(57)【要約】本発明はコロイド密度媒体中での遠心分離によってＸ精子細胞とＹ精子細胞を互いに分離することに関する。本方法でＸ精子細胞とＹ精子細胞は、目的のＸおよびＹ９細胞種に近い密度の媒体組成物中で互いに分離することができる。本方法は簡便かつ迅速なものであり、高純度のＸおよびＹ精子細胞がそれぞれ高収率で得られる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遠心分離による密度勾配媒体中の精液サンプルにおいてＸ精子細胞とＹ精子細胞を互いに分離する方法であって、以下の
（ａ）ＸおよびＹ精子細胞を含むサンプルを準備し；
（ｂ）サンプルからＸおよびＹ細胞以外の成分を除去して汚染のない精製サンプルを得；
（ｃ）遠沈管に
ｉ）ＸおよびＹ精子細胞の密度に近い密度となるように選択した密度媒体；および
ｉｉ）ステップｂ）から得られたサンプル
を入れ、
（ｄ）上記の管を遠心分離して、上記媒体中のＸ精子細胞とＹ精子細胞の互いの分離を達成し；さらに
（ｅ）ＸおよびＹ精子細胞を個別に回収する
ステップを含む、方法。
【請求項２】
上記コロイド密度勾配媒体がｐＨ約６〜約８の間および浸透圧約２００〜約４００の間で定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｃ）において上記サンプルを上記遠沈管に加える前に上記媒体中で密度勾配が形成される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記勾配が不連続もしくは連続であるか、または一定の密度で表される、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
上記サンプルが非ヒト哺乳類に由来する、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
上記サンプルがステップｂ）で不連続遠心分離によって精製される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記サンプルがステップｂ）で沈降および／または浮遊によって精製される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
上記分離がＸおよびＹ精子細胞の密度を操作することにより向上される、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＸおよびＹの膨潤を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記サンプルが、ＸおよびＹ精子細胞の密度に近いサンプル−媒体混合物密度を達成するよう上記媒体と混合される、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
上記密度媒体がコロイド密度媒体である、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は密度勾配媒体で遠心分離することによりＸ精子細胞とＹ精子細胞を互いに分離することに関する。
【０００２】
（発明の背景）
特に動物の育種および生産では長年、Ｘ精子細胞とＹ精子細胞を互いに分離できるかどうか、そしてそれにより例えばウシであれば牛乳生産には雌牛のみに、食肉生産には雄牛のみに後代の性を選択することができるかどうかに大きな関心が寄せられてきた。多くの様々な技術が試みられてきたが、全ての商業的要件を満たす技術はまだ１つとしてない。
【０００３】
質的に上手くいくと主張されている技術として、それぞれ９８〜９９％までのＸおよびＹ精子細胞の濃縮を報告する免疫磁気分離とフローサイトメトリーがある（Ａ． Ｔ． Ｐｅｔｅｒ， Ｐ． Ｐ． Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｊ． Ｐ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｇｙ １１−１１８４， １９９３； Ｓｅｘ ｐｒｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ＤＮＡ： Ｕｐｔａｋｅ ｏｎ ｓｕｃｃｅｓｓ ｏｆ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｓｐｅｒｍ ｓｏｒｔｉｎｇ ｆｏｒ ｓｈｉｆｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｘ ｒａｔｉｏ ｔｏ ９０：１０ ｏｒ ｍｏｒｅ． Ｌ． Ａ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｊ． Ｒ． Ｄｏｂｒｉｎｓｋｙ ａｎｄ Ｇ． Ｒ． Ｗｅｌｃｈ． Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｐ２４−１， Ｔｈｅ １３ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ Ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， Ｓｉｄｎｅｙ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ １９９６）。これらの技術は技術的に極めて煩雑であって、単位時間当たりに得られる精子細胞があまりにも少なく、日常的な使用に適当であるとはいえない。
【０００４】
実験は不連続および連続密度遠心分離によりＸ精子細胞とＹ精子細胞を互いに分離するためコロイド密度媒体Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）を用いて行われてきたが、結果は有望なものではなく、不連続法では６０〜７０％の濃縮率に過ぎず、連続法では全く濃縮されなかったことが報告されている（Ａｂｏｕｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｂｕｌｌ ｏｎ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｘ−ａｎｄ Ｙ−ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ ｂｙ ＰｅｒｃｏｌｌＴＭ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ． Ｗ． Ｌａｎｇｅ， Ｈ． Ｐｅｍｓｅｌｌ， Ｓ． Ｂｌｏｔｔｎｅｒ， Ｒ． Ｒｏｓｅｌｉｕｓ， Ｊ． Ｐｆｅｉｌｓｔｉｃｋｅｒ ａｎｄ Ｐ． Ｒｏｍｍｅｌ， Ａｒｃｈ． Ｔｉｅｒｚ．， ３８， ２， １５６−１６１， １９９５； Ａｔｔｅｍｐｔｅｄ ｓｅｘｉｎｇ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ ｂｙ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｏｎ ａ ＰｅｒｃｏｌｌＴＭ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ． Ｇ． Ｃ． Ｕｐｒｅｔｉ， Ｐ． Ｃ． Ｒｉｃｈｅｓ， ａｎｄ Ｌ． Ａ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｇａｍｅｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０： ８３−９２， １９８８）。
【０００５】
米国特許第４，９２７，７４９号では、あるコロイド密度勾配媒体が記載され、これはその媒体で２，０００ｇにて、ヒトＸ精子とＹ精子の間の密度であるとされている１．１８５ｇ／ｍＬの開始密度で１０〜１５分の連続密度遠心分離によりＸ精子細胞とＹ精子細胞を分離できるとしている（実施例１１）。この特許には回収または濃縮回数は示されておらず、科学的な報告を証明するものもなく、そこに示されているパラメーターを検討すると、この方法が実際に証明されたかどうか極めて疑問である。さらにまた、この技術では精子細胞は残渣その他、可能性のある夾雑物から分離されない。従って、このサンプルはその多分散性が最も損なわれている可能性の高い分離を受けている。より重要なことには、米国特許４，９２７，７４９号に従って分離された精子細胞の活性は極めて低いことから、その生成物は育種目的には有用でない。
【０００６】
（発明の概要）
本発明はＸ精子細胞とＹ精子細胞を互いに高収率かつ高純度で分離する簡便かつ迅速な方法を提供する。
【０００７】
本発明は遠心分離により密度勾配媒体中で精液サンプルのＸ精子細胞とＹ精子細胞を互いに分離する方法に関する。この方法は以下の
（ａ）ＸおよびＹ精子細胞を含むサンプルを準備し；
（ｂ）サンプルからＸおよびＹ細胞以外の不要な成分を除去して汚染のない精製サンプルを得；
（ｃ）遠沈管に
ｉ）ＸおよびＹ精子細胞の密度に近い密度となるように選択した密度勾配媒体；および
ｉｉ）精液サンプル
を入れ、
（ｄ）上記の管を遠心分離して、上記媒体中のＸ精子細胞とＹ精子細胞の互いの分離を達成し；さらに
（ｅ）ＸおよびＹ精子細胞を個別に回収する
ステップを含む。
【０００８】
上記において、ステップ（ｂ）で除去されたサンプルの夾雑物は不全精子細胞、精子頭部、細胞残渣、白血球、微生物などをはじめとする精液血漿または射精物に存在するいずれかの不要な夾雑物でありうると理解される。よって、受精目的に有用でない欠陥または異常細胞がステップ（ｂ）で除去される。このサンプルは生理食塩水として提供されることが多い。当業者ならば分かるであろうが、最良の結果のためには本方法をＸおよびＹ精子が不活性な、すなわちそれら自体が上記の分離を妨げる活動を見せない温度で行う。従って本方法は室温以下、例えば１５℃未満または好ましくは約６℃未満といった、ＸおよびＹ細胞ができる限り粒子と同じ程度に振る舞うような温度で行う。
【０００９】
特定の理論にとらわれるものではないが、本発明によって得られる優れた分離結果はおそらく沈降、浮遊および密度の組合せによるものであると考えられる。本方法は、濃度４５重量％のシリカの、例えば１５〜３０ｎｍ粒子（またはある場合にはその範囲未満、例えば約２〜３ｎｍ粒子）のコロイド媒体での精子細胞の大きさ、密度、および排除限界からなる３パラメーター系として考察できるが、これは当業者が解するところ、上述の米国特許第４，９２７，７４９号とは類似しない。
【００１０】
ある実施形態では、本遠心分離は等密度であり、これは各種の細胞が媒体中でその真の浮遊密度に位置するように平衡化するために行われることを意味する。
【００１１】
あるいは、平衡が達成される前に遠心分離を止めてもよく（レートゾーナル条件）、これは細胞間の密度および／または大きさの違いが得られる分離パターンに影響を及ぼすことを意味する。この場合、満足のいく分離が得られるまで分離を行う。特定の系について適正な時間を定めるには、検量線を描けるように試験遠心分離を何回か簡単に行う。
【００１２】
密度に基づく最初のレートゾーナル遠心分離の場合、媒体組成物の密度は精子の密度に近い値、より具体的には沈降させたい場合にはそれより低い値、浮遊させたい場合にはそれより高い値に選択する。
【００１３】
別のレートゾーナル遠心分離では、媒体組成物の密度は精子の密度とは相対的に異なる値に設定し、かけ離れているほど結果はよくなる。様々な遠心分離技術については、第２版改訂２ ＰｅｒｃｏｌｌＴＭ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢを参照。管内の精子細胞の移動速度は下式：
Ｖ＝ｄｒ／ｄｔ＝［Ｄ２（ρｓ−ρｍ）ｇ］／１８η
（式中、
Ｄは細胞の直径であり、
ρｓは精子の密度であり、
ρｍは媒体の密度であり、
ηは用いる媒体の粘度である）
で示すことができる。
【００１４】
サンプルは上記媒体の上層かそのすぐ下に置けばよい。所望によりステップｃ）の媒体は、サンプルを遠沈管に加える前に密度勾配を形成する処理をする。このような事前に形成した勾配は例えば遠心分離または混合によって形成することができる。この勾配は好ましくは平坦または実質的に平面であり、すなわち遠沈管には、少なくとも勾配の中心では、微細な密度差を含む。
【００１５】
この勾配は不連続、連続、または一定の密度によって表されるものなど様々な形態であってよい。密度が連続的である場合、終端部では急勾配となり、中央部では多少平坦となる。この勾配がＸ精子とＹ精子がそれぞれ少なくとも７０％以上、好ましくは１００％に濃縮される画分を回収可能となることを意味する必要分離条件を与えることが重要である。
【００１６】
上記のように、精液サンプルは分離前にステップｂ）で不連続遠心分離により精製する。
【００１７】
もう１つの手段として同時係属ＳＥ ０００４２７１−３に記載されている沈降および浮遊によりサンプルを精製するというものがある。本発明に従って用いられる遠心分離媒体はコロイドシリカに基づく材料など、重い媒体でなければならない。この媒体は不活性であり、塩の存在下でオートクレーブ可能であって、内毒素含量が低いか全く含まず、浸透圧ができる限り低く、好ましくは２０ｍＯｓｍ／ｋｇ未満、高濃度（＞１．３ｇ／ｍｌ；ＲＧ）下で塩が低粘度（＜５ｃＰ）でなければならない。適当な媒体の典型例の１つに、ＲｅａｄｙＧｒａｄｅＴＭ（一般にＲＧと呼ばれ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎから入手できる）がある。あるいは、Ｎｙａｃｏｌなどの商業ソースからシリカ粒子を購入し、使用者が周知の技術に従ってシラン化することもできる。次に、このような媒体を各々の特定の実施形態について望ましいｐＨおよび浸透圧を設定すべく、媒体組成物へと調製することができる。以下、上記のＲｅａｄｉＧｒａｄＴＭに基づくがこのようにして調製された媒体をＲＧフォーミュラと呼ぶ。ある例示的実施形態では、本発明に有用なＲＧフォーミュラはｐＨ約６〜８（例えば約７）、浸透圧約２００〜４００（例えば約３００を超える、好ましくは約３５０）を示す。
【００１８】
上述の、２７％シリカ（７〜２２０ｎｍ粒子）溶液を用いる米国特許第４，９２７，７４９号と比べれば、上記の媒体の性質は極めて異なる粘度効果を示す。
【００１９】
ある実施形態では、本方法は非ヒト哺乳類に由来する精液サンプルを用いる。サンプルがウシである場合、上述の密度はＸおよびＹ精子細胞に近い密度、すなわち約１．１２０ｇ／ｍＬとする。ヒト細胞に関してこれに相当する値も実質的に同じである。一般に例えばサンプルの供給源および用いる分離原理（等密度やレートゾーナル条件）に応じて、本発明では１．０５〜１．３０、例えば１．０６〜１．１３の範囲、特には約１．１２ｇ／ｍｌの密度を用いる。これらの密度は以下実施例の部分に記載されている実験条件下で適用できる。本発明はヒトＸ精子およびＹ精子細胞がそれぞれ１．１８５ｇ／ｍＬを中心とする密度を有する場合の遠心分離に関するものではない。
【００２０】
上記の方法では、例えばｐＨ、サンプルの浸透圧および／または媒体を変更することでＸ精子およびＹ精子細胞の密度を操作することによって分離を向上させることができる。この操作にはＸ精子およびＹ精子細胞の膨潤および／または収縮も含まれうる。
【００２１】
別の手段として、この操作はＸおよびＹを種々の化学化合物および／または生物化合物で誘導体化することで達成しうる。
【００２２】
上記で定義されたような密度勾配でＸ細胞とＹ細胞を互いに分離する上記遠心分離はすべて、分離がどの種の差異（浮遊密度または大きさ）に着目するのかによって、等密度条件下かレートゾーナル条件下のいずれかで行われる。
【００２３】
本発明はまた、上記の分離方法であって、上記サンプルを上記媒体と混合してＸ精子およびＹ精子細胞の密度に近いサンプル−媒体混合物密度を達成する方法に関する。この場合、分離は主として等密度遠分離によって達成される。従って、本発明のこの態様で得られる分離パターンは優先的に精子細胞の種々の浮遊密度に基づくものである。
【００２４】
この密度媒体は上記のタイプのＸおよびＹ精子分離勾配を形成するのに好適ないずれのコロイド密度媒体であってもよい。好ましい媒体はコロイド密度媒体である。コロイド密度媒体の例としては、出典明示により本明細書の一部とする発明者らの同時係属ＳＥ ０００４２７１−３に記載のＲｅａｄｉＧｒａｄ（商標）（ＲＧ）フォーミュラがある。
【００２５】
【実施例】
実施形態例の概説
１．  ＲＧフォーミュラ（＝上記のコロイド媒体）と混合して密度１．０５７ｇ／ｍＬとした水性射精物を遠沈管の底に入れ、密度１．０３０ｇ／ｍＬのＲＧフォーミュラおよびその上にに０．１５０Ｍ ＮａＣｌ溶液を重層した後、これを１０，０００ｘｇで約１５分間遠心分離する。このステップで軽い粒子が浮遊する。精子およびその他の射精物内容物は下相に見られる。
２．  得られた下相をＲＧフォーミュラに再懸濁、混合して密度１．２００ｇ／ｍＬとしたものを新しい遠沈管の底に入れ、密度１．０９０ｇ／ｍＬのＲＧフォーミュラおよびその上に０．１５０Ｍ ＮａＣｌ溶液を重層した後、この管を１，０００ｘｇで約１５分間遠心分離する。変性精子や未熟精子、細胞（大抵は白血球）および存在しうる射精物由来の原生動物は上層に存在する。精子、精子頭部およびその他の射精物内容物は下相に存在する。
３．  得られた下相を再懸濁して新しい遠沈管に移し、密度１．１３０ｇ／ｍＬのＲＧフォーミュラおよびその上に０．１５０Ｍ ＮａＣｌ溶液を重層した後、この管を１，０００ｘｇで約１５分間遠心分離する。このとき、サンプルの無傷で活性のある精子は上相に存在し、一方、細菌、ウイルス、精子頭部およびその他の射精物内容物は下相に存在する。
４．  このようにして分離、濃縮、精製された精子をここで、
（ａ）ＲＧフォーミュラと混合して本来のＸおよびＹ精子細胞混合物の平均密度に相当する密度、典型的には１．１２０ｇ／ｍＬとし、
（ｂ）新しい遠沈管に入れ、
（ｃ）分離が達成されるまで、すなわち、Ｘ精子が濃縮されたバンド、そしてＹ精子が濃縮された別のバンドが現れるまで遠心分離を行う。
【００２６】
典型的な場合では、分離はローターのタイプ（アングル、スイングアウトまたはバーティカルローター）にもよるが１，０００ｘｇで約１時間後に達成される。好ましいのはスイングアウトローターを用いる場合である。
【００２７】
３つのうち最初のステップで、無傷で活性のある精子が機能上能力のない精子、精子頭部および精子のその他残部、細胞および細胞残渣、微生物、また、その他精子に付随し、例えばその後の受精に負の影響を与える溶解物質およびフリーラジカルをはじめとする射精物中のその他全てのものから分離される。よって、精製サンプルが得られる。本明細書において「精製された」とは、ＸおよびＹ精子細胞の分離を損なう可能性のある原精液サンプルの成分が除去されている、または満足のいく分離が達成される程度まで実質的に除去されていることを意味するものとする。
【００２８】
最終のステップでは、Ｘ精子細胞とＹ精子細胞が遠心分離の際のそれらの挙動を基に互いに分離される。系が平衡に達するまでは（レートゾーナル条件）、大きさの違いが分離に影響を及ぼす。何回か経た後、その系は平衡に達し、異なる細胞はそれらの浮遊密度に相当する密度に位置するようになる。細胞の大きさはこのような条件下で得られる分離パターンに小さなまたは無視できる作用しか持たないと考えられる。典型的にはＸおよびＹ精子細胞の浮遊密度の違いは極めて小さく、例えば０．００１０ｇ／ｍＬの規模である。あるいはこの違いはパーセンテージでも表すことができ、この場合望ましい違いは１％未満である。これは遠心分離条件をしかるべく選択しなければならないことを意味し、すなわち、
（ａ）全ての精子をそれらの個々の密度に対して沈降または浮遊させる時間とｇ力に加えて分離するのに十分平坦な勾配を開発した上での等密度条件、または
（ｂ）大きさの違いが分離を助けるようなレートゾーナル遠心分離
である。
【００２９】
その後、Ｘ精子細胞とＹ精子細胞の間の物理的分離は十分大きくなり（例えば、１、２、３またはそれ以上、例えば数ｃｍ）、以下の勾配分画中、それぞれＸおよびＹ精子細胞の、ほぼ１００％といった十分な濃縮が維持される。
【００３０】
精子は第３ステップの後に濃縮され、ＲＧ媒体フォーミュラ例は、第４ステップ前の濃縮精子で約１：２．３の希釈が可能な１．４０ｇ／ｍＬの密度を持つことから、単位時間当たりに大容量の射精物が処理できる。さらにこの技術は実施が簡単で、この方法はコスト効率がよく、日常の使用に十分適したものとなる。
【００３１】
以下、２つの実施例を例として示すが、これに限定されるものではない。
【００３２】
実施例１  ＸおよびＹ精子の精製
３個体の健康な雄牛由来の射精物をプールしたものを０．１５Ｍ ＮａＣｌで１：１０希釈した後、８本の５０ｍＬ管でそれぞれＲＧフォーミュラと混合して最終密度１．０５７ｇ／ｍｌとした（１７ｍＬ １：１０射精物＋２．８ｍＬ ＲＧフォーミュラ）。この混合物を新しい遠沈管（５０ｍＬ）に移し、密度１．０３０ｇ／ｍＬのＲＧフォーミュラ５．０ｍＬおよびその上に０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液５．０ｍＬを重層した。次にスイングアウトローターにて１０，０００ｘｇで約１５分間遠心分離を行った。上相をパスツールピペットで吸引廃棄した。下相（約２０ｍＬ）を再懸濁され、新しい管に移し、１５ｍＬのＲＧフォーミュラと混合して密度１．２００ｇ／ｍＬとし、密度１．０９０／ｍＬのＲＧフォーミュラ５．０ｍＬおよびその上０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液５．０ｍＬを重層した後、１０００ｘｇで約１５分間遠心分離した。次に上相をパスツールピペットで吸引廃棄した後、下相（約２０ｍＬ）を再懸濁させ、新しい管に移し、密度１．１３０ｇ／ｍＬのＲＧフォーミュラ５．０ｍＬおよび０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液５．０ｍＬを重層した後、１０００ｘｇで１５分間遠心分離を行った。この管を上からオートピペットで０．９ｍＬずつ分画した。精製精子を含む８本の分画遠沈管から画分６〜１０をプールした（約３．６ｍＬ）。
【００３３】
上記予備精製工程の後、以下の原理：
ａ）等密度条件、すなわち、浮遊密度によるもの、または
ｂ）レートゾーナル条件、すなわち、異なる細胞の大きさが分離パターンに影響するもの
のいずれかによって本発明に従い、精製されたＸおよびＹ細胞を互いに分離する。
【００３４】
いずれを選択しても対象とする種のＸおよびＹ細胞の密度に近い密度を有する密度勾配媒体を用いる。
【００３５】
ａ）では、サンプルをＲＧフォーミュラと混合するか、ＲＧフォーミュラの上に重層する。ｂ）では、サンプルをＲＧフォーミュラの上に重層する。
【００３６】
実施例２  雄牛のＸ精子とＹ精子の精製および分離
正常な雄牛由来の新鮮な精液を予冷（＋６℃）した後に、２０ｍＬ ８０％調製ＲＧ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ＝６．９、密度＝１．１０ｇ／ｍＬ、浸透圧＝３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ）および１０ｍＬ ４０％調製ＲＧ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ＝６．９、密度＝１．０５ｇ／ｍＬ、浸透圧＝３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ）を含む不連続勾配の上に重層した。スイングアウトローターにて約８００ｇ、＋６℃で３０分間遠心分離した後、８０％層の底部から精製された精子を採取した。Ｘ精子とＹ精子を互いに分離するため、この精製精子の０．５ｍＬアリコート（約０．５ｘ１０９精子）をａ）１０．６５０＋／−０．０００５ｇの調製ＲＧ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ＝６．９、密度＝１．１２１０ｇ／ｍＬ、浸透圧＝３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ）、またはｂ）１０．８００＋／−０．０００５ｇの調製ＲＧ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ＝６．９、密度＝１．１３６８ｇ／ｍＬ、浸透圧＝３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ）のいずれかと混合し、混合したサンプルをスイングアウトローターにて約３，０００ｇ、＋６℃で６０分間遠心分離した。
【００３７】
遠心分離後、ａ）では、勾配の上層からＹ精子が濃縮された画分が回収され、ｂ）では、底部の画分からＸ精子が濃縮された画分が回収された。
【国際公開パンフレット】
2004516035.tif 000002
2004516035.tif 000003
2004516035.tif 000004
2004516035.tif 000005
2004516035.tif 000006
2004516035.tif 000007
2004516035.tif 000008
2004516035.tif 000009
2004516035.tif 000010
2004516035.tif 000011
2004516035.tif 000012
2004516035.tif 000013
2004516035.tif 000014
2004516035.tif 000015
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004516035.tif 000016
【国際調査報告】
2004516035.tif 000017
2004516035.tif 000018
2004516035.tif 000019