(57)【要約】本発明は、生体外の細胞培養の使用に基づく、ジノフィシス毒素及びイエソー毒素の群に属する毒素の検知、識別及び測定の方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
毒素を含む試料を使って処理された生体外の細胞システムでのＥ−カドヘリンタンパク質及び関連抗原、ＥＣＲＡ１００とＥＣＲＡ１３５の量の評価に基づいた、該試料中のジノフィシス毒素及びイエソー毒素の群に属する毒素の質的及び量的決定の方法。
【請求項２】
前記質的決定が、汚染が測定されなければならない試料を使って処理された細胞システムにおけるＥ−カドヘリンタンパク質及び関連抗原、ＥＣＲＡ１００とＥＣＲＡ１３５の細胞の含有量の観測からなる請求項１による方法。
【請求項３】
前記量的決定が、対照標準で処理された細胞システムに関して、汚染が測定されなければならない試料を使って処理された細胞システムにおけるＥ−カドヘリンタンパク質及び関連抗原、ＥＣＲＡ１００とＥＣＲＡ１３５の細胞の含有量の変化観測を含む請求項１による方法。
【請求項４】
前記評価が、抗Ｅ−カドヘリン抗体を使って生体外の細胞システムから作製された細胞抽出物中で行われたＥ−カドヘリン及びＥ−カドヘリン関連抗体の免疫学の識別後に行なわれる請求項１による方法。
【請求項５】
前記免疫学の識別が、免疫沈殿、固体相免疫ブロット法（ウェスタンブロット法）、エンザイムリンクド免疫吸着剤測定法からなる群から選ばれる技術によって行なわれる請求項４による方法。
【請求項６】
前記技術が固体相免疫ブロット法（ウェスタンブロット法）である請求項５による方法。
【請求項７】
前記毒素が、イエソー毒素とそれらの派生体と構造上関連する類似体の群及びオカダ酸とその派生体と構造上関連する類似体の群に属する請求項１による方法。
【請求項８】
前記イエソー毒素が、イエソー毒素、ホモイエソー毒素、４５−水酸化イエソー毒素、４４−カルボキシイエソー毒素からなる群から選ばれる請求項７による方法。
【請求項９】
前記オカダ酸の構造上関連する類似体が、ジノフィシス毒素１、ジノフィシス毒素２、ジノフィシス毒素３からなる群から選ばれる請求項７による方法。
【請求項１０】
更に次のステップを含む請求項１−９による方法：
ａ）汚染を評価しなければならない試料の作製、
ｂ）生体外の細胞システムでの試料の培養、
ｃ）細胞システムの可溶性細胞質抽出物の作製及びタンパク質成分の分子容量に基づく抽出物の分留、
ｄ）抗Ｅ−カドヘリン抗体によるＥ−カドヘリン及び関連抗原、ＥＣＲＡ１００とＥＣＲＡ１３５の識別。
【請求項１１】
前記試料が未精製の軟体動物抽出物である請求項１０による方法。
【請求項１２】
前記未精製抽出物が有機溶媒を使った抽出及び分離によって作製された請求項１１による方法。
【請求項１３】
方法のステップｂ）の前記細胞システムが、ヒトＥ−カドヘリン抗原を表す細胞系統中から選ばれる請求項１０による方法。
【請求項１４】
前記Ｅ−カドヘリンを表す細胞系統がＭＣＦ−７、Ａ５４９、ＢｘＰｃ３である請求項１３による方法。
【請求項１５】
細胞系統がＭＣＦ−７で表わされ、かつ方法のステップｂ）の培養の時間が１２〜２４時間の間に含まれる請求項１３による方法。
【請求項１６】
方法のステップｄ）の前記識別が、抗Ｅ−カドヘリン抗体を使った免疫ブロット法により行なわれた請求項１０による方法。
【請求項１７】
前記抗体が単クローンである求項１６による方法。
【請求項１８】
方法のステップｃ）の前記分留が、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法より行なわれた請求項１０による方法。
【請求項１９】
前記ゲルが更に還元している請求項１８による方法。
【請求項２０】
方法のステップｄ）の前記識別に続き、ステップｅ）抗原、Ｅ−カドヘリン、ＥＣＲＡ１００及びＥＣＲＡ１３５から得られた免疫反応性のレベルの評価がある請求項９−１９による方法。
【請求項２１】
前記評価が視覚検査によって行われる請求項２０による方法。
【請求項２２】
前記評価が、濃度計分析の使用と総免疫反応性及び試料の相対的な総免疫反応性（Σ）の値の計算によって行われる請求項２０による方法。
【請求項２３】
前記試料が海産物である請求項１−２２による生体外の細胞システムで、Ｅ−カドヘリンタンパク質及び関連抗原、ＥＣＲＡ１００とＥＣＲＡ１３５の量の評価に基づいて、ジノフィシス毒素とイエソー毒素の群に属する毒素の質的・量的決定の方法。
【請求項２４】
前記海産物が人間及び動物消費のための食料である請求項２３による方法。
【請求項２５】
前記産物が軟体動物である請求項２４による方法。
【請求項２６】
前記軟体動物がイガイとホタテガイである請求項２５による方法。
【請求項２７】
１００ｋＤａの分子質量で、Ｅ−カドヘリンと免疫学的に関係する抗原ＥＣＲＡ１００。
【請求項２８】
存在を検知し、毒素の属する群を識別し及び試料中の毒素レベルを測定する抗原Ｅ−カドヘリン、ＥＣＲＡ１００及びＥＣＲＡ１３５の使用。
【請求項２９】
前記毒素は、ジノフィシス毒素及びイエソー毒素の群に属する請求項２８による抗原使用。
【請求項３０】
前記毒素が、イエソー毒素、ホモイエソー毒素、４５−水酸化イエソー毒素、４４−カルボキシイエソー毒素、ジノフィシス毒素１、ジノフィシス毒素２、ジノフィシス毒素３、オカダ酸またそれらの派生体及び構造上関連する類似体のもの中から選ばれる請求項２９による抗原使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明の技術分野は、毒素の検知及び生体外での培養細胞システムによるそれらの測定に関する。
【０００２】
（背景技術）
毒性物質を作り出す藻類によって汚染された甲殻類又は魚の食物摂取によって引き起こされた人間の中毒は、昨年恐ろしい進化を示した現象で、事実上中毒期間がより頻繁に及びそれらが過去に報告されていなかったこの惑星の地域で生じた。
【０００３】
中毒のいくつかのタイプは、動物に引き起こされた症候学上に基づいて、また可能な場合は常に、誘因物質の化学特性及びそれらの作用メカニズムが、これまで記述されてきた。これらのうちの１つは、汚染された軟体動物（主としてイガイ及びホタテガイ）の食物摂取による甲殻類中毒下痢（ＤＳＰ）である（ヤスモト　Ｔ、オシマ　Ｙ、ヤマグチ　Ｍ、１９７８年、Ｂｕｌｌ．Ｊｐｎ．Ｓｏｃ．Ｓｃｉ．Ｆｉｓｈ、４４：１２４９）。
【０００４】
人間のＤＳＰ中毒による致死量は記述されていないが、人間のＤＳＰ中毒は公衆衛生に重大問題を引き起こすことができるので、本規則（欧州連合、指令ＣＥ／９１／４９２／ＣＥＥ）に従って管理された、軟体動物の毒性の連続的な監視によって実行された正確な予防によって、一旦それが制定されることは軟体動物収穫及び販売の禁止を暗示し、軟体動物が毒素混合物の有効水準を示すまで、それは継続される。
【０００５】
現在、ＤＳＰ毒素中に分類された物質の測定は、化学的方法（末端が質量分析に繋がったＨＰＬＣ）（ＱｕｉｌｌｉａｍＭ．Ａ．；Ｊ．ＡＯＡＣ　Ｉｎｔ、１９９５年、７８：５５５）、そして免疫学方法（ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ；それらが例えばＥＰ５０９８１９記述のように）で行なうことができ、それは軟体動物組織から得られた未精製又は半精製の抽出物で行なわれ、免疫学方法の場合には、単にオカダ酸（ＯＡ）及びあるジノフィシス毒素（ＤＴＸ）のために得られた特定抗体の有効性に基づく。
【０００６】
化学的方法は、ＤＳＰ物質中に分類された成分の大部分を正確な測定をもたらすことができるが、汚染された材料の実際の毒性が過小評価されるかもしれないので、二枚貝軟体動物中の毒性プログラムを監視するのに日常的に用いることはない。確かに、その一方で化学上異なる成分の３つの群がＤＳＰ毒素（ジノフィシス毒素、イエソー毒素及びペクテノ毒素）（ヤスモト Ｔ、ムラタ Ｍ、１９９３年、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ、９３：１８９７）として分類されており、実際に人間が汚染された軟体動物の毒性の全成分を見つけることができるのことが、十分に確立されたとは限らなかった。
【０００７】
更に、軟体動物において検知できるＤＳＰとして分類された成分のタイプ及び濃度は、それらの地理的な出所及び収穫時期に依存して変わることができ、その結果、全ての試料は個々の“毒素学プロフィール”を示す。
【０００８】
更に、毒素の３つの群の各々の分析のために使用することができる化学的−物理的方法は、個々に、同じ試料中に存在するかもしれない１以上の群に属する成分の同時期の検知は可能でない。
【０００９】
生化学や細胞方法（機能的分析）もＤＳＰ毒素の検知を行うことができ、毒素がそれらの活動の修正により特定分子の目標への結合が引き起こすことができる測定結果に基づくか、さもないと、毒素に感じて反応する有能な培養細胞が、毒素によって影響を及ぼされた全ての細胞毒性に基づく。現在、生化学分析はリンタンパク質ホスファターゼ活動抑制を含む測定に制限され、ジノフィシス毒素１及びオカダ酸を測定するＷＯ９６／４０９８３に記述されたのように、この後者の混合物と機能的に関係する毒素の場合にのみ適切であり、（Ｔｕｂａｒｏ　Ａら、１９９６年、Ｔｏｘｉｃｏｎ、３４：７４３）、そして、その酵素群の同じメカニズム抑制を表している。今度は培養細胞の使用に基づいた分析で、分析はシステムに供給された毒素の用量と、残存する細胞の数の減少又は出現形態の変化の影響を受けた細胞の一方の間の相関性に制限される（Ｆｌａｄｍａｒｋ　Ｋ．Ｅ．ら、１９９８年、Ｔｏｘｉｃｏｎ；３６：１１０１）。
【００１０】
最後に第３のタイプの検知方法は、ＤＳＰ毒性を検知するのに有能な生物学的検定を含んでいる。これらの分析では、複合システムでの個々の物質ではなく、成分群の全面的な影響は、正確なパラメーターを表わす。
【００１１】
これらの方法は、全ての生きた動物に用いられる全毒素プールの生物学的検定を含んでいる（ヤスモト　Ｔ．ら：“シーフード毒素”章、Ｒａｇｅｌｉｓ　Ｅ．Ｐ，編、ＡＣＳシンポジウム・シリーズ、２６２、１９８４年、ｐｐ．２０７−２１４）。より明確には、有機溶媒を使った軟体動物の抽出によって得られた汚染された材料は、通常腹腔内注射によって（同章）、ネズミ達に投与される、さもなければ、それはＤ．ｍａｇｎａ（Ｖｅｒｎｏｕｘ　Ｊ．Ｐら、１９９３年、Ｆｏｏｄ Ａｄｄｉｔ．Ｃｏｎｔａｍ、１０：６０３）のように、小さな甲殻類動物を培養器に加え、そして動物達の死は定時時間内モニターされる。
【００１２】
上述されたマウス生物学的検定は、ＤＴＸ及び／又はＹＴＸにより汚染された軟体動物の総ＤＳＰ毒性を検知するために、ＥＵのほとんどの国々及び日本で使用された検知方法である。確かに、これら毒素のために国際的ＬＤ５０セットはマウス生物学的検定を参照する（ヤスモト　Ｔら：“有害な藻類”章、Ｂ Ｒｅｇｕｅｒａ、Ｊ．Ｂｌａｎｃｏ、ＭＡ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ Ｔ．Ｗｙａｔｔ、医師編、Ｘｕｎｔａ ｄｅ ガリシア及びユネスコ政府間海洋学委員会、１９９８年、ｐｐ４６１−４６４）。しかしながら、この検定は、ヨーロッパの国々の中で高まっている適正な倫理的問題を引き起こす懸念を示し、一つの軟体動物試料の分析が少なくとも５匹の動物の犠牲を意味するともしある人が思う場合、そのインパクトはなお一層明白である。更に、この生物学的検定の結果は、おそらくネズミ達に注射された材料中の脂肪酸が高レベルであることにより、無病誤診を含んでいるかもしれない（Ｑｕｉｌｌｉａｍ Ｍ．Ａ．、Ｗｒｉｇｈｔ Ｊ．Ｌ．Ｃ．；“有害な海の微藻類マニュアル”章、Ｈａｌｌｇｒａｅｆｆ Ｇ．Ｍ．、Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｄ．Ｍ．、Ｃｅｍｂｅｌｌａ Ａ．Ｄ、医師編、ＩＯＣマニュアル及びガイド、Ｎｏ．３３、ユネスコ、１９９５年、ｐｐ９５−１１１）。
【００１３】
（発明の要約）
本発明は、生体外細胞システムでのＥ−カドヘリンと呼ばれるタンパク質及びこのタンパク質の関連抗原、ＥＣＲＡ１００とＥＣＲＡ１３５の量の測定に基づくジノフィシス毒素及びイエソー毒素の質的・量的検知の方法に関する。発明によれば、本方法は、ホモイエソー毒素、４５−水酸化イエソー毒素、４４−カルボキシイエソー毒素のようなイエソー毒素群に属し及びその派生体、構造上関連する類似体を含み、及びオカダ酸またその派生体、又はジノフィシス毒素１、ジノフィシス毒素２及びジノフィシス毒素３のような構造上関連する類似体の定性分析及び毒素測定が可能である。方法は次のステップを含む：ａ）試料調製；ｂ）生体外細胞システムでの試料培養；ｃ）試料処理された細胞からの可溶性細胞質抽出物の作製及びタンパク質の分子質量に基づくそれらが含んでいるタンパク質の分留；ｄ）抗Ｅ−カドヘリン抗体によるＥ−カドヘリン抗原及びその関連抗原ＥＣＲＡ１００とＥＣＲＡ１３５の検知。更に本発明は、シーフードの汚染を評価する目的と共に、上述の毒素を測定するための方法の使用に関係ある。
【００１４】
より具体的には、発明はＥ−カドヘリンの関連抗原ＥＣＲＡ１００に関し、またＥ−カドヘリンの関連抗原ＥＣＲＡ１００とＥＣＲＡ１３５を用いた試料中の毒素レベルの存在検知と測定である。
【００１５】
（図面の詳細な説明）
（図１）ＭＣＦ−７細胞中でのＥ−カドヘリン及び関連抗原のオカダ酸及びイエソー毒素の影響。
【００１６】
ＭＣＦ−７細胞は、５０ｎＭのオカダ酸、５０ｎＭのイエソー毒素、両物質の最終濃度が５０ｎＭ又は媒体（対照標準）を使って３７℃で１８時間処理された。
【００１７】
処理の終わりに、細胞は可溶性細胞質抽出物を作製するために使用され、また各抽出物からタンパク質５０μｇに相当する試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分留によって得られ及び抗Ｅ−カドヘリン抗体を用いた免疫ブロット法を受けた。図の上方に、その処理を詳述して、また分子量マーカーとして使用されるβ−ガラクトシダーゼ（１１８ｋＤａ）及び果糖、６−Ｐのキナーゼ（９０ｋＤａ）サブユニットの電気泳動可動性は左側に示した。
【００１８】
対照標準に比べ、ＯＡ、ＹＴＸ又は両方を使った細胞処理後には顕著な典型的なパターンが観測することができる：確かに、ＥＣＲＡ１３５の出現はＯＡ単独を使った処理に相当するレーン中に観測することができ、また更に、２重処理（オカダ酸＋イエソー毒素）の後にも検知でき、ＥＣＲＡ１００に相当する免疫反応性の顕著な増加が、イエソー毒素単独を使った処理に相当するレーンにおいて顕著で、また更に２重処理後にも維持される。
【００１９】
（図２）ＭＣＦ−７細胞中でのＥ−カドヘリン及び関連抗原のオカダ酸濃度レベルを増加させたときの影響。
【００２０】
ＭＣＦ−７細胞は、図示されたオカダ酸濃度を使って３７℃で２０時間処理された。処理の終わりに可溶性細胞質抽出物が得られ、また“材料及び方法”節に記述されたように、Ｅ−カドヘリン（黒丸）、ＥＣＲＡ１３５（正方形）及びＥＣＲＡ１００（三角形）のそれらの含有量を検知するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロット法によって分留を受けた。
【００２１】
値は、各試料（黒シンボル）での総免疫反応性（Ｅ−カドヘリン＋ＥＣＲＡ１３５＋ＥＣＲＡ１００）あるいは対照標準細胞（あるいは媒体のみを与えられた細胞から得られた抽出物）（白丸）で測定されたのと比較した、その試料の総免疫反応性のパーセンテージとして表される、相対的な総免疫反応性（Σ）のパーセンテージとして表された。データは、３−７の別個の実験の±Ｓ．Ｄ．平均を表す。
【００２２】
（図３）ＭＣＦ−７細胞中でのＥ−カドヘリン及び関連抗原のイエソー毒素濃度レベルを増加させたときの影響。
【００２３】
ＭＣＦ−７細胞は、図示されたイエソー毒素濃度を使って３７℃で２０時間処理された。処理の終わりに可溶性細胞質抽出物が得られ、また“材料及び方法”内に記述されたように、Ｅ−カドヘリン（黒丸）及びＥＣＲＡ１００（三角形）のそれらの含有量を検知するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロット法によって分留を受けた。
【００２４】
値は、各試料（黒シンボル）での総免疫反応性（Ｅ−カドヘリン＋ＥＣＲＡ１３５＋ＥＣＲＡ１００）あるいは対照標準細胞（あるいは媒体のみを与えられた細胞から得られた抽出物）（白丸）で測定されたのと比較したその試料の総免疫反応性のパーセンテージとして表される、相対的な総免疫反応性（Σ）のパーセンテージとして表された。データは、３−７の別個の実験の±Ｓ．Ｄ．平均を表す。
【００２５】
（図４）ＭＣＦ−７細胞中でのＥ−カドヘリン及び関連抗原のオカダ酸濃度レベルを増加させることによるイエソー毒素の変化が引き起こす影響。
【００２６】
ＭＣＦ−７細胞は、図示されたオカダ酸濃度及び１０ｎＭのイエソー毒素が存在（実線）あるいは欠如（点線）のどちらか一方を使って３７℃で２０時間処理された。
【００２７】
処理の終わりに、可溶性細胞質抽出物が得られ、また“材料及び方法”内に記述されたように、Ｅ−カドヘリン（パネルＡ）、ＥＣＲＡ１３５（パネルＢ）及びＥＣＲＡ１００（パネルＣ）のそれらの含有量及び試料（パネルＤ）の相対的な総免疫反応性（Σ）を検知するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロット法によって分留を受けた。
【００２８】
値は、各試料（パネルＡ−Ｃ）での総免疫反応性（Ｅ−カドヘリン＋ＥＣＲＡ１３５＋ＥＣＲＡ１００）あるいは対照標準細胞（あるいは媒体のみを与えられた細胞から得られた抽出物）で測定されたのと比較したその試料の総免疫反応性のパーセンテージとして表される、相対的な総免疫反応性（Σ、パネルＤ）のパーセンテージとして表された。データは、３つの別個の実験の±Ｓ．Ｄ．平均を表す。
【００２９】
（図５）ＭＣＦ−７細胞中でのＥ−カドヘリン及び関連抗原のイエソー毒素濃度レベルを増加させることによるオカダ酸の変化が引き起こす影響。
【００３０】
ＭＣＦ−７細胞は、図示されたイエソー毒素濃度及び５０ｎＭのオカダ酸が存在（実線）あるいは欠如（点線）のどちらか一方を使って３７℃で２０時間処理された。
【００３１】
処理の終わりに、可溶性細胞質抽出物が得られ、また“材料及び方法”内に記述されたように、Ｅ−カドヘリン（パネルＡ）、ＥＣＲＡ１３５（パネルＢ）及びＥＣＲＡ１００（パネルＣ）のそれらの含有量及び試料（パネルＤ）の相対的な総免疫反応性（Σ）を検知するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロット法によって分留を受けた。
【００３２】
値は、各試料（パネルＡ−Ｃ）での総免疫反応性（Ｅ−カドヘリン＋ＥＣＲＡ１３５＋ＥＣＲＡ１００）あるいは対照標準細胞（あるいは媒体のみを与えられた細胞から得られた抽出物）で測定されたのと比較したその試料の総免疫反応性のパーセンテージとして表される、相対的な総免疫反応性（Σ、パネルＤ）のパーセンテージとして表された。データは、３つの別個の実験の±Ｓ．Ｄ．平均を表す。
【００３３】
（図６）ＡＯとＹＴＸを増したイガイ肝膵臓から作製された未精製抽出物のＥ−カドヘリン及び関連抗原の影響。
【００３４】
ＭＣＦ−７細胞は、図に記述されるように作製され、図示された抽出物又は媒体単独（対照標準）を使って３７℃で１８時間処理された。
【００３５】
処理の終わりに、細胞は可溶性細胞質抽出物を作製するために使用され、また各抽出物からタンパク質５０μｇに相当する試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分留によって得られ及び抗Ｅ−カドヘリン抗体を用いた免疫ブロット法を受けた。
【００３６】
対照標準に比べ、ＯＡ、ＹＴＸ又は両方を加えた未精製のイガイ抽出物を使って処理された細胞及び毒素が除かれたイガイ抽出物を使って処理された細胞場合、図１中で示される典型的なパターンも得られることが観測できるかもしれない：ＥＣＲＡ１３５の出現はＯＡ単独を使った処理に相当するレーン中に観測することができ、また更にこの抗原は２重処理（ＯＡ＋ＹＴＸ）後にも検知でき；今度はＥＣＲＡ１００抗原の増加したレベルは、ＹＴＸ単独を使った処理に相当するレーンにおいて検知できて、また更に２重処理（ＯＡ＋ＹＴＸ）後にも維持される。
【００３７】
（発明の詳細な説明）
本発明の方法は、存在を検知し、群を識別し、細胞性のシステムでＥ−カドヘリン抗原及びＥ−カドヘリン関連抗原（ＥＣＲＡ１００とＥＣＲＡ１３５）の細胞内レベルの測定に基づいて、ジノフィシス毒素及びイエソー毒素の群に属する毒素量を評価する方法に関する。
【００３８】
適切な細胞性のシステムで、ジノフィシス毒素（ヤスモト　Ｔら、１９９３年、Ｃｈｅｍ　Ｒｅｖ：９３、１８９７）及びイエソー毒素（ヤスモト　Ｔら、同箇所；サタケら、１９７７年、ナット毒素、５：１０７；Ｃｉｍｉｎｉｅｌｌｏら、２０００年、Ｅｕｒ　Ｊ　Ｏｒｇ　Ｃｈｅｍ、２９１）の部類に属する毒素の存在が、Ｅ−カドヘリン及びその関連抗原ＥＣＲＡ１００とＥＣＲＡ１３５の細胞性のレベルで測定可能な変化に関係していることは驚くほど知られた。
【００３９】
Ｅ−カドヘリンは細胞接着分子で、更にウボモルリンあるいはＬ−ＣＡＭ、又は他に、人間の配列はデータベース（スイスＰｒｏｔ）内の録番号Ｚ１８９２３に預けられたＣｅｌｌ ＣＡＭ１２０／８０と名付けられる。本発明の範囲内で、Ｅ−カドヘリンは、更に分子質量が約１２６ｋＤａ（１２６．１±４．１ｋＤａ）を示すタンパク質に関係し、変性する及び還元する条件下（β−メルカプトエタノール存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ）でのポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって決定され、また抗Ｅ−カドヘリン抗体によって識別された文献データ（Ｄａｍｓｋｙ　Ｃ．Ｈ．ら、１９８３年、Ｃｅｌｌ、３４：４５５）と一致する。更に、定義されたＥ−カドヘリン関連抗原のＥＣＲＡ１００とＥＣＲＡ１３５の抗原（ＥＣＲＡ：Ｅ−カドヘリン関連抗原）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって行なわれた一連の測定によって決定されるように、それぞれ１００ｋＤａ（１０１．９±３．２ｋＤａ）及び１３５ｋＤａ（１３６．３±３．３）の分子質量を示す。更に、これらの抗原は特定の抗Ｅ−カドヘリン抗体によって識別できる。
【００４０】
本発明の範囲内で、もしそれらがＥ−カドヘリン、好ましくはヒトタンパク質のもので表せられ、細胞のシステム（あるいは細胞システム）は細胞系統に属し、当技術の既知の方法による培養中で維持されて、連続継代細胞系又は初代培養のいずれか一方に由来する。好ましくはこれらの細胞系統は哺乳類起源であり、更に好ましくはＣａｃｏ−２、Ａ５４９、ＢｘＰｃ３、ＭＣＦ−７のように、これらはヒト細胞である。最も好ましい具体化のうちの１つは、当技術に熟練したものが概知の下記方法によって培養した、細胞のシステムはＭＣＦ−７細胞系統（ＥＣＡＣＣ　Ｎｏ：８６０１２８０３）によって構成される。更に、人間以外の細胞系統又はＥ−カドヘリン、好ましくはヒトＥ−カドヘリンのＤＮＡ配列の決定コードを並べ替えた、当然、Ｅ−カドヘリン抗原で表されない、定義内の適切な細胞システムで構成される。
【００４１】
本発明の方法によって検知可能かつ測定可能な毒素は、ジノフィシス毒素群に属し、好ましくはジノフィシス毒素１（ＤＴＸ１）、ジノフィシス毒素２（ＤＴＸ２）、ジノフィシス毒素３（ＤＴＸ３）とオカダ酸及びオカダ酸と構造上関係する毒素を含んたそれらの派生体だけでなく、イエソー毒素（ＹＴＸ）、４４−カルボキシイエソー毒素、ホモイエソー毒素、４５−水酸化イエソー毒素（ヤスモト　Ｔら、１９９３年、Ｃｈｅｍ　Ｒｅｖ：９３、１８９７；サタケら、１９７７年、ナット毒素、５：１０７；Ｃｉｍｉｎｉｅｌｌｏら、２０００年、Ｅｕｒ　Ｊ　Ｏｒｇ　Ｃｈｅｍ、２９１の同箇所）、イエソー毒素と構造上関係する毒素を含んだようなイエソー毒素群に属するものもである。
【００４２】
本発明によって、２つの群に属する毒素の様々な濃度及び組み合わせで処理された培養からの細胞抽出物で観測されたＥ−カドヘリン及び免疫学的に関連抗原中の分子の「パターン」は、下記の表中で要約され、それは、Ｅ−カドヘリン及び免疫学的に関連抗原の相対的なレベルを報告する。
【００４３】
【表１】
2004502937.tif 000002
【００４４】
この表中で、免疫反応性抗原のレベル（＊）は、試料の総免疫反応性（Ｅ−カドヘリン＋ＥＣＲＡ１００＋ＥＣＲＡ１３５）と比較したパーセンテージとして表された。更に、相対的な総免疫反応性（Σ）のレベル（◆）は、対照標準での総免疫反応性と比較した試料の総免疫反応性のパーセンテージとして表される。値は個々に示された毒素濃度の合計から得られた：（Ｃ）［ＹＴＸ］＜０．２ｎＭＥ／［ＤＴＸ］＜２５ｎＭＥ；（１）［ＹＴＸ］≧０．５ｎＭＥ／［ＤＴＸ］＜２５ｎＭＥ；（２）［ＤＴＸ］≧４０ｎＭＥ／［ＹＴＸ］＜０．２ｎＭＥ；（３）［ＹＴＸ］０．２−０．５ｎＭＥ／［ＤＴＸ］２５−４０ｎＭＥ；（４）［ＤＴＸ］≧４０ｎＭＥ／［ＹＴＸ］≧０．５ｎＭＥ。
【００４５】
従って、細胞のシステムでの２５ｎＭＥ（オカダ酸濃度と等価な濃度を表す）以上の濃度のジノフィシス毒素及びそれらの派生体あるいは構造上関連する毒素の存在は、典型的なＥ−カドヘリン及び関連抗原パターンに関係し：ａ）Ｅ−カドヘリン免疫反応性の減少；ｂ）Ｅ−カドヘリン関連抗原、ＥＣＲＡ１３５の出現；ｃ）相対的な総免疫反応性（Σ）の減少、を含んでいる。０．２ｎＭＥ（イエソー毒素と等価な濃度を表す）以上の濃度のイエソー毒素又はその派生体又は構造上関連する毒素の存在は：ｄ）Ｅ−カドヘリン免疫反応性の減少；ｅ）Ｅ−カドヘリン関連抗原、ＥＣＲＡ１００の増加；ｆ）例えば免疫ブロット法によって測定されるようなＥＣＲＡ１３５レベルが検出できない；ｇ）相対的な総免疫反応性（Σ）の増加、を導く。
【００４６】
従って、その具体化のうちの１つは、発明は質的にジノフィシス毒素及びイエソー毒素の存在を、どちらか別々又は組み合わせで、細胞のシステム中又は試料中での識別するのに適した方法を生み出し、出現又はＥＣＲＡ１３５とＥＣＲＡ１００抗原及びＥ−カドヘリンレベルの増加の分析によって、その汚染は決定される。むしろ、この評価は、毒素を使って処理されなかった細胞又は別に試料として作製されて、媒体単独を使って処理されたで表される、対照標準に関して実行される。
【００４７】
従って、要約は本発明の範囲内の、Ｅ−カドヘリン及びその免疫学的に関連する抗原のレベルを検知する、及び／又は各抗原を視覚化する又は表１に記述されるような１つあるいは別の典型的なパターンを識別するのに有用な任意の方法を含む。
【００４８】
表１中で要約され及び図１中で示された毒素の各群のパターン特性の観測は、３５ｎＭオカダ酸及び０．４ｎＭイエソー毒素以上の濃度で、毒素の２つの群が細胞培養の中に同時に存在する場合、更に維持される。従って、本発明は、更に細胞のシステム中又は試料中の毒素の２つの群の各々の存在を共に又は別々のいずれかで検知する及び毒素の属する群を識別する方法に関する。
【００４９】
検知又は評価の好ましい具体化は、Ｅ−カドヘリン及びＥ−カドヘリン関連抗原の免疫学識別後、抗Ｅ−カドヘリン抗体を使った生体外の細胞システムで作製された細胞抽出物で行う。従って、その分析は、好ましくは免疫学の方法によって行なわれ、より好ましくは細胞の抽出物の分留の後に行われる。
【００５０】
Ｅ−カドヘリン及び関連抗原ＥＣＲＡ１３５とＥＣＲＡ１００を免疫学以外で特性を評価する生化学方法のような、分子種Ｅ−カドヘリン、ＥＣＲＡ１３５とＥＣＲＡ１００を識別する他の方法は使用することができ及び本発明の範囲内に含まれる。
【００５１】
Ｅ−カドヘリン、ＥＣＲＡ１００及びＥＣＲＡ１３５のレベルの変化は、利用毒素濃度に比例し、実際、細胞のシステムでのイエソー毒素の存在はＥＣＲＡ１００レベルの増加を導き（処理細胞から作製された抽出物での観測）、毒素で処理されていない対照標準細胞と比較して（これらの条件の下では、ＥＣＲＡ１３５抗原は未検出）、総免疫反応性（Ｅ−カドヘリン＋ＥＣＲＡ１３５及びＥＣＲＡ１００）の６０％に達して、試料中のジノフィシス毒素の存在はＥＣＲＡ１３５の出現に関係しているとしても、毒素で処理されていない対照標準細胞と比較して、そのレベルは総免疫反応性の４０％以内を占めることができ、かつＥＣＲＡ１００は総免疫反応性の１０％未満の存在又は欠損のどちらかである。本発明の範囲内での、“総免疫反応性”なる用語は、例えば電気泳動図の濃度計の分析によって測定された、任意の特定の試料中のＥ−カドヘリン、ＥＣＲＡ１３５及びＥＣＲＡ１００による免疫反応性の総量を示す。今度“相対的な総免疫反応性”（Σ）なる用語は、媒体単独で処理された細胞あるいは処理されていない細胞で表わされるその対照標準と比較して、処理細胞から得られた任意の試料の総免疫反応性のパーセンテージで示される。
【００５２】
従って、本発明は、細胞培養中又は試料中でどちらかを別々又は組み合わせた、ジノフィシス毒素及び／又はイエソー毒素の群に属する毒素を検知する方法にも関し、それは次のものを含む：ａ）試料及びパラレル内の系列希釈を備えた、毒素の２つの群の各々に属する個々の代表的な混合物の濃度増加を備えた細胞のシステムの処理；ｂ）抗原Ｅ−カドヘリン、ＥＣＲＡ１３５、ＥＣＲＡ１００用免疫反応性及び毒素の２つの群の各々用の相対的な総免疫反応性（Σ）の標準カーブを構築する、該標準カーブは、好ましくはジノフィシス毒素類のための照合混合物としてオカダ酸、またイエソー毒素類のための照合混合物としてのイエソー毒素が、ジノフィシス毒素のために０〜８０ｎＭ含有のオカダ酸濃度、またイエソー毒素のために０〜１ｎＭ含有のイエソー毒素濃度、で使用して構築される；ｃ）試料中又は細胞のシステム中で測定された、３つの抗原の各々の免疫反応性の値及びΣ（相対的な総免疫反応性）に相当する毒素濃度の標準カーブを書き入れる。
【００５３】
この好ましい具体化で、Ｅ−カドヘリン、ＥＣＲＡ１３５及びＥＣＲＡ１００は、免疫化学手段によって細胞抽出物内から検出される。それらは細胞抽出物の電気泳動の分留後に視覚化されるのが好ましく、フィルタ上の分留タンパク質が転移し及び抗Ｅ−カドヘリン抗体（免疫ブロット法又はウェスタンブロット技術による）によって抗原が識別される。Ｅ−カドヘリン及び関連抗原の選択的な検知に適した他の免疫学方法も使用されてもよく、また本発明の範囲内に含まれる。本発明によって使用することができる方法の例：放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着剤測定法（ＥＬＩＳＡ）は、Ｅ−カドヘリン及び／又はＥＣＲＡ１３５及び／又は特異性ＥＣＲＡ１００を運ぶ単クローン又は多クローン抗体を使用する。当技術で既知の他の免疫学方法も、Ｅ−カドヘリン及び関連抗原パターンを識別するために使用されてもよい。更に、免疫学のもの以外に、これらのタンパク質の生化学の特性に基づくような、ＥＣＲＡ１３５及びＥＣＲＡ１００の選択的な識別に適したどんな方法も、本発明内に含まれる。本発明の方法によって、食料の汚染の確認を目指したジノフィシス毒素類とイエソー毒素類の毒素レベルの検知及び測定は、人間の消費のために意図されたシーフード、特に二枚貝の軟体動物、好ましくはイガイ及びホタテガイにとても役立ち、また汚染された材料の商業化防止を目的とした監視プログラムの日常的な分析として使用することができる。
【００５４】
従って、本発明による方法の好ましい具体化のうちの１つは、試料は好ましくはアセトンの均質化ステップ及びジエチルエーテル又は酢酸エチル又はジクロロメタンを有する残留物の再抽出を含む、標準方法によって作製されたイガイ抽出物により構成され（イタリアで報告されたＧ．Ｕ．ｎ°２７９、１９９５年１１月２９日、Ｄ．Ｍ．Ｓａｎｉｔａ、１９９５年７月３１日又は指令９１／９４２／ＥＵ）、ここで未精製抽出物、更に好ましくは精製された、より好ましくは有機溶媒を用いた抽出及び分留によって精製されたことを特徴とし、前に詳細に明示されたように、培養容器、系列希釈、細胞のシステムの選択を包含し、またそれらの培養条件下（例えば３７℃、５％ＣＯ２）で１２〜２４時間、好ましくは２０時間の間、細胞を培養した。
【００５５】
その後、培養細胞は、燐酸塩緩衝食塩水のような等張液で数回洗われ、次に、例えばＳＤＳとデオキシコール酸ナトリウムのようなイオン洗剤、オプションでトリトンＸ−１００のような非イオンの洗剤と例えばＰＭＳＦ、アプロチニン等のようなプロチアーゼ抑制剤が結合した存在中で、当技術で既知の方法によって溶解された。溶解方法は、試料中のタンパク質低下を最小限にするために４℃で行なわれた。とにかく、細胞溶解方法におけるバリエーションは、当技術に熟練しているものから容易に入手可能で、洗剤濃度、溶解時間等の変化の導入によって、タンパク質分解に限定条件を付けて使用される。
【００５６】
その後、細胞の溶解物は、好ましくは遠心分離によって部分的に精製され、また、可溶性になった細胞のタンパク質を含んでいる可溶性細胞質抽出物が作製される。その後、可溶性細胞質抽出物はβ−メルカプトエタノール（５％）のようなメルカプト基還元剤で処理また同様に当技術で知られた２％ＳＤＳ存在で１００℃に加熱することによりタンパク質の全変性するためにさらすことができる。可溶性細胞質抽出物の一部分は、約３０−５０μｇのタンパク質の合計に相当する、その後それらの分子質量に基づいて分留される。Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ　Ｕ．Ｋ　１９７０年、Ｎａｔｕｒｅ、２２７：６８０）によれば、分留は、変性状況下（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、好ましくはメルカプト基還元剤存在中で、混合アクリルアミド−ビスアクリルアミド含有濃度７〜１２％、好ましくは１０％ポリアクリルアミドゲルを使用した電気泳動によって起こる。毛細電気泳動（マナベ　Ｔ、電気泳動、１９９９年、２０：３１１６）及びゲル透過クロマトグラフィー（Ｓｉｅｇｅｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ、１９６６年、１１２：３４６）のような、それらの分子質量によるタンパク質分留に適した他の確立している方法も使用してもよい。
【００５７】
その後、分留タンパク質は、ブロット法、電気ブロット法又は毛細ブロット法のような当技術で既知の方法により、固体基質又はフィルタ、例えばＰＶＤＦ又はニトロセルロース薄膜の上に転移される。ウェスタンブロット法によれば、好ましくは電気ブロット法を用い、またその後に固体基質は抗Ｅ−カドヘリン抗体を備えた次の免疫学検知を用いる：この方法によれば、転移タンパク質を運ぶ支援基質は、含有濃度０．５〜３ｍＭ、好ましくは１ｍＭのＣａＣｌ２を含んでいる緩衝液中（例えばＴＢＳ：２０ｍＭ　三塩化水素、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）で主要な抗Ｅ−カドヘリン抗体（単クローンか多クローンそのもの又は単一特異的）で精査される。
【００５８】
抗Ｅ−カドヘリン抗体は、Ｚｙｍｅｄ研究所社によって出荷された抗Ｅ−カドヘリン抗体（クローンＨＥＣＤ−１）のような、単クローンが好ましく、含有濃度１−１０μｇ／ｍｌ、好ましくは２μｇ／ｍｌの緩衝液が好ましく使用される。どんな場合も、ここで記述した抗体濃度及び免疫ブロット法条件は、当技術に熟練しているものにより容易に修正することができ、また使用抗体に応じて変えてもよい。もしそれらが抗Ｅ−カドヘリン抗体の多クローン又は単一特異的又は単クローンのいずれかのかならば、他の主要な抗体を使用することができる。好ましい具体化では、単クローン抗体はＥ−カドヘリン分子のＮ−終末部に位置する特定の抗原決定基である。
【００５９】
その後、主要抗体は適切な特異性を表示する第２の抗体によって検知され、抗マウスＩｇ抗体が、例えば西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、ビオチンなどと結合して一部検知できる。一方、主要抗体は標識分子と直接接合してもよい。その後、Ｅ−カドヘリン、ＥＣＲＡ１３５及びＥＣＲＡ１００に対応するバンドの検知は当技術の既知の方法、例えばアメラサーム−ファラマシア社からのＥＣＬ方法による化学発光信号開発によって得られる。
【００６０】
ウェスタンブロット法の代わりとして、可溶性細胞質抽出物がタンパク質標識、例えば放射性同位体（３５Ｓ又は１２５Ｉのような）を含有している、例えばＲＩＰＡ法（放射免疫投下分析）によって、電気泳動的な分留をする前に抗Ｅ−カドヘリン抗体で精査することができ、また免疫沈殿された成分の分子質量はポリアクリルアミドゲル電気泳動法によってついに決定することができる。
【００６１】
その後、試料中のＥ−カドヘリン及び関連抗原ＥＣＲＡ１３５とＥＣＲＡ１００の相対的なレベルは、例えばコダックＸ−Ｏｍａｔの写真用フィルムの露光によって起こる。好ましくは、電気泳動図は濃度計の走査を受け、また任意のユニットで吸光度値は各試料のピークの面積として測定されて、抗体によって検知されるような抗原量を計り、かつ総免疫反応性及び相対的な総免疫反応性（Σ）の値を決定するために使用される。簡単な定性分析の場合には、自動Ｘ線撮影フィルムの視覚検査が毒素の２つの群に関係する特徴的な分子パターンを直接識別することが可能である。処理細胞からの成分と、毒素で処理されていない又は別の分子質量マーカーを用いた細胞のシステムような対照標準で見つかったものとの直接比較によって、その分析は行なうことができる。
【００６２】
既に利用可能な方法と比較して、この発明による検知方法は次の長所を有する：
・選択性、２つの別個の分子抗原（ＥＣＲＡ１３５とＥＣＲＡ１００）の測定により、それぞれＤＴＸ毒素とＹＴＸ毒素の２つの異なる部類に対する反応を示し、試料中の毒素の２つの部類のうちの１つ又は両方の存在を決定することが可能で、また毒素の属する群を識別する（質的決定）、
・実施の平易性、ただ１回の分析及び１つの抗体により同時に毒素の両方の部類が検知される、
・精度、主観的またほとんど量れない形態構造変質の見積もりではなく、測定可能なパラメーターを正確に定量化する、
・測定の的確さ、測定した分子パラメーターを明確な特徴づけをする（量的決定）。
【００６３】
一層の具体化により、この発明は、抗Ｅ−カドヘリン抗体によって識別され、かつ平均分子質量が１００ｋＤａ（１０１．９＋３．２ｋＤａ）と表示される抗原ＥＣＲＡ１００分子にも関する（Ｌａｅｍｍｌｉ　Ｕ．Ｋ．によるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって行なわれた測定から得られた平均値、１９７０年、Ｎａｔｕｒｅ、２２７：６８０、そして抗原及び既知分子量を有するこれら分子マーカーが、パラレルレーンを走り、特にβ−ガラクトシダーゼ（１１８ｋＤａ）及び果糖、６−Ｐキナーゼ（９０ｋＤａ）サブユニット、である相対的な電気泳動可動性を補間する）。更に本発明は、Ｅ−カドヘリン、ＥＣＲＡ１３５及びＥＣＲＡ１００抗原を用いて、存在を検知する、毒素に付属の構造的に関連した類似性の官能基を識別する、また毒素レベルを測定する、好ましくは存在を検知する、またイエソー毒素類（ＹＴＸ）及びジノフィシス毒素類（ＤＴＸ）の毒素レベルを測定するに関する。更に好ましいそのような毒素は：イエソー毒素、ホモイエソー毒素、４５−水酸化イエソー毒素、４４−カルボキシイエソー毒素、ジノフィシス毒素１、ジノフィシス毒素２、ジノフィシス毒素３、オカダ酸、またそれらの派生体及び構造上関連する類似体である。
【００６４】
この発明は、下記に報告された実験例で更に記述されるあろうが、それは発明を何ら制限することを示さない。
【００６５】
（実施例）
＜材料と方法＞
材料．洋わさびペルオキシダーゼと結合した抗マウスＩｇ抗体及びＥＣＬ検知のために使用された試薬は、アメラサーム−ファラマシア社製品であった。細胞培養器はライフ・テクノロジーズ社及び細胞培養のために使用されたプラスチック器はヌーク社のを得た。オカダ酸（アンモニウム塩）は、アレクシス株式会社から購入した。イエソー毒素は、有限会社サイエンスアンドリサーチ環境研究所（ニュージーランド）から得た。これらの実験中で用いた単クローン抗Ｅ−カドヘリン抗体（クローンＨＥＣＤ−１）は、有限会社ジミード研究所社の製品であった。前染色分子質量マーカーは、シグマ社から得た。ニトロ細胞ロース薄膜“プロトランＢ８３”は、シュライヒャー＆シュエール社からであった。
【００６６】
＜細胞培養と処理＞
これらの実験中で用いたＭＣＦ−７細胞系統は、細胞培養のヨーロッパコレクション（ＥＣＡＣＣ　Ｎｏ：８６０１２８０３；ＣＢ　Ｎｏ：ＣＢ２７０５）から得た。細胞は、ＣＯ２５％を含有の大気中に３７℃で維持されたペトリ皿中にあり、培地基は胎児牛の血清（１０％）、非本質的アミノ酸（１％）及び２ｍＭグルタミンを含んでいるダルベッコズ改良ＭＥＭから構成された。
【００６７】
細胞処理は、無水エタノールで作製された原液からの適切な毒素の一部分を加えることにより実行され、また対照標準培養は、媒体の同一容量を受け取った。異なる物質の溶解作用は原液の系列希釈、それぞれ５０μＭオカダ酸及び５００μＭイエソー毒素で表されるものが得られ、遮光されたガラス薬瓶に−２０℃で貯蔵された。培養器中のエタノール濃度は０．５％（ｖ／ｖ）以上ではなく、それはこれらの実験中で測定された分子パラメーターに影響しない濃度を表わす。
【００６８】
培養容器中の物質の最終濃度及び個々の処理時間が、私たちが得た記述の結果を明確にした。
【００６９】
＜細胞抽出物の作製＞
本分析で使用された細胞抽出物は、示された処理の終わりに培養容器に付着する細胞から得られ、また方法は４℃で行なわれた。細胞は、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ（ＰＢＳ）を含んでいる２０ｍＭリン酸緩衝液で３回洗われ、またその後、培養表面積ｃｍ２当たり溶解緩衝液２５μｌの追加によって溶解され、そしてこの溶液に接する細胞を１０分間４℃で保存し続けた。溶解緩衝液は次のものを含んでいるＰＢＳから構成された：０．５％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸塩、０．１％（ｗ／ｖ）ドデシルサルフェート塩（ＳＤＳ）、１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、０．１ｍｇ／ｍｌフェニルメチルスルホニル基フッ化物（ＰＭＳＦ）。その後、細胞も溶解物は１６０００ｘｇで３０分間遠心分離され、この遠心分離の上澄み（可溶性細胞質抽出物）は再利用され、ビチンチョニック酸を用いた比色定量方法によってそれらの総タンパク質容量を測定するために使用された（スミスＰ．Ｋら、１９８５年、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１５０：７６）。その後、可溶性細胞質抽出物は、最終的に２％ＳＤＳ、５％β−メルカプトエタノール及び２０％グリセリンの濃度に至り、電気泳動によってタンパク質分留のために使用される前に、１００℃で５分間で処理された。
【００７０】
＜ＳＤＳ存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及び免疫ブロット法分析によるタンパク質分留＞
通常、約５０ｍｇに相当する同量のタンパク質を含んでいる試料は、ラエミリーによる方法によって（Ｌａｅｍｍｌｉ　Ｕ．Ｋ、１９７０年、Ｎａｔｕｒｅ、２２７：６８０）、１０％アクリルアミド・モノマーを含んでいる分離するゲルを使用して、ＳＤＳ存在下でポリアクリルアミドゲル電気泳動法を受けた。電気泳動（１７０ボルトで３時間の運転時間）が終わり、タンパク質はニトロ細胞ロース薄膜（プロトランＢ８３）に電気泳動的に転送され、そしてその後ポンソーＳで染色された。
【００７１】
その後、薄膜上の特定結合した部位を、２０ｍＭの三塩化水素、２５℃でｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ＴＢＳ）、３％（ｗ／ｖ）含有の低脂肪粉ミルク及び１ｍＭのＣａＣｌ２から構成された溶液で室温にて１時間飽和させた。その後、薄膜は、１％（ｗ／ｖ）含有の低脂肪粉ミルク、１ｍＭのＣａＣｌ２及び２μｇ抗Ｅ−カドヘリン抗体／緩衝液ｍｌを含んいるＴＢＳで、室温にて１時間培養された。培養が終わった薄膜は、０．０５％（ｗ／ｖ）のトゥイーン２０（ＴＢＳトゥイーン緩衝液）を含んでいるＴＢＳで、５分間を４回そして５回目に１０分間洗浄された。その後、薄膜は１％（ｗ／ｖ）の低脂肪粉ミルク及び１：３０００希釈の第２抗体（西洋わさびペリオキシダーゼが結合した抗マウスＩｇ抗体）を含んでいるＴＢＳトゥイーンで、室温にて１時間培養された。培養が終わったこの薄膜は、前述されるように洗浄され、また抗原は、ＥＣＬ法及びコダックＸ−Ｏｍａｔフィルムを用いた自動Ｘ線撮影法によって検知された。その後、電気泳動図は濃度計走査を受け、また、ピーク面積から測定された吸光度は記録され、検知された抗原量を計るために使用された。
【００７２】
＜これらの実験中で使用された照合混合物＞
これらの実験で具体化した範囲内で、オカダ酸（ＯＡ）及びイエソー毒素（ＹＴＸ）（“材料”セクション参照）は、それぞれジノフィシス毒素類とイエソー毒素類の照合混合物として使用される（同箇所にヤスモト　Ｔら、１９９３年、Ｃｈｅｍ　Ｒｅｖ：９３、１８９７；サタケら、１９７７年、ナット毒素、５：１０７；Ｃｉｍｉｎｉｅｌｌｏら、２０００年、Ｅｕｒ　Ｊ　Ｏｒｇ　Ｃｈｅｍ、２９１）。その後、使用される毒素濃度は、それらの２つの照合混合物への等価物として表される。
【００７３】
実施例１：オカダ酸（ＯＡ）及びイエソー毒素（ＹＴＸ）培養の下記細胞処理での細胞中のＥ−カドヘリン及び関連抗原ＥＣＲＡ１３５とＥＣＲＡ１００の含有量変化。
【００７４】
ＭＣＦ−７細胞は、５０ｎＭ　ＯＡ、５０ｎＭ　ＹＴＸ、両物質の最終濃度が５０ｎＭ又は媒体（対照標準）を使って３７℃で１８時間処理した。処理が終わりに、細胞は細胞抽出物を作製するために使用され、各試料から５０μｇのタンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥの分留によって得られ、抗Ｅ−カドヘリン抗体を使用してを免疫ブロット法分析を受けた。
【００７５】
それは図１中で示されるように、免疫反応性の材料として主要な１２６ｋＤａ（１２６．１±４．１ｋＤａ）の分子質量バンド、対照標準及びオカダ酸で処理した両方は、この処理に関連したＥＣＲＡ１３５（１３６．３±３．３ｋＤａ）の出現以外は、文献に報告されたデータと一致した（Ｄａｍｓｋｙ　Ｃ．Ｈら、１９８３年、Ｃｅｌｌ、３４：４５５）。今度はイエソー毒素処理の後に、ほとんどの免疫反応性はＥＣＲＡ１００に付随して、１００ｋＤａ（１０１．９±３．２ｋＤａ）バンドに関連し、また、Ｅ−カドヘリンもわずかにより少ない暗いバンドとして検知される。ＥＣＲＡ１３５及びＥＣＲＡ１００の両方、ＯＡ及びＹＴＸ処理の特性は、それぞれ、在来のＥ−カドヘリンのバンドと一緒に２重処理（ＯＡ＋ＹＴＸ）の後に検知される。
【００７６】
同様の方法及び同様の実験条件下によって得られた電気泳動図の濃度計の走査は、更に細胞処理後ではＥ−カドヘリン媒体（対照標準）が総免疫反応性の主要成分（９２．１±５．４％、ｎ＝６）を構成するのを示している。時々、そして次のフィルムの過剰露出が、抗原ＥＣＲＡ１００（Ｅ−カドヘリン関連抗原）は少数成分として観測することができる。５０ｎＭ　ＯＡで処理された細胞では、対照標準細胞から作製された抽出物での検知の１５．４±８．７％に達する相対的な総免疫反応性（Σ）の実質減少が検知された。ＯＡ処理後、Ｅ−カドヘリンはまだ主要な免疫反応性成分を表し（総免疫反応性の７７．６±１２．３％）、しかしＥＣＲＡ１３５は重要な程度検知され総免疫反応性の２０．６±９．６％を占めて、ところがＥＣＲＡ１００は常に観測されないかもしれず総免疫反応性の１．８±３．１％を占めている。ＹＴＸ（１μＭ）を使ったＭＣＦ−７細胞の処理は、更にＥ−カドヘリン及び関連抗原の相対的な比率の変化に結びつく。事実、この物質を２４時間培養し、相対的な総免疫反応性（Σ）を対照標準と比較した時、ほとんど２倍になる（１９０±３２％、ｎ＝４）。これらの実験条件下では、ＥＣＲＡ１３５は検出できないが、ところがＥ−カドヘリン及びＥＣＲＡ１００は、ほとんど同レベルの総免疫反応性の５２．０±１．７及び４８．０±１．７（ｎ＝４）にそれぞれ現れる。
【００７７】
図１中で示される結果に基づき、ＯＡ処理は、在来の内因性のＥ−カドヘリン（約１２６ｋＤａ分子質量）に伴う約１３５ｋＤａ（ＥＣＲＡ１３５）の分子質量に相当する電気泳動の可動性を示す抗原の検知を引き起こし、ところが同じ実験のシステムのＹＴＸ処理は、約１００ｋＤａ（ＥＣＲＡ１００）の分子質量に相当する電気泳動の可動性を示す抗原の相対的な増加を引き起こし、対照標準細胞は低レベルである。その後、これらの結果は、量的関係がＥ−カドヘリン、ＥＣＲＡ１３５及びＥＣＲＡ１００レベルの間にあること示唆し、また一方では、培養細胞に処方されたＯＡとＹＴＸの濃度、また他方では、更にＥ−カドヘリン及び関連抗原の細胞のプール中の質的変化が、同時に両毒素で処理されたＭＣＦ−７細胞の場合でさえ維持されることを示しめすと、要約することができる。
【００７８】
実施例２．Ｅ−カドヘリンとＥＣＲＡ１３５及びＥＣＲＡ１００レベルの間及び培養細胞に処方されたＯＡとＹＴＸの濃度の量的関係。
【００７９】
前記発見に基づいて、実験は、ＭＣＦ−７細胞でのＥ−カドヘリン及び関連抗原レベルの変化を引き起こすことができる最低のＯＡ及びＹＴＸの濃度の検知を目指して行われた。
【００８０】
ＯＡを用いた細胞処理後に得られ結果は図２中で報告され、ＭＣＦ−７細胞が１０ｎＭ以上、最大が７５ｎＭ以上の濃度のＯＡ濃度で２０時間処理された場合、私たちが分析した試料を供給する培養容器の表面領域のために標準化された私たちが使用した抗Ｅ−カドヘリン抗体への免疫反応性材料のレベル減少を検知できることを示す。ＭＣＦ−７細胞が２０−３０ｎＭ　ＯＡで処理された場合、その検知が始まり、最大７５ｎＭ　ＯＡ処理で終わる際の相対的な総免疫反応性（Σ）の減少には、ＥＣＲＡ１３５レベルの進歩的な増加が伴う（図２）。同間隔で含んだＯＡ濃度でのＭＣＦ−７細胞処理は、ＥＣＲＡ１００レベルの相対的な減少を導き５０ｎＭ以上のＯＡ濃度で最低となる。
【００８１】
図２中で報告された結果は更に、一定の実験条件の下では、ＯＡの相対濃度が３０−７５ｎＭ、約２５−６０ｎｇＯＡ／ｍｌに相当する間で含まれる場合、分析中の比例数が維持されることも示している。
【００８２】
この種の分析はＹＴＸを繰り返し使用し、また結果（図３）は、ＭＣＦ−７細胞が２０時間約０．２ｎＭ　ＹＴＸ、ＹＴＸ濃度で同等又は１ｎＭ以上の最大のレベルに達する処理がなされた場合、私たちが分析した試料を供給する培養容器の表面領域のために標準化された抗Ｅ−カドヘリン抗体への免疫反応性材料の増加が検知できることを示している。在来のＥ−カドヘリンの縮小に伴ったＥＣＲＡ１００の増加は、実は、ＥＣＲＡ１３５がＹＴＸ単独を使ったＭＣＦ−７細胞処理後に検知されていない０．２〜１ｎＭ（図３）間に含まれたＹＴＸ濃度によって引き起こされたように見える。
【００８３】
図３中で報告された結果は更に、一定の実験条件の下では、ＹＴＸの相対濃度が０．２〜０．５ｎＭ、約２４０−６００ｐｇのＹＴＸ／ｍｌに相当する間で含まれる場合、分析中の比例数が維持されることも示している。
【００８４】
実施例３．培養細胞中のＯＡ及びＹＴＸの同時期測定の影響。
【００８５】
この差異はＯＡとＹＴＸによって引き起こされた反応から見つかり、また細胞の上澄み中の物質濃度にそれらの程度を関連づける可能性がＯＡ及びＹＴＸが同時期に培地器に存在するＭＣＦ−７細胞処理にあるかどうかチェックし、細胞が私たちの実験システムでは別々に添加された２つの物質を使って処理された時に既に観測されたものに類似のＥ−カドヘリン及び関連抗原の細胞プールの変化の検知に帰着した。
【００８６】
その結果は実施例１（図１）において概説され、測定可能なレベルのＥ−カドヘリン、ＥＣＲＡ１３５、ＥＣＲＡ１００を含み、かつ同時に培地中が５０ｎＭの濃度のＯＡとＹＴＸを使って１８時間処理されたＭＣＦ−７細胞から得られ抽出物が示しており、また培養細胞に単独で加えたＯＡとＹＴＸによって引き起こされたＥ−カドヘリン及び関連抗原のプールの質的変化は、ＭＣＦ−７細胞が２つの毒素を同時に加えて処理される、私たちの実験システムの培養細胞の時でさえ維持される。
【００８７】
別のものの存在下でさえ、毒素の２つの部類の各々の用量作用の関係を識別するために、更なる実験は先の例において報告された一般的な実施手順に従って行なわれた。その後、ＭＣＦ−７細胞は、２つの物質の各々の濃度が増加していき、かつ他方の物質の有効濃度の存在又は欠如のどちらかで２０時間処理された。図４はＭＣＦ−７細胞が１０ｎＭ　ＹＴＸの存在又は欠如においてＯＡ濃度が増加しながら処理された時に得られた結果を表し、また３０ｎＭ以上の濃度でＯＡによって引き起こされたＥＣＲＡ１３５の細胞のレベルの増加が１０ｎＭ　ＹＴＸ存在下で維持されることを示す、しかしＥＣＲＡ１３５の相対的なレベルはＹＴＸ欠如状態で測定したのと比較するとほとんど半分である。ＯＡを使って処理された細胞から得られた抽出物より低レベルのＥＣＲＡ１００が検知され（図２）、それどころか、細胞培養がＯＡ及び１０ｎＭ　ＹＴＸの両方の存在下で実行される場合には観測されない、それは総免疫反応性の４０〜５０％間のＥＣＲＡ１００の相対的なレベルを維持する。この結果には在来のＥ−カドヘリンの相対的な減少が伴い、１０ｎＭ　ＹＴＸと共に加えられたＯＡ濃度を増加させることが相対レベルを更に縮小し、相対的な総免疫反応性（Σ）の約４０％に達する（図４）。これらの実験条件下では、ＭＣＦ−７細胞から作製された抽出物から検知された総免疫反応性のレベルは、ＯＡ濃度を増加させながら細胞処理した後とにかく次第に減少し、また低ＯＡ濃度でさえ同時期の１０ｎＭ　ＹＴＸの存在が免疫反応性の相対的な増加を維持するようには見えなかった、（図４）。
【００８８】
これらの実験が、私たちの実験のシステム及び５０ｎＭ　ＯＡの存在又は欠如でＹＴＸの濃度を増加させた結果を分析するために繰り返された場合、私たちは前結果に従って結果を得た（図５）。従って、ＹＴＸが同時期の培地中のＯＡの存在によってそのレベルは縮小されたＥＣＲＡ１００の用量依存の増加を引き起こすことが確認された（図５）。更にＥＣＲＡ１３５がＯＡ欠如で検出できない、またＹＴＸ濃度を増加させることでＥＣＲＡ１３５の相対的レベルが減少することが確認された（図５）。更に、総免疫反応性に関して、培地中のＹＴＸ濃度を増加させることにより、Ｅ−カドヘリンの相対的なレベルが次第に減少することが確認された。しかしながら、ＭＣＦ−７細胞が５０ｎＭ　ＯＡ存在下で処理された時、この結果は検知されず、またＥ−カドヘリンの相対的なレベルは処理で使用されたＹＴＸ濃度と無関係に総免疫反応性の７０％付近で維持された。最後に、細胞が５０ｎＭ　ＯＡ存在下でＹＴＸを使って処理された時、ＹＴＸ濃度を増加させることにより引き起こされて相対的な総免疫反応性（Σ）が２倍になることは観測されなかった（図５）。実際これらの実験条件の下では、その相対的な総免疫反応性（Σ）のレベルは、５０ｎＭ　ＯＡを使って処理中のＹＴＸ濃度と無関係に処理していない細胞に検知されたものの約２０％で維持された。
【００８９】
これらの発見に基づいて、本方法が合理的な精度で同時期に同じ試料中のＹＴＸ及びＤＴＸの群に属する毒物の全面的なレベルの検知を可能すると結論を下せるかもしれず、また従って、本方法は、汚染された材料からここまで加工された抽出物の上述の成分を測定するのに役立つものの範囲を超える。
【００９０】
実施例４．ＯＡ及びＹＴＸを含有する未精製イガイを使って処理されたＭＣＦ−７細胞のＥ−カドヘリン及び関連抗原のレベルの変化。
【００９１】
イガイ肝膵臓からの未精製抽出物の作製
未製製抽出物は、市場で見つけた未汚染の青イガイ（Ｍｉｔｙｌｕｓ　ｇａｌｌｏｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉｓ）から作製されている。その抽出物は、公式のイタリア方法によって作製されている（Ｇ．Ｕ．Ｎ．２７９、２９　ｎｏｖｅｍｂｒｅ　１９９５年、Ｄ．Ｍ．Ｓａｎｉｔａ　３１　Ｌｕｇｌｉｏ、１９９５）。肝膵臓は解剖され、そして２５ｇｒが（登録商標）テフロンすりこ木を備えたポッター−エレベジャム社のホモジナイザー中でアセトン１２５ｍｌで均質化された。ホモジェネートは紙上でろ過され、また残留物はアセトン５０ｍｌで再抽出され、そしてろ過を２度された。３つの抽出物が組み合わせられ、またアセトンは４０℃で蒸発した。水の残留物はジエチルエーテル５０ｍｌで次に抽出され、そしてエーテル溶液が集められた。その後、水の試料は、ジエチルエーテル５０ｍｌで２度再抽出され、そして３つのエーテル抽出物が組み合わせられた。その後、エーテルは蒸発し、そして最終材料がイガイ肝膵臓からの未精製抽出物であった。
【００９２】
（ＭＣＦ−７細胞中にＥ−カドヘリン及び関連抗原のレベルでＯＡ及びＹＴＸを含んでいるイガイ抽出物によって引き起こされた影響の分析．．）
これらの実験の目的は、更に毒素が、食用の軟体動物、特にイガイから得られた未精製抽出物のような複雑な材料中にある場合、ＯＡ及びＹＴＸがＥ−カドヘリン及び関連抗原の変化を引き起こすことができるかどうか確認することである。
【００９３】
この目的は、未精製抽出物は、名目上ＤＳＰ毒素が不足している市場で使用可能なイガイから作製され、決められた多量のＯＡ及び／又はＹＴＸを添加されている。その後、その未精製抽出物は、ここで“オリジナルの未精製抽出物”と定義され、方法の項目で記述されたように得られ、実験中で以下のように使用されている。第１の実例では、細胞培養への試料の正確な添加を可能にすることができる解決法を得るためにオリジナルの未精製抽出物の１容量が５容量のエタノール：ジメチルスルホキシド（１：１）で希釈され、それによって不安定な容量の機会を最小限にする。これら後者の抽出物は、ここで“希釈された未精製抽出物”と定義され、汚染されたイガイ試料で見つかるものに匹敵するレベルのＯＡ及び／又はＹＴＸの添加を受けた。
【００９４】
その後、希釈された未精製抽出物はＯＡ及び／又はＹＴＸを加えられ、また以下に述べるように、もう３つの抽出物が得られた：
−オリジナルの未製製抽出物に３６ｎｇＹＴＸ／μｌ含んで希釈された未精製抽出物（「イガイ抽出＋ＹＴＸ」と定義）；
−オリジナルの未精製抽出物に１２５ｎｇＯＡ／μｌ含んで希釈された未精製抽出物（「イガイ抽出＋ＯＡ」と定義）；
−オリジナルの未精製抽出物に３６ｎｇＹＴＸ／μｌ及び１２５ｎｇＯＡ／μｌ含んで希釈された未精製抽出物（「イガイ抽出＋ＹＴＸ＋ＯＡ」と定義）。
【００９５】
図６はＭＣＦ−７細胞中で得られた結果を示す。実験は培地に計５ｍｌの融合性の細胞を含有しているペトリ皿の使用により行われた。細胞へ加えられたイガイ抽出物の量は、５０ｎｇのＹＴＸ及び／又は１７０ｎｇのＯＡを含有と示されるような、オリジナルの未精製抽出物の１．３μｌと等価であった。
【００９６】
試料に対照標準細胞及び毒素が不足しているイガイ抽出（イガイ抽出、図６）を使って処理された細胞の試料から得られた結果を比較すると、ＤＳＰ毒素（ＯＡとＹＴＸ）によって汚染されていなかったイガイから作製された抽出物を使った細胞処理の結果が、検知可能なＥ−カドヘリン及び関連抗原で表示される質的変化はないことを示す。その代わりに、ＹＴＸを含むイガイ抽出物を使ったＭＣＦ−７細胞処理は、Ｅ−カドヘリンのものに匹敵するレベルにＥＣＲＡ１００の実質増加を引き起こし、私たちが検知した相対的な総免疫反応性（Σ）がほとんど２倍になることを導いた（図６）。
【００９７】
次に、ＯＡを含んでいる抽出物を使った細胞処理は、相対的な総免疫反応性（Σ）の実質減少に伴って、ＥＣＲＡ１３５の出現を検知できることに結びついた。最後に、両方の毒素が、処理に使用されたイガイ抽出物中に存在した時、相対的な総免疫反応性（Σ）の減少に伴って、ＥＣＲＡ１００のレベルの増加及びＥＣＲＡ１３５の出現の両方は検知された（図６）。
【００９８】
その後、ＯＡとＹＴＸによって引き起こされたＥ−カドヘリン及び関連抗原の変化は、これらの毒素がイガイ肝膵臓から作製された未精製抽出物のような複雑な生物学の基材に存在する時でさえ検知可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＭＣＦ−７細胞中でのＥ−カドヘリン及び関連抗原のオカダ酸及びイエソー毒素の影響。
【図２】
ＭＣＦ−７細胞中でのＥ−カドヘリン及び関連抗原のオカダ酸濃度レベルを増加させたときの影響。
【図３】
ＭＣＦ−７細胞中でのＥ−カドヘリン及び関連抗原のイエソー毒素濃度レベルを増加させたときの影響。
【図４】
ＭＣＦ−７細胞中でのＥ−カドヘリン及び関連抗原のオカダ酸濃度レベルを増加させることによるイエソー毒素の変化が引き起こす影響。
【図５】
ＭＣＦ−７細胞中でのＥ−カドヘリン及び関連抗原のイエソー毒素濃度レベルを増加させることによるオカダ酸の変化が引き起こす影響。
【図６】
ＡＯとＹＴＸを増したイガイ肝膵臓から作製された未精製抽出物のＥ−カドヘリン及び関連抗原の影響。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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