(57)【要約】本発明は、タンパク質標的中の外側部位およびこれらの外側部位を同定するための方法に関する。本発明は、アロステリック部位を同定するための方法およびこのアロステリック部位に結合する化合物を同定するための方法に関する。アロステリック部位を同定するための方法であって、以下の工程：ａ）第一の結合部位、第二の結合部位および該第二の結合部位またはその近傍に化学反応基を備える標的を提供する工程；ｂ）該標的を、該化学反応基と共有結合を形成し得る化合物と接触させる工程；ｃ）該標的と該化合物との間に共有結合を形成し、それによって、標的−化合物結合体を形成する工程；ｄ）該標的−化合物結合体が、該標的と比較して、主な結合部位中に変化を有するか否かを決定する工程、を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アロステリック部位を同定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）第一の結合部位、第二の結合部位および該第二の結合部位またはその近傍に化学反応基を備える標的を提供する工程；
ｂ）該標的を、該化学反応基と共有結合を形成し得る化合物と接触させる工程；
ｃ）該標的と該化合物との間に共有結合を形成し、それによって、標的−化合物結合体を形成する工程；
ｄ）該標的−化合物結合体が、該標的と比較して、主な結合部位中に変化を有するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記化学反応基がチオールである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化学反応基がマスキングされたチオールである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記マスキングされたチオールが、ジスルフィドの形態である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記共有結合がジスルフィド結合であり、そして前記接触させる工程が、還元剤の存在下で生じる、請求項２または３に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物が、以下：
【化１】
2006503264.tif 000024
からなる群より選択されるリガンド候補であり、
ここで、ＲおよびＲ’は、各々独立して非置換Ｃ１〜Ｃ２０脂肪族、置換Ｃ１〜Ｃ２０脂肪族、非置換アリールまたは置換アリールであり；
ｍは０、１または２であり；そして
ｎは１または２である、
請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記変化が、前記標的の活性における機能的変化である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記変化が、構造的変化である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記構造的変化が、ｘ線結晶学を使用して決定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記構造的変化が、ＮＭＲを使用して決定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記構造的変化が、円偏光二色性を使用して決定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的がプロテアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的がキナーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的がホスファターゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
アロステリックインヒビターを同定する方法であって、該方法は、以下：
ａ）第一の係留実験を実施する工程、および
ｂ）第二の係留実験を実施する工程、
を包含し、ここで、両方の係留実験が、以下：
ｉ）第一の結合部位、第二の結合部位および該第二の結合部位またはその近傍に化学反応基を備える標的を提供する工程；
ｉｉ）該標的を、該化学反応基と共有結合を形成し得る化合物と接触させる工程；
ｉｉｉ）該標的と該化合物との間に共有結合を形成し、それによって、標的−化合物結合体を形成する工程；および
ｉｖ）該標的−化合物結合体を同定する工程、
を包含し、ここで、
該第一の係留実験が、該第一の結合部位に結合するリガンドの存在下で実施され、そして該第二の係留実験が、該第一の結合部位に結合するリガンドの非存在下で実施される、
方法。
【請求項１６】
前記化学反応基が、チオールまたはマスキングされたチオールである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記共有結合がジスルフィド結合であり、そして前記接触させる工程が、還元剤の存在下で生じる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記化合物が、以下：
【化２】
2006503264.tif 000025
からなる群より選択されるリガンド候補であり、
ここで、ＲおよびＲ’は、各々独立して非置換Ｃ１〜Ｃ２０脂肪族、置換Ｃ１〜Ｃ２０脂肪族、非置換アリールまたは置換アリールであり；
ｍは０、１または２であり；そして
ｎは１または２である、
請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
アロステリックインヒビターを同定する方法であって、該方法は、以下：
ａ）アロステリック調節をし得る標的およびアロステリック調節をし得ないその変異体を提供する工程；
ｂ）該標的を化合物と接触させる工程；
ｃ）該変異体を該化合物と接触させる工程；ならびに
ｄ）該標的に対する該化合物の活性を、変異体に対する該化合物の活性と比較する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
カスパーゼのアロステリックインヒビター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（背景）
（発明の分野）
薬物発見標的は、しばしば、タンパク質、特に、酵素である。ほとんどの薬物発明の努力は、リード化合物を同定するための大量の機能的スクリーニングに依存するので、強力な活性部位インヒビターがしばしば同定されるが、これらが薬物候補となるのはまれである。実に低い成功率についての理由は、変動するが、特異性の欠如および毒性は、それらがない場合より高い頻度で役割を果たす。
【０００２】
酵素標的は、通常、関連する酵素のファミリーの１つのメンバーである。驚くべきことではないが、関連する酵素はしばしば、互いに類似する三次元構造を共有し、そして、その活性部位領域は、最も保存されている。標的化される部位は、ファミリーメンバーの中でも最も類似する酵素の領域であるので、１つのメンバーに対する選択性を達成することが、非常に困難なことであることは驚くべきことではない。特異性の欠如は、しばしば、意図しない標的の阻害に由来する毒性を生じる。固有の問題にもかかわらず、多くの最も有望な薬物標的は、大きな酵素ファミリー（例えば、プロテアーゼ（例えば、アスパルチルプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、およびセリンプロテアーゼ）、キナーゼならびにホスファターゼ）のメンバーである。結果として、薬物発見のための新規な方法が、特異性を増強するこれらの型の標的に対して必要とされる。本発明は、このような方法を提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（好ましい実施形態の説明）
本発明は、本明細書で「外部部位（ｅｘｏｓｉｔｅ）」として言及される、タンパク質上の新規な結合部位を同定するための方法およびそこに結合するリガンドを同定するための方法を提供する。本発明の方法によって同定されたリガンド自体は、例えば、新規な治療薬物、酵素インヒビター、標識化合物、診断試薬、タンパク質精製のための親和性試薬などの開発のためのリード化合物としての用途を見出す。
【０００４】
他に規定されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解される意味と同じ意味を有する。参考文献（例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｉｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第２版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ  １９９４）および３月、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９２））は、本発明の適用において使用される多くの用語に対する一般的指針を当業者に提供する。
【０００５】
（定義）
本明細書で使用される用語の定義としては、以下が挙げられる：
用語「脂肪族」または「非置換脂肪族」とは、直鎖、分枝鎖、環状、または多環式の炭化水素をいい、アルキル部分、アルケニル部分、アルキニル部分、シクロアルキル部分、シクロアルケニル部分、およびシクロアルキニル部分が挙げられる。
【０００６】
用語「アルキル」または「非置換アルキル」とは、飽和炭化水素をいう。
【０００７】
用語「アルケニル」または「非置換アルケニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する炭化水素をいう。
【０００８】
用語「アルキニル」または「非置換アルキニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する炭化水素をいう。
【０００９】
用語「芳香族」または「非置換芳香族」とは、少なくとも１つのアリール基を有する部分をいう。この用語はまた、脂肪族修飾アリール（例えば、アルキルアリールなど）を含む。
【００１０】
用語「アリール」または「非置換アリール」とは、少なくとも１つの芳香環を有する単環または多環の不飽和部分をいう。この用語は、少なくとも１つの芳香環内に１つ以上のヘテロ原子を含むヘテロアリールを含む。アリールの例示的な例としては、以下が挙げられる：フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、インデニル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、チオフェニル、フラニル、キノリニル、イソキノリニルなど。
【００１１】
部分を改変するために使用される場合、用語「置換（された）」は、その部分の置換されたバージョンをいい、ここで、少なくとも１つの水素原子は、以下が挙げられるが、これらに限定されない別の基により置換される：脂肪族、アリール、アルキルアリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｉ、Ｂｒ、−ＯＨ；−ＮＯ２；−ＣＮ；−ＣＦ３；−ＣＨ２ＣＦ３；−ＣＨ２Ｃｌ；−ＣＨ２ＯＨ；−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ；−ＣＨ２ＮＨ２；−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３；−ＯＲＸ；−Ｃ（Ｏ）ＲＸ；−ＣＯＯＲＸ；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＸ）２；−ＯＣ（Ｏ）ＲＸ；−ＯＣＯＯＲＸ；−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｘ）２；−Ｎ（ＲＸ）２；−Ｓ（Ｏ）２ＲＸ；および−ＮＲＸＣ（Ｏ）ＲＸ。ここで、各ＲＸの出現は、独立して、水素、置換脂肪族、非置換脂肪族、置換アリール、または非置換アリールである。さらに、部分上の隣接基の置換基は、一緒になって環状基を形成し得る。
【００１２】
用語「アロステリック部位」とは、外部部位をいい、ここで、リガンドのこの部位への結合が、タンパク質の活性または機能を調節する。
【００１３】
用語「アンタゴニスト」は、最も広い意味で使用され、標的（例えば、ＴＢＭ）によって示される生物学的活性を部分的または完全にブロック、阻害または中和する任意のリガンドを含む。類似の様式において、用語「アゴニスト」は、最も広い意味で使用され、標的（例えば、ＴＢＭ）によって示される生物学的活性を、例えば、このようなＴＢＭの機能もしくは発現、またはこのようなＴＢＭを介するシグナル伝達の効率を特異的に変化させ、それにより、既に存在する生物学的活性を変更（増大もしくは阻害）するか、または新たな生物学的活性を誘発することによって模倣する、任意のリガンドを含む。
【００１４】
用語「外部部位」は、その主な結合部位でない、タンパク質上の結合部位である。例えば、酵素上の主な結合部位は、活性部位である。レセプター上の主な結合部位は、リガンド結合部位である。
【００１５】
用語「リガンド候補」または「候補リガンド」とは、標的上の相補的または適合性の反応基と共有結合を形成し得る反応基を保有するか、または、保有するように改変された化合物をいう。リガンド候補上または標的上のいずれかの反応基は、例えば、保護基でマスクされ得る。
【００１６】
用語「ポリヌクレオチド」は、単数または複数で使用される場合、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを一般にいい、これらは、非改変ＲＮＡもしくは非改変ＤＮＡ、または改変ＲＮＡもしくは改変ＤＮＡであり得る。従って、例えば、本明細書で定義されるポリヌクレオチドとしては、限定されないが、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域を含むＲＮＡ、一本鎖、もしくはより代表的には二本鎖であり得るか、または一本鎖領域および二本鎖領域を含むＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられる。さらに、用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡあるいはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域をいう。このような領域における鎖は、同じ分子由来であっても、異なる分子由来であってもよい。これらの領域は、１つ以上の分子の全てを含み得るが、より代表的には、幾つかの分子の１つの領域のみを包含する。三重らせん領域の分子の１つは、しばしば、オリゴヌクレオチドである。用語「ポリヌクレオチド」は、特に、１つ以上の改変された塩基を含むＤＮＡおよびＲＮＡを含む。従って、安定性または他の理由のために改変された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、その用語が本明細書で意図されるような「ポリヌクレオチド」である。さらに、通常でない塩基（例えば、イノシン）または改変された塩基（例えば、トリチル化塩基）を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書で定義されるような「ポリヌクレオチド」との用語に含まれる。一般的に、用語「ポリヌクレオチド」は、非改変のポリヌクレオチドの全ての化学的、酵素的および／または代謝的に改変された形態、ならびにウイルスおよび細胞（単純細胞および複雑細胞を含む）の特徴であるＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を含む。
【００１７】
語句「保護されたチオール」または「マスク（マスキング）されたチオール」とは、本明細書で使用される場合、基または分子と反応して、より反応性が低くされた共有結合を形成しているチオールをいい、これは、脱保護されて、遊離のチオールを再生し得る。
【００１８】
語句「可逆的な共有結合」とは、本明細書で使用される場合、好ましくは、標的を変性させない条件下で分解され得る共有結合をいう。例としては、ジスルフィド、シッフ塩基、チオエステル、配位錯体、ボロン酸エステルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
語句「反応基」は、存在する場合、適合性または相補的な反応基との共有結合が形成され得る部位を提供する化学的な基または部分である。例証的な例は、以下である：−ＳＨであり、これは、別の−ＳＨまたは−ＳＳ−と反応して、それぞれジスルフィドまたはジスルフィド交換を形成し得る；−ＮＨ２であり、これは、活性化された−ＣＯＯＨと反応して、アミドを形成し得る；−ＮＨ２であり、これは、アルデヒドまたはケトンと反応して、シッフ塩基などを形成し得る。
【００２０】
語句「反応性求核試薬」は、本明細書で使用される場合、標的を変性も損傷も条件下で、別の分子上の適合性の官能基と共有結合を形成し得る求核試薬をいう。最も適切な求核試薬は、チオール、アルコール、およびアミンである。同様に、語句「反応性求電子試薬」とは、本明細書で使用される場合、好ましくは、標的を変性も損傷もしない条件下で、別の分子上の適合性の官能基と共有結合を形成し得る求電子試薬をいう。最も適切な求電子試薬は、ハロゲン化アルキル、イミン、カルボニル、エポキシド、アジリジン（ａｚｉｒｉｄｉｅ）、スルホネート、ジスルフィド、活性化エステル、活性化カルボニル、およびヘミアセタールである。
【００２１】
語句「目的の部位」とは、リガンドが結合し得る、標的上の任意の部位をいう。本明細書で使用される場合、目的の部位は、タンパク質の主な結合部位の外側にある任意の部位である。例えば、標的が酵素である場合、目的の部位は、活性部位でない部位である。標的がレセプターである場合、目的の部位は、レセプターのリガンドの結合部位でない部位である。
【００２２】
用語「標的」、「標的分子」および「ＴＭ」は、交換可能に、最も広い意味で使用され、リガンドの結合が標的の機能に対して影響を有する化学的または生物学的な実体をいう。標的は、分子、分子の一部、または分子の凝集体であり得る。リガンドの結合は、可逆的でも不可逆的でもよい。標的分子の特定の例としては、以下が挙げられる：ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、酵素およびレセプター）、転写因子、増殖因子およびサイトカインのような、レセプターに対するリガンド、免疫グロブリン、核タンパク質、シグナル伝達成分（例えば、キナーゼ、ホスファターゼ）、ポリヌクレオチド、糖質、糖タンパク質、糖脂質、および他の高分子（例えば、核酸−タンパク質複合体、クロマチンまたはリボソーム）、資質二重層含有構造（例えば、膜）、または膜から誘導される構造（例えば、ベシクル）。この定義は、特に、以下に定義されるような標的生物学的分子（Ｔａｒｇｅｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）（「ＴＢＭ」）を含む。
【００２３】
「標的生物学的分子」または「ＴＢＭ」とは、本明細書で使用される場合、低分子アゴニストまたは低分子アンタゴニストがＴＢＭの機能に対する効果を有する、互いに生物学的に関連する複合体を形成し得る、単数または複数の生物学的分子をいう。好ましい実施形態において、ＴＢＭは、２つ以上のアミノ酸を含むタンパク質またはその一部であり、これらは、相補的な反応基を有する化合物と共有結合を形成し得る反応基を保有するか、または保有するように改変され得る。好ましいＴＢＭとしては、以下が挙げられる：細胞表面レセプターおよび可溶性レセプターならびにそれらのリガンド；ステロイドレセプター；ホルモン；免疫グロブリン；凝血因子；核タンパク質；転写因子；シグナル伝達分子；細胞接着分子、同時刺激性分子、ケモカイン、アポトーシスの媒介に関与する分子、酵素、ならびにＤＮＡおよび／またはＲＮＡ合成または分解に関連するタンパク質。
【００２４】
多くのＴＢＭは、レセプター−リガンド結合相互作用に関与し、レセプター−リガンド対のいずれかのメンバーであり得る分子である。増殖因子およびそれらのそれぞれのレセプターの例証的な例としては、以下に対するものが挙げられる：エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、アンジオポエチン（ＡＮＧ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヘレグリン−ａ（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ−ａ）およびヘレグリン−ｂ、脈管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰＬＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−ａおよびＴＧＦ−ｂ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ならびにインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）。ホルモンおよびそれらのそれぞれのレセプターの例証的な例としては、以下に対するもの挙げられる：成長ホルモン、プロラクチン、胎盤ラクトゲン（ＬＰＬ）、インスリン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ならびにニューロキニン−１。サイトカインおよびそれらのそれぞれのレセプターの例証的な例としては、以下に対するものが挙げられる：毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、ＴＮＦ−ａ；ＣＤ４０Ｌ、幹細胞因子（ＳＣＦ）；インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１３、ならびにインターロイキン−１８。
【００２５】
他のＴＢＭとしては以下が挙げられる：細胞接着分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−５、ＶＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−５およびＶＬＡ−４）；同時刺激分子（例えば、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−１；Ｂ７−２、ＩＣＯＳおよびＢ７ＲＰ−１）；ケモカイン（例えば、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ１ｂ）；アポトーシス因子（例えば、ＡＰＡＦ−１、ｐ５３、ｂａｘ、ｂａｋ、ｂａｄ、ｂｉｄおよびｃ−ａｂｌ）；抗アポトーシス因子（例えば、ｂｃｌ２、ｂｃｌ−ｘ（Ｌ）およびｍｄｍ２）；転写調節因子（例えば、ＡＰ−１およびＡＰ−２）；シグナル伝達タンパク質（例えば、ＴＲＡＦ−１、ＴＲＡＦ−２、ＴＲＡＦ−３、ＴＲＡＦ−４、ＴＲＡＦ−５およびＴＲＡＦ−６）；およびアダプタータンパク質（例えば、ｇｒｂ２、ｃｂｌ、ｓｈｃ、ｎｃｋおよびｃｒｋ）。
【００２６】
酵素は、別の分類の好ましいＴＢＭであり、以下を含む多くの方法で分類され得る：アロステリック酵素；細菌性酵素（イソロイシルｔＲＮＡシンターゼ、ペプチドデホルミラーゼ、ＤＮＡジャイレースなど）；真菌性酵素（チミジル酸合成酵素など）；ウイルス酵素（ＨＩＶインテグラーゼ、ＨＳＶプロテアーゼ、Ｃ型肝炎Ｃヘリカーゼ、Ｃ型肝炎プロテアーゼ、ライノウイルスプロテアーゼなど）；キナーゼ（セリン／スレオニン、チロシンおよび二重特異性（ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ））；ホスファターゼ（セリン／スレオニン、チロシンおよび二重特異性）；およびプロテアーゼ（アスパルチルプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼ）。酵素の注目すべき下位分類としては、以下が挙げられる：キナーゼ（例えば、Ｌｃｋ、Ｓｙｋ、Ｚａｐ−７０、ＪＡＫ、ＦＡＫ、ＩＴＫ、ＢＴＫ、ＭＥＫ、ＭＥＫＫ、ＧＳＫ−３、Ｒａｆ、ｔｇｆ−ｂ−活性化キナーゼ−１（ＴＡＫ−１）、ＰＡＫ−１、ｃｄｋ４、Ａｋｔ、ＰＫＣｑ、ＩＫＫｂ、ＩＫＫ−２、ＰＤＫ、ａｓｋ、ｎｉｋ、ＭＡＰＫＡＰＫ、ｐ９０ｒｓｋ、ｐ７０ｓ６ｋおよびＰＩ３−Ｋ（ｐ８５およびｐ１１０サブユニット））；ホスファターゼ（例えば、ＣＤ４５、ＬＡＲ、ＲＰＴＰ−ａ、ＲＰＴＰ−ｍ、Ｃｄｃ２５Ａ、キナーゼ関連ホスファターゼ、ｍａｐキナーゼホスファターゼ−１、ＰＴＰ−１Ｂ、ＴＣ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−ＰＥＳＴ、ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２；カスパーゼ（例えば、カスパーゼ−１、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９およびカスパーゼ−１１）；およびカテプシン（例えば、カテプシンＢ、カテプシンＦ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＳおよびカテプシンＶ）。他の酵素標的としては、以下が挙げられる：ＢＡＣＥ、ＴＡＣＥ、細胞質ホスホリパーゼＡ２（ｃＰＬＡ２）、ＰＡＲＰ、ＰＤＥ  Ｉ〜ＶＩＩ、Ｒａｃ−２、ＣＤ２６、イノシン１リン酸デヒドロゲナーゼ、１５−リポキシゲナーゼ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ、ジヒドロオロテートデヒドロゲナーゼ、ロイコトリエンＡ４ヒドロラーゼ、および一酸化窒素シンターゼ。
【００２７】
（外部部位）
本発明は、本明細書中で「外部部位（ｅｘｏｓｉｔｅ）」と呼ばれるタンパク質上の新規の結合部位を同定するための方法を提供する。これらの外部部位は、特定の標的タンパク質の一次結合領域とは異なる標的タンパク質上の結合部位である。例えば、酵素上の外部部位は、活性部位でない任意の結合部位である。同様に、レセプター上の外部部位は、レセプターのリガンドの結合部位ではない任意の結合部位である。
【００２８】
１つの実施形態において、目的の外部部位は、タンパク質の適応性の結合部位である。用語「適応性」は、活性部位のようなよく定義されたポケットとは異なり、適応性の結合部位は、リガンドの不在下では明らかでないため、これらの部位をさすために使用される。リガンドの存在は、タンパク質の１つ以上の鎖の立体配座の変化を誘導し、リガンドが最終的に結合し得る結合部位を生じる。
【００２９】
別の実施形態において、目的の外部部位はアロステリック部位である。言い換えると、標的タンパク質のこのような部位へのリガンドの結合は、その標的タンパク質の機能を調節する。この調節は、負ならびに正の両方であり得る。例えば、調節が負である場合、外部部位へのリガンドの結合は、標的の機能を阻害する。調節が正である場合、外部部位のリガンドへの結合は、標的の機能を増強（または増幅）する。アロステリック部位は、しばしば、アクセサリータンパク質および／または調節タンパク質に対する認識部位である。
【００３０】
なお別の実施形態において、目的の外部部位は適応性の結合部位とアロステリック部位との両方である。
【００３１】
（係留方法）
係留は、標的上の反応基と潜在的なリガンド上の相補的な反応基との間の共有結合の形成に依存するリガンドの同定方法である。係留方法は、発明者ら（Ｄａｎｉｅｌ  Ｅｒｌａｎｓｏｎ、Ａｎｄｒｅｗ  ＢｒａｉｓｔｅｄおよびＪａｍｅｓ  Ｗｅｌｌｓ）による米国特許第６，３３５，１５５号；ＰＣＴ公報番号ＷＯ００／００８２３およびＷＯ０２／４２７７３；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＬＩＧＡＮＤ  ＤＩＳＣＯＶＥＲＹとの表題の米国番号１０／１２１，２１６（対応するＰＣＴ出願番号ＵＳ０２／１３０６１）；およびＥｒｌａｎｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：９３６７−９３７２（２０００）（これらは、全てが参考として援用される）に記載される。得られた共有複合体は、標的−リガンド結合体と称される。共有結合が標的（例えば、ネイティブまたは非ネイティブのシステイン）の所定の部位で形成されるので、化学量論および結合位置は、この方法によって同定されるリガンドについて公知である。
【００３２】
一旦形成されると、標的−リガンド結合体のリガンド部分が多数の方法を使用して同定され得る。好ましい実施形態において、質量分析法が使用される。質量分析法は、質量／電荷比（ｍ／ｚ）に基づいて分子を検出し、そして、それらのサイズに基づいて分子を分離し得る（Ｙａｔｅｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：５−８［２０００］において総説される）。標的−リガンド結合体は、質量分析計において直接検出され得るか、または検出の前にフラグメント化され得る。あるいは、化合物は、質量分光光度計内で遊離され、引き続いて同定され得る。さらに、質量分析法を単独でかまたは標的に共有結合する化合物を検出もしくは同定するための他の手段と組み合せて使用し得る。さらに、質量分析法技術の説明としては、ＦｉｔｚｇｅｒａｌｄおよびＳｉｕｚｄａｋ，Ｃｈｅｍｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：７０７−７１５［１９９６］；Ｃｈｕら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：７８２７−７８３５［１９９６］；Ｓｉｕｄｚａｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１２９０−１１２９７［１９９４］；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８：５９９Ｒ−６５１Ｒ［１９９６］；Ｗｕら，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：６５３−６５７［１９９７］；ならびにＬｏｏら，Ａｍ．Ｒｅｐｏｒｔｓ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３１：３１９−３２５［１９９６］）が挙げられる。
【００３３】
あるいは、標的−リガンド結合体は、他の手段を用いて同定され得る。例えば、反応混合物の成分の分離のために種々のクロマトグラフィー技術（例えば、液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーなど）を使用し得、その結果、共有結合分子を同定する能力を高める。このようなクロマトグラフィー技術は、質量分析法と組み合せてかまたは質量分析法とは別に使用され得る。また、標識化プローブ（蛍光、放射線または他の手段で）を遊離した化合物に結合させ、それによって上記の技術のいずれかを用いる同定を容易にし得る。なお別の実施形態において、新しい結合の形成は、標識化プローブを遊離させ、次いで、モニタリングされ得る。単純な機能的アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡまたは酵素アッセイ）がまた、アッセイが測定するのに必須の領域において結合が生じるときに結合を検出するのに使用され得る。標的分子に結合する有機化合物を同定するための用途が見出され得る他の技術としては、例えば、核磁気共鳴分析法（ＮＭＲ）、表面プラスモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）、キャピラリー電気泳動、Ｘ線結晶解析、などが挙げられ、これらは全て、当業者に周知である。
【００３４】
標的がタンパク質であり、かつ共有結合がジスルフィドである係留方法の１つの実施形態の略図を図１に示す。チオール含有タンパク質を、複数のリガンド候補と反応させる。この実施形態において、リガンド候補は、式−ＳＳＲ１のジスルフィドの形態でマスクされたチオールを保有し、ここでＲ１は非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、非置換のアリールまたは置換アリールである。特定の実施形態において、Ｒ１は潜在的なリガンド候補の溶解性を高めるように選択される。示すように、標的に対して固有の結合親和性を保有するリガンド候補が同定され、ジスルフィド部分を含まない対応するリガンドが、同定された結合決定基（円で表される）から作製される。
図２は、２つの代表的な係留実験を示す。ここで、標的酵素、Ｅ．ｃｏｌｉチミジル酸シンターゼは以下の式
【００３５】
【化３】
2006503264.tif 000002
のリガンド候補と接触し、ここで、Ｒｃは、ライブラリメンバーのこのプールの中で可変の部分であり、そして、非置換の脂肪族、置換脂肪族、非置換のアリール、または置換アリールである。全てのＴＳ酵素のと同様に、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＴＳは係留に使用され得る活性な部位システイン（Ｃｙｓ１４６）を有する。Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＴＳはまた４つの他のシステインを含むが、これらのシステインは変化し、係留実験において反応性でないことが見出された。例えば、最初の実験において、野生型のＥ．ｃｏｌｉ  ＴＳおよびＣ１４６Ｓ変異体（１４６位のシステインがセリンに変異している）をシスタミン（Ｈ２ＮＣＨ２ＣＨ２ＳＳＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）と接触させた。野生型のＴＳ酵素は、シスタミンの１つの等価物ときちんと反応したが、その一方で、変異体ＴＳは反応せず、これは、シスタミンがＣｙｓ１４６と反応し、Ｃｙｓ１４６に選択的であったことを示す。
【００３６】
図２Ａは、ＴＳとＴＳに対してほとんど結合親和性を有さないかまたは全く結合親和性を有さない１０の異なるリガンド候補のプールとの反応の逆重畳質量スペクトルである。任意の結合相互作用の不在下で、ＴＳと個々のリガンド候補との間のジスルフィド交換反応の平衡は改変されていない酵素に向う。このことを以下の式によって模式的に示す。
【００３７】
【化４】
2006503264.tif 000003
予想した通り、改変されていない酵素に対応するピークは、スペクトルのうち２つの最も突出したピークのうちの１つである。もう一方の突出したピークは、ＴＳであり、ここでは、Ｃｙｓ１４６のチオールがシステアミンで改変されている。この種は任意の個々のライブラリメンバーについて有意な程度まで形成されないが、このピークはライブラリプールの各メンバーについての平衡反応の蓄積効果に起因する。反応がチオール含有還元剤（例えば、２−メルカプトエタノール）の存在下で実行される場合、活性部位のシステインはまた、還元剤で改変され得る。システアミンと２−メルカプトエタノールは類似した分子量を有するので、これらのそれぞれのジスルフィド結合化ＴＳ酵素は、この実験で用いた条件下においては区別できない。右側の小さなピークは、目立たないライブラリメンバーに対応する。特に、これらのピークはいずれもが非常に顕著でない。図２Ａは、リガンド候補のいずれもが標的に対して固有の結合親和性を保有しないスペクトルの特徴である。
【００３８】
図２Ｂは、リガンド候補の１つが酵素に対して固有の結合親和性を保有する、１０の異なるリガンド候補のプールとのＴＳの反応の逆重畳質量スペクトルである。見られ得るように、最も突出したピークはＴＳに対応するものであり、ここでは、Ｃｙｓ１４６のチオールがＮ−トシル−Ｄ−プロリン化合物で改変されている。このピークは、改変されていない酵素およびＴＳに対応するピークを含む全ての他のピークを矮化し、ここではＣｙｓ１４６のチオールがシステアミンで改変されている。図２Ｂは、係留が所望の部位に対して強い固有の結合親和性を保有する部分を有する、質量スペクトルの例である。
【００３９】
（係留を用いた外部部位同定）
本発明の１つの局面において、タンパク質標的表面上の外部部位を同定するための方法が提供される。一般に、この方法は以下の工程を包含する：
ａ）主な（ｐｒｉｍａｒｙ）結合部位、および主な結合部位以外の部位またはその付近の部位に化学反応基を有する標的を提供する工程；
ｂ）上記の化学反応基と共有結合を形成し得る化合物に標的を接触させる工程；
ｃ）標的と化合物との間に共有結合を形成し、それによって標的−化合物結合体を形成する工程；ならびに
ｄ）標的との共有結合の不在下で、上記部位における標的に化合物が結合するか否かを決定する工程。
【００４０】
多くの場合、潜在的な外部部位が標的の凹部領域に位置される。他の場合において、潜在的な外部部位は、明らかでない。なぜならば、この部位はリガンドの存在がタンパク質の１つ以上の側鎖の立体配置の変化を誘導し、リガンドが最終的には結合し得る結合部位を作成する、適応性の結合部位であるからである。
【００４１】
標的が酵素である場合、主な結合部位は活性部位である。標的がレセプターである場合、主な結合部位はレセプターのリガンドが結合する部位である。
【００４２】
化学反応基が、この結合部位を含む残基の任意の原子から１０Å以下である場合、この基は、結合部位の近くであると考えられる。別の実施形態において、化学反応基が、この結合部位を含む残基の任意の原子から５Å以下である場合、この基は結合部位の近くであると考えられる。
【００４３】
別の実施形態において、この方法は以下の工程を包含する：
ａ）第１の結合部位、第２の結合部位および第２の結合部位または第２の結合部位の近くの化学反応基を有する標的を提供する工程；
ｂ）化学反応基と共有結合を形成し得る第１の化合物に標的を接触させる工程；
ｃ）標的と第１の化合物との間に共有結合を形成させ、それによって標的−化合物結合体を形成する工程；
ｄ）標的を第２の化合物に接触させる工程であって、第２の化合物が化学反応基を欠失した第１の化合物の変形である、工程；ならびに
ｅ）第２の結合部位に対して非共有結合するための第２の化合物の親和性を決定する工程。
【００４４】
本発明の別の局面において、アロステリック外側部位を同定するための方法が提供される。概して、この方法は、以下の工程を包含する：
ａ）主な結合部位および該主な結合部位以外の部位またはその近傍の化学反応基を備える標的を提供する工程；
ｂ）該標的を、該化学反応基と共有結合を形成し得る化合物と接触させる工程；
ｃ）該標的と該化合物との間の共有結合を形成し、それによって、標的−化合物結合体を形成する工程；
ｄ）該標的−化合物結合体が、該標的と比較して、主な結合部位中に変化を有するか否かを決定する工程。
【００４５】
この方法によって同定されるアロステリック部位は、ネガティブおよびポジティブの両方で標的タンパク質の機能を調節し得る。例えば、この調節はネガティブである場合、外側部位へのリガンドの結合は、この標的の機能を阻害する。この調節がポジティブである場合、外側部位へのリガンドの結合は、この標的の機能を促進（または増幅）させる。
【００４６】
１実施形態において、主な結合部位における変化は、構造的変化であり、そして主な結合部位の三次元構造における変更である。三次元構造における変更は、少なくとも１Åまでの、活性部位残基の少なくとも１つのヘテロ原子の動きとして規定される。構造における変化は、ｘ線結晶学、ＮＭＲ、円偏光二色性などを含む多くの任意の方法によって検出される。別の実施形態において、この主な結合部位における変化は、機能的変化である。標的が酵素である場合、その機能は、阻害または促進され得る。この標的がレセプターである場合、レセプターリガンド結合部位への、レセプターリガンドの結合は、阻害または促進され得る。
【００４７】
別の実施形態において、この方法は、以下の工程を包含する：
ａ）第一の結合部位、第二の結合部位およびこの第二の結合部位またはその近傍の化学反応基を備える標的を提供する工程；
ｂ）この標的を、この化学反応基と共有結合を形成し得る化合物と接触させる工程；
ｃ）この標的と化合物との間の共有結合を形成し、それによって、標的−化合物結合体を形成する工程；
ｄ）この標的−化合物結合体が、標的の第一の結合部位と比較して、第一結合部位中に変化を有するか否かを決定する工程。
【００４８】
本方法の特定の実施形態において、この化学反応基は、システイン残基のチオールであり、そしてこの化合物は、−ＳＨ基を有する。他の実施形態において、この化合物は、マスキングされたチオールを有する。他の実施形態において、この化合物は、式−ＳＳＲ１のジスルフィドの形態でマスキングされたチオールを有するリガンド候補であり、ここで、Ｒ１は、非置換Ｃ１〜Ｃ１０脂肪族、置換Ｃ１〜Ｃ１０脂肪族、非置換アリールまたは置換アリールである。他の実施形態において、このリガンド候補は、式−ＳＳＲ２Ｒ３のジスルフィドのようにマスキングされたチオールを有し、ここで、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ５アルキル（好ましくは、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、または−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）であり、そしてＲ３は、ＮＨ２、ＯＨ、またはＣＯＯＨである。リガンド候補の例示的な例としては、以下が挙げられる：
【００４９】
【化５】
2006503264.tif 000004
ここで、ＲおよびＲ’は、各々独立して非置換Ｃ１〜Ｃ２０脂肪族、置換Ｃ１〜Ｃ２０脂肪族、非置換アリールまたは置換アリールであり；
ｍは０、１または２であり；そして
ｎは１または２である。
【００５０】
他の実施形態において、この標的は、還元剤の存在下においてジスルフィド結合を形成し得る化合物と接触される。適切な還元剤の例示的な例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：システイン、システアミン、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、グルタチオン、２−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロピオン酸、ホスフィン（例えば、トリス−（２−カルボキシ−ホスフィン）（「ＴＣＥＰ」）、または水素化ホウ素ナトリウム。１実施形態において、この還元剤は、２−メルカプトエタノールである。別の実施形態において、この還元剤は、システアミンである。別の実施形態において、この還元剤は、グルタチオンである。別の実施形態において、この還元剤はシステインである。
【００５１】
外側部位を同定する係留方法の概略図を、図３に示す。この実施形態において、主な結合部位は、活性部位として示される。図３Ａは、外側部位が適応性結合部位である状況を示す。理解され得るように、この外側部位は、リガンドの存在によって誘導される。しかし、この外側部位へのリガンドの結合は、活性部位のコンフォメーションも、標的の機能も変更しない。対照的に、図３Ｂは、アロステリック部位でもある外側部位が同定される状況を示す。示されるように、アロステリック外側部位へのリガンドの結合は、活性部位のコンフォメーションを変更し、その結果、標的の機能を阻害する。両方の場合において、この標的−化合物結合体は、必要に応じて、標的を再生するために還元剤と接触され得る。この外側部位がアロステリック外側部位である場合、リガンドの除去は、このアロステリック外側部位へのリガンドの結合から生じる変化を逆転する。
【００５２】
図３に示される方法は、所望の標的のシステイン変異体を作製することにより適用される。システイン残基は、タンパク質標的上の、目的の部位またはその近傍に導入される。１実施形態において、目的の部位は、標的上の位置が系統的に調査されるように選択される。別の実施形態において、標的が複数のサブユニットから構成される場合、目的の部位は境界面領域の近傍にある。これらのサブユニットは、同じポリペプチド（例えば、ホモダイマー）または異なるポリペプチド（例えば、へテロダイマー）から構成され得る。システインは、目的の部位から１０Å内、好ましくは、目的の部位から５Å内に位置される場合、目的の部位の近傍にあるとみなされる。標的が、目的の部位の外側の天然に存在するシステインを含む場合、それらは、必要に応じて二重標識の可能性を排除するために、アラニンのような別の残基に変異され得る。
【００５３】
概して、システイン残基に変異される残基は、溶媒接近可能である。溶媒接近可能性は、標準的な数値（Ｌｅｅ，Ｂ．＆Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｆ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ５５：３７９−４００（１９７１）；Ｓｈｒａｋｅ，Ａ．＆Ｒｕｐｌｅｙ，Ｊ．Ａ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７９：３５１−３７１（１９７３））または分析（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｍ．Ｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２１：７０９−７１３（１９８３）；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｔ．Ｊ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：６３−８９（１９８４））法を使用する構造モデルから計算され得る。例えば、潜在的なシステイン改変体は、ＬｅｅおよびＲｉｃｈａｒｄｓの方法（Ｌｅｅ，Ｂ．＆Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｆ．Ｍ．Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ  ５５：３７９−４００（１９７１））によって計算されるとき、炭素−β（ＣＢ）、または硫黄−γ（ＳＧ）の合わせた表面領域が、２０Å２より大きい場合に、溶媒接近可能であるとみなされる。この値は、Ｃｒｅａｍｅｒら（Ｃｒｅａｍｅｒ，Ｔ．Ｐ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１６２４５−１６２５０（１９９５））によって記載されるような、システイン側鎖に接近可能な理論上の表面領域の約３３％を示す。
【００５４】
また、システイン、または別のチオール含有アミノ酸残基へ変異される残基が、骨格原子との水素結合に関与しないこと、あるいは、多くとも１つの水素結合のみによって骨格と相互作用することが好ましい。側鎖が他の側鎖との複数（＞１）の水素結合に関与する野生型残基はまた、あまり好ましくない。全ての標準的な回転異性体（−６０°、６０°、または１８０°のｃｈｉ１角度）が他の任意の残基のＮ原子、ＣＡ原子、Ｃ原子、Ｏ原子、またはＣＢ原子との、都合の悪い立体的接触を誘導し得る改変体もまた、あまり好ましくない。都合の悪い接触は、関与している原子のファンデルワールス半径の合計の８０％未満である原子間距離として規定される。目的の部位が凹部領域である特定の実施形態において、このような部位の端（例えば、隆線または近接した凹部領域）に見出される残基は、システイン残基に変異するのにより好ましい。凸性および凹性は、表面ベクトル（ｖｅｃｔｏｒ）（Ｄｕｎｃａｎ，Ｂ．Ｓ．＆Ｏｌｓｏｎ，Ａ．Ｊ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３３：２１９−２２９（１９９３））に基づいて計算され得るか、または分子表面に沿って配置される水プローブの接近可能性を決定すること（Ｎｉｃｈｏｌｌｓ，Ａ．らＰｒｏｔｅｉｎｓ  １１：２８１−２９６（１９９１）；Ｂｒａｄｙ，Ｇ．Ｐ．，Ｊｒ．＆  Ｓｔｏｕｔｅｎ，Ｐ．Ｆ．Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．１４：３８３−４０１（２０００））によって計算され得る。Ｌ−アミノ酸について通常禁じられた骨格コンフォメーションを有する残基（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ，Ｇ．Ｎ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：９５−９９（１９６３）；Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ，Ｇ．Ｎ．＆Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｈｎ，Ｖ．Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．２３：２８３−４３７（１９６８））は、システインの改変についてのあまり好ましい標的ではない。禁じられたコンフォメーションは、φ角度の正の値を一般的に特徴とする。
【００５５】
他の好ましい改変体は、システインに変異され、かつ−Ｃｙｓ−ＳＳＲ１を含むように係留される場合、Ｒ１の原子を目的の部位に向かって指向するコンホメーションを有するものである。２つの一般的手順が使用されて、これらの好ましい改変体が同定され得る。第１の手順において、独特の構造（Ｈｏｂｏｈｍ，Ｕ．ら．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １：４０９−４１７（１９９２））に関してＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋ（Ｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ｍ．ら  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８：２３５−２４２（２０００））において検索が行われて、ｊ位においてジスルフィド結合されたシステインを含む構造フラグメントが同定される。この位置において、フラグメントの残基ｊ−１、ｊ、およびｊ＋１のその骨格原子は、０．７５平方Å未満のＲＭＳＤと、標的分子の残基ｉ−１、ｉ、およびｉ＋１の骨格原子上で重ね合わせられ得る。フラグメントが、残基ｉのＣβ原子（システインに変異された場合）よりも、目的の部位の何れの原子にもより近いｊ位においてシステインにジスルフィド結合される残基のＣβ原子が位置すると同定される場合、ｉ位が好ましいと考えられる。代替的手順において、ｉ位の残基は、システインへと計算により「変異」され、ジスルフィド結合を介してＳ−メチル基でキャップされる。
【００５６】
種々の組換え技術、化学的技術、合成技術および／または他の技術が、標的が係留に利用可能な所望の数の遊離チオール基を有するように標的を改変するために使用され得る。このような技術としては、例えば、標的ポリペプチドをコードする核酸配列の部位特異的変異誘発が挙げられ、その結果、この核酸配列は、異なる数のシステイン残基を有するポリペプチドをコードする。特に好ましいのは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を使用する部位特異的変異誘発である（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号（１９８７年７月２８日発行）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１５章（Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９１）を参照のこと）。他の部位指向性変異誘発技術もまた、当該分野で周知であり、例えば、以下の刊行物において記載されている：Ａｕｓｕｂｅｌら，前出，第８章；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）；Ｚｏｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）；Ｚｏｌｌｅｒ＆Ｓｍｉｔｈ，ＤＮＡ  ３：４７９−４８８（１９８４）；Ｚｏｌｌｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０：６４８７（１９８７）；Ｂｒａｋｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：４６４２−４６４６（１９８４）；Ｂｏｔｓｔｅｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１１９３（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−８２（１９８７）、Ａｄｅｌｍａｎら，ＤＮＡ  ２：１８３（１９８３）；ならびにＣａｒｔｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：４３３１（１９８６）。カセット変異誘発（Ｗｅｌｌｓら，Ｇｅｎｅ，３４：３１５［１９８５］）、および制限選択変異誘発（Ｗｅｌｌｓら，Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ，３１７：４１５［１９８６］）もまた、使用され得る。
【００５７】
１つを超えるアミノ酸置換を有するアミノ酸配列改変体は、いくつかの方法のうちの１つで生成され得る。そのアミノ酸がポリペプチド鎖中でともに近くに位置する場合、それらは、所望のアミノ酸置換の全てをコードする１つのオリゴヌクレオチドを用いて、同時に変異され得る。しかし、そのアミノ酸が互いにいくらか距離が離れて位置する（例えば、１０アミノ酸を超えて分離されている）場合、所望の変化の全てをコードする単一のオリゴヌクレオチドを生成することはより困難である。代わりに、２つの代替的方法のうちの１つが、使用され得る。第１の方法において、別個のオリゴヌクレオチドが、置換されるべき各アミノ酸について生成される。次いで、これらのオリゴヌクレオチドは、一本鎖テンプレートＤＮＡに同時にアニールされ、そのテンプレートから合成される第２鎖のＤＮＡは、所望のアミノ酸置換の全てをコードする。代替的方法は、所望の変異を生成するために２回を超える変異誘発を含む。
【００５８】
本発明の別の局面において、アロステリックインヒビターを同定するための方法が提供され、この方法は、以下：
ａ）第一の係留実験を実施する工程、および
ｂ）第二の係留実験を実施する工程、
を包含し、ここで、両方の係留実験が、
ｉ）第一の結合部位、第二の結合部位およびこの第二の結合部位またはその近傍の化学反応基を含む標的を提供する工程；
ｉｉ）この標的を、この化学反応基と共有結合を形成し得る化合物と、接触させる工程；
ｉｉｉ）この標的とこの化合物との間の共有結合を形成し、それによって、標的−化合物結合体を形成する工程；および
ｉｖ）この標的−化合物結合体を同定する工程、
を包含し、ここで、
この第一の係留実験が、この第一の結合部位に結合するリガンドの存在下で実施され、そしてこの第二の係留実験が、この第一の結合部位に結合するリガンドの非存在下で実施される。
【００５９】
その基質またはリガンドの非存在下で標的−化合物結合体を形成するが、その基質またはリガンドの存在下では標的−化合物結合体を形成しない化合物は、アロステリックインヒビターの候補である。一実施形態において、その標的は酵素であり、その第１の結合部位に結合するリガンドは、既知の競合的インヒビターである。別の実施形態において、その共有結合は、ジスルフィドであり、その化合物は、マスキングされたジスルフィドを有するリガンド候補である。
【００６０】
本発明の別の局面において、アロステリック調節をし得る標的においてアロステリックインヒビターを同定するための方法が提供される。この方法は、リガンドのアロステリック部位への結合が、もはや標的を阻害しないように、アロステリック部位を無能にすることに依存する。この方法は、以下：
ａ）アロステリック調節をし得る標的およびアロステリック調節をし得ないその変異体を提供する工程；
ｂ）この標的を化合物と接触させる工程；
ｃ）この変異体をこの化合物と接触させる工程；ならびに
ｄ）この標的に対するこの化合物の活性を、変異体に対するこの化合物の活性と比較する工程、
を包含する。
【００６１】
一実施形態において、このアロステリック無能化変異体（ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ  ｄｉｓａｂｌｅｄ  ｍｕｔａｎｔ）は、アロステリック部位を含む、少なくとも１つの残基において変異を有する。別の実施形態において、このアロステリック無能化変異体は、アロステリック部位を含む、少なくとも２つの残基において変異を有する。なお別の実施形態において、このアロステリック無能化変異体は、アロステリック部位を含む、少なくとも３つの残基において変異を有する。
【００６２】
（カスパーゼ）
カスパーゼ（システイニルアスパラギン酸特異的プロテアーゼ）は、サイトカイン成熟およびアポトーシスの両方において中心的（ｐｉｖｉｔａｌ）な役割を果たす細胞内システインプロテアーゼのファミリーである。多くの他のプロテアーゼと同様に、カスパーゼは、不活性チモーゲンとして合成される。これらのチモーゲンは、Ｎ末端プロドメイン、および切断されると、大きなサブユニットドメインおよび小さなサブユニットドメインを生じる切断部位を含む。一般に、Ａｓｐ−Ｘ結合の内部切断は、活性なプロテアーゼのアセンブリおよびそれ自体のプロドメインの切断を可能にする、短いＣ末端の小さなサブユニットを分離する。これらの酵素の活性形態は、２つの大きなサブユニットおよび２つの小さなサブユニットから構成されるヘテロテトラマーである。しかし、この大きさサブユニットおよび小さなサブユニットが同じポリペプチドに由来するので、この活性形態は、しばしば、（本明細書中でいわれるように）ホモダイマーといわれる。
【００６３】
本明細書中に記載される方法を使用して、新規なアロステリック部位が、カスパーゼのダイマー境界面において同定されている。この部位は、カスパーゼ−３において初めて同定され、カスパーゼファミリーの酵素内の顕著な構造類似性に起因して、他のカスパーゼにも存在すると考えられた。例えば、カスパーゼ−３と、カスパーゼ−１（２９％同一性）およびカスパーゼ−９（２４％同一性）との間の相対的に低い配列同一性にも拘わらず、この３つの酵素は、高い程度の構造類似性を共有し、本質的に、互いに重ね合わせることが可能である。Ｍｉｔｔｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：６５３９；Ｒｏｔｏｎｄａら，Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ３：６１９；Ｃｈａｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ），９８：１４２５０−１４２５５；ならびにＷａｔｔら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ７：１１３５−１１４３を参照のこと。さらに記載されるように、このカスパーゼのアロステリック部位が、他のカスパーゼにおいて同定されている。しかし、このカスパーゼのアロステリック部位は、カスパーゼ−３において初めて特徴付けられたので、カスパーゼのアロステリック部位を含む残基は、カスパーゼ−３の番号付けスキームを用いて記載される。
【００６４】
カスパーゼ−３と選択された代表的なカスパーゼとの配列アライメントを図４に示す。このアライメントを、示されたカスパーゼについて以下のアミノ酸を使用して作製した：ＸＰ＿０５４６８６（カスパーゼ−３）；ＮＰ＿１５０６３４（カスパーゼ−１）；ＮＰ−１１６７６４（カスパーゼ−２）；ＡＡＨ１５７９９（カスパーゼ−７）；およびＡＡＨ０２４５２（カスパーゼ−９）。カスパーゼ−３配列とカスパーゼ−１配列、カスパーゼ−２配列、カスパーゼ−７配列、およびカスパーゼ−９配列とのそれぞれの間の整列している残基は、互いに対応していると言われる。例えば、Ｃｙｓ−２６４は、カスパーゼ−３の２６４番目のアミノ酸残基であり、カスパーゼ−１のスレオニン、カスパーゼ−２のチロシン、カスパーゼ−７のシステイン、およびカスパーゼ−９のグリシンに対応する。
【００６５】
他のカスパーゼは、図４に示されるアライメントを参照して整列され得る。あるいは、配列は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ（１．８１）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／）のような標準的なアライメントソフトウェアを用いて整列され得る。
【００６６】
１つの実施形態において、カスパーゼアロステリック部位は、カスパーゼ−３のＣｙｓ−２６４に対応する残基の５Å以内であるカスパーゼの残基を含む。残基は、その原子のいずれかが、カスパーゼ−３のＣｙｓ−２６４に対応する残基のいずれかの原子から５Å以下である場合、５Å以内であると言われる。別の実施形態において、カスパーゼアロステリック部位は、カスパーゼ−３のＣｙｓ−２６４に対応する残基のいずれかの原子から３Å以下であるカスパーゼの残基を含む。
【００６７】
別の実施形態において、カスパーゼアロステリック部位は、カスパーゼ−３の残基に対応する少なくとも２つの残基を含む：Ｇｌｕ−１２４；Ｇｌｙ−１２５；Ｌｙｓ−１３５；Ｌｅｕ−１３６；Ｌｙｓ−１３７，Ｌｙｓ−１３８；Ｉｌｅ−１３９；Ｔｈｒ−１４０；Ｌｅｕ−１５７；Ｐｈｅ−１５８；Ｉｌｅ−１５９；Ｐｈｅ−１９３，Ｌｅｕ−１９４；Ｔｙｒ−１９５；Ａｌａ−１９６；Ｔｙｒ−１９７；Ａｌａ−２００；Ｐｒｏ−２０１；Ｇｌｙ−２０２；Ｃｙｓ−２６４；Ｉｌｅ−２６５；Ｖａｌ−２６６；Ｓｅｒ−２６７；Ｍｅｔ−２６８；およびＬｅｕ−２６９。これらのカスパーゼ−３の残基ならびにカスパーゼ−１、カスパーゼ−２、カスパーゼ−７、およびカスパーゼ−９の対応する残基を、図４で囲む。別の実施形態において、カスパーゼアロステリック部位は、カスパーゼ−３の残基に対応する少なくとも２つの残基を含む：Ｃｙｓ−２６４；Ｉｌｅ−２６５；Ｖａｌ−２６６；Ｓｅｒ−２６７；Ｍｅｔ−２６８；およびＬｅｕ−２６９。
【００６８】
（カスパーゼ−３）
カスパーゼ−３は、クローニングされ、そしてシステイン残基がタンパク質の全体にわたる種々の位置で導入されている変異体が作製された。実施例１は、例示的なセットのシステイン変異体についてのクローニングおよび変異誘発をより詳細に記載する。クローニンされたタンパク質および変異体タンパク質を、実施例２に記載されるテトラペプチド酵素アッセイを使用して特徴付けた。
【００６９】
係留（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）実験を、式
【００７０】
【化６】
2006503264.tif 000005
のリガンド候補のライブラリーを用いて、実施例３に記載されるように、カスパーゼ−３およびそのシステイン変異体を使用して、実施した。ここで、Ｒｃは、先に規定された通りである。これらの係留実験の過程の間、カスパーゼ−３のアロステリック部位は、小さなサブユニット中の天然に存在するシステイン（Ｃｙｓ−２６４）の近位において発見された。
【００７１】
選択されたリガンド候補によって改変された天然に存在するシステインとしてのＣｙｓ２６４の同定を、実施例４に記載する。
【００７２】
２つの選択されたリガンド候補は、化合物１および２であった：
【００７３】
【化７】
2006503264.tif 000006
示された部分は、Ｃｙｓ２６４とジスルフィド結合を形成するリガンド候補のＲｃＣ（＝Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｓ−部分に対応する。図５は、カスパーゼ−３の小さなサブユニットとジスルフィド結合を形成するが、大きなサブユニットとは結合を形成しない化合物１を示す代表的な係留実験である。
【００７４】
化合物１および２は、強く選択され、これらの化合物がアロステリック部位に対して固有の結合親和性を有することを示した。さらに、構造−活性関係を係留実験から観察した。例えば、化合物１が強く選択されるものの、化合物３および４は、そうではない。
【００７５】
【化８】
2006503264.tif 000007
実施例５に記載されるアッセイを使用して、化合物１および２をさらに特徴付け、そして化学量論的な様式でカスパーゼ−３活性を阻害することを示した。図６において示され得るように、阻害％を、化合物１または２とジスルフィド結合を形成するカスパーゼ−３の％を用いて追跡する。注目すべきことに、この阻害は、カスパーゼ−３と化合物２との間のジスルフィド結合の減少の際の酵素活性の回復で実証されるように、可逆である。
【００７６】
これらの化合物が活性ホモダイマーの形成を破壊する可能性を調査しそして排除した。活性ホモダイマーからモノマーへの変換に続くサイジングクロマトグラフィーの溶出プロフィールは、化合物１または２の非存在および存在の両方において、カスパーゼ−３について本質的に同一であった。
【００７７】
代わりに、構造実験によって実証されるように、作用の機構は、アロステリック部位への化合物１または２の結合の際の活性部位の再配列に起因する。注目すべきことに、アロステリック外側部位（ｅｘｏｓｉｔｅ）への化合物１または２の結合は、活性部位での基質の結合を防止する。興味深いことに、逆もまた真実である。活性部位への基質の結合は、アロステリック外側部位への化合物１または２の結合を防止する。言い換えると、活性部位およびアロステリック部位への結合事象は、相互に排他的である。
【００７８】
（カスパーゼ−７）
カスパーゼ−３との５３％の配列同一性およびＣｙｓ−２６４として対応する部位に位置するシステインに基づいて、カスパーゼ−７のアロステリック部位が、カスパーゼ−３のアロステリック部位と同様に挙動することが予期された。化合物１および２が、カスパーゼ−３と同様な様式でカスパーゼ−７を阻害することを確認した後に、カスパーゼ−７は、ｐｒｏ形態、活性ａｐｏ形態および活性阻害された形態で結晶化された唯一のカスパーゼであるので、カスパーゼアロステリック部位の構造研究のために選択した。
【００７９】
実施例６は、化合物１および化合物２と複合体化されたカスパーゼ−７の構造研究のためのクローニングおよび結晶化手順を記載する。これらの化合物は、ダイマー界面における深いポケットに結合する。このポケットが化合物１または２の非存在下においてさえ識別可能であるので、カスパーゼアロステリック部位は、アロステリックインヒビターの存在によって誘導されなかった。化合物１または２を用いるカスパーゼ−７の構造研究は、これらの化合物が、アロステリック部位に特異的に結合することを確認し、そしてアロステリック阻害の背後にある潜在的機構を明らかにする。
【００８０】
カスパーゼの活性形態がホモダイマーであるので、アロステリックインヒビターの２つの分子が、活性複合体に結合する（各小さなサブユニットについて１つの分子）。２つの小さなサブユニットの各々によって形成されるアロステリック結合部位は、互いに空間的に隣接する。
【００８１】
化合物１の２つの分子は、それぞれの部位に結合し、そしてアンチパラレルの方向で互いに面する。２つの分子の間の２つの最も近い原子がそれぞれのカルボニルであり、そして７Åの距離で分離されているので、これらは、互いに相互作用するようではない。実際に、化合物１の２つの分子の間にも、化合物１のいずれかの分子とタンパク質との間にも、直接的な水素結合相互作用の証拠は無かった。しかし、５つの潜在的な水媒介性の水素結合が、化合物１の２つの分子とタンパク質との間で同定された。
【００８２】
対照的に、化合物２の２つの分子は、１つの分子のインドール窒素と他の分子のカルボニル酸素との間で１つの分子内水素結合を形成する縁部−縁部（ｅｄｇｅ−ｔｏ−ｅｄｇｅ）様式で、互いに相互作用する。さらに、３つの直接的な水素結合が、化合物２とタンパク質との間でなされるようである。
【００８３】
２つの異なる結合様式は、化合物１および化合物２が活性部位に対してそれぞれの効果を及ぼす異なる方法で相関するようである。化合物１の場合、この化合物は、その化合物が阻害する活性部位と同じポリペプチドによって形成されるアロステリック部位に結合する。化合物２の場合、この化合物は、１つのポリペプチドによって形成されるアロステリック部位に結合し、そして他のポリペプチドによって形成される活性部位を阻害する。
【００８４】
それにもかかわらず、化合物１または化合物２の結合が活性部位において阻害を達成する機構は、同じであるようである。カスパーゼの活性化は、ｐｒｏ−ペプチドの切断、および大きなサブユニットと小さなサブユニットとの間の切断の両方を必要とする。これらの切断がタンパク質の「活性」形態を与えるものの、得られるカスパーゼは、ペプチド結合溝の構造的再配列が生じるまで、触媒的に適格ではない。
【００８５】
結合された基質の非存在下において、カスパーゼのいわゆる「活性」形態は、触媒的に不活性なコンフォメーションのままである。図７Ａに示されるように、Ａｒｇ−１６４（カスパーゼ−３の番号付けを使用する）（活性部位システインにすぐに隣接する残基）は、活性部位にまで突出し、その結果、ペプチド結合溝は、基質に結合するのに適切なコンフォメーションではない。基質が結合した場合、多くの構造的変化が誘導される。Ａｒｇ−１６４は、タンパク質のコア内に押し込められ、そしてペプチド結合溝は、基質に適合するようになり（図７Ｂを参照のこと）、これらの両方が、酵素の触媒的に適格な形態に必要とされる。
【００８６】
化合物１または２のいずれかに結合されたカスパーゼ−７の構造において、Ｔｙｒ−１９７（カスパーゼ−３の番号付けを使用する）は、タンパク質のコアにおけるＡｒｇ−１６４の埋没（ｂｕｒｉａｌ）を防止するように、変位する。結果として、Ａｒｇ−１６４は、非結合構造において見られるように、上に突出する（図７Ｃを参照のこと）。さらに、ペプチド結合溝は、乱れる。
【００８７】
（カスパーゼ−９）
カスパーゼ−９はまた、アロステリック部位の証拠について研究された。カスパーゼ−７とは異なり、カスパーゼ−９は、カスパーゼ−３と２４％のみの配列同一性を共有する。さらに、カスパーゼ−３のＣｙｓ−２６４に対応する残基は、グリシンであり、システインではない。しかし、天然に存在するシステインはまた、アロステリックポケット内に存在し、カスパーゼ−３のＩｌｅ−２６５に対応する。
【００８８】
実施例７は、カスパーゼ−９のクローニングおよびアッセイのために使用される手順を記載する。カスパーゼ−３と同様に、係留実験は、小さなサブユニットに結合するとして、以下：
【００８９】
【化９】
2006503264.tif 000008
を含むいくつかのリガンド候補を同定した。カスパーゼ−９が小さなサブユニットにおいてただ１つの天然に存在するシステインを含むので、それは、カスパーゼ−３のＩｌｅ−２６５に対応する対応物として容易に同定された。注目すべきことに、この残基は、カスパーゼ−３のＣｙｓ−２６４とほとんど同一の位置である。
【００９０】
カスパーゼ−３の場合のように、これらの化合物がアロステリック部位に特異的に結合するという証拠には、識別可能な構造−活性関係が存在した。例えば、構造
【００９１】
【化１０】
2006503264.tif 000009
を有する化合物８のリガンド候補もまた選択した。この化合物は、さらなるカルボキシル基の存在によって、化合物５と一部異なる。しかし、他のリガンド候補を試験し、選択されないことが見出された。試験されたビアリールエーテルにおいて置換された特定の官能基は、さらなるヒドロキシル基、ニトロ基などを有する化合物を含むか、またはこのカルボキシル基が、以下に示されるような異なる位置で置換される：
【００９２】
【化１１】
2006503264.tif 000010
（ＰＴＰ−１Ｂ）
カスパーゼに加えて、別の以前に未知であったアロステリック部位が、ＰＴＰ−１Ｂ（最近の数年において、糖尿病および肥満のような種々の代謝障害の処置についての非常に確証された標的になったホスファターゼ）において同定された。
【００９３】
ヒトＰＴＰ−１Ｂは、４３５アミノ酸タンパク質である。しかし、全長タンパク質が細菌において十分に発現しないので、ＰＴＰ−１Ｂの研究は、代表的に、タンパク質の最初の３２１アミノ酸または最初の２９８アミノ酸に対応する形態のような短縮形態を使用して実施される。実施例８は、ＰＴＰ−１Ｂの短縮型およびその変異体を作製するためのプロトコルを記載する。
【００９４】
種々のアロステリックインヒビターの存在および非存在下でのＰＴＰ−１Ｂの結晶学的研究は、カスパーゼにおいて同定されたアロステリック部位とは異なり、ＰＴＰ−１Ｂのアロステリック部位が、適合可能であることを示した。言い換えると、アロステリック結合部位は、適切なリガンドの非存在下で識別不可能である。
【００９５】
ＰＴＰ−１Ｂのアロステリックインヒビターの例示的な例は、以下：
【００９６】
【化１２】
2006503264.tif 000011
に示される化合物１５である。
【００９７】
この化合物は、約３０μＭのＩＣ５０で非競合的にＰＴＰ−１Ｂに結合し、そして阻害する。ＰＴＰ−１Ｂの活性を決定するための例示的なプロトコルを、実施例９に記載する。化合物１５のようなアロステリックインヒビターの存在下において、以下の残基によって作製された凹部が形成される：Ｇｌｕ−１８６；Ｓｅｒ−１８７；Ｐｒｏ−１８８；Ａｌａ−１８９；Ｌｅｕ−１９２；Ａｓｎ−１９３；Ｐｈｅ−１９６；Ｌｙｓ−１９７；Ｇｌｕ−２００；Ｌｅｕ−２７２；Ｇｌｕ−２７６；Ｇｌｙ−２７７；Ｌｙｓ−２７９；Ｐｈｅ−２８０；Ｉｌｅ−２８１；およびＭｅｔ−２８２。これらの残基は、化合物が結合する接触表面を形成する。しかし、アロステリックインヒビターの存在下において、この部位の大部分は、残基２８３〜２９８によって形成されるヘリックスの存在によって塞がれ、そして上記残基の大部分が、もはや接近可能ではない。
【００９８】
アロステリックインヒビターの存在下で生じる大きなコンフォメーションの変化は、少なくとも３つの残基（Ｔｙｒ−１５２、Ａｓｎ−１９３、およびＴｒｙｐ−２９１）の相互作用によって媒介され、そしてＰＴＰ−１Ｂについての調節機構の一部であると考えられる。アロステリックインヒビターの非存在下において、Ａｓｎ−１９３のＮδ２（アロステリック部位形成残基の１つ）は、Ｔｙｒ−１５２のＯηと水素結合を形成し、そして残基２８３〜２９８によって形成されるヘリックスは、少なくとも一部、Ｔｒｐ−２９１のインドール環とＰｈｅ−２８０およびＰｈｅ−１９６（これらの両方がまたアロステリック部位形成残基である）のフェニル環との非結合相互作用により、適所に維持される。第４の残基（Ｌｙｓ−１９７（別のアロステリック部位形成残基））もまた、Ａｓｎ−１９３のＮδ２とＴｙｒ−１５２のＯηとの間の水素結合相互作用を維持する際に関与すると考えられる。
【００９９】
化合物１５のようなアロステリックインヒビターの存在下において、残基２８３〜２９８によって形成される螺旋は、変位され、そして／または乱される。化合物１５の場合、ベンゾフラン部分は、Ｔｒｐ−２９１のインドール環を変位する。化合物１５のカルボニル酸素は、Ａｓｎ−１９３のＮδ２と水素結合を形成し、その結果、Ａｓｎ−１９３のＮδ２は、Ｔｒｐ−１５２のＯηに対する水素結合にもはや利用可能ではない。Ａｓｎ−１９３とＴｙｒ−１５２との間の水素結合の破壊は、一部、Ｔｙｒ−１５２のフェノール環のコンフォメーションの変化を媒介する。Ｔｙｒ−１５２のフェノール環の回転は、酵素を機能的に不活性化するＰＴＰ−１Ｂの活性部位におけるコンフォメーションの変化を広げる。
【０１００】
アロステリック形成残基（Ａｓｎ−１９３、Ｐｈｅ−１９６、およびＰｈｅ−２８０）の重要性は、変異誘発実験を使用して一部確認された。変異体ＰＴＰ−１Ｂ（Ａｓｎ−１９３がアラニンに変異され、Ｐｈｅ−１９６がアルギニンに変異され、そしてＰｈｅ−２８０がシステインに変異される）が作製された場合、アロステリック機構は無効になり、化合物１５のようなアロステリックインヒビターは、もはや酵素を阻害し得ない。
【０１０１】
本発明は、さらに、以下の非制限的な実施例によって例示される。
【０１０２】
（実施例１  ヒトカスパーゼ−３のクローニング）
ヒトのカスパーゼ−３（Ｙａｍａ、ＣＰＰ３２ベータとしても公知）を、ジャーカット細胞（クローンＥ６−１；ＡＴＣＣ）から直接クローニングした。手短には、総ＲＮＡを、Ｔｒｉ−試薬（シグマ社）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２で増殖したジャーカット細胞から精製した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、カスパーゼ−３／Ｙａｍａ／ＣＰＰ３２のラージ（大きい）サブユニットおよびスモール（小さい）サブユニットをコードするＤＮＡの増殖を可能にするように、オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。手短には、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ−ＰＣＲビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）および以下のオリゴヌクレオチド：
５’−ＴＴＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＧＧＡＡＴＡＴＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＣＡＧＴＴＡ−３’（配列番号１）および
５’−ＡＡＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＣＴＧＴＣＴＣＡＡＴＧＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＧ−３’（配列番号２）
を用いて、１μｇの総ＲＮＡから、アミノ酸２８−１７５（ラージサブユニットのほとんどを含む）をコードするＤＮＡを直接増幅した。Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ−ＰＣＲビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）および以下のオリゴヌクレオチド：
５’−ＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＧＴＧＧＴＧＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＣＧ−３’（配列番号３）および
５’−ＡＡＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＧＡＴＡＡＡＡＡＴＡＧＡＧＴＴＣＴＴＴＴＧＴＧＡＧ−３’（配列番号４）
を用いて、１μｇの総ＲＮＡから、アミノ酸１７６−２７７（スモールサブユニットのほとんどを含む）をコードするＤＮＡを直接増幅した。
【０１０３】
次に、カスパーゼ−３のラージサブユニットまたはスモールサブユニットのいずれかに対応する増幅したＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩで切断し、標準的な分子生物学の技術を用いて、ＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩで消化したｐＲＳＥＴ−ｂ（インビトロジェン社）中に直接クローニングした。［例えば、Ｔｅｗａｒｉ  Ｍ，Ｑｕａｎ  ＬＴ，Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ  Ｋ，Ｄｅｓｎｏｙｅｒｓ  Ｓ，Ｚｅｎｇ  Ｚ，Ｂｅｉｄｌｅｒ  ＤＲ，Ｐｏｉｒｉｅｒ  ＧＧ，Ｓａｌｖｅｓｅｎ  ＧＳおよびＤｉｘｉｔ  ＶＭ．Ｙａｍａ／ＣＰＰ３２  ｂｅｔａ，ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｏｆ  ＣＥＤ−３，ｉｓ  ａ  ＣｒｍＡ−ｉｎｈｉｂｉｔａｂｌｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｔｈａｔ  ｃｌｅａｖｅｓ  ｔｈｅ  ｄｅａｔｈ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｐｏｌｙ  （ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｃｅｌｌ  ８１  （５），  ８０１−８０９  （１９９５）を参照のこと］。
【０１０４】
スモールサブユニットについて２つの報告されたタンパク質配列があり、そして各々は、１アミノ酸が異なり、アミノ酸１９０位（活性部位のシステインを１６３位とした相対位置）に、アスパラギン酸（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ４２５７４）またはグルタミン酸（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿０５４６８６）のいずれかを有する。両方の形態のクローニング、発現、および精製が成功しており、両者は、機能的に区別できない。
【０１０５】
（一本鎖ＤＮＡの調製）
カスパーゼ−３のラージサブユニットまたはスモールサブユニットのいずれかをコードするＤＮＡを含むプラスミドを、別々にＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ＣＪ２３６細胞（ニューイングランドバイオラブス）中に形質転換し、各々の構築物を含む細胞を、アンピシリン含有寒天プレート上での増殖能力によって選択した。ラージサブユニットおよびスモールサブユニットのオーバーナイト培養物を、別々に２ＹＴ（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）中で、３７℃で増殖させた。各々の培養物を、１：１００で希釈し、そしてＡ６００＝０．３−０．６まで増殖させた。各培養物の１．５ｍＬのサンプルを取り出し、そして１０μＬのファージＶＣＳ−Ｍ１３（ストラタジーン社）で感染し、３７℃で６０分間振盪し、そして各々のオーバーナイト培養物を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンと２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含む２ＹＴ中に１：１００で希釈した感染培養物１ｍＬを用いて調製し、そして３７℃で増殖させた。細胞を、３０００ｒｃｆで１０分間遠心し、そして１／５容量の２０％  ＰＥＧ／２．５Ｍ  ＮａＣｌを上清に添加した。サンプルを室温にて１０分間インキュベートし、次に、４０００ｒｃｆで１５分間遠心分離した。ファージのペレットを、ＰＢＳ中に再懸濁し、１５Ｋｒｐｍで１０分間遠心して、残りの微粒子状の物質を取り除いた。上清を保持し、一本鎖ＤＮＡを、ＱＩＡプレップスピンＭ１３キット（キアゲン社）の手順に従って、上清から精製した。
【０１０６】
（システイン残基に改変する残基の同定）
システイン残基に改変したアミノ酸残基の選択は、カスパーゼ−３の三次元結晶構造を考察することによって、なされた。９つの異なるアミノ酸残基を、システイン残基に改変するために選択した。システイン変異を含む各カスパーゼ−３を、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中で、高レベルで発現した（一般的に１ｍｇ／Ｌより多い）。１例以外の全ての場合において、本発明者らは、正確にリフォールディングした四量体タンパク質の精製に成功し得た（Ｕｎｏ−５  Ｑクロマトグラフィーによって精製される能力によって評価）。しかし、ラージサブユニットのアミノ酸１２１においてヒスチジンのシステインへの変異を含むカスパーゼ−３タンパク質は、通常のクロマトグラフィーでは精製することができなかった。本発明者らは、個々のサブユニットを別々に精製することができたので、本発明者らは、カスパーゼ−３のこの改変体が正確に四量体を形成する（すなわち、ラージサブユニットがスモールサブユニットとリフォールディングする）ことができないことに起因する可能性が高いことが原因であると結論付けた。本発明者らはまた、新たなシステイン残基を有するカスパーゼ−３の全てのバージョンが、触媒活性を有するわけではないことを見出した。例えば、Ｙ２０４Ｃは触媒活性を有さない。
【０１０７】
（一本鎖変異誘発）
スモールサブユニット内のシステイン変異体の例示的な例としては、Ｆ２５６Ｃ；Ｓ２０９Ｃ；Ｓ２５１Ｃ；Ｗ２１４Ｃ；およびＹ２０４Ｃが挙げられる。これらの変異体は、以下のプライマー：
Ｆ２５６Ｃ（５’−ＣＴＴ  ＴＧＣ  ＡＴＧ  ＡＣＡ  ＡＧＴ  ＡＧＣ  ＧＴＣ−３’）、（配列番号５）
Ｓ２０９Ｃ（５’−ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＣＴＴ  ＡＣＡ  ＡＴＴ  ＴＣＧ  ＣＣＡ−３’）、（配列番号６）
Ｓ２５１Ｃ（５’−ＡＧＣ  ＧＴＣ  ＡＡＡ  ＧＣＡ  ＡＡＡ  ＧＧＡ  ＣＴＣ−３’）、（配列番号７）
Ｗ２１４Ｃ（５’−ＣＴＧ  ＧＡＴ  ＧＡＡ  ＡＣＡ  ＧＧＡ  ＧＣＣ  ＡＴＣ−３’）、（配列番号８）および
Ｙ２０４Ｃ（５’−ＴＣＧ  ＣＣＡ  ＡＧＡ  ＡＣＡ  ＡＴＡ  ＡＣＣ  ＡＧＧ−３’）、（配列番号９）
を用いて作製された。
【０１０８】
ラージサブユニット内のシステイン変異体の例示的な例としては、Ｈ１２１Ｃ；Ｌ１６８Ｃ；Ｍ６１Ｃ；およびＳ６５Ｃが挙げられる。これらの変異体は、以下のプライマー：
Ｈ１２１Ｃ（５’−ＴＴＣ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＡＡＧ−３’）、（配列番号１０）
Ｌ１６８Ｃ（５’−ＧＣＣ  ＡＣＡ  ＧＴＣ  ＡＣＡ  ＴＴＣ  ＴＧＴ  ＡＣＣ−３’）、（配列番号１１）
Ｍ６１Ｃ  （５’−ＣＣＧ  ＡＧＡ  ＴＧＴ  ＡＣＡ  ＴＣＣ  ＡＧＴ  ＧＣＴ−３’）、（配列番号１２）および
Ｓ６５Ｃ  （５’−ＡＴＣ  ＴＧＴ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＣＣＧ  ＡＧＡ  ＴＧＴ−３’）、（配列番号１３）  
を用いて作製された。
【０１０９】
約１００ｐｍｏｌの各プラスミドを、１×ＴＭ緩衝液（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ７．５、０．１Ｍ  ＭｇＣｌ２）、ｌｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭ  ＤＴＴ、および５単位のＴ４キナーゼ（ＮＥＢ）を含む緩衝液中で、３７℃で６０分間インキュベートすることによってリン酸化した。キナーゼ処理したプライマーを、２０μＬの反応容量（〜５０ｎｇのキナーゼ処理したプライマー、１×ＴＭ緩衝液、および１０〜５０ｎｇ一本鎖ＤＮＡ）中で、８５℃で２分間、５０℃で５分間、次に４℃で３０〜６０分間インキュベートすることによって、鋳型ＤＮＡとアニーリングした。伸長カクテル（２ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、３０ｍＭ  ＤＴＴ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）、およびＴ７ポリメラーゼ（ＮＥＢ））を、各アニーリング反応物に添加し、そして室温で３時間インキュベートした。変異誘発したＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞中に形質転換し、プラスミドＤＮＡを含むコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートでの増殖によって選択した。ＤＮＡ配列決定を用いて、適切な変異を含むプラスミドを同定した。
【０１１０】
（タンパク質発現および精製）
ラージサブユニット中のシステイン変異をコードするプラスミドＤＮＡを、Ｃｏｄｏｎ  Ｐｌｕｓ  ＢＬ２１細胞中に形質転換し、そしてスモールサブユニット中のシステイン変異をコードするプラスミドＤＮＡを、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞中に形質転換した。野生型ラージサブユニットおよびシステイン変異型ラージサブユニットをコードするプラスミドを含むＣｏｄｏｎ  Ｐｌｕｓ  ＢＬ２１細胞を、１５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２ＹＴ中で一晩、３７℃で増殖させ、すぐに収集した。野生型スモールサブユニットおよびシステイン変異型スモールサブユニットをコードするプラスミドを含むＢＬ２１ｐＬｙｓＳ細胞を、１５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２ＹＴ中でＡ６００＝０．６まで、３７℃で増殖させた。その後、培養物を１ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導し、さらに３〜４時間、３７℃で増殖させた。４Ｋｒｐｍで１０分間の遠心によって細胞を収集した後、細胞のペレットを、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／５ｍＭ  ＥＤＴＡ中に再懸濁し、２回、ミクロ流動化した（ｍｉｃｒｏ  ｆｌｕｉｄｉｚｅ）。封入体を、９Ｋｒｐｍで１０分間の遠心によって単離し、次に、６Ｍのグアニジン塩酸中に再懸濁した。変性したサブユニットを迅速かつ均一に、１００μｇ／ｍＬの濃度で再生緩衝液（ｌ００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＫＯＨ（ｐＨ  ８．０）、１０％スクロース、０．１％  ＣＨＡＰＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、およびｌ０ｍＭ  ＤＴＴ）中に希釈し、室温で６０分間、ゆっくりと攪拌しながら、インキュベートすることによって、再生させた。
【０１１１】
再生したタンパク質を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ  ＤＴＴ、および０．１ｍＭ  ＤＥＴＡを含む緩衝液中で一晩透析した。９Ｋｒｐｍで１５分間遠心し、０．２２μｍの硝酸セルロースフィルターを通して上清をろ過することによって、沈殿物を取り除いた。次に、上清をアニオン交換カラム（Ｕｎｏ５  Ｑ−カラム（バイオラッド））にロードし、正確に折りたたまれたカスパーゼ−３タンパク質を０−０．２５Ｍ  ＮａＣｌ勾配を３ｍＬ／分で用いて、溶出した。各画分のアリコートを、変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動して、カスパーゼ−３タンパク質を含む画分をプールした。
【０１１２】
（実施例２）
本実施例は、カスパーゼ−３の酵素活性を特徴付ける１つの方法を記載する。
【０１１３】
カスパーゼ−３についての最適なテトラペプチド認識モチーフを組み込んだクマリンベースの蛍光発生的な基質を、Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社より購入した。カスパーゼ−３を、１×反応緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．４、０．１％  ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ  ＫＣｌおよび５ｍＭ  β−メルカプトエタノール）に添加して、最終濃度を、〜１．６ｎＭとした。テトラペプチド基質（Ａｃ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＡＦＣ）を、添加して、最終濃度を、５μＭとし、最終的な容量を５０μＬとした。アッセイを黒色の９６ウェル平底ポリスチレンプレート（コーニング社）中で行い、そしてカスパーゼ活性を、３６５ｎｍの励起波長および４９５ｎｍの発光波長を用いて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社のＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＳを用いて、モニターした。速度論データを、室温での１５分間にわたるアッセイによって収集した。
【０１１４】
（実施例３）
本実施例は、カスパーゼ−３またはそのシステイン変異体を使用する、つなぎとめ（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）実験の１つの実施形態を記載する。つなぎとめスクリーニングは、典型的には、５０μＬの容量中で、最終濃度１〜５μＭのカスパーゼ−３、１〜２０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、および１〜２ｍＭのリガンド候補（プール中の全てのリガンド候補の総濃度；従って、〜１０のプール中の各リガンド候補は、１００〜２００μＭの最終濃度を有する）を用いて、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中で行われた。質量分析によって分析する前に、平衡まで反応を進ませた（１時間以上）。反応混合物を、Ｆｉｎｎｅｇａｎ  ＬＣＱ２またはＬＣＱ３  ＬＣＭＳにロードし、分離手順に依存して、各々２〜５分間分析した。逆重畳の後、ラージサブユニットおよび／またはスモールサブユニットを公知の分子量に基づいて同定した。
【０１１５】
（実施例４）
本実施例は、化合物１および２がカスパーゼ−３とジスルフィド結合を形成する、天然に存在するシステインとしてのＣｙｓ２６４の同定を記載する。カスパーゼ−３のスモールサブユニットは、３つのシステイン（Ｃｙｓｌ８４、Ｃｙｓ２２０、およびＣｙｓ２６４）を含む。これら３つの中で、Ｃｙｓ２２０が、埋もれており、従って、可能性として除外された。
【０１１６】
１つの実験において、適切なＤＮＡプライマー（Ｃ１８４Ｓ  ５’−ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＡＴＧ  ＡＧＡ  ＣＧＣ  ＣＡＴ  ＧＴＣ−３’  （配列番号１４）；Ｃ２６４Ｓ  ５’−ＧＧＡ  ＡＡＣ  ＡＡＴ  ＣＧＡ  ＴＧＧ  ＡＡＴ  ＣＴＧ−３’  （配列番号１５）、下線を引いたトリプレットは、導入されたセリン残基を示す）を用いて、１８４位および２６４位のシステインのいずれかを、セリンに変異した変異体を作製した。その後、クローンを、ＤＮＡ配列分析によって確認した。Ｃ１８４Ｓ変異体は、化合物１および２と、標的−化合物結合体を形成し得たが、Ｃ２６４Ｓ変異体は、形成し得なかった。
【０１１７】
システイン残基としてのＣｙｓ２６４の同定を、化合物１との標的−化合物結合体のペプチドマッピングによって、さらに確認した。ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）中のカスパーゼ−３（４μＭ）を、化合物１（２００μＭ）およびβメルカプトエタノール（１ｍＭ）の存在下で、１時間、２５℃でインキュベートした。１００％のスモールサブユニットが化合物１によって改変した時（ＬＣ／ＭＳによって決定した）に、過剰な化合物１および還元剤を、セファデックスＧ−２５カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによって除去した。微量の還元剤または未結合の化合物１が除去されることを確実にするために、タンパク質をＴＥ緩衝液中に１０倍に希釈し、そして、ミリポア５，０００ＭＷＣＯろ過デバイスによって再度濃縮した。このプロセスを、３回繰り返した。改変されたカスパーゼ−３を、９８℃  １分間熱変性し、次に、溶液が室温になるまで、氷上でインキュベートした。熱処理後、約７０％のカスパーゼ−３が、標的−化合物結合体として残った。標的−化合物結合体を、５００ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．０）中のエンドプロテイナーゼＧｌｕ−ｃ（２０ｎｇ／μＬ）によって、２０時間  室温で消化した。ペプチドの質量を、Ｑ−ＳＴＡＲ装置においてＬＣ／ＭＳ分析した。化合物１と共有結合したＣｙｓ２６４を含むペプチドを含む、予測された消化フラグメントの各々の質量を観察した。化合物１に共有結合したＣｙｓ１８４またはＣｙｓ２２０に対応するペプチド質量は、観察されなかった。このことを、ＭＳ／ＭＳによってフラグメント化した後の、トリペプチドＰ２６３Ｃ２６４Ｉ２６５＋化合物１の観察によって、確認した。
【０１１８】
（実施例５）
本実施例は、ジスルフィド形成の程度（標的−リガンド結合体の形成）と、カスパーゼ−３酵素活性の阻害の程度とを相関付ける１つの実施形態を記載する。
【０１１９】
一定濃度のタンパク質（１〜５μＭ）および化合物（典型的には２００μＭ）を用いて、反応物中のβ−メルカプトエタノールの濃度を変化させ、標的−リガンド結合体の形成の程度を変化させた。約１時間後、サンプルを、ＬＣ／ＭＳによって試験して、各β−メルカプトエタノール濃度において、化合物１によって改変されたスモールサブユニットの割合を決定した。同時に、１μＬのサンプルを取り出し、そして１９９μＬの１×反応緩衝液（５μＭのＡｃ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＡＦＣを含む、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．４、０．１％  ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ  ＫＣｌおよび５ｍＭ  β−メルカプトエタノール）に添加した。化合物１の分析のために、２００μＭの化合物および種々の濃度のβ−メルカプトエタノールもまた添加し、その結果、つなぎとめ反応において、β−メルカプトエタノールの最終濃度を同一にした。希釈後、カスパーゼ−３酵素の最終濃度は、〜５ｎＭであった。カスパーゼ活性を、３６５ｎｍの励起波長および４９５ｎｍの発光波長を用いて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社のＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＳを用いて、モニターした。種々の量の化合物１を用いて改変したカスパーゼ−３の相対活性を、化合物１の不存在下での同様の反応条件下で観察された活性と比較した。化合物２を、同様に試験した。
【０１２０】
（実施例６）
本実施例は、化合物１および２と複合体化したカスパーゼ−７の構造研究のためのクローニングおよび結晶化手順を記載する。
【０１２１】
表１において詳細に記載されるように、カスパーゼ−７のラージサブユニット発現のための一連のプラスミドを、カスパーゼ−７の残基５０−１９８または５７−１９８のコード配列を、ｐＲＳＥＴ（ａｍｐｒ、インビトロジェン）またはｐＥＴ３ａ（ａｍｐｒ、ノバジェン）中にサブクローニングすることによって、作製した。
【０１２２】
【表１】
2006503264.tif 000012
スモールサブユニットの発現のために、カスパーゼ−７残基１９９−３０３＋アミノ酸ＱＬＨＨＨＨＨＨ、または同様の添加残基を有する残基２１０−３０３のコード配列を、ｐＢＢ７５（ｋａｎｒ）中に連結した（Ｂａｔｃｈｅｌｏｒ、Ｐｉｐｅｒら、１９９８）。変異Ｄ１９２Ａもまた、ラージサブユニット中に導入し、異質性を最小限とした。プラスミドｐＪＨ０２、０３、０５、  ０８、０９または１１（表２）を、ｐＪＨ０６または０７と組み合わせて形質転換し、過剰発現試験を行った。これらの組み合わせの中で、ｐＪＨ０７および０８、またはｐＪＨ０７および０９が、最も高く過剰発現し、そしてＣｈａｉら、Ｃｅｌｌ  １０４：７６９−８０（２００１）およびＣｈａｉら、Ｃｅｌｌ  １０７：３９９−４０７に記載される方法を用いて、容易に精製された。
【０１２３】
ｐＪＨ０７およびｐＪＨ０８（１０μＭ）から発現されたカスパーゼ−７（Ｄ１９２Ａ）を、化合物１（１００μＭ）によって、５００μＭのβ−メルカプトエタノールを含むＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で１週間室温にてインキュベーションすることによって、標識した。スモールサブユニットの標識は、数時間後、９８％完全であったが（質量分析計によって決定された）、１００％完全な標識を得るために、より長時間行った。化合物２（５０μＭ）によるカスパーゼ−７（Ｄ１９２Ａ）の標識化を、ＴＥ緩衝液中の２５０μＭのβ−メルカプトエタノール存在下で行った。標識は、４時間後に６０％完全であり、１週間後に１００％完全であった。これらのタンパク質をＮＡＰ−５カラム（アマシャムファルマシアバイオテクＡＢ）中での緩衝液交換によって、結晶化のための１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０を含む緩衝液中に移した。標識されたタンパク質を、ミリポア５Ｋ  ＭＷＣＯ濃縮デバイス中で１２ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
【０１２４】
１μＬのタンパク質および２μＬの母液溶液（１００ｍＭ  シトレート緩衝液（ｐＨ５．８）、１Ｍ  ＬｉＳＯ４、１Ｍ  ＮａＣｌ）を含む液滴から、４℃でのハンギングドロップ拡散蒸着によって１週間で形成されたカスパーゼ−７（Ｄ１９２Ａ）／化合物１の結晶。カスパーゼ−７／化合物２の結晶は、１μＬのタンパク質および１μＬの母液である液滴から成長した。いずれかの化合物とのカスパーゼ−７（Ｄ１９２Ａ）の結晶を、２０％グリセロールを含む成長母液の液滴に移し、４℃で一晩インキュベートした。次いで、この結晶を、液体窒素中でフラッシュ凍結した。
【０１２５】
化合物１との複合体についてのデータを、Ｒａｘｉｓ−４検出器を備えるＲｉｇａｋｕジェネレータで収集した。データを、Ｄ＊ｔｒｅｋを用いて処理した。化合物２との複合体についてのデータを、Ｑｕａｎｔｕｍ−３１５  ＣＣＤカメラ（ＡＤＳＣ）で、ＳＳＲＬ  Ｂｅａｍｌｉｎｅ  ９−１にて収集した。データを、Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｃ．Ｃ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａ．Ｄ．５０：７６０−７６３（１９９４）に記載されるように、ＣＣＰ４−ｍｏｓｆｌｍおよびスカラーを用いて処理した。これらの構造を、活性カスパーゼ−７（１Ｋ８６．ｐｄｂ）の構造およびＣＣＰ４−ａｍｏｒｅにおける剛性本体の精製を使用して、直接的分子置換によって解析した。これらの構造を、反復回の、Ｏにおける分子再構築（Ｊｏｎｅｓら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ａ  ４７：１１０−１１９（１９９１））およびＣＣＰ４−ｒｅｆｍａｃにおけるエネルギー最小化によって、精緻化した。最終データ統計を、表２に示す。
【０１２６】
（表２）
【０１２７】
【表２】
2006503264.tif 000013
両方の複合体についての電子密度マップは、このタンパク質のコアと相互作用する化合物１および化合物２の方向を明確に明らかにした。これらの化合物の順序付けられた性質は、これらの係留化合物が特異的様式で結合していることを確認する。これらの化合物についての温度要因は、タンパク質自体由来の周辺原子と同じくらい低いかまたはそれよりも低く、インヒビター分子が、非常によく順序付けられ、そしてランダム様式または擬似様式で結合していないことを示す。
【０１２８】
（実施例７）
ヒトカスパーゼ−９を、刊行された手順（Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｌｖｏ，Ｍら、１９９８．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｓｐａｓｅｓ  ｂｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ  ａｎｄ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ＪＢＣ  ２７３（４９）：３２６０８−３２６１３；Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，ＮＡら、Ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｄｅｆｉｎｅｓ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃａｓｐａｓｅ  Ｆａｍｉｌｙ  ａｎｄ  Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ，ＪＢＣ  ２７２（２９）：１７９０７−１７９１１）に従って、クローニング、発現および精製し、次いで、適切な酵素活性について試験した。カスパーゼ−９酵素を、１×反応緩衝液（１００ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．５）、１０％グルコース、０．１％  ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭ  ＤＴＴおよび１００ｍＭ  ＮａＣｌ）に添加した。２００μＭの最終濃度までの基質の添加（Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＡＦＣ）により反応を開始し、そして最終反応容量を５０μＬにした。アッセイを、黒色９６ウェル平底ポリスチレンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で実施した。カスパーゼ活性を、３６５ｎｍの励起波長および４９５ｎｍの発光波長でＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ’  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＳを使用してモニタリングした。反応速度論的データを、室温での１５分間の実行時間の間に収集した。
【０１２９】
（実施例８）
この実施例は、野生型ヒトＰＴＰ−１Ｂの短縮バージョンを作製するための１つの実施形態を記載する。ヒトＰＴＰ−１Ｂの最初の３２１アミノ酸をコードするｃＤＮＡを、ヒト胎児心臓総ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から単離した。ＰＴＰ−１Ｂ  ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｍ３１７２４．１、Ｃｈｅｒｎｏｆｆ、１９９０）のヌクレオチド９１〜１１４（Ｆｏｒ）に対応するオリゴヌクレオチドプライマーおよびヌクレオチド１０３０〜１０５３（Ｒｅｖ）に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、そしてポリメラーゼ連鎖反応を使用してＤＮＡを生成するために使用した。
【０１３０】
プライマーＦｏｒｗａｒｄは、最初のＡＴＧコドンでＮｄｅＩ制限部位を組み込み、そしてプライマーＲｅｖは、ヌクレオチド１０５３の後ろに、ＵＡＡコドンとその後ろのＥｃｏＲＩ制限部位とを挿入する。ｃＤＮＡを、標準的な分子生物学的技術を用いて、制限ヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そしてｐＲＳＥＴｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。単離されたｃＤＮＡの正体を、ＤＮＡ配列決定分析によって確認した。
【０１３１】
アミノ酸残基１〜２９８をコードする、より短いｃＤＮＡであるＰＴＰ−１Ｂ  ２９８を、ポリメラーゼ連鎖反応において、オリゴヌクレオチドプライマーＦｏｒｗａｒｄおよびＲｅｖ２、ならびにテンプレートとして上記のクローンを使用して生成した。
【０１３２】
【化１３】
2006503264.tif 000014
ヒトＰＴＰ−ｌＢの３２１アミノ酸形態は、以下の配列番号１７である：
【０１３３】
【化１４】
2006503264.tif 000015
変異体を、以下のように作製した。ｐＲＳＥＴｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のＰＴＰ−１Ｂ  ３２１を、テンプレートとして使用し、そしてＴ７プライマーおよびＲＳＥＴｒｅｖプライマーを、「外側」プライマーとして使用した。変異誘発プライマーは、以下であった：
【０１３４】
【化１５】
2006503264.tif 000016
ＰＴＰ−１Ｂ［３２１；Ｎ１９３Ａ；Ｆ１９６Ｒ；Ｆ２８０Ｃ］を、残基１〜２１５に対応する、ＰＴＰ−１Ｂ［３２１；Ｎ１９３Ａ；Ｆ１９６Ｒ］由来のＮｄｅＩ−ＰｓｔＩフラグメントを、残基２１６〜３２１に対応する、ＰＴＰ−１Ｂ［３２１；Ｆ２８０Ｃ］由来のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントと連結することによって、生成した。
【０１３５】
ＰＴＰ−１Ｂ［２９８；Ｎ１９３Ａ；Ｆ１９６Ｒ；Ｆ２８０Ｃ］を、テンプレートとしてＰＴＰ−１Ｂ［３２１；Ｎ１９３Ａ；Ｆ１９６Ｒ；Ｆ２８０Ｃ］を使用するＰＣＲによって生成した。Ｔ７ベクタープライマーを順方向プライマーとして使用して、残基２９８での短縮を、プライマー
【０１３６】
【化１６】
2006503264.tif 000017
を使用して生成した。
【０１３７】
ＰＴＰ−ｌＢ［２９８；Ｃ２１５Ｓ］を、Ｋｕｎｋｅｌ変異誘発およびテンプレートとしてのＰＴＰ−１Ｂ［２９８］を使用して生成した。変異誘発プライマーは、以下であった：
【０１３８】
【化１７】
2006503264.tif 000018
（実施例９）
この実施例は、ＰＴＰ−１Ｂに対する本発明の化合物のＩＣ５０を決定するための１つの例示的な方法を記載する。基質であるｐＮＰＰ（Ｓｉｇｍａ）を、１×ＨＮ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）；１００ｍＭ  ＮａＣｌ；１ｍＭ  ＤＴＴ）中に４ｍＭで溶解させ、そして８３μｌを２μｌのＤＭＳＯまたは２μｌのＤＭＳＯ中化合物と混合した。この反応を、１５μｌの１×ＨＮ緩衝液中のＰＴＰ−１Ｂ（標準的なアッセイ条件で７５０ηｇ）の添加によって開始した。産物形成の速度（ＯＤ４０５ｎｍ−（マイナス）ＯＤ６５５ｎｍ、ＢｉｏＲａｄ  ＢｅｎｃｈｍａｒｋまたはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  １９０）を、２５℃で１５分間にわたって３０秒毎に測定し、データを線形回帰によって分析した。終点アッセイのために、この反応を、５０μｌ  ３Ｍ  ＮａＯＨを用いて１５分後に停止させ、そしてＯＤ４０５ｎｍ−ＯＤ６５５ｎｍを測定した。ＩＣ５０決定のために、非阻害コントロールに対して正規化した速度を、化合物濃度に対してプロットし、そして４パラメータの非線形回帰曲線当てはめ（
【０１３９】
【数１】
2006503264.tif 000019
、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅ）を使用して当てはめた。
【０１４０】
本明細書中で引用される全ての参考文献は、本明細書中で参考として明示的に援用される。本発明は、その特定の実施形態を参照して記載されているが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなしに、種々の変化がなされ得、そして等価物が置換され得ることが、当業者に理解されるべきである。さらに、多くの改変が、特定の状況、材料、物の組成、プロセスなどを適合させるためになされ得る。全てのこのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】図１は、係留方法の１つの実施形態の模式図である。チオール含有タンパク質は、複数のリガンド候補と反応される。標的に対して固有の結合親和性を保有するリガンド候補が同定され、ジスルフィド部分を含まない同定された結合決定基（円によって表される）を含むリガンドが、作製される。
【図２】図２は、２つの係留実験の代表的な例である。図２Ａは、チミジル酸シンターゼ（「ＴＳ」）に対する結合親和性をほとんど有さないか、または全く有さない１０個の異なるリガンド候補のプールとＴＳとの反応の逆重畳質量分析スペクトルである。図２Ｂは、リガンド候補のうちの１つがＴＳに対して固有の結合親和性を保有する１０個の異なるリガンド候補のプールとこの酵素との反応の逆重畳質量分析スペクトルである。
【図３】図３は、係留実験の模式図であり、ここで、チオールは、２つの異なる外部部位か、またはその付近に位置する。図３Ａは、リガンドの外部部位への結合が、標的の機能に影響しない状況を示す。図３Ｂは、リガンドの外部部位への結合が、標的の機能に影響する状況を示す。この場合において、リガンドの外部部位への結合は、活性部位のコンフォメーションを変更し、その結果、これは、標的の機能を阻害する。図３Ｂは、外部部位がまた、アロステリック部位である例である。
【図４】図４は、選択されたカスパーゼの配列整列である。アロステリック部位を含む残基は、四角で囲んである。数字は、カスパーゼ−３における番号付けに対応する。
【図５】図５は、係留実験の結果であり、化合物１が、カスパーゼ−３の小さなサブユニットとジスルフィド結合を形成するが、大きなサブユニットとはジスルフィド結合を形成しないことを示す。
【図６】図６は、カスパーゼ−３活性の阻害と、カスパーゼ−３と化合物１または２との間のジスルフィド形成の度合いとを相関させた実験の結果である。
【図７】図７は、カスパーゼ−７の未結合形態（Ａ）、基質結合形態（Ｂ）、およびアロステリック的に阻害された形態（Ｃ）を示す。
【配列表】
2006503264.tif 000020
2006503264.tif 000021
2006503264.tif 000022
2006503264.tif 000023
【図１】
2006503264.tif 000026
【図２】
2006503264.tif 000027
【図３】
2006503264.tif 000028
【図４】
2006503264.tif 000029
【図５】
2006503264.tif 000030
【図６】
2006503264.tif 000031
【図７】
2006503264.tif 000032
【手続補正書】
【提出日】平成17年10月13日(2005.10.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
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【国際調査報告】
2006503264.tif 000033
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