(57)【要約】天然デンプンの分解耐性特性を、測光方法を用いるイン・ビトロで試験する。デンプン分子の酵素分解によって形成された還元糖が、３，５−ジニトロ サリチラートと複合体を形成し、その濃度を分光法で測定し得る。該方法は、良好な精度および高い再現性を示す。得られる結果は、イン・ビボでの酵素分解挙動を予測するのに使用し得る。例えば、多様な天然デンプン製剤の分解プロファイルを予測することである（図４）。【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然デンプンの分解耐性を分析するための方法であって、この方法において、天然デンプンの予め決めた量を緩衝液中に縣濁し、デンプンを分解する物質を添加し、試薬を添加し、該試薬は還元糖の存在下で色素化複合体を形成し、これらの成分は試験溶液を形成するものであって、該試験溶液をデンプンのゼラチン化の温度以下でインキュベートし、デンプンの加熱処理または化学処理を先行さすことなく色の変化を検査することを特徴とする方法。
【請求項２】
− 使用される緩衝液が、約中性のｐＨを持ち、約０．０１Ｍ 塩化物イオンを含有し、
− αアミラーゼをデンプン懸濁液に添加し、
− 試験溶液を約３５℃−約７０℃の間にある温度でインキュベートし、
− 試料を、試験溶液から採取し、濾過し、次いで試薬と混合し、そして
− 試験溶液の色の変化を、時間関数として測定すること、
を特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
− 使用される緩衝液が約６．６のｐＨを持ち、
− 試験溶液を約３７℃−約４２℃の間にある温度でインキュベートし、
− 吸光度を、４５０〜５００ ｎｍ のインターバルの波長をスキャンすることによって測定し、最高値で測定されたその吸光度は、このインターバル内で生じること、
を特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
試薬が３，５−ジニトロ サリチラートであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
試薬溶液を使用前に濾過することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
既知のフラクションの無処理顆粒の酵素分解特性を、比較目的に使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
種々のデンプンのフラクションを、酵素分解に耐え得るそれらの能力について比較することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
種々のデンプン製剤を、酵素分解に耐え得るそれらの能力について比較することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
得られる値を使用して、イン・ビボでのデンプンの酵素分解挙動を予測することを特徴とする、 請求項６〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
得られる値を使用して、イン・ビボでのデンプンの酵素分解プロファイルを予測することを特徴とする、請求項６〜８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、天然デンプンの分解に対する耐性を測定するため、および哺乳動物の胃腸管内における天然デンプンの消化速度または消化プロファイルを−イン・ビトロ試験によって−正確に予測するための方法に関する。
【０００２】
本発明の背景
デンプンは、植物における主要な貯蔵多糖、炭水化物の重要な源および食品中の成分である。ヒトによって摂取される炭水化物の半分以上はデンプンである。また、デンプンは、多くの工業的用途を持ち、産生される大量のデンプンがその役をはたしている。例としては、製紙産業におけるサイズ剤、プラスチック製造や繊維産業などにおける原料および／または添加剤、医薬産業における担体およびバルク剤としての使用が含まれる。加熱処理（例えば、煮沸）の場合、デンプン顆粒が崩壊し、そして、デンプンが溶解され、ゼラチン化される。顆粒サイズ２−３２μｍからなるコーンスターチは、主に２成分、アミロースおよびアミロペクチンを含む。アミロースは直鎖構造であるが、アミロペクチンは分鎖である。アミロースおよびアミロペクチンの両方とも、α−（１，４）−結合グルコース残基を含み、またアミロペクチンはα−（１，６）−結合グルコース残基も含む。
【０００３】
デンプン顆粒は、冷水に不溶性であり、温水中で膨張する。膨張は、温度が約５５〜６５℃に達するまでは可逆的である。この温度で、デンプン顆粒はゼラチン化し、それらの結晶構造を失う。次いで、ゼラチン化デンプンは、胃腸管内に存在する消化酵素によって、主にα−アミラーゼの作用によって、容易に分解される。ヒトにおいて、α−アミラーゼは唾液および小腸中に存在する。
【０００４】
イン・ビボおよびイン・ビトロの両方において、デンプンの消化性は、デンプンの起源、さらにその予備処理（例えば、天然、細かさ／荒さ、ゼラチン化または化学的に修飾されたもの）に依存する。本発明の詳細な説明、請求の範囲および実施例において、用語「天然デンプン」は、加熱処理や化学的処理を受けなかったデンプンを定義するのに使用する。即ち、用語「天然デンプン」は、野菜および／または植物種子（仁または穀粒）の両方を含み、また化学的に処理されたフラクション、例えば製粉にし、ふるい分けした顆粒および穀粉も包含する。
【０００５】
しかし、天然デンプンは、非常にゆっくりとヒトの胃腸管内で分解される。これは、デンプン顆粒の３次元形態に由来するものであり、酵素がデンプン分子の炭素鎖に接近することを困難にさせる。
【０００６】
（従来技術）
Ｐｅｔｅｒ Ｂｅｒｎｆｉｅｌｄ （Ａｍｙｌａｓｅ α ａｎｄ β， Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ １， ｐａｇｅ １４９−１５８， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９５５）らは、溶液中のマルトースの光学的測定に使用される試薬として、３，５−ジニトロサリシル酸を用いるアミラーゼアッセイを記述している。
【０００７】
デンプン分解を分析する方法は、Ｒｏｂｅｒｔ Ｌ． Ｂｒｕｎｅｒ （Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｖａｌｕｅ， ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９６４， ｐａｇｅｓ ６７　７１）によって開示され、以来、多かれ少なかれ標準的な方法とされている。α−アミラーゼの作用による煮沸デンプンの分解は、酵素添加後のデンプン懸濁液中の還元糖濃度として、測定される。規則正しいインターバルで採取した試料、および還元糖、例えばグルコースおよびマルトースは、試薬と反応し、この吸光度は、光学的好ましくは分光学的に測定される。次いで、酵素分解は、インキュベーション時間の関数として糖濃度でプロットされる。しかし、この方法は、多くの欠点、例えば、低い再現性、満足のいかない正確性を有する。
【０００８】
Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｇ． Ｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ． （Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｒｃｈ： Ｉｔｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｆｏｒｍ Ｉｎ Ｆｏｏｄｓｔｕｆｆｓ ａｎｄ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ Ｄｉｇｅｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ， ｉｎ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２８ （１９８８） ９７−１０９）らは、エンドウマメ、大豆、小麦およびポテト由来の生デンプンおよびゼラチン化デンプンに関するイン・ビトロでの加水分解耐性を研究した。
【０００９】
Ｊａｎｅ Ｇ． Ｍｕｉｒ ａｎｄ Ｋｅｒｉｎ Ｏ’Ｄｅａ （Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ Ｓｔａｒｃｈ ｔｈａｔ ｅｓｃａｐｅｓ ｄｉｇｅｎｔｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｍａｌｌ ｉｎ ｔｅｎｔｉｎｅ ｏｆ ｈｕｍａｎｓ， ｉｎ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ， １９９３； ５７：５４０−６）らは、回腸造瘻（フィステル形成）に罹患している８人の患者におけるゼラチン化デンプンの消化を、回腸造瘻排出物中に残っている未消化量を測定することによって研究した。
【００１０】
上記の従来技術文献は、試料を同時に変性（故意であってもなくても）させないで天然デンプンの分解に対する耐性を測定するための、哺乳動物の胃腸管内における天然デンプンの消化速度または消化プロファイルを−イン・ビトロ試験によって−正確に予測するための、完全に満足のいく、正確な、そして有用な方法には到達できていない。
【００１１】
本発明の要約
驚くべきことに、我々は、請求の範囲に記載の分析方法を用いると、天然デンプンの分解耐性をより正確に測定し得ることを見出した。本発明の方法は、種々のデンプンの型、種々のデンプンのフラクションまたは種々のデンプン製剤を比較するために使用し、イン・ビボでの分解耐性特性、例えば、種々のデンプン製剤に対する消化プロファイルを予測するために有利に用いる。
【００１２】
（図面の簡単な説明）
本発明は、下記の説明および実施例、添付の図面においてより詳細に開示する。
図１は、非濾過試料（破線）と比較した濾過試料（実線）についての種々の放出プロファイルを示す。
図２は、反応緩衝液中に０．０１Ｍ ＮａＣｌを含むもの（実線）と、ＮａＣｌを含まないもの（破線）について、無処理コーンスターチの放出プロファイルを示す。
【００１３】
図３は、無処理の天然コーンスターチと比較した種々のデンプン製剤に関する放出プロファイルを示す。ここで、エチルセルロース（１０％）による顆粒化コーンスターチは記号（Ｏ）、エチルセルロース（２０％）による顆粒化コーンスターチは（△）、グアーガム（２０％）による顆粒化コーンスターチは（＋）、無処理コーンスターチは （×）をつける。
図４は、図３の製剤に関するイン・ビトロとイン・ビボ挙動との相関関係を示す。記号は同じである。
【００１４】
（詳細な説明）
本発明者らは、天然デンプンの分解耐性特性または消化挙動を分析するための新規方法の利用を可能にした。この方法は、天然デンプンの予め決めた量を緩衝液中に縣濁し、デンプンを分解する物質を添加し、還元糖と色素化複合体を形成する試薬を上記混合物から採取した試料に添加し、次いで形成した色について検査または測定を行う。好ましくは酵素を、最も好ましくはαアミラーゼを、デンプン分解物質として用いる。好ましくは、３，５−ジニトロ サリチラートを、試薬として使用する。
【００１５】
本方法の特定の特徴は、下記工程を包含する：
− 緩衝液を調製する、この緩衝液は、約中性のｐＨ（約ｐＨ５−ｐＨ９もしくは約ｐＨ６．６が好ましい）を持ち、少量の塩化物イオン、好ましくは約０．０１Ｍ 塩化物イオンを含有する、
− 試験溶液をデンプンのゼラチン化の温度以下でインキュベートする、
− 試料を試験溶液から採取し、濾過し、試薬を混合する、
− 吸光度を検査する、好ましくは分光法、特に波長インターバル内４５０〜５００ ｎｍをスキャンすることによって測定し、この吸光度をインターバル内で生じる最高値で決定する。
【００１６】
この方法は、酵素分解の耐性能に関して天然デンプンの種々のフラクションを比較するために使用するのが好ましい。また、この方法は、酵素分解の耐性能に関して種々のデンプン製剤を比較するために使用し得る。重要なことは、本発明の方法が、胃腸管内におけるデンプンの自然消化を刺激し、得られる値を、イン・ビボでのデンプンの酵素分解を確実に予測するために使用し得ることである。
【００１７】
本発明に従って、試薬溶液は、３，５−ジニトロ サリチラートをＮａＯＨ水溶液に溶解することによって調製する。試薬溶液は、暗所に貯蔵し、使用前に濾過する。これは、試薬溶液中で形成しやすい沈殿を除去するという利点がある。本発明の実施態様において、試薬溶液は、容器、例えば試験チューブに試薬を添加すると同時に濾過する。本発明の実施態様において、試薬溶液を濾過する場合、０．４５μｍフィルターを通す。アルカリ試薬溶液は、酵素変性によって、酵素活性を停止するさらなる利点を持つ。
【００１８】
さらに本発明に従って、緩衝溶液を、ＫＨ２ＰＯ４およびＮａＯＨを水に溶解して、ｐＨを約中性、約ｐＨ５〜約ｐＨ９、好ましくは約ｐＨ６．６に調整することによって調製した。次いで、ＮａＣｌを、塩化物イオン濃度が０．０１Ｍになるまで添加した。驚くべきことに、塩化物イオンは、酵素を活性化し、急勾配放出プロファイルに導くので、分析には非常に有益であることがわかった。これは重要な利点である、というのも分析を行うために要する時間を短縮し得るからである。ＮａＣｌの添加に関する効果については、図２を参照されたい。
【００１９】
通常、酵素は過剰添加するが、我々は、酵素が分光測定と干渉しあう可能性のある酵素自身の吸収を持つので、添加した酵素量が、重要なファクターであることを示す。本発明に関して、酵素は、４ＩＵ／ｍｇ 糖にほぼ一致する量を添加する。
【００２０】
選択される酵素は、菌類、細菌または動物起源のα−アミラーゼである。商業的には、利用し得るα−アミラーゼに４つの型がある：膵臓 （ｐｏｒｃｉｎｅ）、菌類、細菌（常温）および細菌（高温度）。適当な酵素の提供者には、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｐａｎｙ， ＵＳＡ （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅによりつくられる菌類性α−アミラーゼ）， Ｄｅｅｒｌａｎｄ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， ＵＳＡ （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓによりつくられる菌類性α−アミラーゼ）がある。
【００２１】
試料、分析すべき予め決めた量のデンプンを、緩衝液に縣濁し、試料−緩衝液を含有する容器をインキュベーション浴に置く。本発明に従って、試料を、デンプンのゼラチン化の温度以下；１５℃−７０℃、好ましくは約３５℃−７０℃の間の温度、最も好ましくは約３７℃−約４２℃、例えば、３７℃±０．５℃でインキュベートする。これは、室温で行った従来法よりも正確に胃腸管内における温度を擬態するだけでなく、酵素作用を促進させ、所要時間を短縮して測定を行える、追加の価値を示す。注目すべきことは、ほとんどの酵素が、我々により最も好ましいとして選択された温度を超える至適温度を示す。酵素活性の低下は代わりに、他のパラメーター、例えば、ＮａＣｌの添加、インキュベーション時間、試料の濾過などを調整することによって補償する。
【００２２】
本方法によれば、試料は、時間「ゼロ」、即ち、酵素溶液の添加前に採取する。「ブランク」または「０分間」のものを、試薬と水の混合物から採取する。さらに、全ての成分； 緩衝液、試薬、酵素およびデンプンを含有する試料を、デンプンの添加直後、酵素添加約１〜２０分間後に採取する。好ましくは、この試料を、酵素添加２−１０分間後に、最も好ましくは５分間後に採取する。これは後記の実施例において、「５分間試料」 という。別の試料を、予め決定したインターバル、酵素添加後、例えば、１０、２０、３０および４５分間、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間および４時間のインターバルで採取する。明らかに異なるインターバルを、試験目的によって選択することができる。同様に、この研究は、４時間、例えば、８、１０または１２時間またはそれ以上長く続けてもよい。
【００２３】
本発明の方法の実施態様に従って、特に実験室的または工業的な使用に適当な方法に従って、「ブランク」または「０分間」試料を、試薬と緩衝液のみを混合し、最初に採取する。デンプン試料を添加する。平衡化の数分間後、「０分間」試料を採取する。「０分間」試料は、デンプン試料が、短い糖鎖、例えば、グルコースおよびマルトースを含有するかどうかを示す。緩衝液および酵素は、別の容器内で混合する。ブランク試料を採取する。デンプン試料を添加し、時間推移の計測を始める。さらなる試料は、予め測定された時点、例えば、９０分間で採取する。種々の時点は、試験目的によって選択できる。同様に、試験を、９０分間以上、例えば、８、１０または１２時間またはそれ以上長く続けてもよい。
【００２４】
本発明の好ましい実施態様に従って、試料アリコートを、吸光度を検査または測定する前に濾過する。好ましくは、試料を、０．８μｍフィルターにより濾過する。濾過の効果については図１を参照されたい。驚くべきことに、濾過は、測定の精度を著しく改善することがわかった。
【００２５】
実施態様に従って、各吸光度測定を波長インターバル４５０−５００ｎｍにわたるスキャン形態で行い、吸光度の最高値を測定する。吸光度のリーディングは最高値でとる。これは、従来測定法、例えば、唯一固定された測定波長、例えば５９０ｎｍを用いる分析法に勝る顕著な改良点を構成する。本発明は、スキャン、その後の吸光度最高値での測定を包含し、精度および再現性を改善する。測光法は、試料がモノおよびジサッカライドから巨視的なデンプンのフラグメントまでの多様な範囲の化合物を含有するので、間違いおよび不正確さの数多くの元になると認識されるべきである。我々によって導入されたスキャン工程は、これらの間違いの根源を克服し、改善された信頼性を提供する。
【００２６】
天然コーンスターチ顆粒に対する分解プロファイルを標準として使用する。検査の目的に応じて、どのようなデンプンフラクションでも、標準としてまたは比較目的に、使用し得る。図３は、比較を示すもので、３つの異なるデンプン組成物の放出プロファイルを、同じ条件下で無処理コーンスターチについて得られる放出プロファイルと共に、同じ図に示す。
【００２７】
本発明の利点は、下記に限定するものではないが、分析の容易な手順および良好な種々の再現性および信頼性を包含する。さらに、本発明の方法は、種々の型のデンプン、同じ種内の種々のフラクションおよび／または品質のものの消化性について実際的な実験に非常に適している分析方法を提供する。さらに、本発明は、実際のイン・ビトロ方法を構成し、この結果は、図４に見られるように、イン・ビボで得られる結果と密に相関する。
【００２８】
実施例
実施例１： ４時間にわたる分析
試薬を、３，５−ジニトロ サリチラート（２．００ ｇ， Ａｌｄｒｉｃｈ）をＮａＯＨ （７０ ｍｌ， １Ｍ）水溶液に溶解することによって調製した。所望により、該混合物を、透明な溶液の形成を促進するために加熱した。冷却するために、水を１００ ｍｌ添加した。試薬溶液を、暗所で貯蔵し、可能な沈殿物を除去するために、使用前に０．４５ μｍ フィルターをとおして濾過した。
【００２９】
試薬溶液を、下記の試験チューブ中に等量（２ ｍｌ）添加した。「対照」、「ゼロ」、「５分間」、「１０分間」、「２０分間」、「３０分間」、「４５分間」、「１時間」、「１．５時間」、「２時間」、「２．５時間」、「３時間」、「３．５時間」および「４時間」である。試験チューブは分析を待つ間氷浴中に置いた。
【００３０】
緩衝溶液（ｐＨ ６．６）を、ＫＨ２ＰＯ４ （２５０．０ ｍｌ， ０．２０Ｍ， Ｓｉｇｍａ）とＮａＯＨ（８９．０ ｍｌ， ０．２０ Ｍ）を混合し、水を全体積１０００ｍｌになるまで添加してつくった。次いで、ＮａＣｌ（０．５８ ｇ， Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ Ｈａｅｅｎ）を添加し、０．０１Ｍの塩化物濃度をつくった。
【００３１】
本発明の実施態様に従って、既知のフラクションの無処理または天然のデンプン顆粒の酵素分解特性を、比較目的のために使用した。既知のフラクションの好ましくは天然または無処理コーンスターチ顆粒を使用した。
【００３２】
検査しようとするデンプンの正確な量 （この実験で４．０ ｇ）を測定し、上記緩衝液中に縣濁し、分解浴中に置いた。分解浴は、３７℃±０．５℃の温度で保ち、５０ｒｐｍｓの速度で攪拌した。本実施例において、４．０ｇの無処理コーンスターチ（Ｍａｉｚｅｎａ， Ｂｅｓｔｆｏｏｄ Ｎｏｒｄｉｃ ＡＢ）を用いた。
【００３３】
１５０００ ＩＵ αアミラーゼ （Ｔｙｐｅ ＶＩ−Ｂ ｆｒｏｍ ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｓ， Ｓｉｇｍａ）に相当する量を測定して、分解浴中の緩衝液に縣濁した。酵素溶液の添加前に、分解浴の試料を「時間０」時の糖濃度を測定するために採取した。試料を、０．８μｍ フィルターをとおして濾過し、アリコート（２ｍｌ）を試験チューブ「ゼロ」にピペットで採取した。同じフィルターを、一連の操作をとおして使用してよい。試料を短時間に煮沸し（５分間）、氷浴中に静置する。酵素溶液を、分解浴に添加し、時間を記録した。次いで、試料を、予め定めたインターバル（例えば、時間は、試験チューブに記載しておく）で採取した。対照を、試薬（２ｍｌ）および水（２ｍｌ）を５分間沸騰させて、氷浴中に試料を入れて調製した。
【００３４】
各試料について、吸光度を４５０−５００ｎｍにわたってスキャンし、ピークの高さを、各吸光度の最高値に対して登録する。天然デンプンにおける遊離の糖（ＦＳ０）の濃度を測定するために、試料「ゼロ」の吸光度は、緩衝液および試薬、対照（または 「０分間ブランク」）試料のバックグラウンドに対して測定する。試料および対照の両方は、１１．６ ｍｌの水を４００μｌ試料に添加することによって稀釈する。反応し稀釈された試料溶液は安定ではない（３時間の間０．１〜０．２の吸光度ユニット示度目盛が低い）ため、全試料をＵＶ−分光分析の直前に稀釈した。
【００３５】
試料中に存在する遊離の非顆粒化デンプン（酵素に容易に接近しやすい）の図を得るために、「５分間」試料を、対照として同じような方法で分析した。この測定により、試薬と煮沸した酵素が反応した還元糖とほぼ同じ波長で光を吸収するので、分解浴における酵素量の指標を得る。この後、「５分間」試料は、天然デンプン顆粒の遅い分解についてのバックグラウンドとして使用した。この一連の試料を、対照および「ゼロ」試料、即ち１１．６ ｍｌとして、同じような方法で稀釈し、水を４００μｌ試料に添加した。
【００３６】
実施例２：２つの測定値を基にした分析
実施例１の方法を、下記修飾を行い反復した：
試薬溶液を、「０分間」、「０分間ブランク」、「９０分間」および「９０分間ブランク」として、試験チューブに等量添加した。試験チューブを、分析を待つ氷浴中に置いた。
０分間試料について、試料を消化浴における緩衝液媒体から採取した。試料を、濾過し、上記のような試薬と反応させた。ブランク試料をデンプン試料の添加前に採取した。
【００３７】
試料および対照の両方を、８．７ｍｌの水を３００μｌの試料に添加して稀釈した。天然デンプン顆粒のゆっくりとした分解についてのバックグラウンドとして「９０分間ブランク」試料を使用した。この一連の試料を、「０分間」および「０分間ブランク」試料と同じような方法で稀釈した。即ち８．７ｍｌ の水を３００μｌの試料に添加した。
【００３８】
所望により、「対照」および「ゼロ」のリーディングは、バックグラウンドの測定および／または完全な分解プロファイルを得るために使用してもよい。
【００３９】
稀釈した時に、反応した試料が安定性を失うので、測光測定器がバックグラウンドスキャンを貯蔵する能力を持つのでなければ、全ての試料について稀釈と分析を連続して行うべきである。しかし、稀釈していない試料は数時間安定である。
【００４０】
次いで、測光測定器リーディングの結果は、試料時間の関数として、吸光度をプロットする。その代わりに「スライディング」平均を用いてもよい。この後者の方法を用いると、最も接近した前、そして次ぎの座標（時間、吸光度）が平均され、新しい点を新しい座標で導入する。この方法によって、回帰直線に関係する結果の分散が低下し、直線の方程式における変化が、無視できる程度に小さくなった。
【００４１】
図１では、放出プロファイルの回帰が非濾過試料（破線）と比較して濾過試料（実線）についてどのように改良されたかを示す。試料を０．８μｍフィルターで濾過した。残る実験プロトコールは同一である。
【００４２】
図２において、少量の塩化物イオンは（この場合０．０１Ｍ）の存在における放出プロファイル（実線）は、塩化物非存在下での分解についてプロットしたプロファイル（破線）よりも急勾配であることが明らかである。例示方法は上記と同じであった。
【００４３】
図３は、天然コーンスターチ（Ｍａｉｚｅｎａ， Ｂｅｓｔｆｏｏｄ Ｎｏｒｄｉｃ ＡＢ）と比較した種々のデンプン製剤についての放出プロファイルを示す。この図において、エチルセルロース（１０％）中でカプセル化されたコーンスターチに対する値は記号（Ｏ）で、エチルセルロース（２０％）でカプセル化されたコーンスターチは（△）で、グアーガム（２０％）でカプセル化されたコーンスターチは（＋）で そして無処理コーンスターチの値は（×）である。
【００４４】
図４において、上記試験製剤に関するイン・ビトロとイン・ビボ挙動の良好な相関関係を示す。印は同じものである。
【００４５】
イン・ビボ挙動を、標準的技術に従って正常グルコース耐性を有する４人の健康なやせ型のボランティア（３５〜４５歳）における血液グルコース応答反応を測定することによって決定した。この技術に関する 「ゴールデン・スタンダード」に従って、各物質を各ボランティアについて２回試験し、平均値を計算した。物質を少なくとも１日おいてランダムな順番で試験した。さらに、その試験は、厳密な標準化した条件下で行った。被験者に朝に研究室にきてもらい、１０時間絶食させた。これは、身体的活動を試験直前と試験中に避けるためである。被験者に、試験中、０、３時間に、２回、炭水化物（水、茶またはコーヒー）を含まない約２ｄｌ液体を飲むことを許容した。
【００４６】
毛細血液グルコースレベルを、グルコース測定値のための、Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ ＤＥＸ （Ｂａｙｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ ＡＢ）、次いで標準的な方法を用いて、毛細血液試料（ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｉｃｋｉｎｇ）で測定した。ベースラインでは、３回の連続的な血液グルコース測定を行い、０時間での安定なベースラインを確実にした。その後、試験物質（２０．０ ｇ）を、５分間以内に、標準的な水の量と共に摂取した。全液体は、慎重に計算して各々摂取量と同じにし、胃腸管からの遷移時間内での誤差を避けた。血中グルコースの測定を、０．５、１．０、１．５、２．０、３．０および４．０時間で反復した。
【００４７】
本発明の分析方法を用いてデータを収集することによって、標準曲線を作成でき、少ない測定値を基にする後日の評価および予測が可能になる。
【００４８】
本発明を、その好ましい実施態様に関して説明してきた。この態様は、発明者に現在知られている最良の様式を構成するものであるが、当技術分野における当業者には明白であるような多様な変化および修飾を、本明細書に添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲から逸脱することなく、なし得ると解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、非濾過試料（破線）と比較した濾過試料（実線）についての種々の放出プロファイルを示す。
【図２】図２は、反応緩衝液中に０．０１Ｍ ＮａＣｌを含むもの（実線）と、ＮａＣｌを含まないもの（破線）について、無処理コーンスターチの放出プロファイルを示す。
【図３】図３は、無処理の天然コーンスターチと比較した種々のデンプン製剤に関する放出プロファイルを示す。
【図４】図４は、図３の製剤に関するイン・ビトロとイン・ビボ挙動との相関関係を示す。記号は同じである。
【図１】
2004512526.tif 000002
【図２】
2004512526.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年12月19日(2002.12.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然デンプンの分解耐性をイン・ビトロで分析するための方法であって、この方法において、天然デンプンの予め決めた量を緩衝液中に縣濁し、デンプンを分解する物質を添加し、試薬を添加し、該試薬は還元糖の存在下で色素化複合体を形成し、これらの成分は試験溶液を形成するものであって、該試験溶液をデンプンのゼラチン化の温度以下でインキュベートし、デンプンの加熱処理または化学処理を先行さすことなく色の変化を検査し、そしてイン・ビボでの酵素分解挙動を予測することを特徴とする方法。
【請求項２】
− 使用される緩衝液が、約中性のｐＨを持ち、約０．０１Ｍ 塩化物イオンを含有し、
− デンプンを分解する物質がαアミラーゼであり、
− 試験溶液を約３５℃−約７０℃の間隔にある温度でインキュベートし、
− 試料を、試験溶液から採取し、濾過し、次いで試薬と混合し、そして
− 試験溶液の色の変化を時間関数として測定する、
、請求項１記載の方法。
【請求項３】
− 使用される緩衝液が約６．６のｐＨを持ち、
− 試験溶液を約３７℃−約４２℃の間にある温度でインキュベートし、
− 吸光度を、４５０〜５００ ｎｍ のインターバルの波長をスキャンすることによって測定し、最高値で測定されたその吸光度は、このインターバル内で生じる、、請求項１記載の方法。
【請求項４】
試薬が３，５−ジニトロ サリチラートである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
試薬溶液を使用前に濾過する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの既知フラクションの無処理顆粒の酵素分解特性を、種々のフラクションを酵素分解に耐え得るそれらの能力について比較するために使用する、請求項１記載の方法。
【請求項７】
種々のデンプン製剤を、酵素分解に耐え得るそれらの能力について分析および比較する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
得られる値を使用して、イン・ビボでのデンプンの酵素分解プロファイルを予測する、請求項１記載の方法。
【国際調査報告】
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