＦＡＳＥ）の溶媒（Ｓ）に対する重量比が、２０：８０と８０：２０の間、好ましくは３０：７０と７０：３０の間、特に好ましくは４０：６０または６０：４０であることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の培地。
【請求項９】
培地中の（ＦＡＳＥ）の濃度（重量％）が以下のもの：
０．１≦［ＦＡＳＥ］≦１０、
好ましくは０．５≦［ＦＡＳＥ］≦５、
特に好ましくは１．５≦［ＦＡＳＥ］≦３．５
であることを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１０】
培地中の基質の濃度（ｍｇ／ｌ）が以下：
１≦［基質］≦２０００、
好ましくは５≦［基質］≦１５００、
特に好ましくは２５≦［基質］≦１０００
の通り定義されることを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１１】
その培養培地が、以下のもの：
―マッコンキー、コロンビアＡＮＣ、ＰＡＬＣＡＭおよびサブローゲンタマイシン―クロラムフェニコール培地を含むタイプの選択培地、好ましくはマッコンキー培地；および
―コロンビア＋／―血液、トリプカーゼ大豆、栄養ゲロースおよびサブロー培地を含むタイプの非選択的培地、好ましくはコロンビア培地
を含む群から選択されることを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１２】
検出／識別されるべき微生物が、医学上または産業上の関心がもたれる微生物、特にサルモネラ属、シュードモナス属、リステリア属、スタフィロコッカス属、エンテロコッカス属またはカンジダ属に属するものであることを特徴とする請求項１から１１のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１３】
―色原性または蛍光原性エステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ基質を含む溶媒ＳとＦＡＳＥ、ＦＡまたはＦＡＳＥ／ＦＡ混合物の少なくとも１種類から少なくとも１種類のストック溶液を調製すること；
―培養培地にこの溶液および他の添加物を添加すること；ならびに
―全体を均質化すること
から実質的になることを特徴とする請求項１から１２のいずれか一項に記載の培地を得る方法。
【請求項１４】
―分析しようとするバクテリアを請求項１から１２のいずれか一項に記載の培地または請求項１３に記載の方法で得られる培地に接種すること；
―接種した培地を適当な条件下にインキュベートすること；および
―バクテリアによる基質の加水分解を明らかにするコロニー周辺の発色を読み取り／解釈すること
からなることを特徴とするエステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ活性を有する菌株の検出／識別方法。
【請求項１５】
エステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ活性から選択される酵素活性を有する微生物、特にバクテリアまたは酵母の検出／識別用培地（液体またはゲル）の乳化安定化剤としての、脂肪酸ソルビタンエステル（ＦＡＳＥ）、脂肪酸（ＦＡ）またはＦＡＳＥ／ＦＡの使用であって、前記培地は特に培養培地と少なくとも１種類の色原性または蛍光原性のエステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ基質を含み（ただし、４―［２―（４―オクタノイルオキシ―３，５―ジメトキシフェニル）ビニル］キノリニウム―１―（プロパン―３―イル）カルボキシレートおよびアニオンを含む基質を除く）、場合によっては、前記培地中に存在する色原性または蛍光原性エステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ基質用の少なくとも１種類の溶媒Ｓと組み合わせた使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、生化学的手段による微生物の分析、特に反応培地（特に栄養培地）の接種によるバクテリア菌株の検出および識別の分野である。後者は、標的菌株に特異的な酵素と反応し得る色原性または蛍光原性基質を含み、問題となる各コロニーについて発色または蛍光を生じる。
【０００２】
本発明の枠内において特により興味深い点は、医療環境におけるか産業環境におけるかを問わず、病原性の微生物または品質を示す微生物、より特定して言えば、エステラーゼ、オシダーゼ、ペプチダーゼ、スルファターゼまたはホスファターゼタイプの酵素活性を有する微生物、例えば、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）およびカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属のバクテリアまたは酵母、特に、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）およびカンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）を検出／識別することである。
【背景技術】
【０００３】
大腸菌の菌株の存在は、多くの場合、β―グルクロニダーゼやβ―ガラクトシダーゼ活性などのオシダーゼタイプの酵素活性を明らかにすることによって示される。
【０００４】
同様に、リステリア属は、β―グルコシダーゼ活性の存在を明らかにすることにより検出される。
【０００５】
アミノペプチダーゼ活性も、微生物のグループ、属または種を明らかにするために利用できる。例えば、アラニンアミノペプチダーゼ活性により、グラム陰性バクテリアとグラム陽性バクテリアとを区別することが可能である。
【０００６】
サルモネラ属の菌（これは人間において様々な感染症（腸チフス、食中毒）の原因となる）は、色原性（例えばインジゴ生成性）合成基質を加水分解可能な非特異的エステラーゼを有する。
【０００７】
サルモネラ属、より一般的にはエステラーゼ活性を有するバクテリアの検出／識別は、従来、エステラーゼ活性を有する疑いのあるバクテリア（特にサルモネラ属）のコロニーの検出／識別が可能なゲロース（ｇｅｌｏｓｅ）分離培地上または液体分離培地上で行われている。こうした培地への接種は、分析する試料に前述の培地を浸漬するか、または試料を培地に接触させることによって行われる。
【０００８】
エステラーゼ、オシダーゼ、ペプチダーゼ、スルファターゼまたはホスファターゼ活性を有するバクテリアは、それらの酵素遺伝子型において、培地中に存在する基質の標的結合を開裂させ、この結果、前述の基質の一部である活性化された発色団または発蛍光部分を放出させる。この結果、発色または蛍光が生じて加水分解が起こったことがわかり、したがって、標的バクテリアまたは標的バクテリアのコロニーの存在が明らかになる。
【０００９】
ルーチン化された試験を大規模に実行できるようにするためには、検出／識別培地が安定で、対応する検出／識別方法を操作を制限することにより可能な限り単純化する必要がある。また、その方法が高感度（発色の高い強度）で一次オーダーの特異性を示すことが重要である。前述の酵素活性を示すバクテリアの検出／識別用のこれらのタイプの培地および方法の別の基本的パラメーターは、疑わしいコロニーが明らかにされる割合である。
【００１０】
一方、エステラーゼ、オシダーゼ、ペプチダーゼ、スルファターゼまたはホスファターゼなどの酵素基質は、これらの活性を有する微生物（特にバクテリア）の培養培地と適合性の問題を示すことが知られている。さらに、このような基質は経時的に安定していないが、これは問題の酵素活性に対する感度が保存時間とともに減少することを意味する。
【００１１】
こうした情況の中で、「Ｓｙｎｔｈｅｓｅｄｅｓｕｂｓｔｒａｔｓｉｎｄｉｇｏｇｅｎｉｑｕｅｓ．Ｍｉｓｅｅｎｅｖｉｄｅｎｃｅｄｅｌ´ａｃｔｉｖｉｔｅｅｓｔｅｒａｓｉｑｕｅｄｅｓｓａｌｍｏｎｅｌｌｅｓ」（「インジゴ生成性基質の合成。サルモネラ属のエステラーゼ活性の証明」）と題する学術論文（Ａ．Ａｇｂａｎ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）２５、６９７―６９９）は、インジゴ生成基質、すなわち特にペラルゴン酸５―ブロモインドキシル（Ｃ９）、および胆汁酸塩、すなわちデオキシコール酸ナトリウムを含むゲロース培養培地を開示する。このような培養培地は、特許文献仏国特許第２６９７０２８号について後述するのと同じ欠点がある。
【００１２】
仏国特許第２６９７０２８号は、胆汁酸塩（デオキシコール酸ナトリウム）から選択される界面活性剤とともに、インドール基を有するカプリル酸エステル（カプリル酸５―ブロモ―４―クロロ―３―インドリル）からなる色原性エステラーゼ基質を含む、サルモネラ属の菌の存在を明らかにするために培養培地を開示する。この色原体およびこの胆汁酸塩は、サルモネラ属の菌の成長を可能にする栄養培地に含まれている。仏国特許第２６９７０２８号が教えるところによれば、胆汁酸塩は、既にエステラーゼ基質を含んでいる選択培地に直接加えられる。
【００１３】
胆汁酸塩類の使用に伴う別の問題は、それらが動物起源の出発原料であるという事実（このため品質にある程度の変動が避けられない）に起因する。
【００１４】
さらに、生物学的活性の面で結果の改善をなし得る。
【００１５】
この培養培地は、エステラーゼ基質の安定性の点ですべての望ましい保証を与えるものではない。さらに、後者は、培養培地との混和が不完全であることが分かる（これは、感度、迅速性および安定性の点から見て、得られる結果の質を明らかに落とすものである）。
【００１６】
仏国特許第２６９７０２８号による培養培地が粉末状であることも注意すべきである。これは、液体またはゲル培地を再構成するために、利用者がまず操作を行わなければならないことを意味する。こうした拘束条件は使用するエステラーゼ基質が安定性に欠けている結果である。さらに、仏国特許第２６９７０２８号の教えるところによって調製されたゲロース培地は半透明ではなく、この結果、標的バクテリアのいずれかのコロニーに伴う発色を読み誤る危険がある。
【００１７】
ＰＣＴ特許出願ＷＯ―９２／１７６０７は、ＴＥＲＧＩＴＯＬ―４（登録商標）（７―エチル―２―メチル―４―ウンデカノエートハイドロジェンスルフェートまたはそのナトリウム塩）を含むサルモネラ属の菌の検出用培地に関する。この添加剤は、サルモネラ属を標的とする検出培地の選択性を改善するとされている。ＴＥＲＧＩＴＯＬ―４（登録商標）の濃度は、寒天ゲロース／キシロース／リジンを基礎とする培養培地中２〜３０ｍｌ／ｌで変えることができる。前述の文献によれば、サルモネラ属の菌の検出はもっぱら競争による選択的成長の原理に基づく。
【００１８】
ＰＣＴ特許出願ＷＯ―９９／４１４０９は、サルモネラ属の菌を検出するための色原性エステラーゼ基質に関する。
【００１９】
前記文献は、サルモネラ属の菌に特異的なエステラーゼ／リパーゼと反応し、Ｃ８脂肪酸エステルへの親和性を有する色原性化合物の使用を提案する。問題の色原性化合物は式［４―［２―（４―オクタノイルオキシ―３，５―ジメトキシフェニル）ビニル］キノリニウム―１―（プロパン―３―イル）カルボキシレート］＋［臭化物または塩化物イオン］−のアニオンとカチオンを含む。より正確には、使用される基質は、カルボキシレートカチオンの、例えばＣ８エステルである。
【００２０】
ＷＯ―９９／４１４０９による方法は、ソルビタン脂肪酸エステル（特にモノラウリン酸エステルＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）の使用についても記載している。これらの製品は、培地１リットル当たり２ｇの割合で界面活性剤として使用される。
【００２１】
さらに、このＰＣＴ特許出願の教示による特異的基質は、メタノール、エタノールまたはＮ，Ｎ―ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）との混合物として栄養培養培地に導入できる。界面活性剤を使用する場合には、基質および溶媒と同時にではなく別個に導入する。
【００２２】
いずれにせよ、ＷＯ―９９／４１４０９に開示された手段は、検出培地に含まれる酵素基質の安定性を改良するものとして提供されてはいない。
【００２３】
さらに、様々な文献が、１つの酵素活性の検出のためにいくつかの基質を含む培養培地、および種々の酵素活性の検出のために数種類の基質を含む培養培地を開示している。
【００２４】
例えば、特許文献ＷＯ―９５／０４１５７は、５―ブロモ―４―クロロ―３―インドキシルガラクトシド、５―ブロモ―４―クロロ―３―インドキシルグルクロニド、５―ブロモ―４―クロロ―３―インドキシルグルコシドまたは６―クロロ―３―インドキシルガラクトシドなどの種々の色原性オシダーゼ基質を含む培養培地について記載している。このような培地は、特に大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ種と他の大腸菌類（ｃｏｌｉｆｏｒｍ）バクテリアを区別するために使用される。
【００２５】
前記文献は、オシダーゼとホスファターゼのような異なる酵素に特異的な色原性基質を含む培地についても記載している。これらの基質の例は５―ブロモ―４―クロロ―３―インドキシルＮ―アセチルグルコサミニドおよび５―ブロモ―６―クロロ―３―インドキシルホスフェートである。このような培地は、特に、カンジダアルビカンスとカンジダ属の他の酵母の区別を可能にする。
【００２６】
特許文献ＷＯ―００／５３７９９は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）検出用の色原性培地について記載している。この培地は、２つの色原性基質の組合せ、特に５―ブロモ―４―クロロ―３―インドキシグルコシドおよび５―ブロモ―６―クロロ―３―インドキシルホスフェートを含んでいる。このような培地の主たる意義は擬陽性または擬陰性を避け、黄色ブドウ球菌と他の種またはストレプトコッカス属を区別することである。
【００２７】
しかし、特許文献ＷＯ―９５／０４１５７およびＷＯ―００／５３７９９には、記載された培地が、培地に含まれる酵素基質の安定性を改善するために開発されたものであることを示す点は全くない。
【００２８】
脂肪酸ソルビタンエステル（ＦＡＳＥ）は特に食物および医薬調剤において広く使用される既知の界面活性剤である。一例としては、ＤＩＣＫＩＮＳＯＮらによる論文「Ｊ．ＣｏｌｌｏｉｄＩｎｔｅｒｆａｃｅＳｃｉ．１９９９Ａｐｒ．１５；２１２（２）：４６６―４７３」を挙げることができるであろう。これは、カゼイン酸ナトリウムとエチレンオキシドを２０単位含むポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート（ＴＷＥＥＮ２０）とを含むエマルジョンの安定化に関する。問題のエマルジョンは水中油型エマルジョン（ｐＨ６．８でｎ―テトラデカン３０体積％）である。この技術分野は、選択培地上の発色反応によって特異的酵素活性を有するバクテリアを検出する分野からは比較的遠い。
【００２９】
ＧＲＡＭらによる論文「Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９８５Ｏｃｔ．；３１（１０）；１６８３―８」は、抗トロンビンＩＩＩ検定培地中でのポリエトキシル化ソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ８０）の使用に関するもので、この培地はさらにポリエチレングリコール、トロンビン溶液および合成色原性ペプチド基質も含む。使用される添加剤は、検定の良好な実行を確実にするためのもので、活性トロンビン濃度を増加させるものとして提供されている。ここでもやはり、このタイプの技術的課題は、色原性基質を含む選択的な培養培地を使用して特異的酵素活性を有するバクテリアを検出する培地に特有な課題とは非常に異なったものであると言わざるを得ない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
このような技術的な状況において、本発明の本質的な目的のうちの１つは、エステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ活性から選択される酵素活性を有するバクテリアの検出／識別用培地であって、分析感度を最適化するように、すなわち、標的バクテリアの存在を明らかにする発色または蛍光強度を最大にするように構成される培地を提供することである。
【００３１】
本発明の別の本質的な目的は、エステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ活性から選択される酵素活性を有する微生物、特にバクテリアまたは酵母の検出／識別用培地であって、分析対象である試料の接種の前には完全に半透明（ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｔ）である培地を提供することである。
【００３２】
本発明の別の本質的な目的は、エステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ活性から選択される酵素活性を有する微生物、特にバクテリアまたは酵母の検出／識別用培地であって、エステラーゼ基質および／またはオシダーゼ基質および／またはペプチダーゼ基質および／またはスルファターゼ基質および／またはホスファターゼ基質から選択される少なくとも１種類の色原性または蛍光原性酵素基質を含み、保存に対して安定な（検出時の発色または蛍光強度を少なくとも数週間、最大レベルに保つ）培地を提供することである。
【００３３】
本発明の別の本質的な目的は、エステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ活性から選択される酵素活性を有する微生物、特にバクテリアまたは酵母の検出／識別用培地であって、液体またはゲル培地を再構成するために液体で再構成しなければならない乾燥粉末の形ではなく、そのまますぐに使用できる形態で存在する培地を提供することである。
【００３４】
本発明の別の本質的な目的は、エステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ活性から選択される酵素活性を有する微生物、特にバクテリアまたは酵母の検出／識別用培地であって、１種または複数の色原性または蛍光原性酵素基質（これは非常に高価である）の含有量が低減された経済的な培地を提供することである。
【００３５】
本発明の別の本質的な目的は、実行が容易でかつ経済的な前記検出／識別培地を得る方法を提供することである。
【００３６】
本発明の別の本質的な目的は、エステラーゼ、オシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ活性から選択される酵素活性を有する菌株の検出／識別方法であって、実行が容易（ルーチン試験）で、経済的（試薬の量、取扱性、ラベル、スピード等）で、信頼性を備え、高感度で、特異的かつ再現性のある方法を提供することである。
【００３７】
本発明の別の本質的な目的は、エステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ活性から選択される酵素活性を有する微生物、特にバクテリアまたは酵母の検出／識別培地（前記活性を染料または蛍光性の生成物を放出する加水分解反応の結果として明らかにする）における新規な安定化添加物の使用を提案することである。
【課題を解決するための手段】
【００３８】
これらおよび他の目的は本発明によって達成され、それは、第一にまたは主として、エステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ活性から選択される酵素活性を有する微生物、特にバクテリアおよび／または酵母の検出／識別用培地に関し、特に反応培地、特に培養培地と、少なくとも１種の色原性または蛍光原性エステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ基質を含むタイプであり（ただし、４―［２―（４―オクタノイルオキシ―３，５―ジメトキシフェニル）ビニル］キノリニウム―１―（プロパン―３―イルカルボン酸）カチオンおよびアニオンを含む基質を除く）、この検出／識別は、本質的に、エステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ活性の存在を明らかにすることに基づいており、前記培地は、
＊安定な、すぐに使用できる液体またはゲル状であり、
＊以下のものを含んでいる：
―乳化安定化剤として、少なくとも１種類の脂肪酸ソルビタンエステル（ＦＡＳＥ）または少なくとも１種類の脂肪酸（ＦＡ）またはＦＡＳＥ／ＦＡ混合物（少なくとも１種類の脂肪酸ソルビタンエステルおよび少なくとも１種類の脂肪酸を含む）および、
―場合によっては少なくとも１種類の溶媒（Ｓ）。
【００３９】
本発明による、エステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ活性から選択される酵素活性を有する微生物、特にバクテリアおよび／または酵母の検出／識別用培地は、上記特許文献ＷＯ―９５／０４１５７およびＷＯ―００／５３７９９に示された培地から得ることができる。
【００４０】
本発明による培地は、すぐに使用でき、安定性の点で問題を示すことなく液体または半流動体（ゲル）状であるという長所を有する。実際、本発明の培地中に含まれるエステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ基質は、比較的急速に劣化する傾向を有することで知られているが、ＦＡＳＥ、ＦＡまたはＦＡＳＥ／ＦＡ乳化安定添加剤の存在によって安定化される。
【００４１】
これらの添加剤は、場合によっては溶媒Ｓとの組合せで、一層の利点、すなわち、エステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ基質（これらは従来溶解しにくい）に優れた可溶性をもたらす。これにより、接種前には半透明の検出／識別培地を得ることが可能となり、これにより発色または蛍光の結果の読取りが容易になる。
【００４２】
このＦＡＳＥ、ＦＡまたはＦＡＳＥ／ＦＡ添加物は比較的廉価であり、操作手順を簡単にし、用いる基質の量を減らし（安定化）、経済的な面で明らかにコストを節減する。
【００４３】
最後に、本発明による手段は、前述の基質の生物学的活性を改良し、それにより、標的コロニーの発色強度を高め特異性を増す。
【００４４】
この乳化安定化剤の特定のクラス、特にＦＡＳＥを選択したのは発明者によるものであり、これらは、驚くべきこと、また予想外にも、安定性、半透明性、生物学的活性、感度、信頼性および特異性（これらはすべて本発明の生化学的手段による微生物分析に適している）を与える。
【００４５】
本発明の１つの注目すべき特徴によれば、本発明の対象である検出／識別培地は、基質を溶媒Ｓ中に含む少なくとも１種類のストック溶液とＦＡＳＥ、ＦＡまたはＦＡＳＥ／ＦＡ混合物とを、培養培地の成分のうち少なくともいくつかと混合することにより得られる。
【００４６】
実際、本発明によれば、上記の１種または複数のＦＡＳＥ、ＦＡまたはＦＡＳＥ／ＦＡ混合物の存在下にエステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ基質を溶媒Ｓに可溶化することが重要であると思われる。次いで、ＦＡＳＥ、ＦＡまたはＦＡＳＥ／ＦＡ基質と溶媒Ｓのこの混合物を、培養培地の少なくとも一部（それは好ましくは過冷却ゲルの形である）に組み込む。この操作上の特徴により、本発明の手段によりもたらされる有利な結果の最適化が可能となることが見出された。
【００４７】
好ましくは、ＦＡＳＥは以下：
―エチレンオキシド（ＥＯ）を２０単位含むポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）；
―ポリエトキシル化ソルビタンモノパルミテート（２０ＥＯ）（ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０）；
―ポリエトキシル化ソルビタンモノステアレート（２０ＥＯ）（ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０）；
―ポリエトキシル化ソルビタントリステアレート（２０ＥＯ）（ＴＷＥＥＮ（登録商標）６５）；
―ポリエトキシル化ソルビタンモノオレエート（２０ＥＯ）（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）；
―ポリエトキシル化ソルビタンセスキオレエート（２０ＥＯ）（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８３）；
―ポリエトキシル化ソルビタントリオレエート（２０ＥＯ）（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８５）；および
―これらの混合物
を含む群から選択され、ＦＡは、Ｃ４〜Ｃ２０飽和または不飽和脂肪酸、好ましくはＣ６〜Ｃ１１飽和または不飽和脂肪酸、特に好ましくはＣ８〜Ｃ９脂肪酸、およびこれらの混合物を含む群から選択される。
【００４８】
本発明によって特に選択される製品は、非イオン性乳化剤として食品および化粧産業において広く用いられているソルビタンエステルであるが、従来、それらは微生物学的検出／識別培地においてエステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ基質の安定化剤として使用されたことはない。
【００４９】
前述のＦＡＳＥの親水性親油性バランス（ＨＬＢ）は、それぞれ８．６、６．７、４．７、２．１、４．３、３．７および１．８．である。
【００５０】
本発明の有利な変形では、上記乳化安定化剤、特にＦＡＳＥは、少なくとも１種類の相乗性助剤、好ましくは、少なくとも１種類のアニオン性界面活性剤、特に好ましくは７―エチル―２―メチル―４―ウンデシルハイドロジェンスルフェートまたはその塩類、中でも特にそのナトリウム塩類（ＴＥＲＧＩＴＯＬ―４（登録商標））と組み合わせることができる。
【００５１】
このような相乗性助剤の使用は、標的バクテリア中の酵素活性の存在を明らかにすることをより容易にする。この相乗性助剤は乳化安定化剤、特にＦＡＳＥの優れた補足剤である。それは、他の酵素活性の発現を落とさずに、選択性ならびに標的微生物中のエステラーゼおよび／またはオシダーゼ、ペプチダーゼ、スルファターゼおよび／またはホスファターゼ活性の検出を改善することを可能にし、問題の標的微生物の存在を明らかにするために使用できるであろう。特定の理論に拘束されるものではないが、相乗性助剤ＴＥＲＧＩＴＯＬ―４（登録商標）は、標的微生物の細胞膜を通した色原性または蛍光原性なエステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ基質の浸透や酵素の分泌を容易にし、これにより、その活性が求められる酵素に関するこれらの基質への接近容易性を最適化すると考えられる。これは、使用される基質の量を減らしその結果明らかな経済的利点を導き出すことを可能にする。
【００５２】
さらにより好ましくは、ＴＷＥＥＮ（登録商標）とＴＥＲＧＩＴＯＬ―４（登録商標）の組合せが、本発明による検出／識別培地全般に有効であると思われる。
【００５３】
酵素のための標的部分および発色団または蛍光団部分からなる色原性または蛍光原性基質は、特に、その標的部分を下記を含む群から選択される基質から選択するのが有利である：
―発色団または蛍光団部分の水酸基にαまたはβ位で結合している単糖、二糖および／または多糖単位からなる配糖体；
―α―アミノ酸またはペプチド；
――Ｏ―ＣＯ（ＣＨ２）ｎ―ＣＨ３（式中、ｎは０と２０の間）などの有機酸；および
―硫酸塩、燐酸塩、ピロ硫酸塩、ピロ燐酸塩およびホスホジエステルであり、その発色団または蛍光団部分は、特に下記を含む群から選択される：
―キノン／アントラキノンおよび誘導体、特にジヒドロキシアントラキノン（アリザリン）；
―アミノ―およびヒドロキシ―クマリンおよび誘導体；
―フルオレセインおよび誘導体；ならびに
―インドキシルおよび誘導体。
【００５４】
エステラーゼ基質の例として挙げられるのは、インドール、特に５―ブロモ―３―インドリルノナノエート、６―クロロ―３―インドリルノナノエートまたは５―ブロモ―３―インドリルデカノエートに由来する色原性エステル基質である。
【００５５】
２―アリザリンオクタノエートは、アントラキノンから誘導される色原性エステラーゼ基質の例として挙げられる。
【００５６】
オシダーゼ基質の例として挙げられるのは、インドールから誘導される色原性オシダーゼ基質、特に６―クロロ―３―インドリル―β―ガラクトシド、５―ブロモ―４―クロロ―３―インドリル―β―Ｎ―アセチルグルコサミニドまたは５―ブロモ―６―クロロ―α―グルコシドである。
【００５７】
２―アリザリン―β―グルクロニドは、アントラキノンから誘導される色原性オシダーゼ基質の例として挙げられる。
【００５８】
蛍光原性オシダーゼ基質の例として挙げられるのは、ヒドロキシクマリン、特に４―メチルウンベリフェロン―β―グルコシド（４―ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ―β―ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）である。
【００５９】
インドールに由来する基質としては、色原性ペプチダーゼ基質が挙げられる。
【００６０】
蛍光原性ペプチダーゼ基質は、特にアラニルアミノメチルクマリンなどのヒドロキシクマリンに由来する基質である。
【００６１】
スルファターゼ基質として挙げられるのは、インドール、特に５―ブロモ―４―クロロ―３―インドリルスルフェートに由来する色原性基質である。４―メチルウンベリフェロンスルフェートは蛍光原性スルファターゼ基質の例である。
【００６２】
同様にしてホスファターゼ基質として挙げられるのは、５―ブロモ―４―クロロ―３―インドリルホスフェートなどのインドールに由来する色原性基質である。４―メチルウンベリフェロンホスフェートは蛍光原性ホスファターゼ基質の例である。
【００６３】
溶媒Ｓは、対象とする酵素基質、特に色原性酵素基質を可溶化するための補助剤である。これはまた、乳化安定化剤であるＦＡＳＥ、ＦＡまたはＦＡＳＥ／ＦＡの作用を補足する。したがって、これは好ましくは本発明による培地の構成要素である。
【００６４】
本発明の有利な条件によれば、溶媒Ｓは以下のものを含む群から選択される：
―アルコール、好ましくはメタノール、エタノールおよびメトキシエタノール；
―アミド、好ましくはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）；
―含硫黄溶媒、好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；
―水性溶媒、好ましくは水および緩衝水溶液；ならびに
―これらの混合物。
実際上、使用が好ましい溶媒はメタノール、ＤＭＦおよびＤＭＳＯである。
【００６５】
本発明によれば、脂肪酸ソルビタンエステル（単数または複数）（ＦＡＳＥ）の溶媒（Ｓ）に対する重量比は、２０：８０と８０：２０の間、好ましくは３０：７０と７０：３０の間、特に好ましくは４０：６０または６０：４０である。
【００６６】
また、量的な観点から言うと、培地中の（ＦＡＳＥ）の濃度（重量％）は以下のものとすることが好ましい：
０．１≦［ＦＡＳＥ］≦１０、
好ましくは０．５≦［ＦＡＳＥ］≦５、
特に好ましくは１．５≦［ＦＡＳＥ］≦３．５。
培地中で使用する色原性または蛍光原性基質の量はその濃度（ｍｇ／ｌ）が以下のように定義されるものである：
１≦［基質］≦２０００、
好ましくは５≦［基質］≦１５００、
特に好ましくは２５≦［基質］≦１０００。
【００６７】
ＦＡＳＥと溶媒Ｓの溶液の中で使用する基質の量は、培地中のその濃度（ｇ／１）が以下のように定義されるものである：
０．５≦［ストック溶液中基質］≦２０００、
好ましくは１≦［ストック溶液中基質］≦１０００、
特に好ましくは２≦［ストック溶液中基質］≦２００。
【００６８】
検出／識別培地中の培養培地については、以下のものを含む群から選択されるように特定し得る：
―マッコンキー（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ）、コロンビアＡＮＣ（ＣｏｌｕｍｂｉａＡＮＣ）、ＰＡＬＣＡＭおよびサブロー（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ）ゲンタマイシン―クロラムフェニコール培地を含むタイプの選択培地、好ましくはマッコンキー培地；
―コロンビア＋／―血液、トリプカーゼ大豆（ｔｒｙｐｃａｓｅｓｏｙａ）、栄養ゲロースおよびサブロー培地を含むタイプの非選択的培地、好ましくはコロンビア培地。
【００６９】
実際上、当業者は、標的バクテリアにより、および当業者が知悉している完全によく知られた基準によって培養培地を選択するであろう。
【００７０】
以下に限定されるものではないが、本発明による培地は、医学上または産業上の関心がもたれる微生物、特にサルモネラ属、シュードモナス属、リステリア属、スタフィロコッカス属、エンテロコッカス属またはカンジダ属の検出／識別に特に適していることが判明した。
【００７１】
サルモネラ属バクテリアの検出の場合には、例えば、マッコンキー培地が培地に選択されるであろう。
【００７２】
さらに、本発明による培地は、場合によっては１種または複数の他の酵素基質（例えば色原性または蛍光原性の酵素基質）、ペプトン、１種または複数の成長因子、炭水化物、１種または複数の選択剤、緩衝液、１種または複数のゲル化剤などの他の添加物を含むことができる。
【００７３】
本発明による培地は直ちに使用できる（つまり、チューブもしくはフラスコ中、またはペトリ皿上への接種の準備ができている）液体またはゲル状である。
【００７４】
本発明による培地は、液体またはゲル状で４℃で数週間、容器内に保存できる。
【００７５】
その他の特徴によれば、本発明は、さらに、実質的に以下のことからなることを特徴とする、上に定義されるような培地を得る方法に関係する：
―色原性または蛍光原性エステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ基質を含む溶媒ＳとＦＡＳＥ、ＦＡまたはＦＡＳＥ／ＦＡ混合物の中の少なくとも１種類から少なくとも１種類のストック溶液を調製すること；
―培養培地にこの溶液および他の添加物を添加すること；ならびに
―全体を均質化すること。
【００７６】
ストック溶液は、基質、溶媒ＳおよびＦＡＳＥ、ＦＡまたはＦＡＳＥ／ＦＡ混合物を順次組み合わせ、場合によっては相乗性助剤を加えることにより個別に調製される。生成物および量は上に定義した通りである。
【００７７】
均質化した後、ストック溶液を、水で予め再生しておいた過冷却ゲル培地に加える。培地は非ゲル状の液体培地、例えば栄養スープでもよい。
【００７８】
培養培地とストック溶液とを混合することにより、直ちに接種できる液体またはゲル状検出培地が得られる。
【００７９】
さらに別の特徴によれば、本発明はさらに、下記の操作からなるエステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ活性を有する菌株の検出／識別方法に関する。
―上に定義されるような検出／識別培地製品それ自体に、または上記の方法によって得られた製品に、分析される標的バクテリアを含む試料を接種すること；
―当業者に知られている適切な条件の下で接種した培地をインキュベートすること；および
―それを例えば３７℃でオーブンにおいてインキュベートした後に現像したコロニーの発色または蛍光（これらの発色は、色原性または蛍光原性エステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ基質の標的バクテリアによる加水分解を明らかにする）を読み取り／解釈すること。
【００８０】
最後に、本発明は、エステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ活性から選択される酵素活性を有する微生物、特にバクテリアまたは酵母の検出／識別用培地（液体またはゲル）の乳化安定化剤として、脂肪酸ソルビタンエステル（ＦＡＳＥ）、脂肪酸（ＦＡ）またはＦＡＳＥ／ＦＡ混合物を使用することに関し、この培地は特に反応培地および少なくとも１種類の色原性または蛍光原性のエステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ基質を含み（ただし、４―［２―（４―オクタノイルオキシ―３，５―ジメトキシフェニル）ビニル］キノリニウム―１―（プロパン―３―イル）カルボキシレートおよびアニオンを含む基質を除く）、場合によっては、色原性または蛍光原性のエステラーゼおよび／またはオシダーゼおよび／またはペプチダーゼおよび／またはスルファターゼおよび／またはホスファターゼ基質用の少なくとも１種類の溶媒Ｓを培地に併せて含む。
【００８１】
以下の実施例は、本発明についてのより明瞭な理解をもたらし、その種々の実施形態および実施態様とともにその利点をすべて評価することを可能にするであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８２】
実施例１：ゲル状培地におけるインドキシル系エステラーゼ基質５―ブロモ―３―インドリルノナノエート（色原性エステラーゼ基質）の可溶性試験
様々な基質ストック溶液を、３番胆汁酸塩（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）の存在下、メタノールで調製する。次いで、これらの溶液を様々な体積で過冷却されたゲル状培地（すなわちマッコンキー培地）（水で５０ｇ／ｌの濃度に再生成した）に加える。
【００８３】
プロトコルおよび培地の外観を下記表１中に併せて示す。
【００８４】
【表１】
2004516827.tif 000002
【００８５】
光学的に最も均質の培地は３、４および５で、メタノール濃度が最大の培地である。しかし、これらの培地は「乳汁状」の外観を有し、したがって、エステラーゼ基質はエマルジョン状になっているようである。
【００８６】
実施例２：Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＦＡＳＥ）の添加によるエステラーゼ基質の可溶性改善
溶媒Ｓとしてメタノールを用いて、一方は３番胆汁酸塩の存在下、他方は３番胆汁酸塩およびＴｗｅｅｎ（登録商標）２０［エチレンオキシド（ＥＯ）を２０単位含むポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート］の存在下に、２種類の基質ストック溶液を調製する。次いで、基質の最終濃度５００ｍｇ／ｌに対応する体積を、過冷却したゲル状培養培地（すなわち、マッコンキー培地）に加える。プロトコルおよび培地の外観を下記表２中に併せて示す。
【００８７】
【表２】
2004516827.tif 000003
【００８８】
培地２は培地１より良好な光学的均質性を有する。エステラーゼ基質は完全に溶解するか、またはそのミセル粒子がもはや目に見えないエマルジョンの状態である。
【００８９】
実施例３：前記例に記載する２種類の培地の生物学的試験
出願人のコレクション由来の微生物を、３つの四分円隔離によって０．５マックファーランド（ＭｃＦａｒｌａｎｄ）懸濁液から上記２種類の培地のそれぞれに接種した。ペトリ皿を３７℃で４８時間インキュベートした。形成されたコロニーを、２４時間および４８時間のインキュベーション後に視覚的に検査した。これらのコロニーの発色およびその発色の強度を記録した。結果を下記表３に示す。
【００９０】
【表３】
2004516827.tif 000004
【００９１】
したがって、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む培地では、エステラーゼ活性を示す微生物の菌株についてより強い発色を得ることが可能になる。したがって、基質はその溶解性が高まる点で、あるいは、それがより容易に利用可能な点でより広く使用される。２種の培地の強度差から見て、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０の存在下では使用する基質の濃度を低減し、したがってこの種の基質の使用に要するコストを低減できると思われる。
【００９２】
実施例４：グラム陽性またはグラム陰性バクテリア種および酵母に対する別のインドキシル誘導体（色原性エステラーゼ基質）の溶解性試験
５―ブロモ―４―クロロ―３―インドリルオクタノエート（色原性エステラーゼ基質）のストック溶液４０ｇ／ｌを、メタノール（４０％）およびＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（６０％）の混合物に調製した。次いで、基質の最終濃度５００ｍｇ／ｌに対応する体積を、過冷却したゲル状培地（すなわちコロンビアタイプの培地）に加える。この培地をぺトリ皿に注いだ。
【００９３】
出願人のコレクション由来の微生物を、３つの四分円隔離によって０．５マックファーランド懸濁液から接種した。ペトリ皿を３７℃で４８時間インキュベートした。形成されたコロニーを、２４時間および４８時間のインキュベーション後に視覚的に検査した。これらのコロニーの発色およびその発色の強度を記録した。結果を下記表４に示す。
【００９４】
【表４】
2004516827.tif 000005
【００９５】
したがって、Ｔｗｅｅｎ２０の存在下では、その属する群に関わらず、エステラーゼ活性を示すすべての微生物において、エステラーゼ活性の発現を明らかにできる。しかも、この使用態様は調べたインドキシル誘導体（色原性エステラーゼ基質）に依存しない。
【００９６】
実施例５：胆汁酸塩の存在下または不存在下かつＴｗｅｅｎ２０存在下で、メタノールを他の溶媒に置換する
前述の実施例で使用したメタノールを２種類の他の溶媒、すなわちジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に代えた。これら３種類の溶媒を、Ｔｗｅｅｎ２０が存在する状態、および培地中の最終濃度を６．５ｇ／ｌとし、胆汁酸塩が存在する状態またはしない状態で試験した。下記の表５は、試験した６種類の培地の構成を示す。
【００９７】
【表５】
2004516827.tif 000006
【００９８】
前記実施例と同様の方法、すなわち、上記溶媒のうちの１種類に溶解したエステラーゼ基質を含むマッコンキーゲロース培地上に接種した微生物の存在下に、基質の活性を確認した。結果を下記表６に示す。
【００９９】
【表６】
2004516827.tif 000007
【０１００】
したがって、Ｔｗｅｅｎ２０が存在する場合には、エステラーゼ基質を溶解するために様々な溶媒を使用することが可能である。しかも、可溶性の点または生物学的結果では、供試溶媒に関係なく胆汁酸塩の添加は変化をもたらさなかった。最も簡単な溶解方法は、胆汁酸塩をさらに加えることなく、溶媒とＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を混合することであると結論付けられる。
【０１０１】
実施例６：様々な溶媒Ｓ／Ｔｗｅｅｎ２０比の試験
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０の存在下、ＤＭＳＯを用いて種々の基質ストック溶液を調製した。各ストック溶液は異なるＤＭＳＯ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０の比に相当する。次いで、基質の最終濃度５００ｍｇ／ｌに対応する体積を、過冷却したゲル状培地（すなわち、マッコンキー培地）に加える。下記の表７は、試験した６種類の培地の構成を示す。
【０１０２】
【表７】
2004516827.tif 000008
【０１０３】
出願人のコレクション由来の微生物を、３つの四分円隔離によって０．５マックファーランド（ＭｃＦａｒｌａｎｄ）懸濁液から上記６種類の培地それぞれに接種した。ペトリ皿を３７℃で４８時間インキュベートした。形成されたコロニーを、２４時間および４８時間のインキュベーション後に視覚的に検査した。これらのコロニーの発色およびその発色の強度を記録した。結果を下記表８に示す。
【０１０４】
【表８】
2004516827.tif 000009
【０１０５】
試験された６種の比では、良好な基質可溶性が得られ、非常に受容可能な発色強度で基質の加水分解を明らかにすることが可能である。発色の最大強度は、４０％ＤＭＳＯ／６０％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０と６０％ＤＭＳＯ／４０％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０の間で得られる。
【０１０６】
実施例７：インドキシル以外にマーカーを有するエステラーゼ基質に対する可溶化方法の試験
試験した基質は１，２―ジヒドロキシアントラキノンオクタノエート（２―アリザリンオクタノエート）である。溶媒としてＤＭＦ、ＤＭＳＯ、メタノールまたはメトキシエタノールを用い、いずれの場合もＴｗｅｅｎ（登録商標）２０の存在下で様々な基質ストック溶液を調製する。下記の表９は、それぞれの構成によるストック溶液の外観を示す。
【０１０７】
【表９】
2004516827.tif 000010
【０１０８】
次いで、基質の最終濃度１００ｍｇ／ｌに対応する体積を、過冷却したゲル状培地（すなわち、マッコンキー培地）に加える。アリザリン系基質の存在下にエステラーゼ活性を明らかにできるように、最終濃度５０ｍｇ／ｌのクエン酸鉄塩も培地に加えた。基質全部の溶解を示すストック溶液の１つのみを試験した（ＤＭＦにおけるストック溶液）。出願人のコレクション由来の微生物を、３つの四分円隔離によって０．５マックファーランド懸濁液から上記２種類の培地それぞれに接種した。ペトリ皿を３７℃で４８時間インキュベートした。形成されたコロニーを２４時間および４８時間のインキュベーション後に視覚的に検査した。これらのコロニーの発色およびその発色の強度を記録した。結果を下記表１０に示す。
【０１０９】
【表１０】
2004516827.tif 000011
【０１１０】
したがって、この溶解方法は、インドキシルエステルに特異的ではないが、特に酵素基質の他のファミリーとともに使用することができる。
【０１１１】
実施例８：エステラーゼ基質５―ブロモ―３―インドリルノナノエートの可溶性に関するＴｗｅｅｎ（登録商標）２０に由来する様々なＦＡＳＥの試験；
様々な基質ストック溶液を、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（ポリエトキシル化ソルビタンモノオレエート）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０（ポリエトキシル化ソルビタンモノステアレート）またはＴｗｅｅｎ（登録商標）６５（ポリエトキシル化ソルビタントリステアレート）の存在下、ＤＭＳＯを用いて調製する。次いで、基質の最終濃度５００ｍｇ／ｌに対応する体積を、過冷却したゲル状培地（すなわち、マッコンキー培地）に加える。表１１は、試験した培地の構成を示す。
【０１１２】
【表１１】
2004516827.tif 000012
【０１１３】
出願人のコレクション由来の微生物を、３つの四分円隔離によって０．５マックファーランド懸濁液から上記６種類の培地それぞれに接種した。ペトリ皿を３７℃で４８時間インキュベートした。形成されたコロニーを２４時間および４８時間のインキュベーション後に視覚的に検査した。これらのコロニーの発色およびその発色の強度を記録した。結果を表１２に示す。
【０１１４】
【表１２】
2004516827.tif 000013
【０１１５】
注：試験した各Ｔｗｅｅｎ（登録商標）について様々なＴｗｅｅｎ（登録商標）／溶媒比を調製した。しかし、調べた比によらず結果は同様であったため、この実施例では１種類の比のみ掲げた。
【０１１６】
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０およびＴｗｅｅｎ（登録商標）６０によれば、良好な基質可溶性が得られ、非常に受容可能な発色強度で基質の加水分解を明らかにすることが可能である。
【０１１７】
実施例９：Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０存在下で可溶化されたまたは可溶化されていないエステラーゼ基質５―ブロモ―３―インドリルノナノエートを含むゲル状培地の比較安定性
一方は６．５ｇ／ｌの３番胆汁酸塩の存在下４０ｇ／ｌの濃度のメタノール溶液として、他方はＤＭＳＯ（４０％）およびＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（６０％）の混合物中４０ｇ／ｌの濃度の溶液として、２種類の基質ストック溶液を調製する。基質の最終濃度５００ｍｇ／ｌに対応する体積を、過冷却したゲル状培地（すなわち、マッコンキー培地）に加える。これらの２種類の培地を直径９０ｍｍのペトリ皿に注ぎ、＋４℃で８週間保存した。１週、２週、４週および８週後に、上記の２種の培地を即時使用のために調製した。
【０１１８】
出願人のコレクション由来の微生物を、３つの四分円隔離によって０．５マックファーランド懸濁液から即時使用用に調製した上記２種類の培地に接種し、２種の培地は＋４℃で保存した。このペトリ皿を３７℃で４８時間インキュベートした。形成されたコロニーを２４時間および４８時間のインキュベーション後に視覚的に検査した。これらのコロニーの発色およびその発色の強度を記録した。結果を下表に示す。
【０１１９】
【表１３】
2004516827.tif 000014
【０１２０】
【表１４】
2004516827.tif 000015
【０１２１】
【表１５】
2004516827.tif 000016
【０１２２】
【表１６】
2004516827.tif 000017
【０１２３】
メタノールと胆汁酸塩の混合物に溶解した基質を含む培地は、２週間保存後にはエステラーゼ活性の発現に非常に実質的な低下を示す。この低下は時間とともに増幅される。ＤＭＳＯとＴｗｅｅｎ２０の混合物で溶解した基質を含む培地は、少なくとも６週間までエステラーゼ活性の一定の発現を示す。８週後には、わずかながら（決定的なものではない）エステラーゼ活性の発現低下が見られる。したがって、Ｔｗｅｅｎ２０は、エステラーゼ基質の安定化を可能にし、この種の基質を含む培養培地の保存および使用をより容易にする。
【０１２４】
注：上記の実施例において、菌株の後の数字は、出願人のコレクションにおいて付与された各菌株の整理番号に相当する。発色強度は以下の通り定義された任意スケールに対応する：
０      活性なし
０．１    痕跡程度の発色
０．５    非常に薄い発色
１      低強度だが識別できる発色
２      中強度の明瞭な発色
３      強い発色
４      非常に強い発色
【０１２５】
実施例１０：Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０存在下で可溶化された、または可溶化されていないオシダーゼ基質６―クロロ―３―インドリル―β―Ｎ―アセチルグルコサミニドを含むゲル状培地の比較安定性
一方は５０ｇ／ｌの濃度のＤＭＦ溶液として、他方はＤＭＦ（４０％）およびＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（６０％）の混合物中５０ｇ／ｌの濃度の溶液として、２種類の基質ストック溶液を調製した。基質の最終濃度１７５ｍｇ／ｌに対応する体積を、過冷却したゲル状培地（すなわち、血液不添加のコロンビア培地）に加える。これらの２種類の培地を直径９０ｍｍのペトリ皿に注ぎ、＋４℃で８週間保存した。３週、６週、９週および１２週後に、上記の２種の培地を即時使用のために調製した。
【０１２６】
出願人のコレクション由来の微生物を、３つの四分円隔離によって０．５マックファーランド懸濁液から即時使用用に調製した上記２種類の培地に接種し、２種の培地は＋４℃で保存した。このペトリ皿を３７℃で４８時間インキュベートした。形成されたコロニーを２４時間および４８時間のインキュベーション後に視覚的に検査した。これらのコロニーの発色およびその発色の強度を記録した。結果を下表に示す。
【０１２７】
【表１７】
2004516827.tif 000018
【０１２８】
【表１８】
2004516827.tif 000019
【０１２９】
【表１９】
2004516827.tif 000020
【０１３０】
【表２０】
2004516827.tif 000021
【０１３１】
ＤＭＦのみに溶解した基質を含む培地は、３週間保存後にはβ―Ｎ―アセチルグルコサミニダーゼ活性の発現に非常に実質的な低下を示す。この低下は時間とともに増幅される。１２週間後にはもはや活性は見られない。ＤＭＦとＴｗｅｅｎ２０の混合物で溶解した基質を含む培地は、少なくとも６週間までβ―Ｎ―アセチルグルコサミニダーゼ活性の一定の発現を示す。９週後および１２週後には、わずかながら（決定的なものではない）β―Ｎ―アセチルグルコサミニダーゼ活性の発現低下が見られる。したがって、Ｔｗｅｅｎ２０は、β―Ｎ―アセチルグルコサミニダーゼ基質の安定化を可能にし、この種の基質を含む培養培地の保存および使用をより容易にする。
【０１３２】
上記の実施例において、菌株の後の数字は、出願人のコレクションにおいて付与された各菌株の整理番号に相当する。発色強度は以下の通り定義された任意スケールに対応する：
０      活性なし
０．１    痕跡程度の発色
０．５    非常に薄い発色
１      低強度だが識別できる発色
２      中強度の明瞭な発色
３      強い発色
４      非常に強い発色
【国際公開パンフレット】
2004516827.tif 000022
2004516827.tif 000023
2004516827.tif 000024
2004516827.tif 000025
2004516827.tif 000026
2004516827.tif 000027
2004516827.tif 000028
2004516827.tif 000029
2004516827.tif 000030
2004516827.tif 000031
2004516827.tif 000032
2004516827.tif 000033
2004516827.tif 000034
2004516827.tif 000035
2004516827.tif 000036
2004516827.tif 000037
2004516827.tif 000038
2004516827.tif 000039
2004516827.tif 000040
2004516827.tif 000041
2004516827.tif 000042
2004516827.tif 000043
2004516827.tif 000044
2004516827.tif 000045
2004516827.tif 000046
2004516827.tif 000047
2004516827.tif 000048
2004516827.tif 000049
2004516827.tif 000050
2004516827.tif 000051
2004516827.tif 000052
2004516827.tif 000053
2004516827.tif 000054
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004516827.tif 000055
2004516827.tif 000056
【国際調査報告】
2004516827.tif 000057
2004516827.tif 000058
2004516827.tif 000059
2004516827.tif 000060
2004516827.tif 000061
2004516827.tif 000062
2004516827.tif 000063
2004516827.tif 000064
2004516827.tif 000065
2004516827.tif 000066
2004516827.tif 000067
2004516827.tif 000068
2004516827.tif 000069
2004516827.tif 000070