(57)【要約】細胞培養物複製を樹立する高められた効率を有する特異なＨＣＶ ＲＮＡ分子が提供される。新規な適応突然変異が細胞培養物中で永久に複製するＨＣＶ ＲＮＡを樹立する効率を改良するＨＣＶ非構造領域内で同定された。この自己複製ポリヌクレオチド分子は、全ての従来の論文とは逆に、既に開示されたＧの代替としてＡであり得る５’−ＮＴＲを含み、それ故、自己複製ＨＣＶ ＲＮＡ分子を含む既存の系の別型を提供する。Ｇ→Ａ突然変異は、ＨＣＶ非構造領域中の突然変異、例えば、Ｇ（２０４２）Ｃ／Ｒ突然変異と協力して、導入及び／又は複製の一層大きい効率を有するＨＣＶ ＲＮＡ分子を生じる。細胞系中でトランスフェクトされた場合のこれらのＲＮＡ分子はＨＣＶ複製の潜在的なインヒビターを評価するのに有益である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１位にあるグアニンがアデニンに置換されている５’非翻訳領域（ＮＴＲ）を含むことを特徴とするＨＣＶポリヌクレオチド分子。
【請求項２】
−ＡＣＣＡＧＣ（配列番号８）からなる５’−ＮＴＲ、
−ＨＣＶポリタンパク質をコードするＨＣＶポリタンパク質領域、及び
−３’−ＮＴＲ領域
を含むことを特徴とするＨＣＶ自己複製ポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリタンパク質がＲ（１１３５）Ｋ； Ｓ（１１４８）Ｇ； Ｓ（１５６０）Ｇ； Ｋ（１６９１）Ｒ； Ｌ（１７０１）Ｆ； Ｉ（１９８４）Ｖ； Ｔ（１９９３）Ａ； Ｇ（２０４２）Ｃ； Ｇ（２０４２）Ｒ； Ｓ（２４０４）Ｐ； Ｌ（２１５５）Ｐ； Ｐ（２１６６）Ｌ 及び Ｍ（２９９２）Ｔからなる群から選ばれた一つ以上のアミノ酸置換を含む請求項２記載のＨＣＶポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３記載のアミノ酸置換の一つ以上を含み、更にアミノ酸置換Ｅ（１２０２）Ｇを含むことを特徴とするポリタンパク質をコードするＨＣＶポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記置換がＧ２０４２Ｃ又はＧ２０４２Ｒ突然変異である請求項３記載のＨＣＶポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記置換がＫ（１６９１）Ｒ、及びＧ（２０４２）Ｃからなる群から選ばれる請求項３記載のＨＣＶポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記置換がＲ（１１３５）Ｋ； Ｓ（１５６０）Ｇ； Ｋ（１６９１）Ｒ； Ｔ（１９９３）Ａ； Ｇ（２０４２）Ｃ； 及び Ｐ（２１６６）Ｌからなる群から選ばれる請求項３記載のＨＣＶポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記置換がＲ（１１３５）Ｋ； Ｓ（１５６０）Ｇ； Ｋ（１６９１）Ｒ； Ｔ（１９９３）Ａ； Ｇ（２０４２）Ｃ； Ｌ（２１５５）Ｐ； 及び Ｐ（２１６６）Ｌからなる群から選ばれる請求項３記載のＨＣＶポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記置換がＥ（１２０２）Ｇ； Ｉ（１９８４）Ｖ； Ｇ（２０４２）Ｃ； 及び Ｍ（２９９２）Ｔからなる群から選ばれる請求項３記載のＨＣＶポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記置換がＳ（１１４８）Ｇ； Ｅ（１２０２）Ｇ； Ｌ（１７０１）Ｆ； Ｇ（２０４２）Ｒ； 及び Ｓ（２４０４）Ｐからなる群から選ばれる請求項３記載のＨＣＶポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドが配列番号２、４、５、６、７、２４及び２５からなる群から選ばれたＤＮＡ分子によりコードされたＲＮＡ分子である請求項２記載のＨＣＶポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドが配列番号２、４、５、６、７、２４及び２５からなる群から選ばれたＤＮＡ分子である請求項２記載のＨＣＶポリヌクレオチド。
【請求項１３】
プロモーターに機能し得る形で連結された、請求の範囲第２項記載のポリヌクレオチドのＤＮＡ形態を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項１４】
請求項２記載の自己複製ポリヌクレオチド分子でトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１５】
宿主細胞が真核生物細胞系である請求項４記載の宿主細胞。
【請求項１６】
前記真核生物細胞系が肝臓細胞系である請求項１５記載の宿主細胞系。
【請求項１７】
前記肝臓細胞系がＨｕｈ−７である請求項１６記載の宿主細胞。
【請求項１８】
ａ）請求項１４記載の宿主細胞をＲＮＡ複製に適した条件下でインキュベートする工程、
ｂ）全細胞ＲＮＡを細胞から単離する工程、及び
ｃ）複製されたＨＣＶ ＲＮＡの量を測定するようにＲＮＡを分析する工程
を含むことを特徴とするＲＮＡ複製アッセイ。
【請求項１９】
複製されたＨＣＶ ＲＮＡの量を測定するようにＨＣＶ特異性プライマーを使用する実時間ＲＴ−ＰＣＲ分析によりＲＮＡを増幅することにより工程ｃ）におけるＲＮＡレベルの分析を行なう請求項１８記載のアッセイ。
【請求項２０】
前記ポリヌクレオチドがリポーター遺伝子をコードし、工程ｃ）におけるＲＮＡレベルの分析を発現されたリポーターのレベルを評価することにより行なう請求項１８記載のアッセイ。
【請求項２１】
ａ）化合物の存在下又は不在下で、請求項１８記載の工程ａ）を行なう工程、
ｂ）全細胞ＲＮＡを細胞から単離する工程、及び
ｃ）複製されたＨＣＶ ＲＮＡの量を測定するようにＲＮＡを分析する工程、
ｄ）インヒビターの不在下と存在下の細胞中のＨＣＶ ＲＮＡのレベルを比較する工程を含み、
減少されたＲＮＡレベルが複製を抑制する化合物の能力を示すことを特徴とするＨＣＶ複製の抑制について化合物を試験する方法。
【請求項２２】
前記細胞系を試験化合物とともに約３−４日間にわたって約３７℃の温度でインキュベートする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
−５’−ＮＴＲ領域、
−Ｒ（１１３５）Ｋ； Ｓ（１１４８）Ｇ； Ｓ（１５６０）Ｇ； Ｋ（１６９１）Ｒ； Ｌ（１７０１）Ｆ； Ｉ（１９８４）Ｖ； Ｔ（１９９３）Ａ； Ｇ（２０４２）Ｃ； Ｇ（２０４２）Ｒ； Ｓ（２４０４）Ｐ； Ｌ（２１５５）Ｐ； Ｐ（２１６６）Ｌ 及び Ｍ（２９９２）Ｔからなる群から選ばれた一つ以上のアミノ酸置換を含むＨＣＶポリタンパク質をコードするＨＣＶポリタンパク質領域、及び
−３’−ＮＴＲ領域
を含むことを特徴とするＨＣＶポリヌクレオチド分子。
【請求項２４】
請求項２４記載のアミノ酸置換のいずれか一つを含み、更にアミノ酸置換Ｅ（１２０２）Ｇを含むポリタンパク質をコードするＨＣＶ自己複製ポリヌクレオチド。
【請求項２５】
前記置換がＧ２０４２Ｃ又はＧ２０４２Ｒ突然変異である請求項２４記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
前記置換がＫ（１６９１）Ｒ、及びＧ（２０４２）Ｃからなる群から選ばれる請求項２４記載のＨＣＶポリヌクレオチド。
【請求項２７】
前記置換がＲ（１１３５）Ｋ； Ｓ（１５６０）Ｇ； Ｋ（１６９１）Ｒ； Ｔ（１９９３）Ａ； Ｇ（２０４２）Ｃ； 及び Ｐ（２１６６）Ｌからなる群から選ばれる請求項２４記載のＨＣＶポリヌクレオチド。
【請求項２８】
前記置換がＲ（１１３５）Ｋ； Ｓ（１５６０）Ｇ； Ｋ（１６９１）Ｒ； Ｔ（１９９３）Ａ； Ｇ（２０４２）Ｃ； Ｌ（２１５５）Ｐ； 及び Ｐ（２１６６）Ｌからなる群から選ばれる請求項２４記載のＨＣＶポリヌクレオチド。
【請求項２９】
前記置換がＥ（１２０２）Ｇ； Ｉ（１９８４）Ｖ； Ｇ（２０４２）Ｃ； 及び Ｍ（２９９２）Ｔからなる群から選ばれる請求項２４記載のＨＣＶポリヌクレオチド。
【請求項３０】
前記置換がＳ（１１４８）Ｇ； Ｅ（１２０２）Ｇ； Ｌ（１７０１）Ｆ； Ｇ（２０４２）Ｒ； 及び Ｓ（２４０４）Ｐからなる群から選ばれる請求項２４記載のＨＣＶポリヌクレオチド。
【請求項３１】
前記分子が配列番号２、４、５、６、７、２４及び２５からなる群から選ばれたＤＮＡ分子によりコードされたＲＮＡ分子である請求項２４記載のＨＣＶポリヌクレオチド。
【請求項３２】
前記分子が配列番号２、４、５、６、７、２４及び２５からなる群から選ばれたＤＮＡ分子である請求項２４記載のＨＣＶポリヌクレオチド。
【請求項３３】
プロモーターに機能し得る形で連結された、請求項２４記載のポリヌクレオチドのＤＮＡ形態を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項３４】
請求項２４記載の自己複製ポリヌクレオチド分子でトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項３５】
宿主細胞が真核生物細胞系である請求項３４記載の宿主細胞。
【請求項３６】
前記真核生物細胞系が肝臓細胞系である請求項３５記載の宿主細胞。
【請求項３７】
前記肝臓細胞系がＨｕｈ−７である請求項３６記載の宿主細胞。
【請求項３８】
請求項３４記載の宿主細胞をＲＮＡ複製に適した条件下でインキュベートする工程、
全細胞ＲＮＡを細胞から単離する工程、及び
複製されたＨＣＶ ＲＮＡの量を測定するようにＲＮＡを分析する工程
を含むことを特徴とするＲＮＡ複製アッセイ。
【請求項３９】
複製されたＨＣＶ ＲＮＡの量を測定するようにＨＣＶ特異性プライマーを使用する実時間ＲＴ−ＰＣＲ分析によりＲＮＡを増幅することにより工程ｃ）におけるＲＮＡレベルの分析を行なう請求項３８記載のアッセイ。
【請求項４０】
前記ポリヌクレオチドがリポーター遺伝子をコードし、工程ｃ）におけるＲＮＡレベルの分析を発現されたリポーターのレベルを評価することにより行なう請求項３８記載のアッセイ。
【請求項４１】
ａ）化合物の存在下又は不在下で、請求項３８記載の工程ａ）を行なう工程、
ｂ）全細胞ＲＮＡを細胞から単離する工程、及び
ｃ）複製されたＨＣＶ ＲＮＡの量を測定するようにＲＮＡを分析する工程、
ｄ）インヒビターの不在下と存在下の細胞中のＨＣＶ ＲＮＡのレベルを比較する工程を含み、
減少されたＲＮＡレベルが複製を抑制する化合物の能力を示すことを特徴とするＨＣＶ複製の抑制について化合物を試験する方法。
【請求項４２】
前記細胞系を試験化合物とともに約３−４日間にわたって約３７℃の温度でインキュベートする請求項４１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は一般に適当な細胞系中で自己複製するＨＣＶ ＲＮＡ分子、特に細胞培養物複製を樹立する高められた効率を有する自己複製ＨＣＶ ＲＮＡ構築物に関する。
【０００２】
（背景技術）
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は世界中の輸血後及び群集−後天性非Ａ非Ｂ肝炎の主要な病因物質である。世界中の２００万人以上の人々がそのウイルスにより感染されると推定される。高比率のキャリヤーが慢性感染されるようになり、多くが慢性肝臓疾患、所謂慢性Ｃ型肝炎に進行する。このグループは順に重症肝臓疾患、例えば、肝硬変、肝細胞癌及び死に至る末期肝臓疾患のリスクが高い。ＨＣＶがウイルス存続を確立し、高率の慢性肝臓疾患を生じるメカニズムは充分に解明されていなかった。ＨＣＶが宿主免疫系と相互作用し、侵食する方法は知られていない。加えて、ＨＣＶ感染及び疾患に対する保護における細胞性免疫応答及び体液性免疫応答の役割は未だ実証されていなかった。
種々の臨床研究が慢性Ｃ型肝炎で冒された患者のＨＣＶ感染症を有効に治療することができる医薬化合物を同定することを目標として行なわれていた。これらの研究はインターフェロン−α、単独及びリバビリンの如きその他の抗ウイルス薬と組み合わせての使用を伴っていた。このような研究はかなりの数の参加者がこれらの治療に応答せず、また有利に応答するもののうち、大部分が治療の終了後に再発することを示した。現在まで、ＨＣＶ感染症の治療に広く有効な抗ウイルス化合物はない。
【０００３】
ＨＣＶはフラビウイルス科のエンベロープ陽性ストランドＲＮＡウイルスである。一本鎖ＨＣＶ ＲＮＡゲノムは陽極性のものであり、長さ約９６００ヌクレオチドの一つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、これは約３０１０アミノ酸の線状ポリタンパク質をコードする。感染細胞では、このポリタンパク質が多くの部位で細胞プロテアーゼ及びウイルスプロテアーゼにより開裂されて構造タンパク質及び非構造（ＮＳ）タンパク質を生じる。構造タンパク質（Ｃ、Ｅ１、Ｅ２及びＥ２−ｐ７）はウイルス粒子を構成するポリペプチドを含む（Ｈｉｊｉｋａｔａら， １９９１； Ｇｒａｋｏｕｉら， １９９３（ａ））。非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ）はＨＣＶ ＲＮＡゲノムの複製を触媒作用し、調節する酵素又はアクセサリー因子をコードする。構造タンパク質のプロセシングは宿主細胞プロテアーゼにより触媒作用される（Ｈｉｊｉｋａｔａら， １９９１）。成熟非構造タンパク質の生成は２種のウイルスによりコードされたプロテアーゼにより触媒作用される。
【０００４】
第一のものはポリタンパク質からのＮＳ３タンパク質の放出を自己触媒作用するＮＳ２／３亜鉛依存性メタロプロテアーゼである。放出されたＮＳ３はＮ末端セリンプロテアーゼドメインを含み（Ｇｒａｋｏｕｉら， １９９３（ｂ）； Ｈｉｊｉｋａｔａら， １９９３）、ポリタンパク質からの残りの開裂を触媒作用する。放出されたＮＳ４Ａタンパク質は少なくとも二つの役割を有する。第一に、ＮＳ３タンパク質と安定な複合体を形成し、ＮＳ３／ＮＳ４Ａ複合体の膜局在化を助け（Ｋｉｍら， Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ． １９９９， １４４： ３２９−３４３）、第二に、ＮＳ３プロテアーゼ活性のコファクターとして作用する。この膜関連複合体は順にポリタンパク質の残りの部位の開裂を触媒作用し、こうしてＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂの放出を行なう（Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒら， １９９３； Ｇｒａｋｏｕｉら， １９９３（ａ）； Ｈｉｊｉｋａｔａら， １９９３； Ｌｏｖｅら， １９９６； またＫｗｏｎｇら， １９９８に概説されている）。ＮＳ３タンパク質のＣ末端セグメントはまたヌクレオシドトリホスファターゼ及びＲＮＡヘリカーゼ活性を有する（Ｋｉｍら， １９９５）。タンパク質ＮＳ４Ｂの機能は知られていない。高度にリン酸化されたタンパク質であるＮＳ５Ａは種々のＨＣＶ遺伝子型のインターフェロン耐性を担うと考えられる（Ｇａｌｅ Ｊｒ．ら， １９９７ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３０， ２１７； Ｒｅｅｄら， １９９７）。ＮＳ５ＢはＨＣＶの複製に関係するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）である。
【０００５】
ＨＣＶ ＲＮＡゲノムのオープンリーディングフレームはその５’末端で約３４０ヌクレオチドの非翻訳領域（ＮＴＲ）（これは内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）で機能する）により隣接され、またその３’末端で約２３０ヌクレオチドのＮＴＲにより隣接される。５’ＮＴＲ及び３’ＮＴＲの両方がＲＮＡゲノム複製に重要である。ゲノム配列変化はゲノムにわたって等しく分布されておらず、５’ＮＴＲ及び３’ＮＴＲの部分が最も高度に保存された部分である。真性の高度に保存された３’ＮＴＲはＲｉｃｅらに付与された米国特許第５，８７４，５６５号の目的である。
ＨＣＶゲノムのクローン化され、特性決定された部分配列及び完全配列がまた有望な抗ウイルス療法に適した標的に関して分析されていた。４種のウイルス酵素活性が可能な標的、例えば、（１）ＮＳ２／３プロテアーゼ、（２）ＮＳ３／４Ａプロテアーゼ複合体、（３）ＮＳ３ヘリカーゼ及び（４）ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを与える。ＮＳ３／４Ａプロテアーゼ複合体及びＮＳ３ヘリカーゼが既に結晶化され、それらの三次元構造が決定されていた（Ｋｉｍら， １９９６； Ｙｅｍら， １９９８； Ｌｏｖｅら， １９９６； Ｋｉｍら， １９９８； Ｙａｏら， １９９７； Ｃｈｏら， １９９８）。ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがまた結晶化されてその他の核酸ポリメラーゼを連想させる構造を明らかにした（Ｂｒｅｓｓａｎｅｌｌｉら， １９９９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ ９６： １３０３４−１３０３９； Ａｇｏら， １９９９， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ７： １４１７−１４２６； Ｌｅｓｂｕｒｇら， １９９９， Ｎａｔ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ６： ９３７−９４３）。
【０００６】
たとえ慢性ＨＣＶ感染症の療法の開発に重要な標的がこれらの酵素で同定されたとしても、またたとえ好適なインヒビターに関する世界中の広範な研究が合理的な薬剤設計及びＨＴＳの助けにより進行しているとしても、療法の開発は一つの重大な欠陥、即ち、細胞培養系又は簡単な動物モデル（これらはＨＣＶウイルスの直接かつ信頼できる増殖を可能にする）の欠如を有する。有効な細胞培養系の欠如は依然としてＨＣＶ複製の理解がわかりにくいままであるという現在までの主たる理由である。
フラビウイルス及びペスチウイルス自己複製ＲＮＡが記載され、比較的高い歩留りで異なる細胞系中の複製に使用されていたが、ＨＣＶによる同様の実験は現在まで成功していなかった（Ｋｈｒｏｍｙｋｈら， １９９７； Ｂｅｈｔｅｎｓら， １９９８； Ｍｏｓｅｒら， １９９８）。細胞系又は一次細胞培養物がＨＣＶを含む高力価患者血清で感染し得ることが異なる刊行物から知られている（Ｌａｎｆｏｒｄら， １９９４； Ｓｈｉｍｉｚｕら， １９９３； Ｍｉｚｕｔａｎｉら， １９９６； Ｉｋｅｄａら， １９９８； Ｆｏｕｍｅｒら， １９９８； Ｉｔｏら， １９９６）。しかしながら、これらのウイルス感染細胞系又は細胞培養物はＨＣＶ−ＲＮＡ又はＨＣＶ抗原の直接検出を可能にしない。
【０００７】
また、ヘパトーマ細胞系がクローン化ＨＣＶゲノムのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により得られた合成ＨＣＶ−ＲＮＡでトランスフェクトし得ることがＹｏｏら， １９９５、及びＤａｓｈら， １９９７の刊行物から知られている。両方の刊行物において、著者らはウイルスＨＣＶゲノムが細胞にトランスフェクトされた後にｍＲＮＡとして直接機能し、翻訳プロセスの経過中にウイルスタンパク質の合成を可能にするプラスストランドＲＮＡであり、こうして新しいＨＣＶ粒子がＨＣＶウイルスを形成でき、それらのＲＮＡがＲＴ−ＰＣＲにより検出されるという基本的概念から出発した。しかしながら、ＲＴ−ＰＣＲ実験の公表された結果は記載されたＨＣＶトランスフェクトされたヘパトーマ細胞中のＨＣＶ複製が潜在的な抗ウイルス薬への暴露後の複製の変調を測定するのはもちろん、複製の量を測定するのに特に有効ではなく、しかも充分ではないことを示す。更に、高度に保存された３’ＮＴＲはウイルス複製に必須であることが現在知られている（Ｙａｎａｇｉら， １９９９）。この知識はＹｏｏらの記述（上記文献）及びＤａｓｈらの記述（上記文献）とは厳密には矛盾し、彼らは彼らの実験のためにＨＣＶゲノムの真性３’末端ではなく更に短い３’ＮＴＲを有するＨＣＶゲノムのみを使用していた。
【０００８】
ＷＯ ９８／３９０３１に、Ｒｉｃｅらは、特にａ）高度に保存された５’−末端配列“ＧＣＣＡＧＣＣ”、ｂ）ＨＣＶポリタンパク質コーディング領域、及びｃ）３’−ＮＴＲ真性配列を含む、真性ＨＣＶゲノムＲＮＡ配列を開示していた。
ＷＯ ９９／０４００８に、Ｐｕｒｃｅｌｌらはまた高度に保存された５’−末端配列“ＧＣＣＡＧＣ”のみを含むＨＣＶ感染性クローンを開示していた。
最近、Ｌｏｈｍａｎら， １９９９ （Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５： １１０−１１３）及びＢａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒら（２０００年１０月３日に公開されたＣＡ２，３０３，５２６に）は複製の量が正確かつ再現性良く測定し得るような効率でウイルスＲＮＡ（Ｉ３７７／ＮＳ２−３’）がトランスフェクトされた細胞中で自己複製するＨＣＶ細胞培養系を開示していた。Ｌｏｈｍａｎ及びＢａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒの開示はノーザンブロットによる直接測定により立証された細胞培養におけるＨＣＶ ＲＮＡ複製の最初の実証であった。その中に開示されたこのレプリコン系及び配列は保存された５’配列“ＧＣＣＡＧＣ”をもう一度強調する。５’ＮＴＲの保存を強調する同様の観察がＢｌｉｇｈｔら， ２０００ （Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０： １９７２−１９７４）及び２００１年１１月２９日に公表されたＷＯ ０１／８９３６４によりなされた。
【０００９】
ＲＮＡを複製する細胞培養物中の５’及び３’非翻訳領域の保存に加えて、Ｌｏｈｍａｎら， ２００１、Ｋｒｉｅｇｅｒら， ２００１及びＧｕｏら， ２００１による三つのその他の刊行物がＨＣＶ非構造タンパク質コーディング領域内の異なる適応突然変異体を最近開示していた。ＨＣＶ非構造タンパク質のアミノ酸を変化する特定ヌクレオチド変化が培養細胞中の安定な複製ＨＣＶサブゲノムレプリコンを樹立する効率を高めることが示されている。
今、本件出願人は、全ての先の論文とは反対に、高度に保存された５’−ＮＴＲが適応により突然変異されて、ＨＣＶ非構造領域における突然変異と協力して、導入及び／又は複製の一層大きい効率を与えるＨＣＶ ＲＮＡ配列を生じ得ることを見出した。
また、本件出願人は細胞培養において永久に複製するＨＣＶ ＲＮＡを樹立する効率を改良するＨＣＶ非構造領域内の新規な適応突然変異を同定した。
本発明の一つの利点は自己複製するＨＣＶ ＲＮＡ分子を含むこれらの既存の系の別型を提供することである。更に、本発明はプラスストランドゲノムの開始ヌクレオチドが既に開示されたＧの別型としてのＡであり得ることを実証する。
本発明の更なる利点は一層高い効率で導入し、かつ／又は複製する特異なＨＣＶ ＲＮＡ分子を提供することである。本件出願人は細胞系中のこの特定ＲＮＡ分子の実用性及びＨＣＶ複製の特定インヒビターを評価する際のその使用を実証する。
【００１０】
（発明の開示）
第一実施態様において、本発明は１位にある高度に保存されたグアニンがアデニンに置換されているＣ型肝炎ウイルスの５’−非翻訳領域を提供する。
特に、本発明はＩ３７７／ＮＳ２−３’構築物（Ｌｏｈｍａｎｎら， １９９９、受理番号ＡＪ２４２６５１）に従ってナンバリングして１位にアデニンを含むＣ型肝炎ウイルスポリヌクレオチドを提供する。
特に、本発明はＡＣＣＡＧＣ（配列番号８）からなる５’−末端を含むＨＣＶ自己複製ポリヌクレオチドを提供する。
第二実施態様において、本発明はＲ（１１３５）Ｋ； Ｓ（１１４８）Ｇ； Ｓ（１５６０）Ｇ； Ｋ（１６９１）Ｒ； Ｌ（１７０１）Ｆ； Ｉ（１９８４）Ｖ； Ｔ（１９９３）Ａ； Ｇ（２０４２）Ｃ； Ｇ（２０４２）Ｒ； Ｓ（２４０４）Ｐ； Ｌ（２１５５）Ｐ； Ｐ（２１６６）Ｌ 及び Ｍ（２９９２）Ｔからなる群から選ばれた一つ以上のアミノ酸置換を含むポリタンパク質をコードするＨＣＶ自己複製ポリヌクレオチドに関する。
特に、本発明は上記アミノ酸置換のいずれか一つを含み、更にアミノ酸置換Ｅ（１２０２）Ｇを含むポリタンパク質をコードするＨＣＶ自己複製ポリヌクレオチドに関する。
【００１１】
更に特別に、本発明はＧ２０４２Ｃ又はＧ２０４２Ｒ突然変異を含むポリタンパク質をコードするＨＣＶ自己複製ポリヌクレオチドを提供する。
最も特別に、本発明は１位のヌクレオチド置換Ｇ→Ａを含むＨＣＶ自己複製ポリヌクレオチドを提供し、前記ポリヌクレオチドはＧ２０４２Ｃ又はＧ２０４２Ｒ突然変異を更に含むポリタンパク質をコードする。
特に、本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡ又はＲＮＡに転写し得るＤＮＡの形態であってもよい。
第三実施態様において、本発明はまたプロモーターと機能し得る形で連結された、上記ポリヌクレオチドのＤＮＡ形態を含む発現ベクターを提供する。
第四実施態様によれば、上記自己複製ポリヌクレオチド又はベクターでトランスフェクトされた宿主細胞が提供される。
第五実施態様において、本発明は
−潜在的Ｃ型肝炎ウイルスインヒビターの存在下又は不在下で上記宿主細胞をインキュベートする工程、
−全細胞ＲＮＡを細胞から単離する工程、
−複製されたＨＣＶ ＲＮＡの量を測定するようにＲＮＡを分析する工程、
−インヒビターの不在下と存在下の細胞中のＨＣＶ ＲＮＡのレベルを比較する工程
を含むＲＮＡ複製アッセイを提供する。
第六実施態様において、本発明は
ａ）上記宿主細胞を化合物で処理する工程、
ｂ）処理された宿主細胞を減少された複製について評価する工程を含む、ＨＣＶ複製を抑制するための化合物の試験方法に関するものであり、減少された複製が複製を抑制する化合物の能力を示す。
【００１２】
（発明を実施するための最良の形態）
定義
特に定義されない限り、本明細書に使用される科学用語及び技術用語並びに命名法は本発明が関係する当業者により普通に理解されるのと同じ意味を有する。一般に、細胞培養、感染、分子生物学方法等に関する操作は当業界で使用される普通の方法である。このような通常の技術は参考マニュアル、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌら（１９９４）に見られる。
ヌクレオチド配列は当業界で普通に使用されるような１文字ヌクレオチド記号を使用して、またＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会の推奨（１９７２）に従って、５’から３’の方向に、左から右に、一本鎖により本明細書に示される。
【００１３】
本記載は幾つかのルーチンで使用される組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）技術用語について言及する。それにもかかわらず、このようなｒＤＮＡ用語の選ばれた例の定義が明瞭及び一貫性のために示される。
“ＤＮＡセグメントもしくは分子又は配列”という用語は、デオキシリボヌクレオチドアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）及び／又はシトシン（Ｃ）を含む分子を表すのに本明細書に使用される。これらのセグメント、分子又は配列は天然に見られ、又は合成により誘導し得る。遺伝子コードに従って読まれる場合、これらの配列はポリペプチド、タンパク質、タンパク質フラグメント等と称し得るアミノ酸の線状ストレッチ又は配列をコードし得る。
本発明に使用される“遺伝子”という用語は当業界で公知であり、単一タンパク質又はポリペプチドを特定する核酸配列に関する。タンパク質の機能活性が保持される限り、ポリペプチドは完全長配列又はコーディング配列のいずれかの部分によりコードし得る。
【００１４】
“構造遺伝子”はＲＮＡに転写され、ウイルス粒子を構成する特定構造機能を有するタンパク質に翻訳されるＤＮＡ配列を特定する。“構造タンパク質”はウイルス粒子にとり込まれたＨＣＶタンパク質、即ち、コアー“Ｃ”、Ｅ１、Ｅ２、及びＥ２−ｐ７を特定する。
“非構造タンパク質”はウイルス粒子中に含まれないＨＣＶタンパク質、即ち、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂを特定する。
“制限エンドヌクレアーゼ又は制限酵素”はＤＮＡ分子中の特定塩基配列（通常４、５又は６塩基対の長さ）を認識し、この配列が現れるあらゆる場所でＤＮＡ分子を開裂する能力を有する酵素である。このような酵素の例はＥｃｏＲＩであり、それは塩基配列Ｇ↓ＡＡＴＴＣを認識し、この認識部位でＤＮＡ分子を開裂する。
“制限フラグメント”は制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡの消化により生成されたＤＮＡ分子である。あらゆる所定のゲノム又はＤＮＡセグメントが特別な制限エンドヌクレアーゼにより制限フラグメントの少なくとも二つの別個の分子に消化し得る。
【００１５】
“アガロースゲル電気泳動”はサイズに基づいてポリヌクレオチド分子を分別するための分析方法である。その方法は核酸分子が篩中のようにゲル中を移動し、それにより最小の分子が最大の移動度を有し、ゲル中を最も遠くに移動するという事実に基づいている。ゲルの篩特性は最大分子を遅延し、その結果、これらは最小の移動度を有する。分別されたポリヌクレオチドは当業界で公知の方法を使用してゲルを染色すること、核酸ハイブリダイゼーション又は分別された分子を検出可能な標識で標識することにより視覚化し得る。全てのこれらの方法が当業界で公知であり、特別な方法がＡｕｓｕｂｅｌらの上記文献に見られる。
“オリゴヌクレオチド又はオリゴマー”は二つ以上、好ましくは三つより多いデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含む分子である。その分子の正確なサイズは多くの因子に依存し、これらは順にオリゴヌクレオチドの最終の機能又は使用に依存する。オリゴヌクレオチドは合成、クローニング又は増幅により誘導し得る。
【００１６】
“配列増幅”は多量の標的配列を生じるための方法である。一般に、一種以上の増幅プライマーが核酸配列にアニールされる。適当な酵素を使用して、プライマーに隣接し、又はプライマーの間に見られる配列が増幅される。本明細書に使用される増幅方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、逆転写酵素（ＲＴ）と一緒に使用されて特定ＲＮＡ配列の増幅されたＤＮＡコピーを生じ得る。
“増幅プライマー”は標的配列に隣接するＲＮＡ又はＤＮＡ領域にアニールすることができ、当業界で公知の好適な条件下でＤＮＡ合成の開始プライマーとして利用できるオリゴヌクレオチドを表す。合成されたプライマー延長生成物は標的配列に相補性である。
“ドメイン”又は“領域”という用語はタンパク質内の特定の機能又は構造を特定する特定アミノ酸配列を表す。本明細書中の例として、ＨＣＶ非構造ポリタンパク質内に含まれるＮＳ３プロテアーゼドメインがある。
【００１７】
“プラスミド”、“ベクター”又は“ＤＮＡ構築物”という用語は当業界で普通に知られており、オリゴヌクレオチド配列、又は本発明の配列を含むことができ、本発明のＤＮＡがクローン化し得るＤＮＡビヒクルとして利用できるプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ等を含むが、これらに限定されないあらゆる遺伝要素を表す。多くの型のベクターが存在し、当業界で公知である。
“発現ベクター”という用語は上記されたが、宿主への形質転換又はトランスフェクション後に挿入された配列の発現を可能にするように設計されたベクターを特定する。クローン化遺伝子（挿入された配列）は通常プロモーター配列の如き調節要素配列の制御下に置かれる。このような発現調節配列はベクターが原核生物もしくは真核生物の宿主又はその両方（シャトルベクター）中で機能し得る形で連結された遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで発現されるように設計されているかどうか、更に転写要素、例えば、エンハンサー要素、終結配列、組織特異性要素、及び／又は翻訳開始部位及び翻訳終結部位を含むことができるかどうかに応じて変化するであろう。
【００１８】
宿主細胞又はインジケーター細胞はこのような核酸が細胞内に導入された場合に外因性又は異種のＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ構築物）又はＲＮＡにより“トランスフェクト”された。トランスフェクトＤＮＡは細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組み込まれ（共有結合され）てもよく、又は組み込まれなくてもよい。例えば、原核生物、酵母、及び哺乳類細胞では、トランスフェクト／形質転換ＤＮＡがプラスミドの如きエピソーム要素に維持されてもよい。真核細胞に関して、安定にトランスフェクトされた細胞の例はトランスフェクトＤＮＡが染色体に組み込まれたようになり、染色体複製により娘細胞により遺伝される細胞である。宿主細胞又はインジケーター細胞はＲＮＡでトランスフェクトし得る。細胞はＲＮＡが複製し、ＲＮＡのコピーが細胞分裂後に娘細胞に分離する場合にＲＮＡで安定にトランスフェクトし得る。この安定性は真核細胞がトランスフェクトＤＮＡ又はＲＮＡを含む娘細胞の集団を含む細胞系又はクローンを樹立する能力により実証される。トランスフェクション方法は当業界で公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９； Ａｕｓｕｂｅｌら， １９９４）。ＲＮＡが観察可能な表現型、例えば、抗生物質耐性を与える遺伝マーカーをコードする場合、複製ＲＮＡの安定なトランスフェクションが宿主細胞によるこのような表現型の獲得により監視し得る。
【００１９】
本明細書に使用される“導入”という用語は複製ＲＮＡの安定なトランスフェクションによる宿主細胞への遺伝マーカーの導入を表す。
本発明を実施するのに有益なヌクレオチド配列及びポリペプチドとして、突然変異体、同族体、サブタイプ、準種、対立遺伝子、等が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、本発明の配列はポリタンパク質をコードすることが理解される。本発明のポリタンパク質及びそのあらゆる変異体、誘導体又はフラグメントは活性プロテアーゼに自己プロセシングされることが当業者に明らかであろう。
本明細書に使用される“変異体”という表示は本発明の状況下で初期の配列の生物学的活性と実質的に同様である生物学的活性（機能的又は構造的）を保持する配列（核酸又はアミノ酸）、分子を表す。この変異体は同種又は異種であってもよく、また天然変異体であってもよく、又は合成により調製されてもよい。このような変異体として、一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、又は付加を有するアミノ酸配列が挙げられるが、但し、そのタンパク質の生物学的活性が保存されることを条件とする。同じことが一つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を有し得る核酸配列の変異体に当てはまるが、但し、その配列の生物学的活性が一般に維持されることを条件とする。
【００２０】
“誘導体”という用語は通常これらの分子の一部ではない付加的な化学部分を含む場合の上記変異体のいずれをも含むことが意図されている。これらの化学部分は、分子の可溶性、吸収、生物学的半減期の改良、毒性の低下及び望ましくない副作用の排除又は軽減を含む種々の目的を有し得る。更に、これらの部分は標識、結合の目的に使用でき、又はそれらは一種以上の融合生成物中に含まれてもよい。上記作用を媒介することができる種々の部分がレミントンのＴｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ （１９９５）に見られる。
このような部分を分子に結合する方法は当業界で公知である。“フラグメント”という用語は同定されたＤＮＡ、ＲＮＡ又はアミノ酸配列のあらゆるセグメント及び／又は本発明により必要とされるようなその生物学的活性（機能的又は構造的）を実質的に保持する本明細書に上記された変異体又は誘導体のいずれかのあらゆるセグメントを表す。
本発明の“変異体”、“誘導体”、及び“フラグメント”という用語は単離／精製でき、化学合成でき、又は組換えＤＮＡ技術により生成し得るタンパク質又は核酸分子を本明細書中で表す。全てのこれらの方法が当業界で公知である。本明細書に以下に例示されるように、本発明に使用されるヌクレオチド配列及びポリペプチドは、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発により修飾し得る。
【００２１】
本発明に使用される“ＨＣＶポリタンパク質コーディング領域”という用語はポリタンパク質オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードするＣ型肝炎ウイルスの部分を意味する。このＯＲＦは野生型ＨＣＶタンパク質と同じであり、又は異なるタンパク質をコードし得る。ＯＲＦはまた野生型ポリタンパク質コーディング領域によりコードされた機能性タンパク質の一部のみをコードしてもよい。その中にコードされたタンパク質はＨＣＶの異なる分離株からのものであってもよく、非ＨＣＶタンパク質はまたその中にコードされてもよい。
本明細書に使用されるように、ポリヌクレオチド分子に関して使用される略号“ＮＴＲ”は非翻訳領域を意味する。“ＵＴＲ”という用語は非翻訳領域を意味する。両方が互換可能に使用される。
【００２２】
好ましい実施態様
特に、本発明はＡＣＣＡＧＣ（配列番号８）からなる５’−末端を含むＨＣＶ自己複製ポリヌクレオチド分子を提供する。
本発明の第一実施態様によれば、特に
−５’−末端又はその付近に配列ＡＣＣＡＧＣを含む５’−非翻訳領域（ＮＴＲ）、
−ＨＣＶポリタンパク質コーディング領域、及び
−３’−ＮＴＲ領域
を含むＨＣＶポリヌクレオチド構築物が提供される。
第二実施態様において、本発明はＲ（１１３５）Ｋ； Ｓ（１１４８）Ｇ； Ｓ（１５６０）Ｇ； Ｋ（１６９１）Ｒ； Ｌ（１７０１）Ｆ； Ｉ（１９８４）Ｖ； Ｔ（１９９３）Ａ； Ｇ（２０４２）Ｃ； Ｇ（２０４２）Ｒ； Ｓ（２４０４）Ｐ； Ｌ（２１５５）Ｐ； Ｐ（２１６６）Ｌ 及び Ｍ（２９９２）Ｔからなる群から選ばれた一つ以上のアミノ酸置換を含むポリタンパク質をコードするＨＣＶ自己複製ポリヌクレオチドに関する。
【００２３】
特に、本発明は上記アミノ酸置換のいずれか一つを含み、更にアミノ酸置換Ｅ（１２０２）Ｇを含むポリタンパク質をコードするＨＣＶ自己複製ポリヌクレオチドに関する。
また、本発明の第一実施態様はＧ２０４２Ｃ／Ｒ突然変異を含むＨＣＶ自己複製ポリヌクレオチド分子に関する。
第二実施態様によれば、本発明は特に
−５’−末端又はその付近に配列ＡＣＣＡＧＣを含む５’−ＮＴＲ領域、
−Ｇ（２０４２）Ｃ又はＧ（２０４２）Ｒ突然変異を含むＨＣＶポリタンパク質をコードするＨＣＶポリタンパク質領域、及び
−３’−ＮＴＲ領域
を含むＨＣＶポリヌクレオチド構築物を提供する。
本発明のポリヌクレオチド構築物はＤＮＡ又はＲＮＡ分子であることが好ましい。構築物はＲＮＡ分子であることが更に好ましい。構築物はＤＮＡ分子であることが最も好ましい。
更に特別には、本発明の第一実施態様は配列番号２、４、５、６、７、２４及び２５からなる群から選ばれたＤＮＡ分子によりコードされたＲＮＡ分子に関する。
最も特別には、本発明は配列番号２、４、５、６、７、２４及び２５からなる群から選ばれたＤＮＡ分子を提供する。
【００２４】
第三実施態様において、本発明はまたプロモーターと機能し得る形で連結された、上記ポリヌクレオチドのＤＮＡ形態を含む発現ベクターに関する。
プロモーターはＴ３、Ｔ７及びＳＰ６からなる群から選ばれることが好ましい。
本発明の第四実施態様によれば、上記自己複製ポリヌクレオチド又はベクターでトランスフェクトされた宿主細胞が提供される。特に、宿主細胞は真核生物細胞系である。更に特別には、真核生物細胞系は肝臓細胞系である。最も特別には、肝臓細胞系はＨｕｈ−７である。
第五実施態様において、本発明は
ａ）上記宿主細胞をＲＮＡ複製に適した条件下でインキュベートする工程、
ｂ）全細胞ＲＮＡを細胞から単離する工程、及び
ｃ）複製されたＨＣＶ ＲＮＡの量を測定するようにＲＮＡを分析する工程
を含むことを特徴とするＲＮＡ複製アッセイを提供する。
工程ｃ）におけるＲＮＡレベルの分析は複製されたＨＣＶ ＲＮＡの量を測定するようにＨＣＶ特異性プライマーを使用する実時間ＲＴ−ＰＣＲ分析によりＲＮＡを増幅することにより行なわれることが好ましい。
またこの第五実施態様において、構築物はリポーター遺伝子を含み、工程ｃ）におけるＲＮＡレベルの分析は発現されたリポーターのレベルを評価することにより行なわれる。
【００２５】
第六実施態様の好ましい局面によれば、本発明は
ａ）化合物の存在下又は不在下で、上記アッセイに記載された工程ａ）を行なう工程、
ｂ）全細胞ＲＮＡを細胞から単離する工程、及び
ｃ）複製されたＨＣＶ ＲＮＡの量を測定するようにＲＮＡを分析する工程、
ｄ）インヒビターの不在下と存在下の細胞中のＨＣＶ ＲＮＡのレベルを比較する工程を含み、
減少されたＲＮＡレベルが複製を抑制する化合物の能力を示すことを特徴とするＨＣＶ複製の抑制について化合物を試験する方法に関する。
細胞系は約３−４日にわたって約３７℃の温度で試験化合物とともにインキュベートされることが好ましい。
【００２６】
（実施例）
実施例１
レプリコン構築物（ＡＰＧＫ−１２；図１）
オリゴヌクレオチドリンカー
５’ ｇａａｔｔｃｃａｇａｔｇｇｃｇｃｇｃｃｃａｇａｔｇｔｔａａｃｃａｇａｔｃｃａｔｇｇｃａｃａｃｔｃｔａｇａｇｔａｃｔｇｔｃｇａｃ ３’（配列番号９）をＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで切断されたｐＥＴ−９ａ（ノバゲン）につないでベクターｐＥＴ−９ａ−ｍｏｄを生成することによりｐＥＴ９ａ−ＥＭＣＶを得た。このリンカーは下記の制限部位を含む：ＥｃｏＲＩ、ＡｓｃＩ、ＨｐａＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ、ＳｃａＩ、ＳａｌＩ。プライマー
５’ ｃｇｇａａｔｃｇｔｔａａｃａｇａｃｃａｃａａｃｇｇｔｔｔｃｃｃｔｃ ３’ （配列番号１０）及び５’ ｇｇｃｇｔａｃｃｃａｔｇｇｔａｔｔａｔｃｇｔｇｔｔｔｔｔｃａ ３’（配列番号１１）を用いてＥＭＣＶ ＩＲＥＳをＰＣＲによりベクターｐＴＭ１から増幅し、ＥｃｏＲＩ及びＮｃｏＩによりｐＥＴ−９ａ−ｍｏｄにつないでｐＥＴ−９ａ−ＥＭＣＶを生成した。
ＨＣＶ ＮＳ２〜ＮＳ５Ｂの配列続いてＨＣＶの３’ＵＴＲをレプリコン構築物Ｉ３７７／ＮＳ２−３’（Ｌｏｈｍａｎら， １９９９；受理番号：ＡＪ２４２６５１）から得、オペロン・テクノロジーズ社によりヌクレオチド８０３２でＮＳ５Ｂ中のＮｃｏＩ部位でＴからＣへの変化により合成した。この配列をＧｅｎＯｐ（登録商標）ベクター（オペロン・テクノロジーズ）からＮｃｏＩ及びＳｃａＩで放出し、ｐＥＴ−９ａ−ＥＭＣＶに導入してｐＥＴ−９ａ−ＥＭＣＶ−ＮＳ２−５Ｂ−３’ＵＴＲを生成した。
【００２７】
プライマー
Ｔ７プロモーターを含む５’ ｇｃａｔａｔｇａａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｃｃａｇｃｃｃｃｃｇａｔｔｇ ３’（配列番号１２）及びプライマー
５’ ｇｇｃｇｃｇｃｃｃｔｔｔｇｇｔｔｔｔｔｃｔｔｔｇａｇｇｔｔｔａｇｇａｔｔｃｇｔｇｃｔｃａｔ ３’（配列番号１３）を用いる患者血清から単離されたＨＣＶ ｃＤＮＡからのＨＣＶ ＩＲＥＳの増幅並びに
プライマー
５’ ａａａｇｇｇｃｇｃａｔｇａｔｔｇａａｃａａｇａｔｇｇａｔｔｇｃａｃｇｃａ ３’（配列番号１４）及び
５’ ｇｃａｔａｔｇｔｔａａｃｔｃａｇａａｇａａｃｔｃｇｔｃａａｇａａｇｇｃｇａｔａ ３’（配列番号１５）を用いるベクターｐｃＤＮＡ ３．１（インビトロゲン）からのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の増幅によりｐＥＴ−９ａ−ＨＣＶ−ｎｅｏを得た。これらの２種のＰＣＲフラグメントを混合し、プライマー
５’ ｇｃａｔａｔｇａａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｃｃａｇｃｃｃｃｃｇａｔｔｇ ３’（配列番号１６）及び
５’ ｇｃａｔａｔｇｔｔａａｃｔｃａｇａａｇａａｃｔｃｇｔｃａａｇａａｇｇｃｇａｔａ ３’（配列番号１５）で増幅し、ＥｃｏＲＩ及びＨｐａＩで切断し、ｐＥＴ−９ａ−ｍｏｄに導入してｐｅｔ−９ａ−ＨＣＶ−ｎｅｏを生成した。ＥＭＣＶ−ＮＳ２−５Ｂ−３’ＵＴＲをｐＥＴ−９ａ−ＥＭＣＶ−ＮＳ２−５Ｂ−３’ＵＴＲからＨｐａＩ及びＳｃａＩで放出し、ｐｅｔ−９ａ−ＨＣＶ−ｎｅｏに導入し、これをＨｐａＩで切断してｐＥＴ−９ａ−ＡＰＧＫ１２を生成した。ＡＢＩプリズム（登録商標）ビッグダイＴＭターミネーター・サイクル配列決定キットを使用してこのインサートを特定の連続プライマーで配列決定し、ＡＢＩプリズム（登録商標）３７７ＤＮＡシーケンサーで分析し、配列番号１に示す。
【００２８】
ＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
ｐＥＴ−９ａ−ＡＰＧＫ１２ ＤＮＡを完全長レプリコンの発現のためにＳｃａＩで切断し、又はトランケート陰性対照ＲＮＡの発現のためにＢｇｌＩＩで切断した。ＤＮＡを１％アガロースゲルで分析し、フェノール／クロロホルム抽出により精製した。Ｔ７リボマックス（登録商標）キット（プロメガ）を使用してＲＮＡを生成し、続いてフェノール／クロロホルムで抽出し、７．５ Ｍ ＬｉＣｌ２で沈殿させた。ＲＮＡを１５分間にわたってＤＮＡｓｅ Ｉで処理してＤＮＡ鋳型を除去し、ＲＮイージイ（登録商標）カラム（キアゲン）で更に精製した。ＲＮＡ保全性を変性ホルムアルデヒド１％アガロースゲルで確かめた。
【００２９】
実施例２
Ｈｕｈ７細胞の一次トランスフェクション及びレプリコン細胞系の選択
ヒトヘパトーマＨｕｈ７細胞（健康科学研究資源バンク、大阪、日本）を１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中で増殖させた。細胞を７０％集密まで増殖させ、トリプシン処理し、食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、１ｘ１０７細胞／ＰＢＳ１ｍｌに調節した。細胞８００μｌを０．４ｃｍのキュベットに移し、レプリコンＲＮＡ１５μｇと混合した。約１８ミリ秒にわたって９６０μＦ、３００ボルトを使用して細胞をエレクトロポレーションにかけ、二つの１５ｃｍの組織培養プレートに均等に分配し、２４時間にわたって組織培養インキュベーター中でインキュベートした。第一世代及び第二世代のレプリコン細胞系の選択は１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補給した１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地によるものであった。コロニーが観察されるまで細胞を３−５週間にわたって選択し、これらを単離し、膨張させた。
Ｇ４１８選択及びＡＰＧＫ１２（配列番号１）ＲＮＡでトランスフェクトしたＨｕｈ−７細胞の増殖後に、特有のコロニーを形成した細胞をトリプシンで処理し、更に大きい培養フラスコに連続的に通して細胞系を樹立した。約１０Ｘ１０６の細胞を夫々の細胞系から回収した。細胞を溶解し、全細胞ＲＮＡを抽出し、キアゲンＲＮＡイージイ（登録商標）調製操作に概説されたように精製した。図２は変性アガロース−ホルムアルデヒドゲルのノーザンブロットで分析された種々の細胞系からの全細胞ＲＮＡ１２μｇの分析を示す。
【００３０】
図２ＡはプラスストランドレプリコンＲＮＡの存在を検出するノーザンブロット（ＨＣＶ特異性マイナスストランドＲＮＡで放射能探査した）である。レーン１及び２はｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＡＰＧＫ１２ ＲＮＡの１０９コピーを含む陽性対照である。レーン２はナイーブＨｕｈ−７細胞からの全細胞ＲＮＡ１２μｇと混合されたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡを含む。レーン３は未処理Ｈｕｈ−７細胞からの全細胞ＲＮＡの陰性対照である。レーン４及び５はネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のＤＮＡ組込みコピーを有するＢ１及びＢ３ Ｇ４１８耐性細胞系からの細胞ＲＮＡを含む。レーン６は８キロベース範囲の陽性シグナルにより検出された高コピー数のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを有する、Ｓ２２．３と称される、Ｈｕｈ−７細胞系からの全細胞ＲＮＡを含む。その他の細胞系は検出可能なレプリコンＲＮＡを有しない。図２ＢはブロットがＨＣＶマイナスストランドＲＮＡの存在を検出するためにＨＣＶ特異性プラスストランドＲＮＡで放射能探査された以外は２Ａに示されたゲルの２回反復のノーザンブロットである（レーン１及び２は完全長ゲノムＨＣＶマイナスストランドＲＮＡの１０９コピーを含む陽性対照レーンである）。レーン６（これは細胞系Ｓ２２．３からの全細胞ＲＮＡ１２μｇを含む）のみが８−９キロベースの予想サイズで検出可能なマイナスストランドレプリコンＲＮＡを有する。ノーザンブロットのホスファーイメージャー走査に基づいた、ＲＮＡコピー数の定量推定はプラスストランドの約６Ｘ１０７コピー／全ＲＮＡ１μｇ、及びマイナスストランドの６Ｘ１０６コピー／全ＲＮＡ１μｇである。プラスストランド及びマイナスストランド中間体の存在はＨＣＶサブゲノムＲＮＡがＳ２２．３細胞系中で活発に複製していることを確かめる。
【００３１】
実施例３
Ｓ２２．３細胞系はＨＣＶ非構造タンパク質を構成的に発現する。
ＨＣＶ非構造タンパク質発現をＳ２２．３細胞系中で調べた。図３はレプリコン陰性Ｂ１細胞系（Ｇ４１８耐性Ｈｕｈ−７細胞系）ではなくＳ２２．３細胞系中のＨＣＶ ＮＳ４Ａタンパク質を検出する間接免疫蛍光の結果を示す。間接免疫蛍光を培養され、ラブ−テクチャンバースライドに固定（４％パラホルムアルデヒド）された細胞について行なった。細胞を１０分間にわたって０．２％トリトンＸ−１００で予備浸透し、続いて食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解した５％ミルク粉末で１時間処理した。ＨＣＶ ＮＳ４Ａ領域をスパンするペプチドに対し生じたポリクローナル抗体を含むウサギ血清が検出に使用した一次抗体であった。一次抗体とともに２時間インキュベートした後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、レッド−フルオー・アレキサ（登録商標）５９４（モレキュラー・プローブズ）と結合された二次ヤギ抗ウサギ抗体を３時間にわたって細胞に添加した。未結合二次抗体をＰＢＳ洗浄で除去し、細胞をカバースリップでシールした。図３（上部パネル）は特定蛍光フィルターを備えた顕微鏡で検出した免疫蛍光の結果を示す。下部パネルは屈折干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡により見た細胞の同じ視野を表す。視野内のＳ２２．３（図３Ａ）細胞の大半は細胞質中に局在化するＨＣＶ ＮＳ４Ａタンパク質について陽性染色し、一方、ＨＣＶタンパク質を発現することができないＢ１細胞（図３Ｂ）は染色のバックグラウンドレベルを有するにすぎない。Ｓ２２．３細胞の小部分が高レベルの強く染色されたＨＣＶ ＮＳ４Ａを発現する。
【００３２】
また、２シストロンのレプリコンＲＮＡによりコードされたタンパク質の発現を（ｉ）ナイーブＨｕｈ−７細胞系、（ｉｉ）ネオマイシン耐性Ｈｕｈ−７細胞系Ｂ１、及び（ｉｉｉ）Ｓ２２．３細胞系から抽出された全タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離後にウェスタン−ブロットで調べた。図４パネルＡ、Ｂ、及びＣは、夫々ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）、ＨＣＶ ＮＳ３、及びＨＣＶ ＮＳ５Ｂに特異的なウサギポリクローナル抗血清で探査したウェスタンブロットの結果を示す。視覚化をケミルミネセント反応性二次ＨＲＰ−結合ヤギ抗ウサギ抗体のオートラジオグラフィー検出により得た。図４パネルＡはＳ２２．３ ＲＮＡレプリコン細胞系がＢ１細胞系（これはｎｐｔ遺伝子の組込みＤＮＡコピーを含む）より高いレベルでＮＰＴタンパク質を発現し、ナイーブＨｕｈ−７細胞系がＮＰＴタンパク質を生成しないことを示す。図４パネルＢ及びＣはＳ２２．３細胞系のみが夫々成熟ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質を生成することを示す。ウェスタンブロットはＳ２２．３細胞系（これは活発に複製するＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを有する）がＨＣＶ非構造タンパク質の高レベル発現によりＲＮＡの複製を維持することを実証する。
【００３３】
実施例４
適応レプリコンの配列決定
ＲＮイージイキット（キアゲン）を使用して、レプリコン含有Ｈｕｈ７細胞から全ＲＮＡを抽出した。レプリコンＲＮＡを逆転写し、ワンステップＲＴ−ＰＣＲキット（キアゲン）及びＨＣＶ特異性プライマー（ＷＯ ００／６６６２３に開示された完全長配列から選ばれたような）を使用するＰＣＲにより増幅した。オリゴヌクレオチドプライマーを使用して１０種の異なるＲＴ−ＰＣＲ産物（スタッガー様式で全２シストロンレプリコンをカバーした）を増幅した。ＰＣＲフラグメントをＡＢＩプリズム（登録商標）ビッグダイＴＭターミネーター・サイクルＰＣＲ配列決定で直接配列決定し、ＡＢＩプリズム（登録商標）３７７ＤＮＡシーケンサーで分析した。ＨＣＶレプリコン３’末端及び５’末端の配列を分析するために、Ｋｏｌｙｈａｌｏｖら， １９９６に記載されたＲＮＡ連結反応／ＲＴ−ＰＣＲ操作に従った。Ｓ２２．３のヌクレオチド配列を配列番号２として表す。
【００３４】
実施例５
ＨＣＶレプリコンＲＮＡの連続継代
Ｓ２２．３細胞系からの全細胞ＲＮＡを上記のように調製した。ＨＣＶレプリコンＲＮＡコピー数をタクマン（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲ分析により測定し、全Ｓ２２．３細胞ＲＮＡ２０μｇ（ＨＣＶ ＲＮＡの１Ｘ１０９コピーを含む）を８Ｘ１０６ナイーブＨｕｈ−７細胞へのエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を続いて１０％ウシ胎児血清（１０％ＦＣＳ）を補給したＤＭＥＭを含む１０ｃｍの組織培養プレート中で培養した。トランスフェクションの２４時間後に培地を１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補給したＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）に交換し、次いで３日毎に交換した。２３の見えるコロニーがトランスフェクション及びＧ４１８選択後の３〜４週で形成した。Ｇ４１８耐性コロニーを連続継代ＨＣＶレプリコンＲＮＡを有する第一細胞系に相当する第二世代細胞系に膨張させた。これらの細胞系の３種：Ｒ３、Ｒ７、及びＲ１６は更なる分析の主題であった。第一に、適応レプリコンの夫々による導入の効率をナイーブＨｕｈ−７細胞への全細胞ＲＮＡ（Ｒ３、Ｒ７及びＲ１６から抽出した）のエレクトロポレーションにより測定した。
【００３５】
エレクトロポレーション後に、Ｇ４１８選択の３〜５週後に生じた見えるＧ４１８耐性コロニーをカウントすることにより、導入効率を上記のように測定した（表１）。第二に、連続継代適応レプリコンの配列を実施例４に記載されたＲ３、Ｒ７及びＲ１６レプリコン細胞系の夫々から抽出された全細胞ＲＮＡから決定した（配列番号４、５、６）。ｐＡＰＧＫ１２を基準配列（配列番号１）として使用して、適応レプリコンのＨＣＶセグメント中で選択されたヌクレオチド変化を図５Ａに示す。これらのヌクレオチド変化の幾つかがサイレントであり、コードされたアミノ酸を変化せず、一方、その他がアミノ酸置換をもたらす。図５ＢはｐＡＰＧＫ１２のアミノ酸配列を基準として用いて適応レプリコンによりコードされたアミノ酸変化を要約する。基準配列ＡＰＧＫ−１２（配列番号１）は樹立細胞系の複製ＲＮＡ中に維持されない５’−末端に特別なＧ（５’−ＧＧ）を含むことを注目することが重要である。また、ヌクレオチド１におけるＧ→Ａに加えて、分析された全てのクローン中に見られるアミノ酸２０４２（ＮＳ２のａ．ａ．８１０が配列番号中ａ．ａ．１としてナンバリングされるので、配列表中にアミノ酸１２３３として示される）に適応突然変異Ｇ→Ｃ／Ｒがあることは注目に値する。
【００３６】
【表１】
Ｈｕｈ−７細胞のトランスフェクション
2004516039.tif 000002
【００３７】
実施例６
５’Ｇ→Ａ置換を含むＡＰＧＫ１２（ＡＰＧＫ１２−５’Ａ、配列番号２４）の構築
ｐＡＰＧＫ１２ ＤＮＡを修飾して配列中の第一ヌクレオチドを変化して５’ＧＧを５’Ａで置換した。配列のＥｃｏＲＩ／ＡｇｅＩ部分をその突然変異を含むＰＣＲ生成ＥｃｏＲＩ／ＡｇｅＩフラグメントで置換することによりｐＡＰＧＫ１２中の変化を導入した。増幅に使用したオリゴヌクレオチドは（配列番号２０）：５’−ＧＴＧ ＧＡＣ ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＡ ＣＣＡ ＧＣＣ ＣＣＣ ＧＡＴ ＴＧＧ−３’及び（配列番号２１）：５’−ＧＧＡ ＡＣＧ ＣＣＣ ＧＴＣ ＧＴＧ ＧＣＣ ＡＧＣ ＣＡＣ ＧＡＴ−３’であり、１９５ｂｐ ＤＮＡフラグメントを生成し、次いでこれをＥｃｏＲＩ及びＡｇｅＩで消化した。得られる１７８ｂｐ制限フラグメントを使用してｐＡＰＧＫ１２中のＥｃｏＲＩ／ＡｇｅＩフラグメントを置換してｐＡＰＧＫ１２−５’Ａプラスミドを生成した。
【００３８】
実施例７
Ｒ３−レプリコン（Ｒ３ＲＥＰ）のｃＤＮＡクローニング
Ｒ３レプリコンのｃＤＮＡクローンをＲ３細胞系から抽出されたＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより生成した。下記の２種のオリゴヌクレオチドを使用した：（配列番号２２）：５’−ＧＴＣ ＧＴＣ ＴＴＣ ＴＣＴ ＧＡＣ ＡＴＧ ＧＡＧ ＡＣ−３’及び（配列番号２３）：５’−ＧＡＧ ＴＴＧ ＣＴＣ ＡＧＴ ＧＧＡ ＴＴＧ ＡＴＧ ＧＧＣ ＡＧＣ−３’。ＮＳ２コーディング領域内で開始してＮＳ５Ｂコーディング領域の５’−末端まで延びる、約４４００ｎｔ ＰＣＲフラグメントをＴＡクローニング（インビトロゲン）によりプラスミドｐＣＲ３．１にクローン化した。次いでこのＲ３配列のＳａｃＩＩ／ＸｈｏＩ部分を使用して上記ｐＡＰＧＫ１２及びｐＡＰＧＫ１２−５’Ａ中に存在するＳａｃＩＩ／Ｘｈｏフラグメントを置換した。その結果、２種のＲ３ ｃＤＮＡ配列を生成した：（Ｉ）開始５’Ｇを有するＲ３−Ｒｅｐ−５’Ｇ（配列番号７）及び開始５’Ａを有するＲ３−Ｒｅｐ−５’Ａ（配列番号２５）。Ｒ３ ｒｅｐ ｃＤＮＡの配列決定は初期のｐＡＰＧＫ１２配列とは異なる特異なヌクレオチド変化を同定した（図５Ａを参照のこと）。これらの変化の幾つかはサイレントであり、コードされたアミノ酸を変化せず、一方、その他はアミノ酸変化をもたらす（図５Ｂを参照のこと）。Ｒ３とＲ３−ｒｅｐの相違はＲ３細胞系から抽出された全ＲＮＡの配列決定から観察されなかったヌクレオチド変化をコードする特異なＲ３−ｒｅｐ ｃＤＮＡクローンの単離を反映する。
【００３９】
実施例８
修飾構築物によるコロニー形成の効率
上記実施例１に記載されたようにしてＴ７リボマックス（登録商標）キット（プロメガ）を使用して、ｐＡＰＧＫ１２、ｐＡＰＧＫ１２−５’Ａ、ｐＲ３−Ｒｅｐ及びｐＲ３−Ｒｅｐ−５’ＡからのＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により生成した。ｐＡＰＧＫ１２−５’Ａ鋳型及びｐＲ３−Ｒｅｐ−５’Ａ鋳型を含む反応を５’−Ａを有する開始転写産物中の市販ＲＮＡポリメラーゼの制限のために１０倍にスケールアップした。夫々のクローンに関する完全長ＲＮＡ及び対照トランケートＲＮＡを実施例２に記載されたようにしてエレクトロポレーションにより８ｘ１０６のナイーブＨｕｈ−７細胞に導入した。レプリコンＲＮＡに全細胞Ｈｕｈ−７キャリヤーＲＮＡを補給して最終の１５−２０μｇの量を得た。次いで細胞を二つの１５０ｍｍのプレート中で１０％ウシ胎児血清及び０．２５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補給したＤＭＥＭ培地中で培養した。Ｇ４１８の低濃度はレプリコン含有細胞系を単離し、選択するのに充分であった。何とならば、対照トランケートＲＮＡを含むトランスフェクタントのいずれもが耐性コロニーを生じなかったからである。対照的に、５’Ｇ又は５’Ａを有するｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＡＰＧＫ−１２ＲＮＡはＧ４１８による選択後に同じ効率でコロニーを形成する（図６パネルＡ及びＢ中で約８０ｃｆｕ／μｇ）。
【００４０】
種々の量（０．１ｎｇから１μｇまでの範囲）のＲ３−ｒｅｐ−５’Ａ ＲＮＡをナイーブＨｕｈ−７細胞にトランスフェクトして１．２ｘ１０６ｃｆｕ／μｇのＲＮＡのコロニー形成効率を測定した（図６パネルＣはＲＮＡ１μｇによるトランスフェクションを示す）。種々の量（０．１ｎｇから１μｇまでの範囲）のＲ３−ｒｅｐ〔５’Ｇ〕を同様にトランスフェクトして２ｘ１０６ｃｆｕ／μｇのＲＮＡのコロニー形成効率を生じた（図６パネルＤはＲＮＡ１μｇによるコロニー形成を示す）。最初に示された、ＨＣＶサブゲノムレプリコンは５’Ｇに代えて５’Ａヌクレオチドにより有効に複製することに注目されたい。５’Ａ又は５’Ｇ ＲＮＡを有するＡＰＧＫ１２は同様の導入効率を有する。同様に、５’Ａ又は５’Ｇを有するＲ３−Ｒｅｐ ＲＮＡは両方とも著しく増大された導入効率を示す。注目すべきは、Ｒ３−ＲｅｐによりコードされたＨＣＶ非構造セグメント内の適応突然変異体はトランスフェクトされたＲＮＡ１μｇ当りのコロニー形成単位の著しい増大により示されるように導入効率のかなりの増大を与える。
【００４１】
実施例９
細胞系中のＨＣＶレプリコンＲＮＡレベルの定量
Ｓ２２．３細胞、又はその他の適応レプリコンを有する細胞系を、１０％ＦＢＳ、ＰｅｎＳｔｒｅｐ及び１μｇ／ｍｌのゲネチシンを補給したＤＭＥＭに接種した。インキュベーション期間の終了時に、レプリコンコピー数をＡＢＩプリズム７７００配列検出系とともに実時間ＲＴ−ＰＣＲにより評価する。タクマン（登録商標）ＥＺ ＲＴ−ＰＣＲキットはＨＣＶ ＲＮＡの検出及び分析のための系を与える（Ｍａｒｔｅｌｌら， １９９９ Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３７： ３２７−３３２により最初に実証された）。下流プロセシングを伴わない逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）産物の直接検出を色素染色ＤＮＡプローブの蛍光の増大を監視することにより行なう（図６）。両方のプライマー（Ｒｕｓｔｅｒ， Ｂ． Ｚｅｕｚｅｍ， Ｓ．及びＲｏｔｈ， Ｗ．Ｋ．， １９９５， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２４： ５９７−６００から適応）のヌクレオチド配列及びＨＣＶゲノムの５’−領域中に配置されたプローブ（１９９８年６月２５−２８日のベネチア−リド、イタリアにおけるＣ型肝炎ウイルス及び関連ウイルス分子ウイルス学及び病因に関する第五回国際会議におけるＨｏｈｎｅ， Ｍ．、Ｒｏｅｓｋｅ， Ｈ．及びＳｃｈｒｅｉｅｒ， Ｅ． １９９８， Ｐｏｓｔｅｒ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ： Ｐ２９７から適応）は以下のとおりである。
【００４２】
ＨＣＶフォワードプライマー：
５’ＡＣＧ ＣＡＧ ＡＡＡ ＧＣＧ ＴＣＴ ＡＧＣ ＣＡＴ ＧＧＣ ＧＴＴ ＡＧＴ ３’（配列番号１７）
ＨＣＶリバースプライマー：
５’ＴＣＣ ＣＧＧ ＧＧＣ ＡＣＴ ＣＧＣ ＡＡＧ ＣＡＣ ＣＣＴ ＡＴＣ ＡＧＧ ３’（配列番号１８）
ＨＣＶプローブ：
５’ＦＡＭ−ＴＧＧ ＴＣＴ ＧＣＧ ＧＡＡ ＣＧＧ ＧＴＧ ＡＧＴ ＡＣＡ ＣＣ−ＴＡＭＲＡ ３’（配列番号１９）
ＦＡＭ：蛍光リポーター色素
ＴＡＭＲＡ：クエンチャー色素
タクマン（登録商標）ＥＺ ＲＴ−ＰＣＲキットを使用して、下記の反応をセットアップした。
【００４３】
【表２】
2004516039.tif 000003
【００４４】
この反応混合物に、１０ｎｇ／μＬに希釈されたＳ２２．３細胞から抽出された全ＲＮＡ５μＬを反応当りＲＮＡ合計５０ｎｇのために添加した。レプリコンコピー数を既知の量のレプリコンコピーからつくられた標準曲線で評価し（野生型Ｈｕｈ−７ ＲＮＡ ５０ｎｇを補給した）、同じ反応混合物中でアッセイした（図７）。
ＡＢＩプリズム７７００配列検出系でのＲＴ−ＰＣＲ反応に使用した熱サイクラーパラメーターをＨＣＶ検出のために最適化した。
【００４５】
【表３】
2004516039.tif 000004
【００４６】
定量化は閾値サイクルに基づき、この場合、増幅プロットが特定蛍光閾値と交差する。閾値サイクルの比較は異なるサンプル中の相対的鋳型濃度の高感度の測定を与える。ＰＣＲ適合度が最高である場合の、早期サイクル中の監視は、正確な定量化のための正確なデータを与える。相対的鋳型濃度は既知のコピー数でＨＣＶ ＲＮＡの標準曲線を使用することによりＲＮＡコピー数に変換し得る（図７）。
実施例１０
特定のＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ抗ウイルス化合物がＳ２２．３細胞系中でＨＣＶレプリコンの複製を抑制する。
Ｓ２２．３細胞中でレプリコンレベルに関する特定のＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ抗ウイルス化合物の効果を測定するために、細胞を１０％ＦＢＳ、ＰｅｎＳｔｒｅｐ及び１μｇ／ｍｌのゲネチシンを補完したＤＭＥＭ５００μＬ中でウェル当り５Ｘ１０４細胞で２４ウェル細胞培養クラスターに接種した。化合物添加まで細胞を５％ＣＯ２のインキュベーター中で３７℃でインキュベートした。インヒビターの投与量−応答曲線は連続２倍希釈（１：１）から得られる１１の濃度を示した。化合物Ａの開始濃度は１００ｎＭであった。また、一つの対照ウェル（化合物を含まない）を実験の過程に入れた。２４ウェルプレートを５％ＣＯ２のインキュベーター中で３７℃で４日間インキュベートした。４日のインキュベーション期間後に、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＲＮＡをキアゲンからのＲＮイージイ（登録商標）ミニキット及びキアシュレッダー（登録商標）で抽出した。夫々のウェルからのＲＮＡを５０μＬのＨ２Ｏ中で溶離した。ＲＮＡをカリイ１ＥＵＶ−可視スペクトロフォトメーターで２６０ｎｍにおける光学密度により定量した。夫々のウェルからのＲＮＡ５０ｎｇを使用して実施例６に詳述されたようにＨＣＶレプリコンＲＮＡコピー数を定量した。インヒビターを含む夫々のウェルの抑制のレベル（抑制率、％）を下記の式（ＣＮ＝ＨＣＶレプリコンコピー数）により計算した。
【００４７】
【数１】
2004516039.tif 000005
【００４８】
次いで計算された抑制率（％）を使用して、下記の式を使用してＳＡＳの非線形回帰ルーチンＮＬＩＮ操作によりＩＣ５０、傾斜係数（ｎ）及び最大抑制（Ｉｍａｘ）を測定した。
【００４９】
【数２】
2004516039.tif 000006
【００５０】
化合物Ａを少なくとも４回そのアッセイで試験した。ＩＣ５０曲線をＳＡＳ非線形回帰分析により個々に分析した。図８は典型的な曲線を示し、表２は化合物Ａの個々のＩＣ５０値及び平均ＩＣ５０値を示す。複製アッセイにおける化合物Ａの平均ＩＣ５０は１．１ｎＭであった。
【００５１】
【表４】
表２  Ｓ２２．３細胞系レプリコンアッセイにおける化合物ＡのＩＣ５０
2004516039.tif 000007
【００５２】
検討
潜在的な抗ウイルス化合物の正確な試験に必要とされるレベルまでの、Ｃ型肝炎ウイルスの再現性のあり、かつ盛んなｅｘ ｖｉｖｏ増殖はいずれの系でも得られていなかった。Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡ複製の分子メカニズムを研究する別のアプローチとして、選択可能な自己複製２シストロンＲＮＡが開発された（Ｌｏｈｍａｎら， １９９９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５： １１０−１１３； Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ ＣＡ ２，３０３，５２６）。最小に、これらのレプリコンは非構造タンパク質の一部又は全部をコードし、またネオマイシンホスホトランスフェラーゼの如き選択可能なマーカーを有する。選択されたクローン間のこれらのサブゲノムレプリコンＲＮＡの細胞内定常状態レベルは適度から高度までであるが、Ｌｏｈｍａｎら又はＢａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒにより記載されたコンセンサスＲＮＡのトランスフェクション後にＧ４１８耐性コロニーを生じる頻度は非常に低い。８百万の細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏ転写された２シストロンレプリコンＲＮＡ１μｇでトランスフェクトされる場合、１００未満のコロニーが生じられる。低効率のコロニー形成が最初にＬｏｈｍａｎｎら（１９９９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５： １１０−１１３）により最初に認められた。それ以来、Ｌｏｈｍａｎｎら（２００１）、Ｂｌｉｇｈｔら（２０００）、及びＧｕｏら（２００１）は、コロニー形成アッセイで著しく改良された効率でサブゲノムＲＮＡを単離していた。Ｌｏｈｍａｎｎらは１９９９年にサブゲノムレプリコンの選択が適応突然変異体の選択に関係しないかもしれないことを初期に報告していた。何とならば、連続継代ＲＮＡは改良されたトランスフェクション効率を示さなかったからである。それにもかかわらず、複製ＨＣＶ ＲＮＡの機能及び適応度を特徴づけようと努力して、本発明者らは最初に選択された細胞系から単離されるレプリコンＲＮＡを連続継代した。注目すべきことに、たとえレプリコンＲＮＡの量がｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡをトランスフェクトするのに最初に使用されたよりも低い大きさの程度であったとしても、コロニー形成効率の有意な増大がこの実験から得られた。更に、この第一世代クローンからナイーブＨｕｈ−７細胞へのレプリコンＲＮＡの第二ラウンドの連続継代はコロニー形成効率の更に別の増大を与えた（表１）。
【００５３】
複製ＨＣＶ ＲＮＡの本発明者らの分析はコロニー形成の効率を大きさの４倍程度まで高める幾つかの適応突然変異を同定した。適応突然変異は多くの非構造タンパク質だけでなく、５’非翻訳領域に見られた。ＨＣＶ ５’−ＵＴＲのインオウギュレーティング（ｉｎａｕｇｕｒａｔｉｎｇ）ヌクレオチドとしての５’−Ａへの５’−ＧＧダブレットの置換は、世界中からの多くの遺伝子型及びサブタイプの配列決定にもかかわらず、従来記載されていなかったＨＣＶゲノムの変異体である。５’−ＧＧを有する本発明者らの初期のレプリコンは単一の５’−Ａ又は５’−Ｇを有する変異体に進化し、これらの両方が等しい導入効率を示した。本発明者らは５’Ａ端に耐え、それを安定に維持することができるＨＣＶゲノムの最初の報告をここに記載する。更に、本発明者らはこの特定単一ヌクレオチド置換を本発明者らのｃＤＮＡクローンに再導入するのに成功し、このような端を有するｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡを生成して５’Ａが５’Ｇと同じく有効に機能することを確かめる。
【００５４】
本発明者らはＲ３レプリコン中のＨＣＶ非構造タンパク質ＮＳ３、ＮＳ４Ａ及びＮＳ５Ａ中の適応アミノ酸置換、並びにＲ７クローン中のＮＳ５Ｂ中の置換を同定した（図５Ｂを参照のこと）。これらの突然変異、特にＲ３−ｒｅｐ（配列番号７）により特定された組み合わせは、ｃＤＮＡクローンに再構成され、ＲＮＡレプリコンに転写された場合に、初期の野生型ＡＰＧＫ１２レプリコンＲＮＡから２０，０００倍までの有意に高められた導入効率をもたらす。しかしながら、細胞内レプリコンＲＮＡの定常状態レベルは異なる単離されたクローンの夫々と匹敵した。この結果は適応突然変異による複製効率の増大が一層高いＲＮＡ複製のために一層高い安定な細胞内ＲＮＡレベルをもたらすのではなく、むしろ一層多くの数のＨｕｈ７細胞中のレプリコン樹立のための増大された許容性を与えることを示唆する。このような表現型は、分裂細胞の集団内の永久複製ＲＮＡを樹立するために特定閾値を越えるのに必要とされる、ｄｅ ｎｏｖｏ複製の量の初期の増大により、一時的に発現されるかもしれない。
【００５５】
最近、三つのその他のグループがまたその他の異なる適応突然変異体を同定した。Ｌｏｈｍａｎｎら（２０００）はＮＳ３、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂ中の突然変異により１０，０００倍まで高められた導入効率を報告した。Ｂｌｉｇｈｔら（２０００）はＮＳ５Ａ中の単一突然変異により２０，０００倍までの導入効率の増強を報告し、一方、Ｇｕｏら（２００１）はＮＳ５Ａ中の単一アミノ酸の欠失により５，０００−１０，０００倍の導入効率の増大を報告した。本発明者らがここに記載するアミノ酸置換はＲＮＡトランスフェクション及び／又は複製の効率を高める適応突然変異体として従来同定されていなかった。一つの例外は本発明者らがＲ７及びＲ１６レプリコンの両方中で見出したＮＳ３中のＥ１２０２Ｇの突然変異である。この適応はＧｕｏら（２００１）及びＫｒｉｅｇｅｒら（２００１）に既に記載されていた。本明細書に記載された、例外以外の、全てのその他の適応突然変異は公表されていない。
選択可能なサブゲノムＨＣＶレプリコンの開発は培養細胞中のＨＣＶ ＲＮＡ複製、存続、及び病因に関する探求の潜在的な手段を与えた。しかしながら、初期に記載された（Ｌｏｈｍａｎｎら， １９９９）ＨＣＶ ＲＮＡ含有レプリコンによる低い導入効率はそれがリバースゲネチクス（ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）研究に実用的な系ではないことを示した。本明細書に記載された適応突然変異体は低い導入効率を解決する。その他のグループによる適応突然変異体の最近の記載に鑑みて、本発明者らは適応のレベルが著しく変化し得るが、適応が異なるＨＣＶ ＮＳタンパク質中の異なる突然変異により得られることに注目する。本明細書に記載される適応突然変異体をコードするレプリコンはＨＣＶ ＲＮＡ複製又はＨＣＶレプリコンＲＮＡコロニー形成を変調し得る新規ＨＣＶ標的又は宿主細胞標的を同定するためのリバースゲネチクス研究に理想的に適している。適応され、かつ高度に有効なレプリコンは容易に定量可能な導入効率に影響する微妙な遺伝子型又は表現型の変化を特徴づけるのに適した手段である。
【００５６】
最後に、本発明者らは本発明者らの適応ＨＣＶサブゲノムレプリコン細胞系を使用してＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの特定の小分子インヒビターによるＨＣＶ ＲＮＡ複製の上手な抑制を実証した。これはＨＣＶ非構造タンパク質の一種を特異的に抑制するように設計された、抗ウイルス薬が細胞培養物中のＨＣＶ ＲＮＡ複製を抑制するという最初の実証である。更に、この化合物及び本発明者らのＳ２２．３細胞系はＲＮＡ複製がＨＣＶ非構造タンパク質ＮＳ３〜ＮＳ５Ｂにより誘導されるという提案を正当化する。本発明者らが記載し、正当化したアッセイは細胞培養物中のＨＣＶ非構造タンパク質機能のその他のインヒビターを高処理量様式で特徴づけるのに極めて有益であろう。
本開示中に見られるあらゆる文献はそれらが下記のリスト中に見られようと、また見られなくても参考として本明細書に含まれる。
【００５７】
文献
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Ｙａｎａｇｉ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９６， ２２９１−９５
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Ｙｏｏ ｅｔ ａｌ． １９９５， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６９， ３２−３８
【図面の簡単な説明】
【図１】
２シストロンレプリコンＲＮＡの略図である。Ｌｏｈｍａｎら， １９９９からのＩ３７７／ＮＳ２−３’レプリコンとＡＰＧＫ１２レプリコンの間の配列のずれがレプリコンの下に示される。Ｉ３７７／ＮＳ２−３’レプリコン中の＋１位にあるＧヌクレオチドに代えて、ＡＰＧＫ１２は５’末端にＧＧをもたらす付加的なＧを含む（最初のＧは−１位としてカウントされる）。ｎｅｏ遺伝子とＥＭＣＶ ＩＲＥＳ配列の間のリンカー領域において、二つの領域はＩ３７７／ＮＳ２−３’からずれている。Ｉ３７７／ＮＳ２／３中に存在しない１４ヌクレオチド（ＣＧＣＧＣＣＣＡＧＡＴＧＴＴ）がＡＰＧＫ１２中の位置１１８４に挿入される。Ｉ３７７／ＮＳ２−３’中に存在する１１ヌクレオチド（１２３１−１２４１）が欠失されてＡＰＧＫ−１２を生成する。ＮＳ５Ｂコーディング領域において、位置８０３２にあるＴがＣに突然変異されてＮｃｏＩ制限部位を除く。
【図２】
ＲＮＡトランスフェクトされたＨｕｈ−７細胞系のノーザンブロットを示す。全細胞ＲＮＡ又は対照ＲＮＡ１２μｇを０．５％アガロース−ホルムアルデヒドゲルで分離し、ハイボンドＮ＋紙に移し、固定し、プラスストランドレプリコンＲＮＡの存在を検出するＨＣＶ特異性マイナスストランドＲＮＡで放射能探査した（図２Ａ）。レーン１及び２：ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＡＰＧＫ１２ ＲＮＡの１０９コピーを含む陽性対照。レーン３：トランスフェクトされなかったＨｕｈ−７細胞からの全細胞ＲＮＡの陰性対照。レーン４及び５：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のＤＮＡコピーを組み込んだＢ１細胞系及びＢ３細胞系からの細胞ＲＮＡ。レーン６：矢印により強調された高コピー数ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを有する、Ｓ２２．３と称される、Ｈｕｈ−７細胞系からの全細胞ＲＮＡ。その他の細胞系は検出可能なレプリコンＲＮＡを有しない。図２ＢはブロットがＨＣＶマイナスストランドＲＮＡの存在を検出するためにＨＣＶ特異性プラスストランドＲＮＡで放射能探査された以外は図２Ａと同じである。レーン１及び２は完全長ＨＣＶマイナスストランドＲＮＡの１０９コピーを含む陽性対照レーンである。レーン６（これは細胞系Ｓ２２．３からの全細胞ＲＮＡ１２μｇを含む）は８−９キロベースの予想サイズの検出可能なマイナスストランドレプリコンＲＮＡを有する。Ｍはアガロースゲル上の非放射性分子サイズマーカーの移動を表す。２８ｓは２８ｓリボソームＲＮＡの移動を表し、全細胞ＲＮＡのサンプル中のこの種の検出を説明する。
【図３】
Ｓ２２．３細胞系中のＨＣＶ非構造タンパク質の間接免疫蛍光を示す。間接免疫蛍光を培養され、固定され、透過され、ＨＣＶ ＮＳ４Ａタンパク質のセグメントに特異性のウサギポリクローナル抗体に暴露された細胞について行なった。レッド−フルオー・アレキサ５９４（モレキュラー・プローブズ）と結合された二次ヤギ抗ウサギ抗体を検出のために使用した。上部パネルは免疫蛍光の結果（４０Ｘの対物）及びＳ２２．３細胞の特定染色を示す。下部パネルは屈折干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡検査により見た細胞の同じ視野を表す。視野内のＳ２２．３（図３Ａ）細胞の大半が細胞質中に局在化するＨＣＶ ＮＳ４Ａタンパク質について陽性染色し、一方、ＨＣＶタンパク質を発現することができないＢ１細胞（図３Ｂ）のみが染色のバックグラウンドレベルを有する。
【図４】
３種の細胞系：（ｉ）ナイーブＨｕｈ−７細胞系、（ｉｉ）ネオマイシン耐性Ｈｕｈ−７細胞系Ｂ１、及び（ｉｉｉ）Ｓ２２．３細胞系から抽出された全タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離後のウェスタン−ブロットを示す。パネルＡ、Ｂ、及びＣは、夫々ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）、ＨＣＶ ＮＳ３、及びＨＣＶ ＮＳ５Ｂに特異性のウサギポリクローナル抗血清で探査されたウェスタンブロットの結果を示す。視覚化をケミルミネセント反応性二次ヤギ抗ウサギ抗体のオートラジオグラフィー検出により得た。パネルＡはＳ２２．３ＲＮＡレプリコン細胞系が対照Ｂ１細胞より高いレベルでＮＰＴタンパク質を発現し、ナイーブＨｕｈ−７細胞系がＮＰＴタンパク質を生成しないことを示す。パネルＢ及びＣはＳ２２．３細胞系のみが夫々成熟ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質を生成することを示す。Ｍは前染色されたポリペプチドマーカーの分子量（キロダルトン）を表す。
【図５Ａ】
異なるＨＣＶ２シストロンレプリコン中のＡＰＧＫ１２配列とは異なるヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を同定する。Ｓ２２．３適応レプリコンはＡＰＧＫ１２鋳型から転写されたＲＮＡのトランスフェクション後に選択された第一世代レプリコンである。Ｒ３、Ｒ７、Ｒ１６はＳ２２．３第一世代レプリコン細胞系から単離されたＲＮＡのトランスフェクション後に選択された第二世代レプリコンである。図５Ａ：適応レプリコンの夫々中で特性決定されたヌクレオチド突然変異がレプリコンの夫々のセグメント（ＩＲＥＳ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂ）に隣接して示される。
【図５Ｂ】
異なるＨＣＶ２シストロンレプリコン中のＡＰＧＫ１２配列とは異なるヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を同定する。Ｓ２２．３適応レプリコンはＡＰＧＫ１２鋳型から転写されたＲＮＡのトランスフェクション後に選択された第一世代レプリコンである。Ｒ３、Ｒ７、Ｒ１６はＳ２２．３第一世代レプリコン細胞系から単離されたＲＮＡのトランスフェクション後に選択された第二世代レプリコンである。図５Ｂ：アミノ酸番号は完全長ＨＣＶポリタンパク質に従ってナンバリングされ、第二シストロン中の最初のアミノ酸はＩ３７７／ＮＳ２−３’構築物のＮＳ２中のアミノ酸８１０に相当する。
【図６】
４種のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＨＣＶサブゲノム２シストロンレプリコンＲＮＡのコロニー形成効率を示す。ＡＰＧＫ１２は基準配列として利用できる。構築物の夫々中のＨＣＶ ＩＲＥＳの開始ヌクレオチド及び二つのＲ３−ｒｅｐに関するＨＣＶ非構造領域におけるアミノ酸の相違（ＡＰＧＫ１２基準配列からの）が強調される。５’Ｇ又は５’Ａを有するｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＡＰＧＫ−１２ ＲＮＡは０．２５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８による選択後に同じ効率（パネルＡ及びＢ中で約８０ｃｆｕ／μｇ）でコロニーを形成することに注目されたい。第二世代Ｒ３細胞系から単離されたＲＮＡをＤＮＡに逆転写し、ｐＡＰＧＫ１２ベクター骨格にクローン化してＲ３−ｒｅｐを生成し、これを配列決定し、ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ５Ａセグメント中にＬ（２１５５）Ｐ置換を含む付加的な変化をコードすることがわかった（Ｒ３−ｒｅｐ配列を表２及び表３中でＲ３配列と比較のこと）。種々の量のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲ３−ｒｅｐ−５’Ａ ＲＮＡをナイーブＨｕｈ−７細胞にトランスフェクトして１．２Ｘ１０６ ｃｆｕ／μｇのＲＮＡのコロニー形成効率を測定した（パネルＣ）。また、種々の量のＲ３−ｒｅｐ−５’Ｇをトランスフェクトして２Ｘ１０６ ｃｆｕ／μｇのＲＮＡのコロニー形成効率を生じた（パネルＤ）。
【図７】
典型的なＲＴ−ＰＣＲ増幅プロット（左パネル）及び標準曲線におけるＣｔ値ｖｓ既知のＨＣＶ ＲＮＡ量のグラフ表示（右パネル）を示す。左パネル中のプロットされた曲線の夫々は、前もって決めた量のＨＣＶレプリコンＲＮＡに関する蛍光リポーターシグナル（デルタ−Ｒｎ）の増分ｖｓＰＣＲサイクル数をグラフ化する。Ｃｔ値は蛍光が任意の値（水平線）を越える点を測定することにより得られる。右パネルは前もって測定した標準の開始ＲＮＡコピー数（大きい黒いドット）とＣｔ値の間の線形関係を示す。小さいドットは種々の濃度のＨＣＶ複製の特定インヒビターで処理されたＳ２２．３細胞からのＲＮＡサンプル（未知の量のＨＣＶレプリコンＲＮＡを含む）のＣｔ値である。
【図８】
Ｈｕｈ７細胞中のＨＣＶ ＲＮＡレプリコンレベルに関するインヒビターＡの次第に増大する濃度の効果を示す。Ｓ２２．３細胞を０．５ｎＭで開始し、１０２４ｎＭまでの範囲の次第に増大する濃度のインヒビターＡの存在下で増殖させた。インヒビター投与量−応答曲線は連続２倍希釈（１：１）からの１１種の濃度の結果である。また、インヒビターを含まない、一つの対照ウェルを実験の過程中に入れた。細胞を５％ＣＯ２インキュベーター中で４日間にわたって３７℃でインキュベートした。全細胞ＲＮＡを抽出し、光学密度により定量した。ＨＣＶレプリコンＲＮＡを実時間ＲＴ−ＰＣＲにより評価し、インヒビター濃度の関数としてのゲノム均等物／全ＲＮＡ１μｇとしてプロットした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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