(57)【要約】IL-28A、IL-28B、IL-29およびそれらの特定の突然変異体は、多種多様のウイルス種への抗ウイルス活性をもつことが示された。特に関心がもたれることには、抗ウイルス活性が、B型肝炎ウイルスおよびC型肝炎ウイルスのような肝臓に感染するウイルスに対して実証されたことである。さらに、IL-28A、IL-28B、IL-29およびそれらの突然変異体は、インターフェロン治療で観察される造血細胞への増殖抑制活性の一部を示さない。インターフェロン治療に伴う免疫抑制効果なしに、IL-28A、IL-28BおよびIL-29は、ウイルス感染について免疫無防備状態の患者を治療するのに有用であると思われる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓炎症を引き起こすウイルスに感染している哺乳動物に、アミノ酸残基22位から残基205位までのSEQ ID NO:2と少なくとも95%同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドの治療的有効量を投与する段階であって、該ポリペプチドの投与後、ウイルス感染レベルまたは肝臓炎症が低下している、段階を含む、ウイルス感染を治療する方法。
【請求項２】
ポリペプチドが残基1位から残基175位までのSEQ ID NO:18に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ポリペプチドがSEQ ID NO:24またはSEQ ID NO:26示されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
ポリペプチドがSEQ ID NO:28またはSEQ ID NO:30示されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
ポリペプチドがSEQ ID NO:36示されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
ポリペプチドがポリアルキルオキシド部分に結合している、請求項1記載の方法。
【請求項７】
ウイルス感染レベルの低下が、ウイルス量の減少、抗ウイルス抗体の増加、アラニンアミノトランスフェラーゼの血清学的レベルの減少、または組織学的改善として測定される、請求項1記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物がヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項９】
ウイルス感染が、B型肝炎ウイルスもしくはC型肝炎ウイルス感染、またはB型肝炎ウイルス感染である、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
肝臓炎症を引き起こすウイルスに感染している哺乳動物に、アミノ酸残基20位から残基200位までのSEQ ID NO:4と少なくとも95%同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドの治療的有効量を投与する段階であって、該ポリペプチドの投与後、ウイルス感染レベルまたは肝臓炎症が低下している、段階を含む、ウイルス感染を治療する方法。
【請求項１１】
ポリペプチドが残基1位から残基181位までのSEQ ID NO:20に示されるアミノ酸配列を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
ポリペプチドがSEQ ID NO:32またはSEQ ID NO:34示されるアミノ酸配列を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
ポリペプチドがSEQ ID NO:38示されるアミノ酸配列を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１４】
ポリペプチドがポリアルキルオキシド部分に結合している、請求項10記載の方法。
【請求項１５】
ウイルス感染レベルの低下が、ウイルス量の減少、抗ウイルス抗体の増加、アラニンアミノトランスフェラーゼの血清学的レベルの減少、または組織学的改善として測定される、請求項10記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物がヒトである、請求項10記載の方法。
【請求項１７】
ウイルス感染がB型肝炎ウイルス感染またはC型肝炎ウイルス感染である、請求項10記載の方法。
【請求項１８】
肝臓炎症を治療する方法であって、それを必要としている哺乳動物に、アミノ酸残基22位から残基205位までのSEQ ID NO:2と少なくとも95%同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドの治療的有効量を投与する段階であって、該ポリペプチドの投与後、肝臓炎症が低下している、段階を含む、方法。
【請求項１９】
ポリペプチドが残基1位から残基175位までのSEQ ID NO:18に示されるアミノ酸配列を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
ポリペプチドがSEQ ID NO:24またはSEQ ID NO:26示されるアミノ酸配列を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
ポリペプチドがSEQ ID NO:28またはSEQ ID NO:30示されるアミノ酸配列を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２２】
ポリペプチドがSEQ ID NO:36示されるアミノ酸配列を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２３】
ポリペプチドがポリアルキルオキシド部分に結合している、請求項18記載の方法。
【請求項２４】
哺乳動物がヒトである、請求項18記載の方法。
【請求項２５】
肝臓炎症がB型肝炎ウイルス感染またはC型肝炎ウイルス感染に付随している、請求項18記載の方法。
【請求項２６】
肝臓炎症を治療する方法であって、それを必要としている哺乳動物に、アミノ酸残基22位から残基205位までのSEQ ID NO:4と少なくとも95%同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドの治療的有効量を投与する段階であって、該ポリペプチドの投与後、肝臓炎症が低下している、段階を含む、方法。
【請求項２７】
ポリペプチドが残基1位から残基181位までのSEQ ID NO:20に示されるアミノ酸配列を含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
ポリペプチドがSEQ ID NO:32またはSEQ ID NO:34示されるアミノ酸配列を含む、請求項26記載の方法。
【請求項２９】
ポリペプチドがSEQ ID NO:38示されるアミノ酸配列を含む、請求項26記載の方法。
【請求項３０】
ポリペプチドがポリアルキルオキシド部分に結合している、請求項26記載の方法。
【請求項３１】
哺乳動物がヒトである、請求項26記載の方法。
【請求項３２】
肝臓炎症がB型肝炎ウイルス感染またはC型肝炎ウイルス感染に付随している、請求項26記載の方法。
【請求項３３】
ウイルスに感染している免疫無防備状態の哺乳動物に、アミノ酸残基22位から残基205位までのSEQ ID NO:2と少なくとも95%同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドの治療的有効量を投与する段階であって、該ポリペプチドの投与後、ウイルス感染が低下している、段階を含む、ウイルス感染を治療する方法。
【請求項３４】
ポリペプチドが残基1位から残基175位までのSEQ ID NO:18に示されるアミノ酸配列を含む、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
ポリペプチドがSEQ ID NO:24またはSEQ ID NO:26示されるアミノ酸配列を含む、請求項33記載の方法。
【請求項３６】
ポリペプチドがSEQ ID NO:28またはSEQ ID NO:30示されるアミノ酸配列を含む、請求項33記載の方法。
【請求項３７】
ポリペプチドがSEQ ID NO:36示されるアミノ酸配列を含む、請求項33記載の方法。
【請求項３８】
ポリペプチドがポリアルキルオキシド部分に結合している、請求項33記載の方法。
【請求項３９】
ウイルス感染における低下が、ウイルス量の減少、抗ウイルス抗体の増加、アラニンアミノトランスフェラーゼの血清学的レベルの減少、または組織学的改善として測定される、請求項33記載の方法。
【請求項４０】
ウイルスに感染している免疫無防備状態の哺乳動物に、アミノ酸残基20位から残基200位までのSEQ ID NO:4と少なくとも95%同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドの治療的有効量を投与する段階であって、該ポリペプチドの投与後、ウイルス感染が低下している、段階を含む、ウイルス感染を治療する方法。
【請求項４１】
ポリペプチドが残基1位から残基181位までのSEQ ID NO:20に示されるアミノ酸配列を含む、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
ポリペプチドがSEQ ID NO:32またはSEQ ID NO:34示されるアミノ酸配列を含む、請求項40記載の方法。
【請求項４３】
ポリペプチドがSEQ ID NO:38示されるアミノ酸配列を含む、請求項40記載の方法。
【請求項４４】
ポリペプチドがポリアルキルオキシド部分に結合している、請求項40記載の方法。
【請求項４５】
ウイルス感染における低下が、ウイルス量の減少、抗ウイルス抗体の増加、アラニンアミノトランスフェラーゼの血清学的レベルの減少、または組織学的改善として測定される、請求項40記載の方法。
【請求項４６】
哺乳動物がヒトである、請求項40記載の方法。
【請求項４７】
肝臓炎症をもつ免疫無防備状態の哺乳動物に、アミノ酸残基22位から残基205位までのSEQ ID NO:2と少なくとも95%同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドの治療的有効量を投与する段階であって、該ポリペプチドの投与後、肝臓炎症が低下している、段階を含む、肝臓炎症を治療する方法。
【請求項４８】
ポリペプチドが残基1位から残基175位までのSEQ ID NO:18に示されるアミノ酸配列を含む、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
ポリペプチドがSEQ ID NO:24またはSEQ ID NO:26示されるアミノ酸配列を含む、請求項47記載の方法。
【請求項５０】
ポリペプチドがSEQ ID NO:28またはSEQ ID NO:30示されるアミノ酸配列を含む、請求項47記載の方法。
【請求項５１】
ポリペプチドがSEQ ID NO:36示されるアミノ酸配列を含む、請求項47記載の方法。
【請求項５２】
ポリペプチドがポリアルキルオキシド部分に結合している、請求項47記載の方法。
【請求項５３】
肝臓炎症をもつ免疫無防備状態の哺乳動物に、アミノ酸残基20位から残基200位までのSEQ ID NO:4と少なくとも95%同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドの治療的有効量を投与する段階であって、該ポリペプチドの投与後、肝臓炎症が低下している、段階を含む、肝臓炎症を治療する方法。
【請求項５４】
ポリペプチドが残基1位〜181位のSEQ ID NO:20に示されるアミノ酸配列を含む、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
ポリペプチドがSEQ ID NO:32またはSEQ ID NO:34示されるアミノ酸配列を含む、請求項53記載の方法。
【請求項５６】
ポリペプチドがSEQ ID NO:38示されるアミノ酸配列を含む、請求項53記載の方法。
【請求項５７】
ポリペプチドがポリアルキルオキシド部分に結合している、請求項53記載の方法。
【請求項５８】
哺乳動物が血球減少している、請求項47記載の方法。
【請求項５９】
哺乳動物が血球減少している、請求項53記載の方法。
【請求項６０】
血球減少が、白血球欠乏、好中球減少、血小板減少および貧血からなる群より選択される、請求項58記載の方法。
【請求項６１】
血球減少が、白血球欠乏、好中球減少、血小板減少および貧血からなる群より選択される、請求項59記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
感染疾患を治療するためのストラテジーは、しばしば、免疫を増強する方法に焦点を当てる。例えば、ウイルス感染を治療するための最も一般的な方法は、免疫に基づく記憶応答を誘導する予防的ワクチンを含む。ウイルス感染を治療するためのもう一つの方法は、免疫グロブリン療法による受動免疫を含む(Meissner, J. Pediatr. 124:S17-21, 1994)。インターフェロンアルファ(IFN-α)の投与は、生殖器疣(Reichman et al., Ann. Intern. Med. 108:675-9, 1988)ならびにC型肝炎ウイルス(HCV)(Davis et al., New Engl. J. Med. 339:1493-9, 1998)およびB型肝炎ウイルス(HBV)のような慢性ウイルス感染のようなウイルス感染を治療するためのもう一つの方法である。例えば、IFN-αおよびIFN-βは、ウイルス複製を阻害するのに重要である(Vilcek et al., (Eds.), Interferons and other cytokines. In Fields Fundamental Virology., 3rd ed., Lippincott-Raven Publishers Philadelphia, PA, 1996, ページ341-365)。ウイルス感染に応答して、CD4+ T細胞が活性化し、細胞性免疫に必要とされるTヘルパーI型(TH1)応答およびその後のカスケードを惹起する。すなわち、サイトカインIL-2のような特定の成長因子によるそれらの増殖後、Tヘルパー細胞は、ウイルスに感染した宿主細胞を殺すように抗原特異的CD8+ T細胞、マクロファージ、およびNK細胞を刺激する。しばしば、効果的であるが、これらの方法は、臨床的使用において制限をもつ。例えば、多くのウイルス感染は、ワクチン開発を受け入れられないし、また抗体のみでは治療もできない。さらに、IFNは、極めて効果的であるというわけではなく、それらは、有意な毒性を引き起こしうる；このように、療法の改善が必要である。
【０００２】
感染は急性か慢性か、および患者の基礎にある健康のような因子が、推奨される治療の型に影響を及ぼすため、すべてのウイルスおよびウイルス疾患が全く同じに治療されるわけにはいかない。一般的に、免疫適格性患者における急性感染の治療は、疾患の重症度を低下させ、合併症を減少させ、伝染の速度を減少させる。安全性、費用および簡便性は、急性抗ウイルス剤を推奨するにおいて本質的な検討材料である。慢性感染についての治療は、肝臓、肺、心臓、中枢神経系、および胃腸系のような器官へのウイルス性損傷を防ぐべきであり、効力が主として考慮されるものとなる。
【０００３】
慢性肝炎は、ウイルスのヘパドナウイルス(Hepadnaviridae)科に属する、世界中で最も一般的かつ重篤なヒトのウイルス感染の一つである。感染した個体は、肝硬変、およびついには肝癌を発症するリスクが高い。慢性肝炎は、改善なしに少なくとも6ヶ月間持続する炎症性肝疾患として特徴付けられる。慢性肝炎を患っている患者の大多数は、慢性HBV、HCVのいずれかに感染している、または自己免疫疾患を患っている。一般的な個体群におけるHCV感染の有病率は、米国、日本、中国および東南アジアにおいて1%を超える。
【０００４】
慢性HCVは、肝硬変および肝臓の広範囲にわたる壊死へ進行しうる。慢性HCVは、しばしば、肝線維症へ導くI型コラーゲンの沈着を付随しているが、線維形成の機構はわからないままである。肝線維症は、慢性肝臓損傷への創傷治癒応答の一部として起こる。線維症は、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、アルコール依存症、住血吸虫症、ウイルス性肝炎、胆管閉塞症、毒素曝露、および代謝性疾患の合併症として起こる。この瘢痕組織の形成は、損傷組織を封入しようとする身体の試みを表していると考えられている。肝線維症は、正常な肝臓におけるものとは質的に区別されうる細胞外マトリックスの蓄積を特徴とする。検査を受けないでいると、肝線維症は、肝硬変(被包性小結節の存在により定義される)、肝不全および死へ進行する。
【０００５】
肝炎についての効果的な治療は少ししかない。例えば、自己免疫性慢性肝炎の治療は、一般的に、コルチコステロイドでの免疫抑制性治療に限定される。HBVおよびHCVの治療について、FDAは、組換えIFN-αの投与を承認した。しかしながら、IFN-αは、血小板減少、白血球減少、細菌性感染およびインフルエンザ様症状を含む、多数の用量依存性副作用を伴う。慢性HBVまたはHCVを治療するために用いられる他の薬剤は、ヌクレオシド類似体RIBAVIRIN(商標)およびウルソデオキシコール酸を含む；しかしながら、どちらも非常に効果的であるとは示されなかった。RIBAVIRIN(商標)＋IFN併用療法は、結果として、47%の持続性ウイルスのクリアランス率を生じる(Lanford, R.E. and Bigger, C. Virology 293:1-9 (2002))。(Medicine, (D.C. Dale and D.D. Federman, eds.)(Scientific American, Inc., New York), 4:VIII:1-8 (1995)を参照)。
【０００６】
呼吸器合胞体ウイルスは、幼年期における肺炎および細気管支炎の主な原因である。RSVは、曝露の1年目の間に幼児の半数より多くを感染させ、2年目後には、ほとんどすべてが感染している。季節的な流行の間には、たいていの幼児、小児および成人が、感染または再感染のリスクがある。重篤なRSV感染のリスクがある他の群は、早産児、免疫力が低下した小児および成人、ならびに高齢者を含む。RSV感染の症状は、軽い風邪から重篤な細気管支炎および肺炎まで及ぶ。呼吸器合胞体ウイルスはまた、急性中耳炎を伴っており、RSVは、中耳液から回収されうる。単純ヘルペスウイルス-1(HSV-1)および単純ヘルペス-2(HSV-2)は、溶解性または潜在性のいずれかでありうり、口辺ヘルペス(HSV-1)および陰部ヘルペスにおける原因物質であり、典型的には、眼、口および生殖器(HSV-2)の領域に損傷を伴う。これらのウイルスは、ひとたび感染が起きてしまった場合に有効な適切な治療がほとんどない、ヒトを感染させる多くのウイルスのうちの数例である。
【０００７】
IL-28およびIL-29サイトカインファミリーの実証された活性は、特異的ウイルス感染、特に、肝臓特異的ウイルス感染、を治療するための方法を提供する。IL-28およびIL-29の活性はまた、これらのサイトカインが免疫無防備状態の患者を治療するための方法を提供することを実証している。これらを始めとする使用のための方法は、本明細書での教示から当業者にとって明らかであると思われる。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
一つの局面において、本発明は、肝臓炎症を引き起こすウイルスに感染している哺乳動物に、アミノ酸残基22位から残基205位までのSEQ ID NO:2に少なくとも95%同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドの治療的有効量を投与する段階であって、該ポリペプチドの投与後、ウイルス感染レベルまたは肝臓炎症が低下している、段階を含むウイルス感染を治療するための方法を提供する。他の態様において、方法は、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、またはSEQ ID NO:36に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを投与する段階を含む。他の態様において、ポリペプチドは、PEGのようなポリアルキルオキシド部分に結合している。もう一つの態様において、ウイルス感染レベルの低下は、ウイルス量の減少、抗ウイルス抗体の増加、アラニンアミノトランスフェラーゼの血清学的レベルの減少、または組織学的改善として測定される。もう一つの態様において、哺乳動物はヒトである。もう一つの態様において、本発明は、ウイルス感染がB型肝炎ウイルス感染またはC型肝炎ウイルス感染であることを提供する。
【０００９】
もう一つの局面において、本発明は、肝臓炎症を引き起こすウイルスに感染している哺乳動物に、アミノ酸残基20位から残基200位までのSEQ ID NO:4に少なくとも95%同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドの治療的有効量を投与する段階であって、該ポリペプチドの投与後、ウイルス感染が低下している、段階を含むウイルス感染を治療する方法を提供する。もう一つの態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、またはSEQ ID NO:38に示されるアミノ酸配列を含む。もう一つの態様において、ポリペプチドは、PEGのようなポリアルキルオキシド部分に結合している。もう一つの態様において、ウイルス感染レベルの低下は、ウイルス量の減少、抗ウイルス抗体の増加、アラニンアミノトランスフェラーゼの血清学的レベルの減少、または組織学的改善として測定される。もう一つの態様において、哺乳動物はヒトである。もう一つの態様において、ウイルス感染は、B型肝炎ウイルス感染またはC型肝炎ウイルス感染である。
【００１０】
もう一つの局面において、本発明は、肝臓炎症を治療するための方法であって、それを必要としている哺乳動物に、アミノ酸残基22位から残基205位までのSEQ ID NO:2に少なくとも95%同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドの治療的有効量を投与する段階であって、該ポリペプチドの投与後、肝臓炎症が低下している、段階を含む方法を提供する。一つの態様において、本発明は、ポリペプチドが、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、またはSEQ ID NO:36に示されるアミノ酸配列を含むことを提供する。もう一つの態様において、ポリペプチドは、PEGのようなポリアルキルオキシド部分に結合している。もう一つの態様において、本発明は、肝臓炎症における低下が、アラニンアミノトランスフェラーゼの血清学的レベルの減少または組織学的改善として測定されることを提供する。もう一つの態様において、哺乳動物はヒトである。もう一つの態様において、肝臓炎症は、C型肝炎ウイルス感染またはB型肝炎ウイルス感染に付随している。
【００１１】
もう一つの局面において、本発明は、ウイルスに感染している免疫無防備状態の哺乳動物に、アミノ酸残基22位から残基205位までのSEQ ID NO:2に少なくとも95%同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドの治療的有効量を投与する段階であって、該ポリペプチドの投与後、ウイルス感染が低下している、段階を含むウイルス感染を治療する方法を提供する。もう一つの態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、またはSEQ ID NO:36に示されるアミノ酸配列を含む。もう一つの態様において、ポリペプチドは、PEGのようなポリアルキルオキシド部分に結合している。もう一つの態様において、ウイルス感染レベルの低下は、ウイルス量の減少、抗ウイルス抗体の増加、アラニンアミノトランスフェラーゼの血清学的レベルの減少、または組織学的改善として測定される。もう一つの態様において、哺乳動物はヒトである。もう一つの態様において、本発明は、ウイルス感染がB型肝炎ウイルス感染またはC型肝炎ウイルス感染であることを提供する。
【００１２】
もう一つの局面において、本発明は、ウイルスに感染している免疫無防備状態の哺乳動物に、アミノ酸残基20位から残基200位までのSEQ ID NO:4に少なくとも95%同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドの治療的有効量を投与する段階であって、該ポリペプチドの投与後、ウイルス感染が低下している、段階を含むウイルス感染を治療する方法を提供する。他の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、またはSEQ ID NO:38に示されるアミノ酸配列を含む。もう一つの態様において、ポリペプチドは、PEGのようなポリアルキルオキシド部分に結合している。もう一つの態様において、ウイルス感染レベルの低下は、ウイルス量の減少、抗ウイルス抗体の増加、アラニンアミノトランスフェラーゼの血清学的レベルの減少、または組織学的改善として測定される。もう一つの態様において、哺乳動物はヒトである。もう一つの態様において、ウイルス感染は、B型肝炎ウイルス感染またはC型肝炎ウイルス感染である。
【００１３】
もう一つの局面において、本発明は、肝臓炎症をもつ免疫無防備状態の哺乳動物に、アミノ酸残基22位から残基205位までのSEQ ID NO:2に少なくとも95%同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドの治療的有効量を投与する段階であって、該ポリペプチドの投与後、肝臓炎症が低下している、段階を含む肝臓炎症を治療する方法を提供する。もう一つの態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、またはSEQ ID NO:36に示されるアミノ酸配列を含む。もう一つの態様において、ポリペプチドは、PEGのようなポリアルキルオキシド部分に結合している。もう一つの態様において、肝臓炎症レベルにおける低下は、アラニンアミノトランスフェラーゼの血清学的レベルの減少、または組織学的改善として測定される。もう一つの態様において、哺乳動物はヒトである。もう一つの態様において、本発明は、ウイルス感染がB型肝炎ウイルス感染またはC型肝炎ウイルス感染であることを提供する。
【００１４】
もう一つの局面において、本発明は、肝臓炎症をもつ免疫無防備状態の哺乳動物に、アミノ酸残基20位から残基200位までのSEQ ID NO:4に少なくとも95%同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドの治療的有効量を投与する段階であって、該ポリペプチドの投与後、肝臓炎症が低下している、段階を含む肝臓炎症を治療する方法を提供する。他の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、またはSEQ ID NO:38に示されるアミノ酸配列を含む。もう一つの態様において、ポリペプチドは、PEGのようなポリアルキルオキシド部分に結合している。もう一つの態様において、肝臓炎症における低下は、アラニンアミノトランスフェラーゼの血清学的レベルの減少または組織学的改善として測定される。もう一つの態様において、哺乳動物はヒトである。もう一つの態様において、ウイルス感染は、B型肝炎ウイルス感染またはC型肝炎ウイルス感染である。
【００１５】
発明の説明
発明を詳細に示す前に、以下の用語を定義することがその理解に役立つであろう。
【００１６】
用語「親和性タグ」は、第二ポリペプチドに付着して、第二ポリペプチドの精製もしくは検出を提供しうる、または第二ポリペプチドの基質への付着のための部位を提供しうる、ポリペプチドセグメントを意味するように本明細書に用いられる。主として、抗体もしくは他の特異的結合剤が利用可能である任意のペプチドまたはタンパク質が、親和性タグとして用いられうる。親和性タグは、ポリヒスチジン域、プロテインA(Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3, 1991)、グルタチオンSトランスフェラーゼ(Smith and Johnson, Gene 67:31, 1988)、Glu-Glu親和性タグ(Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-4, 1985)、サブスタンスP、Flag(商標)ペプチド(Hopp et al., Biotechnology 6:1204-10, 1988)、ストレプトアビジン結合ペプチド、または他の抗原性エピトープもしくは結合ドメインを含む。一般的に、Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95-107, 1991を参照されたい。DNAコード親和性タグは、商業的供給業者(例えば、Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)から入手できる。
【００１７】
用語「対立遺伝子変異体」は、同じ染色体座を占める遺伝子の2個またはそれ以上の選択的な形のいずれかを意味するように本明細書で用いられる。対立遺伝子の変化は、突然変異を通して自然に生じ、結果として、個体群内に表現型多型を生じうる。遺伝子突然変異は、サイレント(コードされたポリペプチドにおいて変化無し)でありうる、または変化したアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードしうる。対立遺伝子変異体という用語はまた、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を意味するように本明細書で用いられる。
【００１８】
用語「アミノ末端」および「カルボキシル末端」は、ポリペプチド内の位置を意味するように本明細書で用いられる。その文脈が許すところにおいて、これらの用語は、近接または相対的位置を意味するように、ポリペプチドの特定の配列または部分に関して用いられる。例えば、ポリペプチド内の参照配列のカルボキシル末端に位置づけられた特定の配列は、参照配列のカルボキシル末端に近接して位置しているが、必ずしも、完全なポリペプチドのカルボキシル末端にあるとは限らない。
【００１９】
用語「補体/抗補体対」は、適切な条件下で非共通結合性に会合した、安定な対を形成する非同一性部分を意味する。例えば、ビオチンおよびアビジン(またはストレプトアビジン)は、補体/抗補体対の原型的メンバーである。他の例示的な補体/抗補体対は、受容体/リガンド対、抗体/抗原(またはハプテンまたはエピトープ)対、センス/アンチセンスポリヌクレオチド対などを含む。補体/抗補体対のその後の解離が望ましい場合、補体/抗補体対は、好ましくは、<109 M-1の結合親和力をもつ。
【００２０】
用語「縮重ヌクレオチド配列」は、1個または複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列(ポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド分子と比較して)を意味する。縮重コドンは、ヌクレオチドの異なるトリプレットを含むが、同じアミノ酸残基をコードする(すなわち、GAUおよびGACトリプレットはそれぞれ、Aspをコードする。
【００２１】
用語「発現ベクター」は、転写を供給する付加のセグメントに実施可能に連結された、対象となるポリペプチドをコードするセグメントを含む、線状または環状の、DNA分子を意味するように用いられる。そのような付加のセグメントは、プロモーターおよびターミネーター配列を含み、1つまたは複数の複製起点、1つまたは複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを含む場合もある。発現ベクターは、一般的に、プラスミドもしくはウイルスDNA由来である、または両方のエレメントを含みうる。
【００２２】
ポリヌクレオチドに適用される場合、用語「単離された」は、ポリヌクレオチドがそれの天然の遺伝的環境から取り出されており、従って、他の無関係のまたは不必要なコード配列を含まず、かつ遺伝子操作されたタンパク質産生系内での使用に適した形をとっていることを意味する。そのような単離された分子は、それらの天然の環境から分離され、cDNAおよびゲノムクローンを含むものである。本発明の単離されたDNA分子は、それらが普通は結合している他の遺伝子を含まないが、プロモーターおよびターミネーターのような、天然に存在する5'および3'の非翻訳領域を含みうる。関連した領域の同定は、当業者には明らかであると思われる(例えば、Dynan and Tijan, Nature 316:774-78, 1985を参照)。
【００２３】
「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、血液および動物組織と離れているような、それの本来の環境以外の状況において見出されるポリペプチドまたはタンパク質である。好ましい形において、単離されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチド、を実質的に含まない。高度に精製された形、すなわち、95%より大きい純粋、より好ましくは99%より大きい純粋、においてポリペプチドを供給することが好ましい。このような関係において用いられる場合、用語「単離された」は、二量体または選択的にグリコシル化もしくは誘導化された形のような、選択的な物理的形における同じポリペプチドの存在を排除しない。
【００２４】
NK細胞、T細胞、特に細胞障害性T細胞、B細胞などのような免疫細胞に言及する場合の用語「レベル」、レベルの増加は、細胞数の増加または細胞機能活性の増強のいずれかである。
【００２５】
ウイルス感染に言及する場合、用語「レベル」は、ウイルス感染のレベルにおける変化を指し、限定されるものではないが、CTLもしくはNK細胞のレベルにおける変化、ウイルス量の減少、抗ウイルス抗体力価の増加、アラニンアミノトランスフェラーゼの血清学的レベルの減少、または標的組織もしくは器官の組織学的検査により測定される改善を含む。これらのレベルにおける変化が有意な差または変化であるかどうかの決定は、十分、当業者の技術の範囲内である。
【００２６】
DNAセグメントに言及する場合、用語「実施可能に連結された」は、セグメントがそれらの意図された目的のために協力して機能するように配置されることを示す、例えば、転写は、プロモーターで開始し、コードセグメントを通ってターミネーターまで進行する。
【００２７】
用語「オルソログ」は、異なる種由来のポリペプチドもしくはタンパク質の機能的対応物である、ある種から得られたポリペプチドまたはタンパク質を意味する。オルソログ間の配列差は、種分化の結果である。
【００２８】
「パラログ」は、生物体により生成された別個であるが構造的に関連したタンパク質である。パラログは、遺伝子重複により生じると考えられている。例えば、α-グロビン、β-グロビン、およびミオグロビンは、お互いのパラログである。
【００２９】
「ポリヌクレオチド」は、5'末端から3'末端まで読まれるデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーである。ポリヌクレオチドは、RNAおよびDNAを含み、天然源から単離されうる、インビトロで合成されうる、または天然および合成の分子の組み合わせから調製されうる。ポリヌクレオチドのサイズは、塩基対(省略された「bp」)、ヌクレオチド(「nt」)またはキロベース(「kb」)として表される。文脈が許すところにおいて、後者の2つの用語は、一本鎖または二本鎖であるポリヌクレオチドを記載しうる。その用語が二本鎖分子に適用される場合、それは、全長を意味するように用いられ、用語「塩基対」と同意義であるように理解されるものと思われる。二本鎖ポリヌクレオチドの2つの鎖は長さがわずかに異なる可能性があること、およびそれらの末端は酵素的切断の結果としてずれる可能性があること；その結果、二本鎖ポリヌクレオチド分子内のヌクレオチドのすべてが対にされるとは限らない、ことは、当業者により認識されているものと思われる。
【００３０】
「ポリペプチド」は、自然に産生されようと合成で作製されようと、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基のポリマーである。約10個未満のアミノ酸残基のポリペプチドは、一般に、「ペプチド」と呼ばれる。
【００３１】
用語「プロモーター」は、それの技術分野に認識されている意味として、RNAポリメラーゼの結合および転写の開始を与えるDNA配列を含む遺伝子の一部を意味するように本明細書で用いられる。プロモーター配列は、一般に、しかし必ずということではないが、遺伝子の5'非コード領域に見出される。
【００３２】
「タンパク質」は、1つまたは複数のポリペプチド鎖を含む高分子である。タンパク質はまた、糖群のような非ペプチド性成分を含みうる。糖および他の非ペプチド性置換基は、タンパク質が産生される細胞によりタンパク質に付加されうり、細胞の型によって異なる。タンパク質は、それらのアミノ酸バックボーン構造によって本明細書で定義される；糖群のような置換基は、一般的に明記されないが、それでもなお、存在している場合がある。
【００３３】
用語「受容体」は、生物活性分子(すなわち、リガンド)に結合し、リガンドの細胞への効果を仲介する、細胞結合型タンパク質を意味する。膜結合型受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン、および典型的にはシグナル伝達に関与する細胞内エフェクタードメインを含む多ペプチド構造を特徴とする。リガンドの受容体への結合は、結果として、細胞においてエフェクタードメインと他の分子の間の相互作用を引き起こす受容体における高次構造的変化を生じる。この相互作用は、次に、細胞の代謝における変化へ導く。受容体-リガンド相互作用に結びつけられる代謝事象は、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、環状AMP産生における増加、細胞性カルシウムの動員、膜脂質の動員、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解およびリン脂質の加水分解を含む。一般的に、受容体は、膜結合型の、サイトゾルまたは核の；単量体(例えば、甲状腺刺激ホルモン受容体、ベータ-アドレナリン受容体)または多量体(例えば、PDGF受容体、成長ホルモン受容体、IL-3受容体、GM-CSF受容体、G-CSF受容体、エリスロポエチン受容体およびIL-6受容体)でありうる。
【００３４】
用語「分泌シグナル配列」は、より大きいポリペプチドの構成要素として、それが合成されている細胞の分泌経路を通って、より大きいポリペプチドを方向づけるポリペプチド(「分泌ペプチド」)をコードするDNA配列を意味する。より大きいポリペプチドは、一般に、切断されて、分泌経路を通過中に分泌ペプチドを除去する。
【００３５】
用語「スプライス変異体」は、遺伝子から転写されたRNAの選択的な型を意味するように本明細書で用いられる。スプライス変異は、転写されたRNA分子内で、または一般的ではないが、別々に転写されたRNA分子間で、選択的スプライシング部位の使用により自然に生じ、結果として、同じ遺伝子から転写されたいくつかのmRNAを生じうる。スプライス変異体は、変化したアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードしうる。スプライス変異体という用語はまた、遺伝子から転写されたmRNAのスプライス変異体によりコードされるタンパク質を意味するように本明細書で用いられる。
【００３６】
不正確な分析方法(例えば、ゲル電気泳動法)により測定されたポリマーの分子量および長さは、近似値であることを理解されているものと思われる。そのような値が「約」Xまたは「およそ」Xとして表現される場合、Xの表示値は、±10%として正確であることを理解されるだろう。
【００３７】
「zcyto20」、「zcyto21」、「zcyto22」は、ヒトIL-28A、IL-29およびIL-28Bについての前の名称である。IL-28Aヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、SEQ ID NOS:1、2、17、18、35、36に示されている。IL-28Bヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、SEQ ID NOS:5、6、21、22、39、40に示されている。IL-29ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、SEQ ID NOS:3、4、19、20、37、38に示されている。これらの配列は、PCT出願WO 02/086087およびU.S.仮特許出願No. 60/493,194に記載されているが、両方とも、ZymoGenetics, Inc.の同一出願人によるものであり、参照として本明細書に組み入れられている。
【００３８】
「zcyto24」および「zcyto25」は、マウスIL-28AおよびIL-28Bについての前の名称であり、それぞれ、SEQ ID NOS:7、8、9、10に示されている。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、参照として本明細書に組み入れられている、ZymoGenetics, Inc.の同一出願人によるPCT出願WO 02/086087に完全に記載されている。
【００３９】
「zcytor19」は、IL-28受容体α-サブユニットについての前の名称であり、SEQ ID NOS:11、12、13、14、15、16に示されている。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、PCT出願、Schering, Inc.の代表としてのWO 02/20569およびZymoGenetics, Inc.の出願人によるWO 02/44209に記載されており、参照として本明細書に組み入れられている。「IL-28受容体」は、ヘテロ二量体の受容体を形成するIL-28α-サブユニットおよびCRF2-4サブユニットを意味する。
【００４０】
本明細書に引用されるすべての参照文献は、完全に参照として本明細書に組み入れられている。
【００４１】
本発明者らは、以前に、インターフェロン様分子の新しいファミリーの発見を、PCT出願、PCT/US01/21087およびPCT/US02/12887、ならびにSheppard et al., Nature Immunol. 4:63-68, 2003(本明細書にすべて参照として組み入れられている)に報告した。この新しいファミリーは、zcyto20(SEQ ID NOS:1および2；17および18)、zcyto21(SEQ ID NOS:3および4；19および20)、zcyto22(SEQ ID NOS:5および6；21および22)、zcyto24(SEQ ID NOS:7および8)、zcyto25(SEQ ID NOS:9および10)と名付けられた分子を含み、zcyto20、21および22はヒト配列であり、zcyto24および25はマウス配列である。HUGO名称は、インターフェロン様タンパク質に割り当てられた。zcyto20はIL-28Aと名付けられ、zycto22はIL-28Bと名付けられ、zycto21はIL-29と名付けられ、この後は、HUGO名により呼ばれるものと思われる。Kotenko et al., Nature Immunol. 4:69-77, 2003は、IL-28AをIFNλ2として、IL-28BをIFNλ3として、およびIL-29をIFNλ1として同定した。これらのタンパク質についての受容体は、当初はzcytor19(SEQ ID NOS:11および12)と名付けられたが、HUGOによりIL-28RAと名付けられた。
【００４２】
本発明は、広範囲のウイルス感染において抗ウイルス剤としてIL-28およびIL-29を用いるための方法を提供する。特定の態様において、方法は、肝炎のような、肝臓に特異的であるウイルス感染においてIL-28およびIL-29を用いることを含む。さらに、データは、IL-28およびIL-29が、ウイルス感染についてのIFN療法の使用に伴う毒性のいくらかを含むことなく、これらの抗ウイルス活性を示すことを示している。I型インターフェロン療法に関連した毒性の一つは、骨髄抑制である。これは、I型インターフェロンによる、骨髄前駆細胞の抑制である。IL-29は、骨髄細胞増殖またはB細胞増殖をIFN-αに関して見られるように、有意には抑制しないため、IL-29は、治療に伴う毒性がより少ないように思われる。同様の結果は、IL-28AおよびIL-28Bについて期待される。
【００４３】
IFN-αは、いくらかの患者には、特に効力に十分な用量がいくらかの毒性または骨髄抑制効果をもつ場合、禁忌でありうる。IFNが禁忌である患者の例は、(1)前に免疫抑制薬物を与えられた患者、(2)HIVまたは血友病をもつ患者、(3)妊娠している患者、(4)白血球不足、好中球減少、血小板減少のような血球減少している患者、および(5)血清肝臓酵素のレベルの増加を示している患者を含みうる。さらに、IFN療法は、悪心、嘔吐、下痢および食欲不振を特徴とする症状を伴う。結果は、いくつかの患者集団がIFN療法に耐えないだろうということであるため、IL-28A、IL-28BおよびIL-29は、それらの患者のいくらかに代替療法を提供することができる。
【００４４】
本発明の方法は、IL-28A、IL-28B、IL-29、またはIL-28A、IL-28BもしくはIL-29に関連したいくつかの生物活性を保持したそれらの分子の突然変異体の治療的有効量を、単独でまたは他の生物製剤もしくは調合薬と組み合わせて、投与する段階を含む。本発明は、肝臓炎症を引き起こす、慢性または急性ウイルス感染を有している哺乳動物を治療し、それにより、ウイルス感染または肝臓炎症を低下させる方法を提供する。もう一つの局面において、本発明は、肝臓特異的疾患、特にウイルス感染が、一部分、病因である肝疾患、を治療する方法を提供する。これらの方法は、IL-28およびIL-29が肝細胞において抗ウイルス活性をもつという発見に基づいている。
【００４５】
上で述べられているように本発明の方法は、IL-28A、IL-28B、IL-29、またはIL-28A、IL-28BもしくはIL-29に関連したいくつかの生物活性を保持したそれらの分子の突然変異体の治療的有効量を、単独でまたは他の生物製剤もしくは調合薬と組み合わせて、投与することを提供する。本発明は、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎およびD型肝炎からなる群より選択されるウイルスに感染している哺乳動物の治療の方法を提供する。本発明の他の局面は、呼吸器合胞体ウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン-バーウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、パラインフルエンザウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、ワクシニアウイルス、西ナイルウイルス、デング熱ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ピキンデウイルスおよびポリオウイルスからなる群より選択されるウイルス感染において抗ウイルス剤としてIL-28またはIL-29を用いるための方法を提供する。特定の態様において、哺乳動物は、慢性または急性のどちらのウイルス感染でももちうる。
【００４６】
もう一つの局面において、本発明の方法はまた、IL-28A、IL-28B、IL-29、またはIL-28A、IL-28BもしくはIL-29に関連したいくつかの生物活性を保持したそれらの分子の突然変異体の治療的有効量を、単独でまたは他の生物製剤もしくは調合薬と組み合わせて、ウイルスに感染している免疫無防備状態の哺乳動物に投与し、それにより、上で記載されているような、ウイルス感染を低下させる段階を含む、ウイルス感染を治療する方法を含む。本発明の上の方法のすべてはまた、同様に、zcyto24またはzcyto25の投与を含みうる。
【００４７】
A. IL-28A、IL-28BおよびIL-29ポリヌクレオチドならびにポリペプチドの説明
IL-28A遺伝子は、SEQ ID NO:2に示される205個のアミノ酸のポリペプチドをコードする。IL-28Aについてのシグナル配列は、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基1位(Met)からアミノ酸残基21位(Ala)までを含む。IL-28Aについての成熟ペプチドは、アミノ酸残基22位(Val)で始まる。変異体IL-28A遺伝子は、SEQ ID NO:18に示される200個のアミノ酸のポリペプチドをコードする。IL-28Aについてのシグナル配列は、SEQ ID NO:18のアミノ酸残基-25位(Met)からアミノ酸残基-1位(Ala)までを含むものと予測されうる。IL-28Aについての成熟ペプチドは、アミノ酸残基1位(Val)で始まる。IL-28Aヘリックスは、以下のように予測される：ヘリックスAは、SEQ ID NO:18に示される、アミノ酸残基24位(Leu)〜40位(Glu)により；ヘリックスBはアミノ酸残基58位(Thr)〜65位(Gln)により；ヘリックスCはアミノ酸残基69位(Arg)〜85位(Ala)により；ヘリックスDはアミノ酸残基95位(Val)〜114位(Ala)により；ヘリックスEはアミノ酸残基126位(Thr)〜142位(Lys)により；およびヘリックスFはアミノ酸残基148位(Cys)〜169位(Ala)により、規定される。成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が大腸菌(E. coli)のような原核生物系において発現される場合、分泌シグナル配列は、必要とされない場合があり、N末端Metが存在し、結果として、SEQ ID NO:36に示されるようなポリペプチドの発現を生じるものと思われる。
【００４８】
IL-29遺伝子は、SEQ ID NO:4に示される200個のアミノ酸のポリペプチドをコードする。IL-29についてのシグナル配列は、SEQ ID NO:4のアミノ酸残基1位(Met)からアミノ酸残基19位(Ala)までを含む。IL-29についての成熟ペプチドは、アミノ酸残基20位(Gly)で始まる。IL-29は、公開されたPCT出願WO 02/02627に記載されている。変異体IL-29遺伝子は、アミノ酸残基169位が、Aspの代わりにAsnである、SEQ ID NO:20に示される200個のアミノ酸のポリペプチドをコードする。IL-29についてのシグナル配列は、SEQ ID NO:20のアミノ酸残基-19位(Met)からアミノ酸残基-1位(Ala)までを含むものと予測されうる。IL-29についての成熟ペプチドは、アミノ酸残基1位(Gly)で始まる。IL-29は、PCT出願WO 02/02627に記載されている。IL-29ヘリックスは、以下のように予測される：ヘリックスAは、SEQ ID NO:20に示される、アミノ酸残基30位(Ser)〜44位(Leu)により；ヘリックスBはアミノ酸残基57位(Asn)〜65位(Val)により；ヘリックスCはアミノ酸残基70位(Val)〜85位(Ala)により；ヘリックスDはアミノ酸残基92位(Glu)〜114位(Gln)により；ヘリックスEはアミノ酸残基118位(Thr)〜139位(Lys)により；およびヘリックスFはアミノ酸残基144位(Gly)〜170位(Leu)により、規定される。成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が大腸菌のような原核生物系において発現される場合、分泌シグナル配列は、必要とされない場合があり、N末端Metが存在し、結果として、SEQ ID NO:38に示されるようなポリペプチドの発現を生じるものと思われる。
【００４９】
IL-28B遺伝子は、SEQ ID NO:6に示される205個のアミノ酸のポリペプチドをコードする。IL-28Bについてのシグナル配列は、SEQ ID NO:6のアミノ酸残基1位(Met)からアミノ酸残基21位(Ala)までを含む。IL-28Bについての成熟ペプチドは、アミノ酸残基22位(Val)で始まる。変異体IL-28B遺伝子は、SEQ ID NO:22に示される200個のアミノ酸のポリペプチドをコードする。IL-28Bについてのシグナル配列は、SEQ ID NO:22のアミノ酸残基-21位(Met)からアミノ酸残基-1位(Ala)までを含むものと予測されうる。IL-28Bについての成熟ペプチドは、アミノ酸残基1位(Val)で始まる。IL-28Bヘリックスは、以下のように予測される：ヘリックスAは、SEQ ID NO:2に示される、アミノ酸残基8位(Leu)〜41位(Glu)により；ヘリックスBはアミノ酸残基58位(Trp)〜65位(Gln)により；ヘリックスCはアミノ酸残基69位(Arg)〜86位(Ala)により；ヘリックスDはアミノ酸残基95位(Gly)〜114位(Ala)により；ヘリックスEはアミノ酸残基126位(Thr)〜142位(Lys)により；およびヘリックスFはアミノ酸残基148位(Cys)〜169位(Ala)により、規定される。成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が大腸菌のような原核生物系において発現される場合、分泌シグナル配列は、必要とされない場合があり、N末端Metが存在し、結果として、SEQ ID NO:40に示されるようなポリペプチドの発現を生じるものと思われる。
【００５０】
zcyto24遺伝子は、SEQ ID NO:8に示される202個のアミノ酸のポリペプチドをコードする。zcyto24分泌シグナル配列は、SEQ ID NO:8のアミノ酸残基1位(Met)からアミノ酸残基28位(Ala)までを含む。分泌シグナル配列の切断についての選択的な部位は、アミノ酸残基24位(Thr)に見出されうる。成熟ポリペプチドは、アミノ酸残基29位(Asp)〜アミノ酸残基202位(Val)を含む。
【００５１】
zcyto25遺伝子は、SEQ ID NO:10に示される202個のアミノ酸のポリペプチドをコードする。zcyto25分泌シグナル配列は、SEQ ID NO:10のアミノ酸残基1位(Met)からアミノ酸残基28位(Ala)までを含む。分泌シグナル配列の切断についての選択的な部位は、アミノ酸残基24位(Thr)に見出されうる。成熟ポリペプチドは、アミノ酸残基29位(Asp)〜アミノ酸残基202位(Val)を含む。
【００５２】
本発明は、結果として、IL-28またはIL-29分子の単一型の発現を生じるIL-28およびIL-29野生型配列において突然変異をもつポリペプチドの投与を含む方法を提供する。例示的な突然変異は、SEQ ID NOS:24、28および32に示されている。IL-28およびIL-29は大腸菌で発現される場合、N末端メチオニンが存在する。SEQ ID NOS:26、30および34は、N末端Metが存在する場合のIL-28AおよびIL-29突然変異体として数えられるアミノ酸残基を示す。表1は、野生型IL-28A、IL-28BおよびIL-29について分子内のジスルフィド結合されるシステイン対の可能な組み合わせを示す。
【００５３】
（表１）
2006509041.tif 000002
【００５４】
水溶性ポリマーとインターフェロンの結合は、インターフェロンの循環半減期を増大させ、かつポリペプチドの免疫原性を低下させることが示された(例えば、Nieforth et al., Clin. Pharmacol. Ther. 59:636 (1996)、およびMonkarsh et al., Anal. Biochem. 247:434 (1997)を参照)。適した水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール(PEG)、モノメトキシ-PEG、モノ-(C1-C10)アルコキシ-PEG、アリールオキシ-PEG、ポリ-(N-ビニルピロリドン)PEG、トレシルモノメトキシPEG、PEGプロピオンアルデヒド、ビス-スクシンイミジルカーボネートPEG、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシド  コポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物に基づくポリマーを含む。適したPEGは、例えば、5,000、12,000、20,000および40,000を含む、約600から約60,000までの分子量をもちうる。システイン突然変異体IL-28またはIL-29結合体はまた、そのような水溶性ポリマーの混合物を含む。
【００５５】
IL-28またはIL-29結合体の一つの例は、IL-28もしくはIL-29部分、またはそれらの突然変異体、およびIL-28またはIL-29部分のN末端に付着したポリアルキルオキシド部分を含む。PEGは、一つの適したポリアルキルオキシドである。実例として、IL-28またはIL-29がPEGで修飾されうるが、過程は「PEG化」として知られている。IL-28またはIL-29のPEG化は、当技術分野において公知のPEG化反応のいずれかにより実行されうる(例えば、EP 0 154 316, Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249 (1992)、Duncan and Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27:290 (1994)、および Francis et al., Int J Hematol 68:1 (1998)を参照)。本発明の方法は、PEGのような水溶性ポリマーに結合したIL-28、IL-29およびそれらの突然変異体の投与を含む。
【００５６】
IL-28A、IL-29、IL-28B、zcyto24およびzcyto25、それぞれは、zcytor19(IL-28RA)と名付けられたオーファン受容体と複合体を形成することが示された。IL-28RAは、同一出願人による特許出願PCT/US01/44808に記載されている。IL-28B、IL-29、zcyto24およびzcyto25は、同様に、IL-28RAを、結合するまたは通してシグナル伝達することが示され、IL-28A、IL-29、IL-28B、zcyto24およびzcyto25がサイトカインの同じファミリーのメンバーであることをさらに裏付けている。IL-28RA受容体は、クラスIIサイトカイン受容体である。クラスIIサイトカイン受容体は、通常、4本ヘリックスバンドルのサイトカインに結合する。例えば、インターロイキン-10およびインターフェロンは、このクラスにおける受容体(例えば、インターフェロン-ガンマ受容体、アルファ鎖およびベータ鎖、ならびにインターフェロン-アルファ/ベータ受容体、アルファ鎖およびベータ鎖)を結合する。
【００５７】
クラスIIサイトカイン受容体は、それらの細胞外ドメインに1個または複数のサイトカイン受容体モジュール(CRM)の存在を特徴とする。他のクラスIIサイトカイン受容体は、zcytor11(同一所有者によるUS特許No. 5,965,704)、CRF2-4(GenBankアクセッション番号Z17227)、IL-10R(GenBankアクセッション番号U00672およびNM_001558)、DIRS1、zcytor7(同一所有者によるUS特許No. 5,945,511)、および組織因子を含む。IL-28RAは、インターフェロン-アルファ/ベータ受容体アルファ鎖を除くすべての既知のクラスII受容体のように、それの細胞外ドメインにたった1個のクラスII CRMを有する。
【００５８】
IL-28RA(SEQ ID NO:11)をコードするヒトcDNAクローンの分析により、分泌シグナル配列(SEQ ID NO:12の残基1位(Met)〜20位(Gly))および成熟IL-28RAサイトカイン受容体ポリペプチド(SEQ ID NO:12の残基21位(Arg)〜520位(Arg))、およそ206個のアミノ酸残基の細胞外リガンド結合ドメイン(SEQ ID NO:12の残基21位(Arg)〜226位(Asn))、およそ23個のアミノ酸残基の膜貫通ドメイン(SEQ ID NO:12の残基227位(Trp)〜249位(Trp))、およびおよそ271個のアミノ酸残基の細胞内ドメイン(SEQ ID NO:12の残基250位(Lys)〜520位(Arg))を含む、520個のアミノ酸(SEQ ID NO:12)をコードするオープンリーディングフレームが明らかにされた。細胞外リガンド結合ドメイン内に、2個のフィブロネクチンIII型ドメインおよびリンカー領域がある。第一のフィブロネクチンIII型ドメインは、SEQ ID NO:12の残基21位(Arg)〜119位(Tyr)を含み、リンカーは、SEQ ID NO:12の残基120位(Leu)〜124位(Glu)を含み、第二のフィブロネクチンIII型ドメインは、SEQ ID NO:12の残基125位(Pro)〜223位(Pro)を含む。
【００５９】
さらに、29個のアミノ酸欠失をもつIL-28RA変異体をコードするヒトcDNAクローンが同定された。このIL-28RA変異体(SEQ ID NO:13に示されている)は、分泌シグナル配列(SEQ ID NO:14の残基1位(Met)〜20位(Gly))および成熟IL-28RAサイトカイン受容体ポリペプチド(SEQ ID NO:14の残基21位(Arg)〜491位(Arg))、およそ206個のアミノ酸残基の細胞外リガンド結合ドメイン(SEQ ID NO:14の残基21位(Arg)〜226位(Asn))、およそ23個のアミノ酸残基の膜貫通ドメイン(SEQ ID NO:14の残基227位(Trp)〜249位(Trp))、およびおよそ242個のアミノ酸残基の細胞内ドメイン(SEQ ID NO:14の残基250位(Lys)〜491位(Arg))を含む、491個のアミノ酸(SEQ ID NO:14)をコードするオープンリーディングフレームを含む。
【００６０】
IL-28RA受容体mRNAの切り詰められた可溶性型は、自然に発現されるように思われる。切り詰められた可溶性IL-28RA(SEQ ID NO:15)をコードするヒトcDNAクローンの分析により、分泌シグナル配列(SEQ ID NO:16の残基1位(Met)〜20位(Gly))および成熟の切り詰められた可溶性IL-28RA受容体ポリペプチド(SEQ ID NO:16の残基21位(Arg)〜211位(Ser))、およそ143個のアミノ酸残基の切り詰められた細胞外リガンド結合ドメイン(SEQ ID NO:16の残基21位(Arg)〜163位(Trp))、膜貫通ドメイン無し、しかしおよそ48個のアミノ酸残基の追加のドメイン(SEQ ID NO:16の残基164位(Lys)〜211位(Ser))を含む、211個のアミノ酸(SEQ ID NO:16)をコードするオープンリーディングフレームが明らかにされた。
【００６１】
IL-28RAは、クラスIIサイトカイン受容体と同じ受容体サブファミリーのメンバーであり、このサブファミリーの受容体は、シグナルを伝達するホモ二量体を形成するように会合しうる。そのサブファミリーのいくつかのメンバー(例えば、インターフェロン、IL-10、IL-19およびIL-TIFを結合する受容体)は、リガンドを結合し、シグナルを伝達するために第二のサブユニット(β-サブユニットと呼ばれる)と結合する。しかしながら、多くの場合、特定のβ-サブユニットは、複数の特定のサイトカイン受容体サブユニットと会合する。例えば、zcytor11(US特許No. 5,965,704)のようなクラスIIサイトカイン受容体およびCRF2-4受容体は、サイトカインIL-TIFを結合するためにヘテロ二量体化する(WIPO公開WO 00/24758; Dumontier et al., J. Immunol. 164:1814-1819, 2000; Spencer, SD et al., J. Exp. Med. 187:571-578, 1998; Gibbs, VC and Pennica Gene 186:97-101, 1997(CRF2-4 cDNA); Xie MH et al., J. Biol. Chem. 275:31335-31339, 2000を参照)。IL-10β受容体は、CRF2-4と同義であると考えられている(Dumoutier, L. et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 97:10144-10149, 2000; Liu Y et al., J. Immunol. 152:1821-1829, 1994(IL-10R cDNA))。それゆえに、zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24およびzcyto25は、単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体および多量体のいずれのzcytor19受容体でも結合することが予想されうる。実験的証拠は、CRF2-4を、IL-28RAについての推定上の結合パートナーと同定した。
【００６２】
本発明の方法に有用であるIL-28またはIL-29分子を同定するために用いられた分子についての生物活性の例は、いくらかの特異性を以てIL-28受容体に結合することができる分子を含む。一般的に、同族受容体に結合するリガンドは、KDが100 nM〜100 pMの範囲内にある場合、特異的である。100 mM〜10 nM KDの範囲での特異的結合は、低親和性結合である。2.5 pM〜100 pM KDの範囲での特異的結合は、高親和性結合である。もう一つの例において、生物活性のあるIL-28またはIL-29分子は、野生型IL-28またはIL-29に関連した抗ウイルス活性のある程度の能力がある。
【００６３】
B. ウイルス感染についてのIL-28A、IL-28B、およびIL-29の使用
IL-28およびIL-29は、肝臓特異的疾患、特にウイルス感染が一部分、病因である肝疾患、を治療するのに用いられうる。特に、IL-28およびIL-29は、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎およびD型肝炎からなる群より選択されるウイルスに感染している哺乳動物を治療するために用いられる。肝疾患が炎症性であり、かつ少なくとも6ヶ月間、持続している場合、それは、一般的に慢性肝炎とみなされる。感染進行中のC型肝炎ウイルス(HCV)患者は、血液中のHCV-RNAが陽性になり、それは、逆転写酵素/ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)アッセイにより検出可能である。本発明の方法は、肝疾患の進行を遅らせる。臨床的には、HCVについての診断検査は、抗体についての血清学的アッセイおよびウイルス粒子についての分子検査を含む。酵素免疫アッセイが利用できるが(Vrielink et al., Transfusion 37:845-849, 1997)、免疫ブロットアッセイのような追加の試験を用いる確認を必要としうる(Pawlotsky et al., Hepatology 27:1700-1702, 1998)。定性的および定量的アッセイは、一般的に、ポリメラーゼ連鎖反応技術を用い、ウイルス血症および治療応答を評価するのに好ましい(Poynard et al., Lancet 352:1426-1432, 1998; McHutchinson et al., N. Engl. J. Med. 339:1485-1492, 1998)。定量的RT-PCR(Amplicor HCV Monitor(商標)、Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ)および分岐型DNA(デオキシリボ核酸)シグナル増幅アッセイ(Quantiplex(商標)HCV RNA Assay [bDNA]、Chiron Corp., Emeryville, CA)のような、いくつかの市販用検査が利用できる。肝臓炎症または壊死についての非特異的検査室検査は、アラニンアミノトランスフェラーゼのレベル(ALT)を測定し、安価で、容易に利用できる(National Institutes of Health Consensus Development Conference Panel, Hepatology 26 (Suppl. 1):2S-10S, 1997)。肝生検の組織学的評価は、一般的に、肝炎進行を測定するための最も正確な手段と考えられている(Yano et al., Hepatology 23:1334-1340, 1996)。HCVについての臨床検査の概説については、Lauer et al., N. Engl. J. Med. 345:41-52, 2001を参照されたい。
【００６４】
当業者に知られているHBVおよびHCVを検査するためのいくつかのインビボのモデルがある。例えば、HBVに感染した哺乳動物へのIL-28またはIL-29の効果は、ウッドチャックモデルを用いて評価されうる。簡単には、ウッドチャック肝炎ウイルス(WHV)に慢性的に感染したウッドチャックは、HBVに慢性的に感染したヒトにおける疾患と類似している肝炎および肝細胞癌を発症する。モデルは、抗ウイルス活性の前臨床評価のために用いられた。慢性的に感染したWHV株は確立されており、このモデルを用いて特定の化合物の効果を研究するための動物を供給するために、新生児が血清を接種される。(概説として、Tannant et al., ILAR J. 42(2):89-102, 2001を参照されたい)。チンパンジーもまた、HBV感染した哺乳動物へのIL-28およびIL-29の効果を評価するために用いられうる。チンパンジーを用いて、HBVの特徴付けがなされ、これらの研究は、チンパンジー疾患が、ヒトにおける疾患と著しく類似していることを実証した(Barker et al., J. Infect. Dis. 132:451-458, 1975、およびTabor et al., J. Infect. Dis. 147:531-534, 1983)。チンパンジーモデルは、ワクチンを評価するのに用いられた(Prince et al., In: Vaccines 97, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997)。HIVについての療法は、通常、サル免疫不全ウイルスに感染したヒト以外の霊長類を用いて試験される(概説として、Hirsch et al., Adv. Pharmcol. 49:437-477, 2000、およびNathanson et al., AIDS 13(suppl. A):S113-S120, 1999)。HIV、肝炎、マラリア、呼吸器合胞体ウイルスおよび他の疾患におけるヒト以外の霊長類の使用の概説について、Sibal et al., ILAR J. 42(2):74-84, 2001を参照されたい。
【００６５】
IL-28A、IL-28BおよびIL-29が有用でありうるウイルス感染の型の他の例は、限定されるものではないが、以下のものを含む：DNAウイルス(例えば、単純ヘルペスウイルス、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルスのようなヘルペスウイルス；天然痘ウイルスのようなポックスウイルス；ペパドナウイルス(例えば、B型肝炎ウイルス)；パピローマウイルス；アデノウイルス)；RNAウイルス(例えば、HIV I、II；HTLV I、II；ポリオウイルス；A型肝炎；オルソミクソウイルス(例えば、インフルエンザウイルス)；パラミクソウイルス(例えば、麻疹ウイルス)；狂犬病ウイルス；C型肝炎)；ライノウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病、リフトバレー熱ウイルス、ラッサ熱ウイルス、エボラウイルス、肝臓を含む組織において複製する、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスなどにより引き起こされる感染。さらに、IL-28およびIL-29が用いられうる疾患の型の例は、限定されるものではないが、以下のものを含む：後天性免疫不全症；肝炎；胃腸炎；出血性疾患；腸炎；心臓炎；脳炎；麻痺；細気管支炎；上部および下部呼吸器疾患；呼吸器の乳頭腫症；関節炎；播種性疾患、慢性C型肝炎感染に起因する肝細胞癌。さらに、他の組織におけるウイルス性疾患が、IL-28A、IL-28BおよびIL-29で治療されうるが、例えば、ウイルス性髄膜炎およびHIV関連疾患である。例えば、治療サンプルの活性を試験するためのトランスジェニックモデルは、以下の実施例に記載され、かつMorrey, et al., Antiviral Ther., 3(Suppl3):59-63, 1998に記載されている。
【００６６】
特定のウイルスにおける効力について試験するために用いられる動物モデルは知られている。例えば、デング熱ウイルスは、Huang et al., J. Gen. Virol. Sep;81(Pt9):2177-82, 2000に記載されているようなモデルを用いて試験されうる。西ナイルウイルスは、Xiao et al., Emerg. Infect. Dis. Jul-Aug;7(4):714-21, 2001またはMashimo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Aug 20;99(17):11311-6, 2002に記載されているようなモデルを用いて試験されうる。ベネズエラウマ脳炎ウイルスのモデルは、Jackson et al., Veterinary Pathology, 28(5):410-418, 1991; Vogel et al., Arch. Pathol. Lab. Med. Feb;120(2):164-72, 1996; Lukaszewski and Brooks, J. of Virology, 74(11):5006-5015, 2000に記載されている。ライノウイルスのモデルは、Yin and Lomax, J. Gen. Virol. 67(Pt 11):2335-40, 1986に記載されている。呼吸器合胞体ウイルスについてのモデルは、Byrd and Prince, Clin. Infect. Dis. 25(6):1363-8, 1997に記載されている。他のモデルは当技術分野において知られており、そのようなモデルの用い方を知ることは、十分、当業者の技術の範囲内である。
【００６７】
IL-28A、IL-28BおよびIL-29は、上で記載されたものを含め、抗ウイルス剤と併用して用いられうる。ウイルス感染についてのより一般的な治療法のいくつかは、ACYCLOVIR(商標)のようなウイルス複製を阻害する薬物を含む。さらに、これらの薬剤のいくつかの組み合わせでの使用は、AIDSの治療に用いられる高活性抗レトロウイルス療法(HAART)についての基礎をなす。免疫療法(すなわち、サイトカイン)および抗ウイルス薬の組み合わせが効力の向上を示す例は、慢性C型肝炎感染の治療のためのRIBAVIRIN(商標)を加えたインターフェロンの使用(Maddrey, Semin. Liver. Dis. 19 Suppl 1:67-75, 1999)、ならびにIL-2およびHAARTの組み合わせでの使用(Ross, et al.、同書)を含む。このように、IL-28およびIL-29は疾患に対する免疫系を刺激することができるため、同様に、HAART適用に用いられうる。
【００６８】
特に、IL-28A、IL-28BおよびIL-29は、IFN療法にあまり応答しない患者における単一療法またはIFN-α(RIBAVIRIN(商標)を含むまたは含まない)との併用療法に有用でありうる。これらの患者は、彼らの細胞の表面上にI型インターフェロン受容体がより少ないことにより、IFN療法に応答しない可能性がある(Yatsuhashi H, et al., J Hepatol. Jun.30(6):995-1003, 1999; Mathai et al., J Interferon Cytokine Res. Sep.19(9):1011-8, 1999; Fukuda et al., J Med. Virol. 63(3):220-7, 2001)。IL-28A、IL-28BおよびIL-29はまた、I型インターフェロン治療後のI型インターフェロン受容体の下方制御により彼らの細胞の表面上にI型インターフェロン受容体がより少ない患者における単一療法またはIFN-α(RIBAVIRIN(商標)を含むまたは含まない)との併用療法に有用でありうる(Dupont et al., J. Interferon Cytokine Res. 22(4):491-501, 2002)。
【００６９】
IL-28またはIL-29は、サイトカイン、免疫グロブリン移入を含む他の免疫療法、および様々な共刺激分子と併用して用いられうる。抗ウイルス薬に加えて、IL-28、IL-29またはそれらの突然変異体は、免疫系を刺激するように意図される任意の他の免疫療法と併用して用いられうる。このように、IL-28、IL-29またはそれらの突然変異体は、インターフェロンまたはIL-2のような他のサイトカインと共に用いられうる。IL-28、IL-29またはそれらの突然変異体はまた、免疫グロブリン移入を含む受動免疫化の方法に加えられうり、一つの例は、高リスクの患者においてRSV感染を治療する抗体の使用を提起する(Meissner HC、同書)。さらに、IL-28、IL-29またはそれらの突然変異体は、CD137のような様々な細胞表面分子を認識する4-1BBリガンドのような追加的な共刺激分子と共に用いられうる(Tan, JT et al., J Immunol. 163:4859-68, 1999)。
【００７０】
C. 免疫無防備状態の患者におけるIL-28A、IL-28BおよびIL-29の使用
IL-28およびIL-29は、急性および慢性ウイルス感染について、ならびに免疫無防備状態の患者のための単一療法として用いられうる。免疫を増強させる方法は、未解決の感染をもつ患者における回復時間を速めうる。免疫療法は、年端もいかぬ子どもまたは高齢者のような免疫無防備状態の患者、および感染によって起こる、または化学療法もしくは骨髄除去のような医学的介入後に引き起こされる免疫不全を被っている患者の一部によりいっそう大きな影響を与えうる。免疫調節により治療されることになっている適用の型の例は、以下のものを含む；慢性肝炎についてのIFN-αの使用(Perry CM, and Jarvis B, Drugs 61:2263-88, 2001)、HIV感染後のIL-2の使用(Mitsuyasu R., J. Infect. Dis. 185 Suppl 2:S115-22, 2002;およびRoss RW et al., Expert Opin. Biol. Ther. 1:413-24, 2001)、および移植後のエプスタインバーウイルス感染を治療するためのいずれかのIFN-α(Faro A, Springer Semin. Immunopathol. 20:425-36, 1998)の使用。動物モデルにおいて行われた実験は、IL-2およびGM-CSFがまた、EBV関連疾患を治療するのに効果的でありうることを示している(Baiocchi RA et al., J Clin. Invest. 108:887-94, 2001)。
【００７１】
要約すれば、IL-28、IL-29またはそれらの突然変異体は、以下のものとして用いられうる：
(1)急性および慢性ウイルス感染について、ならびに免疫無防備状態の患者のための単一療法として。免疫を増強させる方法は、未解決の感染をもつ患者における回復時間を速めうる。
(2)ACYCLOVIR(商標)、RIBAVIRIN(商標)を加えたインターフェロンのような、他の抗ウイルス剤と併用して。
(3)サイトカイン、免疫グロブリン移入を含む免疫療法、および様々な共刺激分子と併用して。
(4)結果として肝臓炎症を生じた慢性または急性ウイルス感染を有している哺乳動物を治療し、それにより、ウイルス感染および/または肝臓炎症を低下させるために。特に、IL-28およびIL-29は、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎およびD型肝炎からなる群より選択されるウイルスに感染している哺乳動物を治療するために用いられる。
(5)呼吸器合胞体ウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン-バーウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、パラインフルエンザウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、ワクシニアウイルス、西ナイルウイルス、デング熱ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ピキンデウイルスおよびポリオウイルスからなる群より選択されるウイルス感染における抗ウイルス剤として。
【００７２】
実施例
実施例1
ポリI:Cおよびウイルス感染によるIL-28A、IL-29、IL-28Bの誘導
新鮮に単離されたヒト末梢血単核細胞を、ポリイノシン酸-ポリシチジル酸(ポリI:C；100 μg/ml)(SIGMA; St. Louis, MO)、0.1のMOIをもつ脳心筋炎ウイルス(EMCV)の存在下において、または培地のみにおいて、増殖させた。15時間のインキュベーション後、全RNAを細胞から単離し、リボヌクレアーゼを含まないデオキシリボヌクレアーゼで処理した。100 ng 全RNAを、製造会社(Invitrogen)により提案されているように、Platinum Taqキットおよび遺伝子特異的プライマーを含むSuperscript One-Step RT-PCRを用いる1段階RT-PCRのための鋳型として用いた。
【００７３】
ヒトIL-28A、IL-28BおよびIL-29、IFN-αならびにIFN-βのRNAの低量から検出不可能な量が、未処理の細胞に見られた。対照的に、IL-28A、IL-29、IL-28BのRNAの量は、ポリI:C処理およびウイルス感染の両方により増加し、I型インターフェロンについても見られた。これらの実験は、I型インターフェロンのようなIL-28A、IL-29、IL-28Bは、二本鎖RNAまたはウイルス感染により誘導されうる。
【００７４】
実施例2
HepG2細胞におけるIFNαと比較したIL-28、IL-29シグナル伝達活性
A. 細胞トランスフェクション
HepG2細胞を、以下のようにトランスフェクションした：700,000HepG2細胞/ウェル(6ウェルプレート)を2ミリリットル DMEM＋10%ウシ胎児血清に、トランスフェクションのおよそ18時間前に蒔いた。ウェルにつき、1マイクログラム pISRE-ルシフェラーゼDNA(pISRE-Luciferase DNA)(Stratagene)および1マイクログラム pIRES2-EGFP DNA(Clontech)を6マイクロリットル Fugene 6試薬(Roche Biochemicals)に加え、合計100マイクロリットル DMEMにした。このトランスフェクション混合物を、あらかじめ蒔かれたHepG2細胞へ30分後、加えた。24時間後、トランスフェクションされた細胞をトリプシン-EDTAを用いてプレートから取り出し、96ウェルマイクロタイタープレートに、およそ25,000細胞/ウェルで再び蒔いた。リガンド刺激のおよそ18時間前に、培地をDMEM＋0.5%FBSに交換した。
B. シグナル伝達レポーターアッセイ
シグナル伝達レポーターアッセイを以下のように行った：37℃、DMEM＋0.5%FBSでの18時間のインキュベーション後、トランスフェクションされた細胞を、100 ng/ml IL-28A、IL-29、IL-28B、zcyto24、zcyto25およびhuIFN-α2aリガンドで刺激した。37℃、4時間のインキュベーション後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ基質の添加後、照度計で相対光ユニット(RLU)を測定した。得られた結果は、培地のみの対照に対する実験試料のRLUの倍誘導(fold induction)として示されている(実験試料のRLU/培地のみのRUL＝倍誘導)。表2は、IL-28A、IL-29、IL-28B、zcyto24およびzcyto25が、ISRE-ルシフェラーゼでトランスフェクションされたヒトHepG2肝臓細胞においてISREシグナル伝達を誘導することを示している。
【００７５】
（表２）HepG2細胞におけるサイトカイン依存性ISREシグナル伝達の倍誘導
2006509041.tif 000003
【００７６】
実施例3
HepG2細胞におけるIFNαと比較したIL-29抗ウイルス活性
抗ウイルス活性法をヒト細胞でのEMCV(American Type Culture Collection # VR-129B, Manassas, VA)に適応させた(Familletti, P., et al., Methods Enzym. 78:387-394, 1981)。細胞をサイトカインと共に蒔き、0.1〜1の感染多重度におけるEMCVによる曝露の前に24時間、インキュベートした。細胞を、感染の24時間後、色素取り込みバイオアッセイで生存度について分析した(Berg, K., et al., Apmis 98:156-162, 1990)。標的細胞にMTTを与え、37℃で2時間、インキュベートした。可溶化剤溶液を添加し、37℃で一晩、インキュベートし、570 nmにおける光学濃度を測定した。OD570は、抗ウイルス活性に正比例する。
【００７７】
結果は、IL-29およびIFNがHepG2細胞で試験された場合の抗ウイルス活性を示している：IL-29、IFN-βおよびIFN-α2aをEMCV感染および色素取り込みアッセイの前に様々な濃度でHepG2へ加えられた。3連のウェルからのOD570の平均および標準偏差をプロットする。OD570は、抗ウイルス活性に正比例する。IL-29について、EC50は、0.60 ng/mlであった；IFN-α2aについて、EC50は、0.57 ng/mlであった；およびIFN-βについて、EC50は、0.46 ng/mlであった。
【００７８】
実施例4
肝臓およびリンパ球分画におけるIL-28RA mRNA発現
IL-28RAについてのmRNA分布をさらに調べるために、半定量的RT-PCRをSDS 7900HTシステム(Applied Biosystems, CA)を用いて行った。1段階RT-PCRを、各試料について100 ng 全RNAおよび遺伝子特異的プライマーを用いて行った。標準曲線をBjab RNAを用いて各プライマーセットについて作成し、すべての標本値をHPRTに対して標準化した。標準化された結果は、表2〜4に要約されている。IFNAR2およびCRF2-4についての標準化された値もまた示されている。
【００７９】
（表３）B細胞およびT細胞は、有意なレベルのIL-28RA mRNAを発現する。低レベルは、樹状細胞およびたいていの単球に見られた。
2006509041.tif 000004
【００８０】
表4に示されているように、正常肝臓組織および肝臓由来細胞株は、実質的なレベルのIL-28RAおよびCRF2-4のmRNAを示す。
【００８１】
（表４）
2006509041.tif 000005
【００８２】
表5に示されているように、主要な気道上皮細胞は、豊富なレベルのIL-28RAおよびCRF2-4を含む。
【００８３】
（表５）
2006509041.tif 000006
【００８４】
表6に示されているように、IL-28RAは、正常および罹患肝臓検体に存在し、C型肝炎およびB型肝炎に感染した検体由来の組織に発現が増加している。
【００８５】
（表６）
2006509041.tif 000007
【００８６】
表7〜11に示されているように、IL-28RAは、正常B細胞、Bリンパ腫細胞株、T細胞、Tリンパ腫細胞株(ジャーカット)、正常および形質転換されたリンパ球(B細胞およびT細胞)ならびに正常なヒト単球において検出できる。
【００８７】
（表７）
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【００８８】
（表８）
2006509041.tif 000009
【００８９】
（表９）
2006509041.tif 000010
【００９０】
（表１０）
2006509041.tif 000011
【００９１】
（表１１）
2006509041.tif 000012
【００９２】
実施例5
マウスIL-28はダウディ(Daudi)細胞増殖に影響を及ぼさない
ヒトダウディ細胞を50,000細胞/ミリリットルでRPMI＋10%FBSに懸濁し、5000細胞を96ウェルプレートのウェルごとに蒔いた。IL-29-CEE(gluタグを結合したIL-29)、IFN-γまたはIFN-α2aを各ウェルへ2倍連続希釈で加えた。IL-29-CEEは、1000 ng/mlから0.5 ng/mlまでの濃度範囲で用いられた。IFN-γは、125 ng/mlから0.06 ng/mlまでの濃度範囲で用いられた。IFN-α2aは、62 ng/mlから0.03 ng/mlまでの濃度範囲で用いられた。細胞を37℃で72時間、インキュベートした。72時間後、アラマーブルー(Alamar Blue)(Accumed, Chicago, IL)を20マイクロリットル/ウェルで添加した。プレートを37℃、5%COで24時間、さらにインキュベートした。プレートを、波長544(励起)および波長590(発光)において、SoftMax(商標)Proプログラムを用いるFmax(商標)プレートリーダー(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)上で読んだ。アラマーブルーは、細胞の代謝活性に基づく蛍光測定読み出しを与え、従って、陰性対照と比較した細胞増殖の直接的測定である。結果は、IL-29-CEEが、IFN-α2aとは対照的に、ダウディ細胞の増殖に有意な影響を及ぼさないことを示している。
【００９３】
実施例6
マウスIL-28はマウスB細胞に増殖抑制効果を生じない
マウスB細胞を、MACS磁気ビーズを用いてCD43+細胞を枯渇させることにより、2つのBalb/C脾臓(生後7ヶ月)から単離した。精製されたB細胞をLPS、抗IgMまたは抗CD40モノクローナル抗体と共にインビトロで培養した。マウスIL-28またはマウスIFNαを培養物に加え、3H-チミジンを48時間目に加え、3H-チミジン取り込みを72時間の培養後、測定した。
【００９４】
10 ng/mlでのIFNαは、LPSまたは抗IgMのいずれかで刺激されたマウスB細胞による3H-チミジン取り込みを阻害した。しかしながら、IL-28は、1000 ng/mlを含むいずれの試験された濃度においても、3H-チミジン取り込みを阻害しなかった。対照的に、mIFNαおよびマウスIL-28の両方とも、抗CD40モノクローナル抗体で刺激されたマウスB細胞による3H-チミジン取り込みを増加させた。
【００９５】
これらのデータは、IFNaとは違って、マウスIL-28が、高濃度でさえも増殖抑制活性を示さないことを実証している。さらに、zcyto24は、抗CD40モノクローナル抗体の存在下において増殖を促進させる。その結果は、マウスIL-28が高濃度でさえもマウスB細胞への増殖抑制活性を示さない点で、マウスIL-28はIFNαと異なることを例証している。さらに、マウスIL-28は、抗CD40モノクローナル抗体の存在下において増殖を促進させる。
【００９６】
実施例7
骨髄増殖アッセイ
新鮮なヒト骨髄単核細胞(Poietic Technologies, Gaithersburg, Md.)を、αMEM、10%FBS、50マイクロモルのβ-メルカプトエタノール、2 ng/ml FLT3Lにおいて37℃で、2時間、プラスチックへ付着させた。非付着細胞を、その後、1000 ng/ml IL-29-CEE、100 ng/ml IL-29-CEE、10 ng/ml IL-29-CEE、100 ng/ml IFN-α2a、10 ng/ml IFN-α2aまたは1 ng/ml IFN-α2aの存在または非存在下における、αMEM、10%FBS、50マイクロモルのβ-メルカプトエタノール、2 ng/ml FLT3Lにおいて、25,000〜45,000細胞/ウェル(96ウェル組織培養プレート)で蒔いた。これらの細胞を、骨髄由来造血細胞の増殖または分化について試験するために様々なサイトカインとインキュベートした(20 ng/ml IL-2、2 ng/ml IL-3、20 ng/ml IL-4、20 ng/ml IL-5、20 ng/ml IL-7、20 ng/ml IL-10、20 ng/ml IL-12、20 ng/ml IL-15、10 ng/ml IL21またはサイトカイン添加なし)。8〜12日後、アラマーブルー(Accumed, Chicago, Ill)を20マイクロリットル/ウェルで添加した。プレートを37℃、5%COで24時間、さらにインキュベートした。プレートを、波長544(励起)および波長590(発光)において、SoftMax(商標)Proプログラムを用いるFmax(商標)プレートリーダー(Molecular Devices, Sunnyvale, Calif.)上で読んだ。アラマーブルーは、細胞の代謝活性に基づく蛍光測定読み出しを与え、従って、陰性対照と比較した細胞増殖の直接的測定である。
【００９７】
IFN-α2aは、試験されたすべての条件下において、骨髄増殖の有意な阻害を引き起こした。対照的に、IL-29は、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-21の存在下またはサイトカイン添加なしにおいて、骨髄細胞の増殖に有意な影響を及ぼさなかった。骨髄細胞増殖の少しの阻害が、IL-2またはIL-15の存在下に見られた。
【００９８】
実施例8
IL-28およびIL-29のシグナル伝達の可溶性受容体(zcytoR19/CRF2-4)での阻害
A. シグナル伝達レポーターアッセイ
シグナル伝達レポーターアッセイは、zcytor19-Fc4ホモ二量体およびzcytor19-Fc/CRF2-4-Fcヘテロ二量体の可溶性受容体の、zcyto20、zcyto21およびzcyto24シグナル伝達への阻害剤性質を示すために用いられうる。zcytor19受容体を過剰発現させるヒト胚性腎臓(HEK)細胞を、ルシフェラーゼ受容体遺伝子の転写を操作するインターフェロン刺激応答配列(interferon-stimulated response element)(ISRE)を含むレポータープラスミドでトランスフェクションする。トランスフェクションされた細胞のリガンド(zcyto20(SEQ ID NO:18)、zcyto21(SEQ ID NO:20)、zcyto24(SEQ ID NO:8)を含む)での刺激後のルシフェラーゼ活性は、リガンドの可溶性受容体との相互作用を反映している。
【００９９】
B. 細胞トランスフェクション
zcytor19を過剰発現させる293HEK細胞を以下のようにトランスフェクションした：700,000個の293細胞/ウェル(6ウェルプレート)を2ミリリットルのDMEM＋10%ウシ胎児血清にトランスフェクションの約18時間前に蒔いた。ウェルにつき、1マイクログラム pISRE-ルシフェラーゼDNA(pISRE-Luciferase DNA)(Stratagene)および1マイクログラム pIRES2-EGFP DNA(Clontech)を6マイクロリットル フュージーン6(Fugene 6)試薬(Roche Biochemicals)に加え、合計100マイクロリットル DMEMにした。このトランスフェクション混合物を、あらかじめ蒔かれた293細胞へ30分後、加えた。24時間後、トランスフェクションされた細胞をトリプシン-EDTAを用いてプレートから取り出し、96ウェルマイクロタイタープレートに、およそ25,000細胞/ウェルで再び蒔いた。リガンド刺激のおよそ18時間前に、培地をDMEM＋0.5%FBSに交換した。
C. シグナル伝達レポーターアッセイ
シグナル伝達レポーターアッセイを以下のように行った：37℃、DMEM＋0.5%FBSでの18時間のインキュベーション後、トランスフェクションされた細胞を、10 ng/ml zcyto20、zcyto21またはzcyto24、および10マイクログラム/mlの以下の可溶性受容体で刺激した；ヒトzcytor19-Fcホモ二量体、ヒトzcytor19-Fc/ヒトCRF2-4-Fcヘテロ二量体、ヒトCRF2-4-Fcホモ二量体、マウスzcytor19-Igホモ二量体。37℃、4時間のインキュベーション後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ基質の添加後、照度計で相対光ユニット(RLU)を測定した。得られた結果は、PBSのみの存在下におけるシグナル伝達に対する、可溶性受容体の存在下におけるリガンド誘導シグナル伝達のパーセント阻害として示されている。表11は、ヒトzcytor19-Fc/ヒトCRF2-4ヘテロ二量体の可溶性受容体が、対照の16%と45%の間で、zcyto20、zcyto21およびzcyto24誘導シグナル伝達を阻害することができることを示している。ヒトzcytor19-Fcホモ二量体の可溶性受容体もまた、zcyto21誘導シグナル伝達を45%、阻害することができる。huCRF2-4-Fcまたはmuzcytor19-Igのホモ二量体の可溶性受容体に関して、有意な効果は見られなかった。
【０１００】
（表１２）可溶性受容体による、リガンド誘導のインターフェロン刺激応答配列(ISRE)シグナル伝達のパーセント阻害
2006509041.tif 000013
【０１０１】
実施例9
IL-28およびIL-29は新鮮なヒトPBMCにおいてHIV複製を阻害する
ヒト免疫不全ウイルス(HIV)は、免疫系の細胞に感染する病原性レトロウイルスである。CD4 T細胞および単球は、一次感染細胞型である。インビトロでHIV複製を阻害するIL-28およびIL-29の能力を試験するために、正常なドナー由来のPBMCをIL-28、IL-29およびMetIL-29C172S-PEGの存在下においてHIVウイルスに感染させた。
【０１０２】
新鮮なヒト末梢血単核細胞(PBMC)を、HIVおよびHBVについて血清反応陰性であったスクリーニングされたドナーから得られた全血から単離した。末梢血細胞を低速度遠心分離により2〜3回、ペレット状にし/洗浄し、混入している血小板を除去するためにPBSに再懸濁した。洗浄された血液細胞をダルベッコのリン酸緩衝食塩水(D-PBS)で1:1に希釈し、50 mL 遠心分離管における14 mLのリンパ球分離培地(Lymphocyte Separation Medium)((LSM; cellgro(商標)、Mediatech, Inc. Herndon, VAによる)；密度1.078+/-0.002 g/ml)一面に層にし、600 x Gで30分間、遠心分離した。団結したPBMCを結果として生じた界面から穏やかに吸引し、その後、低速度遠心分離によりPBS中で2X、洗浄した。最後の洗浄後、細胞をトリパンブルー排除により数え、15%ウシ胎児血清(FBS)、2 mM L-グルタミン、4 μg/ml PHA-Pを追加したRPMI 1640に1 x 107細胞/mLで再懸濁した。細胞を37℃で48〜72時間、インキュベートするようにさせておいた。インキュベーション後、PBMCを遠心分離し、15%FBS、2 mM L-グルタミン、100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン、10 μg/mL ゲンタマイシン、および20 U/mL 組換えヒトIL-2を含むRPMI 1640に再懸濁した。PBMCを、培地において1〜2 x 106細胞/mLの濃度で維持し、アッセイプロトコールに用いるまで隔週の培地交換を行った。単球は、組織培養フラスコへの付着の結果として培養物から枯渇した。
【０１０３】
標準PBMCアッセイについて、少なくとも2人の正常なドナー由来のPHA-Pに刺激された細胞をプールし、1 x 106細胞/mLの最終濃度へ新鮮な培地に希釈し、50 μL/ウェル(5 x 104細胞/ウェル)で、96ウェル丸底マイクロプレートの内部ウェルに蒔いた。試験希釈をマイクロタイターチューブに2X濃度で調製し、各濃度の100 μLを標準的形式で適切なウェルに配置した。IL-28、IL-29およびMetIL-29C172S-PEGを0〜10 μg/mlの濃度で、通常には1/2対数希釈で、加えた。予定希釈度のウイルス貯蔵物の50 μLを各試験ウェルに置いた(0.1の最終MOI)。細胞およびウイルスのみが加えられたウェルをウイルス対照として用いた。分離プレートを、MTSアッセイ系を用いる薬物細胞毒性研究のために、ウイルスなしで同様に調製した。PBMC培養物を感染後7日間、維持し、その時点で、細胞を含まない上清試料を収集し、逆転写酵素活性およびp24抗原レベルについてアッセイした。
【０１０４】
IL-28、IL-29およびMetIL-29C172S-PEGでの逆転写酵素活性またはp24抗原レベルにおける減少は、抗ウイルス活性の指標であると思われる。結果は、IL-28およびIL-29が、HIVおよびAIDSを治療するにおいて治療的価値をもちうることを実証しているものと思われる。
【０１０５】
実施例10
IL-28およびIL-29はマーモセット肝臓細胞におけるGBV-B複製を阻害する
HCVは、RNAウイルスのフラビウイルス(Flaviviridae)科のメンバーである。HCVは、エキソビボまたはインビトロのいずれの培養においてもあまり複製せず、それゆえに、インビトロで分子の抗HCV活性を試験する満足な系がない。GBウイルスB(GBV-B)は、それがHCVと比較的高レベルの配列同一性をもち、かつ肝臓指向性ウイルスであるため、抗HCV抗ウイルス剤の開発における使用として魅力的な代理モデルである。現在まで、そのウイルスは、特定のヒト以外の霊長類の一次肝細胞においてのみ増殖することができる。これは、インビトロで肝細胞を単離し、それらをGBV-Bで感染させることによるか、またはGBV-B感染したマーモセットから肝細胞を単離し、直ちにそれらを抗ウイルス化合物と用いることによるかのいずれかで、達成される。
【０１０６】
IL-28、IL-29およびMetIL-29C172S-PEGの効果は、3連で6つの半対数希釈IL-28、IL-29またはMetIL-29C172S-PEGポリペプチドで、TaqMan RT-PCRによりGBV-B細胞外RNA産生について、およびCellTiter96(登録商標)試薬(Promega, Madison, WI)を用いて細胞毒性について、アッセイされた。未処理の培養物は、細胞およびウイルスの対照としての役割を果たす。RIBAVIRIN(登録商標)(最高試験濃度において200 μg/ml)およびIFN-α(最高試験において5000 IU/ml)の両方が陽性対照化合物として含まれる。一次肝細胞培養物を単離し、コラーゲンコーティングされたプレート上に蒔く。次の日、培養物を、GBV-Bビリオンに曝す前に24時間、試験試料(IL-28、IL-29、MetIL-29C172S-PEG、IFNαまたはRIBAVIRIN(登録商標))で処理する、またはインビボで感染した肝細胞を用いる場合、直ちに試験試料で処理する。試験試料および培地は、次の日に加えられ、3日後に交換される。3〜4日後(試験試料添加後6〜7日目)、上清を収集し、細胞数をCellTiter96(登録商標)で定量化する。ウイルスRNAを上清から抽出し、標準としてRT-PCR標的を含むインビトロで転写されたRNAを用いる定量的TaqMan RT-PCRアッセイにおいて3連の複製について定量化する。複製試料の平均を計算する。ウイルス産生の阻害は、未処理のウイルスおよび細胞対照に対して、3連の試料の平均RNA値および細胞数値をプロットすることにより、評価される。GBV-B RNA産生の50%阻害(IC50)を結果として生じる薬物の阻害性濃度、および対照値に対して細胞数の50%の破壊を結果として生じる毒性濃度(TC50)は、データで作成されたグラフから補間法により計算される。
【０１０７】
IL-28およびIL-29によるGBV-B RNA産生の阻害は、肝細胞、C型肝炎の感染の原発性器官、におけるこのC型肝炎様ウイルスへのIL-28およびIL-29の抗ウイルス性質の指標であり、陽性結果は、IL-28またはIL-29がヒトにおいてHCV感染を治療するのに有用でありうることを示唆している。
【０１０８】
実施例11
IL-28、IL-29およびMetIL-29C172S-PEGはWT10細胞におけるHBV複製を阻害する
慢性B型肝炎(HBV)は、ウイルスのヘパドナウイルス(Hepadnaviridae)科に属する、ヒトの最も一般的かつ重篤なウイルス感染の一つである。IL-28およびIL-29のHBVに対する抗ウイルス活性を試験するために、IL-28、IL-29およびMetIL-29C172S-PEGを、ヒト肝臓系統HepG2の変異体を用いるインビトロ感染系においてHBVに対して試験した。IL-28、IL-29およびMetIL-29C172S-PEGは、この系においてウイルスの複製を阻害し、ヒトでHBVを治療することにおける治療的価値を示唆している。
【０１０９】
WT10細胞は、ヒト肝臓細胞株HepG2 2.2.15の派生物である。WT10細胞は、HBVゲノムで安定的にトランスフェクションされ、その細胞株においてHBV転写産物の安定的発現を可能にする(Fu and Cheng, Antimicrobial Agents Chemother. 44(12):3402-3407, 2000)。WT10アッセイにおいて、問題の薬物および3TC対照は、半対数系列で希釈された5つの濃度それぞれでアッセイされる。評価項目は、細胞外HBV DNA(IC50)についてのTaqMan PCR、およびCellTiter96試薬を用いる細胞数(TC50)である。アッセイは、Korba et al. Antiviral Res. 15(3):217-228, 1991およびKorba et al., Antiviral Res. 19(1):55-70, 1992により記載されたものと類似している。簡単には、WT10細胞を96ウェルマイクロタイタープレートに蒔く。16〜24時間後、HepG2-2.2.15細胞の集密的な単層を洗浄し、培地を、3連で試験試料の様々な濃度を含む完全培地と交換する。陽性対照として、3TCが用いられ、陰性対照(ウイルス対照、VC)として、培地のみを細胞へ加える。3日後、培地を、適切に希釈された試験試料を含む新鮮な培地と交換する。試験化合物の最初の添加から6日後、細胞培養上清を収集し、プロナーゼおよびデオキシリボヌクレアーゼで処理し、リアルタイム定量的TaqMan PCRアッセイに用いる。PCR増幅されたHBV DNAは、増幅したHBV DNAにハイブリダイズする消光した蛍光プローブ分子の外ヌクレオチド鎖分解性分解から生じる蛍光シグナルにおける増加をモニターすることによりリアルタイムで検出される。各PCR増幅について、標準曲線は、精製されたHBV DNAの希釈を用いて同時に作成される。抗ウイルス活性は、HBV DNAレベルにおける低下から計算される(IC50)。色素取り込みアッセイは、その後、毒性を計算するために用いられる細胞生存度を測定するために使用される(TC50)。治療指数(TI)は、TC50/IC50として計算される。
【０１１０】
IL-28、IL-29およびMetIL-29C172S-PEGは、IC50<0.032 ug/mlで、WT10細胞におけるHepBウイルスの複製を阻害した。これは、肝臓細胞株で増殖したHBVに対するIL-28およびIL-29の抗ウイルス活性を実証しており、ヒト患者においてHBVを治療するについての治療的価値の証拠を提供している。
【０１１１】
実施例12
IL-28、IL-29およびMetIL-29C172S-PEGはウシ腎臓細胞におけるBVDV複製を阻害する
HCVは、RNAウイルスのフラビウイルス(Flaviviridae)科のメンバーである。この科に属する他のウイルスは、ウシウイルス性下痢症ウイルス(BVDV)および黄熱病ウイルス(YFV)である。HCVは、エキソビボまたはインビトロのいずれの培養においてもあまり複製せず、それゆえに、インビトロで抗HCV活性を試験する系がない。BVDVおよびYFVアッセイは、ウイルスのフラビウイルス(Flavivirida)科に対する抗ウイルス活性を試験するためのHCVについての代理ウイルスとして用いられる。
【０１１２】
IL-28、IL-29およびMetIL-29C172S-PEGの抗ウイルス効果は、細胞変性効果(CPE)の抑制アッセイにおいて評価された。アッセイは、細胞変性BVDVウイルスでの感染後のマディン-ダービー(Madin-Darby)ウシ腎臓細胞(MDBK)を用いる細胞死、ならびにIL-28、IL-29およびMetIL-29C172S-PEGの添加による細胞死の抑制を測定した。MDBK細胞を10%ウマ血清、1%グルタミンおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシンを加えた、フェノールレッドを含むダルベッコの改変基本培地(DMEM)において増殖させた。CPE抑制アッセイは、2%FBS、1%グルタミンおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシンを加えた、フェノールレッドなしのDMEMにおいて行われた。アッセイの前日に、細胞をトリプシン処理(1%トリプシン-EDTA)し、洗浄し、数え、100 μl/ウェルの容量である96ウェル平底BioCoat(登録商標)プレート(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)に104細胞/ウェルで蒔いた。次の日、培地を除去し、ウイルスのあらかじめ力価測定されたアリコートを細胞に加えた。ウイルスの量は、最大CPE発生の時点(BVDVについて7日目)で完全な細胞殺害(>80%)を生じるであろう最大希釈であった。細胞生存度は、Vmaxプレートリーダー(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を用いて、製造会社のプロトコールに従ってCellTiter96(登録商標)試薬(Promega)を使用し測定された。試験試料は、半対数系列でアッセイ培地に希釈された、6つの濃度それぞれにおいて試験された。IFNαおよびRIBAVIRIN(登録商標)は、陽性対照として用いられた。試験試料は、ウイルス感染の時点で加えられた。各濃度におけるパーセントCPE低下およびパーセント細胞生存度についての平均バックグラウンドならびに試料色補正データは、対照に対して決定され、IC50は、TC50に対して計算された。
【０１１３】
IL-28、IL-29およびMetIL-29C172S-PEGは、MDBKウシ腎臓細胞においてBVDVにより引き起こされる細胞死を抑制した。IL-28は、0.02 μg/mlのIC50で細胞死を抑制し、IL-29は、0.19 μg/mlのIC50で細胞死を抑制し、MetIL-29C172S-PEGは、0.45 μg/mlのIC50で細胞死を抑制した。これは、IL-28およびIL-29がウイルスのフラビウイルス科に対する抗ウイルス活性をもっていることを実証した。
実施例13
IL-28およびIL-29による、インターフェロン刺激遺伝子(Interferon Stimulated Genes)の誘導
A. ヒト末梢血単核細胞
新鮮な単離されたヒト末梢血単核細胞を、IL-29(20 ng/mL)、IFNα2a(2 ng/ml)(PBL Biomedical Labs, Piscataway,NJ)の存在下において、または培地のみにおいて増殖させた。細胞を6、24、48または72時間、インキュベートし、その後、全RNAを単離し、リボヌクレアーゼを含まないデオキシリボヌクレアーゼで処理した。100 ng 全RNAを、製造会社(Applied Biosystems, Branchburg, NJ)により提案されているように、Taqman One-Step RT-PCR Master Mix(登録商標)試薬および遺伝子特異的プライマーを用いるOne-Step Semi-Quantitative RT-PCR(登録商標)のための鋳型として用いた。結果は、HPRTに対して標準化され、各時点について培地のみの対照に対する倍誘導として示されている。表13は、IL-29が、試験されたすべての時点において、ヒト末梢血単核細胞においてインターフェロン刺激遺伝子の発現を誘導することを示している。
【０１１４】
（表１３）
2006509041.tif 000014
【０１１５】
B. 活性化ヒトT細胞
ヒトT細胞を、Pan T-cell Isolation(登録商標)キットを用いて、製造会社(Miltenyi, Auburn, CA)の使用説明書に従い、新鮮に採取された末梢血単核細胞から負の選択により単離した。T細胞を、その後、プレートに結合した抗CD3、可溶性抗CD28(0.5 ug/ml)(Pharmingen, San Diego, CA)およびインターロイキン2(IL-2; 100 U/ml)(R&D Systems, Minneapolis, MN)で5日間、活性化しかつ増殖させ、洗浄し、その後、IL-2でさらに5日間、増殖させた。活性化および増殖後、細胞を、IL-28A(20 ng/ml)、IL-29(20 ng/ml)または培地のみで、3、6または18時間、刺激した。全RNAを単離し、リボヌクレアーゼを含まないデオキシリボヌクレアーゼで処理した。One-Step Semi-Quantitative RT-PCR(登録商標)を上の実施例に記載されているように行った。結果は、HPRTに対して標準化され、各時点について培地のみの対照に対する倍誘導として示されている。表14は、IL-28およびIL-29が、試験されたすべての時点において、活性化ヒトT細胞においてインターフェロン刺激遺伝子の発現を誘導することを示している。
【０１１６】
（表１４）
2006509041.tif 000015
【０１１７】
C. 一次ヒト肝細胞
2人の別々のドナー(Cambrex, Baltimore, MDおよびCellzDirect, Tucson, AZ)由来の新鮮に単離されたヒト肝細胞を、IL-28A(50 ng/ml)、IL-29(50 ng/ml)、IFNα2a(50 ng/ml)、または培地のみで、24時間、刺激した。刺激後、全RNAを単離し、リボヌクレアーゼを含まないデオキシリボヌクレアーゼで処理した。One-step semi-quantitative RT-PCRを上の実施例で前に記載されているように行った。結果は、HPRTに対して標準化され、各時点について培地のみの対照に対する倍誘導として示されている。表15は、IL-28およびIL-29が、24時間の刺激後、一次ヒト肝細胞においてインターフェロン刺激遺伝子の発現を誘導することを示している。
【０１１８】
（表１５）
2006509041.tif 000016
【０１１９】
D. HepG2およびHuH7：ヒト肝臓肝細胞腫細胞株
HepG2およびHuH7(ATCC NOS. 8065, Manassas, VA)をIL-28A(10 ng/ml)、IL-29(10 ng/ml)、IFNα2a(10 ng/ml)、IFNB(1 ng/ml)(PBL Biomedical Piscataway, NJ)、または培地のみで、24または48時間、刺激した。別個の培養において、HepG2細胞を20 ng/mlのMetIL-29C172S-PEGまたはMetIL-29-PEGで上記のように刺激した。全RNAを単離し、リボヌクレアーゼを含まないデオキシリボヌクレアーゼで処理した。100 ng 全RNAを、前に記載されているように、one-step semi-quntitative RT-PCRについての鋳型として用いた。結果は、HPRTに対して標準化され、各時点について培地のみの対照に対する倍誘導として示されている。表16は、IL-28およびIL-29が、24および48時間後、HepG2およびHuH7肝臓肝細胞腫細胞株においてISG発現を誘導することを示している。
【０１２０】
（表１６）
2006509041.tif 000017
【０１２１】
（表１７）
2006509041.tif 000018
示されたデータは、24時間の培養後の20 ng/mlの、IL-29のMetIL-29-PEGおよびMetIL-29C172S-PEGバージョンについてである。
【０１２２】
示されたデータは、HPRTに対して標準化され、刺激されていない細胞に対する倍誘導として示されている。
【０１２３】
実施例14
HCVレプリコン系におけるIL-28およびIL-29の抗ウイルス活性
HCV複製を阻害する抗ウイルス薬の能力は、HCVレプリコン系についてインビトロで試験されうる。レプリコン系は、HCVゲノムRNAの構成的複製を方向づけるサブゲノムRNAレプリコンでトランスフェクションされたHuh7ヒト肝細胞腫細胞株からなる(Blight, K.J. et al. Science 290:1972-1974, 2000)。10 IU/mlのIFNαでのレプリコンクローンの処理は、HCV RNAの量を未処理の対照細胞株と比較して85%、低下させる。72時間後には、レプリコンクローンにより産生されたHCV RNAの量を低下させるIL-28AおよびIL-29の能力は、IL-28A/IL-29処理によりHuh7細胞に与えられた抗ウイルス状態が、HCVレプリコン複製を阻害するのに効果的であり、それにより、HCV複製を阻害するのに効果的である可能性が非常に高いことを示している。
【０１２４】
Bayer Branched chain DNAキットにより測定されるようなHCV複製を阻害するIL-28AおよびIL-29の能力は、以下の条件下で行われる：
1. 1.0 μg/mlまでの増加性濃度(6)＊におけるIL28単独
2. 1.0 μg/mlまでの増加性濃度(6)＊におけるIL29単独
3. 1.0 μg/mlまでの増加性濃度(6)＊におけるPEGIL29単独
4. 0.3、1.0および3.0 IU/mlにおけるIFNα2A単独
5. Ribavirin単独
【０１２５】
陽性対照はIFNαであり、陰性対照はribavirinである。
【０１２６】
細胞は、生存度を評価するために72時間後にアラマーブルーで染色される。
【０１２７】
＊条件1〜3についての濃度は以下である：
1.0 μg/ml、0.32 μg/ml、0.10 μg/ml、0.032 μg/ml、0.010 μg/ml、0.0032 μg/ml。
【０１２８】
レプリコンクローン(BB7)は、上で列挙された用量で3日間連続、1日あたり1X、処理される。全HCV RNAは、72時間後、測定される。
【０１２９】
実施例15
IL-28およびIL-29は病原性ウイルスに対する抗ウイルス活性をもつ
特にアデノウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、インフルエンザウイルス、ワクシニアウイルス、西ナイルウイルス、デング熱ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ピキンデウイルスおよびポリオウイルスを含む病原性ウイルスのパネルに対するIL-28およびIL-29の抗ウイルス活性をインビトロでアッセイするために、2つの方法が用いられる。これらの2つの方法は、細胞の視覚的(顕微鏡の)検査により測定されるウイルス誘導細胞変性効果(CPE)の抑制、および細胞へのニュートラルレッド(NR)色素取り込みにおける増加である。CPE抑制方法において、7つの濃度の試験薬物(1000、100、10、1、0.1、0.01、0.001 ng/mlのようなlog10希釈)が、宿主細胞を含む96ウェル平底マイクロプレートにおいて各ウイルスに対して評価される。化合物は、ウイルスの24時間前に加えられ、細胞あたり0.01〜0.0001感染性粒子の感染多重度(MOI)と同等と考える、ウイルスに依存して、ウェルあたりおよそ5〜100細胞培養感染用量(cell culture infectious doses)の濃度で用いられる。試験は、適当なウイルスの細胞変性効果が発生するのを可能にするのに十分な特定時間の37℃でのインキュベーション後に読まれる。NR取り込みアッセイにおいて、色素(培地において0.34%濃度)は、視覚による得点を得るために用いられるプレートの同じセットに添加される。2時間後、細胞に吸収されかつ続いて細胞から溶出される色素の色の強さは、マイクロプレート自動リーダーを用いて測定される。抗ウイルス活性は、半対数グラフ用紙上に化合物濃度対パーセント阻害をプロットすることにより決定された50%有効(ウイルス阻害性)濃度(EC50)として表示される。いくつかの場合におけるEC50/IC50は、適切な回帰分析ソフトウェアにより決定されうる。一般的に、NRアッセイにより測定されたEC50は、CPE方法により得られたものより2〜4倍高い。
【０１３０】
（表１８）視覚的アッセイ
2006509041.tif 000019
2006509041.tif 000020
2006509041.tif 000021
【０１３１】
（表１９）ニュートラルレッドアッセイ法
2006509041.tif 000022
2006509041.tif 000023
2006509041.tif 000024
【０１３２】
実施例16
IL-28、IL-29、metIL-29-PEGおよびMetIL-29C172S-PEGはマウス肝臓細胞株AML-12においてISG誘導を刺激する
インターフェロン刺激遺伝子(ISG)は、I型インターフェロン(IFN)により、ならびにまたIL-28およびIL-29ファミリー分子によっても、誘導される遺伝子であり、IFNならびにIL-28およびIL-29が抗ウイルス活性へ導く類似した経路を誘導することを示唆している。ヒトI型IFN(IFNα1-4およびIFNβ)は、マウス細胞へほとんどまたは全く活性をもたず、種間交差反応性の欠如に起因するものと考えられる。ヒトIL-28およびIL-29がマウス細胞に効果を生じるかどうかを試験するために、ヒトIL-28およびIL-29によるISG誘導が、マウス肝臓由来細胞株AML-12におけるリアルタイムPCRにより評価された。
【０１３３】
AML-12細胞を、6ウェルプレートの完全DMEM培地に2 x 106細胞/ウェルの濃度で蒔いた。細胞を蒔いてから24時間後、ヒトIL-28およびIL-29を培養物へ20 ng/mlの濃度で加えた。対照として、細胞は、マウスIFNαで刺激される(陽性対照)かまたは刺激されない(陰性)かのいずれかであった。細胞を、CHO由来ヒトIL-28A(SEQ ID NO:18)またはIL-29(SEQ ID NO:20)の添加から8、24、48および72時間後、採集した。RNAをRNAEasy-kit(登録商標)(Qiagen, Valencia, CA)を用いて細胞ペレットから単離した。RNAを、どんな混入しているDNAもRNAから取り除くためにデオキシリボヌクレアーゼ(Millipore, Billerica, MA)で処理した。cDNAをPerkin-Elmer RT mixを用いて作製した。ISG遺伝子誘導は、マウスOAS、PkrおよびMx1に特異的なプライマーならびにプローブを用いるリアルタイムPCRにより評価された。定量的データを得るために、HPRTリアルタイムPCRは、ISG PCRと二重化された。標準曲線は、IFNに刺激されたマウスPBL由来のRNAの既知の量を用いて得られた。すべてのデータは内部HPRT発現に対する発現として示されている。
【０１３４】
ヒトIL-28AおよびIL-29は、マウス肝細胞細胞株AML-12においてISG誘導を刺激し、I型IFNとは違って、IL-28/29ファミリータンパク質が異種間反応性を示すことを実証した。
【０１３５】
（表２０）
2006509041.tif 000025
【０１３６】
示されたすべてのデータは、HPRT遺伝子発現に対する倍として表示されている。
OAS mRNAのng＝内部のHPRT mRNAのngに対するOAS mRNA量の標準化された値
ハウスキーピング遺伝子、HPRT
例として、48時間時点についてのデータが示されている。
【０１３７】
（表２１）AML12のもの
2006509041.tif 000026
細胞は、20 ng/ml MetIL-29-PEGまたはMetIL-29C172S-PEGで24時間、刺激された。
【０１３８】
示されたデータは、HPRTに対して標準化され、刺激されていない細胞に対する倍誘導として示されている。
【０１３９】
実施例17
ISGはヒトIL-29を発現させるトランスジェニックマウスの脾臓において効率的に誘導される
Eu-lckプロモーターの制御下でヒトIL-29を発現させるトランスジェニック(Tg)マウスを作製した。ヒトIL-29がマウスにおいてインビボで生物活性をもつかどうかを研究するために、ISGの発現を、Eu-lck IL-29トランスジェニックマウスの脾臓におけるリアルタイムPCRにより分析した。
トランスジェニックマウス(C3H/C57BL/6)は、Eu-lckプロモーターの制御下でヒトIL-29遺伝子を発現させる構築物を用いて作製された。このプロモーターは、T細胞およびB細胞において活性がある。トランスジェニックマウスおよびそれらの非トランスジェニック同腹子(n=2/群)を約10週間の齢で屠殺した。マウスの脾臓を単離した。RNAをRNAEasy-kit(登録商標)(Qiagen)を用いて細胞ペレットから単離した。RNAを、どんな混入しているDNAもRNAから取り除くためにデオキシリボヌクレアーゼで処理した。cDNAをPerkin-Elmer RT(登録商標)mixを用いて作製した。ISG遺伝子誘導は、マウスOAS、PkrおよびMx1に特異的なプライマーならびにプローブ(5'FAM、3'NFQ)を用いるリアルタイムPCRにより評価された。定量的データを得るために、HPRTリアルタイムPCRは、ISG PCRと二重化された。さらに、標準曲線は、IFNに刺激されたマウスPBLの既知の量を用いて得られた。すべてのデータは内部HPRT発現に対する発現として示されている。
【０１４０】
IL-29 Tgマウスから単離された脾臓は、それらの非Tg同腹子対照と比較してISG OAS、PkrおよびMx1の高誘導を示し、ヒトIL-29がマウスにおいてインビボで生物活性があることを示唆した。
【０１４１】
（表２２）
2006509041.tif 000027
【０１４２】
示されたすべてのデータは、HPRT遺伝子発現に対する倍発現である。2匹のマウスにおける平均発現が示されている。
【０１４３】
実施例18
ヒトIL-28およびIL-29タンパク質は、マウスの肝臓、脾臓および血液においてISG遺伝子発現を誘導する
ヒトIL-28およびIL-29がインビボでインターフェロン刺激遺伝子を誘導するかどうかを測定するために、CHO由来ヒトIL-28AおよびIL-29タンパク質をマウスへ注射した。さらに、大腸菌由来IL-29はまた、MetIL-29C172S-PEGおよびMetIL-29-PEGを用いて上記のようにインビボアッセイで試験された。様々な時点および異なる用量において、ISG遺伝子誘導が、マウスの血液、脾臓および肝臓で測定された。
【０１４４】
C57BL/6マウスに、一連の用量(10 μg〜250 μg)のCHO由来ヒトIL-28AおよびIL-29またはMetIL-29C172S-PEGおよびMetIL-29C16-C113-PEGを腹腔内または静脈内に注射した。マウスを様々な時点(1時間〜48時間)で屠殺した。脾臓および肝臓をマウスから単離し、RNAを単離した。RNAはまた、血液細胞からも単離された。細胞をペレット状にし、RNAをRNAEasy(登録商標)キット(Qiagen)を用いてペレットから単離した。RNAを、どんな混入しているDNAもRNAから除去するためにデオキシリボヌクレアーゼ(Amicon)で処理した。cDNAをPerkin-Elmer RT mix(Perkin-Elmer)を用いて作製した。ISG遺伝子誘導は、マウスOAS、PkrおよびMx1に特異的なプライマーならびにプローブを用いるリアルタイムPCRにより測定された。定量的データを得るために、HPRTリアルタイムPCRは、ISG PCRと二重化された。標準曲線は、IFNに刺激されたマウスPBLの既知の量を用いて計算された。すべてのデータは内部HPRT発現に対する発現として示されている。
【０１４５】
ヒトIL-29は、用量依存性様式で、マウスの肝臓、脾臓および血液においてISG遺伝子発現(OAS、Pkr、Mx1)を誘導した。ISGの発現は、注射後の1〜6時間の間でピークになり、48時間まで、対照マウスより多い持続的発現を示した。この実験において、ヒトIL-28Aは、ISG遺伝子発現を誘導しなかった。
【０１４６】
（表２３）
2006509041.tif 000028
【０１４７】
示された結果は、HPRT遺伝子発現に対する倍発現である。IL-29が静脈内の250 μgの単回投与で肝臓にOASを誘導したことについての試料データセットが示されている。示されたデータは、5匹の異なる動物/群からの平均発現である。
【０１４８】
（表２４）
2006509041.tif 000029
【０１４９】
（表２５）
2006509041.tif 000030
【０１５０】
マウスは、静脈内に100 μgのタンパク質を注射された。示されたデータは、マウスの肝臓からのHPRT発現に対する倍発現である。同様のデータがマウスの血液および脾臓から得られた。
【０１５１】
実施例19
IL-28およびIL-29はマウスにおいてISGタンパク質を誘導する
ISGタンパク質(OAS)の誘導へのヒトIL-28およびIL-29の効果を分析するために、IL-28およびIL-29で処理されたマウス由来の血清ならびに血漿をOAS活性について試験した。
【０１５２】
C57BL/6マウスに、PBSまたは一連の濃度(10 μg〜250 μg)のヒトIL-28もしくはIL-29を静脈内に注射した。様々な時点において、血清および血漿をマウスから単離し、OAS活性をEiken Chemicals(Tokyo, Japan)からのOAS放射性免疫アッセイ(RIA)キットを用いて測定した。
【０１５３】
IL-28およびIL-29は、マウスの血清および血漿においてOAS活性を誘導し、これらのタンパク質がインビボで生物活性があることを示した。
【０１５４】
（表２６）
2006509041.tif 000031
【０１５５】
OAS活性は、ヒトIL-29の単一濃度(250 μg)についての血漿のpmol/dLにおいて示されている。
【０１５６】
実施例20
IL-28およびIL-29はマウスにおいてアデノウイルスによる病変を阻害する
肝臓に感染するウイルスに対するIL-28およびIL-29の抗ウイルス活性を試験するために、内部緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を発現させる感染性アデノウイルスベクターに対して、試験試料をマウスにおいて試験した。静脈内に注射される場合、これらのウイルスは、最初に、遺伝子発現について肝臓を標的とする。アデノウイルスは、複製欠損であるが、ASTおよびALTのような肝臓酵素の血清レベルの測定により、または肝臓病変の直接的検査によりモニターされうる、炎症性細胞浸潤による肝臓損傷を引き起こす。
【０１５７】
C57BL/6マウスに、50 μg マウスIL-28(SEQ ID NO:9に示されているようなzcyto24)またはMetIL-29C172S-PEGの腹腔内注射を1日1回、3日間、与えた。対照動物にPBSを注射した。第3回投与から1時間後、マウスに、アデノウイルスベクター、AdGFP(1 X 109プラーク形成単位(pfu))の単回の静脈内ボーラス尾静脈注射を与えた。この後、隔日に、マウスに、PBS、マウスIL-28またはMetIL-29C172S-PEGの追加の用量をさらに4回分として(合計7回分)与えた。PBS、マウスIL-28またはMetIL-29C172S-PEGの最終投与から1時間後、マウスは、終末的に採血され、屠殺された。血清および肝臓組織を分析した。血清は、ASTおよびALT肝臓酵素について分析された。肝臓は、単離され、GFP発現および組織像について分析された。組織像について、肝臓検体をホルマリンに固定し、その後、パラフィンに包埋し、続いて、H&E染色をした。処理することを目隠しされていた肝臓の切片を光学顕微鏡で調べた。変化は、注意深く観察され、肝臓病変および炎症を測定するように設計された尺度で得点を付けられた。
【０１５８】
マウスIL-28およびIL-29は、肝臓蛍光により測定されるようなアデノウイルス感染および遺伝子発現を阻害した。PBSで処理されたマウス(n=8)は、平均相対肝臓蛍光が52.4(任意単位)であった。対照的に、IL-28で処理されたマウス(n=8)は、相対肝臓蛍光が34.5であり、IL-29で処理されたマウス(n=8)は、相対肝臓蛍光が38.9であった。アデノウイルスおよび遺伝子発現における低下は、血清ALTおよびASTレベルならびに組織像により測定されるような肝臓病変の減少へと導いた。PBSで処理されたマウス(n=8)は、平均血清ASTが234 U/L(ユニット/リットル)、および血清ALTが250 U/Lであった。対照的に、IL-28で処理されたマウス(n=8)は、平均血清ASTが193 U/L、および血清ALTが216 U/Lであり、IL-29で処理されたマウス(n=8)は、平均血清ASTが162 U/L、および血清ALTが184 U/Lであった。さらに、肝臓組織像は、マウスIL-28かまたはIL-29のいずれかを与えられたマウスが、PBSで処理された群より低い肝臓および炎症得点であった。IL-29群由来の肝臓はまた、PBS処理群においてより、少ない洞様細胞の増殖、少ない有糸分裂像、および少ない肝細胞における変化(例えば、空胞形成、多核の存在、肝細胞肥大)であった。これらのデータは、マウスIL-28およびIL-29が肝臓指向性ウイルスに対する抗ウイルス性質をもつことを実証している。
【０１５９】
実施例21
LCMVモデル
マウスにおけるリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)感染は、急性および慢性感染の優れたモデルである。これらのモデルは、サイトカインの抗ウイルス免疫応答への効果、ならびにIL-28およびIL-29が、ウイルス量および抗ウイルス免疫応答へ与える効果を評価するために用いられる。用いられる2つのモデルは以下のものである：LCMVアームストロング(Armstrong)(急性)感染およびLCMVクローン13(Clone 13)(慢性)感染。(例えば、Wherry et al., J. Virol. 77:4911-4927, 2003; Blattman et al., Nature Med. 9(5):540-547, 2003; Hoffman et al., J. Immunol. 170:1339-1353, 2003を参照。)ウイルスに応答してのCD8 T細胞発生の3段階がある：1)増殖、2)収縮および3)記憶(急性モデル)。IL-28またはIL-29は、急性および慢性モデルの両方についての各段階中に注射される。慢性モデルにおいて、IL-28またはIL-29は、IL-28またはIL-29の持続性ウイルス量への効果を評価するために感染から60日後に注射される。急性および慢性モデルの両方について、IL-28またはIL-29が注射され、血液、脾臓および肝臓におけるウイルス量が調べられる。調べられうる他のパラメーターは以下のものを含む：LCMV特異的CD8+ T細胞の数を数えるためのフローによる四量体染色；それらの同族LCMV抗原で刺激される場合、サイトカインを産生する四量体+ 細胞の能力；およびそれらの同族LCMV抗原に応答して増殖するLCMV特異的CD8+ T細胞の能力。LCMV特異的T細胞は、細胞活性化および分化状態を評価するためにフローサイトメトリーにより表現型で分類される。また、LCMV特異的CTLの、それらの同族LCMV抗原を生んでいる標的細胞を溶解する能力が調べられた。LCMV特異的CD4+ T細胞の数および機能もまた評価される。
【０１６０】
IL-28またはIL-29での治療後のウイルス量における低下が測定される。任意の器官、特に肝臓、でのウイルス量における50%低下は有意であると思われる。IL-28またはIL-29で処理されたマウスについて、処理されていないマウスに対して、増殖する、サイトカインを生成する、または成熟表現型を示す四量体陽性のT細胞のパーセンテージにおける20%増加もまた、有意とみなされるものと思われる。
【０１６１】
ウイルス量における低下へと導くIL-28またはIL-29の注射は、特に、未処理の場合、ウイルス力価が長期間上昇したままである慢性モデルにおいて、ウイルス感染のより効果的な制御のおかげである。未処理のマウスに対してのウイルス力価における2倍低下は、有意とみなされる。
【０１６２】
実施例22
急性ウイルス感染のインフルエンザモデル
A. 抗ウイルス活性を試験する予備実験
インフルエンザによる急性感染へのIL-28またはIL-29の抗ウイルス活性を測定するために、インフルエンザに感染したC57BL/6マウスを用いるインビボ研究を以下のプロトコールを用いて行う：
動物：群あたり30匹、148匹のマウスを含む、生後6週間の雌BALB/cマウス(Charles River)。
群：
(1)抗体力価および組織学について並行して行う絶対的対照(感染していない)(群あたり2動物)
(2)媒体(腹腔内)生理食塩水
(3)アマンタジン(陽性対照)10 mg/日、感染の2時間前に開始する5日間(経口)
(4)IL-28またはIL-29処理(5 μg、腹腔内、感染の2時間後に開始)
(5)IL-28またはIL-29(25 μg、腹腔内、感染の2時間後に開始)
(6)IL-28またはIL-29(125 μg、腹腔内、感染の2時間後に開始)
0日目−絶対的対照を除き、すべての動物がインフルエンザウイルスに感染
ウイルス量について(LD50で10)
免疫学検査(LD30)
0〜9日目−IL-28またはIL-29の毎日の注射(腹腔内)
体重および全体的様子の記録(3回/週)
3日目−群あたり8匹の動物の屠殺
右肺におけるウイルス量(TCID50)
左肺における組織変化
抗体力価測定のための血液試料
10日目−すべての生き残っている動物の屠殺、抗体力価測定のための血液試料の採集、直接的CTLアッセイ(すべての5群において)および以下のマーカー：CD3/CD4、CD3/CD8、CD3/CD8/CD11b、CD8/CD44/CD62L、CD3/DX5、GR-1/F480およびCD19についての定量的免疫表現型分類のための肺リンパ球(3の4プール)の単離
【０１６３】
研究No. 2
マウス適応性ウイルスに感染したC57BL/6マウスにおけるIL-28またはIL-29の効力研究は、生後8週間の雌C57BL/6マウス(Charles River)を用いて行われる。
群1：媒体(腹腔内)
群2：陽性対照：抗インフルエンザ中和抗体(ヤギ抗インフルエンザA/USSR(H1N1)(Chemicon International, Temecula, CA)；40 μg/マウス、感染の2時間後および4時間後(10 μl鼻腔内)
群3：IL-28またはIL-29(5 μg、腹腔内)
群4：IL-28またはIL-29(25 μg、腹腔内)
群5：IL-28またはIL-29(125 μg、腹腔内)
次の生活に従って、観察および免疫学的検査が調製される：
0日目−すべての動物がインフルエンザウイルスに感染(実験2で決定された用量)
0〜9日目−IL-28またはIL-29の毎日の注射(腹腔内)
体重および全体的様子を隔日に記録
10日目−生き残っている動物の屠殺、および肺におけるウイルス量を測定するウイルスアッセイを行う
肺リンパ球の単離(標的としてのEL-4および異なるE:T比(実験1および2からの最良結果に基づく)を用いる肺における直接的CTLアッセイのために)。
四量体染色：インフルエンザA核タンパク質(NP)エピトープを含むMHCクラスI四量体を結合するCD8+ T細胞の数が、ウイルスペプチド：FLU-NP366-374/Db(ASNENMETM)、(LMCVペプチド/Db)とMHCクラスIの複合体を用いて評価される。
定量的な、以下の免疫表現型分類：CD8、四量体、細胞内IFNγ、NK1.1、CD8、四量体、CD62L、CD44、CD3(+または-)、NK1.1(+)、細胞内IFNγ、CD4、CD8、NK1.1、DX5、CD3(+または-)、NK1.1、DX5、四量体、血球計算器調整のための単一色試料。
【０１６４】
生存/再曝露研究
30日目：マウスに関する生存研究は、IL-28またはIL-29の異なる用量で、または陽性の抗インフルエンザ抗体の対照で、9日間、処理される。体重および個々の血清試料における抗体産生(合計、IgG1、IgG2a、IgG2b)が測定される。
【０１６５】
再曝露研究：
0日目：両方の群は、A/PRウイルス(1LD30)に感染させられる。
群6は処理されない。
群7はIL-28またはIL-29の125 μgで9日間、処理される。
30日目：生存研究
体重および個々の血清試料における抗体産生(合計、IgG1、IgG2a、IgG2b)が測定される。
60日目：再曝露研究
各群における生存しているものは、2つの下位群へ分割される
群6Aおよび7AはA/PRウイルス(1LD30)に再曝露される
群6Bおよび7BはA/PRウイルス(1LD30)に再曝露される
両方の群は、経過観察され、屠殺の日が決定される。
体重および個々の血清試料における抗体産生(合計、IgG1、IgG2a、IgG2b)が測定される。
【０１６６】
実施例21
IL-28およびIL-29はインビボでB型肝炎ウイルス(HBV)に対する抗ウイルス活性をもつ
トランスジェニックマウスモデル(Guidotti et al., J. Virology 69:6158-6169, 1995)は、高レベルの感染性HBVの複製を維持し、HBV感染についての化学療法モデルとして用いられた。トランスジェニックマウスは、抗ウイルス薬で処理され、HBV DNAおよびRNAのレベルが、処理後のトランスジェニックマウス肝臓および血清において測定される。HBVタンパク質レベルもまた、処理後のトランスジェニックマウス血清において測定されうる。このモデルは、HBVウイルス力価を低下させることにおけるラミブジン(lamivudine)およびIFN-αの効果を評価するために用いられた。
【０１６７】
HBV TGマウス(雄)に、2.5、25もしくは250マイクログラムのIL-28またはIL-29の腹腔内注射を隔日に14日間(合計8回分)を与える。マウスを、処理の日(0日目)および7日目に、血清収集のために血液を採取する。IL-29の最終投与から1時間後、マウスは、終末の採血を受け、屠殺される。血清および肝臓は、肝臓HBV DNA、肝臓HBV RNA、血清HBV DNA、肝臓HBc、血清Hbeおよび血清HBsについて分析される。
【０１６８】
IL-28またはIL-29に応答しての肝臓HBV DNA、肝臓HBV RNA、血清HBV DNA、肝臓HBc、血清Hbeまたは血清HBsにおける低下は、これらの化合物のHBVに対する抗ウイルス活性を反映している。
【０１６９】
実施例22
IL-28およびIL-29はBCBL-1細胞におけるヒトヘルペスウイルス-8(HHV-8)複製を阻害する
IL-28およびIL-29の抗ウイルス活性は、Bリンパ系細胞株、BCBL-1を用いるインビトロ感染系においてHHV-8に対して試験された。
【０１７０】
HHV-8アッセイにおいて、試験化合物およびガンシクロビル対照を、半対数系列で希釈された5つの濃度それぞれでアッセイした。評価項目は、細胞外HHV-8 DNAについてのTaqMan PCR(IC50)、およびCellTiter96(登録商標)試薬(TC50; Promega, Madison, WI)を用いる細胞数である。簡単には、BCBL-1細胞を96ウェルマイクロタイタープレートに蒔いた。16〜24時間後、細胞を洗浄し、培地を、3連で試験化合物の様々な濃度を含む完全培地と交換した。ガンシクロビルが陽性対照であり、培地のみが陰性対照(ウイルス対照、VC)である。3日後、培地を、適切に希釈された試験化合物を含む新鮮な培地と交換した。試験化合物の最初の投与から6日後、細胞培養上清を収集し、プロナーゼおよびデオキシリボヌクレアーゼで処理し、その後、リアルタイム定量的TaqMan PCRアッセイに用いた。PCR増幅されたHHV-8 DNAは、増幅したHHV-8 DNAにハイブリダイズする消光した蛍光プローブ分子の外ヌクレオチド鎖分解性から生じる蛍光シグナルにおける増加をモニターすることによりリアルタイムで検出された。各PCR増幅について、標準曲線は、精製されたHHV-8 DNAの希釈を用いて同時に作成された。抗ウイルス活性は、HHV-8 DNAレベルにおける低下から計算される(IC50)。新規の色素取り込みアッセイは、その後、毒性を計算するために用いられる細胞生存度を測定するために使用された(TC50)。治療指数(TI)は、TC50/IC50として計算される。
【０１７１】
IL-28およびIL-29は、BCBL-1細胞におけるHHV-8ウイルス複製を阻害する。IL-28Aは、IC50が1 μg/ml、およびTC50が>10 μg/mlであった(TI>10)。IL-29は、IC50が6.5 μg/ml、およびTC50が>10 μg/mlであった(TI>1.85)。MetIL-29C172S-PEGは、IC50が0.14 μg/ml、およびTC50が>10 μg/mlであった(TI>100)。
【０１７２】
実施例23
エプスタインバーウイルス(EBV)に対する、IL-28およびIL-29の抗ウイルス活性
IL-28およびIL-29の抗ウイルス活性が、Bリンパ系細胞株、P3HR-1でのインビトロ感染系においてEBVに対して試験される。EBVアッセイにおいて、試験化合物および対照を半対数系列で希釈された5つの濃度それぞれでアッセイする。評価項目は、細胞外EBV DNAについてのTaqMan PCR(IC50)、およびCellTiter96(登録商標)試薬(TC50; Promega)を用いる細胞数である。簡単には、P3HR-1細胞を96ウェルマイクロタイタープレートに蒔く。16〜24時間後、細胞を洗浄し、培地を、3連で試験化合物の様々な濃度を含む完全培地と交換する。陽性対照に加えて、培地のみが陰性対照(ウイルス対照、VC)として細胞に加えられる。3日後、培地を、適切に希釈された試験化合物を含む新鮮な培地と交換する。試験化合物の最初の投与から6日後、細胞培養上清を収集し、プロナーゼおよびデオキシリボヌクレアーゼで処理し、その後、リアルタイム定量的TaqMan PCRアッセイに用いる。PCR増幅されたEBV DNAは、増幅したEBV DNAにハイブリダイズする消光した蛍光プローブ分子の外ヌクレオチド鎖分解性から生じる蛍光シグナルにおける増加をモニターすることによりリアルタイムで検出される。各PCR増幅について、標準曲線は、精製されたEBV DNAの希釈を用いて同時に作成された。抗ウイルス活性は、EBV DNAレベルにおける低下から計算される(IC50)。新規の色素取り込みアッセイは、その後、毒性を計算するために用いられる細胞生存度を測定するために使用された(TC50)。治療指数(TI)は、TC50/IC50として計算される。
【０１７３】
実施例24
単純ヘルペスウイルス-2(HSV-2)に対するIL-28およびIL-29抗ウイルス活性
IL-28およびIL-29の抗ウイルス活性は、ベロ細胞でのインビトロ感染系においてHSV-2に対して試験された。IL-28およびIL-29の抗ウイルス効果は、細胞変性効果(CPE)の抑制アッセイにおいて評価された。アッセイは、細胞変性HSV-2ウイルスによるベロ細胞の殺害、ならびにIL-28およびIL-29による細胞殺害の抑制を含む。ベロ細胞を10%ウマ血清、1%グルタミンおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシンを加えた、フェノールレッドを含むダルベッコの改変基本培地(DMEM)において増殖させ、CPE抑制アッセイは、2%FBS、1%グルタミンおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシンを加えた、フェノールレッドなしのDMEMにおいて行われる。アッセイの前日に、細胞をトリプシン処理(1%トリプシン-EDTA)し、洗浄し、数え、100 μl/ウェルの容量である96ウェル平底BioCoat(登録商標)プレート(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)に104細胞/ウェルで蒔いた。次の日、培地を除去し、ウイルスのあらかじめ力価測定されたアリコートを細胞に加えた。用いられるウイルスの量は、最大CPE発生の時点で完全な細胞殺害(>80%)を生じるであろう最大希釈である。細胞生存度は、Vmaxプレートリーダー(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を用いて、CellTiter96(登録商標)試薬(Promega)を使用し、製造会社のプロトコールに従って、測定される。化合物は、半対数系列でアッセイ培地に希釈された、6つの濃度それぞれにおいて試験される。アシクロビルは、陽性対照として用いられた。化合物は、ウイルス感染の時点で加えられる。各濃度におけるパーセントCPE低下およびパーセント細胞生存度についての平均バックグラウンドならびに薬物色補正データは、対照に対して決定され、IC50は、TC50に対して計算される。
【０１７４】
IL-28A、IL-29およびMetIL-29C172S-PEGは、このアッセイにおいて細胞死を抑制しなかった(>10 ug/mlのIC50)。IFNαの抗ウイルス活性もアッセイになかった。
【０１７５】
前述から、本発明の特定の態様が例証を目的として本明細書に記載されたが、様々な改変が本発明の真意および範囲から逸脱することなく、なされうることは認識されているものと思われる。従って、本発明は、添付された特許請求の範囲による場合を除き、限定されない。
【配列表】
2006509041000001.app
【国際調査報告】
2006509041.tif 000032
2006509041.tif 000033
2006509041.tif 000034