(57)【要約】本発明は、アポトーシスのような神経死を伴う中枢神経系の、またはレプチン代謝に関係する病状もしくは障害を予防および／もしくは治療するための化合物の検出方法における、ＧＲＦ１タンパク質の全体もしくは一部、またはＧＲＦ１タンパク質の全体もしくは一部を発現する細胞の使用に関する。中枢神経系の病状は、とりわけ脳虚血、パーキンソン病もしくはアルツハイマー病である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経死を伴う中枢神経系の、または肥満もしくはレプチン代謝に関連する病理学的状態もしくは障害の予防および／もしくは治療に意図される化合物の検出方法における、ＧＲＦ１タンパク質の全部もしくは一部、またはＧＦＲ１タンパク質の全部もしくは一部を発現する細胞の使用。
【請求項２】
前記検出方法が、ＧＲＦ１タンパク質のリン酸化を測定することよりなる段階を含んで成ることを特徴とする、請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記方法が、低分子量Ｇタンパク質のファミリーのタンパク質、とりわけＲａｓ、ＲａｃおよびＣｄｃ４２上のＧＲＦ１タンパク質の交換活性を測定することよりなる段階を含んで成ることを特徴とする、請求項１記載の使用。
【請求項４】
前記方法が、ＧＲＦ１タンパク質とヘテロ三量体Ｇタンパク質のβ−γサブユニットとの間の相互作用を測定することよりなる段階を含んで成ることを特徴とする、請求項１記載の使用。
【請求項５】
前記検出方法が、スクリーニングされるべき化合物を、ｇｒｆ１で形質転換された酵母と接触させることよりなる段階を含んで成ることを特徴とする、請求項１記載の使用。
【請求項６】
前記検出方法が、スクリーニングされるべき化合物を、ｇｒｆ１で形質転換されかつその中でＣＤＣ２５および／もしくはＣＤＣ２４遺伝子が不活性化もしくは変異されている酵母と接触させることよりなる段階を含んで成ることを特徴とする、請求項５記載の使用。
【請求項７】
前記検出方法が、スクリーニングされるべき化合物を、Ｒａｓ、ＣＤＣ４２ＨｓもしくはＲａｃとＤＮＡと相互作用するドメインとの間の融合タンパク質よりなる第一のハイブリッドタンパク質、およびＧＲＦ１の全部もしくは一部とトランス活性化ドメインとの間の融合タンパク質よりなる第二のハイブリッドタンパク質を発現する酵母と接触させることよりなる段階を含んで成ることを特徴とする、請求項１記載の使用。
【請求項８】
前記検出方法が、スクリーニングされるべき化合物を、ＧＲＦ１の全部もしくは一部、トランス活性化ドメインと融合されたＰＡＫ１（ＣＲＩＢドメイン）、およびＤＮＡと相互作用するドメインと融合されたＲａｃもしくはＣＤＣ４２Ｈｓを発現する酵母と接触させることよりなる段階を含んで成ることを特徴とする、請求項１記載の使用。
【請求項９】
前記検出方法が、スクリーニングされるべき化合物を、ＧＲＦ１の全部もしくは一部、トランス活性化するドメインと融合されたＲａｆ１（ＲＢＤ）およびＤＮＡと相互作用するドメインと融合されたＲａｓを発現する酵母と接触させることよりなる段階を含んで成ることを特徴とする、請求項１記載の使用。
【請求項１０】
病理学的状態が脳虚血、パーキンソン病もしくはアルツハイマー病であることを特徴とする、先行する請求項のいずれか１つ記載の使用。
【請求項１１】
（ｉ）リン酸化された基質および試験化合物の存在下でＧＲＦ１タンパク質を発現する細胞よりなる細胞を培養すること、
（ｉｉ）前記細胞を溶解すること、ならびに
（ｉｉｉ）標識されたＧＲＦ１タンパク質の量を測定すること
からなる段階を含んで成る、神経死を伴う中枢神経系の、またはレプチン代謝に関連する病理学的状態の予防および／もしくは治療に意図される化合物のスク
リーニングもしくは検出方法。
【請求項１２】
（ｉ）試験化合物の存在下でＧＲＦ１タンパク質を発現する細胞よりなる細胞を培養すること、
（ｉｉ）前記細胞を溶解すること、および
（ｉｉｉ）リン酸化されたアミノ酸に特異的な抗体を使用してリン酸化されたＧＲＦ１の量を測定すること
から成る前段階を含んで成る、神経死を伴う中枢神経系の、またはレプチン代謝に関連する病理学的状態の予防および／もしくは治療に意図される化合物のスクリーニングもしくは検出方法。
【請求項１３】
（ｉ）ＧＦＲ１タンパク質、標識されたＧＤＰもしくはＧＴＰで負荷された低分子量Ｇタンパク質ファミリーの１種のタンパク質の全部もしくは一部、および試験化合物を接触させること、
（ｉｉ）それぞれ未標識のＧＴＰもしくはＧＤＰを添加すること、ならびに
（ｉｉｉ）標識されたＧタンパク質の量を測定すること
から成る段階を含んで成る、神経死を伴う中枢神経系の、またはレプチン代謝に関連する病理学的状態の予防および／もしくは治療に意図される化合物のスクリーニングもしくは検出方法。
【請求項１４】
（ｉ）不死化された哺乳動物細胞をｇｒｆ１導入遺伝子を発現するベクターでトランスフェクトし、前記細胞に選択剤に対する耐性を賦与すること、
（ｉｉ）トランスフェクトされかつ導入遺伝子を発現する前記細胞を選択しかつクローン化すること、およびそれらをアガー成長支持体中にクローン化すること、
（ｉｉｉ）前記試験化合物を前記細胞の懸濁物に添加すること、ならびに
（ｉｖ）クローンの数の減少により前記ＧＲＦ１を阻害する化合物を検出すること
からなる段階を含んで成る、神経死を伴う中枢神経系の、またはレプチン代謝に関連する病理学的状態の予防および／もしくは治療に意図される化合物の、細胞スクリーニングによるかつインビトロによる検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は生物学の分野に関しおよびニューロン中の細胞のシグナル伝達の分野に関する。より具体的には、本発明は神経死に対する保護および肥満の治療の活性を表す分子をスクリーニングするためのＧＲＦ１（グアニンヌクレオチド放出因子１）タンパク質の全部もしくは一部の新規使用に関する。図１Ａに略図的に表されているＧＲＦ１タンパク質は、元はｐ２１Ｒａｓタンパク質の活性化状態を調節するその能力についてヒトで発見された。ヒト、マウスおよびラットのＧＲＦ１タンパク質の配列はそれぞれ配列、配列番号１、配列番号２および配列番号３である。ＷＯ  ９３／２１３１４明細書および米国特許第５，６５６，５９５号明細書は、このタンパク質のヒトの形態の同定、単離およびまた特徴づけを記述する。
【０００２】
ＧＲＦ１はＰＨ、ＩＱ、ＤＨおよびＣＤＣ２５ドメインと命名されるいくつかの機能的ドメインを有し、それらの意味および関与を下に明記する。
【０００３】
ヒト、マウスおよびラットタンパク質の配列上のＧＲＦ１の機能的ドメインの位置を下の表に示す。
【０００４】
ＧＲＦ１は、癌原遺伝子Ｄｂ１の一領域と強い配列の相同性を表すＤＨ（Ｄｂ１相同性）ドメインを含んで成る。Ｄｂ１は、細胞骨格の運動性もしくは「ストレス」キナーゼの活性化のいずれかを制御する多様な細胞シグナルの調節に関与するＲｈｏ／Ｒａｃ／Ｃｄｃ４２Ｈｓファミリーの低分子量Ｇタンパク質の交換因子（ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｆａｃｔｏｒ）である（１）。
【０００５】
Ｄｂ１タンパク質中では、Ｒｈｏファミリーのタンパク質上のＧＤＰ／ＧＴＰの交換の活性はＤＨドメインが有する。このドメインは、ＧＲＦ１タンパク質およびＳＯＳタンパク質を包含する他の低分子量Ｇタンパク質交換因子中に見出される。ＧＲＦ１のＤＨドメインが、Ｒａｃに対して機能的であり（ＧＴＰ形態でのＲａｃの活性化）かつヘテロ三量体Ｇタンパク質のβ／γサブユニットを過剰発現する培養物中の細胞でのＪＮＫ１の活性化につながることを示唆する結果が公表されている（２）。さらに、カルシウムによるＧＲＦ１タンパク質の活性化は無傷のＤＨドメインを必要とすることを示す部位特異的変異誘発実験の結果により、ニューロン突起中でのＧＲＦ１のＤＨドメインの機能的役割もまた示唆されている（３，４）。
【０００６】
カルシウムは神経活動、すなわち神経媒介物質の分泌、ニューロンの成長、細胞の死／生存、シナプス伝達の適合および刺激、ある種の遺伝子の転写活性化の調節において重要な役割を演じている。新生ラット大脳皮質ニューロンの初代培養物で実施された研究は、ＧＲＦ１によるＲａｓの活性化がカルシウムの存在下で増大されることを示した。この活性化はＧＲＦ１のＩＱドメインへのカルモジュリンの結合により調節される（３−５）。
【０００７】
Ｒａｓタンパク質（Ｈａ、ＫｉおよびＮ−Ｒａｓ）についてのＧＲＦ１の交換活性に関して、それは該分子のカルボキシ末端に配置されるビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＣＤＣ２５に相同な領域により運搬される（６）。
【０００８】
ＧＲＦ１は、タンパク質間の相互作用のドメインでありそしておそらくヘテロ三量体Ｇタンパク質のβ−γサブユニットへの結合に関与している２個のＰＨ（プレクストリン（Ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ）相同性）ドメインを有する（７−９）。
【０００９】
癌原遺伝子Ｒａｓに対するその交換活性について当初発見されたＧＲＦ１タンパク質の機能は、今日、より詳細に知られている。遍く発現されるＲａｓの３種の他の交換因子、ＳＯＳ１、ＳＯＳ２およびＧＲＦ２タンパク質と反対に、ｇｒｆ１遺伝子の発現はヒト、マウスおよびラットの中枢神経系に限定されることが今や受け入れられている（６，１０，１１）。
【００１０】
脳中では、この発現の局所配置（ｒｅｇｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）は微細に研究されている。ラットにおいて、それは海馬、新皮質、小脳の前葉の若干の小脳核および顆粒細胞中で多量である（１２）。マウスにおいてもまた、それはまた扁桃体（１３）および視床下部（１４）中で豊富であると記述されている。
【００１１】
中枢神経系に存在する多様な細胞型のなかで、ｇｒｆ１遺伝子の発現はニューロンに限定されているようである（１５）。この遺伝子は時に従って厳密な転写制御を受ける。それは胚生活の間は発現されず、そして生誕の時点でのみ転写されることを開始して、約第１５日に最大レベルに到達する（１４，１５）からである。
【００１２】
ｇｒｆ１の発現は、両親からの刷り込み（ｐａｒｅｎｔａｌ  ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ）と呼ばれる特定の転写機構により制御され、それは、マウスにおいては父親の起源の遺伝子座からの遺伝子の発現をもたらす一方、母親の遺伝子座はサイレントである（１４，１６）。通常は両親からの刷り込みにさらされるいくつかの遺伝子（癌原遺伝子）が、刷り込み機構の喪失が存在しかつ２つの遺伝子座が転写される場合に細胞増殖および腫瘍の出現に関与することが見いだされたことは興味深い。
【００１３】
ＳＯＳ交換因子によるＲａｓ活性化の経路は十分に報告されているとは言え、ＧＲＦ１を使用するシグナル伝達経路およびインビボでのその生物学的機能については非常にわずかしか知られていないようである。
【００１４】
ＳＯＳファミリーのＲａｓ交換因子と反対に、ＧＲＦ１は、チロシンキナーゼ活性をもつ受容体へのリガンドの結合から生じるシグナルを伝達しないが、しかしむしろ、７個の膜貫通ドメインをもつヘテロ三量体Ｇタンパク質共役型受容体から生じるものを伝達するようである（１７−１９）。
【００１５】
最後に、ｇｒｆ１遺伝子を不活性化する変異を有するマウス（もはやＧＲＦ１を発現しない、相同的組換え技術により得られるノックアウトもしくはＫＯマウス）の表現型を研究することによって、インビボのＧＲＦ１の生物学的機能のいくつかに言及することが可能であったことに注目することができよう（１３，１４）。これらの動物は「嫌悪（ａｖｅｒｓｉｖｅ）」刺激を使用する学習および記憶の試験で比較的乏しい成績を上げるか、もしくは欠陥でさえある。この研究の著者らによれば、扁桃体と呼ばれる脳の領域の完全性が変異体マウス中で損なわれておりそして観察される表現型の原因であると考えられる（１３）。しかしながら、治療的活性を表す分子をスクリーニングするためのこれらのマウスの可能な使用に関して指摘が与えられていない。
【００１６】
脳虚血もしくは脳外傷（急性もしくは事故性損傷）のような脳への物理的損傷、ならびにアルツハイマー病およびパーキンソン病のような神経変性性疾患は、先進諸国の死亡および罹病の主要原因の１つのままである。
【００１７】
アポトーシスがこの損傷につながる機構の１つを構成することが示されている。
【００１８】
中枢神経系への攻撃により引き起こされる多様な生理病理学的事象に作用するかなりの数の分子が、多様なモデルおよび種における実験的研究で成功裏に評価されている。それらのいくつかはこれらの障害のために臨床試験で使用されたかもしくは使用されているとは言え、試験された分子のいずれも、フェーズＩＩＩ試験の間、もしくはそれらが市場に導入された場合に、いかなる真の有効性も示していない。脳虚血を治療するために現在使用されている唯一の医薬は、いかなる出血の危険も表さない患者においてのみ血栓溶解薬を注入することよりなる。
【００１９】
本発明者は、ｇｒｆ１遺伝子を不活性化する変異を有するマウスを研究することにより、ＧＲＦ１タンパク質の発現の非存在が脳虚血の間の脳に対する物理的損傷に対する保護を賦与することを示した。
【００２０】
さらに、数十年にわたり、肥満は工業国で大きな公衆衛生上の問題となっており、そこではそれは今や人口の２０ないし３０％を冒している。これらの数は今後数年のうちに恐怖を抱かせるほどさらに増大するはずである。その原因が多元的であり、そしてその起源は、多かれ少なかれ、一方で環境的要因（食餌習慣、食物への到達手段、熱量の消費、など）および他方で複数の遺伝的根源に存しているため、肥満は医薬に対する真の挑戦を構成している。
【００２１】
体重に結び付けられる疾患の生理病理学は複雑かつ不均質である。肥満は、普遍的には、死亡の増大された危険、心血管系疾患、インスリン非依存型糖尿病およびインスリン抵抗性を伴う。不安およびうつのような心理学的および行動障害もまた、該疾患の臨床像に加えられていた。さらに、そして表現型的に該スペクトルの反対端に、過剰の減量、とりわけ環境的（栄養不良）もしくは病理学的（例えば精神的食欲不振）情況は、かなりの罹病率および死亡率を伴っている。これらの多様な理由から、体重増加で役割を演じている遺伝子の同定は、力点が肥満の治療に置かれるにしろ過剰な減量のものに置かれるにしろ、かなりの価値がある。
【００２２】
本発明者は、ｇｒｆ１遺伝子を不活性化する変異を有するマウスを研究することにより、ＧＲＦ１タンパク質の発現がレプチンの発現の調節に不可欠であることを示した。レプチンは、体重増加の制御において主要な役割を演じている飽満の感情と関連するサイトカインである（２０）。
【００２３】
今ここで要約したところの科学的情況内で、とりわけ神経アポトーシスを伴うもしくはレプチン代謝と関連する障害をもたらし得る関係する多様な機構のより良い理解のニーズがなお存在する。
【００２４】
中枢神経系の障害の治療および肥満の治療において有効である医薬製品に対する必要性もまた存在する。
【００２５】
本発明者は、とりわけ中枢神経系に影響を及ぼす障害および肥満の予防および／もしくは治療に意図される化合物について探索することに着手した。
【００２６】
研究モデルとしてｇｒｆ１遺伝子を不活性化する変異を有するマウスを使用して、ＧＲＦ１がこれらの障害に関与していることが示された。
【００２７】
本発明は、従って、アポトーシスのような神経死を伴う中枢神経系の、もしくはレプチン代謝に関連する病理学的状態もしくは障害の予防および／もしくは治療に意図される化合物の検出方法における、ＧＲＦ１タンパク質の全部もしくは一部、またはＧＲＦ１タンパク質の全部もしくは一部を発現する細胞の使用に関する。それはまた、神経死を伴う中枢神経系の、または肥満もしくはレプチン代謝と関連する病理学的状態もしくは障害の予防および／もしくは治療に意図される化合物にも関する。
【００２８】
ＧＲＦ１タンパク質は優先的にヒト起源のものである。しかしながら、それはいずれかの他の起源のものであってよく、また、とりわけ、マウスＧＲＦ１タンパク質もしくはいずれかの他の哺乳動物のＧＲＦ１タンパク質であってよい。それはまた、ＧＲＦ１タンパク質、そしてとりわけ配列番号１を有するヒトＧＲＦ１タンパク質、または配列番号２もしくは配列番号３を有するものような動物起源のＧＲＦ１タンパク質と、最低８５％、および優先的に９０％の同一性を表すいずれかのタンパク質であってもよい。「ＧＲＦ１タンパク質の一部」という表現は、ＧＲＦ１タンパク質の機能的一部を含んで成るアミノ酸配列、およびとりわけＧＲＦ１タンパク質のＰＨ、ＤＨもしくはＣＤＣ２５ドメインの１つの全部もしくは一部に対応する配列を意味することを意図している。
【００２９】
本発明の主題であるスクリーニング方法の利点の１つは、とりわけＪＮＫの上流であるＧＲＦ１の位置の点にあり（図１Ｂ）、これは、ＧＲＦ１が関与するＪＮＫ活性化経路を特異的に調節することが可能であるという利点を有する。
【００３０】
別の利点はこれらの化合物が毒性を欠如していることを示したことにあり、ｇｒｆ１−ノックアウトマウスは生存可能でありかつ健康である。
【００３１】
ＧＲＦ１タンパク質の全部もしくは一部を使用する本発明のスクリーニング方法は：
−ＧＲＦ１タンパク質のリン酸化；または
−直接もしくは間接的に、Ｒａｓファミリー（Ｈａ、Ｋ、Ｎ−Ｒａｓ）のタンパク質もしくはＲａｃおよびＣｄｃ４２タンパク質のいずれか上のＧＲＦ１タンパク質の交換活性、または
−ＧＲＦ１タンパク質と、ヘテロ三量体Ｇタンパク質のβ−γサブユニットもしくはＲａｓファミリーの低分子量Ｇタンパク質、すなわちＲａｃおよびＣｄｃ４２との間の相互作用；
−ＧＲＦ１による細胞の形質転換
を測定することよりなる段階を含んでよい。
【００３２】
従って、第一の有利な態様によれば、本発明は：
（ｉ）標識されたリン酸化された化合物および試験化合物の存在下でＧＲＦ１タンパク質を発現する細胞を培養すること、
（ｉｉ）前記細胞を溶解すること、ならびに
（ｉｉｉ）標識されたＧＲＦ１タンパク質の量を測定すること
から成る段階を含んで成る、神経死を伴う中枢神経系の、またはレプチン代謝に関連する病理学的状態の予防および／もしくは治療に意図される化合物のスクリーニングもしくは検出方法に関する。
【００３３】
段階（ｉｉ）で得られる細胞ライセートは、抗ＧＲＦ１抗体で前被覆された微小滴定プレートのウェル中でインキュベートすることができる。
【００３４】
ＧＲＦ１のリン酸化はまた、リン酸化されたアミノ酸に特異的な抗体を使用して測定することもできる。
【００３５】
従って、別の有利な態様によれば、本発明は：
（ｉ）試験化合物の存在下でＧＲＦ１タンパク質を発現する細胞を培養すること、
（ｉｉ）前記細胞を溶解すること、
（ｉｉｉ）リン酸化されたＧＲＦ１の量を測定すること
から成る段階を含んで成る、神経死を伴う中枢神経系の、またはレプチン代謝に関連する病理学的状態の予防および／もしくは治療に意図される化合物のスクリーニングもしくは検出方法に関する。
【００３６】
リン酸化されたＧＲＦ１の量は、優先的に、リン酸化されたアミノ酸に特異的な抗体を使用して測定する。
【００３７】
前記細胞は、Ｐ３２もしくはＰ３３で標識されたオルトリン酸を含有する培地中で培養することができる。
【００３８】
ＧＲＦ１タンパク質のリン酸化は、培地にカルバコールを添加することにより前記神経細胞中で、そうでなければ血清を一夜奪われそしてその後血清の存在下で再インキュベートされる細胞系中で、あるいは三量体Ｇタンパク質のβ−γサブユニット、β１γ２もしくはβ１γ５をコードするｃＤＮＡでコトランスフェクトされ、その後血清を一夜奪われそしてその後血清の存在下で再インキュベートされる細胞系中で、実施することができる。
【００３９】
本発明の別の態様によれば、該スクリーニングは低分子量Ｇタンパク質ファミリーのある種のタンパク質（Ｒａｓ、Ｒａｃ、Ｃｄｃ４２）上のＧＲＦ１の交換活性を測定することを含んで成る。従って、なお別の有利な態様によれば、本発明は：
（ｉ）ＧＲＦ１タンパク質の全部もしくは一部、標識されたＧＤＰもしくはＧＴＰで負荷された低分子量Ｇタンパク質ファミリーの１種のタンパク質、および試験化合物を接触させること、
（ｉｉ）それぞれ未標識のＧＴＰもしくはＧＤＰを添加すること、
（ｉｉｉ）標識されたＧタンパク質の量を測定すること
から成る段階を含んで成る、神経死を伴う、もしくはレプチン代謝に関連する中枢神経系の病理学的状態の予防および／もしくは治療に意図される化合物のスクリーニングもしくは検出方法に関する。
【００４０】
低分子量Ｇタンパク質ファミリーのこうしたタンパク質はとりわけＲａｓ（５３，５４，５５）、Ｒａｃ（５６，５７，５８）もしくはＣｄｃ４２（５９）であってよい。
【００４１】
Ｒａｓファミリーのタンパク質もしくはＲａｃおよびＣＤＣ４２タンパク質上のＧＲＦ１タンパク質の交換活性は、微小滴定プレートのウェル中で、トリチウム化されたＧＤＰで負荷された組換え状態の前記低分子量Ｇタンパク質、コールドのＧＴＰ、および組換え状態のＧＲＦ１タンパク質の全部もしくは一部を含んで成る反応混合物をインキュベートすることにより、非細胞生物培地中でインビトロで測定することができる。前記反応混合物のアリコート画分を採取し、そしてメンブレンで濾過し、そしてその上に保持される放射活性を測定するか、そうでなければ前記ウェルのそれぞれの内容物をＰＤ１０カラムを通過させ、そして溶出物の放射活性を測定する。
【００４２】
組換え状態の前記低分子量Ｇタンパク質は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）中または哺乳動物細胞中で発現させる野生型または融合タンパクの型の、または昆虫細胞中で発現され精製されるバキュロウイルスにおけるタッグ型の、Ｒａｓ、Ｃｄｃ４２またはＲａｃタンパク質から成る群から選択されよう。交換されたヌクレオチドの量は保持により示すことができる。
【００４３】
有利には、ＧＳＴ−Ｒａｆ（ＲＢＤドメイン）もしくはＧＳＴ−ＰＡＫ（ＣＲＩＢドメイン）融合タンパク質、ならびに抗ＧＳＴ  ＩｇＧおよび微小球にＰＶＴ結合されたＳＰＡ（シンチレーションプロキシミティアッセイ（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ））プロテインＡ（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））の混合物を添加し、そして前記微小滴定プレートの蛍光を遠心分離後に測定する。ＧＤＰ結合型の形態は相互作用を可能にしない。ＰＡＫおよびＲａｆの配列は公表されている（それぞれ参考文献６０ないし６４および６５ないし６９を参照されたい）。
【００４４】
Ｒａｓ（もしくはＲａｃ）組換えタンパク質をコールドのＧＤＰとインキュベートする。Ｒａｓ−ＧＤＰ（もしくはＲａｃ−ＧＤＰ）が生じる。トリチウム化されたＧＴＰおよびＧＲＦ１をその後添加する。変換反応が起こる。Ｒａｓ−トリチウム化されたＧＴＰが生じる。６０分後、ＧＳＴ−Ｒａｆ融合タンパク質を添加する（もしくはＲａｃを用いて作業する場合はＧＳＴ−ＰＡＫ）。融合タンパク質はＲａｓ−ＧＴＰと相互作用し、培地中のその量はＧＲＦ１の交換活性に依存する。抗ＧＳＴ抗体に結合されている微小球を添加する。ＧＳＴ−Ｒａｆ／Ｒａｓ−トリチウム化されたＧＴＰ複合体が球体に付着する。これらの球体は、それらが放射活性源の近傍にある場合に発光する能力を有する。それらはその後、Ｒａｓ−ＧＴＰの比率、そして従って培地中のＧＲＦ１の交換活性を定量することを可能にする。
【００４５】
該スクリーニング方法はまた細胞系中でも使用することができる。
【００４６】
従って、それは、スクリーニングされるべき化合物を、ｇｒｆ１で形質転換されかつその中でＣＤＣ２５および／もしくはＣＤＣ２４遺伝子が不活性化もしくは変異されている酵母と接触させることにより実施してよい。有利には、こうした酵母の膜を前もって透過性にし、そして／もしくは解毒の機構に関与する遺伝子の最低１種を不活性化しておく。
【００４７】
それはまた、ｇｒｆ１で形質転換されたビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母中でも単純に実施してよい。ｇｒｆ１の発現により創製される代謝障害の上昇をその後測定する。
【００４８】
該スクリーニング方法はまた、Ｒａｓ、ＣＤＣ４２ＨｓもしくはＲａｃとＤＮＡと相互作用するドメインとの間の融合からのタンパク質よりなる第一のハイブリッドタンパク質、ならびにＧＲＦ１の全部もしくは一部とトランス活性化（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）ドメインとの間の融合からのタンパク質よりなる第二のハイブリッドタンパク質を含んで成るタンパク質−タンパク質相互作用の「二重ハイブリッド」系であってもよい。それはまた、同一のビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母の核中で、ＧＲＦ１の全部もしくは一部のいずれか、トランス活性化ドメインと融合されたＰＡＫ１（ＣＲＩＢドメイン）およびＤＮＡと相互作用するドメインと融合されたＲａｃもしくはＣＤＣ４２Ｈｓのいずれか、またはＧＲＦ１の全部もしくは一部、トランス活性化ドメインと融合されたｃ−Ｒａｆ１（ＲＢＤ）、およびＤＮＡと相互作用するドメインと融合されたＲａｓを発現させることに存する「二重ハイブリッドプラス１」系であってもよい。
【００４９】
最後に、該スクリーニングは、
（ｉ）ｇｒｆ１導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）（全部もしくは一部）を発現するベクターで、不死化された哺乳動物細胞をトランスフェクトし、前記細胞に形質転換された表現型および選択剤に対する耐性を賦与すること、
（ｉｉ）トランスフェクトされかつ導入遺伝子を発現する前記細胞を選択すること、およびそれらをアガー成長支持体中にクローン化すること（ＧＲＦ１での形質転換は細胞を接着することなしに成長させる）、
（ｉｉｉ）前記試験化合物を前記細胞の懸濁物に添加すること、ならびに
（ｉｖ）成長培地上で得られるクローンの数の減少により前記ＧＲＦ１を阻害する化合物を検出すること
に存する段階を含んで成る細胞スクリーニングであってよい。
【００５０】
別の局面によれば、本発明は、医薬製品の製造における、上で挙げられた検出方法の１つによりスクリーニングされるところの化合物の使用に関する。
【００５１】
なお別の局面によれば、本発明は、神経死を伴う、もしくはレプチン代謝と関連する病理学的状態もしくは障害の予防を研究するためのモデルとしての、ｇｒｆ１遺伝子を不活性化する変異を有するマウスの使用に関する。
【００５２】
既に挙げられたとおり、本出願の主題は、中枢神経系の多様な病理学的状態（Ａ）および肥満（Ｂ）の予防および／もしくは治療のための医薬製品の製造に意図される化合物について探索することである。ＧＲＦ１の中心的役割のため、本出願の主題である方法はまた、ある種の心血管系疾患（Ｂ）、および病理学的脈管形成過程（Ｃ）に対する活性を表す分子、ならびに他の生物学的分子に関して（Ｄ）スクリーニングするのにも使用することができる。
【００５３】
Ａ−中枢神経系
１−急性神経変性性疾患
本発明は、ＧＲＦ１の活性の効果に拮抗しかつ脳虚血、頭蓋もしくは脳の外傷、および脊髄もしくは髄鞘の外傷により誘発される神経死に対する保護を賦与する化合物をスクリーニングすることを可能にする。
【００５４】
２−神経死およびアポトーシス。
本発明の主題である方法は、神経のアポトーシスを伴う神経変性、パーキンソン病、アルツハイマー病、老人性痴呆、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、癲癇、多発性硬化症、小脳および脊髄小脳の障害、認識障害、頭蓋の外傷、髄鞘の外傷、内耳の外傷、網膜の外傷、緑内障、ならびに神経系の癌の治療もしくは予防のための分子をスクリーニングするのに使用することができる。
【００５５】
３−その他
本発明の主題である方法は、統合失調症を包含する精神病、不安障害、うつ、パニック発作、末梢性ニューロパシー、偏頭痛、振盪、強迫性障害、胸腺の障害、遅発性ジスキネジー、双極性障害、薬物誘発性の運動障害、ジストニア、内毒血症性ショック、出血性ショック、低血圧、不眠、免疫学的疾患、嘔吐、食欲障害（過食症、食欲不振）、肥満、記憶障害の治療もしくは予防のための、慢性治療およびアルコール濫用もしくは薬物濫用（例えばオピオイド、バルビツレート、大麻、コカイン、アンフェタミン、フェンシクリジン、幻覚発現薬、ベンゾジアゼピン）からの中断における、鎮痛薬もしくは麻薬性および非麻薬性の医薬製品の鎮痛活性の増強剤としての、分子をスクリーニングするのに使用することができる。
【００５６】
Ｂ−肥満／心血管系疾患
本発明は、ＧＲＦ１の活性に拮抗しかつ主として成体の個体における体重増加に対する保護的役割を演じる化合物について探索することを可能にする。
【００５７】
ＧＲＦ１は、直接もしくは間接的にレプチン合成の上流の調節に関与していると考えられる。レプチンは、視床下部の弓状核のニューロンにより産生される食欲刺激分子、ニューロペプチド−Ｙ（ＮＰＹ）の放出を阻害することが知られているホルモンである（２０，２１）。それはまた、弓状核中での食欲抑制ペプチドすなわちＣＡＲＴ（コカインおよびアンフェタミンに調節される転写物）の合成も制御する（２２）。これら２種のニューロペプチドのアンタゴニスト活性は、結果として食物摂取に対するレプチンのシグナルの影響の均衡をとる。レプチンはまた、α−ＭＳＨ／メラノコルチン４受容体の食欲抑制回路も刺激する（２３−２５）。
【００５８】
ＧＲＦ１は神経媒介物質（７個の膜貫通ドメインを有する受容体に結合する）を使用する経路中のシグナルに寄与する。われわれの変異体マウス中でのその非存在は、結果として脂肪塊の減少および低血中レプチン（ｌｅｐｔｉｎｅｍｉａ）を伴う「飽満および／もしくは熱量の消費の増大」型のシグナルをもたらそう。
【００５９】
Ｃ−脈管形成
血管内皮細胞はレプチンの新たな標的であるようである。最近の結果は、レプチンがインビボで内皮細胞増殖および脈管形成を刺激することを示している（２６，２７）。
【００６０】
脈管形成は胚形成、瘢痕化および月経周期において、しかしまた腫瘍の血管新生、慢性関節リウマチ、乾癬、カポジ肉腫、糖尿病性網膜症およびアテローム硬化症のような病理学的状態でも重要な役割を演じている。
【００６１】
本発明は、ｇｒｆ１遺伝子についてノックアウトの成体マウスが、対照動物のものよりずっとより低いレプチン含量を有することを示した。変異体の動物が、病理学的脈管形成過程の出現に対し、そして結果として腫瘍の成長および播種に対し、ならびに全部の前述の病理学的状態に対してある種の形態の保護を表すことが可能である。
【００６２】
血中レプチンの低下につながるとみられるＧＲＦ１アンタゴニストはこれらの疾患に対する保護的役割を有しよう。避妊的役割もまた予見することができる。
【００６３】
Ｄ−他の生物学的標的
レプチンは思春期の誘発および生殖の制御に関与する（２８−３２）。
【００６４】
レプチンはまた、Ｔリンパ球に調節される免疫応答の調節でもある役割を演じている（３３）。
【００６５】
ＧＲＦ１の活性の調節物質は、免疫機能および生殖の機構に対する影響を有しよう。後者の仮説はさらに確かめる必要があるかもしれない。本発明の観察結果がｇｒｆ１  ＫＯマウスにおける遅発性思春期および早期閉経を示すからである。この現象は部分的にレプチンレベルの低下もしくは視床下部−下垂体軸により制御される性ホルモンの合成の脱調節（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）によるものであろう。
【００６６】
骨合成に関するレプチンの阻害特性が最近示された。それは骨芽細胞（骨形成を司る細胞の集団）の活性を阻害することにより作用する（３４）。ＧＲＦ１に作用することにより血中レプチンを改変することは、例えば骨粗鬆症のような骨密度の低下を伴う疾患、もしくは逆に例えば骨化石症のようなかなりの石灰化を伴うものを治療することを可能にするであろう。
【００６７】
ＮＰＹ遺伝子についてノックアウトのマウスで実施された研究は、これらの動物が、アルコールに対する顕著な嗜好を表しかつ野性型マウスよりもその沈静および催眠効果に対しより抵抗性であることを示した（３５）。レプチンはＮＰＹの放出に対し負の役割を演じている（２０，２１）。ＧＲＦ１の活性の調節物質を、アルコール中毒の挙動（ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｂｅｈａｖｉｏｒ）の治療および睡眠障害の治療で使用してよい。
【００６８】
他の付加的な主題、特徴および利点は、制限しない具体的説明として純粋に示される後に続く製造の実施例に関して、および付属としてつけられる図面に関して下述されよう。
【００６９】
（図面の簡単な説明）
図１ＡはＧＲＦ１タンパク質の図解である。
図１ＢはＧＲＦ１タンパク質の機能が関与する主要なシグナル伝達経路の組合せ図である。
図２Ａは神経学的検査を表すヒストグラムである。
図２Ｂは神経学的検査を表すヒストグラムである。
図３Ａはそれぞれ全体および大脳皮質の脳傷害の程度を説明するヒストグラムである。
図３Ｂはそれぞれ全体および大脳皮質の脳傷害の程度を説明するヒストグラムである。
図３Ｃは大脳皮質領域の多様な領域の傷害を説明する図である。
図３Ｄは３．２２と１．７６との間の大脳皮質領域の傷害の容量を説明する図である。
図４Ａはｇｒｆ１  ＫＯ変異体マウス（−／−で示される）の体重および血中レプチンを説明する図である。
図４Ｂは野性型マウス（＋／＋で示される）の体重および血中レプチンを説明する図である。
図５Ａはｇｒｆ１  ＫＯ変異体マウス４８時間絶食後の体重および血中レプチンを説明する図である。
図５Ｂは野性型マウスの４８時間絶食後の体重および血中レプチンを説明する図である。
【００７０】
実施例
実施例１：脳虚血により誘発される神経死に対する保護を研究するためのモデルとしてのｇｒｆ１遺伝子を不活性化する変異を有するマウス（「ｇｒｆ１ノックアウト」もしくは「ｇｒｆ１  ＫＯ」マウス）の使用
ｇｒｆ１  ＫＯマウスは、脳虚血に対するＧＲＦ１タンパク質依存性の経路の影響を検討する可能性を提供する。ＫＯマウスおよび野性型マウスを永続的局所性脳虚血にさらす。脳損傷に対するＧＲＦ１の担持を決定するために測定されるパラメータは、（ｉ）神経学的機能の検査から、および（ｉｉ）脳傷害の組織学的定量から生じる。
【００７１】
１．１．：永続的局所性脳虚血のモデル
笑気−酸素混合物（７０：３０）中１．４％のハロタンで麻酔された、Ｃ５７Ｂ１／６および１２９ＳＶの遺伝的背景由来の体重２２〜３７ｇの雄性マウスを使用する。切開を眼と左耳との間で行う。側頭筋を後ろに折り畳む。開頭術を側頭骨の水準で実施し、それは中大脳動脈への到達を可能にする。これは電気凝固により焼灼する。その後、永続的局所性脳虚血を、左中大脳動脈閉塞により引き起こす（ＭＣＡ．Ｏ、（３６））。外科手術の間、側頭筋の温度および体温の双方を正常レベルで維持する。その後切開を縫合し、そして動物を２４〜２６℃で加熱された室中のそれらのケージに戻す。
【００７２】
マウスは以下のとおり群に分割する：
ＧＲＦ１発現について欠陥のあるマウス（ＫＯマウス）：変異体Ｃ５７Ｂ１／６（ｎ＝１０）、変異体１２９  ＳＶ（ｎ＝２１）。
【００７３】
対照として使用される野性型マウスは、対照Ｃ５７Ｂ１／６（ｎ＝１０）および対照１２９  ＳＶ（ｎ＝２０）である。
【００７４】
１．２．：神経学的検査
神経学的検査のため、以下の手順を実施する：
虚血前、およびその後虚血１時間および２４時間後に、当初ラットで記述され（３７）そして本発明者らによりわずかに改変された神経学的検査を実施する。検査の間、多様な点に点数をつける。すなわち０（正常）、１（前脚の屈曲）、２（回転運動）、３（前脚の屈曲および胸部の捻転）、４（正向反射の喪失）。
【００７５】
図２Ａおよび２Ｂで注目されることができるとおり、全部のマウスは、ＭＣＡ．Ｏの１時間および２４時間後に、それら自身の虚血前の神経スコアに比較して有意の神経学的欠損を示す。Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおいては、該時点で検査された点の全部で、野性型マウスとＫＯマウスとの間に差異は観察されない。しかしながら、野性型マウスに比較して、１２９ＳＶ−ＫＯマウスは、虚血の１時間（ｐ＜０．０１）および２４時間（ｐ＜０．０５）後に明瞭により少なく顕著な欠損を表す。
【００７６】
１．３：脳傷害
以下の手順を実施する。すなわち、それらの「神経スコア」を記録した後に、マウスを殺し、そして脳を迅速に取り出しかつ−３０℃の液体イソペンタン中で凍結させる。４０μｍ厚の冠状薄片を、クライオスタット（ｃｒｙｏｓｔａｔ）を用いて多様な定位的レベルで切断し、そしてその後０．５％クレシルバイオレットで染色する。傷害の領域を、多様な冠状レベルで画像分析器（Ｌｅｉｃａ  Ｑ５００）で測定する。その後、脳傷害の容量を表面積の積分により計算する。
【００７７】
Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおいては、野性型マウスとＫＯマウスとの間に有意差は観察されない（結果は示されない）。
【００７８】
図３Ａおよび３Ｂで注目されることができるとおり、１２９ＳＶマウスにおいて、脳傷害中の有意の全体のもしくは大脳皮質の減少は観察されない。
【００７９】
しかしながら、傷害の面積の有意の減少がある定位的レベルで示され（図３Ｃ）、この結果は、この特定の領域中の傷害の２３％の減少（ｐ＜０．０５）に対応する（図３Ｄ）。
【００８０】
上の実施例１に記述される結果は、ｇｒｆ１遺伝子の非存在が、虚血が誘発された１２９ＳＶ−ＫＯマウスにおけるより良好な機能的回復をもたらすことを示す。
【００８１】
特定の皮質レベルの傷害の減少は、その中でｇｒｆ１遺伝子が高度に発現されているであろう（１２）、検査された運動および感覚運動機能が関与する構造（とりわけ新皮質および小脳）に対応していよう。しかしながら、Ｃ５７Ｂ１／６の遺伝的背景をもつマウスで影響は見いだされていない。
【００８２】
ｇｒｆ１遺伝子の不活性化は、アポトーシスにつながるシグナル伝達経路の１つを分断させよう。言い換えれば、上に報告された結果は、ＧＲＦ１タンパク質が、ストレスキナーゼの活性化またはＲｈｏ、ＲａｃおよびＣｄｃ４２タンパク質ファミリーの低分子量Ｇタンパク質の１種もしくはそれ以上の活性化の経路に介入することにより神経アポトーシスにつながるシグナル伝達に寄与することを示唆している。ＧＲＦ１の活性は、さらに、Ｒａｃタンパク質で記述されている（２）。
【００８３】
要約すれば、ＧＲＦ１タンパク質は、部分的に、虚血に対する脆弱性の原因であるアポトーシス経路を活性化するかもしれない。これらの結果はまた、ＧＲＦ１タンパク質それ自身が、とりわけ急性神経変性性障害の標的を表すであろうことを示唆する。
【００８４】
実施例２：肥満に対する保護を研究するためのモデルとしてのｇｒｆ１遺伝子を不活性化する変異を有するマウス（「ｇｒｆ１ノックアウト」もしくは「ｇｒｆ１  ＫＯ」マウス）の使用
肥満
２．１：肥満
離乳させて以来、タンパク質（２２％）および脂肪（７％）が豊富な育種に意図された食餌（参照：Ｄ０３、コード：Ｒ０３１。供給元：ＵＡＲ、フランス）を給餌された１０〜１２月齢の野性型マウスは、皮膚と腹筋層との間、ならびにまた腹腔（主として雌性の子宮角周囲）および腹膜中にかなりの脂肪塊を有する。心周囲の脂肪の存在もまた、肥満として記述することができる最も太った個体で見出され、そしてそれらの体重は雌性で３５グラムおよび雄性で４０グラムを越える。
【００８５】
育種および栄養の同一条件下で、１年もしくはそれ以上の齢のｇｒｆ１遺伝子を不活性化する変異を有するマウスは、肥満を記述する特徴を示さない。それらの大多数は皮膚と腹壁との間に脂肪組織を有しない。雌性において、子宮角周囲の脂肪の沈着物は非常に小さく、そして量は６〜８週齢の野性型動物のものに匹敵する。成体のｇｒｆ１  ＫＯマウスもまた、腹膜中および心周囲の脂肪の欠如を特徴とする。
【００８６】
成体マウス中でのｇｒｆ１遺伝子の不活性化が、体重増加および脂肪組織の蓄積に対する保護をもたらすことが観察される。
【００８７】
２．２：血中レプチン
ｇｒｆ１  ＫＯマウスおよび肥満の表現型の既知の特徴をもつ野性型マウスでなされた観察結果を相関させるために、野性型および変異体のマウスの血漿レプチンをアッセイした。
【００８８】
レプチンは、その効果が食物摂取を減少させることおよび熱量の消費を増大させることであるサイトカインである。比例の関係が、第一に脂肪細胞（レプチンを分泌する）の数とそれらが含有する脂質小胞の大きさ、および第二にこのホルモンの血漿濃度との間に存在する（２０）。
【００８９】
本発明は、１年齢の雄性および雌性の野性型マウスもしくはｇｒｆ１遺伝子について変異体（ＫＯ）のマウスの体重および血中レプチンを測定した。研究された動物の群はいくつかの同胞群よりなる。各同胞群は野性型および変異体の動物より構成される。
【００９０】
血液サンプルは、断頭による動物の安楽死の時点で採取した。
【００９１】
血漿レプチンは、会社クリニサイエンシーズ（Ｃｌｉｎｉｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりフランスで市販されているキット（参照：ＫＬ−８２Ｋ）の形態の、会社リンコ（Ｌｉｎｃｏ）により製造されたラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を使用してアッセイした。
【００９２】
図４Ａおよび４Ｂに観察することができるとおり、変異体マウス（−／−で示される）において、血漿レプチン含量は同一齢の対照の野性型マウス（＋／＋で示される）のものに比較して非常に低い。この言及は文献になされ、１２月齢以上のｇｒｆ１ノックアウトマウスの血中レプチンは６〜８週齢の非常に幼若なマウスのもの（５ないし１０ｎｇ／ｍｌ）に匹敵する。これらの動物の概略の比較検査はこれと完全に一致する。
【００９３】
動物を４８時間絶食させる場合（図５Ａおよび５Ｂ）、対照動物においては、血漿レプチン濃度のかなりの減少により付随される体重の減少が結果として起こる一方、ＫＯ動物においては、血中レプチンの低下が非常に小さい。後者の結果は、ＫＯ動物においてはレプチン含量が既に最小閾値であり、それは延長された絶食に応答してわずかに調節することができるのみであることを示唆する。
【００９４】
変異体のマウスにおける食餌消費量の最初の測定は、食餌摂取が対照に比較して減少することを示す。しかしながら、吸収された食餌の量と動物の体重とを戻って関係づけたとき、ＫＯと野性型との間に有意差は存在しない。
【００９５】
変異体のマウスの表現型の原因はエネルギー消費の増大であるが、エネルギー消費の増大はｇｒｆ１  ＫＯマウスの活動過剰によることはないようであることに注目するべきである。
【００９６】
実施例３：ＧＲＦ１タンパク質のセリン／トレオニンもしくはチロシンリン酸化を測定することにより化合物をスクリーニングするためのＧＲＦ１タンパク質の使用
本実験は培養物中の細胞で実施する。
【００９７】
ＧＲＦ１のリン酸化は、培養物中の細胞において多様な方法で誘発される。
【００９８】
３種のプロトコルを使用する。すなわち
１）ＧＲＦ１タンパク質の放射活性標識および免疫沈降
これらの多様な処理は、Ｐ３２もしくはＰ３３（１ｍＣｉで２００μＣｉ／１０ｍｍペトリ皿で）で標識されたオルトリン酸を含有する培地中、スクリーニングされるべき分子の存在および非存在下で実施する。細胞は、ＨＮＴＧ緩衝液（プロテアーゼおよびホスファターゼの阻害剤、すなわち１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、２．２μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌアンチパイン、１０μｇ／ｍｌベンズアミジン、１μｇ／ｍｌダイズトリプシンインヒビター、１μｇ／ｍｌキモスタチン、１μｇ／ｍｌペプスタチン−Ａの存在下の２０ｍＭ  ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、１０％グリセロール）、もしくはＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１００μＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、２５μｇ／ｍｌアプロチニン、２５μｇ／ｍｌロイペプチン）中、低温条件下で溶解する。その後、ＧＲＦ１タンパク質を、抗ＧＲＦ１抗体もしくは抗タグ抗体（１０）（モノクローナル抗体により認識されかつＦＬＡＧ、ｍｙｃもしくはヘマグルチニン（ＨＡ）のようなタグをつけられたタンパク質の検出もしくは免疫沈降を可能にするエピトープ）を使用して免疫沈降し、そしてその後免疫沈降物をＳＤＳ−４〜２０％ポリアクリルアミドゲル上で分離する。ＧＲＦ１タンパク質（１４０ｋＤａ）に対応するバンドの放射活性を、ホスホルイメージャ（ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ）型の放射線検出器を使用して定量する。
【００９９】
分子の有効性は、値０％であるべき刺激されない細胞について見出される値および値１００％になるべきスクリーニングされる分子の非存在下で刺激された細胞について見出される値を考慮して、ＧＲＦ１タンパク質のリン酸化の阻害パーセンテージにより計算する。
【０１００】
２）サイトスター（ＣＹＴＯＳＴＡＲ）プレート中でのＧＲＦ１タンパク質の放射活性標識および保持
本方法の第一の代替は、その中にＧＲＦ１タンパク質を保持するために抗ＧＲＦ１もしくは抗タグ抗体で前被覆されたサイトスター（ＣＹＴＯＳＴＡＲ）プレート（会社アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により市販される）のウェル中で、以前に得られた細胞ライセートをインキュベートすることに存する。すすいだ後に、シンチレーション計数器を使用して放射活性シグナルの定量を得る。
【０１０１】
３）ＥＬＩＳＡによる定量
本方法の第二の代替は、上のような細胞を、しかし標識されたオルトリン酸の非存在下で処理することに存する。その後、細胞ライセートをＥＬＩＳＡアッセイ法に従って使用する。このアッセイのためには、プレートのウェルを抗ＧＲＦ１もしくは抗タグ抗体で被覆し、そしてＧＲＦ１リン酸化が表示され（ｒｅｖｅａｌｅｄ）、そして標識されていてももしくはされていなくてもよく（放射性元素、蛍光、酵素など）かつ抗ホスホチロシンもしくは抗ホスホセリン／ホスホトレオニンのいずれかであってよい二次抗体で定量する。二次抗体が標識されていない場合、表示および定量は、二次抗体に対し向けられかつ標識された三次抗種抗体を使用して実施する。すすいだ後、放射活性計数器もしくは蛍光分光測光計を使用して、または分光測光法による光学密度の読取り（プレートリーダー）に至る酵素活性を測定することにより、シグナルを定量する。
【０１０２】
培養物中の細胞は：
・内在性のＧＲＦ１タンパク質の発現を可能にするために１０日間培養物中で維持された神経細胞の初代培養物；
・全体のかつおそらくタグづけされたＧＲＦ１タンパク質（マウスもしくはヒト）の発現を可能にするベクターでトランスフェクトされた、いずれかの組織起源の培養物中の細胞系。哺乳動物細胞中での異種のｃＤＮＡの発現を可能にするいかなるプラスミドもしくはウイルスベクターを使用してよい：
であってよい。
【０１０３】
培養物中の細胞中のＧＲＦ１タンパク質のリン酸化は、ニューロンの培地に１００μＭのカルバコールを添加すること（５ないし３０分）により神経細胞中で得られる。
【０１０４】
ＧＲＦ１をコードするｃＤＮＡでトランスフェクトされた非神経細胞については、目的のタンパク質のリン酸化を以下の条件下、すなわち
・トランスフェクトされた細胞を、一夜血清を枯渇させ、そしてその後１０％ウシ胎児血清の存在下でインキュベートするか、
・または、細胞を、三量体のＧタンパク質のβ−γサブユニットβ１γ２もしくはβ１γ５をコードするｃＤＮＡでコトランスフェクトするかのいずれか
で研究する。発現ベクターはＣＭＶもしくはＳＶ４０型のプロモーターの制御下に真核生物細胞中での発現を可能にするプラスミドである（例、ｐＳＶ２、そうでなければｐＣＤＮＡ３（インヴィトロジェン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）））。目的のタンパク質をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲのフラグメントの増幅、この配列の確認およびベクター中に存在するマルチクローニング部位への該フラグメントのサブクローニングの後にその中に挿入する。細胞は一夜血清を枯渇させ、そしてその後血清の存在下で再インキュベートする。
【０１０５】
実施例４：ＧＲＦ１の存在下でのＲａｓタンパク質またはＲａｃもしくはＣｄｃ４２タンパク質上の交換活性を測定することにより化合物をスクリーニングするためのＧＲＦ１タンパク質の使用
これらの活性は非細胞生物系（組換えタンパク質の使用）もしくは細胞系で測定することができる。
【０１０６】
１）非細胞生物系での測定
０．５μＭの最終濃度の組換えＲａｓ、ＲａｃもしくはＣｄｃ４２タンパク質を、交換緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）中、３Ｈ−ＧＤＰ（０．５μＭの最終濃度、ＮＥＮ、１１１μｍｏｌ、９Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下に３０℃で３０分間インキュベートし、そしてその後氷中に保つ。その後、ＭｇＣｌ２を、交換反応を封鎖するために１０ｍＭの最終濃度を有するように添加し、そしてその後５０μｌの各インキュベーションを取り出し（トリチウム化されたＧＤＰに結合されたＲａｓ／Ｒａｃ／Ｃｄｃ４２）、そしてマイクロプレートの９６穴の１つに分注する。
【０１０７】
交換反応を、１０μｌの１０ｍＭのコールドのＧＴＰ（０．１ｍＭの最終濃度）、組換えＧＲＦ１タンパク質（全部もしくは一部）および試験分子のウェルへの添加により開始する。
【０１０８】
３０℃で６０分間のインキュベーション後に、４０μｌのアリコートを取り出し、そして０．４５μｍのニトロセルロースメンブレンを通して濾過する（タンパク質を保持することが可能な濾過メンブレンで被覆された底部をもつ９６穴プレート、ザルトリウス（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）ＳＭ  １１３０６）。放射活性（低分子量タンパク質Ｇに結合されたトリチウム化されたＧＤＰ）を、シンチレーション液の存在下にシンチレーション計数器で計数する。この場合、それは、その場合に計数されるナイロン濾過メンブレン上に保持される放射活性である。
【０１０９】
濾過反応に対する一代替は、インキュベーション後に各ウェルの内容物を溶出緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、５ｍＭ  ＤＴＴおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で予め平衡化されたＰＤ１０カラムを通過させることに存する。この場合、それは測定されるカラムからの溶出物（カラムを通過される４ｍｌの溶出緩衝液＋１０ｍｌのベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）レディゲル（ＲｅａｄｙＧｅｌ）シンチレーション液）の放射活性である。
【０１１０】
双方の場合において、交換活性は、ＧＲＦ１タンパク質を伴わないアッセイで得られたものに比較しての、ＧＲＦ１タンパク質の存在下での放射活性の量の差異により測定する。分子の有効性はこの交換活性の阻害により計算する。
【０１１１】
組換えＲａｓ、ＲａｃもしくはＣｄ４２タンパク質は：
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（製造元により記述されるプロトコルに従いかつＢＬ２１細菌中でのプラスミドの形質転換後。タンパク質発現は３０℃で０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）で４時間誘導する）、もしくは該プラスミドでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞中哺乳動物細胞（ｐＢＣＧＳＴ（３８））中で融合タンパク質の形態（ＧＳＴ、ｐＧＥＸ−１λｔもしくは−２Ｔ系、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の製品）で。該発現は５％ＣＯ２を含むインキュベータ中３７℃で一夜で得られる。該タンパク質はファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（バイオテック（Ｂｉｏｔｅｃｈ）（ＧＳＴ−遺伝子融合系））により供給されるプロトコルに従ってグルタチオンアフィニティーカラム上で精製する。これらの融合タンパク質は、それらのＧＳＴドメインを欠失させるためにトロンビンでの消化により切断されてももしくはされなくてもよい；
または、販売元により推奨される方法に従って得られる組換えバキュロウイルスでの細胞の感染後の昆虫細胞（Ｓｆ９、Ｓｆ２１、ハイ  ファイブ（Ｈｉｇｈ  ＦＩｖｅ）など）中で発現される、バキュロウイルス中でのタグづけした形態（ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の製品）で。発現は２７℃で２ないし４日にわたって実施し、そしてその後タンパク質をニッケルカラム上で精製する、かのいずれかで発現された多様な起源（ヒト、マウスなど）の野性型のＲａｓ、Ｃｄｃ４２もしくはＲａｃタンパク質であってよい。
【０１１２】
組換えＧＲＦ１タンパク質は、バキュロウイルスもしくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現されそしてアフィニティーカラム上で精製された、ＣＤＣ２５もしくはＤＨまたは双方のいずれかの変換ドメインを含有する多様な起源（ヒト、マウスなど）のＧＲＦ１タンパク質の全体もしくは断片であってよい。
【０１１３】
先行する技術の一変形物は、ＲａｆのＲａｓ結合ドメイン（ＲＢＤ）を介してＲａｆ−１に結合するＲａｓ−ＧＴＰ、または後者のＣＲＩＢドメインを介してＰＡＫ１に結合するＲａｃ１−ＧＴＰもしくはＣｄｃ４２−ＧＴＰのいずれかの能力を使用することに存する（３９）。米国特許第ＵＳ  ４  ５６８  ６４９号、欧州特許第ＥＰ  １５４  ７３４号および日本国特許第ＪＰ  ８４／５２４５２号明細書に記述されるＳＰＡ（シンチレーションプロキシミティアッセイ）系は、高スループットスクリーニングで２種のタンパク質間の結合を示しかつ定量することを可能にする。
【０１１４】
０．５μＭの最終濃度の組換えのＲａｓ、ＣＤＣ４２もしくはＲａｃタンパク質（本実験において、低分子量ＧがそれらのＧＳＴドメインから切断されることができるか、そうでなければ別のタグ、例えばＨｉｓ尾部などとともに発現されることができる）を、交換緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ジチオスレイトール、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）中でコールドのＧＤＰの存在下に３０℃で３０分間インキュベートし、そしてその後氷中に保つ。その後の段階は、交換反応を封鎖するために１０ｍＭの最終濃度までＭｇＣｌ２を添加すること、ならびにその後各インキュベーションの５０μｌを取り出すこと、およびマイクロプレート上の９６穴の１つにそれらを分注することに存する。
【０１１５】
交換反応は、１０μｌのトリチウム化されたＧＴＰ（ＮＥＮ  １１１μｍｏｌ、９Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、組換えＧＲＦ１タンパク質および試験分子のウェルへの添加により開始する。
【０１１６】
３０℃で６０分間のインキュベーション後に、２ｍＭジチオスレイトールを含有する５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５中の０．００１３ｍｇ／ｍｌの濃度のＧＳＴ−Ｒａｆ（ＲＢＤドメイン）もしくはＧＳＴ−ＰＡＫ（ＣＲＩＢドメイン）タンパク質８０μｌ、ならびに２ｍＭジチオスレイトールおよび２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液中の抗ＧＳＴ免疫グロブリン（０．１２ｍｇ／ｍｌ）および微小球にＰＶＴ結合されたＳＰＡプロテインＡ（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）；１２．６ｍｇ／ｍｌ）の混合物４０μｌを添加する。その後、プレートを封止し、２２℃で１時間攪拌し、そしてその後７６０ｇで２分間遠心分離し、かつシンチレーション計数器で計数する。
【０１１７】
分子の有効性は、交換活性の阻害のパーセンテージにより計算し、そして：１００×（１−（ＧＲＦ１および分子の存在下での値−ＧＲＦ１および分子の非存在下での対照）／（ＧＲＦ１の存在下かつ分子の非存在下での値−ＧＲＦ１および分子の非存在下での対照）に等しい。
【０１１８】
２）細胞系中での測定（酵母）
多様な可能性を予見することができる。それらは酵母（ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）系、もしくは生理学的障害を生じさせる競合系、もしくは二重ハイブリッド系のいずれかを使用する。酵母を使用する全部の技術および方法は文献（４０−４５）に広範に記述されている。
【０１１９】
これらの系の一方もしくは他方の使用は、哺乳動物細胞中で記述されるものに相同な低分子量タンパク質Ｇ／交換因子の対（ｃｏｕｐｌｅ）の酵母中での存在により予見することができる。Ｇタンパク質に関して、酵母のＲＡＳタンパク質は哺乳動物のＲａｓタンパク質に相同であり（後者は酵母中のＲＡＳタンパク質の不活性化する変異を補完する）、また、ビール酵母菌（Ｓ．ｃ．）のＣＤＣ４２タンパク質は哺乳動物のＲａｃタンパク質に相同である。交換因子に関して、ＣＤＣ２５およびＳＤＣ２５はＧＲＦ１に相同であり、そしてそれらの触媒的部分は哺乳動物のＲａｓタンパク質に対し活性である（４６，４７）。ＧＲＦ１は、ＣＤＣ２５に相同なそのドメインによって、ＣＤＣ２５を不活性化する変異のいずれか、そうでなければ二重変異体ＣＤＣ２５／ＳＤＣ２５（ＳＤＣ２５変異体もしくは表現型を有しないＫＯ）を補完することが可能である。ＶａｖのＤＨドメインにより補完される可能性があるＣＤＣ２４と呼ばれる交換因子もまたビール酵母菌（Ｓ．ｃ．）のＣＤＣ４２について既知である（４８）。ＣＤＣ２４についての酵母の変異体中のＣＤＣ４２に対するＧＲＦ１の全部もしくは一部（ＤＨドメインを包含する）の交換活性を外挿することが可能であり、これらの不活性化する変異は致死的表現型を有する。ＧＲＦ１（全部もしくは一部）のこの活性は、ＣＤＣ２４の効果を完全にもしくは部分的に（その親和性に依存して）模倣するとみられる。
【０１２０】
２．１  酵母における補完
この系において、ＧＲＦ１（全部もしくは一部）は、これら酵母の交換因子が成長停止型の表現型に至る変異により不活性化される場合に、酵母の交換因子（ＣＤＣ２５、ＣＤＣ２４）の機能を模倣することが可能である。この補完の効果は、成長を復帰させることにより酵母の生存を可能にすることである。不活性化されたＣＤＣ２５もしくはＣＤＣ２４の情況（熱感受性変異）でＲＡＳもしくはＣＤＣ４２タンパク質に対するＧＲＦ１（タンパク質全体、ＣＤＣ２５ドメイン、ＤＨドメイン）の機能を阻害する分子は、補完現象の喪失および許容温度での細胞の死につながる。ＲＡＳ／ＣＤＣ２５もしくはＣＤＣ４２ドメイン／ＤＨドメイン系に対する該分子の作用方法の特異性は、野性型酵母に対する該分子の作用を測定することにより確かめることができる（抗真菌活性に関する情報）。
【０１２１】
このスクリーニングは、膜透過性および解毒過程に関与する遺伝子の発現を調節することにより（例えばＥｒｇ６遺伝子および／もしくはＰＤＲファミリーの遺伝子の変異体を使用して）、該分子の細胞内濃度を上昇させることに存する、当業者に既知の技術により、透過性酵母中で小分子について実施することができる。これらの「透過性」化技術は以下の特許出願、すなわち第ＦＲ  ９４１１５０９号および第ＷＯ  ９６／１０８２号明細書に記述される。
使用された酵母株
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの１株、ＣＤＣ２５  ＴＳもしくはＣＤＣ２４  ＴＳ（熱感受性変異）を使用する。これは許容温度条件下でのみ成長することができる。これは以下の培地上で成長させる：
最小ＹＮＢ培地：−酵母窒素基礎（アミノ酸を含まない）（６．７ｇ／ｌ）（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）
−ブドウ糖（２０ｇ／ｌ）（メルク（Ｍｅｒｃｋ））
この培地は２０ｇ／ｌのアガー（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ））を添加することにより固化することができる。
【０１２２】
この培地上での栄養要求性の酵母の成長を可能にするために、それらが依存する窒素性塩基もしくはアミノ酸を５０ｍｇ／ｍｌでそれに添加することが必要である。１００μｍｇ／ｍｌのアンピシリンを、細菌の汚染を回避するために培地に添加する。
【０１２３】
プラスミドの構築および増幅
遺伝子型ＳｕｐＥ、ｈｓｄΔ５、ｔｈｉ、Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）、Ｆ´［ｔｒａＤ３６  ｐｒｏ  Ａ＋Ｂ＋ｌａｃＩｑｌａｃＺΔＭ１５］を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株ＴＧ１を、プラスミドを構築しそしてプラスミドを増幅および単離するのに使用する。それは以下の培地上で成長させる：
ＬＢ培地：−ＮａＣＬ（５ｇ／ｌ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ））
−バクトトリプトン（１０ｇ／ｌ）（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ））
−酵母抽出物（５ｇ／ｌ）（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ））
この培地は２０ｇ／ｌのアガー（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ））を添加することにより固化することができる。
【０１２４】
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを、この抗生物質に対する耐性の遺伝子をマーカーとして有するプラスミドを受領した細菌を選択するのに使用する。
【０１２５】
少量および大量のプラスミドＤＮＡの調製は、ＤＮＡ精製キット：
−キアプレップ（Ｑｕｉａｐｒｅｐ）スピンミニプレップ（Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅ）キット、参照：２７１０６
−キアプレップ（Ｑｕｉａｐｒｅｐ）プラスミドマキシプレップ（Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ）キット、参照：１２１６３
の、製造元キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）により推奨されるプロトコルに従って実施する。
【０１２６】
プラスミドでの酵母の形質転換
酵母は、Ｇｉｅｔｚら（４９）により記述される方法に従ったＬｉＡＣ／ＰＥＧでの処理によりコンピテントにし、そして酵母中でのＧＲＦ１の全部もしくは一部の構成的もしくは誘導可能な発現を可能にするプラスミド１μｇで形質転換する。形質転換段階の後に酵母を非許容条件下の培養物中に戻す。選択されるクローンは、ＧＲＦ１により補完されているものである。
【０１２７】
分子のスクリーニング
ＧＲＦ１により補完された選択されたクローンを、その上に数滴の化合物が適用される選択培地を含有する皿上でプレート培養する。皿は許容条件下に置く。酵母の成長阻害の環を生じる生成物を選択し、そして同一の型の成長阻害を生じる抗真菌活性をもつ分子を除外するために対照の野性型酵母で試験する。
【０１２８】
２．２  酵母ＧＥＦとの競合（２種の変形物）
ａ−構成的活性化／優勢正の効果：
この系において、酵母中のＧＲＦ１の全部もしくは一部の発現は、ＲＡＳもしくはＣＤＣ４２に対する交換の構成的刺激による成長の混乱を伴う。該系で活性である分子は、ＧＲＦ１の発現により発生される生理学的障害（表現型）のいくぶん完全な標準化につながることができる。
【０１２９】
使用された株
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの野性型酵母株を使用する。それを２．１に記述されるところの最小ＹＮＢ培地上で成長させる。プラスミドの構築および増幅は２．１に記述されたとおり実施する。
【０１３０】
下述される実施例において、ＧＲＦ１の発現は酵母のＲＡＳの過剰活性化につながる。こうした酵母は、その後、それらが静止前成長期に達する場合にグリコーゲン貯蔵物をもはや産生することが可能でない。このような酵母は、ヨウ素蒸気への曝露後の褐色の着色の非存在により同定することができる。
【０１３１】
分子のスクリーニング
スクリーニングは上述された技術に従って透過性にされた酵母で実施することができる。
【０１３２】
数滴の化合物を、ＧＲＦ１の全部もしくは一部を発現する酵母で前もって接種された培養皿の表面に直接適用する。該皿を成長させ、そしてその後ヨウ素結晶を含有する閉鎖チャンバー中でヨウ素蒸気に曝露させる。酵母の成長を可能にしかつ褐色の着色の出現を復帰させる生成物を陽性として選択することができる。
ｂ−構成的阻害／優性負の効果：
優性負として酵母中で挙動し、ＣＤＣ２５もしくはＣＤＣ２４酵母タンパク質の活性を阻害し、かつ成長停止型の生理学的障害を引き起こす、ＧＲＦ１の全部もしくは一部の発現を予見することもまた可能であり、この生理学的障害は、該系に対し活性である分子により完全にもしくは部分的に上昇させることができる。
【０１３３】
使用された株
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの野性型株を使用する。それを２．１に記述されたとおり最小ＹＮＢ培地上で成長させる。プラスミドの構築および増幅は２．１に記述されたとおり実施する。
【０１３４】
プラスミドでの酵母の形質転換
野性型酵母は、Ｇｉｅｔｚら（４９）により記述される方法に従ったＬｉＡＣ／ＰＥＧでの処理によりコンピテントにし、そして酵母中でＧＲＦ１の全部もしくは一部の誘導可能な発現を可能にするプラスミド１μｇで形質転換する（例：ｇｒｆ１遺伝子の発現を、培地中の唯一の炭素源としてのガラクトースの存在下で誘導可能であるＧａｌ  ４遺伝子プロモーターの制御下に置く）。
【０１３５】
下述される実施例および誘導条件下において、ＧＲＦ１の発現は、酵母中のＲＡＳタンパク質を使用する細胞のシグナル伝達の混乱につながり、そして成長停止型の表現型をもたらす。
【０１３６】
分子のスクリーニング
スクリーニングは、上述された技術に従って透過性にされた酵母で実施することができる。
【０１３７】
数滴の化合物を、ＧＲＦ１の誘導可能な発現のためプラスミドで形質転換されたがしかし誘導剤の非存在下で前もって培養された酵母を用いて接種された培養皿の表面に直接適用する。該皿を、ＧＲＦ１の発現を可能にする条件下でインキュベートする。酵母の成長を可能にする生成物を陽性として選択することができる。
【０１３８】
これらの競合系を、哺乳動物のＲａｓで補完されたＲＡＳについての酵母の突然変異体（熱感受性変異体）（ＲＡＳ  ｍｕｔ  ＴＳ）もしくは哺乳動物のＲａｃで補完されたＣＤＣ４２  ｍｕｔ  ＴＳにおいて生じさせることを予見することが可能である。
【０１３９】
２．３−二重ハイブリッドおよび逆二重ハイブリッド系／タンパク質−タンパク質相互作用
第一の応用：
この系の使用は、ＲａｓもしくはＲａｃ／ＣＤＣ４２ＨｓとＧＲＦ１との間の物理的相互作用を阻害することができる分子のスクリーニングの実施を可能にする（５０，２）。
【０１４０】
この方法は、Ｒａｓ、ＣＤＣ４２ＨｓもしくはＲａｃとＤＮＡと相互作用するドメインとの間の第一の融合タンパク質、およびＧＲＦ１（全部もしくはＣＤＣ２５様もしくはＤＨドメイン）とトランス活性化ドメインとの間の第二の融合タンパク質の調製に基づく。２種のハイブリッドタンパク質間の相互作用は、レポーター遺伝子（ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＣＹＨ２、ＣＡＮ１、ＬａｃＺ、ＧＦＰなど）の活性化につながる。該系は適切な酵母（例：レポーター遺伝子がＵＲＡ３である場合に変異体のｕｒａ３）中で使用する。
【０１４１】
分子をスクリーニングするための逆二重ハイブリッド系の例（５１）：
ＣＬ９酵母株を、二重ハイブリッド系中で妨害する分子をスクリーニングするためのツールとして使用する。これはタンパク質−タンパク質相互作用を示すことを可能にする。これは、ＰＤＲ遺伝子のファミリーおよび解毒過程に関与するＥＲＧ６遺伝子に変異を導入することにより透過性にすることができる。
【０１４２】
それを最小ＹＮＢ培地上で成長させる。
【０１４３】
遺伝子型ｓｕｐＥ、ｈｓｄΔ５、ｔｈｉ、Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）、Ｆ′［ｔｒａＤ３６  ｐｒｏ  Ａ＋Ｂ＋ｌａｃＩｑｌａｃＺΔＭ１５］を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株ＴＧ１を、プラスミド構築しそしてプラスミドを増幅かつ単離するのに使用する。
【０１４４】
使用されるプラスミドは以下のとおりである：
クロンテック［Ｃｌｏｎｔｅｃｈ］（商標）により供給されるベクターｐＧＡＤ１０は、ＧＲＦ１の全部もしくは一部とＧＡＬ４のトランス活性化ドメインとの間の融合タンパク質（ＧＲＦ１−ＴＡタンパク質）の酵母中での発現を可能にする。
【０１４５】
クロンテック［Ｃｌｏｎｔｅｃｈ］（商標）により提供されるベクターｐＧＢＴ９は、Ｒａｓ、ＲａｃもしくはＣｄｃ４２とＧＡＬ４のＤＮＡと相互作用するドメインとの間の融合タンパク質（Ｒａｓ−ＢＤもしくはＲａｃ−ＢＤもしくはＣｄｃ４２−ＢＤタンパク質）の酵母中での発現を可能にする。
【０１４６】
コメント：有利には、Ｒａｓのファルネシル化もしくはＲａｃおよびＣｄｃ４２タンパク質のゲラニルゲラニル化のためのカルボキシ末端ドメインを構築物から除去する。これは、脂質膜に結合せずかつ細胞核に効率的に進入するタンパク質を得ることを可能にする。
【０１４７】
プラスミドでの酵母の形質転換
ＣＬ９酵母を、Ｇｉｅｔｚら（４９）により記述された方法に従ったＬｉＡＣ／ＰＥＧでの処理によりコンピテントにする。それをその後、二重ハイブリッド系を構成する、融合タンパク質の発現を可能にするプラスミドのそれぞれの１μｇで形質転換する。これらの融合タンパク質の発現はシクロヘキシミドに感受性である株につながる。
【０１４８】
二重ハイブリッド系の融合タンパク質間の相互作用を妨害する生成物は、この型の培地上で酵母の成長を可能にすることができる。スクリーニングを実施するために、酵母を１０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを含有する選択培地の表面上でプレート培養する。数滴の化合物を皿の表面に直接適用する。選択される生成物は、沈殿物の周囲に成長の環を生じさせるものである。
【０１４９】
スクリーニングは、上述された技術に従って透過性にされた酵母で実施することができる。
【０１５０】
別の系において、活性の分子によるタンパク質−タンパク質相互作用の阻害は、レポーター遺伝子の発現の減少により示すことができる。これは、比色、蛍光光度もしくは酵素（例：β−ガラクトシダーゼ）アッセイを使用して適切なように示すことができる。成長の阻害は選択培地（例えば：ＵＲＡ３レポーター遺伝子の使用のためのフッ素酸（ｆｌｕｏｒａｔｅ）培地もしくはＣＡＮ１のためのカナバリン培地）を使用して測定することができる。
【０１５１】
β−ガラクトシダーゼ活性は以下の方法で測定する：
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｍａｔａ、ｈｉｓ３Ｄ２００、ｔｒｐ１−９０１、ｌｅｕ２−３，１１２、ａｄｅ２、ＬＹＳ２：：（ｌｅｘＡｏｐ）４−ＨＩＳ３、ＵＲＡ３：：ｌｅｘＡｏｐ）８−ＬａｃＺ、ＧＡＬ４、ＧＡＬ８０）をスクリーニングのツールとして使用する。この株は、タンパク質パートナーの一方がＬｅｘＡタンパク質に融合される場合にタンパク質−タンパク質相互作用を示すことを可能にする（７０）。それを最小ＹＮＢ培地上で成長させた。
【０１５２】
遺伝子型ｓｕｐＥ、ｈｓｄＤ５、ｔｈｉ、Ｄ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）、Ｆ’［ｔｒａＤ３６  ｐｒｏ  Ａ＋Ｂ＋ｌａｃＩｑｌａｃＺＤＭ１５］を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株ＴＧ１を、プラスミドを構築しそしてプラスミドを増幅かつ単離するのに使用した（２．１に記述されるとおり）。
【０１５３】
使用されたプラスミドは以下のとおりである：
クロンテック［Ｃｌｏｎｔｅｃｈ］（商標）により提供されるベクターｐＧＡＤ１０は、ＧＲＦ１の全部もしくは一部とＧＡＬ４のトランス活性化ドメインとの間の融合タンパク質の酵母中での発現を可能にする。
【０１５４】
ベクターｐＬｅｘ９（ｐＢＴＭ１１６）は、Ｒａｓ、ＲａｃもしくはＣｄｃ４２とＬｅｘＡタンパク質のＤＮＡと相互作用するドメインとの間の融合タンパク質の酵母中での発現を可能にする。
【０１５５】
酵母は、Ｇｉｅｔｚら（４９）により記述される方法に従ったＬｉＡＣ／ＰＥＧでの処理によりコンピテントにする。その後、それを、二重ハイブリッド系を構成する、融合タンパク質の発現を可能にするプラスミドのそれぞれの１μｇで形質転換する。これらのタンパク質の発現はβ−ガラクトシダーゼの発現につながる。
【０１５６】
ニトロセルロースのシートを、酵母の層およびスクリーニングされるべき数滴の化合物を含有するペトリ皿の上に置く。その後、このシートを、酵母を破裂させそして従ってβ−ガラクトシダーゼ活性を放出させるために、液体窒素に３０秒間浸す。融解した後に、ニトロセルロースのシートを、コロニーを上方に向けて、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中４０ｍｇ／ｍｌのＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）１５μｌを含有する１．５ｍｌのＰＢＳ溶液（６０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、４０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、ｐＨ７）で前浸積されたワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）紙を含有する別のペトリ皿に入れる。その後、該皿を３７℃のインキュベータに入れる。試験は、６時間後にコロニーがメンブレン上で青色に変わる場合に陽性として記述する。
【０１５７】
タンパク質間の弱いもしくは非常にはかない相互作用の場合には、相互作用をより強くするためにこれらのタンパク質中に変異を導入することを予見することが可能であることに注目すべきである（５２）。
【０１５８】
第二の応用：
この応用は、これらの低分子量Ｇタンパク質がＧＴＰ結合型の形態にある場合のＲａｃおよびＣｄｃ４２とＰＡＫ１（ＣＲＩＢドメイン）の、ならびにＲａｓ−ＧＴＰとｃ−Ｒａｆ１（ＲＢＤドメイン）の相互作用の特性を使用する。その場合：
ＧＲＦ１（全部もしくは一部）、ＧＡＬ４のトランス活性化ドメインと融合されたＰＡＫ１（ＣＲＩＢドメイン）、およびＧＡＬ４のＤＮＡと相互作用するドメインと融合されたＲａｃもしくはＣｄｃ４２  Ｈｓのいずれか、または
ＧＲＦ１（全部もしくは一部）、ＧＡＬ４のトランス活性化ドメインと融合されたｃ−Ｒａｆ１（ＲＢＤ）、およびＧＡＬ４のＤＮＡと相互作用するドメインと融合されたＲａｓ
のいずれかの、同一の酵母の核中での発現に存するであろう二重ハイブリッドプラス１と呼ばれる二重ハイブリッド系の変形物を予見することが可能である。
【０１５９】
Ｒａｓのファルネシル化もしくはＲａｃおよびＣｄｃ４２タンパク質のゲラニルゲラニル化のためのカルボキシ末端ドメインを、該構築物から除去することができ、それは、脂質膜に結合せずかつ細胞核に効率的に進入するタンパク質を得ることを可能にする。
【０１６０】
ＧＲＦ１による低分子量Ｇの活性化は、ＧＴＰでのそれらの負荷、そして従ってそれらのエフェクター（ＰＡＫ１もしくはＲａｆ−１）とのそれらの相互作用を誘導するであろう。そして従って上述されたレポーター遺伝子の発現を可能にするであろう。
【０１６１】
小分子によるＧＲＦ１タンパク質の交換活性の阻害は、従って、レポーター遺伝子の発現の阻害をもたらすとみられる（上を参照されたい）。
【０１６２】
ＣＬ酵母株を、二重ハイブリッド系中で妨害する分子をスクリーニングするためのツールとして使用する。この酵母はタンパク質−タンパク質相互作用を示すことを可能にする。この酵母はＰＤＲ遺伝子のファミリーおよび解毒過程に関与するＥＲＧ６遺伝子に変異を導入することにより透過性にすることができる。これは最小ＹＮＢ培地上で成長させた。
【０１６３】
遺伝子型ｓｕｐＥ、ｈｓｄΔ５、ｔｈｉ、Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）、Ｆ′［ｔｒａＤ３６  ｐｒｏ  Ａ＋Ｂ＋ｌａｃＩｑｌａｃＺΔＭ１５］を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株ＴＧ１を、プラスミドを構築しそしてプラスミドを増幅かつ単離するのに使用する。それはＬＢ培地上で成長させる。
【０１６４】
使用されたプラスミドは以下のとおりである：
クロンテック［Ｃｌｏｎｔｅｃｈ］（商標）により供給されるベクターｐＧＡＤ１０は、ＰＡＫ１（ＣＲＩＢドメイン）もしくはｃ−Ｒａｆ１（ＲＢＤドメイン）とＧＡＬ４のトランス活性化ドメインとの間の融合タンパク質（Ｐａｋ１−ＴＡもしくはｃ−Ｒａｆ１−ＴＡタンパク質）の酵母中での発現を可能にする。
【０１６５】
クロンテック［Ｃｌｏｎｔｅｃｈ］（商標）により供給されるベクターｐＧＢＴ９は、Ｒａｓ、ＲａｃもしくはＣｄｃ４２とＧＡＬ４のＤＮＡと相互作用するドメインとの間の融合タンパク質（Ｒａｓ−ＢＤもしくはＲａｃ−ＢＤもしくはＣｄｃ４２−ＢＤタンパク質）の酵母中での発現を可能にする。
【０１６６】
ＧＲＦ１（全部もしくは一部）の酵母中での発現を可能にするベクター。
【０１６７】
プラスミドでの酵母の形質転換
ＣＬ酵母を、Ｇｉｅｔｚら（４９）により記述された方法に従ったＬｉＡＣ／ＰＥＧでの処理によりコンピテントにする。それをその後、二重ハイブリッドプラス１系を構成する、融合タンパク質およびＧＲＦ１の発現を可能にするプラスミドのそれぞれの１μｇで形質転換する。これらのタンパク質の発現はシクロヘキシミドに対し感受性である株につながる。
【０１６８】
該系のＲａｓ−ＢＤ、Ｒａｃ−ＢＤもしくはＣｄｃ４２−ＢＤ融合タンパク質のＧＲＦ１による活性化を妨害する生成物は、この型の培地上での酵母の成長を可能にすることができる。スクリーニングを実施するために、酵母を、１０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを含有する選択された培地の表面上でプレート培養する。数滴の化合物を皿の表面に直接適用する。選択される生成物は沈殿物の周囲に成長の環を生じさせるものである。
【０１６９】
スクリーニングは、上述された技術に従って透過性にされた酵母で実施する。
【０１７０】
Ｒａｓ−ＢＤもしくはＲａｃ−ＢＤもしくはＣｄｃ４２−ＢＤタンパク質のＧＲＦ１による活性化に対する生成物の特異性は、例として示される他の試験の１つを使用して確認することができる。
【０１７１】
他の二重ハイブリッドプラス１系の表示技術を使用することができる。
【０１７２】
タンパク質−タンパク質相互作用を阻害することにより、活性の分子をレポーター遺伝子の発現の減少により示すことができる。この減少は、比色、蛍光光度もしくは酵素アッセイを使用して適切なように示すことができる。成長阻害は選択培地（例えば：ＵＲＡ３レポーター遺伝子の使用のためのフッ素酸培地もしくはＣＡＮ１のためのカナバリン培地）を使用して測定することができる。
【０１７３】
タンパク質間の弱いもしくは非常にはかない相互作用の場合には、相互作用をより強くするためにこれらのタンパク質に変異を導入することを予見することが可能であることに注目されるべきである（５２）。後者の例を実行するために、当業者は特許第ＵＳ５，２８３，１７３号、同第ＵＳ  ５，４６８，６１４号、同第ＵＳ  ５，５２５，４９０号、同第ＵＳ  ５，５８０，７３６号および同第ＵＳ  ５，８８５，７７９号明細書を参照することができる。
【０１７４】
実施例５：ＧＲＦ１とヘテロ三量体のＧタンパク質のβ−γサブユニットとの間の相互作用を測定することにより化合物をスクリーニングするためのＧＲＦ１タンパク質の使用
ＧＲＦ１のＰＨドメインとヘテロ三量体のＧタンパク質のβ−γサブユニットとの間に物理的相互作用が存在する（７−９）。酵母中での二重ハイブリッド系（実施例４で記述されるところの）は、この相互作用を混乱させることが可能な分子を示すためのスクリーニングを実施するための適切なツールであろう。それは、ＧＲＦ１タンパク質全体、もしくはＰＨドメイン、またはＧＲＦ１タンパク質中に天然に見出されるところのＰＨ−ＤＨ−ＰＨドメインの連続のいずれかを使用してよい。
【０１７５】
実施例６：トランスフェクトされた細胞を使用するＧＲＦ１阻害剤についての細胞スクリーニングアッセイにおけるＧＲＦ１の使用。
【０１７６】
文献によれば、ＧＲＦ１の触媒的部分の過剰発現は、トランスフェクトされた細胞に形質転換された表現型を賦与する（４６，４７）。
【０１７７】
ＧＲＦ１阻害剤についてのスクリーニングアッセイは、ｇｒｆ１でトランスフェクトされた細胞の安定なクローンを使用し、それについて本発明者らはウェスタンブロッティングによる導入遺伝子の過剰発現を示すことが可能であった。
【０１７８】
ＧＲＦ１の過剰発現は、細胞にアガー中でクローン化される能力を賦与し、それは以下のプロトコルに従って確かめられる：
細胞を計数し、そして１ｍｌあたり細胞２．５×１０５個の濃度でフェノールレッドを含まない完全培地に再懸濁する。
【０１７９】
以下を９６穴プレートのウェルに連続して注ぐ：
５０％のフェノールレッドを含まない２×培地および５０％のアガロース（水中で調製されかつオートクレーブ滅菌された、１．２％の例えばシグマ（ＳＩＧＭＡ）（Ａ−６５６０）タイプＶＩＩのような低融点アガロース）を含有する７５μｌの下層、
以下の混合物から調製された７５μｌの上層：
−フェノールレッドを含まない１．６７×培地２５ｍｌ（フェノールレッドを含まない２×培地５００ｍｌ、１００ｍｌのウシ胎児血清、２×グルタミンおよび２×ペニシリン／ストレプトマイシン、１００ｍｌの滅菌水）、１０ｍｌの細胞懸濁物、１５ｍｌのアガロース（水中で調製されかつオートクレーブ滅菌された、１．２％の例えばシグマ（ＳＩＧＭＡ）（Ａ−６５６０）タイプＶＩＩのような低融点アガロース）。
【０１８０】
アガーが固化すれば、試験分子を１×培地で適する濃度で希釈し、そして７５μｌをウェル中のアガーの層に添加する。
【０１８１】
細胞をカルセインで染色することにより２週間後に計数する：
カルセインＡＭ（モレキュラー  プローブス（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ）Ｃ−１４３０、４ｍＭ  ＤＭＳＯ）はＨＢＳＳで１０μＭに希釈し、そして−２０℃で保存する。２５μｌのカルセインＡＭを各ウェルに添加し、そして細胞を最低１時間インキュベータ（３７℃）中に放置する。プレートをＣ０装置で読取る。
【０１８２】
ＧＲＦ１阻害剤は、アガー中のクローンの数の減少により示されることができる。ヒトもしくはマウスのｇｒｆ１の全部もしくは一部（ＣＤＣ２５様ドメインもしくはＤＨドメイン）の発現を可能にする真核生物発現ベクター（プラスミド）でトランスフェクトされたいかなる不死化された哺乳動物細胞もまた使用することができる。この発現ベクターは、同時に、ヒグロマイシン、ネオマイシン、ゼオシンなどのような選択剤に対し耐性の表現型を賦与し、そして、そのようなものとして、トランスフェクトされかつ該導入遺伝子を発現する細胞を選択しそしてその後クローン化する（ＦＡＣＳもしくは限界希釈法により）ことを可能にする。
【０１８３】
【表１】
2004537961.tif 000003
【０１８４】
【表２】
2004537961.tif 000004
2004537961.tif 000005
2004537961.tif 000006
2004537961.tif 000007
2004537961.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
ＧＲＦ１タンパク質の図解である。
【図１Ｂ】
ＧＲＦ１タンパク質の機能が関与する主要なシグナル伝達経路の組合せ図である。
【図２Ａ】
神経学的検査を表すヒストグラムである。
【図２Ｂ】
神経学的検査を表すヒストグラムである。
【図３Ａ】
それぞれ全体および大脳皮質の脳傷害の程度を説明するヒストグラムである。
【図３Ｂ】
それぞれ全体および大脳皮質の脳傷害の程度を説明するヒストグラムである。
【図３Ｃ】
大脳皮質領域の多様な領域の傷害を説明する図である。
【図３Ｄ】
３．２２と１．７６との間の大脳皮質領域の傷害の容量を説明する図である。
【図４Ａ】
ｇｒｆ１  ＫＯ変異体マウス（−／−で示される）の体重および血中レプチンを説明する図である。
【図４Ｂ】
野性型マウス（＋／＋で示される）の体重および血中レプチンを説明する図である。
【図５Ａ】
ｇｒｆ１  ＫＯ変異体マウス４８時間絶食後の体重および血中レプチンを説明する図である。
【図５Ｂ】
野性型マウスの４８時間絶食後の体重および血中レプチンを説明する図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004537961.tif 000093
【国際調査報告】
2004537961.tif 000094
2004537961.tif 000095
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