(57)【要約】化学的または酵素的分解を受け易い核酸プローブを本明細書に記載する。さらに、標的核酸配列の検出において係るプローブを使用する検定および方法を開示する。この分解可能なプローブの標的特異的ハイブリダイゼーション領域または標的相補性領域は、分解プロセスを経て検出可能領域から分離できる。分解可能プローブの残りの部分は容易に検出できる。本明細書に記載の分解可能プローブの使用は、核酸検出の検定および方法においてバックグラウンド特異的または非特異的シグナル生成を減少させることによってシグナル対ノイズ比を改善する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的核酸配列を検出するための方法であって、
（ｉ）  配列特異的ハイブリダイゼーションの条件下で試料を一対のプローブと合し［ここで、各プローブは、（ａ） いずれかの末端にある、他方のプローブとの相互作用を介してプローブ−プローブ分枝を形成できるが該標的核酸配列に相補的でないプローブ−プローブ分枝形成領域、（ｂ） 一方のプローブのプローブ−プローブ分枝形成領域内部に位置する少なくとも１個の架橋化合物（これは、該標的核酸配列と該プローブとの塩基対合の後、該プローブ対のうち他方のプローブのプローブ−プローブ分枝形成領域内部に位置する架橋化合物反応体と共有結合による架橋を形成する）、および、（ｃ） プローブの少なくとも一方に結合した少なくとも１個の検出可能成分、を持つ］；
（ｉｉ）  この試料を光照射して、隣接するプローブ対のプローブ−プローブ分枝形成領域を架橋し；
（ｉｉｉ）  プローブの架橋したプローブ−プローブ分枝形成領域を標的相補性領域から分離し；そして、
（ｉｖ）  該試料中に該標的核酸配列が存在することを示す、少なくとも１個の分離し架橋したプローブ−プローブ分枝の存在を検出する、
ことを含む方法。
【請求項２】
試料中の標的核酸配列を検出するための方法であって、
（ｉ）  配列特異的ハイブリダイゼーションの条件下で試料を一対のプローブと合し［ここで、各プローブは、（ａ） いずれかの末端にある、他方のプローブとの相互作用を介してプローブ−プローブ分枝を形成できるが該標的核酸配列に相補的でないプローブ−プローブ分枝形成領域、（ｂ） プローブ対のうち第一のプローブのプローブ−プローブ分枝形成領域内部に位置する第一の架橋化合物、（ｃ） プローブ対のうち第二のプローブのプローブ−プローブ分枝形成領域内部に位置する第二の架橋化合物、および、（ｄ） プローブの少なくとも一方に結合した少なくとも１個の検出可能成分、を持つ］；
（ｉｉ）  この試料を光照射して、隣接するプローブ対のプローブ−プローブ分枝形成領域を架橋し；
（ｉｉｉ）  プローブの架橋したプローブ−プローブ分枝形成領域を標的相補性領域から分離し；そして、
（ｉｖ）  該試料中に該標的核酸配列が存在することを示す、少なくとも１個の分離し架橋したプローブ−プローブ分枝の存在を検出する、
ことを含む方法。
【請求項３】
前記検出可能成分が、フルオレセイン、発蛍光団、ラジオアイソトープ、抗原、または酵素より成る群から選ばれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記プローブの対がリボ核酸またはデオキシリボ核酸で構成される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記プローブ対の各プローブのプローブ−プローブ分枝形成領域が、塩基対を形成する少なくとも２個、好ましくは約２ないし約８個のヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記プローブが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８より成る群から選ばれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
標的相補性領域からの、前記プローブの架橋したプローブ−プローブ分枝の分離を、化学的または酵素的分解によって達成する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記標的核酸配列が、一本鎖、二本鎖デオキシリボ核酸、またはリボ核酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記標的核酸配列が、プローブの対に相補的な配列の間に約２ヌクレオチドを越えないギャップを持っている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
試料中の標的核酸配列を検出するための方法であって、
（ｉ）  配列特異的ハイブリダイゼーションの条件下で試料を一対のプローブと合し［ここで、各プローブは、（ａ） いずれかの末端にある、他方のプローブとの相互作用を介してプローブ−プローブ分枝を形成できるが該標的核酸配列に相補的でないプローブ−プローブ分枝形成領域、（ｂ） 一方のプローブのプローブ−プローブ分枝形成領域内部に位置する少なくとも１個の架橋化合物（これは、該標的核酸配列と該プローブとの塩基対合の後、該プローブ対のうち他方のプローブのプローブ−プローブ分枝形成領域内部に位置する架橋化合物反応体と共有結合による架橋を形成する）、（ｃ） 一方のプローブに結合した少なくとも１個のシグナルリポーター基、および、（ｄ） 他方のプローブに結合した少なくとも１個の捕捉基、を持つ］；
（ｉｉ）  この試料を光照射して、隣接するプローブ対のプローブ−プローブ分枝形成領域を架橋し；
（ｉｉｉ）  プローブの架橋したプローブ−プローブ分枝形成領域を標的相補性領域から分離し；そして、
（ｉｖ）  該試料中に該標的核酸配列が存在することを示す、少なくとも１個の分離し架橋したプローブ−プローブ分枝の存在を検出する、
ことを含む方法。
【請求項１１】
前記架橋化合物が、クマリン、クマリン誘導体、３−（７−クマリニル）グリセロール；ソラレン、ソラレン誘導体、８−メトキシソラレン、５−メトキシソラレン；ｃｉｓ−ベンゾジピロン、ｃｉｓ−ベンゾジピロン誘導体；ｔｒａｎｓ−ベンゾジピロン、ｔｒａｎｓ−ベンゾジピロン誘導体；および融合クマリン−シノリン環系を含む化合物、より成る群から選ばれる、請求項１または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記架橋化合物反応体がピリミジンおよびピリミジン誘導体より成る群から選ばれる、請求項１または１０に記載の方法。
【請求項１３】
試料中の標的核酸配列を検出するための方法であって、
（ｉ）  配列特異的ハイブリダイゼーションの条件下で試料を一対のプローブと合し［ここで、各プローブは、（ａ） いずれかの末端にある、他方のプローブとの相互作用を介してプローブ−プローブ分枝を形成できるが該標的核酸配列に相補的でないプローブ−プローブ分枝形成領域、（ｂ） プローブ対のうち第一のプローブのプローブ−プローブ分枝形成領域内部に位置する第一の架橋化合物、（ｃ） プローブ対のうち第二のプローブのプローブ−プローブ分枝形成領域内部に位置する第二の架橋化合物、（ｄ） 一方のプローブに結合した少なくとも１個のシグナルリポーター基、および、（ｅ） 他方のプローブに結合した少なくとも１個の捕捉基、を持つ］；
（ｉｉ）  この試料を光照射して、隣接するプローブ対のプローブ−プローブ分枝形成領域を架橋し；
（ｉｉｉ）  プローブの架橋したプローブ−プローブ分枝形成領域を標的相補性領域から分離し；そして、
（ｉｖ）  該試料中に該標的核酸配列が存在することを示す、少なくとも１個の分離し架橋したプローブ−プローブ分枝の存在を検出する、
ことを含む方法。
【請求項１４】
前記シグナルリポーター基がフルオレセイン、発蛍光団、ラジオアイソトープ、抗原、または酵素より成る群から選ばれる、請求項１０または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記捕捉基がビオチン、抗原、またはレセプター基質より成る群から選ばれる、請求項１０または１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記架橋化合物がアリールオレフィンおよびアリールオレフィン誘導体より成る群から選ばれる、請求項２または１３に記載の方法。
【請求項１７】
（ｉ） 塩基が標的配列の或る領域と対合する、標的相補性領域；
（ｉｉ） 該標的配列とハイブリダイズしないプローブ−プローブ分枝形成領域；
（ｉｉｉ） 該プローブと標的配列の塩基対合後に、第二プローブのプローブ−プローブ分枝形成領域内部に位置する少なくとも１個の架橋化合物反応体と、共有結合による架橋を形成できる、プローブ−プローブ分枝形成領域内部に位置する少なくとも１個の架橋化合物；
（ｉｖ） 少なくとも１個のプローブのプローブ−プローブ分枝形成領域に結合した、少なくとも１個の検出可能成分；および、
（ｖ） 標的相補性領域とプローブ−プローブ分枝形成領域の間の分解部位、
を含む核酸プローブ。
【請求項１８】
（ｉ） 塩基が標的配列の或る領域と対合する、標的相補性領域；
（ｉｉ） 該標的配列とハイブリダイズしないプローブ−プローブ分枝形成領域；
（ｉｉｉ） 該プローブと標的配列の塩基対合後に、第二プローブのプローブ−プローブ分枝形成領域内部に位置する第二の架橋化合物との反応時に共有結合による架橋を形成できる、プローブ−プローブ分枝形成領域内部に位置する第一の架橋化合物；
（ｉｖ） 少なくとも１個のプローブのプローブ−プローブ分枝形成領域に結合した、少なくとも１個の検出可能成分；および、
（ｖ） 標的相補性領域とプローブ−プローブ分枝形成領域の間の分解部位、
を含む核酸プローブ。
【請求項１９】
前記核酸プローブが約１５から約５０ヌクレオチドまでの配列長を持つ、請求項１７または１８に記載の核酸プローブ。
【請求項２０】
（ｉ） 塩基が標的配列の或る領域と対合する、各プローブの標的相補性領域；
（ｉｉ） 該標的配列とハイブリダイズしない、各プローブのプローブ−プローブ分枝形成領域；
（ｉｉｉ） 該プローブと標的配列の塩基対合後に、該核酸プローブ対の他方のプローブのプローブ−プローブ分枝形成領域内部に位置する少なくとも１個の架橋化合物反応体と、共有結合による架橋を形成できる、プローブ−プローブ分枝形成領域内部に位置する少なくとも１個の架橋化合物；
（ｉｖ） 該核酸プローブ対の少なくとも１個のプローブのプローブ−プローブ分枝形成領域に結合した、少なくとも１個の検出可能成分；および、
（ｖ） 標的相補性領域とプローブ−プローブ分枝形成領域の間の分解部位、
を含む核酸プローブ対。
【請求項２１】
（ｉ） 塩基が標的配列の或る領域と対合する、各プローブの標的相補性領域；
（ｉｉ） 該標的配列とハイブリダイズしない、各プローブのプローブ−プローブ分枝形成領域；
（ｉｉｉ） 該プローブと標的配列の塩基対合後に、該核酸プローブ対の他方のプローブのプローブ−プローブ分枝形成領域内部に位置する少なくとも１個の架橋化合物反応体と、共有結合による架橋を形成できる、プローブ−プローブ分枝形成領域内部に位置する少なくとも１個の架橋化合物；
（ｉｖ） 該核酸プローブ対のうち一方のプローブのプローブ−プローブ分枝形成領域に結合した、少なくとも１個のシグナルリポーター基、および、該核酸プローブ対の他方のプローブのプローブ−プローブ分枝形成領域に結合した少なくとも１個の捕捉基；並びに、
（ｖ） 標的相補性領域とプローブ−プローブ分枝形成領域の間の分解部位、
を含む核酸プローブ対。
【請求項２２】
（ｉ） 塩基が標的配列の或る領域と対合する、各プローブの標的相補性領域；
（ｉｉ） 該標的配列とハイブリダイズしない、各プローブのプローブ−プローブ分枝形成領域；
（ｉｉｉ） 該プローブと標的配列の塩基対合後に、該核酸プローブ対の他方のプローブのプローブ−プローブ分枝形成領域内部に位置する第二の架橋化合物との反応時に共有結合による架橋を形成できる、一方のプローブのプローブ−プローブ分枝形成領域内部に位置する第一の架橋化合物；
（ｉｖ） 該核酸プローブ対の少なくとも１個のプローブのプローブ−プローブ分枝形成領域に結合した、少なくとも１個の検出可能成分；および、
（ｖ） 標的相補性領域とプローブ−プローブ分枝形成領域の間の分解部位、
を含む核酸プローブ対。
【請求項２３】
（ｉ） 塩基が標的配列の或る領域と対合する、各プローブの標的相補性領域；
（ｉｉ） 該標的配列とハイブリダイズしない、各プローブのプローブ−プローブ分枝形成領域；
（ｉｉｉ） 該プローブと標的配列の塩基対合後に、該核酸プローブ対の他方のプローブのプローブ−プローブ分枝形成領域内部に位置する第二の架橋化合物との反応時に共有結合による架橋を形成できる、一方のプローブのプローブ−プローブ分枝形成領域内部に位置する第一の架橋化合物；
（ｉｖ） 該核酸プローブ対のうち一方のプローブのプローブ−プローブ分枝形成領域に結合した、少なくとも１個のシグナルリポーター基、および、該核酸プローブ対の他方のプローブのプローブ−プローブ分枝形成領域に結合した少なくとも１個の捕捉基；並びに、
（ｖ） 標的相補性領域とプローブ−プローブ分枝形成領域の間の分解部位、
を含む核酸プローブ対。
【請求項２４】
前記核酸プローブ対の各プローブが約１５から約５０ヌクレオチドまでの配列長を持つ、請求項２０−２３のいずれか１項に記載の核酸プローブ対。
【請求項２５】
以下のプローブ−プローブ分枝：
【化１】
2004501615.tif 000008
［式中、（ｉ） ＬおよびＬ’の少なくとも一方が存在し、それは標識であり；
（ｉｉ） Ｎは核酸であり；
（ｉｉｉ） ａおよびｂはＮの数を表す独立した整数であり；
（ｉｖ） Ｘは第一の架橋化合物であり；
（ｖ） Ｙは第二の架橋化合物または架橋化合物反応体であり；そして、
（ｖｉ） 第一の架橋化合物は第二の架橋化合物または架橋化合物反応体と共有結合して、該プローブ−プローブ分枝を永続的に連結する］
を含む核酸プローブ対。
【請求項２６】
以下のプローブ−プローブ分枝：
【化２】
2004501615.tif 000009
［式中、（ｉ） ＬおよびＬ’の少なくとも一方が存在し、それは標識であり；
（ｉｉ） Ｐはプリンまたはプリン誘導体であり；
（ｉｉｉ） Ｐ’はピリミジンまたはピリミジン誘導体であり；
（ｉｖ） ａおよびｂはＰおよびＰ’の数を表す独立した整数であり；
（ｖ） Ｘは架橋化合物であり；
（ｖｉ） Ｙは架橋化合物反応体であり；そして、
（ｖｉｉ） 架橋化合物は架橋化合物反応体と共有結合して、該プローブ−プローブ分枝を永続的に連結する］
を含む核酸プローブ対。
【請求項２７】
Ｌがシグナルリポーター基であり、Ｌ’が捕捉基である、請求項２５または２６に記載の核酸プローブ対。
【請求項２８】
前記シグナルリポーター基がフルオレセイン、発蛍光団、ラジオアイソトープ、抗原、または酵素より成る群から選ばれる、請求項２５または２６に記載の核酸プローブ対。
【請求項２９】
前記捕捉基がビオチン、抗原、またはレセプター基質より成る群から選ばれる、請求項２５または２６に記載の核酸プローブ対。
【請求項３０】
前記プローブ対の各プローブがａ＝０〜２０且つｂ＝０〜８０である配列長を有する、請求項２５または２６に記載の核酸プローブ対。
【請求項３１】
前記架橋化合物がクマリン、クマリン誘導体、３−（７−クマリニル）グリセロール；ソラレン、ソラレン誘導体、８−メトキシソラレン、５−メトキシソラレン；ｃｉｓ−ベンゾジピロン、ｃｉｓ−ベンゾジピロン誘導体；ｔｒａｎｓ−ベンゾジピロン、ｔｒａｎｓ−ベンゾジピロン誘導体；融合クマリン−シノリン環系を含む化合物；アリールオレフィン、およびアリールオレフィン誘導体、より成る群から選ばれる、請求項２５または２６に記載の核酸プローブ対。
【請求項３２】
前記架橋化合物反応体がピリミジン、ピリミジン誘導体、プリン、およびプリン誘導体より成る群から選ばれる、請求項２５または２６に記載の核酸プローブ対。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
ａ）  発明の分野
本発明は、化学的または酵素的分解を受け易い核酸プローブ、ならびに、試料中の標的核酸配列の検出において係るプローブを使用する検定および方法に関するものである。
【０００２】
ｂ）  関連技術の説明
核酸、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）は遺伝情報の分子的貯蔵媒体である。究極的には、あらゆる蛋白は細胞の核酸に内包された情報の帰結である。遺伝子は、蛋白またはＲＮＡといった機能的生物学的産物のための情報を内包するＤＮＡのセグメントである。ＤＮＡの機能は生物学的情報の貯蔵であり、細胞は典型的には数千の遺伝子を持っていることから、ＤＮＡ分子は極めて大きくなる傾向がある。人間の１個の細胞にある全ＤＮＡの合計の長さは約２メートルであり、数十億のヌクレオチドで構成されている。
【０００３】
真核生物では、ＤＮＡは大抵細胞の核に見出される。ところが蛋白合成は細胞質中のリボソーム上で起こる。よってＤＮＡ以外の分子が蛋白合成のための遺伝的メッセージを核から細胞質へと運搬せねばならない。ＲＮＡは核と細胞質の両方に見出され、これが遺伝情報をＤＮＡからリボソームへと運搬する。それぞれ別個の機能を持つ、幾つかのクラスのＲＮＡが存在している。リボソームＲＮＡ （ｒＲＮＡ）は、蛋白の合成を実行するリボソームの構造的成分である。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、遺伝子から、対応蛋白が作られるリボソームへと情報を運搬する核酸である。トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）は、ｍＲＮＡ中の情報をアミノ酸の特定配列へと翻訳するアダプター分子である。細胞内でさらなる機能を実行する、多岐にわたる特定機能ＲＮＡがさらに存在する（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， 第２版， １９９３， Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．）。
【０００４】
二重螺旋ＤＮＡは、互いに螺旋状により合わさった２本のポリ核酸鎖で構成されている。ポリヌクレオチド鎖の各々のヌクレオチド単位は、含窒素塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧ）、糖デオキシリボース、および燐酸基で構成される。２本のポリヌクレオチド鎖の向きは、それらの５’から３’方向が逆であるような逆平行である。この鎖は水素結合および疎水性相互作用によってまとめられている。ＤＮＡ内の塩基対は、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）のようなプリン、ならびにチミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）のようなピリミジンで構成される。Ａは２個の水素結合の形成によってＴと対合し、一方Ｇは３個の水素結合の形成によってＣと対合する。この塩基対相補性はＤＮＡ分子の本質的な特徴であり、塩基のサイズ、形、および化学組成に起因している。二重螺旋の幾何学的配置の結果、プリンは常にピリミジンと対合せねばならない。さらに、Ｇは常にＣと、そしてＡは常にＴと対合する。この単純且つ洗練された構造が、二重螺旋の並外れた安定性を提供している。
【０００５】
細胞内に見出される温度およびイオン濃度の条件下で、ＤＮＡは、Ａ−ＴおよびＧ−Ｃ塩基対の水素結合による二本鎖構造として維持される。この二本鎖は、これらを加熱することにより（通常、例えば０．０１Ｍ ＮａＣｌといった希釈塩溶液中で）、またはｐＨを１１より高くすることにより、融解（一本鎖へと変性）できる。溶液の温度を下げイオン濃度を上げた場合、またはｐＨを下げた場合、この一本鎖はアニーリング、または再会合して二本鎖を再構成する（溶液中のそれらの濃度が充分高いならば）。この性質が核酸ハイブリダイゼーションと呼ばれる技術の基礎である。核酸の混合物において、相補的な鎖のみが再会合し、それらの再会合の程度は非相補鎖の存在には事実上影響を受けない。分子ハイブリダイゼーションはＤＮＡもしくはＲＮＡいずれかの相補鎖の間で、またはＲＮＡ鎖とＤＮＡ鎖の間で起こり得る。
【０００６】
目的の遺伝子（およびＲＮＡ）を検出するためにオリゴヌクレオチドプローブを使用する様々なハイブリダイゼーション技術の使用が分子生物学の分野で良く知られている。一般に、プローブは、相補的核酸配列を含むフラグメントとハイブリダイズするように設計する。形成されたハイブリッドの存在と量を、使用したシグナルの性質に応じて、放射線（放射性プローブの場合）、酵素の産生した生成物（酵素標識プローブの場合）、蛍光（蛍光標識プローブの場合）などを測定することによって検出する。
【０００７】
プローブ−標的複合体の核酸二本鎖安定性を評価するために、そして非標的ＤＮＡまたはＲＮＡに対するプローブの非特異的（バックグラウンド）結合を減らすために、様々な実験条件を考慮せねばならない。融解温度またはその他の変性条件、アニーリング温度、塩濃度、ｐＨ等を包含する、ハイブリダイゼーション検定を実施する際に考慮する必要がある数多くの変数の故に、非標的核酸配列に対する核酸プローブの非特異結合の可能性は、様々なハイブリダイゼーション技術を実施する際には依然として大きな欠点である。
【０００８】
卓越性を成就した分子ハイブリダイゼーションの１つの用途がｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションである。試料中のＤＮＡまたはＲＮＡの特異的配列に相補的な標識化ＤＮＡまたはＲＮＡを調製する。このような相補的ＤＮＡまたはＲＮＡをオリゴヌクレオチドプローブと称する。この検定では、オリゴヌクレオチドプローブを、特異的標的ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡと、または該ＤＮＡ中の特定の天然または組み込まれた遺伝子配列とアニーリングするように設計する。細胞または組織切片を熱または酸に短時間暴露し、それにより、核酸を含む細胞内容物が適切にガラススライド、フィルター、またはその他の材料上に固定することができる。次にこの固定された細胞または組織を、ハイブリダイゼーションのため、標識した相補的ＤＮＡまたはＲＮＡプローブに暴露する。
【０００９】
標識試薬は、ラジオアイソトープ、例えば３２Ｐ、蛍光色素、ビオチニル化ヌクレオチド類似体、抗原またはその他の一般的に実施される標識技術であってよい。インキュベーション時間の後、ハイブリダイズしていない標識化したＤＮＡまたはＲＮＡを除去し、ハイブリダイズしている複合体を検出して、個々の細胞または組織切片内部の特異的ＲＮＡまたはＤＮＡの存在および／または位置を明らかにすることができる。この技術は評判の良いものであるが、検定の感受性を改善し標識化したプロープの非特異結合（バックグラウンド）を減らすための、不断の努力が必要である（Ｄａｒｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版， １９９０， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｉｎｃ．）。
【００１０】
当分野で一般的に使用されているもう一つのハイブリダイゼーション技術は、固定化核酸への標識化プローブのハイブリダイゼーションである。ニトロセルロースフィルターまたはナイロン膜といった固体支持体上に固定化した核酸に標識化プローブをハイブリダイズするために、数多くの方法が利用できる。これらの方法は、使用する溶媒および温度；溶媒の容量およびハイブリダイゼーションの長さ；攪拌の程度および方法；固体マトリックス表面へのプローブの非特異結合をブロックするための、デンハート試薬またはＢＬＯＴＴＯといった試薬の使用；標識化プローブの濃度およびその比活性；核酸の再会合速度を増大させる、硫酸デキストランまたはポリエチレングリコールのような化合物の使用；およびハイブリダイゼーション後の洗浄の緊縮度、といった様々な点で異なっている。
【００１１】
常套的な検定法では、固体支持体表面へのプローブの非特異結合をブロックするため、幾つかの異なる型の物質が使用できる。このような物質は、デンハート試薬、ヘパリン、脱脂粉乳などを包含する。このような物質はしばしば、変性させたフラグメント化鮭精子または酵母ＤＮＡおよび洗浄剤、例えばＳＤＳと組み合わせて使用する。ニトロセルロースフィルターを使用する場合は、通常、プレハイブリダイゼーション溶液とハイブリダイゼーション溶液の両方にブロッキング剤を加える。
【００１２】
核酸の固定化にナイロン膜を使用する場合、高濃度の蛋白はプローブがその標的にアニーリングすることを妨げると考えられるため、しばしばブロッキング剤をハイブリダイゼーション溶液から省略する。バックグラウンドの問題を最小化するため、最少量のプローブを使用して最も短い時間でハイブリダイズさせるのが最善である。しかしながら、特に核酸の検出可能量が少ないような条件である場合、プローブの非特異結合を全て排除する事が常に可能であるとは限らない（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版， １９８９， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。
【００１３】
核酸ハイブリダイゼーションはまた、ｃＤＮＡライブラリーを目的クローンについてスクリーニングするための最も信頼できる方法である。膨大な数のクローンを、核酸プローブの使用によって同時且つ迅速に分析することができる。様々な技術が、異なる長さと特異性のプローブを使用している。ホモローガスプローブは、所望ｃＤＮＡの正確な核酸配列の少なくとも一部を含んでいる。これらは、例えば存在しているｃＤＮＡの部分クローンを用いてｃＤＮＡライブラリーから完全長クローンを単離するといったように、様々なやり方で使用できる。ホモローガスプローブを用いるハイブリダイゼーションは緊縮条件下で実施する。
【００１４】
部分的にホモローガスなプローブは、そのプローブ配列と関連してはいるが同一ではないｃＤＮＡクローンを検出するために用いる。例えば、同じ遺伝子が別の種から既にクローニングされているならば、または関連遺伝子が同じ種からクローニングされているならば、その核酸配列が、ハイブリダイゼーションによりｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングができるほど充分保存されているかどうかを実験的に決定することができる。非特異的シグナル生成を産むバックグラウンドハイブリダイゼーションからの不適当な干渉を伴わずに、目的とするｃＤＮＡのためのプローブとして過去にクローニングされた遺伝子が使用できるような条件を確立することが必要である。ハイブリダイゼーション検定と条件に関するより詳細な情報については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（上記）を参照されたい。
【００１５】
ハイブリダイゼーション検定において、核酸プローブが表面に非特異結合することをブロックするために使用できる幾つかの異なる物質がある（上記）。しかしながら、シグナル対ノイズ比を増大させ、非特異的シグナル生成を減少させる、ハイブリダイゼーション技術における核酸プローブの使用のための改善法を提供することが望ましい。
【００１６】
発明の要約
本発明は、分解可能な核酸プローブと、試料中の標的核酸配列の検出においてこれらのプローブを使用する方法に関するものである。この分解プロセスの目的は、非特異的シグナル生成を減少させることである。
分解可能なプローブを使用する標的核酸配列の検出のための検定が、本発明によって企図される。好ましくはこの検定は、化学的または酵素的分解を受け易い核酸プローブを使用する、溶液に基づくまたはｉｎ ｓｉｔｕの核酸ハイブリダイゼーション検定である。この検定は、（１）標識した分解可能な核酸プローブを標的配列とハイブリダイズさせて、このプローブから標的特異的生成物を作り出し、（２）このプローブの標識化領域から標的相補性領域を分解または分離し、そして（３）標識した領域の存在を検出する、ことを含む。
【００１７】
本発明の一つの態様は、試料中の標的核酸配列を検出し、それにより少なくとも一対の核酸プローブが標的核酸とアニーリングするような方法を提供する。このプローブは、該プローブが標的核酸配列の隣接領域と塩基対合した後に、末端のプローブ−プローブ分枝またはステムを形成する、二つの核酸領域を特徴とする。本明細書に記載のステムまたはプローブ−プローブ分枝を形成できるプローブの領域は、「ステム領域」または「プローブ−プローブ領域」とも称する。このプローブは、プローブ対のうち少なくとも一方のプローブのステム領域内部に位置する少なくとも１個の架橋化合物を有する。
【００１８】
プローブ対の第二のプローブのステム領域は、第一プローブのステム領域の架橋化合物と共有結合を形成できる反応体を組み込んでいる。これに代わり、両方のステム領域が、二つの架橋化合物の反応、例えば二量体化によって共有結合を形成することのできる、架橋化合物を組み込んでいるかも知れない。この共有結合はプローブと標的核酸配列との塩基対合後に生成し、それによりこのプローブ対のステム領域を相互に永続的に架橋する。加えて、プローブの少なくとも１つのステム領域は、該ステム領域の末端に結合した検出可能成分またはシグナル生成成分を含んでいる。
【００１９】
このシグナルはステムの架橋後に生成および検出されるが、一方この架橋は該プローブが標的核酸配列と塩基対合した後に起こる。この核酸プローブは、該プローブの標的特異的ハイブリダイゼーション領域または標的相補性領域が、検出可能な標識された領域から分解プロセスを経て分離できるような方法で設計する。よって、プローブの残りの部分はステムと標識で構成される。この分離の目的は、バックグラウンド特異的または非特異的シグナル生成を減少させることによりシグナル対ノイズ比を改善することである。
【００２０】
本発明の別の態様は、少なくとも２個のプローブが標的核酸配列の隣接領域と塩基対合した後に、プローブ−プローブ分枝またはステムを形成するよう設計した修飾または非修飾核酸領域を包含する核酸配列を含む核酸プローブを提供する。ステムを形成できるプローブの領域は「ステム領域」または「プローブ−プローブ領域」とも呼ばれる。このプローブの少なくとも１つのステム領域は、ステム領域の末端に結合した検出可能部分、例えば標識を含んでいる。
【００２１】
本発明の好ましい態様では、プローブ対のうち１つのプローブのステム領域は、例えば修飾または非修飾アデニン残基のような修飾または非修飾プリンヌクレオシドまたは誘導体と、少なくとも１個の架橋化合物を含み、一方このプローブ対の他方のプローブのステム領域は、該架橋化合物のための反応体として機能する、修飾または非修飾ピリミジンヌクレオシドを含む。１つの好ましい反応体は、修飾または非修飾チミジン残基より成る。
【００２２】
このプローブは、標的配列の隣接領域とハイブリダイズして三アーム連結点を含むプローブ−プローブ分枝またはステムを形成する。その結果、プローブが標的核酸の隣接領域と塩基対合した後に、該プローブ対のステム領域が架橋し、末端ステムまたはプローブ−プローブ分枝が形成される。共有結合的架橋は光照射またはその他の手段によって誘発される。次いで、架橋したステムを標的相補性領域から分離し、引き続き検出する。ここで言及する架橋化合物とは、クマリン誘導体を含む安定な光活性非ヌクレオシド化合物である。
【００２３】
架橋化合物反応体、例えば修飾または非修飾ピリミジンヌクレオシドまたは誘導体と反応する架橋化合物の例は、（１） ３−（７−クマリニル）グリセロール；（２） ソラレンおよびその誘導体、例えば８−メトキシソラレンまたは５−メトキシソラレン；（３） ｃｉｓ−ベンゾジピロンおよびその誘導体；（４） ｔｒａｎｓ−ベンゾジピロン；および（５） 融合クマリン−シノリン環系を含む化合物、を包含するクマリン誘導体である。これらの分子は全て、ヌクレオチドと架橋するための正しい向きおよび正しい距離に位置する必要な架橋基を含んでいる。さらに、これらの分子は全て基本的クマリン環系を含み、分子の残部がそれを基礎としているという点で、クマリン誘導体である。
【００２４】
本発明の別の態様では、プローブ対のステム領域は、修飾または非修飾プリンおよび／またはピリミジンヌクレオシドまたは誘導体と、第一の架橋化合物を含み、一方このプローブ対のもう一方のプローブのステム領域は、修飾または非修飾プリンおよび／またはピリミジンヌクレオシドまたは誘導体と、第二の架橋化合物を含む。プローブが標的核酸の隣接領域と塩基対合した後に、このプローブ対のステム領域は、光照射時の架橋化合物の反応（例えば二量体化）によって架橋し、ステムまたはプローブ−プローブ分枝が形成される。
【００２５】
ここで言及する架橋化合物とは、アリールオレフィン誘導体を含む、安定な光活性非ヌクレオシド化合物である。このアリールオレフィンの二重結合は、適当な反応体、例えば該プローブ−プローブ分枝の反対の鎖に位置する別のアリールオレフィン誘導体と、共有結合により架橋する光活性基である。したがって、このアリールオレフィンの二重結合は、プローブが標的核酸の隣接領域と塩基対合した後に、反対のプローブ−プローブ領域にある非ヌクレオシド反応体と架橋するための正しい向きおよび正しい距離に位置している。
【００２６】
本発明の特に好ましい態様では、プローブの標的特異的ハイブリダイゼーション領域または標的相補性領域は、検出の前に、このプローブの検出可能な標識された領域から、分解プロセスを経て分離される。本発明の１つの目的は、標識されたプローブ−プローブ分枝またはステムを形成する二つのプローブ末端間の架橋により、共有結合を維持し、一方で、架橋部位までの任意のプローブの部分、とりわけ該プローブの標的相補性領域を除去することである。特に、プローブの標的相補性領域が、分解または該プローブのステムから分離（例えば切除）されねばならない。分解または切断の方法は、化学的および酵素的手段を包含し、ここで、選択される方法はそのプローブの組成に依存する。
【００２７】
プローブの標的相補性領域は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはプローブのヌクレオチド単位を置換している非天然置換部分を含むことができる。したがって、この系の全体的設計は、プローブのステム領域が、該プローブの標的相補性領域の分離または除去に使用する所望の分解または切断方法に耐える、プローブを提供することである。分解の後、該プローブの分離され且つ検出可能な部分はステムと標識で構成され、この標識をその後に測定（下記参照）および定量する。プローブの検出可能領域からの標的相補性領域の分離は、プローブの非特異結合を減少させ、それによりシグナル対ノイズ比を改善する。結果として、バックグラウンド特異的または非特異的シグナルの生成が著しく減少する。
【００２８】
本発明のもう一つの好ましい態様では、プローブのステム領域が検出可能部分と捕捉部分を含み、これらがステム領域の末端を結合している。この検出可能部分は任意のシグナルリポーター基であってよく、捕捉部分は任意の捕捉基であってよい。特に、捕捉基およびシグナルリポーター基はそれぞれビオチンおよびフルオレセインとすることができる。これに代わる態様では、プローブの片方または両方のステム領域が、ステム領域の末端に結合する検出可能部分を含む。検出可能部分は、発蛍光団、ラジオアイソトープ、抗原、または酵素のような標識で構成されていてよい。さらに、標識は、検出可能シグナルを生成する二つの標識間の相互作用であるように設計できる。
【００２９】
本発明のさらに別の好ましい態様では、このプローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８より成る群から選択する。
完全長遺伝子、診断用マーカー遺伝子、発現配列タグ（ＥＳＴ）、単一ヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃｃｃＤＮＡ、組換え遺伝子、ならびにｍＲＮＡおよびｒＲＮＡを包含する（但しこれらに限定されない）標的配列の検出もまた本発明により包含される。
【００３０】
発明の詳細な説明
ａ）  定義および一般的パラメータ
本明細書に記載の発明を説明するために使用する特別な用語の意義および範囲を例示および定義するため、以下の定義を開示する。
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」または「核酸配列」は、天然ヌクレオシド塩基アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルを含むｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃｃｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ならびに合成ＤＮＡおよびＲＮＡ配列を包含し（但しこれらに限定される訳ではない）、さらに、１またはそれ以上の修飾または非修飾ヌクレオシドを有する配列をも包含する。「核酸」または「核酸配列」という語はオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの両者を包含する。本明細書中のこれらの用語のいずれの使用によっても、長さまたは合成起源に関するいかなる限定をも示唆しない。
【００３１】
「プローブの標的特異的ハイブリダイゼーション領域」または「プローブの標的相補性領域」という語は、緩衝化した（ｐＨ７．０〜７．５）食塩水溶液（例えば１ｍＭないし２Ｍ ＮａＣｌ）中、室温、といったようなハイブリダイゼーション条件の下で、別の核酸配列、とりわけ特異的標的配列と水素結合を形成できる核酸プローブ配列を意味する。ハイブリダイゼーション条件は、関係するポリヌクレオチドの長さに依存するが、これは典型的には少なくとも１種類のカチオン、例えばＮａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、またはＣａ２＋の存在、中性付近のｐＨ、および５５℃未満の温度を包含する。
【００３２】
ポリヌクレオチドにハイブリダイズする配列は該ポリヌクレオチドに対し約９０％〜１００％相補性であってよいが、その配列に充分な長さがあり、高い塩濃度の溶液であり、そして／または低温条件の下では、７０％、または５０％の相補性を持つポリヌクレオチドでさえもハイブリダイズできる。そこにハイブリダイズする配列は、典型的には、標的ヌクレオチドに相補的である、少なくとも１０のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１５〜３０のヌクレオチド、そして約１０００以内のヌクレオチドを含む。
【００３３】
「試料中の標的核酸配列を検出するための方法」において言及される「試料」とは、組織または体液の試料、または単離した試料であってよい。「組織」という語は本明細書中、１個の細胞、複数の細胞、細胞の凝集塊、または臓器全体より成る任意の生物学的材料を指す。本明細書中使用する組織という語は、細胞または細胞群を包含し、これは正常であっても異常（即ち腫瘍）であってもよい。「体液」とは、生物または生物の組織から抽出され、排出され、または分泌された任意の液体物質であってよい。
【００３４】
体液は必ずしも細胞を含有する必要はない。本発明に関連する体液は、全血、血清、血漿、尿、脳脊髄液、涙液、および羊水を包含するがこれらに限定されない。「単離された試料」という語は、試料を含む材料がその元の環境（例えば、それが天然に存在するならば天然環境）から取り除かれたことを意味する。例えば、生きている動物または組織切片中に存在する、天然に存在するポリヌクレオチドは単離されていないが、同じポリヌクレオチドがその元の環境外の溶液中では単離されて存在でき、またはベクターもしくは組成物の一部となることができ、そして係るベクターまたは組成物がそれらの元の環境の一部でないと言う点で単離されている。
【００３５】
「検出可能成分」という語は、目的とする標的核酸、例えば試料中のＤＮＡまたはＲＮＡのリポーティングまたは検出を支援するために核酸配列またはプローブに結合させた、任意のシグナル生成部分、シグナルリポーター基、標識物質、または標識を指す。検出可能成分は、単独でまたは相互に組み合わされて機能する１またはそれ以上の核酸プローブに結合させることができる。検出可能部分は、ラジオアイソトープ、発蛍光団、または直接酵素標識（例えば、プローブに直接コンジュゲートさせた酵素）といったように直接検出可能であってよく；または、後に酵素−抗体コンジュゲート（これは該酵素の基質を検出可能生成物に変換する）に結合させる抗原のように、間接的に検出可能であってもよい。
【００３６】
本明細書中使用する「捕捉部分」または「捕捉基」という語は、検出可能部分と組合わされて働く部分であり、ここで、プローブ対の中の一方の核酸プローブは検出可能部分で標識されており、プローブ対の中の他方のプローブは捕捉部分で標識されている。捕捉部分は任意の抗原、レセプター基質、またはビオチンであってよく、それは、抗体、レセプター、またはアビジンもしくはストレプトアビジンを含む固体支持体上に該生成物を結合させる。生成物の捕捉は、捕捉基が該生成物と結合するために起こる。使用する捕捉部分に応じて、ビオチンがアビジンまたはストレプトアビジンに結合し、抗原が抗体に結合し、またはレセプター基質がレセプターに結合する。
【００３７】
「分解可能なプローブ」という語は、バックグラウンド特異的または非特異的シグナル生成を減少させることによりシグナル対ノイズ比を改善するために、該プローブの分解可能領域を、化学的または酵素的手段によって該プローブの標的相補性領域から分離させることのできる、核酸配列またはプローブを指す。一対のプローブの検出可能且つ分離可能な領域は、プローブ−プローブ分枝またはステムとも呼ばれる。このプローブ−プローブ分枝またはステムは、標的相補性ではなく互いに相互作用するよう設計された、各プローブの部分で構成されている（下記）。分解可能プローブは、例えばハイブリダイゼーション検定のような核酸検出のための検定に使用できる。本明細書で言及する酵素的手段とは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを分解する能力を持つ酵素的物質を包含するが、これに限定されない。
【００３８】
デオキシリボヌクレオチドを分解または切断する酵素的物質の例は、ＤＮアーゼＩ、ミクロコッカスヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＳ１、または緑豆ヌクレアーゼといったヌクレアーゼ類；またはエキソヌクレアーゼＩＩＩのようなエキソヌクレアーゼ類である。リボヌクレオチドを分解または切断する酵素的物質の例は、ＲＮアーゼＡ、Ｓ１、ホスホジエステラーゼＩ、ホスホジエステラーゼＩＩ、またはＲＮアーゼＨといったリボヌクレアーゼ類である。本明細書で言及する化学的手段とは、ＲＮＡを分解する化学物質、例えば水酸化ナトリウム；またはＤＮＡを分解する化学物質、例えば天然抗生物質（例えば、ブレオマイシン、ネオカルジノスタチン）または合成試薬（例えば、メチジウムプロピル−ＥＤＴＡ鉄（ＩＩ）複合体）を包含するがこれらに限定される訳ではない。
【００３９】
「架橋化合物」という語は、本明細書に記載のプローブのヌクレオチド配列内部に位置する化学化合物を指す。架橋化合物は、所望によりプローブ対またはプローブ組の一方のプローブのプローブ−プローブ領域またはステム領域内部に位置することができる［ここで、一方のプローブはこの架橋化合物を取り込むことができ、他方のプローブは、この架橋化合物のための反応体として機能する、１またはそれ以上の修飾または非修飾プリンまたはピリミジンヌクレオシドまたは誘導体で構成され得る］。この架橋化合物は、プローブが標的核酸配列と塩基対合した後に該反応体と共有結合を形成するように設計する。別法として、両方のステム領域が、プローブが標的核酸配列と塩基対合した後に、反応時（例えば二量体化）に共有結合を形成できる架橋化合物を取り込む。本発明で企図される架橋化合物はＷＯ００／２７６８０；および米国特許第６００５０９３号；米国特許第５０８２９３４号；および米国特許第４８２６９６７号に詳細が論じられている。
【００４０】
「プローブ−プローブ分枝」および「ステム」という語は本明細書において互換的に使用し、二つのプローブが標的核酸配列の隣接領域と塩基対合した後に光架橋し、その後各プローブの標的特異的領域から分離する、プローブ対の核酸領域を表す。ステムまたはプローブ−プローブ分枝を形成できるプローブ領域を「ステム領域」または「プローブ−プローブ領域」と称する。このステム領域は、最初に水素結合、塩橋、および／またはファンデルワールス力により非共有結合的に相互作用する。次いでプローブ対が相補的標的配列とハイブリダイゼーションした後に、ステムの架橋が起こる。
【００４１】
プローブは、プローブ対の片方のステム領域内部に位置する少なくとも１個の架橋化合物を持っているため、この架橋が可能となる。プローブ対の他方のステム領域は反応体を組み込み、これが、プローブが標的核酸の隣接領域と塩基対合した後にステムの架橋化合物と共有結合を形成する。別法として、両方のステム領域は、プローブが標的核酸配列と塩基対合した後に、光架橋（例えば二量体化）の際に共有結合を形成できる架橋化合物を取り込む。いかなるプローブのステム領域も、標的に結合するプローブの領域が相補的標的配列とハイブリダイズしてしまうまではハイブリダイズしていない形で存在する。
【００４２】
よって、与えられた任意のプローブのステム領域は、ステムが形成されるまではプローブの残部と識別不能であり得る。請求項に記載のプローブ−プローブ分枝、ステム、プローブ−プローブ領域、およびステム領域という語は不当に限定してはならない。これらの用語の使用によって、サイズまたは長さに関する限定は示唆されていない。当業者には、これらの用語の変形が請求項の範囲内に意図されることが明らかであろう。例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いて目的ＲＮＡを検出する場合、得られるプローブ−プローブ分枝またはステムは、ステム構造のみが残されるようには分離され得ない。標的相補性領域は実質上分解されるであろうが、標的の幾つかのＲＮＡ塩基はステムに結合したまま残り、これは本発明の目的を妨げないであろう。
【００４３】
これに代わり、ＤＮＡまたはＲＮＡプローブを目的ＤＮＡの検出に使用する場合、得られるプローブ−プローブ分枝またはステムは、これもまたステム構造のみが残されるようには分離され得ない。同様に、標的相補性領域はほぼ分解されるものの、標的の幾つかのＤＮＡ塩基はステムに結合したまま残り、これは本発明の目的を妨げない。プローブまたは標的が修飾核酸、核酸誘導体、または核酸類似体から成る状況についても同様である。架橋したプローブ−プローブ分枝またはステムは、標的相補性領域から分離でき、その後、このプローブ−プローブ分枝またはステムの長さおよびサイズに拘わらず検出できる。
【００４４】
「Ｎ」という語は、１またはそれ以上の修飾または非修飾核酸、核酸誘導体、または核酸類似体を示すために使用する。例えば、非修飾プリンおよび／またはピリミジンヌクレオシドまたは誘導体を含むプローブが本発明によって企図され、ここでＮは任意の数の係る残基を示すために使用できる。非修飾残基の例はチミンまたはチミジン、シトシン、アデニン、グアニン、およびウラシルである。これに代わり、修飾プリンおよび／またはピリミジンヌクレオシドまたは誘導体を含むプローブもまた本発明によって企図される。同様にＮを用いて任意の数のこのような修飾残基を示すことができる。修飾残基の例は、デオキシチミジン、燐酸デオキシチミジン、５−フルオロウラシルなどである。
【００４５】
用語Ｎの使用には、サイズまたは長さについての限定は示唆されない。「Ｎ（ａ）」または「Ｎ（ｂ）」という語は、例えばプローブまたは標的配列中の、任意の数の修飾または非修飾核酸、核酸誘導体、または核酸類似体を示すのに用いる。下付文字「ａ」および「ｂ」は、任意の整数を指し、それによって残基の数を示す。例えば、ａが０−２０に等しい（ａ＝０−２０）場合、Ｎ（ａ）は０から２０までいずれかの修飾または非修飾核酸残基、核酸誘導体、または核酸類似体に等しい。当業者にとっては、Ｎ（ａ）およびＮ（ｂ）はプローブまたは標的配列中のおよその残基数を示すのに用いられるということが明らかであろう。故に、Ｎ、Ｎ（ａ）、およびＮ（ｂ）という語がサイズまたは長さを不当に限定してはならない。
【００４６】
ｂ）  分解可能プローブを用いるハイブリダイゼーション検定
本発明は、化学的または酵素的分解を受け易い核酸プローブを用いる、溶液に基づく且つｉｎ ｓｉｔｕの核酸ハイブリダイゼーション検定を開示するものである。本発明の目的は、核酸プローブの配列特異的ハイブリダイゼーション特性を使用して、標的配列の存在を検出し、該プローブから標的特異的生成物を作り出し、該プローブの標的相補性領域を分解または分離し、そして標的特異的生成物の存在を検出することである。この分解プロセスの目的は、バックグラウンド特異的または非特異的シグナル生成を減少させることにより、シグナル対ノイズ比を改善することである。
【００４７】
本発明の一つの態様は、試料中の標的核酸配列を検出し、それにより少なくとも１対の核酸プローブが標的核酸とアニーリングするような方法を提供する。この方法は、標的核酸を、塩基対合にとって好適な媒質中で、プローブまたはプローブ対（下記参照）と合することにより実施する。核酸はＤＮＡまたはＲＮＡ、一本鎖または二本鎖、または塩基対合のできるピリミジンおよび／またはプリンを含むその他の分子であってよい。
【００４８】
特に本発明の或る態様は分解可能なプローブを提供する。このプローブは、少なくとも２つのプローブが標的核酸配列の隣接領域と塩基対合した後にプローブ−プローブ分枝またはステムを形成する核酸領域を特徴とする。好ましくは、この核酸プローブは、少なくとも２つのプローブが標的核酸配列の隣接領域と塩基対合した後にプローブ−プローブ分枝またはステムを形成するよう設計された修飾または非修飾核酸領域を包含する核酸配列を含む。このプローブの対は、ステムを形成するプローブの領域を除いて標的配列に相補的である。プローブの各々は標的配列に結合しないステム領域を含んでいる。
【００４９】
ステム領域は、標的核酸に結合するプローブの領域が相補的標的配列とハイブリダイズするまでは非ハイブリダイズ形態で存在する。その結果、与えられた任意のプローブのステム領域は、ステムが形成されるまではプローブの残部と識別不能であり得る。このステム領域は、最初に水素結合、塩橋、および／またはファンデルワールス力により非共有結合的に相互作用する。次いでプローブが標的核酸の隣接領域と塩基対合した後に、このプローブ対のステム領域が架橋し、ステムが形成される。プローブは、プローブ対の片方のステム領域内部に位置する少なくとも１個の架橋化合物を持っているため、この架橋が可能となる。
【００５０】
プローブ対の他方のステム領域は反応体を組み込み、これが、ステムの架橋化合物と共有結合を形成する。別法として、両方のステム領域が、光反応（例えば二量体化）の際に共有結合を形成できる架橋化合物を取り込む。充分なインキュベーションの後、このプローブは試料中の標的核酸とハイブリダイズし、架橋系が活性化して二つのプローブ間に共有結合を生成する。よって、プローブが標的核酸配列と塩基対合した後に共有結合が生成し、それによりステム領域が相互に永続的に架橋する。架橋したステムをその後標的相補性領域から分離し、引き続き検出する。
【００５１】
各々のプローブは少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは約１５ないし３０ヌクレオチド、そして約１０００ヌクレオチド以内の配列長を持ち、ここでこの配列は標的配列に対して少なくとも８０パーセントホモローガスであり、より好ましくは標的配列に対し９０−１００パーセントホモローガスである。標的核酸上に存在する塩基対合領域は通常約１０ヌクレオチド以上離れておらず、より普通には約５ヌクレオチド、好ましくは約１ヌクレオチド以上離れていない。
【００５２】
本発明の好ましい態様では、プローブは約２０ないし３０ヌクレオチド長であり、且つ標的に対し約９５パーセントホモローガスである［ここで、標的核酸上に存在する塩基対合領域は約１ヌクレオチド離れている］。与えられた標的配列の検出にどのプローブを使用するかに拘わらず、そのプローブ対内部の各プローブの長さが異なり得るという事は理解できる。プローブの各々は、そのプローブ対のうちの他方のプローブとステムまたはプローブ−プローブ分枝を形成できる領域を持っている。
【００５３】
このプローブが相補的標的配列に結合した後、該プローブ対のステム領域の１つにあるステム内部に位置する架橋化合物が活性化して、プローブ対中の他方のプローブのステム領域内に位置する反応体と共有結合を形成し、それにより、プローブ対の各成員のステム領域が相互に永続的に架橋する。加えて、プローブ対中のプローブの少なくとも一方は、所望によりそのステム領域の５’または３’末端に結合した検出可能部分またはシグナル生成部分を含んでいる。このシグナルはステムの架橋後に検出または生成され、それは一方標的核酸配列に対するプローブの塩基対合の後に起こる。
【００５４】
本発明の特に好ましい態様では、試料中の所望標的核酸配列に相補的なプローブの領域は、該プローブの検出可能領域から除去可能である。この核酸プローブは、該プローブの標的特異的ハイブリダイゼーション領域または標的相補性領域を、分解プロセスを経て検出可能部分またはシグナル生成部分から分離できるように設計する。プローブが標的核酸配列の隣接領域および生成したステム内部の架橋に結合した後、このプローブの標的相補性領域を化学的または酵素的分解によって除去することができる。
【００５５】
よって、プローブの残りの部分はステムとシグナルで構成され、これらは適当な洗浄工程（下記参照）が完了した後の検定で容易に検出できる。この分離の目的は、バックグラウンド特異的または非特異的シグナル生成を減少させることによってシグナル対ノイズ比を改善することである。標準ハイブリダイゼーション検定は当分野で既知であり、一般に経験される問題は、表面への核酸材料の非特異結合と、検定における非特異的シグナルの生成である。シグナル生成部分を核酸ハイブリダイゼーション領域から分離することにより、非特異的シグナルは最小化できる。残る唯一のシグナルは、架橋したプローブのステムと、任意の与えられた試料において標的配列と直接比例する付随部分（群）から誘導される。
【００５６】
本発明の１つの目的は、標識したプローブ−プローブ分枝またはステムを形成する二つのプローブ末端の間の架橋によって共有結合を維持し、一方では、この架橋部位までのプローブの任意の部分、とりわけ該プローブの標的相補性領域を除去することである。特に、プローブの標的相補性領域は、分解されまたはプローブのステム領域から分離（例えば切除）されねばならない。分解または切断の方法は、化学的および酵素的手段を包含する［ここで、選択した方法は該プローブの組成に依存する］。プローブの標的相補性領域は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、または該プローブのヌクレオチド単位を置換する非天然置換部分を含み得る。その結果、分解法はこの検定に使用するプローブの型に依存することになる。
【００５７】
本発明の一つの態様では、デオキシリボヌクレオチドはプローブの標的相補性領域を含む［ここでは数多くのヌクレアーゼを単独または組み合わせて使用して、該プローブを選択的に分解または切断することができる］。ＤＮアーゼＩまたはミクロコッカスヌクレアーゼのような二本鎖ＤＮＡを加水分解するエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素を使用して、架橋工程の後、直ちにプローブの標的相補性領域を分解することができる。一本鎖ＤＮＡを加水分解するエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素、例えばヌクレアーゼＳ１または緑豆ヌクレアーゼは、任意のプローブ−標的二本鎖の変性後に、この方法に使用できる。別法として、二方向特異性エキソヌクレアーゼを組み合わせて使用し、プローブ対のプローブを分解できる。
【００５８】
例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩは二本鎖ＤＮＡ上で３’−＞５’エキソヌクレアーゼ活性を示し、一方バクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼは５’−＞３’エキソヌクレアーゼ活性を示す。この二種類のヌクレアーゼを架橋工程の直後に試料に導入し、所望のプローブ分解反応を奏効させることができる。同様に、基質として一本鎖ＤＮＡを要するその他のエキソヌクレアーゼが知られており、これらは酵素導入の前に試料を変成させることが必要であるかも知れない。所望により、化学的ＤＮＡ開裂試薬をデオキシリボヌクレオチドの分解に使用できる。例として、天然抗生物質ブレオマイシンおよびネオカルジノスタチン、ならびにメチジウムプロピル−ＥＤＴＡ鉄（ＩＩ）複合体のような合成試薬が挙げられる。
【００５９】
これとは別の本発明の態様では、リボヌクレオチドがプローブの標的相補性領域を含む［ここでは強塩基性溶液のような化学的手段を用いてプローブを分解または切断できる］。典型的には、０．１Ｍないし５Ｍ濃度の水酸化ナトリウム溶液を該プローブに接触させ、得られた溶液を室温またはより高い温度、例えば３０−９０℃でインキュベートする。この塩基性溶液は、プローブ鎖のＲＮＡ塩基位置にニックの形成を惹起する［ここでは反応に必要な時間は水酸イオン濃度とインキュベーション温度に依存する］。リボヌクレオチド部位でのプローブの分解または切断を奏効させるために、多くの酵素的手段もまた使用できる。
【００６０】
一本鎖ＲＮＡを開裂させることが分かっている酵素は、例えばリボヌクレアーゼＡ、Ｓ１、ホスホジエステラーゼＩ、ホスホジエステラーゼＩＩを包含する。酵素が一本鎖ＲＮＡに選択的に働く場合、この溶液は変性条件とする（例えば、二本鎖の融解温度を超える温度に加熱）必要があり、それにより、架橋したプローブ−標的二本鎖は酵素プロセスの開始前に標的鎖から分離する。エンドヌクレアーゼ活性を持つ酵素、例えばＲＮアーゼＡおよびＳ１は、個別的に使用して、プローブ組の各プローブで所望のプローブ分解反応を起こすことができる。
【００６１】
方向依存性エキソヌクレアーゼ活性のみを持つ酵素は、各プローブで、所望のプローブ分解反応を起こさせるため、好ましくは対で使用する。例えば、ホスホジエステラーゼＩは５’−＞３’エキソヌクレアーゼ活性を示し、ホスホジエステラーゼＩＩは３’−＞５’活性を示す。一方のプローブはその標的相補性領域の５’末端で終止し、他方のプローブはその標的相補性領域の３’末端で終止することから、この二種類の酵素は、好ましくは或る組の両方のプローブを分解するために組み合わせて使用することになろう。
【００６２】
別法として、ＲＮアーゼＨを用いてプローブのＲＮＡ部分を選択的に分解することができる。ＲＮアーゼＨはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖上でＲＮＡ加水分解活性を示す。この場合、リボヌクレオチドを含む標的相補性領域を持つプローブを適用してＤＮＡ標的を検出する。プローブを試料と接触させハイブリダイズと架橋を行わせた後、ＲＮアーゼＨを導入して、ＤＮＡ標的とハイブリダイズしているプローブのリボヌクレオチド単位の選択的加水分解を奏効させることができる。
【００６３】
ステムは、架橋部位を越える構造が、酵素または化学物質によって接近または識別できず、それ故切断または分解できないように設計する。これは、プローブ核酸配列の糖燐酸バックボーンを修飾してまたは修飾せずに達成できる。プローブのステム領域は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドの誘導体、または非核酸成分を含むことができる。ステムに用いられる核酸または非核酸部分の型は、プローブの標的相補性領域を分解するために使用する試薬の影響を受けにくい上の基のうちのいずれかから選択する。
【００６４】
例えば、分解プロセスにＤＮＡヌクレアーゼを使用する場合、このプローブのステム部分はリボヌクレオチドを含むことができる。逆に、分解プロセスにＲＮＡヌクレアーゼを使用する場合は、ステム部分はデオキシリボヌクレオチドを含み得る。しかしながら、幾つかのヌクレアーゼ、例えばＳ１、ならびにホスホジエステラーゼＩおよびＩＩは、ＤＮＡおよびＲＮＡ基質の両者を加水分解することが分かっており、この場合、天然ヌクレオチドまたは非核酸成分のヌクレアーゼ耐性誘導体が必要である。多くの天然ヌクレオチド構造の化学的修飾は、当該部分にヌクレアーゼ耐性を付与することが知られている。
【００６５】
例えば、燐酸部分の硫黄原子を酸素原子に交換してチオ燐酸部分を作り出すと、典型的には酵素的加水分解反応が遅延または停止する。同様に、メチルホスホネート基への燐酸基の置換は酵素的耐性を付与する。非天然結合もまた酵素により認識されず、該プローブのステム部分を組み立てるための有用な手段を提供する。例えば、ペプチド結合は、相補的二本鎖において塩基対形成能力を維持する核酸構造のバックボーン部分として働くことが知られているが、これらはいかなる酵素によっても認識されない非天然バックボーンを持っている。
【００６６】
本発明はさらに、使用する分解方法の型に関わりなく、架橋剤とプローブ末端の任意の標識の間、または架橋部位とプローブ末端の任意の標識の間の、プローブのステム領域に使用できる、天然に存在する核酸部分を包含する。架橋剤または架橋部位と標識化プローブ末端の間の天然塩基の数が１０未満、より好ましくは３未満である場合、架橋および標識部分が酵素の認識部位を変化させるため、ヌクレアーゼの活性は著しく妨げられる。
【００６７】
ステム形成が起こるためには、該ステムの二分の一を含むプローブの各ステム領域は、少なくとも２または３対のヌクレオチド、且つ通常は約２０以下の塩基対を含んでいてよい。好ましい態様では、ヌクレオチド対はＡおよびＴであり、この場合、ヌクレオチドは１つのステム領域において同一であっても相違していてもよく、即ち、或るステム領域では全てＴであり別のステム領域では全てＡであるか、またはプローブ対の二つのステム領域でＡとＴの混合物であってよい。
【００６８】
別法として、ＧとＣをこれらのみで、またはＡおよびＴと組み合わせて使用できる。より好ましくは、ステムは３種類のヌクレオチド単位で構成される［ここでは、或るステム領域はＴから成り別のステム領域は二つのＡと１つの架橋化合物から成るか；または或るステム領域は二つのＴと１つの架橋化合物から成り、別のステムは二つのＡと１つの架橋化合物から成る］。特定のヌクレオチドの選択は、所望の親和性、合成の容易性、共有結合的架橋化合物との相互作用、分解方法の型などに依存するであろう。
【００６９】
本発明の好ましい態様では、プローブのステム領域は、ステム領域の末端に結合した検出可能部分および捕捉部分を含んでいる。検出可能部分は任意のシグナルリポーター基であってよく、捕捉部分は任意の捕捉基であってよい。特に、捕捉基とシグナルリポーター基はそれぞれビオチンおよびフルオレセインとすることができる。これに代わる態様では、プローブの両ステム領域は、ステム領域の末端に結合した検出可能部分を含む。検出可能部分は発蛍光団、ラジオアイソトープ、抗原、または酵素といった標識で構成される。別の態様では、プローブの両ステム領域は、組合わさって相互作用して検出可能シグナルを提供する部分、例えば蛍光共鳴エネルギー転移対またはアクティベーター／レセプター対を含む。
【００７０】
別の好ましい態様では、プローブ対の一方のプローブのステム領域は修飾または非修飾プリンヌクレオシドまたは誘導体、例えば修飾またはひ修飾アデノシン残基および少なくとも１個の架橋化合物を含み、該プローブ対の他方のプローブのステム領域は、架橋化合物のための反応体として機能する修飾または非修飾ピリミジンヌクレオシドまたは誘導体を含む。或る好ましい反応体は、修飾または非修飾チミジン残基から成る。このプローブは標的配列の隣接領域とハイブリダイズし、三アーム連結点を含むプローブ−プローブ分枝またはステムを形成する。
【００７１】
その結果、このプローブが標的核酸の隣接領域と塩基対合した後には、プローブ対のステム領域が架橋し、ステムまたはプローブ−プローブ分枝が形成される。共有結合的架橋は光照射またはその他の手段によって誘発できる。さらに、共有結合的架橋は標識の活性化を惹起し、プローブが検出可能となる。次に、架橋したステムを標的相補性領域から分離し、引き続き検出する。本明細書で言及する架橋化合物は、クマリン誘導体を含む安定な非ヌクレオシド光活性化合物である。このクマリン誘導体は、クマリン分子または誘導体のフェニル環をヒドロキシまたはポリヒドロキシ炭化水素分子、例えばグリセロール分子の末端ヒドロキシ基に連結することにより製造する。
【００７２】
得られた化合物の（ポリ）ヒドロキシ炭化水素部分はヌクレオシドの糖に相当し、クマリン部分は塩基の位置を占有する。このようにして、この化合物をポリヌクレオチド領域に挿入することができる。クマリン環系の３および４位の間の二重結合は、プローブ対のプローブが標的核酸の隣接領域と塩基対合した後に、プローブ−プローブ領域を含む反対の鎖のヌクレオシドと共有結合的架橋を形成する、光活性基である。
【００７３】
架橋化合物反応体、例えば修飾または非修飾ピリミジンヌクレオシドまたは誘導体と反応する、架橋化合物の例は、（１） ３−（７−クマリニル）グリセロール；（２） ソラレンおよびその誘導体、例えば８−メトキシソラレンまたは５−メトキシソラレン；（３） ｃｉｓ−ベンゾジピロンおよびその誘導体；（４） ｔｒａｎｓ−ベンゾジピロン；および（５） 融合クマリン−シノリン環系を含む化合物、を包含するクマリン誘導体である。これらの分子は全て、ヌクレオチドと架橋するための正しい向きおよび正しい距離に位置する必要な架橋基（活性二重結合）を含んでいる。加えて、これらの分子は全て、当該分子の残部が基礎としている塩基性クマリン（ベンゾピロン）環系を含んでいるという点で、クマリン誘導体である。これらの架橋化合物は米国特許第６００５０９３号に詳細が論じられている。
【００７４】
本発明の別の態様では、プローブ対の１つのプローブのステム領域は修飾もしくは非修飾プリンおよび／またはピリミジンヌクレオシドまたは誘導体ならびに第一の架橋化合物を含み、このプローブ対の他方のプローブは修飾もしくは非修飾プリンおよび／またはピリミジンヌクレオシドまたは誘導体ならびに第二の架橋化合物を含む。このプローブが標的核酸の隣接領域に塩基対合した後に、プローブ対のステム領域は、光照射時に架橋化合物の反応（例えば二量体化）によって架橋し、共有結合によって結合したステムまたはプローブ−プローブ分枝が形成される。本明細書で言及する架橋化合物とは、アリールオレフィン誘導体を含む安定な非ヌクレオシド光活性化合物である。
【００７５】
このアリールオレフィン誘導体は、アリール部分を、官能基化した飽和または不飽和炭化水素分子、例えばグリセロールに連結することによって製造する。得られた化合物の官能基化された炭化水素部分はヌクレオシドの糖に相当し、アリールオレフィン部分は塩基の位置を占有する。したがってこの化合物をポリヌクレオチド中に挿入することができる。このアリールオレフィンの二重結合は、適当な反応体、例えば該プローブ−プローブ分枝の反対側の鎖に位置する別のアリールオレフィン誘導体と、共有結合により架橋する光反応基である。アリールオレフィンの二重結合は、プローブが標的核酸の隣接領域と塩基対合し、引き続き光照射を受けた後に、反対のプローブ−プローブ領域にある非ヌクレオシド反応体と架橋するための正しい向きおよび正しい距離に位置している。これらの架橋化合物はＷＯ００／２７８６０に詳細が論じられている。
【００７６】
本発明のさらに別の好ましい態様では、このプローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８より成る群から選択する。
完全長遺伝子、診断用マーカー遺伝子、発現配列タグ（ＥＳＴ）、単一ヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃｃｃＤＮＡ、組換え遺伝子、ならびにｍＲＮＡおよびｒＲＮＡを包含する（但しこれらに限定されない）標的配列の検出もまた本発明により包含される。標的配列は二本鎖または一本鎖であってよい。さらにこれらは天然に存在していてよく、または性質が人工的なものであってもよい。標的配列は精製されていてもいなくてもよく、溶液でまたは液体もしくは組織内部に存在していてよい。
【００７７】
本発明は、化学的および酵素的分解を受け易い核酸プローブ、および係るプローブを標的核酸配列の検出に使用する方法を包含する。この系の包括的意図は、該プローブのステム領域が、プローブの標的相補性領域をプローブの標識化領域から分離するために使用する分解または切断の所望方法に対し耐性であるようなプローブを提供することである。分解の後、プローブの、分離された且つ検出可能な領域は、ステムと標識とで構成され、この標識を引き続き測定（下記参照）および定量する。プローブの検出可能領域からの標的相補性領域の分離は該プローブの非特異結合を減少させ、それによりシグナル対ノイズ比を改善する。結果として、バックグラウンド特異的または非特異的シグナル生成は著しく減少する。
【００７８】
ｃ）  プロトコル
以下のプロトコルは、２個のＤＮＡプローブがプローブ−プローブ分枝またはステム内部で架橋し、制限エンドヌクレアーゼが分解剤として機能する、本発明を説明するものである。
プローブ＊：
１． 試料溶液（標的を含有）中のプローブを合する：
【化３】
2004501615.tif 000002
【００７９】
２． 二つのプローブを架橋する：
【化４】
2004501615.tif 000003
【００８０】
３． エンドヌクレアーゼ制限酵素を用いてプローブ（およびその他の核酸材料）を分解：
【化５】
2004501615.tif 000004
【００８１】
＊標的配列中のハイフンは単に二つの鎖中の塩基の整列を維持する役割を持つに過ぎず；ハイフンの両側にある二つの塩基は通常のホスホジエステル結合によって結合している。
Ｂはビオチンを表す。
Ｆはフルオレセインを表す。
Ｘは架橋化合物を表す。
ＸとＴの間の「＝」は共有結合による架橋を表す。
【００８２】
ステムは、架橋部位を越える構造が酵素により接近されまたは認識されないように、そして故に酵素による切断を受けないように設計する。これは、糖燐酸バックボーン（例えば、ホスホロチオアート、メチルホスホナート、ペプチド結合など）の修飾なしに、または修飾を伴って達成できる。
【００８３】
残存するプローブの部分は今や二つの連結した標識で構成され、これは本態様ではビオチン基とフルオレセイン基、またはそれぞれ捕捉基とシグナルリポーター基である。これに代わり二つの標識は、相互作用して蛍光共鳴エネルギー転移によりシグナルを提供する発蛍光団であってもよい。この検定は、標識されたステムに連結した捕捉基の、固体支持体上への捕捉によって進行し、その後近傍から非結合物質およびプローブ（プローブ消化物）を除去する洗浄工程、次いでシグナルリポーター基の存在を検出する工程が続く（下記の検出方法を参照されたい）。捕捉基、例えばビオチンがステムに連結しているため、ステムは保持される。この態様では、ビオチンはアビジンまたはストレプトアビジン被覆ビーズに結合している。
【００８４】
この特別の態様の幾つかの変形もまた本明細書に開示する（上記）。
ＲＮＡプローブ用：
プローブ分解のための酵素物質としてＲＮアーゼＡを使用。
プローブ分解のための化学物質として水酸化ナトリウムを使用。
ＤＮＡプローブ用：
プローブ分解のための酵素物質としてＤＮアーゼＩを使用。
プローブ分解のための酵素物質としてエンドヌクレアーゼを使用（即ちミクロコッカスヌクレアーゼ）。
以下に第１表のプローブを用いる本発明を例示する。ＤＮＡプローブの組を、目的核酸配列とハイブリダイズする能力と、標識部分により検出される能力について試験する。分解したプローブと分解していないプローブを比較する。
【００８５】
【表１】
2004501615.tif 000005
【００８６】
試料のプロトコル：
溶菌溶液（１１９．２μｌ）、プローブ溶液（３６．４μｌ）および中和溶液（４４．４μｌ）を９６ウェル微量定量プレートのウェル中で合することにより、試料を調製した。
溶菌溶液は０．１８７５Ｍ水酸化ナトリウムであった。二つの型の溶菌溶液を調製した。一方は水酸化ナトリウムのみを含有し、他方はＢ型肝炎ウイルスゲノムを含むプラスミドベクター２４ｆｍｏｌをも含有させた。これらの溶液を３０分間煮沸した。得られた溶菌液を、プレートのウェルに分注する前にＡｃｒｏｄｉｓｋ ０．４５μｌｍシリンジフィルターで濾過した。
【００８７】
プローブ溶液において、架橋剤プローブ（第１表：プローブ１、３、５または７）の濃度は５４．９ｎＭ、反応体プローブ（第１表：プローブ２、４、６または８）の濃度は１３７．４ｎＭであった。プローブ溶液はさらに０．０１２％牛血清アルブミン、１．８１５Ｍ塩化ナトリウム、およびｐＨ指示薬として０．００１％フェノールレッドを含有していた。
中和溶液は０．１５Ｍクエン酸、０．３１Ｍ燐酸二水素ナトリウム、１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．４２％Ｔｗｅｅｎ２０および３５％ホルムアミドであった。
【００８８】
全ての試薬を合した後、プレートを４０℃で１５分間インキュベートし、次いで、４０℃のインキュベーション温度を維持しつつ、１．５ｍｍ Ｐｙｒｅｘフィルターを通して５個１列の８Ｗ電球（Ｆ８Ｔ５／３５０ＢＬ、Ｓｙｌｖａｎｉａ）により３００−３７０ｎｍで３０分間光照射した。  各ウェルにストレプトアビジン被覆した常磁性ビーズ（７５ｇ、Ｄｙｎａｌ Ｍ２８０）を加え、室温で３０分間インキュベートした。
以下の洗浄工程の各々では、まず微量定量プレートを磁性板上に置いて常磁性ビーズをペレット状に集め、吸引により液体を除去し、そしてウェルに新たな溶液を加え、工程中の常磁性ビーズを再懸濁した。
【００８９】
最初に試料を１００μｌのＷａｓｈ Ｉ（５０ｍＭ水酸化ナトリウムおよび０．１％ドデシル硫酸ナトリウム）で洗浄した。次にこの試料を２００μｌのＷａｓｈ ＩＩ（１Ｘ ＳＳＣおよび１％Ｔｗｅｅｎ２０）で１回洗浄した。
次いで試料を異なる組み合わせの制限酵素による２回のインキュベーションと抗体コンジュゲート処理に付した。使用した組み合わせは第２表に要約する。全ての例において同じ緩衝液を使用し、制限酵素、モノコッカスヌクレアーゼ、および抗体コンジュゲート、抗フルオレセイン／アルカリホスファターゼを、インキュベーションにおいて除くか、別個に含有させるか、または一諸に含有させた。
【００９０】
緩衝液は０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１１２５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｘ ＳＳＣ、１．０ｍＭ塩化マグネシウム、１．０ｍＭ塩化カルシウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および０．２５％牛血清アルブミンであった。ミクロコッカスヌクレアーゼの量は１単位であった。抗フルオレセイン／アルカリホスファターゼは１／２００００希釈で使用した。
第一のインキュベーションでは、適当な緩衝液５０μｌをウェルに加え、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで試料をＷａｓｈ ＩＩ ２２０μｌで２回洗浄した。次に第二のインキュベーションでは、適当な緩衝液やはり５０μｌをウェルに加え、３７℃で３０分間インキュベートした。
次いで試料をＷａｓｈ ＩＩ ２２０μｌで４回洗浄した。最後に洗浄溶液をＡｔｔｏｐｈｏｓ（登録商標）１００μｌに交換した。この基質を３７℃で１時間インキュベートし、プレート読み取り蛍光光度計（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で蛍光シグナルを測定した。
【００９１】
Ｉ．  １つのプローブを検出可能部分で標識し、以下の検出法を使用：
１．  蛍光偏光分光法による均質な検出。
２．  質量分析（ＭＡＬＤＩ、ＴＯＦ、エレクトロスプレーなど）。
３．  質量または電荷によって生成物を分離し（即ち、クロマトグラフィーまたは電気泳動）、その後蛍光検出、質量分析、触媒反応を受けたリポーターの析出など。
【００９２】
ＩＩ． 各プローブを相互作用する対の一員で標識し、以下の検出法を使用：
１．  蛍光共鳴エネルギー転移。
２．  ＬＯＣＩ法。
【００９３】
ＩＩＩ．  一方のプローブを検出可能部分で、そして他方のプローブを捕捉可能部分で標識し、以下の検出法を使用：
１．  捕捉基は例えばビオチン、抗原、またはレセプター基質であってよく、これらはそれぞれ、例えばアビジンもしくはストレプトアビジン、抗体、またはレセプターを含有する固体支持体上への生成物の結合をもたらす。検出可能部分は直接検出可能、例えば発蛍光団、ラジオアイソトープ、または直接酵素標識（例えば、プローブに直接コンジュゲートした酵素）であってよく、または間接的に検出可能、例えば、酵素の基質を検出可能生成物に変換する酵素−抗体コンジュゲートが後に結合する、抗原であってもよい。
【００９４】
プローブ対：
２個のプローブがプローブ対を構成する。第１表（上記）では、以下の対合が４個のプローブ対を構成する：（１、２）、（３、４）、（５、６）、および（７、８）。
プローブ対は、２個のプローブが標的の隣接領域にハイブリダイズし、その際、三アーム連結点を含むプローブ−プローブ分枝またはステムが形成されるように設計した。三アーム連結点を持つプローブ−プローブ対またはステムにおいては、一方のプローブが架橋化合物とビオチン標識を有し、他方のプローブは、チミジン塩基（架橋化合物のための反応体）、最後のチミジンとテトラエチレングリコールスペーサー単位の間のホスホロチオアート結合、およびフルオレセイン部分で構成されている。
【００９５】
それぞれのプローブ対を各々標的ＤＮＡの存在下または不在下で、三つの方法で試験した。
（１）  酵素消化無し。
（２）  酵素消化と消化後の抗体結合。
（３）  酵素消化と消化中の抗体結合。
下の第２表および第３表にプローブを試験した条件を示す。
【００９６】
【表２】
2004501615.tif 000006
【００９７】
【表３】
2004501615.tif 000007
【００９８】
四つのプローブ対全てについて類似の結果が観察された。負の試料由来の非特異的シグナルは減少し（対照Ａに比したＣおよびＥ）、標的特異的シグナルは、プローブを分解するために処理した試料において、より大きかった（対照Ｂに比したＤおよびＦ）。
標的ＤＮＡの不在下で観察されたシグナル（条件Ａ、Ｃ、Ｅ）に比して、制限エンドヌクレアーゼで処理した試料（Ｃ、Ｅ）は、共により低く且つより均一なシグナルを生成した（Ｃ：平均：３１．２５；％ＣＶ：１７．８；Ｅ：平均：２９．７５；％ＣＶ：１４．１）。対照的に、非処理試料のシグナルはより高く且つかなり変動していた（平均：８５．７５；％ＣＶ：４２．４）。試料の酵素的分解は、負の試料でより低い非特異（「バックグラウンド」）シグナルを生成した。
【００９９】
標的ＤＮＡの存在下で観察されたシグナル（条件Ｂ、Ｄ、Ｆ）に比して、制限エンドヌクレアーゼで処理した試料は、非処理試料から得たシグナルよりも５０−３００％大きなシグナルを生成した。この、より大きなシグナルは、酵素的分解プロセスの結果、検出可能生成物のサイズと電荷に著名な低下が起こり、したがって、抗体コンジュゲートにとってより好ましい結合相手と、検出可能な蛍光産物を生成するその後の酵素反応にとってより好ましい環境とを提供したためであると仮定できる。
【０１００】
本明細書で言及する特許および刊行物は全て引用により本出願の一部とする。
本発明の様々な修飾および変形は、本発明の範囲および精神から乖離することなく当業者にとって自明であろう。本発明を特定の好ましい態様に関連して記載してきたが、特許請求した本発明は、係る特定の態様に不当に限定されるべきでない事を理解せねばならない。事実、本発明を実施するために記載した様式の、当業者にとって自明な種々の修飾は、以下の請求項の範囲内にあることを意図している。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004501615.tif 000054
【国際調査報告】
2004501615.tif 000055
2004501615.tif 000056