(57)【要約】血管内皮細胞増殖因子（本明細書中ではＶＥＧＦ−Ｘと呼ぶ）およびＶＥＧＦ−Ｘの配列中に存在するＣＵＢドメインの新規使用を提供し、これらは平滑筋細胞増殖を強化し、そして減少した平滑筋細胞増殖に伴う疾患を処置するために使用することができる。ＶＥＧＦ−ＸおよびＣＵＢドメインは組織機能または構造を回復するために、特別な組織中で平滑筋細胞数を増すための組織工学的応用にも使用することができる。ＶＥＧＦ−Ｘの生物学的活性のインヒビターを同定するスクリーニング法も開示し、そしてこれらのインヒビターには中和化ＶＥＧＦ−Ｘ抗体、アンチセンスＶＥＧＦ−Ｘ配列またはＶＥＧＦ−Ｘの生物学的活性と拮抗する非タンパク質アンタゴニストを含む。また平滑筋細胞過増殖に関係する障害を処置するための治療法、および平滑筋細胞過増殖に関係する病理学的状態または罹患率を診断する方法も提供する。
2004527506.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織および器官中の平滑筋細胞の増殖を刺激するための薬剤の製造における、図１（ａ）に従うアミノ酸配列を含んでなるＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドまたはその機能的均等物、誘導体もしくは生物前駆体をコードする核酸分子、該核酸分子を含んでなる発現ベクター、図１（ａ）に従うアミノ酸配列を含んでなるＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドまたはその機能的均等物、誘導体もしくは生物前駆体、あるいは該核酸分子、ベクターまたは該ＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドのいずれかを含んでなる製薬学的組成物の使用。
【請求項２】
尿道機能不全、膀胱機能不全、括約筋機能不全、またはＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドの異型の内因的活性に伴う機能不全を処置または防止するための、あるいは骨盤床の再構成のための薬剤の製造における、図１（ａ）に従うアミノ酸配列を含んでなるＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドまたはその機能的均等物、誘導体もしくは生物前駆体をコードする核酸分子のいずれか、該核酸を含んでなる発現ベクター、あるいは図１（ａ）に従うアミノ酸配列を含んでなるＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドまたはその機能的均等物、誘導体もしくは生物前駆体、あるいは該核酸分子ベクターまたはＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドのいずれかを含んでなる製薬学的組成物の使用。
【請求項３】
組織および／または器官中の平滑筋細胞の増殖を刺激するための薬剤の製造における、図１（ａ）に従うアミノ酸配列を含んでなるＶＥＧＦ−ＸポリペプチドのＣＵＢドメインまたはその機能的均等物もしくは誘導体、あるいは該ＣＵＢドメインまたはその機能的均等物、誘導体もしくは生物前駆体をコードする核酸分子、該核酸分子を含んでなる発現ベクターの使用。
【請求項４】
上記ＣＵＢドメインが図１（ａ）に表すアミノ酸配列の40から150位のポリペプチドを含んでなる請求項３に記載の使用。
【請求項５】
尿道機能不全、膀胱機能不全、括約筋機能不全、またはＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドの異型の内因的活性に伴う機能不全を処置または防止するための、あるいは骨盤床の再構成のための薬剤の製造における、図１（ａ）に従うＶＥＧＦ−ＸポリペプチドのＣＵＢドメイン、または該ＣＵＢドメインまたはその機能的均等物もしくは誘導体をコードする核酸分子、該核酸分子を含んでなる発現ベクター、該核酸分子もしくは該ＣＵＢドメインを含んでなる製薬学的組成物の使用。
【請求項６】
個体において組織または器官の平滑筋細胞の増殖を刺激するか、または組織修復を刺激する方法であって、該個体にある量の図１（ａ）に従うアミノ酸配列を含んでなるＶＥＧＦ−ＸポリペプチドをコードするＶＥＧＦ−Ｘ核酸分子、または図１（ａ）のＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドまたはその機能的均等物、誘導体もしくは生物前駆体を、平滑筋細胞の増殖を刺激するために十分な濃度で投与することを含んで成る上記方法。
【請求項７】
尿道機能不全、膀胱機能不全、骨盤床再構成、括約筋機能不全、またはＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドの異型の内因的活性に伴う機能不全を処置または防止するための方法であって、個体に図１（ａ）に従うアミノ酸配列を含んでなるＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドまたはその機能的均等物、誘導体もしくは生物前駆体、該ポリペプチドまたはその機能的均等物、誘導体もしくは生物前駆体をコードする核酸分子、該核酸分子を含んでなる発現ベクター、および任意の該核酸分子または該ポリペプチドを含んでなる製薬学的組成物から選択されるある量の群を投与することを含んでなる上記方法。
【請求項８】
治療に有効な量の図１（ａ）に従うアミノ酸配列を含んでなるＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドまたはその機能的均等物、誘導体もしくは生物前駆体、該ポリペプチドを製薬学的に許容されうる担体、希釈剤または補形剤と一緒に含んでなる製薬学的組成物を適用することによる、尿道機能不全、膀胱機能不全を処置するため、または骨盤床再構成のため、括約筋機能不全またはＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドの異型の内因的活性に伴う機能不全を処置するための方法。
【請求項９】
個体における組織または器官および組織修復中の平滑筋細胞の増殖を刺激する方法であって、該個体にある量の図１（ａ）に表すヌクレオチド配列の40から150位の配列を含んでなるＶＥＧＦ−ＸポリペプチドのＣＵＢドメインまたはその機能的均等物もしくは誘導体を、平滑筋細胞の増殖を刺激するために十分な濃度で投与することを含んでなる上記方法。
【請求項１０】
尿道機能不全、膀胱機能不全、骨盤床再構成、括約筋機能不全、またはＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドの異型の内因的活性に伴う機能不全を処置または防止するための方法であって、該個体に図１（ａ）に表すアミノ酸配列の40から150位の配列を含んでなるＣＵＢドメインまたはその機能的均等物もしくは誘導体をコードする核酸分子、該核酸分子を含んでなる発現ベクター、ならびに該核酸分子および該ＣＵＢドメインのいずれかを含んでなる製薬学的組成物から選択されるある量の群を投与することを含んでなる上記方法。
【請求項１１】
尿道機能不全、膀胱機能不全を処置するため、または骨盤床再構成のため、括約筋機能不全またはＣＵＢドメインポリペプチドの異型の内因的活性に伴う機能不全を処置するための方法であって、治療に有効な量の図１（ａ）に表すアミノ酸配列の40から150位のポリペプチドを含んでなるＣＵＢドメインまたはその機能的均等物もしくは誘導体、該ＣＵＢドメインおよびそれらの製薬学的に許容され得る担体、希釈剤または補形剤を含んでなる製薬学的組成物を適用することを含んでなる上記方法。
【請求項１２】
アテローム硬化症、動脈吻合またはバルーンカテーテルにより生じる新生内膜過形成、経皮的経管的冠動脈形成術後の動脈のステント留置により生じる動脈形成術後の再狭窄を処置または防止するための薬剤の製造における、図１（ａ）に従うアミノ酸配列を含んでなるＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドまたはそれらのエピトープに結合することができる抗体の使用。
【請求項１３】
アテローム硬化症、動脈吻合またはバルーンカテーテルにより生じる新生内膜過形成、経皮的経管的冠動脈形成術後の動脈のステント留置により生じる動脈形成術後の再狭窄を処置または防止する方法であって、該個体に図１（ａ）に従うＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドをコードする核酸分子またはその相補体に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができるある量のアンチセンスポリヌクレオチド分子を、該障害を処置または防止するために十分な濃度で投与することを含んでなる上記方法。
【請求項１４】
アテローム硬化症、動脈吻合またはバルーンカテーテルにより生じる新生内膜過形成、経皮的経管的冠動脈形成術後の動脈のステント留置により生じる動脈形成術後の再狭窄を処置または防止する方法であって、該個体に図１（ａ）に従うＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドのある量のアンタゴニストを、該障害を処置または防止するために十分な濃度で投与することを含んでなる上記方法。
【請求項１５】
アテローム硬化症、動脈吻合またはバルーンカテーテルにより生じる新生内膜過形成、経皮的経管的冠動脈形成術後の動脈のステント留置により生じる動脈形成術後の再狭窄を処置または防止する方法であって、該個体に図１（ａ）に従うＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドまたはそれらのエピトープに結合することができるある量の抗体を、該障害を処置または防止するために十分な濃度で投与することを含んでなる上記方法。
【請求項１６】
個体の病理学的状態または病理学的状態に対する罹病性を診断する方法であって：
（ａ）生物学的サンプル中の図１（ａ）に従うＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドまたはその受容体中における突然変異の存在または不存在を決定し：そして
（ｂ）ＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドまたはその受容体の発現の程度に基づき、病理学的状態または病理学的状態に対する罹病性を診断する、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項１７】
平滑筋細胞の増殖を抑制または強化する化合物を同定する方法であって、ＶＥＧＦ−Ｘ受容体を発現している細胞を図１（ａ）に従うＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドの存在下で該化合物と接触させ、そして該化合物とは接触させられなかった細胞と比べた時、該化合物が該細胞に及ぼす効果をモニタリングすることを含んでなる上記方法。
【請求項１８】
図１（ａ）に従うＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドのアンタゴニスト、または該ポリペプチドをコードする核酸分子に対するアンチセンス分子、または該ＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドもしくはそのエピトープに結合することができる中和抗体の直接的送達法であって、該アンタゴニスト、アンチセンス分子または抗体を伸張傷害（stretchinjury）後の新生内膜過形成を制限するために塞栓切除カテーテルのバルーンチップを介して投与することを含んでなる上記方法。
【請求項１９】
組織および器官における平滑筋細胞の増殖を刺激するための薬剤の製造における、ＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドまたはその機能的均等物、誘導体もしくは生物前駆体をコードする核酸分子、該核酸を含んでなる発現ベクター、ＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドまたはそれらの機能的均等物、誘導体もしくは生物前駆体、あるいは該核酸分子または該ＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドのいずれかを含んでなる製薬学的組成物の使用。
【請求項２０】
尿道、膀胱または括約筋の機能不全、あるいはＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドの異型の内因的活性に伴う機能不全を処置または防止するための、あるいは骨盤床の再構成のための薬剤の製造における、ＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドまたはその機能的均等物、誘導体もしくは生物前駆体をコードする核酸分子、該核酸を含んでなる発現ベクター、ＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドまたはその機能的均等物、誘導体もしくは生物前駆体、あるいは該核酸分子または該ＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドのいずれかを含んでなる製薬学的組成物の使用。
【請求項２１】
組織および／または器官における平滑筋細胞の増殖を刺激するための薬剤の製造における、ＶＥＧＦ−ＸポリペプチドのＣＵＢドメイン、または該ＣＵＢドメインまたはその機能的均等物もしくは誘導体をコードする核酸分子、該核酸分子を含んでなる発現ベクター、該ＣＵＢドメイン、核酸分子もしくは発現ベクターのいずれかを含んでなる製薬学的組成物の使用。
【請求項２２】
上記ＣＵＢドメインが図１（ａ）に表すアミノ酸配列の40から150位のポリペプチドを含んでなる請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
尿道、膀胱または括約筋の機能不全、あるいはＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドの異型の内因的活性に伴う機能不全を処置または防止するための、あるいは骨盤床の再構成のための薬剤の製造における、ＶＥＧＦ−ＸポリペプチドのＣＵＢドメイン、または該ＣＵＢドメインもしくはその機能的均等物もしくは誘導体をコードする核酸分子、該核酸分子を含んでなる発現ベクター、該ＣＵＢドメイン、核酸分子または発現ベクターのいずれかを含んでなる製薬学的組成物の使用。
【請求項２４】
個体において組織または器官の平滑筋細胞の増殖を刺激するか、または組織修復を刺激する方法であって、該個体にある量のＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドをコードする核酸分子、またはＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドまたはその機能的均等物、誘導体もしくは生物前駆体を、平滑筋細胞の増殖を刺激するために十分な濃度で投与することを含んで成る上記方法。
【請求項２５】
尿道機能不全、膀胱機能不全、骨盤床再構成、括約筋機能不全、またはＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドの異型の内因的活性に伴う機能不全を処置または防止する方法であって、該個体にＶＥＧＦ−Ｘポリペプチド、該ポリペプチドまたはその機能的均等物、誘導体もしくは生物前駆体をコードする核酸分子、該核酸分子を含んでなる発現ベクター、および該核酸分子または該ポリペプチドのいずれかを含んでなる製薬学的組成物から選択されるある量の群を投与することを含んでなる上記方法。
【請求項２６】
治療に有効な量のＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドまたはその機能的均等物、誘導体もしくは生物前駆体、該ポリペプチドを製薬学的に許容されうる担体、希釈剤または補形剤と一緒に含んでなる製薬的組成物を適用することによる、尿道機能不全、膀胱機能不全、括約筋機能不全、またはＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドの異型の内因的活性に伴う機能不全を処置するため、または骨盤床再構成のための方法。
【請求項２７】
個体において組織または器官および組織修復中の平滑筋細胞の増殖を刺激する方法であって、該個体にある量のＶＥＧＦ−ＸポリペプチドのＣＵＢドメインまたはその機能的均等物もしくは誘導体を、平滑筋細胞の増殖を刺激するために十分な濃度で投与することを含んで成る上記方法。
【請求項２８】
尿道機能不全、膀胱機能不全、骨盤床再構成、括約筋機能不全、またはＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドの異型の内因的活性に伴う機能不全を処置または防止する方法であって、該個体にＣＵＢドメインまたはその機能的均等物、誘導体もしくは生物前駆体をコードする核酸分子、該核酸分子を含んでなる発現ベクター、および該核酸分子および該ＣＵＢドメインのいずれかを含んでなる製薬学的組成物から選択されるある量の群を投与することを含んでなる上記方法。
【請求項２９】
治療に効果的な量のＣＵＢドメイン、該ＣＵＢドメインポリペプチドまたはその機能的均等物もしくは誘導体および製薬学的に許容されうるそれらの担体、希釈剤または補形剤を含んでなる製薬的組成物のいずれかを適用することを含んでなる、尿道機能不全、膀胱機能不全、括約筋機能不全、またはＣＵＢドメインポリペプチドの異型の内因的活性に伴う機能不全を処置するため、または骨盤床再構成のための方法。
【請求項３０】
アテローム硬化症、動脈吻合またはバルーンカテーテルにより生じる新生内膜過形成、経皮的経管的冠動脈形成術後の動脈のステント留置により生じる動脈形成術後の再狭窄を処置または防止するための薬剤の製造における、ＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドまたはそのエピトープに結合することができる抗体の使用。
【請求項３１】
アテローム硬化症、動脈吻合またはバルーンカテーテルにより生じる新生内膜過形成、経皮的経管的冠動脈形成術後の動脈のステント留置により生じる動脈形成術後の再狭窄を処置または防止する方法であって、該個体にＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドをコードする核酸分子に対するある量のアンチセンス分子を、該障害を処置または防止するために十分な濃度で投与することを含んでなる上記方法。
【請求項３２】
アテローム硬化症、動脈吻合またはバルーンカテーテルにより生じる新生内膜過形成、経皮的経管的冠動脈形成術後の動脈のステント留置により生じる動脈形成術後の再狭窄を処置または防止する方法であって、該個体にＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドのある量のアンタゴニストを、該障害を処置または防止するために十分な濃度で投与することを含んでなる上記方法。
【請求項３３】
アテローム硬化症、動脈吻合またはバルーンカテーテルにより生じる新生内膜過形成、経皮的経管的冠動脈形成術後の動脈のステント留置により生じる動脈形成術後の再狭窄を処置または防止する方法であって、該個体にＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドまたはそのエピトープに結合することができるある量の抗体を、該障害を処置または防止するために十分な濃度で投与することを含んでなる上記方法。
【請求項３４】
個体の病理学的状態または病理学的状態に対する罹病性を診断する方法であって：
（ａ）生物学的サンプル中のＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドまたはその受容体中における突然変異の存在または不存在を決定し：そして
（ｂ）ＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドまたはその受容体の発現の程度に基づき、病理学的状態または病理学的状態に対する罹病性を診断する、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項３５】
平滑筋細胞の増殖を抑制または強化する化合物を同定する方法であって、ＶＥＧＦ−Ｘ受容体を発現している細胞をＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドの存在下で該化合物と接触させ、そして該化合物とは接触させられなかった細胞と比べた時、該化合物が該細胞に及ぼす効果をモニタリングすることを含んでなる上記方法。
【請求項３６】
ＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドのアンタゴニスト、または該ポリペプチドをコードする核酸分子に対するアンチセンス分子、または該ＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドもしくはそれらのエピトープに結合することができる中和抗体の直接的送達法であって、該アンタゴニスト、アンチセンス分子または抗体を伸張傷害後の新生内膜過形成を制限するために塞栓切除カテーテルのバルーンチップを介して投与することを含んでなる上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、平滑筋細胞増殖のモジュレーション（modulation）、そして特に平滑筋細胞増殖を強化し、そして減少した平滑筋細胞の増殖に付随する疾患を処置するための血管内皮増殖因子の新規な使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦ増殖因子ファミリーは多数の構造的に関連した増殖因子を含む。このファミリーの員は鎖間（inter-chain）ジスルフィド結合により共有的に連結された二量体を形成する保存されたシステイン-リッチ領域であるシステインノット（cysteine knot）（Sun,P.D.1995）を含む（Potgenset al.1994,Andersson et al.1992）。血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は繊維芽細胞および平滑筋細胞を含む結合組織細胞に分裂促進的（mitogenic）である（Heldin et al.1999に総説されている）。ＰＤＧＦは異なるＡおよびＢ鎖のホモ−およびヘテロ二量体から成り、そして２つの受容体チロシンキナーゼであるＰＤＧＦＲ−αおよびＰＤＧＦＲ−βを活性化する。ＰＤＧＦのｍＲＮＡは正常な細胞型の範囲で発現され、そして腫瘍形成および他の疾患プロセスに関与しているかもしれない（Heldin et al.1999）。さらにＰＤＧＦ−Ｂ遺伝子は形質転換性レトロウイルスによってｖ−ｓｉｓガン遺伝子として運ばれ（Devare et al.,1983）、過剰発現は発ガン性となり得ることを示している。
【０００３】
血管内皮細胞増殖因子は新生血管形成（neovascularisation）および血管透過性（vascularpermeability）に関与する（Ferrara & Davis-Smyth,1997,Neufeld et al.,1999に総説されている）。今日まで５種の内因性ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄおよび胎盤増殖因子（ＰＬＧＦ））が記載された。ＶＥＧＦシグナル発信は受容体チロシンキナーゼのファミリーを介するが（Ferrara& Davis-Smyth,1997,Neufeld et al.,1999）、最近はニューロピリン（neuropilin）−１もＶＥＧＦ−Ａの幾つかのアイソフォームに関する受容体であることが示された（Soker et al.,1998）。
【０００４】
ＶＥＧＦ−Ａは心臓、胎盤および膵臓を含む幾つかの正常な組織中で発現する（Berse et al.,1992）。ＶＥＧＦ−Ａは多くの腫瘍細胞中で過剰に発現し（Takahashiet al.,1995)、そしてＶＥＧＦ−Ａ作用の阻害は動物モデルにおいて腫瘍の後退を引き起こすことが示された（Kim et al.,1993）。ＶＥＧＦ−Ａは不適切な新脈管形成（angiogenesis）が関与する他の疾患プロセスにもかかわっていた（Folkman 1995）。正常組織でのＶＥＧＦ−Ｂ mＲＮＡ発現はＶＥＧＦ−Ａの発現と重複するが、中枢神経系でも検出可能である（Lagercrantz et al,1998）。ＶＥＧＦ−ＣはＶＥＧＦ ＡおよびＢよりも低いレベルで発現するが（Lagercrantz et al,1998）、組織の範囲で検出可能である（Lee et al.1996,Fitzet al.,1997）。ＶＥＧＦ−Ｄは肺、心臓および小腸で強力に発現し、そして幾つかの他の組織で検出可能である（Yamada et al,1997）。
【０００５】
ＥＳＴデータベースの調査はＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリーの新たな員の同定をもたらした。同定されたポリペプチド配列はＮ−末端ＣＵＢドメインおよびＣ−末端ＰＤＧＦドメインを含み、そして血管内皮増殖因子（vascularendothelial growth factor）−Ｘ（ＶＥＧＦ−Ｘ；特許文献１；ＥＭＢＬ受託番号ＡＸ０２８０３２）と命名された。最近、同じ配列が公開され、そしてＰＤＧＦ活性を有することが示され（Liet al.,2000）、そしてＰＤＧＦ−Ｃと命名され、そしてこれら２つの名称は互換的に使用することができる。Li et alは、ＰＤＧＦ−ＣのＣ−末端ＰＤＧＦドメインはＰＤＧＦＲ結合および繊維芽細胞増殖の刺激において活性であるが、完全長のＰＤＧＦ−Ｃはそのような活性を示さないことが分かった。彼らはＣＵＢドメインがＰＤＧＦドメインのインヒビターとして機能するモデルを提案した：活性化は活性なＰＤＧＦ−Ｃを放出するためにタンパク質切断を介する。
【０００６】
平滑筋細胞は膀胱機能を制御するために尿道および膀胱壁において重要である。平滑筋細胞数の増加は、運動性尿失禁および膀胱機能不全の治療となることが示された（Yokoyamaet al.,2000）。治療として使用する細胞数の増加は、平滑筋細胞（筋芽細胞）を尿道および膀胱壁に直接注入することであった。
【０００７】
他方では、動脈の平滑筋細胞過形成は様々な疾患を引き起こすことが知られており、そしてこの望ましくない細胞レベルの出来事（event）を遮断する作用物質（agent）はこれらの疾患に薬剤標的化療法（drugtargeted therapy）で使用することができるであろう。
【０００８】
大動脈の疾患であるアテローム硬化症は心臓疾患および発作の主要な原因である。西洋化した社会ではこれが全死亡のうちの約50％の根本的原因である。アテローム硬化症は大動脈に脂質および繊維状の要素の蓄積を特徴とする進行性の疾患である。血管壁の細胞、特に平滑筋細胞（ＳＭＣ）の過剰成長はアテローム硬化症の発病の一因となる（Lusis,AJ,2000）。平滑筋細胞の増殖および移動を遮断することができる処置は、内膜過形成（intimal hyperplasia）を防止するために十分であり、そして血管治癒プロセスにも貢献するかもしれない。最近の血管介入的環境では、高い再狭窄率により内膜過形成、血管壁傷害後に生じる慢性的な構造的損傷の重要性が益々知られるようになり、そしてこれは管腔狭窄および血管閉塞を導き得る。内膜過形成は、細胞外結合組織マトリックスの会合した沈着を含む血管平滑筋細胞の異常な移動および増殖と定義されている（HagenP.O.,et al.1994）。心臓同種移植片動脈硬化症（cardiac allograftarteriosclerosis）は受容体の長期生存を限定する主原因の１つである。これは動脈壁に対する極端な傷害により、吻合の部位で起こり得る増殖性平滑筋細胞からなる内膜の厚化を特徴とする（SuzukiJ.et al.2000）。平滑筋細胞の病理学的な過増殖（hyperproliferation）の防止は、治癒しているミクロ動脈吻合（microartherial anastomoses）の内膜過形成および同種移植片の動脈内膜過形成を減らすために使用できた（RobertC,et al.1995）。平滑筋細胞の成長を静止させると、周囲細胞は冠状動脈形成術により誘導される新生内膜過形成を減らすために役立つ。膀胱または腎臓肥大および過形成も糖尿病シストパシー（cystopathy）でよく認識されている。平滑筋細胞の過増殖は、慢性および／または重篤な膀胱出口の閉塞から生じる膀胱および腎臓機能の不可逆的改変を引き起こす可能性もあった（Mumtaz FH,et al 2000）。
【特許文献１】
国際公開第0037641号パンフレット
【発明の開示】
【０００９】
今、驚くべきことには、組換え完全長ＶＥＧＦ−ＸおよびＣＵＢドメインタンパク質の両方がインビトロでヒトの大動脈平滑筋細胞に分裂促進活性（mitogenic activity）を現すことが判明し、これはＣＵＢドメインがＰＤＧＦドメインの潜伏（latency）を維持する役割を越えて機能することを示唆している。したがって平滑筋細胞の増殖を上昇させるＶＥＧＦ−ＸおよびＣＵＢドメインは、運動性尿失禁、膀胱機能不全および平滑筋細胞からなる他の括約筋の機能不全の治療に有利となり得る。ＶＥＧＦ−ＸおよびＣＵＢドメインは、平滑筋機能を向上させるために骨盤床再構成（pelvicfloor reconstruction）に使用することもできる。
【００１０】
したがって本発明の第１の観点によれば、インビボまたはインビトロでの平滑筋細胞の増殖を刺激するための薬剤の製造において、ＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドまたはそれらの機能的均等物、誘導体もしくは変異体をコードする核酸分子の使用を提供する。好ましくはＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドの配列は図１（ａ）に表す通りである。またインビボまたはインビトロでの平滑筋細胞の増殖を刺激するために、好ましくは図１（ａ）に表す40から150位のアミノ酸配列またはそれらの機能的均等物、誘導体もしくは変異体から成るＶＥＧＦ−ＸのＣＵＢドメインの使用も提供する。前述のポリペプチド、ＣＵＢドメインおよび核酸分子は、尿道機能不全、膀胱機能不全、括約筋機能不全または機能的なＶＥＧＦ−ＸもしくはＣＵＢドメインタンパク質の減少した発現に伴う他の疾患もしくは状態を処置し、あるいは骨盤床再構成のために薬剤としてまたは薬剤の調製にも使用することができる。本発明のさらなる観点では、インビボもしくはインビトロの組織工学的応用（tissueengineering application）のために、マトリックスに平滑筋細胞を集める（populating）ためにＶＥＧＦ−ＸもしくはそれらのＣＵＢドメインの使用を提供する。
【００１１】
本発明のＤＮＡ分子は有利なことには適当な発現ベクター中に包含させて適当な宿主中でベクターにコードされたＶＥＧＦ−Ｘを発現することができる。後に該細胞を形質転換し、そして続いて形質転換した細胞を選択するために、適当な発現ベクター中へクローン化されるＤＮＡの包含は、Sambrook et al.(1989)、モレキュラークローニング、ア ラボラトリーマニュアル（MolecularCloning，a Laboratory Manual）、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版に提供されているように当業者には周知である。
【００１２】
本発明による発現ベクターには、該ＤＮＡフラグメントの発現を行うことができるプロモーター領域のような調節配列に操作可能に連結された本発明による核酸を有するベクターを含む。用語「操作可能に連結された」とは、記載する成分が意図する様式で機能することを可能とする関係にある並置を称する。そのようなベクターは適当な宿主細胞中で形質転換されて本発明によるポリペプチドの発現を提供することができる。
【００１３】
そのような発現ベクターはまた平滑筋細胞の増殖を刺激し、そしてまた尿道機能不全、膀胱機能不全または機能的ＶＥＧＦ−Ｘタンパク質の減少した発現に伴う他の疾患を含む本発明による疾患もしくは状態の処置にも使用することができる。
【００１４】
本発明によるポリペプチドは組換え体、合成または自然に存在するものでよいが、好ましくは組換え体である。同様に本発明の核酸配列は組換えまたは例えばPＣＲクローニングメカニズムを使用するような合成法を使用して生成することができる。
【００１５】
さらなる観点によれば、本発明はポリペプチドの可溶性状態のような治療に有効な量の本発明のポリペプチド、または本発明の核酸分子、または該核酸分子を包含するベクターを製薬学的に許容される得る担体もしくは補形剤と組み合わせて含んでなる製薬学的組成物の使用を提供する。そのような担体には限定するわけではないが、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせを含む。本発明の観点による製薬学的組成物は、組織および器官中の平滑筋細胞の増殖を刺激するために使用することができ、あるいは尿道、膀胱もしくは括約筋機能不全または本発明のＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドの異型の（aberrant）内因的活性に伴う機能不全を処置しまたは防止するために使用することができる。
【００１６】
本発明はさらに本発明の前述の組成物の１以上の材料を満たした１以上の容器を含んでなる製薬学的パックおよびキットに関する。本発明のポリペプチドおよび他の化合物は単独または治療用化合物のような他の化合物と一緒に使用することができる。
【００１７】
本発明によるタンパク質またはポリペプチド（この用語は本明細書では互換的に使用する）は、本発明による核酸分子によりコードされるすべての可能なアミノ酸変異体（該分子によりコードされ、そして保存的アミノ酸の変化を有するポリペプチドを含む）を含むと本明細書では定義する。保存的なアミノ酸置換とは、タンパク質の機能または発現に影響を及ぼさないタンパク質中の１以上のアミノ酸の置き換えを称する。本発明のタンパク質またはポリペプチドはさらに本明細書において該タンパク質またはポリペプチドに実質的に相同的である自然に存在する対立遺伝子変異体を含む、そのような配列の変異体を含むと定める。これとの関連で実質的な相同性とは、本発明の核酸分子にコードされるタンパク質またはポリペプチドと少なくとも70％、好ましくは80もしくは90％、そして好ましくは95％のアミノ酸相同性を有する配列とみなす。本発明に従いタンパク質またはポリペプチドの「機能的均等物（functionalequivalent）」とは、本発明の方法および使用に必要とされるようなＶＥＧＦ−Ｘ活性を現す、上で認識されたすべてのアミノ酸および対立遺伝子変異体を包含する。本発明のタンパク質またはポリペプチドは、組換え体、合成または自然に存在するものでよいが、好ましくは組換え体である。
【００１８】
本明細書中に定めるような本発明によるタンパク質またはポリペプチドは、該タンパク質またはポリペプチドの生物前駆体（bioprecursor）も含む。生物前駆体は生物学的プロセスで本発明により必要とされるようなＶＥＧＦ−Ｘ活性を有するタンパク質またはポリペプチドに転換され得る分子である。本発明の核酸またはタンパク質はガンまたはＶＥＧＦ−Ｘタンパク質の発現に関係する他の疾患もしくは状態を処置するために、薬剤または薬剤の調製に使用することができる。
【００１９】
有利なことには本発明の核酸分子またはタンパク質は、それらの製薬学的に許容され得る担体、希釈剤または補形剤と一緒に製薬学的組成物で提供することができる。
【００２０】
本発明はさらにアンチセンス技法の使用によりインビボでＶＥＧＦ−Ｘを阻害することを対象とする。アンチセンス技法はアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡの三重-ヘリックス形成を通して遺伝子発現を制御するために使用することができ、その両方法ともポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づいている。例えば本発明のタンパク質をコードする５’コード部分または成熟ＤＮＡ配列を、10から50塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために使用する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは転写に関与する遺伝子の領域に相補的になるように設計し（三重-ヘリックス−Leeet al.Nucl. Acids Res.,6:3073(1979)；Cooney etal.,Science,241:456(1988)；およびDervan etal.,Science,251:1360(1991)を参照にされたい）、これによりＶＥＧＦ−Ｘの転写および生産を防止する。
【００２１】
したがって本発明はアテローム硬化症、動脈吻合またはバルーンカテーテルにより生じる新生内膜過形成（neointimalhyperplasia）、経皮的経管的冠動脈形成術後（percutaneous transluminal coronary angioplasty）の動脈のステント留置（arterial stenting）により生じる動脈形成術後の再狭窄（postangioplastyrestenosis）を処置または防止するための方法も提供し、該方法は該個体に図１（ａ）に従う核酸分子またはそれらの相補体に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができるアンチセンスポリヌクレオチド分子のような、ＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドをコードする核酸分子に対してアンチセンスなある量のポリヌクレオチド分子を、該障害を処置または防止するために十分な濃度で投与することを含んでなる。
【００２２】
高ストリンジェンシーの条件は一般に30℃を越える温度、典型的には37℃を越える温度、そして好ましくは45℃を越える温度を含む。ストリンジェントな塩条件は通常は1000mM未満、典型的には500mM未満、そして好ましくは200mM未満である。
【００２３】
組成物は例えば全身的または経口経路による投与の経路に従い適合させることができる。好適な全身投与の形態には、注射、典型的には静脈内注射を含む。皮下、筋肉内または腹腔内のような他の注射経路を使用することもできる。
【００２４】
全身投与の別の手段には胆汁酸塩またはフシジン酸または他の界面活性剤のような浸透剤を使用した経粘膜的（transmucosal）および経皮的投与を含む。さらに本発明のポリペプチドまたは他の化合物が腸溶性、またはカプセル化製剤に配合され得る場合、経口投与も可能である。これらの化合物の投与は膏薬、ペースト、ゲル等の状態で局所的および／または局在化させることもできる。
【００２５】
必要な投薬用量範囲は本発明のペプチドまたは他の化合物、投与の経路の選択、製剤の性質、個体の状態の性質および医師の判断に依存する。しかし適当な投薬用量は0.1〜100mg/kg（個体）の範囲である。しかし必要な投薬用量における広い変動が、利用できる化合物の多様性および種々の投与経路で異なる効力という観点から期待される。
【００２６】
例えば経口投与は静脈内注入による投与よりも高い投薬用量が必要となると予想される。これら投薬用量レベルの変動は当該技術分野で十分に理解されているように至適化のための標準的な経験的ルーチンを使用して調整することができる。
【００２７】
本明細書で使用する用語「治療に有効な量」とは、望ましい処置法に従い投与した時、所望する治療的効果または応答を現すか、または所望の利益を現す本発明のＶＥＧＦ−Ｘまたは他の活性剤（actives）の量を意味する。
【００２８】
好適な治療に有効な量は、平滑筋細胞の増殖を刺激する量である。
【００２９】
本明細書で使用するように「製薬学的に許容され得る」とは、毒性または安全性の立場から一般にヒトを含む哺乳動物への投与に適することを意味する。
【００３０】
本発明では、ＶＥＧＦ−Ｘタンパク質は典型的には所望の治療効果が達成されるまで十分な期間投与される。本明細書で使用する用語「所望の治療効果が達成されるまで」とは、治療薬（１つまたは複数）が選択された投与スケジュールに従い、媒介される疾患または状態について得ようとする臨床的または医学的効果が医師または研究者により観察される時まで、連続的に投与されることを意味する。本発明の処置法について、化合物は骨量（bonemass）または構造に所望の変化が観察されるまで連続的に投与される。そのような場合、平滑筋細胞の増加を達成することが所望する目的である。疾患状態または状態の危険性を下げる方法について、化合物は望ましくない状態を防ぐために必要である限り連続的して投与される。
【００３１】
平滑筋細胞の増殖の２以上の刺激物（stimulant）の組み合わせも本発明の範囲内であると見なす。
【００３２】
「ポリヌクレオチド」とは一般にポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシヌクレオチドを称し、これは非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡでよい。「ポリヌクレオチド」には限定するわけではないが一本−および二本−鎖ＤＮＡ、一本−および二本−鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本−および二本−鎖ＲＮＡ、および一本−および二本−鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本−鎖またはより典型的には二本−鎖もしくは一本−および二本−鎖領域の混合であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含んでなるハイブリッド分子を含む。さらに「ポリヌクレオチド」はＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含んでなる三本鎖領域を称する。
【００３３】
用語「ポリヌクレオチド」には１以上の修飾された塩基を含むＤＮＡもしくはＲＮＡ、および安定性もしくは他の理由から修飾された骨格を持つＤＮＡもしくはＲＮＡを含む。「修飾された」塩基には例えばトリチル化塩基およびイノシンのような通常ではない塩基を含む。種々の修飾をＤＮＡおよびＲＮＡに施すことができ；すなわち「ポリヌクレオチド」は多くは自然に見いだされるようなポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はしばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれる比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
【００３４】
「ポリペプチド」はペプチド結合または修飾ペプチド結合により互いに連結された２以上のアミノ酸を含んでなるペプチドまたはタンパク質、すなわちペプチドイソスター（isostere）を称する。「ポリペプチド」は通常はペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと呼ばれる短鎖、および一般にはタンパク質とよばれるより長い鎖の両方を称する。ポリペプチドは20個の遺伝子にコードされるアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。
【００３５】
「ポリペプチド」には翻訳後プロセッシングのような自然なプロセスにより、または当該技術分野で周知な化学的修飾技法によるいずれかで修飾されたアミノ酸配列を含む。そのような修飾は基本的なテキストおよびより詳細な小論ならびに分厚い研究論文に十分に記載されている。修飾はペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノもしくはカルボキシ末端を含むポリペプチド中の任意の場所で起こることができる。同じ型の修飾が同じかまたは異なる程度で上記ポリペプチド中の幾つかの部位に存在してよい。また上記ポリペプチドは多くの型の修飾を含むことができる。ポリペプチドはユビキチン化の結果として分岐してもよく、そしてそれらは分岐を含むかまたは含まない環状でもよい。環状、分岐化および分岐化環状ポリペプチドは、翻訳後の自然なプロセスから生じることができ、または合成法により作成することができる。修飾にはアセチル化、アシル化、ＡＤＰ-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有的な架橋結合の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ-カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質溶解プロセッシング、リン酸化、プレニレーション、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニン化（arginylation）のようなトランスファーＲＮＡが媒介するアミノ酸のタンパク質への付加、およびユビキチン化を含む（例えばタンパク質−構造および分子的性質（PROTEIS-STRUCTUREAND MOLECULAR PROPERTIES）、第２版、T.E.Creighton、W.H.フリーマン  アンド  カンパニー（W.H.Freeman and Company）、ニューヨーク、1993；タンパク質の翻訳後の共有的修飾（POSTTRANSLATIONALCOVALENT MODIFICATION OF PROTEINS)、B.C.Johnson、編集、アカデミック出版、ニューヨーク、1983の中のWold,F.、翻訳後のタンパク質修飾:展望および予測（Post-translational Protein Modifications;Perspective and Prospects）、第１〜12頁；Selfter et al.,「タンパク質修飾および非タンパク質コファクターに関する分析（Analysis forprotein modifications and nonprotein cofactors)」、Meth Enzymol（1990）182:626-646およびRattanet al.,「タンパク質合成：翻訳後修飾および老化（Protein Synthesis:Post-translationalModification and Aging)」、Ann NYAcad Sci(1992)663:48-62を参照にされたい）。
【００３６】
上記の任意の修飾を含んでなるポリペプチドは、本発明に従いタンパク質またはポリペプチドの「誘導体」と記載され得る。
【００３７】
さらに本発明はＶＥＧＦ−Ｘの生物学的活性のインヒビターを同定するためのスクリーニング法に関する。これらのインヒビターには中和化ＶＥＧＦ−Ｘ抗体、アンチセンスＶＥＧＦ−Ｘ配列またはＶＥＧＦ−Ｘの生物学的活性と競合する非タンパク質アンタゴニストを含む。適当な抗体は単離されたおよび／または組換え抗原またはその部分（合成ペプチドのような合成分子を含む）のような適切な免疫原に対して、あるいは組換え抗原を発現する宿主細胞に対して生じることができる。さらにトランスフェクトされた細胞のような組換え抗原を発現している細胞は免疫原として、または受容体に結合する抗体の調査に使用することができる（例えばChuntharapai et al.,J.Immunol.,152.-17831-1789(1994)を参照にされたい）。
【００３８】
抗体生産細胞、好ましくは脾臓またはリンパ節の細胞は目的の抗原で免疫感作した動物から得ることができる。融合細胞（ハイブリドーマ）は選択的な培養条件を使用して単離し、そして限界希釈によりクローン化することができる。所望する特異性を持つ抗体を生産する細胞は、適当なアッセイ（例えばELISA）により選択することができる。
【００３９】
したがって本発明はアテローム硬化症、動脈吻合またはバルーンカテーテルにより生じる新生内膜過形成、経皮的経管的冠動脈形成術後の動脈のステント留置により生じる動脈形成術後の再狭窄を処置または防止するための方法を提供し、この方法は該個体に図１（ａ）のようなＶＥＧＦ−Ｘポリペプチドまたはそれらのエピトープに結合することができるある量の抗体を、該障害を処置または防止するために十分な濃度で投与することを含んでなる。
【００４０】
本発明における使用に適する抗-ＶＥＧＦ−Ｘ抗体は、ＶＥＧＦ−Ｘ受容体に対して高い親和性で結合することが特徴である。ＶＥＧＦ−Ｘに対する抗体は吸息（例えば吸入剤または噴霧または霧状にしたミストとして）により投与することができるであろう。他の投与経路には鼻内、経口、注入および／またはボーラス注射を含む静脈内、皮内、経皮（例えば緩効性ポリマー中）、筋肉内、腹腔内、皮下、局所、硬膜外、口内等の経路を含む。例えば上皮もしくは皮膚粘膜のライニング（linings）を通して吸収を達成するために、他の適当な投与経路も使用することができる。抗体は遺伝子療法により投与することもでき、ここで特定の治療用タンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡ分子は患者に、例えばベクターを介して投与され、これにより特定のタンパク質またはペプチドをインビボにて治療的レベルで発現または分泌させる。さらに抗-ＶＥＧＦ−Ｘ抗体は製薬学的に許容されうる表面活性剤（例えばグリセリド）、補形剤（例えばラクトース）、担体、希釈剤および賦形剤のような生物学的に活性な薬剤の他の成分と一緒に投与することができる。抗-ＶＥＧＦＸ抗体を個体に他の治療法または治療薬の前に、同時にまたは順次に予防的にまたは治療的に投与することができる（多剤処方（multipledrug regimens)）。他の治療薬と同時に投与する抗-ＶＥＧＦ−Ｘ抗体は、同じかまたは異なる組成物中で投与することができる。抗-ＶＥＧＦ−Ｘ抗体は製薬学的に許容されうる非経口賦形剤と共に溶液、懸濁液、乳液または凍結乾燥粉末として配合することができる。
【００４１】
治療に有効な量のＶＥＧＦ−Ｘ抗体は、症状および同時処置の性質および程度ならびに所望する効果のような因子に依存して、単回または分割された用量（例えば日、週または月の間隔により分離された一連の用量）で、または徐放性の形態で投与することができる。
【００４２】
別の観点ではアゴニストおよびアンタゴニストに関するスクリーニングアッセイを提供し、これには候補化合物が本発明に従いＶＥＧＦ−ＸまたはＣＵＢドメインポリペプチドのＶＥＧＦ−Ｘ受容体への結合に及ぼす効果を測定することが含まれる。特にこの方法にはＶＥＧＦ−Ｘ受容体と本発明によるＶＥＧＦ−ＸまたはＣＵＢドメインポリペプチドおよび候補化合物とを接触させ、そしてＶＥＧＦ−Ｘ受容体に結合するＶＥＧＦ−ＸまたはＣＵＢドメインポリペプチドが候補化合物の存在により上昇または減少するかどうかを測定することが含まれる。このアッセイでは標準的な結合に優るＶＥＧＦ−ＸまたはＣＵＢドメインポリペプチドの結合における上昇は、候補化合物がＶＥＧＦ−ＸまたはＣＵＢドメインのアゴニストであることを示す。標準に比べてＶＥＧＦ−ＸまたはＣＵＢドメインポリペプチドの結合の減少は、化合物がＶＥＧＦ−ＸまたはＣＵＢドメインのアンタゴニストであることを示す。  本発明は以下の実施例および添付する図面を参考にすることにより、より明確に理解することができ、ここで：
図１は（ａ）はＰＤＧＦ-ＣのｃＤＮＡ配列の説明である。推定されるＰＤＧＦ-Ｃ翻訳産物を配列の上に表し、推定されるシグナル配列には下線を付す。推定されるｍＲＮＡスプライシング反応の位置は黒(closed)三角で示す。ｍＲＮＡスプライシング反応の位置は単離されたBACクローンに関する直接的シークエンシングから、またはEMBLデータベース中の部分的BAC配列との比較（AC0015837に由来するnt.１−374の領域、2000年4月7日に出されたデータ；AC009582に由来するnt.375-571からの領域、2000年4月5日にだされたデータ）のいずれかにより推測した。イタリック体で示すnt.900−957に由来する領域に関してはスプライシング反応について利用できる情報はない。719/720および988/989（白（open)三角）での隠れた(cryptic)スプライシング供与／受容部位は、ＰＣＲにより単離した変異体配列から推測した。ポリペプチド配列中の可能性のあるＮ-連結グリコシル化部位をボックスで囲み、そして（ｂ）は変異体ＰＤＧＦ-Ｃタンパク質配列であり−ポリペプチド配列は期待されたサイズよりも小さいＰＣＲフラグメントから予測した。この領域を網羅するＰＣＲフラグメントをクローン化し、そしてシークエンシングして隠れたスプライシング供与／受容部位を図１（ａ）に示した。
【００４３】
図２はＰＤＧＦ-Ｃドメインとデータベース配列との比較の説明である：
（Ａ）ＰＤＧＦ-ＣのＰＤＧＦドメインを他のヒトＰＤＧＦおよびＶＥＧＦのＰＤＧＦドメインと並べた
（Ｂ）ＰＤＧＦ-ＣのＣＵＢドメインをＢＭＰおよびニューロフィリン（neuropilin）のＣＵＢドメインと並べた；タンパク質は示すようにＸ．レビス（X.laevis）、マウスまたはニワトリに由来する。
【００４４】
すべてのドメインの配列はPFAMAデータベース（Rocchigiani,M.et al,(1998)Genomics 47,204-216）から取り、そしてCLUSTALW 整列プログラム（EMBL、ハイデルべルク、ドイツ）を使用して並べた。表１は図２に示すタンパク質の領域の比較結果をまとめる。これらの比較から、他のデータベース配列に対するＣＵＢドメインの類似性の程度は、ＰＤＧＦドメインよりも高いことが明らかである。
【００４５】
図３はＰＤＧＦ-ＣのｍＲＮＡ発現から得られた結果の説明である：
（Ａ）組織およびガン細胞系のＰＤＧＦ-Ｃ ｍＲＮＡ分布のノーザンブロット分析。β-アクチン ｃＤＮＡプローブを使用した対照のハイブリダイゼーションは、各レーンに等量のｍＲＮＡが存在することを示した。ＰＤＧＦ-ＣｍＲＮＡの位置を示す。
（Ｂ）組織およびガン細胞系に由来するｃＤＮＡのＰＣＲ分析。グリセルアルデヒド-3-ホスフェート デヒドロゲナーゼのｃＤＮＡの部分を増幅するために設計したプライマーを使用した対照は、等量の各ｃＤＮＡが増幅反応に存在することを示した（データは示さず）。
【００４６】
図４はＰＤＧＦ-Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｘ）座のFISHマッピングにより得られた結果の具体的説明である−１例を示す：左パネルはヒト染色体上のFISHシグナルを示し、右はヒトの染色体４を同定するために4’’-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）で染色した同じ有糸分裂的図である。また図式的な要約も示す：各ドットは染色体４で検出された二重FISHシグナルを表す。
【００４７】
図５はＰＤＧＦ-Ｃ組換えタンパク質の性質の説明である。
（Ａ）グリコシル化および鎖間ジスルフィド形成。ティ.ニー（T.ni）Hi5細胞は完全長のＰＤＧＦ-Ｃを発現するバキュロウイルスで感染させた。バキュロウイルスで感染した昆虫細胞培地のサンプルを以下のように処理した：レーン１−酵素バッファー＋Ｎ-グリコシダーゼＦ；レーン２−酵素バッファー、Ｎ-グリコシダーゼＦは加えず；レーン３−還元型；レーン４−非還元型。ウエスタンブロッティング後の検出は導入されたＣ-末端エピトープタグを検出するために抗His6抗体を使用した。
（Ｂ）ヘパリン結合。精製した大腸菌（E.coli）に由来する完全長のMBP融合タンパク質をSDS-PAGEにかけ、そしてゲルをクーマシーブルーで染色した。レーン１−ヘパリンカラムにのせた画分、レーン２カラム洗浄、レーン３−高塩溶出。
（Ｃ）完全長およびＣＵＢドメイン−大腸菌（E.coli）中で生産したＰＤＧＦ-Ｃ完全長融合タンパク質（レーン１）およびＣＵＢドメイン（レーン２）のサンプルのクーマシー染色したSDS-PAGE。ＣＵＢドメインは不溶性材料のリホールディング（refolding）により生成された；20および25Kdaで両主要バンドが抗-His6抗体を使用したウエスタンブロット実験で検出されるので、25KDa種は非開裂シグナルペプチドを含むと推測される。分子量標準は左にkDaで示す。
【００４８】
図６はヒト冠状動脈平滑筋細胞の増殖に対するＰＤＧＦ-Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｘ）またはＰＤＧＦ-ＣＵＢドメイン効果のグラフ表示である。細胞は示した濃度の大腸菌（E.coli）由来ＣＵＢまたは完全長ＰＤＧＦ-Ｃタンパク質で処理した。
材料および方法
ＶＥＧＦ−ＸのｃＤＮＡおよび部分的なゲノムクローニング
既知のＶＥＧＦ配列（ＶＥＧＦ−Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）中のＰＤＧＦ−様ドメインに基づき１つのプロフィールを作り（Lee et al.,1996）、そしてLifeSeq(商標)ヒトESTデータベース（インサイト ゲノミックス社（IncyteGenomics Inc.）、パロアルト、カリフォルニア州、米国）を調査するために使用した。調査ではＶＥＧＦファミリーの有力な新規員の部分配列が明らかとなった。ｃＤＮＡ配列を広げるために、５’をMarathon−Readyae胎盤および骨格筋ｃＤＮＡを使用して行った（クローンテック（Clontech)、パロアルト、カリフォルニア州、米国）。次いで完全なコード配列は標準的なポリメラーゼ連鎖反応法を使用して増幅した（Fritzet al.,1997）。ＰＣＲフラグメントをベクターpCR2.1（インビトロゲン（Invitrogen)、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）またはpCR2.1-TOPO（インビトロゲン、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）にクローン化した。コード配列を決定するために、多数のクローンを配列決定した；またすべてのサブクローンをＤＮＡシークエンシングにより確認した。部分的なゲノムクローンを得るために、ヒトゲノムのＢＡＣライブラリー（ゲノムシステムズ社（Genome Systems Inc.）、セントルイス、ミシガン州、米国）を、ＰＤＧＦ−Ｃ ｃＤＮＡ配列から派生したオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。イントロン／エキソン境界を決定するために、ＢＡＣＤＮＡは既知のｃＤＮＡ配列に基づく20-merのシークエンシングプライマーを使用して直接配列決定した。ＢＡＣ ＤＮＡはキアゲン（Qiagen）プラスミドmidiキット（キアゲン社、デュッセルドルフ、ドイツ）を使用して調製した。
ＶＥＧＦ−Ｘ遺伝子の染色体位置推定
染色体マッピング実験は、シー DNA バイオテック社（See DNA Biotech Inc.）（トロント、カナダ）により、すでに記載されたように（Yamadaet al.,1997；Gribsteor et al.,1987,Ausabel et al.,1997）、ビオチン化された2.7kbプローブを用いたFISH分析を使用して行った。
ノーザンブロットおよびＲＴ-ＰＣＲによるＶＥＧＦ−Ｘ ｍＲＮＡ発現の分析
異なるヒト組織（クローンティック ラボラトリーズ；MTN(商標)ブロット、MTN(商標)ブロットＩＩおよびガン細胞系MTN(商標)ブロット）に由来する２μのpoly(A)+リッチRNAを含むノーザンブロットは、ａ-［３２Ｐ]-dCTPランダム-プライミングで標識した（Multiprimeラベリングキット、ロッシュダイアグノスティックス（RocheDiagnostics））293bpの特異的ＰＤＧＦ−Ｃフラグメント（ＰＤＧＦ−Ｃの92bpの３’末端コード領域および201bpの３’非翻訳領域を含むPinAＩ−StuＩフラグメント）とハイブリダイズさせた。ブロットは68℃で一晩ハイブリダイズさせ、そして高ストリンジェンシーでの最終的な洗浄は68℃で0.1×／0.1％ SDSであった。膜は１〜３日間、増感スクリーンを用いてオートラジオグラフィーにかけた。ＲＴ−ＰＣＲ分析に関しては、オリゴヌクレオチドプライマーGTTTGATGAAAGATTTGGGCTTGおよびCTGGTTCAAGATATCGAATAAGGTCTTCCをＰＤＧＦ−Ｃに由来する350bpのフラグメントの特異的なＰＣＲ増幅について使用した。ＰＣＲ増幅は、６種の異なるハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルに対して標準化されたヒトの多数の組織のｃＤＮＡ（MTC(商標)）パネル（クローンテックのヒトMTCパネルＩおよびＩＩならびにヒト腫瘍MTCパネル）について行った。さらにｃＤＮＡは異なる腫瘍細胞カルチャーから作成した（Caco-2結腸直腸腺ガン；Ｔ-84結腸直腸ガン；MCF-7胸部腺ガン；Ｔ-47D胸部管腺ガン；HT1080骨繊維ガン；SaOS-2 骨肉腫；SK-N-MC神経芽腫；HepG2悪性ヘパトーマ；JURKATＴ-細胞白血病およびTHP-1骨髄単球性白血病）。腫瘍細胞のｃＤＮＡの調製については、細胞を均一化し、そして全ＲＮＡはRNeasyMiniキット（キアゲン社、ヒルデン、ドイツ）を使用して調製した。 １μの全ＲＮＡはプライマーとしてoligo(dT)１５および50UのExpand(商標)逆転写酵素（ロッシュ ダイアグノスティックス、マンハイム、ドイツ）を使用して逆転写した。ＰＤＧＦ-Ｃ-特異的またはグリセルアルデヒド-３-ホスフェートデヒドロゲナーゼ（G3PDH）-特異的プライマーを用いたＰＣＲ反応を１μのこのｃＤＮＡについて行った。すべてのｃＤＮＡに関して、ＰＤＧＦ−Ｃ特異的プライマーを用いたＰＣＲ反応は50μの総容量で行った。サンプルは95℃で30秒加熱し、そしてサイクリングは95℃で30秒および68℃で30秒を25、30または35サイクル行った。ハウスキーピング遺伝子G3PDHの１kbのフラグメントを増幅する特異的プライマーを用いた対照反応も行った。
組換えタンパク質の発現、精製および検出
哺乳動物細胞の発現には、完全なコード配列を増幅し、そして検出および精製を援助するためのＣ-末端His６ペプチドタグを付加するために、ベクターpcDNA6/V5-His（インビトロゲン、リーク、オランダ）にクローン化した。大腸菌（E.coli）発現には、予想される成熟タンパク質のコード領域（Glu23-Gly345）をPCR増幅してＣ-末端His６タグを付加し、そして次いでベクターpMAL-p2（ニューイングランドバイオラボス（New England Biolabs）、ベヴァリー、マサチューセッツ州、米国）にクローン化した。生じたMBP融合タンパク質を最初にニッケルキレート樹脂（Ni-NTA)、キアゲン社、デュッセルドルフ、ドイツ）で精製し、そして次にアミロース樹脂（ニューイングランドバイオラボス、ベヴァリー、マサチューセッツ州）で精製した。ＰＤＧＦ−Ｃ（Glu23-Val1171）のＣＵＢドメインフラグメントをコードするＤＮＡ配列をＰＣＲ増幅してＮ-末端His６タグを付加し、そして次いで大腸菌（E.coli）中での分泌のためにpET22b（ノバジェン（Novagen）、マジソン、ウィスコンシン州）にクローン化した。ＣＵＢドメインタンパク質はペリプラズムからまたは標準的な方法（Fitz et al.,1997）により誘導したカルチャーの無細胞培地のいずれかから調製した。タンパク質は最初に20％飽和の硫酸アンモニウム沈殿により精製した。硫酸アンモニウムを除去するために20mMTris pH8.0，300mM NaClに対して一晩透析した後、タンパク質をさらにニッケルキレート樹脂で上記のように精製した。タンパク質グリコシル化の分析をＮ-グリコシダーゼＦ(ロッシュ  モレキュラー  バオケミカルズ（RocheMolecular Biochemicals）、ブリュッセル、ベルギー）を使用して行った。ヘパリンSepharose カラム（HiTrap、アマーシャム ファルマシアバイオテック（Amersham Pharmacia Biotech）、ウプサラ、スウェーデン）を製造元の使用説明に従い使用した。細胞に基づくアッセイで使用する前に、タンパク質サンプルをエンドトキシンの混入について市販されているキット（COATEST(商標)エンドトキシン、クロモゲニックス（Chromogenix）社、スウェーデン）を使用して試験した。
細胞培養
ヒトの臍静脈内皮細胞（HUVEC）（クローンティックス（Clonetics）、サンディエゴ、カリフォルニア州）をEGM-2成長培地（クローンティックス、サンディエゴ、カリフォルニア州）で維持し、そしてヒト骨格筋細胞（SkMC）（クローンティックス、サンディエゴ、カリフォルニア州）を骨格筋成長培地（クローンティックス、サンディエゴ、カリフォルニア州）中で培養した。HCASM（クローンティックス、サンディエゴ、カリフォルニア州）、ラット心臓の心筋H9c2（アメリカンタイプ セル コレクション、ロックビル、メリーランド州）、およびヒト新生児の皮膚繊維芽細胞（39-SK）（アメリカン タイプ セル コレクション、ロックビル、メリーランド州）を含む細胞は、10％ウシ胎児血清（FBS）（ハイクローン（HyClone）、ロガン、ユタ州）、６mM Hepes、50I.U./mlのペニシリンおよび50μのストレプトマイシンを補充したダッベッコの改良イーグル培地（DMEM）（ギブコ（Gibco）、ゲチスバーグ、メリーランド州）で維持した。細胞は４〜６継代の間で使用した。ヒトの骨芽細胞（MG63）（アメリカンタイプ セル コレクション、ロックビル、メリーランド州）は、10％FBS、100 U/mlのペニシリンおよび100μのストレプトマイシンを補充したDMEMで維持した。初代軟骨細胞はすでに記載されているように（Masure et al.,1998）ウシの肩から単離した。初代ウシ軟骨細胞は10％FBS、10mM HEPES、0.1mM非必須アミノ酸、20μL-プロリン、50μアスコルビン酸、100μペニシリン、100μストレプトマイシンおよび0.25μアンホテリシンＢを補充したDMEM（高グルコース)（軟骨細胞成長培地）中で培養した。すべての細胞培養は37℃の加湿インキュベーター中、５％CO２および95％空気の雰囲気下で行った。
細胞増殖アッセイ
HUVECを0.05％トリプシン／0.53mMEDTA（ギブコ、ゲチスバーグ、メリーランド州）でトリプシン処理し、そして5,000細胞／ウェルで96-ウェルの組織培養プレートに分配した。細胞接着および単層の形成後（16時間）、細胞を種々の濃度のＶＥＧＦ−Ｘ（示すような0.5％〜２％FBSを含有するDMEM中）で刺激した。ヒト皮膚の繊維芽細胞については、成長培地を種々の濃度のＶＥＧＦ−Ｘを含むかまたは含まずに0.1％BSAを含有するDMEMに置き換えた。MG63、ヒトSkMC、H9c2またはHCASMCについては、培地を0.5％FBSを含有するDMEMに置き換えた。ウシ軟骨細胞は10％ FBSを補充した高グルコースDMEM培地中、5,000細胞／ウェルで96-ウェルの組織培養プレートにまき、そして72時間付着させた。培地は２日間の処理無し、または有りで２％BSAを含有するDMEMに置き換えた。試験したすべての細胞について、処置を含むインキューベーションの後、培養基を100mlのDMEM（５％ FBSおよび３μの[３H]-チミジンを含有する）に置き換えた。パルス標識後、細胞をメタノール／酢酸（３：１、容量／容量）で室温にて１時間固定した。細胞は250ml／ウェルの80％メタノールで２回洗浄した。細胞を0.05％トリプシン（100ml／ウェル）で30分間可溶化し、次いで0.5％SDS（100ml／ウェル）でさらに30分間可溶化した。細胞溶解物（180ml）のアリコートを２mlのシンチレーションカクテルと合わせ、そして細胞溶解物の放射活性を液体シンチレーションカウンター（ウァラック（Wallac）1409）を使用して測定した。
ＰＤＧＦ-Ｃ遺伝子の染色体位置推定およびイントロン／エキソン構造
ＶＥＧＦ−Ｘは、FISH分析によりヒト染色体４の長腕上、領域q31−q32に位置した（図２）。このプローブに関するハイブリダイゼーション効率は〜70％であった。データベースの調査ではＶＥＧＦ−Ｘ配列を持つ２つのゲノムＢＡＣクローンが同定された（EMBL寄託番号AC009582およびAC015837）。これらのＢＡＣクローンは染色体４に由来し、FISHデータを支持していた。
【００４９】
ｃＤＮＡの３’部分を含む１つのＢＡＣクローンを単離した。このクローンの直接的シークエンシングにより、ｃＤＮＡのPDGFドメイン領域中のスプライシング反応（splicingevent）の位置を推定することができた（図１のnt.1179/1180位）。このスプライシング部位の位置はＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−Ｄに関して保存されている（Heng et al.,1993、Hagen et al.,1994）。図１に示す他のスプライシング部位の位置は、上記のデータベースＢＡＣクローンAC009582およびAC015837の配列から推定した。
ＶＥＧＦ−ＸおよびＣＵＢドメインの試験のまとめ
ＶＥＧＦ−ＸまたはＣＵＢドメインのいずれもヒト皮膚繊維芽細胞、ヒト臍静脈内皮細胞、ウシ軟骨細胞またはヒト骨芽細胞（MG63)の増殖を上昇させなかった。しかし完全長およびＣＵＢドメインコンストラクトの両方がヒトの冠動脈平滑筋細胞の増殖を用量依存的様式で刺激することができた（図３）。最適な刺激濃度は１〜10μの範囲であった。完全長およびＣＵＢドメイン構築物の両方の効果は試験した最高濃度で、対照レベルの４倍であった（図２）。我々はＣＵＢドメインの、ヒト骨格筋細胞またはラット心臓の心筋のような他の筋肉細胞型に対する分裂促進活性を認識しなかった（データは示さず）。第３システインの削除またはセリン残基への変異後、我々はＣＵＢドメインのヒトの冠動脈平滑筋細胞に対する分裂促進活性が最高濃度（10μ）で約半分に減少したことを見いだした（データは示さず）。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
比較は図２に示すタンパク質の領域間であり、Genedocプログラム（http://www.cris.com/〜）で算出した。
【００５２】
【表２】
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【００５３】
【表３】
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【００５４】
【表４】
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【００５５】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は（ａ）はＰＤＧＦ-ＣのｃＤＮＡ配列の説明である。推定されるＰＤＧＦ-Ｃ翻訳産物を配列の上に表し、推定されるシグナル配列には下線を付す。推定されるｍＲＮＡスプライシング反応の位置は黒(closed)三角で示す。ｍＲＮＡスプライシング反応の位置は単離されたBACクローンに関する直接的シークエンシングから、またはEMBLデータベース中の部分的BAC配列との比較（AC0015837に由来するnt.１−374の領域、2000年4月7日に出されたデータ；AC009582に由来するnt.375-571からの領域、2000年4月5日にだされたデータ）のいずれかにより推測した。イタリック体で示すnt.900−957に由来する領域に関してはスプライシング反応について利用できる情報はない。719/720および988/989（白（open)三角）での隠れた(cryptic)スプライシング供与／受容部位は、ＰＣＲにより単離した変異体配列から推測した。ポリペプチド配列中の可能性のあるＮ-連結グリコシル化部位をボックスで囲み、そして（ｂ）は変異体ＰＤＧＦ-Ｃタンパク質配列であり−ポリペプチド配列は期待されたサイズよりも小さいＰＣＲフラグメントから予測した。この領域を網羅するＰＣＲフラグメントをクローン化し、そしてシークエンシングして隠れたスプライシング供与／受容部位を図１（ａ）に示した。
【図２】図２はＰＤＧＦ-Ｃドメインとデータベース配列との比較の説明である：（Ａ）ＰＤＧＦ-ＣのＰＤＧＦドメインを他のヒトＰＤＧＦおよびＶＥＧＦのＰＤＧＦドメインと並べた（Ｂ）ＰＤＧＦ-ＣのＣＵＢドメインをＢＭＰおよびニューロフィリン（neuropilin）のＣＵＢドメインと並べた；タンパク質は示すようにＸ．レビス（X.laevis）、マウスまたはニワトリに由来する。すべてのドメインの配列はPFAMAデータベース（Rocchigiani,M.et al,(1998)Genomics 47,204-216）から取り、そしてCLUSTALW 整列プログラム（EMBL、ハイデルべルク、ドイツ）を使用して並べた。表１は図２に示すタンパク質の領域の比較結果をまとめる。これらの比較から、他のデータベース配列に対するＣＵＢドメインの類似性の程度は、ＰＤＧＦドメインよりも高いことが明らかである。
【図３】図３はＰＤＧＦ-ＣのｍＲＮＡ発現から得られた結果の説明である：（Ａ）組織およびガン細胞系のＰＤＧＦ-Ｃ ｍＲＮＡ分布のノーザンブロット分析。β-アクチン ｃＤＮＡプローブを使用した対照のハイブリダイゼーションは、各レーンに等量のｍＲＮＡが存在することを示した。ＰＤＧＦ-ＣｍＲＮＡの位置を示す。（Ｂ）組織およびガン細胞系に由来するｃＤＮＡのＰＣＲ分析。グリセルアルデヒド-3-ホスフェート デヒドロゲナーゼのｃＤＮＡの部分を増幅するために設計したプライマーを使用した対照は、等量の各ｃＤＮＡが増幅反応に存在することを示した（データは示さず）。
【図４】図４はＰＤＧＦ-Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｘ）座のFISHマッピングにより得られた結果の具体的説明である−１例を示す：左パネルはヒト染色体上のFISHシグナルを示し、右はヒトの染色体４を同定するために4’’-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）で染色した同じ有糸分裂的図である。また図式的な要約も示す：各ドットは染色体４で検出された二重FISHシグナルを表す。
【図５】図５はＰＤＧＦ-Ｃ組換えタンパク質の性質の説明である。（Ａ）グリコシル化および鎖間ジスルフィド形成。ティ.ニー（T.ni）Hi5細胞は完全長のＰＤＧＦ-Ｃを発現するバキュロウイルスで感染させた。バキュロウイルスで感染した昆虫細胞培地のサンプルを以下のように処理した：レーン１−酵素バッファー＋Ｎ-グリコシダーゼＦ；レーン２−酵素バッファー、Ｎ-グリコシダーゼＦは加えず；レーン３−還元型；レーン４−非還元型。ウエスタンブロッティング後の検出は導入されたＣ-末端エピトープタグを検出するために抗His6抗体を使用した。（Ｂ）ヘパリン結合。精製した大腸菌（E.coli）に由来する完全長のMBP融合タンパク質をSDS-PAGEにかけ、そしてゲルをクーマシーブルーで染色した。レーン１−ヘパリンカラムにのせた画分、レーン２カラム洗浄、レーン３−高塩溶出。（Ｃ）完全長およびＣＵＢドメイン−大腸菌（E.coli）中で生産したＰＤＧＦ-Ｃ完全長融合タンパク質（レーン１）およびＣＵＢドメイン（レーン２）のサンプルのクーマシー染色したSDS-PAGE。ＣＵＢドメインは不溶性材料のリホールディング（refolding）により生成された；20および25Kdaで両主要バンドが抗-His6抗体を使用したウエスタンブロット実験で検出されるので、25KDa種は非開裂シグナルペプチドを含むと推測される。分子量標準は左にkDaで示す。
【図６】図６はヒト冠状動脈平滑筋細胞の増殖に対するＰＤＧＦ-Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｘ）またはＰＤＧＦ-ＣＵＢドメイン効果のグラフ表示である。細胞は示した濃度の大腸菌（E.coli）由来ＣＵＢまたは完全長ＰＤＧＦ-Ｃタンパク質で処理した。
【図１Ａ】
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【図１Ａ（ａ）】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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