(57)【要約】本発明は、ＢＡＲＤ１タンパク質解裂により生じた新規ポリペプチド、前記ポリペプチドをコードする核酸、並びにその診断及び治療上の利用、詳細には腫瘍を治療する為の利用に関係する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリペプチドであって、それは約６７ｋＤの分子量を有し且つその配列がＢＡＲＤ１のＣ末端の最後から５０５−５２５番目のアミノ酸からなる、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
請求項１記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる、単離した核酸。
【請求項３】
請求項２記載の核酸配列を含んで成る、クローニング及び／又は発現ベクター。
【請求項４】
請求項３記載のベクターでトランスフェクトした宿主細胞。
【請求項５】
請求項１記載のポリペプチドを生産する為の方法であって、請求項３記載の発現ベクターを宿主細胞中に移入し、そしてその細胞を前記タンパク質の発現を可能にする条件下で培養する方法。
【請求項６】
請求項１記載のポリペプチドを、医薬的に許容できるビヒクルとの組み合わせにおいて含んで成る医薬組成物。
【請求項７】
請求項２記載の核酸を、医薬的に許容できるビヒクルとの組み合わせにおいて含んで成る医薬組成物。
【請求項８】
腫瘍の治療を目的とする医薬製品を生産する為の請求項６又は７記載の医薬組成物の利用。
【請求項９】
請求項１記載のポリペプチドに対して特異的に向けられた抗体。
【請求項１０】
生物試料における請求項１に記載したポリペプチド又は請求項９記載の抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出の為の方法であって、前記生物試料を、請求項９記載の抗体又は請求項１記載のポリペプチドのどちらかと接触せしめ、そして免疫複合体の形成を観察し、それぞれ前記ポリペプチド又は前記抗体の存在を明らかにする方法。
【請求項１１】
プロアポトーシス薬剤（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｄｒｕｇ）で治療した患者において抗ガン治療の効果をモニタリングするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、請求項１記載のポリペプチドに対して向けられた抗体、又は前記ポリペプチド自身を生物試料中で検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はＢＡＲＤ１タンパク質の開裂により生ずる新規ポリペプチド並びにその診断上及び治療上の利用に関連する。
【０００２】
ＢＡＲＤ１タンパク質は、ＢＲＣＡ１腫瘍サプレッサー遺伝子産物と、ＢＲＣＡ１及びＢＡＲＤ１上に存在するリングモチーフ（「ＲＲＣＡ１に関連するリングドメイン」）を介して反応する９７ｋＤのタンパク質である（Ｗｕら、１９９６）。このタンパク質をコードする遺伝子は最近クローニングされた（ＷＯ９８／１２３２７）。
【０００３】
本発明者はこの度、アポトーシスの過程で開裂ＢＡＲＤ１のタンパク質分解断片に対応する新規ポリペプチドを同定した。
【０００４】
この切断されたタンパク質は極めて免疫原性であり、とりわけ、ガンを患う患者のガンの治療において用いること又はプロアポトーシス薬剤による治療の効果をモニタリングすることにおいて用いることが出来うる。
【０００５】
従って、本発明の対象は、変性条件下での電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって測定した時に約６７ｋＤの分子量を有し、そしてＲＩＮＧドメインを含んで成るＮ末端部分が除去されたＢＡＲＤ１タンパク質のアミノ酸配列からなる配列を有する、単離されたポリペプチドである。
【０００６】
さらに具体的には、本発明のポリペプチドは、ヒトのＢＡＲＤ１タンパク質（その既知の配列を、添付の配列番号１に示す）のＣ末端の最後から約５０５〜５２５番目のアミノ酸からなるものとして定義できうる。更に具体的には、本発明のポリペプチドは、ヒトのＢＡＲＤ１の５２５〜５２２番目のＣ末端アミノ酸からなる。
【０００７】
本発明のポリペプチドは、例えば、結腸又は乳ガン細胞系統より生じるアポトーシス小体より精製できる。
【０００８】
更に具体的には、本発明のポリペプチドは：
−  例えば細胞ＰＲＯｂ、ＳＷ４８又はＭＣＦ７ような細胞系統に属する細胞をコンフルエント（な状態）に培養し；
−  これらの細胞を５ｍＭの酪酸ナトリウム（ＮａＢ）を含有する培養培地で３７℃、２４時間に渡り処理することによって、アポトーシスを誘導して；
−  単離された組換えＢＡＲＤ１タンパク質を添加し；
−  ＢＡＲＤ１タンパク質の６７ｋＤａ 形態への開裂を観察するのに十分な時間、例えば３７℃で６０分間、に渡りインキュベートする
ことから成る方法により得ることができる。
【０００９】
本発明のポリペプチドは、ＢＡＲＤ１の２５５〜２６５番目のアミノ酸に対応するポリペプチドに対して特異的な抗体によって認識される。
【００１０】
更に、本発明の作者は、ＢＡＲＤ１の加水分解はアポトーシスの早い段階で生じそして細胞周期依存的に生じることを示した。この加水分解は、ＥＧＴＡ及びカルパイン阻害物質Ｉ、Ｎ−アセチル−ｌｅｕ−ｌｅｕ−ノルロイシン（ＡＬＬｎＬ）によって阻害されるが、しかしいくつかのカスパーゼ阻害物質によっては阻害されない。このことは、カルシウム依存性システインプロテアーゼ、カルパインによる加水分解を示唆する。
【００１１】
前記５０５〜５２５番目のアミノ酸の配列に相同的な配列からなる任意のタンパク質も又６７ｋＤポリペプチドの定義に含まれている。本発明の対象は又、この切断されたタンパク質及びその相同体をコードする核酸でもある。
【００１２】
語句「相同アミノ酸配列」は、前記５０５〜５２５番目のアミノ酸の配列に対して７０％、好ましくは８０％、最も好ましくは９０％以上類似する配列を意味している。
【００１３】
用語「類似の」とは比較されるアミノ酸間での完全な類似又は同一性を言及するが、類似性として言及される不完全な類似をも言及する。ポリペプチド配列における類似性の検索は、保存的置換を考慮している。保存的置換は、同じ種類のアミノ酸の置換であり、例えば、荷電していない側鎖を有するアミノ酸（アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、又はチロシン等）の置換、塩基性側鎖を有するアミノ酸（リジン、アルギニン又はヒスチジン等）の置換、酸性側鎖を有するアミノ酸（アスパラギン酸又はグルタミン酸等）の置換、非極性側鎖を有するアミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン又はシステイン等）の置換である。
【００１４】
従って、一層一般的には、語句「相同なアミノ酸配列」は、あるアミノ酸又は少数のアミノ酸の置換、欠失及び／もしくは挿入によって前記配列とは異なる任意のアミノ酸配列、詳細には、これらの変更が上記の生物学的な特性に有意に悪影響しないような位置で、非天然のアミノ酸もしくは擬似のアミノ酸での天然のアミノ酸の置換による、前記配列とは異なる任意のアミノ酸配列を意図する。
【００１５】
相同性は一般的に配列解析ソフトウェア（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ， １７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ５３７０５）を用いることで特定される。類似のアミノ酸配列は、最高程度の相同性（即ち、上に定義した同一性又は類似性）を得られるように並べられる。この目的のため、ギャップを配列中に人工的に入れることが必要であろう。一度至適な位置合わせが行われると、相同性の程度は、位置の合計に対する。比較される２つの配列でアミノ酸が同一である全ての位置を記録することによって確認される。
【００１６】
本発明のポリペプチドは当業者に周知の全ての方法によって合成できる。本発明のポリペプチドは、例えば合成化学の技術、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｅｉｌｄ型の合成によって合成できうる。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ型の合成は、純度、抗原性特性及び不都合な副産物の不在の理由の為に有利であり、そして生産物の利用の為に有利である。
【００１７】
次いで生産されたタンパク質は回収されそして精製できる。
【００１８】
精製の方法は当業者に公知である。獲得した組換えポリペプチドは、細胞溶出物及び抽出物から、そして／又は培養培地の上清から、個別に又は、組み合わせにおいて用いられる方法、例えば分画、クロマトグラフィー手法、特異的な、モノもしくはポリクローナル抗体を用いるイムノアフィニティー技術等によって精製できる。
【００１９】
詳細には、本発明のポリペプチドは、腫瘍細胞から生ずるアポトーシス小体から、ＢＡＲＤ１タンパク質のＣ末端に対して特異的な抗体によるカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーによって、精製される。
【００２０】
切断されたＢＡＲＤ１タンパク質をコードする核酸配列は、発現ベクター中に挿入できる。ここにおいて、それは、その発現を調節する為の成分、例えば詳細には、転写のプロモーター、アクチベーター及び／又はターミネーターと機能的に連結される。
【００２１】
次いで、組換えタンパク質は、上記核酸を含有するベクターが宿主細胞中に移入されて、細胞が対応するポリペプチドを発現する条件下で培養される方法を用いて生産できる。
【００２２】
ヌクレオチド配列の発現を制御するシグナル（プロモーター、アクチベーター、ターミネーション配列等）は、用いられる細胞宿主の一つの関数として選択される。この趣旨で、本発明に係る核酸配列を、選択した宿主内で自律複製するベクター中、又は選択した宿主内で一体化するベクター中に挿入できる。係るベクターは、当業者によって共通に用いられている方法に従い調製されるだろうし、そしてそれらから生ずるクローンを標準的な方法、例えばエレクトロポレーション又はリン酸カルシウム沈澱等によって、適切な宿主中に導入できうる。
【００２３】
本発明の定義されたヌクレオチド配列を含んで成る、上記クローニング及び／又は発現ベクターも本発明の一部である。
【００２４】
本発明は又、これらの発現ベクターにより一時的に又は安定してトランスフェクトされた宿主系細胞にも関する。これらの細胞は、先に定義したベクター中に挿入されたヌクレオチド配列を原核又は真核宿主細胞中に挿入し、そして前記細胞をトランスフェクトされたヌクレオチド配列の複製及び／又は発現を可能にする条件下で培養することによって獲得できる。
【００２５】
本発明に係るトランケーションＢＡＲＤ１タンパク質、又はこのタンパク質をコードする核酸の腫瘍のリプレッサーとしての性質は、腫瘍の治療において利用できる。これは任意の型の腫瘍を含みうるが、より具体的には、乳ガン、卵巣ガン、肺ガン、又は大腸ガンのような消化管のガンに関連しうる。
【００２６】
従って、本発明の対象は、先に定義したポリペプチド、又は前記ポリペプチドをコードする核酸を、医薬的に許容できるビヒクルとの組み合わせにおいて含んで成る医薬組成物でもある。
【００２７】
１以上のポリペプチドを含有する、本発明に係る医薬組成物の投与の方法、投与量及び医薬形態は、当業者により通常用いられる方法によって決定できうる。詳細には、患者に対して適切な治療処置を確立することを一般的に考慮する基準、例えば患者の年齢もしくは体重、彼もしくは彼女の全身症状の症度、治療に対する寛容性、及び顕著な副作用等に従い決定できる。
【００２８】
一般に、治療上又は予防上有効な量（約０．１μｇ〜約１μｇの範囲）がヒトの成人に対して投与できうる。
【００２９】
本発明の対象は、又切断されたＢＡＲＤ１タンパク質をコードする先に定義された核酸、及び医薬的に許容できるビヒクルを含んで成る医薬組成物であり、前記組成物は遺伝子治療において用いることが意図されている。好適には、ベクター、一般的にはウィルスベクター（アデノウィルス及びレトロウィルス等）中に挿入される核酸は、標的細胞への転移を促す任意のビヒクル例えば、陰イオンリポソーム、陽イオン脂質、微粒子、例えば金微粒子、沈澱剤、例えばリン酸カルシウム又は任意の他のトランスフェクションを促す物質を有さず、ネイキッド形態（Ｎａｋｅｄ  ｆｏｒｍ）において投与できる。この場合、ポリヌクレオチドは、ビヒクルの存在もしくは不在において、滅菌溶液もしくは無菌緩衝溶液のような生理学的に許容できる溶液中で簡単に希釈できる。
【００３０】
代わりに、本発明の核酸はトランスフェクションを促す物質と組み合わせることができうる。それは、とりわけ、（ｉ）細胞の透過性を改変する化学剤、例えばブピバカイン（ｂｕｐｉｖａｃａｉｎｅ）と組み合わされて良く；（ｉｉ）任意的にトランスフェクションを促す更なる物質の存在において、リポソーム中に包括されて良く；又は （ｉｉｉ）陽イオン脂質もしくはシリカ、金、もしくはタングステンの微粒子と組み合わされて良い。
【００３１】
本発明の核酸構築体で微粒子を被覆した場合に、これらの微粒子は、「遺伝子銃」の技術（ＷＯ９４／２４２６３）により皮内又は表皮内に注射できる。
【００３２】
医薬製品として用いられる量は、特に核酸構築体自身、この核酸が投与される個体、製剤の投与の方法及び製剤の型、並びに病状に依存する。一般に、約０．１μｇ〜約１ｍｇ、好適には約１μｇ〜約８００μｇ、そして好ましくは、約２５μｇ〜約２５０μｇの範囲の治療上又は予防上有効な量をヒトの成人に対して投与できる。
【００３３】
本発明の核酸構築体は、任意の投与の常用の経路、例えば詳細には、非経口で投与できる。投与の経路の選択は、特に選択した製剤に依存する。標的とされた腫瘍の部位を標的とする投与が特に有利でありうる。
【００３４】
従って最後に、本発明の対象は、遺伝子治療の背景において、先に定義した有効な量の切断されたＢＡＲＤ１タンパク質又はこのタンパク質をコードする核酸が、係る治療を要求する患者に対して投与される治療処置の方法である。
【００３５】
対象となる患者は一般的にヒトである。しかし適用は適切な任意の動物に拡大されても良い。
【００３６】
アポトーシスの過程で現れる、ＢＡＲＤ１の切断された形態の出現は更に、プロアポトーシス薬剤（ｐｒｏａｐｏｐｔｏｐｉｃ  ｄｒｕｇ）で治療した患者における抗ガン治療の効果を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて追跡することを可能にする。この為に、例えば腫瘍組織試料のような生物試料中の、本発明の６７ｋＤのポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出の方法を用いることが可能である。
【００３７】
変法に従い、患者由来の血液又は尿のような生物試料において、免疫原性の６７ｋＤのポリペプチドに対して生産される抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出の方法を用いることができる。
【００３８】
これらの方法は、例えば抗−ＢＡＲＤ１もしくは抗切断されたＢＡＲＤ１抗体を用いることにより、それが６７ｋＤのポリペプチドの検出に関わる時には又は前記ポリペプチドもしくはそのエピトープ断片を用いることで、それが前記抗体の検出に関わる時に、通常の免疫検出の技術、例えばウェスタンブロッティング、又は免疫組織化学を、最大限に利用できる。
【００３９】
一層一般的には、本発明は又生物試料における切断されたＢＡＲＤ１ポリペプチド又は抗切断されたＢＡＲＤ１抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出の方法に向けられる。この方法において前記生物試料をそれぞれ、抗切断されたＢＡＲＤ１抗体もしくは切断されたＢＡＲＤ１タンパク質もしくはエピトープ断片と接触せしめ、そして免疫複合体の形成を観察し、生物試料中での切断されたＢＡＲＤ１タンパク質もしくは抗切断されたＢＡＲＤ１抗体の存在がそれぞれ明らかにする。
【００４０】
切断されたＢＡＲＤ１タンパク質に対して特に特異的である抗体は又本発明の一部である。
【００４１】
それらは、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体又はその断片、キメラ抗体、特に、ヒト化抗体もしくは免疫結合（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）抗体、又は抗体で標識した他のものであって良い。
【００４２】
ポリクローナル抗体は、通常の手順に従い、ポリペプチドに対する免疫性を与えた動物の血清から獲得できる。
【００４３】
本発明の実施態様によれば、反応残基を介してタンパク質又は他のペプチドに連結できるＢＡＲＤ１タンパク質の適切なペプチド断片を、抗原として利用できる。Ｂｅｎｏｉｔら（１９８２）により記載された手順に従いウサギに１ｍｇ当量のペプチド抗原で免疫する。４週の間隔で、動物を２００μｇの抗原の注射で処理し、そして１０〜１４日後採血した。第３の注射後、抗原ペプチドに対する結合の能力を特定する為に、クロラミン−Ｔ法によって調製したヨウ素で放射性同位体標識して抗血清を試験する。次いで、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）イオン交換カラム上で精製する。次いで抗体分子をホ乳動物から回収し、そして当業者に周知の方法、例えばＩｇＧ画分を得るＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘを用いることによって、所望の濃度に単離した。
【００４４】
ポリクローナル血清の特異性を向上する為に、抗体は、固相において免疫化ポリペプチドを用いてイムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製できる。固相において免疫複合体を形成する為に、免疫化ポリペプチドと抗体分子が免疫反応をする十分な時間に渡り固相において抗体を当該ポリペプチドとの接触せしめる。
【００４５】
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎにより記載されたハイブリドーマ培養の汎用の方法（１９７５）に従い獲得できる。
【００４６】
以下の例及び図は本発明の範囲を限定することなくそれを説明する。
【００４７】
実施例
実施例１：
ＢＡＲＤ１タンパク質の開裂の産物としての６７ｋＤのタンパク質の同定
材料と方法：
細胞株
用いたＲＥＧｂ結腸ガン細胞及びＰＲＯｂラット結腸腺ガン細胞はジメチルヒドラジンで誘導した細胞系統（Ｃａｉｇｎａｒｄら、１９８５）に由来する。１３７６２ラット乳ガン、ＳＷ４８ヒト大腸ガン及びＭＣＦ７腺ガンをＥＣＡＣＣより獲得した。細胞を単層培養、３７℃、１０％のウシ胎仔血清及び２ｍＭのグルタミンを含むＲＭＰＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）により培養した。細胞を０．０２５％のトリプシン及び０．０２％のＥＤＴＡで継代培養した。
【００４８】
ラットＢＡＲＤ１  ｃＤＮＡのイムノスクリーニング及びクローニング
ＰＲＯｂラットガン細胞系統のｃＤＮＡライブラリーをλＴｒｉｐｌＥｘ発現ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中に構築した。アポトーシス抗体及びＩＬ−２でワクチン処理したラット由来の血清（Ｂｏｉｓｔｅａｕら、１９９７）で１００万個のプラークをスクリーニングした。音波処理した大腸菌を、ＰＢＳ＋５％の脱水スキムミルク中で１／１０に希釈した血清を大気温度で４時間に渡りインキュベートし、次いで１３，０００ｇで１０分に渡り遠心することによって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する抗体をラットの抗血清から取り出した。４５６塩基対の挿入断片（断片Ｆ１）を配列決定しそしてその配列をＮＣＢ１遺伝子バンクによる解析に掛けた。それはヒトＢＡＲＤ１タンパク質と高い相同性を示した。完全なラットＢＡＲＤ１  ｃＤＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈより入手したＰＣＲ  ＳＭＡＲＴキットで構築したＰＲＯｂ  ｃＤＮＡライブラリーを用いてクローン化した。ＲＡＣＥ  ＰＣＲの為の内部プライマーを、製品説明書に従ってクローン化した挿入断片に基づいて選択した。
【００４９】
ヒトＢＡＲＤ１  ｃＤＮＡのクローニング
３つのヒトＢＡＲＤ１  ｃＤＮＡ断片を、ＳＷ４８ヒト大腸ガン細胞系統から抽出したトータルＲＮＡから増幅した。Ａ，Ｂ及びＣと命名した断片を以下のプライマーを用いて得た。断片Ａ、センスプライマー  Ｒ１３５Ｓ／アンチセンスプライマー  Ｂ２０２Ｎ（Ｔｈａｉら、１９９８）；断片Ｂ、センスプライマー  Ｂ２０２Ａ（Ｔｈａｉら、１９９８）、アンチセンスプライマー：
【化１】
2004518410.tif 000002
断片Ｃ、センスプライマー：
【化２】
2004518410.tif 000003
アンチセンスプライマー
【化３】
2004518410.tif 000004
であった。各断片をｐＧＥＭプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にクローン化した。次いでＮｏｔ１−Ｐｓｔ１／Ｐｓｔ１−ＨｉｎｄＩＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｔＸＩを用いてそれぞれ切り出し精製した。そしてその後のｐＧＥＭのＮｏｔ１／ＢｓｔＸＩ部位へライゲーションした。
【００５０】
アポトーシスの誘導及びアポトーシス小体の精製
アポトーシスを酪酸ナトリウム（ＮａＢ）で処理することによって誘導した。様々な段階にあるコンフルエントな細胞を、３７℃で様々な時間に渡り５ｍＭのＮａＢ（Ｓｉｇｍａ）と共に完全培地において処理した。アポトーシス小体を既に記載された（Ｇａｕｔｉｅｒら、１９９９）ように精製した。
【００５１】
ラットＢＡＲＤ１のＦ１断片の生産及び精製
ラットＢＡＲＤ１のＦ１断片をプラスミドλＴｒｉｐｌｅｘのｃＤＮＡライブラリーから切り出して、インフレームでプラスミドｐＱＥ３２（Ｑｉａｇｅｎ）のＰｓｔ１部位に挿入した。ＢＡＲＤ１のＦ１断片のＮ−末端に位置した６×Ｈｉｘ標識を含有する生じる融合タンパクを、大腸菌中で発現させた。その後ＱＩＡ発現キット（Ｑｉａｇｅｎ）に関する製造者の推薦を用いてＮｉ−ＮＴＡ樹脂上でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【００５２】
マウスへの免疫化及びモノクローナル抗体の生産
Ｂａｌｂ−ｃマウス（Ｉｆｆａ−ｃｒｅｄｏ）に、０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む０．１ｍｌの無菌ＰＢＳ緩衝液中で乳化させた０．１ｍｌの不完全Ｆｒｅｕｎｄのアジュバント（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中の１００μｇのラットＢＡＲＤ１のＦ１断片１００μｇを３週おきに皮下注射した。マウスの脾臓細胞を、ポリエチレングリコール１５００（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の存在下でＳＰ２０マウスミエローマ（ＥＣＡＣＣ）と融合させた。２０％のウシ胎仔血、ヒポキサンチン−アミノプロテインチミジン及び１．５ｎｇ／ｍｌの組換えＩＬ６（ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍ）で補足した完全培地中９６ウェルプレート上にハイブリドーマを置いた。精製ＢＡＲＤ１断片を抗原として用いてハイブリドーマ上清をＥＬＩＳＡによって試験した。
【００５３】
免疫沈降
アポトーシス小体を、ＥＤＴＡを含まずプロテアーゼ阻害物質のカクテルで補ったＰＢＳ中の２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により氷上で３０分に渡り抽出した。抽出物を１５分に渡り１３，０００ｇで遠心し、そして上清を１／１０００に希釈したヒトＢＡＲＤ１タンパク質に特異的なウサギのポリクローナル抗体（６６９Ｄ）（Ｗｕら、１９９６及び Ｊｉｎら、１９９７）と共にインキュベートした。一定の撹拌を伴う４時間に渡るインキュベーションの後、５０μｌの抗ウサギＩｇＧアガロースを添加することによって免疫複合体を免疫沈降させた。アガロースに結合した免疫複合体を、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びプロテアーゼ阻害物質を含有するＰＢＳで洗浄し、そしてアガロースビーズから、電気泳動及び以下に記載の免疫ブロッティングの為の還元バッファー中で加熱することにより抽出した。
【００５４】
ウェスタンブロッティング
電気泳動を変性条件下（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）（Ｌａｅｍｍｌｉら、１９７０）で行った。タンパク質を０．４５μｍのＰＶＤＦフィルター（ミリポア）上に移しそして一次抗体と接触させた。１／１５０００に希釈したホースラディシュペルオキシダーゼと結合した二次抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いた。Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、免疫複合体を化学発光により視覚化した。
【００５５】
カップリングしたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳及びｉｎ  ｖｉｔｒｏによるタンパク質の開裂の特定
３５Ｓ−メチオニンで標識したヒトＢＡＲＤ１タンパク質を、ＴＮＴ結合網状赤血球溶出系キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写及び翻訳した。４μｌの３５Ｓ−メチオニンを含有する転写及び翻訳の為の反応培地（ＭＥＮ）中で１μｇのプラスミドを用いた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ開裂の為に、ＤＩＶバッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２ 、０．１％のＳＢ１４、０．５ｍＭのＰＭＳＦ）中で３７℃で指示した時間に渡り、２μｌの転写／翻訳産物をアポトーシス又は非アポトーシス細胞抽出物と共にインキュベートした。次いで加水分解産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてホスホリメジャー４４５ＳＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｒｉｃｓ）を用いて明らかにした。開裂の阻害をカスパーゼ阻害物質もしくはプロテアソーム阻害物質（ラクタシスチン）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）もしくはカルパイン阻害物質（ＡＬＬｎＬ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を添加することにより評価した。
【００５６】
細胞周期の同期化
１７５ｃｍ２ のフラスコにおける接触阻止によってＳＷ４８細胞をＧ０ において捕えた。３日に渡りコンフルエントな状態にした後、７５ｃｍ２ のフラスコにおいて３×１０６ 細胞／フラスコの濃度で細胞を１：１０に分けた。播種の１２，２０，２８，３６及び４４時間後、細胞を５ｍＭのＮａＢで２４時間に渡り処理しそして回収した。各時、細胞周期の分布を特定する為に、各フラスコの含有物をトリプシンで処理し、氷冷したＰＢＳで３回洗浄し、そして１ｍｌの氷冷７０％エタノールを滴下して−２０℃で１６時間に渡り固定化した。固定化した細胞はペレット化していた。５００μｌのＰＣ緩衝液（９６％の０．２Ｍ  Ｎａ２ ＨＰＯ４ 、４％の０．１Ｍクエン酸、ｐＨ７．８）中で再懸濁し、そして、３０分に渡り室温に放置し、次いでそれらを染色溶液（ＰＢＳ、０．１２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１２ｍＭＭＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＡ）において５００μｌのヨウ化プロピジウム中で再懸濁し、３７℃で３０分に渡りインキュベートしそしてＦＡＣＳｃａｎ（フローサイトメーター）（Ｂａｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｓｏｎ）により解析した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのタンパク質の開裂を特定する為に、細胞をこすりとり、そして細胞抽出物を従前に記載されたように調製した。
【００５７】
結果
６７ｋＤのタンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニング
ガンの治療のためにアポトーシス小体／ＩＬ２で処理したマウス由来の血清によるλＴｒｉｐｌＥｘ  ｃＤＮＡライブラリーのイムノスクリーニングにより、ラットＢＡＲＤ１遺伝子の４５６対のポジィティブ挿入物（Ｆ１断片）の同定がもたらされた。この断片は、アミノ酸４６０〜６１１番目に及ぶ（図１）。以下の表１にラット、ヒト及びマウスＢＡＲＤ１タンパク質間の相同性の百分率を与える。
【表１】
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【００５８】
６７ｋＤタンパク質はＢＡＲＤ１の断片である
ＢＡＲＤ１の断片と６７ｋＤタンパク質との同一性を証明できるようにする為に、本発明者は、腫瘍細胞及びアポトーシス小体におけるその発現を特定した。この目的の為に、Ｆ１断片に対するモノクローナル抗体（クローン６Ｄ１０）を生産した。ＰＲＯｂ及びＲＥＧｂラットガン細胞上で試験した時には、モノクローナル抗体６Ｄ１０は、９７ｋＤのタンパク質を認識したのみならず酪酸ナトリウムで処理した後に当該細胞から生じたアポトーシス小体中の約６７ｋＤのバンドも記録した（図２Ａ）。この結果は、ヒトＢＡＲＤ１タンパク質に対するポリクローナル抗体６６９Ｄ（Ｗｕら、１９９６及び Ｊｉｎら、１９９７）を用いることで裏づけられた。ＳＶ４８ヒト結腸細胞もしくはＭＣＦ７ホ乳動物腺細胞の酪酸ナトリウムでの処理は、ポリクローナル抗体６６９Ｄを用いての免疫沈降後に類似の結果をもたらす（図２Ｂ）。最後に、ラット、ヒトガンから生じたアポトーシス小体由来のＢＡＲＤ１のポリクローナル抗体６６９Ｄによる免疫沈降、それに続く処理したラット血清を用いての免疫ブロットで、６７ｋＤタンパク質の検出が可能になった（図２Ｄ）。この一連の結果は、ＢＡＲＤ１の断片と６７ｋＤタンパク質との同一性を証明した。
【００５９】
ＢＡＲＤ１はアポトーシスの間に開裂する
ヒトＭＣＦ７ガンもしくはラットＰＲＯｂガン由来のアポトーシス小体を、同じ膜上で、抗ヒトＢＡＲＤ１ポリクローナル抗体６６９ＤもしくはマウスＢＡＲＤ１タンパク質のＮ−末端の部分（アミノ酸１０１−１１４）に対する抗体ＷＦＳ逐次とインキュベートした場合（Ｉｒｍｉｎｇｅｒ−Ｆｉｎｇｅｒ  １９８８）、本発明者が観察したところによると、抗体ＷＦＳは６７ｋＤ分子を認識しなかったが、一方で抗体６６９Ｄは６７ｋＤ分子を各型のアポトーシス小体を認識した（図２Ｃ）。これは、ＢＡＲＤ１の開裂部位が、Ｎ−末端部分中であるが、ＢＡＲＤ１及びＢＲＣＡ１タンパク質の相互作用に欠かせないＲＩＮＧドメイン（アミノ酸４０−８４、図１）の下流にある、ことを強く示唆する（Ｗｕら、１９９６）。
【００６０】
アポトーシスの間のＢＡＲＤ１の開裂は細胞周期依存性である。
本発明者は、接着ＳＷ４８細胞又は上清から回収したアポトーシス小体におけるＢＡＲＤ１の開裂に対する処理の効果を検証した。図３Ａは、接着細胞溶解物が、放射性標識したヒトＢＡＲＤタンパク質を４時間のインキュベーションの後に完全に開裂することを示している。その理由は、全長ヒトＢＡＲＤ１タンパク質が完全に消えそして６７ｋＤタンパク質が現われたからだ。しかし、アポトーシス小体の溶解物とのインキュベートはｈＢＡＲＤ１の加水分解に対する影響を持たない。これらの結果は、ＢＡＲＤ１の開裂に関連するタンパク質分解活性が、アポトーシス小体の形成及び細胞の分離をもたらすアポトーシスの最後の段階の前に介在することを示している。５ｍＭのＮａＢで４８時間に渡り処理したＳＷ４８接着細胞の溶出物によるｈＢＡＲＤ１の加水分解をもたらす反応速度の解析では、開裂が１時間後に完了していることが示された（図３Ｂ）。ＮａＢによるこの開裂の反応速度誘導の更なる解析では、ＮａＢでの細胞の処理の４時間後にｐ６７タンパク質が現れ、そしてその開裂は実質上１２時間後に完了したことが示された。注目すべきことに、ｈＢＡＲＤ１の加水分解は、細胞周期依存的に調節されており、そしてＧ０ ／Ｇ１ 期の間に優性にある。これは、８０％の細胞がＧ０ ／Ｇ１ 期にあり且つ５％のみがＧ２ ／Ｍ期にある細胞分裂の３２時間後の段階での、ＮａＢの添加によってｈＢＡＲＤ１がｐ６７に完全に転換することによって証明された。
【００６１】
実施例２：
カルパインによる開裂
材料と方法
カスパーゼ活性の決定
カスパーゼ活性をアッセイする為に、１０μｇの細胞抽出物を５μｌのＤＩＶ緩衝液中で希釈した。それぞれカスパーゼ３，６及び８に対する基質のアセチル−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−７−アミノ−４−メチルクマリン（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ）、アセチル−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−７−アミノ−４−メチルクマリン（Ａｃ−ＶＥＩＤ−ＡＭＣ）及びアセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−７−アミノ−４−メチルクマリン（Ａｃ−ＩＥＴＤ−ＡＭＣ）（Ｂａｃｈｅｍ）を最終濃度５０μＭで添加した。開裂活性をＦｌｕｏｒｏｌｉｔｅ  １０００（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により調節した。
【００６２】
細胞画分
細胞を７５ｃｍ２ のフラスコ中で培養し、トリプシンで処理して、１００μｌのＣＥＢ緩衝溶液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、５０ｍＭのＭｇＣｌ２ 、１ｍＭのＤＴＴ、１０μＭのサイトカラシンＢ）中に再懸濁した。再懸濁した細胞を氷上に３０分に渡放置し、そして５０ストロークのＤｏｕｎｃｅホモジナイザーでホモジナイズし、そして氷中で冷却した。８００ｇ、４℃で１０分に渡る遠心で核の画分を得た。ペレットをＣＥＢ緩衝液中で再懸濁して−８０℃で保存した。ミトコンドリア及びポストミトコンドリア画分を１３，０００ｇ、４℃で１０分に渡る遠心後に得た。ＣＥＢ中で再懸濁したミトコンドリアペレット及びポストミトコンドリア画分を等量の画分に分けて−８０℃で保存した。
【００６３】
結果
ｈＢＡＲＤ１の開裂を担うタンパク質分解活性を明らかにする為に、ＮａＢで処理したＳＷ４８細胞由来の細胞抽出物の様々な調製物を試験した。見掛け上、核調製物及びミトコンドリア調製物の両方はｈＢＡＲＤ１を開裂できた。オルガネラ調製物の１３，０００ｇでの上清は作用を持たなかった。
【００６４】
アポトーシス過程のエフェクターであるプロテアーゼのカスケードは、カスパーゼ又はカルパインのようなシステインプロテアーゼを含んで成る。次いで本発明者は、特異的な基質を用いて、ＮａＢでＳＷ４８細胞を処理する間のカスパーゼ活性を特定し、そしてカスパーゼ３，６及び８の活性は徐々に増加し、カスパーゼ３は、ＮａＢ処理の６時間及び１２時間後に最大の活性であることを発見した。カスパーゼに対するペプチド阻害物質の利用では、カスパーゼ阻害物質のベンジルオキシカルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−フルオロメチルケトン（Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ）は、高濃度（１００μＭ）でわずかにｈＢＡＲＤ１の加水分解を阻害したことが分かった。他方、カスパーゼ３に対する阻害物質ベンジルオキシカルボニル−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−フルオロメチルケトン（Ｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋ）又はカスパーゼ６に対する阻害物質ベンジルオキシカルボニル−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−フルオロメチルケトン（Ｚ−ＶＥＩＤ−ｆｍｋ）は、作用を有さなかった。この現象は、精製カスパーゼ３がｈＢＡＲＤ１の加水分解に対する効果を有さないという事実によって裏づけられた。これらの結果はｈＢＡＲＤ１がカスパーゼの為の直接的基質ではないことを明らかに示した。加えて、プロテアソーム阻害物質のラクタシスチン（ｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎｅ）は、１００μｍの濃度でさえも、ｈＢＡＲＤ１のタンパク質分解を遮断しない。このことによりプロテアソームがこの機構に関連している可能性が除かれる。
【００６５】
アポトーシスの間に分解したある数のタンパク質は、カルパインの標的である。カルパインの活性化の為のありうる機構は、ｉｎ  ｖｉｖｏカルパイン阻害物質、カルパスタチン（ｃａｌｐａｓｔａｔｉｎ）の開裂を含む（ＤｅＭａｒｔｉｎｏ ら、１９８４）。本発明者の結果は、第１にカルパスタチンがＳＷ４８細胞中でＮａＢでの処理の１２時間後に完全に開裂し、そして第２には、カルパイン阻害物質Ｉ、ＡＬＬｎＬ、及びＥＧＴＡは投与量依存的にｈＢＡＲＤ１の加水分解を強力に阻害したことを示す。一連のこの結果ではＢＡＲＤ１タンパク質がカルパインによって加水分解されることが強く示唆される。
【００６６】
実施例３：
開裂したＢＡＲＤ１タンパク質の精製
翻訳されたタンパク質に対して特異的な抗体の生産
切断されたタンパク質のＮ及びＣ末端に位置しているペプチド配列に対して向けられたポリ及びモノクローナル抗体は、：
−  ヒトＢＡＲＤ１タンパク質のアミノ酸２５５−２６５に対応するペプチド１に対して
−  ヒトＢＡＲＤ１タンパク質のアミノ酸５２７−５４０に対応するペプチド２に対して
生産されている。
【００６７】
ペプチドをＫＬＨと連結させた。各々のウサギには各々、２００μｇのペプチドを３回の注射により、１５日おきに与えた。４回目の注射を最後の注射の３週間後に与えた。遊離ペプチドを抗原として用いることで、ＥＬＩＳＡ技術によってウサギの血清上で抗体の生産を試験した。
【００６８】
得られた血清の力価は高かった（１／１６０００）。加えて、２つの血清のペプチド間で交差反応性は観察されなかった。
【００６９】
開裂したＢＡＲＤ１タンパク質の精製
これらの抗体は、本発明者が切断されたタンパク質を、アフィニティークロマトグラフィーによって、アポトーシス小体もしくは腫瘍細胞から又は上記のように生産された全ＢＡＲＤ１タンパク質及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで開裂した（ＢＡＲＤ１タンパク質）から精製することを可能にする。
【００７０】
精製はアフィニティークロマトグラフィーの標準的な技術を用いて行われる。精製した画分は、生産された抗体を用いてのウェスタンブロッティングにより同定される。
【００７１】
実施例４：
切断されたＢＡＲＤ１タンパク質によるラットのワクチン処理
材料と方法
２つの群のＢＤＩＸラットに、ＢＡＲＤ１のＦ１断片（アミノ酸４６０−６１１）又はＦ１断片と同じ条件下で精製したコントロールのタンパク質（フコシルトランスフェラーゼ）１００μｇの足底内注射を行った。タンパク質を１００μｌの完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント中で乳化にした。最後の免疫化の２週間後、ラットの大腸腫瘍細胞（ＲＤＯｂ、５０×１０３ ／ラット）を皮下に注射し、そしてＰＲＯｂ腫瘍の体積を見積った。
【００７２】
結果
腫瘍増殖低下が観察され、従って、６７ｋＤ形態に由来するＢＡＲＤ１断片でのワクチン処理による保護作用が示される（図４）（各点は、標準偏差により６匹のラットで測定した腫瘍の平均の体積を示している）。
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
ヒト、ラット及びマウスＢＡＲＤ１タンパク質のアミノ酸配列を示している。ＲＩＮＧモチーフ、３つのアンキリン（ａｎｋｙｒｉｎ）反復及びタンデムな２つのＢＲＣＴドメインに印をつけている。ＢＡＲＤ１ヒトタンパク質の保存されたＱ５６４Ｈ変異も示してある。アミノ酸配列の最高程度の同一性を達成するようにギャップを導入することによって配列が並べられている。次いで、各間隔を一つの非類似性として考慮することによってアミノ酸の同一性の値を計算している（表１）。ＢＡＲＤ１  ｃＤＮＡ配列は、受入番号ＡＦ１８２９４６、マウスはＡＦ０５７１５７及びヒトはＧｅｎｂａｎｋ番号Ｕ７６６３８の下ＥＭＢＬ上で入手可能である。
【図２Ａ】
ラット抗ＢＡＲＤ１モノクローナル抗体６Ｄ１０により明らかになったラット及びヒトガン細胞のタンパク質及びそれらのアポトーシス小体のウェスタンブロッティング解析である。
【図２Ｂ】
抗ヒトポリクローナル抗体６６９Ｄを用いて明らかにした同じ型の解析である。ａ，ｂはアポトーシス小体を意図することに注目するべきだ。
【図２Ｃ】
最初に抗マウスＢＡＲＤ１ポリクローナル抗体ＷＦＳを用いて行ったアポトーシス小体のウェスタンブロッティング解析である。免疫複合体をケミコンキット（ｃｈｅｍｉｃｏｎｋｉｔ）を用いて解離させ、そして更にフィルターを抗ヒトＢＡＲＤ１抗体６６９Ｄに掛けた。
【図２Ｄ】
抗ヒトＢＡＲＤ１抗体６６９Ｄにより明らかになったあるガン細胞由来のアポトーシス小体の溶出物の免疫沈降である。沈澱物を電気泳動に掛けそしてその後１／２５０に希釈したＰＲＯｂアポトーシス小体で免疫化したラット由来の血清で免疫ブロッティングを行った。
【図３Ａ】
コンフルエントな状態において２４時間に渡り５ｍＭのホウ酸ナトリウムで処理したＳＷ４８細胞溶出物によるヒトＢＡＲＤ１タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ加水分解の産物の解析である。上清（１）又は接着細胞（２）から回収したアポトーシス小体をＤＩＶ緩衝液中で可溶化し、そして３５Ｓ−メチオニンで標識したヒトＢＡＲＤ１タンパク質に添加した。３７℃で４時間に渡るインキュベートの後、加水分解産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてホスホリメジャーを用いてオートラジオグラフィーに掛けた。
【図３Ｂ】
同じ型の解析である。接着細胞をＤＩＶ緩衝液中で可溶化し、そして３５Ｓ−メチオニンで標識したヒトＢＡＲＤ１タンパク質とそれぞれ０〜３時間（Ｔ０〜Ｔ３）に渡りインキュベートした。
【図４】
ＢＡＲＤ１タンパク質のＦ１断片又はコントロールタンパク質（フコシルトランスフェラーゼ）でワクチン処理した後のＢＤＩＸラットにおけるＰＲＯｂ腫瘍増殖を示すグラフである。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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