(57)【要約】本発明は、親水性ブロック及び、末端ヒドロキシル基を有する疎水性ブロックとの両親媒性ブロック共重合体であって、疎水性ブロックの末端ヒドロキシル基がトコフェロールまたはコレステロール基で置換されているものに関する。また、本発明は、水溶液中で安定なミセルを形成しうる高分子組成物であって、両親媒性ブロック共重合体とポリ乳酸誘導体を含み、ポリ乳酸の１以上の末端が少なくとも１つのカルボキシル基と共有結合しているものに関する。
2006526052.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
両親媒性ブロック共重合体であって、
親水性Ａブロック、及び末端にヒドロキシル基を有する疎水性Ｂブロックを含み、
当該疎水性ブロックの末端ヒドロキシル基がトコフェロールまたはコレステロール基で置換されている両親媒性ブロック共重合体。
【請求項２】
Ａ−Ｂ型ジブロック共重合体またはＢ−Ａ−Ｂ型トリブロック共重合体である請求項１に記載の両親媒性ブロック共重合体。
【請求項３】
親水性Ａブロックが、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、及びその誘導体よりなる群から選択されるものである請求項１に記載の両親媒性ブロック共重合体。
【請求項４】
疎水性Ｂブロックが、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリカプロラクトン、ポリジオキサン−２−オン、ラクチドとグリコリドの共重合体、ラクチドとジオキサン−２−オンの共重合体、ラクチドとカプロラクトンの共重合体、及びグリコリドとカプロラクトンの共重合体よりなる群から選択されるものである請求項１に記載の両親媒性ブロック共重合体。
【請求項５】
親水性Ａブロック対疎水性Ｂブロックの比率が３０：７０〜９７：３の重量比である請求項１に記載の両親媒性ブロック共重合体。
【請求項６】
親水性ブロックの数平均分子量が２００〜５０，０００ダルトンである請求項１に記載の両親媒性ブロック共重合体。
【請求項７】
疎水性ブロックの数平均分子量が５０〜５０，０００ダルトンである請求項１に記載の両親媒性ブロック共重合体。
【請求項８】
下記一般式（Ｉ’）の両親媒性ブロック共重合体。
Ｒ1’−Ｏ−［Ｒ3’］l’−［Ｒ4’］m’−［Ｒ5’］n’−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ2）x’−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ2’      （Ｉ’）
式中、
Ｒ1’は、ＣＨ3−、Ｈ−［Ｒ5’］n’−［Ｒ4’］m’−またはＲ2’−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ2）x’−Ｃ（＝Ｏ）−［Ｒ5’］n’−［Ｒ4’］m’−であり、
Ｒ2’はトコフェロールまたはコレステロールであり、
Ｒ3’は−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−、−ＣＨ（Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ2）−ＣＨ2−、または
【化１】
2006526052.tif 000030
であり；
Ｒ4’は−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨＺ’−Ｏ−（ここで、Ｚ’は水素原子またはメチル基である）であり；
Ｒ5’は−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨＹ”−Ｏ−（ここで、Ｙ”は水素原子またはメチル基である）、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−または−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−であり；
ｌ’は４〜１１５０の整数であり；
ｍ’は１〜３００の整数であり；
ｎ’は０〜３００の整数であり；及び
Ｘ’は０〜４の整数である。
【請求項９】
親水性Ａブロック、及び末端にヒドロキシル基を有する疎水性Ｂブロックを含み、当該疎水性ブロックの末端ヒドロキシル基がトコフェロールまたはコレステロール基で置換されている両親媒性ブロック共重合体を製造するための方法であって、
１）トコフェロールまたはコレステロール基を有する疎水性化合物をカルボキシ化するステップ；及び
２）親水性Ａブロック及び末端ヒドロキシル基を有する疎水性Ｂブロックを含む両親媒性ブロック共重合体を、開始剤であるジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の存在下、上記カルボキシル化された疎水性化合物と反応させることによって、疎水性Ｂブロックの末端ヒドロキシル基にカルボキシル化疎水性化合物を化学結合させるステップ
を含む方法。
【請求項１０】
親水性Ａブロック、及び末端にヒドロキシル基を有する疎水性Ｂブロックを含み、当該疎水性ブロックの末端ヒドロキシル基がトコフェロールまたはコレステロール基で置換されている両親媒性ブロック共重合体を製造するための方法であって、
１）トコフェロールまたはコレステロール基を有する疎水性化合物をカルボキシ化し、得られたカルボキシ化疎水性化合物をオキサリルクロリドにより活性化するステップ；及び
２）親水性Ａブロック及び末端ヒドロキシル基を有する疎水性Ｂブロックを含む両親媒性ブロック共重合体を、上記の活性化されたカルボキシル化疎水性化合物と反応させることによって、疎水性Ｂブロックの末端ヒドロキシル基にカルボキシル化疎水性化合物を化学結合させるステップ
を含む方法。
【請求項１１】
親水性Ａブロック、及び末端にヒドロキシル基を有する疎水性Ｂブロックを含み、当該疎水性ブロックの末端ヒドロキシル基がトコフェロールまたはコレステロール基で置換されている両親媒性ブロック共重合体を製造するための方法であって、
１）トコフェロールまたはコレステロール基を有する疎水性化合物を、連結剤であるジクロライド化合物と混合するステップ；
２）親水性Ａブロック及び末端ヒドロキシル基を有する疎水性Ｂブロックを含む両親媒性ブロック共重合体を、ステップ１）の反応混合物に添加することによって、疎水性Ｂブロックの末端ヒドロキシル基に疎水性化合物を化学結合させるステップ；及び
３）段階２）で得られたブロック共重合体を溶解して沈澱させるステップ、
を含む方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の両親媒性ブロック共重合体を含む薬剤担体。
【請求項１３】
請求項１に記載の両親媒性ブロック共重合体と水難溶性薬剤を含み、体液または水溶液中で高分子ミセルを形成し得る医薬組成物。
【請求項１４】
水難溶性薬剤の水溶解度が３３．３ｍｇ／ｍＬ以下である請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
親水性Ａブロック及び末端ヒドロキシル基を有する疎水性Ｂブロックを含む両親媒性ブロック共重合体、並びにポリ乳酸誘導体を含み、
疎水性Ｂブロックの末端ヒドロキシル基がトコフェロールまたはコレステロール基で置換されており、
ポリ乳酸誘導体の少なくとも１つの末端が、少なくとも１つのカルボキシル基と共有結合している薬剤送達用高分子組成物。
【請求項１６】
ポリ乳酸誘導体が下記一般式（Ｉ）で表されるものである請求項１５に記載の高分子組成物。
ＲＯ−ＣＨＺ−［Ａ］n−［Ｂ］m−ＣＯＯＭ      （Ｉ）
式中、
Ａは−ＣＯＯ−ＣＨＺ−であり；
Ｂは−ＣＯＯ−ＣＨＹ−、−ＣＯＯ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−または−ＣＯＯ−ＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2であり；
Ｒは水素原子、またはアセチル、ベンゾイル、デカノイル、パルミトイル、メチル、若しくはエチル基であり；
ＺとＹはそれぞれ水素原子、またはメチル若しくはフェニル基であり；
ＭはＨ、Ｎａ、Ｋ、またはＬｉであり；
ｎは１〜３０の整数であり；及び
ｍは０〜２０の整数である。
【請求項１７】
ポリ乳酸誘導体が下記一般式（ＩＩ）で示される請求項１５に記載の高分子組成物。
ＲＯ−ＣＨＺ−［ＣＯＯ−ＣＨＸ］p−［ＣＯＯ−ＣＨＹ’］q−ＣＯＯ−ＣＨＺ−ＣＯＯＭ            （ＩＩ）
式中、
Ｘはメチル基であり；
Ｙ’は水素原子またはフェニル基であり；
ｐは０〜２５の整数；ｑは０〜２５の整数であり（但し、ｐ＋ｑは５〜２５の整数である。）；
Ｒは水素原子、またはアセチル、ベンゾイル、デカノイル、パルミトイル、メチル若しくはエチル基であり；
Ｚは水素原子、またはメチル若しくはフェニル基であり；及び
ＭはＨ、Ｎａ、Ｋ、またはＬｉである。
【請求項１８】
ポリ乳酸誘導体が下記一般式（ＩＩＩ）で示される請求項１５に記載の高分子組成物。
ＲＯ−ＰＡＤ−ＣＯＯ−Ｗ−Ｍ’    （ＩＩＩ）
式中、
Ｗ−Ｍ’は
【化２】
2006526052.tif 000031
であり；
ＰＡＤはＤ，Ｌ−ポリ乳酸、Ｄ−ポリ乳酸、ポリマンデル酸、Ｄ，Ｌ−乳酸とグリコール酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とマンデル酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とカプロラクトンの共重合体、及びＤ，Ｌ−乳酸と１，４−ジオキサン−２−オンの共重合体よりなる群から選択されるものであり；
Ｒは水素原子、またはアセチル、ベンゾイル、デカノイル、パルミトイル、メチル若しくはエチル基であり；及び
ＭはＨ、Ｎａ、Ｋ、またはＬｉである。
【請求項１９】
ポリ乳酸誘導体が下記一般式（ＩＶ）で示される請求項１５に記載の高分子組成物。
Ｓ−Ｏ−ＰＡＤ−ＣＯＯ−Ｑ      （ＩＶ）
式中、
Ｓは
【化３】
2006526052.tif 000032
であり［ここで、Ｌは−ＮＲ1−または−Ｏ−であり（Ｒ1は水素原子またはＣ1-10アルキルである。）、ａは０〜４の整数であり、 ｂは１〜１０の整数であり、 ＭはＨ、Ｎａ、Ｋ、またはＬｉである］、
ＱはＣＨ3、ＣＨ2ＣＨ3、ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、またはＣＨ2Ｃ6Ｈ5であり；及び
ＰＡＤはＤ，Ｌ−ポリ乳酸、Ｄ−ポリ乳酸、ポリマンデル酸、Ｄ，Ｌ−乳酸とグリコール酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とマンデル酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とカプロラクトンの共重合体、及びＤ，Ｌ−乳酸と１，４−ジオキサン−２−オンの共重合体よりなる群から選択されるものである。
【請求項２０】
ポリ乳酸誘導体が下記一般式（Ｖ）で示される請求項１５に記載の高分子組成物。
【化４】
2006526052.tif 000033
式中、
Ｒ’は−ＰＡＤ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ2ＣＨ2−Ｃ（Ｏ）−ＯＭであり；
ＰＡＤはＤ，Ｌ−ポリ乳酸、Ｄ−ポリ乳酸、ポリマンデル酸、Ｄ，Ｌ−乳酸とグリコール酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とマンデル酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とカプロラクトンの共重合体、及びＤ，Ｌ−乳酸と１，４−ジオキサン−２−オンの共重合体よりなる群から選択されるものであり；
Ｍは一般式（Ｉ）の定義と同義であり；及び
ａは１〜４の整数である。
【請求項２１】
親水性Ａブロックが、ポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール及びポリアクリルアミドよりなる群から選択され；
疎水性Ｂブロックが、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリジオキサン−２−オン、ポリカプロラクトン、ラクチドとグリコリドの共重合体、ラクチドとカプロラクトンの共重合体、ラクチドとジオキサン−２−オンの共重合体、及びその誘導体よりなる群から選択されるものである請求項１５に記載の高分子組成物。
【請求項２２】
両親媒性ブロック共重合体が下記一般式（Ｉ’）で示される請求項１５に記載の高分子組成物。
Ｒ1’−Ｏ−［Ｒ3’］l’−［Ｒ4’］m’−［Ｒ5’］n’−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ2）x’−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ2’      (Ｉ’)
式中、
Ｒ1’はＣＨ3−、Ｈ−［Ｒ5’］n’−［Ｒ4’］m’−またはＲ2’−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ2）x’−Ｃ（＝Ｏ）−［Ｒ5’］n’−［Ｒ4’］m’−であり；
Ｒ2’はトコフェロールまたはコレステロールであり；
Ｒ3’は−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−、−ＣＨ（Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ2）−ＣＨ2−、または
【化５】
2006526052.tif 000034
であり；
Ｒ4’は−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨＺ’−Ｏ−（ここで、Ｚ’は水素原子またはメチル基である。）であり；
Ｒ5’は−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨＹ”−Ｏ−（ここで、Ｙ”は水素原子またはメチル基である。）、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−、または−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−であり；
ｌ’は４〜１１５０の整数であり；
ｍ’は１〜３００の整数であり；
ｎ’は０〜３００の整数であり；及び
Ｘ’は０〜４の整数である。
【請求項２３】
親水性Ａブロック及び疎水性Ｂブロックの数平均分子量が、それぞれ２００〜５０，０００ダルトン及び５０〜５０，０００ダルトンの範囲である請求項１５に記載の高分子組成物。
【請求項２４】
両親媒性ブロック共重合体における親水性Ａブロック対疎水性Ｂブロックの比率が３０：７０〜９７：３の重量比である請求項１５に記載の高分子組成物。
【請求項２５】
組成物全重量に対して０．１〜９９．９ｗｔ％の両親媒性ブロック共重合体及び０．１〜９９．９ｗｔ％のポリ乳酸誘導体を含む請求項１５に記載の高分子組成物。
【請求項２６】
ポリ乳酸誘導体の数平均分子量が５０〜５０，０００ダルトンである請求項１５に記載の高分子組成物。
【請求項２７】
ポリ乳酸誘導体が、触媒不在下に縮合反応させた後、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、または炭酸カリウムで中和して得られたナトリウムまたはカリウム塩の形態である請求項１５に記載の高分子組成物。
【請求項２８】
さらに、ポリ乳酸誘導体の末端カルボキシル基１当量に対して、０．０１〜１０当量の二価または三価金属イオンを含む請求項１５に記載の高分子組成物。
【請求項２９】
二価または三価金属イオンが、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、Ｂａ2+、Ｃｒ3+、Ｆｅ3+、Ｍｎ2+、Ｎｉ2+、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+及びＡｌ3+よりなる群から選択される請求項２８に記載の高分子組成物。
【請求項３０】
請求項１５に記載の高分子組成物から製造されたミセルまたはナノ粒子。
【請求項３１】
ミセルまたはナノ粒子の粒径が１〜４００ｎｍの範囲である請求項３０に記載のミセルまたはナノ粒子。
【請求項３２】
請求項１５に記載の高分子組成物を７０〜９９．９ｗｔ％及び水難溶性薬剤を０．１〜３０ｗｔ％含む医薬組成物。
【請求項３３】
請求項２８に記載の高分子組成物を７０〜９９．９ｗｔ％及び水難溶性薬剤を０．１〜３０ｗｔ％含む医薬組成物。
【請求項３４】
水難溶性薬剤を含有する高分子組成物の製造方法であって、
１）親水性Ａブロック及び末端ヒドロキシル基がトコフェロールまたはコレステロール基で置換された疎水性Ｂブロックの両親媒性ブロック共重合体、少なくとも１つの末端が少なくとも１つのカルボキシル基と共有結合しているポリ乳酸誘導体、及び水難溶性薬剤を有機溶媒の中に溶解するステップ、及び
２）有機溶媒を減圧留去し、水溶液を加えて水難溶性薬剤を含有する高分子ミセルを形成するステップ、
を含む方法。
【請求項３５】
さらに、二価または三価金属イオンを水難溶性薬剤含有高分子ミセルに加え、ポリ乳酸誘導体の末端カルボキシル基を固定するステップを含む請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
有機溶媒が、アセトン、エタノール、メタノール、酢酸エチル、アセトニトリル、メチレンクロリド、クロロホルム、酢酸及びジオキサンよりなる群から選択されるものである請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
抗癌剤として有用な医薬組成物であって、
親水性Ａブロック及び末端ヒドロキシル基を有する疎水性Ｂブロックの両親媒性ブロック共重合体、ポリ乳酸誘導体、及び抗癌剤を含み、
疎水性Ｂブロックの末端ヒドロキシル基がトコフェロールまたはコレステロール基で置換されており、且つ
ポリ乳酸誘導体の少なくとも１つの末端が、少なくとも１つのカルボキシル基と共有結合している医薬組成物。
【請求項３８】
さらに、ポリ乳酸誘導体の末端カルボキシル基１当量に対して０．０１〜１０当量の二価または三価金属イオンを含む請求項３７に記載の薬剤学的組成物。
【請求項３９】
薬剤耐性腫瘍を治療するための医薬組成物であって、
親水性Ａブロック及び末端ヒドロキシル基を有する疎水性Ｂブロックの両親媒性ブロック共重合体、ポリ乳酸誘導体、及び抗癌剤を含み、
疎水性Ｂブロックの末端ヒドロキシル基がトコフェロールまたはコレステロール基で置換されており、且つ
ポリ乳酸誘導体の少なくとも１つの末端が、少なくとも１つのカルボキシル基と共有結合している医薬組成物。
【請求項４０】
さらに、ポリ乳酸誘導体の末端カルボキシル基１当量に対して０．０１〜１０当量の二価または三価金属イオンを含む請求項３９に記載の薬剤学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親水性ブロック及び、末端ヒドロキシル基を有する疎水性ブロックを含む両親媒性ブロック共重合体であって、疎水性ブロックの末端ヒドロキシル基がトコフェロールまたはコレステロール基で置換されているものに関する。また、本発明は、両親媒性ブロック共重合体とポリ乳酸誘導体を含む高分子組成物であって、ポリ乳酸の１以上の末端が少なくとも１つのカルボキシル基と共有結合しているものに関する。さらに本発明は、金属イオンで固定された高分子組成物であって、ポリ乳酸誘導体の末端カルボキシル基が、二価または三価金属イオンで固定されているものに関する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤が生体に投与されると、投与された薬剤のうち極微量のみが標的部位に達し、投与された大部分は標的でない部位へ送達され、望ましくない副作用を引き起こすことがある。従って、ここ２０年においては、適切な担体を利用して薬剤を部位特異的に送達するための効率的なシステムを開発することに研究が集中されてきており、このような担体には、リポソーム、小分子界面活性剤ミセル、高分子ナノ粒子及び高分子ミセル（硬質ミセルでできている高分子ナノ粒子）が含まれる。リポソームを薬剤担体として使用することは、主に封入効率が低い、薬剤の不安定性、急速な薬剤流出及び低い貯蔵安全性のような問題のために制限されることが分かっている。小分子界面活性剤ミセルは、体内投与後、体液で希釈されて容易に分解するので、薬剤担体として十分な役割を遂行することは難しい。
【０００３】
最近、生分解性高分子を利用する高分子ナノ粒子と高分子ミセルが、このような問題を克服するのに非常に有用であることが報告された。これらは静脈内投与薬剤の生体内における分布を変化させることにより副作用を減少して効能を向上させ、薬剤の特異的な細胞標的化や放出制御といった利点を呈する。これらはまた、体液との適合性に優れ、水難溶性薬剤の溶解度と生体利用効率を向上させる。
【０００４】
親水性表面を有するナノメートルサイズの薬剤担体は、細網内皮系［reticulo-endothelial systems（ＲＥＳ）］による認識と取込みを回避して、血液中に長時間循環できることが明らかにされている。これらの親水性ナノ粒子の別の長所としては、サイズが非常に小さいために、粒子が受動的標的化メカニズムを通じて固体癌のような病変に到達できることがある。しかし、薬剤を特異的な標的位置へ上手く送達するためには、循環中、担体が薬剤を安定に保持することが要求される。薬剤標的化は長い循環時間を必要とするものと見られ、担体は長時間血液成分に露出されるので、速かに除去される担体に比べて薬剤−担体の結合安全性を改善させる必要がある。
【０００５】
親水性表面を持つナノメートルサイズの薬剤担体において、高分子ミセルは通常数百個のブロック共重合体からなり、その直径は約２０〜５０ｎｍである。高分子ミセルは、２つの球形の共通−中心部位、即ち、疎水性薬剤を封入する役割を有する疎水性物質で稠密に充填されたコアと、体内ＲＥＳを回避して血液中で長時間循環できるようにする親水性物質でできている外皮を持つ。これらの担体はサイズが小さく、溶解度が高く、滅菌過程が簡単で薬剤を放出制御できるという際立った長所を示すにもかかわらず、導入された薬剤が生体内で急速に放出され得るので、その物理的安定性が重大な課題である。
【０００６】
ミセルは、総共重合体濃度が臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）より高くなると、熱力学的に安定となる。従って、ＣＭＣ値が低い共重合体システムを用いれば、ミセルの生体内における安定性を向上させることができる。力学的安定性は、ミセルの分解速度を意味する。この分解速度は、ミセルコアの物理的状態に依存する。ガラス転移温度が高い疎水性ブロックを含む共重合体で形成されたミセルは、ガラス転移温度が低いものに比べて、ゆっくり分解される傾向がある。また、ミセル間でユニマー（unimer）交換速度に影響を及ぼす多くの因子によっても影響され得る。ユニマー交換速度は、コア内の溶媒含量、共重合体の疎水性成分含量及び親水性と疎水性ブロックの長さのような多くの因子に依存することが見出されている。
【０００７】
水難溶性薬剤を封入でき、安定性と効能が改善された生分解性で且つ生体適合性のコア−シェル型薬剤担体を開発するための鋭意研究が為されてきた。高分子ミセルを化学的に固定する製造方法であって、当該高分子がシェルとして親水性ポリエチレンオキサイドと、コアとして水溶液中で架橋結合した疎水性生分解性高分子を含むコア−シェル型ポリマーである方法が、ＥＰ  ０，５５２，８０２  Ａ２に開示されている。しかし、この高分子ミセルは、コアを形成する高分子が安定な構造を示すように、架橋結合剤をＡ−Ｂ型ジブロックまたはＡ−Ｂ−Ａ型トリブロック共重合体の親水性成分へ導入しなければならないので、製造することが難しい。また、人体に適用したことがない架橋結合剤を使用することは、安全性問題を引き起こし得る。
【０００８】
ミセル形成ブロック共重合体−薬剤複合体が、米国特許第６，０８０，３９６号に開示されている。高分子ブロック共重合体が親水性高分子分画と疎水性高分子分画を有する高分子ブロック共重合体−薬剤複合体は、外皮として親水性分画を持つミセルを形成し、その疎水性内核にアントラサイクリン抗癌剤を含有する。抗癌剤分子は、ミセルのコア内に共有結合される。しかし、薬剤が高分子ミセル内に共有結合されれば、薬剤−共重合体結合の分解速度を制御することが難しくなる。
【０００９】
一方、親水性高分子であるポリアルキレングリコール誘導体と、脂肪酸ポリエステルまたはポリアミノ酸のような疎水性生分解性高分子を含む二重または三重ブロック共重合体からなる高分子ミセルを用いて、疎水性薬剤を可溶化し得ることが報告された。米国特許第５，４４９，５１３号は、親水性高分子であるポリエチレングリコール、及び疎水性高分子であるポリアミノ酸誘導体、例えば、ポリベンジルアスパラギン酸などを含むジブロック共重合体を開示している。このジブロック共重合体は、例えば、ドキソルビシンのような疎水性抗癌剤や、インドメタシンのような抗炎症剤を可溶化することができる。しかし、ポリアミノ酸誘導体は生体内で加水分解されないことから、免疫反応による副作用を誘発する。
【００１０】
高分子ミセルの安全性を向上する方法としては、高分子の疎水性を増加させる方法がある。そのためには、高分子の分子量や濃度を調節しなければならない。しかし、分子量が増加するにつれて生分解効率が低下し、体外への排泄が難しくなり、臓器に蓄積されて毒性を示す。米国特許第５，４２９，８２６号は、親水性ポリアルキレングリコールと疎水性ポリ乳酸を含むジブロックまたはマルチブロック共重合体を開示している。具体的には、上記特許は、アクリル酸誘導体がジブロックまたはマルチブロック共重合体の末端基に結合されたジブロックまたはマルチブロック共重合体をミセル化した後、水溶液中で高分子を架橋結合させて高分子ミセルを形成することによって、高分子ミセルを安定化する方法を開示している。上記方法は高分子を安定化することはできるが、架橋結合された分子が分解されないため、生体に適用することができない。上記高分子ミセルは、中性ｐＨの水溶液で多量の水難溶性薬剤を可溶化することができるが、短時間内に薬剤を放出する短所がある。また、米国特許第６，４５８，３７３号では、水難溶性薬剤がα−トコフェロールによりエマルジョン形態で可溶化されている。この特許では、エマルジョンを安定化するために、ＰＥＧ修飾されたビタミンＥが界面活性剤として使用されている。ＰＥＧ修飾されたビタミンＥは、親水性ブロックと疎水性ブロックとを含む両親媒性二重ブロック共重合体と類似構造を有し、疎水性が強いトコフェロールが水難溶性薬剤の共重合体との親和力を増加させるために、水難溶性薬剤を可溶化することができる。しかし、親水性高分子として用いられたポリエチレングリコールの分子量が限定されるので、ＰＥＧ修飾されたビタミンＥ単独では、パクリタキセルを僅か２．５ｍｇ／ｍＬまで可溶化できるに過ぎない。２．５ｍｇ／ｍＬの以上の濃度では不安定なミセルが形成され、薬剤の結晶が沈澱物を形成し得る。
【００１１】
化学療法に対する臨床的な腫瘍耐性は、先天的または後天的でありうる。先天的な耐性は、診断時、第１に選択した化学療法に反応しない腫瘍に存在するものである。後天的な耐性は、初期段階の治療に対しては敏感に反応するが、再発時、完全に異なった表現型を見せる腫瘍でよく発生する。耐性は、従来使用された薬剤と、構造及び作用メカニズムが異なる新しい薬剤のいずれに対しても形成され得る。例えば、タキソール（登録商標）を用いた癌化学療法は、癌細胞の後天的耐性により失敗することがあるが、このことは、Ｐ−ｇｐの過剰発現とβ−チューブリンの変形としばしば結び付けられる。タキソール（登録商標）耐性細胞は、アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン、ビンブラスチン、及びビンクリスチンを含む他の薬剤に対して交差耐性を示す。よって、臨床的薬剤耐性は、化学療法が転移性癌患者を治療できるようにするために、克服しなければならない主要な障害である。
【００１２】
薬剤耐性癌細胞は、正常細胞より高いＩＣ50（薬剤の５０％細胞抑制濃度）を示すので、正常細胞では濃度を低くする一方で、腫瘍細胞では薬剤濃度を高くする化学療が効果的である。従って、薬剤耐性癌に対する効果を改善するためには、長い全身循環と腫瘍組織での薬剤の特異的な送達が求められる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上述した観点から、疎水性薬剤送達のためのものであり、生体適合性と生分解性を示す改良高分子ミセル組成物の開発が求められてきた。本発明は、生体適合性かつ生分解性で、安全性を貶めることなく疎水性薬剤を效果的に送達できる改良高分子ミセル組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一つの様態は、親水性Ａブロック及び末端ヒドロキシル基を有する疎水性Ｂブロックを含む両親媒性ブロック共重合体であって、疎水性ブロックの末端ヒドロキシル基がトコフェロールまたはコレステロール基で置換されたものと、その製造方法に関するものである。本発明の両親媒性ブロック共重合体は、在来の高分子とほぼ同じ分子量を保持しながら、疎水性ブロックの疎水性を顕著に増加させる。また、疎水性官能基が水難溶性薬剤との親和力を大きく向上させることによって、高分子から形成された高分子ミセルは水溶液中でさらに安定になり、ミセルに可溶化された水難溶性薬剤の血漿濃度をより長時間保持することができる。さらに、上記の両親媒性ブロック共重合体は、別の高分子と混合され、薬剤送達用高分子組成物とされ得る。
【００１５】
本発明の他の様態は、親水性Ａブロック及び末端ヒドロキシル基を有する疎水性Ｂブロックの両親媒性ブロック共重合体、並びにポリ乳酸誘導体を含み、疎水性Ｂブロックの末端ヒドロキシル基がトコフェロールまたはコレステロール基で置換されており、ポリ乳酸誘導体の少なくとも１つの末端が、少なくとも１つのカルボキシル基と共有結合している高分子組成物に関するものである。
【００１６】
本発明の第三の形態は、親水性Ａブロック及び末端ヒドロキシル基を有する疎水性Ｂブロックの両親媒性ブロック共重合体、並びにポリ乳酸誘導体を含み、疎水性Ｂブロックの末端ヒドロキシル基がトコフェロールまたはコレステロール基で置換されており、ポリ乳酸誘導体の少なくとも１つの末端が、少なくとも１つのカルボキシル基と共有結合しており、ポリ乳酸誘導体の末端カルボキシル基が二価または三価金属イオンで固定された高分子組成物に関するものである。
【００１７】
本発明の高分子組成物は、体液や水溶液中で安定な高分子ミセルやナノ粒子を形成し得る。本発明の組成物で形成されたミセルやナノ粒子は、親水性外皮と、多量の疎水性薬剤を物理的に封入できる疎水性内核を有する。本発明の薬剤含有ミセルとナノ粒子は、投与後、血流中で滞留時間が延長され、様々な医薬製剤の製造に使われ得る。本発明の組成物から製造された抗癌剤含有高分子ミセルは、癌組織によく移行され、抗癌剤耐性癌細胞に対して效果的に作用し得る。本発明の付加的な特徴と長所は、実施例を通じて本発明の特徴を示す添付図面と共に、下記の詳細な説明から明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明高分子組成物とその使用方法及び製造方法を説明する前に、本発明はここに開示された特定形態、製造ステップと材料に限定されず、そのような形態、製造ステップ及び材料は変更し得ることが理解されなければならない。また、ここで使われる用語は特定具体例のみについて記述する目的で使われており、添付された特許請求の範囲とその均等物によってのみ制限される本発明の範囲を制限するものではないことが理解されなければならない。
【００１９】
本明細書と添付された特許請求の範囲において、単数型を示す「a」、「an」または「the」は、明確に他の意味として言及しない限り、複数形態を含む。従って、例えば「末端基」を含有する高分子に関する言及は、２以上のそのような基に関する言及を含み、「疎水性薬剤」に関する言及は、２以上のそのような薬剤に関する言及を含む。さらに、両親媒性ブロック共重合体に関する言及は、各Ａ及びＢブロックの組成物、各ブロックのそれぞれの比率、及び各ブロック及び／又は全体ブロック高分子組成物の重量または数平均分子量が、ここで定義された規定内のものであるならば、ブロック共重合体の混合物を含むものとする。
【００２０】
本発明の説明と請求において、下記用語が下記定義に従って使われる。
【００２１】
本明細書で使われる「生物活性薬剤」若しくは「薬剤」または他の類似用語は、当該技術分野で既に公知の方法および／または本発明で教示された方法による投与に適し、所望の生物学的または薬理学的効果を示すあらゆる化学的または生物学的物質または化合物を意味する。そのような効果は、これらに限定されるものではないが、（１）生物に対して予防的効果を有し、感染防止のような、望まない生物学的影響の防止、（２）疾患により誘発された異常の緩和、例えば疾患による痛みや炎症の緩和、及び／または（３）生物からの疾患の緩和、減少、または完全除去を含み得る。その効果は、局所麻酔効果の提示のように局所的であってもよく、全身的であってもよい。
【００２２】
本明細書で使われる「生分解性（biodegradable）」または「生分解（biodegradation）」の語は、可溶化加水分解、または酵素や生物の他の産物であり生物学的に形成された物質の作用によって、物質があまり複雑でない中間体や最終産物に転換されることを意味する。
【００２３】
本明細書で使われる「生体適合性」の語は、生体に副作用を及ぼさない可溶化加水分解、または酵素若しくは生物の他の産物であり生物学的に形成された物質の作用によって形成された物質または物質の中間体または最終産物を意味する。
【００２４】
本明細書で使われる「有効量」の語は、任意の医学的処置に伴うものと同じ程度の合理的なリスク／利益比率における所望の局所または全身効果の提供に十分な生物活性薬剤の量を意味する。
【００２５】
本明細書で使われる「投与」及びその類似の語は、組成物が全身的に循環できるように組成物を治療される個体へ送達することを意味する。好ましくは、本発明の組成物は皮下、筋肉内、経皮、経口、経粘膜、静脈内、または腹腔内経路で投与される。そのような用途のための注射剤は、通常的な形態、即ち液状溶液若しくは懸濁液、または注射前に液状溶液や懸濁液として製造するのに適当な固体形態、またはエマルジョンとして製造することができる。投与のために使われ得る適当な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどを含み；必要な場合、湿潤剤や乳化剤、緩衝剤などのような少量の補助剤を含む。経口投与のために、液剤、錠剤、カプセル剤などのような様々な形態に製剤化できる。
【００２６】
以下では例示的な具体例を示し、これを記述するために具体的な用語を使用する。それによって、本発明の範囲は制限されるものではないことが理解されなければならない。本開示内容に関して、関連分野の技術者にとって、ここに示された発明的特徴の変化と追加的な変形と、ここに説明された本発明の原理の付加的な応用は、本発明の範囲内に属するものと見なされるべきである。
【００２７】
１つの態様として、本発明は、親水性Ａブロック、及び末端にヒドロキシル基を有する疎水性Ｂブロックを含み、当該疎水性ブロックの末端ヒドロキシル基がトコフェロールまたはコレステロール基で置換されている両親媒性ブロック共重合体を提供する。
【００２８】
本発明は、また、上記両親媒性ブロック共重合体の製造方法に関するものであり、下記方法Ｉ〜ＩＩＩを含む。
【００２９】
方法Ｉ：
１）トコフェロールまたはコレステロール基を有する疎水性化合物をカルボキシ化するステップ；及び
２）親水性Ａブロック及び末端ヒドロキシル基を有する疎水性Ｂブロックを含む両親媒性ブロック共重合体を、開始剤であるジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の存在下、上記カルボキシル化された疎水性化合物と反応させることによって、疎水性Ｂブロックの末端ヒドロキシル基にカルボキシル化疎水性化合物を化学結合させるステップ
を含む方法。
【００３０】
方法ＩＩ：
１）トコフェロールまたはコレステロール基を有する疎水性化合物をカルボキシ化し、得られたカルボキシ化疎水性化合物をオキサリルクロリドにより活性化するステップ；及び
２）親水性Ａブロック及び末端ヒドロキシル基を有する疎水性Ｂブロックを含む両親媒性ブロック共重合体を、上記の活性化されたカルボキシル化疎水性化合物と反応させることによって、疎水性Ｂブロックの末端ヒドロキシル基にカルボキシル化疎水性化合物を化学結合させるステップ
を含む方法。
【００３１】
方法ＩＩＩ：
１）トコフェロールまたはコレステロール基を有する疎水性化合物を、連結剤であるジクロライド化合物と混合するステップ；
２）親水性Ａブロック及び末端ヒドロキシル基を有する疎水性Ｂブロックを含む両親媒性ブロック共重合体を、ステップ１）の反応混合物に添加することによって、疎水性Ｂブロックの末端ヒドロキシル基に疎水性化合物を化学結合させるステップ；及び
３）段階２）で得られたブロック共重合体を溶解して沈澱させるステップ、
を含む方法。
【００３２】
本発明の「カルボキシル化疎水性化合物」とは、カルボキシ基が結合したヒドロキシル基を有する疎水性化合物を意味し、カルボキシ基は、サクシネート、マロネート、グルタレートまたはアジペート由来のものであってもよい。
【００３３】
また、本発明は、本発明の両親媒性ブロック共重合体を含有する薬剤担体を提供する。
また、本発明は、両親媒性ブロック共重合体と水難溶性薬剤を含み、体液または水溶液中で高分子ミセルを形成し得る医薬組成物を提供する。
【００３４】
本発明の両親媒性ブロック共重合体は、好ましくは、親水性Ａブロック及び疎水性Ｂブロックを含むＡ−Ｂ型ジブロック共重合体またはＢ−Ａ−Ｂ型トリブロック共重合体であってもよく、疎水性ブロックの末端基はヒドロキシル基である。本発明の両親媒性ジブロック共重合体は、水性環境に置かれると、疎水性Ｂブロックがコアを形成し親水性Ａブロックがシェルを形成するコア−シェルタイプの高分子ミセルを形成する。
【００３５】
好ましくは、親水性Ａブロックは、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、及びその誘導体よりなる群から選択されるものである。より好ましくは、親水性Ａブロックは、モノメトキシポリエチレングリコール、モノアセトキシポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリエチレンとプロピレングリコールの共重合体、及びポリビニルピロリドンで構成された群から選択されるものである。好ましくは、親水性Ａブロックの数平均分子量は、２００〜５０，０００ダルトンである。より好ましくは、親水性Ａブロックの数平均分子量は、１，０００〜２０，０００ダルトンである。
【００３６】
本発明の両親媒性ブロック共重合体の疎水性Ｂブロックは、ポリエステル、ポリ無水物、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル及びポリホスファジンで構成された群から選択される高度な生体適合性かつ生分解性の高分子である。より好ましくは、疎水性Ｂブロックは、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリカプロラクトン、ポリジオキサン−２−オン、ラクチドとグリコリドの共重合体、ラクチドとジオキサン−２−オンの共重合体、ラクチドとカプロラクトンの共重合体、及びグリコリドとカプロラクトンの共重合体よりなる群から選択される１つ以上である。好ましくは、両親媒性ブロック共重合体の疎水性Ｂブロックの数平均分子量は、５０〜５０，０００ダルトンである。より好ましくは、両親媒性ブロック共重合体の疎水性Ｂブロックの数平均分子量は、２００〜２０，０００ダルトンである。
【００３７】
疎水性Ｂブロックは末端ヒドロキシル基を有し、この末端ヒドロキシ基は、疎水性Ｂブロックの疎水性を増加させるために、疎水性に優れたトコフェロールまたはコレステロール基で置換される。本発明の両親媒性ブロック共重合体における疎水性ブロックは、水溶液中に置かれると、水との接触を避けて内核を形成し、球形の高分子ミセルを形成する。従って、水との親和力に劣る水難溶性薬剤を両親媒性ブロック共重合体と反応させるとき、水難溶性薬剤は高分子ミセルの内核の疎水性高分子により囲まれながらミセル内に封入され得る。この際、形成されるミセルの安定性は、疎水性ブロックの疎水性と薬剤に対する親和力に依存する。よって本発明では、疎水性ブロックの高分子の分子量をそのまま保持しながら疎水性を増加させるために、トコフェロール、コレステロールなどのような疎水性の強い官能基を、結合剤を用いて疎水性ブロックの末端に化学結合させる。トコフェロールとコレステロールは生体適合性化合物であって、水難溶性薬剤とのブロック共重合体親和性を増大させることができる環状構造を有する疎水性化合物である。
【００３８】
本発明の両親媒性ブロック共重合体における親水性Ａブロック対疎水性Ｂブロックの比率は、好ましくは３０：７０〜９７：３の重量比の範囲であり、より好ましくは、４：６〜７：３の範囲である。親水性Ａブロックの含量が過度に低ければ高分子が水溶液で高分子ミセルを形成できず、その含量が過度に高ければ形成された高分子ミセルが安定的ではない。
【００３９】
１つの具体例において、本発明の両親媒性ブロック共重合体は、下記一般式（Ｉ’）で示すことができる。
Ｒ1’−Ｏ−［Ｒ3’］l’−［Ｒ4’］m’−［Ｒ5’］n’−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ2）x’−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ2’      （Ｉ’）
式中、
Ｒ1’は、ＣＨ3−、Ｈ−［Ｒ5’］n’−［Ｒ4’］m’−またはＲ2’−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ2）x’−Ｃ（＝Ｏ）−［Ｒ5’］n’−［Ｒ4’］m’−であり、
Ｒ2’はトコフェロールまたはコレステロールであり、
Ｒ3’は−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−、−ＣＨ（Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ2）−ＣＨ2−、または
【００４０】
【化１】
2006526052.tif 000003
であり；
Ｒ4’は−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨＺ’−Ｏ−（ここで、Ｚ’は水素原子またはメチル基である）であり；
Ｒ5’は−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨＹ”−Ｏ−（ここで、Ｙ”は水素原子またはメチル基である）、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−または−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−であり；
ｌ’は４〜１１５０の整数であり；
ｍ’は１〜３００の整数であり；
ｎ’は０〜３００の整数であり；及び
Ｘ’は０〜４の整数である。
【００４１】
従来の両親媒性ブロック共重合体に比べ、疎水性基で置換された疎水性ブロックを有する本発明の共重合体は、疎水性が増加しており、低い臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を有し、水難溶性薬剤との親和力が大きいため、薬剤を安定的に含有することができる。また、末端に結合された官能基により水溶液中で形成されるミセルの大きさが増大するので、十分な量の薬剤をミセル中に包含することができる。従って、本発明の両親媒性ブロック共重合体は、効率的な薬剤担体として使用できる。本発明で導入される疎水性の強い官能基は分子量が大きい化合物である。よって、ブロック高分子の疎水性と薬剤に対するブロック共重合体の親和性を同時に大きく増加させて、ミセルを含有する製剤を顕著に安定化させる。
【００４２】
さらに、本発明の両親媒性ブロック共重合体を用いた高分子ミセルは、体内滞留時間が増加されている。高分子ミセル中の薬剤の血中濃度は、両親媒性ジブロック共重合体の疎水性Ｂブロックの末端ヒドロキシル基に置換した疎水性部分に依存する。表６と図８に示すように、疎水性Ｂブロックの末端ヒドロキシル基に置換された疎水性部位（トコフェロールまたはコレステロール）を有する両親媒性ジブロック共重合体の高分子ミセル（組成物１〜２）は、従来のｍＰＥＧ−ＰＬＡ−ＯＨ高分子ミセル（組成物３）に比べて、遥かに長い血流滞留時間を示した。さらに、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールミセル（組成物１）が、高分子中で最も長く血液中に循環した。この結果は、疎水性Ｂブロックのトコフェロールとコレステロール部分の疎水性増加により説明できる。
【００４３】
その末端ヒドロキシル基がトコフェロールまたはコレステロールで置換された疎水性ブロックを有するブロック共重合体は、下記方法で製造することができる。１つの具体例では、好適なリンカー、例えばコハク酸、マロン酸、グルタル酸またはアジピン酸のようなジカルボン酸をトコフェロールやコレステロールのヒドロキシル基に導入して、カルボキシル化されたトコフェロールやコレステロールを疎水性Ｂブロックの末端ヒドロキシル基へ化学結合させる。
【００４４】
１つの具体例として、米国特許第６，３２２，８０５号の方法に従って、モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ；Ｍｎ＝２０，０００）とポリラクチド（ＰＬＡ；Ｍｎ＝１，７５０）からなる両親媒性ブロック共重合体（ｍＰＥＧ−ＰＬＡ）を定量し、真空ポンプを用いて１２０℃で水分を除去した後、アセトニトリルまたはメチレンクロリドに溶解する。ここへトコフェロールサクシネートまたはコレステロールサクシネートを添加し、開始剤としてジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）と触媒として４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ)を定量して添加した後、室温で反応させる。ｍＰＥＧ−ＰＬＡの末端基−ＯＨと疎水性化合物の−ＣＯＯＨの反応により生成するジシクロヘキシルウレア（ＤＣＵ）によって、反応物は不透明になる。２４時間後、グラスフィルタを用いてＤＣＵを除去した後、塩酸水溶液を用いＤＭＡＰを抽出して除去する。このように精製された生成物溶液へ硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）を加えて残留する水分を除去した後、ヘキサン／ジエチルエーテル溶媒で沈澱させて、トコフェロールスクシニルまたはコレステロールスクシニルが結合した両親媒性ブロック共重合体であるｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールまたはｍＰＥＧ−ＰＬＡ−コレステロール（ここで、トコフェロールやコレステロールはコハク酸ジエステルによりＰＬＡへ結合される）を得る。沈澱した高分子生成物は、濾過した後に真空乾燥して白色粒子形態として得られる。
【００４５】
他の製造方法としては、触媒無を用いることなくオキサリルクロリドでカルボキシル化された疎水性化合物を活性化し、ｍＰＥＧ−ＰＬＡの末端に結合させる方法がある。即ち、トコフェロール（またはコレステロール）サクシネートをオキサリルクロリドと反応させた後、過剰のオキサリルクロリドを室温で真空除去する。ここへ、ｍＰＥＧ−ＰＬＡを定量して添加し、１００℃で１２時間反応させ、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（またはコレステロール）を得る。合成された高分子をアセトニトリルまたはメチレンクロリドに溶解した後、ヘキサン／ジエチルエーテル溶媒で沈殿させて濾過する。
【００４６】
上記２種類の製造工程において、トコフェロール（またはコレステロール）サクシネートの代わりに、トコフェロール（またはコレステロール）マロネート、トコフェロール（またはコレステロール）グルタレートまたはトコフェロール（またはコレステロール）アジペートなどを使用することができる。
【００４７】
他の方法として、結合剤としてジクロライド化合物を使用し、トコフェロールまたはコレステロールをｍＰＥＧ−ＰＬＡの末端に結合させる方法がある。具体的には、トコフェロールまたはコレステロールを定量し、真空ポンプを利用して５０℃で水分を除去する。ここへ過量の結合剤を添加し、１２時間反応させる。反応終了後、過量添加された結合剤を１００℃で真空除去する。ここに定量したｍＰＥＧ−ＰＬＡを添加し、１００℃で１２時間反応させる。合成された高分子をメチレンクロリドに溶かした後、ヘキサン／ジエチルエーテル溶媒で沈澱させることによって、トコフェロールまたはコレステロールがＰＬＡにコハク酸ジエステルを介して結合した両親媒性ブロック共重合体、即ち、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールまたはｍＰＥＧ−ＰＬＡ−コレステロールを得る。沈澱させた高分子生成物は、濾過した後に真空乾燥して高分子として白色粒子形態として得られる。この反応で使用可能な結合剤は、スクシニルクロリド、オキサリルクロリド、マロニルクロリド、グルタリルクロリドまたはアジポイルクロリドなどのようなジクロライド化合物から選択して使用することができる。
【００４８】
上述のように合成したブロック共重合体は、水難溶性薬剤と混合して高分子ミセル組成物を得ることができる。即ち、ブロック共重合体（１０〜２００ｍｇ）と水難溶性薬剤（１〜５０ｍｇ）をアセトニトリルまたはメチレンクロリドなどの有機溶媒に溶解する。溶液を攪拌して混合した後、真空条件下６０℃で乾燥してマトリックスを調製する。水難溶性薬剤と高分子のマトリックスを蒸留水に溶解した後、凍結乾燥して水難溶性薬剤が導入された高分子ミセル組成物を得る。上記高分子ミセル組成物は、生理食塩水のような水溶液に希釈して注射剤として使用することができる。
【００４９】
「水難溶性薬剤」または「疎水性薬剤」の語は、水に対する溶解度が３３．３ｍｇ／ｍＬ以下のあらゆる薬剤または生物活性薬剤を示す。これには、抗癌剤、抗生物質、抗炎症剤、麻酔剤、ホルモン、抗高血圧剤、及び糖尿病治療剤、抗高脂血症剤、抗ウィルス剤、パーキンソン病治療剤、抗痴呆制、抗嘔吐剤、免疫抑制剤、抗潰瘍剤、緩下剤及び抗マラリア剤が含まれる。具体的な水難溶性薬剤には、パクリタキセル、ケトコナゾール、イトラコナゾール、サイクロスポリン、シサプリド、アセトアミノフェン、アスピリン、アセチルサリチル酸、インドメタシン、ナプロキセン、ワルファリン、パパベリン、チアベンダゾール、ミコナゾール、シナリジン、ドキソルビシン、オメプラゾール、コレカルシフェロル、メルファラン、ニフェジピン、ジゴキシン、安息香酸トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、アズスレオナム、イブプロフェン、フェノキシメチルペニシリン、サリドマイド、メチルテストステロン、プロクロルペラジン、ヒドロコルチゾン、ジデオキシプリンヌクレオシド、ビタミンＤ２、スルホンアミド、スルホニルウレア、パラアミノ安息香酸、メラトニン、ベンジルペニシリン、クロランブシル、ジアゼピン、ジギトキシン、ヒドロコルチゾンブチラート、メトロニダゾール安息香酸塩、トルブタミド、プロスタグランジン、フルドロコルチゾン、グリゼオフルビン、硝酸ミコナゾール、ロイコトリエンＢ４抑制剤、プロプラノロール、テオフィリン、フルルビプロフェン、安息香酸ナトリウム、安息香酸、リボフラビン、ベンゾジアゼピン、フェノバルビタール、グリブリド、スルファジアジン、スルファエチルチアヂアゾール、ジクロフェナクナトリウム、フェニトイン、チオリダジン塩酸塩、ブロピリミン、ヒドロクロロチアジド、フルコナゾールなどが含まれる。
【００５０】
上記水難溶性薬剤は、０．１〜２０．０：８０．０〜９９．９のｗ／ｗ比でブロック共重合体に添加され、本発明の両親媒性ブロック共重合体から形成されたミセル内部に適宜包含される。
【００５１】
他の実施様態として、本発明は、親水性Ａブロック及び末端ヒドロキシル基を有する疎水性Ｂブロックを含む両親媒性ブロック共重合体、並びにポリ乳酸誘導体を含み、疎水性Ｂブロックの末端ヒドロキシル基がトコフェロールまたはコレステロール基で置換されており、ポリ乳酸誘導体の少なくとも１つの末端が、少なくとも１つのカルボキシル基と共有結合している用高分子組成物を提供する。
【００５２】
親水性Ａブロック及び疎水性Ｂブロックを含み、疎水性ブロックの末端ヒドロキシル基が、疎水性に優れたトコフェロールまたはコレステロール基で置換されている両親媒性ブロック共重合体については、上述した通りである。
【００５３】
本発明のポリ乳酸誘導体の１つ以上の末端は、少なくとも一つのカルボン酸またはカルボン酸と共有結合する。本発明のポリ乳酸誘導体の結合していない末端は、ヒドロキシ、アセトキシ、ベンゾイルオキシ、デカノイルオキシ及びパルミトイルオキシ基よりなる群から選択された官能基と共有結合できる。カルボン酸またはカルボン酸は、ｐＨ４以上の水溶液中で親水性基として作用し、ポリ乳酸誘導体が高分子ミセルを形成できるようにする。本発明のポリ乳酸誘導体が水溶液に溶解される際、高分子ミセルを形成するためには、ポリ乳酸誘導体に存在する親水性及び疎水性成分が均衡を保たなければ為らない。従って、本発明のポリ乳酸誘導体の数平均分子量は、好ましくは５０〜５０，０００ダルトンの範囲である。ポリ乳酸誘導体の分子量は、製造工程中の反応温度や時間などを制御することにより調節することができる。
【００５４】
ポリ乳酸誘導体は、好ましくは下記一般式（Ｉ）で示される。
ＲＯ−ＣＨＺ−［Ａ］n−［Ｂ］m−ＣＯＯＭ      （Ｉ）
式中、Ａは−ＣＯＯ−ＣＨＺ−であり；Ｂは−ＣＯＯ−ＣＨＹ−、−ＣＯＯ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−または−ＣＯＯ−ＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2であり；Ｒは水素原子、またはアセチル、ベンゾイル、デカノイル、パルミトイル、メチル、若しくはエチル基であり；ＺとＹはそれぞれ水素原子、またはメチル若しくはフェニル基であり；ＭはＨ、Ｎａ、Ｋ、またはＬｉであり；ｎは１〜３０の整数であり；及びｍは０〜２０の整数である。
【００５５】
本発明のポリ乳酸誘導体の１つ以上の末端は、カルボキシル基またはそのアルカリ金属塩、好ましくはそのアルカリ金属塩と共有結合する。ポリ乳酸誘導体を形成するアルカリ金属塩の金属イオンは一価であり、例えばナトリウム、カリウムまたはリチウムである。金属イオン塩形態のポリ乳酸誘導体は常温で固体であり、比較的中性のｐＨを示すことから非常に安定である。
【００５６】
より好ましくは、ポリ乳酸誘導体は一般式（ＩＩ）で示される。
ＲＯ−ＣＨＺ−［ＣＯＯ−ＣＨＸ］p−［ＣＯＯ−ＣＨＹ’］q−ＣＯＯ−ＣＨＺ−ＣＯＯＭ            （ＩＩ）
式中、Ｘはメチル基であり；Ｙ’は水素原子またはフェニル基であり；ｐは０〜２５の整数；ｑは０〜２５の整数であり（但し、ｐ＋ｑは５〜２５の整数である。）；Ｒ、Ｚ及びＭは一般式（Ｉ）の定義と同義である。
【００５７】
さらに、下記一般式（ＩＩＩ）〜（Ｖ）のポリ乳酸誘導体が、本発明において適している。
【００５８】
ＲＯ−ＰＡＤ−ＣＯＯ−Ｗ−Ｍ’    （ＩＩＩ）
式中、Ｗ−Ｍ’は
【００５９】
【化２】
2006526052.tif 000004
であり；ＰＡＤはＤ，Ｌ−ポリ乳酸、Ｄ−ポリ乳酸、ポリマンデル酸、Ｄ，Ｌ−乳酸とグリコール酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とマンデル酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とカプロラクトンの共重合体、及びＤ，Ｌ−乳酸と１，４−ジオキサン−２−オンの共重合体よりなる群から選択されるものであり；Ｒ及びＭは一般式（Ｉ）の定義と同義である。
【００６０】
Ｓ−Ｏ−ＰＡＤ−ＣＯＯ−Ｑ      （ＩＶ）
式中、Ｓは
【００６１】
【化３】
2006526052.tif 000005
であり［ここで、Ｌは−ＮＲ1−または−Ｏ−であり（Ｒ1は水素原子またはＣ1-10アルキルである。）、ａは０〜４の整数であり、 ｂは１〜１０の整数であり、Ｍは一般式（Ｉ）の定義と同義である。］；ＱはＣＨ3、ＣＨ2ＣＨ3、ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、またはＣＨ2Ｃ6Ｈ5であり；及びＰＡＤは一般式（ＩＩＩ）の定義と同義である。
【００６２】
【化４】
2006526052.tif 000006
【００６３】
式中、Ｒ’は−ＰＡＤ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ2ＣＨ2−Ｃ（Ｏ）−ＯＭであり；Ｍは一般式（Ｉ）の定義と同義であり；ＰＡＤは一般式（ＩＩＩ）の定義と同義であり；ａは１〜４の整数である。例えば、ａ＝１のとき、３−ａｒｍＰＬＡ−ＣＯＯＮａ；ａ＝２のとき、４−ａｒｍＰＬＡ−ＣＯＯＮａ；ａ＝３のとき、５−ａｒｍＰＬＡ−ＣＯＯＮａ；ａ＝４のとき、６−ａｒｍＰＬＡ−ＣＯＯＮａである。
【００６４】
高分子（一般式（Ｖ））合成のための開始剤としては、グリセロール、エリトリトール、トレイトール、ペンタエリトリトール、キシリトール、アドニトール、ソルビトール及びマンニトールが挙げられる。
【００６５】
本発明の高分子組成物は、両親媒性ブロック共重合体及びポリ乳酸誘導体の全重量に対して、０．１〜９９．９重量％の両親媒性ブロック共重合体と０．１〜９９．９重量％のポリ乳酸誘導体を含有することができる。好ましくは、本発明の高分子組成物は、２０〜９５重量％の両親媒性ブロック共重合体と５〜８０重量％のポリ乳酸誘導体を含有する。より好ましくは、本発明の高分子組成物は、５０〜９０重量％の両親媒性ブロック共重合体と１０〜５０重量％のポリ乳酸誘導体を含有する。
【００６６】
本発明のポリ乳酸誘導体は、単独でｐＨ４以上の水溶液中でミセルを形成できるが、高分子組成物は溶液のｐＨと関係がなく水溶液中でミセルを形成できる。生分解性高分子は通常１０以上のｐＨで加水分解されるので、本発明の高分子組成物は、１〜１０の範囲のｐＨ、好ましくは４〜８の範囲のｐＨで使用できる。本発明の高分子組成物から製造されたミセルやナノ粒子の粒径は、高分子の分子量とポリ乳酸誘導体の両親媒性ブロック共重合体に対する比率に従って１〜４００ｎｍ、より好ましくは５〜２００ｎｍの範囲に調節することができる。
【００６７】
図１〜３に示されるように、ポリ乳酸誘導体または両親媒性ブロック共重合体単独及びこれらの混合物は、水溶液中でミセルを形成できるが、両親媒性ブロック共重合体及びポリ乳酸誘導体の高分子組成物は、ポリ乳酸誘導体や両親媒性ブロック共重合体単独で形成されたミセルに比べて、水溶液中で形成されたミセルの薬剤封入効率と安定性が高い。図において、１は水難溶性薬剤を示し；１０はモノメトキシポリエチレングリコール−ポリラクチド疎水性部分（ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−疎水性部分）を示し；１１はモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）を示し；１２はポリラクチド疎水性部分（ＰＬＡ−疎水性部分）を示し；２０はＤ，Ｌ−ポリ（乳酸）のナトリウム塩を示し；２１はＤ，Ｌ−ポリ乳酸を示し；２２はカルボン酸ナトリウムを示す。しかし、本発明の高分子組成物では、ポリ乳酸誘導体または両親媒性ブロック共重合体単独から形成されたミセルと比較して、水溶液中で形成されたミセルの薬剤封入効率と安定性が顕著に向上されている。
【００６８】
本発明における他の実施様態として、親水性Ａブロック及び末端ヒドロキシル基を有する疎水性Ｂブロックを含む両親媒性ブロック共重合体と、ポリ乳酸誘導体を含有し、当該末端ヒドロキシル基が疎水性のトコフェロールまたはコレステロール基で置換されており、ポリ乳酸誘導体の少なくとも１つの末端が少なくとも１つのカルボキシル基と共有結合しており、当該カルボキシ基が二価または三価金属イオンで固定された高分子組成物を提供する。
【００６９】
金属イオンで固定された高分子組成物は、二価または三価金属イオンを、両親媒性ブロック共重合体とポリ乳酸誘導体の高分子組成物に加えて製造できる。高分子ミセルやナノ粒子は、ポリ乳酸誘導体の末端カルボキシル基を結合または固定するために添加する二価または三価金属イオンの量を変えることにより形成できる。
【００７０】
二価または三価金属イオンは、好ましくは、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、Ｂａ2+、Ｃｒ3+、Ｆｅ3+、Ｍｎ2+、Ｎｉ2+、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+及びＡｌ3+よりなる群から選択されるものである。二価または三価金属イオンは、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、リン酸塩または水酸化物の形態、好ましくは、ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2、ＺｎＣｌ2、ＡｌＣｌ3、ＦｅＣｌ3、ＣａＣＯ3、ＭｇＣＯ3、Ｃａ3（ＰＯ4）2、Ｍｇ3（ＰＯ4）2、ＡｌＰＯ4、ＭｇＳＯ4、Ｃａ（ＯＨ）2、Ｍｇ（ＯＨ）2、Ａｌ（ＯＨ）3、またはＺｎ（ＯＨ）2の形態で、両親媒性ブロック共重合体とポリ乳酸誘導体の高分子組成物に添加し得る。
【００７１】
図４と図５に示されるように、ポリ乳酸誘導体のカルボキシル末端の一価金属イオンが二価または三価金属イオンで置換され、金属イオン結合を形成すると、形成されたミセルやナノ粒子の安定性が向上し得る。
【００７２】
高分子ミセルやナノ粒子は、金属イオンの添加当量を変えることにより製造することができる。具体的には、二価金属イオンをポリ乳酸誘導体の末端カルボキシル基に対して０．５当量以下で添加すれば、末端カルボキシル基と結合を形成できる金属イオンが不十分となるため、高分子ミセルが形成される。二価金属イオンを０．５当量以上に添加すれば、ポリ乳酸誘導体の末端カルボキシル基と結合を形成できる金属イオンが十分となるため、高分子ミセルを堅固に固定することによって、ナノ粒子が形成される。
【００７３】
また、高分子ミセルまたはナノ粒子からの薬剤放出速度は、金属イオンの添加当量を変えることにより調節することができる。金属イオンがポリ乳酸誘導体のカルボキシル基に対して１当量以下で存在する場合、ポリ乳酸誘導体の末端カルボキシル基に結合できる数が減少して薬剤放出速度が増加する。金属イオンが１当量以上に存在すれば、ポリ乳酸誘導体の末端カルボキシル基に結合できる数が増加して、薬剤放出速度が減少する。従って、血中で薬剤放出速度を増加させるためには、金属イオンを少ない当量で使用し、薬剤放出速度を減少させるためには、金属イオンを多い当量で使用する。
【００７４】
本発明に係る金属イオンで固定された高分子組成物は、ポリ乳酸誘導体の末端カルボキシル基の当量に対して、５〜９５重量％の両親媒性ブロック共重合体、５〜９５重量％のポリ乳酸誘導体、及び０．０１〜１０当量の二価または三価金属イオンを含有し得る。好ましくは、２０〜８０重量％の両親媒性ブロック共重合体、２０〜８０重量％のポリ乳酸誘導体、及び０．１〜５当量の二価または三価金属イオンを含有する。より好ましくは、２０〜６０重量％の両親媒性ブロック共重合体、４０〜８０重量％のポリ乳酸誘導体、及び０．２〜２当量の二価または三価金属イオンを含有する。
【００７５】
親水性ブロック及び末端ヒドロキシル基が疎水性の高いトコフェロールまたはコレステロール基で置換されている疎水性ブロックを含む両親媒性ブロック共重合体と、少なくとも１つのポリ乳酸末端が少なくとも１つのカルボキシル基と共有結合しているポリ乳酸誘導体と、金属イオンで固定化された高分子組成物を含有する高分子組成物は、水性環境で安定な高分子ミセルやナノ粒子を形成することができる。従って、本発明は、本発明の高分子組成物から形成された高分子ミセルやナノ粒子と、それらに封入された疎水性薬剤を含む医薬組成物に関するものである。上記組成物は、投与後において、血流中で有効薬剤濃度保持時間を延長させる。本発明の医薬組成物は、疎水性薬剤の血漿濃度を増加させるものであり、様々な薬剤学的剤形で使用できる。
【００７６】
図３〜図５に示されるように、水難溶性薬剤を両親媒性ブロック共重合体とポリ乳酸誘導体の高分子組成物と混合し、その中に薬剤を含有する高分子ミセルを形成する。二価または三価金属イオンを加えてポリ乳酸誘導体の末端カルボキシル基と金属イオン結合を形成させることによって、安定性がより増した薬剤含有高分子ミセル及びナノ粒子を形成することができる。
【００７７】
水難溶性薬剤の含量は、好ましくは、両親媒性ブロック共重合体、ポリ乳酸誘導体及び疎水性薬剤を含む医薬組成物全重量に対して、０．１〜３０重量％範囲内である。薬剤含有高分子ミセルまたはナノ粒子の大きさは、高分子の分子量、及びポリ乳酸誘導体に対する両親媒性ブロック共重合体の比率に従って５〜４００ｎｍ、好ましくは１０〜２００ｎｍに調節することができる。例えば、表７に示すように、金属イオンで固定された高分子ミセルまたはナノ粒子は、２０〜４０ｎｍの平均大きさを持つ。この大きさの範囲のミセルは、注射剤と滅菌濾過に適する。
【００７８】
本発明に係る金属イオン−無処理高分子組成物または金属イオン−固定化高分子ミセルまたはナノ粒子は、水溶液中で安定であり、特に金属イオンで固定された場合の安定性がより高い。表９に示すように、本発明の薬剤含有高分子ミセル組成物（組成物４及び５）は力学的に安定で、金属イオンで固定されたパクリタキセル含有高分子ミセル組成物が、さらに安定していることが分かる。金属イオンの添加によって、本発明の高分子ミセル中の薬剤滞留時間を有意に増加せることができる。これは、ポリ乳酸誘導体のカルボキシレートアニオンの架橋的静電相互作用が、疎水性コアの堅固性の増加を誘導するためである。
【００７９】
さらに、疎水性Ｂブロックの末端ヒドロキシル基が置換された疎水性部位（トコフェロールコハク酸）を有する両親媒性ジブロック共重合体の金属イオン固定化高分子ミセル（組成物４）が、従来のｍＰＥＧ‐ＰＬＡ‐ＯＨ（組成物７）に比べて力学的に安定であった。この結果は、両親媒性高分子中の疎水性Ｂブロックの疎水性を増加すれば、両親媒性高分子の疎水性部位と薬剤と間のさらに強い相互作用によって、一層安定なミセルを形成できることを示す。
【００８０】
表１１及び図９に示すように、疎水性Ｂブロックの末端ヒドロキシル基が置換された疎水性部位（トコフェロールコハク酸）を有する両親媒性ジブロック共重合体の金属イオン固定化高分子ミセル（組成物８）は、従来の両親媒性ジブロック共重合体の金属イオン固定化高分子ミセル（組成物９）より長い血流滞留時間を有する。この結果は、実施例３６で実証されているように、両親媒性高分子の疎水性Ｂブロックの疎水性増加が両親媒性高分子の疎水性部位と薬剤と間の相互作用をより強化し、さらに安定なミセルを形成していることを示す。
【００８１】
図１０〜１３に示すように、薬剤が金属イオンで固定された高分子組成物に封入された組成物は、血流中で薬剤滞留時間が増加され、市販製剤に比べて長時間の間有効血漿薬剤濃度を維持する。
【００８２】
また、本発明は、抗癌活性を示す医薬組成物を提供する。好ましい一様態として、本発明は、抗癌剤として有用な医薬組成物であって、親水性Ａブロック及び末端ヒドロキシル基を有する疎水性Ｂブロックの両親媒性ブロック共重合体、ポリ乳酸誘導体、及び抗癌剤を含み、疎水性Ｂブロックの末端ヒドロキシル基がトコフェロールまたはコレステロール基で置換されており、且つポリ乳酸誘導体の少なくとも１つの末端が、少なくとも１つのカルボキシル基と共有結合している医薬組成物を提供する。上記ポリ乳酸誘導体のカルボキシ末端基は、さらに、二価または三価金属イオンで固定することができる。
【００８３】
抗癌剤としては、これらに限定されないが、パクリタキセル及びドセタキセルなどのタキソイド類、タキシン類及びタキサン類；ポドフィロトキシン類；カンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン、９−アミノカンプトテシン、カンプトテシン−１１、トポデカンなどのカンプトテシン類；ドキソルビシン、エピルビシン、アクラルビシン、イダルビシン、ピラルビシンなどのアントラサイクリン類；ビンクリスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ビントリポール、ビンサルチンなどのビンカアルカロイド類；エポシロン、プラチナ、エトポシド、メトトレキサート、カルムスチン、５−フルオロウラシル、レチノイン酸、レチノール、タモキシフェン、マイトマイシンＢ、マイトマイシンＣ、アモナフィド、イルージンＳなどが挙げられる。
【００８４】
本発明の高分子ミセル医薬組成物は、医薬的効能が大きく向上されている。具体例として図１４〜２１に示すように、パクリタキセル含有Ｃａ2+固定化高分子ミセルは、高い癌増殖抑制率を示し、抗癌剤耐性癌細胞の増殖も抑制する（図２２及び図２３）。
【００８５】
癌の化学療法において、タキソール（登録商標）（またはパクリタキセル）やドキソルビシンなどの薬剤が広く使われてきた。これら抗癌剤は化学療法で効果的且つ有用であるが、癌細胞で抗癌剤耐性癌細胞が発現することにより薬剤の効能が低下する。Ｐ−グリコプロテイン（Ｐ−ｇｐ）の過剰発現とｂ−チューブリンの変形を含むタキソール（登録商標）耐性の様々なメカニズムとして特定されている。それらの内、Ｐ−ｇｐの過剰発現が、タキソール（登録商標）耐性を含む多重薬剤耐性現象を説明するのに有力なメカニズムである。抗癌剤耐性癌細胞は正常細胞より高いＩＣ50（薬剤の５０％細胞抑制濃度）を示すので、抗癌剤を用いた化学療法では、腫瘍細胞での薬剤濃度をより高くしなければならない。従って、癌に対する有効性を保障するためには、薬剤が腫瘍組織へ特異的に送達されなければならない。図１０に示すように、金属イオンで固定された高分子ミセルは、通常的な製剤に比べて長い循環性を示した。従って、通常のものより増加された透過滞留（ＥＰＲ）効果によって、腫瘍組織により選択的に蓄積された。本発明では、抗癌剤耐性癌に対する金属イオン固定化高分子ミセルの有効性を立証するために、タキソール（登録商標）耐性癌に対する生体内の抗癌活性に関する動物モデルを確立した。マウスに接種した癌細胞をタキソール（登録商標）に反復的に曝すと、タキソール（登録商標）で前処理された癌細胞に対する薬剤のＩＣ50が、元来の癌細胞に対する薬剤のものに比べて有意に増加した。この動物モデルにおいて、金属イオン固定化高分子ミセル（組成物１０）処理群が、クレモフォアＥＬ製剤（組成物１１）−処理群に比べてより高い抑制率を示した。このことは、図２２及び表２２に示すように、おそらく金属イオン固定化高分子ミセルに導入された薬剤の有効濃度の滞留時間がより長くなったことによる、また、ドキソルビシン耐性癌動物でも同じ効果を得ることができた（図２３）。
【００８６】
よって、本発明は、薬剤耐性腫瘍を治療するための医薬組成物であって、親水性Ａブロック及び末端ヒドロキシル基を有する疎水性Ｂブロックの両親媒性ブロック共重合体、ポリ乳酸誘導体、及び抗癌剤を含み、疎水性Ｂブロックの末端ヒドロキシル基がトコフェロールまたはコレステロール基で置換されており、且つポリ乳酸誘導体の少なくとも１つの末端が、少なくとも１つのカルボキシル基と共有結合している医薬組成物を提供する。
【００８７】
さらに本発明は、上記医薬組成物を製造する方法を含む。具体的には、図３及び５に示すように、ポリ乳酸誘導体、両親媒性ブロック共重合体、及び水難溶性薬剤を一定の割合で、アセトン、エタノール、メタノール、酢酸エチル、アセトニトリル、メチレンクロリド、クロロホルム、酢酸及びジオキサンよりなる群より選択される１以上の有機溶媒に溶解する。当該有機溶媒を除去することによって、水難溶性薬剤と高分子との均一混合物を製造する。水難溶性薬剤と本発明の高分子組成物との均一した混合物を、０〜８０℃でｐＨ４〜８の水溶液に加え、水難溶性薬剤含有混合高分子ミセル水溶液を製造する。その後、当該薬剤含有高分子ミセル水溶液を凍結乾燥して、固体形態の高分子ミセル組成物を製造する。
【００８８】
０．００１〜２Ｍの二価または三価金属イオンを含有する水溶液を、水難溶性薬剤含有混合高分子ミセル水溶液に加えて、金属イオンで固定された高分子ミセルを製造する。当該混合物を常温で０．１〜１時間ゆっくり攪拌した後、凍結乾燥することによって、固体形態の金属イオンで固定された高分子ミセルまたはナノ粒子組成物を製造する。
【００８９】
水難溶性薬剤が封入され溶解された本発明の高分子ミセルまたはナノ粒子は、経口または非経口的に投与することができる。ミセルが分解されつつ、薬剤はミセルの疎水性コアから放出され、薬理効果を示す。特に、金属イオンで固定された高分子ミセルまたはナノ粒子は、長時間血流内に存在し、標的病巣に蓄積される。
【００９０】
非経口送達のために、薬剤は、静脈内、筋肉内、腹腔内、経鼻、直腸内、眼球内、または肺内に投与することができる。経口送達のために、薬剤を本発明の高分子ミセルと混合した後、錠剤、カプセル、または水溶液の形態で投与する。
【００９１】
本発明で使われる高分子ミセルまたはナノ粒子の容量は、患者の症状、年齢及び体重などの様々な条件に応じて広い範囲にわたって変更できる。
【００９２】
下記実施例は、本発明をどのように実施するかを、当業者がより明確に理解できるようにしたものである。本発明を好ましい具体例で説明するが、下記は本発明の範囲を制限するものではない。本発明の他の側面は、本発明が属する技術分野の当業者に自明であろう。
【実施例】
【００９３】
製造例１  Ｄ，Ｌ−ポリ乳酸（ＰＬＡ−ＣＯＯＨ）の合成１
１００ｇのＤ，Ｌ−乳酸を２５０ｍＬの三口丸底フラスコへ挿入した。フラスコに攪拌機を取り付け、油浴で８０℃ に加熱した。真空アスピレーターで２５ｍｍＨｇに減圧することにより過剰な水分を除去しつつ、反応を１時間行なった。その後、２５ｍｍＨｇの減圧下、反応を１５０℃で６時間行なった。生成した産物を１Ｌの蒸留水に加え、高分子を沈殿させた。次いで、沈殿した高分子を蒸留水に加えることによって、ｐＨ４以下の水溶液に溶ける低分子量高分子を除去した。その後、沈殿した高分子を１Ｌの蒸留水に加え、炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて水溶液のｐＨを６〜８に調節して高分子を溶解させた。水に不溶の高分子を遠心分離または濾過により分離除去した。１Ｎ塩酸を滴下して、高分子を水溶液中で沈殿させた。沈殿した高分子を蒸留水で２回洗浄し、分離し、減圧下に乾燥して粘性の高い液体（７８ｇのＤ，Ｌ−ポリ乳酸、収率：７８％）を得た。1Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定によれば、高分子の数平均分子量は５４０ダルトンであった。
【００９４】
製造例２〜４  Ｄ，Ｌ−ポリ乳酸（ＰＬＡ−ＣＯＯＨ）の合成２
反応温度、圧力、時間を表１に示すようにした以外は製造例１と同様の手段によって、Ｄ，Ｌ−ポリ乳酸を得た。上記製造例１〜４から合成されたＤ，Ｌ−ポリ乳酸の数平均分子量と収率を、下記表１に示す。
【００９５】
【表１】
2006526052.tif 000007
【００９６】
製造例５  Ｄ，Ｌ−乳酸とグリコール酸の共重合体（ＰＬＧＡ−ＣＯＯＨ）の合成１
５５ｇのＤ，Ｌ−乳酸（０．６モル）と４５ｇのグリコール酸（０．６モル）を２５０ｍＬ三口丸底フラスコへ挿入した。１０ｍｍＨｇの減圧下、１５０℃で１２時間反応を行なったことを除いては、製造例１と同様の処理を行なった。
【００９７】
製造例６  Ｄ，Ｌ−乳酸とグリコール酸の共重合体（ＰＬＧＡ−ＣＯＯＨ）の合成２
７３ｇのＤ，Ｌ−乳酸（０．８モル）と２７ｇのグリコール酸（０．３５モル）を２５０ｍＬ三口丸底フラスコに挿入した。１０ｍｍＨｇの減圧下、１６０℃で１２時間反応を行なったことを除いては、製造例１と同様の処理を行なった。
【００９８】
製造例７  Ｄ，Ｌ−乳酸とグリコール酸の共重合体（ＰＬＧＡ−ＣＯＯＨ）の合成３
９１ｇのＤ，Ｌ−乳酸（１．０モル）と９ｇのグリコール酸（０．１２モル）を２５０ｍＬ三口丸底フラスコに挿入した。１０ｍｍＨｇの減圧下、１６０℃で１２時間反応を行なったことを除いては、製造例１と同様の処理を行なった。
【００９９】
製造例８  Ｄ，Ｌ−乳酸とグリコール酸の共重合体（ＰＬＧＡ−ＣＯＯＨ）の合成４
７３ｇのＤ，Ｌ−乳酸（０．８モル）と２７ｇのグリコール酸（０．３５モル）を２５０ｍＬ三口丸底フラスコに挿入した。５ｍｍＨｇの減圧下、１８０℃で２４時間反応を行なったことを除いては、製造例１と同様の処理を行なった。
【０１００】
上記製造例５〜８で合成された共重合体を表２に示す。
【０１０１】
【表２】
2006526052.tif 000008
【０１０２】
製造例９  Ｄ，Ｌ−乳酸とマンデル酸の共重合体（ＰＬＭＡ−ＣＯＯＨ）の合成
７５ｇのＤ，Ｌ−乳酸（０．８３モル）と２５ｇのＤ，Ｌ−マンデル酸（０．１６モル）を、２５０ｍＬ三口丸底フラスコに挿入した。１０〜２０ｍｍＨｇの減圧下、１８０℃で５時間反応を行なったことを除いては、製造例１と同様の処理を行なった。５４ｇ（収率：５４％）のＤ，Ｌ−乳酸とマンデル酸の共重合体を得た。Ｄ，Ｌ−乳酸とマンデル酸のモル比は８５／１５であった。1Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定によれば、高分子の数平均分子量は１，０９６ダルトンであった。
【０１０３】
製造例１０  アセトキシＤ，Ｌ−ポリ乳酸誘導体（ＡｃＯ−ＰＬＡ−ＣＯＯＨ）の合成
製造例２で合成した５０ｇのＤ，Ｌ−ポリ乳酸（Ｍｎ：１，１４０ダルトン）と、２０ｍＬのクロロ酢酸を２５０ｍＬ丸底フラスコに挿入した。フラスコに冷却器を取り付けて、反応混合物を窒素気流下に４時間還流した。過量のクロロ酢酸を蒸留で除去した後、反応産物を氷と水の混合物に加えた。全混合物をゆっくり攪拌することによって、高分子を沈殿させた。沈殿した高分子を分離し、蒸留水で２回洗浄した後、無水アセトンに溶解した。無水硫酸マグネシウムを加えて過剰の水分を除去した。得られた産物を濾過して硫酸マグネシウムを除去した。アセトンを真空エバポレーターで除去することによって、液体のアセトキシＤ，Ｌ−ポリ乳酸（４６ｇ、収率：９２％）を得た。1Ｈ−ＮＭＲによって、アセトキシ基が２．０２ｐｐｍで単一ピークとして確認された。
【０１０４】
製造例１１  パルミトイルオキシ  Ｄ，Ｌ−ポリ乳酸誘導体（ＰａｌｍＯ−ＰＬＡ−ＣＯＯＨ）の合成
製造例２で合成した２０ｇのＤ，Ｌ−ポリ乳酸（Ｍｎ：１，１４０ダルトン）を、２５０ｍＬ丸底フラスコに挿入した。反応物を、１２０度の油浴で真空下に完全に脱水した。油浴を５０℃に冷却し、５０ｍＬのアセトンを加えて高分子を完全に溶解した。５ｍＬのクロロパルミチン酸を加えて、窒素下、５０℃で１０時間反応を行なった。反応産物を過量のヘキサンで洗浄し、残っている反応物を除去した。その後、産物をアセトンに溶解し、溶液を氷と水の混合物に加えた。全混合物をゆっくり攪拌することによって、オリゴマーを沈殿させた。オリゴマーを分離し、蒸留水で２回洗浄した後、無水アセトンに溶解した。無水硫酸マグネシウムを溶液に加え、過剰の水分を除去した。得られた産物を濾過し、硫酸マグネシウムを除去した。アセトンを真空エバポレーターで除去することによって、パルミトイルオキシＤ，Ｌ−ポリ乳酸誘導体（１９．１ｇ、収率：９６％）を得た。1Ｈ−ＮＭＲによって、パルミトイル基が０．８８、１．３及び２．３８ｐｐｍのピークとして確認された。
【０１０５】
製造例１２  ３ａｒｍポリ乳酸（３ａｒｍ  ＰＬＡ−ＣＯＯＨ）の合成
１ｇのグリセロール（０．０１１ｍｏｌ）を１００ｍＬ三口丸底フラスコに挿入した。フラスコに攪拌機を取り付けて、油浴で８０℃に加熱した。真空アスピレーターにより２５ｍｍＨｇに減圧して、反応を３０分間行なうことによって、過剰の水分を除去した。反応触媒であるオクチル酸スズ（Ｔｉｎ（Ｏｃｔ）2）をトルエンに溶解し、グリセロールに加えた。反応混合物を３０分間攪拌し、１１０℃で１時間、圧力を１ｍｍＨｇに減圧することによって、触媒を溶解した溶媒（トルエン）を除去した。精製されたラクチド（３５．８、０．２４９ｍｏｌ；１０ｗｔ％）を加え、２５ｍｍＨｇの減圧下、混合物を１３０℃で６時間加熱した。形成された高分子をアセトンに溶解し、０．２Ｎ  ＮａＨＣＯ3水溶液を滴下して高分子を沈殿させた。沈殿した高分子を蒸留水で３〜４回洗浄し、分離、減圧乾燥して粉末（３ａｒｍ  ＰＬＡ−ＯＨ）を得た。
【０１０６】
１００ｇの３ａｒｍ  ＰＬＡ−ＯＨ（０．０３３モル）を１００ｍＬ一口丸底フラスコに挿入し。真空アスピレーターで２５ｍｍＨｇに減圧しながら、反応を３０分間行なって過剰の水分を除去した。１９．８ｇの無水コハク酸（０．１９８ｍｏｌ）を加え、混合物を１２５℃で６時間加熱した。形成された高分子をアセトンに溶解し、蒸留水を滴下して高分子を沈殿させた。沈殿した高分子を、６０℃で０．２Ｎ  ＮａＨＣＯ3水溶液に溶解した。溶けない高分子を濾過で除去した。２Ｎ  ＨＣｌを滴下して高分子を沈殿させた。沈殿した高分子を蒸留水で５〜６回洗浄し、分離、減圧乾燥して粉末（３ａｒｍ  ＰＬＡ−ＣＯＯＨ）を得た。1Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定によれば、高分子の数平均分子量は３，０００ダルトンであった。
【０１０７】
製造例１３  ５ａｒｍポリ乳酸（５ａｒｍ  ＰＬＡ−ＣＯＯＨ）の合成
１ｇのキシリトール（０．００６６ｍｏｌ）を１００ｍＬ三口丸底フラスコに挿入した。フラスコに攪拌機を取り付けて、油浴で８０℃に加熱した。真空アスピレーターで２５ｍｍＨｇに減圧し、反応を３０分間行なうことによって、過剰の水分を除去した。反応触媒であるオクチル酸スズ（Ｔｉｎ（Ｏｃｔ）2）をトルエンに溶解し、グリセロールに加えた。反応混合物を３０分間攪拌し、反応混合物を３０分間攪拌し、１１０℃で１時間、圧力を１ｍｍＨｇに減圧することによって、触媒を溶解した溶媒（トルエン）を除去した。精製されたラクチド（３１．７、０．１５１モル；１０ｗｔ％）を加え、混合物を６時間、２５ｍｍＨｇの減圧下に１３０℃に加熱した。形成された高分子をアセトンに溶解し、０．２Ｎ  ＮａＨＣＯ3水溶液を滴下して高分子を沈殿させた。沈殿した高分子を蒸留水で３〜４回洗浄し、分離、減圧乾燥して粉末（５ａｒｍ  ＰＬＡ−ＯＨ）を得た。
【０１０８】
１００ｇの５ａｒｍ  ＰＬＡ−ＯＨ（０．０３３ｍｏｌ）を１００ｍＬ一口丸底フラスコに挿入した。真空アスピレーターで２５ｍｍＨｇに減圧し、反応を３０分間行なうことによって、過剰の水分を除去した。３３．０ｇの無水コハク酸（０．３３ｍｏｌ）を加え、混合物を６時間１２５℃に加熱した。形成された高分子をアセトンに溶解し、蒸留水を滴下して高分子を沈殿させた。沈殿した高分子を０．２Ｎ  ＮａＨＣＯ3水溶液に６０℃で溶解した。溶けない高分子を濾過で除去した。２Ｎ  ＨＣｌ水溶液を滴下して高分子を沈殿させた。沈殿した高分子を蒸留水で５〜６回洗浄し、分離、減圧乾燥して粉末（３ａｒｍ  ＰＬＡ−ＣＯＯＨ）を得た。1Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定によれば、高分子の数平均分子量は３，０００ダルトンであった。
【０１０９】
製造例１４  ポリ乳酸ナトリウム塩（ＰＬＡ−ＣＯＯＮａ）の合成１
製造例１で合成したＤ，Ｌ−ポリ乳酸（Ｍｎ：５４０ダルトン）をアセトンに溶解した。溶液を丸底フラスコに挿入し、フラスコに攪拌機を取り付けた。溶液を室温でゆっくり攪拌し、ｐＨ７になるように炭酸水素ナトリウム溶液（１Ｎ）をゆっくり加えた。無水硫酸マグネシウムを加えて過剰の水分を除去した。得られた混合物を濾過し、アセトンを溶媒エバポレーターで留去した。白色固体が得られた。得られた固体を無水アセトンに溶解し、溶液を濾過して不溶部分を除去した。アセトンを留去することによって、Ｄ，Ｌ−ポリ乳酸のナトリウム塩（収率：９６％）を白色固体として得た。 図２に示されるように、1Ｈ−ＮＭＲによってカルボン酸に隣接した水素ピークを４．８８ｐｐｍで観察した。また、高分子は水に溶かした時、６．５〜７．５のｐＨを示した。
【０１１０】
製造例１５  ポリ乳酸ナトリウム塩（ＰＬＡ−ＣＯＯＮａ）の合成２
製造例２で合成したＤ，Ｌ−ポリ乳酸（Ｍｎ：１，１４０ダルトン）と炭酸ナトリウム水溶液を用いたことを除いては、上記製造例１４と同様の処理によりポリ乳酸のナトリウム塩（収率：９５％）を合成した。
【０１１１】
製造例１６  アセトキシ−Ｄ，Ｌ−ポリ乳酸ナトリウム塩（ＡｃＯ−ＰＬＡ−ＣＯＯＮａ）の合成
製造例１０で合成したアセトキシ−Ｄ，Ｌ−ポリ乳酸（Ｍｎ：１，１４０ダルトン）と炭酸ナトリウム水溶液を用いたことを除いては、上記製造例１４と同様の処理によりアセトキシ−Ｄ，Ｌ−ポリ乳酸のナトリウム塩（収率：９５％）を合成した。
【０１１２】
製造例１７  パルミトイルオキシ  Ｄ，Ｌ−ポリ乳酸ナトリウム塩（ＰａｌｍＯ−ＰＬＡ−ＣＯＯＮａ）の合成１
製造例１１で合成したパルミトイルオキシ  Ｄ，Ｌ−ポリ乳酸（Ｍｎ：１，１４０ダルトン）をアセトン水溶液（２８．６ｖ／ｖ％）に完全に溶解した。溶液を丸底フラスコに挿入し、フラスコに攪拌機を取り付けた。溶液を常温でゆっくり攪拌した後、炭酸水素ナトリウム水溶液（１Ｎ）を加えて中和した。溶液を室温でゆっくり攪拌し、炭酸水素ナトリウム（１Ｎ）をｐＨ７になるまでゆっくり加えた。無水硫酸マグネシウムを加えて過剰の水分を除去した。得られた溶液を濾過し、アセトン溶液を溶媒エバポレーターで留去した。白色固体が得られた。得られた固体をアセトンに溶解し、溶液を濾過してアセトンに溶けない物質を除去した。アセトンを留去して、パルミトイルオキシ  Ｄ，Ｌ−ポリ乳酸のナトリウム塩を白色固体として得た（収率：９６％）。
【０１１３】
製造例１８  ポリ乳酸カリウム塩（ＰＬＡ−ＣＯＯＫ）の合成
製造例３で合成したＤ，Ｌ−乳酸（Ｍｎ：１，５５０ダルトン）と炭酸水素カリウム水溶液を用いたことを除いては、上記製造例１４と同様の処理によりポリ乳酸のカリウム塩（収率：９８％）を合成した。
【０１１４】
製造例１９  ポリ乳酸ナトリウム塩（ＰＬＡ−ＣＯＯＮａ）の合成３
製造例４で合成したＤ，Ｌ−乳酸（Ｍｎ：２，１００ダルトン）を用いたことを除いては、上記製造例１４と同様の処理によりポリ乳酸のナトリウム塩（収率：９５％）を合成した。
【０１１５】
製造例２０  Ｄ，Ｌ−乳酸とグリコール酸共重合体のナトリウム塩（ＰＬＧＡ−ＣＯＯＮａ）の合成１
製造例５で合成したＤ，Ｌ−乳酸とグリコール酸の共重合体（Ｍｎ：９２０ダルトン)と炭酸ナトリウム水溶液を用いたことを除いては、上記製造例１４と同様の処理によりＤ，Ｌ−乳酸とグリコール酸共重合体のナトリウム塩（収率：９８％）を合成した。
【０１１６】
製造例２１  Ｄ，Ｌ−乳酸とグリコール酸の共重合体のナトリウム塩（ＰＬＧＡ−ＣＯＯＮａ）の合成２
製造例６で合成したＤ，Ｌ−乳酸とグリコール酸の共重合体（Ｍｎ：１，０４０ダルトン）を用いたことを除いては、上記製造例１４と同様の処理によりＤ，Ｌ−乳酸とグリコール酸の共重合体のナトリウム塩（収率：９３％）を合成した。
【０１１７】
製造例２２  Ｄ，Ｌ−乳酸とグリコール酸の共重合体のカリウム塩（ＰＬＧＡ−ＣＯＯＫ）の合成
製造例７で合成したＤ，Ｌ−乳酸とグリコール酸の共重合体（Ｍｎ：１，１８０ダルトン）と炭酸カリウム水溶液を用いたことを除いては、上記製造例１４と同様の処理によりＤ，Ｌ−乳酸とグリコール酸の共重合体のカリウム塩（収率：９２％）を合成した。
【０１１８】
製造例２３  Ｄ，Ｌ−乳酸とグリコール酸の共重合体のナトリウム塩（ＰＬＧＡ−ＣＯＯＮａ）の合成３
製造例８で合成したＤ，Ｌ−乳酸とグリコール酸の共重合体（Ｍｎ：１，６５０ダルトン）を用いたことを除いては、上記製造例１４と同様の処理によりＤ，Ｌ−乳酸とグリコール酸の共重合体のナトリウム塩（収率：９８％）を合成した。
【０１１９】
製造例２４  Ｄ，Ｌ−乳酸とマンデル酸の共重合体のナトリウム塩（ＰＬＭＡ−ＣＯＯＮａ）の合成
製造例９で合成したＤ，Ｌ−乳酸とマンデル酸の共重合体（Ｍｎ：１，０９６ダルトン）を用いたことを除いては、上記製造例１４と同様の処理によりＤ，Ｌ−乳酸とマンデル酸の共重合体のナトリウム塩（収率：９６％）を白色固体として合成した。
【０１２０】
製造例２５  ３ａｒｍポリ乳酸のナトリウム塩（３ａｒｍ  ＰＬＡ−ＣＯＯＮａ）の合成
製造例１２で合成した３−ａｒｍ  Ｄ，Ｌ−乳酸の共重合体（Ｍｎ：３，０００ダルトン）を用いたことを除いては、製造例１４と同様の処理により３ａｒｍポリ乳酸のナトリウム塩を白色固体として合成した。
【０１２１】
製造例２６  ５ａｒｍポリ乳酸のナトリウム塩（５ａｒｍ  ＰＬＡ−ＣＯＯＮａ）の合成
製造例１３で合成した５−ａｒｍ  Ｄ，Ｌ−乳酸（Ｍｎ：３，０００ダルトン）を用いたことを除いては、製造例１４と同様の処理により５ａｒｍポリ乳酸のナトリウム塩を白色固体として合成した。
【０１２２】
上記製造例１４〜２６で合成したポリ乳酸誘導体のカルボン酸塩を表３に示す。
【０１２３】
【表３】
2006526052.tif 000009
【０１２４】
製造例２７  モノメトキシポリエチレングリコール−ポリラクチド（ｍＰＥＧ−ＰＬＡ）ブロック共重合体（ＡＢ型）の重合
５ｇのモノメトキシポリエチレングリコール（Ｍｎ：２，０００ダルトン）を１００ｍＬ二口丸底フラスコに挿入し、混合物を２〜３時間、減圧（１ｍｍＨｇ）下に１００℃ に加熱して脱水した。反応フラスコに乾燥窒素を充填し、反応触媒であるオクチル酸スズ（Ｓｎ（Ｏｃｔ）2）を注射器でラクチドの０．１ｗｔ％（５ｍｇ）に注入した。反応混合物を３０分間攪拌し、１１０℃で１時間、１ｍｍＨｇに減圧して触媒を溶解した溶媒（トルエン）を除去した。精製されたラクチド（５ｇ）を加え、混合物を１３０℃で１２時間加熱した。形成された高分子をエタノールに溶解し、ジエチルエーテルを加えて高分子を沈殿させた。得られた高分子を真空オーブンで４８時間乾燥した。得られたｍＰＥＧ−ＰＬＡの数平均分子量は２，０００〜１，７６５ダルトンであり1Ｈ−ＮＭＲによってＡＢ型であることが確認された。
【０１２５】
製造例２８  モノメトキシポリエチレングリコール−ポリ（ラクチドとグリコリドの共重合体)（ｍＰＥＧ−ＰＬＧＡ）ブロック共重合体（ＡＢ型）の重合
ｍＰＥＧ−ＰＬＧＡブロック共重合体を合成するために、製造例２７と同様の処理によって、１２０℃で１２時間、モノメトキシポリエチレングリコール（Ｍｎ：５，０００ダルトン）を、触媒であるオクチル酸スズの存在下、ラクチド及びグリコリドと反応させた。得られたｍＰＥＧ−ＰＬＧＡの数平均分子量は５，０００〜４，０００ダルトンであり、1Ｈ−ＮＭＲによってＡＢ型であることが確認された。
【０１２６】
製造例２９  モノメトキシポリエチレングリコール−ポリ（ラクチドとｐ−ジオキサン−２−オンの共重合体)（ｍＰＥＧ−ＰＬＤＯ）ブロック共重合体（ＡＢタイプ）の重合
ｍＰＥＧ−ＰＬＤＯブロック共重合体を合成するために、製造例２７と同様の処理によって、１１０℃で１２時間、モノメトキシポリエチレングリコール（Ｍｎ：１２，０００ダルトン）を、触媒であるオクチル酸スズの存在下、ラクチド及びｐ−ジオキサン−２−オンと反応させた。得られたｍＰＥＧ−ＰＬＤＯの数平均分子量は、１２，０００〜１０，０００ダルトンであり、1Ｈ−ＮＭＲによりＡＢ型であることが確認された。
【０１２７】
製造例３０  モノメトキシポリエチレングリコール−ポリカプロラクトン（ｍＰＥＧ−ＰＣＬ）ブロック共重合体（ＡＢ型）の重合
ｍＰＥＧ−ＰＣＬブロック共重合体を合成するために、製造例２７と同様の処理によって、１３０℃で１２時間、触媒であるオクチル酸スズの存在下、モノメトキシポリエチレングリコール（Ｍｎ：１２，０００ダルトン）をカプロラクトンと反応させた。得られたｍＰＥＧ−ＰＣＬの数平均分子量は１２，０００−５，０００ダルトンであり、1Ｈ−ＮＭＲによってＡＢ型であることが確認された。
【０１２８】
上記製造例２７〜３０で合成されたブロック共重合体を下記表４に示す。
【０１２９】
【表４】
2006526052.tif 000010
【０１３０】
製造例３１  モノメトキシポリエチレングリコール−モノメトキシポリエチレングリコール（ＰＬＡ−ｍＰＥＧ−ＰＬＡ）ブロック共重合体（ＢＡＢ型）の重合
２５ｇのメトキシポリエチレングリコール（分子量＝２，０００）と５０ｇのＤ，Ｌ−ラクチドを用いたことを除いては、製造例２７と同様の処理によって、ＰＬＡ−ｍＰＥＧ−ＰＬＡを得た。ＰＬＡ−ｍＰＥＧ−ＰＬＡの数平均分子量は１，７６５〜２，０００〜１，７６５ダルトンであり、1Ｈ−ＮＭＲによってＢＡＢ型であることが確認された。
【０１３１】
実施例１  ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−コレステロールの重合１
ａ）コレステロールサクシネートの合成
７．６ｇのコレステロールと２．３６ｇの無水コハク酸を、丸底フラスコ中で１００ｍＬの１，４−ジオキサンに溶解した。反応触媒である２．９ｇの４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）を加え、当該混合物を室温で２４時間攪拌した。当該反応混合物をＨＣｌ溶液に加えることによって、コレステロールサクシネート（９．１ｇ；収率９５％）を沈殿させた。
【０１３２】
ｂ）ｍＰＥＧ−ＰＬＡとコレステロールサクシネートの結合
製造例２７で合成した１０ｇのｍＰＥＧ−ＰＬＡと、１．５５ｇのコレステロールサクシネート（高分子の１．２モル倍）を、丸底フラスコ中、５０ｍＬのアセトニトリルに溶解した。反応触媒として、０．７６ｇのジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）と０．０４５ｇの４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）を加え、室温で２４時間攪拌した。反応終了後、混合物をガラスフィルターにより濾過することによって、副生物であるシクロヘキシルカルボウレア（ＤＣＵ）を除去した。残留した触媒は、塩酸で抽出して除去した。精製された生成物溶液にマグネシウム硫酸塩を加えることによって、残留水分を除去した後、再結晶のために混合物をｎ−ヘキサン／ジエチルエーテル（ｖ／ｖ＝７／３）の混合溶媒へ加え、精製されたｍＰＥＧ−ＰＬＡ−コレステロール（１０ｇ；収率８８．６％）を得た。そのＮＭＲスペクトルを図６に示す。
【０１３３】
実施例２  ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−コレステロールの重合２
ａ）コレステロールサクシネートの合成
７．６ｇのコレステロールとスクシニルクロリド（コレステロールの２モル倍）をフラスコに入れ、５０ｍＬのアセトニトリルに溶解した。５０℃で１２時間反応することによって、コレステロールのヒドロキシル基にサクシネートを結合させた後、ＨＣｌ中で沈殿させることによって、コレステロールサクシネート（８．２ｇ；収率９２％）を得た。
【０１３４】
ｂ）ｍＰＥＧ−ＰＬＡとコレステロールサクシネートの結合
１０ｇのｍＰＥＧ−ＰＬＡと、実施例２ａ）で得られたコレステロールサクシネート（高分子の１．２モル倍）を用いたことを除いては、実施例１ｂ）と同様にして、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−コレステロール（９．５２ｇ；収率８５％）を得た。
【０１３５】
実施例３〜５  ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−コレステロールの重合３〜５
マロニルクロリド（実施例３）、グルタリルクロリド（実施例４）及びアジポイルクロリド（実施例５）を高分子の２モル倍でそれぞれ用いたことを除いては、実施例２と同様にして、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−コレステロールを得た。
【０１３６】
実施例６〜９  ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールの重合１〜４
８．５ｇのトコフェロールと、マロニルクロリド（実施例６）、スクシニルクロリド（実施例７）、グルタリルクロリド（実施例８）及びアジポイルクロリド（実施例９）を高分子の２モル倍でそれぞれ用いたことを除いては、実施例２と同様にして、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールを得た。そのＮＭＲスペクトルを図７（実施例７）に示す。
【０１３７】
実施例１０  モノメトキシポリエチレングリコール−ポリ（ラクチドとグリコリドの共重合体）トコフェロール（ｍＰＥＧ−ＰＬＧＡ−トコフェロール）ブロック共重合体（ＡＢ型）の重合
製造例２８で合成した１０ｇのｍＰＥＧ−ＰＬＧＡと１．７６７ｇのトコフェロールサクシネートを用いたことを除いては、実施例１ｂ）と同様にして、精製されたｍＰＥＧ−ＰＬＧＡ−トコフェロール（１０ｇ；収率＝８７．５％）を得た。
【０１３８】
実施例１１  モノメトキシポリエチレングリコール−ポリ（ラクチドとグリコリドの共重合体）コレステロール（ｍＰＥＧ−ＰＬＧＡ−コレステロール）ブロック共重合体（ＡＢ型）の重合
製造例２８で合成した１０ｇのｍＰＥＧ−ＰＬＧＡと０．７０ｇのコレステロールサクシネートを用いたことを除いては、実施例１ｂ）と同様にして、精製されたｍＰＥＧ−ＰＬＧＡ−コレステロール（１０ｇ；収率＝８８．６％）を得た。
【０１３９】
実施例１２  モノメトキシポリエチレングリコール−ポリ（ラクチドとｐ−ジオキサン−２−オンの共重合体）トコフェロール（ｍＰＥＧ−ＰＬＤＯ−トコフェロール）ブロック共重合体（ＡＢ型）の重合
製造例２９で合成した１０ｇのｍＰＥＧ−ＰＬＤＯと０．３１４ｇのトコフェロールサクシネートを用いたことを除いては、実施例１ｂ）と同様にして、精製されたｍＰＥＧ−ＰＬＤＯ−トコフェロール（１０ｇ；収率＝８７．５％）を得た。
【０１４０】
実施例１３  モノメトキシポリエチレングリコール−ポリ（ラクチドとジオキサン−２−オンの共重合体）コレステロール（ｍＰＥＧ−ＰＬＤＯ−コレステロール）ブロック共重合体（ＡＢ型）の重合
製造例２９で合成した１０ｇのｍＰＥＧ−ＰＬＤＯと０．２８８ｇのコレステロールサクシネートを用いたことを除いては、実施例１ｂ）と同様にして、精製されたｍＰＥＧ−ＰＬＤＯ−コレステロール（１０ｇ；収率＝８８．６％）を得た。
【０１４１】
実施例１４  モノメトキシポリエチレングリコール−ポリカプロラクトントコフェロール（ｍＰＥＧ−ＰＣＬ−トコフェロール）ブロック共重合体（ＡＢ型）の重合
製造例３０で合成した１０ｇのｍＰＥＧ−ＰＣＬと０．４０６ｇのトコフェロールサクシネートを用いたことを除いては、実施例１ｂ）と同様にして、精製されたｍＰＥＧ−ＰＣＬ−トコフェロール（１０ｇ；収率＝８７．５％）を得た。
【０１４２】
実施例１５  モノメトキシポリエチレングリコール−ポリカプロラクトンコレステロール（ｍＰＥＧ−ＰＣＬ−コレステロール）ブロック共重合体（ＡＢ型）の重合
製造例３０で合成した１０ｇのｍＰＥＧ−ＰＣＬと０．３７２ｇのコレステロールサクシネートを用いたことを除いては、実施例１ｂ）と同様にして、精製されたｍＰＥＧ−ＰＣＬ−コレステロール（１０ｇ；収率＝８８．６％）を得た。
【０１４３】
実施例１６  ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−コレステロールの重合６
４ｇのコレステロールを定量し、真空ポンプを用いて５０℃で水分を除去した。ここにスクシニルクロリド（３．０ｇ；コレステロールの２．０モル倍）を添加し、１２時間反応した。反応終了後、過剰のスクシニルクロリドを真空下１００℃で除去した。ここにｍＰＥＧ−ＰＬＡ（３６ｇ；コレステロールの０．９５モル倍）を添加し、１２時間反応した。合成された高分子をメチレンクロリドに溶解した後、ヘキサン／ジエチルエーテル溶媒で沈澱することによって、コレステロール基が結合した両親媒性ブロック共重合体であるｍＰＥＧ−ＰＬＡ−コレステロールを得た。沈澱した高分子生成物（３５ｇ；収率８８％）は、濾過した後に真空乾燥することによって、白色粒子としてで得た。
【０１４４】
実施例１７〜２０  ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−コレステロールの重合７〜１０
オキサリルクロリド（実施例１７）、マロニルクロリド（実施例１８）、グルタリルクロリド（実施例１９）及びアジポイルクロリド（実施例２０）をコレステロールの２．０モル倍でそれぞれ用いたことを除いては、実施例１６と同様にして、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−コレステロールを得た。
【０１４５】
実施例２１〜２５  ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールの重合５〜９
４．３ｇのトコフェロールと、オキサリルクロリド（実施例２１）、マロニルクロリド（実施例２２）、スクシニルクロリド（実施例２３）、グルタリルクロリド（実施例２４）及びアジポイルクロリド（実施例２５）をトコフェロールの２．０モル倍でそれぞれ用いたことを除いては、実施例１６と同様にして、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールを得た。
【０１４６】
実施例２６  ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−コレステロールの重合１１
コレステロールサクシネート（４．９ｇ）とオキサリルクロリド（２．５３ｇ；コレステロールサクシネートの２モル倍）を定量し、５０℃で６時間反応した。反応終了後、過剰のオキサリルクロリドを真空条件で除去した。ここに、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ（３６ｇ；コレステロールサクシネートの０．９５モル倍）を定量して添加した。反応温度を１００℃とし、１２時間反応した。合成された高分子をメチレンクロリドに溶解した後、ヘキサン／ジエチルエーテル中で沈殿させ、濾過した。産生物を真空乾燥してｍＰＥＧ−ＰＬＡ−コレステロール（３４．６ｇ；収率９１％）を得た。
【０１４７】
実施例２７〜２９  ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−コレステロールの重合１２〜１４
コレステロールマロネート（実施例２７）、コレステロールグルタレート（実施例２８）及びコレステロールアジペート（実施例２９）をそれぞれ用いたことを除いては、実施例２６と同様にして、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−コレステロールを得た。
【０１４８】
実施例３０〜３３  ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールの重合１０〜１３
トコフェロールマロネート（実施例３０）、トコフェロールサクシネート（実施例３１）、トコフェロールグルタレート（実施例３２）及びトコフェロールアジペート（実施例３３）をそれぞれ用いたことを除いては、実施例２６と同様にして、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールを得た。
【０１４９】
実施例３４  トコフェロール−ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールの製造
製造例３１で合成した１０ｇのＰＬＡ−ｍＰＥＧ−ＰＬＡとトコフェロールサクシネート（高分子の２．４モル倍）を用いたことを除いては、実施例１ｂ）と同様にして、トコフェロール−ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（収率＝９２．４％）を得た。
【０１５０】
実施例３５  コレステロール−ＰＬＡ−ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−コレステロールの製造
製造例３１で合成した１０ｇのＰＬＡ−ｍＰＥＧ−ＰＬＡを用いたことを除いては、実施例１ｂ）と同様にして、コレステロール−ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＬＡ−コレステロール（収率＝９４．２）を得た。
【０１５１】
実施例３６  疎水性部位とコンジュゲートされた両親媒性ジブロック共重合体のパクリタキセル含有高分子ミセルの薬剤動態
パクリタキセル含有高分子ミセルの血流滞留時間に関する両親媒性ジブロック共重合体（ｍＰＥＧ−ＰＬＡ、Ｍｎ２０００−１７６５）の疎水性Ｂブロックにおける末端ヒドロキシル基に置換した疎水性部位の影響を評価するために、下記のように組成物を製造した。パクリタキセルと実施例１、７または製造例２７の両親媒性ジブロック共重合体を１：９９の重量比で混合した後、混合物を５ｍＬの無水エタノールに溶解して透明な溶液を調製した。エタノールを真空エバポレーターで除去し、パクリタキセル含有高分子組成物を製造した。蒸留水（４ｍＬ）を加え、混合物を６０℃で１０分間攪拌することによって、パクリタキセル含有高分子ミセル水溶液を製造した。細孔の大きさが２００ｎｍのフィルタで混合物を濾過した後、凍結乾燥した。
【０１５２】
上記組成物と薬剤含量を表５に要約した。
【０１５３】
【表５】
2006526052.tif 000011
【０１５４】
動物実験のために、体重２５０〜３００ｇの雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの大腿静脈と大腿動脈に挿管した。組成物１〜３を５ｍｇ／ｋｇ容量で１５秒かけて大腿静脈に注射した。注射から１、５、１５、３０分及び１、２、３、４、６時間後、０．３ｍＬの全血を大腿動脈から採血した後、遠心分離して透明な上清血漿を得た。
【０１５５】
また、薬剤の血漿濃度を分析するために、０．１ｍＬの血漿を蓋付きガラス管に挿入し、内部標準物質を含有する０．１ｍＬのアセトニトリル溶液を加えた。１０ｍＬの酢酸エチルを上記溶液に加えて混合物を３０秒間激しく混合した後、２，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。全酢酸エチル層を取り試験管に移した後、有機溶媒を窒素気流下４０℃で完全に留去した。そこへ０．１ｍＬの４０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル溶液を加え、混合物を３０秒間激しく攪拌した後、ＨＰＬＣを行なった。ＨＰＬＣ条件は下記通りである。
注入容積：０．０７５ｍＬ
流速:１．０ｍＬ／分
波長：２２７ｎｍ
移動相：５分間２４％アセトニトリル水溶液、１６分間５８％に増加、２分間７０％に増加、４分間３４％に減少して５分間保持
カラム：４．６×５０ｎｍ（Ｃ１８、Ｖｙｄａｃ、ＵＳＡ）。
【０１５６】
ミセルの大きさと薬剤血漿濃度の分析結果を、下記表６と図８に示した。
【０１５７】
【表６】
2006526052.tif 000012
【０１５８】
表６と図８の通り、疎水性Ｂブロックの末端ヒドロキシル基に疎水性部位（トコフェロールコハク酸またはコレステロールコハク酸）が置換した両親媒性ジブロック共重合体の高分子ミセル（組成物１または２）は、従来のｍＰＥＧ−ＰＬＡ−ＯＨ高分子ミセル（組成物３）に比べて、より長い血流滞留時間を示した。この結果は、両親媒性高分子にある疎水性Ｂブロックにおける疎水性の増加が、両親媒性高分子の疎水性部位と薬剤と間の相互作用を強めることによって、より安定なミセルを形成することを示唆するものである。
【０１５９】
また、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールミセル（組成物１）が、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−コレステロールミセル（組成物２）に比べて、より長く血液中に循環していることが分かる。
【０１６０】
実施例３７  イオンで固定された高分子ミセルの製造
ステップ１：Ｄ，Ｌ−ＰＬＡ−ＣＯＯＮａ及びｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールブロック共重合体の高分子ミセルの製造
製造例１５で得られた２４８．１ｍｇ（０．２１８ｍｍｏｌ）のＤ，Ｌ−ＰＬＡ−ＣＯＯＮａ（Ｍｎ：１，１４０）と、実施例７で得られた７４４．３ｍｇのｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（Ｍｎ：２，０００〜１，８００ダルトン）を、５ｍＬのエタノールに完全に溶解し、透明な溶液を得た。エタノールを除去して高分子組成物を得た。蒸留水（６．２ｍＬ）を加え、混合物を６０℃で３０分間攪拌して、高分子ミセル水溶液を製造した。
【０１６１】
段階２：二価金属イオンによる固定
無水塩化カルシウムの０．９Ｍ水溶液０．１２１ｍＬ（０．１０９ｍｍｏｌ）をステップ１で製造した高分子ミセル水溶液に加え、混合物を常温で２０分間攪拌した。細孔の大きさが２００ｎｍのフィルタで混合物を濾過した後、凍結乾燥した。動的光散乱（ＤＬＳ）法によれば、測定粒径は２５ｎｍであった。
【０１６２】
実施例３８  Ｄ，Ｌ−ＰＬＡ−ＣＯＯＮａ、及びｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールブロック共重合体のＣａ2+固定化パクリタキセル含有ミセルの製造
ステップ１：パクリタキセル含有Ｄ，Ｌ−ＰＬＡ−ＣＯＯＮａ及びｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールブロック共重合体の高分子ミセルの製造
製造例１５で得られた２４８．１ｍｇ（０．２１８ｍｍｏｌ）のＤ，Ｌ−ＰＬＡ−ＣＯＯＮａ（Ｍｎ：１，１４０）、７．５ｍｇのパクリタキセル、および実施例７で得られた７４４．３ｍｇのｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（Ｍｎ：２，０００〜１，８００ダルトン）を、５ｍＬのエタノールに完全に溶解して透明な溶液を得た。エタノールを除去し、パクリタキセル含有高分子組成物を製造した。蒸留水（６．２ｍＬ）を加え、混合物を６０℃で３０分間攪拌することによって、パクリタキセル含有高分子ミセル水溶液を製造した。
【０１６３】
ステップ２：二価金属イオンによる固定
無水塩化カルシウムの０．９Ｍ水溶液の０．１２１ｍＬ（０．１０９ｍｍｏｌ）をステップ１で製造した高分子ミセル水溶液に加え、混合物を常温で２０分間攪拌した。細孔の大きさが２００ｎｍのフィルタで混合物を濾過した後、凍結乾燥した。パクリタキセルの含量と溶解度をＨＰＬＣで測定し、粒径を動的光散乱（ＤＬＳ）法により測定した。
【０１６４】
Ｄ，Ｌ−ＰＬＡ−ＣＯＯＮａ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（重量比）：１／３
パクリタキセル含量：０．７５ｗｔ％
粒径：２９ｎｍ。
【０１６５】
実施例３９  Ｄ，Ｌ−ＰＬＭＡ−ＣＯＯＮａ及びｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールブロック共重合体のＭｇ2+固定化パクリタキセル含有高分子ミセルの製造
製造例２４で得られた２４８．１ｍｇ（０．２２６ｍｍｏｌ）のＤ，Ｌ−ＰＬＭＡ−ＣＯＯＮａ（Ｍｎ：１，０９６）、７．５ｍｇのパクリタキセル、実施例７で得られた７４４．３ｍｇのｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（Ｍｎ：２，０００〜１，８００ダルトン）と、０．２３０ｍＬ（０．１１３ｍｍｏｌ）の塩化マグネシウム６水和物（Ｍｗ：２０３．３１）の０．５Ｍ水溶液を用いたことを除いては、実施例３８と同様の処理によって、Ｍｇ2+固定化パクリタキセル含有高分子ミセル組成物を製造した。
Ｄ，Ｌ−ＰＬＭＡ−ＣＯＯＮａ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（重量比）：１／３
パクリタキセル含量：０．７５ｗｔ％
粒径：３０ｎｍ。
【０１６６】
実施例４０  Ｄ，Ｌ−ＰＬＭＡ−ＣＯＯＮａ及びｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールブロック共重合体のＣａ2+固定化パクリタキセル含有高分子ミセルの製造
２４８．１ｍｇ（０．２２６ｍｍｏｌ）の製造例２４で得られたＤ，Ｌ−ＰＬＭＡ−ＣＯＯＮａ（Ｍｎ：１，０９６）、７．５ｍｇのパクリタキセル、７４４．３ｍｇの実施例７で得られたｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（Ｍｎ：２，０００〜１，８００ダルトン）と、０．１２６ｍＬ（０．１１３ｍｍｏｌ）の無水塩化カルシウムの０．９Ｍ水溶液を用いたことを除いては、実施例３８と同様の処理によって、Ｃａ2+固定化パクリタキセル含有高分子ミセル組成物を製造した。
Ｄ，Ｌ−ＰＬＭＡ−ＣＯＯＮａ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（重量比）：１／３
パクリタキセル含量：０．７５ｗｔ％
粒径：３４ｎｍ。
【０１６７】
実施例４１  Ｄ，Ｌ−ＰＬＡ−ＣＯＯＫ及びｍＰＥＧ−ＰＬＡ−コレステロールブロック共重合体のＣａ2+固定化パクリタキセル含有高分子ミセルの製造
２４８．１ｍｇ（０．１６０ｍｍｏｌ）の製造例１８で得られたＤ，Ｌ−ＰＬＡ−ＣＯＯＫ（Ｍｎ：１，５５０）、７．５ｍｇのパクリタキセル、７４４．４ｍｇの実施例１で得られたｍＰＥＧ−ＰＬＡ−コレステロール（Ｍｎ：２，０００〜１，８００ダルトン）と、０．０８９ｍＬ（０．０８０ｍｍｏｌ）の無水塩化カルシウムの０．９Ｍ水溶液を用いたことを除いては、実施例３８と同様の処理によって、Ｃａ2+固定化パクリタキセル含有高分子ミセル組成物を製造した。
Ｄ，Ｌ−ＰＬＡ−ＣＯＯＮａ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−コレステロール（重量比）：１／３
パクリタキセル含量：０．７５ｗｔ％
粒径：３４ｎｍ。
【０１６８】
実施例４２  Ｄ，Ｌ−ＰＬＭＡ−ＣＯＯＮａ及びｍＰＥＧ−ＰＬＡ−コレステロールブロック共重合体のＣａ2+固定化パクリタキセル含有の高分子ミセルの製造
２４８．１ｍｇ（０．２２６ｍｍｏｌ）製造例２４で得られたＤ，Ｌ−ＰＬＭＡ−ＣＯＯＮａ（Ｍｎ：１，０９６）、７．５ｍｇのパクリタキセル、７４４．４ｍｇの実施例１で得られたｍＰＥＧ−ＰＬＡ−コレステロール（Ｍｎ：２，０００〜１，８００ダルトン）と、０．１２６ｍＬ（０．１１３ｍｍｏｌ）の無水塩化カルシウムの０．９Ｍ水溶液を用いたことを除いては、実施例３８と同様の処理によって、Ｃａ2+固定化パクリタキセル含有高分子ミセル組成物を製造した。
Ｄ，Ｌ−ＰＬＭＡ−ＣＯＯＮａ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−コレステロール（重量比）：１／３
パクリタキセル含量：０．７５ｗｔ％
粒径：３４ｎｍ。
【０１６９】
実施例４３  ３ａｒｍ  ＰＬＡ−ＣＯＯＮａ及びｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールブロック共重合体のＣａ2+固定化パクリタキセル含有高分子ミセルの製造
２４８．１ｍｇ（０．０８２７ｍｍｏｌ）の製造例２５で得られた３ａｒｍ  ＰＬＡ−ＣＯＯＮａ（Ｍｎ：３，０００）、７．５ｍｇのパクリタキセル、７４４．４ｍｇの実施例７で得られたｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（Ｍｎ：２，０００〜１，８００ダルトン）と、０．１３７７ｍＬ（０．１２４ｍｍｏｌ）の無水塩化カルシウムの０．９Ｍ水溶液を用いたことを除いては、実施例３８と同様の処理によって、Ｃａ2+固定化パクリタキセル含有高分子ミセル組成物を製造した。
３ａｒｍ  ＰＬＡＣＯＯＮａ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（重量比）：１／３
パクリタキセル含量：０．７５ｗｔ％
粒径：２９ｎｍ。
【０１７０】
実施例４４  ５ａｒｍ  ＰＬＡ−ＣＯＯＮａ及びｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールブロック共重合体のＣａ2+固定化パクリタキセル−含有高分子ミセルの製造
２４８．１ｍｇ（０．０８２７ｍｍｏｌ）の製造例２６で得られた５ａｒｍ  ＰＬＡ−ＣＯＯＮａ（Ｍｎ：３，０００）、７．５ｍｇのパクリタキセル、７４４．４ｍｇの実施例７で得られたｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（Ｍｎ：２，０００〜１，８００ダルトン）と、０．２２９５ｍＬ（０．２０７ｍｍｏｌ）の無水塩化カルシウムの０．９Ｍ水溶液を用いたことを除いては、実施例３８と同様の処理によって、Ｃａ2+固定化パクリタキセル含有高分子ミセル組成物を製造した。
５ａｒｍ  ＰＬＡＣＯＯＮａ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（重量比）：１／３
パクリタキセル含量：０．７５ｗｔ％
粒径：２９ｎｍ。
【０１７１】
実施例４５  Ｄ，Ｌ−ＰＬＭＡ−ＣＯＯＮａ及びｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールブロック共重合体のドキソルビシン含有高分子ミセルの製造
ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（Ｍｎ：２，０００〜１，８００）、Ｄ，Ｌ−ＰＬＭＡ−ＣＯＯＮａ（Ｍｎ：９６９）及びドキソルビシンＨＣｌを７８．６２：１７．２４：１．００の重量比で混合した後、混合物を５ｍＬの無水メタノールに溶解して、透明な溶液を調製した。真空エバポレーターを用いてメタノールを除去して、ドキソルビシン含有高分子組成物を製造した。蒸留水（４ｍＬ）を加え、混合物を６０℃で１０分間攪拌して、ドキソルビシンを含有する高分子ミセル水溶液を製造した。細孔の大きさが２００ｎｍのフィルタで混合物を濾過した後、凍結乾燥した。
Ｄ，Ｌ−ＰＬＭＡ−ＣＯＯＮａ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（重量比)：１／４．５６
ドキソルビシン含量：１．０３ｗｔ％
粒径：３５ｎｍ。
【０１７２】
実施例４６  Ｄ，Ｌ−ＰＬＭＡ−ＣＯＯＮａ及びｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールブロック共重合体のエピルビシン含有高分子ミセルの製造
ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（Ｍｎ：２，０００〜１，８００）、Ｄ，Ｌ−ＰＬＭＡ−ＣＯＯＮａ（Ｍｎ：９６９）及びエピルビシンＨＣｌを７８．６２：１７．２４：１．００の重量比で混合した後、混合物を５ｍＬの無水メタノールに溶解して、透明な溶液を調製した。真空エバポレーターを用いてメタノールを除去し、エピルビシン含有高分子組成物を製造した。蒸留水（４ｍＬ）を加え、混合物を６０℃で１０分間攪拌することによって、エピルビシンを含有する高分子ミセル水溶液を製造した。細孔の大きさが２００ｎｍのフィルタで混合物を濾過した後、凍結乾燥した。
Ｄ，Ｌ−ＰＬＭＡ−ＣＯＯＮａ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（重量比）：１／４．５６
エピルビシン含量：１．０３ｗｔ％
粒径：３０ｎｍ。
【０１７３】
実施例４７  Ｃａ2+固定化高分子ミセルの粒径
Ｃａ2+で固定された高分子ミセルの粒径を測定するために、高分子ミセル組成物を下記のように製造した。
ｍＰＥＧ−ＰＬＡ（Ｍｎ：２，０００〜１，８００）とＤ，Ｌ−ＰＬＭＡ−ＣＯＯＮａ（Ｍｎ：８６６、９９４、１，１５６、１，５３６）を１：１の当量比で混合した後、混合物を５ｍＬの無水エタノールに溶解して、透明な溶液を調製した。真空エバポレーターを用いてエタノールを除去し、高分子組成物を製造した。蒸留水を加え、混合物を６０℃で１０分間攪拌することによって、パクリタキセルを含有する高分子ミセル水溶液を製造した。上記高分子ミセル溶液にＤ，Ｌ−ＰＬＭＡ−ＣＯＯＮａと同じ当量のＣａＣｌ2水溶液（濃度：１００ｍｇ／ｍＬ）を加え、混合物を常温で２０分間攪拌した。細孔の大きさが２００ｎｍのフィルタで混合物を濾過した後、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液を加え、混合物中の高分子が４０ｍｇ／ｍＬとなるように希釈した。０．２２ｕｍ薄膜フィルタで濾過した後、粒径を光子相関粒径分析器で測定した。
【０１７４】
【表７】
2006526052.tif 000013
【０１７５】
表７の通り、Ｃａ2+で固定された高分子ミセルの粒径は、平均２０〜４０ｎｍであった。この粒径範囲のミセルは、注射剤と滅菌濾過に適する。Ｄ，Ｌ−ＰＬＭＡ−ＣＯＯＮａの分子量が８６６から１５３６まで増加するにつれて、Ｃａ2+処理された全ミセルと無処理のものにおいて、粒径は若干増加した。Ｃａ2+で固定された高分子ミセルの粒径は、Ｃａ2+無処理のミセルより約１０ｎｍ大きい。
【０１７６】
実施例４８  Ｃａ2+で固定されたパクリタキセル−含有高分子ミセルの力学的安定性
ナノ粒子組成物の安定性を試験するために、高分子ミセル組成物を下記のように製造した。
【０１７７】
（組成物４）  パクリタキセル、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（Ｍｎ：２，０００〜１，８００）、及びＤ，Ｌ−ＰＬＭＡ−ＣＯＯＮａ（Ｍｎ：１，０９６）を１：３：３の当量比で混合した後、混合物を５ｍＬの無水エタノールに溶解して、透明な溶液を調製した。真空エバポレーターを用いてエタノールを除去し、パクリタキセル含有高分子組成物を製造した。蒸留水（４ｍＬ）を加え、混合物を１０分間６０℃で攪拌することによって、パクリタキセルを含有する高分子ミセル水溶液を製造した。当該高分子ミセル溶液にＤ，Ｌ−ＰＬＭＡ−ＣＯＯＮａと同じ当量のＣａＣｌ2水溶液（濃度：１００ｍｇ／ｍＬ）を加え、混合物を常温で２０分間攪拌した。細孔の大きさが２００ｎｍのフィルタで混合物を濾過した後、凍結乾燥した。
【０１７８】
（組成物５）  パクリタキセル、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（Ｍｎ：２，０００〜１，８００）、及びＤ，Ｌ−ＰＬＭＡ−ＣＯＯＮａ（Ｍｎ：１，０９６）を１：３：３の当量比で混合した後、混合物を５ｍＬの無水エタノールに加えて、透明な溶液を調製した。真空エバポレーターを用いてエタノールを除去し、パクリタキセル含有高分子組成物を製造した。蒸留水（４ｍＬ）を加え、混合物を６０℃で１０分間攪拌することによって、パクリタキセルを含有する高分子組成物を製造した。細孔の大きさが２００ｎｍのフィルタで混合物を濾過した後、凍結乾燥した。
【０１７９】
（組成物６）  パクリタキセルとｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（Ｍｎ：２，０００〜１，８００）を１：３の当量比で混合した後、混合物を５ｍＬの無水エタノールに溶解して、透明な溶液を調製した。真空エバポレーターでエタノールを除去し、パクリタキセル含有高分子組成物を製造した。蒸留水（５ｍＬ）を加え、混合物を６０℃で１０分間攪拌することによって、パクリタキセルを含有する高分子ミセル水溶液を製造した。細孔の大きさが２００ｎｍのフィルタで混合物を濾過した後、凍結乾燥した。
【０１８０】
（組成物７）  パクリタキセル、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ（Ｍｎ：２，０００〜１，７６５）及びＤ，Ｌ−ＰＬＭＡ−ＣＯＯＮａ（Ｍｎ：１，０９６）を１：３：３の当量比で混合した後、混合物を５ｍＬの無水エタノールに溶解して、透明な溶液を調製した。真空エバポレーターでエタノールを除去し、パクリタキセル含有高分子組成物を製造した。蒸留水（４ｍＬ）を加え、混合物を６０℃で１０分間攪拌してパクリタキセルを含有する高分子ミセル水溶液を製造した。当該高分子ミセル溶液にＤ，Ｌ−ＰＬＭＡ−ＣＯＯＮａと同じ当量のＣａＣｌ2水溶液（濃度：１００ｍｇ／ｍＬ）を加え、混合物を室温で２０分間攪拌した。細孔の大きさが２００ｎｍのフィルタで混合物を濾過した後、凍結乾燥した。
【０１８１】
【表８】
2006526052.tif 000014
【０１８２】
ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液を凍結乾燥組成物に加え、パクリタキセルの濃度が１．０ｍｇ／ｍＬになるようにした。混合物を３７℃で静置して、時間経過に伴うパクリタキセル濃度をＨＰＬＣによって測定した。その結果を表９に示す。
【０１８３】
【表９】
2006526052.tif 000015
【０１８４】
表９の通り、Ｃａ2+で固定されたパクリタキセル含有高分子ミセル組成物（組成物４）は、Ｃａ2+無処理組成物（組成物５）に比べて力学的により安定であった。Ｃａ2+を添加することによって、本発明の高分子ミセル中のパクリタキセルの保有を有意的に増加させることができた。これは、疎水性コアの堅固性増加を誘導できるＤ，Ｌ−ＰＬＡＣＯＯ−とＣａ2+の架橋結合静電気的相互作用による。疎水性Ｂブロックの疎水性部位（トコフェロールコハク酸）が末端ヒドロキシル基に置換された両親媒性ジブロック共重合体のＣａ2+固定化高分子ミセル（組成物４）は、従来のｍＰＥＧ−ＰＬＡ−ＯＨのＣａ2+固定化高分子ミセル（組成物７）に比べて、より長い滞留時間を示した。この結果は、両親媒性高分子における疎水性Ｂブロックの疎水性を増加させれば、両親媒性高分子の疎水性部位と薬剤と間の相互作用強化によって、より安定なミセルを形成できることを示すものである。
【０１８５】
実施例４９  Ｃａ2+固定化パクリタキセル含有高分子ミセルの薬剤動態
両親媒性ジブロック共重合体（ｍＰＥＧ−ＰＬＡ、Ｍｎ２０００〜１７６５）における疎水性Ｂブロックの末端ヒドロキシル基に置換された疎水性部位のＣａ2+固定化パクリタキセル含有高分子ミセルの血流滞留時間に対する影響を評価するために、組成物を下記のように製造した。
【０１８６】
パクリタキセル、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（Ｍｎ：２，０００〜１，８００）またはｍＰＥＧ−ＰＬＡ−ＯＨ及びＤ，Ｌ−ＰＬＭＡ−ＣＯＯＮａ（Ｍｎ：１，００４）を、７４．２５：２４．７５：１．００の重量比で混合した後、混合物を５ｍＬ無水エタノールに溶解して、透明な溶液を調製した。真空エバポレーターを用いてエタノールを除去し、パクリタキセル含有高分子組成物を製造した。蒸留水（４ｍＬ）を加え、混合物を６０℃で１０分間攪拌することによって、パクリタキセルを含有する高分子ミセル水溶液を製造した。当該高分子ミセル溶液にＤ，Ｌ−ＰＬＭＡ−ＣＯＯＮａと同じ当量のＣａＣｌ2水溶液（濃度：１００ｍｇ／ｍＬ）を加え、混合物を常温で２０分間攪拌した。細孔の大きさが２００ｎｍのフィルタで混合物を濾過した後、凍結乾燥した。
【０１８７】
上記組成物と薬剤含量を表１０に示す。
【０１８８】
【表１０】
2006526052.tif 000016
【０１８９】
動物実験のために、体重２２０〜２７０ｇの雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの大腿静脈と大腿動脈に挿管した。組成物８と９を５ｍｇ／ｋｇ容量で１５秒かけて大腿静脈に注射した。注射から１、５、１５、３０分及び１、２、３、４、６時間後、０．３ｍＬの全血を大腿動脈から採血した後、遠心分離して透明な上清血漿を得た。
【０１９０】
また、薬剤の血漿濃度を実施例３６と同様の処理により分析し、薬剤血漿濃度分析結果を下表１１と図９に示す。
【０１９１】
【表１１】
2006526052.tif 000017
【０１９２】
表１１と図９に示されたように、疎水性Ｂブロックの末端ヒドロキシル基に疎水性部位（トコフェロールコハク酸）が置換した両親媒性ジブロック共重合体のＣａ2+固定化高分子ミセル（組成物８）は、従来のｍＰＥＧ−ＰＬＡ−ＯＨのＣａ2+固定化高分子ミセル（組成物９）に比べて、より長い血流滞留時間を示した。この結果は、実施例３６で立証されたように、両親媒性高分子の疎水性Ｂブロックの疎水性増加が両親媒性高分子の疎水性部位と薬剤との間の相互作用を強化することによって、より安定なミセルを形成することを示す。
【０１９３】
実施例５０  Ｃａ2+固定化パクリタキセル含有高分子ミセルの薬剤動態
Ｃａ2+で固定されたパクリタキセル含有高分子ミセルの血流滞留時間を別の担体を含有する製剤と比較するために、組成物を下記のように製造した。
【０１９４】
（組成物１０）  Ｃａ2+固定化パクリタキセル含有高分子ミセル
パクリタキセル、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（Ｍｎ：２，０００〜１，８００）及びＤ，Ｌ−ＰＬＭＡ−ＣＯＯＮａ（Ｍｎ：１，００４）を９９．２５：３３．０８：１．００の重量比で混合した後、混合物を５ｍＬの無水エタノールに溶解して、透明な溶液を調整した。真空エバポレーターを用いてエタノールを除去し、パクリタキセル含有高分子組成物を製造した。蒸留水（４ｍＬ）を加え、混合物を６０℃で１０分間攪拌し、パクリタキセルを含有する高分子ミセル水溶液を製造した。当該高分子ミセル溶液にＤ，Ｌ−ＰＬＭＡ−ＣＯＯＮａと同じ当量のＣａＣｌ2水溶液（濃度：１００ｍｇ／ｍＬ）を加え、混合物を室温で２０分間攪拌した。細孔の大きさが２００ｎｍのフィルタで混合物を濾過した後、凍結乾燥した。高分子ミセルの流体力学粒径は３４ｎｍであった。
【０１９５】
（組成物１１）  パクリタキセル、クレモフォアＥＬ、及び無水エタノール含有組成物
パクリタキセル（３０ｍｇ）を、クレモフォアＥＬと無水エタノールの混合溶液（５０：５０ｖ／ｖ）５ｍＬに溶解して、透明な溶液を得た。この溶液を、細孔の大きさが２００ｎｍのフィルタで濾過した。
【０１９６】
（組成物１２）  パクリタキセル、ポリソルベート８０（ツイーン８０）、及び無水エタノール含有組成物
パクリタキセル（３０ｍｇ）を、ポリソルベート８０と無水エタノールの混合溶液（５０：５０ｖ／ｖ）５ｍＬに溶解して、透明な溶液を得た。細孔の大きさが２００ｎｍのフィルタでこの溶液を濾過した。
【０１９７】
上記組成物及び薬剤含量を表１２に要約した。
【０１９８】
【表１２】
2006526052.tif 000018
【０１９９】
動物実験のために、体重２３０〜２５０ｇの雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの大腿静脈と大腿動脈に挿管した。組成物１０，１１及び１２を、５ｍｇ／ｋｇ容量で１５秒かけて大腿静脈に注射した。注射から１、５、１５、３０分及び１、２、３、４、６時間後、０．３ｍＬの全血を大腿動脈から採血した後、遠心分離して透明な上清血漿を得た。
【０２００】
また、薬剤の血漿濃度を実施例３６と同様の処理により分析した。薬剤血漿濃度分析結果を下表１３と図１０に示す。
【０２０１】
【表１３】
2006526052.tif 000019
【０２０２】
表１３及び図１０に示すように、Ｃａ2+で固定された高分子ミセル（組成物１０）は、別の界面活性剤を含有する注射剤（組成物１１及び１２）に比べて、より長い血流滞留時間を示した。本発明のＣａ2+固定化高分子ミセル（組成物１０）は、市販製剤であるタキソール（登録商標）（組成物１１）より長い血流滞留時間を示すので、本発明は、本発明の生分解性生体適合性高分子を利用することによって、タキソール（登録商標）以上に、血流中において薬剤滞留時間を増大することができる。
【０２０３】
実施例５１  Ｃａ2+固定化パクリタキセル含有高分子ミセルの薬剤動態
Ｃａ2+で固定されたパクリタキセル含有高分子ミセルの血流滞留時間を別の担体を含有する製剤と比較するために、組成物を下記のように製造した。
【０２０４】
（組成物１３）  Ｃａ2+固定化パクリタキセル含有高分子ミセル
パクリタキセル、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（Ｍｎ：２，０００〜１，８００）及び５ａｒｍ  ＰＬＡ−ＣＯＯＮａ（Ｍｎ：３，０００）を９９．２５：３３．０８：１．００の重量比で混合した後、混合物を５ｍＬの無水エタノールに溶解して、透明な溶液を調製した。真空エバポレーターを用いてエタノールを除去し、パクリタキセル含有高分子組成物を製造した。蒸留水（４ｍＬ）を加えて混合物を６０℃で１０分間攪拌することによって、パクリタキセル含有高分子ミセル水溶液を製造した。当該高分子ミセル溶液に５ａｒｍ  ＰＬＡ−ＣＯＯＮａと同じ当量のＣａＣｌ2水溶液（濃度：１００ｍｇ／ｍＬ）を加え、混合物を常温で２０分間攪拌した。細孔の大きさが２００ｎｍのフィルタで混合物を濾過した後、凍結乾燥した。高分子ミセルの流体力学粒径は３２ｎｍであった。
【０２０５】
（組成物１１）  パクリタキセル、クレモフォアＥＬ及び無水エタノール含有組成物
パクリタキセル（３０ｍｇ）をクレモフォアＥＬと無水エタノールの混合溶液（５０：５０ｖ／ｖ）５ｍＬに溶解して、透明な溶液を得た。溶液を、細孔の大きさが２００ｎｍのフィルタで濾過した。
【０２０６】
上記組成物と薬剤含量を表１４に要約する。
【０２０７】
【表１４】
2006526052.tif 000020
【０２０８】
動物実験のために、体重２３０〜２５０ｇの雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの大腿静脈と大腿動脈に挿管した。組成物１３と１１を５ｍｇ／ｋｇ容量で１５秒かけて大腿静脈に注射した。注射から１、５、１５、３０分及び１、２、３、４、６時間後、０．３ｍＬの全血を大腿動脈から採血した後、遠心分離して透明な上清血漿を得た。
【０２０９】
薬剤の血漿濃度を、実施例３６と同様の処理により分析した。薬剤血漿濃度分析結果を下表１５と図１１に示す。
【０２１０】
【表１５】
2006526052.tif 000021
【０２１１】
表１５及び図１１に示すように、Ｃａ2+固定化高分子ミセル（組成物１３）は、別の界面活性剤を含有する注射剤（組成物１１）に比べて、より長い血流滞留時間を示した。本発明のＣａ2+固定化高分子ミセル（組成物１３）は、市販製剤であるタキソール（登録商標）（組成物１１）より長い血流滞留時間を示すので、本発明は、本発明の生分解性生体適合性高分子を利用することによって、タキソール（登録商標）以上に血流中における薬剤滞留時間を増大することができる。
【０２１２】
実施例５２  Ｃａ2+固定化ドセタキセル含有高分子ミセルの薬剤動態
Ｃａ2+固定化ドセタキセル含有高分子ミセルの血流滞留時間を、別の担体を含有する製剤と比較するために、組成物を下記のように製造した。
【０２１３】
（組成物１４）  Ｃａ2+固定化ドセタキセル含有高分子ミセル
ドセタキセル、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（Ｍｎ：２，０００〜１，８００）及び３ａｒｍ  ＰＬＡ−ＣＯＯＮａ（Ｍｎ：３，０００）を９９．２５：３３．０８：１．００の重量比で混合した後、混合物を５ｍＬの無水エタノールに溶解して、透明な溶液を調製した。真空エバポレーターを用いてエタノールを除去し、ドセタキセル含有高分子組成物を製造した。蒸留水（４ｍＬ）を加え、混合物を６０℃で１０分間攪拌することによって、ドセタキセル含有高分子ミセル水溶液を製造した。当該高分子ミセル溶液に３ａｒｍ−ＰＬＡＣＯＯＮａと同じ当量のＣａＣｌ2水溶液（濃度：１００ｍｇ／ｍＬ）を加え、混合物を室温で２０分間攪拌した。細孔の大きさが２００ｎｍのフィルタで混合物を濾過した後、凍結乾燥した。高分子ミセルの流体力学粒径は３０ｎｍであった。
【０２１４】
（組成物１５）  ドセタキセル、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０)及び無水エタノール含有組成物
ドセタキセル（２０ｍｇ）とツイーン８０（５２０ｍｇ）を、１．５ｍＬの１３％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液に溶解し、透明な溶液を得た。細孔の大きさが２００ｎｍのフィルタで溶液を濾過した。
【０２１５】
上記組成物と薬剤含量を表１６に要約する。
【０２１６】
【表１６】
2006526052.tif 000022
【０２１７】
動物実験のために、体重２１０〜２４０ｇの雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの大腿静脈と大腿動脈に挿管した。組成物１４と１５を１０ｍｇ／ｋｇ容量で１５秒かけて大腿静脈に注射した。注射から５、１５、３０分及び１、２、３、６、８時間後、０．３ｍＬの全血を大腿動脈から採血した後、遠心分離して透明な上清血漿を得た。
【０２１８】
薬剤の血漿濃度を実施例３６と同様の処理により分析した。薬剤血漿濃度分析結果を下表１７と図１２に示す。
【０２１９】
【表１７】
2006526052.tif 000023
【０２２０】
表１７及び図１２に示すように、Ｃａ2+固定化高分子ミセル（組成物１４）は、ツイーン８０を含有する注射剤（組成物１５）に比べて、より長い血流滞留時間を示した。本発明のＣａ2+固定化高分子ミセル（組成物１４）は、市販製剤であるタキソテール（登録商標）（組成物１５）より長い血流滞留時間を示すので、本発明は、本発明の生分解性生体適合性高分子を利用することによって、タキソテール（登録商標）以上に血流で薬剤滞留時間を増大することができる。
【０２２１】
実施例５３  Ｃａ2+固定化ドセタキセル含有高分子ミセルの薬剤動態
Ｃａ2+固定化ドセタキセル含有高分子ミセルの血流滞留時間を、別の担体を含有する製剤と比較するために、組成物を下記のように製造した。
【０２２２】
（組成物１６）  Ｃａ2+固定化ドセタキセル-含有高分子ミセル
ドセタキセル、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（Ｍｎ：２，０００〜１，８００）及びＤ，Ｌ−ＰＬＡ−ＣＯＯＮａ（Ｍｎ：１，７００）を７５．０：２５．０：１．０の重量比で混合した後、混合物を５ｍＬの無水エタノールに溶解して、透明な溶液を調製した。真空エバポレーターを用いてエタノールを除去し、ドセタキセル含有高分子組成物を製造した。蒸留水（４ｍＬ）を加え、混合物を６０℃で１０分間攪拌することによって、ドセタキセル含有高分子ミセル水溶液を製造した。当該高分子ミセル溶液にＤ，Ｌ−ＰＬＡＣＯＯＮａと同じ当量のＣａＣｌ2水溶液（濃度：１００ｍｇ／ｍＬ）を加え、混合物を常温で２０分間攪拌した。細孔の大きさが２００ｎｍのフィルタで混合物を濾過した後、凍結乾燥した。高分子ミセルの流体力学粒径は３２ｎｍであった。
【０２２３】
（組成物１５）  ドセタキセル、ツイーン８０及び１３％エタノール含有組成物
ドセタキセル（２０ｍｇ）とツイーン８０（５２０ｍｇ）を１．５ｍＬの１３％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液に溶解して、透明な溶液を得た。細孔の大きさが２００ｎｍのフィルタで溶液を濾過した。
【０２２４】
上記組成物と薬剤含量を表１８に要約する。
【０２２５】
【表１８】
2006526052.tif 000024
【０２２６】
動物実験のために、体重２３０〜２５０ｇの雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの大腿静脈と大腿動脈に挿管した。組成物１６と１５を５ｍｇ／ｋｇ容量で１５秒かけて大腿静脈に注射した。注射から１、５、１５、３０分及び１、２、３、４、６時間後、０．３ｍＬの全血を大腿動脈から採血した後、遠心分離して透明な上清血漿を得た。
【０２２７】
薬剤の血漿濃度を実施例３６と同様の処理により分析した。薬剤血漿濃度分析結果を下表１９と図１３に示す。
【０２２８】
【表１９】
2006526052.tif 000025
【０２２９】
表１９及び図１３に示すように、Ｃａ2+固定化高分子ミセル（組成物１６）は、ツイーン８０を含有する注射剤（組成物１５）に比べて、より長い血流滞留時間を示した。本発明のＣａ2+固定化高分子ミセル（組成物１６）は、市販製剤であるタキソテール（登録商標）（組成物１５）より長い血流滞留時間を示すので、本発明は、本発明の生分解性生体適合性高分子を利用することによって、タキソテール（登録商標）以上に血流中における薬剤滞留時間を増加することができる。
【０２３０】
実施例５４  Ｃａ2+固定化パクリタキセル含有高分子ミセルの最大耐用量（maximum tolerated dose）
１０群のＴａｃ：Ｃｒ：（Ｎｃｒ）−ｎｕ無胸腺マウス（雌性、８週齢、２０．５±０．５０ｇ；雄性、８週齢、２１．３±１．６ｇ）へ、それぞれ１６、２０、２５、３０ｍｇ／ｋｇの容量でＣａ2+固定化パクリタキセル含有高分子ミセル溶液（組成物１０）を、尾静脈を通じて０、１、２日の日程で静脈内投与した。群全体において、生存マウスと体重の変化を３０日にわたって毎日観察した。
【０２３１】
５群のＴａｃ：Ｃｒ：（Ｎｃｒ）−ｎｕ無胸腺マウス（雌性、８週齢、２４．７±１．２ｇ；雄性、８週齢、２４．２±１．３ｇ）へ、それぞれ２０、２５、３０、３５ｍｇ／ｋｇの容量でＣａ2+固定化パクリタキセル含有高分子ミセル溶液（組成物１０）を、尾静脈を通じて０、２、４日の日程で静脈内投与した。群全体において、生存マウスと体重変化を３０日にわたって毎日観察した。
【０２３２】
４群のＴａｃ：Ｃｒ：（Ｎｃｒ）−ｎｕ無胸腺マウス（雌性、８週齢、２２．５±０．８ｇ；雄性、８週齢、２４．３±１．６ｇ）へ、それぞれ２０、２５、３０ｍｇ／ｋｇの容量でＣａ2+固定化パクリタキセル含有高分子ミセル溶液（組成物１０）を、尾静脈を通じて０、２、４、６日の日程で静脈内投与した。群全体において、生存マウスと体重変化を３０日にわたって毎日観察した。
【０２３３】
１０群のＴａｃ：Ｃｒ：（Ｎｃｒ）−ｎｕ無胸腺マウス（雌性、８週齢、１９．３±０．７１ｇ；雄性、８週齢、２３．３±１．１ｇ）へ、それぞれ２５、２８、３０、３５、３９ｍｇ／ｋｇの容量でＣａ2+固定化パクリタキセル含有高分子ミセル溶液（組成物１０）を、尾静脈を通じて０、４、８日の日程で静脈内投与した。群全体において、生存マウスと体重変化を３０日にわたって毎日観察した。
【０２３４】
ＭＴＤを、薬剤投与後から２週間以内に毒性による死やバイタルサインの顕著な変化を誘発しない範囲で、平均体重が対照群に比べて約１０〜２０％減少する容量として定義した。表２０に示すように、各容量スケジュールでのＭＴＤは、２０〜３０ｍｇ／ｋｇの範囲であった。
【０２３５】
また、担体毒性実験を行なった。薬剤を含有しないＣａ2+固定化高分子ミセルを投与された動物は速かに成長し、食塩水を投与するか或いは注射しない動物に比べて、若干体重が増加した。これは、製剤のカロリー含量によるものである。
【０２３６】
【表２０】
2006526052.tif 000026
【０２３７】
実施例５５  Ｃａ2+固定化パクリタキセル含有高分子ミセルの抗癌活性
細胞を液体窒素中に保存されたものから採取し、インビトロ細胞培養として確立した。細胞を集めた後、滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、生存細胞数を測定した。細胞を約７×１０7細胞／ｍＬの濃度で滅菌ＰＢＳに再懸濁した。健常なヌード（ｎｕ／ｎｕ）無胸腺マウス（２０〜２５ｇ、８週齢）の右側腹部に、７×１０6ヒト癌細胞（ＭＸ−１、ＳＫＯＶ−３、ＭＤＡＭＢ４３５Ｓ、ＨＴ２９、ＰＣ−３、Ｕ３７３ＭＧ）を含有する０．１ｍＬの細胞懸濁液を皮下注射した。癌が一定の大きさに達した後、３回異種移植して３〜４ｍｍの異種移植片を形成した。この異種移植断片を、健常なヌード（ｎｕ／ｎｕ）無胸腺マウス（２０〜２５ｇ、８週齢）の右側腹部に、１２ゲージトロカールニードルで皮下注射した。癌体積が１００〜３００ｍｍ3に達した後、薬剤を投与し、この時点を０日と記録した。０日目にマウスを５群に分け、０、１及び２日、０、２及び４日、または０、４及び８日目に、金属イオンで固定された高分子ミセル（組成物１０）とクレモフォアＥＬ製剤（組成物１１）を、様々なパクリタキセル容量で尾静脈を通じて投与し、癌容積を異なる時間間隔で測定した。癌容積は、式（Ｗ2×Ｌ）／２（ここで、Ｗは短軸、Ｌは長軸である）により計算した。
【０２３８】
治療効果を評価するために、腫瘍容積を下記のように計算した。
腫瘍容積（ＴＶ）＝０．５×Ｌ×Ｗ2(Ｌ：長軸、Ｗ：短軸)
相対的腫瘍容積（ＲＴＶ）＝（Ｖt／Ｖ0）×１００％（Ｖｔ：ｔ日のＴＶ、Ｖ０：０日のＴＶ）
治療効果を、３つの基準を併行使用して決定した：平均腫瘍増殖曲線、最適の成長阻害（Ｔ／Ｃ％）及び特異的な増殖遅延（ＳＧＤ）。
【０２３９】
最終の注射から４週間以内における特定日での最適の成長阻害を、処理群対対照群の平均ＲＴＶ値に１００％（Ｔ／Ｃ％）を乗じて計算した。
【０２４０】
ＳＧＤを、下記のように１及び２倍増時間にかけて計算した。
特異的増殖遅延（ＳＧＤ）：ＳＧＤ＝（ＴD処理群−ＴD対照群）／ＴD対照群
ＴD：腫瘍倍増時間。
【０２４１】
活性水準は、下記のように定義した。
【０２４２】
Ｔ／Ｃ％                        ＳＧＤ  
（＋）             ＜５０          又は          ＞１．０
＋               ＜５０          及び          ＞１．０
＋＋              ＜４０          及び          ＞１．５
＋＋＋             ＜２５          及び          ＞２．０
＋＋＋＋            ＜１０          及び          ＞３．０
ＮＣＩ標準によれば、Ｔ/Ｃ≦４２％が最低活性水準である。Ｔ/Ｃ<１０％であれば、更なる開発を正当化する高い抗腫瘍活性水準と見なされる。
【０２４３】
実験を有意なものとするために、対象群に対して１処理当り少なくとも４匹のマウスと、１群当り少なくとも４個の腫瘍を使用した。処理開始時、最小腫瘍径は４ｍｍであるか、３０ｍｍ3容積であった。最終薬剤投与後から２週間以内に死亡する動物を、毒性による死亡と見なして評価から除外した。３匹当り１匹より多い毒性死亡や完全に回復せず平均体重が１５％超で減少した処理群は、抗腫瘍効能がないものと見なした。
【０２４４】
図１４〜２１及び表２１に示すように、金属イオンで固定された高分子ミセルによる処理群とクレモフォアＥＬ製剤による処理群のいずれもが、対照群に比べて相当な癌成長抑制を示しており、また、特に金属イオンで固定された高分子ミセル（組成物１０）による処理群は、クレモフォアＥＬ製剤（組成物１１）による処理群に比べて高い抑制率を示した。
【０２４５】
【表２１】
2006526052.tif 000027
【０２４６】
実施例５６  タキソール（登録商標）耐性癌動物モデルに対するＣａ2+固定化パクリタキセル有高分子ミセルの抗癌活性
細胞を液体窒素中に保存されたものから採取し、インビトロ細胞培養として確立した。細胞を集めた後、滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、生存細胞数を測定した。細胞を約７×１０7細胞／ｍＬの濃度で滅菌ＰＢＳに再懸濁した。健常なヌード（ｎｕ／ｎｕ）無胸腺マウス（２０〜２５ｇ、８週齢）の右側腹部に、７×１０6ヒト癌細胞（ＨＴ２９）を含有する０．１ｍＬの細胞懸濁液を皮下注射した。癌が一定の大きさに達した後、３回異種移植し、３〜４ｍｍの異種移植片を形成した。この異種移植断片を、健常なヌード（ｎｕ／ｎｕ）無胸腺マウス（２０〜２５ｇ、８週齢）の右側腹部に、１２ゲージトロカールニードルで皮下注射した。癌容積が一定大きさに達した後、パクリタキセル（クレモフォアＥＬ製剤、タキソール（登録商標））を、ｑ１ｄＸ５投与スケジュールにより尾静脈を通じて２０ｍｇ／ｋｇ／日容量で投与した。３週間後、薬剤をｑ１ｄＸ５投与スケジュールにより２０ｍｇ／ｋｇ／日容量で再投与し、タキソール（登録商標）耐性癌の異種移植断片を得た。癌が一定の大きさに達した後、異種移植断片（３〜４ｍｍ）を、健常なヌード（ｎｕ／ｎｕ）無胸腺マウス（２０−２５ｇ、８週齢）の右側腹部に、１２ゲージトロカールニードルで皮下注射した。癌容積が１００〜３００ｍｍ3に達した後、薬剤を投与し、この時点を０日と記録した。０日目にマウスを５群に分け、０、２、４日に金属イオンで固定された高分子ミセル（組成物１０）とクレモフォアＥＬ製剤（組成物１１）を、様々なパクリタキセル容量で尾静脈を通じて投与し、癌容積を異なる時間間隔で測定した。
【０２４７】
上記実験で示した通り、金属イオンで固定された高分子ミセルのタキソール（登録商標）耐性癌に対する効果を立証するために、タキソール（登録商標）耐性癌に対する金属イオン固定化高分子ミセルの効果に関する動物モデルを確立した。マウスに接種された癌細胞をタキソール（登録商標）に反復的に曝したところ、タキソール（登録商標）で前処理した癌細胞に対するパクリタキセルのＩＣ50は、元来の癌細胞に対するパクリタキセルのそれより有意に増加した（結果未図示）。この動物モデルで、金属イオン固定化高分子ミセル（組成物１０）による処理群は、クレモフォアＥＬ製剤（組成物１１）処理群に比べて、図２２及び表２２に示されたように、おそらく金属イオン固定化高分子ミセルに導入された薬剤の有効血中濃度をより長く維持するので、より高い抑制率を示した。
【０２４８】
【表２２】
2006526052.tif 000028
【０２４９】
実施例５７  ドキソルビシン耐性癌動物モデルに対するＣａ2+固定化パクリタキセル含有高分子ミセルの抗癌活性
凍結状態のドキソルビシン（アドリアマイシン（登録商標））耐性ヒト子宮肉腫細胞株（ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５；ＭＤＲ変異株）を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から購入し、１０％ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ−１６４０培地で培養、分離した。細胞を集めた後、滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、生存細胞数を測定した。細胞を約７×１０7細胞／ｍＬの濃度で滅菌ＰＢＳに再懸濁した。健常なヌード（ｎｕ／ｎｕ）無胸腺マウス（２０〜２５ｇ、８週齢）の右側腹部に、７×１０6ヒト癌細胞（ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５）を含有する０．１ｍＬの細胞懸濁液を皮下注射した。癌が一定の大きさ（５００〜７００ｍｇ）に達した後、その腫瘍片を一定の大きさ（３×３×３ｍｍ）で切断し、トロカールニードルを用いて移植した後に３回継代培養し、再び３〜４ｍｍの異種移植片を得た。この異種移植断片を、健常なヌード（ｎｕ／ｎｕ）無胸腺マウス（２０〜２５ｇ、８週齢）の右側腹部に、１２ゲージトロカールニードルで皮下注射した。癌容積が１００〜３００ｍｍ3に達した後、薬剤を投与し、この時点を０日と記録した。０日目にマウスを５群に分け、０、２、４日に金属イオン固定化高分子ミセル（組成物１０）とクレモフォアＥＬ製剤（組成物１１）を、尾静脈を通じて、２０ｍｇ／ｋｇのパクリタキセル容量で投与し、癌容積を異なる時間間隔で測定した。
【０２５０】
上記実験で示したように、金属イオンで固定された高分子ミセルのドキソルビシン耐性癌に対する効能を立証するために、ドキソルビシン耐性癌動物モデルを確立した。この動物モデルで、金属イオン固定化高分子ミセル（組成物１０）による処理群は、クレモフォアＥＬ製剤（組成物１１）処理群に比べて、図２３及び表２３に示されるように、おそらく金属イオン固定化高分子ミセルに導入された薬剤の有効濃度をより長く保持するので、より高い抑制率を示した。
【０２５１】
【表２３】
2006526052.tif 000029
【０２５２】
本発明に係る両親媒性ブロック共重合体から製造されたミセルは、無害で薬剤の封入率が高いだけでなく、水溶液中で薬剤を長時間安定に保持するので、注射剤体内に投与した時、薬剤の血漿濃度を向上することができる。
【０２５３】
また、本発明の高分子組成物は、体液または水溶液中で安定な高分子ミセルまたはナノ粒子を形成しうる。本発明の組成物から形成されたミセルまたはナノ粒子は、親水性外皮と、多量の疎水性薬剤を物理的に封入できる疎水性内核とを有する。本発明の薬剤含有ミセルとナノ粒子は、投与後に血流中での滞留時間が延長されており、様々な医薬製剤を製造するのに使用され得る。
【０２５４】
上記の具体例は、本発明の原理の適用を説明のみのものであることが理解されるべきである。本発明の精神と範囲を逸脱しなければ、種々の変形や代替態様が導き出せ、添付された特許請求の範囲は、そのような変形やアレンジを含むものである。従って、現在、本発明の最も実用的かつ好ましい形態と見なされるものに関して、図面に示し、また、特定的に詳しく十分に記載したが、特許請求の範囲に記載されたような本発明の原理と概念を逸脱しないならば、種々変形が加えられることは当業者にとって自明である。
【図面の簡単な説明】
【０２５５】
本発明の付加的な特徴と長所は、実施例を通じて本発明の特徴を示す添付図面と共に、詳細な説明から明らかになる。
【図１】図１は、水性環境でモノメトキシポリエチレングリコール−ポリラクチド−疎水性部分（ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−疎水性部分）によって形成された高分子ミセルの模式図である。
【図２】図２は、水性環境でカルボン酸ナトリウムにより誘導体化されたＤ，Ｌ−ポリ乳酸によって形成された高分子ミセルの模式図である。
【図３】図３は、水性環境でモノメトキシポリエチレングリコール−ポリラクチド−疎水性部分（ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−疎水性部分）、及びカルボン酸ナトリウムにより誘導体化されたＤ，Ｌ−ポリ乳酸の混合物によって形成された高分子ミセルの模式図である。
【図４】図４は、Ｃａ2+で固定された図３の高分子ミセルの模式図である。
【図５】図５は、ミセルの疎水性コア内に封入された疎水性薬剤を含み、Ｃａ2+で固定された高分子ミセルの模式図である。
【図６】図６は、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−コレステロール（実施例１）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図７】図７は、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（実施例７）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図８】図８は、様々な時間間隔で様々なジブロック共重合体により製造されたパクリタキセル含有高分子ミセルの投与後における血漿薬剤濃度プロファイルを示す。
【図９】図９は、様々な時間間隔でｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール及びｍＰＥＧ−ＰＬＡ−ＯＨにより製造されたパクリタキセル含有Ｃａ2+固定化高分子ミセルの投与後にける血漿薬剤濃度を示す。
【図１０】図１０は、様々な時間間隔でパクリタキセル含有Ｃａ2+固定化高分子ミセル、クレモフォールＥＬ（タキソール（登録商標））及びツイーン８０製剤の投与後における血漿薬剤濃度プロファイルを示す。
【図１１】図１１は、様々な時間間隔でパクリタキセル含有Ｃａ2+固定化高分子ミセル及びクレモフォールＥＬ（タキソール（登録商標））の投与後における血漿薬剤濃度を示す。
【図１２】図１２は、様々な時間間隔でドセタキセル含有Ｃａ2+固定化高分子ミセル及びツイーン８０製剤（タキソテール（登録商標））の投与後における血漿薬剤濃度を示す。
【図１３】図１３は、様々な時間間隔でドセタキセル含有Ｃａ2+固定化高分子ミセル及びツイーン８０製剤（タキソテール（登録商標））の投与後における血漿薬剤濃度を示す。
【図１４】図１４は、ヒト乳癌細胞株ＭＸ−１を用いたマウスでの薬剤含有Ｃａ2+固定化高分子ミセルの抗癌効果を示す。
【図１５】図１５は、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡＭＢ４３５Ｓを用いたマウスでの薬剤含有Ｃａ2+固定化高分子ミセルの抗癌効果を示す。
【図１６】図１６は、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ−３を用いたマウスでの薬剤含有Ｃａ2+固定化高分子ミセルの抗癌効果を示す。
【図１７】図１７は、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ−３を用いたマウスでの薬剤含有Ｃａ2+固定化高分子ミセルの抗癌効果を示す。
【図１８】図１８は、ヒト結腸癌細胞株ＨＴ−２９を用いたマウスでの薬剤含有Ｃａ2+固定化高分子ミセルの抗癌効果（３サイクル）を示す。
【図１９】図１９は、ヒト結腸癌細胞株ＨＴ−２９を用いたマウスでの薬剤含有Ｃａ2+固定化高分子ミセルの抗癌効果を示す。
【図２０】図２０は、ヒト前立腺癌細胞株ＰＣ３を用いたマウスでの薬剤含有Ｃａ2+固定化高分子ミセルの抗癌効果を示す。
【図２１】図２１は、ヒト脳腫瘍細胞株Ｕ−３７３ＭＧを用いたマウスでの薬剤含有Ｃａ2+固定化高分子ミセルの抗癌効果を示す。
【図２２】図２２は、パクリタキセル（タキソール（登録商標））耐性ヒト癌動物モデルでの薬剤含有Ｃａ2+固定化高分子ミセルの抗癌効果を示す。
【図２３】図２３は、ドキソルビシン（アドリアマイシン（登録商標））耐性ヒト癌動物モデルでの薬剤含有Ｃａ2+固定化高分子ミセルの抗癌効果を示す。
【０２５６】
参照文献は、例示的な具体例として示すものであり、特別な用語も同様に示されるものである。何れにせよ、それにより本発明の範囲は制限されないものと理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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