(57)【要約】カラム頭部で移動相を希釈することによりクロマトグラフィカラムのローディング容量を増大させるための方法および器具。サンプルを溶解するための強移動相を供給する。強移動相にサンプルを注入し、その後、弱移動相で希釈する。得られたサンプル含有弱移動相をクロマトグラフィカラムに通して、サンプルの成分を保持し、分離する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマトグラフィシステムでサンプルを分離する強化型クロマトグラフ法であって、
サンプル溶液を強移動相に注入してサンプル含有強移動相を形成するステップと、
サンプル含有強移動相を希釈してサンプル含有弱移動相を形成するステップと、
サンプル含有強移動相をクロマトグラフィカラムに通すステップと
を含む、強化型クロマトグラフ法。
【請求項２】
カラムのローディング容量を増大させる、請求項１に記載の強化型クロマトグラフ法。
【請求項３】
カラムのローディング容量を少なくとも２倍増大させる、請求項２に記載の強化型クロマトグラフ法。
【請求項４】
強化型クロマトグラフ法が、カラムのローディング容量を少なくとも５倍増大させる、請求項２に記載の強化型方法。
【請求項５】
強化型クロマトグラフ法が、カラムのローディング容量を少なくとも１０倍増大させる、請求項２に記載の強化型方法。
【請求項６】
強化型クロマトグラフ法が、カラムのローディング容量を少なくとも２０倍増大させる、請求項２に記載の強化型方法。
【請求項７】
強化型クロマトグラフ法が、カラムのローディング容量を少なくとも３０倍増大させる、請求項２に記載の強化型方法。
【請求項８】
強化型クロマトグラフ法が、カラムのローディング容量を少なくとも６０倍増大させる、請求項２に記載の強化型方法。
【請求項９】
強化型クロマトグラフ法が、カラムのローディング容量を少なくとも８０倍増大させる、請求項２に記載の強化型方法。
【請求項１０】
サンプル含有弱移動相中の有機溶媒のパーセンテージが、サンプル含有強移動相中の有機溶媒のパーセンテージとは異なる、請求項１に記載の強化型方法。
【請求項１１】
サンプル含有弱移動相中の有機溶媒のパーセンテージが、サンプル含有強移動相中の有機溶媒のパーセンテージ未満である、請求項１０に記載の強化型方法。
【請求項１２】
サンプル含有弱移動相中の有機溶媒のパーセンテージが、サンプル含有強移動相中の有機溶媒のパーセンテージよりも高い、請求項１０に記載の強化型方法。
【請求項１３】
サンプル含有弱移動相のｐＨが、サンプル含有強移動相のｐＨとは異なる、請求項１に記載の強化型方法。
【請求項１４】
サンプル含有弱移動相のｐＨが、サンプル含有強移動相のｐＨ未満である、請求項１３に記載の強化型方法。
【請求項１５】
サンプル含有弱移動相のｐＨが、サンプル含有強移動相のｐＨよりも高い、請求項１３に記載の強化型方法。
【請求項１６】
サンプル含有弱移動相のイオン強度が、サンプル含有強移動相のイオン強度とは異なる、請求項１に記載の強化型方法。
【請求項１７】
サンプル含有弱移動相のイオン強度が、サンプル含有強移動相のイオン強度未満である、請求項１６に記載の強化型方法。
【請求項１８】
サンプル含有弱移動相のイオン強度が、サンプル含有強移動相のイオン強度よりも大きい、請求項１６に記載の強化型方法。
【請求項１９】
サンプル含有弱移動相の温度が、サンプル含有強移動相の温度とは異なる、請求項１に記載の強化型方法。
【請求項２０】
サンプル含有弱移動相の温度が、サンプル含有強移動相の温度未満である、請求項１９に記載の強化型方法。
【請求項２１】
所定の流量および組成で強移動相を供給するための第１の流体ポンプと、
強移動相にサンプル溶液を注入してサンプル含有強移動相を形成するためのインジェクタと、
所定の流量および組成でサンプル含有強移動相に弱移動相を供給して、サンプル含有弱移動相を形成するための第２の流体ポンプと、
サンプルを分離するためのクロマトグラフィ用収着剤が入っているクロマトグラフィ用カラムと、
サンプル含有強移動相と弱移動相を組み合わせて、クロマトグラフィ用収着剤の前にサンプル含有弱移動相を形成するためのカラム取付け具と
を含む、クロマトグラフィシステム。
【請求項２２】
カラム取付け具がクロマトグラフィ用カラムの上流に位置決めされる、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２３】
カラム取付け具がクロマトグラフィ用カラムの入口端部に一体化した、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２４】
カラム取付け具が、第１の流体ポンプに接続された第１のコンジットと、第２の流体ポンプに接続された第２のコンジットと、クロマトグラフィ用カラムの入口端部に接続された第３のコンジトットを含む、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２５】
第１のコンジットが、流体取付け具を第１の流体ポンプに接続するための接続機構を含む、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
第２のコンジットが、流体取付け具を第２の流体ポンプに接続するための接続機構を含む、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２７】
第３のコンジットが、流体取付け具をクロマトグラフィ用カラムの入口端部に接続する接続機構を含む、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２８】
弱移動相が第１の流量を有し、強移動相が第２の流量を有し、サンプルがカラムに到達した後、第１および第２の流量が変化する、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２９】
弱移動相の流路に接続するように構成された第１のコンジットと、
サンプル含有強移動相の流路に接続するように構成された第２のコンジットと、
クロマトグラフィ用カラムに接続するように構成された第３のコンジットとを含む、クロマトグラフィ用カラムのカラム取付け具であって、
サンプルおよび強移動相を含むサンプル含有強移動相と弱移動相とを混合してサンプル含有弱移動相を形成し、サンプル含有弱移動相をカラムに通す、カラム取付け具。
【請求項３０】
第１のコンジットと第２のコンジットと第３のコンジットとの接合点で形成されたキャビティをさらに含む、請求項２９に記載のカラム取付け具。
【請求項３１】
弱移動相とサンプル含有強移動相を混合するために、キャビティ内に配置された混合要素をさらに含む、請求項３０に記載のカラム取付け具。
【請求項３２】
カラム取付け具を流体ポンプに接続するために、第１のコンジット上に接続機構をさらに含む、請求項２９に記載のカラム取付け具。
【請求項３３】
カラム取付け具を流体ポンプに接続するために、第２のコンジット上に接続機構をさらに含む、請求項２９に記載のカラム取付け具。
【請求項３４】
カラム取付け具をクロマトグラフィカラムに接続するために、第３のコンジット上に接続機構をさらに含む、請求項２９に記載のカラム取付け具。
【請求項３５】
カラム取付け具がクロマトグラフィカラムの入口端部に一体的に形成された、請求項２９に記載のカラム取付け具。
【請求項３６】
クロマトグラフィ用収着床と、
収着床の上流にある共通の入口流路と、
共通の入口流路に接続するように構成された第１の入口流体接続ポートと、
共通の入口流路に接続するように構成された第２の入口流体接続ポートと
を含む、クロマトグラフィ用カラム。
【請求項３７】
共通の入口流路が、第１の入口流体接続ポートからの第１の移動相と第２の入口流体接続ポートからの第２の移動相とを混合して１つに組み合わせられた移動相を形成するための流体混合要素を含む、請求項３６に記載のクロマトグラフィ用カラム。
【請求項３８】
１つに組み合わせられた移動相が、共通の入口流路を通して収着床に導入される、請求項３７に記載のクロマトグラフィ用カラム。
【請求項３９】
第１の入口流体接続ポートが、カラムと流体ポンプとを接続するための接続機構を含む、請求項３６に記載のクロマトグラフィ用カラム。
【請求項４０】
第２の入口流体接続ポートが、カラムと流体ポンプとを接続するための接続機構を含む、請求項３６に記載のクロマトグラフィ用カラム。
【請求項４１】
クロマトグラフィシステムにおいて、
強移動相を供給するための第１のポンプと、
サンプルを強移動相に注入して、サンプル含有強移動相を形成するためのインジェクタと、
弱移動相を供給するための第２のポンプと、
弱移動相とサンプル含有強移動相を混合して、サンプル含有弱移動相を形成するためのカラム取付け具と
を含む、溶媒送出サブシステム。
【請求項４２】
弱移動相の流路に取着するように構成された第１のコンジットと、サンプル含有強移動相の流路に接続するように構成された第２のコンジットと、クロマトグラフィ用カラムに接続するように構成された第３のコンジットとを有する流体コンジットを含む、パッケージカラム取付け具であって、
クロマトグラフィシステムでサンプルを分離する強化型方法の使用上の説明と共にパッケージにされたカラム取付け具。
【請求項４３】
所定の流量で弱移動相をサンプル含有強移動相に供給して、サンプル含有強移動相を希釈するように構成されたクロマトグラフィシステム用のパッケージポンプであって、クロマトグラフィシステムでサンプルを分離する強化型方法の使用上の説明と共にパッケージにされたパッケージポンプ。
【請求項４４】
前記ポンプと共にパッケージにされた請求項４２に記載のカラム取付け具をさらに含む、請求項４３に記載のパッケージポンプ。
【請求項４５】
強移動相および弱移動相のそれぞれが初期流量を有し、弱移動相の初期流量が鏡移動相の初期流量よりも多い、請求項１に記載の強化型方法。
【請求項４６】
弱移動相の初期流量が、強移動相の初期流量よりも少なくとも２０倍多い、請求項４５に記載の強化型方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の参照）
本願は、２０００年１１月２１日出願の米国仮特許出願第６０／２５２，４３６号の優先権を主張するものであり、その内容を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
（背景）
科学の多くの分野では、試験および分析プロトコルのために、精製済みの化合物が必要である。化合物の精製は、余分な成分または不純物を含有する混合物から所望の成分を分離することを要する。クロマトグラフィは、混合物を分画して混合物の成分を分離する方法である。液体クロマトグラフィでは、分離すべき何種類かの成分を含有するサンプルを流体の流れに注入し、クロマトグラフィ用カラムに通す。カラムは、そのカラム上での保持率の差によって、混合物をその成分種に分離するよう設計されている。その結果、異なる成分種が別々のバンドとしてカラムから生じ、時間と共に分離される。
【０００３】
典型的な高性能液体クロマトグラフィシステム（ＨＰＬＣシステム）は、制御された流量および組成で流体（「移動相」）を送出するためのポンプと、流れる流動相にサンプル溶液を導入するインジェクタと、充填材料または収着剤（「固定相」）が入っている管状カラムケースと、移動相中のサンプル成分の存在および量を記録する検出器とからなる。サンプル中の種々の成分は充填材料に対する親和性が異なるので、移動相が固定相を通過するときにサンプルの各成分は異なる時間でカラムから出てくる。カラムから出てくる移動相中に特定の成分が存在するかどうかは、溶離剤の物理的または化学的性質の変化を測定することによって検出することができる。時間に対する検出器の信号をプロットすることによって、サンプルの各成分の存在に対応する応答「ピーク」を観察し記録することができる。
【０００４】
分取（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）ＨＰＬＣは、さらなる調査を行うためにかなりの量の化合物を分離し精製する便利で簡単な方法である。分取ＨＰＬＣのスケールに制限はない。特定の適用例に応じて、分取分離は、非常に大きいカラムおよびサンプルサイズを用いることができ、その結果マルチグラムの収量が得られ、または非常に小さいカラムを使用して分取分離を行うことができ、その結果マイクログラムの収量を得ることができる。したがって分取ＨＰＬＣと分析ＨＰＬＣとの一般的な相違とは、分取ＨＰＬＣでは精製後にサンプルを収集するのに対し、分析ＨＰＬＣではサンプル成分を単に検出して定量する点である。
【０００５】
分取分離の典型的な目標要件には、純度が９０％を超える大量のサンプル化合物の回収と、迅速で効率的なルーチンが含まれる。１日当たり５０〜１００個のサンプルを分離し精製する単一の機器が必要とされる。したがって、各実験操作によって可能な限り大量のサンプルを精製して分離し、それによって労働力、スペース、操作費用、実験操作時間、および関連する計測コストを削減することが非常に望ましい。
【０００６】
分取ＨＰＬＣと質量分析計を組み合わせることによって、多数のサンプルを自動的に処理することが可能になる。自動化分離スキームは、質量分析計による検出によって導かれる。質量分析計は、予想される目標サンプルの分子量を検出し、この分子量を含有する精製済み成分の収集を実行するよう設定される。
【０００７】
分取ＨＰＬＣシステムでの実験操作時間を短縮するその他の手法は、勾配溶離中に急速勾配をもたらすこと、および固定相により小さい粒子が入っているより短いカラムを使用することを含む。しかしこれらの技法は、分析結果にしばしば支障をきたし、分離能が低下してピーク形状が損なわれ、分離したサンプルの純度の低下が示される。
【０００８】
分取クロマトグラフィでは、カラムにおける充填材料の体積当たりの分離すべきサンプル量を、最大限にすることも望ましい。容積がより小さいカラムにはより少ない充填材料が入り、したがってカラムのコストにしばしば著しい影響を与えることになる。しかし、クロマトグラフ分析または「実験操作」における応答ピーク同士の分離能は、一部はカラムのローディング容量（ｌｏａｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ）に依存する。クロマトグラフィの結果は、その結果に支障をきたすことなくカラムに導入されるサンプルの最大体積および／または質量の閾値として定義されるカラムのローディング容量によって制限される。
【０００９】
カラムのローディング容量は、２つの方法、すなわち体積の過負荷および質量の過負荷によって、その限度を超える可能性がある。体積過負荷は、分離能の低下が生じた時点における、注入されたサンプル溶液の体積と定義することができる。質量過負荷は、それよりも高いと分離能の低下が生じるサンプル溶液中の溶質の質量と定義することができる。
【００１０】
カラムのローディング容量は、徐々に大量のサンプルを注入することによって測定することができる。しばしば化合物は、保持時間が異なる複数のピークとして溶離されることになる。カラム容量を超えた負荷は、分離を行って得られたピーク形状の劣化および分離能の低下を特徴とする。
【００１１】
カラムは、従来のまたはカートリッジ設計の任意のクロマトグラフィ用カラムでよい。カラムは、何らかの方法で相互接続する２つ以上のカラムからなるものでもよい。そのような配置構成の例として、別のカラムの上流で直列に接続された容易に交換可能な保護カラムを使用することが考えられ、それによって、主カラムが汚れによって早期に機能しなくなるのを防止する。
【００１２】
Ｎｅｕｅ他（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、４１：９３〜１３６（２００１）、その開示を参照により本明細書に組み込む）は、カラムの長さ、粒度、および分離のための実験操作条件を変化させることによって、逆相勾配分離を最適化するための技法について述べている。この論文はさらに、単純化され自動化可能な分取勾配溶離を行うための、最適化されたサンプル導入スキームについて述べている。
【００１３】
カラムのローディング容量を高め、それによって、クロマトグラフィの実験操作１回当たり、より大量のサンプルを精製して分離できるようにすることが望ましい。クロマトグラフィカラムのローディング容量の増大は、必要とされる実験操作時間が短縮され、固定量のサンプルの分離に関連するコストが削減されることをも意味する。
【００１４】
（発明の概要）
本発明は、液体クロマトグラフィの計装および溶媒送出システムに関し、より詳細には、カラムの頭部で移動相を希釈することによりクロマトグラフィカラムのローディング容量を増大させるための方法および装置に関する。
【００１５】
一態様によれば、本発明は、クロマトグラフィシステムでサンプルを分離する強化型の（ｅｎｈａｎｃｅｄ）方法を提供し、この方法は、強移動相（ｓｔｒｏｎｇ  ｍｏｂｉｌｅ  ｐｈａｓｅ）にサンプル溶液を注入して、サンプル含有強移動相を形成するステップと、クロマトグラフィカラムの上流でサンプル含有強移動相を弱移動相（ｗｅａｋ  ｍｏｂｉｌｅ  ｐｈａｓｅ）で希釈して、サンプル含有弱移動相を形成するステップと、サンプル含有弱移動相をクロマトグラフィカラムに通すステップとを含むものである。
【００１６】
別の態様によれば、クロマトグラフィシステムが提供される。このクロマトグラフィシステムは、所定の流量および組成で強移動相を供給するための第１の流体ポンプと、サンプル溶液を強移動相に注入してサンプル含有強移動相を形成するためのインジェクタと、所定の流量および組成でサンプル含有強移動相に弱移動相を供給して、サンプル含有弱移動相を形成するための第２の流体ポンプと、サンプルを分離するためのクロマトクラフィ用収着剤が入っているクロマトグラフィ用カラムと、クロマトグラフィ用収着剤の前にサンプル含有強移動相と弱移動相を組み合わせてサンプル含有弱移動相を形成するためのカラム取付け具とを含む。
【００１７】
別の態様では、クロマトグラフィ用カラムのカラム取付け具が提供される。カラム取付け具は、弱移動相流路に接続するように構成された第１のコンジット（導管）と、サンプル含有強移動相流路に接続するように構成された第２のコンジットと、クロマトグラフィ用カラムに接続するように構成された第３のコンジットとを含む。カラム取付け具は、サンプルおよび強移動相を含むサンプル含有強移動相と弱移動相を混合してサンプル含有弱移動相を形成し、このサンプル含有弱移動相をカラムに通す。
【００１８】
別の態様によれば、クロマトグラフィ用カラムが提供される。このカラムは、クロマトグラフィ用収着床と、収着床の上流にある共通の入口流路と、共通の入り流路に接続するように構成された第１の入口流体接続ポートと、共通の入口流路に接続するように構成された第２の入口流体接続ポートを含む。
【００１９】
別の態様では、クロマトグラフィシステム用の溶媒送出サブシステムが提供される。このサブシステムは、強移動相を供給するための第１のポンプと、強移動相にサンプルを注入してサンプル含有強移動相を形成するためのインジェクタと、弱移動相を供給するための第２のポンプと、弱移動相とサンプル含有強移動相を混合してサンプル含有弱移動相を形成するためのカラム取付け具とを含む。
【００２０】
別の態様によれば、パッケージにされたカラム取付け具が提供される。パッケージにされたカラム取付け具は、弱移動相流路に取着するように構成された第１のコンジットと、サンプル含有強移動相流路に接続するように構成された第２のコンジットと、クロマトグラフィ用カラムに接続するように構成された第３のコンジットとを有する流体コンジットを含む。カラム取付け具は、クロマトグラフィシステムでサンプルを分離する強化型の方法を用いた取扱い説明書と共に包装される。
【００２１】
別の態様によれば、クロマトグラフィシステム用のパッケージポンプが提供される。このパッケージポンプは、所定の流量でサンプル含有強移動相に弱移動相を供給してサンプル含有強移動相を希釈するように構成される。ポンプは、クロマトグラフィシステムでサンプルを分離する強化型方法の使用上の説明と共に包装される。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本発明の例示的な実施形態は、サンプルを分離し精製するための強化型クロマトグラフィ用システムを提供する。この例示される実施形態を分取ＨＰＬＣシステムで実現した場合について以下に述べる。当業者なら、本発明をその他のタイプのクロマトグラフィシステムでも実現できることが理解されよう。この例示される実施形態は、希釈スキームによってクロマトグラフィカラムのローディング容量を高める。
【００２３】
本発明は、クロマトグラフィカラムのローディング容量が増大するように、かつ分取ＨＰＬＣシステムでのサンプルの分離が高まるように設計された、強化型クロマトグラフ法を提供する。本発明の例示的な実施形態では、クロマトグラフィ用カラムにサンプルを導入する前にサンプルを含有する強移動相が希釈されるよう、クロマトグラフィシステムにカラム希釈スキーム（ａｔ−ｃｏｌｕｍｎ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｓｃｈｅｍｅ）を実装する。この希釈には、カラムのローディング容量を増大させる効果があり、それによって、クロマトグラフィの実験操作中により大量のサンプルを分離することができる。あるいは、固定量のサンプルを分離するためにより短いカラムを使用することができ、それによって、固定量のサンプルを分離するのに必要とされる実験操作時間が短縮される。
【００２４】
例示される実施形態によれば、サンプル溶液を強移動相に注入する。サンプル溶液は、サンプル成分に対する溶解性が良好な、比較的少ない体積の溶媒に溶解した化合物の混合物からなるものでよい。当業者なら、サンプル、サンプルの溶解度、およびその他の関連するパラメータに応じて任意の適切な溶媒を使用できることを理解するであろう。サンプル溶液の一般的な例は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）やテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、これらの混合物など、その他の適切な溶媒に溶解した薬剤化合物の混合物と考えられる。
【００２５】
サンプルを注入することによって、サンプルを含有する強移動相が形成され、その後、弱移動相を添加することによって、この強移動相をクロマトグラフィカラムの頭部で希釈する。得られる溶液、すなわちサンプル含有弱移動相を、クロマトグラフィカラムに導入する。カラム頭部でのサンプル含有強移動相の希釈には、カラムのローディング容量を増大させる効果があり、それによって、クロマトグラフィの実験操作中に、より大量のサンプルを分離することが可能になる。
【００２６】
クロマトグラフィでは、移動相は、サンプル溶液を溶解するように、かつサンプルをクロマトグラフィシステムの固定相に通すように選択された流体である。本明細書で使用される移動相は、互いに対して「強」または「弱」と呼ぶ。移動相の「強度」（例えば強、または弱）は移動相の溶離強度を指し、サンプル成分が移動相または固定相に対して有する親和性について述べるのに使用される。
【００２７】
「強移動相」および「弱移動相」という用語は、当技術分野で知られている。本明細書で使用する「強移動相」は、高溶離強度を有する移動相を指し、クロマトグラフィ用収着剤にサンプルはほとんど保持されないかまたは全く保持されないことになる。「強」移動相に溶解したサンプルは、固定相よりも移動相に対する親和性が大きく、その結果、サンプルは固定相にほとんど保持されないかまたは全く保持されず、溶離時間が短くなる。
【００２８】
本明細書で使用する「弱移動相」は、低溶離強度を有する移動相を指し、強移動相よりも多量のサンプルがクロマトグラフィ用収着剤に保持されることになる。強移動相に溶解したサンプルとは対照的に、「弱」移動相に溶解したサンプルは、固定相よりも移動相に対する親和性が低く、その結果、サンプル成分は固定相に強力に保持され、溶離時間が長くなる。
【００２９】
収着床がサンプル成分を優先的に保持するために、移動相は、少なくともその初期において、低い強度のものから中程度の強度のものであることが有利である。そうでない場合は、サンプル成分が単にカラムを通過するだけになり、サンプル成分はほとんどまたは全く保持されずまたは分離されない。勾配分取ＨＰＬＣでは、初期移動相強度が非常に低く保たれ、したがってサンプル成分は収着床に多量に保持される。移動相の強度は時間と共に系統的に増大して、各サンプル成分を溶離する。この手法は、ＨＰＬＣに注入することができるサンプル溶液の体積および／または質量に溶解度限界を設ける。
【００３０】
使用される保持メカニズムに応じ、多くの異なる移動相特性を使用して、移動相強度を調整することができる。特に溶媒は、移動相の強度を調整するよう選択される。使用される溶媒のタイプは当業者に周知である。例えば「逆相」および「順相（ｎｏｒｍａｌ  ｐｈａｓｅ）」のクロマトグラフィでは共に、移動相中での有機溶媒と水の比が一般に移動相の強度を調整するよう修正される。イオン交換に基づく分離の場合、移動相のｐＨおよび／またはイオン強度は、一般に移動相の強度が調整されるよう操作される。本発明で示された例は「逆相」分離に焦点を当てているが、当業者なら、本発明の強化型技法をその他の分離形態にも同様に適用できることが理解されよう。
【００３１】
逆相クロマトグラフィでは、より極性の高い大部分が水性の移動相と共に、無極性の固定相が使用される。この場合のサンプルの保持は疎水性の相互作用によって行われるので、強移動相、すなわち固定相からサンプルを容易に溶離できる移動相は、有機溶媒のパーセンテージが高いものになる。逆に弱移動相は、逆相クロマトグラフィにおいて有機溶媒のパーセンテージがより低いものになる。
【００３２】
順相クロマトグラフィでは、移動相よりも固定相の極性が高い。順相クロマトグラフィの一般的な適用例は、有機溶媒のパーセンテージが高い移動相と共にシリカやアルミナなどの極性固定相を使用する際に見られる。順相では、弱移動相の有機溶媒のパーセンテージが高くなり、一方、強移動相の有機溶媒のパーセンテージは低くなると考えられる。
【００３３】
イオン交換クロマトグラフィでは、固定相でのサンプルの保持は、帯電した検体とこれとは反対の極性に帯電した固定相表面の官能基との相互作用によって制御される。サンプル成分と固定相は共にカチオンまたはアニオン交換基（場合によっては両方）を含有するので、これらの分離は移動相のｐＨおよび／またはイオン強度の影響を強く受ける。イオン交換分離の場合、サンプルのｐＫａに応じて、また固定相がカチオン交換体かアニオン交換体かに応じて、移動相のｐＨおよび／またはイオン強度を上昇させまたは低下させることによって移動相の溶離強度を増大させまたは低下させる。ｐＨおよび／またはイオン強度は、分離の要求に応じて上昇させまたは低下させることができ、それによって移動相の溶離強度を調整する。広範な適用領域はバイオポリマーの分離であり、特にタンパク質とペプチドの分離である。
【００３４】
移動相の温度変化も、多くの形態のクロマトクラフィにおいてサンプルの保持に影響を与える可能性がある。一般に、移動相の温度が上昇するにつれて移動相の強度も増大し、固定相での保持時間がより短くなる。その作用は、有機溶媒のパーセンテージまたはｐＨが変化した場合にしばしば見られるほど劇的なものではないが、一般に全ての形態のクロマトグラフィ全体を通して観察することができる。この作用は、高温で移動相の溶媒和力を増大させただけで得ることができ、または溶解状態のサンプル分子の分子構造を温度によって変化させることによって得ることができる。一般的な適用領域は、タンパク質や関連するバイオポリマーなどの複合構造を有するサンプルの分離である。
【００３５】
本発明によれば、強移動相はサンプルを溶解する。強移動相は、例えば１００％アセトニトリルなど、サンプルの溶解度が高い強有機溶媒を含む。強移動相は、弱移動相よりも多量のサンプルを溶解することができる。本明細書で使用する「サンプル含有強移動相」は、強移動相と、この強移動相に保持された溶解したサンプルからなる。
【００３６】
強移動相は多量のサンプルを溶解するのに適しているが、この移動相の強度では収着床に保持されるサンプル成分が少なく、ピークが歪み、クロマトグラフィによる分離が損なわれる。サンプル含有強移動相をカラムに通す前に溶媒の強度を調節するために、サンプル含有強移動相に弱移動相を添加することによってサンプル含有強移動相を希釈し、それによってサンプル含有弱移動相を形成する。「サンプル含有弱移動相」は、強移動相と、サンプルと、弱移動相（すなわち希釈剤）を含む。サンプル含有弱移動相は、移動相に対するサンプルの親和性が低く、したがって固定相に対する親和性が高い点で、強移動相よりも溶離強度が弱い。希釈されたサンプル含有移動相は、クロマトグラフィの結果を損なうことなく固定相にサンプルを保持させるのに適している。
【００３７】
上述の技法は、カラムのローディング容量を著しく増大させることができる。この技法は、サンプルを溶解し、サンプルをクロマトグラフィカラムに通すという両方の条件を強化する。このように、より大量のサンプルを、１回のクロマトグラフィ実験操作で分析することができる。記述した希釈スキームが無いクロマトグラフィシステムは、最終結果を損なわずに分離することができるより少量のサンプルに制限される。上述の希釈スキームを使用してサンプルを分離する強化型の方法は、カラムのローディング容量を増大させることができる。カラムのローディング容量は、少なくとも約２倍増大することが好ましく、より好ましくは約２倍〜約８０倍の間、さらに好ましくは少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、および８０倍である。
【００３８】
カラムのローディング容量を増大する他、この強化型クロマトグラフ法は、固定量サンプルに関するピーク形状および分離能を改善する。サンプルの溶解度が不十分である溶媒にサンプルを注入すると、サンプルの沈澱が生じる。これは、注入ポート、弁、および相互接続しているチューブライン内を塞ぐという厄介な問題を引き起こす。しかし、サンプルの溶解度が高い溶媒も不十分な結果をもたらし、すなわちサンプルをカラムの長さのはるか下の方まで運ぶ傾向があり、そのためピークが広がって分離効率が不十分になるという望ましくない結果が得られる。本発明のクロマトグラフ法は、注入ポート、弁、および相互接続しているチューブライン内のサンプルの沈殿を減少させ、その一方で、クロマトグラフィカラム頭部でのサンプルの強力な保持を可能にして、異なる成分の分離も改善する。サンプルを完全に溶解するために初めに強移動相を準備し、その後、移動相を希釈してからカラムに導入することによって、サンプルの分離および精製を強化する。
【００３９】
図１に示す従来の分取ＨＰＬＣシステムでは、単一の勾配ポンプ（ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｐｕｍｐ）１１によって、組成が制御された可変強度移動相がシステムに送出される。分離すべきサンプル溶液を、インジェクタループ１２を通して溶媒の流れに挿入し、移動相の流れに挟まれたサンプル溶液のスラグとしてクロマトグラフィカラム１３に送出する。移動相はカラム１３内に押しやられ、検出器１４に移動して評価される。個々のサンプル成分は収着床に様々な程度で保持され、クロマトグラフィの実験操作中にカラムから溶離する。
【００４０】
勾配分取ＨＰＬＣでは、所望の分離を実現するために、実験操作中に移動相溶媒強度が様々に変化する。カラム内を流れる初期低強度移動相によって、サンプル成分はカラム内の収着剤に強力に吸収される。サンプルをカラム１３に導入した後、移動相の強度が増大するよう勾配が生じ始める。勾配ポンプ１１によって生じた勾配により、個々のサンプル成分はカラム１３から順次溶離される。
【００４１】
その他の分離条件では、移動相の組成を経時的に固定させたままにする必要がある（この形態を「定組成分取ＨＰＬＣ」と呼ぶ）。この場合、移動相の強度は、全てのサンプル成分が収着剤に一部保持される中間レベルに固定されたままである。
【００４２】
図１に示す従来の分取ＨＰＬＣシステムには固有の限界がある。クロマトグラフィの実験操作で精製し分離することができる化合物の量は、最大限にすることが望ましい。初期の手法は、適切な溶媒に溶解したサンプルからなるサンプル溶液であってその体積が増大したサンプル溶液を導入するものであった。しかしサンプル溶液が大量であると、システムに注入するときに、体積の過負荷によってクロマトグラフィに悪影響を与えかつピークの歪みを引き起こすことがわかった。したがって、全注入体積を制限するために、最大量の化合物を少量の溶液に溶かしたものを導入することが望ましいと考えられる。このためサンプル濃度が高くなる。サンプル濃度が高いと、強溶媒が必要である。しかし強溶媒も、質量の過負荷により分離に悪影響を与えかつピーク歪みを引き起こす。したがって、図１に示すシステムの移動相に対するサンプルの溶解度には限界がある。クロマトグラフィシステムでは、過剰な質量または過剰な体積の過負荷なく大量の化合物を最適な状態で分離するために、これら相矛盾する原理を解決しなければならない。
【００４３】
本発明は、実験操作１サイクルにつき分離することができるサンプル量を最大限にするために見かけのローディング容量を増大させることによって、これらの制限を克服するものである。したがって図２に示す本発明は、サンプルを分離するためのクロマトグラフィ用カラム２５と、例えばアセトニトリルなどの強移動相をシステムに供給するための負荷ポンプ（ｌｏａｄｉｎｇ  ｐｕｍｐ）２２と、可変強度弱移動相流をシステムに供給するための分離勾配ポンプ２１と、負荷ポンプ２２および勾配ポンプ２１の出力を組み合わせるための、カラム２５に連絡する取付け具２４を提供する。負荷ポンプ２２は、インジェクタ２３を通して強移動相の流れを送出する。サンプルは、まず溶媒に溶解し、次いでインジェクタ２３を通して強移動相の流れに注入して、サンプル含有強移動相を形成する。この場合、少量の溶液に溶けたサンプル濃度を高くすることができる。サンプルは、強移動相の流れに挟まれたスラグとして取付け具２４に運ばれる。取付け具２４で、サンプル溶液および高強度移動相からなるサンプル含有強移動相を、勾配ポンプ２１からの弱移動相流で希釈して、サンプル含有弱移動相を形成する。次いでサンプル含有弱移動相を、取付け具２４を通してカラム２５に送る。サンプル溶液と、勾配ポンプおよび負荷ポンプからの移動相の組合せとからなる希釈されたサンプル含有弱移動相をカラム２５に通し、その後、検出器２６に送って評価し、精製された化合物を収集する。
【００４４】
好ましい実施形態では、勾配ポンプ２１からの弱移動相の初期流量は強移動相の初期流量よりも多く、弱移動相の初期流量は、負荷ポンプ２２からの強移動相の初期流量の少なくとも約２０倍であることが有利である。このように、カラム頭部で希釈された移動相は、強移動相５％および弱移動相９５％を含有するが、これは、図１のシステムのカラム頭部において勾配分離が始まったときの移動相と同様である。
【００４５】
本発明の代替の実施形態では、２つの単一溶媒、すなわち非勾配ポンプを使用することができ、その一方のポンプは強移動相流のみ送出し、第２のポンプは弱移動相流のみ送出するものである。このシステムは、固定組成の弱移動相を送出する単一溶媒定組成ポンプを勾配ポンプ２１の代わりに使用すること以外、図２に示すシステムと同一である。この実施形態で、カラムに入る移動相の組成は、２つの単一溶媒ポンプの流量プログラミングによって制御される。この実施形態について可能性ある利点とは、勾配ポンプ２１に関連する計装コストをより削減できることである。
【００４６】
上述の移動相希釈スキームに使用される適切な取付け具２４を、図３に示す。取付け具２４は、共通の流路を有する３つの流体コンジットからなる。流路３１は、サンプル含有強移動相を接合点３２に送出する。希釈流路３３は、弱移動相を接合点３２に送出する。接合点３２で、サンプル含有強移動相は、サンプル含有弱移動相と混合され希釈される。このサンプル含有弱移動相は第３のコンジット３４を通過し、カラム頭部に至る（図２の２５）。
【００４７】
接合点３２は、２つの流路を合わせるのに適した任意のサイズおよび形状のキャビティを含んでよい。接合点３２はさらに、弱移動相によるサンプル含有強移動相の希釈および混合を容易にするための混合要素を含んでよい。
【００４８】
図３に示す実施形態によれば、取付け具２４は、クロマトグラフィカラムと勾配ポンプと負荷ポンプの間に設けられる。取付け具は、当技術分野で知られている任意の適切な手段によって、クロマトグラフィ用カラムの入口と勾配ポンプおよび負荷ポンプの出口に接続することができる。例えば、コンジット３１、３３、または３４の端部の１つまたは複数には、それぞれ負荷ポンプ、クロマトグラフィ用カラム、および／または勾配ポンプとの接続が容易になるように、ねじ山を付けることができる。あるいはコンジットは、摩擦嵌めによって、クロマトグラフィカラムの入口および／または勾配ポンプおよび負荷ポンプの出口に接続することができる。取付け具２４を形成するコンジット３１、３３、３４は、特定の適用例に応じて任意の適切なサイズおよび形状を有することができる。
【００４９】
カラム取付け具の代替のデザインを図４に示す。図４で、２つの流路を一緒にし、この一緒になった流路をカラムに繋げるためのカラム取付け具は、クロマトグラフィ用カラム４０に一体的に形成される。カラム本体４１は、意図される用途に向けて選択された様々な長さ、直径、および材料のチューブであり、様々な粒度、形状、または化学組成のものでよいクロマトグラフィ用収着剤４２が充填されている。この収着床は、固定相を保持するよう選択された多孔質フィルタ要素４３、４４によって、入口と出口の両方の端部に含まれている。フィルタ要素は、カラム端部の取付け具またはカラム本体へのプレス嵌めを含んだいくつかの技法を使用して、所定位置に封止することができる。カラム出口端部の取付け具４５は、出口フィルタ４４をカラム本体４１に取着し、流体をカラムから出すための流体接続ポート４６を含んでいる。カラム入口端部の取付け具４７は、入口フィルタ４３をカラム本体４１に取着し、カラムに入る流体の流れ用の複数の接続ポート４８、４９を提供する。好ましい実施形態で、第１の接続ポート４８はサンプル含有強移動相をカラムに送出し、第２の接続ポート４９は弱移動相をカラムに送出する。次いで流体の流れをクロマトグラフィ用収着床４２のすぐ近くで混合して、サンプル含有強移動相を希釈する。
【００５０】
代替のデザインでは、入口端部の取付け具内に位置付けられた凹型のキャビティ５０内で、カラムに入る流体の流れを混合するが、これはキャビティ５０に挿入された混合要素５１によって行われる。混合要素は、任意の従来のデザインでよい。混合した後、希釈されたサンプル含有移動相は入口フィルタおよびクロマトグラフィ用収着床を通過し、次いで最終的にはカラムから出る。好ましい実施形態で、カラムは、前述の流体接続ポートを含むカートリッジホルダと、混合要素と、充填クロマトグラフィ用収着床が入っており多孔質フィルタ要素を保持する取外し可能なカートリッジタイプのカラムとからなるカートリッジシステムのデザインにすることができる。
【００５１】
本発明の例示的な実施形態の、完全分取システムの一実施形態を図５に示す。負荷ポンプ５３は、制御された強移動相流をインジェクタ５４に通し、複数入口保護カラム５５の頭部にその第１の入口を介して供給する。勾配ポンプ５２は、制御された可変強度弱移動相流を、保護カラム５５の第２の入口に供給する。カラム５５に入る流体を収着床のすぐ近くで混合し、カラム５５および５６内に入っているクロマトグラフィ用収着剤に送って分離し、最後に検出器５７で検出する。
【００５２】
本発明の希釈スキームは、クロマトグラフィの結果を著しく向上させる。サンプルを溶解するための初期強移動相によって、大量のサンプルを少量の体積に溶かしたものを導入することが可能になる。これによって、移動相へのサンプルの溶解が最大限になる。その後、サンプル含有強移動相を希釈してからサンプルをカラムに導入することによって、最適な分離条件が実現される。例示する希釈スキームによって、大量の注入体積と、クロマトグラフィに悪影響を及ぼす強サンプル溶媒という相矛盾する原理が解決される。
【００５３】
ローディング容量が向上することによって、かなりの量の化合物を精製し分離するのに必要な時間が短縮され、したがって分離操作コストが削減されるという著しい利点が得られる。所与のサンプルサイズの場合、より短いカラムを使用することができ、実験操作時間が短縮され、溶媒消費量が少なくなり、カラムにかかる費用が削減され、それと同時に高品質の結果を得ることができる。したがって、１日当たりより多くの数のサンプルを、単一のクロマトグラフィシステムで精製することができる。所与のカラムサイズでは、各実験操作中に、より大量に導入されたサンプルを精製することができ、それによって、特定量のサンプルを精製するのに必要な実験操作の数を減らすことができる。
【００５４】
さらに、本発明の希釈スキームを実現することによって分離能が増大し、所与のサンプル質量に関するピーク形状が改善され、それによって、収集されたピークの純度が高められる。これらの作用を非限定的な実施例として以下に示す。
【００５５】
（発明の例示）
実施例１：標準のクロマトグラフ法を使用して注入負荷を増大させたことによる分離品質の変化
サンプル溶媒としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を使用して、ジフェンヒドラミン、オキシブチニン、およびターフェナジンを各成分につきミリリットル当たり２０ミリグラムの濃度で組み合わせることによりサンプル混合物を調製する。図１に示す標準のクロマトグラフィ用システムを使用してサンプルを分離するが、この場合カラム１３は、従来デザインの内径１９ｍｍ×長さ３０ｍｍのカラムに直列に接続された、従来デザインの内径１９ｍｍ×長さ１０ｍｍの保護カラムからなる。クロマトグラフィ用カラムには、標準の逆相Ｃ１８収着剤（ＷａｔｅｒｓのＸＴｅｒｒａ  ＭＳ−Ｃ１８、５ミクロン粒子）が充填されている。開始時には移動相組成がアセトニトリル５％／水９５％であってｐＨ１０の重炭酸アンモニウム緩衝液を含有するものと共に、また終了時には移動相の組成がアセトニトリル９０％／水１０％であってｐＨ１０の重炭酸アンモニウム緩衝液を含有するものと共に、線形勾配溶離プロフィルを使用する。時間に対する移動相組成プロフィルを以下の表１に示す。流量を、１分当たり３０ミリリットルに設定し、従来デザインの紫外線検出器を使用して、カラム溶離液をモニタする。
【００５６】
図６ａおよび６ｂは、図１の標準的なクロマトグラフィシステムを使用してサンプル注入体積５００μＬおよび２０００μＬをそれぞれ分離した結果を示す。注入負荷が５００μＬから２０００μＬに増大するにつれ、ピーク間の基線分離能はもはや実現されず、ピーク１および３は割れて複数のピークを形成する。図６ｂにおける分離能の低下およびピークが割れた外観は、クロマトグラフィ用カラムのローディング容量を超えることによって生じる。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
実施例２：本発明の例示的な実施形態の強化型クロマトグラフ法を使用して注入負荷を増大させたことによる分離品質の変化
図２に示すようにクロマトグラフィ用システムを使用するが、カラム２５と検出器２６は実施例１で述べたものと同一である。取付け具２４（図３に示す）は、カラム２５の前に配置する。線形勾配溶離プロフィルは、１分当たり２８．５ミリリットルの流量で勾配ポンプ２１から送出される。負荷ポンプ２２を１分当たり１．５ミリリットルの流量に設定し、第１の実施例と同様に、組み合わせた後の全流量を１分当たり３０ミリリットルにする。時間に対する勾配組成を表１に示す。実施例１と同じ勾配組成を使用するが、この勾配に初期延期を付加することによって、負荷ポンプ２２から導入する溶媒をインジェクタ２３を介してポンピングすることが可能になり、それによって、勾配開始前にカラムにサンプルを完全に移送することが確実になる。実施例１で使用したものと同じサンプル混合物をシステムに注入する。
【００５９】
図７ａ、ｂ、ｃ、およびｄはそれぞれ、サンプル注入体積が５００μＬ、１０００μＬ、２０００μＬ、および４０００μＬであるものに関する分離結果を示す。注入負荷が増大したとき、ピーク同士の基線分離能は維持されており、基線分離能に優れてピークが割れない状態であることがわかる。図示するように、カラム導入前にサンプル含有強移動相が希釈されるようカラム取付け具を使用する場合、図１で述べた希釈スキームを使用しない標準クロマトグラフィシステムに比べ、ボリュームのローディング容量が著しく増大する。
【００６０】
実施例３：図３の実施形態を使用した場合と図４の実施形態を使用した場合の比較
図５に示すようにクロマトグラフィ用システムを配置する。図５の構成は、例示的な実施形態の移動相希釈スキームを設けるために保護カラム５５が一体的な二重入口設計（図４に示す）を含むこと以外は、図２で使用したものと同一である。この二重入口設計は、実施例２の取付け具２４の代わりに使用される。サンプル組成、勾配溶離プロフィル、および全ての移動相流量は、実施例２で使用したものと同一である。
【００６１】
図８ａおよびｂはそれぞれ、実施例２および３に示すクロマトグラフ法およびシステムを使用してサンプル溶液を４０００μＬ注入した場合の分離結果を比較する。この結果は、実施例３で述べる一体的な複数入口設計を有するカラムが、実施例２のクロマトグラフィ用取付け具と実質的に同様に機能することを示す。
【００６２】
本発明を、例示的な実施形態および適用例に関して詳細に述べてきたが、当業者なら、上述の請求項で定義された本発明の意図される範囲から逸脱することなく、様々な修正および変更を加えることができることを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
分取クロマトグラフィシステムにおける溶媒送出システムの、従来の機器構成を示す図である。
【図２】
本発明の教示による、分取クロマトグラフィシステムにおける溶媒送出システムの機器構成であって、複数溶媒勾配送出ポンプと共に単一の溶媒導入ポンプを利用した状態を示す図である。
【図３】
クロマトグラフィ用カラムのローディング容量を増大させるために本発明の教示により使用されるカラム取付け具を示す図である。
【図４】
本発明の教示による移動相の希釈をカラムで行うための複数の入口ポートを備えたクロマトグラフィ用カラムを示す詳細な図である。
【図５】
本発明の教示による分取クロマトグラフィシステムでの溶媒送出システム用の代替の機器構成であって、クロマトグラフィ用カラムが、別のクロマトグラフィ用カラムに直列に接続されている複数の入口ポートを備えた保護カラムからなる状態を示す図である。
【図６】
図６ａは標準のクロマトグラフィシステムに関して５００μＬサンプル溶液を分離した状態を示すクロマトグラムである。
図６ｂは標準のクロマトグラフィシステムに関して２０００μＬサンプル溶液を分離した状態を示すクロマトグラムである。
【図７】
図７ａは図２のクロマトグラフィシステムを使用して５００μＬサンプル溶液を分離した状態を示すクロマトグラフである。
図７ｂは図２のクロマトグラフィシステムを使用して１０００μＬサンプル溶液を分離した状態を示すクロマトグラムである。
図７ｃは図２のクロマトグラフィシステムを使用して２０００μＬサンプル溶液を分離した状態を示すクロマトグラムである。
図７ｄは図２のクロマトグラフィシステムを使用して４０００μＬサンプル溶液を分離した状態を示すクロマトグラムである。
【図８】
図８ａは図３のカラム取付け具およびカラムを使用した分離を示すクロマトグラムである。
図８ｂは図５に示す複数の入口ポートを有するカラムを使用した分離を示すクロマトグラムである。
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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