(57)【要約】特異性に優れた高感度な血小板活性化因子(platelet-activating factor, PAF)の定量方法を提供する。本発明を用いて生体試料中のPAF濃度を測定することにより、各種病態におけるPAFの役割を明らかにすることができる。また、PAFの変動にともなう各種疾患の診断を容易に行うことができると同時に、その疾病の治療効果の評価に貢献することが期待できる。本発明は、生体試料からPAFを選択的に抽出・精製した後に、PAFを高感度かつ特異的にガスクロマトグラフ質量分析計または液体クロマトグラフ質量分析計にて測定する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中に含まれる下記式：
【化１】
2004527770.tif 000005
（式中、R1は飽和もしくは不飽和の非環状炭化水素基または飽和もしくは不飽和の脂肪酸より導かれるアシル基であり、R3はホスホコリン、ホスホエタノールアミン、ホスホモノメチルエタノールアミンまたはホスホジメチルエタノールアミンである）で表される血小板活性化因子（Platelet-activating factor, PAF）の含有量を測定するために生体試料を処理する方法において、
ａ) 生体試料を、水溶性有機溶媒と混合して、遠心分離し、
ｂ）上記遠心分離で得られた上澄液に含まれるPAFを、水不溶性有機溶媒中に抽出し、そして
ｃ）水不溶性有機溶媒中に抽出したPAFを、そのまま又は適当な濃度に調整してシリカゲル固相カラムに導入し、ヘキサン／２−プロパノール／水の混液で洗浄および溶出してPAFを精製する、
工程を含む、上記生体試料の処理方法。
【請求項２】
工程ａ）の水溶性有機溶媒がテトラヒドロフランである、請求項１の方法。
【請求項３】
工程ｂ）の水不溶性有機溶媒が酢酸エチルである、請求項１または２の方法。
【請求項４】
工程ｃ）の洗浄を、ヘキサン／２−プロパノール／水の1／0.5〜1／0.05〜0.2の混液で行う、請求項１ないし３のいずれか１項の方法。
【請求項５】
工程ｃ）の溶出を、ヘキサン／２−プロパノール／水の1／2〜20／0.2〜2の混液で行う、請求項４の方法。
【請求項６】
PAF量を測定する方法が、ガスクロマトグラフ質量分析法である、請求項１ないし５のいずれか１項の方法。
【請求項７】
工程ｃ）で精製されたPAFを、さらにｄ）フォスフォリパーゼＣで加水分解し、そしてｅ）生成したPAFの加水分解体（以下、グリセロール体と記す）を精製する工程を含む、請求項６の方法。
【請求項８】
フォスフォリパーゼＣでの加水分解を弱酸性条件で行う、請求項７の方法。
【請求項９】
グリセロール体の精製を、逆相シリカゲルカラムにより、アセトニトリル／水の混液で洗浄および溶出することにより行う、請求項７または８の方法。
【請求項１０】
請求項７ないし９のいずれか１項の工程ｅ）で精製されたグリセロール体を、ｆ）ガスクロマトグラフ質量分析に適する誘導体とし、必要であれば該誘導体を精製して、ガスクロマトグラフ分離し、および分離した成分を質量分析する、工程に付して生体試料中のPAFの含有量を測定する方法。
【請求項１１】
所定量のPAF標準品について、生体試料と同様にａ）〜ｆ）の工程を行って得られた検量線と、生体試料について得られた分析値を比較して、生体試料中のPAFの含有量を決定する工程をさらに含む、請求項１０の方法。
【請求項１２】
PAF量を測定する方法が、液体クロマトグラフ質量分析法である、請求項１ないし５のいずれか１項の方法。
【請求項１３】
所定量のPAF標準品について、生体試料と同様に処理して得られた検量線と、生体試料について得られた分析値を比較して、生体試料中のPAFの含有量を決定する工程をさらに含む、請求項１２の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料からPAFを選択的に抽出および精製した後に、高感度かつ特異的にPAFを測定するPAFの測定方法、特にガスクロマトグラフ質量分析（GC-MS）法および液体クロマトグラフ質量分析(LC-MS)法である。本発明の方法を用いて生体試料中のPAF濃度を測定することにより、各種病態におけるPAFの役割を明らかにすることができる。また、PAFの変動にともなう各種疾患の診断を容易に行うことができると同時に、その疾病の治療効果の評価に貢献することが期待できる。
【従来技術】
【０００２】
PAFはIgE感作ウサギ好塩基球より抗原刺激により放出され、血小板を活性化する液性因子として1972年に発見され、1979年にウサギ好塩基球由来のPAFの構造が、１−O−アルキル−２−アセチル−sn−グリセロ−３−ホスホコリンであると決定された。その後、種々の生体試料からのPAFの検出・定量が試みられ、現在では、PAFには種々の分子種が存在することが明らかとなってきた。
【０００３】
PAFは下記の式：
【０００４】
【化２】
2004527770.tif 000002
【０００５】
（式中、R1は飽和もしくは不飽和の非環状炭化水素基または飽和もしくは不飽和の脂肪酸より導かれるアシル基であり、R3はホスホコリン、ホスホエタノールアミン、ホスホモノメチルエタノールアミンまたはホスホジメチルエタノールアミンである）
に示すように、リン脂質の一種であり、グリセロール骨格のClに飽和または不飽和の非環状炭化水素基または飽和もしくは不飽和の脂肪酸より導かれるアシル基がエーテル、エステルまたはビニルエーテル結合し、C2にアセチル基、C3にホスホコリン、ホスホエタノールアミン、ホスホモノエチルエタノールアミンまたはホスホジメチルエタノールアミンが結合した構造を有している。C1位に結合する飽和もしくは不飽和の非環状炭化水素基または飽和もしくは不飽和の脂肪酸より導かれるアシル基は、炭素数が12〜18のものが知られている。これら分子種はそれぞれ異なる生物活性を示すことが知られており、これら分子種のなかで、1-O-ヘキサデシル-2-アセチル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(C16-PAF)が最も強い生物活性を示す。PAFの主な生理作用は、血小板活性化、白血球遊走および活性化、血管透過性亢進などであり、気管支喘息をはじめとするアレルギー疾患や、エンドトキシンショック、多くの炎症性疾患に関与すると考えられている。これらの疾患にPAFが関与するか否かを明らかにするためには、その疾病患者から採取された生体試料中のPAF濃度を測定し、その変動を調べることが必要である。しかしながら、生体試料中のPAF濃度は極めて低く、またPAFと構造が極めて類似した生体成分が高濃度で共在するため、PAFの測定は難しく、各種疾病とPAFとの関連はいまだ明確にされていないのが現状である。
【０００６】
これまでに報告されたPAFの測定方法は、主に生物活性測定法、免疫学的測定法、およびGC-MS法および液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）法などの物理化学的測定法の３つに分類される（「血小板活性化因子」、現代化学増刊17、25-34 、1989）。生物活性測定法としては血小板凝集能を指標とした方法がほとんどである。しかしながら、PAF以外の生体成分も血小板凝集能を示すことや、PAFの分子種の相違により異なる血小板凝集能を持つため、生物活性測定法ではPAFを特異的に測定できていないのが現状である。また、免疫学的測定法では、PAFと構造が極めて類似したホスファチジルコリン（PC）およびリゾホスファチジルコリン（LysoPC）が高濃度で生体中に存在し、これらのリン脂質が抗体に結合する交叉反応のため、免疫学的測定法で生体試料中のPAFを測定するには至っていない。
【０００７】
物理化学的測定法については、Ramesha C.M.らがGC-MS法によりPAFを高感度で検出する方法を開発した(Biomed. Envilon. Mass Spectrom.13,107-111,1986)。彼らは、C16-PAFのC3のフォスフォコリン基をフォスフォリパーゼＣにて加水分解し、生成したグリセロール体の水酸基にペンタフルオロベンゾイル基を導入してGC-MSで分析した。この方法は高感度でPAFを検出できるため、多くの研究者がGC-MS法でPAFを分析する方法として採用してきている。
【０００８】
しかしながら、このGC-MS 法を生体試料中のC16-PAF濃度測定に応用しても、これまでに報告された血液などの生体試料中のC16-PAF濃度は、夾雑するリン脂質を完全分離できず、実存の値よりも遥かに高い値が報告されていた。このように、生体試料中のPAF濃度を測定するための実用的方法はいまだ開発されていないのが現状であり、高感度で特異性の高いPAFの定量方法の開発が望まれていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は上記問題を解決するものであり、その目的とするところは再現性および信頼性に優れたGC-MS法およびLC-MS法により、PAF類縁体も含む可能性がある任意の試料、例えば生体試料（以下、これらを総称して単に生体試料と呼ぶ）中のPAFを、高感度で特異的に測定する方法を提供することにある。
【００１０】
より具体的には、本発明は生体試料からPAFをできるだけ効率良く抽出する溶媒系を提供する。
本発明はさらに、シリカゲルカラムと特定の洗浄および溶出溶媒を用いることにより、生体試料からPAF類縁体を効率的に除去する方法を提供する。
【００１１】
さらに、本発明をGC-MS法に供する場合、本発明は、上記シリカゲルカラムでは除去しきれない可能性があるLysoPCを含む生体試料中のPAFを、選択的にフォスフォリパーゼＣで加水分解し、生成したグリセロール体を未分解のLysoPCから分離する方法を提供する。
【００１２】
また、本発明は、このグリセロール体をガスクロマトグラフに供するために行うペンタフルオロベンゾイル誘導体化工程において、生成した誘導体が図4-B、C,Dに示す異性体を生じないようにするための、フォスフォリパーゼＣによるPAFの加水分解反応方法を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、上記シリカゲルカラムと特定の洗浄および溶出溶媒を用いて、効率的にPAF類縁体を除去した生体試料を、それ以上の前処理を行うことなく、そのままLC-MSにより分析して、生体試料中のPAFを、迅速かつ高感度で正確に測定する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、PAFの検出方法として生物活性測定法、免疫学的測定法および物理化学的測定法のいずれにも応用できるが、好ましい方法としては、最も高い感度と特異性が得られるGC-MS法およびLC-MS法である。
【００１５】
生体試料のPAFの測定においては、試料中のPAFを効率良く抽出し、且つ混在するPAF類縁体を十分に分離することが必要である。
即ち、生体試料からPAFを抽出する際に、PAF以外の生体成分が大量に混入する可能性があることに加え、抽出物をさらに固相抽出カラム等を用いて精製する際にも、カラムの洗浄・溶出条件を最適条件にしなければ、PAFの精製が不十分となると推察される。例えば、J. Chromatogr.433,243-247,1988に記載されたYamada K.らの方法では、血液にメタノールを加えて混和し、遠心分離後の上澄液にクロロホルムを加えて下層を分取する、リン脂質の抽出法として従来より専ら用いられているBligh & Dyer法(Can.J.Biochem.37,911-917,1959)を使用している。ついで、順相系固相抽出カラムを用いてクロロホルム／メタノール／水系の洗浄液と溶出液によりPAFを精製している。しかしながら、本発明者らの研究によると、この方法ではPAF以外の生体成分を多く抽出していることや、PAFと類縁体との分離精製が不十分なため、血中PAF濃度が10〜30pg/mLと算出され、実存の値よりも高く測定されることが判明した。
【００１６】
そこで、まずPAFを生体試料から効率的に抽出するための溶媒系、および抽出物をさらに精製してPAF類縁体をできるだけ除去するための精製方法を鋭意検討した。
次に、本発明者らの研究によれば、生体試料から抽出および精製したPAFをGC-MS法で測定する場合、フォスフォリパーゼＣで加水分解する際の反応条件が、PAF測定の精度に大きな影響を及ぼすことが判明した。従来法は反応pHを中性または弱アルカリ性領域に設定する場合がほとんどであった。しかし、反応液のpHを中性または弱アルカリ性にすると、PAFを加水分解する過程で異性体が生成してグリセロール体の収率が低下するのみならず、PAF以外の生体成分の異性体も生成するために、さらに余分な夾雑ピークが多数出現し、PAFの分析を一層困難にすることが明らかになった。
【００１７】
さらに、フォスフォリパーゼＣ処理によりPAF類縁体（C3位のホスホコリンがホスホエタノールアミン、ホスホモノエチルエタノールアミンまたはホスホジメチルエタノールアミンに置換したリン脂質など）からもPAFから得られるものと同一のグリセロール体が生成するために、PAF濃度を過大評価するなどの測定精度に重大な影響を及ぼすことが判明した。
本発明は上記の知見に基づいて完成したもので、下記の工程からなる：
(1) PAFを測定すべき試料（例えば、PAF類縁体も含むと思われる試料、特に生体試料）を、Bligh & Dyer法とは全く異なるテトラヒドロフランなどの水溶性有機溶媒と混和し、遠心分離等で分離する；
(2) 分離後の上澄液に酢酸エチルなどの水不溶性有機溶媒を加えて、遠心分離等で分離することで、PAFを高い回収率で上澄液中に抽出する；
(3) 上記抽出物からPAFを精製するため、該抽出物をシリカゲル等の固相抽出カラム（好ましくは順相固相抽出カラム）に負荷し、ヘキサン／２−プロパノール／水の混液で洗浄および溶出して、PAFを精製し、PAF類縁体から分離する；
(4) 精製されたPAFを、GC-MS法で測定する場合は、好ましくはLysoPCが加水分解されない条件下で、フォスフォリパーゼＣにて加水分解する；
(5) 加水分解されたPAFを、未分解物（例えば未分解のLysoPC）から分離する；
(6) 加水分解により生成したグルセロール体をペンタフルオロベンゾイル誘導体とし、その量をGC-MS 法により定量する。
【００１８】
(7) 必要であれば、既知濃度のPAFを(1)〜(6)の工程に付して得られた検量線と比較して、試料中のPAF量を決定する。
(8) (1)〜(3)の工程で精製されたPAFを、そのままLC-MS法で分析する。
本発明の測定方法の対象となる試料には、体液（血液、血清・血漿、唾液、尿、胆汁、膵液など）および組織などの生体試料などがあげられる。これら試料のなかで、血液は採取し易く、疾病の診断の際に有用であるため、本発明の実施の形態について血液を用いた例を中心に説明する。
【００１９】
(1) 水溶性有機溶媒によるPAFの抽出
本発明では、血液からPAFを高い回収率で抽出するために、水溶性有機溶媒および水不溶性有機溶媒を組み合わせて使用する。
【００２０】
水溶性溶媒としては、血液中のPAF分解酵素を速やかに不活性化し、さらに試料を遠心分離した上澄液中にPAFがほぼ完全に回収されることから、テトラヒドロフランが最適である。使用するテトラヒドロフランは、過酸化物を除去したものが好ましい。その他、水溶性有機溶媒としてアセトニトリル、2−プロパノール、ジオキサン、アセトンおよびエタノールなども使用可能である。試料と水溶性有機溶媒は、約1：1〜1：10の用量比で混合し、室温で約30秒間攪拌した後、遠心分離（例えば3000回転、15分、4℃）して上澄液を採取する。
【００２１】
(2) 水不溶性有機溶媒によるPAFの抽出
上記の水溶性有機溶媒による抽出液（遠心分離後の上澄液）中には、PAFの他に水溶性の血液成分が含まれるため、水不溶性の有機溶媒を加えることにより水溶性の血液成分を除去する。使用可能な有機溶媒は、ヘキサン、シクロヘキサン、キシレン、トルエン、ベンゼン、ジエチルエーテル、酢酸エチルなどである。この水不溶性有機溶媒を上記のテトラヒドロフラン抽出液を加えて攪拌して遠心分離すると、上澄液中にPAFがほぼ完全に回収され、水溶性血液成分は下層に移行し、PAFと水溶性血液成分が分離できる。水溶性有機溶媒による抽出液と水不溶性有機溶媒は、約1：0.5〜1：10の用量比で混合し、室温で約30秒間攪拌した後、遠心分離（例えば3000回転、15分、4℃）してPAF抽出液を得る。
【００２２】
本発明の水溶性有機溶媒および水不溶性有機溶媒の組み合わせにおいて、水溶性有機溶媒としてテトラヒドロフランを用いると、Yamada K.らの方法（J. Chromatogr.433,243−247,1988）で用いられている、メタノールとクロロホルムと水との組合せであるBligh & Dyer法の溶媒に比べて、試料からのPAFの抽出率が格段に向上する。
【００２３】
(3) PAFの精製
次に、本抽出液中のPAFを固相抽出カラムにて精製する。使用するカラムは、好ましくは順相系のシリカゲルカラムであり、例えば、市販品として、Bond Elut SITMが使用できる。本発明者らは、カラムの洗浄溶媒および溶出溶媒を調べた結果、カラムの洗浄溶媒および溶出溶媒として、ヘキサン／２−プロパノール／水の混液で洗浄および溶出するのが、PAFを選択的に精製するのに効果的であることを見出した。ヘキサン／２−プロパノール／水の好ましい比率は、洗浄工程で1／0.5〜1／0.05〜0.2、溶出工程では1／2〜20／0.2〜2である。
【００２４】
この溶媒系の選択は、Yamada K.らの方法（J. Chromatogr.433,243−247,1988）で用いられている、クロロホルム／メタノール／水系の洗浄液と溶出液とによってPAFを精製する場合に比べると、PAF類縁体をはるかに良好に分離できる。それのみならず、前記(2) からの水不溶性有機溶媒の上澄液を直接固相抽出カラムに負荷できるので、操作性が格段に向上する。
【００２５】
ここで、精製されたPAFは、生物活性測定法、免疫学的測定法およびLC-MS法を含む物理化学的測定法のいずれを用いる測定にも適用できる。感度と特異性に優れているGC-MS 法での測定のためには、さらに下記の処理が必要である。
【００２６】
(4) PAFのフォスフォリパーゼＣによる加水分解反応
前記(3) で精製されたPAFは、フォスフォリパーゼＣにて処理するが、その目的は、PAFのC3位のホスホコリンを加水分解し、GC-MSに適した揮発性の誘導体にするためである。
【００２７】
従来から本操作中に図4-B,C,DにみられるようなPAFのC2位のアセチル基とC3位のペンタフルオロベンゾイル基の間で転位反応が起き、異性体が生じることが知られている。このような異性体の生成は本来単一ピークとして出現するPAFのピーク強度を下げ、検出感度を低下させる原因となることに加えて、生体成分由来の夾雑ピークが増える原因となるため、この転位反応を抑制することが必要である。この転位反応が起きる工程としては、フォスフォリパーゼＣでPAFを加水分解して生成したグリセロール体をペンタフルオロベンゾイル化する工程で起きるとするHaroldsen P.E.らの報告（J.Lipid Res.32,723-729,1991）と、順相シリカゲルクロマトグラフィーで精製する工程で起きるとするChristman B.W.らの報告（Biomed. Environ. Mass Spectrom.18,258-264,1989）がある。しかしながら、本発明者らは、転位反応が起きる原因を鋭意検討した結果、これらとは異なる工程で異性化が生じることを見出し、この転位反応を抑制することに成功した。
【００２８】
すなわち、本発明の方法は、フォスフォリパーゼＣによるPAFの処理を行うに際し、反応液のpHを弱酸性に設定することである。この条件は、上記の不都合な転位反応を抑えるため、必須の要件として本発明者らにより初めて見出されたものである。好ましい弱酸性のpHは、約4〜7、特に好ましくは約6である。フォスフォリパーゼＣによる処理は、例えば0.2単位以上、25〜40℃、15分〜24時間の条件で行うことができる。
【００２９】
上記(3) の工程で得られる精製された試料は、生体成分の混入が少ないため、従来法と比べて少量のフォスフォリパーゼＣでPAFを加水分解できる。
(5) リゾホスファチジルコリン(LysoPC)の除去
なお、上記(4) で定めたフォスフォリパーゼＣによるPAF の処理条件は次のような技術的意義も有する。すなわち、前記(3) で得られた精製されたPAF中には、十分除去されずになお残存するLysoPCが含まれている可能性がある。これを除去するために、フォスフォリパーゼＣに対するPAFとLysoPCの反応性の差に着目し、PAFは加水分解されるのに対してLysoPCは加水分解されない反応条件を設定したのである。すなわち、従来法では反応液にエーテル(Ramesha C.M.ら, Biomed. Envilon. Mass Spectrom.13,107-111,1986)を加えてPAFを加水分解するために、LysoPCも加水分解されてガスクロマトグラフ上に夾雑ピークが多数出現するなどの問題があった。本発明の特徴の一つとして、PAF の加水分解のためにこれまでに報告されているエーテルなどの水不溶性溶媒を使用しないことが挙げられる。
【００３０】
さらに、本反応液からグリセロール体とLysoPCを分離するのに、逆相系固相抽出カラムを用いてアセトニトリル／水の混液で洗浄・溶出する方法を確立した。逆相系固相抽出カラムは市販の製品、例えばBond Elut C18TMが使用できる。洗浄溶媒としてアセトニトリル／水の望ましい比率は10／90〜90／10であり、溶出溶媒として、メタノール、エタノール、アセトニトリル、２−プロパノール、テトラヒドロフランが使用できる。
【００３１】
(6) GC-MS法による定量
PAFの誘導体化
上記のPAF加水分解体をペンタフルオロベンゾイル誘導体化した後、順相系固相抽出カラムにて精製し、GC-MSにて分析する。GC-MS用の誘導体化試薬は数多く市販されており、使用に制限はないが、感度の点でペンタフルオロベンゾイル誘導体化試薬が望ましい。また、順相系固相抽出カラムは市販の製品が使用できる。
ガスクロマトグラフ法によるPAFの分析
上記の方法で調製した試料中には、血液成分の混入も少なくかつPAFの収率も高いため、安価で小型の四重極型質量分析計を用いて検出感度の高い負イオン／化学イオン化／電子捕獲型／選択イオン検出法でPAFを検出することが可能である。さらに、PAFの内部標準物質により作成した検量線を用いれば、測定の精度が格段に向上する。特に、内部標準物質として、例えばPAFの安定同位体([2H4]PAF)を使用することが望ましい。
【００３２】
GC-MSの装置、ガスクロマトグラフ条件および質量分析計条件の非限定的な例を以下に示す。
装置
ガスクロマトグラフ:TraceGC（サーモクエスト株式会社）
質量分析計:TraceMS（サーモクエスト株式会社）
ガスクロマトグラフ条件
カラム:HP-lMS(30mXO.25mm, 膜厚0.25μm、ヒューレットパッカード社)
昇温条件:150℃(2分)→50℃/分→260℃(13分)→50℃/分→310℃(5分)
注入口温度:300℃
ヘリウムガス流速:1.2ml/分
注入量:2μ1(スプリットレス)
注入サイクル時間:22分
質量分析計条件
イオン化方法: 負イオン／化学イオン化／電子捕獲型
測定法：選択イオン検出法
反応ガス: メタン
モニタリングイオン:PAF;m/z552,[2H4]PAF;m/z556
マルチプライアー電圧:500V
トランスファーライン温度:300℃
イオン化室温度:130℃
本発明者らはさらに、本発明の方法の妥当性、特に検出の特異性を検証するために、試料中のPAFを上記の方法で抽出および精製した後、遺伝子組換ヒトPAFアセチルヒドロラーゼ (recombinant human platelet-activating factor acetylhydrolase, 以下、rhPAF-AHと記す) で処理し、測定されたPAFが試料中のPAFに由来するか否かを確認した。本発明の方法でヒトの内因性血中PAF濃度を測定した結果、約1pg/mLの濃度が検出され、GC-MS法で測定した唯一の報告であるYamada K.ら（J. Chromatogr.433,243−247,1988）の値10〜30pg/mLと大きく相違し、PAFの内因性濃度は極めて低いことが明らかになった。このように、本発明により、上記の抽出、精製および誘導体化の一連の操作を行うことで、特異性に優れた高感度なPAF濃度測定が初めて可能になったのである。
【００３３】
(6') LC-MS法による定量
前記の工程(3)により精製した生体試料中のPAFは、それ以上の前処理を行うことなくLC-MSにより、定量することが可能である。
【００３４】
LC-MSの装置、液体クロマトグラフ条件および質量分析計条件の非限定的な例を以下に示す。
装置
液体クロマトグラフ：HP1100 SERIES (Hewlett Packard)
質量分析計：API3000 (Applied Biosystems)
液体クロマトグラフ条件
カラム：Inertsil SIL150-5 (2.1×250mm, GLサイエンス)
移動相：クロロホルム／メタノール／10mM酢酸アンモニウム＝70／40／5
流速：0.2mL/min
注入量：20μL
質量分析計条件
イオン化方法：エレクトロスプレーイオン化法
測定法：選択反応検出法  Selected reaction monitoring (SRM)
モニタリングイオン：先駆負イオン→生成負イオンPAF; m/z580→m/z59,
[2H4]PAF; m/z512→m/z59
イオンスプレー電圧：-4500V
オリフィス電圧：-91V
コリジョンエネルギー：-60eV
【実施例】
【００３５】
次に実施例に基づき本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例で用いたPAFおよび標識化合物は以下のとおりである。
PAF:1-O-Hexadecyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholine
[3H]-PAF: 1-O-Hexadecyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholine, [1-O-hexadecyl-1',2'-3H(N)]
[14C]-ホスファチジルコリン(PC): Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl, [dipalmitoyl-1-14C]
[14C]-リゾホスファチジルコリン(LysoPC): Lysopalmitoyl phoshatidyl choline, L-1-[Palmitoyl-1-14C]
実施例１  PAFの全操作過程での回収率
ヒト血液を用いて全操作過程におけるPAF、PCおよびLysoPCの回収率を測定した結果を表１に示す。4mL のテトラヒドロフランを含むチューブに1mLのヒト血液を加えた後に、[3H]PAF、[14C]-PCおよび[14C]-LysoPCを加えて撹拌し、遠心分離(3000mm ×15分、4 ℃)した。得られた上澄液に4mLの酢酸エチルを加えて撹拌し遠心分離した。得られた上澄液をBond Elut SITMに負荷し、8mLのヘキサン／２−プロパノール／水=70/40/5で洗浄した後、3mLのヘキサン／２−プロパノール／水=30/60/16で溶出した。溶出画分を60℃で窒素気流下蒸去し、0.9mLの0.1mM Bis-Tris緩衝液(pH6.0、10mM CaC12、0.1% Triton X-100)で溶解し、0.1mLのフォスフォリパーゼＣ溶液(10U/mL)を加え、37℃で1時間反応した。反応液をBond Elut 18TMカラムに負荷し、8mLのアセトニトリル／精製水=60/40でカラムを洗浄後、1mL のアセトニトリルで溶出した。本試料を窒素気流下で乾固し、0.1mLのペンタフルオロ安息香酸無水物溶液(2mg/mL のn-ヘキサン溶液)および0.9mLの1.1%ピリジンを含むn-ヘキサン溶液を加え、室温で1時間反応した。反応液をBond Elut SITMカラムに負荷し、8mLのn-ヘキサン／ベンゼン=60/40で洗浄後、ベンゼン3mL で溶出した。本溶出液を窒素気流下で乾固し、酢酸エチル20μLで再溶解した。
【００３６】
【表１】
2004527770.tif 000003
【００３７】
全操作過程におけるPAFの回収率は45% であった。表1に示すように、PCはBond Elut SITMの精製過程で完全に除去され、さらにLysoPCもBond Elut C18TMの精製過程で完全に除去された。
実施例２  PAFの抽出溶媒の選択
4mL の各種溶媒を含むチューブに1mLのヒト血液を添加し、さらに[3H]-PAFを加えて撹拌した。本試料を遠心分離(3000rpm×15分、4℃)し、上澄液中の放射能(3H-PAF)を測定した結果を表２に示す。
【００３８】
上澄液中への[3H]-PAFの回収率はテトラヒドロフラン、ついでジオキサン、アセトニトリルおよび2-プロパノールが高く、なかでもテトラヒドロフランが最も高かった。
【００３９】
【表２】
2004527770.tif 000004
【００４０】
実施例３  PAFピークの特異性の検討
ガスクロマトグラフ上のPAFピークの単一性を、rhPAF-AHを用いて検証した結果を図１に示す。実施例１に示した方法で1mL のヒト血液からテトラヒドロフランおよび酢酸エチルを用いてPAFを抽出した後、Bond Elut SITMにて精製した。本試料を40μgのrhPAF-AHを含む0.5mLの緩衝液に溶解し、37℃で1時間反応した。以下、実施例１に示した方法に従って処理し、ペンタフルオロベンゾイル誘導体化し、GC-MSにて分析した。
【００４１】
rhPAF-AHで処理しない試料では図1-Aに示すように、PAFおよび内部標準物質([2H4]PAF)のピークがそれぞれ保持時間13.76分および13.70分に検出された。一方、rhPAF-AHで処理した試料では図1-Bに示すように、これらのピークが消失した。これらの結果から、本方法で検出されるピークは血中のPAFに由来し、PAF以外の生体成分が混入しないことが示された。
実施例４  メタノールおよびクロロホルムを用いる抽出法と本発明方法との比較
クロロホルム／メタノール／水系の溶媒によりPAFを抽出する従来法(Bligh & Dyer法)と本発明方法を比較した結果を図２に示す。抽出工程以外は、実施例１と同様であり、従来法の抽出方法は以下のとおりである。メタノール4mLを含むチューブにヒト血液1mL を加えて撹拌し、遠心分離(3000mm×15分、4℃)した。得られた上澄液に4mLのクロロホルムおよびlmLの蒸留水を加えて撹拌し遠心分離した。得られた下層を実施例１に示した方法に従い、Bond Elute SITMを用いて精製し、フォスフォリパーゼＣによる加水分解後、ペンタフルオロベンゾイル誘導体化し、GC-MSにて分析した。
【００４２】
本発明方法で測定したときのPAFのヒト血中内因性レベルは図2-Aに示すように2.lpg/mLであった。一方、上記と同一のヒト血液をクロロホルム／メタノール／水系の溶媒で抽出した試料では、PAFの血中内因性レベルは図2-Bに示すように29.6pg/mLと算出され、クロロホルム／メタノール／水系の溶媒を用いる従来法(Bligh & Dyer法)ではPAFとPAF類縁体の分離ができないことを明確に検証することができた。
実施例５  順相系固相カラムによる精製工程の従来法と本発明方法との比較
順相系固相カラムでの精製工程について、本発明方法とWeintraub S.T.ら(J.Am.Soc.Mass Spectrom.11,176-181,2000)に記載されている方法を比較した。Weintraub S.T.らは、培養細胞中のPAF濃度を測定したことを記載しているが、その方法は培養細胞からPAFをメタノールおよびクロロホルムを用いて抽出し、その試料を順相系固相カラムに負荷した後、ｎ−ヘキサン／２−プロパノール／水=46.75/46.75/6.5で洗浄し、クロロホルム／メタノール／水=1/2/0.8で溶出している。
【００４３】
この文献に記載されている順相系固相カラムでの精製工程と本発明とを比較するために、試料としては実施例４と同一のヒト血液を用い、順相系固相カラムでの精製工程に用いる洗浄液と溶出液以外は、全て実施例１と同じ方法で測定した。順相系固相カラムでの精製工程に用いる洗浄液は、ｎ−ヘキサン／２−プロパノール／水=46.75/46.75/6.5を用い、溶出液はクロロホルム／メタノール／水=1／2／0.8を用いた。
【００４４】
図3に示すように、Weintraub S.T.らの方法では、PAFのヒト血中内因性レベルが10.9pg/mL と算出された。この結果は、実施例4図2Aに示した2.1pg/mLおよび実施例7に記載したヒト内因性PAF濃度の平均濃度1.1pg/mL（n=21）と比較して遥かに高いことから、Weintraub S.T.らの方法での順相系固相カラムの洗浄および溶出条件ではPAFとPAF類縁体が分離されないことが明示された。
実施例６  PAF異性体の生成抑制
フォスフォリパーゼＣにてPAFを加水分解する際、PAF異性体の生成を抑制する反応条件を検討した結果を図４に示す。PAFをpH6.0、7.0、7.5および8.0の緩衝液(100mM Bis-Trisまたは100mM HEPES、10mM CaC12および0.1% Triton X-100を含有)にて溶解し、実施例１に示した方法でフォスフォリパーゼＣ加水分解およびペンタフルオロベンゾイル誘導体化し、GC-MSにて分析した。
【００４５】
図4-Aに示すようにPAF異性体はpH6.0の反応液で殆ど生成せず、pHの上昇に伴い増加した。また、PAFのピーク面積はpH6.0で最も大きく、pHの上昇に伴い低下した。このように、従来から用いられてきたフォスフォリパーゼＣ加水分解液のpH（7.5〜8.0）では、異性体が生成し、ピーク強度が低下することが示された。一方、本発明の方法では、反応液のpHを弱酸性に設定することにより転位反応を抑えることができたのである。
実施例７  検量線の作成
ヒト血液にPAFおよび内部標準物質([2H4]PAF)を0〜181pg/mLおよび10pg/mLの濃度になるように添加し、実施例１に示した方法で各濃度の試料を3重測定した。
【００４６】
図５-Aに示すように、検量線の相関係数は0.9992であり、0〜181pg/mLの範囲で良好な直線性を示した。また、各濃度での測定の変動係数（coefficient of variation, CV）は3.7%〜11.4％と小さかった。このときに測定したヒトの内因性血中PAF濃度と標準偏差は1.1±1.0pg/mL（n=21）であった。
【００４７】
ヒト血液にPAFの0〜20.2 pg/mLを添加して検量線を作成した。図5-Bに示すように、このときの回帰式はY=1.114×PAF添加濃度+0.7711で示されたので、添加濃度を0としたときの内因性血中PAF濃度を推定すると、0.77 pg/mLと算出され、上記の内因性血中PAF濃度である1.1 pg/mLとほぼ一致した。このことからも、本発明者らの測定値の正当性が立証された。
実施例８液体クロマトグラフ質量分析法への応用
実施例１に示したPAFの抽出および精製方法を、PAFを誘導体化しないで直接分析できる液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）法に応用した。1mLのヒト血液を4mLのテトラヒドロフランを含むチューブに加えた。本試料に内部標準物質（[2H4]PAF）を50pg/mLの血液中濃度になるように添加し、撹拌後、遠心分離(3000mm ×15分、4 ℃)した。得られた上清に4mLの酢酸エチルを加えて撹拌し遠心分離した。得られた上清をBond Elut SITMに負荷し、8mLのヘキサン／２−プロパノール／水=70/40/5で洗浄した後、3mLのヘキサン／２−プロパノール／水=30/60/16で溶出した。溶出画分を60℃で窒素気流下蒸去し、50μLのHPLC移動相（クロロホルム／メタノール／10mM酢酸アンモニウム=70/40/5）で溶解した。本試料20μLを下記のLC-MSシステムに注入した。HPLCはHP1100 SERIES（Hewlett Packard）を使用し、カラムにInertsil SIL 150-5（2.1X250 mm, GL サイエンス）を、移動相にクロロホルム／メタノール／10mM酢酸アンモニウム=70/40/5を用い、流速を0.2 mL/minとした。質量分析計はAPI 3000（Applied Biosystems）を用い、ターボイオンスプレー法によってイオン化した。選択反応検出Selected reaction monitoring（SRM）により、PAFの先駆負イオンおよび生成イオンはm/z 508と59を、[2H4]PAFはm/z 512と59を用いて測定した。
【００４８】
図6-Aに示すように、血液に50 pg/mLの[2H4]PAFを添加した試料では、[2H4]PAFのピークが保持時間21.5分に検出され、この保持時間に血液由来の夾雑物のピークはみられなかった。一方、図6-Bに示すように、血液に100 pg/mLのPAFおよび50 pg/mLの[2H4]PAFを添加した試料では、PAFおよび[2H4]PAFのピークが検出された。これらのことから、本発明の抽出および精製方法を用いれば、LC-MS法でも血液中のPAFを測定できることが示された。
[発明の効果]
【００４９】
本発明の方法により、生体試料中のPAF濃度を特異的にかつ正確に測定できることが示された。生体試料中にはPAFと構造が類縁したリン脂質が大量に存在することに加えて、PAFの生体中濃度が極めて低いために、PAF測定が困難であることが従来から指摘されていた。本発明者らはPAFを生体試料から選択的に抽出ならびに精製する方法を見出し、再現性および信頼性に優れた高感度なPAFの定量方法を確立し、本発明を完成するに至った。本発明により生体試料中のPAFを定量し、各種病態におけるPAFの役割を明らかにすることができる。また、PAFの変動にともなう各種疾患の診断を容易に行うことができると同時に、その疾病の治療効果の評価に貢献することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１Ａ】実施例３における、ヒト血液サンプルをrhPAF-AHで処理して得られたPAFピークの均一性を示すガスクロマトグラフィー−選択イオンモニタリング(GC-SIM)の記録である。
【図１Ｂ】実施例３における、ヒト血液サンプルをrhPAF-AHで処理して得られたPAFピークの均一性を示すガスクロマトグラフィー−選択イオンモニタリング(GC-SIM)の記録である。
【図２Ａ】実施例４における、本発明とBligh & Dyer法(メタノール／クロロホルム／水)を用いた抽出法の比較を示すGC-SIMの記録である。
【図２Ｂ】実施例４における、本発明とBligh & Dyer法(メタノール／クロロホルム／水)を用いた抽出法の比較を示すGC-SIMの記録である。
【図３】実施例５における、順相系固相カラムでの精製工程をWeintraub, S.T.らの方法と比較したGC-SIMの記録である。
【図４Ａ】実施例６における、フォスフォリパーゼＣによってPAFを加水分解する際の、インキュベート溶媒のpHに依存的な異性体の生成を示すGC-SIMの記録である。
【図４Ｂ】実施例６における、フォスフォリパーゼＣによってPAFを加水分解する際の、インキュベート溶媒のpHに依存的な異性体の生成を示すGC-SIMの記録である。
【図４Ｃ】実施例６における、フォスフォリパーゼＣによってPAFを加水分解する際の、インキュベート溶媒のpHに依存的な異性体の生成を示すGC-SIMの記録である。
【図４Ｄ】実施例６における、フォスフォリパーゼＣによってPAFを加水分解する際の、インキュベート溶媒のpHに依存的な異性体の生成を示すGC-SIMの記録である。
【図５】実施例７における、ヒト血液中のPAF濃度0〜181pg/mLの検量線およびヒト内因性血中PAFを濃度0〜20.2pg/mLの範囲で推定した検量線である。
【図６Ａ】実施例8における、ヒト血液中のPAFを測定する液体クロマトグラフ−選択反応検出の記録である。
【図６Ｂ】実施例8における、ヒト血液中のPAFを測定する液体クロマトグラフ−選択反応検出の記録である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004527770.tif 000064
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