(57)【要約】【課題】本発明は細胞または組織サンプルにおけるＡＫＴタンパク質およびその活性化状態の検出および定量方法を提供する。【解決手段】具体的には本発明は、別の免疫学的、生化学的、または分子生物学的アッセイに関して換算された免疫組織化学アッセイを、これらのタンパク質の発現または活性化レベルを定量するための撮像系と組み合わせた、ＡＫＴ１またはＡＫＴ２タンパク質またはその活性化された誘導体の検出および定量方法を提供する。
2004512495.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）異なる量のＡＫＴタンパク質を発現する少なくとも２つの細胞系から調製した各細胞ペレットの第１の部分のＡＫＴタンパク質の量を決定する工程と；
ｂ）検出用標識が細胞ペレット中のＡＫＴタンパク質の量に比例する染色の光学密度を生じる検出可能な標識抗ＡＫＴ抗体で、各々の前記細胞ペレットの第２の部分を染色する工程と；
ｃ）各々の前記細胞ペレットの第２の部分のＡＫＴタンパク質に関する光学密度を決定する工程と；
ｄ）工程ｃ）で決定されたＡＫＴタンパク質に関する光学密度に対して工程ａ）で決定されたＡＫＴタンパク質の濃度をプロットすることにより光学密度に対するＡＫＴタンパク質濃度の標準曲線を作成する工程と；
ｅ）細胞または組織サンプル中のＡＫＴタンパク質の光学密度を決定する工程と；
ｆ）工程ｅ）で決定された光学密度および工程ｄ）でプロットされた標準曲線の比較により細胞または組織サンプル中で発現されたＡＫＴタンパク質の量を算出する工程と；
からなる細胞または組織サンプル中のＡＫＴタンパク質発現量または活性化レベルを決定する方法。
【請求項２】
異なる量のＡＫＴ２タンパク質を発現する少なくとも２つの細胞系から調製された各細胞ペレットの第１の部分におけるＡＫＴタンパク質の量を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
異なる量のＡＫＴ２タンパク質を発現する少なくとも２つの細胞系から調製された各細胞ペレットの第１の部分におけるＡＫＴタンパク質の量を、高密度オリゴヌクレオチドアレイをそこから調製した細胞性ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡでハイブリダイズすることにより決定する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
異なる量のＡＫＴ２タンパク質を発現する少なくとも２つの細胞系から調製された各細胞ペレットの第１の部分におけるＡＫＴタンパク質の量を細胞性ＲＮＡまたはｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより決定する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
異なる量のＡＫＴ２タンパク質を発現する少なくとも２つの細胞系から調製された各細胞ペレットの第１の部分におけるＡＫＴタンパク質の量をノーザン・ブロットハイブリダイゼーションにより決定する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
異なる量のＡＫＴ２タンパク質を発現する少なくとも２つの細胞系から調製された各細胞ペレットの第１の部分におけるＡＫＴタンパク質の量を免疫組織化学検出により決定する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
異なる量のＡＫＴ２タンパク質を発現する少なくとも２つの細胞系から調製された各細胞ペレットの第１の部分におけるＡＫＴタンパク質の量をタンパク質マイクロアレイにより決定する請求項１に記載の方法。
【請求項８】
異なる量のＡＫＴ１タンパク質を発現する少なくとも２つの細胞系から調製された各細胞ペレットの第１の部分におけるＡＫＴタンパク質の量を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
異なる量のＡＫＴ１タンパク質を発現する少なくとも２つの細胞系から調製された各細胞ペレットの第１の部分におけるＡＫＴタンパク質の量を、高密度オリゴヌクレオチドアレイをそこから調製した細胞性ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡでハイブリダイズすることにより決定する請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
異なる量のＡＫＴ１タンパク質を発現する少なくとも２つの細胞系から調製された各細胞ペレットの第１の部分におけるＡＫＴタンパク質の量を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定する請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
異なる量のＡＫＴ１タンパク質を発現する少なくとも２つの細胞系から調製された各細胞ペレットの第１の部分におけるＡＫＴタンパク質の量をノーザン・ブロットハイブリダイゼーションにより決定する請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
異なる量のＡＫＴ１タンパク質を発現する少なくとも２つの細胞系から調製された各細胞ペレットの第１の部分におけるＡＫＴタンパク質の量を免疫組織化学検出により決定する請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
異なる量のＡＫＴ１タンパク質を発現する少なくとも２つの細胞系から調製された各細胞ペレットの第１の部分におけるＡＫＴタンパク質の量をタンパク質マイクロアレイにより決定する請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は２０００年４月１４日出願の米国特許仮出願番号第６０／１９７７８０号に対する優先権を請求する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は病態、とりわけ癌の病態の診断および処置に関連する細胞または組織サンプルにおけるタンパク質発現を定量するための方法に関する。具体的には、本発明は撮像系を用いてＡＫＴ１およびＡＫＴ２タンパク質発現を定量する、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２タンパク質発現および活性化状態を定量する方法に関する。
【０００３】
（背景技術）
癌診断は従来、患者から取り出した細胞または組織サンプルの組織学的試験により確認される。臨床病理学者は、かかるサンプルが良性または悪性であるかどうかを正確に決定でき、かつ悪性であると考えられる腫瘍サンプルの攻撃性を分類できる必要がある。なぜならばこれらの決定はしばしば患者の処置の適当なコースを選択する基礎になるからである。
【０００４】
組織学的試験は従来、サンプルの形態学的特徴を光学顕微鏡下で容易に観察できる組織染色方法を必要とする。病理学者は染色サンプルを試験した後、典型的には腫瘍サンプルが悪性かどうかを定性的に決定する。しかしながら単にサンプルの組織学的試験により腫瘍の攻撃性を確認するのは困難である。
【０００５】
当該分野で公知の自動（コンピューターを使用）画像分析系によりサンプルの視覚試験が増加し得る。代表的な系では細胞または組織サンプルの拡大画像を特異的生物学的マーカーを検出する試薬に暴露し、画像を電荷結合素子（ＣＣＤ）またはカメラ、例えばテレビカメラからの画像を受けとるコンピューターにより加工する。かかる系を用いて例えば特定のサンプル中のエストロゲンレセプター（ＥＲ）、プロゲステロンレセプター（ＰＲ）、またはオンコジーンＨＥＲ−２／ｎｅｕの発現レベルを検出および測定できる。この方法を用いてより有効な治療の投与計画を実行することができる。例えばサンプルがＥＲおよびＰＲに関して陽性であるかを試験する場合、ホルモン治療を用いることができ、サンプルがＨＥＲ−２／ｎｅｕに関して陽性であるかを試験する場合、抗オンコジーンレセプター治療を用いることができる。例えばいくつかの技術が報告されている（非特許文献１〜７参照。）：
ナショナル・インスティテュート・オブ・ヘルス・コンセンサス・デベロプメント・コンフェレンス：「乳癌におけるステロイドレセプター」Ｂｒｅａｓｔ　Ｃａｎｃｅｒ（１９１９）、ベテスダ、メリーランド州；
Ｈａｎｃｏｃｋら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５１：４５７４−４５８０（１９９１）；
Ａｒｔｅａｇａら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５４：３７５８−３７６５（１９９４）；
Ｂａｃｕｓら、Ａｎａｌ．Ｑｕａｎｔ．Ｃｙｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｌ．１９：３１６−３２８（１９９７）；
Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉら、Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６：６０−７０（１９９９）；
Ｓｈａｋ、Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６：７１−７７（１９９９）；
Ｃｏｂｌｅｉｇｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７：２６３９−２６４８（１９９９）。
【０００６】
正常な哺乳動物の発達の一部として生じるアポトーシス、すなわちプログラム細胞死がほぼ１００年前に最初に観察された。発達上の細胞死の誘導は種々の細胞外刺激により抑制され得る高度に制御された過程である。例えば、アポトーシスの成長抑制因子の意味深い生物学的な結果は、ニューロンの生存および機能的ニューロン回路の維持における標的由来のニューロトロフィンの重大な役割により例示される（ＰｅｔｔｍａｎｎおよびＨｅｎｄｅｒｓｏｎ、Ｎｅｕｒｏｎ　２０：６３３−６４７（１９９８））。生存を促進する栄養因子の能力は少なくとも部分的にホスファチジルイノシタイド３’−ＯＨキナーセ（ＰＩ３Ｋ）／ｃ−ａｋｔキナーゼカスケードに寄与する。生存を促進し、アポトーシスを妨げる制御カスケードの能力の基礎となり得るＰＩ３Ｋ／ｃ−ａｋｔシグナル発生経路のいくつかの標的が同定されている。細胞生存およびアポトーシス回避が癌細胞の無制限な増殖特性に必要な部分であるので、この挙動は癌診断に適切である。
【０００７】
従って、患者から得られる細胞および組織標本を診断、ステージングおよび評価するための良好な方法の一部として；癌細胞を調節または切除する臨床努力の効果をモニター観察するといった最初の癌診断の一部として；または１次腫瘍細胞の再発もしくは転移疾患の存在を検出するために；アポトーシスを妨げることができる細胞とりわけ癌細胞を検出する技術が必要とされている。
特に、疾患の経過中できるだけ早期に改善された診断および正確な診断を行うために、腫瘍マーカー遺伝子生成物の発現の改善された検出法が当技術分野において必要とされている。
【０００８】
（発明の開示）
本発明は動物、最も好ましくはヒト癌患者または癌を有していることが疑われる個体から得られる細胞または組織サンプル中のＡＫＴ１またはＡＫＴ２タンパク質発現および活性化レベルを定量する方法を提供する。具体的には本発明は撮像系を定量的に用いてＡＫＴ１およびＡＫＴ２タンパク質発現または活性化レベルを定量する方法を提供する。さらに具体的には本発明は撮像系を用いてＡＫＴタンパク質特異的色素で染色されている細胞または組織サンプルの画像を受け取り、増強し、加工する方法を提供し、かかる動物からの細胞または組織サンプルで発現されるＡＫＴタンパク質の量または活性化レベルを決定する。
【０００９】
本発明の方法の好ましい実施形態では、異なる量のＡＫＴタンパク質を発現する少なくとも２つの細胞系に関してＡＫＴ１およびＡＫＴ２タンパク質の標準曲線を作成する。次いで標準曲線を用いて細胞または組織サンプル中で発現されたＡＫＴタンパク質の量を定量的に決定する。活性化の特徴に特異的な試薬を用いて、活性化されたＡＫＴ１またはＡＫＴ２タンパク質に関して類似の標準曲線を作成できる。これを用いて臨床上の癌処置の前後でＡＫＴ（ＡＫＴ１およびＡＫＴ２）の量および活性化状態の変化を決定することもできる。
【００１０】
本発明の方法の１つの実施形態では細胞または組織サンプル中のＡＫＴ２タンパク質発現を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて定量し、異なる量のＡＫＴ２タンパク質を発現する少なくとも２つの調節細胞系から調製した細胞ペレットの部分のＡＫＴ２タンパク質の量を決定し、これを細胞または組織サンプル中のＡＫＴ２の発現と比較する。本発明の方法の別の実施形態では、細胞または組織サンプルから単離されるｃ−ａｋｔ２　ｍＲＮＡの高密度オリゴヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーション、またはＲＴ−ＰＣＲによるかもしくはノーザンブロットハイブリダイゼーション実験によるｃ−ａｋｔ２　ｍＲＮＡ発現の決定により細胞または組織サンプルにおいて発現するＡＫＴ２タンパク質の量を間接的に定量する。重要なことに、同一細胞ペレットの別個の部分を次いで抗ＡＫＴ２抗体で染色し、続いて免疫組織学的分析により、好ましくはＡＫＴ−２タンパク質を検出するために使用される免疫組織学的染色に特異的な波長でサンプルの光学密度を測定することによりサンプル中のＡＫＴ２タンパク質の量を決定する。本発明の好ましい実施形態の実施において、最も好ましくはＥＬＩＳＡにより決定されるＡＫＴ２タンパク質濃度をＡＫＴ２タンパク質に関する光学密度測定に対してプロットする標準曲線を準備する。細胞または組織サンプル中に発現されるＡＫＴ２タンパク質の量を決定するために、ＡＫＴ２タンパク質に関して光学密度を測定し、対照細胞系から作成した標準曲線と比較する。
【００１１】
本発明の具体的な好ましい実施形態が以下の特定の好ましい実施形態および請求の範囲のより詳細な記載から明らかになろう。
【００１２】
（好ましい形態の説明）
本発明は細胞性タンパク質、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２の発現および活性化レベルを定量的に決定する方法を提供し、これは個体からの細胞または組織サンプルにおいて検出される腫瘍細胞、とりわけヒト腫瘍細胞におけるアポトーシスの回避の媒介に関与する。これらの方法は哺乳動物とりわけヒトの正常および腫瘍細胞におけるアポトーシスの重要なメディエーターであるＡＫＴタンパク質の同定に依存する。
【００１３】
細胞の生存の重要なレギュレーターであるＡＫＴ（ｃ−ａｋｔ遺伝子により産生されるタンパク質）の同定は腫瘍形成および薬物抵抗に関して重大な意味を有する。例えばヒト腫瘍サプレッサーであるＰＴＥＮの欠如はＡＫＴ活性の増加に相関する（Ｌｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７５：１９４３−１９４７（１９９７）；Ｌｉａｗら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５４−６７（１９９７）；Ｎｅｌｅｎら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．６：１３８３−１３８７（１９９７）；ＣａｎｔｌｅｙおよびＮｅｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：４２４０−４２４５（１９９９）；Ｄａｔｔａら、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．１３：２９０５−２９２７（１９９９））。加えて、アポトーシスの抑制はＡＫＴが発癌性を助長するときに有し得る機能のみではない。ある環境で、ＡＫＴは細胞サイクルの進行をも誘導できる。しかしながら、ＰＴＥＮの削除による活性ラスの過剰発現かまたは活性ＰＩ３Ｋの過剰発現のいずれかにより細胞がアポトーシスに対する抵抗性を付与できるという知見に鑑み、ＡＫＴがアポトーシスを抑制し得るという観察はオンコジーンがＡＫＴの過剰活性化により適応性のある細胞性アポトーシスを遮断できることを示唆する。
【００１４】
アポトーシスの機構が複雑であれば、ＡＫＴが細胞の生存を促進し、細胞死を阻止するように作用できる多くの経路が存在する。Ｂｃｌ−２ファミリー遺伝子（これは細胞生存または細胞死において役割を果たすことが知られている）のメンバーの発現または作用を制御することにより、ＡＫＴはアポトーシスを遮断できる。また別に、ＡＫＴはタンパク質のカスパーゼファミリーの発現もしくは活性、または死レセプター経路の機能を制御できる。ＡＫＴの制御効果は直接的メカニズム、例えばアポトーシスの機構の構成要素のリン酸化によるか、または間接的メカニズム、例えば死機構の構成要素をコードする遺伝子の発現レベルを変化させることによる。最近の研究によりＡＫＴが複数の部位でアポトーシスを制御することが示唆されている。ＢＡＤ、カスパーゼ−９、転写因子のフォークヘッドファミリーおよびＮＦｋＢレギュレーターＩＫＫなどの多くのＡＫＴ標的が同定されており、これらは全て細胞死の媒介において重大な役割を果たしている（Ｄａｔｔａら、前出（１９９９））。
【００１５】
ＡＫＴによりリン酸化されることが解っているアポトーシスの機構の第１の構成要素はＢｃｌ−２ファミリーのメンバーのＢＡＤである。ＢＣＬ−２に結合するその能力に基づいてＢＡＤが同定された；Ｂａｄの１次構造の分析により、これはＢｃｌ−２に類似することが示された（Ｙａｎｇら、Ｃｅｌｌ　８０：２８５−２９１（１９９５））。ＡＫＴがＢＡＤの直接リン酸化によりＢＡＤ誘起の細胞死を抑制するという知見は、内因性ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路が最高潮に達してＢＡＤのリン酸化に至ることを示唆する相関的な証拠に合致する。加えて、セラミド、紫外線（ＵＶ）照射、赤外線放射（ＩＲ）、およびソルビトールのごとき刺激は未知のメカニズムによりＡＫＴ活性を下方制御し、各々はまたＢＡＤリン酸化を阻止する（ＺｕｎｄｅｌおよびＧｉａｃｃｉａ、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．１２：１９４１−１９４６（１９９８））。
【００１６】
ＡＫＴはまたカスパーゼ−９をリン酸化する。ＡＫＴを過剰発現する細胞系からの抽出物はインビトロでチロクロームＣ媒介カスパーゼ−９活性化を遮断するので、このリン酸化事象は機能的に作用する。これらの結果はチトクロームＣ放出の下流でのカスパーゼ−９の不活性化によりＡＫＴが細胞生存を促進することを示唆している。カスパーゼ−９のリン酸化がどのようにその不活性化に至るのかは明らかではないが、カスパーゼ−９のリン酸化がタンパク質の内在性触媒活性を不活性化するようである。
【００１７】
加えて、ＡＫＴがＥｒｂＢファミリー遺伝子発現の腫瘍形成効果の媒介に関与するという明白な証拠がある。オンコジーンレセプターのＥｒｂＢファミリー（ＨＥＲ）は４つのメンバー、ＨＥＲ（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ−２、（ＥｒｂＢ−２）、ＨＥＲ−３、およびＨＥＲ−４を含有する。このレセプターファミリーにおける興味は、ＨＥＲ−２の過剰発現は細胞を形質転換し、ヒト乳癌および卵巣癌の進行および転移の増加に相関するという知見により大いに鼓舞されている。極最近では、ＨＥＲ−２のヒト化モノクローナル抗体がＨＥＲ−２が過剰発現されている乳癌患者の処置に関して承認されている。このように乳癌の発達におけるＨＥＲ−２過剰発現の重要性が確立されている（Ｌｉｕら、Ｖｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６１：８９７−９０３（１９９９））。
【００１８】
ＨＥＲ−３（ＥｒｂＢ−３）およびＨＥＲ−４（ＥｒｂＢ−４）レセプター双方のリガンドであるヘレグリンはヘテロ二量体の形成によりＨｅｒ−２／ｎｅｕを活性化できる。ヘレグリンはまたＨＥＲ−２を発現するＭＣＦ−７細胞においてＡＫＴ酵素活性の強力および迅速なアクチベーターでもある。この活性化はＰＩ３Ｋ経路のＨＥＲ−２またはＨＥＲ−３刺激により媒介される。さらに、ＢＴ４７４乳癌細胞中のＨＥＲ−２の過剰発現はＡＫＴの基礎活性の増加に相関する。最後に、乳癌患者の処置に用いられるＨＥＲ−２のモノクローナル抗体はこれらの細胞における基礎ＡＫＴ活性を低下させる。これはヘレグリン／ＨＥＲ−２の下流標的の１つであるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路に関与する。このように、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴカスケードは、ＨＥＲ−２過剰発現がさらに攻撃的な乳癌表現型を生じる能力において役割を果たし得る。
【００１９】
ＡＫＴ２はまた放射線または化学療法処置の後の細胞生存において、およびプログラム細胞死において重要な役割を果たす。例えば、ＡＫＴ２は膵臓、乳房および卵巣癌において過剰発現されることが見出された。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現が検出された患者ではｃ−ａｋｔ２遺伝子が転写的に活性化されることが見出されるのみならず、ＡＫＴ２タンパク質もまた過剰発現されることが示されている。基礎レベルのＨＥＲ−２／ｎｅｕを発現するＭＣＦ−７細胞、およびＨＥＲ−２／ｎｅｕ発現構築物でトランスフェクトされたＭＣＦ−７細胞を比較して、ｃ−ａｋｔ２　ｍＲＮＡレベルはＨＥＲ−２／ｎｅｕトランスフェクトされたＭＣＦ−７において２７倍増加した。ＨＥＲ−２／ｎｅｕが過剰発現することが見出された腫瘍サンプルではＡＫＴ２が上方制御されることが見出された（表Ｉ）。
【００２０】
【表１】
2004512495.tif 000003
【表２】
2004512495.tif 000004
表中、ＡＫＴ２の結果は光学密度の任意の単位で示し、一方ＨＥＲ−２／ｎｅｕの結果は細胞あたりのＨＥＲ−２／ｎｅｕのピコグラムで示す。
【００２１】
これらの結果は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕを過剰発現する乳癌におけるＡＫＴ２の活性化および過剰発現がこれらの癌の攻撃的な生物学的挙動の重要な因子であり得ることを示唆している。ＡＫＴシグナル発生経路の構成要素を指向する治療薬およびＡＫＴタンパク質のレベルを検出および測定し、並びにかかる活性化状態を検出および測定する診断試験はかかる癌の処置において重要である。当該分野では患者から得られた細胞または組織サンプルにおけるＡＫＴタンパク質レベルおよびその活性化状態を決定するための信頼性のあるアッセイが必要とされている。また満足できる方法では病理学者が分析から正常組織を排除することが可能でなければならない。
【００２２】
本発明の方法の好ましい実施形態の実施において、２成分免疫組織化学的染色系を用いて細胞ペレットまたは組織が１色で対比染色され、一方細胞ペレットまたは組織サンプル中の目的のタンパク質は別の色で染色される。次いで細胞ペレットおよび組織サンプル中の細胞の画像を光学顕微鏡で拡大し、一対の別個の画像に分割する。各々の特定の色素に関して最大吸収を有するように特に適合させた一対の光学フィルターを用いて分割された画像を増強する。光学フィルターの１つは対比染色された組織の吸収波長の波長を有する光を優先的に透過させる。別の狭い帯域光学フィルターは目的のタンパク質を検出するために用いられる色素に関するスペクトル吸収の領域で優先的に透過させる。画像分析フィルターを用いて、種々成分、例えば膜、細胞質および核などにおける異なる細胞性タンパク質を定量できる。いずれかの測定を行う前に最適な結果に関して撮像系を換算する。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態およびその利点は実施例１から５を参考にすると最もよく理解される。これらの実施例は本発明の具体的な実施形態、およびその種々の使用を説明するものである。これらは説明目的でのみ提示するものであり、本発明を限定すると考えるべきではない。
【００２４】
（実施例１）
ＡＫＴ２タンパク質発現の画像分析
前記するように２成分免疫組織化学的染色系を用い、ＫＡＴ２タンパク質の異なる量を発現する少なくとも２つの細胞系を用いて標準曲線を作成する。ヒト癌患者からの細胞または組織サンプルを対照細胞ペレットの第２の部分と同一の様式で染色し、免疫組織化学的染色の程度を測定する光学密度を各被験組織サンプルに関して決定する。本発明の方法の好ましい実施形態では、組織サンプルおよび細胞ペレットの第２の部分を同時に染色して、使用した色素のロット間で起こり得るいずれかの差異または染色方法における変化を明らかにする。対照細胞系におけるＡＫＴ２タンパク質の測定値から作成した標準曲線を用いて組織サンプル中の生物学的タンパク質の量を決定する。
【００２５】
画像分析で換算した画素あたりの平均合計光学密度をＡＫＴ２タンパク質陽性染色された画像の全光学密度を考慮して、対比色素、例えばファスト・グリーンまたはエチル・グリーンを用いて染色された画像全画素数でそれを割り、膜または核部分を含んでなる全画素数を誘導する。各々の染色後に標準曲線を作成する。
【００２６】
標準曲線を誘導して、細胞ペレットを標準として用いて組織中のＡＫＴ２タンパク質レベルを定量できるように系を換算する。当該分野で公知のＥＬＩＳＡにおける酵素反応により形成される色の強度は、アッセイの動作範囲内でサンプル中のＡＫＴ２タンパク質の濃度に比例する。ＡＫＴ２タンパク質濃度（ＥＬＩＳＡよりフェムトモル／ｍｇ）または細胞あたりのレセプターを、これらの３つのペレットの別個の部分からの染色スライドカットの画像分析からの平均Ｏ．Ｄ．データに対してプロットすることにより曲線が得られる。
【００２７】
（実施例２）
ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質発現の画像分析
一例としてＨＥＲ−２／ｎｅｕを用いて、ＥＬＩＳＡで決定されたタンパク質ｍｇあたりＨＥＲ−２／ｎｅｕの量（フェムトモル）が公知である、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ発現細胞に対応する４つの凍結細胞キャリブレーターペレットを切断し、染色の各ラウンドで患者の組織切片と共に染色した。各組織に関して２つの部分を試験した：一方は凍結薄切をＯ．Ｃ．Ｔ．（オプティマル・カッティング・テンパーチャー、バクスター・サイエンティフィック・プロダクツ、マックグロウ・パーク、イリノイ州）に包埋したものであり、他方はＥＬＩＳＡアッセイで使用するために液体窒素中ですりつぶし、ホモジナイゼーションバッファー中に入れたものであった。各組織のＥＬＩＳＡ部分を、カルビオケムＥＬＩＳＡキットを用いてＨＥＲ−２／ｎｅｕのために加工した。次いでこれらの染色したスライドを画像分析を用いて定量し、平均Ｏ．Ｄ．（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ）を決定した。ＥＬＩＳＡにより決定したキャリブレーター細胞系において発現されたＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質の量および画像分析を表ＩＩに示す。
【００２８】
【表３】
2004512495.tif 000005
各キャリブレーターペレットに関する平均Ｏ．Ｄ．を、同一のキャリブレーターペレットのＥＬＩＳＡから誘導したタンパク質ｍｇあたりのＨＥＲ−２／ｎｅｕの値に対してプロットした。次いでこのグラフからの等式を用いて、定量値からの平均Ｏ．Ｄ．を用いて５つの患者組織サンプルのＨＥＲ−２／ｎｅｕの量（フェムトモル）を誘導した。組織サンプルの染色の各々のラウンドを１組のキャリブレーターペレットからの切片と組み合わせて行った。一連の組織を試験した各時間での染色の実施にペレットを含め、その定量値（平均Ｏ．Ｄ．）を用いて標準曲線を作成した。ＥＬＩＳＡにより決定される患者組織サンプルにおいて発現されたＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質の量および画像分析を表ＩＩＩに示す。
【００２９】
【表４】
2004512495.tif 000006
これらの方法の結果は、この方法が腫瘍細胞により発現されるＨＥＲ−２／ｎｅｕの量に関する定量値を生じることを示している。表Ｉは正常レベル（＋１）ＨＥＲ−２／ｎｅｕまたは過剰発現ＨＥＲ−２／ｎｅｕのいずれかを発現する乳房組織におけるＡＫＴ２タンパク質のレベルを決定するために抗体単位の光学密度を用いて得られた予備試験の結果を示す。ＨＥＲ−２／ｎｅｕを過剰発現する癌（＋３または＋４）では高レベルのＡＫＴ２タンパク質発現が検出された。このように自動（コンピューター使用）画像分析系を、キャリブレーターとして使用される一連のペレットと組み合わせると、細胞または組織サンプル中のＡＫＴ２タンパク質発現レベルの正確な定量方法が提示される。ＡＫＴ活性を遮断する特定の薬物と処置する前後でのＡＫＴ活性の量の測定に同一の方法を適用できる。
【００３０】
（実施例３）
ＡＫＴ上方制御はＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現に随伴し、インビトロでアポトーシスに抵抗性を付与する
空気中に８％　ＣＯ２を伴う加湿インキュベーター中３７℃で、ＭＣＦ７（ミシガン・キャンサー・ファウンデーション、デトロイト、ミシガン州より入手）および、予めＭＣＦ７細胞をＥｒｂＢ−２　ｃＤＮＡ発現ベクターで形質導入することにより作製した（Ｂａｃｕｓら（１９９６）；Ｐｅｌｅｓら（１９９３）；Ｄａｌｙら（１９９７））、発現が５から８倍増のＨＥＲ−２／ｎｅｕを発現するＭＣＦ７／ＨＥＲ−２／ｎｅｕ細胞を、１０％　ウシ胎児血清、ペニシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（ギブコ、グランド・アイランド、ニューヨーク州）中で成長させた。ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔインヒビターウォルトマニン（カルビオケム、サンディエゴ、カリフォルニア州）の存在下または不在下、低酸素条件を増強させながら細胞にアポトーシスを誘導した。ウォルトマニンで処置した細胞を、細胞をプレートしてから７から４８時間後、１から３日間５０μＭのインヒビターに暴露した。低酸素条件下、ＭＣＦ７細胞はアポトーシスに鋭敏であった。ウォルトマニンの存在下でのみ、低酸素下でのＭＣＦ７細胞の生存に関して限界有効性を有した。しかしながら、ＭＣＦ７／ＨＥＲ−２／ｎｅｕ細胞は低酸素下でアポトーシスに抵抗したが、ウォルトマニンに暴露したＭＣＦ７／ＨＥＲ−２／ｎｅｕ細胞の生存性は大きく減少した。従って、ＨＥＲ−２／ｎｅｕを過剰発現する細胞の低酸素に対する細胞の抵抗性はＡＫＴ経路の活性化に随伴する。低酸素下での細胞生存性におけるＰＩ３キナーゼ／ＡＫＴおよびＨＥＲ−２／ｎｅｕ経路の役割が低酸素条件下の種々細胞系の成長により確認され、生存性とＨＥＲ−２／ｎｅｕの発現は相関した。
【００３１】
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５／ＨＥＲ−２細胞をＡＴＭＤ　アンダーソン癌センター、ヒューストン、テキサス州のＤｒ．Ｙｕより入手した。８％　ＣＯ２中３７℃で、前記のように補充したＲＰＭＩ１６４０中細胞を成長させた。以下のとおりウェスターン・ブロットを行った。溶解バッファー（５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ　塩化ナトリウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１％　ノンダイエットＰ−４０、１ｍＭ　オルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭ　フッ化ナトリウム、１ｍＭ　フッ化フェニルメチルスルホニル、１μｇ／ｍｌ　ペプスタチン、２μｇ／ｍｌ　ロイペプチン、２μｇ／ｍｌ　アプロチニン）中細胞を溶解し、６５００ｇ、４℃で５分間遠心し、バイオラッド・プロテイン・アッセイキット（バイオラッド、ヘルクレス、カリフォルニア州）でタンパク質濃度を決定した。ビス・トリスＮｕＰＡＧＥシステムを用いて１ｘＭＯＰＳランニングバッファー（ノベックス、サンディエゴ、カリフォルニア州）で電気泳動してタンパク質を分離し、ハイボンドＣエクストラ・メンブラン（アメルシャム・ファルマシア・バイオテック、ピスカッタウェイ、ニュージャージー州）に移した。膜を脱脂粉乳で遮断し、適当な抗体と共にインキュベートし、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝生理食塩水）で洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート２次抗体と共にインキュベートした。ルネサンス・ケミルミネセンス・リージェント・プラス（ＮＥＮライフ・サイエンス、ボストン、マサチューセッツ州）で検出を実施した。ＨＥＲ−２／ｎｅｕを１０倍過剰に発現するＭＤＡ−ＭＢ−４３５／ＨＥＲ−２細胞を、ウェスターン・ブロット分析により決定した親のＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞系と比較した。これらの細胞からのライゼートを収集し、２つの異なるＡＫＴ−２に対する抗体、ポリクローナル抗体（サンタ・クルーズ、カリフォルニア州）およびモノクローナル抗体（ｄｒ．Ｔｅｓｔａ、フォックス・チェース癌センター、フィラデルフィア、ペンシルバニア州）を用いるウェスターン・ブロット分析によりＡＫＴ−２発現を試験した。ＨＥＲ−２／ｎｅｕを過剰発現する細胞においてＡＫＴ−２レベルの増加が観察された。
【００３２】
（実施例４）
ＡＫＴ−２上方制御は癌におけるＨＥＲ−２／ｎｅｕの過剰発現に相関する
４２人の患者からの腫瘍サンプルをｃ−ａｋｔ１およびｃ−ａｋｔ−２発現に関して試験した。組織を２群：正常レベル（＋１まで）のＨＥＲ−２／ｎｅｕを発現する群およびＨＥＲ−２／ｎｅｕを過剰発現する（＋２から＋３まで）群に分けた。組織をＡＫＴ−１およびＡＫＴ−２に関して染色した。ＡＫＴ−１レベルは双方の群で類似したが、画像分析によりＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現組織ではＡＫＴ−２が１０倍まで上方制御されたことが示された（図１）。図２は免疫組織化学分析により、乳癌腫瘍のパラフィン切片でＡＫＴ−２の高発現がＨＥＲ−２／ｎｅｕの過剰発現と相関することを示している。
【００３３】
（実施例５）
ＨＥＲ−２／ｎｅｕを過剰発現する細胞におけるｃ−ａｋｔの活性化
ＨＥＲ−２／ｎｅｕを過剰発現する細胞における全ＡＫＴ（ＡＫＴ−１プラスＡＫＴ−２）の活性化（リン酸化）状態を測定し、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現細胞および癌におけるｃ−ａｋｔの機能的重要性を研究した。全てＨＥＲ−２／ｎｅｕを過剰発現するＳＫＢＲ３、ＢＲ４７４、およびＡＵ５６５細胞（セル・カルチャー・ラボラトリー・ネービー・バイオサイエンス・ラボラトリー、ネービー・サプライ・センター、オークランド、カリフォルニア州）を、プレート後７から４８時間に１から３日間、公知のｃ−ａｋｔアクチベーター、ＮＤＦ／ヘレグリン（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｙ．Ｙａｒｄｅｎ、レオボット、イスラエルより贈呈）、またはＨＥＲ−２／ｎｅｕに対するモノクローナル抗体、ヘルセプチン（２０ｍｇ／ｍｌ）で処理した。ＳＫＢＲ３、ＢＲ４７４、およびＡＵ５６５細胞からの細胞ライゼートを前記のようにウェスターン・ブロットにより試験した。ＡＫＴタンパク質のリン酸化状態を特異的に認識する抗体により活性化されたＡＫＴを測定した。細胞を前記のように溶解し、抗ＡＫＴ−１および抗ＡＫＴ−２抗体を用いる免疫沈澱に供した。以下のとおり免疫沈澱を実施した。細胞ライゼート（バッファー５００μｌあたりタンパク質２５０μｇ）をプロテインＡ＋プロテインＧアガロース・ビーズ（ギブコ　ＢＲＬ　ライフ　テクノロジーズ、ロックビル、メリーランド州）と共にプレインキュベートし、抗ＡＫＴ−１または抗ＡＫＴ−２抗体（アップステート・バイオテクノロジー、レーク・プラシッド、ニューヨーク州）０．５μｇと共に４℃で一晩インキュベートし、続いてプロテインＡ＋プロテインＧアガロース・ビーズ４０μｌと共に１時間インキュベートした。免疫複合体を冷溶解バッファーで洗浄し、抗ホスホ−Ａｋｔを用いるウェスターン・ブロットにより試験して、ＡＫＴ−１またはＡＫＴ−２のリン酸化形態を検出した（図３）。
【００３４】
ＡＫＴの全量およびＡＫＴ−１のリン酸化はヘレグリンで処理した細胞において増加した。ヘルセプチンでの処理により全ＡＫＴおよびＡＫＴ−１のリン酸化が低減した。ＡＫＴ−２リン酸化の基礎レベルは高く、ヘレグリンまたはヘルセプチンでの処理の後高いままであった。ヘルセプチンおよびヘレグリンに３日間暴露することによりＡＫＴ−１のリン酸化状態が下方制御されたが、ＡＫＴ−２には影響しなかった。従って、ＮＤＦ／ヘレグリンによるＨＥＲ−２／Ｈｅｒ−３レセプターの活性化によりＡＫＴおよびＡＫＴ−１の活性化に至る。ＨＥＲ−２／ｎｅｕの下方制御に導くヘルセプチンでの処理によっても、ＫＡＴ−１の下方制御に至るが、ＡＫＴ−２では至らなかった。ＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３のヘテロ二量体形成がＡＫＴ−１の活性化において役割を果たすかどうかを決定するために、未処理ＮＤＦおよびヘルセプチン処理ＭＤＡ−ＭＢ−４７４細胞からＨＥＲ−３を免疫沈澱させた。免疫沈澱物を抗ＨＥＲ−２抗体を用いるウェスターン・ブロットにより分析した。ＡＫＴ活性化の下方制御はＨＥＲ−２／Ｈｅｒ−３ヘテロ二量体の下方制御に相関する。ヘルセプチンでの処理はこれらのヘテロ二量体の下方制御を随伴し、これはＡＫＴ−１活性の下方制御に至る。リン酸化ＡＫＴ−２の基礎レベルはヘレグリンまたはヘルセプチンでの処理により影響を受けなかった。
【００３５】
前記の開示は本発明の特定の具体的な実施形態を強調するものであって、それらに等価な全ての修飾または変更は添付の請求の範囲に示す発明の精神および範囲内であることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は腫瘍切片の乳癌細胞の画像分析によるＨＥＲ−２／ｎｅｕおよびＡＫＴ−２定量の結果を示すチャートである。ＡＫＴ−２の結果は光学密度の任意の単位を示し、一方ＨＥＲ−２／ｎｅｕの結果は細胞あたりのＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質をピコグラムで表現する。ＨＥＲ−２／ｎｅｕを過剰発現しない細胞（＋１および陰性）を黒く塗りつぶした四角で示し、＋２および＋３に対応するレベルでＨＥＲ−２／ｎｅｕを発現する細胞を灰色の四角で示す。
【図２】
図２はＨＥＲ−２／ｎｅｕに関して（２１１４Ｈｅｒ−２　ＩＨＣ）、ＡＫＴ−２に関して（２１１４ＡＫＴ２　ＩＨＣ）、またはアルカリ性ホスファターゼ技術により染色し、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析（２１１４ＨＥＲ−２ＦＩＳＨ）を提供するフォイルゲン法により対比染色した乳癌組織のパラフィン切片の免疫組織学的分析である。
【図３】
図３はリン酸化および非リン酸化形態のＡＫＴ１およびＡＫＴ２のレベルを示すウェスターン・ブロットである。レーン１：負制御、レーン２：ＡＫＴ活性ＮＤＦ／ヘレグリン使用の治療：レーン３：ヘルセプチン使用の治療。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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