(57)【要約】本発明はエンドトキシン血症および関連する障害を予防および治療する方法に関する。特に本発明はエンドトキシン血症および関連する障害を、プロバイオティックを用いて予防および治療する方法に関する。本発明はまたエンドトキシン血症および関連する障害の予防および治療における、プロバイオティックの有効性を評価する方法にも関するものである。
2004501978.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドトキシン血症の治療を必要とする哺乳類に有効量のプロバイオティックを投与することを含む、同疾患の予防法および／または治療法。
【請求項２】
哺乳類が肝障害である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
肝障害が肝炎である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
肝障害がアルコール誘発性肝疾患である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
哺乳類が炎症性腸疾患である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
治療有効量のプロバイオティックを、それを必要とする哺乳類に投与することを含むアルコール誘発性肝障害の治療法。
【請求項７】
治療有効量のプロバイオティックを、それを必要とする哺乳類に投与することを含む炎症性腸疾患の治療法。
【請求項８】
哺乳類がヒトである請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
プロバイオティックが乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）である請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
乳酸桿菌がアシドフィルス菌（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
アシドフィルス菌がＶＲＩ−００１株である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
乳酸桿菌がファーメンタム乳酸菌（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）である請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ファーメンタム乳酸菌がＶＲＩ−００２株である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
プロバイオティックを経口、座薬、または管を通しての経胃ルートにより投与する請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
プロバイオティックが錠剤またはカプセルの形である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
錠剤またはカプセルが１０８から１０１２ｃｆｕのプロバイオティックを含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
プロバイオティックが食品組成物の形である請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
食品が乳製品または大豆製品である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
哺乳類のエンドトキシン血症の予防および／または治療用薬剤の製造のためのプロバイオティックの使用。
【請求項２０】
アルコール誘発性肝障害の予防および／または治療用薬剤の製造におけるプロバイオティックの使用。
【請求項２１】
炎症性腸疾患の予防および／または治療用薬剤の製造におけるプロバイオティックの使用。
【請求項２２】
哺乳類がヒトである請求項１９から２１のいずれか１項に記載の使用法。
【請求項２３】
プロバイオティックが乳酸桿菌である請求項１９から２２のいずれか１項に記載の使用法。
【請求項２４】
乳酸桿菌がアシドフィルス菌である請求項２３に記載の使用法。
【請求項２５】
アシドフィルス菌がＶＲＩ−００１株である請求項２４に記載の使用法。
【請求項２６】
乳酸桿菌がファーメンタム乳酸菌である請求項２３に記載の使用法。
【請求項２７】
ファーメンタム乳酸菌がＶＲＩ−００２株である請求項２６に記載の使用法。
【請求項２８】
プロバイオティックが経口または直腸から、または管を通しての経胃ルートにより投与するためのものである請求項１９から２７のいずれか１項に記載の使用法。
【請求項２９】
プロバイオティックが錠剤またはカプセルの形である請求項２８に記載の使用法。
【請求項３０】
錠剤またはカプセルが１０８から１０１２ｃｆｕのプロバイオティックを含む請求項２９に記載の使用法。
【請求項３１】
プロバイオティックが食品組成物の形である請求項２８に記載の使用法。
【請求項３２】
食品が乳製品または大豆製品である請求項３１に記載の使用法。
【請求項３３】
以下のステップ：
（ａ）哺乳類へのエンドトキシンおよび／またはエンドトキシン誘発物質の投与、および／または哺乳類にエンドトキシン誘発性損傷を与えること；
（ｂ）哺乳類へのプロバイオティックの投与；および
（ｃ）エンドトキシン血症におけるプロバイオティックの効果の決定
を含む、哺乳類のエンドトキシン血症の予防および／または治療におけるプロバイオティックの効果を評価する方法。
【請求項３４】
以下のステップ：
（ａ）哺乳類へのアルコールの投与；
（ｂ）哺乳類へのプロバイオティックの投与；および
（ｃ）動物の肝臓の症状におけるプロバイオティックの効果の決定
を含む、哺乳類のアルコール誘発性肝障害の予防および／または治療におけるプロバイオティックの効果を評価する方法。
【請求項３５】
以下のステップ：
（ａ）腸の炎症の原因となる物質の投与；
（ｂ）哺乳類へのプロバイオティックの投与；および
（ｃ）腸の症状におけるプロバイオティックの効果の決定
を含む、哺乳類の炎症性腸障害の予防および／または治療におけるプロバイオティックの効果を評価する方法。
【請求項３６】
ステップ（ａ）および（ｂ）を同時に行う、請求項３３から３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
ステップ（ａ）および（ｂ）を連続して行う請求項３３から３６のいずれか１項に記載の方法であって、ステップ（ａ）をステップ（ｂ）の前または後に行うことのできる前記方法。
【請求項３８】
哺乳類がヒトである請求項３３から３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
哺乳類がげっ歯目である請求項３３から３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
適切な期間にわたって濃度を漸増しながら哺乳類にアルコールを投与する、請求項３３から３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
飲用水中に５％から４０％の範囲のアルコール量を含む請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
約２ヶ月間にわたって哺乳類にアルコールを投与する請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
アルコールを哺乳類の結腸に送達する、請求項３３から３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
アルコールが４５％の濃度である請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
プロバイオティックが乳酸桿菌である請求項３３から４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
乳酸桿菌がアシドフィルス菌である請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
アシドフィルス菌がＶＲＩ−００１株である請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
プロバイオティックがファーメンタム乳酸菌である請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
ファーメンタム乳酸菌がＶＲＩ−００２株である請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
プロバイオティックを経口、座薬、または管を通しての経胃ルートにより投与する請求項３３から４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
プロバイオティックが錠剤またはカプセルの形である請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
錠剤またはカプセルが１０８から１０１２ｃｆｕのプロバイオティックを含む請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
プロバイオティックが食品組成物の形である請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
食品が乳製品または大豆製品である請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
５ｘ１０１０ｃｆｕ量のプロバイオティックを１日おきに投与する請求項３９に記載の方法。
【請求項５６】
プロバイオティックがリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に存在する請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
プロバイオティックを経胃栄養により投与する請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
エンドトキシン血症におけるプロバイオティックの効果を、血中エンドトキシンレベルの直接的および／または間接的指標であるパラメータの測定により決定する、請求項３３から５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
エンドトキシン血症におけるプロバイオティックの効果を、エンドトキシンレベルの測定により決定する請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
肝臓の症状におけるプロバイオティックの効果を、肝臓への障害の直接的および／または間接的指標であるパラメータの測定により決定する、請求項３４に記載の方法。
【請求項６１】
障害のレベルを示すパラメータの測定が、血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルの測定であって、ＡＬＴの低下がエンドトキシン血症におけるプロバイオティックの正の効果を示す、請求項６１に記載の方法。
【請求項６２】
肝臓の症状におけるプロバイオティックの効果を、血中エンドトキシンレベルの直接的および／または間接的指標であるパラメータの測定により決定する、請求項３４に記載の方法。
【請求項６３】
肝臓の症状におけるプロバイオティックの効果を、エンドトキシンレベルの直接測定により決定する請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
エンドトキシンレベルをリムルス（ＬＡＬ）試験により決定する請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
アルコールを哺乳類の直腸内に投与する請求項３５に記載の方法。
【請求項６６】
プロバイオティックの投与により腸内グラム陰性菌の成長を阻害することを含む、哺乳類の血中エンドトキシンレベルを調節する方法。
【請求項６７】
プロバイオティックが乳酸桿菌である請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
アシドフィルス菌がＶＲＩ−００１株である請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
プロバイオティックがファーメンタム乳酸菌である請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
ファーメンタム乳酸菌がＶＲＩ−００２株である請求項６９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明はエンドトキシン血症および関連する障害を予防および治療する方法に関する。特に本発明はエンドトキシン血症および関連する障害を、プロバイオティック（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）を用いて予防および治療する方法に関する。本発明はまたエンドトキシン血症および関連する障害の予防および治療における、プロバイオティックの有効性を評価する方法にも関するものである。
【０００２】
背景
本明細書において先行技術のいかなる考察もすでに認められたものとして、同先行技術が広く知られているあるいは当該技術分野の共通の一般知識の一部となっていると決して考えるべきではない。
【０００３】
エンドトキシンは、グラム陰性菌の細胞壁に見出される高分子（ＭＷ　２００，０００から１，０００，０００）、耐熱性のリポ多糖である。グラム陰性菌−特に大腸菌であるが他の種も含む−による腸内のコロニー形成は血中への少量のエンドトキシンの移行に寄与する。コロニー形成の特性または粘膜の完全な状態を変えてしまうような様々な病理学的状態は、細菌の移動を著しく高め、高レベルの血中エンドトキシン、すなわちエンドトキシン血症をきたすことになる。
【０００４】
エンドトキシン血症は次に、エンドトキシンに起因する組織損傷による様々な臨床疾患症状へとリンクする。例として急性の障害、例えば“エンドトキシンショック”からより緩やかに進行する慢性的組織損傷、例えば特に肝疾患への関与が知られている物質（例えばアルコールおよび肝毒性ウイルス）の併用投与という環境下での肝細胞壊死／（炎症）（肝炎）を含む。
【０００５】
近年、肝細胞損傷への共通の経路として血中Ｔリンパ球が着目されている。古典的には肝細胞損傷を引き起こすものとして、自己免疫性肝炎と同様にＡ、ＢおよびＣ型肝炎の感染（およびおそらくその他のウイルス感染、例えばエブスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）が認められている。Ｔリンパ球はまたアルコール関連性慢性肝疾患にも関与することが現在明らかになっている。アルコールはＴリンパ球由来腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の分泌を高めることが見出された。Ｔ細胞刺激物質（注目のエンドトキシン）の存在下のこの“二重攻撃”モデルは肝臓内の高濃度ＴＮＦを確実なものとし、細胞死、肝炎をもたらし、肝臓の構築が損なわれる場合には肝硬変に至る。
【０００６】
アルコール性肝炎におけるエンドトキシンレベルの増加に大腸菌が寄与することが、抗生物質を与えた患者のエンドトキシンレベルの顕減により示された。抗生物質（経口投与）はエンドトキシンレベルを低下させるが、特に長期治療を基準とする場合、最終目標を達成する理想的な方法とは言えない。治療法として考えられる他のストラテジーとして、３−デオキシ−Ｄ−ｍａｎｎｏ−２−オクツロン酸合成阻害薬、ポリミキシンＢ（エンドトキシンに結合するポリカチオン分子）プラズマフェレーシス、モノクローナルならびにポリクローナル免疫療法、およびエンドトキシンアンタゴニストによる治療（Ｊ Ｈｕｒｌｅｙ（１９９５）によりＣｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ８： ２６８−２９２にまとめられている）を含む。これら各ストラテジーには有利な点と不利な点があり、今までのところエンドトキシン血症のための簡便で有効な治療法はない。
【０００７】
先行技術の不利な点の少なくとも１つを克服もしくは改善し、あるいは有用な代替法を提供することが本発明の目的である。
【０００８】
発明の概要
驚くことに、プロバイオティックによる治療はエンドトキシンレベルを低下し、アルコール誘発性肝障害を抑えることができることが見出された。プロバイオティックは多数の微生物のうちのいずれか１つまたはそれ以上とすることができる。乳酸菌による治療を以下に述べる。プロバイオティックの有効性の決定に使用できる哺乳類モデルについても述べる。
【０００９】
第１の側面により本発明は、エンドトキシン血症の治療を必要とする哺乳類に有効量のプロバイオティックを投与することを含む、同疾患の予防法および／または治療法を提供する。
【００１０】
哺乳類はエンドトキシン血症を発症するリスクがある状態でも、またはエンドトキシン血症を既に発症していてもよい。哺乳類は急性症状、例えば臨床的疾患もしくは急性肝炎、または慢性症状、例えば慢性肝疾患であってもよい。
【００１１】
当該方法および／または使用法は、エンドトキシンが血中に存在するいかなる症状にも適用できることは、当業者には明らかであろう。
【００１２】
第２の側面により本発明は、治療有効量のプロバイオティックをそれを必要とする哺乳類に投与することによる、アルコール誘発性肝障害の治療法を提供する。
【００１３】
第３の側面により本発明は、治療有効量のプロバイオティックをそれを必要とする哺乳類に投与することを含む、炎症性腸疾患の治療法を提供する。
【００１４】
第４の側面により本発明は、哺乳類のエンドトキシン血症の予防および／または治療用薬剤の製造のためのプロバイオティックの使用を提供する。
【００１５】
第５の側面により本発明は、アルコール誘発性肝障害の治療用薬剤の製造におけるプロバイオティックの使用を提供する。
【００１６】
第６の側面により本発明は、炎症性腸疾患の治療用薬剤の製造におけるプロバイオティックの使用を提供する。
【００１７】
哺乳類は好ましくはヒトであるが、他の哺乳類も考慮されることは当業者には明らかであろう。
【００１８】
適切なプロバイオティックは当業者により決定でき、例えば乳酸菌、例えば乳酸桿菌を含むことができる。好ましくはプロバイオティックはアシドフィルス菌またはファーメンタム乳酸菌である。最も好ましくはプロバイオティックはアシドフィルス菌株（ＶＲＩ−００１）またはファーメンタム乳酸菌株（ＶＲＩ−００２）である。双方の菌株ともＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｅｗ Ｓｏｕｔｈ Ｗａｌｅｓ， Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｓｙｄｎｅｙ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ より入手可能である。
【００１９】
プロバイオティックまたは薬剤は他の投与経路、例えば座薬または管を通しての経胃ルートも考えられるが、好ましくは経口投与する。
【００２０】
プロバイオティックまたは薬剤は食品組成物、例えば乳製品または大豆製品の形にすることもできるが、好ましくは錠剤またはカプセルの形である。好ましくは錠剤またはカプセルは１０８から１０１２ｃｆｕのプロバイオティックを含む。
【００２１】
第７の側面により本発明は、以下のステップ：
（ａ）哺乳類へのエンドトキシンおよび／またはエンドトキシン誘発物質の投与、および／または哺乳類にエンドトキシン誘発性損傷を与えること；
（ｂ）哺乳類へのプロバイオティックの投与；および
（ｃ）エンドトキシン血症におけるプロバイオティックの効果の決定
を含む、哺乳類のエンドトキシン血症の予防および／または治療におけるプロバイオティックの効果を評価する方法を提供する。
【００２２】
第８の側面により本発明は、以下のステップ：
（ａ）哺乳類へのアルコールの投与；
（ｂ）哺乳類へのプロバイオティックの投与；および
（ｃ）動物の肝臓の症状におけるプロバイオティックの効果の決定
を含む、哺乳類のアルコール誘発性肝障害の予防および／または治療におけるプロバイオティックの効果を評価する方法を提供する。
【００２３】
第９の側面により本発明は、以下のステップ：
（ａ）腸の炎症の原因となる物質の投与；
（ｂ）哺乳類へのプロバイオティックの投与；および
（ｃ）腸の症状におけるプロバイオティックの効果の決定
を含む、哺乳類の炎症性腸障害の予防および／または治療におけるプロバイオティックの効果を評価する方法を提供する。
【００２４】
前記方法のステップ（ａ）および（ｂ）は同時にまたは連続して行うことができ、連続して行う場合には評価する効果の性質により、ステップ（ａ）をステップ（ｂ）の前に行うべきかまたは後に行うべきかが決定されることになることは、当業者には明らかであろう。
【００２５】
哺乳類はヒトを含むあらゆる哺乳類とすることができる。哺乳類はまた例えば実験動物モデル、例えばラットでもよい。
【００２６】
アルコールの濃度、量および投与手段は、様々な因子、例えばモニターする効果、哺乳類のタイプ、プロバイオティックのタイプおよび製剤等に依存することになる。当業者はこのようなパラメータを容易に決定することができるだろう。例えばアルコールは適切な期間にわたって濃度を漸増しながら哺乳類に投与することができる。アルコールの量は例えば約５％から４０％の範囲とし、飲用水に混入して投与することができる。例えばアルコールを哺乳類に数ヶ月間−例えば２ヶ月間にわたって投与することができる。
【００２７】
あるいは例えばアルコールは、炎症性腸疾患を誘発するために哺乳類の結腸に投与することができる。アルコールの適当な濃度および量は当業者により容易に決定することができ、例えば４５％エタノールとすることができる。
【００２８】
好ましくは評価されるプロバイオティックは乳酸菌、例えば乳酸桿菌である。より好ましくはプロバイオティックはアシドフィルス菌またはファーメンタム乳酸菌であり、最も好ましくはアシドフィルス菌ＶＲＩ−００１株またはファーメンタム乳酸菌ＶＲＩ−００２株である。双方の菌株ともＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｅｗ Ｓｏｕｔｈ Ｗａｌｅｓ， Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｓｙｄｎｅｙ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ より入手可能である。
【００２９】
プロバイオティックは他の投与経路、例えば座薬または管を通しての経胃ルートも考えられるが、好ましくは経口投与する。プロバイオティックは食品組成物、例えば乳製品または大豆製品の形をとることもできるが、好ましくは錠剤またはカプセルまたはサシェ（ｓａｃｈｅｔ）の形である。好ましくは錠剤またはカプセルは１０８から１０１２ｃｆｕのプロバイオティックを含む。
【００３０】
哺乳類がラットの場合、プロバイオティックは約５ｘ１０１０ｃｆｕ量を１日おきに投与することができる。好ましくはプロバイオティックはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に存在するものとする。プロバイオティックは例えば経胃栄養により投与することができる。
【００３１】
プロバイオティックの効果はあらゆる適切な方法により決定することができる。このような１つの方法は血中エンドトキシンレベルの直接的および／または間接的指標であるパラメータの測定である。プロバイオティックの効果は、例えばリムルス（Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ： ＬＡＬ）試験によるエンドトキシンレベルの測定により決定することができる。
【００３２】
プロバイオティックの効果は、例えば障害のレベルを示すパラメータの測定、例えば肝障害に正の相関を示す血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の測定により決定することができる。
【００３３】
好ましくはエンドトキシン誘発物質はアルコールである。好ましくはアルコールが肝障害を誘発する。
【００３４】
本発明の文脈において“エンドトキシン血症の予防および／または治療”という用語は、エンドトキシン血症に起因するエンドトキシンレベルの増加および／または症状／合併症の予防および／または治療を含むが、これに限定されない。
【００３５】
発明の説明
本発明の好ましい実施の形態を、添付の図を参照して、あくまでも一例として以下に述べる。
【００３６】
実施例１
アルコール誘発性肝障害のラットモデルが以前に報告された （Ｃａｏ Ｑｉ， Ｂａｔｅｙ Ｒ， Ｐａｎｇ Ｇ， Ｃｌａｎｃｙ Ｒ （１９９８） Ａｌｃｏｈｏｌｉｓｍ： Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２： ７２３−７２９）。同モデルを用いて、プロバイオティックの投与で肝障害を低減できることが驚くことに発見された。
【００３７】
雌ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラット（ｎ＝１０−１４）８−１０週齢、体重約２５０ｇは本研究期間中、個体別の吊り下げ式ワイヤーケージにて、温度調節された環境下、１２時間毎の採光−消灯周期で飼育し、ラット用飼料および水を自由に摂取させた。本研究はｔｈｅ ａｎｉｍａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｅｔｈｉｃｓ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ（ニューキャッスル大学度物研究倫理委員会）により定められた規定に従って行った。
【００３８】
ラットには蒸留水中のエタノール濃度を５％（ｖ／ｖ）から開始し、４週間にわたって漸増させたものを給餌した。蒸留水中のエタノール濃度が４０％（ｖ／ｖ）に達した時点で、同濃度をさらに４週間維持した。後半４週間は各ラットに経胃栄養投与によりリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ：０．０１Ｍリン酸バッファー、０．０２０Ｍ塩化カリウムおよび０．１２０Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）中のアシドフィルス菌をさらに経口給餌した。アシドフィルス菌株はＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｅｗ Ｓｏｕｔｈ Ｗａｌｅｓ， Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｓｙｄｎｅｙ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ より入手可能なＶＲＩ−００１を使用した。
【００３９】
コントロールのラット（ｎ＝８）にはＰＢＳのみを（乳酸桿菌を加えずに）与えたことを除いて上述と同様の方法で処置した。
【００４０】
血中の血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを８週間の終了時に、ビクロマティックアナライザー（ｂｉｃｈｒｏｍａｔｉｃ ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いた標準的な吸光度測定により決定した（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｊｏｈｎ Ｈｕｎｔｅｒ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。血漿ＡＬＴレベルは肝障害に正の相関を示し、血漿中の同酵素レベルの測定は、肝障害を評価するための一般に認められた標準的測定法である。
【００４１】
結果を図１に示したが、アシドフィルス菌を給餌したラットはプロバイオティックを与えていないラットより有意に低いＡＬＴを示した（ｐ＜０．０３）。このようにアシドフィルス菌の投与により肝障害を低減することができる。アルコール誘発性肝障害モデルは一般的肝障害モデルとして使用でき、特に肝臓病変だけでなくウイルス性肝炎のような障害による細胞性応答に関しても共通の性質を持つとみなせる。得られた結果はしたがって、前記疾患（ウイルス性肝炎）のラットへのプロバイオティック投与効果の指標として使用することもできる。
【００４２】
実施例２
アルコール誘発性肝障害ラットモデルはまた、これら動物の血中に高レベルのエンドトキシンが存在するため、エンドトキシン血症の一般的モデルとして使用することもできる。
【００４３】
乳酸菌はグラム陽性菌で、消化管内に一時的に住みつく。アシドフィルス菌の形でサプリメントの乳酸菌を投与することで、同動物モデルの血中エンドトキシンレベルが低下することが、驚くことに発見された。
【００４４】
血液サンプルは実施例１で使用したラットの尾からの採血により（４０％アルコール投与の第１日目以降の）０、１４、２８日に採取した。血漿エンドトキシンレベルはＣａｐｅ Ｃｏｄ Ｉｎｃ， Ｗｏｏｄｓ Ｈｏｌｅ， ＭＡ， ＵＳＡより提供されたリムルス（ＬＡＬ）試薬により測定した（Ｊ．Ｃ．Ｈｕｒｌｅｙ （１９９５）Ｅｎｄｏｔｏｘｅｍｉａ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ， Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ８：２６８−２９２ に記載）。図２に示したように、生理食塩水を給餌したラットと比較してアシドフィルス菌を給餌したラットでは、１４日および２８日目により低レベルのエンドトキシンが検出された。
【００４５】
理論に拘束されるものではないが、これよりアシドフィルス菌はエンドトキシンの移動を抑制することができると推測される。
【００４６】
実施例３
エンドトキシンレベルを低下する能力が上述のアルコール誘発性肝障害ラットモデルに限定されないことを示すため、エタノール誘発性炎症性腸疾患のマウスモデルにプロバイオティックのファーメンタム乳酸菌を前もって投与し、同疾患の症状により誘発されるエンドトキシンにおけるプロバイオティックの効果を決定した。
【００４７】
血中エンドトキシンにおけるプロバイオティックの効果
雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（５，８週齢の群）に４５％エタノール溶液を微細カテーテルを用いて直腸経由で結腸内に投与する処置前に３日間連続して、１ｘ１０９ファーメンタム乳酸菌（ＶＲＩ−００２株、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｅｗ Ｓｏｕｔｈ Ｗａｌｅｓ， Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｓｙｄｎｅｙ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ より入手可能）を給餌した。コントロールのマウスにはＰＢＳを給餌した。
【００４８】
処置後２日目にマウスをと殺し、血中の血漿エンドトキシンレベルを上述のＬＡＬ試験により分析した。図３に示したように、未処置のマウス（正常）またはエタノール投与前にファーメンタム乳酸菌を給餌したマウスでは血中にエンドトキシンは検出されなかったが、反対にＰＢＳを給餌してエタノール処置したマウスは有意に高レベルのエンドトキシンを示した。
【００４９】
この結果は、エタノール誘発性炎症性腸疾患の当マウスモデルにおいて、炎症性腸疾患誘発前のプロバイオティックの投与により、通常同疾患に伴うエンドトキシンレベルの上昇を防ぐことができたことを示している。
【００５０】
実施例４
腸内細菌叢のバランスとエンドトキシン血症との関連
血中エンドトキシンの増加または減少が腸内細菌叢の存在量と相関するかどうかを調べるため、糞便中の腸内細菌および大腸菌型細菌のコロニー形成レベルを測定した。実施例３で使用したマウスの糞便内容物をＰＢＳに懸濁し、一連の１０倍希釈を繰り返しＭｃＣｏｎｋｅｙ ＣＭ７ 寒天培地に接種培養した。２−３日後コロニーをカウントし、結果を１ｇ糞便あたりのｌｏｇ１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）として表した。
【００５１】
図４に示したように、ファーメンタム乳酸菌給餌群では大腸菌型細菌の増加が認められた（１ｌｏｇ）が、一方結腸の腸内細菌の６−７ｌｏｇの減少が観察され、血中にエンドトキシンが検出されないこととの相関を示した。
【００５２】
理論に拘束されるものではないが、これらのデータは、プロバイオティックがストレス負荷後の腸内の腸内グラム陰性菌の成長を阻害することにより、血中エンドトキシンレベルを調節できることを示している。
【００５３】
本発明は特定の実施例を参照して述べたが、本発明は他の多くの形で実施可能であることを当業者は理解するだろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】エタノールおよびアシドフィルス菌を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を給餌した８頭のラット；およびエタノールおよびＰＢＳのみを給餌した８頭のラットにおける、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベル。２群間のＡＬＴレベルの差はｐ＜０．０３３のレベルで有意であった。
【図２】リムルス（ＬＡＬ）試験により測定した、２８日間アルコールを給餌したラットの血中エンドトキシンレベル。
【図３】結腸のエタノール誘発性炎症を有するマウスにおける、プロバイオティックによる血中エンドトキシンレベルの調節。
【図４】結腸の腸内細菌コロニー形成の減少は、プロバイオティックを給餌したマウスではエタノール処置後に血中エンドトキシンが検出されないことに相関する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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