(57)【要約】本発明は、癌の治療または診断のための新規な化合物に関し、さらに具体的には受容体Ｇｂ３を過剰発現している細胞への診断用製品または薬物のベクターとしてシガトキシン変異体の無毒性Ｂサブユニットを使用することに関し、そのような化合物は以下の式、ＳＴｘＢ−Ｚ（ｎ）−Ｃｙｓ−Ｙ（ｍ）−Ｔを有し、式中ＳＴｘＢはシガトキシンＢサブユニットまたはその機能的同等物であり、Ｚ（ｎ）でｎは０または１あり、ｎが１の場合、Ｚはスルフヒドリル基を欠くアミノ酸残基であるか、またはポリペプチドであり、Ｃｙｓはシステインのアミノ酸残基であって、Ｔは、インビボ診断用薬剤、細胞毒性剤、プロドラッグ、またはプロドラッグを薬物に変換する酵素、を含む群から選択される、ＣｙｓのＳ部分に共有結合により連結する分子であり、Ｙ（ｍ）でｍは０または１であって、ｍが１の場合、ＹはＴとＣｙｓの間のリンカーであり、前記リンカーはハイブリッド化合物が前記細胞にインターナリゼーションした後にＴを放出するために開裂できるか、または開裂できない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体Ｇｂ３を過剰発現している細胞を診断または治療するための、以下の式、ＳＴｘＢ−Ｚ（ｎ）−Ｃｙｓ−Ｙ（ｍ）−Ｔを有するハイブリッド化合物であって、
式中、
ＳＴｘＢは、シガトキシンＢサブユニットまたはその機能的同等物であり、
Ｚ（ｎ）で、ｎは０または１であり、ｎが１の場合、Ｚはスルフヒドリル基を欠くアミノ酸基であるか、またはポリペプチドであり、
Ｃｙｓは、システインのアミノ酸残基であり、
Ｔは、
インビボ診断用薬剤
細胞毒性剤、
プロドラッグ、または
プロドラッグを薬物に変換するための酵素、
を含む群から選択される、ＣｙｓのＳ部分と共有結合により連結する分子であり、
Ｙ（ｍ）で、ｍは０または１であり、ｍが１の場合、ＹはＴとＣｙｓの間のリンカーであり、前記リンカーは前記細胞に前記ハイブリッド化合物がインターナリゼーションした後にＴを放出するために開裂できるかまたは開裂できない、ハイブリッド化合物。
【請求項２】
ｎ＝０である、請求項１に記載のハイブリッド化合物。
【請求項３】
Ｔが、ポルフィリン−ガドリニウム、ポルフィリン−マンガン、合成ポリマーガドリニウム、ガドリニウム−エトキシベンジル−ジエチレントリアミン五酢酸、ＤＯＰＴＡ−ガドリニウム、磁性流体およびナノ粒子などの常磁性化合物を含む群から選択されるＭＲＩ用造影剤である、請求項１または２に記載のハイブリッド化合物。
【請求項４】
ｍ＝１であって、Ｔが、酵素感受性リンカーと結合したアントラサイクリン（ダウノマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン）、イダルビシン、シスプラチン、マイトマイシンＣ、デスアセチルビンブラスチン、メトトレキサート、Ｎ−アセチルメルファン、５−フルオロウラシル、ナイトロジェンマスタード、カリチェアミシン、マイタンシノジドなどの細胞毒性薬、
ガンシクロビルまたはアシクロビルなどのＤＮＡ複製を終止できるヌクレオチドアナログ、
アミドキシム、
を含む群から選択される、請求項１または２に記載のハイブリッド化合物。
【請求項５】
前記リンカーＹが、カルボキシペプチダーゼＧにより開裂できる還元および非還元葉酸エステル、アルカリホスファターゼで開裂できるリン酸化プロドラッグからのリン酸基、カルボキシペプチダーゼＡにより加水分解で開裂できる化合物、プロドラッグ活性化用のニトロレダクターゼ、β−ラクタマーゼにより開裂できるラクタム環の加水分解、ペニシリンアミダーゼにより開裂できるアミド、プロドラッグ活性化用のシトシンデアミダーゼ、β−グルコロニダーゼにより開裂できるグルコロン酸、ガラクトシダーゼにより開裂できるガラクトース、マンノシダーゼにより開裂できるマンノースを含む群から選択される、酵素により開裂できるリンカーである、請求項１に記載のハイブリッド化合物。
【請求項６】
前記酵素がＧｂ３を過剰発現している細胞に内在するか、またはＴが前記酵素である請求項１の第２のハイブリッド化合物と共にインターナリゼーションされる、請求項４に記載のハイブリッド化合物。
【請求項７】
Ｔがペプチダーゼ、ＨＳＶ１のチミジンキナーゼ、リパーゼ、グリコシダーゼを含む群から選択される酵素である、請求項１に記載のハイブリッド化合物。
【請求項８】
Ｔが光線力学療法用の光増感薬である、請求項１に記載のハイブリッド化合物。
【請求項９】
前記薬物が、Ｐｈｏｔｏｆｏｒｍ（登録商標）、ｆｏｒｅａｎ（登録商標）、ポルフィリンなどの糖複合テトラピロールマクロ環を含む群から選択される、請求項８に記載のハイブリッド化合物。
【請求項１０】
Ｔがホロ−ネオカルジノスタチンである、請求項１に記載のハイブリッド化合物。
【請求項１１】
受容体Ｇｂ３を発現する腫瘍のインビボ診断用の造影剤として使用するための、請求項１から３のいずれかに記載のハイブリッド化合物。
【請求項１２】
腸腫瘍のインビボ診断用の造影剤として使用するための、請求項１１に記載のハイブリッド化合物。
【請求項１３】
受容体Ｇｂ３を過剰発現している腫瘍細胞を治療または死滅させるための薬剤として使用するための、請求項１に記載のハイブリッド化合物。
【請求項１４】
腸腫瘍細胞を治療または死滅させるための薬剤として使用するための、請求項１３に記載のハイブリッド化合物。
【請求項１５】
薬学的に許容できる担体と共に、請求項１から１０に記載の少なくとも１つのハイブリッド化合物を含有する、医薬組成物。
【請求項１６】
Ｔがプロドラッグである第１のハイブリッド化合物と、前記プロドラッグを毒性薬物に変換するための第２の成分とを含有する、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記第２の成分が請求項１に記載のハイブリッド化合物であって、Ｔが前記プロドラッグを毒性薬物に変換するための酵素である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記２つの化合物が同時または連続的に投与される、請求項１６または１７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、癌の治療または診断のための新規の化合物に関し、さらに具体的には受容体Ｇｂ３を過剰発現している細胞への診断用製品または薬物のベクターとしての無毒性シガトキシンＢサブユニット変異体の使用に関する。
【０００２】
腫瘍学の分野で数十年も基礎研究および臨床研究がなされたにもかかわらず、攻撃的な疾病を有する患者の長期の見通しは気力を失わせるものである。現在の癌の治療法である化学療法と放射線療法の主な制限の１つは、癌細胞への標的づけが不足していることである。標的づけに対する最も合理的で成功する取り組みは、腫瘍細胞への癌化学療法剤、放射性同位体、または生物トキシンの局在を促進することを期待して、癌細胞表面の特異的リガンド（例えばモノクローナル抗体、ペプチド性ホルモンなど）にそれらの物質を結合させることを必要とする。
【０００３】
細胞の形質転換と腫瘍発生はスフィンゴ糖脂質の発現と構造の変化を伴っている。これらの変化は、細胞の接着と細胞のシグナル伝達に果たすスフィンゴ糖脂質の提案された機能と関係していると一般に考えられている。実際にスフィンゴ糖脂質は、コレステロールと共に受容体の凝集に、そしてＳｒｃファミリーキナーゼなどのシグナル伝達分子との受容体の相互作用に、中心的な役割を演じる膜ミクロドメイン（ラフト）の主要成分である。さらに、細胞内でのソーティングに果たすスフィンゴ糖脂質と膜ミクロドメインの役割について現在評価が行われている。Ｓｉｍｏｎｓと共同研究者らにより提唱されたいわゆる「ラフト仮説」によると、膜面に沿った脂質と蛋白質の分布が非対称であることが細胞内で別個の場所への膜ソーティングが行われることに寄与している。
【０００４】
ＧＳＬであるグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３またはＣＤ７７）は、分化を方向づけられたＢ細胞の狭い範囲および関連するＢ細胞リンパ腫に発現する（Ｇｏｒｄｏｎら、１９８３；Ｋａｌｉｓｉａｋら、１９９１；Ｍａｎｇｅｎｅｙら、１９９１；Ｍｕｒｒａｙら、１９８５；Ｏｏｓｔｅｒｗｉｊｋら、１９９１）。実際に、全てのグレードの濾胞中心細胞リンパ腫でＧｂ３特異的リガンドの結合部位を検出でき、患者の腫瘍検体の７０％超が陽性であることが最近報告された（ＬａＣａｓｓｅら、１９９９）。小リンパ球性リンパ腫、大Ｂ細胞リンパ腫または多発骨髄腫の検体の３０〜４０％も陽性であることが認められた。卵巣の過形成（Ａｒａｂら、１９９７）およびヒト乳房腫瘍から得られた細胞懸濁物（ＬａＣａｓｓｅら、１９９９）はＧｂ３陽性と検査された。最後に、Ｇｂ３は若干のヒト星状細胞腫由来細胞系でも顕著に増加していた（Ａｒａｂら、１９９９）。
【０００５】
記載されたヒト癌細胞上でのＧｂ３の発現に照らして、この脂質をベクター化目的に使用する提案は心をそそるものである。志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）由来の細菌タンパク質毒素シガトキシンおよび大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来ベロ毒素を包含する、Ｇｂ３の天然リガンドが記載された（Ｌｉｎｇｗｏｏｄ、１９９６；Ｓａｎｄｖｉｇとｖａｎ  Ｄｅｕｒｓ、１９９６）。これらの毒素は２つのサブユニットから構成される。酵素であるＡサブユニットはリボソームＲＮＡを修飾することによってタンパク質の生合成を阻害する。細胞と結合し細胞内輸送を行うために、Ａサブユニットは５つのＢ断片のホモ五量体である無毒性Ｂサブユニットと相互作用しなければならない。Ｂサブユニットは一定条件で１０〜１５個のＧｂ３分子と協同的に結合する。このクラスター形成によってこのトキシンは膜のミクロドメインと会合することになる。これは、このトキシンの細胞内輸送に重要なできごとである（Ｆａｌｇｕｉｅｒｅｓら、２００１）。トキシン感受性細胞ではシガトキシンとその無毒性Ｂサブユニットは、初期エンドソームとゴルジ装置を介して形質膜から小胞体へと逆輸送により標的づけされる（総説は（Ｊｏｈａｎｎｅｓ、２００２）を参照のこと）。小胞体のレベルでは、Ａサブユニットは次に逆移行により膜を通過して細胞質ゾルに達する。一部の種類の細胞はＧｂ３を発現しているにもかかわらずこのトキシンの作用に耐性であることに注目することが重要である（Ｆａｌｇｕｉｅｒｅｓら、２００１）。このことは、これらの細胞での細胞内輸送パターンの変化に関係するようである（Ｆａｌｇｕｉｅｒｅｓら、２００１）。
【０００６】
シガトキシンのホロ毒素はマウスでの異種移植片を用いて抗腫瘍剤として記載された（Ａｒａｂら、１９９９）。さらに除去に応用すると、このホロ毒素はクローン原性腫瘍細胞を排除する（ＬａＣａｓｓｅら、１９９６）。しかし、治療薬としてのホロ毒素の使用には重大な制限がある。第１に、この毒素のＡサブユニットの作用は腫瘍細胞に特異的ではない。第二に、このホロ毒素は固形腫瘍に浸潤する能力が限られている高分子量のタンパク質である。第三に、ホロ毒素などの高分子量の細菌タンパク質は有効な免疫応答を生じる。第四に、Ｇｂ３とＡサブユニットが同時に結合することを維持する必要性によって、免疫の回避または細胞内標的づけに有利に働く突然変異を導入する可能性が制限される。
【０００７】
したがって、本発明においてわれわれは、Ａサブユニットの非存在下における癌細胞へのベクター化手段としてシガトキシンのＢサブユニットを使用した。Ｂサブユニットへの部位特異的化学結合が可能で、Ｇｂ３との相互作用を保った、以前に構築したＢサブユニット変異体を使用した。
【０００８】
さらに具体的には、Ｂサブユニット変異体またはＳＴｘＢ−Ｚ（ｎ）−Ｃｙｓ（ｎは０または１）と名付けた誘導体を設計した。このタンパク質では成熟ＳＴｘＢのＣ末端にシステインを付加している。細菌から精製した場合、このタンパク質は野生型ＳＴｘＢと同様に分子内ジスルフィド結合を保持するが、Ｃ末端のＣｙｓにあるスルフヒドリル基は遊離である。求核性によって遊離スルフヒドリル基は部位特異的結合法の優れたアクセプターとなる（Ｐｈｉｌｉｐｐｅ  Ｓｃｈｅｌｔｅら、１９９９）。
【０００９】
受容体Ｇｂ３発現細胞に分子を標的づけするための万能の担体としてこれらの変異体を使用できる。
【００１０】
したがって、本発明は、受容体Ｇｂ３を過剰発現する細胞を診断または治療するための、以下の式、ＳＴｘＢ−Ｚ（ｎ）−Ｃｙｓ−Ｙ（ｍ）−Ｔを有するハイブリッド化合物に関し、式中、
−  ＳＴｘＢは、シガトキシンＢサブユニットまたはその機能的同等物であり、
−  Ｚ（ｎ）で、ｎは０または１であり、ｎが１の場合、Ｚはスルフヒドリル基を欠くアミノ酸残基またはポリペプチドであり、
−  Ｃｙｓは、システインのアミノ酸残基であり、
−  Ｔは、
・インビボ診断用薬剤、
・細胞毒性剤、
・プロドラッグ、または
・プロドラッグを薬物に変換するための酵素
から成る群から選択される、ＣｙｓのＳ部分に共有結合により連結する分子であり、
−  Ｙ（ｍ）で、ｍは０または１であり、ｍが１の場合、ＹはＴとＣｙｓの間のリンカーであり、前記リンカーは前記細胞にハイブリッド化合物がインターナリゼーションした後にＴの放出のために開裂できるか、または開裂できない。
【００１１】
したがって、本発明において、Ｔは共有結合により直接、またはリンカーＹを介して間接的にＣｙｓと作動可能に結合されており、Ｔ部分の前記の放出を可能にするか、または可能にしない。
【００１２】
好ましい実施形態では、Ｚ（ｎ）で、ｎ＝０であり、このハイブリッド化合物のＳＴｘＢ−Ｚ（ｎ）−Ｃｙｓ部分は以下の配列（配列番号１）を有する。
ＣＯＯＨＭＫＫＴＬＬＩＡＡＳＬＳＦＦＳＡＳＡＬＡＴＰＤＣＶＴＧＫＶＥＹＴＫＹＮＤＤＤＴＦＴＶＫＶＧＤＫＥＬＦＴＮＲＷＮＬＱＳＬＬＬＳＡＱＩＴＧＭＴＶＴＩＫＴＮＡＣＨＮＧＧＧＦＳＥＶＩＦＲＣ−ＮＨ２
【００１３】
Ｚ（ｎ）で、ｎ＝０の場合、上記部分はＳＴｘＢ／Ｃｙｓとしても表される。
【００１４】
事実上、Ｚ部分が長すぎる、すなわちｎが２以上である場合、細胞内ジスルフィド架橋が数か所形成し、受容体Ｇｂ３に対するＳＴｘＢの結合および、特に目的分子に対する結合を阻害するおそれがある。
【００１５】
本発明は、癌細胞、さらに具体的には腫瘍、さらに具体的には腸腫瘍および結腸直腸腫瘍が下記の図１、図２および図１０からわかるように受容体Ｇｂ３を過剰発現するという観察に由来する。Ｇｂ３はヒトの正常な腸上皮には存在しない（Ｊｏｎｅｓら、２０００）。結果的に、Ｇｂ３はマウスにおいて低レベルないし検出できないレベルしか存在しないことが示された。逆にＧｂ３はヒト結腸癌細胞系ＣａＣ０２に過剰発現する（Ｊｏｎｅｓら、２０００）。したがって、Ｇｂ３はヒトならびにマウスモデルの両方において腫瘍細胞と正常腸細胞を識別するための優れたマーカーとなる。Ｇｂ３の発現パターンの相違は直腸結腸癌、さらに一般的にはＧｂ３過剰発現腫瘍または癌細胞における本発明の治療および診断での新しい開発の基礎となっている。マウスモデルを評価する場合、特に生検材料から開始する場合に、実施例１に開示したような方法を実施することにより、細胞上での受容体Ｇｂ３の過剰発現を評価できる。別の方法はＧｂ３の分布の測定にＭＲＩを実施することを包含している。しかし、治療すべき腫瘍がＧｂ３を過剰発現する腫瘍であるという確認が治療の開始前に特異的に探索されない状況もある。
【００１６】
本発明によると、「治療上の処置」という表現は、治療を受けている患者に有益効果を招く本発明のハイブリッド化合物の作用を包含し、結果として患者の状態の改善または寛解状態または健康状態の回復を包含することを含めて、その効果は細胞レベルまたは臨床レベルのどちらかで得られる。本発明において、前記治療上の処置は腫瘍を有し、特に癌を患う患者に提供される。
【００１７】
本発明によると、「診断」という表現は病理学的状態の検出を、または他のパラメータと可能的に組み合わせて、病理学的状態と直接もしくは間接的に相関でき、診断プロトコールに有用な情報を提供できる１つもしくは複数のパラメータの検出を、包含している。この表現はそのような病理学的状態に関係するパラメータの考えられる定量的検出も包含している。
【００１８】
一実施形態では、本発明のハイブリッド化合物は、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）などの生命画像化法によりＧｂ３発現癌細胞を検出するための造影剤であるＴ部分を有することができる。他の非侵襲性の生命画像化法には二光子顕微鏡、造影超音波、Ｘ線造影、コンピュータ断層撮影、同位元素スキャン、造影サーモグラフィーがある。
【００１９】
さらに具体的には、ポルフィリン−ガドリニウム、ポルフィリン−マンガン、合成ポリマー−ガドリニウム、ガドリニウム−エトキシベンジル−ジエチレントリアミン五酢酸、ＤＯＰＴＡ−ガドリニウム、磁性流体およびナノ粒子などの常磁性化合物を含む群から前記造影剤を選択でき、それらは次にヒトまたは動物に投与される。
【００２０】
本発明は腫瘍のインビボ診断、さらに具体的にはＭＲＩによる診断へのそのような化合物の使用にも関する。その使用は、受容体Ｇｂ３が癌細胞に特異的に発現するが正常細胞には発現しないことが示される限り腸癌および結腸直腸癌に好都合である。
【００２１】
別の実施形態では、本発明のハイブリッド化合物は、Ｇｂ３陽性癌細胞における腫瘍特異的輸送経路に向けてベクター化された腫瘍特異的薬物またはプロドラッグをＴ部分として有することができ、これらの治療の有効性および／または特異性の増大を可能にする。Ｔ部分はプロドラッグ活性化剤でもあり得、一方でプロドラッグ単独は公知の薬物送達系、すなわち全身投与、経皮投与、経口投与、直腸投与により直接投与される。
【００２２】
全般的にみて、癌への標的づけ手段としてのＢサブユニットの使用は以下の利点を有する。第１に、サイズが小さいことから組織へのＢサブユニットの透過が効率的である。第二に、Ｂサブユニットに対する抗体応答は非効率的である。第三に、腫瘍選択的な化合物をＢサブユニットに結合することができる。第四に、治療の効率を高めるために腫瘍特異的輸送経路を利用することができる。第五に、Ｂサブユニットの修飾がなされる場合に保存する必要があるのはＧｂ３結合能のみである。
【００２３】
本発明の一態様において、薬物は光線力学療法（ＤＰＴ）に適した光増感剤である。ＤＰＴはヒトの固形腫瘍を治療するための最近開発された技術である。ＤＰＴは、腫瘍組織内にポルフィリンなどの色素またはそれに関連する系を標的づけして光活性化することに基づく。アポトーシスによる細胞死やミトコンドリア、核などに影響を与える他のメカニズムなどの分子的なできごとについては理解が始まった最中である。一部の光増感剤は医療機関ですでに使用されている（Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）、Ｆｏｓｃａｎ（登録商標）など）。しかし、これらの物質にはいくつかの欠点があり、その最たるものは腫瘍特異的な標的づけの欠如である。光増感剤の腫瘍選択性を向上させるために種々の戦略が提案されてきた。それらには色素の生体分布を変更するリポソーム、リポタンパク質、モノクローナル抗体、ナノ粒子などの適合した送達系の使用を含んでいる。Ｃｕｒｉｅ研究所が開発した別の取り組みはマクロ環の両親媒性をモジュレートすることである。テトラピロール系の糖複合により誘導される構造修飾は親水性と疎水性の間のバランスを作り出す効果的な手段である。この取り組みに続き、中性のトリ−およびテトラ−糖複合テトラピロールマクロ環が調製され、それらの光細胞毒性がインビトロで評価された（Ｍｏｍｅｎｔｅａｕら、１９９９）。
【００２４】
したがって、糖が複合した比較的親水性の高いテトラピロールマクロ環（ポルフィリン）が合成された。そのマクロ環はＳＴｘＢ／Ｃｙｓとの結合を可能にするブロモベンジル基を保有している。得られた化合物の合成、ＳＴｘＢ／Ｃｙｓとの結合、および精製を以下に解説する。腫瘍細胞との接触を果たした場合、ＳＴｘＢ／Ｃｙｓから構成される治療用化合物および糖複合ポルフィリンは小胞体とゴルジ装置に安定して蓄積する。次に、樹状細胞のように保護する必要のある細胞から細胞毒性化合物が除去された後に可視光を照射することにより、ポルフィリンの光毒性を局所的に活性化できる（Ｆａｌｇｕｉｅｒｅｓら、２００１）。樹状細胞ではＳＴｘＢは逆ルートを標的としない。
【００２５】
本発明の別の態様では、Ｔは細胞毒性剤である。前記細胞毒性剤は、直接または間接的にインターナリゼーションした後に第２の成分の作用を介して細胞に対して毒性であり得、前記第２の成分はプロドラッグを細胞毒性薬に変換する手段として働く。
【００２６】
細胞毒性剤の一例はネオカルジノスタチン（ＮＣＳ）である。この場合、ｍ＝０で、Ｔはホロ−ＮＣＳである。
【００２７】
ホロ−ネオカルジノスタチン（ホロ−ＮＣＳ）はタンパク質性抗生物質ファミリーの原型である。これは細胞毒性活性を含有するドデカジイン抗生物質（ＮＣＳＣｈｒｏｍ）がアポ−ネオカルジノスタチン（アポ−ＮＣＳ）として知られている担体タンパク質に可逆的に結合したものから成る１１．３ｋＤａの複合体である（総説は（Ｆａｖａｕｄｏｎ、１９８２）を参照のこと）。ホロ−ＮＣＳはナノモル領域で活性で、ＮＣＳＣｈｒｏｍは自殺反応の過程でＤＮＡを開裂させ培養数分後には活性薬物を残留しない。薬物の細胞内輸送（ＭＤＲ）の減少に伴うＮＣＳＣｈｒｏｍに対する耐性は報告されていない。
【００２８】
ＤＮＡにおいてＮＣＳＣｈｒｏｍにより誘導される主なＤＮＡの損傷はラジカルによる攻撃に起因し、一方の鎖でのチミジン−５’−アルデヒド残基を有する平滑末端切断と、その相補鎖でのヌクレオチド２つを隔てた無塩基部位とから成る。この無塩基部位はエンドヌクレアーゼＩＩＩの基質であり、生細胞においてＮＣＳＣｈｒｏｍが誘導した損傷が非常に迅速にＤＮＡ二本鎖の切断に変換される。最も顕著にはＤＮＡ依存性プロテインキナーゼの欠陥により、二本鎖切断の修復経路に欠陥のある大腸菌、酵母または哺乳動物細胞の変異体は、ＮＣＳにより誘導される細胞死に一貫して過敏である。
【００２９】
ＮＣＳの精製、ＮＣＳがＣｙｓと共有結合しているハイブリッド化合物の入手法、およびこのハイブリッド化合物の細胞毒性作用を下の実施例１で説明する。
【００３０】
本発明のハイブリッド化合物の別の実施形態では、Ｔはプロドラッグで、ｍ＝１である。プロドラッグは不活性であるが生体内変換により活性代謝物に変換される治療薬として定義される。次にプロドラッグは、ハイブリッド化合物のインターナリゼーション後に細胞内で第２の成分により変換される。前記第２の成分は酵素などの細胞代謝物であり得る。本実施形態の一例は、Ｔがアントラサイクリン（ダウノマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシンなど）、イダルビシン、シスプラチン、マイトマイシンＣ、デスアセチルビンブラスチン、メトトレキサート、Ｎ−アセチルメルファン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｅｌｐｈａｎ）、５−フルオロウラシル、ナイトロジェンマスタード、カリチェアミシン、マイタンシノジド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｄｉｄ）などの細胞毒性薬で、Ｙがマンノシダーゼなどの内因性酵素に感受性のリンカーであるハイブリッド化合物である。
【００３１】
別の実施形態は（ＳａｘｏｎとＢｅｒｔｏｚｚｉ、２０００）により記載された取り組みを包含する。アジド基を含有する糖前駆体をＳＴｘＢ／Ｃｙｓを介して癌細胞に標的づける。ゴルジ装置中でアジド保有糖を遊離させた後に、後者のアジド保有糖は癌細胞の糖鎖に組み込まれる。ホスフィン保有プロドラッグと相互作用して、腫瘍環境で特異的に働く治療用化合物が放出される。
【００３２】
別の実施形態は、アミドキシム（Ｎ−ヒドロキシアミジン）を内因性レダクターゼにより開裂できるプロドラッグとして使用することを包含する。
【００３３】
種々のレダクターゼがアミドキシムからアミジンへの還元を担っている。シトクロムｂ５、そのレダクターゼおよびＰ４５０イソ酵素から成るミクロソーム酵素系がブタおよびヒトの肝臓から精製された（Ｃｌｅｍｅｎｔ  Ｂら、１９９７）。類似の酵素系はミトコンドリアに存在する。還元活性は種々の臓器、例えば肝臓、腎臓、肺および脳にさえも局在する。
【００３４】
別の定式化では、マンノシダーゼに感受性である結合を組み込んだプロドラッグを作製する。このプロドラッグをＳＴｘＢ／Ｃｙｓと結合させ、Ｇｂ３発現癌細胞に標的づける。この場合、酵素を前もってベクター化することなしに癌細胞のゴルジ装置内で内因性マンノシダーゼによりプロドラッグの活性化が起こる。
【００３５】
別の実施形態では、前記第２の成分は本発明のハイブリッド化合物であり、Ｔはプロドラッグを薬剤に転換する酵素である。この場合、前記酵素は内在しないか、または細胞の標的区画、すなわちゴルジ装置に存在しない。
【００３６】
一例は、ドキソルビシンのアミノグリコシドにリンカー部分を介して結合しているグルコロン酸を含有するプロドラッグの使用である。そのようなプロドラッグを（ＢａｋｉｎａとＦａｒｑｕｈａｒ、１９９９）に記載されたように合成する。アントラサイクリン系プロドラッグをβ−グルクロニダーゼによりドキソルビシンに変換できる。この場合、第二化合物のＴ部分はβ−グルクロニダーゼである。第１のステップで、ＢＳＡとＮＣＳについて下に解説するようにβ−グルクロニダーゼをＳＴｘＢ／Ｃｙｓと結合させる。この結合生成物はＧｂ３発現腫瘍細胞のゴルジ装置（図１３）および小胞体に標的づけされ、この区画に保持される。樹状細胞などの他の細胞では結合生成物は速やかに分解する（Ｆａｌｇｕｉｅｒｅｓら、２００１）。第二ステップでプロドラッグをＳＴｘＢ／Ｃｙｓと結合させる。すでにＳＴｘＢ／Ｃｙｓ−β−グルクロニダーゼ結合生成物を保持した細胞（癌細胞）では第二ステップの生成物を活性化できるがこの生成物を失った細胞（樹状細胞）では活性化しない。
【００３７】
別の実施形態では、このプロドラッグは酵素により転換した後に複製中のＤＮＡに組み込まれ、その複製を終止できるヌクレオチドアナログである。癌の自殺遺伝子療法のためのそのようなプロドラッグはＳｉｎｇｈａｌ  Ｓ．ら（１９９９）に総説されている。一例は、Ｔがガンシクロビル（ＧＣＶ）またはアシクロビル（ＡＣＶ）で、かつＹがマンノニダーゼなどの内因性酵素により開裂できるリンカーであるハイブリッド化合物である。第二化合物は、Ｔが単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）である第二ハイブリッド化合物である。この酵素はＧＣＶまたはＡＣＶをＧＣＶ一リン酸またはＡＣＶ一リン酸に変換できる。これらのヌクレオシド一リン酸は次に内因性キナーゼによりリン酸化されて二リン酸エステルおよび三リン酸エステルであるヌクレオチドアナログになる。ＧＣＶ三リン酸は、ＤＮＡ鎖の伸長に必要なデオキシリボース上の３’ＯＨと、２’および３’炭素の間の結合とを欠く。結果としてＧＣＶ三リン酸の組み込みはＤＮＡ鎖の未熟な状態での終止を引き起こしアポトーシスを招く。
【００３８】
したがって、本発明は、以下も包含する。
−  Ｙが、カルボキシペプチダーゼＧにより開裂できる還元および非還元葉酸エステル、アルカリホスファターゼにより開裂できるリン酸化プロドラッグからのリン酸基、カルボキシペプチダーゼＡによる加水分解で開裂できる化合物、プロドラッグ活性化用のニトロレダクターゼ、β−ラクタマーゼにより開裂できるラクタム環の加水分解、ペニシリンアミダーゼにより開裂できるアミド、プロドラッグ活性化用のシトシンデアミダーゼ、β−グルコロニダーゼにより開裂できるグルコロン酸、ガラクトシダーゼにより開裂できるガラクトース、マンノシダーゼにより開裂できるマンノースを含む群から選択される、酵素により開裂できるリンカーである、ハイブリッド化合物。
−  Ｙが、グルタル酸、ジエチレントリアミン五酢酸の二無水物、カルボジイミドなどなどの非選択的リンカー、シス−アコニット酸無水物、アシルヒドラゾン、シッフ塩基、トリチルリンカーなどの酸で開裂できるリンカー、ＳＰＤＰなどのリソソームで分解できるジスルフィドリンカーを含む群から選択される、ハイブリッド化合物。
【００３９】
当業者は本発明のハイブリッド化合物を用いて、このプロドラッグ変換戦略を公知のプロドラッグ理論に、さらに具体的には多様で相補的な自殺遺伝子療法に容易に適用できる。多様な自殺戦略の相乗作用は低用量または個々の薬物で最大の感受性を得ることを可能にし、形質導入されていない細胞における細胞毒性を減少させる。さらに、２つ（以上）の別々の経路を標的づける場合に自殺戦略に対する耐性の発生は大きく減少する。
【００４０】
本発明は、Ｇｂ３発現細胞に対する治療のための式ＳＴｘＢ−Ｚ（ｎ）−Ｃｙｓ−Ｙ（ｍ）−Ｔのハイブリッド化合物の使用に関する。これらの細胞の一例は、これらの細胞が腫瘍細胞である場合にだけ受容体Ｇｂ３を発現する腸細胞、具体的には直腸結腸細胞である。
【００４１】
したがって、本発明で定義されたＳＴｘＢ−Ｚ（ｎ）Ｃｙｓ−Ｙ（ｍ）−Ｔは腫瘍細胞上での受容体Ｇｂ３の過剰発現を伴う腫瘍または癌を含めた病原状態の治療手段を提供する。
【００４２】
本発明は、受容体Ｇｂ３を過剰発現している細胞を有する癌の診断または治療のための式ＳＴｘＢ−Ｚ（ｎ）−Ｃｙｓ−Ｙ（ｍ）−Ｔの少なくとも１つのハイブリッド化合物を、許容できる薬学的担体と共に含有する医薬組成物にも関する。
【００４３】
本明細書において医薬組成物は癌細胞または腫瘍のインビボ診断または治療のどちらかに適用され、本明細書において記載された如何なるハイブリッド化合物をも含有し得ることを理解すべきである。
【００４４】
本発明の医薬組成物は、一段階で、または時間連続的に投与される１つまたは複数の成分を含むのが好都合である。例えば医薬組成物の第１の成分は有効成分としてハイブリッド化合物を含有し、このときＴは酵素、例えばβ−グルコロニダーゼであり、この第１の成分は受容体Ｇｂ３を過剰発現している細胞を有する腫瘍を有する患者にまず投与される。この第１の成分はそのような患者に単回投与され、その医薬組成物の第２の成分は本発明のハイブリッド化合物を含有し、このときＴはプロドラッグでＹはグルコロン酸であり、治療の長期効果を得るためにこの医薬組成物のこの第２の成分を患者に時間連続的に繰り返し投与できる。
【００４５】
第１に腸腫瘍、さらに具体的には結腸直腸腫瘍が特異的に受容体Ｇｂ３を発現し、第二に経口または直腸投与のための医薬用担体を有する医薬組成物がその医薬組成物の経口または直腸投与後に有効であることが本明細書において実証された限りでは、本発明の医薬組成物は、これらの腫瘍の治療にとって特に興味深い。
【００４６】
本発明は、過剰発現している受容体Ｇｂ３を有する癌細胞の死滅を誘導する方法にも関し、この方法は、本明細書において上に記載された少なくとも１つのハイブリッド化合物有効量を、癌細胞の死滅が生じるように投与することを含む。
【００４７】
したがって、本発明は具体的には腫瘍のインビボ診断または癌のインビボ診断に適した手段に関する。
【００４８】
本発明は受容体Ｇｂ３を過剰発現する癌または腫瘍細胞のインビボ診断法にも関し、この方法は造影剤であるＴ部分を有する有効量のハイブリッド化合物を投与することを含む。
【００４９】
本発明のハイブリッド化合物の製造法は、ＰＣＴ／ＥＰ０２／０１６２７に記載されている。以下簡潔に説明する。
【００５０】
このハイブリッド化合物のＳＴｘＢ−Ｚ（ｎ）−Ｃｙｓ部分をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターまたはプラスミドを用いて形質転換により得た組換え細胞系により、ハイブリッド化合物の普遍的部分、すなわちＳＴｘＢ−Ｚ（ｎ）−Ｃｙｓを製造できる。さらに具体的には、そのような分子を包含する配列は、以下の群から選択される単離されたポリヌクレオチドである。
（ａ）システインをコードするコドンＴＧＴまたはコドンＴＧＣを３’末端に有し、シガトキシンＢサブユニットまたはその機能的同等物をコードするヌクレオチド配列ＳＴｘＢを含むポリヌクレオチド、
ｂ）コドンＴＧＴまたはＴＧＣを３’末端に有し、シガトキシンＢサブユニットまたはその機能的同等物をコードするヌクレオチド配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
ｃ）ａ）またはｂ）の配列と相補的なヌクレオチド配列。
【００５１】
ＳＴｘＢ−Ｚ（ｎ）−Ｃｙｓに−Ｙ（ｍ）−Ｔ部分（ｍは０または１）を共有結合させる結合法は、技術者により記載または実施された方法またはプロセスであり得る。
【００５２】
具体化できる第１の方法は、Ｃａｒｌｓｓｏｎらにより記載されたＳＰＤＰヘテロ二官能性架橋剤の使用である。しかし、ＳＰＤＰは血清チオラーゼにより開裂可能であり、これは反応収率が減少する原因である。
【００５３】
ＳＴｘＢ−Ｚ（ｎ）−Ｃｙｓペプチドを別の目的ペプチドと共有結合させる第二の方法は、Ｐ．Ｓｃｈｅｌｔｅらにより記載されたように後者にブロモアセチル官能基またはマレイミド官能基を作製することである。簡潔には、目的ペプチドを無水ブロモ酢酸で、またはマレイミド基によりそれぞれ化学的に活性化する。適当な反応条件（ｐＨ、温度、温置時間）でこれらの基はシス脱離により脱離し、それぞれ−Ｓ−Ｓ、−Ｓ−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＯ−、または−Ｓ−ＮＨ−の共有結合を得る。
【００５４】
例として、普遍的担体のＣ末端システインの−ＳＨ部分に結合させるポリペプチドまたはペプチドのＮ末端を以下の反応式にしたがって無水ブロモ酢酸で活性化する。
ＢＲ−ＣＨ２−ＣＯ−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＢＲ＋ＮＨ２−ペプチド→ＢＲ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−ペプチド＋ＢＲ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ
【００５５】
ブロモアセチル官能基はペプチドのチオール基に対して高い化学選択性をもち、活性化ペプチドは以下のようにＳＴｘＢ−Ｃｙｓと反応できる。
ＳＴｘＢ−Ｃｙｓ−ＳＨ＋Ｂｒ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−ペプチド→ＳＴｘＢ−Ｃｙｓ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−ペプチド＋ＨＢｒ
【００５６】
得られたチオエーテル結合は加水分解に対して安定である。
【００５７】
本発明の普遍的担体に分子を結合させる別の方法は、図９に示すようにＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）を使用することである。この結合により酵素などの大きな分子の輸送とプロセシングが可能になる。
【００５８】
メタロポルフィリンなどの錯体分子の結合についての別の実施例を下の実施例２に示す。
【００５９】
本発明のハイブリッド化合物、それらの使用および医薬組成物の範囲を限定することなしに、下の実施例と図は本発明の利点を例示するものである。
【００６０】
実施例１：ハイブリッド化合物のインビボ診断および治療用投与のためのマウスモデルの妥当性確認
本マウスモデルは結腸直腸癌を有する。
【００６１】
注射後２．５時間または２４時間におけるＳＴｘＢの組織分布を検討するためのパイロット実験を実施した。ＳＴｘＢは腫瘍組織に広範囲に取り込まれるが、低レベルのＧｂ３しか発現しない正常腸上皮には取り込まれない。ＳＴｘＢは無毒性であるため、治療に対する腫瘍の増大または腫瘍の退縮の長期研究のためにこの方法を繰り返し適用できる。
【００６２】
１．１：Ｇｂ３は腸腫瘍において強く過剰発現する：重複分析
遺伝的に改変された結腸直腸癌マウスモデル３種を使用し、これらのモデルは本研究において事実上同じ結果を示す。われわれは、Ｂ６Ｄ２の遺伝的背景で腸上皮においてビリンプロモーターの制御下で癌遺伝子Ｒａｓを発現するトランスジェニック動物（Ｔｇビリン−Ｋ−ｒａｓＶ１２Ｇ（Ｊａｎｓｓｅｎら、２００２）およびＣ５７／Ｂｌ／６の背景でＡｐｃ（大腸腺腫性ポリポーシス）遺伝子座にヘテロ接合性変異対立遺伝子を保持するマウス系統Ａｐｃ１６３８Ｎ（Ｆｏｄｄｅら、１９９４）を使用する。さらに、２つのトランスジェニック系統を交配させることによってダブルトランスジェニック系統ＲａｓＡＰＣを作製した。使用した動物は注射時に６か月齢を超え、体重２５〜３５ｇである。これらのマウスを１２時間の明暗サイクルで飼育し、標準飼料を給餌し、水を自由摂取させる。
【００６３】
動物の屠殺後直ちに腸標本を処理する。小腸および大腸を縦に開き、周囲の正常組織と共に腫瘍部分を切り離し、凍結切片用に包埋するか（下を参照）、またはＡＦＡ（７５％エタノール、２０％ホルマリンおよび５％酢酸）中で２４時間固定する。包埋後に厚さ３μｍの切片を組織ブロックから切り出し、ワックスを除き、水でもどして日常的なＨ＆Ｅ染色により加工する。世界保健機関の腫瘍分類にしたがって腫瘍を分類しグレード分けする（ＨａｍｉｌｔｏｎとＡａｌｔｏｎｅｎ、２０００）。腺様構造および／または索状構造をとって配列した悪性上皮細胞が少なくとも粘膜下組織に侵入していることが認められる場合、腺癌を侵襲性とみなす。
【００６４】
ＢｌｉｇｈとＤｙｅｒの方法（ＢｌｉｇｈとＤｙｅｒ、１９５９）にしたがって脂質を抽出する。ヒトとマウスの腫瘍組織および隣接する非腫瘍標本の重量を測定し、水性緩衝液１ｍｌの中で機械的にホモジェナイズし、クロロホルム：メタノール（１：２）３．７５ｍｌの中に注入する。
【００６５】
混合後にクロロホルム１．２５ｍｌと水１．２５ｍｌを加える。混合後に相を分離させ、水アルコール相をクロロホルム１．５ｍｌで１回洗う。クロロホルム相を合わせ、窒素気流下で乾燥させ、メタノール／ＫＯＨ１ｍｌの中で脂質を５６℃で１時間けん化する。けん化反応物を上記のようにもう一度抽出して、クロロホルム相をメタノール：水（１：１）で１回洗浄する。単離された中性糖脂質を高性能ＴＬＣ板（メルク、ダルムシュタット、ドイツ）にスポットし、クロロホルム：メタノール：水（６５：２５：４）で分離する。０．１％のメタクリル酸ポリイソブチルを溶かしたヘキサンに乾燥した薄層板を浸し、ブロッキング溶液中に１時間浮遊させてからＳＴｘＢ（２０ｎＭ）、抗ＳＴｘＢポリクローナル一次抗体およびホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼと結合した二次抗ウサギ抗体と共に温置する。強化化学発光または化学蛍光（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、リトルチャルフォント、イギリス）およびＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒを使って反応性バンドを現す。
【００６６】
正常組織と腫瘍組織の間でＧｂ３の発現レベルを比較する。
【００６７】
図１０は、マウスおよびヒトの腫瘍によるＧｂ３の過剰発現を示す。
【００６８】
１．２：Ｇｂ３は腸腫瘍において強く過剰発現する：組織切片のＳＴｘＢ−Ｃｙ３標識
他の点では未処理の動物の正常腸組織と腫瘍組織における内因性Ｇｂ３を検出するために凍結切片のＳＴｘＢ−Ｃｙ３標識を実施する。ＳＴｘＢ−Ｃｙ３の貯蔵液（０．２２ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳ＋０．２％ＢＳＡで２２倍に希釈し（終濃度１０μｇ／ｍｌ）、室温で２０分間ＰＦＡで固定する前または後の切片に落とし３０分間放置する。その後、パラホルムアルデヒドで固定した切片をＰＢＳに溶かした５０ｍＭのＮＨ４Ｃｌで２０分間処理し、０．１％のトリトンＸ−１００で５分間可溶化させる。ＦＩＴＣ−ファロイジンおよびＨｏｅｃｈｓｔ色素を用いて上記のように対比染色する。陰窩にときにみられる弱い染色および正常組織の単一細胞での偶発的染色を除き、正常組織は全般的に陰性である。これらの単一細胞は形態の基準に基づき胃腸内分泌／リンパ細胞を構成している可能性がある。対照的に、腫瘍は強く染色する。
【００６９】
１．３：経口投与したＳＴｘＢはインビボで腸腫瘍に達する
マウスの腸内の注射された流体の分布を追跡するために着色マーカーを用いたパイロット実験を実施する。トリパンブルー０．５ｍｌを注射する。動物を４５分後に屠殺し、腸管を取り出し、トリパンブルーの分布を分析する。青い着色は小腸の大部分にわたってはっきりと進行した。
【００７０】
次に、動物１匹に１ｍｇ／ｍｌ溶液０．５ｍｌの用量（動物Ａ）またはそれよりも低い０．１ｍｇ／ｍｌ溶液０．５ｍｌの用量（動物Ｂ）を用い、動物２匹にＳＴｘＢを注射する。長さ４０ｍｍで直径０．４ｍｍのプラスチック製フレキシブル針（Ｍａｒｑｕａｔ  Ｇｅｎｉｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｂｏｉｓｓｙ  Ｓｔ  Ｌｅｇｅｒ、Ｖ０１０４４０参照）を使用する。細菌からＳＴｘＢを精製し（ＭａｌｌａｒｄとＪｏｈａｎｎｅｓ、２００２）、注射前にＰＢＳに対して透析する。ＳＴｘＢをＰＢＳに種々の濃度となるように溶かした溶液０．５ｍｌを麻酔なしに動物の食道に単回注射する。強制給餌後に、動物を種々の時間飼育し、標準飼料を給餌し水を自由摂取させる。
【００７１】
注射後２．５時間で頚椎脱臼によりマウスを屠殺し、組織を取り出し、以後の分析に供する。組織試料を腸管に沿って採取し、各動物から腫瘍も採取する。切除した正常組織および腫瘍組織を凍結切片用に調製するか、上記のように脂質抽出し、その後の重複実験用に加工する。凍結連続切片について、ＳＴｘＢに対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を用いて動物を分析する。Ｔｉｓｓｕｅ−ｔｅｋ  ＯＣＴ（Ｓａｋｕｒａ）に包埋したマウス組織を厚さ５μｍの連続切片に切断し、風乾し、３％パラホルムアルデヒドで室温で２０分間固定する。パラホルムアルデヒドで固定した切片をＰＢＳに溶かした５０ｍＭのＮＨ４Ｃｌで２０分間処理し、０．１％のトリトンＸ−１００で５分間可溶化する。使用した抗体は、ＳＴｘＢに特異的なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の１００倍希釈（Ｆａｌｇｕｉｅｒｅｓら、２００１）、ｍＡｂ抗ビリンＩＤ２Ｃ３（Ｄｕｄｏｕｅｔら、１９８７）、抗Ｋｉ６７ｐＡｂ（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）、抗クロモグラニンＡ／Ｂポリクローナル抗血清（ＰｒｏＧｅｎ、ハイデルベルグ）で、二次抗体は、Ａｌｅｘａ４８８またはＣｙ３と結合したヤギ抗マウスＩｇＧおよびヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で、アクチンを可視化するためのＴＲＩＴＣ−ファロイジン（シグマ）、および核を染色するＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（シグマ）である。
【００７２】
組織に関する標準的な基準により腫瘍の領域を確認する。それらの領域は増殖マーカーＫｉ６７に陽性である。上皮細胞を抗ビリンモノクローナル抗体で確認する。正常な腸上皮細胞ではＳＴｘＢ染色がみられない（図１）が、上皮層に散在し、胃腸内分泌細胞の形態学的特徴を示し、胃腸内分泌細胞のマーカーであるクロモグラニンＡ／Ｂ染色が陽性であることがわかる単一細胞の偶発的な一部に強い染色が生じる（図２）。さらに、リンパ起源（マクロファージまたは樹状細胞）の可能性がある少数の細胞が標識される。この染色パターンは十二指腸、空腸、および回腸でみられるが、結腸ではみられない。パイエル板も事実上マークされない。動物Ａの膨大部周囲腺癌は非常に強く標識される（図１）。標識は腫瘍表面積全体の約５０％を構成し、上皮細胞が並んだ索状構造または腺様構造にみられる。さらに、炎症の兆候を有する間質領域もときに染色され、標識された細胞はリンパ起源であると推定される。それ以外では間質は陰性である。しかし、間質でリンパ起源と推定される細胞の染色とは別に、同一動物の２つの異なる病変が陰性である。低用量のＳＴｘＢを投与された動物Ｂは、少数の単一細胞を除いて正常組織は陰性であるという同じ結果を事実上示す。膨大部周囲腫瘍はマークされないが、十二指腸からの第二の腫瘍は（抗ビリン染色で証明されるように）上皮起源の腫瘍細胞が標識される。しかし、染色の全般的な強度は動物Ａ（１．０ｍｇ／ｍｌの用量）に比べ顕著に減少する。
【００７３】
１．４：２４時間培養後にＳＴｘＢは腫瘍に保持される
ＰＢＳに溶かした１ｍｇ／ｍｌＳＴｘＢ溶液０．３５ｍｌを動物２匹に注射する。２４時間後にマウスを屠殺する。対照組織（肝臓）および腸管（十二指腸、空腸、回腸、近位結腸）から組織試料を採取する。両動物から腫瘍を単離し、凍結切片用に調製し、抗ＳＴｘＢポリクローナルＡｂおよび抗クロモグラニンＡ／Ｂで染色する。２４時間後でさえもＳＴｘＢは偶発的な細胞で依然検出でき、上皮はそれ以外は陰性であり、腫瘍では依然として非常に強く存在する（図３）。両動物の肝切片では染色はみられない（図４）。
【００７４】
実施例２：ＭＲＩによるインビボ診断
２．１：ポルフィリン（造影剤）の合成とＳＴｘＢ−Ｃｙｓとの結合
ＲＭＩ研究に通常使用される造影剤は常磁性メタロポルフィリンである。腫瘍細胞に親水性ポルフィリンを標的づけるために以下の物質を合成する。
【００７５】
ポルフィリンＩ（図６）をＬｉｎｄｓｅｙの方法（Ｌｉｎｄｓｅｙら、１９８７）によるピロール、パラ−２，３，４，６−テトラアセチルグルコシルオキシベンズアルデヒド（Ｈａｌａｚｙら、１９９０）および−ブロモ−パラ−トルアルデヒド（Ｗｅｎら、１９９７）の縮合により高収率（３１％）で調製する。塩化メチレン／アセトン（１０／１、ｖ／ｖ）混液で溶離させた分取用シリカゲル薄層クロマトグラフィーにより化合物Ｉを精製し、物理学的方法でキャラクタリゼーションする。Ｃ：５８．０３、Ｈ：５．０９、Ｎ：５．０９のＣ８７Ｈ８５ＢｒＮ４Ｏ３０、３Ｈ２Ｏの微量分析ではＣ：５８．０７、Ｈ４．７７、Ｎ：２．７４を確認し、塩化メチレン中の紫外可視スペクトルχｍａｘ（ｎｍ）、（εｍｍｏｌｅ−１ｃｍ−１）は４１９．５（４１４．３）、５１６（１７．９）、５５２（１０．５）、５９１（６．９）、６４７（５．９）で、ＣＤＣｌ３中の１ＨＮＭＲスペクトルδ（ｐｐｍ）は８．８８（ｓ、８Ｈ、ピロール）、８．２６（ｄ、２Ｈ、オルト−フェニル）、８．１６（ｄ、６Ｈ、オルト−フェノキシ）、７．８２（ｄ、２Ｈ、メタ−フェニル）、７．４２（ｄ、６Ｈ、メタ−フェノキシ）、５．５０（ｍ、９Ｈ、Ｈ「オース」）、５．３３（ｍ、３Ｈ、Ｈ「オース」）、４．８８（ｓ、２Ｈ、ＣＨ２Ｂｒ）、４．４５（ｄｄ、３Ｈ、ＨＣ６ａ「オース」）、４．３３（ｄ、３Ｈ、ＨＣ６ａ「オース」）、４．０８（ｍ、３Ｈ、ＨＣ５「オース」）、２．２４（ｓ、９Ｈ、アセチル）、２．１４（ｓ、９Ｈ、アセチル）、２．１３（ｓ、１８Ｈ、アセチル）、−２．７９（ｓ、２Ｈ、ＮＨ）である。ＭｅＯＮａ／ＭｅＯＨ（Ｚｅｍｐｌｅｎ、１９２７）を用いた処理により化合物Ｉから定量的に糖複合化合物ＩＩ（図６）を得る。ＤＭＳＯ中の紫外可視スペクトルχｍａｘ（ｎｍ）、（εｍｍｏｌｅ−１ｃｍ−１）は４２２（３７３．７）、５１７．５（１６．２）、５５４（１１．５）、５９２．５（６．７）、６４９（６．６）、ＤＭＳＯｄ６中の１ＨＮＭＲスペクトルδ（ｐｐｍ）は８．８７（ｓ、６Ｈ、ピロール）、８．８２（ｓ、２Ｈ、ピロール）、８．２４（ｄ、２Ｈ、オルト−フェニル、Ｊ＝７．９Ｈｚ）、８．１３（ｄ、６Ｈオルト−フェノキシ、Ｊ＝７．９Ｈｚ）、７．８９（ｄ、２Ｈ、メタ−フェニル、Ｊ＝８．３Ｈｚ）、７．４８（ｄ、６Ｈ、メタ−フェノキシ、Ｊ＝８Ｈｚ）、５．７（ｓ、２Ｈ、ＣＨ２Ｂｒ）、５．２３（ｄ、３Ｈ、ＨＣ１「オース」）、３．８２（ｄ  ｂｒｏａｄ、３Ｈ、ＨＣ６ａ「オース」）、３．５４（ｍ、３Ｈ、ＨＣ６ａ「オース」）、３．４２（ｍ、３Ｈ、ＨＣ３「オース」）、−２．９１（ｓ、２Ｈ、ＮＨ）で、ＤＭＳＯｄ６中の１３ＣＮＭＲスペクトルδ（ｐｐｍ）は１５７．４（パラ−Ｃフェノキシ）、１４１（メソ−Ｃフェニル）、１３７（パラ−Ｃフェニル）、１３５．１（メソ−Ｃおよびメタ−Ｃフェノキシ）、１３４．５（オルト−Ｃフェニル）、１３１（Ｃ−Ｈピロール）、１２７（メタ−Ｃフェニル）、１２０（メソ−Ｃ）、１１４．３（オルト−Ｃまたはメタ−Ｃフェノキシ）、１００．５（Ｃ１「オース」）、７３．５（Ｃ２「オース」）、６０．７（Ｃ６「オース」）、４５．７（ＣＨ２Ｂｒ）で、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ��はＣ６３Ｈ６１ＢｒＮ４Ｏ１８の計算値１２４０．３２に対して、Ｍ＋１の実測値１２４１．４８である。
【００７６】
化合物ＩＩまたはＩＩ−ＭをＳＴｘＢ／Ｃｙｓと結合させるために１０ｍＭホウ酸塩（ｐＨ９．０）、７５ｍＭのＮａＣｌ、５０％ＤＭＳＯに溶かした３ｍｇ／ｍｌのＳＴｘＢ／Ｃｙｓを５倍過剰の化合物ＩＩまたはＩＩ−Ｍと共に室温で２時間放置する。結合をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで検証し、結合したタンパク質をゲルろ過で精製し−８０℃で貯蔵する。
【００７７】
２．２：ＳＴｘＢ／Ｃｙｓに対するＢＳＡの結合とナノ粒子（または造影剤である磁性流体）との結合
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）に溶かした２０ｍｇ／ｍｌ精製ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を１ｍＭのヘテロ二官能性架橋剤ＭＢＳと共に室温で３０分間放置する。反応物にＰＢＳ／ＥＤＴＡ１０ｍＭで平衡化したゲルろ過カラムを通過させる。溶離したＢＳＡを２０ｍｇ／ｍｌに濃縮する。ＰＢＳ／ＥＤＴＡに３．５ｍｇ／ｍｌとなるように溶かしたＳＴｘＢ／Ｃｙｓ１容を活性化ＢＳＡ１容と混合し、室温で一晩放置する。抗ＳＴｘＢ免疫精製カラムおよびＭｏｎｏＱ陰イオン交換カラムを通過させることにより結合生成物を精製する。ウエスタン分析によると、その生成物は事実上純粋である。ナノ粒子に対するＳＴｘＢ／Ｃｙｓ−ＢＳＡの結合をすでに記載されたように行う（Ｗｉｌｈｅｌｍら、２００２）。
【００７８】
２．３：Ｇｂ３の分布の非侵襲性画像化
原理
ＭＲＩ法によるＧｂ３の分布の監視には、適当な常磁性造影剤（磁性流体またはポルフィリン）と連結した受容体特異的分子ＳＴｘＢから構成される化合物を投与する必要がある。この標的づけされた造影剤が定着部位に蓄積すると、水の緩和速度Ｒ１、Ｒ２、Ｒ２＊が局所的に変更され、Ｔ１および／またはＴ２および／またはＴ２＊強調画像シーケンスを用いたＭＲＩシグナルの変更に至る。造影剤の投与前後に取得された画像の重大なシグナルの相違は、非特異的蓄積を除外できた場合のＧｂ３過剰発現領域を描写している。本プロトコールをＧｂ３を過剰発現している様々な種類の腫瘍に適用できる。下に解説する典型的な測定法は、われわれのトランスジェニックマウスモデルで発生した腸腫瘍を画像化するために最適化したものである。
【００７９】
画像の取得
造影剤を投与しないスクリーニングセッションで、ＭＲＩにより腫瘍をまず検出する。高磁場ミニ画像化システムで、われわれの場合では４．７テスラの水平磁場を備えたＢｒｕｋｅｒのＢｉｏｓｐｅｃ４７／３０システムを用いて画像化を行った。そのためにマウスを麻酔（好ましい麻酔薬はイソフルラン）し、背臥位でクレードルに配置した。循環している湯の入った管を動物の近くに置き、体温を保つ。動物の大きさに合わせたＭＲＩプローブに動物を導入する。われわれが好んで用いるプローブは、自家製の溝のついたシリンダー型プローブ（ｄ＝４４ｍｍ）である。Ｒ１／Ｒ２緩和速度を調整した水溶液が入った管もＭＲＩプローブに導入し、シグナル強度の外部標準とする。運動のアーチファクトが最小となった腹部の画像を得るためには呼吸誘発を実施しなければならない。マウスに呼吸を誘発するために様々な取り組みがある。われわれが好んで用いる高感度誘発装置は自家製で、マウスの腹に設置され、誘発シグナルを適当な電子機器を介してＭＲＩシステムに送る圧トランスデューサーと接続した可膨張性チャンバーを基本とする。肝臓と腸領域に概して及ぶ視野で高速スピンエコー法による３ＤのＴ２強調画像シーケンスにより腫瘍の検出を行う。これらの条件で腫瘍は過剰シグナル領域として現れる。解像度は概して０．１×０．１×０．５ｍｍ３である。腫瘍を解剖学的マーカー、例えば胃腸接合部に対して位置決定する。次に、Ｔ１およびＴ２＊強調高速グラジエントエコーシーケンスで腫瘍を画像化する。これで第１の画像化セッションを終わる。
【００８０】
造影剤を投与（好ましくは経口投与）後に同マウスについて第二画像化セッションを実施する。画像化プロトコールは第１の画像化セッションのプロトコールと正確に合致する。
【００８１】
画像解析
２回の画像化セッションから得た共存するスライスで腫瘍をカバーする目的領域（ＲＯＩ）を規定する。ＲＯＩの平均強度を測定し、外部標準の強度に対して標準化する。したがって、造影剤の投与後に腫瘍に検出された有意差のあるシグナル強度はＧｂ３の過剰発現を実証している。
【００８２】
２．４ＲＭＩの追加実験
酸化鉄ナノ粒子性造影剤（ナノ粒子、ＮＰ）と共に培養してからエッペンドルフ試験管に入れて遠心分離して得られたＨｅＬａ細胞のペレット（約５０×１０６個／ペレット）についてＭＲＩを実施する。さらに詳しくは、細胞試料の調製は以下の主なステップを含む。１．細胞とＮＰを４℃で３０分間培養する（結合）、２．洗浄（３回）、３．３７℃で２時間培養（エンドサイトーシス）、４．洗浄（３回）、６．遠心分離。異なる４条件を使用した。１．未処理酸化鉄ナノ粒子と共に培養（ＮＰ）、２．ＢＳＡをコーティングしたナノ粒子と共に培養（ＮＰ−ＢＳＡ）、３．標的づけした造影剤、すなわちＳＴｘＢと連結したＮＰ−ＢＳＡと共に培養（ＳＴｘＢ−Ｃｙｓ−ＭＢＳ−ＢＳＡ−ＮＰ）、４．Ｇｂ３の発現を減少させるためにＰＰＭＰで処理した細胞を用いて（３．）と同条件。
【００８３】
４．７テスラにおけるＭＲ画像のために、細胞を試料ホルダーに配置し４つの試料を同時に画像化できるようにした。シングルスライスマルチエコーＭＲＩシーケンス（１０エコー、エコー時間４．５〜４５ｍｓｅｃ）を用いてＴ２緩和時間（＝緩和速度Ｒ２の逆数）の定量測定を実施した。
【００８４】
結果を図１５に示す。
【００８５】
実施例３：多光子顕微鏡を用いた腫瘍画像化
方法：
ビリン−ＲａｓＶ１２マウスから切除した腫瘍組織試料を、フェノールレッドを含まないダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）の入った画像化チャンバーに直接配置する。われわれはオリンパスＩＸ７０倒立顕微鏡を使用する。Ｎｄ−ＹＶＯ４レーザー（Ｍｉｌｅｎｎｉａ、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｈｙｓｉｃｓ）により励起する波長可変パルスＴｉ：サファイアレーザー（Ｔｓｕｎａｍｉ、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｈｙｓｉｃｓ）は繰り返し周波数８０ＭＨｚで７５０ｎｍにおいて７０ｆｓのパルスを供給する。走査機能をもたない構成で内蔵のＦｌｕｏｖｉｅｗ光電子倍増管（Ｒ９２８、浜松ホトニクス）により蛍光を検出する。
【００８６】
非侵襲性精密画像化法により腸腫瘍に標的づけし、確認するために官能化ＳＴｘＢを使用できる
ＳＴｘＢと結合した場合、発蛍光団Ｃｙ３は腸腫瘍に強く蓄積し、ＳＴｘＢがＧｂ３発現腫瘍に対してインビボ診断のための造影剤を送達することを実証している。生検が光学的に多光子画像を形成する能力を使ってわれわれはこれを示す。まず第１に、切除した正常組織または癌組織の十二指腸絨毛を、予め固定または染色せずに非線形自己蛍光を使って観察する（図１１Ａ〜Ｃ）。上皮細胞における核の規則的な整列（黒い部分）がはっきりと見える（図１１Ｂ）。対照的に、脱分化した腫瘍試料では核は拡大し不規則である（図１１Ｃ）。次に、トランスジェニックマウスに発蛍光団と結合したＳＴｘＢを強制給餌する。６時間後に腫瘍試料および正常粘膜の試料を切除し多光子画像により観察する。正常組織は暗く見えるが、腫瘍組織はインターナリゼーションしたＳＴｘＢで明るく標識される（図１１Ｄ〜Ｅ）。
【００８７】
結果を図１１に示す。
【００８８】
実施例４：光線力学療法による腫瘍の治療
方法：
グリコポルフィリンＨ２ＴＰＰ（ｐ−Ｏ−□−Ｄ−ＧｌｕＯＡｃ）３（ｐ−ＣＨ２Ｂｒ）を０．７ｍＭとなるようにＤＭＳＯに溶かし、等体積の５．３ｍｇ／ｍｌのＳＴｘＢ−Ｃｙｓと混合する。この混合物を室温で２時間放置してからＧ２５ゲルろ過カラムを通過させる。結合生成物を液体窒素に入れて急速冷凍し、−８０℃で保存する。
【００８９】
ヒト腫瘍細胞（ＨＴ２９結腸癌またはＨｅｌａ子宮頚部腺癌）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコのＭＥＭで培養する。対数増殖期の細胞を９６ウェル平板に植え（０．２ｍＬ、３×１０４個／ウェル）、ウォータージャケット式培養器に入れ空気／ＣＯ２雰囲気（５％ＣＯ２）下で３７℃で３時間培養する。試験化合物を最小体積で添加する。平板を３時間培養し、培地を除き、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄してから薬物を含まない新鮮培地を加える。オレンジ色のフィルター（５２０ｎｍで０％Ｔ、５９０ｎｍ以上で８０％Ｔ）を装着し２ｍＷ／ｃｍ２のフルエンスを生じる自家製の「光源」を使って平板の底から可視光（２Ｊ／ｃｍ２）の照射を行う。平板を３日間培養してからＭＴＴアッセイ（Ｍｏｓｍａｎｎ、１９８３）を使って、１０μｇ／ウェルの３−［４，５−ジメチルチアゾル−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ、シグマ）と共に３０分間培養して細胞の生存率を評価する。培地を除去した後に、ホルマザンの結晶をＤＭＳＯ１００μＬに溶解させ５４０ｎｍにおける吸光度をＢｉｏ−Ｒａｄマイクロプレートリーダー（モデル４５０）で測定する。生存率を未処理対照に対する％として表す。
【００９０】
ＨｅＬａ−Ｇｂ３＋細胞、ＨＴ２９細胞（Ｇｂ３の発現は低レベル）または完全にＧｂ３の発現を阻害したＨｅＬａ細胞のいずれかを遊離ポルフィリンまたはＳＴｘＢ−ポルフィリン複合体で処理した場合を比較するとＳＴｘＢによる色素の特異的標的づけを検証できる。
【００９１】
結果を図１２に示す。
【００９２】
実施例５：ネオカルジノスタチンによる腫瘍の治療
ａ）ネオカルジノスタチンの精製
ホロ−ＮＣＳを日本化薬株式会社（東京、日本）から購入し、記載されたように精製する（Ｆａｖａｕｄｏｎ、１９８３）。１ｍＭの酢酸で酸性にした蒸留水に対して精製ホロ−ＮＣＳを透析し、凍結乾燥し、−８０℃で暗所保存する。
【００９３】
ホロ−ＮＣＳ調製物はポリアクリルアミドゲルを用いた等電点電気泳動（ｐＨ２．４〜４．５の勾配）で純度≧９８％であり、吸光度と蛍光スペクトルからみてアポ−ＮＣＳの混入はない。ＮＣＳＣｈｒｏｍはその大部分（＞９０％）がＮａｐｉｅｒらの命名による「Ａ」型である（Ｎａｐｉｅｒら、１９８１）。
【００９４】
モル消衰係数、すなわちアポ−ＮＣＳではε２７７＝１４．４ｍＭ−１．ｃｍ−１、ホロ−ＮＣＳではε２７３＝３５．４ｍＭ−１．ｃｍ−１およびε３４０＝１０．９ｍＭ−１．ｃｍ−１を使って、ホロ−ＮＣＳ溶液を吸収分光測定により滴定する。
【００９５】
ｂ）アポ−ＮＣＳとＳＴｘＢ−Ｃｙｓとの結合
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）に溶かした２０ｍｇ／ｍｌの精製アポ−ＮＣＳを１ｍＭのヘテロ二官能性架橋剤ＭＢＳと共に室温で３０分間放置する。反応物に、１０ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳで平衡化したゲルろ過カラムを通過させる。溶離した活性化アポ−ＮＣＳを２０ｍｇ／ｍｌに濃縮する。ＰＢＳ／ＥＤＴＡに溶かした３．５ｍｇ／ｍｌのＳＴｘＢ／Ｃｙｓ１容を活性化アポ−ＮＣＳ  １容と混合し、室温で一晩放置する。抗ＳＴｘＢ免疫精製カラムおよびゲルろ過カラムを通過させることにより結合生成物を精製する。ウエスタン分析によると、アポ−ＮＣＳ／ＳＴｘＢと名付けたこの結合生成物は事実上純粋である。
【００９６】
ｃ）アポ−ＮＣＳ／ＳＴｘＢ複合体へのＮＣＳＣｈｒｏｍの取り込み
凍結乾燥ホロ−ＮＣＳ粉末１μｍｏｌ（乾燥重量１１．３ｍｇ）を１ＮのＨＣｌで酸性にした氷冷無水メタノール１ｍｌに懸濁し、２分ごとにボルテックスミキサーで撹拌しながら１０分間放置し、その後遠心分離する（１１０００×ｇで１０分間）。遊離ＮＣＳＣｈｒｏｍを含有する上清画分を回収し記載されたように吸収分光測定により滴定する（Ｆａｖａｕｄｏｎ、１９８３）。全ての手技を氷温暗所で実施する。ＮＣＳＣｈｒｏｍの抽出効率はほぼ５０％である。
【００９７】
ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）１ｍｌに溶かしたアポ−ＮＣＳ／ＳＴｘＢ複合体６ｎｍｏｌを氷冷し、ボルテックスミキサーで撹拌しながら１０倍モル濃度過剰の上記の調製によるＮＣＳＣｈｒｏｍを混合する。おそらく酸性ｐＨであることか、または水性媒質での遊離ＮＣＳＣｈｒｏｍの溶解度が低いことが原因で沈殿が形成する。調製物を遠心分離する（１０分間、１１０００×ｇ）。２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．４）で平衡化したセファデックスＧ−２５の１．０×２０ｃｍカラムに上清画分を載せる。ペレットを同緩衝液５００μｌに再溶解し、第１の上清画分と共にカラム上でプールする。２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．４）で溶離を行う。全ての操作を４℃で遮光して実施する。集めた画分を吸収分光測定でチェックする。（２８０ｎｍにおける吸光度から検出した）タンパク質を含有する画分は、タンパク質が結合したＮＣＳＣｈｒｏｍに典型的な３４０ｎｍを中心とする吸収バンドを示す（図７）。
【００９８】
このタンパク質画分をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）遠心フィルターユニット（分画分子量３０００Ｄａ）を用いて遠心分離し、Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）ユニット（孔径０．２μｍ）でろ過することで滅菌し液体窒素の温度で遮光して保存する（長期保存にはｐＨ５．０まで下げることを薦める）。タンパク質が結合したＮＣＳＣｈｒｏｍの３４０ｎｍにおける吸光度から、再構成されたホロ−ＮＣＳ／ＳＴｘＢの終濃度は９．８μＭである。
【００９９】
ｄ）細胞毒性のアッセイ
４．５ｇ／ｌグルコース、０．１ｇ／ｌピルビン酸塩、１０５Ｕｌ／ｌペニシリン、０．１ｇ／ｌストレプトマイシン、０．８６ｇ／ｌのＧｌｕｔａｍａｘ  Ｉおよび１０％ｖ／ｖウシ胎仔血清（３７℃、５％ＣＯ２）を含むダルベッコ変法イーグル最小必須培地で、Ｇｂ３の発現を阻害するための５μＭのＤＬ−トレオ−１−フェニル−２−ヘキサデカノイル−アミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール（ＰＰＭＰ）を無添加または添加して、ヒト子宮頚部腺癌であるＨｅＬａ細胞を対数増殖している単層として維持する。添加する場合ＰＰＭＰを細胞毒性アッセイ前の少なくとも６日間の前培養に導入し、薬物を洗浄するまで存在させる。
【０１００】
ＰＰＭＰ存在下または非存在下で継代培養したＨｅＬａ細胞を並行して使用して細胞毒性のアッセイを実施する。簡潔には、８００個の密度（２５ｃｍ２のフラスコ）で細胞を植え、処理前に４時間培養して接着させ伸展させる。播種用細胞懸濁液に細胞の小塊が混入しないように注意する。それは、細胞の小塊が存在するとクローン原性の測定に主な誤差が生じるからである。
【０１０１】
ホロ−ＮＣＳまたはホロ−ＮＣＳ／ＳＴｘＢの細胞毒性を測定するために、薬物の滅菌液の一部を使用直前に解凍し、ｐＨ６．０のＰＢＳで適当な濃度に調整し、直ちに培養フラスコに導入する。全ての実験を減光下で実施し、薬物の光分解を防止する。
【０１０２】
本発明者らはホロ−ＮＣＳの最大細胞毒性効果がわずか６分間以内の培養（３７℃）で発生し、それ以上薬物との接触時間を延ばしても細胞死は増加しないことを観察する。この理由から、薬物に対する曝露時間は全体で１５分間に限定した。
【０１０３】
処理後にフラスコをハンクス平衡塩類溶液で２回洗い、新鮮培地を補充し、培養器に戻し８日間培養する。コロニーをメタノールで固定し、染色し、評点する。
【０１０４】
ｅ）ＨｅＬａ細胞に対する細胞毒性
ホロ−ＮＣＳの細胞毒性がＳＴｘＢ／Ｃｙｓと結合した後でも変化しないままであることを最初に検証する。ホロ−ＮＣＳとホロ−ＮＣＳ／ＳＴｘＢを用いたとき、細胞数の５０％を死滅させる薬物濃度は０．７１±０．０５ｎＭである。次に、ＰＰＭＰ非存在下および存在下で致死濃度のＮＣＳ（４ｎＭ）を用いて、ホロ−ＮＣＳおよびホロ−ＮＣＳ／ＳＴｘＢの細胞毒性を０℃で検討する。この実験の原理は、ホロ−ＮＣＳは低温で不活性であることが知られているが（Ｋａｐｐｅｎら、１９８０）、ＳＴｘＢはこれらの条件でも受容体と結合し飽和させることができ（Ｊｏｈａｎｎｅｓら、１９９７）、温度を上げるとインターナリゼーションすることが期待されるというものである。
【０１０５】
フラスコに植えた細胞を１５分間氷冷してからホロ−ＮＣＳまたはホロ−ＮＣＳ／ＳＴｘＢを曝露する。次に、薬物（４ｎＭ）を導入し、氷冷しながらさらに１５分間放置する。それから培地を吸引除去し、氷冷したハンクス平衡塩類溶液でフラスコを注意深く２回洗い薬物を除去する。最後に氷冷した無薬物培地をフラスコに補充し、室温で再び平衡化してから３７℃で８日間培養する。ブランクを作り、実験期間の間に細胞を冷却することにより毒性が導入されないことを確認する。結果を図８に示す。
【０１０６】
ホロ−ＮＣＳに対する生存率は９０％以上の範囲である。したがって、低温はホロ−ＮＣＳの細胞毒性を効果的に打ち消す。対照的に、ホロ−ＮＣＳ／ＳＴｘＢは０℃でも活性で、細胞生存率はわずか約３０％である。ＰＰＭＰはホロ−ＮＣＳ／ＳＴｘＢに顕著な耐性を誘導する。
【０１０７】
まとめると、本実験はＳＴｘＢが他の経路による薬物の取り込みを制限する条件で細胞内への薬物の取り込みを行うことができることを示している。細胞表面でのＳＴｘＢの受容体部位の数は限られていることから、本方法はナノモル範囲で作用する薬物で特異的に作動することが示唆される。
【０１０８】
本研究でわれわれは、腫瘍細胞に特異的に標的づけるベクターとしてのＳＴｘＢの使用を拡大し、われわれは結腸直腸癌のためのマウスモデルにおいてその標的づけを試験することに成功した。われわれはＳＴｘＢをマウスに経口投与できることを示し、その場合ＳＴｘＢは２．５時間以内に腸腫瘍に達し、対照組織（肝臓）および正常腸組織に比べて腫瘍組織に高濃度を示す。さらに、ＳＴｘＢは２４時間培養した後でさえも腫瘍に保持される。官能化ＳＴｘＢは新規な診断アプローチおよび治療アプローチを試験する価値ある手段である。これは、他の方法で明らかにするのが困難であることが証明された、腸での腫瘍の形成における初期のできごとを研究するために使われている。周辺組織から腫瘍をよりよく識別するために、ＳＴｘＢと結合した造影剤を適用する前後にＲＭＩ実験を実施する。さらに、非侵襲性画像化法に基づく長期実験をこの官能化薬剤を用いて実施する。最後に、免疫無防備状態のヌードマウスの盲腸に同所移植したヒト腫瘍にこの造影剤を使用する。
【０１０９】
さらに、担体としてＳＴｘＢを用いて新規な組成物を作製し、治療用化合物をＧｂ３発現腫瘍に標的づけることを可能にする。インビトロの腫瘍細胞、記載された動物モデルでの腫瘍、およびヒトの腫瘍に及ぼすこれらの組成物の効果を実証する。
【０１１０】
実施例６：プロドラッグを活性化するための酵素の送達
β−グルクロニダーゼとＳＴｘＢ−Ｃｙｓとの化学結合
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）に溶かした３ｍｇ／ｍｌ精製β−グルクロニダーゼ（β−ＧＵＳ）を９０μＭヘテロ二官能性架橋剤ＭＢＳと室温で３０分間反応させる。１０ｍＭのＰＢＳ−ＥＤＴＡで平衡化したＰＤ−１０カラムを通過させるゲルろ過により、形成した複合β−ＧＵＳ−ＭＢＳから未反応のＭＢＳを分離する。次にこの活性化β−ＧＵＳを２ｍｇ／ｍｌに濃縮し、３５倍モル濃度過剰のＳＴｘＢ−Ｃｙｓと混合し、室温で一晩放置する。ゲルろ過カラムおよび抗ＳＴｘＢ免疫アフィニティカラムを通過させることにより、形成した複合体ＳＴｘＢ−Ｃｙｓ−β−ＧＵＳを精製する。精製した結合生成物はウエスタンブロット試験によると極めて純粋で、酵素活性は化学修飾により変化していない。
【０１１１】
細胞へのＳＴｘＢ−Ｃｙｓ結合β−グルクロニダーゼの標的づけ
ＳＴｘＢ−Ｃｙｓ−β−ＧＵＳの輸送特性をβ−ＧＵＳおよびＳＴｘＢ−Ｃｙｓと比べＨｅｌａ細胞で検討する。カバーグラス上に増殖させたＨｅｌａ細胞（０．７５×１０５）に０．５μＭのＳＴｘＢ−Ｃｙｓ、β−ＧＵＳまたはβ−ＧＵＳ−ＳＴｘＢ−Ｃｙｓを加えて４℃で３０分間培養する（結合ステップ）。次に氷冷した培地で細胞を洗浄し、３７℃に変え４０分間培養し（インターナリゼーションステップ）、４％ＰＦＡで１０分間固定し、サポニンで透過性にし、表示した一次および二次抗体で染色し、共焦点顕微鏡で分析する。得られた結果を図１３に示す。
【０１１２】
共焦点顕微鏡実験は、ＳＴｘＢに対する抗体とβ−ＧＵＳに対する抗体で得られた標識が完全に重複することを示す（図１３）。ベクター化されていないβ−ＧＵＳでは細胞の染色は観察されない（データは示さず）。これらの結果は、ＳＴｘＢを用いてベクター化すると、β−グルクロニダーゼが逆輸送経路に標的づけられることを明らかに実証している。結果を図１３に示す。
【０１１３】
細胞に関連した、ベクター化されたβ−グルクロニダーゼ活性
ＳＴｘＢ−Ｃｙｓによりβ−ＧＵＳをベクター化することが、シガトキシン受容体Ｇｂ３を発現するか発現しないＨｅｌａ細胞における細胞性酵素活性の増加を生じるかどうかを試験した。β−ＧＵＳによる加水分解で蛍光性４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）を生成する４−メチルウンベリフェリルグルクロニドの存在下でβ−ＧＵＳ酵素アッセイを行い、４−ＭＵの蛍光活性を蛍光測定法で測定する。
【０１１４】
０．５μＭのＳＴｘＢ−Ｃｙｓ−β−ＧＵＳの存在下または非存在下で４℃で３０分間Ｈｅｌａ細胞（１０６個）を培養する（結合ステップ）。培地で洗浄後に、温度を３７℃に変え、細胞を６０分間培養する（インターナリゼーションステップ）。ＲＩＰＡ緩衝液（ＰＢＳ１×、ＮＰ４０（１％）、Ｄｏｃ（０．５％）、ＳＤＳ（０．５％））を用いて細胞溶解液を調製する。細胞でのβ−ＧＵＳの基礎活性およびβ−ＧＵＳ−ＳＴｘＢ処理、Ｇｂ３発現、Ｇｂ３非発現のＨｅｌａ細胞に関連するβ−ＧＵＳ活性を図１４にまとめる。Ｇｂ３発現ＨｅＬａ細胞は、非発現細胞に比べてβ−ＧＵＳ活性の有意な増加を示す。これら非発現細胞は対照細胞（基礎活性）と同レベルのβ−グルクロニダーゼ活性を有する。このことはβ−ＧＵＳ活性の細胞への標的づけはＳＴｘＢ／Ｇｂ３系に依存することを示している。
【０１１５】
総合すれば、われわれのデータはβ−ＧＵＳとＳＴｘＢ−Ｃｙｓとの化学結合に基づくわれわれの取り組みによってβ−ＧＵＳの酵素活性は変化せず、この化学結合がプロドラッグ戦略用に活性酵素を標的づけるために適していることを実証している。
【０１１６】
結果を図１４に示す。
【０１１７】
実施例７：代替結合法
スルフヒドリル基（−ＳＨ）を介した結合に代わるのはアミノ基（−ＮＨ２）、糖質、カルボキシル（−ＣＯＯＨ）、または水酸基（−ＯＨ）を介したカップリングである。ベクター化する化合物上の反応性基の例は、イミドエステル（第１の級アミンと反応）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（第１の級アミンと反応）、マレイミド（スルフヒドリルと反応）、ハロアセチル（スルフヒドリルと反応）、ヒドラジン（酸化した糖質と反応）、カルボジイミド（カルボキシルと反応）である。
【０１１８】
野生型ＳＴｘＢはグリコシル化されていない。化学結合のためのグリコシル化ＳＴｘＢは、酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなどのグリコシル化コンピテント細胞に、グリコシル化部位を有するＳＴｘＢ変異体を発現させることにより得ることができる。アミノ基、カルボキシル、および水酸基は野生型ＳＴｘＢに存在し、化学結合は不活性化タンパク質を含有する不均質混合物を生じる。ある程度の部位特異的結合を得るために、適当な側鎖をもつアミノ酸をＳＴｘＢのカルボキシル末端に融合させる。一例では、アミノ酸配列ＥＤＥＫＫＫ（Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）を野生型ＳＴｘＢのカルボキシル末端に融合させる。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで活性化されたビオチンとの反応により、タンパク質を不活性化させないでＳＴｘＢ−ＥＤＥＫＫＫにビオチンを導入することが可能になる。図１６に実施例を示すようにＳＴｘＢによりベクター化されたビオチンをＨｅＬａ細胞のゴルジ装置から検出できる。
【０１１９】
結果を図１６に示す。
【０１２０】
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【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】腸腫瘍による２．５ｈ後のＳＴｘＢの取り込みを正常組織と比べて示す図である。上：正常十二指腸。下：膨大部周辺領域の腫瘍。左：Ｈｏｅｃｈｓｔ色素で核を染色。右：抗ＳＴｘＢ染色。
【図２】正常組織では胃腸内分泌細胞がＳＴｘＢを取り込むことを示す図である。正常十二指腸の領域を示す。Ｈｏｅｃｈｓｔで核を染色（左上）、抗クロモグラニンＡ／Ｂ抗体（右上）および抗ＳＴｘＢ抗体（左下）。右下の図は３つの染色を重ね合わせたものを示す：核（青）、クロモグラニンＡ／Ｂ（赤）、ＳＴｘＢ（緑）。黄色はクロモグラニンとＳＴｘＢの共存を実証している。
【図３】腸腫瘍による２４ｈ後のＳＴｘＢの取り込みを正常組織と比べて示す図である。上：正常十二指腸。下：膨大部周辺領域の腫瘍。左：Ｈｏｅｃｈｓｔ色素で核を染色。右：抗ＳＴｘＢ染色。
【図４】２４ｈ後でさえも対照組織（肝臓）にＳＴｘＢが存在しないことを示す図である。上：未処理対照動物。下：ＳＴｘＢで処理して２４ｈ放置後の動物。左：核染色（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、右：抗ＳＴｘＢ染色。
【図５】ＳＴｘＢ／Ｃｙｓと結合した水溶性メタロポルフィリンの構造を示す図である。
【図６】ＲＭＩ（ＩＩ−Ｍ）における造影剤またはＰＤＴ（ＩＩ）用の抗腫瘍細胞毒性剤として機能するようにＳＴｘＢ／Ｃｙｓと結合した化合物の合成を示す図である。
【図７】ＮＣＳＣｈｒｏｍを取り込みセファデックスＧ２５でろ過して過剰な非特異的に結合したＮＣＳＣｈｒｏｍを除去した後のホロ−ＮＣＳ／ＳＴｘＢの光学吸収スペクトルを示す図である。
【図８】（ＮＣＳＣｈｒｏｍに関して）４ｎＭのホロ−ＮＣＳまたはホロ−ＮＣＳ／ＳＴｘＢに対するＨｅＬａ細胞の反応に及ぼす低温（０℃）およびＰＰＭＰの効果をまとめた図である。対照としてブランクを氷で処理する。
【図９】ＭＢＳ結合法を示す図である。
【図１０】マウスおよびヒトの腫瘍によるＧｂ３の過剰発現を示す図である。（Ａ）正常組織試料（Ｃｔｒｌ）およびＲａｓ−ＡＰＣマウスから得られた腫瘍組織試料から抽出した中性ＧＳＬを使ったＳＴｘＢ重複実験。（Ｂ）正常（白棒線）または腫瘍（灰色棒線）の腸組織試料におけるＧｂ３発現の定量。平均を黒棒線で示す。（Ｃ）正常ヒト結腸（Ｃｔｒｌ）および腫瘍組織から抽出した中性ＧＳＬを使ったＳＴｘＢ重複実験。（Ｄ）ヒト結腸腫瘍によるＧｂ３の過剰発現の表示。結果を同患者から得た正常隣接組織におけるＧｂ３発現に対する腫瘍におけるＧｂ３発現の比として表す。６つの独立した実験（白棒線）および平均（黒棒線）を表す。
【図１１】多光子顕微鏡を使った腫瘍の画像化を示す図である。（Ａ、Ｂ、Ｃ）未固定、未染色組織での自己蛍光に現される未処理の腸組織の外観。（Ａ）十二指腸の絨毛。（Ｂ）正常組織における整列した上皮細胞。（Ｃ）脱分化腫瘍における拡大した核を伴う不規則な細胞。（Ｄ、Ｅ）Ｃｙ５−ＳＴｘＢを用いた胃内強制投与実験。腫瘍組織は明るく標識されるが、周辺の正常組織は、（Ａ〜Ｃ）と比べて励起様式が小さいことが原因で暗く見える。
【図１２】癌細胞に対するグリコポルフィリンＨ２ＴＰＰ（ｐ−Ｏ−ｂ−Ｄ−ＧｌｕＯＡｃ）３（ｐ−ＣＨ２Ｂｒ）のベクター化を示す図である。上の青い線（白い四角）はＧｂ３の発現がＰＰＭＰを用いて阻害されたＨｅｌａ細胞の応答を報告している。下の赤い線（白丸）は対照ＨｅＬａ細胞について報告している。Ｇｂ３が発現しているＨｅＬａ細胞でのみ生存が有意に影響を受けることは、グリコ−ポルフィリンＨ２ＴＰＰ（ｐ−Ｏ−ｂ−Ｄ−ＧｌｕＯＡｃ）３（ｐ−ＣＨ２Ｂｒ）がＳＴｘＢを介して癌細胞へと受容体に依存して送達されることを示している。
【図１３】ＳＴｘＢに依存してβ−ＧＵＳが癌細胞の逆ルートに標的づけられたことの分析を示す図である。ＳＴｘＢ（赤、上）およびβ−ＧＵＳ（緑、中央）に対する抗体を用いて得られた標識（黄色、下）が完全に重複することに注意。
【図１４】癌細胞へのβ−ＧＵＳ活性のベクター化を示す図である。β−ＧＵＳ活性を任意の単位で示す。Ｇｂ３を発現しているＨｅＬａ細胞（Ｇｂ３＋細胞）が非発現細胞（Ｇｂ３−細胞）に比べてβ−ＧＵＳ活性の有意な増加を示すことに注意。精製β−ＧＵＳの活性を対照として示す。
【図１５】４つの細胞調製物のコンピュータ定量Ｔ２マップを示す図である。ＮＰが関連した細胞が暗く見えることに注意。コーティングしていないＮＰはＨｅＬａ細胞と容易に非特異的に結合する。ＢＳＡのコーティング（ＮＰ−ＢＳＡ）は非特異的結合を減少させる。ＳＴｘＢで官能化したＮＰ（ＳＴｘＢ−Ｃｙｓ−ＭＢＳ−ＢＳＡ−ＮＰ）はＨｅＬａ細胞と受容体依存的に結合する。
【図１６】ＨｅＬａ細胞のゴルジ装置への、ＳＴｘＢ−ＥＤＥＫＫＫと結合したビオチンの標的づけを示す図である。製造業者の説明書（Ｐｉｅｒｃｅ）にしたがってビオチンをＳＴｘＢ−ＥＤＥＫＫＫと結合させる。氷冷しながらＨｅｌａ細胞に結合させた後（３０分間）、ＳＴｘＢ−ＥＤＥＫＫＫを３７℃で４５分間インターナリゼーションさせる。細胞を固定し、ＳＴｘＢ（１３Ｃ４抗体）について、およびベクター化されたビオチンを検出するためにストレプトアビジンについて二重染色する。ベクター化されたビオチンが核周辺のゴルジ装置に蓄積することに注意。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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