(57)【要約】選択的に誘導可能な一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）発現ライブラリー、ｓｓＤＮＡ発現ライブラリーを構築する方法、この発現ライブラリーを使用してｓｓＤＮＡをスクリーニングする方法、ならびに細胞増殖及び毒素の産生と分泌に関係する細菌遺伝子及び真菌遺伝子の発現を変化させるｓｓＤＮＡ分子を同定する方法。このスクリーニングライブラリーは、とりわけ、細胞増殖の停止、細菌もしくは真菌の死滅、又は細菌及び／もしくは真菌がその毒素を合成し分泌するのを防止すること、に有効なＯＤＮを同定し、かつ／あるいは標的とする遺伝子機能改変に有効な真核生物（例えば、哺乳動物）細胞のＯＤＮを発見するために使用される。このライブラリーは、例えば、敗血症などの細菌感染症の治療方法を提供するために、治療薬として使用されるｓｓＤＮＡ又はＯＤＮを同定するためにも有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の長さの複数のオリゴデオキシヌクレオチドを含むオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）ライブラリーであって、
前記ＯＤＮライブラリーを構成する前記オリゴデオキシヌクレオチドの少なくとも１個は、前記オリゴデオキシヌクレオチドに対する特定の呼び出し配列が前記発現ベクターに埋め込まれたＤＮＡ発現ベクター中に挿入されたときに標的ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はタンパク質と相互作用することができ、
前記発現ベクターは、標的細胞に導入されて、化学薬品に暴露されることによって誘導されたときに、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はタンパク質と相互作用して観察可能な結果を示す前記オリゴデオキシヌクレオチドの少なくとも１個を生成することができる、
オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）ライブラリー。
【請求項２】
オリゴデオキシヌクレオチドを同定し単離する方法であって、
請求項１のＯＤＮライブラリーを利用して少なくとも１個の前記オリゴデオキシヌクレオチドの複数のコピーを標的細胞中で発現するステップと、
前記標的細胞を増殖させて細胞のコロニーとするステップと、
前記コロニーを対のコロニーに分割するステップと、
暴露されるコロニーの細胞に少なくとも１個の前記オリゴデオキシヌクレオチドの発現を誘導できる化学薬品に、前記対のコロニーの一方を暴露し、発現したオリゴデオキシヌクレオチドをゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はタンパク質と相互作用させて遺伝子の発現を変化させるステップと、
暴露された前記細胞における結果を観測するステップと、
暴露されていないコロニーの細胞のＤＮＡの塩基配列を決定することによって、前記遺伝子に変化を引き起こす前記ライブラリーオリゴデオキシヌクレオチドの配列を同定するステップと、
を含む方法。
【請求項３】
前記細胞が細菌系統ＤＨ５αＰｒｏである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
プラスミドｐｓｓＸＧ。
【請求項５】
配列５’−ＴＧＧＴＧＣＧＴＣＣＧＡＧ−３’［配列番号３］を有するＰＢＳを含む、請求項４に記載のプラスミド。
【請求項６】
その中に請求項４に記載のプラスミドを形質転換した細胞。
【請求項７】
その中に請求項４に記載のプラスミドを形質転換した原核細胞。
【請求項８】
細菌ＦｔｓＺ遺伝子のｍＲＮＡ転写物を標的とし、ｉｎ  ｖｉｖｏで発現する一本鎖ＤＮＡエンザイムをコードする配列を含む、請求項４に記載のプラスミド。
【請求項９】
前記一本鎖ＤＮＡエンザイムが前記細菌ＦｔｓＺ遺伝子の８８０位のＧＵ部位に特異的である、請求項８に記載のプラスミド。
【請求項１０】
前記一本鎖ＤＮＡエンザイムが、５’−Ｎ１−ＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡ−Ｎ２−３’［配列番号７］を含み、
Ｎ１及びＮ２は、特定のＲＮＡを標的とする、大きさが約７〜１０ヌクレオチドである任意のヌクレオチド配列である、請求項８に記載のプラスミド。
【請求項１１】
その中に請求項８に記載のプラスミドを形質転換した細胞。
【請求項１２】
約７〜１０ヌクレオチドの無作為なＲＮＡ標的結合ドメインが各々隣接する、１５ヌクレオチド触媒ドメインを含む、一本鎖ＤＮＡエンザイム。
【請求項１３】
前記触媒ドメインは、配列５’−Ｎ１−ＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡ−Ｎ２−３’［配列番号７］を含み、
Ｎ１及びＮ２は、特定のＲＮＡを標的とする大きさが約７〜１０ヌクレオチドである任意のヌクレオチド配列である、請求項１２に記載の一本鎖ＤＮＡエンザイム。
【請求項１４】
その中に請求項１２に記載のＤＮＡエンザイムをコードする配列を含む、プラスミド。
【請求項１５】
その中に請求項１４に記載のプラスミドを形質転換した細胞。
【請求項１６】
ＯＤＮ発現プラスミドＡＳ０８０１０３。
【請求項１７】
動物患者における敗血症の治療方法であって、
敗血症の病原体を、前記病原体の特定の遺伝子を標的とした配列を含むＯＤＮと接触させ、前記特定の遺伝子の発現を変化させて、前記病原体の増殖を阻害し、前記病原体を死滅させ、又は前記病原体による毒素の合成もしくは分泌を阻害するステップ、
を含む治療方法。
【請求項１８】
以下のヌクレオチド配列、
５’（ＣＴＴ  ＴＣＡ  ＡＣＡ  ＧＴＴ  ＴＴＧ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＴＴＴ  ＧＣＴ  ＧＡＣ  ＣＡＴ  ＡＣＡ  ＡＴＴ  ＧＣＧ  ＡＴＡ  ＴＣＧ  ＴＧＧ  ＧＧＡ  ＧＴＧ  ＡＧＡ  Ｇ）３’、
５’（ＣＴＣ  ＡＴＡ  ＣＴＣ  Ｔ）３’、又は、
５’（ＧＴＴ  ＴＣＧ  ＡＡＧ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＴＡＣ  ＡＡＣ  ＧＡＴ  ＣＡＴ  ＣＣＡ  Ｇ）３’、
の１又は複数を有する、
敗血症治療用ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＰＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
その中に請求項１８に記載の配列の１又は複数を形質転換した細胞。
【請求項２０】
配列５’−ＣＴＴＴＣＡＡＣＡＧＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＴＧＡＣＣＡＴＡＣＡＡＴＴＧＣ−ＧＡＴＡＴＣＧＴＧＧＧＧＡＧＴＧＡＧＡＧ−３’    ［配列番号１３］、
又はそれに相同な以下の配列：
５’−ＣＣＴＴＴＧＣＴＧＡＣＣＡＴＡＣ−３’                ［配列番号１４］
５’−ＧＡＣＣＴＴＴＧＣＴＧＡＣＣＡ−３’                  ［配列番号１５］
５’−ＡＣＡＧＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣ−３’                    ［配列番号１６］
５’−ＡＣＡＡＴＴＧＣＧＡＴＡＴ−３’                      ［配列番号１７］
５’−ＧＡＣＣＴＴＴＧＣＴＧＡＣ−３’                      ［配列番号１８］
５’−ＴＣＡＡＣＡＧＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣ−３’              ［配列番号１９］
５’−ＡＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＴＧ−３’                      ［配列番号２０］
５’−ＣＡＧＴＴＴＴＧＡＴＧＡ−３’                        ［配列番号２１］
５’−ＡＣＣＴＴＴＧＣＴＧＡＣ−３’                        ［配列番号２２］
５’−ＴＴＧＣＴＧＡＣＣＡＴＡ−３’                        ［配列番号２３］
５’−ＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＴＧ−３’                        ［配列番号２４］
５’−ＧＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＣ−３’                        ［配列番号２５］
５’−ＧＣＧＡＴＡＴＣＧＴＧＧ−３’                        ［配列番号２６］
５’−ＴＴＧＡＴＧＡＣＣＴＴＴ−３’                        ［配列番号２７］
５’−ＴＧＧＧＧＡＧＴＧＡＧ−３’                          ［配列番号２８］
５’−ＴＴＧＣＴＧＡＣＣＡＴ−３’                          ［配列番号２９］
５’−ＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＣ−３’                          ［配列番号３０］
５’−ＴＧＡＴＧＡＣＣＴＴＴ−３’                          ［配列番号３１］
の１を有する、オリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
その中に請求項２０に記載のオリゴヌクレオチドの１又は複数をコードする配列を含む、プラスミド。
【請求項２２】
その中に請求項２１に記載のプラスミドを形質転換した細胞。
【請求項２３】
ヌクレオチド配列５’−Ｎ１−ＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡ−Ｎ２−３’［配列番号７］と、
それに相同な配列と、を含み、
Ｎ１及びＮ２は、特定のＲＮＡを標的とするように適応させた、大きさが約７〜１０ヌクレオチドである任意のヌクレオチド配列である、
一本鎖ＤＮＡエンザイム。
【請求項２４】
Ｎ１及びＮ２が、細菌ＦｔｓＺ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の一部を含む配列に特異的な配列、及び／又はそれに相同な配列、を含む、
請求項２３に記載の一本鎖ＤＮＡエンザイム。
【請求項２５】
その中に請求項２３に記載の一本鎖ＤＮＡエンザイムをコードする配列を含む、プラスミド。
【請求項２６】
配列ＫＦＦＫＦＦＫＦＦＫ  ＣＴＣ  ＡＴＡ  ＣＴＣ  Ｔ［配列番号３４］を含む、ペプチド−ＰＮＡ複合体。
【請求項２７】
細菌病原体又は真菌病原体の細胞増殖、複製又は毒素産生もしくは毒素分泌遺伝子から転写されたｍＲＮＡに結合可能なオリゴヌクレオチドであって、
前記結合が前記遺伝子の活性を変化させる、オリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
前記オリゴヌクレオチドが、
５’−ＣＴＴＴＣＡＡＣＡＧＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＴＧＡＣＣＡＴＡＣＡＡＴＴＧＣ−ＧＡＴＡＴＣＧＴＧＧＧＧＡＧＴＧＡＧＡＧ−３’    ［配列番号１３］
５’−ＣＣＴＴＴＧＣＴＧＡＣＣＡＴＡＣ−３’                ［配列番号１４］
５’−ＧＡＣＣＴＴＴＧＣＴＧＡＣＣＡ−３’                  ［配列番号１５］
５’−ＡＣＡＧＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣ−３’                    ［配列番号１６］
５’−ＡＣＡＡＴＴＧＣＧＡＴＡＴ−３’                      ［配列番号１７］
５’−ＧＡＣＣＴＴＴＧＣＴＧＡＣ−３’                      ［配列番号１８］
５’−ＴＣＡＡＣＡＧＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣ−３’              ［配列番号１９］
５’−ＡＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＴＧ−３’                      ［配列番号２０］
５’−ＣＡＧＴＴＴＴＧＡＴＧＡ−３’                        ［配列番号２１］
５’−ＡＣＣＴＴＴＧＣＴＧＡＣ−３’                        ［配列番号２２］
５’−ＴＴＧＣＴＧＡＣＣＡＴＡ−３’                        ［配列番号２３］
５’−ＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＴＧ−３’                        ［配列番号２４］
５’−ＧＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＣ−３’                        ［配列番号２５］
５’−ＧＣＧＡＴＡＴＣＧＴＧＧ−３’                        ［配列番号２６］
５’−ＴＴＧＡＴＧＡＣＣＴＴＴ−３’                        ［配列番号２７］
５’−ＴＧＧＧＧＡＧＴＧＡＧ−３’                          ［配列番号２８］
５’−ＴＴＧＣＴＧＡＣＣＡＴ−３’                          ［配列番号２９］
５’−ＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＣ−３’                          ［配列番号３０］
５’−ＴＧＡＴＧＡＣＣＴＴＴ−３’                          ［配列番号３１］
から選択される、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
前記結合が前記ｍＲＮＡの翻訳を防止し、
前記変化が遺伝子産物の減少である、
請求項２７又は２８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
前記オリゴヌクレオチドが一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオエート又はホスホロチオエートモルホリノオリゴ（ＰＭＯ）から選択される、
請求項２７〜２９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
前記病原体が敗血症病原体である、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
前記病原体が、
グラム陰性菌バクテロイデス（ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ブランハメラ（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ）、
ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ペプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、プロピオニバクテリア（Ｐｒｏｐｉｏｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）などのグラム陽性菌、
マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、クラミジア（Ｃｌａｍｙｄｉａ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）などのグラム染色でほとんど又はまったく染色されない生物、又は、
カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、アスペルギルス症（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ）、ブラストミセス症（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ）、コクシジウム症（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏｍｙｃｏｓｉｓ）、クリプトコッカス症（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ）、ヒストプラスマ症（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ）、パラコクシジオイデス症（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｍｙｃｏｓｉｓ）、スポロトリクム症（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｏｓｉｓ）、接合菌症（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｓｉｓ）
から選択される、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
前記遺伝子が、細胞分裂、細胞壁合成、タンパク質合成（翻訳）、核酸合成、脂肪酸代謝及び遺伝子調節の１つに関与する、請求項２７〜３２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
前記ｍＲＮＡが、
細菌遺伝子ＦｔｓＺ  ＭｕｒＢ、ａｃｐＰ、１６ｓ  ｒＲＮＡ、ＰＢＰｓ、ＤＮＡＡ、ＤＮＡＣ、ｐｃｒＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＣ、ｒｐｓＣ、ｒｐｓＤ、ｒｐｓＦ、ｒｐｓＩ、ｒｐｓＪ、ｒｐｓＭ、ｒｐｓＲ、ＦａｂＫ、ＦａｂＨ、ｒｐｌＢ、ｒｐｌＣ、ｒｐｌＪ、ｒｐｌＫ、ｒｐｌＭ、ｒｐｌＮ、ｒｐｌＯ、ｒｐｌＰ、ｒｐｌＲ、ｒｐｌＴ、ｒｐｌＶ、ｒｐｌＸ、ｒｐｍＡ、ｒｐｍＬ、ｖａｌＳ、ｓｅｒＳ、ｐｒｏＳ、ｃｙｓＳ、ａｌａＳ、ｐｈｅＳ、ｓｐｏｒＣ、ｔｓｆ、ｔｕｆＡ、ｆｕｓ、ｓｅｃＡ、ｓｅｃＶ、ｐｙｒＣ、ｂｔｕＥ、ＣａｉＢ、ｙｄｇＤ、ｙｇｃＱ、ｆｔｓＨ、ｐｐｉＢ、ｙｉｈｌ、ｚｎｔＡ、ｙｉｃＩ、ｆｈｕＡ、ｒｐｌＤ、ｉｌｖＢ、ｌｅｐＢ、ａｒｏＫ、ｍｆｄ、ｒｌｐＡ、ａｃｃＡ、ｐｇｐＡ、又は、
真菌遺伝子ＥＲＧ１、ＥＲＧ２、ＥＲＧ３、ＥＲＧ４、ＥＲＧ５、ＥＲＧ６、ＥＲＧ７、ＥＲＧ１１、ＥＲＧ２４、ＥＲＧ２５、ＥＲＧＸ、ＥＲＧＹ、ＣＨＳ１、ＣＨＳ２、ＣＨＳ３、ＣＷＰ１、ＣＷＰ２、ＫＲＥ１、ＫＲＥ２、ＫＲＥ５、ＫＲＥ１１、ＴＩＰ１、ＧＦＡ１、
から選択される遺伝子から転写された、請求項２７〜３３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
前記オリゴヌクレオチドがアンチセンス分子として機能する、請求項２７〜３４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドヌクレオチド。
【請求項３６】
前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡエンザイムとして機能する、請求項２７〜３４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
前記ＤＮＡエンザイムが１０〜２３ＤＮＡエンザイムである、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
前記ＤＮＡエンザイムが、
５’−Ｎ１−ＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡ−Ｎ２−３’［配列番号７］の形をとり、
Ｎ１及びＮ２が、大きさ３〜２５ヌクレオチド、好ましくは７から１０ヌクレオチド、である特定のＲＮＡを標的にする任意のヌクレオチド配列である、
請求項３７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
前記ＤＮＡエンザイムが、
５’−ＧＴＴＴＣＧＡＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＴＣＡＴＣＣＡＧ−３’［配列番号６］である、請求項３７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
前記ＤＮＡエンザイムがＦｔｓＺ  ｍＲＮＡに結合する、請求項３９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４１】
請求項２７〜４１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドとペプチドを含む、複合体。
【請求項４２】
前記ペプチドがＫＦＦＫＦＦＫＦＦＫ又はその相同体及び誘導体である、請求項４１に記載の複合体。
【請求項４３】
請求項２７〜４１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、を含むベクター。
【請求項４４】
前記ベクターが発現ベクター、好ましくは誘導性発現ベクター、である、請求項４３に記載のベクター。
【請求項４５】
請求項４３又は４４のいずれか一項に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項４６】
前記細胞が細菌病原体又は真菌病原体、好ましくは敗血症病原体である、請求項４５に記載の宿主細胞。
【請求項４７】
治療に使用される、請求項２７〜４０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項４１又は４２に記載の複合体、あるいは請求項４３又は４４に記載のベクター。
【請求項４８】
前記治療が細菌病原性症状又は真菌病原性症状、好ましくは敗血症、の治療である、請求項４７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４９】
細菌病原性症状又は真菌病原性症状の治療用医薬品の製造における、請求項２７〜４０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項５０】
前記症状が、バクテロイデス（ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ブランハメラ（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ペプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、プロピオニバクテリア（Ｐｒｏｐｉｏｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、クラミジア（Ｃｌａｍｙｄｉａ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）及びコクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）、又はカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、アスペルギルス症（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ）、ブラストミセス症（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ）、コクシジウム症（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏｍｙｃｏｓｉｓ）、クリプトコッカス症（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ）、ヒストプラスマ症（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ）、パラコクシジオイデス症（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｍｙｃｏｓｉｓ）、スポロトリクム症（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｏｓｉｓ）、接合菌症（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｓｉｓ）に起因する、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
前記症状が敗血症である、請求項４９又は５０に記載の使用。
【請求項５２】
細菌又は真菌による病的症状を治療するのに使用する、
（ａ）請求項２７〜４０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドと、
（ｂ）薬学的に許容される賦形剤と、
を含むキット。
【請求項５３】
前記症状が敗血症である、請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
前記薬学的に許容される賦形剤が、ペプチド、好ましくはＫＦＦＫＦＦＫＦＦＫ、及びベクターから選択される、請求項５２又は５３に記載のキット。
【請求項５５】
試験オリゴヌクレオチドを含む誘導性発現ベクターで形質転換された少なくとも１の細菌種を含み、
前記細菌種が病的症状を引き起こし得る、
ライブラリー。
【請求項５６】
前記病的症状が敗血症である、請求項５５に記載のライブラリー。
【請求項５７】
前記細菌種が、
グラム陰性菌バクテロイデス（ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ブランハメラ（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ）；
グラム陽性菌ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ペプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）及びプロピオニバクテリア（Ｐｒｏｐｉｏｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、
から選択される、請求項５５又は５６に記載のライブラリー。
【請求項５８】
前記細菌種が大腸菌、好ましくはＤＨ５αＰｒｏ細胞である、請求項５５〜５７のいずれか一項に記載のライブラリー。
【請求項５９】
前記試験オリゴヌクレオチドが少なくとも１０、好ましくは２０、より好ましくは３０、さらにより好ましくは４０、さらにより好ましくは５０、さらにより好ましくは６０塩基長である、請求項５５〜５８のいずれか一項に記載のライブラリー。
【請求項６０】
前記誘導性発現ベクターがテトラサイクリンによって調節され、
前記ベクターが好ましくはｐｓｓＸＧｂである、
請求項５５〜５９のいずれか一項に記載のライブラリー。
【請求項６１】
細菌又は真菌による病的症状の治療に使用されるオリゴヌクレオチドを同定する方法であって、
（ａ）請求項５５〜６０のいずれか一項に記載のライブラリーを準備するステップと、
（ｂ）細菌増殖が維持される条件下で、少なくとも１の前記細菌種の少なくとも２個の試料を準備するステップであって、少なくとも１個の試料が誘導物質と接触しており、少なくとも１個の試料が誘導物質と接触していないステップと、
（ｃ）前記誘導物質の非存在下でのみ増殖可能な細菌種を選択し、前記試験オリゴヌクレオチドを単離するステップと、
を含む方法。
【請求項６２】
前記症状が敗血症である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
（ｄ）前記単離された試験オリゴヌクレオチドを分析して、標的細菌遺伝子配列を同定するステップ、
をさらに含み、
ステップ（ｃ）の後にステップ（ｄ）が実施される、
請求項６１又は６２に記載の方法。
【請求項６４】
（ｅ）単離された前記試験オリゴヌクレオチドの敗血症治療における使用、
をさらに含み、
ステップ（ｃ）又は（ｄ）の後にステップ（ｅ）が実施される、
請求項６１〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記細菌種が、
バクテロイデス（ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ブランハメラ（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ）；
ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ペプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、プロピオニバクテリア（Ｐｒｏｐｉｏｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、
から選択される、請求項６１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
重度の敗血症及び敗血症ショックは、集中治療室における一般的な死因であり、生命にかかわる感染合併症である（Ａｎｇｕｓら、２００１、Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．、２９：１３０３〜１３１０）。最近の調査によれば、重度の敗血症は、病院又は集中治療室の全入院患者の２〜１１％を占めると推定され（Ｍａｒｔｉｎら、２００３、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、３４８、１５４６〜１５５４）、その発生率は、高齢化及び免疫不全の重症患者数の増加のために上昇している。敗血症は、細菌病原体及び／又は真菌病原体による感染に起因する複雑な臨床症候群を含む（Ｃｏｈｅｎ、２００２、Ｎａｔｕｒｅ、４２０、８８５〜８９１）。通常は、免疫カスケードが、微生物曝露に対する防御応答を確実なものとする。しかし、防御が不十分であると、感染が確立し、又は内因性炎症性化合物の不適応な放出によって宿主に害を及ぼすことがある。この炎症及び凝固のカスケードは、敗血症を進行させ、多数の患者に低酸素症、虚血、器官機能不全をもたらし、最終的に死をもたらす。また、糖尿病患者やリンパ浮腫患者は、浮腫媒介物又は循環不足によってもたらされる潜在的増殖性のために日和見病原体の危険にさらされている。かかる感染症は、重度の蜂巣炎、又は敗血症に至る関連する続発症を生じる恐れがある。
【０００２】
グラム陰性桿菌（主に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種及びシュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））及びグラム陽性球菌（主にスタフィロコッカス（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）及びストレプトコッカス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ））は、重度の敗血症及び敗血症ショック患者から単離される一般的な微生物病原体である。（Ｂｏｃｈｕｄ、２００１、Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．、２７（Ｓｕｐｐｌ  １）：Ｓ３３〜Ｓ４８）。真菌、主にカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）は、重度の敗血症の全症例の約５％を占めるが、真菌感染症の発生率は増加している。
【０００３】
グラム陰性感染症は、肺、腹部、血流又は尿路において起こる。リポ多糖（ＬＰＳ）の形の内毒素は、グラム陰性菌の外膜の重要な成分であり、グラム陰性菌敗血症を引き起こすのに中心的な役割を担っている（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、２００１、Ｊ．  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｓ．、７：１６７〜２０２）。グラム陽性菌は、通常、皮膚、軟部組織及び血管内装置の感染症、ならびに原発性血流感染及び呼吸器感染症の原因である。グラム陽性菌及び真菌の独特な細胞壁物質は、グラム陰性菌と類似した事象のカスケードを誘発すると一般に考えられているが、関与する構造はグラム陰性内毒素ほど一般には研究されていない。グラム陽性菌は少なくとも２つの機序、すなわち、スーパー抗原として作用する外毒素の産生及び免疫細胞を刺激するその細胞壁成分によって、敗血症を引き起こすことができる（Ｃａｌａｎｄｒａ、２００１、Ｊ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、１３：１７３〜１８０）。外毒素を持たないグラム陽性菌も、おそらくはグラム陰性菌敗血症における機序と類似した機序によって自然免疫応答を刺激することによってショックを誘発することができる。
【０００４】
微生物毒素及び炎症誘発性サイトカインの中和、非特異的抗炎症薬及び免疫抑制薬、ならびに凝固異常の矯正を含めて、（抗生物質及び支持療法以外の）多数の補助的治療が重度の敗血症及び敗血症ショックに対して試験された。これらの成果を総合しても（Ｖｉｎｃｅｎｔら、２００２、Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．、３４：１０８４〜１０９３）、１つの治療で敗血症のすべての症状及び／又は病原体に対処できるとは思われない。
【０００５】
理論的証拠及び実験動物による証拠によれば、重度の敗血症及び敗血症ショックにおいては多量のコルチコステロイドの使用が支持されるが、全無作為化ヒト試験によって、コルチコステロイドが敗血症ショックを防止せず、ショック状態を元に戻さず、又は死亡率を改善しないことが見出された。Ｌｅｆｅｒｉｎｇら、１９９５、Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．、２３、１２９４〜１３０３；Ｃｒｏｎｉｎ、１９９５、Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．、２３、１４３０〜１４３９。凝固異常は、敗血症患者及び微小血管血栓症患者に一般的なものである。活性化タンパク質Ｃを用いた治療によって、重度の敗血症による死亡率は減少する（Ｂｅｒｎａｒｄら、２００１、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、３４４：６９９〜７０９）。これまで知られているところによれば、これは現行市場における唯一の敗血症治療薬である。しかし、この薬物による治療は、出血現象がわずかに増加するわりに患者死亡率はさほど改善されない（同上）。
【０００６】
したがって、抗生物質の予防的投与は、病院における敗血症の最適な治療である（Ｃｕｎｈａ、１９９５、Ｍｅｄ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．、７９、５５１〜５５８）。抗生物質は、広域スペクトルなものでなければならず、グラム陽性菌、グラム陰性菌及び嫌気性菌を網羅していなければならない。というのは、これらの生物のすべてのクラスが同一の臨床症状をもたらすからである。臨床の改善は、投与された抗生物質数よりも血清殺菌レベルの達成と相関があるので、抗生物質は、殺菌血清レベルを達成するのに適切な用量で非経口投与されなければならない。
【０００７】
残念ながら、多数の抗生物質クラスは、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ．ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｅ．フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）などの細菌による抗生物質耐性の結果、有効性が低下した（Ｎｉｃｏｌａｏｕら、２００１、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ、ｐ．５６〜６１）。メチシリン耐性Ｓ．アウレウス（ＭＲＳＡ）、ペニシリン耐性Ｓ．ニューモコッカス（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）及びバンコマイシン耐性Ｅ．フェカーリス（ＶＲＥ）は、有効な治療が現時点では困難である（Ｐｆａｌｌｅｒら、１９９８、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、４２：１７６２〜１７７０；Ｊｏｎｅｓら、１９９９、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．、３３：１０１〜１１２）。多剤耐性病原体の出現にも警戒が必要である（Ｓｗａｒｔｚ、１９９４、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：２４２０〜２４２７；Ｂａｑｕｅｒｏ、１９９７、Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、３９：１〜６）。抗真菌剤に抵抗性のある真菌病原体も記録されており、その出現頻度は増加するものと思われる（Ｒｅｘ、１９９７、Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．、２４：２３５〜２４７）。
【０００８】
敗血症に関係する薬剤耐性菌及び真菌病原体の発生のために、敗血症治療に対する新たな手法が求められている。より広範には、薬物耐性病原体の出現によって、細菌剤又は真菌剤が関係するあらゆる病的症状の治療に対して新たな手法が求められている。かつて抗生物質によって容易に治療された結核、髄膜炎、肺炎などの感染症はもはやそう容易には防止できない。
【０００９】
したがって、本発明は、オリゴヌクレオチドによって媒介される介入（ＯＭＩ）技術を利用して、かかる病的症状に関与する遺伝子の活性を治療目的のために変化させるものである。任意の配列及び長さの一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を選択細胞中で生成することができる能力によって、三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）を用いてゲノムレベルで、アンチセンス及びＤＮＡエンザイムオリゴを用いてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）レベルで、ならびにｓｓＤＮＡをアプタマーとして用いてタンパク質レベルで、遺伝子発現を目標通りに変化させることができる（Ｃｈｅｎ、２００２、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ２（７）７３５〜７４０）。アンチセンス、ＤＮＡエンザイム、三重鎖及びアプタマー技術は、細胞及び生物における遺伝子ノックアウトの作製などのより困難な方法に対する効率的選択肢を提供するものである。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）は、ＯＤＮとその標的ｍＲＮＡとのワトソン−クリック塩基対を形成することによって遺伝子発現を妨害する（Ｃｒｏｏｋｅ、１９９９、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １４８９：３１〜４４）。アンチセンスＯＤＮは、真核細胞における遺伝子発現を効果的に阻害するために使用され、市場には１種類のアンチセンスＯＤＮ型製品が存在し、臨床試験中の別の製品もある（Ｕｈｌｍａｎ、２００１、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、１：３１９〜３２８）。しかし、アンチセンス技術は、原核生物系においては広範に使用されていない。原核細胞自体は、遺伝子調節のための内在性アンチセンス機構を発達させてきた（Ｓｉｍｏｎｓら、１９８８、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．、２２、５６７〜６００）。初期の結果によれば、細菌における遺伝子発現は、改変ＯＤＮによって阻害することができる（Ｊａｙａｙａｒａｍａｎら、１９８１、ＰＮＡＳ、７８：１５３７〜１５４１；Ｇａｓｐａｒｒｏら、１９９１、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ  Ｄｅｖ．、１：１１７〜１４０）。別の研究者は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が細菌における遺伝子発現を阻害できることを報告した（Ｇｏｏｄら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６：３５５〜３５８）。ヌクレオチド塩基が偽ペプチド骨格に結合した模擬ＤＮＡであるＰＮＡは、ワトソン−クリック塩基対形成及びヘリックス形成によって相補ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＰＮＡオリゴマーとハイブリダイズする。
【００１０】
ＯＭＩ戦略の有効性における１つの重要な要因は、標的部位利用可能性である。塩基組成はヘテロ二重鎖形成に影響を及ぼし得るが、主要な要因とは思われない。現在、相補的ＯＤＮの結合がＲＮＡ分子の二次構造及び三次構造によって決まるという証拠がある（Ｆｒａｕｅｎｄｏｒｆら、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．、１９９６、４：１０１９〜１０２４）。アンチセンス及び／又はＤＮＡエンザイム設計に関係して標的ｍＲＮＡ上の利用可能部位を同定する様々な手法が開発された。従来、ｍＲＮＡの様々な領域を標的としたいくつかのＯＤＮが合成され、そのアンチセンス、ＤＮＡエンザイム活性又は他の活性（又は標的部位への結合親和性）が測定される線形ショットガン（ｌｉｎｅａｒ  ｓｈｏｔ−ｇｕｎ）手法。しかし、ＯＤＮのわずか２〜５％しか良好なアンチセンス試薬であることが一般に判明していない。標的の選択にコンピュータプログラムを使用することも知られている。例えば、ＭＦＯＬＤ（Ｍ．Ｚｕｋｅｒ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４、４８〜３２）などのＲＮＡ折りたたみプログラムを使用して標的ＲＮＡの二次構造が予測され、分子内の塩基対形成がないと予測された領域に結合するようにアンチセンスＯＤＮが設計されている。しかし、エネルギーに基づくＲＮＡ構造予測方法は、アンチセンス試薬の設計に大部分は不適当であり、この手法を用いた成功は限られている。
【００１１】
アンチセンスによって媒介される効果にリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）が関与しているという証拠から、利用可能なｍＲＮＡ結合部位を同定する手順が開発された。一手順においては、ＲＮａｓｅ  Ｈは、ｍＲＮＡ中の利用可能部位を同定するために、規定の長さのＯＤＮを可能な限り総て含むＯＤＮライブラリーと一緒に使用される。例えば、長さがＮの場合、ＯＤＮライブラリーセットを構成するＮ４個の異なる可能なＯＤＮがあり、４０量体ＯＤＮの場合には約２．５６×１０６個の分子がある。標的ＲＮＡ上の利用可能部位に相補的なライブラリーＯＤＮは、ゲル電気泳動によってＲＮａｓｅ  Ｈ切断部位として同定されるＲＮＡとのハイブリッドを生成し、そのライブラリーセットのメンバーは、特定の標的ｍＲＮＡに対して下方制御効果を示すかどうか試験される。原核細胞におけるテトラサイクリン調節系などの制御された発現系によって、選択的な遺伝子の下方制御又は上方制御が可能になり、それによって遺伝子産物に関する情報が提供される。
【００１２】
ハンマーヘッド型及びヘアピン型リボザイムは、規定のＲＮＡ標的に結合しそれを切断する触媒ＲＮＡ分子であって、標的となるウイルス及び細胞の遺伝子発現をノックダウンするために使用された（Ｊａｍｅｓら、Ｂｌｏｏｄ、９１：３７１〜３８２、１９９８参照）。哺乳動物細胞でライブラリー構成分子の発現を可能にするハンマーヘッド型リボザイムライブラリーを用いて、アンチセンスによる遺伝子阻害に利用可能なＩＣＰ４  ｍＲＮＡ上の部位を同定する方法が開発された（Ｐｉｅｒｃｅら、１９９８、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２６：５０９３〜５１０１）。ハンマーヘッド型リボザイムは特定のｍＲＮＡ標的を効率的に切断するが、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＲＮａｓｅ分解に起因する不安定性のためにその臨床への適用は限られている。リボザイムライブラリーは、ある特定の表現型の生成に関与する遺伝子を同定するために使用することもできる。Ｉｍｍｕｓｏｌ社の研究者は、プラスミド又はレトロウイルスベクターによって哺乳動物細胞に運搬されるヘアピン型リボザイムライブラリーを構築した（Ｗｅｌｃｈら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、６６、２７４〜２８３、２０００、Ｌｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２８：２６０５〜２６１２、２０００、Ｋｒｕｇｅｒら、ＰＮＡＳ、９７：８５６６〜８５７１、２０００、Ｂｅｇｅｒら、ＰＮＡＳ、９８：１３０〜１３５、２００１）。彼らは、遺伝子発現をノックダウンすることによって新規遺伝子を同定し、又は公知遺伝子の新機能を同定することができた。しかし、ハンマーヘッド型リボザイム同様、ヘアピン型リボザイムのｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性も限られている。
【００１３】
Ｊｉらは、ゲノムＤＮＡを切り取ることによって、２００〜８００ｂｐの長さのブドウ球菌性ＤＮＡ断片のライブラリーを構築した（Ｊｉら、２００１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３：２２６６〜２２６９）。このライブラリーをＳ．アウレウスに形質転換することによって、ランダムにアンチセンスＲＮＡ分子を作製した。この手法を用いて、抗生物質発見の標的として働き得る遺伝子が同定された。ＦｏｒｓｙｔｈらによってＳ．アウレウスにおいて類似の手法が使用された（Ｆｏｒｓｙｔｈら、２００２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、４３：１３８７〜１４００）。しかし、大きさが２００〜８００ｂｐのアンチセンスＲＮＡは、１）ＰＮＡ分子の不安定性、２）大きさが２００〜８００ｂｐのＲＮＡ分子を合成するのが困難であること、及び３）ＲＮＡを適切な細胞に輸送するための問題、のために治療目的には有用ではないので、この手法は必須遺伝子を同定するためにしか使用することができない。
【００１４】
したがって、細菌病原体及び真菌病原体に対する新しい治療薬を発見し開発することが緊急に求められている。ＤＮＡ配列決定技術の最近の進歩によって病原細菌菌のゲノム配列全体を解明することが可能になった。ゲノムの配列決定によって、抗生物質による標的候補に関係する細菌の全情報が明らかになり、それ故、新しい治療薬を開発するためにより合理的な標的に基づく手法が提供される。したがって、細菌及び／又は真菌の増殖を阻害し、細菌及び／又は真菌を死滅させ、あるいは細菌及び／又は真菌が毒素を合成・分泌するのを抑制するために、ＯＤＮを同定するスクリーニングライブラリーを使用することは、本発明の１つの焦点である。真核生物（例えば、哺乳動物）細胞で遺伝子機能に目標とする改変を加える有効なＯＤＮを発見するためにスクリーニングライブラリーを使用することは、論理的なことである。
【００１５】
したがって、本発明の目的は、治療用抗細菌剤及び／又は抗真菌剤として有用な三重鎖形成オリゴ（ＴＦＯ）、アンチセンスオリゴ、ＤＮＡエンザイム、アプタマーなどのｓｓＤＮＡを同定する方法を提供することである。
【００１６】
本発明の別の目的は、抗細菌剤及び／又は抗真菌剤を発見するための標的として役立ち得る細菌遺伝子及び／又は真菌遺伝子を同定する方法を提供する。
【００１７】
本発明の別の目的は、細菌感染症及び真菌感染症を治療する方法及びＯＤＮを提供することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、テトラサイクリン系などの選択的に誘導可能な発現ベクターを用いた制御系で、真核細胞における遺伝子発現を調節する方法を提供することである。
【００１９】
本発明のさらに別の目的は、細菌及び真菌の生存に必要な遺伝子、ならびに敗血症であることを示す自然免疫応答の悪化に関連する宿主遺伝子を同定することである。
【００２０】
本発明の別の目的は、細菌遺伝子、真菌遺伝子及び宿主遺伝子をノックダウンする（サイレントにする）ＯＤＮならびにその配列を提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、治療用抗細菌剤及び抗真菌剤としてＯＤＮ及びその配列を提供することである。
【００２２】
本発明の別の目的は、治療用ＯＤＮを標的細菌又は真菌細胞に輸送する手段を提供することである。
【００２３】
本発明の別の目的は、細菌遺伝子、真菌遺伝子及び宿主遺伝子をノックダウンするために使用されるプラスミド構築体を提供することである。
【００２４】
本発明の別の目的は、治療用抗細菌剤及び抗真菌剤として使用されるプラスミド構築体を提供することである。
【００２５】
本発明のさらに別の目的は、病原体の増殖を阻害し、病原体を死滅させ、又は病原体による毒素の合成もしくは分泌を阻害するために、その特定の遺伝子の発現を変化させる病原体の特定の遺伝子を標的とする配列を含むＯＤＮと細菌病原体又は真菌病原体を接触させるステップを含む、動物患者における敗血症などの細菌感染症及び／又は真菌感染症の治療を提供することである。
【００２６】
これらの目的及び多数の他の目的は、選択的に誘導可能な一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）発現ライブラリー、ｓｓＤＮＡ発現ライブラリーを構築する方法、ｓｓＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングする方法、ならびに細胞増殖、複製及び／又は毒素産生及び分泌に関係する細菌遺伝子のスイッチをオンオフするｓｓＤＮＡ分子を同定する方法を提供することによって達成される。この方法は、順序が無作為な１セットの固定長オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）鎖を構築し、ある種の化学環境に引き続いて曝される細胞に形質転換されたときに、発現ベクター中にプログラムされた個々のＯＤＮ配列を発現することによって細胞が反応するように構成された発現ベクターにこれらのＯＤＮをサブクローニングする方法を含む。個々のＯＤＮのための指示を含む細胞は成長してコロニーとなり、各コロニーは対照セットと実験セットに分けられる。ＯＤＮの生成を引き起こす化学物質に実験コロニーが曝されると、ＯＤＮが発現され、細胞の遺伝子機能、例えば、タンパク質産生が変化し、異なる細胞表現型が生成されると考えられる。この形質発現が所望の最終結果である場合には、対照コロニーを処理して、問題の表現型を生成したＯＤＮの正確なヌクレオチド配列を決定するＤＮＡを抽出する。
【００２７】
この方法を使用して、細菌及び／又は真菌の増殖を阻害し、死滅させ、あるいは細菌及び／又は真菌による毒素の分泌の合成を阻害するＯＤＮが同定され、それによって病原細菌及び／又は真菌に対する新しい治療薬を同定することが可能になり、新しい治療薬を発見するための追加の標的として役立ち得る細菌及び／又は真菌の必須遺伝子を同定することが可能になる。同じ方法及びスクリーニングライブラリーを利用して、細胞増殖、複製及び／又は毒素産生及び分泌に関係する細菌遺伝子及び真菌遺伝子のスイッチをオンオフするｓｓＤＮＡ分子が同定される。
【００２８】
本発明は、細菌細胞又は真菌細胞においてｉｎ  ｖｉｖｏでＯＤＮを生成し、前記ＯＤＮがその標的遺伝子に到達し、それをノックダウンし、それによって細菌細胞もしくは真菌細胞を死滅させ、又はその増殖を阻害するときに、血流中の細菌もしくは真菌の蓄積が一定に保たれ、又は減少し、敗血症症候群が軽減され、又は解消されることによって、敗血症などの細菌もしくは真菌によって引き起こされる疾患を治療する方法を含む。
【００２９】
別の態様においては、本発明は、触媒作用配列が導入される細菌細胞もしくは真菌細胞、及び／又は触媒作用配列がｉｎ  ｖｉｖｏで合成される細菌細胞もしくは真菌細胞を死滅させるのに有効な標的配列に隣接する触媒作用配列を有する新規ｓｓＤＮＡエンザイムを提供する。
【００３０】
本発明は、宿主細胞中でｉｎ  ｖｉｖｏでＯＤＮが生成され、ＯＤＮがその標的遺伝子をサイレントにするときに、宿主の悪化した自然免疫応答が阻害され、敗血症症候群が緩和される、敗血症の治療方法も含む。
【００３１】
本発明は、ＯＤＮ発現プラスミド構築体をｉｎ  ｖｉｖｏで宿主細胞に輸送し、ＯＤＮが細胞内で生成されその標的遺伝子をノックダウンするときに、宿主の悪化した自然免疫応答が阻害され、敗血症症候群が緩和されることによって、敗血症を治療する方法も含む。
【００３２】
別の態様においては、本発明は、遺伝子発現を下方制御し又は変化させて細菌細胞又は真菌細胞を死滅させ、その増殖を阻害し、あるいは細菌細胞又は真菌細胞による毒素の合成又は分泌を減少させるように働く、細菌、真菌などの微生物病原体中の遺伝子を標的としたオリゴヌクレオチドと、細菌又は真菌による病的症状の治療に使用される、薬学的に許容される賦形剤とを含むキットも含む。
【００３３】
ここで、図面を参照すると、図１は、本発明によって構築されたプラスミドｐｓｓＸＧの略図であって、標的細胞にある種の所望の下記核酸を生成させる生化学的命令の内容及び構成を、この場合は標的細菌細胞中に導入される二本鎖ＤＮＡループの形で示す。
【００３４】
図２は、ＦｔｓＺ遺伝子を標的とするＤＮＡエンザイムを標的細胞中で産生するように改変された図１のプラスミドｐｓｓＸＧを示し、ｐｓｓＸＧｂ（ＦｔｓＺ−ＤＺ）と命名された。
【００３５】
図２に示されたプラスミドｐｓｓＸＧｂ（ＦｔｓＺ−ＤＺ）の重要な成分は逆転写酵素であって、図３は、大腸菌中でテトラサイクリンによって誘導されるＨＩＳタグ付き逆転写酵素（ＲＴ）の発現のウェスタンブロットアッセイの結果を示す。ｐｓｓＸＧｂ（ＦｔｓＺ−ＤＺ）ベクターを含む細菌細胞は、０、１００又は２００ｎｇ／ｍｌ  ａＴｃの存在下、３７℃で１時間（レーン１〜３）、２時間（レーン４〜６）又は３時間（レーン７〜９）増殖された。細胞可溶化物はアッセイに使用され、ＲＴバンドは矢印で示され、ＲＴ酵素の活性を裏づけている。
【００３６】
図４は、図２に示されたｐｓｓＸＧｂ（ＦｔｓＺ−ＤＺ）プラスミドにおける逆転写酵素（ＲＴ）の発現及び活性を検証する第２のアッセイの結果を示す。このアッセイにおいては、大腸菌中のＨＩＳタグ付きＲＴの産生がテトラサイクリンによって誘導された。ベクターを含む細菌細胞をＯＤ２８０値が０．５になるまで３７℃で増殖させ、次いでテトラサイクリンの誘導体であるａＴｃを２００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞に添加し、さらに１〜２時間インキュベートした。細胞可溶化物はアッセイに使用され、Ｓｉｌｖｅｒら（１９９３、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：３５９３〜３５９４）に従って実施された。レーン１：テトラサイクリン誘導なし；レーン２：１時間ａＴｃ誘導；レーン３：２時間ａＴｃ誘導。ＰＣＲ増幅産物は矢印で示す。
【００３７】
図５Ａは、ＦｔｓＺ遺伝子によって生成されたｍＲＮＡの予測構造を示す（Ｔｅｔａｒｔら、１９９２、Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６：６１５〜６２０）。矢印は、核酸が一致しないループを示し、それによって一本鎖核酸配列がｍＲＮＡに結合する機会が作られる。下記に示すように、矢印で示される８８０位のＧＵ部位は、ＦｔｓＺ  ｍＲＮＡ切断ＤＮＡエンザイムを設計するのに利用された。図５Ｂは、このＦｔｓＺ  ｍＲＮＡ切断ＤＮＡエンザイム（３’から５’配列）及びその標的配列又は基質（５’から３’配列）の設計をそれぞれ示す図である。
【００３８】
図６は、ＦｔｓＺ  ＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの切断結果を示し、本発明のＤＮＡエンザイムが機能して標的ｍＲＮＡを消化することを証明している。レーン１は、ＤＮＡエンザイムの非存在下で２時間インキュベートされた対照反応である。Ｓ：基質；Ｐ１（８５７ｎｔ）及びＰ２（３６８ｎｔ）：ＤＮＡエンザイム消化産物。
【００３９】
図７は、ＤＮＡエンザイムによって媒介される、ｆｔｓＺ遺伝子発現の抑制を実証するために、誘導時にｐｓｓＸＧ及びｐｓｓＸＧｂ（ＦｔｓＺ）プラスミドが導入された細胞内のタンパク質をＦｔｓＺタンパク質に特異的な抗体を用いて検出するアッセイ結果を示す：Ａ．ｐｓｓＸＧｂ（ＦｔｓＺ−ＤＺ）ベクターを含む細菌細胞；Ｂ．対照ｐｓｓＸＧａベクターを含む細菌細胞。以下に示すように、誘導系を利用してスクリーニングを容易にした。
【００４０】
図８Ａは、ｉｎ  ｖｉｖｏで発現された本発明のＦｔｓＺ  ｍＲＮＡ切断ＤＮＡエンザイムによる細胞増殖阻害を示す。
【００４１】
図８Ｂは、ｐｓｓＸＧｂ（ＦｔｓＺ−ＤＺ）を含む細菌細胞の形態を示す：Ａ．ｐｓｓＸＧｂ（ＦｔｓＺ−ＤＺ）を含む細菌細胞、ａＴｃなし；Ｂ．ｐｓｓＸＧｂ（ＦｔｓＺ−ＤＺ）を含む細菌細胞、８００ｎｇ／ｍｌ  ａＴｃ；Ｃ．ｐｓｓＸＧａベクターを含む細菌細胞、ａＴｃなし；及びＤ．ｐｓｓＸＧａを含む細菌細胞、８００ｎｇ／ｍｌ。長い糸状の細胞（Ｂ）は、分割することができない細胞であることを示す。
【００４２】
図９は。ライブラリースクリーニングの結果を示す。コロニーは、ａＴｃを含むＬＢプレート又は含まないＬＢプレート中で２組ずつ増殖された。陽性クローン（配列ＣＹＧＸ０８０１０３を含むｐｓｓＸＧｂベクターを含む）を矢印で示す。
【００４３】
図１０は、ライブラリースクリーニングからの陽性クローン（ＣＹＧＸ０８０１０３、図９）の抑制効果の再確認を示す。ＣＹＧＸ０８０１０３プラスミド及び負の対照としてＯＤＮ挿入断片を含まない同プラスミドをＤＨ５αＰｒｏに形質転換し、２００ｎｇ／ｍｌのａＴｃを含むＬＢ培地又は含まないＬＢ培地に播いた。図１０Ａは、ＣＹＧＸ０８０１０３プラスミドを含むＤＨ５αＰｒｏが、ａＴｃを含まない培地上では正常に増殖するが、ａＴｃを含む培地上では正常に増殖しないことを示す。ＯＤＮ挿入断片を含まないプラスミドを含むＤＨ５αＰｒｏは両方の培地上で増殖する（図１０Ｂ）。
【００４４】
図１１は、ＯＤＮ（ＣＹＧＸ０８０１０３）発現ベクターを大腸菌ＸＬ１０−ｇｏｌｄ（ｋａｎ）細胞に形質転換した結果を示す。この形質転換体を、クロラムフェニコールを含むＬＢ培地に播き、３７℃で一晩インキュベートした。ＣＹＧＸ０８０１０３発現プラスミドを含むＸＬ１０−ｇｏｌｄ（ｋａｎ）細胞はＬＢ培地上で増殖しなかったが、ＯＤＮ挿入断片を含まない同プラスミドを含むＸＬ１０−ｇｏｌｄ（ｋａｎ）細胞は正常に増殖した。
【００４５】
図１２は、ＯＤＮ処理された感染マウス又はＯＤＮ処理されていない感染マウスの生存を示す。細菌の対数期調製物をＰＢＳで希釈し、３×１０８ＣＦＵの細菌をｉ．ｐ．注射して、マウスに敗血症を誘発させた。マウスを治療するために、ＯＤＮを細菌とｉｎ  ｖｉｔｒｏで混合して注射するか、又は、感染前にマウスをＯＤＮで前処理した。血清を収集し、炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ−６、ＴＮＦ、ＩＬ−１）及び細菌負荷を試験し、マウスの挙動を注射後の様々な時点で監視した。
【００４６】
図１３は、細菌感染後４時間及び２４時間のマウス炎症誘発性サイトカインＩＬ−６の変化を示す。ＩＬ−６濃度は、市販キットを用いて測定された。
【００４７】
図１４は、ＯＤＮによる細菌増殖阻害を示す。一晩培養した培養物を１／５０に希釈した直後に、ＯＤＮを添加して最終濃度４μＭ、４０μＭ又は４００μＭとし、負の対照として等量の水加え、振とうしながら３０℃でインキュベートした。２、４又は６時間後に、増殖を生細胞数によって測定し、これは、培養物を希釈し、ストレプトマイシンを含むＬＢプレートに播いて実施された。
【００４８】
図１５は、クロラムフェニコールを含むＬＢ培地上に播かれ、３７℃で一晩インキュベートされた、ＯＤＮ発現プラスミドＡＳ８３０１０３又はＯＤＮ挿入断片を含まない同プラスミドで形質転換されたコンピテントなＸＬ１０−ｇｏｌｄ（ｋａｎ）細胞の細菌増殖阻害を示す。
【００４９】
図１６は、ペプチド−ＰＮＡ複合体による細菌増殖の用量依存的な阻害を示す。図示したように、この複合体はＫ−１２細胞の増殖を８２〜９９．８％阻害した。
【００５０】
本発明の方法及び構築体は、いくつかの実施形態の以下の説明を参照することによってよりよく理解される。
【００５１】
テトラサイクリン誘導性原核生物ｓｓＤＮＡ発現ベクターの構築
ＰＣＲ増幅は、この特定指示によりその全体を本明細書に援用される国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／２７３８１号に記載された真核生物プラスミドｐｓｓＸＥを鋳型として用いて実施された。ＰＣＲ反応に用いられたＤＮＡプライマー、５’ＮｈｅＩＰｖｕＩＡＴＧ
５’−ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＧＡＴＣＧＡＴＧＧＧＡＣＣＡＡＴＧＧＧＧＣＡＧ−３’                                                        ［配列番号１］
及び３’ＫｐｎＩ
５’−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＡＧＴＡＴＴＣＣＣＴＧＧＴＣ−３’  ［配列番号２］
は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）によって合成された。ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片は、ＮｈｅＩとＫｐｎＩを用いて二重消化され、次いで同じ酵素を用いて二重消化されたｐｓｓＸＥベクターにサブクローニングされた。この置換によって、翻訳開始部位（ＡＴＧ）前の原核生物遺伝子発現に不要な配列が除去され、新しい制限酵素部位ＰｖｕＩが生成する。新規に生成された構築体は、ＰｖｕＩ及びＸｂａＩによって消化された。ＰｖｕＩ−ＸｂａＩ断片は、１）短縮されているが十分に活性のあるＲＴをコードするマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭｏＭｕＬＶ  ＲＴ）遺伝子（Ｔａｎａｓｅら、ＰＮＡＳ、２０００、８５：１７７７〜１７８１）；２）ＭｏＭｕＬＶ  ＲＴによる逆転写開始に必須であるプロモーターのいくつかの隣接領域に沿ったプライマー結合部位（ＰＢＳ）（Ｓｈｉｎｎｉｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８１、２９３：５４３〜５４８）；及び３）援用された上記国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／２７３８１号に記載されているすべての逆転写反応の終結用に設計されたステムループ構造、を含み、ｓｓＤＮＡ生成に必須なすべての要素を含む。このＤＮＡ断片は、ｐＰＲＯＴｅｔ．Ｅ２３３ベクター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社社、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）にサブクローニングされ、新規に生成された構築体は、図１に示すようにｐｓｓＸＧａと命名された。しかし、細菌ｔＲＮＡＰｒｏの配列は、哺乳動物細胞中でＰＢＳに結合するようにデザインれた哺乳動物ｔＲＮＡＰｒｏとは異なる。細菌ｔＲＮＡＶａｌはＲＴ用プライマーとして利用することができるので、新しいＰＢＳは、哺乳動物細胞に使用されるベクターｐｓｓＸＥで使用されるＰＢＳを置換するように設計された。新規ＰＢＳの配列は、
５’−ＴＧＧＴＧＣＧＴＣＣＧＡＧ−３’                      ［配列番号３］
である。
所望のＤＮＡエンザイムを発現するベクターを構築し、ｐｓｓＸＥ（ＣＭＶ）の発現カセット中の最初のプライマー結合部位（ＰＢＳ）を置換するために、
５’−ｄＴＡＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＴＡＧＣＣＴＴＣＧＡＡＡＣＴＴＧＧＴＧＧＴ−ＧＣＧＴＣＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＧＧＧＡＧＡＣＣＣＣＴＧＣＴＣＧＡＧＴ−３’                                                    ［配列番号４］
及び
５’−ＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＣＡＧＧＧＧＴＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＡＣＴＣＧＧＡＣＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡ−ＧＴＴＴＣＧＡＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＴＣＡＴＣＣＡＧＴＴＡＡＴ−３’                                          ［配列番号５］
の配列のＯＤＮをアニールして５’ＰａｃＩと３’ＸｂａＩ付着末端を有する合成二重鎖を生成し、ｐｓｓＸＧａのＰａｃＩ部位とＸｂａＩ部位に連結した。生成したベクターをｐｓｓＸＧｂ（ＦｔｓＺ−ＤＺ）と命名し、図２に示す。
【００５２】
ｐＰＲＯＴｅｔ．Ｅ２３３は、６ｘＨＮとの融合タンパク質を発現するテトラサイクリン誘導性細菌発現ベクターである。このベクターは、高い特異的を有するＴｅｔリプレッサータンパク質によって厳しく抑制され、無水テトラサイクリン（ａＴｃ）に応答して誘導されるＰＬｔｅｔＯ１プロモーターを利用し、誘導を広範に制御することが可能になる（無水テトラサイクリンは、ＰＲＯＴｅｔ．Ｅ系の強力な誘導物質として作用するテトラサイクリンの誘導体である）。ｐｓｓＸＧベクターは、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（Ｃｍ）と５０μｇ／ｍｌスペクチノマイシン（ｓｐｅｃ）の存在下で菌種ＤＨ５αＰｒｏ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社社、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）に形質転換された。スペクチノマイシンは、ＴｅｔＲをコードする転写単位を有するＤＨ５αＰｒｏ細胞を選択するために使用される（Ｌｕｔｚら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９７、２５：１２０３〜１２１０）。ＤＨ５αＰｒｏ細胞は、規定量のＴｅｔリプレッサーを発現する。細胞可溶化物は、Ｂ−ＰＥＲ  ＩＩ細菌タンパク質抽出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用い、製造元の指示に従って調製された。細胞可溶化物を使って、逆転写酵素（ＲＴ）の発現は、Ｓｉｌｖｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９３、２１：３５９３〜３５９４）に従って、細胞可溶化物を用いたＲＴ活性アッセイによって図３に示すように確認され、図４に示す６ｘＨＮ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）に対する抗体を用いたウェスタンブロットによって確認された。
ＦｔｓＺを標的としたＤＮＡエンザイムによる細菌増殖の阻害
【００５３】
細胞分裂は、細菌の生存にとって極めて重要である。大腸菌などの細菌は通常は二分裂によって分裂し、大きさが同じで各々が核様体を含む２個の娘細胞を生成する。ＦｔｓＺは細菌の分裂及び生存の必須遺伝子である。ＦｔｓＺが母細胞の中央に局在化し、中隔構造（ｓｅｐｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）のＺリングが形成されて分裂が始まり、次いで他の必須な細胞分裂タンパク質がＺリングにリクルートされる。ＦｔｓＺ遺伝子の欠失及び突然変異は、細胞分裂を初期で阻止するものであり、それ故、広範な細菌病原体に対する新しい治療薬の好機を提供するものである。
【００５４】
ＤＮＡエンザイムは、プリン／ピリミジン接合部において任意の標的ＲＮＡを結合及び切断するその能力のために、援用された上記国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／２７３８１号に記載されたように遺伝子発現を妨害することができる。ＦｔｓＺ  ｍＲＮＡの予測された二次構造に基づいて、ＤＮＡエンザイム（ＤＮＡｚｙｍｅ）は、例えば、５０〜６６、５３０〜５４７、６１２〜６２９、６４８〜６６２、８７１〜８８７、９５８〜９７２及び１０３２〜１０４８位のループを含めてこのｍＲＮＡ上の様々な部位を標的にするように設計された。具体的には、１０〜２３ＤＮＡエンザイム切断部位は、ほとんどの生物学的基質において豊富であり、したがって、最大切断効率を達成する機会を提供し、８８０位のＧＵ部位を標的にした１０〜２３ＤＮＡエンザイムは、以下の３１ｎｔ配列を用いて設計され、
５’−ＧＴＴＴＣＧＡＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＴＣＡＴＣＣＡＧ−３’
［配列番号６］
予測された自由エネルギーは、２１．３ｋｃａｌ／ｍｏｌである（図５）。この３１ｎｔ酵素が、８ヌクレオチドの無作為標的結合ドメインが隣接する１５ヌクレオチド触媒ドメインで構成されることは図５から明らかであるが、この開示の利点を得る当業者は、標的結合ドメインがわずか３ヌクレオチドから最大２５又はそれ以上のヌクレオチドまで大きさが変動し得ることを認識するであろう。好ましい実施形態においては、標的結合ドメインは７から１０ヌクレオチドで構成され、酵素は、
５’−Ｎ１−ＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡ−Ｎ２−３’        ［配列番号７］
の形をとり、ここで、Ｎ１及びＮ２は、大きさが３から２５ヌクレオチド、好ましくは７から１０ヌクレオチドの特定のＲＮＡを標的とする任意のヌクレオチド配列である。
【００５５】
本発明のｐｓｓＸＧｂ（ＦｔｓＺ−ＤＺ）発現ベクターが細菌細胞中でＤＮＡエンザイム分子を産生する能力は、設計されたＤＮＡエンザイムの無細胞系における切断活性を評価することによって試験された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写によって生成される１２２５ｎｔ  ＦｔｓＺ  ＲＮＡは基質として使用され、切断アッセイは、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｎＭ鋳型ＦｔｓＺ  ＲＮＡ、１００μＭ  ＤＮＡエンザイム及び１０ユニットＲＮａｓｉｎを含む１０μｌの反応液において、３７℃で示された様々な時間で実施される。図６に示すように、合成ＤＮＡエンザイムはわずか０．５時間でＦｔｓＺ  ＲＮＡを効果的に切断し、予想サイズ（３６８ｎｔ及び８５７ｎｔ）の生成物を生成することができる。
【００５６】
他のＤＮＡエンザイムは、上記８８０位以外のＦｔｓＺ  ｍＲＮＡループを標的にするように設計された。例えば、あるＤＮＡザイムは、以下の配列を有する１０３２〜１０３８位のループを標的にするように設計された：
５’−ＣＣＴＧＣＴＴＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＴＧＧＴＣＡＣＣ−３’
［配列番号８］。
【００５７】
設計されたＤＮＡエンザイムがｉｎ  ｖｉｔｒｏでＦｔｓＺ  ＲＮＡを切断できること（図６）、ａＴｃによって制御される発現ベクターが活性のあるＲＴを産生できることが示され（図３及び４）、発現ベクターは、細胞中でＤＮＡエンザイムが産生するのに使用され、次いで、ＦｔｓＺ遺伝子発現に対するＤＮＡエンザイムの効果が判定された。図７に示すように、ｐｓｓＸＧｂ（ＦｔｓＺ−ＤＺ）ベクターを含む細菌細胞（Ａ）ならびにｐｓｓＸＧａベクターを含む負の対照細胞（Ｂ）は、様々な量のａＴｃ（０、２００、４００、８００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で３時間増殖することができる。ａＴｃの非存在下で増殖された細胞と比較して、ｐｓｓＸＧｂ（ＦｔｓＺ−ＤＺ）を含む細菌細胞におけるＦｔｓＺ発現レベルは、ａＴｃの添加によって有意に減少する（図７Ａ）。この減少は、対照細胞においては認められない（図７Ｂ）。
【００５８】
ＦｔｓＺ遺伝子は細菌の分裂及び生存に必須であり、図７によれば細胞内で産生されたＤＮＡエンザイムはＦｔｓＺ発現を有意に抑制するので、細菌細胞増殖に対する発現ＤＮＡの効果が検討された。ｐｓｓＸＧｂ（ＦｔｓＺ−ＤＺ）ベクターを含む細菌細胞は、様々な量のａＴｃ（０、２００、４００、８００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で１時間又は２時間増殖され、生細胞が数えられた。図８Ａに示すように、細胞増殖は時間及びａＴｃ濃度に依存して阻害された。さらに、細胞増殖阻害の結果、長い糸状の細胞が形成されることが観測された（図８Ｂ）。
テトラサイクリン誘導性ｓｓＤＮＡ又はＯＤＮ発現ライブラリーの構築
【００５９】
ライブラリー挿入断片は、３個のＯＤＮ、ＣＹ（ＳａｃＩＩ）−４０、
ＣＴＣＴＣＡＣＴＣＣ（Ｎ）４０ＡＣＴＧＴＴＧＡＡＡＧＧＣ    ［配列番号９］
ＣＹ（ＳａｃＩＩ）−Ｌ、
ＣＧＧＡＧＡＧＴＧＡＧＧ                                    ［配列番号１０］
及びＣＹ（ＳａｃＩＩ）−Ｒ、
ＣＴＴＴＣＡＡＣＡＧＴ                                      ［配列番号１１］
をモル比１：２０：２０でアニールすることによって作製された。“Ｎ”は塩基Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧである。したがって、無作為に合成され、ＣＹ（ＳａｃＩＩ）−４０  ＯＤＮと表される４０量体配列がある。ＯＤＮを混合し、９５℃で３分間変性し、次いで約１時間かけて室温に徐冷した。ＣＹ（ＳａｃＩＩ）−ＬはＣＹ（ＳａｃＩＩ）−４０の左腕を補完し、一方、ＣＹ（ＳａｃＩＩ）−Ｒは同じＯＤＮの右腕を補完するので、アニーリングプロセスによって部分二本鎖ＯＤＮが形成される。アニールされたＯＤＮは、部分二本鎖ＤＮＡを形成し、残りの一本鎖Ｎで補充され、ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ、ラージクレノウ（Ｌａｒｇｅ  Ｋｌｅｎｏｗ）断片（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を用いて平滑末端化された。次いで、二本鎖ＤＮＡは原核生物ｓｓＤＮＡ発現ベクターｐｓｓＸＧｂにサブクローニングされ、ＤＨ５αＰｒｏ細胞にエレクトロポレーションによって形質転換された。
【００６０】
ＤＮＡエンザイム発現ライブラリーは、同様に、ａ．ＤＺｌｉｂ１
５’−ＣＴＣＧＡＧＴＣＴＡＧＡＮＮＮＮＮＮＮＮＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＮＮＮＮＮＮＮＴＴＡＡＴＴＡＡＧＣＴＡＧＣ−３’                ［配列番号１２］
（Ｎは、ＡもしくはＴ又はＣもしくはＧ）とｂ．ＤＺｌｉｂ２
５’−ＧＣＴＡＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡ−３’                    ［配列番号１３］
を用いて構築される。
２個のオリゴヌクレオチドをモル比１：２０（ａ：ｂ）で混合し、７５℃で５分間加熱することによってアニールして部分二本鎖ＤＮＡを形成し、次いで室温に徐冷する。部分二本鎖ＤＮＡの３’陥凹末端は、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片によって平滑化され、生成した二本鎖ＤＮＡはＰａｃＩ及びＸｂａＩによって消化された。次いで、二重消化された生成物はゲル精製された。フェノール抽出及びエタノール沈殿後、ＰａｃＩ／ＸｂａＩ消化されたライブラリーＤＮＡはｐｓｓＸＧｂ発現ベクターにクローン化された。
ｓｓＤＮＡ発現ライブラリースクリーニング
【００６１】
ｓｓＤＮＡ発現ライブラリーはテトラサイクリン誘導性ベクターに基づいて構築されたので、ｓｓＤＮＡ発現ライブラリーを含む細菌細胞は、２００ｎｇ／ｍｌ  ａＴｃの存在下又は非存在下でルリアブロス（ＬＢ）プレートに２つ組で播かれた。図９に示すように、ａＴｃの非存在下でのみ増殖したコロニーは陽性コロニーと確認された。プラスミドＤＮＡをライブラリースクリーニング由来の陽性コロニーから抽出し、挿入断片配列を３’末端シングルパスシーケンシングによって求めた。この実験セットによって作製された挿入断片はＣＹＧＸ０８０１０３と命名され、
５’−ＣＴＴＴＣＡＡＣＡＧＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＴＧＡＣＣＡＴＡＣＡＡＴＴＧＣ−ＧＡＴＡＴＣＧＴＧＧＧＧＡＧＴＧＡＧＡＧ−３’    ［配列番号１４］
の配列を有する。
次いで、この配列をＧｅｎＢａｎｋ  ＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて分析して、配列相同性に基づいて遺伝子標的候補を同定した。ＣＹＧＸ０８０１０３及び本発明によってノックダウンすることができるその遺伝子候補に含まれるＯＤＮとしては、ＣＹＧＸ０８０１０３０１
５’−ＣＣＴＴＴＧＣＴＧＡＣＣＡＴＡＣ−３’                ［配列番号１５］
及びその標的ｂｔｕＥ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ−４１６２２５．１）、ＣＹＧＸ０８０１０３０２
５’−ＧＡＣＣＴＴＴＧＣＴＧＡＣＣＡ−３’                  ［配列番号１６］
及びその標的ＣａｉＢ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ−４１４５８０．１）、ＣＹＧＸ０８０１０３０３
５’−ＡＣＡＧＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣ−３’                    ［配列番号１７］
及びその標的ｙｄｇＤ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ−４１８１５２．１）、ＣＹＧＸ０８０１０３０４
５’−ＡＣＡＡＴＴＧＣＧＡＴＡＴ−３’                      ［配列番号１８］
及びその標的ｙｇｃＱ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ−４１７２４９．２）、ＣＹＧＸ０８０１０３０５
５’−ＧＡＣＣＴＴＴＧＣＴＧＡＣ−３’                      ［配列番号１９］
及びその標的ｆｔｓＨ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ−４１７６４５．１）、ＣＹＧＸ０８０１０３０６
５’−ＴＣＡＡＣＡＧＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣ−３’              ［配列番号２０］
及びその標的ｐｐｉＢ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ−４１５０５８．１）、ＣＹＧＸ０８０１０３０７
５’−ＡＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＴＧ−３’                      ［配列番号２１］
及びその標的ｙｉｈｌ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ−４１８３０８．１）、ＣＹＧＸ０８０１０３０８
５’−ＣＡＧＴＴＴＴＧＡＴＧＡ−３’                        ［配列番号２２］
及びその標的ｚｎｔＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ−４１７９２６．１）、ＣＹＧＸ０８０１０３０９
５’−ＡＣＣＴＴＴＧＣＴＧＡＣ−３’                          ［配列番号２３］
及びその標的ｙｉｃＩ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ−４１８１１６．１）、ＣＹＧＸ０８０１０３１０
５’−ＴＴＧＣＴＧＡＣＣＡＴＡ−３’                        ［配列番号２４］
及びその標的ｆｈｕＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ−４１４６９２．１）、ＣＹＧＸ０８０１０３１１
５’−ＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＴＧ−３’                        ［配列番号２５］
及びその標的ｒｐｌＤ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ−４１７７７８．１）、ＣＹＧＸ０８０１０３１２
５’−ＧＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＣ−３’                        ［配列番号２６］
及びその標的ｉｌｖＢ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ−４１８１２７．１）、ＣＹＧＸ０８０１０３１３
５’−ＧＣＧＡＴＡＴＣＧＴＧＧ−３’                        ［配列番号２７］
及びその標的ｌｅｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ−４１７０６３．１）、ＣＹＧＸ０８０１０３１４
５’−ＴＴＧＡＴＧＡＣＣＴＴＴ−３’                        ［配列番号２８］
及びその標的ａｒｏＫ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ−４１７８４９．１）、ＣＹＧＸ０８０１０３１５
５’−ＴＧＧＧＧＡＧＴＧＡＧ−３’                          ［配列番号２９］
及びその標的ｍｆｄ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ−４１５６３２．１）、ＣＹＧＸ０８０１０３１６
５’−ＴＴＧＣＴＧＡＣＣＡＴ−３’                          ［配列番号３０］
及びその標的ｒｌｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ−４１５１６６．１）、ＣＹＧＸ０８０１０３１７
５’−ＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＣ−３’                          ［配列番号３１］
及びその標的ａｃｃＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ−４１４７２７．１）、ＣＹＧＸ０８０１０３１８
５’−ＴＧＡＴＧＡＣＣＴＴＴ−３’                          ［配列番号３２］
及びその標的ｐｇｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ−４１４９５２．１）
などが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００６２】
ＯＤＮ  ＣＹＧＸ０８０１０３の抗菌力は、別個の２つの実験でさらに評価された。第１の実験は、ライブラリースクリーニングに使用された菌種である宿主細胞ＤＨ５αＰｒｏにおけるＯＤＮ発現プラスミドの条件致死効果を検討するために設計された。第２の実験は、他の菌種に対するＯＤＮ発現プラスミドの効果を試験するために設計された。第１の試験においては、ＯＤＮ発現プラスミド及び負の対照としてＯＤＮ挿入断片を含まない同プラスミドをＤＨ５αＰｒｏに形質転換し、２００ｎｇ／ｍｌ  ａＴｃを含むＬＢ培地又は含まないＬＢ培地に播いた。図１０Ａに示すように、ＯＤＮ発現プラスミドを含むＤＨ５αＰｒｏ細胞は、ａＴｃを含まない培地上では正常に増殖したがａＴｃを含む培地上では正常に増殖しなかった。ＯＤＮ挿入断片を含まないプラスミドを含むＤＨ５αＰｒｏ細胞は両方の培地上で増殖する（図１０Ｂ）。第２の試験においては、ＯＤＮ発現プラスミド及びＯＤＮ挿入断片を含まないプラスミドが大腸菌ＸＬ１０−ｇｏｌｄ（ｋａｎ）に形質転換された。生成した形質転換体を、クロラムフェニコールを含むＬＢ培地に播き、３７℃で一晩インキュベートした。図１１に示すように、ＯＤＮ発現プラスミドを含むＸＬ１０−ｇｏｌｄ（ｋａｎ）はＬＢ培地上で増殖しなかったが、ＯＤＮ挿入断片を含まない同プラスミドを含むＸＬ１０−ｇｏｌｄ（ｋａｎ）は正常に増殖した。
マウス敗血症モデルの開発
【００６３】
検出可能なすべてのアシルトランスフェラーゼ活性を失った温度感受性ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンアシルトランスフェラーゼ突然変異体大腸菌ＳＭ１０１及びその野生型Ｋ１２を以下に示すようにｉ．ｐ．注射してマウスに敗血症を誘発させた。ＳＭ１０１は、高分子量物質に対して外膜を透過性にする脂質Ａ生合成の欠陥がある。ＳＭ１０１の脂質Ａ含量は野生型の２〜３倍減少している。マウス感染細菌を調製するために、ＳＭ１０１の対数期培養物をＬＢ培地中、３７℃で、６００ｎｍにおける光学濃度が１．１（５×１０８ＣＦＵ／ｍｌと等価）になるまで増殖させ、続いて遠心分離し、４℃の無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁させた。細菌の対数期調製物をＰＢＳで段階希釈し、細菌３×１０８ＣＦＵをｉ．ｐ．注射してマウスに敗血症を誘発させた。血清を収集し、炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ−６、ＴＮＦ、ＩＬ−１）及び細菌負荷を試験し、マウスの挙動を注射後様々な時点で監視した。全マウスから２４時間ごとに採血した。マウスは６時間で感染の徴候（昏睡、触れると暖かい、みすぼらしい（ｓｃｒｕｆｆｙ））を示した。図１２に示すように、約６０％のマウスが感染後４８時間以内に死亡した。図１３に示すように、５匹のマウスのうち３匹で血清ＩＬ−６濃度が有意に減少した。以下の表は感染後の血中のマウス細菌負荷を示す。
【００６４】
【表１】
2006526416.tif 000002
【００６５】
血清試料を感染後２４時間で収集し、細胞増殖アッセイにかけて生細胞数を測定した。生細胞の計数は、培養物を希釈し、ＬＢプレートに播くことによって実施された。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、コロニー数を目視検査によって数えた。
ＯＤＮによる細菌増殖の阻害
【００６６】
ＯＤＮによる細菌増殖阻害は、ＳＭ１０１増殖に対するＯＤＮ投与量の効果を検討することによって評価された。この試験では、配列がＣＴＣ  ＡＴＡ  ＣＴＣ  ＴのＯＤＮを、最終濃度が４０μＭ又は４００μＭになるように、１／５０希釈したＯ／Ｎ  ＳＭ１０１細胞培養物に加え、負の対照には等量の水を加え、振とうしながら３０℃でインキュベートした。２、４又は６時間後、その増殖は、６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）によって測定されるか、又は、培養物を希釈し、ストレプトマイシンを含むＬＢプレート上にそれらを３組播くことによって実施される生細胞数の計数によって測定された。図１４に示すように、ＯＤＮを添加すると、細胞増殖は８６〜９６％阻害された。
ＯＤＮ発現プラスミドによる細菌増殖の阻害
【００６７】
この試験では、上記配列ＣＹＧＸ０８０１０３を有するＯＤＮ発現プラスミドＡｓ０８０１０３及び負の対照としてＯＤＮ挿入断片を含まないｐｓｓｘＧｂプラスミドを大腸菌ＸＬ１０−ｇｏｌｄ（ｋａｎ）に形質転換した。生成した細胞培養物を、クロラムフェニコールを含むＬＢ培地に播き、３７℃で一晩インキュベートした。図１５に示すように、ＯＤＮ発現プラスミドを含むＸＬ１０−ｇｏｌｄ（ｋａｎ）はＬＢ培地上で増殖しなかった。
マウスモデルにおける致死量（ＬＤ７０）の確認
【００６８】
６週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（一群５匹）を感染実験に使用した。４００μｌ分量のＳＭ１０１の段階希釈物をマウスの腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射した。マウスを１００時間観察した。細菌を接種されたマウスの健康状態を、いくつかの臨床徴候によって示される進行性の病態に基づいて５から０の段階で記録した。正常状態及び目立たない状態は５と記録され、昏睡及び毛の乱れとして定義されるわずかな疾病は４と記録され、重度の昏睡、毛の乱れ及び脊柱後湾曲として定義される中程度の疾病は３と記録され、上記徴候に加えて半ば閉じられた目の周囲の滲出性蓄積を伴う重度の疾病は２と記録され、瀕死の状態は１と記録され、死亡は０と記録された。実験は二重盲検方式で実施されなかったが、すべての動物は２人以上の無関係な観察者によって評価された。これらの実験によって、１０９ＣＦＵのＳＭ１０１系統は６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスに対してＬＤ７０であることが確認され、ＬＤ７０用量を投与された〜６０％のマウスが４８時間以内に死亡した。このＬＤ７０を下記ＤＮＡ治療実験に使用した。類似の手法を使用して大腸菌系統Ｋ−１２のＬＤ７０を確認した。
ＯＤＮを用いた敗血症の治療
【００６９】
ＯＤＮ治療の有効性は、上述のＳＭ１０１菌血症マウスモデルを使用した２つの実験で評価された。第１の実験では、ＳＭ１０１菌血症からマウスを救うＯＤＮの能力に対するＤＮＡ用量の効果を検討した。第２の実験では、様々な時期における治療を遅延させる結果に及ぼす効果を試験した。用量変動試験においては、５群のマウス（各５匹）にＬＤ７０のＳＭ１０１をｉ．ｐ．注射によって投与した。各群は、４ｎｍｏｌ、４０ｎｍｏｌ、４００ｎｍｏｌ及び０ｎｍｏｌで細菌に暴露された直後に、ＯＤＮである
ＣＴＣ  ＡＴＡ  ＣＴＣ  Ｔ                                  ［配列番号３３］
の単回投与をｉ．ｐ．投与で行う処理を受けた。追加の対照として、第５の群（マウスは２匹）は細菌に暴露されず、（最高用量の）ＯＤＮの注射のみを受けた。これらの動物の健康状態を１週間監視した。図１２は、ＯＤＮの処理の有無における感染マウスの生存を示す。
バクテリオファージＴ３抽出による標的細菌細胞へのプラスミドの輸送
【００７０】
標準ＤＮＡパッケージング反応混合物（２５μｌ）は、完全ｐａｃ緩衝剤（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｐａｃ  ｂｕｆｆｅｒ）中に０．５ｍｇのプラスミドＤＮＡ、２×１０１０ファージ当量（ｐｅｇ）のプロヘッド、２０ｐｍｏｌのｇｐ１８及び３ｐｍｏｌのｇｐ１９を含む。ＤＮＡパッケージングをするには、反応混合物を３０℃で３０分間インキュベートし、１μｌの２ｍｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅＩを添加して反応を終結させた。３０℃で２０分間のインキュベーション後、充填頭部（ｆｉｌｌｅｄ  ｈｅａｄ）は、尾部及び尾部繊維タンパク質を含む頭部受容体抽出物と一緒にインキュベートすることによって感染性粒子に転化された。プロヘッドは、Ｎａｋａｓｕら（１９８３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１２７、１２４〜１３３）によって記載されたように、Ｔ３バクテリオファージで感染された細菌細胞の溶解物をショ糖勾配遠心分離することによって調製された。ｇｐ１８及びｇｐ１９タンパク質は、Ｈａｍａｄａら（１９８６、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１５１、１１０〜１１８）に記載されたように精製された。頭部受容体抽出物は、Ｔ３バクテリオファージに感染された細菌細胞の溶解物から単離され、硫安塩析によって精製された。生成した感染性粒子は、標的細菌細胞輸送用のＯＤＮ発現プラスミドを含む。
ペプチド−ＯＤＮ複合体による細菌増殖の阻害
【００７１】
ペプチド−ＰＮＡ複合体による細菌増殖阻害は、Ｋ１２の増殖を阻害する複合体の能力における、複合体の用量の効果を検討することによって評価された。この試験においては、配列
ＫＦＦＫＦＦＫＦＦＫ−ＣＴＣ  ＡＴＡ  ＣＴＣ  Ｔ            ［配列番号３４］
を有するペプチド−ＯＤＮ複合体を、１／５０希釈したＯ／Ｎ  Ｋ１２細胞培養物に添加し、最終濃度４μＭ、４０μＭ又は４００μＭとし、負の対照には等量の水を加え、振とうしながら３７℃でインキュベートした。Ｏ／Ｎ培養物を１／５０に希釈した直後に、最終濃度が４μＭ、４０μＭ又は４００μＭとなるようにペプチド−ＯＤＮ複合体を添加し、負の対照として等量の水を加え、振とうしながら３７℃でインキュベートした。２時間後、培養物を希釈し、ＬＢプレートに３組で播いて生細胞を数えることによって増殖を測定した。図１６に示すように、ペプチド−ＯＤＮ複合体を添加すると、細胞増殖は８２〜９９．８％阻害された。
ペプチド−ＯＤＮ複合体による血中でのマウスの細菌負荷の減少
【００７２】
ペプチド−ＯＤＮ複合体治療の有効性は、血中でのマウスの細菌負荷を減少する複合体の能力を試験することによって評価された。この試験では、Ｋ１２の対数期調製物をＰＢＳで希釈し、３×１０９ＣＦＵの野生型細菌Ｋ１２をｉ．ｐ．注射することによって６週齡のＢａｌｂ／ｃマウスを感染させた。感染マウスは、細菌暴露から３０分後にｉ．ｐ．投与された５０ｎｍｏｌペプチド−ＯＤＮ複合体［配列番号３４］の単回投与によって処理された。複合体はｉｎ  ｖｉｔｒｏで細菌と混合され、次いでマウスに注射され、又は感染後３０分に複合体の後処理がされた。血清試料は、生細胞数を測定することによる細胞増殖アッセイのために、感染後２４時間で収集された。生細胞の計数は、培養物を希釈し、それをＬＢプレートに播くことによって実施された。結果を以下の表に示す。
【００７３】
【表２】
2006526416.tif 000003
【００７４】
本発明は、選択されたＯＤＮ及びその生成に使用された発現プラスミドを治療薬として使用する細菌病原体及び真菌病原体と闘う新しい戦略に関する。本発明のＯＤＮ及び発現プラスミドを利用して首尾よく治療される病原性症状の１つは敗血症である。本発明によって処理することができる敗血症を引き起こす微生物の例としては、肺、腹部、血流、皮膚、軟部組織における感染症、血管内装置に関連する感染症及び呼吸器感染症を引き起こす微生物が挙げられるが、これらだけに限定されない。本発明によって処理することができる他の病原性微生物としては、バクテロイデス（ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ブランハメラ（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ）などのグラム陰性菌、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ペプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、プロピオニバクテリア（Ｐｒｏｐｉｏｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）などのグラム陽性菌、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、クラミジア（Ｃｌａｍｙｄｉａ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）などのグラム染色でほとんど又はまったく染色されない生物、及びカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、アスペルギルス症（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ）、ブラストミセス症（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ）、コクシジウム症（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏｍｙｃｏｓｉｓ）、クリプトコッカス症（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ）、ヒストプラスマ症（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ）、パラコクシジオイデス症（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｍｙｃｏｓｉｓ）、スポロトリクム症（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｏｓｉｓ）、接合菌症（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｓｉｓ）などの真菌が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００７５】
本発明によってノックダウンすることができる細菌標的遺伝子の例としては、ライブラリースクリーニングによって同定される遺伝子及び細菌生理学の知識に基づいて選択される遺伝子が挙げられるが、これらだけに限定されない。標的遺伝子は、主要な複合プロセス、すなわち、細胞分裂、細胞壁合成、タンパク質合成（翻訳）、核酸合成、脂肪酸代謝及び遺伝子調節の１つに関与する遺伝子中に見出すことができる。したがって、本発明によってノックダウンすることができる細菌標的遺伝子の例としては、上述のＦｔｓＺ遺伝子、ＭｕｒＢ、ａｃｐＰ、１６ｓ  ｒＲＮＡ、ＰＢＰｓ、ＤＮＡＡ、ＤＮＡＣ、ｐｃｒＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＣ、ｒｐｓＣ、ｒｐｓＤ、ｒｐｓＦ、ｒｐｓＩ、ｒｐｓＪ、ｒｐｓＭ、ｒｐｓＲ、ＦａｂＫ、ＦａｂＨ、ｒｐｌＢ、ｒｐｌＣ、ｒｐｌＪ、ｒｐｌＫ、ｒｐｌＭ、ｒｐｌＮ、ｒｐｌＯ、ｒｐｌＰ、ｒｐｌＲ、ｒｐｌＴ、ｒｐｌＶ、ｒｐｌＸ、ｒｐｍＡ、ｒｐｍＬ．ｖａｌＳ、ｓｅｒＳ、ｐｒｏＳ、ｃｙｓＳ、ａｌａＳ、ｐｈｅＳ、ｓｐｏｒＣ、ｔｓｆ  ｔｕｆＡ、ｆｕｓ、ｓｅｃＡ、ｓｅｃＶ、ｐｙｒＣが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００７６】
真菌の生存に極めて重要な標的遺伝子は、主要な複合プロセス、すなわち、細胞分裂、細胞壁合成、タンパク質合成（翻訳）、核酸合成、脂肪酸代謝及び遺伝子調節の１つに関与する遺伝子中に見出すことができる。したがって、本発明によってノックダウンすることができる真菌標的遺伝子の例としては、ＥＲＧ１、ＥＲＧ２、ＥＲＧ３、ＥＲＧ４、ＥＲＧ５、ＥＲＧ６、ＥＲＧ７、ＥＲＧ１１、ＥＲＧ２４、ＥＲＧ２５、ＥＲＧＸ、ＥＲＧＹ、ＣＨＳ１、ＣＨＳ２、ＣＨＳ３、ＣＷＰ１、ＣＷＰ２、ＫＲＥ１、ＫＲＥ２、ＫＲＥ５、ＫＲＥ１１、ＴＩＰ１、ＧＦＡ１が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００７７】
ＯＤＮ技術は、敗血症において悪化した自然免疫応答に関連する宿主遺伝子の過剰発現を下方制御でき、その結果、感染に対する適切な宿主応答が存続する。本発明によってノックダウンすることができる宿主標的遺伝子の例としては、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）、高移動度タンパク質−１（ＨＭＧ−１）、遊走阻止因子（ＭＩＦ）、キニン、血小板活性化因子受容体拮抗物質（ＰＡＦｒａ）、可溶性ホスホリパーゼＡ２（ｓＰＬＡ２）が挙げられるが、これらだけに限定されない。特に、ＴＮＦは、敗血症カスケードにおける最も重要な炎症伝達物質の１つであると考えられる。ＴＮＦは、敗血症で有意に増加し（Ｃａｓｅｙら、１９９３、Ａｎｎ．  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｍｅｄ．１１９：７７１〜７７８；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｌｌら、１９９５、Ｓｈｏｃｋ、１〜１２）、ＴＮＦレベルは、敗血症の重症度及び臨床結果と関連がある（Ｃａｌａｎｄｒａら、１９９０、Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．１６１：９８２〜９８７；Ｃａｎｎｏｎら、１９９０、Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．、１６１：７９〜８４）。さらに、敗血症の有害作用のほとんどは、ＴＮＦを投与することによって模倣することができる（Ｏｋｕｓａｗａら、１９８８、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、８１：１１６２〜１１７２；Ｎａｔａｎｓｏｎら、１９８９、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１６９：８２３〜８３２）。
【００７８】
本発明によって敗血症を治療するのに使用されるＯＤＮ治療薬の例としては、その配列が５’（ＣＴＴ  ＴＣＡ  ＡＣＡ  ＧＴＴ  ＴＴＧ  ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴＴ  ＧＣＴ  ＧＡＣ  ＣＡＴ  ＡＣＡ  ＡＴＴ  ＧＣＧ  ＡＴＡ  ＴＣＧ  ＴＧＧ  ＧＧＡ  ＧＴＧ  ＡＧＡ  Ｇ）３’であって、その標的候補がｂｔｕＥ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ＿４１６２２５．１）、ＣａｉＢ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ＿４１４５８０．１）、ｙｄｇＤ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ＿４１８１５２．１）、ｙｇｃＱ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ−４１７２４９．２）、ｆｔｓＨ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ−４１７６４５．１）、ｐｐｉＢ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ＿４１５０５８．１）、ｙｉｈｌ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ４１８３０８．１）、ｚｎｔＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ−４１７９２６．１）、ｙｉｃＩ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ＿４１８１１６．１）、ｆｈｕＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ＿４１４６９２．１）、ｒｐｌＤ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ＿４１７７７８．１）、ｉｌｖＢ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ＿４１８１２７．１）、ｌｅｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ＿４１７０６３．１）、ａｒｏＫ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ＿４１７８４９．１）、ｍｆｄ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ  ４１５６３２．１）、ｒｌｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ＿４１５１６６．１）、ａｃｃＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ＿４１４７２７．１）、ｐｇｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ＿４１４９５２．１）であるＣＹＧＸ０８０１０３、その配列がＰＮＡ型の５’（ＣＴＣ  ＡＴＡ  ＣＴＣ  Ｔ）３’であって、その標的が細菌必須脂肪酸生合成遺伝子ａｃｐＰ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ＿３０９４９９）であるＣＹＧＸａｃｐＰ、その配列が５’（ＧＴＴ  ＴＣＧ  ＡＡＧ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＴＡＣ  ＡＡＣ  ＧＡＴ  ＣＡＴ  ＣＣＡ  Ｇ）３’であって、その標的が細菌必須細胞分裂遺伝子ＦｔｓＺ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ＿３０８１２６）であるＣＹＧＸＦｔｓＺＤＺが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００７９】
本発明によって敗血症を治療するのに使用されるＯＤＮ治療薬の例としては、通常のＯＤＮ及びその発現プラスミド、ロックされた核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）、上記のものなどのペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエート、ホスホロチオエートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）などのその改変型が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００８０】
本発明によって細菌病原性又は真菌病原性症状を治療するために本発明のＯＤＮ及び前記ＯＤＮ発現プラスミドを細菌細胞又は真菌細胞に輸送する手段の例としては、裸のＤＮＡ；ＰＥＩ、ＥＰＥＩ、ポルフィリンなどの陽イオン性ポリマー；レトロウイルス、アデノウイルスなどのウイルスベクター；ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡなどの陽イオン性リポソーム；及びＸａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ｘａａ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ｔｒｐ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ、Ｌｙｓ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｔｒｐ  Ｔｒｐ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ｔｒｐ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｘａａ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｘａａ、Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｘａａ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ｔｒｐ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｘａａなどのペプチド（Ｘａａは任意のアミノ酸とすることができる）の直接注射が挙げられるが、これらだけに限定されない。本発明のＯＤＮ発現プラスミドは、上で詳述したファージ抽出体を用いてプラスミドを感染性粒子にパッケージングすることによっても細菌細胞又は真菌細胞に輸送される。
【００８１】
本発明の抗真菌配列（ＡＦＳ）及び抗細菌配列（ＡＢＳ）は、プラスミド、ウイルスベクター及び当分野で公知の他のベクターに組み込むことができ、リポソーム、ＰＥＩなどの陽イオン性ポリマー又は他の賦形剤にパッケージすることができ、例えば予防的に使用して、敗血症をもたらす感染症などの感染症の可能性を防止又は低下させることができる。かかる使用としては、細菌負荷を減少させ、それ故に感染のリスクを低下させる皮膚又は外科的切開部位への噴霧塗布などが挙げられるが、これだけに限定されない。本発明のＡＦＳ及びＡＢＳは、この同じ方法で局所感染に対して、また、全身的な静脈内注入によって利点を得るためにも使用される。一般的な微生物病原体に対するＡＦＳとＡＢＳの「カクテル」はこの目的で投与され、あるいは細菌病原体又は真菌病原体が培養され同定されると、特定の病原体に適切な配列が選択され投与される。
【００８２】
本発明のＡＦＳ及びＡＢＳは、本発明と同じ譲受人に譲渡された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／１２３４５号に記載の方法で、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）などの宿主の炎症関連タンパク質に対する配列と併用することもできる。抗炎症性配列と抗細菌配列を併用することによって、感染のリスク及び外科的処置による瘢痕化を減少させることができる。配列の併用は、床ずれ（じょくそう）などの感染症をもたらす炎症症状に対する治療としても有用である。
【００８３】
この開示の利点を得る当業者は、本発明の用具（ａｐｐａｒａｔｕｓ）の構成要素に、これらの要素が機能してその意図される結果を達成する方法を変えることなしに、ある種の変更を成し得ることを理解されたい。かかる変更のすべて及び本発明の記載から当業者には明らかなその他の変更は、以下の非限定的な特許請求の範囲内にあるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】本発明によって構築されたプラスミドｐｓｓＸＧの略図である。
【図２】ＦｔｓＺ遺伝子を標的とするＤＮＡエンザイムを標的細胞中で産生するように改変された図１のプラスミドｐｓｓＸＧを示す図である。
【図３】大腸菌中でテトラサイクリンによって誘導されるＨＩＳタグ付き逆転写酵素（ＲＴ）の発現に対するウェスタンブロットアッセイの結果を示す図である。
【図４】図２に示されたｐｓｓＸＧｂ（ＦｔｓＺ−ＤＺ）プラスミドにおける逆転写酵素（ＲＴ）の発現及び活性を検証する第２のアッセイの結果を示す図である。
【図５】図５Ａは、ＦｔｓＺ遺伝子によって生成されたｍＲＮＡの予測構造を示す図で、図５Ｂは、このＦｔｓＺ  ｍＲＮＡ切断ＤＮＡエンザイム（３’から５’配列）及びその標的配列又は基質（５’から３’配列）の設計をそれぞれ示す図である。
【図６】ＦｔｓＺ  ＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの切断結果を示す図である。
【図７】ＤＮＡエンザイムによって媒介される、ｆｔｓＺ遺伝子発現の抑制を実証するために、誘導時にｐｓｓＸＧ及びｐｓｓＸＧｂ（ＦｔｓＺ）プラスミドが導入された細胞内のタンパク質をＦｔｓＺタンパク質に特異的な抗体を用いて検出するアッセイ結果を示す図である。
【図８】図８Ａは、ｉｎ  ｖｉｖｏで発現された本発明のＦｔｓＺ  ｍＲＮＡ切断ＤＮＡエンザイムによる細胞増殖阻害を示すグラフであり、図８Ｂは、ｐｓｓＸＧｂ（ＦｔｓＺ−ＤＺ）を含む細菌細胞の形態を示す図である。
【図９】ライブラリースクリーニングの結果を示す図である。
【図１０】ライブラリースクリーニングからの陽性クローン（ＣＹＧＸ０８０１０３、図９）の抑制効果の再確認を示す図である。
【図１１】ＯＤＮ（ＣＹＧＸ０８０１０３）発現ベクターを大腸菌ＸＬ１０−ｇｏｌｄ（ｋａｎ）細胞に形質転換した結果を示す図である。
【図１２】ＯＤＮ処理された感染マウス又はＯＤＮ処理されていない感染マウスの生存を示すグラフである。
【図１３】細菌感染後４時間及び２４時間のマウス炎症誘発性サイトカインＩＬ−６の変化を示すグラフである。
【図１４】ＯＤＮによる細菌増殖阻害を示すグラフである。
【図１５】クロラムフェニコールを含むＬＢ培地上に播かれ３７℃で一晩インキュベートされた、ＯＤＮ発現プラスミドＡＳ８３０１０３又はＯＤＮ挿入断片を含まない同プラスミドで形質転換されたコンピテントなＸＬ１０−ｇｏｌｄ（ｋａｎ）細胞における細菌増殖阻害を示す図である。
【図１６】ペプチド−ＰＮＡ複合体による用量依存的な細菌増殖阻害を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年2月8日(2006.2.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌細胞又は真菌細胞に一本鎖オリゴヌクレオチドを発現させるベクターであって、
プロモーターと、
前記プロモーターの３’側に位置する1セットの逆方向タンデム反復配列と、
前記逆方向タンデム反復配列の３’側に位置するか、又は、前記逆方向タンデム反復配列に隣接する、クローニング部位と、
前記クローニング部位の３’側に位置する逆転写酵素のためのプライマー結合部位（ＰＢＳ）と、
前記ＰＢＳの３’側に位置する発現終結配列（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と、
を含む、ベクター。
【請求項２】
さらに逆転写酵素をコードする遺伝子を含む、請求項１に記載のクローニングベクター。
【請求項３】
前記逆転写酵素がマウス白血病ウイルス（ｍｏｕｓｅ  Ｍａｌｏｎｅｙ  ｖｉｒｕｓ）の逆転写酵素である、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
さらに複製起点を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項５】
前記プライマー結合部位（ＰＢＳ）が、逆転写酵素の存在下、ｔＲＮＡ  Ｖａｌによって認識される配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のベクター。
ベクター。
【請求項６】
前記プライマー結合部位（ＰＢＳ）が、配列５’−ＴＧＧＴＧＣＧＴＣＣＧＡＧ−３’［配列番号３］を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項７】
前記プロモーターが細菌のプロモーターである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項８】
前記プロモーターが誘導可能である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項９】
前記プロモーターがテトラサイクリン又はテトラサイクリン類似体によって誘導可能である、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
前記ベクターがｐｓｓＸＧである、請求項１〜９のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１１】
さらにオリゴヌクレオチド挿入断片が前記クローニング部位に挿入された、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の複数のベクターを含み、
前記複数のベクター中の前記オリゴヌクレオチド挿入断片が異なるヌクレオチド配列を有する、
一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを発現するライブラリー。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチド挿入断片が、配列５’−Ｎ１−ＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡ−Ｎ２−３’［配列番号７］を有し、
Ｎ１及びＮ２のおのおのは、無作為の配列であって、長さが３〜２５ヌクレオチド長のヌクレオチド配列である、
請求項１２に記載のライブラリー。
【請求項１４】
その中に請求項１〜１３のいずれか一項に記載のベクター又はライブラリー、を有する細胞。
【請求項１５】
前記ベクター中の前記プロモーターが誘導可能であり、
請求項１２又は１３のライブラリーを使って細胞の機能を調節するオリゴデオキシヌクレオチドをスクリーニングする方法であって、
前記ライブラリーを宿主細胞に形質導入するステップと、
レプリカプレートの１つは、形質導入した前記宿主細胞中の前記ベクターのオリゴヌクレオチド挿入断片から一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドの発現を誘導する薬剤を含むようにして、レプリカプレート上で形質導入した前記宿主細胞を増殖させるステップと、
異なる表現型を示す宿主細胞を同定するために、誘導用の前記レプリカプレートと非誘導用の前記レプリカプレートとを比較するステップと、
異なる表現型を示す宿主細胞から前記ベクターのオリゴヌクレオチド挿入断片の塩基配列を調べるステップと、
を含む、方法。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチド挿入断片が、
５’−ＧＴＴＴＣＧＡＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＴＣＡＴＣＣＡＧ−３’［配列番号６］、
５’−ＣＣＴＧＣＴＴＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＴＧＧＴＣＡＣＣ−３’［配列番号８］、
５’−ＣＴＴＴＣＡＡＣＡＧＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＴＧＡＣＣＡＴＡＣＡＡＴＴＧＣＧＡＴＡＴＣＧＴＧＧＧＧＡＧＴＧＡＧＡＧ−３’［配列番号１４］、又は、
５’−ＣＴＣＡＴＡＣＴＣＴ−３’［配列番号３３］、
の配列を有することを決定する、
請求項１１に記載のベクター。
【請求項１７】
５’−ＧＴＴＴＣＧＡＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＴＣＡＴＣＣＡＧ−３’［配列番号６］、
５’−ＣＣＴＧＣＴＴＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＴＧＧＴＣＡＣＣ−３’［配列番号８］、
５’−ＣＴＴＴＣＡＡＣＡＧＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＴＧＡＣＣＡＴＡＣＡＡＴＴＧＣＧＡＴＡＴＣＧＴＧＧＧＧＡＧＴＧＡＧＡＧ−３’［配列番号１４］、
５’−ＣＴＣＡＴＡＣＴＣＴ−３’［配列番号３３］、又は、
配列番号６、８、１４又は３３に相同な配列、
を含む、単離されたオリゴヌクレオチド又は細胞内で発現するオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
その中に請求項１６又は１７に記載のベクター又はオリゴヌクレオチドを形質導入した細胞。
【請求項１９】
細菌、真菌又はそれら以外の微生物を、請求項１６又は１７に記載のベクター又はオリゴヌクレオチドと接触させるステップを含む、
細菌、真菌又はそれら以外の微生物の増殖を抑制する方法、又は、毒素の活性を減少させる方法。
【請求項２０】
細菌、真菌又はそれら以外の微生物を、請求項１１に記載のベクターと接触させるステップを含む、
細菌、真菌又はそれら以外の微生物の増殖を抑制する方法、又は、毒素の活性を減少させる方法。
【請求項２１】
前記細菌、真菌又はそれら以外の微生物が敗血症病原体である、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
敗血症の治療用医薬品の製造における、請求項１１、１６又は１７に記載のベクター又はオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２３】
体液を請求項１１、１６又は１７に記載のベクター又はオリゴヌクレオチドと接触させるステップを含む、
敗血症に関連する毒素の活性又は敗血症により誘導される免疫反応、を減少又は阻止する方法。