(57)【要約】骨格筋萎縮若しくは肥大を調節する化合物、血管活性腸管ペプチド受容体（ＶＰＡＣ）の活性若しくは発現を調節する化合物、または血管活性腸管ペプチド（ＶＩＰ）若しくはＶＩＰ類縁体の発現を調節する化合物を同定するための、スクリーニング方法を提供する。介入のための標的としてＶＰＡＣを使用する、骨格筋萎縮の予防的または治療的処置のための方法について説明する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨格筋の量または機能を調節する候補化合物を同定するための方法であって、
（ａ）ＶＰＡＣ受容体に試験化合物を接触させる工程と、
（ｂ）前記試験化合物が前記ＶＰＡＣ受容体に結合するかどうかを決定する工程とを含み、該ＶＰＡＣ受容体に結合する該試験化合物を、骨格筋の量または機能を調節する候補化合物として同定し、好ましくは、工程（ｂ）で該ＶＰＡＣ受容体に結合すると決定された該試験化合物を非ヒト動物に投与し、該試験化合物が動物内で骨格筋の量または機能を調節するかどうかを決定し、動物内で骨格筋の量または機能を調節する試験化合物を、生体内で骨格筋の量または機能を調節する治療用候補化合物として同定する方法。
【請求項２】
骨格筋の量または機能を調節する候補化合物を同定するための方法であって、
（ａ）ＶＰＡＣ受容体を発現する細胞に試験化合物を接触させる工程であって、好ましくは前記ＶＰＡＣ受容体が真核細胞上で発現され、機能的ＶＰＡＣ１受容体またはＶＰＡＣ２受容体である工程と、
（ｂ）前記試験化合物がＶＰＡＣ受容体を活性化するかどうかを決定する工程とを含み、該ＶＰＡＣ受容体を活性化する試験化合物を骨格筋の量または機能を調節する候補化合物として同定する方法。
【請求項３】
前記細胞が細胞性ｃＡＭＰレベルを有し、前記試験化合物が前記ＶＰＡＣ受容体を活性化するかどうかを決定する工程が、前記細胞性ｃＡＭＰレベルを測定する工程を包含する、請求項２に記載の候補化合物を同定するための方法。
【請求項４】
前記細胞がｃＡＭＰ応答要素に施術により結合されたレポーター遺伝子をさらに含み、前記細胞性ｃＡＭＰレベルを測定する工程がレポーター遺伝子発現を測定する工程を包含し、好ましくはレポーター遺伝子が、アルカリ性ホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、グルクロニドシンセターゼ、成長ホルモン、胎盤アルカリ性ホスファターゼまたは緑色蛍光タンパク質である、請求項３に記載の候補化合物を同定するための方法。
【請求項５】
骨格筋の量または機能を調節する治療用候補化合物を同定するための方法であって、
（ａ）機能的ＶＰＡＣ受容体を発現する細胞に試験化合物を接触させる工程と、
（ｂ）前記試験化合物が前記ＶＰＡＣ受容体を活性化するかどうかを決定する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で前記ＶＰＡＣ受容体を活性化すると決定された試験化合物を非ヒト動物に投与し、該試験化合物が動物内で骨格筋の量または機能を調節するかどうかを決定する工程とを含み、動物内で骨格筋の量または機能を調節する試験化合物を、生体内で骨格筋の量または機能を調節する治療用候補化合物として同定する方法。
【請求項６】
ＶＰＡＣ受容体の活性化またはＶＰＡＣ受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる候補化合物を同定するための方法であって、
（ａ）機能的ＶＰＡＣ受容体を発現する細胞に試験化合物を接触させる工程と、
（ｂ）対照細胞で前記ＶＰＡＣ受容体の脱感作を引き起こすのに十分な時間かつ十分な濃度で作動薬によって前記細胞を処理する工程であって、好ましくは工程（ｂ）が工程（ａ）の前または工程（ａ）と同時に実施される工程と、
（ｃ）前記ＶＰＡＣ受容体の活性化レベルを決定する工程とを含み、ＶＰＡＣ受容体またはＶＰＡＣ受容体のシグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる試験化合物を、骨格筋の量または機能を調節する候補化合物として同定する方法。
【請求項７】
ＶＰＡＣ受容体の発現を増加させる候補化合物を同定するための方法であって、
（ａ）ＶＰＡＣ受容体調節要素に施術により結合されたレポーター遺伝子を含有する細胞または細胞溶解物に、試験化合物を接触させる工程と、
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現を検出する工程とを含み、該レポーター遺伝子の発現を増加させる試験化合物を、骨格筋の量または機能を調節する候補化合物として同定する方法。
【請求項８】
ＶＩＰまたはＶＩＰ類縁体の発現を増加させる候補化合物を同定するための方法であって、
（ａ）ＶＩＰ類縁体調節要素に施術により結合されたレポーター遺伝子を含有する細胞または細胞溶解物に、試験化合物を接触させる工程と、
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現を検出する工程とを含み、該レポーター遺伝子の発現を増加させる試験化合物を、骨格筋の量または機能を調節する化合物として同定する方法。
【請求項９】
医薬組成物であって、
（ａ）安全かつ有効な量のＶＰＡＣ受容体作動薬と、
（ｂ）薬学的に許容可能な担体とを含む組成物。
【請求項１０】
骨格筋の量または機能の増加が望まれる被験体で骨格筋の量または機能を増加させるための方法であって、
（ａ）筋量または筋機能の増加が望まれる被験体を特定する工程と、
（ｂ）その被験体に、ＶＰＡＣ受容体作動薬、ＶＰＡＣ受容体の活性化またはＶＰＡＣ受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる化合物、機能的ＶＰＡＣ受容体をコード化する発現ベクター、構造的活性型ＶＰＡＣ受容体をコード化する発現ベクター、ＶＰＡＣ受容体の発現を増加させる化合物、ＶＩＰの発現を増加させる化合物、およびＶＩＰ類縁体の発現を増加させる化合物から成る群から選択される、安全かつ有効な量の化合物を投与する工程とを含む方法。
【請求項１１】
骨格筋萎縮の処置が必要な被験体で骨格筋萎縮を処置するための方法であって、
（ａ）骨格筋萎縮を処置する必要がある被験体を特定する工程と、
（ｂ）その被験体に、ＶＰＡＣ受容体作動薬、ＶＰＡＣ受容体の活性化またはＶＰＡＣ受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる化合物、機能的ＶＰＡＣ受容体をコード化する発現ベクター、構造的活性型ＶＰＡＣ受容体をコード化する発現ベクター、ＶＰＡＣ受容体の発現を増加させる化合物、ＶＩＰの発現を増加させる化号物、およびＶＩＰ類縁体の発現を増加させる化合物とから成る群から選択され、好ましくは該化合物がＶＰＡＣ受容体作動薬である、安全かつ有効な量の化合物を投与する工程とを含む方法。
【請求項１２】
前記ＶＰＡＣ受容体作動薬が、ＶＩＰ、ＰＡＣＡＰ−２７、ＰＡＣＡＰ−３８、ヘロデルミン、ペプチドヒスチジンイソロイシンアミド、ペプチドヒスチジンメチオニンアミド、ペプチドヒスチジンバリンアミド、成長ホルモン放出ホルモン、セクレチン、グルカゴン、（Ａｒｇ１５、Ａｒｇ２１）ＶＩＰ、［Ａｒｇ１５、２０、２１Ｌｅｕ１７］−ＶＩＰ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ２、［Ｋ１５、Ｒ１６、Ｌ２７、ＶＩＰ（１−７）、ＧＲＦ（８−２７）−ＮＨ２］、多重結合ＶＩＰ融合タンパク質、Ｒｏ２５−１５５３、Ｒｏ２５−１３９２またはＰＡＣＡＰ（６−３８）である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＶＰＡＣ受容体に特異的な精製抗体であって、該抗体がキメラ抗体またはヒト抗体、好ましくはヒト抗体である抗体。
【請求項１４】
前記抗体がＶＰＡＣ受容体の作動薬である、請求項１３に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、骨格筋の量若しくは機能を調節する候補化合物、血管活性腸管ペプチド受容体（ＶＰＡＣ）の活性若しくは発現を調節する候補化合物、または血管活性腸管ペプチド（ＶＩＰ）若しくはＶＩＰ類縁体の発現を調節する候補化合物を同定するための方法に関する。本発明はまた、介入のための標的としてＶＰＡＣ受容体を使用する、骨格筋萎縮を処置するための方法、または骨格筋肥大を誘発するための方法に関する。
【０００２】
（配列表の説明）
配列表に含まれる各ＶＰＡＣ受容体タンパク質配列を、対応するジェンバンク受入番号およびクローン元の動物種と併せて表Ｉに示す。
【０００３】
【表１】
2004512530.tif 000002
【０００４】
（背景）
ＶＰＡＣおよびリガンド
血管活性腸管ペプチド（ＶＩＰ）並びにその機能的および構造的関連類縁体（ＶＩＰ類縁体）は、平滑筋弛緩（気管支拡張、腸管運動）、微小血管トーン（血管抑制）および透過性の調整、粘液分泌の調整、様々な免疫機能（抗炎症、免疫細胞防護）の変調、神経影響（記憶増進、催眠、食事摂取、概日リズム制御、性的行動）、唾液腺機能の維持、発育成長の調節、およびホルモン分泌（プロラクチン、成長ホルモン、インスリン）の刺激を含め、多くの生理的機能を有することで知られている。ＶＩＰおよびＶＩＰ類縁体は、ニューロン経路（推定の神経伝達物質として）および神経内分泌経路を介して、その効果を血管活性腸管ペプチド受容体を通じて媒介する。今日までに２つのＶＰＡＣ受容体が特定されている（ＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２）。ＶＰＡＣ１受容体は、ヒト、マウス（ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））、ラット（ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）およびクマネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｓｐ．））、ブタ（イノシシ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ））、カエル（ワライガエル（Ｒａｎａ ｒｉｄｉｂｕｎｄａ））、キンギョ（Ｃａｒａｓｓｉｕｓ ａｕｒａｔｕｓ）、およびシチメンチョウ（Ｍｅｌｅａｇｒｉｓ ｇａｌｌｏｐａｖｏ）をクローン元としてきた。ＶＰＡＣ２受容体は、ヒト、マウス（ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））、およびラット（ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））をクローン元としてきた。
【０００５】
ＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２受容体は、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）ファミリーの他のメンバに対する配列相同性に基づいて、ＰＡＣＡＰ受容体ファミリーに分類される。ＰＡＣＡＰファミリーの受容体は、さらにリガンド親和性に基づいて、２つのサブクラスに細分される。ＰＡＣＡＰタイプＩ受容体は、ＶＩＰよりもＰＡＣＡＰにはるかに強い親和性を有し、一方ＰＡＣＡＰタイプＩＩ受容体は、ＰＡＣＡＰとＶＩＰにほぼ等しい親和性を有する。ＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２受容体は、ＰＡＣＡＰとＶＩＰに同様の親和性を有するので、ＰＡＣＡＰタイプＩＩ受容体として分類される。選択的作動薬および拮抗薬は、ＰＡＣＡＰタイプＩ受容体同様に、分子的かつ薬理的にＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２受容体を区別することができる。これらの作動薬および拮抗薬は、生物活性を特定のＶＰＡＣ受容体サブクラスに合致させるのに有用であった。
【０００６】
ＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２受容体は、共にＧタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）クラスに属する。ＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２受容体の、特定のＧタンパク質への結合の特異性は、検査する組織によって異なるように思われる。筋肉などの組織では、ＶＰＡＣ１またはＶＰＡＣ２受容体の作動薬活性化が、アデニル酸シクラーゼのＧαｓ活性化をまねく。アデニル酸シクラーゼは、ｃＡＭＰの形成に触媒作用を及ぼし、それが次には、タンパク質キナーゼＡの活性化、細胞内カルシウム放出、およびマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）活性化を含む、多数の効果を有する。他の研究では、ＶＰＡＣ受容体の作動薬活性後の細胞内イノシトール３リン酸合成の強化が、ＧαｉまたはＧαｑに結合するＶＰＡＣ受容体を示唆する。
【０００７】
ＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２受容体の発現は組織特異性であり、各受容体の発現パターンには差異がある。ヒトでは、ＶＰＡＣ１受容体は、脳、脂肪、肝臓、および心臓で発現され、ＶＰＡＣ２受容体は、肺、膵臓、脳、腎臓、骨格筋、胃、心臓、および胎盤で発現することがわかっている。ラットでは、ＶＰＡＣ１受容体の発現は、松果腺、小腸、肝臓、脾臓、膵臓、肺、大動脈、輸精管、および脳で見られ、ＶＰＡＣ２受容体の発現は、胃、腸、骨格筋、脾臓、膵臓、胸腺、副腎、心臓、肺、大動脈、脳、下垂体、および嗅球で見られる。
【０００８】
骨格筋萎縮および肥大
骨格筋は、仕事のための生理的要求または代謝的需要の変化に容易に適合する塑性組織である。肥大は、骨格筋量の増加を指し、骨格筋萎縮は、骨格筋量の減少を指す。急性の骨格筋萎縮は、手術、ベッド休養、または骨折による不使用；脊髄損傷、自己免疫疾患、または感染病による神経除去／神経損傷；無関係条件に対する糖質コルチコイド使用；感染または他の原因による敗血症；病気または飢餓による栄養制限；および宇宙旅行を含めて、様々な原因を追跡可能であるが、これに限るものではない。骨格筋萎縮は、正常な生物学的プロセスを通じて起こるが、ある医療状況では、この正常な生物学的プロセスが衰弱レベルの筋萎縮を引き起こす。例えば、急性の骨格筋萎縮は、整形外科的処置に付随するものを含め、患者の運動抑制状態からのリハビリテーションにおける顕著な制限を与えるが、これに限るものではない。このような場合、骨格筋萎縮を改善するのに必要なリハビリテーション期間は、しばしば、本来の損傷を修復するのに要する期間よりもはるかに長くなる。このような急性の不使用萎縮は、永久的な障害および早死にをまねくことがあるので、既に筋機能および筋量にかなりの加齢性欠損を患っている可能性のある高齢者では特に問題となる。
【０００９】
骨格筋萎縮はまた、癌性悪液質、慢性炎症、ＡＩＤＳ性悪液質、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、うっ血性心不全、遺伝病（例えば筋ジストロフィー）、神経変性病、筋肉減少症（年齢に関係する筋肉の喪失）など、慢性的な状態にも起因することがある。これらの慢性状態では、骨格筋萎縮が運動能力の早期喪失をまねき、その結果、疾病関連発症率を増加させる可能性がある。
【００１０】
骨格筋の萎縮または肥大を制御する分子的プロセスについては、ほとんど知られていない。骨格筋萎縮を開始させる引き金となるものは、様々な萎縮開始事象に関して異なるが、患部の骨格筋線維では、タンパク質合成の減少およびタンパク質分解の増加、ならびに遅線維（きわめて酸化的な代謝／遅い収縮性タンパク質イソ型）から速線維（きわめて解糖的な代謝／速い収縮性タンパク質イソ型）への転換の収縮性および代謝性酵素タンパク質アイソザイム特徴における変化を含め、いくつかの共通する生化学的変化が生じる。発生する骨格筋での他の変化には、脈管構造の喪失および細胞外マトリックスの再構築が含まれる。速攣縮筋および遅攣縮筋は、相対的な筋肉喪失が特定の萎縮刺激または条件に依存する適切な条件下で、萎縮を実証する。重要なことは、これらの変化すべてが調和して調節され、生理的および代謝的需要の変化に応じて始動または停止することである。
【００１１】
萎縮および肥大が生じるプロセスは、哺乳類種にわたって維持されている。多数の研究により、萎縮時に、げっ歯類とヒトで同一の基本的な分子的、細胞的、および生理的プロセスが起こることが実証されている。従って、骨格筋萎縮のげっ歯類モデルをうまく利用して、ヒトの萎縮反応が理解および予測されてきた。例えば、げっ歯類とヒトの両方で様々な手段によって誘発される萎縮は、筋肉の解剖学的構造、断面積、機能、線維タイプ転換、収縮性タンパク質の発現、および組織学的に同様の変化をもたらす。加えて、いくつかの薬剤が、げっ歯類とヒトの両方で骨格筋萎縮を調節することが実証されている。これらの薬剤としては、タンパク質同化ステロイド、成長ホルモン、インスリン様成長因子Ｉ、およびβアドレナリン作動薬が挙げられる。総合して、これらのデータは、骨格筋萎縮がげっ歯類とヒトで共通の機構に起因することを実証している。
【００１２】
いくつかの薬剤が骨格筋萎縮を調節することがわかり、この徴候に関するヒトでの使用を承認されているが、これらの薬剤は、心筋肥大、腫瘍形成、多毛症、女性の男性化、疾病率および死亡率の増加、肝臓障害、低血糖症、筋骨格系疼痛、組織膨張の増加、頻脈、浮腫など、望ましくない副作用を有する（医師用卓上参考書（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）第５４版、２０００年）。現在、急性または慢性の骨格筋萎縮のための、きわめて有効かつ選択的な処置が存在しない。従って、骨格筋萎縮を調節する他の治療用薬剤の同定が必要とされている。
骨格筋萎縮の処置で使用する化合物の同定に関する問題の１つは、そのような化合物を同定するための優れたスクリーニング方法がないことであった。本出願人らは、ＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２受容体が、骨格筋の量または機能の調節に関与し、ＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２受容体の作動薬が、骨格筋萎縮を阻止、かつ／または骨格筋の肥大を誘発することを見出した。
【００１３】
（発明の概要）
本発明は、骨格筋萎縮の処置で潜在的に有用、および／または骨格筋肥大の誘発に有用な候補化合物を同定するための、ＶＰＡＣ受容体の使用に関する。特に、本発明は、骨格筋の量または機能を調節する候補化合物を同定するための生体外の方法を提供する。本発明の一実施形態では、この方法は、ＶＰＡＣ受容体に試験化合物を接触させる工程と、試験化合物がＶＰＡＣ受容体に結合するかどうかを決定する工程とを含み、ＶＰＡＣ受容体に結合する試験化合物を、骨格筋の量または機能を調節する候補化合物として同定する。本発明の他の実施形態では、この方法は、ＶＰＡＣ受容体を発現する細胞に試験化合物を接触させる工程と、試験化合物がＶＰＡＣ受容体を活性化するかどうかを決定する工程とを含み、ＶＰＡＣ受容体を活性化する試験化合物を、骨格筋の量または機能を調節する候補化合物として同定する。本発明のさらに他の実施形態では、この方法は、さらに候補化合物のリストを作成する工程を含む。
【００１４】
他の態様では、本発明は、生体内で骨格筋の量または機能を調節する治療用候補化合物を同定するための、ＶＰＡＣ受容体の使用に関する。特に、本発明は、ＶＰＡＣ受容体に試験化合物を接触させる工程と、試験化合物がＶＰＡＣ受容体に結合するかどうかを決定する工程と、前の工程でＶＰＡＣ受容体に結合すると決定された試験化合物またはＶＰＡＣ受容体に結合することが予めわかっている化合物を非ヒト動物に投与する工程と、試験化合物が処置した動物内で骨格筋の量または機能を調節するかどうかを決定する工程とを含む方法を提供する。骨格筋の量または機能を調節する試験化合物を、生体内で骨格筋の量または機能を調節する治療用候補化合物として同定する。本発明の他の実施形態では、この方法は、ＶＰＡＣ受容体を発現する細胞に試験化合物を接触させる工程と、試験化合物がＶＰＡＣ受容体を活性化するかどうかを決定する工程と、前の工程でＶＰＡＣ受容体を活性化すると決定された試験化合物またはＶＰＡＣ受容体を活性化することが予めわかっている化合物を非ヒト動物に投与する工程と、試験化合物が処置した動物内で骨格筋の量または機能を調節するかどうかを決定する工程とを含む。生体内で骨格筋の量または機能を調節する試験化合物を、生体内で骨格筋の量または機能を調節する治療用候補化合物として同定する。
【００１５】
本発明は、さらに、ＶＰＡＣ受容体の活性化またはＶＰＡＣ受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる候補化合物を同定するための方法を提供する。これらの方法は、（ｉ）機能的ＶＰＡＣ受容体を発現する細胞を、受容体を脱感作するのに十分な作動薬の濃度および作動薬−受容体暴露期間で、ＶＰＡＣ受容体作動薬に接触させる工程と、（ｉｉ）試験化合物に細胞を接触させる工程と、（ｉｉｉ）ＶＰＡＣ受容体の活性化レベルを決定する工程とを含む。本発明の前述の実施形態では、工程（ｉｉ）は、工程（ｉ）の前または後に実施することができる。特定の一実施形態では、本発明は、ＶＰＡＣ受容体またはＶＰＡＣ受容体シグナルトランスダクション経路の作動薬誘発活性化を持続または増大させる候補化合物を、単独でまたはＶＰＡＣ受容体作動薬と組み合わせて非ヒト動物に投与して、候補化合物が処置した動物内で骨格筋の量または機能を調節するかどうかを決定することによって、候補化合物が生体内で骨格筋の量または機能を調節するために使用できるかどうかを決定する方法に関する。生体内で骨格筋の量または機能を調節する候補化合物を、生体内で骨格筋の量または機能を調節する治療用候補化合物として同定する。
【００１６】
本発明は、さらに、ＶＰＡＣ受容体遺伝子調節要素に施術により結合されたレポーター遺伝子を含有する細胞または細胞溶解物に試験化合物を接触させる工程と、レポーター遺伝子の発現を検出する工程とを含む、ＶＰＡＣ受容体の発現を増加させる候補化合物を同定するための方法を提供する。レポーター遺伝子の発現を増加させる試験化合物を、ＶＰＡＣ受容体の発現を増加させる候補化合物として同定する。特定の一実施形態では、本発明は、ＶＰＡＣ受容体の発現を増加させる候補化合物を非ヒト動物に投与して、候補化合物が処置した動物内で骨格筋の量または機能を調節するかどうかを決定することによって、候補化合物が生体内で骨格筋の量または機能を調節するために使用できるかどうかを決定する方法に関する。生体内で骨格筋の量または機能を調節する候補化合物を、生体内で骨格筋の量または機能を調節する治療用候補化合物として同定する。
【００１７】
その他の実施形態では、本発明は、ＶＰＡＣ受容体に特異的な抗体を提供する。特に、本発明は、ＶＰＡＣ受容体に特異的なキメラ抗体またはヒト抗体を提供する。
【００１８】
本発明は、さらに、ＶＩＰまたはＶＩＰ類縁体遺伝子調節要素に施術により結合されたレポーター遺伝子を含有する細胞または細胞溶解物に試験化合物を接触させる工程と、レポーター遺伝子の発現を検出する工程とを含む、ＶＩＰまたはＶＩＰ類縁体の発現を増加させる化合物を同定するための方法を提供する。レポーター遺伝子の発現を増加させる試験化合物を、ＶＩＰまたはＶＩＰ類縁体の発現を増加させる候補化合物として同定する。特定の一実施形態では、本発明は、ＶＩＰまたはＶＩＰ類縁体の発現を増加させる候補化合物を非ヒト動物に投与して、候補化合物が処置した動物内で骨格筋の量または機能を調節するかどうかを決定することによって、候補化合物が生体内で骨格筋の量または機能を調節するかどうかを決定する方法に関する。生体内で骨格筋の量または機能を調節する候補化合物を、生体内で骨格筋の量または機能を調節する治療用候補化合物として同定する。
【００１９】
本発明はまた、骨格筋の量または機能を増加させるための治療用標的としてのＶＰＡＣ受容体の使用に関する。この使用には、骨格筋の量または機能を増加、および／または骨格筋萎縮を処置するための、ＶＰＡＣ受容体作動薬、ＶＰＡＣ受容体の活性化またはＶＰＡＣ受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる化合物、機能的ＶＰＡＣ受容体をコード化する発現ベクター、構造的活性型ＶＰＡＣ受容体をコード化する発現ベクター、ＶＰＡＣ受容体の発現を増加させる化合物、ＶＩＰの発現を増加させる化合物、またはＶＩＰ類縁体の発現を増加させる化合物の使用が含まれる。特に、本発明は、骨格筋の量または機能の増加が望まれる被験体で骨格筋の量または機能を増加させるための方法であって、骨格筋の量または機能の増加が望まれる被験体を特定する工程と、その被験体に、安全かつ有効な量の、ＶＰＡＣ受容体作動薬、ＶＰＡＣ受容体の活性化またはＶＰＡＣ受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる化合物、機能的ＶＰＡＣ受容体をコード化する発現ベクター、構造的活性型ＶＰＡＣ受容体をコード化する発現ベクター、ＶＰＡＣ受容体の発現を増加させる化合物、ＶＩＰの発現を増加させる化号物、またはＶＩＰ類縁体の発現を増加させる化合物を投与する工程とを含む方法を提供する。その他の実施形態では、本発明は、骨格筋萎縮の処置が必要な被験体で骨格筋萎縮を処置する方法であって、その被験体に、有効な量のＶＰＡＣ受容体作動薬、ＶＰＡＣ受容体の活性化またはＶＰＡＣ受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる化合物、機能的ＶＰＡＣ受容体をコード化する発現ベクター、構造的活性型ＶＰＡＣ受容体をコード化する発現ベクター、ＶＰＡＣ受容体の発現を増加させる化合物、ＶＩＰの発現を増加させる化合物、またはＶＩＰ類縁体の発現を増加させる化合物を投与する工程を含む方法を提供する。
【００２０】
本発明はまた、骨格筋の量または機能を増加、および／または骨格筋萎縮を処置するための、ＶＰＡＣ受容体の活性化またはＶＰＡＣ受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる化合物の使用に関する。特に、本発明は、骨格筋萎縮の処置が必要な被験体で、骨格筋萎縮を処置する方法であって、安全かつ有効な量の、ＶＰＡＣ受容体の活性化またはＶＰＡＣ受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる化合物を、単独でまたはＶＰＡＣ受容体作動薬と組み合わせて投与する工程を含む方法を提供する。
【００２１】
（詳細な説明）
Ｉ．用語および定義
以下は、本明細書で使用する用語に関する定義の一覧である。
「作動薬」とは、受容体を活性化するいかなる化合物をも意味する。
「対立形質の変異型」とは、所与の遺伝子または遺伝子生成物の変異形態を意味する。多数の遺伝子が個体群中に２つまたはそれ以上の対立形態で存在し、多数の対立遺伝子を有する遺伝子もあることが、当技術の習熟者には認識されている。
【００２２】
「抗体」とは、その文法的な様々な形において、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原を特異的に結合する抗原結合部位を有する分子を意味する。「精製抗体」とは、それが生来付随するタンパク質および自然発生有機分子から、部分的または完全に分離された抗体を意味する。好ましくは、乾燥重量で少なくとも６０％抗体、より好ましくは少なくとも７５％抗体、さらに好ましくは少なくとも９０％抗体、最も好ましくは少なくとも９９％抗体を調製する。
「結合親和性」とは、リガンドが受容体と相互作用する傾向を意味し、特異的なＶＩＰリガンド−ＶＰＡＣ相互作用に関する解離定数に反比例する。解離定数は、標準的な飽和、競合、若しくは動的結合技術を介して直接的に、または機能的アッセイおよびエンドポイントに関する薬理学的技術を介して間接的に測定することができる。
【００２３】
「キメラ抗体」とは、２つまたはそれ以上の異なる抗体分子由来、すなわち異なる動物種由来の構造要素を含有する抗体を意味する。キメラ抗体には、「ヒト化抗体」として知られる抗体が含まれるが、これに限るものではなく、これには相補的決定領域移植として知られる技術によって生成されるキメラ抗体が含まれるが、これに限るものではない。
「融合」とは、１つのハイブリッドタンパク質をコード化するように、作用可能に結合する２つまたはそれ以上のＤＮＡコード配列を意味する。従って、「融合タンパク質」とは、そのようなハイブリッドタンパク質を指す。
「阻害」とは、特定のプロセスまたは活性を部分的または完全に阻止することを意味する。例えば、完全または部分的に筋萎縮を妨げる場合、その化合物は、骨格筋萎縮を阻害する。
【００２４】
本明細書で使用する時、２つのＤＮＡ配列は、その間の連鎖の性質が、（１）フレームシフト変異の移入を引き起こさず、（２）プロモーター領域がコード配列の転写を方向づける能力に干渉せず、または（３）対応するＲＮＡ転写産物をタンパク質に翻訳する能力に干渉しない場合に、「作用可能に結合する」と言われる。例えば、コード配列および調節配列は、コード配列の転写を調節配列の影響下または制御下におくようにそれらが共有結合する時に、作用可能に結合する。従って、プロモーター領域は、得られる転写産物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳できるように、そのＤＮＡ配列の転写をもたらすことができる時には、コード配列と作用可能に結合する。
「ＰＡＣＡＰ」とは、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドを意味する。
【００２５】
「パーセント同一性」とは、以下のように計算される、２つの配列が共通に有するヌクレオチドまたはアミノ酸の百分率を意味する。特異的配列（クエリー）のパーセント同一性を計算するには、ジェネティクスコンピュータグループ社（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｉｎｃ．）から入手可能なベストフィット（ＢｅｓｔＦｉｔ）比較コンピュータプログラムである、ウィスコンシンパッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ）、バージョン１０．１を用いて、クエリー配列の関連部分をリファレンス配列と比較する。このプログラムは、スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）の、応用数学の進歩（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ）、第２号：４８２〜４８９（１９８１年）のアルゴリズムを使用する。パーセント同一性は、ベストフィットプログラムに関する以下の初期設定パラメータで計算する：スコアリングマトリックス（ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ）がｂｌｏｓｕｍ６２．ｃｍｐ、ギャップクリエーションペナルティ（ｇａｐ ｃｒｅａｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）が８、ギャップエクステンションペナルティ（Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）が２。配列をリファレンス配列と比較する時には、クエリー配列の関連部分は、ＶＰＡＣ配列由来のものになる。例えば、クエリーがＶＰＡＣ／精製タグ融合タンパク質の場合、パーセント同一性スコアを計算するために、配列のＶＰＡＣポリペプチド部分だけを整合させる。
【００２６】
「ポリペプチド」とは、長さまたは翻訳後修飾（例えば、リン酸化反応またはグリコシル化）に関わらず、アミノ酸の任意の鎖を意味する。
「プロモーター」とは、転写の開始、および遺伝子またはコード領域からの転写速度を制御するＤＮＡ配列を意味する。
「予防的処置」とは、現時点では骨格筋萎縮の徴候を示していない被験体の、骨格筋萎縮の発生を完全にまたは部分的に阻止するための防止的な処置を意味する。本明細書の背景の項で説明したように、骨格筋萎縮の恐れのある人がいることが当技術の習熟者には認識されよう。さらに、骨格筋萎縮をまねく生化学的変化を適切に調節すれば、その危険のある個人での萎縮の発生が防止または低減されることが、当技術の習熟者には認識されよう。
「調節」とは、文法的なすべての形において、増加、減少、または維持することを意味し、例えば骨格筋の量または機能を調節するとは、骨格筋の量または機能のレベルを増加、減少、または維持することを意味する。
【００２７】
「骨格筋の量または機能の調節」には、骨格筋量の調節、骨格筋機能の調節、またはその両方が含まれる。
「調節要素」とは、作用可能に結合するＤＮＡ配列からの転写のレベルを制御できるＤＮＡ配列を意味する。調節要素のこの定義には、プロモーターおよびエンハンサーが含まれる。例えば、ＶＰＡＣ受容体遺伝子調節要素とは、ＶＰＡＣ受容体遺伝子からの転写レベルを制御できるＤＮＡ配列である。
「レポーター遺伝子」とは、その生成物を好ましくは定量的に検出できるコード配列を意味し、レポーター遺伝子は、測定すべき信号に応答性のある異種プロモーターまたはエンハンサー要素と作用可能に結合する。この状況でのプロモーターまたはエンハンサー要素は、本明細書では「応答要素」と呼ぶ。
【００２８】
「選択的作動薬」とは、作動薬が、ある受容体（類）に、他の受容体に比べて顕著に大きい活性を有することを意味するもので、それが他の受容体に関して完全に不活性であることではない。
「骨格筋肥大」とは、骨格筋量の増加、骨格筋機能の増加、またはその両方を意味する。
「骨格筋萎縮」とは、「筋消耗」と同一で、骨格筋量の減少、骨格筋機能の低下、またはその両方を意味する。
「スプライス変異型」とは、代替的なエクソン使用の結果得られるｍＲＮＡまたはタンパク質を意味する。細胞のタイプに応じて、または単一の細胞タイプ内でさえ、ｍＲＮＡがわずかに異なる形態でスプライス変異型として発現されることがあり、従って発現されるｍＲＮＡに応じて、翻訳されるタンパク質が異なることが当技術の習熟者には認識されている。
【００２９】
物質の「治療的に有効な量」とは、ヒトまたは非ヒト哺乳類における許容可能な利益対危険比で、処置を受ける被験体で医学的に望ましい結果、例えば骨格筋萎縮の軽減、骨格筋量または骨格筋機能の増加を実現することのできる量である。
「治療的処置」とは、筋量または筋機能の増加が望まれる被験体の処置を意味する。例えば、既に発生した骨格筋萎縮を部分的または完全に改善、またはさらなる骨格筋萎縮の発生を完全または部分的に阻止するための、現在骨格筋萎縮の徴候を示す被験体の処置が、その被験体の治療的処置である。「治療的処置」という用語は、また、例えば、骨格筋萎縮の徴候を示していない被験体に骨格筋肥大を誘発させる処置、例えば筋量を増加させるための家畜動物の処置を含む。
【００３０】
「処置」という用語は、予防的または治療的処置を意味する。
「ＶＩＰ」は、血管活性腸管ペプチドを意味する。
「ＶＩＰ類縁体」は、ＶＰＡＣ受容体のリガンドとして作用するポリペプチドを意味する。好ましいＶＩＰ類縁体は、ＰＡＣＡＰ−２７、ＰＡＣＡＰ−３８、ヘロデルミン、ペプチドヒスチジンイソロイシンアミド（ＰＨＩ）、ペプチドヒスチジンメチオニンアミド、ペプチドヒスチジンバリンアミド（ＰＨＶ）、成長ホルモン放出ホルモン、セクレチン、グルカゴン、（Ａｒｇ１５、Ａｒｇ２１）ＶＩＰ、［（Ａｒｇ１５、２０、２１Ｌｅｕ１７）−ＶＩＰ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ２］、［Ｋ１５、Ｒ１６、Ｌ２７、ＶＩＰ（１−７）、ＧＲＦ（８−２７）−ＮＨ２］、多重結合ＶＩＰ融合タンパク質、Ｒｏ２５−１５５３、Ｒｏ２５−１３９２、またはＰＡＣＡＰ（６−３８）である。より好ましいＶＩＰ類縁体は、ＶＩＰ、ＰＡＣＡＰ−２７、ＰＡＣＡＰ−３８、ＰＨＩ、ＰＨＶ、Ｒｏ２５−１５５３、Ｒｏ２５−１３９２、および［Ｋ１５、Ｒ１６、Ｌ２７、ＶＩＰ（１−７）、ＧＲＦ（８−２７）−ＮＨ２］である。
【００３１】
「ＶＰＡＣ受容体作動薬」とは、ＶＰＡＣ１若しくはＶＰＡＣ２受容体、またはその両方を活性化することのできる化合物または分子を意味する。ＶＰＡＣ受容体の活性化は、本明細書で以下に説明するように測定することができる。
本明細書で用いるＶＰＡＣ受容体に関する専門用語は、ハーマー（Ｈａｒｍａｒ）らの薬理学総説（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ）（１９９８年）５０（２）：２６５〜２７０で提案された規約に従う。
「ＶＰＡＣ受容体」とは、ＶＰＡＣ１受容体またはＶＰＡＣ２受容体を意味する。
【００３２】
「ＶＰＡＣ１受容体」とは、任意の動物種由来のＶＰＡＣ１受容体を意味する。ＶＰＡＣ１受容体は、これまでに、「ＶＩＰ受容体」、「ＶＩＰ１受容体」（ラッツ（Ｌｕｔｚ）ら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ（１９９３年）３３４：３−８）、「ＶＩＰ／ＰＡＣＡＰタイプＩＩ受容体」（チッカレリ（Ｃｉｃｃａｒｅｌｌｉ）ら、Ｒｅｇｕｌ　Ｐｅｐｔ（１９９４年）５４：３９７−４０７）、「ＨＩＶＲ」または「ヒト腸ＶＩＰ受容体」（Ａ・クービノー（Ｃｏｕｖｉｎｅａｕ）ら、生化学・生物理学研究通信（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．）（１９９４年）２００（２）、７６９−７７６）、および「ＰＶＲ２」（ローリングス（Ｒａｗｌｉｎｇｓ）ら、内分泌学（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）（１９９５年）１３６：２０８８−２０９８）と呼ばれてきた。
【００３３】
ＶＰＡＣ１受容体の定義には、それに関するｃＤＮＡまたは受容体をコード化するゲノム配列が配列データベースに蓄積されている受容体が含まれるが、これに限るものではない。これらの配列には、受入番号Ｌ１３２８８、Ｘ７５２９９、Ｍ８６８３５、ＮＭ＿０１１７０３、Ｕ４９４３４、ＡＦ１００６４４、Ｉ２８７３４、Ｕ３１９９１（部分的ｃＤＮＡ配列）、Ｕ５６３９１、Ｅ０５５５１、および８０６７０２が含まれる。これらのＶＰＡＣ１受容体のタンパク質配列は、これらのＤＮＡ配列のコード領域を翻訳することによって得られ、一般にデータベース登録の一部分として利用可能である。
「ＶＰＡＣ２受容体」とは、任意の動物種由来のＶＰＡＣ２受容体を意味する。ＶＰＡＣ２受容体はまた、「ＶＩＰ２」（ラッツ（Ｌｕｔｚ）ら、１９９３年）、「ＰＡＣＡＰＲ−３」（イナガキ（Ｉｎａｇａｋｉ）ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９９４年）９１：２６７９−２６８３）、および「ＰＶＲ３」（ローリングス（Ｒａｗｌｉｎｇｓ）ら、内分泌学（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）（１９９５年）１３６：２０８８−２０９８）とも呼ばれてきた。
【００３４】
ＶＰＡＣ２受容体の定義には、それに関する受容体をコード化するＤＮＡ配列が配列データベースに蓄積されている受容体が含まれるが、これに限るものではない。これらの配列には、受入番号Ｘ９５０９７、Ｌ４０７６４、Ｌ３６５６６、Ｙ１８４２３、Ｕ１８８１０、Ｄ２８１３２、Ｚ２５８８５、Ｕ０９６３１、およびＡ４３８０８が含まれる。これらのＶＰＡＣ２受容体のタンパク質配列は、これらのＤＮＡ配列のコード領域を翻訳することによって得られ、一般にデータベース登録の一部分として利用可能である。
【００３５】
「ＶＰＡＣ受容体」という用語には、欠損型および／または変異型タンパク質が含まれ、リガンド結合または信号伝達に必要のない受容体分子の領域は、削除または修飾されてきた。例えば、主要なアミノ酸配列に１つまたはそれ以上の同類変化を有するＶＰＡＣ受容体が本発明で有用であることが、当技術の習熟者には認識されよう。特定のアミノ酸の、同様の構造または特性を有する異なるアミノ酸による置換（同類置換）が、静止変化（ｓｉｌｅｎｔ ｃｈａｎｇｅ）、すなわち、機能を顕著に変えない変化を引き起こす可能性があることが、当該技術分野で公知である。同類置換は、当該技術分野では周知である。例えば、ＧＰＣＲは、膜貫通型αヘリックス中のアミノ酸残基の置換を許容でき、これは他の疎水性アミノ酸と共に脂肪の方を向き、機能性を残すものである。欠損および／または同類アミノ酸置換などの変異により自然発生する配列とは異なるＶＰＡＣ１受容体は、ＶＰＡＣ１受容体の定義に含まれる。欠損および／または同類アミノ酸置換などの変異により自然発生する配列とは異なるＶＰＡＣ２受容体は、ＶＰＡＣ２受容体の定義に含まれる。
【００３６】
当技術の習熟者には、また、上述した以外の種、特に哺乳類種由来のＶＰＡＣ受容体が本発明で有用であることも認識されよう。当技術の習熟者には、さらに、公知のＶＰＡＣ種の配列からのプローブを使用することによって、ｃＤＮＡまたは公知の配列に相同なゲノム配列が、公知のクローニング方法によって同じまたは代替的な種から得られることがあることも認識されよう。このようなＶＰＡＣ１受容体は、ＶＰＡＣ１の定義に含まれ、このようなＶＰＡＣ２受容体は、ＶＰＡＣ２の定義に含まれる。
加えて、当技術の習熟者には、ＶＰＡＣ受容体の対立形質変異型またはスプライス変異型が特定の種に存在する可能性があり、これらの変異型が本発明で有用であることが認識されよう。このようなＶＰＡＣ１受容体の変異型は、ＶＰＡＣ１の定義に含まれ、このようなＶＰＡＣ２受容体の変異型は、ＶＰＡＣ２の定義に含まれる。
【００３７】
ＶＰＡＣ１若しくはＶＰＡＣ２受容体ポリペプチド、またはＶＰＡＣ１若しくはＶＰＡＣ２受容体ポリペプチド断片の、非ＶＰＡＣポリペプチドとの融合体は、ＶＰＡＣ受容体融合タンパク質と呼ばれる。公知の方法を用いて、当技術の習熟者には、ＶＰＡＣ１受容体またはＶＰＡＣ２受容体の融合タンパク質を製造することができ、これは、天然のＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２受容体とは異なるが、本発明での有用性を残している。ＶＰＡＣ１受容体融合タンパク質は、ＶＰＡＣ１受容体の定義の範囲に含まれ、ＶＰＡＣ２受容体融合タンパク質は、ＶＰＡＣ２受容体の定義の範囲に含まれる。
「機能的ＶＰＡＣ受容体」とは、生体内または生体外で、ＶＩＰまたはＶＩＰ類縁体に結合するＶＰＡＣ受容体を指し、リガンド結合の結果として活性化する。
【００３８】
特に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、タンパク質化学、薬理学、または分子生物学の技術者に一般に理解されているのと同一の意味を有する。本明細書で述べる、方法、材料、および実施例は、制限的なものではない。本明細書に記載のものと同様または等価の、他の方法および材料は、本発明の実施または試験で使用することができる。
【００３９】
ＩＩ．骨格筋量の調節におけるＶＰＡＣ受容体の役割
本発明を利用すると、従来技術における情報が得られ、以下のことが教示されることが、当技術の習熟者には認識されよう。本明細書の結果は、ＶＰＡＣ受容体の作動薬が、骨格筋肥大を誘発、並びに／または神経除去、不使用、および副腎皮質ホルモンによって誘発される骨格筋萎縮を阻害することを示しており、従って骨格筋萎縮プロセスにおけるＶＰＡＣ受容体の調節的役割または機能が実証される。理論に縛られることを意図しないが、ＶＰＡＣ受容体作動薬が骨格筋萎縮および肥大に及ぼす効果は、筋肉細胞への直接的な効果によるものと考えられている。ただし、この効果を、全体または一部分で、作動薬の非筋肉組織への分泌促進効果を通じて媒介することも可能である。
【００４０】
生体内でのＶＰＡＣ受容体の固有の役割を、ＰＡＣＡＰ受容体、ＶＰＡＣ１受容体、またはＶＰＡＣ２受容体のいずれかに対して選択的な作動薬である薬理学的薬剤を用いて、以下に説明される骨格筋萎縮の様々なモデルで調査した。使用した選択的作動薬には、ＰＡＣＡＰ−３８（ＶＰＡＣ１／ＶＰＡＣ２／ＰＡＣ１受容体には非選択的）（バッケムバイオサイエンス社（Ｂａｃｈｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）（ペンシルベニア州キングオブプルシア）；グーレット（Ｇｏｕｒｌｅｔ）、バートンゲン（Ｖｅｒｔｏｎｇｅｎ）らの、ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）１８（１９９７年）４０３〜４０８の方法に従って合成された［Ｋ１５、Ｒ１６、Ｌ２７、ＶＩＰ（１−７）、ＧＲＦ（８−２７）−ＮＨ２］（ＰＡＣＡＰ３８と同様の効力を有するＶＰＡＣ１受容体選択的作動薬）；およびシンペップ社（Ｓｙｎｐｅｐ Ｉｎｃ．）（カリフォルニア州ダブリン）から購入したＲｏ２５−１５５３（ＰＡＣＡＰ３８と同様の効力を有するＶＰＡＣ２受容体選択的作動薬）が含まれる。使用前に、薬剤を、ＨＰＬＣによって純度に関して、質量分析法によって組成物に関して調べた。これらの薬剤は、科学文献（グーレット（Ｇｏｕｒｌｅｔ）、ヴァンダーミアズ（Ｖａｎｄｅｒｍｅｅｒｓ）らの、ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）１８（１９９７年）１５３９〜１５４５；グーレット（Ｇｏｕｒｌｅｔ）、バートンゲン（Ｖｅｒｔｏｎｇｅｎ）らの、ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）１８（１９９７年）４０３〜４０８；ゴーゼス（Ｇｏｚｅｓ）らの、現代医療化学（Ｃｕｒｒ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．）６（１９９９年）１０１９〜１０３４）で十分に特徴付けられ、記載されてきた。
【００４１】
図１〜５は、ＶＰＡＣ１またはＶＰＡＣ２受容体のための作動薬の投与が、統計的に有意に、骨格筋萎縮の阻害、または肥大の誘発を引き起こすことを実証する、実験の結果を示す。ＶＰＡＣ１またはＶＰＡＣ２受容体作動薬を、１日に２回、テオフィリンと組み合わせて投与すると、骨格筋萎縮の動物モデルで骨格筋萎縮が阻害された。テオフィリンは、ＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２受容体作動薬の作用の期間および大きさを増強するために添加され、従ってこれらの化合物の有効性が高められる。これらの萎縮モデルにテオフィリンを単独で投与しても効果はなく、ＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２受容体作動薬をテオフィリンと組み合わせた抗萎縮効果が、ＶＰＡＣ受容体作動薬の効果によるものであることが実証された。さらに、浸透性ミニポンプを介して、テオフィリンを含まずに、ＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２受容体作動薬を連続投与すると、やはり骨格筋萎縮が阻害、および／または骨格筋肥大が引き起こされた。
【００４２】
具体的には、図１は、ＶＰＡＣ１受容体選択的作動薬である、［Ｋ１５、Ｒ１６、Ｌ２７ＶＩＰ（１−７）、ＧＲＦ（８−２７）−ＮＨ２］（ＶＰＡＣ１Ｒ作動薬）、ＶＰＡＣ２受容体選択的作動薬である、Ｒｏ２５−１５５３（ＶＰＡＣ２Ｒ作動薬）、またはＶＰＡＣ１／ＶＰＡＣ２受容体非選択的作動薬である、ＰＡＣＡＰ−３８を利用したマウス神経除去萎縮研究の結果を示す。右坐骨神経の神経除去後、オスのマウスの肩甲骨間領域に、１日に２回、図１Ａおよび１Ｂに記載の用量で上述の薬剤のいずれかまたは対照ビヒクル（生理食塩水）を９日間皮下注射した。これらの作動薬は、１日に２回のホスホジエステラーゼ阻害テオフィリン（Ｔ−３０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与と併せて共投与した（ＶＰＡＣ受容体作動薬によって誘発されたｃＡＭＰ信号の作用の大きさおよび期間を増加させるために含める）。９日目に、内側腓腹筋および前脛骨筋を摘出し、重量を測定して萎縮度を決定した。この実験で、非特異的ＶＰＡＣ受容体作動薬であるＰＡＣＡＰ−３８が、神経除去した前脛骨筋（図１Ａ）および内側腓腹筋（図１Ｂ）の萎縮を阻害することが実証された。ＶＰＡＣ１受容体選択的作動薬である［Ｋ１５、Ｒ１６、Ｌ２７ＶＩＰ（１−７）、ＧＲＦ（８−２７）−ＮＨ２］は、神経除去した内側腓腹筋（図１Ｂ）の萎縮を阻害した。ＶＰＡＣ２受容体選択的作動薬であるＲｏ２５−１５５３は、神経除去した前脛骨筋（図１Ａ）および内側腓腹筋（図１Ｂ）の萎縮を阻害した。この結果の統計的有意性は、ＡＮＣＯＶＡ（ダグラス・Ｃ・モンゴメリ（Ｄｏｕｇｌａｓ Ｃ． Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ）の、実験の設計と分析（Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）、ジョンワイリーアンドサンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）（ニューヨーク）（第２版、１９８４年））を用いて決定した。
【００４３】
図２は、ＶＰＡＣ１受容体選択的作動薬である、［Ｋ１５、Ｒ１６、Ｌ２７ＶＩＰ（１−７）、ＧＲＦ（８−２７）−ＮＨ２］（ＶＰＡＣ１Ｒ作動薬）、ＶＰＡＣ２受容体選択的作動薬である、Ｒｏ２５−１５５３（ＶＰＡＣ２Ｒ作動薬）、またはＶＰＡＣ１／ＶＰＡＣ２受容体非選択的作動薬である、ＰＡＣＡＰ−３８を利用したマウス神経除去萎縮研究の結果を示す。右坐骨神経の神経除去後、オスのマウスに、実験期間の終わりまで、ＡＬＺｅＴ浸透性ミニポンプを用いた５μｌ／時間の連続注入によって、上述の薬剤または対照ビヒクル（生理食塩水）を投薬した。薬剤の１日の供給量は、図２Ａおよび２Ｂに示す通りである。ミニポンプの埋め込みは、坐骨神経摘出と同時に実施した。９日目に、内側腓腹筋および前脛骨筋を摘出し、重量を測定して萎縮度を決定した。ＶＰＡＣ２受容体選択的作動薬であるＲｏ２５−１５５３は、神経除去した前脛骨筋（図２Ａ）の萎縮を阻害した。加えて、ＶＰＡＣ２受容体選択的作動薬であるＲｏ２５−１５５３は、神経除去していない（対照）前脛骨筋（図２Ａ）および内側腓腹筋（図２Ｂ）の肥大を誘発した。結果の統計的有意性は、ＡＮＣＯＶＡを用いて決定した。
【００４４】
図３は、ＶＰＡＣ１受容体選択的作動薬である、［Ｋ１５、Ｒ１６、Ｌ２７ＶＩＰ（１−７）、ＧＲＦ（８−２７）−ＮＨ２］（ＶＰＡＣ１Ｒ作動薬）、ＶＰＡＣ２受容体選択的作動薬である、Ｒｏ２５−１５５３（ＶＰＡＣ２Ｒ作動薬）、またはＶＰＡＣ１／ＶＰＡＣ２受容体非選択的作動薬である、ＰＡＣＡＰ−３８を利用したマウスの糖質コルチコイド誘発性萎縮研究の結果を示す。糖質コルチコイドであるデキサメタゾンを飲用水に添加後（１．２ｍｇ／ｋｇ／日）に、オスのマウスの肩甲骨間領域に、１日に２回、図３Ａおよび３Ｂに記載の用量で上述の薬剤のいずれかまたは対照ビヒクル（生理食塩水）を９日間皮下注射した。これらの作動薬は、１日に２回のホスホジエステラーゼ阻害テオフィリン（Ｔ−３０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与と併せて共投与した。ＶＰＡＣ受容体作動薬およびデキサメタゾンの投与開始から９日で、内側腓腹筋および前脛骨筋を摘出し、重量を測定して萎縮度を決定した。この実験で、非特異的ＶＰＡＣ受容体作動薬であるＰＡＣＡＰ−３８が、糖質コルチコイド投与によって誘発される内側腓腹筋の萎縮を阻害することが実証される（図３Ｂ）。ＶＰＡＣ１受容体選択的作動薬である［Ｋ１５、Ｒ１６、Ｌ２７ＶＩＰ（１−７）、ＧＲＦ（８−２７）−ＮＨ２］は、糖質コルチコイド投与によって誘発された前脛骨筋の筋萎縮を阻害した（図３Ａ）。ＶＰＡＣ２受容体選択的作動薬であるＲｏ２５−１５５３は、糖質コルチコイド投与によって誘発された前脛骨筋（図３Ａ）および内側腓腹筋（図３Ｂ）の筋萎縮を阻害した。結果の統計的有意性は、ＡＮＣＯＶＡを用いて決定した。
【００４５】
図４は、ＶＰＡＣ２受容体選択的作動薬であるＲｏ２５−１５５３（ＶＰＡＣ２Ｒ作動薬）を利用した、マウスの不使用（キャスト固定）萎縮研究の結果を示す。右後肢のキャスト固定後、オスのマウスの肩甲骨間領域に、１日に２回、図４Ａおよび４Ｂに記載の用量で上述の薬剤のいずれかまたは対照ビヒクル（生理食塩水）を９日間皮下注射した。ＶＰＡＣ２Ｒ作動薬は、１日に２回のホスホジエステラーゼ阻害テオフィリン（Ｔ−３０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与と併せて共投与した。９日目に、内側腓腹筋および前脛骨筋を摘出し、重量を測定して萎縮度を決定した。ＶＰＡＣ２受容体選択的作動薬であるＲｏ２５−１５５３は、前脛骨筋（図４Ａ）の不使用誘発性萎縮を阻害した。加えて、Ｒｏ２５１５５３は、内側腓腹筋の肥大を誘発した。結果の統計的有意性は、ＡＮＣＯＶＡを用いて決定した。
【００４６】
図５は、ＶＰＡＣ２受容体選択的作動薬であるＲｏ２５−１５５３（ＶＰＡＣ２Ｒ受容体）を利用した、ラットの神経除去萎縮研究の結果を示す。右坐骨神経の神経除去後、オスのラットの肩甲骨間領域に、１日に２回、図５Ａおよび５Ｂに記載の用量でＶＰＡＣ２Ｒ受容体作動薬のいずれかまたは対照ビヒクル（生理食塩水）を９日間皮下注射した。ＶＰＡＣ２Ｒ受容体作動薬は、１日に２回のホスホジエステラーゼ阻害テオフィリン（Ｔ−３０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与と併せて共投与した。９日目に、前脛骨筋および足の長指伸筋（ＥＤＬ）を摘出し、重量を測定して萎縮度を決定した。この実験で、ＶＰＡＣ２受容体選択的作動薬であるＲｏ２５−１５５３が、神経除去した前脛骨筋（図５Ａ）およびＥＤＬ筋（図５Ｂ）の萎縮を阻害することが実証された。結果の統計的有意性は、ＡＮＣＯＶＡを用いて決定した。
【００４７】
ＩＩＩ．ＶＰＡＣ受容体、ＶＩＰまたはＶＩＰ類縁体、あるいはＶＰＡＣ受容体を発現する細胞株の調製
ＶＰＡＣ１受容体、ＶＰＡＣ２受容体、ＶＩＰおよびＶＩＰ類縁体は、抗体の生成、本発明のスクリーニングアッセイでの試薬としての使用、および骨格筋萎縮の処置のための医薬品試薬としての使用を含めて、様々な使用に関して調製することができるが、これに限るものではない。本発明の特定の実施形態には、精製ポリペプチドが最も有用であり、他の実施形態には、ポリペプチドを発現する細胞株が最も有用であることが、当技術の習熟者には明白である。例えば、ＶＰＡＣ受容体の構造的及び機能的特徴を保持することが重要な状況、例えばＶＰＡＣ受容体を活性化する候補化合物を同定するスクリーニング方法では、機能的ＶＰＡＣ受容体を発現する細胞を使用することが望ましい。
【００４８】
ＶＩＰおよびＶＩＰ類縁体が短鎖ポリペプチドであるので、これらのポリペプチドが、組換え手段によってではなく、当該技術分野で周知の技術を用いて直接合成によって最も好都合に得られることが当技術の習熟者には認識されよう。加えて、これらの分子の多くが市販されている。
ＶＰＡＣ受容体源がポリペプチドを発現する細胞株である場合、細胞は、例えば内生的にＶＰＡＣ受容体を発現させることができ、内生ＶＰＡＣ受容体の発現を増加させるように刺激され、またはＶＰＡＣ受容体を発現するように遺伝子操作されてきた。細胞株が対象のポリペプチドを発現するかどうかを決定するための方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、適切な抗体によるポリペプチドの検出、タンパク質をコード化するｍＲＮＡを検出するためのＤＮＡプローブの使用（例えば、ノーザンブロットまたはＰＣＲ技術）、または対象のポリペプチドに選択的な薬剤の結合の測定（例えば、放射性同位体標識した選択的作動薬）がある。
【００４９】
ＶＰＡＣ１、ＶＰＡＣ２、またはこれらのポリペプチドを発現する細胞株の調製で組換えＤＮＡ技術を用いることが、特に企図されている。このような組換え方法は、当該技術分野では周知である。組換えＶＰＡＣ１またはＶＰＡＣ２受容体を発現するには、１つまたはそれ以上の調節要素の制御下で対象のポリペプチドをコード化する核酸を含む発現ベクターを調製する。いくつかの種由来のＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２受容体をコード化するゲノムまたはｃＤＮＡ配列は、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／で入手可能）に記載されており、そこから容易に入手可能である。ＶＰＡＣ１受容体配列に関する受入番号としては、Ｌ１３２８８（ヒト）；ヒトＶＰＡＣ１受容体に関する完全な遺伝子配列を併せて構築する（収集リストは８０６７０２にある）、Ｕ１１０７９、Ｕ１１０８０、Ｕ１１０８１、Ｕ１１０８２、Ｕ１１０８３、Ｕ１１０８４、Ｕ１１０８５、Ｕ１１０８６、Ｕ１１０８７；Ｘ７５２９９（ヒト）；Ｍ８６８３５（ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））；ＮＭ＿０１１７０３（ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））、Ｕ４９４３４（イノシシ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ））、ＡＦ１００６４４（ワライガエル（Ｒａｎａ ｒｉｄｉｂｕｎｄａ））、Ｉ２８７３４（ブタ（Ｐｏｒｃｉｎｅ））、Ｅ０５５５１（クマネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｓｐ．））、およびＵ５６３９１（キンギョ（Ｃａｒａｓｓｉｕｓ ａｕｒａｔｕｓ））が挙げられる。ＶＰＡＣ２受容体配列に関する受入番号としては、Ｘ９５０９７（ヒト）、Ｌ４０７６４（ヒト）、Ｌ３６５６６（ヒト）、Ｙ１８４２３（ヒト）、Ｕ１８８１０（ヒト）、Ｄ２８１３２（ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））、Ｚ２５８８５（ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））、Ｕ０９６３１（ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））、およびＡ４３８０８（ラット）が挙げられる。この公的に利用可能な配列情報を用いて、ＶＰＡＣ１またはＶＰＡＣ２受容体をコード化する核酸分子を単離する手段の１つは、天然のＤＮＡプローブ、または当該技術分野で周知の方法、例えば適切なライブラリからの配列のＰＣＲ増幅によって人工的に合成したＤＮＡプローブによる、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリのスクリーニングである。その他の方法は、対象の受容体に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、特定の組織（骨格筋など）から単離されたｍＲＮＡから、直接的にｃＤＮＡをＰＣＲ増幅することである。このように単離されたｍＲＮＡは、市販されている。当技術の習熟者には、さらに、公知のＶＰＡＣ受容体配列の一部分に対応する核酸プローブを使用することによって、相同なｃＤＮＡまたは他の種からのゲノム配列を、公知の方法を用いて得ることができることも認識されよう。本発明の方法に特に有用であるのは、ヒト、マウス、ラット、ブタ、サル、チンパンジー、マーモセット、イヌ、雌ウシ、ヒツジ、ネコ、ニワトリ、およびシチメンチョウを含めた種由来のＶＰＡＣ受容体であるが、これに限るものではない。次いで、当該技術分野で周知の方法によって、対象のＶＰＡＣ受容体をコード化する単離核酸分子を、適切な発現ベクターに連結させる。このようにして調製される発現ベクターが宿主細胞中で発現し、受容体を発現する宿主細胞は、スクリーニングアッセイで直接的に使用されるか、または、受容体を発現する宿主細胞から受容体を単離し、単離された受容体をスクリーニングアッセイで使用する。
【００５０】
本発明の目的で使用できる宿主発現ベクター系としては、ＶＰＡＣ受容体ヌクレオチド配列を含有する、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターによって形質転換させた細菌（例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））などの微生物；ＶＰＡＣ受容体ヌクレオチド配列を含有する、組換え酵母発現ベクターによって形質転換させた酵母（例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ））；ＶＰＡＣ受容体ヌクレオチド配列を含有する、組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ））で感染させた昆虫細胞系；ＶＰＡＣ受容体ヌクレオチド配列を含有する、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス）で感染させた、または組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）によって形質転換させた植物細胞系；または哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）若しくは哺乳類ウイルス由来のプロモーター（例えば、レトロウイルスＬＴＲ）を含有し、さらにＶＰＡＣ受容体ヌクレオチド配列を含有する、組換え発現構造を有する哺乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３）が挙げられるが、これに限るものではない。
【００５１】
宿主細胞を用いて、対象のポリペプチドを産生する。ＶＰＡＣ受容体は膜結合分子であるので、宿主細胞膜から精製、またはＶＰＡＣ受容体を細胞膜中に固定して使用、すなわち、細胞全体または細胞の膜断片を使用する。このような発現系からのＶＰＡＣ受容体の精製または濃縮は、当技術の習熟者に周知の方法によって、適切な界面活性剤または脂質ミセルを用いて達成される。
細菌系では、多数の発現ベクターが、発現する遺伝子生成物に意図される用途に応じて有利に選択される。例えば、ＶＰＡＣ受容体に対する抗体の生成のためにこのようなタンパク質を大量に産生する時には、高レベルのタンパク質生成物の発現を導くベクターが望ましい。当技術の習熟者は、このようなベクター構成を生成し、融合タンパク質選択的カラムや抗体カラムなどの選択的な精製技術、および非選択的精製技術を含めた様々な方法によって、タンパク質を精製することができる。
【００５２】
昆虫タンパク質発現系では、バキュロウイルスＡ．カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、ヨトウガ（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞で異種遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。この場合、ＶＰＡＣ受容体ヌクレオチド配列は、ウイルスの非必須領域にクローニングされ、ＡｃＮＰＶプロモーターの管理下に置かれる。次いで、組換えウイルスを使用して、挿入した遺伝子を発現させる細胞を感染させ、当技術の習熟者に公知の多くの技術のうちの１つによってタンパク質を精製する。
【００５３】
哺乳類の宿主細胞では、多数のウイルスベースの発現系を使用することができる。これらの発現系の使用には、しばしば、挿入したヌクレオチド配列の効率的な翻訳のために、ベクター中で特定の開始信号を形成する必要がある。これは、内生的な開始信号を含まないＶＰＡＣ受容体遺伝子の一部分を使用する場合に、特に重要である。挿入したヌクレオチド配列のコード領域の枠内でのこの開始信号の配置、ならびに転写および翻訳促進要素の添加、および組換えタンパク質の精製は、当技術の習熟者に公知の多くの方法の１つによって達成される。哺乳類宿主細胞では、組換えタンパク質の必須な翻訳後修飾ができる適切な細胞タイプを選択することも重要である。このような修飾、例えば、開裂、リン酸化反応、グリコシル化などには、修飾酵素を含有する適切な宿主細胞の選択が必要である。このような宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳなどが挙げられるが、これに限るものではなく、当技術の習熟者には公知である。
【００５４】
長期的で組換えタンパク質の高い発現には、安定な発現が好ましい。例えば、安定してＶＰＡＣ受容体を発現する細胞株が作りだされてもよい。当技術の習熟者は、電気穿孔法、リン酸カルシウムトランスフェクション、またはリポソーム媒介トランスフェクションなどの公知の方法に従って、安定してＶＰＡＣ受容体を発現する細胞株を生成することができる。これは、通常、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、転写終止端配列、ポリアデニル化部位、翻訳開始部位など）を含む、発現ベクター、選択マーカ、および対象の遺伝子を用いて、細胞をトランスフェクションすることによって達成される。選択マーカは、対象の遺伝子として同じベクター内に含有されるか、またはＶＰＡＣ配列含有ベクターと共にトランスフェクションする別個のベクター上に含有されることができる。発現ベクター中の選択マーカは、選択に対する耐性を与えることができ、細胞がベクターを安定的にその染色体に組み入れるようにし、細胞を成長させて、次にクローニングされ細胞株に拡張することができる増殖巣を形成させる。あるいは、発現ベクターにより、マーカの物理的特質を用いて選択可能マーカを発現する細胞を選択することができ、すなわち、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現により、蛍光活性細胞分類（ＦＡＣＳ）分析を用いてマーカを発現する細胞を選択することができる。
【００５５】
当技術の習熟者は、対象の遺伝子がうまく組み入れられた細胞を選択できるようにするために、トランスフェクションに適した細胞タイプを選択することができる。例えば、選択マーカが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、またはアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼの場合、適した細胞のタイプは、それぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞になる。または、選択マーカが、メトトレキサート、ミコフェノリン酸、Ｇ−４１８、またはハイグロマイシンに対する耐性を与える、それぞれｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ｎｅｏ、またはｈｙｇｒｏの場合、野生型細胞を使用することができる。このような組換え型細胞株は、ＶＰＡＣ受容体の活性に影響を及ぼす候補化合物の同定に有用である。
【００５６】
ＩＶ．ＶＰＡＣ受容体抗体の調製
ＶＰＡＣ受容体の１つまたはそれ以上のエピトープを選択的に認識する抗体も、本発明に包含される。このような抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ発現ライブラリを用いて産生される分子、トランスジェニックマウスで産生されるヒト抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）、および上述のいずれかの断片に結合するエピトープが挙げられる。治療的な使用の場合、キメラ抗体またはヒト抗体が好ましく、ヒト抗体が最も好ましい。
【００５７】
抗体は、試験化合物の評価、例えばＶＰＡＣ受容体ポリペプチドの不動化に関して、本明細書で説明する化合物スクリーニングスキームと組み合わせて使用でき、または、このような抗体を、遺伝子治療技術と組み合わせて使用し、細胞内で、またはこれらの遺伝子を導入する患者の組織内で直接、例えばＶＰＡＣ受容体の発現を評価することができる。加えて、本発明の抗体は、骨格筋萎縮の処置で有用である。ＶＰＡＣ受容体に選択的な抗体は、ＶＰＡＣ受容体作動薬である抗体の部分集合を同定するために、本発明の方法によってスクリーニングすることができる。加えて、ＶＩＰまたはＶＩＰ類縁体に特異的な抗体に対して生成される抗イディオタイプ抗体は、ＶＰＡＣ受容体作動薬として有用な可能性があり、抗ＶＰＡＣ抗体と同様に、本発明の方法によってＶＰＡＣ受容体を活性化する能力に関してスクリーニングすることができる。
【００５８】
抗体の産生では、当該技術分野で周知の方法によって、ＶＰＡＣ、ＶＩＰ若しくはＶＩＰ類縁体、抗ＶＩＰ抗体、抗ＶＩＰ類縁体抗体、またはこれらの免疫原性断片で注射することにより、様々な宿主動物を免疫化することができる。抗イディオタイプ抗体の調製では、免疫原は、抗ＶＩＰ抗体または抗ＶＩＰ類縁体抗体である。抗イディオタイプ抗体の産生については、例えば米国特許第４，６９９，８８０号に記載されており、これを参考として本明細書に組み込む。適切な宿主動物としては、ウサギ、マウス、ヤギ、ヒツジ、およびウマが挙げられるが、これに限るものではない。免疫化技術は、当該技術分野で周知である。ポリクローナル抗体は、免疫化動物の血清から精製することができ、またはモノクローナル抗体は、当該技術分野で周知の方法によって生成することができる。これらの技術には、クーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）の周知のハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶハイブリドーマ技術が含まれるが、これに限るものではない。モノクローナル抗体は、κまたはλ軽鎖を含有する、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＤを含めて、いかなる免疫グロブリンのクラスのものでもよい。
【００５９】
ヒトにおける非ヒト抗体の免疫原性のため、ヒトの患者の治療的処置に使用する時には、非ヒト抗体に対してはキメラ抗体が好ましい。キメラ抗体を産生および使用する技術は、当該技術分野で公知であり、例えば、バズワニ（Ｖａｓｗａｎｉ）らのアレルギー喘息免疫学年報（Ａｎｎ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｉｍｍｕｎｏｌ．）（１９９８年）８１：１０５〜１１９、ファラー（Ｆａｒａｈ）らの真核生物遺伝子発現総評（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（１９９８年）８（３−４）：３２１−５６、米国特許第５，８０７，７１５号、同第４，８１６，３９７号、同第４，８１６，５６７号、および同第５，８２４，３０７号に記載されており、これらすべてを参考として本明細書に組み込む。
【００６０】
完全ヒト抗体は、非ヒト抗体よりも免疫原性が低いので、ヒト患者の治療的処置に特に望ましい。このような抗体を、内生免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子は実質的に発現できないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子は発現できる、トランスジェニックマウスを用いて産生することができる。トランスジェニックマウスは、選択された抗原、例えばＶＰＡＣのすべてまたは一部分によって通常の様式で免疫化される。抗原に反する指向性のあるモノクローナル抗体は、これらの免疫化したトランスジェニックマウスから、従来のハイブリドーマ技術を用いて得られる。この技術は、米国特許第５，８７４，２９９号、同第５，８７７，３９７号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，７７０，４２９号、および同第６，０７５，１８１号に詳細に記載されており、これらすべてを参考として本明細書に組み込む。ヒト免疫グロブリンをハイブリドーマ細胞の培養によって直接得る代替案として、ハイブリドーマ細胞を、その後の発現または遺伝子操作のための再配列重鎖および軽鎖部位源として使用することができる。高レベルの適切なｍＲＮＡが利用可能であるので、このような抗体産生細胞からの遺伝子の単離は、容易である。再生し、再配置した部位は、所望通りに操作することができる。例えば、一定領域をなくすか、若しくは異なるイソタイプのもので置き換えることができ、または単鎖Ｆｖ領域をコード化するために様々な領域を連結させることができる。このような技術については、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０９６に記載されており、これらすべてを参考として本明細書に組み込む。
【００６１】
Ｖ．試験化合物の選択
本発明のアッセイに従ってスクリーニングできる化合物としては、植物や動物抽出物などの天然生成物、合成化学物質、ならびにタンパク質、ランダムペプチドライブラリのメンバおよびＤ−またはＬ−型アミノ酸から成る順列組み合わせ的化学由来の分子ライブラリを含むがこれには限定されない可溶性ペプチド、ホスホペプチド（ランダムまたは部分的に変性した、指向性ホスホペプチドライブラリのメンバを含むが、これには限定されない）などのペプチド、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト、抗イディオタイプ、または単鎖抗体、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦａｂ発現ライブラリ断片、ならびにこれらのエピトープ結合断片を含むが、これには限定されない）、有機及び無機分子を含めた生物学的活性材料を含めて公知の化合物ライブラリが挙げられるが、これに限るものではない。
【００６２】
試験化合物のより伝統的な供給源に加え、コンピュータモデルおよびサーチ技術により、ＶＰＡＣのリガンド結合部位から、または既に同定したＶＰＡＣ受容体の作動薬からの構造的な情報を用いることによって、試験化合物の理論的選択が可能になる。試験化合物のこのような理論的選択により、治療用候補化合物を同定するためにスクリーニングしなければならない試験化合物の数を減らすことができる。ＶＰＡＣ受容体はＧＰＣＲであり、従ってＶＰＡＣタンパク質配列の知識が、潜在的リガンドのスクリーニングのために使用できる結合部位のモデル生成を可能にする。このプロセスは、いくつかの様式で達成することができる。最も確固たる手法とは、テンプレート（バクテリオロドプシンまたはロドプシン結晶構造または他のＧＰＣＲモデルから得られる）へのＶＰＡＣ受容体配列の配列整合の生成、アミノ酸構造の変換、および分子力学および視覚的検査によるモデルのリファイニングを伴うものである。強い配列整合を得られない場合、疎水性ヘリックスのモデル構築によって、モデルを生成することもできる。次いで、既知のロドプシン構造の一般的なレイアウトから開始する他のものに対して相対的に各ヘリックスを回転させ翻訳することによって、これらを組み合わせる。残基と残基の接触を示す変異型データも使用することができ、これらの接触が達成されるように、ヘリックスを互いに対して相対的に位置決めすることができる。このプロセス中、既知のリガンドの、ヘリックス内の結合部位空洞内へのドッキングを用いて、リガンドの結合を安定化させる相互作用を発生させることによって、ヘリックスの位置決めに役立たせることもできる。モデルは、分子力学を用いた精製、ならびに標準的な相同性モデリング技術を用いた細胞内および細胞外ループのループ構築によって完成させることができる。ＧＰＣＲ構造およびモデリングに関する一般的な情報は、Ｔ・シェーンベルグ（Ｓｃｈｏｎｅｂｅｒｇ）らの分子および細胞内分泌学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）、１５１（１９９９年）、１８１〜１９３、Ｄ・フラワー（Ｆｌｏｗｅｒ）の生物化学および生物理学公報（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ）、１４２２（１９９９年）、２０７〜２３４、およびＰ・Ｍ・セクストン（Ｓｅｘｔｏｎ）の薬物の発見と開発における最新の見解（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、２（５）（１９９９年）、４４０〜４４８に見ることができ、これらを参考として本明細書に組み込む。
【００６３】
モデルを完成させた後は、いくつかの既存のコンピュータプログラムの１つを用いることによって、例えば潜在的リガンドのスクリーニングに使用することができる。これらの最も一般的なものは、ＤＯＣＫプログラム（ＵＣＳＦ分子設計インスティテュート（ＵＣＳＦ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（カリフォルニア州サンフランシスコ私書箱０４４６、パルナサスアヴェニュー５３３、Ｕ−６４、９４１４３−０４４６）である。その変異型のいくつかのものにおいては、立体的適合および結合部位への大まかな静電相補性のために、市販および／または専売化合物のデータベースをスクリーニングすることができる。しばしば、ＤＯＣＫで優れた得点の分子が、リガンドになる高い可能性を有することがわかっている。使用できるその他のプログラムは、ＦＬＥＸＸ（トライポス社（Ｔｒｉｐｏｓ Ｉｎｃ．）、ミズーリ州セントルイス、サウスハンリーロード（Ｓｏｕｔｈ Ｈａｎｌｅｙ Ｒｄ．）１６９９、６３１４４−２９１３　ｗｗｗ．ｔｒｉｐｏｓ．ｃｏｍ）である。このプログラムはかなり遅いので、化合物のより小規模のデータベースを通す検索に通常制限されている。ＦＬＥＸＸ内のスコアリングスキームは、より詳細にわたっており、通常、ＤＯＣＫよりも結合能力の優れた推測が得られる。ＦＬＥＸＸは、ＤＯＣＫの提案を確認するために、または既知のリガンド若しくはテンプレートから組み合わせて生成される化合物のライブラリを調査するために最もよく使用される。
【００６４】
ＶＩ．骨格筋の量または機能を調節する候補化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ
ＶＰＡＣ受容体が骨格筋萎縮を調節する役割を果たすことがわかったことで、骨格筋萎縮の予防的または治療的処置に最終的に使用することができる候補化合物を同定するための、１つまたはそれ以上の試験化合物をスクリーニングする様々な方法が可能になる。本発明は、ＶＰＡＣ受容体に結合し、ＶＰＡＣ受容体を活性化し、ＶＰＡＣ受容体若しくはＶＰＡＣ受容体シグナルトランスダクション経路の作動薬誘発活性化を持続若しくは増大させ、ＶＰＡＣ受容体遺伝子の発現を増加させ、またはＶＩＰ若しくはＶＩＰ類縁体遺伝子の発現を増加させる能力に関して、試験化合物をスクリーニングするための方法を提供する。
【００６５】
ヒトにおいて、ＶＰＡＣ１受容体を通じて最終的に骨格筋の量または機能を調節するために使用される化合物をスクリーニングする場合、初期の生体外スクリーニングを、６０％より多くがヒトＶＰＡＣ１受容体（受入番号Ｌ１３２８８（配列ＩＤ番号：１））の配列と同一のアミノ酸配列を有するＶＰＡＣ１受容体を用いて実施することが好ましい。より好ましくは、ＶＰＡＣ１受容体の配列が、配列ＩＤ番号：１に７０％より多くが同一であり、より好ましくは、配列ＩＤ番号：１に８０％より多くが同一であり、より好ましくは、配列ＩＤ番号：１に９０％より多くが同一である。試験化合物を、ヒトＶＰＡＣ１受容体に対してスクリーニングすることが最も好ましい。非ヒト種において、ＶＰＡＣ１を通じて最終的に骨格筋の量または機能を調節するために使用される化合物をスクリーニングする場合、処置が企図される種由来のＶＰＡＣ１受容体を使用することが好ましい。
【００６６】
ヒトにおいて、ＶＰＡＣ２受容体を通じて最終的に骨格筋の量または機能を調節するために使用される化合物をスクリーニングする場合、初期の生体外スクリーニングを、６０％より多くがヒトＶＰＡＣ２受容体（受入番号Ｘ９５０９７（配列ＩＤ番号：１０））の配列と同一のアミノ酸配列を有するＶＰＡＣ２受容体を用いて実施することが好ましい。より好ましくは、ＶＰＡＣ２受容体の配列が、配列ＩＤ番号：１０に７０％より多くが同一であり、より好ましくは、配列ＩＤ番号：１０に８０％より多くが同一であり、より好ましくは、配列ＩＤ番号：１０に９０％より多くが同一である。試験化合物を、ヒトＶＰＡＣ２受容体に対してスクリーニングすることが最も好ましい。非ヒト種において、ＶＰＡＣ２受容体を通じて最終的に骨格筋の量または機能を調節するために使用される化合物をスクリーニングする場合、処置が企図される種由来のＶＰＡＣ２受容体を使用することが好ましい。
【００６７】
本発明の方法は、大量処理用途を実施するが、この方法でわずか１つの試験化合物を使用することは、スクリーニングという用語に包含される。ＶＰＡＣ受容体を活性化し、ＶＰＡＣ受容体若しくはＶＰＡＣ受容体シグナルトランスダクション経路の作動薬誘発活性化を持続若しくは増大させ、ＶＰＡＣ受容体遺伝子の発現を増加させ、またはＶＩＰ若しくはＶＩＰ類縁体遺伝子の発現を増加させる試験化合物を、本発明の方法によって決定されるように、本明細書では「候補化合物」と呼ぶ。このような候補化合物を使用して、骨格筋の量または機能を調節することができる。ただし、より典型的には、生体外スクリーニングのこの第１レベルは、追加的なレベルのスクリーニングでさらに調査するに値する化合物、すなわち候補化合物を、より狭い範囲で選択するための手段を提供するものである。本発明の使用が、１つまたはそれ以上の試験化合物の群から、さらなる調査に値する化合物の部分集合を同定するためのものであることが、当事者には認識されよう。また、本発明のアッセイが、他の候補化合物に対して相対的に、特定の候補化合物の予想される有用性をランク付けするのに有用であることも、当技術の習熟者には認識されよう。例えば、１０ｎＭでＶＰＡＣを活性化する候補化合物は、１０００ｎＭでＶＰＡＣを活性化する（しかし１０ｎＭでは活性化しない）ものより関心が高い。このような情報を用いて、当技術の習熟者は、さらなる調査に関してスクリーニングの第１レベルで同定された候補化合物の部分集合を選択することができる。ほんの一例であるが、２００ｎＭ未満の濃度でＶＰＡＣを活性化する化合物には骨格筋萎縮の動物モデルでさらに試験を実施し、閾値より高いものにはそれ以上の試験を実施しない。また、試験化合物群の選択方法、および陽性のものの選択方法に応じて、試験化合物のある割合だけが候補化合物として同定され、この割合が非常に小さいものであることも、当事者には認識されよう。
【００６８】
以下で説明するアッセイシステムは、ＶＰＡＣ受容体、またはＶＰＡＣ受容体を発現する細胞を含むキットに形成してもよく、それは様々な容器、例えばバイアル瓶、チューブ、マイクロタイターウェルプレート、ボトルなどに詰めることができる。その他の試薬は、別個の容器に入れて、キット、例えば陽性対照試料、陰性対照試料、緩衝液、および細胞培養媒質と合わせて提供することができる。
【００６９】
一実施形態では、本発明は、ＶＰＡＣ受容体に結合する候補化合物を同定するために、１つまたはそれ以上の試験化合物をスクリーニングする方法を提供する。化合物の受容体への結合を決定する方法は、当該技術分野では周知である。通常、このアッセイには、試験化合物を含むまたは含まない環境で受容体に結合することがわかっている標識化合物と共に、ＶＰＡＣ受容体源をインキュベートする工程と、結合した標識化合物の量を決定する工程とを含む。本明細書に記載されるように、ＶＰＡＣ受容体源は、ＶＰＡＣ受容体を発現する細胞、またはある形態の単離ＶＰＡＣ受容体であることができる。標識化合物は、好ましくは定量的に測定できるように、ＶＩＰまたはいかなるＶＩＰ類縁体標識（例えば、１２５Ｉ標識、ユーロピウム標識、フルオレセイン標識、ＧＦＰ標識、３５Ｓ−メチオニン標識）でもあることができる。このような標識技術は、当該技術分野では周知である。ＶＰＡＣ受容体に結合する試験化合物は、受容体に結合する標識リガンドの量を低減させるので、対照試料（試験化合物を含まない）からのものに比べて信号レベルが低下する。この技術の変形形態が記載されており、これは、Ｇタンパク質非連結剤を含むまたは含まない環境で結合する受容体（例えば、グアニンヌクレオチド類縁体、すなわちＧｐｐｐＮＨｐを含むまたは含まない環境で結合）が、作動薬と拮抗薬を区別できるものである。Ｍ・キーン（Ｋｅｅｎ）の受容体シグナルトランスダクションプロトコルにおける膜調製および完全な状態の細胞のための放射性リガンド結合方法（Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｉｎｔａｃｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、Ｒ．Ａ．Ｊ．チャリス（Ｃｈａｌｌｉｓ）（編集）、ヒュマナプレス社（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．）、ニュージャージー州トトウェイ（１９９７年）を参照されたい。
【００７０】
ＶＰＡＣ１またはＶＰＡＣ２に特異的に結合する（すなわち、１つのタイプの受容体には結合するが他のタイプには結合しない）化合物を区別することが望まれる時には、上述のアッセイは、ＶＰＡＣ受容体の一方だけ発現する細胞若しくは細胞由来の膜を使用して実施、またはアッセイを特定の受容体の組換え源によって実施すべきである。２つ以上の形態のＶＰＡＣを発現する細胞は、対象外のＶＰＡＣ受容体遺伝子を不活性または無効にするために、相同組換えを用いて修飾することができる。あるいは、ＶＰＡＣ源が２つ以上のＶＰＡＣ受容体タイプを含有する場合、アッセイで得られる信号から、対象外の受容体によって産生されたバックグラウンド信号を差し引かなければならない。バックグラウンド反応は、アンチセンス、抗体、または選択的拮抗薬を使用することによって、対象外のＶＰＡＣ受容体からの信号を排除することを含めて、多数の方法によって決定することができる。
【００７１】
その他の実施形態では、本発明は、ＶＰＡＣ受容体を活性化する候補化合物を同定するために、試験化合物をスクリーニングする方法を提供する。通常、このアッセイは、細胞ベースのものであるが、上述のように作動薬と拮抗薬を区別できる細胞不使用アッセイも知られている。細胞ベースのアッセイは、ＶＰＡＣ１またはＶＰＡＣ２受容体を発現する細胞を試験化合物または対照に接触させる工程と、ＶＰＡＣ受容体シグナルトランスダクション経路の化合物の発現または活性を測定することによってＶＰＡＣ受容体の活性化を測定する工程とを含む。
【００７２】
上述の背景の項で述べたように、ＶＰＡＣ受容体は、細胞のタイプに応じて、Ｇαｓ、Ｇαｑ、またはＧαｉを含む、いくつかの異なる経路を通じて連結するように思われる。必要な経路成分が特定の細胞タイプに存在すれば、ＶＰＡＣの作動薬活性化により、受容体がこれらの経路のいずれかを介して信号を発することができると考えられる。従って、ＶＰＡＣ活性化に関してスクリーニングするために、処置に関係のある細胞タイプが生体内で異なる経路を介してＶＰＡＣを骨格筋萎縮に連結させる場合でも、アッセイでは、読出しとして、いずれのシグナルトランスダクション経路も使用することができる。スクリーニングアッセイが、受容体活性化を測定する経路とは関係なく、有用なＶＰＡＣ作動薬を同定するのに有効であることが、当技術の習熟者には認識されよう。これらの信号伝達経路の活性化を測定するためのアッセイは、当該技術分野では公知である。
【００７３】
例えば、試験化合物に接触させた後で、ｃＡＭＰ誘発のために細胞の溶解物を調製し分析することができる。ｃＡＭＰは、Ｇαｓ活性化に応答して誘発される。ＧαｓがＶＰＡＣ以外の受容体によって活性化され、試験化合物がＶＰＡＣ受容体を通してまたは他の機構によってその効果を与えるので、２つの対照比較物は、試験化合物がＶＰＡＣ受容体の活性化によってｃＡＭＰのレベルを増加させるかどうかを決定するのに関係する。一方の対照は、試験化合物に接触させた細胞のｃＡＭＰレベルと、対照化合物（すなわち、試験化合物を溶解させたビヒクル）に接触させた細胞のｃＡＭＰレベルとを比較するものである。試験化合物が対照化合物に対して相対的にｃＡＭＰレベルを増加させる場合、これは、試験化合物がいくつかの機構によってｃＡＭＰを増加させることを示す。もう一方の対照は、ＶＰＡＣを発現する細胞株のｃＡＭＰレベルと、ＶＰＡＣ受容体を発現しないことを除いて本質的に同一の細胞株のｃＡＭＰレベルとを、両方の細胞株を試験化合物で処置して、比較するものである。試験化合物が、ＶＰＡＣ受容体を発現しない細胞株に対して相対的に、ＶＰＡＣ受容体を発現する細胞株におけるｃＡＭＰレベルを高める場合、これは、試験化合物がＶＰＡＣ受容体の活性化によってｃＡＭＰを高めることを示す。
【００７４】
本発明の特定の実施形態では、様々なレポーター遺伝子のいずれかに連結されたｃＡＭＰ応答要素を含有する構成を、ＶＰＡＣ受容体を発現する細胞に導入することができる。このようなレポーター遺伝子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、グルクロニドシンセターゼ、成長ホルモン、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）、またはアルカリ性ホスファターゼが挙げられるが、これに限るものではない。細胞を試験化合物に暴露した後、レポーター遺伝子発現のレベルを計量して、試験化合物がＶＰＡＣ受容体を活性化する能力を決定することができる。
【００７５】
このアッセイで有用な細胞は、上述のＶＰＡＣ受容体結合アッセイに関するものと同一であるが、活性化アッセイで使用される細胞が、好ましくはＶＩＰまたは１つ若しくはそれ以上のＶＩＰ類縁体に統計的に有意に応答する機能的受容体を発現する点で異なる。完全長のＶＰＡＣ受容体を発現する細胞の使用に加えて、レポーター要素に連結された、またはレポーター要素を含むように若しくは信号伝達タンパク質と相互作用するように物理的に修飾された、受容体のリガンド結合領域を含むＶＰＡＣ受容体を発現する細胞は操作されることができる。例えば、野生型ＶＰＡＣまたはＶＰＡＣ断片をＧタンパク質に融合させて、融合タンパク質のＶＰＡＣ部分に結合する作動薬で融合させたＧタンパク質の活性化を引き起こすことができる。Ｒ・シーフェルト（Ｓｉｅｆｅｒｔ）らの薬理科学の風潮（Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．）（１９９９年）、２０：３８３〜３８９。この細胞はまた、例えばＣＲＥレポーター遺伝子の強い誘発を検出するためのＶＩＰまたはＶＩＰ類縁体による誘導応答を最大限にするために、読出しに応じて、好ましくは多数の特徴を有するべきであり、（ａ）低い天然レベルのｃＡＭＰ、（ｂ）ＶＰＡＣ受容体と相互作用できるＧタンパク質、（ｃ）高レベルのアデニリルシクラーゼ、（ｄ）高レベルのタンパク質キナーゼＡ、（ｅ）低レベルのホスホジエステラーゼ、および（ｆ）高レベルのｃＡＭＰ応答要素結合タンパク質が有利である。ＶＩＰまたはＶＩＰ類縁体に対する応答を高めるために、宿主細胞を操作して、望ましい因子の発現量をより多くし、または望ましくない因子の発現量をより少なくすることができる。加えて、ＣＲＥレポーターの誘発のための代替的な経路を排除して、基礎レベルを低下させることができる。
【００７６】
場合によっては、作動薬への長期暴露後に、Ｇタンパク質連結受容体反応が弱まり、または感度が低下する。本発明の他の実施形態は、ＶＰＡＣ受容体作動薬に応答して、ＶＰＡＣ受容体またはＶＰＡＣ受容体シグナルトランスダクション経路の作動薬誘発活性化を持続または増大させる化合物を同定するための方法を提供する。このような化合物は、骨格筋萎縮を処置するために、例えば単独でまたはＶＰＡＣ受容体作動薬と組み合わせて使用することができる。通常、この方法は、（ｉ）機能的ＶＰＡＣ受容体を発現する細胞を、受容体を脱感作するのに十分な作動薬の濃度および作動薬−受容体暴露の期間で、ＶＰＡＣ受容体作動薬によって処置する工程と、（ｉｉ）細胞を試験化合物に接触させる工程と、（ｉｉｉ）ＶＰＡＣ受容体の活性化レベルを決定する工程とを含む、細胞ベースのアッセイを使用する。いくつかの機構は、これに限るものではないが、受容体リン酸化反応、受容体内在化または分解、およびＶＰＡＣ受容体シグナルトランスダクション経路の下方調節を含む、受容体脱感作に寄与することが、当技術の習熟者には認識されよう。当技術の習熟者は、脱感作のどの機構を標的にするかに応じて、細胞を試験化合物に接触させる適切な時間（すなわち、作動薬処置前、処置時、または処置後）を決定することができる。例えば、作動薬処置後に細胞を試験化合物に接触させると、受容体のリン酸化反応の結果として起こる受容体脱感作を阻止する試験化合物を検出することができる。
【００７７】
その他の実施形態では、本発明は、ＶＰＡＣ遺伝子の転写またはＶＰＡＣ受容体発現を調節する候補化合物を同定するために、１つまたはそれ以上の試験化合物をスクリーニングする方法を提供する。ＶＰＡＣ遺伝子の転写活性を調節する候補化合物は、ＶＰＡＣ受容体調節領域（レポーター遺伝子構成）に作用可能に結合するレポーター遺伝子を用いて同定することができる。このような方法は、当該技術分野では公知である。このような方法の１つでは、細胞因子源が存在する環境でレポーター遺伝子構造を試験化合物に接触させ、レポーター遺伝子発現のレベルを決定する。対照試料に比べて発現レベルの増加を引き起こす試験化合物は、ＶＰＡＣ遺伝子の転写を増加させる候補化合物の指標である。生体外または生体内転写に必要な細胞因子を提供するには、通常ＶＰＡＣ受容体を発現する任意の細胞タイプから、適切な細胞または細胞抽出物を調製する。
【００７８】
ＶＰＡＣ受容体発現を調節する候補化合物は、また、細胞を試験化合物に接触させてＶＰＡＣの発現を決定する方法で同定することもできる。試験化合物を含む環境でのＶＰＡＣ受容体の発現レベルを、試験化合物を含まない環境での発現レベルと比較する。ＶＰＡＣの発現を増加させる試験化合物を、筋量または筋機能を増加させる候補化合物として同定する。このような方法は、ＶＰＡＣ受容体の転写若しくは翻訳を増加させ、またはｍＲＮＡ若しくはＶＰＡＣ受容体の安定性を増加させる候補化合物を検出する。
その他の実施形態では、本発明は、ＶＩＰまたはＶＩＰ類縁体の発現を調節する候補化合物を同定するために、１つまたはそれ以上の試験化合物をスクリーニングするための方法を提供する。このようなアッセイは、後の修飾によってＶＰＡＣ受容体の発現を調節する候補化合物を同定するためのアッセイに関して本質的に上述したように実施される。ＶＩＰ遺伝子またはＶＩＰ類縁体遺伝子からの転写を調節する候補化合物を同定するには、レポーター遺伝子は、対象のＶＩＰ遺伝子またはＶＩＰ類縁体遺伝子の調節領域に作用可能に結合し、細胞因子源は、対象の遺伝子を発現する細胞タイプ由来であるべきである。
【００７９】
ＶＩＩ．骨格筋萎縮モデルを用いる候補化合物のスクリーニング
上述のように、生体外アッセイによって、１つまたはそれ以上の試験化合物から選択される候補化合物は、骨格筋萎縮および／または肥大モデル系で骨格筋の量または機能を調節する能力に関してさらに試験を実施することができる。このような骨格筋萎縮または肥大モデルには、骨格筋萎縮の生体外細胞培養モデルと生体内動物モデルの両方が含まれる。このようなスクリーニングの追加的なレベルは、追加的な調査、例えば治験に値する候補化合物の範囲をさらに狭めるのに有用である。
【００８０】
筋肉萎縮の細胞培養モデル
骨格筋萎縮の生体外モデルは、当該技術分野では公知である。このようなモデルについては、例えば、Ｈ・Ｈ・バンデンブルフ（Ｖａｎｄｅｎｂｕｒｇｈ）の生体外（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ）（１９８８年）２４：６０９−６１９、Ｈ・Ｈ・バンデンブルフ（Ｖａｎｄｅｎｂｕｒｇｈ）らの生体力学雑誌（Ｊ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ）（１９９１年）２４Ｓｕｐｐｌ１：９１−９、Ｈ・Ｈ・バンデンブルフ（Ｖａｎｄｅｎｂｕｒｇｈ）らの生体外細胞発生生物学（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．）（１９８８年）２４（３）：１６６−７４、Ｊ・Ａ・クロミアック（Ｃｈｒｏｍｉａｋ）らの生体外細胞発生生物学・動物学（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ａｎｉｍ．）（１９９８年）３４（９）：６９４−７０３、Ｊ・シャンスキー（Ｓｈａｎｓｋｙ）らの生体外細胞発生生物学・動物学（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ａｎｉｍ．）（１９９７年）３３（９）：６５９−６１、Ｃ・Ｅ・ペロン（Ｐｅｒｒｏｎｅ）らの生化学雑誌（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）（１９９５年）２７０（５）：２０９９−１０６、Ｊ・Ａ・クロミアック（Ｃｈｒｏｍｉａｃ）およびＨ・Ｈ・バンデンブルフ（Ｖａｎｄｅｎｂｕｒｇｈ）の細胞生理学雑誌（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．）（１９９４年）１５９（３）：４０７−１４、およびＨ・Ｈ・バンデンブルフ（Ｖａｎｄｅｎｂｕｒｇｈ）およびＰ・カーリッシュ（Ｋａｒｌｉｓｃｈ）の生体外細胞発生生物学（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．）（１９８９年）２５（７）：６０７−１６に記載されている。このようなモデルは、前述の生体外スクリーニングに従って動物モデルでの試験に値する候補化合物の範囲をさらに狭めるのに有用であるが、必要ではない。細胞培養モデルを候補化合物によって処置し、処置に対するモデルの応答を、筋肉タンパク質合成または分解、骨格筋量または収縮機能における変化など、筋肉マーカの変化を評価することによって測定する。筋肉マーカで有意な変化を誘発する化合物には、通常、骨格筋萎縮の動物モデルでさらにスクリーニングを実施する。
【００８１】
骨格筋萎縮の動物モデル
候補化合物を非ヒト動物に投与し、例えば、骨格筋量、骨格筋機能、筋肉または筋線維断面積、収縮タンパク質含量、非収縮タンパク質含量、または骨格筋の量若しくは機能変化と相関のある生化学または遺伝子マーカなど、萎縮または肥大のマーカの変化を評価することによって、動物の応答を監視する。骨格筋肥大を誘発し、または骨格筋萎縮のいかなる側面も防止する候補化合物は、ヒトの骨格筋萎縮を処置するための見込みの治療用候補と考えるべきであり、本明細書では治療用候補化合物と呼ぶ。候補化合物が骨格筋萎縮を調節する能力の評価に加えて、毒性などの望ましくない副作用も、このようなスクリーニングで検出することができる。許容不可能な高レベルの副作用がないことを、治療用候補化合物の選択のためのさらなる基準として使用することができる。
【００８２】
骨格筋萎縮に関する様々な動物モデルが当該技術分野で知られており、Ｇ・Ｊ・ハービソン（Ｈｅｒｂｉｓｏｎ）ら（１９７９年）の物理療法医学リハビリ文書（Ａｒｃｈ．Ｐｈｙｓ．Ｍｅｄ．Ｒｅｈａｂｉｌ．）６０：４０１〜４０４、Ｈ−Ｊ・アッペル（Ａｐｐｅｌｌ）（１９９０年）のスポーツ医学（Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）１０：４２〜５８、Ｐ−Ｏ・ハッセルグレン（Ｈａｓｓｅｌｇｒｅｎ）およびＪ・Ｅ・フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）（１９９８年）の世界外科雑誌（Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｓｕｒｇ．）２２：２０３〜２０８、Ｅ・Ｔ・アグベニーガ（Ａｇｂｅｎｙｅｇａ）およびＡ・Ｃ・ウェアハム（Ｗａｒｅｈａｍ）（１９９２年）の計算生化学・生理学（Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．）１０２Ａ：１４１〜１４５、Ｄ・Ｂ・トマソン（Ｔｈｏｍａｓｏｎ）およびＦ・Ｗ・ブース（Ｂｏｏｔｈ）（１９９０年）の応用生理学雑誌（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．）６８：１〜１２、Ｒ・Ｈ・フィッツ（Ｆｉｔｔｓ）ら（１９８６年）の応用生理学雑誌（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．）６０：１９４６−１９５３、Ｐ・ブラマンティ（Ｂｒａｍａｎｔｉ）ら（１９９８年）の国際解剖発生学雑誌（Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｎａｔ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．）１０３：４５〜６４、Ｇ・Ｄ・カーティー（Ｃａｒｔｅｅ）（１９９５年）のアメリカ老年学会生物科学医用科学雑誌（Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．Ａ Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．）５０：１３７〜１４１、Ｌ・Ｃ・コーク（Ｃｏｒｋ）ら（１９８７年）の発展臨床生物学研究（Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．）２２９：２４１〜２６９、Ｆ・Ｗ・ブース（Ｂｏｏｔｈ）およびＰ・Ｄ・ゴールニック（Ｇｏｌｌｎｉｃｋ）（１９８３年）の医用科学スポーツ運動学（Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｓｐｏｒｔｓ Ｅｘｅｒｃ．）１５：４１５〜４２０、Ｓ・Ａ・ブルームフィールド（Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ）（１９９７年）の医用科学スポーツ運動学（Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｓｐｏｒｔｓ Ｅｘｅｒｃ．）２９：１９７〜２０６などに記載されている。これらのモデルに好ましい動物は、マウスおよびラットである。これらのモデルには、例えば、肢のキャスト固定または不動化、後肢懸架、動物の完全不動化、および低重力状況などの不使用誘発萎縮モデルが含まれる。神経損傷誘発萎縮モデルには、例えば、神経圧挫、特定の筋肉を刺激する神経部分の除去、神経への毒素適用、およびウイルス性、細菌性、または真核生物感染性剤による神経感染が含まれる。糖質コルチコイド誘発萎縮モデルには、動物への外因性糖質コルチコイドの萎縮誘発用量の適用、および、例えば、視床下−下垂体−副腎（ＨＰＡ）軸を活性化するホルモンの適用による外因性副腎皮質ホルモン産生の刺激が含まれる。敗血症誘発萎縮モデルには、例えば、細菌などの敗血症誘発有機体の接種、細菌細胞壁抽出物または内毒素などの免疫活性化化合物による動物の処置、および腸壁の穿刺が含まれる。悪液質誘発萎縮モデルには、例えば、悪液質形成の可能性を有する腫瘍形成細胞による動物の接種、悪液質をまねく感染性剤（ＡＩＤＳを引き起こすウイルスなど）による動物の感染、悪液質を誘発するホルモンまたはＣＮＴＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１などのサ���トカインによる動物の処置が含まれる。心機能不全誘発萎縮モデルには、心機能不全が骨格筋萎縮を付随して発生するような動物の操作が含まれる。神経変性病誘発萎縮モデルには、ニューロンの構成要素による動物の免疫化で得られるものなど、自己免疫動物モデルが含まれる。筋ジストロフィー誘発萎縮モデルには、自然または人工の遺伝的誘発筋ジストロフィーモデル、例えばＭｄｘマウスで発生するジストロフィン遺伝子の変異などが含まれる。
【００８３】
骨格筋肥大の動物モデルには、例えば、対向肢の不活性化による肢筋肉高使用モデル、不使用萎縮誘発事象後の再測定モデル、一時的神経損傷のために萎縮した筋肉の再使用モデル、協力筋の不活性化による選択的な筋肉高使用（例えば相補的肥大）モデル、筋肉に置かれた高荷重による筋肉高使用モデル、および糖質コルチコイド誘発萎縮後の糖質コルチコイド除去によって誘発される肥大モデルが含まれる。好ましい動物萎縮モデルには、坐骨神経除去萎縮モデル、糖質コルチコイド誘発萎縮モデル、および足キャスト固定不使用萎縮モデルが含まれ、これらは以下で詳細に説明する。
【００８４】
坐骨神経除去萎縮モデルは、動物への麻酔、およびその後の右または左坐骨神経の小断片の外科的除去を伴うものであり、例えばマウスにおける坐骨神経は、大腿に沿ったほぼ中間点で単離し、３〜５ｍｍの断片を摘出する。これにより、下位後肢筋肉組織の神経が除去され、これらの筋肉の萎縮を生じさせる。通常、実質的に正常歩行のために膝の満足な動きを提供するように、大腿二頭筋に対する神経支配は完全な状態で残される。通常、未処置動物では、神経除去１０日後に、神経除去した筋肉の筋量が３０〜５０％減少する。神経除去後、神経除去誘発骨格筋萎縮に対する効果を決定するために、試験化合物を、例えば注射によって、または例えば浸透性ミニポンプ（例えば、カリフォルニア州パロアルトのアルザ（Ａｌｚａ））の埋め込みを介した連続注入によって投与する。神経除去後の様々な時点で、動物を安楽死させ、神経除去した足と神経除去していない足の両方から下肢筋肉を迅速に解剖して、腱と結合組織を取り除いた筋肉の重量を測定する。例えば、筋量、筋肉断面積、筋線維断面積、または収縮タンパク質含量を測定することによって、患部筋肉における萎縮の程度を分析する。
【００８５】
糖質コルチコイド誘発萎縮モデルは、試験動物への糖質コルチコイド（例えば飲用水中でデキサメタゾン１．２ｍｇ／ｋｇ／日）の投与を伴う。通常、未処置動物では、骨格筋量は、１０日間のデキサメタゾン投与後に３０〜５０％減少する。糖質コルチコイド投与に付随して、またはその後に、糖質コルチコイド誘発骨格筋萎縮への影響を決定するために、例えば注射または連続注入によって、試験化合物を投与する。糖質コルチコイド投与後の様々な時点で、神経除去モデルに関して上述したように、患部筋肉における萎縮の程度を分析する。
足キャスト固定不使用萎縮モデルは、動物の一方の後肢の、膝から足の先までのキャスト固定を伴う。通常、１０日間のキャスト固定後に、筋量が２０〜４０％減少する。キャスト固定後、足キャスト固定誘発骨格筋萎縮への効果を決定するために、試験化合物を、例えば注射によって、または例えば浸透性ミニポンプ（例えば、カリフォルニア州パロアルトのアルザ（Ａｌｚａ））の埋め込みを介した連続注入によって投与する。足キャスト固定後の様々な時点で、神経除去モデルに関して上述したように、患部筋肉における萎縮の程度を分析する。
【００８６】
ヒトで使用する化合物のスクリーニングでは、ヒトＶＰＡＣ受容体と他の動物種由来のＶＰＡＣ受容体との間に相違があるので、非ヒトＶＰＡＣ受容体を用いてスクリーニングを実施した時に、偽陽性または陰性の結果がいくつか現れる可能性があるということが、当技術の習熟者には認識されよう。従って、初期の生体外スクリーニングを、ヒトＶＰＡＣ受容体を用いて実施することが好ましい。ある環境では、同定した候補化合物は、ヒト受容体にだけ活性があって、非ヒト受容体には活性がないことがある。このような環境では、これらの候補化合物がスクリーニングの第２レベルで骨格筋の量または機能を調節できるかどうかを決定することが望ましい場合がある。これらの候補は、非ヒトＶＰＡＣを活性化しないので、非ヒト動物による標準生体内スクリーニングは勧められない。このような環境では、これらの候補に関するスクリーニングの第２レベルは、ヒトＶＰＡＣ受容体を発現するトランスジェニック動物で実施することができる。
【００８７】
これに限るものではないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ヤギ、イヌ、およびヒト以外の霊長類を含めた任意の種の動物を使用して、ＶＰＡＣ受容体トランスジェニック動物を生成することができる。マウスおよびラットが好ましく、マウスが最も好ましい。当該技術分野では様々な技術が知られており、それを使用して、トランスジェニック動物の創始株を産生するために、動物にヒトＶＰＡＣ導入遺伝子を導入することができる。このような技術としては、前核マイクロインジェクション、レトロウイルス媒介遺伝子の生殖細胞系への転移、胚幹細胞での遺伝子標的化、胚の電気穿孔法、および精子媒介遺伝子転移が挙げられるが、これに限るものではない。
【００８８】
ＶＩＩＩ．骨格筋萎縮の処置のための遺伝子治療方法
ＶＰＡＣ、ＶＩＰ、およびＶＩＰ類縁体の発現は、遺伝子治療手法を用いて生体内で制御することができる。ＶＰＡＣ、ＶＩＰ、およびＶＩＰ類縁体遺伝子の発現および／または活性は、ＶＰＡＣ受容体、構造的活性型ＶＰＡＣ、ＶＩＰ、またはＶＩＰ類縁体遺伝子を適切な組織内に導入することによって増加させることができる。これらの遺伝子の過剰発現は、総細胞ＶＰＡＣ活性を高め、従って骨格筋萎縮を調節する。遺伝子又は対象の遺伝子を、被験体での発現に適切なベクターに挿入する。これらのベクターには、ＤＮＡを細胞内に導入する他の粒子（例えば、リポソーム、金粒子など）、または対象の遺伝子を含有するＤＮＡ発現ベクターのヒト組織（例えば筋肉）への直接注射に加えて、アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス、レトロウイルスおよびヘルペスウイルスベクターが含まれるが、これに限るものではない。
【００８９】
全体的なＶＩＰまたはＶＩＰ類縁体遺伝子発現レベルを増加させるために使用できる他の方法には、患者へのＶＩＰまたはＶＩＰ類縁体発現細胞、好ましくは自家細胞の導入が含まれる。これらの細胞は、組換え型（例えば、ＶＩＰまたはＶＩＰ類縁体を発現するように操作したもの）または非組換え型（例えば、内生的にＶＩＰまたはＶＩＰ類縁体を発現する細胞）であることができる。細胞は、骨格筋萎縮の処置のため、体内の多数の部位（例えば筋肉）に送られることができる。細胞ベースの遺伝子治療技術は、当該技術の習熟者には公知である。
【００９０】
ＩＸ．医薬品の配合および使用方法
スクリーニング方法によって同定される候補化合物または治療用候補化合物は、骨格筋萎縮を処置するために個人に投与することができる。このために、本発明は、これに限るものではないが、手術、ベッド休養、骨折による不使用；脊髄損傷による神経除去／神経損傷；自己免疫疾患；感染病；無関係状況での糖質コルチコイド使用；感染症または他の原因による敗血症；病気または飢餓による栄養制限；癌性悪液質；慢性炎症；ＡＩＤＳ性悪液質；ＣＯＰＤ；うっ血性心不全；例えば、筋ジストロフィー、神経変性病などのサルコペニアおよび遺伝病によって誘発される骨格筋萎縮を含む、骨格筋萎縮を変調させるための方法および組成物を包含する。ＶＰＡＣの作動薬を用いて、骨格筋萎縮を阻害することができる。必ずしも、有効な化合物が、対象のＶＰＡＣまたはＶＰＡＣ受容体サブタイプに完全な特異性を示す必要はない。他の病変受容体の特異的拮抗薬を、有効であるが特異性のない作動薬と合わせて共投与できることが企図されている。あるいは、投薬量のみ、または投薬計画の調節によって、この特異性の欠如に対処してもよい。
【００９１】
本発明のスクリーニング方法によって同定される候補化合物または治療用候補化合物は、ＶＰＡＣ受容体またはＶＰＡＣ受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる化合物と組み合せて投与してもよい。これらは、公知の化合物、例えばテオフィリンであってもよく、または本発明のスクリーニング方法によって、これらの化合物がＶＰＡＣ受容体またはＶＰＡＣ受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させることを同定してもよい。
【００９２】
用量の決定
ＶＰＡＣに害を与える化合物の安全性および治療的有効性は、生体外または生体内技術を用いる標準的な手順によって決定することができる。大きい治療指数を示す化合物が好ましいが、副作用のレベルが許容可能であれば、治療指数の低い化合物も有用である。生体外および生体内の毒性学的および薬理学的技術から得られるデータを使用して、有用な可能性のあるヒトの用量範囲を配合することができる。好ましい用量は、化合物の循環濃度が、許容可能な安全性を備えて、治療的に最大限になる範囲内にある。化合物の循環濃度は、投薬形態、投薬後の時間、投与経路などに応じて変更することができる。副作用が許容可能であれば、この範囲から外れる用量も有用である。患者の年齢や体重などの事項を用いて、従来の様式でこのような事項を決定することができる。薬理遺伝学的手法が、臨床群における化合物の選択、用量、および投薬計画の最適化に有用な可能性がある。
【００９３】
配合および使用
本発明による骨格筋萎縮の調節で使用するための医薬組成物は、製薬上許容可能な担体および賦形剤を使用し、従来の方法を用いて配合することができる。本発明の組成物は、単位剤形で提供することが好ましい。本明細書で使用する時、「単位剤形」とは、動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒト被験者への投与に適切な、優れた医療慣習に基づく１回用量のＶＰＡＣ受容体作動薬を含有する本発明の組成物である。医薬組成物は、例えば、経鼻投与、経皮投与、吸入投与、非経口投与、皮膚投与、経口投与、または直腸投与による供給のために配合することができる。経口投与の場合、医薬組成物は、薬理学的に活性な化合物、およびこれに限定されないが、結合剤、充填剤、潤沢剤、崩壊剤、または湿潤剤を含む添加物を含有する錠剤またはカプセル剤形であることができる。錠剤は、コーティングすることができる。経口投与のための液体製剤には、薬理学的に活性な化合物、およびこれに限定されないが、懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクル、防腐剤、緩衝塩、香料、着色剤、甘味剤などを含む添加物を含有する、シロップ、懸濁液、または使用前に液体で再構成される乾燥製品が含まれるが、これに限るものではない。経口投与用の医薬組成物は、口、胃、または腸管における薬理学的活性化合物の放出を制御するように配合することができる。
【００９４】
吸入投与の場合、本発明に従って使用するための化合物は、液体、粉末、ゲル、または、事前測定または非事前測定用量の加圧または非加圧噴射剤を利用するエアロゾル噴霧の形態によって供給することができるが、これに限るものではない。薬理学的に活性な化合物は、適切な充填剤、ビヒクル、防腐剤、緩衝剤などと併せて配合することができる。非経口投与の場合、薬理学的に活性な化合物は、許容可能な生理学的担体、防腐剤などと合わせて配合でき、ボーラス注射または注入のための懸濁液、溶液、エマルション、すぐに構成可能な粉末などとして調製することができる。これらの化合物の投薬は、皮下注射針、高圧装置などを含め、様々な技術によって投与することができる。直腸投与の場合、薬理学的に活性な化合物は、座薬、浣腸などとして供給するために、許容可能な生理学的担体、防腐剤などと併せて配合することができる。皮膚投与の場合、薬理学的に活性な化合物は、ローション、皮膚軟化剤などを含む許容可能な生理学的担体と併せて配合することができ、またはパッチタイプの手段に組み込むことができる。長期的な投与の場合、薬理学的に活性な化合物、およびこれに限定されないが、ポリマー、疎水性材料、樹脂などの適切な添加物は、これに限定されないが、筋肉内または皮下の位置を含む多数の部位に注射または埋め込むための持続性製剤として配合することができる。加えて、薬理学的に活性な化合物は、分配装置によって投与することができる。
【００９５】
治験時の効果の監視
ＶＰＡＣの発現または活性に対する化合物（例えば薬物）の影響の監視は、基本的な薬物スクリーニングだけでなく、治験においても実施することができる。例えば、スクリーニングアッセイによってＶＰＡＣ受容体活性またはＶＰＡＣ受容体発現を増加させると決定した化合物の効果は、骨格筋萎縮の患者または骨格筋萎縮の危険性のある患者の治験において評価することができる。試験化合物または擬薬投与後の様々な時点で、例えば、骨格筋量、骨格筋機能、筋肉破壊の生化学的マーカ、または生活水準指標の変化を観察することによって、患者に対する化合物の効果を決定することができる。ヒト被験体で骨格筋量を測定する方法は、当該技術分野では公知であり、例えば、肢の周囲の測定、例えばコンピュータ断層撮影法、ＭＲＩ、若しくは超音波による筋肉の厚さの測定、または、形態学的および生化学的パラメータ（例えば、断面線維面積、線維直径、または酵素活性）を検査するための筋肉生検が挙げられる。さらに、骨格筋量は骨格筋機能と相関があるので、筋機能は、筋量の代用マーカとして使用でき、筋量の変化は、機能的測定、例えば、強度、協力筋群の力、または筋電図記録で見られる収縮特徴を用いて評価することができる。加えて、筋萎縮の結果生じる筋肉タンパク質喪失は、被験体の尿または血液中のアミノ酸またはアミノ酸誘導体、すなわち３−メチルヒスチジンのレベルの定量化によって測定することができる。このような方法の概観については、アッペル（Ａｐｐｅｌｌ）のスポーツ医学（Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ．）１０：４２〜５８（１９９０年）を参照されたい。生活水準指標としては、椅子からの立ち上がりの容易さ、疲労前の歩数、または階段昇降能力が挙げられるが、これに限るものではない。
【００９６】
（実施例）
実施例１　ヒトＶＰＡＣ２受容体発現に関するベクターの構成
ヒトＶＰＡＣ２受容体（ｈＶＰＡＣ２Ｒ）ＤＮＡ配列（受入番号Ｘ９５０９７）を取り出し、１つが開始コドンで開始する遺伝子の５’末端（５’オリゴヌクレオチド）で、１つが停止コドンを含有する遺伝子の３’末端（３’オリゴヌクレオチド）の、２つのオリゴヌクレオチドを合成する。これらのオリゴヌクレオチドは、５’オリゴヌクレオチド内に１つの固有部位を有し、３’オリゴヌクレオチド内に異なる固有の制限エンドヌクレアーゼ部位を有する、ｈＶＰＡＣ２遺伝子には存在しない制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するように設計される。加えて、３’オリゴヌクレオチドは、ポリアデニル化添加信号配列を含有する。ヒト骨格筋由来の二重鎖ｃＤＮＡは、ユニバーサルクイッククローンｃＤＮＡコレクション（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）から購入される。上述の５’および３’オリゴヌクレオチドを用いて、ｈＶＰＡＣ２Ｒ　ｃＤＮＡは、アドバンタックＰＣＲキット（ＡｄｖａｎＴａｑ ＰＣＲ ｋｉｔ）（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）を用いたヒト骨格筋ｃＤＮＡのＰＣＲによって増幅される。ｈＶＰＡＣ２遺伝子ＰＣＲ生成物は、アガロースゲル電気泳動によってＰＣＲアーチファクトから精製され、ｈＶＰＡＣ２遺伝子ＤＮＡ断片は、ヌクレオトラップ（ＮｕｃｌｅｏＴｒａｐ）（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）などの精製製品を用いてアガロースゲルから精製される。
【００９７】
ｐＩＲＥＳｎｅｏベクター（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）へのｈＶＰＡＣ２Ｒ　ＰＣＲ生成物のクローニングは、５’および３’制限エンドヌクレアーゼ部位がライゲーションの準備を完了するように、初めにｈＶＰＡＣ２Ｒ　ＰＣＲ生成物とｐＩＲＥＳｎｅｏベクターを適切な制限エンドヌクレアーゼで切断することによって達成される。製造業者の推奨に従って、アドバンテージ（ＡｄｖａｎｔＡｇｅ）（商標）ＰＣＲクローニングキット（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）からのＤＮＡリガーゼを用いて、ｐＩＲＥＳｎｅｏベクターＤＮＡをｈＶＰＡＣ２Ｒ　ＰＣＲ生成物ＤＮＡにライゲーションする。次いで、ライゲーションしたベクターおよび挿入構成（ｐＩＲＥＳｎｅｏ／ｈＶＰＡＣ２Ｒ）を用いて、ＴＯＰ１０Ｆ’コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）を形質転換させる。形質転換させた細胞を、寒天を含むＬＢ／Ｘ−ｇａｌ／ＩＰＴＧおよびアンピシリン上に塗布する。白色コロニー（陽性クローン）を選択し、ＬＢ培地で個々に培養する。ヌクレオボンドＤＮＡ精製システム（ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）を用いて、プラスミドＤＮＡを単離する。少なくとも１つのクローンからの挿入を配列させて、確実にｈＶＰＡＣ２Ｒ配列が正しくなるようにする。安定統合型マーキュリーＣＲＥ−ＬＵＣプラスミド（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）を含有するＨＥＫ２９３細胞を、カルフォス（ＣａｌＰｈｏｓ）（商標）哺乳類トランスフェクションキット（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）を用いて、正しい配列挿入を有する精製ｐＩＲＥＳｎｅｏ／ｈＶＰＡＣ２Ｒ　ＤＮＡによってトランスフェクションする。ｐＩＲＥＳｎｅｏ／ｈＶＰＡＣ２Ｒ
【００９８】
ＤＮＡによって安定にトランスフェクションした細胞を、Ｇ４１８中で細胞を培養することによって選択する。安定にトランスフェクションした細胞（ＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ＬＵＣ／ｐＩＲＥＳｎｅｏ／ｈＶＰＡＣ２Ｒ細胞）を、３７℃の５％二酸化炭素／９５％空気環境で、１０％ウシ胎児血清（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）、ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ロックビル）、Ｌ−グルタミン（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ロックビル）、および非必須アミノ酸（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ロックビル）を含有するＤＭＥＭ（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ロックビル）中で増殖させる。クローンは、実施例２および実施例３で説明するように、ＶＩＰへの暴露後に、ＶＩＰ結合およびＣＲＥ−ＬＵＣ活性化に関して特徴付ける。次いで、適切なレベルでｈＶＰＡＣ２受容体を発現し、ＣＲＥ−ＬＵＣレポーター系に適切に連結される細胞を、さらなる分析で使用する。
【００９９】
実施例２　受容体結合アッセイ
化合物の受容体結合分析は、実施例１のＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ＬＵＣ／ｐＩＲＥＳｎｅｏ／ｈＶＰＡＣ２Ｒ細胞を９６ウェルポリリシンコーティングプレートで平板培養することによって細胞全体に実施する。細胞を、３７℃の５％二酸化炭素／９５％空気環境で、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン溶液、Ｌ−グルタミン、および非必須アミノ酸を含有するＤＭＥＭ培地に播種し、一晩インキュベートする。培養培地を取り除き、ＭＥＭ（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ロックビル）中のユーロピウム（Ｅｕ−ＶＩＰ）＋１０％シーブロック（Ｓｅａｂｌｏｃｋ）（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）で共有標識した適切な量のＶＩＰを添加する。細胞をＥｕ−ＶＩＰと共に室温で９０分インキュベートし、次いでマグネシウムとカルシウムを含まないリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ロックビル）で４回洗浄する。最後の洗浄の後、強化溶液（ワラック社（Ｗａｌｌａｃ Ｉｎｃ．）、メリーランド州ゲイサーズバーグ）を添加し、バイオワークスユーロピウムプログラム（ＢｉｏＷｏｒｋｓ Ｅｕｒｏｐｉｕｍ ｐｒｏｇｒａｍ）を用いてワラックプレートリーダ（Ｗａｌｌａｃ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）（ワラック社（Ｗａｌｌａｃ Ｉｎｃ．）、メリーランド州ゲイサーズバーグ）でプレートを読み取る。飽和結合分析の場合、１０（−１２）〜１０（−３）Ｍの範囲のＥｕ−ＶＩＰの記録用量（ｌｏｇ ｄｏｓｅｓ）を細胞に添加し、非特異的結合の評価のために、非標識ＶＩＰの飽和濃度を含まない環境と含む環境の両方で結合を分析する。競合的結合の場合、対象の化合物の濃度の変更に加えて、結合に対する最大値の半分であるＥｕ−ＶＩＰ濃度を添加する。
【０１００】
実施例３　受容体活性化アッセイ
受容体活性化分析は、実施例１のＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ＬＵＣ／ｐＩＲＥＳｎｅｏ／ｈＶＰＡＣ２Ｒ細胞をパッカードビュープレート（Ｐａｃｋａｒｄ Ｖｉｅｗ Ｐｌａｔｅ）−９６（パッカード社（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州）に播種して実施する。細胞を、３７℃の５％二酸化炭素／９５％空気環境で、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン溶液、Ｌ−グルタミン、および非必須アミノ酸を含有するＤＭＥＭ培地に播種し、一晩インキュベートする。次いで、培地を取り除き、対象の化合物を含有する、０．０１％ウシアルブミン断片Ｖ（シグマ（ＳＩＧＭＡ）、ミズーリ州セントルイス）を含有するＤＭＥＭ（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ロックビル）で置き換える。次いで、細胞を３７℃の５％二酸化炭素／９５％空気環境で４時間インキュベートし、その後培地を取り除いて、ハンクス平衡食塩溶液（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ロックビル）で細胞を２回洗浄する。次いで、洗浄した細胞に溶解試薬（Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ）（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ．）、ウィスコンシン州マジソン）を加え、細胞を３７℃の５％二酸化炭素／９５％空気環境で２０分間インキュベートする。次いで、細胞を−８０℃に２０分間置き、その後３７℃の５％二酸化炭素／９５％空気環境で２０分間インキュベートする。このインキュベーション後、ルシフェラーゼ分析緩衝液およびルシフェラーゼ分析基質（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ．）、ウィスコンシン州マジソン）を細胞溶解物に加え、照度計を用いてルシフェラーゼ活性を定量化する。化合物暴露後の増加を、化合物暴露後の、ｈＶＰＡＣ２受容体なしでＣＲＥ−ＬＵＣ構成を含有するＨＥＫ細胞中のルシフェラーゼのレベルと比較することによって、化合物の相対的な活性を評価する。１０倍超過のｈＶＰＡＣ２受容体拮抗薬を含む環境および含まない環境で、ｈＶＰＡＣ２受容体／ＣＲＥ−ＬＵＣ　ＨＥＫ細胞の化合物へのルシフェラーゼ応答を評価することによって、応答の特異性についても確認する。
【０１０１】
実施例４　ｈＶＰＡＣ２受容体またはＶＰＡＣ２受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる候補化合物を同定するためのスクリーニング
ＶＰＡＣ２受容体またはＶＰＡＣ２受容体シグナルトランスダクション経路の作動薬誘発活性化を持続または増大させる化合物の同定は、実施例３で説明した受容体活性化アッセイの変形形態に関与する。具体的には、このアッセイは、ＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ＬＵＣ／ｐＩＲＥＳｎｅｏ／ｈＶＰＡＣ２Ｒ受容体細胞をパッカードビュープレート（Ｐａｃｋａｒｄ Ｖｉｅｗ Ｐｌａｔｅ）−９６（パッカード社（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州）に播種することによって実施する。細胞を、３７℃の５％二酸化炭素／９５％空気環境で、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン溶液、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、およびＶＩＰの飽和量を含むＤＭＥＭ培地に播種し、４８時間インキュベートする。次いで、培地を取り除き、対象の化合物に加えて０．０１％ウシアルブミン断片Ｖ（シグマ（ＳＩＧＭＡ）、ミズーリ州セントルイス）およびＶＩＰを含有するＤＭＥＭ（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ロックビル）で置き換える。次いで、細胞を、３７℃の５％二酸化炭素／９５％空気環境で４時間インキュベートし、その後、培地を取り除いて、ハンクス平衡食塩溶液（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ロックビル）で細胞を２回洗浄する。次いで、洗浄した細胞に溶解試薬（Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ）（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ．）、ウィスコンシン州マジソン）を加え、細胞を３７℃の５％二酸化炭素／９５％空気環境で２０分間インキュベートする。次いで、細胞を−８０℃に２０分間置き、その後３７℃の５％二酸化炭素／９５％空気環境で２０分間インキュベートする。このインキュベーション後、ルシフェラーゼ分析緩衝液およびルシフェラーゼ分析基質（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ．）、ウィスコンシン州マジソン）を細胞溶解物に加え、照度計を用いてルシフェラーゼ活性を定量化する。細胞密度のばらつき補正後、対照の未処置細胞のレベルを有意に超えて蛍光性を刺激する試験化合物を、骨格筋の量または機能を調節する候補化合物とする。最も対象の化合物は、相対的に高レベルの蛍光性を誘発するものである。
【０１０２】
実施例５　ｈＶＰＡＣ２受容体の発現を増加させる候補化合物を同定するためのスクリーニング
適切な組織中のｈＶＰＡＣ２受容体遺伝子の生理的発現に必要なすべての調節要素を含有するように、転写開始部位の十分に上流で開始するｈＶＰＡＣ２受容体遺伝子のプロモーター領域を含有する配列を、ヒトゲノムのデータベースから読み出す。一方がプロモーター領域の５’末端を含有し（５’オリゴヌクレオチド）、他方が転写開始部位を含むプロモーター領域の３’末端を含有する（３’オリゴヌクレオチド）、２つのオリゴヌクレオチドを合成する。これらのオリゴヌクレオチドは、５’オリゴヌクレオチド内に１つの固有部位を有し、３’オリゴヌクレオチド内に異なる固有の制限エンドヌクレアーゼ部位を有する、ｈＶＰＡＣ２遺伝子調節領域には存在しない制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する。５’および３’オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲキットである、アドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）（登録商標）ゲノムＰＣＲキット（Ｇｅｎｏｍｉｃ ＰＣＲ ｋｉｔ）（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）を使って、ヒトＤＮＡ（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）由来のｈＶＰＡＣ２遺伝子調節領域のＰＣＲ増幅のために使用される。ｈＶＰＡＣ２遺伝子調節領域ＰＣＲ生成物は、アガロースゲル電気泳動によってＰＣＲアーチファクトから精製され、ｈＶＰＡＣ２遺伝子調節領域ＤＮＡ断片は、ヌクレオトラップ（ＮｕｃｌｅｏＴｒａｐ）（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）などの精製製品を用いてアガロースゲルから精製される。ｐＥＣＦＰ−１ベクター（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）へのｈＶＰＡＣ２遺伝子調節領域ＰＣＲ生成物のクローニングは、５’および３’制限エンドヌクレアーゼ部位がライゲーションの準備を完了するように、初めにｈＶＰＡＣ２遺伝子調節領域ＰＣＲ生成物とｐＥＣＦＰ−１ベクターを適切な制限エンドヌクレアーゼで切断することによって達成される。ｐＥＣＦＰ−１ベクターＤＮＡのｈＶＰＡＣ２遺伝子調節領域ＰＣＲ生成物ＤＮＡへのライゲーションは、製造業者の推奨に従って、アドバンテージ（ＡｄｖａｎｔＡｇｅ）（商標）ＰＣＲクローニングキット（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）からのＤＮＡリガーゼを用いて達成される。次いで、ライゲーションしたベクターおよび挿入構成を用いて、ＴＯＰ１０Ｆ’コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）に形質転換させる。細胞をＬＢおよびカナマイシン含有寒天上で平板培養し、さらなる分析のために、カナマイシン耐性コロニーを選択する。カナマイシン耐性クローンをカナマイシン含有ＬＢ培地で培養し、ヌクレオボンドＤＮＡ精製システム（ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）を用いてプラスミドＤＮＡを単離し、ｈＶＰＡＣ２遺伝子調節領域を含有する構成をＤＮＡ配列法によって分析して、構成の正確性および一体性を確実にする。次いで、ｈＶＰＡＣ２遺伝子調節領域を含有する、精製した構成プラスミドＤＮＡを、カルフォス（ＣａｌＰｈｏｓ）（商標）哺乳類トランスフェクションキット（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）を使用し、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションを用いて、ＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクションする。トランスフェクションした細胞クローンを、Ｇ４１８を用いて選択し、単離して、３７℃の５％二酸化炭素／９５％空気環境中で、１０％ウシ胎児血清（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）、ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ロックビル）、Ｌ−グルタミン（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ロックビル）、非必須アミノ酸（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ロックビル）、およびＧ４１８（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ロックビル）を含有するＤＭＥＭ（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ロックビル）中で増殖させる。Ｇ４１８耐性クローンは、それがｈＶＰＡＣ２遺伝子プロモーター配列を確実に含有するように、サザンブロット法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）によって特徴化し、さらに、ｈＶＰＡＣ２遺伝子調節領域の活性化を、適切な刺激剤を用いて分析する。次いで、適切なレベルでｈＶＰＡＣ２遺伝子調節領域−ＥＣＦＰを発現する細胞を、以下のように、ｈＶＰＡＣ２遺伝子調節領域の活性を変調させることのできる化合物を評価するように設計されたアッセイで使用する。調節領域活性化分析は、ｈＶＰＡＣ２遺伝子調節領域−ＥＣＦＰ含有ＨＥＫ２９３細胞を、適切な密度で、黒色で透明底の９６ウェルマイクロタイタープレートに播種し、一晩成長させることによって実施する。翌日、培地を取り除き、試験化合物を新たな成長培地に加える。細胞を、３７℃で５％二酸化炭素／９５％空気環境で１６時間インキュベートし、その後蛍光を測定する（蛍光光度計（バイオルミン（ｂｉｏｌｕｍｉｎ）（商標）９６０、モルキュラーダイナミクス／アマーシャムファーマシアバイオテック（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ／Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ニュージャージー州ピスカタウェイ）使用、検出放射４７５（５０１）ｎｍによる励起４３３（４５３）ｎｍ）。細胞密度のばらつき補正後、対照の未処置細胞のレベルを有意に超えて蛍光性を刺激する試験化合物を、骨格筋の量または機能を調節する候補化合物とする。最も対象の化合物は、相対的に高レベルの蛍光性を誘発するものである。
【０１０３】
実施例６　ヒトＶＩＰ発現を増加させる化合物を同定するためのスクリーニング
ヒトＶＩＰ（ｈＶＩＰ）発現を増加させる化合物を同定するための方法は、使用される調節領域がｈＶＩＰ遺伝子のためのものであることを除き、本質的には、ｈＶＰＡＣ２受容体の発現を増加させる化合物を同定するための方法と同一である。適切な組織中のｈＶＩＰ遺伝子の生理学的発現に必要なすべての調節要素を含有するように、転写開始部位の十分に上流で開始するｈＶＩＰ遺伝子の調節領域を含有する配列を、ヒトゲノムのデータベースから読み出す。一方が調節領域の５’末端を含有し（５’オリゴヌクレオチド）、他方が転写開始部位を含む調節領域の３’末端を含有する（３’オリゴヌクレオチド）、２つのオリゴヌクレオチドを合成する。これらのオリゴヌクレオチドはまた、５’オリゴヌクレオチド内に１つの固有部位を有し、３’オリゴヌクレオチド内に異なる固有の制限エンドヌクレアーゼ部位を有する、ｈＶＩＰ遺伝子調節領域には存在しない制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する。５’および３’オリゴヌクレオチドは、アドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）（登録商標）ゲノムＰＣＲキット（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）を使って、ヒトＤＮＡ（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）由来のｈＶＩＰ遺伝子調節領域のＰＣＲ増幅のために使用する。ｈＶＩＰ遺伝子調節領域ＰＣＲ生成物は、アガロースゲル電気泳動によってＰＣＲアーチファクトから精製され、ｈＶＩＰ遺伝子調節領域ＤＮＡ断片は、ヌクレオトラップ（ＮｕｃｌｅｏＴｒａｐ）（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）などの精製製品を用いてアガロースゲルから精製される。ｐＥＣＦＰ−１ベクター（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）へのｈＶＩＰ遺伝子調節領域ＰＣＲ生成物のクローニングは、５’および３’制限エンドヌクレアーゼ部位がライゲーションの準備を完了するように、初めにｈＶＩＰ遺伝子調節領域ＰＣＲ生成物とｐＥＣＦＰ−１ベクターを適切な制限エンドヌクレアーゼで切断することによって達成される。ｐＥＣＦＰ−１ベクターＤＮＡのｈＶＩＰ遺伝子調節領域ＰＣＲ生成物ＤＮＡへのライゲーションは、製造業者の推奨に従って、アドバンテージ（ＡｄｖａｎｔＡｇｅ）（商標）ＰＣＲクローニングキット（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）からのＤＮＡリガーゼを用いて達成される。次いで、ライゲーションしたベクターおよび挿入構成を使用して、ＴＯＰ１０Ｆ’コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）に形質転換させる。細胞をＬＢおよびカナマイシン含有寒天上で平板培養し、さらなる分析のために、カナマイシン耐性コロニーを選択する。カナマイシン耐性クローンをカナマイシン含有ＬＢ培地で培養し、ヌクレオボンドＤＮＡ精製システム（ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）を用い��プラスミドＤＮＡを単離し、ｈＶＩＰ遺伝子調節領域を含有する構成をＤＮＡ配列法によって分析して、構成の正確性および一体性を確実にする。次いで、ｈＶＩＰ遺伝子調節領域を含有する、精製した構成プラスミドＤＮＡを、カルフォス（ＣａｌＰｈｏｓ）（商標）哺乳類トランスフェクションキット（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）を使用し、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションを用いて、ＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクションする。トランスフェクションした細胞クローンを、Ｇ４１８を用いて選択し、単離して、３７℃の５％二酸化炭素／９５％空気環境で、１０％ウシ胎児血清（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）、ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ロックビル）、Ｌ−グルタミン（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ロックビル）、非必須アミノ酸（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ロックビル）、およびＧ４１８（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ロックビル）を含むＤＭＥＭ（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ロックビル）中で増殖させる。Ｇ４１８耐性クローンは、それがｈＶＩＰ遺伝子調節領域配列を確実に含有するように、サザンブロット法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）によって特徴化し、さらに、ｈＶＩＰ遺伝子調節領域の活性化を、適切な刺激剤を用いて分析する。次いで、適切なレベルでｈＶＩＰ遺伝子調節領域−ＥＣＦＰを発現する細胞を、以下のように、ｈＶＩＰ遺伝子調節領域の活性を変調させることのできる化合物を評価するように設計されたアッセイで使用する。調節領域活性化分析は、ｈＶＩＰ遺伝子調節領域構成を含有するクローンを使用することを除いて、実施例５と同様に実施する。
【０１０４】
実施例７　ｈＶＰＡＣ２受容体を活性化するヒト抗体の製造方法
ｈＶＰＡＣ２受容体を活性化する完全なヒトモノクローナル抗体は、以下のように最初に組換えｈＶＰＡＣ２受容体タンパク質を形成することによって産生する。実施例１からの手順に従い、ｈＶＰＡＣ２ＰＣＲ生成物を得る。次いで、このｈＶＰＡＣ２ＰＣＲ生成物を、５’および３’制限エンドヌクレアーゼ部位がライゲーションの準備を完了するように、初めにｈＶＰＡＣ２遺伝子ＰＣＲ生成物とｐＨＡＴ２０ベクター（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）を適切な制限エンドヌクレアーゼで切断することによって、ｐＨＡＴ２０ベクターにクローニングする。ｐＨＡＴ２０ベクターＤＮＡのｈＶＰＡＣ２遺伝子ＰＣＲ生成物ＤＮＡへのライゲーションは、製造業者の推奨に従って、アドバンテージ（ＡｄｖａｎｔＡｇｅ）（商標）ＰＣＲクローニングキット（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）からのＤＮＡリガーゼを用いて達成される。次いで、ライゲーションしたベクター／挿入構成を使用し、ＴＯＰ１０Ｆ’コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）に形質転換させる。形質転換させた細胞をＬＢおよびアンピシリン含有寒天上で平板培養し、さらなる分析のためにアンピシリン耐性コロニーを選択する。陽性のクローンをアンピシリン含有ＬＢ培地で培養し、ヌクレオボンドＤＮＡ精製システム（ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）を用いてプラスミドＤＮＡを単離し、ｈＶＰＡＣ２遺伝子を含有する構成をＤＮＡ配列法によって分析して、構成の正確性および一体性を確実にする。次いで、ｈＶＰＡＣ２−ｐＨＡＴ２０ベクターＤＮＡを、ＨＡＴ配列の開始部とｈＶＰＡＣ２−ｐＨＡＴ２０構成には存在しない固有の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む５’オリゴヌクレオチド、および既に使用した３’ｈＶＰＡＣ２オリゴヌクレオチドを使用することによって、さらなるＰＣＲクローニングに使用する。オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ｈＶＰＡＣ２−ｐＨＡＴ２０構成からのＨＡＴ−ｈＶＰＡＣ２融合遺伝子をＰＣＲ増幅し、上述のようにＰＣＲ生成物を精製する。次いで、ＨＡＴ−ｈＶＰＡＣ２融合遺伝子生成物を、クローンテック製ＢａｃＰＡＫバキュロウイルス発現システム（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）を用いて、ｐＢａｃＰＡＫ８ベクターへのクローニングに使用する。ＨＡＴ−ｈＶＰＡＣ２融合遺伝子のｐＢａｃＰＡＫ８ベクターへのライゲーションは、本質的には上述の通りである。次いで、ｈＶＰＡＣ２／ＨＡＴ−ｐＢａｃＰＡＫ８構成をＴＯＰ１０’Ｆコンピテント大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞にトランスフェクションし、アンピシリン耐性細胞を選択し、プラスミドＤＮＡを単離して上述のように構成の一体性を確認する。次いで、カルフォス（ＣａｌＰｈｏｓ）（商標）哺乳類トランスフェクションキット（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア��パロアルト）を用いて、この構成を線形化ＢａｃＰＡＫ６ＤＮＡと共に、Ｓｆ２１昆虫宿主細胞に共トランスフェクションする。次いで、昆虫細胞を２〜３日インキュベートし、その後、個々の透明なプラークからウイルスを採取する。その後、すべて製造業者（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）の推奨に従って、ＢａｃＰＡＫ昆虫細胞培地を用い、ウイルスをｓｆ２１細胞内で増幅させ、採取したウイルスを力価測定し、力価測定したウイルスをＳｆ２１細胞の大規模感染に使用する。次いで、製造業者が推奨する条件を用いて、ＴＡＬＯＮ（登録商標）クローンテック製セルスルー（ＣｅｌｌＴｈｒｕ）精製キット（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト）を使用して、組換えＨＡＴ−ＶＰＡＣ２融合タンパク質を精製する。簡潔には、感染の４８時間後に、感染させたＳｆ２１細胞を採取し、抽出／ローディング緩衝液内で超音波分解する。次いで、細胞溶解物をＴＡＬＯＮ（登録商標）セルスルー（ＣｅｌｌＴｈｒｕ）カラムの中に通す。カラムを抽出／ローディング緩衝液で２回洗浄し、結合したＨＡＴ−ｈＶＰＡＣ２タンパク質を溶出緩衝液で溶出させる。溶出したタンパク質を、製造業者（Ｂｉｏ−Ｒａｄラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリフォルニア州ハーキュレス）の推奨に従って、Ｂｉｏ−Ｒａｄ　ＳＤＳ−ＰＡＧＥシステムおよびタンパク質定量化システムを用い、一体性に関してＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、タンパク質濃度を定量化する。その後、精製したＨＡＴ−ｈＶＰＡＣ２融合タンパク質を、以下のようにヒトモノクローナル抗体産生のために異種マウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ）動物の免疫化に使用する。１０μｇの精製した組換えＨＡＴ−ｈＶＰＡＣ２融合タンパク質を、２５μｇの補助剤モノホスホリル脂質Ａ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス）と組み合わせて使用して、８週間にわたり、何度も１０匹の異種マウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ）動物に接種する。接種した動物から血清を取得し、ＨＡＴ−ｈＶＰＡＣ２融合タンパク質でポリスチレンＥＬＩＳＡプレート（コーニンググラスワークス（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｇｌａｓｓ Ｗｏｒｋｓ）、ニューヨーク州コーニング）を塗布することによってＨＡＴ−ｈＶＰＡＣ２タンパク質に対する抗体を検出するために、精製したＨＡＴ−ｈＶＰＡＣ２融合タンパク質を用いる抗原回収ＥＬＩＳＡで使用して、ＰＢＳ−１％ＢＳＡでブロッキングし、洗浄して、血清試料の１：５０希釈液と共に３７℃で１時間インキュベートする。ＰＢＳで５回洗浄後、プレートはヒト免疫グロブリンＧに対するアルカリ性ホスファターゼ抱合ヤギ抗体と合わせて、３７℃で１時間インキュベートする。次いで、プレートをＰＢＳで５回洗浄し、緩衝液中のｐ−ニトロフェニルホスフェート基質（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス）によって抗体を検出する。プレートリーダを使用して４０５ｎｍでの光学密度を測定し、信号を定量化した。高い抗体産生が実証されたマウスを、ハイブリドーマ形成のために使用する。ハイブリドーマは、異種マウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ）動物からの脾臓細��と非分泌骨髄腫細胞株ＮＳＡ−ｂｃｌ２を、３０％ポリエチレングリコールＰＥＧ４５０の存在下で、比率４：１の脾臓細胞とＮＳＡ−ｂｃｌ２細胞を用いて融合させることによって生成される。融合細胞を、９６ウェルプレートへの希釈を制限することによりクローニングし、１０％ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、１００ｕ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン、およびヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（すべてライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（メリーランド州ロックビル）から入手）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地内で培養する。ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン選択ハイブリドーマからの上清を、前述のようにＥＬＩＳＡによってヒト抗体産生に関してスクリーニングした。ＨＡＴ−ｈＶＰＡＣ２融合タンパク質に対するヒト抗体を産生するハイブリドーマは、大規模な抗体産生のため選択される。モノクローナル抗体を、タンパク質Ｇ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）クロマトグラフィーによって精製する。簡潔には、培養したハイブリドーマクローンからの上清を、ローディング緩衝液中でタンパク質Ｇ−セファロースカラム（シグマ（ＳＩＧＭＡ）、ミズーリ州セントルイス）上に置き、３回洗浄し、ＩｇＧを溶出緩衝液で溶出させる。次いで、これらの抗体を、ｈＶＰＡＣ２活性化（作動性）潜在性を評価するためのスクリーニングで使用する。これは、実施例３で概略した方法を用いて実施する。ｈＶＰＡＣ２受容体に対する作動薬活性を示すそれらのヒトモノクローナル抗体は、指定の候補化合物である。
【０１０５】
実施例８　ＶＰＡＣ２受容体の作動薬であるヒト抗体を用いた骨格筋萎縮の治療的処置
体重５０ｋｇで、長期のベッド休養による腕および足の重度筋萎縮を患うヒト男性被験者に、骨格筋萎縮を改善させるための処置を行う。３ヶ月間、週に１度、抗ＶＰＡＣ２受容体を含むｐＨ６の水溶液１５ｍｌを、静脈注射を介して被験者に投与する。この溶液は、以下を含む。
【０１０６】
【表２】
2004512530.tif 000003
【０１０７】
処置期間の終わりに、被験者は、腕と足の筋量、強度、および可動性の測定可能な増加を示す。
【０１０８】
実施例９　ＶＰＡＣ２受容体の作動薬であるヒト抗体を用いた骨格筋萎縮の予防的処置
体重５５ｋｇのヒト女性被験者に、１ヶ月以内に臀部関節置換手術を計画する。術後回復時の筋肉不使用による骨格筋萎縮のレベルを最終的に低減させるために、手術の前と後で、被験者に骨格筋量を増加させるための処置をする。具体的には、手術前の１か月間および手術後の２ヶ月間、週に１度、抗ＶＰＡＣ２受容体を含むｐＨ６．０の水溶液１８ｍｌを、静脈注射を介して被験者に投与する。この溶液は、以下を含む。
【０１０９】
【表３】
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【０１１０】
処置期間の終わりに、被験者は、抗体治療を行わない場合の被験者の予想される状態に比べて、腕と足の筋量、強度、可動性の測定可能な維持を示す。
【０１１１】
実施例１０　ＶＰＡＣ１受容体の作動薬であるヒト抗体を用いた骨格筋萎縮の予防的処置
体重４５ｋｇのヒト女性被験者に、落下後の上腕の単純骨折を処置するためにキャスト固定術を実施した。被験者に、骨折治癒時の不使用および制限使用による患部の腕と肩の骨格筋萎縮を防止する処置を実施する。具体的には、キャスト固定の日から開始して、週に１度、抗ＶＰＡＣ１受容体を含むｐＨ６．０を１３ｍｌを、静脈注射を介して被験者に投与する。この溶液は、以下を含む。
【０１１２】
【表４】
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【０１１３】
処置期間の終わりに、被験者は、抗体治療を行わない場合の被験者の予想される状態および追跡治療に比べ、腕と肩の患部の筋量、強度、および可動性の測定可能な維持、ならびに物理治療課程の短縮を示す。
【０１１４】
実施例１１　ＶＰＡＣ２受容体の作動薬である、Ｒｏ２５−１５５３を用いた骨格筋萎縮の予防的処置
昏睡状態の体重５０ｋｇのヒト女性被験者を、病院に収容する。被験者に、昏睡状態の間の不使用による全身の骨格筋萎縮を防止するための処置を実施する。具体的には、昏睡状態の間、月に１度、筋肉注射を介して、以下を含むｐＨ６．０の水溶液３ｍｌを被験者に投与する。
【０１１５】
【表５】
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【０１１６】
処置の結果、被験者は、薬物療法なしの被験者の予想される状態に比べ、昏睡時および意識回復後の、骨格筋量の測定可能な維持、ならびに物理療法の必要性の低下を示す。
本発明は、単に発明の個々の態様を示すことを意図して述べた特定の実施形態の範囲に制限されるものではなく、機能的に等価の方法および成分は、本発明の範囲内にある。これらには、試験動物の種類、ＶＰＡＣ作動薬の性質およびタイプ、動物の性別、萎縮モデル、遺伝的方法を含むＶＰＡＣ活性化方法などが含まれるが、これに限るものではない。本明細書で示し記載するものに加え、上記の説明および添付の図面を読めば、当技術の習熟者には本発明の様々な修正形態が明らかであろう。このような修正形態は、添付の特許請求の範囲内に入るものとする。
本明細書のすべての参照を、参考として本明細書に組み込む。
【図面の簡単な説明】
図１〜５で使用される省略形：
【表６】2004512530.tif 000007
図１Ａおよび１Ｂは、マウス神経除去萎縮モデルにおけるＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２受容体作動薬（１日２回、皮下に投与）の抗萎縮効果を示す。図１Ａは、神経除去した前脛骨筋におけるＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２受容体選択的作動薬の抗萎縮効果を示す。図１Ｂは、神経除去した内側腓腹筋におけるＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２受容体選択的作動薬の抗萎縮効果を示す。Ｘ軸に関する説明：Ａ：食塩水、Ｂ：ＶＰＡＣ１Ｒ作動薬（０．１ｍｇ／ｋｇ）＋Ｔ、Ｃ：ＶＰＡＣ１Ｒ作動薬（０．３ｍｇ／ｋｇ）＋Ｔ、Ｄ：ＶＰＡＣ２Ｒ作動薬（０．１ｍｇ／ｋｇ）＋Ｔ、Ｅ：ＶＰＡＣ２Ｒ作動薬（０．３ｍｇ／ｋｇ）＋Ｔ、Ｆ：ＰＡＣＡＰ−３８（０．１ｍｇ／ｋｇ）＋Ｔ、Ｇ：ＰＡＣＡＰ−３８（０．３ｍｇ／ｋｇ）＋Ｔ。
図２Ａおよび２Ｂは、マウス神経除去萎縮モデルにおけるＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２受容体選択的作動薬（浸透性ミニポンプによって連続的投与）の抗萎縮および肥大誘発効果を示す。図２Ａは、神経除去および正常な前脛骨筋におけるＶＰＡＣ２受容体選択的作動薬の抗萎縮および肥大誘発効果を示す。図２Ｂは、正常な内側腓腹筋におけるＶＰＡＣ２受容体選択的作動薬の肥大誘発効果を示す。Ｘ軸に関する説明：Ａ：注入した水、Ｂ：ＶＰＡＣ１Ｒ作動薬（０．３ｍｇ／ｋｇ）、Ｃ：ＶＰＡＣ１Ｒ作動薬（１ｍｇ／ｋｇ）、Ｄ：ＶＰＡＣ１Ｒ作動薬（３ｍｇ／ｋｇ）、Ｅ：ＶＰＡＣ２Ｒ作動薬（０．３ｍｇ／ｋｇ）、Ｆ：ＶＰＡＣ２Ｒ作動薬（１ｍｇ／ｋｇ）、Ｇ：ＶＰＡＣ２Ｒ作動薬（３ｍｇ／ｋｇ）、Ｈ：ＰＡＣＡＰ−３８（０．３ｍｇ／ｋｇ）、Ｉ：ＰＡＣＡＰ−３８（１ｍｇ／ｋｇ）、ＰＡＣＡＰ−３８（３ｍｇ／ｋｇ）。
図３Ａおよび３Ｂは、マウスの糖質コルチコイド（デキサメタゾン）誘発萎縮モデルにおけるＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２受容体選択的作動薬（１日２回、皮下投与）の抗萎縮効果を示す。図３Ａは、糖質コルチコイド誘発萎縮を起こした前脛骨筋におけるＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２受容体選択的作動薬の抗萎縮効果を示す。図３Ｂは、糖質コルチコイド誘発萎縮を起こした内側腓腹筋におけるＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２受容体選択的作動薬の抗萎縮効果を示す。Ｘ軸に関する説明：Ａ：食塩水＋デキサメタゾン（１．２ｍｇ／ｋｇ／日を飲用水に含める），Ｂ：ＰＡＣＡＰ−３８（０．１ｍｇ／ｋｇ）＋デキサメタゾン＋Ｔ、Ｃ：ＰＡＣＡＰ−３８（０．３ｍｇ／ｋｇ）＋デキサメタゾン＋Ｔ、Ｄ：ＶＰＡＣ１Ｒ作動薬（０．１ｍｇ／ｋｇ）＋デキサメタゾン＋Ｔ、Ｅ：ＶＰＡＣ１Ｒ作動薬（０．３ｍｇ／ｋｇ）＋デキサメタゾン＋Ｔ、Ｆ：ＶＰＡＣ２Ｒ作動薬（０．１ｍｇ／ｋｇ）＋デキサメタゾン＋Ｔ、Ｇ：ＶＰＡＣ２Ｒ作動薬（０．３ｍｇ／ｋｇ）＋デキサメタゾン＋Ｔ。
図４Ａおよび４Ｂは、マウスの不使用（キャスト固定）萎縮モデルにおけるＶＰＡＣ２受容体選択的作動薬（１日２回、皮下投与）の抗萎縮および肥大誘発効果を示す。図４Ａは、キャスト固定誘発萎縮を起こした前脛骨筋における、ＶＰＡＣ２受容体選択的作動薬であるＲｏ２５−１５５３の抗萎縮効果を示す。図４Ｂは、正常な内側腓腹筋における、ＶＰＡＣ２受容体選択的作動薬であるＲｏ２５−１５５３の肥大誘発効果を示す。Ｘ軸に関する説明：Ａ：食塩水、Ｂ：ＶＰＡＣ２Ｒ作動薬（０．０３ｍｇ／ｋｇ）＋Ｔ、Ｃ：ＶＰＡＣ２Ｒ作動薬（０．１ｍｇ／ｋｇ）＋Ｔ、Ｄ：ＶＰＡＣ２Ｒ作動薬（０．３ｍｇ／ｋｇ）＋Ｔ。
図５Ａおよび５Ｂは、ラット神経除去萎縮モデルにおけるＶＰＡＣ２受容体選択的作動薬（１日２回、皮下投与）の抗萎縮効果を示す。図５Ａは、神経除去誘発萎縮を起こした前脛骨筋における、ＶＰＡＣ２受容体選択的作動薬であるＲｏ２５−１５５３の抗萎縮効果を示す。図５Ｂは、神経除去誘発萎縮を起こした足の長指伸筋（ＥＤＬ）における、ＶＰＡＣ２Ｒ作動薬であるＲｏ２５−１５５３の抗萎縮効果を示す。Ｘ軸に関する説明：Ａ：食塩水、Ｂ：ＶＰＡＣ２Ｒ作動薬（０．０３ｍｇ／ｋｇ）＋Ｔ、Ｃ：ＶＰＡＣ２Ｒ作動薬（０．１ｍｇ／ｋｇ）＋Ｔ、Ｄ：ＶＰＡＣ２Ｒ作動薬（０．３ｍｇ／ｋｇ）＋Ｔ。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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