(57)【要約】本発明は、適当な培養培地におけるＨＣＶ又は派生した生存可能突然変異体の複製及び作製（必要である場合）のための、ＮＳ５Ａタンパク質のプレニル化のようなＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノムによりコードされたタンパク質のプレニル化の過程を実施する能力を有する細胞の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
適当な培養培地における、ＨＣＶ又は派生した生存可能突然変異体の複製及び、適用可能な場合には作製のための、ＮＳ５Ａタンパク質のプレニル化のようなＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のゲノムによりコードされたタンパク質のプレニル化過程を実施する能力を有する細胞の使用。
【請求項２】
哺乳動物の細胞、特にＶｅｒｏ細胞とも呼ばれるサル腎細胞の、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ネオマイシンのような抗生物質に対する耐性遺伝子により形質転換されたＶｅｒｏ細胞、特にＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞の、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
適用可能な場合にはネオマイシンのような抗生物質に対する耐性遺伝子により形質転換された、Ｖｅｒｏ細胞のような細胞の、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用において、該細胞が、ＨＣＶのゲノムの全部もしくは一部を含有している核酸、又はＨＣＶから派生した突然変異体により形質転換されている、使用。
【請求項５】
請求項４に記載の使用において、核酸が、
−ＨＣＶの構造タンパク質及び非構造タンパク質をコードするもの、又は
−ＨＣＶの非構造タンパク質をコードするもの、又は
−抗生物質、特にハイグロマイシンＢに対する耐性遺伝子と、ＨＣＶの非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含有しているレプリコン
より選択されることを特徴とする使用。
【請求項６】
細胞が、ヌクレオチド配列である配列番号１、配列番号２、及び配列番号３より選択される核酸により形質転換されていることを特徴とする、請求項４又は５に記載の使用。
【請求項７】
１ａ型ＨＣＶの複製及び、適用可能な場合には作製のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
番号Ｉ−２６５８及びＩ−２６５９の下で２００１年４月１３日にＣＮＣＭに寄託されたような細胞の、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
配列番号１を含むか又は配列番号１により構成されることを特徴とするヌクレオチド配列。
【請求項１０】
配列番号３を含むか又は配列番号３により構成されることを特徴とするヌクレオチド配列。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載のヌクレオチド配列を含有している組換えベクター、特にプラスミド、コスミド、ファージ、又はウイルスＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組換えベクターを使用して形質転換された、特に細菌、ウイルス、酵母、真菌、植物、又は哺乳動物細胞より選択される宿主細胞。
【請求項１３】
−ＨＣＶの構造タンパク質及び非構造タンパク質をコードするもの、又は
−ＨＣＶの非構造タンパク質をコードするもの、又は
−抗生物質、特にハイグロマイシンＢに対する耐性遺伝子と、ＨＣＶの非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含有しているレプリコン
より選択される核酸を含むＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞により構成された形質転換細胞。
【請求項１４】
ハイグロマイシンＢのような抗生物質に対する耐性遺伝子並びに、ＨＣＶの非構造タンパク質、即ちＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂをコードするヌクレオチド配列を含有しているものより選択される核酸により構成されたレプリコンを含むＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞により構成された、請求項１３記載の細胞。
【請求項１５】
番号Ｉ−２６５９の下で２００１年４月１３日にＣＮＣＭに寄託されたＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞のような、請求項１３又は１４に記載の細胞。
【請求項１６】
番号Ｉ−２６５８の下で２００１年４月１３日にＣＮＣＭに寄託された、ハイグロマイシンＢのような抗生物質に対する耐性遺伝子と、ＨＣＶの非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含有している核酸を含むＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞のような、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１７】
抗生物質、特にハイグロマイシンＢに対する耐性遺伝子と、非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含有している核酸を含み、かつ抗生物質、特にハイグロマイシンＢの８００〜１０００μg/mlの濃度においてＨＣＶを複製するという特性を有するＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞により構成された、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１８】
Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８細胞、特に番号Ｉ−２６５９の下で２００１年４月１３日にＣＮＣＭに寄託されたＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞のＣ型肝炎ウイルスによる感染、及びこれらの感染細胞の適当な条件の下での培養を含む、Ｃ型肝炎ウイルスを作製する方法。
【請求項１９】
請求項９もしくは１０に定義されたような核酸、又は配列番号２を含むかもしくは配列番号２により構成されることを特徴とする核酸のいずれかによるＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞の形質転換、特に、番号Ｉ−２６５９の下で２００１年４月１３日にＣＮＣＭに寄託されたＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞の形質転換、及びこれらの形質転換細胞の適当な条件の下での培養により、形質転換Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８細胞、特に番号Ｉ−２６５８の下で２００１年４月１３日にＣＮＣＭに寄託されたものを得るための、Ｃ型肝炎ウイルスを複製するための方法。
【請求項２０】
ＨＣＶの構造タンパク質及び非構造タンパク質をコードする核酸による、Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８細胞、特に番号Ｉ−２６５９の下で２００１年４月１３日にＣＮＣＭに寄託されたＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞の形質転換、形質転換Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８細胞の適当な条件の下での培養、並びにＨＣＶウイルス粒子の回収により、Ｃ型肝炎ウイルスを作製するための方法。
【請求項２１】
抗ＨＣＶ剤をスクリーニングするための方法であって、
−・ＨＣＶの構造タンパク質及び非構造タンパク質をコードするもの、又は
・ＨＣＶの非構造タンパク質をコードするもの、又は
・抗生物質、特にハイグロマイシンＢに対する耐性遺伝子と、ＨＣＶの非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含有しているレプリコン
より選択される核酸を含むＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞により構成された形質転換細胞、特に番号Ｉ−２６５８の下で２００１年４月１３日にＣＮＣＭに寄託されたような細胞を用いる抗ＨＣＶ特性に関して試験される化合物の導入、
−該細胞の全ＲＮＡの抽出、並びに
−該被検化合物の非存在下での細胞のＨＣＶのＲＮＡの合成の速度に相当するコントロール値と比較した、該細胞のＨＣＶのＲＮＡの合成の速度の低下の分析
を含む方法。
【請求項２２】
−ＨＣＶの構造タンパク質及び非構造タンパク質をコードするもの、又は
−ＨＣＶの非構造タンパク質をコードするもの、又は
−ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子と、ＨＣＶの非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含有しているレプリコン
より選択される核酸を含むＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞を調製するための方法であって、
＊請求項９〜１１のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列のうちの一つのＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞内への挿入、
＊そのようにして得られた細胞を、増加する濃度、特に８００〜１０００μg/mlのハイグロマイシンＢに供すること
を含む方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法を実行することにより得られるような細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスを複製するための方法に関するものである。本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスの阻害剤をスクリーニングするための方法にも関するものである。
【０００２】
１９８９年にChooのチームにより同定されたＣ型肝炎ウイルスすなわちＨＣＶ（Chooら、１９８９）は、長い間、非Ａ非Ｂ型肝炎と呼ばれていたウイルス感染の主要な病原体である。「非Ａ非Ｂ型」という用語は、病因は未同定であるが、免疫学的試験の導入のおかげで血清学的にはＡ型肝炎及びＢ型肝炎と異なっているらしい肝炎を記載するため、７０年代に導入された（Feinstoneら、1975; Princeら、1974）。
【０００３】
臨床的には、Ｃ型肝炎ウイルスによる感染は、無症候型の強い優勢、及び慢性への進展の頻発を特徴とする。
【０００４】
Ｃ型肝炎ウイルスの分子クローニング及び配列決定は、Chooら（1988及び1989）によって最初に実施され、他のチームにより確認された（Katoら、1990; Okamotoら、1992; Inchauspeら、1991）。その後のＨＣＶのゲノムの分析は、ＡＵＧ開始コドンがゲノムの３４２位に見出される単一のオープンリーディングフレームを明らかにしている。ある種のプラス鎖ＲＮＡウイルスと同様に、ＨＣＶの非コーディング５’領域は、インターナルリボソームエントリーサイト又はＩＲＥＳの存在により、翻訳の開始の過程に関与している（Tsukiyama-Koharaら、1992; Reynoldsら、1995）。
【０００５】
Ｃ型肝炎ウイルスのポリプロテインの全部をコードするｃＤＮＡの構築、及び様々な原核生物又は真核生物のベクターにおけるその発現は、ゲノムの組織の解明、及びポリプロテインの成熟により生じる様々なタンパク質の特徴決定を可能にした。ウイルスプロテアーゼ及び細胞プロテアーゼを含む、このポリプロテインを切断するための種々の過程が、構造タンパク質及び非構造タンパク質を生成させる。インビトロ翻訳及びインビボ発現の研究（Grakouiら、1993; Hijikataら、1991）は、タンパク質がゲノムによりコードされている順序の確立を可能にしており、これは、以下のように図式化される：Ｈ2Ｎ−Ｃ−Ｅ1−Ｅ2−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ−ＣＯＯＨ。
【０００６】
Ｃ型肝炎のゲノムの最初の３分の１は、構造タンパク質Ｃ、Ｅ１、Ｅ２、及びｐ７をコードしている。構造領域の異なるタンパク質は、細胞由来のプロテアーゼの関与の結果である。
【０００７】
およそ２１kDaという分子量を有し、１７３アミノ酸を含有しているＣタンパク質は、カプシドタンパク質である。このタンパク質は、ＨＣＶのヌクレオカプシドの主要な構成物である。アミノ酸１７４〜１９１に位置しているカルボキシ末端領域は、Ｅ１糖タンパク質のシグナルペプチドを構成している。この配列は、シグナラーゼにより切断される。アミノ酸アルギニン及びリシンの豊富さ（Ｎ末端領域のアミノ酸の２３．５％）のため、極めて塩基性の組成を有するカプシドタンパク質Ｃは、ＲＮＡ−タンパク質相互作用に関与している可能性がある。
【０００８】
それぞれ３１kDa及び７０kDaという分子量を有するＥ１糖タンパク質及びＥ２糖タンパク質は、エンベロープ糖タンパク質を構成している。それらは、Ｉ型膜糖タンパク質であり、各々、カルボキシ末端に疎水性ドメインを有している。さらに、それらは、各々、小胞体における転位及び細胞シグナラーゼによるこれらのタンパク質の成熟を可能にする疎水性シグナル配列をＮ末端に有している。ＨＣＶのポリプロテインの１７４〜１９１に含まれるアミノ酸及び３７１〜３８３に含まれるアミノ酸は、Ｅ１糖タンパク質及びＥ２糖タンパク質のシグナルペプチドに相当する。Ｅ２の配列の最後のアミノ酸は、ＨＣＶのポリプロテインの７４６位に位置しており、Ｅ１糖タンパク質の最後のアミノ酸は、ポリプロテインの３８３位に存在しており、このことは、Ｅ２糖タンパク質のシグナルペプチドがＥ１の構成要素であることを意味している。
【０００９】
Ｅ２タンパク質とＮＳ２タンパク質との間には、小さなタンパク質ｐ７が同定されているが、その機能は未だ不明である。
【００１０】
ＨＣＶのゲノムの残りの３分の２は、非構造タンパク質ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂをコードしている。
【００１１】
ＮＳ２タンパク質は２３kDaの疎水性タンパク質であり、そのＮ末端アミノ酸はポリプロテイン上の８１０位に存在し、Ｃ末端アミノ酸は１０２６位に存在する。ＮＳ２タンパク質及びＮＳ３のＮ末端の３分の１は、ＮＳ２タンパク質とＮＳ３タンパク質との間の切断を保証するプロテアーゼとして機能する（Grakouiら、1993）。このプロテアーゼは、亜鉛依存性メタロプロテアーゼであろう。この所見は、このタンパク質の活性が、ＥＤＴＡによって阻害され、ＺｎＣｌ2によって刺激されるという事実に基づいている。９５２位のヒスチジン及び９９３位のシステインが、この酵素の触媒活性に関与していると思われる。
【００１２】
ＮＳ３タンパク質は、７０kDaのタンパク質である。ＨＣＶのポリプロテインのアミノ酸１０２７〜１６５７に位置しており、それは、２個の別々の機能ドメインを有しており、タンパク質のＮ末端部分はプロテアーゼをコードし、Ｃ末端ドメインはＲＮＡ依存性ＮＴＰａｓｅ／ヘリカーゼをコードしている。
【００１３】
ＮＳ４タンパク質は、８kDaという見かけの分子量を有するタンパク質である。それは、ポリプロテイン上のアミノ酸１６５８〜１７１１に位置している。その機能は、ジャンクションＮＳ３／ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ａ／ＮＳ４Ｂ、及びＮＳ４Ｂ／ＮＳ５Ａの切断がＮＳ４Ａを必要とすることを研究が示しているため、ＮＳ３プロテアーゼの補因子として機能することであろう。このタンパク質は、不可欠ではないが、ＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ切断を加速する。
【００１４】
２７kDaという分子量を有するＨＣＶのＮＳ４Ｂタンパク質は、現在のところ既知の機能を有していない。ＮＳ４Ｂタンパク質は、ＨＣＶのポリプロテインのアミノ酸１７１２〜１９７２に位置している。さらに、ＮＳ４Ｂタンパク質は、塩基性タンパク質であるらしい。
【００１５】
５６kDaという分子量を有するＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質は、ＮＳ５Ｂタンパク質と相互作用し、おそらくはＨＣＶの複製に関与しているタンパク質である。ＮＳ５Ａタンパク質は、遺伝子型１ａのＨＣＶのポリプロテインのアミノ酸１９７３〜２４２０に位置している。しかしながら、観察されている異なる遺伝子型によって、このタンパク質は、異なるアミノ酸の挿入を含む場合があり、従って、遺伝子型２ａの場合には４６６アミノ酸、遺伝子型３ａの場合には４５２アミノ酸を含み、遺伝子型１ａの場合には４６６アミノ酸のみを含む。このタンパク質の基本的な機能は未だ不明であるが、にもかからわず、それは、いくつかの特徴を示す。例えば、５６kDaタンパク質及び５８kDaタンパク質の発現が観察されている。それは、それぞれ５６kDaタンパク質及び５８kDaタンパク質の産生を導く、ＮＳ５Ａタンパク質のリン酸化及び過剰リン酸化に相当する。
【００１６】
６８kDaという分子量を有するＮＳ５Ｂタンパク質は、ポリプロテインのアミノ酸２４２１〜３０１１に位置している。多数のＲＮＡウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列に見出されるものと類似しているＧｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐペプチド単位又はＧＤＤ単位の存在は、ＮＳ５Ｂタンパク質が、レプリカーゼの機能の候補として提唱されることを可能にしている。
【００１７】
Ｃ型肝炎ウイルスは、感染した患者又は動物のもっぱら肝臓において病原力を発現すると思われる（Negroら、1992）。しかしながら、ヒト肝細胞におけるウイルスの繁殖、又はチンパンジーにおける創作の試みは、失敗の連続という結果に終わった（Lanfordら、1994）。Seippら（1997）により報告された、異なる細胞系（ＨｕＨ７及びＨｅｐＧ２）又はブタ由来の細胞（ＰＫ１５）の感染に関する他の研究は、ウイルス感染及び複製の可能性を明らかにした。現時点で、大量のウイルス作製のためのこれらの細胞系の活用を構想することは困難である。Ｃ型肝炎に罹患した患者の末梢血のリンパ球、又はＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）の単球／マクロファージの亜集団におけるウイルスゲノムの複製が、異なる著者により記載されている（Bouffardら、1992）。しかし、さらに最近、Shimizu及び共同研究者ら（Shimizuら、1992; Shimizuら、1994）は、リンパ芽球性Ｔ細胞白血病に由来する系（Ｍｏｌｔ４細胞）、又はマウスレトロウイルス（マウス白血病ウイルス）に過去に感染したＨＰＢ−Ｍａ細胞系のいずれかにおいて、ＨＣＶの複製が起こり得ることを示した。これらの後者の細胞においては、感染周期も再現された。これらの細胞のＨＣＶのウイルスゲノムを複製する能力は、インビトロ中和試験の導入を可能にした（Shimizuら、1994）。従って、ある種の患者の血清とのインキュベーションの後のウイルスの中和が、これらの細胞系におけるＨＣＶの複製力の減損と相関していることが示された。さらに、ＨＰＢ−Ｍａ細胞系の使用において、この著者らは、ＨＣＶによる細胞の再感染、及びインターフェロンに対するウイルスの感受性も示すことができた（Shimizuら、1994）。
【００１８】
さらに、ＨＣＶの感染性ｃＤＮＡを再構成することが可能であることが、C.M.Rise（Kolykhalovら、1997）及びR.H.Purcell（Yanagiら、1997）のグループにより最近示された。実際、ＨＣＶの完全ｃＤＮＡから転写されたＲＮＡの肝臓内注射を受けたチンパンジーは、数週間後に感染を再現することができた。
【００１９】
欧州特許出願ＥＰ１  ０４３  ３９９は、Ｃ型肝炎ウイルスの細胞培養のための系に関するものであり、その系は、基本的には、トランスフェクトされるＨＣＶに特異的な遺伝材料を含有している真核細胞を含んでおり、真核細胞がヒト肝細胞腫の細胞であるという事実、並びにトランスフェクトされるＨＣＶに特異的な遺伝材料が、ＨＣＶに特異的なＲＮＡセグメント：５’ＮＴＲ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ、及び３’ＮＴＲと、付加的な「マーカー」選択遺伝子（選択遺伝子）とを含むＨＣＶのＲＮＡ構築であるという事実を特徴とする。問題の細胞は、ヒト肝細胞腫のＨｕＨ７細胞であり、使用されるＣ型肝炎ウイルスの遺伝子型は、遺伝子型１ｂである（Lohmannら、1997）。しかしながら、この複製過程は、遺伝子型１ａのＨＣＶには適用不可能である。
【００２０】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の研究における主要な問題は、ＨＣＶのウイルス周期を再現する能力を有する細胞系の欠如である。実際、現時点では、これの理由を説明するための仮説を立てることは困難である。しかしながら、ある種の細胞系におけるＣ型肝炎ウイルスの自律複製の可能性は時々言及されている（Kato及びShimotohno、2000）。それゆえ、Ｃ型肝炎ウイルスに関して、特にその構造、そのタンパク質の組み立て、及びそのゲノム組織に関して獲得された知識は、全て、インビトロの無細胞系及びインビボの培養細胞において実施されたＨＣＶの相補ＤＮＡの翻訳の研究に基づくという結果となる。従って、繁殖及びウイルス複製のメカニズムは、ほとんど未知である。阻止は、異なる分子レベルで起こり得る。それらは、ウイルス粒子及びその受容体の吸着、ウイルス粒子の脱殻、ゲノムの発現、又は複製のレベルで起こりうる。
【００２１】
従って、本発明の面のうちの一つは、これらの細胞におけるＣ型肝炎ウイルスのゲノムの複製を可能にする特定の細胞因子を示す細胞の使用である。
【００２２】
本発明の他の面のうちの一つは、Ｃ型肝炎ウイルスの複製及び増殖のための、従って作製のためのこれらの細胞の使用である。
【００２３】
本発明の他の面のうちの一つは、適当な細胞の形質転換による、遺伝子型１ａのＣ型肝炎ウイルスの複製及び作製のための新規の方法を提供することである。
【００２４】
本発明の他の面のうちの一つは、抗ＨＣＶ剤の新規のスクリーニング法を提供し、従ってＣ型肝炎ウイルスの阻害剤を提供することである。
【００２５】
本発明は、適当な培養培地におけるＨＣＶ又は派生した生存可能突然変異体の複製及び適用可能な場合には作製のための、ＮＳ５Ａタンパク質のプレニル化のようなＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のゲノムによりコードされたタンパク質のプレニル化過程を実施する能力を有する細胞の使用に関する。
【００２６】
細胞由来のみならずウイルスにも由来する多数のタンパク質が、細胞位置を正しい方向に置く翻訳後修飾を受ける。例えば、これらのタンパク質のうちのいくつかは、脂肪酸の修飾を保持している。特に興味深い修飾は、ファルネシル基（炭素原子１５個）又はゲラニルゲラニル基（炭素原子２０個）によるシステインのアルキル化に相当するプレニル化であり、これらの基は、メバロン酸の重合により生じる。
【００２７】
ＮＳ５Ａタンパク質のカルボキシ末端における２個のシステイン残基（ＣＣ）の存在（Grakouiら、1993）は、このタンパク質が、プレニル化により修飾され得ることを示す（Casey P.J.、1992）。プレニルトランスフェラーゼは、Ｃ末端位のシステインに、メバロン酸の重合より派生するそれぞれ炭素原子１５個又は２０個のファルネシル基又はゲラニルゲラニル基を付加することができる。これらの修飾を担うことが同定されている単位は、しばしばＣＡＡＸ型又はＣＣ型であり、ここで、Ｃはシステインであり、Ａは脂肪族アミノ酸であり、かつＸは、Ｍ（メチオニン）、Ｓ（セリン）、Ｑ（グルタミン）、又はＬ（ロイシン）のようなアミノ酸である。
【００２８】
「ＨＣＶの複製」という表現は、ＨＣＶのゲノム材料を構成するプラス極性の新たな鎖を生ずるようにはたらくであろうマイナス極性の鎖の合成に至る１個以上の分子的過程を意味する。
【００２９】
「ＨＣＶの作製」という表現は、所定の細胞がＣ型肝炎ウイルスの感染性粒子（ウイルス増殖周期）を再現する可能性を記載するものである。
【００３０】
「派生した生存可能突然変異体」という表現は、異なる選択圧の下でのＨＣＶのレプリコンの選択において発生することができる生存可能変異体のみを意味する。この選択圧は、より良好な複製、より定量的な異なるタンパク質の発現に至り、その結果として、より高い選択生成物に対する細胞の耐性に至るＨＣＶのゲノムの突然変異の選択を生じるものでなければならない。選択圧に対する耐性を可能にする生存可能突然変異のみが観察される。その他の生存可能でない突然変異は、細胞死に至る。
【００３１】
「適当な培養培地における」という表現は、細胞系が最も良好に増殖しうる培地を記載するものである。培養培地は、特に、選択のため必要なエレメント、例えばネオマイシン（Ｇ４１８）又はハイグロマイシンＢが補足されたＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）であり得る。
【００３２】
本発明の有利な使用は、哺乳動物の細胞、特にＶｅｒｏ細胞とも呼ばれるサル腎細胞の、前記定義のような使用である。
【００３３】
Ｖｅｒｏ細胞は、アフリカミドリザル（セルコピテカス・アエチオプス（Cercopithecus aethiops、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ８１）に由来する正常腎臓の細胞である。
【００３４】
本発明は、ネオマイシンのような抗生物質に対する耐性遺伝子により形質転換されたＶｅｒｏ細胞、特にＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞の、前記定義のような使用にも関する。
【００３５】
本発明の有利な実施態様によると、使用される細胞は、ネオマイシンのような抗生物質に対する耐性遺伝子によるＶｅｒｏ細胞の形質転換から生じる、特定の細胞系Ｖｎ５に由来する。これらのＶｎ５細胞又はＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞は、Freseら（1995）により記載されている。
【００３６】
本発明の有利な実施態様によると、抗生物質耐性遺伝子は、ブレオマイシン耐性遺伝子、フレオマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、又はピューロマイシン耐性遺伝子より選択され得る。
【００３７】
本発明は、ＨＣＶのゲノムの全部もしくは一部を含有している核酸、又はＨＣＶから派生した突然変異体により形質転換された、適用可能な場合にはネオマイシンのような抗生物質に対する耐性遺伝子により形質転換されている、Ｖｅｒｏ細胞のような細胞の、前記定義のような使用に関する。
【００３８】
本発明の有利な実施態様によると、Ｖｅｒｏ細胞は、以下の抗生物質耐性遺伝子：ブレオマイシン耐性遺伝子、フレオマイシン耐性遺伝子、もしくはゼオシン耐性遺伝子；又はピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子、もしくはネオマイシン耐性遺伝子により形質転換され得る。
【００３９】
細胞、特にＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞を形質転換するため、使用されるリボ核酸は、以下のＨＣＶのゲノムの部分を含む。非コーディング５’及び３’領域、カプシドタンパク質Ｃをコードする配列の一部（５０〜１００ヌクレオチドを含む配列）、並びに非構造タンパク質、即ちＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂ、又はＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂをコードする領域。
【００４０】
ＨＣＶの生存可能変異体は、有利には、異なる選択圧の下でのレプリコンの選択により生じる。次いで、この圧は、選択生成物に対するより高い耐性に至るゲノムの突然変異の選択を引き起こす。
【００４１】
本発明は、核酸が、
−ＨＣＶの構造タンパク質及び非構造タンパク質をコードするもの、又は
−ＨＣＶの非構造タンパク質をコードするもの、又は
−抗生物質、特にハイグロマイシンＢに対する耐性遺伝子と、ＨＣＶの非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含有しているレプリコン
より選択されることを特徴とする前記定義のような使用にも関する。
【００４２】
ＨＣＶの構造タンパク質及び非構造タンパク質をコードする核酸は、例えば配列番号２のヌクレオチド配列である。
【００４３】
ＨＣＶの非構造タンパク質をコードする核酸は、例えば配列番号１のヌクレオチド配列である。
【００４４】
ＨＣＶの構造タンパク質は、前述のようなタンパク質、即ちＣタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質及びｐ７タンパク質を含む。
【００４５】
ＨＣＶの非構造タンパク質は、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質を含む。
【００４６】
「抗生物質、特にハイグロマイシンＢに対する耐性遺伝子と、ＨＣＶの非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含有しているレプリコン」という表現は、ＨＣＶのゲノムの非コーディング５’及び３’領域、ＨＣＶのカプシドタンパク質Ｃをコードする配列の一部の後にハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）をコードするヌクレオチド配列が続いたもの、並びに前記定義のＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有している核酸を意味する（図１参照）。
【００４７】
構造タンパク質の全部又は一部を交換する可能性は、別のプラス鎖ＲＮＡウイルスについて実現されており、現在ではＨＣＶの完全ｃＤＮＡが入手されているため、カプシドタンパク質Ｃをコードする配列の一部を維持しているＨＣＶのレプリコンが構築された。実際、これらの配列は、ＩＲＥＳ（インターナルリボソームエントリーサイト）を介したＨＣＶの翻訳の開始において重要な役割を果たしていることが、Jackson博士のチーム（Reynoldsら、1995）により示された。ＨＣＶの条件下でこのＩＲＥＳの完全性を維持するため、カプシドタンパク質をコードする配列の部分が保存された。このようにして、構造タンパク質の配列は、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子をコードする配列に置換された。このアプローチによると、耐性細胞クローンを選択するため、ハイグロマイシンＢ選択圧の下で細胞を維持することが可能である。これらの結果は、細胞内のレプリコンの維持によってのみ説明され得る。しかしながら、ピューロマイシン、ゼオシン、又はブレオマイシンのようなその他の選択マーカーも、この選択を助長するため使用され得る。
【００４８】
本発明は、細胞が、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３のヌクレオチド配列より選択される核酸により形質転換されていることを特徴とする、前記定義のような使用に関する。
【００４９】
配列番号１の配列は、非構造タンパク質、即ちＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする遺伝子型１ａのＨＣＶの配列の部分に相当する。
【００５０】
配列番号２の配列は、遺伝子型１ａのＨＣＶの完全配列（構造タンパク質及び非構造タンパク質）に相当する。
【００５１】
配列番号３の配列は、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子の、非構造タンパク質をコードする遺伝子型１ａのＨＣＶの配列の部分との融合により得られたレプリコンに相当する。
【００５２】
本発明は、１ａ型ＨＣＶの複製及び適用可能な場合には、作製のための、前記定義のような使用に関する。
【００５３】
遺伝子型１ａ型のＨＣＶは、Peter Simmonds（2001）により詳細に記載されている。
【００５４】
ＨＣＶ遺伝子型の主要な特徴は、可変性である。実際、ゲノムは３１〜３４％の範囲の割合でヌクレオチドが異なっており、このことは、アミノ酸の可変性も意味している。
【００５５】
本発明は、番号Ｉ−２６５８及びＩ−２６５９の下で２００１年４月１３日にＣＮＣＭに寄託されたような細胞の、前記定義のような使用に関する。
【００５６】
番号Ｉ−２６５９の下で登録された株は、前記定義のようなＶｅｒｏ／Ｇ４１８（Ｖｎ５）細胞に相当する。
【００５７】
番号Ｉ−２６５８の下で登録された株は、前記定義のような配列番号３の配列が挿入されたＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞である、Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８＋レプリコン細胞に相当する。
【００５８】
本発明は、配列番号１を含むか又は配列番号１により構成されることを特徴とするヌクレオチド配列に関する。
【００５９】
本発明は、配列番号３を含むか又は配列番号３により構成されることを特徴とするヌクレオチド配列に関する。
【００６０】
本発明は、前記定義のようなヌクレオチド配列を含有している組換えベクター、特にプラスミド、コスミド、ファージ、又はウイルスＤＮＡに関する。
【００６１】
本発明の有利なベクターは、該ベクターに挿入された、前記定義のような核酸によりコードされたポリペプチドの宿主細胞における発現にとって必要なエレメントを含有している、前記定義のような組換えベクターである。
【００６２】
本発明の有利な実施態様によると、前記定義の組換えベクターは、特に、宿主細胞のＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター、特に誘導可能プロモーターを含有しており、場合によっては転写配列、終結配列を含有しており、場合によってはシグナル配列及び／又は足場（anchorage）配列を含有している。
【００６３】
本発明のもう一つの有利な実施態様によると、前記定義のような組換えベクターは、前記定義のようなヌクレオチド配列の発現を可能にするエレメントを、成熟タンパク質又は融合タンパク質として含有している。
【００６４】
本発明の有利な実施態様によると、ＨＣＶのクローニングのために使用されるベクターは、ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）ベクター（Promega）である。このベクターは、アンピシリン耐性遺伝子、プラスミドの複製開始点、及びファージｆ１の遺伝子間断片（intergenic fragment）を含有している。さらに、ＨＣＶの断片は、Ｔ７プロモーター又はＳＰ６プロモーターの制御下に置かれる。
【００６５】
本発明は、特に前記定義のような組換えベクターを使用して形質転換された、特に細菌、ウイルス、酵母、真菌、植物又は哺乳動物細胞より選択される宿主細胞にも関する。
【００６６】
本発明の有利な実施態様によると、前記定義のような宿主細胞は、前記定義のようなヌクレオチド配列のうちの一つの発現を可能にする制御エレメントを含有している。
【００６７】
本発明の有利な実施態様によると、Ｇｉｆｃｏ社より販売されているＤＨ５α菌が使用される。これらの細菌は、トランスフェクション後、ＨＣＶの相補配列又はレプリコンの配列を保有しているｐＧＥＭ３Ｚｆプラスミド（Promega）を増幅するために使用される。ＨＣＶの配列を含有している全てのプラスミドが、ＤＨ５α菌の形質転換のため使用される。ＨＣＶの配列は、この細菌において安定である。
【００６８】
本発明の有利な実施態様によると、組換えワクチンウイルスのウイルス作製のために使用される細胞は、特にＴｋ−細胞（実施例Ｉ−３参照）又はＣＶ１Ｌ細胞である。
【００６９】
組換えワクチンウイルスは、ｐＴＭ１プラスミド（Mossら、1990）より作製され、実験的手法により組み換えられる。これらの組換えウイルスは、ＮＳ５Ａタンパク質又はＮ末端部分断端型ＮＳ５Ａタンパク質をコードする配列を含有している。
【００７０】
ＣＶ１細胞株は、アフリカミドリザル腎臓（ＡＧＭＫ）の細胞に由来する継続系であり、ＣＶ１−Ｌ細胞株は、ＣＶ１株のサブクローニングより生じる。
【００７１】
本発明は、
−ＨＣＶの構造タンパク質及び非構造タンパク質をコードするもの、又は
−ＨＣＶの非構造タンパク質をコードするもの、又は
−抗生物質、特にハイグロマイシンＢに対する耐性遺伝子と、ＨＣＶの非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含有しているレプリコン
より選択される核酸を含むＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞により構成された任意の形質転換細胞に関する。
【００７２】
本発明に係る有利な細胞は、ハイグロマイシンＢのような抗生物質に対する耐性遺伝子と、ＨＣＶの非構造タンパク質、即ちＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂをコードするヌクレオチド配列とを含有しているものより選択される核酸により構成されたレプリコンを含むＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞により構成された、前記定義のような細胞である。
【００７３】
本発明の有利な細胞は、番号Ｉ−２６５９の下で２００１年４月１３日にＣＮＣＭに寄託されたＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞のような、前記定義のような細胞である。
【００７４】
本発明に係る有利な細胞は、番号Ｉ−２６５８の下で２００１年４月１３日にＣＮＣＭに寄託された、ハイグロマイシンＢのような抗生物質に対する耐性遺伝子と、ＨＣＶの非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含有している核酸を含むＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞のような、前記定義のような細胞である。
【００７５】
本発明に係る有利な細胞は、抗生物質、特にハイグロマイシンＢに対する耐性遺伝子と、非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含有している核酸を含み、かつ抗生物質、特にハイグロマイシンＢの８００〜１０００μg/mlという濃度においてＨＣＶを複製するという特性を有するＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞により構成された、前記定義のような細胞である。
【００７６】
本発明は、Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８細胞、特に番号Ｉ−２６５９の下で２００１年４月１３日にＣＮＣＭに寄託されたＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞のＣ型肝炎ウイルスによる感染、及びこれらの感染細胞の適当な条件の下での培養を含む、Ｃ型肝炎ウイルスを作製するための方法にも関する。
【００７７】
Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８＋レプリコン細胞は、第一工程において、この細胞系が感染可能であり、ウイルス産生能を有するか否かを決定するため、力価測定されたＨＣＶウイルスストックからの感染により試験される。
【００７８】
次いで、ＨＣＶの完全ｃＤＮＡに戻すため、最も機能的なレプリコンの配列をクローニングし、感染性及びウイルス産生が存在するか否かを決定するため、Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８＋レプリコン細胞又はＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞をトランスフェクションすることが必要である。
【００７９】
最も機能的なレプリコンは、有利には、最も高いハイグロマイシンＢ濃度に対して耐性である細胞より得られる。細胞の増殖は、より多いハイグロマイシンＢ耐性遺伝子の発現を示し、それは、レプリコンの複製効率に関連している。
【００８０】
ここで決定された感染性は、ＨＣＶの相補ＤＮＡの感染性、即ちＨＣＶのｃＤＮＡの転写により生じたＲＮＡによる細胞のトランスフェクションの後の感染性ウイルス粒子の再構成の可能性である。次いで、ウイルスは、適当な細胞培養物上で自律的に繁殖し、大量のウイルス粒子を産生する能力を有する。
【００８１】
本発明は、前記定義のような核酸によるＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞の形質転換、特に、形質転換Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８細胞、特に番号Ｉ−２６５８の下で２００１年４月１３日にＣＮＣＭに寄託されたものを得るための、番号Ｉ−２６５９の下で２００１年４月１３日にＣＮＣＭに寄託されたＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞の形質転換、及びこれらの形質転換細胞の適当な条件の下での培養により、Ｃ型肝炎ウイルスを複製するための方法にも関する。
【００８２】
ＨＣＶの複製は、選択にとって有用な特定の細胞においてのみ起こり得る。このために、ＨＣＶの構造タンパク質をコードする配列の代わりに挿入されたハイグロマイシンＢ耐性遺伝子の配列を含有している最小複製単位であるレプリコンが使用される。ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子はＨＣＶにより追加されるため、ある種の細胞の選択培地（例えば、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ及びハイグロマイシンＢ）中での増殖可能性は、ＨＣＶのゲノムの複製の指標となる。耐性細胞の選択は、これらの細胞における自律複製能を有するＨＣＶのゲノムの選択も意味する。結果として、ＨＣＶの複製は、耐性細胞の選択と関連している。
【００８３】
従って、この方法は、ＨＣＶのゲノムを複製する能力を有する細胞の選択の方法に基づく。
【００８４】
本発明は、ＨＣＶの構造タンパク質及び非構造タンパク質をコードする核酸による、Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８細胞、特に番号Ｉ−２６５９の下で２００１年４月１３日にＣＮＣＭに寄託されたＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞の形質転換、形質転換Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８細胞の適当な条件の下での培養、並びにＨＣＶウイルス粒子の回収により、Ｃ型肝炎ウイルスを作製するための方法にも関する。
【００８５】
第一工程において、１．５〜２．０mg/mlのハイグロマイシンＢのプレッシャーの下で増殖する細胞が選択され、次いでこれらの細胞の全ＲＮＡが、ＨＣＶのＲＮＡをＤＮＡへと変換するため、抽出される。次いで、これが、レプリコンの非構造タンパク質をコードする配列のみが、ＨＣＶの完全ｃＤＮＡの代わりに再導入されているｐＧＥＭ３Ｚｆベクター（Promega）にクローニングされる。このようにして、使用される細胞におけるＨＣＶのより良好な複製にとって必要な全てのバリエーションが導入される。次いで、得られたＤＮＡが、ＲＮＡへと変換され、このＲＮＡが、これらの細胞においてウイルス産生が可能であるか否かを決定するため、Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８細胞のトランスフェクションに利用される。
【００８６】
本発明は、
−・ＨＣＶの構造タンパク質及び非構造タンパク質をコードするもの、又は
・ＨＣＶの非構造タンパク質をコードするもの、又は
・抗生物質、特にハイグロマイシンＢに対する耐性遺伝子と、ＨＣＶの非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含有しているレプリコン、より選択される核酸を含むＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞により構成された形質転換細胞、特に番号Ｉ−２６５８の下で２００１年４月１３日にＣＮＣＭに寄託されたような細胞と共に、抗ＨＣＶ特性に関して試験される化合物を導入する工程、
−該細胞の全ＲＮＡを抽出する工程、並びに
−該被検化合物の非存在下での細胞のＨＣＶのＲＮＡの合成の速度に相当するコントロール値と比較した、該細胞のＨＣＶのＲＮＡの合成の速度の低下を分析する工程、を含む抗ＨＣＶ剤をスクリーニングするための方法にも関する。
【００８７】
８００〜２０００μg/mlというハイグロマイシンＢ濃度において増殖するＶｅｒｏ／Ｇ４１８＋レプリコン細胞が、メバスタチン又はロバスタチンのような３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼの特異的阻害剤の作用に供される。次いで、これらの阻害剤で処理された細胞において、様々な時点でＲＮＡ抽出が実施される。次いで、ＨＣＶのＲＮＡの合成が、LightCycler（Roche）と呼ばれる装置を使用した一段階ＲＴ−ＰＣＲ、又はＨＣＶ特異的放射性プローブを使用したフィルター上でのＲＮＡのハイブリダイゼーションにより、分析される。
【００８８】
ある種の波長において自然に蛍光を発するという特性を有するＧＦＰタンパク質をコードする配列も含有しているレプリコンの再生を含む、以下の系も使用され得る。さらに、比較的短い半減期を有するため、このタンパク質が選択される。これらの条件の下では、細胞を固定する必要がなく、蛍光がリアルタイムで観察され得る。ＨＣＶの効果的な阻害剤がＶｅｒｏ／Ｇ４１８＋レプリコン細胞と接触させられ、ＨＣＶのＲＮＡの合成の阻害が観察される場合、これは、産生されたタンパク質の合成の段階においても、そして、その結果として、ＧＦＰにより産生された蛍光の強度においても観察される。次いで、ＧＦＰの半減期は極めて短いため、細胞内のＧＦＰの蛍光の低下が観察される。
【００８９】
本発明は、Ｃ型肝炎の治療用の薬剤の作製のための、コレステロール低下薬（hypocholesterolemiants）、特にスタチン類、より具体的にはロバスタチン、メバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン及びフルバスタチンの使用に関する。
【００９０】
スタチン類は、高コレステロール血症の処置のため使用されている生成物である。それらは、メバロン酸の合成を阻止するため、ヒドロキシメチルグルタリル（ＨＭＧ）ＣｏＡシンセターゼ酵素のレベルで作用する。コレステロールの生合成経路に参与しているメバロン酸は、重合によってゲラニル又はファルネシルも産生する。
【００９１】
従って、スタチン類は、メバロン酸の合成を阻止する際に、ファルネシル基又はゲラニル基の合成にも影響を与え、従って、プレニル化に対する間接的な効果を有する。
【００９２】
従って、これらのスタチン類は、前記定義のような抗ＨＣＶスクリーニング法を確証するために使用され得る。
【００９３】
いくつかのスタチンの化学式：
【化１】
2004527252.tif 000002
【００９４】
本発明は、適用可能であれば、抗ウイルス化合物と組み合わされた、Ｃ型肝炎の治療用の薬剤の作製のためのプレニル化阻害剤の使用にも関する。
【００９５】
本発明は、
＊前記定義のようなヌクレオチド配列のうちの一つをＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞へ挿入する工程、
＊そのようにして得られた細胞を、増加する濃度、特に８００〜１０００μg/mlのハイグロマイシンＢに供する工程を含む、
−ＨＣＶの構造タンパク質及び非構造タンパク質をコードするもの、又は
−ＨＣＶの非構造タンパク質をコードするもの、又は
−ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子と、ＨＣＶの非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含有しているレプリコン、より選択される核酸を含むＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞を調製するための方法に関する。
【００９６】
本発明は、前記定義のような方法を実行することにより得られるような細胞に関する。
【００９７】
本発明は、抗ウイルス剤及び薬理学的に許容され得る賦形剤と組み合わせて、活性成分としてプレニル化阻害剤を含むことを特徴とする薬学的組成物に関する。
【００９８】
プレニル化は、タンパク質−タンパク質相互作用を促進するためＮＳ５Ａタンパク質にとって重要であり、これらの相互作用の妨害は全てＨＣＶの複製の過程に対して作用し、その効率を低下させる。
【００９９】
ＨＣＶの複製速度を低下させるプレニル化阻害剤の組み合わせは、感染患者のＨＣＶウイルス負荷量の低下も含む。このため、抗ウイルス剤との組み合わせ作用は、感染患者におけるより良好なウイルスの排除に至るに違いない。
【０１００】
本発明は、抗ウイルス剤及び薬理学的に許容され得る賦形剤と組み合わせて、活性成分としてコレステロール低下化合物を含むことを特徴とする薬学的組成物に関する。
【０１０１】
メバロン酸の合成に作用する化合物は、ＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質のプレニル化の速度に対する作用を有し、従って、ＨＣＶの複製に対する作用を有する。ＨＣＶの複製に対して間接的に作用するコレステロール低下化合物との組み合わせは、感染患者のＨＣＶウイルス負荷量の低下も含む。このため、抗ウイルス剤との組み合わせ作用は、感染患者におけるより良好なウイルスの排除に至るに違いない。
【０１０２】
使用されるコレステロール低下化合物は、ロバスタチン、メバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン及びフルバスタチンより選択される。
【０１０３】
本発明に係る薬学的組成物は、特に、２０mg錠の形態であり、１日用量は１０〜４０mgである。
【０１０４】
実施例
Ｉ−プレニル化：材料及び方法
１．細胞及び維持条件
Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８細胞：Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８（又はＶｎ５）細胞（Freseら、1995）は、１０mmディッシュ内の薄層において、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有しているＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）の中で培養した。細胞は、３００μg/ml（これらの細胞のための維持値）のネオマイシンプレッシャーの下で培養されうる。それらを、トリプシン／ベルセン溶液（ＮａＣｌ  ８g/l；ＫＣｌ  ０．４g/l；デキストロース１g/l；ＮａＨＣＯ3  ０．５８g/l；結晶化トリプシン０．０４５g/l；ベルセン０．２g/l）により５又は６日毎に剥離し、１〜１０6個の細胞を１００mmディッシュに移した（１／１０希釈に相当）。培地を、２〜３日毎に交換した。
【０１０５】
２．Ｃ型肝炎ウイルスのゲノムのクローニング
Ｃ型肝炎ウイルスの配列に特異的なプライマーを使用して、Gubler及びHoffmanの方法（Gubler及びHoffman、1983）に従い、ｃＤＮＡを合成した。次いで、既知の配列のプライマーのおかげで、Ｃ型肝炎の配列を、いわゆる「ネスティッド（nested）プライマー」法（Mullis及びFaloona、1987）により増幅することができた。ＨＣＶのゲノムの異なる領域に相当するＤＮＡ断片、及びＨＣＶのゲノムの非コーディング末端に相当する配列を、ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）ベクター（Promega）のたった一つの制限部位Ｓｍａ１にクローニングした。このベクターは、アンピシリン耐性遺伝子、プラスミドの複製開始点、及びファージｆ１の遺伝子間断片を含有している。さらに、断片を、ＨＣＶの５’末のプロモーターＴ７、又はＨＣＶの３’末のＳＰ６の制御下に置いた。これらの全てのクローンを、インビトロ組み換えを容易にするため、重複するＤＮＡ配列を用いて構築した。これらの異なるクローンのＤＮＡの完全又は部分的な消化の後、断片をアガロースゲル上で精製し、Ｃ型肝炎ウイルスのゲノムを再構成させるため、共にライゲートさせた。このようにして、９６２３ヌクレオチド長のｃＤＮＡを生成させることができた。
【０１０６】
３．組換えｐＴＭ１プラスミドの構築、及び対応する組換えワクチンウイルスの作製
ＨＣＶのタンパク質、特にＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質をコードする異なるＤＮＡ断片を、ＨＣＶのゲノムからの酵素増幅により生成させた（ｐＧ／ＨＣＶ１−９６２３）。これらのＤＮＡを、ｐＴＭ１プラスミドのマルチプルクローニング領域のＥｃｏＲＩ制限部位に挿入した（Mossら、1990）。この領域は、ファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼ、及びＥＭＣＶウイルス（脳心筋炎ウイルス）のＩＲＥＳ（インターナルリボソームエントリーサイト）のプロモーターの直ぐ下流に位置している。
【０１０７】
対応する組換えワクチンウイルスを、Kienyら（1984）により解明された原理に従い、相同的組み換えにより生成させた。組換えウイルスを、ブロモデオキシウリシン（５０μg/ml）の存在下での１４３Ｂ  ｔｋ−細胞（チミジンキナーゼ欠損細胞、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８３０３）におけるコロニーの形成により精製した。単離されたコロニーに由来する各ウイルスストックを、１コロニー形成単位／細胞（ＣＦＵ／細胞）という感染多重度（m.o.i.）による感染の後、ＣＶ１−Ｌ細胞（アフリカミドリザルの腎細胞のサブクローニングにより生じた株）において精製した。
【０１０８】
４．組換えワクチン−ＨＣＶウイルスを使用して発現されたタンパク質の分析
タンパク質の（35Ｓ）標識：Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８（Ｖｎ５）細胞に、それぞれ５ＣＦＵ／細胞というm.o.i.で、ｖＴＦ７．３ウイルス（Fuerstら、1986）単独を感染させるか、又はこのウイルスとＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質を発現する組換えウイルスのうちの一つとを共感染させた。３７℃１時間の後、接種物を除去し、５％のウシ胎仔血清を含有しているＤＭＥＭに交換した。感染後１６時間目、細胞をメチオニンを含まないＤＭＥＭ培地で洗浄し、この培地中で１〜２時間インキュベーションし、次いで１００μCi/mlのメチオニン（35Ｓ）（35Ｓ−プロテインラベリングミックス（Protein Labeling Mix）（ＮＥＮ）、標識溶液）で３時間標識した。この時間の後、培地を排除し、次いで細胞をＰＢＳで洗浄し、最後に、細胞質抽出のため、溶解バッファー（５０mMトリス−ＨＣｌ  pH７．５；１５０mM  ＮａＣｌ；１mM  ＥＤＴＡ；ＮＰ４０（又はIgepal）１％（Sigma）；デオキシコール酸Ｎａ  ０．１％；アプロチニン１０μg/ml；ＴＰＣＫ（Sigma）及びＰＭＳＦ（Sigma）、２０μg/ml）を使用して、又は全抽出のため、５０mMトリス−ＨＣｌ  pH７．５；１５０mM  ＮａＣｌ；１mM  ＥＤＴＡ；０．５％ＮＰ４０；０．５％デオキシコール酸Ｎａ；０．２％ＳＤＳ；アプロチニン１０μg/ml；ＴＰＣＫ及びＰＭＳＦ、２０μg/mlを含有している溶解溶液により溶解させた。次いで、Wychowskiら（1985）により記載されたようなポリクローナルウサギ血清を使用して、ＨＣＶのタンパク質をこの溶解物から免疫沈降させ、沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１０９】
タンパク質のメバロン酸（3Ｈ）標識：Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８（Ｖｎ５）細胞に、それぞれ５ＣＦＵ／細胞というm.o.i.で、ｖＴＦ７．３ウイルス（Fuerstら、1986）単独を感染させるか、又はこのウイルスとＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質を発現する組換えウイルスのうちの一つとを共感染させた。３７℃１時間の後、接種物を除去し、メバスタチン（１００μg/ml）の存在下で１０％のウシ胎仔血清を含有しているＤＭＥＭに交換した。４時間後、１００mCi/mlのメバロン酸（3Ｈ）を培地に添加した。感染後１８時間目、細胞をＤＭＥＭ培地で洗浄し、培地を排除し、細胞をＰＢＳ溶液で洗浄した後、５０mMトリス−ＨＣｌ  pH７．５；１５０mM  ＮａＣｌ；１mM  ＥＤＴＡ；０．５％ＮＰ４０；０．５％デオキシコール酸Ｎａ；０．２％ＳＤＳ；アプロチニン１０μg/ml；ＴＰＣＫ及びＰＭＳＦ、２０μg/mlを含有しているバッファーにより溶解させた。次いで、以前に記載されたようなポリクローナルウサギ血清を使用して、ＨＣＶのタンパク質をこの溶解物から免疫沈降させ、沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１１０】
ＩＩ−ＨＣＶのレプリコンの分析：材料及び方法
１．ＨＣＶの相補ＤＮＡからのＨＣＶのレプリコンの構築
ＨＣＶの配列全体を含有しているクローン（ｐＧ／ＨＣＶ１−９６２３）から出発して、まず、構造タンパク質をコードする配列がネオマイシンをコードする配列に置換されたＨＣＶのレプリコンを構築した。ネオマイシン遺伝子に相当するＤＮＡを、Ａｓｐ７１８制限部位（遺伝子型１ａのＨＣＶのヌクレオチド配列の５７９位）とＥｃｏ４７ＩＩＩ（遺伝子型１ａのＨＣＶのヌクレオチド配列の２８４７位）との間に導入した。ネオマイシンをコードする配列に相当するＤＮＡ断片を、ネオマイシンをコードし、５’末端及び３’末端にＡｓｐ７１８制限部位及びＥｃｏ４７ＩＩＩ制限部位を含有している配列の相補プライマーを使用して増幅した。増幅された断片を、低融点ゲル（低い融点を有するアガロースゲル）上で精製し、次いで、この断片を前記の制限酵素により消化した。次いで、この断片を、Ａｓｐ７１８〜Ｅｃｏ４７ＩＩＩの配列が欠失しているｐＧ／ＨＣＶ１−９６２３プラスミドに組み込んだ。このようにして、カプシドタンパク質をコードする配列の残りの部分、及びＮＳ２タンパク質をコードする配列と位相が合うように、配列を挿入した。しかしながら、Ｅｃｏ４７ＩＩＩ制限部位の位置のため、ＮＳ２の末端ＮＨ２部分は欠失した。結果として、ＮＳ２配列全体を、ＮＳ２タンパク質をコードする配列、及びＮＳ３タンパク質をコードする配列の一部をＰＣＲにより増幅することにより再構築した。配列の５’位のプライマーは、ＳｐｅＩ制限部位の配列も含有している。ＤＮＡ断片を、常法に従い増幅し、精製し、次いでそれをＳｐｅＩ酵素及びＢｓｔ１１０７Ｉ酵素（これの部位は、遺伝子型１ａのＨＣＶのヌクレオチド配列の３６４０位に存在する）により消化した。最後に、この断片をＳｐｅＩ制限部位とＢｓｔ１１０７Ｉ制限部位との間に組み込んだ。その結果、ｐＧ／Ｎｅｏ２−５Ｂプラスミドが得られた。このプラスミドは、非コーディング５’及び３’領域、カプシドタンパク質Ｃをコードする配列の一部、ネオマイシン耐性遺伝子の配列、並びにＨＣＶの非構造タンパク質の領域をコードする配列全体を含有している。この構築において、カプシド部分は、ネオマイシン耐性遺伝子及びＨＣＶのＮＳ２産物と融合しているようである。ＨＣＶの他のタンパク質は、通常、ＨＣＶの２個のウイルスプロテアーゼにより生成するであろう切断により産生されるであろう。Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８細胞はネオマイシンに対して耐性であるため、ネオマイシンをコードする配列を、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子をコードする配列に置換するため、ｐＧ／Ｎｅｏ２−５Ｂプラスミドを使用した。ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子、並びにそれぞれ５’末及び３’末に位置するＡｓｐ７１８制限部位及びＸｂａＩ制限部位の配列を含有しているＤＮＡ断片を増幅した。ＸｂａＩ部位は、ＳｐｅＩ部位と適合性であるが、ハイブリダイゼーション後、ＳｐｅＩ部位及びＸｂａＩ部位は生成しないであろう。特有のＳｐｅＩ部位は、配列から消失する。従って、このＤＮＡ断片をｐＧ／Ｎｅｏ２−５ＢプラスミドのＡｓｐ７１８部位とＳｐｅＩ部位との間に組み込んだ。形質転換及び選択の後、ネオマイシン耐性遺伝子をコードする配列がハイグロマイシンＢ耐性遺伝子をコードするものと置換され、その他の配列は正確に保存されているｐＧ／Ｈｙｇｒｏ２−５Ｂプラスミドが得られた。
【０１１１】
２．ＨＣＶの相補ＤＮＡのＲＮＡへの転写
トランスフェクションのための転写：ＲＮＡの大規模作製のため、Promegaキット（リボマックス（Ribo MAX）（登録商標）ラージスケール（Large Scale）ＲＮＡ作製システム−Ｔ７）を使用した。レプリコンに相当するＤＮＡを予め直鎖化し、末端を平滑化した。制限酵素Ｘｂａ１による消化及びマングビーン（mung bean）ヌクレアーゼ（Biolabs）（Kowalskiら、1976）による処理の後、余分な塩基が消化されるよう、ＨＣＶのゲノムの３’末に制限部位を置いた（以後、これが、ＨＣＶのＲＮＡの真の末端に相当する）。ＤＮＡ  ５μgに対して処理を実施した。ＤＮＡ調製物のフェノール及びクロロホルムによる抽出の後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。遠心分離後、ＤＮＡを、微量のＲＮアーゼを回避するためＤＥＰＣ（ジエチルピロカルボネート）で処理された無菌水にとった。次いで、ＤＮＡはＲＮＡへと転写され得る。従って、滅菌エッペンドルフ（Eppendorf）チューブで、ＤＮＡ  ２０μl（およそ５μg）に、ＤＥＰＣ処理水２０μl、５×転写バッファー（ヘペス−ＫＯＨ（pH７．５）４００nM、ＭｇＣｌ2  １２０mM、スペルミジン１０mM、ＤＴＴ  ２００mM）２０μl、ｒＮＴＰ（２５mM  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）３０μl、酵素ミックス（Enzyme Mix）（Ｔ７）（Promega）１０μlを補足し、混合物を３７℃で２〜４時間インキュベーションした。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによりＤＮＡを転写した後、ＲＱ１  ＤＮアーゼ（ＲＮアーゼフリー）（Promega）５μlにより３７℃で１５〜３０分間ＤＮＡマトリックスを分解した。フェノール／クロロホルム抽出を実施し、ＲＮＡを含有している水性溶液を、１／１０の３M酢酸ナトリウム及び２倍容量のエタノールを添加することにより沈殿させた。一夜の後、ＲＮＡペレットを回収するためそれを遠心分離した。次いで、ペレットを７０％エタノール溶液で洗浄し、次いでベンチ上で軽く乾燥させ、最後にＤＥＰＣ処理水で再可溶化した。その後、ＲＮＡを−８０℃で保管した。
【０１１２】
放射標識のための転写：Promega転写キットを使用した。放射性ＲＮＡの作製のためのマトリックスとして使用されたＤＮＡは、ＰＣＲ法（５’又は３’位のプライマーは、レプリコンのプラス極性のＲＮＡを特徴決定するのか、マイナス極性のＲＮＡを特徴決定するのかによって、マイナス極性又はプラス極性のＲＮＡの産生を可能にするバクテリオファージＴ７又はＳＰ６のプロモーターの配列を含有している）により増幅されたＤＮＡに由来した。末端は平滑であるため、ＰＣＲによって産生されたＤＮＡを制限酵素によって直鎖化する必要はなかった。しかしながら、ＤＮＡ断片は、転写前に低融点ゲル（低い融点を有するアガロースゲル）上で精製されるであろう。ＤＮＡ  ３μl（１〜２μgに相当）に、５×転写バッファー（トリス−ＨＣｌ（２５℃においてpH７．９）２００mM、ＮａＣｌ  ５０mM、ＭｇＣｌ2  ３０mM、スペルミジン１０mM）４μl、ＤＴＴ  １００mMの溶液２μl、ＲＮａｓｉｎ（阻害剤）（４０U/μl）（Blackburn及びMoore、1982）０．５μl、ｒＣＴＰが削除されたｒＮＴＰの混合物（ｒＡＴＰ、ｒＵＴＰ、及びｒＧＴＰ、各２．５mM）４μl、ＤＥＰＣ処理水５．５μl、Ｔ７ポリメラーゼ酵素（２０U/μl）１μl、並びに凍結乾燥ｄＣＴＰαＰ32  ５０μCiを補足した。ＤＮＡを３７℃で１時間転写した。次いで、以前に記載されたようにしてＤＮＡを分解し、ＲＮＡを沈降させ、ＤＥＰＣ処理水で再可溶化した。
【０１１３】
３．電気穿孔技術
この技術は、Liljestromら（1991）により記載された手法に従い実施した。電気穿孔のため使用された装置は、BioRad製品（BioRad Gene Pulsar with Pulse Controller）である。Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）が補足されたＤＭＥＭ培地に入れ、１００mmディッシュに播種し、それらを８０〜９０％のコンフルエンスに達するまで培養した。各電気穿孔には５×１０6個の細胞が必要であることに注意されたい。結果として、ディッシュの数は、十分な量の細胞が利用可能となるよう計算される。電気穿孔すべき細胞を、ＰＢＳの溶液で洗浄し、次いで、ＥＤＴＡを含有しているトリプシン溶液の補助により剥離した。この溶液を廃棄し、数分後、剥離された細胞をＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ培地にとり、８００rpmで６分間遠心分離した。次いで、細胞を懸濁させ、ＰＢＳ溶液で再洗浄し、次いで、遠心分離後、最終細胞濃度が１×１０7個／mlとなるような容量のＰＢＳ培地に細胞ペレットをとった。これらを氷中で保管した。BioRad製の０．２mm電気穿孔キュベットにおいて、１×１０7個／mlの細胞懸濁液５００μlをＲＮＡ（レプリコンのＲＮＡ）３０μgと接触させ、抵抗コントローラーを無限の位置（装置の∞ボタン）にしながら、同チューブを１．７５kV及び２５μFDに較正された電気穿孔装置に置いた。このようにして、細胞に２回の電気ショックを与えた。これらのショックの後、生存している細胞の割合は、２０〜３０％であった。これらのショックの後、細胞をＤＭＥＭ１０％ＦＣＳ培地にとり、１０分間室温で維持した後、１００mmディッシュに再播種した。次いで、全てのディッシュを、３７℃の温度のＣＯ2オーブン内に置いた。ここで、それらをハイグロマイシンＢ選択プレッシャーに供する準備が整った。
【０１１４】
４．ハイグロマイシンＢ耐性細胞の選択
ＨＣＶのＲＮＡの存在下で電気穿孔され、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を含有しているＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞を、ハイグロマイシンＢの存在下での進行的な圧のため使用した。以前に記載されたような電気穿孔の後、まず、細胞を１００mmディッシュに投入した。４８時間後、細胞を１００μg/mlという低いハイグロマイシンＢプレッシャーに供し、次いでコンフルエンスに達するまで２００μg/mlに供した。次いで、トリプシン／ベルセン混合物の作用によりそれらを剥離し、最初の選択圧を維持しながら、それらを６０mmディッシュに移した。細胞集団を安定化するため、この濃度で５〜１０代（可変）にわたり維持した。継代培養は、最初は、３〜４日毎に培地を交換しながら、およそ３週間毎に細胞の１／２希釈物を用いて行った。細胞増殖の安定化（平均１０〜１５日毎の継代培養、細胞の一般状態に関しても観察）の後、これらを、状況に応じて５０〜１００μg/mlのオーダーの増加するハイグロマイシンＢプレッシャーに供した。細胞の安定化は、明確な圧の下で、５継代後に起こる場合が多かった。選択圧下で増殖した細胞の全ＲＮＡを抽出し、非コーディング５’及び３’領域におけるＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素を使用したＰＣＲ）に供した。これらが陽性であることが判明したならば、選択圧を維持し、次第に増加させた。しかしながら、間接免疫蛍光を使用した研究は、ＨＣＶのタンパク質の検出を可能にしなかった。免疫蛍光による検出は、６００μg/ml超のハイグロマイシンＢプレッシャーの下で増殖する細胞についてのみ可能であった。中間の選択圧においても細胞を凍結させた。１０００μg/mlのハイグロマイシンＢプレッシャーの下で増殖する細胞が、現在利用可能である。
【０１１５】
５．細胞及び維持条件
Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８／ＨＣＶレプリコン細胞：細胞は、７５cm2ボトル内の薄層において、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）及びハイグロマイシンＢを含有しているＤＭＥＭ培地の中で培養した。ハイグロマイシンＢ濃度は、細胞の選択に依った。それは、２００〜１０００μg/mlの範囲であった。７５cm2ボトルに、常法により５×１０6個の細胞を播種し（２倍希釈に相当）、それらを密度に応じて１０〜１５日間維持した。継代時には、これらの細胞の培地を廃棄し、細胞をトリプシン／ベルセン培地（ＮａＣｌ  ８g/l；ＫＣｌ  ０．４g/l；デキストロース１g/l；ＮａＨＣＯ3  ０．５８g/l；結晶トリプシン０．０４５g/l；ベルセン０．２g/l）で２回洗浄した。細胞は、極めて迅速に数分（２〜５分）後に剥離された。次いで、これらの細胞を、適当なハイグロマイシンＢ濃度を含有しているＤＭＥＭ培地にとり、細胞を２個のボトルに分配した。細胞が自らボトルに固定され確立されるようにし、培地は３〜４日後に交換し、次いで所望の細胞密度（８〜１０×１０6個／７５cm2ボトル）が達成されるまで隔日に交換した。
【０１１６】
６．間接免疫蛍光によるタンパク質の分析
Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８細胞は、ハイグロマイシンＢの非存在下でガラスシート上で培養し、Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８＋レプリコン細胞は、ハイグロマイシンＢ（８００μg/ml）の存在下で培養した。３日間の培養後、細胞を４％パラホルムアルデヒドを含有しているＰＢＳ溶液で固定した。次いで、パラホルムアルデヒド固定された細胞を、細胞内標識を援助するため、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で処理した。次いで、細胞を、ＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水：２０mMトリス−ＨＣｌ  pH７．５；１３７mM  ＮａＣｌ；２mM  ＥＤＴＡ）で希釈されたＨＣＶの異なるタンパク質に対する特異的抗体と接触させた。これらの抗体は、マウスにおいて調製されたカプシドタンパク質、ＮＳ３タンパク質、もしくはＮＳ５タンパク質に対するモノクローナル抗体、又はウサギにおいて調製されたＮＳ４タンパク質もしくはＮＳ５Ａタンパク質もしくはＮＳ５Ｂタンパク質を認識するポリクローナル抗体、又はＨＣＶに感染した患者に由来する抗ＨＣＶ抗体のいずれかであった。数回の濯ぎの後、次いで、細胞を二次ローダミン結合抗体（ウサギにおいて産生された抗マウス免疫グロブリン；ＤＡＫＯ）もしくはフルオレセイン結合抗体（ロバにおいて産生された抗マウス免疫グロブリン；Jackson）、又はウサギ免疫グロブリンもしくはヒト免疫グロブリンを認識する二次ローダミンもしくはフルオレセイン結合抗体と共にインキュベートした。次いで、このようにして標識された細胞を、蛍光顕微鏡（Zeiss）を用いて観察し、写真撮影した（図２参照）。
【０１１７】
７．ＲＮＡの精製
ａ）Promegaキット（ＳＶ「全ＲＮＡ単離システム（Total RNA isolation System）」キット）に記載された方法による
ＲＮＡ精製は、１．５×１０3〜５×１０6個の細胞に対して実施され得る。抽出手順は、Promegaマニュアルの記載に従い、Promegaキット（「全ＲＮＡ単離システム」キット）を用いて実施した。接着細胞の場合には、細胞を剥離した後、培地を除去し、細胞をトリプシン／ベルセン溶液で２回洗浄した。これらを培養培地にとり、３００gで５分間遠心分離した。次いで、培地を吸引し、細胞をＰＢＳ溶液にとり、以前に記載されたようにして遠心分離した。培地を吸引し、細胞ペレットは、操作の残りのため処理するか、又は−８０℃で保管することができた。プロトコールの残りは、Promega法の記載に相当する。細胞の細胞ペレットを溶解溶液（キットと共に供給されたＳＶ  ＲＮＡ溶解バッファー（Lysis Buffer）：４M  ＧＴＣ（グアニジンイソチオシアネート）；１０mMトリス−ＨＣｌ  pH７．５；０．９７％β−メルカプトエタノール）１７５μlに懸濁させた。次いで、数回のピペッティングによりペレットを分散させた。細胞濃度が１×１０6〜５×１０6個である場合には、極めて微細なニードルに通すことによりＤＮＡを壊す必要があった。次いで、ＳＶ  ＲＮＡ希釈バッファー（Dilution Buffer）（Promega）３５０μlを溶解溶液１７５μlに添加した。チューブを３〜４回反転させることにより、これを混合し、次いでチューブを７０℃に加温された水浴中に置き、３分間（ＲＮＡ分解のおそれがあるため、この時間を超えてはならない）インキュベーションした。これを１２０００〜１４０００gで２０〜２５℃で１０分間遠心分離し、キットと共に供給されたチューブを、操作の残りに使用した。さらに、使用される各調製物毎に各チューブを特定すること、及びＲＮアーゼ混入を回避するため手袋を着用することが必要であった。溶解溶液をもう一つの遠心分離チューブに移し、ペレットが再び懸濁することを防止しなければならなかった。９５℃のエタノール２００μlを水性溶液に添加した。これを、３〜４回のピペッティングにより混合し、次いでこの溶液を遠心分離チューブに含まれているマイクロカラムへと移し、１２０００〜１４０００gで１分間遠心分離した。チューブからマイクロカラムを除去し、収集チューブ内に存在する液体を排除し、次いでマイクロカラムを再び最初のチューブに置いた。ＲＮＡ洗浄溶液（ＲＮＡ洗浄溶液：６０mM酢酸カリウム、１０mMトリスＨＣｌ  pH７．５、及び６０％エタノール）６００μlをマイクロカラムに添加した。これを１２０００〜１４０００gで１分間遠心分離した。収集チューブを再び空にし、前記と同様に交換した。精製すべき各調製物について、（この順序で）以下の溶液を調製した：４０μl黄色バッファー（Yellow Buffer）（２２．５mMトリスＨＣｌ  pH７．５；１．１２５M  ＮａＣｌ；０．００２５％黄色（Yellow）色素（Promega）（w/v）、０．０９M  ＭｎＣｌ2  ５μl、及びＤＮアーゼＩ酵素５μl）。混合物は、ボルテックス処理するのではなく徐々に混合しなければならなかった。全部を氷中に維持し、酵素を解凍すべき場合には、それを氷中に置かれなければならなかった。この溶液５０μlをSpin Basketの膜上に添加した。溶液が膜全部を覆うことを保証する必要があった。これを２０〜２５℃（常温）で１５分間作用させた。このインキュベーション時間の後、酵素活性を停止させ���溶液２００μlを添加した（ＳＶ  ＤＮアーゼ停止溶液）（２Mグアニジンイソチオシアネート、４mMトリスＨＣｌ  pH７．５、及び５７％エタノール）。マイクロカラムを１２０００〜１４０００gで１分間遠心分離した。ＲＮＡ洗浄溶液（ＳＶ  ＲＮＡ洗浄溶液）６００μlを添加し、これを１２０００〜１４０００gで１分間遠心分離した。ＲＮＡ洗浄溶液２５０μlを添加した。これを最高スピードで２分間遠心分離した。最初のキットの溶出チューブを各調製物について除去し、マイクロカラムをもう一つの遠心分離チューブに移した。ＤＥＰＣ処理水１００μlをマイクロカラムの膜上に添加した。これを１２０００〜１４０００gで１分間遠心分離した。ＲＮＡ溶液を溶出チューブに含め、−８０℃で保管した。
【０１１８】
ｂ）より大量のＲＮＡの場合、Promegaキットを使用した（全ＲＮＡ単離システム）
ここに与えられた値は、１×１０7個の細胞に使用されるものである。細胞の調製は、前記と同様に行った。ＲＮＡの抽出の原理は、Chomczynski及びSacchi（1987）により記載された、グアニジウムチオシアネートを使用する方法に基づいていた。細胞のペレットを、２６mMクエン酸ナトリウム（pH６．８）、０．５％  Ｎ−ラウリルサルコシン、０．１２５M  β−メルカプトエタノール、及び４Mグアニジンチオシアネートを含有している変性溶液１．２mlに懸濁させた。溶液を、溶液６００μlを含有している２本のエッペンドルフチューブに分けた。次いで、２M酢酸ナトリウム６０μlを各チューブに添加し、チューブを反転させることにより（４〜５回）徐々に全体を混合した。次いで、この溶液をフェノール：クロロホルム：ＩＡＡ（イソアミルアルコール）６００μlで抽出し、次いでチューブを氷中に１５分間置いた。この時間の後、エッペンドルフ機において４℃で１４０００rpmで３０分間チューブを遠心分離することにより水性溶液を回収した。次いで、水性溶液に等容量のイソプロパノールを添加し、混合後、全体を−２０℃で１５分間放置しなければならなかった。ＤＮＡ残さを回収するため、４℃で１４０００rpmで３０分間これを遠心分離し、その残さを７５％エタノール溶液で洗浄した。これを改めて遠心分離し、次いでエタノールを廃棄し、次いでペレットを軽く乾燥させ、それを（ＤＥＰＣで処理された）Rnaseフリーの水５０μlに懸濁させた。精製されたＲＮＡ溶液は一つに合わせることができた。次いで、ＲＮＡを−８０℃で保管した。
【０１１９】
ｃ）トリフルオロ酢酸セシウム：ＣｓＴＦＡ（登録商標）（Pharmacia製品）によるＲＮＡの精製
グアニジウムチオシアネートを使用した標準的な方法により、細胞から、又はある種の場合には生検材料から出発して調製された全ＲＮＡ抽出物を、Zarlenga及びGamble（1987）により記載された手法に従い、トリフルオロ酢酸セシウム（ＣｓＴＦＡ）での遠心分離によっても精製した。従って、これは、肝細胞から単離されたＲＮＡのため、ＤＮＡ、タンパク質、そしてある種の場合にはグリコーゲンを含まないＲＮＡ調製物を得ることを可能にした。次いで、グアニジウムチオシアネートにより事前に単離されたＲＮＡを、ＣｓＴＦＡ（Pharmacia）で精製した。ＲＮＡを、最終的に１．６５g/mlの濃度となるよう、２．０g/mlの密度で、０．５μg/mlの濃度のＢＥＴ（臭化エチジウム）を含有するＣｓＴＦＡの溶液に懸濁させた。次いで、５mlポリアロマーチューブ（Beckman）に含有された溶液をＳＷ５５Ｔｉローター（Beckman）において１５℃で２０００００gで４４時間遠心分離した。この遠心分離時間の後、ＲＮＡを除去し、０．３M酢酸ナトリウム溶液から沈殿させ、夜間に−２０℃で２倍容量のエタノールから沈殿させた。次いで、ＲＮＡペレットを回収するためこれを遠心分離し、このペレットを７０％エタノールで洗浄し、ペレットを乾燥させ、ＲＮＡをＤＥＰＣ処理水にとった。他の精製はもはや必要でない。このようにして調製されたＲＮＡは、増幅操作、又はフィルター上でのハイブリダイゼーション操作のため使用され得る。
【０１２０】
８．放射性プローブによるレプリコンを含有している細胞の全ＲＮＡのハイブリダイゼーション
フィルターの調製：グリオキサール溶液によりＲＮＡの変性を行い、次いで、変性後、吸引によりＲＮＡをニトロセルロースフィルター上に固定した（使用された装置は、BioRadのＢｉｏＤｏｔ  ＳＦ）。前記のようにして精製されたＲＮＡを、以下のようにして処理した。ＲＮＡ  ２２μlを１００mMリン酸ナトリウム溶液（pH７．０）９μl、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド（Sigma））４５μl、及び６Mグリオキサール溶液（Sigma）１３．２μlと混合した。全体を混合し、全ての液体を収集するため遠心分離した。従って、ＲＮＡ及び変性溶液により形成された混合物を、５０℃で１時間インキュベートし、次いで試料を氷中で冷却した。次いで、２倍容量の２０×ＳＳＣ溶液（３M  ＮａＣｌ：０．３M  クエン酸ナトリウムpH７．０）を各試料へ添加した後、予め１０×ＳＳＣ溶液（１．５M  ＮａＣｌ：０．１５M  クエン酸ナトリウムpH７．０）で処理しておいたニトロセルロース膜へ通した。残存しているグリオキサールを排除するため、フィルターを９５℃に加熱された溶液：２０mM  トリスＨＣｌ、pH８．０；１mM  ＥＤＴＡへ通し、室温で穏和に撹拌しながら放置した。次いで、真空オーブン（８０℃）内に１〜２時間、各フィルターを置いた。
【０１２１】
フィルターのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション：フィルターをプラスチックバッグ内に置き、プレハイブリダイゼーション溶液（１０mM  ＥＤＴＡ；７％  ＳＤＳ；０．５M  Ｎａ2ＨＰＯ4、pH７．２）を添加した。プラスチックバッグを密封し、全体を６５℃で５分間プレハイブリダイズさせた。プラスチックバッグの角を切り取り、プレハイブリダイゼーション溶液を除去した。次いで、１０6cpm/mlの放射性プローブを含む同溶液を、バッグに添加した。内容物を６５℃で４〜２４時間ハイブリダイズさせた。
【０１２２】
フィルターの洗浄：異なる洗浄を実施した。まず、２×ＳＳＣ溶液（０．３M  ＮａＣｌ：０．０３M  クエン酸ナトリウムpH７．０）及び０．１％ＳＤＳを含有している混合物による５〜１０分間の２回の洗浄。次いで、０．１×ＳＳＣ溶液（１．５×１０−2M  ＮａＣｌ：１．５×１０−3M  クエン酸ナトリウムpH７．０）、０．１％ＳＤＳを含有している混合物による２回の洗浄を、５０℃で、各１５分間実施した。
【０１２３】
ＩＩＩ−感染によりＨＣＶを作製するための方法：
この方法は、レプリコンを含有している細胞が、感染によりＨＣＶ粒子を産生しうるか否かの試験を可能にする。
【０１２４】
現在、Ｃ型肝炎を産生する能力を有する細胞系は存在しない。ＨＣＶのゲノムを複製する能力を有する細胞の導入は、ウイルスの増殖も支援する因子の選択を含む。そのような細胞がウイルス増幅を可能にした後は、ウイルスの精製のみならず、予防接種試験のためのその不活化も構想され得る。
【０１２５】
Ｈ株（Feinstoneら、1981）（これは、ＨＣＶの完全ｃＤＮＡをクローニングするために使用されたのと同一の株である）のウイルスのストック、又は感染患者に由来するウイルスから細胞を感染させるため、Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８型（又はＶｎ５）の細胞、ハイグロマイシンＢプレッシャーの下にある型のＶｅｒｏ／Ｇ４１８＋レプリコン細胞、又はハイグロマイシンＢプレッシャーのない型のＶｅｒｏ／Ｇ４１８＋レプリコン細胞を使用した。これらの細胞を、レプリコンの作用を減弱させるため、ハイグロマイシンＢを含まない通常培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ）の中で維持した。同時に感染特質を決定することなくウイルス材料（ＲＮＡの存在）の定量を可能にするＲＴ−ＰＣＲを、最初のウイルスに対して実施した。次いで、細胞に、前記のようなウイルスを感染させた。細胞を維持し、ＨＣＶの遺伝材料の増幅が存在するか否かを決定するため異なる時点で研究した。このため、細胞のサンプリングを実施し、これらの細胞の全ＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲ、又はフィルター上でのＲＮＡのハイブリダイゼーションのいずれかにより、ＨＣＶのＲＮＡを定量するため抽出した。さらに、目標は、ウイルスが細胞を溶解させる能力を有するか、又は細胞内で持続するかを知ることであった。細胞溶解が存在する場合、その他の細胞を感染させるためには、細胞溶解物をとれば充分である。次いで、ウイルスの定量を、ウイルス学において使用されている様々な方法により行うことができる。さらに、ウイルス感染が細胞の溶解に至らない場合には、ＨＣＶの増殖は、ＨＣＶのタンパク質に対する抗体を使用した間接免疫蛍光により観察されうる。
【０１２６】
ＩＶ−細胞のトランスフェクションによるレプリコンの配列を用いて再構成されたＨＣＶの完全ｃＤＮＡに関する感染性試験
最も機能的なレプリコン、即ち細胞が極めて高い濃度のハイグロマイシンＢに耐性であることを可能にすることにより最も効果的な複製を示したものの配列を再クローニングすることが必須である。従って、これらの細胞のＲＮＡを前記の手法に従い抽出した。バリエーション全体が同じレプリコン分子に相当するよう、レプリコンのＲＮＡを一段階ＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。ＤＮＡを配列決定し、細胞における複製力を確証するため、ＤＮＡの転写により生じたＲＮＡを改めてトランスフェクションした。このようにして得られたＤＮＡ配列においては、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子に相当する配列が、ＨＣＶの構造タンパク質をコードする配列に置換されている。これらの配列を、ＤＮＡからの転写によりＲＮＡを産生することができるよう、ベクターにクローニングした。これらのｃＤＮＡを、電気穿孔（前記参照）によりＶｅｒｏ／Ｇ４１８（又はＶｎ５）細胞、ハイグロマイシンＢプレッシャーの下にあるＶｅｒｏ／Ｇ４１８＋レプリコン細胞、又はハイグロマイシンＢプレッシャーのないＶｅｒｏ／Ｇ４１８＋レプリコン細胞をトランスフェクトするためのＲＮＡを作製するため利用した。次いで、同定試験を、前記のようにして実施した。
【０１２７】
Ｖ−抗ＨＣＶ剤をスクリーニングするための方法
高いハイグロマイシンＢプレッシャーの下での細胞増殖は、ＨＣＶのレプリコンの複製の効率に依存しているため、ＨＣＶの複製を直接的又は間接的に阻害することができるＨＣＶの異なる抗ウイルス剤を、試験した。
【０１２８】
Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８＋レプリコン細胞及びＶｅｒｏ／Ｇ４１８（又はＶｎ５）コントロール細胞を、様々な濃度の異なる抗ウイルス薬の作用に平行に供した。レプリコンの複製に対する作用は、必ず、ＨＣＶのＲＮＡの合成に対する影響を有し、結果として、タンパク質の合成に対する影響を有する。従って、抗ウイルス薬の作用に供された細胞の全ＲＮＡを抽出し、次いでフィルター上に固定し、最後にＨＣＶに特異的なプローブをハイブリダイズさせた。さらに、タンパク質の合成は複製の減少により影響されるため、タンパク質の標識を実施し、異なるタンパク質の発現を、ＨＣＶに特異的なタンパク質に対する抗体を使用した免疫沈降により研究した。
【０１２９】
ＧＦＰをコードする配列を配列内に含有しているレプリコンも、使用され得る。このため、短い半減期を有するＧＦＰを選択した（Clontech）。このタンパク質の再生は、合成速度のみならず、レプリコンの複製にも依存する。ＨＣＶの複製に対して作用する阻害剤は、タンパク質の合成に影響し、結果的にＧＦＰタンパク質の合成に影響する。このアプローチの利点は、ある種の波長の下で天然に蛍光を発するという特性を有しているため、免疫蛍光によりＧＦＰを検出するため細胞を固定する必要がない点である。レプリコン及びＧＦＰを含有しており、抗ウイルス剤の作用に供された細胞を、異なる時点で観察することができる。写真を撮影し、次いでＧＦＰの免疫蛍光を分析することができる。ＧＦＰの免疫蛍光の低下又は消失が、ＨＣＶの抗ウイルス剤の作用の証拠となる。
【０１３０】
ＶＩ−遺伝子型１ａ及び１ｂのＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質のプレニル化の研究：
この研究のため、異なる組換えワクチンウイルスを使用した。それらは、遺伝子型１ａ及び遺伝子型１ｂのＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質全体を発現している。遺伝子型１ｂについては、ＮＳ５Ａタンパク質をコードする配列を遺伝子型１ｂのＨＣＶに感染した２人の患者より増幅した。ＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質のある種の構築は、タンパク質のアミノ末端部分に位置するタンパク質配列の欠失を含有している。これらの異なる組換えウイルスは、ｖｖＮＳ５Ａ．１ａ  ｄｌ１（ｄｅｌ１９７３−２１００ａａ）、ｖｖＮＳ５Ａ．１ａ  ｄｌ２（ｄｅｌ１９７３−２０７３ａａ）、及びｖｖＮＳ５Ａ．１ａ  ｄｌ３（ｄｅｌ１９７３−２００１ａａ）に相当する。ＮＳ５Ａタンパク質内の欠失しているアミノ酸が括弧内に与えられている。さらなる正確のため、ＨＣＶのポリプロテイン内のアミノ酸の位置に相当する値が維持されている。従って、ｄｅｌ１９７３−２１００ａａは、ＨＣＶのポリプロテインのアミノ酸１９７３〜２１００のペプチド配列の欠失に相当する。このタンパク質の欠失は、ＮＳ５Ａタンパク質のアミノ末端部分に関するものである。さらに、ＨＣＶのＮＳ２タンパク質からＮＳ５Ｂタンパク質まで、即ちＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂを発現する組換えワクチンウイルスｖｖＮＳ２−５Ｂも使用した。
【０１３１】
このようにして感染させた細胞を、メバロン酸（Ｈ3）の存在下又はメチオニンＳ35の存在下のいずれかで代謝標識を実施するために使用した。これらの標識のため使用された手法を以下に詳述する。
【０１３２】
ａ）タンパク質のメバロン酸（Ｈ3）標識
Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８（Ｖｎ５）細胞を１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有しているＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）に入れ、１０6個／ウェルで６穴プレート（Costar）に播種した。これらの細胞を３７℃のＣＯ2オーブン内に２４時間置いた。次いで、それらに、各々５ＣＦＵ／細胞というm.o.i.で、ｖＴＦ７．３ウイルス単独（Fuerstら、1986）を感染させるか、又はこのウイルスと、前記のＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質を発現している組換えウイルスのうちの一つとを感染させた。３７℃１時間の後、接種物を除去し、４時間の前処理のため、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）及び１００μg/mlのメバスタチンを含有しているＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）に交換した後、１００μCi/mlのメバロン酸（Ｈ3）を培地へ添加した。感染後１８時間目、細胞をＤＭＥＭ培地で洗浄し、培地を廃棄し、細胞をＰＢＳ溶液で洗浄した後、５０mMトリス−ＨＣｌ  pH７．５；１５０mM  ＮａＣｌ；１mM  ＥＤＴＡ；０．５％ＮＰ４０；０．５％デオキシコール酸Ｎａ；０．２％ＳＤＳ；アプロチニン１０μg/ml；ＴＰＣＫ及びＰＭＳＦ、２０μg/mlを含有しているバッファーにより溶解させた。次いで、既に記載されている手法（Wychowskiら、1985）に従い、ＮＳ５Ａタンパク質に対するポリクローナルウサギ血清を使用して、この溶解物からＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質を免疫沈降させ、沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。これらの標識の結果を、図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、及び３Ｄに与える。メバロン酸標識は、Ｍｅｖ．Ｈ3と示されている。図３Ａ、３Ｂ、及び３Ｃにおいて、ライン１は、組換えウイルスｖＴＦ７．３を感染させた細胞に由来する溶解物おいて得られた結果を示す。この場合、それはコントロール基準である。
【０１３３】
ｂ）タンパク質の（Ｓ35）標識：
Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８（Ｖｎ５）細胞に、前述のような同じ組換えウイルスを感染させた。３７℃で１時間接触させた後、接種物を除去し、５％ウシ胎仔血清を含有しているＤＭＥＭ培地に交換した。感染後１６時間目、細胞をメチオニンを含まないＤＭＥＭ培地で洗浄し、この培地中で１〜２時間インキュベートし、１００μCi/mlのメチオニン（35Ｓ）により３時間標識した（35Ｓ−プロテインラベリングミックス（ＮＥＮ）、標識溶液）。この時間の後、培地を排除し、次いで細胞をＰＢＳで洗浄し、最後に５０mMトリス−ＨＣｌ  pH７．５；１５０mM  ＮａＣｌ；１mM  ＥＤＴＡ；０．５％ＮＰ４０；０．５％デオキシコール酸Ｎａ；アプロチニン１０μg/ml；ＴＰＣＫ及びＰＭＳＦ、２０μg/mlを含有している溶解バッファーを使用して溶解させた。次いで、Wychowskiら（1985）に記載されたようなポリクローナルウサギ血清を使用して溶解物からＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質を免疫沈降させ、沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。図３Ａ及び３Ｃにおいて、メチオニンＳ35標識は、Ｍｅｔ．Ｓ35と示されている。図３Ａ及び３Ｃにおいて、ライン１は、組換えウイルスｖＴＦ７．３を感染させ、メチオニンＳ35で標識した細胞に由来する溶解物において得られた結果を示す。この場合、それはコントロール基準である。
【０１３４】
Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８（Ｖｎ５）細胞において、遺伝子型１ａ及び１ｂのＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質はプレニル化されていることが認められよう（図３Ａ及び３Ｄ参照）。このプレニル化は、ＮＳ５Ａタンパク質を単独で発現させた場合、又はポリプロテインとして発現させた場合に起こった（図３Ｂ、それぞれライン２及び３参照）。プレニル化は、遺伝子型１ａ及び１ｂのＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質に主として影響する、そして他の遺伝子型にも影響するかもしれない翻訳後修飾過程である。
【０１３５】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】１ａ遺伝子型のＣ型肝炎ウイルスのレプリコンの概略図である。該レプリコンは、ＨＣＶの非コーディング領域に相当する５’及び３’配列；カプシドタンパク質の一部をコードするヌクレオチド配列（Ｃ’）、即ち２４６ヌクレオチド（アミノ酸１〜８２）；選択遺伝子であるハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子をコードするヌクレオチド配列（概略図にはハイグロマイシンＲと表記）；ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂに相当する非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列（ＮＳ２→ＮＳ５Ｂと表記）を含有している。Ａｓｐ７１８部位は、選択遺伝子をコードする配列の挿入のために利用された、カプシドタンパク質のヌクレオチド配列に含まれている制限部位のうちの一つである。ＸｂａＩ制限部位は、転写前にＤＮＡを直鎖化するために使用される部位である。次いで、この部位は、「材料及び方法」の部分に記載された方法に従い修飾される。
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８＋レプリコン細胞における免疫蛍光の結果を表す。Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８細胞は、ハイグロマイシンＢの非存在下でガラスシート上で培養され（図２Ｄ）、Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８＋レプリコン細胞はハイグロマイシンＢ（８００μg/ml）の存在下で培養される（図２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃ）。次いで、これらの細胞は、「材料及び方法」の部分に記載された方法に従い処理される。  図２Ａは、カプシドタンパク質Ｃに対するモノクローナルマウス抗体を使用してＶｅｒｏ／Ｇ４１８＋レプリコン細胞において得られた間接免疫蛍光に相当する。  図２Ｂは、ＨＣＶに感染した患者の血清を使用してＶｅｒｏ／Ｇ４１８＋レプリコン細胞において得られた間接免疫蛍光に相当する。  図２Ｃは、ウサギにおいて産生されたＮＳ４タンパク質に対するポリクローナル抗体を使用してＶｅｒｏ／Ｇ４１８＋レプリコン細胞において得られた間接免疫蛍光に相当する。  図２Ｄは、ウサギにおいて産生されたＮＳ４タンパク質に対するポリクローナル抗体を使用してＶｅｒｏ／Ｇ４１８細胞（コントロール細胞）において得られた間接免疫蛍光に相当する。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質のプレニル化の特徴決定に関する。  図３Ａは、組換えワクチンウイルスｖＴＦ７−３（ライン１）のみ、又は組換えワクチンウイルスｖＴＦ７−３及びｖｖＮＳ５Ａ（ライン２）のいずれかを感染させ、メバロン酸Ｈ3の存在下又はメチオニンＳ35の存在下のいずれかで標識したＶｅｒｏ／Ｇ４１８（又はＶｎ５）細胞に由来する細胞抽出物に対して実施された、ＮＳ５Ａタンパク質に対するウサギポリクローナル抗体を使用して得られた免疫沈降の結果を表す。免疫沈降したＮＳ５Ａタンパク質の存在が、矢印により示されている。  図３Ｂは、組換えワクチンウイルスｖＴＦ７−３単独（ライン１）、ｖＴＦ７−３及びｖｖＮＳ５Ａ．１ａ（ライン２）、並びにｖＴＦ７−３及びｖｖＮＳ２−５Ｂ（ライン３）を感染させたＶｎ５（Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８）細胞に由来する細胞抽出物に対して実施された、ＮＳ５Ａタンパク質に対するウサギポリクローナル抗体を使用して得られた免疫沈降の結果を表す。ＮＳ５Ａタンパク質の存在が、矢印により示されている。  図３Ｃは、組換えワクチンウイルスｖＴＦ７−３単独（ライン１）、ｖＴＦ７−３及びｖｖＮＳ５Ａ．１ａ  ｄｌ１（１９７３〜２１００位に位置するアミノ酸の欠失、ライン２）、ｖＴＦ７−３及びｖｖＮＳ５Ａ．１ａ  ｄｌ２（１９７３〜２０７３位に位置するアミノ酸の欠失、ライン３）、ｖＴＦ７−３及びｖｖＮＳ５Ａ．１ａ  ｄｌ３（１９７３〜２００１位に位置するアミノ酸の欠失、ライン４）、並びにｖＴＦ７−３及びｖｖＮＳ５Ａ．１ａ（ライン５）を感染させ、メバロン酸Ｈ3の存在下又はメチオニンＳ35の存在下のいずれかで標識したＶｎ５（Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８）細胞に由来する細胞抽出物に対して実施された、ＮＳ５Ａタンパク質に対するウサギポリクローナル抗体を使用して得られた免疫沈降の結果を表す。異なる短縮型ＮＳ５Ａ．１ａタンパク質の位置が、図の側面のラインにより示されている。  図３Ｄは、組換えワクチンウイルスｖＴＦ７−３及び遺伝子型１ａのｖｖＮＳ５Ａ、ｖＴＦ７−３及び遺伝子型１ｂのｖｖＮＳ５Ａ（２人の異なる患者に由来）（ライン１及び２）を感染させ、メバロン酸Ｈ3の存在下で標識したＶｎ５（Ｖｅｒｏ／Ｇ４１８）細胞に由来する細胞抽出物に対して実施された、ＮＳ５Ａタンパク質に対するウサギポリクローナル抗体を使用して得られた免疫沈降の結果を表す。ＮＳ５Ａタンパク質の位置が、矢印により示されている。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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