(57)【要約】本願発明は、ペプチドに結合したＭｅｔＡＰ−２阻害コアを含む血管新生阻害化合物とともに、前記血管新生阻害化合物を含む薬学的組成物および薬学的に許容な担体を提供する。本願発明はまた、対象におけるたとえば癌などの血管新生疾患を、１種類以上の本願発明の血管新生薬を治療上有効な量、対象に投与することによって治療する方法を提供する。
2004531466.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化１の化合物であって、
【化１】
2004531466.tif 000075
当該化学式では
ＡはＭｅｔ−ＡＰ２阻害コアであって、
ＷはＯまたはＮＲ２であって、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に水素またはアルキルであって、
Ｘはアルキレンまたは置換アルキレンであって、
ｎは０または１であって、
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立に水素、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アリール、または置換若しくは非置換ヘテロアリールであるか、或いはＲ３およびＲ４がともに炭素原子に結合して炭素環基または複素環基を形成するか、或いはＲ３およびＲ４がともにアルキレン基を形成しているか、であって、
Ｚは−Ｃ（Ｏ）−またはアルキレン−Ｃ（Ｏ）−であって、
Ｐは１乃至約１００のアミノ酸からなるペプチドであって、そのアミノ末端がＺまたはＯＲ５基もしくはＮ（Ｒ６）Ｒ７基に結合し、当該化学基において
Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７はそれぞれ独立に水素、アルキル、置換アルキル、アザシクロアルキル、または置換アザシクロアルキルであるか、若しくはＲ６およびＲ７がともに窒素原子に結合して置換または非置換複素環構造を形成するか、であるか、または
Ｚは−Ｏ−、−ＮＲ８−、アルキレン−Ｏ−、またはアルキレン−ＮＲ８−であって、ここでＲ８は水素またはアルキルであって、Ｐは水素、アルキル、または１乃至約１００のアミノ酸残基からなっておりそのカルボキシ末端でＺに結合するペプチドである、化合物。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物であって、当該化合物においてＲ１、Ｒ３、およびＲ４の少なくとも１つが置換または非置換アルキル基である、化合物。
【請求項３】
請求項２に記載の化合物であって、当該化合物においてＲ１、Ｒ３、およびＲ４の少なくとも１つが置換または非置換の直鎖、分岐または環状のＣ１−Ｃ６アルキル基である、化合物。
【請求項４】
請求項３に記載の化合物であって、当該化合物において、Ｒ１、Ｒ３、およびＲ４の少なくとも１つが直鎖または分岐鎖Ｃ１−Ｃ４アルキル基である、化合物。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物であって、当該化合物においてＲ３およびＲ４の１つが置換若しくは非置換アリール基、置換若しくは非置換ヘテロアリール基、置換若しくは非置換ヘテロアリールアルキル基、または置換若しくは非置換アリールアルキル基である、化合物。
【請求項６】
請求項５に記載の化合物であって、当該化合物においてＲ３およびＲ４の１つがフェニル、ナフチル、インドリル、イミダゾリル、ピリジル、ベンジル、ナフチルメチル、インドリルメチル、イミダゾリルメチル、およびピリジルメチルからなる群から選択される、化合物。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物であって、当該化合物においてｎが１であって、ＸがＣ１−Ｃ６−アルキレンである、化合物。
【請求項８】
請求項７に記載の化合物であって、当該化合物においてＸがメチレンまたはエチレンである、化合物。
【請求項９】
請求項１に記載の化合物であって、当該化合物においてＺがＣ１−Ｃ６−アルキレン−Ｃ（Ｏ）−である、化合物。
【請求項１０】
請求項９に記載の化合物であって、当該化合物においてＺがメチレン−Ｃ（Ｏ）−またはエチレン−Ｃ（Ｏ）−である、化合物。
【請求項１１】
請求項１に記載の化合物であって、Ｒ６およびＲ７の少なくとも１つがアルキル、置換アルキル、置換若しくは非置換アザシクロアルキル、または置換若しくは非置換アザシクロアルキルである、化合物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の化合物であって、当該化合物においてＲ６およびＲ７の少なくとも１つがＮ−アルキル置換基を有するアザシクロアルキル基である、化合物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の化合物であって、当該化合物においてＮ−アルキル置換基がＣ１−Ｃ４−アルキル基である、化合物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の化合物であって、当該化合物においてＮ−アルキル置換基がメチル基である、化合物。
【請求項１５】
請求項１に記載の化合物であって、当該化合物においてＲ６およびＲ７がともに窒素原子に結合し、置換または非置換の５員環または６員環のアザまたはジアザシクロアルキル基を形成する、化合物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の化合物であって、当該化合物においてＲ６およびＲ７がともに窒素原子に結合し、Ｎ−アルキル置換基を含む置換または非置換の５員環または６員環のジアザシクロアルキル基を形成する、化合物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の化合物であって、当該化合物においてＮ−アルキル置換基がＣ１−Ｃ４アルキル基である、化合物。
【請求項１８】
請求項１７に記載の化合物であって、当該化合物においてＮ−アルキル置換基がメチル基である、化合物。
【請求項１９】
請求項１に記載の化合物であって、当該化合物においてＰがＮＨ２または以下の置換基、
【化２】
2004531466.tif 000076
【化３】
2004531466.tif 000077
のうちの１つである、化合物。
【請求項２０】
式ＸＶに記載の化合物で、
【化４】
2004531466.tif 000078
当該化合物において
ＡはＭｅｔＡＰ−２阻害コアであって、
ＷはＯまたはＮＲであって、
Ｒはそれぞれ独立に水素またはアルキルであって、
Ｚは−Ｃ（Ｏ）−またはアルキレン−Ｃ（Ｏ）−であって、
ＰはＮＨＲ、ＯＲ、または１乃至約１００アミノ酸残基からなりＮ−末端がＺに結合しているペプチドであって、
Ｑは水素、直鎖、分岐鎖、または環状アルキルまたはアリールであって、ここでＰが−ＯＲの場合Ｑは水素ではないか、
または、
Ｚはアルキレン−Ｏ−または−アルキレン−Ｎ（Ｒ）−であって、
Ｐは水素または１乃至約１００アミノ酸残基からなりカルボキシル末端でＺに結合しているペプチドであって、
Ｑは水素、直鎖、分岐鎖、または環状アルキルまたはアリールであって、ここでＰが水素の場合Ｑは水素ではない、化合物と、
薬学的に許容なそれらの塩と、
である化合物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の化合物であって、当該化合物においてＺはＺは−Ｃ（Ｏ）−またはＣ１−Ｃ４−アルキレン− Ｃ（Ｏ）−である、化合物。
【請求項２２】
請求項２１に記載の化合物であって、当該化合物においてＺは− Ｃ（Ｏ）−またはＣ１−Ｃ２アルキレン−Ｃ（Ｏ）−である、化合物。
【請求項２３】
請求項２１に記載の化合物であって、当該化合物においてＱは直鎖、分岐鎖、または環状Ｃ１−Ｃ６アルキル、フェニル、またはナフチルである、化合物。
【請求項２４】
請求項２３に記載の化合物であって、当該化合物においてＱはイソプロピル、フェニル、またはシクロヘキシルである、化合物。
【請求項２５】
請求項１に記載の化合物であって、当該化合物においてＺはＣ１−Ｃ６−アルキレン−Ｏ−またはＣ１−Ｃ６−アルキレン−ＮＲ−である、化合物。
【請求項２６】
請求項２５に記載の化合物であって、当該化合物においてＺはＣ１−Ｃ４−アルキレン−Ｏ−またはＣ１−Ｃ４−アルキレン−ＮＨ−である、化合物。
【請求項２７】
請求項２６に記載の化合物であって、当該化合物においてＺはＣ１−Ｃ２−アルキレン−Ｏ−またはＣ１−Ｃ２−アルキレン−ＮＨである、化合物。
【請求項２８】
請求項２５に記載の化合物であって、当該化合物においてＱは直鎖、分岐鎖、または環状Ｃ１−Ｃ６−アルキル、フェニル、またはナフチルである、化合物。
【請求項２９】
請求項２８に記載の化合物であって、当該化合物においてＱはイソプロピル、フェニル、またはシクロヘキシルである、化合物。
【請求項３０】
請求項２０に記載の化合物であって、当該化合物においてＲはそれぞれ独立に、水素、または直鎖、分岐鎖、若しくは環状Ｃ１−Ｃ６−アルキルである、化合物。
【請求項３１】
請求項３０に記載の化合物であって、当該化合物においてＲはそれぞれ独立に、水素、又は直鎖若しくは分岐鎖Ｃ１−Ｃ４−アルキルである、化合物。
【請求項３２】
請求項３１に記載の化合物であって、当該化合物においてＲはそれぞれ独立に水素またはメチルである、化合物。
【請求項３３】
請求項３２に記載の化合物であって、当該化合物においてＲは水素である、化合物。
【請求項３４】
請求項２０に記載の化合物であって、当該化合物においてＡは式ＩＩＩ
【化５】
2004531466.tif 000079
であって、当該化合物において
Ｒ１は水素またはアルコキシであって、
Ｒ２は水素または水酸基であって、
Ｒ３は水素またはアルキルであって、
Ｄは直鎖または分岐鎖アルキルまたはアリールアルキルであるか、またはＤは
【化６】
2004531466.tif 000080
という構造である、化合物。
【請求項３５】
請求項３４に記載の化合物であって、当該化合物においてＲ１はＣ１−Ｃ４−アルコキシである、化合物。
【請求項３６】
請求項３５に記載の化合物であって、当該化合物においてＲ１はメトキシである、化合物。
【請求項３７】
請求項３４に記載の化合物であって、当該化合物においてＲ３は水素またはＣ１−Ｃ４−アルキルである、化合物。
【請求項３８】
請求項３７に記載の化合物であって、当該化合物においてＲ３はメチルである、化合物。
【請求項３９】
請求項３４に記載の化合物であって、当該化合物においてＤは直鎖、分岐鎖、または環状Ｃ１−Ｃ６−アルキル、またはアリール−Ｃ１−Ｃ４−アルキルである、化合物。
【請求項４０】
請求項２０に記載の化合物であって、当該化合物においてＡは
【化７】
2004531466.tif 000081
【化８】
2004531466.tif 000082
【化９】
2004531466.tif 000083
【化１０】
2004531466.tif 000084
【化１１】
2004531466.tif 000085
【化１２】
2004531466.tif 000086
からなる群から選択され、
当該群において
ｐは０乃至１０の整数であって、
Ｒ１は水素、−ＯＨ、またはＣ１−Ｃ４−アルコキシであって、
Ｘは離脱基であって、
Ｒ２はＨ、ＯＨ、アミノ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、またはジ（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ）である、
化合物。
【請求項４１】
請求項４０に記載の化合物であって、当該化合物においてＡは以下の式
【化１３】
2004531466.tif 000087
である、化合物。
【請求項４２】
請求項２０に記載の化合物であって、当該化合物においてＰは１乃至約２０アミノ酸残基からなる、化合物。
【請求項４３】
請求項４２に記載の化合物であって、当該化合物においてＰはマトリックスメタロプロテアーゼの基質であるアミノ酸配列を含む、化合物。
【請求項４４】
請求項４３に記載の化合物であって、当該化合物において前記マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３ およびＭＭＰ−２６からなる群から選択される、化合物。
【請求項４５】
請求項４４に記載の化合物であって、当該化合物において前記マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ−２またはＭＭＰ−９である、化合物。
【請求項４６】
請求項４５に記載の化合物であって、当該化合物においてＰは配列−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−を含み、当該配列においてＸａａは天然に存在するアミノ酸残基である、化合物。
【請求項４７】
請求項４６に記載の化合物であって、当該化合物においてＰはＰｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｄ−Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｎｖａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｎｖａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ａｌａ−Ａｂｕ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、およびＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）からなる群から選択される配列を含む、化合物。
【請求項４８】
以下の式の化合物であって、
【化１４】
2004531466.tif 000088
当該化合物において
ＷはＯまたはＮＲであって、
Ｒはそれぞれ独立に水素またはＣ１−Ｃ４−アルキルであって、
Ｑは水素、直鎖、分岐鎖、または環状Ｃ１−Ｃ６−アルキル、またはアリールであって、
Ｒ１は水素、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、またはハロゲンであって、
Ｚは−Ｃ（Ｏ）−またはＣ１−Ｃ４−アルキレンであって、
ＰはＮＨＲ、ＯＲ、または１乃至１００アミノ酸残基を含みＮ末端でＺに結合するペプチドであって、或いは
Ｚはアルキレン−Ｏまたはアルキレン−ＮＲであって、
Ｐは水素または１乃至１００アミノ酸残基を含みＣ末端でＺに結合するペプチドである、化合物であるか、
または薬学的に許容なそれらの塩であって、
Ｐが水素、ＮＨＲ、またはＯＲである時にはＱは水素ではない、
化合物。
【請求項４９】
請求項４８に記載の化合物であって、当該化合物において
ＷはＯまたはＮＨであって、
Ｚはアルキレン−Ｏまたはアルキレン−ＮＨであって、
Ｑはイソプロピルであって、
Ｒ１はメトキシであって、
Ｐは１乃至１５アミノ酸残基からなる、
化合物。
【請求項５０】
請求項４９に記載の化合物であって、当該化合物において
ＷはＯであって、
Ｐは１０以下のアミノ酸残基を含む、
化合物。
【請求項５１】
請求項４８に記載の化合物であって、当該化合物においてＰは１乃至約２０アミノ酸残基からなる、化合物。
【請求項５２】
請求項５１に記載の化合物であって、当該化合物においてＰはマトリックスメタロプロテアーゼの基質であるアミノ酸配列を含む、化合物。
【請求項５３】
請求項５２に記載の化合物であって、前記マトリックスメタロプロテアーゼはＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３ およびＭＭＰ−２６からなる群から選択される、化合物。
【請求項５４】
請求項５３に記載の化合物であって、当該化合物において前記マトリックスメタロプロテアーゼはＭＭＰ−２またはＭＭＰ−９である、化合物。
【請求項５５】
請求項５４に記載の化合物であって、当該化合物においてＰは配列−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−を含み、当該配列においてＸａａは天然に存在するアミノ酸残基である、化合物。
【請求項５６】
請求項５５に記載の化合物であって、当該化合物においてＰはＰｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｄ−Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｎｖａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｎｖａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ａｌａ−Ａｂｕ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、ａｎｄ Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）からなる群から選択される配列を含む、化合物。
【請求項５７】
｛（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ）−５−メトキシ−４−［（２Ｒ， ３Ｒ）−２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルオキシカルボニルアミノ｝−３−メチル−ブチル酸メチルエステル、
２−｛（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ）−５−メトキシ−４−［（２Ｒ， ３Ｒ）−２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルオキシカルボニルアミノ｝−３−メチル−ブチル酸メチルエステル、
２−｛（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ）−５−メトキシ−４−［（２Ｒ， ３Ｒ）−２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルオキシカルボニルアミノ｝−４−メチル−ペンタン酸メチルエステル、
｛（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ）−５−メトキシ−４−［（２Ｒ， ３Ｒ ）−２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルオキシカルボニルアミノ｝−フェニル−酢酸メチルエステル、
（１−カルバモイル−２−メチル−プロピル）−カルバミン酸−（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ ）−５−メトキシ−４−［（２Ｒ， ３Ｒ）−２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルエステル、
（１−カルバモイル−２−メチル−プロピル）−カルバミン酸−（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ ）−５−メトキシ−４−［（２Ｒ， ３Ｒ）−２−メチル−３−（３−メチル−ブトイル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルエステル、
（１−ヒドロキシメチル−２−メチル−プロピル）−カルバミン酸−（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ）−５−メトキシ−４−［（２Ｒ， ３Ｒ）− ２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルエステル、
２−｛（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ ）−５−メトキシ−４−［（２Ｒ， ３Ｒ）−２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルオキシカルボニルアミノ｝−３，３−ジメチル−ブチル酸 メチルエステル、
シクロヘキシル−２−｛（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ ）−５−メトキシ−４−［（２Ｒ， ３Ｒ）−２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルオキシカルボニルアミノ｝−酢酸メチルエステル、
２−｛（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ ）−５−メトキシ−４−［（２Ｒ， ３Ｒ）−２−メチル−３−３−メチル−ブト−２−エニル］−オキシラニル｝−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルオキシカルボニルアミノ｝−３−メチル−ペンタン酸メチルエステル、
［１−（１−カルバモイル−２−ヒドロキシ−エチルカルバモイル）−２−メチル−プロピル］−カルバミン酸−（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ ）−５−メトキシ−４−［（２Ｒ， ３Ｒ）−２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル］−オキシラニル−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルエステル、
２−（３−｛（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ ）−５−メトキシ−４−［（２Ｒ， ３Ｒ）−２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イル｝−ウレイド）−３−メチル−ブチラミド、
２−｛（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ）−５−メトキシ−４−［（２Ｒ， ３Ｒ）−２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルオキシカルボニルアミノ｝−３−メチル−ブチル酸、
Ｎ−カルバモイル（ＩＤ＃３１） （３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ） ５−メトキシ−４−［（２Ｒ，３Ｒ）２−メチル−３−（３−メチル−ブチル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルエステル、
Ｎ−カルバモイル（ＩＤ＃３０） （３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ） ５−メトキシ−４−［（２Ｒ，３Ｒ）２−メチル−３−（３−メチル−ブチル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルエステル、
Ｎ−カルバモイル（ＩＤ＃３２） （３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ） ５−メトキシ−４−［（２Ｒ，３Ｒ）２−メチル−３−（３−メチル−ブチル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルエステル、
Ｎ−カルバモイル（ＩＤ＃４０） （３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ） ５−メトキシ−４−［（２Ｒ，３Ｒ）２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルエステル、
Ｎ−カルバモイル（ＩＤ＃３９） （３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ） ５−メトキシ−４−［（２Ｒ，３Ｒ）２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルエステル、
Ｎ−カルバモイル（ＩＤ＃２６） （３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ） ５−メトキシ−４−［（２Ｒ，３Ｒ）２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルエステル、
Ｎ−カルバモイル（ＩＤ＃２７） （３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ） ５−メトキシ−４−［（２Ｒ，３Ｒ）２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルエステル、
（ＩＤ＃２４）−（２Ｒ−｛（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ） ５−メトキシ−４−［（２Ｒ，３Ｒ）２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルオキシカルボニル｝アミノ−３−メチル−ブタノール） エステル、
（ＩＤ＃３６）−（２Ｒ−｛（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ） ５−メトキシ−４−［（２Ｒ，３Ｒ）２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルオキシカルボニル｝ アミノ−３−メチル−ブタノール） エステル、
（ＩＤ＃３７）−（２Ｒ−｛（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ） ５−メトキシ−４−［（２Ｒ，３Ｒ）２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルオキシカルボニル｝ アミノ−３−メチル−ブタノール） エステル、
（ＩＤ＃３８）−（２Ｒ−｛（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ） ５−メトキシ−４−［（２Ｒ，３Ｒ）２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルオキシカルボニル｝ アミノ−３−メチル−ブタノール） エステル、
（ＩＤ＃３４）−（２Ｒ−｛（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ） ５−メトキシ−４−［（２Ｒ，３Ｒ）２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルオキシカルボニル｝ アミノ−３−メチル−ブタノール） エステル、
｛２−メチル−１−［メチル−（１−メチル−ピペリジン−４−イル）−カルバモイル］−プロピル｝−カルバミン酸 ５−メトキシ−４−［２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルエステル、
［１−（２−ジメチルアミノ−エチルカルバモイル）−２−メチル−プロピル］−カルバミン酸 ５−メトキシ−４−［２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イル エステル、
｛１−［（２−ジメチルアミノ−エチル）−メチル−カルバモイル］−２−メチル−プロピル｝−カルバミン酸 ５−メトキシ−４−［２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルエステル、
［１−（３−ジメチルアミノ−プロピルカルバモイル）−２−メチル−プロピル］−カルバミン酸 ５−メトキシ−４−［２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルエステル、
［１−（３−ジメチルアミノ−２，２−ジメチル−プロピルカルバモイル）−２−メチル−プロピル］−カルバミン酸 ５−メトキシ−４−［２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルエステル、
［２−メチル−１−（４−メチル−ピペラジン−１−カルボニル）−プロピル］−カルバミン酸 ５−メトキシ−４−［２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルエステル、
｛２−メチル−１−［２−（１−メチル−ピロリジン−２−イル）−エチルカルバモイル］−プロピル｝−カルバミン酸 ５−メトキシ−４−［２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルエステル、
［２−メチル−１−（４−ピロリジン−１−イル−ピペリジン−１−カルボニル）−プロピル］−カルバミン酸 ５−メトキシ−４−［２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルエステル、および
［１−（４−ベンジル−ピペラジン−１−カルボニル）−２−メチル−プロピル］−カルバミン酸 ５−メトキシ−４−［２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イル エステルからなる群から選択される血管新生阻害化合物。
【請求項５８】
対象における血管新生疾患の治療の方法であって、前記対象に以下の構造
【化１５】
2004531466.tif 000089
を含む血管新生阻害化合物を治療上有効な量投与するステップを含み、
当該構造において
ＡはＭｅｔＡＰ−２阻害コアであって、
ＷはＯまたはＮＲであって、
Ｒはそれぞれ独立に水素またはアルキルであって、
Ｚは−Ｃ（Ｏ）−またはアルキレン−Ｃ（Ｏ）−であって、
ＰはＮＨＲ、ＯＲ、または１乃至約１００アミノ酸残基からなりＮ−末端がＺに結合しているペプチドであって、
Ｑは水素、直鎖、分岐鎖、または環状アルキルまたはアリールであって、ここでＰが−ＯＲの場合Ｑは水素ではなく、
または、
Ｚはアルキレン−Ｏ−または−アルキレン−Ｎ（Ｒ）−であって、
Ｐは水素または１乃至約１００アミノ酸残基からなりカルボキシル末端でＺに結合しているペプチドであって、
Ｑは水素、または直鎖、分岐鎖、または環状アルキルまたはアリールであって、
ここでＰが水素の場合Ｑは水素ではない、構造と、
前記対象において血管新生疾患を治療する薬学的に許容なそれらの塩と、
である、方法。
【請求項５９】
請求項５８に記載の方法であって、当該方法において前記血管新生疾患が自己免疫疾患である、方法。
【請求項６０】
請求項５９に記載の方法であって、当該方法において前記自己免疫疾患がリュウマチ様関節炎である、方法。
【請求項６１】
請求項５８に記載の方法であって、当該方法において前記血管新生疾患が癌である、方法。
【請求項６２】
対象における血管新生疾患の治療の方法であって、前記対象に以下の構造
【化１６】
2004531466.tif 000090
を含む血管新生阻害化合物を治療上有効な量投与するステップを含み、
当該構造において
ＡはＭｅｔ−ＡＰ２阻害コアであって、
ＷはＯまたはＮＲ２であって、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に水素またはアルキルであって、
Ｘはアルキレンまたは置換アルキレンであって、
ｎは０または１であって、
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立に水素、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アリール、または置換または非置換ヘテロアリールであるか、或いはＲ３およびＲ４がともに炭素原子に結合して炭素環基または複素環基を形成するか、或いはＲ３およびＲ４がともにアルキレン基を形成しているか、であって、
Ｚは−Ｃ（Ｏ）−またはアルキレン−Ｃ（Ｏ）−であって、
Ｐは１乃至約１００のアミノ酸からなるペプチドであって、そのアミノ酸末端がＺまたはＯＲ５基もしくはＮ（Ｒ６）Ｒ７基に結合し、当該化学基において
Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７はそれぞれ独立に水素、アルキル、置換アルキル、アザシクロアルキル、または置換アザシクロアルキルであるか、或いはＲ６およびＲ７がともに窒素原子に結合して置換または非置換複素環構造を形成するか、であるか、
または
Ｚは−Ｏ−、−ＮＲ８−、アルキレン−Ｏ−、またはアルキレン−ＮＲ８−であって、ここでＲ８は水素またはアルキルであって、Ｐは水素、アルキル、または１乃至約１００のアミノ酸残基からなりそのカルボキシ末端でＺに結合するペプチドである、
化合物。
【請求項６３】
請求項６２に記載の方法であって、前記血管新生疾患が自己免疫疾患である、方法。
【請求項６４】
請求項６３に記載の方法であって、前記自己免疫疾患がリュウマチ様関節炎である、方法。
【請求項６５】
請求項６２に記載の方法であって、前記血管新生疾患が癌である、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本願は、２００１年１０月５日に提出され係属中の米国特許出願第０９／９７２，７７２号の一部継続出願であり、２０００年１１月１日に提出され係属中の米国特許出願第０９／７０４，２５１号の一部係属出願でもある。前述の各出願の内容全体は引用をもってこれを援用する。
【０００２】
発明の背景
血管新生は新しい血管を形成する基本的なプロセスで、正常な様々な身体活動（生殖、成長および創傷の修復）に必須である。このプロセスは完全に理解されてはいないが、毛細血管の主要細胞である内皮細胞の成長の刺激および阻害の両方を行う分子の複雑な相互作用が関与していると考えられている。通常の条件下では、これら分子は微小血管構造を数週間、または場合によっては数十年間にわたる長期間、休止状態（つまり毛細血管成長のない状態）に維持するように見える。しかし、必要時（たとえば創傷の修復中など）には、同じこれらの細胞は急激に増殖し５日以内に代謝回転することができる（Ｆｏｌｋｍａｎ， Ｊ． ａｎｄ Ｓｈｉｎｇ， Ｙ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２６７（１６）： １０９３１−１０９３４， ａｎｄ Ｆｏｌｋｍａｎ， Ｊ． ａｎｄ Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ， Ｍ． （１９８７） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３５： ４４２−４４７）。
【０００３】
血管新生は正常な状況下では高度に制御されたプロセスだが、多くの疾患（「血管新生疾患」として特徴づけられる）は、制御されていない持続的な血管新生に起因している。 他に定義されない限り、制御されていない血管新生は特定の疾患を直接引き起こすか、または既存の病理学的症状の悪化を引き起こす可能性がある。たとえば、眼の異常新生血管は失明の原因では最多であると示唆されており、約２０種類の眼疾患がこれに起因する。関節炎など特定の既存の症状では、新しく形成された毛細血管が関節に侵入し、軟骨を破壊する。糖尿病では、網膜に新しく形成された毛細血管が硝子体に侵入し、出血して失明を引き起こす。充実性腫瘍の増殖および転移も血管新生に依存している（Ｆｏｌｋｍａｎ， Ｊ． （１９８６） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４６： ４６７−４７３ ａｎｄ Ｆｏｌｋｍａｎ， Ｊ． （１９８９） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ８２： ４−６）。たとえば、２ｍｍを超える大きさに拡大した腫瘍は血液を得なければならず、新しい毛細血管の成長を誘導することによって血液を獲得する。このような新しい血管が腫瘍に埋まってしまうと、腫瘍細胞が循環器系に侵入し、肝、肺、または骨など遠方の部位に転移するための手段になる（Ｗｅｉｄｎｅｒ， Ｎ．， ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３２４（１）：１−８）。
【０００４】
フマジリンは抗菌薬および抗原虫薬として用いられる既知の化合物である。その物理化学的特性と生成方法は公知である（米国特許第２，８０３，５８６号、およびＰｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９６２） ４８：７３３−７３５）。フマジリンおよびフマジリン類似体の特定の種類も抗血管新生活性を示すことが報告されている。しかし、このような阻害物質（ＴＮＰ−４７０など）の使用は、急速な代謝分解、血液値の異常、および中枢神経系（ＣＮＳ）の副作用による用量制限によって制約を受けることもある。
【０００５】
したがって、いまだに、より強力で、神経毒性が少なく、安定で、および／または血清の半減期が長い血管新生阻害物質の必要性がある。
【０００６】
発明の概要
本願発明は、たとえばフマジリンコアなど、ペプチドに結合したメチオニンアミノペプチダーゼ２（ＭｅｔＡＰ−２）を阻害すると考えられているコアを有する、血管新生阻害化合物を提供する。本願発明は、ＭｅｔＡＰ−２阻害コアをアミノ酸残基またはアミノ酸誘導体とカップリングさせると血管新生阻害化合物の代謝分解を防いで、優れた薬物動態学的プロフィールが得られ、血管新生阻害化合物の血液脳関門の通過能が変化して中枢神経系の副作用が抑制されるという発見に、少なくとも部分的に基づいている。本願発明はまた、ＭｅｔＡＰ−２阻害コアを部位特異的な配列を含むペプチドと結合させると血管新生阻害化合物の細胞特異的送達が可能になり、血管新生阻害化合物の毒性が抑制されるという発見にも少なくとも部分的に基づいている。
【０００７】
従って、本願発明は以下の式Ｉ
【化１７】
2004531466.tif 000003
の化合物を提供する。
【０００８】
式Ｉにおいて、ＡはＭｅｔＡＰ−２阻害コアであって、ＷはＯまたはＮＲ２であって、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に水素またはアルキルであって、Ｘはアルキレンまたは置換アルキレン、好ましくは直鎖Ｃ１−Ｃ６アルキレンであって、ｎは０または１であって、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立に水素、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アリール若しくはアリルアルキル、または置換若しくは非置換ヘテロアリール若しくはヘテロアルキルである。Ｒ３およびＲ４はまた、ともに炭素原子に結合して炭素環式または複素環式基を形成していてもよく、または、Ｒ１およびＲ４がともにアルキレン基を形成してもよく、Ｚは−Ｃ（Ｏ）−、アルキレン−Ｃ（Ｏ）−、またはアルキレンであって、Ｐは１乃至約１００アミノ酸残基からりアミノ末端がＺまたはＯＲ５基またはＮ（Ｒ６）Ｒ７基に結合しており、ここでＲ５、Ｒ６、およびＲ７はそれぞれ独立に水素、アルキル、置換アルキル、アザシクロアルキル、または置換アザシクロアルキルである。Ｒ６およびＲ７はともに窒素原子に結合して、置換または非置換複素環構造を形成していてもよい。
【０００９】
式Ｉの化合物の別の実施態様では、Ｗ、Ｘ、ｎ、Ｒ１、Ｒ３、およびＲ４は上述の通りの意味で、変数は以下に定義するとおりである。Ｚは−Ｏ−、−ＮＲ８−、アルキレン−Ｏ−、またはアルキレン−ＮＲ８−で、ここでＲ８は水素またはアルキルであって、Ｐは水素、アルキル、好ましくは直鎖または分岐鎖Ｃ１−Ｃ４アルキルまたは１乃至約１００アミノ酸残基からなりカルボキシ末端でＺに結合しているペプチドである。
【００１０】
式Ｉの化合物の場合、Ｒ１乃至Ｒ８のいずれかがアルキル基である場合、好ましいアルキル基は置換または非置換の直鎖、分岐鎖、または環状Ｃ１−Ｃ６アルキル基である。特に好ましいアルキル基は直鎖または分岐鎖Ｃ１−Ｃ４アルキル基である。置換アルキル基には、アミノ基、アルキルアミノ基、もしくはジアルキルアミノ基、フッ化、塩化、臭化、もしくはヨウ化置換基などのハロゲン置換基、または水酸基などの少なくとも１つの非水素置換基が含まれる。
【００１１】
Ｒ３またはＲ４の少なくとも１つが置換または非置換アリールまたはヘテロアリール基の場合、好ましい基は置換または非置換フェニル、ナフチル、インドリル、イミダゾリル、およびピリジルが含まれる。Ｒ３またはＲ４の少なくとも１つが置換または非置換アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキルである場合、好ましい基には置換または非置換ベンジル基、ナフチルメチル基、インドリルメチル基、イミダゾリルメチル基、およびピリジルメチル基が含まれる。アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、およびヘテロアリールアルキル基上にある好ましい置換基は、アミノ、アルキル置換アミノ、フッ化、塩化、臭化、ヨウ化基などのハロゲン化基、水酸基およびアルキル基、好ましくは直鎖または分岐鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル基、最も好ましくはメチル基からなる群から、独立に選択される。Ｘは好ましくは直鎖Ｃ１−Ｃ６アルキレン、さらに好ましくはＣ１−Ｃ４アルキレン、最も好ましくはメチレンまたはエチレンである。Ｚがアルキレン−Ｃ（Ｏ）−、アルキレン−Ｏ−、またはアルキレン−ＮＲ８である場合、アルキレン基は好ましくは直鎖Ｃ１−Ｃ６アルキレン、さらに好ましくはＣ１−Ｃ４アルキレン、最も好ましくはメチレンまたはエチレンである。
【００１２】
アルキル、置換アルキルまたは水素に加えてＲ６およびＲ７もまた、それぞれ独立に置換若しくは非置換アザシクロアルキル基、または置換若しくは非置換アザシクロアルキルアルキル基であってもよい。適切な置換アザシクロアルキル基には、Ｎ−アルキル置換基、好ましくはＮ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル置換基、さらに好ましくはＮ−メチル置換基を有するアザシクロアルキル基が含まれる。Ｒ６およびＲ７はともに窒素原子に結合して、置換または非置換の５員環または６員のアザまたはジアザシクロアルキル基などの複素環系を形成してもよい。好ましくは、ジアザシクロアルキル基にはＮ−Ｃ１−Ｃ４アルキル置換基、またはさらに好ましくはＮ−メチル置換基など、Ｎ−アルキル置換基が含まれる。
【００１３】
特に好ましい実施態様では、−Ｎ（Ｒ６）Ｒ７はＮＨ２または以下に記載の基である。
【化１８】
2004531466.tif 000004
【００１４】
好ましくは、式Ｉの化合物には、Ｚが−Ｏ−、Ｐが水素、Ｒ３およびＲ４が両方とも水素、ｎが１、およびＸがメチレンである化合物は含まれない。好ましくは、式Ｉの化合物には、Ｚがメチレン−Ｏ−、Ｒ３およびＲ４が両方とも水素、ｎが０である化合物は含まれない。
【００１５】
別の態様では、本願発明は式ＸＶの血管新生阻害化合物に関し、
【化１９】
2004531466.tif 000005
ここでＡはＭｅｔＡＰ−２阻害コア、およびＷはＯまたはＮＲである。ある実施態様では、Ｚは−Ｃ（Ｏ）−またはアルキレン−Ｃ（Ｏ）−であり、ＰはＮＨＲ、ＯＲまたは１乃至約１００アミノ酸残基からなりＮ−末端でＺに結合しているペプチドである。この実施態様では、Ｑは水素、直鎖、分岐鎖、もしくは環状アルキル、またはアリールであり、このときＰが−ＯＲである場合はＱは水素ではない。
【００１６】
別の実施態様では、Ｚはアルキレン−Ｏ−または−アルキレン−Ｎ（Ｒ）−で、Ｐは水素または１乃至約１００アミノ酸残基からなりカルボキシル末端でＺに結合しているペプチドである。この実施態様では、Ｑは水素、直鎖、分岐鎖、または環状アルキル、またはアリールであり、このときＰが水素である場合Ｑは水素ではない。
【００１７】
式ＸＶに記載の血管新生阻害化合物の場合、Ｒはそれぞれ独立に水素またはアルキルである。
【００１８】
別の態様では、本願発明は式Ｉまたは式ＸＶに記載の血管新生阻害化合物を含む薬学的組成物、および薬学的に許容な担体を特徴とする。
【００１９】
さらに別の態様では、本願発明は、対象におけるたとえば癌（たとえば肺癌、脳癌、腎癌、大腸癌、肝癌、膵癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸部癌、黒色腫、および前述の癌の転移癌）などの血管新生疾患の治療方法を特徴とする。本願方法には、１種類以上の式Ｉまたは式ＸＶの血管新生阻害化合物を治療上有効な量投与するステップが含まれる。
【００２０】
本願発明のそのほかの特徴または利点は、後述の発明の詳細な説明、および前述の特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００２１】
発明の詳細な説明
本願発明は血管新生阻害物質として有用な化合物、および血管新生疾患の治療におけるこの化合物の使用方法を提供する。理論によって制限されることを意図することなしに、本願発明の血管新生阻害化合物は、新規に合成したタンパク質のＮ−末端メチオニン残基を切断してそのタンパク質の活性型を生成する酵素であるメチオニンアミノペプチダーゼ２（ＭｅｔＡＰ−２）を阻害することによって血管新生を阻害すると考えられている。同時に、本願発明の血管新生阻害化合物にペプチドが存在するために、血管新生阻害化合物の代謝分解が抑制され、優れた薬物動態学的プロフィールが得られる。また、本願発明の血管新生阻害化合物にペプチドが存在することによって、血管新生阻害化合物の血液脳関門の通過能が変化し、たとえば中枢神経系の副作用（たとえば中枢神経系毒性）が抑制される。本願発明の血管新生阻害化合物に部位特異的配列を含むペプチドが存在すると、血管新生阻害化合物の部位特異的輸送達が可能となり、したがって血管新生阻害化合物の毒性が抑制される。
【００２２】
本願発明の血管新生阻害化合物は、ＭｅｔＡＰ−２阻害コアおよびそれに直接的または間接的に結合するペプチドを含む。ある実施態様では、本願発明は以下の式Ｉの血管新生阻害化合物を提供する。
【化２０】
2004531466.tif 000006
【００２３】
式Ｉでは、ＡはＭｅｔＡＰ−２阻害コアであって、ＷはＯまたはＮＲ２であって、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に水素、またはアルキルであって、Ｘはアルキレンまたは置換アルキレンであって、好ましくは直鎖Ｃ１−Ｃ６アルキレンであって、ｎは０または１であって、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立に水素、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アリール若しくはアリールアルキル、または置換若しくは非置換ヘテロアリール若しくはヘテロアルキルである。Ｒ３およびＲ４はまたともに炭素原子に結合して、炭素環基または複素環基を形成してもよく、またはＲ１およびＲ４はともにアルキレン基を形成してもよく、Ｚは−Ｃ（Ｏ）−、アルキレン−Ｃ（Ｏ）−、またはアルキレンであって、Ｐは１乃至約１００アミノ酸残基からなりそのアミノ酸末端がＺまたはＯＲ５基もしくはＮ（Ｒ６）Ｒ７基に結合するペプチドであって、ここでＲ５、Ｒ６、およびＲ７はそれぞれ独立に水素、アルキル、置換アルキル、アザシクロアルキル、または置換アザシクロアルキルである。Ｒ６およびＲ７はともに窒素原子に結合して、置換または非置換複素環構造を形成してもよい。
【００２４】
式Ｉに記載の化合物の別の実施態様では、Ｗ、Ｘ、ｎ、Ｒ１、Ｒ３、およびＲ４は上述のとおりの意味で、変数は以下に定義するとおりである。Ｚは−Ｏ−、−ＮＲ８−、アルキレン−Ｏ−、またはアルキレン−ＮＲ８−であって、ここでＲ８は水素またはアルキルであって、Ｐは水素、アルキル、好ましくは直鎖または分岐鎖Ｃ１−Ｃ４アルキルまたは１乃至約１００アミノ酸残基からなりカルボキシ末端でＺに結合しているペプチドである。
【００２５】
式１に記載の化合物では、Ｒ１乃至Ｒ８のいずれかがアルキル基の場合、好ましいアルキル基は置換または非置換の直鎖、分岐鎖、または環状Ｃ１−Ｃ６アルキル基である。特に好ましいアルキル基は直鎖または分岐鎖Ｃ１−Ｃ４アルキル基である。置換アルキル基には、アミノ基、アルキルアミノ基、またはジアルキルアミノ基、フッ化、塩化、臭化、またはヨウ化置換基などのハロゲン基、または水酸基など少なくとも１つの非水素置換基が含まれる。
【００２６】
Ｒ３またはＲ４の少なくとも１つが置換または非置換アリールまたはヘテロアリール基の場合、好ましい基には、置換および非置換フェニル、ナフチル、インドリル、イミダゾリルおよびピリジルが含まれる。Ｒ３またはＲ４の少なくとも１つが置換または非置換アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキル基の場合、好ましい基には置換および非置換ベンジル基、ナフチルメチル基、インドリルメチル基、イミダゾリルメチル基、およびピリジルメチル基が含まれる。アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、およびヘテロアリールアルキル基上の好ましい置換基は、アミノ、アルキル置換アミノ、フッ化、塩化、臭化、およびヨウ化基などのハロゲン基、水酸基およびアルキル基、好ましくは直鎖または分岐鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル、最も好ましくはメチルからなる群から独立に選択される。Ｘは好ましくは直鎖Ｃ１−Ｃ６アルキレン、さらに好ましくはＣ１−Ｃ４−アルキレン、最も好ましくはメチレンまたはエチレンである。Ｚがアルキレン−Ｃ（Ｏ）−、アルキレン−Ｏ−、またはアルキレン−ＮＲ８である場合、アルキレン基は好ましくは直鎖Ｃ１−Ｃ６アルキレン、さらに好ましくはＣ１−Ｃ４−アルキレン、および最も好ましくはメチレンまたはエチレンである。
【００２７】
アルキル、置換アルキル、または水素に加えてＲ６およびＲ７も、それぞれ独立に置換若しくは非置換アザシクロアルキル基または置換若しくは非置換アザシクロアルキルアルキル基であってもよい。適切な置換アザシクロアルキル基には、Ｎ−アルキル置換基、好ましくはＮ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル置換基、さらに好ましくはＮ−メチル置換基を有するアザシクロアルキル基が含まれる。Ｒ６およびＲ７はともに窒素原子と結合して、置換または非置換の５員環または６員環アザまたはジアザシクロアルキル基など、複素環系を形成してもよい。好ましくは、ジアザシクロアルキル基には、Ｎ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル置換基またはさらに好ましくはＮ−メチル置換基などのＮ−アルキル置換基が含まれてもよい。
【００２８】
特に好ましい実施態様では、−Ｎ（Ｒ６）Ｒ７はＮＨ２または以下に示す基
【化２１】
2004531466.tif 000007
のうちの１つである。
【００２９】
好ましくは、式Ｉに記載の化合物にはＺが−Ｏ−、Ｐが水素、Ｒ３およびＲ４が両方とも水素、ｎが１、およびＸがメチレンである化合物は含まれない。好ましくは、化１の化合物には、Ｚがメチレン−Ｏ−、Ｒ３およびＲ４が両方とも水素、ｎが０である化合物はさらに含まれない。
【００３０】
別の実施態様では、本発明は式ＸＶに記載の血管新生阻害化合物を提供し、
【化２２】
2004531466.tif 000008
ここでＡはＭｅｔＡＰ−２阻害コアであって、ＷはＯまたはＮＲである。ある実施態様では、Ｚは−Ｃ（Ｏ）−またはアルキレン−Ｃ（Ｏ）−であって、ＰはＮＨＲ、ＯＲまたは１乃至約１００アミノ酸残基からなりＮ−末端でＺに結合しているペプチドである。この実施態様では、Ｑは水素、直鎖、分岐鎖、または環状アルキル、またはアリールであり、このときＰが−ＯＲである場合はＱは水素ではない。Ｚは好ましくは−Ｃ（Ｏ）−またはＣ１−Ｃ４−アルキレン−Ｃ（Ｏ）−で、さらに好ましくは−Ｃ（Ｏ）−またはＣ１−Ｃ２−アルキレン−Ｃ（Ｏ）−である。Ｑは好ましくは直鎖、分岐鎖、または環状Ｃ１−Ｃ６−アルキル、フェニル、またはナフチルである。さらに好ましくは、Ｑはイソプロピル、フェニル、またはシクロヘキシルである。
【００３１】
別の実施態様では、Ｚは−アルキレン−Ｏ−または−アルキレン−Ｎ（Ｒ）−で、ここでアルキレンは好ましくはＣ１−Ｃ６アルキレンで、さらに好ましくはＣ１−Ｃ４アルキレンで、最も好ましくはＣ１−Ｃ２アルキレンである。Ｐは水素または１乃至約１００アミノ酸残基からなりカルボキシル末端でＺに結合しているペプチドである。この実施態様では、Ｑは水素、直鎖、分岐鎖、もしくは環状アルキル、またはアリールであり、このときＰが水素である場合Ｑは水素ではない。Ｑは好ましくは直鎖、分岐鎖または環状Ｃ１−Ｃ６アルキル、フェニル、またはナフチルである。さらに好ましくは、Ｑはイソプロピル、フェニル、またはシクロヘキシルである。
【００３２】
式ＸＶに記載の化合物では、Ｒはそれぞれ独立に水素またはアルキルである。ある実施態様では、Ｒはそれぞれ独立に水素、または直鎖、分岐鎖、または環状Ｃ１−Ｃ６アルキルである。好ましくは、Ｒはそれぞれ独立に水素または直鎖、分岐鎖、または環状Ｃ１−Ｃ４アルキルである。さらに好ましくは、Ｒはそれぞれ独立に水素またはメチルである。最も好ましい実施態様では、Ｒはそれぞれ水素である。
【００３３】
式Ｉおよび式ＸＶでは、ＡはＭｅｔＡＰ−２阻害コアである。本願明細書に用いられる「ＭｅｔＡＰ−２阻害コア」には、たとえば新しく合成したタンパク質のＮ末端メチオニン残基を切断してタンパク質の活性型を生成するＭｅｔＡＰ−２の能力など、メチオニンアミノペプチダーゼ２（ＭｅｔＡＰ−２）の活性を阻害することができる部分が含まれる。好ましいＭｅｔＡＰ−２阻害コアはフマジリン由来構造である。
【００３４】
適切なＭｅｔＡＰ−２阻害コアには式ＩＩＩのコアが含まれ、
【化２３】
2004531466.tif 000009
ここでＲ１は水素またはアルコキシであり、好ましくはＣ１−Ｃ４−アルコキシであり、さらに好ましくはメトキシである。Ｒ２は水素または水酸基である。Ｒ３は水素またはアルキルで、好ましくはＣ１−Ｃ４−アルキルで、さらに好ましくは水素である。Ｄは直鎖または分岐鎖アルキル、好ましくはＣ１−Ｃ６−アルキル、またはアリールアルキル、好ましくはアリール−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、さらに好ましくはフェニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキルであるか、またはＤは
【化２４】
2004531466.tif 000010
のような構造で、ここで点線は単結合または二重結合を表す。
【００３５】
Ａは式ＩＩＩのＭｅｔＡＰ−２阻害コアでもよく、
【化２５】
2004531466.tif 000011
ここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＤは式ＩＩに記載されたものと同一の意味であり、Ｘはハロゲンなどの脱離基である。
【００３６】
適切なＭｅｔＡＰ−２阻害コアの例には以下の化学式が含まれるが、これらに限定されない。
【化２６】
2004531466.tif 000012
【化２７】
2004531466.tif 000013
【化２８】
2004531466.tif 000014
【化２９】
2004531466.tif 000015
【化３０】
2004531466.tif 000016
【化３１】
2004531466.tif 000017
【００３７】
式ＩＶ乃至Ｘのそれぞれにおいて、炭素環上に表示した結合手は、式Ｉおよび式ＸＶに記載の構造変数Ｗの結合箇所である。式ＩＸにおいて、ｐは０乃至１０、好ましくは１乃至４の整数である。式ＩＶ、Ｖ、およびＶＩ乃至ＩＸにおいて、Ｒ１は水素またはＣ１−Ｃ４−アルコキシ、好ましくはメトキシである。式ＩＶおよびＶにおいて、点線は結合が二重結合または単結合であってよいことを示す。式Ｖにおいて、Ｘはチオアルコキシ基、チオアリールオキシ基、ハロゲン基、またはジアルキルスルフィニウム基などの脱離基を表す。式ＩＶおよびＶにおいて、Ｒ２はＨ、ＯＨ、アミノ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、またはジ（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ）、好ましくはＨである。特定の立体中心の立体化学が表示されていない化学式では、その立体中心は、血管新生阻害化合物のＭｅｔＡＰ−２活性阻害能に矛盾しない、考えられる立体化学のいずれかを有してもよい。
【００３８】
特に好ましい実施態様では、Ａは下記の式Ｘ
【化３２】
2004531466.tif 000018
に記載のＭｅｔＡＰ−２阻害コアである。
【００３９】
本願明細書で用いられる「Ｐ」および「ペプチド」という用語には、１乃至約１００アミノ酸残基（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のアミノ酸残基）からなる化合物が含まれる。好ましい実施態様では、前記ペプチドには約９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０アミノ酸残基未満、好ましくは約１乃至１０、１乃至２０、１乃至３０、１乃至４０、１乃至５０、１乃至６０、１乃至７０、１乃至８０、または１乃至９０アミノ酸残基を含む化合物が含まれる。前記ペプチドは天然のものか、または合成されたものでもよい。前記アミノ酸残基は好ましくはαアミノ酸残基である。たとえば、前記アミノ酸残基は、天然に存在する２０種類のアミノ酸残基、および２０種類の天然アミノ酸残基のＤ型の鏡像異性体からなる群から独立に選択されてよく、および非天然アミノ酸残基（たとえば、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、β−アラニン、または３−アミノメチル安息香酸などのペプチド模擬体など）であってもよい。ある実施態様では、前記アミノ酸残基は式ＸＩ、式ＸＩＩ、及び式ＸＩＩＩに記載の残基から独立に選択される。
【００４０】
【化３３】
2004531466.tif 000019
【化３４】
2004531466.tif 000020
【化３５】
2004531466.tif 000021
【００４１】
式ＸＩにおいて、Ｘ１は水素、２０種類の天然に存在するアミノ酸残基のうちの１つの側鎖、直鎖、分岐鎖、もしくは環状Ｃ１−Ｃ８−アルキル基、フェニル基もしくはナフチル基などのアリール基、アリール−Ｃ１−Ｃ４−アルキル基、ピリジル基、チエニル基、ピロリル基もしくはフリル基などのヘテロアリール基、またはヘテロアリール−Ｃ１−Ｃ４−アルキル基であり、Ｘ２は水素、直鎖、分岐鎖、もしくは環状Ｃ１−Ｃ８−アルキル基、フェニル基もしくはナフチル基などのアリール基、アリール−Ｃ１−Ｃ４−アルキル基、またはＸ１について前述のヘテロアリール基である。好ましくは、Ｘ２は水素である。式ＸＩＩでは、Ｙはメチレン、酸素、硫黄またはＮＨであって、ａおよびｂはそれぞれ独立に０乃至４であってａとｂの合計は１から４の間である。式ＸＩおよびＸＩＩはα炭素原子においてＤ型またはＬ型の立体化学のいずれかを有するα−アミノ酸残基を包含する。１つ以上の前記アミノ酸残基は、β−、γ−、またはε−アミノ酸残基など、α−アミノ酸残基以外のアミノ酸残基であってもよい。このようなアミノ酸残基の適切な例は式ＸＩＩＩで、ここでｑは２乃至約６の整数で、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に式ＸＩの変数として前述の意味を有する。
【００４２】
好ましい実施態様では、本発明の血管新生阻害化合物に用いられるペプチドは、前記血管新生阻害化合物を目的の細胞表面に結合させる特異性を向上させるために、部位特異的配列を含む。本願明細書に用いられる「部位特異的配列」という用語は、血管新生阻害化合物が周辺に露出することを抑制する働きをする、および／または血管新生部位または異常な細胞増殖部位など目的の部位に血管新生阻害化合物を向かわせる働きをするいずれのアミノ酸配列（たとえば天然または非天然のアミノ酸残基からなる）を含むことを意図する。
【００４３】
本願発明の血管新生阻害化合物内に含まれるペプチドは、血管新生部位または異常な細胞増殖部位に発現する酵素のペプチド切断部位を含んでよく、細胞透過性の活性血管新生阻害化合物またはそのフラグメント（たとえば前記血管新生阻害化合物のＭｅｔＡＰ−２阻害コアを含むフラグメント）の組織選択的な送達が可能になる。前記ペプチドはまた、血管新生部位または異常な細胞増殖部位で発現する細胞表面レセプタのリガンドである配列を含んで、血管新生阻害化合物を目的の細胞表面に向かわせてもよい。たとえば、本発明の血管新生阻害化合物内に含まれるペプチドは、マトリックスメタロプロテイナーゼの切断部位、またはインテグリン結合ＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）配列、または血管新生阻害化合物を内皮細胞のメンバーに向かわせる働きをする酵素「切断」配列および細胞表面「リガンド」の両方の組み合わせを含んでよい。しかし、ペプチド配列の選択は、ＭｅｔＡＰ−２阻害が望ましい細胞への送達活を性血管新生阻害化合物ができるようでなければならない。
【００４４】
たとえば、マトリックスメタロプロテイナーゼによって切断される配列は、ＭｅｔＡＰ−２阻害コア、カップリング基、およびペプチド断片を含有する生成物を生成する。配列は、たとえばマトリックスメタロプロテイナーゼ切断によって生じる活性血管新生阻害化合物などの活性血管新生阻害化合物が細胞透過性であるように選択される。このましくは、前記活性血管新生阻害化合物は、切断後、遊離酸を含有しない。
【００４５】
ある実施態様では、前記ペプチドには、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、またはＭＭＰ−２６などマトリックスメタロプロテイナーゼの切断部位が含まれる。このましくは、前記ペプチドにはＭＭＰ−２またはＭＭＰ−９の切断部位が含まれる。たとえば、前記ペプチドは配列−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｘａａ− （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含み、ここでＸａａはＧｌｙ−Ｘａａ結合におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）切断に一致する天然に存在するアミノ酸残基のいずれかである。Ｘａａは好ましくはトリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、およびバリンなどの疎水性アミノ酸残基である。
【００４６】
そのほかの適切な配列には、Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｄ−Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、 Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｎｖａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｎｖａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ａｌａ−Ａｂｕ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、およびＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）の１つ以上を含む配列が含まれる。これらの配列は、天然のアミノ酸残基を慣例的な３文字略語を用いて識別しており、以下の略語は非天然アミノ酸を表す。Ａｂｕ＝Ｌ−ａ−アミノブチリル、Ｃｈａ＝Ｌ−シクロヘキシルアラニン、Ｎｖａ＝Ｌ−ノルバリン。
【００４７】
ある実施態様では、ＰはＡｃ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ａｌａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−（Ｍｅ）Ｇｌｙ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）、Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）、Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−（Ｏ−Ｍｅ−Ｔｙｒ）−Ａｒｇ−Ｇｌｕ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）、 Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｌａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、Ａｃ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ａｌａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ａｌａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、 Ｍｅｔ−Ｇｌｙ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、および Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（３−アミノ−３−ピリジルプロピオン酸） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０） （前述の配列中のＡｃはアセチル基を表す）からなる群から選択されるアミノ酸配列である。
【００４８】
前記ペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかにおいてＭｅｔＡＰ−２阻害コアに結合してよい。前記ペプチドが、Ｃ末端でＭｅｔＡＰ−２阻害コアに結合している場合、前記ペプチドのＮ末端は−ＮＲ２Ｒ３であってよく、ここでＲ２は水素、アルキル、またはアリールアルキルであり、Ｒ３は水素、アルキル、アリールアルキル、またはアシルである。前記ペプチドがＮ−末端においてＭｅｔＡＰ−２阻害コアに結合している場合、Ｃ末端は−Ｃ（Ｏ）Ｒ４であってよく、ここでＲ４は−ＯＨ、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アリールアルキル、または−ＮＲ２ Ｒ３であって、ここでＲ２は水素、アルキル、またはアリールアルキルであって、Ｒ３は水素、アルキル、アリールアルキル、またはアシルである。この実施態様では、Ｃ末端残基は対応する１級アルコールなど、還元型であってもよい。
【００４９】
本発明はまた、本発明の血管新生阻害化合物の薬学的に許容な塩も含む。「薬学的に許容な塩」には、親血管新生阻害化合物の所望の生物学的活性を有していて、不必要な毒性学的作用を与えない塩が含まれる。このような塩の例には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、および硝酸などの酸の塩、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸、安息香酸、パモ酸、アルギン酸、メタンスルホン酸、およびナフタレンスルホン酸などの塩である。さらに、ナトリウム、カリウム、リチウム、亜鉛、銅、バリウム、ビスマス、およびカルシウムなどのカチオンの塩、またはトリアルキルアンモニウムなどの有機カチオンの塩も含まれる。前述の塩の組み合わせも有用である。
【００５０】
好ましい式Ｉに記載の血管新生阻害化合物
本発明の好ましい血管新生阻害化合物のあるセットには、Ａが式Ｘに記載のＭｅｔＡＰ−２阻害コアであって、ＷがＯまたはＮＲ２であって、構造
【化３６】
2004531466.tif 000022
が以下の構造によって表される化合物が含まれる。
【化３７】
2004531466.tif 000023
【化３８】
2004531466.tif 000024
【化３９】
2004531466.tif 000025
【化４０】
2004531466.tif 000026
【化４１】
2004531466.tif 000027
【化４２】
2004531466.tif 000028
【化４３】
2004531466.tif 000029
【化４４】
2004531466.tif 000030
【化４５】
2004531466.tif 000031
【化４６】
2004531466.tif 000032
【００５１】
好ましい式ＸＶに記載の血管新生阻害化合物
式ＸＶに記載の血管新生阻害化合物の好ましいサブセットは、以下の式ＸＩＶを含む。
【化４７】
2004531466.tif 000033
【００５２】
ある実施態様では、ＷはＯまたはＮＲである。Ｚは−Ｃ（Ｏ）またはアルキレン−Ｃ（Ｏ）−であって、好ましくはＣ１−Ｃ４−アルキレン−Ｃ（Ｏ）−である。Ｒは水素またはＣ１−Ｃ４−アルキルである。Ｑは水素、直鎖、分岐鎖または環状Ｃ１−Ｃ６−アルキル、またはアリールである。Ｒ１は水素、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、またはハロゲンである。ＰはＮＨ２、ＯＲ、またはＮ末端でＺに結合して、天然に存在するアミノ酸残基、天然に存在するアミノ酸残基のＤ型の鏡像異性体、および非天然のアミノ酸残基から独立に選択された１乃至１００アミノ酸残基からなるペプチドである。ＱがＨであるとき、ＰはＮＨ２またはＯＲではない。好ましい実施態様では、ＷはＯまたはＮＨであって、Ｑはイソプロピルであって、Ｒ１はメトキシであって、Ｐは１乃至１５アミノ酸残基からなっていて、式ＸＩＶに記載の点線は二重結合である。特に好ましい実施態様では、ＷはＯであって、Ｐは１０以下のアミノ酸残基を含む。
【００５３】
式ＸＩＶに記載の化合物の別の実施態様では、ＷはＯまたはＮＲである。Ｚはアルキレン−Ｏまたはアルキレン−ＮＲであって、好ましくはＣ１−Ｃ４−アルキレン−ＯまたはＣ１−Ｃ４−アルキレン−ＮＲ−である。Ｒは水素またはＣ１−Ｃ４−アルキルである。Ｑは水素、または直鎖、分岐鎖または環状Ｃ１−Ｃ６−アルキル、またはアリールである。Ｒ１は水酸基、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシまたはハロゲンである。Ｐは水素、またはＣ末端でＺに結合し天然に存在するアミノ酸残基、天然に存在するアミノ酸残基のＤ型の鏡像異性体、および非天然のアミノ酸残基から独立に選択された１乃至１００アミノ酸残基からなるペプチドである。ＱがＨのとき、ＰはＨではない。好ましい実施態様では、ＷはＯまたはＮＨであって、Ｏはイソプロピルであって、Ｒ１はメトキシであって、Ｐは１乃至１５アミノ酸残基からなっていて、式ＸＩＶに記載の点線は二重結合である。特に好ましい実施態様では、ＷはＯであって、Ｐは１０以下のアミノ酸残基を含むか、またはＰは水素である。
【００５４】
本発明の特に好ましい血管新生阻害化合物のあるセットは、以下の構造で表される。
【化４８】
2004531466.tif 000034
【化４９】
2004531466.tif 000035
【化５０】
2004531466.tif 000036
【化５１】
2004531466.tif 000037
【化５２】
2004531466.tif 000038
【化５３】
2004531466.tif 000039
【化５４】
2004531466.tif 000040
【化５５】
2004531466.tif 000041
【００５５】
血管新生疾患の治療のための血管新生阻害化合物の使用方法
別の実施態様では、本願発明は対象における血管新生疾患の治療方法を提供する。前記方法には、前記対象に本願発明の血管新生阻害化合物を治療上有効な量投与し、前記対象における血管新生疾患を治療するステップが含まれる。
【００５６】
本願明細書に用いられる「血管新生疾患」という用語には、異常なまたは好ましくない、たとえば促進または抑制された血管の形成（血管新生）によって特徴づけられる、または引き起こされる疾患、障害、または症状が含まれる。異常または好ましくない血管新生は、ある特定の疾患を直接引き起こすか、または既存の病理学的症状を悪化させることがある。血管新生疾患の例には、たとえば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植片拒絶、水晶体後線維増殖症、血管新生緑内障、ルベオーシス、黄斑変性による網膜新生血管、低酸素症、感染症または外科的介入に伴う眼の血管新生、眼腫瘍ならびにトラコーマ、およびそのほかの眼における異常な血管新生症状などの眼障害であって、血管新生が失明を引き起こす眼障害、たとえば乾癬および化膿性肉芽腫などの皮膚障害、たとえば腫瘍細胞による血管新生が連続的に誘導されて進行性に成長する癌腫および肉腫など、肺癌、脳癌、腎癌、結腸癌、肝癌、膵癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸部癌、黒色腫、および前述のいずれかの癌の転移癌などの癌、たとえば血管線維腫、および血友病関節症などの小児疾患、たとえば血管腫およびアテローム斑の中での毛細管増殖などの血管疾患、たとえば肥厚性瘢痕、創傷肉芽形成および血管癒着などの外科手術に伴う障害、および、関節内に血管が新生して関節の軟骨を破壊することがあるリウマチ様免疫性変形性関節炎、および強皮症などの自己免疫疾患が含まれる。
【００５７】
血管新生疾患という用語にはさらに内皮細胞の過度のまたは異常な刺激によって特徴づけられる疾患も含まれ、その疾患には腸管癒着症、クローン病、アテローム性動脈硬化症、強皮症、および肥厚性瘢痕すなわちケロイド、ネコ引っかき病（Ｒｏｃｈｅｌｅ ｎｉｎａｌｉａ ｑｕｉｎｔｏｓａ）および潰瘍（ヘリコバクター・ピロリ菌）など病理学的な結果として血管新生が生じる疾患などがそれらに限定されずに含まれる。さらに、本願発明の血管新生阻害化合物は避妊薬としても有用であり（血管新生に依存する排卵および胎盤の確立を阻害する能力があるため）、また、出血を減少させるために手術前に対象に投与することも可能である。
【００５８】
本願明細書で用いられる「対象」という用語には、温血動物であって、好ましくはヒトを含む哺乳動物が含まれる。好ましい実施態様では、前記対象は霊長類である。さらに好ましい実施態様では、前記霊長類はヒトである。
【００５９】
本願明細書で用いられる対象への「投与」という文言には、たとえば薬学的剤形状の血管新生阻害化合物（前述）などの血管新生阻害化合物を、筋肉内注射、皮下／皮内注射、静脈注射、口腔内投与、経皮送達、および直腸、結腸、膣、鼻腔内、または呼吸器経路による投与など非経または経口経路のいずれかによる送達法など、対象における望ましい部位へ前記化合物を送達するための適切な経路によって、前記対象に提供、送達、または適用することが含まれる。
【００６０】
本願明細書に用いられる「有効な量」という文言には、たとえば対象の血管新生疾患を治療するのに十分など、望ましい結果を得るために有効な用量および期間であることが含まれる。本願明細書に定義される血管新生阻害化合物の有効な量は、対象の疾患の病期、年齢、および体重、ならびに血管新生阻害化合物が対象において望ましい反応を誘導する能力などの因子によって変化することがある。投与方法は最良の治療反応が得られるように調整されることがある。有効な量はまた、血管新生阻害化合物の治療上の有益な作用が毒性作用または有害作用（たとえば副作用）を上回る場合の量でもある。
【００６１】
血管新生阻害化合物の治療上有効な量（すなわち有効な投与量）は、体重１ｋｇにつき約０．００１乃至３０ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇにつき約０．０１乃至２５ｍｇ、さらに好ましくは体重１ｋｇにつき約０．１乃至２０ｍｇ、さらにより好ましくは体重１ｋｇにつき約１乃至１０ｍｇ、２乃至９ｍｇ、３乃至８ｍｇ、４乃至７ｍｇ、５乃至６ｍｇの範囲内であってよい。当業者は、対象の疾患または障害の重度、過去の治療、全般的な健康状態および／または年齢、ならびにそのほかに罹患している疾患などであるがそれらに限定されない特定の因子が、対象を効果的に治療するために必要な容量に影響を与える可能性があることを理解するだろう。さらに、治療上有効な量の血管新生阻害化合物を用いた対象の治療には単回治療を含んでもよく、または好ましくは一連の治療を含んでもよい。ある実施例では、対象に、体重１ｋｇにつき約０．１乃至２０ｍｇの範囲内の血管新生阻害化合物を約１乃至１０週、好ましくは約２乃至８週、さらに好ましくは約３乃至７週、よりさらに好ましくは約４、５、または６週の期間中週１回投与する。治療に使用した血管新生阻害化合物の有効な投与量は特定の治療の経過に伴って増加または減少してもよいことも、理解されよう。
【００６２】
本願発明の方法には、さらに、治療上有効な量の血管新生阻害化合物を、たとえばタクソール、パクリタキセル、またはアクチノマイシンＤなどの化学療法薬またはトルブタミドなどの抗糖尿病薬などの血管新生疾患を治療することが知られている薬学的に活性な別の化合物、またはヘパリンもしくは硫酸化シクロデキストリンなどの血管新生阻害化合物の血管新生阻害活性が増強されていると考えられる化合物とともに、対象に投与するステップが含まれる。使用が可能なそのほかの薬学的に活性な化合物は、その内容全体を引用することによってここに援用するＨａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｔｈｉｒｔｅｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｅｄｓ． Ｔ．Ｒ． Ｈａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ． ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｎ．Ｙ．， ＮＹと、ｔｈｅ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ５０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ １９９７， Ｏｒａｄｅｌｌ Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏ．に見つけることができる。前記血管新生阻害化合物および前記薬学的に活性な化合物は、対象に同一の薬学的組成で投与されてもよく、または異なる薬学的組成で（同時に、または異なる時期に）投与されてもよい。
【００６３】
血管新生阻害化合物の薬学的組成
本願発明はさらに、１種類以上の血管新生阻害化合物を含む薬学的に許容な調剤を提供する。このような薬学的に許容な調剤には、一般に、１種類以上の血管新生阻害化合物とともに薬学的に許容な担体および／または賦形剤が含まれる。本願明細書に用いられる「薬学的に許容な担体」には、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、および生理学的に適合する同等物が含まれる。このような薬理学的に活性な物質用の溶媒または薬剤の使用は当業に公知である。従来の溶媒または薬剤が血管新生阻害化合物に適合しない場合でない限り、薬学的組成物にそれらを使用することが意図される。
【００６４】
たとえばタクソール、パクリタキセル、もしくはアクチノマイシンＤなどの化学療法薬、またはトルブタミドなどの抗糖尿病薬など血管新生疾患を治療することが知られている補助的な薬学的に活性な化合物、またはヘパリンまたは硫酸化シクロデキストリンなどの血管新生阻害化合物の血管新生阻害活性が増強されている化合物を、本願発明の組成に組み込んでもよい。使用してもよい適切な薬学的に活性な化合物は、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（同上）で見つけることができる。
【００６５】
本願発明の薬学的な組成物は、意図する投与経路に適合するように調剤される。投与経路の例には、たとえば静脈内、皮内、皮下、経口（たとえば吸入）、経皮（局所）、経粘膜および直腸投与などの非経口経路が含まれる。非経口、皮内、または皮下投与に用いられる溶液または懸濁液には、以下の組成物、水などの注射用滅菌希釈剤、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、またはそのほかの合成溶媒、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または重硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの浸透張力調整剤が含まれてもよい。ｐＨは塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整してよい。非経口製剤は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、または複数回投与用バイアルに封入されていてよい。
【００６６】
注射用に適した薬学的組成物には、滅菌水溶液（水溶性）また分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即時調合用滅菌パウダーが含まれる。静脈内投与用に適切な担体には、生理学的食塩水、静菌水、クレモホールＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ社、ニュージャージー州パーシッパニー）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。すべての場合において、薬学的組成物は滅菌性でなければならず、注射器への装填がある程度容易であるように流体であるべきである。製造および保存状況下において安定でなければならず、細菌または真菌などの微生物の混入活性から防御されていなければならない。担体は、たとえば水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物などを含有する溶媒、または分散媒であってよい。適切な流動性は、たとえば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散液の場合は必要な粒子サイズの維持、および表面活性剤の使用などによって維持することができる。微生物の活性は、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメローサルなどの各種抗菌剤および抗真菌剤によって防御することができる。多くの場合、たとえば糖、マニトールなどのポリアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムなど、等張剤が組成物に含まれることが好ましい。注射用組成物の吸収は、たとえばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなど吸収を遅延する薬剤を組成物に含むことによって持続させることができる。
【００６７】
滅菌注射用溶液は、適切な溶媒に溶解した必要量の前記血管新生阻害化合物を上述の成分の１つまたは組み合わせに組み入れて、滅菌濾過することによって調製することができる。一般に、分散液は、前記血管新生阻害化合物を塩基性分散媒および上述の成分から選択されたそのほかの必要な成分を含有する滅菌賦形剤に組み入れて調製する。滅菌注射用溶液の調製用の滅菌パウダーの場合、好ましい調製方法は真空乾燥または凍結乾燥であって、その結果、血管新生阻害化合物と前もって滅菌濾過された溶液から得られたもう１つの望ましい成分の混合物のパウダーが得られる。
【００６８】
経口用組成物は一般に不活性希釈剤、または食用担体を含む。その組成物は、ゼラチンカプセルに封入されていてもよいし、または圧縮して錠剤にしてもよい。治療用経口投与の目的のために、前記血管新生阻害化合物を賦形剤に組み入れて、錠剤、トローチ、またはカプセルの形状で使用してもよい。経口用組成物には腸溶コーティングも含まれてよい。経口用組成物は、洗口液として使用するための流体状担体を用いて調製してもよく、その場合、流体状担体中の前記血管新生阻害化合物は口腔内に適用され、吐き出すか、または燕下する。薬学的に適合する結合剤および／またはアジュバントを前記組成物の一部として含んでもよい。錠剤、丸剤、カプセル、およびトローチなどは、以下の成分または同様の性質の化合物のいずれかを含有してもよい。それは、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどの結合剤、デンプンまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、またはコーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムまたはステロテス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）などの潤滑剤、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤、スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤、またはペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香料などの香料添加剤などである。
【００６９】
吸入による投与のために、前記血管新生阻害化合物は、加圧容器、またはたとえば二酸化炭素などの気体などの適切な推進剤を含有するディスペンサ、またはネブライザからのエアゾールスプレー状で送達する。
【００７０】
全身投与は経粘膜または経皮手段によって行ってもよい。経粘膜または経皮投与のために、障壁を透過させるのに適した浸透剤を製剤に用いる。このような浸透剤は一般に当業に公知で、たとえば経粘膜投与の場合、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔用スプレーまたは坐薬を用いて行うことができる。経皮投与の場合、前記血管新生阻害化合物は、一般に当業に公知の軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔｓ）、軟膏（ｓａｌｖｅｓ）、ゲル、またはクリームに調製する。
【００７１】
前記血管新生阻害化合物は坐薬（たとえばカカオバターおよびそのほかのグリセリドなど従来の坐薬の基剤を用いて）または直腸への送達の場合は停留浣腸の形状で調製することもできる。
【００７２】
ある実施態様では、前記血管新生阻害化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル封入送達システムなど制御放出製剤など、化合物が体内から急速に排出されないように保護する担体とともに調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸など生分解性、生体適合性ポリマーを用いることができる。このような製剤の調製方法は、当業者には明らかであろう。材料はアルザコーポレーション社およびノバファーマシューティカルズ社から購入することができる。リポソーム懸濁液も薬学的に許容な担体として用いることができる。これらは、たとえば引用によりその内容を援用する米国特許第４，５２２，８１１号、米国特許第５，４５５，０４４号、 米国特許第５，５７６，０１８号、および米国特許第４，８８３，６６６号に記載の通り、当業に公知の方法によって調製する。
【００７３】
本願発明の血管新生阻害化合物は、前記血管新生阻害化合物を対象に少なくとも数週間から１ヶ月以上の間、持続的に送達できるような薬学的組成物に組み入れることもできる。このような製剤は、引用によりその内容を援用する米国特許第５，９６８，８９５号に記載されている。
【００７４】
投与の簡便化と投与量の均等化のために、経口または非経口用組成物を単回投与剤形に調剤するのは特に有用である。本願明細書で用いる単回投与剤形とは、治療する対象に適切な単回投与量を物理的に離散させたユニットを意味する。各ユニットは、望ましい治療効果を生じさせるために計算してあらかじめ決定した量の血管新生阻害化合物を必要な薬学的担体と併せて含有する。本発明の単回投与剤形の詳細は、前記血管新生阻害化合物の固有の特徴、および特定の治療効果、ならびにこのような血管新生阻害化合物を個別の治療用に混合する技術に特有の限界によって決定され、また直接的に依存する。
【００７５】
このような血管新生阻害化合物の毒性および治療上の有効性は、たとえばＬＤ５０（集団の５０％を死亡させる投与量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療上の有効性が見られる投与量）を決定するなど、細胞培養および実験動物において標準の薬学的手順によって決定することができる。毒性と治療上の有効性が見られる投与量の比は治療指数といい、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比で表すことができる。大きい治療指数を示す血管新生阻害化合物が好ましい。毒性の副作用を示す血管新生阻害化合物が用いられることもあるが、罹患していない細胞に与えるダメージを最小限に抑えて副作用を減少させるために、このような血管新生阻害化合物で罹患組織の部位を狙うデリバリーシステムの設計は慎重に行うべきである。
【００７６】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトにおいて使用するための投与量の範囲を決定するために用いることができる。このような血管新生阻害化合物の投与量は、毒性が少ないかまたは皆無のＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内であることが好ましい。前記投与量は剤形および投与経路に依存するこの範囲内で変化してもよい。本願発明の方法に用いられるいずれの血管新生阻害化合物の場合にも、治療上有効な用量の推定はは、まず細胞培養アッセイから始めることができる。動物モデルでは、細胞培養で決定したＩＣ５０（すなわち、症状の５０％を阻害する前記血管新生阻害化合物の濃度）を含む循環血漿濃度の範囲に達するように決定してよい。このような知見を用いて、ヒトにおける有用な用量をさらに正確に決定することができる。血漿濃度は、たとえば高性能液体クロマトグラフィで測定してもよい。
【００７７】
血管新生阻害化合物の活性を検出するアッセイ
本願発明の血管新生阻害化合物は、たとえばラット大動脈輪血管新生阻害アッセイ（本願明細書例２７に記載）など多種の公知のアッセイ、または漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイにおいて、血管新生を調節（阻害または刺激）する能力についてテストしてもよい。
【００７８】
ＣＡＭアッセイは、基本的には、引用によってその内容を援用するＬｉｅｋｅｎｓ Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９： １７３−１８１に記載の通り行ってよい。簡単に説明すると、新鮮な受精卵を３７℃で３日間インキュベートする。３日目に殻を割り、卵を組織培養プレートに置いて３８℃でインキュベートする。このアッセイのために、テストの対象である血管新生阻害化合物をナイロンメッシュにのせたコラーゲン基質上に付着させる。このメッシュを用いて漿尿膜を覆い、卵を３７℃でインキュベートする。血管新生が生じる場合、２４時間以内に新しい毛細管が形成され前記メッシュを通って成長する。そこで、血管新生阻害化合物がＦＧＦ誘導血管新生などの血管新生を、たとえば阻害など調節する能力を決定できる場合もある。
【００７９】
本願発明の血管新生阻害化合物は、ヒト内皮細胞の成長を調節（たとえば阻害または刺激）する能力についてもテストすることができる。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥ）は、臍静脈をトリプシン含有培地で灌流して分離することができる。ついで、ＨＵＶＥを、２．５％ウシ胎児血清および２．０ ｎｇ／ｍｌの組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｒｂＦＧＦ、武田バイオ技術研究所、大阪）を添加したＧＩＴ培地（Ｄｉａｇｏ Ｅｉｙｏｕ Ｋａｇａｋｕ社、日本）で、５％ＣＯ２および７％Ｏ２下、３７℃で培養してもよい。その後、ＨＵＶＥを９６穴マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ、１−６７００８）に細胞密度が培地１００μｌあたり２ｘ１０３になるように蒔いてもよい。翌日、ｒｂＦＧＦ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）を含有する培地１００μｌおよび各種濃度の血管新生阻害化合物を各ウエルに加えてもよい。前記血管新生阻害化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、培養培地を最終ＤＭＳＯ濃度が０．２５％を超えないように希釈する。５日間の培養後、培地を取り除き、１ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２−Ｈ−テトラゾリウムブロミド）１００μｌをウエルに加え、マイクロタイターを４時間３７℃に維持する。その後、１０％ドデシル硫酸ナトリウム１００μｌをウエルに加えて、マイクロタイターを５乃至６時間３７℃に維持する。前記血管新生阻害化合物が細胞数に及ぼす作用を決定するために、各ウエルの吸光度（５９０μｍ）を吸光度計で測定する。
【００８０】
本願発明の血管新生阻害化合物がｉｎ ｖｉｔｒｏにおける毛細血管内皮細胞遊走を調節する能力を、ボイデンチャンバーアッセイを用いてテストしてもよい（引用によりその内容を援用するＦａｌｋ ｅｔ ａｌ． （１９８０） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ３３：２３９−２４７に記載の通り）。簡単に説明すると、ウシ毛細血管内皮細胞を無血清ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）に１ウエルあたり１．５ｘ１０４個蒔き、フィブロネクチン（ＰＢＳ１ｍｌにつきフィブロネクチン７．３μｇ）であらかじめコーティングしたヌクレオポアフィルターの片側に置く。血管新生阻害化合物をエタノールに溶解してＤＭＥＭで希釈し、最終エタノール濃度が０．０１％を超えないようにする。細胞を２００μｇ／ｍｌエンドセリアル・マイトジェン（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｍｉｔｏｇｅｎ、バイオメディカル・テクノロジーズ社、マサチューセッツ州）および各種濃度の無血清ＤＭＥＭ中の血管新生阻害化合物に、３７℃で４時間暴露する。このインキュベーションの終了時に、前記フィルターの８μ孔を通り抜けて遊走する細胞の数を、１００倍の接眼グリッドを用いて４回計数して決定した。
【００８１】
本願発明の血管新生阻害化合物が腫瘍増殖を調節する能力を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてテストしてもよい。マウス細網肉腫（Ｍ５０７６）を腹腔内に移植したＣ５７ＢＬ／６Ｎなどの動物モデルを使用してもよい。腹水中の腫瘍細胞を遠心分離して収集し、食塩水に懸濁させる。この細胞懸濁液（２ｘ１０６細胞／１００μｌ／マウス）をマウスの右側腹に接種する。腫瘍を有するマウスの皮下に前記血管新生阻害化合物（エタノール１％を含有する５％アラビアゴム溶液に各種濃度で懸濁させた）を、腫瘍接種の１日後から１２日間投与する。腫瘍の増殖は、数日ごとにノギスで腫瘍の２方向を測定して決定する。
【００８２】
最後に、本願発明の血管新生阻害化合物がＭｅｔＡＰ２活性を調節する能力は、以下のようにテストしてもよい。組み換えヒトＭｅｔＡＰ２は、Ｌｉ ａｎｄ Ｃｈａｎｇ， （１９９６） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２２７：１５２−１５９に記載の昆虫細胞から発現させて精製してもよい。様々な量の血管新生阻害化合物を１ｎＭ精製組み換えヒトＭｅｔＡＰ２を含有するバッファＨ（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ ７．３５、１００ ｍＭ ＫＣｌ、１０％グリセロール、および０．１Ｍ Ｃｏ２＋）に加え、３７℃で３０分間インキュベートする。酵素反応を開始するために、たとえばＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔなどのメチオニン残基を含有するペプチドを反応混合物に加える（濃度が１ｍＭになるまで）。その後、放出されたメチオニンを、Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｍｏｌ． Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４６：２４７−２５３の方法を用いて、各時点（たとえば０、２、３、および５分の時点）において計量する。
【００８３】
本願発明は、以下の実施例によってさらに具体化されるが、それらは本願発明を制限するものと解釈されてはならない。本願明細書全体に引用されたすべての参考文献、特許、および公開された特許出願、ならびに図および配列リストは、引用によりここに援用される。
【００８４】
【実施例】
合成方法
本願発明の化合物は以下に記載の１つ以上の一般方法を用いて調製することができる。
【００８５】
一般手順Ａ：カルボン酸 −（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ）−５−メトキシ −４−［（２Ｒ， ３Ｒ）−２−メチル −３−（３−メチル −ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ −スピロ ［２．５］オクト−６−イルエステル４−ニトロ −フェニルエステル １ （１， ０．４７ ｍｍｏｌ； Ｈａｎ， Ｃ． Ｋ．； Ａｈｎ， Ｓ． Ｋ．； Ｃｈｏｉ， Ｎ． Ｓ．； Ｈｏｎｇ， Ｒ． Ｋ．； Ｍｏｏｎ， Ｓ． Ｋ．； Ｃｈｕｎ， Ｈ． Ｓ．； Ｌｅｅ， Ｓ． Ｊ．； Ｋｉｍ， Ｊ． Ｗ．； Ｈｏｎｇ， Ｃ． Ｉ．； Ｋｉｍ， Ｄ．； Ｙｏｏｎ， Ｊ． Ｈ．； Ｎｏ， Ｋ． Ｔ． Ｂｉｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ２０００， １０， ３９−４３） およびアミン（２．３５ ｍｍｏｌ） の ＥｔＯＨ （９ ｍＬ）溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（２．３５ ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。３乃至１８時間後、エタノールを減圧除去し、粗材料をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）に溶解してＨ２Ｏ（２ ｘ ５ ｍＬ）で洗浄し、その後食塩水（５ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を減圧除去した。フラッシュクロマトグラフィ（２−５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）で精製し、生成物を得た。
【００８６】
一般手順ＢパートＩ：（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ） −５−メトキシ −４−［（２Ｒ， ３Ｒ）− ２−メチル −３−（３−メチル −ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ ［２．５］オクト−６−イルオキシカルボニルアミノ）−酢酸 ２ （２， ０．１１ ｍｍｏｌ； 米国特許第６，０１７，９５４号） のＤＭＦ （１ ｍＬ）溶液を膨潤させたＰＳ−ＤＣＣ（０．２８ ｍｍｏｌ）を入れた１０ｍＬの丸底フラスコに加えた。別の容器で、ペプチド（０．０４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解し、ＮＭＭ（０．０４ｍｍｏｌ）で中和した。１時間後、前記ペプチド溶液を、前もって活性化させてある酸に加え、反応を５乃至１８時間続けた。濾過によって樹脂を除去し、ＤＭＦ（０．５ ｍＬ）で洗浄して、溶媒を減圧除去した。ＨＰＬＣ（ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ）で精製し、生成物を得た。
【００８７】
一般手順ＢパートＩＩ：  パートＩで得られた生成物の溶液（０．００９ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解し、Ｐｄ／Ｃ（２ｍｇ）で処理してから、Ｈ２雰囲気下（３８ ｐｓｉ）に２４時間おいた。その混合物をセライトを通して濾過し、ＭｅＯＨ（０．５ｍＬ）で洗浄してから、溶媒を減圧除去した。ＨＰＬＣ（ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ）で精製して、白色固体状の生成物を得た。
【００８８】
一般手順Ｃ：  （１−ヒドロキシメチル −メチル −プロピル）−カルバミン酸（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ）−５−メトキシ −４−［（２Ｒ， ３Ｒ）−２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ ［２．５］オクト−６−イルエステル （例７， １８９ ｍｇ， ０．４６ ｍｍｏｌ）、酸（０．４６ ｍｍｏｌ） およびＤＭＡＰ （０．６９ ｍｍｏｌ） を無水ＣＨ２Ｃｌ２ （５ ｍＬ） に溶解し、ジイソプロピルカルボジイミド（０．４６ ｍｍｏｌ）で処理した。７乃至１８時間後、溶媒を減圧除去し、フラッシュクロマトグラフィ（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）で精製して生成物を得た。
【００８９】
例１
２−｛（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ）−５−メトキシ−４−［（２Ｒ， ３Ｒ）−２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルオキシカルボニルアミノ ｝−３−メチル−ブチル酸メチルエステル
【化５６】
2004531466.tif 000042
【００９０】
１ （３１ ｍｇ， ０．０７ ｍｍｏｌ）、 Ｌ−バリンメチルエステル塩酸塩 （５８ ｍｇ， ０．３５ ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ （６０ μＬ， ０．３５ ｍｍｏｌ） のＥｔＯＨ （２ ｍＬ）溶液を用いて、一般手順Ａ に従った。フラッシュクロマトグラフィ（１％ ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）で精製し、無色油状の生成物を得た； Ｒｆ ＝ ０．６０ （２０％ ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２）； ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋１］＋ ４４０．３ （Ｃ２３Ｈ３８ＮＯ７の計算値， ４４０．３）。
【００９１】
例２
２−｛（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ）−５−メトキシ −４−［（２Ｒ， ３Ｒ）−２−メチル−３−（３−メチル−ブト −２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ ［２．５］オクト−６−イルオキシカルボニルアミノ ｝−３−メチル−ブチル酸メチルエステル
【化５７】
2004531466.tif 000043
【００９２】
１ （４１ ｍｇ， ０．０９ ｍｍｏｌ） およびＤ−バリンメチルエステル塩酸塩（７７ ｍｇ， ０．４５ ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ （８０ μＬ， ０．４５ ｍｍｏｌ） のＥｔＯＨ （２ ｍＬ）溶液を用いて、一般手順Ａに従った。フラッシュクロマトグラフィ（１％ ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）で精製し、無色油状の生成物を得た（１８ ｍｇ， ０．０４ ｍｍｏｌ、収率４５％）； Ｒｆ ＝ ０．３９ （２０％ ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２； ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋１］＋ ４４０．３ （Ｃ２３Ｈ３８ＮＯ７の計算値、４４０．３）。
【００９３】
例３
２−｛（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ）−５−メトキシ−４−［（２Ｒ， ３Ｒ）−２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルオキシカルボニルアミノ｝−４−メチル−ペンタン酸メチルエステル
【化５８】
2004531466.tif 000044
【００９４】
１ （２３ ｍｇ， ０．０５ ｍｍｏｌ）、Ｄ−ロイシンメチルエステル塩酸塩 （４７ ｍｇ， ０．２５ ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ （４５ μＬ， ０．２５ ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ （２ ｍＬ）を用いて、一般手順Ａに従った。フラッシュクロマトグラフィ（１％ ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２） で精製し、無色油状の生成物を得た （１９ ｍｇ， ０．０４ ｍｍｏｌ、収率８３％）； Ｒｆ ＝ ０．２２ （１５％ ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２）； ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋１］＋ ４５４．３ （Ｃ２４Ｈ４０ＮＯ７の計算値， ４５４．３）。
【００９５】
例４
｛（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ）−５−メトキシ−４−［（２Ｒ， ３Ｒ）−２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルオキシカルボニルアミノ｝−フェニル−酢酸メチルエステル
【化５９】
2004531466.tif 000045
１ （３７ ｍｇ， ０．０８ ｍｍｏｌ）、 Ｄ−フェニルグリシン メチルエステル塩酸塩（８３ ｍｇ， ０．４０ ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ （７２ μＬ， ０．４０ ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ （２ ｍＬ）溶液を用いて、一般手順Ａに従った。フラッシュクロマトグラフィ（１％ ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２） で精製し、無色油状の生成物を得た（３２ ｍｇ， ０．０７ ｍｍｏｌ、収率８２％）； Ｒｆ ＝ ０．４１ （２％ ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）； ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋１］＋ ４７４．３ （ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ２６Ｈ３６ＮＯ７， ４７４．３）。
【００９６】
例５
（１−カルバミル−２−メチル−プロピル）−カルバミン酸−（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ ）−５−メトキシ−４−［（２Ｒ， ３Ｒ ） −２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト −６−イルエステル
【化６０】
2004531466.tif 000046
１ （５５ ｍｇ， ０．１２ ｍｍｏｌ）、Ｄ−バリンアミド塩酸塩 （９３ ｍｇ， ０．６２ ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ （１１０ μＬ， ０．６２ ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ （２ ｍＬ）溶液を用いて、一般手順Ａに従った。フラッシュクロマトグラフィ（２％ ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）で精製し、無色油状の生成物を得た。 （４２ ｍｇ， ０．１０ ｍｍｏｌ， 収率８０％）； Ｒｆ ＝ ０．１９ （２％ ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）； ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋１］＋ ４２５．５ （Ｃ２２Ｈ３７Ｎ２Ｏ６の計算値４２５．５）。
【００９７】
例６
（１−カルバモイル−２−メチル−プロピル）−カルバミン酸−（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ ）−５−メトキシ−４−［（２Ｒ， ３Ｒ ）−２−メチル−３−（３−メチル−ブチル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルエステル
【化６１】
2004531466.tif 000047
【００９８】
例４に記載の化合物 （１８ ｍｇ， ０．０４ ｍｍｏｌ） を無水ＭｅＯＨ （１．５ ｍＬ） に溶解し、Ｈ２雰囲気下でＰｄ−Ｃ （２ ｍｇ） で処理した。１２時間後、その反応物をセライトを通して濾過し、溶媒を減圧除去して、無色油状の生成物を得た （１８ ｍｇ， ０．０４ ｍｍｏｌ， 収率１００％）； Ｒｆ ＝ ０．２１ （２％ ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）； ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋１］＋ ４２７．５ （Ｃ２２Ｈ３９Ｎ２Ｏ６の計算値， ４２７．５）。
【００９９】
例７
（１−ヒドロキシメチル−２−メチル−プロピル）−カルバミン酸−（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ ）−５−メトキシ−４−［（２Ｒ， ３Ｒ ）−２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルエステル
【化６２】
2004531466.tif 000048
【０１００】
１ （２９０ ｍｇ， ０．６５ ｍｍｏｌ）、Ｄ−バリノール （３３７ ｍｇ， ３．２５ ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ （５６０ μＬ， ３．２５ ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（５ ｍＬ）溶液を用いて、一般手順Ａに従った。フラッシュクロマトグラフィ （２％ ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）で精製し、無色油状の生成物を得た（２００ ｍｇ， ０．４９ ｍｍｏｌ， 収率７５％）； Ｒｆ ＝ ０．２６ （２％ ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）； ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋１］＋ ４１２．５ （Ｃ２２Ｈ３８ＮＯ６の計算値， ４１２．５）。
【０１０１】
例８
２−｛（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ ）−５−メトキシ−４−［（２Ｒ， ３Ｒ）−２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルオキシカルボニルアミノ｝−３，３−ジメチル −ブチル酸メチルエステル
【化６３】
2004531466.tif 000049
【０１０２】
１ （６５ ｍｇ， ０．１５ ｍｍｏｌ）、Ｄ−ｔＢｕ グリシンメチルエステル塩酸塩 （１３２ ｍｇ， ０．７３ ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ （１２７ μＬ， ０．７３ ｍｍｏｌ） の ＥｔＯＨ （８ ｍＬ）溶液を用いて、一般手順Ａに従った。フラッシュクロマトグラフィ （１０％ ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２） で精製し、無色油状の生成物を得た。 （１０ ｍｇ， ０．０２ ｍｍｏｌ， 収率１５％）； Ｒｆ ＝ ０．２２ （１０％ ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２）； ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋１］＋ ４５４．５ （Ｃ２４Ｈ４０ＮＯ７の計算値， ４５４．５）。
【０１０３】
例９
シクロヘキシル−２−｛（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ ）−５−メトキシ−４−［（２Ｒ， ３Ｒ）−２−メチル−３−（３−メチル −ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルオキシカルボニルアミノ｝−酢酸メチルエステル
【化６４】
2004531466.tif 000050
【０１０４】
１ （６５ ｍｇ， ０．１５ ｍｍｏｌ）、Ｄ−シクロヘキシルグリシンメチルエステル塩酸塩（２０７ ｍｇ， ０．７３ ｍｍｏｌ）、および ＤＩＥＡ （１２７ μＬ， ０．７３ ｍｍｏｌ） のＥｔＯＨ （７ ｍＬ）溶液を用いて、一般手順Ａに従った。フラッシュクロマトグラフィ （１０％ ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２）で精製し、 無色油状の生成物を得た（２０ ｍｇ， ０．０４ ｍｍｏｌ， 収率２８％）； Ｒｆ ＝ ０．２２ （１０％ ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２）； ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋１］＋ ４８０．３ （Ｃ２６Ｈ４２ＮＯ７の計算値， ４８０．３）。
【０１０５】
例１０
２−｛（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ ）−５−メトキシ−４−［（２Ｒ， ３Ｒ）−２−メチル−３−３−メチル−ブト−２−エニル］−オキシラニル｝−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルオキシカルボニルアミノ｝−３−メチル−ペンタン酸メチルエステル
【化６５】
2004531466.tif 000051
１ （６５ ｍｇ， ０．１５ ｍｍｏｌ）、Ｄ−イソロイシンメチルエステル塩酸塩（１３２ ｍｇ， ０．７３ ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ （１２７ μＬ， ０．７３ ｍｍｏｌ） のＥｔＯＨ （７ ｍＬ）溶液を用いて、一般手順Ａに従った。フラッシュクロマトグラフィ （１０％ ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２）で精製し、 無色油状の生成物を得た。（２０ ｍｇ， ０．０４ ｍｍｏｌ， 収率３０％）； Ｒｆ ＝ ０．２０ （１０％ ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２）； ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋１］＋ ４５４．５ （Ｃ２４Ｈ４０ＮＯ７の計算値， ４５４．５）。
【０１０６】
例１１
［１−（１−カルバモイル−２−ヒドロキシ−エチルカルバモイル）−２−メチル−プロピル］−カルバミン酸 −（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ ）−５−メトキシ−４−［（２Ｒ， ３Ｒ）−２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルエステル
【化６６】
2004531466.tif 000052
１ （７４ ｍｇ， ０．１７ ｍｍｏｌ）、Ｈ−Ｄ−ｖＳ−ＮＨ２・ＴＦＡ （２６２ ｍｇ， ０．８３ ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ （１４０ μＬ， ０．８３ ｍｍｏｌ） のＥｔＯＨ （５ ｍＬ）溶液を用いて、一般手順Ａに従った。ＨＰＬＣ （６０％ ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ） で精製し、白色固体状の生成物を得た（３４ ｍｇ， ０．０７ ｍｍｏｌ， 収率４０％）； Ｒｆ ＝ ０．２１ （５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）； ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋１］＋ ５１２．５ （Ｃ２５Ｈ４２Ｎ３Ｏ８の計算値， ５１２．３）。
【０１０７】
例１２
２−｛３−（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ ）−５−メトキシ−４−［（２Ｒ， ３Ｒ）−２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イル｝−ウレイド）−３−メチル−ブチラミド
【化６７】
2004531466.tif 000053
（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ）−５−メトキシ−４−［（２Ｒ， ３Ｒ）−２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルアミン （３； ＰＣＴ公報第ＷＯ ９９／５９９８７号） を公告済みの手順に基づいて調製した。０ ｏＣに冷却した粗 ３ （２９ ｍｇ， ０．１ ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ （２１ ｍＬ， ０．１ ｍｍｏｌ） およびＤＭＡＰ （２ ｍｇ） のＣＨ２Ｃｌ２ （１．５ ｍＬ） 溶液にｐ−ＮＯ２ フェニルクロロホルム酸塩（２５ ｍｇ， ０．１２ ｍｍｏｌ）を加えた。４５分後、その反応物を室温まで暖め、Ｈ−Ｄ−ｖａｌ−ＮＨ２・ＨＣｌ （４０ ｍｇ， ０．１５ ｍｍｏｌ） のＥｔＯＨ （１ ｍＬ） 溶液およびＤＩＥＡ （３５ μＬ， ０．２ ｍｍｏｌ）を加えた。
【０１０８】
その反応を１時間続けた後、減圧濃縮してＥｔＯＡｃ （１５ ｍＬ）に溶解し、希釈 ＨＣｌａｑ（２ ｘ １５ ｍＬ）， Ｈ２Ｏ （２ ｘ １５ ｍＬ） および食塩水（１５ ｍＬ）で洗浄した。フラッシュクロマトグラフィ （５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２） で精製し、白色固体状の生成物を得た （６ ｍｇ， ０．０１４ ｍｍｏｌ， ３からの収率１３％）； Ｒｆ ＝ ０．１２ （５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）； ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋１］＋ ４２４．４ （Ｃ２２Ｈ３８Ｎ３Ｏ５の計算値， ４２４．４）。
【０１０９】
例１３
Ｎ−カルバモイル （ＩＤ＃３１） ３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ） ５−メトキシ−４−［（２Ｒ，３Ｒ）２−メチル−３−（３−メチル−ブチル）−ｏオキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルエステル
【化６８】
2004531466.tif 000054
２ （４１ ｍｇ， ０．１１ ｍｍｏｌ）、ＰＳ−ＤＣＣ （２５６ ｍｇ， ０．２８ ｍｍｏｌ） のＤＭＦ （１ ｍＬ）溶液およびＨ−ＲＧＤ（Ｂｎ）Ｓ（ＯＢｎ）Ｐ−ＮＨ２・２ＴＦＡ （３７ ｍｇ， ０．０４ ｍｍｏｌ）、ＮＭＭ （４ μＬ， ０．０４ ｍｍｏｌ） のＤＭＦ （０．５ ｍＬ）溶液を用いて、一般手順ＢパートＩに従った。ＨＰＬＣ （７０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／０．０７５％ ＴＦＡ） で精製し、白色蛍光固体状の生成物を得た（９．３ ｍｇ， ０．００９ ｍｍｏｌ，収率１７％）と、 ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋１］＋ １０７５．４ （Ｃ５３Ｈ７５Ｎ１０Ｏ１４の計算値， １０７５．５）。
【０１１０】
一般手順パートＩの生成物（９．３ ｍｇ， ０．００９ ｍｍｏｌ） およびＰｄ／Ｃ （２ ｍｇ） のＭｅＯＨ （１ ｍＬ）溶液を用いて、Ｈ２雰囲気下（３８ ｐｓｉ）で２４時間かけて、一般手順パートＩＩに従った。ＨＰＬＣ （５５％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／０．０７５％ ＴＦＡ） で精製し、白色固体状の生成物を得た（５ ｍｇ， ０．００６ ｍｍｏｌ， 収率６５％）； ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋１］＋ ８９７．３ （Ｃ３９Ｈ６５Ｎ１０Ｏ１４の計算値， ８９７．５ ）。
【０１１１】
例１４
Ｎ−カルバモイル （ＩＤ＃３０） ３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ） ５−メトキシ−４−［（２Ｒ，３Ｒ）２−メチル−３−（３−メチル−ブチル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルエステル
【化６９】
2004531466.tif 000055
２ （３８ ｍｇ， ０．１０ ｍｍｏｌ） およびＰＳ−ＤＣＣ （２３８ ｍｇ， ０．２５ ｍｍｏｌ） のＤＭＦ （１ ｍＬ）溶液、Ｈ−ＲＧＤ（Ｂｎ）Ｙ（ＯＭｅ）ＲＥ（Ｂｎ）−ＮＨ２・３ＴＦＡ （３５ ｍｇ， ０．０３ ｍｍｏｌ） およびＮＭＭ （３ μＬ， ０．０３ ｍｍｏｌ）のＤＭＦ （０．５ ｍＬ）溶液を用いて、一般手順パートＩに従った。ＨＰＬＣ （７０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／０．０７５％ ＴＦＡ）で精製し、 白色蛍光固体状の生成物を得た（４．０ ｍｇ， ０．００２ ｍｍｏｌ， 収率８％）； ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋２／２］＋ ６７７．６ （Ｃ６６Ｈ９２Ｎ１４Ｏ１７の計算値， ６７７．８）。
【０１１２】
一般手順パートＩの生成物（３．０ ｍｇ， ０．００２ ｍｍｏｌ）およびＰｄ／Ｃ （２ ｍｇ） のＭｅＯＨ （１ ｍＬ）溶液を用いて、Ｈ２雰囲気下（３８ ｐｓｉ）で２４時間かけて、一般手順パートＩＩに従った。， ＨＰＬＣ （５５％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／０．０７５％ ＴＦＡ） で精製し、白色固体状の生成物を得た（３．３ ｍｇ， ０．００２７ ｍｍｏｌ， 収率９４％）； ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋２／２］＋ ５８８．５ （Ｃ５２Ｈ８２Ｎ１４Ｏ１７の計算値， ５８８．７）。
【０１１３】
例１５
Ｎ−カルバモイル （ＩＤ＃３２） ３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ） ５−メトキシ−４−［（２Ｒ，３Ｒ）２−メチル−３−（３−メチル−ブチル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルエステル
【化７０】
2004531466.tif 000056
２ （３８ ｍｇ， ０．１０ ｍｍｏｌ）、ＰＳ−ＤＣＣ （２３８ ｍｇ， ０．２５ ｍｍｏｌ）、および ＨＯＢｔ （２９ ｍｇ， ０．２５ｍｍｏｌ） のＤＭＦ （１ ｍＬ）溶液、およびＨ−ＲＧＤ（Ｂｎ）ＮＨ２・ＴＦＡ （２９ ｍｇ， ０．０４ ｍｍｏｌ）およびＮＭＭ （４．８ μＬ， ０．０４ ｍｍｏｌ） のＤＭＦ （０．５ ｍＬ）溶液を用いて、一般手順Ｂに従った。ＨＰＬＣ （６０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／０．０７５％ ＴＦＡ） で精製し、白色固体状の生成物を得た（３５ ｍｇ， ０．０４ ｍｍｏｌ， ４４％ｙｉｅｌｄ）； ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ８０１．２ （Ｃ３８Ｈ５７Ｎ８Ｏ１１の計算値， ８０１．４）。
【０１１４】
一般手順パートＩの生成物（３５ ｍｇ， ０．０４ ｍｍｏｌ）およびＰｄ／Ｃ （２ ｍｇ） のＭｅＯＨ （１ ｍＬ）溶液を用いて、Ｈ２雰囲気下（３８ ｐｓｉ）で２４時間かけて、一般手順パートＩＩに従った。 ＨＰＬＣ （５０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／０．０７５％ ＴＦＡ） で精製し、白色固体状の生成物を得た （２２ ｍｇ， ０．０３ ｍｍｏｌ， ７１％ ｙｉｅｌｄ）； ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ７１３．２ （Ｃ３１Ｈ５３Ｎ８Ｏ１１の計算値， ７１３．４）。
【０１１５】
例１６
Ｎ−カルバモイル （ＩＤ＃４０） ３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ） ５−メトキシ−４−［（２Ｒ，３Ｒ）２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルエステル
【化７１】
2004531466.tif 000057
２ （６５ ｍｇ， ０．１７ ｍｍｏｌ）、ＰＳ−ＤＣＣ （４０５ ｍｇ， ０．４３ ｍｍｏｌ）、および ＨＯＢｔ （３４ ｍｇ， ０．２６ ｍｍｏｌ） のＤＭＦ （１ ｍＬ）溶液、および Ｈ−ＲＧ（ピリジル）Ｄ−ＯＭｅ （４３ ｍｇ， ０．０６ ｍｍｏｌ） およびＮＭＭ （７ μＬ， ０．０６ ｍｍｏｌ） のＤＭＦ （０．５ ｍＬ）溶液を用いて、一般手順ＢパートＩに従った。ＨＰＬＣ （５０％ ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／０．０７５％ ＴＦＡ） で精製し、白色固体状の生成物を得た（１５ ｍｇ， ０．０２ ｍｍｏｌ， 収率３４％）； ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ７７３．２ （Ｃ３４Ｈ５５Ｎ４Ｏ１０の計算値， ７７３．４）。
【０１１６】
一般手順パートＩの生成物（１１ ｍｇ， ０．０１ ｍｍｏｌ） をＴＨＦ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ （２：１：１， ５００ μＬ） に溶解し、ＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ （１．２ ｍｇ， ０．０２ ｍｍｏｌ） で２時間処理した。粗材料をＥｔＯＡｃ （５ ｍＬ）で希釈し、 希塩酸 （１０ ｍＬ）で酸化させた。その水相をＥｔＯＡｃ （２ ｘ ５ ｍＬ）を加えて洗浄し、混合有機抽出物をＮａ２ＳＯ４ で乾燥し、溶媒を減圧除去した。ＨＰＬＣ （３０％ ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／０．０７５％ ＴＦＡ） で精製し、白色固体状の生成物を得た（２ ｍｇ， ０．００３ ｍｍｏｌ， 収率１９％）． ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ７４５．３ （Ｃ３３Ｈ５３Ｎ４Ｏ１０の計算値， ７４５．４）。
【０１１７】
例１７
Ｎ−カルバモイル （ＩＤ＃３９）（ ３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ） ５−メトキシ−４−［（２Ｒ，３Ｒ）２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルエステル
【化７２】
2004531466.tif 000058
２ （２５ ｍｇ， ０．０７ ｍｍｏｌ） およびＰＳ−ＤＣＣ （１５５ ｍｇ， ０．１６ ｍｍｏｌ） のＤＭＦ （１ ｍＬ）溶液、およびＨ−ＰＬＧＭＷＡＧ−ＮＨ２ （２０ ｍｇ， ０．０３ ｍｍｏｌ） およびＮＭＭ （３ μＬ， ０．０３ ｍｍｏｌ） のＤＭＦ （０．５ ｍＬ）溶液を用いて、一般手順ＢパートＩに従った。ＨＰＬＣ （７０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／０．０７５％ ＴＦＡ） で精製し、白色固体状の生成物を得た。 （１．４ ｍｇ， ０．００１ ｍｍｏｌ， 収率５％）； ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋１］＋ １０９５．６ （Ｃ５３Ｈ７９Ｎ１０Ｏ１３Ｓの計算値， １０９５．６）。
【０１１８】
例１８
Ｎ−カルバモイル （ＩＤ＃２６） （３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ） ５−メトキシ−４−［（２Ｒ，３Ｒ）２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルエステル
【化７３】
2004531466.tif 000059
２ （６９ ｍｇ， ０．１８ ｍｍｏｌ）、ＰＳ−ＤＣＣ （４２９ ｍｇ， ０．４５ ｍｍｏｌ） およびＨＯＢｔ （２１ ｍｇ， ０．１８ ｍｍｏｌ） のＤＭＦ （１ ｍＬ）溶液、ならびにＨ−ＰＬ（Ｎ−Ｍｅ）Ｇ−ＯＭｅ （３１ ｍｇ， ０．０７ ｍｍｏｌ） およびＮＭＭ （８ μＬ， ０．０７ ｍｍｏｌ） のＤＭＦ （０．５ ｍＬ）溶液を用いて、一般手順ＢパートＩに従った。ＨＰＬＣ （７０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／０．０７５％ ＴＦＡ） で精製し、白色固体状の生成物を得た（２７ ｍｇ， ０．０４ ｍｍｏｌ， ５９％ｙｉｅｌｄ）； ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋１］＋ ６７９．４ （Ｃ３４Ｈ５５Ｎ４Ｏ１０の計算値， ６７９．４）。
【０１１９】
パートＩの生成物 （２７ ｍｇ， ０．０４ ｍｍｏｌ） をＴＨＦ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ （２：１：１， １．５ ｍＬ） に溶解し、ＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ （４ ｍｇ， ０．１０ ｍｍｏｌ） で１時間処理した。０．１ Ｎ ＨＣｌ を用いてこの溶液をｐＨ ３に酸化させ、ＭｅＯＨ およびＴＨＦを減圧除去した。ＨＰＬＣ （６０％ ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／０．０７５％ ＴＦＡ） で精製し、白色固体状の生成物を得た（６ ｍｇ， ０．０１ ｍｍｏｌ， 収率２３％）。ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ６６５．４ （Ｃ３３Ｈ５３Ｎ４Ｏ１０の計算値， ６６５．４）。
【０１２０】
例１９
Ｎ−カルバモイル （ＩＤ＃２７） （３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ） ５−メトキシ−４−［（２Ｒ，３Ｒ）２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルエステル
【化７４】
2004531466.tif 000060
２ （４４ ｍｇ， ０．１２ ｍｍｏｌ）、ＰＳ−ＤＣＣ （２７６ ｍｇ， ０．２９ ｍｍｏｌ） およびＨＯＢｔ （２７ ｍｇ， ０．２３ ｍｍｏｌ） のＤＭＦ （１ ｍＬ）溶液、ならびにＨ−ＰＬＧ−ＯＭｅ （２０ ｍｇ， ０．０５ ｍｍｏｌ） およびＮＭＭ （５ μＬ， ０．０５ ｍｍｏｌ） のＤＭＦ （０．５ ｍＬ）溶液を用いて、一般手順ＢパートＩに従った。ＨＰＬＣ （９０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／０．０７５％ ＴＦＡ） で精製し、白色固体状の生成物を得た （１３ ｍｇ， ０．０２ ｍｍｏｌ， 収率４３％）； ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋１］＋ ６６４．４ （Ｃ３４Ｈ５２Ｎ４Ｏ１０の計算値， ６６４．４）。
【０１２１】
パートＩの生成物 （２７ ｍｇ， ０．０４ ｍｍｏｌ） をＴＨＦ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ （２：１：１， ７９０ μＬ） に溶解し、ＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ （１．２ ｍｇ， ０．０３ ｍｍｏｌ）で２時間処理した。この溶液を０．１ Ｎ ＨＣｌ を用いてｐＨ ３ に酸化させ、ＭｅＯＨおよびＴＨＦを減圧除去した。ＨＰＬＣ （９０％ ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／０．０７５％ ＴＦＡ）で精製し、白色固体状の生成物を得た （１．８ ｍｇ， ０．００３ ｍｍｏｌ， 収率１５％）。ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ６５０．４ （Ｃ３２Ｈ５０Ｎ４Ｏ１０の計算値， ６５０．４）。
【０１２２】
例２０
（ＩＤ＃２４）−（２Ｒ−｛（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ） ５−メトキシ−４−［（２Ｒ，３Ｒ）２−メチル −３−（３−メチル−ブト −２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ ［２．５］オクト−６−イルオキシカルボニル｝ アミノ−３−メチル−ブタノール） エステル
【化７５】
2004531466.tif 000061
例７に記載の化合物 （１８９ ｍｇ， ０．４６ ｍｍｏｌ）、Ａｃ−ＰＬＧＭＷＡ−ＯＨ （３２９ ｍｇ， ０．４６ ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ （８４ ｍｇ， ０．６９ ｍｍｏｌ） およびＤＩＣ （７２ μＬ， ０．４６ ｍｍｏｌ） のＣＨ２Ｃｌ２ （５ ｍＬ）溶液を用いて、一般手順Ｃ従った。１８時間後、その溶媒を減圧除去してフラッシュクロマトグラフィ（２％ ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）で精製し、 白色固体状の生成物を得た（３５７ ｍｇ， ０．３２ ｍｍｏｌ， 収率７０％）； Ｒｆ ＝ ０．１８ （５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）； ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋１］＋ １１１０．３ （Ｃ５６Ｈ８５Ｎ８Ｏ１３Ｓの計算値， １１１０．３）。
【０１２３】
例２１
（ＩＤ＃３６）−（２Ｒ−｛（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ） ５−メトキシ−４−［（２Ｒ，３Ｒ）２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ ［２．５］オクト−６−イルオキシカルボニル｝アミノ−３−メチル−ブタノール） エステル
【化７６】
2004531466.tif 000062
例７に記載の化合物 （６１ ｍｇ， ０．１５ ｍｍｏｌ）、Ａｃ−ＰＬＧＭＧ−ＯＨ （９２ ｍｇ， ０．１８ ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ （２２ ｍｇ， ０．１８ ｍｍｏｌ） およびＤＩＣ （２８ μＬ， ０．１８ ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２ （２ ｍＬ）溶液を用いて、一般手順Ｃに従った。７時間後、その溶媒を減圧除去し、フラッシュクロマトグラフィ （３％ ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）で精製し、白色固体状の生成物を得た （６１ ｍｇ， ０． ｍｍｏｌ， 収率４５％）； Ｒｆ ＝ ０．２０ （５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）； ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋１］＋ ９０９．７ （Ｃ４４Ｈ７３Ｎ６Ｏ１２Ｓの計算値， ９０９．５）。
【０１２４】
例２２
（ＩＤ＃３６）−（２Ｒ−｛（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ） ５−メトキシ−４−［（２Ｒ，３Ｒ）２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ ［２．５］オクト−６−イルオキシカルボニル｝アミノ−３−メチル−ブタノール） エステル
【化７７】
2004531466.tif 000063
例７に記載の化合物（７９ ｍｇ， ０．１９ ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−ＭＷＡ−ＯＨ （１２１ ｍｇ， ０．１９ ｍｍｏｌ） およびＤＭＡＰ （４ ｍｇ， ０．０３ ｍｍｏｌ）およびＤＩＣ （３０ μＬ， ０．１９ ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２ （２ ｍＬ）溶液を用いて、一般手順Ｃに従った。１１時間後、その溶媒を減圧除去し、フラッシュクロマトグラフィ （２％ ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）で精製し、白色固体状の生成物を得た （１２８ ｍｇ， ０．１２ ｍｍｏｌ， 収率６５％）； ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋１］＋ １０２２．９ （Ｃ４４Ｈ７３Ｎ６Ｏ１２Ｓの計算値， １０２２．５）。
【０１２５】
一般手順Ｃの生成物 （上述） （５４ ｍｇ， ０．０５ ｍｍｏｌ） を０ ｏＣに冷却した無水ＣＨ２Ｃｌ２ （３ ｍＬ） に溶解し、ゆるいＮＨ３（ｇ） 流で１５分間処理した。この反応物を密封して、３６時間０℃に維持した。その溶媒を減圧除去し、粗残留物をＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（０．０７５％ ＴＦＡ） （５ ｍＬ）で処理した。ＨＰＬＣ （７０％ ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／０，０７５％ ＴＦＡ） で精製し、白色固体状の生成物を得た （２ ｍｇ， ０．００３ ｍｍｏｌ， 収率５％）； ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋１］＋ ８００．６ （Ｃ４１Ｈ６２Ｎ５Ｏ９Ｓの計算値， ８００．５）。
【０１２６】
例２３
（ＩＤ＃３８）−（２Ｒ−｛（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ） ５−メトキシ−４−［（２Ｒ，３Ｒ）−２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ ［２．５］オクト−６−イルオキシカルボニル｝アミノ−３−メチル−ブタノール） エステル
【化７８】
2004531466.tif 000064
例７に記載の（７６ ｍｇ， ０．１８ ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−ＭＧ−ＯＨ （７９ ｍｇ， ０．１８ ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ （４ ｍｇ， ０．０３ ｍｍｏｌ） およびＶＤＩＣ （２９ μＬ， ０．１８ ｍｍｏｌ） のＣＨ２Ｃｌ２ （２ ｍＬ）溶液を用いて、一般手順Ｃに従った。１０時間後、その溶媒を減圧除去し、フラッシュクロマトグラフィ（２％ ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）で精製して、白色固体状の生成物を得た（１２８ ｍｇ， ０．１２ ｍｍｏｌ， 収率６５％）； ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋１］＋ ８２２．６ （Ｃ４４Ｈ６０Ｎ３Ｏ１０Ｓの計算値， ８２２．５）。
【０１２７】
一般手順Ｃの生成物（上述） （４２ ｍｇ， ０．０５ ｍｍｏｌ） を０ ｏＣに冷却した無水ＣＨ２Ｃｌ２ （３ ｍＬ） に溶解し、ゆるいＮＨ３（ｇ） 流で１５分間処理した。その反応物を密封し、３６時間０℃に維持した。その溶媒を減圧除去し、その粗残留物をＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（０．０７５％ ＴＦＡ） （５ ｍＬ）で酸化させた。ＨＰＬＣ （７０％ ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／０．０７５％ ＴＦＡ） で精製し、白色固体状の生成物を得た（２ ｍｇ， ０．００３ ｍｍｏｌ， 収率５％）； ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋１］＋ ６００．４ （Ｃ２９Ｈ５０Ｎ３Ｏ８Ｓの計算値， ６００．４）。
【０１２８】
例２４
２−｛（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ）−５−メトキシ−４−［（２Ｒ， ３Ｒ）−２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルオキシカルボニル｝−３−メチル−ブチル酸
【化７９】
2004531466.tif 000065
例２に記載の化合物 （９ ｍｇ， ０．０２ ｍｍｏｌ）をＴＨＦ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ （１ ｍＬ） に溶解し、ＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ （２ ｍｇ， ０．０５ ｍｍｏｌ）で処理した。２時間後、その反応物をＥｔＯＡｃ （５ ｍＬ） および希塩酸 （５ ｍＬ）に分割した。その有機相をＮａ２ＳＯ４ で乾燥させ、その溶媒を減圧除去した。ＨＰＬＣ （８５％ ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／０．０７５％ ＴＦＡ）で精製し、白色固体状の生成物を得た （０．５８ ｍｇ， ０．００１ ｍｍｏｌ， 収率６％ ）； ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋１］＋ ４２６．４ （Ｃ２２Ｈ３６ＮＯ７の計算値， ４２６．５）。
【０１２９】
例２５
（ＩＤ＃３４）−２−｛（３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｓ， ６Ｒ）−５−メトキシ−４−［（２Ｒ， ３Ｒ）−２−メチル−３−（３−メチル−ブト−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクト−６−イルオキシカルボニル｝アミノ−３−メチル−ブタノール）エステル
【化８０】
2004531466.tif 000066
例７に記載の化合物 （４１ ｍｇ， ０．１０ ｍｍｏｌ）， Ａｃ−ＰＬＧＭＧ−ＯＨ （６３ ｍｇ， ０．１２ ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ （１５ ｍｇ， ０．１２ ｍｍｏｌ） およびＤＩＣ （１９ μＬ， ０．１２ ｍｍｏｌ） のＣＨ２Ｃｌ２ （２ ｍＬ）溶液を用いて、一般手順Ｃに従った。７時間後、その溶媒を減圧除去し、フラッシュクロマトグラフィ（３％ ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）で精製し、白色固体状の生成物を得た（４３ ｍｇ， ０．０５ ｍｍｏｌ， 収率４７％）； Ｒｆ ＝ ０．２１ （５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）； ＬＲＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋１］＋ ９２３．７ （Ｃ４５Ｈ７５Ｎ６Ｏ１２Ｓの計算値， ９２３．５）。
【０１３０】
例２６
本願発明の血管新生阻害化合物を、ヒト内皮細胞成長の調節能力、およびＭｅｔＡＰ２の活性の調節能力についてテストした。ＭｅｔＡＰ２酵素アッセイは、基本的に、その内容全体を引用することにより援用するＴｕｒｋ， Ｂ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｃｈｅｍ． ＆ Ｂｉｏ． ６： ８２３−８３３に記載の通り行った。ウシ大動脈内皮細胞成長アッセイ（Ｂａｅｃアッセイ）は、基本的に、その内容全体を引用することにより援用するＴｕｒｋ， Ｂ． ｅｔ ａｌ． （同上） に記載の通り行った。
【０１３１】
ヒト内皮細胞成長アッセイのために、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をクロンティクス（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）社製内皮成長培地（ＥＧＭ）に入れ、３７℃の加湿したインキュベータで維持した。細胞をトリプシンで剥がし、３００ ｘ ｇで５分間室温で遠心分離器にかけてペレットにした。ＨＵＶＥＣを９６穴プレートに５，０００細胞／ウエル入れた。６時間インキュベーションした後、その培地を、０．５ ｎＭ ｂＦＧＦを添加した新鮮ＥＧＭ ０．２ ｍｌおよび所望の濃度のテスト用血管新生阻害化合物に交換した。テスト用血管新生阻害化合物を、まずストック濃度が１０ｍＭまたは０．１ｍＭのエタノールに溶解し、次いでＥＧＭ中で最終濃度が１ ｐＭ乃至０．１ ｍＭになるように希釈した。３７℃で４８時間維持した後、その培地を新鮮ｂＦＧＦ添加ＥＧＭおよびテスト用血管新生阻害化合物に交換した。３７℃でさらに４８時間インキュベーションした後、ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチル値アゾー−２−イル］−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド）を１ｍｇ／ｍｌになるまで加えた。３７℃で２乃至４時間経過後、その培地を０．１ｍｌ／ウエルのイソプロパノールに交換した。そのプレートを室温で１５分間振盪器にかけ、ラブシステムズ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）社製マルティスキャン（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ）プレートスペクトロフォトメータで吸光度５７０ｎｍにおいて解析した。
【０１３２】
表Ｉ乃至ＩＩＩに記載のこのアッセイの結果は、本願発明の血管新生阻害化合物が、優れたＭｅｔＡＰ２阻害活性を有し、ピコモル台で内皮細胞の成長を阻害することができることを示している。
【表１】
2004531466.tif 000067
【表２】
2004531466.tif 000068
【表３】
2004531466.tif 000069
【０１３３】
各実験に用いた血管新生阻害化合物の特性を表ＩＶおよびＶに示す。
【表４】
2004531466.tif 000070
【表５】
2004531466.tif 000071
【０１３４】
例２７
本発明の血管新生阻害化合物を、ラット大動脈輪アッセイ（ＲＡＲＡ）を用いて、血管新生を調節する能力についてもテストした。このアッセイのために、体重１２５乃至１５０ｇのオスＳＤ系（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットにカテミン（ｃａｔｅｍｉｎｅ）を筋肉内注射後に心臓内注射し、エタノールに浸してから滅菌培養フードに移して解剖した。中腹部から胸郭まで切開してから、肋骨を切除して胸腔を露出させた。心臓および肺を脇へよけて胸部大動脈の位置を特定した。大動脈弓から遠位の部分から横隔膜までのびている大動脈の一部分を取り出し、ただちに４ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（バッファＡ）を含有するＭＣＤＢ−１３１培地中においた。ピペットマンで静かに大動脈からバッファＡを吸い取り、血液を除去した。大動脈を取り巻く線維組織を慎重に除去し、その大動脈を滅菌カミソリで１乃至２ ｍｍの切片にスライスした。その切片を５０ｍｌの円錐管に収集し、新鮮なバッファＡで５回洗浄した。
【０１３５】
２４穴培養プレートに、オートクレーブした１．５％アガロースをバッファＡに溶解したものをコーティングした。アガロースが凝固した後、そのウエルをバッファＡ １ｍｌで満たした。各ウエルに大動脈を１片ずつ浸し、３５．５℃／５％ ＣＯ２の加湿インキュベーターに入れて１０日間インキュベートした。バッファＡは２日ごとに交換した。その大動脈片を５０ ｍｌの円錐管に収集して、新鮮なバッファＡで５回洗浄した。
【０１３６】
オートクレーブした１．５％アガロース１ ｍｌをバッファＡに溶解したものを、２４穴培養プレートの各ウエルに加え、凝固させた。凝固したアガロースからエタノールで滅菌したコルク穿孔器でアガロースウエルを切り出し、１２穴培養プレートに入れた。コラボラティブ・バイオメディカル・プロダクツ社製ラット尾部タイプＩコラーゲンと、１Ｎ ＮａＯＨ約０．２ｍｌでｐＨ７に調整した７．５ Ｘダルベッコ変法イーグル培地２ ｍｌを混合して、コラーゲン溶液を調製した。コラーゲン溶液１００ μｌをアガロースウエルの基質に加えて、３５．５℃／５％ ＣＯ２の加湿インキュベーターに入れた。０．５ｎＭ ｂＦＧＦおよび所望の濃度のテスト化合物を添加したコラーゲン溶液３００ｍｌを加え、大動脈片をコラーゲン上層に浸した。テスト化合物は、最初にストック濃度０．１ｍＭのエタノールに溶解し、次いでバッファＡ、最後にコラーゲン溶液で希釈して、最終濃度を０．１ｎＭ乃至１００ｎＭにした。コラーゲンをセットした後、アガロースウエルを０．５ｎＭ ｂＦＧＦおよび所望の濃度のテスト血管新生阻害化合物を添加したバッファＡ １．５ｍｌで取り囲んだ。４８時間ごとにウエルを取り囲んでいるバッファを交換した。７日後、大動脈輪から飛び出した血管を顕微鏡で計数した。
【０１３７】
本願明細書の図１に記載のこのアッセイの結果は、本願発明の血管新生阻害化合物は優れた（ＴＮＰ−４７０の血管新生阻害活性と比較してはるかに優れた）血管新生阻害活性を有することを示している。
【０１３８】
例２８
ヒト血漿における本願発明の血管新生阻害化合物の血漿安定性も、３７℃でテストした（血管新生阻害化合物の濃度は２０μＭ）。テスト血管新生阻害化合物を加えていない基質を３７℃で３分間平衡化した。このアッセイは、まずテスト化合物を加えることから始め、その反応混合物を振盪するウォーターバスに入れ３７℃でインキュベートした。１００μＬずつを３回、０、６０、および１２０分経過時点に取り除き、氷冷したアセトニトリル２００μＬと混合して反応を停止させた。この上清を、液体クロマトグラフィ／質量分光法（ＬＣ／ＭＳ）で４点標準曲線を用いて分析し、回収率（％）を求めた。
【０１３９】
インキュベーション混合物中の親化合物の残量（時間点が０の時と比較して）を時間の関数としてプロットし、観測データを一次の指数方程式にフィットし、テスト用血管新生阻害化合物の消失に関する消失半減期を求めた。結果を表ＶＩに示す。
【０１４０】
【表６】
2004531466.tif 000072
【０１４１】
肝ミクロソーム中の血管新生化合物の安定性もテストした。濃度が３μＭのテスト血管新生阻害化合物を、ｐＨ７．４の１００ｍＭリン酸塩バッファに入れたＮＡＤＰＨ再生システム（１ ｍＮ ＮＡＤＰ、１０ ｍＭ Ｇ６Ｐ、１Ｕ／ｍＬ Ｇ６ＰｄＨ２、３ ｍＭ ＭｇＣｌ２）の存在下で、オスラット肝ミクロソームと共に３７℃でインキュベートした。インキュベーションは、１ｍＭエポキシドヒドロラーゼ（ＥＨ）阻害物質Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（３−フェニルプロピル）尿素の存在下および不在下において行い（Ｍ． Ｍｏｒｉｓｓｅａｕ ｅｔ ａｌ．  （１９９９） ＰＮＡＳ ９６：８８４９−５４）、定量解析はＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて行った。
【０１４２】
インキュベーション混合物中の親化合物の残量（時間点が０の時と比較して）を時間の関数でプロットし、観測データを一次指数方程式にフィットして、テスト化合物の消失に関する消失半減期を求めた。結果を表ＶＩＩに示す。
【０１４３】
【表７】
2004531466.tif 000073
【０１４４】
例２９
例５に記載の化合物の有効性を、コラーゲン誘導関節炎モデルを用いて評価した。簡単に説明すると、同系の８週齢メスルーバンラットを、第０日にエーテル麻酔して、０．１Ｍ酢酸に溶解して不完全フロイントアジュバント（ディフコ社、ミシガン州デトロイト）に乳化したヒヨココラーゲンＩＩ（ゲンザイム社、マサチューセッツ州ボストン）０．５ｍｇを皮下注射して免疫した。この方法を用いると、一般に、免疫してから１０乃至１４日後に、９０％を超えるラットの両後脚に滑膜炎が生じる。関節炎の発症が確定したラット（合計４７匹）を本研究に繰り入れ、４種類のプロトコルのうちの１つに無作為に割り付けた。例５に記載の化合物をエタノールと蒸留水の混合液に溶解させた。ラットへの投与は免疫後の第１０日から以下のように開始した：（１）対照群：賦形剤のみを毎日静脈注射（ｉｖ）で投与、（２）高用量群：例５に記載の化合物３０ｍｇ／ｋｇを１日おきにｉｖで投与（ラット１２匹）、（３）低用量群：例５に記載の化合物１５ｍｇ／ｋｇを毎日ｉｖで投与（ラット１２匹）、（４）経口群：例５に記載の化合物１００ｍｇ／ｋｇを１日おきに強制経口投与（ラット１１匹）。
【０１４５】
各脚の毎日の臨床評価は０から４までの整数スケールで評価し、０点の場合は正常で病変のない脚を示し、４点は重度の関節破壊を示す。臨床点数は４本の脚の合計点数で、最大で１６点になりうる。コラーゲン誘導関節炎は一般に後脚にしか発生せず、従って６乃至８点は重度の関節炎である。
【０１４６】
後脚の放射線学的評価は、治療プロトコルを知らされていない試験担当医師が行った。各脚の点数は、（１）軟組織の膨潤度、（２）関節間の空間の狭窄度、（３）骨膜の新しい骨の形成度、（４）びらんまたは強直の存在に基づいて決定した。各脚は１乃至３の点数で評価され、１点は正常脚を示し、３点は重度の関節破壊を示す。したがって各ラットの放射線学的評価の点数は最大で６点（両後脚の合計）になりうる。
【０１４７】
本研究の結果を図２に記載する。図２は臨床関節炎の誘導（第１０日）後から１９日間の、ラットの４群それぞれにおける平均１日臨床点数を示す。この結果は、各治療群とも例５に記載の化合物から有意な治療上の利益（ベネフィット）を受けたことを示している。この観察に一致して、平均放射線学的評価点数は、対照群では２．２点、高用量群では０．６点、低用量群では０．６点、および経口投与群では１．６点だった。したがって、例５に記載の化合物を投与された各群は、対照群と比較して、関節破壊に関しては有意な利益を受けた。
【０１４８】
例３０
例５に記載の化合物を癌細胞株パネルに対しても評価した（Ａｌｌｅｙ， Ｍ．Ｃ． ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４８： ５８９−６０１と、 Ｇｒｅｖｅｒ， Ｍ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １９， Ｎｏ． ６， ｐｐ ６２２−６３８と、 Ｂｏｙｄ， Ｍ．Ｒ．， ａｎｄ Ｐａｕｌｌ， Ｋ．Ｄ． （１９９５） Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４： ９１−１０９）。癌スクリーニングパネルのヒト腫瘍細胞株を、５％ウシ胎仔血清および２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ １６４０培地で増殖した。細胞を１００μＬずつ９６穴マイクロタイタープレートに播種した。プレーティング濃度は、各細胞株の倍加時間によって５，０００乃至４０，０００細胞／ウエルの範囲内であった。細胞の播種後、そのマイクロタイタープレートを３７℃、５％ ＣＯ２、９５％空気、相対湿度１００％で、実験用薬物を添加する前の２４時間インキュベートした。
【０１４９】
２４時間のインキュベーション時間後、２プレートの各細胞株をＴＣＡとともにｉｎ ｓｉｔｕで固定し、薬物を添加する時点（Ｔｚ）における各細胞株の細胞数の測定とした。実験用薬物をジメチルスルホキシドに溶解し、所望の最終最大テスト濃度の４００倍の濃度にして、使用前に凍結保存した。薬物を添加する時点において凍結させた濃縮液の一部を解凍し、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有する完全培地で所望の最終最大テスト濃度の２倍まで希釈した。さらに４倍、１０倍または１／２ｌｏｇ連続希釈を行い、５種類の薬物濃度と対照を作製した。これら異なる薬物希釈液１００μｌずつを、すでに１００μｌの培地を含有する適切なマイクロタイターウエルに添加し、所要の最終薬物濃度を得た。
【０１５０】
薬物の添加後、そのプレートを３７℃、５％ ＣＯ２、９５％空気、相対湿度１００％で、さらに４８時間インキュベートした。接着細胞のために、冷ＴＣＡを加えてこのアッセイを停止させた。５０％（ｗ／ｖ）の冷ＴＣＡ５０μｌ（最終濃度、１０％ＴＣＡ）を静かに加えて、細胞をｉｎ ｓｉｔｕで固定し、４℃で６０分間インキュベートした。その上静を廃棄し、プレートを水道水で５回洗浄し、空気乾燥させた。０．４％（ｗ／ｖ）のスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）１％酢酸溶液（１００μｌ）を各ウエルに加え、プレートを室温で１０分間インキュベートした。染色後、結合しなかった色素を、１％酢酸で５回洗浄して除去し、このプレートを空気乾燥させた。次に、結合した色素を１０ｍＭトリズマベース（ｔｒｉｚｍａ ｂａｓｅ）で溶解し、自動化プレートリーダーで波長５１５ ｎｍの吸光度を測定した。細胞を懸濁させるために用いた方法は同一であるが、アッセイを終了するには５０ｍｌの８０％ ＴＣＡ（最終濃度は１６％ ＴＣＡ）を静かに加え、定着した細胞をウエルの底に固定した。７つの吸光度測定値（ゼロ時点（Ｔｚ）、対照の増殖（Ｃ）、および５種類の濃度の薬物が存在する場合のテスト増殖）を用いて、増殖率（％）を各薬物濃度において計算した。
【０１５１】
成長阻害率は、
濃度がＴｉ＞／＝Ｔｚの場合  ［（Ｔｉ−Ｔｚ）／（Ｃ−Ｔｚ）］ ｘ １００
濃度がＴｉ＜Ｔｚの場合  ［（Ｔｉ−Ｔｚ）／Ｔｚ］ ｘ １００
で計算した。
【０１５２】
５０％増殖阻害（ＧＩ５０）は［（Ｔｉ−Ｔｚ）／（Ｃ−Ｔｚ）］ ｘ １００ ＝ ５０で計算した。これは、薬物インキュベーションの間に対照細胞中の純タンパク増加量（ＳＲＢ染色によって測定）が５０％減少する薬物濃度である。各細胞株のＧＩ５０は、活性レベルに到達する場合に計算した。しかし、その効果に達していなかったり超過している場合には、そのパラメタについての値は最大（１０−４Ｍ）または最小濃度（１０−８Ｍ）よりも大きいまたは小さいと表現する。
【０１５３】
【表８】
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【０１５４】
表ＶＩＩＩに示した細胞株スクリーニングの結果は、例５に記載の化合物が多様な腫瘍細胞株に有意な阻害作用を与えることを示している。また、この結果から、特定の細胞株が他のものよりも例５に記載の化合物に対して感受性がはるかに高いことが明らかであり、この化合物には特定の細胞株に対して選択性があることを示唆している。
【０１５５】
等価物
当業者であれば、ごく普通の実験を用いるのみで、ここに説明した本願発明の特定の実施例の等価物を数多く認識し、または確認できることであろう。このような等価物は、上述の請求の範囲の包含するところである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本願発明の血管新生阻害化合物が血管新生を阻害する能力をテストするために用いたラット大動脈輪アッセイ（ＲＡＲＡ）の結果を示すグラフである。
【図２】
臨床関節炎を導入後１９日間テストしたラット４群のそれぞれにおける平均１日臨床点数を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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