(57)【要約】アレイの形態で固体基質の上面に付着した複数の光学的に透明なハイドロセルを備えたバイオチップを形成する。セルはそれぞれ、反応性イソシアネート基を有するポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはそれらのコポリマーのハイドロゲルで形成される。非ハイブリダイゼーション結合要素をこれらのセルに結合させ、前記要素は標的蛋白質またはその他の同等の生体分子を選択的に隔離するために有効である。異なる結合要素は、異なるセルに固定され、いくつかの標的生体分子をアッセイするために使用できるバイオチップを作製する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学的に透明なハイドロゲルバイオチップであって、
ａ）表面を有する固体基板、
ｂ）前記基板の前記表面に付着した少なくとも１個の光学的に透明なハイドロゲルセルであって、イソシアネート官能性ポリマーから形成されたハイドロゲルセル、および
ｃ）前記ハイドロゲルセル内部または上部に固定された非ハイブリダイゼーション結合要素であって、標的蛋白質またはその他の同等分子を選択的に隔離するために有効である結合要素
を含むことを特徴とするハイドロセルバイオチップ。
【請求項２】
前記ハイドロゲルがウレタン結合を有するポリマーを含むことを特徴とする、請求項１に記載のバイオチップ。
【請求項３】
前記ハイドロゲルがポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはそれらのコポリマーを含むことを特徴とする、請求項１に記載のバイオチップ。
【請求項４】
前記ハイドロゲルセルの厚さが少なくとも３０μｍであることを特徴とする、請求項１に記載のバイオチップ。
【請求項５】
前記ハイドロゲルセルの厚さが約３０μｍと約１００μｍとの間であることを特徴とする、請求項４に記載のバイオチップ。
【請求項６】
前記結合要素が、イソシアネート基との反応によって前記ハイドロゲルセルに共有結合し、前記ハイドロゲル内部にあることを特徴とする、請求項１に記載のバイオチップ。
【請求項７】
前記セルの前記ポリマー中の約１５％以下の前記反応性イソシアネートが前記結合要素と反応したことを特徴とする、請求項５に記載のバイオチップ。
【請求項８】
前記セルの前記ポリマー中の１０％以下の前記反応性イソシアネートが前記結合要素と反応したことを特徴とする、請求項６に記載のバイオチップ。
【請求項９】
前記結合要素がイムノグロブリン、酵素、受容体、酵素阻害剤、酵素基質、またはペプチドを含むことを特徴とする、請求項１に記載のバイオチップ。
【請求項１０】
前記結合要素それぞれが媒介剤との相互作用によってハイドロゲル内に固定されていることを特徴とする、請求項１に記載のバイオチップ。
【請求項１１】
前記結合要素が、前記ハイドロゲル中に固定され、前記媒介剤を構成する金属キレートに結合する蛋白質であることを特徴とする、請求項９に記載のバイオチップ。
【請求項１２】
前記蛋白質がヒスチジン含有ポリペプチドを介して前記蛋白質の一方の末端で前記金属キレートと結合することを特徴とする、請求項１０に記載のバイオチップ。
【請求項１３】
前記結合要素が前記ハイドロゲルに結合した第１媒介剤および前記第１媒介剤に結合した第２媒介剤を介して固定されていることを特徴とする、請求項１０に記載のバイオチップ。
【請求項１４】
前記第１媒介剤が抗体であり、前記第２媒介剤が蛋白質であることを特徴とする、請求項１３に記載のバイオチップ。
【請求項１５】
前記基板が該基板表面に付着した複数のハイドロゲルセルを有し、異なる結合要素が異なるハイドロゲルセルに固定されていることを特徴とする、請求項１から１４のいずれかに一項に記載のバイオチップ。
【請求項１６】
前記基板が光学的に透明であることを特徴とする、請求項１から１５のいずれか一項に記載のバイオチップ。
【請求項１７】
前記基板が、前記ハイドロゲルが共有結合している上面に反応性分子を有することを特徴とする、請求項１から１６のいずれか一項に記載のバイオチップ。
【請求項１８】
前記ハイドロゲルセルが前記ポリマーのいくつかの前記イソシアネート基を介して前記基板に共有結合することを特徴とする、請求項１７に記載のバイオチップ。
【請求項１９】
ａ）上面を有する固体基板、
ｂ）前記基板の前記上面に結合したポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはそれらのコポリマーを含む複数のハイドロゲルセル、
ｃ）前記セルの前記ハイドロゲルの内部または上部に固定された媒介剤、および
ｄ）少なくとも数個の前記ハイドロゲルセル内の前記媒介剤にそれらの相互作用によって結合した異なる蛋白質結合要素であって、前記蛋白質結合要素が天然の構造をとるような方法で結合した蛋白質結合要素を含むことを特徴とするハイドロゲルバイオチップ。
【請求項２０】
生化学的アッセイを実施するためにバイオチップを使用する方法であって、
（ａ）少なくとも２個のハイドロセルゲルが結合した表面を有する基板を備えた光学的に透明なハイドロゲルバイオチップを提供する工程であって、各セルが少なくとも約３０μｍの厚さであり、主にポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールまたはそれらのコポリマーを含み、前記ハイドロゲルセルそれぞれがその内部または上部に固定された種々の蛋白質結合要素を含む工程、
（ｂ）前記ハイドロゲルバイオチップを結合条件下で標的生体分子を含む分析物溶液と接触させる工程、
（ｃ）非選択的結合および未結合標的生体分子を除去する条件下で前記ハイドロゲルバイオチップを洗浄する工程、および
（ｄ）前記セルの１個に結合した前記標的生体分子を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
標的生体分子の結合によって前記結合要素の構造変化が生じることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記構造変化がリン酸化現象であることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記構造変化が脱リン酸化現象であることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記構造変化を受けた前記結合要素が１つまたは複数の媒介剤によってハイドロゲルに結合することを特徴とする、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
内部または上部に固定された非ハイブリダイゼーション結合要素を有する光学的に透明なイソシアネート官能性ハイドロゲルバイオチップの調製方法であって、前記要素が標的蛋白質または標的生体分子の選択的隔離に有効であり、
ａ）イソシアネート官能性ハイドロゲルプレポリマーの有機溶媒溶液を提供する工程、
ｂ）前記非ハイブリダイゼーション結合要素の溶液を提供する工程、
ｃ）前記要素を、前記反応性イソシアネートの１５％以下との反応によって前記イソシアネート官能性ハイドロゲルプレポリマーに共有結合させる工程、
ｄ）光学的に透明なハイドロゲルを生成する条件下で、前記イソシアネート官能性ハイドロゲルプレポリマーの重合を開始する工程、および
ｅ）前記結合要素を含有する光学的に透明なハイドロゲルポリマーが前記基板に付着するように、前記重合イソシアネート官能性ハイドロゲルプレポリマーを固体基板上に小滴形態で分散させる工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
前記要素の前記結合が重合と同時に行われることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
二酸化炭素の発生を制御して、得られた前記ハイドロゲルの透明度を確実にするために、粘度およびｐＨを選択することを特徴とする、請求項２５または２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記基板を処理して、前記重合ハイドロゲルを前記基板に共有結合する上面上に反応性部分を提供することを特徴とする、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
捕捉剤として機能するために選択された、内部または上部に固定された蛋白質を有するイソシアネート官能性ハイドロゲルバイオチップの調製方法であって、
ａ）イソシアネート官能性ハイドロゲルプレポリマーの有機溶媒溶液を提供する工程、
ｂ）所望の蛋白質捕捉剤の溶液を提供する工程、
ｃ）前記蛋白質の媒介結合剤を前記イソシアネート官能性ハイドロゲルプレポリマーに共有結合させる工程、
ｄ）前記イソシアネート官能性ハイドロゲルプレポリマーの重合を開始する工程、
ｅ）前記ポリマーが前記基板に付着するように、前記重合イソシアネート官能性ハイドロゲルプレポリマーの小滴を固体基板上に分散させる工程、および
ｆ）個々のハイドロゲル小滴を所望の前記蛋白質溶液の１つに曝露し、前記蛋白質捕捉剤を前記結合剤への結合によってその内部また上部に固定する工程
を含み、それによって前記小滴が重合して異なる蛋白質捕捉剤を有する複数のセルを備えたバイオチップを作製することを特徴とする方法。
【請求項３０】
前記結合剤への前記蛋白質の結合が重合と同時に行われることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記結合剤への前記蛋白質の前記結合が重合後に行われることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記結合剤がキレート剤であることを特徴とする、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記蛋白質がそれぞれヒスチジン含有末端ペプチド配列を含むことを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
二酸化炭素の発生速度を遅くし、得られた前記ハイドロゲルの光学的透明度を確実にするために、前記重合中の反応条件が制御されることを特徴とする、請求項２９から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記基板を処理して、前記ハイドロゲルを前記基板に共有結合する上面上の反応性部分を提供することを特徴とする、請求項２９から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
内部または上部に固定された蛋白質を有する複数のセルを備えたイソシアネート官能性ハイドロゲルバイオチップの調製方法であって、
ａ）イソシアネート官能性ハイドロゲルプレポリマーの有機溶媒溶液を提供する工程、
ｂ）前記イソシアネート官能性ハイドロゲルプレポリマーの重合を開始する工程、
ｃ）前記小滴が前記基板に付着し、複数のセルを形成するように、前記重合イソシアネート官能性ハイドロゲルプレポリマーの小滴を固体基板上に分散させる工程、および
ｄ）少なくとも２個の前記セルそれぞれの内部または上部に異なる蛋白質を物理的に固定する工程であって、前記蛋白質が特定の生体分子を選択的に隔離する結合剤として機能するために選択されている工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３７】
前記固定が、分子量約１００，０００以上を有する蛋白質を、前記セルに前記蛋白質を拡散させる電流の使用によって物理的に閉じ込めることを含むことを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
固定化したＤＮＡなどの核酸から成るマイクロアレイは、ハイスループット分析および生体試料の特徴付けにおいて非常に有用であることが示されている。核酸バイオチップ上で複数の生物学的プローブを組み合わせて使用してこのような試料を分析することによって、試料の核酸成分に関する情報が得られる。このようなバイオチップは、たとえばスライドガラスなどの平坦なプレートを使用して形成してもよいし、凹部またはウェルが形成されたプレートを使用して形成してもよい。一般に、種々の配列の核酸オリゴマー、ＤＮＡ、すなわち、１本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡを試料の相補的な配列とハイブリダイズする形態で固定させる。米国特許第６２４２２４６号参照のこと。このようなハイブリダイゼーションの特異性および多数の核酸配列の組み合わせを迅速に確認できる能力ゆえに、得られたデータは遺伝子発現および試料中の配列特性の決定に有用である。このようなデータは、遺伝子ベースの疾患メカニズムの決定や診断および治療の標的となり得るものの同定において重要な要素となる。
【０００２】
核酸マイクロアレイ法は、市販のＤＮＡ合成機、ＰＣＲ法、および開発中の遺伝子標的情報を利用する。生物学的に関心のあるその他の結合要素（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｎｔｉｔｉｅｓ）、たとえば抗体またはその他の蛋白質を固定するためにこのようなマイクロアレイの使用を拡大することついて将来の関心があり、これを用いることで、核酸マイクロアレイを使用しても容易には推論できない新しい生物学的考察を潜在的に提供することができるハイブリダイゼーションに基づかない相互反応を用いたその他のハイスループット分析を可能とすることができるであろう。
【０００３】
しかし、核酸バイオチップと比較して、いくつかの種々の結合要素、たとえば蛋白質およびペプチドを適切に固定できるバイオチップを製作するためには困難に直面することが予想される。蛋白質などの物質を固定するために通常使用される固定化化学は、固相支持体表面への付着または直接接触によってこれらの物質の変性を引き起こすことが多い。さらに、蛋白質などの多くの結合要素上に存在する多数の競合的に活性な部分の結果として、核酸では問題にはならない、付着化学の制限もあり得るし、蛋白質などの多くのその他の結合要素の構造がその生物学的活性を保存するために重要であって、分子上の多数の部分によって固定すると容易に破壊され得ることは周知である。
【０００４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅法が使用できないために標的蛋白質の検出が本来的に非常に困難であるといった場合、このような潜在的な活性損失はより重要である。すなわち、多くの場合、組織試料から単離された蛋白質などの結合要素の使用量は非常に限られており、核酸では実行可能であるがこのような物質を容易かつ便利な方法で大量に再生することが不可能であることがこのような分析を妨げる。
【０００５】
（発明の背景）
現在、蛋白質リガンド、蛋白質−蛋白質、蛋白質−ＤＮＡの相互作用を研究するために使用されている公知の方法がいくつかある。これらの方法はいずれも、操作が煩雑で、高価で、または大量の蛋白質を必要とし、蛋白質相互作用の迅速なハイスループット分析には適さないという点で、厳しい制限がある。
【０００６】
蛋白質相互作用を研究するために当初行われた方法は、蛋白質親和性カラムである。この方法では、捕捉された蛋白質はアガロースビーズに共有結合で固定され、アフィニティクロマトグラフィを使用して多くの汚染された蛋白質を含む不均一な混合物から標的蛋白質をアフィニティ精製するために使用される。この方法では、アガロースビーズに適切に固定するために比較的大量の捕捉蛋白質が必要で、蛋白質相互作用の迅速なハイスループットスクリーニングには適していない。
【０００７】
蛋白質相互作用を研究するために使用された他の方法は、酵母２−ハイブリッドシステムである。この方法では、標的蛋白質ライブラリが酵母で構築される。このシステムは、関心のあるこれらの蛋白質を発現し、それぞれが転写活性領域と結合するように考案されている。ベイト蛋白質（または他の相互作用蛋白質候補を確かめるための蛋白質）をコードするＤＮＡをＤＮＡ結合ドメインと融合させ、さらに同ライブラリーにおいて発現させる。蛍光蛋白質または容易に検出可能な生物学的活性を有する蛋白質などの検出系をコードする対応ＤＮＡ配列を有するレポーター遺伝子も含まれる。関心のある標的蛋白質をベイト蛋白質に結合することによって、この２種が結果的に相互作用し、レポーター遺伝子の活性化が達成し、シグナルの発生がもたらされる。この方法は比較的頻繁に使用することができるが、時間がかかり、取り扱いが煩雑で、分子生物学的専門知識を熟知していることが必要で、蛋白質−蛋白質相互作用の経済的かつ迅速なハイスループットスクリーニングには向いていない。
【０００８】
当初から蛋白質相互作用の研究に通常使用されてきた他の方法は、捕捉蛋白質および標的蛋白質の双方を免疫沈殿し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して、得られた複合体を分析する方法である。この方法では、捕捉蛋白質をまず不均一な蛋白質混合物とインキュベートし、標的との結合を起こさせる。次に、得られた複合体を、対の蛋白質の一方に対して作製した抗体を使用して免疫沈殿し、この複合体をゲル電気泳動によって分離して分析し、次に検出工程、たとえば色素による染色を行う。この方法は時間がかかり、煩雑で、生化学的専門知識を熟知していることが必要で、これも同様に蛋白質相互作用の迅速なハイスループット分析には向かない。
【０００９】
蛋白質相互作用の研究に使用されるもう１つの方法は、ファージディスプレイである。この方法では、宿主細菌、たとえばＥ．ｃｏｌｉの表面に表れるある種の繊維状ファージの鞭毛上に蛋白質ライブラリを発現させ、このように「ディスプレイ」された蛋白質のアフィニティ支持体を提供する。次に、このファージライブラリを多数の標的蛋白質候補に曝露する。ディスプレイされた蛋白質が標的蛋白質と結合することによって、標的の同定が可能となる。この方法には多くの制限があり、たとえば分子量の大きな蛋白質はディスプレイするのが困難であり、このような用途に適したファージ繊維状蛋白質はほんのわずかである。さらに、ディスプレイされた蛋白質の構造的な圧迫により、親和性が減少し、結果として天然のリガンドとの結合能力に影響が及ぶことが知られている。
【００１０】
このような要素、たとえば、蛋白質の結合に適したハイスループットの可能なマイクロアレイまたはバイオチップの製作には一般的に、通常標的と呼ばれる関心のある他の物質または分子、たとえば、蛋白質とその後容易に相互反応させて検出を行うため使用することができるような形式で、蛋白質を表面上に付着させる方法を使用することが必要である。たとえば、蛋白質を２価または３価金属イオン、たとえばＣｕ２＋またはＦｅ３＋で処理した表面に直接結合させてもよく、蛋白質はこれらに種々の親和程度で自然に結合する。次いで標的をプローブに結合させる場合、米国特許第５７１９０６０号に記載されているように、質量分析を併用してＳＥＬＤＩ（商標）（表面強化レーザー脱離／イオン化）により検出および同定を行うことができる。Ｇ．ＭａｃＢｅａｔｈおよびＳ．Ｓｃｈｒｅｉｌｂｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：１７６０、２０００）によって報告された他の方法では、化学結合を用いて蛋白質を基質表面に結合させる一方、標的リガンドを蛍光タグで標識し、したがってプローブと標識標的との間の任意の相互作用を蛍光に基づいたスライドスキャナを使用して検出することができる。
【００１１】
結合要素を付与する前述の蛋白質固定方法では、一般に蛋白質の基質表面上への直接的な化学結合を用いるので、活性部位における不適切な化学結合または元の構造の欠損のいずれによってもこれらの方法には蛋白質の機能が結果的に損失するという大きな制限が生じる。このようなことが生じる場合、ほんのわずかな固定蛋白質のみが活性を維持しており、結果として検出が困難で、試験の感度が低くなる。さらに、これらの方法は複雑で正確さを欠くため、一般にハイスループット用途のための高密度マイクロアレイの作製に使用するには適さない。
【００１２】
米国特許第６０８７１０２号では、ポリアクリルアミドゲルを利用して電気泳動した蛋白質スポットから成る個々のセルを生成し、次いでゲルにインサイチューで架橋結合させてバイオチップを形成する方法について記載している。この方法の制限には、バイオチップ上に精密な小さなセルを調製することが困難であること、および架橋結合する際に捕捉蛋白質に破壊的な影響が生じる可能性があることが含まれる。米国特許第５８４７０１９号は、光反応性フリーラジカル化学物質を用いてパターン化されたネットワーク層を形成してバイオチップを製作するために、光重合可能なポリマーを利用した他のアプローチについて記載している。バイオチップに蛋白質を固定するために用いるこの光活性化によるアプローチは、アクリルアミドポリマーに関連したある種の光活性化学物質に限定され、さらに、フリーラジカル光化学の使用によりこのような方法で製作したバイオチップに使用した捕捉蛋白質に対してフリーラジカルによる障害が生じ得る。
【００１３】
蛋白質と直接反応させて発泡ポリウレタン内で蛋白質を固定するためのイソシアネートキャップ液体ポリウレタンプレポリマーの使用は、米国特許第４０９８６４５号および第３６７２９５５号に記載されており、イソシアネート官能性ハイドロゲル系を使用し、それらのアミノ部位および水酸部位を介して直接蛋白質を結合し、それによって酵素反応物および抗体／抗原をベースにしたアフィニティカラムを形成することが教示されている。記載された方法はこのような目的に適するであろうが、これらの方法では、バイオチップ使用に適した制御された形状の光学的に透明なハイドロゲルが形成されない。さらに、蛋白質側鎖に生じる可能性のある結合を阻害しないでこのような方法を使用すると、蛋白質とポリマーとの望ましくない架橋結合が生じる可能性が非常に高く、多数の架橋結合が蛋白質の天然の構造を傷つけたり、破壊したりすることとなり、したがって蛋白質の生物活性が減少し、このような方法はバイオチップを使用する精度の高い結合アッセイには適さない。
【００１４】
これらの技術上の困難にもかかわらず、蛋白質−蛋白質および他の適合生体分子相互作用を理解することは重要性をもとに、多数の異なる非ハイブリダイゼーション結合要素を導入するのに適した実用的かつ順応性のある型のバイオチップ、生物科学分野での種々の研究および商用使用のための望ましいツールが達成した。要するに、最大の結合活性を維持し、次いで該結合活性により非核酸／ハイブリダイゼーションをベースとしたマイクロアレイの作製を可能とするような形式で、要素を支持する効率的な結合系または支持系が必要とされている。
【００１５】
別の言い方をすれば、標的を自由に隔離する（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒ）ために、蛋白質の天然の構造（ｎａｔｉｖｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）および機能の維持を可能にする方法で蛋白質などの結合要素を固定または封入する方法を提供することが求められている。
【００１６】
（発明の概要）
現在、望ましい固定化学特性を有する適当なゲルを提供することによって、生体分子相互作用および特徴のハイスループット分析に適した３次元型（ｔｈｒｅｅ  ｄｉｍｅｎｔｉｏｎａｌ  ｆｏｒｍａｔ）アレイに多数の異なる非ハイブリダイゼーション結合要素を導入したマイクロアレイまたはバイオチップを提供できることが発見された。
【００１７】
本発明は、固体基板にアレイした光学的に透明なＰＥＧまたはＰＰＧをベースとした重合体微小滴（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅｔｓ）のアレイ形態のバイオチップを提供し、これは平方センチメートル当たり１０００個もの個々の反応セルを形成できる能力を付与する。各セルは通常、一般的に微小滴内部またはその表面上に固定された少なくとも１個の結合要素を含む。アレイのセル内の種々の結合要素を公知の方法で改変することによって、結合相互作用または活性について生物学的試料または化合物の効率的なスクリーニングが実施および定量できる。これらのセルは、それぞれに含有される結合要素の量を最大にし、これにより検出感度を最大にする、３次元形態であることが好ましい。
【００１８】
このようなバイオチップの各セルを形成する重合体微小滴は、固定した結合要素、たとえば蛋白質またはペプチドの天然の構造の維持に役立つ環境を提供するために選択される。得られたポリマーは、バイオチップの作製および使用に用いられる連続的な洗浄およびその他の液体処理工程を可能とするために、物理的および化学的に安定なハイドロゲルであることが好ましい。イソシアネート官能性反応基を有するポリエチレングリコールをベースとしたプレポリマーの使用が好ましく、重合した場合にウレタン結合によってポリエチレングリコールハイドロゲルネットワークが形成され、伸長し、架橋結合する。重合反応開始後、プレポリマーをバイオチップ基板上にマイクロスポットし、完全に重合させ、３次元反応セルのアレイを形成する。セル用の特定のポリマー化学は、核酸オリゴマーをハイブリダイゼーション捕捉ブローブとして使用したバイオチップを開示している米国特許第６１７４６８３号、国際特許出願ＷＯ００／６５０９７に記載されている。現在では、さらなる技術開発の結果、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはそれらのコポリマーを、蛋白質およびペプチドを含む種々の非ハイブリダイゼーション結合要素を含めるのに適した３次元バイオチップの製作に効率的に使用できることが見出された。
【００１９】
特定の一態様において、本発明は、（ａ）表面を有する固体基板、（ｂ）前記基板の表面に付着した少なくとも１個の光学的に透明なハイドロゲルセルであって、イソシアネート官能性ポリマーから形成されるハイドロゲルセル、および（ｃ）前記ハイドロゲルセル内部または上部に固定された非ハイブリダイゼーション結合要素であって、標的蛋白質またはその他の同等分子を選択的に隔離するために有効である結合要素を含む、光学的に透明なハイドロゲルバイオチップを提供する。
【００２０】
他の特定の態様では、本発明は生化学的アッセイを実施するためのバイオチップの使用方法を提供し、この方法には、（ａ）少なくとも２個のハイドロゲルが結合した表面を有する基板を備えた光学的に透明なハイドロゲルバイオチップを提供する工程であって、各セルの厚さは少なくとも約３０μｍで、主にポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールまたはそれらのコポリマーからなり、前記ハイドロゲルはそれぞれその内部または上部に固定した種々の蛋白質結合要素を含む工程、（ｂ）結合条件下で、標的生体分子を含有する分析物溶液とハイドロゲルバイオチップを接触させる工程、（ｃ）ハイドロゲルバイオチップを非選択的結合および未結合標的生体分子を除去する条件下で洗浄する工程、および（ｄ）前記セルの１個に結合した標的生体分子を検出する工程が含まれる。
【００２１】
さらに他の特定の態様では、本発明は、内部または上部に固定された非ハイブリダーゼーション結合要素を有する光学的に透明なイソシアネート官能性ハイドロゲルバイオチップの調製方法を提供し、この要素は標的蛋白質または標的生体分子を選択的に隔離するために有効であり、この方法には、（ａ）イソシアネート官能性ハイドロゲルプレポリマーの有機溶媒溶液を提供する工程、（ｂ）前記非ハイブリダーゼーション結合要素の溶液を提供する工程、（ｃ）前記要素を、１５％以下のイソシアネート官能性ハイドロゲルプレポリマーに前記反応性イソシアネートとの反応を介して共有結合させる工程、（ｄ）光学的に透明なハイドロゲルを生成する条件下で、イソシアネート官能性ハイドロゲルプレポリマーの重合を開始する工程、および（ｅ）前記結合要素を含有する光学的に透明なハイドロゲルポリマーが前記基板に付着するように、小滴形態の重合イソシアネート官能性ハイドロゲルプレポリマーを固体基板上に分散させる工程が含まれる。
【００２２】
さらに他の特定の態様では、本発明は、捕捉剤（ｃａｐｔｕｒｅ  ａｇｅｎｔ）として機能させるように選択された、内部または上部に固定された蛋白質を有するイソシアネート官能性ハイドロゲルバイオチップの調製方法を提供し、この方法には、（ａ）イソシアネート官能性ハイドロゲルプレポリマーの有機溶媒溶液を提供する工程、（ｂ）所望の蛋白質捕捉剤の溶液を提供する工程、（ｃ）前記蛋白質の媒介結合剤をイソシアネート官能性ハイドロゲルプレポリマーに共有結合する工程、（ｄ）前記イソシアネート官能性ハイドロゲルプレポリマーの重合を開始する工程、（ｅ）前記ポリマーが前記基板に付着するように、重合したイソシアネート官能性ハイドロゲルプレポリマーの小滴を固体基板に分散する工程、および（ｆ）個々のハイドロゲル小滴を所望の前記蛋白質溶液の１つに曝露して前記蛋白質捕捉剤を前記結合剤の連結を介して内部または上部に固定し、それによって前記小滴を重合して、異なる蛋白質捕捉剤を備えた複数のセルを有するバイオチップを生成する工程が含まれる。
【００２３】
さらに他の態様では、本発明は、（ａ）上面（ｔｏｐ  ｓｕｒｆａｃｅ）を有する固形基板、（ｂ）前記基板の上面に結合したポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはそれらのコポリマーを含む複数のハイドロゲルセル、（ｃ）前記セルの前記ハイドロゲル内部または上部に固定した媒介剤（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ａｇｅｎｔ）、および（ｄ）前記蛋白質結合要素が天然の構造をとるような様式で相互作用することによって、少なくとも数個の前記ハイドロゲルセルの内部で前記媒介剤と結合した種々の蛋白質結合要素を含むハイドロゲルバイオチップを提供する。
【００２４】
さらに特定の態様では、本発明は、内部または上部に蛋白質を固定した複数のセルを有するイソシアネート官能性ハイドロゲルバイオチップを調製する方法を提供し、この方法には、（ａ）イソシアネート官能性ハイドロゲルプレポリマーの有機溶媒溶液を提供する工程、（ｂ）イソシアネート官能性ハイドロゲルプレポリマーの重合を開始する工程、（ｃ）重合したイソシアネート官能性ハイドロゲルプレポリマーの小滴を固体基板上に、前記小滴が前記基板に付着し複数のセルを形成するように、分散する工程、および（ｄ）少なくとも２個の前記セルそれぞれの内部または上部に種々の蛋白質を物理的に固定する工程であって、前記蛋白質が選択的に特定の生体分子を隔離する結合剤として機能するように選択される工程が含まれる。
【００２５】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
ハイドロゲルは、マトリックスの内部および外部において分子を拡散さるために適当な大きさの孔および高い水分含量を有し、ガラスなどの表面に結合する能力を有し、完全に重合した状態で光学的に十分透明で、蛍光タグとの光学的妨害が最小限に留められており、完全に重合すると優れた構造完全性を有し、かつ一般研究用および臨床用に適当な保存性を有するゲルマトリックスを提供できるポリマーの種類である。ハイドロゲルは、脱水状態でガラス状であって水の存在下では膨潤して弾力性のあるゲルを形成する親水性ネットワークポリマーである。イソシアネート官能性ハイドロゲルは、非ハイブリダイゼーション結合要素、たとえば蛋白質の固定に有利に使用できるいくつかの特性を備えている。イソシアネート官能性ハイドロゲルとは、さらなる所望の重合を実施するように機能し、さらに蛋白質などまたは蛋白質を付着する媒介剤を共有結合する、イソシアネート基でキャップされた有機ポリマーを意味する。たとえば、ジイソシアネートとポリエーテルまたはポリエステルポリオールとの反応によって形成することができる当業界で周知であるポリウレタンポリマーは、この目的に適したハイドロゲルを提供することができる。
【００２６】
これらのイソシアネート官能性ハイドロゲルを使用したバイオチップを形成するための出発物質として、プレポリマーを使用することが好ましく、これらのプレポリマーは、水和したポリウレタン、ポリウレア−ウレタンおよび／またはポリウレアポリマーゲルを付与するために調製されることが好ましい。ハイドロゲルポリマーは、種々のプレポリマーから調製され、その他の種々の用途に広く使用されている。一般に、ハイドロゲルは、濃縮形態でゲル化する３次元ポリマーネットワークを有する軽度に架橋結合したプレポリマーを最初に形成するような条件下で、親水性モノマーを溶液中で重合することによって形成される。ポリウレタンハイドロゲルは、ウレアとウレタンの結合を生じさせることによりイソシアネートで末端をキャップしたプレポリマーの重合によって形成される。
【００２７】
適当なイソシアネート官能性プレポリマーは、２官能性または官能性イソシアネート化合物と反応する比較的高分子量のポリオキシアルキレンジオールまたはポリオールから調製されることが多い。好ましいプレポリマーは、エチレンオキシド単位のホモポリマーまたはエチレンオキシド単位とプロピレンオキシド単位またはブチレンオキシド単位の混合物を含有するブロックコポリマーまたはランダムコポリマーを含むことができるポリオキシアルキレンジオールまたはポリオールから形成される。ブロックコポリマーまたはランダムコポリマーの場合、単位の少なくとも７５％がエチレンオキシド単位であることが好ましい。あるいは、ポリプロピレンオキシドのホモポリマーも用いることができるが、あまり好ましくない。ポリオキシアルキレンジオールまたはポリオールの分子量は、好ましくは２０００から３００００、より好ましくは５０００から３００００である。適当なプレポリマーは、本質的に全ての水酸基がポリイソシアネートでキャップされるように、たとえば水酸基に対するイソシアネートの比を約１．２から約２．２として、選択したポリオキシアルキレンジオールまたはポリオールをポリイソシアネートと反応させることによって調製することができる。イソシアネート官能性プレポリマーは、活性イソシアネートを約０．１ｍｅｑ／ｇから約１．２ｍｅｑ／ｇの量で、好ましくは約０．２ｍｅｑ／ｇから約０．８ｍｅｑ／ｇの量で含むことが好ましい。一般に、かなり低分子量、たとえば３０００ＭＷ未満のプレポリマーでは、イソシアネート含量が比較的高いことが好ましい（約１ｍｑ／ｇ以上）。このようなプレポリマーの重合速度は、重合が速すぎて効果的にマイクロスポットできないようにならないように制御するべきであり、この点において、イソシアネートの含量が比較的低い高分子量プレポリマーが一般的に好まれる。
【００２８】
このような高分子量プレポリマーは、２つの一般的な方法、（１）分子量が少なくとも２０００であるポリオール（トリオール以上）をイソホロンジイソシアネートなどのポリイソシアネートと反応させる方法、または（２）分子量が少なくとも２０００であるジオールをポリイソシアネートおよび架橋結合剤、たとえばグリセロール、トリメチロールプロパン、トリメチロールエタン、トリエタノールアミンまたは有機トリアミンと反応させる方法のいずれかで調製されることが多いが、当業界で公知の他の方法も使用できる。
【００２９】
芳香族、脂肪族または環状脂肪族ポリイソシアネートを使用することができる。高分子量脂肪族イソシアネートでキャップしたプレポリマーは一般に約２０分から９０分で水和ポリマーの状態にゲル化するが、芳香族ポリイソシアネートでキャップしたプレポリマーはより迅速にゲル化する。適当な２官能性または多官能性イソシアネートの例は以下の通りである：トルエン−２，４−ジイソシアネート、トルエン−２，６−ジイソシアネート、イソホロンジイソシアネート、エチレンジイソシアネート、エチリデンジイソシアネート、プロピレン−１，２−ジイソシアネート、シクロベキシレン−１，２−ジイソシアネート、シクロヘキシレン−１，４−ジイソシアネート、−フェニレンジイソシアネート、３，３’’−ジフェニル−４，４’’−ビフェニレンジイソシアネート、１，６−ヘキサメチレンジイソシアネート、１，４−テトラメチレンジイソシアネート、１，１０−デカメチレンジイソシアネート、クメン−２，４−ジイソシアネート、１，５−ナフタレンジイソシアネート、メチレンジシクロヘキシルジイソシアネート、１，４−シクロヘキシレンジイソシアネート、ｐ−テトラメチルキシリレンジイソシアネート、ｐ−フェニレンジイソシアネート、４−メトキシ−１，３−フェニレンジイソシアネート、４−クロロ−１，３−フェニレンジイソシアネート、４−ブロモ−１，３−フェニレンジイソシアネート、４−エトキシ−１，３−フェニレンジイソシアネート、２，４−ジメチル−１，３−フェニレンジイソシアネート、２，４−ジメチル−１，３−フェニレンジイソシアネート、５，６−ジメチル−１，３−フェニレンジイソシアネート、１，４−ジイソシアナトジフェニルエーテル、４，４’−ジイソシアナトジ−フェニルエーテル、ベンジジンジイソシアネート、４，６−ジメチル−１，３−フェニレンジイソシアネート、９，１０−アントラセンジイソシアネート、４，４’−ジイソシアナトジベンジル、３，３’ジメチル−４，４’−ジイソシアナトジ−フェニルメタン、１，６−ジメチル−４，４’−ジイソシアナトジフェニル、２，４−ジイソシアナトスチベン、３，３’−ジメトキシ−４，４’−ジイソシアナトジフェニル、１，４−アントラセンジイソシアネート、２，５−フルオロネジイソシアネート、１，８−ナフタレンジイソシアネート、２，６−ジイソシアナトベンズルラン、２，４，６−トルエントリイソシアネート、ｐ，ｐ’，ｐ’’−トリフェニルメタントリイソシアネート、イソホロンジイソシアネートの３官能性３量体（イソシアヌレート）、ヘキサメチレンジイソシアネートの３官能性ビウレット、ヘキサメチレンジイソシアネートの３官能性３量体（イソシアヌレート）、重合４，４’−ジフェニルメタンジイソシアネート、キシレンジイソシアネートおよびｍ−テトラメチルキシレンジイソシアネート。
【００３０】
選択されたジオールまたはポリオールをポリイソシアネートでキャップしてプレポリマーを形成することは、化学量論的量の反応物を使用して実施することができる。水酸基に対するイソシアネートの比は、当業界で知られているように変化することができるが、約１から約３が好ましく、約１．２から約２．２がより好ましい。キャップ反応は適当な条件を用いて実施することができ、たとえば約２０℃から約１５０℃、乾燥窒素下で、約２時間から約１４日間、好ましくは触媒なしで実施することができる。好ましい温度は、約６０℃から約１００℃で、イソシアネート濃度が理論値に近くなったとき、反応を停止する。
【００３１】
好ましいプレポリマーには、トルエンジイソシアネートで末端をキャップしたポリエチレングリコール、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシド（場合によってはトリメチロールプロパンを有する）およびトルエンジイソシアネートのコポリマー、トルエンジイソシアネート−ポリエチレングリコール−トリメチロールプロパン、メチレンジイソシアネート−メチレンホモポリマー、重合メチレンジイソシアネート−ポリエチレングリコール、エチレンオキシド−プロピレンオキシド−トリメチロールプロパンおよびイソホロンジイソシアネートのポリマー、およびポリエチレングリコールトリラクテートおよびトルエンジイソシアネートが含まれる。上記種類の適当なプレポリマーは、Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．（レキシントン、マサチューセッツ）から、ＨＹＰＯＬ  ＰｒｅＭＡ（登録商標）Ｇ−５０、ＨＹＰＯＬ（登録商標）２０００、ＨＹＰＯＬ（登録商標）３０００、ＨＹＰＯＬ（登録商標）４０００およびＨＹＰＯＬ（登録商標）５０００として市販されており、これらの調製物は一般にポリエチレンオキシドおよび微量のポリプロピレンオキシドのコポリマーを含んでいる。
【００３２】
あらゆることを考慮すると、ハイドロゲルポリマーの主鎖には、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーを含むことが好ましい。理論的機構によって制約されるものではないが、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールハイドロゲルの非イオン性の親水的な特性によって、ハイドロゲルに対する分析物の非特異的結合の程度が低く、固定した生体分子の天然の構造および生物活性を維持するように生体分子に対する適合性が良好になると信じられている。イソシアネート官能性ハイドロゲルは、大量の液体を迅速に、かつ、ゲル物質の全体てきな基本形状が維持されるような比較的均一な方法で有利に吸収する。さらに、これらの物質によって吸収された水分は、使用する圧力下でも吸着物質内部に保持される。この一般的な種類のポリウレタンをベースとしたイソシアネート官能性ハイドロゲルは、米国特許第３９３９１２３号（Ｍａｔｈｅｗｓ他）、第４１１０２８６号（Ｖａｎｄｅｇａｅｒ他）および第４０９８６４５号（Ｈａｒｔｄｅｇａｎ他）に記載されている。このようなポリウレタンをベースにしたハイドロゲルは、表面コーティング剤として、および柔軟性または剛性発泡樹脂製品を形成するために広く使用されており、これらは、酵素反応系用の発泡樹脂製品を形成するためにも使用されている。
【００３３】
好ましい実施形態において、バイオチップは、水に活性なジイソシアネートでキャップされ、任意選択で適当な架橋結合剤で軽度に架橋結合することができる、高分子量ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシドまたはポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシドのコポリマーのジオールまたはトリオールに基づくイソシアネート官能性ハイドロゲルを使用して作製される。プレポリマーに存在する活性イソシアネートの量が予測できることが好ましく、たとえば約０．１ｍｅｑ／ｇと約１ｍｅｑ／ｇとの間が好ましく、約０．８ｍｅｑ／ｇ以下がより好ましい。一般に好ましいジイソシアネートには、芳香族をベースとしたジイソシアネート、たとえばトルエンジイソシアネートまたはメチレンジフェニル−イソシアネート、並びに脂肪族ジイソシアネート、たとえばイソホロンジイソシアネートが含まれる。ポリマー中の反応性イソシアネートの約１５％から約５％が結合要素を固定する部位をもたらすために使用されることが好ましく、プレポリマー中の反応性イソシアネートの１０％以下が結合要素の固定に使用されることがより好ましい。水混和性有機溶媒中で予備生成することができるバイオチップ作製用のプレポリマーの重合は、水の添加のみによって生じるウレア結合の形成によって起こる。
【００３４】
結合要素は、セル物質の重合中または前後に、各セルまたはマイクロスポットに直接的または間接的に固定することができる。直接的固定化には、ハイドロゲルに最初に結合する媒介剤が検討され、おそらく今度はそれに結合する第２の媒介剤の使用が検討される。たとえば、ハイドロゲルマトリックスに封入される第１の媒介剤は、カルモジュリンに対する抗体であることができる。カルモジュリンが抗体に一旦結合すると、カルモジュリンはカルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩなどのカルモジュリン結合蛋白質を隔離するために今度は利用される第２の媒介剤として働く。（よく引用される）ＣａＭキナーゼＩＩをハイドロゲルに付着するアプローチは、天然の結合モチーフを介して、すなわちカルモジュリン蛋白質によって結合する穏やかな方法を提供する。ＣａＭキナーゼＩＩは、たとえばＣａＭキナーゼＩＩの制御現象（リン酸化、脱リン酸化）を調べる目的のため、またはドッキング蛋白質またはその他の細胞内輸送蛋白質となり得るものを検索するために、分析物溶液を探索することに束縛はない。ＣａＭキナーゼＩＩを結合する他の方法は、機能の損失またはその他の有害な影響を引き起こし得る。
【００３５】
結合要素という用語は、特定の方法で１個または複数の標的分子と相互作用し、ハイブリダイゼーション以外の機構によってそれらを物理的に隔離できる物質を意味するために使用される。これらの非ハイブリダイゼーション結合要素には、限定はしないが、生物学的物質、たとえば受容体を含む蛋白質、ペプチド、酵素、酵素阻害剤、酵素基質、抗体などの免疫グロブリン、抗原、レクチン、修飾蛋白質、修飾ペプチド、２本鎖ＤＮＡ、生体アミンおよび複合炭化水素が含まれ、この種の特異的な結合活性を有するように設計された合成分子、たとえば薬剤および合成リガンドも含まれる。「修飾」蛋白質またはポリペプチドとは、分子内の１個または複数個のアミノ酸が、新規化学部分の付加、既存の化学部分の除去、または除去および付加両方の組み合わせによって改変された蛋白質またはペプチドを意味する。この改変には、天然および合成の両方の改変を含めることができる。天然の修飾には、限定はしないが、リン酸化、硫酸化、グリコシル化、ヌクレオチド付加、および脂質化が含まれる。合成的修飾には、限定はしないが、ハイドロゲルへの結合を容易にする化学的リンカー、および蛍光色素、微小構造、量子ドットなどのナノ構造、またはその他の合成物質の付加が含まれる。さらに、修飾には既存の官能性部分、たとえば水酸基、スルフヒドリル基またはフェニル基の除去、または天然の側鎖またはポリペプチドアミド主鎖の除去または改変が含まれる。複合炭化水素の例には、限定はしないが、天然および合成の直鎖および枝分かれオリゴ糖、修飾多糖、たとえば、糖脂質、ペプチドグリカン、グリコサミノグリカンまたはアセチル化種、および異種オリゴ糖、たとえば、Ｎ−アセチルグルコサミンまたは硫酸化種が含まれる。それらの合成的修飾、たとえば薬物、リガンド、色素またはスクリーニングおよび定量の目的のために有用なその他の薬剤等の分子の付加も含まれる。天然の複合炭化水素の例には、キチン、ヒアルロン酸、硫酸ケラタン、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、セルロース、およびアルブミンやＩｇＧなどの修飾蛋白質上に認められる炭化水素部分がある。このような要素の２つ以上の組み合わせは、マイクロチップアレイ上のいくつかの箇所に固定することができ、この組み合わせは２つの要素の１混合物として付加してもよいし、順番に付加してもよい。
【００３６】
隔離または非ハイブリダイゼーション結合するときの固定した要素と標的との間の相互作用の記述においては、特異的かつ選択的な形式で、一般には共有結合または非共有結合によって（たとえば、ファンデルワールス力および／またはイオン相互作用によって）２つ以上の分子が一緒に付着または結合することを意味する。特定の標的は、生物学的物質または合成物質の複合混合物中に存在することができる単純な分子であることができる。隔離または結合は、共有修飾または抗体−抗原相互作用などの延長的性質であってもよいし、あるいはリン酸化現象などの際に生じる一時的なものであってもよい。
【００３７】
ＤＮＡ結合要素には、限定はしないが、合成および天然のデオキシリボヌクレオシドの２本鎖ポリマー、合成および天然のポリリボヌクレオチド、アプタマー、および１個または複数の修飾されたまたは非天然の化学要素を有する合成ポリヌクレオチドが含まれる。結合／隔離剤としてのこのようなＤＮＡの使用は、標的ＤＮＡがハイブリダイズする１本酸ＤＮＡ（オリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡ）を一般的に使用した従来のヌクレオチドハイブリダイゼーションアレイと対照的である。２本鎖ＤＮＡは、生体分子を結合または隔離するために、適当な生体分子、たとえばＤＮＡ結合蛋白質、転写因子、たとえばエストロゲン受容体、または合成薬物または合成分子と（ハイブリダイズとは対照的に）相互作用するために使用することができる。例として、ＴＢＰまたはＳＰ１などの一般的な転写因子、または核ホルモン受容体などの遺伝子特異的転写因子を、螺旋２本鎖ＤＮＡに付着し、該螺旋２本鎖ＤＮＡによって隔離することができる。モノクローナル抗体とよく似た機能を示すアプタマーについては、米国特許第５８４０８６７に記載されている。
【００３８】
あるいは、ある実施形態において、ゲルマトリックス内に物理的に共重合された最初の結合要素、たとえば選択された抗体またはアプタマーなどのその他の選択的結合剤を用いることができ、１つまたは複数の異なる抗体がアレイの各セルに固定される。その後、生体物質の複合混合物をこのようなアレイに塗布した際、各セル内で固定されたこれらの抗体による特有の結合寄与が、このような複合混合物を「自己選別（ｓｅｌｆ−ｓｏｒｔ）」し、「自己会合（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｓ）」した新規アレイを形成し、この新規アレイは最初の結合要素に相補的である。たとえば、特定の抗原に対する抗体を重合中に各ゲルのマイクロスポット内に固定し、その後、特定の蛋白質またはペプチド抗原が、蛋白質またはペプチド抗原の混合物をそのようなアレイに曝露することによって同系の抗体それぞれに結合するために提供される。このような媒介抗体アレイの用途の一例は、各蛋白質をそれぞれ単離する必要なく細胞抽出物から蛋白質の複合混合物を自己選別することである。次いで、このように形成されたアレイを使用して、添加した蛋白質キナーゼまたはその他の蛋白質修飾部分に曝露した各部位にどんな影響が生じるかを評価することができる。この概念は、このような修飾された活性が、薬物またはその他の添加された化学的化合物によって影響を受けるかどうかを確かめるために適用することができる。
【００３９】
さらに他には、重合後、最初に固定された媒介剤を使用することによって、その他の結合要素をバイオチップアレイのセル内に局在または結合させることができる。たとえば、プロテインＡなどの適当な媒介剤を重合中に固定し、その後、溶液中でイムノグロブリンに制御しながら曝露することによって、所望のイムノグロブリン捕捉剤を固定したプロテインＡに結合させる。
【００４０】
さらに他の実施形態において、その後に最初に固定した結合要素を修飾することができる。このような修飾には、（ａ）生物学的修飾、たとえば、リン酸化、グリコシル化、アセチル化、メチル化、ユビキチン化、脂質修飾、およびＡＤＰ−リボシル化、または（ｂ）非生物学的修飾、たとえば、蛍光色素修飾、ビオチン化、アルキル化、および異常残基の導入、並びに他の蛋白質または酵素との結合によってアレイの改変された最終形態を生じること、が含まれる。さらに他の実施形態として、２本鎖核酸オリゴヌクレオチド（またはポリマー）を重合中に固定し、その後、所望の蛋白質をこの核酸に核酸配列特異的蛋白質の相互作用により結合し、自己会合蛋白質−核酸複合体アレイを作製する。
【００４１】
まず、プレポリマーと結合要素を非プロトン性溶媒中で反応させることによって結合要素を効率的にプレポリマーに固定するが、この方法はハイドロゲルの調製において多くの利点を有することができる。この方法はその後のプレポリマーの均一な水溶液の生成を助けることができ、重合混合物の粘度を低めることによりＣＯ２の気泡がゆっくり発生することが可能となるため重合工程中の二酸化炭素の発生を減速させるのに役立つこともできる。たとえば、ポリウレタンをベースとした重合では、いくらかのガス状の二酸化炭素が水とハイドロゲルプレポリマーのイソシアネート基との反応によって発生する。このような反応を図１および図２に示すが、このようなプレポリマーからバイオチップを調製した場合、二酸化炭素ガスの発生および二酸化炭素ガスのゲルからの逃避を制御するのに有利であることができる。重合が高粘度の混合物中であまりに迅速に起こった場合、発生した二酸化炭素ガスは逃れることができず、ゲル内に閉じこめることができる。この結果、ゲルマトリックスの連続性の問題となり得る離散性発泡マトリックスが生じ、光学的透明性の障害となり得る。バイオチップの設計において、光学的透明度が大きいほど、標的への結合に成功したことを示す蛍光の検出がより正確になる。二酸化炭素の発生を制御する１つの方法は、ｐＨを約８．５以下に維持して反応速度を制御し、したがって重合溶液中における二酸化炭素の拡散を制御する方法である。
【００４２】
非プロトン性溶媒中においてハイドロゲルを誘導体化する他の利点は、プレポリマーの沈殿を最小限に抑えることによってハイドロゲルの光学的透明度または透明性が高まることである。ゲルをゆっくり重合し、したがってＣＯ２をゆっくり発生させ、確実に連続的かつ透明なゲルマトリックスにする他の方法は、水に対する非プロトン性溶媒の比を少なくとも約０．２５から１、好ましくはより高めに、たとえば０．３〜０．３５から１に維持することである。ハイドロゲルの誘導体化および重合は、一般にこのような比において約３０分間で達成される。セルのプレポリマーに結合した結合要素の量は、単純に反応に添加する結合要素の量を（たとえば、各微小滴当たり蛋白質約１０ｆｍｏｌから約１ｐｍｏｌまで）変化させて容易に調整され、これによって各ハイドロゲル微小滴内に固定された結合要素の量をほぼ制御できる。
【００４３】
ゲルマトリックス内に固定された媒介剤または第１結合要素と相互作用する標的予定分子またはその他の第２結合要素のゲル内への拡散しやすさは、部分的には用いる溶液中のハイドロゲルプレポリマーの割合によって決定される。第６８３号特許では、ハイドロゲル小滴の調製にはプレポリマーの５％溶液を使用することが記載されているが、５％濃度では、蛋白質などのより大きい分子の重合ハイドロゲルへの拡散は所望するよりも遅い。現在のところ、より低い割合、たとえば３．５％のプレポリマーがより大きな生体分子をハイドロゲルに容易に通過させるためには好ましいことが見出されている。しかし、約３％未満のプレポリマー溶液では、得られるゲルは十分な構造完全性、および／または有用となる十分な重合に欠くであろう。したがって、抗体を視覚化ツールとして使用するなど、多くの適用において、ポリマーの範囲は３％と５％の間が好ましいと考える。ＩｇＧなどの一般的な抗体よりも小さいサイズの分子（またはより大きいサイズ、たとえばゲルがマイクロスフェアに封入または結合されている場合）を調べる場合などその他の適用および用途では、より高いまたはより低い溶液中のポリマー割合をそれぞれ使用することができる。
【００４４】
重合開始後および終了前に、まずハイドロゲルを蛋白質で誘導体化し、次に固相表面に沈着した場合、任意の好都合な方法で送達を達成することができ、たとえば微小滴のアレイを形成するためにゲルを沈着させる慣用のマイクロスポット機器を用いることができる。このようなゲルは、本来的に、ある基板に非共有的に付着し得るが、一般的にハイドロゲルの添加前に基板表面を誘導体化して、基板に対するゲルの確実な付着を達成する。たとえば、ガラスを基板として使用する好ましい一実施形態において、重合したハイドロゲルを沈着させる前にガラスをアミンで誘導体化する。次いで、蛋白質で誘導体化した重合ハイドロゲルは、誘導体化ガラス基板上に沈着したときに、いくつかの活性イソシアネート基とガラス表面上に局在するアミンとの反応によって、基板と強く結合する。これによって、ハイドロゲルと基板との共有的付着がもたらされ、プレポリマーに元々ある活性イソシアネート基の約５％以下がこの機能に使用されることが好ましい。
【００４５】
ある実施形態において、結合要素の一部を最初にブロックすることは、結合要素の効率的な固定を最大にするために好ましい。イソシアネートプレポリマーと、特定の結合要素に含まれるある種の化学的部分、たとえば１級アミンとの反応は、結合要素とポリマーとの間の過剰な架橋結合を生じ、これによって結合要素の変性が引き起こされ、または標的化合物に対する結合親和性が低下し得る。重合中にこれらの部分の少なくともいくつかを保護することによって、このようなことを回避または制限することができ、次いで、重合後の脱保護によりアレイ内の結合要素の機能性および有効性を回復する。すなわち、重合後の脱ブロックにより、結合要素が天然の構造を確保することが可能となる。このようなブロック／脱ブロックは、共有または非共有手段のいずれかによって達成することができる。たとえば、結合要素として抗体を使用するとき、ポリマーに架橋結合しやすい抗原認識部位を、プレポリマーと混合する前に非架橋結合ペプチド（またはその他のエピトープ様物質）とインキュベートする。このようなペプチドまたはエピトープ様物質は、重合過程中、抗原認識部位を反応性イソシアネート基との複合体化から保護する。重合後、たとえば酸、ｐＨ３．０に短時間曝露してこのようなペプチドを抗体から放ち、したがって抗体の抗原認識部位を再度曝露する。同様の機構を使用して結合要素上の選択されたスルフヒドリル部分またはアミンを保護することができる。これらは、重合過程の間、これらの官能基を保護するための周知の可逆的化学誘導体化方法を使用することができる。
【００４６】
第６８３号特許における留意点は、重合中に直鎖の伸長を容易にするためにポリエチレングリコールを増粘剤として添加することができることである。その後、その他の化合物を重合中にハイドロゲルに添加して、蛋白質などの結合要素の安定性および天然の活性を維持できることが発見された。結合要素を安定化するために、場合によっては非結合性添加物をプレポリマー混合物に含めることができる。これらの添加物には、限定はしないが、グリセロール、フィコール、およびエチレングリコール並びにマンニトール、スクロースおよびトレハロースなどの糖類が含まれる。ハイドロゲルの架橋結合の程度を制限することが望ましい場合、ウシ血清アルブミンなどの非特異的（非結合）蛋白質を含むその他のバルク剤を用いて蛋白質などの要素の活性を補助することもできる。
【００４７】
他の添加物の任意選択による使用は、重合したハイドロゲル内の領域またはドメインを生成する物質を用いることである。重合が完了すると、これらの物質は水溶液に溶けるか拡散し、これらの物質がない場合に存在するものよりも大きな孔、空胞または通路をハイドロゲルポリマー内に残す。このような大きな孔の存在は、ハイドロゲル上部または内部に広い表面積を作りだし、ハイドロゲル中に容易に分散するには大きすぎる生体分子などを結合する能力を増大させる。
【００４８】
ハイドロゲルポリマーは、限定はしないが、合成分子などの物質、薬物、非ペプチド受容体リガンド、金属ポルフィリンなどの混合された有機／無機種、およびゼオライトなどの無機物質を含むその他の結合要素にも適している。好ましい一実施形態において、これらの要素は、結合要素と分析物種との間の特異的な相互作用をに基づいて化合物を溶液から隔離するために用いられる。他の好ましい実施形態において、これらの結合要素は一時的に溶液中の種と相互作用する。これは、結合要素がリン酸化やメチル化などの反応プロセス、切断またはその他の形態の修飾のための選択的基質として役立つ場合である。さらに他の実施形態において、導入された物質は反応の触媒に関与することができる。このような触媒物質は生体反応において有用であることができる。あるいは、種々の触媒要素のアレイを使用して、最も効率的な触媒要素をスクリーニングすることができる。一般に、このような結合要素を用いて調製されたこれらのハイドロゲルは、限定はしないが、生物学的アッセイ、物質スクリーニング、およびセンサーを含む種々の作業に有用である。
【００４９】
あるいは、図３Ａに図示したように、重合前または重合中のいずれかにおいて非生物学的化合物、たとえばアミン誘導体化Ｃ４〜Ｃ８の適当なリンカーを有する３配位または４配位金属キレート剤、たとえばイミノ二酢酸またはニトリロ三酢酸を媒介結合剤としてハイドロゲルに固定する。図３Ｂに図示したように、望ましい蛋白質などの結合要素は、たとえば蛋白質の尾部または頭部の末端として、複数のヒスチジン含有配列を有するように合成または修飾されることが好ましく、次いでこのような末端残基と共にキレートし、固定したキレート剤との結合によってハイドロゲル内に蛋白質を物理的に固定するように、Ｃｕ２＋またはＦｅ３＋などの２価または３価金属イオンと共に曝露することによってバイオチップの各セルに固定することができる。各セルを特定の結合要素、たとえば種々の蛋白質捕捉剤に曝露することによって、分析使用に安定な蛋白質チップが形成される。このようなポリマー微小滴を生成する際に媒介剤を使用する１つの利点は、特に影響を受けやすい蛋白質が変性する可能性が回避され、最終的な結合要素蛋白質の構造および立体配置が変化しないで維持されることである。特定の蛋白質マイクロアレイ中に各微小滴またはセルを生成し、その後それに結合剤を結合するために同キレート剤を使用することにより製作を簡単にすることができる。
【００５０】
バイオチップ基板は、結合アッセイおよび個々のセルに結合した標的分子のその後の検出の際の自動操作を助ける種々の物質および形式から成ることができる。スライドガラスなどの平坦な固相プレートが適しているが、個々のセルを保持するようにプレート中に形成された凹部またはウェルを有するプレートを使用することができる。ガラスなどの光学的に透明な基板または透明なポリスチレンはセルを通過する透過光の検出ができ、蛍光または光学的吸収を用いた検出様式に好都合である。三次元ハイドロゲルセルは高い結合能を有するので、反射光での方法も可能であり、不透明な基板も使用できる。硬い基板を使用すると、バイオチップを使用した分析検出段階でのアラインメントが正確になるが、適当なアラインメントがセルに導入され検出が容易な場合はこのようなことは必要ではないだろう。たとえば、テープまたはフィラメントなどの柔軟性のある形式は、磁気テープの使用と同様のスキャン形式によって正確に検出することできる。光学的方法および適当な基板は簡便さのため好まれるが、放射活性剤の検出などのその他の生化学的検出法を使用することもできる。一般に、セルは何個でも（たとえば１から１０００個）バイオチップ上に付与することができる。自動操作を助けるために、９６個の倍数のセルを使用することが多い。たとえば、３８４個のセルを３インチ（７．６ｃｍ）×５インチ（１２．７ｃｍ）プレート上のアレイに付与することができる。複数のセルを使用することが好ましいが、１個のみのセルを使用したバイオチップもある条件では十分であることができる。
【００５１】
ある実施形態において、ハイドロゲルセルの重合後に結合要素をハイドロセルに添加することが好ましいだろう。これを達成するには、単純拡散は効果的でない手段であろう。迅速にハイドロゲル内に拡散する小分子は、その後の使用過程において迅速にハイドロゲル外に拡散し、それによってこれらの結合要素の損失が生じる。したがって、このような迅速に拡散する薬剤、たとえば小分子およびペプチドの場合、マトリックスに拡散した後、このような薬剤を重合マトリックスに共有結合する機構を有することが好ましい。これを達成するための好ましい１つの手段には、組成の一部としてポリマー内に含有されるか、またはポリマーに拡散した小分子に結合させて架橋結合を実施するために適当な部分、たとえば光活性化試薬または化学的架橋結合試薬が使用される。
【００５２】
これに対して、蛋白質および大きなＤＮＡセグメントなどのより大きな結合要素は、受動的拡散によってハイドロゲルマトリックス中に効率的に移動することができない。より大きな種が容易にマトリックス中に拡散するように、蛋白質などの正味の電荷を有する種の移動を制御するような方法で蛋白質の等電点とは異なるｐＨ値を有する溶液内で電界をかける。この方法を「電気泳動」という。ハイドロゲルセルが荷電した種の移動経路内であれば、荷電した種は受動的拡散力に加えて電界をかけることによって与えられる他の力を受け、それによってハイドロゲル内に加速される。この電界によって促進される拡散の利点は、その後のアッセイ工程中にこれらのより大きな結合要素がハイドロゲルマトリックスから簡単には受動的に拡散しないことである。
【００５３】
ハイドロゲルを重合した後、ハイドロゲルセルによって占有されていない基板表面をその後のアッセイ試薬、標的分子またはその他の物質の非特異的または所望しない付着を減少させる薬剤または物質で処理することができる。アッセイ試薬が表面に非特異的に結合することができ、したがって溶液中のアッセイ試薬または標的分子の有効濃度が実質的に減少する可能性がある場合に、これは特に有用である。あるいは、このような処理は、表面から観察されるバックグラウンドシグナルの量を減少させ、それによってアッセイの目的に対するハイドロゲルセルの有効性を高めるために使用することができる。
【００５４】
このような曝露表面領域の処理としては、最初の層として存在するか、あるいは基板表面上にコーティングされた１級アミンと反応する試薬の使用が含まれる。これらの試薬には、限定はしないが、１級アミン、およびスクシニルエステルなどの求核反応性部分で官能化された非重合小分子に共有結合する、イソシアネートなどの反応性部分を含有する少なくとも１つの末端を有する活性化ポリエチレングリコールポリマーが含まれる。あるいは、ガラスのシラン処理、または、分子生物学用途の当業者に周知のバックグラウンドシグナルを減少するために通常使用されるウシ血清アルブミンなどの標準的ブロック試薬を使用することができる。
【００５５】
この系に含まれる全反応、すなわち（１）直接蛋白質プローブによって、または媒介剤によってハイドロゲルプレポリマーを誘導体化する反応、（２）ハイドロゲルの重合および（３）誘導体化したハイドロゲルの基板表面への結合は、強力な尿素またはウレタン（カルバメート）結合が関与する。これらの結合は、微小滴アレイに機械的完全性を与え、バイオチップの半減期を著しく延長させる。
【００５６】
後述するある好ましい実施形態において、基板上に重合した後のハイドロゲル微小滴の厚さは、好ましくは少なくとも約３０μｍ、より好ましくは少なくとも約５０μｍ、最も好ましくは約５０μｍと１００μｍとの間である。さらに、微小滴は一般に楕円形で、このような系で以前使用された正方形のゲルセルと対照的である。ゲル微小滴（またはセル）が全体的に大きいことによって、そこに固定される結合要素の量が著しく増加し、それによってバイオチップの検出限界をより低く減少させることができ、使用しやすくなる。ポリマー溶液の粘度を減少させ、バイオチップ基板上にマイクロスポットするために今まで使用されてきた分散機構に適当な修飾を加えることによって、より小さな個々のセルを作製することができ、超高密度バイオチップアレイができる。ウェルを有する基板を使用する場合、微小滴をウェルの底部に沈着させる。
【００５７】
以下の実施例は蛋白質チップに関連したいくつかの適用を例示している。蛋白質−蛋白質相互作用の研究に適した代表的なバイオチップの例は、カルシニューリンに対するカルモジュリンのカルシウム依存方法による結合である。蛋白質−ＤＮＡ相互作用に適したバイオチップの例は、ＤＮＡに対するラムダリプレッサー蛋白質の結合である。もちろん、これらのバイオチップは抗原−抗体相互作用に適しており、操作実施例では詳細に示していないが、前述したその他のこのような相互作用にも適していることは理解されるだろう。
【００５８】
実施例１．生体活性を増強するための添加物（グリセロール／トレハロース）の使用
以下の実施例は、不活性な蛋白質、単純な炭化水素および湿潤剤がこれらのバイオチップのハイドロゲル固定抗体活性に保護効果を有し、全体的なシグナルおよびアッセイの性能を高めることを示している。
【００５９】
パネルＡ−トレハロース。この実験では、トレハロース保存溶液、５０ｍＭ  ホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０中の５０％ｗ／ｖ  Ｄ（＋）トレハロース２水和物のアリコートを最終量５０μｌのハイドロゲル配合物に添加した。この配合物には、最終濃度３．５重量％のＨＹＰＯＬ  ＰｒｅＭＡ（登録商標）ハイドロゲルプレポリマー（ＨＹＰＯＬ、アセトニトリル、Ｎ−メチル−２−ピロリジノンをそれぞれ重量比１：３：３で含有する予備混合した保存溶液）、抗トランスフェリン（リン酸緩衝食塩水１Ｘ（ＰＢＳ）中４ｍｇ／ｍｌ、２μｌウシＩｇＧ（ＰＢＳ中５０ｍｇ／ｍｌおよび１．２５％グリセロール）も含まれる。トレハロースの量は、最終ｗ／ｖパーセント、０．１％、２％、５％および１０％トレハロースに対応して、０から１０μｌで変化させる。蛋白質を含まないブランクハイドロゲルスポットも含める。これらの試験溶液を試料あたり３ピン、アミンコーティングスライドガラスに１ピンあたり２箇所スポットした。封入された試験蛋白質は抗トランスフェリンで、この系をＣｙ３蛍光色素標識トランスフェリン（Ａｍｅｒｓｈａｍ、０．１％トリトン１００を含有したＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中、約０．１μｇ／ｍｌ）、および１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））と４５℃で振盪しながら指定した時間インキュベートした。インキュベーション後、スライドを２×１０分ＰＢＳＴで洗浄して、次いでＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｌｉｔｅスライドスキャナを使用して画像化した。ブランクハイドロゲルスポットのシグナルは検出不可能であり、０％トレハロースは弱いシグナルを有していた。１％および２％トレハロースは少し強く、５％は強いシグナルを有し、１０％は最も強いシグナルを有する。これらの結果によって、トレハロースの添加はハイドロゲル中の試験抗体の生体活性に正の影響を有することが示される。
【００６０】
パネルＢ−グリセロール。ホウ酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ８．０中の２０％保存液として溶解したグリセロールを、最終濃度３．５％のＨＹＰＯＬ  ＰｒｅＭＡ（登録商標）Ｇ−５０、抗トランスフェリン、ウシＩｇＧ、および５％トレハロースを含有する前述のハイドロゲル配合物に添加し、最終濃度０％、０．５％および１％、たとえば保存グリセロールを０μｌ、１．２５μｌおよび２．５μｌとした。前述のアッセイのように、Ｃｙ３蛍光色素標識トランスフェリン系をアッセイ用に使用した。パネルＢについては、グリセロールを半パーセント増加させる毎に、シグナル強度が増加するので、抗体活性に対して正の効果が証明された。
【００６１】
実施例２．拡散（％ハイドロゲル３％対５％）
以下の実験は、ハイドロゲルのパーセントがハイドロゲルマトリックス中の結合要素の拡散に影響を及ぼすことを示している。
【００６２】
実施例１で説明した方法を使用して、マウスＩｇＧを３％、４％および５％ハイドロゲルそれぞれに固定した。ＢＳＡを非特異的結合対照として別のスポットとして含めた。ポリマーの重合に続いて、アレイをローダミン標識ウサギ抗マウス抗体の溶液で１時間インキュベートし、次いで洗浄した。マウスＩｇＧ抗体に結合したウサギの抗マウス抗体、および結合の程度をＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｌｉｔｅスライドスキャナを使用して各位置の蛍光によって測定した。同一の結合条件および結合時間では、ハイドロゲルスポットのパーセントが少なければ少ないほど、より強い結合シグナルが示された。このことは、これらの低パーセントにおいて、ローダミン標識ウサギ抗マウスＩｇＧのハイドロゲルマトリックスへの拡散速度が速いことを示している。
【００６３】
実施例３．非特異的結合をブロックするため／スライドのバックグラウンドを低下するためのコーティングの使用
Ｎ−ヒドロキシスクシニミジル活性エステル（ＮＨＳ）活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ−ＮＨＳ  ５Ｋ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を０．０５Ｍ  重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．２５に溶解し、最終ＰＥＧ濃度を５０ｍｇ／ｍｌとした。コーニング製アミノシランスライドを、ポリマーの表面グラフトに使用した。Ｇｒａｃｅ−Ｂｉｏｌａｂｓハイブリダイゼーションチャンバー（ＳＡ５００−３ＬＣＬＲ）を反応容器として使用した。表面をコーティングするために、３枚のスライドはＰＥＧ溶液で室温（ＮＳＨ  ｒｔ）において振盪機上で３時間処理し、３枚のスライドは３時間４５℃（ＮＨＳ  ４５）で処理し、他のスライドは対照としてＤＩ水中で３時間４５℃処理した。
【００６４】
ＰＥＧ処理後、ハイブリダイゼーションチャンバーを取り除いて、このスライドをＰＢＳで１０分間洗浄して、次に蒸留水で１０分間洗浄して、その後空気乾燥した。Ｃｙ３−標識グリア細胞由来神経栄養性因子をＰＢＳＴに溶解した。スライドを室温で１時間インキュベートした。次に、ＰＢＳで１０分間、蒸留水１０分間洗浄した。次いでこのスライドをＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｌｉｔｅスライドスキャナを使用してスキャンした。両条件設定で処理した後、バックグラウンド強度シグナルは５〜１０倍低下し、表面上の蛍光物質の非特異的吸収の減少にＰＥＧコーティングが効果的であることを示している。
【００６５】
実施例４．バイオチップ上の蛋白質−ＤＮＡ相互作用
以下の実験においては、図４Ａに示したように、１本鎖ＤＮＡをまずハイドロゲルに結合させた後、その後の標的蛋白質の隔離に有効なハイブリダイゼーションを行う。
【００６６】
５’アミノ就職、１本鎖細菌λリプレッサー結合配列ＯＲ２ＯＲ１（ｗｔ）および結合部位に１塩基変異を有するその変異体（ｍｕｔ）（配列は図４Ｂに示す。結合部位には下線が引いてある）を、３．７５％ＨＹＰＯＬ（商標）中１３０μＭでアミノシラン化スライドにプリントした。プリントされたスポットを個々のハイブリダイゼーションチャンバーに封入し、対応する相補配列と３Ｘ  ＳＳＣ、０．１％トリトンＸ−１００、ＭｇＣｌ２５ｍＭ中１μＭで、４５℃で１８時間ハイブリダイズさせた。次に、得られた２本鎖ＤＮＡを、結合緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ  ７．６）、ＮａＣｌ  １００ｍＭ、ＣａＣｌ２  １ｍＭ、ＥＤＴＡ  ０．１ｍＭ、ＢＳＡ  ０．１ｍｇ／ｍｌ、ポリ（ｄＡ−ｄＴ）２．５μｇ／ｍｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、ＤＴＴ  １ｍＭ）中で、Ｃｙ３−標識バクテリオファージラムダリプレッサーλＣＩ  １．５μｇ／ｍｌと室温で２時間インキュベートした。Ｃｙ３−標識λＣＩを結合反応終了時に除去し、スライドを結合緩衝液、次いで脱イオン化Ｈ２Ｏ（ｄＨ２Ｏ）で簡潔に洗浄し、ＧＳＩレーザースキャナで画像化した。別個のスライドにおいて、２本鎖ＤＮＡを製造元の方法にしたがってＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）で染色し、ＤＮＡ総含量をＧＳＩレーザースキャナによって視覚化した。
【００６７】
Ｃｙ３標識λリプレッサーの天然のオペロンｄｓＤＮＡ配列に対する結合は、対応するスポット中の蛍光シグナルが得られることによって示された。変異体スポット中に強い蛍光がなければ、相互作用が配列特異的であることが示される。ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（２本鎖ＤＮＡ染色）で染色したプリントスライドの蛍光をλリプレッサーのＣｙ３蛍光と比較することにより、野生型ＯＲ２ＯＲ１配列に関連したＣｙ３シグナルを発生するのは、不均一にプリントしたＤＮＡに対する非特異的蛋白質結合ではなく、配列特異的λリプレッサー−λオペロンの相互作用であることが確認される。野生型配列への結合間のシグナル強度が変異配列と比較して１００倍異なることにより、ハイドロゲルマトリックス内に固定した２本鎖ＤＮＡに対する反応の特異性が確認される。
【００６８】
実施例５．バイオチップ上の蛋白質−ＤＮＡ相互作用
この実験では、重合および固定化の前に、２本鎖ＤＮＡを予備ハイブリダイズし、次いで標的蛋白質を結合させる。
【００６９】
２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡバイオチップは、プリントした５’アミノ修飾予備ハイブリダイズｄｓＤＮＡによって直接作製することもできる。この方法は、１本鎖ＤＮＡをプリントした後に同種のオリゴヌクレオチドをこのプリントしたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせて結合要素を形成した、今までの実施例とは異なる。
【００７０】
この実施例では、５３ｋＤ蛋白質であるエストロゲン受容体（ＥＲ）はホモダイマーとして共通のエストロゲン応答要素（ＥＲＥ）に結合する。野生型ＥＲＥ配列は、受容体と結合するために重要であることが知られている領域の４個のヌクレオチドが変異配列と異なっている。野生型配列は、配列５’−ｔｔｔａｃｇｇｔａｇａｇｇｔｃａｃｔｇｔｇａｃｃｔｃｔａｃｃｃｇ−３’の３２塩基のオリゴマーである。変異配列は４個のオリゴヌクレオチド（下線）が異なっており、配列５’−ｔｔｔａｃｇｇｔａｇａｇｇｔｃａｃｔｇｔａｔｇｇｔｃｔａｃｃｃｇ−３’を有する。プリント用のｄｓＤＮＡを生成するために、関心のあるアミン結合オリゴヌクレオチドおよびその相補的オリゴヌクレオチドそれぞれの６５０μＭ保存液の５μｌをＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液、ｐＨ８（３ｘＳＳＣ、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ）４０μｌで１：６５０（最終濃度６５μＭ）に希釈して、最終反応量を５０μｌとする。反応生成物を９５℃で１０分間インキュベートし、次いで氷上で３分間冷却する。この２本酸ＤＮＡ  １０マイクロリットルを、３．７５％ポリマー、０．５％グリセロールおよび５０ｍＭ  ホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０から成る溶液を使用して４５０μｍハイドロゲルスポット内にプリントする。ＰＢＳＴ中の１％ＢＳＡ溶液で１時間ブロックした後、ＥＲ濃度１．１５３μＭの形態の転写因子１μｌを適当な緩衝液（１０％グリセロール、ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ、ＫＣｌ  ３０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ０．１ｍＭ、ＤＴＴ  ０．２５ｍＭ、Ｎａ２ＨＰＯ４  １ｍＭ、ｐＨ７．９）で希釈して、ｄｓＤＮＡを１時間室温で結合させ、次いでＰＢＳＴによる１０分間洗浄を行った。ＥＲ−ＥＲＥ複合体を次に１：１００に希釈したウサギ抗ＥＲβ抗体でＲＴで１時間インキュベートし、次にＰＢＳＴで３０分間洗浄した。次に１：１０００に希釈したヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ｃｙｓ複合体でＲＴで１時間インキュベートし、次にＰＢＳＴで３０分間洗浄した。実験全体を図５に図式で示す。このスライドをｄＨ２Ｏで洗浄し、ＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｌｉｔｅスキャナで画像化する前に空気乾燥した。シグナル分析は、ＡｒｒａｙＰｒｏ  ４．０ソフトウエアを使用して実施した。対照が類似している変異配列シグナルと比較して野生型配列を含有するスポットで観察されたシグナルが増大していることによって、ハイドロゲルマトリックス内でエストロゲン受容体の標的配列に対する結合特異性が保持されていることが示唆される。
【００７１】
実施例６．抗原バイオチップ
この実験は、ハイドロゲル基盤はさらに他の結合要素、たとえば抗原を結合するマトリックスとして使用できることを示す。抗体−抗原相互作用は、通常種々の生物学的アッセイにおいて使用され、（抗体または抗原の）いずれかの成分を結合する能力は支持体として望ましい特性である。この実施例では、抗原をハイドロゲル内に結合させる。
【００７２】
実施例１で説明した方法を使用して、蛋白質抗原、ヒトトランスフェリン（０．２ｍｇ／ｍｌ）を、５％トレハロースを有する３．３％ハイドロゲル、ＢＳＡ  ２ｍｇ／ｍｌで様々に希釈して、直接アミンコーティングしたスライドガラス上に固定した。５％無脂肪ドライミルクでブロックした後、スライドを種々の濃度の抗ヒトトランスフェリンを含有したマウス腹水液で１時間インキュベートした。インキュベート後、スライドをＰＢＳＴで１０分間３回洗浄した。結合したマウス抗トランスフェリン抗体は、スライドをＣｙ３標識ロバ抗マウスＩｇＧでインキュベートして視覚化し、次にレーザースキャナで画像化した。３オーダーの希釈度、すなわち０．１から０．００１にかけて直線的な用量応答が認められた。この用量応答関係は、ハイドロゲル内に結合した抗原の機能、およびアッセイ方法全体の一部として、マトリックス中に段階希釈した抗体を支持するハイドロゲルの透過性を示している。
【００７３】
実施例７．抗体バイオチップ
前実施例で記したように、抗体−抗原反応は通常生物学的アッセイに使用される。この実施例では、実施例６で抗原を結合したのとは逆に、抗体をハイドロゲルマトリックスをハイドロゲル内に結合させる。
【００７４】
実施１の方法に従って、抗ヒトトランスフェリン、抗ＢＳＡおよび抗ＰＳＡ抗体（０．４〜０．８ｍｇ／ｍｌ）を、アミノシラン化スライドガラス上の５％トレハロース、ウシＩｇＧ  ２ｍｇ／ｍｌおよび０．５％グリセロールを存在させた３．３％ハイドロゲルに固定した。次に、このスライドを、１％ＢＳＡを含有したＰＢＳＴ中１ｍｇ／ｍｌの濃度のＣｙ３標識した個々の抗原と室温で一晩インキュベートした。結合した蛋白質は、ＰＢＳＴで何度も洗浄した後、レーザースキャナイメージングによって視覚化した。マイクロアレイ上の対応する抗体部位に標識標的蛋白質が存在することにより、ハイドロゲルマトリックス中で抗体機能が保持されていることが示された。
【００７５】
実施例８．多層ＥＬＩＳＡアッセイ
より複雑な結合相互作用を支持する能力は、ハイドロゲルマトリックスに望ましい特性でもあり得る。この実施例では、抗体を第１結合要素として結合したハイドロゲルを使用する。次いで抗原を特異的に局在化し、続いて視覚化のために他の結合現象を加え、このことは蛋白質による多数の結合現象に関するハイドロゲルの生体適合性、および蛋白質機能維持の確認を示す。
【００７６】
実施例１に概略を示した方法によって、ラット抗マウスＩＬ−２モノクローナル捕捉抗体（ＢＤ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、アミノシラン化スライドガラス上の５％トレハロース、ウシＩｇＧ  ２ｍｇ／ｍｌを有する３．３％ハイドロゲルに直接固定した。このスライドをフィトヘマグルチニン刺激マウスＬＢＲＭ−３３  ４Ａ１細胞または未刺激細胞の希釈培養液と、適度に混合しながら室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ１５分洗浄を２回行った後、スライドをビオチン化ラットモノクローナル抗マウスＩＬ−２検出抗体（ＢＤ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と室温で１時間インキュベートした。遊離抗体は、ＰＢＳＴ１５分洗浄を３回行うことによって除去した。その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ複合ストレプトアビジンをこのスライドに添加し、室温でさらに１時間インキュベートした。推奨プロトコールに従ってストレプトアビジン−ＨＲＰを徹底的に洗浄した後、ＴＳＡ試薬系のＣｙ３チラミド基質を、プリントしたスポットが完全に覆われるようにこのスライドに添加する。未反応基質を洗浄後、スライドをレーザースキャナイメージングによって分析する。蛍光シグナルが８倍増加したことによって、ハイドロゲル内に結合された抗体によって結合した抗原の存在が示された。
【００７７】
実施例９．多層小分子媒介（ＣａＭ／カルシニューリン）
複数の蛋白質間の複合した総合作用は、支持体表面上で実施することが困難であることが多い。しかし、以下の実施例は、小分子によって媒介される多数蛋白質相互作用の使用を示しており、図６に図示する。
【００７８】
実施例１の方法によって、実施例１の方法と同様にマウス抗ウシ脳カルシニューリンモノクローナル抗体（０．４ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）、ヒツジ抗ウシカルモジュリン抗体（０．２ｍｇ／ｍｌ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）および対照ウシＩｇＧ（０．４ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれ、アミンコートしたスライドガラス上の５％トレハロース、ウシＩｇＧ  ２ｍｇ／ｍｌを有する３．３％ハイドロゲルに直接固定した。その後、スライドを５％粉乳でブロックした後、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）、ＫＣｌ  １３０ｍＭ、０．１％トリトンＸ−１００、ポリグルタミン酸  １０μｇ／ｍｌ中のウシカルシニューリン０．１ｍｇ／ｍｌでインキュベートした。Ｃｙ３−標識ニワトリカルモジュリンをＰＢＳＴ、１％ＢＳＡ中のＣａＣｌ２  １ｍＭまたはＥＧＴＡ  ５ｍＭの存在下で、室温で１時間カルシニューリン処理スライドに結合させる。結合したカルモジュリンをレーザースキャナイメージングによってＣｙ３励起発光波長で視覚化した。抗カルシニューリン抗体の位置のシグナル強度が、カルシウムの存在下でカルシウム無し（すなわち、ＥＧＴＡ存在下）の６倍に増加したことによって、ハイドロゲルが蛋白質および小分子の両方を含む複合生体分子相互作用を支持する能力を有することが示される。
【００７９】
実施例１０．チロシンリン酸化ペプチドのバイオチップによる特異的検出
ハイドロゲルマトリックスは、非常に広範な結合要素およびアッセイ形式に適合する。この実施例では、ペプチド結合要素内のリン酸化アミノ酸の使用を示す。
【００８０】
各ペプチドを濃度４０μＭで、４連ずつ２対でスライド上に並べてプリントした。実施例１の方法によって、０．５％グリセロールを含有した３．５％ＨＹＰＯＬ（商標）中にペプチドを固定した。以下の表１に挙げたペプチドをスライドにプリントした。
【００８１】
【表１】
2004518138.tif 000002
【００８２】
慣用の略号、ｐＴｒｙ＝ホスホチロシンおよびｐＳｅｒ＝ホスホセリンを使用している。
【００８３】
以下のインキュベーション工程全てにおいて、スライドガラスをスライドガラス染色皿中のロッカー上でインキュベートした。ペプチドバイオチップを１％ＢＳＡ（０．１％トリトンＸ−１００を含有するＰＢＳ中）で室温で６０分間ブロックして、次に１％ＢＳＡを含有するＰＢＳＴで１：２０００に希釈したビオチン化抗ホスホチロシン抗体と４℃で一晩インキュベートした。室温でＰＢＳＴで１０分間、２回洗浄し、このスライドを１％ＢＳＡを含有するＰＢＳＴで１：２０００に希釈したＣｙ３標識ストレプトアビジンとインキュベートした。その後、スライドを室温でＰＢＳＴで１５分間、３回洗浄した。蒸留水で軽く洗浄した後、スライドを空気乾燥し、ＧＳＩ  Ｌｕｍｏｎｉｃｓスキャナを使用してスキャンした。その結果から、ホスホチロシンを含有する箇所では蛍光シグナルが存在し、ホスホセリンを含有する箇所を含む他の箇所には存在しないことが示され、ハイドロゲルに結合したイソシアネートにもかかわらず、ホスホペプチドは適当な天然の構造を保持し、抗体によって認識されることができることが示された。
【００８４】
実施例１１．チロシンホスファターゼを有するバイオチップ上でのチロシンリン酸化ペプチドの脱リン酸化
前記の実施例において、長期に渡る（分または時間）特性の結合相互作用を支持するためのハイドロゲルマトリックスの使用について例証した。以下の実験は、マトリックスが、酵素活性に関与する結合相互作用など一時的な結合相互作用をも支持することを示している。この実施例では、ホスホペプチド基質は、ハイドロゲルマトリックス内に結合されており、次いでリン酸基を除去する酵素の基質として働く。次に、残存するリン酸基を実施例１０の方法を使用して検出する。
【００８５】
実施例１０で説明したものと同じ実験方法を使用して、プリントしたスライドを、供給された反応緩衝液（１Ｘ  ＬＡＲ緩衝液：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＮａＣｌ  ５０ｍＭ、Ｎａ２ＥＤＴＡ  ２ｍＭ、ジチオスレイトール  ５ｍＭ、０．０１％  Ｂｒｉｊ−３５、ｐＨ７．０、２５℃。１Ｘ  ＹＯＢ緩衝液：５０ｍＭ  Ｈｒｉｓ−ＨＣｌ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ、Ｎａ２ＥＤＴＡ  ２ｍＭ、ジチオスレイトール  ５ｍＭ、０．０１％  Ｂｒｉｊ−３５、ｐＨ７．０、２５℃）中の白血球抗原関連（ＬＡＲ）蛋白質チロシンホスファターゼ６単位またはエルシニアエンテロコリチカ（ＹＯＰ）蛋白質チロシンホスファターゼ６単位で、４３０μＬのチャンバー内において室温で１０分間インキュベートした。その後、チャンバーを取り除き、スライドガラスをスライドガラス染色皿に移した。スライドを室温でＰＢＳＴによるペルバナジン酸ナトリウム（汎用チロシンホスファターゼ阻害剤）１ｍＭ溶液で２×１０分洗浄した。その後、実施例１０で説明したように、スライドを１％ＢＳＡでブロックして、ビオチン化抗ホスホチロシン抗体でインキュベートして、Ｃｙ３−ストレプトアビジンを結合させた。実施例１０で早期に観察された蛍光シグナルの損失によって、ホスホリラーゼ酵素がハイドロゲルに入り、生物学的活性を維持し、かつ１つまたは複数の基質、すなわち結合されたホスホペプチドとの一時的な相互作用を維持する能力があることが示された。より詳細には、この結果によって、ＬＡＲ−ＰＴＰアーゼが選択的にリン酸基をペプチド番号１から実質的に完全に除去するが、ｐＴｙｒを含有する残存ペプチドではより少ない程度除去されることが示される。ＹＯＢ−ＰＴＰアーゼ酵素はペプチド番号１、３、６、８および１３からリン酸基を実質的に完全に除去する。この酵素は、ペプチド番号２、７、１０、１４および１５からリン酸基を有意に除去し、すなわちそれらのペプチドについてＬＡＲ−ＰＴＰアーゼが除去するより大きい程度で除去する。したがって、蛍光が種々のホスホペプチドから得られたことによって、ある種のホスホペプチド配列に対する２種のホスホリラーゼ酵素の一部に対する選択的特異性が示された。
【００８６】
実施例１２．金属キレート剤
結合要素の起源は生物である必要はなく、種々の合成分子も使用することができる。この実施例では、蛋白質分子内に存在する多数のヒスチジン分子に結合するために役立つ金属キレート剤をハイドロゲルマトリックス内で金属イオンの結合ために使用する。
【００８７】
Ｎｉ＋＋またはＣｕ＋＋ＮＴＡハイドロゲルは、種々の量のニトリロ三酢酸とＨＹＰＯＬ（商標）溶液を混合して生成し、スライドガラス上にスポットする。重合したゲルスポットをｄＨ２Ｏ中の酢酸５０ｍＭで洗浄し、Ｃｕ（ＮＯ３）２またはＮｉ（ＮＯ３）２  ５０ｍＭを添加する。次いで、これらをＫＮＯ３  ０．１Ｍを含有するｄＨ２Ｏ中の酢酸  ５０ｍＭ（ｐＨ  ４．０）で洗浄して、最後にｄＨ２Ｏで洗浄した。６ｘＨｉｓタグを付けた緑色蛍光蛋白質１０μｇ／ｍｌ（１％ＢＳＡを含有するＰＢＳＴ中）をスライドに添加し、未結合の遊離６ｘＨｉｓ−ＧＦＰを除去後、自家製ＣＣＤカメラによって、適当な励起、発光フィルタを使用してＰＢＳ中で画像化した。キレート剤の増加に対応して蛍光シグナルの増加が認められ、ハイドロゲルマトリックスにおいて媒介結合剤として小分子が使用できることを示している。
【００８８】
実施例１３．バイオチップ上のα−２−マクログロブリン−トリプシン相互作用（電界をベースとした添加）
アルファ−２−マクログロブリンは、特異的にプロテアーゼに結合して中和を行うために血液中を循環する大きな血漿蛋白質（ｍｗ  ８０００００）であり、この機構によって過剰なプロテアーゼ活性から体が保護され、特に「消化」自体から体が保護される。アルファ−２−マクログロブリンやトリプシンなどのプロテアーゼとの関係は非常に強く、アガロースビーズに固定されたアルファ−２−マクログロブリンはトリプシンおよびその他のプロテアーゼをアフィニティ精製するために使用されている。
【００８９】
３組のハイドロゲル微小滴をアミン誘導体化したガラスにスポットした。このスライドガラスを、１％ＢＳＡ（１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液およびＮａＣｌ  １５０ｍＭ（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４）で室温で２時間処理して、非特異的結合部位をブロックした。これが不十分であると、いくらかのフルオレセイン標識蛋白質が非特異的に結合し、したがってシグナル対ノイズの割合の上昇が引き起こされよう。ハイドロゲルは、イソシアネート官能性ＨＹＰＯＬ（商標）を含むプレポリマーから構成される。重合は水性溶液で開始し、重合動力学をｐＨおよび温度によって制御した。ハイドロゲル微小滴それぞれは、ＣＯ２ガス発生による混濁を回避するために制御された速度で重合するようにされ、マイクロアレイの１セルを形成する。このようなハイドロゲルセルの第１組は、５ｍｇ／ｍＬ  ＰＢＳの濃度の溶液５０μＬを使用してα−２−マクログロブリンと共に添加される。高分子量のα−２−マクログロブリンはハイドロゲル小滴中への迅速な拡散を制限し、小さな電極系によって流される弱電流（２．５〜５ｍＶ）を用いることにより拡散速度は増大する。α−２−マクログロブリンが一旦ハイドロゲル小滴内に拡散すれば、その後に小滴から著しく拡散することが大きな分子量によって回避される。トリプシンに結合しないことが知られている陰性対照蛋白質を形成するためにフェリチンを使用する。フェリチンは、同電極系および同条件下における弱電流を使用してハイドロゲル小滴の第２組中に同様に拡散する。第３組の小滴は蛋白質では処理せず、他の陰性対照として使用する。次に、３組の小滴全てをＦＩＴＣ標識トリプシンで約１５分間曝露し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ、ｐＨ７．４で約５分間から２０分間洗浄する。蛍光強度をＣＣＤカメラで測定し、結果を表２に示す。
【００９０】
【表２】
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【００９１】
この結果から、ＦＩＴＣ−標識トリプシンはハイドロゲル小滴内で天然のリガンド、α−２−マクログロブリンと特異的に結合し、陰性対照蛋白質フェリチンおよびハイドロゲル自体のいずれにも結合活性はほとんど検出されないことが示される。
【００９２】
本発明は、本発明者等によって現在最良と考えられるモデルを含むいくつかの異なる実施形態に関して説明されているが、添付した特許請求の範囲に記載された本発明の範囲から逸脱することなく変化および改変が可能であることは、当業者には明らかであることが理解されよう。たとえば、特定の蛍光体、たとえばＦＩＴＣおよびＣｙ３を使用したが、その他の蛍光体またはその他のレポーターを代わりに使用することができる。異なる非ハイブリダイゼーション結合要素を有する複数のセルを含むバイオチップを使用することは有利であるが、場合によっては単一のセルのバイオチップが適している可能性がある。
【００９３】
本発明の詳細な特徴は、前述の特許請求の範囲において重視して記載している。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明の種々の特徴を具体的に示した方法の一部として、有機溶媒中におけるハイドロゲルと蛋白質との反応、その後のハイドロゲルの重合を示した図である。
【図２】
ハイドロゲル重合の際の水中でのハイドロゲルプレポリマーと蛋白質との別の反応を示した図である。
【図３Ａ】
ハイドロゲルプレポリマーとキレート剤との別の反応、その後の金属のキレート化、およびその後の尾部に複数のヒスチジン基を含んだ蛋白質との結合を示した図である。
【図３Ｂ】
ハイドロゲルプレポリマーとキレート剤との別の反応、その後の金属のキレート化、およびその後の尾部に複数のヒスチジン基を含んだ蛋白質との結合を示した図である。
【図４Ａ】
実施例４で記述した実験を表した図である。
【図４Ｂ】
実施例４で使用した２つの１本酸核酸配列を表した図である。
【図５】
実施例５で実施した実験を表した図である。
【図６】
実施例９で実施した実験を表した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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