(57)【要約】硝子軟骨、線維軟骨および弾性軟骨等の軟骨の疾患、またはそのような軟骨が見出される組織の疾患（例えば喉頭、耳道、椎間円板、靭帯、腱、および関節包を冒す疾患もしくは障害）、骨粗鬆症を含む骨成長に影響を及ぼす疾患、関節破壊を伴う疾患、ならびに関節リウマチおよび変形性関節症と関連する疼痛の治療計画を策定する上での、ＶＲ４ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟骨および／もしくは骨の疾患を治療するための医薬またはそれらの疾患に伴う疼痛を治療するための医薬を製造するための、以下の（ａ）〜（ｄ）から選択される化合物の使用。
（ａ） ＶＲ４ポリペプチド、
（ｂ） ＶＲ４ポリペプチドの活性をモジュレートする化合物、
（ｃ） ＶＲ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
（ｄ） ＶＲ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンスポリヌクレオチド
【請求項２】
前記疾患が、喉頭、耳道、椎間円板、靭帯、腱および関節包を冒す疾患、または骨粗鬆症を含む骨成長と関連する疾患、または関節破壊を伴う疾患である、請求項１記載の使用。
【請求項３】
関節破壊を伴う疾患が、関節リウマチまたは変形性関節症である、請求項２記載の使用。
【請求項４】
疼痛が、関節リウマチまたは変形性関節症と関連するものである、請求項１記載の使用。
【請求項５】
ＶＲ４ポリペプチドの活性をモジュレートする化合物がアゴニストである、請求項１〜４のいずれか１項記載の使用。
【請求項６】
ＶＲ４ポリペプチドの活性をモジュレートする化合物がアンタゴニストである、請求項１〜４のいずれか１項記載の使用。
【請求項７】
前記化合物が、配列番号２のＶＲ４ポリペプチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドを含んでなるＶＲ４ポリペプチドである、請求項１〜４のいずれか１項記載の使用。
【請求項８】
前記化合物が配列番号２のＶＲ４ポリペプチドである、請求項７記載の使用。
【請求項９】
前記化合物が、配列番号２のアミノ酸配列との間で少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の使用。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１のポリヌクレオチドとの間で少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドを含んでなる、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１のポリヌクレオチド配列を有する、請求項９または１０記載の使用。
【請求項１２】
請求項７で規定したポリペプチドの機能またはレベルを刺激もしくは阻害する化合物を同定するためのスクリーニング方法であって、以下の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ） 候補化合物の前記ポリペプチドもしくはその融合タンパク質に対する結合性を、該候補化合物に直接的または間接的に結合させた標識を用いて、定量的もしくは定性的に測定または検出すること、
（ｂ） 候補化合物の前記ポリペプチドもしくはその融合タンパク質に対する結合の競合性を、標識した競合物質の存在下で測定すること、
（ｃ） 候補化合物が、前記ポリペプチドの活性化または阻害により生成されるシグナルをもたらすか否かを、前記ポリペプチドに好適な検出系を使用して試験すること、または
（ｄ） 候補化合物を請求項２または４に記載のポリペプチドを含有する溶液と混合して混合物を作製し、該混合物中の該ポリペプチドの活性を測定し、さらに該混合物についてのその活性を、候補化合物を含有しない対照混合物と比較すること、
からなる群より選択される手法を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明は、ポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの新規用途、特に治療におけるそれらの使用ならびに治療上有用でありうるアゴニスト、アンタゴニストおよび／またはインヒビターである化合物を同定する上でのそれらの使用に関する。
【０００２】
発明の要旨
１つの態様において、本発明はバニロイド４受容体（本明細書では、以下、ＶＲ４）ポリペプチドの新規な用途に関する。そのような用途としては、硝子軟骨、線維軟骨および弾性軟骨等の軟骨の疾患、またはこれらの軟骨が見出される組織の疾患の治療において有用な化合物の同定や開発が挙げられる。そのような疾患の例としては、限定するものではないが、喉頭、耳道、椎間円板、靭帯、腱、関節包を冒す疾患もしくは障害、または骨粗鬆症を含む骨成長に影響を及ぼす疾患が含まれる。特に本発明は、関節破壊を伴う疾患、および関節リウマチおよび変形性関節症と関連する疼痛にも関係する。これらの疾患徴候を、本発明では「本発明に係る疾患」と称する。さらなる態様においては、本発明は同定された化合物を用いてＶＲ４の不均衡または突然変異と関連する病的状態を治療する方法に関する。なおさらなる態様においては、本発明は不適切なＶＲ４活性またはレベルと関連する疾患もしくは障害を検出するための診断アッセイに関する。
【０００３】
発明の説明
近年になってヒトＶＲ４をコードするｃＤＮＡが報告された（特許出願番号ＥＰ２０２３５２．１ ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ； Ｓｔｒｏｔｍａｎｎ， Ｒ．ら （２０００） Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２： ６９５−７０２）。ＶＲ４はバニロイド受容体１と類似する推定上の構造を有しており、アンキリンリピートを含有するＮ末端ドメイン、６回膜貫通ドメインおよび５番目と６番目の膜貫通ドメインの間に存在する推定上のポア・ループを備える。ヒトＶＲ４遺伝子のスプライス変異体に対応する様々なｃＤＮＡが報告されており、例えばＤｅｌａｎｙ， Ｎ．Ｓ．ら， （２０００） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １２： ｓｕｐｐｌ． １１， １３４．１０ ｐ．３０６に記載されているが、彼らは膵臓、前立腺、胎盤、および気管におけるＶＲ４の発現も報告している。さらに、ヒトＶＲ４に相同な領域を含む種ホモログが知られており、例えばＳｕｚｕｋｉ， Ｍ．ら， （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５： ２７５６−２７６２に記載されたものがある。
【０００４】
本発明は、関節軟骨において、試験した様々な他の組織におけるレベルよりも有意に高いレベルでＶＲ４が発現されるという驚くべき知見に基づいている。さらに、単離された軟骨細胞は、ＶＲ４ ｍＲＮＡの発現を異例の高レベルで示すことが判明している。本発明は、軟骨を冒す疾患の治療におけるＶＲ４ポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用に関する。本発明のポリペプチドは、そのような治療において直接使用することもできるし、そのような治療に有用な化合物を同定するためのスクリーニングにおいて使用することもできる。
【０００５】
従って、第１の態様において、本発明は、軟骨および／または骨の疾患の治療のための、あるいはそれらの疾患と関連する疼痛の治療のための医薬を製造するための、以下の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ） ＶＲ４ポリペプチド、
（ｂ） ＶＲ４ポリペプチドの活性をモジュレートする化合物、
（ｃ） ＶＲ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
（ｄ） ＶＲ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンスポリヌクレオチド
から選択される化合物の使用に関する。
【０００６】
そのような軟骨の疾患としては、硝子軟骨、線維軟骨および弾性軟骨等を冒す疾患、またはそのような軟骨が見出される組織の疾患、例えば喉頭、耳道、椎間円板、靭帯、腱、関節包を冒す疾患もしくは障害が挙げられる。骨の疾患としては、骨粗鬆症を含む骨成長の疾患が挙げられる。
【０００７】
好適な実施形態においては、本発明に係る疾患は、関節破壊を伴う疾患であり、好ましくは関節リウマチまたは変形性関節症である。
【０００８】
さらに好適な実施形態においては、本発明に係る疾患は、関節破壊を伴う疾患（好ましくは関節リウマチおよび変形性関節症）と関連する疼痛に関する。
【０００９】
ＶＲ４ポリペプチドの活性をモジュレートする化合物としては、ＶＲ４ポリペプチドを活性化する化合物、およびＶＲ４ポリペプチドの活性を阻害する化合物が含まれる。
【００１０】
本発明において、医薬の製造において直接的に使用されるか、または例えばＶＲ４活性のモジュレーターを同定するためのスクリーニングにおいて、間接的に使用されるかのいずれかであるＶＲ４としては、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチドが含まれる。そのようなポリペプチドには、配列番号２のアミノ酸を含んでなるものが含まれる。
【００１１】
さらにＶＲ４ポリペプチドには、単離されたポリペプチドであって、そのアミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有する、前記ポリペプチドが含まれる。このようなポリペプチドには、配列番号２のポリペプチドが含まれる。
【００１２】
さらには、ＶＲ４ポリペプチドとしては、配列番号１に含まれる配列を含んでなるポリヌクレオチドによってコードされる単離されたポリペプチドを含む。
【００１３】
ＶＲ４ポリペプチドは「成熟」タンパク質の形態であっても、前駆体または融合タンパク質のようなより大きいタンパク質の一部であってもよい。しばしば、追加のアミノ酸配列を含めることが有利であり、このようなアミノ酸配列としては、分泌配列すなわちリーダー配列、プロ配列、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、または組換え体産生の際の安定性を確保する付加配列などがある。
【００１４】
ＶＲ４ポリペプチドは任意の適当な方法で製造することができる。このようなポリペプチドには、単離された天然のポリペプチド、組換え的に生産されたポリペプチド、合成的に製造されたポリペプチド、またはこれらの方法の組合せにより製造されたポリペプチドが含まれる。こうしたポリペプチドを製造するための手段は当技術分野ではよく理解されている。
【００１５】
組換え手法によってＶＲ４ポリペプチドを製造するためには、ＶＲ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（本明細書中では以下、「ＶＲ４ポリペプチド」）を用いればよい。
【００１６】
ＶＲ４ポリヌクレオチドは、標準的なクローニングおよびスクリーニング技術により（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（１９８９）および欧州特許出願第ＥＰ２０２３５２．１ ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ）、ヒト変形性関節症の軟骨、心臓、腎臓またはヒト脳の細胞中のｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。また、ＶＲ４ポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡライブラリーのような天然源から得ることもできるし、市販されている周知の技法を用いて合成することもできる。さらにＥＰ２０２３５２．１は、発現ベクターおよび宿主を含むＶＲ４ポリペプチドの組換え産生法、ならびに精製法の詳細を開示している。
【００１７】
本発明はまた、被験体におけるＶＲ４ポリペプチドの過剰発現もしくは過小発現、または突然変異型ＶＲ４の発現によって引き起こされる疾患を検出する上で有用な診断用試薬としての、本発明のポリヌクレオチドの使用に関する。そのような疾患としては、硝子軟骨、線維軟骨および弾性軟骨等の軟骨の疾患、またはこれら軟骨が見出される組織の疾患（喉頭、耳道、椎間円板、靭帯、腱および関節包を冒す疾患もしくは障害を含む）、骨粗鬆症を含む骨成長に影響を及ぼす疾患、関節破壊を伴う疾患、ならびに関節リウマチおよび変形性関節症と関連する疼痛も含まれる。
【００１８】
配列番号１のポリヌクレオチドによって特徴付けられる遺伝子の、機能障害と関連する突然変異形態を検出することによって、ＶＲ４遺伝子の過小発現、過剰発現もしくは変化した発現の結果として生ずる疾患の診断法、該疾患への罹りやすさの診断法を追加するかまたは規定することができる、診断ツールが提供される。この遺伝子中に突然変異を有する個体を、様々な技術により、ＤＮＡレベルで検出することが可能である。
【００１９】
診断用の核酸は、被験者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織生検または剖検材料由来の細胞から得ることができる。検出のためにゲノムＤＮＡを直接使用してもよいし、分析前にＰＣＲまたは他の増幅法を用いてゲノムＤＮＡを酵素的に増幅してもよい。同様の方法でＲＮＡまたはｃＤＮＡを使用することもできる。欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズの変化により検出できる。点突然変異は増幅ＤＮＡを標識ＶＲ４ヌクレオチド配列とハイブリダイズさせることで同定できる。完全にマッチした配列とミスマッチの二重鎖とは、ＲＮアーゼ消化により、または融解温度の差異により区別できる。また、ＤＮＡ配列の差異は、変性剤を含むもしくは含まないゲルでのＤＮＡ断片の電気泳動の移動度の変化により、または直接的なＤＮＡ配列決定によっても検出できる（例えば、Ｍｙｅｒｓら， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８５） ２３０：１２４２ を参照のこと）。特定位置での配列変化はヌクレアーゼプロテクションアッセイ（例えば、ＲＮアーゼおよびＳ１プロテクション）または化学的開裂法によっても確認できる（Ｃｏｔｔｏｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９８５） ８５：４３９７−４４０１を参照のこと）。別の実施形態では、ＶＲ４ヌクレオチド配列またはその断片を含んでなるオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築して、例えば遺伝子変異の効率のよいスクリーニングを実施することができる。アレイ技法は周知であり、汎用的な適用可能性を有していて、遺伝子発現、遺伝的連鎖および遺伝的多様性を含めた分子遺伝学のさまざまな問題を解きあかすために用いることができる（例えば、Ｍ． Ｃｈｅｅら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ．２７４， ｐｐ６１０−６１３ （１９９６）を参照）。
【００２０】
本発明の診断アッセイは、前記方法によるＶＲ４遺伝子中の突然変異の検出によって、前記疾患の診断方法または前記疾患への罹りやすさの判定方法を提供する。さらに、そのような疾患は、被験体に由来するサンプルについてポリペプチドまたはｍＲＮＡのレベルの異常な低下または増加を測定することを含む方法により、診断することができる。発現の低下または増加は、当技術分野で周知のポリヌクレオチドの定量法、例えば核酸増幅（例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮアーゼプロテクション、ノーザンブロッティング、その他のハイブリダイゼーション法等の任意のものを用いてＲＮＡレベルで測定することができる。本発明のポリペプチド等のタンパク質について宿主に由来するサンプル中のレベルを測定するために使用可能なアッセイ法は、当業者には周知である。そうしたアッセイ法としては、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。
【００２１】
かくして別の態様において、本発明は、以下の（ａ）〜（ｂ）：
（ａ） 本発明のポリヌクレオチド、好ましくは、配列番号１のヌクレオチド配列もしくはその断片、
（ｂ） （ａ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
（ｃ） 本発明のポリペプチド、好ましくは、配列番号２のポリペプチドもしくはその断片、または
（ｄ） 本発明のポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）に対する抗体、
を含む診断用キットに関する。
【００２２】
このようなキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が本質的な構成要素であることは理解されよう。かかるキットは、硝子軟骨、線維軟骨および弾性軟骨等の軟骨の疾患、またはこれらの軟骨が見出される組織の疾患（喉頭、耳道、椎間円板、靭帯、腱、関節包を冒す疾患もしくは障害を含む）、骨粗鬆症を含む骨成長に影響を及ぼす疾患、関節破壊を伴う疾患、ならびに関節リウマチおよび変形性関節症と関連する疼痛をも診断する上で有用であろう。
【００２３】
ＶＲ４ポリペプチドもしくはその断片またはそれらの類似体、あるいはそれらを発現する細胞はまた、本発明のポリペプチドに対する免疫特異性を有する抗体を製造するための、免疫原として用いることができる。用語「免疫特異性を有する」は、抗体が、本発明のポリペプチドに対して、先行技術における他の関連ポリペプチドに対する親和性を上回る非常に高い親和性を示すことを意味する。
【００２４】
ＶＲ４ポリペプチドに対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくは非ヒト動物）に該ポリペプチド、またはエピトープを含む断片、類似体、あるいは細胞を投与することにより得ることができる。モノクローナル抗体の調製には、連続的な細胞系培養によって抗体を産生させる任意の技法を用いることができる。例としては、ハイブリドーマ法 （Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ．， Ｎａｔｕｒｅ （１９７５） ２５６：４９５−４９７）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法 （Ｋｏｚｂｏｒら， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ （１９８３） ４：７２） およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法 （Ｃｏｌｅら， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， ７７−９６， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， １９８５）が挙げられる。
【００２５】
本発明のポリペプチドに対して一本鎖抗体を作製できるように、米国特許第４，９４６，７７８号に記載されたような一本鎖抗体作製法を適合させてもよい。またヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス、または他の哺乳動物を含む他の生物を利用することができる。
【００２６】
本発明のポリペプチドに対する抗体を用いて、硝子軟骨、線維軟骨および弾性軟骨等の軟骨の疾患、またはこれらの軟骨が見出される組織の疾患（喉頭、耳道、椎間円板、靭帯、腱、関節包を冒す疾患もしくは障害を含む）、さらに骨粗鬆症を含む骨成長に影響を及ぼす疾患、関節破壊を伴う疾患、ならびに関節リウマチおよび変形性関節症と関連する疼痛を診断または治療することができる。
【００２７】
本発明の別の態様は、とりわけ、前記疾患から動物を保護するための抗体応答および／またはＴ細胞免疫応答をもたらすのに十分な本発明のポリペプチドを哺乳動物に接種することを含む、哺乳動物における免疫応答を誘導する方法に関する。本発明のさらに別の態様は、免疫応答を誘導することにより抗体を産生させて疾患から動物を保護する目的で、本発明のポリヌクレオチドの発現を指令しかつ本発明のポリペプチドをコードするベクターを介して本発明のポリペプチドをｉｎ ｖｉｖｏ送達することを含む、哺乳動物における免疫応答を誘導する方法に関する。
【００２８】
本発明のさらなる態様は、免疫製剤／ワクチン製剤（組成物）であって、哺乳動物宿主に導入されると、該哺乳動物において本発明のポリペプチドに対する免疫応答を誘導し、かつ該組成物が本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含むものである、前記製剤に関する。ワクチン製剤は、適当な担体をさらに含んでもよい。ポリペプチドは胃の中で分解される可能性があるので、非経口的に（例えば、皮下、筋肉内、静脈内または皮内注射により）投与することが好ましい。非経口投与に適した製剤としては、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、およびこの製剤を受容者の血液と等張にする溶質、を含み得る水性および非水性の無菌注射液、並びに懸濁化剤または増量剤を含みうる水性および非水性の無菌懸濁液が挙げられる。こうした製剤は１回量容器または複数回量容器（例えば、密閉アンプルおよびバイアル）で提供することができ、また、使用直前に無菌の液状担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で保管することもできる。ワクチン製剤はこの製剤の免疫原性を増強するためのアジュバント系、例えば水中油型のアジュバント系や当技術分野で公知の他のアジュバント系を含んでいてもよい。投与量はワクチンの比活性に依存するが、慣用の実験操作により簡単に決定できる。
【００２９】
ＶＲ４ポリペプチドは、そのＶＲ４ポリペプチドの活性をモジュレートする化合物を同定するためのスクリーニング方法を作り出すために使用することができる。そうしたモジュレーターには、ＶＲ４ポリペプチドの機能を刺激する（アゴニスト）か、または阻害する（アンタゴニスト）化合物が含まれる。従って、第１の態様においては、本発明は、ＶＲ４ポリペプチドの機能を刺激するかまたは阻害する化合物を同定するための化合物のスクリーニング方法を提供する。ＶＲ４の一般的なモジュレーター（アゴニストまたはアンタゴニスト）は、前述のような本発明に係る疾患の治療および予防目的のために使用されうる。化合物は、種々の供給源、例えば、細胞、無細胞調製物、化学物質ライブラリー、天然産物の混合物から同定することができる。このようにして同定されるモジュレーターは、天然のもしくは修飾された、ＶＲ４ポリペプチドの基質、リガンドまたは受容体であるか、それらの構造的もしくは機能的なミメティック（Ｃｏｌｉｇａｎら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）： 第５章 （１９９１）を参照）でありうる。
【００３０】
本発明のスクリーニング法では、候補化合物の、ＶＲ４ポリペプチド、またはＶＲ４ポリペプチドを担持する細胞もしくは膜、またはその融合タンパク質への結合を、候補化合物に直接的または間接的に結合された標識を用いて簡単に測定できる。あるいはまた、本発明のスクリーニング法は標識した競合物質との競合を伴うものでもよい。さらに、これらのスクリーニング法は、候補化合物がＶＲ４ポリペプチドの活性化または阻害により生ずるシグナルを結果的にもたらすか否かを、ＶＲ４ポリペプチドを担持する細胞に適した検出系を用いて試験することができる。一般的には、ＶＲ４アゴニストの存在下で活性化のインヒビターをアッセイして、アゴニストによる活性化に候補化合物の存在が与える影響を調べる。構成的には、活性ポリヌクレオチドを用いて、アゴニストまたはインヒビターの不在下で候補化合物がＶＲ４ポリペプチドの活性化の阻害をもたらすか否かを試験することにより、インバースアゴニストまたはインヒビターのスクリーニング法を実施することができる。さらに、このスクリーニング法は、候補化合物と、ＶＲ４ポリペプチドを含む溶液とを混合して混合物を作製し、この混合物中のＶＲ４活性を測定し、そしてこの混合物のＶＲ４活性を標準と比較する各ステップを単に含んでいればよい。本発明のポリペプチドに対するアンタゴニストを同定するためのハイスループットなスクリーニングアッセイにおいては、前述のような、Ｆｃ部分とＶＲ４ポリペプチドから作製されるような融合タンパク質も使用することができる（Ｄ． Ｂｅｎｎｅｔｔら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ， ８：５２−５８ （１９９５） およびＫ． Ｊｏｈａｎｓｏｎら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０（１６）：９４５９−９４７１ （１９９５）を参照）。
【００３１】
また本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびＶＲ４ポリペプチドに対する抗体を用いて、細胞におけるｍＲＮＡおよびポリペプチドの産生に及ぼす添加した化合物の作用を検出するためのスクリーニング法を構築することができる。例えば、当技術分野で公知の標準方法により、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いてポリペプチドの分泌レベルまたは細胞結合レベルを測定するためのＥＬＩＳＡアッセイを構築することができる。これは、適切に操作された細胞または組織からのポリペプチドの産生を阻害または増強しうる物質（それぞれアンタゴニストまたはアゴニストともいう）の探索に用いることができる。
【００３２】
ポリペプチドの潜在的アンタゴニストの例としては、抗体、ある場合には、ＶＲ４ポリペプチドのリガンド、基質または受容体と密接な関係があるオリゴヌクレオチドもしくはタンパク質（例えば、リガンド、基質もしくは受容体の断片）、または本発明のＶＲ４ポリペプチドと結合するが応答を誘導しない（それゆえＶＲ４ポリペプチドの活性を妨げる）小分子が挙げられる。
【００３３】
かくして、他の態様において、本発明は、ＶＲ４ポリペプチドに対するアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質など、または本発明のＶＲ４ポリペプチドの産生を低減または増加させる化合物、を同定するためのスクリーニングキットに関し、このキットは、
（ａ） ＶＲ４ポリペプチド、
（ｂ） ＶＲ４ポリペプチドを発現している組換え細胞、
（ｃ） ＶＲ４ポリペプチドを発現している細胞膜、または
（ｄ） ＶＲ４ポリペプチドに対する抗体、
を含んでなり、かつこのポリペプチドは好ましくは配列番号２のポリペプチドである。
【００３４】
そのようないかなるキットにおいても、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ａ）が本質的な構成要素を含み得ることは理解されるであろう。
【００３５】
当業者であれば、ＶＲ４ポリペプチドの活性をモジュレートする化合物をその構造に基づいて設計する方法であって、以下：
（ａ） まず、ＶＲ４ポリペプチドの三次元構造を決定し、
（ｂ） モジュレートする化合物が反応すると思われる部位または結合すると思われる部位の三次元構造を推定し、
（ｃ） その推定上の結合部位または反応部位と結合または反応すると予想される候補モジュレート化合物を合成し、そして
（ｄ） その候補化合物が実際にモジュレーターであるか否かを調べる、
による方法においても、ＶＲ４ポリペプチドを使用できることは容易に理解されよう。
【００３６】
さらなる態様において、本発明は、例えば、硝子軟骨、線維軟骨および弾性軟骨等の軟骨の疾患、またはこれらの軟骨が見出される組織の疾患（喉頭、耳道、椎間円板、靭帯、腱、関節包を冒す疾患もしくは障害を含む）、さらに骨粗鬆症を含む骨成長に影響を及ぼす疾患、関節破壊を伴う疾患、ならびに関節リウマチおよび変形性関節症と関連する疼痛等の、ＶＲ４ポリペプチド活性の過剰発現または過小発現のいずれかと関連する異常な状態を治療する方法を提供する。
【００３７】
ＶＲ４ポリペプチドの活性が過剰である場合、いくつかのアプローチが有効である。１つのアプローチは、前述したインヒビター化合物（アンタゴニスト）を、ＶＲ４ポリペプチドの機能を阻害してそれにより異常な状態を軽減するために有効な量で、場合により製薬上許容される担体と組み合わせて、そのアプローチを必要としている被験体に投与することを含む。この場合のＶＲ４ポリペプチドの機能の阻害は、例えば、リガンド、基質、受容体、酵素等の結合をブロックすることによって、または第２シグナルを阻害することによるものである。別のアプローチでは、内在性のポリペプチドとの競合下でリガンド、基質、酵素、受容体等を依然として結合することができるＶＲ４ポリペプチドの可溶性形態を投与してもよい。そのような競合物質の典型例としては、ＶＲ４ポリペプチドの断片が挙げられる。
【００３８】
さらに別のアプローチでは、内在性ＶＲ４ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を、発現ブロック技術を用いて阻害することができる。そのような公知の技術は、アンチセンス配列を内生的に生成させるかまたは外部から投与して使用することを伴う（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ， Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ （１９９１） ５６：５６０ Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ （１９８８）を参照）。かかるアンチセンスポリヌクレオチドは、ＶＲ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその断片のアンチセンス配列を含んでなるように設計される。ＶＲ４をコードするポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えばｍＲＮＡを含む。
【００３９】
あるいは、本発明の遺伝子と三重らせん（トリプレックス）を形成するオリゴヌクレオチドが供給され得る（例えば、Ｌｅｅら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ （１９７９） ６：３０７３； Ｃｏｏｎｅｙら， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８８） ２４１：４５６； Ｄｅｒｖａｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９１） ２５１：１３６０）。これらのオリゴマーは、それ自体を投与してもよいし、当該オリゴマーをｉｎ ｖｉｖｏで発現させてもよい。合成アンチセンスまたはトリプレックスオリゴヌクレオチドは、修飾塩基または修飾骨格を含んでいてもよい。この後者の例としては、メチルホスホネート骨格、ホスホロチオエート骨格、またはペプチド核酸骨格が挙げられる。このような骨格は、ヌクレアーゼによる分解から保護するためにアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはトリプレックスオリゴヌクレオチド中に組み込まれるが、これは当技術分野では周知の技法である。これらの修飾骨格または他の修飾骨格を用いて合成されたアンチセンス分子およびトリプレックス分子もまた、本発明の一部を構成する。
【００４０】
さらに、ヒトＶＲ４ポリペプチドの発現を、ヒトＶＲ４ ｍＲＮＡ配列に特異的なリボザイムを使用することによって妨げることができる。リボザイムは触媒活性を有するＲＮＡであり、天然のものまたは合成性のものであり得る（例えば、Ｕｓｍａｎ， Ｎら， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ （１９９６） ６（４）， ５２７−３３）。選択した位置で合成リボザイムがヒトＶＲ４ ｍＲＮＡを特異的に切断しそれによりヒトＶＲ４ ｍＲＮＡの機能的なポリペプチドへの翻訳を妨害するように、その合成リボザイムを設計することができる。リボザイムは、ＲＮＡ分子中に通常見出される天然のリボース−リン酸骨格および天然塩基を有するように合成され得る。あるいは、リボザイムは、リボヌクレアーゼ分解からの保護をもたらす非天然骨格、例えば２’−Ｏ−メチルＲＮＡを有するように合成してもよいし、修飾塩基を含んでいてもよい。
【００４１】
ＶＲ４及びその活性の過小発現と関連した異常な状態を治療するために、同様にいくつかのアプローチが有効である。１つのアプローチは、本発明のＶＲ４ポリペプチドを活性化する化合物、すなわち上記のアゴニストを治療上有効な量で、製薬上許容される担体と組み合わせて被験体に投与し、それにより異常な状態を軽減することを含む。あるいは、遺伝子治療を利用して、被験体において当該細胞によるＶＲ４の内生的産生を引き起こしてもよい。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、上記のように複製能欠陥レトロウイルスベクター中で発現させるように、遺伝子工学的に作製してもよい。次いで、そのレトロウイルス性発現構築物を単離し、それを、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターを用いて形質導入したパッケージング細胞中に導入して、そのパッケージング細胞が目的の遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を産生するようにしてもよい。これらの産生細胞を被験体に投与して、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞を操作し、かつｉｎ ｖｉｖｏで本発明のポリペプチドを発現させてもよい。遺伝子治療の概説としては、「ヒトの分子遺伝学（Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」中の２０章「遺伝子治療および分子遺伝学に基づく他の治療的アプローチ（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ−ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ）」［Ｔ Ｓｔｒａｃｈａｎ ａｎｄ Ａ Ｐ Ｒｅａｄ， ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｔｄ （１９９６）］を参照されたい。別のアプローチは、治療量の本発明のＶＲ４ポリペプチドを適当な薬剤担体と組み合わせて投与することである。
【００４２】
更なる態様においては、本発明は、治療上有効な量のＶＲ４ポリペプチド（例えば可溶性形態の本発明のＶＲ４ポリペプチド）、アゴニストペプチド／アンタゴニストペプチド、または低分子化合物を、製薬上許容し得る担体または賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物を提供する。そのような担体としては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明はさらに、前述した本発明の組成物の１種以上の成分を充填した容器を１以上含む医薬パックおよびキットに関する。本発明のＶＲ４ポリペプチドおよび他の化合物は、単独で用いてもよく、または治療用化合物等の他の化合物と組み合わせて用いてもよい。
【００４３】
本発明の組成物は、投与経路、例えば全身または経口による投与経路に適合させられる。全身投与に適した形態としては、注入、典型的には静注によるものが挙げられる。皮下、筋肉内または腹腔内のような他の注入経路も使用できる。全身投与の別の手段としては、胆汁酸塩、フシジン酸、その他の界面活性剤などの浸透剤を用いた経粘膜および経皮投与が挙げられる。さらに、ＶＲ４ポリペプチドまたは本発明に係る他の化合物を腸溶剤またはカプセル剤中に製剤化し得る場合には、経口投与も可能である。これらの化合物を軟膏、ペースト、ゲルなどの剤形として、局所に投与しても、かつ／または局在化させてもよい。
【００４４】
必要な用量範囲は、本発明のペプチドまたは他の化合物の選択、投与経路、製剤の種類、被験体の病的状態の種類、および主治医の判断によって決まる。しかしながら、適切な用量は、被験体の体重１ｋｇあたり０．１〜１００μｇの範囲内である。しかしながら、多様な化合物が利用可能であることおよび各種投与経路の効率が様々であることから、必要とされる用量の変動が大きいことが予想される。例えば、経口投与は、静脈注射による投与よりも高用量が必要であると予想される。これらの用量レベルの変動は、当技術分野においてよく理解されているような、最適化のための標準的な実験手法を用いて調節することができる。
【００４５】
治療に用いるポリペプチドはまた、前述したしばしば「遺伝子治療」と称される治療様式で、被験体中で内生的に産生させてもよい。すなわち、例としては、被験体由来の細胞を、ＶＲ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いてｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子工学的に（例えばレトロウイルスプラスミドベクターを使用して）操作してもよい。次いでこの細胞は被験体内に導入される。
【００４６】
以下の定義は、上記の説明中でしばしば用いられる一定の用語の理解を円滑にするためのものである。
【００４７】
本明細書中で用いる「抗体」には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、さらにＦａｂまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物を含むＦａｂフラグメントが含まれる。
【００４８】
「単離された」とは、その天然の状態から「人間の手によって」変化させられていることを意味する。「単離された」組成物または物質が天然に存在する場合には、それはそのもとの環境から変更されているかもしくは取り出されており、またはその両方である。例えば、生存している生物の体内に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離された」ものではないが、その天然状態での共在物質から分離された同ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書中で用いられている通り、「単離された」ものである。
【００４９】
「ポリヌクレオチド」とは、一般に任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを言い、これは修飾されていないかまたは修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。「ポリヌクレオチド」には、限定するものではないが、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合ったＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合ったＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子（一本鎖であっても、より典型的には二本鎖であってもよく、一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合ったものでもよい）が含まれる。加えて、「ポリヌクレオチド」はＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三重鎖領域を言う。「ポリヌクレオチド」という用語はまた、１個以上の修飾塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性もしくは他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡも含む。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化された塩基およびイノシンのような特殊な塩基が挙げられる。ＤＮＡおよびＲＮＡに対してさまざまな修飾を行うことができる。従って、「ポリヌクレオチド」は自然界に通常見られるポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。また「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと称される比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
【００５０】
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合もしくは修飾されたペプチド結合（すなわち、ペプチドアイソスター）により互いに連結された２個以上のアミノ酸を含むペプチドまたはタンパク質のいかなるものをも意味する。「ポリペプチド」は短鎖（通常はペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーという）と長鎖（一般的にはタンパク質という）の両方を意味する。ポリペプチドは２０種類の遺伝子コード化アミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。「ポリペプチド」は、翻訳後プロセシングのような天然のプロセスによって、または当業界で周知の化学的修飾技術によって修飾されたアミノ酸配列を含む。このような修飾は基本的な教科書、より詳細な学術論文およびおびただしい数の研究文献に詳述されている。修飾はペプチド骨格、アミノ酸側鎖、アミノまたはカルボキシル末端を含めてポリペプチドのどこでも行うことができる。同じタイプの修飾が所定のポリペプチドのいくつかの部位に同程度でまたはさまざまに異なる程度で存在してもよい。また、所定のポリペプチドが多くのタイプの修飾を含んでいてもよい。ポリペプチドはユビキチン化の結果として分枝していてもよく、分枝しているかまたはしていない環状であってもよい。環状の、分枝した、または分枝した環状のポリペプチドは翻訳後の天然プロセスから生じる場合があり、または合成法によって作製することもできる。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、ビオチン化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加、およびユビキチン化が挙げられる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，第２版， Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３； Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｂ．Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏｎ編， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８３中のＷｏｌｄ， Ｆ．， Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ： Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ， １−１２頁； Ｓｅｉｆｔｅｒら， 「タンパク質修飾および非タンパク質補因子についての分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ）」， Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ （１９９０） １８２：６２６−６４６； および Ｒａｔｔａｎら， 「タンパク質合成：翻訳後修飾および老化（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ）」， Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ （１９９２） ６６３：４８−６２を参照のこと）。
【００５１】
「変異体」は、基準ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なるが、本質的な性質を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドを言う。典型的なポリヌクレオチドの変異体は、基準とする別のポリヌクレオチドとヌクレオチド配列の点で相違する。この変異体のヌクレオチド配列の変化は、基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更するものであっても、または変更しないものであってもよい。ヌクレオチドの変化は、以下で述べるように、基準配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸の置換、付加、欠失、融合および末端切断（トランケーション）をもたらしうる。典型的なポリペプチドの変異体は基準とする別のポリペプチドとアミノ酸配列の点で相違する。一般的には、基準ポリペプチドの配列と変異体の配列とが全体としてよく類似し、多くの領域で同一となるような相違に限られる。変異体ポリペプチドと基準ポリペプチドとは任意に組み合わせた１以上の置換、付加、欠失によりアミノ酸配列が相違していてよい。置換または挿入されるアミノ酸残基は遺伝コードによりコードされるものであってよいが、コードされないものでもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は対立遺伝子変異体のように天然に存在するものであってよく、天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天然に存在しない変異体は、突然変異誘発法または直接合成により作製することができる。
【００５２】
当技術分野で知られる「同一性」とは、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の比較により決定された、２以上のかかる配列間の類縁性のことである。当技術分野ではまた、「同一性」は、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の鎖間の一致度（ｍａｔｃｈ）により決定された、そのような配列間の配列類縁性の程度を意味する。「同一性」および「類似性」は公知の方法により難なく算出することができ、そのような公知の方法としては、例えば Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， Ａ．Ｍ．編， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８； Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．Ｗ． 編， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３； Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ Ｉ， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ．Ｍ． ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｈ．Ｇ． 編， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， １９９４； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ． 編， Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１； および Ｃａｒｉｌｌｏ， Ｈ． ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｄ．， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．， ４８： １０７３ （１９８８） に記載された方法が挙げられるが、これらに限定されない。同一性を決定するための好ましい方法は、検討する配列間で最大級のマッチングが得られるように設計される。同一性および類似性を決定する方法は公的に入手可能なコンピュータプログラムにプログラム化されている。２配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ （Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．ら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）：３８７ （１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ （Ａｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．ら， Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０ （１９９０）） があるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴ ＸプログラムはＮＣＢＩおよび他のソースから公的に入手可能である （ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ， Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．ら， ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ ２０８９４； Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．ら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３−４１０ （１９９０））。よく知られているＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性の決定に使用することができる。
【００５３】
ポリペプチド配列比較のための好適なパラメーターとしては、以下のものが挙げられる。
【００５４】
１）アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ および Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３−４５３ （１９７０）
比較マトリックス：Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ および Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ８９：１０９１５−１０９１９ （１９９２） に由来するＢＬＯＳＳＵＭ６２
ギャップペナルティー：１２
ギャップ長ペナルティー：４
これらのパラメーターを用いて有効なプログラムは Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩから「ｇａｐ」プログラムとして公的に入手可能である。前記のパラメーターはペプチド比較のためのデフォルトパラメーターである（末端ギャップのペナルティーは無し）。
【００５５】
ポリヌクレオチド配列比較のための好適なパラメーターとしては、次のものが挙げられる。
【００５６】
１）アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ および Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３−４５３ （１９７０）
比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０
ギャップペナルティー：５０
ギャップ長ペナルティー：３
以下の通り入手可能：Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩからの「ｇａｐ」プログラム。
これらは核酸比較のためのデフォルトパラメーターである。
【００５７】
例としては、本発明のポリヌクレオチド配列は、配列番号１の基準配列と同一であり、すなわち、基準配列に対して１００％の同一性を有するか、または該基準配列に対して、一定の整数個までのヌクレオチド変異を含んでいてもよい。そのような変異は少なくとも１個のヌクレオチドの欠失、置換（トランジションおよびトランスバージョンを含む）または挿入よりなる群から選択され、こうした変異は基準ヌクレオチド配列の ５’もしくは ３’末端位置、またはこれらの末端位置の間のどこに存在してもよく、基準配列中のヌクレオチドの間に個々に、または基準配列内に１以上の連続するグループとして散在する。ヌクレオチド変異の数は、配列番号１のヌクレオチドの総数に、それぞれの同一性％値の絶対比率（１００で割った値）を掛け、その積を配列番号１のヌクレオチドの総数から差し引くことにより、すなわち、次式：
ｎｎ ≦ｘｎ −（ｘｎ・ｙ）
により求めることができる。式中、ｎｎはヌクレオチド変異の数であり、ｘｎは配列番号１のヌクレオチドの総数であり、ｙは例えば７０％については０．７０、８０％については０．８０、８５％については０．８５、９０％については０．９０、９５％については０．９５などであり、さらにｘｎとｙの非整数の積は、その積をｘｎから引く前に、最も近似する整数に切り下げる。配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変異は、そのコード配列にナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異を生じ、それにより、こうした変異後のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを改変することがあり得る。
【００５８】
同様に、本発明のポリペプチド配列は、配列番号２の基準配列と同一であってよく、すなわち基準配列に対して１００％の同一性を有するか、または同一性％が１００％未満であるように基準配列に対して一定の整数個までのアミノ酸変異を含んでいてもよい。このような変異は少なくとも１個のアミノ酸の欠失、置換（保存的および非保存的置換を含む）または挿入よりなる群から選択され、これらの変異は基準ポリペプチド配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置、またはこれらの末端位置の間のどこに存在してもよく、基準配列中のアミノ酸の間に個々に、または基準配列内に１以上の連続したグループとして散在する。アミノ酸変異の数は、配列番号２中のアミノ酸の総数にそれぞれの同一性％の絶対比率（１００で割った値）を掛け、その積を配列番号２中のアミノ酸の総数から引くことにより、すなわち次式により求められる。
【００５９】
ｎａ ≦ｘａ −（ｘａ・ｙ）
式中、ｎａはアミノ酸変異の数であり、ｘａは配列番号２中のアミノ酸の総数であり、ｙは例えば７０％については０．７０、８０％については０．８０、８５％については０．８５などであり、さらにｘａとｙの非整数の積は、その積をｘａから引く前に、最も近似する整数に切り下げる。
【００６０】
「相同体」とは、当技術分野において用いられる、被験配列に対し高度な配列類縁性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指す総称用語である。この類縁性は前述のように比較した配列間の同一性および／または類似性の程度を決定することにより定量化することができる。別々の種における機能的に等価なポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する「オーソログ体」、同じ種内で考える場合に機能的に類似した配列を意味する「パラログ体」という用語は、この総称用語の範囲に含まれるものである。
【００６１】
「融合タンパク質」は、２つの（しばしば類縁でない）遺伝子が融合したものまたはその断片によってコードされるタンパク質を言う。一例としては、ＥＰ−Ａ−０ ４６４が、免疫グロブリン分子の定常領域の様々な部分を別のヒトタンパク質またはその一部と一緒に含んでなる融合タンパク質を開示している。例えば薬物動態特性を改善する結果をもたらすような治療および診断上の使用のためには、多くの場合、融合タンパク質の一部分として免疫グロブリンＦｃ領域を用いることが有利である ［例えば、ＥＰ−Ａ ０２３２ ２６２］。一方で、一部の使用については、融合タンパク質が発現され、検出され、さらに精製された後に、そのＦｃ部分を除去することが望ましい場合があるであろう。
【００６２】
実施例
実施例１−ＶＲ４は軟骨および軟骨細胞中で発現される
ヒトＶＲ４の組織および細胞での発現について、ＴａｑＭａｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）定量ＲＴ−ＰＣＲ（Ｇｉｂｓｏｎら， （１９９６） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １９９６ Ｏｃｔ； ６（１０）： ９９５−１００１）を製造業者の説明書に従って用いて調べた。ＴａｑＭａｎ反応は、ヒトＧＡＰＤＨ、シクロフィリンおよびヒトＶＲ４に対するプローブを用いて行った。ヒトＶＲ４プローブは、以下のものからなる：
５’−ＡＴＧＡＧＧＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＴＧＣＡ（配列番号３）および５’−ＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣ（配列番号４）のフランキングプライマー、ならびに
５’−ＣＡＣＴＴＡＣＣＣＣＴＣＧＴＧＣＣＧＴＧＡＣＡＧ（配列番号６）の発蛍光性プローブ。データは、Ｐｏｗｅｒ Ｍａｃｉｎｔｏｓｈソフトウェアを備えたＡＢＩ ＰｒｉｓｍＴＭ ７７００を用いて解析した。
【００６３】
結果：体組織のスクリーニングから得たデータを表１に示すが、このデータは、ヒトＶＲ４が軟骨において最も顕著に発現されていることを示している。初代細胞培養物およびクローン細胞培養物のスクリーニングは、軟骨細胞においてのみ有意な発現を示している。
【００６４】
【表１】
表１　ヒト組織および細胞系におけるｍＲＮＡの相対的発現。数値は、１（低い発現）から５（非常に高い発現）までの量的スコアを示す。
2004512310.tif 000002
【００６５】
Ｔは、以下のような様々な体組織の種類を示している。
Ａ： ＣＮＳ。Ｂ： 下垂体。Ｃ： 心臓。Ｄ： 肺。Ｅ： 肝臓。Ｆ： 胚性肝臓（ｆｏｅｔａｌ ｌｉｖｅｒ）。Ｇ： 腎臓。Ｈ： 骨格筋。Ｉ： 胃。Ｊ： 腸。Ｋ： 脾臓。Ｌ： リンパ球。Ｍ： マクロファージ。Ｎ： 脂肪。Ｏ： 膵臓。Ｐ： 前立腺。Ｑ： 胎盤。Ｒ： 軟骨、Ｓ： 骨。Ｔ： 骨髄。
【００６６】
Ｃは、以下のような様々な細胞系の種類を示している。
Ａ： 大動脈平滑筋細胞。Ｂ： 膀胱平滑筋細胞。Ｃ： Ｃ２０Ａ４。Ｄ： ＭＧ６３。Ｅ： ＳＡＯＳ２。Ｆ： リンパ球。Ｇ： マクロファージ。Ｈ： 血小板。Ｉ： 好中球。Ｊ： ＣＨＡＮＧ。Ｋ： ＨｅｐＧ２。Ｌ： ＩＭＲ３２。Ｍ： ＳＫ−Ｎ−ＭＣ。Ｎ： ＳＫ−Ｎ−ＳＨ。Ｏ： ＮＴ−２。Ｐ： １３２１Ｎ１。Ｑ： Ｃ１３。Ｒ： 初代ヒト軟骨細胞。Ｓ： Ｈｓ−６８３。Ｔ： ＨＥＫ２９３。
【００６７】
この結果は、軟骨組織（Ｔ、Ｒ）および初代ヒト軟骨細胞（Ｃ、Ｒ）における高レベルの発現を示した。
【００６８】
実施例２　ＶＲ４は４α−ホルボール−１２，１３ジデカノエートにより活性化される
ＶＲ４ ｃＤＮＡを、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１ Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に挿入した。野生型ＨＥＫ２９３細胞、またはヒトＶＲ４：ｐｃＤＮＡ３．１ Ｖ５−Ｈｉｓ構築物をトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞、または偽トランスフェクション細胞、またはウシ軟骨細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレートに２５，０００細胞／ウェルで播種し、一晩培養した。次いで細胞に４μＭ Ｆｌｕｏ−３を加えて室温の暗所で２時間にわたりインキュベートした。色素を負荷した細胞を、０．２％ ＢＳＡをさらに含有するがプロベネシドは含有しないＴｙｒｏｄｅｓバッファー（ＮａＣｌ， １４５ ｍＭ； ＫＣｌ， ２．５ ｍＭ； Ｈｅｐｅｓ， １０ ｍＭ； グルコース， １０ ｍＭ； ＭｇＣｌ２， １．２ ｍＭ； ＣａＣｌ２， １，５ ｍＭ）により、４回洗浄した。さらにアゴニストおよびアンタゴニストをＴｙｒｏｄｅｓバッファー中に調製した。細胞をアンタゴニストまたはバッファーと共に３０分間プレインキュベートした。アゴニストの添加および細胞質カルシウム濃度の測定は、ＦＬＩＰＲ中で実施した（Ｓｍａｒｔら， （２０００） Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １２９， ２２７−２３０）。
【００６９】
結果：
ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）および４α−ホルボール−１２，１３ジデカノエート（４αＰＤＤ）はいずれも、ＨＥＫ２９３−ＶＲ４細胞において細胞内カルシウムを増加させたが（表１）、野生型ＨＥＫ２９３細胞、または空のベクターによりトランスフェクションした細胞においては効果を示さなかった。ＰＭＡはＶＲ１をも活性化したが、カプサイシンやＲＴＸと比較すると部分的アゴニスト（Ｅｍａｘ ０．４６）でしかなかった。４αＰＤＤはＶＲ１について不活性であった（表１）。
【００７０】
【表２】
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表中、データは、平均値±平均の標準誤差（ｎ＝３〜５）である。
ＩＡ＝不活性
ｈＶＲ１は、ヒトＶＲ１である。ｈＶＲ４は、ヒトＶＲ４である。
【００７１】
すなわち、４αＰＤＤは、ＶＲ４選択的アゴニストとしてはたらく。
ウシ関節軟骨細胞は、４α−ＰＤＤに対して、トランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞と同様の用量依存性をもって応答した。４α−ＰＤＤに対するこの応答は、ＨＥＫ２９３細胞にて発現された組換えＶＲ４に関して認められたのと同様の速度プロフィールおよび濃度依存性を示した。その応答は、細胞外カルシウムイオンに依存しており、またチャネル阻害剤であるルテニウムレッドによって阻害された。これらのデータは、４α−ＰＤＤへの応答が軟骨細胞によって内生的に発現されるＶＲ４に起因することを示唆している。
【００７２】
配列情報
配列番号１
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【００７３】
配列番号２
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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