(57)【要約】本発明は、式：Ｐｘ−Ｓｘ−Ｂｎ−（ＺＲ）−輸送ペプチド−（Ｚ１Ｚ２）−タンパク質（Ｙ）−（Ｚ１Ｚ２）−タンパク質（Ｙｍ）−Ｔ；の発現カセット、ならびにその製造方法および使用に関し、式中、当該発現カセットは、輸送ペプチドをコードしており、該輸送ペプチドは配列Ｚ１Ｚ２を介して第二のタンパク質に連結しており、該第二のタンパク質は順番にＺ１Ｚ２を介してタンパク質Ｙ１に連結しており、該タンパク質Ｙ１はＹに相当するかまたはＹとは異なるかのいずれでもよく、該輸送ペプチドはＹおよび／またはＹｍの分泌速度を改善し、ここで、Ｐｘは、所定のタンパク質の最適な収率が得られるような方法で選択される任意のプロモーターＤＮＡ配列であり；Ｓｘは、それに応じて最適な収率を可能にする任意のシグナルまたはリーダー配列をコードする任意のＤＮＡであり；Ｂｎは、１〜１５個の遺伝学的にコード可能なアミノ酸または化学結合であり；Ｚは、ＬｙｓおよびＡｒｇからなる群より選択されるアミノ酸のコドンであり；Ｚ１は、ＬｙｓおよびＡｒｇからなる群より選択されるアミノ酸のコドンであり；Ｚ２は、ＬｙｓおよびＡｒｇからなる群より選択されるアミノ酸のコドンであり；タンパク質Ｙｍは、酵母により生産または分泌され得る任意のタンパク質をコードするＤＮＡ配列（ｍ＝１〜５）であるか、または、化学結合（ｍ＝０）であり；Ｒは、アルギニンコドンであり；輸送ペプチドは、効率的に輸送され得る、かつ膜を通過し得るペプチドをコードするＤＮＡ配列であり；タンパク質Ｙは、酵母により生産または分泌され得る任意のタンパク質をコードするＤＮＡ配列であり、その生物活性は、Ｙｍが化学結合ではない場合、塩基性ジペプチド伸長により損なわれないか、または、カルボキシペプチダーゼによる伸長の分解を可能にし；Ｔは、発現に有利な翻訳されないＤＮＡ配列である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
Ｐｘ−Ｓｘ−Ｂｎ−（ＺＲ）−輸送ペプチド−（Ｚ１Ｚ２）−タンパク質（Ｙ）−（Ｚ１Ｚ２）−タンパク質（Ｙｍ）−Ｔ；
のＤＮＡ分子であって、
式中、当該ＤＮＡ分子は、輸送ペプチドをコードしており、該輸送ペプチドは配列Ｚ１Ｚ２を介して第二のタンパク質に連結しており、該第二のタンパク質は順番にＺ１Ｚ２を介してタンパク質Ｙ１に連結しており、該タンパク質Ｙ１はＹに相当するかまたはＹとは異なるかのいずれでもよく、該輸送ペプチドはＹおよび／またはＹｍの分泌速度を改善し、ここで、
Ｐｘは、所定のタンパク質の最適な収率が得られるような方法で選択される任意のプロモーターＤＮＡ配列であり；
Ｓｘは、それに応じて最適な収率を可能にする任意のシグナルまたはリーダー配列をコードする任意のＤＮＡであり；
Ｂｎは、１〜１５個の遺伝学的にコード可能なアミノ酸または化学結合であり；
Ｚは、ＬｙｓおよびＡｒｇからなる群より選択されるアミノ酸のコドンであり；
Ｚ１は、ＬｙｓおよびＡｒｇからなる群より選択されるアミノ酸のコドンであり；
Ｚ２は、ＬｙｓおよびＡｒｇからなる群より選択されるアミノ酸のコドンであり；
タンパク質Ｙｍは、酵母により生産または分泌され得る任意のタンパク質をコードするＤＮＡ配列（ｍ＝１〜５）であるか、または、化学結合（ｍ＝０）であり；
Ｒは、アルギニンコドンであり；
輸送ペプチドは、効率的に輸送され得る、かつ膜を通過し得るペプチドをコードするＤＮＡ配列であり；
タンパク質Ｙは、酵母により生産または分泌され得る任意のタンパク質をコードするＤＮＡ配列であり、その生物活性は、Ｙｍが化学結合ではない場合、塩基性ジペプチド伸長により損なわれないか、または、カルボキシペプチダーゼによる伸長の分解を可能にし；
Ｔは、発現に有利な翻訳されないＤＮＡ配列である、上記のＤＮＡ分子。
【請求項２】
輸送ペプチドが、ヒルジンまたはヒルジン誘導体である、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
【請求項３】
（Ｙ）が、プロインスリンおよびその誘導体、インターロイキン、リンフォカイン、インターフェロンならびに血液凝固系から誘導された因子からなる群より選択された薬学的に適切なタンパク質である、請求項１または２に記載のＤＮＡ分子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子のいずれかによりコードされるタンパク質。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子を含む多コピー型ベクター。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子を含むプラスミド。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子、請求項５に記載の多コピー型ベクター、および／または、請求項６に記載のプラスミドを、染色体の一部として、ミニ染色体の一部として、もしくは染色体外に含む宿主細胞。
【請求項８】
宿主細胞が酵母である、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓからなる群より選択される、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
（ａ）請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子、請求項５に記載の多コピー型ベクター、または、請求項６に記載のプラスミドが、請求項７〜９のいずれか一項に記載の宿主細胞で発現され；そして、
（ｂ）発現タンパク質が細胞培養物の上清から単離される、
請求項４に記載の培養によりタンパク質を得る方法。
【請求項１１】
培養が完了した後に、望まないタンパク質を沈殿させるためにｐＨを２．５〜３．５に調節し、発現タンパク質を沈殿の上清から単離する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
宿主細胞からの培養上清を分離した後、宿主細胞を新しい培地で繰り返し培養し、培養中に得られた各上清から放出された融合タンパク質を単離する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
沈殿後の上清中の発現タンパク質を濃縮する工程が、精密ろ過、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーからなる群より選択される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）請求項１０または１１に記載の方法において、プロインスリンは、請求項１に記載の発現カセットのタンパク質（Ｙ）として発現され；
（ｂ）工程（ａ）のプロインスリンは、単離され、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢで処理され；そして、
（ｃ）インスリンは、工程（ｂ）の反応混合物から単離される、
インスリンの調製方法。
【請求項１５】
輸送ペプチドが、工程（ａ）または（ｂ）の後に、破壊されるか、または生物学的に不活性化されるヒルジンまたはヒルジン誘導体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
タンパク質が、そのＣ末端に２つの塩基性アミノ酸残基を有するヒルジン誘導体である、請求項４に記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
経済上の実行可能性という観点において、薬学的に重要なタンパク質の製造方法は、生物学的に活性な産物を可能な最も高い純度で得られなければならない。このような重要なタンパク質の酵母での発現がここで広く用いられる。インスリン、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ（Ｒ））およびヒルジン（Ｒｅｆｌｕｄａｎ（Ｒ））のようなタンパク質の製造は、特定のタンパク質またはその前駆体の酵母での合成に基づく遺伝子工学的方法の成功した開発の一例である。一般的に、酵母は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｗｅｙｄｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４４： ３７７−３８５， １９９５）またはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ：４， ４７６−８２， １９９６）を用いた場合、グラム規模での良好な収率で特にヒルジンを直接合成することができる。
【０００２】
ＥＰ−Ａ０３２４７１２は、Ｎ末端アミノ酸がロイシンであるヒルジン誘導体（Ｒｅｆｌｕｄａｎ（Ｒ））、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株Ｙ７９におけるその構成的発現を説明する。ＥＰ−Ａ０３４７７８１は、ミニプロインスリンと、一例としてパン酵母でのその発現を説明する。Ｒｅｆｌｕｄａｎ（Ｒ）およびインスリンは、２つの別々な発現を実行することによって生産される。
【０００３】
驚くべきことに、現在本発明者らは、前駆タンパク質を、分泌シグナルとして酵母に認識されるシグナルまたはリーダー配列に、塩基性ジペプチド（好ましくはＬｙｓ−Ａｒｇ）を介して融合し、そしてさらに、Ｎ末端ヒルジン誘導体とミニ−プロインスリン誘導体との間に酵母エンドプロテアーゼにより認識される切断部位を導入することによって、ヒルジン誘導体およびミニ−プロインスリン誘導体を共通の前駆タンパク質から得ることができることを見出した。これに関して、好ましくは、塩基性ジペプチドに、例えばＬｙｓ−Ａｒｇが提供される。発現後、Ｌｙｓ−Ａｒｇにより伸長したヒルジン誘導体、および、インスリンＢ鎖の第一のアミノ酸で始まるミニ−プロインスリン誘導体が上清に見出される。驚くべきことに、ここで本発明者らは、直接のシグナル−ミニ−プロインスリン発現で達成される収率と比べて、このミニ−プロインスリンの収率が著しく改善されるが、それに反して、ヒルジン誘導体の収率はほとんど同じのままであることを見出した。従って、驚くべきことに、ヒルジンは、ミニ−プロインスリンの収率に関してある種のエンハンサーペプチドとして作用する。
【０００４】
エンハンサータンパク質として作用し得るペプチドは、通常、比較的小さいペプチドであり、自然では例えば腺組織から短期間で大量に分泌される。このタイプのペプチドは、例えば、ヘビ毒またはエグリンＣまたはＴＡＰ（ダニ類の抗凝血ペプチド）が挙げられ、これらは極端に優れた輸送適合性を特徴とする。本発明は、このようなタンパク質にも関連する。
【０００５】
他の利点は、すでに医薬で用いられているヒルジンと同等な、または、それより優れた薬学的特性を有するヒルジン誘導体に起因する。この場合、全く同じ培養から２またはさらにそれ以上の医薬を生産することができるようになる。結果として、必要とされる培養能力が、より少なくなる。これは、製造コストに直接的に有利である。
【０００６】
しかしながら、複数の産物の製造は随意的である。例えば、Ｒｅｆｌｕｄａｎに必要な量はインスリンの量より少なく、これは、薬学的に関心のある物質のいずれか一つを捨てるような方法になる可能性がある。
【０００７】
収率を改善するために、特許出願ＥＰ−Ａ０２００６５５で提案されたように、ヒルジン誘導体の前のＮ末端にＬｙｓ−Ａｒｇを介して、短いペプチド配列をシグナルまたはリーダー配列に対するリンカーとして置くことが可能である。また、シグナルまたはリーダー配列の選択が所定のタンパク質の収率に直接作用することも当業者に明白である。このような配列の選択は、さらなる最適化の主題である。発現カセットの３′末端に位置する配列もまた、ｍＲＮＡ安定性に影響を与えることにより収率に直接作用する。これに関して、前記配列が所定の各タンパク質を発現させるのに最適化可能であることは当業者に明白である。これは、誘導的または構成的に活性であり得る適切なプロモーターの選択に関しても同様である。ベクター系および宿主系の選択も同等に収率に関して重要である。従って、例えば用いられたパン酵母の代わりに、酵母のＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａまたはＫ．ｌａｃｔｉｓを、それぞれの場合において異なる生理学に関して最適化されたベクターまたは発現カセットと共に用いることも可能である。
【０００８】
培地に分泌させることが可能な方法の他の利点は、所定のタンパク質の、より単純なタンパク質−化学的処理（ｗｏｒｋｕｐ）である。驚くべきことに、本発明者らは、１０ｋＤａより大きい分子量を有する分子の除去限界を有するメンブレンを通過させるろ過により、ヒルジン存在下でミニ−プロインスリンを濃縮することができることを見出した。残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）中には、ほとんど上記分子のみが見出される。新規の分離技術および新規の方法工程の組み合わせの開発が常に精製方法の改善を可能にすることは当業者に明白である。これは直接的に収率に有利であり、それゆえに、製造コストにも有利である。
【０００９】
従って、本発明は、式：
Ｐｘ−Ｓｘ−Ｂｎ−（ＺＲ）−輸送ペプチド−（Ｚ１Ｚ２）−タンパク質（Ｙ）−（Ｚ１Ｚ２）−タンパク質（Ｙｍ）−Ｔ；
のＤＮＡ分子（あるいは用語「発現カセット」）に関し、
式中、発現カセットは、輸送ペプチドをコードしており、該輸送ペプチドは配列Ｚ１Ｚ２を介して第二のタンパク質に連結しており、該第二のタンパク質は順番にＺ１Ｚ２を介してタンパク質Ｙ１に連結しており、該タンパク質Ｙ１はＹに相当するかまたはＹとは異なるかのいずれでもよく、該輸送ペプチドはＹおよび／またはＹｍの分泌速度を改善し、ここで：
【００１０】
Ｐｘは、所定のタンパク質の最適な収率が得られるような方法で選択される任意のプロモーターＤＮＡ配列であり；
Ｓｘは、それに応じて最適な収率を可能にする任意のシグナルまたはリーダー配列をコードする任意のＤＮＡであり；
Ｂｎは、１〜１５個の遺伝学的にコードされたアミノ酸または化学結合であり；
Ｚは、ＬｙｓおよびＡｒｇからなる群より選択されるアミノ酸のコドンであり；
Ｚ１は、ＬｙｓおよびＡｒｇからなる群より選択されるアミノ酸のコドンであり；
Ｚ２は、ＬｙｓおよびＡｒｇからなる群より選択されるアミノ酸のコドンであり；
Ｒは、Ａｒｇコドンであり；
輸送ペプチドは、効率的に輸送され得る、かつ膜を通過し得るペプチド（例えばヒルジンまたはヒルジン誘導体）をコードするＤＮＡ配列であり、例えば；
タンパク質Ｙは、酵母により生産または分泌され得る任意のタンパク質をコードするＤＮＡ配列であり；
タンパク質Ｙｍは、酵母により生産または分泌され得る任意のタンパク質をコードするＤＮＡ配列（ｍ＝１〜５）であるか、または、化学結合（ｍ＝０）であり；
Ｔは、発現に有利な翻訳されないＤＮＡ配列である。
【００１１】
本発明の他の実施形態は、上述のＤＮＡ分子のいずれかでコードされる融合タンパク質である。
本発明のさらなる実施形態は、上述のＤＮＡ分子を含む多コピー型ベクターおよびプラスミドである。
本発明のさらなる実施形態は、上述のＤＮＡ分子、または、上述の多コピー型ベクターもしくは上述のプラスミドを、その染色体の一部として、ミニ染色体の一部として、もしくは染色体外に含む宿主細胞であって、ここで好ましくは、前記宿主細胞は酵母であり、特に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓからなる群より選択される酵母である。
【００１２】
本発明の他の実施形態は、培養により上述のタンパク質を得る方法であり、当該方法において、
（ａ）上述のＤＮＡ分子、上述の多コピー型ベクター、または上述のプラスミドが、上述の宿主細胞で発現され、および、
（ｂ）発現タンパク質が細胞培養物の上清から単離され、
ここで特に、培養が完了した後に、望まないタンパク質を沈殿させるためにｐＨを２．５〜３．５に調節し、その沈殿の上清から発現タンパク質を単離する。
本発明の他の実施形態は、上述の方法であり、当該方法において、宿主細胞からの培養上清を分離した後、宿主細胞を新しい培地で繰り返し培養し、放出された融合タンパク質を培養中に得られた各上清から単離する。
【００１３】
本発明の他の実施形態は、上述の方法であり、当該方法において、沈殿後の上清中の発現タンパク質を濃縮する方法工程は、精密ろ過、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーからなる群より選択される。
【００１４】
本発明のさらなる実施形態は、インスリンを調製する方法であり、当該方法において、
（ａ）プロインスリンは、上述の方法において上述の発現カセットにおけるタンパク質（Ｙ）として発現され；
（ｂ）工程（ａ）のプロインスリンは、単離され、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢで処理され；および、
（ｃ）インスリンは、工程（ｂ）の反応混合物から単離され、
ここで特に、輸送ペプチドは、工程（ａ）または（ｂ）の後に、破壊されるか、または生物学的に不活性化されるヒルジンまたはヒルジン誘導体である。
【００１５】
本発明のさらなる実施形態は、タンパク質であり、当該タンパク質は、Ｃ末端に２つの塩基性アミノ酸残基を有するヒルジン誘導体である。
チスイビル属（Ｈｉｒｕｄｏ）型のヒルは、例えば、トロンビン阻害剤であるヒルジンの様々なアイソフォームを発達させてきた。ヒルジンは、例えばＮ末端アミノ酸の交換による人工的な分子の変異によって、薬学的な必要性に関して最適化されている（例えばＥＰ０３２４７１２）。本発明は、ヒルジンおよびヒルジン変異体の使用を含む。本発明の特定の実施形態は、天然ヒルジンアイソフォーム（天然アイソフォームも総じて「ヒルジン」と示す）のいずれか１種を用いる。天然アイソフォームとしては、例えば、Ｖａｌ−Ｖａｌ−ヒルジンまたはＩｌｅ−Ｔｈｒ−ヒルジンがある。本発明の他の実施形態は、天然ヒルジンアイソフォームの変異体を用いる。当該変異体は、天然ヒルジンアイソフォームから誘導されるが、例えば、天然アイソフォームに比べて、付加されたアミノ酸および／またはアミノ酸欠失および／またはアミノ酸置換を含む。ヒルジン変異体としては、天然ヒルジンアイソフォームの改変ペプチドセグメント、および、新規のアミノ酸を含む。ヒルジン変異体は既知であり、例えばＤＥ３４３０５５６で説明されている。ヒルジン変異体は、タンパク質の形態で市販されている（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， ｃａｔ． ｎｏ． ３７７−８５３，−９５０，−９６０）。用語「ヒルジン誘導体」とは、天然ヒルジンと少なくとも４０％相同な配列を示す。
【００１６】
発現カセットは、好ましくは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａまたはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのような酵母に導入される。前記発現カセットは、安定して特定の酵母ゲノムに結合された１またはそれ以上のコピーを有してもよく、または、染色体外の多コピー型ベクターに存在してもよい。この技術が動物細胞培養物または植物細胞のような他の系にも適用できることは当業者に明白である。これもまた本発明の主題である。
【００１７】
以下に説明した発現系を例として示す。発現カセットを前記選択された系に導入するために、適切な組換えＤＮＡ構築物を、選択された宿主系のタイプに応じて作製しなければならないことは、当業者に明白である。従って、産業的な培養は、選択された宿主／ベクター系に関して最適化することができる。従って、実施例は非制限的である。
【００１８】
実施例１：ヒルジン（Ｒｅｆｌｕｄａｎ）−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ミニ−プロインスリンをコードする酵母発現プラスミドの構築
出発原料は、プラスミドｐＫ１５２（ＰＣＴ／ＥＰ００／０８５３７）、ｐＳＷ３（ＥＰ−Ａ０３４７７８１）、および、ウシインターロイキン２をコードした組換え酵母プラスミド誘導体（Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ ５５，１９８７）である。該酵母プラスミドは、αファクターのリーダー配列を酵母ＡＤＨ２プロモーターの制御下に有することによって区別される。この配列は、ＫｐｎＩ制限酵素認識部位を介して連結されたウシインターロイキン２のｃＤＮＡ配列が続き、当該ｃＤＮＡ配列は、このベクターに特有な翻訳されない３′末端にＮｃｏＩ制限酵素認識部位を操作により含む。従って、ｃＤＮＡ配列は、ＫｐｎＩ／ＮｃｏＩ切断によりプラスミドから容易に取り除くことができる。良好な発現収率が報告されていることから、（Ｔのような）残存する３′インターロイキン２配列はｍＲＮＡに対して安定化効果を有し、従って除去したり酵母ターミネーター配列で置換したりする必要が無いと考えられる。プラスミドｐＫ１５２は、Ｌｅｕ−ヒルジン（Ｒｅｆｌｕｄａｎ）をコードするＤＮＡ配列を有し、プラスミドｐＳＷ３は、ミニ−プロインスリンに関するＤＮＡ配列を有する。ヒルジン−Ｌｙｓ  Ａｒｇ−ミニ−プロインスリンをコードする遺伝子配列は、初めにＰＣＲ技術を用いて調製される。この目的のために、４種のプライマーがＥｘｐｅｄｉｔｅ（Ｒ）ＤＮＡ合成システムを用いて調製される：
【００１９】
ｉ．ｈｉｒ＿ｉｎｓｆｋｒ（配列番号１、コードされたタンパク質セグメント：配列番号２）
【化１】
2004518442.tif 000002
ｉｉ．ｈｉｒ＿ｉｎｓｒｅｖｋｒ（配列番号３）
【化２】
2004518442.tif 000003
ｉｉｉ．ｈｉｒｆ１（配列番号４、コードされたタンパク質セグメント：配列番号５）
【化３】
2004518442.tif 000004
ｉｖ．ｉｎｓｃｏ１ｒｅｖ（配列番号６）
【化４】
2004518442.tif 000005
【００２０】
プライマーｈｉｒ＿ｉｎｓｆｋｒは、ヒルジン（５９〜６５）とインスリン配列Ｂ１〜Ｂ７の末端アミノ酸に関するコドンの間に、Ｌｙｓ−Ａｒｇリンカーを介した結合を示す。プライマーｈｉｒ＿ｉｎｓｒｅｖｋｒは、それらに１００％相補的である。プライマーｈｉｒｆ１は、ＥＰ−Ａ０３２４７１２に記載のＫｐｎＩ切断部位まで伸長するヒルジン遺伝子の開始部位をコードする。
【００２１】
プライマーｉｎｓｎｃｏｉｒｅｖは、ＥＰ−Ａ０３４７７８１に従った合成ミニ−プロインスリンの３′末端を示す。プライマー対ｈｉｒｆ１／ｈｉｒ＿ｉｎｓｒｅｖｋｒ（テンプレートとしてプラスミドｐＫ１５２のＤＮＡを用いる）およびｈｉｒ＿ｉｎｓｆｋｒ／ｉｎｓｎｃｏｉｒｅｖ（テンプレートとしてプラスミドｐＳＷ３のＤＮＡを用いる）を用いた、２種の標準的なポリメラーゼ連鎖反応を実行する。その反応を、それぞれの場合において、２００ｎｍｏｌのプライマー、１μｌのポリメラーゼおよび１００ｎｇのベクターを含むＰＣＲ緩衝液（１００μｌ）中で実行する。工程１は、９５℃で２分間のインキュベーションである。これに続いて、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、および、７２℃で３０秒を２５サイクルを行う。最後のサイクルの後、７２℃で３分間インキュベートし、その後反応を止める。
【００２２】
プライマーｈｉｒ＿ｉｎｓｒｅｖｋｒおよびｈｉｒ＿ｉｎｓｆｋｒが１００％相補的であるため、２種の産物のＤＮＡ産物は前記配列に従ってオーバーラップしており、それにより、テンプレートとして第一の２つの反応の産物ならびにプライマーｈｉｒｆ１およびｉｎｓｎｃｏｉｒｅｖを用いた第三の反応において、ＤＮＡ断片が形成され、そのＤＮＡ断片は、Ｌｙｓ−Ａｒｇで仕切られたヒルジンおよびミニ−プロインスリンをコードする。ＰＣＲ断片は酵素ＫｐｎＩとＮｃｏＩとで消化され、続いてＴ４リガーゼ反応によりＫｐｎＩ／ＮｃｏＩで切断されたｐαＡＤＨ２ベクターに挿入される。続いて、ＥＰ−Ａ０３４７７８１の実施例７と同様にして、コンピテントＥ．ｃｏｌｉの株ＭＭ２９４細胞をライゲーション混合物で形質転換する。続いて、ＤＮＡ配列分析により特徴付けるために、プラスミドＤＮＡを２種のクローンから単離する。挿入されたＤＮＡ配列を確認した後、前記実施例に従って、プラスミド調製物のＤＮＡを、パン酵母の株Ｙ７９の細胞を形質転換するのに用いる。しかしながら、ｐαＡＤＨ２ベクターを用いる場合、前記実施例とは異なって、ベクターの導入の後に、ｔｒｐ１−１変異の相補性に関する選択を行う。他のコントロールに関して、プラスミドＤＮＡを酵母形質転換体から再単離し、制限分析で分析する。構築された発現ベクターは、ｐＡＤＨ２Ｈｉｒ＿ＫＲ＿Ｉｎｓと記載される。実施例４に従って発現を行う。
【００２３】
実施例２：ヒルジン（Ｒｅｆｌｕｄａｎ）−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−インスリンＢ鎖−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−インスリンＡ鎖をコードする酵母発現プラスミドの構築
特許出願ＥＰ−Ａ０１９５６９１は、ジペプチドＸＹを含み得るプロインスリン誘導体を説明しており、ここでＸおよびＹは、それぞれ、インスリンのＢ鎖とＡ鎖との間のリンカーとしてＬｙｓまたはＡｒｇのいずれかに相当する。以下の実施例は、この種のプロインスリン誘導体のための発現ベクターの調製を説明する。一例として、Ｂ鎖−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ鎖の形態のプロインスリン誘導体をコードするＤＮＡ配列が選択され、それに応じて合成される。
遺伝子セグメントの合成は、実施例１に従って実行される。用いられたオリゴヌクレオチド配列は、ｈｉｒｆ１およびｉｎｓｎｃｏｉｒｅｖである。オリゴヌクレオチドＢ＿ＫＲ＿Ａｆ１およびＢ＿ＫＲ＿Ａｒｅｖ１がデノボ合成される。
【００２４】
Ｂ＿ＫＲ＿Ａｆ１は、以下の配列：配列番号７を有し、
【化５】
2004518442.tif 000006
Ｂ＿ＫＲ＿Ａｒｅｖ１は、以下の配列：配列番号８を有する。
【化６】
2004518442.tif 000007
【００２５】
示された２種のプライマーで太字で示された部分は、部分的にオーバーラップする配列を示す。双方のプライマーは、６個の下線で示したヌクレオチド以外にも、ＥＰ−Ａ０３４７７８１のミニ−プロインスリン遺伝子に関する配列と正確に対をなす。下線で示した部分は、ＬｙｓおよびＡｒｇのコドンに相当する。実施例１に従って構築されたプラスミドｐＡＤＨ２Ｈｉｒ＿ＫＲ＿ＩｎｓのＤＮＡは、ＰＣＲでテンプレートとして提供される。
【００２６】
実施例１で説明したように、プライマー対ｈｉｒｆ１／Ｂ＿ＫＲ＿Ａｒｅｖおよびｉｎｓｎｃｏｉｒｅｖ／Ｂ＿ＫＲ＿Ａｆ１を用いて２つのポリメラーゼ連鎖反応を実行する。それぞれの場合において、テンプレートは、実施例１で構築されたプラスミドｐＡＤＨ２Ｈｉｒ＿ＫＲ＿ＩｎｓのＤＮＡである。双方の反応産物は、プライマー対ｈｉｒｆ１およびｉｎｓｎｃｏ１を用いた第三のＰＣＲでテンプレートとして提供される。ＰＣＲ３の反応産物をＮｃｏＩ／ＳａｌＩで切断し、開いたｐαＡＤＨ２ベクターに挿入する。配列分析および制限分析の後、正しいプラスミドをｐＡＤＨＨｉｒＫＲ＿Ｂ＿ＫＲ＿Ａと称する。
【００２７】
実施例３：ヒルジン−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−サルプロインスリンをコードする酵母プラスミドの構築
特許出願ＥＰ−Ａ４８９７８０はプラスミドｐｌＮＴ９０ｄを説明しており、当該プラスミドは、サルプロインスリンのｃＤＮＡを含む（Ｗｅｔｅｋａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ １９， ｐ．１７９−１８３， １９８２）。前記プラスミドのＤＮＡおよびプラスミドｐＫ１５２のＤＮＡは、テンプレートとして提供される。実施例１で説明されたプライマーｈｉｒｆ１が用いられ、３種のさらなるプライマーが合成される。
【００２８】
プライマーｉｎｓｎｃｏｒｅｖは、ｐｌＮＴ９０ｄにクローニングされたインスリン遺伝子の３′領域に逆に結合し、以下の配列を有する。
【化７】
2004518442.tif 000008
下線で示された配列は、制限酵素ＮｃｏＩの認識部位を示す。
プライマーｈｉｒ＿ｉｎｓｆｋｒは、以下の配列を有する。
【化８】
2004518442.tif 000009
（配列番号１０）
ここで、太字のヌクレオチドは、ヒルジンとプロインスリンとの間のＬｙｓ−Ａｒｇリンカーを示す。
プライマーｈｉｒ＿ｉｎｓｒｅｖｋｒは、プライマーｈｉｒ＿ｉｎｓｋｒと完全に相補的であり、以下の配列を有する。
【化９】
2004518442.tif 000010
（配列番号：１１）
【００２９】
実施例１に対応して、２つのポリメラーゼ連鎖反応が行われる。プライマー対ｈｉｒｆ１／ｈｉｒ＿ｉｎｓｒｅｖｋｒは、プラスミドｐＫ１５２のＤＮＡと反応し、プライマー対ｈｉｒ＿ｉｎｓｆｋｒ／ｉｎｓｎｃｏｒｅｖはプラスミドｐｌＮＴ９１ｄのＤＮＡと反応する。実施例１で説明したように、双方の反応産物は、プライマー対ｈｉｒｆ１／ｉｎｓｎｃｏｒｅｖを用いる第三のＰＣＲでテンプレートとして提供される。この反応のＤＮＡ産物は、ヒルジン＿Ｌｙｓ−Ａｒｇ＿プロインスリンに関する配列を含む。その後、該産物を酵素ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩを用いて切断し、実施例１に従って、プラスミドｐαＡＤＨ２に挿入する。従って、任意の天然プロインスリン誘導体のための発現ベクターを構築することができる。
【００３０】
実施例４：組換え産物の発現
発現は２つのフェーズに分かれる。第一に、前培養を酵母最小培地で培養する。培地は、１リットル当たり以下の組成物である：
６．７ｇ−酵母窒素ベース（アミノ酸を含まない）
５．０ｇ−カザミノ酸（ビタミンを含まない）
０．００８％−アデニン
０．００８％−ウラシル
２％−グルコース。
メイン培養または発現培養に前培養のアリコートを接種させる。
メイン培地は、１リットル当たり以下を含む。
１０ｇ−酵母エキストラクト
２０ｇ−ペプトン
０．００８％−アデニン
０．００８％−ウラシル
４％−グルコース。
【００３１】
説明された培地を用いて、以下の方法により振盪フラスコで発現を行う：一晩培養した０．３ｍｌの前培養を８０ｍｌの予め温めた培地で希釈し、３０℃で約２４時間激しく振盪しながらインキュベートする。それぞれの場合において、次に、この方法で作製された培養物１ｍｌを、光学密度を測定した後、遠心分離し、細胞を除去した後、上清を凍結乾燥し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。生物学的に活性なヒルジンの含有量は、トロンビン阻害分析を行うことにより測定される。
【００３２】
ろ過または慎重な遠心分離により除去される細胞に対して、代替の培養方法が提供される。所定のタンパク質を培地から単離する際に、新しい予め温めたメイン培地（炭素源としてアルコールおよび０．５％以下のグルコースを含む）を細胞に供給し、それにより培養を中断することなく継続させる。この工程は５回まで繰り返すことができる。
【００３３】
実施例５：トロンビン阻害試験
ヒルジン濃度は、Ｇｒｉｅｓｓｂａｃｈ等（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３７， ｐｐ． ３４７−３５０， １９８５）の方法に従って測定される。この目的のため、校正曲線を確立するためにＲｅｆｌｕｄａｎ標準の特定量が測定に含まれ、その校正曲線からｍｇ／ｌで収率を直接決定することができる。
【００３４】
実施例６：Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ系における、ヒルジン−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ミニ−プロインスリン融合タンパク質のクローニングおよび発現
インビトロジェン（Ｒ）は、宿主系としてＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓを用いた組換えタンパク質を調製するためのクローニングおよび発現キットを販売する。これに関して、所望の組換えタンパク質を製造するためのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ系の調製およびそれに続く発現に関する詳細な技術プロトコールが提供されており、そのため、前記プロトコールに従った場合、所望のタンパク質をコードする発現ベクターの構築のみが説明されなければならない。ＥａｓｙＳｅｌｅｃｔ（Ｒ）Ｐｉｃｈｉａ発現キット（カタログ番号：Ｋ１７４０−０１）が用いられる。
【００３５】
ｐＰｌＣＺαＡベクターがキットの一部である。ベクターを制限酵素ＸｈｏＩおよびＳａｃＩＩで切断することにより、実施例１と同様に所定のタンパク質をαファクターのリーダー配列に付加し、上清への分泌に関して試験することができる。クローニングは、２つのプライマーを必要とする。プライマーｐｉｃｈｉａ＿Ｈ＿ｌｆ１（配列番号１２）は、以下の配列を有する。
【化１０】
2004518442.tif 000011
【００３６】
プライマーｐｉｃｈｉａ＿Ｈ＿ｌｒｅｖ２（配列番号１３）は、以下の配列を有する。
【化１１】
2004518442.tif 000012
【００３７】
用いられたテンプレートは、プラスミドｐＡＤＨ２Ｈｉｒ＿ＫＲ＿ＩｎｓのＤＮＡである。双方のプライマーを用いた標準的なＰＣＲにより、ＸｈｏＩおよびＳａｃＩＩ組み込み部位で伸長された、配列ヒルジン＿Ｌｙｓ−Ａｒｇ＿ミニ−プロインスリンを含むＤＮＡ産物が生産される。ＤＮＡ産物が適切に切断され、その断片が単離された場合、前記断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応において開いたベクターＤＮＡに挿入することができる。製造者の使用説明書からの逸脱において、実施例１で説明されたＥ．ｃｏｌｉのＭＭ２９４株は、ライゲーション混合物で形質転換され、組換えコロニーがゼオシン選択プレートでスクリーニングされる。プラスミドＤＮＡは、クローンから再単離され、続いて制限分析とＤＮＡ配列分析とで特徴付けられる。この方法で構築されたプラスミドを用いて、製造者の使用説明書に従いペプチド製造のためのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現クローンを次に調製する。
【００３８】
実施例７：ミニ−プロインスリンおよびヒルジンの精製
精製は、初期段階で２種のタンパク質の分離が必要である。発現が完了した後、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて培地を分析する。酵母細胞の自発的な溶解または分泌のいずれかのために上清で見出される多くの他のポリペプチドとは異なって、２種のタンパク質、すなわちヒルジンおよびミニ−プロインスリンはｐＨ２．５〜３では沈殿しない。それゆえに、培地は適切に酸性化され、続いて、沈殿が完了した後、沈殿物と細胞とを遠心分離で除去する。遠心分離の後、培地をｐＨ３．５〜７に調節し、２種の成分、すなわちヒルジンおよびミニ−プロインスリンを、疎水性相互作用クロマトグラフィーで、例えばＤｉａｉｏｎ  ＨＰ２０（Ｒ）材料で充填したクロマトグラフィーカラムを用いて互いに分離する。続いて、ヒルジンを、ＥＰ−Ａ０５４９９１５に従ってヒルジン含有分画から単離することができ、インスリンを、ＥＰ−Ａ０３４７７８１に従ってミニ−プロインスリン含有分画から単離することができる。
【００３９】
実施例８：ミニ−プロインスリンからのインスリン調製
発現期間の最後に、培養培地をｐＨ６．８に調節し、続いて、最終濃度が４〜８ｍｇ／ｌになるようにトリプシンを撹拌しながら加える。約４時間インキュベートした後、この方法で処理された培養ブロスをｐＨ２．５〜３に調節する。１〜６時間沈殿させた後、沈殿物を除去する。続いて、形成されたモノ−Ａｒｇ−インスリンをイオン交換クロマトグラフィーで、一例としてＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｒ）で、５０ｍＭ乳酸および３０％イソプロパノール（ｐＨ３．５）の緩衝液中で単離する。ＮａＣｌ勾配により０．０５〜０．５Ｍの塩で、溶出を行う。産物含有分画をＨ２Ｏで１：１に希釈し、続いて、０．１％強度のＺｎＣｌ２溶液が形成されるようにＺｎＣｌ２を加える。モノ−Ａｒｇ−インスリンをｐＨ６．８で沈殿させ、一例として、ＥＰ−Ａ０３２４７１２に従ってインスリンに変換する。
【００４０】
実施例９：ろ過後のミニ−プロインスリンからのインスリンの調製
発現期間の最後に、細胞および上清成分を、ｐＨ２．５〜３で沈殿させることにより除去する。続いて、１０ｋＤａの除去限界を有するメンブレンを通過させるろ過により、培地を濃縮する。ヒルジン誘導体と同様に、残留物中に定量的にミニ−プロインスリンが見出され、続いて、実施例８に従ってインスリンに加工することができる。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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