(57)【要約】自己会合粒子の安定性強化及び前記粒子による実質的な核酸結合の欠如の両目的のために、改変操作を施したカルボキシ末端が切端されたキメラＢ型肝炎ウイルスヌクレオカプシド（コア）タンパク質（HBc）が開示される。前記キメラタンパク質分子は、HBcのN-末端、免疫原性ループ又はC-末端の1つ又は2つ以上にペプチド結合した1つ又は2つ以上の免疫原性エピトープを含むことができる。自己会合粒子の安定性強化は、キメラ分子のアミノ末端又はカルボキシ末端の一方又は両方近くの少なくとも1つの異種システイン残基の存在、及び天然の配列のHBc48位及び107位に存在するシステイン残基の欠如によって達成される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
長さが約600アミノ酸残基までのリコンビナントキメラＢ型肝炎コア（HBc）タンパク質分子であって、
（a）残基4位から約75位及び約85位から約140位のHBc配列を含み、48位及び107位のシステイン残基の一方又は両方が別の残基によって置換されているHBc分子のN-末端183アミノ酸残基の少なくとも約125のHBc配列を含み；
（b）場合によって、前記キメラのN-末端、約76位から約85位の間（HBcイムノドミナントループ中）、又はC-末端の1つ又は2つ以上にペプチド結合した異種アミノ酸残基を含み、ここで（i）前記HBcイムノドミナントループ中の配列の0から全ての残基が存在するかもしくは置換されており、更に免疫原を構成する前記1つから約245アミノ酸の異種アミノ酸残基配列、又は抗抗原若しくは複合ハプテンのための化学的に反応性のリンカー残基を構成する約40残基までの配列とペプチド結合されているか、又は（ii）76位から85位のHBcの配列が存在し、更に欠落及び異種残基を含まないか、又は（iii）残基76位から85位の1つ又は2つ以上が欠如しているか又は置換されれてあり；
（c）（i）HBcプレコア配列の配列以外の配列で配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-20位から約+１位に対応するキメラ分子のアミノ酸位の1つから3つのシステイン残基（N-末端システイン残基）、及び（ii）前記HBc配列のC-末端残基からキメラ分子のC-末端側で更に前記キメラ分子のC-末端から約30残基内の1つから3つのシステイン残基（C-末端システイン残基）の一方又は両方を含み；
前記キメラ分子が（i）HBc配列内に約20％まで置換されたアミノ酸残基を含み、（ii）発現後に自己会合して核酸結合を実質的に含まない粒子を形成する、前記リコンビナントキメラＢ型肝炎コアタンパク質分子。
【請求項２】
前記N-末端配列が、免疫原エピトープを含む、HBc残基2‐4の1つにペプチド結合した約75アミノ酸残基までを含む異種配列を含む、請求項1に記載のリコンビナントキメラＢ型肝炎コアタンパク質分子。
【請求項３】
76位から85位のHBcの配列が存在し、更に欠落及び異種残基を含まない、請求項1に記載のリコンビナントキメラＢ型肝炎コアタンパク質分子。
【請求項４】
76位から85位のHBc配列中の0から全ての残基が存在し、更にHBcにとって異種であり、異種エピトープを構成する1つから約245アミノ酸残基とペプチド結合している、  請求項1に記載のリコンビナントキメラＢ型肝炎コアタンパク質分子。
【請求項５】
残基76から85の1つ若しくは2つ以上が欠如しているか又は置換されれている、請求項1に記載のリコンビナントキメラＢ型肝炎コアタンパク質分子。
【請求項６】
前記C-末端配列が、HBcに対して異種である配列中に免疫原性エピトープを含む約100アミノ酸残基までを含む、請求項1に記載のリコンビナントキメラＢ型肝炎コアタンパク質分子。
【請求項７】
76位及び82位の各々のHBc残基がシステイン残基で置換されれる、請求項1に記載のリコンビナントキメラＢ型肝炎コアタンパク質分子。
【請求項８】
HBc分子のN-末端163アミノ酸残基の少なくとも約125のHBc配列を含む、請求項1に記載のリコンビナントキメラＢ型肝炎コアタンパク質分子。
【請求項９】
長さが約380アミノ酸残基までの、請求項1に記載のリコンビナントキメラＢ型肝炎コアタンパク質分子。
【請求項１０】
HBc分子のN-末端163アミノ酸残基の少なくとも約135を含む、請求項1に記載のリコンビナントキメラＢ型肝炎コアタンパク質分子。
【請求項１１】
長さが約380アミノ酸残基までのリコンビナントキメラＢ型肝炎コア（HBc）タンパク質分子であって、
（a）残基4位から約75位及び約85位から約140位までのHBc配列を含み、48位及び107位のシステイン残基の一方又は両方が別の残基によって置換されれているHBc分子のN-末端163アミノ酸残基の少なくとも約125のHBc配列を含み；
（b）場合によって下記の（i）、（ii）の1つ又は2つ以上を含むか：（i）前記キメラのN-末端、HBcイムノドミナントループ、及びC-末端（前記C-末端の配列は163位から天然のHBcのC-末端までのHBcの配列以外の配列である）の1つ又は2つ以上にペプチド結合した約75残基までの異種配列、（ii）存在しているか若しくは置換されれてあって、更に免疫原を構成する約75アミノ酸残基までの前記異種配列、又は抗抗原若しくは複合ハプテンのための化学的に反応性のリンカー残基を構成する1つから約40アミノ酸残基の配列とペプチド結合している約76位から約85位までの配列の0から全ての残基；又は約76位から85位のHBcの配列が存在し、更に欠落及び異種残基を含まないか、又は残基76位から85位の1つ若しくは2つ以上が欠如しているか又は置換されており；
（c）（i）HBcプレコア配列の配列以外の配列で配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-20位から約+１位に対応するキメラ分子のアミノ酸位に存在するか（N-末端システイン残基）、又は（ii）HBc配列のC-末端残基からキメラ分子のC-末端側で更に前記キメラ分子のC-末端から約30残基内に存在するか（C-末端システイン残基）、又は（i）及び（ii）の両方の位置に存在する1つから3つのシステイン残基を含み；
（d）前記HBc配列内に約20％まで置換されたアミノ酸残基を含み、更に
（e）発現後に自己会合して、採集、精製及び溶解時に280nmから260nmで0.9から約1.7の吸収比を示す粒子を形成する、前記リコンビナントキメラＢ型肝炎コアタンパク質分子。
【請求項１２】
1つから3つのC-末端システイン残基を含む、請求項11に記載のリコンビナントキメラＢ型肝炎コアタンパク質分子。
【請求項１３】
HBcのN-末端163アミノ酸残基の少なくとも約135を含む、請求項11に記載のリコンビナントキメラＢ型肝炎コアタンパク質分子。
【請求項１４】
HBc分子のN-末端156アミノ酸残基の少なくとも約135のHBc配列を含む、請求項13に記載のリコンビナントキメラＢ型肝炎コアタンパク質分子。
【請求項１５】
76位及び82位の各々のHBcの残基が、システイン残基によって置換されている、請求項11に記載のリコンビナントキメラＢ型肝炎コアタンパク質分子。
【請求項１６】
約75残基までの前記ペプチド結合配列が、存在する、請求項11に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
【請求項１７】
約75残基までの前記ペプチド結合配列が、前記キメラのN-末端に結合している、請求項16に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
【請求項１８】
約75残基までの前記ペプチド結合配列が、前記キメラのHBcイムノドミナントループに結合して存在する、請求項16に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
【請求項１９】
約75残基までの前記ペプチド結合配列が、前記キメラのC-末端に結合している、請求項16に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
【請求項２０】
約75残基までの前記第一ペプチド結合配列が結合した位置とは異なる位置で、前記キメラのN-末端、HBcイムノドミナントループ又はC-末端と結合して存在する約75残基までの第二のペプチド結合配列を含む、請求項16に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
【請求項２１】
約75残基までの前記第一のペプチド結合配列が、B細胞エピトープを含む、請求項20に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
【請求項２２】
約75残基までの前記第二のペプチド結合配列が、T細胞エピトープを含む、請求項21に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
【請求項２３】
48位及び107位の両システイン残基が別の残基で置換されている、請求項11に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
【請求項２４】
各システインのための置換残基が、グルタミン、アスパラギン、セリン、アラニン、スレオニン及びリジンから成る群から選択される、請求項23に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
【請求項２５】
約135から約365アミノ酸残基の長さを有し、更にドメインI、II、III及びIVと称されるN-末端からの4つのペプチド結合アミノ酸残基配列ドメインを含むリコンビナントＢ型肝炎ウイルスコア（HBc）タンパク質キメラ分子であって、ここで、
ドメインIは約72から約150アミノ酸残基を含み、その配列は、
（i）少なくともHBcの4位から75位までの残基の配列、
（ii）48位のシステイン残基の別の残基による置換、
（iii）HBcプレコア配列の配列以外の配列において配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-20位から約+１に対応するキメラ分子のアミノ酸位の0から3つのシステイン残基（N-末端システイン残基）、
（iv）HBc残基2‐4の1つにペプチド結合した、約75アミノ酸残基までを含む随意の免疫原性エピトープ、
を含み；
ドメインIIは、ドメインIのHBc残基75とペプチド結合した約85アミノ酸残基までを含み、ドメインIIでは、
（i）HBcの約76位から約85位の配列中の0から全ての残基が存在しているか又は置換されており、更にHBcループとは異種で免疫原を構成する1つから約75アミノ酸残基、又は抗抗原若しくは複合ハプテンのための化学的に反応性のリンカー残基を構成する1つから約40アミノ酸残基までの配列とペプチド結合しているか、又は
（ii）76位から85位のHBcの配列が存在し、更に欠落及び異種残基の付加を含まず；
ドメインIIIは、ドメインIIの残基85にペプチド結合した86位から135位までのHBc配列であり、前記ドメインでは107位のシステインが別の残基で置換されており；
ドメインIVは、
（i）ドメインIIIの135位の残基とペプチド結合した、約136位から約163位までのHBcアミノ酸残基配列の5から約30残基、
（ii）キメラ分子のC-末端から約30残基内の0から3つのシステイン残基（C-末端システイン残基）、
（iii）165位からC-末端までのHBcに存在する配列以外の配列中の0から約75アミノ酸残基、
を含み、
HBc150位からキメラ分子のC-末端までのキメラ分子の配列は、約10より少ないアルギニン、リジン残基又は両残基の混合物を含み；
前記キメラ分子は、（i）キメラのHBc配列の約10％までのアミノ酸残基が置換されているアミノ酸残基配列を有し、（ii）ドメインI及びIVの前記0から3つのシステイン残基に由来する少なくとも1つのシステイン残基を有し、更に（iii）宿主細胞による発現時に自己会合して粒子を形成し、そのようにして形成された粒子は実質的に核酸との結合を含まず、更に48位及び107位の両方のシステイン残基を含みその他の点では同一のHBcキメラ分子から形成された粒子よりも、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）で37℃で1ヶ月間保存された後でより安定である、前記リコンビナントＢ型肝炎ウイルスコア（HBc）タンパク質キメラ分子。
【請求項２６】
1つから3つのC-末端システイン残基を含む、請求項25に記載のリコンビナントキメラＢ型肝炎コアタンパク質分子。
【請求項２７】
HBcのN-末端156アミノ酸残基の少なくとも約135を含む、請求項25に記載のリコンビナントキメラＢ型肝炎コアタンパク質分子。
【請求項２８】
HBc分子のN-末端149アミノ酸残基の少なくとも約135のHBc配列を含む、請求項27に記載のリコンビナントキメラＢ型肝炎コアタンパク質分子。
【請求項２９】
76位及び82位の各々のHBc残基がシステイン残基によって置換されている、請求項25に記載のリコンビナントキメラＢ型肝炎コアタンパク質分子。
【請求項３０】
約75残基までのペプチド結合配列が存在する、請求項25に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
【請求項３１】
前記約75残基までのペプチド結合配列が前記キメラのN-末端で結合している、請求項30に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
【請求項３２】
前記約75残基までのペプチド結合配列が前記キメラのHBcイムノドミナントループ内で結合して存在する、請求項30に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
【請求項３３】
前記約75残基までのペプチド結合配列が前記キメラのC-末端に結合している、請求項30に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
【請求項３４】
約75残基までの前記第一のペプチド結合配列が結合した位置とは異なる位置で、前記キメラのN-末端、HBcイムノドミナントループ又はC-末端と結合している約75残基までの第二のペプチド結合配列を含む、請求項30に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
【請求項３５】
約75残基までの前記第一のペプチド結合配列が、B細胞エピトープを含む、請求項34に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
【請求項３６】
前記B細胞エピトープが、アミノ酸残基76と85の間のHBc配列のある位置でペプチド結合し、更に76位から85位のHBc配列の少なくとも5残基が存在する、請求項35に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
【請求項３７】
アミノ酸残基76と85の間のHBc配列は存在するが、前記B細胞エピトープによって中断されている、請求項36に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
【請求項３８】
約75残基までの前記第二のペプチド結合配列が、T細胞エピトープを含む、請求項35に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
【請求項３９】
前記T細胞免疫原性エピトープが、C-末端のHBcアミノ酸残基とペプチド結合している、請求項38に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
【請求項４０】
前記C-末端システイン残基の少なくとも1つが存在する、請求項39に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
【請求項４１】
前記キメラが、4位から少なくとも140位までの中断されていないHBcアミノ酸残基配列とともにHBcキメラタンパク質分子のC-末端のシステイン残基を含む、請求項25に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
【請求項４２】
前記キメラが、4位から149位までの中断されていないHBcアミノ酸残基配列を含む、請求項41に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
【請求項４３】
前記キメラが、HBcイムノドミナントループ内に存在する複合エピトープのための異種リンカー残基を含む、請求項25に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
【請求項４４】
前記複合エピトープのための異種リンカー残基が、アミノ酸残基76と85の間のHBc配列のある位置でペプチド結合し、更に76位から85位までのHBc配列の少なくとも4残基が存在する、請求項43に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
【請求項４５】
アミノ酸残基76と85の間のHBc配列は存在するが、前記複合エピトープのための異種リンカー残基によって中断されている、請求項44に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
【請求項４６】
48位及び107位の各システインを置換する残基が、グルタミン、アスパラギン、セリン、アラニン、スレオニン及びリジンからなる群から独立に選択される、請求項25に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互引用
本出願は、仮特許出願60/432,123号（2002年12月10日出願）の優先権を主張する。本出願は、米国特許出願10/080,299号（2002年2月21日出願）及び同10/082,014号（2002年2月21日出願）の部分継続出願としての米国特許出願10/274,616号（2002年10発21日出願）の部分継続出願である。
本発明は、免疫学及びタンパク質工学の学際的分野に関し、特に肝炎ウイルス（HBV)ヌクレオキャプシドタンパク質（HBc）キメラに関する。前記はワクチンの免疫原として有用であり、C-末端及びN-末端のシステイン残基の一方又は両方、並びにHBcの天然の配列の48位及び107位に存在するシステインの一方又は両方の置換を含む。
【背景技術】
【０００２】
ヘパドナウイルス科は、ヒトにB型肝炎を引き起こすエンベロープをもつDNA含有動物ウイルス（HBV）である。ヘパドナウイルス科には、他の哺乳類（例えばウッドチャック（WHV）、地上性リス（GSHV））のB型肝炎ウイルス、並びにアヒル（DHV）及びサギ（HeHV）で見出される鳥類のウイルスが含まれる。本明細書で用いられるB型肝炎ウイルス（HBV）は、考察が非哺乳類ウイルスに言及しないかぎり、鳥類宿主に感染するウイルスと対比される哺乳類に感染するヘパドナウイルス科のメンバーを指す。
哺乳類のB型肝炎ウイルス（HBV又はヘパドナウイルス）のヌクレオキャプシド又はコアは、ウイルスのサブタイプにより183又は185個のアミノ酸残基配列を含むが、一方、アヒルのウイルスキャプシドは262個のアミノ酸残基を含む。いくつかのヘパドナウイルス科のB型肝炎コアタンパク質モノマーは、感染細胞内で自己会合して、Ｂ型肝炎コアタンパク質粒子（HBc粒子）として知られる安定な凝集物を形成する。HBc粒子について2つの三次元構造が報告されている。小集団を構成する第一のものは、ダイマーとして90コピーのHBcサブユニットタンパク質、又は180の個々のモノマータンパク質を含み、第二のものは主要集団であり、ダイマーとして120コピーのHBcサブユニットタンパク質、又は240の個々のモノマータンパク質を含む。これらの粒子はそれぞれT=3又はT=4粒子と称され、この場合 “T”は三角形の形成数である。ヒトに感染するウイルス（ヒトウイルス)のこれらHBc粒子は、直径がそれぞれ約30又は34nmである（Pumpens et al. (1995) Intervirology 38:63-74；Metzger et al. (1998) J. Gen. Virol. 79:587-590）。
【０００３】
Conwayら（Nature 386:91-94 (1997)）は、9Åの解像度で凍結電子顕微鏡写真から決定したヒトHBc粒子の構造を記載している。Bottcherら（Nature 386:88-91 (1997)）はヒトHBcモノマーのポリペプチド折り畳みを記載し、アルファヘリックス領域及びそれらの連結ループ領域が形成するアミノ酸残基の凡その番号を付与したスキームを提供した。Zhengら（J. Biol. Chem. (1992) 267(13):9422-9429）は、1つ又は2つ以上のシステインを欠く変異タンパク質に関する彼らの研究、及び他の研究者のC-末端切端タンパク質に関する研究（Birnbaum et al, (1990) J. Virol. 64:3319-3330）から、コア粒子形成は、アルギニン富裕C-末端ドメイン、核酸の結合、又はジスルフィド結合形成には左右されないことを報告している。
Ｂ型肝炎ヌクレオキャプシド又はウイルスコアタンパク質（HBc）は、免疫された宿主動物のT細胞応答を刺激する免疫原性担体成分として開示された。例えば米国特許4,818,527号、同4,882,145号及び同5,143,726号を参照されたい。この担体の特に有用な応用は、そのイムノドミナントループ部位に外来又は異種B細胞エピトープを提示する能力である。前記ループは約70‐90残基部位に存在し、より一般的には前記タンパク質のアミノ末端（N-末端）から約75から85位であると記載されている（Clarke et al. （1991）F. Brown et al. eds., Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp. 313-318）。
【０００４】
ウイルスの複製中に、HBVのヌクレオキャプシドは、前記ウイルスのRNAプレゲノム、ウイルス逆転写酵素（Pol）及び末端タンパク質（Polに由来する）と結合して複製能力を有するコアを形成する。ヌクレオキャプシドとウイルスRNAプレゲノム間の結合は、カルボキシル-末端（C-末端）に存在するアルギニン富裕ドメインによって仲介される。ウイルスプレゲノムが存在しない異種発現系（例えば大腸菌）で発現される場合、プロタミン様C-末端（すなわち150位から183位の残基）が大腸菌RNAと結合することができる（Zheng et al. (1992) JBC 267(13):9422-9429）。
HBcAgは、異種エピトープの担体であると提唱されているB型肝炎ウイルス由来の粒状タンパク質である。HBsAg（HBs）の相対的免疫原性がHBcAg（HBc）と比較され、種々の遺伝的背景において免疫応答を惹起するそれぞれの能力が比較された（Milich et al. Science 234(4782):1398-1401 (1986)）。前記のデータは、HBsよりもHBcの免疫原性が高く、更に遺伝的背景に関係なくHBcに対して普遍的な応答性が存在することを強調した。  例えば、HBcは、BALB/cマウスでHBsよりも300倍高い免疫原性を有し、更に、B10.S及びB10.MはともにHBsに対して無反応マウスであるが、調べた各株がHBcに対して反応する。これらの結果はワクチン担体としてのHBcの適切性、特にHBsよりも優れていることを再確認し、したがって異種エピトープの担体としてHBsではなくHBcを選択することの適切性が更に確認される。
【０００５】
HBc担体のまた別の利点は、前記は有効性のために強力なアジュバントを必要としないであろうという事実である。これは固有の高い免疫原性によるものである。HBc-P. berghei粒子の免疫原性の比較によって、ミョウバン（人体への使用が承認されている）がIFA又はCFAよりも有効であることが示された（Schdel et al. (1994) J. Exp. Med. 180(3):1037-46）。前記の観察の重要性は、SKBのマラリア候補ワクチンの臨床試験で最近観察された新参のより複雑なアジュバントに付随する毒性の問題のために注目された（Stoute et al. (1997) N. Engl. J. Med. 336(2):86-91）。
ワクチンの担体成分として応用する場合、HBVヌクレオキャプシドは宿主由来の核酸と結合しないことが好ましい。Birnbaumら（J. Virol. 64:3319-3330 (1990)）は、HBVヌクレオキャプシドのプロタミン様C-末端ドメインは、ウイルス様粒子に会合するタンパク質の能力を損なうことなく欠落させることができることを示した。したがって、約144位に短縮されたタンパク質（すなわち1位から約144位のHBc配列を含む）は自己会合することができるが、残基139を超える欠落はキャプシドの会合を停止させる（Birnbaum et al. (1990) J. Virol. 64:3319-3330；Seifer et al. (1995) Intervirology 38:47-62）。
【０００６】
Zlotnickら（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94:9556-9561 (1997)）は、完全長及び切端HBcタンパク質の粒子への会合を調べた。完全長分子の考察の他に、前記著者らは1位から149位のHBc配列を含む切端タンパク質の調製を報告した（前記切端形では、48、61及び107位のシステインが各々アラニンで置換されれ、更に１つのシステイン残基がC-末端（150位）に付加されていた）。前記のC-末端のメルカプタンは電子顕微鏡検査での標識のための金原子クラスターとの結合に用いられた。
更に最近、Metzgerら（J. Gen. Virol. 79:587-590 (1998)）は、ヒトのウイルス配列の138位のプロリン（Pro-138又はP138）が粒子形成に必要であることを報告した。前記の著者らはまた、カルボキシ末端において142残基及び140残基の長さに短縮した粒子の会合能力は影響を受けるが、139及び137残基の長さを生じる短縮では会合能力は完全に失われることを報告した。
切端粒子は標準的なB型肝炎コア粒子と比べて安定性の低下を示すことをいくつかのグループが示した（Galena et al. (1998) J. Virol. 63:4645-4652；Inada et al. (1989) Virus Res. 14:27-48）。前記は、粒子サイズの変動性、及び精製調製物中に粒子フラグメントが存在することによって証明された（Massen et al. (1994) Arch. Virol. 135:131-142）。したがって、上記のMetzgerらの報告の前に、Pumpensら（Intervirology 38:63-74 (1995)）は、自己会合に必要なHBc配列のためのカルボキシ末端の境界はアミノ酸残基130及び144の間に位置し、最初の2つ又は3つのアミノ末端残基を他の配列に置き換えることができるが4つ又は11のアミノ末端残基の排除は、形質転換した大腸菌細胞でのキメラタンパク質の完全な消失をもたらすことを記載して文献の報告を要約した。
【０００７】
種々のポリペプチドの内部挿入を含む、組換えによって作製されたハイブリッドHBc粒子（当業界ではHBcキメラ粒子又はHBcキメラと称される）は、多様な生物（大腸菌、枯草菌（B. subtilis）、ワクシニア、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、ビール酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）を含む）で異種発現によって作製されてきた。例えば以下を参照されたい：Pumpens et al. (1995) Intervirology 38:63-74；及びいくつかの研究者グループの研究が記されている前記文献中の引用文献。
そのようなHBcキメラは、電子顕微鏡で分析したとき、異種エピトープを欠く粒子と比較してしばしば秩序の低い構造を有するようである（Schodel et al. (1994) J. Exp. Med. 180:1037-1046）。いくつかの事例では、異種エピトープのC-末端切端HBc粒子への挿入は、異種発現後にハイブリッド粒子を回収できないほど劇的な安定化喪失の影響を与える（Schodel et al. (1994) Infect. Immunol. 62:1669-1676）。したがって、多くのキメラHBc粒子は不安定で精製中に破壊され、その程度は、前記粒子が回収不能であるか又は極めて低い安定性を示すほどであり、ワクチン開発を困難にしている。
上記の文献（Pumpens et al. (1995) Intervirology 38:63-74）は、挿入されたポリペプチド配列がN-末端、C-末端及び末端間に存在する粒子形成キメラを列挙している。前記文献に報告されている挿入物の長さはN-末端で24から50残基、内部で7から43残基、C-末端で11から741残基である。
【０００８】
最近、Kratzら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:1915-1920）は、238残基の緑色蛍光タンパク質（GFP）を内部融合させた切端HBc配列で構成されたキメラHBc粒子の大腸菌発現について記載した。前記キメラは、HBcのアミノ酸残基79及び80と置換されれた一対のグリシン富裕可撓性リンカーアームによってフランキングされている挿入GFP配列を含んでいた。前記粒子は、ウサギを宿主動物として天然のGFPに対して効果的に抗体を誘発すると記された。
米国特許5,990,085号は、（i）カルボキシ末端切端HBcのイムノドミナントループに残基78と79の間で、及び（ii）カルボキシ末端切端HBcの残基144の後に融合された抗原性ウシインヒビンペプチドから形成された2つの融合タンパク質について記載している。発現された融合タンパク質は、宿主動物に投与されたとき抗インヒビン抗体の産生を誘発すると記載された。前記特許で報告された免疫後30日の力価は比較的低く、ループ挿入を有する融合タンパク質については1:3000から15000で、残基144の後に挿入されたものについては1:100から125である。
米国特許6,231,864号は、ハプテンと結合させた、戦略的に改変したB型肝炎コアタンパク質の製造及び使用を教示する。前記改変コアタンパク質は、ハプテンが付加されている化学的に反応性を有するアミノ酸残基を含む長さが1から約40残基の挿入物を含む。
【０００９】
最近公開されたWO01/27281は、HBcに対する免疫応答は、天然の分子のC-末端システイン含有配列の存在又は欠如によってそれぞれTh1応答からTh2応答に変化させることができることを開示している。前記開示はまた、C-末端システインによるジスルフィド形成は粒子の安定化に役立つと述べている。C-末端システインの直ぐ上流の天然HBc配列のいくつかの残基の存在は好ましいが、要求されないと記載された。切端C-末端HBc配列の置換に用いることが可能なそのような選択肢には、C-末端システイン及びHBc以外のタンパク質からエピトープを区別する随意の配列が含まれると記載された。
公開されたPCT出願WO01/98333は、C-末端のシステイン残基を維持しながら、天然のHBcのC-末端に存在する4つのアルギニンリピートの1つ又は2つ以上の欠落を教示している。前記出願はまた、前記欠落領域をHBc以外のタンパク質のエピトープによって置き換え、前記のようにして形成された分子のHBc部分が添加されたエピトープのための担体として機能できるようにすることを開示している。
本発明の１つのWO02/13765A2及びWO02/14478A2に対応する公開されたPCT出願は、C-末端切端HBc粒子の安定化は、前記粒子が組み立てられるキメラタンパク質で1つ又は2つ以上の添加システイン残基の使用により達成できることを開示している。前記添加されたシステイン残基は、キメラタンパク質のC-末端に存在するか、又はC-末端近くに存在することが示されている。
【００１０】
完全長のHBc粒子の安定性を維持しながら、完全長HBc粒子の核酸結合能力を失わせることができる構造的特徴は、ヘパドナウイルスヌクレオキャプシドデリバリー系を用いたワクチン開発で極めて有益であろう。実際、Ulrichらは、外来エピトープのための担体としてHBcキメラを使用することに関する彼らの最近の総説で、人間のワクチンで前記キメラを使用するために解決すべき潜在的な3つの問題を記載している（Ulrich et al. Adv. Virus Res., 50:141-182 (1998)）。第一の潜在的な問題は、キメラワクチン内の核酸の免疫される宿主への偶然による移送である。第二の潜在的な問題は以前から存在するHBcに対する免疫による干渉である。第三の可能な問題は、長期保存にも耐えることができる完全なキメラ粒子の増殖可能な調製物の要求に関する。
上記の4つのPCT出願公開は、Ulrichらによって開示された潜在的な問題の克服に用いることができる教示を含んでいるように思われる。以下で開示されるように、本発明は、予期に反して高力価の抗体を提供し、更にある特徴ではまたHBcキメラの安定性に関する問題を解決するとともに核酸結合能力のない構築物を提供するまた別のHBcキメラを提供する。更にまた、意図される組換えキメラは、既に存在する抗HBc抗体に対し（もし存在するとすれば）最小限の抗原性を示す。
N-末端切端形のHBcキメラ分子に関する上記の粒子の不安定性に関する発見にもかかわらず、Neirynckら（Nature Med. 5(10):1157-1163, 1999（October））は、完全長のHBcの残基5に融合されているインフルエンザM2タンパク質のN-末端24残基部分を含むHBcキメラの粒子形成が大腸菌発現で生じたことを報告した。HBcの残基4はM2配列の残基24と同一であり、したがって、前記研究者らは残基1から3を欠落させたこともまた記載することができた。
【００１１】
ワクチンへの応用のためにC-末端が切り縮められたハイブリッドHBcの以前に検討された使用によって、それらの完全長の対応物を陵駕するいくつかの利点が提供される。前記利点には、発現レベルの強化及び結合大腸菌RNAの欠如が含まれる。しかしながら、異種エピトープを展示するように創出されたC-末端切端粒子はしばしば不安定で、発現後に結合して安定な粒子構造を形成できないか、又は精製時及び／又は精製後に容易に非粒子構造に分解する粒子を生じる。そのような安定性の欠如は、HBc149位までC-末端が切端されてあり、更にまた残基70から80位で免疫原性ループに挿入された残基を含むキメラHBc分子で構成された粒子によって示される。
他の研究者らは、野生型ヘパドナウイルスコア抗原では、HBcAg開始コドンの上流のシステイン残基は粒子形成の防止に直接関与することを報告した（Schodel et al. (Jan. 15, 1993), J. Biol. Chem. 268(2):1332-1337；Wasenauer et al. (Mar. 1993), J. Virol. 67(3):1315-1322；Nassal et al. (Jul. 1993), J. Virol. 67(7):4307-4315）。前記3グループはいずれも、野生型HBeAgでは、プレコア配列の-7位のシステイン残基（前記は、コア遺伝子が-30位に存在する上流のイニシエーターメチオニンから翻訳されるときに存在する）が粒子形成の防止に必要で、したがって粒子状HBcAgから分泌非粒子状HBeAgへの変化に必要であることを報告した。
【００１２】
Bachmann及び共同研究者ら（Jegerlehner et al. (2002) Vaccine, 20:3104-3112）は、融合構築物（上記のNeirynckらの構築物と実質的に同一）を、本発明者らの1人による米国特許6,231,864号で開示された構築物と類似の複合(conjugated)構築物と比較した。前記複合構築物ではインフルエンザAのM2タンパク質の外部23残基が、C-末端切端HBcのループに創出されたリジン残基にリンカーを介して結合されていた。前記複合物では、HBcループ79位及び80位（プロリン及びアラニン）の残基が、2つのグリシンを含む5ペプチドによってリジン残基のどちらかの側で置換されれていた。Bachmannらの前記キメラはまた、セリン残基によって置換されるシステイン残基を48位及び107位に有していた。著者らが得た免疫後の結果は、N-末端融合タンパク質よりも複合構築物で抗M2力価の増加及び生存強化（6/6に対して0/3）を示した。
前記のキメラタンパク質は粒子を形成し、ポリペプチド又はタンパク質ハプテンと結合することができると記載されている。大腸菌発現粒子はゲルろ過及びヒドロキシアパタイトカラムによって精製された。粒子の正確な会合は、アガロースゲル電気泳動で臭化エチジウム又はクマシーブルー染色を用いたとき単一バンドの存在によって証明されると記載されている。しかしながら、提供された図の精査によれば、天然のHBc粒子と比較したとき改変HBcキメラについては少なくとも2つの染みが示されているようである。前記文献で示された各SDS-PAGEは還元条件下で実施され、したがって会合粒子及び担体と比較したとき置換及び非置換キメラモノマーだけしか見ることができない。
以下で開示するように、本発明は、構築物の核酸結合能力の実質的欠如と同様にHBcキメラの安定性の問題に対する１つの解決を提供し、一方、強力な免疫原性を有する物質を提供する。
【発明の開示】
【００１３】
発明の要旨
本発明は、宿主細胞による発現後に自己会合して粒子を形成する、組換えによって作製されたヘパドナウイルスのヌクレオキャプシドタンパク質（すなわちＢ型肝炎コア（HBc）キメラタンパク質、本明細書ではリコンビナントキメラHBcタンパク質分子、キメラＢ型肝炎コアタンパク質分子、HBcキメラ分子又は単にキメラとも称される）を含むワクチン又は接種物のための免疫原を目的とする。意図されるキメラ分子は、通常は約183位の残基で終了する天然のコア分子に比して少なくともC-末端で切り縮められているであろう。
意図されるリコンビナントキメラＢ型肝炎コア（HBc）タンパク質分子は、長さが約600までのアミノ酸残基である。このキメラは、（a）HBc分子のN-末端183アミノ酸残基、好ましくは163アミノ酸残基、より好ましくはHBc分子のN-末端156アミノ酸残基、もっとも好ましくはHBc分子のN-末端149アミノ酸残基の少なくとも約125のHBc配列を含み、残基4位から約75位及び約85位から約140位のHBc配列を含み、ここで48位及び107位のシステイン残基の一方又は両方が別の残基によって置換されれている。
意図されるキメラ分子はまた、（b）（i）HBcプレコア配列の配列以外の配列中で配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-20位から約+１位に対応するキメラ分子のアミノ酸位に存在する1つから3つのシステイン残基（N-末端システイン残基）、及び（ii）HBc配列のC-末端残基から分子のC末端にむかい、キメラ分子のC-末端側から約30残基内の1つから3つのシステイン残基（C-末端システイン残基）の一方又は両方を含む。
前記キメラ分子は、HBc配列内に約20％までの置換されたアミノ酸残基を含みことができ、更に、以下で考察されるように、リン酸緩衝食塩水（pH7.4）中で粒子が280nmから260nmで好ましくは0.9から約1.7、より好ましくは約1.2から約1.7の吸収比を示すことができるように、宿主細胞による発現時に自己会合して核酸と実質的に結合しない粒子を形成する。前記粒子は、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）で1ヶ月間37℃で保存した後、48位及び107位の両方のシステイン残基を含みその他の点では同一であるHBcキメラ分子から形成される粒子よりも典型的には安定であり、更に、HBcの48位及び107位にシステインを含む粒子よりも典型的には高収量で発現される。
【００１４】
更にまた、場合によって前記キメラは、ペプチド結合により結合された異種アミノ酸残基をN-末端、HBcイムノドミナントループ内（すなわち残基約76から約85位の間）又はキメラのC-末端の1つ又は2つ以上に含む。前記N-末端配列は、場合によって、HBc残基2‐4の1つとペプチド結合した、免疫原性エピトープを含む約75までのアミノ酸残基を含む異種配列を含む。前記HBcイムノドミナントループ配列は、（i）そのまま存在するか又は置換されており、HBcループとは異種で免疫原を構成す1つから約245アミノ酸残基、約40残基までの配列中に存在する抗抗原又は複合ハプテンのための化学反応性リンカー残基とペプチド結合したHBc76位から85位の配列内の0から全ての残基、又は（ii）そのまま存在してあり、欠落及び異種残基を含まない76位から85位のHBcの配列、又は（iii）残基76位から85位の1つ又は2つ以上が存在しないか又は置換されれているものを含むことができる。前記C-末端配列は、HBcにとって異種の配列中に免疫原性エピトープを含む約100までのアミノ酸残基を、HBc183位からC-末端まで、又は好ましくはHBc165位からC-末端まで、より好ましくはHBc156位からC-末端まで、もっとも好ましくはHBc149位からC-末端までの間に含むことができる。
【００１５】
より好ましくは、意図されるキメラは、長さが約380アミノ酸残基までのリコンビナントHBcタンパク質分子を構成する。前記キメラは、（a）HBc分子のN-末端163アミノ酸残基、又はより好ましくはN-末端156アミノ酸残基、最も好ましくはHBc分子のN-末端149アミノ酸残基の少なくとも約125、好ましくは少なくとも約135のHBc配列で、残基4位から約75位、及び約85位から約140位のHBc配列を含み、48位及び107位のシステイン残基の一方、好ましくは両方が別の残基、例えばセリンによって置換されているHBc分子を含む。キメラは、場合によって以下の（i）、（ii）の1つ又は2つ以上を含む：（i）キメラのN-末端、HBcイムノドミナントループ内、及びC-末端の1つ又は2つ以上にペプチド結合された約75残基までの免疫原性配列（ここで前記C-末端配列は163位、好ましくは156位から天然のHBcC-末端までのHBcの配列以外の配列である）、（ii）そのまま存在しているか又は置換されており、更にHBcにとって異種であって免疫原を構成する0から約75、好ましくは1つから約45のアミノ酸残基、好ましくは1つから約40アミノ酸残基の配列中に存在する抗抗原又は複合ハプテンのための化学反応性リンカー残基とペプチド結合した76位から85位の配列の0から全ての残基。
【００１６】
更にまた、意図されるキメラ分子は、（b）（i）HBcプレコア配列の配列以外の配列中に、配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-20位から約+１までのアミノ酸置に対応するキメラ分子のアミノ酸位に存在する（N-末端システイン残基）、又は（ii）HBc配列のC-末端残基からキメラ分子のC-末端側で更に前記キメラ分子のC-末端から約30残基内に存在する（C-末端システイン残基）、又は（i）及び（ii）の両方の位置に存在する1つから3つのシステイン残基を含む。
そのような意図されるキメラ分子は、（c）HBc配列内の約20％までが置換されたアミノ酸残基を含み、更に（d）宿主細胞での発現時に自己会合して、下記で考察されるように、採集時、精製時及び溶解時に、280nmから260nmにおいて0.9から約1.7、より好ましくは約1.2から約1.7の吸収比を示す。
前記の自己会合粒子は、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）で1ヶ月間37℃で保存した後、48位及び107位の両方のシステイン残基を含みその他の点で同一であるHBcキメラ分子から形成された粒子よりも典型的にはより安定である。したがって、残基48位及び107位に存在する一方のシステイン、より好ましくは両方のシステインの欠如は、N-末端もしくはC-末端システイン又は両方のシステインによってまた別のやり方で安定化された粒子の保存安定性を強化することができる。これらシステイン残基の一方又は両方の置換によってキメラ分子の粒子の発現もまた強化することができる。
【００１７】
別の実施態様は、リコンビナントB型肝炎ウイルスコア（HBc）タンパク質キメラ分子を目的とし、前記は約135から約365アミノ酸残基の長さを有し、更にドメインI、II、III及びIVと称されるN-末端由来の4つのペプチド結合アミノ酸残基配列ドメインを含む。
前記キメラ分子のドメインIは約72から約150アミノ酸残基を含み、前記の配列は（i）少なくともHBcの4位から75位までの残基の配列、（ii）48位のシステイン残基の例えばセリンのようなまた別の残基による置換（置き換え）、（iii）HBcプレコア配列の配列以外の配列中で配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-20位から約+１に対応するキメラ分子のアミノ酸位に存在する0から3つのシステイン残基（N-末端システイン残基）、（iv）HBc残基2‐4の1つにペプチド結合した、約75までのアミノ酸残基を含む随意の免疫原性エピトープを含む。
前記キメラ分子のドメインIIは、ドメインIのHBc残基約75とペプチド結合した約85アミノ酸残基までを含み、前記では、（i）HBcの約76位から約85位までの配列中の0から全ての残基が存在するか又は置換されてあり、更にHBcループとは異種で免疫原を構成する1つから約75アミノ酸残基、又は抗抗原若しくは複合ハプテンのための化学反応性リンカー残基を構成する1つから約4 0残基の配列とペプチド結合しているか、又は（ii）約76位から約85位のHBcの配列が存在し、欠落及び異種残基の添加を含まない。
キメラのドメインIIIは、ドメインIIの残基約85にペプチド結合した約86位から約135位のまでのHBc配列であり、前記ドメインでは107位のシステインが別の残基で置換されている。
【００１８】
キメラ分子のドメインIVは以下を含む：
（i）ドメインIIIの135位の残基にペプチド結合した、約136位から約163位まで、好ましくは約156位まで、もっとも好ましくは149位までの5から30残基、
（ii）キメラ分子のC-末端から約30残基内の0から3つのシステイン残基（C-末端システイン残基）、及び
（iii）163位、好ましくは156位、より好ましくは149位からC-末端までのHBcに存在する配列以外の配列の0から約75アミノ酸残基。HBc150位からキメラ分子のC-末端までのキメラ分子の配列は、約10より少ないアルギニン、リジン残基又は両残基の混合物を含む。
この好ましいキメラ分子は、（i）キメラのHBc配列の約10％までのアミノ酸残基が置換されているアミノ酸残基配列を有し、（ii）ドメインI及びIVに記載の0から3つのシステイン残基に由来する少なくとも1つのシステイン残基を有し、更に（iii）宿主細胞による発現時に自己会合して粒子を形成する。上記のようにして形成された粒子は、核酸との結合を好ましくは実質的に含まず、更に好ましくは、48位及び107位の両方のシステイン残基を含みその他の点では同一であるHBcキメラ分子から形成された粒子よりも、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）で1ヶ月間37℃で保存された後でより安定である。
【００１９】
一般的に見れば、48位及び107位に通常存在するHBcシステイン残基は、全ての意図されるキメラ分子で他の残基（例えばセリン）によって置換されれ、更に全ての意図されるキメラ分子は、HBc配列にとっては本来ではない、少なくとも１つのN-末端又はC-末端システイン残基を含む。したがって、いくつかの実施態様では、ドメインIのHBc配列は、少なくとも１つのN-末端システイン残基とともに4位から75位の残基のみを含むのが好ましい。他の実施態様では、意図されるキメラ分子は、N-末端システイン残基だけではなく、上記に単独であると記載されたように、ドメインIV内に１つのシステイン残基を含むことが好ましい（すなわちHBc配列又は別のアミノ酸残基配列内に添加される）。更にまた別の実施態様では、好ましいキメラ分子は、1つ又は2つ以上のC-末端システイン残基のみを含み、ドメインIは、48位のHBcシステイン残基と同様に天然のHBc配列（例えば図1の配列）には存在しないシステイン残基を含まない。HBcシステイン残基は、図1のHBc配列の各々の約61位に存在する。
意図されるワクチン又は接種物は、医薬的に許容できる希釈組成物（典型的にはまた水を含む）に溶解又は分散された免疫応答誘発量の前述の自己会合キメラ分子粒子を含む。意図されるキメラ分子のドメインI、II及びIVの1つ又は2つ以上に存在する特に好ましい非HBcエピトープは、マラリアCSタンパク質由来の免疫原性配列、インフルエンザA M2タンパク質のアミノ末端24由来の配列、Ｂ型肝炎表面たんぱく質（HBs）のプレS1又はプレS2領域由来の配列、又は米国特許5,124,726号（Thorton et al.）（更にその親特許4,882,145号）に開示されたHBc由来の追加T細胞刺激配列、例えば約85位から約100位の配列もしくは約93位から約100位のより狭い領域である。特に好ましいリンカー残基はリジン残基である。
【００２０】
本発明はいくつかの利点及び長所を有する。
本発明の特別な利点は、好ましいキメラ粒子免疫原は、典型的には、48位及び／又は107位に置換されたシステイン残基を含みその他の点では同一のHBcキメラ粒子よりも調製時にはるかに高い安定性を示すということである（一方、核酸を実質的に含まない）。
本発明の長所は、48位及び107位にシステイン以外の残基を含むキメラから形成された粒子は、48位及び107位にシステインを含むキメラタンパク質が会合した粒子よりも迅速にジスルフィド含有粒子を形成するということである。
本発明のまた別の利点は、リコンビナント免疫原は容易に及び周知の細胞培養技術を用いて調製されるということである。
本発明のまた別の利点は、前記免疫原は周知のリコンビナント技術を用いて容易に調製されるということである。
本発明の更に別の利点は、粒子の発現は、48位及び107位の両方にシステインを含む同様なキメラ分子と比較して強化されるということである。
本発明の更に別の利点は、発現された粒子は、48位及び107位にシステインを含む粒子よりも容易に性状を（例えば品質確認の目的のために）調べることができるということである。
更に別の利点及び長所は下記の開示から当業者には明白であろう。
【００２１】
定義
HBcキメラとの関係で使用される数字は、配列番号:1のHBc aywのアミノ酸残基配列内の位置を、前記について付加又は欠落が存在するか否かにかかわらず表示される（HBcキメラでは1つ又は2つ以上の残基が前記配列に付加され又は前記配列から欠落している）。したがって、HBc149はキメラが残基149で終了することを表示し、一方、HBc149＋C150は、当該キメラが、配列番号:1の配列内番号に対応してHBc150位にシステイン残基を含むことを示す。
“抗体”という用語は、免疫グロブリンと称されるグリコシル化タンパク質類のメンバーである分子（前記は特異的に抗原と結合することができる）を指す。
“抗原”という語は、歴史的に抗体又は受容体と結合する物質を意味するために、更に抗体の産生を誘発する物質を意味するために用いられてきた。より最近の使用は、抗原の意味を抗体又は受容体と結合する物質に限定し、一方、“免疫原”という語が抗体産生を誘発するか、又は受容体と結合する物質に用いられる。本明細書で考察される物質が免疫原性であり、更に抗原性を有する 場合は、免疫原又は抗原のいずれとして言及するかは、その意図される使用にしたがって行われる。
“抗原決定基”は、抗体結合部位又はT細胞受容体が免疫学的に結合する抗原の実際の構造部分を指す。前記用語はまた“エピトープ”と互換的に用いられる。したがって、抗原決定基は、抗体産生又はT細胞活性化を刺激する構造であり、そのような構造の存在は、どの構造に抗体が結合するか、又はT細胞活性化を誘発するかを決定することによって確認することができる。
【００２２】
本明細書で用いられる“複合物”という用語は、アミノ酸残基側鎖を介して担体タンパク質に機能的に連結されたハプテンを指す。
本明細書で用いられる“保存的置換”という用語は、あるアミノ酸残基が別の生物学的に類似の残基によって置換されれたことを意味する。保存的置換の例には、１つの疎水性残基（例えばイソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニン）によるもう１つの疎水性残基の置換、又は1つの極性残基によるもう１つの極性残基の置換（例えばアルギニンとリジン、グルタミン酸とアスパラギン酸又はグルタミンとアスパラギンなど）が含まれる。意図される“保存的置換”に含まれるものは、ある哺乳動物のHBc配列（例えば図1の配列）に由来する残基を用いて、別の哺乳動物のHBc配列の同じ位置の残基を置き換えるものである。
ペプチド配列に関して用いられる“対応する（一致する）”という用語は、記載のペプチド配列に約3つまでのアミン酸残基がアミノ末端又はカルボキシ末端の一方又は両方に付加され又は前記から削除されたもので、更に前記ポリペプチド配列の個々のアミノ酸残基に保存的置換のみを含む前記ペプチド配列を意味する。
本明細書では“ドメイン”という用語は、Galibertら（Nature 281:646-650 (1979)）が報告したHBcAg サブタイプayw（配列番号:1）の位置番号に対応する残基位置番号付与によって特定される、リコンビナントHBcキメラ分子の部分を指すために用いられる。少なくともキメラドメインI、II及びIIIのポリペプチド部分は、天然に存在するHBcAgの対応する配列と類似の三次構造で存在すると考えられる。
【００２３】
本明細書で用いられる“融合タンパク質”という用語は、ペプチド結合によってそれらの対応するカルボキシ末端及びアミノ末端のアミノ酸残基間で機能的に末端対末端（頭部対尾部）結合された、自然界では通常は一緒に結合した状態で見出されない少なくとも2つのアミノ酸残基配列を含むポリペプチドを指す。本発明の融合ペプチドは、アミノ酸残基配列中の融合タンパク質のポリペプチドと一致する前記ポリペプチドと免疫反応する抗体の産生を誘発するHBcキメラ分子である。
本明細書で用いられる“Ｂ型肝炎”という語句は、上記で考察されたようにそのもっとも広い意味で哺乳類のヘパドナウイルス科の任意のメンバーを指す。
“ポリペプチド”及び“ペプチド”という語は本明細書では互換的に用いられ、隣接するアミノ酸のα-アミノ基とカルボキシ基との間でペプチド結合によって一方が他方に連結された一連の直鎖状アミノ酸残基を指す。ポリペプチドは種々の長さを有することができ、それらの天然の形態（荷電をもたない）でも、塩の形態でもよい。アミノ酸残基配列は酸性基及び塩基性基を含むこと、及び、ペプチドが示す個々のイオン化状態は、前記ペプチドが溶液の場合は周囲の媒体のpH値に、又は前記ペプチドが固体の場合は前記ペプチドが得られた媒体のpH値に左右されることは当業者にはよく理解されていよう。したがって、“ポリペプチド”又はそれに匹敵する用語には、関連する適切なアミノ酸残基配列が含まれる。ペプチド又はポリペプチドは、本明細書では常に左から右に、アミノ末端（N-末端）からカルボキシ末端（C-末端）の方向で示される。
【００２４】
“残基”という用語は、アミノ酸残基という語句と互換的に用いられる。本明細書で特定される全てのアミノ酸残基は天然型又はL型立体配置である。標準的なポリペプチドの命名法にしたがって（J. Biol. Chem. 243:3557-59 (1969)）、アミノ酸残基の略語は以下の対応表に示されているとおりである。
2006509026.tif 000002
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明は、免疫原性HBcタンパク質、前記タンパク質を含む安定化免疫原性粒子、及び前記安定化粒子を含むワクチン又は接種物を目的とする。意図されるキメラ分子は、好ましくは、天然のコア分子（そのC-末端は、通常は図1の天然のaywサブタイプの残基183位である）に比して少なくともC-末端で切り縮められている。本発明のキメラ分子を含む粒子は、天然のHBcタンパク質（図1）の残基48位及び107位に存在するシステイン残基の一方又は両方の置換、並びにC-末端及びN-末端の一方若しくは両方に又は前記の近くに位置する付加されたシステイン残基の存在によって安定化される。そのような粒子は、以下で考察されるように、好ましくは実質的に核酸との結合を含まない。
より具体的には、本発明のキメラ分子は、ペプチド結合した約600までのαアミノ酸残基、より好ましくは約380残基、もっとも好ましくは約200残基までの長さを有する。前記のように意図されるキメラ分子は、HBcのN-末端183アミノ酸残基、好ましくは163アミノ酸残基、より好ましくはN-末端156アミノ酸残基、もっとも好ましくはN-末端149アミノ酸残基の少なくとも約125、より好ましくは少なくとも約135を含む。存在する前記HBc配列は、残基4位から約75位まで及び約85位から約140位までを含み、前記配列では48位及び107位の一方、好ましくは両方のシステイン残基が別の残基によって置換されれている。
【００２６】
意図されるキメラ分子はまた、（a）HBcプレコア配列の配列以外の配列において配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-20位から約+1位に対応するキメラ分子のアミノ酸位に1つから3つのシステイン（N-末端システイン残基）、及び（b）HBc配列のC-末端残基からキメラ分子のC-末端側で更に前記キメラ分子のC-末端から約30残基内の1つから約3つのシステイン残基（C-末端システイン残基）の一方又は両方を含む。前記キメラ分子は、（i）HBc配列内に約20％までが置換されたアミノ酸残基を含み、更に（ii）宿主細胞による発現時に好ましくは実質的に核酸との結合を含まない粒子に自己会合する。
前記形成された粒子は、下記で考察されるように、リン酸緩衝食塩水（pH7.4）中において0.9から約1.7の280nmから260nmの吸収比を示し、核酸結合を含まないことは、より好ましくは、リン酸緩衝食塩水（pH7.4）において約1.2から約1.7の280nmから260nmの吸収比を示すことによって明示される。形成された粒子は、典型的には及び好ましくは、48位及び107位の両方のシステイン残基を含みその他の点で同一であるHBcキメラ分子から形成された粒子よりも、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）で1ヶ月間37℃で保存した後で（単離後に）より安定である。更にまた、前記キメラは場合によって、キメラのN-末端、HBcイムノドミナントループ内（すなわち残基約76位から約85位の間；HBcループ又は単にループ）、又はC-末端の1つ又は2つ以上にペプチド結合した異種アミノ酸残基配列を含む。分子のN-末端に存在する異種配列は、長さが約75アミノ酸残基までを有することができ、一方、分子のC-末端に存在する異種配列は約100アミノ酸残基までの長さを有することができる。前記分子のN-末端又はC-末端のどちらかに存在するときは、前記異種配列は通常はB-細胞又はT-細胞免疫原性エピトープ、又は前記の両方を含み、好ましくは約75までのアミノ酸残基を含む。HBcループ内に存在する異種配列は、下記に考察するように約245アミノ酸残基までの配列を含むことができる。
【００２７】
前記HBcイムノドミナントループ配列は、（i）そのまま存在するか又は置換されれてあり、HBcループとは異種でエピトープ含有免疫原を構成する1つから約245アミノ酸残基、又約40残基までの配列中に存在する抗抗原若しくは複合ハプテンのための化学反応性リンカー残基とペプチド結合したHBc約76位から約85位の配列内の0から全ての残基を含むことができ、又は（ii）約76位から約85位のHBcの配列が存在し、欠落及び異種残基を含まないか、又は（iii）残基76位から85位の1つ又は2つ以上が存在しないか又は置換されれる。
複合ハプテンのためのリンカー残基を含む約40残基までの異種アミノ酸残基配列は、したがって、抗抗原性残基又は配列が存在できるようにHBcループ内に存在することができる。抗抗原性残基若しくは配列、又は複合ハプテンのための化学的に反応性のリンカー残基を含む残基若しくは配列は、各々好ましくは1つから約40アミノ酸残基を含み、より好ましくは1つから約5残基を含み、もっとも好ましくはただ1つの残基を含む。HBcループ内に存在する前記異種エピトープ含有免疫原配列は、好ましくは約75残基まで、より好ましくは約50残基まで、もっとも好ましくは約25残基までを含むが、上記に記載したように約245残基までは含むことができる。
本明細書で用いられる“抗抗原”という用語は、個々の配列の抗原性（すなわち抗体によって結合される当該配列の能力）を崩壊させることを意味しようとするものである。したがって、抗抗原は免疫原性ループ内に存在することができ、前記が存在するときは、当該残基又は配列は抗体と前記ループとの結合を崩壊させる。前記抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、市場（Institute of Immunology Co., Ltd., Tokyo, Japan）から入手可能な3105と称されるようなモノクローナル抗体を除く。前記モノクローナル抗体はHBc免疫原性ループの先端でアミノ酸残基と結合すると考えられている。複合ハプテンのための化学的に反応性を有するリンカー残基は、ループと結合する抗体の破壊で抗抗原として機能することができる。しかしながら簡便なように、本明細書では、抗抗原性残基又は配列は、化学的に反応性を有する残基（例えばリジン又はシステイン）を欠き、更に抗抗原として機能する残基又は配列であると考えられる。
【００２８】
別の実施態様では、HBc76位及び82位のロイシン及びアルギニン残基は両者ともシステイン残基によって置換されれ、HBc約76位から約85位の配列中に残留する0から全ての残基が存在し、場合によって存在する異種免疫原を構成する1つから約245のアミノ酸残基の配列、約40アミノ酸残基までの配列に存在する抗抗原性配列又は複合ハプテンのための化学的反応性リンカー残基とペプチド結合する。
意図される免疫原性粒子は、リコンビナントＢ型肝炎コア（HBc）キメラタンパク質分子を含み、前記キメラタンパク質分子は長さが約600アミノ酸残基までである。前記キメラタンパク質分子は、（a）HBc分子のN-末端183アミノ酸残基、好ましくは163アミノ酸残基、より好ましくはN-末端156残基、もっとも好ましくはN-末端149残基の少なくとも約125、より好ましくは少なくとも約135残基のHBc配列を含み、前記は、残基4位から約75位及び約85位から約140位のHBc配列を含み、前記配列では48位及び107位の一方、好ましくは両方のシステイン残基が別の残基、例えばセリンで置換されれている。セリンの他に、他の意図されるHBc48位及び107位のシステインの置換にはシステイン以外の任意の残基が含まれる。前記任意の残基には特にグルタミン、アスパラギン、セリン、アラニン、スレオニン及びリジンが含まれる。
HBcキメラ分子配列は、上記で考察したように、場合によって以下を含む：（a'）キメラのN-末端、HBcイムノドミナントループ内、C-末端の1つ又は2つ以上に免疫原性配列を含むペプチド結合した異種アミノ酸配列、又は（b'）1つから約40アミノ酸残基の長さを有し、複合ハプテンのための化学反応性リンカー残基を含むHBcイムノドミナントループ内の異種挿入物、又は（c'）HBc76位から85位の配列の0から全ての残基。
前記キメラ分子はまた、（a'）HBcプレコア配列の配列以外の配列で配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-20位から約+１位に対応するキメラ分子のアミノ酸位の1つから3つのシステイン残基（N-末端システイン残基）、及び（b'）HBc配列のC-末端残基からキメラ分子のC-末端側で更に前記キメラ分子のC-末端から約30残基内の1つから約3つのシステイン残基（C-末端システイン残基）の一方又は両方を含む。
【００２９】
キメラタンパク質分子はHBc配列内に約20％までの置換されたアミノ酸残基を含み、更に、宿主細胞による発現時に核酸との結合を好ましくは実質的に含まない粒子に自己会合する（以下で考察するように、280nmから260nmで約0.9から約1.7の吸収比、好ましくは約1.2から約1.7の吸収比を示す）。前記粒子は、典型的には及び好ましくは、48位及び107位の両方のシステイン残基を含みその他の点では同一であるHBcキメラ分子から形成される粒子よりも、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）で1ヶ月間37℃で保存した後でより安定である。この強化された安定性は、サイズ排除分析クロマトグラフィーで観察されるピーク下の面積の比較により、又は非還元SDSゲルバンドサイズ若しくはタンパク質密度の比較により測定することができる。
したがって、キメラタンパク質は、N-末端、HBc免疫原性（イムノドミナント）ループ又はC-末端に1つ若しくは2つ以上の免疫原性エピトープ、又はイムノドミナントループにリンカー（例えばB細胞又はT細胞エピトープのための）を提示することができ、又は76位から約85位の残基の0から全てを有する。ある実施態様では、キメラタンパク質は、形成時に更なる安定性強化を自己会合粒子に付与することができる1つ又は2つ以上のN-末端システイン残基を含む。別の実施態様では、前記キメラタンパク質はまた、形成時に更なる安定性強化を自己会合粒子に付与することができる1つ又は2つ以上のC-末端システイン残基を含む。意図されるキメラタンパク質分子はまた、N-末端及びC-末端に、又は前記末端近くにシステイン残基を含むことができる。すなわち、キメラタンパク質分子は、上記に定義したようにN-末端システイン残基及びC-末端システイン残基の両方を含むことができる。
【００３０】
意図されるキメラタンパク質は、HBcの150位から183位までの残基を含むことができるが、自己会合粒子が実質的に核酸結合を含まないように、好ましくはHBc残基149位の下流（149位からカルボキシ末端側）のアルギニン及びリジン残基は好ましくはほとんど含まれない。いくつかの実施態様では、アルギニン富裕リピート配列の2つを含む149位から163位のHBc配列が存在する（図1参照）。他の実施態様では、1つのアルギニン富裕配列を含む約156位までのHBc配列が存在する。更に他の実施態様では、C-末端HBc配列はHBc140位と149位の間で終わり、キメラ分子は、図1の天然の配列の150位からC-末端に存在するアルギニンリピート、又は1つ若しくは2つ以上のアルギニン残基の代わりにリジン残基を含む類似の配列を含まない。核酸結合を実質的に含まないことについては以下で考察するが、前記は容易に決定される。
考察を容易にするために、本明細書で言及する意図されるキメラ配列及び配列の残基位置番号は、配列番号:1に示されるヒトＢ型肝炎コアタンパク質サブタイプayw（Galibert et al. (1979) Nature 281:646-650）の配列及び位置番号付けを基準にしている。しかしながら、哺乳類のヘパドナウイルスキャプシドタンパク質配列間の強い類似性及びこれらタンパク質によって示される類似の粒子形成のために（前記は当業者には周知である）、ヒトHBcサブタイプaywに関する考察は、ウッドチャック及び地上性リスのタンパク質と同様にadwサブタイプにも適用できることは理解されよう。このような強い類似性の結果として、本明細書では別に記載がなければ、HBc配列は “HBc”配列として一般的に記載される。
【００３１】
別の実施態様では、意図されるHBcキメラは長さが約380残基までであり、以下を含む：（a）HBc分子のN-末端163アミノ酸残基、より好ましくは156アミノ酸残基、もっとも好ましくはN-末端149アミノ酸残基の少なくとも約125、より好ましくは少なくとも約135のHBc配列であって、残基4位から約75位及び約85位から約140位のHBc配列を含み、前記配列では、上記で考察されたように48位及び107位の一方、好ましくは両方のシステイン残基が別の残基、例えばセリンで置換されれている。
キメラタンパク質分子配列はまた、（a'）HBcプレコア配列の配列以外の配列で配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-20位から約+１位に対応するキメラ分子のアミノ酸位の1つから3つのシステイン残基（N-末端システイン残基）、及び（b'）HBc配列のC-末端残基からキメラ分子のC-末端側で更に前記キメラ分子のC-末端から約30残基内の1つから約3つのシステイン残基（C-末端システイン残基）の一方又は両方を含む。
キメラ分子はまた、HBc配列内で約20％までの置換されたアミノ酸残基を含み、更に、宿主細胞による発現時に核酸との結合を実質的に含まない粒子に自己会合する。好ましくは前記粒子は、48位及び107位の両方のシステイン残基を含みその他の点では同一であるHBcキメラ分子から形成される粒子よりも、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）で1ヶ月間37℃で保存した後でより安定である。意図されるキメラ分子はまた、好ましくは発現量の強化を示す。
【００３２】
前記の実施態様のキメラ分子は、上記で考察したように場合によって、キメラのN-末端、HBcイムノドミナントループ内（すなわち残基約76位から約85位の間）、又はC-末端の1つ又は2つ以上にペプチド結合した異種アミノ酸残基配列を含む。前記HBc免疫原性ループ配列は、（i）そのまま存在するか又は置換されれてあり、HBcループとは異種で免疫原を構成する1つから約245、好ましくは約75までのアミノ酸残基、又抗抗原若しくは存在する複合ハプテンのための化学反応性リンカー残基を構成する約40残基までの配列とペプチド結合したHBcの約76位から約85位の配列内の0から全ての残基、又は（ii）存在する約76位から約85位のHBcの配列であって、欠落及び異種残基を含まないものを含むことができるか、又は（iii）残基76位から85位の1つ又は2つ以上が存在しないか又は置換されれている。
上記で述べたように、意図されるキメラ分子は、（i）図1及び配列番号:1に示されたHBcのN-末端に対して約-20位から約+1位、又は（ii）HBc配列のC-末端残基から分子のC-末端側でキメラ分子のC-末端から約30残基内のどちらか又は両方に位置する少なくとも1つのシステイン残基を含む。負のアミノ酸位の考えは通常はリーダー配列、例えばHBcのプレコア配列に付随する。前記の考えは、あるキメラ分子配列を配列番号:1の配列と単純にアラインメントして、HBcの+1位の開始メチオニン残基の位置に対応するキメラの位置を決定することができるように本明細書では同様に用いられる。アミノ酸残基配列に関する限り、通常は左から右に、N-末端からC-末端の方向で示され、HBc開始メチオニンが占有することができる位置から左へアラインメントされるキメラ分子残基はいずれも負の位置を有する。意図されるシステイン残基は、HBcの開始メチオニンに対応する位置に対してアラインメントされた前記開始メチオニンから左に約20残基の位置に存在することができる。
【００３３】
また別の特徴では、好ましいHBcキメラは、約135から約360のL-α-アミノ酸残基の配列を有し、4つの連続的にペプチド結合したドメイン（すなわちドメインI、II、II及びIV）を含む。前記4つのドメインは、上記で述べたキメラ及び天然のタンパク質と同じ態様で一緒に結合している。すなわち、前記ドメインは互いにペプチド結合し、α-アミノ酸以外の他の残基を含みしたがってペプチド結合を形成できないポリペプチド、D-アミノ酸残基を含むポリペプチド、又は2つ又は3つ以上のポリペプチドがアミノ酸残基の側鎖を介して機能的に結合しているオリゴペプチド複合物とは対照的である。したがって、意図されるキメラHBcタンパク質は通常のリコンビナント技術を用いて発現により製造することができる。
前記キメラ分子のドメインIは約72から約160アミノ酸残基を構成し、その配列は、（i）少なくともHBcの4位から約75位までの残基の配列、（ii）HBcプレコア配列の配列以外の配列において配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-20位から約+1位、好ましくはアミノ酸-14位から約+1位に対応するキメラ分子のアミノ酸位の0から3つのシステイン残基（N-末端システイン残基）、（iii）HBc残基2‐4の1つにペプチド結合した、免疫原性エピトープ（免疫原）を構成する約75アミノ酸残基までを含む随意の配列を含む。前記免疫原性エピトープは、存在するときは、典型的にはB細胞免疫応答を誘発するために用いられるエピトープである。
【００３４】
前記キメラ分子のドメインIIは、ドメインIのHBc残基約75とペプチド結合した約60アミノ酸残基までを構成し、ドメインIIでは、（i）HBcの約76位から約85位の配列中の0から全ての残基が存在しているか又は置換されれてあり、更にHBcと異種で免疫原を構成する1つから約50アミノ酸残基、又は抗抗原を構成するか若しくは複合ハプテンのための化学反応性リンカー残基を含む1つから約40アミノ酸残基の配列とペプチド結合しているか、又は（ii）76位から約85位のHBcの配列が存在し、更に異種残基の添加を含まない。
本キメラ又は別のキメラでHBc約76位から約85の配列中の残基が存在せず、HBcにとって異種である1つから約50アミノ酸残基にペプチド結合している状況では、前記の残基は存在せず、約75位のHBc残基は、異種配列のN-末端に直接結合し、そのC-末端残基はHBc約86位の残基とペプチド結合する。HBc約76‐85の全ての残基が存在しない状況は好ましくなく、前記配列から少なくとも4つの残基が存在するのが好ましく、更に10個の残基全て又は置換が存在するのが好ましい。
ある好ましい実施態様では、76位から85位の10残基の配列（76‐85位配列）が存在するが、前記は、1つから約50残基の免疫原含有配列、又は1つから約40残基の抗抗原含有若しくはリンカー含有配列によって中断される。別の実施態様では、HBc76‐85位の前記10個配列が、HBc76位及び82位に2つのシステイン残基置換とともに存在し、更に上記のとおりの50残基までの中断配列を含む。
ドメインIIIは、ドメインIIの残基85にペプチド結合した86位から135位までのHBc配列である。
キメラ分子のドメインIVは以下を含む：（i）ドメインIIIの135位の残基とペプチド結合した、136位から約149位のHBcアミノ酸残基配列の5から約14残基、（ii）キメラ分子のC-末端から約30残基内の0から3つのシステイン残基（C-末端システイン残基）、及び（iii）HBc約150位からC-末端までのHBcには存在しない免疫原性配列中の0から約75アミノ酸残基。
HBc約136位から約163位の配列がドメインIVに存在することができるが、キメラのHBc部分は配列の156位で停止するのが好ましい。好ましくは、ドメインIVは、HBcの前記位置には存在しない配列中に0から約50アミノ酸残基の配列を含み、より好ましくは、前記配列は0から約25残基である。したがって、約163位から183位の領域に存在しないHBc由来の更なる配列の使用はドメインIVについて意図される。そのような配列の1つはHBc85位から100位又は93位から100位のT細胞エピトープである。ドメインIVはまた、好ましくは1つのシステイン残基を分子のC-末端に、又はC-末端近くに含む。
【００３５】
キメラ分子は、（i）そのアミノ酸残基配列において約10％までのアミノ酸残基がキメラのHBc配列で置換されているアミノ酸残基配列を有し、更に（ii）宿主細胞による発現時に自己会合して粒子を形成する。前記粒子は実質的に核酸との結合を含まず、好ましくは、48位及び107位の両方のシステイン残基を含みその他の点では同一のHBcキメラ分子から形成された粒子よりも、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）で37℃で1ヶ月間保存された後でより安定である
ある特徴では、意図されるキメラ分子は、HBc残基2‐4の1つとN-末端でペプチド結合したエピトープを含む配列を含む。別の特徴では、意図されるキメラ分子は、イムノドミナントループ内のHBc残基76と85の間に位置する分子の中央近くでペプチド結合した、免疫原含有、抗抗原又はリンカー残基含有配列を含む。更に別の特徴では、免疫原含有配列は、HBc残基136‐149の1つ又は残基140‐156の1つ又は残基140‐163の1つとペプチド結合してキメラ分子のC-末端部分に位置する。
更にまた他の特徴では、2つ若しくは3つの免疫原含有配列が上記の位置に存在するか、又は1つ若しくは2つの免疫原含有配列がエピトープのためのリンカー残基と一緒に存在する。多重免疫原が2つ又は3つの位置で同じであっても、又は特定の免疫原のダイマー又はトリマーが1つ又は2つ以上に存在してもよい。これらのキメラ分子の各々は、上記で考察したように、N-末端又はC-末端システイン残基の一方又は両方を含む。これら免疫原、キメラ分子及びぞれらの自己会合粒子のいくつかの具体的な例は以下で考察される。
【００３６】
ある好ましいキメラ分子は約130から約355アミノ酸残基を含むことができ、48位及び107位のシステイン残基の一方又は両方のための置換残基を含み、天然に存在するHBc分子に存在しないN-末端又はC-末端安定化システイン残基が少なくとも1つ付加される。いくつかの好ましい実施態様では、HBc残基4が存在し、一方残基2‐4は他の好ましい実施態様で存在し、したがってドメインIはHBc残基4、3又は2で開始し残基75（すなわちHBc75位のHBc残基）まで続くことができる。残基1は、メチオニンDNA開始コドンのアミノ酸）である。キメラがN-末端免疫原性配列又はシステイン残基を含む場合は、ただ1つの開始シグナルがコードDNA又はRNAに存在することができるように、通常はHBcの1位に存在する天然のメチオニンは存在しないであろう。
ドメインIはまた、HBcプレコア配列の配列以外の配列において配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-20位から約+１、好ましくはアミノ酸-14位から約+1位に対応するキメラ分子のアミノ酸位に0から3つのシステイン残基（N-末端システイン残基）を含む。
ドメインI又はドメインIIのイムノドミナントループに存在することができる異種免疫原性免疫原は、好ましくは約15から約50残基を含み（ただし約6アミノ酸残基の短いエピトープが抗体を誘発することができ更に抗体によって認識され、したがって有用である）、更にドメインIのN-末端に約75残基の配列が存在することができる。
76位から85位までのドメインIIのHBc残基の全てが存在するのが好ましい（ただし1つ又は2つ以上の他の残基によって中断されている）。ドメインIIは好ましくは少なくとも4つの残基を含む（前記は発現又は使用に干渉しない任意の配列であろう）が、これら残基は、好ましくは75位と85位の残基の間の配列の一部分である。ある実施態様では、ループ76位と82位の残基は変異が誘発され、システイン残基によって置換されれてその結果更なるループの安定化を達成することができる。
【００３７】
ドメインIIIは残基85にペプチド結合したHBc残基86から135を含む。
ドメインIVは少なくとも5残基の配列を含み、前記配列は、（i）残基135にペプチド結合した、HBc136位から140位、又は残基163まで、好ましくは156位まで、より好ましくは149位まで；（ii）0から3つのシステイン残基を含み；更に（iii）場合によって、特にHBc配列が残基140で終わるとき、約75残基までの免疫原性エピトープの配列を含むことができるが、約25残基までの短い配列がより好ましい。
前記ドメインIV免疫原性配列は好ましくは、約163位からHBcC-末端に由来するHBcの配列にとって異種である。前記免疫原性配列は、ドメインIVに存在するときは好ましくはT細胞エピトープであるが、ドメインI及びIIの一方又は他方に通常存在するB細胞エピトープでもよい。HBc配列由来の、HBsのpreS1及びpreS2由来の、並びに他の供給源由来のB細胞及びT細胞エピトープ例は、以下の表A及びBで提供される。
ドメインIVはまた0から3つのシステイン残基を含むことができ、これらのシステイン残基はキメラ分子のカルボキシ末端（C-末端）の約30残基内に存在する。好ましくは1つのシステイン（Cys）残基が存在し、好ましくは前記Cysは、T細胞エピトープがドメインIVの部分として存在しない場合はカルボキシ末端（C-末端）残基として存在する。そのようなT細胞エピトープが存在するときは、好ましいCysはHBcキメラのC-末端の最後の5残基内に好ましくは存在する。
【００３８】
ある実施態様では、特に好ましいキメラは2つの免疫原性エピトープ配列を含む。これら2つの免疫原性エピトープ配列は、ドメインI及びII、又はII及びIV、又はI及びIVに存在する。前記2つの免疫原性エピトープ配列の1つはいくつかの実施態様では好ましくはB細胞エピトープである。他の実施態様では、前記2つの免疫原性エピトープ配列の1つはT細胞エピトープである。より好ましくは、前記2つの免疫原性エピトープは異なるB細胞及びT細胞エピトープである。更にまた、複数のB細胞エピトープがB細胞エピトープの配置場所に存在することができ、同様にT細胞エピトープの配置場所に複数のT細胞エピトープが存在することができる。
キメラ分子が免疫原性エピトープ配列をドメインIIに含む実施態様では、前記配列は1つ又は2つ以上のB細胞エピトープを含み、アミノ酸残基76と85の間のHBc配列は存在するが、免疫原性エピトープによって中断されてあり、キメラは更に1つ又は2つ以上のT細胞エピトープをHBc残基140‐156の1つとペプチド結合したドメインIV内に含むのが好ましい。
この同じ好ましい形態は、複合エピトープのための異種リンカー残基がドメインIIに存在するキメラ分子についても維持され、それによってドメインIIで1つ又は2つ以上の免疫原性エピトープを提供し、残基76と85は存在するが異種リンカー残基によって中断され、T細胞エピトープはHBc残基140‐156の１つとペプチド結合して存在する。そのようなキメラ分子から形成される粒子は、典型的には約1:4から1:1の複合エピトープ対C-末端ペプチド結合T細胞エピトープの比を含み、約1:2の比が一般的である。
【００３９】
上記のキメラ分子の例示構造では、複合エピトープのための異種リンカー残基はドメインIIに存在し、T細胞エピトープはドメインIVに存在し、追加B細胞エピトープはドメインIIには存在しない。下記で考察するように抗ループモノクローナル抗体の結合によりELISAアッセイで測定したとき、そのようなキメラはT細胞エピトープの免疫原性を示すが、HBc抗原性は最低限示されるだけである。
意図される好ましいHBcキメラ分子は、約135から約360残基の配列を含む。各々が約15から約75残基の好ましい長さを有する1つ又は2つの免疫原性エピトープ及び約140から約156残基の好ましい長さのHBc部分を含む好ましいHBcキメラ分子は、約170から約280アミノ酸残基の配列長を有する。1つ又は2つの免疫原性エピトープを含む特に好ましいキメラ分子は、約190から約225残基の長さを有する。追加される免疫原性エピトープを含まない特に好ましいキメラ分子は、約140から約156残基の長さを有する。N-末端及びC-末端HBc部分の長さの多様性並びに免疫原性ループに挿入できるいくつかの意図されるエピトープの種々の長さを考慮して、広い範囲のキメラ分子の長さが意図されることは理解されるところである。
【００４０】
宿主細胞による発現後に、意図されるリコンビナントタンパク質は自己会合して、実質的に核酸との結合を含まない粒子を形成する。意図されるHBcキメラ粒子は一般的に球状の形状で、与えられた調製について通常均質なサイズを有する。したがって、これらのキメラ粒子は、類似の形状及びサイズを有する天然のHBc粒子に類似し、感染者から回収することができる。
意図されるキメラ粒子は上記で考察したキメラ分子を含む。より広く、そのようなキメラ粒子は、N-末端163残基の少なくとも約125、好ましくは少なくとも約135の配列を有し、更に（i）N-末端、C-末端又はイムノドミナントループの1つ若しくは2つ以上とペプチド結合した免疫原性エピトープ、又はイムノドミナントループ内のエピトープのための異種リンカー残基、及び（ii）上記で述べたようにN-末端及びC-末端の一方又は両方に1つから3つのシステイン残基、並びに135位から少なくとも1つの5HBc残基配列を含む、キメラC-末端切端HBcタンパク質を含む。
意図される粒子は、ドメインIVのアルギニン及び／又はリジン残基を好ましくはほとんど含まず、その結果自己会合粒子は実質的に核酸結合を含まず、以下で考察するように約0.9から約1.7、より好ましくは約1.2から約1.7の280/260吸収比を示す。したがって、好ましいキメラタンパク質は163位から183位の間でHBc配列を含まず、より好ましいキメラタンパク質は156位から183位の間でHBc配列を含まない。特に好ましいHBcキメラ分子は、HBc149位からキメラ分子のC-末端まで9つ未満のアルギニン及びリジン並びにそれらの混合物を含む。
【００４１】
意図される粒子によって示される核酸結合の実質的欠如は、水溶液中での粒子の280及び260nmの両方における吸収を比較することによって（すなわち280/260吸収比）容易に決定できる。意図される粒子は、タンパク質の発現に用いられる微生物細胞に本来存在するオリゴマー及び／又はポリマーDNA並びにRNA種である核酸と実質的に結合しない。そのような核酸は260nmで吸収を、更に280nmで比較的低い吸収を示し、一方、タンパク質（例えば意図されるキメラ）は260nmで比較的低い吸収を示し、280nmでより強い吸収を示す。
したがって、残基150‐183（又は150‐185）位（当業者には時にプロタミン領域と称される）にアルギニン富裕及びリジン富裕配列を含む、組換えにより発現させた完全長のHBc粒子又はキメラHBc粒子は、約0.8の280nm吸収対260nm吸収比（280/260吸収比）を示す。163位までのHBc配列を含む粒子は約0.9から約1.0の280/260吸収比を示し、核酸のために臭化エチジウムで陽性に染色される。
他方、ドメインIVにアルギニン及びリジンをほとんど含まず、その結果自己会合した粒子が核酸結合を実質的に含まない粒子、例えば天然に存在するHBcのアルギニン富裕核酸結合領域を含まない粒子（3つ未満のアルギニン又はリジン又はそれらの混合物を互いに隣接して含むもの、又はHBc残基約140位から149位で終わる天然の配列又はキメラ配列を有するもの）は、約1.2から約1.7の280/260吸収比を示す。より典型的な280/260吸収比は約1.4から約1.7である。前記の範囲は、大半が、与えられたキメラHBc粒子のドメインII及びIVに存在する芳香族アミノ酸残基の数に依るものである。
【００４２】
上記で考察したN-末端及び／又はC-末端システインの存在によって、安定な免疫原性粒子を形成するキメラ分子の能力の強化が提供される（下記で考察）。更にまた、N-末端及び／又はC-末端システイン残基によって提供される安定性に加えて、48位及び107位の一方又は両方の本来のシステインの置換によって形成される粒子の安定性が強化される。したがって、意図されるHBcキメラ粒子の免疫原は、分析用サイズ排除クロマトグラフィー及び非還元SDS-PAGE分析で測定したとき、採集及び最初の精製時に一緒に留まる傾向を有する（その詳細は下記で考察される）。
意図される粒子は、典型的及び好ましくは、48位及び107位の両方のシステイン残基を含みその他の点で同一であるHBcキメラ分子から形成された粒子よりも、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）で1ヶ月間37℃で保存された後でより安定である。安定性の強化の例は下記の実施例で更に詳細に考察される。意図される好ましいキメラHBcタンパク質のドメインIは、少なくともアミノ酸残基4位から75位で始まるHBcのアミノ酸残基配列を構成し、ドメインIIIは86位から135位のHBc配列を構成する。前記ドメインは、図1に示される天然の配列に存在するシステイン残基について48位及び107位の一方又は両方で別の残基による少なくとも１つの置換を含む。哺乳類のヘパドナウイルスいずれの配列もドメインI及びIIIのどちらかのために用いることができ、2つ又は3つ以上のウイルス由来の配列を1つのキメラで用いることができるが、48位及び107位の一方又は両方のシステイン残基の記載の置換は用いられるいずれの配列とも合致する。好ましくは、更に構築の容易さのために、ヒトのayw配列がキメラの全体を通して用いられる。
【００４３】
最初の3つのアミノ末端（N-末端）残基の欠失よりも多くを含むドメインIを有するHBcキメラは、大腸菌細胞でのHBcキメラタンパク質の完全な消失をもたらすことが報告された（Pumpens et al. (1995) Intervirology 38:63-74）。他方、インフルエンザM2タンパク質由来の免疫原性23残基ポリペプチドがHBcのN-末端配列に融合させた最近の研究で、天然のHBc配列の残基1‐3を置換したとき生成された融合タンパク質は粒子を形成することが報告された（Neirynck et al. (October, 1999) Nature Med. 5（10）:1157-1163）。したがって、従来技術は、HBcの残基2‐4の1つに付加アミノ酸配列がペプチド結合して存在するときは粒子を形成することができるが、追加される配列が存在せず、更に残基1‐3より多い残基がHBcのN-末端から欠落する場合は粒子は形成されないことを教示している。
HBcの最初の5つのN-末端残基の1つとペプチド結合したN-末端エピトープ配列は、ただ1つのシステイン残基、又は免疫原性配列を含む約30残基までの配列を含むことができる。1つから3つのシステイン残基が前記配列内の都合のよい位置に存在することができるが、典型的には、付加されるN-末端のシステイン残基が、配列番号:1に示されるようにHBcのN-末端に対して約-20から約+1位に存在するように、より好ましくは約-14から約+1位に存在するように、付加される配列のC-末端近くに存在する。典型的な配列は、B細胞又はT細胞エピトープ、例えば以下で考察及び例示されるようなもの（それぞれ表A及び表B）、2つのシステイン残基を含む上記のNeirynckらのインフルエンザM2タンパク質由来の23残基ポリペプチド、及び少なくとも約6残基を含む前記配列の変種、使用発現系の結果として融合タンパク質として生じるまた別の（異種）タンパク質の配列（例えばβ-ガラクトシダーゼ）、又は別のＢ型肝炎関連配列、例えばPreS1若しくはPreS2領域又は主要HBsAg免疫原性配列である。
【００４４】
ドメインII（ループ領域）は0から約255アミノ酸残基の配列を含む。これらの残基のうちで、0（無）、及び好ましくは少なくとも4残基、より好ましくは少なくとも8、もっとも好ましくは10が約76位から約85位のHBc配列の部分を構成し、更に1つから約245残基、好ましくは1つから約50残基がHBcにとって異種（外来）であるか、又はHBcの約76‐85位には少なくとも存在しないで、免疫原性配列（例えばB又はT細胞エピトープ）、抗抗原配列又はハプテン結合用の化学反応性残基を含む配列と一致する。
より具体的には、イムノドミナントループに存在する異種配列は、（i）エピトープ、例えばB細胞又はT細胞エピトープのための異種リンカー残基、又は抗抗原残基若しくは配列を含む約40までの残基の配列、又は（ii）好ましくは6から50、より好ましくは約15から約50、もっとも好ましくは約20から約30アミノ酸残基を含む免疫原性B又はT細胞エピトープを構成することができる。これら1つ又は2つ以上の残基は、0又は好ましくは少なくとも4、より好ましくは少なくとも8残基、又はHBc配列の76位から85位の残基の全ての間でペプチド結合できるように配置される。免疫原性B細胞エピトープ配列は好ましくはHBc配列にペプチド結合されるか、又は前記文献は参照により本明細書に含まれる位置でリンカー残基によって結合される。B細胞エピトープの使用は以下で例証しながら考察する。
【００４５】
好ましくは、ループ（ドメインII）に存在する前記好ましい少なくとも4HBc残基は、１つの配列の全て、例えば前記82‐85であってもよく、又は、残基76‐77と84‐85が存在する場合若しくは残基76と83‐85が存在する場合のように異種リンカー残基のいずれかの側に分割されてあっても（フランキングしていても）よい。より好ましくは、ドメインIIは、残基76から85までのHBc配列の少なくとも8残基を含む。もっとも好ましくは、76位から85位までの10残基の全ての配列がキメラに存在する。
HBcループ配列に付加される1つから約245残基はHBc配列にとって異種であっても、又は約76‐85位のHBc配列以外の1つ又は2つ以上の免疫原性部分に一致していてもよい。したがってそのような配列はHBcの挿入位置にとって異種である。ただ1つの付加される異種残基は、上記で考察したように、B細胞エピトープ又は抗抗原のための異種リンカー残基であってもよい。より長い配列、典型的には少なくとも6残基の長さから50アミノ酸残基の長さまで、より好ましくは約15から約50残基の長さまでが（ただし制限部位によってコードされる異種残基を除く）、上記で述べたように、免疫原（例えばB細胞又はT細胞エピトープ）を含む配列内に存在する。
意図されるキメラの発現後のリンカー残基への結合のため、及びキメラのN-末端、免疫原性ループ内又はC-末端の1つ若しくは2つ以上でのHBcキメラ内での発現のために有用な典型的ペプチドB細胞エピトープは下記の表Aに、前記配列が得られた遺伝子に与えられた一般名称、発表されたエピトープの引用文献若しくは特許、及び配列番号とともに例示されている。
【００４６】
2006509026.tif 000003
【００４７】
2006509026.tif 000004
【００４８】
2006509026.tif 000005
【００４９】
2006509026.tif 000006
【００５０】
2006509026.tif 000007
【００５１】
2006509026.tif 000008
【００５２】
2006509026.tif 000009
【００５３】
2006509026.tif 000010
*発表されたエピトープの引用は以下の表Bで提供される。
【００５４】
配列番号:44のインフルエンザA M2ポリペプチド配列、X1X2X3X4X5X6X7X8X10X11X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X22X23X24について：
残基X1からX8は欠如しているか又は存在し、存在する場合は、M2タンパク質配列に天然に存在する残基で、それぞれメチオニン、セリン、ロイシン、ロイシン、スレオニン又はプロリン、グルタミン酸、バリン及びグルタミン酸であるが、ただし下付文字を有する1つのX残基が存在するときは、より大きな8までの下付数字をもつ残余の下付文字の有るXもまた存在することを条件とし、
X10は存在し、プロリン、ロイシン又はヒスチジンであり、
X11は存在し、イソロイシン又はスレオニンであり、
X13は存在し、アスパラギン又はセリンであり、
X14は存在し、グルタミン酸又はグリシンであり、
残基X15及びX16は存在するか又は欠如し、存在する場合はそれぞれトリプトファン及びグリシン、又はグルタミン酸であり、
残基X17及びX19は存在するか又は欠如し、存在する場合はそれぞれ別個にシステイン、セリン、又はアラニンであり、
残基X18は存在するか又は欠如し、存在する場合はアルギニン又はリジンであり、更に
残基X20からX24までは存在するか又は欠如し、存在する場合は、M2タンパク質配列に天然に存在する残基であって、それぞれアスパラギン又はセリン、アスパラギン酸又はグリシン、セリン、セリン及びアスパラギン酸であり、ただしただし下付文字を有する1つのX残基が存在するときは、より小さな15までの下付数字をもつ残余の下付文字の有るXもまた存在することを条件とする。
同様に、配列番号:39の上記の好ましいインフルエンザA M2配列では：
残基X1からX8は欠如しているか又は存在し、存在する場合は、M2タンパク質配列に天然に存在する残基で、それぞれメチオニン、セリン、ロイシン、ロイシン、スレオニン、グルタミン酸、バリン及びグルタミン酸であるが、ただし下付文字を有する1つのX残基が存在するときは、より大きな8までの下付数字をもつ残余の下付文字の有るXもまた存在することを条件とし、
X15及びX16は存在するか又は欠如し、存在する場合はそれぞれトリプトファン及びグリシンであり、
残基X17及びX19は存在するか又は欠如し、存在する場合はそれぞれ別個にシステイン、セリン、又はアラニンであり、
残基X18は存在するか又は欠如し、存在する場合はアルギニンであり、更に
残基X20からX24までは存在するか又は欠如し、存在する場合は、M2タンパク質配列に天然に存在する残基であって、それぞれアスパラギン、アスパラギン酸、セリン、セリン及びアスパラギン酸であり、ただしただし下付文字を有する1つのX残基が存在するときは、より小さな15までの下付数字をもつ残余の下付文字の有るXもまた存在することを条件とする。
【００５５】
異種残基又は配列のどちらかの側に存在するドメインIIの残りの残基は、好ましくはHBc76位から85位の残基である。したがって、実施例（残基78から82が置換されている）では、ドメインIIのキメラ配列は76から77で、制限部位コード残基、免疫原性（エピトープ）配列、更なる制限部位コード残基、及び続いてHBc配列84から85が続く。残基78と79の間への挿入によって調製されたキメラの典型的な配列は、2位から78位、その後に制限部位コード残基、免疫原性配列、更なる制限部位コード残基及びHBc配列79から85が続いている。他の意図されるキメラのドメインIとII間の配列は、前記の説明及び以下の例示から明らかで、列挙する必要はないであろう。
複数のグリシン残基を含み、更に上記記載の髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）B細胞エピトープ配列のC-末端でペプチド結合した約5から約9残基の長さを有する短い親水性ペプチドが、前記配列を含むキメラ粒子の発現で役立つことが判明した。有用な短いペプチドは、文献（Karpenko et al. (2000) Amino Acids 18:329-337）に開示されもので、配列番号:169のGSGDGEGGの配列を有する。
既に述べたように、複合エピトープのための異種リンカーはHBc配列のアミノ酸76位と85位との間の位置でペプチド結合される。免疫原性エピトープでの事例のように、残基76から85のHBc配列は好ましくは存在するが、複合エピトープのための異種リンカーによって中断される。このキメラは、好ましくは、キメラタンパク質のN-末端又はC-末端近くのシステイン残基とともに4位から少なくとも140位のHBc配列を含む。より好ましくは、2位から149位のHBc配列は存在するが、残基76と85の間で複合エピトープのための異種リンカー残基によって中断され、更にキメラ分子はC-末端システインを含む。
【００５６】
複合エピトープのための異種リンカーはもっとも好ましくはリジン（K）残基である。グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン及びシステイン残基もまた、チロシン及びシステイン残基を用いることができるように、リンカー残基として用いることができる。例えば3つのリジン配列のように2つ以上のリンカーが存在してもよいと記載されているが、不均質な複合（複合ハプテンは第一のキメラのあるリンカーに結合し、第二のキメラでは別のリンカーに結合する）がそのような使用で形成されるのでそのような使用は好ましくない。米国特許6,231,864B1は、1つ又は2つ以上の連結残基を含むがN-末端安定化システイン残基を欠くHBcキメラ分子を開示している。
更にまた、意図されるHBcキメラに存在する免疫原性エピトープ含有配列はまた、免疫原性（エピトープ）配列の一方又は両側にある（フランキングしている）“可撓性リンカーアーム”によって分離できることもまた特記される。これは、特に、前記免疫原性配列が約30アミノ酸残基を超える長さである場合である。典型的な可撓性リンカーアーム配列は、典型的には約4から約10のグリシン残基を含み、前記は、そうでなければいっぱいになっているループ配列を外側に膨れ上がらせ、更なる安定性を前記構築物に付加することを可能にする。これらの可撓性リンカーアームは、髄膜炎菌B細胞エピトープ配列（例えば配列番号:125のペプチド）に関して上記で考察したものと類似する。他の可撓性リンカーアーム配列の例は文献（Kratz et al. (March 1999) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96:1915-1920）に開示され、以下のアミノ酸残基配列によって表される：
GGGGSGGGGT    配列番号:170
GGGGSGGGG     配列番号:171
直ぐ下の配列は、挿入されるエピトープ含有配列のC-末端で利用され、一方、その後の配列は、挿入される免疫原性配列のN-末端及びC-末端の各々で用いられる：
GSGDEGG       配列番号:172
GGGGSGGG      配列番号:173
【００５７】
上記に記載したように、ドメインIIIは86位から135位のHBc配列を構成する。結果として、ドメインI及びIIのために上記で考察した例示キメラの配列は、第一に考察したキメラが84位から140位までのHBcの配列を有し、第二に考察したキメラが79位から140位のHBcの配列を有するように伸長することができる。
ドメインIVは、（i）約136位から約140位までのHBc配列、場合によって149位まで、156位まで、又は低優先的に163位まで、又は183位までのHBc配列を含む配列、（ii）0から約3つまでのシステイン（Cys）残基を含む配列、及び（iii）163位から、より好ましくは156位からC-末端までのHBcにとって好ましくは異種である免疫原性配列中の約75までのアミノ酸残基を含む配列を収納し、ただし、ドメインIVはHBc配列の136位から140位までの少なくとも5つのアミノ酸残基を含むことを条件とする。ドメインIVの免疫原性配列はより好ましくは約50アミノ酸残基を含み、もっとも好ましくは約25アミノ酸残基を含む。したがって、ドメインIVの配列は、約163位からC-末端までのC-末端HBc配列を除く実質的に任意の配列である。
【００５８】
ドメインIVの配列の長さは、5残基（すなわち136位から140位の残基）、約125アミノ酸残基まで（約HBc183位までに加えて免疫原性配列の約75免疫原性残基）（合計3つまでのシステイン残基を含む）であり、意図されるキメラタンパク質が全長約135から約580残基を有することができるように十分な長さを有する。ドメインI又はIIの一方又は両方とペプチド結合したエピトープが、これらのエピトープのために好ましいようにそれぞれ約30まで又は約50までの残基を含む場合、ドメインIVエピトープを含むキメラ分子のより好ましい長さは約150から約280残基である。2つの免疫原性エピトープを含む特に好ましいキメラ分子は長さが約190から約210残基を有する。生じた粒子が核酸結合を含まないことは、上記で考察したように280/260吸収比を測定することによって決定される。
ドメインIV配列は0から3つまでのCys残基を含むことができる。Cysが存在する場合は、1つ又は2つ以上のCys残基は、キメラ分子のC-末端から約30残基内に、好ましくはキメラタンパク質分子のC-末端に又は約5アミノ酸残基内に存在することが好ましい。更にまた、2つ以上のCys残基がドメインIV配列内に存在する場合は、前記Cys残基は互いに隣接するのが好ましい。
ドメインIV配列は、目的のキメラを免疫原として用いようとしている生物のための1つのT細胞エピトープ、複数のT細胞エピトープ（同じ又は異なっている）、又は更に追加のB細胞エピトープを含むのが好ましい。典型的なドメインIVのT細胞エピトープ配列は下記の表Bに、表Aのように下線を付した例示の付加C-末端システイン残基（C）とともに提供されている。
【００５９】
2006509026.tif 000011
【００６０】
2006509026.tif 000012
【００６１】
2006509026.tif 000013
*下線を付したC（C）は天然配列に由来するものではない。
【００６２】
引用文献：
2006509026.tif 000014
2006509026.tif 000015
【００６３】
別の有用なT細胞エピトープはPADREエピトープ（米国特許6,413,517号（Sette et al.）参照）と称される合成配列である。ある典型的なエピトープは文献（Alexander et al. (1994) Immunity 5:751-761）に記載され、配列AKFVAAWTLKAAA（配列番号:233）を有する。
残基4位から少なくとも140位までのHBcのアミノ酸配列が、好ましくは意図されるキメラ分子及び粒子に存在する。より好ましくは2位から149位及び約163位までの配列が存在する。B細胞エピトープは、（前記が存在する場合は）好ましくは残基76と85の間に存在する。通常HBcの48位及び107位に存在するシステイン残基の一方又は両方が、別の残基によって置換されれる（置換される）。既に記載したように、少なくとも1つのシステイン残基がドメインIのN-末端に若しくはその近くに存在し、又は以前に考察したようにC-末端若しくはその近くに存在する。1つ又は2つ以上のT細胞エピトープもまた、HBc配列へのN-末端又はC-末端付加として存在できる。意図されるリコンビナントHBcキメラは実質的に結合核酸を含まない。通常HBcの48位及び107位に存在するシステイン残基の一方又は両方が置換されているキメラ粒子は、前記置換を含まない類似の粒子（すなわち、48位及び107位にシステインを含むキメラ）よりも安定である。
意図されるリコンビナントHBcキメラ分子は、典型的には自己会合粒子として存在し、使用される。これらの粒子は180から240キメラ分子（90又は120ダイマー対）、通常は240キメラ分子を含み、前記はジスルフィド還元剤（例えば2-メルカプトエタノール）の存在下でタンパク質分子に分離され、個々の分子はしたがって主としてジスルフィド結合によって粒子中に一緒に結合していると考えられる。観察された安定性の強化は48位及び107位のシステインの一方又は両方の欠如のためと考えられる。
【００６４】
これらの粒子は、HBV感染患者で観察される粒子と類似するが、前記粒子は感染性をもたない。種々の原核及び真核宿主による発現時に、個々のリコンビナントHBcキメラ分子は会合して粒子を形成し、前記粒子は宿主細胞、両者の栄養溶液から容易に採集でき、所望の場合には精製することができる。
上記に記載したように、HBcイムノドミナントループは、通常は無傷のタンパク質のアミノ末端（N-末端）から約75位から約85位に位置するといわれている。ドメインIIの免疫原性エピトープ含有配列は前記イムノドミナントループ配列中に配置される。前記配置は実質的にHBcの免疫原性及びHBcループ配列の抗原性を除去するが、一方、前記免疫原性配列又はリンカー残基を会合キメラ粒子の極めて免疫原性の高い位置に提示する。
上記で考察したN-末端及びC-末端の短縮、種々のエピトープ及びスペーサーの挿入の他に、目的のキメラ分子はまた、HBcドメインI、II、III及びIVを構成するアミノ酸残基で保存的置換を含むことができる。保存的置換は以前に定義したとおりである。保存的置換の例示は、2位及び3位の残基（アスパラギン酸及びイソロイシン；DI）のグルタミン酸及びロイシン（EL）残基による置換で認められる（前記EL残基は、所望のN-末端エピトープ（N-末端システイン残基を含む）をコードする核酸を付加するために用いられるEcoRI制限部位によってコードされる）。更に別の例は、7位及び97位のリジン残基のアルギニンによる置換、並びに48位及び107位のシステインのセリン残基による置換である。
より稀なものでは、“非保存的”変更、例えばグリシンのトリプトファンによる置換、又はシステインのアラニン残基による置換が意図される。類似の軽微な変化にはまたアミノ酸の欠落、挿入又は前記の両方が含まれよう。生物学的活性又は粒子形成を停止させることなく、どのアミノ酸残基を置換、挿入又は欠落させることができるかの決定は、当分野で周知のコンピュータプログラム、例えばLASERGENEソフト（DNASTAR Inc., Madison, Wis）を用いて見つけることができる。
【００６５】
本発明のキメラ分子のHBc部分、すなわち付加された免疫原、抗抗原、リンカー、可撓性リンカーアームの配列もしくは残基又は制限酵素の人工的産物である異種残基以外のものを含むHBc配列は、もっとも好ましくは図1に示すサブタイプayw（配列番号:1）のアミノ酸残基配列であって、一端又は両端での短縮のために欠如しているサブタイプaywの任意の部分を差し引いた配列を有する。典型的には、前記配列はHBc2位から149位又は156位の配列である。いくぶん優先性が低いものは、サブタイプadw、adw2及びadywのアミノ酸残基配列に一致するもので、前記もまた図1（配列番号:2、3及び4）に示されている。更に優先性が低いものは、ウッドチャック及び地上性リスのアラインメントを実施した2位から149位又は2位から156位の配列であり、前記は図1の最後の2つの配列（配列番号:5及び6）である。いずれかに記載したように、異なる哺乳類のHBcタンパク質に由来する異なる配列の部分をただ1つのキメラに一緒に用いてもよい。
上記に記載した本発明のキメラ分子のHBc部分が2位から約183位に対応する哺乳類のHBc分子の配列以外を有する場合、前記アミノ酸残基の約20％までが、2位から183位、好ましくは2位から163位までの配列番号:１に匹敵するように置換される。約10％まで、より好ましくは約5％まで、もっとも好ましくは約3％までのアミノ酸残基が、配列番号:1の2位から163位に匹敵するように置換される。
【００６６】
したがって、183のHBc残基を有する意図されるキメラは、配列番号:1の残基とは2位から183位で、好ましくは約18残基で異なっている。より好ましくは、約9残基がayw配列（配列番号:1）と残基2‐183位で異なり、もっとも好ましくは約5残基が異なる。より短い配列、例えば2‐149又は2‐156又は2‐163における相違は上記で考察したものと百分率にしたがって比例する。ドメインIIのイムノドミナントループ又は末端以外では置換は好ましくはキメラ分子の非ヘリックス部分に存在し、粒子の形成の担保に役立つ典型的には残基2から約15及び残基24から約50の間に存在する。例えば以下を参照されたい：Koschel et al. (1999) J. Virol. 73(3):2153-2160。
HBc配列が163位を超えてC-末端で又はN-末端で短縮されている場合、又はイムノドミナントループ内に1つ又は2つ以上の欠落を含む場合、配列の全長が163残基未満であるために置換される残基数は比例的に減少する。分子のどこか別の場所での欠落は、計算のために保存的置換と考えられ、その結果、例えばドメインIIIが135位の代わりに133位にC-末端を有することができ、2つの残基は計算のために存在すると仮定されるであろう。
【００６７】
キメラの製造
目的のキメラHBc免疫原は、典型的には周知のリコンビナントDNA技術を用いて製造される。したがって、具体的なポリペプチド配列をコードする核酸配列が、HBcをコードする前駆体配列に付加され又は前記前駆体配列から欠落されて、目的のキメラをコードする核酸が形成される。
目的のキメラ免疫原の例では、典型的にはN-末端システインとしてインフルエンザA M2配列に存在するシステインが利用される。HBc分子をコードするポリヌクレオチドのin vitro変異導入によるそのようなキメラ分子の製造のためのプライマーは以下で考察される。システイン含有M2ポリペプチドエピトープがN-末端に存在しない場合は、N-末端システインは、単にM2ポリペプチドのシステイン含有部分をコードするプライマー又は単純なN-末端開始配列（例えばMet-Cys-又はMet-Gly-Cys-）を用いてin vitro変異導入により提供することができる。
上記に記載したように、HBcイムノドミナントループは、無傷のタンパク質のアミノ末端（N-末端）から約75位から85位に通常位置するといわれている。
前記例示のインフルエンザAM2 B細胞エピトープ含有配列をドメインIIのイムノドミナントループ配列に配置することができる。前記配置は、実質的にHBcの免疫原性及びHBcループ配列の抗原性を減少させ、一方、会合キメラ粒子の極めて免疫原性の強い位置にインフルエンザAM2 B細胞エピトープを提示する。
ループ配列内に異種エピトープ配列を配置するためには2つの手法のうち1つが好ましい。第一の手法は置き換えと称され、前記ではイムノドミナントループの部分をコードするDNAが切り出され、異種エピトープ（例えばB細胞エピトープ）をコードするDNAで置換されれる。第二の手法は挿入と称され、前記では異種エピトープはループ内の隣り合う残基間に挿入される。
【００６８】
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いる位置特異的変異導入をある典型的な置き換えアプローチで用いて、一対の異なる制限部位（例えばEcoRIとSacI）（イムノドミナントループをコードするDNAの各末端に近い制限部位）をコードするキメラHBcDNA配列を提供する。置換される典型的な残基は76から81である。ループコード部分を切り出し、異種B細胞エピトープをコードする所望の配列を制限部位に連結し、得られたDNAを用いてHBcキメラの発現に用いる。前記技術の典型的な使用のために、例えばPumpensら（Intervirology 38:63-74 (1995)）の報告の表2を参照されたい。
また別には、ただ1つ又は2つの制限部位を前記領域に導入し、DNAを制限酵素で切断し、“粘着”又は平滑端を提供し、適切な粘着端又は平滑端をもつ異種DNAセグメントを前記切断領域に連結することができる。このタイプのHBcへの配列置換の例は、以下の文献に報告された実験で見出すことができる：Schodel et al. (1991) F. Brown et al. eds., Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp.319-325；Schodel et al. Behring Inst. Mitt. 1997(98): p.114-119；Schodel et al. J. Exp. Med. (1994) 180(3):1037-4。後者の2つの文献は、それぞれマラリアの病原体、P.イエーリー（P. yoelii）及びP.ベルゲイ（berghei）に対するワクチンの製造を論じている。イムノドミナントループから正味の残基の除去をもたらす置換手法は通常本明細書では用いない。
HBc免疫原性ループ内の挿入位置及びループ残基の存在は、免疫原の活性にとって重要である。したがって、公開されたPCT出願、PCT/US01/25625及びPCT/US01/41759に説明されているとおり、HBc残基78と79との間におけるマラリアのB細胞エピトープの置き換えは、残基76と81の間を切り出して置き換えた領域内に同じ免疫原を配置したものより10倍から1000倍強い免疫原性を有する粒子状免疫原を提供する。更にまた、残基78と79の間に同じマラリア免疫原を配置したものは、残基77と78の間に配置したものと比較して、予期に反して約15倍の免疫原性の強化を提供した。
【００６９】
したがって、一般的に挿入が好ましい。挿入手法の説明例では、位置特異的変異導入を用いて互いに隣接し、隣接アミノ酸をコードするコドン例えば残基78及び79のアミノ酸残基）の間に2つの制限部位が作出される。この技術では、もとは隣接していたHBcループ内の残基の間に4つのアミノ酸残基（各制限部位に対して2つ）をコードする12の塩基対が付加される。
制限酵素による切断、異種B細胞エピトープ配列をコードするDNAの連結、及びHBcキメラ形成のための発現時に、HBcループアミノ酸配列は、そのN-末端側で5'制限部位によりコードされる2つの残基によって、続いてC-末端側で異種B細胞エピトープによって、続いて3'制限部位によりコードされる更に2つの異種非ループ残基、続いてループ配列の残余によって中断されるのが認められる。この同じ手法を用いて、Neirynckら（Nature Med. 5(10):1157-1163 (1999)）が報告したように、ドメインIにN-末端システイン又はN-末端配列を挿入し、又はドメインIVにT細胞エピトープ又は1つ若しくは2つ以上のシステイン残基を挿入することができる。残基82と83の間の挿入を用いる類似の手法が報告された（Schodel et al. (1990) F. Brown et al. eds., Vaccines 90, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp.193-198）。
【００７０】
より具体的には、C‐末端短縮HBc配列（HBc149）をコードするDMA配列が隣接するEcoRI及びSacI部位を残基78と79の間に含むように細工する。前記DNAを両酵素で切断して、EcoRIの粘着3'末端を有するHBc1‐78をコードする1つのフラグメントを提供し、一方、他方のフラグメントは5'末端SacI粘着末端を有し、79‐149位の残基をコードする。5'-AATTオーバーハングを有し、その後に所望のB細胞エピトープをコードする配列及びAGCT3'オーバーハングが続く合成核酸の連結によって、残基78と79の間の各々の側に2つの異種残基（それぞれGlyIle（GI）及びGluLeu（EL））がフランキングしたB細胞エピトープをコードするHBcキメラ配列が提供される。前記キメラ配列で通常EcoRI部位は破壊され、SacI部位は温存される。
類似の手法が、システイン含有配列、例えば326位から345位のP.ファルシパルム（falciparum）CSタンパク質配列（本明細書ではPF/CS326-345（Pf-UTC）と称する）を含むマラリアT細胞エピトープのドメインIVへの挿入に用いることができる。ここでは、EcoRI及びHindIII制限部位を149位のアミノ酸残基の後に作出する。EcoRI及びHindIIIによる消化の後、T細胞エピトープコード配列、1つ又は2つ以上の終止コドン及び3'AGCTオーバーハングがその後に続く上記のAATT5'オーバーハングを有する合成DNAを前記消化した配列に連結し、HBc1‐149残基とそれに続く2つの異種残基（GI）、異種T細胞エピトープ、終止コドン及びHindIII部位をコードする配列を形成する。
【００７１】
残基79位で開始するHBcをコードする配列が続くSacI制限部位を有するフォワードプライマーを用いたPCR増幅、それに続くSacI及びHindIIIによる消化によって、ＨＢc79‐149とともに2つに付加された残基及びC-末端のT細胞エピトープをコードする配列が提供される。前記構築物のSacI及びHindIIIによる消化及びその後のB-細胞含有構築物との連結によって、HBcのN-末端から1‐78位、2つの付加残基、B細胞エピトープ（例えばマラリアエピトープ）、2つの付加残基、HBc79‐149、2つの付加残基及びT細胞エピトープを有する、図2Cに示された所望のリコンビナントHBcキメラ免疫原をコードする完全な遺伝子が提供される。
類似の技術を用いて、B細胞エピトープの複合のための異種リンカー残基をループ領域配列に配置することができる。意図されるリンカー残基には、リジン（Lys）（前記は特に好ましい）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、システイン（Cys）及びチロシン（Tyr）が含まれる。
配列番号:1で示されるアミノ酸残基はGlu及びAsp残基を77位及び78位に含むことを記載しておく。それにもかかわらず、更に追加される異種カルボキシル含有残基の導入が意図される。現存のグルタミン酸及びアスパラギン酸の化学反応性は他の要因によって低下するであろう。例えば、近傍のプロリン（例えば79位に見出されるようなもの）は、基部のカルボキシル基の化学反応性を中和しこれを低下させることができる。
ここでは、第一に記載した挿入手法を用い、5つの異種残基をループ配列に配置する。すなわち、１つはB細胞エピトープを複合させるための異種リンカー残基であり、前記1つの残基のいずれかの側で隣接する2つの残基であってそれら自身もまたループ配列残基に隣接し、更に挿入された制限部位の発現生成物（制限酵素の人工産物）である残基。B細胞エピトープのための異種リンカー残基をコードするただ1つのコドンをHBcループ配列に付加するために位置特異的変異導入をまた用いることができることを記載しておく。
【００７２】
B細胞又はT細胞エピトープのいずれかの側に（フランキングする）2つの異種残基を使用するのは便利さのためであることを記載しておく。結果として、HBc配列の部分ではない0から3つ又は4つ以上の付加残基を挿入される配列の一方の側又は両側に用いることができる。挿入物及びHBc核酸の一方の端又は両端を適切なヌクレアーゼ（例えばS1ヌクレアーゼ）で“咀嚼し”一緒に連結することができる平滑端を提供する。挿入されるB細胞又はT細胞エピトープの部分でもなく、HBc配列の一部分でもない付加異種残基は、以下で考察される構築物のいくつかでGluLeuがAspIleを代替する場合のように、前記残基がすでに存在する残基のための保存的置換でない限り表示のドメインに存在する残基数には数えられない。
タバコ（Nicotiana tabacum）の59残基のリブロースビス-ホスフェートカルボキシラーゼ-オキシゲナーゼシグナルペプチドをコードする177塩基対のDNAの合成について米国特許5,656,472で考察され説明されているように、所望のリコンビナントHBcキメラ核酸の全部又は一部を周知の合成方法を用いて合成できることもまた書き留めておく。例えば、ドメインIII及びIVに連結することができる平滑端又は“粘着端”を用いてドメインI及びIIを合成し、意図されるHBcキメラ（B細胞エピトープのN-末端側に0から3つの付加残基及びC-末端側に又はドメインII/III結合部に又は他のいくつかの所望位置に0から3つの付加残基を含む）を発現する構築物を提供することができる。
また別の挿入技術は文献に報告された：Clarke et al. (1991) F. Brown et al. eds., Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp.3131-318）。ここでは遺伝暗号の縮退を利用し、前記研究者らは、残基80及び81位に本来存在する残基をコードする残基80及び81に一致するただ1つの制限部位を作出した。したがって彼らが発現させたHBcキメラは制限部位コード残基を含まず、挿入配列のすぐ隣のHBcループ残基を含んでいた。
上記に記載したHBcキメラ分子又は前記コード配列の相補物もまた本発明に包含される。いくつかの好ましい実施態様では、そのような核酸セグメントは単離又は精製形中に存在する。
【００７３】
生きている生物では、タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸残基は、前記タンパク質をコードする遺伝子のデオキシリボ核酸（DNA）と遺伝暗号を介して直接的関係を有する。したがって、遺伝暗号の周知の縮退により、同じキメラアミノ酸残基をコードするが、先に考察した遺伝子配列とは十分に異なる（2つの配列は高ストリンジェンシーではハイブリダイズしないが中等度のストリンジェンシーでハイブリダイズする）付加DNA及び対応するRNA配列（核酸）を所望のように調製することができる。
高ストリンジェンシー条件は、約50℃−55℃の温度で6ＸSSC中でのハイブリダイゼーション、及び68℃の温度で1−3ＸSSC中での最終的洗浄を含むと定義できる。中等度のストリンジェンシー条件は、約50℃から約65℃の温度で0.2から0.3MのNaCl中でのハイブリダイゼーション、続いて約50℃から約55℃で0.2ＸSSC、0.1％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）中での洗浄を含む。
（1）それ自体又はその相補鎖がコードする核酸配列（DNA配列又はRNA配列）、残基4位から136位のそのHBc部分が（存在する場合には）配列番号:1、2、3、4、5又は6であり、更に（2）配列番号:234、235、236、237、238又は239のDNA配列と少なくとも中等度のストリンジェンシー（下記を参照されたい）でハイブリダイズするキメラ分子；更に（3）そのHBc配列が少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、更に好ましくは少なくとも95％、もっとも好ましくは100％の同一性を配列番号:234、235、236、237、238及び239のDNA配列と共有するキメラ分子はDNA変種配列と定義される。周知のように、例えば本発明の核酸のような核酸配列は、本明細書のいずれかの場所で考察されるように適切なプロモーターと機能的に連結されたとき適切な発現系で発現する。
【００７４】
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【００７５】
目的のキメラ分子をコードする同族体又は同族核酸（DNA又はRNA）配列もまた本発明の部分として包含される。キメラ同族体核酸配列又はその相補性核酸配列は、少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、もっとも好ましくは少なくとも95％が、配列番号:1、2、3、4、5又は6に示される残基4位から残基140位のHBc配列部分と同一であるHBcアミノ酸残基配列をコードする。前記DNA又はRNAは本明細書では、配列番号:234、235、236、237、238及び239の核酸の配列の“同族体”又は前記と“同族である”と称され、配列番号:234、235、236、237、238及び239の核酸配列又はそれらの相補鎖と中等度ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。同族配列をコードする核酸はまた、適切なトランスフェクション及び発現時に目的のキメラを生成する。
種々の宿主がしばしば個々のアミノ酸残基をコードするために用いられるそれぞれのコドンに対して優先性を有する。そのようなコドンの優先性は周知であり、所望のキメラ配列をコードするDNA配列はin vitro変異導入を用いて変更し、それによって前記酵素が発現される宿主に優先的なコドンを個々の宿主のために利用することができる。更にまた、遺伝暗号の縮退を用いて、配列番号:1、2、3、4、5若しくは6のDNA又はそれらの相補鎖との実質的な同一性を回避した配列番号:234、235、236、237、238及び239の配列のHBc部分をコードすることができる。したがって、有用な同族DNA配列は、配列番号:234、235、236、237、238及び239のヌクレオチド配列又は相補鎖と中等度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするとは限らないが、なお目的のキメラ分子を提供することができる。
【００７６】
上記に述べた目的のキメラをコードする遺伝子を示す外因性核酸セグメント（例えばDNAセグメント又は配列）、及び適合宿主生物で前記遺伝子の発現を駆動するために適したプロモーターに機能的に連結されたベクターを構成するリコンビナント核酸分子（例えばDNA分子）もまた本発明で意図される。より具体的には、キメラ又はDNA変種（配列番号:234、235、236、237、238及び239のキメラ遺伝子と少なくとも90％同一性を有し、更に前記遺伝子と中等度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする）のHBc部分のための遺伝子を表すDNAセグメントに機能的に連結された、宿主細胞でのキメラの発現を駆動させるためのプロモーターを含むベクターを構成するリコンビナントDNA分子もまた意図される。
更に意図されるものは、配列番号:1、2、3、4、5又は6の配列のHBc部分と少なくとも80％同一、より好ましくは90％同一、もっとも好ましくは95％同一性を有するHBcキメラ部分のアミノ酸残基をコードする同族体核酸配列であるDNAセグメントに機能的に連結された、宿主細胞でのキメラの発現を駆動させるためのプロモーターを含むベクターを構成するリコンビナントDNA分子である。前記リコンビナントDNA分子は、適切なトランスフェクション及び宿主細胞による発現時に目的のキメラ分子を提供する。
地上リスのHBcの30アミノ酸残基のN-末端配列は他のいずれのHBc配列ともアラインメントすることができないことを記載しておく。前記の配列及びそのコード核酸配列並びにそれらの相補鎖は上記の同一性のパーセンテージに含まれず、ハイブリダイゼーションの測定で用いられる前記30残基配列又はその相補鎖をコードする核酸の部分でもない。同様に、HBcのN-末端及びC-末端のどちらか又は両端で短縮された配列は同一性の計算に含まれず、イムノドミナントループの残基が異種エピトープの挿入のために除去されるそれら配列でもない。したがって、キメラ分子に存在する前記HBc-コード塩基又はHBc配列残基のみが同一性の百分率の計算に含まれ、アラインメントされる核酸又はアミノ酸残基配列と比較される。
【００７７】
本明細書に開示した遺伝子のコード配列は配列番号:234、235、236、237、238及び239に示されているので、その単離核酸セグメント（好ましくはDNA配列）、変種及び同族体（遺伝子の最初のコドンATGで始まり、各遺伝子の終止コドンの直ぐ下流で終わる）は、当分野で周知であり文献（Current Protpcols In Molecular Biology, Ausabel et al. eds., John Wiley & Sons (New York: 1987), p. 8.1.1-8.1.6）でも考察されているin vitro変異導入によって調製することができる。したがって、所望の制限部位は、開始コドンで又は開始コドンの上流で、及び終止コドンの下流で作出し、それによって前記のまた別の遺伝子を調製し切り出し単離することができる。
当分野で周知のように、要求される核酸（明示すればDNA配列）（開始及び終止シグナルを含む）が存在する限り、追加される塩基対は通常は前記セグメントのどちらかの末端に存在することができ、前記セグメントはなおタンパク質発現に利用することができる。前記の場合、もちろんのこと、発現を抑制したり、発現されるべき所望の酵素を消費する更なる生成物を発現させたり、当該所望の酵素によって精製される所望される反応生成物を消費する生成物を発現したり、又は別の態様で前記DNAセグメントの遺伝子の発現に干渉したりする機能的に連結されたDNA配列が前記セグメントに存在しないと仮定される。
したがって、前記DNAセグメントがそのような干渉DNAセグメントを含まない限り、本発明のDNAセグメントは長さが約500から約15000塩基対であろう。リコンビナントDNA分子、特に発現ベクターの最大サイズは、複製及び発現（所望される場合）に必要な最小限のDNA配列の全てが存在するならば、主に便利さ及び宿主細胞に収容できるベクターサイズによって決定される。最小限のベクターサイズは周知である。そのような長いDNAセグメントは好ましくはないが用いることができる。
【００７８】
上記で述べたキメラをコードするDNAセグメントを化学的な技術、例えばMatteucciら（J. Am. Chem. Soc.. 103:3185 (1981)）のホスホトリエステル法によって合成することができる。もちろん、コード配列を化学的に合成することによって、本来のアミノ酸残基配列をコードする塩基を適切な塩基で置換することにより、簡単に所望の改変のいずれも実施することができる。しかしながら、上記で考察した配列を含むDNAセグメントが好ましい。
目的のHBcキメラは多くの形質転換宿主系、典型的に宿主細胞で製造する（発現させる）ことができるが、ただし無細胞（in vitro）系発現もまた意図される。前記の宿主細胞系には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：微生物、例えばリコンビナントファージ、プラスミド、又はコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス；タバコモザイクウイルス）又は細菌発現ベクター（例えばTiプラスミド）で形質転換した植物細胞系；又は適切に形質転換させた動物細胞系、例えばCHO、VERO又はCOS細胞。本発明はまた用いられる宿主細胞系によって制限されない。
HBcキメラをコードする遺伝子を含むDNAセグメントは、好ましくは前記遺伝子を含むリコンビナントDNA分子（プラスミドベクター）から得られる。キメラ遺伝子をHBcキメラタンパク質に発現させることができるベクターは、本明細書では“発現ベクター”と称される。
【００７９】
発現ベクターはプロモーターを含む発現制御エレメントを含む。キメラコード遺伝子は発現ベクターに機能的に連結され、前記プロモーター配列がRNAポリメラーゼの結合及びキメラコード遺伝子の発現を指令することを可能にする。誘発性プロモーター、ウイルスプロモーター、合成プロモーター、文献に記載された（Poszkowski et al. (1989) EMBO J. 3:2719;及びOdell et al. (1985) Nature 313:810）構成的プロモーターの他時間的制御プロモーター、空間的制御プロモーター、時間的空間的制御プロモーター（Chua et al. (1989) Science 244:174-181）がポリペプチドコード遺伝子の発現に有用である。
原核細胞（例えば大腸菌）での使用に好ましいプロモーターはRec7プロモーターであり、前記は外因的に供給されるナリジクス酸によって誘発することができる。より好ましいプロモーターはプラスミドベクターJHEX25（Promega Corp.から入手できる）に存在し、前記は、外因的に供給されるイソプロピル-β-D-チオガラクト-ピラノシド（IPTG）によって誘発することができる。更に好ましいプロモーター、tacプロモーターはプラスミドベクターpＫＫ223-3に存在し、外因的に供給されるIPTGによってまた誘発することができる。PKK233-3プラスミドは、多数の大腸菌株、例えばXL-1、TB1、BL21及びBLRで、約25から約100μＭのIPTGを誘発に用いて良好に発現させることができる。驚くべきことには、約25から約50μＭのIPTG濃度が２Lのシェーカーフラスコ及び発酵装置で最適結果を提供することが判明した。
【００８０】
免疫原として使用する粒子供給源として、並びに完全細胞の弱毒生ワクチン及び接種物として上記のHBcキメラ粒子を含む免疫原性トランスジーンの発現のために、サルモネラのいくつかの株、例えば腸チフス菌（S. typhi）及びネズミチフス菌（S. typhimurium）並びにネズミチフス菌-大腸菌ハイブリッドがこれまでに用いられた。本明細書では前記の発現及びワクチン接種系を用いることができる。米国特許6,024,961号；同5,888,799号；同5,387,744号；同5,297,441号；Ulrich et al. (1998) Adv. Virus Res. 50:141-182；Tacket et al. (Aug 1997) Infect. Immun. 65(8):3381-3385；Schodel et al. (Feb 1997) Behring Inst. Mitt. 98:114-119；Nardelli-Haefliger et al. (Dec. 1996) Infect. Immun. 64(12):5219-5224；Londono et al. (Apr. 1996) Vaccine 14(6):545-552及び前記文献中の引用文献を参照されたい。
真核細胞に適合する発現ベクター、例えば酵母細胞に適合するもの又は高等植物若しくは哺乳動物細胞に適合するものもまた本明細書で意図される。そのような発現ベクターもまた本発明のリコンビナントDNA分子の生成に用いることができる。酵母、例えばビール酵母菌（S. cerevisiae）又はピキア=パストリス（Pichia pastoris）で使用されるベクターは、周知のように染色体外に存在しても、又は組み込まれてもよい。真核細胞発現ベクターは当分野では周知で、いくつかの市場供給元から入手できる。通常は、そのようなベクターは1つ又は2つ以上の便利な制限部位を所望のDNAセグメント及びプロモーター配列の挿入のために含んでいる。場合によって、そのようなベクターは真核細胞での使用に特異的な選別性マーカーを含む。ビール酵母菌で使用される典型的なプロモーターには、ビール酵母菌のホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーター及び派生プロモーターGAL10及びGAL1が含まれ、一方、アルコールオキシダーゼ遺伝子（AOX1）はピキア=パストリスのための有用なプロモーターである。
【００８１】
例えば、メチロール栄養性酵母P.パストリスでキメラを生成するために、ピキアでの構造遺伝子の発現を指令する調節配列の制御下に所望のキメラをコードする遺伝子を配置する。得られた前記遺伝子の発現能を有する形態をピキア細胞に導入する。
より具体的には、Creggら（Biotechnology 5:479-485 (1987)及びMolecular and Cellular Biology 12:3376-3385 (1987)）の記載した形質転換及び発現系を用いることができる。キメラV12.Pf3.1のための遺伝子をアルコールオキシダーゼ遺伝子（AOX1）プロモーターの下流及び同じAOX1遺伝子の転写ターミネーター配列の上流に配置する。続いて前記遺伝子及びそのフランキング調節領域をプラスミドに導入する。前記プラスミドは、P.パストリスHIS4遺伝子及びP.パストリスARS配列（自律的複製配列）の両遺伝子を含み、それらはP.パストリス細胞内でのプラスミドの複製を可能にする（Cregg et al. (1987) Molecular and Cellular Biology 12:3376-3385）。
ベクターはまたプラスミド（例えばpBR322）の適切な部分を含み、大腸菌細胞内でのプラスミドの増殖を可能にする。キメラ遺伝子とともに上記に記載した種々の付加エレメントを含む得られたプラスミドは、例示のようにP.パストリスを形質転換してhis4変異体、すなわち機能的なヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子を欠く株細胞が得られる。
形質転換コロニーをヒスチジンを欠く培地上で選別した後、Creggら（Molecular and Cellular Biology 12:3376-3385 (1987)）の記載にしたがって細胞をヒスチジンを欠くがメタノールを含む培地で増殖させて、AOX1プロモーターを誘発する。誘発されたAOX1プロモーターは、P.パストリスでキメラタンパク質の発現及びキメラ粒子の生成を引き起こす。
【００８２】
目的のキメラ遺伝子はまた組み込み形質転換によって導入してもよい。前記は、Creggら（Molecular and Cellular Biology 12:3376-3385 (1987)）が記載したように、ARS配列の使用を必要としない。
哺乳動物細胞でのリコンビナントDNA発現によるキメラ粒子の産生は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞でキメラ遺伝子を発現することができるリコンビナントDNAベクターを用いて例示のように実施される。前記は、当分野で周知であり、文献（Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratories (1989)）に詳細に記載された方法を用いて達成される。
ある例では、サルウイルス（SV40）系発現ベクター、pKSV-10（Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ）が、NcoI及びHindIIによる制限エンドヌクレアーゼ消化に付される。実施例１に記載したように調製した所望のHBcキメラをコードするNcoI/HindIII配列フラグメントを発現プラスミドに連結し、それによって、pSV-Pfと称される環状リコンビナント発現プラスミドが生成される。
前記発現プラスミドpSV-PFは完全な大腸菌アンピシリン耐性遺伝子を含む。大腸菌RR101（Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD）は、したがってpSV-PFで形質転換されたとき、前記プラスミドを含む細菌のためにアンピシリン耐性を基準に選別することができる。続いてプラスミド含有細菌をクローニングし、続いて前記発現ベクターへの挿入コード遺伝子の適切な向きについてクローンをスクリーニングする。
【００８３】
所望のHBcキメラをコードする遺伝子を含む上記で得られたプラスミド、pＳＶ-ＰＦを、前記を含有する大腸菌を培養することにより増殖させる。大腸菌培養からプラスミドDNAを上記のSambrookらの著書に記載されたように単離する。
キメラの発現は、pSV-Pfを哺乳動物の細胞、例えばCHO細胞にGrahamら（Virol. 52:456 (1973)）のリン酸カルシウム仲介トランスフェクション法又は類似の技術を用いて導入することにより達成できる。
最大効率のpSV-Pfの培養CHO細胞への導入を担保するために、Southernら（J. Mol. Appl. Genet. 1:327 (1982)）の記載にしたがって、トランスフェクションは第二のプラスミド、pSV2NEO（ATCC#37149）及び細胞毒性薬剤G418（GIBCO Laboratories, Grand Island, N.Y.）の存在下で実施される。G418に耐性の前記CHO細胞を培養し、（両プラスミド（pSV2NEO及びpSV-Pf）を獲得した）CHO/pSV-PF細胞と称する。pSV-Pf発現ベクターの遺伝的構造のために、キメラは得られたCHO/pSV-PF細胞で発現され、これら細胞の細胞質で検出され、前記細胞質から精製される。得られた細胞タンパク質含有組成物は本明細書の別の箇所で考察されるようにカラムで分離される。
どの発現ベクター、及び最終的にどのプロモーターにキメラコード配列を機能的に連結するかの選択は、所望される機能的特性、例えばタンパク質発現の場所及び時期、並びに形質転換される宿主細胞に直接的に左右される。前記はリコンビナントDNA分子の構築分野でよく知られている固有の限定事項である。しかしながら、本発明の実施に有用なベクターは、前記に機能的に連結されているDNAセグメントに含まれているキメラ遺伝子の複製、好ましくはまた発現（発現ベクターのために）を指令することができる。
【００８４】
ある好ましい実施態様では、キメラを発現する宿主は原核細胞、大腸菌であり、好ましいベクターは原核細胞レプリコン、すなわちリコンビナントDNA分子の自律的複製及び形質転換された宿主原核細胞の染色体外での前記の維持を指令する能力を有するDNA配列を含む。そのようなレプリコンは当分野では周知である。
原核細胞レプリコンを含むこれらベクターはまた、目的のHBcキメラ遺伝子の発現を、前記で形質転換された宿主細胞、例えば大腸菌で指令することができる原核細胞プロモーター領域を含むことができる。細菌宿主に適合するプロモーター配列は、目的のDNAセグメントの挿入のために典型的には1つ又は2つ以上の便利な制限部位を含むプラスミドベクターで提供される。そのようなベクタープラスミドの典型的なものは、pUC8、pUC9及びpBR329（Biorad Laboratories（Richmond, CA）から入手できる）並びにpRL及びpKK223-3（Pharmacia（Piscataway, NJ）から入手できる）である。
高等植物及び哺乳類由来の細胞で遺伝子発現に有用な典型的ベクターは当分野で周知であり、Rogersら（Meth. in Enzymol. 153:253-277 (1987)）記載のアグロバクテリウム=ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の腫瘍誘発（Ti）プラスミド由来の植物ベクター、及び哺乳動物発現ベクター、pKSV-10（上記）及びpCI-neo（Promega Corp., #E1841, Madison, WI）が含まれる。しかしながら、いくつかの他の発現ベクター系も植物で機能することが知られており、Frommら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:58-24 (1985)）記載のpCaMVCNトランスファーコントロールベクターが含まれる。プラスミドpCaMVCN（Pharmacia（Piscataway, NJ）から入手できる）は、カリフラワーモザイクウイルスCaMVの35Sプロモーターを含む。
上記植物発現系は典型的には挿入されたトランスジーンの系統的又は構成的発現を提供する。系統的発現は、植物のほとんど又は全てが目的のキメラ分子又は生成粒子の供給源として用いられる場合、又は植物の大部分が経口用ワクチンの供給に用いられる場合に有用であろう。しかしながら、キメラ分子又は粒子を植物の貯蔵器官、例えば根、種子又は果実で発現させることが更に有効であろう（前記から粒子をより容易に単離又は摂取することができる）。
【００８５】
貯蔵器官での発現を達成する１つの態様は、1つ若しくは2つ以上の予め選択した又は決定した非光合成植物器官でその制御遺伝子を発現するプロモーターを用いることである。  予め選択した1つ又は2つ以上の貯蔵器官で発現し他の器官ではほとんど又は全く発現しない（例えば根、種子又は果実に対して葉又は茎）場合を本明細書では強化又は優先発現と称する。別の器官と比較して1つ又は2つ以上の予め選択した器官で少なくとも5：1の比で発現を指令する典型的なプロモーターは、本明細書では器官強化プロモーターと定義される。実質的にただ1つの貯蔵器官で発現し他の貯蔵器官では実質的に発現されない場合は器官特異的発現と称される。すなわち、別の器官に対する貯蔵器官における発現生成物比が約100：1又はそれ以上は器官特異性を示している。貯蔵器官特異的プロモーターはしたがって貯蔵器官強化プロモーター類のメンバーである。
典型的な植物貯蔵器官にはニンジン、タロイモ又はキャッサバの根、ジャガイモの塊茎、果肉、例えばバンジロウ、トケイソウの果実、マンゴ、パパイヤ、トマト、アボカド、サクランボ、ミカン、マンダリンオレンジ、ヤシの実、メロン、例えばマスクメロン及びスイカ及び他の多肉質果実、例えばカボチャ、キュウリ、マンゴ、アプリコット、モモとともに、トウモロコシの種子（コーン）、ダイズ、米、ナタネなどが含まれる。
【００８６】
CaMV35Sプロモーターは通常は構成的プロモーターであると思われる。しかしながら、最近の研究では、CaMV35Sプロモーターの21-bp領域は、また別の通常の異種緑色組織プロモーター、rbcS-3Aプロモーターに機能的に連結された場合は生成されるキメラプロモーターを根強化プロモーターにすることができることが示された。前記21-bp配列は米国特許5,023,179号に開示されている。21-bp挿入物を含む米国特許5,023,179号の前記キメラrbcS-3Aプロモーターは、本明細書では有用な根強化プロモーターである。
上記の21-bpセグメントを含む同様な根強化プロモーターは、CAMV35Sプロモーター自体の-90から+8領域である。米国特許5,110,732号は、切端CaMV35Sプロモーターは、根及び発芽根、根となるべき組織で発現強化を提供することを開示した。前記プロモーターもまた本発明で有用である。
また別の根強化プロモーターは、PCT/GB92/00416（WO91/13922、公開1991年9月19日）で開示されたナタネ（Brassica napus L.）遺伝子の-1616から-1のプロモーターである。プラスミドpRlambdaS4及び前記プロモーターを含むバクテリオファージλ.β.1を保有する大腸菌DH5.αは公的機関（National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, GB）に1990年3月8日に寄託され、アクセッション番号NCIMB40265及びNCIMB40266を有する。前記プロモーターの有用な部分は、HaeIIIで前記プラスミドを切断することにより1.0kbフラグメントとして得ることができる。
好ましい根強化プロモーターは、DiRita & Gelvin（Mol. Gen. Genet. 207:233-241 (1987)）記載のプラスミドpKan2に存在するマンノピンシンターゼ（mas）プロモーターである。前記プロモーターはそのプラスミドpKan2からXbaI‐XbaIIフラグメントとして取り出すことができる。
好ましいマンノピンシンターゼ根強化プロモーターは、-138位までのコアマンノピンシンターゼ（mas）プロモーター領域及び138位から-213位までのマンノピンシンターゼアクチベーターを含み、包括的にAmasPmasと称される。前記プロモーターは、葉の発現レベルと比較して、タバコの根で約10から約100倍に酵素の産生を増加させることが判明した。
【００８７】
また別の根特異的プロモータは、Kellerら（Genes Dev. 3:1639-1646 (1989)）が報告した、側根発生時に発現されるヒドロキシプロリン富裕糖タンパク質遺伝子HRGPnt3に付随する約500bpの5'フランキング配列である。別の好ましい根特異的プロモーターは、Yamamotoら（Plant Cell 3:371-381 (1991)）が報告したタバコの根特異的遺伝子ToRBFの約-636から-1に存在する5'フランキング領域である。発現を調節する前記cis-作動性エレメントは、前記著者らによって転写開始部位から約-636から約-2995'側の領域に更に具体的に位置が決定された。Yamamotoらは、根ではToRBF遺伝子からmRNAが定常状態で生成されるが、葉、シュート分裂組織又は茎では生成されないことを報告した。
また別の有用な貯蔵器官特異的プロモーターは、トマト（Lycopersicon esculentum）の果実成熟遺伝子E8の5'及び3'フランキング領域である。これらの領域及びそれらのcDNA配列は、Deikmanら（EMBO J. 7(11):3315-3320 (1988)；及びPlant Physiol. 100:2013-2017 (1992)）が記載し考察した。
E8遺伝子の発現を制御するように思われる3つの領域が、前記遺伝子の5'フランキング配列の2181bp及びポリ（A）付加部位側の522bp配列に位置する。-2181から-1088までの領域は、エチレンによる未成熟果実でのE8遺伝子の転写の活性化に要求され、更に成熟時の転写に寄与する。2つの更に別の領域（-1088から-863及び409から-263）は、未成熟果実におけるエチレン反応性を付与することができないが、成熟中のE8遺伝子発現には十分である。
【００８８】
内乳で高レベルに制御された酵素を発現させるが、根でははるかに低いレベルで更に緑色組織又は花粉では発現させないトウモロコシのシュクロースシンターゼ-1（Sh）プロモーターが、キメラレポーター遺伝子、β-グルクロニダーゼ（GUS）を特にタバコの篩部細胞（茎及び根に豊富である）で発現させることが報告された（Yang et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4144-4148）。したがって、前記プロモーターは、植物器官、例えばメロン（例えばマスクメロン）のような多肉質果実、又は内乳を含む種子、及び高レベルの篩部細胞を有する根で有用である。
また別の典型的な組織特異的プロモーターはレクチンプロモーターである。前記は種子特異的である。ダイズ種子のレクチンタンパク質は、種子の成熟時にのみ発現され、種子の全mRNAの約2から約5％になる、単一遺伝子（Le1）によってコードされる。レクチン遺伝子及び種子特異的プロモーターは完全に性状が決定され、トランスジェニックなタバコの植物体で種子特異的発現を誘導するために用いられた。例えば以下を参照されたい：Vodkin et al. (1983) Cell 34:1023；及びLindstrom et al. (1990) Developmental Genetics 11:160。
特に好ましい塊茎特異的発現プロモーターはジャガイモのパパチン遺伝子の5'フランキング領域である。前記プロモーターの使用はTwellら（Plant Mol. Biol. 9:365-375 (1987)）が記載している。前記プロモーターはバクテリオファージLPOTIの406bpフラグメントに存在する。前記LPOTIプロモーターは、他の4つのパパチンプロモーターと90％を超える相同性、及びパパチンプロモーターPGT5と400塩基の全てにわたって約95％の相同性を有する領域をもつ。これらプロモーターの各々が本発明で有用である。以下もまた参照されたい：Wenzler et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:41-50。
【００８９】
更にまた別の器官強化及び器官特異的プロモーターはBenfeyら（Science 244:174-181）が開示している。
利用されるプロモーター配列のいずれも細胞内のキメラ分子又は粒子の量によって実質的に影響を受けない。本明細書で用いられるように、“実質的に影響を受けない”という用語は、前記プロモーターが、形質転換細胞又はトランスジェニック植物に蓄積されたキメラ分子又は粒子により直接的フィードバック制御（抑制）に反応しないことを意味する。
アグロバクテリウム=ツメファシエンスを用いる植物細胞のトランスフェクションは、典型的には双子葉植物でもっとも良好に実施される。単子葉類は、通常はプロトプラストのいわゆる直接遺伝子移転によりもっとも容易に形質転換される。直接遺伝子移転は通常エレクトロポレーション、ポリエチレングリコール仲介移転、又は必要なDNAを運ぶ微少発射体による細胞の爆撃によって実施される。前記のトランスフェクションの方法は等分やでは周知で、ここで更に考察する必要はない。トランスフェクトした細胞及びプロトプラストから完全な植物を再生する方法もまた、所望のタンパク質を植物組織から得る技術と同様に周知である。例えばまた、米国特許5,618,988号及び5,679,880号及びその中に引用された文献を参照されたい。
アグロバクテリウム=ツメファシエンス、エレクトロポレーション又は他の方法を用いて形成されたトランスジェニック植物は、典型的には1つの染色体上にただ1つの遺伝子を含む。そのようなトランスジェニック植物は、前記付加した遺伝子についてヘテロ接合であると称することができる。しかしながら、“ヘテロ接合”という用語の使用は、通常は、一対の染色体の第二の染色体の同じ座位に相補的な遺伝子が存在することを暗示し、しかもそのような遺伝子はこの場合のように付加遺伝子を含む植物には存在しないので、前記のような植物のためのより正確な名称は独立分離体（セグリガント）であると考えられる。なぜならば前記の付加された外因性キメラ分子コード遺伝子は、有糸分裂及び減数分裂時に独立して分離されていくからである。目的のHBcキメラ分子をコードするただ1つの構造遺伝子を駆動する器官強化プロモーターを含むトランスジェニック植物（すなわち独立セグリガント）は好ましいトランスジェニック植物である。
【００９０】
より好ましいものは、前記付加構造遺伝子についてホモ接合であるトランスジェニック植物、すなわち2つの付加遺伝子（染色体対の各染色体の同じ座位に1つの遺伝子をもつ）を含むトランスジェニック植物である。ホモ接合のトランスジェニック植物は、ただ1つの付加遺伝子を含む独立セグリガントのトランスジェニック植物を有性交配し（自殖）、産生された種子のいくつかを発芽させ、生産された植物をキメラ粒子の蓄積強化についてコントロール（天然の非トランスジェニック植物）又は独立セグリガントのトランスジェニック植物と比較して分析することによって入手することができる。ホモ接合のトランスジェニック植物は、天然の非トランスジェニック植物及び独立セグリガントのトランスジェニック植物と比較して、キメラ粒子の蓄積強化を示す。
異なる2つのトランスジェニック植物を交配して、2つの別個に分離されていく付加外因性（異種）遺伝子を含む子孫を生産することができることもまた理解されよう。適切な子孫の自殖によって、キメラHBc分子をコードする両方の付加外因性遺伝子についてホモ接合である植物を生産することができる。親植物への戻し交配及び非トランスジェニック植物との雑種交配もまた意図される。
したがって、本発明のトランスジェニック植物は、目的のキメラHBc分子をコードする異種構造遺伝子を含む。好ましいトランスジェニック植物は、付加された異種キメラHBc構造遺伝子について独立セグリガントであり、前記遺伝子をその子孫に伝達することができる。より好ましいトランスジェニック植物は前記異種遺伝子についてホモ接合であり、前記遺伝子をその全ての子孫に有性交配で伝達する。
【００９１】
キメラHBc分子をコードする遺伝子が植物で天然には生じないので、目的のトランスジェニック植物は、同じタイプ又は株の非形質転換植物よりも両植物を同じ条件下で生育させたとき、キメラHBc分子粒子を極めて大量に蓄積する。
“同じタイプ”又は“同じ株”という語句は、非形質転換植物と同じ雑種又はクローン植物を指すために本明細書では用いられる。交配された兄弟間の対立形質変種が少ない場合（強度の近親交配の場合のように）、兄弟間の比較を用いるか、又はいくつかの兄弟を用いて得られた平均を用いることができる。そうでなければ、クローンが比較のために好ましい。
トランスジェニック植物の種子を野外の温室又は窓台などで生育させ、得られた性成熟トランスジェニック植物を自家受粉させて標準育種植物を作出する。これらの植物の子孫は、キメラHBc分子粒子の蓄積について一定範囲の環境条件下（好ましくは野外）で評価される標準育種株となる。
キメラHBc分子粒子の蓄積についてホモ接合のトランスジェニック植物を他の所望の属性を有する親植物と交配する。子孫（キメラHBc分子粒子の蓄積についてへテロ接合であるか又は独立して分離することができる）を、キメラHBc分子粒子の蓄積及び他の所望の属性を示すある親又は別の親と戻し交配する。多数の所望の属性を有するトランスジェニック植物得るために、親と子孫との前記戻し交配は2度以上繰り返す必要があるだろう。
【００９２】
昆虫細胞系もまたHBcキメラの発現に用いることができる。例えば、そのような系の1つオートグラファ=カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス（AcNPV）又はバキュロウイルスをベクターとして用いて、スポドプテラ=フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞又はトリコプルシア（Trichoplusia）の幼虫で外来遺伝子を発現させる。
キメラをコードする配列は、ウイルスの非必須領域、例えばポリヘドリン遺伝子でクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置くことができる。キメラ配列の挿入の成功によって、ポリヘドリン遺伝子は不活化され、コートタンパク質を欠くリコンビナントウイルスが産生される。続いて前記リコンビナントウイルスを用いて、その中でHBcキメラが発現することができる、例えばS. フルギペルダ（S. frugiperda）細胞又はトリコプルシア（Trichoplusia）の幼虫を感染させる（E. Engelhard et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3224-3227；及びV. Luckow Insect Cell Expression Technology pp.183-218, in Protein Engineering: Principles and Practice, J.L. Chelamd et. al. eds., Wiley-Liss,Inc. 1996）。オートグラファ=カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス（AcNPV）のポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれた異種遺伝子は、感染後期にしばしば高レベルで発現される。
キメラ遺伝子を含むリコンビナントバキュロウイルスは、バキュロウイルスシャトルベクター系（Luckow et al. (1993) J. Virol. 67:4566-4579）を用いて構築される。前記はBac-To-Bac（登録商標）バキュロウイルス発現系として市販されている（Life Technologies）。標準的なプロトコルによってリコンビナントウイルスのストックを調製し、リコンビナントタンパク質の発現をモニターする（O'Reilly et al. Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company, New York, 1992；及びKing et al. The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman & Hall, London, 1992）。
【００９３】
相補的な粘着末端又は平滑端を介してDNAをベクターに機能的に連結するために多様な方法が開発された。例えば、ベクターDNAに挿入されるべきDNAセグメントに相補的なホモポリマー索を付加することができる。続いて前記相補的ホモポリマーテール間の水素結合によって前記ベクター及びDNAセグメントを結合させる。
また別には、1つ又は2つ以上の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーを用いてDNAセグメントを発現ベクターに上記で述べたように結合させることができる。前記合成リンカーは、平滑端DNA分子の連結を触媒することができる酵素（例えばバクテリオファージT4DNAリガーゼ）の存在下で、大過剰の合成リンカー分子とともに平滑端をもつDNAセグメントをインキュベートすることによって平滑端DNAセグメントに結合させる。したがって、反応生成物は、それらの末端に合成リンカー配列を有するDNAセグメントである。続いてこれらのDNAセグメントを適切な制限エンドヌクレアーゼで切断し、更に、合成リンカーの末端と適合する末端を作製する酵素で切断しておいた発現ベクターと連結する。多様な制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーが、多くの供給元（New England Biolabs（Beverly, MA）を含む）から市場で入手できる。
所望のDNAセグメントはまたPCR技術を用いて入手することができる。前記技術では、遺伝子をベクターに挿入できるように、フォワード及びリバースプライマーは増幅後に切断することができる所望の制限部位を含む。また別には、当分野で周知のように、PCR生成物は、T-オーバーハングを含むベクター（Promega Corp., A3600, Madison, WI）に直接クローニングすることもできる。
発現されたキメラタンパク質は、単細胞宿主であれ多細胞宿主であれ、宿主細胞内で自己会合して粒子を形成する。粒子を含む細胞は標準的な方法を用いて採集され、フレンチプレス、リゾチーム、ソニケーター、ビーズビーター又は超小型液化装置（microfluidizer）（Microfluidics International Corp., Newton MA）を用いて溶解される。溶解物を清澄にした後、粒子を45％硫酸アンモニウムで沈殿させ、20mMのリン酸ナトリウム（pH6.8）に再懸濁し、同じ緩衝液に対して透析する。前記透析物質を簡単な遠心で清澄にし、上清をセファロース（登録商標）CL-4Bを用いてゲルろ過クロマトグラフィーに付す。粒子含有分画を特定し、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに付し、硫酸アンモニウムで再度沈殿させ、その後で透析、滅菌ろ過し、-70℃で保存する。
【００９４】
HBcキメラ複合
B細胞又はT細胞応答が所望される任意のハプテン（免疫原）を目的のHBcキメラ又はキメラ粒子（例えば異種リンカー残基（例えばリジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン又はチロシン）をドメインIIのループ領域内に含み、更に付加されたシステイン残基をドメインIのN-末端近くに有する）に結合させ、HBcキメラ複合物を形成することができる。問題のハプテンは典型的にはB細胞免疫原である。ハプテンはポリペプチド、タンパク質、炭水化物（糖類、すなわちオリゴ糖又は多糖類）、又は非ポリペプチド、非炭水化物性化学物質（例えば2,4-ジニトロベンゼン）又は医薬物質（例えばコカイン又はニコチン）であろう。例示的糖類化合物には、NTHi又はM. cat.のリポオリゴ糖（LOS）が含まれる（Sun et al. (2000) Vaccime 2000, 18(13):1264-1272；及びJiaro et al. (2002) Infect. Immun. 70(11):5982-5989）。LOSは、疎水性脂質A部分及び親水性コアオリゴ糖部分から成り、グラム陰性細菌の外側膜の主要成分の1つである。無毒化したLOS（dLOS）分子は脱-O-アシル化又は脱-N-アシル化され又はその両方であり、Hochstein（Clinical application of the Limulus amoebocyte lysate test, R.B. Prior, ed. CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, Pages 38-49）が記載したリィムルス（Limulus）アメーボサイト溶解物アッセイ（LAL）において出発のLOSと比較して100倍から約10000倍低下した内毒素毒性を示す。
【００９５】
担体タンパク質を多糖類に複合させる多くの方法が当分野で知られている。オリゴ糖又は比較的小さな多糖類の還元端（Anderson (1983) Infect. Immun. 39:233-238；Jennings et al. (1981) J. Immunol. 127:1011-1018；Poren et al. (1985) Mol. Immunol. 22:907-919）又は終末端のどちらかにアルデヒド基を調製し、前記を担体タンパク質に還元アミノ化により結合することができる。更に、過ヨウ素酸イオンによる隣接ヒドロキシルの酸化、それに続く生成アルデヒドのシアノボロハイドライドによる還元的アミノ化が、キメラの免疫原性ループに付加された付加ε-アミン-供給リジン残基を有するHBcキメラ分子に特に有用である。
大きな多糖類は、末端活性化（Anderson et al. (1986) J. Immunol. 137:1181-1186）又は多糖類鎖のいくつかの官能基のランダムな活性化（Chu et al. (1983) Infect. Immun. 40:245-256；Gordon, U.S. Patent No. 4,619,828 (1986)；Marburg, U.S. Patent No. 4,882,317 (1989)）のどちらかによって複合させることができる。多糖類鎖のいくつかの官能基のランダムな活性化は、多糖類鎖に沿ったランダムな結合のために高度に架橋された複合物を生じる。多糖類対担体タンパク質の最適比は個々の多糖類、担体タンパク質及び使用される複合物に左右される。
糖類と担体タンパク質の複合方法の詳しい概論は以下で見出すことができる：Dick et al. in Contributions to Microbiology and Immunology, vol.10, Cruse et al., eds., (S. Karger: 1989), Pages 48-114；Jennings et al. in Neoglycoconjugates: Preparation and Applications, Lee et al.., eds., (Academic Press: 1994), pages 325-371；Aplin et al. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 10:259-306；及びStowell et al. (1980) Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 37:225-281。
【００９６】
炭水化物自体は当分野で公知の方法、例えばWitteら（J. Am. Chem. Soc. 119:2114-2118 (1997)）が記載した酵素的な糖タンパク質合成によって合成することができる。
いくつかのオリゴ糖（合成、半合成及び天然のもの）は、本発明のHBc複合物の製造で使用される意図されるハプテンであるオリゴ糖の例として下記の節で考察される。
インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）b型（Hib）の治療用ワクチンの製造に適したオリゴ糖ハプテンは、D-リボース-D-リビトール-ホスフェート（I、下記）、D-リビトール-ホスフェート-D-リボース-（II、下記）、又はホスフェート-D-リボース-D-リビトール（III、下記）の2から20の繰り返しから作製される（Eduard C. Beuvery et al. EP-0276516-B1）。
【００９７】
【化１】
2006509026.tif 000018
【００９８】
米国特許4,220,717号はまた、インフルエンザ菌b型のためのポリリボシルリビトールホスフェート（PRP）ハプテンを開示している。
Petersonら（Infect. Immun. 66（8）：3848-3855(1998)）は三糖類ハプテン、αKdo(2 4)αKdo(2 4)αKdoを開示する。前記はクラミジア=ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）に対する防御を提供する。クラミジア＝ニューモニエは、咽頭炎から致死的な肺炎までヒトの呼吸器感染の原因である。Kdoは3-デオキシ-D-マンノ-オクタ-2-ウロソン酸である。
Anderssonら（EP-0126043-A1）は、肺炎連鎖球菌（Streptococci pneumoniae）によって引き起こされる細菌感染の治療、予防又は診断に用いることができる糖類を開示している。有用な糖類のあるクラスは二糖類GlcNAcβ1 3Galに由来する。Anderssonら（上掲書）はまた、ネオラクトテトラオシルセラミドが有用であると報告した。前記は、Galβ1 4GlcNAcβ1 3galβ1 4Glc-cerである。
McKenneyら（Science 284:1523-1527 (1999)）は多糖類、ポリ-N-スクシニルβ1 6GlcN（PNSG）を開示している。前記は黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に対する防御を提供する。黄色ブドウ球菌は、集団感染（心内膜炎、骨髄炎、敗血症性関節炎、肺炎及び膿瘍を含む）の共通原因である。
欧州特許0157899-B1は、本発明に有用な肺炎球菌の多糖類の単離を開示している。下記の表は、本発明のハプテンとして有用な莢膜多糖類を産生する肺炎球菌培養型のリストである。
【００９９】
多糖類ハプテン供給源
2006509026.tif 000019
【０１００】
モラクセラ（ブランハメラBranhamella）=カタラーリス（Moraxella catarrhalis）は、小児の中耳炎及び副鼻腔炎並びに成人の下気道感染の原因であると報告されている。細菌のリポオリゴ糖（LOS）表面抗原の脂質A部分が3-デオキシ-D-マンノ-オクツロソン酸-グルコサミン結合で切断される。前記切断生成物は、穏やかなアルカリ又はヒドラジンで処理してエステル結合脂肪酸を除去し、一方アミド結合脂肪酸は温存してM. カタラーリスの無毒化リポオリゴ糖（dLOS）を生成する。dLOSは、タンパク質担体に結合するまでは免疫原性をもたない（Xin-Xing Gu et al. (1998) Infect. Immun. 66(5):1891-1897）。
B群連鎖球菌（GBS）はヒトで敗血症、髄膜炎、及び関連の神経学的疾患を引き起こす。莢膜多糖類特異的抗体は幼児を感染から護ることが知られている（米国特許5,795,580号（Jennings et al.））。GBS莢膜多糖類II型の反復単位は以下のとおりである：4)-β-D-GlcpNAc-(1 3)-[β-D-Galp(1 6)]-β-D-Galp(1 4)-β-D-Glcp-(1 3)-β-D-Glcp-(1 2)-[α-D-NeupNAc(2 3)]-β-D-Galp-(1、式中、括弧部分は直後の括弧にくくられていないサブユニットと連結された分枝である。GBS莢膜多糖類V型の反復単位は以下のとおりである：4)-[α-D-NeupNAc-(2 3)-α-D-Galp(1 4)-β-D-GlcpNAc-(1 6)-α-D-Glcp-(1 4)-[β-D-Glcp-(1 3)]-β-D-Galp-(1 4)-β-D-Glcp-(1。
欧州特許出願EU-0641568-A1（Brade）は、クラミジア=トラコーマチス、ニューモニエ及びシッタシー（Chlamydia trachomatis、pneumoniae及びpsittaci）由来のはしご様縞模様抗原を入手する方法を開示する。
Solvinら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(10):5710-5715 (1999)）は、前立腺癌に対して用いられるワクチンの製造で、担体としてKLHに結合させた合成オリゴ糖、globo Hの使用を報告している。同様に、Hellingら（Cancer Res. 55:2783-2788 (July 1995)）は、メラノーマ患者治療用ワクチンでKLH結合GM2の使用を報告している。後者のワクチンは、セラミド二重結合のオゾン切断、アルデヒド基の導入及びKLHへの還元的アミノ化によって製造された。同様な方法を目的のキメラ粒子に用いることができる。
正常な細胞と同様に他の腫瘍細胞（例えばメラノーマ、神経芽腫）及び健康な脳細胞の表面に存在する、スフィンゴ脂質（例えばグロボシド及びガングリオシド）のオリゴ糖部分も同様にハプテンとして本発明で用いることができる。グロボシドのオリゴ糖部分グロボHはFucα-(1 2)-Galβ(1 3)-GalNAcβ-(1 3)-Galα-(1 4)-Galβ-(1 4)Glcの構造を有し、一方、ガングリオシドの糖部分GM2、GM1及びGD1aはそれぞれ以下の構造を有する：GalNAcβ-(1 4)-[NeuAcα-(2 3)]-Galβ-(1 4)-Glc；Galβ-(1 3)-GalNAcβ-(1 4)-[NeuAcα-(2 3)]-Galβ-(1 4)-Glc；及びNeuAc-(2 3)-Galβ-(1 3)]-GalNAcβ-[NeuAcα-(2 3)]-Galβ-(1 4)-Glc。
【０１０１】
米国特許4,356,170号は、還元し続いて酸化して末端アルデヒド基を有する化合物が形成される、有用な多糖類の製造を開示する。前記アルデヒド基は、顕著な架橋とともに、又は架橋を伴わずに担体タンパク質（例えば破傷風類毒素及びジフテリア類毒素）の遊離アミン基上に還元的にアミノ化される。典型的な有用な細菌の多糖類には、β-溶血性連鎖球菌、インフルエンザ菌、髄膜炎菌、肺炎菌及び大腸菌が含まれる。粒子を還元的にアミノ化するよりも、リンカーアーム(例えばε-アミノC2−C8アルキルカルボン酸によって提供されるもの)を前記多糖類上に還元的にアミノ化し、続いて水溶性カルボジイミドを用いて粒子に結合させてもよい。
したがって、“ハプテン”という用語は、本明細書では通常よりも幾分広く、それ自体は免疫反応を誘発しない小分子を、しばしばそれ自体が免疫反応を誘発するより大きな分子（例えばタンパク質）と同様に含むことが理解されよう。そのようにして形成されたHBcキメラ粒子複合物は以下で考察されるように接種物又はワクチンとして有用である。キメラタンパク質は発現後に自己会合し、複合物は発現後に形成されるので、複合物の形成は、遊離タンパク質分子に対応して、典型的には会合粒子を用いて実施される。
個々のハプテン（免疫原）をタンパク質又はポリペプチドに前記タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸側鎖を介して機能的に結合させて、懸垂結合した免疫原性複合物（例えば分枝鎖ポリペプチドポリマー）を形成するための方法は当分野では周知である。前記方法は、種々の側鎖上の1つ又は2つ以上のタイプの官能基を介する結合を含み、ハプテンと懸垂結合--共有結合(複合)--しているが、少なくとも1つの側鎖によって分離されている粒子内に担体タンパク質のポリペプチド骨格（ここではHBcキメラ）を生じる。
【０１０２】
担体タンパク質を上記官能基の各々を用いてハプテンと結合させる方法は以下の文献に記載されている：Erlanger (1980) Method of Enzymology 70:85；Aurameas et al. (1978) Scand. J. Immunol. vol.8, Suppl. 7, 7-23；及びU.S. Patent No. 4,493,795（Nestor et al.）。更に、ポリペプチドの生物学的活性が実質的に減少しないように、Rodwellら（Biotech. 3:889-894 (1985)）が記載した位置特異的複合反応を実施してもよい。
更にまた、当分野で周知のように、HBcタンパク質及びポリペプチドハプテンの両方をそれらの本来の形態で用いるか、又はそれらの官能基成分をリジン残基のスクシニル化によって、若しくはシステイン‐チオラクトンとの反応によって改変することもできる。スルフヒドリル基もまた担体たんぱく質又は複合物のどちらかに、アミノ官能基と2-イミノチオラン、3-(3-ジチオピリジル)-プロピオネートのN-ヒドロキシスクシンンイミドエステル、又は当分野で公知の他の試薬との反応によって取り込むことができる。
HBcキメラ又はハプテンは又、スペーサーアーム（例えばヘキサメチレンジアミン又は別の二官能性分子）を取り込んで改変させ、懸垂結合を促進することができる。そのような方法は以下で考察される。
【０１０３】
ポリペプチドハプテンの共有結合のための方法は極めて多様であり、免疫学分野の業者には周知である。例えば、米国特許4,818,527号にしたがって、m-マレイミドベンゾイル
-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（ICN Biochemicals, Inc., Costa Mesa, CA）又はスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）（Pierce Chemical Co., Rockford, IL）を適切なHBcキメラと反応させて活性化担体を形成する。続いて、前記活性化担体をハプテン、例えばスルフヒドリルの末端をもつハプテン又は末端システインを含むか、若しくは更に付加されたアミノ若しくはカルボキシ末端システイン残基が付加されているポリペプチドと反応させて共有結合HBcキメラ複合物を形成する。また別の例として、ポリペプチドハプテンのアミノ基を先ずN-スクシンイミジル3-(2-ピリジルチオ)プロピオネート（SPDP）（Pharmacia, Piscataway, NJ）と反応させ、更に前記チオール含有ポリペプチドを還元後に活性化担体と反応させることができる。もちろんのこと、前記硫黄含有成分及び二重結合含有ミカエル受容体は入れ替えることができる。これらの反応は供給元の文献に記載されてあり、更に以下の文献にも記載されている：Kitagawa et al. (1976) J. Biochem. 79:233；及びLachmann et al. in 1986 Synthetic Peptides as Antigens, (Ciba Foundation Symposium 119), pp. 25-40 (Wiley, Chichester: 1986)。更に図5も参照されたい。
【０１０４】
米国特許4,767,842号は、本発明で有用な担体とポリペプチドとの間の共有結合の態様を開示している。ある方法では、トリレンジイソシアネートをジオキサン緩衝溶媒中で0℃で担体と反応させて活性化担体を形成する。その後ポリペプチドハプテンを混合し、前記活性化担体と反応させて共有結合HBcキメラ複合物を形成する。
多数のヘテロ二官能性物質が特に有用で、前記は一方の官能基端と他方のアミド結合でジスルフィド結合を形成する。前記にはN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオネート（SPDP）が含まれる（それ自体とHBcキメラ又はハプテン内のチオールとの間でジスルフィド結合を作出することが上記で考察された）。典型的な試薬は、ポリペプチドハプテン内にシステイン残基及び複合パートナー上にアミン(例えばリジンのε-アミン又は担体タンパク質の他の遊離アミノ基)を含む。そのような種々のジスルフィド/アミド形成物質は公知である。例えば以下を参照されたい：Immun. Rev. (1982) 62:185。
他の二官能性複合試薬はジスルフィド結合ではなくチオエーテルを形成する。これらチオエーテル形成物質の多くは市場で入手でき、6-マレイミドカプロン酸、2-ブロモ酢酸、2-ヨード酢酸、4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸などの反応性エステルが含まれる。前記カルボキシル基は、スクシンジイミド又は1-ヒドロキシ-2-ニトロ-4-スルホン酸のナトリウム塩とそれらを結合させることによって活性化することができる。本発明の方法のために特に好ましい複合試薬は、スクシンイミジル4-(マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）である（Pierce Chemical Co. (Rockford, IL）から入手できる)。また別のヘテロ二官能性架橋剤は、N-(γ-マレイミドブチロキシ)スクシンイミドエステル（GMBS）及びそのスルホン酸塩（Sulfo-GMBS）並びにピアスケミカル社（Pierce Chemical Co., Rockford, IL）から入手できる類似の化合物である。前述のリストは包括的なものではなく、更に、列挙した化合物の改変も明らかに実施できる。図5は、SMCCを用いたHBc活性化担体の形成（I）及びそれに続く前記活性化担体とスルフヒドリル-末端化ハプテンとの反応（II）を示す模式図（スキームI）を提供する。
【０１０５】
ポリペプチドハプテンは当分野で周知の多数の方法で得ることができる。通常のペプチド合成技術を容易に利用することができる。例えば、より長いペプチドを生成するためにリコンビナント及びPCRによる技術は有用である。所望の配列は通常は比較的短いので、固相化学合成が有用である。
典型的なポリペプチドハプテンは前述の表A及びBに示されている。これらのポリペプチドの各々はそのN-末端アミノ基を介して、又は別に付加されたN-末端システイン（前記表には示されていない）を使用することによって利用することができる。
関連する化学反応を用いて、“化合物”と称することができるものと担体タンパク質とを複合させる。典型的には、複合のための適切な官能基が前記化合物中にデザインされる。それに対して誘発された抗体が肺炎連鎖球菌を予防する典型的な化学的ハプテンは、6-O-ホスホコリンヒドロキシヘキサノエートである（Fischer et al. (1995) J. Immunol. 154:3373-3382）。下記の表は典型的な更に別の化学的ハプテンを提供する。
有用なハプテンに関する更に別の説明例は、前述した、現時点では公表されている米国特許出願09/930,915号及び他の親出願で見出すことができる。
【０１０６】
接種物及びワクチン
本発明の更に別の実施態様では、HBcキメラ粒子又はハプテンとのHBcキメラ粒子複合物は患者又は適切な動物宿主（例えばチンパンジー、マウス、ラット、ウマ、ヒツジなど）で接種物又はワクチンの免疫原として用いられる。接種物はB細胞若しくはT細胞応答（刺激）、例えば免疫原性エピトープ又はハプテンと免疫反応する抗体の産生又はT細胞活性化を誘発し、一方、ワクチンは、B細胞若しくはT細胞応答の一方又は両者を介して免疫原が由来した物質に対して防御を提供する。
T細胞活性化は種々の技術によって測定することができる。通常の実施では、宿主動物は目的のHBcキメラ粒子ワクチン又は接種物を接種され、抹消単核血球（PMBC）がその後で採集される。続いて、前記PMBCをin vitroでT細胞免疫原の存在下で約3から5日間培養する。更に前記培養PMBCを増殖又はサイトカイン分泌（例えばIL-2、GM-CSF又はIFN-γ）についてアッセイする。T細胞活性化についてのアッセイは当分野では周知である。例えば米国特許5,478,726号及び前記で引用された文献を参照されたい。
見本として抗体形成を用いた場合、目的の接種物又はワクチンは、医薬的に許容できる希釈組成物（典型的にはまた水を含む）に溶解又は懸濁させた、免疫原として有効な量のHBcキメラ粒子又はHBcキメラ粒子複合物を含む。免疫を必要とする、又は抗体の誘発が所望される宿主動物、例えば哺乳動物（例えばマウス、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、サル、尾無しサル又はヒト）に投与したとき、接種物は、遺伝子的に結合されたか又は複合（懸垂結合）されたハプテンと免疫返納する抗体を誘発する。前記抗体はまた、好ましくはB細胞免疫原のタンパク質又は糖類と結合する。
【０１０７】
各免疫で用いられるリコンビナントHBcキメラ免疫原の量は、免疫原として有効な量と称され、広範囲に、とりわけ下記で考察するようにリコンビナントHBcキメラ免疫原、免疫される患者及びワクチン中のアジュバントの有無に応じて変動することができる。ワクチン及び接種物の免疫原として有効な量によって、それぞれ下記で考察される防御又は抗体活性が提供される。
ワクチン又は接種物は典型的には、接種物当たり約１マイクログラムから約１ミリグラム（ユニットドース）のリコンビナントHBcキメラ免疫原濃度、好ましくは約10マイクログラムから約50マイクログラム/ユニットドースのリコンビナントHBcキメラ免疫原濃度を含む。“ユニットドース”という用語は、本発明のワクチン又は接種物に関する場合、動物に対する分割できない投与量として適切な物理的に分離されたユニットを指し、各ユニットは、必要な希釈剤と一緒に所望の免疫原としての効果を個々に又は総合的に生じるように計算した予め定めた量の活性物質を含む。
ワクチン又は接種物は、典型的には回収されたリコンビナントHBcキメラ免疫原から、好ましくは粒状形の前記免疫原を、生理学的に耐性が示される（許容される）希釈ビヒクル（例えば水、食塩水、リン酸緩衝食塩水（PBS）、酢酸緩衝食塩水（ABS）、リンゲル液など）中で懸濁して水性組成物を形成することによって調製される。前記希釈ビヒクルはまた、以下で考察されるように油性物質、例えばピーナツ油、スクァラン又はスクァレンを含むことができる。
活性成分としてタンパク質性物質を含む接種物又はワクチンの調製もまた当分野ではよく理解されている。典型的にはそのような接種物又はワクチンは非経口薬として、溶液又は懸濁液のどちらかとして調製される。注射前の液体として溶液又は懸濁液に適した固形物もまた調製できる。前記調製物は乳化してもよく、乳化が特に好ましい。
【０１０８】
免疫原として活性な成分は、医薬的に許容でき更に活性成分と適合する賦形剤としばしば混合される。適切な賦形剤は、例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど及び前記の組合せである。更にまた、所望される場合は、接種物又はワクチンは、組成物の免疫原としての有効性を強化する微量の補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝剤を含むことができる。
有利には意図されるワクチン又は接種物はまたアジュバントを含む。本発明のワクチン及び接種物のために適切なアジュバントは、キメラのB細胞エピトープに対して抗体応答を強化することができるアジュバントとともに、キメラに含まれるT細胞エピトープに対して細胞仲介応答を強化することができるアジュバントを含む。アジュバントは当分野で周知である（例えば以下を参照されたい：Vaccine Design-The Subunit and Adjubant Approach, 1995 Pharmaceutical Biotechnology, Vol.6, M.F. Powell and M.J. Newman, Plenum Press, New York and London, ISBN 0-306-44867-X）。
典型的なアジュバントには、完全フロイントアジュバント（CFA）（前記は人間には使用されない）、不完全フロイントアジュバント（IFA）、スクァレン、スクァラン及びミョウバン（例えばアルヒドロゲル（Alhydrogel（登録商標））（Superfos, Denmark））が含まれる。前記は当分野で周知であり、いくつかの供給元から市販されている。
【０１０９】
本発明の免疫原とともに使用するために好ましいアジュバントには、アルミニウム又はカルシウムの塩（例えば水酸化物又はリン酸塩）が含まれる。本発明での使用に特に好ましいアジュバントは水酸化アルミニウムゲル、例えばアルヒドロゲル（登録商標）である。水酸化アルミニウムゲルの場合、キメラタンパク質は、単位投与量当たり約50から約800マイクログラム、好ましくは約400から約600マイクログラムが存在するようにアジュバントと混合される。また別の特に好ましいアジュバントはリン酸アルミニウムで、前記はアジュ-フォスAdju-Phos（登録商標）の商標名でSuperfos Biosector（Denmark）から入手できる。第一のリン酸アルミニウム粒子は直径が約50から約100nmの平板状の形態を有し、製品中の最終粒子サイズは約0.5から約10μである。リン酸カルシウムのナノ粒子（CAP）はバイオサンテ社（Biosante Inc., Lincolnshire, IL）によって開発されたアジュバントである。対象の免疫原は粒子の外側を被覆されるか、又は内部の内側上に被包化することができる（He et al. (Nov. 2000) Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7(6):899-903）。
本発明の免疫原で使用されるまた別の特に好ましいアジュバントはエマルジョンである。意図されるエマルジョンは水中油エマルジョン又は油中水エマルジョンである。免疫原性キメラタンパク質の他に、そのようなエマルジョンは、周知のスクァレン、スクァラン、ピーナツ油などの油相及び分散剤を含む。非イオン性分散剤が好ましく、そのような物質には、ソルビタン並びにマンニドのモノ-及びジ-C12-C24-脂肪酸エステル、例えばソルビタンモノ-ステアレート、ソルビタンモノ-オレエート及びマンニドモノ-オレエートが含まれる。免疫原含有エマルジョンはエマルジョンとして投与される。
【０１１０】
好ましくは、そのようなエマルジョンは油中水エマルジョンであり、スクァレン及びマンニドモノ-オレエート（Arlacel（登録商標）A）を含み、（場合によってスクァランとともに）水相中でキメラタンパク質を乳化する。そのようなエマルジョンのよく知られた例には、モンタニド（Montanide（登録商標））ISA-720及びモンタニド（登録商標）ISA703（Seppic, Castres, France）が含まれる。前記は各々、スクァレン及びスクァランの両方を含むと考えられ、いずれもスクァレンが優勢であるが、モンタニド（登録商標）ISA703では優勢の程度は低い。もっとも好ましくは、モンタニド（登録商標）720が用いられ、油対水の比は7：3（w/w）が用いられる。他の好ましい水中油エマルジョンアジュバントには、WO95/17210及びEP0399843に開示されたものが含まれる。
本明細書では小分子アジュバントの使用もまた意図される。本発明で有用な小分子アジュバントのあるものは、米国特許4,539,205号、同4,643,992号、同5,011,828号及び同5,093,318号に記載された7-置換-8-オキソ-又は8-スルホ-グアノシン誘導体である（前記文献は参照により本明細書に含まれる）。これらの物質のうちで、7-アリル-8-オキソグアノシン（ロキソリビン）が特に好ましい。前記分子は抗原（免疫原）特異的応答の誘発に特に有効であることが示された。
【０１１１】
好ましい有用なアジュバントには、モノホスホリル脂質A（MPL）、3-デアシルモノホスホリル脂質A（3D-MPL）が含まれ、前記は、リビイムノケム社（Ribi Immunochem, Hamilton, Montana）によって製造されている周知のアジュバントである。前記アジュバントは、細菌から抽出された3つの成分（モノホスホリル脂質（MPL）A、トレハロースジミコレート（TDM）及び細胞壁骨格（CWS））（MPL＋TDM＋CWS）を2％スクァレン/トウィーン（Tween（登録商標））80エマルジョン中に含んでいる。このアジュバントはGB2122204Bに教示された方法によって調製することができる。3-デ-O-アシル化モノホスホリル脂質Aの好ましい形態は、直径が０．２μm未満の小粒子サイズを有するエマルジョンである（EP0689454B1）。もっとも好ましいものは、アミノアルキルグルコサミド4-ホスフェート（AGP）と称されるMPLの合成単糖類の類似体で、例えばRC-529の呼称で市販されている、｛2-[(R)-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイル-アミノ]-エチル-2-デオキシ-4-O-ホスホノ-3-O-[(R)-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイル]-2-[(R)-3-テトラ-デカノイルオキシテトラ-デカノイルアミノ]-p-D-グルコピラノシドトリエチルアンモニウム塩｝である。RC-529は、RC-529SEとしてスクァレンエマルジョンで、更にRC-529AFとして水性製剤でコリオキサ社（Corixa Corp.）から入手できる（米国特許4,987,237号及び6,113,918号を参照されたい）。これらのアジュバントは単独で用いても、1つ又は2つ以上の他のアジュバント（例えばアルヒドロゲル（登録商標））と併用してもよい。
【０１１２】
更に意図されるアジュバントには、CpGヌクレオチドモチーフを1回又は2回以上（フランキング配列もともに）含む合成オリゴヌクレオチドアジュバントが含まれる（Coley Phamaceutical Groupから入手できる）。QS21（Aquila Biopharmaceuticals, Inc.から入手できる）と称されるアジュバントは、南アメリカの樹木、キラヤ=サポナリア=モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の樹皮に由来するアジュバント活性を有する免疫学的に活性なサポニン分画（例えばQuil（登録商標）A）であり、その製造方法は米国特許5,057,540号に開示されている。キラヤ=サポナリア=モリナ（Quillaja Saponaria Molina）サポニンの半合成及び合成誘導体、例えば米国特許5,977,081号及び6,080,725号に記載されているものもまた有用である。MF59と称されるアジュバント（Chiron Corp.から入手できる）は米国特許5,709,879号及び6,086,901号に記載されている。
ムラミルジペプチドアジュバントもまた意図され、N-アセチル-ムラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミン（thur-MDP）、N-アセチル-nor-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン（CGP11637、nor-MDPと称される）、及びN-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミル-L-アラニン-2-(1'-2'-ジパルミトリル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ)エチルアミン（（CGP）1983A、MTP-PEと称される）が含まれる。いわゆるムラミルジペプチド類似体は米国特許4,767,842号に記載されている。
【０１１３】
好ましいアジュバント混合物には、3D-MPLとQS21との組合せ（EP0671948B1）、3D-MPLとQS21とを含む水中油エマルジョン（WO95/17210、PCT/EP98/05714）、他の担体との3D-MPL製剤（EP0689454B1）、コレステロール含有リポソーム中で製剤化されたQS21（WO96/33739）又は免疫刺激性オリゴヌクレオチド（WO96/01555）が含まれる。SKB（今はGlaxo-Smithkline）から入手できるSBAS2（今はASO2）はQS21及びMPLを水中油エマルジョン中に含む。また別のアジュバントには、WO99/52549に記載されたもの及びポリオキシエチレンエーテルの非粒子化懸濁物（UK特許出願9807805.8）が含まれる。
アジュバントはアジュバント量で用いられ、前記の量は、アジュバント、哺乳動物及びリコンビナントHBcキメラ免疫原に応じて変動することができる。典型的な量は各免疫当たり約1μgから1mgで変動することができる。適切な濃度又は量は容易に決定できることは当業者には理解されよう。
【０１１４】
接種物及びワクチンは、便利には非経口的に注射によって、例えば皮下又は筋肉内に投与される。他の投与態様に適した更に別の製剤には座薬、及びいくつかの事例では経口用製剤が含まれる。接種のための鼻腔スプレーの使用もまたNeirynckら（Nature Med. 5(10):1157-1163 (1999)）の考察のように意図される。座薬の場合、伝統的な結合剤及び担体、例えばポリアルカレングリコール又はトリグリセリドを含むことができ、そのような座薬は、0.5％から10％、好ましくは1％から2％の範囲で活性成分を含む混合物から形成することができる。経口製剤は、例えば医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような通常用いられる賦形剤を含む。
接種物又はワクチン組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤又は散剤の形態を有し、活性成分として免疫学的に有効な量のHBcキメラ又はHBcキメラ複合物を好ましくは粒子として含む。典型的な組成物では、好ましいHBcキメラ又はHBcキメラ複合物粒子の免疫学的に有効な量は、上記に記載したように単位用量当たり約1μgから約1mg、より好ましくは単位用量当たり約5μgから約50μgの活性成分である。
ワクチンは、典型的には非経口投与のために製剤化される。典型的な免疫は皮下（SC）、筋肉内（IM）、静脈内（IV）、腹腔内（IP）又は皮内（ID）に実施される。しかしながら、経口ルート及び鼻腔ルートのワクチン接種もまた意図される。
【０１１５】
HBcキメラ粒子及びHBcキメラ粒子複合物は中性又は塩の形でワクチンに製剤化することができる。医薬的に許容できる塩には酸付加塩が含まれ（タンパク質又はハプテンの遊離アミノ基により形成される）、無機酸（例えば塩酸、リン酸）又は有機酸（例えば酢酸、蓚酸、酒石酸、リンゴ酸など）で形成される。遊離カルボキシル基で形成される塩もまた、無機塩基（例えば水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム若しくは鉄）及び有機塩基（例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導することができる。
更に別の実施態様では、目的のHBcキメラをコードする遺伝子が適切に弱毒化された腸内細菌（例えば腸チフス菌、ネズミチフス菌、ネズミチフス菌-大腸菌ハイブリッド又は大腸菌）にトランスフェクトされているワクチン又は接種物が意図される。典型的な弱毒化又は無毒化腸チフス菌及びネズミチフス菌及びネズミチフス菌-大腸菌ハイブリッドが上記で提供した引用文献で考察されている。これらのワクチン及び接種物は特に、鼻粘膜、腸粘膜及び生殖管を介して感染又は伝達される疾患（例えばインフルエンザ、酵母（例えばアスペルギルス及びカンジダ）、ウイルス（例えばポリオ、口蹄疫、A型肝炎）及び細菌（例えばコレラ、サルモネラ及び大腸菌）に対して使用するために、更に粘膜IgA反応がIgG全身反応に加えて又は前記に代わって所望される場合に意図される。
腸内細菌は凍結乾燥し、医薬的に許容できる乾燥希釈剤と混合し、摂取のために錠剤又はカプセルにし、通常の固形医薬のように宿主動物に投与又は摂取させることができる。更にまた、これら細菌ワクチンの水性調製物は、経口、鼻腔、直腸又は膣投与のように粘膜免疫で使用するために応用される。
【０１１６】
目的のキメラ分子粒子を含む植物材料を用いる経口免疫は、トランスジェニック植物組織（例えば根（ニンジンのように）又は種子（例えば米又はコーン））の単純な摂取によって達成できる。この事例では、口又は腸管の水分は免疫に通常用いられる水性媒体を提供し、更に周囲の植物組織は医薬的に許容できる希釈剤を提供する。
接種物又はワクチンは、投薬製剤に適合した態様及び治療的に有効で免疫を誘発する量で投与される。投与されるべき量は、治療される対象者、対象者の免疫系の抗体合成能力、及び所望される防御の程度に左右される。投与に要求される活性成分の正確な量は、医師の判定に依存し、各人に固有である。しかしながら、適切な投薬範囲は個体当たり数十マイクログラムの規模である。初回投与及びブースター注射のための適切な治療計画もまた変動可能であるが、典型的には初回投与に間隔をあけて（数週又は数ヶ月）その後の注射又は別の投与が続く。
いったん免疫されたら、当該哺乳動物は、リコンビナントHBcキメラ免疫原が問題の抗原（例えばマラリアワクチンのためのスポロゾイト）と結合する十分な力価の抗体の産生を誘発するために十分な時間維持される。例示の抗スポロゾイト抗体の産生のための維持期間は典型的には約3から約12週間続き、ブースター又は2回目のワクチン免疫投与を含むことができる。所望の場合は、3回目の免疫もまた初回免疫後24週から5年で意図される。いったん防御レベルの抗体力価が得られたら、約1から約5年の間隔で周期的ブースター免疫によって、ワクチン接種哺乳動物は好ましくは前記抗体力価で又は抗体力価近くで維持される。
【０１１７】
抗スポロゾイト（マラリアワクチンの場合）又は他の抗体の産生は、血漿又は血清サンプルを免疫哺乳動物から入手し、前記サンプル中の抗体を適切な抗原［例えば合成スポロゾイト周囲イムノドミナント抗原（例えば本明細書で用いられるP. ファルシパルム（farusiparumu）のCSタンパク質ペプチド(NANP)5）］と結合する能力について以下に記載するようにELISAアッセイで、又は別の免疫アッセイ、例えば当分野で周知のウェスタンブロットによってアッセイすることにより容易に確認される。
誘発抗体、例えば抗CS抗体又は抗インフルエンザ抗体は接種された宿主動物の血液から周知の技術を用いて単離し、続いて、受動免疫用の第二のワクチンにこれもまた周知のように再構成することができることを記載しておく。同様な技術が人間のガンマ-グロブリン免疫のために用いられる。例えば、1つ又は多数の免疫宿主由来の抗血清を硫酸アンモニウム水溶液（典型的には40−50％飽和で）で沈殿させ、前記沈殿抗体をアフィニティークロマトグラフィー［(NANP)5又はインフルエンザM2ポリペプチドがクロマトグラフィーカラム上に固定される抗原として用いられる］の使用によりクロマトグラフィーで精製することができる。したがって、例えば1つの接種物をウマ又はヒツジで用いて、また別の動物（例えばヒト）での受動免疫で使用するためにマラリアの1つの種に対する抗体産生を誘発することができる。
本発明の別の実施態様は、動物宿主に接種物を接種する工程を含む、抗体、活性化T細胞又はその両方を前記動物宿主で誘発する方法である。前記方法で用いられる接種物は、医薬的に許容できる希釈剤に溶解又は懸濁された免疫誘発量の前述のHBcキメラ粒子又はHBcキメラ粒子複合物を含む。前記動物宿主は、抗体又は活性化T細胞の誘発に十分な時間（周知の技術によってアッセイできる、典型的には周知のように数週間又は数ヶ月が要求される）維持される。この維持期間に複数のそのような免疫が意図される。
【０１１８】
ジスルフィド結合を予測するコンピュータモデリング
ジスルフィド結合の予測はプログラムSS-BOND（Hazes et al. Protein Eng. 2:119-25(1988)）を用いて実施した（前記プログラムは対象のタンパク質について三次元構造情報を要求する）。HBc構造座標をタンパク質データバンクからロードし（前記はWynneらによって解像された3.3Å構造である）、最後の3つのモノマーの座標は、この構造が2つのダイマーのための情報を含んでいるので欠落させた。
標準的なパーソナルコンピュータで実行したとき、前記プログラムは、ジスルフィド結合の予測時に考慮される以下の3つのパラメータについてもっともストリンジェントな用件を自動的に選択する：(1)χ-3の角度、前記はSγ-Sγ結合周囲の回転である（理想は±90°でこの角度の偏差は0°に設定される）、(2)結合の形成に要求される最大エネルギー(理想は10kcal/mol未満)、及び(3)与えられた結合について可能なもっとも低いエネルギー構成を超えて許容されるエネルギーの差(推奨される最大値は5kcal/molである)。しかしながら、イムノドミナントループヘリックス（ILH）1（アミノ酸残基50−73）とILH2（アミノ酸79−110）との間でジスルフィド結合の形成についていずれのヒットを得るためにも、前記の要件は緩和されねばならなかった。リナックス操作系からプログラムを実行する場合、前記のパラメータを編集することができる。
後者の2つのパラメータを緩和することによっては更なるヒットは得られなかった。しかしながらχ-3の角度の緩和によって、結合周囲で30°の回転を許容したとき5つの可能なキメラが得られた（表）。29°と72°の間では更なるヒットは得られず (この場合最大許容偏差は90°である)、したがってこのヒットはこの実験には含めなかった。このようにして作製された出力の側鎖の位置を続いてプログラムGRASP（Nicholls et al. Proteins 30:9686-97 (1991)）を用いて、近接アミノ酸の目視によって精査した。72°のヒットを除き、全てが空間的に基部に存在するように見え、したがってこれらのキメラをクローニングした。29°で得られたヒット（ただしいずれのILH内ではないが）もまた、これらの残基が実際のイムノドミナントループ内に存在するので含めた。エピトープの挿入はアミノ酸残基D78とP79の間で実施し、したがって架橋はエピトープの塩基で生じているであろう。
【０１１９】
2つの主要なHBcイムノドミナントへリックスを架橋するSS-結合ヒット
2006509026.tif 000020
*イムノドミナントへリックスではなくイムノドミナントループに存在する
本発明を以下の非制限的実施例によって詳述する。
【実施例１】
【０１２０】
システイン変異を含むキメラの構築
Ａ．プラスミドベクターpKK223-3Ｎ及びシステイン置換
Zhengら（J. Biol. Chem. 267:9422-9429 (1992)）は、HBc183モノマー配列中に存在する4つのシステイン残基の2つはジスルフィド結合に必要とされないことを見出した。システイン48は与えられたサンプル中で部分的に共有結合していることが判明し、システイン107は遊離チオールとして存在することが分かった。これらのシステインの変異は粒子の会合又は安定性に影響を与えることは認められず、更にスルフヒドリル反応性は検出されず、システイン61及びシステイン183は完全にジスルフィド結合しているという決定的証拠を提供した。
システイン残基C48及びC107の両方をセリン残基に変異させて、導入されたシステインを含む粒子のスルフヒドリル含有量が容易に定量された。セリンはシステインと化学的に極めて類似するアミノ酸であるので、前記は保存的変異である（（ヒドロキシルR基に対してスルフヒドリル基であることを除いてそれらは同一である）。このキメラはこの後の全てのキメラのための鋳型として用いられた。鋳型の2つの変型が作製された。1つはV149で終わり（HBc149（C48S/C107S））、他方は追加のシステインをC-末端に保持している（HBc149（C48S／C107S）＋C）。
HBc遺伝子は最初にpKK223-3ベクター（Pharmacia Biotech（Piscataway, NJ）から入手できる）でクローニングした。PCRを用いてNcoI部位を含むようにマルチクローニング部位を改変した。全てのPCR反応はミニサイクラー（Minicycler（登録商標））（MJ Research（Waltham, MA）から入手できる）を用いて実施した。全ての実験のPCR反応条件は以下のとおりであった：
工程１−94℃で3分
工程２−92℃で1分
工程３−50℃で１分
工程４−72℃で40秒
工程５−工程2まで14回
工程６−72℃で5分
工程７−4℃で10分
工程８−終了
【０１２１】
全てのオリゴヌクレオチドPCRプライマーはインビトロゲン(Invitrogen; Carlsbad, CA）によって合成され、1μMの濃度で使用し、一方、各反応で約1μgの必須の鋳型を用いた。ベントポリメラーゼは増幅酵素で、塩化マグネシウムの追加はいずれの反応でも必要でないことが判明した。言及された全てのプライマーは下記の表2に挙げられている。全ての制限酵素はニューイングランド=バイオラブ社（New England BioLabs）から購入した。
各キメラのDNA配列はSequi-Net（Fort Collins, CO）への外部供給による自動配列決定によって確認された。プラスミドストックは、キアゲン（Qiagen; Valencia, CA）のプラスミド単離用ミディキット（Midi Kit）を用いて作製した。PCRを用いて作製した全てのキメラの完全な遺伝子ヌクレオチド配列は配列リストに提供されている。
プライマー配列は下記の表2に示され、前記表では、HBcアミノ酸残基は、フォワードプライマーのためのヌクレオチド配列の上及びリバースプライマーの下に示されている。太字のイタリック体で示されたアミノ酸残基及び塩基は置換を示している。問題の制限部位は太字で示されている。全ての配列は5'から3'の方向に記載されている。
【０１２２】
2006509026.tif 000021
【０１２３】
2006509026.tif 000022
【０１２４】
キメラHBc149及びHBc149＋C
ベクターpKK223-3（図2）をプライマー1及び2を用いて増幅させた。続いてPCR生成物及び親ベクターをSphI及びHindIIIで消化し、キアゲン（Qiagen）のQIAEX IIゲル抽出系を用い1.25％のアガロースゲル（Gibco BRLG（Gaithersburg, MD）のゲル装置）から精製した（全てのクローニングはこれらの装置及び試薬を用いて実施された）。消化したとき、480塩基対は親ベクターから切り出され、このフラグメントを廃棄し、ベクターを458塩基対のPCR生成物と連結する。このクローン（pKK233-3N、図2）は、今やNcoIとHindIII部位によってフランキングされる挿入物を受容することができる。pKK223-3ベクターに対するこの改変の結果は、マルチクローニング部位の全ての制限部位が欠落し、プライマー2に由来するNcoI−EcoRI−HindIII配列のみがtacプロモーターと5SのrRNA領域との間に残存するということである。
HBVのaywサブタイプゲノム（NCBIから入手できる）を用いてHBc遺伝子をクローニングした。プライマー3及び4を用いて、フランキングするNcoI及びHindIII部位を、アミノ酸149の後の終止コドンとともに添加した。続いて、pKK223-3Nベクター及びPCR生成物をNcoI及びHindIIIで消化した。ベクターから遊離した12塩基対フラグメントを廃棄した。ベクターをほぼ450塩基対のPCRフラグメントとともに連結してキメラHBc149を得た。HBc149＋C（CV-1123）を同じ方法で作製したが、ただしリバースプライマー9（配列番号:248）を用いて、バリン149と終止コドンとの間にシステイン残基を挿入した。
【０１２５】
キメラHBc149(C48S/C107S)及びHBc149(C48S/C107S)＋C
48位及び107位でシステインからセリンへの変異（C48S/C107S）を含むこれら2つのキメラを作製するために、いくつかのPCR反応が必要であった。C107S変異を先ず初めに内因性EarI部位を利用して実施した。5'片をプライマー3及びプライマー5を用いて作製した（前記プライマーはC107S変異を導入した）。3'片を完全マッチプライマー6及び4を用いて調製した。これらのフラグメント（それぞれ約320及び130塩基対）をEarIで消化し、連結した。
続いてこの連結物を鋳型として用いてC48S変異を導入した。HhaI部位をサイレント変異としてA54に導入し、この変異を可能にした。再びPCRを2つの半分部分で実施した。5'片はプライマー3及び7を用いて導入し、一方、3'片はプライマー8及び4を用いて作製した。これらの生成物（それぞれ約165及び295塩基対）を続いてHhaIで消化して連結した。続いて連結生成物をプライマー3及びプライマー4（V149の後ろに終止コドンを配置）又はプライマー9（V149の後ろにシステインを付加）のどちらかとともに増幅し、続いて終止コドンを付加した。生成物（約450塩基対をNcoI及びHindIIIで消化し、上記のように調製したpKK223-3Nベクターに連結してキメラHBc149(C48S/C107S)及びHBc149(C48S/C107S)＋Cを得た。
5つのジスルフィドキメラの4つのパネルの構築はC48S/C107Sキメラと類似の態様で実施した。第一の変異は2つの半分部分のPCRによって導入され、続いて第二の変異は、第一の連結物を鋳型として用いて2つの半分部分に導入された。全てのジスルフィドキメラはC-末端システインを用いて作製され、全ての最初のPCRは鋳型としてHBc149(C48S/C107S)＋Cを用いて実施された。
【０１２６】
キメラHBc149(C48S/C107S)L55C/H104＋C
サイレントCac8I部位をHBcの残基E64辺りに導入して、L55C変異を作製した。プライマー3及び12を用いて5'半分を増幅し、更にプライマー13及び9を用いて3'半分を増幅した。続いてこれらPCR生成物をCac8Iで消化し連結した。続いて連結物を2つの半分部分で増幅した。5'半分（プライマー3及び10を用いて作製）にはH104C変異を導入し、C48S/C107キメラの構築で先に用いたEarI部位を用いて鋳型中のC107S変異は維持された。3'半分は完全なマッチプライマー6及び9を用いた。EarIのよる消化の後で、フラグメントを連結し、プライマー3及び9で再度増幅した。この生成物をNcoI及びHindIIIで消化し、上記のように調製したpKK223-3Nでクローニングした。
キメラHBc149(C48S/C107S)A58C/L100C＋C
A58C変異を導入する5'半分を導入したCac8I部位を用い上記のL55C変異と同じ方法で作製した。プライマー3及び14を用いA58C変異を作製し、一方、プライマー13及び9から作製した同じ3'PCR生成物（上記L55C/H104C参照）をこの連結に用いた。しかしながら、L100C変異を作製するために、内因性Sau96I部位を利用した。5'半分を完全マッチプライマー3及び15を用いて作製し、一方、プライマー16及び9を用いてL100C変異を3'半分に導入した。PCR生成物をSau96Iで消化して連結し、続いてプライマー3及び9で再度増幅し、更に上記のようにpKK223-3Nでクローニングした。
キメラHBc149(C48S/C107S)A69C/V89C＋C
A69C変異は、プライマー3及び17並びに内因性BstNI部位を用いて5'PCRに導入した。3'PCRには完全マッチプライマー18及び9を用いた。生成物をBstNIで消化し連結した。続いて前記連結物を用いて5'PCR半分にV89C変異を作製し、前記は再度遺伝しないに天然に存在するSau96I部位を利用した（プライマー3及び11）。3'PCRは完全マッチプライマー19及び9によりなんらの変異も導入しない。生成物をSau96Iで消化し、連結し、プライマー3及び9で再増幅し、更にpＫＫ223-3で上記のようにクローニングした。
【０１２７】
キメラHBc149(C48S/C107S)W62C/F97C＋C
L55C及びA58Cの場合のように、W62C変異をCac8I部位から作製した。プライマー3及び20により5'半分に前記変異を導入し、一方、L55C及びA58C変異を作製するために用いた同じ3'PCR生成物を個々で用いた。生成物をCac8Iで消化し、連結し、更に第2回目のPCRに付した。Sau96I部位を再び利用してプライマー21及び9により3'F97C変異を作製し、一方、5'プライマー3及び15は完全マッチであった。このキメラの作製に必要なPCRは、更に別のCac8I部位がF97C変異の作製時に導入できるように前記の順序で実施される必要があることを特記する。Sau96Iで消化した後、生成物を連結し、プライマー3及び9で再び増幅し、更にpKK223-3でクローニングした。
キメラHBc149(C48S/C107S)L67C/R82C＋C
HBcループ内のA80−S81配列にサイレンと変異を作製することによって、NheI部位をループ内に導入し、ほんの2回のPCRでこのキメラを作製することが可能になる。5'片にプライマー3及び22を用いてL67C変異を導入し、3'片にプライマー23及び9を用いてR82Cを導入した。PCR生成物（それぞれ約245及び222塩基対）をNheIで消化し、連結した。続いて、連結物をプライマー3及び9を用いて増幅し、標準的な450塩基対フラグメントを得た。前記をNcoI及びHindIIで消化し、pKK223-3Nでクローニングした。
【０１２８】
Ｂ．ループ挿入ベクターの調製
エンジニアリング技術により作製した5つのシステインを含むキメラの4つがHBc粒子への会合に成功した。したがってこれらの全てをイムノドミナントループに外来エピトープを受容する能力についてアッセイした。更にまた、導入システインを全くもたないキメラを会合能力（更に後で安定性能力）の比較のためのコントロールとして用いた。エピトープはHBcアミノ酸のアスパラギン酸78とプロリン79との間に挿入された。全てのエピトープが、5'端でGly及びIle（EcoRI制限部位によってコードされる）並びに3'端でGlu及びLeu（SacI制限部位によってコードされる）とフランキングするように、新規な制限部位EcoRI及びSacIを導入した。したがって、HBc149(C48S/C107S)L55C/H104C＋C（会合粒子を形成することができなかった）を除く全てのシステインキメラでベクターを作製し、HBc配列のアミノ酸残基D78とP79との間に異種エピトープを受容することができた。
改変HBc149（V2及びV16）又はHBc183（V8)遺伝子（イムノドミナントループ領域に合成dsDNAフラグメントの方向性挿入を受容できる）を、PCRを用いて構築した（D78とP79との間で挿入物を受容しV149に短縮されたプラスミドをV2と呼び、追加されたシステインをV149の後にもつ同じプラスミドをV16と呼び、D78とP79との間に挿入物を受容しC183で終わるプラスミドをV8と呼んだ）。HBc149及びHBc183遺伝子は、2つのPCRプライマー対（そのうちの1つはアミノ末端を増幅し、他方はカルボキシル末端を増幅する）を用いて2つの半分部分で増幅した。V2の場合、PCR反応の生成物は249bpフラグメント（N-末端）及び243bpフラグメント（C-末端）であり、V16の場合、生成物は249bpフラグメント（N-末端）及び246bpフラグメント（C-末端）であり、V8の場合、生成物は249bpフラグメント（N-末端）及び349bpフラグメント（C-末端）である。
調製したN-末端フラグメントをNcoI及びEcoRIで消化し、C-末端フラグメントをEcoRI及びHindIIIで消化した。続いてV2、V16及びV8のフラグメント対を共通のEcoRIオーバーハングで一緒に連結した。得られたNcoI−HindIIIフラグメントを続いてpKK223-3Nベクターに連結した（前記ベクターはNcoI及びHindIIIによる消化で既に調製されてあった）。
B細胞エピトープをV2、V16及びV8プラスミドに挿入するために、適切なプラスミドをEcoRI及びSacI制限酵素で消化した。5'EcoRI及び3'SacIオーバーハングを有する合成dsDNAフラグメントを続いて挿入した。全ての事例V2、V16及びV8で、グリシン-イソロイシン（EcoRI）及びグルタミン酸-ロイシン（SacI）アミノ酸対は挿入されたB細胞エピトープとフランキングする。挿入された制限部位は下記のプライマーで下線を付されている。
【０１２９】
V2
HBc149/NcoI-F
5'-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA                            配列番号:263
HBc-D78/EcoRI-R
5'-GCGGAATTCCATCTTCCAAATTAACACCCAC                     配列番号:264
HBc-P79/EcoRI-SacI-R
5'-CGCGAATTCAAAAAGAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAG             配列番号:265
HBc149/HindIII-R
5'-CGCAAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG                     配列番号:266
V16
HBc149/NcoI-F
5'-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA                            配列番号:263
HBc-D78/EcoRI-R
5'-GCGGAATTCCATCTTCCAAATTAACACCCAC                     配列番号:264
HBc-P79/EcoRI-SacI-F
5'-CGCGAATTCAAAAAGAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAG             配列番号:265
HBc149+C/HindIII-R
5'-CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG               配列番号:267
V8
HBc149/NcoI-F
5'-GGGCCATGGACATCGACCCTTA                              配列番号:263
HBc-D78/EcoRI-R
5'-GCGGAATTCCATCTTCCAAATTAACACCCAC                     配列番号:264
HBc-P79/EcoRI-SacI-F
5'-CGCGAATTCAAAAAGAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAG             配列番号:265
HBc183/HindIII-R
5'-GGAAAGCTTACTAACATTGAGATTCCCG                        配列番号:268
システイン変異がループに近いために、特にキメラHBc149(C48S/C107S)L76C/R82C+Cのためにプライマーセットをデザインする必要があったが、一方、他の全てのキメラは同じプライマーセットを用いた（以下の表2及び表3）。5'半分は、プライマー3及び22（HBc149(C48S/C107S)L76C/R82C+Cの場合にはプライマー23）を用い、EcoRI部位を3'端に付加することにより作製した。3'半分は、プライマー24（HBc149(C48S/C107S)L76C/R82C+Cの場合にはプライマー25）及び9を用いて作製した（前記によって、これらのフラグメントにEcoRI部位及び下流のSacIが付加された）。続いて、全てのPCR生成物をEcoRIで消化し、各々対応する半分と連結し、プライマー3及び9を用いて再び増幅した。続いて、これらの生成物をNcoI及びHindIIIで消化し、準備したプラスミドpKK223-3Nでクローニングした。各クローンの配列は、上記で述べたように自動DNA配列決定によって実証した。
【０１３０】
エピトープの選択は、導入システインを含まなかった同等なベクター（V16）でのエピトープの過去の成功又は不成功を基準にした。V16で成功しなかった2つのエピトープを選択した：1つはアルツハイマー病（Morgan et al. Nature 408:982-985 (2000)）に関係するβ-アミロイドタンパク質（残基1−32）に由来し、残基701−721の防御抗原は炭疽菌（B. anthracis（Ba））（Little et al. Microbiology 142:707-715 (1996)）に由来する。十二指腸虫タンパク質Asp-1（残基292−303）（Dr. Peter Hotz（George Washington University）より提供）は、V16で低いが検出可能な粒子会合を生じ、このエピトープも粒子生成がジスルフィド結合導入により増加するか否かの評価に含めた。最後のエピトープ（V16で非常に良好な粒子会合を示した）は、このキメラの粒子会合及び安定性をエンジニアリング技術によって作製された型と比較するために含めた。前記エピトープは、インフルエンザAのM2タンパク質の細胞外ドメイン（残基2−24）（Zebedee et al. J. Virol. 62:2762-2772 (1988)；Neirynck et al. Nat. Med. 5:1157-63 (1999)）に由来し、前記は、このエピトープに関する我々の実験室での以前の実験で粒子会合に必要であることが判明した配列内の2つの改変を含んでいた。全てのエピトープ配列は下記の表3に提供されている。
オリゴヌクレオチド配列は、アニールさせたときに上記のように調製したシステイン操作ベクターに連結することができる一本鎖粘着端を上部鎖及び下部鎖が保有するようにデザインされた。オリゴ鎖アニーリングは、ミニサイクラー（Mj Research）を用いて、等モル量のオリゴ（10μＭの各上部及び下部オリゴ）を添加し、95℃で5分加熱し、続いて75℃まで毎分1℃ずつ下げることによって実施した。アニールさせたオリゴ含有溶液を続いてTE緩衝液で1：20に希釈した。この方法をプライマー対、26及び27、28及び29、30及び31、並びに32及び33について実施した。各ジスルフィドベクターは、EcoRI及びSacIによる消化、続いて生じた小フラグメントからベクターを除いて調製した。続いてアニールさせたオリゴの各々の1μLを用意したベクターと連結した。更にクローンの配列は配列決定によって実証した、
【０１３１】
2006509026.tif 000023
【０１３２】
Ｃ．キメラの発現及び精製
配列を確認した後、キメラでpREP4（Qiagen）（lacリプレッサーを発現するプラスミド）とともに大腸菌のBLR株（Novagen, Madison, WI）を同時形質導入した。細胞を塩化カルシウム調製物によってコンピテントにした（Sambrook et al. Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）。プラスミドpKK223-3はtacプロモーターを保有するがlacリプレッサーはコードせず、したがってこのタンパク質はpREP4によってtransで供給され、IPTGの添加によって誘発されるまでHBc遺伝子の発現を抑制する。形質転換体は、いずれのプラスミドの消失も防ぐために50μg/Lのアンピシリン（pKK223-3はアンピシリン耐性マーカーを有する）及び10μg/Lのカナマイシン（pREP4はカナマイシン耐性マーカーを有する）を補充したLBプレートで平板培養される。
続いて、同じ濃度の抗生物質を含む3mLのTBドライ培地（Doc Frugal, San Diego, CA）の開始培養へ形質転換体を釣り上げ、一晩増殖させた。続いて各開始培養の1mLを用いて同じ抗生物質を含む500mLのTBドライ培地に接種し、0.6−1.0のOD600まで培養を増殖させ、続いて25μＭのIPTGで誘発した。培養を16−24時間増殖させ、15000ＸGで10分遠心して細胞を採集した。
【０１３３】
キメラの会合はサイズ排除クロマトグラフィーを用いてアッセイした。会合したHBcは明瞭なピークとして溶出し（4つのピークをもつプロフィールの2番目）、前記は粒子が会合に失敗したときは存在しない（未会合モノマーは最後のピークで溶出する）。50mLの50mMトリス-HCl（pH8.0）及び10mMのEDTA（溶解緩衝液）に攪拌によって細胞ペレットを再懸濁する。続いて細胞懸濁液をミクロ液化剤（Microfluidics, Newton, MA）を用いて溶解し、31000ＸGで20分遠心して細胞屑を沈殿させた。HBc粒子は典型的には可溶性分画に存在し、そこで上清の容積を測定し、飽和硫酸アンモニウムで1：1に希釈してタンパク質を沈殿させた。得られた溶液を4℃で15分穏やかに攪拌し、続いて31000XGで20分、もう1回遠心して硫酸アンモニウム沈殿物を沈殿させた。
上清を廃棄し、ペレットを5mLの溶解緩衝液に再懸濁させ、続いて透析チューブ（分子量カット8000ダルトン）に移した。サンプルを1Lの溶解緩衝液に対して少なくとも3時間透析し、0.45μmの注射筒フィルターでろ過し、続いて、2.5X100cmのXK26カラムに充填してアクタプライム（Akta Prime）FPLC（全てPharmacia Biotech）につないだセファロースCL-4B樹脂を用いてサイズ排除クロマトグラフィーに付した。
カラムは20mMのリン酸ナトリウム（pH6.8）及び0.02％アジ化ナトリウムで予備平衡化し、同じ緩衝液約800mLを1.5mL/分の流速でポンプでカラムに通し、6−8mLの分画を採集した。粒子の生成は、カラムを通過する物質の最初の狭い第一のピークに続く特徴的なピークについて溶出プロフィールを調べることによって評価した。
【０１３４】
会合粒子が検出されたら、ピーク分画をプールし、20−25mLのカラム容積のコースHYPATITE（登録商標）C樹脂（Clarkson, Williamsport, PA）（2.5X20cmのカラム（Kontes, Vineland, NJ）に充填）に通した。HBc粒子は典型的にはこの樹脂に最小限の結合を示し、そこで前記タンパク質をこのカラムにロードし、全溶出液を採集した。続いてカラムを50mMのリン酸ナトリウム（pH6.8）で溶出液のAbs280が0.1未満になるまで洗浄した。
続いてプールを0.45μmのフィルターに通し、更にHPLC（PerSeptive BiosystemsのBioCad、 Framingham, MA）の溶媒ラインからMonoQ（登録商標）HR10/10陰イオン交換カラム（Pharmacia Biotech）にロードした。カラムは、25mMトリス-HCl及び0.02％のアジ化ナトリウムで平衡化させ、サンプルをいったんロードしたら同じ緩衝液で洗浄した。粒子は、25mMのトリス-HCl中の0−3MのNaClの直線状グラディエントで溶出させた。ピーク分画をプールし、飽和硫酸アンモニウムで1：1に希釈して再沈殿させ、穏やかに1時間4℃で攪拌し、続いて17500XGで30分遠心した。得られたペレットを20mMのリン酸ナトリウム（pH6.8）の最小容積に再懸濁させ、透析チューブに移し、同じ緩衝液に対して十分に透析した。続いて、最終的な精製サンプルを0.45μmのフィルターに通し、前記を凍結する前に4℃で24時間インキュベート（維持）した。タンパク質濃度はBCAアッセイ（Sigma（St. Louis, MO）から入手できる）によって決定した。
【０１３５】
Ｄ．会合キメラの性状決定
精製タンパク質は、それらの天然の配座にある粒子を調べるために2つの方法（分析的サイズ排除及びエルマン（Ellman's）テスト）を用いて性状を決定した（非還元条件下での変性粒子を調べたもの（非還元SDS-PAGE）、及びモノマーの完全性を調べたもの（還元SDS-PAGE））。
粒子状対非粒子状物質を評価するために、精製タンパク質サンプルを解析用サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分析した。前記の方法では、各サンプルの50−90μgをスーパーロース6HR10/30カラム（Pharmacia Biotech）上に注入し、HPLC（BioCad）又はアクタピューリファイア（Akta Purifier）（Pharmacia Biotech）のどちらかとつないだ。20mMのリン酸ナトリウム（pH6.8）をポンプで0.5mL/分の流速でカラムに通した。粒子の完全性はピークの溶出プロフィールの可視化によって評価した。この場合、約7mLの溶出位置の1つのピークの存在は完全に形成された粒子の存在である。後のピークは非粒子構造、例えばダイマー及びモノマーを示す。
ジスルフィド結合形成は、Zhengら（J. Biol. Chem. 267:9422-9429 (1992)）が記載した方法と類似の方法を用いて判定した。したがって、粒子は、ELISAプレートのウェルで20mMリン酸ナトリウム（pH6.8）及び0.1％SDS中で最終濃度1mg/mLに希釈された。続いて、エルマン試薬（Sigma）のストック溶液をジメチルスルホキシド（DMSO）中で200mMの濃度で作製した。続いてこの溶液を20mMリン酸ナトリウム（pH6.8）中で1：200に希釈し、HBcサンプルに最終濃度0.1mMに添加した。反応は室温で15分進行させた。プレートをスペクトラマックス（Spectramax（登録商標）；Molecular Devices, Sunnyvale, CA）で412nmで読み取った。続いて比色分析を実施してジスルフィド結合形成を決定した。この場合、エルマン試薬と遊離スルフヒドリルとの反応性は黄色を生じ、サンプル中の完全なジスルフィド結合は発色を生じなかった。
【０１３６】
粒子の最終的な性状決定は非還元及び還元SDS-PAGEゲルを用いて実施し、モノマー及びダイマーのジスルフィド結合誘発架橋とともにモノマーの完全性を調べた。全てのSDS-PAGEゲルはNuPAGE（登録商標）システム（Invitrogen, arlsbad, CA）を用いて泳動した。NuPAGE（登録商標）10％ビス-トリス1.5mmX10ウェルをエクセル=シュアロック（XCell SureLock（登録商標））電気泳動装置でMES緩衝液を用いて泳動した。サンプルは、LDS NuPAGE（登録商標）サンプル緩衝液を添加し、50℃で10分加熱して調製した。還元サンプルの調製のためには、β-メルカプトエタノールを加熱工程の前に最終濃度10％に添加した。
ゲルは、提供されたプロトコルにしたがい200Vで30−40分泳動し、続いてシンプリーブルー=セーフステイン（SimplyBlue SafeStain(登録商標); Invitrogen, Carlsbad, CA）で染色した。非還元サンプルの架橋は、モノマー及びダイマー種の存在及びゲルの最上部にスメァとして認識することができる高分子量タンパク質の存在によって確認された。モノマーの完全性は、既知の標準物と同じ分子量（約17ｋDa）をもつ1本の限局バンドの存在によって確認された。
粒子の安定性は、種々の温度（4℃，室温及び37℃）で一定時間（0、3、7及び14日で分析のためにサンプルを採集）インキュベートしたサンプルについて上記の方法を用いて評価した。
【０１３７】
Ｅ．N-末端システイン及びイムノドミナントループにP. ファルシパルム由来のCS-リピートエピトープを含むキメラ粒子を発現するためのベクター
2つの発現ベクター（V2.Pf1(N-MGCELDP)及びV2.Pf1(N-MGCDIDP)）を調製して、N-末端システイン残基のキメラ粒子安定化能力を決定した。ベクターV2.Pf1(N-MGCELDP)を作製するために、オリゴヌクレオチド、HBc(MGCELDP)-NcoI-F及びHBc149/HindIII-Rを用いてベクターV2.pF1からハイブリッドHBc遺伝子を増幅させる。得られた528bpフラグメントをNcoI及びHindIIIで切断し、pKK-223-3N（既に同じ2つの酵素で切断されている）に挿入する。
ベクターV2.Pf1(N-MGCDIDP)を作製するために、オリゴヌクレオチド、HBc(MGCDIDP)-NcoI-F及びHBc149/HindIII-Rを用いてベクターV2.pF1からハイブリッドHBc遺伝子を増幅させる。得られた528bpフラグメントをNcoI及びHindIIIで切断し、pKK-223-3N（既に同じ2つの酵素で切断されている）に挿入する。
HBc(MGCELDP)-NcoI-F
M  G  C  E   L   D   P   Y   K   E   F   G      配列番号:277
5'-GCGCCATGGGGTGTGAGCTCGACCCTTATAAAGAATTTGG                配列番号:278
HBc(MGCDIDP)-NcoI-F
M  G  C  D   I   D   P   Y   K   E   F   G       配列番号:279
5'-GCGCCATGGGGTGTGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGG                配列番号:280
【０１３８】
Ｆ．V7クローニングベクターの調製
T細胞エピトープをHBcキメラC-末端に融合させるために、新規なベクターを構築した。固有のEcoRI及びSacI制限部位をバリン149とHindIII部位との間に挿入し、合成dsDNAのEcoRI-HindIII（又はEcoRI-SacI）制限部位への定方向性挿入を容易にした。下記のPCRプライマー対を用いて、アミノ末端にNcoI制限部位並びにカルボキシル末端にEcoRI、SacI及びHindIII部位を有するHBc149遺伝子を増幅させた。前記PCR反応生成物（479bp）をNcoI及びHindIIIで消化し、pKK223-3NでクローニングしV7を形成した。
T細胞エピトープを挿入するために、プラスミド（V7）をEcoRI及びHindIII（又はEcoRI及びSacI）で消化し、EcoRI/HindIII（又はEcoRI/SacI）オーバーハングを有する合成dsDNAフラグメントをV7に連結した。全てのV7構築物のために、天然のHBcの最後のアミノ酸（バリン149）及び挿入されるT細胞エピトープの最初のアミノ酸を、EcoRI制限部位を形成するヌクレオチドによってコードされるグリシン-イソロイシン二ペプチド配列によって分離させた。EcoRI/SacIに挿入されるエピトープの場合、T細胞エピトープの後ろ、終止コドンの前にSacI部位によって提供される付加グルタミン酸-ロイシン残基が存在する。表示のプライマーでは制限部位に再び下線が付されている。
HBc149/NcoI-F
5'-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA                       配列番号:263
HBc149/SacI-EcoRI-H3-R
5'-CGCAAGCTTAGAGCTCTTGAATTCCAACAACAGTAGTCTCCG     配列番号:281
【０１３９】
Ｇ．V12発現構築物の調製
V12ベクターをV2及びV7ベクターから構築する。V12ベクターは、アミノ酸78と79の間にB細胞エピトープを含むとともに、バリン149の下流にT細胞エピトープを含む。EcoRI/HindIIIに挿入されたT細胞エピトープを含むV7ベクターのカルボキシル末端を2つのPCRプライマー（HBc-P79/SacI-F及びｐKK223-3/4515-32R）を用いて増幅し、SacI及びHindIII制限部位によってフランキングされたアミノ酸79−149及びT細胞エピトープに対応するdsDNAフラグメントを提供する。
前記PCR生成物をSacI及びHindIIIで切断し、続いて、同じ2つの酵素で切断して用意した所望のV2ベクターにクローニングする。前記PCRプライマーは、HBc遺伝子のアミノ酸149の後ろに存在するT細胞エピトープに関係なく、全てのV7遺伝子のカルボキシル末端の増幅に使いやすい。
制限部位には下線が付されている。
HBc-P79/SacI-F
5'-CGCGAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAG                       配列番号:282
ｐKK223-3/4515-32R
5'-GTATCAGGCTGAAAATC                                    配列番号:283
【０１４０】
Ｈ．V2に挿入されるP.ファルシパルムCS-リピートB細胞エピトープ
V2及びV7構築物のためには、対象のB細胞（V2）又はT細胞（V7）エピトープをコードする合成dsDNAフラグメントをEcoRI/SacI制限部位に挿入する。対象のB細胞又はT細胞エピトープをコードする合成dsDNAフラグメントは、相補性の一本鎖DNAオリゴヌクレオチドを等モル濃度で混合し、95℃に5分加熱し、続いて-1℃/分の速度で室温に冷却することによって調製する。このアニーリング反応はTE緩衝液中で実施される。二本鎖DNAは、上部に示したコードされるエピトープ配列とともに下記に示されている。ポンド記号（＃）は、以下のアミノ酸配列のいくつかで終止コドンの存在を示すために用いられる。
【０１４１】
2006509026.tif 000024
【０１４２】
2006509026.tif 000025
【０１４３】
2006509026.tif 000026
【０１４４】
2006509026.tif 000027
【０１４５】
2006509026.tif 000028
【０１４６】
2006509026.tif 000029
【０１４７】
2006509026.tif 000030
【実施例２】
【０１４８】
インフルエンザA M2ポリペプチド配列を含むキメラの調製
Ａ．インフルエンザA M2のN-末端ドメインのV2、V7、V8、V16、V34、V47、V48、V54及びV55クローニングベクターへの挿入：
V2、V7、V8、V16、V34及びV55構築物のためには、M2エピトープ（インフルエンザA M2の残基2−24；配列番号:9）をコードする合成dsDNAフラグメントをEcoRI/SacI制限部位に挿入し、一方、V47、V48及びV54構築物のためには、同一物の残基1−24をNcoI/SacI制限部位に挿入した。合成dsDNAフラグメントは相補性一本鎖DNAオリゴヌクレオチドを等モル濃度で混合し、95℃で5分加熱し、続いて-1℃/分の速度で室温に冷却することによって調製した。このアニーリング反応はTE緩衝液中で実施した。二本鎖DNAは、上部に示したコードされるエピトープ配列とともに下記に示されている。
【０１４９】
2006509026.tif 000031
【０１５０】
Ｂ．個々のシステイン変異インフルエンザA M2のN-末端ドメイン［M2(1-24/C17S),M2(1-24/C19S)］のV47発現ベクターへの挿入：
M2タンパク質の残基1−24をコードする、17位又は19位のどちらかのシステインがセリンに変異したアニールDNAフラグメントを下記に示す。前記は上記のパートＡに記載したようにV47のNcoI/SacI制限部位に挿入された。
【０１５１】
2006509026.tif 000032
【０１５２】
Ｃ．インフルエンザA M2のN-末端ドメイン［M2(2-24/C17S, C19S)］の発現ベクターV8、V16、V47、V48及びV54への挿入：
V8及びV16構築物のためには、システインからセリンへの2つの変異を保有し、M2エピトープ（インフルエンザA M2タンパク質の残基2−24）をコードする合成dsDNAフラグメントをEcoRI/SacI制限部位に挿入し、一方、V47、V48及びV54構築物のためには、同一物の残基1−24をNcoI/SacI制限部位に挿入した。合成dsDNAフラグメントは上記のパートＡに記載したように調製した。
【０１５３】
2006509026.tif 000033
【０１５４】
Ｄ．インフルエンザA M2のN-末端ドメインのまた別のコピーの発現ベクターＶ54.M2(1-24)のN-末端への挿入：
天然のM2配列［M2(1-24/C17S)］又は変異M2配列［M2(1-24/C17S, C19S)］のどちらかの更に別のコピーを現存のM2(1-24)配列のN-末端でクローニングした。これらのクローンの構築では、付加されたコピーがただ1つのイニシエーターメチオニンを供給することができるように本来のメチオニンを除去した。PCRを用いて2つのフラグメントで構築物を作製した。2つの天然M2コピーを含むクローン［M2(1-24)/V54.M2(2-24)］を作製するために、鋳型V54.M2(1-24)を用いて、先ず初めにN-末端フラグメント（生成フラグメントは353bp）を増幅し（前記はXhoI部位（したがってグルタミン酸の後ろにアミノ酸ロイシン）をM2配列のD24の後ろに挿入する）、続いてC-末端フラグメント（生成フラグメントは538bp）を増幅した（前記はM2配列のS2のN-末端にXhoIを挿入し、したがってメチオニンを除去する）。M2の天然のコピーの後ろに変異を含むクローン［M2(1-24)/C17S、C19S/V54.M2(2-24)］を作製するために、鋳型V54.M2(1-24/C17S, C19S)を用いてN-末端フラグメントを作出し、一方、C-末端フラグメントは上記のものと同一である（生成フラグメントサイズもまた同一である。
調製されたN-末端フラグメントをBamHI及びXhoIで消化し、C-末端フラグメントはXhoI及びHindIIIで消化した。続いてフラグメント対を共通のXhoIオーバーハングで一緒に連結し、生成されたBamHI-HindIIIフラグメントを続いてpKK223-3Nベクター（BamHI及びHindIIIで予め消化されていた）に連結した。
変異M2配列の更に別の2つのコピーを現存のM2(1-24)配列のN-末端でクローニングした。繰り返せば、前記遺伝子の1位でイニシエーターメチオニンを温存して、構築物M2(1-24)/C17S, C19S/M2(2-24)/C17S, C19S/V54.M2（2-24）を得た。更に繰り返せば、前記クローンは2つのPCRフラグメントで生成された。鋳型V54.M2(1-24/C17S, C19S)を用いてN-末端フラグメント（生成フラグメントは353bp）を増幅した（前記はPstI部位（したがってグルタミンの後ろにアミノ酸ロイシン）を変異M2配列のD24の後ろに挿入する）。上記に由来する鋳型M2(1-24)/C17S, C19S/V54.M2(2-24)を用いて、C-末端フラグメント（生成フラグメントは613bp）を作製した（前記は変異M2配列のS2のN-末端にPstI部位を挿入し、したがってメチオニンを除去する）。
調製されたN-末端フラグメントをBamHI及びPstIで消化し、C-末端フラグメントはPstI及びHindIIIで消化した。続いてフラグメント対を共通のPstIオーバーハングで一緒に連結した。生成されたBamHI-HindIIIフラグメントを続いてpKK223-3Nベクター（BamHI及びHindIIIで予め消化されていた）に連結した。
【０１５５】
M2(1-24)/V54.M2(2-24)；M2(1-24/C17S, C19S/V54.M2(2-24)
pKK-BamHI-F
5'-CGTAGAGGATCCGGAGCTTATCGACTGCACGG            配列番号:365
M2-D24/XhoI-R
5'-GCGCTCGAGATCACTTGAATCGTT                    配列番号:366
M2-XhoI/S2-R
5'-GCGCTCGAGAGCTTATTGACCGAAGTTGAAACC           配列番号:367
HBc149+C/HindIII-R
5'-CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTACTCTCCGGAAG       配列番号:267
M2(1-24/C17S, C19S)/M2(2-24/C17S, C19S)/V54.M2(2-24)
pKK-BamHI-F
5'-CGTAGAGGATCCGGAGCTTATCGACTGCACGG            配列番号:365
M2-D24/PstI-R
5'-GCGCTGCAGATCACTTGAATCGTT                    配列番号:368
M2-PstI/S2-F
5'-GCGCTGCAGTCTCTGCTGACCGAAG                   配列番号:369
HBc149+C/HindIII-R
5'-CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG       配列番号:267
【０１５６】
Ｅ．天然のM2-HBcの切端型の構築：
183残基（完全長HBc配列）を含む本来のM2-HBc構築物（Neirynck et al. (1999) Nature Med. 5(10):1157-1163：WO99/07839）をV149まで短縮し、全遺伝子をpKK223-3発現ベクターに移した。前記を達成するために、プラスミド3453（University of Gentより提供された）を鋳型としてPCR反応で用い、523bpの生成物を得た。前記生成物を制限酵素AflIII及びHindIIIで消化し、続いてpKK223-3Nベクター（NcoI及びHindIIIで予め消化した）に連結した。
AflIII-M2-F
5'-CGCGACATGTCTCTGCTGACCG                          配列番号:370
HBc-HindIII-R
5'-CGCAAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG                 配列番号:371
【０１５７】
2006509026.tif 000034
【実施例３】
【０１５８】
部分的切端粒子を発現するための発現ベクターの合成
部分的切端HBc粒子を発現するための発現プラスミドを調製するために、ただ1つのアミノ末端オリゴヌクレオチドPCRプライマーを（HBc149/NcoI-F）を固有のC-末端プライマーと一緒に用いた。例えば、HBc156（E.cR;CV-1600粒子）発現プラスミドを調製するために、プラーマーHBc149/NcoI-F及びHBc156(E.cR)-H3-Rを用いる。プライマーHBc149/NcoI-F及びHBc156(E.cR)-H3-Rを用いてHBc156(E.cR)＋C（CV-1601粒子）発現プラスミドを調製した。用いた全てのプラーマーの配列は下記に示す。
粒子の切端及びいくつかの事例ではC-末端システイン残基の取り込みに加えて、大腸菌での発現に最適であるコドンもまた用いた。いくつかのアルギニンコドン（特にAGA及びAGG）は大腸菌ではほとんど用いられず、更に翻訳時のポリペプチド合成を失速させ、不完全な終了をもたらすことによって大腸菌でのタンパク質の効率的な発現の障害となると考えられていることは周知である。HBcの150から183の間の16のアルギニンのコドンのうち、7つは稀なAGAコドンによってコードされ、2つは非常に稀なAGGコドンによってコードされる。したがって、この実験では、全てのAGA及びAGGコドンを、大腸菌でより頻繁に用いられるコドンで置換した。
稀なアルギニンコドンの連続的な置換を可能にするために、HBc156遺伝子を先ず初めに合成し（CV−1600及びCV-1601粒子）、続いてHBc163構築物（CV-1634及びCV-1632粒子）のための鋳型として用いた。HBc163構築物はその後HBc171構築物（CV-1642及びCV-1643粒子）のための鋳型として用い、最後にHBc171構築物をアルギニンコドン最適化HBc182及びHBc183構築物のための鋳型として用いる。非最適化HBc182構築物（CV-1575）もまたコントロールのために調製した。全てのPCR生成物は制限酵素NcoI及びHindIIIで切断し、発現ベクターpKK223-3N（上記述べたように同じ酵素で既に切断されている）でクローニングした。
アミノ末端プライマー配列（NcoI制限部位は下線を付されている）は以下のとおりである：
HBc149/NcoI-F
5'-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA                         配列番号:263
カルボキシル末端プライマー配列（HindIII制限部位は下線を付されている）は以下のとおりである：
HbC156(E.cR)-H3-R
5'-GCGAAGCTTACTAAGGGGAGCGGCCTCGTCGACGAACAACAGTAGTCTCCGG
配列番号:372
HBc156C(E.cR)-H3-R
5'-GCGAAGCTTACTAACAAGGGGAGCGGCCTCGTCGACGAACAACAGTAGT-
CTCCGG                                             配列番号:373
HBc163(E.Cr)-H3-R
5'-GCGAAGCTTACTAAGGCGAGGGAGTGCGCCGACGAGGGGAGCGGCCTCG
配列番号:374
HBc163C(E.cR)-H3-R
5'-GCGAAGCTTACTAACAAGGCGAGGGAGTGCGCCGACGAGGGGAGCGGCCTCG
配列番号:375
HBC171(E.cR)-H3-R
5'-GCGAAGCTTACTACGGCGATTGAGAGCGTCGACGGCGAGGCGAGGGAGT
配列番号:376
HBc171C(E.cR)-H3-R
5'-GCGAAGCTTACTAACACGGCGATTGAGAGCGTCGACGGCGAGGCGAGGGAGT
配列番号:377
HBc183(E.cR)-H3-R
5'-GCGAAGCTTACTAACATTGAGATTCCCGAGATTGAGATCGCCGGCGACGCGG-
CGATTGAGAGCGTC                                               配列番号:378
HBc182-H3-R
5'-GCGAAGCTTACTATTGAGATTCCCGAGATTGA                          配列番号:379
HBc183-H3-R
5'-GGAAAGCTTACTAACATTGAGATTCCCG                              配列番号:380
HBC149/HindIII-R
5'-CGCAAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG                           配列番号:266
HBc149+C/HindIII-R
5'-CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG                     配列番号:267
2006509026.tif 000035
【０１５９】
下記の表は、完全長のHBcAg（HBc183）及びC-末端短縮を含む全ての粒子のC-末端の立体配置を示すアラインメントを示している。配列は、全ての構築物によって共有されている配列番号:1のHBcのN-末端からアミノ酸残基149までにしたがってアラインメントされている。C-末端システイン残基は存在するときは下線を付されている。
表
構築物名称                      配列                        配列番号
HBc183            VRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC       381
HBc182            VRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQ        382
HBc171(E.cR)+C    VRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPC                  383
HBc171(E.cR)       VRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSP                  384
HBc163(E.cR)+C    VRRRGRSPRRRTPSPC                          385
HBc163(E.cR)       VRRRGRSPRRRTPSP                          386
HBc156(E.cR)+C    VRRRGRSPC                                 387
HBc156(E.cR)       VRRRGRSP                                 388
【実施例４】
【０１６０】
アッセイの方法
Ａ．抗原性
１．粒子ELISA
精製粒子を被覆緩衝液（50mM重炭酸ソーダ、pH9.6）中で2μg/mLの濃度に希釈し、ELISAストリップのウェルを被覆した（100μL/ウェル）。前記ELISAストリップを室温で一晩インキュベートした（約18時間）。次の朝、前記ウェルをELISA洗浄緩衝液（EWB）（リン酸緩衝食塩水（PBS）、pH7.4、0.05％トゥイーン(Tween(登録商標))-20）で洗浄し、更にPBS中の3％BSAで1時間ブロックした（200μL/ウェル）。ELISAストリップを乾燥状態で-20℃で必要になるまで保存した。
粒子の抗原性を決定するために、抗血清をEWB中の１％BSAを用いて希釈し、100μL/ウェルを抗原被覆ELISAウェルに添加した。血清を1時間インキュベートし、ELISA洗浄緩衝液（上記）で洗浄し、抗マウス(IgG)-HRP（The Binding Site, San Diego, CA; HRP=セイヨウワサビペルオキシダーゼ）複合物又は他の適切な抗体を1時間用いて探索した。ELISA洗浄緩衝液で洗浄した後、前記反応物をTMブルー基質の添加によって（100μL/ウェル）可視化した。10分後に1NのH2SO4（100μL/ウェル）を添加して反応を停止させ、ELISAプレート読取装置で450nmで読み取った。
２．合成ペプチドELISA
20アミノ酸残基の合成ペプチド（(NANP)5）又は24アミノ酸残基の合成ペプチドM2を被覆緩衝液（50mM重炭酸ソーダ、pH9.6）中で1μg/mLの濃度に希釈し、ELISAストリップのウェルを被覆した（100μL/ウェル）。一晩（約18時間）37℃のインキュベーターでインキュベートすることによってウェル上のペプチドを乾燥させる。次の朝、前記ウェルをELISA洗浄緩衝液（リン酸緩衝食塩水（PBS）、pH7.4、0.05％トゥイーン(Tween(登録商標))-20）で洗浄し、更にPBS中の3％BSAで1時間ブロックした（200μL/ウェル）。ELISAストリップを乾燥状態で-20℃で必要になるまで保存した。
粒子の抗原性を決定するために、抗血清（モノクローナル又はポリクローナル）をEWB中の１％BSAを用いて希釈し、100μL/ウェルをペプチド被覆ELISAウェルに添加した。血清を1時間インキュベートし、ELISA洗浄緩衝液で洗浄し、抗マウス(IgG)-HRP複合物（上記のように100μL/ウェルで）又は他の適切な抗体を1時間用いて探索し、再びELISA洗浄緩衝液で洗浄し、続いてTMブルー基質の添加によって（100μL/ウェル）可視化した。10分後に1NのH2SO4（100μL/ウェル）を添加して反応を停止させ、ELISAプレート読取装置で450nmで読み取った。
Ｂ．粒子の免疫原性
粒子の免疫原性をアッセイするために、選択アジュバント中の10又は20μgの粒子でマウスをIPで免疫し、4週間して同じアジュバント中の10μgの粒子でブースター免疫した。マウスを2、4、6及び8週で採血した。
【実施例５】
【０１６１】
280：260吸収比の決定
精製粒子の280：260吸収比を決定するために、粒子を20mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）で約0.2mg/mLの濃度に希釈し、260及び280nmの波長で吸収値を測定した。280nmで測定された吸収を260nmの値で割って、280：260比を決定した。前記の比をいくつかのサンプル（天然粒子（HBc183）、残基149位の後ろで切端したHBc粒子（HBc149）、及び本明細書のいずれかの場所で明らかにしたいくつかのHBcキメラを含む）について得た。前記の比は下記の表に示されている。完全長粒子CV-1559は、Neirynckら（Nature Med. 5(10):1157-1163）が最初に報告した粒子調製物で、一方、完全長粒子CV-1607は同様な粒子であるが、ポリペプチドの17位及び19位のM2ポリペプチドシステイン（配列番号:9のX17及びX19）がセリン残基に変異している。
表
2006509026.tif 000036
NT：テスト実施せず。*CV-1159はNeirynck (1999)が記載したIM2-HBcと同一である。
【実施例６】
【０１６２】
耐熱性プロトコル
精製粒子は、50mMのNaPO4（pH6.8）を用いて0.5−1mg/mLの濃度に希釈し、4℃、室温又は37℃でインキュベートした。サンプルを種々の時点で採取し、SDS-PAGEサンプル緩衝液（還元型）と混合し、10％SDS-PAGEゲルで泳動した。ゲルをシンプリーブルー=セーフステイン（SimplyBlue SafeStain; Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて染色してから分析した。
【実施例７】
【０１６３】
ハイブリッド粒子の解析的ゲルろ過分析
25mLのスーパーロース（Superrose(登録商標)）6HR10/30クロマトグラフィーカラム（Amersham Pharmacia #17-0537-01）及びBioCAD（登録商標）SPRINT還流クロマトグラフィーシステムを用いて、精製ハイブリッドHBc粒子の解析的ゲルろ過分析を実施した。UV検出装置を280nmの波長のモニターのために設定する。カラムは、3カラム容積（CV；約75mL）の緩衝液（20mM NaPO4（pH6.8））を流速0.50mL/分で用いて平衡化した。
分析するべき粒子を20mMのNaPO4（pH6.8）を用いて1mg/mLの濃度に希釈した。続いて200マイクロリットル（μL）のサンプルを前記カラムにロードした。流速0.50mL/分で20mMのNaPO4（pH6.8）を用いてサンプルをカラムから溶出させた。
N-末端システイン残基を含む粒子又はそのようなシステインを含まない同様な粒子を上記の方法を用いて解析した。280nmのトレースの積分はBioCAD(登録商標)ソフト（PerSeptive(登録商標)）を用いて実施した。
【実施例８】
【０１６４】
インフルエンザM2構築物
最近、Neirynckら（Nature Med. 5(10):1157-1163 (1999)及びWO99/07839）は、M2の24アミノ酸残基の細胞外ドメインと完全長HBc粒子（HBc183）（アミノ酸残基1−4を欠く）のN-末端との融合を報告した。本明細書でIM2HBcと称する前記構築物の模式図は下記に示されている。前記模式図では前記24量体はHBcのN-末端と連結されている。
IM2HBc
MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD-HBc(5-183)        配列番号:389
ある説明例では、M2エピトープはＢ型肝炎コアのイムノドミナントループに挿入され、CV-1475と称される粒子は良好に発現され、そのような挿入及び精製のために以前に考察された技術を用いて精製することができた。M2エピトープの変異型（M2の天然の17位及び19位の2つのシステイン残基はアラニン残基によって置換されている）もまたイムノドミナントループで発現され（CV-1473粒子）、生じた粒子は精製された。これら2つの粒子を下記に模式的に示す。
CV-1475
HBc(1-78)-GI-SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD-EL-HBc(79-149)    配列番号:390
CV-1473
HBc(1-78)-GI-SLLTEVETPIRNEWGARANDSSD-EL-HBc(79-149)-C  配列番号:391
【０１６５】
CV-1473粒子構築物は、天然の配列（CV-1475）と比較したとき約7倍多い精製粒子を生じた。システイン残基の変異が粒子の潜在保護能力を変化させたのか否かは決定されていない。しかしながら、HBcのイムノドミナントループに配送されたエピトープは、同一物が他の領域（N-末端を含む）に融合されたときと比較して通常は顕著に免疫原性を示し、生じた粒子は抗HBc免疫原性の低下を示す。
M2のN-末端24量体エピトープがC-末端切端Ｂ型肝炎コア粒子のN-末端と融合された粒子もまた調製された。前記構築物（CV-1438）はまたN-末端プレコア配列（配列番号:259）を含んでいた。ハイブリッドタンパク質（CV-1492）の末端（この事例ではHBc遺伝子のVal-149の直後）にただ1つのシステイン残基を含む同様な構築物を調製した。これらの構築物を下記に模式的に示す。
CV-1438
MGISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELLGWLWGI-HBc(2-149)     配列番号:392
CV-1492
MGISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELLGWLWGI-HBc(2-149)-C   配列番号:393
本来のイニシエーターメチオニンからの翻訳開始を防止するために、前記残基のコドンを省略したことは特記されるべきである。EcoRI（GI）及びSacI（EL）制限部位によって付与された残基には下線が付されている。プレコア配列は下線を付されたEL残基と“-HBc(2-149)”の間に挙げられている。
SDS-PAGEによる分析によって、CV-1438モノマー構築物は、SDS-PAGEゲルで分子量コントロールとして添加されたCV-1492（HBc149を含む）、CV-1475及びCV-1473と比較して調製時に不安定であることが示された。CV-1438モノマーの不安定性は粒子の解析的ゲルろ過を用いたときは明瞭ではなかった。
CV-1475及びCV1473は両方とも、CV-1438及びCV-1492よりもわずかに小さな分子量を有すると期待された。なぜならば、前者の2つはイムノドミナントループに直接挿入されたM2エピトープを含み、したがってCV-1438及びCV-1492に存在するプレコア配列（配列番号:259）を欠くからである。期待通り、CV-1492はCV-1475及びCV-1473よりも大きかったが、CV-1438（CV-1492と同一であるが、C-末端のシステイン残基を確保している）は、明白な切断のためにCV-1475及びCV-1473より明らかに大きくはない。
HBcのN-末端（ドメインI）又はループ（ドメインII）に連結された以前に考察したM2のN-末端細胞外配列を含み、更にまた、HBcのループ（ドメインII）又はC-末端（ドメインIV）に連結されたM2タンパク質C-末端配列を含む構築物（例えば配列番号:11の配列（表A参照））もまた意図される。意図されるそのような構築物はまた、本明細書のいずれかの箇所で考察したように少なくとも1つの安定化C-末端システイン残基を含む。
【０１６６】
イムノドミナントループ融合を含むハイブリッドHBc粒子のアミノ末端を改変してシステイン残基、及び最小M2-由来配列を取り込むために、一連の合成オリゴヌクレオチドを合成する。V2.Pf1(N-M2(17-24/C17S))を作製するために、オリゴヌクレオチドM2(17-24/C17S)-NcoI-F及びHBc149/HindIII-Rを用いて、ベクターV2.Pf1のハイブリッドHBc遺伝子を増幅する。得られた546bpフラグメントをNcoI及びHindIIIで切断し、pKK223-3N（同じ2つの酵素によってその前に切断されている）に挿入する。
V2.Pf1(N-M2(17-24/C19S))を作製するために、オリゴヌクレオチドM2(17-24/C19S)-NcoI-F及びHBc149/HindIII-Rを用いて、ベクターV2.Pf1のハイブリッドHBc遺伝子を増幅する。得られた540bpフラグメントをNcoI及びHindIIIで切断し、pKK223-3N（同じ2つの酵素によってその前に切断されている）に挿入する。
2006509026.tif 000037
【実施例９】
【０１６７】
N-及びC-末端の両システイン残基を含む又は含まないHBcキメラ分子
C-末端が残基149で短縮されたHBcのN-末端で、又はN-末端近くでペプチド結合したインフルエンザA M2タンパク質の残基1−24を含む、一連のHBcキメラ分子含有粒子を調製した。前記キメラタンパク質分子は種々のN-末端配列を含んでいた。前記配列はM2配列又は変種を含み、更にいくつかはC-末端システイン残基を含んでいた。
以下の表9A−9Cに挙げた全ての精製粒子は、解析用サイズ排除クロマトグラフィーによって分析して、精製に続いて粒子状構造の維持を評価した。CV-1603と称される粒子（N-末端システイン残基を含まない）は、亜粒子状構造への分解を示す証拠を提示した。その理由は、タンパク質が1500秒の範囲で溶出したからである（粒子はほぼ1000秒で溶出する）。
粒子CV-1590（天然のN-末端M2配列の2つのセリン残基がシステイン残基に変異していることを除いてCV-1603粒子と同様である）の同様な分析では、前記構築物は精製の後粒状構造を維持することが示され、溶出は約1000秒で生じ、これはハイブリッド粒子にとって典型的である（図4）。CV-1590粒子については分解の証拠は存在しなかった。
CV-1560粒子（そのキメラタンパク質は又2つのN-末端システイン残基を有する）は、前記もまた精製後に粒子状構造を有することを示したが、前記はある程度の分解も示し、安定化はCV-1590粒子ほどは強固でないことを示唆した。CV-1590とCV-1560粒子のN-末端立体配置の比較（以下の表11）によって、CV-1560粒子の2つのシステイン残基の相対的な位置は、3つのアミノ酸残基（DEL）の欠落のためにCV-1590粒子と比較して3アミノ酸残基だけシフトしていることが示された。前記は、システイン残基は、最適な架橋を可能にするためにコア遺伝子の開始部から最小限の距離であることが必要である可能性を示している。
【実施例１０】
【０１６８】
M2又はM2変種配列及びC-末端システイン残基を含む粒子
CV-1603粒子は、精製後迅速に分解することが図4で示された。CV-1605粒子を含むHBcキメラ分子は、CV-1605の成分キメラ分子がただ1つのC-末端安定化システインを有することを除いてCV-1603粒子の分子と類似する。C-末端システイン残基のCV-1603への付加がタンパク質により高い安定性を付与することができるか否かを決定するために、CV-1605粒子の発現を誘導するプラスミドを作製した。精製に続いて、CV-1605粒子を解析的サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分析した。
前記実験の結果によって、粒子の安定化はCV-1603粒子の場合よりも完全であるが、CV-1590粒子よりも不完全であることが示された（CV-1590粒子は2つのアミノ末端システイン残基を含みC-末端安定化システインを含まない）。顕著な量のCV-1605は粒子構造のままであったが、広い範囲にわたって溶出する亜粒子構造をもつ不均質な混合物の存在を示す証拠があった。これらの観察は、このハイブリッド粒子（CV-1603）の場合、CV-1605で見出されるようなC-末端安定化は、CV-1590粒子で見出されるN-末端安定化よりも不完全であることが示唆される。
ハイブリッド粒子のアミノ末端及びカルボキシ末端システインの安定化合体の両立性を調べるために、CV-1604粒子の発現を誘導する発現プラスミドを構築した。CV1604粒子の成分キメラ分子は、（CV-1590のように）天然のM2ポリペプチド配列に存在する2つのアミノ末端安定化システイン残基を、（CV-1605のように）C-末端安定化システインと同様に含む。CV-1604粒子の分析によって、前記粒子は精製後均質な粒子状態を維持することが示され、前記2つの安定化の方法は補完的であり、互いに協調的に用いられることを示した。
HBcのN-末端とN-末端システイン残基との間のまた別のリンカー配列をCV-1438粒子及びCV-1492粒子を用いて究明した。これら粒子は両方とも、アミノ酸配列ELLGWLWGIDI（配列番号:398）をM2融合部とHBcのアミノ酸D4との間に含んでいる。アミノ酸残基LGWLWGIDIはHBcのプレコアのアミノ酸-6からアミノ酸I3に由来し、この位置から翻訳が開始するのを防ぐためにHBcのイニシエーターコドンが欠落している（前記は本実験の妥協の産物である）。HBプレコア配列は-7位にシステインを含んでいる。
これらの粒子は、CV-1438の成分キメラ分子はHBcの149位で終了するが、CV-1492の成分キメラ分子はHBcの149位で終了し、配列番号:1のHBcに対応する150位に末端システインを含むという点でのみ相違していた。また別の方法であるが上記で考察したものと類似の方法（それによれば粒子は約10分で溶出する）を用いて解析的ゲルろ過によって分析したとき、両構築物は精製後に粒子状態であることが示された。この実験は、切端粒子のアミノ末端及びカルボキシル末端システイン安定化の両立性、並びにアミノ酸配列における実質的変動性及びN-末端システイン残基とHBc遺伝子の開始部間の距離に対する寛容性を示した。
【０１６９】
表9A
2006509026.tif 000038
【０１７０】
表9B
2006509026.tif 000039
表9C
2006509026.tif 000040
【０１７１】
下記の表10は、HBeAg、及びN-末端融合物をもつ粒子のN-末端の立体配置を明らかにするアラインメントを示している。配列は、全ての構築物が共有する配列番号:1のHBcのN-末端のアミノ酸残基4位からアラインメントされている。存在する場合は、N-末端のシステイン残基には下線が付されている。
表10
構築物番号 配列 配列番号
HBeAg                             SKLCLGWLWGMDID                   399
CV-1438/CV-1492  MGISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELLGWLWGIDID            400
CV-1560                         MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD           401
CV-1590/CV-1604/CV-1606         MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELD        402
CV-1603/CV-1605/CV-1607         MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDELD        403
CV-1671                         MSLLTEVETPIRNEWGSRCNDSSDELD        404
CV-1672                         MSLLTEVETPIRNEWGCRSNDSSDELD        405
CV-1816           MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDLESLLTEVET-
PIRNEWGCRCNDSSDELD   406
CV-1817           MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDLESLLTEVET-
PIRNEWGCRCNDSSDELD   407
CV-1818           MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDLQSLLTEVET-
PIRNEWGSRSNDSSDLESLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELD            408
【０１７２】
下記の表11は、本明細書で意図される、N-末端インフルエンザA M2配列又は変種を含む粒子の安定性を評価した結果の一覧表を提供する。表に示されているように、安定な粒子は、配列番号:1のHBc配列のN-末端に対してマイナス14（-14）位のN-末端システイン残基を粒子自体のN-末端周囲に含むHBcキメラ分子から生成されている。
表11
2006509026.tif 000041
a：48位及び107位のそのシステインがセリンに変化している。b：第二のN-末端M2コピーから数える。
【実施例１１】
【０１７３】
種々のM2含有粒子の抗原性
モノクローナル抗体14C2に対する種々の粒子の抗原性をELISAを用いて調べた。それらの本来の構造で粒子が維持されていることを担保するために、ELISAプレートを粒子を捕捉するポリクローナル抗体（ウサギ）で先ず初めに被覆し、続いて14C2モノクローナル抗体又は、HBc粒子のイムノドミナントループに対して特異性を有する抗HBcモノクローナル抗体のどちらかの種々の希釈で調べた。下記の表に提示したデータは、HBcのイムノドミナントループにおけるM2eの提示は、N-末端での提示と比較して、14C2モノクローナル抗体のM2eエピトープのアクセス能力を顕著には変化させないことを示している（IM2HBc/CV-1559及びCV-1604）。これらの観察は驚くべきことではない。なぜならば、14C2は、N-末端に結合するのではなくM2eの内部領域（M2のアミノ酸8、10、11及び14）と結合することが以前に示されたからである（Zebedee et al. (1988) J. Virol. 62(8):2762-2727）。
更に、CV-1569を除く全ての粒子が抗HBcモノクローナル抗体3105に対する抗原性を維持していた。3105による認識の低下は、イムノドミナントループに挿入された配列を有する粒子について以前に観察された現象であり、これは典型的には免疫後にこれら粒子に対する抗HBc応答の低下に転化される。モノクローナル抗体3105はInstitute of Immunology（Tokyo, Japan）から購入した。
2006509026.tif 000042
【実施例１２】
【０１７４】
抗体のサブクラス及び防御
種々のM2e-HBc構築物（10μg/マウス）及び種々のアジュバントをアッセイしたいくつかの実験の要約。約1/2を腹腔投与し、約1/2を鼻内投与した。各群（14匹マウス）について、血清をプールし、抗M2e IgGサブクラス抗体の力価を決定した。結果は第二のブースター後1週間で採取した血清から得られた。IgG2a力価が104を超えるマウスについて、IgG2Aの力価は104（*）であった。
2006509026.tif 000043
アジュバントは、ワクチンに対するそれらの免疫応答の強さ及び持続期間の強化能力が免疫応答のTh1/Th2偏向の調節能力とともにだんだんと解明されていった。多くの実験的アジュバントは研究中であるが、ミョウバンは、米国でFDA承認ワクチンの成分であるただ1つのアジュバントである。典型的にはミョウバンは免疫応答をTh2型に偏向させる（前記偏向はマウスでの高レベルのIgG1抗体産生によって示される）。
ミョウバンによって製剤化されたM2e-HBc粒子は顕著にIgG1応答を誘発するが、IgG2a及びIgG2b抗体（Th1インジケーターである）もまた誘発される。Th1型IgGサブクラスの産生を強化させるために、RC529を補充したアルヒドロゲル(Alhydrogel(登録商標))製剤粒子（RC529はコリキサ社（Corixa Corporation）が開発したMPLの合成誘導体である）をマウスでテストした。これらの実験によって、アルヒドロゲル（登録商標）製剤へのRC529の包含は、抗M2e IgG2a：IgG1比を約10倍高めて、抗M2e IgG2a力価の劇的な強化をもたらすことが明らかにされた。両群の全てのマウスが致死的攻撃から完全に防御されたが、しかしながら、アルヒドロゲル（登録商標）単独に対して、アルヒドロゲル(登録商標)＋RC529で製剤化されたCV-1569で免疫したマウスで罹患率の低下（体温降下及び体重減少）が示唆された。
【実施例１３】
【０１７５】
選択キメラの粒子会合
サイズ排除クロマトグラフィーの溶出プロフィルの分析によって、前記5つの予想システイン変異キメラのうちの4つが良好に粒子に会合した。C48及びC107のセリンへの変異は粒子会合に影響がないことを確認するために、HBc149及びHBc149(C48S/C107S)を、C-末端システイン保有ペア、HBc149+C及びHBc149(C48S/C107S)+Cとともに使用した。これらの構築物の包含はまた、粒子の安定性の比較及び変異粒子のジスルフィド結合の程度の決定のために必要であった。
全ての発現粒子を精製し、最終収量を以下に一覧表にした。粒子収量は、非操作HBc149と比較して一般的に非常に高く、導入変異は粒子会合に大きな衝撃を与えなかったことが示唆された。第1回目の粒子産生における高い成功により、キメラの全てを異種ループ挿入物を受容するように同様に改変したが、ただし不成功の粒子HBc149(C48S/C107S)L55C/H104C+Cは除外した。
表12：システイン変異を保有するキメラの精製タンパク質収量
2006509026.tif 000044
*：この段階で粒子は典型的には75％以上純粋である。NA=会合無し
各キメラの約2mgが性状決定実験に必要であると決定された。そこで、多くの事例で、最大約50AU（半精製タンパク質25mg）を陰イオン交換カラムに適用し、過剰ローディングを回避した。したがって、最終精製タンパク質収量は、HAクロマトグラフィー工程の後で廃棄された物質量を基準に予想される収量を表す。
【実施例１４】
【０１７６】
会合粒子の性状決定
ジスルフィド結合形成は時間及び温度の関数であることが判明した。その天然の配座が改変操作された各粒子の解析的サイズ排除クロマトグラフィーによる分析では、4℃、室温及び37℃で実施し0、3、７及び14日で分析した2週間におよぶ安定性実験で粒子間に相違は示されなかった。与えられた粒子について全ての溶出プロフィルは実質的に同一であってので、簡潔にするために、37℃で0日及び14日（もっとも厳しい条件）のプロフィルのみが記載されている。C-末端システインを欠く2つのコントロール粒子（HBc149及びHBc(C48S/C107S)）は、それらの粒子状構造を完全には保持できず、それらの溶出プロフィルは低次構造の別個の集団を示した。
粒子の架橋についての更なる解析は、粒子/タンパク質の非還元SDS-PAGEゲルへの泳動能力の判定によって評価された。ジスルフィド結合は、ほとんどの粒子（コントロールを含む）で0日目に不完全で、この実験の間中4℃で不完全のままであることが示された。モノマー及びダイマーバンドの濃度の低下、及び高次マルチマーの出現における対応する増加によって判定されるように、室温でのインキュベーションはジスルフィド結合を強化した。
重要なことには、37℃でインキュベートされた全ての粒子（C-末端非安定化コントロールを除く）が7日後に完全にジスルフィド結合された。特に注目すべきことは、C-末端安定化C48S/C107Sキメラは0日目に完全にジスルフィド結合されるようで、そのC48/C107の対応物はジスルフィド結合を生じず、前記実験期間中にはC48S/C107Sキメラが達成した同じレベルの架橋には到達しなかった。更にまた、改変操作粒子、HBc149(C48S/C107S)W62C/F97C+Cは0日目に同じ高レベルの架橋を示した。
【０１７７】
全てのサンプルの還元SDS-PAGEゲルで、安定性実験の開始から終了までモノマーの濃度に顕著な変化は示されず、0日目及び14日目に採取されたサンプルの37℃ゲルでの比較によって例証されたように全てのモノマーは全温度にわたって無傷のままであることが示唆された。重要なことには、非還元状態下で分析を実施した選択キメラについて時間が経過したときのモノマー及びダイマーの濃度の減少はモノマーの分解のためではないことがこれらの観察によって確認された。
前記安定性実験の全時点で全ての粒子について遊離チオールの存在を測定し、ジスルフィド結合形成の程度を確定した。遊離チオールはエルマン試薬と反応するが、ジスルフィド結合に必要とされるものは、エルマン試薬と反応しない。これらの実験によって、遊離チオールの存在は時間経過にしたがって減少し、37℃でインキュベートされたサンプルでは室温及び4℃でインキュベートされたサンプルと比較して加速されることが示された。前記の観察は、非還元SDS-PAGEゲル（前記ゲルでは構築物の泳動は遊離チオールのレベルの減少に比例して低下する）を用いた粒子の解析で得られた観察と一致する。
Zhengら（上掲書）の観察と一致して、野生型のC48及びC107を含む前記2つのコントロール粒子は、全ての時点及び温度で遊離チオールの存在を示し、これらのシステイン残基はほとんどが還元状態のままであることが確認された。これらのシステインがセリンに変異している対応する粒子では、遊離チオールの反応性は消失し、あらためてC61及びC150は完全にジスルフィド結合されているという事実が立証された。改変操作された粒子は精製工程の終了時に完全には架橋されなかったが、非還元SDS-PAGEゲルでの遊離モノマー及びダイマーの存在によって証明されたように、いずれも37℃7日でほとんど検出不能レベルの遊離チオールを示した。
【０１７８】
これらのデータは有用で、仮定的ジスルフィド結合形成残基の予測に用いられるコンピュータモデリングは非常に有力であったが、完璧な予想ではなかった。しかしながら、ループの安定性はこの態様では予想が困難で、したがって一組のエピトープ保有ベクターを作製した。
第一に、全てのC48S/C107Sエピトープ保有粒子は、それらの野生型の対応物と類似の態様で反応し、前記の変異は粒子の会合に影響を与えないことを示したことは記載されるべきである。β-アミロイドエピトープ（前記は改変操作された非ジスルフィド粒子で安定な粒子に会合することができない）もまた4つの全ての改変操作システインベクターで会合に失敗し、システインがイムノドミナントループと架橋してモノマーをその所望の立体配置に維持することができないことを示した。ASP-1エピトープは改変操作ベクターで同様な態様を示したが、ただし付加システインをもたないコントロールベクターは低レベルの会合粒子を生成した。炭疽エピトープ（PA）（コントロール粒子で会合に失敗した）は、実際A58C/L100Cベクターでは低レベルの会合粒子を生成したが、他のベクターでは生成できなかった。最後に、インフルエンザエピトープ（高レベルの会合HBcをコントロールベクターゼ生じた）は、4つの改変操作粒子のうち2つ（L76C/R82Cキメラ及びW62C/F97Cキメラ）で中等度のレベルの会合ベクターを生成した。全てのキメラの粒子収量の要約は下記の表3に示されている。良好に会合した粒子は下線を付されている。
【０１７９】
表13：エピトープ保有キメラの生成タンパク質収量*
2006509026.tif 000045
*：粒子はこの段階で典型的には75％以上純粋である。“HBc149(C48S/C107S)+C”は、簡潔にするために改変操作ジスルフィド粒子名から省略した。
【０１８０】
原型のV16.IA(M2)2C/2Sクローン（キメラCV-1569）と同様いずれの粒子も発現されなかったが、C48S/C107S型は同様な発現レベルを示した。しかしながら、精製されたときは、C48S/C107S型では1mg未満の材料、精製材料の1/10が原型クローンから回収され、異なる精製方法がこのタイプのキメラには必要かもしれないということを示唆した。精製では、粒子はヘパタイトカラムに強固に結合しているようであり、このカラムからの回収はロードされたもののわずかに10％であった。この実験で使用した他の粒子では60％又はそれ以上が前記カラムで回収された。
インフルエンザの粒子セットがもっとも完全であったので、前記は安定性実験のためのただ1つの粒子組立てセットであった。精製は最適ではないようであったが（4種の粒子のうち2種の回収は非常に低かった）、前記材料を（以前に見出されたようにジスルフィド結合促進のために）37℃でインキュベートし、最初の安定性実験に用いた同じ解析方法を用いてこれら粒子の性状を調べた。最初この実験は以前に記載したように2週間実施するためにセットアップしたが、0、3及び7日で採集したサンプルがパターンの観察に十分であった。
【０１８１】
0日目に粒子は非還元ゲルで典型的なジスルフィド結合を示したが、4種の粒子の解析は、全ての改変操作粒子において別個の切断モノマーを明らかにした。コントロール粒子（V16.IA(M2)2C/2S）は切断を示さなかったが、ただしこれは完全なままであったただ1つのロットで、他の全て（5ロット）は同じ切断パターンを示した（データは提示されていない）。3日間のインキュベーションによって、完全なモノマーの分解がV16(C48S/C107S)及びL76C/R82Cで示され、W62C/F97Cキメラでは切断生成物の一定の増加が示されたが、ただしこれらの天然の粒子は無傷のままであった。しかしながら、解析的サイズ排除クロマトグラフィーによる天然の粒子の解析は、精製V16(C48S/C107S)キメラは会合粒子ではなかった（前記は、おそらく極めて低い精製収量のためで、おそらく形成された粒子は精製カラムから効率的に溶出されなかったのであろう）。全ての粒子の分解傾向は、安定性実験が終了する7日間の間ずっと続いた。
IA(M2)2C/2Sエピトープに関する最近の研究では、ループで提示されるとき、このエピトープは切断されやすいことが判明した。したがって、N-末端配列決定は約半分で切断されたフラグメントを示し、前記は挿入エピトープ内の位置で切断されている。したがって、モノマーは単純に個々のエピトープの性質のためにループの安定化に関係なく切断されるのであろうと考えられる。他のエピトープを含むループの安定性の更なる解明が進行中である。
【実施例１５】
【０１８２】
HBcタンパク質CV-1843及びCV-1842コントロール
タンパク質モノマー当たり1つ又は2つ以上の複合事象を可能にするために、HBc担体を考案及び構築した。本明細書で意図された複合反応は、糖類、ペプチド、脂質又は糖脂質を第一アミンに結合させる。担体タンパク質CV-1843はただ1つのリジン残基を含み、前記残基は、HBcイムノドミナントループのHBc77位に存在する付加されたリジンである。リジンマイナス変異体（CV-1842）に関する実験によって、ある種のハプテン（特にペプチド）はN-末端に複合することができるが、オリゴ糖、ジアシル-LOSは複合させることができないことが示された。前記の相違はおそらくハプテンタイプの幾何学構造及び／又は親水性における相違のためであろう。この固有の合成にはヘルパーT細胞エピトープの付加は必要とされないが、ただしヘルパーT細胞エピトープは融合タンパク質として担体に複合させるか、又は前記とともに発現させることができる。
したがって、CV-1843タンパク質は、リジンコドンAAAをアルギニンコドン（CGC）で置き換えることにより7位で、リジンコドンAAGをアルギニンコドンAGGで置き換えることにより97位で、更にシステインコドン（TGT）をセリンコドン（TCT）で置き換えることのより48位及び107位でHBcコアの4つのアミノ酸変異を含んでいる。リジンコドンの1つの挿入はHBc遺伝子のアミノ酸L76とE77との間で実施された。上記の位置特異的変異導入は、出発プラスミドCV-1123をクィックチェンジ（QuickChange(登録商標)）XL位置特異的変異導入キット（Stratagene）とともに用いて達成した。
各変異導入又は挿入に2つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。一方のプライマーは他方の相補鎖である。全ての変異導入反応のためのオリゴヌクレオチドプライマーは、変異コドンが、基部ヌクレオチド（変異部位にもっとも近い）としてG又はCと併せて、変異コドンのどちらかの側に存在する16から20ヌクレオチドのフランキング配列と一緒に存在できるように考案された。Pfuターボ（Turbo(登録商標)）DNAポリメラーゼを変異導入PCRに用い、DpnIを親DNAプラスミドの消化に用いた。
用いたプライマーセットは下記に示されている。ここで与えられた位置の本来の残基は一文字名で最初に記され、続いて置換位置の番号、続いて置換のための一文字名が記載されている。77位のリジン（K）の挿入のためのプライマーは、ただ1つの残基が前記の位置に挿入されるだけであるので本来の残基も置換残基も含んでいない。
【０１８３】
7位のためのプライマー
K7R-フォワード
CCATGGACATCGACCCTTATCGCGAATTTGGAGCTACTGTGGAG        配列番号:440
K7R-リバース
CTCCACAGTAGCTCCAAATTCGCGATAAGGGTCGATGTCCATGG        配列番号:441
97位のためのプライマー
K97R-フォワード
CACTAATATGGGCCTAAGGTTCAGGCAACTCTTGTGG               配列番号:442
K97R-リバース
CCACAAGAGTTGCCTGAACCTTAGGCCCATATTAGTG               配列番号:443
48位のためのプライマー
C48S-フォワード
GCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGTTCACCTCACCATACTGC           配列番号:444
C48S-リバース
GCAGTATGGTGAGGTGAAGAATGCTCAGGAGACTCTAAGGC           配列番号:445
107位のためのプライマー
C107S-フォワード
GGCAACTCTTGTGGTTTCACATTTCTTGTCTCACTTTTGGAAGAG       配列番号:446
C107S-リバース
CTCTTCCAAAAGTGAGAGAAGAAATGTGAAACCACAAGAGTTGCC       配列番号:447
77位にリジン挿入のためのプライマー
K77-フォワード
CCTGGGTGGGTGTTAATTTGAAAGAAGATCCAGCGTCTAGAG          配列番号:448
K77-リバース
CTCTAGACGCTGGATCTTCTTTCAAATTAACACCCACCCAGG          配列番号:449
【０１８４】
CV-1842タンパク質粒子ベクターはCV-1843タンパク質粒子の形成のためのベクターと同じ方法で構築した。CV-1842タンパク質は、7、97、48及び107位にCV-1843と同じ4つの変異を含んでいる。しかしながら、CV-1842タンパク質は77位にリジン挿入を含んでいない。CV-1842タンパク質粒子は、リジンを官能基として用いるとき、複合でCV-1843のためのコントロール粒子として機能する。
リコンビナントプラスミドは大腸菌BLRで増殖させ、0.5mMのIPTGで誘発し、更に一晩（約18時間）増殖させた。細胞を遠心で採集し、ミクロ液化によって溶解させた。可溶性物質を2度硫安沈殿させ、セファロースCL-4Bカラム（Amersham）にロードした。カラムから溶出した第二のピークをセラミックヒドロキシアパタイトカラムにロードし、溶出させ、硫安で再度沈殿させた。タンパク質を水に再懸濁し、解析と複合のために50mMのリン酸ナトリウム（pH6.8）に対して透析した。
【実施例１６】
【０１８５】
CV-1843及びCV-1123タンパク質へのdLOS複合
CV-1843タンパク質及びCV-1123タンパク質を以下の実験に用いた。アジピン酸ジヒドラジド（ADH）誘導9274dLOSはXin-Xing Gu博士（National Institute of Health, Bethesda, MD）から供給され、2つの方法の各々によりHBcの各タイプと別々に複合させた。第一の方法は、CV-1123上の酸性残基との直接的なカルボジイミド結合であった。第二は、ADH誘導スクシンイミジル3-[2-ピリジルジチオ]プリピオンアミド(SPDP)-N-[γ-マレイミドブチリルオキシ]スクシンイミドエステル（GNBS）（販売元の指示に従って調製）を用いて7、77及び97位のリジンとの結合であった。
したがって、ADH誘導dLOSをN-スクシンイミジル-3-[2-ピリジルジチオ]プロピオネート（SPDP）と反応させ、混合ジスルフィドを生成し、更にN-[γ-マレイミドブチリルオキシ]スクシンイミドエステル（GNBS）をHBcタンパク質のN-末端アミン又はε-アミノリジンと反応させ手HBc誘導スクシンイミドエステルを生成した。SPDP混合ジスルフィドのジチオスレイトールとの反応、それに続く透析によって3-チオプロピオンヒドラジド-dLOS誘導体が提供され、前記をHBc誘導スクシンイミドエステルと反応させて所望の複合物を生成した。
上記で調製した複合物を用い、食塩水溶液又は食塩水とともにミョウバンへの複合物の予備吸着のどちらかを用いてマウスを免疫した（各群に5匹）。マウスを3回3週間離して免疫した。提示した力価は最後の追加免疫後2週間である。各投与用量は5μgの炭水化物を含んでいた。ELISA条件は文献から採用した（Sun et al. (2000) Vaccine  18(13):1264-1272）。以前から存在する力価を示した抗体クラスはIgMのみであった。全ての構築物で力価は１log高められた。
IgG2b力価はワクチンのミョウバンへの吸着を止めたときに顕著に低下した。これは炭水化物の脱アシル化又は加水分解によるものであろう（Sturgess et al. (1999) Vaccine 17(9-10):1169-1178）。いずれのマウスも測定可能な力価のIgG2aを示さなかった。IgG1誘発（Th2反応の特徴）はHBc上のより長い架橋物による免疫で減速したが、最終的には残りの動物と同じレベルまで上昇した。IgG3レベルは類似していた。
【実施例１７】
【０１８６】
CV-1843及びCV-1842タンパク質から調製された粒子とのペプチド複合
CV-1843及びCV-1842タンパク質から調製された粒子にペプチドを複合させた。前記ペプチドは、アミノ酸配列SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD（配列番号:450）を有し、リンカーN-[γ-マレイミドブチリルオキシ]-スルホスクシンイミドエステル（スルホ-GMBS、Pierce Chemical Co.）を用いて複合させた。最適化後、複合の結果は所望のリジンとの結合を示し、更に下記に考察するようにアミノ末端との結合もまた示した。
したがって、CV-1843タンパク質から調製された粒子の銀染色還元SDS-PAGE分析は、約22000ダルトンの完全に還元されたHBcポリペプチド鎖のモノマーバンド、その上に1リピート（1ペプチド付加）バンド及び前記１リピートバンドの上に2リピート（2ペプチド付加）バンドを示した。約44000ダルトンの領域には、更にまた１つの主要バンド及び2つの複合バンドが存在した。CV-1842タンパク質から調製された粒子の場合、モノマー及びダイマーバンドが、モノマー及びダイマーの他に単一ポリペプチドが存在する場合のバンドのように存在した。したがって、CV-1843タンパク質から調製された粒子の場合は、前記ペプチドは7位及びN-末端の付加リジンの両者に複合されたが、リジン残基をもたないCV-1842タンパク質から調製された粒子の場合、前記ペプチドはN-末端にのみ複合された。モノマー及びダイマーは完全な還元は不能とみなされ、複合後2つの22000ダルトンのモノマーに分離する。これらの結果は、精製粒子はペプチドを前記精製粒子と複合させることができることを明瞭に示している。
本明細書に引用した特許及び論文は各々参照により本明細書に含まれる。英文中の冠詞“a”又は“an”は1つ又は2つ以上を含むことを意図する。
前述の説明及び実施例は例示的であり、限定と解されるべきではない。本発明には他の変型がなお可能であり、当業者には容易に類推されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１】図1A及び図1Bとして2つのパネルで示されている図1は6つのウイルスに由来する哺乳類HBcタンパク質の6種の公表された配列のアラインメントを提供する。第一（配列番号:1）のヒトのウイルス配列はaywサブタイプであり、Galibertら（Nature 281:646-650 (1983)）の報告に記載されている。第二のヒトのウイルス配列（配列番号:2）はadwサブタイプであり、Onoら（Nucleic Acids Res. 11(6):1747-1757 (1983)）の報告に記載されている。第三のヒトのウイルス配列は、adw2サブタイプであり、Valenzuelaら（Animal Virus Genetics, Field et al. eds., Academic Press, New York 1980, pages 57-70）によって記載されている。第四のヒトのウイルス配列（配列番号:4）はadywサブタイプであり、Pasekら（Nature 282:575-579 (1979)）の報告に記載されている。第五の配列（配列番号:5）は、Galibertら（J. Virol. 41:51-65 (1982)）が記載したウッドチャックウイルスの配列である。第六の哺乳類の配列（配列番号:6）は、Seegerら（J. Virol. 51:367-375 (1984)）が記載した地上リスのウイルスの配列である。
【図２】リコンビナントHBcキメラの作製のために本明細書で用いられるプラスミドベクターpKK223-3Nの調製のために、市販のプラスミドベクターpKK223-3で実施された改変を示す。改変配列（配列番号:7）は市場で入手できるベクター（配列番号:8）の配列の下に示されている。付加されるNcoI部位の塩基は小文字で示され、付加塩基は二重下線で示され、一方、欠落塩基は点線で示されている。前記配列のこのセグメントに存在する2つの制限部位（NcoI及びHindIII）が表示されている。
【図３】図3A、3B及び3Cとして3つのパネルで示される図3は、好ましいクローニング方法を模式的に示している。前記では、マラリアB細胞エピトープ、例えば(NANP)4（配列番号:9）が、改変操作されたHBc遺伝子の78位と79位との間のEcoRI及びSacI部位でクローニングされる。前記改変操作されたHBc遺伝子ではシステイン残基48はセリン残基に置換されてあり（図3A、HBc1−78(48S)）、前記置換によってEcoRI部位は破壊されるが、SacI部位は保存される。図3Bは、T細胞エピトープ（例えばPf/CS-UTCと称されるもの）及び終止コドンをコードするDNA（配列番号:10）を示す。前記は、改変操作された切端HBc遺伝子のC-末端のEcoRI及びHindIII部位でクローニングされる。前記HBc遺伝子は、残基107位のシステインがセリン残基で置換されたHBc残基79−149をコードする（HBc79-149(107S)+PF/CS-UTC）。残基79位で始まるHBcコード配列に隣接して5'-末端SacI制限部位を有するプライマーによる図3Bの構築物のPCR増幅、前記増幅配列及び図3Aの構築物のSacIによる消化、それに続く適切な部分の連結、その結果のP. ファルシパルムに対するワクチンのための免疫原のB細胞及びT細胞含有エピトープをコードする単一遺伝子構築物の生成が図3Cに示されている。
【図４】図4A−4Hとして8つのパネルで示されている図4は、HBc149、HBc149(C48S/C107S)、HBc1499+C及びHBc149(C48S/C107S)+Cと称される4種の粒子の、37℃でインキュベートした後、それぞれ0日（4A、4C、4E及び4G）、及び14日（4B、4D、4F及び4H）の解析用サイズ排除クロマトグラフィー溶出プロフィルである。会合粒子は7mLで溶出し、一方低次構造は後続ピークで溶出する。サンプルを20mMリン酸ナトリウム（pH6.8）及び0.02％のアジ化ナトリウム中で泳動し、280nmの吸収は縦座標にミリ吸収単位（mAu）で示され、容積は横座標にミリリットル（mL）で示されている。
【図５】図5は、米国特許6,231,864号から引用した（I）及び（II）の2つの反応工程を示す反応模式図である。（I）では、スルホ-スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン1-カルボキシレート（スルホ-SMCC）を用い、活性化担体を形成してキメラＢ型肝炎コアタンパク質（sm-HBc）粒子にハプテンを懸垂結合させ、続いて（II）では、スルフヒドリル末端をもつ（システイン末端をもつ）ハプテンを活性化担体に結合させて複合粒子を形成する。sm-HBc粒子はただ1つの懸垂アミノ基（図を簡潔にするために）を有する枠として描かれてあり、一方、スルフヒドリル末端をもつハプテンはSH基末端をもつ線として描かれている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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