(57)【要約】本発明は、ＤＮＡ含有媒体に曝露された表面へのＤＮＡの吸着を大幅に減少するような、ＤＮＡプロセシングデバイスの表面の処理に関する方法論を開示する。これら上述の表面処理は、以下を含む：（ｉ）ケイ素に富む、窒化ケイ素の薄いフィルムおよび水酸基含有の、低温の酸化ケイ素の薄いフィルムの蒸着、および（ｉｉ）塩基性の、酸化的な洗浄溶液での表面の洗浄工程。本発明はまた、上記の方法により処理された表面を利用する、ＤＮＡプロセシングデバイスの製造を開示する。そのようなＤＮＡプロセシングデバイスは、例えば、小型の電気泳動および他のＤＮＡ分離デバイス、小型ＰＣＲ反応器などを含む。本発明はさらに、所定の表面へのＤＮＡの蒸着の度合いを試験するための方法論を開示する。さらに、本発明の方法論およびデバイスはまた、一般に核酸のプロセシングに適用可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面への核酸の吸着を試験するための方法であって、以下の工程：
（ａ）該表面を標識した核酸分子の溶液と接触させる工程；
（ｂ）該接触させた表面を洗浄して該核酸溶液を除去する工程；および、
（ｃ）該表面上の該標識を測定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記核酸が、ＤＮＡである、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記標識が、蛍光性である、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記表面が、核酸を含む媒体と接触する核酸プロセシングデバイスの表面であって、ここで、前記溶液が、該デバイスに存在すると予期される濃度で核酸分子を含む該媒体を含有し、そしてここで、前記接触工程は、該媒体が該デバイスの操作中に該表面に接触する時間の代表的な時間である、方法。
【請求項５】
核酸のプロセシングのための装置であって、以下：
（ａ）核酸を含有する媒体に接触するための１以上の表面；および、
（ｂ）該表面上に蒸着された、ケイ素に富む窒化ケイ素を含む表面フィルム、
を備える、装置。
【請求項６】
請求項５に記載の装置であって、ここで、前記表面フィルムが、化学蒸着を包含する方法により蒸着される、装置。
【請求項７】
請求項５に記載の装置であって、ここで、前記ケイ素に富む、窒化ケイ素は、Ｘが約０．８と約１．２との間の値を有するような化学的組成物ＳｉＮＸを有する、装置。
【請求項８】
請求項５に記載の装置であって、ここで、前記ケイ素に富む、窒化ケイ素は、Ｘが約０．９５と約１．０５との間の値を有するような化学的組成物ＳｉＮＸを有する、装置。
【請求項９】
請求項５に記載の装置であって、ここで、前記ケイ素に富む、窒化ケイ素は、Ｘが、前記１以上の表面への核酸の吸着を最小化するよう選択される値を有するような、化学的組成物ＳｉＮＸを有する、装置。
【請求項１０】
請求項５に記載の装置であって、ここで、前記表面フィルムが、約２．１と約２．５との間の屈折率を有する、装置。
【請求項１１】
請求項５に記載の装置であって、ここで、前記表面フィルムが、約２．１５と約２．２５との間の屈折率を有する、装置。
【請求項１２】
請求項５に記載の装置であって、ここで、前記表面フィルムが、前期表面に蒸着された該表面フィルムへの核酸の吸着を最小化するように選択される屈折率を有する、装置。
【請求項１３】
核酸のプロセシングのための装置であって、以下；
（ａ）核酸を含有する媒体に接触するための１以上の表面；および、
（ｂ）該表面上に蒸着される、１〜４％重量の水酸基および０．５％重量より少ない水素基を有する酸化ケイ素を含有する表面フィルム被覆であって、ここで、該表面フィルムは、化学蒸着を含む方法により蒸着される、表面フィルム被覆、
を備える、装置。
【請求項１４】
核酸をプロセシングするための装置を製造するための方法であって、該方法は、核酸を含む媒体に接触するための前記デバイスの１以上の表面上に、酸化ケイ素の被覆を蒸着する工程を包含し、ここで、該蒸着は、５００℃より低い温度での化学蒸着を包含する手段による、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、ここで、前記温度が、前記１以上の表面への核酸の吸着を最小化するように選択される、方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、ここで、前記温度が、２００℃より低い、方法。
【請求項１７】
請求項１４に記載の方法であって、ここで、前記温度が、１００℃より低い、方法。
【請求項１８】
請求項１４に記載の方法に従って作製される、核酸をプロセシングするための装置。
【請求項１９】
アルカリ性／塩基性洗浄溶液と、核酸を含む媒体を接触させるための前記デバイスの１以上の表面を洗浄する工程を包含する、核酸をプロセシングするための装置を製造するための方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、ここで、前記アルカリ性／塩基性洗浄溶液が、少なくとも８．０のｐＨを有する、方法。
【請求項２１】
請求項１９に記載の方法であって、ここで、前記アルカリ性／塩基性洗浄溶液が、揮発性である、方法。
【請求項２２】
請求項１９に記載の方法であって、ここで、前記アルカリ性／塩基性洗浄溶液が、水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）および水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）からなる群から選択されるアルカリ化剤を含有する、方法。
【請求項２３】
請求項１９に記載の方法であって、ここで、前記アルカリ性／塩基性洗浄溶液が、酸化剤を含有する、方法。
【請求項２４】
請求項１９に記載の方法であって、前記アルカリ性／塩基性洗浄溶液が、水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）および過酸化水素水（Ｈ２Ｏ２）の水溶液を含有する、方法。
【請求項２５】
請求項１９に記載の方法であって、ここで、前記水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）の濃度、前記過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の濃度、および前記洗浄工程の継続期間は、前記１以上の表面への核酸の吸着を最小化するように選択される、方法。
【請求項２６】
請求項１９に記載の方法であって、ここで、前記アルカリ性／塩基性洗浄溶液が、約４部の水、約１部の３０％の水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）、および約１部の３０％の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の溶液を含有する、方法。
【請求項２７】
請求項１９に記載の方法であって、ここで、前記洗浄の工程を、室温で行う、方法。
【請求項２８】
請求項１９に記載の方法に従って作製される、核酸をプロセシングするための装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（助成金支援）
本発明は、国立標準および技術研究所のＡｄｖａｎｃｅｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｐｒｏｇｒａｍにより与えられた、助成金番号７０ＮＡＮＢ７Ｈ３００４の下で、政府支援により行われた。従って、米国政府は本発明における特定の権利を有する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、全ての型の改良された核酸プロセシングデバイス、およびより特に、ＤＮＡ含有媒体に曝露されたデバイス表面へのＤＮＡの吸着を減少するように設計された表面処理を用いる小型化ＤＮＡプロセシングデバイスに関する。
【０００３】
（発明の背景）
分析化学および生物工学の領域における最近の発展は、ＤＮＡのプロセシングおよび分析のためのデバイスおよび系の小型化である。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら、１９９７．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：２６２６を参照のこと。同様に、微小製造（ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ）に対する現在の傾向は、半導体産業において達成された小型化に平行するための努力、および類似の微小製造技術を開発するための努力によりもたらされた。例えば、Ｒａｍｓｅｙら、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．１：１０９３を参照のこと。小型化についての正当性としては、費用の減少、速度および信頼性の増加、アクセス（医療診断の点）の分散、サンプルおよび試薬消費の減少、ならびに廃棄物発生の減少が挙げられる。
【０００４】
微小製造されたＤＮＡ分析デバイスの例は、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／３５８１０（その全体が本明細書中に参考として援用される）に示される。この上述の公開は、電気泳動ゲルでの生体高分子フラグメントの分離および観察のための電気泳動デバイスを記載する。１つの実施態様において、小型電気泳動レーンを有する電気泳動デバイスが開示され、そのレーンは、約２５μｍまでに減少した寸法を有する平板内の開口チャネルにより形成され、そして平らなカバープレートにより閉じられる。さらなる実施態様において、その公開は、そのデバイスによる引き続く分離のための生体高分子フラグメントを生成するための、完全に関連した、小型反応器を含む電気泳動デバイスを開示する。これらの小型化の特色は、半導体産業において初期に発展したリソグラフおよびエッチングの方法論を含む、種々の微小機械の技術により構築され得る。
【０００５】
微小製造されたＤＮＡ分析デバイスのさらなる例は、一般に譲渡された１９９６年３月２７日出願の、米国特許出願番号第０８／６２３，３４６号（その全体が本明細書中に参考として援用される）に示される。この上述の出願は、電気泳動媒体内への粒子の差動的拡散の性質に従って、電位を空間的および時間的に変化させる方法による、媒体中の荷電粒子の分離のための装置を開示する。そのような装置は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡフラグメントの分離に対する適用を有する。１つの実施態様において、このデバイスは、基板上にパターン化される一連の小型電極および１以上の小型チャネル（同じく約２５μｍまで減少した）を有するカバープレートからなる。このデバイスもまた、半導体産業において初期に発展した技術を使用して製造されるよう記載される。
【０００６】
それらの減少された寸法により、小型化または微小製造されたＤＮＡプロセシングデバイスにおける容量に対する表面の比は、他の従来のデバイスを越えて著しく増加した。例えば、Ｓｈｏｆｆｎｅｒら、１９９６．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２４：３７５を参照のこと。この増加した表面対容量の比は、そのような微小製造されたデバイスにおける表面化学の効果の有意性を増加する。特に、ＤＮＡは、多くの表面と強く相互作用し、そして蒸着することが当該分野で周知である。例えば、Ｈｊｅｒｔｅｎ　１９８５．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　３４７：１９１を参照のこと。親水性リン酸基および親水性プロトン化塩基は、任意のほとんどの表面が相互作用するようであることを意味している。さらに、標準的微小製造プロセスの間に使用される厳しいプロセスは、より強い相互作用力さえ作る表面を破損または汚染し得る。例えば、Ｈｅｎｃｋ、１９９７．Ｔｒｉｂｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　３：２３９を参照のこと。この問題は大型のＤＮＡプロセシングデバイスに存在するが、それはより大きな表面対容量比を有する微小機械化デバイス中でかなり増悪される。それはまた、ＰＣＲ反応器、キャピラリーおよび平板ゲル電気泳動系のようなＤＮＡプロセシング系においても問題である。
【０００７】
表面性相互作用は、微小製造されたポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）デバイスに対して提起された（例えば、Ｓｈｏｆｆｎｅｒら、１９９６．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２４：３７５を参照のこと）。さらに、いくつかの型の表面処理は、ＰＣＲに「都合のいい」表面を見出すための初期の試みにおいて研究され、それらは、シラン処理に続いて、ポリマー処理、化学量論的な窒化ケイ素被覆、そして酸化ケイ素被覆による表面処理を含む。しかし、酸化ケイ素のみが、ＰＣＲ反応を阻害しないことが実証され；一方、他の処理方法論によるＰＣＲ増幅反応の阻害は、ＰＣＲ反応に含まれる分子を非特異的に吸着する表面の結合部位の結果であったと推定されたことは留意されるべきである。（例えば、Ｃｈｅｎｇ、１９９６．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２４：３８０を参照のこと）。
【０００８】
従って、ＤＮＡの表面吸着を阻害する微小機械化ＤＮＡプロセシングデバイスにおいて作製される表面に対する表面処理の必要性が存在することは明らかである。そのような阻害は、本明細書中で表面の「不動態化」という。
【０００９】
本明細書に記載の参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明の先行分野であることの承認として取り上げられたものでないことは留意すべきである。
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、特定の表面処理がＤＮＡ吸着を減少する能力を有するという知見を開示する。例えば、特定の表面処理は、以下に基づく：（ｉ）プラズマ増強された酸化ケイ素の低温蒸着、または（ｉｉ）低温酸化ケイ素の低圧の化学蒸着（本明細書で後に「ＬＰＣＶＤ」と示される）。特に、本発明は、処理された表面に対する最小のＤＮＡ吸着を提供する、条件（前駆型を含む）、蒸着プロセスの条件、および引き続くプロセスの条件を開示する。同様に、本発明の他の表面処理は、窒化ケイ素のＬＰＣＶＤ蒸着に基づく。特に、本発明は、特定のレベルのケイ素濃縮が、新規な性質および高度に有効な性質を有する知見を開示する。さらに、本発明は、表面処理がまた、低ｐＨ洗浄溶液に基づいて、ＤＮＡ吸着を顕著に減少する知見を開示する。本明細書中で開示されるように、これらの上述の処理は、以前まで、主にエレクトロニクス産業における、小型デバイスの製造においてのみ利用されてきた微小製造プロセスに採用されている。
【００１１】
従って、本発明の１つの実施態様は、種々の型のＤＮＡ分析装置に対するこれら表面処理の実施のための方法論を開示する。本発明の別の実施態様は、例えば、核酸の分析に適用し得る、これらの方法論によって作製されるデバイスを開示する。好ましい実施態様において、このデバイスは、本発明の表面処理および洗浄を実施された表面を有する、改良されたＤＮＡプロセシングデバイスである。これらの処理がＤＮＡ吸着を減少する場合、そのような改良されたデバイスは、その全体の表面対容量比における付随的な増加により、さらに有利に小型化され得る。
【００１２】
さらなる実施態様において、本発明は、未処置の表面および処置した表面に対するＤＮＡ吸着の程度をアッセイするための方法を含む。これらの方法は、蛍光標識されたＤＮＡを用いて表面を洗浄し、リンスし、そして分光蛍光分析の使用による吸着されたＤＮＡの蛍光検出を含むが、これらに限定されない。
【００１３】
本発明はまた、微小製造されたＤＮＡ系およびＤＮＡデバイス、およびより大型のＤＮＡ系およびＤＮＡデバイスの両方に適用され得る。そのような系およびデバイスは、以下を含むが限定されないプロセシング機能を実施し得る：（ｉ）ＤＮＡ分析（例えば、配列決定、分離、ハイブリダイゼーション、電気泳動）；（ｉｉ）ＤＮＡプロセシング（例えば、ＤＮＡ複製、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）、逆転写に基づいたＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）、インビトロ転写およびインビトロ翻訳、酵素を用いるかまたは用いない鎖交換反応）；（ｉｉｉ）ＤＮＡ修飾（例えば、末端または内部標識、リン酸化、脱リン酸化、消化、連結、鎖同定のための複合体形成）；（ｉｖ）ＤＮＡパッケージング（例えば、高次構造形成のための結合）；および（ｖ）ＤＮＡ抽出。
【００１４】
１つの実施態様において、本発明は、以下の工程を含む、表面に対する核酸の吸着レベルを定量的に確認するための方法を開示する；（ｉ）処置した表面を標識した核酸分子の溶液と接触させる工程；（ｉｉ）標識した核酸溶液を取り除くために、この接触させた表面を洗浄する工程、および（ｉｉｉ）処置した表面上になお存在する標識の量の測定する工程。好ましい実施態様において、核酸はＤＮＡであり、そして標識は蛍光性である。前述の処置した表面は、核酸を含む媒体と接触する核酸プロセシングデバイスを含み、ここで、その溶液は、前記デバイスに存在すると予想される濃度の核酸分子を含む前記媒体を含み、そしてここで、その媒体は、その媒体がそのデバイスの操作中に表面に接触する時間の代表的な時間、表面に接触することが可能となる。
【００１５】
第２の実施態様において、本発明は、核酸含有媒体に接触する１以上の表面およびケイ素に富んだ、窒化ケイ素蒸着物を蒸着させた表面フィルムからなる核酸のプロセシングのための装置を開示する。好ましくは、その窒化ケイ素表面フィルムは、化学蒸着を含む方法により蒸着される。この実施態様の１つの局面において、ケイ素に富んだ、窒化ケイ素の表面は化学組成物ＳｉＮＸを有し、ここでそのＸは、その表面に対する核酸の吸着を最小化するよう選択される。好ましい実施態様において、Ｘは約０．８と約１．２との間の値であり、または、より好ましくは、約０．９５と約１．０５との間の値である。この実施態様の別の局面において、ケイ素に富んだ、窒化ケイ素は、約２．１と約２．５との間の、そしてより好ましくは約２．１５と約２．２５との間の屈折率を有する。
【００１６】
第３の実施態様において、本発明は、以下を含む核酸のプロセシングのための装置を開示する：核酸含有媒体に接触する１以上の表面、および化学蒸着方法論によりその表面上に蒸着された酸化ケイ素（１〜４％の水酸基の質量、および０．５％より少ない水素基の質量を有する）を含む表面フィルム被覆。
【００１７】
第４の実施態様において、本発明は、核酸をプロセシングするためのデバイスを製造するための方法を含み、その方法は、核酸を含む媒体に接触する前記デバイスの１以上の表面上に酸化ケイ素の被覆を蒸着する工程を含む。ここで、その蒸着は、その表面に対する核酸の吸着を最小化するように選択された温度で実行される化学蒸着方法論による。この蒸着温度は、好ましくは、５００℃より低く、より好ましくは２００℃より低く、または最も好ましくは１００℃より低い。
【００１８】
第５の実施態様において、本発明は第４の実施態様で示された方法論に従って生成された核酸の接触プロセシングのための装置を開示する。
【００１９】
第６に実施態様において、本発明は、特定の洗浄溶液を用いて、核酸含有媒体に接触するそのデバイスの表面を洗浄する工程を含む、核酸をプロセシングするためのデバイスを製造するための方法を開示する。好ましくは、特定の洗浄溶液は、少なくとも８の塩基性ｐＨを有し、または揮発性であり、または酸化剤を含む。第６の実施態様の１つの局面において、その特定の洗浄溶液は、水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）および水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）からなる群から選択されるアルカリ性物質を含む。第６の実施態様の別の局面において、特定の洗浄溶液は、水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）および酸化剤である過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の水溶液を含み、そして好ましくは約４部の水、約１部の３０％のＮＨ４ＯＨ、そして約１部の３０％のＨ２Ｏ２の溶液を含む。あるいは、ＮＨ４ＯＨの濃度、Ｈ２Ｏ２の濃度、および洗浄工程の継続時間は、デバイスの表面に対する核酸の吸着を最小化するように選択される。好ましい実施態様において、洗浄の工程は室温で行う。
【００２０】
第７の実施態様において、本発明は、第６の実施態様の方法論に従って生成された核酸をプロセシングするための装置を開示する。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、核酸プロセシングデバイスのための表面処理を提供する方法論を開示し、そしてこのような表面処理を有するデバイスを開示する。これらの処理およびデバイスは、この媒体を含む容積に対して、核酸を含む媒体と接触するより高い割合の表面積を有する小型化デバイスに主に向けられている。このようなデバイスでは、含有される核酸の限られた量の表面吸着を減少するのに特に有利である。
【００２２】
本発明により開示する方法およびデバイスが、これらの主な適用に関して（ＤＮＡプロセシングのためのデバイスに関して）記載されていることに注目すべきである。
【００２３】
従って、本発明の処理は、処理化表面に接触している媒体において、ＤＮＡとの不必要な相互作用がほとんど存在しない表面を提供するように設計されている。これらの処理は、いずれかの表面フィルムの蒸着を含む（例えば、ＤＮＡ含有媒体に曝露されるこれらの表面上の、またはこのような表面を高ｐＨ洗浄液（例えば、水酸化アンモニウムおよび過酸化水素、水酸化アンモニウム単独、または水酸化ナトリウム単独を含む溶液）で処理することにより曝露されるこれらの表面上の、ケイ素に富む窒化ケイ素、プラズマで機能強化した化学蒸着をした低温度酸化ケイ素、または低圧化学蒸着をした（「ＬＰＣＶＤ」）酸化ケイ素）。
【００２４】
これらの上述の処理は、全ての大きさおよび全ての型のＤＮＡプロセシングデバイスへ有利に適用され得る。ＤＮＡ吸着は、マイクロ機械化（ｍｉｃｒｏ−ｍａｃｈｉｎｅｄ）デバイスにおいて悪化されるが、それは大型ＤＮＡプロセシングデバイスにおいても存在する。ＤＮＡ装置は、ゲルスラブ、キャピラリー、およびマイクロ機械化（ｍｉｃｒｏ−ｍａｃｈｉｎｅｄ）を含む、電気泳動デバイスの全ての機器構成として、このような周知の機器を含む。これらはさらに、プロセシングデバイス（例えば、ＰＣＲ反応、配列決定反応、および制限エンドヌクレア―ゼ消化、ライゲーションなどのような他の酵素的反応、を行うための反応器）を含む。
【００２５】
この節では、第１に、例示的ＤＮＡプロセシングデバイス、第２に、例示的な表面処理工程を開示することにより本発明を紹介する。さらに、表面処理に適切な特異的反応条件を開示する。
【００２６】
（（ｉ）例示的なＤＮＡプロセシングデバイス）
この小節では、例示的ＤＮＡ分離デバイスおよび例示的ＤＮＡプロセシング反応器の機器構成を記載する。２つの例示的、小型化したＤＮＡプロセシングデバイスが、この小節において記載されるが、この記述は、本発明を決して限定しないことに注意すべきである。当業者は、本発明の方法が、どのようにして本明細書で開示される処理に影響を受けやすい表面を有する、ほとんどの型のＤＮＡプロセシングデバイスに適用され得るのか容易に理解するであろう。
【００２７】
図１、パネルＡおよびパネルＢは、核酸フラグメントの分離のために微小製造されるデバイスを例証する。好ましくは、このデバイスは、媒体内に存在する個々の核酸種の各々に固有の異なる拡散に従い、デバイスのチャネル内に含まれる液体媒体中に存在する核酸フラグメントを分離する。核酸種の各々の分離は、空間的にまたは時間的に変化する電位により推進される。このデバイスは、分離手順中の間に「オン状態」および「オフ状態」を利用する。「オン状態」において、電位は、荷電粒子（すなわち核酸）を捕捉する役目をする複数の偏心的な形をしたポテンシャルの井戸を有する。「オフ状態」において、電位はフラットであり、そしてこの分離は、分離媒体中の拡散率の違いに基づき、粒子が差動的様式で井戸から井戸へ拡散するように生じる（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９７／３６１７１を参照のこと）。
【００２８】
図１、パネルＢ、に図示するように、本発明の分離デバイスは、一つ以上の物理的に定義した、本デバイスの上蓋（１１）内に含まれる分離レーンまたはチャネル（１５）で構成される。上蓋は、上蓋が基板で密封される場合、液体媒体および核酸を封じ込める役割をする。図１パネルＡに例証するように、分離レーン（１５）は、ローディングポート（１６）と観測帯域（１８）との間に延びる。基板（１１）は、ガラスまたはケイ素、あるいは代わりに石英、サファイア、または金属のような材料から成り得る。また、図１、パネルＢに示されるように、空間的に、および時間的に変化する電位は、底板（１２）上に型取られるボンドパッド（１３および１４）と接続される電極（２０、２１、２２、および２３）により誘起される。電極は、核酸を分離する方向（Ｓ）に対して横行する様式で配置され、偏心的ポテンシャルの井戸を誘起するために位置を合わせられる；電位差が、外部電源（１７）により加えられる場合、各井戸は、通常偏心的、「鋸歯状の」形を有する。
【００２９】
上述の配置の分離デバイスは、微小製造され得る。このような装置において、金属性電極材料は、底板に蒸着され、選択した金属に適用可能である標準的なマイクロ−リトグラフの、およびエッチングの方法論により所望の配置にエッチングされる。同様に、チャネル（２５μｍ以下であり得る）は、選択した上蓋の材質に適用可能な同様の工程を用いて、上蓋（１１）へエッチングされ得る。例えば、このような装置の製造に関連する微小製造工程のさらに詳しい記述については、ＰＣＴ公開ＷＯ／９７／３６１７１を参照のこと。
【００３０】
核酸含有媒体は、チャネル（１５）を有する上蓋（１１）、底板（１２）および複数の電極（２０、２１、２２および２３）を含む、いくつかの装置の部品と接触する。媒体内の核酸が、これらの上述した部品の表面と相互作用し、そして蒸着する場合、吸着が始まり得る；この場合において、観測帯域（１８）で検出される核酸は、減少するか、または存在しない。さらに、これらの相互作用が、十分に強い場合、核酸は、表面と化学的に反応し得、従って、この装置をさらなる分離に使用不能にする。このような相互作用は、ケイ素に基づく基板の場合に観察されている。このケイ素から電極を遮蔽するために、誘電性のフィルムが、電極の形成の前に基板上で蒸着または成長される。適切なフィルムの一つの例は、ケイ素基板を酸素含有雰囲気下で上昇した温度に曝露することにより成長される酸化ケイ素である。しかし、１本鎖ＤＮＡが、このような熱成長酸化ケイ素に対して過剰な蒸着を示したことが実証されている。このような蒸着は、装置のその後の処理の間に利用される慣用的製造プロセス（例えば、プラズマプロセス）により明らかに悪化された。プラズマ内で生じるエネルギー性の相互作用は、表面の損傷、およびその反応性の増大の可能性がある。ケイ素処理は、良く理解され、そして酸化ケイ素は、微小製造において容易に成長し、そして広範に利用されるので、熱成長酸化ケイ素に対する核酸（すなわち１本鎖ＤＮＡ）の蒸着を減少するプロセスは、非常に有利である。
【００３１】
あるいは、同様の構成の装置（しかし、複数の電極を欠く）は、より慣習的な、ゲルに基づく電気泳動的方法論に従った核酸フラグメントの分離において用いられ得る。このような装置において、分離チャネル（１５）は、適切なゲルマトリックスで充填され、そして電位は、各分離チャネルの末端に配列される電極により加えられる。同様に、この装置において、核酸含有媒体はまた、いくつかのデバイス部品と接触し、したがって核酸蒸着の全体のレベルを減少するのに有利である。関連した、微小製造される電気泳動デバイスは、ＰＣＴ公開ＷＯ／９６／３５８１０に開示される。
【００３２】
図２は例示的核酸プロセシング反応器アレイの一部を例証する。例証されるのは、基板（８８８）において形成される２つのマイクロ−反応器（８９８）である。これらの反応器は、核酸をプロセスする反応（例えば、ＤＮＡ配列決定反応）の間、試薬を保持する。基板（８８８）は、代表的にはガラスを含み、そして反応器（８９８）は、代表的には、エッチングプロセスまたは穿孔プロセスのいずれかにより微小製造される。マイクロ反応器は、注入キャピラリーチャネル（８９４および８９５）を介してこのマイクロ反応器へと導かれる、上端ポート（８０２）および注入ポート（８００）の両方を通じて試薬を供給される。生成物は、アセンブリ（８９４、９８５および８９６）により制御される放出キャピラリーチャネル（８９４）により放出ポート（８９０）に導かれる。これらは、好ましくは、電熱マイクロバルブであり得る。注入キャピラリチャネル、および放出キャピラリチャネルは、それぞれ基板８６６ａおよび８６６ｂ中、ならびに基板８６６ｃおよび８６６ｄ中に形成される。これらの基板は、代表的にはケイ素であり、そしてキャピラリはマイクロ−リトグラフプロセスにより形成される。次に、このキャピラリは、例えば熱成長酸化ケイ素の層で、有利に被覆され、それらを溶かしてより不活性にする。このようなマイクロ−反応器アレイの設計および製造は、例えばＰＣＴ公開ＷＯ／９６／３５８１０にさらに詳細に記載されている。
【００３３】
このような装置においてまた、ＤＮＡを含むのみならず、例えば、酵素、試薬、ラベル化オリゴマーなどを含む媒体は、多くのデバイス部品と接触する。特にキャピラリは、高い表面対体積率を有し、そして熱成長オキシドで被覆され得る。これらが反応性である場合、これらは、分子の好ましくない捕捉をするようである。従って、このような装置における蒸着（および特にＤＮＡの蒸着）を減少することもまた、ましてなおさら有利なことである。
【００３４】
従って、一般的に、多くの型の微小製造されたＤＮＡプロセシングデバイスにおける使用に有利な、これらの表面へのＤＮＡの蒸着を除去または排除する表面処理は、有用であり、そして本発明により達成される。
【００３５】
（（ｉｉ）一般的表面処理）
微小製造された核酸プロセシングデバイス、および大型核酸プロセシングデバイスにおける核酸の蒸着の減少のために有用な表面処理は：（ｉ）特定のフィルムの蒸着または、制御される特性および所望の特性の被覆、あるいは（ｉｉ）制御される状態において不必要な物質を除去し、そして固有の表面基を残すように設計した種々の表面洗浄液の利用、を一般に含む。蒸着フィルムは、ケイ素、酸化ケイ素、ガラス、金属、プラスチック、および他の同様な材料を含むが、これに限定されない、より広範で多様な表面に適用可能である；ここで好ましくは、表面洗浄は、ケイ素または酸化ケイ素を含む表面に対して適用可能である。以下の小節は、これらの上述した型の表面処理の両方をさらに十分に議論する。
【００３６】
注目すべきは、以下の記載は、主にＤＮＡプロセシングデバイスにおけるＤＮＡ吸着の減少に関するが、本発明において開示する方法論およびデバイスはまた、核酸プロセシングのために設計された種々のデバイスにおいて、他の核酸（例えば、ＲＮＡ、改変した核酸、核酸模倣物など）の吸着の減少に適合することである。さらに、これらの他の上述した核酸種は、いくらか異なる吸着特性を有するが、本明細書で開示される方法論およびデバイスはまた、一般的な範囲および開示された組成物の内で、後で議論される吸着を試験する方法論を用いて、これらの異なる特性に対して最適化され得る。
【００３７】
（（ａ）フィルム蒸着）
本発明の好ましい実施態様において、蒸着した薄層フィルムは、窒化ケイ素、または酸化ケイ素で形成され、そして化学蒸着（以下「ＣＶＣ」）技術により蒸着される。好ましいＣＶＤ技術は、低圧化学蒸着（「ＬＰＣＶＤ」）、およびプラズマで機能強化した化学蒸着（「ＰＥＣＶＤ」）を含む。ＣＶＤに基づくフィルムの蒸着は、半導体集積回路の製造において広範に実施されている。例えば、その全体を本明細書中で参考として援用する、Ａｄａｍｓ、１９８８．ＶＬＳＩ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２版：中の「Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ　ａｎｄ　Ｐｏｌｙｓｉｌｉｃｏｎ　Ｆｉｌｍ　Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ，」、２３３〜２７１頁、（ＭｃＧｒｅｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を参照のこと。本発明はまた、スパッター蒸着または物理蒸着、エバポレーション、イオンビーム蒸着、およびスピン−オン被覆を含むが、これに限定されない、当該分野で公知のこれらの材料の薄層フィルムを蒸着するための種々の他の技術に適合可能である。
【００３８】
より具体的には、ＣＶＤに基づくプロセスは、熱的加熱、高周波放電などを含む、多様な励起方式により、初めに高い反応性で作られる気相反応物から、基板上にフィルムを蒸着する。これらのプロセスは、種々の励起方式で、および種々の反応工程の条件下で、基板を隔離するために設計した種々の反応器および反応器構成物中で行われ得る。例えば、その全体を本明細書中で参考として援用する、ＲｕｎｙａｎおよびＢｅａｎ、Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｃｉｒｃｕｉｔ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１９９０．１２１〜１６０頁（Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ，Ｒｅａｄｉｎｇ，ＭＡ）を参照のこと。
【００３９】
ＣＶＤに基づく蒸着方法論において利用した反応器および励起方式は：（ｉ）任意のプラズマグロー放電を伴う熱的加熱煙管；（ｉｉ）連続処理、熱的加熱、大気圧反応器、および（ｉｉｉ）平行板、誘導結合プラズマ（「ＩＣＰ」）、および電子サイクロトロン共鳴（「ＥＣＲ」）プラズマ補助ＣＶＤ反応器、のようなプラズマ放電反応器を含むが、これに限定されない。熱的加熱煙管は、代表的には、反応炉により加熱される石英管を含み、この中で気体反応物は、一端から注入され、そしてもう一方から排出される（すなわち、汲み出される）。蒸着のために利用される基板は、代表的には石英ホルダー内に保持され、引き込んだ気体の流れに直交する様式の空間的向きで被覆される表面を有する。気体流速、温度、および圧力は、フィルムの蒸着速度、フィルムの均質性、フィルムの構造、および他のフィルム特性を制御するために調整される。連続処理、熱的加熱、大気圧反応器において、コンベヤアセンブリは、熱的加熱気体反応物を有する領域を通じて基板を運ぶ。これらの領域は、窒素の高速流噴射（ｆａｓｔ−ｆｌｏｗｉｎｇｊｅｔｓ）のガスカーテンに接している。プラズマ放電反応器において、気体反応物は、プラズマ放電を同時に生成する、高エネルギー高周波帯域で励起される。引き続き、この放電を通じて流れる気体反応物分子は、励起およびイオン化され、このようにしてプラズマの形成および化学反応の原因が生じる。高い強度のプラズマは、例えば、電子サイクロトロン共鳴（「ＥＣＲ」）における磁場により高周波発生プラズマを封じ込めることにより、または誘導結合プラズマ（「ＩＣＰ」）増幅の方法論により生成し得る。
【００４０】
酸化ケイ素および窒化ケイ素の蒸着のためのＣＶＤに基づくプロセス条件は、１００〜１００００ＥＣの範囲の蒸着温度、および１ミリＴｏｒｒ未満から大気圧（すなわち、７６０Ｔｏｒｒ）の範囲の作業圧を含むが、これに限定されない。プロセス時間は、所望されるフィルムの厚さに従い調整され、かつ秒から時間の範囲に及び得る。ＣＶＤに基づく蒸着プロセスは、これらが、適切なフィルムの均質性、フィルムの品質、および一致した工程適応範囲を有するという事実のために、本発明の実施において好ましい。
【００４１】
本発明の窒化ケイ素（「窒化物」）フィルムは、化学量論的ではないが、代わりに、ケイ素に富んでいる（すなわち、化学量論的窒化物中に過剰量のケイ素を有する）。本明細書で利用するように、化学量論的窒化物は、慣習的な化学命名法でＳｉ３Ｎ４と命名され得るか、または、代わりに、ＳｉＮｘと命名され得るのいずれかであり、ここで化学量論的窒化物Ｘは、１．３３の値を有する。好ましくは、本発明のケイ素に富む窒化物フィルムは、約０．８〜約１．２におよぶＸ値を有し、そして最も好ましくは、実質的に１に等しい（すなわち、約０．９５〜約１．０５）Ｘ値を有する。過剰なケイ素含有量の蒸着した窒化物フィルムは、蒸着したフィルムの屈折の指数（すなわち、屈折率）を測定することにより有利にモニターされ得る。例えば、Ｘが、１．３３の値を有する化学量論的窒化物フィルムは、２．０１の屈折率を有する。２．５まで増加した屈折率は、一般的に、好ましいケイ素に富む不均質フィルムに関連する。例えば、Ａｄａｍｓ、１９８８．ＶＬＳＩ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２版：中の「Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ　ａｎｄ　Ｐｏｌｙｓｉｌｉｃｏｎ　Ｆｉｌｍ　Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ，」、２６１頁、（ＭｃＧｒｅｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を参照のこと。屈折率に関しては、本発明の好ましいケイ素に富む窒化物フィルムは、約２．１〜約２．５におよぶ屈折率を有し、そして最も好ましくは、実質的に２．２に等しい（すなわち、約２．１５〜約２．２５）屈折率を有する。蒸着した窒化物フィルムの屈折率は、偏光解析法の方法論により、便利に測定され得る。例えば、その全体を本明細書で参考として援用する、Ａｚｚａｍら、１９８９．Ｅｌｌｉｐｓｏｍｅｔｒｙ　ａｎｄ　Ｐｏｌａｒｉｚｅｄ　ｌｉｇｈｔ，（Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）；Ｔｏｍｐｋｉｎｓ、１９９３．Ａ　Ｕｓｅｒ’ｓ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｅｌｌｉｐｓｏｍｅｔｒｙ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、を参照のこと。
【００４２】
本発明の好ましい窒化物フィルムは、市販の蒸着装置の限界、および被覆される装置の温度制限に応じて選択され得る多くのＣＶＤ反応化学を用いることにより蒸着され得る。例えば、プラスチックのデバイスに関して、プロセス温度は、プラスチック材料を破壊する温度を超え得ない。化学蒸着した窒化物は、非結晶誘電体である。窒化物フィルムに組み入れられるケイ素の量は、種々の蒸着パラメーターに依存し、そして、特に、ＳｉおよびＮ反応物の比率に依存する。なぜならば、これら上述した反応物を提供するガスの蒸気圧から定量的に決定されるからである。一般的に、より多くのケイ素は、ケイ素供給源に対する窒素の低い割合で、かつ低い蒸着温度で組み込まれる。詳細なプロセス条件は、所望の程度のケイ素に富む窒化物フィルム、または同等に、所望の屈折率の窒化物フィルムを達成するために選択される。
【００４３】
適した反応化学は：ＣＶＤ、ＬＰＣＶＤおよびＰＥＣＶＤプロセスを含むが、これに限定されない。ＣＶＤプロセスの方法論において、窒化物フィルムは、シラン（ＳｉＨ４）をアンモニア（ＮＨ３）と、大気圧（すなわち、７６０Ｔｏｒｒ）で、かつ７００〜９００℃で反応することにより形成され得る。ＬＰＣＶＤプロセスの方法論において、窒化物フィルムは、ジクロロシラン（ＳｉＨ２Ｃｌ２）およびアンモニアを、７００〜８５０℃で、かつ１０Ｔｏｒｒを超えない減圧下で反応することにより形成され得る。ＰＥＣＶＤプロセスの方法論において、窒化物フィルムは、シランをアンモニアまたは窒素と、２００〜４００℃で、かつ中圧で、なおかつプラズマ放電と共に反応することにより形成され得る。
【００４４】
より詳細には、本発明の酸化ケイ素（以下「オキシド」）フィルムは、好ましくは、適切な水酸基またはイオン（−ＯＨまたはＯＨ−）を含む完全な「格子（ｌａｔｔｉｃｅ）」を有する。当該分野で公知の種々の技術（例えば、赤外（ＩＲ）分光法）により測定されるように、水酸基含有量の好ましい範囲は、重量あたり約１％〜重量あたり約４％におよぶ。一般的に、任意のフーリエ（ｆｏｕｒｉｅｒ）変換に基づくＩＲ分光法装置が、利用され得る（例えば、Ｎｉｃｏｌｅｔ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏｒｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ　ＷＩ）の５５０モデル）。オキシドフィルムが、最小の水素化物基の水素化物イオン（−ＨまたはＨ−）を有することもまた好ましい。ＩＲ分光法によりまた測定されるように、本発明の好ましい実施態様において、オキシドフィルムは重量あたり約１％未満の水素化物、そしてより好ましくは、重量あたり約０．５％未満の水素化物を有する。
【００４５】
蒸着プロセスの条件は、本発明の好ましい酸化物フィルムの産生において重要である。重要なことには、最も低い実用的な温度で蒸着した酸化物フィルムは、一般的に、最も多い水酸基を有し、そして本発明の実行に最も好ましい。そのようなフィルムはまた、多くの反応化学に従って蒸着され得る。例えば、好ましい実施態様において、シランおよび酸素が、好ましくは、５００℃未満の温度、またはより好ましくは、２００℃未満の温度、または最も好ましくは、１００℃未満の温度、および大気圧からミリＴｏｒｒまでの範囲の圧力において、炉管を用いて反応可能にされる。本発明の最も好ましい温度は、室温から最大で約１２０〜１５０℃までの範囲である。特筆すべきことに、テトラエトキシシラン（Ｓｉ（ＯＥｔ）４）または他の有機シランは、ミリＴｏｒｒ以下から数１０ミリＴｏｒｒの範囲の圧力で、ＬＰＣＶＤまたはＰＥＣＶＤ反応器において６５０〜７５０ＥＣのより高い温度で分解され得る。あまり好ましくはないが、９００ＥＣに近いより高い温度でさえ、ジクロロシランおよび一酸化二窒素の反応が、酸素フィルムを産生する。しかし、これらの後者のフィルムは、本発明のために有利となるような十分な水酸基を含まない。
【００４６】
両方の材質のフィルムは、有害なＤＮＡ吸着を妨害するために、好ましくは２〜２０００ｎｍ（またはそれ以上）の間の厚さであり、本実施態様の最も好ましいフィルムの厚さは、１００ｎｍのオーダーである。最も薄い厚さが、ＤＮＡを含む培地からオリジナルデバイス表面を効果的に分離し、かつ蒸着されたフィルムを越えて培地中のＤＮＡとの相互作用を有するオリジナル表面の特性を妨害するフィルムの厚さとして決定された。最大の厚さは、構造的に達成でき、そして処置のためのプロセシングデバイスに適した任意の厚さであり得る。代表的には、フィルムの厚さは、蒸着の持続時間によって決定される。蒸着フィルムの厚さと蒸着時間の間の相関関係は使用される、正確な反応器およびプロセスパラメーターに依存している。
【００４７】
図５は、図１のパネルＡ〜ＢのＤＮＡ分離デバイスに対する本発明の蒸着フィルムの例示的なアプリケーションを図示する。図５は、基板（１１）および底部プレート（１２）によって区切られ、そしてその表面に蒸着された電極（２０）を有するチャネル（１５）を図示する。フィルム（２５）は、前述のように、基盤（１１）のチャネルの境界上およびそれらの電極部分（２０）、およびＤＮＡを含有する培地に対して曝露される底部プレート（１２）の残りの部分に蒸着される。従って、ＤＮＡを含有する培地が、蒸着フィルム（２５）にのみ接触するので、望ましくないＤＮＡ吸着は、減少する。
【００４８】
表面の洗浄に関しては、特定の塩基性の表面洗浄が、ＤＮＡの付着を有利に減少させることが示された。そのような塩基性の表面洗浄は、中性の、親水性水酸基を末端に有する、表面上の反応性部位を離れさせることによって機能すると考えられる。ＤＮＡは、そのような中性、親水性、塩基性表面との親和性を減少させる。適切な塩基性洗浄溶液は、溶媒和溶液中で溶液のｐＨを８、１０、１２、１４、またはそれ以上にするアルカリ化薬剤を含む。適切な溶媒和溶液は、水およびアルコール（例えば、メタノール、（ＭｅＯＨ）またはエタノール（ＥｔＯＨ））を含み、そして特に、ＥｔＯＨ／ＫＯＨ溶液が本発明に適する。適切なアルカリ化薬剤は、水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、または他の塩を含む。選択的なしかし好ましい実施態様は、いずれかの以前の微小製造工程から、残った有機残渣混入物を酸化（そしてそれにより取り除く）するための酸化剤を含む。適切な酸化剤は、ぺルオキシド、塩素酸塩、過塩素酸塩、硝酸塩、過マンガン酸塩などを含む。最も好ましい溶媒和であるアルカリ化剤および酸化剤は、残渣を残すことなく、容易に揮発する。
【００４９】
好ましい表面洗浄溶液は、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）（酸化剤）と組み合わせた水酸化アンモニウムまたは水酸化ナトリウム（アルカリ化剤）の水溶性（溶媒和剤）溶液を含む。最も好ましい表面洗浄溶液は、水をおよそ４、３０％過酸化水素をおよそ１、および３０％水酸化アンモニウムをおよそ１の割合で含む。この後者の溶液は、最も好ましい。なぜなら、第１にその全ての組成物が揮発性であり、そして表面に残留物を残さないからであり、第２に、これは強力に酸化性であって、そして表面の有機混入物を酸化および除去し得るためである。十分な水酸化アンモニウムが、洗浄溶液が十分に塩基性であるように存在し、そして十分な過酸化水素が、予期される表面の有機混入物を酸化し得るように存在する限り、広範な組成物が、最も好ましい。この試薬は、表面からそれらが蒸発する際に表面に混入物を残さないような純度（すなわち、試薬のグレード）が好ましい。
【００５０】
処理されるためのデバイス表面は、室温で、好ましくは１分〜１時間の間の時間、最も好ましい実施態様においては１０分間洗浄で、洗浄液に曝露される。本発明はまた、曝露が、より短くとも、またはより長くとも適用され、同様に洗浄液が、実際の沸騰温度まで上昇した温度における暴露にも適用され得る。この処理に続いて、表面を、いくらかの残った溶液を取り除くために、水、好ましくは脱イオン水でリンスする。表面を曝露するために用いた装置は、代表的には、浸漬バス（超音波による攪拌を伴うものあるいは伴わないもの）、またはスピン−スプレイデバイスのいずれかである。
【００５１】
半導体加工にまた、表面洗浄および化学的洗浄を用いるが、しかし、代表的には、好ましい実施態様において、本明細書に開示されたプロセシングパラメーターとは著しい違いを有する。例えば、Ｒｕｎｙａｎら、１９９０．Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｃｉｒｃｕｉｔ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９９〜１０４頁（Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ；Ｒｅａｄｉｎｇ、ＭＡ）を参照のこと。洗浄液に対する表面の曝露は、代表的には、７５℃〜１００℃近くの間の範囲の温度である。水酸化ナトリウム溶液は、代表的には、回路酸化物領域の取りこみの減少および酸化物絶縁体への電荷の構築を含む、このアルカリ金属（例えば、ナトリウム）の潜在的な混入による影響のために、半導体加工には利用されない。過酸化水素と水酸化アンモニウムまたは塩酸とは、「ＲＣＡ　Ｃｌｅａｎ」（例えば、ＫｅｒｎおよびＰｕｏｔｉｎｅｎ、１９７０．ＲＣＡ　Ｒｅｖｉｅｗ　３１：１８７を参照のこと、これは、本明細書中にその全体が参考として援用される）に参照されるように、日常的な洗浄の一部としても用いられている。しかし、半導体加工において、最終的な酸洗浄は、一般的に通常は、金属種による汚染を取り除くために行なわれる。そのような最終的な酸洗浄は、本発明が依存している水酸化した表面を破壊し、従ってＤＮＡと相互作用し得る荷電した表面の形成を生じる。
【００５２】
（ｉｉｉ）　表面処理の評価
表面処理方法論は、以下のいくつかの測定基準により評価され得る（例えば、Ｕｌｍａｎ、１９９１．Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｆｉｌｍｓ　１〜１００頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、この本は、その全体が本明細書において参考として援用される、を参照のこと）。続いて開示される節は、まず第１に、ＤＮＡ吸着を直接試験するための方法論であり、そして第２に表面の相互作用エネルギーを評価するための方法論である。
【００５３】
有利なことに、ＤＮＡプロセシングデバイス表面へのＤＮＡの付着は、以下により直接試験され得る：（ｉ）目的の表面とデバイス中に存在するらしいＤＮＡ含有培地との接触；（ｉｉ）予測されない条件下での、デバイス表面に吸着されないＤＮＡの洗浄、および（ｉｉｉ）吸着されたままであるＤＮＡの測定。吸着されたＤＮＡの測定は、当該分野において公知の任意の方法に従って行われ得、特にＤＮＡと結合し得る蛍光標識の蛍光発光の測定により行われ得る。核酸を標識するために、当該分野において公知である、簡便な任意の蛍光標識が用いられ得る。種々の表面処理（表面処理を行なわなかったのと同様に）が、例えば表面からの蛍光発光と比較して、ＤＮＡの吸着の比較により評価され得る。
【００５４】
より具体的には、ＤＮＡ分離デバイスの場合での上述の測定のための好ましい実施態様を、以下の工程に従って行なった。しかし特筆すべきことに、他のデバイスの型のために、条件を、他のデバイスについて想定されるかまたは要求されるような条件に適切に変更した。蛍光標識されたＤＮＡフラグメントの代表的な希釈溶液が、一般的に、所定のデバイスの実際の操作の間に予想される、持続的な接触時間の代表的な時間の間で、目的の表面に配置された（代表的には、数分）。続いて、この表面は、脱イオン水で、約３０秒間リンスされた。リンスに続いて、表面を乾燥させ、そして任意の蛍光（以下、蛍光標識されたＤＮＡ）発光を測定した。
【００５５】
吸着されたＤＮＡからの蛍光発光は、たとえあるにしても、発光を促すための光源を用いて、傾斜方向の表面の発光により、そして実質的に表面に対して垂直方向の発光を観察することにより測定し得る。この空間的な配向は、励起された（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）光源から散乱される光からの干渉を除去するために利用される。測定は、蛍光標識の最大発光付近のスペクトル、または単に最大付近の総強度のいずれかにより行なわれ得る。これらのスペクトルの測定は、ＦｌｕｏｒｏＭａｘ−２（ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＳ．Ａ．，Ｉｎｃ．：Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）のような分光蛍光光度計での傾斜した角度の基板の配置により有利に行われ得る。図３は、そのような測定装置の配置およびプロセスの構成図を示す。代表的には、キセノンランプ（１０１）からの光が、励起スペクトロメーター（１０２）に入り、適切な選択された波長の実質的な単色光が、サンプル（１０３）に送られる。サンプルからの光の発光は、発光スペクトロメーター（１０４）によって分散され、そして光電子増倍管検出装置（１０５）に方向付けされる。発光スペクトルおよび総強度が、発光スペクトロメーターのスキャンによりコンピューター（１０６）の制御下で記録され得る。
【００５６】
本発明の例示的な蛍光色素は、最大で５５０ｎｍ付近の励起（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）および最大で６００ｎｍ付近の発光を有する、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（「ＲＯＸ」）である。５５０ｎｍの光源を、ＲＯＸの励起に利用し得、そして生じる５７５ｎｍ〜７００ｎｍの発光スペクトルが、記録され得る。図４のパネルＡ〜Ｄは、前述のプロトコールに従うＤＮＡ付着について試験した表面から測定されたサンプル発光スペクトルを示す。
【００５７】
有利なことに、本明細書に開示されたＤＮＡ付着試験のための方法論はまた、種々の蒸着フィルムのための最適なパラメーターの決定および本発明の表面洗浄に適用され得る。前述の記載が、ケイ素が豊富な窒化物フィルム、低い温度での酸化フィルムを含む水酸基、そして本発明の塩基性および必要に応じて酸化する洗浄のための好ましいパラメーターの選択のための、一般的な指導を与える。しかし、それぞれのアプリケーションにおいて、最適なフィルムの獲得は、少なくとも以下の理由により、いくつかの好ましいパラメーターの変動を必要とし得る。表面洗浄の場合において、処理されるそれぞれの表面は、プロセスの個別化を必要とし得る特定の特徴を有する。蒸着フィルムの場合において、ＣＶＤ反応装置は、蒸着パラメーターに対する調節を必要とし得る、特定の特徴を有する。そのようなパラメーターの変動および調節は、以下の方法論によって、本発明に従って、系統的に行われ得る：（ｉ）関連する処理パラメーターにおける制御された変化に従う、複数の表面の処理の実行；（ｉｉ）記載された試験方法に従った、処理された表面へのＤＮＡ吸着の測定、および（ｉｉｉ）適切なあるいは最適な結果を与えるそれらのプロセスの組み合わせの選択。いくつかのパラメーターが改変される必要がある場合において、前述の方法論は、いくつかのパラメーターの適切なまたは最適な接続値について、多次元パラメーター値空間を効率的に調査するために有利に繰り返され得る。一般的に、本発明の最も好ましいフィルムは、前述のような方法によってプロセスパラメーターが最適化された、本発明の方法により生産されるフィルムである。
【００５８】
表面と種々の液体との間の相互作用エネルギーの測定は、代表的に、表面を評価するために利用され得る。例えば、Ｕｌｍａｎ、１９９１．Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｆｉｌｍｓ　４８〜５８頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を参照のこと。特に、表面への分子の付着または吸着において、表面相互作用エネルギーに関連するエネルギーが観察された。例えば、本明細書中においてその全体が参考として援用される、Ｄｅ　Ｇｅｎｎｅｓ、１９８５．Ｒｅｖ．Ｍｏｄ．Ｐｈｙｓ．５７：８２７を参照のこと。液体で湿った表面はまた、相互作用エネルギーに依存しているという事実のために、当業者は、液体により表面が湿るに従って、液体が、よりその表面へ付着または吸着するという意味で，分子がより可溶性であるらしいと予期する。従って、例えば、ＤＮＡ分子への吸着を減らすために湿気を下げる表面処理が選択された。
【００５９】
単純な湿潤測定は、そのような相互作用エネルギーを測定する有利な方法、および表面付着の期待値を得るための有利な方法を提供する。１つのそのような測定方法論で、定着性の滴の接地角度を観察する。この技術において、同種の、面状の固形表面上の液状滴（滴の自由エネルギーの結果）の全体的な形状を、表面の自由エネルギーを見積もるために用いる。例えば、Ｕｌｍａｎ、１９９１．Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｆｉｌｍｓ　４８１頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。一般的に、表面および液体の間に相互作用がない場合、接地角度は、高く、１８０°に近づき、そして滴の全体的な形状は、より球状である。逆に、相互作用が増す場合、接地角度が０°に近づくまで液体が広がり、そして滴は、より平らな形状になる。
【００６０】
（ｉｖ）　特定の実施例
本発明は、さらに以下の特定の実施例を記載するが、これは、本明細書で開示される本発明の範囲を制限することを意図しない。
【００６１】
（実施例１：フィルム蒸着）
好ましい、９６０ｎｍの厚さのケイ素に富んだ窒化物フィルムＬＰＣＶＤは、８３５℃で、Ｔｙｌａｎ炉管（Ｔｙｌａｎ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｉｎｃ．；Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）中のケイ素（１００）ウェーハに、１５０ミリＴｏｒｒのチャンバー圧で、１００ｓｃｃｍ（標準立法センチメートル分）のジクロロシラン流および２５ｓｃｃｍのアンモニア流を用いて蒸着された。比較的高い屈折率（すなわち、Ｎ＝２．２）によって明示される場合、このフィルムは、化学量論的ではなく、そしておそらくほとんどが、化学量論的にＳｉ３Ｎ４よりは、ＳｉＮである（例えば、Ａｄａｍｓ、「Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ　ａｎｄ　Ｐｏｌｙｓｉｌｉｃｏｎ　Ｆｉｌｍ　Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ」１９８８．：ＶＬＳＩ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２版（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｉｎｃ．；Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ）を参照のこと）。
【００６２】
プラズマ増強ＣＶＤ低温酸化物（「ＰＥＣＶＤ　ＬＴＯ」）は、ＥＣＲ　プラズマ補助（ｐｌａｓｍａ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）（Ｐｌａｓｍａ　Ｑｕｅｓｔ　Ｉｎｃ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、ＴＸ）蒸着酸化物であった。それは、１２０℃未満の基板温度で、１００ｓｃｃｍの気体流量のシラン、２０ｓｃｃｍの気体流量の酸素、１２０ｓｃｃｍの気体流量のアルゴン、６ミリＴｏｒｒのチャンバー圧、および上部のマグネットに１８５ａｍｐを適用した２ＧＨｚで３５０Ｗの出力を用いて蒸着され、そして２９０ｎｍの厚さであった。特筆すべきことに、この蒸着フィルムは、高温によってダメージを受けたこれらの表面（例えば、プラスチック表面）にとって好ましい。ＬＰＣＶＤ低温酸化物（「ＬＰＣＶＤ　ＬＴＯ」）は、４５０ＥＣで、６０ｓｃｃｍの気体流量のシラン、および９０ｓｃｃｍの気体流量の酸素、および３００ミリＴｏｒｒのチャンバー圧を用いてＴｙｌａｎ炉管（Ｔｙｌａｎ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｉｎｃ．；Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）中に蒸着され、そして２５０ｎｍの厚さであった。これらの反応の蒸着温度が低いため、当業者らは、一般的に、化学量論的であり、そして特にこれらのフィルムの表面構造は、不均質であることを認識する（例えば、Ａｄａｍｓ、「Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ　ａｎｄ　Ｐｏｌｙｓｉｌｉｃｏｎ　Ｆｉｌｍ　Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ」１９８８．：ＶＬＳＩ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２版、２５９−２６０頁（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｉｎｃ．；Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ）を参照のこと）。
【００６３】
表１は、上述のように蒸着した、本発明の好ましい表面フィルムのＤＮＡ吸着の測定値、ならびに特定の他のあまり好ましくない表面フィルムのＤＮＡ吸着の測定値を示している。比較目的のために利用した他の表面フィルムは：（ｉ）１００ｎｍの厚さの熱成長酸化物（Ｔｙｌａｎ炉管；１０００℃で１０分間）；（ｉｉ）３８０ｎｍの厚さのポリ−ヘキサンフィルム（ヘキサンおよびメチルシクロペンタン（ｍｅｔｈｙｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｅ）のｒｆ−蒸着混合物；１５０ワット、１５０ミリＴｏｒｒ圧）；（ｉｉｉ）テフロンＡＦ（ＤｕＰｏｎｔ　ＡＦ　１６０１；アモルファスフッ素ポリマーの５０００ＲＰＭでの回転および９０℃５分間、１７０℃５分間、３２５℃５分間、のホットプレート上での硬化）；（ｉｖ）４５０ｎｍの厚さのスピン−オン−グラスフィルム（Ａｌｌｉｅｄ　Ｓｉｇｎａｌ　Ａｃｃｕｇｌａｓｓ５１２、メチルシロキサンポリマー、３０００ＲＰＭでの回転および９０℃５分間、１７０℃５分間、２７５℃５分間のホットプレート上でのベーキング、および窒素中での４２５℃３０分間の炉管中での硬化）；（ｖ）１４０ｎｍの厚さのＬＰＣＶＤ化学量論窒化物（８３５℃でのＴｙｌａｎ炉管での加熱、３００ミリＴｏｒｒでの２５ｓｃｃｍジクロロシラン、２００ｓｃｃｍアンモニア）および（ｖｉ）１２００ｎｍの厚さのフォトレジストフィルム（５０００ＲＰＭでのＯＣＧ８２５−ｇライン抵抗回転および９０℃１分間の穏やかなベーキング）を含む。
【００６４】
これらの上述の処理を行なった表面に対するＤＮＡ吸着を、明細書中で以前に記載されたように測定した。これらの全ての場合において、ＤＮＡ吸着試験プロトコールを、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（「ＲＯＸ」）で標識された、１０ｎｔ．の長さを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドの４×１０−６Ｍ（４ｐＭ／μｌ）溶液を用いて使用した。６００ｎｍ付近の発光強度（すなわち、ＲＯＸの最大発光）および５７５〜７００のスペクトルを、前述のように測定した。種々の表面発光スペクトルを示す図４、パネルＡ−Ｄに図示するように、グラフの縦軸は、毎秒ごとの光放射の計数を示し、そして横軸は、発光波長を示す。
【００６５】
表１は、６００ｎｍ付近の観察された発光強度を列挙する。結果が示すように、ケイ素に富んだ窒化ケイ素フィルムおよび２つの蒸着酸化物フィルムは、単なる熱酸化物フィルムまたは他の絶縁フィルムよりも優位に少ないＤＮＡが保持される。実際、励起バックグラウンドを超える、認識できる発光ピークが、窒化物およびＰＥＣＶＤ　ＬＴＯフィルムについて観察されなかった。これは、これらの被覆が、ＤＮＡ吸着を非常に減少させるか、または除去することを実証する。
【００６６】
この結果を予期しなかったが、他の理由によりこれらのフィルムは、非化学量論的であるようであり、従ってＤＮＡの表面吸着が増強される傾向にある、より多くの「ダングリング（ｄａｎｇｌｉｎｇ）」結合を有するあまり良く定義されていない表面化学を有する。しかし、図４のパネルＡおよび図４のパネルＢに示したスペクトルの比較により、主に化学量論的に異なる表面に付着するＤＮＡのＲＯＸ標識から減少したか、または取り除かれた６００ｎｍ付近の発光が、図示される。特に、図４パネルＡの発光ピーク４０１（６００ｎｍ付近）が、図４パネルＢでは存在しない。
【００６７】
（実施例２：表面洗浄）
本発明において開示される表面洗浄方法論は、熱酸化ケイ素表面のＤＮＡ吸着を減少し、そして種々の他の表面と同様の処理がまた適用される。最初に、６つのケイ素「１００」の表面が、およそ１００ｎｍの厚さの酸化物層を作製するように１０分間１０００℃で、Ｔｙｌａｎ加熱室中で熱酸化された。蛍光的に標識されたＤＮＡを用いた洗浄に続く、残渣の蛍光発光が、前述のように続いて測定された。表２は、前述のＤＮＡ吸着試験プロトコールの後の、これらの表面からの６００ｎｍ付近の発光強度を示す。
【００６８】
表面１は、熱成長酸化物表面である。表面２は、以下の好ましい表面洗浄後の熱酸化物表面である。表面３〜６は、ヘキサメチルジシラザン、ＨＭＤＳおよびフォトレジストで被覆されている。これは、代表的なＤＮＡプロセシングデバイスの微小製造の間に起きる後のプロセシングの代表的なものである。表面３および４上のフォトレジストを、無線周波数酸素プラズマ中で標準的なフォトレジストアッシュプロセス用いて取り除いた。表面５および６上のフォトレジストを、表面からフォトレジストを溶解するために使用される有機溶媒に基づく溶液である液体フォトレジストストリッパー、ＰＲ−２０００（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ　Ｉｎｃ．；Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）を用いて取り除いた。
【００６９】
本発明の好ましい洗浄は、表２の表面１〜６の、室温で、浸漬バス中の水、水酸化アンモニウム（３０％）、および過酸化水素（３０％）を４：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）の割合で含む混合水溶液中での、全てで１０分間の処理工程を含む。次いで処理後、ウェーハを、残留洗浄溶液の除去を促進するために脱イオン水を用いてリンスした。前述の洗浄工程の結果、残留した蛍光の劇的な減少が実証された。
【００７０】
表面の残留した蛍光で測定されたこの減少を、さらに図４の、表面３からのパネルＣおよび図４の表面４からのパネルＤに示されたスペクトルの比較により図示す。図示するように、水酸化アンモニウム／過酸化水素処理による付着したＤＮＡの全体的な減少が、吸着されたＤＮＡのＲＯＸ標識からの６００ｎｍ付近の発光の大きな減少から明らかである。特に、図４パネルＣのより大きな発光ピーク４０２が、図４パネルＤのより小さな発光ピーク４０３まで減少した（両方のピークは６００ｎｍ付近である）。これらの結果は、広範な種々の表面のＤＮＡ吸着の大きな減少における、塩基性および酸化的な洗浄の有効性を実証する。
【００７１】
（実施例３：表面エネルギー）
前出の特定の実施例１および２に示される前述の表面処理の結果は、表面エネルギーを基礎として説明されない事実であったために、むしろ予期しないものである。表３は、前出の表２の表面１〜６についての水、ジヨードメタンおよびヘキサデカンの一連の定着性の滴の接地角度の測定から得た結果を示す。以前に議論したように、ＤＮＡの吸着は、一般的に、表面の相互作用エネルギーが増加するにつれて増加することが予測される。さらに、表面相互作用エネルギーはまた、滴の接地角度のような「湿潤能力（ｗｅｔａｂｉｌｉｔｙ）」特性により反映される。
【００７２】
観察されたＤＮＡの振るまいおよび接地角度の測定による表面エネルギーの間には、明確な相関関係が存在しない。例えば、ＬＰＣＶＤケイ素に富んだ窒化ケイ素およびＬＰＣＶＤ化学量論窒化ケイ素は、実質的に同じ湿潤特性を有するが（従って、表面相互エネルギー）、劇的に異なるＤＮＡ吸着特性を有する。さらに、テフロンＡＦ、スピン−オン−グラスおよびポリ−ヘキサン（これらは最も高い接地角度、従って最も低い表面エネルギーを有する）はまた、最も高くそして最も望ましくないＤＮＡ吸着レベルを示す傾向にある。最後に、ＰＥＣＶＤおよびＬＰＣＶＤ　ＬＴＯの両方の酸化物フィルム処理、および表面１の天然の熱−成長酸化物は、実質的に同じ湿潤特性を有するが、本発明の好ましい酸化物処理は、単なる熱−成長酸化物よりも１／２と１／３との間より少ないＤＮＡ吸着の減少を生じる。
【００７３】
本発明は、本明細書に記載された特定の実施態様により範囲が制限されない。実際、本明細書に記載された実施態様に付加した本発明の種々の改変が、前述の記載および添付の図面から当業者に明らかにされる。そのような改変は、添付の請求の範囲の範囲内にあることを意図する。
【００７４】
種々の刊行物が、明細書中に引用され、その開示にはそれらの全体が参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
これらおよび本発明の他の目的、特性、および利点は、添付の図面、詳細な説明、および添付の特許請求の範囲を考慮すれば当業者に明白となる。そしてそこで、以下を例証する：
【図１】
パネルＡおよびパネルＢは、本発明を実施可能なＤＮＡプロセシングのために微小製造されたデバイスの例示的実施例を例証する。
【図２】
本発明を実施可能な、ＤＮＡプロセシングのために微小製造されたデバイスの別の例示的実施例を例証する。
【図３】
本発明により開示されるように使用される、分光蛍光光度計の組立分解図を例証する。
【図４Ａ】
パネルＡ−　ＲＯＸ　ＤＮＡ溶液で洗浄され、そしてＲＯＸ標識由来の蛍光を６００ｎｍ付近に示す、化学量論的ＬＰＣＶＤ窒化ケイ素の表面から観察される発光スペクトルを例証する。
【図４Ｂ】
パネルＢ−　ＲＯＸ標識化ＤＮＡ溶液で洗浄され、そして蛍光を６００ｎｍ付近に示さない、ＬＰＣＶＤケイ素に富む窒化ケイ素の表面から観察される発光スペクトルを例証する。
【図４Ｃ】
パネルＣ−　標準的デバイスの組立の代表的な様式（すなわち、フォトレジストで被覆して、そして灰化した）で処理されており、次いで、ＲＯＸ標識化ＤＮＡ溶液で洗浄され、そしてＲＯＸ標識由来の蛍光を６００ｎｍ付近に示す、熱成長酸化ケイ素の表面から観察される発光スペクトルを例証する。
【図４Ｄ】
パネルＤ−　パネルＣの様式で処理され、そしてその後、本発明に従って水酸化アンモニウム／過酸化水素で洗浄される熱成長酸化ケイ素の表面から観察される発光スペクトルを例証する；ＲＯＸ標識化ＤＮＡ溶液での洗浄は、パネルＣの表面と比較して、ＲＯＸ標識由来の非常に減少した蛍光を６００ｎｍ付近に示す。
【図５】
本発明において開示されるような、表面被覆後の図１の例示的なデバイスの断面図を例証する。
【図１】
2004502922.tif 000002
【図４Ａ】
2004502922.tif 000003
【図４Ｂ】
2004502922.tif 000004
【図４Ｃ】
2004502922.tif 000005
【図４Ｄ】
2004502922.tif 000006
【図６】
2004502922.tif 000007
【図７】
2004502922.tif 000008
【図８】
2004502922.tif 000009
【国際公開パンフレット】
2004502922.tif 000010
2004502922.tif 000011
2004502922.tif 000012
2004502922.tif 000013
2004502922.tif 000014
2004502922.tif 000015
2004502922.tif 000016
2004502922.tif 000017
2004502922.tif 000018
2004502922.tif 000019
2004502922.tif 000020
2004502922.tif 000021
2004502922.tif 000022
2004502922.tif 000023
2004502922.tif 000024
2004502922.tif 000025
2004502922.tif 000026
2004502922.tif 000027
2004502922.tif 000028
2004502922.tif 000029
2004502922.tif 000030
2004502922.tif 000031
2004502922.tif 000032
2004502922.tif 000033
2004502922.tif 000034
2004502922.tif 000035
2004502922.tif 000036
2004502922.tif 000037
2004502922.tif 000038
2004502922.tif 000039
2004502922.tif 000040
2004502922.tif 000041
2004502922.tif 000042
2004502922.tif 000043
2004502922.tif 000044
2004502922.tif 000045
2004502922.tif 000046
2004502922.tif 000047
【国際調査報告】
2004502922.tif 000048
2004502922.tif 000049
2004502922.tif 000050
2004502922.tif 000051
2004502922.tif 000052