(57)【要約】本発明によると、細胞測定法として知られる分野に関連する細胞選択および特性解析の方法が提供される。さらに、本発明は、レーザーを用いたノンフロー細胞測定法を使用することにより、抗がん剤に対するヒトがん細胞感受性（あるいは、細胞耐性）を試験するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物に対する細胞の薬物感受性を試験するための方法であって、
（ａ）  液体中の細胞懸濁液を調製するステップ；
（ｂ）  細胞の一部分を薬物に曝露するステップ；
（ｃ）  測定可能な程度の蛍光を付与できる少なくとも１つの物質を前記懸濁液中の細胞に添加するステップ；
（ｄ）  細胞を所定の場所に個別に存在させ、各個別細胞が前記所定の場所の１つに正確に対応し、さらに前記所定の場所へ分析装置を個別にアクセスできるようにするステップ；
（ｅ）  細胞の薬物感受性を決定する手段として、前記分析装置によって前記所定の場所内の細胞の少なくとも一部分を少なくとも１回分析するステップ
を含む方法。
【請求項２】
薬物がウイルス、ミセルおよびリポソームから成る群より選択されたいずれかの単位体内に封入されている請求項１に記載の方法。
【請求項３】
薬物が核酸である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞が培養皿で培養され、その後採取される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細胞がタンパク質分解酵素を用いて採取される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質分解酵素がトリプシンである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
細胞が少なくとも１回洗浄される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
細胞が前記測定可能な程度の蛍光を付与できる物質と一緒に培養される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記測定可能な程度の蛍光を付与できる物質が、
（ａ）  生きている細胞を区別して染色する物質；
（ｂ）  生きている細胞を区別して染色する蛍光物質の前駆物質；および
（ｃ）  核酸を染色する蛍光物質
から成る群より選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、
（ｆ）  前記分析の結果を報告するステップ
を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
さらに、
（ｇ）
（ｉ）  細胞数対蛍光強度のヒストグラム；
（ｉｉ）  細胞数対蛍光偏光のヒストグラム；
（ｉｉｉ）  蛍光強度対時間のヒストグラム；
（ｉｖ）  蛍光偏光対時間のヒストグラム；
（ｖ）  蛍光強度対蛍光偏光の散乱図；
（ｖｉ）  蛍光偏光対蛍光強度の散乱図；
（ｖｉｉ）  平均蛍光強度；
（ｖｉｉｉ）  蛍光強度の標準偏差；
（ｉｘ）  蛍光強度の標準誤差；
（ｘ）  平均蛍光偏光；
（ｘｉ）  蛍光偏光の標準偏差；および
（ｘｉｉ）  蛍光偏光の標準誤差
から成る群より選択された少なくとも１つのアイテムを得るために前記結果を処理するステップ
を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヒストグラムがエラー・バーを含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記処理するステップが
（１）  コンピュータ・スクリーン上に前記少なくとも１つのアイテムのうちの少なくとも１つを提示するステップ；
（２）  プリンターで前記少なくとも１つのアイテムのうちの少なくとも１つを印刷するステップ；
（３）  プロッターで前記少なくとも１つのアイテムのうちの少なくとも１つをプロットするステップ；
（４）  データ記憶装置に前記少なくとも１つのアイテムのうちの少なくとも１つを記憶するステップ
から成る群より選択された少なくとも１つのサブステップをさらに含む請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野および背景）
本発明は、細胞の感受性を試験するための光学的方法である。本方法は、細胞の薬物感受性、すなわち化学的もしくは生物学的物質への曝露後の生存率を試験するための細胞測定法に依存している。
腫瘍学の領域における主要な臨床的問題は、組織病理学的特徴によって同一と分類されたがんがそれらの薬物感受性では高度に個性的である点にある。現在の治療は、しばしば類似の疾患タイプおよび疾患期を有する患者を対象に実施されたランダムな臨床試験の結果に基づいて行われている。だが残念なことに、これらの治療プロトコールは、期待通りに反応する患者数が極めて限られていることを示している。
【０００２】
最近数年間は、潜在的により効果的であると思われる化学療法レジメンを選択するため、および潜在的に効果が得られないと思われる薬剤の毒性を回避するために、数種の異なる化学感受性および化学抵抗性分析法が開発されてきた。ＨａｍｂｕｒｇｅｒとＳａｌｍｏｎは、形質転換した細胞が軟質寒天上で増殖し、引き続いてコロニーを形成する独特の能力に基づいて、コロニー原性分析法の一部修正法を開発した（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ， Ａ．Ｗ．，及びＳａｌｍｏｎ， Ｓ．Ｅ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９７：４６１，１９７６）。これに、核酸前駆物質であるチミジンの放射性標識［３Ｈ］を用いて評価率の向上（培養に成功可能な腫瘍の数）およびより短時間の分析法を保証するコロニー原性分析法が続いた（Ｔａｎｉｇａｗａ， Ｎ．ら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４２：２１５９−２１６４， １９８２；Ｋｅｒｎ， Ｄ．Ｈ．ら，同書、 ４５： ５４３６−５４４１， １９８５）。例えば色素排除試験（Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌ， Ｌ．Ｍ．ら， 同書、４３：７４９−７５７， １９８３）およびゲル支持一次培養分析法（Ｖｅｓｃｉｏ， Ｒ．Ａ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：５０２９−５０３３， １９８７）のような新規方法もまた開発され、それに続いて市販で入手できる蛍光細胞プリント （Ｒｏｔｍａｎ， Ｂ．ら， Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐ． Ｂｉｏｌ． ２４：１１３７−１１４６， １９８８）および最大薬物耐性試験（Ｋｅｒｎ， Ｄ．Ｈ． ａｎｄ Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌ， Ｌ．Ｍ．， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８２：５８２−５８８， １９９０）が開発された。がん細胞の化学感受性を試験するためのさらに別の方法は、米国特許第５，３５６，７９３号に記載されている。
上記の先行技術の重大な欠点は、コロニー形成のために必要な培養時間が長いことである。多くの場合、腫瘍細胞を培養することは、不可能である。
さらに、近年の科学文献は、これらの分析法のいずれかが患者生存率の向上に結びついていることを証明した臨床試験は、ないことを示唆している（Ｂｒｏｗｎ， Ｅ． ａｎｄ Ｍａｒｋｍａｎ， Ｍ．， Ｃａｎｃｅｒ ７７：１０２０−１０２５， １９９６）。
【０００３】
セルスキャン（ＣｅｌｌＳｃａｎ）は、１０，０００ウエルを含む独特の細胞担体グリッドを備えた、レーザーを用いるノンフローサイトメーターであり、ウエル各１つに細胞１個を収容できる（Ｄｅｕｔｃｈ， Ｍ． ａｎｄ Ｗｅｉｎｒｅｂ， Ａ．， Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １６：２１４−２２６， １９９４）。この装置は、米国特許第４，７２９，９４９号、第４，７７２，５４０号、第５，２７２，０８１号、第５，３１０，６７４号および第５，５０６，１４１号に記載された新規の技術に基づいている。この技術を使用することで、異質細胞集団中の個別細胞の蛍光強度および偏光を迅速にかつ反復して監視することができるので、それにより外部刺激への経時的な特異的細胞反応に関する重要な情報が得られる。セルスキャンは、識別可能な位置に置かれた単一の非付着性細胞の特性解析を可能にする唯一の自動細胞測定法である。
このように、上記の制限のない抗がん剤に対するヒトがん細胞の感受性を試験する方法に対しては、その必要性が広く認識されており、それが得られれば非常に有益であろう。
【０００４】
（発明の概要）
本発明によると、薬物に対する細胞の薬物感受性（あるいは、薬物耐性）を試験する方法が提供される。本方法は、液体中の細胞懸濁液を調製するステップ；細胞の一部分を薬物に曝露するステップ；細胞を所定の場所に個別に存在させ、細胞に測定可能な程度の蛍光を付与できる少なくとも１つの物質を懸濁液中の細胞に添加するステップ；各個別細胞が所定の場所の１つに正確に対応し、さらにそれらの所定の場所へ分析装置が個別にアクセスできるようにし；および細胞の薬物感受性（あるいは、薬物耐性）を決定する手段として、分析装置によって所定の場所における細胞の少なくとも一部分を少なくとも１回分析するステップを含む。
【０００５】
下記に記載する本発明の好適な実施形態におけるさらに別の特徴によると、薬物はウイルス、ミセルおよびリポソームから成る群より選択されたいずれかの単位体に封入される。
下記の好適な実施形態におけるさらに別の特徴によると、薬物は、核酸である。
下記の好適な実施形態におけるさらに別の特徴によると、細胞は、培養皿で培養されて、その後採取される。
下記の好適な実施形態におけるさらに別の特徴によると、細胞は、タンパク質分解酵素を用いて採取される。
下記の好適な実施形態におけるさらに別の特徴によると、タンパク質分解酵素は、トリプシンである。
下記の好適な実施形態におけるさらに別の特徴によると、細胞は、少なくとも１回洗浄される。
下記の好適な実施形態におけるさらに別の特徴によると、細胞は、測定可能な程度の蛍光を付与できる物質と一緒に培養される。
下記の好適な実施形態におけるさらに別の特徴によると、測定可能な程度の蛍光を付与できる物質は、生きている細胞のミトコンドリアを区別して染色する物質；生きている細胞を区別して染色する蛍光物質の前駆物質；および核酸を染色する蛍光物質から成る群より選択される。
下記の好適な実施形態におけるさらに別の特徴によると、本方法は、さらに分析の結果を報告するステップを含んでいる。
【０００６】
下記の好適な実施形態におけるさらに別の特徴によると、本方法は、さらに結果を処理し、蛍光強度対細胞数のヒストグラム；蛍光偏光対細胞数のヒストグラム；蛍光強度対時間のヒストグラム；蛍光偏光対時間のヒストグラム；１つの波長範囲での蛍光強度対別の波長範囲での蛍光強度の散乱図；蛍光強度対蛍光偏光の散乱図；蛍光偏光対蛍光強度の散乱図；平均蛍光強度；蛍光強度の標準偏差；蛍光強度の標準誤差；平均蛍光偏光；蛍光偏光の標準偏差；および蛍光偏光の標準誤差から成る群より選択された少なくとも１つのアイテムを得るステップを含んでいる。
下記の好適な実施形態におけるさらに別の特徴によると、ヒストグラムは、エラー・バーを含む。
下記の好適な実施形態におけるさらに別の特徴によると、処理するステップは、さらに、コンピュータ・スクリーン上で少なくとも１つのアイテムのうちの少なくとも１つを提示するステップ；プリンターで少なくとも１つのアイテムのうちの少なくとも１つを印刷するステップ；プロッター上で少なくとも１つのアイテムのうちの少なくとも１つをプロットするステップ；およびデータ記憶装置上に少なくとも１つのアイテムのうちの少なくとも１つを記憶するステップから成る群より選択された少なくとも１つのサブステップを含む。
【０００７】
（発明の詳細な説明）
本発明を、例示する目的でのみ、添付の図面を参照しながら説明する。特に、図面を詳細に参照するにあたり、示される細目は例であり、本発明の好適な実施形態を具体的に考察する目的でのみ示されており、最も有用であり本発明の原理および概念上の態様の説明が容易に理解されると考えられるものを提供するために提示されていることを強調しておきたい。この点について、本発明の構造的な詳細を本発明の基本的理解のために必要以上に詳細に示そうとはしておらず、図面と一緒に説明すれば、本発明の数種の形態が実際にどのように具体化できるのかは、当業者には明白であろう。
本発明は、個々の細胞を正確に分析するために使用できる化学的および生物学的処理に対する細胞の感受性（あるいは耐性）を試験するための光学的方法である。
詳細には、本発明は腫瘍標本から導かれる細胞の治療薬に対する反応に関する予測精度を増加させるために使用することができる。
本発明による化学的および生物学的処理に対する細胞の感受性を試験するための方法の原理および操作は、添付の図面および説明を参照すると、より明確に理解できる。
【０００８】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明の適用は、下記の説明に記載した、または図面に示した構成の詳細および構成要素の配列に限定されないことが理解されなければならない。本発明は、他の実施形態にすることも、または様々な方法で実践もしくは実施することもできる。同様に、ここで使用する語法および用語は、説明を目的としており、限定的なものと見なすべきではないことが理解されなければならない。本発明によると、薬物に対する細胞の薬物感受性を試験するための方法１０が提供される。方法１０には、細胞を液体中に懸濁させるステップ５０が含まれる。液体は、例えば食塩水、緩衝食塩水または細胞培地であってもよい。本方法には、さらに懸濁液中の細胞の少なくとも一部分を薬物に曝露させるステップ７０および測定可能な程度の蛍光を付与できる少なくとも１つの物質を添加するステップ８０が含まれる。さらに本方法には、細胞を所定の場所で個別に存在させるステップ９０も含まれる。これは、各個別細胞が所定の場所の１つに正確に対応するように、さらに所定の場所に分析装置が個別にアクセスできるように行われる。当業者であれば、市販で入手可能な分析装置を本発明の方法と一緒に使用するために組み込むことができよう。そのような分析装置の１つの例は、セルスキャン（ＣｅｌｌＳｃａｎ）（登録商標）（Ｍｅｄｉｓ−Ｅｌ社製、ヤフード、イスラエル）であるが、他の装置も本方法の実施手順を大きく変更せずに使用できよう。本方法には、さらに細胞の薬物感受性を決定する手段として、所定の場所で分析装置によって細胞の少なくとも一部分を少なくとも１回分析するステップ１１０が含まれる。
その薬物は、例えばウイルス、ミセルおよびリポソームから成る群より選択されたいずれかの単位体に封入されてよい。本発明のある実施形態によれば、その薬物は、核酸である。ある場合には、細胞は、培養皿中で培養され、その後で採取される。細胞を採取するステップ４０は、例えば組織培養中での細胞採取のために一般的に使用されるトリプシンまたはその他の市販で入手できる酵素のようなタンパク質分解酵素であってよい。典型的には、必ずしも洗浄するとは限らないが、細胞は、少なくとも１回洗浄される。
【０００９】
方法１０（図１）によれば、細胞は、測定可能な程度の蛍光を付与できる物質と一緒に培養される。測定可能な程度の蛍光を付与できる物質は、例えば、生きている細胞のミトコンドリアを区別して染色する物質、生きている細胞を区別して染色する蛍光物質の前駆物質または核酸を染色する蛍光物質であってよい。
方法１０には、さらに分析の結果を報告するステップが含まれてよい。
方法１０には、さらに結果を処理するステップが含まれてよい。この処理するステップは、例えば、蛍光強度対細胞数のヒストグラム、蛍光偏光対細胞数のヒストグラム、蛍光強度対時間のヒストグラム、蛍光偏光対時間のヒストグラム、蛍光強度対蛍光偏光の散乱図、平均蛍光強度、蛍光強度の標準偏差、蛍光強度の標準誤差、平均蛍光偏光、蛍光偏光の標準偏差および蛍光偏光の標準誤差を生成することができる。これらのヒストグラムは、エラー・バーを含んでいることがある。
処理するステップは、さらに少なくとも１つのアイテムのうちの少なくとも１つをコンピュータ・スクリーン上で提示するステップ１３０、少なくとも１つのアイテムのうちの少なくとも１つをプリンターで印刷するステップ１４０、少なくとも１つのアイテムのうちの少なくとも１つをプロッター上にプロットするステップおよび少なくとも１つのアイテムのうちの少なくとも１つをデータ記憶装置上に記憶するステップ１５０、１６０から成るサブステップ（これには限定されないが）を含んでいる。各細胞から付与された光線が測定される１１０。
【００１０】
培養した細胞は、いつでも例えばＰＢＳのようないずれかの種類の緩衝液を用いて洗浄できるが、ＰＢＳには例えばカルシウムまたはマグネシウムのような二価カチオンを補充してよい。当業者であれば、例えば、緩衝食塩水、または適当な濃度の適切な洗浄剤を含有する緩衝食塩水のような別の適切な洗浄溶液を選択できるであろう。
蛍光は、物質が生きている細胞の内部で化学変化した後に、または培養した細胞の中の例えば生きている細胞の核酸もしくはミトコンドリアのような特定の標的に結合した後に付与されてよい。
さらに別の好適実施形態によれば、培養した細胞は、薬物および測定可能な程度の蛍光を付与できる物質へ連続的に曝露させるために培養中に振とうまたは攪拌されてよい。
ある場合には、本方法にはコンピュータ・スクリーン上にダイアグラムまたは統計的パラメーターのうちの少なくとも１つを提示するステップ１３０が含まれる。
【００１１】
下記の好適な実施形態におけるさらに別の特徴によれば、ダイアグラムおよび統計的パラメーターのうちの少なくとも１つは、印刷されてよい１４０。ダイアグラムおよび統計的パラメーターのうちの少なくとも１つは、ダイアグラムとしてプロットされても、あるいは磁気媒体のようないずれかの媒体に記憶されてもよい１５０。本明細書および添付のクレームでは、語句「磁気媒体」は、フロッピー（登録商標）ディスク、ジップ（ｚｉｐ）ディスクやジャズ（ｊａｚｚ）ディスク、および例えばコンパクトディスクのような光媒体１６０が含まれるが、それらに限定されない。
がん細胞は、例えば充実性腫瘍の生検または採血のような当業者にはよく知られている方法によって患者から採取する。
本明細書および添付のクレームでは、用語「薬物」は、がん患者の化学療法において使用する可能性がある、当業者には知られているあらゆる物質または医薬組成物を意味する。薬物の定義には、さらにそれらの有効性が判明していなくても治療における使用可能性について分析されている物質が含まれる。
本発明のその他の目的、利点および新規の特徴は、限定することを意図していない下記の実施例を検討すれば当業者には明白になるであろう。さらに、上記で記述し、特許請求の範囲で請求した本発明の様々な実施形態および態様の各々は、下記の実施例において実験的に裏付けられている。
本発明は、１つ以上の薬物への悪性腫瘍細胞の感受性の統計的解析を許容する迅速で便利かつ自動化された方法を提供することにより、現在知られている構成の欠点を解決するのに成功した。
【００１２】
材料および実験方法
下記の材料および方法は、下記の特定実施例とともに提供される。
細胞培養：Ｔ８０およびＴ４７Ｄヒト乳がん細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（バイオロジカル・インダストリーズ［Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ］社製、ベイト・ヘメク、イスラエル）、４ｍＭグルタミン（バイオロジカル・インダストリーズ社製）、１００μ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、１２．５単位／ｍｌナイスタチン（バイオロジカル社製）および０．２単位／ｍｌインスリン（リリー［Ｌｉｌｌｙ］社製、Ｆｅｇｅｒｓｈｅｉｍ、フランス）を補充したＤＭＥＭ中でルーチン的に培養した。
約２×１０５細胞を６ウエル・プレート上で平板培養し、付着するように一晩放置した。２つの異なる濃度の異なる薬物を２４、４８および７２時間にわたって添加し、その後トリプシンにより細胞を採取し、遠心分離し、染色するまで培地中にて再懸濁させた。
【００１３】
細胞染色およびローディング：
特定の時点の各処理につき３つのサンプルを調製し、各々を異なる色素で染色した：フルオレセイン二酢酸エステル（ＦＤＡ）、ローダミン１２３（Ｒｈ１２３）、およびアクリジン・オレンジ（ＡＯ）。
ＦＤＡは、生きている細胞の内部に蓄積して加水分解し、フルオロクロマジー（ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍａｓｉａ）と呼ばれるプロセスによって蛍光分子であるフルオレセインを生成する非蛍光分子である（Ｒｏｔｍａｎ， Ｂ．及びＰａｐｅｒｍａｓｔｅｒ， Ｂ．Ｗ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５５：１３４−１４１， １９６６）。
懸濁液中の細胞は、最終濃度が２．４μモルのＦＤＡを用いて５分間染色した。その後細胞を細胞担体上にローディングし、Ｍｇ＋２およびＣａ＋２を補充したＰＢＳを用いて２回洗浄し、蛍光強度および偏光をＨｅ／Ｃｄレーザーを使用するセルスキャン（登録商標）電気光学式スキャナーにより測定した。
Ｒｈ１２３は、生きている細胞のミトコンドリア内に選択的に蓄積し、その特異的取り込みおよび放出がミトコンドリア膜電位に依存する脂肪親和性カチオンの蛍光色素である（Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｌ．Ｖ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７７：９９０−９９４， １９８０；Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｌ．Ｖ．ら， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ８８：５２６−５３５， １９８１）。近年、膜電位の消失は、初期のアポトーシスと結び付けられてきた（Ｃｏｓｓａｒｉｚｚａ， Ａ． ら， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ． Ｒｅｓ． ２１４：３２３−３３０， １９９４；Ｌｉｚａｒｄ， Ｇ．ら， Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ２１：２７５−２８３， １９９５；Ｐｅｔｉｔ， Ｐ．Ｘ．ら， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １３０：１５７−１６５， １９９５）。
Ｒｈ１２３（１μｇ／ｍｌ最終濃度）は、培地中で懸濁させた細胞に３７℃で３０分間添加した。その後でＭｇ＋２およびＣａ＋２を補充した低温ＰＢＳを用いて細胞を２回洗浄し、細胞担体上にローディングし、アルゴンレーザーを使用する電気光学式スキャナーにより蛍光強度および偏光を測定した。
【００１４】
ＡＯは、通常、固定または透過化処理された細胞中の核酸に対する直接プローブとして使用される。濃度およびｐＨの適切な条件下で使用した場合は、二本連鎖ＤＮＡに結合すると明るい緑色蛍光を発し、一本連鎖ＲＮＡに結合すると濃い赤色蛍光を発するので、細胞のＤＮＡ含有量および転写活性の推定に役立たせることができる。ＡＯを細胞担体に直接添加し、１０μｇ／ｍｌの最終濃度で細胞に５分間ローディングし、グリッド上で直接２回洗浄し、アルゴンレーザーを使用する電気光学式スキャナー上で測定した。
【００１５】
電気光学式スキャナーによる測定：
Ｄｅｕｔｃｈ， Ｍ．およびＷｅｉｎｒｅｂ， Ａ．（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １６：２１４−２２６， １９９４）に詳細に記載されているように、染色後（Ｒｈ１２３およびＦＤＡの場合）または染色前（ＡＯの場合）に、２×１０６細胞／ｍｌの細胞懸濁液９０μｌを細胞担体グリッド上にローディングした。このグリッドについては、米国特許第４，７２９，９４９号、第４，７７２，５４０号、第５，２７２，０８１号、第５，３１０，６７４号および第５，５０６，１４１号に記載されている。簡潔に述べると、細胞担体グリッドは、緩衝液を充填したリザーバーを含んでいるホルダー上に取り付けられた１００×１００の円錐形ウエルのアレイから構成される。軽度の陰圧をかけると、１ウエルあたり細胞１個を捕捉できる。この手順に続いて、それらの場所を変えずに細胞を洗浄または再染色することができる。
ＦＤＡ染色細胞を励起させるためには、Ｈｅ／Ｃｄレーザー（４４２ｎｍ、励起出力：４．５μＷ（マイクロワット））を利用し、５２７ｎｍで発光を測定した。ＡＯおよびＲｈ１２３染色細胞の検出には、アルゴンレーザー（４８８ｎｍ、励起出力：１５μＷ（マイクロワット））を利用し、５３０ｎｍで発光を測定した。
２０×２０ウエルを含有する領域の蛍光発光は、各細胞について同一数（１０，０００）の光子が計測されるプレセット光子計数モードを使用して測定し、強く発光する細胞と弱く発光する細胞からの精度差を解消した。各細胞についての蛍光強度（ＦＩ）および偏光（ＦＰ）は、オンラインで測定した。
データ処理および解析：
提示した偏光および強度値は、スキャン領域で各細胞について測定した平均値である。同一サンプルについて、実験誤差として標準偏差を使用して連続２回の測定を実施した。
【００１６】
【実施例】
ここで、上記の説明と一緒に非限定的方法で本発明を例示している下記の実施例を参照されたい。
発明者らは、実験モデルとして２つのヒト乳がん細胞株を使用して、グリッド（例えば、セルスキャン（登録商標）グリッド、Ｍｅｄｉｓ−Ｅｌ社製、ヤフード、イスラエル）上に細胞を配置した後にそれらをスキャニングすることによって観察できる変化を確定した。その結果は、ヒト充実性腫瘍から採取した組織生検についてこれらの測定値を適用する前に薬物有効性と相関させることができる。
一般に、ここで使用する用語および本発明で利用した実験手順には、医学的および細胞生物学的技術が含まれている。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、次に記載されている一連の方法を参照されたい：
“Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（細胞生物学：実験ハンドブック）”，第Ｉ〜ＩＩＩ巻，Ｃｅｌｌｉｓ， Ｊ．Ｅ．， 編集（１９９４）；“Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ−Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（動物細胞の培養−基本技術マニュアル）”，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｒ．Ｉ．， 編集（２０００）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（動物細胞培養）”，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｒ．Ｉ．， 編集（１９９２）。
上記は全部、ここに完全に記載されているごとく参考文献として記載されている。その他の一般的文献は、この明細書を介して提供される。ここに記載する手順は、当分野においてよく知られているが、読者の便宜のために提供される。この中に含まれるすべての情報は、参考文献としてここに記載されている。
【００１７】
【実施例１】
細胞染色およびローディング
細胞染色の目的は、蛍光測定できるように細胞を調製することであり、このため測定可能な程度の蛍光を付与できる色素を用いて細胞を染色した。下記に示した結果は、細胞染色にＲｈ１２３、ＦＤＡまたはＡＯを使用した実験についてのものであるが、ここに提示していない別の実験では、他の蛍光色素を使用した。
ナベルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）および５−フルオロウラシル（５ＦＵ）を各々Ｔ８０およびＴ４７Ｄ細胞に低用量および高用量で２４、４８および７２時間にわたり添加した。細胞は、死細胞を取り除くためにトリパンブルーを使用して、電気光学式スキャナーに依存せずに薬物有効性を推定するために血球計算器で計数した。結果は、図２に示した。パネル１８０は、ナベルビンが感受性細胞（Ｔ８０）に及ぼす作用を示している。パネル１８１は、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）が耐性細胞（Ｔ４７）に影響を及ぼさないことを示している。細胞計数により、使用した全濃度において処理開始後すでに２４時間にわたりナベルビンがＴ８０細胞に毒性作用を及ぼすことが明らかになった（パネル１８０）。他方、Ｔ４７Ｄ細胞は、薬物曝露後に計数した細胞数への薬物の軽度もしくは有意ではない作用から認められた通り、５ＦＵに対して耐性があると思われる（パネル１８１）。
【００１８】
【実施例２】
電気光学式スキャナーによる測定、データ処理および解析
この測定の目的は、単一細胞によって付与された蛍光の変化を経時的に追跡することである。細胞計数で観察された細胞の薬物への感受性または耐性を電気光学式スキャナーのパラメーターと相関付ける意図で、発明者らは細胞を異なる蛍光色素で染色し、異なる時点で対照細胞および処理細胞の蛍光強度（ＦＩ）および蛍光偏光（ＦＰ）を測定した。
Ｒｈ１２３蛍光測定から関係付けられたナベルビン感受性細胞（Ｔ８０）と５ＦＵ耐性細胞（Ｔ４７Ｄ）との比較は、図３に示した。対照の未処理細胞と比較して、ナベルビン処理Ｔ８０細胞ではＲｈ１２３蛍光強度の低下は、明白かつ顕著に有意であった（パネル１８２）。他方、５ＦＵ処理に対して耐性を示したＴ４７Ｄ細胞では、蛍光強度における有意な変化は、観察されなかった（パネル１８３）。計数した細胞数から推定された増殖阻害の程度とＲｈ１２３染色細胞について測定された蛍光強度における低下との間には極めて明白な相関が見出された。
【００１９】
図４は、１度に１個の細胞を測定した場合のＲｈ１２３蛍光の結果を示している。Ｒｈ１２３染色ナベルビン感受性Ｔ８０細胞の薬物曝露後における平均蛍光強度の低下は、処理開始１日後に明白であったが（パネル１８４〜１８６）、これに比較してＲｈ１２３染色５ＦＵ耐性Ｔ４７Ｄ細胞の薬物曝露後における平均蛍光強度の有意な変化は見られなかった（パネル１８７〜１８９）。
薬物曝露後の染色したナベルビン感受性Ｔ８０細胞によって付与されたＦＤＡ蛍光の平均偏光の増加は、電気光学式スキャナーによってはっきりと観察された（図５、パネル１９０）。平均偏光の増加が有意であったが、これに比較してＦＤＡ染色５ＦＵ耐性Ｔ４７Ｄ細胞の薬物曝露後における平均蛍光偏光の有意な変化は見られなかった（図５、パネル１９１）。
図６は、細胞を１度に１個ずつ測定した場合のＡＯ蛍光の結果を示している。ＡＯ染色ナベルビン感受性Ｔ８０細胞の薬物曝露後における平均蛍光強度の低下は、処理開始１日後に明白であったが（パネル１９２〜１９４）、これに比較してＡＯ染色５ＦＵ耐性Ｔ４７Ｄ細胞の薬物曝露後における平均蛍光強度の有意な変化は見られなかった（パネル１９５〜１９７）。
【００２０】
これらの結果は、単一細胞から発光された蛍光を測定するために化学的および生物学的処理への細胞の感受性（あるいは耐性）を試験するための確実な方法として電気光学式スキャナーグリッドを使用する意義があることを証明している。
これまで本発明を特定の実施形態とともに説明してきたが、当業者には多くの代替、変更および変形が明白であろう。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および幅広い範囲に含まれるこのような代替、変更および変形をすべて包含することが意図されている。
本明細書で言及したすべての出版物、特許および特許出願は、各個別の出版物、特許および特許出願が参考文献としてここに記載されていると詳細かつ個別に指示されたのと同程度に、その全体が参考文献として本明細書に記載されている。さらに、本出願でのあらゆる参考文献の引用または識別は、このような参考文献を本発明の先行技術として利用できるということを承認するものであると解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
化学処理に対する細胞の感受性を試験する方法を説明したフローチャートである。
【図２】
トリパンブルー染色によって死細胞を取り除いた後で血球計数器内の生存細胞を計数することによって化学処理後の感受性細胞および耐性細胞の用量依存性の細胞生存性を測定した結果を示した棒グラフである。
【図３】
化学処理後の感受性細胞および耐性細胞によって付与されたローダミン１２３（Ｒｈ１２３）の蛍光強度を測定した用量依存性の結果を示した棒グラフである。
【図４】
蛍光強度（ＦＩ、垂直軸）および蛍光偏光（ＦＰ、水平軸）によって特性解析されたＲｈ１２３染色感受性細胞および耐性細胞集団を示したグラフである。
【図５】
感受性細胞および耐性細胞における薬物なし（ダークグレーの列）、低用量（ライトグレーの列）および高用量（黒色の列）の薬物を用いての処理後の、フルオレセイン二酢酸エステル（ＦＤＡ）で染色した細胞に実施した蛍光偏光測定の結果を示したヒストグラムである。
【図６】
蛍光強度（ＦＩ、垂直軸）および蛍光偏光（ＦＰ、水平軸）によって特性解析された感受性細胞および耐性細胞の薬物処理後の、アクリジン・オレンジ（ＡＯ）で染色した細胞集団を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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