(57)【要約】本発明は、被験対象の病気になった組織または損傷した組織に新しい血管を形成する方法、被験対象の病気になった組織または損傷した組織への血流を増加させる方法、被験対象の病気になった組織における血管形成を増加させる方法に関するものであり、この方法は、ａ）被験対象からその被験対象に由来する骨髄単核細胞を単離し；ｂ）その被験対象に由来する骨髄単核細胞の有効量を組織内に局所的に移植することにより、その病気になった組織または損傷した組織に新しい血管を形成する操作を含んでいる。新しい血管としては、虚血組織または任意の血管形成部位における毛細血管または副行血管が可能である。本発明は、被験対象に由来する骨髄単核細胞の有効量を病気になった組織または損傷した組織に局所的に移植して病気になったそのような組織における血管形成を誘導することにより組織の治療を行なう方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験対象の組織内に新しい血管を形成する方法であって、
ａ）被験対象からその被験対象に由来する骨髄単核細胞を単離し；
ｂ）その被験対象に由来する骨髄単核細胞の有効量を組織内に局所的に移植することにより、その組織内に新しい血管を形成する操作を含む方法。
【請求項２】
上記組織が虚血組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記虚血組織が心筋組織である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記虚血組織が骨格筋組織である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
上記組織が損傷した組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
損傷した上記組織が、心筋、骨格筋、脳、腎臓、肝臓、胃腸管器官、冠状血管、末梢血管、萎縮した筋肉、皮膚、肺のいずれかである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
損傷した上記組織が、人工的に形成された部位である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
上記被験対象が哺乳類である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
上記哺乳類がヒトである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記新しい血管が毛細血管を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
上記新しい血管が副行血管を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
被験対象の組織への血流を増加させる方法であって、
ａ）被験対象からその被験対象に由来する骨髄単核細胞を単離し；
ｂ）その被験対象に由来する骨髄単核細胞の有効量を組織内に局所的に移植することによりその組織内に新しい血管を形成し、その結果として被験対象のその組織への血流を増加させる操作を含む方法。
【請求項１３】
上記新しい血管が毛細血管を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
上記新しい血管が副行血管を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
上記組織が虚血組織である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
上記虚血組織が心筋組織である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
上記虚血組織が骨格筋組織である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
上記組織が損傷した組織である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
損傷した上記組織が、心筋、骨格筋、脳、腎臓、肝臓、胃腸管器官、冠状血管、末梢血管、萎縮した筋肉、皮膚、肺のいずれかである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
損傷した上記組織が、人工的に形成された部位である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
上記被験対象が哺乳類である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
上記哺乳類がヒトである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
被験対象の病気になった組織を治療する方法であって、
ａ）被験対象からその被験対象に由来する骨髄単核細胞を単離し；
ｂ）その被験対象に由来する骨髄単核細胞の有効量を病気になった組織内に局所的に移植することにより新しい血管を形成し、その結果として被験対象の病気になった組織を治療する操作を含む方法。
【請求項２４】
病気になった上記組織が虚血組織である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
上記虚血組織が心筋組織である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
上記虚血組織が骨格筋組織である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
病気になった上記組織が、心筋、骨格筋、脳、腎臓、肝臓、胃腸管器官、冠状血管、末梢血管、萎縮した筋肉、皮膚、肺のいずれかである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
上記新しい血管が毛細血管を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
上記新しい血管が副行血管を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
上記被験対象が哺乳類である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
上記哺乳類がヒトである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
被験対象の病気になった組織における血管形成を増やす方法であって、
ａ）被験対象からその被験対象に由来する骨髄単核細胞を単離し；
ｂ）その被験対象に由来する骨髄単核細胞の有効量を病気になった組織内に局所的に移植することにより、被験対象の病気になった組織における血管形成を増やす操作を含む方法。
【請求項３３】
病気になった上記組織が虚血組織である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
上記虚血組織が心筋組織である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
上記虚血組織が骨格筋組織である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
病気になった上記組織が、心筋、骨格筋、脳、腎臓、肝臓、胃腸管器官、冠状血管、末梢血管、萎縮した筋肉、皮膚、肺のいずれかである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
上記被験対象が哺乳類である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
上記哺乳類がヒトである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
被験対象の心不全を予防する方法であって、
ａ）被験対象からその被験対象に由来する骨髄単核細胞を単離し；
ｂ）その被験対象に由来する骨髄単核細胞の有効量を心臓に移植することにより新しい血管を形成し、その結果として被験対象の心不全を予防する操作を含む方法。
【請求項４０】
上記新しい血管が毛細血管を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
上記新しい血管が副行血管を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
上記被験対象が哺乳類である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
上記哺乳類がヒトである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
被験対象の組織を再生させる方法であって、
ａ）被験対象からその被験対象に由来する骨髄単核細胞を単離し；
ｂ）その被験対象に由来する骨髄単核細胞の有効量をその組織に局所的に移植することによりその組織内に新しい血管を形成し、その結果として被験対象の組織を再生させる操作を含む方法。
【請求項４５】
上記新しい血管が毛細血管を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
上記新しい血管が副行血管を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
上記組織が病気になった組織である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
病気になった上記組織が虚血組織である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
上記虚血組織が心筋組織である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
上記虚血組織が骨格筋組織である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
病気になった上記組織が、傷ついた冠状血管または閉塞した冠状血管である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
病気になった上記組織が、傷ついた末梢血管または閉塞した末梢血管である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
病気になった上記組織が、心筋、骨格筋、脳、腎臓、肝臓、胃腸管器官、冠状血管、末梢血管、萎縮した筋肉、皮膚、肺のいずれかである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
上記被験対象が哺乳類である、請求項４４に記載の方法。
【請求項５５】
上記哺乳類がヒトである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
組み換え核酸分子を被験対象の病気組織部位に到達させる方法であって、
ａ）被験対象からその被験対象に由来する骨髄単核細胞を単離し；
ｂ）その被験対象の骨髄単核細胞に組み換え核酸分子を挿入して形質転換された骨髄単核細胞を形成し；
ｃ）病気組織部位に、その被験対象の形質転換された骨髄単核細胞の有効量を投与する操作を含む方法。
【請求項５７】
上記組み換え核酸分子が増殖因子をコードしている、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
上記増殖因子がサイトカインである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
上記サイトカインを、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ（ｃ−ｋｉｔリガンド）、ｂＦＧＦ、ケモカイン、インターロイキンからなるグループの中から選択する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
上記組み換え核酸分子が細胞生存タンパク質をコードしている、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
上記細胞生存タンパク質を、ヘム・オキシゲナーゼ、ＡＫＴ（セリン−トレオニン・キナーゼ）、ＨＩＦα（低酸素血症誘導因子）、Ｄｅｌ−１（発生胚遺伝子座−１）、ＮＯＳ（一酸化窒素シンターゼ）、ＢＭＰ（骨誘導因子）、β２−アドレナリン受容体、ＳＥＲＣＡ２ａ（筋小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ）からなるグループの中から選択する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
病気になった上記組織が虚血組織である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６３】
上記虚血組織が心筋組織である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
上記虚血組織が骨格筋組織である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
上記病気組織部位が、傷ついた冠状血管または閉塞した冠状血管である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６６】
上記病気組織部位が、傷ついた末梢血管または閉塞した末梢血管である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６７】
病気になった上記組織が、心筋、骨格筋、脳、腎臓、肝臓、胃腸管器官、冠状血管、末梢血管、萎縮した筋肉、皮膚、肺のいずれかである、請求項５６に記載の方法。
【請求項６８】
上記被験対象が哺乳類である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６９】
上記哺乳類がヒトである、請求項６６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０００年７月２６日に出願された同時係属中のアメリカ合衆国特許仮出願第６０／２２０，８３４号の恩恵を主張するものであり、参考としてその内容の全体がこの明細書に組み込まれている。
【０００２】
本発明は、虚血組織など、病気の組織または損傷した組織に新しい血管を形成する方法、自己の骨髄由来の細胞を移植することによって病気の組織または損傷した組織における血管形成を増加させる方法、そのような方法を用いて、虚血組織が存在していたり血管形成が必要だったりするような病気または怪我を治療する方法に関する。
【０００３】
発明の背景
成体における新たな血管の形成は、すでに存在している内皮細胞（ＥＣ）の増殖、移動、再構成によってのみ生じると考えられてきた（Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ．、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．、１９９５年、第１巻、２７−３０ページ；Ｓｃｈａｐｅｒ Ｗ．他、Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ．、１９７１年、第２８巻、６７１−６７９ページ；Ｒｉｓａｕ Ｗ．、Ｎａｔｕｒｅ、１９９７年、第３８６巻、６７１−６７４ページ）。このプロセスは血管形成と呼ばれている。他方、脈管形成は、胚形成の間に内皮前駆細胞（ＥＰＣ）から新しい血管が形成されるプロセスであると定義されており（Ｒｉｓａｕ Ｗ．、Ｎａｔｕｒｅ、１９９７年、第３８６巻、６７１−６７４ページ；Ｒｉｓａｕ Ｗ．、ＦＡＳＥＢＪ．、１９９５年、第９巻、９２６−９３３ページ；Ｒｉｓａｕ Ｗ．他、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１９８８年、第１０２巻、４７１−４７８ページ）、ＥＰＣと造血幹細胞（ＨＳＣ）を含む血液の島が多数形成されることによってスタートする（Ｆｌａｍｍｅ Ｉ．他、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１９９２年、第１１６巻、４３５−４３９ページ；Ｈａｔｚｏｐｏｕｌｏｓ他、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１９９８年、第１２５巻、１４５７−１４６８ページ）。血液の島々が互いに融合し、胚の中に原初的な血管網を形成する。ＥＰＣとＨＳＣにはＦｌｋ−１／ＫＤＲ、Ｔｉｅ−２、ＣＤ３４といった共通の細胞表面抗原が存在しているため、ＥＰＣとＨＳＣは共通の中胚葉母細胞（すなわち血管芽細胞）から生まれると考えられている（Ｍｉｌｌａｕｅｒ Ｂ．他、Ｃｅｌｌ、１９９３年、第７２巻、８３５−８４６ページ；Ｓａｔｏ ＴＮ．他、Ｎａｔｕｒｅ、１９９５年、第３７６巻、７０−７４ページ；Ｙａｎｏ Ｍ．他、Ｂｌｏｏｄ、１９９７年、第８９巻、４３１７−４３２６ページ；Ｋｒａｕｓｅ ＤＳ．、Ｂｌｏｏｄ、１９９６年、第８７巻、１−１３ページ）。
【０００４】
最近、成体の末梢血とヒト臍帯血において、循環しているＥＰＣが発見された（Ａｓａｈａｒａ Ｔ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９７年、第２７５巻、９６４−９６７ページ；Ｍｕｒｏｈａｒａ Ｔ．他、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、２０００年、第１０５巻、１５２７−１５３６ページ）。循環しているＥＰＣは、骨髄（ＢＭ）から動員されて生後の新たな血管形成に関与していることが明らかにされた（Ｔａｋａｈａｓｈｉ他、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．、１９９９年、第５巻、４３４−４３８ページ）。さらに、以前の研究では、野一色らが、骨髄移植によって人工血管内で管腔の内皮化と壁面での血管形成が容易になる可能性があることを指摘した（Ｎｏｉｓｈｉｋｉ Ｙ．、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．、１９９６年、第２巻、９０−９３ページ）。最近、シーらは、移植した人工血管移植片の内皮化に骨髄細胞が動員されて関与していることを示した（Ｓｈｉ Ｑ．他、Ｂｌｏｏｄ、１９９８年、第９２巻、３６２−３６７ページ）。これらの研究は、ＥＰＣが成体の骨髄に由来することを示唆しているが、機能を発揮するＥＰＣが成体の骨髄細胞から発生しうるかどうかと、自己由来の骨髄が成体の虚血組織において新しい血管形成を増やしてその機能を改善できるかどうかについては、ほとんどわかっていない。治療として血管を形成することが危機的な虚血から組織を救うための方法として浮上しているため、これらの問題は意味がある（Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ Ｉ．他、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１９９８年、第９７巻、１１１４−１１２３ページ；Ｌｏｓｏｒｄｏ ＤＷ．他、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１９９８年、第９８巻、２８００−２８０４ページ；Ｉｓｎｅｒ ＪＭ．とＡｓａｈａｒａ Ｔ．、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９９年、第１０３巻、１２３１−１２３６ページ）。
【０００５】
そこで本発明に至る研究では、（１）機能を発揮するＥＰＣが、成熟した動物の骨髄単核細胞（ＢＭ−ＭＮＣ）から発生しうるという仮説と、（２）自己由来の骨髄単核細胞を移植すると、慢性の心筋虚血になっているモデル・ブタと一側性後肢虚血になっているモデル・ウサギの虚血組織において新たな血管形成が促進されるという仮説を検証した。
自己由来の骨髄単核細胞を直接局所的に移植することは、“治療を目的とした脈管形成”に合致しており、成熟した動物の虚血組織に治療として新たに血管を形成する有効な方法である。
【０００６】
発明の要約
本発明は、被験対象の組織内に新しい血管を形成する方法と、被験対象の組織への血流を増加させる方法と、被験対象の組織において血管形成を増加させる方法を提供する。これらの方法は、ａ）被験対象からその被験対象に由来する骨髄単核細胞を単離し；ｂ）その被験対象に由来する骨髄単核細胞の有効量を組織内に局所的に移植することにより、その組織内に新しい血管を形成する操作を含んでいる。組織としては虚血組織が考えられる。新しい血管としては、虚血組織の毛細血管または副行血管が考えられる。また、本発明により、被験対象の病気になった組織または怪我をしている組織を治療する方法であって、自己由来の骨髄単核細胞の有効量を局所的に移植することにより、その病気になった組織または怪我をしている組織に血管形成と修復を誘導する方法も提供される。治療する組織としては虚血組織が考えられる。
【０００７】
本発明は、被験対象の病気部位、損傷部位、虚血部位、血管形成部位のいずれかまたはその近傍に、その被験対象に由来する単離した骨髄単核細胞の有効量を移植することにより、その病気部位、損傷部位、虚血部位、血管形成部位のいずれかに組み換え核酸分子を到達させる方法であって、その単離した骨髄単核細胞が、問題のタンパク質、すなわち組織の修復、灌流、血管形成のいずれかに必要なタンパク質または役立つタンパク質をコードしている組み換え核酸分子を含む方法も提供する。
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明の一部は、以下のような成果と発見に基づいている。（１）骨髄単核細胞のサブセットが培養物の中でＥＰＣを生成させる；（２）虚血領域に移植した自己由来の骨髄単核細胞は新しい血管形成部位に組み込まれて毛細管ネットワークになるのに対し、移植した骨髄繊維芽細胞はネットワークの形成に関与しない；（３）自己由来の骨髄繊維芽細胞ではなく骨髄単核細胞を虚血組織に直接局所的に移植すると、虚血組織において、新たな血管形成、副行血管の形成、血流が、数値として確かに増加する。
【０００９】
本発明は、被験対象の組織内に新しい血管を形成する方法であって、ａ）被験対象からその被験対象に由来する骨髄単核細胞を単離し；ｂ）その被験対象に由来する骨髄単核細胞の有効量を組織内に局所的に移植することにより、その組織内に新しい血管を形成する操作を含む方法を提供する。この方法の好ましい実施態様では、組織は虚血組織である。この方法の別の好ましい実施態様では、新しい血管は毛細血管である。上記の方法のさらに別の好ましい実施態様では、新しい血管は副行血管である。別の実施態様では、毛細血管と副行血管の両方が形成される。移植した骨髄単核細胞が新しい血管に成長する、すなわち新しい血管になる、と考えられる。
【００１０】
本発明はさらに、被験対象の組織への血流を増加させる方法であって、ａ）被験対象からその被験対象に由来する骨髄単核細胞を単離し；ｂ）その被験対象に由来する骨髄単核細胞の有効量を組織内に局所的に移植することによりその組織内に新しい血管を形成し、その結果として被験対象のその組織への血流を増加させる操作を含む方法を提供する。組織は、虚血になったり損傷したりしていて修復、再生、脈管形成のいずれかを必要としている組織であることが好ましい。上記の方法の好ましい実施態様では、新しい血管は毛細血管である。別の好ましい実施態様では、新しい血管は副行血管である。さらに別の実施態様では、毛細血管と副行血管の両方が形成される。
【００１１】
本発明は、被験対象の病気になった組織を治療する方法であって、ａ）被験対象からその被験対象に由来する骨髄単核細胞を単離し；ｂ）その被験対象に由来する骨髄単核細胞の有効量を病気になった組織内に局所的に移植することにより、被験対象の病気になったその組織を治療する操作を含む方法を提供する。好ましい実施態様では、病気になった組織は、後述するように、虚血組織、または修復や再生を必要としている組織である。
【００１２】
本発明は、被験対象の病気になった組織における血管形成を増やす方法であって、ａ）被験対象からその被験対象に由来する骨髄単核細胞を単離し；ｂ）その被験対象に由来する骨髄単核細胞の有効量を病気になった組織内に局所的に移植することにより、被験対象の病気になったその組織における血管形成を増やして修復を促進する操作を含む方法を提供する。好ましい実施態様では、組織は、虚血組織、または修復や再生を必要としている組織である。
【００１３】
本発明は、被験対象の心不全を予防する方法であって、ａ）被験対象からその被験対象に由来する骨髄単核細胞を単離し；ｂ）その被験対象に由来する骨髄単核細胞の有効量を心臓組織に局所的に移植することにより心臓組織に新しい血管を形成し、その結果として被験対象の心不全を予防する操作を含む方法も提供する。好ましい実施態様では、心臓組織は、虚血の心臓組織、あるいは、損傷後または手術後に修復や再生を必要としている心臓組織である。別の好ましい実施態様では、傷ついた冠状血管または閉塞した冠状血管を上記の方法で治療して新しい血管を形成する。
【００１４】
本発明は、被験対象の組織を再生させる方法であって、ａ）被験対象からその被験対象に由来する骨髄単核細胞を単離し；ｂ）その被験対象に由来する骨髄単核細胞の有効量をその組織に局所的に移植することによりその組織に新しい血管を形成する（すなわち血管形成を増やし、被験対象の病気になった組織を修復する）操作を含む方法を提供する。好ましい実施態様では、組織は病気になった組織である。より好ましいのは、病気になった組織が、虚血組織、あるいは、損傷していて修復または再生を必要としている組織であることである。
【００１５】
本発明の方法では、一般に全身麻酔をかけた被験対象の頸骨、大腿骨、腸骨、胸骨のいずれかから、１８ゲージの針を有する注射器を用いて吸引することにより、その被験対象に由来する骨髄を単離する。注射器には、１ｍｌのヘパリンが含まれていることが好ましい。当業者が慣れている標準的な方法で骨髄単核細胞を単離する。この方法は、骨髄単核細胞を単離する被験対象の種が何であるかに応じ、変更することができる。骨髄細胞を殺菌チューブに移し、適切な量の培地、例えば１０ｍｌの培地（１０％のウシ胎仔血清、ペニシリンＧ［１００Ｕ／ｍｌ］、ストレプトマイシン［１００μｇ／ｍｌ］を含むイスコフ改変ダルベッコ培地ＩＭＤＭ）と混合する。このチューブを例えば２０００ｒｐｍで５分間にわたって遠心分離することにより骨髄細胞をペレット状にし、この細胞ペレットを再び培地（例えば５ｍｌの培地）に分散させる。低密度の骨髄単核細胞が、例えばヒストパック−１０８３（登録商標）（シグマ社）を用いた密度勾配遠心分離により、この懸濁液から単離される。この方法は、例えばヤブロンカ−レウヴェニとナメロフ（Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８７年、第８７巻、２７−３８ページ）が記載しており、その内容が参考としてこの明細書に組み込まれている。簡単に説明するならば、例えばヒストパック−１０８３（登録商標）（シグマ社）、フィコール−ハイパック、パーコール（後者の２つはどちらもファルマシア社、ウプサラ、スウェーデンから入手できる）のいずれかを製造者の指示に従って使用し、ヤブロンカ−レウヴェニとナメロフが記載しているようにして、細胞懸濁液を２０％〜６０％の勾配に充填する。例えば、フィコール−ハイパックを用いる場合には４００ｇで２０分間、パーコールを用いる場合には２０００ｒｐｍで１０分間にわたって細胞を遠心分離する。遠心分離の後、全体積の上部３分の２をチューブに移す。というのも、この層に低密度の骨髄単核細胞がほとんど含まれているからである。細胞を例えば２０００ｒｐｍで１０分間にわたって遠心分離し、ヒストパックを除去する。この操作を繰り返し、骨髄単核細胞からなる細胞ペレットを再び培地または緩衝液（例えばＩＭＤＭ、生理的食塩水、リン酸緩衝液）に分散させ、移植を行なう。移植には、上記のようにして単離した新鮮な骨髄単核細胞を用いることが好ましい。
【００１６】
骨髄単核細胞は、血清を１０％まで含む任意の完全培地（例えば１０％のウシ胎仔血清と抗生物質を含む上記のＩＭＤＭ）の中で移植の４週間前まで培養することもできる。骨髄単核細胞は、増殖因子（例えば血管内皮増殖因子）とともに培養することもできる。培地は１週間に約２回取り換えた。培養した細胞は、０．０５％のトリプシン（ジブコＢＲＬ社、グランド・アイランド、ニューヨーク州）を用いて培養皿から単離し、培地を用いて中和し、遠心分離（例えば室温にて２０００ｒｐｍで５分間）によって回収した。細胞を再びＩＭＤＭの中に分散させ、移植を行なう。濃度は、５０μｌに約１×１０５個〜約１×１０１０個、好ましくは約１×１０７個〜約１×１０８個になるようにする。
【００１７】
自己由来の骨髄単核細胞を虚血組織の中心領域、周辺領域、近傍領域のいずれかに注入することによって移植する。本発明の別の実施態様では、自己由来の骨髄単核細胞は、血管形成または修復が必要な任意の組織の任意の部位またはその近傍に移植することができる。そのような組織としては、あらゆる末端器官における灌流が不十分な組織、例えば慢性虚血組織が挙げられるが、これだけに限られるわけではない。灌流が不十分な組織としては、心臓、脳、骨格筋、腎臓、肝臓、胃腸管器官、これ以外の器官、修復を必要としている組織などが挙げられるが、これだけに限られるわけではない。
【００１８】
移植する骨髄単核細胞は、望む組織部位１ヶ所ごとに約１×１０５個〜約１×１０１０個（好ましくは約１×１０７個〜約１×１０８個）という有効量を供給される。注入は、針を用いて行なうことが好ましい。１つの組織は、例えば脚や腕の場合には合計で約５０回の注入、心筋の場合には約１０回の注入を受けることが好ましい。また、自己由来の骨髄単核細胞を供給する別の方法としては、動脈内または静脈内への注入または輸液、閉塞箇所への管腔内直接注入、逆行灌流、心臓周辺供給、（生物分解性または生体安定性のある）インプラント（例えば局所的インプラントの足場）、パッチ、ＣＯ２などのガスによる推進力を利用した針なし注射、これ以外の方法による加速または移動を利用した組織内への注入（イオン泳動または電気穿孔）、組織または器官の表面への加圧または塗布などの方法がある。一般に、供給は、移植する細胞を供給するための任意の医学機器を用いて実現することができる。
【００１９】
本明細書に記載した方法の好ましい実施態様では、自己由来の骨髄単核細胞を移植する組織として、病気になった組織、損傷した組織、修復や再生が必要な組織が挙げられる。具体的には、慢性虚血になった組織のように灌流が不十分な組織が挙げられるが、それだけに限定されることはない。自己由来の骨髄単核細胞を移植する組織としては虚血組織が好ましいが、それだけに限定されることはない。さらに好ましい組織としては、心筋組織、骨格筋組織、（例えば発作またはＡＶの奇形により損傷している）脳組織、冠状血管、腎臓、肝臓、胃腸管器官、萎縮（例えば神経に起因する筋萎縮）した筋肉組織などが挙げられる。さらに別の実施態様では、被験対象は哺乳類であることが好ましい。哺乳類はヒトであることが最も好ましい。
【００２０】
以前の研究によると、ヒトではＥＰＣ、成熟ＥＰＣ、ＨＳＣが細胞表面抗原（例えばＣＤ３４、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、Ｔｉｅ−２）を共有していることが示唆されている（Ｍｉｌｌａｕｅｒ Ｂ．他、Ｃｅｌｌ、１９９３年、第７２巻、８３５−８４６ページ；Ｓａｔｏ ＴＮ．他、Ｎａｔｕｒｅ、１９９５年、第３７６巻、７０−７４ページ；Ｙａｎｏ Ｍ．他、Ｂｌｏｏｄ、１９９７年、第８９巻、４３１７−４３２６ページ；Ｋｒａｕｓｅ ＤＳ．他、Ｂｌｏｏｄ、１９９６年、第８７巻、１−１３ページ）。ＣＤ３４とＫＤＲは、ヒトＥＰＣを単離するための目印分子として用いられてきた（Ａｓａｈａｒａ Ｔ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９７年、第２７５巻、９６４−９６７ページ；Ｍｕｒｏｈａｒａ Ｔ．他、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、２０００年、第１０５巻、１５２７−１５３６ページ）。理想的なのは、精製したＥＰＣを骨髄単核細胞から単離して移植に使用できるようにすることであろう（Ｍｕｒｏｈａｒａ Ｔ．他、上記文献；Ｋａｌｋａ Ｃ．他、Ｐｒｏｃ． ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、２０００年、第９７巻、３４２２−３４２７ページ）。しかしこの明細書で取り扱うウサギの研究では、ウサギのＣＤ３４またはウサギのＥＰＣに対して特異的な抗体は使用できなかった。それにもかかわらず、この明細書に記載したインビトロの実験において、ＥＰＣがウサギの骨髄単核細胞から確かに発生することが明らかになった。フィブロネクチン上での培養中、ウサギの骨髄単核細胞の一部が、内皮系に関する多くの特別な機能とマーカー（例えばａｃＬＤＬの取り込み、ＮＯの放出、ｖＷＦに対する免疫染色への反応、ハリエニシダのレクチンの結合）を有する紡錘形のＡＴ細胞を生み出した。さらに、ＡＴ細胞は、直線状の紐のような構造とネットワーク構造を形成した（図１）。これらの構造は、以前の研究においてヒトＥＰＣによって生み出された構造と似ていた（Ａｓａｈａｒａ Ｔ．他、１９９７年、上記文献；Ｍｕｒｏｈａｒａ Ｔ．他、２０００年、上記文献）。したがってＡＴ細胞は、今や、本研究においてＥＰＣの大部分を占めていることが明らかになった。それゆえ、本発明で使用するのにＥＰＣを精製することは重要ではない。骨髄単核細胞を単離して移植すると、望むような好ましい効果が得られる。さらに、本発明の方法において骨髄単核細胞を用いると、移植部位において発達する血管が増加する。
【００２１】
ヒトのＣＤ３４＋単核細胞とＣＤ３４−単核細胞を同時に培養すると、ＣＤ３４＋単核細胞だけを培養したときよりも多数のＥＰＣが生み出されたことが報告されている（Ａｓａｈａｒａ Ｔ．他、１９９７年、上記文献；Ｍｕｒｏｈａｒａ Ｔ．他、２０００年、上記文献）。これは、ＣＤ３４＋単核細胞と残ったＣＤ３４−細胞の間での細胞間コミュニケーションがＥＰＣの分化にとって重要であることを示唆している。したがって、ＥＰＣを精製していない骨髄単核細胞は、治療を目的として新たに血管形成をするための細胞供給源として十分どころか非常に効果的であると考えられた。本研究では、骨髄単核細胞を移植すると、虚血組織における血管形成と副行血管の形成が着実に増加した。この効果は、細胞移植の非特異的作用に起因するようには見えない。というのも、骨髄繊維芽細胞を移植しても血管形成や組織の修復が増えることはないからである。
【００２２】
移植した骨髄単核細胞によって誘起される血管形成の促進には別のメカニズムが存在している可能性がある。骨髄は、非造血幹細胞を含んでいる。非造血幹細胞としては、成熟していない間充織幹細胞、ＥＰＣ、繊維芽細胞、造骨細胞、ＥＣ、脂肪細胞が挙げられる。これらの細胞は、増殖してＥＰＣを供給する細胞となる可能性がある（Ｐｒｏｃｋｏｐ ＤＪ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９７年、第２７６巻、７１−７４ページ）。このような供給細胞を含む細胞を移植することにより、血管形成に依存するプロセスである皮膚の治癒が動物において実際に促進された（Ｂｅｌｌ Ｅ．， Ｅｈｒｌｉｃｈ ＨＰ．， Ｂｕｔｔｌｅ ＤＪ．他、「生きた組織がインビトロで形成され、皮膚と等価な十分な厚さの組織として受容された」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８１年、第２１１巻、１０５２−１０５４ページ）。本明細書の研究では、単離した骨髄単核細胞の４９％が単球様細胞またはリンパ球様胞の分画であり、その中にＥＰＣを含めた骨髄幹細胞が存在していると考えられる（Ａｓａｈａｒａ Ｔ．他、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９９９年、第１８巻、３９６４−３９７２ページ）。さらに、骨髄単核細胞はＨＳＣを含んでいるようである。このＨＳＣは、最近、Ｔｉｅ−２に対するリガンドであるアンギオポエチン−１を放出することによって血管形成を促進することが明らかにされた（Ｔａｋａｋｕｒａ Ｎ．、Ｃｅｌｌ、２０００年、第１０２巻、１９９−２０９ページ）。これらの事実を合わせて考えるならば、骨髄単核細胞を本発明の方法で移植すると、さまざまな種類の細胞が互いに協力して供給細胞となり、生体に骨髄移植した後により多数のＥＰＣが発生することになる。
【００２３】
本発明では、自己由来の骨髄単核細胞を虚血組織に局所的に移植した。治療を目的として新たな血管を形成させるために骨髄単核細胞を局所的に移植することには、静脈内に骨髄単核細胞を注入することと比べていくつかの利点がある。第１に、局所的移植により、ターゲットとする組織におけるＥＰＣの密度を静脈内注入の場合よりも大きくすることができる。本発明では、注入部位１ヶ所ごとに約１×１０５個〜約１×１０１０個の細胞、好ましくは約１×１０７個〜約１×１０８個の細胞を供給する。注入は、病気の組織、損傷した組織、修復または再生を必要としている組織のいずれか（例えば虚血組織）の中またはその近傍に針を用いて行なうことが好ましい。これは、組織内で細胞が生き延びる上で利点となる。というのも、細胞が組織内で生き延びるにはクラスターにならねばならないと考えられているからである。例えばガン細胞では、離れた組織に新しい転移コロニーを形成しようとすると５０個以上の腫瘍細胞の塊が必要とされる。第２に、局所的移植により、移植した骨髄単核細胞による全身への副作用が全身注入の場合と比べて少なくなる可能性がある。骨髄単核細胞またはＥＰＣを静脈内投与して全身に供給すると、血管形成に好ましくない影響を与え、ガン、関節リューマチ、糖尿病性網膜症といった疾患が発生する可能性がある。
【００２４】
自己由来の骨髄単核細胞を組織に供給する他の好ましい手段としては、動脈内または静脈内への注射または輸液、管腔内直接注入、逆行灌流、心臓周辺供給、（生物分解性または生体安定性のある）インプラント（例えば局所的インプラントの足場）、パッチ、ＣＯ２などのガスによる推進力を利用した針なし注射、これ以外の方法による加速または移動を利用した組織内への注入（イオン泳動または電気穿孔）、組織または器官の表面への加圧または塗布などの方法があるが、これだけに限られるわけではない。一般に、供給は、移植する細胞を供給するための任意の医学機器を用いて実現することができる。それぞれの組織は、合計で約１０〜５０回の注入を受けることが好ましい。
【００２５】
本発明では、自己由来の骨髄単核細胞を虚血組織に移植する。そしてその骨髄単核細胞は、その場所で新しい血管および／または毛細血管に組み込まれるか、これら血管の形成に関与する。本発明の方法では、自己由来のウサギの骨髄単核細胞（約１×１０６個）を緑色蛍光マーカーで標識し、虚血の肢部に局所的に移植した。移植してから１４日後に蛍光顕微鏡を用いて調べたところ、標識した骨髄単核細胞の形が紡錘形に変化して注入部位から芽を出し、骨格筋細胞相互間の毛細管ネットワークに組み込まれていた（図２）。重要なことだが、蛍光陽性の（移植した）細胞は、隣接した切片においてＡＰでも染色された。利用したＡＰ検出法はＥＣ内の固有の酵素活性に基づいているため、ＡＰ陽性という染色結果は、移植した骨髄単核細胞が虚血組織において生き延びたことを示している（Ｚｉａｄａ ＡＭ．他、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｒｅｓ．、１９８４年、第１８巻、７２４−７３２ページ）。これとは対照的に、蛍光標識した自己由来の骨髄繊維芽細胞を移植しても、毛細様構造には関与しなかった。これは、骨髄単核細胞が新しい血管形成に関して特異的な性質を有することを示している。
【００２６】
現在のところ、骨髄移植は、化学療法の後にさまざまな新生物疾患を治療するのに用いられている。しかし同種骨髄移植の効果を妨げる１つの大きな障害は、移植片対宿主病の発生である（Ｂｏｒｔｉｎ ＭＭ．他、Ａｎｎ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ．、１９９２年、第１１６巻、５０５−５０９ページ）。この点に関する本発明の最大の利点の１つは、成体で治療を目的として新たな血管形成をするのに自己由来の骨髄単核細胞を用いることである。このようにすると、移植片対宿主病が避けられる。さらに、本発明の研究では、治療を目的として新たな血管形成に使用する自己由来の骨髄血は動物１匹につき３〜４ｍｌ（すなわち体重の０．１％）であった。ヒトの患者からそれだけの量またはそれ以上の量（８００ｍｌまで）を吸引しても安全であるため、本発明のプロトコルは、末梢動脈閉塞病の患者に対しても適用可能である。
【００２７】
要するに、本発明では、成体の骨髄単核細胞のサブセットを供給することにより、その骨髄単核細胞がＥＰＣに分化してインビトロでＥＣの表現型を獲得する。移植した自己由来の骨髄単核細胞は生体内で生き延び、血管形成と修復が盛んに行なわれている部位における骨格筋細胞の間にある毛細管ネットワークにうまく組み込まれる。最終的に、骨髄単核細胞を移植すると虚血組織における新たな血管形成と副行血管形成が増える。したがって本発明は、臨床上の大きな意味がいくつかある。第１に、自己由来の骨髄単核細胞の移植は、虚血組織や、それ以外の損傷した組織または病気の組織において血管再生または修復を行なうために臨床に応用できる新しい方法である。第２に、移植した骨髄単核細胞が成体の組織において血管形成に積極的に関与するという事実は、骨髄単核細胞が、生体内で損傷組織部位または病気組織部位に遺伝子を供給するためのベクターとして役立つことも意味する。
【００２８】
本発明のさらに別の特徴として、骨髄単核細胞は、生体内で虚血部位および／または血管形成部位に遺伝子を供給するためのベクターとして用いることができる。したがって本発明により、組み換え核酸分子を被験対象の病気組織部位に到達させる方法であって、ａ）被験対象からその被験対象に由来する骨髄単核細胞を単離し；ｂ）その被験対象から単離した骨髄単核細胞に組み換え核酸分子を挿入して形質転換された骨髄単核細胞を形成し；ｃ）病気組織部位にその形質転換された骨髄単核細胞の有効量を投与する操作を含む方法が提供される。好ましい実施態様では、病気組織部位は、後述するように、虚血組織（例えば心筋虚血組織または骨格筋虚血組織）、または修復、再生、血管形成を必要としている他の組織である。
【００２９】
本発明のさらに別の特徴では、組み換え核酸分子を被験対象の血管形成部位または損傷組織部位に到達させる方法であって、ａ）被験対象からその被験対象に由来する骨髄単核細胞を単離し；ｂ）その被験対象から単離した骨髄単核細胞に組み換え核酸分子を挿入して形質転換された骨髄単核細胞を形成し；ｃ）血管形成部位または損傷組織部位に、その形質転換された骨髄単核細胞の有効量を投与する操作を含む方法が提供される。
【００３０】
骨髄単核細胞に挿入する組み換え核酸分子は、個々の病気を治療する際に望まれる遺伝子療法がどのようなタイプであるかによって異なる。遺伝子を遺伝子療法によってヒトの患者に導入する方法、すなわちヒトの患者にヒトの遺伝子で形質転換した細胞を導入する方法は、公知である。そのような方法は、アンダーセンらのアメリカ合衆国特許第５，３９９，３４６号に記載されており、その内容が参考としてこの明細書に組み込まれている。
【００３１】
本発明の方法において役に立つ組み換え遺伝子としては、被験対象の治療に役立つタンパク質をコードしている既知の核酸が挙げられる。好ましい実施態様では、核酸分子は、増殖因子（例えばＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＰｌＧＦ、ＫＤＲ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、アンギオポエチン−１、サイトカインなどが挙げられるが、これだけに限られるわけではない）などのタンパク質をコードしている。別の好ましい実施態様では、核酸分子がコードしているのは、内皮一酸化窒素シンターゼであるｅＮＯＳとｉＮＯＳ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦ、ａＦＧＦ、ＳＣＦ（ｃ−ｋｉｔリガンド）、ｂＦＧＦ、ＴＮＦ、ヘム・オキシゲナーゼ、ＡＫＴ（セリン−トレオニン・キナーゼ）、ＨＩＦα（低酸素血症誘導因子）、Ｄｅｌ−１（発生胚遺伝子座−１）、ＮＯＳ（一酸化窒素シンターゼ）、ＢＭＰ（骨誘導因子）、ＳＥＲＣＡ２ａ（筋小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ）、β２−アドレナリン受容体、ＳＤＦ−１、ＭＣＰ−１、他のケモカイン、インターロイキン、これらの組み合わせ、である。別の好ましい実施態様では、本発明の方法により自己由来の骨髄単核細胞に供給できる遺伝子として、ＶＩＩＩ因子／フォンビルブラント因子、ＩＸ因子、インスリンをコードしている核酸分子、ＮＯ生成遺伝子（例えばｅＮＯＳとｉＮＯＳ）、プラーク戦闘遺伝子、血栓防止遺伝子などが挙げられるが、これだけに限られるわけではない。
【００３２】
本発明で使用できる既知の核酸としては、ＫＤＲのＤＮＡ配列（Ｔｅｒｍａｎ他、アメリカ合衆国特許第５，８６１，３０１号）、ＥＧＦのＤＮＡ配列（Ｕｌｌｒｉｃｈ他、Ｎａｔｕｒｅ、第３０９巻、４１８−４２５ページ、１９８６年）、Ｇ−ＣＳＦのＤＮＡ配列（Ｎａｇａｔａ他、ＥＭＢＯ Ｊ．、第５巻、５７５ページ、１９８６年）、ＧＭ−ＣＳＦのＤＮＡ配列（Ｗｏｎｇ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２２８巻、８１０ページ、１９８５年）、Ｍ−ＣＳＦのＤＮＡ配列（Ｗｅｌｔｅ他、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、第８２巻、１５２６ページ、１９８５年）、ＴＮＦのＤＮＡ配列（Ｐｏｒｔｅｒ、ＴｉＢＴｅｃｈ．、第９巻、１５８ページ、１９９１年）、ＴＮＦ−αのＤＮＡ配列（Ｂｅｕｔｌｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、第３２０巻、５８４ページ、１９８６年）、ＴＮＦ−βのＤＮＡ配列（Ｇｒａｙ他、Ｎａｔｕｒｅ、第３１２巻、７２１ページ、１９８４年）、ＩＬ−２のＤＮＡ配列（Ｆｅｉｔｓｃｈｅｒ他、Ｌｙｍｐｈｏｋ． Ｒｅｓ．、第６巻、４５ページ、１９８７年）、ＩＬ−４（Ｌｅｅ他、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、第８３巻、２０６１ページ、１９８６年）などが挙げられるが、これだけに限られるわけではない。なおこれらの文献は、その内容が参考としてこの明細書に組み込まれている。
望むタンパク質をコードしている組み換え核酸分子は、既知のＤＮＡ配列からポリメラーゼ連鎖反応によって製造することができる。ポリメラーゼ連鎖反応はサイキら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３９巻、４８７−４９１ページ、１９８８年）とマリスら（アメリカ合衆国特許第４，６８３，１９５号）が記載しており、参考としてその内容がこの明細書に組み込まれている。別の方法として、ＤＮＡは、市販の装置を利用して化学的に合成することもできる。その方法は例えばカルザース（Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３０巻（４７２２３）、２８１−２８５ページ、１９８５年）が記載しており、この文献の内容を本明細書に援用する。
【００３３】
要するに、望む核酸を供給する適切な細胞／組織供給源からＲＮＡを単離して精製し、ｃＤＮＡを標準的な方法で合成する。その方法は、サムブルック他、『分子クローニング  −  実験室ハンドブック』、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（１９８９年）や、オースベル他（編）、『分子生物学における最新プロトコル』、グリーン・アソシエイツ／ワイリー・インターサイエンス社、ニューヨーク（１９９０年）に記載されている。望むＤＮＡ配列は、そのような配列を既知の組み換えＤＮＡ技術を利用して多数ある利用可能な任意のＤＮＡクローニング・ベクターに挿入することによって複製することが可能である。クローニング・ベクターとしては、プラスミド、ファージ、宿主細胞内で自律的に複製を行なうことが可能な他のＤＮＡ配列が可能である。このようなベクターは、エンドヌクレアーゼ認識部位を少なくとも１つ有する。そのエンドヌクレアーゼ認識部位において、このベクターの主要な生物学的機能の損失なしにそのようなＤＮＡ配列が切断される。適切なクローニング・ベクターとしては、原核生物のクローニング・ベクター（例えば大腸菌からのプラスミドであるｃｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ｐＵＣ、ＰＫＳＭ、ＲＰ４）；ファージＤＮＡ誘導体（例えばＭ１３や他の繊維状一本鎖ＤＮＡファージ）などが挙げられる。望むＤＮＡ配列はスプライスしてクローニング・ベクターに組み込み、複製とクローニングを行なう。ベクターは、テトラサイクリン耐性マーカー、アンピリシン耐性マーカーなどのマーカーを含んでいてもよい。このようにすると、このベクターで形質転換した細胞を容易に同定することができる。
【００３４】
興味の対象であるタンパク質をコードしている組み換え核酸分子の完全長クローン（すなわち望むタンパク質の全コード領域を有するクローンであることが好ましい）を適切な発現ベクターに挿入し、骨髄単核細胞内に供給する。クローニングされた遺伝子は、ベクター内で、発現に必要な少なくとも１つの調節要素（すなわちプロモータ配列）と機能上の関係がある（すなわちその調節要素の制御下にある）。プロモータ配列には、エンハンサー配列、終止配列、スプライス・シグナル、組織特異的要素、翻訳開始部位、終止部位のいずれか、またはこれらの組み合わせが含まれていてもよい。役に立つ発現制御配列としては、ｌａｃプロモータ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、λファージの主要なオペレータ領域とプロモータ領域などが挙げられるが、これだけに限られるわけではない。
【００３５】
遺伝子の供給制御は、内在性制御と外来性制御のいずれによることも可能である。内在性制御の具体例としては、低酸素血症または血糖値上昇などの生理学的シグナルに対して感受性のあるプロモータが挙げられる。外来性制御系としては、小分子の薬剤を投与することによって制御する遺伝子発現がある。具体的には、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、エクジソンとそのアナログ、ＲＵ４８６、化学的二量体形成剤（例えばラパマイシンとそのアナログ）などが挙げられる。
哺乳類の細胞で使用されるベクターとしては、ＳＶ−４０の誘導体、アデノウイルス、レトロウイルス由来のＤＮＡ配列、哺乳類の機能的ベクターと機能的プラスミドの組み合わせに由来するシャトル・ベクター、ファージＤＮＡなどが挙げられる。真核生物の発現ベクターはよく知られている（例えば、ＰＪ． ＳｏｕｔｈｅｒｎとＰ． Ｂｅｒｇ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．、第１巻、３２７−３４１ページ、１９８２年；Ｓｕｂｒａｍｉｎｉ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第１巻、８５４−８６４ページ、１９８１年；ＫａｕｆｍａｎｎとＳｈａｒｐ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、第１５９巻、６０１−６２１ページ、１９８２年；Ｓｃａｈｉｌｌ他、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、第８０巻、４６５４−４６５９ページ、１９８３年；ＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉｎ、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、第７７巻、４２１６−４２２０ページ、１９８０年に記載されている発現ベクターがある。これらの文献は、参考としてその内容がこの明細書に組み込まれている）。本発明の方法で使用するベクターとしてはウイルスのベクターが可能だが、レトロウイルスのベクターが好ましい。複製欠損性アデノウイルスが好ましい。例えば、レトロウイルスの構造遺伝子が興味の対象である１つの遺伝子で置換されていて、長い末端繰り返し部に含まれるウイルスの調節配列によって制御される“１遺伝子ベクター”を用いることができる。具体的には、モロニー・ネズミ白血病ウイルス（ＭｏＭｕｌＶ）、ハーヴェイ・ネズミ肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、ネズミ哺乳類腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、ネズミ骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭｕＭＰＳＶ）、鳥類レトロウイルス（細網内皮症ウイルス（Ｒｅｖ）とラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））などが挙げられる（ＥｇｌｉｔｉｓとＡｎｄｅｒｓｅｎ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第６巻（７）、６０８−６１４ページ、１９８８年に記載されており、その内容が、明細書中に援用する）。
【００３６】
多数の遺伝子を導入できる組み換えレトロウイルス・ベクターも、本発明の方法において使用可能である。エグリティスとアンダーセン（上記文献）が記載しているように、内部プロモータとｃＤＮＡを含むが独立したプロモータにより調節されるベクターを従来技術を利用して設計し、本発明の方法において利用することができる。そのようなベクターとして、例えば、選択マーカー（ｎｏｅ（登録商標））を有する、Ｎ２ベクター由来のＳＡＸベクターがある。このベクターには、ヒトのアデノシンデアミナーゼ（ｈＡＤＡ）のｃＤＮＡが、その調節配列であるＳＶ４０ウイルス（ＳＶ４０）からの初期プロモータとともに挿入されている。
【００３７】
組み換え核酸分子を含むベクターは、骨髄単核細胞に組み込む（すなわち感染させる）。そのとき、エグリティスとアンダーセン（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第６巻（７）、６０８−６１４ページ、１９８８年；この文献の内容が参考としてこの明細書に組み込まれている）が記載しているようにして、約５×１０５個の骨髄単核細胞を１８〜２４時間にわたってベクター産生細胞に植える。
望むタンパク質をコードしているＤＮＡも骨髄単核細胞に組み込むことができる。そのためには、エグリティスとアンダーセン（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第６巻（７）、６０８−６１４ページ、１９８８年；この文献の内容が参考としてこの明細書に組み込まれている）が記載しているように、電気穿孔、超音波、化学的方法（例えばリン酸カルシウムを媒介としたトランスフェクション）、脂質小胞内へのＤＮＡのカプセル化、物理的手段（例えばマイクロインジェクション）などの方法を利用する。
興味の対象である組み換え核酸分子を含むベクターを感染させるか、あるいはＤＮＡをトランスフェクトするかした組み換え核酸分子を含む骨髄単核細胞は、被験対象の修復、再生、血管形成、遺伝子治療を必要としている組織部位（例えば虚血部位、損傷した組織、病気になった組織）またはその近傍の組織部位に針による注射で供給することによって局所的に移植する。注入部位１ヶ所につき、約１×１０５〜約１×１０１０個のベクターを感染させた骨髄単核細胞を注入することが好ましい。より好ましいのは、約１×１０７〜約１×１０８個のベクターを感染させた骨髄単核細胞を虚血部位、損傷部位、血管形成部位のいずれかに供給することである。
【００３８】
自己由来の骨髄単核細胞を組織に供給する別の好ましい手段としては、動脈内または静脈内への注入または輸液、閉塞箇所への管腔内直接注入、逆行灌流、心臓周辺供給、（生物分解性または生体安定性のある）インプラント（例えば局所的インプラントの足場）、パッチ、ＣＯ２などのガスによる推進力を利用した針なし注射、これ以外の方法による加速または移動を利用した組織内への注入（イオン泳動または電気穿孔）、組織または器官の表面への加圧または塗布などが挙げられるが、これだけに限られるわけではない。一般に、供給は、移植する細胞を供給するための任意の医学機器を用いて実現することができる。それぞれの組織は、合計で約１０〜５０回の注入を受けることが好ましい。
【００３９】
虚血部位、損傷した組織、病気になった組織、血管形成部位は、心筋組織、骨格筋組織、傷ついた冠状血管または閉塞した冠状血管、傷ついた末梢血管または閉塞した末梢血管、自然に病気になったり傷ついたりして新たな血管が必要な部位（例えば脳、腎臓、肝臓、胃腸管器官、萎縮した筋肉、皮膚、肺などが挙げられるが、これだけに限られるわけではない）などであることが好ましいが、これだけに限られるわけではない。虚血部位または血管形成部位としては、人工的に形成した部位も可能である。興味の対象である核酸分子が組み込まれた自己由来の骨髄単核細胞を注入することによって治療できる可能性のある病気としては、糖尿病、血管潰瘍、血管その他の組織の傷、血友病、レイノー現象、褥瘡、火傷、モヤモヤ病、骨折、（貧血を伴う）慢性腎不全、慢性肝炎、他の微小循環疾患、攣縮性狭心症、心不全、発作、ＡＶの奇形、パーキンソン病、癲癇、アルツハイマー病、ハンチントン病、肝不全、筋ジストロフィー、ガン、組織の損傷による感染（例えば心筋炎）などが挙げられるが、これだけに限られるわけではない。好ましい実施態様では、自己由来の骨髄単核細胞を局所的に移植することによって治療が可能な組織として、何らかの病気によって損傷が起こり細胞死（すなわちアポトーシスまたは壊死）に至った組織、または、加齢、怪我、手術などにより損傷し、修復および／または再生を必要としている組織などが挙げられる。別の実施態様では、被験対象は哺乳類であることが好ましい。最も好ましいのは、哺乳類がヒトであることである。
【００４０】
本発明は、以下の実施例によってさらによく理解することができよう。しかし本発明がこれらの実施例に限定されることはなく、実施例は単なる説明のためのものである。
【００４１】
実施例１
自己由来の骨髄単核細胞による生後の新たな血管形成の増加
ウサギの骨髄単核細胞の単離
動物に関するプロトコルはすべて、久留米大学の「動物のケアおよび利用に関する委員会」の承認を受けた。動物をケタミン５０ｍｇ／ｋｇとキシラジン５ｍｇ／ｋｇで麻酔し、骨髄（３〜５ｍｌ）を右腸骨稜から吸引した。次に、以前に報告されているようにして（Ｍｕｒｏｈａｒａ Ｔ．他、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、２０００年、第１０５巻、１５２７−１５３６ページ）、フィコール・ヒストパック（登録商標）密度勾配法を利用して遠心分離することにより、骨髄単核細胞を単離した。
【００４２】
骨髄単核細胞は、ヒストパック密度勾配遠心分離法を用いてウサギの骨髄血から単離した。以下に説明するように、細胞培養実験に用いた培地は、２０％のＦＢＳ、ＥＣ増殖補助剤としてのウシ下垂体抽出液、ヘパリン（１００μｇ／ｍｌ）、抗生物質（ライフ・テクノロジーズ社、グランド・アイランド、ニューヨーク州）を補足した培地１９９（標準培地）であった。単核細胞は、ヒトのフィブロネクチンで覆ったプラスチック板（バイオコート、ベクトン−ディクソン社）の上で培養した。
【００４３】
簡単に説明するならば、ヤブロンカ−レウヴェニとナメロフが記載しているようにして細胞懸濁液を２０％〜６０％の密度勾配になるように充填する。細胞は、１４０００ｒｐｍで１０分間にわたって遠心分離する。上部の３分の２をチューブに移す。細胞を２０００ｒｐｍで１０分間にわたって遠心分離した後、ＰＢＳで洗浄してパーコールを除去する。この操作を繰り返し、細胞ペレットをすでに説明したようにして培地（ＩＭＤＭ）に再び分散させる。単離したばかりの骨髄単核細胞は、移植してもよいし、その細胞をプラスチック製の組織培養皿に１時間載せ、分化した接着細胞によって汚染されないようにしてもよい。別の方法として、すでに説明したように、移植前に骨髄単核細胞を４週間まで培養することもできる。
【００４４】
メイ−ギムサ染色（ｎ＝４）により、骨髄単核細胞には、赤芽球（３７±６％）、単球細胞（１２±２％）、リンパ球細胞（３７±１０％）、顆粒球（１４±２％）が含まれていることがわかった。ＥＰＣを含む骨髄幹細胞は、単球細胞および／またはリンパ球細胞の分画中に存在していると考えられている（Ｐｒｏｃｋｏｐ ＤＪ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９７年、第２７６巻、７１−７４ページ；Ａｓａｈａｒａ Ｔ．他、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９９９年、第１８巻、３９６４−３９７２ページ）。
【００４５】
細胞の培養
骨髄単核細胞は、培地１９９（ジブコ・カタログ第１１１５０−０５９番）（標準培地）中に入れた、フィブロネクチンで覆ったプラスチック板の上で、３７℃にて５％のＣＯ２のもとで培養した。なおこの培地には、２０％のＦＢＳ、内皮細胞増殖補助剤、ヘパリン１０Ｕ／ｍｌ、抗生物質［ペニシリンＧ＋ストレプトマイシン＋アンフォテリシンＢ］（ジブコＢＲＬ、ライフ・テクノロジーズ社、ジブコ・カタログ第１５２４０−０６２番）を添加した。培養物において、典型的な出現物すなわちＥＰＣが細胞クラスターや紐状の構造となって発生したかどうかを調べた。その方法については以前に報告されており（Ａｓａｈａｒａ Ｔ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９７年、第２７５巻、９６４−９６７ページ；Ｍｕｒｏｈａｒａ Ｔ．他、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、２０００年、第１０５巻、１５２７−１５３６ページ）、これら文献の内容が参考としてこの明細書に組み込まれている。培養を開始してから７日目、ＥＣ特異的な機能とマーカーを以下に説明するようにして評価した。
【００４６】
一連の継代培養の後、ＨＳＣを含まないウサギの骨髄由来の繊維芽細胞を付着している骨髄幹細胞から単離し、培養した。希釈度を制限することによって繊維芽細胞をサブクローニングし、標準培地で培養した。繊維芽細胞は、典型的な“髪の毛のウエーブ”様の形態によって同定した。フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）の発現がないということ、さらにＤｉＩ−アセチル化ＬＤＬ（ＤｉＩ−ａｃＬＤＬ、すなわち１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩で標識したアセチル化低密度リポタンパク質）が組み込まれたということは、ＥＣまたはＥＰＣの汚染がなかったことを示していた。
【００４７】
ＥＰＣに関する免疫細胞化学
免疫細胞化学分析を行ない、ＥＣ系列のマーカーとして、ｖＷＦの発現と欧州産ハリエニシダのレクチン（シグマ社）の結合を同定した。これについては以前に室原ら（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、２０００年、第１０５巻、１５２７−１５３６ページ）とジャクソンら（Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．、１９９０年、第９６巻、２５７−２６２ページ）が記載している。簡単に説明するならば、培養して７日目の紡錘形のＡＴ細胞をチェンバーのスライド上で増殖させ、冷たいメタノールを用いて固定した。３％の過酸化水素を用いて内在性ペルオキシダーゼを不活性化した。ウマの１０％血清を用いて非特異的モノクローナル抗体の結合をブロックした。次に、ヒトｖＷＦに対する第１モノクローナル抗体（クローンＦ８／８６；ダコ社、グロストループ、デンマーク）を添加した。このモノクローナル抗体はマウスのＩｇＧ１であり、次に、ネガティブ・コントロールのスライドを、非免疫マウスのＩｇＧ１であるＭＯＰＣ−２１（シグマ社）の適切な希釈液とともに培養した。ＰＢＳで２回洗浄した後、ビオチン化したウマの抗マウスＩｇＧ１を添加し、次いでアビジン−ビオチン免疫ペルオキシダーゼ（ヴェクター・ラボラトリーズ社、バーリンゲイム、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）で処理した。第２抗体としては、抗マウスＩｇＧ（例えばウサギまたはヤギの抗マウスＩｇＧ）でありさえすれば任意の抗体を用いることができる。最終的な免疫反応産物を目に見えるようにするため、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ヒストファイン；株式会社ニチレイ、東京、日本国）を用いる。
【００４８】
培養物中のＥＰＣの機能に関する研究
ＥＣの特徴的な機能の１つである、ＥＰＣがａｃＬＤＬに組み込まれたかどうかの分析を、以前に室原ら（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、２０００年、第１０５巻、１５２７−１５３６ページ）が報告しているようにして、ヴォイタらの方法（Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、１９８４年、第９９巻、２０３４−２０４０ページ）を利用して行なった。これらの文献は、その内容が参考としてこの明細書に組み込まれている。簡単に説明するならば、付着している細胞（ＡＴ）を、ＤｉＩで標識したＡｃ−ＬＤＬ（ＤｉＩ−Ａｃ−ＬＤＬ；モレキュラー。プローブ社、ユージーン、オレゴン州、アメリカ合衆国）１５μｇ／ｍｌを含む培地内のフィブロネクチン上で３７℃にて２４時間にわたって培養した。次に、蛍光顕微鏡を用いて細胞を調べ、ＤｉＩ−Ａｃ−ＬＤＬの存在を明らかにした。
【００４９】
以前に小島ら（Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．、１９９８年、第７０巻、２４４６−２４５３ページ）が報告しているように、膜透過性のＮＯ検出試薬であるジアミノフルオレセイン−２−ジアセテート（ＤＡＦ−２ＤＡ、第一化学薬品株式会社）を用いてＥＰＣからのＮＯの放出も分析した。この文献の内容は、参考としてこの明細書に組み込まれている。ＤＡＦ−２ＤＡが遊離したＮＯと反応すると、緑色の蛍光を出すトリアゾール（ＮＯを検出できる下限は５ｎＭ）が生成する。簡単に説明するならば、Ｃａ２＋を含まないＰＢＳで２回洗浄した細胞を、今度はＬ−アルギニン（１ｍＭ）と１０μＭのＤＡＦ−２ＤＡを含むクレブス−ヘンゼライト緩衝液の中に浸し、３７℃にて１時間にわたって培養した。細胞内におけるＮＯの発生（ニトロシル化したＤＡＦ−２ＤＡとして検出される）を、蛍光顕微鏡を用いて調べた。
【００５０】
一側性後肢虚血のモデル・ウサギ
組織が虚血になると新たな血管が形成されることを、一側性後肢虚血のモデル・ウサギにおいて調べた。その方法については室原ら（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９８年、第１０１巻、２９６７−２９７８ページ）が報告しており、その内容が参考としてこの明細書に組み込まれている。簡単に説明するならば、まず最初に、オスのニュージーランド白ウサギ（２．６〜３．６ｋｇ）（パイン・エーカー・ラッビトリー社、ノートン、マサチューセッツ州）に麻酔した。そのときキシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）を用い、次にケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）とアセプロマジン（０．８ｍｇ／ｋｇ）を用いた。皮膚を切開し、大腿動脈の全体とその主要なすべての分枝を分けてほどけた状態にした。外腸骨動脈と上記のすべての動脈を４−０の絹糸（エシコン社、ソマーヴィル、ニュージャージー州）を用いて縛った。最後に、大腿動脈を、外腸骨動脈の１つの分枝としての近位起点から、二股に分岐して伏在動脈と膝窩動脈になる遠位点まで切除した。その結果、虚血の肢部への血流は、内腸骨動脈から出る副行血管に完全に依存するようになる。
移植した骨髄単核細胞または骨髄繊維芽細胞の虚血組織における検出
移植した自己由来の骨髄単核細胞または骨髄繊維芽細胞が虚血組織内で生き延びて毛細血管構造の形成に関与するかどうかの分析を行なった。ウサギを上記のようにして一側性後肢虚血の状態にした。７日目、自己由来の骨髄単核細胞（ｎ＝８）または骨髄繊維芽細胞（ｎ＝５）を緑色蛍光マーカーＰＫＨ２−ＧＬ（シグマ社）で標識した。その方法については以前に報告されており（Ｙｕａｎ Ｙ．とＦｌｅｍｉｎｇ ＢＰ．、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ． Ｒｅｓ．、１９９０年、第４０巻、２１８−２２９ページ；Ｍｕｒｏｈａｒａ Ｔ．他、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６年、第１５６巻、３５５０−３５５７ページ）、これら文献の内容が参考としてこの明細書に組み込まれている。次に、標識した骨髄単核細胞または骨髄繊維芽細胞（１匹につきそれぞれ５×１０６個）を、虚血になった大腿骨格筋の異なる６ヶ所の地点に、２６ゲージの針を用いて移植した。２１日目（移植後１４日目）、ペントバルビタールを過剰に投与してウサギを安楽死させ、虚血組織の断片を１匹につき４つ取得した。厚さ５μｍの多数の凍結切片を調製し、蛍光顕微鏡を用いて調べた。
移植した髄単核細胞または骨髄繊維芽細胞が組織内で生き延びたかどうかを調べるため、互いに隣接した凍結切片を、インドキシル−テトラゾリウム法により、３７〜３８℃にて１時間にわたってアルカリホスファターゼ（ＡＰ）染色した。その方法については以前に報告されており（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ他、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９４年、第９３巻、６６２−６７０ページ；Ｚｉａｄａ ＡＭ．他、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｒｅｓ．、１９８４年、第１８巻、７２４−７３２ページ）、これら文献の内容が参考としてこの明細書に組み込まれている。ＡＰ染色により、骨格筋組織内の毛細血管ＥＣも検出することができる。毛細血管ＥＣは、生きていて細胞内酵素活性が完全なままであるときにだけ、ＡＰ染色によって濃い青色になる。蛍光陽性の細胞とＡＰ陽性の細胞の間の空間的関係を調べ、移植した細胞（骨髄単核細胞または骨髄繊維芽細胞）が毛細血管構造の形成に関与しているかどうかを明らかにした。
【００５１】
骨髄移植による、治療としての新たな血管形成
別のウサギ（ｎ＝２７）を一側性後肢虚血の状態にし、ランダムに３つの群に分けた。実験中に死んだウサギはいなかった。対象群（ｎ＝８）には２．５ｍｌの生理的食塩水を注入した。手術後７日目、虚血になった筋肉に対し、第２の群（ｎ＝１３）では自己由来の骨髄単核細胞（１匹につき６．９±２．２×１０６個；骨髄単核細胞群）を移植し、第３の群（ｎ＝６）では自己由来の骨髄繊維芽細胞（１匹につき６．５±１．５×１０６個；骨髄繊維芽細胞群）を移植した。簡単に説明するならば、自己由来の骨髄単核細胞または骨髄繊維芽細胞を単離し２．５ｍｌの生理的食塩水に分散させた。細胞を調製してから１０分以内に、虚血になった大腿骨格筋の異なる６ヶ所の地点に細胞を移植した。骨髄単核細胞、骨髄繊維芽細胞、生理的食塩水のいずれかを注入した後、虚血肢組織における血管形成と副行血管形成を以下のようにして分析した。
【００５２】
ふくらはぎの血圧比
カフ血圧モニター・システム（ジョンソン・エンド・ジョンソン社）を用い、手術前、手術後７日目（細胞移植前）、手術後３５日目に、両方の後肢のふくらはぎにおける収縮期血圧（ＣＢＰ）を測定した。それぞれの時点で測定は３回行ない、平均値を計算した。ＣＢＰ比は、虚血肢のＣＢＰ／正常肢のＣＢＰの値と定義され、副行血流の程度を示す有用な生理学的パラメータであると考えられる。測定方法については以前に報告されており（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ他、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９４年、第９３巻、６６２−６７０ページ；Ｍｕｒｏｈａｒａ Ｔ．他、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９８年、第１０１巻、２９６７−２９７８ページ）、これら文献の内容が参考としてこの明細書に組み込まれている。
【００５３】
血管造影法
血管造影法により、手術後３５日目に副行血管の形成状態を評価した。５Ｆカテーテルを右総頚動脈を通じて挿入し、下方の腹部大動脈まで到達させた。Ｘ線血管造影システム（ＯＥＣメディカル社）を用いて血管造影を行なった。非イオン性造影剤（シェリング社）を注入してから４秒後に血管造影写真を撮影した。副行血管の形成を定量評価するため、血管造影スコアを計算した。その方法については、以前に報告されている（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ他、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９４年、第９３巻、６６２−６７０ページ）。簡単に説明するならば、５ｍｍ２の多数のグリッドからなる複合体を、４秒（４−ｓ）後の血管造影写真の中央大腿領域の上に置いた。どの治療法を適用したか知らない１人の検者が、中央大腿領域に含まれるグリッドの合計数と、造影剤で不透明になった動脈の一部が含まれるグリッドの合計数をそれぞれ数えた。血管造影スコアは、それぞれのフィルムについて、不透明な動脈の一部が含まれるグリッドの合計数を中央大腿領域に含まれるグリッドの合計数で割った値として計算した。
【００５４】
免疫組織化学と毛細血管密度の測定
虚血になった筋肉から採取した切片内のＥＣ毛細血管の数を光学顕微鏡を用いて測定することにより、細胞移植（または生理的食塩水の注入）が新たな血管形成に及ぼす効果を評価した。組織のサンプルは、３５日目に内転筋と半膜様筋から採取した。これら２つの筋肉を選択したのは、中央大腿領域の主要な２つの筋肉だからであり、それぞれの筋肉は、総大腿動脈／表面大腿動脈を切除したときに縛った深部大腿動脈によってもともと灌流していた。厚さ５μｍの凍結切片を各サンプルから調製し、筋肉繊維が横方向を向くようにした。切片をＡＰ染色し、毛細血管ＥＣを検出した。別の切片をｖＷＦ染色し、さらにＥＣの表現型を確認した。毛細血管ＥＣを光学顕微鏡（倍率２００倍）で数え、毛細血管の密度を測定した。各ウサギの２つの筋肉サンプルから５つの視野をランダムに選択し、毛細血管を数えた。毛細血管の密度を筋細胞萎縮のために過大評価したり、間質性浮腫のために過小評価したりしないようにするため、毛細血管／筋肉繊維の比も測定した。
【００５５】
レーザー・ドップラー血液灌流分析
手術後３５日目、われわれは、レーザー・ドップラー血液灌流画像（ＬＤＰＩ）システム（ＭｏｏｒＬＤＩ、ムーア・インスツルメンツ社）を用いて虚血になった大腿領域の血流状態を評価した。その方法については、以前に報告されており（Ｍｕｒｏｈａｒａ Ｔ．他、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９８年、第１０１巻、２９６７−２９７８ページ）、この文献の内容が参考としてこの明細書に組み込まれている。血液の灌流が少ない場合または血液の灌流がない場合には濃い青色に表示され、灌流が盛んだと赤色から白色に表示された。
上に説明した研究から得られた結果は、平均値±標準誤差で表わした。差の統計的有意性を３つの実験群の間でＡＮＯＶＡにより分析した後、任意の２つの群を比較するためにフィッシャーのｔ検定を行なった。Ｐ＜０．０５のときに統計的有意性があるとした。ｎは、ウサギの数を表わす。
【００５６】
インビトロにおいてウサギの骨髄単核細胞から発生したＥＰＣ
単離した骨髄単核細胞（ｎ＝１０）をフィブロネクチン上で培養すると、多数の細胞クラスターが２４時間以内に出現した（図１ａ）。続いて３日以内に紡錘形の付着（ＡＴ）細胞がクラスターの縁部から芽を出した。ＡＴ細胞は直線状の紐のような構造（図１ｂ）と多数の細胞クラスター構造（図１ｃ）を形成した。これらのクラスターは互いに融合してより大きな１つの単層細胞を形成し（図１ｃ）、それがさらにネットワーク構造になった（図１ｄ）。
【００５７】
培養開始７日後に観察されたＡＴ細胞を染色したところ、ＥＣの特徴的なマーカーであるハリエニシダのレクチンの結合（図１ｅ）とｖＷＦの発現（図１ｆ）の両方が検出された。ＡＴ細胞の８０％以上が、ＥＣの特徴的な機能の１つであるＤｉＩ−ａｃＬＤＬの取り込みを行なった（図１ｇと図１ｈ）（ＧａｒｌａｎｄａとＤｅｊａｎａ、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｃｓ． Ｂｉｏｌ．、１９９７年、第１７巻、１１９３−１２０２ページ）。ＤｉＩ−ａｃＬＤＬを取り込む能力を有するＡＴ細胞は、１ミリモル／リットルのＬ−アルギニンの存在下でＮＯも放出した。そのことは、ＮＯ特異的な蛍光標示薬であるＤＡＦ−２ＤＡによって調べた（図１ｉ）。以上より、ＡＴ細胞は多数のＥＣ特性を有しており、ＥＰＣの主要な構成要素になっていると判断された。
【００５８】
虚血組織において、移植した自己由来の骨髄繊維芽細胞ではなく骨髄単核細胞が新たな血管形成に関与した
蛍光標識した骨髄単核細胞（ｎ＝８）を移植してから２週間後、虚血組織から調製した凍結切片を蛍光顕微鏡で調べたところ、移植した骨髄単核細胞が、残っていた骨格筋細胞の間にあるＥＣ毛細血管ネットワークに組み込まれたことがわかった（図２ａと図２ｂ）。隣接した凍結切片では、蛍光陽性の細胞の大部分は、無傷の毛細血管ＥＣ内の酵素であるＡＰでも染色された。これは、移植した骨髄単核細胞が生き延び、毛細血管ネットワークの形成に関与したことを示している（図２ｂと図２ｃ）。
対照実験として、移植した自己由来の骨髄繊維芽細胞（ｎ＝１５）が虚血組織において新たな血管形成に関与したかどうかを調べた。移植後２週間のときに得られた多数の凍結切片を調べたところ、虚血組織内で蛍光陽性だった細胞はほとんどないことがわかった（図２ｄと図２ｅ）。蛍光陽性の細胞（骨髄繊維芽細胞）とＡＰ陽性の細胞（毛細血管ＥＣ）では空間的分布が異なっていた（図２ｃと図２ｆ）。これは、移植した骨髄繊維芽細胞が毛細血管構造に組み込まれなかったことを示している。
【００５９】
自己由来の骨髄単核細胞を局所的に移植すると、虚血になった後肢において新たな血管形成と副行血管形成が増加した
自己由来の骨髄単核細胞と骨髄繊維芽細胞を局所的に移植し、生きたウサギの虚血になった後肢において新たな血管形成と副行血管形成が増加するかどうかを調べた。細胞移植（対照群では生理的食塩水の注入）の直前と手術後３５日目に３つの実験群を調べたところ、体重や収縮期圧に差はなかった。
【００６０】
ＣＢＰ比
肢部を虚血にする前と手術後７日目（すなわち細胞移植の前）には、３つの群で虚血（左）／正常（右）のＣＢＰ比に有意な差はなかった（図３）。これは、肢部の虚血が３つの群で同程度だったことを示している。しかし手術後３５日目（細胞移植してから２８日目）には、ＣＢＰ比が骨髄単核細胞群において他の２つの群よりも有意に大きかった（図３）。これは、副行血流が骨髄単核細胞群においてだけ増加したことを示している。
【００６１】
血管造影スコア
手術後３５日目、すべてのウサギに対して腸骨血管造影を行なった。３つの群の代表的な血管造影図を図４に示してある。骨髄単核細胞を移植したウサギでは多数の副行血管が発達したのに対し、対照のウサギまたは骨髄繊維芽細胞を移植したウサギではそうならなかった。血管造影スコアを用いて定量分析したところ、骨髄単核細胞群では他の２つの群よりも虚血組織における副行血管の数が有意に多いことがわかった（図４ｂ）。
【００６２】
毛細血管の密度
血管形成の具体的な証拠として毛細血管の密度を微小血管レベルで計算した。虚血組織における組織学的切片の代表的な顕微鏡写真を図５ａに示してある。ｖＷＦとＡＰを用いた免疫組織学的染色により、骨髄単核細胞を移植したウサギでは多数の毛細血管ＥＣが存在していたのに対し、対照のウサギや骨髄繊維芽細胞を移植したウサギではそれよりも少数の毛細血管ＥＣしか存在していないことがわかった。定量分析により、虚血領域における毛細血管の密度が骨髄単核細胞群において他の２つの群よりも有意に大きいことがわかった（図５ｂ）。毛細血管／筋肉繊維の比も、骨髄単核細胞群において他の２つの群よりも大きかった（図５ｂ）。
【００６３】
レーザー・ドップラー血液灌流
虚血になった後肢における皮下の血液灌流を分析するため、ＬＤＰＩ分析を行なった。代表的な画像を図６ａに示してある。骨髄単核細胞を移植したウサギの虚血になった後肢（色彩分布が赤色から白色）においては、対照のウサギや骨髄繊維芽細胞を移植したウサギ（青色から緑色）よりも血液灌流が大きいことが観察された。図６ｂは、虚血になった大腿領域におけるＬＤＰＩから血液灌流指数を計算した結果をまとめたものである。骨髄単核細胞を移植した群では血液灌流の顕著な回復が観察された一方で、他の２つの群では血流が低いままであった。
【００６４】
実施例２
冠状血管の圧迫によって慢性心筋虚血を誘導したブタに骨髄由来の細胞を移植することによる、治療としての血管形成
ウサギから単離した骨髄由来の単核細胞（ＢＭ−ＭＮＣ）をウサギの虚血になった後肢に注入すると内皮前駆細胞（ＥＰＣ）が生み出されて機能を発揮し、生後の血管形成に寄与することが以前に明らかにされている（Ｓｈｉｎｔａｎｉ他、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００１年、第１０３巻、８９７−９０３ページ）。
ここでは慢性心筋虚血になったモデル・ブタを用い、機能を発揮するＥＰＣが骨髄単核細胞から発生するという仮説を検証した。ここでは血管内法を用い、自己由来の骨髄単核細胞を局所的に移植すると虚血になった組織において新たな血管形成が増加することを示す。
【００６５】
左回旋動脈の周囲にアメロイド圧迫器を設置して虚血にした１ヶ月後、基準値の測定と治療を行なった。心筋内注入用カテーテル（ボストン・サイエンティフィック社）を用い、ブタ（ｎ＝９）の虚血領域に生理的食塩水（ｎ＝４）または自己由来の骨髄単核細胞（ｎ＝５）を注入した。密度勾配遠心分離法を利用してブタから骨髄単核細胞を単離した。それぞれのブタには２０μｌを１０回にわたって心筋内に注入した。治療時と４週間後に、冠状血管造影、ドブタミン負荷心エコー検査、マイクロスフェアの注入を利用した心筋血流測定を行なった。
【００６６】
追跡検査において、治療群では、有意な改善が、アメロイド圧迫器による閉塞から遠い動脈の充填率（１５±１４から４±７フレームへ；ｐ＜０．０５）と、最大負荷における左心室局所壁運動スコア（１．３２±０．１１から１．０２±０．０４へ；ｐ＜０．０１）において見られた。さらに、虚血領域における心筋血流の心内膜／心外膜の比は、追跡検査において治療群で大きくなった（０．８０±０．２３から１．１７±０．１３へ；ｐ＜０．０７）。これらの結果は、骨髄単核細胞の移植によって治療部位で血流が増加することを示している。
【００６７】
実施例３
冠状血管の圧迫によって慢性心筋虚血を誘導したブタに骨髄由来の細胞を移植することによる、治療としての血管形成
心筋内への血管形成因子の直接注入が副行機能に及ぼす効果が、実験的研究としてだけでなく開心術中の患者においても最近報告された（Ｍａｃｋ ＣＡ．他、Ｊ． Ｔｈｏｒａｃ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｓｕｒｇ．、１９９８年、第１１５巻、１６８−１７６ページ；Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ Ｂ．他、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１９９８年、第９７巻、６４５−６５０ページ；Ｌｏｓｏｒｄｏ ＤＷ．他、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１９９８年、第９８巻、２８００−２８０４ページ）。さらに、カテーテルを用いて心筋内にマーカー遺伝子を注入するため、カテーテルを利用したさまざまなシステムの可能性がモデル動物において調べられた（Ｖａｌｅ ＰＲ．他、Ｊ． Ａｍ． Ｃｏｌｌ． Ｃａｒｄｉｏｌ．、１９９９年、第３４巻、２４６−２５４ページ）。慢性心筋虚血に対するこの可能性ある新しい治療法を発展させたりテストしたりするにあたって論理的に次に来るステップは、カテーテルに基づく技術的に可能な方法を大きな動物に適用することである。
【００６８】
そこで、慢性心筋虚血になったモデル・ブタにおいて本発明の方法を用い、自己由来の骨髄単核細胞を局所的に移植すると虚血組織において新たな血管形成が増加するという仮説を検証した。実施例３は、動物の数が増えたことを除いては実施例２と同じである。
すべての実験と動物のケアは、動物のケアと利用に関する国立衛生研究所とアメリカ心臓協会のガイドラインに従い、アトランタ心臓血管研究所の「動物のケアと利用に関する委員会」の承認を得た。
【００６９】
慢性心筋虚血のモデル・ブタ
体重が約２０〜２５ｋｇの家畜のブタにテラゾール（５ｍｇ／ｋｇ）を筋肉内注射して落ち着かせ、挿管し、イソフルランを吸入させることにより麻酔した。ブタを麻酔状態にして人工呼吸装置を取り付け、血管のサイズに合ったアメロイド圧迫器（典型的な値は１．７５、２．００、２．２５ｍｍ ＩＤ）を第４左肋間空間を通じて入れ、左冠状動脈の中心部から遠い近位ＬＣＸの周囲に設置した。胸を閉じ、ブタの回復を待った。１ヶ月後、ブタに対して基準値の測定を行なった後、ブタをランダムに分けて骨髄単核細胞または偽薬（生理的食塩水、対照）を虚血になった心筋に注入した。ブタが回復して治療から１ヶ月が経過したとき、血管造影、血流力学測定、心エコー検査を再度行なった。心筋サンプルを虚血領域と正常な隣接領域から採取し、局所的血流をマイクロスフェア法により調べるとともに、毛細血管の密度を組織計測法により調べた。
【００７０】
骨髄単核細胞の単離
腸骨稜から骨髄５０ｍｌを吸引し、クエン酸塩を用いて凝固しないようにした。密度勾配遠心分離法により骨髄単核細胞を単離した。その方法については以前に報告されており（Ｓｈｉｎｔａｎｉ他、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００１年、第１０３巻、８９７−９０３ページ；Ｍａｃｋ ＣＡ．他、Ｊ． Ｔｈｏｒａｃ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｓｕｒｇ．、１９９８年、第１１５巻、１６８−１７６ページ）、この文献の内容がこの明細書に組み込まれている。
【００７１】
虚血になった心筋への骨髄単核細胞の移植
２つの群に分けたブタに対し、左回旋動脈の周囲にアメロイド圧迫器を設置した１ヶ月後、心筋内注入用カテーテル（スティレット（登録商標）、ボストン・サイエンティフィック社、ボストン、マサチューセッツ州、図Ａ）を用い、骨髄単核細胞（ｎ＝６）または生理的食塩水（ｎ＝６）を左心室心筋腔内に注入した。注入用カテーテルは、＃７Ｆステアリング・ガイドと＃９Ｆ ＬＶシースを通じ、大腿動脈から導入した。スティレットは、蛍光透視とＥＣＧの監視を行ないながら心内膜壁に到達させた。シャフトを壁に押しつけた。そのことは、シャフトの正常位置からのわずかなずれおよび／またはガイドの後退から明らかであった。この操作の間、心室の期外収縮がしばしば観察された。
【００７２】
細胞培養
すべての培養実験において、２０％のウシ胎仔血清、内皮細胞増殖補助剤、抗生物質を含む培地１９９を用いた。湿潤環境で５％ＣＯ２／９５％空気の状態にしたインキュベータの中にゼラチンで覆ったプラスチック板を入れ、そのプラスチック板の上で３７℃にて骨髄単核細胞を培養した。
【００７３】
左心室壁運動の研究
左心室壁運動を、骨髄単核細胞または生理的食塩水を注入するときと１ヶ月後に、ドブタミン負荷心エコー検査法によって評価した。
【００７４】
ドブタミン負荷心エコー検査法
ドブタミンの投与量を約３分間の間に段階的に約２．５μｇ／ｋｇ／分から４０μｇ／ｋｇ／分まで増やしながらドブタミン負荷心エコー検査を行なった。１０分割モデル（６分割は乳頭筋レベルでの短軸像、４分割は長軸像）に基づき、壁運動を点数で評価した。１＝正常、２＝運動低下、３＝運動消失、４＝逆方向運動である。局所壁運動スコアを、安静時、低投与量（５．０μｇ／ｋｇ／分未満のドブタミン）、最大負荷の場合に計算した。どの治療法が割り当てられたか知らない熟練した検者が心エコー図を解釈した。
【００７５】
冠状血管造影法
副行血管の形成を、骨髄単核細胞を移植したときと１ヶ月後に、冠状血管造影法によって評価した。血管造影は左右の冠状動脈に対して実施し、直交するＬＡＯ画像とＲＡＯ画像を取得した。評価は、どの治療法が割り当てられたか知らない熟練した２人の血管造影技師が撮影フィルムを点検することによって行なった。副行血管スコアは、レントロップらによって提案されている分類（Ｒｅｎｔｒｏｐ ＫＰ．他、Ｊ． Ａｍ． Ｃｏｌｌ． Ｃａｒｄｉｏｌ．、１９８５年、第５巻、５８７−５９２ページ）に基づき、それぞれのフィルムについて決定した。この分類は、参考としてこの明細書に組み込まれている。要するに、副行血管を以下のような点数で評価した。存在していない場合（０）、心外膜冠状動脈そのものは見えないが、ターゲットである閉塞した心外膜冠状動脈の分枝が副行血管を通じて満たされている（１＋）、心外膜が副行動脈を通じて部分的に満たされている（２＋）、心外膜が完全に満たされている（３＋）。
【００７６】
心筋の血流測定
心筋の血流の基準値と、骨髄単核細胞または偽薬を注入してから１ヶ月後の値を、以前に報告されているラインハルトらの方法（Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．、第２８０巻、Ｈ１０８−Ｈ１１６ページ、２００１年）を変更した方法により、金含有マイクロスフェアとサマリウム含有マイクロスフェア（バイオフィジックス・アッセイ・ラボラトリー社、ウェルスリー・ヒルズ、マサチューセッツ州）を用いて測定した。なおこの方法は、参考としてこの明細書に組み込まれている。簡単に説明するならば、＃６Ｆ多目的カテーテルを大腿動脈から逆行挿入することにより、マイクロスフェアを左心房に注入した。カテーテルの位置は蛍光顕微鏡法で確認した。約５００万個の赤いマイクロスフェア（金を含んでおり、血流の基準値の評価に用いる）または黒いマイクロスフェア（サマリウムを含んでおり、治療してから１ヶ月後の血流を評価するのに用いる）を１回分の適用量として左心房に注入した後、１０ｍｌの無菌生理的食塩水を勢いよく流し込んだ。マイクロスフェアを注入する５秒前に、シリンジ・ポンプを用いて大腿動脈導入用シースから基準血液サンプルの取り出しを開始した。この作業は、５ｍｌ／分の割合で２分間継続して行なった。ブタを安楽死させた後、心臓を取り出し、幅約１ｃｍの経壁組織サンプルを、左心室の自由な壁部の虚血領域（ＬＣＸ領域）と正常領域（ＬＡＤ領域）からカットした。次に、これらサンプルを径方向の６つの区画に切断し、それをさらに心外膜領域と心内膜領域に分割した。インビトロでの中性子活性化によりマイクロスフェアの数が得られ、組織については組織１ｍｇあたりのマイクロスフェアの数が、血液については１ｍｌあたりのマイクロスフェアの数が得られた。次に、以下の式を用い、３つの領域における心筋血流の平均値を、基準値と追跡検査時に関して計算した。
組織サンプル中の心筋血流（ｍｌ／分／ｇ）＝［シリンジ・ポンプの吸引速度（１０ｍｌ／２分）／組織サンプルの重量（ｇ）］×［組織中のマイクロスフェアの数／基準血液サンプル中のマイクロスフェアの数］
【００７７】
免疫組織化学と毛細血管の密度測定
光学顕微鏡による面積測定式形態測定法を利用し、自己由来の骨髄単核細胞の移植が１ヶ月目の時点で心筋の新たな血管形成に及ぼす効果を、どの治療法が割り当てられたか知らない１人の検者が評価した。アビジン−ビオチン複合体法（第２の抗体と結合する染色体酵素としてアルカリホスファターゼを用い、基質としてベクターレッドを用いた）を利用した間接的免疫細胞化学によりＶＩＩＩ因子関連抗原（ｖＷＦ）で染色し、ジルのヘマトキシリンで対比染色した切片において、毛細血管の数と断面密度を測定した。ＬＣＸ虚血領域とその領域に隣接するＬＡＤ正常領域に由来する心筋繊維を長軸に対して垂直に切断した切片からそれぞれ１０箇所の顕微鏡視野（倍率４００倍）を取得し、数値化した。サイズと形状（大まかに円形で５０μｍ未満）ならびにｖＷＦの反応性によって明らかになる毛細血管の合計数を、それぞれの視野において、画像処理関数（イメージ・プロ・プラス、メディア・サイバネティックス社、ロックヴィル、メリーランド州）を利用して数えた。毛細血管の密度（数／ｍｍ２）を計算した。
【００７８】
虚血組織に移植した骨髄単核細胞の同定
別の３頭のブタにアメロイド圧迫器を取り付けてから２週間後、自己由来の骨髄単核細胞を単離し、赤色蛍光マーカーＰＫＨ２６−Ｒｅｄ（シグマ社）で標識した。次に、心筋注入用カテーテルを上に説明したのと同じようにして使用し、標識した骨髄単核細胞を虚血の心筋に移植した。移植してから１４日目、塩化カリウムを過剰に投与してブタを安楽死させ、虚血組織を１頭につき１６片取得した。厚さ５μｍの多数の凍結切片を調製し、ＤＮＡ蛍光染料であるＤＡＰＩで染色し、移植した骨髄単核細胞が組織内で生き延びたかどうかを蛍光顕微鏡を利用して調べた。
【００７９】
統計的分析
すべての数値を平均値±標準偏差として表わした。スチューデントのｔ検定（場合に応じ、対にして検定したり対にせずに検定したりする）を利用して群同士の比較を行なった。３つ以上の群を比較する場合には、一方向ＡＮＯＶＡの後、フィッシャーのｔ検定を行なった。臨界値Ｐ＜０．０５を考慮して有意差または治療効果を表示した。
【００８０】
インビトロでブタの骨髄単核細胞からＥＰＣが発生する
骨髄単核細胞をゼラチンで覆ったプラスチック板の上で培養すると、以前の研究（Ｓｈｉｎｔａｎｉ他、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００１年、第１０３巻、８９７−９０３ページ）と同様、付着して広がった紡錘形の細胞が、紐のような構造と多数の細胞クラスターを１４日以内に形成した（図７ａ−図７ｃ）。
【００８１】
カテーテルを用いた注入
４頭のブタにおいて、カテーテルで注入したメチレンブルー２０μｌの局在状態を調べた。メチレンブルーの注入部位は、それぞれの心臓を剖検して同定した。後側左心室の心筋に局在する注入の成功率は８５±１３％であった。どの心臓でも、心臓周辺の出血、またはメチレンブルーに影響された出血は見られなかった。
治療群では、それぞれのブタの虚血になった後側左心室の自由壁部に心筋注入用カテーテルを用いて２０μｌを１０回注入することにより、骨髄単核細胞を約８．０±１．５×１０８個注入した。対照には、２０μｌの生理的食塩水を１０回注入した。
【００８２】
冠状血管造影法
骨髄単核細胞を移植したときまたは生理的食塩水を注入したときと１ヶ月後に、ブタに対して冠状血管造影を行なった。アメロイド圧迫器を設置した部位におけるＬＣＸの狭窄に関し、基準値（９２±１１％：９４±１１％＝治療群：対照）と追跡検査値（９６±９％：９５±９％）の両方とも、群間で差はなかった。
レントロップ・スコアが１＋よりも大きい副行血管造影図は、対照に属する２頭のブタと、治療前の骨髄単核細胞群に属する１頭のブタで観察された。追跡検査では、治療群に属するブタ６頭のうちの５頭において副行血管の形成が１＋よりも大きくなった。それに対して対照群でそうなったのはブタ６頭のうちの４頭だった。
【００８３】
ドブタミン負荷心エコー検査法
局所壁運動スコアの平均値は、基準となる時点における安静時と負荷時の両方とも、対象群と治療群で差がなかった（図８ａ）。これは、アメロイド圧迫器を用いた狭窄によって誘導される左心室機能の低下が、治療前には両方の群で同程度だったことを示している。治療してから１ヶ月後、薬物負荷を低投与量から高投与量へと増やしていくときに観察される運動低下が対照ではまだ存在していたのに対し、治療時に骨髄単核細胞を移植したブタでは、低投与量と高投与量のドブタミンで壁運動に差はなかった（図８ｂ）。骨髄単核細胞で治療したブタは、治療前と比べると治療後の追跡検査において高投与量のドブタミン実験で有意な改善を示した（図８ｂ）（１．０２±０．０４：１．２７±０．１６；ｐ＜０．０２０）。
【００８４】
心筋の血流
治療前には、２つの群で心筋の血流に有意な差はなかった。しかし治療してから１ヶ月後、心筋の血流は、骨髄単核細胞群でだけ、基準値と比べて有意に増加した（０．３１±０．１４：０．６５±０．３５ｍｌ／分／ｇ、Ｐ＜０．０５）。しかもこの値は、骨髄単核細胞群において対照よりも有意に大きくなっていた。
【００８５】
毛細血管の密度
心筋からの組織切片を上記にようにして組織学的に調べた。虚血になった心筋からの組織学的切片の代表的な顕微鏡写真を図１０ａと図１０ｂに示してある。定量分析により、毛細血管の密度が、骨髄単核細胞で治療したブタからの虚血領域（１８５４±２７９／ｍｍ２）では、生理的食塩水を注入したブタからの虚血領域（１２９２±３４７／ｍｍ２）よりも有意に大きいことが明らかになった。
【００８６】
移植した自己由来の骨髄単核細胞の虚血になった心筋における検出
移植した細胞が注入部位で２週間後に生き残っているということは、ＰＫＨ標識法とカテーテルによる注入法が成功したことを示している（図１１ａ−図１１ｃ）。この結果は、骨髄単核細胞が新たな血管形成のプロセスに関与していることを示す。
本発明は、自己由来の骨髄単核細胞が虚血になった心筋にうまく移植されてその細胞が生き延び、新たな血管形成を促進し、心筋の血流を増大させることを示している。さらに、薬物負荷に対する心臓機能が改善されたことが、骨髄単核細胞の移植後に確認された。したがって、自己由来の骨髄単核細胞を移植することにより、虚血になった心筋における新たな血管形成が促進される。これは、アメロイド圧迫器によって誘導された心筋虚血からの機能回復が促進されたことと関係している。
【００８７】
本発明の方法では、内皮前駆細胞を精製せずに骨髄単核細胞を移植した。ヒトＥＰＣを単離するのに目印としてＣＤ３４とＫＤＲが以前は用いられたが（Ａｓａｈａｒａ Ｔ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９７年、第２７５巻、９６４−９６７ページ；Ｍｕｒｏｈａｒａ Ｔ．他、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、２０００年、第１０５巻、１５２７−１５３６ページ）、ヒトのＣＤ３４＋単核細胞とＣＤ３４−単核細胞を同時に培養すると、ＣＤ３４＋を単独で培養するよりもＥＰＣの数が増えることが最近報告された。さらに、以前のインビトロでの研究により、ＥＰＣが、ウサギの骨髄単核細胞およびヒトの臍帯血から発生することが示された（Ｍｕｒｏｈａｒａ Ｔ．他、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、２０００年、第１０５巻、１５２７−１５３６ページ；Ｓｈｉｎｔａｎｉ他、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００１年、第１０３巻、８９７−９０３ページ）。さらに、現在のところ、ブタで利用できるＣＤ３４に対する特異的抗体はない。それにもかかわらず、培養中にブタの骨髄単核細胞が直線状の紐のような構造とネットワーク構造を発生させた。これは、以前の研究でヒトおよびウサギのＥＰＣから発生した構造（Ａｓａｈａｒａ Ｔ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９７年、第２７５巻、９６４−９６７ページ；Ｍｕｒｏｈａｒａ Ｔ．他、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、２０００年、第１０５巻、１５２７−１５３６ページ；Ｓｈｉｎｔａｎｉ他、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００１年、第１０３巻、８９７−９０３ページ）と似ていた。
【００８８】
本発明では、カテーテルを利用して針で注入することにより、自己由来の骨髄単核細胞を局所的に移植した。カテーテルによる心内膜を横断した局所的供給には、外科手術が必要ないという同じ利点があり、注入した内容物は、外科的方法で心外膜を横断して注入した場合と同じくらい心筋に保持される（Ｇｒｏｓｓｍａｎ ＰＭ．他、Ｊ． Ａｍ． Ｃｏｌｌ． Ｃａｒｄｉｏｌ．、１９９９年、第３５巻（補Ａ）、８７０−８７１ページ、要約）。以前の研究では、成熟した動物での実験において、静脈内に輸液したＥＰＣが虚血組織内で新たな血管形成に関与した。しかし血管形成因子が静脈を通じて全身に供給されると、腫瘍や微小血管症などの血管形成疾患になりやすい他の組織、またはこうした血管形成疾患に関係した他の組織に好ましくない潜在的な効果が及ぶ可能性がある（Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、１９９５年、第１巻、２７−３０ページ）。局所的な供給だと、全身輸液と比べ、血管形成細胞または血管形成分子の持つ潜在的な副作用が全身に及ぶことが避けられる。
【００８９】
要するに、自己由来の骨髄単核細胞を移植すると、ブタの慢性虚血になった心筋に新たな血管が形成され、その結果として心臓機能が改善された。本発明は、ＰＴＣＡまたはＣＡＢＧの候補ではない冠状血管に関する心臓病患者に対する治療戦略として、臨床で自己由来の骨髄単核細胞を移植する方法をサポートする。
以上の説明と実施例では、本発明を実施するときに用いられる可能性のある特別な方法について詳しく説明した。当業者であれば、通常の技術を用いて本発明の開示内容を利用および／または変更することにより、同じ情報に到達する別の信頼できる方法を考案することができよう。しかし以上の説明と実施例は、本発明の全体的範囲を制限するものではなく、説明のために示してあると見なされるべきものである。この明細書で引用したすべての文献と出版物を、明示的に本出願に援用する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１ａ−図１ｉ。インビトロにおいてウサギの骨髄単核細胞から分化したＥＰＣ。骨髄単核細胞の培養開始から２４時間以内に細胞クラスターが出現した（図１ａ）。培養開始から３日以内に紡錘形のＡＴ細胞が出現し、直線状の紐のような構造（図１ｂ）と多数の細胞クラスターが形成された。細胞クラスターが互いに融合してより大きな１つの単層細胞を形成し（図１ｃ ）、それがネットワーク構造になった（図１ｄ）。ＡＴ細胞は、ＥＣ特異的なマーカー（ハリエニシダのレクチンの結合（図１ｅ）とｖＷＦ（図１ｆ））を発現した。紐のような構造の内部にあるＡＴ細胞（図１ｇ）は、ＤｉＩ−ａｃＬＤＬ（図１ｈ）を取り込んだ。ＡＴ細胞はＮＯも放出した。そのことは、ＤＡＦ−２ＤＡにより確認した（方法の項を参照のこと）（図１ｉ）。図１ｇ、図１ｈ、図１ｉは、顕微鏡の同じ視野である。Ｐｈａｓｅは、位相差顕微鏡写真を意味する。
【図２】
図２ａ−図２ｆ。移植した自己由来の骨髄単核細胞は、生体内で生き延び、毛細血管構造の形成に関与した。図２ａと図２ｄは位相差顕微鏡写真（Ｐｈａｓｅ）であり、骨格筋繊維（Ｍ）の横断切片を示している。同じ切片の蛍光顕微鏡写真（Ｆｌ）からは、蛍光標識した骨髄単核細胞（矢印）が筋細胞間の毛細管状ＥＣネットワークに組み込まれたことがわかった（図２ｂ）。しかし蛍光標識した骨髄繊維芽細胞は検出されなかった（図２ｅ）。隣りの切片では（図２ｃ）、蛍光陽性の骨髄単核細胞の大部分が、ＡＰ（矢印）でも染色された。これは、移植した細胞が生き延び、毛細血管構造の形成に関与したことを示している。その一方で、蛍光陽性の細胞とＡＰ陽性の細胞の間には空間的なずれがあった。これは、移植した骨髄繊維芽細胞が毛細血管構造に組み込まれなかったことを示している。図２ａ、図２ｂ、図２ｃのセットと、図２ｄ、図２ｅ、図２ｆのセットは、それぞれ、顕微鏡の同じ視野である。動物８匹（骨髄単核細胞）と５匹（骨髄繊維芽細胞）からの代表的な顕微鏡写真を示してある。棒は５０μｍを表わす。
【図３】
図３。虚血肢ＣＢＰ／正常肢ＣＢＰの比を、虚血になる前（０日目）、細胞移植の直前（７日目）、手術後である３５日目に調べた結果である。０日目と７日目には３つの群でＣＢＰの比に差がなかった。これは、肢部の虚血の程度が細胞移植前は３つの群で同じくらいだったことを意味する。しかし手術後である３５日目には、骨髄単核細胞群でＣＢＰの比が他の２つの群よりも大きくなった。
【図４】
図４ａ−図４ｂ。手術後である３５日目に得られた代表的な血管造影図である。対照の動物と、骨髄繊維芽細胞を移植したウサギでは、虚血になった大腿領域で副行血管が適度に形成されていることが観察された。しかし骨髄単核細胞を移植したウサギでは、多数の副行血管が観察された。図４ｂは、虚血になった後肢における血管造影スコアが、骨髄単核細胞群では他の２つの群よりも有意に大きくなったことを示している。
【図５】
図５ａ−図５ｂ。図５ａは、虚血になった骨格筋における組織学的断面の代表的な顕微鏡写真である。ＶＷＦとＡＰを用いた免疫組織学的染色により、骨髄単核細胞を移植したウサギに多数の毛細血管ＥＣが存在していることが明らかになった。しかし骨髄繊維芽細胞を移植した対照のウサギで観察された毛細血管ＥＣはこれよりも少なかった。Ｍは、骨格筋細胞を意味する。棒は５０μｍを表わす。図５ｂは、定量的分析により、虚血になった骨格筋組織において、毛細血管の密度（図５ｂ、左）が、骨髄単核細胞を移植した群では他の２つの群よりも有意に大きくなったことを示している。毛細血管／筋肉繊維の比（図５ｂ、右）も、骨髄単核細胞を移植した群では他の群よりも大きくなった。
【図６】
図６ａ−図６ｂ。図６ａは、代表的なＬＤＰＩである。骨髄単核細胞を移植したウサギでは、虚血になった大腿領域で大きな血液灌流シグナル（赤から白）が観察されたのに対し、骨髄繊維芽細胞を移植した対照のウサギではそれよりも小さな血液灌流シグナル（緑から青）が観察された。図６ｂは、コンピュータを利用してＬＤＰＩを分析することにより、虚血になった大腿領域における血液灌流値が骨髄単核細胞群において他の２つの群よりも有意に大きくなったことを示している。
【図７】
図７ａ−図７ｃ。インビトロでＥＰＣがブタの骨髄単核細胞から発生する様子を示している。ゼラチンで覆った板の上で培養した骨髄単核細胞は、付着細胞、紡錘形細胞へと生育し（図７ａ、倍率１００倍）、１４日間で直線状の紐のような構造と多数の細胞クラスターを形成した（図７ｂ、倍率４００倍）。細胞クラスターは融合してより大きな１つの単層細胞となり、それがネットワーク構造を形成した（図７ｃ、倍率１００倍）。
【図８】
図８ａ−図８ｂ。負荷心エコー図の局所壁運動スコアである。安静時と、基準時（すなわち安静時）において負荷をかけたときの両方とも、局所壁運動スコアの平均値は、対照群と治療群で差がなかった（図８ａ）。治療した１ヶ月後、薬物負荷を低投与量から高投与量へと増やしていくときに観察された運動低下は、対照ではまだ存在していた。それに対し、治療時に骨髄単核細胞を注入したブタでは、ドブタミンを低投与量にした場合と高投与量にした場合で壁運動スコアに差がなかった（図８ｂ）。骨髄単核細胞で治療したブタは、ドブタミンを高投与量にした実験において、治療後の追跡検査時には治療前と比べて有意な改善を示した（１．０２±０．０４：１．２７±０．１６；ｐ＜０．０２０）（図８ｂ）。
【図９】
図９。虚血領域における経壁心筋血流。治療前には、２つの群、すなわち対照群と骨髄単核細胞を移植した群の間で、心筋血流に有意な差はなかった。しかし治療した１ヶ月後、骨髄単核細胞を移植した群でだけ、心筋血流が基準値と比べて有意に増加した（０．３１±０．１４：０．６５±０．３５ｍｌ／分／ｇ、Ｐ＜０．０５）。この心筋血流値は、骨髄単核細胞を移植した群において対照よりも有意に大きかった。
【図１０】
図１０ａ−図１０ｂ。ＶＩＩＩ因子関連抗原（フォンビルブラント因子）の免疫細胞化学。虚血になった心筋から取得した組織学的断面の代表的な顕微鏡写真である。対照となる虚血領域（図１０ａ、倍率４００倍）と、骨髄単核細胞を移植した虚血領域（図１０ｂ、倍率４００倍）を示してある。
【図１１】
図１１ａ−図１１ｃ。骨髄単核細胞を移植してから２週間後にブタの心筋をＰＫＨ２６とＤＡＰＩで染色した結果である。ＰＫＨ２６染色（図１１ａ）、ＤＡＰＩ染色（図１１ｂ）、ＰＫＨ２６とＤＡＰＩによる染色（図１１ｃ）を示してある。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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