(57)【要約】本発明は、ＸＢＰ−１タンパク質、またはＸＢＰ-１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の発現、プロセシング、翻訳後修飾、および/または活性を調整する方法および組成物を提供する。本発明の方法および組成物を用いて調整し得るＸＢＰ-１活性の例としては、非折り畳みタンパク質の応答（ＵＰＲ）、形質細胞の分化、免疫グロブリン産生、アポトーシスおよびＩＬ−６の産生が挙げられる。本発明はまた、ＸＢＰ−１タンパク質、またはＸＢＰ-１を含むシグナル伝達経路中の分子の発現、プロセシング、翻訳後修飾、および/または活性を調整する化合物を同定する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物ＸＢＰ−１の生物学的活性を調整する際に有用な化合物を同定する方法であって、
ａ）哺乳動物ＸＢＰ−１タンパク質を含む指標組成物を提供すること；
ｂ）前記指標組成物を試験化合物のライブラリーの各メンバーに接触させること；
ｃ）前記試験化合物のライブラリーから、ＸＢＰ−１タンパク質の発現、プロセシング、翻訳後修飾、および/または活性を調整する関連化合物を選択し、それによって哺乳動物ＸＢＰ−１の生物学的活性を調整する化合物を同定することを含む、方法。
【請求項２】
前記化合物のＸＢＰ−１の生物学的活性に対する効果を測定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的活性は、ＵＰＲの調整、細胞分化の調整、ＩＬ−６産生の調整、免疫グロブリン産生の調整、プロテアソーム経路の調整、タンパク質の折り畳みおよび輸送の調整、Ｂ細胞最終分化の調整、ならびにアポトーシスの調整からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記翻訳後修飾は、リン酸化（phophorylation）、グリコシレーションおよびユビキチン化からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＸＢＰ−１の活性は、ＸＢＰ−１と、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６αとの結合を測定することによって測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＸＢＰ−１の活性は、ＸＢＰ−１とＸＢＰ−１に応答する遺伝子の調節領域との結合を測定することによって測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子は、シャペロン遺伝子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子は、ＥＲｄｊ４、ｐ５８ｉｐｋ、ＥＤＥＭ、ＰＤＩ−Ｐ５、ＲＡＭＰ４、ＨＥＤＪ、ＢｉＰ、ＡＴＦ６α、ＸＢＰ−１、ArmetおよびＤＮＡＪＢ９からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ＸＢＰ−１の活性は、タンパク質の産生を測定することによって測定される、請求項１に記載の方法。 
【請求項１０】
前記タンパク質は、α-フェトプロテイン、α１-抗トリプシンおよびアルブミンからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記タンパク質は、免疫グロブリンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＸＢＰ−１の活性は、ＩＬ-６発現を測定することによって測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記指標組成物は、ＸＢＰ−１タンパク質を発現する細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞は、ＸＢＰ−１タンパク質をコードする発現ベクターを前記細胞に導入することによって、ＸＢＰ−１タンパク質を発現するように操作されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記指標組成物は、無細胞組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記指標組成物は、ＸＢＰ−１タンパク質と標的分子を発現する細胞であり、前記試験化合物のＸＢＰ−１タンパク質と標的分子との相互作用を調整する能力がモニターされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記指標組成物は、指標細胞を含み、前記指標細胞は、ＸＢＰ−１タンパク質およびＸＢＰ−１タンパク質に応答するレポーター遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記指標細胞は、ＸＢＰ−１タンパク質をコードする組換え発現ベクターを含有し、レポーター遺伝子に作用可能に結合するＸＢＰ−１応答調節エレメントを含み、前記方法は、
ａ）前記指標細胞を試験化合物に接触させること；
ｂ）前記試験化合物の存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現レベルを決定すること；および
ｃ）前記試験化合物の存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現レベルと、前記試験化合物の不存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現レベルとを比較し、それによってＸＢＰ−１タンパク質の活性を調整する関連化合物を選択することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物ＸＢＰ−１の生物学的活性を調整する際に有用な化合物を同定する方法であって、
ａ）哺乳動物ＩＲＥ-１タンパク質を含む指標組成物を提供すること；
ｂ）前記指標組成物を試験化合物のライブラリーの各メンバーに接触させること；
ｃ）前記試験化合物のライブラリーから、ＩＲＥ-１タンパク質の発現、プロセシング、翻訳後修飾、および/または活性を調整する関連化合物を選択し、それによって哺乳動物ＸＢＰ−１の生物学的活性を調整する化合物を同定することを含む、方法。
【請求項２０】
前記生物学的活性は、ＵＰＲの調整、細胞分化の調整、ＩＬ-６産生の調整、免疫グロブリン産生の調整、プロテアソーム経路の調整、タンパク質の折り畳みおよび輸送の調整、Ｂ細胞最終分化の調整、ならびにアポトーシスの調整からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＩＲＥ-１の活性は、キナーゼ活性である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＩＲＥ-１の活性は、エンドリボヌクレアーゼ活性である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＩＲＥ-１の活性は、ＩＲＥ-１のＸＢＰ−１との結合を測定することによって測定される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記指標組成物は、ＩＲＥ-１を発現する細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞は、ＩＲＥ-１タンパク質をコードする発現ベクターを前記細胞に導入することによって、ＩＲＥ-１タンパク質を発現するように操作されている、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記指標組成物は、無細胞組成物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記指標組成物は、ＩＲＥ-１タンパク質と標的分子を発現する細胞であり、前記試験化合物のＩＲＥ-１タンパク質と標的分子との相互作用を調整する能力がモニターされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
哺乳動物ＸＢＰ−１の生物学的活性を調整する化合物を同定する方法であって、
ａ）ＸＢＰ−１が欠損している細胞またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子を試験化合物に接触させること；および
ｂ）ＸＢＰ−１が欠損している細胞またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子における生物学的活性を調整する試験化合物の能力に基づいて生物学的活性のモジュレーターとして同定される試験化合物が、ＸＢＰ−１の生物学的活性に及ぼす効果を決定し、それによって哺乳動物ＸＢＰ−１の生物学的活性を調整する化合物を同定することを含む、方法。  
【請求項２９】
前記細胞は、ＸＢＰ−１が欠損する非ヒト動物の細胞中にあり、またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子および細胞は、前記試験化合物を前記動物に接触投与することによって前記試験化合物に接触させる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
哺乳動物ＸＢＰ−１の生物学的活性を調整する際に有用な化合物を同定する方法であって、
ａ）哺乳動物ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子を提供すること；
ｂ）前記指標組成物を試験化合物のライブラリーの各メンバーに接触させること；
ｃ）前記試験化合物のライブラリーから、ＸＢＰ−１タンパク質もしくはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の、発現、プロセシング、翻訳後修飾、および/または活性を調整する関連化合物を選択し、それによって哺乳動物ＸＢＰ−１の生物学的活性を調整する化合物を同定することを含む、方法。
【請求項３１】
前記指標組成物は、ＸＢＰ−１、ＩＲＥ-１、ＰＥＲＫおよび/またはＡＴＦ６αタンパク質を発現する細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞は、ＸＢＰ−１、ＩＲＥ-１、ＰＥＲＫまたはＡＴＦ６αタンパク質をコードする発現ベクターを前記細胞に導入することによって、ＸＢＰ−１、ＩＲＥ-１、ＰＥＲＫまたはＡＴＦ６αタンパク質を発現するように操作されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記指標組成物は、無細胞組成物である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記指標組成物は、ＸＢＰ−１、ＩＲＥ-１、ＰＥＲＫまたはＡＴＦ６αタンパク質と標的分子を発現する細胞であり、前記試験化合物のＸＢＰ−１、ＩＲＥ-１、ＰＥＲＫまたはＡＴＦ６αタンパク質と標的分子との相互作用を調整する能力がモニターされる、請求項３０に記載の方法。  
【請求項３５】
自己免疫疾患を調整する際に有用な化合物を同定する方法であって、
ａ）哺乳動物ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子を含む指標組成物を提供すること；
ｂ）前記指標組成物を試験化合物のライブラリーの各メンバーに接触させること；および
ｃ）前記試験化合物のライブラリーから、ＸＢＰ−１タンパク質もしくはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の発現、プロセシング、翻訳後修飾、および/または活性をダウンレギュレートする関連化合物を選択し、それによって自己免疫疾患を調整する化合物を同定することを含む、方法。
【請求項３６】
前記ＸＢＰ−１の活性は、ＸＢＰ−１と、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６αとの結合を測定することによって測定される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＸＢＰ−１の活性は、ＸＢＰ−１と、ＸＢＰ−１に応答する遺伝子の調節領域との結合を測定することによって測定される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記遺伝子は、シャペロン遺伝子である、請求項３７に記載の方法
【請求項３９】
前記遺伝子は、ＥＲｄｊ４、ｐ５８ｉｐｋ、ＥＤＥＭ、ＰＤＩ−Ｐ５、ＲＡＭＰ４、ＨＥＤＪ、ＢｉＰ、ＡＴＦ６α、ＸＢＰ−１およびＤＮＡＪＢ９からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＸＢＰ−１の活性は、タンパク質の産生を測定することによって測定される、請求項３５に記載の方法。  
【請求項４１】
前記タンパク質は、α-フェトプロテイン、アルブミン、α１-抗トリプシンまたは免疫グロブリンからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＸＢＰ−１の活性は、ＩＬ-６発現を測定することによって測定される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＩＲＥ-１の活性が測定される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＩＲＥ-１の活性は、キナーゼ活性である、請求項４３に記載の方法
【請求項４５】
前記ＩＲＥ-１の活性は、エンドリボヌクレアーゼ活性である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＩＲＥ-１の活性は、ＩＲＥ-１とＸＢＰ−１の結合を測定することによって測定される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、グッドパスチャー病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、尋常天疱瘡、重症筋無力症、強皮症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、多発性筋炎および皮膚筋炎、悪性貧血、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎、血管炎、多発性硬化症、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、ならびにI型糖尿病からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４８】
前記自己免疫疾患は抗体の産生を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４９】
悪性疾患を治療するのに有用な化合物を同定する方法であって、
ａ）哺乳動物ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子を含む指標組成物を提供すること；
ｂ）前記指標組成物を試験化合物のライブラリーの各メンバーに接触させること；
ｃ）前記試験化合物のライブラリーから、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の発現、プロセシング、翻訳後修飾、および/または活性を調整する関連化合物を選択し、それによって悪性疾患を調整する化合物を同定することを含む、方法。
【請求項５０】
前記ＸＢＰ−１の活性は、前記ＸＢＰ−１とＩＲＥ-１の結合を測定することによって測定される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＸＢＰ−１の活性は、ＸＢＰ−１とＸＢＰ−１に応答する遺伝子の調節領域との結合を測定することによって測定される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記遺伝子は、シャペロン遺伝子である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記遺伝子は、ＥＲｄｊ４、ｐ５８ｉｐｋ、ＥＤＥＭ、ＰＤＩ-Ｐ５、ＲＡＭＰ４、ＨＥＤＪ、ＢｉＰ、ＡＴＦ６α、ＸＢＰ−１、ArmetおよびＤＮＡＪＢ９からなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＸＢＰ−１の活性は、タンパク質の産生を測定することによって測定される、請求項４９に記載の方法。 
【請求項５５】
前記タンパク質は、α-フェトプロテイン、アルブミン、α１-抗トリプシン、または免疫グロブリンからなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＸＢＰ−１の活性は、ＩＬ-６発現を測定することによって測定される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記シグナル伝達経路中の分子は、ＩＲＥ-１であり、前記ＩＲＥ-１の活性は、キナーゼ活性を測定することによって測定される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５８】
前記シグナル伝達経路中の分子は、ＩＲＥ-１であり、前記ＩＲＥ-１の活性は、エンドリボヌクレアーゼ活性である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５９】
前記シグナル伝達経路中の分子は、ＩＲＥ-１であり、前記ＩＲＥ-１の活性は、ＩＲＥ-１とＸＢＰ−１との結合を測定することによって測定される、請求項４９に記載の方法。
【請求項６０】
前記悪性疾患は、急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌腫；エイズ関連性リンパ腫；胆管癌；膀胱癌；骨の癌、悪性骨肉種、線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、脳腫瘍；乳癌；気管支腺腫；カルチノイド腫瘍；副腎皮質カルシノーマ；中枢神経系リンパ腫；サイナスの癌、胆嚢癌；胃癌；唾液腺の癌；食道癌；神経細胞の癌；腸の癌（例えば、大腸または小腸）；子宮頸癌；結腸癌；結腸直腸癌；皮膚Ｔ細胞リンパ腫；Ｂ細胞リンパ腫；Ｔ細胞リンパ腫；子宮体癌；上皮癌；子宮体癌；眼内メラノーマ；網膜芽細胞腫；ヘアリーセル白血病；肝臓癌；ホジキン病；カポジ肉腫；急性リンパ芽球性白血病；肺癌；非ホジキンリンパ腫；メラノーマ；多発性骨髄腫；神経芽細胞腫；前立腺癌；網膜芽細胞腫；ユーイング肉腫；膣癌；ワルデンストレーム大グロブリン血症；悪性腺腫；卵巣癌；慢性リンパ性白血病、膵臓癌；ウイルム腫瘍からなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項６１】
前記悪性疾患が分泌細胞内にある、請求項４９に記載の方法。
【請求項６２】
哺乳動物ＸＢＰ−１と哺乳動物ＩＲＥ-１との相互作用を調整する化合物を同定する方法であって、
ａ）ＸＢＰ−１分子のＩＲＥ-１相互作用部分を含む第１のポリペプチドと、ＩＲＥ-１分子のＸＢＰ−１相互作用部分を含む第１のポリペプチドを、複数の試験化合物の存在下および不存在下に提供すること；および
ｂ）試験化合物の存在下および不存在下における前記第１と第２のポリペプチドとの相互作用の程度を決定し、それによって哺乳動物ＸＢＰ−１と哺乳動物ＩＲＥ-１の間の相互作用を調整する化合物を同定することを含む、方法。
【請求項６３】
哺乳動物ＸＢＰ−１と哺乳動物ＡＴＦ６αとの相互作用を調整する化合物を同定する方法であって、
ａ）ＸＢＰ−１分子のＡＴＦ６α相互作用部分を含む第１のポリペプチドと、ＡＴＦ６α分子のＸＢＰ−１相互作用部分を含む第１のポリペプチドを、複数の試験化合物の存在下および不存在下に提供すること；および
ｂ）試験化合物の存在下および不存在下における前記第１と第２のポリペプチドとの相互作用の程度を決定し、それによって哺乳動物ＸＢＰ−１と哺乳動物ＡＴＦ６αの間の相互作用を調整する化合物を同定することを含む、方法。**
【請求項６４】
前記第１と第２のポリペプチドの相互作用は、ＸＢＰ−１と、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６αとの結合を測定することによって決定される、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記第１と第２のペプチドの間の相互作用は、ＸＢＰ−１活性を測定することによって決定される、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記第１と第２のペプチドの間の相互作用は、ＸＢＰ−１のスプライシングされたレベルを測定することによって決定される、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記第１と第２のペプチドの間の相互作用は、ＸＢＰ−１のスプライシングされていないレベルを測定することによって決定される、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記化合物は、自己免疫疾患を治療するために有用である、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６９】
前記化合物は、悪性疾患を治療するために有用である、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項７０】
前記化合物は、ＸＢＰ−１の生物学的活性を調整するために有用である、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項７１】
外因性哺乳動物ＸＢＰ−１分子、またはその部分を含む組換え細胞であって、スプライシング部位にまたがるＸＢＰ−１のヌクレオチド配列および、ＸＢＰ−１タンパク質をスプライシングするとすぐ、レポーター遺伝子の転写が起こるように、スプライシングされたＸＢＰ−１の調節領域に作用可能に結合するレポーター遺伝子を含む、組換え細胞。
【請求項７２】
化合物が哺乳動物ＸＢＰ−１のスプライシングを上方調整する能力を検出するための方法であって、請求項６８に記載の細胞を化合物に接触させること、および前記化合物の存在下および不存在下でレポーター遺伝子の発現を測定することを含み、前記化合物の存在下でスプライシングされたＸＢＰ−１のレベルが上昇すると、前記化合物が哺乳動物ＸＢＰ−１のスプライシングを上方調整することを示す、方法。
【請求項７３】
哺乳動物ＸＢＰ−１の細胞中での発現および/または活性を調整する方法であって、前記細胞を、ＸＢＰ−１を活性化するタンパク質の発現および/または活性を調整する作用物質に接触させ、それによって哺乳動物ＸＢＰ−１の発現および/または活性を調節することを含む、方法。
【請求項７４】
前記ＸＢＰ−１を活性化するタンパク質は、ＩＲＥ-１である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記作用物質は、ジペプチジルボロナート（dipeptidyl boronate）クラスのプロテアソームインヒビターではない、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者からの細胞である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
前記患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
その転写が哺乳動物ＸＢＰ−１によって調節される遺伝子の、細胞中での発現を調整する方法であって、前記細胞を、スプライシングされたＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を増加させる作用物質に接触させ、遺伝子の発現を変えることを含む方法。
【請求項７９】
前記細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者に存在する細胞からの単離された細胞である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
その転写が哺乳動物ＸＢＰ−１によって調節される遺伝子の、細胞中での発現を調整する方法であって、前記細胞を、スプライシングされたＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を増加させる作用物質に接触させ、遺伝子の発現を変えることを含む方法。
【請求項８２】
前記細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者に存在する細胞からの単離された細胞である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記接触させるステップは、ＸＢＰ−１の生物学的活性の調節が有効である被験体のin vivoで行われる、請求項７８〜８１のいずれかに記載の方法。
【請求項８５】
転写がＸＢＰ−１によって調節される、ＸＢＰ−１の生物学的作用の媒介に関与する遺伝子の哺乳動物細胞中での発現を増加させる方法であって、細胞を、ＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を調整する作用物質に接触させ、前記遺伝子の発現を増加させる方法。
【請求項８６】
前記細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者に存在する細胞からの単離された細胞である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
転写がＸＢＰ−１によって調節される、ＸＢＰ−１の生物学的作用の媒介に関与する遺伝子の哺乳動物細胞中での発現を増加させる方法であって、細胞を、ＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を調整する作用物質に接触させ、前記遺伝子の発現を増加させる方法。
【請求項８９】
前記作用物質は、ジペプチジルボロナートクラスのプロテアソームインヒビターではない、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者に存在する細胞から単離された細胞である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
前記患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
転写がＸＢＰ−１によって調節される、ＸＢＰ−１の生物学的作用の媒介に関与する遺伝子の哺乳動物細胞中での発現を増加させる方法であって、細胞を、スプライシングされたＸＢＰ−１の、細胞中での発現を増加させる作用物質に接触させ、前記遺伝子の発現を増加させる方法。
【請求項９３】
前記細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者に存在する細胞から単離された細胞である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される、請求項９２に記載の方法。
【請求項９５】
転写がＸＢＰ−１によって調節される、ＸＢＰ−１の生物学的作用の媒介に関与する遺伝子の哺乳動物細胞中での発現を増加させる方法であって、細胞を、スプライシングされていないＸＢＰ−１の、細胞中での発現を増加させる作用物質に接触させ、前記遺伝子の発現を増加させる方法。
【請求項９６】
前記スプライシングされていないＸＢＰ−１の活性は、スプライシングされたＸＢＰ−１の活性を阻害することを含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
転写がＸＢＰ−１によって調節される、ＸＢＰ−１の生物学的作用の媒介に関与する遺伝子の哺乳動物細胞中での発現を減少させる方法であって、細胞を、スプライシングされたＸＢＰ−１の、細胞中での発現を減少させる作用物質に接触させ、前記遺伝子の発現を減少させる方法。
【請求項９８】
前記作用物質は、ジペプチジルボロナートクラスのプロテアソームインヒビターではない、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者に存在する細胞から単離された細胞である、請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
前記患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記スプライシングされたＸＢＰ−１の活性は、RNAiを媒介する、強い陰性のＸＢＰ−１タンパク質または核酸の、スプライシングされたＸＢＰ−１の活性を阻害するのに十分な量を細胞に導入することによって減少する、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０２】
転写がＸＢＰ−１によって調節される、ＸＢＰ−１の生物学的作用の媒介に関与する遺伝子の哺乳動物細胞中での発現を減少させる方法であって、細胞を、スプライシングされていないＸＢＰ−１の、細胞中での発現を減少させる作用物質に接触させ、前記遺伝子の発現を減少させる方法。
【請求項１０３】
前記スプライシングされていないＸＢＰ−１の活性は、スプライシングされたＸＢＰ−１の活性を阻害することを含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記遺伝子は、ＥＲｄｊ４、ｐ５８ｉｐｋ、ＥＤＥＭ、ＰＤＩ-Ｐ５、ＲＡＭＰ４、ＨＥＤＪ、ＢｉＰ、ＡＴＦ６α、ＸＢＰ−１、ArmetおよびＤＮＡＪＢ９からなる群から選択される、請求項８６、９０、９３、９５、９９および１０２のいずれかに記載の方法。
【請求項１０５】
前記細胞は、Ｂ細胞である、請求項８６、９０、９３、９５、９９および１０２のいずれかに記載の方法。
【請求項１０６】
少なくとも１つの哺乳動物ＸＢＰ−１の生物学的活性を調整する方法であって、細胞を、スプライシングされたＸＢＰ−１の細胞中での、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を増加させる作用物質と接触させ、哺乳動物ＸＢＰ−１の少なくとも１つの生物学的活性を調整する方法。
【請求項１０７】
前記細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者に存在する細胞からの単離された細胞である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
少なくとも１つの哺乳動物ＸＢＰ−１の生物学的活性を調整する方法であって、細胞を、スプライシングされたＸＢＰ−１の細胞中での、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を減少させる作用物質と接触させ、前記生物学的活性を調整する方法。
【請求項１１０】
前記作用物質は、ジペプチジルボロナートクラスのプロテアソームインヒビターではない、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者に存在する細胞からの単離された細胞である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１２】
前記患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１３】
哺乳動物細胞をスプライシングされていないＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を調整する作用物質に接触させることを含む、細胞分化を調整する方法。
【請求項１１４】
前記細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者に存在する細胞からの単離された細胞である、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
哺乳動物細胞において、ＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路を誘導する細胞外の影響によって活性化される遺伝子の発現レベルを下方調整する方法であって、前記方法は、スプライシングされたＸＢＰ−１の細胞中での発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を減少させる作用物質に接触させ、前記遺伝子の発現を減少させる方法。
【請求項１１７】
前記作用物質は、ジペプチジルボロナートクラスのプロテアソームインヒビターではない、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者に存在する細胞から単離された細胞である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１９】
前記患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
哺乳動物細胞において、ＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路を誘導する細胞外の影響によって活性化される遺伝子の発現レベルを上方調整する方法であって、前記方法は、スプライシングされたＸＢＰ−１の細胞中での発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を増加させる作用物質に接触させ、前記遺伝子の発現を増加させる方法。
【請求項１２１】
前記細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者に存在する細胞から単離された細胞である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２３】
前記細胞外の影響がＥＲストレスを誘発する、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２４】
哺乳動物細胞において、ＸＢＰ−１媒介性の細胞内シグナリングを下方調整する方法であって、前記細胞を、スプライシングされたＸＢＰ−１の前記細胞中での発現、プロセシング、翻訳後修飾、および/または活性を下方調整する作用物質に接触させ、ＸＢＰ−１媒介性の細胞内シグナリングを下方調整することを含む方法。
【請求項１２５】
前記作用物質は、ジペプチジルボロナートクラスのプロテアソームインヒビターではない、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者に存在する細胞から単離された細胞である、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２７】
前記患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
ＸＢＰ−１媒介性の細胞内シグナリングを上方調整する方法であって、哺乳動物細胞を、スプライシングされたＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾、および/または活性を上方調整する作用物質に接触させ、ＸＢＰ−１媒介性の細胞内シグナリングを上方調整することを含む方法。
【請求項１２９】
前記細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者に存在する細胞から単離された細胞である、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
細胞内でのＩＬ-６発現を増加させる方法であって、細胞を、前記細胞内においてスプライシングされたＸＢＰ−１の活性を増加させる作用物質に接触させ、ＩＬ-６発現を増加させることを含む方法。
【請求項１３２】
細胞内でのＩＬ-６発現を増加させる方法であって、細胞を、前記細胞内においてスプライシングされていないＸＢＰ−１の活性を増加させる作用物質に接触させ、ＩＬ-６発現を増加させることを含む方法。
【請求項１３３】
細胞内でのＩＬ-６発現を減少させる方法であって、細胞を、前記細胞内においてスプライシングされたＸＢＰ−１の活性を減少させる作用物質に接触させ、ＩＬ-６発現を減少させることを含む方法。
【請求項１３４】
細胞内でのＩＬ-６発現を減少させる方法であって、細胞を、前記細胞内においてスプライシングされていないＸＢＰ−１の活性を減少させる作用物質に接触させ、ＩＬ-６発現を減少させることを含む方法。
【請求項１３５】
哺乳動物細胞においてアポトーシスを下方調整する方法であって、細胞を、前記細胞内においてスプライシングされたＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を減少させる作用物質に接触させ、アポトーシスを減少させることを含む方法。
【請求項１３６】
哺乳動物細胞においてアポトーシスを上方調整する方法であって、細胞を、前記細胞内においてスプライシングされたＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を減少させる作用物質に接触させ、アポトーシスを上方調整することを含む方法。
【請求項１３７】
前記作用物質は、ジペプチジルボロナートクラスのプロテアソームインヒビターではない、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
前記細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者に存在する細胞から単離された細胞である、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３９】
前記患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
タンパク質の折り畳み、輸送および/または分泌作用を増加させる方法であって、細胞を、前記細胞内においてスプライシングされたＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を増加させる作用物質に接触させ、タンパク質の産生を増加させることを含む方法。
【請求項１４１】
前記タンパク質は、ウイルス蛋白である、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
前記タンパク質の折り畳み、または輸送の増加は、シャペロンタンパク質の増加によって測定される、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４３】
前記タンパク質は、α-フェトプロテイン、アルブミン、α１-抗トリプシンおよびルシフェラーゼからなる群から選択される、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４４】
前記タンパク質は、前記細胞に対して外因性である、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４５】
前記タンパク質は、免疫グロブリンである、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４６】
前記細胞は、Ｂ細胞である、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４７】
前記細胞は、ヘパトサイトである、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４８】
前記タンパク質は、細胞内に組換えによって発現される、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４９】
タンパク質の折り畳み、または輸送を増加させる方法であって、細胞を、前記細胞内においてスプライシングされていないＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を減少させる作用物質に接触させ、タンパク質の産生を増加させることを含む方法。
【請求項１５０】
細胞中におけるタンパク質の折り畳み、または輸送を増加させる方法であって、細胞を、前記細胞内においてスプライシングされていないＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を増加させる作用物質に接触させ、タンパク質の産生を減少させることを含む方法。
【請求項１５１】
前記作用物質は、ジペプチジルボロナートクラスのプロテアソームインヒビターではない、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者からの細胞である、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５３】
前記患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５４】
Ｂ細胞の最終分化を調整する方法であって、哺乳動物細胞を、Ｂ細胞中のＩＬ-４誘導性シグナリングを調整して、ＸＢＰ−１誘導性の転写が調整する作用物質に接触させることを含み、それによってＢ細胞の最終分化を調整することを含む方法。
【請求項１５５】
前記細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者からの細胞である、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
前記患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
哺乳動物細胞におけるＸＢＰ−１の生物学的活性を調整する方法であって、細胞を、Ｂ細胞の最終分化を誘導する作用物質に接触させることを含む方法。
【請求項１５８】
前記細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者に存在する細胞からの単離された細胞である、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
前記患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６０】
前記作用物質は、ＩＬ-４である、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６１】
前記作用物質は、シグナリングタンパク質、ＳＴＡＴ６を介して作用する、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６２】
前記作用物質は、ＬＰＳ、ＣＤ４０およびＩＬ-４からなる群から選択される１以上の作用物質である、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６３】
ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、哺乳動物被験体中での活性を下方調整する作用物質を用いた治療が有効となり得る異常を治療または予防するための方法であって、前記異常を持つ被験体にＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を下方調整する作用物質を投与することを含む、方法。
【請求項１６４】
前記患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される、請求項７５に記載の方法。
【請求項１６５】
前記作用物質は、スプライシングされていないＸＢＰ−１のスプライシングされたＸＢＰ−１に対する比率を調整する、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６６】
前記疾患は、自己免疫疾患である、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６７】
前記疾患は、悪性疾患である、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６８】
前記悪性疾患を有する哺乳動物被験体に、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を下方調整する作用物質を投与することを含み、さらに、悪性疾患を治療するのに有用なさらなる作用物質を含む、悪性疾患を治療または予防するための方法。
【請求項１６９】
前記さらなる作用物質は、ジペプチジルボロナートクラスのプロテアソームインヒビターである、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７０】
スプライシングされたＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、被験体中での活性を上方調整する作用物質を用いた治療によってが有効となり得る異常を治療または予防するための方法であって、前記異常を持つ被験体にＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を上方調整する作用物質を投与することを含む、方法。
【請求項１７１】
前記作用物質は、スプライシングされていないＸＢＰ−１のスプライシングされたＸＢＰ−１に対する比率を調整する、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
前記異常は、後天性免疫不全症の異常または感染症である、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７３】
スプライシングされた哺乳動物ＸＢＰ−１をコードする核酸分子および抗原を含む、免疫調節性組成物。
【請求項１７４】
スプライシングされた哺乳動物ＸＢＰ−１活性を増加させる化合物および抗原を含む、免疫調節性組成物。
【請求項１７５】
スプライシングされた哺乳動物ＸＢＰ−１のインヒビターおよび抗原を含む、免疫調節性組成物。
【請求項１７６】
前記インヒビターは、スプライシングされた哺乳動物ＸＢＰ−１および抗原の強い陰性のインヒビターである、請求項１７５に記載の免疫調節性組成物。
【請求項１７７】
被験体における自己免疫疾患を調整する方法であって、請求項１７３〜１７５のいずれか１項に記載の免疫調節性組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１７８】
哺乳動物被験体における細胞分化を調整する方法であって、請求項１７３〜１７５のいずれか１項に記載の免疫調節性組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１７９】
哺乳動物被験体における免疫応答を高めるための方法であって、スプライシングされたＸＢＰ−１をコードする核酸分子を被験体に投与して、免疫応答を高める、方法。
【請求項１８０】
哺乳動物被験体における免疫応答を高めるための方法であって、ＸＢＰ−１アゴニストを被験体に投与して、免疫応答を高める、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本願は、２００２年８月３０日に出願された、「ＸＢＰ−１活性を調整するための方法および組成物」と題する米国仮特許出願第60/407,166号および２００３年７月１８日に出願された、「ＸＢＰ−１活性を調整するための方法および組成物」と題する米国仮特許出願第60/488,568号の優先権を主張し、これらの出願の内容全体を本明細書において引用によって援用する。
【０００２】
政府援助
本明細書において述べた研究は、少なくとも部分的に、米国国立衛生研究所（the National Institutes of Health）による助成金AI 32412 の援助を受けた。従って、米国政府は本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
発明の背景
ＸＢＰ−１は、成体では広汎に発現するが、マウス胚では外分泌腺および骨前駆体に主に見つかっている（Liouら、1990, Science 247: 1581-1584; Clauss et al.
1993, Dev. Dynamics 197: 146-156）。in vitro研究では、BSAPによるＸＢＰ−１遺伝子のダウンレギュレーションや、ＸＢＰ−１タンパク質がc-Fosとダイマー形成すること、ラージ細胞にアンチセンスＸＢＰ−１遺伝子を導入するとMHCクラスII遺伝子発現が減少することが、証明されている（Reimoldら、1996, J. Exp. Med., 183: 393-401 ; Ono ら、1991, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 88: 4309-4312）。ＸＢＰ−１は、Ｂリンパ球から形質細胞への最終分化にとって選択的かつ特異的に必要であることがわかった最初の転写因子である。ＸＢＰ−１転写物は、形質細胞分化を誘導する刺激によってin
vitro で急速にアップレギュレートされ、ＸＢＰ−１は、正常形質細胞において高レベルに認められる。
【０００４】
しかしながら、ＸＢＰ−１が関与するシグナル伝達経路およびＸＢＰ−１が誘導される分子メカニズムについては、殆ど知られていない。細胞におけるＸＢＰ−１の役割を更に解明することは、薬物発見の標的の同定およびＸＢＰ−１が関与する細胞経路を調整するための方法を提供する際にかなり有益であろう。
【０００５】
発明の開示
本発明は、とりわけ、非折り畳みタンパク質の応答（ＵＰＲ）の活性化における転写因子ＸＢＰ−１の役割を証明する。ＵＰＲは、細胞が適切なタンパク質の折り畳みを確実に扱うことができるようにするシグナル伝達経路である。ＵＰＲは、ストレスタンパク質GRP78およびGRP94の誘導を担う近位の信号を調べる研究において、１０年以上前に説明されている。ＥＲ（小胞体）中の誤って折り畳まれたタンパク質の過剰発現は、これらの分子シャペロンの生産の増加の最初のシグナルであることがわかった（Kozutsumiら、（1988） Nature）。環境的な刺激からのストレスを受けている、またはホメオスタシスを破壊する薬物にさらされている細胞におけるＵＰＲの役割が明らかになってきているが、形質細胞分化におけるＵＰＲの役割が記載されたものはない。
【０００６】
本発明は、細胞分化を誘導するシグナルと非折り畳みタンパク質応答（ＵＰＲ）が協同して、ＸＢＰ−１
ｍＲＮＡ発現および得られたＸＢＰ−１転写物のスプライシングの双方を誘導するという所見に少なくとも部分的に基づいている。さらにＸＢＰ−１は、多くの遺伝子の転写を調節し、また種々の細胞応答を調節することがわかっている。
【０００７】
したがって、一局面において、本発明は、哺乳動物ＸＢＰ−１の生物学的活性を調整する際に有用な化合物を同定する方法であって、ａ）哺乳動物ＸＢＰ−１タンパク質を含む指標組成物を提供すること；ｂ）前記指標組成物を試験化合物のライブラリーの各メンバーに接触させること；ｃ）前記試験化合物のライブラリーから、ＸＢＰ−１タンパク質の発現、プロセシング、翻訳後修飾、および/または活性を調整する関連化合物を選択し、それによって哺乳動物ＸＢＰ−１の生物学的活性を調整する化合物を同定することを含む方法に関する。
【０００８】
ある態様において、前記方法は、前記化合物のＸＢＰ−１の生物学的活性に対する効果を測定することをさらに含む。
【０００９】
ある態様において、前記生物学的活性は、ＵＰＲの調整、細胞分化の調整、ＩＬ−６産生の調整、免疫グロブリン産生の調整、プロテアソーム経路の調整、タンパク質の折り畳みおよび輸送の調整、Ｂ細胞最終分化の調整、ならびにアポトーシスの調整からなる群から選択される。
【００１０】
ある態様において、前記翻訳後修飾は、リン酸化（phophorylation）、グリコシレーションおよびユビキチン化からなる群から選択される。
【００１１】
ある態様において、前記ＸＢＰ−１の活性は、ＸＢＰ−１とＩＲＥ−１またはＡＴＦ６αとの結合を測定することによって測定される。
【００１２】
別の態様において、前記ＸＢＰ−１の活性は、ＸＢＰ−１とＸＢＰ−１に応答する遺伝子の調節領域との結合を測定することによって測定される。
【００１３】
ある態様において、前記遺伝子は、シャペロン遺伝子である。別の態様において、前記遺伝子は、ＥＲｄｊ４、ｐ５８ｉｐｋ、ＥＤＥＭ、ＰＤＩ-Ｐ５、ＲＡＭＰ４、ＨＥＤＪ、ＢｉＰ、ＡＴＦ６α、ＸＢＰ−１、ArmetおよびＤＮＡＪＢ９からなる群から選択される。
【００１４】
ある態様において、前記ＸＢＰ−１の活性は、タンパク質の産生を測定することによって測定される。ある態様において、前記タンパク質は、α-フェトプロテイン、α１-抗トリプシンおよびアルブミンからなる群から選択される。ある態様において、前記タンパク質は、免疫グロブリンである。
【００１５】
ある態様において、前記ＸＢＰ−１の活性は、ＩＬ-６発現を測定することによって測定される。
【００１６】
ある態様において、前記指標組成物は、ＸＢＰ−１タンパク質を発現する細胞である。
【００１７】
別の態様において、前記細胞は、ＸＢＰ−１タンパク質をコードする発現ベクターを前記細胞に導入することによって、ＸＢＰ−１タンパク質を発現するように操作されている。
【００１８】
さらに別の態様において、前記指標組成物は、無細胞組成物である。
【００１９】
さらに別の態様において、前記指標組成物は、ＸＢＰ−１タンパク質と標的分子を発現する細胞であり、前記試験化合物のＸＢＰ−１タンパク質と標的分子との相互作用を調整する能力がモニターされる。
【００２０】
別の態様において、前記指標組成物は、指標細胞を含み、前記指標細胞は、ＸＢＰ−１タンパク質およびＸＢＰ−１タンパク質に応答するレポーター遺伝子を含む。
【００２１】
別の態様において、前記指標細胞は、ＸＢＰ−１タンパク質をコードする組換え発現ベクターを含有し、レポーター遺伝子に作用可能に結合するＸＢＰ−１応答調節エレメントを含み、前記方法は、ａ）前記指標細胞を試験化合物に接触させること；ｂ）前記試験化合物の存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現レベルを決定すること；およびｃ）前記試験化合物の存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現レベルと、前記試験化合物の不存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現レベルとを比較し、それによってＸＢＰ−１タンパク質の活性を調整する関連化合物を選択することを含む。
【００２２】
別の局面において、本発明は、哺乳動物ＸＢＰ−１の生物学的活性を調整する際に有用な化合物を同定する方法であって、ａ）哺乳動物ＩＲＥ-１タンパク質を含む指標組成物を提供すること；ｂ）前記指標組成物を試験化合物のライブラリーの各メンバーに接触させること；ｃ）前記試験化合物のライブラリーから、ＩＲＥ-１タンパク質の発現、プロセシング、翻訳後修飾、および/または活性を調整する関連化合物を選択し、それによって哺乳動物ＸＢＰ−１の生物学的活性を調整する化合物を同定することを含む方法に関する。
【００２３】
ある態様において、前記生物学的活性は、ＵＰＲの調整、細胞分化の調整、ＩＬ−６産生の調整、免疫グロブリン産生の調整、プロテアソーム経路の調整、タンパク質の折り畳みおよび輸送の調整、Ｂ細胞最終分化の調整、ならびにアポトーシスの調整からなる群から選択される。
【００２４】
ある態様において、前記ＩＲＥ-１の活性は、キナーゼ活性である。
【００２５】
別の態様において、前記ＩＲＥ-１の活性は、エンドリボヌクレアーゼである。
【００２６】
さらに別の態様において、前記ＩＲＥ-１の活性は、ＩＲＥ-１のＸＢＰ−１との結合を測定することによって測定される。
【００２７】
また別の態様において、前記指標組成物は、ＩＲＥ-１を発現する細胞である。
【００２８】
別の態様において、前記細胞は、ＩＲＥ-１タンパク質をコードする発現ベクターを前記細胞に導入することによって、ＩＲＥ-１タンパク質を発現するように操作されている。
【００２９】
別の態様において、前記指標組成物は、無細胞組成物である。
【００３０】
さらに別の態様において、前記指標組成物は、ＩＲＥ-１タンパク質と標的分子を発現する細胞であり、前記試験化合物のＩＲＥ-１タンパク質と標的分子との相互作用を調整する能力がモニターされる。
【００３１】
さらに別の局面において、本発明は、哺乳動物ＸＢＰ−１の生物学的活性を調整する化合物を同定する方法であって、ａ）ＸＢＰ−１が欠損している細胞またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子を試験化合物に接触させること；およびｂ）ＸＢＰ−１が欠損している細胞またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子における生物学的活性を調整する試験化合物の能力に基づいて生物学的活性のモジュレーターとして同定される試験化合物が、ＸＢＰ−１の生物学的活性に及ぼす効果を決定する方法に関する。
【００３２】
ある態様において、前記細胞は、ＸＢＰ−１が欠損する非ヒト動物の細胞中にあり、またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子および細胞は、前記試験化合物を前記動物に接触投与することによって前記試験化合物に接触させる。
【００３３】
さらに別の局面において、本発明は、哺乳動物ＸＢＰ−１の生物学的活性を調整する際に有用な化合物を同定する方法であって、ａ）哺乳動物ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子を提供すること；ｂ）前記指標組成物を試験化合物のライブラリーの各メンバーに接触させること；ｃ）前記試験化合物のライブラリーから、ＸＢＰ−１タンパク質もしくはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の、発現、プロセシング、翻訳後修飾、および/または活性を調整する関連化合物を選択し、それによってＸＢＰ−１経路の生物学的活性を調整する化合物を同定することを含む方法に関する。
【００３４】
別の態様において、指標組成物は、ＸＢＰ−１、ＩＲＥ-１、ＰＥＲＫおよび/またはＡＴＦ６αタンパク質を発現する細胞である。
【００３５】
別の態様において、細胞は、ＸＢＰ−１、ＩＲＥ-１、ＰＥＲＫまたはＡＴＦ６αタンパク質をコードする発現ベクターを前記細胞に導入することによって、ＸＢＰ−１、ＩＲＥ-１、ＰＥＲＫまたはＡＴＦ６αタンパク質を発現するように操作されている。
【００３６】
ある態様において、指標組成物は、無細胞組成物である。
【００３７】
ある態様において、指標組成物は、ＸＢＰ−１、ＩＲＥ-１、ＰＥＲＫまたはＡＴＦ６αタンパク質と標的分子を発現する細胞であり、前記試験化合物のＸＢＰ−１、ＩＲＥ-１、ＰＥＲＫまたはＡＴＦ６αタンパク質と標的分子との相互作用を調整する能力がモニターされる。
【００３８】
別の局面において、本発明は、自己免疫疾患を調整する際に有用な化合物を同定する方法であって、ａ）ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子を含む指標組成物を提供すること；ｂ）前記指標組成物を試験化合物のライブラリーの各メンバーに接触させること；およびｃ）前記試験化合物のライブラリーから、ＸＢＰ−１タンパク質もしくはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の発現、プロセシング、翻訳後修飾、および/または活性をダウンレギュレートする関連化合物を選択し、それによって自己免疫疾患を調整する化合物を同定することを含む方法に関する。
【００３９】
別の態様において、ＸＢＰ−１の活性は、ＸＢＰ−１と、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６αとの結合を測定することによって測定される。
【００４０】
ある態様において、ＸＢＰ−１の活性は、ＸＢＰ−１と、ＸＢＰ−１に応答する遺伝子の調節領域との結合を測定することによって測定される。
【００４１】
ある態様において、遺伝子は、シャペロン遺伝子である。別の態様において、遺伝子は、ＥＲｄｊ４、ｐ５８ｉｐｋ、ＥＤＥＭ、ＰＤＩ−Ｐ５、ＲＡＭＰ４、ＨＥＤＪ、ＢｉＰ、ＡＴＦ６α、ＸＢＰ−１およびＤＮＡＪＢ９からなる群から選択される。
【００４２】
ある態様において、ＸＢＰ−１の活性は、タンパク質の産生を測定することによって測定される。別の態様において、タンパク質は、α-フェトプロテイン、アルブミン、α１-抗トリプシンまたは免疫グロブリンからなる群から選択される。
【００４３】
ある態様において、ＸＢＰ−１の活性は、ＩＬ-６発現を測定することによって測定される。
【００４４】
別の態様において、ＩＲＥ-１の活性が測定される。ある態様において、ＩＲＥ-１の活性は、キナーゼ活性である。別の態様において、ＩＲＥ-１の活性は、エンドリボヌクレアーゼ活性である。別の態様において、ＲＥ-１の活性は、ＩＲＥ-１とＸＢＰ−１の結合を測定することによって測定される。
【００４５】
ある態様において、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、グッドパスチャー病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、尋常天疱瘡、重症筋無力症、強皮症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、多発性筋炎および皮膚筋炎、悪性貧血、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎、血管炎、多発性硬化症、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、ならびにI型糖尿病からなる群から選択される。
【００４６】
別の態様において、自己免疫疾患は抗体の産生を含む。
【００４７】
ある局面において、本発明は、悪性疾患を治療するのに有用な化合物を同定する方法であって、ａ）哺乳動物ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子を含む指標組成物を提供すること；ｂ）前記指標組成物を試験化合物のライブラリーの各メンバーに接触させること；ｃ）前記試験化合物のライブラリーから、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の発現、プロセシング、翻訳後修飾、および/または活性を調整する関連化合物を選択し、それによって悪性疾患を調整する化合物を同定することを含む方法に関する。
【００４８】
ある態様において、ＸＢＰ−１の活性は、前記ＸＢＰ−１とＩＲＥ-１の結合を測定することによって測定される。
【００４９】
別の態様において、ＸＢＰ−１の活性は、ＸＢＰ−１とＸＢＰ−１に応答する遺伝子の調節領域との結合を測定することによって測定される。ある態様において、遺伝子は、シャペロン遺伝子である。別の態様において、遺伝子は、ＥＲｄｊ４、ｐ５８ｉｐｋ、ＥＤＥＭ、ＰＤＩ-Ｐ５、ＲＡＭＰ４、ＨＥＤＪ、ＢｉＰ、ＡＴＦ６α、ＸＢＰ−１、ArmetおよびＤＮＡＪＢ９からなる群から選択される。
【００５０】
ある態様において、ＸＢＰ−１の活性は、タンパク質の産生を測定することによって測定される。別の態様において、タンパク質は、α-フェトプロテイン、アルブミン、α１-抗トリプシン、または免疫グロブリンからなる群から選択される。
【００５１】
別の態様において、ＸＢＰ−１の活性は、ＩＬ-６発現を測定することによって測定される。
【００５２】
さらに別の態様において、シグナル伝達経路中の分子は、ＩＲＥ-１であり、前記ＩＲＥ-１の活性は、キナーゼ活性を測定することによって測定される。
【００５３】
別の態様において、シグナル伝達経路中の分子は、ＩＲＥ-１であり、前記ＩＲＥ-１の活性は、エンドリボヌクレアーゼ活性である。別の態様において、シグナル伝達経路中の分子は、ＩＲＥ-１であり、前記ＩＲＥ-１の活性は、ＩＲＥ-１とＸＢＰ−１との結合を測定することによって測定される。
【００５４】
ある態様において、悪性疾患は、急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌腫；エイズ関連性リンパ腫；胆管癌；膀胱癌；骨の癌、悪性骨肉種、線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、脳腫瘍；乳癌；気管支腺腫；カルチノイド腫瘍；副腎皮質カルシノーマ；中枢神経系リンパ腫；サイナスの癌、胆嚢癌；胃癌；唾液腺の癌；食道癌；神経細胞の癌；腸の癌（例えば、大腸または小腸）；子宮頸癌；結腸癌；結腸直腸癌；皮膚Ｔ細胞リンパ腫；Ｂ細胞リンパ腫；Ｔ細胞リンパ腫；子宮体癌；上皮癌；子宮体癌；眼内メラノーマ；網膜芽細胞腫；ヘアリーセル白血病；肝臓癌；ホジキン病；カポジ肉腫；急性リンパ芽球性白血病；肺癌；非ホジキンリンパ腫；メラノーマ；多発性骨髄腫；神経芽細胞腫；前立腺癌；網膜芽細胞腫；ユーイング肉腫；膣癌；ワルデンストレーム大グロブリン血症；悪性腺腫；卵巣癌；慢性リンパ性白血病、膵臓癌；ウイルム腫瘍からなる群から選択される。
【００５５】
ある態様において、悪性疾患が分泌細胞内にある。
【００５６】
別の局面において、本発明は、哺乳動物ＸＢＰ−１と哺乳動物ＩＲＥ-１との相互作用を調整する化合物を同定する方法であって、ａ）ＸＢＰ−１分子のＩＲＥ-１相互作用部分を含む第１のポリペプチドと、ＩＲＥ-１分子のＸＢＰ−１相互作用部分を含む第１のポリペプチドを、複数の試験化合物の存在下および不存在下に提供すること；およびｂ）試験化合物の存在下および不存在下における前記第１と第２のポリペプチドとの相互作用の程度を決定し、それによって哺乳動物ＸＢＰ−１と哺乳動物ＩＲＥ-１の間の相互作用を調整する化合物を同定することを含む方法に関する。
【００５７】
さらに別の局面において、哺乳動物ＸＢＰ−１と哺乳動物ＡＴＦ６αとの相互作用を調整する化合物を同定する方法であって、ａ）ＸＢＰ−１分子のＡＴＦ６α相互作用部分を含む第１のポリペプチドと、ＡＴＦ６α分子のＸＢＰ−１相互作用部分を含む第１のポリペプチドを、複数の試験化合物の存在下および不存在下に提供すること；およびｂ）試験化合物の存在下および不存在下における前記第１と第２のポリペプチドとの相互作用の程度を決定し、それによって哺乳動物ＸＢＰ−１と哺乳動物ＡＴＦ６αの間の相互作用を調整する化合物を同定することを含む方法に関する。
【００５８】
別の態様において、第１と第２のポリペプチドの相互作用は、ＸＢＰ−１と、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６αとの結合を測定することによって決定される。さらに別の態様において、第１と第２のペプチドの間の相互作用は、ＸＢＰ−１活性を測定することによって決定される。
【００５９】
ある態様において、第１と第２のペプチドの間の相互作用は、ＸＢＰ−１のスプライシングされたレベルを測定することによって決定される。
【００６０】
別の態様において、第１と第２のペプチドの間の相互作用は、ＸＢＰ−１のスプライシングされていないレベルを測定することによって決定される。
【００６１】
ある態様において、化合物は、自己免疫疾患を治療するために有用である。
【００６２】
別の態様において、化合物は、悪性疾患を治療するために有用である。
【００６３】
さらに別の態様において、化合物は、ＸＢＰ−１の生物学的活性を調整するために有用である。
【００６４】
別の局面において、本発明は、外因性哺乳動物ＸＢＰ−１分子、またはその部分を含む組換え細胞であって、スプライシング部位にまたがるＸＢＰ−１のヌクレオチド配列および、ＸＢＰ−１タンパク質をスプライシングするとすぐ、レポーター遺伝子の転写が起こるように、スプライシングされたＸＢＰ−１の調節領域に作用可能に結合するレポーター遺伝子を含む組換え細胞に関する。
【００６５】
別の局面において、化合物が哺乳動物ＸＢＰ−１のスプライシングを上方調整する能力を検出するための方法であって、請求項６８に記載の細胞を化合物に接触させること、および前記化合物の存在下および不存在下でレポーター遺伝子の発現を測定することを含み、前記化合物の存在下でスプライシングされたＸＢＰ−１のレベルが上昇すると、前記化合物が哺乳動物ＸＢＰ−１のスプライシングを上方調整することを示す方法に関する。
【００６６】
さらに別の局面において、本発明は、哺乳動物ＸＢＰ−１の細胞中での発現および/または活性を調整する方法であって、前記細胞を、ＸＢＰ−１を活性化するタンパク質の発現および/または活性を調整する作用物質に接触させ、それによって哺乳動物ＸＢＰ−１の発現および/または活性を調節することを含む方法に関する。
【００６７】
ある態様において、ＸＢＰ−１を活性化するタンパク質は、ＩＲＥ-１である。
【００６８】
ある態様において、作用物質は、ジペプチジルボロナート（dipeptidyl boronate）クラスのプロテアソームインヒビターではない。
【００６９】
別の態様において、細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者からの細胞である。
【００７０】
さらに別の態様において、患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される。
【００７１】
別の局面において、本発明は、その転写が哺乳動物ＸＢＰ−１によって調節される遺伝子の、細胞中での発現を調整する方法であって、前記細胞を、スプライシングされたＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を増加させる作用物質に接触させ、遺伝子の発現を変えることを含む方法に関する。
【００７２】
ある態様において、細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者に存在する細胞からの単離された細胞である。
【００７３】
ある態様において、患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される。
【００７４】
さらに別の局面において、本発明は、その転写が哺乳動物ＸＢＰ−１によって調節される遺伝子の、細胞中での発現を調整する方法であって、前記細胞を、スプライシングされたＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を増加させる作用物質に接触させ、遺伝子の発現を変えることを含む方法に関する。
【００７５】
ある態様において、細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者に存在する細胞からの単離された細胞である。
【００７６】
ある態様において、患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される。
【００７７】
ある態様において、接触させるステップは、ＸＢＰ−１の生物学的活性の調節が有効である被験体のin vivoで行われる。
【００７８】
さらに別の局面において、本発明は、転写がＸＢＰ−１によって調節される、ＸＢＰ−１の生物学的作用の媒介に関与する遺伝子の哺乳動物細胞中での発現を増加させる方法であって、細胞を、ＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を調整する作用物質に接触させ、前記遺伝子の発現を増加させる方法に関する。
【００７９】
ある態様において、細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者に存在する細胞からの単離された細胞である。
【００８０】
ある態様において、患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される。
【００８１】
更なる局面において、本発明は、転写がＸＢＰ−１によって調節される、ＸＢＰ−１の生物学的作用の媒介に関与する遺伝子の哺乳動物細胞中での発現を増加させる方法であって、細胞を、ＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を調整する作用物質に接触させ、前記遺伝子の発現を増加させる方法に関する。
【００８２】
ある態様において、作用物質は、ジペプチジルボロナートクラスのプロテアソームインヒビターではない。
【００８３】
さらに別の態様において、細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者に存在する細胞から単離された細胞である。
【００８４】
ある態様において、患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される。
【００８５】
さらに別の局面において、本発明は、転写がＸＢＰ−１によって調節される、ＸＢＰ−１の生物学的作用の媒介に関与する遺伝子の哺乳動物細胞中での発現を増加させる方法であって、細胞を、スプライシングされたＸＢＰ−１の、細胞中での発現を増加させる作用物質に接触させ、前記遺伝子の発現を増加させる方法に関する。
【００８６】
ある態様において、細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者に存在する細胞から単離された細胞である。
【００８７】
ある態様において、患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される。
【００８８】
さらに別の局面において、本発明は、転写がＸＢＰ−１によって調節される、ＸＢＰ−１の生物学的作用の媒介に関与する遺伝子の哺乳動物細胞中での発現を増加させる方法であって、細胞を、スプライシングされていないＸＢＰ−１の、細胞中での発現を増加させる作用物質に接触させ、前記遺伝子の発現を増加させる方法に関する。
【００８９】
ある態様において、スプライシングされていないＸＢＰ−１の活性は、スプライシングされたＸＢＰ−１の活性を阻害することを含む。
【００９０】
別の局面において、本発明は、転写がＸＢＰ−１によって調節される、ＸＢＰ−１の生物学的作用の媒介に関与する遺伝子の哺乳動物細胞中での発現を減少させる方法であって、細胞を、スプライシングされたＸＢＰ−１の、細胞中での発現を減少させる作用物質に接触させ、前記遺伝子の発現を減少させる方法に関する。
【００９１】
ある態様において、作用物質は、ジペプチジルボロナートクラスのプロテアソームインヒビターではない。
【００９２】
ある態様において、細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者に存在する細胞から単離された細胞である。
【００９３】
ある態様において、患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される。
【００９４】
更なる態様において、スプライシングされたＸＢＰ−１の活性は、RNAiを媒介する、強い陰性のＸＢＰ−１タンパク質または核酸の、スプライシングされたＸＢＰ−１の活性を阻害するのに十分な量を細胞に導入することによって減少する。
【００９５】
別の局面において、本発明は、転写がＸＢＰ−１によって調節される、ＸＢＰ−１の生物学的作用の媒介に関与する遺伝子の哺乳動物細胞中での発現を減少させる方法であって、細胞を、スプライシングされていないＸＢＰ−１の、細胞中での発現を減少させる作用物質に接触させ、前記遺伝子の発現を減少させる方法に関する。
【００９６】
ある態様において、スプライシングされていないＸＢＰ−１の活性は、スプライシングされたＸＢＰ−１の活性を阻害することを含む。
【００９７】
ある態様において、遺伝子は、ＥＲｄｊ４、ｐ５８ｉｐｋ、ＥＤＥＭ、ＰＤＩ-Ｐ５、ＲＡＭＰ４、ＨＥＤＪ、ＢｉＰ、ＡＴＦ６α、ＸＢＰ−１、ArmetおよびＤＮＡＪＢ９からなる群から選択される。
【００９８】
ある態様において、細胞は、Ｂ細胞である。
【００９９】
別の局面において、本発明は、少なくとも１つの哺乳動物ＸＢＰ−１の生物学的活性を調整する方法であって、細胞を、スプライシングされたＸＢＰ−１の細胞中での、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を増加させる作用物質と接触させ、哺乳動物ＸＢＰ−１の少なくとも１つの生物学的活性を調整する方法に関する。    
【０１００】
ある態様において、細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者に存在する細胞からの単離された細胞である。
【０１０１】
ある態様において、患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される。
【０１０２】
さらに別の局面において、少なくとも１つの哺乳動物ＸＢＰ−１の生物学的活性を調整する方法であって、細胞を、スプライシングされたＸＢＰ−１の細胞中での、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を減少させる作用物質と接触させ、前記生物学的活性を調整する方法に関する。
【０１０３】
ある態様において、作用物質は、ジペプチジルボロナートクラスのプロテアソームインヒビターではない。
【０１０４】
別の態様において、細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者に存在する細胞からの単離された細胞である。
【０１０５】
さらに別の態様において、患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される。
【０１０６】
さらに別の局面において、本発明は、哺乳動物細胞をスプライシングされていないＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を調整する作用物質に接触させることを含む、細胞分化を調整する方法に関する。
【０１０７】
ある態様において、細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者に存在する細胞からの単離された細胞である。
【０１０８】
ある態様において、患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される。
【０１０９】
別の局面において、本発明は、哺乳動物細胞において、ＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路を誘導する細胞外の影響によって活性化される遺伝子の発現レベルを下方調整する方法であって、前記方法は、スプライシングされたＸＢＰ−１の細胞中での発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を減少させる作用物質に接触させ、前記遺伝子の発現を減少させる方法に関する。
【０１１０】
ある態様において、作用物質は、ジペプチジルボロナートクラスのプロテアソームインヒビターではない。
【０１１１】
別の態様において、細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者に存在する細胞から単離された細胞である。
【０１１２】
ある態様において、患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される。
【０１１３】
さらに別の局面において、本発明は、哺乳動物細胞において、ＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路を誘導する細胞外の影響によって活性化される遺伝子の発現レベルを上方調整する方法であって、前記方法は、スプライシングされたＸＢＰ−１の細胞中での発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を増加させる作用物質に接触させ、前記遺伝子の発現を増加させる方法に関する。
【０１１４】
ある態様において、細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者に存在する細胞から単離された細胞である。
【０１１５】
別の態様において、患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される。
【０１１６】
ある態様において、細胞外の影響がＥＲストレスを誘発する。
【０１１７】
さらに別の局面において、本発明は、哺乳動物細胞において、ＸＢＰ−１媒介性の細胞内シグナリングを下方調整する方法であって、前記細胞を、スプライシングされたＸＢＰ−１の前記細胞中での発現、プロセシング、翻訳後修飾、および/または活性を下方調整する作用物質に接触させ、ＸＢＰ−１媒介性の細胞内シグナリングを下方調整することを含む方法に関する。
【０１１８】
ある態様において、作用物質は、ジペプチジルボロナートクラスのプロテアソームインヒビターではない。
【０１１９】
別の態様において、細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者に存在する細胞から単離された細胞である。
【０１２０】
ある態様において、患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される。
【０１２１】
さらに別の局面において、本発明は、ＸＢＰ−１媒介性の細胞内シグナリングを上方調整する方法であって、哺乳動物細胞を、スプライシングされたＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾、および/または活性を上方調整する作用物質に接触させ、ＸＢＰ−１媒介性の細胞内シグナリングを上方調整することを含む方法に関する。
【０１２２】
ある態様において、細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者に存在する細胞から単離された細胞である。
【０１２３】
別の態様において、患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される。
【０１２４】
別の局面において、本発明は、細胞内でのＩＬ-６発現を増加させる方法であって、細胞を、前記細胞内においてスプライシングされたＸＢＰ−１の活性を増加させる作用物質に接触させ、ＩＬ-６発現を増加させることを含む方法に関する。
【０１２５】
さらに別の局面において、本発明は、細胞内でのＩＬ-６発現を増加させる方法であって、細胞を、前記細胞内においてスプライシングされていないＸＢＰ−１の活性を増加させる作用物質に接触させ、ＩＬ-６発現を増加させることを含む方法に関する。
【０１２６】
さらに別の局面において、本発明は、細胞内でのＩＬ-６発現を減少させる方法であって、細胞を、前記細胞内においてスプライシングされたＸＢＰ−１の活性を減少させる作用物質に接触させ、ＩＬ-６発現を減少させることを含む方法に関する。
【０１２７】
さらに別の局面において、本発明は、細胞内でのＩＬ-６発現を減少させる方法であって、細胞を、前記細胞内においてスプライシングされていないＸＢＰ−１の活性を減少させる作用物質に接触させ、ＩＬ-６発現を減少させることを含む方法に関する。
【０１２８】
別の局面において、本発明は、哺乳動物細胞においてアポトーシスを下方調整する方法であって、細胞を、前記細胞内においてスプライシングされたＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を減少させる作用物質に接触させ、アポトーシスを減少させることを含む方法に関する。
【０１２９】
さらに別の局面において、本発明は、哺乳動物細胞においてアポトーシスを上方調整する方法であって、細胞を、前記細胞内においてスプライシングされたＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を減少させる作用物質に接触させ、アポトーシスを上方調整することを含む方法に関する。
【０１３０】
ある態様において、作用物質は、ジペプチジルボロナートクラスのプロテアソームインヒビターではない。
【０１３１】
ある態様において、細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者に存在する細胞から単離された細胞である。
【０１３２】
別の態様において、患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される。
【０１３３】
ある局面において、本発明は、タンパク質の折り畳み、輸送および/または分泌作用を増加させる方法であって、細胞を、前記細胞内においてスプライシングされたＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を増加させる作用物質に接触させ、タンパク質の産生を増加させることを含む方法方法に関する。
【０１３４】
ある態様において、タンパク質は、ウイルス蛋白である。
【０１３５】
ある態様において、タンパク質の折り畳み、または輸送の増加は、シャペロンタンパク質の増加によって測定される。
【０１３６】
別の態様において、タンパク質は、α-フェトプロテイン、アルブミン、α１-抗トリプシンおよびルシフェラーゼからなる群から選択される。
【０１３７】
さらに別の態様において、タンパク質は、前記細胞に対して外因性である。別の態様において、タンパク質は、免疫グロブリンである。
【０１３８】
別の態様において、細胞は、Ｂ細胞である。別の態様において、細胞は、ヘパトサイトである。
【０１３９】
別の態様において、タンパク質は、細胞内に組換えによって発現される。
【０１４０】
さらに別の局面において、本発明は、タンパク質の折り畳み、または輸送を増加させる方法であって、細胞を、前記細胞内においてスプライシングされていないＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を減少させる作用物質に接触させ、タンパク質の産生を増加させることを含む方法に関する。
【０１４１】
さらにまた別の局面において、本発明は、細胞中におけるタンパク質の折り畳み、または輸送を増加させる方法であって、細胞を、前記細胞内においてスプライシングされていないＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を増加させる作用物質に接触させ、タンパク質の産生を減少させることを含む方法に関する。
【０１４２】
ある態様において、作用物質は、ジペプチジルボロナートクラスのプロテアソームインヒビターではない。
【０１４３】
別の局面において、細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者からの細胞である。
【０１４４】
ある態様において、患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される。
【０１４５】
別の局面において、本発明は、Ｂ細胞の最終分化を調整する方法であって、哺乳動物細胞を、Ｂ細胞中のＩＬ-４誘導性シグナリングを調整して、ＸＢＰ−１誘導性の転写が調整する作用物質に接触させることを含み、それによってＢ細胞の最終分化を調整することを含む方法に関する。
【０１４６】
ある態様において、細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者からの細胞である。
【０１４７】
別の態様において、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される。
【０１４８】
さらに別の局面において、本発明は、哺乳動物細胞におけるＸＢＰ−１の生物学的活性を調整する方法であって、細胞を、Ｂ細胞の最終分化を誘導する作用物質に接触させることを含む方法に関する。
【０１４９】
ある態様において、細胞は、ＵＰＲの調整が必要であると同定された患者に存在する細胞からの単離された細胞である。
【０１５０】
ある態様において、患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される。
【０１５１】
ある態様において、作用物質は、ＩＬ-４である。
【０１５２】
別の態様において、作用物質は、シグナリングタンパク質、ＳＴＡＴ６を介して作用する。
【０１５３】
さらに別の態様において、作用物質は、ＬＰＳ、ＣＤ４０およびＩＬ-４からなる群から選択される１以上の作用物質である。
【０１５４】
ある局面において、本発明は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、哺乳動物被験体中での活性を下方調整する作用物質を用いた治療が有効となり得る異常を治療または予防するための方法であって、前記異常を持つ被験体にＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を下方調整する作用物質を投与することを含む方法に関する。
【０１５５】
ある態様において、患者は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を測定することによって同定される。
【０１５６】
別の態様において、作用物質は、スプライシングされていないＸＢＰ−１のスプライシングされたＸＢＰ−１に対する比率を調整する。
【０１５７】
別の態様において、疾患は自己免疫疾患である。さらに別の態様において、疾患は悪性疾患である。
【０１５８】
さらに別の局面において、本発明は、悪性疾患を有する哺乳動物被験体に、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を下方調整する作用物質を投与することを含み、さらに、悪性疾患を治療するのに有用なさらなる作用物質を含む、悪性疾患を治療または予防するための方法に関する。
【０１５９】
ある態様において、さらなる作用物質は、ジペプチジルボロナートクラスのプロテアソームインヒビターである。
【０１６０】
更なる局面において、本発明は、スプライシングされたＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、被験体中での活性を上方調整する作用物質を用いた治療によってが有効となり得る異常を治療または予防するための方法であって、前記異常を持つ被験体にＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の、発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を上方調整する作用物質を投与することを含む方法に関する。
【０１６１】
ある態様において、作用物質は、スプライシングされていないＸＢＰ−１のスプライシングされたＸＢＰ−１に対する比率を調整する。
【０１６２】
ある態様において、異常は、後天性免疫不全症の異常または感染症である。
【０１６３】
さらに別の局面において、本発明は、スプライシングされた哺乳動物ＸＢＰ−１をコードする核酸分子および抗原を含む免疫調節性組成物に関する。
【０１６４】
別の局面において、本発明は、スプライシングされた哺乳動物ＸＢＰ−１活性を増加させる化合物および抗原を含む免疫調節性組成物に関する。
【０１６５】
別の局面において、本発明は、スプライシングされた哺乳動物ＸＢＰ−１のインヒビターおよび抗原を含む免疫調節性組成物に関する。
【０１６６】
ある態様において、インヒビターは、スプライシングされた哺乳動物ＸＢＰ−１および抗原の強い陰性のインヒビターである。
【０１６７】
別の局面において、本発明は、被験体における自己免疫疾患を調整する方法であって、免疫調節性組成物を投与することを含む方法に関する。
【０１６８】
さらに別の局面において、本発明は、哺乳動物被験体における細胞分化を調整する方法であって、免疫調節性組成物を投与することを含む方法に関する。
【０１６９】
別の局面において、本発明は、哺乳動物被験体における免疫応答を高めるための方法であって、スプライシングされたＸＢＰ−１をコードする核酸分子を被験体に投与して、免疫応答を高める方法に関する。
【０１７０】
さらに別の局面において、本発明は、哺乳動物被験体における免疫応答を高めるための方法であって、ＸＢＰ−１アゴニストを被験体に投与して、免疫応答を高める方法に関する。  
【発明を実施するための最良の形態】
【０１７１】
本発明は、哺乳動物細胞における非折り畳みタンパク質応答において、ＸＢＰ−１が役割を果たすという所見に少なくとも部分的に基づいている。さらに、本実施例では、ＸＢＰ−１が種々の異なる遺伝子の発現を調節し、ＩＬ-６産生を活性化することを証明している。これらの所見は、ＸＢＰ−１（およびＸＢＰ−１が関与する経路における他の分子）の発現および/または活性化を調整する作用物質の、薬物標的としての、および治療的インターベンションの標的としての、単独もしくは更なる作用物質、例えば、プロテアソームインヒビターとの組み合わせでの使用を提供する。本発明はさらに、ＸＢＰ−１の調整は、ＵＰＲの調整、細胞分化の調整、ＩＬ−６産生の調整、免疫グロブリン産生の調整、プロテアソーム経路の調整、タンパク質の折り畳みおよび輸送の調整、Ｂ細胞最終分化の調整、ならびにアポトーシスの調整を含んだ種々の生物学的作用を有することを証明する。これらの所見は、ＸＢＰ−１（およびＸＢＰ−１が関与する経路における他の分子（例えば、ＩＲＥ-１およびＰＥＲＫ））の、薬物標的としての、および悪性疾患、後天性免疫不全症および自己免疫異常などの疾患における治療的インターベンションの標的としての、使用を提供する。本発明はさらにまた、ＸＢＰ−１活性を調整する作用物質を含むワクチンなどの免疫調節性組成物を提供する。
【０１７２】
本発明はさらに、スプライシングされた形態のＸＢＰ−１が遺伝子転写において活性な形態であることを確認し、さらにスプライシングされたＸＢＰ−１の活性がスプライシングされていない形態によって負に調節されることを示している。ＸＢＰ−１の活性は、スプライシングされていないＸＢＰ−１のスプライシングされたＸＢＰ−１に対する比率を増加させるプロテアソームインヒビターなどの作用物質によって調整されることがわかっている。
【０１７３】
本明細書に記載の特別な実施例において、スプライシングされたＸＢＰ−１は、形質細胞の分化を可能にするＢ細胞において、ＵＰＲを活性化することが示されている。ＸＢＰ−１は骨髄細胞の生存にとって、ＵＰＲにおけるその役割のため、およびＸＢＰ−１が、骨髄細胞の生存にとって重要な因子であるＩＬ-６を制御するという両方の理由から重要であることがわかっている。したがって、本発明は、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含む経路の他の分子を調製する作用物質を同定する方法、ならびにＸＢＰ−１の生物学的作用またはＸＢＰ−１を含む経路を介してのシグナリングを調整する方法を提供する。
【０１７４】
ＸＢＰ−１活性化は、他のいくつかの遺伝子、例えば、ＥＲｄｊ４、ｐ５８ｉｐｋ、ＥＤＥＭ、ＰＤＩ-Ｐ５、ＲＡＭＰ４、ＨＥＤＪ、ＢｉＰ、ＡＴＦ６α、ＸＢＰ−１、ArmetおよびＤＮＡＪＢ９（２２２アミノ酸であるｍＤｊ７（GenBankアクセッション番号： NM_013760 [gi:31560494]）をコードする）の発現を制御することが本明細書において示されている。これらの遺伝子は、種々の細胞機能において重要である。例えば、代表的なＥＲ局在化ＨＳＰ７０メンバーであるＢｉＰ/Ｇｒｐ７８を含むＨｓｐ７０ファミリーのタンパク質は、哺乳動物細胞におけるタンパク質折り畳みにおいて機能する。哺乳動物DnaJ/Hsp40様タンパク質のファミリーは、付属的な折り畳み機能を行うと仮定されると、最近同定された。そのうちの２つＥＲｄｊ４とｐ５８ｉｐｋは、ＥＲストレスによって誘発され、ＥＲに局在し、ＨＳＰ７０活性を調整することがわかった（Chevalier ら、2000 J
Biol Chem 275: 19620-19627;
OhtsukaとHata 2000 Cell Stress
Chaperones 5: 98-112; Yanら、2002 Proc Natl Acad Sci U S A 99: 15920-15925）。ＥＲｄｊ４は最近、ＢｉＰのATPase活性を刺激し、ＥＲストレス誘発性細胞死を抑制することがわかった（Kurisuら、2003 Genes Cells 8: 189-202; Shenら、2003 J Biol Chem 277: 15947-15956）。ＥＲｄｊ４、ｐ５８ｉｐｋ、ＥＤＥＭ、ＰＤＩ-Ｐ５、ＲＡＭＰ４、およびＨＥＤＪは全てＥＲ内で機能すると思われる。ＥＲｄｊ４（Shenら、2003）、ｐ５８ｉｐｋ（Melville ら、J Biol Chem 274: 3797-3803）、ＨＥＤＪ（Yuら、2000 Mol Cell 6: 1355-1364）は、ＥＲに局在し、HspTOファミリーシャペロンタンパク質のＨｓｐ４０様ATPase賦活活性を表示する。ＥＤＥＭは、ＥＲＡＤ基質の分解を促進することによってＥＲＡＤ経路に重要に関与していることがわかった（Hosokawa ら、2001 EMBO Rep 2:415-422; Molinariら、2003  Science 299 1397-1400; Odaら。2003 Science 299:1394-1397; Yoshidaら、2003 Dev. Cell.  4:265-271）。ＲＡＭＰ４は、ストレスに応答して、膜タンパク質の糖化および安定化に関与するタンパク質であることが最近同定された（Schroderら、1999 EMBO J 18:4804-4815; WangとDobberstein 1999 Febs Lett
457:316-322; Yamaguchiら、1999 J. Cell Biol 147:1195-1204）。ＰＤＩ-Ｐ５は、ジスルフィド結合形成に関与すると考えられているタンパク質ジスルフィドイソメラーゼに相同性をもつ（Kikuchiら、2002 J. Biochem （Tokyo） 132:451-455）。集合的に、これらの結果は、ＩＲＥ１/ＸＢＰ−１経路は、ＥＲにおける効率的なタンパク質折り畳み、成長および分解において必要であることを示している。
【０１７５】
別のＵＰＲシグナル伝達経路は、ＰＥＲＫタンパク質キナーゼによって活性化される。ＰＥＲＫは、ＡＴＦ４などの転写因子の誘導に伴うタンパク質の翻訳の過渡的な抑制を引き起こすｅＩＦ２αをリン酸化する（Hardingら、2000 Mol Cell 6: 1099-1108）。ｅＩＦ２αはまた、種々の細胞ストレス条件下で特異的なキナーゼである、二本鎖ＲＮＡ活性化キナーゼＰＫＲ、アミノ酸制御キナーゼＧＣＮ２およびヘム調節インヒビターＨＲＩによってもリン酸化される（Samuel 1993 J. Biol. Chem
268:7603-76-6; Kaufman
1999 Genes Dev.
13: 1211-1233）。ＰＥＲＫ経路によって誘導される遺伝子はまた、アミノ酸欠乏などの他のストレスシグナルによっても誘導されるので、ＰＥＲＫ依存性ＵＰＲ標的遺伝子は、細胞ホメオスタシス、アポトーシスおよび細胞サイクルなどの一般的な細胞防御メカニズムを行うと思われる（Hardingら、2003 Mol. Cell 11619-633）。集合的に、ＥＲストレスは、それぞれＩＲＥ／ＸＢＰ−１およびＰＥＲＫ／ｅＩＦ２α経路を活性化し、分泌性タンパク質の成熟と分解を確実にし、かつ一般的な細胞防御メカニズムを行う。
【０１７６】
ｐ５８ＩＰＫ遺伝子発現のＸＢＰ−１への依存は、ＵＰＲシグナル伝達経路、ＩＲＥ１／ＸＢＰ−１およびＰＥＲＫのうちの２つと関連する。ｐ５８ＩＰＫはもともと、インフルエンザウイルス感染腎細胞のＰＫＲの５８ｋＤインヒビターとして同定されていた（Leeら、1990 Proc Natl Acad Sci U S A 87: 6208-6212）、そしてキナーゼドメインに結合することによってＰＫＲの活性をダウンレギュレートするものであると記載されていた（Katze 1995 Trends
Microbiol 3: 75-78）。それはまた、ＪドメインをＣ末端に有しており、Ｈｓｐ７０ファミリータンパク質との相互作用に関与することがわかっている（Melvilleら、1999 J Biol Chem 274: 3797-380）。最近、Katzeらの研究グループは、ｐ５８ＩＰＫは、ＰＫＲと構造的に類似するＥＲＫと相互作用すること、そのｅＩＦ２αキナーゼ活性を阻害すること、およびそれはＵＰＲの間にそのプロモーター領域のＥＲストレス応答エレメントによって誘導されることを証明した（Yan et al. 2002 Proc Natl Acad Sci U S A 99: 15920-15925）。本明細書に記載したデータは、ＸＢＰ−１がＵＰＲの間にｐ５８ＩＰＫ発現を制御する転写因子であることを示している。これは、ＥＲストレスを受けたｐ５８ＩＰＫのアップレギュレーションがｅＩＦ２αリン酸化および、それに続く、ＰＥＲＫによって陰性フィードバックの方法で引き起こされるタンパク質翻訳の変化を緩和するかもしれない。
【０１７７】
これらの遺伝子およびＸＢＰ−１活性化に応答して発現された他の遺伝子は、機能的ＸＢＰ−１（もしくはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子）が異常に発現し、プロセシングし、および/または翻訳後修飾される、および/またはＸＢＰ−１もしくはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の活性が異常である疾患または異常における、治療標的となり得る。障害または疾患の例としては、悪性疾患、後天性免疫不全症、神経系障害（例えば、神経変性障害、神経性疾患（例えば、双極性障害））、II型糖尿病、自己免疫異常、細胞によるタンパク質分泌の減少もしくは細胞の小胞体中のタンパク質蓄積に伴う異常、細胞分化の調整がが有効である異常、ＵＰＲの調整がが有効である異常、ＩＬ-６産生の調整がが有効である異常、免疫グロブリン産生の調整がが有効である異常、プロテアソーム経路の調整がが有効である異常、タンパク質折り畳みおよび輸送の調整が有効である異常、Ｂ細胞最終分化の調整が有効である異常、またはアポトーシスの調整が有効である異常があげられる。
【０１７８】
本発明をより容易に理解できるよう、いくつかの用語をまず定義しておく。
【０１７９】
Ｉ．定義
本明細書において用いる用語「ＸＢＰ−１」とは、DNA結合タンパク質であり、例えば、Liou,
H-C.ら （1990） Science 247:
1581-1584 およびYoshimura, T.ら（1990） EMBO J. 9: 2537-2542に記載されたアミノ酸配列を有するＸボックス結合ヒトタンパク質、および、例えば、Kishimoto T. ら、（1996） Biochem. Biophys. Res. Commun. 223 : 746-751 （ラットホモログ）などに記載されたその他の哺乳動物ホモログを言う。用語「ＸＢＰ−１」に包含されると意図されたタンパク質には、GenBankにアクセッション番号A36299 [gi:105867]、NP_005071 [gi:4827058]、P17861
[gi:139787]、CAA39149 [gi:287645]およびBAA82600 [gi:5596360]で開示されたアミノ酸配列を有するもの、または、例えば、GenBankにアクセッション番号AF027963 [gi: 13752783]; NM_013842
[gi:13775155]; またはM31627 [gi:184485]で開示されたものなどの核酸分子によってコードされたものが含まれる。ＸＢＰ−１はまた、当該技術分野においてはＴＲＥＢ５またはＨＴＦとも呼ばれる（Yoshimuraら、1990. EMBO Journal. 9:2537; Matsuzakiら、1995. J.
Biochem. 117:303）。
【０１８０】
ＸＢＰ−１は、マウスクラスII MHC Aα・ 遺伝子またはHTLV-1 21塩基対エンハンサー中のCRE様部位における、サイクリックＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）様配列に結合するその能力によって独立に単離され、引き続いて、ＤＲα・およびHTLV-1 ltr遺伝子の双方の転写を調節することがわかっている、塩基性領域ロイシンジッパー（b-zip）転写因子である。
【０１８１】
b-zipファミリーの他のメンバーと同様、ＸＢＰ−１は、ＤＮＡ結合を媒介する、およびタンパク質のダイマー化を媒介するロイシンジッパー構造に隣接する塩基性領域を有している。欠失および変異解析は、酸性残基、グルタミン、セリン/トレオニンおよびプロリン/グルタミンに富んだ領域におけるＸＢＰ−１のＣ末端中のトランスアクチベーションドメインを同定した。ＸＢＰ−１は、慢性関節リウマチ患者の関節滑液膜中の形質細胞中に高レベルに存在する。ヒト多発性骨髄腫において、ＸＢＰ−１は、ＩＬ-６治療によって選択的に誘導され、悪性形質細胞の増殖に関与している。 
【０１８２】
上記のように、スプライシングされた、スプライシングされていない２種類の形態ＸＢＰ−１タンパク質が存在し、それらは、その配列および活性が著明に異なる。本明細書において、その形態について明確に述べられていない場合、本明細書に用いられている「ＸＢＰ−１」は、スプライシングされた、スプライシングされていない双方の形態を含むものとする。スプライシングされたＸＢＰ−１タンパク質は、ＵＰＲの活性化、細胞質の分化の制御（図１Ｂ）および骨髄腫細胞生存サイトカインＩＬ-６の産生の制御（図１Ｃ）を直接的にコントロールし、一方、スプライシングされていないＸＢＰ−１は、そのスプライシングされたＸＢＰ−１を陰性調節する能力により、これらの経路のみにおいて機能する。
【０１８３】
本明細書において用いられている「スプライシングされたＸＢＰ−１」は、スプライシングされ、プロセシングされた形態の哺乳動物ＸＢＰ−１
ｍＲＮＡまたは対応するタンパク質を言う。ヒトおよびネズミＸＢＰ−１ ｍＲＮＡは、２６１および２６７アミノ酸のｂＺＩＰタンパク質をそれぞれコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１）を含有する。双方のｍＲＮＡはまた、特に、フレームにおいてではないが、ＯＲＦ１と重なる別のＯＲＦであるＯＲＦ２を含有する。ＯＲＦ２は、ヒトおよびネズミ細胞の２２２アミノ酸をコードする。ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡの、ヒトおよびネズミＯＲＦ１およびＯＲＦ２は、それぞれ７５％および８９％の同一性を共有している。ＥＲストレスに応答して、ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡは、ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡからイントロンを切断する、ＥＲ膜貫通エンドリボヌクレアーゼおよびキナーゼＩＲＥ-１によってプロセシングされる。ネズミおよびヒト細胞において、２６ヌクレオチドイントロンが切断される。切断されたイントロンの境界は、短いステムによって占められる７つの残基のうち２つのループを含むＲＮＡ構造に包含されている。切断されたイントロンの境界に対するＲＮＡ配列５’〜３’は、広範な塩基対の相互作用を形成する。ネズミおよびヒト細胞中の２６ヌクレオチドのスプライシングの結果、アミノ酸１６５におけるフレームシフトとなる（本明細書のＸＢＰ−１アミノ酸のナンバリングは、GenBankアクセッション番号NM_013842 [gi:13775155]に基づいている。また、当業者は、例えば、単純な位置合わせによって、他の生物からのＸＢＰ−１のアミノ酸番号に対応するアミノ酸番号を決定することができる）。これによって、第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１）からＣ末端９７アミノ酸を除去し、およびＯＲＦ２からの２１２アミノ酸の、ｂ-ＺＩＰドメインを含有するＯＲＦ１のＮ末端１６４アミノ酸への添加を引き起こす。哺乳動物細胞においては、このスプライシング事象の結果、２６７アミノ酸のスプライシングされていないＸＢＰ−１タンパク質の３７１アミノ酸のスプライシングされたＸＢＰ−１タンパク質への変換が起こる。スプライシングされたＸＢＰ−１はその後、それが標的配列に結合する核に転移して転写を誘導する。スプライシングされた形態のネズミＸＢＰ−１の核酸およびアミノ酸配列を図８Ｃおよび８Ｄにそれぞれ示す。
【０１８４】
本明細書において用いられている「スプライシングされていないＸＢＰ−１」は、プロセシングされていないＸＢＰ−１
ｍＲＮＡまたは対応するタンパク質を言う。上記したように、スプライシングされてないネズミＸＢＰ−１は、２６７アミノ酸長であり、スプライシングされたネズミＸＢＰ−１は、３７１アミノ酸長である。スプライシングされてないＸＢＰ−１の配列は、当該技術分野において公知であり、例えば、Liou, H-C. ら（1990） Science 247:1581-1584 and Yoshimura, T.ら （1990） EMBO J. 9:2537-2542、またはGenBankアクセッション番号NM_005080 [gi:14110394]もしくはNM_013842
[gi:13775155]に見出すことができる。スプライシングされていない形態のネズミＸＢＰ−１の核酸およびアミノ酸配列を図８Ａに示す。
【０１８５】
本明細書において用いられている「スプライシングされたＸＢＰ−１のスプライシングされていないＸＢＰ−１に対する比率」とは、細胞または無細胞系に存在するスプライシングされていないＸＢＰ−１の量に対する、細胞または無細胞系に存在するスプライシングされたＸＢＰ−１の量を言う。「スプライシングされていないＸＢＰ−１のスプライシングされたＸＢＰ−１に対する比率」は、スプライシングされていないＸＢＰ−１の量と比較したスプライシングされていないＸＢＰ−１の量を言う。「スプライシングされていないＸＢＰ−１のスプライシングされたＸＢＰ−１に対する比率の増加」は、例えば、スプライシングされていないＸＢＰ−１の分解を促進することによる、スプライシングされたＸＢＰ−１の量の増加またはスプライシングされていないＸＢＰ−１の量の減少を包含する。スプライシングされていないＸＢＰ−１のスプライシングされたＸＢＰ−１に対する比率の増加は、例えば、スプライシングされたＸＢＰ−１の量を減少させることによって、またはスプライシングされていないＸＢＰ−１の量を増加させることによって達成させることができる。スプライシングされたおよびスプライシングされていないＸＢＰ−１のレベルは、本明細書に記載のようにして、例えば、それぞれのそれぞれの分子量に基づいて、もしくはそれらが抗体によって認識され得る能力に基づいて区別可能なタンパク質のそれぞれの量を比較することによって、決定することができる。下記に詳細に記載した別の態様において、ＰＣＲは、スプライス部位にまたがるプライマーを用いて行い、スプライシングされていないＸＢＰ−１とスプライシングされたＸＢＰ−１、およびこれらのレベルの比率を容易に計算することができる。
【０１８６】
本明細書において用いられている「非折り畳みタンパク質応答」（UPR）または「非折り畳みタンパク質応答経路」は、ＥＲ中における非折り畳みタンパク質の蓄積への適応応答を言い、シャペロンをコードする遺伝子および折り畳み触媒およびタンパク質分解複合体をの転写活性化、ならびに非折り畳みタンパク質のさらなる蓄積を限定する翻訳減衰（translational attenuation）を含む。表面タンパク質および分泌されたタンパク質の双方が小胞体（ＥＲ）において合成され、そこでは、それらは輸送される前に折り畳まれ、集められる必要がある。
【０１８７】
ＥＲおよび核は、細胞内の別個の区画に位置するため、非折り畳みタンパク質シグナルは、ＥＲのルーメンで感知され、ＥＲ膜を超えて移送され、核内の転写機構において受信されなければならない。非折り畳みタンパク質応答（ＵＰＲ）は、細胞に対してこの機能を行う。ＵＰＲの活性化は、細胞に対するＤＴＴのような還元剤を用いた治療によって、ツニカマイシンのようなコアグリコシレーションのインヒビターによって、またはＥＲカルシウム貯蔵を欠失させるＣａイオン泳動によって引き起こされ得る。ＵＰＲは、酵母において最初に発見されたが、今ではC.elegansならびに哺乳動物細胞のものも記載されている。哺乳動物において、ＵＰＲシグナルカスケードは、３種類のＥＲ膜貫通タンパク質：タンパク‐キナーゼおよび部位特異的エンドリボヌクレアーゼＩＲＥ-１; 真核細胞翻訳開始ファクター２キナーゼ、ＰＥＲＫ/ＰＥＫ；および転写アクチベータＡＴＦ６によって媒介される。ＵＰＲがＥＲにおける非折り畳みタンパク質の存在に適用されることができない場合、アポトーシス反応が開始され、ＪＮＫタンパク質キナーゼおよびカスパーゼ７、１２および３の活性化を導く。ＥＲのルーメンからの最も近位のシグナルは、膜貫通エンドリボヌクレアーゼおよびＩＲＥ−１と呼ばれるキナーゼによって受け取られる。ＥＲストレスに続いて、ＩＲＥ−１は、生存にとって必須である。なぜなら、それは、ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡのスプライシングを開始し、そのスプライシングされたものが、本明細書に記載のようにＵＰＲを活性化するからである。
【０１８８】
真核細胞は、ＥＲレシデントタンパク質シャペロン、例えば、グルコース調節BiP/Grp74、GrP94およびCHOP遺伝子をコードする遺伝子の転写をアップレギュレートし、触媒とタンパク質を折り畳み、タンパク質折り畳みの助けとなる複合体を分解することによって、非折り畳みタンパク質の存在に応答する。本明細書において用いられている「ＵＰＲの調整」は、ＵＰＲのアップレギュレーションとダウンレギュレーションの双方を含む。本明細書において用いられている「ＵＰＲＥ」は、例えば、小胞体のルーメン内の非折り畳みタンパク質が蓄積され、送信されるシグナルに対して応答するこれらの遺伝子の、活性化に関与するＵＰＲエレメント上流の特定の遺伝子を言う。  
【０１８９】
本明細書において用いられている「ＥＲストレス」は、還元剤の存在下、ＥＲルーメンCa2+の欠乏、グリコシレーションの阻害または分泌経路の妨害（ゴルジ系への移行を阻害することによる）などの状況を含み、それは、誤折り畳みタンパク質中間体の蓄積を導き、シャペロン能力の需要を増加させ、ＥＲ特異的ストレス反応経路を誘導する。タンパク質プロセシングに関与するＥＲストレス経路としては、非折り畳みタンパク質応答（ＵＰＲ）および小胞体オーバーロード（ＥＯＲ）応答が含まれ、それは、ＵＰＲを活性化させる条件（例えば、グルコースの欠乏、グリコシレーション阻害）として知られているものと同じ特定の条件によって、ならびに、ＥＲ内のタンパク質の重過剰発現によって引き起こされる。ＥＯＲの際立つ特徴としては、その転写因子NF-κBとの関係が挙げられる。ＵＰＲとＥＯＲの双方を調整は、本発明の方法および組成物を用いて達成することができる。ＥＲストレスは、例えば、ＥＲCa2+ ATPase、例えば、タプシガルギンを阻害することによって誘導することができる。本明細書において用いられている「タンパク質の折り畳みまたは輸送」は、翻訳後プロセシングを包含する。それは、折り畳み、グリコシレーション、サブユニット組み立て、および分泌経路へ入る新生ポリペプチド鎖のゴルジ区画への移行、ならびにＥＲルーメン内に発生する、外部もしくは内部細胞膜へ定められているタンパク質のサイトゾル外部分を含む。ＥＲ内のタンパク質は、細胞表面に分泌され、発現されることになっている。したがって、細胞表面上でのタンパク質の発現またはタンパク質の分泌は、タンパク質折り畳みまたは輸送の指標として用いることができる。
【０１９０】
本明細書において用いられているように「プロテアソーム経路」は、それによって種々の細胞タンパク質が分解される経路を言い、ユビキチン−プロテアソーム経路とも呼ばれる。多くのタンパク質は、この経路内での、ユビキチンとの共有結合性付着による分解によって特徴付けられている。例えば、本明細書の実施例において示されているように、ＸＢＰ−１のスプライシングされていないタンパク質は、ユビキチン化されていない、したがって、非常に不安定なタンパク質の例である。ＸＢＰ−１のスプライシングされたタンパク質は、ユビキチン化されておらず、スプライシングされていないＸＢＰ−１タンパク質より半減期がはるかに長い。
【０１９１】
本明細書において用いられている用語「ＩＲＥ-１」は、ＥＲ膜貫通エンドリボヌクレアーゼおよび「鉄応答エレメント結合タンパク質-１」と呼ばれるキナーゼである。それは、 オリゴマー化し、非折り畳みタンパク質の存在を感知して自己リン酸化することによって活性化される（例えば、Shamuら、（1996） EMBO
J. 15: 3028-3039）。サッカロミセス-セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）において、ＵＰＲは、ＩＲＥｐによって制御される。哺乳動物ゲノムには、ＩＲＥ−１の２つのホモログ、ＩＲＥ１αおよびＩＲＥ１βが存在する。ＩＲＥ１αは、全ての細胞および組織において発現するが、一方、ＩＲＥ１βは、腸組織において主に発現する。ＵＰＲを活性化するにはＩＲＥ１αおよびＩＲＥ１βのいずれかのエンドリボヌクレアーゼで十分である。したがって、本明細書において用いられている「ＩＲＥ-１」は、例えば、ＩＲＥ１α、ＩＲＥ１βおよびＩＲＥｐを含む。好ましい態様において、ＩＲＥ-１はＩＲＥ１αである。
【０１９２】
ＩＲＥ−１は、タンパク質をＥＲ膜につなぎとめる膜貫通セグメントを持つ大きなタンパク質である。ＩＲＥ−１タンパク質のセグメントは、タンパク質キナーゼに相同性を有しており、そのＣ末端は、RNAsesにいくらかの相同性を有している。ＩＲＥ−１遺伝子の過剰発現は、ＵＰＲの構成的活性化を導く。タンパク質内の特異的なセリンまたはトレオニン残基においてＩＲＥ−１タンパク質のリン酸化が起こる。
【０１９３】
ＩＲＥ−１は、ＥＲのルーメン内の非折り畳みタンパク質の過剰を感知する。このキナーゼのオリゴマー化は、その細胞質ドメインのトランス自己リン酸化によるＣ末端エンドリボヌクレアーゼの活性化を導く。ＩＲＥ−１は、そのエンドリボヌクレアーゼ活性を利用して、ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡからイントロンを切断する。小イントロンの切断および除去に続いて、５’および３’断片の再ライゲーションを行い、より効率的に翻訳され、安定なタンパク質をコードする、プロセシングされたｍＲＮＡを作製する（Calfonら （2002） Nature 415（3）: 92-95）。ＸＢＰ−１をスプライシングするための切断反応のヌクレオチド特異性は、十分に記載されており、ＩＲＥ-ｐ媒介性のＨＡＣ１ ｍＲＮＡ 切断のそれに非常に類似している（Yoshidaら（2001） Cell 107:881-891）。特に、ネズミＸＢＰ−１ ｃＤＮＡのＩＲＥ−１媒介性の切断は、ヌクレオチド５０６および５３２で起こり、その結果、２６塩基対の切断が生じる（例えば、マウスＸＢＰ−１のCAGCACTCAGACTACGTGCACCTCTG 配列番号１）；図８Ａ参照）。ヒトを含む他の種に由来するＸＢＰ−１のＩＲＥ−１媒介性の切断は、ネズミＸＢＰ−１ ｃＤＮＡのヌクレオチド５０６および５３２に対応するヌクレオチド、例えば、ヒトＸＢＰ−１のヌクレオチド５０２〜５０３および５２８〜５２９において生じる。  
【０１９４】
本明細書において用いられている用語「活性化転写因子６」は、ＡＴＦ６αおよびＡＴＦ６βを含む。ＡＴＦ６は、転写因子の塩基性ロイシンジッパーファミリーのメンバーである。それは、膜貫通ドメインと含み、小胞体の膜に位置する。ＡＴＦ６は、ＥＲの膜に不活性化形態で構成的に発現する。ＥＲストレスに応答する活性化の結果、Ｎ末端細胞質ドメインのＳ２Ｐセリンプロテアーゼによる原核細胞の切断が起こり、シャペロン遺伝子の強力な転写アクチベータを生成する（Yoshidaら、1998 J. Biol. Chem. 273: 33741-33749; Liら 2000 Biochem J 350 Pt 1: 131-138; Yeら、2000 Mol Cell 6: 1355-1364; Yoshidaら2001 Cell 107: 881-891; Shenら. 2002 Dev Cell 3: 99-111）。最近記載されたＡＴＦ６βは、ＡＴＦ６αと構造的に密接に関連しており、ＵＰＲに関与すると仮定される（Hazeら、2001 Biochem
J 355: 19-28; Yoshidaら 2001b Mol Cell Biol
21: 1239-1248）。第３の経路は、タンパク質合成の転写後制御のレベルにおいて機能する。ＰＫＲと関連するＥＲ膜貫通成分、ＰＥＫ／ＰＥＲＫ（インターフェロン誘導性二本鎖ＲＮＡ活性化タンパク質キナーゼ）は、原形質において作用し、真核開始因子２α（ｅＩＦ２α）をリン酸化するセリン／トレオニンタンパク質キナーゼである。ｅＩＦ２αのリン酸化の結果、ＥＲに応答して翻訳の減衰が起こる（Shiら、Mol. Cell. Biol. 18: 7499-7509; Hardingら、1999 Nature
397: 271-274）。
【０１９５】
本明細書で用いられているように「ＩＬ−６」は、宿主防御メカニズムにおいて中心的な役割を果たす多機能性サイトカインを表す。ＩＬ−６は、標的細胞の表面上の少なくとも２つの特異的レセプターとの相互作用を介して機能する。これら２つのレセプター鎖のｃＤＮＡをクローニングした。それらは、２つの膜貫通糖タンパク質、すなわち、８０ｋＤａのＩＬ−６レセプター（「ＩＬ−６Ｒ」）、および１３０ｋＤａの「ｇｐ１３０」と呼ばれる糖タンパク質をコードしている。ＩＬ−６は、これらの糖タンパク質とユニークなメカニズムによって相互作用している。まず、ＩＬ−６Ｒは、ＩＬ−６と低アフィニティー（Ｋｄ＝約１ｎＭ）で信号を誘発すること無しに結合している。続いて、ＩＬ−６/ＩＬ−６Ｒ複合体は、ｇｐ１３０と結合し、信号の変換を行っている。Ｇｐ１３０自体は、溶液中のＩＬ−６に対してアフィニティーを持たないが、ＩＬ−６/ＩＬ−６ Ｒ複合体を膜上に安定化させ、その結果、ＩＬ−６と高いアフィニティーで結合している（Ｋｄ＝約１０ｐＭ）。成熟ヒトＩＬ−６は、２つのジスルフィド結合を含む１８５アミノ酸ポリペプチドであり、市販されている。本明細書において用いられている用語「ＩＬ−６産生を調整する」は、細胞中、例えば、多発性骨髄腫細胞中においてＩＬ−６産生を増加または減少させることを含む。ＩＬ−６は、種々のヒト炎症性疾患、自己免疫疾患、腫瘍性疾患（例えば、多発性骨髄腫）、敗血症、骨の吸収（骨粗鬆症）、悪液質、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、腎細胞癌、カポジ肉腫、慢性関節リウマチ、高γ−グロブリン血症、カストルマン病、IgM gammapathy、心臓粘液腫および自己免疫性インスリン依存性糖尿病において役割を果たしている。したがって、穂母、ＩＬ−６産生に関連する疾患の治療に有用である。
【０１９６】
本明細書において用いられている用語「自己免疫疾患」は、免疫系が自身の体の細胞を攻撃し、組織破壊を引き起こす、被験体における異常または状態を意味する。自己免疫疾患は、自己免疫応答が同時に多くの組織で起こる通常の自己免疫疾患、または自己免疫応答が単一の臓器を標的とする臓器特異的自己免疫疾患を含む。本発明の方法および組成物によって、診断、予防または治療されることができる自己免疫疾患の例としては、限定されないが、クローン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、全身紅はん性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、慢性関節リウマチ、グッドパスチャー病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、尋常天疱瘡、重症筋無力症、強皮症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、多発性筋炎および皮膚筋炎、悪性貧血、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎、および自己免疫疾患の結果引き起こされる二次疾患が含まれる。
【０１９７】
本明細書において用いられている用語「悪性疾患」は、非良性腫瘍または癌を意味する。ある態様において、悪性疾患は、体の他の部分にも広がっている（転移している）。悪性腫瘍は通常、治療せずに放置すれば、生命を脅かし、死を引き起こすことになる。治療すれば、悪性腫瘍の広がりは、遅らせることができ、また阻止することさえできる。治療前の組織の損傷の量によるが、組織または臓器の機能は取り留めることができる。本発明の方法および組成物によって、診断、予防または治療されることができる悪性疾患の例としては、限定されないが、急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌腫；エイズ関連性リンパ腫；胆管癌；膀胱癌；骨の癌、悪性骨肉種、線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、脳腫瘍；乳癌；気管支腺腫；カルチノイド腫瘍；副腎皮質カルシノーマ；中枢神経系リンパ腫；サイナスの癌、胆嚢癌；胃癌；唾液腺の癌；食道癌；神経細胞の癌；腸の癌（例えば、大腸または小腸）；子宮頸癌；結腸癌；結腸直腸癌；皮膚Ｔ細胞リンパ腫；Ｂ細胞リンパ腫；Ｔ細胞リンパ腫；子宮体癌；上皮癌；子宮体癌；眼内メラノーマ；網膜芽細胞腫；ヘアリーセル白血病；肝臓癌；ホジキン病；カポジ肉腫；急性リンパ芽球性白血病；肺癌；非ホジキンリンパ腫；メラノーマ；多発性骨髄腫；神経芽細胞腫；前立腺癌；網膜芽細胞腫；ユーイング肉腫；膣癌；ワルデンストレーム大グロブリン血症；悪性腺腫；卵巣癌；慢性リンパ性白血病、膵臓癌；ウイルム腫瘍が含まれる。
【０１９８】
ある態様において、本発明は、体の分泌細胞に由来する悪性疾患の診断および/または治療に有用である。本明細書において用いられる「分泌細胞」とは分泌に特化した細胞である。これらの細胞は通常、上皮を起源とし、よく発達した粗面小胞体を有し、または脂質を分泌する細胞または脂質由来産物の場合、よく発達した滑面小胞体を有することを特徴とする。分泌細胞の例としては、唾液腺細胞、乳腺細胞、涙腺細胞、クレウミナス腺細胞（creuminous gland cell）、エクリン汗腺細胞、アポクリン汗腺細胞、皮脂腺細胞、ボーマン腺細胞、ブルンナー腺細胞、精嚢腺細胞、前立腺細胞、尿道球腺細胞、バルトリン腺細胞、リトル腺細胞、子宮内膜細胞、呼吸器管および消化器管の杯細胞、胃の粘膜細胞、胃腺の酵素原細胞、胃腺の酸分泌細胞、膵臓の腺房細胞、小腸のパネート細胞、肺のII型肺細胞、肺のクララ細胞、下垂体前葉細胞、垂体中葉細胞、垂体後葉細胞、腸管および呼吸器管の細胞、甲状腺の細胞、副甲状腺の細胞、副腎腺の細胞、精巣の細胞、卵巣の細胞、腎臓の傍糸球体器の細胞、細胞外基質を分泌する細胞（例えば、上皮細胞、非上皮細胞（例えば、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞/骨細胞、骨原種細胞など）、および免疫系の分泌細胞（例えば、Ｉｇ産生Ｂ細胞、サイトカイン産生Ｔ細胞など）が含まれる。
【０１９９】
本明細書において用いられている「多発性骨髄腫」は、癌性形質細胞が制御不能に成長し、腫瘍を作出する骨髄の悪性疾患を言う。これらの腫瘍が多数部位において成長するとき、多発性骨髄腫と呼ばれる。通常、形質細胞は、骨髄の５％未満の細胞を構成するが、多発性骨髄腫のヒトは、１０％〜９０％以上あらゆるところにそれを有している。骨髄の悪性の形質細胞の過成長は、多くの深刻な問題を体中に引き起こし得る。時間が経つにつれて、骨の内部に浸透し、骨の皮質（外側の層）を侵食する。これらの弱くなった骨は、特に、背骨、頭蓋骨、肋骨、骨盤において骨折しやすくなる。
【０２００】
本明細書において用いられている「ＩＬ-４」は、それらの膜ＩｇＭの抗ＩｇＭ抗体による膜の架橋結合を介して刺激された休止Ｂ細胞の増殖における共因子である、多機能サイトカインを意味する。それはまた、Ｂ細胞の形質細胞分泌ＩｇＧへの分化を誘導するＴ細胞ファクターでもある。したがって、その早期の名前はＢ細胞刺激因子（ＢＳＦ−Ｉ）、Ｂ細胞分化因子Ｉ（ＢＣＤＦ−Ｉ）およびＢ細胞成長因子Ｉ（ＢＣＧＦ−Ｉ）であった。ＩＬ−４は、Ｂ細胞に対して、細胞周期の異なるステージにおいて異なる作用を及ぼす。休止Ｂ細胞に対しては、ＩＬ−４は、活性化因子として機能し、それらを増大するよう誘導し、クラスＩＩ ＭＨＣ発現を増加させる。抗原またはミトゲンによる活性化に続いて、Ｉｌ-４は、成長因子として機能し、Ｂ細胞においてＤＮＡ複製を誘発する。Ｂ細胞を増殖させる場合、ＩＬ−４は、クラススイッチをＣεおよびＣγ１、すなわち、ＩｇＥおよびＩｇＧ１サブクラスの作製に調節することによって分化因子として機能する。この役割において、「スイッチ誘導」因子と称されていた。ＩＬ−４はまた、Ｔ細胞発達に大きな役割を果たす。それは、免疫応答において、ＴヘルパーのＴＨ２細胞への分化の促進に影響力を有すると考えられている。ＩＬ−４はまたマスト細胞成長因子としても機能する。
【０２０１】
本明細書において用いられている用語「ＳＴＡＴ６」は、ＩＬ−４レセプターに結合したシグナル伝達タンパク質を意味する。ＳＴＡＴ６は、Ｔｈ２ Ｔ細胞およびＩｇＥクラススイッチの誘導において重要な役割を果たすＣＤ１２４の細胞質ドメインに関連する。ＩＬ−４は、ＣＤ１２４のためのリガンドである。
【０２０２】
本明細書で用いられている種々の形の用語「調整する」には、刺激（例えば、特定の応答または活性を増加させるまたはアップレギュレートするなど）、および阻害（例えば、特定の応答または活性を減少させるまたはダウンレギュレートするなど）が含まれる。
【０２０３】
本明細書で用いられている用語「ＸＢＰ−１のモジュレーター」は、ＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性のモジュレーターを含む。この語は、作用物質、例えば、ＸＢＰ−１遺伝子の転写、ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡのプロセシング（例えば、スプライシング）、ＸＢＰ−１
ｍＲＮＡの翻訳、ＸＢＰ−１タンパク質の翻訳後修飾（例えば、グリコシレーション、ユビキチン化）、またはＸＢＰ−１タンパク質の活性を調整する化合物または組成物を含む。「ＸＢＰ−１活性のモジュレーター」は、直接的または間接的にＸＢＰ−１活性を調整する化合物を含む。例えば、ＸＢＰ−１活性の間接的なモジュレーターは、ＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路内にある非ＸＢＰ−１分子を調整し得る。ＸＢＰ−１発現、プロセシング、翻訳後修飾、および/または活性を直接的に調整するモジュレーターの例としては、ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに結合するアンチセンスまたはｓｉＲＮＡ核酸分子、ＸＢＰ−１に細胞内において結合し、ＸＢＰ−１活性を調整（すなわち、阻害）する細胞内抗体、ＸＢＰ−１と標的分子（例えば、ＩＲＥ−１）との相互作用を阻害するＸＢＰ−１ペプチド、および細胞内でのＸＢＰ−１活性の発現を増加させるＸＢＰ−１をコードする発現ベクター、強い陰性形のＸＢＰ−１、ならびにＸＢＰ−１の活性を特異的に調整するように作用する化学化合物が含まれる。 
【０２０４】
本明細書において互換可能に用いられている用語「ＸＢＰ−１活性」、「ＸＢＰ−１の生物学的活性」または「機能的活性ＸＢＰ−１」は、ＸＢＰ−１応答細胞または組織上のＸＢＰ−１タンパク質によって示される活性、例えば、標準的な技法によってin vivoまたはin
vitroで決定される、ヘパトサイト、Ｂ細胞、またはＸＢＰ−１核酸分子またはタンパク質標的分子またはタンパク質標的分子、を含む。ＸＢＰ−１活性は、直接的な活性、例えば、ＸＢＰ−１標的分子との関係、例えば、スプライシングされたＸＢＰ−１のＸＢＰ−１に応答する遺伝子の調節領域への結合など（例えば、ＥＲｄｊ４、ｐ５８ｉｐｋ、ＥＤＥＭ、ＰＤＩ−Ｐ５、ＲＡＭＰ４、ＨＥＤＪ、ＢｉＰ、ＡＴＦ６α、ＸＢＰ−１、ArmetおよびＤＮＡＪＢ９）、またはスプライシングされたＸＢＰ−１の、スプライシングされていないＸＢＰ−１による阻害であることができる。または、ＸＢＰ−１活性は、ＸＢＰ−１タンパク質とＸＢＰ−１標的分子、例えば、ＩＲＥ−１の相互作用によって媒介される下流の生物学的事象などの間接的な活性である。ＸＢＰ−１の生物学的活性は本明細書に記載されている。そしてそれには、例えば、ＵＰＲの調整、細胞分化の調整、ＩＬ-６産生の調整、免疫グロブリン産生の調整、プロテアソーム経路の調整、タンパク質の折り畳みおよび輸送の調整、Ｂ細胞最終分化の調整、ならびにアポトーシスの調整が含まれる。これらの所見は、ＸＢＰ−１（およびＸＢＰ−１が関与する経路における他の分子）の、薬物標的としての、細胞におけるこれらの生物学的活性の調整の標的としての、および悪性疾患、後天性免疫不全症および自己免疫異常などの疾患における治療的インターベンションの標的としての、使用を提供する。本発明はさらにまた、ＸＢＰ−１活性を調整する作用物質を含むワクチンなどの免疫調節性組成物を提供する。
【０２０５】
「スプライシングされていないＸＢＰ−１の活性」は、スプライシングされたＸＢＰ−１の活性を調整することを含む。ある態様において、スプライシングされていないＸＢＰ−１は、標的ＤＮＡ配列とスプライシングされたＸＢＰ−１との結合と競合する。別の態様において、スプライシングされていないＸＢＰ−１は、ホメオスタシスまたはヘテロダイマー（例えば、ｃｆｏｓまたはＡＴＦ６α）のＸＢＰ−１による形成を破壊する。
【０２０６】
本明細書において互換可能に用いられている用語「ＩＲＥ-１活性」、「ＩＲＥ-１の生物学的活性」または「機能的活性ＩＲＥ−１」は、標準的な技法によってin vivoまたはin
vitroで決定されるように、ＩＲＥ−１応答性の標的または基質上のＩＲＥ−１によって示される活性を含む（Tirasophonら. 2000. 
Genes and Development Genes Dev. 2000 14: 2725-2736）。ＩＲＥ−１活性は、基質のリン酸化のような直接的な活性（例えば、オートキナーゼ活性）または、基質、例えば、ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡ上のエンドリボヌクレアーゼ活性であることができる。別の態様において、ＩＲＥ−１活性は、ＩＲＥ−１タンパク質とＩＲＥ−１標的分子または基質との相互作用によってもたらされる下流の事象などの間接的な活性である。ＩＲＥ−１が、ＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中にあるとき、ＩＲＥ−１の調整は、ＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子を調整する。ＸＢＰ−１の生物学的活性を調整するモジュレーターは、ＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子（例えば、ＩＲＥ−１、ＰＥＲＫ、ｅＩＦ２α、またはＡＴＦ６α）の発現および/または活性を直接的に調整する。
【０２０７】
本明細書において用いられている「基質」または「標的分子」または「結合パートナー」は、タンパク質の機能（例えば、ＸＢＰ−１の場合には、ＵＰＲ、形質細胞分化、ＩＬ-６賛成、免疫グロブリン産生もしくはアポトーシスの調整）が達成されるように、タンパク質が実際に結合または相互作用する分子である。例えば、標的分子は、タンパク質または核酸であることができる。本発明の標的分子の例としては、ＸＢＰ−１タンパク質と同じシグナル伝達経路中のタンパク質が含まれる。例えば、調節、例えば、ＵＰＲの調整、細胞分化の調整、ＩＬ−６産生の調整、免疫グロブリン産生の調整、プロテアソーム経路の調整、タンパク質の折り畳みおよび輸送の調整、Ｂ細胞最終分化の調整、ならびにアポトーシスの調整に関与する経路中のＸＢＰ−１タンパク質の上流（活性の刺激剤とインヒビターの双方を含む）、または下流で機能しうるタンパク質が含まれる。ＸＢＰ−１標的分子の例としては、ＩＲＥ−１、ＡＴＦ６α、ＸＢＰ−１自身 （分子がホモダイマーを形成する場合） cfos （ＸＢＰ−１とともにヘテロダイマーを形成する）ならびにＸＢＰ−１によって調節される遺伝子の調節領域が含まれる。ＩＲＥ−１標的分子の例としては、ＸＢＰ−１およびＩＲＥ−１自身（ホモダイマーを形成する場合）が含まれる。
【０２０８】
本明細書において用いられている用語「シグナル伝達経路」は、それによって細胞が細胞外の影響またはシグナル（例えば、細胞表面上のレセプター、例えば、サイトカインレセプターもしくは抗原レセプターなどにより変換されるシグナル）を細胞応答（例えば、遺伝子転写の調整）に変換する手段を含む。シグナル伝達経路の例としては、ＪＡＫ１/ＳＴＡＴ−１経路（Leonard, W. 2001. Int. J. Hematol. 73:271）およびＴＧＦ−β経路 （AttisanoとWrana. 2002.
Science. 296:1646） が含まれる。「ＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路」は、ＸＢＰ−１がシグナルを中継するシグナリング分子であるシグナル伝達経路である。
【０２０９】
標記方法は、種々の標的分子を用いることができる。例えば、ある態様において、標記方法は、ＸＢＰ−１を用いることができる。別の態様において、標記方法は、ＸＢＰ−１シグナル伝達経路中の、例えば、ＸＢＰ−１の上流もしくは下流の少なくとも１つの他の分子を用いることができる。例えば、ある態様において、標記方法は、ＩＲＥ−１を用いることができる。別の態様において、標記方法は、ＡＴＦ６α またはＰＥＲＫを用いることができる。
【０２１０】
本明細書において用いられている用語「シャペロン遺伝子」は、ＵＲＰまたはＥＯＲの活性化の結果、誘導される遺伝子を含む。シャペロン遺伝子は、例えば、ＧＲＰ７８（ＢｉＰ）およびＧＲＰ９４（エンドプラスミン）などのグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）のファミリーのメンバー、ならびにカルレチクリン（calreticulin）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、およびＥＲｐ７２などの他のシャペロンをを含む。シャペロン遺伝子のアップレギュレーションは、ＥＲ内の折り畳み能の需要の増加に適応する助けとなる。
【０２１１】
本明細書において用いられている「転写がＸＢＰ−１によって調節される遺伝子」と言う表現は、ＸＢＰ−１によって調節される調節領域を持つ遺伝子を含む。そのような遺伝子は、ＸＢＰ−１によって陰性調節または陽性調節される。この語はまた、ＸＢＰ−１によって間接的に調節される、例えば、ＸＢＰ−１が関与するシグナル伝達経路内の分子によって調節される遺伝子を含む。ＸＢＰ−１によって直接的に調節される遺伝子の例としては、例えば、ＥＲｄｊ４ （例えば、NM_012328 [gi:9558754]）、ｐ５８ｉｐｋ （例えば、XM_209778
[gi:2749842] またはNM_006260 [gi:24234721]）、ＥＤＥＭ （例えば、NM_014674 [gi:7662001]）、ＰＤＩ−Ｐ５ （例えば、NC_003284
[gi:32566600]）、ＲＡＭＰ４ （例えば、AF136975 [gi:12239332]）、ＨＥＤＪ （例えば、AF228505
[gi: 7385134]）、ＢｉＰ  （例えば、X87949 [gi: 1143491]）、ＡＴＦ６α (例えば、NM_007348 [gi:6671584]、ＸＢＰ−１ （例えば、NM_005080
[gi:14110394]）、Armet （例えば、NM_006010 [gi:51743920]） および/またはDNAJB9 （which encodes
mDj7） 例えば、（NM_012328
[gi:9558754]）、MHC クラスII遺伝子（種々のMHCクラスII 遺伝子配列が当該技術分野において公知である）およびIL−6遺伝子（例えば、MN_000600 [gi 10834983] ）が挙げられる。
【０２１２】
本明細書において用いられている用語「アポトーシス」は、当該技術分野において公知の技術を用いて特徴付けられるプログラムされた細胞死を含む。アポトーシス細胞死は、例えば、細胞収縮、膜気泡化（membrane blebbin）、および細胞断片化におけるクロマチン凝集完結などによって特徴付けられる。アポトーシスが起きた細胞はまた、ヌクレオゾーム内ＤＮＡ切断の特徴的なパターンを表示している。本明細書に用いられている用語「アポトーシスを調整する」は、細胞のアポトーシスのアップレギュレーションとダウンレギュレーションのいずれかを含む。
【０２１３】
本明細書に用いられている用語「細胞分化」は、それによって発育途上の潜在的な細胞が限定され、それらが特異的な発育運命を取得するプロセスを含む。分化された細胞は、他の細胞のタイプとは認識可能に異なる。
【０２１４】
本明細書に用いられている用語「形質細胞分化」または「Ｂ細胞最終分化」は、骨髄において前Ｂ細胞として生命を開始するＢ細胞が形質細胞へと分化していく過程を意味する。前Ｂ細胞は、その表面に抗体を有していない。Ｂ細胞における免疫グロブリン遺伝子の遺伝子再配列を含む成熟ステップが起こり、その結果、表面免疫グロブリン（ｓＩｇ）が作製され、細胞の表面に輸送される。表面ＩｇＭおよびＩｇＤをもつＢ細胞は、成熟した、しかし「ナイーブ」な細胞（まだ抗原に出会っていないため）となる。抗原に出会うと、Ｔ細胞サイトカインの援助を受けて、Ｂ細胞活性および形質細胞への最終分化を刺激する。Ｂ細胞の形質細胞への分化は、細胞がサイトカインの存在下で分割し続けることで起こる。
【０２１５】
本明細書に用いられている用語「接触」（即ち、細胞、例えば、細胞と化合物との接触）は、化合物と細胞をin
vitroで一緒にインキュベートすること（例えば、化合物を培養中の細胞に加える）、および化合物を被験体に化合物とその被験体の細胞がin vivoで接触するように投与することを含む。用語「接触」は、自然に被験体中に発生するかもしれないＸＢＰ−１モジュレーターに細胞を曝露することを含まない（すなわち、天然の生理学的プロセスの結果生じるかもしれない曝露）。
【０２１６】
本明細書に用いられている用語「試験化合物」とは、試験される活性のモジュレーターとして同定されたことのない、または認識されたことのない化合物を言う。用語「試験化合物のライブラリー」とは、複数の試験化合物を含むパネルを言う。
【０２１７】
本明細書に用いられている用語「強い陰性ＸＢＰ−１タンパク質」は、天然（すなわち、天然に発生する野生型）のＸＢＰ−１分子に競合するが、ＸＢＰ−１活性を持たない、ＸＢＰ−１分子（例えば、その部分または変種）を言う。そのような分子は、効果的に細胞中のＸＢＰ−１活性を減少させる。本明細書に用いられている用語「強い陰性のタンパク質」は、ＸＢＰ−１活性の強力なインヒビターである、修飾された形態のＸＢＰ−１を言う。強い陰性のインヒビターの例は本明細書に記載している。それは、トランスアクチベーションドメインを欠くが、ロイシンジッパーモチーフを維持している。スプライシングされた形態のＸＢＰ−１タンパク質のＮ末端１８８もしくは１３６アミノ酸。例えば、スプライシングされた形態のＸＢＰ−１タンパク質のＮ末端１８８もしくは１３６アミノ酸からなる。
【０２１８】
本明細書に用いられている用語「指標組成物」とは、関連対象のタンパク質（例えばＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子）、例えば、タンパク質を天然で産生する細胞や、タンパク質をコードする発現ベクターを細胞に導入する操作を加えてタンパク質を発現するようにしてある細胞、または、タンパク質（例えば、天然に発生するタンパク質または組換え操作されたタンパク質）を含有する無細胞組成物など、を含む組成物を言う。
【０２１９】
本明細書に用いられている用語「細胞」は、原核細胞および真核細胞を含む。ある態様において、本発明の細胞は、細菌細胞である。別の態様において、本発明の細胞は、酵母細胞などの真菌細胞である。別の態様において、本発明の細胞は、脊椎動物細胞、例えば、鳥類や哺乳動物細胞、である。好ましい態様において、本発明の細胞は、ネズミ細胞またはヒト細胞である。
【０２２０】
本明細書に用いられている用語「操作された」（操作された細胞のような語）は、核酸分子、例えば、ＸＢＰ−１タンパク質（例えば、スプライシングされたおよび/またはスプライシングされていない形態のＸＢＰ−１）をコードするものが導入されている細胞を言う。
【０２２１】
本明細書に用いられている用語「無細胞組成物」は、インタクトな細胞を含有しない、単離された組成物を言う。無細胞組成物の例としては、細胞抽出物および単離されたタンパク質を含有する組成物が含まれる。
【０２２２】
本明細書に用いられている用語「レポーター遺伝子」は、検出可能な遺伝子産物、例えば、ＲＮＡまたはタンパク質を発現するあらゆる遺伝子を言う。好ましいレポーター遺伝子は、容易に検出可能なものである。レポーター遺伝子はまた、望ましい転写調節配列を含み、または他の望ましい特性を示す遺伝子との融合遺伝子の形態の構築物中に含むこともできる。レポーター遺伝子の例としては、限定されないが、CAT （クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ） （AltonとVapnek （1979）、Nature 282: 864-869） 、ルシフェラーゼ、および他の酵素検出系、例えば、β-ガラクトシダーゼ；ホタルルシフェラーゼ （deWetら、（1987）、Mol. Cell. Biol. 7:725-737）；細菌ルシフェラーゼ （EngebrechtとSilverman （1984）、PNAS 1: 4154-4158; Baldwinら（1984）、Biochemistry
23: 3663-3667）；アルカリフォスファターゼ（Tohら、1989） Eur. J. Biochem. 182: 231-238, Hallら、（1983） J. Mol.
Appl. Gen. 2: 101）、ヒト胎盤分泌性アルカリフォスファターゼ （CullenとMalim （1992） Methods in Enzymol. 216: 362-368）および緑色けい光たんぱく質（米国特許第5,491,084号；ＰＣＴ国際公開第WO 96/23898号）が含まれる。
【０２２３】
本明細書に用いられている用語「ＸＢＰ−１応答性エレメント」は、ＸＢＰ−１の活性によって直接的または間接的に調節されるＤＮＡ配列を言う（それによって、ＸＢＰ−１の活性を、例えば、レポーター遺伝子の転写を介して、モニターすることができる。）
【０２２４】
本明細書に用いられている用語「ＸＢＰ−１が欠損した細胞」は、もともとＸＢＰ−１が欠損している被験体の細胞、ならびに非ヒトＸＢＰ−１欠損動物の細胞、例えば、ＸＢＰ−１が欠損するように変更を加えられたマウスの細胞、を含む。用語「ＸＢＰ−１が欠損した細胞」はまた、非ヒトＸＢＰ−１欠損動物またはin
vitroで培養される被験体から単離された細胞を含むことを意図している。
【０２２５】
本明細書に用いられている用語「非ヒトＸＢＰ−１欠損動物」は、内因性遺伝子が、内因性遺伝子と動物細胞中に導入された外因性遺伝子ＤＮＡ分子との間の相同組換えによって変更を加えられた、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは、マウスを言う。（例えば、内因性ＸＢＰ−１遺伝子が変更され、それによってＸＢＰ−１の産生も、ＸＢＰ−１活性が欠損したＸＢＰ−１からの突然変異の産生も導かないようにした、動物の発育前の動物の胚細胞）。ＸＢＰ−１の活性は、全体的にブロックされることが好ましいが、動物のＸＢＰ−１活性の部分的な阻害も包含される。用語「非ヒトＸＢＰ−１欠損動物」はまた、ＲＡＧ-２胚盤胞捕捉系などの胚盤胞捕捉系を用いて作製された、特定の器官または複数の器官（例えば、リンパ器官）が、ＸＢＰ−１遺伝子のホモ接合突然変異で胚性幹（ＥＳ）細胞から生じたキメラ動物（例えば、マウス）を含むことが意図されている。
【０２２６】
ある態様において、小分子を試験化合物として用いることができる。用語「小分子」は、当該技術の用語であり、分子量が約7500未満、約5000未満、約1000未満、約 500 未満の分子を含む。ある態様において、小分子は、排他的にペプチド結合を含まない。別の態様において、小分子はオリゴマーではない。活性についてスクリーニングされることができる小分子化合物の例としては、限定されないが、ペプチド、ペプチドミメティクス、核酸、炭水化物、小有機分子（例えば、Caneら、1998. Science 282:63参照）、および天然の生成物抽出ライブラリーが含まれる。別の態様において、化合物は小分子、有機非ペプチド化合物である。さらに別の態様において、小分子は、生合成物ではない。例えば、小分子は、好ましくはそれ自身、転写または翻訳の産物ではない。
【０２２７】
以下のサブセクションにおいては、本発明の種々の局面をさらに詳細に記載する。
【０２２８】
II.  スクリーニングアッセイ
ある態様において、本発明は、モジュレーター、すなわち、例えば、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１（例えば、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６αタンパク質)を含むシグナル伝達経路に結合し、発現、プロセシング（例えば、スプライシング）、翻訳後修飾（例えば、グリコシレーション、ユビキチン化、もしくはリン酸化もしくはＸＢＰ−１の活性化）、またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子に対して促進性もしくは阻害性効果を有する、候補物質、または試験化合物または薬剤（例えば、酵素、ペプチド、ペプチドミメティクス、小分子、リボザイムまたはアンチセンスもしくはｓｉＲＮＡ分子）を同定するための方法（本明細書において「スクリーニングアッセイ」とも言う）を提供する。例えば、ＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１、ＰＥＲＫおよびＡＴＦ６αは、ＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中ＸＢＰ−１中で機能する。したがって、これらの分子のいずれも当該スクリーニングアッセイにおいて用いることができる。このセクションの以下においておよび他のセクションにおいて記載した特別な態様は、ＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１、ＡＴＦ６αおよび/またはＰＥＲＫを例として記載しているが、ＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路の他の分子もまたを当該スクリーニングアッセイにおいて用いることができる。
【０２２９】
ある態様において、ある化合物が、ＸＢＰ−１の発現、プロセシング（例えば、スプライシング）、翻訳後修飾（例えば、グリコシレーション、ユビキチン化もしくはリン酸化）、または活性を直接調整する能力は、本発明のスクリーニングアッセイにおいて測定される。
【０２３０】
ある態様において、ＸＢＰ−１の発現、プロセシング（例えば、スプライシング）、翻訳後修飾（例えば、グリコシレーション、ユビキチン化、もしくはリン酸化）、または活性は、ＡＴＦ６αを発現する細胞中において測定される。別の態様において、ある薬剤は、ＡＴＦ６αの発現、翻訳後修飾および／または活性を調整しないにもかかわらず、ＸＢＰ−１の生物学的活性を調整する（例えば、ＵＰＲを調整する）ものとして同定される。本発明のある態様において、ある化合物は、ＡＴＦ６αを調整する能力は試験されないにもかかわらず、ＸＢＰ−１の生物学的活性を調整する（例えば、ＵＰＲを調整する）ものとして同定される。本発明のある態様において、ある化合物が、ＡＴＦ６αに依存しないＸＢＰ−１の生物学的活性を調整する能力が測定される。別の態様において、ＡＴＦ６αは、本発明のスクリーニングアッセイには使用されない。  
【０２３１】
本発明のある態様において、ある化合物がＸＢＰ−１（またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子）を２６Ｓプロテアソームを阻害せずに調整する能力を試験することができる。本発明のある態様において、ある化合物がＮＦ−ＫＢ経路を実質的に調整することなく、ＸＢＰ−１（またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子）を調整する能力を試験することができる。
【０２３２】
指標組成物は、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子を発現する細胞、例えば、天然に発現する細胞、より好ましくは、細胞中にタンパク質をコードする発現ベクターを導入することによって該タンパク質を発現するように操作された細胞であることができる。好ましくは、該細胞は、哺乳動物脂肪、例えば、ヒト細胞である。ある態様において、該細胞は、Ｂ細胞である。あるいは、指標組成物は、タンパク質（例えば、細胞抽出物または精製された天然のタンパク質もしくは組み換えタンパク質）を含む無細胞組成物であることができる。別の態様において、該細胞は、分泌細胞である。別の態様において、該細胞は、ＥＲストレスを受けている。また別の態様において、該細胞は、ＡＴＦ６αおよびＰＥＲＫを発現する。  
【０２３３】
本明細書に記載のアッセイを用いて同定された化合物は、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の異常な発現、プロセシング、翻訳後修飾、または活性に関連する障害、例えば、ＵＰＲの異常な活性化、異常な細胞分化、異常なＩＬ−６産生、異常な免疫グロブリン産生、異常なプロテアソーム経路の活性化、タンパク質の異常な折り畳みおよび輸送、異常なＢ細胞最終分化、または異常な細胞増殖（例えば、細胞の不適切なアポトーシス（例えば、神経変性もしくは免疫欠損障害）または制御不能な細胞増殖（例えば、癌細胞））を治療するのに有用である。ＸＢＰ-１を含むシグナル伝達経路の調整が有利がとなりうる状態としては、自己免疫疾患ならびに悪性疾患および免疫欠損疾患が含まれる。ＸＢＰ−１発現および/または活性を調整する化合物は、免疫応答を調整するためにも用いることができる。さらに、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ-１を含むシグナル伝達経路中の分子は、正常細胞中のタンパク質の折り畳みおよび輸送を調整するために、例えば、市販されているタンパク質、例えば、免疫グロブリンの発現、産生または分泌を増加させるために、調整され得る。
【０２３４】
当該スクリーニングアッセイは、他の薬剤の存在下または不存在下で行うことができる。ある態様において、当該スクリーニングアッセイは、非折り畳みタンパク質応答に影響を及ぼす薬剤、例えば、Ｎ−グリコシレーションもしくはタプシガルギンを阻害することによってＵＰＲを誘発するツニカマイシンの存在下で行うことができる。別の態様において、当該アッセイは、ユビキチン−プロテアソーム経路（例えば、ペプチドアルデヒド、ＭＧ１３２など）によるタンパク質の分解を阻害する薬剤の存在下で行うことができる。別の態様において、該スクリーニングアッセイは、細胞活性化を促進する分子、例えば、抗ＣＤ４０の存在下で行うことができる。
【０２３５】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載のアッセイの２以上の組み合わせに関する。例えば、調整薬剤を、細胞ベースのアッセイまたは無細胞アッセイを用いて同定することができる。該薬剤がＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子を調整する能力は、in vivo、例えば、多発性骨髄腫、腫瘍性疾患、ジ細胞癌または自己免疫疾患の動物モデルなどの動物において、確認することができる。
【０２３６】
さらに、本明細書に記載のように同定されたＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子（例えば、酵素、アンチセンス核酸分子、または特異的な抗体、または小分子）のモジュレーターを動物モデルに使用して、そのようなモジュレーターを用いた治療の有効性、毒性、または副作用を決定することができる。あるいは、本明細書に記載のように同定されたモジュレーターを動物モデルに使用して、そのようなモジュレーターの作用機序を決定することができる。
【０２３７】
別の態様において、ＸＢＰ−１の活性および／または発現を、例えば、ＸＢＰ−１が相互作用する分子、例えば、シグナル伝達経路中のＸＢＰ−１の上流もしくは下流のいずれかにおいて機能する分子（例えば、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α）を用いた上記したもののようなスクリーニングアッセイを行うことによって、直接調整する化合物を同定するために類似のスクリーニングアッセイを使用することができることが理解されるであろう。
【０２３８】
本発明の細胞ベースのアッセイまたは無細胞アッセイを以下においてさらに詳細に説明する。
【０２３９】
Ａ．細胞ベースのアッセイ
本発明の指標組成物は、ＸＢＰ−１タンパク質（またはＸＢＰ−１シグナル伝達経路中の非ＸＢＰ−１タンパク質、例えば、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α）、例えば、天然に発現する（内因性）ＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１、ＰＥＲＫもしくはＡＴＦ６α、または、より好ましくは、細胞中にタンパク質をコードする発現ベクターを導入することによって、外因性ＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１、ＰＥＲＫもしくはＡＴＦ６αタンパク質を発現するように操作された細胞であることができる。あるいは、指標組成物は、ＸＢＰ−１、またはＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６αなどの非ＸＢＰ−１タンパク質（例えば、ＸＢＰ−１からの細胞抽出物、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α発現細胞、または精製されたＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６αタンパク質を含む組成物、天然のタンパク質または組換えタンパク質）を含む無細胞組成物であることができる。
【０２４０】
ＸＢＰ-１の発現および/または活性を調整する化合物、またはＸＢＰ−１の上流もしくは下流のいずれかにおいて機能する非ＸＢＰ-１タンパク質を、種々の「リードアウト」を用いて同定することができる。
【０２４１】
例えば、指標細胞を、ＸＢＰ-１発現ベクターを用いて、トランスフェクトし、試験化合物の存在下もしくは不存在下でインキュベートし、その化合物が分子の発現またはＸＢＰ-１によって調節される生物学的応答に及ぼす作用を決定することができる。ある態様において、スプライシングされていないＸＢＰ−１（例えば、細胞が両方の形態を作製することができるようにスプライシングすることが可能である、または、スプライシングされていない形態のみを作製することができるように、スプライシングを不能とする）を細胞中に発現することができる。別の態様において、スプライシングされたＸＢＰ−１は細胞中に発現することができる。ＸＢＰ-１の生物学的活性は、標準的な技術によってin vivo またはin
vitroで決定することができる。ＸＢＰ−１活性は、ＸＢＰ−１標的分子（例えば、ＸＢＰ−１が結合する核酸分子、例えば、シャペロン遺伝子の転写調節領域）またはＩＲＥ−１またはＡＴＦ６αなどのタンパク質との結合といった直接的な活性であることができる。あるいは、ＸＢＰ-１の生物学的活性は、ＸＢＰ-１タンパク質とＸＢＰ-１標的分子の相互作用の下流において生じる、または、そのような相互作用によって引き起こされるシグナリングカスケードの結果生じる細胞シグナリング活性などの間接的な活性である。例えば、本明細書に記載の生物学的活性としては、ＵＰＲの調整、細胞分化の調整、ＩＬ−６産生の調整、免疫グロブリン産生の調整、プロテアソーム経路の調整、タンパク質の折り畳みおよび輸送の調整、Ｂ細胞最終分化の調整、ならびにアポトーシスの調整が挙げられる。
【０２４２】
試験化合物がタンパク質の活性を調整するかどうかを決定するために、in vitro 転写アッセイを行うことができる。そのようなアッセイの一例において、ＸＢＰ-１の全長プロモーターおよびエンハンサーを、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）もしくはルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子に作用可能に結合し、宿主細胞に導入することができる。他の技術が当該技術分野において公知である。
【０２４３】
本明細書において互換可能に用いられている用語「作用可能に結合した」および「機能的に結合した」は、ヌクレオチド配列が調節配列に、そのヌクレオチド配列の宿主細胞中での（または細胞抽出物による）発現を可能にする仕方で結合されていることを意味することを意図している。調節配列は、技術分野において認識されており、適切な宿主細胞において望ましいタンパク質の発現を導くように選択され得る。調節配列は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルおよび他の発現制御エレメントを包含することを意図している。そのような調節配列は、当該技術分野の当業者に公知であり、Goeddel, Gene
Expression Technology:  Methods in
Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA （1990）に記載がある。発現ベクターの設計は、トランスフェクトされる宿主細胞の選択、および/または種類および/または発現が望まれるタンパク質の量などのファクターに依存するかもしれない。 
【０２４４】
構築物の例としては、マウスRANTES遺伝子の最小プロモーターに融合したＸＢＰ-１標的配列TGGATGACGTGTACA
（配列番号２） （Claussら、Nucleic Acids Research 1996. 24:1855）または、レポーター遺伝子に融合した、cfos プロモーターの−５３／＋４５を含むＡＴＦ６／ＸＢＰ−１標的
TCGAGACAGGTGCTGACGTGGCGATTCC（配列番号３）（J.
Biol. Chem. 275:27013） を含むことができる。ある態様において、ＸＢＰ-１標的配列の多数のコピーを含むことができる。
【０２４５】
当該技術分野において、種々のレポーター遺伝子が公知であり、本発明のスクリーニングアッセイに使用するのに適している。好適なレポーター遺伝子の例としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、またはルシフェラーゼをコードするものが挙げられる。これらの遺伝子産物の活性を測定する標準的な方法は、当該技術分野において公知である。
【０２４６】
種々の細胞タイプがスクリーニングアッセイの指標細胞として使用するのに好適である。低レベルの内因性ＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１、ＰＥＲＫもしくはＡＴＦ６αを発現し、その後、組換えＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１、ＰＥＲＫもしくはＡＴＦ６αに操作される細胞株を用いることが好ましい。当該アッセイに使用される細胞は、真核細胞および原核細胞の両方を含む。例えば、ある態様において、細胞は、細菌細胞である。別の態様において、細胞は、酵母細胞などの真菌細胞である。別の態様において、細胞は、脊椎動物の細胞、例えば、鳥類細胞もしくは哺乳動物細胞（例えば、ネズミ細胞、もしくはヒト細胞）である。
【０２４７】
ある態様において、試験化合物の存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現レベルは、試験化合物の不存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現レベルより高い。そして、該試験化合物は、ＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６αの発現を促進する化合物であると同定される。別の態様において、試験化合物の存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現レベルは、試験化合物の不存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現レベルより低い。そして、該試験化合物は、ＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６αの発現を阻害する化合物であると同定される。
【０２４８】
ある態様において、本発明は、ＸＢＰ-１が関与する細胞応答を調整する化合物を同定する方法を提供する。例えば、ある態様において、ＵＰＲまたはＥＲストレスの調整を決定することができる。分子シャペロンをコードする遺伝子の転写および小胞体（ＥＲ）中の折り畳み酵素は、ＥＲ中の非折り畳みタンパク質の蓄積によって誘導される。非折り畳みタンパク質応答（ＵＰＲ）として知られるこの細胞間シグナリングは、哺乳動物におけるｃｉｓ−活性化ＥＲストレス応答エレメント（ＥＲＳＥ）によって媒介される。ＥＲシャペロンに加えて、哺乳動物転写因子ＣＨＯＰ（ＧＡＤＤ１５３とも呼ばれる）は、ＥＲストレスによって誘導される。ＸＢＰ−１（ＴＲＥＢ５とも呼ばれる）もまたＥＲストレスによって誘導される。そしてＣＨＯＰおよびＸＢＰ−１の誘導は、ＥＲＳＥによって媒介される。ＥＲＳＥコンセンサス配列は、CCAAT-N（9）-CCACG（配列番号４）である。転写因子ＮＦ−Ｙ（ＣＢＦとしても知られている）は、CCAATと結合し、CCACGは、哺乳動物ＵＰＲに特異性をもたらすものと考えられている。CCACG‐結合タンパク質として単離された塩基性ロイシンジッパータンパク質ＡＴＦ６は、ＥＲ中に膜貫通タンパク質として合成される。そしてＥＲストレス誘導性タンパク質分解によって、核内に転移する溶解性のＡＴＦ６が作製される。
【０２４９】
ＵＰＲの調整は、例えば、mRNAの内因性レベルの変化およびＥＲｄｊ４、ｐ５８ｉｐｋ、ＥＤＥＭ、ＰＤＩ−Ｐ５、ＲＡＭＰ４、ＨＥＤＪ、ＢｉＰ、ＡＴＦ６α、ＸＢＰ−１、ArmetおよびＤＮＡＪＢ９などのタンパク質の転写または産生をルーチンのＥＬＩＳＡ、ノーザンおよびウェスタンブロット技術を用いて測定することによって測定される。さらに、ＵＰＲに関連する翻訳の減衰を、タンパク質の産生を測定することによって、測定することができる（Ruegseggerら、2001. Cell 107:103）。検出のための好ましいタンパク質は、細胞表面上で発現または分泌する。別の態様において、真核細胞の開始因子２のリン酸化を測定することができる。別の態様において、細胞中の凝集した、誤折り畳みされた、または損傷したタンパク質をモニターすることができる（Welch、W.J. 1992 
Physiol. Rev. 72:1063; Gething
and Sambrook.  1992.  Nature.
355:33; Kuznetsovら、1997.  J. Biol.
Chem.  272:3057）。
【０２５０】
ある態様において、細胞分化は、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路の調整の指標として使用することができる。細胞分化は、直接モニターすることができる（例えば、細胞分化をモニターするための細胞の顕微鏡検査による）、または、例えば、１以上の細胞分化のマーカーをモニターすることによって、間接的にモニターすることもできる（例えば、細胞分化に関連する遺伝子産物のｍＲＮＡの増加、または細胞分化に関連する遺伝子産物の分泌、例えば、タンパク質の分泌など（例えば、形質細胞によって分化される免疫グロブリンの分泌）または細胞表面マーカーの発現（例えば、形質細胞によるSyndecan 発現） Reimoldら、2001. Nature 412:300）。関連対象のｍＲＮＡを検出するための標準的な方法、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）やノーザンブロット法が当該技術分野において公知である。培養上清中のタンパク質分泌を検出するための標準的な方法、例えば酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）も当該技術分野において公知である。タンパク質はまた、例えば、免疫沈降反応または染色、およびＦＡＣＳ分析において、抗体を用いて検出することもできる。    
【０２５１】
ある態様において、化合物がＢ細胞の最終分化を誘導する能力を決定することができる。本明細書に記載しているように、Ｂ細胞の最終分化は、種々の方法で決定することができる。細胞は、顕微鏡検査によって、形質細胞に特徴的な精巧なＥＲ系の存在を検査することができる。免疫グロブリンの分泌も形質細胞分化のホールマークである。あるいは、細胞表面マーカー、例えば、表面ＩｇＭもしくはSyndecanの細胞表面の発現を検出することができる。 
【０２５２】
ある態様において、化合物がIL-6
産生を調整する能力を決定することができる。ＩＬ−６の産生は、例えば、ノーザンまたはウェスタンブロット解析を用いてモニターすることができる。IL-6はまた、ELISAを用いて、またはバイオアッセイにおいて、IL-6 （例えば、サイトカインに応答して増殖する細胞、またはサイトカインの存在下において生存する細胞）に応答する細胞、例えば、形質細胞または多発性骨髄腫細胞を用いたバイオアッセイにおいて、標準的な技術を用いて検出することができる。 
【０２５３】
別の態様において、化合物が細胞のプロテアソーム経路を調整する能力は、当該技術において認識されているいくつかの技法を用いて決定することができる。例えば、ある態様において、正常な短命な調節タンパク質（例えば、ＮＦ−ｋＢ、サイクリン、発癌性生成物または腫瘍抑制物質）の半減期を測定して、プロテアソームの分解能を測定することができる。別の態様において、抗原のプロテアソーム分解が抗原プロセシングおよび提示において重要であるとき、細胞表面上のＭＨＣ分子との関係における抗原の提示測定することができる（例えば、Ｔ細胞の活性化のin
vitro アッセイ）。別の態様において、プロテアソームに関連するトレオニンプロテアーゼ活性を測定することができる。プロテアソーム経路を調整する抗原は、これらのタンパク質の正常な分解に影響を及ぼし得る。別の態様において、プロテアソーム経路の分解は、スプライシングされたＸＢＰ-１とスプライシングされていないＸＢＰ−１の比率、またはスプライシングされていないＸＢＰ-１対ＸＢＰ−１の比率を測定することによって間接的に測定することができる。例示してい示したように、例えば、インヒビターＭＧ−１３２によるプロテアソーム経路の阻害は、スプライシングされたＸＢＰ-１と比較して、スプライシングされていないＸＢＰ−１のレベルを増加させる。これらの異なる形態のＸＢＰ−１の差は、本明細書に記載の種々の技法（例えば、ウェスタンブロット、またはＰＣＲ）または当該技術分野において公知の種々の技法によって測定することができる。また、比率が決定される。ある態様において、化合物がタンパク質折り畳みまたは輸送を調整する能力を決定することができる。細胞表面のタンパク質の発現、または分泌されたタンパク質の分泌をタンパク質折り畳みまたは輸送の指標として測定することができる。細胞上でのタンパク質の発現は、例えば、ＦＡＣＳ分析、表面ヨウ素化、膜調製物からの免疫沈降を用いて測定することができる。タンパク質分泌は、例えば、培養細胞の上清中のタンパク質のレベルを測定することによって測定することができる。あらゆる分泌タンパク質の産生はこの方法で測定することができる。測定されるタンパク質は、細胞に対して内因性または外因性であることができる。好ましい態様において、タンパク質は、α−フェトプロテイン、α１−抗トリプシン、アルブミン、ルシフェラーゼおよび免疫グロブリンからなる群から選択される。タンパク質の産生は、当該技術分野の標準的な技法によって測定することができる。  
【０２５４】
別の態様において、化合物がアポトーシスを調整する、例えば、ＵＰＲを破壊することによってアポトーシスを調整する能力を決定することができる。ある態様において、化合物が分泌細胞またはＥＲストレス下の細胞においてアポトーシスを調整する能力を測定することができる。アポトーシスは、Fas媒介性シグナルの存在下または不存在下で測定することができる。ある態様において、細胞アポトーシス中におけるミトコンドリアからのチトクロームＣ放出を検出することができる（例えば、形質細胞アポトーシス）（例えば、Bossy-Wetzel E.ら（2000） Methods
in Enzymol. 322:235-42に記載されている）。他のアッセイの例としては、無細胞系において誘導される核アポトーシスの細胞蛍光定量（例えば、Lorenzo H.K.ら、（2000） Methods
in Enzymol. 322:198-201に記載されている）；アポトーシス性ヌクレアーゼアッセイ（例えば、Hughes F.M. （2000） Methods
in Enzymol. 322:47-62に記載されている）；アポトーシス細胞、例えば、アポトーシス性形質細胞のフローサイトメトリーおよびレーザースキャニングサイトメトリーによる分析（例えば、Darzynkiewicz Z.ら、（2000） Methods
in Enzymol. 322:18-39に記載されている）；アネキシンＶ標識によるアポトーシスの検出（例えば、Bossy-Wetzel E.ら （2000） Methods
in Enzymol. 322:15-18に記載されている）；細胞死に関する一過性トランスフェクションアッセイ（Miura M.ら、（2000） Methods
in Enzymol. 322:480-92に記載されている）；およびアポトーシス細胞中、例えば、アポトーシス性形質細胞中のＤＮＡ切断を検出するアッセイ（例えば、Kauffman S.H.ら（2000） Methods
in Enzymol. 322:3-15に記載されている）。アポトーシスはまた、よう化プロピジウムまたはＴＵＮＥＬアッセイによって測定することもできる。別の態様において、アポトーシスに関与する、細胞シグナル伝達経路に関連する遺伝子の転写（例えば、JNK）は、標準的な方法によって検出することができる。
【０２５５】
別の態様において、サイトゾルまたはミトコンドリア基質に通常内膜とは交差しないダイ、例えば、カルセインを装着することによって、ミトコンドリア内膜透過をインタクトな細胞で測定することができる（Bernardiら、1999. 
Eur. J. Biochem.  264:687;
Lemasters, J., J.ら 1998. 
Biochem. Biophys. Acta 1366:177）。別の態様において、例えば、ミトコンドリア内膜電位（ΔΨｍ）の変化を測定することによってミトコンドリア内膜透過を評価することができる。例えば、細胞をＤｉＯＣ６（３，３’ジヘキシルオキサカルボシアニンヨウ化物）またはＪＣ−１（５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンゾイミダゾリルカルボシアニンヨウ化物）などの疎水性カチオン型蛍光色素とともにインキュベートし（Grossら、1999. 
Genes Dev. 13:1988）。これらの色素はミトコンドリア基質に蓄積され、Ψｍによって駆動される。放散によって、蛍光強度が低下したり（例えば、ＤｉＯＣ６（Grossら、1999. 
Genes Dev. 13:1988））、または色素のスペクトルの発光へ移行する。これらの変化は、サイトフルオロメトリーまたは顕微鏡によって測定することができる。
【０２５６】
さらに別の態様において、化合物がスプライシングされたＸＢＰ-１の核への転位を調整する能力を決定することができる。スプライシングされたＸＢＰ-１の核への転位は、２以上の蛍光標識された種の発光を同時に検出する核転位アッセイによって測定することができる。例えば、細胞核は、公知のＤＮＡに特異的なフルオロホア、例えば、Hoechst 33342によって標識することができる。スプライシングされたＸＢＰ-１タンパク質は、ＧＦＰとの融合、またはサンプルと蛍光標識された抗体に特異的なスプライシングされたＸＢＰ-１との接触を含む種々の方法によって標識することができる。スプライシングされたＸＢＰ-１の核への転位の量は、第１の蛍光標識された種、すなわち、第２の蛍光標識された種すなわちスプライシングされたＸＢＰ-１に対して相関または反相関して分布している核の量を測定することによって、米国特許第6,400,487号（その内容を本明細書において引用によって援用する）に記載のように決定することができる。 
【０２５７】
試験化合物が、基質または標的分子（ＸＢＰ−１の場合ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α）に結合するＸＢＰ−１（またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子）を調整する能力も測定することができる。試験化合物が、基質または標的分子（ＸＢＰ−１の場合ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α）に結合するＸＢＰ−１（またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子）を調整する能力の決定は、例えば、標的分子を放射性同位体標識または酵素標識と結合させ、標的分子とＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子との結合を、複合体中の標識されたＸＢＰ−１（ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α）標的分子を検出することによって決定することができるようにすることによって達成することができる。例えば、標的は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈを用いて、直接的または間接的に標識することができ、放射性同位体は、放射性放出の直接計数またはシンチレーション計数によって検出することができる。あるいは、化合物は例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、またはルシフェラーゼを用いて標識することができ、その酵素標識は基質の生成物への適切な変換によって検出することができる。  
【０２５８】
別の態様において、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子が酵素による作用を受け、基質に作用する能力を測定することができる。例えば、ある態様において、化合物がＩＲＥ−１のリン酸化、ＩＲＥ−１がＸＢＰ−１を処理する能力、ＰＥＲＫが基質をリン酸化する能力に及ぼす作用は、当該技術分野において公知の技法によって測定することができる。
【０２５９】
化合物が相互作用物質を何も使用せずにＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子と相互作用することができる能力を決定することもまた、本発明の範囲である。例えば、マイクロフィジオメーターを用いて、化合物とＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６αとの相互作用を、化合物またはＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６αのいずれをも標識せずに検出することができる（McConnell, H. M. ら （1992） Science 257:1906-1912）。本明細書において用いられている「マイクロフィジオメーター」（例えば、サイトセンサー）は、細胞がその環境の中で酸性化する率を光アドレス可能電位計（ＬＡＰＳ）で測定する分析機器である。この酸性化の変化を化合物とＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６αとの相互作用の指標として用いることができる。
【０２６０】
ＸＢＰ-１の標的分子の例としては、ＸＢＰ-１応答エレメント、例えば、遺伝子からの上流調節領域、例えば、α１-抗トリプシン、α-フェトプロテイン、ＨＬＡ ＤＲα、ならびにＨＴＬＶ−１ ＬＴＲの２１塩基対繰り返しエンハンサーを挙げることができる。ＸＢＰ−１応答レポーター構築物は、ＨＬＡ ＤＲα−ＣＡＴ構築物（Ono, S.J.ら、（1991） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4309-4312）である。他の例としては、グルコース調節タンパク質（GRP）（GRP78 （BiP）およびGRP94（エンドプラズマ））などのファミリーのメンバーのシャペロン、ならびにカルレチクリン、プロテインジスルフィドイソメラーゼ、ＥＲｐ７２などの他のシャペロンの遺伝子の調節領域を挙げることができる。ＸＢＰ−１標的は、Claussら、Nucleic acids Research  1996. 24:1855に教示されて折り、ＣＲＥ配列およびＴＲＥをも含む。  
【０２６１】
別の態様において、ＸＢＰ−１の上流（例えば、ＩＲＥ−１）または下流（例えば、ＡＴＦ６αまたは、ＥＲ耐性ＨｓｐＴＯを活性化するコシャペロンタンパク質、例えば、ｐ５８ＩＰＫ）で作用するＸＢＰ−１を含む経路において作用する異なる（すなわち、非ＸＢＰ−１）分子をスクリーニングアッセイに用いられる指標組成物の中に含めることができる。そのような分子を採用したスクリーニングアッセイにおいて同定される化合物はまた、間接的ではあるが、ＸＢＰ-１活性を調整するのにも有用であろう。ＩＲＥ−１は、ＩＲＥ−１ 基質（例えば、ＩＲＥ−１の自己リン酸化）の一例である。別の態様において、ＩＲＥ−１のエンドリボヌクレアーゼ活性を、例えば、ＸＢＰ-１のスプライシングを当該技術分野において公知の技法を用いて決定することによって測定することができる。The activity of ＩＲＥ−１の活性はまた、ＸＢＰ−１に関連する生物学的活性の調整測定することによって測定することができる。 
【０２６２】
本アッセイに使用される細胞は、真核細胞または原核細胞起源のいずれでもよい。例えば、ある態様において、該細胞は、細菌細胞である。別の態様において、該細胞は、酵母細胞などの真菌細胞である。別の態様において、本発明の細胞は、脊椎動物細胞、例えば、鳥類や哺乳動物細胞、である。好ましい態様において、本発明の細胞は、ネズミ細胞またはヒト細胞である。
【０２６３】
本発明の細胞は、内因性ＸＢＰ−１もしくはＸＢＰ-１を含むシグナル伝達経路中の別のタンパク質を発現することができる、または、そうするように操作することができる。例えば、ＸＢＰ−１タンパク質および/またはＸＢＰ−１の上流もしくは下流で作用する非ＸＢＰ−１タンパク質を発現するように操作された細胞は、該タンパク質をコードする発現ベクターを細胞中に導入することによって作製することができる。
【０２６４】
ある態様において、スプライシングされていないまたはスプライシングされたＸＢＰ−１タンパク質の発現および/または活性を調整する薬剤の役割を特異的に評価するために、ＸＢＰ-１が欠損した細胞の、スプライシングされたＸＢＰ−１もしくはスプライシングされることができないＸＢＰ−１を用いたレトロウイルス遺伝子形質導入を行うことができる。例えば、ＸＢＰ-１のループ構造（例えば、ＸＢＰ-１のループ構造の−１および＋３位置）に突然変異がある本実施例に記載のもののような構築物を作製することができる。この構築物が細胞中で発現すると、スプライシングされていない形態のＸＢＰ−１のみが作製される。そのような構築物を用いて、化合物が特定の形態のＸＢＰ−１を調整する能力を検出することができる。ある態様において、化合物は、ＸＢＰ−１の１つの形態、例えば、スプライシングされたＸＢＰ−１を、他の形態、例えば、スプライシングされていないＸＢＰ−１を調整することなく、検出することができる。
【０２６５】
ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子（例えば、ＸＢＰ-１の上流 もしくは下流で作用するタンパク質）、または指標細胞中のＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子を発現するために用いることができる組換え発現ベクターは、当該技術分野において公知である。例えば、ＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６α ｃＤＮＡがまず、標準的な分子生物学的技法を用いて組換え発現ベクターに導入される。ｃＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅することによって、または適切なｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、取得することができる。ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子（例えば、ヒト、ネズミおよび酵母）のｃＤＮＡのヌクレオチドは当該技術分野において公知である。そして標準的なＰＣＲ法によってｃＤＮＡの増幅を可能にするＰＣＲプライマーを設計するために、または、標準的なハイブリダイゼーション法を用いて、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用することができるハイブリダイゼーションプローブを設計するために用いることができる。哺乳動物ＸＢＰ−１ ｃＤＮＡのヌクレオチドおよび予期されるアミノ酸配列は、Liou, H-C. ら（1990） Science 247:1581-1584、Yoshimura, T.ら（1990） EMBO J.
9:2537-2542およびKishimoto T.ら、（1996） Biochem. Biophys. Res. Commun. 223:746-751に記載されている。ヒト、マウス、C. elegans および酵母ＩＲＥ−１のヌクレオチド配列は、例えば、Calfonら（2002） Nature 415:92-96に記載されている。  
【０２６６】
ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の非ＸＢＰ-１分子をコードするｃＤＮＡ分子の単離または増幅に続いて、DNA断片を発現ベクターに導入する。本明細書で用いられている「ベクター」は、それが結合した他の核酸を輸送することのできる核酸分子をいう。ベクターの１つの型は、「プラスミド」であり、これは、環状二本鎖ＤＮＡのループであって、その中に追加のＤＮＡセグメントをライゲーションできる。他の型のベクターは、ウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中にライゲーションできる。ある種のベクターは、それらが導入された宿主細胞中で自律的に複製することができる（例えば、細菌性の複製オリジンを有する細菌性ベクターおよびエピゾーム性哺乳動物用ベクター）。他のベクター（例えば、非エピゾーム性哺乳動物用ベクター）は、宿主細胞への導入に際して宿主細胞のゲノム中にインテグレートされ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。その上、ある種のベクターは、それらが機能的に結合された遺伝子の発現を指図することができる。かかるベクターは、ここでは、「組換え発現ベクター」または単に「発現ベクター」と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミド形態である。本明細書においては、「プラスミド」と「ベクター」は、プラスミドが最も普通に用いられる型のベクターであるので、交換可能に用いる。しかしながら、本発明は、かかる他の型の発現ベクター、例えば、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を包含することを意図している。
【０２６７】
本発明の発現ベクターは、宿主細胞での核酸の発現に適した形態での、本発明の核酸を含むが、これは、該組換え発現ベクターが、発現に用いようとする宿主細胞を基準にして選択された、発現しようとする核酸配列に機能的に結合した一つまたはそれ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「機能的に結合した」とは、関心対象のヌクレオチド配列が調節配列に、ヌクレオチド配列の発現を可能とするようにして（例えば、in vitro転写／翻訳系、またはベクターを宿主細胞に導入したときの宿主細胞において）、調節配列に結合されていることを意味するものとする。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーその他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を包含するものとする。そのような調節配列は、例えば、Goeddel;Gene Expression Technology:Methods in
Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA（1990）に記載されている。調節配列は、多くの型の宿主細胞でヌクレオチド配列の構成性発現を支配するもの、一定の宿主細胞でのみヌクレオチド配列の発現を支配するにすぎないもの（例えば、組織特異性調節配列）、または一定の条件でのみヌクレオチド配列の発現を支配するにすぎないもの（例えば、誘導性調節配列）を包含する。
【０２６８】
哺乳動物細胞において用いられるとき、該発現ベクターの制御機能は、ウイルス調節エレメントによって与えられることが多い。例えば、一般的に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。非限定な例としての哺乳動物発現ベクターは、ｐＣＤＭ８（Seed, B., （1987） Nature 329:840） およびｐＭＴ２ＰＣ （Kaufmanら、（1987）, EMBO J. 6:187-195）を含む。異なる調節配列を持つ種々のの哺乳動物発現ベクターが市販されている。  哺乳動物宿主細胞中の核酸の構成性発現にとって、好適な調節エレメントは、サイトメガロウイルスプロモーター/エンハンサーである。さらに、哺乳動物に用いられる誘導可能調節系は、当該技術分野において公知であり、例えば、遺伝子の発現が重金属イオン（例えば、Mayoら （1982） Cell
29:99-108; Brinsterら.
（1982） Nature
296:39-42; Searleら（1985） Mol. Cell. Biol. 5:1480-1489）、熱ショック（例えば、Nouerら（1991） in Heat
Shock Response, e.d. Nouer, L. , CRC, Boca Raton , FL, pp167-220）、ホルモン（例えば、Lee
ら. （1981） Nature
294:228-232; Hynesら（1981） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2038-2042; Klockら （1987） Nature 329:734-736; Israel & Kaufman （1989） Nucl.
Acids Res. 17:2589-2604; およびＰＣＴ国際公開第WO
93/23431号）、FK506関連分子（例えば、ＰＣＴ国際公開第WO 94/18317号）、またはテトラサイクリン（Gossen, M.とBujard, H. （1992） Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Gossen,
M. et al. （1995） Science 268:1766-1769;
ＰＣＴ国際公開第WO 94/29442号;およぎＰＣＴ国際公開第WO 96/01313号）によって調節される系が挙げられる。さらにまた、多くの組織特異的調節配列が当該技術分野において公知であり、アルブミンプロモーター（肝臓特異性；Pinkertら（1987） Genes
Dev. 1:268-277）、リンパ球特異性プロモーター（CalameとEaton （1988） Adv. Immunol. 43:235-275）、特にＴ細胞レセプターのプロモーター（WinotoとBaltimore （1989） EMBO
J. 8:729-733）および免疫グロブリン（Banerjiら （1983） Cell 33:729-740; QueenとBaltimore （1983） Cell 33:741-748）、ニューロン特異性プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター; ByrneとRuddle （1989） Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477）、膵臓特異的プロモーター（Edlundら（1985） Science 230:912-916）、ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許出願第4,873,316号および欧州特許出願第264,166号）が含まれる。発生に関連するプロモーターもまた、包含される。例えば、ネズミホックスプロモーター（KesselとGruss （1990） Science 249:374-379） およびα−フェトプロテインプロモーター（CampesとTilghman （1989） Genes
Dev. 3:537-546）が含まれる。
【０２６９】
ベクターＤＮＡは、哺乳動物細胞に、従来のトランスフェクションの技法によって導入することができる。本明細書において用いられている種々の形の用語「トランスフェクション」とは、外来の核酸（例えば、ＤＮＡ）を、宿主細胞に導入するための、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔を包含する当該技術に認められた様々な手法を意味するものとする。宿主細胞を形質転換または核酸移入するための適切な方法は、Sambrookら［Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd
ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）］その他の研究室便覧に見出すことができる。
【０２７０】
哺乳動物細胞の安定的なトランスフェクションには、用いる発現ベクターおよびトランスフェクション手法に応じて、細胞の小画分のみが、外来ＤＮＡをそれらのゲノムに組みこみ得るにすぎないことが公知である。これらの組込み体を同定かつ選別するために、一般的には、選別できるマーカー（例えば、抗体に対する耐性）をコードする遺伝子を、関連対象の遺伝子とともに宿主細胞に導入する。選別できる好適なマーカーは、薬物、例えばＧ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートに対する耐性を与えるものを包含する。選別できるマーカーをコードする核酸は、ＸＢＰ−１をコードするそれと別個のベクターで宿主細胞に導入するか、またはより好ましくは同じベクターで導入する。導入した核酸で安定的にトランスフェクトされたされた細胞は、薬物選別によって特定することができる（例えば、選別できるマーカー遺伝子を組み込んだ細胞は、生存することになるが、他の細胞は死滅する）。
【０２７１】
ある態様において、発現ベクター内で、コード配列は、指標細胞中の分子の構成性発現を可能とする調節配列に機能的に結合している（例えば、ウイルス調節配列、サイトメガロウイルス、プロモーター/エンハンサーを用いることができる）。指標細胞中において構成性発現を可能とするＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の組換え発現ベクターを使用することによって、分子の活性を高める、または阻害する化合物の同定を化合物の同定が可能となる。さらに別の態様において、発現ベクター内で、コード配列は、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の内因性遺伝子の調節配列（すなわち、内因性遺伝子に由来するプロモーター調節領域）に機能的に結合している。発現が内因性調節配列によって制御される組換え発現ベクターの使用が、分子の活性を高める、または阻害する化合物の同定に好ましい。
【０２７２】
Ｂ．スプライシングされたＸＢＰ-１対スプライシングされていないＸＢＰ−１の測定を行うアッセイ
別の態様において、本発明は、スプライシングされたＸＢＰ−１対スプライシングされていないＸＢＰ−１の比率、またはスプライシングされていないＸＢＰ−１対スプライシングされたＸＢＰ−１の比率を変化させる化合物を同定するためのスクリーニングアッセイを提供する。スプライシングされた形態のＸＢＰ−１ ｍＲＮＡのみが遺伝子の転写を活性化する。スプライシングされていないＸＢＰ−１ ｍＲＮＡは、スプライシングされたＸＢＰ−１ ｍＲＮＡの活性化を阻害する。上で説明したように、ヒトおよびネズミＸＢＰ−１ ｍＲＮＡは、２６１および２６７アミノ酸のｂＺＩＰタンパク質をそれぞれコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１）を含有している。どちらのｍＲＮＡも、ＯＲＦ１と部分的に重なるがフレーム状ではない別のＯＲＦ、ＯＲＦ２を含有している。ＯＲＦ２ は、ヒトおよびネズミ細胞の双方の２２２アミノ酸をコードする。ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡのヒトおよびネズミのＯＲＦ１およびＯＲＦ２は、それぞれ７５％および８９％の同一性を有している。ＥＲストレスに応答して、ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡは、ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡからイントロンを切除したＥＲ膜貫通エンドリボヌクレアーゼおよびキナーゼＩＲＥ−１によってプロセシングされる。ネズミおよびヒト細胞において、26ヌクレオチドのイントロンが切除される。ネズミ細胞の26ヌクレオチドをスプライシングすることによって、アミノ酸 165においてフレームシフトが生じる。これによってＣ末端97 アミノ酸が、第１のオープンリーディングフレーム（ORF1）から除去され、ＯＲＦ２からの212アミノがb-ZIPドメインを含有するＯＲＦ１のＮ末端164 アミノ酸に添加される。哺乳動物細胞において、スプライシング事象の結果、ほぼ267 アミノ酸のスプライシングされていないＸＢＰ−１タンパク質から371アミノ酸のスプライシングされたＸＢＰ−１タンパク質への変換が起こる。スプライシングされたＸＢＰ−１はその後、核に転位し、そこで、標的配列と結合し、それらの転写を誘導する。 
【０２７３】
スプライシングされたＸＢＰ−１対スプライシングされていないＸＢＰ−１の比率、またはスプライシングされていないＸＢＰ−１対スプライシングされたＸＢＰ−１の比率を変化させる化合物は、例えば、ＵＰＲの調整、細胞分化の調整、ＩＬ−６産生の調整、免疫グロブリン産生の調整、プロテアソーム経路の調整、タンパク質の折り畳みおよび輸送の調整、Ｂ細胞最終分化の調整、ならびにアポトーシスの調整といったＸＢＰ-１の生物学的活性を調整するに有用である。該化合物はまた、ＸＢＰ-１発現および/または活性を調整することが有利な疾患、例えば、自己免疫異常や悪性疾患を治療するのに用いることもできる。
【０２７４】
スプライシングされたＸＢＰ−１対スプライシングされていないＸＢＰ−１の比率、またはスプライシングされていないＸＢＰ−１対スプライシングされたＸＢＰ−１の比率を評価するための技法は、当該技術分野においてルーチンで行われている。例えば、ノーザンブロット法またはウェスタンブロット法を用いて、サイズに基づいて２つの形態を区別することができる。スプライシングされた形態のＸＢＰ-１は、スプライシングされていない形態には見られないエクソンを含んでいるので、別の態様において、スプライシングされた、またはスプライシングされていない形態のＸＢＰ-１を特異的に認識する抗体を、当該技術分野において公知の技法を用いて開発することができる（Yoshidaら 2001. 
Cell. 107:881）。さらに、ＰＣＲを用いて、スプライシングされたＸＢＰ−１とスプライシングされていないＸＢＰ−１を区別することができる。例えば、本明細書に記載のように、プライマーがネズミＸＢＰ−１のタンパク質４１０および５８０、または関連するＸＢＰ−１分子の対応する位置に由来する場合、スプライス部位を含む領域を増幅するために、プライマーセットを用いて、ＸＢＰ−１を増幅することができる。１７１塩基対の断片は、スプライシングされていないＸＢＰ−１ ｍＲＮＡに対応している。１４５ｂｐの更なるバンドがスプライシングされた形状のＸＢＰ−１に対応する。異なる形状のＸＢＰ−１の比率を、これのまたは他の、当該技術で認識されている方法を用いて決定することができる。
【０２７５】
Ｃ．無細胞アッセイ
別の態様において、指標組成物は無細胞組成物である。宿主細胞中もしくは培養培地中の組換え法によって発現したＸＢＰ−１またはシグナル伝達経路中の非ＸＢＰ-１タンパク質を、宿主細胞または培養培地から、タンパク質増殖のための標準的な方法を用いて単離することができる。例えば、抗体を用いたイオン変換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、および免疫アフィニティー精製を用いて、無細胞組成物に用いることができる精製されたもしくは半精製されたタンパク質を作製することができる。あるいは、関連対象のタンパク質を発現する細胞のライセートまたは抽出物を無細胞組成物に使用するために調製することができる。
【０２７６】
ある態様において、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子を特異的に調製する化合物は、それらが、ＸＢＰ-１（または、例えば、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６α）が結合する標的分子をもつＸＢＰ−１（または、例えば、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６α）を調整する能力に基づいて同定される。標的分子は、ＤＮＡ分子、例えば、ＸＢＰ−１応答性エレメント、シャペロン遺伝子の調節領域など、またはタンパク質分子であることができる。タンパク質−タンパク質相互作用（例えば、免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイなど）の検出を可能とする、またはＤＮＡ結合タンパク質と標的ＤＮＡ配列の間の相互作用の検出を可能とする（例えば、電気泳動移動度シフトアッセイ、ＤＮＡｓｅ Ｉフットプリンティング法など）の好適なアッセイが該技術分野において公知である。試験化合物の存在下または不存在下において、これらのアッセイを使用して、ＸＢＰ-１と標的分子の相互作用を調整（阻害または促進）する化合物を同定することができる。
【０２７７】
ある態様において、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の、試験化合物の存在下における標的分子への結合の量は、試験化合物の不存在下におけるＸＢＰ−１（または、例えば、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α）の標的分子への結合の量より大きい。そのような場合、該試験化合物は、ＸＢＰ−１（または、例えば、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α）の標的への結合を促進する化合物であると同定される。別の態様において、ＸＢＰ−１（または、例えば、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α）の、試験化合物の存在下における標的分子への結合の量は、試験化合物の不存在下におけるＸＢＰ−１（または、例えば、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α）の標的分子への結合の量より少ない。そのような場合、該試験化合物は、ＸＢＰ−１（または、例えば、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α）の標的への結合を阻害する化合物であると同定される。
【０２７８】
試験化合物のＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子への結合は、上記のようにして、直接的または間接的に決定することができる。ＸＢＰ−１（または、例えば、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α）タンパク質が、試験化合物と結合する能力の決定はまた、リアルタイムBiomolecular Interaction Analysis （BIA）などの技法を用いて達成することもできる （Sjolander, S.とUrbaniczky,
C. （1991） Anal.
Chem. 63:2338-2345; Szabo ら、（1995） Curr. Opin. Struct. Biol.
5:699-705）。本明細書において用いられている「ＢＩＡ」は、いかなる相互作用物質（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）も用いずに、リアルタイムで生物特異的な相互作用を研究するための技術である。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象の変化を、生物学的分子どうしのリアルタイム反応の指標として用いることができる。 
【０２７９】
ＸＢＰ−１（または、例えば、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α）タンパク質と標的分子との間の相互作用を調整する試験化合物を同定するための本発明の方法において、完全なＸＢＰ−１（または、例えば、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α）タンパク質を該方法に用いることができる。または、あるいは、タンパク質の一部のみを用いることができる。例えば、単離されたＸＢＰ−１ ｂ−ＺＩＰ構造（または、ｂ−ＺＩＰを含むＸＢＰ-１のより大きなサブ領域）を用いることができる。別の実施例において、スプライス部位を含むＸＢＰ-１の形態を用いることができる（例えば、約ヌクレオチド５０６から約ヌクレオチド５３２）。タンパク質と標的分子との間の相互作用の程度は、例えば、１以上のタンパク質を、検出可能な物質（例えば、放射性標識）で標識し、標識されていないタンパク質を単離し、標識されていないタンパク質に関連する検出可能な物質の量を定量することによって決定することができる。該アッセイを用いて、ＸＢＰ−１（または、例えば、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α）タンパク質と標的分子との間の相互作用を刺激、もしくは阻害する試験化合物を同定することができる。タンパク質と標的分子との間の相互作用を刺激する試験化合物は、例えば、スプライシングされたＸＢＰ−１と標的分子との間の、試験化合物の不存在下における相互作用の程度との比較において、相互作用の程度を増加させる能力に基づいて同定される。そして、そのような化合物は、細胞中におけるスプライシングされたＸＢＰ−１の活性を増加させることが期待されるであろう。タンパク質と標的分子との間の相互作用を阻害する試験化合物は、例えば、スプライシングされたＸＢＰ−１と標的分子との間の、試験化合物の不存在下における相互作用の程度との比較において、相互作用の程度を減少させる能力に基づいて同定される。そして、そのような化合物は、細胞中におけるスプライシングされたＸＢＰ−１の活性を減少させることが期待されるであろう。 
【０２８０】
本発明の上記アッセイ法のある態様において、ＸＢＰ−１（または、例えば、ＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子、例えば、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α）または、応答性標的分子のいずれかを固定化し、例えば、１もしくは両方のタンパク質の複合体化されたものと、複合体化されていないものを容易に分離し、または、アッセイの自動化を適用することが望ましいかもしれない。試験化合物のＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の結合、または、ＸＢＰ−１タンパク質（または、例えば、ＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子、例えば、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α)と標的分子との、試験化合物の存在下および不存在下における相互作用を、反応物質を収容するのに好適なあらゆる容器中において行うことができる。そのような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管およびマイクロ遠心管が含まれる。ある態様において、融合タンパク質は、タンパク質の一方もしくは両方が基質に結合できるようにするドメインを、１以上の分子に添加して提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ/標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical, St. Louis, MO）または、グルタチオン被覆マイクロタイタープレート上に吸収され得る。それは後に試験化合物、または試験化合物および吸収された標的タンパク質もしくはＸＢＰ−１（または、例えば、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α）タンパク質と結合される。そしてその混合物を複合体形成の助けとなる条件下（例えば、塩とｐＨの生理学的条件）でインキュベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄し、あらゆる未結合の成分を除去し、ビーズの場合は基質を固定化する。そして複合体形成を例えば、上記のようにして、直接的または間接的に決定する。あるいは複合体は、基質から分離することができ、結合または活性のレベルを、標準的な技法を用いて決定することができる。
【０２８１】
タンパク質を基質上に固定化するための他の技法は、本発明のスクリーニングアッセイにも用いることができる。例えば、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子または標的分子を、ビオチンとストレプトアビジンの結合を用いて固定化することができる。ビオチン化されたタンパク質または標的分子は、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ-スクシイミド）から、当該技術分野において公知の技法（例えば、ビオチン化キットPierce Chemicals, Rockford, IL）を用いて調製され、ストレプトアビジンが塗布された９６ウェルプレート（Pierce Chemical）のウェル中で固定化される。あるいは、タンパク質または標的分子に反応するが、タンパク質とその標的分子との結合を妨害しない抗体を該プレートのウェルに被覆することができる。そして未結合の標的またはＸＢＰ−１（または、例えば、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α）タンパク質をウェル中で抗体結合によってトラップすることができる。ＧＳＴ固定化された複合体の上記の方法に加えて、そのような複合体の検出方法としては、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子または標的分子に反応性の抗体を用いた複合体の免疫検出、ならびにＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６αタンパク質または標的分子に関連する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイを含む。
【０２８２】
本発明のさらに別の局面において、ＸＢＰ-１タンパク質（または、例えば、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α）またはその断片を「ベイトタンパク質」としてツーハイブリッドアッセイもしくはスリーハイブリッドアッセイにおいて用い（例えば、米国特許第5,283,317号；Zervosら、 （1993） Cell 72:223-232；Maduraら （1993） J.
Biol. Chem. 268:12046-12054；Bartelら、（1993） Biotechniques 14:920-924；Iwabuchiら、（1993） Oncogene 8:1693-1696；およびBrent、ＰＣＴ国際公開第
WO94/10300号参照）、ＸＢＰ-１（「結合タンパク質」もしくは「ｂｐ」）と結合するまたは相互作用し、ＸＢＰ-１活性に関与する他のタンパク質を同定することができる。そのようなＸＢＰ−１−結合タンパク質はまた、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１標的、例えば、ＸＢＰ-１媒介性シグナル伝達経路の下流エレメントによるシグナルの伝播に関与する可能性がある。あるいは、そのようなＸＢＰ−１−結合タンパク質は、ＸＢＰ−１インヒビターとなり得る。
【０２８３】
ツーハイブリッド系は、殆ど転写因子のモジュラー性に基づく、それは、分離可能なＤＮＡ−結合ドメインおよび活性化ドメインからなる。簡単に述べれば、該アッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。一方の構築物においては、ＸＢＰ−１タンパク質をコードする遺伝子が公知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他方の構築物においては、同定されていないタンパク質（「プレイ」もしくは「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列のライブラリーからのＤＮＡ配列が、公知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「ベイト」および「プレイ」タンパク質がin vivoでＸＢＰ−１依存性複合体の形成と相互作用することができれば、転写因子のＤＮＡ−結合ドメインおよび活性化ドメインは近位に近付けられる。この近さが、転写因子に反応する転写調節部位に作用可能に結合するレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写を可能とする。レポーター遺伝子の発現が検出され、転写因子を含有する細胞コロニーが単離され、使用され、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子と相互作用するタンパク質をコードするクローニングされた遺伝子を得ることができる。 
【０２８４】
Ｄ．ノックアウト細胞を用いたアッセイ
別の態様において、本発明は、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の生物学的作用を、ＸＢＰ−１（または、例えば、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α）が欠損した細胞を用いて調整する化合物を同定する方法を提供する。実施例に記載しているように、Ｂ細胞におけるＸＢＰ-１活性の阻害（例えば、ＸＢＰ-１遺伝子の破壊）によって、例えば、Ｉｇ産生の欠損が起こる。こうして、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子が欠損した細胞を用いて、ＸＢＰ-１自身を調整する以外の手段で（すなわち、ＸＢＰ-１欠損表現型を「救助する」化合物）、ＸＢＰ-１によって調節された生物学的は脳を調整する薬剤を同定することができる。あるいは、条件付で、遺伝子を非機能的にする「条件付 ノックアウト」系を使用して、スクリーニングアッセイに用いる欠失細胞を作出することができる。例えば、ＰＣＴ国際公開第 WO 94/29442号および米国特許第5,650,298号に記載のように、遺伝子を条件付に破壊するためにテトラサイクリン調節系、または、そこから細胞を単離することができる動物を用いて細胞を作出して、制御された仕方で、接触している細胞におけるテトラサイクリン濃度の調製を介して、ＸＢＰ−１（またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子、例えば、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α）を欠損させることができる。形質細胞の分化に関連するアッセイに関して、類似の条件付破壊アプローチを用いることができる、または、あるいは、RAG-2欠損胚盤胞捕捉系を使用して、ＸＢＰ−１（または、例えば、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α）遺伝子のホモ接合体突然変異を有する胚性幹細胞から生じたリンパ性組織を有するマウスを作製することができる。特異的な細胞種、例えば、リンパ球系細胞（例えば、胸腺、脾臓および/もしくはリンパ節細胞）、またはそのような動物由来のＢ細胞などの精製細胞をスクリーニングアッセイに用いることができる。  
【０２８５】
スクリーニング法においては、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子が欠損した細胞を試験化合物に接触させ、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子によって調節される生物学的反応をモニターすることができる。ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子が欠損した細胞における応答の調節（適切な対照、例えば、未処理の細胞もしくは対照薬剤で処理した細胞との比較による）は、ＸＢＰ−１（または、例えば、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α）が調節する反応のモジュレーターとしての試験化合物を同定する。別の態様において、スプライシングされていない、またはスプライシングされたＸＢＰ−１タンパク質を調整する薬剤の役割を特異的に評価するために、ＸＢＰ-１が欠損した細胞のレトロウイルス遺伝子形質導入を行い、スプライシングされたＸＢＰ−１またはスプライシングされ得ない形態のＸＢＰ-１を発現させることができる。例えば、ＸＢＰ−１のループ構造（例えば、ＸＢＰ−１のループの位置−１および＋３）に突然変異を有する、本実施例に記載のもののような構築物を生成することができる。細胞内で、この構築物を発現させることによって、スプライシングされていない形態のＸＢＰ−１のみを産生することになる。このような構築物を用いて、化合物が特定の形態のＸＢＰ−１を調整する能力を検出することができる。例えば、ある態様において、ある化合物は、他の形態を調整することなく、１つの形態を調整する。
【０２８６】
ある態様において、ＸＢＰ−１（または、例えば、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α）が欠損した細胞のin vivo 応答を調整する試験化合物を同定するために、試験化合物を直接的に非ヒトノックアウト動物、好ましくはマウス（例えば、ＸＢＰ-１遺伝子またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の他の遺伝子を上記の手段によって条件付きで破壊したマウス、または、リンパ性臓器が上記のＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子を欠損しているキメラマウス）に直接投与する。別の態様において、ＸＢＰ−１（または、例えば、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α）を欠損する細胞を、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子を欠損する非ヒト動物から単離し、ex vivo で試験化合物を単離し、細胞中でＸＢＰ−１（または、例えば、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α）によって調節される反応を調整する試験化合物を同定する。
【０２８７】
ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子を欠損している細胞は、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子を欠損するように作出された非ヒト動物から取得することができる。好ましい非ヒト動物としては、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギおよびヒツジが含まれる。好ましい態様において、欠損動物は、マウスである。ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子が欠損したマウスは、当該技術分野において公知の方法を用いて作製することができる。特定の遺伝子産物を欠損している非ヒト動物は、典型的に相同組換えによって作製される。簡単に述べれば、欠失、付加もしくは置換が導入され、それによって、例えば、内因性ＸＢＰ−１（または、例えば、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α）を機能的に破壊した遺伝子の少なくとも一部を含有するようにベクターを調製する。該遺伝子は、好ましくはマウス遺伝子である。例えば、マウスＸＢＰ−１遺伝子は、ＸＢＰ−１ ｃＤＮＡをプローブとして用いてマウスゲノムＤＮＡライブラリーから単離することができる。次いでマウスＸＢＰ−１遺伝子を使用して、マウスゲノム中の内因性ＸＢＰ−１遺伝子を調整するのに好適な相同組換えベクターを構築することができる。好ましい態様において、該ベクターは、相同組換えによって内因性遺伝子が機能的に破壊される（すなわち、もはや機能的タンパク質をコードしない。「ノックアウト」ベクターとも呼ぶ）ように設計されている。
【０２８８】
あるいは、該ベクターは、相同組換えによって内因性遺伝子が突然変異するか、またはそうでなければ、依然として機能的タンパク質をコードする（例えば、上流調節領域が変更され、それによって内因性ＸＢＰ−１タンパク質の発現を変更することができる）ように設計することができる。該相同組換えベクターにおいて、遺伝子の変更された部分は、遺伝子の付加核酸によって、胚性幹細胞中のベクターが持つ外因性遺伝子と内因性遺伝子との間に相同組換えを起こすことを可能とする５’および３’末端に隣接する。付加隣接核酸は、内因性遺伝子を用いた相同組換えを成功させるのに十分な長さである。典型的に数キロベースの隣接ＤＮＡ（５’および３’末端の双方）が該ベクターに含まれる（相同組換えベクターについては、例えば、Thomas, K.R. and Capecchi, M. R. （1987） Cell 51:503の記載を参照されたい）。該ベクターを胚性幹細胞株に導入し（例えば、エレクトロポレーションによる）、導入された遺伝子が内因性遺伝子と相同的に組み換えられた細胞を選択する（例えば、Li, E. ら（1992） Cell 69:915参照）。次いで、その選択された細胞を動物（例えば、マウス）の胚盤胞に注入し、凝集キメラを作製する（例えば、Bradley, A. in Teratocarcinomas and 胚nic Stem
Cells: A Practical Approach,
E.J. Robertson, ed. （IRL, Oxford, 1987） pp. 113-152参照）。次いで、キメラ胚を適切な擬妊娠した雌の仮親動物に移植し、胚を落ち着かせる。相同組換えしたＤＮＡをその生殖細胞に宿す子孫は、導入遺伝子の生殖系列伝搬によって、動物のすべての細胞が相同組換えされたＤＮＡを有する動物を繁殖させるのに用いることができる。相同組換えベクター、および相同組換え動物を構成する方法は、Bradley,A.（1991）Current Opinion in Biotechnology 2:823-829、ならびにLe
Mouellecらによる国際公開特許第ＷＯ90/11354号公報；Smithiesらによる国際公開特許第ＷＯ91/01140号公報；Zijlstraらによる国際公開特許第ＷＯ92/0968号公報；およびBernsらによる国際公開特許第ＷＯ93/04169号公報に更に記載されている。
【０２８９】
別の態様において、例えば、ＸＢＰ−１スプライシングされていないＤＮ、またはスプライシングされた構築物を用いて、野生型およびヌルマウスの双方からのドナー骨髄細胞のレトロウイルスによる形質導入を行い、照射されたＲＡＧレシピエントを再構築することができる。これによって、発現されたリンパ球系細胞がスプライシングされていない、もしくは、スプライシングされたＸＢＰ−１タンパク質のみ、または主に陰性のＸＢＰ−１を発現するマウスが作製されるであろう。次いで、これらのマウスからのＢ細胞を、ＸＢＰ-１によって調節される生物学的反応を調整する化合物について調べた。
【０２９０】
該スクリーニングアッセイのある態様において、化合物がＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子によって調節される生物学的反応を調整する能力を有するかどうかを調べ、非ヒト欠損動物にin vivoで試験化合物を投与し、試験化合物が動物における反応に及ぼす作用を評価することによって、試験化合物を欠損細胞に接触させた。
【０２９１】
該試験化合物は、医薬組成物としてノックアウト動物に投与することができる。そのような組成物は、典型的には、試験化合物と、薬学的に許容可能な担体とを含む。ここで用いる用語「薬学的に許容可能な担体」には、薬学的投与に適合性のある、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌性化合物および抗カビ性化合物、等張化合物および吸収遅延化合物、等々が含まれる。このような媒質および化合物の、薬学的に活性な物質への利用は当該技術分野において公知である。従来の何らかの媒質または化合物が活性化合物にとって適合性がない場合を除き、組成物中へのその利用は考察されたところである。補助的な活性化合物も、当該組成物中に加えてもよい。医薬組成物について後において詳細に述べる。
【０２９２】
別の態様において、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子によって調節される生物学的反応を調整する化合物は、ＸＢＰ−１欠損細胞を ex
vivo で１以上の試験化合物に接触させ、試験化合物がリードアウトに及ぼす作用を決定することによって同定される。ある態様において、試験化合物に ex
vivo で接触したＸＢＰ−１欠損細胞は、被験体に再投与される。
【０２９３】
スクリーニング法を ex vivoで 行うために、例えば、ＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６αが欠損する細胞を、非ヒトＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α欠損動物もしくは胚から、標準的な方法によって単離し、in vitro で試験化合物とともにインキュベート（すなわち、培養）した。細胞（例えば、Ｂ細胞）は、例えば、ＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α欠損動物から、標準的な技法によって単離することができる。
【０２９４】
別の態様において、ＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の１つのメンバーより多くが欠損している細胞を当該アッセイに使用することができる。
【０２９５】
欠損細胞と試験化合物とを接触させた後（ex vivo または in
vivo）、該試験化合物が、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子によって調節される生物学的反応を、本明細書に記載の、例えば、細胞の光顕微鏡分析、細胞の組織化学的分析、タンパク質の産生、特定の遺伝子、例えば、シャペロン遺伝子もしくはＩＬ−６の誘導を含む種々の好適な方法によって決定することができる。 
【０２９６】
Ｅ．試験化合物
種々の試験化合物を、本明細書に記載のスクリーニングアッセイを用いて評価することができる。用語「試験化合物」は、本発明のアッセイにおいて用いられ、それがＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の発現および/または活性に影響を及ぼす能力が試験されるあらゆる試薬および試験薬剤を含む。スクリーニングアッセイにおいて、１より多くの化合物、例えば、複数の化合物を、それが例えば、ＸＢＰ−１の発現および/または活性を調整することができる能力について、同時に試験することができる用語「スクリーニングアッセイ」は、好ましくは、１つの化合物がリードアウトに影響を及ぼす能力を試験することより、むしろ、複数の化合物がリードアウト選択に影響を及ぼすことができる能力を試験するアッセイを言う。当該アッセイは、そのスクリーニングの対象となる作用をもつことが以前に知られていなかった化合物を同定することが好ましい。ある態様において、ハイスループットスクリーニングを用いて、化合物の活性を調べることができる。
【０２９７】
いくつかの態様において、テストしようとする化合物は、ライブラリーを由来とするものでもよい（即ち、化合物のライブラリーのメンバーである）。ペプチドライブラリーの利用は、当該技術分野でよく確立されているが、例えばベンゾジアゼピン（Buninら、（1992）. JAm. Chem. Soc. 114 : 10987; DeWitt et al. （1993）. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90: 6909）、ペプトイド（Zuckennann. （1994）. J Med Chem. 37 : 2678）、オリゴカルバメート（Cho
et al. （1993）. Science. 261 : 1303-）、およびヒダントイン（上記のDeWittら）など、他の化合物の混合物を生成できる新しい技術が開発されている。104種乃至105種といった多様な小有機分子の分子ライブラリーを合成する方法が解説されている（Carell ら （1994）. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 33: 2059-Carell et al. （1994） Angew. Chem.
Int. Ed. Engl. 33 : 2061-）。
【０２９８】
本発明の化合物は、生物ライブラリー；空間指定可能なパラレル固相または液相ライブラリー、逆重畳積分を必要とする合成ライブラリー法、「ワンビーズ・ワンコンパウンド」ライブラリー法、および、アフィニティクロマトグラフィ選別を用いた合成ライブラリー法を含め、当該技術分野で公知のコンビナトリアル・ライブラリー法における多数のアプローチのいずれを利用して取得してもよい。生物ライブラリーのアプローチはペプチドライブラリーに限られるが、他の四つのアプローチは、ペプチド、ペプチド以外のオリゴマーまたは小分子の化合物ライブラリーに応用できる（Lam, K. S. （1997） Anticancer Drug Des. 12 : 145）。分子ライブラリーを合成する他の方法の例は、例えば、Erbら （1994）. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422- ; Horwell et al. （1996）
Immunopharmacology 33 : 68 -and in Gallopら. （1994） ; JMedChem. 37 : 1233-. に見ることができる。
【０２９９】
化合物のライブラリーは、溶液中に作製しても（例えば、Houghten （1992） Biotechniques 13 : 412-42 1）、またはビーズ上 （Lam （199 1） Nature 354 : 82-84）、チップ上（Fodor （1993） Nature 364: 555-556）、細菌 （Ladner 米国特許5,223,409）、胞子 （Ladner USP'409）、プラスミド（Cull ら、 （1992） Proc Natl Acad Sci USA 89:
1865-1869） またはファージ （Scott and Smith （1990） Science 249: 3 86-390） ; （Devlin （1990） Science 249: 404-406）; （Cwirla ら、. （1990） Proc. Natl. Acad. Sci 87: 6378-6382）; （Felici （1991） JMol. Biol.
222: 301-310）上に作製してもよい。さらに別の態様においては、コンビナトリアルポリペプチドをｃＤＮＡライブラリーから作製する。
【０３００】
活性についてスクリーニングできる化合物の例には、限定はしないが、ペプチド、核酸、炭水化物、小有機分子、および天然生成物抽出ライブラリーがある。
【０３０１】
候補/試験化合物としては、例えば、１）Ｉｇ尾状融合ペプチド、ランダムペプチドライブラリー（例えば、Lam, K.S.ら、（1991） Nature 354:82-84; Houghten, R.ら、（1991） Nature 354:84-86）、ならびにＤおよび/またはＬ構成アミノ酸のコンビナトリアル化学誘導分子ライブラリーのメンバーを含めた、可溶性ペプチドなどのペプチド類；２）ホスホペプチド類（例えば、ランダムまたは部分縮退化、指向型ホスホペプチドライブラリーのメンバー、例えば、Songyang, Z.ら（1993） Cell 72:767-778）；３）抗体（例えば、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラおよび一本鎖抗体、ならびに抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ発現ライブラリー断片およびエピトープ結合断片）；４）小有機分子および無機分子（例えば、コンビナトリアルおよび天然の生成物ライブラリーから取得した分子）；５）酵素（例えば、エンドリボヌクレアーゼ、ヒドロラーゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、シンタターゼ（synthatases）、イソメラーゼ、ポリメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、オキシドレダクターゼおよびATPases）；ならびに６）ＸＢＰ-１（または、例えば、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α）の突然変異形態、例えば、分子の強い陰性突然変異形態、が含まれる。
【０３０２】
本発明の試験化合物は、生物ライブラリー；空間指定可能なパラレル固相または液相ライブラリー、逆重畳積分を必要とする合成ライブラリー法、「ワンビーズ・ワンコンパウンド」ライブラリー法、および、アフィニティクロマトグラフィ選別を用いた合成ライブラリー法を含め、当該技術分野で公知のコンビナトリアル・ライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを利用して取得することができる。生物ライブラリーのアプローチは、ペプチドライブラリーに限られるが、他の四つのアプローチは、ペプチド、ペプチド以外のオリゴマーまたは小分子の化合物ライブラリーに応用できる（Lam, K. S.ｆ（1997） Anticancer Drug Des. 12 : 145）。
【０３０３】
分子ライブラリーを合成する他の方法の例は、例えば、DeWittら （1993） Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erbら（1994） Proc. Natl. Acad. Sci. USA  91:11422; Zuckermann ら （1994） J. Med. Chem. 37:2678; Choら（1993） Science 261:1303; Carrell et al. （1994） Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carellら（1994） Angew.
Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; and Gallopら（1994） J. Med. Chem. 37:1233に見ることができる。
【０３０４】
化合物のライブラリーは、溶液中に作製しても（例えば、Houghten （1992） Biotechniques 13 : 412-421）、またはビーズ上 （Lam （199 1） Nature 354 : 82-84）、チップ上（Fodor （1993） Nature 364: 555-556）、細菌 （Ladner 米国特許5,223,409）、胞子 （Ladner USP'409）、プラスミド（Cull ら、 （1992） Proc Natl Acad Sci USA 89:
1865-1869） またはファージ （Scott and Smith （1990） Science 249: 3 86-390）； Devlin （1990） Science 249: 404-406）; （Cwirla ら、. （1990） Proc. Natl. Acad. Sci 87: 6378-6382）; （Felici （1991） JMol. Biol.
222: 301-310；Ladner上掲）上に作製してもよい。
【０３０５】
当該スクリーニングアッセイにおいて同定される化合物は、ＸＢＰ-１によって調節される１以上の生物学的反応を調整するための方法に用いることができる。それらを細胞に接触させる前に、そのような医薬組成物（詳細は上掲書）として化合物を調剤することが望ましいかもしれないことが理解されるであろう。
【０３０６】
試験化合物が、本明細書において既に記載してある種々の方法の１つを用いて、例えば、ＸＢＰ-１の発現または活性を直接的もしくは間接的に調整することが一旦同定されれば、次いでその選択された試験化合物（または「関連対象の化合物」）を、それが細胞に及ぼす作用についてを、例えば、in vivo （例えば、関連対象の化合物を被験体に投与することによって）またはex vivo（例えば、被験体から細胞を単離し、その単離した細胞を関連対象の化合物に接触させる、もしくは、あるいは、関連対象の化合物を細胞株に接触させることによって）で関連対象の化合物を細胞に接触させ、関連対象の化合物が細胞に及ぼす影響を、適切な対照（例えば、未処理の細胞、もしくは生物学的反応を調整しない対照化合物もしくは担体で処理された細胞）との比較において決定することによって、さらに評価することができる。
【０３０７】
本発明はまた、当該スクリーニングアッセイによって同定される化合物にも関する。
【０３０８】
ＩＩＩ．医薬組成物
本発明の医薬組成物は、それに意図された投与経路にとって適合性があるように調合する。例えば、非経口、皮内、または皮下投与に用いる溶液または懸濁液には、以下の成分を含めることができる。即ち、注射用の水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの無菌の希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌性化合物；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化合物；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤や、塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性を調節するための化合物、である。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調節できる。非経口投与用製剤は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨て用注射筒または複数回用量用のバイアル内に封入してもよい。
【０３０９】
注射用に適した医薬組成物には、無菌の水溶液（水溶性の場合）または分散液や、無菌の注射用溶液または分散液の即時調合用の無菌の粉末がある。静脈内投与の場合、適した担体には、生理食塩水、静菌水、クレモフォールＥＬ（登録商標）（BASF, Parsippany, NJ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）がある。いずれの場合も、組成物は無菌であることが好ましいであろう。また、注射筒に容易に入れられる程度に流動性でなければならない。また製造および保存条件下で安定でなくてはならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、等々）および適したこれらの混合物を含有する、溶媒でも、または分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングを利用したり、分散液の場合には必要な粒子の大きさを維持したり、そして界面活性剤を利用するなどにより、維持することができる。微生物の活動は、多種の抗菌性化合物および抗カビ性化合物、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどで抑えることができる。多くの場合、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムなどの等張性化合物を組成物 中に含めることが好ましいであろう。注射用組成物 の吸収を長引かせるには、組成物 中に、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなど、吸収を遅らせる化合物を含めれば、可能である。
【０３１０】
無菌の注射用溶液は、必要な量の活性化合物を、適した溶媒に、必要に応じて上に列挙した成分の一つまたは組合せと一緒に加えた後、濾過滅菌して、調製することができる。一般的には、分散液は、塩基性の分散媒と、上に列挙したうちで必要な他の成分とを含有する無菌の賦形剤に、活性化合物を加えることで、調製する。無菌の注射用溶液を調製するための無菌粉末の場合、好適な調製方法 は、真空乾燥および凍結乾燥であり、その結果、活性成分と、前に無菌濾過したその溶液由来の付加的な所望の成分との粉末が生じる。
【０３１１】
経口用組成物には、一般的には、不活性の希釈剤または食用の担体が含まれる。それらをゼラチンカプセル内に封入しても、または、圧縮して錠剤に成形してもよい。治療を目的とした経口投与の場合、活性化合物を添加剤と一緒に加え、錠剤、トローチ、またはカプセルの形で用いることができる。経口用組成物は、さらに、口内洗浄剤として利用できるよう流動性の担体を用いて調製することができ、この場合、この流動性の担体中の化合物は、経口投与されるが、素早く吐き出して喀出されるか、または、飲み込まれることとなる。薬学的に適合性ある結合化合物、および／またはアジュバント材料を、組成物の一部として含めてもよい。当該の錠剤、丸剤、カプセル、トローチ、などに、以下の成分か、または、同様の性質の化合物のいずれかを含有させてもよい。即ち、微結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどの結合剤；でんぷんまたはラクトースなどの添加剤、アルギン酸、プリモゲル、またはコーンスターチなどの崩壊性化合物；ステアリン酸マグネシウムまたはステロートなどの潤滑剤；コロイド状二酸化珪素などの推進剤；ショ糖またはサッカリンなどの甘味化合物；または、ペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香料などの香り付け化合物、である。
【０３１２】
ある態様において、インプラントおよびマイクロカプセル送達系を含め、制御放出製剤など、身体から化合物が迅速に失われないようにする担体と一緒に、当該試験化合物を調製する。例えば、酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸など、生分解性で生体適合性のあるポリマーを用いてもよい。このような製剤の調製法は、当業者には明白であろう。これら材料はAlza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から市販のものを得てもよい。リポソーム懸濁液（感染細胞を、ウィルス抗原に対するモノクローナル抗体の標的とするリポソームを含む）も、薬学的に許容可能な担体として利用できる。これらは、例えば米国特許第4,522,811号に記載されたように、当業者に公知の方法に基づいて調製することができる。
【０３１３】
ＩＶ．ＸＢＰ-１によって調節される生物学的反応を調整する方法
本発明はまた、細胞内での、例えば、in
vitro またはin vivoのいずれかでの、種々のＸＢＰ-１の生物学的活性の調整（例えば、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子による直接的または間接的な調整）を提供する。特に、本発明は、細胞内でのＵＰＲの調整、細胞分化の調整、ＩＬ−６産生の調整、免疫グロブリン産生の調整、プロテアソーム経路の調整、タンパク質の折り畳み、分泌、発現および/または輸送の調整、Ｂ細胞最終分化の調整、ならびにアポトーシスの調整の調整方法を特徴とする。したがって本発明は、細胞をＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および／または活性のモジュレーターに接触させることによって生物学的活性が調整されるようにした、ＸＢＰ−１によって調節される１以上の生物学的反応を調整する方法を特徴とする。別の態様において、ＸＢＰ−１によって調節される生物学的反応は、ＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路の上流または下流で作用する非ＸＢＰ−１分子（例えば、ＡＴＦ６α、ＰＥＲＫ、もしくはＩＲＥ−１）の発現、プロセシング、翻訳後修飾および/または活性を調整することができる。クレームされた調整の方法は、天然に生じる事象を含むことを意図していない。例えば、用語「薬剤」または「モジュレーター」は、被験体の細胞によって産生された内因性媒介物を含むことを意図していない。
【０３１４】
当該方法は、ＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および／または活性（または、ＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路の他の分子のＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および／または活性（例えば、ＩＲＥ−１））を調整して、ＸＢＰ−１の生物学的活性が調整されるようにした薬剤を用いる。当該方法は、臨床的および非臨床的セッティングの双方において有用である。
【０３１５】
ある態様において、本方法は、in
vitroで行うことができる。例えば、商業的に貴重なタンパク質、例えば、組換えによって発現したタンパク質は、スプライシングされたＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および／または活性を刺激することによって、または、スプライシングされたＸＢＰ−１の陰性レギュレータの発現、プロセシング、翻訳後修飾および／または活性を阻害することによって、増加させることができる。好ましい態様において、免疫グロブリンの産生は、in vitroまたはin vivoのいずれかで、細胞中で増加することができる。別の態様において、ＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および／または活性は、in vitroで細胞中で調整することができ、その後処理された細胞を被験体に投与することができる。
【０３１６】
ある態様において、細胞内における、ＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および／または活性（または、ＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路の他の分子のＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および／または活性）を調整するために本発明の方法および組成物を用いる。ある態様において、該細胞は、哺乳動物細胞である。別の態様において、該細胞は、ヒト細胞である。そのような調整は、in
vitro またはin vivoのいずれかで起こりうる。当該発明は、１以上のＸＢＰ-１の生物学的活性の調整が有利であろう種々の状態または異常を治療するために使用することができる。ある態様において、例えば、ＸＢＰ−１がin vitroで調整される細胞は、被験体に導入もしくは再導入することができる。ある態様において、本発明はまた、被験体においてＸＢＰ-１の生物学的作用が調整されうるようにＸＢＰ-１のモジュレーターの治療的有効量を被験体に投与することによって、ＸＢＰ−１の in
vivoでの調整を可能とすることもできる。例えば、ＸＢＰ−１は、悪性疾患、自己免疫異常または免疫欠損症を治療するために調整され得る。
【０３１７】
ある態様において、例えば、スプライシングされたＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の発現、プロセシング、翻訳後修飾および／または活性を下方調整する薬剤を細胞に接触させ、ＵＰＲを下方調整する。ある態様において、該細胞は分泌細胞である。
【０３１８】
ある態様において、該細胞は悪性細胞である。
【０３１９】
別の態様において、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の発現、プロセシング、翻訳後修飾および／または活性を調整するのに使用される薬剤は、［（１Ｒ）−３−メチル−１−［［（２Ｓ）−１−オキソ−３−フェニル−２−［（ピラジニルカルボニル）アミノ］プロピル］アミノ］ブチル］ボロン酸、Velcade（登録商標））などの単量体のボロン酸ではない。
【０３２０】
ある態様において、該薬剤は、下記式（Ｉ）に記載の化合物ではない。
【０３２１】
【化１】
2006515163.tif 000002
【０３２２】
式中、
Ｘは、Ｂ（ＯＲ４）（ＯＲ５）、ＣＨＯ、またはＣ（＝Ｏ）ＮＲ６’Ｒ６であり、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、アルキル（メチル、エチル、イソプロピル、など）、アリール（例えば、フェニル、ヒドロキシルフェニル）、アラルキル（例えば、ベンジル）または疎水性アミノ酸（例えば、ロイシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、もしくはアラニン）であり、
Ｒ３は、複素環（例えば、１、２もしくは３ヘテロ原子をもつ、５もしくは６員環）、炭素環（例えば、インダノン）、アラルキル、または［ＡＡ］１−３−Ｚ、但し、ＡＡはＤもしくはＬアミノ酸であり、Ｚは複素環、アリール、ベンゾイルカルボニル、ベンゾイルグリシン、ｔ−ブトキシカルボニル、９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルカルボニル（Ｆｍｏｃ）、低級アルコール、またはアセチルであり、
Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立に、低級アルキル（例えば、メチル、エチルなど）、水素、アリールまたはアラルキル（araalkyl）であり、
Ｒ６およびＲ６’は、それぞれ独立に、アミノ酸、水素、任意に置換された低級アルキル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたアラルキル、および薬学的に許容可能なそれらの塩である。
【０３２３】
ある態様において、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の発現、プロセシング、翻訳後修飾および／または活性を調整する薬剤は、ジペプチジルボロナートクラスのプロテアソームインヒビターではない。「ジペプチジルボロナート」は、化学式Ｉ（但し、Ｘは、Ｂ（ＯＲ４）（ＯＲ５）である）で表される化合物を含む。それは、少なくとも２つのペプチジル結合（Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ−）およびボロン酸部分またはそれらの誘導体（例えば、ボロン酸エステル）を含む化合物を含む。、
【０３２４】
さらなる態様において、ジペプチジルボロナートは、ＸがＢ（ＯＨ）２である化合物を含む。別の態様においては、Ｒ１は、アルキル（例えば、イソプロピル）であり、Ｒ２は、アラルキル（例えば、ベンジル）である。さらに別の態様においては、Ｒ３は、複素環（例えば、ピラジニル）である。
【０３２５】
別の態様において、該薬剤は、米国特許第5,580,854または米国特許出願第2002/0111314号に記載（それぞれを本明細書に引用によって援用する）のテトラペプチジルアルデヒド（もしくは他の化合物）を含まない。別の態様において、該薬剤は、米国特許第5,693,617号に記載（本明細書に引用によって援用する）のジ−もしくはトリペプチジルアルデヒド誘導体（もしくは他の化合物）を含まない。別の態様において、該薬剤は、米国特許第6,548,668号、第6,083,903号、もしくは国際公開第WO 03/033506号に記載（それぞれを本明細書に引用によって援用する）のボロン酸、エステルもしくは他の化合物を含まない。別の態様において、該薬剤は、米国特許第6,075,150号、もしくは国際公開第WO/99/37666号に記載（それぞれを本明細書に引用によって援用する）のα−ケトアミド化合物（および他の化合物）を含まない。別の態様において、該薬剤は、米国特許第6,117,887号に記載（本明細書に引用によって援用する）のジペプチジルインダノン（または他の化合物）を含まない。 
【０３２６】
別の態様において、該薬剤は、米国特許第6,133,308号、6,214,862号、6,458,825号、もしくは国際公開第WO 99/22729号に記載（それぞれを本明細書に引用によって援用する）のクラスト−ラクタシスチン−β−ラクトン（clasto-lactacystin-β-lactone）および他のラクタシスチンアナログではない。
【０３２７】
別の態様において、該薬剤は、国際公開第WO 03/033507号に記載（本明細書に引用によって援用する）のベンジルマロン酸誘導体または他の化合物ではない。別の態様において、該薬剤は、国際公開第WO 00/43000号に記載（本明細書に引用によって援用する）のカルボン酸誘導体ではない。
【０３２８】
別の態様において、該薬剤は、米国特許第2002/0151582号に記載（本明細書に引用によって援用する）の茶由来のポリフェノールではない。別の態様において、化合物は、国際公開第WO 01/89282号に記載（本明細書に引用によって援用する）の２−アミノ−３−ヒドロキシル−４−テルト−ロイシル−アミノ−５−フェニル−ペンタン酸誘導体ではない。
【０３２９】
別の態様において、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の発現、プロセシング、翻訳後修飾および／または活性を調整するのに使用される薬剤は、プロテアソームインヒビターではない。例えば、ある態様において、該薬剤は、直接的に（例えば、可逆的もしくは不可逆的に）２６Ｓプロテアソームを阻害しない。そのような非プロテアソームインヒビター薬剤は、細胞タンパク質（例えば、ＩκＢαなどのＮＦ−κＢインヒビター）の分解を阻害することによって、細胞に主作用を及ぼすものではない。本発明のある態様において、本発明の調整薬剤は、ＸＢＰ−１（または、ＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路の分子）を、例えば、ＩκＢαの分解を測定することによって測定するように、ＮＦ−κＢ経路を実質的に調整することなく調整する。 
【０３３０】
ある態様において、本発明の調整薬剤は、ＩＲＥ１α活性化の最初のステップを妨害しない。すなわち、オリゴマー化および自己リン酸化を弱めない。別の態様において、本発明の調整薬剤は、ＸＢＰ−１タンパク質のＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および／または活性に直接的に影響を及ぼさない。ある態様においては、ＸＢＰ-１の発現が調整される。別の態様においては、ＸＢＰ-１の翻訳後修飾が調整される。別の態様においては、ＸＢＰ-１の活性が調整される。
【０３３１】
ある態様において、本発明の薬剤は、非折り畳みタンパク質応答に部分的に依存して生存する細胞（例えば、分泌細胞）を優先的に部分的に殺傷する。
【０３３２】
用語「被験体」には、生きた生物が含まれるものと意図されているが、好適な被験体は哺乳動物である。被験体の例には、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギ、およびヒツジなどの哺乳動物がある。
【０３３３】
ＸＢＰ−１の活性を直接的もしくは間接的に調整することによってＸＢＰ−１の生物学的作用を調整する化合物を同定することは、本発明の調整方法を使用した種々の臨床の状況でのこれらの生物学的作用の操作を可能にする。例えば、本発明の刺激方法（例えば、刺激剤を用いた方法）を行った結果、スプライシングされたＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および／または活性を増加させることになり、それによって、例えば、ＩＬ−６産生、形質細胞分化、タンパク質の折り畳みおよび輸送ならびに免疫グロブリン産生を刺激する。別の態様において、本発明の刺激方法を用いて、ＸＢＰ−１（例えば、スプライシングされていないＸＢＰ−１もしくは強い陰性の形態のＸＢＰ−１）の陰性調節の発現、プロセシング、翻訳後修飾および／または活性を増加させ、ＩＬ−６産生、形質細胞分化、タンパク質の折り畳みおよび輸送ならびに免疫グロブリン産生を阻害することができる。
【０３３４】
ある態様において、ＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および／または活性の調整の結果、細胞中のＩＬ−６産生に少なくとも約２倍の差が生じる。別の態様において、ＸＢＰ−１の調整の結果、細胞中のＩＬ−６産生に少なくとも約５倍の差が生じる。さらに別の態様において、ＸＢＰ−１の調整の結果、細胞によるＩＬ−６産生に少なくとも約１０倍の差が生じる。  
【０３３５】
対照的に、本発明の阻害方法（すなわち、阻害剤を使用する方法）は、実施例において証明されているように、スプライシングされたＸＢＰ−１の活性を阻害し、ＩＬ−６産生、形質細胞分化、タンパク質の折り畳みおよび輸送、ならびに免疫グロブリン産生を阻害することができる。
【０３３６】
別の態様において、本発明の阻害方法は、ＸＢＰ−１、例えば、スプライシングされていないＸＢＰ−１もしくは強い陰性の形態のＸＢＰ−１の陰性調節の活性を阻害する。スプライシングされていないＸＢＰ−１タンパク質は、ユビキチン化されたタンパク質、したがって、きわめて不安定なタンパク質の例である。スプライシングされたＸＢＰ−１タンパク質は、ユビキチン化されておらず、スプライシングされていないＸＢＰ−１タンパク質と比べて、非常に長い半減期を有する。プロテアソームインヒビターは、例えば、ユビキチン化をブロックし、したがって、スプライシングされたタンパク質ではなく、スプライシングされていないＸＢＰ−１を安定化させる。したがって、スプライシングされたＸＢＰ−１タンパク質に対するスプライシングされていないタンパク質の比率は、プロテアソーム インヒビターを用いた処理によって増加する。スプライシングされていないＸＢＰ−１タンパク質は、スプライシングされたタンパク質の機能を実際に阻害するので、プロテアソーム インヒビターを用いた処理は、スプライシングされたＸＢＰ−１をブロックする。
【０３３７】
ＸＢＰ−１活性の調整は、したがって、種々の疾患状態における異常なＸＢＰ-１活性から生じる異常を調節するための手段を提供する。したがって、スプライシングされたＸＢＰ−１の生物学的作用の阻害が望ましい異常、例えば、細胞分化の減少、ＵＰＲの下方調整、細胞分化の下方調整、ＩＬ−６産生の下方調整、免疫グロブリン産生の下方調整、プロテアソーム経路の下方調整、タンパク質の折り畳みおよび輸送の下方調整、Ｂ細胞最終分化の下方調整、ならびにアポトーシスの下方調整が有効となる障害（例えば、自己免疫異常または悪性疾患（例えば、多発性骨髄腫））を治療するために、スプライシングされたＸＢＰ−１活性および/または発現が阻害されるように本発明の阻害方法が選択される。または、ＸＢＰ-１の陰性調節の発現および/または活性を選択的に刺激する刺激方法が選択される。阻害方法が有用となり得る異常の例としては、多発性骨髄腫および自己免疫疾患、特に、病原性自己抗体の産生を特徴とする疾患が挙げられる。例えば、免疫寛容化（例えば、アレルゲンに対する）を促進するために、スプライシングされたＸＢＰ−１の活性も減少させることができる。
【０３３８】
あるいは、スプライシングされたＸＢＰ−１の生物学的作用の刺激が望ましい異常、例えば、細胞分化の増加、ＵＰＲの上方調整、細胞分化の上方調整、ＩＬ−６産生の上方調整、免疫グロブリン産生の上方調整、プロテアソーム経路の上方調整、タンパク質の折り畳みおよび輸送の上方調整、Ｂ細胞最終分化の上方調整、ならびにアポトーシスの上方調整が有効となる障害（例えば、抗腫瘍免疫応答が有効であろう悪性疾患、または後天性免疫不全症）を治療するために、スプライシングされたＸＢＰ−１活性および/または発現がアップレギュレートされるように本発明の刺激方法が選択される。または、ＸＢＰ-１の陰性調節の発現および/または活性を選択的に阻害する阻害方法が選択される。さらに、下記に示すように、スプライシングされたＸＢＰ−１活性の増加は、例えば、被験体中の病原菌（例えば、ウイルス、微生物もしくは寄生虫）に対する体液性の応答を向上させる際、および被験体におけるワクチン接種の有効性を高めるために有用である。
【０３３９】
ある態様において、本発明の調整方法は、ＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路の調整が有効である患者集団の被験体において実行される。例えば、ある態様において、本発明の調整方法は、ＵＰＲの調整が有効である被験体において実行される。ある態様において、本発明の調整方法は、本発明の診断方法によって、ＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路の調整が有効であるものと同定された被験体において実行される。例えば、ある態様において、患者は、ＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路の調整またはＸＢＰ−１活性の調整が有効であるものと同定される。これは、例えば、本明細書に記載の診断方法の１つを用いて行うことができる。例えば、生物検体を患者から取得して、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の発現または活性について調べる。
【０３４０】
別の態様において、被験体からの生物サンプルについて、ＸＢＰ−１（またはＸＢＰ−１をコードするシグナル伝達経路中の分子）、またはＸＢＰ−１（または、ＸＢＰ-１をコードするシグナル伝達経路中の遺伝子）のプロモーター領域をコードする遺伝子中の突然変異の有無を調べた。
【０３４１】
別の態様において、その発現がＸＢＰ−１によって調節される遺伝子（例えば、ＥＲｄｊ４、ｐ５８ｉｐｋ、ＥＤＥＭ、ＰＤＩ−Ｐ５、ＲＡＭＰ４、ＢｉＰ、ＸＢＰ−１もしくはＡＴＦ６α）の発現レベルを標準的な技法を用いて測定した。
【０３４２】
別の態様において、被験体は、被験体の特定の細胞を調べてそれらが分泌細胞であるかを決定することによって、ＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路の調整またはＸＢＰ−１活性の調整が有効なものであると同定される。例えば、ある態様において、被験体の悪性疾患が検査され（例えば、標準的な組織学的な手法を用いて）、該悪性疾患が分泌細胞に由来するかどうかが決定される。
【０３４３】
ある態様において、被験体は、ＸＢＰ-１に関与するシグナル伝達経路を調整する薬剤の、ＸＢＰ−１タンパク質またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中のタンパク質の発現、プロセシング、翻訳後修飾および／または活性の調整に有効な量を用いて治療される。例えば、ある態様において、被験体は、ＸＢＰ-１の活性、例えば、被験体の細胞における非折り畳みタンパク質応答を調整するのに十分な量の薬剤を用いて治療される。
【０３４４】
ある障害の治療のために、本発明の調整方法を適用した結果、障害が治癒したり、長期もしくは短期のいずれかで、障害に伴う症状の種類または数が減少したり（即ち、状態の寛解）、または、単に、被験体に一過性の有利な作用があるかも知れない。
【０３４５】
本発明の免疫調整法の応用を以下に詳述する。
【０３４６】
Ａ．阻害性化合物
スプライシングされたＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の発現、プロセシング、翻訳後修飾または活性を阻害する阻害性化合物を用いた本発明の方法は、スプライシングされたＸＢＰ−１活性が望ましくなく上昇した、刺激された、アップレギュレートされたなどの疾患の治療に使用することができる。例えば、多発性骨髄腫および特定の自己免疫疾患には、形質細胞による免疫グロブリン産生の亢進が伴う。従って、本発明の阻害性化合物を用いた処理にとって好適な障害には、例えば、多発性骨髄腫、免疫グロブリン産生の増加を特徴とする自己免疫障害が含まれる。
【０３４７】
別の態様において、阻害性化合物を用いて、ＸＢＰ-１の陰性調節、例えば、スプライシングされていないＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾または活性を阻害することができる。そのような化合物は、スプライシングされていないＸＢＰ−１が望ましくなく上昇する異常の治療において、またはスプライシングされたＸＢＰ−１の発現および/または活性が望ましくなく減少したときに用いられる。 
【０３４８】
本発明のある態様において、阻害性化合物を用いて、スプライシングされたＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および／または活性の調整を阻害（例えば、特異的に阻害）することができる。別の態様において、阻害性化合物 を用いて、スプライシングされていないＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾および／または活性の調整を阻害（例えば、特異的に阻害）することができる。
【０３４９】
本発明の阻害性化合物は、例えば、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ-１を含むシグナル伝達経路中の分子（例えば、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６α）の発現、プロセシング、翻訳後修飾および／または活性を特異的に阻害するよう働く細胞内結合分子であってもよい。本明細書において用いる用語「細胞内結合分子」には、あるタンパク質か、または、このタンパク質をコードする核酸（例えばｍＲＮＡ分子）に結合することにより、そのタンパク質の発現または活性を阻害するよう、細胞内で働く分子が含まれるものと、意図されている。以下に詳述する細胞内結合分子の例には、アンチセンス核酸、細胞内抗体、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子と標的分子との相互作用を阻害するペプチド化合物、および、ＸＢＰ−１の活性またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の活性を特異的に阻害する化学物質、がある。
【０３５０】
ｉ．アンチセンスまたはsiRNA核酸分子
ある態様において、本発明の阻害性化合物は、XBP-1またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子（例えば、ＸＢＰ-１と相互作用する分子）をコードする遺伝子もしくは前記遺伝子の一部に対して相補なアンチセンス核酸分子、または、前記アンチセンス核酸分子をコードする組換え発現ベクターである。ある特定のタンパク質の細胞内での発現をダウンレギュレートするためのアンチセンス核酸の利用は、当該技術分野において公知である（例えば、Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a
molecular tool for genetic analysis, Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1 （1） 1986;
Askari, F. K. and McDonnell, W. M. （1996） N. Eng. JMed. 334 : 316-318 ; Bennett, M. R.
and Schwartz, S. M. （1995） Circulation 92: 1981-1993; Mercola, D. and Cohen, J. S. （1995）Cancer Gene
Ther. 2: 47-59 ; Rossi, J. J. （1995） Br. Med Bull. 51: 217-225 ; Wagner, R. W.
（1994） Nature 372: 333-335）。アンチセンス核酸分子は、別の核酸分子のコーディング鎖（例えばmRNA配列）に対して相補なヌクレオチド配列を含み、従って、この別の核酸分子のコーディング鎖に水素結合することができる。ｍＲＮＡの配列に対して相補的なアンチセンス配列は、ｍＲＮＡのコーディング領域に見られる一配列に対して相補的であっても、ｍＲＮＡの５’末端もしくは３’末端非翻訳領域に対して相補的であっても、または、コーディング領域と非翻訳領域とをつなぐ（例えば、５’非翻訳領域とコーディング領域との間の接合部にある）一領域に対して相補的であってもよい。さらに、アンチセンス核酸は、例えば転写開始配列または調節エレメントなど、ｍＲＮＡをコードする遺伝子の一調節領域に対して相補的であってもよい。好ましくは、コーディング鎖の開始コドンの前に来ているか、または、この開始コドン全長に渡って延びた一領域に対して相補的であるか、または、ｍＲＮＡの３'非翻訳領域にある一領域に対して相補的であるよう、アンチセンス核酸はデザインされる。
【０３５１】
ＸＢＰ−１遺伝子（または、例えば、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６α遺伝子）のコーディング鎖の公知のヌクレオチド配列、したがって、ＸＢＰ−１遺伝子、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６α ｍＲＮＡの公知の配列が与えられているので、本発明のアンチセンス核酸は、ワトソンおよびクリックの塩基対の法則に基づいてデザインすることができる。アンチセンス核酸分子はｍＲＮＡのコーディング領域全体に対して相補的であってもよいが、あるｍＲＮＡのコーディング領域または非コーディング領域の一部分のみに対してアンチセンスであることが好ましい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、あるＸＢＰ−１（または、例えば、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６α）ｍＲＮＡの翻訳開始部位を取り巻く領域に対して相補的であってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチド長であることができる。本発明のアンチセンス核酸は、当該技術分野において公知の手法を用いた化学合成および酵素ライゲーション反応で構築が可能である。例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然で得られるヌクレオチドを用いて化学合成しても、または、当該分子の生物学的安定性を高めるか、または、アンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成される二本鎖の物理的安定性を高めるようデザインされた、様々に修飾されたヌクレオチドを用いて化学合成してもよく、例えば、ホスホロチオエート誘導体や、アクリジン置換ヌクレオチドも利用できる。アンチセンス核酸を生成するのに利用可能な修飾されたヌクレオチドの例には、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン、がある。培養細胞でXBP-1の発現を阻害するには、一種または複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを培養基中の細胞に加えてもよい。
【０３５２】
あるいは、アンチセンス核酸は、ｃＤＮＡの全部または一部をアンチセンス方向でサブクローンしてある発現ベクターを用いて（即ち、挿入された核酸から転写される核酸は、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向になる）生物学的に生成させることもできる。アンチセンス方向でクローンされる核酸に機能的に連結させる調節配列は、関連対象の細胞内でアンチセンスＲＮＡ分子の発現を命令するものが選択され、例えば、アンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的または誘導性発現を命令するような、プロモーターおよび／またはエンハンサまたは他の調節配列を選択してもよい。アンチセンス発現ベクターは、組換え発現ベクターを構築するための標準的な組換えＤＮＡ法に基づいて調製するが、例外として、ｃＤＮＡ（またはその一部）を、アンチセンス方向でベクター内にクローニングする。アンチセンス発現ベクターは、例えば組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウィルスの形であってよい。アンチセンス発現ベクターは、標準的なトランスフェクション技術を用いて細胞内に導入される。
【０３５３】
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には、タンパク質をコードする細胞内ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡにハイブリダイズまたは結合して、例えば転写および／または翻訳を阻害するなどにより、このタンパク質の発現を阻害するよう、被験体に投与されるか、または、in situで生成される。このハイブリダイゼーションは、安定な二本鎖を形成しようとする従来のヌクレオチド相補性によるものでも、または、例えば、ＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重螺旋の大溝で起きる特異的相互作用を介したものでもよい。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の一例には、ある組織部位への直接の注射がある。あるいは、アンチセンス核酸分子を標的の選択された細胞に向けて修飾し、その後に全身投与してもよい。例えば、全身投与の場合、細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に当該アンチセンス核酸分子を結合させるなどにより、選択された細胞表面で発現するレセプターまたは抗原に特異的に結合するよう、アンチセンス分子を修飾してもよい。また、ここに解説したベクターを用いて、アンチセンス核酸分子を細胞に送達することもできる。アンチセンス分子の細胞内濃度を充分にするには、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ ＩＩまたはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの制御下あるベクター構築物が好ましい。
【０３５４】
さらに別の態様において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α-アノメリック核酸分子である。α-アノメリック核酸分子は、相補的なＲＮＡ分子と特異的な二本鎖ハイブリッドを形成するが、この場合、通常のβ-ユニットとは対照的に、これらの鎖は互いに並行に並ぶ（Gaultier et al. （1987） Nucleic Acids. Res. 15: 66256641）。アンチセンス核酸分子は、さらに、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Inoue et al. （1987） Nucleic Acids Res. 15 : 6131-6148）またはキメリックＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Inoueetal. （1987） FEBSLett. 215: 327-330）を含んでいてもよい。
【０３５５】
さらに別の態様においては、本発明のアンチセンス核酸分子はリボザイムである。リボザイムは、リボヌクレアーゼ活性を持つ触媒作用のあるＲＮＡ分子であり、相補領域を有するｍＲＮＡなどの一本鎖核酸を切断することができる。このように、リボザイム（例えばハンマーヘッドリボザイム（（Haselhoff and Gerlach （1988） Nature 334 :
585-591に記載されている）を用いると、ｍＲＮＡ転写産物を触媒作用により切断して、ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。ＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６αをコードする核酸に対して特異性を有するリボザイムは、ｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいて、デザインすることができる。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、ＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６αコーディングｍＲＮＡのうちの切断しようとするヌクレオチド配列に相補的になったテトラヒメナＬ１９ ＩＶＳ ＲＮＡ誘導体を構築してもよい。例えば、Cech らの米国特許第 4,987,071 号およびCechらの米国特許第5,116,742号を参照されたい。あるいは、ＸＢＰ−１（または、例えば、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６α）ｍＲＮＡを用いて、ＲＮＡ分子のプールから、特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒作用のあるＲＮＡを選択することもできる。例えば、Bartel. D. and Szostak, J. W. （1993） Science 261:
1411-1418を参照されたい。
【０３５６】
あるいは、遺伝子発現は、遺伝子の調節領域（例えばＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６αプロモーターおよび／またはエンハンサ）に対して相補的なヌクレオチド配列を標的として、標的細胞内での遺伝子の転写を妨げる三重螺旋構造を形成させることで、阻害することもできる。概略的には、例えば、Helene, C. （1991） Anticancer Drug Des. 6 （6）: 569-84;
Helene, C. et al. （1992） Ann. N. YAcad. Sci. 660: 27-36; and Maher, L. J. （1992） Bioassays 14
（12）: 807-15を参照されたい。
【０３５７】
別の態様において、ＲＮＡｉを促進する化合物を用いて、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の発現を阻害することができる。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を用いて、ｄｓＲＮＡと同じ配列を有するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を低下させる転写後標的遺伝子サイレンシング技法である（Sharp, P.A. and Zamore, P.D. 287, 2431-2432 （2000）; Zamore,
P.D.,らCell 101, 25-33 （2000）.  Tuschl,
T. ら Genes
Dev. 13, 3191-3197 （1999）; Cottrell
TR, and Doering TL. 2003. Trends Microbiol. 11:37-43; Bushman F.2003. Mol
Therapy. 7:9-10; McManus MT and Sharp PA. 
2002. Nat Rev Genet. 3:737-47）。内因性リボヌクレアーゼが長いｄｓＲＮＡを短く切断したとき、例えば、２１もしくは２２ヌクレオチド長のＲＮＡ（小干渉ＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡと呼ばれる）としたとき、このプロセスは起こる。より小さなＲＮＡセグメントが標的ｍＲＮＡの分解を媒介する。ＲＮＡｉ合成キットは、市販されており、例えば、New England Biolabsor Ambionから入手することができる。ある態様において、 アンチセンスＲＮＡに使用される上記の１以上の化学物質を、ＲＮＡｉを媒介する分子に用いることができる。ＸＢＰ−１特異的ＲＮＡｉの実施例については、添付の実施例に記載している。そこでは、5'-GGGATTCATGAATGGCCCTTA-3'（配列番号１１）の２つの相補的オリゴヌクレオチドをｐＢＳ／Ｕ６ベクターに挿入することによって、ＸＢＰ−１特異的ＲＮＡｉベクターを構築する。 
【０３５８】
ｉｉ．細胞内抗体
細胞内でＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の発現および／または活性を阻害するのに利用できる、もう一つの種類の阻害性化合物は、本明細書に記載の経路中のＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６αまたは他の分子に特異的な細胞内抗体である。ある態様においては、抗体をスプライシングされていない ＸＢＰ−１に結合する。別の態様において、抗体は、スプライシングされたＸＢＰ−１に特異的である。すなわち、ＯＲＦ２に存在するエピトープを認識する。細胞内でタンパク質機能を阻害するための細胞内抗体の利用は当該技術分野において公知である（例えば、 Carlson, J. R. （1988） Mol. Cell. Biol. 8: 2638-2646; Biocca, S. et
al. （1990） EMBO J. 9: 101-108; Werge, T. M. et al. （1990） FEBSLetters
274 : 193-198; Carlson, J. R. （1993） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7427-7428;
Marasco, W. A. et al. （1993） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7889-7893; Biocca, S. et
al. （1994） BiolTechnology 12 : 396 399; Chen, S-Y. et al. （1994） Human Gene
Therapy 5: 595-601; Duan, L et al. （1994） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5075-5079; Chen,
S-Y. et al. （1994） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5932-5936; Beerli, R. R. et
al. （1994） J. Biol. Chem. 269: 23931-23936; Beerli, R. R. et al. （1994） Biochem.
Biophys. Res. Commun. 204: 666-672; Mhashilkar, A. M. et al. （1995） EMBO J. 14 :
1542-155 1; Richardson, J. H. et al. （1995） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3137-3141;
MarascoらによるPCT国際公開第WO 94/02610号、およびDuanらによるPCT国際公開第WO 95/03832号を参照されたい）。
【０３５９】
タンパク質活性を細胞内抗体を用いて阻害するには、細胞内に当該ベクターを導入すると、抗体鎖を、この抗体鎖が細胞の細胞内区画で機能的抗体として発現するような形でコードする組換え発現ベクターを調製する。本発明の阻害法に基づいて転写因子活性を阻害するには、転写因子に特異的に結合する細胞内抗体を細胞の核内で発現させるのが好ましい。細胞内抗体を細胞の核で発現させるには、抗体の軽鎖および重鎖から、Ｎ末端疎水性リーダ配列をコードするヌクレオチド配列を取り除き、この軽鎖および重鎖遺伝子のＮまたはＣ末端に、核内局在シグナルをコードするヌクレオチド配列を加えることで、達成できる（例えば、Biocca, S. ら、（1990） EMBO J. 9: 101-108; Mhashilkar, A. M.ら、（1995） EMBO J 14 :
1542-15 5 1を参照されたい）。細胞内抗体鎖を核内標的化するのに用いるのに好適な核内局在シグナルは、ＳＶ４０ラージＴ抗原の核内局在シグナルである（例えばBiocca, S.ら990） EMBO J. 9: 101-108; Mhashilkar, A. M. et al. （1995） EMBO J. 14 :
1542-15 51）。
【０３６０】
細胞内抗体発現ベクターを調製するには、例えば、ＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６αタンパク質など、関連対象の標的タンパク質に特異的な抗体鎖をコードする抗体軽鎖および重鎖cDNAを、典型的にはタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマから単離する。抗抗体は、好適な被験体（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたはその他の哺乳動物）をＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６αタンパク質免疫原で免疫形成することにより、調製することができる。適切な免疫原性製剤は、例えば、組換えにより発現させたタンパク質または化学合成したペプチドを含有していてよい。この製剤には、さらに、フロイント完全もしくは不完全アジュバント、または同様の免疫刺激性化合物など、アジュバントを含めてもよい。抗体産生細胞を被験体から採取し、これを用いて、例えばKohler and Milstein （1975, Nature
256: 495-497） （さらにBrown et
al. （1981） JImmunol 127 : 539-46 ; Brown et al. （1980） J. Biol Chem
255 : 4980-83; Yeh et aL （1976） PNAS 76 : 2927-3 1; and Yeh et al. （1982） Int. J
Cancer 29: 269-75も参照されたい））が最初に説いたハイブリドーマ技術など、標準的な技術でモノクローナル抗体を調製することができる。モノクローナル抗体ハイブリドーマを作製する技術は公知である（概略的には、R. H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies : A New
Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York （1980）; E. A.
Lerner （198 1） Yale JBiol. Med, 54: 387-402; M. L. Gefter et al. （1977） Somatic Cell
Genet., 3: 231-36を参照されたい）。簡単に説明すると、不死細胞系（典型的には骨髄腫）を、上で説明したようにタンパク質免疫原で免疫形成した動物から採ったリンパ球（典型的には脾細胞）に融合させ、その結果得られるハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、ＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６αタンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。リンパ球および不死化細胞系を融合するのに用いられる数多くある公知のプロトコルのいずれを、モノクローナルモノクローナル抗体を生成する目的で利用してもよい（例えば、G. Galfreら （1977） Nature 266: 5 50-52; 上記のGefterら、Somatic Cell Genet.；上記のLerner,
Yale JBiol. Med; 上記のKenneth, Monoclonal Antibodiesを参照されたい）。さらに、当業者であれば、このような方法の改良例中に、有用であろうものが多くあることも、理解されよう。典型的には、不死細胞系（例えば骨髄腫細胞系）は、リンパ球と同じ哺乳動物種に由来する。例えば、マウスハイブリドーマは、本発明の免疫原性製剤で免疫形成したマウスから採ったリンパ球を、不死化マウス細胞株と融合させることで、作製することができる。好適な不死細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培養基（「ＨＡＴ培地」）に対して感受性のあるマウス骨髄腫細胞株である。例えば、Ｐ３−ＮＳｌ／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇｌ４骨髄腫株など、数多くある骨髄腫細胞株のいずれを、標準的な技術に基づいて融合相手として用いてもよい。これらの骨髄腫株は、Rockville, Mdのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能である。典型的には、ＨＡＴ感受性のマウス骨髄腫細胞を、マウス脾細胞に、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を用いて融合する。この融合で生じたハイブリドーマ細胞を、融合しなかった骨髄腫細胞や、増殖能を失って融合した骨髄腫細胞を殺すＨＡＴ培地を用いて選別する（融合しなかった脾細胞は、形質転換していないために、数日後に死滅する）。タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いるなどにより、このような抗体についてハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることで同定される。
【０３６１】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製する代わりに、タンパク質に結合するモノクローナル抗体を、当該タンパク質またはそのペプチドを用いて、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングすることで、同定かつ単離して、当該タンパク質に特異的に結合する免疫グロブリンライブラリーメンバを単離することもできる。ファージディスプレイライブラリーを作製かつスクリーニングするためのキットは市販のものが入手できる（例えば、Pharmacia Recombinant
Phage Antibody System、カタログ番号27-9400-01； およびStratagene SurfZAP（登録商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号240612）。加えて、抗体ディスプレイライブラリーを作製かつスクリーニングする際の利用に特になじむ方法および化合物の例は、例えば、Ladnerらの米国特許第5,223,409号; Kangらの国際公開第WO 92/18619号；Dowerら国際公開第WO 91/17271号； Winterらの国際公開第WO 92/20791号；Markland らの国際公報第WO 92/15679号；Breitlingらの国際公開第WO 93/01288号；McCaffertyらの国際公開第WO 92/01047号； Garrardらの国際公開第WO 92/09690号； Fuchsら（199 1） BiolTechnology 9: 1370-1372 ；Hay ら（1992） Hum Antibod ハイブリドーマs 3:
81-85; Huseら （1989） Science 246:
1275-128 1; Griffithsら、（1993） EMBO J 12: 725-734；Hawkinsら（1992） JMol Biol 226 : 889-896; Clarkson ら（1991） Nature 352:
624-628; Gram et al. （1992） PNAS 89: 3576-3580; Garradら（1991） Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboomら（1991） NucAcidRes
19 : 4133-4137; Barbasら （1991） PNAS 88: 7978-7982; およびMcCafferty ら、Nature （1990） 348: 552-554に見ることができる。
【０３６２】
別の態様においては、リボソームディスプレイは、ディスプレイプラットフォーム としてバクテリオファージに換えることができる（例えば、Hanesら、 2000. Nat.
Biotechnol.  18:1287；Wilson ら、2001.  Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 98:3750; or Irving et al. 2001  J.
Immunol. Methods  248:31）。さらに別の態様においては、細胞表面ライブラリーをスクリーニングして抗体を調べることができる（Boderら、2000. 
Proc. Natl. Acad. Sci.  USA  97:10701; Daughertyら、2000 J. Immunol. Methods 243:211.）。そのような方法は、モノクローナル抗体を単離し、続いてクローニングするための、伝統的なハイブリドーマ技法に取って代わるものになる。 
【０３６３】
本発明のさらに別の態様は、内因性免疫グロブリン産生が不能なトランスジェニック動物（例えば、マウス）中の実質的なヒト抗体の生成を含む（例えば、米国特許第6,075,181号、5,939,598号、5,591,669号および5,589,369号、それぞれの内容を引用によって本明細書に援用する）。例えば、キメラおよび細菌系突然変異マウスの抗体重鎖結合領域のホモ接合欠失によって、内因性抗体の産生の完全な阻害が起こるということが記載されている。ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイをそのような細菌系突然変異マウスに移入すると、抗原攻撃後、ヒト抗体が産生される。マウスを用いたヒト抗体を作製する別の好ましい手段が米国特許第5,811,524号に開示されており、それを引用によって本明細書に援用する。これらのヒト抗体に関連する遺伝物質もまた、本明細書に記載のようにして単離かつ操作することができることが理解されるだろう。
【０３６４】
組換え抗体を作製するためのさらに別の高効率の手段が、Newman, Biotechnology,
10: 1455-1460 （1992）に開示される。特に、この技法によって、サル可変ドメインとヒト定常配列を含有する霊長類化（primatized）抗体が産生される。この引例の全体を本明細書において引用によって援用する。さらに、この技法はまた、米国特許第5,658,570号、5,693,780号および5,756,096号に記載されている。それぞれを引用によって本明細書に援用する。   
【０３６５】
モノクローナル抗体を一旦同定したら（例えば、当該技術分野において既知のモノクローナル抗体を含め、ハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体、または、コンビナトリアルライブラリー由来の組換え抗体のいずれでも）、そのモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを標準的な分子生物学の技術で分離する。ハイブリドーマ由来の抗体の場合、軽鎖および重鎖ｃＤＮＡを、例えば、ＰＣＲ増幅法またはｃＤＮＡライブラリースクリーニングにより、得ることができる。ファージディスプレイライブラリーなど、組換え抗体の場合、その軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、ライブラリーのスクリーニング中に分離されたディスプレイパッケージ（例えば、ファージ）から、回収することができる。ＰＣＲプライマまたはcDNAライブラリープローブを作製する場合の拠り所となる抗体軽鎖および重鎖遺伝子のヌクレオチド配列は当該技術分野において公知である。例えば、数多くのこのような配列がKabat, E. A., et al. （1991） Sequences of
Proteins oflmmunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health
and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 および「Vbase」ヒト生殖細胞系配列データベースに開示されている。
【０３６６】
入手した抗体軽鎖および重鎖配列は、標準的な方法を用いて組換え発現ベクター内にクローニングされる。上で述べたように、軽鎖および重鎖の疎水性のリーダ部分をコードする配列を取り除き、核内局在シグナル（例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原由来のもの）をコードする配列を、この軽鎖および重鎖の両方のアミノ末端か、カルボキシ末端をコードする配列に、インフレームで、連結する。該発現ベクターは、いくつか異なる形の一つで細胞内抗体をコードすることができる。例えば、ある態様において、全長抗体が細胞内で発現するよう、このベクターは、完全長抗体軽鎖および重鎖をコードするものである。別の態様において、Ｆａｂ断片が細胞内で発現するよう、該ベクターは全長の軽鎖はコードしているが、重鎖はＶＨ／ＣＨ１領域しかコードしていない。最も好ましい態様においては、該ベクターは、一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）をコードするものであり、この場合、この軽鎖および重鎖の可変領域は、柔軟性のペプチドリンカー（例えばＧｌｙ４Ｓｅｒ）３）で連結されており、一本鎖分子として発現する。細胞内で転写因子活性を阻害するには、ＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６α特異的細胞内抗体をコードする発現ベクターを、ここに記載したように標準的なトランスフェクション法で細胞内に導入する。
【０３６７】
ｉｉｉ．ペプチド化合物
別の態様において、本発明の阻害性化合物は、ＸＢＰ−１アミノ酸配列またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子（例えば、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６α)のアミノ酸配列由来のペプチド化合物である。例えば、ある態様において、該阻害性化合物は、 例えば、ＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６αと、このペプチド化合物とが接触することによってＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６αと標的分子との相互作用を競合的に阻害する、ＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６α と標的分子との相互作用を媒介するＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６α（もしくはそのミメティクス）の一部を含む。 
【０３６８】
本発明のペプチド化合物を、ペプチドをコードする発現ベクターを細胞内に導入することで、当該化合物を細胞内で生成させることができる。このような発現ベクターは、標準的技術により、当該ペプチド化合物のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドを用いて作製できる。当該ペプチドは、細胞内で、別のタンパク質またはペプチドとの融合対として発現させることもできる（例えば、ＧＳＴ融合など）。当該ペプチドを細胞内で組換え合成する代わりに、標準的なペプチド合成技術を用いた化学合成により、当該ペプチドを作製することもできる。こうして合成したペプチドは、ペプチドを細胞に導入する当該技術分野において公知の種々の手段により細胞内に導入できる（例えばリポソームなど）。さらに、強い陰性タンパク質（例えば、ＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６αの）を、天然（すなわち、野生型）の分子と競合するＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６α分子（例えば、その部分もしくは変種）を含むが、同じ生物学的活性を持たないように作製することができる。そのような分子は、効率的に、例えば、細胞内のＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６α活性を減少させる。例えば、ペプチド化合物は、ＸＢＰ−１転写活性化ドメインの欠損部分であることができる。例えば、スプライシングされた形態のＸＢＰ−１のＮ末端１３６または１８８アミノ酸から構成され得る。
【０３６９】
ｉｖ．ＸＢＰ-１の上流に働く他の薬剤
ある態様において、スプライシングされたＸＢＰ−１の発現は、細胞中でのＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾もしくは活性を増加させるシグナルを阻害する薬剤によって、阻害され得る。ＩＬ−４とＩＬ−６の両方がＸＢＰ−１の転写を増加させることがわかっている（Wenら、1999. Int. Journal of Oncology 15:173）。したがって、ある態様においては、ＩＬ−４またはＩＬ−６によって導入されたシグナルを阻害する薬剤を用いてＸＢＰ−１の発現を下方調整し、それによって、スプライシングされたＸＢＰ−１の細胞中での活性を阻害することができる。例えば、ある態様においては、ＳＴＡＴ−６依存性シグナルを阻害する薬剤を用いて、細胞中でのＸＢＰ−１の発現を減少させることができる。別の態様においては、Ｂ細胞中で（例えば、ＣＤ４０発現またはＣＤ４０−媒介性シグナル伝達を減少させることによって）ＣＤ４０−媒介性シグナルを妨害する薬剤を用いてスプライシングされたＸＢＰ−１活性を下方調製することができる。
【０３７０】
ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の活性を特異的に阻害するために使用することができる他の阻害剤は、例えば、ＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６α標的タンパク質活性の発現、プロセシング、翻訳後修飾、および/または活性を直接的に阻害する化学化合物、またはＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６α標的分子間の相互作用を阻害する化学化合物である。そのような化合物は、上記したように、そのような化合物を選択するスクリーニングアッセイ、ならびに技術分野において認識されている技術を用いて同定される。
【０３７１】
Ｂ．刺激性化合物
スプライシングされたＸＢＰ−１の刺激性化合物を用いた本発明の方法は、スプライシングされたＸＢＰ活性および/または発現が望ましくなく減少する、阻害される、ダウンレギュレートされるなどの、異常の治療において用いることができる。例えば、悪性疾患の場合、抗腫瘍免疫応答（例えば、抗体反応）の上昇および特定の免疫不全を得ることが有効であろう。本発明の刺激方法のある態様においては、被験体は、スプライシングされたＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の発現および/または活性を刺激する刺激化合物を用いて治療される。
【０３７２】
別の態様において、本発明の刺激方法を用いて、スプライシングされたＸＢＰ−１活性の陰性調節物質の発現および/または活性を刺激することができる。
【０３７３】
スプライシングされたＸＢＰ−１刺激化合物を用いた本発明の方法は、その転写がＩＬ−６によって調節される１以上の分子の細胞分化または産生が望ましいとき、または、アポトーシスの減少が望ましいとき、ＵＰＲまたはプロテアソーム経路タンパク質が阻害される、ブロックされる、ダウンレギュレートされるなどの、異常の治療に用いることができる。さらに、本発明のスプライシングされたＸＢＰ−１の発現および/または活性を刺激する刺激方法が、被験体の病原菌に対する体液性の免疫応答の刺激させるため、および被験体にワクチン接種をしたときの抗体反応の向上させるため通常使用される。
【０３７４】
ＸＢＰ−１の陰性調節の発現および／または活性を刺激する分子を、ＵＰＲ、プロテアソーム経路がダウンレギュレートされることが有効であるだろう障害の治療に用いることができる（例えば、自己免疫疾患、悪性疾患、または その発現がＸＢＰ−１によって調節される１以上のタンパク質の細胞分化または産生が減少をダウンレギュレートすべき場合）。さらに、ＸＢＰ−１の陰性調節の発現および／または活性を刺激する分子を、アポトーシスを刺激するために用いることができる。
【０３７５】
刺激化合物の例としては、タンパク質、核酸分子を含む発現ベクター、および関連対象のタンパク質の発現および/または活性を刺激する化学物質が含まれる。
【０３７６】
好適な刺激性化合物は、スプライシングされることも、スプライシングされないことも可能な、スプライシングされていないＸＢＰ−１をコードする核酸分子であるが、この場合、この核酸分子は、被験体に、この被験体の細胞で当該タンパク質の発現にとって適した形で導入される。例えば、ＸＢＰ−１ ｃＤＮＡ（全長または部分的ｃＤＮＡ配列）を組換え発現ベクター内にクローニングし、このベクターを標準的な分子生物学の技術を用いて細胞にトランスフェクトする。ＸＢＰ−１ ｃＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた増幅や、または、適したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることで、得ることができる。ＸＢＰ−１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、当該技術分野において公知であり、この配列を用いれば、標準的なＰＣＲ法でｃＤＮＡの増幅を行えるＰＣＲプライマーをデザインしたり、または、標準的なハイブリダイゼーション法で用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに利用できるハイブリダイゼーションプローブをデザインできる。別の好ましい刺激化合物は、スプライシングされた形態のＸＢＰ-１をコードする核酸分子である。
【０３７７】
XBP-1 cDNA、またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子をコードするｃＤＮＡの単離または増幅後、このDNA断片を適した発現ベクター内に上述したように導入する。XBP-1を、宿主細胞内でXBP-1を発現させるのに適した形でコードする核酸分子を、上述したように、当該技術分野において公知のヌクレオチド配列を利用して作製することができる。このヌクレオチド配列は、標準的なPCR法でcDNAの増幅を行えるPCRプライマーをデザインしたり、または、標準的なハイブリダイゼーション法で用いてcDNAライブラリーをスクリーニングするのに利用できるハイブリダイゼーションプローブをデザインするのに、利用できる。
【０３７８】
ある態様において、刺激性薬剤は、例えば、実施例１８に示すように誘導可能な構築物内に存在することができる。別の態様において、刺激性薬剤は、構成性発現を誘導する構築物内に存在することができる。 
【０３７９】
細胞中でのＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の発現を刺激するための刺激性化合物の別の形態は、内因性のスプライシングされたＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾、または活性を特異的に刺激する化学化合物である。そのような化合物は、本明細書において記載するように、スプライシングされ得るＸＢＰ−１の発現またはスプライシングされたＸＢＰ−１の活性を刺激する化合物を選択するためのスクリーニングアッセイを用いて、同定することができる。
【０３８０】
別の態様において、刺激性化合物は、スプライシングされたＸＢＰ−１の陰性調節剤、例えば、スプライシングされていない ＸＢＰ−１の発現または活性を刺激するものである。  例えば、ある態様において、細胞を操作してスプライシングされ得ない、スプライシングされていない形態のXBPタンパク質を発現させることができる。例えば、本実施例に記載したように、ＸＢＰ−１分子を、例えば、ループ領域に突然変異を含ませて、スプライシングが起こることができないように操作することができる。この分子を細胞中に導入して、スプライシングされたＸＢＰ−１の活性を阻害することができる。別の態様において、薬剤を用いて、スプライシングされていないＸＢＰ−１の低下の妨害をすることによって、細胞中のスプライシングされていないＸＢＰ−１の濃度を上昇させることができる。薬剤の例としては、プロテアソームインヒビターが含まれる。プロテアソームインヒビターの１つの例がVelcade（登録商標）である。他のプロテアソームインヒビターは、当該技術分野において公知であり、例えば、Kisselev and Goldberg （2001.  Chemistry & Biology 8:739） またはLee and
Goldberg （1998.  Trends
in Cell Biology 8:397）に見ることができる。別の態様においては、スプライシングされていないＸＢＰ−１の活性を、例えば、スプライシングされていないＸＢＰ−１のユビキチン化を妨害することによって、増加させることができる。  
【０３８１】
ＸＢＰ−１シグナリングを調製する方法（例えば、ＸＢＰ−１の発現および/もしくは活性、またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の他の分子の発現および/もしくは活性の調整を、in
vitro あるいはin vivoのいずれかで行うことができる。該方法をin
vitroで行うためには、細胞を標準的な方法を用いて被験体から採取し、本発明の刺激性もしくは阻害性化合物とともに、でインキュベート（すなわち、培養）し、ＸＢＰ−１の活性をそれぞれ刺激または阻害する。細胞を単離する方法は、当該技術分野において公知である。 
【０３８２】
in vitroで刺激性化合物または阻害性化合物で処理した細胞を、被験体に投与することで、ＸＢＰ−１シグナリングの生物学的作用に影響を与えてもよい。例えば、細胞を被験体から単離し、刺激性化合物を用いて、細胞内での、例えば、スプライシングされたＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６α活性を刺激することにより、in vitroで数を増やし、この細胞を同じ被験体か、または、この細胞のドナーと適合性のある別の被験体組織に、再投与することができる。従って、別の態様において、本発明の調整方法は、細胞を、in vitroでＸＢＰ−１モジュレーター、またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子のモジュレーターと一緒に培養することを含み、さらに、この細胞を被験体に投与することを含む。細胞を被験体に投与する場合、被験体への投与前に、まず培養液中の残存化合物を細胞から取り除いておくことが好ましいかも知れない。これは、例えば細胞を勾配遠心分離したり、または、組織洗浄によって行うことができる。被験体への再投与前に行う細胞のex vivoでの遺伝子改変に関する更なる詳細は、W. F. Anderson らの米国特許第5,399,346号も参照されたい。
【０３８３】
別の態様において、細胞を、市販されている高価なポリペプチドの生産性を高めるために、例えば、ＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６αモジュレーターを用いてin vitroで処理することができる。例えば、ある態様においては、細胞に対して外因性のポリペプチドの産生を高めることができる。別の態様においては、ポリペプチドは、細胞によって組換え的に発現させることができる。市販されている高価なポリペプチドの例としては、例えば、免疫グロブリン、サイトカイン、ホルモン類、成長因子、またはその他の細胞によって産生されるポリペプチドが挙げられる。
【０３８４】
最後の方
その他の態様において、刺激性化合物または阻害性化合物を被験体にin vivoで投与することができる。そのような方法を、例えば、以下において詳細に述べるように障害を治療するために、および/またはin vivoでタンパク質の産生を高めるために、用いることができる。核酸（例えば、ＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６αなどをコードする組換え発現ベクター、アンチセンスＲＮＡ、細胞内抗体、またはＸＢＰ−１、ＩＲＥ−１もしくはＡＴＦ６αなどに由来するペプチド）を含む刺激性化合物または阻害性化合物に関して、該化合物は、in vivoで細胞に核酸（例えば、ＤＮＡ）を導入するための当分野で公知の方法を用いて、患者の細胞に導入することができる。かかる方法の例には、下記が含まれる。
【０３８５】
直接の注射：裸のＤＮＡを、そのＤＮＡを細胞に直接注射することにより、細胞に、in vivoで導入することができる（例えば、Acsadiら、（1991）Nature
332:815-818；Wolffら、 （1990） Science 247:1465-1468参照）。例えば、in vivoで細胞にＤＮＡを注射するための送達用装置（例えば、「遺伝子銃」）を利用することができる。かかる装置は、市販されている（例えば、BioRadから）。
【０３８６】
レセプター媒介のＤＮＡの取り込み：裸のＤＮＡはまた、in vivoで、ＤＮＡをカチオン例えば、ポリリジンと複合体化する（これは、細胞表面レセプターのリガンドと結合する）ことによっても細胞に導入することができる（例えば、Wu,G.およびWu,C.H.（1988） J.Biol. Chem. 263:14621; Wilsonら（1992） J. Biol. Chem.
267: 963-967；および米国特許第5,166,320号参照）。ＤＮＡ−リガンド複合体のレセプターへの結合は、ＤＮＡのレセプター媒介のエンドサイトーシスによる取り込みを促進する。天然にエンドソームを破壊し、それにより細胞質へ物質を放出するアデノウイルスキャプシッドに結合したＤＮＡ−リガンド複合体を用いて、複合体の細胞内リソソームによる分解を回避することができる（例えば、Curielら（1991） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8850; Cristianoら、（1993） Proc. Natl.
Acad. Sci.USA 90:2122-2126参照）。
【０３８７】
レトロウイルス：欠損レトロウイルスは、遺伝子治療目的の遺伝子トランスファーに用いるためによく特性決定されている（総説としては、Miller,A.D.（1990）Blood 76:271を参照されたい）。レトロウイルスゲノムに取り込まれた関心あるヌクレオチド配列を有する組換えレトロウイルスを構築することができる。更に、レトロウイルスゲノムの部分を除去して、そのレトロウイルスを複製欠損にすることができる。次いで、この複製欠損レトロウイルスを、標準的技術によって、ヘルパーウイルスの利用により、標的細胞への感染に用いることのできるビリオンにパッケージする。組換えレトロウイルスを生成するプロトコルおよび細胞にin
vitro または in vivoでかかるウイルスを感染させるプロトコルは、例えば、Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel,F.M.ら（編） Greene
Publishing Associates,（1989）, 9.10-9.14節および他の標準的な実験室マニュアルに見出すことができる。適当なレトロウイルスの例には、当業者に周知のｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭが含まれる。適当なパッケージングウイルス株の例には、ψＣｒｉｐ、ψＣｒｅ、ψ２およびψＡｍが含まれる。レトロウイルスは、様々な遺伝子を、上皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞を含む多くの異なる細胞型に、in
vitro および/またはin vivoで導入するために利用されてきた（例えば、Eglitisら、（1985） Science 230: 1395-1398; DanosおよびMulligan （1988）
Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85:6460-6464； Wilsonら、（1988） Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:3014-3018；Armentanoら、（1990） Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87: 6141-6145；Huberら、（1991） Proc. Natl.Acad.Sci. USA 88: 8377-8381;
Chowdhuryら、（1991） Science 254: 1802-1805；van Beusechemら、（1992） Proc. Natl.
Acad.Sci. USA 89:7640-7644；Kayら、（1992） Human Gene Therapy 3:641-647；Daiら、（1992）
Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:10892-10895；Hwuら、（1993） J.Immunol.150: 4104-4115: 米国特許第4,868,116号；米国特許第4,980,286号；ＰＣＴ出願ＷＯ89/07136号；ＰＣＴ出願ＷＯ89/02468号；ＰＣＴ出願ＷＯ89/05345号；およびＰＣＴ出願ＷＯ92/07573号参照）。レトロウイルスベクターは、レトロウイルスゲノム（およびそれに挿入された外来核酸）が宿主ゲノムにインテグレートされて安定に核酸を細胞に導入するために、標的細胞の順調な分裂を必要とする。従って、標的細胞の複製を刺激することが必要あり得る。
【０３８８】
アデノウイルス：アデノウイルスのゲノムを操作して、それが、関心ある遺伝子産物をコードして発現するが正常の溶菌ウイルス生活環において複製する能力に関しては不活性化することができる。例えば、Berknerら、（1988）BioTechniques 6:616；Rosenfeldら、（1991）Science 252;431-434；およびRosenfeldら、（1992）Cell 68:143-155を参照されたい。アデノウイルスＡｄ株５ｄ１３２４型または他のアデノウイルス株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７等）から導かれた適当なアデノウイルスベクターが当業者に周知である。組換えアデノウイルスは、それらが有効な遺伝子送達賦形剤であるために分裂している細胞を必要としない点および気道上皮（Rosenfeldら（1992）、前掲）、内皮細胞（Lemarchandら（1992）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6482-6486）、肝細胞（HerzおよびGerard （1993） Proc. Natl.Acad.Sci.USA
90:2812-2816）および筋細胞（Quantinら（1992） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2581-2584）を含む種々の細胞型への感染に用いることができる点において有利である。更に、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびその中に含まれる外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノム中に統合されずにエピソームのままであり、それにより、導入されたＤＮＡが宿主のゲノム中に統合される状況（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）における挿入による突然変異誘発の結果として生じ得る潜在的問題が回避される。その上、アデノウイルスゲノムの外来ＤＮＡに対する運搬容量は、他の遺伝子送達用ベクターに比べて大きい（最大で８ｋｂ）（Berknerら、前掲；Haj-AhmandおよびGraham （1986） J.Virol.57:267）。現在使用されている殆どの複製欠損アデノウイルスベクターは、そのウイルスのＥ１およびＥ３遺伝子の全部または部分を欠失しているが、アデノウイルスの遺伝物質の８０％を保持している。
【０３８９】
アデノ随伴ウイルス：アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、効率的な複製および生産的生活環のためにヘルパーウイルスとしてアデノウイルスまたはヘルペスウイルス等の他のウイルスを必要とする天然の欠損ウイルスである。（総説としては、Muzyczka等Curr.Topics in Micro.and Immunol.（1992）158:97-129を参照されたい）。それは又、そのＤＮＡを分裂していない細胞にインテグレートさせることができ且つ高頻度の安定なインテグレーションを示す少数のウイルスでもある（例えば、Flotte等（1992） Am.J.Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356；Samulskiら （1989） J.Virol. 63:3822-3828；およびMcLaughlinら（1989） J.Virol. 62:1963-1973を参照されたい）。ＡＡＶの少ない３００塩基対を含むベクターをパッケージして統合することができる。外因性ＤＮＡのためのスペースは、約４．５ｋｂに限定されている。Tratschinら、（1985）Mol.Cell.Biol.5:3251-3260に記載されたようなＡＡＶベクターを用いて、ＤＮＡを細胞に導入することができる。ＡＡＶを用いて多様な核酸が種々の型の細胞に導入された（例えば、Hermonatら（1984） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470；Tratschinら（1985）
Mol.Cell.Biol. 4:2072-2081；Wondisfordら、（1988） Mol.Endocrinol.2:32-39；Tratschinら（1984） J.Virol.51:611-619；およびFlotteら（1993） J.Biol.Chem.268:3781-3790を参照されたい）。
【０３９０】
核酸を細胞に導入する特定の発現ベクター系および方法の有効性は、当該技術分野でルーチンで用いられる標準的アプローチによって評価することができる。例えば、細胞に導入されたＤＮＡは、フィルターハイブリダイゼーション技術（例えば、サザーンブロッティング）により検出することができ、導入したＤＮＡの転写により生成したＲＮＡは、例えば、ノーザンブロッティング、ＲＮａｓｅ保護または逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＴ）により検出することができる。遺伝子産物は、適切なアッセイにより、例えば、産生蛋白質の免疫学的検出によって、例えば、特異的抗体を用いて、または遺伝子産物の機能的活性を検出するための、例えば酵素アッセイなどの機能的アッセイによって検出することができる。
【０３９１】
ある態様においては、刺激性または阻害性化合物を医薬組成物として、被験体に投与することができる。ある態様においては、本発明は、活性化合物（例えば、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の調整剤）および担体に関する。そのような組成物は、典型的には、例えば、本明細書に記載のような、または、例えば本明細書に記載したスクリーニングアッセイにおいて同定されたような、刺激性または阻害性化合物、および薬学的に許容可能な担体を含む。薬学的に許容可能な担体、および被験体への投与方法については本明細書に記載している。 
【０３９２】
ある態様において、本発明の活性化合物は、他の薬剤と組み合わせて投与される。例えば、ある態様においては、本発明の活性化合物、例えば、ＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子を調整する（例えば、ＸＢＰ-１の活性を直接的に調整する）化合物は、当該技術分野において、特定の状態または疾患の治療に有用であることが知られている他の化合物とともに投与される。例えば、ある態様においては、悪性疾患の治療のために、本発明の活性化合物は、公知の抗腫瘍治療と組み合わせて投与される（例えば、放射線治療、化学治療、および/またはプロテアソームインヒビター（例えば、Velcade（登録商標））。別の態様においては、本発明の活性化合物（例えば、プロテアソームインヒビターまたはＸＢＰ-１の活性を直接的に調整する化合物）は、悪性疾患を治療するために、細胞におけるＥＲストレスを誘発する薬剤と組み合わせて投与することができる（例えば、ツニカマイシンなどの薬剤、細胞へのＣａ＋＋流入を調整する薬剤、または腫瘍細胞における酸素欠乏を増加させる抗抗体因子）。本発明の別の態様において、プロテアソームインヒビターは、ＵＰＲを破壊するために、細胞のＥＲストレスを誘発する薬剤と組み合わせて使用することができる。ある態様において、プロテアソームインヒビターと細胞のＥＲストレスを誘発する薬剤とを組み合わせた細胞の治療を行うと、細胞はアポトーシスを起こす。
【０３９３】
Ｖ．診断アッセイ
別の局面において、本発明は、異常な生物学的活性またはＸＢＰ−１に関連する異常（ＵＰＲの調整、細胞分化の調整、ＩＬ−６産生の調整、免疫グロブリン産生の調整、プロテアソーム経路の調整、タンパク質の折り畳みおよび輸送の調整、Ｂ細胞最終分化の調整、ならびにアポトーシスの調整が有効となるであろうもの）に関して、被験体を診断する方法によって特徴付けられる。
【０３９４】
ある態様において、本発明は、被験体をＸＢＰ-１活性の活性、例えば、ＵＰＲの調整のが有利であると同定することを含む。例えば、ある態様においては、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の発現は、ＸＢＰ-１の異常な生物学的活性を有している疑いのある被験体の細胞中に検出することができる。次いで、前記被験体の細胞中のＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の発現を対照と比較することができるであろう。そして、対照と比較した、前記被験体の細胞中のＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の発現の差を用いて、被験体にとってＸＢＰ-１活性の調整が有利であると診断することができるであろう。
【０３９５】
被験体の細胞中のＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の「発現の変化」または「発現の差」とは、例えば、被験体の細胞におけるＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の発現レベルの、従前に該被験体から採取していたサンプルとの比較における変化、または対照との比較における変化であって、例えば細胞を被験体から単離して、ノーザンブロット分析、マイクロアレイ分析、逆転写ＰＣＲ分析法およびin situハイブリダイゼーション法を含む、当該技術分野において公知の標準的な方法により細胞におけるＸＢＰ−１ｍＲＮＡの発現量を測定することにより、ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡの量を調べることにより検出が可能な変化であってよい。例えば、生物検体を患者から採取し、そして例えば、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の発現または活性を調べることができる。例えば、ＰＣＲアッセイを用いて、被験体の細胞中のスプライシングされたＸＢＰ−１のレベルを測定することができる。スプライシングされたＸＢＰ−１を検出するためのＰＣＲアッセイの例としては、添付の実施例に記載している。例えば、ＸＢＰ−１中の欠失配列を含むＰＣＲプライマー（5'- ACACGCTTGGGAATGGACAC-3' （配列番号:５）および
5'-
CCATGGGAAGATGTTCTGGG-3'） （配列番号６） を用いてスプライシングされたＸＢＰ−１を同定することができる。スプライシングされたＸＢＰ−１のレベルが、対照において認められるものより高いもしくは低い、または、該患者において従前に観察されていたものより高いもしくは低い場合、該患者にとって、ＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路の調整が有効であるだろうことを示す。あるいは、被験体の細胞におけるＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の発現レベルは、例えば細胞を被験体から単離して、ウェスタンブロット法、免疫沈降法、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、および免疫蛍光法を含む当業で公知の標準的な方法により、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１タンパク質を含むシグナル伝達経路中の分子の発現レベルを測定することにより、検出してもよい。このようなアッセイに使用する抗体は、当該技術分野において公知の、および/または、細胞間抗体を作製するために本明細書に記載の技法を用いることができる。
【０３９６】
別の態様において、被験体の細胞中のＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の変化は、１以上の突然変異（すなわち、野生型からの変化）、例えば、タンパク質のアミノ酸中のおよび１以上の突然変異（すなわち、野生型からの変化）を導くＸＢＰ−１遺伝子およびｍＲＮＡから生じる。ある態様において、該突然変異は、活性（例えば、部分的もしくは完全な活性）が増加した形態の分子を導く。別の態様において、該突然変異は、活性（例えば、部分的もしくは完全な活性）が減少した形態の分子を導く。突然変異は、分子の発現レベルを変化させる、例えば異常のある被験体において、分子の発現レベルを増加させるかも知れない。あるいは、該突然変異は、例えば、突然変異タンパク質と１以上の標的との相互作用を調整することによって、タンパク質の調節を変化させる（例えば、スプライシングされない形態のＸＢＰ−１が生じる）。タンパク質のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列中の突然変異は、DNAまたはタンパク質配列を分析するための標準的な技法、例えば、DNAもしくはタンパク質のシーケンシング、RFLP分析、および一ヌクレオチドもしくはアミノ酸多型の分析を用いて決定することができる。例えば、ある態様において、関連対象の核酸配列に隣接するプライマーを用いた高度に感受性のあるＰＣＲアプローチで、突然変異を決定することができる。ある態様において、変化の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）中のプローブ/プライマーに使用（例えば、米国特許第4,683,195号および第4,683,202号参照）、  他のPCRもしくはRACE PCR、または、あるいは、ライゲーション連鎖反応 （LCR） （例えば、Landegranら （1988） Science 241:1077-1080およびNakazawa ら （1994） PNAS 91:360-364）に関連している。この方法は、患者から細胞のサンプルを採取するステップ、該細胞から核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）を単離するステップ、核酸サンプルと、ハイブリダイゼーション と配列の増幅（もしあれば、）が生じるような条件下で配列を特異的に増幅させる１以上のプライマーとを接触させるステップ、および増幅産物の有無を検出する、または増幅産物の大きさを検出して対照サンプルと、長さを比較するステップを含むことができる。 
【０３９７】
ある態様において、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の完全なヌクレオチド配列を決定することができる。ヒト遺伝子の多型を研究するために、実際の配列を決定するための特別の技術が開発されてきた。例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 544-548 （1988）およびNature
330, 384-386 （1987）; Maxim and Gilbert. 1977. PNAS 74:560; Sanger 1977. PNAS
74:5463を参照されたい。さらに、診断アッセイを行う際の、マススペクトロメトリーによるシーケンシング（例えば、ＰＣＴ国際公開第WO 94/16101号; Cohen ら（1996） Adv.
Chromatogr. 36:127-162;およびGriffinら.
（1993） Appl.
Biochem. Biotechnol. 38:147-159）を含む種々の自動配列処理装置を利用することができる（（1995） Biotechniques 19:448）。
【０３９８】
制限断片長多型マッピング（ＲＦＬＰＳ）は、制限酵素部位における変化を基礎としている。ある態様において、サンプル細胞からの多型は、制限酵素切断パターンの変化によって同定することができる。例えば、サンプルおよび対照ＤＮＡを単離し、増幅（任意に）、１以上の制限ヌクレアーゼで消化し、ゲル電気泳動で断片長を決定し、比較する。さらに、配列特異的リボザイムの使用（例えば、米国特許第5,498,531号参照）を用いて、特異的なリボザイム切断部位の存在を記録することができる。
【０３９９】
特定のＤＮＡセグメント中の特異的な多型を検出する技術は、相補的な、標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて、分析されるＤＮＡセグメント（標的ＤＮＡ）をハイブリダイズすることに関連する（Nucl. Acids Res. 9, 879-894 （1981）参照）。一塩基対のミスマッチを含有するＤＮＡ二本鎖は、高い熱安定性を示すので、融点を変えて、一ヌクレオチドのみ異なる標的ＤＮＡからのプローブに完全に相補的な標的ＤＮＡを区別することに用いることができる。この方法は特異的制限酵素の有無を検出するために適用されてきた（米国特許第4,683,194号）。この方法は、標的ＤＮＡにハイブリダイズされる、制限酵素に伸びる末端標識されたオリゴヌクレオチドプローブの使用に関連する。次いで、このハイブリダイズされたＤＮＡの二本鎖を部位に適切な制限酵素とともにインキュベートする。改変された制限部位は、プローブと標的の間の１対の二本鎖中において、エンドヌクレアーゼを用いた消化によって切断される。短縮されたプローブ分子が検出されれば、この特異的な制限部位は標的ＤＮＡ中に存在する。
【０４００】
核酸配列中に多型を検出するための方法は、切断物質からの保護を用いてミスマッチ塩基をＲＮＡ／ＲＮＡまたは  ＲＮＡ／ＤＮＡへテロ二本鎖中に検出することを含む （Myers et al. （1985） Science 230:1242）。通常、「ミスマッチ切断」の技術は、多型配列を含有する（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡをハイブリダイズすることによって形成されたヘテロ二本鎖に、組織サンプルから取得した潜在的多型ＲＮＡまたはＤＮＡを提供することによって開始する。二本鎖を、例えば、対照とサンプル鎖の間の塩基対ミスマッチによって存在するであろう二本鎖の一本鎖領域を切断する薬剤を用いて処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖をＲＮａｓｅによって、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドをＳ１ ヌクレアーゼによって処理し、該ミスマッチ領域を酵素的に消化する。その他の態様において、ミスマッチ領域を消化するために、DNA/DNAまたはRNA/DNA二本鎖のいずれかをヒドロキシルアミンまたはオスミウムテトロキシドおよびピペリジンで処理する。ミスマッチ領域の消化後、得られた材料を変性多型ゲルに基づく大きさによって分離する。例えば、Cottonら. （1988） Proc.
Natl Acad Sci USA 85:4397; Saleebaら.
（1992） Methods
Enzymol. 217:286-295を参照されたい。好ましい態様においては、対照 DNAまたはRNA を検出のために標識することができる。
【０４０１】
別の態様においては、電気泳動移動度の変化を用いて多型を同定することができる。突然変異核酸と野生型核酸の間の電気泳動移動度の差を検出するために、例えば、一本鎖コンフォメーション多型（SSCP）を用いてもよい（Oritaら （1989） Proc
Natl. Acad. Sci USA: 86:2766、またCotton （1993） Mutat Res 285:125-144;およびHayashi （1992） Genet Anal Tech Appl
9:73-79参照）。サンプル核酸と対照核酸の一本鎖ＤＮＡ断片を変性させ、再生させる。一本鎖核酸の構造は、配列によって変化し、得られた電気泳動移動度の変化は、一塩基変化であっても検出することが可能である。標識プローブでＤＮＡ断片を標識または検出してもよい。アッセイの感受性は、（ＤＮＡよりむしろ）ＲＮＡを用いて高めることができる。そこでは、配列の変化に対して二次構造がより感受性が高い。好ましい態様において、当該方法は、二本鎖のヘテロ二本鎖分子を電気泳動移動度の変化に基づいて分離するために、ヘテロ二本鎖分析を利用している （Keenら. （1991） Trends
Genet 7:5）。 
【０４０２】
さらに別の態様においては、変性剤の勾配を含有するポリアクリルアミドゲル中の多型配列を含む核酸分子の動きは、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を用いて調べられる（Myers ら （1985） Nature 313:495）。分析方法として、DGGEを用いる場合、DNAを、完全には変性しないように、例えば、ＰＣＲによって約４０ｂｐの高融点ＧＣに富んだＤＮＡのＧＣクランプを添加することによって改変することができる。さらに別の態様においては、対照ＤＮＡとサンプルＤＮＡの差を同定するために、変性勾配に変えて、温度勾配が使用される（Rosenbaum and Reissner （1987） Biophys Chem 265:12753）。.
【０４０３】
多型を検出するための他の技法の例としては、限定されないが、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー拡張が挙げられる。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーを調製してもよい。そこでは、多型領域を中心に配置し、次いで、完全なマッチが見つかった場合のみハイブリダイゼーションが可能となるような条件下で、標的ＤＮＡにハイブリダイズする（Saikiら（1986） Nature 324:163）; Saiki et al. （1989） Proc. Natl Acad. Sci USA
86:6230）。そのような対立遺伝子特異的ヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする膜に付着し、標識標的ＤＮＡによってハイブリダイズされているときに、ＰＣＲ増幅された標的ＤＮＡまたは異なる多くの多型にハイブリダイズする。
【０４０４】
ＤＮＡ構造の違いを研究するための別のプロセスは、プライマー拡張プロセスである。それは、標識されたヌクレオチドプライマーを鋳型RNAもしくはDNA にハイブリダイズし、次いでDNA ポリメラーゼとデオキシヌクレオシドトリホスフェートを用いてプライマーを鋳型の５'末端まで拡張する。次いで、サイズに基づいて、例えば、変性ポリアクリルアミドゲルを変性させることを介して電気泳動を行って、標識されたプライマー拡張産物の分解を行う。このプロセスは、相同ＤＮＡセグメントと比較し、ヌクレオチド挿入または欠失による違いを検出するために用いられることが多い。ヌクレオチド置換による違いは検出されない。大きさがプライマー拡張産物を特徴付けるために使用される基準に過ぎないからである。
【０４０５】
別のプロセスは、電気泳動などのサイズ分画プロセス行うと、いくつかのヌクレオチドアナログのDNAへの組み込みによって移動度の増加シフトが生じるということを見出した。ヌクレオチドアナログを使用して、変化を同定することができる。それらが電気泳動移動度シフトの原因であるからである（米国特許第4,879,214号参照）。
【０４０６】
“DNA Markers: Protocols, Applications and
Overview,” G. Caetano-Anolles and P. Gresshoff ed., （Wiley-VCH,
New York） 1997（その全体を本明細書に引用によって援用する）に記載されているものを含めて、多型を同定および検出するための多くの他の技法が当該技術分野の当業者には公知である。
【０４０７】
さらに、ＳＮＰを特異的に検出するために多くのアプローチが用いられてきた。そのような技術は、当該技術分野において公知であり、多くのものが、例えば、DNA Markers: 
Protocols, Applications, and Overviews. 1997.  Caetano-Anolles and Gresshoff, Eds. Wiley-VCH, New York,
pp199-211およびそこに含まれる引例、に記載されてきた。例えば、ある態様において、ＳＮＰのような多型を検出するために固相アプローチを用いることができる。例えば、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）を用いることができる。このアッセイは、共末端プローブオリゴヌクレオチドに相補的な位置において、ＤＮＡリガーゼが一ヌクレオチドの違いを識別する能力に基づく（see, e.g., Nickerson et al. 1990.  Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 87:8923）。結合増幅およびオリゴヌクレオチドライゲーション（ＣＡＬ）分析と呼ばれるこのアプローチの改変例を用いて、多重ゲノムタイピング（例えば、Eggerding 1995 PCR Methods Appl. 4:337）; Eggerding et al. 1995 Hum. Mutat. 5:153参照）。
【０４０８】
別の態様において、遺伝子ビット分析（ＧＢＡ）を用いてＳＮＰ（例えば、Nikiforovら 1994. 核酸s Res. 22:4167; Nikiforov et al. 1994.  PCR Methods Appl. 3:285;  Nikiforov et al. 1995. Anal Biochem.
227:201参照）。別の態様において、マイクロチップ電気泳動を用いて、高速ＳＮＰ検出を行うことができる（例えば、Schmalzingら 
2000. 核酸s Research, 28）。別の態様において、基質アシストレーザー離脱/イオン化タイムオフフライト質量（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ）マススペクトロメトリーを用いてＳＮＰを検出することができる（例えば、Stoerkerら、Nature Biotechnology 18:1213）。
【０４０９】
別の態様において、被験体と対照とのあいだで、ＸＢＰ-１の生物学的活性を検出することができる。例えば、ＸＢＰ-１の生物学的活性に関連する異常を有している疑いのある被験体の細胞内におけるＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の活性を検出することができる。次いで、被験体の細胞中のＸＢＰ−１αまたはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の活性を対照と比較することができるであろう。そして、対照と比較した、被験体の細胞中のＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の発現の差を用いて、被験体にとってＸＢＰ−１活性の調整が有利であると診断することができるであろう。ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の活性は、本明細書に記載した。またはとうがい技術分野において公知である。 
【０４１０】
好ましい態様においては、この診断検査法は、被験体から採取した細胞サンプルまたは組織切片（例えば被験体から摘出した組織の凍結乾燥または新鮮凍結切片）などの生物学的サンプルについて行われる。別の態様では、被験体の細胞におけるＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の発現レベルは、放射標識抗体などを用いた適切な撮像法を用いて、in vivoにおいて検出することができる。
【０４１１】
ある態様において、テスト被験体の細胞におけるＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の発現量は、疾患を伴わない対照と比較して上昇（すなわち増加）していてもよく、または被験体は構成的活性（部分的または完全な）型の分子を発現していてもよい。このようなＸＢＰ−１の発現レベルの増加、または構成的活性型のスプライシングされたＸＢＰ−１の発現は、ＸＢＰ−１の増加を伴う疾患を有しているかどうかについて被験体を診断に用いることが可能である。
【０４１２】
別の態様において、被験体の細胞におけるＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子の発現レベルは、疾患を伴わない対照と比較して低下（すなわち減少）していてもよく、また被験体は不活性な（部分的または完全な）変異型の、例えば、スプライシングされたＸＢＰ−１を発現していてもよい。このようなスプライシングされたＸＢＰ−１の発現の減少、または不活性な変異型のスプライシングされたＸＢＰ−１の発現は、不十分な抗体産生を特徴とする免疫欠損疾患などの異常について、被験体を診断するのに用いることが可能である。
【０４１３】
ある態様において、その発現がＸＢＰ-１によって調節される遺伝子の発現レベルを測定することができる（例えば、ＥＲｄｊ４、ｐ５８ｉｐｋ、ＥＤＥＭ、ＰＤＩ−Ｐ５、ＲＡＭＰ４、ＢｉＰ、ＸＢＰ−１もしくはＡＴＦ６α）。  
【０４１４】
別の態様において、被験体を治療する前に、ＸＢＰ−１（または、ＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子）の発現、プロセシング、翻訳後修飾、および/または活性の調節が有利であると、被験体を診断するためのアッセイが行われる。
【０４１５】
本明細書に記載の方法は、例えば、少なくとも１つのプローブ/プライマー核酸、または他の試薬（例えば、抗体）を含むプレパッケージされた診断キットを用いることによって行ってもよい。それは、例えば、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子に関連する疾患または病気の徴候または家族歴を示す患者を診断するための臨床セットにおいて、都合よく用いることができる。.
【０４１６】
ＶＩ．本発明のキット
本発明の別の態様は、本発明のスクリーニングアッセイ、調整方法または診断アッセイを行うためのキットに関係する。例えば、本発明のスクリーニングアッセイを行うためのキットは、指標組成物を含むことができ、ＸＢＰ−１の生物学的作用のモジュレーターを同定するために用いられる、リードアウト（例えば、タンパク質分泌）を測定するための手段および本キットの使用説明書を含んでよい。別の態様では、本発明のスクリーニングアッセイを行うためのキットは、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子が欠損した細胞の細胞、ＸＢＰ−１の生物学的作用のモジュレーターを同定するために用いられるリードアウトを測定するための手段および本キットの使用説明書を含むことができる。
【０４１７】
別の態様において、本発明は、本発明の調整方法を行うためのキットを提供する。このキットは、例えば適切な担体に入れ、ＸＢＰ−１の生物学的作用のモジュレーターを同定するために用いられる使用説明書とともに適切な容器で包装した本発明の調整薬剤（例えばＸＢＰ−１阻害または刺激性薬剤）を含んでもよい。
【０４１８】
本発明の別の態様は、被験体におけるＸＢＰ−１の生物学的活性に関連する異常を診断するためのキットに関連する。このキットは、ＸＢＰ−１の発現を測定する試薬（例えばＸＢＰ−１ ｍＲＮＡを検出するための核酸プローブ、またはＸＢＰ−１タンパク質を検出するための抗体）、被験体の結果を比較するための対照、およびキットを診断目的に使用する際の説明書を含んでよい。
【０４１９】
本発明の別の局面は、ＸＢＰ-１のスプライシングを検出する方法およびそのような方法を行うためのキットに関する。そのような方法は、スプライシングを調整する試薬を同定するのに有用である。本発明はまた、ＸＢＰ−１またはその一部（例えば、ＸＢＰ−１のスプライス領域およびＸＢＰ−１の転写活性化ドメイン）を含む構築物に関する。ある態様において、そのような構築物は、ＸＢＰ-１のトランスアクチベーションドメインを含む（Claussら、1996. 核酸s Research 24:1855）。細胞を、そのような構築物とスプライシングされたＸＢＰ−１に反応する調節領域に作用的に結合したレポーター遺伝子を発現するように、操作する。ある態様において、細胞を、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）に結合したＸＢＰ-１を含むスクリーニングベクターが発現するように操作し、スプライシングされた形態のＸＢＰ−１が作製されたときは、レポーター遺伝子が転写され、 スプライシングされていない形態のＸＢＰ−１が作製されたときは、レポーター遺伝子が転写されないようにする（図９のスキーム参照）。ある態様において、そのようなアッセイは、非折り畳みタンパク質応答を促進する化合物（例えば、ツニカマイシン）の存在下および不存在下で行うことができ、その結果、試験化合物のその応答への役割を測定することができる（例えば、化合物がこの応答を上方もしくは下方調整する能力を試験することができる）。ある態様において、細胞はさらに、外因性または内因性ＩＲＥ−１分子を発現することができる。試験化合物は、試験化合物の存在下または不存在下でのＸＢＰ−１スプライシングの量を比較することによって、ＸＢＰ−１スプライシング刺激剤もしくは阻害剤として、同定することができる。ある態様において、本発明はまた、ＸＢＰ−１のスプライシングを検出するためのキットに関する。該キットは、外因性ＸＢＰ−１分子またはその一部と、ＸＢＰ−１に反応する調節領域に作用可能に結合するレポーター遺伝子とを含む組換え細胞を含み、ＸＢＰ−１タンパク質のスプライシングによってレポーター遺伝子の転写が起こるようにすることができる。
【０４２０】
ＶＩＩ．免疫調整性組成物
ＸＢＰ−１の発現、プロセシング、翻訳後修飾、および/またはＸＢＰ-１を含むシグナル伝達経路中の１以上の分子の活性、発現、プロセシング、翻訳後修飾を調整する薬剤もまた、免疫調節性組成物において使用するのに適している。本発明の刺激性薬剤または阻害性薬剤を使用して、被験体における免疫応答をアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることができる。好ましい態様においては、体液性の免疫応答が調節される。
【０４２１】
本発明の調整薬剤は、単独で、または免疫応答の上昇もしくは減少が望ましい抗原との組み合わせにおいて、与えられる。
【０４２２】
ある態様において、公知のアジュバントである薬剤を当該調整剤とともに投与することができる。このとき、ヒトにおいて広く使用されてきた唯一のアジュバントは、アラム（リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）である。サポニンおよびその精製成分であるQuil A、フロイントの完全アジュバントおよびその他のアジュバントが研究および獣医学の用途においては使用されてきており、ヒトワクチンでのしようの可能性を有している。しかしながら、ムラミルジペプチド、モノフォスホリル脂質Ａ、リン脂質結合体などの新たな化学的に定義された調製剤、例えば、Goodman-Snitkoff et al. J. Immunol. 147:410-415 （1991）に記載のもの、レソルシノール誘導体、ポリオキシエチレンオレイルエーテルなどの非イオン界面活性剤およびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテル、膵臓トリプシンインヒビターを含む酵素インヒビター、ジイソプロピルフルオロフォスフェート（ＤＥＰ）およびトラシロールも用いることができる。抗原が投与される態様において、抗原は、例えば、Miller et
al., J. Exp. Med. 176:1739-1744 （1992）に記載（本明細書において引用によって援用する）のように、プロテオリポソーム内にカプセル化することができる。または、たとえば、Novasome TM脂質小胞体（Micro Vescular Systems, Inc.,Nashua, N. H.）などの脂質小胞体に組み込み、さらに免疫応答を高めることができる。
【０４２３】
ある態様において、ＸＢＰ−１またはＸＢＰ−１を含むシグナル伝達経路中の分子をコードする核酸分子またはその一部をＤＮＡワクチンとして投与する。これは、レポーターまたは治療的遺伝子の輸送のために用いられるものと類似するプラスミドＤＮＡ構築物を用いて行うことができる。そのような構築物は、大量のプラスミドＤＮＡを増幅することが可能な細菌起源の複製、原核細胞選択マーカー遺伝子、例えばＸＢＰ−１と、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６αポリペプチドをコードする核酸配列、宿主細胞における遺伝子の発現を導く真核細胞転写調節エレメント、およびｍＲＮＡの末端を確実に適切な者にするためのポリアデニル化配列を含むことが好ましい（Davis. 1997. Curr.
Opin. Biotechnol.  8:635）。DNA免疫化に使用されるベクターは、任意にシグナル配列を含んでもよい（Michel et al.  1995.  Proc. Natl. Acad. Sci
USA. 92:5307; Donnelly et al.
1996.  J. Infect Dis. 
173:314）。DNAワクチンは、種々の手段、例えば、注射によって、投与することができる（例えば、筋内、皮内、またはＤＮＡがコードされた金粒子の表皮へのバイオリスティック（biolistic）注射、粒子加速器または粒子を皮膚へ注射するための圧縮ガスを使用した遺伝子銃（Haynes et
al. 1996.  J. Biotechnol.  44:37））。あるいは、ＤＮＡワクチンは、非侵襲的手段によって投与することができる。例えば、精製された、もしくは脂質製剤されたＤＮＡを呼吸器系もしくは標的部位へ送達することができる、例えば、ＤＮＡの経口送達によるPeyersパッチ （Schubbert.  1997.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:961）.。粘膜表面への送達には、減衰された微生物を用いることができる（Sizemore et al.
1995. Science. 270:29）。
【０４２４】
ある態様において、DNA ワクチン接種用プラスミドは、ＸＢＰ−１（または、例えば、ＩＲＥ−１またはＡＴＦ６α）ならびに免疫応答が望ましい抗原を発現させることができ、または免疫応答のモジュレーター、例えば、リンフォカイン遺伝子または共刺激性分子をコードすることができる（Iwasakiら、1997. J.
Immunol. 158:4591）
【０４２５】
下記の実施例によって本発明を更に例示するが、それは、限定するとして解してはならない。本願全体を通じて引用されるすべての参考文献、特許、および公開特許願は、引用によってここに援用される。
【実施例】
【０４２６】
実施例１〜７においては、以下の材料と方法を使用した。
【０４２７】
マウス
ＢＡＬＢ／ｃおよび１２９Ｓ６マウスを、Jackson Laboratory （Bar Harbor, ME）およびTaconic （Germantown, NY）から、それぞれ入手した。６〜８週齢のＳＴＡＴ６欠損マウスを用い、Committee on Animals of Harvard Medical Schoolのガイドラインにしたがって、病原菌の無い施設内において保持した。
【０４２８】
細胞培養および細胞株
マウス脾細胞または精製Ｂ細胞（精製成熟Ｂ細胞は、脾臓およびリンパ節から、磁気式ＣＤ４３デプレションまたはＢ２２０磁気ビーズ選択によって単離した。Miltenyi Biotech, Auburn Ca.）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Hyclone Laboratories）、グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（５０ユニット／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、Ｈｅｐｅｓ（１００ｍＭ）、非必須アミノ酸（１Ｘ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）およびβ−ＭＥ（５０μＭ）を補充したＲＰＭＩ１６４０を含有する完全培地中に播き（１×１０６細胞／ｍｌ）、抗ＣＤ４０（１μｇ／ｍｌ）（Pharmigen）またはＬＰＳ（２０μｇ／ｍｌ）（Sigma）で刺激した。サイトカイン（R&D Systems, Minneapolis, MN）を、ＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｉｌ−５（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１０（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１３（２０ｎｇ／ｍｌ）で用いた。刺激されたＢ細胞を２４時間ごとに、新鮮な培地を用いて、細胞濃度１×１０６細胞／ｍｌに分割した。ＢＣＬ１（ＣＷＳ１３．２０−３Ｂ３ ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６９９）細胞株を、１０％ＦＢＳ、ゲンタマイシン（２０μｇ／ｍｌ）およびβ−ＭＥ（５０μＭ）を添加したＲＰＭＩ培地で培養した。細胞の分化を誘発するために、細胞を２×１０５個／ｍｌで播き、組換えマウスＩＬ−２およびＩＬ−５（２０ｎｇ／ｍｌ） （R&D systems）で処理した。 
【０４２９】
プラスミド構成および一過性トランスフェクション
正常のスプライシングされていない、スプライシングすることができない形態（ＸＢＰ−１ｕ／ｓ）と、スプライシングされた（ＸＢＰ−１ｓ）の形態のＸＢＰ−１ ｃＤＮＡｓについて、未処理およびツニカマイシン処理ＮＩＨ３Ｔ３細胞のＲＮＡの全てから、ＰＣＲによりそれぞれ増幅した。ＸＢＰ−１ｕ（スプライシングされていない）形態は、５３２および５３５位置の２つのＧ残基が、ＸＢＰ−１ｕのオープンリーディングフレームのアミノ酸配列を変えずに、Ａに変わるようにＰＣＲベースの変異誘発を行って、ＸＢＰスプライシングされていない／ｓ ｃＤＮＡから生成した。番号は、ジーンバンクデータベース（ＮＭ＿０１３８４２）の配列に基づくものである。これらのＸＢＰ−１ ｃＤＮＡｓをｐＣＤＮＡ３．１プラスミドに、Hind III部位とApa I部位の間において挿入し、各哺乳動物発現プラスミドを作製した。ＸＢＰ−１ｕ、ＸＢＰ−１ｕ／ｓおよびＸＢＰ−１ｓのそれぞれににつきレトロウイルスベクターを作製するために、ｐＣＤＮＡ３．１由来ベクターからｃＤＮＡｓをPme I消化によって除去し、次いで、平滑末端ライゲーションを利用してGFP-RVレトロウイルスベクターに挿入した（Sambrook et al.,
1989）。NIH3T3細胞を製造元が推奨するようにLipofectamine2000試薬を用いて、トランスフェクトした。 
【０４３０】
ノーザン ハイブリダイゼーションおよびＲＴ−ＰＣＲ
TriZol （Gibco-BRL）またはQiashedder/Rneasy RNA 精製カラム（Quiagen）を用いて全ＲＮＡを単離した。ノーザンブロットを上記のように行った（Rengarajan et al.,
2000 Immunity. 12:293-300）。簡潔に述べれば、７〜１０μｇのＲＮＡを１．２％アガロース上で電気泳動し、６％ホルムアルデヒドゲルをGenescreen膜 （NEN）に移し、UV Stratalinker （Stratagene）を用いて膜に共有結合させた。ReadyPrime標識化システム（Amersham-Pharmacia）を用いた３２Ｐ放射性標識の後、以下のプローブを使用した。すなわち、ＸＢＰ−１ （ネズミコード領域の15-830）、GRP94およびGRP78（両方とも、R.J. Kaufman Univ. of Michigan （Lee et al., 2002）から贈られた）、Blimp（Nco1-Sca1 断片）、c-myc cDNAおよびIl-6 cDNAである。Ultrahyb緩衝液を用いて、製造元（Ambion）の推奨するようにして、プローブハイブリダイゼーションを行った。第１鎖合成のために、Superscript reverse transcriptase （Invitrogen）を用いて全てのＲＮＡを使用した。ＸＢＰ−１における欠失配列を包含するＰＣＲプライマーの対
（5'- ACACGCTTGGGAATGGACAC-3' （配列番号５）および
5'-
CCATGGGAAGATGTTCTGGG-3'） （配列番号６）をAmpliTaq Gold polymerase （Applied
Biosystem）を用いたＰＣＲ増幅に使用した。PCR産物は、３％アガロースゲル （Agarose-1000 Invitro gen） 上で電気泳動を行い、エチジウムブロミド染色によって視覚化した。
【０４３１】
ELISAアッセイ
培養上清中の免疫グロブリンまたはサイトカインレベルを測定するためのアッセイを記載のように行った（例えば、Hodgeら、1996 Immunity. 4:397-405またはScience. 1996 274:1903-5）。
【０４３２】
Ｂ細胞のレトロウイルスの形質導入
スプライシングされていない形態（ＸＢＰ−１ｕ／ｓ）と、スプライシングされた（ＸＢＰ−１ｓ）の形態のＸＢＰ−１ ｃＤＮＡｓについて、未処理およびツニカマイシン処理ＮＩＨ３Ｔ３細胞のＲＮＡの全てから、ＰＣＲによりそれぞれ増幅した。それは、プライマーセット（5'-GACGTTTCCTGGCTATGGTGG-3'（配列番号７）および、5'-CAGGCCTATGCTATCCTCTAGGC-3'（配列番号８））を用いた。ＸＢＰ−１ｕ形態は、 ５３２および５３５位置の２つのＧ残基が、ＸＢＰ−１ｕのオープンリーディングフレームのアミノ酸配列を変えずに、Ａに変わるようにＰＣＲベースの変異誘発を行って、ＸＢＰスプライシングされていない／ｓ ｃＤＮＡから生成した。番号は、ジーンバンクデータベース（ＮＭ＿０１３８４２［ｇｉ：１３７７５１５５］）の配列に基づくものである。これらのＸＢＰ−１ ｃＤＮＡｓを、平滑末端ライゲーションを利用してGFP-RVレトロウイルスベクターに挿入した（Sambrook et al.,
1989）。EFFECTENEトランスフェクション （Quiagen）を用いて、DNAをPhoenix細胞に導入した。製造元が記載しているように行った（例えば、Reimoldら、2001 Nature. 412:300-7 or Int
Immunol. 2001 13:241-8）。４８時間後ウイルス性上清を回収し、後で使用するために−８０℃で凍結した。Ｂ細胞を、ＣＤ４３デプレションを用いて、またはＢ２２０＋磁気ビーズを用いた陽性選択によりマウス脾臓から精製した。製造元（MidiMacs, Miltenyi Biotech）が記載しているように行った。Ｂ細胞の純度は、通常ほぼ９５％である（フローサイトメトリーにより確認する）。次いで、Ｂ細胞（１０６個／ｍｌ）を培養液中でＬＰＳ１０μｇ／ｍｌとＦ（ａｂ’）２抗ＩｇＭ（５μｇ／ｍｌ、Southern Biotechnology Associates Inc.）を用いて２４時間活性化した。活性化したＢ細胞（１０６個／ｍｌ）のうち１ｍｌを４μｇのポリブレンと１ｍｌのウイルス含有上清と混合し、1000 gで４５分間、２４℃で回転させた。細胞を２４〜３６時間３７℃でインキュベートし、次いで、GFP+細胞をフローソートし、４５分間、２４℃で刺激を行って、あるいは行わずに、培養液に戻した。
【０４３３】
実施例 １: 一次Ｂ細胞中のＩＬ−４によるＸＢＰ−１の急速誘導はＳＴＡＴ−６依存性である
ＸＢＰ−１は、Ｂ細胞の最終分化を必要としているので、ＸＢＰ-１遺伝子発現を調節する刺激を同定することが重要である。サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３）の過剰は、in
vitro およびin vivoの双方での形質細胞分化に関与してきた（ Calame, K. L. （2001Nat. Immunol. 2: 1103-1108; Liu, Y. J., and Banchereau,
J. （1997）. Sem Immunol 9: 235; Zubler, 1997Sem. Hematol 34:13に概説されている）.  これらのサイトカインは、ＸＢＰ−１遺伝子の発現を調整することによって、Ｂ細胞の最終分化を行うことが可能であった。したがって、これらのサイトカインがＢ細胞においてＸＢＰ−１ ｍＲＮＡ転写をアップレギュレートする能力を試験した。精製脾臓Ｂ細胞を、サイトカインの存在下または不存在下で、２４時間培養した。そして、ＸＢＰ−１の発現をノーザンブロット分析により測定した。図１Ａにおいて、Ｂ２２０＋脾臓Ｂ細胞を、指示されたサイトカイン（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下および不存在下で、２４時間培養した。対照としてγアクチンを用いて、ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡレベルをノーザンブロット分析によって測定した。図１Ｂは、時間を変えて、脾臓Ｂ細胞を組換えＩＬ−４で処理した場合の結果を示している。そして、ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡレベルをノーザンブロット分析によって測定した。パネルＣでは、脾臓Ｂ細胞を正常ＢＡＬＢ／ｃマウスＩＬ−４またはＳＴＡＴ６欠損マウスのいずれかから取り出し、組換えＩＬ−４を用いて１８時間刺激した。ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡレベルを上記のように測定した。パネルＤでは、脾臓Ｂ細胞を、組換えＩＬ−４を用いて２０μｇ／ｍｌシクロヘキシイミドの存在下または不存在下で４時間刺激した。シクロへキシイミドは、ＩＬ−４による刺激の３０分前に添加した。
【０４３４】
図１Ａは、サイトカインで処理した２４時間後、ＩＬ−４のみが有意な量のＸＢＰ−１転写物を誘導したことを示している。一方、試験に用いた他のサイトカインは未処理細胞と比較して不活性であった。ＩＬ−４処理培養液中では、これらの後者のサイトカインは、ＩＬ−４のみを用いて観察したものと比べて、ＸＢＰ−１転写物をさらに増加させることはなかった。このアップレギュレーションのカイネティクスをより正確に定義するために、精製Ｂ細胞培養液をＩＬ−４で処理し、間隔をあけて２４時間までアッセイを行った。ＸＢＰ−１転写物は、ＩＬ−４に応答して急速に増加した。ＩＬ−４処理の１時間以内に現れ、約８時間でピークに達した（図１Ｂ）。この誘導が新たなタンパク質の合成を必要としたかどうかを決定するために、培養液を、ＩＬ−４を用いて、タンパク質合成阻害剤、シクロへキシイミド（ＣＨＸ）の存在下と不存在下で処理した。シクロへキシイミドを含むものは、ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡのＩＬ−４に応答するアップレギュレーションに影響を及ぼさなかった（図１Ｃ）。この所見は、ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡのＩＬ−４に応答する急速なアップレギュレーションは、ＩＬ−４Ｒ結合シグナリングタンパク質Ｓｔａｔ６による、その直接的な転写活性化に依存するものかもしれないと言うことを示唆している。この仮定を試験するために、ＳＴＡＴ６＋／＋、ＩＬ４−／−およびＳＴＡＴ６−／−マウスからのＢ細胞をＩＬ−４で処理した。１８時間刺激した、対照Ｂ細胞（ＳＴＡＴ６＋／＋）およびＩＬ４−／−Ｂ細胞は、ＸＢＰ−１転写物を有意に刺激したが、一方ＳＴＡＴ６−／−処理したＢ細胞は、ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡを誘導することができなかった（図１Ｄ）。したがって、Ｂ細胞中でのＸＢＰ−１ ｍＲＮＡのレベルは、ＩＬ−４駆動性、Ｓｔａｔ６依存性の経路を介して制御される。
【０４３５】
実施例２:ＸＢＰ−１スプライシングは、一次Ｂ細胞の抗体分泌細胞への分化に相関する
ＵＰＲは、ＥＲのルーメンにおいて、折り畳まれていない、または集合してないタンパク質の不定量を検出する細胞中で誘導される。活性化Ｂ細胞中での分泌の前に、ＥＲ内でＩｇの量が増加することは、ＩＲＥ−１αそして、続くＸＢＰ−１スプライシングを活性化する有益なシグナルとなり得るであろう。この可能性を調べるために、種々の刺激がＸＢＰ−１のスプライシングを誘導する能力を試験した。ＣＤ４０レセプターを介しての、またはリポポリサッカライド（ＬＰＳ）などのマイトゲンを用いた刺激は、ネズミＢ細胞の活性化および分化を誘導するということが十分に確立されている。実際、ＣＤ４０細胞質ドメインとＴＲＡＦ６との特異的な相互作用は、近年、形質細胞の分化に必要であることが示されてきた（Ahonenら、2002 Nat. Immunol. 3: 451-456）。図２のパネルＡでは、脾臓Ｂ細胞をＬＰＳ（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で３日間培養した。全ＲＮＡを、指示された時間で調製し、対照としてγアクチン（ｂ）を用いて、ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡレベル（ａ）をノーザンブロット分析によって測定した。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＸＢＰ−１ｓ ｍＲＮＡのスプライシングされた領域に隣接するプライマーセットを用いて行った。ＰＣＲ産物を、３％アガロースゲル上に分散させ、スプライシングされていない、およびスプライシングされたＸＢＰ−１ ｍＲＮＡ（ｃ）のバンドを分離させた。ＸＢＰ−１ｓタンパク質レベルもまた、ウェスタンブロット分析（ｄ）によって測定した。パネルＢでは、脾臓Ｂ細胞をＩＬ−４と抗ＣＤ４０のいずれかもしくは両方を用いて、指示された時間刺激した。ＲＴ−ＰＣＲ分析を上記のように行った。パネル（Ｃ）では、ＸＢＰ−１ｓタンパク質レベルを、７２時間、指示されたように刺激された細胞内で、ウェスタンブロット分析によって測定した。
【０４３６】
抗ＣＤ４０およびＬＰＳの両方が、精製ネズミＢ細胞内でＸＢＰ−１をコードする転写物をアップレギュレーションさせる（Reimold et al., 2001
Nature 412: 300-307） （図２Ａ）が、これらの転写物がスプライシングされていない形態、スプライシングされた形態のいずれのＸＢＰ−１をコードしたかについては、確立されていなかった。ＬＰＳ、抗ＣＤ４０または抗ＩｇＭを用い、かつＩＬ−４を用いずに、in
vitroで処理した精製ネズミＢ細胞からのｍＲＮＡについて、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による分析を行った。スプライシング部位を包含する領域を増幅させるために、ネズミＸＢＰ−１の４１０および５８０の位置でプライマーセットを使用した。未処理細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析および２４時間処理した全てのグループからの分析により、スプライシングされていないｍＲＮＡに対応する１７１ｂｐの強い増幅断片が明らかになった。４８時間、７２時間ＬＰＳとＣＤ４０＋ＩＬ−４（どちらも分化の刺激に効果的である）を用いたサンプルについても同じ分析を行ったところ、１７１ｂｐのスプライシングされていない形態のＸＢＰ−１ ｍＲＮＡバンドおよび１４５ｂｐのスプライシングされた形態のＸＢＰ−１ ｍＲＮＡ（領域内で２６ｂｐが欠失していた）が現れた。スプライシングされたＸＢＰ−１ ｍＲＮＡも抗ＣＤ４０のみを用いた後４８時間および７２時間で現れた（図２Ａ、２Ｂ）。分化を誘導することができないことに一致して、ＢＣＲのみによる刺激でもスプライシングを誘導できなかった。最後に、８時間以内にＸＢＰ−１転写物を大幅に誘導した外因性ＩＬ−４で処理したものも、サイトカイン処理の２４時間後、スプライシングを誘導することができなかった（図２Ｂ）。これらの結果は、ＬＰＳ処理による、スプライシングされたＸＢＰ−１の産生について述べた先の報告を確認し（Calfon et al., 2002
Nature 415: 92-96）、それを拡大して、それと組織学的に関連するスプライシング事象におけるシグナル伝達経路、ＣＤ４０と関連付けている。しかしながら、抗ＣＤ４０は、スプライシングされたＸＢＰ−１転写物の産生、Ｂ細胞からのＩｇ産生に必要なもに類似する、ＩＬ−４およびＣＤ４０による刺激に必要とされるスプライシングされたＸＢＰ−１タンパク質の最大量の産生（図２Ｃ）を誘導することが可能であった。同様に、ＬＰＳ処理（それ自身によってＩｇ産生および形質細胞分化を促進することができる）を競合させて、その他の刺激がないスプライシングされたＸＢＰ−１タンパク質の実質量を産生させた（図２Ａ）。したがって、所与の刺激がＸＢＰ−１スプライシングを引き起こす能力は、それがＢ細胞分化を促進する能力に相関している。
【０４３７】
実施例３：ＸＢＰ−１スプライシングは、Ｂ細胞最終分化時に発生し、ＢＣＬ−１モデル系中のＵＰＲの誘導と相関する
上記実験によって、活性化したＢ細胞内でのＸＢＰ−１スプライシングの制御を調べた。Ｂ細胞最終分化の最後の段階におけるＸＢＰ−１スプライシングの調節を調べるために、ＢＣｌ−１細胞株の形質細胞分化モデルを利用した。ＩＬ−２およびＩＬ−５による刺激を受けて、成熟B細胞株は、Syndecan （ＣＤ１３８）の表面発現および少量のＩｇＭの分泌によって証明されるように、早期の形質細胞状態に分化した（Blackman et al.,
1986 Cell 47: 609-617; Matsui et al., 1989 J Immunol 142: 2918-2923）。BCL-1細胞は、基線レベルでＸＢＰ−１ ｍＲＮＡを発現した。そして、ＩＬ−２およびＩＬ−５による刺激を受けたとき、これらのレベルは増加しなかった（Reimold et al., 2001、前掲）。ＸＢＰ−１スプライシングがこの分化プロセスの間に起こったかどうかを調べるために、ＢＣＬ−１細胞をＩＬ−２およびＩＬ−５で処理した。図３のパネルＡにおいて、ＩＬ−２およびＩＬ−５（それぞれ２０ｎｇ／ｍｌ）による刺激を受けたＢＣＬ−１細胞の培養上清から、および指示された時間の間に刺激を受けなかった対照からのＩｇＭ産生をＥＬＩＳＡによって測定した。実験は、少なくとも３回行い、標準偏差を示している。パネルＢでは、ＩＬ−２およびＩＬ−５（それぞれ２０ｎｇ／ｍｌ）による刺激を受けたＢＣＬ−１細胞からの全ＲＮＡの７ｕｇを含有する１２、２４および３６時間の間隔でのノーザンブロット分析を示す。パネルＣにおいては、ＩＬ−２およびＩＬ−５（それぞれ２０ｎｇ／ｍｌ）による刺激を受けていない、および刺激を受けたＢＣＬ−１細胞からの全ＲＮＡについて、２４および４８時間の間隔でのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。ネズミＸＢＰ−１のスプライシング部位に伸びるプライマーを用いてスプライシングされていない、およびスプライシングされたｍＲＮＡを増幅した。ＰＣＲ産物を３％のアガロースゲル上にて電気泳動し、エチジウムブロミド染色により視覚化した。
【０４３８】
Ｉｇ産生の増加およびフローサイトメトリーにおけるパラメーターの順方向対横方向の分散の増加が分化を証明している（図３Ａ）。ノーザンブロット分析によって、cMyc mRNA を抑制しながらの、BLIMP-1 mRNAの急速なアップレギュレーションによって、分化がさらに証明された（図３Ｂ）（Lin et al., 1997
Science 276: 596-599; Turner et al., 1994 Cell 77: 297-306）。ＲＴ−ＰＣＲ分析を、未処理のまま放置しておいた、またはＩＬ−２およびＩＬ−５で処理しておいたＢＣＬ−１細胞からのｍＲＮＡを用いて行った。上記のように、スプライシング部位を包含する領域を増幅させるために、ネズミＸＢＰ−１の４１０および５８０の位置でプライマーセットを使用した。未処理細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析およびスプライシングされていないｍＲＮＡに対応する１７１ｂｐの強い増幅断片が明らかになった。対照的に、ＩＬ−２およびＩＬ−５で処理した細胞からのｍＲＮＡについて２４時間および４８時間において、同じ分析を行ったところ、１７１ｂｐのスプライシングされていない断片および１４５ｂｐのスプライシングされた形態のＸＢＰ−１ ｍＲＮＡ（領域内で２６ｂｐが欠失していた）に対応するさらなるバンドが現れた（図３Ｃ）。スプライシングされていない形態ではなく、スプライシングされた形態のＸＢＰ-１の過剰発現の結果、ＵＰＲレポーター構築物がＨｅＬａ細胞内に有意に誘導されることが近年示された （Yoshida et al., 2001
J Biol Chem 273: 33741-33749）。スプライシング事象、形質細胞分化およびＵＰＲの間の関連を確立するために、ＢＣｌ−１細胞の分化中のＸＢＰ−１スプライシングと関連するＵＰＲ標的ＧＲＰ７８およびＧＲＰ９４の誘導を調べた。ＢＣｌ−１細胞の最終分化に伴って、ＵＰＲシャペロン遺伝子、ＧＲＰ９４およびＧＲＰ７８をコードするｍＲＮＡの内因性レベルの有意なアップレギュレーション、ＸＢＰ−１のスプライシングと相関する誘導が起こった（図３Ｂ）。したがって、スプライシングされた形態のＸＢＰ−１によるＵＰＲの誘導と続く転写活性化は、Ｂ細胞の最終分化に関与している。
【０４３９】
実施例４：ＸＢＰ-１の過剰発現がＢＣＬ−１細胞によるＩｇＭ分泌を高める。
ＢＣＬ−１細胞のＸＢＰ-１の異所性発現が膜Syndecan-1レベルを増加させる（Reimold et al.,
2001, 前掲）。ＩｇＭ産生におけるスプライシングされていない形態およびスプライシングされた形態のＸＢＰ−１の影響を決定するために、２つのビシストロン性（bicistronic）レトロウイルスベクターを作製した。第１のものは、スプライシングされていない形態およびスプライシングされた形態の双方のネズミＸＢＰ−１を発現した。第２のものは、スプライシングされた形態のＸＢＰ−１タンパク質のみをコードした。第１のベクター、ＸＢＰ−１ｕ／ｓは、ＸＢＰ−１ｍＲＮＡの発現を導き、 翻訳時にスプライシングされていない形態と、ＩＲＥ依存性スプライシングを作製した。ヒトＸＢＰ−１ ｍＲＮＡに類似して、ネズミＸＢＰ−１ ｍＲＮＡのスプライシングによって、２６ｂｐが除去される。そして、得られたフレームシフトによって、１０８Ｃ−末端ａａと更なる２１２ａａの付加を、残りの１５９ａａＮ末端領域に引き起こした。この構築によって、２６７ａａのタンパク質（３３Ｋ、スプライシングされていない）および３７１ａａのタンパク質（５４Ｋ、スプライスされている）がそれぞれ産生された。スプライシングされた形態のＸＢＰ−１をコードするベクターは、ＸＢＰ−１ｓのみが３７１ａａを含有するタンパク質を作製した （Calfon et al., 2002
Nature 415: 92-96; Yoshida et al., 2001 J Biol Chem 273: 33741-33749）。図４のパネルＡでは、全細胞ライセートを用いた。ツニカマイシンによる刺激を受けていない、および刺激を受けた、精製Ｂ細胞からトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞についてウェスタンブロット分析を行った。パネルＢでは、レトロウイルスの、ＢＣｌ−１細胞のＧＦＰのみ（ＧＦＰ−Ｒｖ）、ＸＢＰ−１ｕ／ｓ（ＸＢＰ−１ｕ／ｓ ＧＦＰ Ｒｖ）またはＸＢＰ−１ｓ（ＸＢＰ−１ｓ ＧＦＰ Ｒｖ）を用いた形質導入を行った。形質導入の３６時間後、細胞をＧＦＰについて分類し、ＩＬ−２およびＩＬ−５（それぞれ２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または不存在下において７２時間インキュベートした。ＢＣＬ−１細胞による刺激を受けていない、および刺激を受けた細胞の培養上清から、ＩｇＭ産生をＥＬＩＳＡによって測定した。実験は、少なくとも３回行い、標準偏差を示している。ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞ＸＢＰ−１ｕ／ｓおよびＸＢＰ−１ｓ ｃＤＮＡの一過性トランスフェクションの過剰発現により、スプライシングされていない形態およびスプライシングされた形態のＸＢＰ−１の適切な産生が、３３Ｋおよび５４Ｋタンパク質が示しているように、確認された（図４Ａ）。次いで、BCL-1細胞株のレトロウイルス遺伝子による形質導入を行い、細胞をＧＦＰによって分類し、対照ベクター、ＸＢＰ−１u/sおよびＸＢＰ−１を発現する安定な細胞の集合体を生成した。次いで、細胞をＩＬ−２およびＩＬ−５で処理した。または、処理せずに放置し、その後ＩｇＭ分泌に関して試験した。ＩＬ−２およびＩＬ−５で３日間しょりしたＧＦＰ陽性ＢＣＬ−１細胞においては、ＸＢＰ−１ｕ／ｓがＩｇＭ分泌を、対照のみと比べた場合、約３倍に増加させた。同様に、ＸＢＰ−１ｓ発現は、Ｉｇ分泌を、サイトカイン処理した細胞中の対照との比較において約４倍に高めた。サイトカインで処理しなったＧＦＰ陽性ＢＣＬ−１細胞においては、ＸＢＰ−１ｕ／ｓもＸＢＰ−１ｓもＩｇ分泌を誘導しなかった（図４Ｂ）。これらのデータは、スプライシングされた形態のＸＢＰ−１が、形質細胞の最終分化に必要な刺激の存在下での、Ｉｇ産生および分泌を駆動することができることを証明するものである。
【０４４０】
実施例５：スプライシングされたＸＢＰ−１タンパク質のみがＩｇ産生ＸＢＰ−１−／−一次Ｂ細胞を回復する
ＢＣＬ−１モデルは、形質細胞分化の研究において有用であることが証明されてきたにもかかわらず、ＩＬ−２およびＩＬ−５だけで処理して形質細胞分化が起こらない場合、それは、一次Ｂ細胞で生じることのほんの一部を複製するだけである。したがって、一次Ｂ細胞中でのＸＢＰ−１の機能の評価は、リンパ系がＸＢＰ−１を欠損したマウスを用いて行うのが有利であった。ＸＢＰ−１欠損Ｂ細胞は、in
vitro でのＬＰＳによる刺激後、ｗｔＢ細胞と比較してわずかなＩｇしか作製しない。Ｂ細胞およびスプライシングされていない形態およびスプライシングされた形態の双方のＸＢＰ−１をコードするｃＤＮＡのＸＢＰ−１−／−Ｂ細胞への異所性発現は、部分的にＩｇ分泌を回復した （Reimold
et al., 2001, 前掲）。これらの結果は、一次Ｂ細胞によるＩｇの産生におけるＸＢＰ−１の強い関与を示唆するものである。Ｉｇ産生における、スプライシングされていない形態およびスプライシングされた形態のＸＢＰ−１の相対的寄与度を調べるために、突然変異形態のＸＢＰ−１を作製した。酵母およびヒトＸＢＰ−１ ｍＲＮＡのための記載と同様に（Gonzalez et al.,
1999 EMBO J 18: 3119-3132; Kawahara et al., 1998 J Biol Chem 273: 1802-1807; Yoshida et al., 2001,前掲）（ＩＲＥ１αによってスプライシングすることはできないであろう）。ＨＡＣ−１ ｍＲＮＡのＩｒｅ１ｐ媒介性のスプライシングの研究は酵母に集中していた。これらの研究に基づいて、この慣習に囚われないスプライシング事象が必要とする特異的ヌクレオチドについては、十分に定義されている。酵母の３’スプライシング部位Ｈａｃ１ ｍＲＮＡのＩｒｅ１ｐ依存スプライシングは、スプライシングの標的とされる７ヌクレオチドのループ構造内の位置−３、−１、＋３および＋４に依存している。４つの重要な部位のいずれかにおける突然変異の結果、ツニカマイシン処理に応答してスプライシングすることができない転写が生じることになる（グリコシレーションの阻害を介してＵＰＲを誘導する）。こうして、ネズミＸＢＰ−１のループ構造中の位置−３および＋３における点突然変異が作出された。このベクターはＸＢＰ−１ｕと定義されている。ＸＢＰ−１ｕ ｃＤＮＡを含有するベクターの過剰発現の結果、単一の33 Kタンパク質が生じた。これによって、スプライシングされていないＸＢＰ−１タンパク質の独占的な産生を確認するものである。
【０４４１】
これら３つの異なる形態のＸＢＰ-１がＩｇ分泌に及ぼす作用を、野生型細胞およびＸＢＰ−１−／−Ｂ細胞において比較した。in
vitroで活性化した脾臓Ｂ細胞を、ＸＢＰ−１ｕ／ｓ、ＸＢＰ−１ｓ、ＸＢＰ−１ｕまたは対照ＧＦＰをコードするビシストロン性ｍＲＮＡを発現するレトロウイルスを用いて導入した。図５ＡおよびＢにおいて、ｗｔマウスおよびＸＢＰ−１−／−マウスからの精製Ｂ細胞を、ＬＰＳ：１０μｇ／ｍｌおよびＦ（ａｂ’）２抗ＩｇＭ（５μｇ／ｍｌ）を有する培養液中で２４時間活性化した。活性化したＢ細胞の、ＧＦＰのみ（ＧＦＰ−Ｒｖ）、ＸＢＰ−１ｕ／ｓ（ＸＢＰ−１ｕ／ｓ ＧＦＰ Ｒｖ）、ＸＢＰ−１ｓ（ＸＢＰ−１ｓ ＧＦＰ Ｒｖ）またはＸＢＰ−１ｕ（ＸＢＰ−１ｕ ＧＦＰ Ｒｖ）を用いたレトロウイルスの形質導入を行った。細胞を２４〜３６時間３７℃でインキュベートし、次いで、ＧＦＰ＋細胞をフローソートし、７２時間、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）で刺激して培養液に戻した。ＩｇＭパネル（Ａ）およびＩｇＧ２ｂパネル（Ｂ）の産生を、刺激したＢ細胞の培養上清からのＥＬＩＳＡによって分析した。実験は、少なくとも３回行い、標準偏差を示している。
【０４４２】
ＸＢＰ−１−／−細胞は、ＩｇＭ産生が有意に弱められていた。対照ＧＦＰを発現する野生型細胞は、類似の対照誘導のＸＢＰ−１−／−細胞におけるＩｇＭの約２０倍を発現した。しかしながら、スプライシングされていないＸＢＰ−１／ｓまたはＸＢＰ−１の発現は、ＸＢＰ−１−／−Ｂ細胞におけるＩｇＭの分泌を、対照と比較して約１０倍に増加させた。対照的に、ＸＢＰ−１ｕの発現は、スプライシングされていない形態のＸＢＰ−１を独占的に生成するものであり、ＸＢＰ−１−／−Ｂ細胞でのＩｇＭ分泌を増加させることはできなかった（図５Ａ）。
【０４４３】
ＬＰＳは、Ｂ細胞のin
vitro 刺激をうけて、ＩｇＭをＩｇＧ２ｂサブクラスにクラススイッチングすることが知られている。ＬＰＳを用いたin
vitro刺激によるＩｇＧ２ｂ産生はまたＸＢＰ−１−／−Ｂ細胞においてＩｇＧ２ｂ産生を有意に減少させた。ＸＢＰ−１の２つバージョンがＸＢＰ−１−／−Ｂ細胞においてＩｇＧ２ｂを回復する能力を試験した。対照ＧＦＰを発現する野生型細胞は、類似の対照が誘導したＸＢＰ−１−／−細胞と比べて、５倍以上多くのＩｇＧ２ｂを発現した。スプライシングされていないＸＢＰ−１／ｓまたはＸＢＰ−１ｓレトロウイルスの発現は、ＸＢＰ−１−／−Ｂ細胞中のＩｇＧ２ｂの分泌を対照との比較において、約２〜４倍に増加させた。対照的に、ＸＢＰ−１ｕの発現は、ＸＢＰ−１−／−Ｂ細胞中でＩｇＧ分泌を増加させることができなかった（図５Ｂ）。
【０４４４】
したがって、スプライスされた形態のＸＢＰ−１のみ（スプライシングされていない形態ではない）が、正常Ｂ細胞リンパ球において、実際的に関与し、かつ、分泌Ｉｇの産生にとって必要とされている。したがって、ＵＰＲによって動かされるシグナリング系は細胞分化に必要とされている。
【０４４５】
実施例６：スプライシングされたＸＢＰ-１タンパク質がｗｔおよびＸＢＰ−１−／−Ｂ細胞においてＩＬ−６分泌を誘導する
ＩＬ−６  は、精製Ｂ細胞をＩｇ分泌性の形質細胞に入れ、形質細胞（多発性骨髄腫細胞）にとって重要な成長因子として働くことがわかっている。（Hallek et al., 1998
Blood 91: 3-21; Hirano and Kishimoto,
1989 Prog Growth Fact Res. 1:
133-142; Kawano et al., 1988 Nature 332: 83-85）。ヒト多発性骨髄腫細胞において、ＸＢＰ−１は、ＩＬ−６処理によって誘導され、悪性形質細胞の増殖に関わった（Wen et al., 1999）。しかしながら、ＸＢＰ−１転写のアップレギュレートまたは成熟Ｂ細胞におけるＸＢＰ−１ ＲＮＡのスプライシングの媒介にはＩＬ−６は役割を持たないことが記載されている（図６Ａ）。ＷｔおよびＸＢＰ−１−／−一次Ｂ細胞において、ＸＢＰ−１がＩＬ−６産生を誘導する能力を試験した。上記のように、in
vitro で活性化したネズミ脾臓Ｂ細胞を、ビシストロン性ｍＲＮＡ、ＸＢＰ−１ｕ／ｓ、ＸＢＰ−１ｓ、ＸＢＰ−１ｕおよび対照ＧＦＰを発現するレトロウイルスを用いて形質導入した。細胞をソートした後、ＧＦＰ＋細胞をＬＰＳで刺激し、７２時間後のサイトカイン産生についてアッセイした。図６のパネル（Ａ）では、ｗｔ  およびＸＢＰ−１−／−マウスからの精製B細胞を、ＬＰＳ：１０μｇ／ｍｌおよびＦ（ａｂ’）２抗ＩｇＭ（５μｇ／ｍｌ）を有する培養液中で２４時間活性化した。活性化したＢ細胞の、ＧＦＰのみ（ＧＦＰ−Ｒｖ）、ＸＢＰ−１ｕ／ｓ（ＸＢＰ−１ｕ／ｓ ＧＦＰ Ｒｖ）、ＸＢＰ−１ｓ（ＸＢＰ−１ｓ ＧＦＰ Ｒｖ）またはＸＢＰ−１ｕ（ＸＢＰ−１ｕ ＧＦＰ Ｒｖ）を用いたレトロウイルスの形質導入を行った。細胞を２４〜３６時間３７℃でインキュベートし、次いで、ＧＦＰ＋細胞をフローソートし、７２時間、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）で刺激して培養液に戻した。サイトカイン産生を、刺激したＢ細胞の培養上清からのＥＬＩＳＡによって分析した。実験は、少なくとも３回行い、標準偏差を示している。パネル（Ｂ）において、全ＲＮＡを、上記刺激したＢ細胞から調製し、ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡレベルを、γアクチン対照を用いて、ノーザンブロット分析した。 
【０４４６】
対照ＧＦＰまたはＸＢＰ−１ｕレトロウイルスを発現する野生型およびＸＢＰ−１−／−細胞は、文献にこれまでに報告されてきたものと同様、中等度の量のＩＬ−６を発現した（Burdin et al., 1995.
J Immunol 154: 2533-2544）。ＸＢＰ−１ｕ／ｓの発現は、ＩＬ−６分泌を、制御を超えた約２倍に増加させた。著しく、ＸＢＰ−１の形態の導入によって、野生型およびＸＢＰ−１−／−Ｂ細胞におけるＩＬ−６の分泌を対照細胞と比較して、約１０倍、７倍にそれぞれ増加させた（図６Ａ）。 ＸＢＰ−１形質導入する細胞からのｍＲＮＡのノーザンブロット分析によって、対照細胞と比較して、ＩＬ−６遺伝子の発現において約５倍に増加したことが明らかになった（図６Ｂ）。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０などの他のサイトカインのレベルは影響がなかった。これらのデータは、ＵＰＲの役割に加えて、スプライシングされた形態のＸＢＰ−１もまた、重要な形質細胞成長因子ＩＬ−６の発現を調節するよう機能していることを示唆するものである。.
【０４４７】
実施例７：スプライシングされていないＸＢＰ−１はユビキチン化されており、不安定である
標識されたＸＢＰ-１のスプライシングされた、およびスプライシングされていないタンパク質を、標識されたユビキチン発現構築物とともにＮＩＨ３Ｔ３細胞にコトランスフェクトした。ライセートをニッケルカラムに通して、ユビキチン化されたタンパク質を選択した。これらのタンパク質を溶出させ、抗ＸＢＰ−１抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った。その結果、スプライシングされていないＸＢＰ−１タンパク質のみがユビキチン化していた。さらに、骨髄腫細胞における３５Ｓパルス追跡実験から、スプライシングされたタンパク質（１２０分追跡後も依然としてバンドが認められた）ではなく、スプライシングされていないＸＢＰ−１（６０分間の追跡後バンドは認められなかった）は、半減期が非常に短く、分解が急速であることが明らかになった。これはユビキチン化と一致していた。
【０４４８】
実施例８：プロテアソームインヒビターは、スプライシングされたＸＢＰ−１を犠牲にして、スプライシングされていないＸＢＰ−１を安定化する 
ユビキチン-プロテアソーム経路によるタンパク質分解を阻害する種々の可逆的および不可逆的インヒビターが最近同定されてきている。プロテアソームインヒビターＭＧ１３２およびＰＳ３４１は、スプライシングされたＸＢＰ−１ではなく、スプライシングされていないＸＢＰ−１のようなユビキチン化されたタンパク質の急速な分解をブロックする。骨髄腫細胞は、最初にスプライシングされたＸＢＰ−１タンパク質を予測されたとおり発現する。しかしながら、マウス骨髄腫ＭＯＰＣ３１５およびヒト骨髄腫ＭＭ，１ＳをＭＧ１３２またはＰＳ３４１を用いて処理したところ、スプライシングされていないＸＢＰ−１タンパク質の量が大幅に増加し、同時に、活性なスプライシングされたＸＢＰ−１タンパク質のレベルが減少する。ＭＯＰＣ３１５細胞からの実験ライセートを６時間、未処理のままにするか、または５ｕｇ／ｍｌのツニカマイシンもしくは２０ｕＭのＭＧ−１３２で処理し、ＸＢＰ−１抗体を用いてＸＢＰ−１の存在を分析した。この２つの形態のＸＢＰ−１はそれらの分子量によって区別した。 
【０４４９】
実施例９：スプライシングされていないＸＢＰ−１タンパク質は、ＸＢＰ−１活性を、プロテアソームインヒビターの存在下で阻害する
プロテアソーム インヒビターの存在下で、スプライシングされていないＸＢＰ−１タンパク質が細胞内に蓄積し、スプライシングされたタンパク質より高いレベルで存在する。ｓＭｍ．１Ｓ細胞からのライセートを、１、４または８時間、未処理のままにしておくか、２０ｕＭのＰＳ−３４１を用いて処理し、抗ＸＢＰ−１抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った。スプライシングされたＸＢＰ−１ではなく、スプライシングされていないＸＢＰ−１は安置している。スプライシングされていないＸＢＰ−１のスプライシングされたＸＢＰ−１に対する比率は、プロテアソームインヒビターで処理した細胞において増加している。
【０４５０】
一過性トランスフェクション実験によって、スプライシングされていないＸＢＰ−１タンパク質がスプライシングされたタンパク質の転写活性化能を大幅に抑制していることが明らかにされている。ルシフェラーゼの折り畳み誘導がＸＢＰ−ルシフェラーゼをもつＮＩＨ３Ｔ３細胞において測定された。構築物は、マウスＲＡＮＴＥＳ遺伝子の最小プロモーターに融合したＸＢＰ−１標的配列TGGATGACGTGTACA（配列番号９）の４つのコピー（Clauss et
al. Nucleic Acids Research 
1996. 24:1855）またはＡＴＦ６/ＸＢＰ−１標的TCGAGACAGGTGCTGACGTGGCGATTCC（配列番号１０）（cfosプロモーター−５３／＋４５を含む）（J. Biol. Chem. 
275:27013）の５つのコピーを含んでいた。５ｕＭ ＭＧ−１３２の存在下で、スプライシングされていないＸＢＰ−１が存在することで、ルシフェラーゼ４１．９〜５．８の折り畳み誘導を阻害する。したがって、プロテアソームインヒビターの存在下では、スプライシングされていないタンパク質は、スプライシングされたタンパク質の機能をブロックする。
【０４５１】
実施例１０〜１５においては、以下の材料と方法を使用した。。
【０４５２】
ウェスタンブロットおよびパルス追跡実験
細胞をＲＩＰＡ緩衝液 （50 mM Tris pH
7.4、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1% Triton X-100、1%デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS）中に溶解し、ライセートをSDS-PAGEに供し、Hybond P膜（Amersham-Pharmacia, Piscataway, New Jersey）に移した。ブロットは、抗ＸＢＰ−１（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California）、抗カスパーゼ１２（J.
Yuan, Harvard University, Boston, Massachusetts）、および抗ＩＲＥ１α（Urano et al. 2000. Science 287: 664-666）抗体によって、標準的な方法により明らかになった。HeLa細胞を、ＸＢＰ−１ｕおよびHis-標識されたユビキチン発現プラスミド（pMT107, D. Bohmann, EMBL, Germany）とともに、Lipofectamine-2000
試薬（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いることによってコトランスフェクトした。細胞抽出物をNi-NTAカラムを介して、前記のようにして精製し（Campenaro et al.  1997.  PNAS
94:2221-2226）、ユビキチン化したＸＢＰ−ｌｕタンパク質を、抗ＸＰＢ−１抗血清を用いたウェスタンブロット分析によって明らかにした。ＸＢＰ−１ｕおよびＸＢＰ−１ｓタンパク質の分解率を、３５Ｓ Ｍｅｔ／ＣｙｓでＪ５５８細胞を１時間パルス標識し、指示された時間追跡した。放射性標識化ＸＢＰ−１タンパク質を、全細胞抽出物から免疫沈降させ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離させ、オートラジオグラフ法によって明らかにした。 
【０４５３】
ノーザンブロット法およびRT-PCR分析
全ＲＮＡを、Trizol試薬を用いて調製し、１．２％アガロース、６％ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動し、次いで Genescreen Plus膜（NEN, Boston, Massachusetts）へ移した。３２Ｐ−放射性標識されたプローブを用いてハイブリダイゼーションを既に示したように行った（Iwakoshi
et al. 2003 Nature Immunology 4: 321-329）。ＥＲｄｊ４およびｐ５８ＩＰＫのプローブを、適切な制限酵素（ＥＲｄｊ４, IMAGE:1920927; ｐ５８ＩＰＫ, IMAGE:2646147）を用いてＥＳＴクローンから切除した、ｃＤＮＡより生成した（ATCC、Manassas、Virginia）。ＸＢＰ−ｌｕとＸＢＰ−１ｓ ｍＲＮＡの比率は、スプライシングされた領域まで伸びるプローブセットを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって既に示したようにして、明らかにした（Iwakoshi
et al.2003 Nature Immunology 4: 321-329）。
【０４５４】
プラスミドおよびレポーターアッセイ
ＸＢＰ-１ｕのＣ末端における２〜３のリジン残基をアルギニンに置換して、ＸＢＰ−１ｕＫＫ（Ｋ２３５Ｒ、Ｋ２５２Ｒ）およびＸＢＰ−１ｕＫＫＫ（Ｋ１４６Ｒ、Ｋ２３５Ｒ、Ｋ２５２Ｒ）を、部位特異的突然変異によって生成させた（Iwakoshi
et al.2003 Nature Immunology 4: 321-329）。ｄｎ−ＸＢＰは、ＸＢＰ−１ｕのＮ末端１８８ａａを含有している。ＮＴＨ３Ｔ３細胞を、Lipofectamine2000試薬を用いて製造元（Invitrogen, Carlsbad, California）の推奨するとおりにして、指示された量のＵＰＲＥ（ＵＰＲエレメント）レポーター（Wang et al. 2000 J Biol Chem 275:
27013-27020）および種々のエフェクタープラスミドを用いて、移動させた。細胞は、特定の実験において回収する前に１６時間処理した。細胞を受動的緩衝剤において、製造元のプロトコルにしたがって二重ルシフェラーゼアッセイを行った（Promega, Madison, Wisconsin）。
【０４５５】
ｉＸＢＰ−１およびｄｎ−ＸＢＰ−１骨髄腫細胞の産生
5'-GGGATTCATGAATGGCCCTTA-3' （配列番号１１） の２つの相補オリゴヌクレオチドをpBS/U6ベクター（前述のSui et
al.  2002 Proc Natl Acad Sci U S A 99:
5515-5520）に挿入することによって、ＸＢＰ−１特異的ＲＮＡｉベクターを構築した。ＲＮＡｉのためのSGFΔU3シャトルレトロウイルスベクターを作製するために、ポリリンカー（PmlI, SalI, BamHI and MluI）を、SFG tcLucECT3のPmlI部位とBamHI部位の間に（Lindemann et al.  1997 Mol. Med. 3:466-476）挿入した。ネオマイシン耐性遺伝子発現カセットを、pMCSV ベクター （Invitrogen） からＰＣＲによって増幅し、SGFΔU3のBamHI部位とMluI部位の間に挿入し、SGFΔU3neo作製した。最後に、U6 プロモーターiXBPカセットを、pBS/U6駆動ベクターから、SmaIおよびBamHI消化によって切り出し、SGFΔU3neoのPmlI部位とBamHI部位の間に挿入し、SGFΔU3neo-iXBPレトロウイルスベクターを作製した。レトロウイルスの上清を調製し、J558細胞を前述のようにして形質導入するするために使用した（Iwakoshi
et al.2003 Nature Immunology 4: 321-329）。未感染細胞を除去した。１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で１週間より長く、細胞を培養することによって、細胞を除去した。ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡおよびＲＮＡｉによるタンパク質の抑制をノーザンおよびウェスタンブロット分析によって確認した。
【０４５６】
アポトーシスアッセイ
細胞をアネキシン V-PE （BD
PharMingen, San Jose, California）で推奨されているようにして染色し、FACScanフローサイトメトリー上で分析した（Becton Dickinson, San Jose, California）。
【０４５７】
実施例１０：プロテアソームインヒビター （PIs）はＥＲストレスを誘導するが、骨髄腫細胞におけるＵＰＲを抑制する
ＥＲ膜の成熟および折り畳み、ならびにタンパク質の分泌は、ＥＲに存在するシャペロンと折り畳み酵素の活性に依存する。究極的に適切に折り畳むことのできないＥＲタンパク質は、２６Ｓプロテアソーム、あるいはＥＲＡＤによって分解される。プロテアソーム活性の抑制によって、ＥＲ中にＥＲＡＤ基質の蓄積が誘導され、それによって、ＥＲストレスを誘導する。プロテアソーム機能障害がＵＰＲ活性化に及ぼす作用を試験するために、ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞（左のパネル）およびＪ５５８骨髄腫細胞（右のパネル）を、プロテアソームインヒビター（ＰＩ）ＭＧ−１３２で、ＥＲストレス誘導物質、ツニカマイシン（Ｔｍ）の存在下または不存在下で処理し、ＵＰＲ標的遺伝子を評価した（図１０ａ）。予期したとおり、Ｔｍ処理の結果、ＢｉＰ（Ｇｒｐ７８）やＣＨＯＰなどの代表的なＵＰＲ標的遺伝子の発現が誘導された。ＰＩのみを含む細胞の処理もまた、これまでに報告されているとおり、ＵＰＲを誘導した（ K. T. Bush,
et al., J Biol Chem 272, 9086-92. （1997） Y. Kawazoe,
et al., Eur J Biochem 255, 356-62 （1998）） （図10a）。前駆種の切断によって証明されるように（図７ｂ）、ＰＩｓもカスパーゼ１２の活性化を誘導した。これによって、プロテアソーム活性の阻害がＥＲストレスおよびアポトーシスシグナル伝達経路を誘導することが確認された（ T. Nakagawa et al., Nature 403, 98-103 （2000））。しかしながら、驚くべきことに、ＰＩによる処理は、ＮＩＨ３Ｔ３およびＪ５５８骨髄腫細胞の双方において、Ｔｍ誘導性のストレス反応をさらに増大させるのではなく、むしろブロックした。これによってＰＩはＵＰＲも抑制する可能性が高い（図１０ａ）。  
【０４５８】
実施例１１：ＰＩはＩＲＥ−１α媒介性のＸＢＰ−１ ｍＲＮＡスプライシングを阻害する
活性なスプライシングされた形態のＸＢＰ−１（ＸＢＰ−１ｓ）を高レベルで発現するＪ５５８細胞のＭＧ１３２またはＰＳ−３４１による処理によって、著しいＸＢＰ−１ｕの蓄積および同時にＸＢＰ−１ｓタンパク質の減少が、ＭＧ−１３２の濃度が０．２〜０．４μＭのときに起こった（図１０ｃ）。２つのＸＢＰ−１種のＭＧ−１３２による、カイネティクスの経時的な誘導と損失は、ＸＢＰ−１ｓが早い時点で誘導されるが、処理の４時間後には急速に傾き、１６時間経過後にはかろうじて検出可能な程度であったことが明らかになった（図１０ｄ）。逆に、ＸＢＰ−１ｕレベルは、処理後の早い時点から上昇し、実験を通じて維持され、８時間後にピークを示した（図１０ｄ）。ＭＧ−１３２およびＰＳ−３４１がＪ５５８細胞においてアポトーシスを誘導することがわかる（図１０ｃ、ｄ）。ＸＢＰ−１ｓの用量依存性とスプライシングされていない形態のへシフトおよびアポトーシスの間に密接な相関関係が観察され、双方ともＭＧ−１３２の濃度が０．２〜０．４μＭのときに最も増加していた（図１０ｃ）。同様に、ＸＢＰ−１ｕの蓄積とＸＢＰ−１ｓの損失のカイネティクスは、これらの細胞のＭＧ−１３２誘導性アポトーシスのカイネティクスを反映していた（図１０ｄ）。ＰＳ−３４１は、ヒトＭＭ細胞株ＭＭ．１ｓ、患者骨髄から誘導される一次ＭＭ細胞において、ＸＢＰ−１ｕに対するＸＢＰ−１ｓの比率における同様の顕著なシフトを誘導した（図１０ｅ）。
【０４５９】
スプライシングされたＸＢＰ−１ｓ種の消失によって、ＰＩがＩＲＥ１a媒介性のＸＢＰ−１ｍＲＮＡスプライシングを抑制したことが示唆された。ノーザンブロット分析によれば、ＸＢＰ−１ ＲＮＡの全体のレベルは、Ｊ５５８細胞において、ＴｍまたはＭＧ−１３２による有意な変化は見られず、ＸＢＰ−１ｕと転写物の区別はできなかった（図１１ａ）。ＸＢＰ−１ｕおよびｓ転写物の相対量をプライマーセットを用いてＲＴ−ＰＣＲ（１４５ｂｐおよび１１９ｂｐのＸＢＰ−１ｕおよびＸＢＰ−１ｓ ｍＲＮＡをそれぞれ増幅）で測定した（図１１ｂ）。予期していたとおり、Ｔｍ処理は著明にＸＢＰ−１ ｍＲＮＡスプライシングを誘導した（図１１ｂ、最初の２レーン）。ＭＧ−１３２のみの場合は、ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡスプライシングを、高濃度で８時間までの長時間の処理後においてさえ、誘導しなかった（図１１ｂ）。しかしながら、興味深いことに、Ｔｍ誘導性のＸＢＰ−１ ｍＲＮＡスプライシングは、ＸＢＰ−１ｓ対スプライシングされていない形態の比率の減少によって反映されているように、ＭＧ−１３２によって用量依存的に抑制された（図１１ｂ）。ＭＧ−１３２処理後のＸＢＰ−１ｓタンパク質の著明な減少の結果、ＩＲＥ１媒介性のＸＢＰ−１ ｍＲＮＡスプライシングが抑制された。ＭＧ−１３２がプロテアソームを標的化することによってＸＢＰ−１スプライシングを誘導することを確認するために、プロテアソーム活性を阻害することが既知の化合物のパネルを調べた。２０Ｓプロテアソーム複合体（ＺＬ３ＶＳおよびＡｄａＡｈｘ３Ｌ３ＶＳ、両方ともプロテアソームの全てのβサブユニットを効率的に標的化する）（ B. M.
Kessler et al., Chem Biol 8, 913-29 （2001）） のキモトリプシン活性の可逆的インヒビターであるＰＳ−３４１は、全てＸＢＰ−１ ｍＲＮＡスプライシングをＭＧ−１３２と同程度に効率的に抑制する（図１１ｃ）、ＭＧ−１３２がプロテアソームを標的化することによってＸＢＰ−１スプライシングを阻害することが確認された。
【０４６０】
ＥＲルーメンにおいて誤折り畳みタンパク質を感知すると、ＩＲＥ１タンパク質は、オリゴマー化と自己リン酸化によって活性化された。どのステップでＰＩｓがＩＲＥ１α機能を妨害するかを決定するために、ＩＲＥ１αリン酸化の統合性を評価した。未処理およびＴｍ処理された細胞の抽出物のウェスタンブロット分析を行ったところ、リン酸化（遅い移動度）の増加、および既に観察されていた未リン酸化ＩＲＥ１α種の減少が認められた（図１１ｄ）。顕著に、ＭＧ−１３２は、ＩＲＥ１αのリン酸化をＴｍにより完全にリン酸化した（図１１ｄ）。これらのデータは、ＩＲＥ１α活性化の最初のステップがＰＩの存在下で破壊され、それによってオリゴマー化と自己リン酸化が損傷を受けると言うことを証明するものである。
【０４６１】
実施例１２：安定化したＸＢＰ−１uタンパク質は、スプライシングされた種のインヒビターとして作用する
PIは、多段階で、ＸＢＰ−１スプライシングされていない種とスプライシングされた種のバランスを変更すべく作用することができるだろう。２つの潜在的な機序は、スプライシング事象自身、またはＸＢＰ−１uタンパク質の優先的な安定化の抑制であった。正常な状態のもとで、ＸＢＰ−１uタンパク質は、ＸＢＰ−１u転写物は豊富であるにもかかわらず、Ｊ５５８細胞中でタンパク質はかろうじて検出可能な程度であり、安定性の低さを示していた（ H. Yoshida,
T. Matsui, A. Yamamoto, T. Okada, K. Mori, Cell
107, 881-891 （2001））。実際、ＸＢＰ−１uタンパク質は、in vivoで高度にユビキチン化されており（図１２ａ）、骨髄腫細胞中で急速に分解され、半減期は約１０分であった（図１２ｂ）。したがって、ＸＢＰ−１ｕタンパク質は、ユビキチン−プロテアソーム経路において急速に分解され、ＰＩの存在下で安定化され、蓄積する。ＸＢＰ−１ｓタンパク質（不安定）は、半減期が約１時間とより長かった。結論として、ＸＢＰ−１ｓタンパク質の早期の時点での最初の蓄積、およびＭＧ−１３２処理後のＸＢＰ−１ｕタンパク質の急速な増加は、  ＰＩによる安定化を示し、一方、その後のＸＢＰ−１ｓタンパク質レベルの減少は、ＩＲＥ１α依存性のＸＢＰ−１スプライシングの抑制によって説明される。 
【０４６２】
ＸＢＰ−１uタンパク質ではなく、ＸＢＰ−１sは、強力なトランスアクチベーションドメインを有しており（ H. Yoshida,
T. Matsui, A. Yamamoto, T. Okada, K. Mori, Cell
107, 881-891 （2001））、Ｂ細胞中にＩｇを再構成するN.
N. Iwakoshi et al., Nature Immunology 4, 321-329 （2003）。ＸＢＰ−１ｕは、Ｎ末端において、ロイシンジッパーモチーフをもち、ＸＢＰ−１ｓのパートナーとなって、その活性を調節することが可能であった。これを試験するために、ＮＩＨ３Ｔ３細胞をＸＢＰ−１ｓ発現プラスミドと、ＸＢＰ−１ｕおよびＵＰＲＥルシフェラーゼレポータープラスミドの存在下または不存在下でコトランスフェクトした。処理を行わなかった場合、ＸＢＰ−１ｕではなくＸＢＰ−１ｓは、レポーター活性を大いに増加させた（図１２ｃ）。しかしながら、ＭＧ−１３２の存在下では、ＸＢＰ−１ｕは、有意にＸＢＰ−１ｓによるレポーターのトランスアクチベーションを抑制していた。これは、安定化ＸＢＰ−１ｕタンパク質が強い陰性であり、スプライシングされた種の活性を抑制したことを示唆するものである（図１２ｃ）。
【０４６３】
ＸＢＰ−１uタンパク質がＸＢＰ−１ｓの強い陰性インヒビターとして作用したかどうかをより直接的に調べるためには、ＰＩの他の可能性のある複雑な行動を除外する必要があった。Ｃ末端（ＸＢＰ−１ユビキチン化の可能性のある部位）のリジン残基をアルギニンに変えて、より安定な形態のスプライシングされていないＸＢＰ−１を作製した。Ｃ末端の２〜３のリジンがアルギニンにそれぞれ置換された突然変異タンパク質であるＸＢＰ−１ｕＫＫおよびＸＢＰ−１ｕＫＫＫは、もともとのＸＢＰ−１ｕタンパク質より高レベルで発現した。これはユビキチン化依存性の分解の役割と矛盾しない（図１２ｄ）。これらのより安定な突然変異形態のＸＢＰ−１ｕは、ＰＩの不存在下においても、レポーターのトランスアクチベーションをＸＢＰ−１ｓによって阻害した（図１２ｅ）。したがって、スプライシングされていないバージョンのＸＢＰ−１ｕは、その発現がユビキチン化による分解によって妨害されているとき（骨髄腫細胞においてＰＩの存在下で起こる状況）、スプライシングされた形態のそれに対して、強い陰性インヒビターとして作用することができる。
【０４６４】
実施例１３：機能的ＸＢＰ−１の欠如が、骨髄腫細胞のＥＲストレス誘導性アポトーシスを増加させる
ＰＩが、ERAD物質の分解を妨害することによって骨髄腫細胞におけるＥＲストレスを高めるとき、それらは逆説的にＵＰＲ活性化を阻害する。ＰＩは、ＥＲストレスを誘発することによって、部分的にアポトーシス、それに続くアポトーシス性シグナル伝達経路を誘導し、そのとき、同時に適切なＰＵＲを阻害することが可能であった。この仮説に一致して、ＴｍおよびＭＧ−１３２は、Ｊ５５８骨髄腫において相乗的にアポトーシスを誘導した（図１３ａ）。これらの結果は、ＴｍおよびＭＧ−１３２が、誤折り畳みタンパク質の入力を増加すること、ＥＲＡＤ分解をブロックすることのそれぞれによって、ＥＲストレスを増大させたことを示している。
【０４６５】
損傷したＵＰＲがＥＲストレスの処置に及ぼす作用をさらに試験するために、ＸＢＰ−１を機能的に欠損している骨髄腫細胞株を、Ｊ５５８細胞を強力な優生陰性ＸＢＰ−１レトロウイルスに形質導入することによって（ｄｎ−ＸＢＰ−１）、またはｓｉＲＮＡレトロウイルス（ｉＸＢＰ）を用いて、作製した。ｄｎＸＢＰ−１は、ＸＢＰ−１ｕに存在するＣ末端の不安定モチーフを所有していないので、高レベルで発現し（図１２ｄ、レーン４）、ＸＢＰ−１ｓ誘導性トランスアクチベーションを非常に効率的に阻害する。ｉＸＢＰ形質導入細胞におけるＸＢＰ−１発現の抑制については、ノーザンおよびウェスタンブロット分析の両方によって確認した（図１３ｂ）。ＸＢＰ−１活性の機能的損傷は、ＸＢＰ−１依存性UPR標的遺伝子（ERdj4およびp58IPK）の誘導の大きな減少 （J. Kurisu et al.,
Genes Cells 8, 189-202 （2003）;Y. Shen, et
al., J Biol Chem 277, 15947-56 （2003）） ｄｎ−ＸＢＰ−１とｉＸＢＰ−１により形質導入された細胞の双方におけるＴｍ（図１３ｃ）によって証明された。対照的に、ＢｉＰおよびＣＨＯＰの誘導（ＸＢＰ−１によって調節されなかった）は、ｄｎ−ＸＢＰまたはＸＢＰ−１ＲＮＡｉによる影響が最小であった。細胞増殖または生存可能性の効果は、ベースラインでは観察されなかった。しかしながら、Ｔｍ治療によって、ｄｎＸＢＰ−１およびｉＸＢＰ−１骨髄腫細胞の両方は、対照ＧＦＰ形質導入ｄＪ５５８細胞と比較して、有意に増加したアポトーシスを示した（図１３ｄ）。これは、ＩＲＥ１α／ＸＢＰ−１経路が、ＥＲストレスの条件下で、骨髄腫細胞の生存に寄与することを示唆するものである。
【０４６６】
これらのデータは、機能的ＵＰＲは、ＸＢＰ−１−／−細胞をストレス誘発性の死から保護するために必要であるということを示している。理論に拘束されることを望むわけではないが、ＰＩは、ＵＰＲを妨害することによって、骨髄腫細胞、形質細胞の悪性のパートナーのアポトーシスを、引き起こすかもしれない。機能的にＸＢＰ−１が欠損している骨髄腫細胞において認められる、完全ではないが部分的なアポトーシスからの保護が、残存するＸＢＰ−１に部分的に起因するかもしれないとき、ＰＩは、アポトーシスに影響を及ぼす他の細胞経路に作用を及ぼす（Y. Yang, et
al., Science 288, 874-7 （2000））。
【０４６７】
２つの追加的なＵＰＲシグナル伝達経路は、転写因子ＡＴＦ６の活性化、またはＰＥＲＫ／ｅＩＦ２αにより媒介される翻訳抑制に関与している。ＸＢＰ−１ａ塩基性領域ロイシンジッパー転写因子のようなＡＴＦ６は、ＥＲストレスの結果、Ｎ末端細胞質ドメインのＳ２Ｐセリンプロテアーゼによるタンパク質分解性の切断が起こり、シャペロン遺伝子の強力な転写アクチベータを作製するまで、不活性形態で構成的に発現される第２のＥＲ膜貫通成分である（ H. Yoshida,
et al., Cell 107, 881-891 （2001）;, H. Yoshida, et al. J. Biol. Chem. 273, 33741-33749 （1998）; J. Shen,et
al., Dev Cell 3, 99-111 （2002） J. Ye et al., Mol Cell 6, 1355-64 （2000）; M. Li et
al., Mol Cell Biol 20, 5096-106 （2000） Y. Wang et al., J Biol Chem 275, 27013-20. （2000）。ｄｎ−ＸＢＰ−１は、ヘテロダイマーかを経てＡＴＦ−６の機能を強く阻害した。しかしながら、ｄｎＸＢＰ−１形質導入された骨髄腫細胞の細胞死は、ｉＸＢＰ−１Ｊ５５８細胞株において観察されたものを超えることはなかった（図１３ｄ）、双方の因子がＰＩの有意な標的であったかことを予測していたとおりであった。
【０４６８】
第３のＥＲ膜貫通成分、ＩＲＥ１αなどのＰＥＫ／ＰＥＲＫは、そのルーメン的ドメインのＥＲストレス誘導性のダイマー化、自己リン酸化を受けたタイプ１の膜貫通セリン／トレオニンタンパク質キナーゼであり、その後原形質に作用して、リン酸化ｅＩＦ２αにはたらく。ｅＩＦ２αのリン酸化によって、ＥＲストレスに応答した翻訳の減衰が導かれる（ H. P.
Harding, Y. Zhang, D. Ron, Nature
397, 271-274 （1999）; Y. Shi et al., Mol. Cell. Biol. 18, 7499-7509 （1998））。ＰＥＲＫ依存性であることが示されているストレス応答性の遺伝子ＣＨＯＰの誘導（ F. Urano, A.
Bertolotti, D. Ron, J. Cell Sci. 113,
3697-3702 （2000））はＰＩによって阻害される（図１０ａ）。このことは、ＰＩもまたＰＥＲＫを標的としている可能性を示唆するものである。さらに、ＩＲＥ１のＥＲルミナールドメインとＰＥＲＫは互換可能であるが、進化を経て保存されているので、ＰＩがＩＲＥ１αおよびＰＥＲＫの活性化を阻害するメカニズムは類似している。予期したとおり、抗ＰＥＲＫ抗体を用いて評価されていたように、Ｊ５５８細胞のＴｍによる処理はリン酸化されたＰＥＲＫの量の増加（ＰＥＲＫ種の移動度における上方シフト）を導く（より最終的には、ホスホＰＥＲＫのみを認識する抗体を用いて）。顕著に、ＭＧ−１３２の導入によって、ＩＲＥ１a において観察されたものと同程度の、非常に著明なＰＥＲＫの自己リン酸化の減少が起こる（図１４）。ＩＲＥ１αの活性化を制御する因子についてわかっていることは少ない。これまでにＢｉＰおよびＴＲＡＦ２のみがＩＲＥ１αに関連するタンパク質であると報告されている（ F. Urano et al., Science 287, 664-666 （2000）; A. Bertolotti, Y. Zhang, L. M. Hendershot, H.
P. Harding, D. Ron, Nat. Cell Biol.
2, 326-332 （2000））、そして, ＰＩがＩＲＥ１αのエンドリボヌクレアーゼ機能の活性を変化させるメカニズムもわかっていない。データは、ＰＩがUPR標的遺伝子を適度に誘導することを示しており、これはこれまでの報告と矛盾しない （Bush et al.  1997.  J.
Biol. Chem  272:9086; Kawazoe
et al.  1998.  Eur.
J. Biochem  255:356）. しかしながら、ＰＩは、ストレス誘発性のＵＰＲを阻害する。ＩＲＥ−１媒介性ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡスプライシングの抑制およびＸＢＰ−１のスプライシングされていないタンパク質の安定化ならびに、ＰＥＲＫ自己リン酸化がその証拠である。同様に、ＸＢＰ−１欠損ＭＥＦｓ（マウス胚線維芽細胞）のＴｍではなくＭＧ−１３２による処理の結果、ＥＲｄｊ４の正常な誘導が生じた（ＸＢＰ−１依存性ＵＰＲ標的遺伝子）。このことは、ＭＧ−１３２とＴｍがＵＰＲ標的遺伝子を、異なるメカニズムで誘導しすることを示唆するものである。理論に拘束されることを望むわけではないが、ＰＩは、明確な転写因子（例えば、熱ショック因子）を誘導し、ひいてはサイトゾルＨｓｐｓならびにＥＲに存在するシャペロンの双方を誘導するかもしれない。ＩＲＥ１a／ＸＢＰ−１経路は、ＥＲストレスの条件下で骨髄腫細胞の生存に寄与している。 
【０４６９】
プロテアソーム阻害は、増殖性の細胞において細胞死を誘導するが、一方それは胸腺リンパ球などの分化した細胞や交感神経ニューロンにおけるアポトーシスを阻害することを多くのデータが示唆している。したがって、ＰＩは、ヒト神経膠腫細胞、ヒトＴ細胞白血病細胞およびＰＣ−１２細胞におけるアポトーシスを誘導するが、胸腺リンパ球エストプシド（estopside）誘導性のアポトーシスペプチドアルデヒドＰＩにより阻害された （Wagenknecht, B. et al.  2000.  J. Neurochem  75:2288; Kitagawa, H. et al. 1999. FEBS Lett  443:181; Stefanelli, C. 1998.  Biochem  J. 332:661）。神経膠腫細胞のアポトーシスは、膨張した（dialted）粗なＥＲと細胞質小胞および密なミトコンドリア付着物によって形態学的に特徴付けられる。興味深いことに、アポトーシスが阻害されたにもかかわらず、この組織学的な図は、広範なカスパーゼインヒビターｚＶＡＤｆｍｋによる影響を受けなかった。別の研究によれば、ＰＩ誘導性の神経膠腫細胞死は、ミトコンドリアから独立したカスパーゼ−３活性化とは関連していなかったことを証明された。本実施例は、ＰＩが、ＵＰＲを破壊する新規なメカニズムによって骨髄腫細胞のアポトーシスを誘導することを示している。ＩＲＥ１ａ／ＸＢＰ−１経路のＰＩによる封鎖は、ＥＲストレス条件下での骨髄腫細胞の死に寄与している。ＰＩがアポトーシスを誘導するメカニズムは、所与の細胞の分化、増殖、活性化、または機能の状態に依存するかもしれない。活性なＵＰＲおよびＥＲＡＤが適切なＥＲのタンパク質のプロセシングを確実に行うことを必要とする分泌細胞は、特に、ＥＲストレスを呼び起こし、しかしＵＰＲを破壊する薬剤によってアポトーシスを受けやすい。これらのデータは、ＩＲＥ１／ＸＢＰ−１の活性を標的化することによってＵＰＲを阻害する化合物は、単独、または公知の抗癌治療、もしくはＥＲストレスを誘導しおよび／もしくはＵＰＲを破壊する薬剤（例えば、プロテアソームインヒビター）、と組み合わせにおいて、例えば、多発性骨髄腫 や他の腫瘍（例えば、前立腺癌、乳癌および卵巣癌、分泌細胞が原因の癌）などの異常の治療のための強力な治療薬となるであろう。
【０４７０】
実施例１４：強力なＸＢＰ−１の強い陰性のタンパク質の生成
Ｃ末端転写活性化ドメインに種々の欠失を伴う、ウェスタン分析によれば高レベルのタンパク質ＸＢＰ−１のバージョン（例えば、スプライシングされた形態のＸＢＰ−１のＮ末端２２５、１８８もしくは１３６アミノ酸からなる）を作製した。そのタンパク質について、スプライシングされたＸＢＰ−１のトランスアクチベーション機能を阻害する能力を試験した。１８８および１３６Ｎ末端突然変異の双方は、スプライシングされたＸＢＰ−１の極めて強力なインヒビター（１：１であるとき効果的）である。ＸＢＰ−ｌｕｃ構築物を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を、２００ｎｇのスプライシングされたＸＢＰ−１を用いてトランスフェクトし、相対的なルシフェラーゼ活性は４４．５であった。２００ｎｇのＸＢＰ−Ｎ１８８は、ルシフェラーゼレベルを１．８にまで下げた。そして、２００ｎｇのＸＢＰ−Ｎ１３６は、ルシフェラーゼ活性を２．２まで下げた。
【０４７１】
実施例１５：ＸＢＰ−１によって調節される遺伝子の同定
ＤＮＡマイクロアレイ分析を用いて、ＸＢＰ−１によって調節される遺伝子を同定した。ＸＢＰ−１欠損胚に由来するＭＥＦにおけるＸＢＰ−１遺伝子の発現を、野生型におけるそれと比較した。ＵＰＲを引き起こす薬剤であるツニカマイシンの不存在下および存在下の双方における遺伝子発現を分析した。分析の結果、いくつかの異なる遺伝子が発現された。その１つは、ｍＤｊ７をコードするＤＮＡＪＢ９であった。ｍＤｊ７は、２２２アミノ酸の小さなタイプＩＩタンパク質である。ｍＤｊ７の発現は、野生型細胞（ツニカマイシンおよびＬＰＳをそれぞれ有するＭＥＦおよびＢ細胞）の治療によって誘導されたが、ＸＢＰ−１は、ＭＥＦおよびＢ細胞を壊した。ＤＮＡＪＢ９プロモーターはＸＢＰ−１によって誘導され、ｍＤｊ７を調節する際のＸＢＰ−１の機能は、ｍＤｊ７プロモーターのＸＢＰ−１による直接的なトランスアクチベーションによって説明される。さらに、スプライシングされた強い陰性のＸＢＰ−１をコードする構築物をもつ誘導可能な発現のテトラサイクリン調節型オフシステムを用いることによって、ｍＤｊ７の発現は、ＸＢＰ−１によって調節され、かつ絶対的にそれに依存することがわかった。これは、その発現がＸＢＰ−１から独立しているＤｎａＫ／Ｈｓｐ７０ファミリーの遺伝子のメンバー、例えば、ＢｉＰ／Ｇｒｐ７８やＣＨＯＰ１０とは対照的である。これらのデータは、ＸＢＰ−１に対する依存によって定義されたシャペロン遺伝子のサブユニットの分類を可能とするものである。
【０４７２】
実施例１６〜２２においては、以下の材料と方法を使用した。
【０４７３】
細胞培養と細胞株
野生型およびＸＢＰ−１−／−胚由来の２９３Ｔ細胞およびＭＥＦ細胞を、１０％ウシ胎児血清 （Hyclone Laboratories）を添加したDMEM中で培養したMEF-tet-off 細胞（Clontech）を、100μg/ml G418と１μg/mlドキシサイクリンをさらに添加して同じ培地に維持した。ＸＢＰ−１s誘導可能細胞をMEF-tet-off 細胞をTREhyg-ＸＢＰ−１sプラスミドを用いてトランスフェクトし、次いで400μg/ml のハイグロマイシン（hygromycin）Ｂの存在下で選択を行うことによって、取得した。いくつかのクローンを試験し、ドキシサイクリン依存性ＸＢＰ−１の発現について調べ、１つを選択してさらに、実験を行った。MEF-dn-XBP 細胞は、TREhyg-dn-XBP プラスミドを用いてMEF-tet-off 細胞をトランスフェクトすることによって作製した。dn-XBPは、細胞生存可能性および成長に影響を及ぼさなかったので、MEF-dn-XBP細胞をドキシサイクリンを含有しに培地に維持した。ATF6αおよびβノックダウンMEF細胞を作製した。野生型MEF細胞とU6-iATF6αおよびβcmv-ピューロマイシンコトランスフェクトすることによって、または細胞とRNAi ベクターを含有するレトロウイルスとをトランスフェクトすることによって作製した。 
【０４７４】
遺伝子チップ分析
全ＲＮＡは、ＴＲＩＺＯＬ試薬 （Invitrogen,
Carlsbad, CA）を用いてＭＥＦ細胞から単離した。ｃＤＮＡ合成、アレイのハイブリダイゼーションおよびレーザースキャンを行った。Gene Array Technology Center （Brigham and
Women's Hospital, Boston, MA）にて、UniGeneデータベース（Affymetrix, Santa Clara, CA）からの６０００の機能的に特徴のある配列と６０００のＥＳＴを有するＭＧ−Ｕ７４Ａ遺伝子チップを用いて、Affymetrixの推奨するとおりにして行った。データの分析は、Affymetrix GeneChip 3.1ソフトウェアを既定値パラメーター設定で行った。
【０４７５】
ノーザンブロット分析  
全ＲＮＡは、ＴＲＩＺＯＬ試薬を用いて調製した。１．２％アガロース上で電気泳動し、次いで６％ホルムアルデヒドゲルをGenescreen Plus膜（ＮＥＮ）に移した。３２Ｐ放射性標識されたプローブをRediPrime II labeling system （Amersham-Pharmacia）を用いて調製した。プローブ用の鋳型ＤＮＡを適切な制限酵素を用いて、ｃＤＮＡ含有プラスミド（ＸＢＰ−１、ネズミコード領域の１５−８３０）から、またはＥＳＴクローンをＡＴＣＣ（ＣＨＯＰ、ＩＭＡＧＥ：５８６３０５５；ＥＲｄｊ４、ＩＭＡＧＥ：１９２０９２７；ｐ５８ＩＰＫプローブＡ、ＩＭＡＧＥ：９００１９３５；ｐ５８ＩＰＫプローブＢ、ＩＭＡＧＥ：２６４６１４７；ＡＴＦ６α、ＩＭＡＧＥ：４５０３６５９；ＭＧＰ、ＩＭＡＧＥ：４９９０６２７；ＥＤＥＭ、ＩＭＡＧＥ：５３２４６６０；ＰＤＩ−Ｐ５、ＩＭＡＧＥ：２６４５１８３；ＲＡＭＰ４、ＩＭＡＧＥ：３４８９７３８）から切り出した。Ｇｒｐ９４およびＧｒｐ７８プローブは、R.J. Kaufman, Univ. of
Michiganから親切に提供してもらい、ＨＥＤＪプローブは、L. Hendershot, St. Jude
Children's Research Hospital, Memphisから贈られたものである。プローブハイブリダイゼーションは、Ultrahyb緩衝剤
用いて、製造元（Ambion）どおりにして行った。.
【０４７６】
プラスミド構築および一過性トランスフェクションアッセイ
４ｘＸＢＰＧＬ３を作製するために、ＸＢＰ−１結合部位5f-CGCG（TGGATGACGTGTACA）4-3'（配列番号１２）および5'-GATC（TGTACACGTCATCCA）4-3f （配列番号１３）を含有する２つの相補オリゴヌクレオチドを、Mlu IおよびBgl
II によって消化された-40-Lucプラスミド （Lee
et al. 2000. Biochem J. 350 Pt1:131-138）にアニーリングかつライゲーションした。UPREレポーターを、２つのUPREモチーフ（Roy
and Lee 1999  Nucleic Acids Res. 27:1437）を含有するアニールされたオリゴヌクレオチド、5'-cgcgtcaCCAATcggaggcctCCACGaccaCCAATcggaggcctCCACGac-3',
（配列番号１４）を-40-LucプラスミドのMlu
IとXho I部位の間にを挿入することによって構築した（Leeら、2000.
Biochem J. 350 Pt1:131-138）。UPREレポーター （5xATF6GL3）、pCGNATF6およびpCGNAF6
（1-373）についてはこれまでに記載されている（Wang
et al. 2000. J. Biol. Chem.. 275:27013）。マウスXBP-lsおよびＸＢＰ−１u/s
のpCDNA3.1 （Clontech） 駆動発現ベクターについては別に記載されている（Iwakoshi
et al. 2003.  Nature Immunology 4:321）。pCDNA-dn-XBPは、pCDNA-XBP-lsプラスミドにおけるXBP-ls
cDNAのEco RV部位の下流領域を除去することによって構築した。TREhyg-XBP-lsおよびTREhyg-dn-XBPは、XBP-ls
cDNAとDN-XBPをそれぞれTRE2hyg
（Clontech）のPvu
II部位とSal I部位の間に挿入することによって構築した。ＥＲｄｊ４プロモーターの０．５ｋｂ断片をＰＣＲにより、Ｃ５７ＢＬ６マウスゲノムＤＮＡから、下のプライマーセットを用いて増幅した。5' AGGCTTGGGCTCTAATGGCCTCTCAA-3’（配列番号１５）および5'-CTCCGAACGCCGAGTAGCCT-3'
（配列番号１６）、次いでpGL3-basic
（Promega）プラスミドのNhe
IおよびXho Iの間の位置に挿入してERdj4GL3を作製した。MEF細胞は、Lipofectamine2000
試薬を用いて製造元（Invitrogen）の推奨どおりにして、トランスフェクトを行った。簡単に述べれば、１μｇのDNAおよび３μｇのLipofectamine
2000試薬をそれぞれ100 μl OPTI-MEMで希釈し、１２ウェルプレート（各ウェルにつき６００００細胞）中で細胞に混合して希釈した。６時間後、細胞を洗浄し、新鮮な培地において１μｇ／ｍｌのＴｍを培養した。デュアルルシフェラーゼアッセイについては、５０もしくは１００ｎｇのレポーターおよび１０ｎｇのRL/cmv（Promega）プラスミドを種々の量のエフェクタープラスミドとともにコトランスフェクトした。そして、ｐＣＤＮＡ３．１を添加して合計のＤＮＡを１μｇとした。細胞をデュアルルシフェラーゼアッセイ用の能動緩衝液中に溶解した。製造元（Promega）のプロトコルにしたがった。１０ｃｍ皿に播いた２９３Ｔ細胞を５μｇの各発現プラスミドを用いて、標準的なリン酸カルシウム法によってトランスフェクトした。
【０４７７】
免疫沈降およびウェスタンブロット 分析 
トランスフェクションの４８時間後、２９３Ｔ細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、プロテアーゼインヒビターカクテルタブレット（Roche）を含有する１ｍｌの溶解緩衝液（10 mM Tris pH7.4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100,
1 mM EDTA）中に溶解した。ライセートをプロテインＡアガロービーズ（Roche）を用いて１時間プレクリアし、アガロース結合抗ＨＡ抗体（Santa Cruz）とともに一晩インキュベートした。そのアガロースビーズを溶解緩緩衝液で５回洗浄し、SDS-PAGE サンプル緩衝剤中に懸濁した。ＭＥＦ細胞を、ＲＩＰＡ緩衝剤 （50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100,
1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS）中に溶解した。ライセートおよび免疫沈澱をSDS-PAGEにかけ、Hybond P膜（Amersham-Pharmacia）に移した。ブロットは、抗ＸＢＰ−１（Santa Cruz）、抗ＡＴＦ６βまたは抗ＡＴＦ６α（Dr. K. Mori, Kyoto University, Japanから贈られた） 抗体によって標準的な手法によって明らかにされた。
【０４７８】
ATF6αおよびATF6βのノックダウン
pBS/U6 プラスミドを用いた （Sui et al. 2002.  Proc.
Natl. Acad Sci USA 99:5515）。２つの相補オリゴヌクレオチドを、pBS/U6の平滑末端化されたApa IおよびEco RI部位の間にアニーリングして挿入し、U6-iATF6ocを作製した;
5'-GGCAGTGTCGCCTGGTGTTGaagcttCAACACCAGGCGACACTGCCCtttttg-3’
（配列番号１７）
5’-aattcaaaaaGGGCAGTGTCGCCTGGTGTTGaagcttCAACACCAGGCGACACTGCC-3’
（配列番号１８）。同様に、ATF6β特異的RNAiベクターを、
5'-GGGTGGCAGAAGTCAGTTTATG
-3’（配列番号１９）の２つの相補オリゴヌクレオチドをpBS/U6 ベクター挿入することによって構築した。ＲＮＡｉのためのSGFΔU3シャトルレトロウイルスベクターを作製するために、ポリリンカー（PmlI, SalI, BamHI and MluI）を、SFG tcLucECT3（Lindemann et al. 1997.  Mol.
Med. 3:466）のPmlI部位とBamHI部位の間に挿入した。ハイグロマイシン耐性遺伝子およびピューロマイシン耐性遺伝子の発現カセットをpMCSVシリーズベクター（Invitrogen）からPCR によって増幅し、SGFΔU3のBamHIとMlul部位の間に挿入し、SGFΔU3hygおよびSGFΔU3purをそれぞれ作製した。最後に、U6 プロモーターiATFカセットを、pBS/U6駆動ベクターから、SmaIおよびBamHI消化によって切り出し、次いで、SGFΔU3hygまたはSGFΔU3purのPmllとBamHIの間の部位に挿入し、種々の薬物選択マーカーを有するiATF6αまたはiATF6βのレトロウイルスベクターを作製した。レトロウイルスの上清を調製し、ＭＥＦ細胞を既に記載したように（Iwakoshi et al. 2003）形質導入するために用いた。２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢもしくは２μｇ／ｍｌのピューロマイシンの存在下で細胞を１週間より長く培養することによって、未感染の細胞を除去した。
【０４７９】
実施例１６：公知のおよび新規なＵＰＲ遺伝子のＤＮＡマイクロアレイ分析による同定 
酵母におけるゲノム全体にわたる分析を行ったところ、ＥＲに存在するシャペロンの遺伝子およびリン脂質合成に関与する遺伝子のサブユニット、ならびにタンパク質分解経路がＵＰＲから誘導されることがが明らかになった（Travers,
K.J., et al. 2000. Cell 101: 249-258）。しかしながら、哺乳動物細胞において知られているＵＰＲ標的遺伝子は、非常に数少ない。ＸＢＰ−１、ＡＴＦ６αおよびＡＴＦ６βによって区別して調節される哺乳動物ＵＰＲ標的遺伝子を同定するために、オリゴヌクレオチドベースの遺伝子アレイ分析を、未処理もしくはツニカマイシン（Ｔｍ）で６時間処理されたＭＥＦ細胞からのＲＮＡ上で使用した。分析した全１２０００の遺伝子プールの〜２．８％において発現が、Ｔｍ治療によって増加した。間違った陽性遺伝子を除去するために、Ｔｍ誘導性遺伝子を、Tm処理によって値が増加したオリゴヌクレオチドプローブ対の比率によって分類し、０．８を超える値であった遺伝子を表１に示した。予期したとおり、ＣＨＯＰ、ＧＡＤＤ４５、Ｈｅｒｐ、ＢｉＰおよびＸＢＰ−１を含む、少数の公知のＵＰＲ標的遺伝子が、Ｔｍ処理におって有意に誘導された。折り畳みの誘導は、４〜２７であった。興味深いことに、Ｔｍ処理は、ＣＨＯＰ、ＬＲＧ−２１、ＸＢＰ−１、ＮＦ−ＩＬ３／Ｅ４ＢＰ４およびＡＴＦ−４（ロイシンジッパーモチーフを持つ）を含むいくつかの転写因子の発現を誘導した。ロイシンジッパーモチーフを含有する転写因子がホモダイマー化およびヘテロダイマー化する能力がわかれば、これらのタンパク質の間の可能な相互作用を試験することが興味深いものとなろう。
【０４８０】
実施例１７：ＥＲストレスを受けたとき、ＥＲｄｊ４およびｐ５８ｉｐｋＤｎａＪ／Ｈｓｐ４０様アクセサリー遺伝子の誘導はＸＢＰ−１を誘導する
標的遺伝子の発現におけるＸＢＰ-１の要件を調べるために、ＭＥＦ細胞をＸＢＰ−１欠損マウスから作製した（ Reimold,
A.M., et al.. 2000. Genes Dev. 14:
152-157）。ｗｔＭＥＦを、既に証明したように、プロテアソームインヒビターＭＧ−１３２またはＴｍで処理して、ＸＢＰ−１ｕおよびＸＢＰ−１ｓタンパク質の両方を、タンパク質の安定化およびｍＲＮＡスプライシングのそれぞれを介して誘導した（図１５Ｂ）（ Yoshida, H.,
et al. 2001a. Cell 107: 881-891）。対照的に、予期したとおり、ｎｅｏカセットに由来する多ステップコドンのために、ＸＢＰ−１タンパク質種はＸＢＰ−１−／−ＭＥＦ細胞中に作製された（図１１Ａ、Ｃ）。ＸＢＰ−１依存性ＵＰＲ標的遺伝子の発現を、未処理もしくはＴｍ処理したＸＢＰ−１欠損ＭＥＦ細胞からのＲＮＡを用いた遺伝子アレイ分析によって、調査した。ＢｉＰもＣＨＯＰも発現せず、原型のＥＲストレスシャペロン遺伝子は、ＩＲＥ１αの損失による影響を受けたこと、そしてこれらのシャペロン遺伝子が他のＵＰＲ経路によって調節された可能性があるということは既に示されている（ Urano, F.,
Bertolotti, A., and Ron, D. 2000a. J.
Cell Sci. 113: 3697-3702; Lee, K., et al., 2002. Genes Dev. 16: 452-466.） 。驚くべきことではないが、したがって、野生型ＭＥＦ細胞中において同定されたプロトタイプのＵＰＲ標的遺伝子の大半は、ＸＢＰ−１−／−ＭＥＦ細胞中に正常に誘導され、ＸＢＰ−１に依存しない更なるＵＰＲシグナル伝達経路の存在を引き起こした（表１）。
【０４８１】
対照的に、いくつかの公知かつ新規なＵＰＲ標的遺伝子が同定された。それは、ＸＢＰ−１ナルＭＥＦ中において、Ｔｍによって誘導されることができなかったものである。遺伝子アレイのアーチファクトを最小にするために、ＲＮＡレベルを、Ｔｍ処理された野生型とＸＢＰ−１−／−ＭＥＦ細胞との間で比較した。この分析、ノーザンブロット法により証明された分析では、２つのＵＰＲ標的遺伝子、ＥＲｄｊ４およびｐ５８ｉｐｋは、ＸＢＰ−１−／−ＭＥＦ細胞において全く誘導されなかった（図１６Ａ）。ＸＢＰ−１が存在しない場合、実験の時間の経過とともに、ＢｉＰおよびＣＨＯＰ発現が受けた損傷はわずかに過ぎなかった（図１６Ａ）。.  
【０４８２】
遺伝子アレイ分析は、ＭＧＰ ｍＲＮＡ、動脈や軟骨のカルシウム沈着のインヒビター（Luo et al. 1997.  Nature
386:78）は、ｗｔにおいてはＴｍ誘導性であり、ＸＢＰ−１−／−ＭＥＦ細胞においてはそうではないことを示唆した。しかしながら、興味深いことに、ノーザンブロット分析によって、ＭＧＰ ｍＲＮＡはＥＲストレスを受けると大幅に減少した。このことは、マイクロアレイデータが正しくなかったことを示している（図１６Ａ）。対照的に、ＥＲｄｊ４およびｐ５８ＩＰＫ発現は、ＸＢＰ−１−／−細胞において殆ど完全に破棄された（図１６Ａ）。ｐ５８ＩＰＫには、転写物が〜６．５、３．３および１．７ｋｂの３つのアイソフォームがあり（Korth et al. 1996.  Gene
170:181）、遺伝子５'領域（図１６Ａ）および３'領域にそれぞれ特異的なプローブＢおよびＡを用いて評価されたように、その全てはＸＢＰ−１依存性である。ＥＳＴ「ウォーキング」分析によって確認されたように、ＥＳＴクローンＡＩ６０４０１３は、ｐ５８ＩＰＫｍＲＮＡの６．５ｋｂ種の３’末端を表していた。プローブＡは、６．５ｋｂ種だけを認識し、プローブＢは、ｐ５８ＩＰＫｍＲＮＡの３つすべてにハイブリダイズした。このことは、〜６．５ｋｂ種は、５’末端を他のmRNA種と共有していることを示すものである。
【０４８３】
ＥＲｄｊ４およびｐ５８ＩＰＫ遺伝子をＸＢＰ−１の下流に配置されているということは、ＭＥＦｓ欠損ＩＲＥ１αにおけるそれらの発現を調べることによりさらに確立された（図１６Ｃ）。ＸＢＰ−１がＥＲｄｊ４発現の調節に及ぼす深遠な作用と一致して、本発明の所見は、ルシフェラーゼレポーターに融合した０．５ｋｂのＥＲｄｊ４プロモーター配列を含有する構築物は、Ｔｍによって、ならびにコトランスフェクトされたＸＢＰ−１ｓによって誘導されたことを示した（図１６Ｄ）。さらに、ＥＲｄｊ４プロモーターは、ＸＢＰ−１−／−細胞においてＴｍによって誘導されなかったが、コトランスフェクトされたＸＢＰ−１ｓによってトランスアクチベーションされた。ＥＲｄｊ４およびｐ５８ＩＰＫ発現のＸＢＰ−１への依存は、一次Ｂ細胞においても試験した。そこでは、ＸＢＰ−１の転写およびＸＢＰ-１ｓへの転写後スプライシングが、Ｂ細胞の形質細胞への最終分化の間に誘導される。ＸＢＰ-１を欠損するリンパ性キメラは、形質細胞区画を生成することができないので、このことは、機能的に重要である。ＥＲｄｊ４およびｐ５８ｉｐｋは、ＬＰＳの刺激性野生型培養物中では誘導されたが、ＸＢＰ−１欠損Ｂ細胞中では誘導されなかった。対照的に、ＢｉＰは、野生型およびＸＢＰ−１欠損Ｂ細胞において誘導されたが、にもかかわらず、ＸＢＰ−１が不存在の場合、その発現はわずかであった。ＸＢＰ−１転写物を突然変異ＭＥＦにおいても調べた。このことは、破壊されたＸＢＰ−１遺伝子が転写物（０．４ｋｂ長く、ネオマイシン遺伝子とｎｅｏカセット中の隠れたスプライスドナー部位の間における二者択一的なスプライシング事象から生じるＸＢＰ−１配列からなり、エクソン１，２とエクソン３のスプライシングアクセプター部位の間に挿入されている）を作出するため可能であった（図１５Ａおよび１５Ｃ）。ＸＢＰ−１ｍＲＮＡは、野生型およびＸＢＰ−１欠損ＭＥＦ細胞中にＴｍ処理によって誘導され（図１５Ｂ、１６Ａ）、ＩＲＥ−１α欠損細胞について報告されていたものと類似していた（ Urano, F., et al.
2000a. J. Cell Sci. 113: 3697-3702;
Urano, F., et al. 2000b.  Science 287: 664-666）。ＡＴＦ６αはまた、Ｔｍによって、これらのネズミＭＥＦにおいて、適度に誘導された。ヒトHeLa細胞において観察されたものとは対照的であった（Yoshida, H., et al.
1998. J. Biol. Chem. 273: 33741-33749）。しかしながら、ＸＢＰ−１およびＡＴＦ６αの双方の折り畳み誘導は、ＸＢＰ−１が存在しない場合、わずかに減少した（図１５Ｂおよび１６Ａ）。突然変異転写物が異常に調節されることが可能であるにもかかわらず、これらの結果は、ある程度のＸＢＰ−１の自己調節、ならびにＡＴＦ６αの交差調節を示すものである（図１５Ｂ、１６Ａ）。
【０４８４】
これらの実験は、公知かつ新規なＵＰＲ標的遺伝子を同定し、ＸＢＰ−１がそれらの中のいくつかのみを発現するのに必須であり、それは、DnaJ様アクセサリータンパク質、ＥＲｄｊ４およびｐ５８ｉｐｋを含むことを示している。他の公知のＵＰＲ標的遺伝子、ＢｉＰ、ＡＴＦ６αおよびそれ自身の発現を調節する際には、適度の効果を有しており、他のＵＰＲ遺伝子にはなんら効果を有してない（ＣＨＯＰ、ＭＧＰ）。
【０４８５】
実施例１８：ＸＢＰ−１により誘導される遺伝子の誘導
ＸＢＰ−１欠損ＭＥＦ細胞のいくつかのＵＰＲ標的遺伝子の、わずかに変化した発現は、ＸＢＰ−１がそれらの発現に有意に関与していないこと、あるいは、ＸＢＰ−１を完全に補う他の転写因子が存在すること、のいずれかを示す。ＸＢＰ−１自身がこれらのＵＰＲ標的遺伝子を誘導するのに十分ではないことを調べるために、ｔｅｔ−ｏｆｆ系を用いて、スプライシングされた形態のＸＢＰ−１であるＸＢＰ−１ｓがテトラサイクリン依存性プロモーターの下流に位置している細胞株を確立した。ＸＢＰ−１ｓは、培養培地中においてドキシサイクリンを３日間除去することによって、誘導された。外因性ＸＢＰ−１ｓの発現レベルと内因性ＸＢＰ−１ｓのそれとを、Ｔｍで処理された親ＭＥＦ細胞中で比較することが可能であった（図１７Ａ）。ＸＢＰ−１ｓによって誘導された遺伝子を同定するために、全ＲＮＡをドキシサイクリンの存在下または不存在下で培養されたＭＥＦ−ｔｅｔ−ｏｆｆ−ＸＢＰ−１ｓ細胞から調製した。そして遺伝子アレイ分析を行った（表１）。ＸＢＰ−１−／−細胞からの結果に一致して、ＸＢＰ−１ｓのみがＥＲｄｊ４およびｐ５８ｉｐｋの発現を十分に誘導した。さらに、分析されたＵＰＲ標的遺伝子のプール全体の〜２３％がＸＢＰ−１ｓによって誘導されたので、その折り畳み誘導は、Ｔｍ処理された場合に比べて低い。これらのＵＰＲ遺伝子は、Ｈｅｒｐ、ＢｉＰ、Ａｒｅｍｔ、ＡＷ１２４０４９ＥＳＴおよびインターフェロンβを誘導した。対照的に、ＣＨＯＰを含むいくつかのＵＰＲ標的遺伝子は、ＸＢＰ−１ｓによって有意に誘導されなかった。このことは、ＸＢＰ−１ｓがそれらの誘導に関与しなかったか、あるいは十分には関与しなかったかのいずれかであることを示唆するものである。ＢｉＰ、ＣＨＯＰ、ＥＲｄｊ４およびｐ５８ｉｐｋの発現をノーザンブロット分析によって確認した（図１７Ａ）。ＸＢＰ−１ｓの過剰発現によるＥＲｄｊ４およびｐ５８ｉｐｋの誘導は、Ｔｍ処理を経て達成されたものと比較可能であった。一方、ＢｉＰは、ＸＢＰ−１ｓによってわずかに誘導された。ＡＴＦ６α（ＸＢＰ−１の下流に位置する）もまた、ＸＢＰ−１ｓによって誘導された（ノーザンブロット分析による）。
【０４８６】
さらに、いくつかのさらなるＸＢＰ−１標的遺伝子、ＥＤＥＭ、プロテインジスルフィドイソメラーゼ関連タンパク質Ｐ５（ＰＤＩ−Ｐ５、ＲＡＭＰ４、ＨＥＤＪが、ＸＢＰ−ｌｓによる誘導率の基準を用いてソートすることによって同定された（表２）。顕著に、それらの発現は、ｗｔにおけるＴｍにおいて誘導され、ＸＢＰ−１−／−ＭＥＦにおいては誘導されなかった。これによってＸＢＰ−１依存性が確認された。ＥＤＥＭのＸＢＰ−１依存性発現は、誘導がＭＥＦ欠損ＩＲＥ１αでは起こらなかったという近年の所見に一致している（Yoshida, H., et al. Dev
Cell 4: 265-271） （図１７Ｂ）。マイクロアレイ分析において同定された、２つの他の遺伝子、ｍｇａｔ−２およびＢＲ１４０様タンパク質は、ノーザンブロットでは確認されなかった。まとめると、これらの結果は、ＸＢＰ−１がいくつかのＵＰＲ  標的遺伝子の調節に必須であることを示唆している。ＥＲｄｊ４、ｐ５８ＩＰＫ、ＥＤＥＭ、ＰＤＩ−Ｐ５、ＲＡＭＰ４およびＨＥＤＪは、適度にＵＰＲ遺伝子の調節に関与しており（ＢｉＰ、ＸＢＰ−１、ＡＴＦ６α）、ＵＰＲ標的遺伝子の別のサブセットの発現には全く必要とされない。調節におけるＸＢＰ−１の重要な機能と一致して、ＵＰＲ標的遺伝子は、ＴｍがＸＢＰ−１−／−ＭＥＦＳにおいて、ＵＰＲＥまたはＥＲＳＥルシフェラーゼレポーターのいずれかの活性の誘導に失敗したものである（下記参照、図１８Ｂ）。
【０４８７】
実施例１９：ＡＴＦ６αおよびＡＴＦ６βの単一および二重に欠損した細胞におけるＵＰＲ遺伝子発現
ＥＲ膜貫通転写因子ＡＴＦ６αは、ＥＲストレスが起こると、タンパク質分解性処理されて、その活性なＮ末端領域を、核輸送のために放出している。また、ＢｉＰやＣＨＯＰを含むＵＰＲ標的遺伝子のサブセットを自主的に誘導することがこれまでに報告されている（ Yoshida, H.,
et al. J. Biol. Chem. 273:
33741-33749; Okada, T., et al. Biochem J
366: 585-594）。標的化されたＡＴＦ６α遺伝子の欠失をもつマウスを入手することはできない。ＵＰＲのＡＴＦ６aにおける要件をより直接的に評価するために、したがって、その発現を、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ駆動ｓｉＲＮＡ発現プラスミドを用いて、ＭＥＦ細胞において「ノックダウン」とした。ＡＴＦ６α特異的ｓｉＲＮＡベクターと、多量体化されたＡＴＦ６標的部位ルシフェラーゼレポーター（５ｘＡＴＦ６ＧＬ３）とをコトランスフェクションした結果、ＡＴＦ６駆動性ルシフェラーゼ発現およびＴｍが引き起こすルシフェラーゼ発現の双方を抑制した、これは、ＡＴＦ６α ｍＲＮＡがｓｉＲＮＡベクターによって適切に標的化されたことを示唆するものである。したがって、ＭＥＦ細胞は、ＡＴＦ６α ｓｉＲＮＡベクターと特異的に安定にトランスフェクトされ、ＡＴＦ６a発現が減少した細胞株が作製される（ｉＡＴＦ６α）。ＡＴＦ６α発現の抑制は、ノーザン法（図示せず）およびウェスタンブロット分析（図１８Ａ）の双方によって確認された。既に報告されているように、野生型ＭＥＦは３つの種（８、４．５および２．５ｋｂ）のＡＴＦ６α ｍＲＮＡを発現した（Zhu, C., et al.  Mol Cell Biol 17:
4957-4966）。そしてＡＴＦ６α ｍＲＮＡレベルは、ノックダウン細胞において著明に減少した。予期されたとおり、親野生型ＭＥＦ株、ＡＴＦ６αタンパク質は、ＥＲ耐性の９０ｋＤａ前駆物質として合成され、Ｓ２Ｐプロテアーゼによって切断され、ＥＲストレスのもとで、５０ｋＤａの活性な形態が作製される（図１８Ａ）。対照的に、Ｔｍ処理の不存在下でも存在下でも、ＡＴＦ６αタンパク質ノックダウン細胞では検出されなかった（図１８Ａ、Ｂ）。ＸＢＰ−１ｓおよびＡＴＦ６β転写物（図示せず）およびタンパク質（図１８Ａ、Ｂ）のレベルは、ｉＡＴＦ６α  ＭＥＦにおいては変わらなかった。この後の点は、ＸＢＰ−１がＡＴＦ６αの下流にはない（以前には示唆されていなかった）ということを示唆しているゆえに興味深い（ Yoshida, H.,
et al. Mol Cell Biol 20: 6755-6767;
Yoshida, H., et al. Cell 107: 881-891）。一過性トランスフェクションアッセイによって、ＵＰＲＥ（５ｘＡＴＦ６ＧＬ３）レポーターもＥＲＳＥレポーターもｉＡＴＦ６α  ＭＥＦｓにおいては、Ｔｍ処理によって全く誘導されなかった（図１５Ｂ）。この細胞株は、ＡＴＦ６αが存在しないときの機能に一致した挙動を示した。
【０４８８】
次いで、これらの細胞株からのＲＮＡについて遺伝子アレイ分析を行い、その発現がＡＴＦ６αに依存しているＵＰＲ標的遺伝子を同定した。驚くべきことに、Ｔｍ処理によるほとんど全てのＵＰＲ標的遺伝子の誘導は、ＡＴＦ６α 枯渇によって大きく影響を受けることはなかった（表３）。ノーザンブロット分析において、ＢｉＰ、ＣＨＯＰ、ＥＲｄｊ４およびｐ５８ｉｐｋ転写物は、ｉＡＴＦ６α ＭＥＦにおいて適度に減少した。これは遺伝子アレイ分析と一致していた（図１８Ｃ）。これらの結果は、ＡＴＦ６αがＵＰＲ遺伝子の調節に最小限度しか関与しなかったこと、あるいは、機能的冗長が存在することのいずれかを示している。もし後者の説明が正しいとすれば、ＡＴＦ６βまたはＸＢＰ−１のいずれかがその損失を補い得ることが１つの可能性である。
【０４８９】
最近記載されたＡＴＦ６β遺伝子（ＡＴＦ６αとヘテロダイマー化する）（Haze, K., et
al. Biochem J 355: 19-28）は、ＡＴＦ６αと構造的に密接に関連しており、膜貫通ＥＲタンパク質でもある。ストレスにより活性化されると、それは、活性な、溶解性の形態になる。それは、核に転位し、内因性ＢｉＰ発現と５ＸＡＦ６ＧＬ３レポーターをトランスアクチベートする。上記方法は、ｗｔＭＥＦならびにＡＴＦ６βにおける発現を「ノックダウン」するために使用され、単一に、または二重に欠損している細胞株を生成した。ノーザンおよびウェスタン（図１８Ａ、右のパネル）ブロット分析によって、双方の細胞株のＡＴＦ６β ｍＲＮＡレベルが非常に減少したことが明らかになった。驚くべきことに、ＵＰＲ標的遺伝子ＢｉＰ、ＣＨＯＰ、およびＧｒｐ９４の誘導は、ノーザンブロット分析によって評価されているように、単一ＡＴＦ６βだけでなく二重ＡＴＦ６α／βノックダウン細胞においても正常であった（図１８Ｃ）。これは、ＵＰＲＥおよびＥＲＳＥレポーターの、ｉＡＴＦ６β ＭＥＦのＴｍ処理の場合の正常な誘導と一致している（図１８Ｂ）。したがって、この系においては、ＵＰＲ標的遺伝子誘導にとってＡＴＦαもβも必要とされない。ｉＡＴＦαおよび二重ｉＡＴＦα／βレポーターにおいてＴｍに反応するＵＰＲＥおよびＥＲＳＥレポーターの活性の損傷（図１８Ｂ）は、しかしながら、ＡＴＦ６によって調節される、更なるＵＰＲ標的遺伝子の存在を示唆している。
【０４９０】
実施例２０：ＸＢＰ−１およびＡＴＦ６αの双方が欠損しているＭＥＦとＸＢＰ−１が欠損しているＭＥＦにおけるＵＰＲ標的遺伝子の発現は非常によく似ている
ＸＢＰ−１とＡＴＦ６αの間に機能的冗長が存在するかどうかを調べた。ウェスタンブロット分析が示すように、ＸＢＰ−１−／−ＭＥＦを、ＡＴＦ６α ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ駆動ｓｉＲＮＡ発現プラスミドを用いて形質導入し、ＸＢＰ−１とＡＴＦ６αが二重に欠損するＭＥＦを作製した（図１９Ａ）．Ｔｍの存在下または不存在下で、ＭＥＦ細胞株から、採集したＲＮＡに関する遺伝子アレイとノーザンブロット分析によって、UPR標的遺伝子の大半の誘導が、ＸＢＰ−１とＡＴＦ６αの両方が存在しないとき、依然としてわずかに減少したことが明らかになった（図１９Ｂ）。しかしながら、Ｔｍによる、ＢｉｐおよびＧｒｐ９４の誘導がＸＢＰ−１またはＡＴＦ６αのいずれかが単一に欠損しているＭＥＦにおいて、わずかだけ減少していたが、二重に欠損したＭＥＦにおいては有意に抑制されていた（図２０Ｂ）。これらの実験には、２つの重要な点がある。第１に、現在公知のシグナル伝達経路のいずれも、プロトタイプのストレス反応遺伝子のいくつかの誘導、最も特に、ＣＨＯＰおよびＧＡＤＤ４５における誘導を説明することができない。第２にＢｉｐおよびＧｒｐ９４は、その発現がＡＴＦ６αまたはＸＢＰ−１のいずれかを必要としているのであって、両方を必要としているのではないシャペロンの例である。これらの二重に欠損した細胞株は、ＵＰＲの間の標的遺伝子の誘導を制御することができる更なる新規なファクターを探すのには、貴重な試薬である。
【０４９１】
実施例２１：ＸＢＰ−１とＡＴＦ６αの相互作用
ＸＢＰ−１およびＡＴＦ６αは、両方ともＵＰＲの機能に関与してきた。他においても示されてきたところであるが、ＡＴＦ６は、ＵＰＲ標的遺伝子のサブセットの誘導に関与している （ Zhu, C.,
Johansen, F.E., and Prywes, R. 1997. Mol
Cell Biol 17: 4957-4966; Ye, J.,
et al.. Mol Cell 6: 1355-1364; Yoshida, H., et al. 2000. Mol Cell Biol 20:
6755-6767; Yoshida, H., et al. 2001a. Cell
107: 881-891）。そのデータについては、本実施例では具体的に述べていない。
【０４９２】
転写因子の塩基性領域ロイシンジッパーファミリーの他のメンバーは、c-Jun/c-Fos、c-Jun/ATF2対によって特徴付けられているように、ホモダイマーおよびヘテロダイマーを形成する（Sassone-Corsi,
P.,et al. 1988. Nature 336: 692-695;
Ivashkiv, L.B., et al.. Mol. Cell. Biol.
10: 1609-1621）。ＸＢＰ−１とＡＴＦ６αタンパク質が相互作用する能力を調べた。この能力を調べるために、過剰発現したＨＡ−標識ＡＴＦ６α（１−３７３）と２９３−Ｔ細胞中のＸＢＰ−１ｓを用いて共免疫沈降実験を行った。抗ＨＡ抗体との免疫沈降の結果、抗ＸＢＰ−１抗体を免疫ブロッティングすることによって検出されたように、ＸＢＰ−１ｓの共免疫沈降が生じた（図２０Ｃ）。ＸＢＰ−１とＡＴＦ６αの双方と共免疫沈降する（図２０Ｃ）、強い陰性バージョンのＸＢＰ−１（図２１）もまた生成された。ＸＢＰ−１ｓのＮ末端は、ＡＴＦ６α（１−３７３）と十分相互作用した。このことは、それらの相互作用が予期したように、ロイシンジッパードメインを介して起こったことを示すものである。ＡＴＦ６α／ＡＴＦ６βヘテロダイマー化と同様、タンパク質のレベルが非常に低いことと同様に、内因性ＸＢＰ−１とＡＴＦ６αとの関連性は証明されなかった。しかしながら、ヘテロダイマー形成の機能的証拠は、ＸＢＰ−１ｓとＡＴＦ６α（１−３７３）の過剰発現から得られた。これによって、一過性コトランスフェクション実験において、適度に相乗的なＵＰＲＥレポーターのトランスアクチベーションが起こった。これは、ホモダイマー複合体と比較して、ヘテロダイマーにおける、より強いトランスアクチベーションの可能性と一致していた（図２０Ｄ）。一過性トランスアクチベーションアッセイの結果はもちろん、内因性の遺伝子発現を調べる研究の状況において解釈されなければならない。したがって、ＸＢＰ−１およびＡＴＦ６αは同様に、機能的に関連するヘテロダイマーを作製する。
【０４９３】
実施例２２：強い陰性ＸＢＰ−１はＵＰＲ遺伝子誘導を抑制する
ＸＢＰ−１ｓタンパク質のＮ末端半分（ａａ１〜１８８）は、トランスアクチベーションドメインを欠いているが、ＤＮＡ結合とダイマーかに必須のロイシンジッパーモチーフは維持している（図２０Ｃ）ので、それは、ＸＢＰ−１およびＡＴＦ６αのみならず、それらに関連する推定上の因子をも阻害するであろう強い陰性として機能し得る。
【０４９４】
この突然変異の機能をレポーターアッセイにおいて調べたところ、ｄｎ−ＸＢＰは、ＸＢＰ−１ｓによるＵＰＲＥレポーターのトランスアクチベーションを完全に破棄していた（図２１Ａ）。同様に、ｄｎ−ＸＢＰは、ＡＴＦ６αによるＵＰＲＥレポーターのトランスアクチベーションを阻害していた。このことは、ｄｎ−ＸＢＰは、ＸＢＰ−１とＡＴＦ６αの双方とダイマー化することを示すものである。ｄｎ−ＸＢＰを過剰発現する安定な細胞株を作製し、ＸＢＰ−１とＡＴＦ６αの双方の機能を阻害した。そしてそれが内因性ＵＰＲ標的遺伝子の発現に及ぼす効果を調べた。ｄｎ−ＸＢＰは、ＸＢＰ−１の標的遺伝子、ＥＲｄｊ４およびｐ５８ｉｐｋの誘導を有意に抑制した（図２１Ｂ）が、それは、ＸＢＰ−１およびＡＴＦ６αの活性を完全には阻害しなかった。それは、ＸＢＰ−１−／−ＭＥＦとは逆に、ｄｎ−ＸＢＰにおいては、残留するＥＲｄｊ４およびｐ５８ｉｐｋによって証明されている。興味深いことに、それはまた、ＣＨＯＰの誘導も抑制した（図２１Ｂ）。ＣＨＯＰの誘導が、ＸＢＰ−１またはＡＴＦ６αもしくはβの損失の影響を単一にも、二重にも、有意に影響を受けるものではなかったことを考慮すると、ＣＨＯＰ誘導は、ｄｎ−ＸＢＰと関連する別のロイシンジッパー転写因子を必要とする。
【０４９５】
ＵＰＲは、新たに合成されたペプチドの小胞体膜への効率的な転位およびそれに続く折り畳み、成熟、輸送を、シャペロン遺伝子の発現を活性化することによって確実にする。ＵＰＲを制御するシグナリング系のうちの２つは、ＩＲＥ１／ＸＢＰ−１経路とＡＴＦ６α経路である。塩基性領域ロイシンジッパークラスの転写因子の２つのメンバーである、ＸＢＰ−１とＡＴＦ６との関係については、明らかになっていない。このことは一部には、酵母とは対照的に、非常に少数の哺乳動物シャペロン遺伝子しか同定されていないからであった。ＤＮＡマイクロアレイ分析を用いて、ＸＢＰ−１やＡＴＦ６α／βによって調節される遺伝子を探した。ＸＢＰ−１欠損胚に由来するＭＥＦの遺伝子発現を、ＵＰＲを引き起こす物質であるＴｍの存在下または不存在下において、野生型ＭＥＦのそれと比較した。この分析の結果、いくつかのＸＢＰ−１依存型遺伝子が算出された。その２つがＤｎａＪ／ＨＳＰ４０様アクセサリー遺伝子ファミリーのメンバーの、ｐ５８ｉｐｋおよびＥＲｄｊ４であった。しかしながら、ＤｎａＫ／Ｈｓｐ７０ファミリーの遺伝子（ＢｉＰ／Ｇｒｐ７８、ＣＨＯＰなど）の発現は、わずかにＸＢＰ−１に依存しているに過ぎなかった。
【０４９６】
いくつかのＸＢＰ−１標的遺伝子を同定することができた。分析されたＵＰＲ標的遺伝子で、ＡＴＦ６α、ＡＴＦ６βあるいはその両方の損失により有意に影響されたものはなかった。ＡＴＦ６α依存型ＵＰＲ標的遺伝子は発見されなかったにもかかわらず、ＵＰＲＥやＥＲＳＥレポーターの活性は、ＡＴＦ６αノックダウン細胞において、完全に欠如するか、または有意に抑制された。さらに、ＡＴＦ６α（１−３７３）は、ＢｉＰやＣＨＯＰを含むいくつかのＵＰＲ標的遺伝子の誘導にとって十分であったことが示された（Okada et al. 2002
Biochem J 366: 585-594）。したがって、ＡＴＦ６αの活性は、類似のＤＮＡ結合特異性を有するＸＢＰ−１などの他のＵＰＲ転写因子によって完全に補われ得る。ｐ５８ＩＰＫ、ＥＲｄｊ４およびＨＥＤＪのＸＢＰ−１依存型誘導は、ＵＰＲにおけるＸＢＰ−１の重要な役割が、ＥＲに存在するＨｓｐＴＯタンパク質を活性化する、いくつかの共シャペロンの発現を制御することであることを示唆している。ＸＢＰ−１が欠如したマウスは、肝臓の形成不全により子宮内で死亡する（Reimold et al. 2000 Genes
Dev. 14: 152-157）。一方、リンパ系のＸＢＰ−１が欠如したマウスは、形質細胞、ひいては抗体を形成することができない（Reimold et al. 1996 J. Exp.
Med. 183: 393-401; Reimold et al. 2001 Nature 412: 300-307）。発現にさいして、ＥＲｄｊ４およびｐ５８ＩＰＫ、ＥＤＥＭ、Ｒａｍｐ４、ＰＤＩ−Ｐ５ならびにＨＥＤＪを含む遺伝子の、ＸＢＰ−１に対する絶対的な依存は、それらが形質細胞のＵＲＥにおいて重要な機能を持つことを示すものである。
【０４９７】
さらに、ＡＴＦ６αは、ＸＢＰ−１の下流に位置している。ＥＲストレスによるマウスＡＴＦ６αｍＲＮＡの誘導は、ＸＢＰ−１が存在しないとき、部分的に軽くなったからである。しかしながら、ＸＢＰ−１によるＡＴＦ６αの誘導が、適度であれば、そして、ＡＴＦ６αが翻訳後メカニズムによって主に調節されるのであれば、これらの２つの因子は、平行な経路の状態で存在することも大いにあるかもしれない。
【０４９８】
等価物
当業者であれば、ごく通常の実験を用いるのみで、ここに説明した本発明の特定の実施例の等価物を数多く認識し、または確認できることであろう。このような等価物は、上述の請求の範囲の包含するところである。
【図面の簡単な説明】
【０４９９】
【図１】図１は、未処理のＢ細胞中でのＩＬ−４によるＸＢＰ−１ ｍＲＮＡの誘導を示す。
【図２】図２は、形質細胞分化中のＸＢＰ−１ ｍＲＮＡの転写活性化とＩＲＥ−１媒介性のスプライシングを示す。
【図３】図３は、ＸＢＰ−１のスプライシングおよびＢＣＬ−１最終分化におけるＵＰＲ誘導を示す。
【図４】図４は、スプライシングされた形態のＸＢＰ−１の異所性発現が、刺激されたＢＣＬ−１細胞中でのＩｇＭ分泌を高めることを示す。
【図５】図５は、ＸＢＰ−１スプライシングされたタンパク質の排他的発現がＸＢＰ−１欠損ＢＣＬ−１細胞中でＩｇ産生を回復することを示す。
【図６】図６は、ＸＢＰ−１スプライシングされたタンパク質がＩＬ−６産生を誘導することを示す。
【図７】図７は、ＸＢＰ−１、ＵＰＲおよび形質細胞分化のモデルを示す。
【図８】図８Ａは、スプライシングされていないネズミＸＢＰ−１のｃＤＮＡ配列を示し、図８Ｂは、スプライシングされていないネズミＸＢＰ−１のタンパク質配列を示し、図８Ｃは、スプライシングされたネズミＸＢＰ−１のｃＤＮＡ配列を示し、図８Ｄは、スプライシングされたネズミＸＢＰ−１のタンパク質配列を示す。
【図９】図９は、ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡのスプライシングを調整する作用物質を検出するためのスクリーニングベクターの例を示す。
【図１０】図１０は、プロテアソームインヒビターは、ＥＲストレスおよびカスパーゼ１２の活性化を誘発するが、ＵＰＲを抑制することを示している。（Ａ）ＢｉＰとＣＨＯＰの誘導をノーザンブロット分析によって調べた後、ＭＧ−１３２（２０μＭ）、Ｔｍ（１０μｇ/ｍｌ）のいずれかもしくは両方を用いてＮＩＨ３Ｔ３またはＪ５５８骨髄細胞を処理した。細胞を、ＭＧ−１３２を用いて１時間前処理し、次いでＴｍを用いて４時間、さらに処理した。ゲルのエチジウムブロミド染色を一番下に示している。（Ｂ）プロテアソームインヒビターによるカスパーゼ−１２プロセシングの誘導を示す。全長カスパーゼ−１２のプロセシングを、タプシガルギン（１μＭ）またはＰＩｓ（２０μＭ）で指示された時間処理したＪ５５８骨髄細胞において、ウェスタンブロットによって調べた。（Ｃ）Ｊ５５８細胞中でのＸＢＰ−１タンパク質細胞種の比率を変えて、ＭＧ−１３２の量を増加させながら、１６時間細胞を処理した。アポトーシスが起きた細胞をアネキシンＶ染色によって計数した。（Ｄ）ＸＢＰ−１ｓからＸＢＰ−１ｕへのシフトの時間経過を示す。細胞を指示された時間、ＭＧ−１３２（１μＭ）で処理し、ＸＢＰ−１ｕとスプライシングされたタンパク質のレベルおよび細胞死を測定した。（Ｅ）ＭＭ．１ｓヒト骨髄細胞株中のＸＢＰ−１種の比率の変化を示す。時間経過分析の中でＰＳ−３４１（８ｎＭ）を用いて細胞を処理し、ＸＢＰ−１タンパク質種を定量した。
【図１１】図１１は、プロテアソームインヒビターがＩＲＥ−１α媒介性のＸＢＰ−１ ｍＲＮＡスプライシングに及ぼす作用を示す。（Ａ）ＭＧ−１３２の存在下または不存在下で、Ｔｍを用いて４時間処理された、ＥＲストレスを受けたＪ５５８細胞中のＸＢＰ−１ ｍＲＮＡのレベル。Ｔｍを添加する前、細胞をＭＧ−１３２で１時間、前処理した。ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡレベルをノーザンブロット分析によって測定した。（Ｂ）既に証明されているように、スプライシングされた領域にまたがるプローブセットを用いたＲＴ−ＰＣＲ分析によって、ＸＢＰ−１ｕとＸＢＰ−１ｓ ｍＲＮＡの比率が明らかにされた（Iwakoshiら、2003. Nature Immunology 4:321-329）。（Ｃ）ＰＩパネルのＸＢＰ−１スプライシングに及ぼす作用。細胞を、Ｔｍを用いて、ＭＧ−１３２（１０μＭ）、ＰＳ−３４１（１０μＭ）、ラクタシスチン（１０μＭ）、ＺＬ３ＶＳ（５０μＭ）、またはＡｄａＡｈｘＬ３ＶＳ（５０μＭ）の存在下または不存在下で４時間処理し、ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡスプライシングをＲＴ−ＰＣＲ分析によって測定した。（Ｄ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞中でのＩＲＥ−１αリン酸化を、ＭＧ−１３２（１０μＭ）で前処理した後、示したようにＴｍで処理した
【図１２】図１２は、プロテアソームインヒビターがＸＢＰ−１ｕタンパク質を固定化し、ＸＢＰ−１活性の強い陰性インヒビターとして機能させることを示す。（Ａ）ＸＢＰ−１のHeLa細胞中でのユビキチン化が、ＸＢＰ−１ｕおよびHis標識されたユビキチン発現プラスミドとともにコトランスフェクトされた。（Ｂ）ＸＢＰ−１ｕおよびＸＢＰ−１ｓタンパク質の分解率を、Ｊ５５８細胞を35S Met/Cys で１時間パルス標識し、指定された時間追跡することによって測定した。（Ｃ）８倍の余剰分のＸＢＰ−１ｕプラスミドをもつＰＩ処理されたNIH3T3細胞中での、ＸＢＰ−１ｕのＸＢＰ−１ｓ依存性UPRE活性化に及ぼす作用。トランスフェクトされた細胞を、ルシフェラーゼアッセイのために回収する前に、MG−132で１６時間処理した。値は、ウミシイタケ（Renilla）に正規化した後、レポーターのみの場合と比較した活性の折り畳み誘導を表す。（Ｄ）リジンをアルギニンにしたＸＢＰ−１ｕ変異体の生成および発現を示す。ＸＢＰ−１ｕのＣ末端の２〜３のリジン残基をアルギニンで置換し、ＸＢＰ−１ｕＫＫ（235、252）およびＸＢＰ−１ｕＫＫＫ（146、235、252）を、部位特異的突然変異によって作製した。ｄｎ−ＸＢＰは、ＸＢＰ−１ｕのＮ末端188 aaを含有している。（Ｅ）NIH 3T3中のUPREのＸＢＰ−１依存性活性化の、ＸＢＰ−１ｕにおけるリジンからアルギニンへの変異による阻害を示す。
【図１３】図１３は、異常のあるＵＰＲを持つ細胞が、ＥＲストレスが誘導するアポトーシスに対してより感受性が高いことを示す。（Ａ）ＴｍとＭＧ−１３２のアポトーシスに対する相乗効果を示す。記載したように、最適以下濃度のＴｍとＭＧ−１３２を用いたＪ５５８細胞で１８時間処理した後、アネキシンＶ陽性細胞を計測した。（Ｂ）Ｕ６プロモーターベースのＸＢＰ−１ ＲＮＡｉベクターを用いたＪ５５８細胞のレトロウイルストランスダクションによってJ558−iXBP細胞を生成した。（Ｃ）Ｔｍで処理した対照ＧＦＰ、ｄｎ−ＸＢＰまたはｉＸＢＰ−１を発現するＪ５５８細胞中のＸＢＰ−１依存性発現を示す。ＧＦＰ−ＲＶベクターに導入されたｄｎ−ＸＢＰ ｃＤＮＡを含有するレトロウイルスで感染させることによるｄｎ−ＸＢＰ−１ Ｊ５５８細胞の生成を示す（N. N. Iwakoshi et al., Nature Immunology4, 321-329 （2003））。ＥＲｄｊ４、ｐ５８ＩＰＫ、ＢｉＰおよびＣＨＯＰ遺伝子発現をノーザンブロット分析によって調べた。（Ｄ）ｉＸＢＰ−１およびＪ５５８を発現するｄｎ-ＸＢＰ−１のアポトーシスの増加を示す。細胞を、図示された量のＴｍを用いて４８時間処理し、アネキシンＶ染色後、細胞死を計測した。
【図１４】Ｊ５５８細胞をＴｍで処理することによって、抗ＰＥＲＫ抗体を用いた、より決定的にはリンＰＥＲＫ（phospho−PERK）のみを認識する抗体を用いたアッセイによって、リン酸化したＰＥＲＫの量が増加した（ＰＥＲＫの可動性の上向きのシフト）。ＭＧ−１３２の存在下で、ＰＥＲＫの自己リン酸化の減少が観察された。
【図１５】図１５は、野生型および突然変異細胞のＸＢＰ−１遺伝子およびタンパク質の構造を示す。（Ａ）野生型のＸＢＰ−１座およびＸＢＰ−１−／−ＭＥＦ細胞を示す。ＸＢＰ−１−／−ＭＥＦ細胞中の突然変異ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡのスプライシングを示す。*は、終止コドンを表す。（Ｂ）１０μｇ/ｍｌのＴｍで６時間処理しなかったもしくは処理した、野生型およびＸＢＰ−１−／−ＭＥＦ細胞を示す。ＸＢＰ−１ ｍＲＮＡをノーザンブロット分析によって明らかにした。（Ｃ）野生型およびＸＢＰ−１−／−ＭＥＦ細胞を１０μＭのＭＧ−１３２もしくは１０μｇ/ｍｌのＴｍで６時間処理した。ＸＢＰ−１ｕおよびＸＢＰ−１ｓタンパク質を、抗ＸＢＰ−１抗体を用いたウェスタンブロット分析によって検出した。
【図１６】図１６は、ＵＰＲ標的遺伝子発現のＸＢＰ−１への依存を示す。（Ａ）野生型およびＸＢＰ−１−／−ＭＥＦ細胞を１０μｇ/ｍｌのＴｍで指示された時間処理した。全てのＲＮＡを単離し、ノーザンブロット分析を行った。そのブロットをＢｉＰ、ＣＨＯＰ、ＥＲｄｊ４、ｐ５８ｉｐｋ、ＡＴＦ６αおよびＧｌａプローブを用いて連続的にハイブリダイズした。ｐ５８ｉｐｋは、遺伝子の５’末端からのプローブＡである。ブロッティング前のゲルのエチジウムブロミド染色を、ローディングコントロール（loading control）として一番下に示した。（Ｂ）ｐ５８ｉｐｋの全てのアイソフォームは、ＸＢＰ−１依存性である。ここで、遺伝子の３’末端の配列を認識するプローブＢを用いてノーザンブロット分析を行った。（Ｃ）ＸＢＰ−１依存性遺伝子もＩＲＥ１α依存性である。Ｔｍで一定時間処理し、ＥＲｄｊ４およびｐ５８ｉｐｋの発現を調べるためにアッセイした、ＩＲＥ１α−／−ＭＥＦｓから調製したＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。（Ｄ）ＥＲｄｊ４ＧＬ３レポーターを、野生型およびＸＢＰ−１−／−ＭＥＦ細胞に導入したＸＢＰ−１プラスミドを用いて、もしくは用いずにトランスフェクトした。回収前、示したように、Ｔｍを用いて１μｇ/ｍｌで１６時間、細胞を処理した。ルシフェラーゼ活性をウミシイタケ（Renilla）活性に正規化した。（Ｅ）一次Ｂ細胞中のＢｉＰ、ＥＲｄｊ４およびｐ５８ＩＰＫのＬＰＳによる誘導を示す。Ｂ２２０+ 一次Ｂ細胞を、野生型またはＸＢＰ−１ −／−ＲＡＧ２−／−リンパ性キメラの脾臓から単離した。細胞を処理しないままにするか、または３日間２０μｇ/ｍｌのＬＰＳで刺激した。ＢｉＰ、ＥＲｄｊ４およびｐ５８ＩＰＫの発現をノーザンブロット分析によって測定した。
【図１７】図１７は、ＵＰＲ標的遺伝子のＸＢＰ−１ｓによる誘導を示す。パネルＡは、１μｇ/ｍｌドキシサイクリンを含有する培地中で培養したMEF-tet-offおよびMEF-tet-off-ＸＢＰ−１ｓを示す。ＸＢＰ−１ｓ発現は、細胞を２日間ドキシサイクリンを含まない培地で培養するか、またはＴｍを用いて指示された時間処理することによって、誘導された。ＸＢＰ−１ｓタンパク質を、ウェスタンブロット分析において抗ＸＢＰ−１抗体によって明らかにした。全てのＲＮＡを調製して、ＢｉＰ、ＣＨＯＰ、ＥＲｄｊ４、ｐ５８ｉｐｋおよびＡＴＦ６α ｍＲＮＡの発現レベルを測定した。（Ｂ）遺伝子プロファイリング実験（表２）中の同定された更なるＸＢＰ−１依存性標的遺伝子の、ＸＢＰ−１ｓ MEF-tet-offおよびＸＢＰ−１−／−MEFsでのノーザンブロット分析による確認。ブロッティング前のゲルのエチジウムブロミド染色を一番下に示している。
【図１８】図１８は、ＵＰＲ標的遺伝子発現が、ＡＴＦ６αおよびβの不存在下であまり影響を受けないことを示す。（Ａ）ｉＡＴＦ６α、ｉＡＴＦ６βおよび二重ｉＡＴＦ６α／βＭＥＦのウェスタンブロット分析を示す。ｉＡＴＦ６α細胞は、ＭＥＦ細胞を、ＡＴＦ６αに対してｓｉＲＮＡを発現するＵ６−ｉＡＴＦ６αプラスミドで、Ｕ６プロモーターの制御下でトランスフェクトすることによって生成された。ｉＡＴＦ６β細胞およびｉＡＴＦ６α/βノックダウン細胞を、ｉＡＴＦ６βまたはＰＮＡプラスミドを用いて作製し、ｗｔまたはｉＡＴＦ６α ＭＥＦを上記のようにトランスフェクトした。１０μｇ/ｍｌＴｍを用いた処理（６時間）を行っていない、もしくは行った、ｗｔからの溶解物およびｉＡＴＦ６α、βおよびα/β ＭＥＦｓを分析してＸＢＰ−１、およびＡＴＦ６αおよびＡＴＦ６βの発現を調べた。*は、抗ＡＴＦ６α抗体によって認識された非特異的なバンドを示す。（Ｂ）5xATF6GL3 またはERSEレポーターをｗｔ、ＸＢＰ−１−／−、ｉＡＴＦ６α、ｉＡＴＦ６β、ダブルｉＡＴＦ６α/βおよびダブルＸＢＰ−１ −／−ｉＡＴＦ６α ＭＥＦ細胞にトランスフェクトした。示したように細胞を回収前Ｔｍで１μｇ/ｍｌで１６時間で処理した。ルシフェラーゼ活性をウミシイタケ活性に正規化した。未処理のサンプルと比較してＴｍ処理によって相対的なルシフェラーゼ活性の折り畳みの誘導も示す。（Ｃ）全てのＲＮＡを調製して、ＢｉＰ、ＣＨＯＰ、ＥＲｄｊ４およびｐ５８ＩＰＫおよびＧｒｐ９４ ｍＲＮＡの発現レベルを測定した。ブロット法を行う前のゲルのエチジウムブロミド染色を一番下に示している。
【図１９】ＸＢＰ−１およびＡＴＦ６αの両方が欠損した細胞中のＵＰＲ標的遺伝子発現を示す。（Ａ）ＸＢＰ−１/ＡＴＦ６α二重欠損ＭＥＦ細胞株を、ＡＴＦ６αのｓｉＲＮＡをＸＢＰ−１-/- ＭＥＦ細胞に移すことによって生成した。抗ＡＴＦ６α抗体を用いて行ったウェスタンブロット分析によって確認されたように、二重欠損細胞にはＡＴＦ６αは存在しなかった。（Ｂ）Ｔｍを用いた処理（６時間）を行っていない、もしくは行った、指示された細胞株から単離された全てのＲＮＡについてノーザンブロット分析を行った。そのブロットをＢｉＰ、ＣＨＯＰ、ＥＲｄｊ４、ｐ５８ｉｐｋおよびＧ９４プローブを用いて連続的にハイブリダイズした。ブロッティング前のゲルのエチジウムブロミド染色を一番下に示している。
【図２０】図２０は、ＸＢＰ−１とＡＴＦ６の間の物理的および機能的相互作用を示す。（Ａ）5xATF6GL3 および4xXBPGL3は、最小プロモーターの上流に５タンデムＡＴＦ６もしくは４ＸＢＰ−１結合部位を有している。これらのＡＴＦ６およびＸＢＰ−１レポータープラスミドを、Ｔｍ処理によってＸＢＰ−１を発現するＸＢＰ−１pCGNATF6 またはXBP-u/sプラスミドとともにコトランスフェクトした。図４の説明において記載したようにルシフェラーゼアッセイを行った。（Ｂ）２９３Ｔ細胞を所望のプラスミドとともにコトランスフェクトした。抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈降を行い、溶解物を抗ＸＢＰ−１抗体を用いて免疫ブロット分析した。（Ｃ）ＸＢＰ−１およびＡＴＦ６αは、相乗的にＵＰＲＥレポーターを活性化した。ＵＰＲＥ（5xATF6GL3）レポータープラスミドをＸＢＰ−１ｓおよびＡＴＦ６α（1-373）発現プラスミドとともに、個別にまたは同時コトランスフェクトした。上記のとおりルシフェラーゼアッセイを行った。（Ｄ）ＡＴＦ６αは、ＵＰＲＥを、ＸＢＰ−１の不存在下でトランスアクチベーションすることができる。ＵＰＲＥ（5xATF6GL3）レポータープラスミドを、ＸＢＰ−１またはＡＴＦ６α（1-373）発現プラスミドとともに、ｗｔもしくはＸＢＰ−１-/- ＭＥＦにコトランスフェクトした。ルシフェラーゼアッセイを上記のように行った。
【図２１】図２１は、強い陰性のＸＢＰ−１がＸＢＰ−１およびＡＴＦα活性の両方を抑制することを示している。（Ａ）5xATF6GL3レポータープラスミドを、pCGNATF6a またはXBP-u/sプラスミドのいずれかとともに、強い陰性ＸＢＰ−１発現プラスミドを用いて、もしくは用いずにＭＥＦ細胞にコトランスフェクトした。pCDNA3.1をのぞく各トランスフェクションには、１００ｎｇのＤＮＡを用いた。それを添加し、合計１μｇのＤＮＡとした。図１８の説明で示したようにルシフェラーゼアッセイを行った。（Ｂ）強い陰性ＸＢＰ−１タンパク質を安定に発現するMEFおよびMEF-dn-XBP細胞を、１０μｇ/ｍｌのＴｍを用いて、指示された時間処理した。全てのＲＮＡを単離し、ノーザンブロット分析を行った。そのブロットをＢｉＰ、ＣＨＯＰ、ＥＲｄｊ４、ｐ５８ｉｐｋ、ＡＴＦ６αおよびＧｌａプローブを用いて連続的にハイブリダイズした。ブロッティング前のゲルのエチジウムブロミド染色を、ローディング管理（loading control）として一番下に示した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
2006515163.tif 000056
【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１Ａ】
2006515163.tif 000062
【図２１Ｂ】
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【国際調査報告】
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2006515163.tif 000065
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