(57)【要約】哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体をコードするＤＮＡをクローン化しかつ特徴づけした。これらの組換え分子は生物学的に活性のヒスタミンＨ４受容体タンパク質を発現することが可能である。該ｃＤＮＡを、活性の組換えタンパク質を産生する組換え宿主細胞中で発現させた。既知のヒスタミンのリガンドの薬理学が立証される。該組換えタンパク質を組換え宿主細胞から精製してよい。加えて、組換え宿主細胞を利用して、受容体活性の調節物質の同定方法を確立し、そして受容体調節物質が同定される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２のアミノ酸１ないし３９０を含んで成るポリペプチドに対する最低７０％の同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子；
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的である核酸分子；
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のポリヌクレオチドの最低１５の連続する塩基を含んで成る核酸分子；
（ｄ）ストリンジェントな条件下で（ａ）のポリヌクレオチド分子にハイブリダイズする核酸分子；
（ｅ）配列番号８のアミノ酸１ないし３９１を含んで成るポリペプチドに対する最低７０％の同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子；
（ｆ）（ｅ）のポリヌクレオチドに相補的である核酸分子；
（ｇ）（ｆ）もしくは（ｅ）のポリヌクレオチドの最低１５の連続する塩基を含んで成る核酸分子；
（ｈ）ストリンジェントな条件下で（ｅ）のポリヌクレオチド分子にハイブリダイズする核酸分子；
（ｉ）配列番号９のアミノ酸１ないし３９１を含んで成るポリペプチドに対する最低７０％の同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子；
（ｊ）（ｉ）のポリヌクレオチドに相補的である核酸分子；
（ｋ）（ｉ）もしくは（ｊ）のポリヌクレオチドの最低１５の連続する塩基を含んで成る核酸分子；
（ｌ）ストリンジェントな条件下で（ｉ）のポリヌクレオチド分子にハイブリダイズする核酸分子；
（ｍ）配列番号１０のアミノ酸１ないし３８９を含んで成るポリペプチドに対する最低７０％の同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子；
（ｎ）（ｍ）のポリヌクレオチドに相補的である核酸分子；
（ｏ）（ｍ）もしくは（ｎ）のポリヌクレオチドの最低１５の連続する塩基を含んで成る核酸分子；および
（ｐ）ストリンジェントな条件下で（ｍ）のポリヌクレオチド分子にハイブリダイズする核酸分子
よりなる群から選択されるメンバーを含んで成る、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質をコードする単離かつ精製された核酸分子。
【請求項２】
ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１記載の核酸分子。
【請求項４】
（配列番号１）、（配列番号５）、（配列番号６）および（配列番号７）よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項１記載の単離かつ精製された核酸分子。
【請求項５】
前記核酸分子がゲノムＤＮＡである、請求項１記載の単離かつ精製された核酸分子。
【請求項６】
哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質をコードする核酸配列を含有する、組換え宿主中での哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質の発現のための発現ベクター。
【請求項７】
発現ベクターが：（配列番号１）、（配列番号５）、（配列番号６）もしくは（配列番号７）よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質をコードする核酸分子を含有する、請求項６記載の発現ベクター。
【請求項８】
発現ベクターが、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質をコードするゲノムＤＮＡを含有する、請求項６記載の発現ベクター。
【請求項９】
哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質をコードする組換え的にクローン化された核酸分子を含有する組換え宿主細胞。
【請求項１０】
前記核酸分子が：（配列番号１）；（配列番号５）、配列番号６）および（配列番号７）よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項９記載の組換え宿主細胞。
【請求項１１】
前記クローン化された核酸分子がゲノムＤＮＡである、請求項９記載の組換え宿主細胞。
【請求項１２】
哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質として機能する、実質的に純粋な形態のタンパク質。
【請求項１３】
（配列番号２）、（配列番号８）、（配列番号９）および（配列番号１０）よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１２記載のタンパク質。
【請求項１４】
哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質と免疫学的に反応性の単一特異性抗体。
【請求項１５】
抗体が哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質活性を封鎖する、請求項１４記載の抗体。
【請求項１６】
（ａ）適する宿主細胞中に請求項６記載の発現ベクターを導入すること；および
（ｂ）発現ベクターからの哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質の発現を可能にする条件下で段階（ａ）の宿主細胞を培養すること
を含んで成る、組換え宿主細胞中での哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質の発現方法。
【請求項１７】
（ａ）哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質活性の推定の調節物質を哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質と組み合わせること；および
（ｂ）該タンパク質に対する該調節物質の効果を測定すること
を含んで成る、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質活性を調節する化合物の同定方法。
【請求項１８】
段階（ｂ）で測定される効果が、受容体への結合についてヒスタミンＨ４受容体の既知のリガンドとの段階（ａ）の調節物質との間の競争である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
段階（ｂ）で測定される効果が、ヒスタミンＨ４受容体の細胞内セカンドメッセンジャーの調節である、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
細胞内セカンドメッセンジャーが、ｃＡＭＰ、カルシウムおよびレポーター遺伝子産物よりなる群から選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記化合物が哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体の調節物質である、請求項１７記載の方法を使用して同定される化合物。
【請求項２２】
前記化合物が、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体のアゴニスト、アンタゴニストもしくはインバースアゴニストである、請求項１７記載の方法を使用して同定される化合物。
【請求項２３】
前記化合物が、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質の発現を調節する、請求項１７記載の方法を使用して同定される化合物。
【請求項２４】
請求項１７記載の方法で活性の化合物および製薬学的に許容できる担体を含んで成る製薬学的組成物。
【請求項２５】
請求項２４記載の製薬学的組成物の投与を含んで成る、ヒスタミンＨ４受容体により媒介される病状のためのような治療の必要な患者の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
ヒスタミンは、グアニンヌクレオチド結合タンパク質を介する細胞内経路に連結される細胞表面受容体によりシグナル伝達する多機能化学伝達物質である。この分類の細胞表面受容体はＧタンパク質共役型受容体もしくはＧＰＣＲと呼ばれる。現在、薬理学的に定義されたヒスタミン受容体の３つのサブタイプが存在し、そしてＨ１、Ｈ２およびＨ３の分類に分割されている（Ｈｉｌｌら  １９９７）。Ｈ１ヒスタミン受容体はクローン化されており（Ｙａｍａｓｈｉｔａら  １９９１）、そしてアレルギー応答における平滑筋に対するヒスタミンの効果を封鎖するジフェンヒドラミンのような薬物の標的である。Ｈ２ヒスタミン受容体はクローン化されており（Ｇａｎｔｚら  １９９１）、そして胃中の酸分泌に対するヒスタミンの効果を封鎖するラニチジンのような薬物の標的である。１９８３年に存在することが仮説として取り上げられた（Ａｒｒａｎｇら  １９８３）Ｈ３ヒスタミン受容体はクローン化されており（Ｌｏｖｅｎｂｅｒｇら、１９９９）、そして現在は中枢神経系薬物の開発の標的である。ヒトではヒスタミンの多数の付加的機能が存在し、それらは未知の分類のヒスタミン受容体により媒介されるかもしれない。例えば、ヒスタミンは白血球の走化性因子であり、皮膚、鼻、眼および肺のようなアレルギー攻撃の領域でのそれらの蓄積を引き起こす（Ｄｅ  Ｖｏｓ、１９９９）。ヒスタミンのこの効果の媒介の原因である受容体は知られていない。
【０００２】
本発明は、新規ヒスタミン受容体（ヒスタミンＨ４受容体）をコードする哺乳動物のｃＤＮＡの単離および特徴づけ、ならびにそれらの用途に関する。
【０００３】
（発明の要約）
哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体をコードするＤＮＡ分子をクローン化かつ特徴づけし、そしてＧタンパク質に共役する受容体の分類の新規メンバーを表す。組換え発現系を使用して、これらのヒスタミンＨ４受容体をコードする機能的ＤＮＡ分子をマウス、ラット、モルモットおよびヒトから単離した。アミノ酸およびヌクレオチド配列がそうであるように、これらのタンパク質の生物学的および構造的特性を開示する。該組換えタンパク質は、限定されるものでないがヒトヒスタミンＨ４受容体の調節物質の同定を挙げることができる多様な目的上有用である。マウス、ラットおよびモルモットのヒスタミンＨ４受容体は、限定されるものでないが異なる哺乳動物種間で観察される薬理学的差異を解消することを挙げることができる多様な用途を有する。とりわけモルモット、ラットおよびマウス種は新たな化学的実体の前臨床評価で普遍的に使用されるからである。こうした調節物質はアゴニスト、アンタゴニストおよびインバースアゴニストを包含する可能性がある。本明細書で開示されるアッセイで同定される調節物質は、例えば治療薬、予防薬および診断薬として有用である。前記治療薬の適応症は、限定されるものでないが喘息、アレルギー、炎症、心血管系および脳血管系障害、インスリン非依存性糖尿病、高血糖症、便秘、不整脈、神経内分泌系の障害、ストレスならびに痙縮、ならびに酸分泌、潰瘍、気道狭窄および前立腺機能不全を挙げることができる。該組換えＤＮＡ分子およびそれらの部分は、限定されるものでないが、該ＤＮＡ分子の相同物の単離、該ＤＮＡ分子のゲノム同等物の同定および単離、ならびに該ＤＮＡ分子の突然変異体の同定、検出もしくは単離を挙げることができる多様な用途を有する。
【０００４】
（詳細な記述）
本発明は、ヒト骨髄からのｃＤＮＡライブラリーから単離されたヒトヒスタミンＨ４受容体をコードするＤＮＡに関する。本明細書で使用されるところのヒトヒスタミンＨ４受容体は、Ｈ４のサブクラスのヒスタミンの受容体として特異的に機能することができるタンパク質を指す。
【０００５】
本発明はまた、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体をコードするＤＮＡ分子にも関する。とりわけ、本発明は、モルモット（ｃａｖｉａ  ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ）、ラット（ｒａｔｔｕｓ  ｒａｔｔｕｓ）およびマウス（ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）のヒスタミンＨ４受容体をコードするＤＮＡ分子に関する。本明細書で使用されるところの哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体という用語は、Ｈ４のサブクラスのヒスタミンの受容体として特異的に機能することができるタンパク質を指す。
【０００６】
ヒト、モルモット、ラットもしくはマウスのヒスタミンＨ４受容体の完全なもしくは部分的なアミノ酸配列は以前に知られておらず、また、ヒスタミンＨ４受容体をコードする完全なもしくは部分的なヌクレオチド配列も知られていなかった。広範な細胞および細胞型が、記述される哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体を含有するであろうことが予測される。ヒスタミンＨ４受容体を産生することが可能な脊椎動物細胞は、限定されるものでないがヒスタミンに対する感受性を示すかもしくはそれに結合する細胞から単離されたヒスタミンＨ４受容体発現細胞を挙げることができる。こうした細胞は骨髄、脾、血液もしくは他の組織由来であることができる。
【０００７】
他の細胞および細胞系もまた、ヒスタミンＨ４受容体のｃＤＮＡを単離するための使用に適するかもしれない。適する細胞の選択は、３［Ｈ］−ヒスタミン結合もしくはヒスタミンに応答してのアデニル酸シクラーゼの阻害についてのスクリーニングにより行ってよい。ヒスタミンＨ４受容体活性は、３［Ｈ］−ヒスタミン結合アッセイ（実験の節を参照されたい）を実施することにより、もしくはヒスタミンＨ４受容体の活性化によるアデニル酸シクラーゼの阻害の直接測定により、もしくはＧＴＰ−γ−Ｓの取り込みにより（Ｃｌａｒｋ、Ｋｏｒｔｅら  １９９３）モニターすることができる。このアッセイでヒスタミンＨ４受容体活性を所有する細胞は、ヒスタミンＨ４受容体のＤＮＡもしくはｍＲＮＡの単離に適するかもしれない。
【０００８】
当該技術分野で既知の多様な手順のいずれかを使用して、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体のＤＮＡをクローン化してよい。これらの方法は、限定されるものでないが、適切な発現ベクター系でのヒスタミンＨ４受容体を含有するｃＤＮＡライブラリーの構築後のヒスタミンＨ４受容体遺伝子の直接機能的発現を挙げることができる。別の方法は、ヒトヒスタミンＨ４受容体のアミノ酸配列から設計された標識オリゴヌクレオチドプローブで、バクテリオファージもしくはプラスミドシャトルベクター中に構築されたヒスタミンＨ４受容体を含有するｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。付加的な一方法は、ヒスタミンＨ４受容体タンパク質をコードする部分的ｃＤＮＡで、バクテリオファージもしくはプラスミドシャトルベクター中に構築されたヒスタミンＨ４受容体を含有するｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることよりなる。この部分的ｃＤＮＡは、本明細書に記述される精製されたヒスタミンＨ４受容体タンパク質のアミノ酸配列からの縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計による、ヒトヒスタミンＨ４受容体のＤＮＡフラグメントの特異的ＰＣＲ増幅により得られる。
【０００９】
別の方法は、ヒスタミンＨ４受容体産生細胞からＲＮＡを単離しそしてインビトロもしくはインビボの翻訳系を介して該ＲＮＡをタンパク質に翻訳することである。ペプチドもしくはタンパク質へのＲＮＡの翻訳は、ヒスタミンＨ４受容体タンパク質の少なくとも一部分の産生をもたらすことができ、それは、例えば抗ヒスタミンＨ４受容体抗体との免疫学的反応性により、もしくはヒスタミンＨ４受容体タンパク質の生物学的活性により同定することができる。この方法において、ヒスタミンＨ４受容体産生細胞から単離されたＲＮＡのプールを、ヒスタミンＨ４受容体タンパク質の少なくとも一部分をコードするＲＮＡの存在について分析することができる。ＲＮＡのプールのさらなる分画を行って、非ヒスタミンＨ４受容体ＲＮＡからヒスタミンＨ４受容体のＲＮＡを精製することができる。この方法により製造されるペプチドもしくはタンパク質を分析してアミノ酸配列を提供してよく、これを順に使用してヒスタミンＨ４受容体のｃＤＮＡの調製のためのプライマーを提供するか、もしくは、翻訳に使用されたＲＮＡを分析してヒスタミンＨ４受容体をコードするヌクレオチド配列を提供しかつヒスタミンＨ４受容体のｃＤＮＡのこの調製のためのプローブを製造することができる。この方法は当該技術分野で既知であり、そして例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー  プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｄＨａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９中、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．に見出すことができる。
【００１０】
他の型のライブラリー、ならびに他の細胞もしくは細胞型から構築されたライブラリーが、ヒスタミンＨ４受容体をコードするＤＮＡを単離するのに有用であるかもしれないことが、当業者に容易に明らかである。他の型のライブラリーは、限定されるものでないが、他の細胞、ヒト以外の生物体由来のｃＤＮＡライブラリー、ならびにＹＡＣ（酵母人工染色体）を包含するゲノムＤＮＡライブラリー、およびコスミドライブラリーを挙げることができる。
【００１１】
適するｃＤＮＡライブラリーを、ヒスタミンＨ４受容体活性を有する細胞もしくは細胞系から調製してよいことが、当業者に容易に明らかである。ヒスタミンＨ４受容体のｃＤＮＡを単離するためのｃＤＮＡライブラリーの調製での使用のための細胞もしくは細胞系の選択は、ヒスタミンＨ４受容体に関連する生物学的活性、もしくは３Ｈ−ヒスタミン結合アッセイ、またはヒスタミンＨ４受容体に結合する能力を有するリガンドを必要とするいずれかの放射リガンド結合の測定を使用して、細胞に関連するヒスタミンＨ４受容体活性を最初に測定することにより行ってよい。
【００１２】
ｃＤＮＡライブラリーの調製は当該技術分野で公知の標準的技術により実施することができる。公知のｃＤＮＡライブラリー構築技術は、例えばＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９）に見出すことができる。
【００１３】
ヒスタミンＨ４受容体をコードするＤＮＡは適するゲノムＤＮＡライブラリーから単離してもまたよいこともまた当業者に容易に明らかである。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は当該技術分野で公知の標準的技術により実施することができる。公知のゲノムＤＮＡライブラリー構築技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９）中、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．に見出すことができる。
【００１４】
他の哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体のｃＤＮＡは、モルモット、ラット、マウスもしくはヒトのヒスタミンＨ４受容体の配列に基づいて設計された同一のもしくは縮重プライマーを使用してＰＣＲもしくはＲＡＣＥを実施することにより単離してよい。ＰＣＲ産物を単離し、そして配列を決定しかつ本明細書に記述されるヒスタミンＨ４受容体の配列と比較して、他の哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体のｃＤＮＡの正体を確立する。
【００１５】
上の方法によりヒスタミンＨ４受容体の遺伝子をクローン化するために、ヒスタミンＨ４受容体のアミノ酸配列が必要であるかもしれない。これを達成するため、ヒスタミンＨ４受容体タンパク質を精製しかつ部分的アミノ酸配列を自動化シークェンサーにより決定してよい。ヒト、モルモット、ラットおよびマウスのヒスタミンＨ４受容体の予測されるアミノ酸配列は本明細書に記述され、そして、ヒスタミンＨ４遺伝子のクローン化において補助するために使用してもまたよい。アミノ酸配列全体を決定することは必要でないが、しかし、該タンパク質からの約６ないし８アミノ酸の２領域の直線的配列を、部分的なヒトヒスタミンＨ４受容体のＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅のためのプライマーの調製のため決定する。
【００１６】
適するアミノ酸配列が同定されていれば、それらをコードすることが可能なＤＮＡ配列を合成する。遺伝暗号は縮重であるため、１種以上のコドンが特定の一アミノ酸をコードするのに使用されてよく、そして従って、アミノ酸配列は一組の類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかによりコードされる可能性がある。該組の１メンバーのみがヒスタミンＨ４受容体配列に同一であろうが、しかし、不適正を伴うＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でさえ、ヒスタミンＨ４受容体のＤＮＡにハイブリダイズすることが可能であろう。不適正にされたＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ヒスタミンＨ４受容体ＤＮＡになお十分にハイブリダイズｓて、ヒスタミンＨ４受容体をコードするＤＮＡの同定および単離を可能にするかもしれない。これらの方法により単離されたＤＮＡを使用して、無脊椎動物および脊椎動物の供給源からの多様な細胞型からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングしかつ相同遺伝子を単離することができる。
【００１７】
精製された生物学的に活性のヒスタミンＨ４受容体はいくつかの異なる物理的形態を有してよい。ヒスタミンＨ４受容体は、完全長のネオもしくはプロセシングされないポリペプチドとして、または部分的にプロセシングされたポリペプチドもしくはプロセシングされたポリペプチドの組合せとして存在してよい。完全長のネオヒスタミンＨ４受容体ポリペプチドは、完全長のネオポリペプチドのフラグメントの形成をもたらす特異的タンパク質分解性切断事象により翻訳後に修飾されてよい。これの一例は、小胞体への移動後のシグナルペプチドの切断である。１個のフラグメントもしくはフラグメントの物理的会合物が、ヒスタミンＨ４受容体に関連する完全な生物学的活性を有するかもしれないが、しかしながら、ヒスタミンＨ４受容体活性の程度は、個々のヒスタミンＨ４受容体フラグメントと、物理的に会合されたヒスタミンＨ４受容体ポリペプチドのフラグメントとの間で変動してよい。
【００１８】
本明細書に記述される方法により得られるクローン化されたヒスタミンＨ４受容体ＤＮＡは、適するプロモーターおよび他の適切な転写調節要素を含有する発現ベクター中に分子クローニングすることにより組換え的に発現され、そして原核生物もしくは真核生物宿主細胞に導入されて組換えヒスタミンＨ４受容体タンパク質を産生してよい。こうした操作の技術はＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、上記に完全に記述され、かつ、当該技術分野で公知である。
【００１９】
発現ベクターは、本明細書で、適切な宿主中でのクローン化された遺伝子のコピーの転写およびそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要とされるＤＮＡ配列と定義する。こうしたベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を包含する細菌、藍藻、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞を包含する真菌細胞および動物細胞のような多様な宿主中で真核生物遺伝子を発現するのに使用することができる。
【００２０】
特別に設計されたベクターは、細菌−酵母もしくは細菌−動物細胞もしくは細菌−真菌細胞もしくは細菌−無脊椎動物細胞のような宿主間のＤＮＡの往復を可能にする。適切に構築された発現ベクターは：宿主細胞中での自律複製のための複製起点、選択可能なマーカー、限定された数の有用な制限酵素部位、高コピー数の潜在能力、および活性のプロモーターを含有すべきである。プロモーターは、ＤＮＡに結合しかつＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼを指図するＤＮＡ配列と定義する。強力なプロモーターは、高頻度でｍＲＮＡを開始させかつ至適には宿主の増殖を大きく制限しないものである。発現ベクターは、限定されるものでないがクローニングベクター、改変されたクローニングベクター、特別に設計されたプラスミドもしくはウイルスを挙げることができる。
【００２１】
多様な哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞中で組換えヒトヒスタミンＨ４受容体を発現させてよい。組換えの哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体の発現に適するかもしれない商業的に入手可能な哺乳動物発現ベクターは、限定されるものでないが、ｐＭＡＭｎｅｏ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））、ｐｃＤＮＡ３（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ｐＭＣ１ｎｅｏ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ｐＸＴ１（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ｐＳＧ５（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ｐＣＩｎｅｏ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７５９３）ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ  ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ  ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ  ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ  ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ  ３７４６０）およびＩＺＤ３５（ＡＴＣＣ  ３７５６５）を挙げることができる。
【００２２】
多様な細菌発現ベクターを使用して、細菌細胞中で組換えの哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体を発現させてよい。組換えの哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体の発現に適するかもしれない商業的に入手可能な細菌発現ベクターは、限定されるものでないがｐＥＴベクター（ノヴァジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））およびｐＱＥベクター（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を挙げることができる。
【００２３】
多様な真菌細胞発現ベクターを使用して、酵母のような真菌細胞中で組換えの哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体を発現させてよい。組換えの哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体の発現に適するかもしれない商業的に入手可能な真菌細胞発現ベクターは、限定されるものでないがｐＹＥＳ２（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）発現ベクター（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を挙げることができる。
【００２４】
多様な昆虫細胞発現ベクターを使用して、昆虫細胞中で組換えの哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体を発現させてよい。哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体の組換え発現に適するかもしれない商業的に入手可能な昆虫細胞発現ベクターは、限定されるものでないがｐＢｌｕｅＢａｃＩＩ（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を挙げることができる。
【００２５】
哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体をコードするＤＮＡを、組換え宿主細胞中での発現のための発現ベクター中にクローン化してよい。組換え宿主細胞は、限定されるものでないが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌、酵母のような真菌細胞、限定されるものでないがヒト、ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類起源の細胞系を挙げることができる哺乳動物細胞、ならびに限定されるものでないがショウジョウバエおよびカイコ由来の細胞を挙げることができる昆虫細胞を挙げることができる、原核生物もしくは真核生物細胞であってよい。適することができかつ商業的に入手可能である哺乳動物種由来の細胞系は、限定されるものでないがＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １７１）、Ｌ−細胞およびＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３）を挙げることができる。
【００２６】
発現ベクターは、限定されるものでないが形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポフェクションおよび電気穿孔法を挙げることができる多数の技術のいずれか１種を介して宿主細胞に導入してよい。発現ベクターを含有する細胞をクローン的に繁殖させ、そして個々に分析してそれらが哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質を産生するかどうかを決定する。哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体を発現する宿主細胞クローンの同定は、限定されるものでないが抗哺乳動物ヒスタミンＨ４受容体抗体との免疫学的反応性、および宿主細胞に関連する哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体活性の存在を挙げることができるいくつかの手段により行ってよい。
【００２７】
哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体のＤＮＡの発現はまた、インビトロで調製された合成ｍＲＮＡを使用して実施してもよい。合成ｍＲＮＡもしくは哺乳動物ヒスタミンＨ４受容体産生細胞から単離されたｍＲＮＡは、限定されるものでないがコムギ胚芽抽出物および網状赤血球抽出物を挙げることができる多様な細胞を含まない系で効率的に翻訳することができ、ならびに、限定されるものでないがカエル卵母細胞への微小注入法を挙げることができる細胞に基づく系で効率的に翻訳することができ、カエル卵母細胞への微小注入法が一般に好ましい。
【００２８】
至適レベルの哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体活性および／もしくは哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質を生じる哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体のＤＮＡ配列（１種もしくは複数）を決定するために、限定されるものでないが以下、すなわちおよそ塩基１から塩基１１７３まで（これらの数字は最初のメチオニンの第一のヌクレオチドおよび最初の終止コドンの前の最後のヌクレオチドに対応する）の４４４９５ｋＤａのタンパク質をコードするヒトヒスタミンＨ４受容体のｃＤＮＡの完全長の読取り枠、ならびにヒトヒスタミンＨ４受容体タンパク質をコードするｃＤＮＡの部分を含有するいくつかの構築物、を挙げることができる、ヒトヒスタミンＨ４受容体ＤＮＡ分子を構築することができる。全部の構築物は、ヒトヒスタミンＨ４受容体のｃＤＮＡの５’もしくは３’非翻訳領域のいずれも含有しないか、全部もしくは部分を含有するよう設計することができる。ヒトヒスタミンＨ４受容体の活性およびタンパク質発現のレベルを、適切な宿主細胞中へのこれらの構築物の単独でおよび組合せでの双方の導入後に測定することができる。一過性アッセイで至適の発現を生じる哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体ＤＮＡカセットの決定後に、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体のＤＮＡ構築物を、限定されるものでないが哺乳動物細胞、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および酵母、ビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を挙げることができる宿主細胞中での発現のため、多様な発現ベクターに導入する。
【００２９】
宿主細胞のトランスフェクション体および微小注入された卵母細胞を使用して、以下の方法により、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体の活性のレベルおよび哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質のレベルの双方をアッセイしてよい。組換え宿主細胞の場合、これは、１種もしくはそれ以上のフラグメントもしくはサブユニットをコードする哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体のＤＮＡを含有する１種またはおそらく２種もしくはそれ以上のプラスミドのコトランスフェクションを必要とする。卵母細胞の場合、これは、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質をコードするＲＮＡの共注入を必要とする。発現を見込む適切な時間の期間の後に、細胞のタンパク質を例えば３５Ｓ−メチオニンで２４時間代謝的に標識し、その後、細胞ライセートおよび細胞培養物上清を収穫し、そして哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質に対し向けられたポリクローナル抗体を用いる免疫沈降にかける。
【００３０】
哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体活性の他の検出方法は、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体のｃＤＮＡでトランスフェクトされた全細胞もしくは哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体のｍＲＮＡを注入された卵母細胞中での哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体の活性の直接測定を必要とする。哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体の活性は、特異的リガンド結合、例えば［Ｈ３］−ヒスタミン、および哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体のＤＮＡを発現する宿主細胞の生物学的特徴により測定する。哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体を発現する組換え宿主細胞および卵母細胞の場合、ｃＡＭＰの定量および受容体結合技術が、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体の活性を測定しかつ哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質を定量するのに使用することができる方法の適する例である。
【００３１】
宿主細胞中での哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質のレベルは、免疫親和性および／もしくはリガンド親和性技術によってもまた定量される。哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体を発現する細胞は、細胞膜に結合する放射活性のヒスタミンもしくはヒスタミンＨ４リガンドの量を測定することにより、発現された哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体分子の数についてアッセイすることができる。哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体に特異的な親和性ビーズ、もしくは哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体に特異的な抗体を使用して、例えば３５Ｓ−メチオニン標識もしくは未標識の哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質を単離する。標識された哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。標識されない哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質は、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体に特異的な抗体を使用するウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡもしくはＲＩＡアッセイにより検出する。
【００３２】
遺伝暗号は縮重であるため、１種以上のコドンが特定の一アミノ酸をコードするのに使用されてよく、そして従って、アミノ酸配列は一組の類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかによりコードされることができる。該組の１メンバーのみが哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体配列に同一であろうが、しかし、適切な条件下で不適正をもつＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でさえ、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体のＤＮＡにハイブリダイズすることが可能であろう。代替の条件下で、不適正にされたＤＮＡオリゴヌクレオチドは、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体のＤＮＡになおハイブリダイズして哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体をコードするＤＮＡの同定および単離を可能にするかもしれない。異なる種は異なるコドン使用頻度の好みを有するため、特定の発現宿主の至適化されたコドン使用頻度を含有する哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体のサイレント突然変異を調製することが好ましい。
【００３３】
特定の生物体からの哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体をコードするＤＮＡを使用して、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体の相同物を他の生物体から単離かつ精製してよい。これを達成するために、第一の哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体のＤＮＡを、適切なハイブリダイゼーション条件下で、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体の相同物をコードするＤＮＡを含有するサンプルと混合してよい。ハイブリダイズされたＤＮＡ複合物を単離してよく、そして相同なＤＮＡをコードするＤＮＡをそれから精製してよい。
【００３４】
特定のアミノ酸をコードする多様なコドン中にかなりの量の冗長が存在することが既知である。従って、本発明はまた、同一のアミノ酸の最後の翻訳をコードする代替コドンを含有するＤＮＡ配列にも向けられる。本明細の目的上、１個もしくはそれ以上の置き換えられたコドンを担持する配列を縮重変異と定義することができる。発現されるタンパク質の最終的な物理的特性を実質的に変えないＤＮＡ配列もしくは翻訳されたタンパク質のいずれか中の突然変異もまた、本発明の範囲内に包含される。例えば、脂肪族アミノ酸アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンの置換、ヒドロキシル残基セリンおよびトレオニンの相互交換、酸性残基アスパラギン酸およびグルタミン酸の交換、アミド残基アスパラギンとグルタミンとの間の置換、塩基性残基リシンおよびアルギニンの交換、ならびに芳香族残基フェニルアラニン、チロシン間の置換は、ポリペプチドの機能性の変化を引き起こさないかもしれない。受容体の機能的特性を変えない突然変異の別の例は、受容体の標的を小胞体内の翻訳に定める多様なシグナルペプチドを発現するキメラ遺伝子の構築である。こうした置換は公知であり、かつ、例えばＷａｔｓｏｎらによりＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ、第４版  ベンガミン  カミングス  パブリッシャーズ  カンパニー（Ｂｅｎｇａｍｉｎ  Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．）に記述される。
【００３５】
ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、天然に存在するペプチドのものと異なる特性を有するペプチドをコードするように変えてよいことが既知である。ＤＮＡ配列を変える方法は、限定されるものでないが部位特異的突然変異誘発もしくはドメインスワッピング（キメラ分析）を挙げることができる。キメラ遺伝子は、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体の遺伝子中の類似のドメインを置き換えるように類似のもしくは異なる遺伝子のドメインを交換することにより製造する。同様に、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体の遺伝子に、遺伝子の同定および単離を助長するための親和性標識のようなドメインを付加する融合遺伝子を製造してよい。哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体の遺伝子の領域を置き換えるための、例えば、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体の遺伝子に、タンパク質の正常の輸送を指図しなおすためのターゲッティング配列を付加するもしくは新たな翻訳後修飾配列を付加する融合遺伝子を製造してよい（例えばネオグリコシル化（ｎｅｏｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）部位）。変えられた特性の例は、限定されるものでないが基質に対する酵素のもしくはリガンドに対する受容体の親和性の変化を挙げることができる。ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列の全部のこうした変化は、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列の元の機能が本明細書に記述されるとおり維持される限りは、本発明の有用な変異体として予期される。
【００３６】
当該技術分野で既知のところの同一性もしくは類似性は、配列の比較により決定されるところの２種もしくはそれ以上のポリペプチド配列または２種もしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該技術分野において、同一性はまた、場合によってはこうした配列の列間の合致により決定されるところのポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列間の配列の関係の程度も意味する。同一性および類似性の双方は容易に計算することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、オックスフォード  ユニバーシティ  プレス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、アカデミック  プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．とＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、ヒューマナ  プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、アカデミック  プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．とＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  ストックトン  プレス（Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９１）。２種のポリヌクレオチドもしくは２種のポリペプチド配列間の同一性および類似性の多数の測定方法が存在する一方、双方の用語は当業者に公知である（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、アカデミック  プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．とＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  ストックトン  プレス（Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．とＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，（１９８８）ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、４８、１０７３）。配列間の同一性もしくは類似性を決定するのに普遍的に使用される方法は、限定されるものでないがＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．とＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，（１９８８）ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、４８、１０７３に開示されるものを挙げることができる。同一性の好ましい決定方法は、試験される配列間の最大の合致を与えるよう設計される。同一性および類似性の決定方法はコンピュータプログラム中で暗号化されている。２種の配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法は、限定されるものでないがＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）、３８７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５、４０３）を挙げることができる。
【００３７】
ポリヌクレオチド（１種もしくは複数）は、一般にいずれかのポリリボヌクレオチドもしくはポリデオキシリボヌクレオチドを指し、それらは修飾されないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい。従って、例えば、本明細書で使用されるところのポリヌクレオチドは、とりわけ、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域もしくは一本鎖、二本鎖および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的には二本鎖または三本鎖、あるいは一本鎖および二本鎖領域の混合物であってよいＤＮＡおよびＲＮＡを含んで成るハイブリッド分子を指す。加えて、本明細書で使用されるところのポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの双方を含んで成る三本鎖領域を指す。こうした領域中の鎖は同一の分子もしくは異なる分子からであってよい。該領域は該分子の１種もしくはそれ以上の全部を包含してよいが、しかしより典型的には該分子のいくつかの一領域のみを伴う。三重らせん領域の分子の１つはしばしばオリゴヌクレオチドである。本明細書で使用されるところのポリヌクレオチドという用語は、１個もしくはそれ以上の修飾された塩基を含有する上述されたところのＤＮＡもしくはＲＮＡを包含する。従って、安定性もしくは他の理由から改変されたバックボーンをもつＤＮＡもしくはＲＮＡは、その用語が本明細書で意図されるとおり「ポリヌクレオチド」である。さらに、わずか２例を挙げれば、イノシンのような異常な塩基もしくはトリチル化塩基のような修飾された塩基を含んで成るＤＮＡもしくはＲＮＡは、該用語が本明細書で使用されるとおりポリヌクレオチドである。多様な修飾がＤＮＡおよびＲＮＡになされ、それが当業者に既知の多くの有用な目的を供することが認識されよう。それが本明細書で使用されるところのポリヌクレオチドという用語は、こうした化学的に、酵素的にもしくは代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチド、ならびにウイルスならびにとりわけ単純型（ｓｉｍｐｌｅ）および複雑型（ｃｏｍｐｌｅｘ）細胞を包含する細胞に特徴的な化学的形態のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドとしばしば称される短いポリヌクレオチドを包含する。
【００３８】
本明細書で使用されるところのポリペプチドという用語は、公知でありかつ教科書および当該技術分野の他の刊行物に記述されているポリペプチドの基本的化学構造を指す。この情況において、該用語は、ペプチド結合により直鎖に相互に結合された２個もしくはそれ以上のアミノ酸を含んで成るいかなるペプチドもしくはタンパク質も指すのに本明細書で使用する。本明細書で使用されるところの該用語は、普遍的に当該技術分野で例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーともまた称される短鎖、ならびに、それの多くの型が存在する、当該技術分野でタンパク質と一般に称されるより長い鎖の双方を指す。ポリペプチドは、２０種の天然に存在するアミノ酸と普遍的に称される２０種のアミノ酸以外のアミノ酸をしばしば含有すること、ならびに、末端アミノ酸を包含する多くのアミノ酸が、プロセシングおよび他の翻訳後修飾のような天然の過程か、しかしまた当該技術分野で公知である化学的修飾技術のいずれかにより所定のポリペプチド中で修飾されてよいことが、認識されるであろう。ポリペプチド中に天然に存在する普遍的な修飾さえ、ここで網羅的に列挙するには多すぎるが、しかし、それらは基本的な教科書およびより詳述された小論、ならびに詳細で長大な研究論文に十分に記述され、そしてそれらは当業者に公知である。本のポリペプチド中に存在してよい既知の修飾は、具体的に説明する数例を挙げれば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸の転位ＲＮＡに媒介される付加、およびユビキチン化などである。こうした修飾は当業者に公知であり、そして学術論文に非常に詳細に記述されている。いくつかのとりわけ普遍的な修飾、例えばグリコシル化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化は、例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．フリーマン  アンド  カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨーク（１９９３）のような最も基本的な教科書に記述される。例えば、ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＶＡＬＥＮＴ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、アカデミック  プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９８３）中、Ｗｏｌｄ，Ｆ．、Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，１〜１２ページ；Ｓｅｉ���ｔｅｒら、（１９９０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２、６２６−６４６およびＲａｔｔａｎら、“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ”，（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３、４８−６２により提供されるもののような多くの詳述された総説がこの主題に関して利用可能である。公知でありかつ上に示されたとおり、ポリペプチドは常に完全に直鎖状でないことが認識されるであろう。例えば、ポリペプチドは一般に、天然のプロセシング事象および天然に起こらない人的操作によりもたらされる事象を包含する翻訳後事象の結果としてであってよい。環状、分枝状および分枝環状のポリペプチドを、同様に非翻訳の天然の過程および全く合成の方法により合成してよい。修飾は、ペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖およびアミノもしくはカルボキシル末端を包含するポリペプチド中のどの場所でも起こることができる。事実、共有修飾によるポリペプチド中のアミノもしくはカルボキシル基または双方の封鎖は、天然に存在するおよび合成のポリペプチド中で普遍的であり、そしてこうした修飾は同様に本発明のポリペプチド中に存在してよい。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）もしくは他の細胞中で作成されたポリペプチドのアミノ末端残基は、タンパク質分解性プロセシングの前にほとんど必ずＮ−ホルミルメチオニンであることができる。該ペプチドの翻訳後修飾の間に、アミノ末端のメチオニン残基が欠失されてよい。従って、本発明は、本発明のタンパク質のメチオニンを含有するおよびメチオニンのないアミノ末端変異体双方の使用を企図する。ポリペプチド中で起こる修飾は、しばしば、それがどのように作成されるかの関数であることができる。例えば宿主中でクローン化された遺伝子を発現させることにより作成されるポリペプチドについて、修飾の性質および程度は、大部分、宿主細胞の翻訳後修飾能力および該ポリペプチドのアミノ酸配列中に存在する修飾シグナルにより決定されることができる。例えば、公知であるとおり、グリコシル化はしばしば例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌宿主中で起こらない。従って、グリコシル化が望ましい場合、ポリペプチドはグリコシル化する宿主、一般に真核生物細胞中で発現させるべきである。昆虫細胞はしばしば哺乳動物細胞と同一の翻訳後グリコシル化を実施し、そして、この理由から、昆虫細胞発現系は、とりわけ本来のグリコシル化パターンを有する哺乳動物タンパク質を効率的に発現させるために開発された。類似の考慮が他の修飾に当てはまる。同一の型の修飾が所定のポリペプチド中のいくつかの部位に同一もしくは変動する程度で存在してよいことが認識されるであろう。また、所定のポリペプチドは多くの型の修飾を含有してよい。一般に、本明細書で使用されるところのポリペプチドという用語は、全部のこうした修飾、とりわけ宿主細胞中でポリヌクレオチドを発現させることにより組換え的に合成されたポリペプチド中に存在するものを包含する。
【００３９】
該用語が本明細書で使用されるところのポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの変異体（１種もしくは複数）は、それぞれ参照ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドと異なるポリヌクレオチドもしくはポリペプチドである。ポリヌクレオチドの変異体は、天然に存在する対立遺伝子変異体のような天然に存在する変異体であってよいか、もしくはそれは天然に存在することが知られていない変異体であってよい。（１）別の参照ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なるポリヌクレオチド。一般に、差異は、参照および変異体のヌクレオチド配列が全体に緊密に類似かつ多くの領域中で同一であるように制限される。下に示されるとおり、変異体のヌクレオチド配列中の変化はサイレントであってよい。すなわち、それらは該ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸を変えなくてよい。変化がこの型のサイレント変化に制限される場合、変異体は参照と同一のアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードすることができる。また下に示されるとおり、変異体のヌクレオチド配列中の変化は、参照ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変えるかもしれない。こうしたヌクレオチド変化は、上で論考されたとおり、参照配列によりコードされるポリペプチド中のアミノ酸の置換、付加、欠失、融合および短縮をもたらすかもしれない。（２）別の参照ポリペプチドとアミノ酸配列が異なるポリペプチド。一般に、差異は、参照および変異体の配列が全体に緊密に類似かつ多くの領域中で同一であるように制限される。変異体および参照ポリペプチドは、１種もしくはそれ以上の置換、付加、欠失、融合および短縮（それらはいずれかの組合せで存在してよい）によりアミノ酸配列が異なってよい。本明細書で使用されるところのヒスタミンＨ４受容体の「機能的誘導体」は、ヒスタミンＨ４受容体の生物学的活性に実質的に類似である生物学的活性（機能的もしくは構造的のいずれか）を所有する化合物である。「機能的誘導体」という用語は、ヒスタミンＨ４受容体の「フラグメント」、「変異体」、「縮重変異体」、「類似物」および「相同物」を包含するか、もしくは「化学的誘導体」を意図している。ポリペプチドの有用な化学的誘導体は当該技術分野で公知であり、そして例えば該ポリペプチド内に含有される反応性有機部位の二次的な化学部分での共有修飾を包含する。公知の架橋試薬が、アミノ、カルボキシルもしくはアルデヒド残基と反応して例えばビオチン、蛍光色素のような親和性標識を導入する、もしくはポリペプチドを固相表面に結合する（例えば親和性樹脂を創製するため）のに有用である。「フラグメント」という用語はヒスタミンＨ４受容体のいかなるポリペプチドサブセットも指すことを意味している。分子は、双方の分子が実質的に類似の構造を有する場合、もしくは双方の分子が類似の生物学的活性を所有する場合に、ヒスタミンＨ４受容体に「実質的に類似」である。従って、２種の分子が実質的に類似の活性を所有する場合、それらは、該分子の一方の構造が他方中で見出されない場合でさえ、もしくは２種のアミノ酸配列が同一でない場合でさえ、変異体であるとみなされる。「類似物」という用語は、ヒスタミンＨ４受容体分子全体もしくはそのフラグメントのいずれかに機能が実質的に類似の分子を指す。配列番号１、５、６もしくは７のいずれか１種の変異体、類似物、誘導体およびフラグメントをコードするポリヌクレオチド、ならびに、その中で数個（ｓｅｖｅｒａｌ）、数個（ａ  ｆｅｗ）、５ないし１０、１ないし５、１ないし３、２、１もしくは０個のアミノ酸残基がいずれかの組合せで置換、欠失もしくは付加されるそれぞれ配列番号２、８、９、１０に示されるポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有する該フラグメントの変異体、類似物および誘導体が、この点についてさらにとりわけ好ましい。配列番号１、５、６もしくは７のいずれか１種の遺伝子の特性および活性を変えないサイレントの置換、付加および欠失がこれらのなかでとりわけ好ましい。保存的置換もまたこの点についてとりわけ好ましい。置換を伴わずに配列番号２、８、９および１０のいずれか１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが最も高度に好ましい。
【００４０】
本発明のさらに好ましい態様は、配列番号２、８、９、１０のいずれか１つで述べられるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびこうしたポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチドに対してそれらの全長にわたって最低７０％同一であるポリヌクレオチドである。あるいは、最低８０％同一である領域を含んで成るポリヌクレオチドが高度に好ましく、最低９０％同一である領域を含んで成るでポリヌクレオチドがより高度に好ましく、そしてこれらの好ましいポリヌクレオチドのなかで最低９５％を伴うものがとりわけ好ましい。さらに、最低９５％を伴うもののなかで最低９７％の同一性をもつものが高度に好ましく、また、これらのなかで最低９８％および最低９９％を伴うものがとりわけ高度に好ましく、最低９９％が最も好ましい。好ましい一態様において本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、配列番号２、８、９もしくは１０のいずれか１種の推定されるアミノ酸配列を特徴とするポリペプチドと実質的に同一の生物学的機能もしくは活性を保持するポリペプチドをコードする。さらに、この点で好ましい態様は、配列番号１、５、６もしくは７のいずれか１種のＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同一の生物学的機能もしくは活性を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。本発明はさらに、本明細書で上述された配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。この点について、本発明はとりわけ、本明細書で上述されたポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書で使用されるところの「ストリンジェントな条件」という用語は、配列間に最低９５％および好ましくは最低９７％の同一性が存在する場合にのみハイブリダイゼーションが起こることができることを意味する。
【００４１】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１、５、６もしくは７のいずれか１種の配列をコードする完全長のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するため、ならびに配列番号１、５、６もしくは７のいずれか１種に対する高い配列の類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するための、ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとして使用してよい。こうしたプローブは一般に最低１５塩基を含むことができる。好ましくは、こうしたプローブは最低３０塩基を有することができ、そして最低５０塩基を有してよい。とりわけ好ましいプローブは最低３０塩基を有することができ、また、５０塩基もしくはより少数を有することができる。例えば、本発明の遺伝子のコーディング領域を、既知のＤＮＡ配列を使用するスクリーニングにより単離してオリゴヌクレオチドプローブを合成してよい。その後、本発明の遺伝子のものに相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドを使用して、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡもしくはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングして、ライブラリーのどのメンバーに該プローブがハイブリダイズするかを決定する。
【００４２】
本発明のポリペプチドは、配列番号２、８、９、１０のいずれか１種のポリペプチド（とりわけ成熟ポリペプチド）、ならびに配列番号２、８、９、１０のいずれか１種のポリペプチドに対する最低７０％の同一性、好ましくは配列番号２、８、９、１０のいずれか１種のポリペプチドに対する最低８０％の同一性、およびより好ましくは配列番号２、８、９、１０のいずれか１種のポリペプチドに対する最低９０％の類似性（より好ましくは最低９０％の同一性）、ならびになおより好ましくは配列番号２、８、９、１０のいずれか１種のポリペプチドに対する最低９５％の類似性（なおより好ましくは最低９７％の同一性）を有するポリペプチドを包含し、そしてまた、最低３０アミノ酸およびより好ましくは最低５０アミノ酸を一般に含有する該ポリペプチドのこうした部分を含むこうしたポリペプチドの部分も包含する。本発明のポリペプチドフラグメントの代表的な例は、例えば配列番号２、８、９、１０のいずれか１種の短縮ポリペプチドを包含する。短縮ポリペプチドは、アミノ末端を包含する連続する一連の残基（すなわち連続的領域、部分（ｐａｒｔ）もしくは部分（ｐｏｒｔｉｏｎ））の欠失、またはカルボキシル末端を包含する連続する一連の残基の欠失、あるいは二重短縮突然変異体でのように２個の連続する一連の残基（１種がアミノ末端を包含しかつ１種がカルボキシル末端を包含する）の欠失を除く、配列番号２、８、９、１０のいずれか１種のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはそれらの変異体もしくは誘導体を包含する。配列番号２、８、９、１０のいずれか１種の配列を特徴とするポリペプチドの構造的もしくは機能的属性を特徴とするフラグメントもまた、本発明の本局面で好ましい。この点についての本発明の好ましい態様は、本発明のポリペプチドのα−らせんおよびα−らせん形成領域、β−シートおよびβ−シート形成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、フレキシブル領域、表面形成領域、基質結合領域、高抗原性指標領域を含んで成るフラグメント、ならびにこうしたフラグメントの組合せを包含する。好ましい領域は本発明のポリペプチドの活性を媒介するものである。類似の活性もしくは改良された活性をもつ、または低下された望ましくない活性をもつものを包含する、本発明の応答調節ポリペプチドの化学的、生物学的もしくは他の活性を有するフラグメントが、この点について最も高度に好ましい。
【００４３】
哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体に対する単一特異性抗体は、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体に対し反応性の抗体を含有する哺乳動物の抗血清から精製されるか、もしくは、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）の技術を使用して哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体と反応性のモノクローナル抗体として調製される。本明細書で使用されるところの単一特異性抗体は、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体に対する均一な結合特徴をもつ単一抗体種もしくは多抗体種と定義する。本明細書で使用されるところの均一な結合は、上述されたところの哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体に関連するもののような、特異的抗原もしくはエピトープに結合する抗体種の能力を指す。哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体に特異的な抗体は、免疫アジュバントを伴うかもしくは伴わないのいずれかの適切な濃度の哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体で、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマなどのような動物（ウサギが好ましい）を免疫化することにより生じられる。
【００４４】
最初の免疫感作前に免疫前血清を収集する。各動物は、許容できる免疫アジュバントを伴う約０．１ｍｇと約１０００ｍｇとの間の哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体を受領する。こうした許容できるアジュバントは、限定されるものでないがフロイントの完全、フロイントの不完全、ミョウバン沈降物、コリネバクテリウム  パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）を含有する油中水型乳剤およびｔＲＮＡを挙げることができる。初期免疫感作は、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）もしくは双方のいずれかでの複数の部位での好ましくはフロイントの完全アジュバント中の哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体よりなる。各動物を定期的間隔で、好ましくは毎週採血して抗体力価を測定する。動物は初期免疫感作後に追加抗原注入を受領してももしくはしなくてもよい。追加抗原注入を受領する動物には、一般に、同一の経路によりフロイントの不完全アジュバント中の等量の抗原を与える。追加抗原注入は、最大の力価が得られるまで約３週間隔で与える。各追加抗原免疫感作後約７日に、もしくは単一免疫感作後ほぼ毎週、動物を採血し、血清を収集し、そしてアリコートを約−２０℃で保存する。
【００４５】
哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体と反応性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、近親交配マウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃを哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体およびそのいずれかのフラグメントで免疫化することにより調製する。マウスは、上に論考されたとおり、等量の許容できるアジュバント中に組み込まれた約０．５ｍｌの緩衝液もしくは生理的食塩水中の約０．１ｍｇないし約１０ｍｇ、好ましくは約１ｍｇの哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体で、ＩＰもしくはＳＣ経路により免疫化する。フロイントの完全アジュバントが好ましい。マウスは第０日に初期免疫感作を受領し、そして約３ないし約３０週間休ませる。免疫化されたマウスに、リン酸緩衝生理的食塩水のような緩衝溶液中の約０．１ないし約１０ｍｇの哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体の１回もしくはそれ以上の追加抗原免疫感作を静脈内（ＩＶ）経路により与える。免疫化されたマウスから当該技術分野で既知の標準的手順により脾を取り出すことにより、抗体陽性マウスからのリンパ球、好ましくは脾リンパ球を得る。ハイブリドーマ細胞は、安定なハイブリドーマの形成を可能にすることができる条件下で、適切な融合パートナー、好ましくは骨髄腫細胞と脾リンパ球を混合することにより生じさせる。融合パートナーは、限定されるものでないが：マウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ  ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ−１９４およびＳｐ  ２／０を挙げることができ、Ｓｐ  ２／０が一般に好ましい。抗体産生細胞および骨髄腫細胞は、分子量約１０００のポリエチレングリコール中で約３０％から約５０％までの濃度で融合する。融合されたハイブリドーマ細胞は、当該技術分野で既知の手順により、ヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリンを補充されたダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中での成長により選択する。上清液を約第１４、１８および２１日に成長陽性のウェルから収集し、そして、抗原として哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体を使用する固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）のようなイムノアッセイにより抗体産生についてスクリーニングする。培養液はオークターロニー沈降アッセイでもまた試験してｍＡｂのアイソタイプを決定する。抗体陽性のウェルからのハイブリドーマ細胞を、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＫｒｕｓｅとＰａｔｅｒｓｏｎ編、アカデミック  プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９７３中、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｓｏｆｔ  Ａｇａｒ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓのソフトアガー技術のような技術によりクローン化する。
【００４６】
モノクローナル抗体は、プリスタンでプライミングされたＢａｌｂ／ｃマウスの、プライミング約４日後の約２×１０６ないし約６×１０６個のハイブリドーマ細胞での注入（マウスあたりおよそ０．５ｍｌ）によりインビボで産生される。細胞導入後およそ８〜１２日に腹水を収集し、そして当該技術分野で既知の技術によりモノクローナル抗体を精製する。
【００４７】
抗哺乳動物ヒスタミンＨ４受容体ｍＡｂのインビトロ調製は、約２％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ中でハイブリドーマを成長させることにより実施して、十分な量の特異的ｍＡｂを得る。ｍＡｂは当該技術分野で既知の技術により精製する。
【００４８】
腹水もしくはハイブリドーマ培養液の抗体力価は、限定されるものでないが沈降法、受動凝集反応、酵素結合免疫吸着抗体（ＥＬＩＳＡ）技術およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）技術を挙げることができる多様な血清学的もしくは免疫学的アッセイにより測定する。類似のアッセイを使用して、体液もしくは組織および細胞抽出物中の哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体の存在を検出する。
【００４９】
哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体のポリペプチドフラグメント、もしくは完全長のネオの哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体ポリペプチド、もしくは個々の哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体のサブユニットに特異的な抗体を製造するのに、単一特異性抗体の上述された製造方法を利用してよいことが、当業者に容易に明らかである。とりわけ、ただ１種の哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体のサブユニットもしくは完全に機能的なヒスタミンＨ４受容体に特異的である単一特異性抗体が生成されるかもしれないことが、当業者に容易に明らかである。
【００５０】
限定されるものでないが哺乳動物細胞もしくは昆虫細胞もしくは細菌を挙げることができるいずれかの組換え宿主中で発現される場合に、ヒスタミンもしくは他のヒスタミンＨ４リガンドに感受性の哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体を形成するタンパク質をコードする、ｐＨ４Ｒと命名されたＤＮＡクローンが同定される。哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体のＤＮＡの発現は、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体で観察される特性の発現をもたらす。
【００５１】
ヒスタミンは、ほぼ全部の生理学的および病態生理学的情況でなんらかの立場で機能する生体アミン伝達物質である。ヒスタミンは、中枢神経系において神経伝達物質および神経調節物質として作用し、炎症およびアレルギー応答を媒介し、気道の機能を調節し、胃中の酸分泌を制御し、心血管系の機能ならびに動脈および静脈の応答を調節し、そして未だ決定されるべき過程に疑いなしに関与している。これらの効果を媒介するヒスタミン受容体は完全には特徴づけられていない。これらの過程においてどのヒスタミン受容体が関与しているかを理解するための一方法は、研究ツールおよび治療的実体としての受容体の化学的調節物質（アゴニスト、アンタゴニストおよびインバースアゴニスト）を開発することである。哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体を発現する組換え宿主細胞を使用して、こうしたアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法のための物質を提供することができる。であるから、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体の本発明は、研究ツールとして有用と判明するかもしれない、またはヒスタミン受容体を直接もしくは間接的に巻き込む障害を治療するための治療薬として使用してよい新たなアゴニストおよびアンタゴニストの一同定方法を直接教示する。ヒスタミンＨ４受容体の化合物の相互作用もしくは調節を検出するためのアッセイは、限定されるものでないが直接リガンド結合アッセイ、競争（もしくは置換）リガンド結合アッセイ、または例えばｃＡＭＰの産生によりリガンドに対する受容体の応答を測定する機能アッセイを挙げることができる。これらのアッセイは当業者に公知であるとは言え、それらは本明細書で教示される組換え分子を得る前には、以前に可能でなかった。
【００５２】
本発明はまた、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現ならびにインビボでの哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質の機能を調節する化合物のスクリーニング方法にも向けられる。これらの活性を調節する化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、もしくは非タンパク質性の有機分子であってよい。化合物は、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現または哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質の機能を増大もしくは減弱させることにより調節するかもしれない。哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現または哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質の機能を調節する化合物は、多様なアッセイにより検出してよい。アッセイは、発現もしくは機能の変化が存在するかどうかを決定する単純な「はい／いいえ（ｙｅｓ／ｎｏ）」アッセイであってよい。アッセイは、試験サンプルの発現もしくは機能を標準サンプルにおける発現もしくは機能のレベルと比較することにより定量的にしてよい。本方法で同定される調節物質は、治療薬、研究ツールおよび診断薬として有用である。
【００５３】
哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体のＤＮＡもしくはＲＮＡ、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体に対する抗体、または哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質を含有するキットを製造してよい。こうしたキットを使用して、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体のＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡを検出するか、またはサンプル中の哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質もしくはペプチドフラグメントの存在を検出する。こうした特徴づけは、限定されるものでないが法廷分析、診断の応用および疫学研究を挙げることができる多様な目的上有用である。
【００５４】
本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組換えタンパク質および抗体を使用して、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体のＤＮＡ、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体のＲＮＡもしくは哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質をスクリーニングしかつそのレベルを測定してよい。組換えタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子および抗体は、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体の検出および型分類に適するキットの処方に役立つ。こうしたキットは、最低１個の容器中に密閉して閉じ込めた状態で保持するのに適する区切られた担体を含むことができる。該担体は、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体を検出するのに適する組換えの哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質もしくは抗哺乳動物ヒスタミンＨ４受容体抗体のような試薬をさらに含むことができる。該担体はまた、標識された抗原もしくは酵素基質などのような検出のための手段も含有してよい。
【００５５】
哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体をコードするＤＮＡ配列に相補的であるヌクレオチド配列を、アンチセンス療法のため合成することができる。これらのアンチセンス分子は、ＤＮＡ、ホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートのようなＤＮＡの安定な誘導体、ＲＮＡ、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡのようなＲＮＡの安定な誘導体、または他の哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体のアンチセンスオリゴヌクレオチド模倣物であってよい。哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体のアンチセンス分子は、微小注入法、リポソーム被包化もしくはアンチセンス配列をもつベクターからの発現により細胞中に導入してよい。哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体のアンチセンス療法は、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体の活性を低下させることが有益である疾患の治療にとりわけ有用であるかもしれない。
【００５６】
哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体の遺伝子治療を、標的生物体の細胞中に哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体を導入するのに使用してよい。哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体の遺伝子は、レシピエント宿主細胞の感染により哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体のＤＮＡの導入を媒介するウイルスベクターに連結することができる。適するウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスなどを包含する。あるいは、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体のＤＮＡは、リガンド−ＤＮＡ複合物もしくはアデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ複合物を使用する受容体に媒介される標的を定められたＤＮＡ導入、リポフェクション、膜融合もしくは直接微小注入法を包含する非ウイルス技術により、遺伝子治療のため細胞中に導入することができる。これらの手順およびそれらの変形は、エクスビボならびにインビボの哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体の遺伝子治療に適する。哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体の遺伝子治療は、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体の活性を上昇させることが有益である疾患の治療にとりわけ有用であるかもしれない。
【００５７】
哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体のＤＮＡ、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体のＲＮＡ、もしくは哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体タンパク質、または哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体の活性の調節物質を含んで成る製薬学的に有用な組成物は、製薬学的に許容できる担体の混合状態によるような既知の方法に従って処方してよい。こうした担体および処方方法の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見出されるかもしれない。有効な投与に適する製薬学的に許容できる組成物を形成するために、こうした組成物は、有効量のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡもしくは調節物質を含有することができる。
【００５８】
本発明の治療もしくは診断組成物は、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体に関係する活性の調節が指示される障害を治療もしくは診断するのに十分な量で個体に投与する。有効量は、個体の病状、体重、性および齢のような多様な因子により変動してよい。他の因子は投与様式を包含する。製薬学的組成物は、皮下、局所、経口および筋肉内のような多様な経路により個体に提供してよい。
【００５９】
「化学的誘導体」という用語は、通常は基礎分子の一部でない付加的な化学的部分を含有する分子を記述する。こうした部分は基礎分子の溶解性、半減期、吸収などを向上させるかもしれない。あるいは、該部分は基礎分子の望ましくない副作用を減弱もしくは基礎分子の毒性を減少させるかもしれない。こうした部分の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓのような多様な教科書に記述される。
【００６０】
本明細書に開示される方法に従って同定される化合物は、いかなる潜在的な毒性も最小限にする一方で哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体もしくはその活性の至適の阻害を得るために、慣例の試験により定義される適切な投薬量で単独で使用してよい。加えて、他の作用物質の共投与もしくは連続投与が望ましいかもしれない。
【００６１】
本発明はまた、本発明の新規治療方法における使用のための適する局所、経口、全身および非経口の製薬学的製剤を提供するという目的も有する。哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体受容体の調節における使用のための有効成分として本発明により同定される化合物もしくは調節物質を含有する組成物は、投与のための慣習的ベヒクル中で広範な治療的投薬形態で投与することができる。例えば、化合物もしくは調節物質は、錠剤、カプセル剤（それぞれ徐放（ｔｉｍｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）および徐放（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）製剤を包含する）、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、溶液、懸濁剤、シロップ剤および乳剤のような経口投薬形態で、もしくは注入により投与することができる。同様に、それらはまた静脈内（ボーラスおよび注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）の双方）、腹腔内、皮下、閉塞を伴うもしくは伴わない局所、または筋肉内の形態で投与してもよく、全部は製薬学的技術の当業者に公知の形態を使用する。有効しかし非毒性の量の所望の化合物を、哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体の調節剤として使用することができる。
【００６２】
該製品の一日投薬量は、患者あたり１日あたり０．０１から１，０００ｍｇまでの広範な範囲にわたって変動してよい。経口投与のためには、該組成物を、好ましくは、治療されるべき患者に対しての投薬量の症候的調節のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０および５０．０ミリグラムの有効成分を含有する割線付もしくは割線を付けられない錠剤の形態で提供する。該薬物の有効量は、通常、１日あたり約０．０００１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重までの投薬量レベルで供給する。該範囲は、より具体的には、１日あたり約０．００１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ体重までである。哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体の調節物質の投薬量は、所望の効果を達成するために組み合わせられる場合に調節される。他方、これらの多様な作用物質の投薬量は、独立に至適化してよく、また、相乗的結果を達成するために組み合わせてよく、ここで、病状は、いずれかの作用物質を単独で使用した場合にそうであろうよりも弱められる。
【００６３】
有利には、本発明の化合物もしくは調節物質は単一の一日用量で投与してよいか、または、総一日投薬量を１日２、３もしくは４回の分割された用量で投与してよい。さらに、本発明の化合物もしくは調節物質は、適する鼻内ベヒクルの局所使用を介して鼻内の形態で、もしくは当業者に公知の経皮皮膚貼付剤の形態を使用して経皮経路を介して投与することができる。経皮送達系の形態で投与されるためには、投薬量の投与はもちろん、投薬量レジメンを通じて間欠的よりむしろ継続的であることができる。
【００６４】
有効成分が別個の投薬製剤中にある１種以上の有効成分を用いる併用療法のためには、有効成分は同時に投与することができるか、もしくはそれらはそれぞれ別個にずらされた時間に投与することができる。
【００６５】
本発明の化合物もしくは調節物質を利用する投薬量レジメンは、患者の型、種、齢、体重、性および医学的病状；治療されるべき病状の重症度；投与経路；患者の腎および肝機能；ならびに使用されるそれらの特定の化合物を包含する多様な因子に従って選択する。通常の熟練の医師もしくは獣医師は、病状の進行を予防、阻止もしくは停止するのに必要とされる薬物の有効量を容易に決定かつ処方することができる。毒性なしに有効性を生じさせる範囲内の薬物の濃度の達成における至適の精度は、標的部位への該薬物の利用可能性の動力学に基づくレジメンを必要とする。これは、薬物の分布、平衡および排泄の考慮を必要とする。
【００６６】
本発明の方法において、本明細書に詳細に記述される化合物もしくは調節物質は有効成分を形成することができ、そして、典型的には、意図される投与形態、すなわち経口の錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤などに関して適して選択されかつ慣習的な製薬学的実務と矛盾しない、適する製薬学的希釈剤、賦形剤もしくは担体（集合的に本明細書で「担体」物質と称される）との混合状態で投与する。
【００６７】
例えば、錠剤もしくはカプセル剤の形態での経口投与のために、有効薬物成分を、エタノール、グリセロール、水などのような経口の非毒性の製薬学的に許容できる不活性担体と組み合わせることができる。さらに、所望のもしくは必要な場合は、適する結合剤、滑沢剤、崩壊剤および着色剤もまた混合物中に組込むことができる。適する結合剤は、制限なしに、デンプン、ゼラチン、ブドウ糖もしくはβ−乳糖のような天然の糖、トウモロコシ甘味料、アラビアゴム、トラガカントもしくはアルギン酸ナトリウムのような天然および合成のガム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、蝋などを包含する。これらの投薬形態で使用される滑沢剤は、制限なしに、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどを包含する。崩壊剤は、制限なしに、デンプン、メチルセルロース、アガー、ベントナイト、キサンタンガムなどを包含する。
【００６８】
液体の形態のためには、有効薬物成分は合成および天然のガム、例えばトラガカント、アラビアゴム、メチルセルロースなどのような適して風味を付けられた懸濁化剤もしくは分散助剤中で組み合わせることができる。使用してよい他の懸濁助剤はグリセリンなどを包含する。非経口投与のためには、滅菌の懸濁剤および溶液が望ましい。静脈内投与が望ましい場合、適する保存剤を一般に含有する等張の製剤を使用する。
【００６９】
有効薬物成分を含有する局所製剤は、例えばアルコール、アロエベラゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡおよびＥ油、鉱物油、ＰＰＧ２ミリスチルプロピオネートなどのような当該技術分野で公知の多様な担体物質と混合して、例えばアルコール性溶液、局所浄化剤、洗顔クリーム、皮膚ゲル、皮膚ローション、およびクリームもしくはゲル製剤のシャンプーを形成することができる。
【００７０】
本発明の化合物もしくは調節物質はまた、小型の単層状小胞、大型の単層状小胞および多層状小胞のようなリポソーム送達系の形態でも投与することができる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンもしくはホスファチジルコリンのような多様なリン脂質から形成することができる。
【００７１】
本発明の化合物は、該化合物分子が結合される個別の担体としてのモノクローナル抗体の使用により送達させてもまたよい。本発明の化合物もしくは調節物質はまた、標的を定めることができる薬物担体としての可溶性ポリマーと結合してもよい。こうしたポリマーは、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェノール、もしくはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリシンを包含することができる。さらに、本発明の化合物もしくは調節物質は、薬物の制御された放出の達成において有用な一分類の生物分解性ポリマー、例えば、ポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、およびヒドロゲルの架橋もしくは両親媒性ブロックコポリマーに結合してもよい。
【００７２】
経口投与のためには、該化合物もしくは調節物質は、カプセル剤、錠剤もしくはボーラスの形態で投与してよいか、あるいは、それらは動物飼料中に混合することができる。カプセル剤、錠剤およびボーラスは、デンプン、タルク、ステアリン酸マグネシウムもしくはリン酸二カルシウムのような適切な担体ベヒクルと組合せの有効成分より構成される。これらの単位投薬形態は、均一な混合物が得られるような希釈剤、増量剤、崩壊剤および／もしくは結合剤を包含する、適する微細に粉末にされた不活性成分と有効成分を緊密に混合することにより製造する。不活性成分は、該化合物もしくは調節物質と反応することができずかつ治療されている動物に対し非毒性であるものである。適する不活性成分は、デンプン、乳糖、タルク、ステアリン酸マグネシウム、植物性ガムおよび油などを包含する。これらの製剤は、治療されるべき動物種の大きさおよび型、ならびに感染の型および重症度のような多数の因子に依存して、広範に変動する量の有効成分および不活性成分を含有してよい。有効成分は、該化合物を飼料と単純に混合することにより、もしくは飼料の表面に該化合物を塗布することにより、飼料への添加物として投与してもまたよい。あるいは、有効成分を不活性担体と混合してよく、そして、生じる組成物をその後、飼料と混合するかもしくは直接動物に給餌するかのいずれかであってよい。適する不活性担体はコーンミール、シトラスミール、醗酵残渣、粗挽きダイズ、乾燥穀物などを包含する。有効成分は、最終的な組成物が０．００１から５重量％までの有効成分を含有するように、粉砕、攪拌、微粉砕もしくは混転によりこれらの不活性担体と緊密に混合する。
【００７３】
該化合物もしくは調節物質は、あるいは、不活性液体担体に溶解された有効成分よりなる製剤の注入を介して非経口で投与してよい。注入は筋肉内、前胃内、気管内もしくは皮下のいずれかであってよい。注入可能な製剤は適切な不活性液体担体と混合された有効成分よりなる。許容できる液体担体は、ラッカセイ油、綿実油、ゴマ油などのような植物油、ならびにソルケタール、グリセロールホルマルなどのような有機溶媒を包含する。一代替として、水性の非経口製剤もまた使用してよい。植物油が好ましい液体担体である。該製剤は、最終的な製剤が０．００５から１０重量％までの有効成分を含有するような、液体担体中に有効成分を溶解もしくは懸濁することにより製造する。
【００７４】
該化合物もしくは調節物質の局所適用は、水性溶液もしくは懸濁液として本化合物もしくは調節物質を含有する液体の飲薬もしくはシャンプーの使用により可能である。これらの製剤は、一般にベントナイトのような懸濁化剤を含有し、そして通常は消泡剤もまた含有することができる。０．００５から１０重量％までの有効成分を含有する製剤が許容できる。好ましい製剤は０．０１から５重量％までの本化合物もしくは調節物質を含有するものである。
【００７５】
以下の実施例は、しかしながらそれにそれを制限することなく本発明を具体的に説明する。
実施例１
ヒトヒスタミンＨ４受容体のＤＮＡのクローニング（ｐＨ４Ｒ）
ｃＤＮＡ合成：
第一鎖の合成：ｃＤＮＡ合成キット（ライフ  テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を使用してｃＤＮＡを合成するのに、およそ５μｇのヒト骨髄ｍＲＮＡ（クローンテック（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ））を使用した。２μｌのＮｏｔＩプライマーアダプターを５μｌのｍＲＮＡに添加し、そして混合物を７０℃に１０分間加熱しかつ氷上に置いた。以下の試薬、すなわち４μｌの５×第一鎖緩衝液（２５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３７５ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、２μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ（ヌクレオチド三リン酸）混合物および１μｌのＤＥＰＣ処理水を氷上で添加した。反応を４２℃で５分間インキュベートした。最後に、５μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ＩＩを添加し、そして４２℃でさらに２時間インキュベートした。反応を氷上で停止した。
第二鎖の合成：第一鎖の産物を水で９３μｌに調節し、そして、以下の試薬、すなわち３０μｌの５×第二鎖緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．９）、４５０ｍＭ  ＫＣｌ、２３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．７５ｍＭ  β−ＮＡＤ＋、５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４）、３μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ（ヌクレオチド三リン酸）、１μｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ（１０単位）１μｌのＲＮアーゼＨ（２単位）、４μｌのＤＮＡ  ｐｏｌ  Ｉ（１０単位）を氷上で添加した。反応を１６℃で２時間インキュベートした。第二鎖合成からのＤＮＡをＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理し、そして１６℃に置いてＤＮＡ端を平滑にした。二本鎖ｃＤＮＡを、１５０μｌのフェノールおよびクロロホルムの混合物（１：１、ｖ：ｖ）で抽出し、そして、０．５容量の７．５Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃおよび２容量の無水エタノールで沈殿させた。ペレットを７０％エタノールで洗浄しかつ３７℃で乾燥して残余のエタノールを除去した。二本鎖ＤＮＡのペレットを２５μｌの水に再懸濁し、そして以下の試薬；１０μｌの５×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液、１０μｌのＳａｌ１アダプターおよび５μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加した。成分を穏やかに混合しかつ１６℃で一夜連結した。ライゲーション混合物をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールで抽出し、徹底的にボルテックス攪拌し、そして室温で１４，０００×ｇで５分間遠心分離して層を分離した。水層を新たなチューブに移し、そして容量を水で１００ｍｌに調節した。精製されたＤＮＡを、クロマスピン（ｃｈｒｏｍａｓｐｉｎ）１０００カラム（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））上で大きさで選択して、より小さいｃＤＮＡ分子を分離した。二本鎖ＤＮＡを、Ｎｏｔ１制限酵素で３７℃で３〜４時間消化した。制限消化物を０．８％低溶融アガロースゲル上で電気泳動した。１〜５ｋｂの範囲のｃＤＮＡを切り出し、そしてゲルザイム（Ｇｅｌｚｙｍｅ）（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用して精製した。生成物をフェノール：クロロホルムで抽出し、そしてＮＨ４ＯＡｃおよび無水エタノールで沈殿させた。ペレットを７０％エタノールで洗浄しかつ１０ｍｌの水に再懸濁した。
ベクターへのｃＤＮＡのライゲーション：ｃＤＮＡを５本のチューブ（各２μｌ）に分割し、そして、４．５μｌの水、２μｌの５×ライゲーション緩衝液、１μｌのｐ−ＳｐｏｒｔベクターＤＮＡ（Ｓａｌ−１／Ｎｏｔ１で切断されかつホスファターゼ処理された）および０．５μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加することにより、ライゲーション反応を始めた。ライゲーションを４０℃で一夜インキュベートした。
電気穿孔法による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中への連結されたｃＤＮＡの導入：
ライゲーション反応の容量を水で２０μｌの総容量に調節した。５ｍｌの酵母ｔＲＮＡ、１２．５ｍｌの７．５Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃおよび７０ｍｌの無水エタノール（−２０℃）を添加した。混合物を徹底的にボルテックス攪拌し、そして直ちに１４，０００×ｇで室温で２０分間遠心分離した。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、そして各ペレットを５ｍｌの水に再懸濁した。全５個のライゲーション（２５ｍｌ）を合わせ、そして、１００μｌのＤＨ１０Ｂ電気コンピテント細胞（ライフ  テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を、１μｌのＤＮＡを用いて電気穿孔し（全体で２０回の電気穿孔）、その後アンピシリンプレート上に広げて（ｐｌａｔｅ  ｏｕｔ）、１μｌあたりの組換え体の数（ｃｆｕ）を決定した。ライブラリー全体を２リットルのスーパーブロス（Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ）に接種し、そしてプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のマキシ  プレップ（Ｍａｘｉ  Ｐｒｅｐ）キットを使用してマキシプレップを作成し、そして塩化セシウム勾配上で精製した。
ライブラリーのスクリーニング：
上で構築されたライブラリーの１μｌのアリコートを、エレクトロマックス（Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｘ）ＤＨ１０Ｂ細胞（ライフ  テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））に電気穿孔した。ＳＯＣ培地で容量を１ｍｌに調節し、そして振とうしながら３７℃で１時間インキュベートした。その後、ライブラリーを、ＬＢを含有する５０  １５０ｃｍ２プレート上にプレートあたり５０００コロニーの密度に広げた。これらを３７℃で一夜成長させた。
【００７６】
ヒスタミンＨ４受容体のプローブは、以下のプライマー対を使用するポリメラーゼ連鎖反応により生成させた。５’オリゴ：５’ＡＣＴＡＧＡＡＴＴＣＡＣＣＧＴＧＡＴＧＣＣＡＧＡＴＡＣＴＡＡＴＡＧＣＡＣＡ３’［配列番号１］および３’オリゴ：５’ＡＴＧＣＡＧＧＡＴＣＣＡＧＣＡＴＴＴＧＡＧＡＣＴＧＡＣＡＧＧＴＡＴ３’［配列番号２］。最終的なプローブの配列を図６に示す。増幅は、５０〜６０℃のアニーリング温度および鋳型としてヒト胸腺ｃＤＮＡを用いて３５回循環した。生成されたＰＣＲフラグメント（４００〜５００ｂｐ）を、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントおよびオリゴ標識キット（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を使用して３２Ｐ標識した。その後、Ｓ−２００カラム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を通る１回の通過によりフラグメントを浄化した。
【００７７】
ライブラリーのコロニーをニトロセルロースフィルター上に持ち上げ、そしてＵＶ照射（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を介して架橋する。フィルターを緩衝液（５０ｍＭトリス、１Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）中４２℃で３回洗浄した。その後、サケ精子ＤＮＡ（５０ｍｇ、煮沸された）を含む１：１のサザン  プレハイブ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｐｒｅｈｙｂ）：ホルムアミド中でフィルターを４２℃で６時間プレハイブリダイズさせた。フィルターをその後、プローブ（１×１０６カウント／ｍｌ）と一夜ハイブリダイズさせた。その後、フィルターを２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで室温で１５分間１回、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで４５℃で各３０分間２回洗浄した。フィルターをその後プラスチックラップで包み、そしてフィルム（コダック（Ｋｏｄａｋ））に−８０℃で一夜露光した。
【００７８】
陽性クローンを同定した。生じる陽性物を元のプレートから円形に抜き取り、ＬＢ中３７℃で４５分間インキュベートし、そして一夜再プレート培養した。フィルターに持ち上げ／ハイブリダイズ／洗浄／コロニーを拾う手順を、個別のｃＤＮＡを表す単一のクローン（１個もしくは複数）が単離されるまで繰り返した。
【００７９】
ヒトヒスタミンＨ４受容体についてのスクリーニングから、全部のｃＤＮＡクローンを単離かつ配列決定した。１個のクローンｐＨ４Ｒが１１７３ｂｐの挿入物を含有した（図１）。この配列は、ヌクレオチド１から１１７３までの１個の見かけの読取り枠を有した。この読取り枠は３７１アミノ酸の１個のタンパク質をコードした（図２）。
実施例４
哺乳動物発現ベクター中へのヒトヒスタミンＨ４受容体のｃＤＮＡのクローニング
ヒトヒスタミンＨ４受容体のｃＤＮＡ（集合的にｐＨ４Ｒと称される）を、哺乳動物発現ベクターｐＣＩｎｅｏにクローン化した。ヒトヒスタミンＨ４受容体のｃＤＮＡクローンをヒト胸腺ｃＤＮＡライブラリーから単離した。完全長のｃＤＮＡを、クローニングのためのＥｃｏＲ１（５’ＡＣＴ  ＡＧＡ  ＡＴＴ  ＣＧＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＣＣ  ＡＧＡ  ＴＡＣ  ＴＡＡ  ＴＡＧ  ＣＡＣＡ３’）［配列番号３］およびＮｏｔ１（５’ＡＣＴ  ＡＣＴ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＴＡＡ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＡＣＴ  ＧＡＣ  ＣＧＡ  ＣＴＧＴ３’）［配列番号４］部位をもつ特異的プライマーを使用するＰＣＲのための鋳型として使用した。ＰＣＲ産物をカラム（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）からのウィザード（Ｗｉｚａｒｄ）ＰＣＲ  ＤＮＡ精製キット）で精製し、そしてＮｏｔ  ＩおよびＥｃｏＲ１（ＮＥＢ）で消化して付着端を創製した。産物を低溶融アガロースゲル電気泳動により精製した。ｐＣＩｎｅｏベクターをＥｃｏＲ１およびＮｏｔ１酵素で消化し、そしてその後低溶融アガロースゲル上で精製した。直鎖状のベクターを使用して、ヒトヒスタミンＨ４受容体のｃＤＮＡ挿入物に連結した。組換え体を単離し、ヒトヒスタミンＨ４受容体と呼称し、そしてＣａＰＯ４−ＤＮＡ沈殿法により哺乳動物細胞（ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞）をトランスフェクトするのに使用した。安定な細胞クローンをＧ４１８の存在下での成長により選択した。単一のＧ４１８耐性クローンを単離し、そして無傷のヒトヒスタミンＨ４受容体遺伝子を含有することが示された。ヒトヒスタミンＨ４受容体のｃＤＮＡを含有するクローンを、（Ｋｏｎｉｇ、Ｍａｈａｎら  １９９１）の方法に従ったヒスタミンに応答してのアデニル酸シクラーゼの阻害を測定すること、もしくはフラッシュプレート（Ｆｌａｓｈｐｌａｔｅ）（ＮＥＮ）を使用するラジオイムノアッセイによりｃＡＭＰ蓄積を直接測定することにより、ｐＨ４Ｒの発現について分析した。発現はまた、［３Ｈ］−ヒスタミン結合アッセイ（Ｃｌａｒｋ、Ｋｏｒｔｅら  １９９２）を使用しても分析した。ヒトヒスタミンＨ４受容体をコードするＤＮＡを含有する組換えプラスミドを使用して、哺乳動物ＣＯＳ７もしくはＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３もしくはＬ−細胞またはＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を形質転換した。
【００８０】
ヒトヒスタミンＨ４受容体を安定にもしくは一過性に発現する細胞を使用して、ヒトヒスタミンＨ４受容体の発現および［３Ｈ］−ヒスタミン結合活性について試験する（図４）。これらの細胞を使用して、ヒトヒスタミンＨ４受容体を調節、阻害もしくは活性化する、および放射活性のヒスタミン結合について競争するそれらの能力について、他の化合物を同定かつ検査する。
【００８１】
プロモーターに関して正の向きにヒトヒスタミンＨ４受容体のｃＤＮＡを含有するカセットを、プロモーターの３’の適切な制限部位に連結し、そして制限部位マッピングおよび／もしくは配列決定により同定する。これらのｃＤＮＡ発現ベクターを、限定されるものでないが電気穿孔法を挙げることができる標準的方法、もしくは化学的手順（陽イオン性リポソーム、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム）により、線維芽細胞性宿主細胞、例えばＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）およびＣＶ−１  ｔａｔ［Ｓａｃｋｅｖｉｔｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１５７５（１９８７）］、２９３、Ｌ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６３６２）、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１０）に導入する。トランスフェクトされた細胞および細胞培養物上清を収穫し、そして本明細書に記述されるところのヒトヒスタミンＨ４受容体の発現について分析する。
【００８２】
哺乳動物の一過性発現に使用されるベクターの全部を、ヒトヒスタミンＨ４受容体を発現する安定な細胞系を確立するのに使用することができる。発現ベクターにクローン化された、変えられていないヒトヒスタミンＨ４受容体のｃＤＮＡ構築物は、ヒトヒスタミンＨ４受容体タンパク質を作成するよう宿主細胞のプログラムを作ると期待される。トランスフェクション宿主細胞は、限定されるものでないがＣＶ−１−Ｐ［Ｓａｃｋｅｖｉｔｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１５７５（１９８７）］、ｔｋ−Ｌ［Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７）］、ＮＳ／０およびｄＨＦｒ−ＣＨＯ［ＫａｕｆｍａｎとＳｈａｒｐ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１、（１９８２）］を挙げることができる。
【００８３】
限定されるものでないがＧ４１８、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ；ヒグロマイシン、ヒグロマイシン−Ｂホスホトランスフェラーゼ；ＡＰＲＴ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを挙げることができる薬物選択プラスミドとのヒトヒスタミンＨ４受容体のｃＤＮＡを含有するいずれかのベクターのコトランスフェクションは、安定にトランスフェクトされたクローンの選択を見込むことができる。ヒトヒスタミンＨ４受容体のレベルは本明細書に記述されるアッセイにより定量する。
【００８４】
ヒトヒスタミンＨ４受容体のｃＤＮＡ構築物はまた、最高の可能なレベルのヒトヒスタミンＨ４受容体を合成する哺乳動物細胞クローンの産生のための増幅可能な薬物耐性マーカーを含有するベクターにも連結される。細胞へのこれらの構築物の導入後に、適切な作用物質を用いて該プラスミドを含有するクローンを選択し、そして、増大する用量の作用物質中での選択により、高コピー数のプラスミドをもつ過剰発現するクローンの単離を達成する。
【００８５】
組換えヒトヒスタミンＨ４受容体の発現は、哺乳動物宿主細胞への完全長のヒトヒスタミンＨ４受容体のｃＤＮＡのトランスフェクションにより達成される。
ヒトヒスタミンＨ４受容体の特徴づけ
ヒトＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞をｐＨ４Ｒでトランスフェクトし、そしてネオマイシンの存在下で１０日間選択した。個別のコロニーを拾いそして６穴皿中で成長させた。その後細胞を９６穴プレートでプレート培養しかつコンフルエンスまで成長させた。細胞をイソブチルメチルキサンチン（１ｍＭ）とともに２０分間インキュベートした。細胞をその後、ヒスタミン（１００ｐＭ〜１００μＭ）で５分間刺激した。その後、細胞をフォルスコリン（３μＭ）で刺激しかつ３７℃で２０分間インキュベートさせた。細胞をその後０．１Ｎ塩酸で処理した。その後、細胞を凍結および融解した。上清のアリコートをその後、標準的ｃＡＭＰラジオイムノアッセイキット（フラッシュプレート（Ｆｌａｓｈｐｌａｔｅ）、ＮＥＮ）を使用してそれらの環状ＡＭＰ含量について分析した。フォルスコリン処理はｃＡＭＰの細胞内濃度を上昇させる。フォルスコリンに応答してｃＡＭＰ含量を減少させることによりヒスタミンに応答したいかなる細胞も、活性の機能的ヒトヒスタミンＨ４受容体を発現しているとみなした。本明細書に記述されるヒトヒスタミンＨ４受容体をコードするＤＮＡ分子から発現された組換えヒトヒスタミンＨ４受容体は、ヒスタミンにより特異的に活性化されることが示された。
実施例５
組換えヒトヒスタミンＨ４受容体での結合アッセイ
ｐＨ４Ｒで一過性にトランスフェクトしかつ１５０ｃｍ２組織培養皿中で成長させたＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞もしくはＣＯＳ７細胞。細胞を生理的食塩水溶液で洗浄し、細胞掻き取り器で掻き取り、そして遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分）により収集した。ヒトヒスタミンＨ４受容体を発現するＳＫ−Ｎ−ＭＣもしくはＣＯＳ７細胞は、３Ｈ−ヒスタミンを高親和性で結合する（図４）。ポリトロン組織ホモジェナイザーを用いる２０ｍＭトリス−ＨＣｌ中での細胞ペレットの高速で１０秒間の均質化により細胞膜を調製する。ホモジェネートを１０００ｒｐｍで４℃で５分間遠心分離する。その後上清を収集しかつ２０，０００×ｇで４℃で２５分間遠心分離する。最終的なペレットを５０ｍＭトリス−ＨＣｌに再懸濁する。細胞膜を過剰のヒスタミン（１００００ｎＭ）の存在もしくは非存在下に３Ｈ−ヒスタミン（．５ｎＭ〜７０ｎＭ）とともにインキュベートする。インキュベーションは室温で４５分間起こる。ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）ＧＦ／Ｃフィルターでの迅速濾過により膜を収穫し、そして氷冷５０ｍＭトリスＨＣｌで４回洗浄する。その後フィルターを乾燥し、シンチラントと混合しかつ放射活性について計数する。ヒトヒスタミンＨ４受容体を発現するＳＫ−Ｎ−ＭＣもしくはＣＯＳ７細胞を使用して、多様な濃度の阻害剤もしくは試験されるべき化合物の存在下で上述された反応をインキュベートすることにより、他の化合物の結合の親和性および３Ｈ−リガンド結合を置き換えるそれらの能力を測定する。
【００８６】
実施例６
ヒトヒスタミンＨ４受容体タンパク質の一次構造
ｐＨ４Ｒ受容体のヌクレオチド配列は約１１７３塩基対の単一の大型の読取り枠を示した。最初の読み枠のメチオニンが、１個の読取り枠（約４４４９５の推定される分子量（Ｍｒ）をもつヒトヒスタミンＨ４受容体タンパク質を予測する）の開始コドンと指定された。
【００８７】
予測されたヒトヒスタミンＨ４受容体タンパク質をヌクレオチドおよびタンパク質データベースと整列させ、そしてヒトヒスタミンＨ１、ヒトヒスタミンＨ２受容体、およびヒトヒスタミンＨ３受容体と関係づけられることを見出した。ヒトヒスタミンＨ４受容体中のアミノ酸のおよそ２５％が高度に保存され、ヒスタミンＨ２受容体内の最低２５％、ヒスタミンＨ１受容体と２８％、ヒトＨ３受容体と３８％、および生体アミンのＧタンパク質共役型受容体のファミリーとおよそ２５％のアミノ酸の同一性を示した。７個の保存された疎水性ドメインのような、このファミリーの受容体で見出される保存されたモチーフは、ヒトヒスタミンＨ４受容体の配列中でもまた見出された。ヒトヒスタミンＨ４受容体タンパク質は、全部の生体アミン受容体の第三の膜貫通ドメイン中に見出される保存されたアスパラギン酸残基を含有した。ヒトヒスタミンＨ４受容体タンパク質は、全部の生体アミン受容体の第一の膜貫通ドメイン中に見出される保存されたアスパラギン残基を含有した。ヒトヒスタミンＨ４受容体タンパク質は、全部の生体アミン受容体の第三の膜貫通ドメイン中に見出される保存されたアルギニン残基を含有した。ヒトヒスタミンＨ４受容体タンパク質は、全部の生体アミン受容体の第四の膜貫通ドメイン中に見出される保存されたトリプトファン残基を含有した。ヒトヒスタミンＨ４受容体タンパク質は、全部の生体アミン受容体の第五の膜貫通ドメイン中に見出される保存されたフェニルアラニン残基を含有した。ヒトヒスタミンＨ４受容体タンパク質は、全部の生体アミン受容体の第六の膜貫通ドメイン中に見出される保存されたプロリン残基を含有した。ヒトヒスタミンＨ４受容体タンパク質は、全部の生体アミン受容体の第七の膜貫通ドメイン中に見出される保存されたチロシン残基を含有した。
実施例７
ヒトヒスタミンＨ４受容体ｃＤＮＡの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターへのクローニング
組換えヒトヒスタミンＨ４受容体は、限定されるものでないがｐＥＴ系列（ノヴァジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））を挙げることができる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターへのヒトヒスタミンＨ４受容体発現カセットの導入後に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で産生される。ｐＥＴベクターは、ヒトヒスタミンＨ４受容体の発現を、しっかりと調節されるバクテリオファージＴ７プロモーターの制御下に置く。誘導可能なｌａｃプロモーターにより駆動されるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体の１コピーを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主へのこの構築物の導入後、適切なｌａｃ基質（ＩＰＴＧ）が培養物に添加される場合にヒトヒスタミンＨ４受容体の発現が誘導される。発現されるヒトヒスタミンＨ４受容体のレベルは本明細書に記述されるアッセイにより測定される。
【００８８】
ヒトヒスタミンＨ４受容体の読取り枠全体をコードするｃＤＮＡを、ｐＥＴ［１６］１１ａのＮｄｅＩ部位に挿入する。配列分析により正の向きの構築物を同定し、そして発現宿主株ＢＬ２１を形質転換するのに使用する。その後、形質転換体を使用して、ヒトヒスタミンＨ４受容体タンパク質の産生のため培養物を接種する。培養物はＭ９もしくはＺＢ培地中で成長させてよく、その処方は当業者に既知である。ＯＤ６００＝１．５への成長後に、ヒトヒスタミンＨ４受容体の発現を、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて３７℃で３時間誘導する。
実施例８
昆虫細胞中での発現のためのバキュロウイルス発現ベクターへのヒトヒスタミンＨ４受容体のｃＤＮＡのクローニング
ＡｃＮＰＶウイルスのゲノム由来であるバキュロウイルスベクターを、Ｓｆ９系統の昆虫細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ番号１７１１）中でｃＤＮＡの高レベル発現を提供するよう設計する。ヒトヒスタミンＨ４受容体のｃＤＮＡを発現する組換えバキュロウイルスを、以下の標準的方法（インヴィトロジェン  マックスバック  マニュアル（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍａｘｂａｃ  Ｍａｎｕａｌ））により調製する。すなわち、ヒトヒスタミンＨ４受容体のｃＤＮＡ構築物を、ｐＡＣ３６０およびＢｌｕｅＢａｃベクター（インヴィトロジェン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ））を包含する多様なバキュロウイルス導入ベクター中のポリへドリン遺伝子中に連結する。組換えバキュロウイルスを、Ｓｆ９細胞中へのバキュロウイルス導入ベクターおよび直鎖状にされたＡｃＮＰＶゲノムＤＮＡ［Ｋｉｔｔｓ，Ｐ．Ａ．、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１８：５６６７（１９９０）］のコトランスフェクション後の相同的組換えにより生成させる。組換え体のｐＡＣ３６０ウイルスを感染した細胞中での封入体の非存在により同定し、また、組換え体のｐＢｌｕｅＢａｃウイルスはβ−ガラクトシダーゼ発現に基づき同定する（Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．とＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．、Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｅｘｐ．Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５）。プラーク精製後に、本明細書に記述されるアッセイによりヒトヒスタミンＨ４受容体の発現を測定する。
【００８９】
ヒトヒスタミンＨ４受容体の読取り枠全体をコードするｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＢａｃＩＩのＢａｍＨＩ部位に挿入する。配列分析により正の向きの構築物を同定し、そして直鎖状のＡｃＮＰＶ野性型ＤＮＡの存在下でＳｆ９細胞をトランスフェクトするのに使用する。
【００９０】
真正の活性のヒトヒスタミンＨ４受容体が感染した細胞の細胞質中に見出される。活性のヒトヒスタミンＨ４受容体を、感染した細胞から低張もしくは洗剤溶解により抽出する。
実施例９
酵母発現ベクターへのヒトヒスタミンＨ４受容体のｃＤＮＡのクローニング
組換えヒトヒスタミンＨ４受容体が、異種タンパク質の細胞内もしくは細胞外発現を指図するよう設計された発現ベクターへの至適のヒトヒスタミンＨ４受容体のｃＤＮＡシストロンの挿入後に、酵母、ビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で産生される。細胞内発現の場合、ＥｍＢＬｙｅｘ４などのようなベクターを、ヒトヒスタミンＨ４受容体シストロンに連結する［Ｒｉｎａｓ，Ｕ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：５４３−５４５（１９９０）；Ｈｏｒｏｗｉｔｚ  Ｂ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：４１８９−４１９２（１９８９）］。細胞外発現のためには、ヒトヒスタミンＨ４受容体のシストロンを、ヒトヒスタミンＨ４受容体タンパク質のＮＨ２末端に分泌シグナル（酵母もしくは哺乳動物のペプチド）を融合する酵母発現ベクターに連結する［Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｍ．Ａ．、Ｇｅｎｅ  ８５：５１１−５１６（１９８９）；Ｒｉｅｔｔ  Ｌ．とＢｅｌｌｏｎ  Ｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：２９４１−２９４９（１９８９）］。
【００９１】
これらのベクターは、限定されるものでないが、発現されるｃＤＮＡにヒト血清アルブミンシグナルを融合するｐＡＶＥ１＞６［Ｓｔｅｅｐ  Ｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：４２−４６（１９９０）］、および発現されるｃＤＮＡにヒトリゾチームシグナルを融合するベクターｐＬ８ＰＬ［Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：２７２８−２８３２］を挙げることができる。加えて、ヒトヒスタミンＨ４受容体は、ベクターｐＶＥＰを利用してユビキチンに結合された融合タンパク質として酵母中で発現される［Ｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｊ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：７７１５−７７１９（１９８９）、Ｓａｂｉｎ，Ｅ．Ａ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：７０５−７０９（１９８９）、ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ  Ｄ．Ｐ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：５５１７−５５２３（１９８９）］。発現されるヒトヒスタミンＨ４受容体のレベルは、本明細書に記述されるアッセイにより測定する。
実施例１０−マウス、ラットおよびモルモットのヒスタミンＨ４受容体のｃＤＮＡをクローニングすること
２種のプライマーすなわち順プライマー：５’ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＧＡＣ  ＡＡＡ  ＡＡＣ  ＣＴＴ  ＡＧＡ  ＣＡＴ  ＣＧＡ  ＡＧＴ３’［配列番号１１］および逆プライマー：５’ＡＣＴ  ＧＡＧ  ＡＴＧ  ＡＴＣ  ＡＣＧ  ＣＴＴ  ＣＣＡ  ＣＡＧ  ＧＣＴ  ＣＣＡ３’［配列番号１２］を使用して、マウス脾、ラット脾およびモルモット骨髄のｃＤＮＡライブラリーから５００ｂｐのｃＤＮＡフラグメントを増幅した。これらのｃＤＮＡフラグメントをｐＰＣＲ２ベクター（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にサブクローニングした。生じるＤＮＡ配列はヒトＨ４配列に対する６５〜７０％の同一性を示し、そして各クローンのこの領域を固定領域（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）として使用して、ＲＡＣＥの方法論により５’および３’端をクローン化した。
マウスＨ４の完全長ｃＤＮＡのクローニング
マウスＨ４のｃＤＮＡの５’端を、アダプタープライマー（ＡＰ）：５’ＣＣＡ  ＴＣＣ  ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧＣ３’［配列番号１３］およびマウス遺伝子特異的プライマーＰ１：５’ＣＡＣ  ＴＣＴ  ＧＴＡ  ＡＣＡ  ＡＡＧ  ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＴＣＡ  ＣＡＧ  ＴＣ３’［配列番号１４］を使用して、マウス脾マラスロン−レディ（Ｍａｒａｔｈｒｏｎ−Ｒｅａｄｙ）ｃＤＮＡ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））からｃＤＮＡ端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）法によりＰＣＲ増幅した。マウスＨ４のｃＤＮＡの３’端は、ＡＰおよびマウスＨ４特異的遺伝子プライマーＰ２：５’ＴＧＣ  ＡＴＣ  ＴＣＧ  ＴＣＡ  ＣＴＣ  ＡＧＡ  ＡＡＧ  ＴＣＣ  ＴＣＧ  ＡＡＧ３’［配列番号１５］を使用して、マウス脾マラスロン−レディ（Ｍａｒａｔｈｒｏｎ−Ｒｅａｄｙ）ｃＤＮＡ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））からＲＡＣＥ増幅した。マウスヒスタミンＨ４受容体のｃＤＮＡの５’端および３’端のＲＡＣＥ産物を配列決定し、そして完全なｃＤＮＡ配列を集成した。その後、マウスＨ４のコーディング領域を、２種のプライマーすなわち順プライマー：５’ＡＣＧ  ＡＧＡ  ＡＴＴ  ＣＧＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＴＣ  ＧＧＡ  ＧＴＣ  ＴＡＡ  ＣＡＧ  ＴＡＣ  ＴＧＧ３’［配列番号１６］および逆プライマー：５’ＡＴＧ  ＡＣＡ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＡ  ＧＴＴ  ＧＧＣ  ＡＣＴ  ＣＧＴ  ＧＡＡ  ＧＣＡ  ＡＴＴ  ＣＴＣ３’［配列番号１７］を使用して、マウス脾ｃＤＮＡからＰＣＲ増幅した。完全長のｃＤＮＡのＰＣＲ産物を、哺乳動物発現ベクターｐＣＩＮｅｏ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））にクローン化した。
ラットＨ４のｃＤＮＡのクローニング。
【００９２】
マウスのものに同様に、ラットヒスタミンＨ４受容体のｃＤＮＡの５’および３’端を、上記に記述されたプライマーＡＰと一緒にＰ３：５’ＣＡＴ  ＴＧＧ  ＧＣＣ  ＡＴＴ  ＧＡＣ  ＣＡＡ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  ＣＡＧ  ＴＡＴ  Ｃ３’［配列番号１８］およびＰ４：５’ＴＣＡ  ＴＴＣ  ＡＧＡ  ＡＡＧ  ＴＣＣ  ＡＣＧ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＧＡＧ  ＣＡＧ３’［配列番号１９］を使用して、ラット脾ｃＤＮＡライブラリー（マラソン−レディ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ）ｃＤＮＡ−クローンテック（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ））からＲＡＣＥによりクローン化した。ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ産物を配列決定し、そして完全なｃＤＮＡ配列を集成した。ラットヒスタミンＨ４受容体のコーディング領域を、２種のプライマー、すなわち順プライマー：５’ＡＣＧ  ＴＧＡ  ＡＴＴ  ＣＧＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＴＣ  ＧＧＡ  ＧＴＣ  ＴＡＡ  ＣＧＧ  ＣＡＣ  ＴＧＡ３’［配列番号２０］および逆プライマー：５’ＡＣＴ  ＧＡＴ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＧ  ＡＡＧ  ＣＴＧ  ＧＣＡ  ＣＡＣ  ＡＴＧ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＴＣ３’［配列番号２１］を使用して、ラット脾ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増幅した。完全長のｃＤＮＡ産物を哺乳動物発現ベクターｐＣＩＮｅｏにクローン化した。
完全長のモルモットＨ４のｃＤＮＡのクローニング
モルモット骨髄ＲＮＡを、ＲＮＡ精製キットトライゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）（ギブコ−ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ））を使用して精製し、そして、ｃＤＮＡの第一鎖を、製造元の説明書に従ってスマートｃＤＮＡ合成系（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用して合成した。このｃＤＮＡライブラリーを使用して、製造元により提供されたアダプタープライマーと一緒にモルモットＨ４特異的プライマーＰ５：５’ＡＴＡ  ＡＴＧ  ＡＴＧ  ＴＡＧ  ＧＧＡ  ＧＡＧ  ＣＡＡ  ＡＧＴ  ＡＣＣ  ＡＣＴ３’［配列番号２２］およびＰ６：５’ＡＣＡ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＡＣＡ  ＧＧＡ  ＣＣＣ  ＣＧＡ  ＴＴＣ  ＡＡＧ３’［配列番号２３］を使用して、ＲＡＣＥの方法論によりモルモットヒスタミンＨ４受容体の５’端および３’端をクローン化した。ｒａｃｅ産物を配列決定し、そして完全なｃＤＮＡ配列を集成した。その後、モルモットヒスタミンＨ４受容体の完全なコーディング領域を、２種のプライマー、すなわち順プライマー：５’ＡＣＧ  ＴＣＴ  ＣＧＡ  ＧＧＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＴＴ  ＧＧＣ  ＡＡＡ  ＴＡＡ  ＣＡＧ  ＴＡＣ  ＡＡＴ  ＣＧ３’［配列番号２４］および逆プライマー：５’ＡＣＧ  ＡＣＡ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＴＴＣ  ＡＡＧ  ＴＧＧ  ＡＴＡ  ＴＴＧ  ＡＧＣ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＧＴ３’［配列番号２５］を使用して、骨髄ｃＤＮＡのプールからＰＣＲ増幅した。完全長のｃＤＮＡクローンを、哺乳動物発現ベクターｐＣＩＮｅｏにクローン化した。
【００９３】
マウス、ラットおよびモルモットの完全なポリヌクレオチドコーディング配列を図５に示す。対応するアミノ酸配列を図６に示し、ヒト、マウス、ラットおよびモルモットのポリヌクレオチドの整列を図７に示し、そして、ヒト、マウス、ラットおよびモルモットのポリペプチドの整列を図８に示す。ヒト、ラット、モルモットおよびマウスのヌクレオチド配列間の相同性パーセントを、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴ１スイート６．０（インフォーマティックス  インク（Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｘ，Ｉｎｃ．））を使用して決定し、そして結果を表１に示す。
【００９４】
【表１】
2004516005.tif 000002
【００９５】
実施例１１−哺乳動物のヒスタミンＨ４受容体へのリガンド結合。
【００９６】
ラット、マウス、モルモットおよびヒトのヒスタミンＨ４受容体に対する３Ｈ−ヒスタミンの親和性を、本明細書に記述されるところの標準的技術を使用して測定した。飽和結合を、適切なヒスタミンＨ４受容体で安定にトランスフェクトされたＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞からの膜で実施した。Ｋｄ値は−１／スキャッチャードプロット（結合型／遊離対結合型）の直線回帰の傾きから得た。結果を表２に示す。
【００９７】
【表２】
2004516005.tif 000003
【００９８】
いくつかの既知のヒスタミン受容体のリガンドの相対的親和性を、３０ｎＭの３Ｈ−ヒスタミンの競争結合により決定した。各リガンドのＫｉ値は、ＣｈｅｎｇとＰｒｕｓｃｏｆｆの方法（Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋［３Ｈ−ヒスタミン］／Ｋｄ）に従って計算した。３Ｈ−ヒスタミンのＫｄ値は表２に示されるものであった。結果を表３に提示する。
【００９９】
【表３】
2004516005.tif 000004
【０１００】
実施例１２
ヒトＨ４のｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ検出。
【０１０１】
ＰＣＲプライマーを使用して、３５周期の間の９４Ｃ４５秒、６０Ｃ４５秒、７２Ｃ２分の条件下で、小脳、大脳皮質、視床下部、小腸、後根神経節（ＤＲＧ）、海馬、脾、胸腺、胎盤、心、肝、肺、子宮、下垂体、脊髄および骨髄のｃＤＮＡライブラリー中のヒトヒスタミンＨ４受容体のｃＤＮＡフラグメントを拡張した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で泳動し、そしてＤＮＡを臭化エチジウム（１０μｇ／ｍｌ）で染色しかつＵＶで可視化した。その後、ゲル中のＰＣＲ産物をニトロセルロースメンブレンに転写し、そして３２Ｐ−標識ヒトＨ４  ＤＮＡプローブでハイブリダイズした。図３にみられるとおり、ヒトヒスタミンＨ４受容体は骨髄中で高度に発現される。
【０１０２】
類似の実験をマウス、ラットおよびモルモットのヒスタミンＨ４受容体について実施した。全部の種で、ヒスタミンＨ４受容体は骨髄で高度に発現される。
【０１０３】
【表４】
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【０１０４】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
発明にかかる、非翻訳領域を包含するヒトヒスタミンＨ４受容体の完全なヌクレオチドコーディング配列を示す。
【図２】
発明にかかる、ヒトヒスタミンＨ４受容体のアミノ酸配列を示す。
【図３】
発明にかかる、ヒトヒスタミンＨ４受容体の組織分布を示す。
【図４】
発明にかかる、ヒトＨ４受容体への［３Ｈ］−ヒスタミンの結合を示す。
【図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃ】
発明にかかる、マウス（Ａ）、モルモット（Ｂ）およびラット（Ｃ）のヒスタミンＨ４受容体の完全なヌクレオチドコーディング配列を示す。
【図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃ】
発明にかかる、マウス（Ａ）、モルモット（Ｂ）およびラット（Ｃ）のヒスタミンＨ４受容体のアミノ酸配列を示す。
【図７】
発明にかかる、ヒト、モルモット、マウスおよびラットのヒスタミンＨ４受容体のポリヌクレオチド配列の整列を示す。
【図８】
発明にかかる、ヒト、モルモット、マウスおよびラットのヒスタミンＨ４受容体のポリペプチド配列の整列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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