(57)【要約】Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの公開されたゲノムは、１０００を超える推定コードタンパク質を開示するが、それ自体は、これらのうちのタンパク質が、免疫化およびワクチン接種または診断のための抗原として有用であり得ることを示すのではない。この困難性は、本発明によって取り組まれ、本発明は、ワクチンの産生および開発ならびに／または診断目的に適切な多数のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのタンパク質配列を提供する。
2004502415.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
【数１】
2004502415.tif 000423
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質に５０％以上の配列同一性を有する、タンパク質。
【請求項３】
以下：
【数２】
2004502415.tif 000424
からなる群より選択されるアミノ酸配列のフラグメントを含む、タンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする、核酸分子。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸分子であって、以下：
【数３】
2004502415.tif 000425
2004502415.tif 000426
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項６】
以下：
【数４】
2004502415.tif 000427
からなる群より選択されるヌクレオチド配列のフラグメントを含む、核酸分子。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項に記載の核酸分子に相補的なヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか１項に記載の核酸分子に５０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項９】
請求項４〜８のいずれか１項に記載の分子に、高ストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズし得る、核酸分子。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のタンパク質または核酸分子を含む、組成物。
【請求項１１】
ワクチン組成物である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
医薬品としての使用のための、請求項１０または請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
Ｃｈａｌｍｙｄｉａ細菌、特にＣｈｌａｍｙｄｉａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに起因する感染を処置または予防するための医薬の製造における、請求項１０に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本明細書中に援用される全ての書類は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、クラミジア感染、特に、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる感染に対する免疫化の分野に存在する。
【０００３】
（背景技術）
Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅは、地域性の性感染症および種々の他の疾患症候群に寄与する真核生物細胞の偏性細胞内寄生生物である。これらは、排他的な真正細菌の分科を占め、他のいずれの既知の生物に対しても密接な関係を有さず、これらは、単一のファミリー（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ）を含むこれら独自の目（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌｅｓ）に分類され、次いで単一の属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）を含む。Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅは、これらの固有の生活環が特に特徴的であり、この生活環において、細菌は、２つの形態学的に別々の形態：細胞外感染性形態（基本小体、ＥＢ）と細胞内非感染性形態（網状体（Ｒｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ　ｂｏｄｉｅｓ）、ＲＢ）との間で交替する。この生活環は、ＲＢのＥＢへの再編成で完了し、ＥＢは、引き続き、分裂した宿主細胞がさらなる細胞を感染する準備をさせておく。
【０００４】
４つのクラミジア種（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃ．ｐｅｃｏｒｕｍおよびＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉ）が現在知られている［例えば、Ｒａｕｌｓｔｏｎ（１９９５）Ｍｏｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　１５：６０７−６１６；Ｅｖｅｒｅｔｔ（２０００）Ｖｅｔ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　７５：１０９−１２６］。Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、各種由来の少なくとも２つの単離体の全体のゲノム比較が示すように、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに密接に関連している［Ｋａｌｍａｎら、（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２１：３８５−３８９；Ｒｅａｄら、（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　２８：１３９７−４０６；Ｓｔｅｐｈｅｎｓら、（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８２：７５４−７５９］。患者の免疫血清を用いる表面反応に基づいて、現在の見解は、世界的に唯一のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの血清型が存在するというものである。
【０００５】
Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、ヒト呼吸器疾患の一般的な原因である。これは、１９６５年に台湾で子供の結膜から最初に単離され、そして１９８３年に主要な呼吸器の病原体として樹立された。米国において、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、約１０％の地域感染型肺炎および５％の咽頭炎、気管支炎、および副鼻腔炎の原因となる。
【０００６】
より最近では、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染の範囲は、関節硬化症、冠状動脈性心臓病、頸動脈狭窄、心臓梗塞、心血管疾患、大動脈瘤、跛行、および発作を含むように広がっている。Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの関節硬化症との関連は、動脈系全体にわたる関節硬化症の病変における生物体の存在、および健康な動脈組織における生物体の非存在と相関する。Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅはまた、冠状動脈および頸動脈のアテローム性プラークから単離された。この細菌はまた、血清疫学的観察、症例報告、試料中の生物体の単離または直接的検出、および抗クラミジア抗生物質に対する首尾良い応答の結果として、他の急性呼吸器疾患および慢性呼吸器疾患（例えば、中耳炎、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症の肺増悪）に関連している。慢性的な感染が、疾患の開始または進行において役割を果たしているか否かを決定するために、ヒトにおける介入研究を開始し、そしてＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染の動物モデルを開発した。
【０００７】
Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染の疫学のかなりの知見は、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的微量免疫蛍光試験を使用する血清学的研究に由来する。感染は、遍在性であり、そして実質上すべてのヒトが、生活のある時点で感染している（一般的な再感染を有する）ことが推定されている。Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する抗体は、途上国および熱帯諸国を除いて、５歳未満の子供においてまれである。抗体の普及は、５〜１４歳で迅速に増加し、２０歳で５０％に達し、そして７０歳までに約８０％までゆっくりと増加し続ける。
【０００８】
Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、ヒト集団の非常に大部分の無症候性軽度感染において持続し得るという現在の仮説が、存在する。この状態が生じる際、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの存在、および／または細菌に対する宿主反応の効果が、心血管の病気の進行を引き起こし得るかまたは補助し得ると考えられる。
【０００９】
Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが実際に心血管病の原因物質であるか否か、またはＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが単に人為的に心血管病に関連しているか否かは、まだ明らかではない。しかし、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染は、ヒト単球によるＬＤＬ酸化を誘導し得ることが示されている［Ｋａｋａｙｏｇｌｕら、（１９９９）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８０：７８０−９０；Ｋａｌａｙｏｇｌｕら、（１９９９）Ａｍ．Ｈｅａｒｔ　Ｊ．１３８：Ｓ４８８−４９０］。ＬＤＬ酸化産物が高度にアテローム生成的であるので、この観察は、可能性のある機構を提供し、これにより、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、アテローム性の分解を引き起こし得る。原因である影響が確認されると、ワクチン接種（予防的および治療的）は、普遍的に推奨される。
【００１０】
ゲノム配列情報は、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅについて公開されており［Ｋａｌｍａｎら、（１９９９）前出；Ｒｅａｄら、（２０００）前出；Ｓｈｉｒａｉら、（２０００）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８１（補遺３）：Ｓ５２４−Ｓ５２７；ＷＯ９９／２７１０５；ＷＯ００／２７９９４］、そしてＧｅｎＢａｎｋより入手可能である。しかし、配列決定の努力は、ワクチン接種に集中しておらず、そしてゲノム配列の利用可能性は、それ自体、１０００を超える遺伝子が、免疫化およびワクチン接種に有用な抗原をコードし得ることを示していない。例えば、ＷＯ９９／２７１０５は、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株ＣＭ１ゲノムにおいて同定された１２９６のＯＲＦのあらゆるＯＲＦが、有用なワクチン抗原であることを示す。
【００１１】
従って、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ中に存在する多数のタンパク質の中からワクチンの産生および開発に有用な抗原を同定することが、本発明の目的である。Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの診断（例えば、免疫診断）に有用な抗原を同定することは、さらなる目的である。
【００１２】
（発明の開示）
本発明は、実施例において開示されるＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。
【００１３】
本発明はまた、実施例において開示されるＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅアミノ酸配列と少なくともｘ％配列同一性を共有する配列を含むタンパク質を提供する。特定の配列に依存して、ｘは、好ましくは、５０％以上（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）である。これらは、変異体および対立遺伝子改変体を含む。代表的には、２つのタンパク質間の５０％以上の同一性は、機能的同等性の指標であると考えられる。タンパク質間の同一性は、好ましくは、パラメーターのギャップオープンペナルティー＝１２およびギャップ伸長ペナルティー＝１を用いるアフィンギャップ検索を使用して、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において実行されるように、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。
【００１４】
本発明は、実施例において開示されるＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅアミノ酸配列のフラグメントを含むタンパク質をさらに提供する。これらのフラグメントは、配列から少なくともｎ連続するアミノ酸を含むはずであり、そして特定の配列に依存して、ｎは、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、７５、１００以上）である。好ましくは、これらのフラグメントは、配列から１つ以上のエピトープを含む。他の好ましいフラグメントは、シグナルペプチドを省略する。
【００１５】
本発明のタンパク質は、もちろん、種々の手段（例えば、ネイティブな発現、組換え発現、細胞培養物からの精製、化学合成など）によってそして種々の形態（例えば、ネイティブ、融合物など）で調製され得る。これらは、好ましくは、実質的に純粋な形態（すなわち、他のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたは宿主細胞タンパク質を実質的に含まない）で調製される。Ｅ．ｃｏｌｉにおける異種発現は、好ましい調製用経路である。
【００１６】
さらなる局面に従って、本発明は、実施例において開示されるＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。さらに、本発明は、実施例において開示されるＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅヌクレオチド配列と少なくともｘ％配列同一性を共有する配列を含む核酸を提供する。特定の配列に依存して、ｘは、５０％以上（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）である。
【００１７】
さらに、本発明は、実施例において開示されるＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ核酸に、好ましくは、「高ストリンジェンシー」条件下（例えば、０．１×ＳＳＣ、０．５％　ＳＤＳ溶液中６５℃）でハイブリダイズし得る核酸を提供する。
【００１８】
これらの配列のフラグメントを含む核酸もまた提供される。これらは、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ配列から少なくともｎ連続するヌクレオチドを含むべきであり、そして特定の配列に依存して、ｎは、１０以上（例えば、１２、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、２００、３００以上）である。
【００１９】
さらなる局面に従って、本発明は、本発明のタンパク質およびタンパク質フラグメントをコードする核酸を提供する。
【００２０】
本発明が上記の配列に相補的な配列を含む核酸を提供すること（例えば、アンチセンスまたはプローブ化目的のために）もまた、理解されるべきである。
【００２１】
本発明に従う核酸は、もちろん、多数の方法で（例えば、化学合成によって、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、生物体自体からなど）調製され得、そして種々の形態（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プローブなど）を取り得る。
【００２２】
さらに、用語「核酸」としては、ＤＮＡおよびＲＮＡ、そしてまたこれらのアナログ（例えば、改変された骨格を含むもの）、そしてまたペプチド核酸（ＰＮＡ）などが挙げられる。
【００２３】
さらなる局面に従って、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）およびそれで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００２４】
さらなる局面に従って、本発明は、本発明に従うタンパク質および／または核酸を含む免疫原性組成物を提供する。これらの組成物は、免疫化およびワクチン接種の目的に適している。本発明のワクチンは、予防的または治療的であり得、そして代表的に、（ａ）クラミジア付着、（ｂ）クラミジア侵入、および／または（ｃ）宿主細胞内での首尾良い複製を阻害し得る抗体を誘導し得る抗原を含む。これらのワクチンは、好ましくは、宿主からのクラミジアクリアランスに必要である任意の細胞媒介性Ｔ細胞応答を誘導する。
【００２５】
本発明はまた、医薬としての（例えば、ワクチンとしての）使用のための本発明に従う核酸およびタンパク質を提供する。本発明はまた、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに起因する感染を処置または予防するための医薬（例えば、ワクチンまたは免疫原性組成物）の製造における本発明に従う核酸またはタンパク質の使用を提供する。
【００２６】
本発明はまた、患者を処置（例えば、免疫化）する方法を提供し、この方法は、本発明に従う治療的に有効な量の核酸またはタンパク質を患者に投与する工程を包含する。
【００２７】
さらなる局面に従って、本発明は、種々のプロセスを提供する。
【００２８】
本発明のタンパク質を産生するプロセスが提供され、このプロセスは、タンパク質発現を誘導する条件下で、本発明に従う宿主細胞を培養する工程を包含する。
【００２９】
本発明のタンパク質または核酸を生成するプロセスが提供され、ここで、このタンパク質または核酸は、化学的手段を一部または全体的に使用して合成される。
【００３０】
サンプル中のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを検出するためのプロセスが提供され、ここで、このサンプルは、本発明のタンパク質に結合する抗体と接触される。
【００３１】
本発明を実行するために（例えば、免疫化について開示される配列を利用するために）使用され得る標準的な技術および手順の要約は、以下の通りである。この要約は、本発明を制限するのではなく、必要とされないが、使用され得る実施例を示す。
【００３２】
（一般）
本発明の実施は、他に示されなければ、当該分野の技術の範囲内である、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は以下の文献で十分説明されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　第２版（１９８９）および第３版（２００１）；ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ　Ｉ　ａｎｄ　ｉｉ（Ｄ．Ｎ　Ｇｌｏｖｅｒ編　１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編　１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編　１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編　１９８４）；Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編　１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｓｅｒｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），特に１５４および１５５巻；Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編１９８７，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ，編（１９８７），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｓｃｏｐｅｓ，（１９８７）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第２版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．）、およびＨａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ　Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編　１９８６）。
【００３３】
ヌクレオチドおよびアミノ酸についての標準的な省略が、本明細書において使用される。
【００３４】
（定義）
Ｘを含む組成物は、組成物中の全Ｘ＋Ｙの少なくとも８５重量％がＸであるとき、Ｙを「実質的に含まない」。好ましくは、Ｘは、組成物中の全Ｘ＋Ｙの少なくとも９０重量％を、さらに好ましくは少なくとも約９５重量％または９９重量％さえを含む。
【００３５】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる」を意味する。例えば、Ｘを「含む」組成物は、もっぱらＸからなり得るか、またはＸ＋ＹのようなＸに付加したものも含み得る。
【００３６】
用語「異種」とは、天然では共に見られない２つの生物学的成分をいう。この成分は、宿主細胞、遺伝子、調節領域（例えば、プロモーター）であり得る。異種成分は天然では共に見られないが、遺伝子に対して異種のプロモーターがその遺伝子に作動可能に連結されるときのように、それらは共に機能し得る。別の例は、クラミジア配列がマウス宿主細胞に対して異種であることである。さらなる例は、天然においてみられない配置で単一タンパク質に組み立てられる同じタンパク質または異なるタンパク質由来の２つのエピトープである。
【００３７】
「複製起点」とは、発現ベクターのような、ポリヌクレオチドの複製を開始または調節するポリヌクレオチド配列である。複製起点は、細胞内でのポリヌクレオチド複製の自律性ユニットとして振る舞い、それ自体の制御下で複製し得る。複製起点は、ベクターが特定の宿主細胞において複製するために必要であり得る。特定の複製起点を有せば、発現ベクターは、細胞内の適切なタンパク質の存在下で高いコピー数で再生され得る。起点の例は、酵母において有効な自律性複製配列；およびＣＯＳ−７細胞で有効であるウイルスＴ抗原である。
【００３８】
「変異体」配列は、天然の配列または開示された配列とは異なるが配列同一性を有するＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列またはアミノ酸配列として規定される。特定の配列に依存して、天然の配列または開示された配列と変異体配列との間の配列同一性の程度は、好ましくは５０％より大きい（例えば、上記記載のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して算出して６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上）。本明細書中で使用される場合、本明細書で核酸分子配列が提供される核酸分子、または領域の「対立遺伝子改変体」は、別のもしくは２番目の単離体のゲノム中の同じ遺伝子座で本質的に生ずる領域および、例えば、変異または組換えにより生ずる天然変化に起因して、類似するが、しかし同一でない核酸配列を有する核酸分子、または領域である。コード領域の対立遺伝子改変体は、代表的には、比較される遺伝子によってコードされるタンパク質の活性と類似した活性を有するタンパク質をコードする。対立遺伝子改変体はまた、遺伝子の５’または３’非翻訳領域（例えば、調節制御領域）での変化を含み得る（例えば、米国特許第５，７５３，２３５号）。
【００３９】
（発現系）
クラミジアヌクレオチド配列は、種々の異なる発現系；例えば、哺乳動物細胞、バキュロウイルス、植物、細菌、および酵母と共に使用される発現系において発現され得る。
【００４０】
（ｉ．哺乳動物系）
哺乳動物発現系は当該分野において公知である。哺乳動物プロモーターは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼを結合し、コード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、転写開始領域（これはコード配列の５’末端の近位に通常位置する）およびＴＡＴＡボックス（転写開始部位の２５〜３０塩基対（ｂｐ）上流に通常位置する）を有する。ＴＡＴＡボックスは、その正しい部位においてＲＮＡポリメラーゼＩＩにＲＮＡ合成を開始させるよう指示すると考えられている。哺乳動物プロモーターはまた、ＴＡＴＡボックスの１００〜２００ｂｐ上流以内に通常位置する上流プロモーターエレメントを含む。上流プロモーターエレメントは、転写が開始され、そしていずれかの方向において作用し得る速度を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｌｏｎｅｄ　Ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅｌｌｓ」　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版）。
【００４１】
哺乳動物ウイルス遺伝子は、しばしば高度に発現され、そして広い宿主範囲を有する；従って、哺乳動物ウイルス遺伝子をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例は、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ　ＭＬＰ）、および単純疱疹ウイルスプロモーターを含む。さらに、マウスのメタロチオネイン遺伝子のような非ウイルス性遺伝子に由来する配列もまた、有用なプロモーター配列を提供する。発現は、構成性であるかまたは調節される（誘導可能）かのいずれかであり得る、プロモーターに依存して、ホルモン応答性細胞においてグルココルチコイドで誘導され得る。
【００４２】
上記に記載されるプロモーターエレメントと組み合わされるエンハンサーエレメント（エンハンサー）の存在は、通常発現レベルを増大させる。エンハンサーは、相同性プロモーターまたは異種プロモーターに連結されるとき、転写を１０００倍まで刺激し得る調節ＤＮＡ配列であり、合成は、通常のＲＮＡ開始部位で開始する。エンハンサーはまた、それらが、通常方向もしくは反対（ｆｌｉｐｐｅｄ）方向のいずれかで転写開始部位より上流または下流に、もしくはプロモーターから１０００ヌクレオチドを超える距離に位置するとき、活性である（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８７）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３６：１２３７；Ａｌｂｅｒｔｓら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅｌｌ，第２版）。ウイルス由来のエンハンサーエレメントは、それらは通常、より広い宿主範囲を有するため、特に有用であり得る。例は、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊｋｅｍａら（１９８５）ＥＭＢＯ　Ｊ．４：７６１）およびラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）に由来するエンハンサー／プロモーター（Ｇｏｒｍａｎら（１９８２）ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　７９：６７７７）およびヒトサイトメガウイルスに由来するエンハンサー／プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ　４１：５２１）を包含する。さらに、いくつかのエンハンサーは調節可能であり、そしてホルモンまたは金属イオンのような誘導因子の存在下のみで活性になる（Ｓａｓｓｏｎｅ−ＣｏｒｓｉおよびＢｏｒｅｌｌｉ（１９８６）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ．２：２１５；Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３６：１２３７）。
【００４３】
ＤＮＡ分子は、哺乳動物細胞において細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、組換えタンパク質のＮ末端における最初のアミノ酸が常にＡＴＧ開始コドンによりコードされるメチオニンである場合、ＤＮＡ分子と直接連結され得る。所望される場合、Ｎ末端は、臭化シアンとのインビトロでのインキュベーションによりタンパク質から切断され得る。
【００４４】
あるいは、外来タンパク質もまた、哺乳動物細胞において外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントで構成される融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することにより、細胞から成長培地へ分泌され得る。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて切断され得る、リーダーフラグメントおよび外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは通常、細胞からのタンパク質の分泌を指示する疎水性アミノ酸で構成される単一のペプチドをコードする。アデノウイルス３部分からなるリーダーは、哺乳動物細胞における外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列の例である。
【００４５】
通常、哺乳類細胞によって認識される転写終結配列およびポリアデニル化配列は、翻訳終止コドンの３’側に存在する調節領域であり、従って、プロモーターエレメントと共に、コード配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特異的転写後切断およびポリアデニル化により形成される（Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌら（１９８５）Ｃｅｌｌ　４１：３４９；ＰｒｏｕｄｆｏｏｔおよびＷｈｉｔｅｌａｗ（１９８８）「Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ａｎｄ　３’ｅｎｄ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｏｆ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ＲＮＡ．」Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｐｌｉｃｉｎｇ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９８９）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１４：１０５）。これらの配列は、ｍＲＮＡの転写を方向づけ、そのｍＲＮＡは、そのＤＮＡにコードされるポリペプチドに翻訳され得る。転写終結／ポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０由来のシグナルが挙げられる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｌｏｎｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ．」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）。
【００４６】
通常、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および転写終結配列を含む上記の構成要素は、発現構築物内に共に導入される。エンハンサー、機能的なスプライス供与部位および受容部位を有するイントロン、ならびにリーダー配列もまた、所望される場合、発現構築物内に含まれ得る。発現構築物はしばしば、哺乳類細胞または細菌のような宿主内で安定的に維持し得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコン内で維持される。哺乳類の複製系としては、複製にトランス作用性の因子を必要とする、動物ウイルス由来の複製系が挙げられる。例えば、ＳＶ４０（Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１）Ｃｅｌｌ　２３：１７５）、あるいはポリオーマウイルスのようなパポバウイルスの複製系を含むプラスミドは、適切なウイルスのＴ抗原の存在下で極めて高いコピー数で複製する。哺乳類レプリコンの別の例としては、ウシパピローマウイルスおよびエプスタイン−バーウイルス由来のレプリコンが挙げられる。さらに、このレプリコンは、二つの複製系を有し得、従って、例えば、発現用の哺乳類細胞内で、ならびにクローニングおよび増幅用の原核生物の宿主内で、そのレプリコンを維持することが可能である。このような哺乳類−細菌シャトルベクターの例としては、ｐＭＴ２（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：９４６）およびｐＨＥＢＯ（Ｓｈｉｍｉｚｕら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１０７４）が挙げられる。
【００４７】
使用される形質転換の手順は、形質転換される宿主に依存する。異種のポリヌクレオチドの哺乳類細胞への導入方法は、当該分野で公知であり、その方法としては、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内でのポリヌクレオチドの封入、およびＤＮＡの核内への直接微量注入が挙げられる。
【００４８】
発現用宿主として利用可能な哺乳類細胞株は、当該分野で公知であり、そのような細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、乳仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ　Ｇ２）および多くの他の細胞株を含むが、これらに限定しない、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が含まれる。
【００４９】
（ｉｉ　バキュロウイルス系）
タンパク質をコードしているポリヌクレオチドはまた、適切な昆虫の発現ベクター内に挿入され得、そしてそのベクター内で、制御エレメントに作動可能に連結される。ベクターの構築には、当該分野で公知の技術を使用する。一般に、その発現系の構成要素として、以下のものが挙げられる：バキュロウイルスゲノムのフラグメント、および発現させる異種遺伝子の挿入用の簡便な制限部位の両方を有する転移ベクター（通常は細菌ベクター）；転移ベクター内のバキュロウイルスに特異的なフラグメントに相同性のある配列を有する野生型バキュロウイルス（これは、バキュロウイルスゲノム内への異種遺伝子の相同組換えを可能にする）；ならびに適切な昆虫宿主細胞および成長培地。
【００５０】
転移ベクターにタンパク質をコードするＤＮＡ配列を挿入した後、そのベクターおよび野生型ウイルスゲノムを、昆虫宿主細胞にトランスフェクトし、そこでベクターとウイルスゲノムを組換え可能にする。パッケージングされた組換えウイルスは発現され、そして組換えプラークが同定されそして精製される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系の材料および方法は、特に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ　ＣＡからキット形態（「ＭａｘＢａｃ」キット）で市販される。これらの技術は、一般に当業者に公知であり、そしてＳｕｍｍｅｒｓならびにＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　Ｓｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ．１５５５（１９８７）（以下、「Ｓｕｍｍｅｒｓ　ａｎｄ　Ｓｍｉｔｈ」）に十分に記載されている。
【００５１】
タンパク質をコードするＤＮＡ配列をバキュロウイルスゲノムに挿入するのに先立って、プロモーター配列、リーダー配列（所望される場合は）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む上記の構成要素を、通常、中間転移構築物（転移ベクター）に構築する。この構築物は、単一の遺伝子および作動可能に連結された調節エレメント；操作可能に連結された調節エレメントのセットを各々が所有する複数の遺伝子；あるいは同じ調節エレメントのセットにより調節される複数の遺伝子を含み得る。中間転移構築物は、しばしば、細菌のような宿主内で安定的に維持し得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコン内で維持される。レプリコンは、複製系を有しており、従って、それはクローニングおよび増幅に適切な宿主内で維持され得る。
【００５２】
現在、外来遺伝子のＡｃＮＰＶへの導入のために最も一般に使用される転移ベクターは、ｐＡｃ３７３である。当業者に公知の多くの他のベクターもまた設計され、これらのものとして、例えば、ｐＶＬ９８５（ポリへドリンの開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに変化させ、そしてそのＡＴＴから３２塩基対下流に、ＢａｍＨＩクローニング部位を導入する；ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７：３１）が挙げられる。
【００５３】
そのプラスミドも通常、ポリへドリンポリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４２：１７７）、および原核生物のアンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子、および大腸菌においての選抜ならびに増殖のための複製起点を有する。
【００５４】
バキュロウイルス転移ベクターは通常、バキュロウイルスプロモーターを有する。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスＲＮＡポリメラーゼに結合し、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（５’から３’）方向の転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して存在する転写開始領域を有している。この転写開始領域は通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始点を含む。バキュロウイルス転移ベクターは、またエンハンサーと呼ばれる第二のドメインを有し得、存在する場合は、通常、構造遺伝子に対し遠位にある。発現は調節され得るか、あるいは構成的であり得る。
【００５５】
ウイルスの感染周期の後期で大量に転写される構造遺伝子は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ウイルス多面体タンパク質をコードする遺伝子（Ｆｒｉｅｓｅｎら（１９８６）「Ｔｈｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，」：Ｔｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｗａｌｔｅｒ　Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編）；ＥＰＯ公開番号１２７８３９および１５５４７６；ならびにｐ１０タンパク質をコードする遺伝子（Ｖｌａｋら，（１９８８），Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６５）由来の配列が挙げられる。
【００５６】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌昆虫タンパク質、あるいはバキュロウイルスポリへドリン遺伝子（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら，（１９９８）Ｇｅｎｅ，７３：４０９）のような、分泌バキュロウイルスタンパク質の遺伝子から由来し得る。あるいは、哺乳類細胞の翻訳後修飾（例えば、シグナルペプチド切断、タンパク質分解性切断、およびリン酸化）のシグナルは、昆虫細胞に認識されると思われ、そして分泌および核蓄積に必要なシグナルはまた、無脊椎動物細胞および脊椎動物細胞間で保存されると思われるので、ヒトインターフェロンα（Ｍａｅｄａら，（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ　３１５：５９２）；ヒトガストリン放出ペプチド（Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら，（１９８８），Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３１２９）；ヒトＩＬ−２（Ｓｍｉｔｈら，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：８４０４）；マウスＩＬ−３（Ｍｉｙａｊｉｍａら，（１９８７）Ｇｅｎｅ　５８：２７３）；およびヒトグルコセレブロシダーゼ（Ｍａｒｔｉｎら，（１９８８）ＤＮＡ、７：９９）をコードする遺伝子由来のような、非昆虫起源のリーダーも、昆虫での分泌を与えるために使用され得る。
【００５７】
組換えポリペプチドあるいは組換えポリタンパク質は、細胞内に発現され得、あるいは適切な調節配列と共に発現される場合、分泌され得る。非融合の外来タンパク質の優れた細胞内発現には通常、ＡＴＧ開始シグナルに先行する適切な翻訳開始シグナルを含む短いリーダー配列を理想的には有する異種遺伝子が必要である。所望であれば、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションにより、成熟タンパク質から切断され得る。
【００５８】
あるいは、自然に分泌されない組換えポリタンパク質あるいは組換えタンパク質は、昆虫において外来タンパク質の分泌を与えるリーダー配列フラグメントを含む、融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作成することにより、昆虫細胞から分泌され得る。リーダー配列フラグメントは通常、タンパク質の小胞体内への輸送を指示する疎水性アミノ酸からなるシグナルペプチドをコードしている。
【００５９】
タンパク質の前駆体である発現産物をコードするＤＮＡ配列および／または遺伝子の挿入後、昆虫細胞宿主に、転移ベクターの異種ＤＮＡおよび野生型バキュロウイルスのゲノムＤＮＡを同時形質転換（通常は、同時トランスフェクションによって）する。構築物のプロモーターおよび転写終結配列は、通常バキュロウイルスゲノムの２〜５ｋｂの区域を含む。バキュロウイルスウイルスの望ましい部位に異種ＤＮＡを導入する方法は、当該分野で公知である（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、上記；Ｊｕら（１９８７）；Ｓｍｉｔｈら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８３）３：２１５６；ならびにＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）を参照のこと）。例えば、その挿入物は、相同二重交差組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｄｏｕｂｌｅ　ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）により、ポリへドリン遺伝子のような遺伝子内にあり得る；挿入物はまた、所望のバキュロウイルス遺伝子に設計された制限酵素部位内にあり得る。Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ　４；９１。発現ベクター内のポリへドリン遺伝子の代わりにクローン化される場合のＤＮＡ配列は、ポリへドリン特異的配列により５’および３’の両側で隣接され、そしてポリへドリンプロモーターの下流に位置される。
【００６０】
新規に形成されたバキュロウイルス発現ベクターは続いて、感染性の組換えバキュロウイルス内にパッケージされる。相同組換えは、低い頻度で起こる（約１％〜約５％の間）；それゆえ、同時トランスフェクション後に産生されたウイルスの大半は、依然野生型ウイルスである。従って、方法には、組換えウイルスの同定が必要となる。その発現系の利点は、組換えウイルスを区別させ得る可視的スクリーニングである。天然のウイルスにより産生されるポリへドリンタンパク質は、ウイルス感染後の後期で、その感染された細胞の核内で非常に高いレベルで産生される。蓄積されたポリへドリンタンパク質は、閉塞体を形成し、またそれは包理された粒子を含む。これらの閉塞体は、最大１５μｍの大きさで、高度に屈折し、明るく輝く外見を与え、容易に光学顕微鏡下で可視化される。組換えウイルスに感染された細胞は、閉塞体を欠く。組換えウイルスと野生型ウイルスを区別するために、トランスフェクションの上清を、当業者に公知の技術により昆虫細胞の単層にプラーク形成させた。すなわち、プラークを、光学顕微鏡下で閉塞体の存在（野性型ウイルスを示す）または非存在（組換えウイルスを示す）によりスクリーニングする。「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」２巻（Ａｕｓｕｂｅｌら編）１６．８（増補１０、１９９０）；ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、上記；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）。
【００６１】
組換えバキュロウイルス発現ベクターは、いくらかの昆虫細胞への感染用に開発された。例えば、組換えバキュロウイルスは、特に以下に示すもののために開発された：Ａｅｄｅｓ　ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ（ＷＯ８９／０４６６９９；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら，（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６：１５３；Ｗｒｉｇｈｔ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ　３２１：７１８；Ｓｍｉｔｈら，（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６；およびＦｒａｓｅｒら，（１９８９）Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５：２２５を一般に参照のこと）。
【００６２】
細胞および細胞培養培地は、バキュロウイルス／発現系における異種ポリペプチドの直接発現および融合発現の両方のために市販される；細胞培養技術は、一般に当業者に公知である。例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（上記）を参照のこと。
【００６３】
次いで、改変した昆虫細胞を、適切な栄養培地で増殖し、その改変した昆虫宿主内で存在するプラスミドの安定的維持を可能にする。発現産物の遺伝子が、誘導性の制御下にある場合、宿主は高密度で増殖され得、そして発現は誘導され得る。あるいは、発現が構成的である場合、その産物は培地中に連続的に発現され、そして栄養培地を連続的に循環し、目的産物を取り出し、そして枯渇した栄養を補給する必要がある。その産物は、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）；電気泳動；密度勾配遠心；溶媒抽出などのような技術により精製し得る。適切には、その産物をさらに精製し、必要ならば、培地中に分泌された、または昆虫細胞の溶解から生じた任意の昆虫タンパク質を実質的に除去し、宿主細片（例えば、タンパク質、脂質および多糖類）を少なくとも実質的に含まない産物を供給する。
【００６４】
タンパク質の発現を得るために、形質転換体に由来する組換え宿主細胞は、組換えタンパク質をコードする配列の発現を可能にする条件下でインキュベートされる。これらの条件は、選択された宿主細胞に依存して変動する。しかし、その条件は、当該分野で公知の条件に基づいて、当業者に容易に確かめられる。
【００６５】
（ｉｉｉ　植物系）
当該分野で公知の多くの植物細胞培養および全植物遺伝子発現系が存在する。例示的な植物細胞遺伝子発現系としては、米国特許第５，６９３，５０６号；米国特許第５，６５９，１２２号；米国特許第５，６０８，１４３号のような特許に記載されるものが挙げられる。植物細胞培養における遺伝子発現の別の例は、Ｚｅｎｋ，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３０：３８６１−３８６３（１９９１）に記載された。植物タンパク質のシグナルペプチドの記載は、上記の参考文献に加え、以下に示すものの中においても確認される；Ｖａｕｌｃｏｍｂｅら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０９：３３−４０（１９８７）；Ｃｈａｎｄｌｅｒら，Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　３：４０７−４１８（１９８４）；Ｒｏｇｅｒｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３７３１−３７３８（１９８５）；Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎら，Ｇｅｎｅ　５５：３５３−３５６（１９８７）；Ｗｈｉｔｔｉｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１５：２５１５−２５３５（１９８７）；Ｗｉｒｓｅｌら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　３：３−１４（１９８９）；Ｙｕら，Ｇｅｎｅ　１２２：２４７−２５３（１９９２）。植物ホルモン（ジベレリン酸およびジベレリン酸により誘導される分泌酵素）による植物遺伝子発現の調節の記載は、Ｒ．Ｌ．ＪｏｎｅｓおよびＪ．ＭａｃＭｉｌｌｉｎ，Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎｓ：Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｌｃｏｌｍ　Ｂ．Ｗｉｌｋｉｎｓ編　１９８４　Ｐｉｔｍａｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，２１−５２頁の中に確認され得る。他の代謝調節性遺伝子が記載される参考文献は以下である；Ｓｈｅｅｎ，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，２：１０２７−１０３８（１９９０）；Ｍａａｓら，ＥＭＢＯ　Ｊ．９：３４４７−３４５２（１９９０）；ＢｅｎｋｅｌおよびＨｉｃｋｅｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：１３３７−１３３９（１９８７）。
【００６６】
代表的に、当該分野で公知の技術を使用して、所望のポリヌクレオチド配列は、植物内で操作するために設計された遺伝子調節エレメントを含む発現カセットの中に挿入される。その発現カセットは、植物宿主内での発現に適切な発現カセットの上流および下流にコンパニオン配列を有する望ましい発現ベクターの中に挿入される。そのコンパニオン配列は、プラスミドまたはウイルス起源のものであり、そしてそのベクターが、細菌のような本来のクローニング宿主から、所望の植物宿主へＤＮＡを移動させるために必要とされる特徴をベクターに提供する。基本的な細菌／植物ベクター構築物は、好ましくは、広い宿主範囲の原核生物の複製起点；原核生物の選択マーカー；および、アグロバクテリウムの形質転換については、アグロバクテリウム媒介転位のためのＴ　ＤＮＡ配列を植物染色体に提供する。異種遺伝子が容易に検出に従順しない場合は、好ましくは、その構築物はまた、植物細胞が形質転換されたかどうかを決定するために適した選択マーカー遺伝子を有する。適切なマーカーの一般的な総説は、例えば、イネ科については、ＷｉｌｍｉｎｋおよびＤｏｎｓ，１９９３，Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｔｒ，１１（２）：１６５−１８５に見られる。
【００６７】
植物ゲノムへの異種配列の組み込みを可能にするために適した配列もまた、推奨される。これらは、植物ゲノム内へ異種発現カセットのランダム挿入を可能にする相同組換え用のためのトランスポゾン配列など、およびＴｉ配列を含み得る。適切な原核生物選択マーカーとしては、アンピシリンまたはテトラサイクリンのような抗生物質に対する耐性が挙げられる。別の機能をコードしている他のＤＮＡ配列もまた、そのベクターの中に存在し得、当該分野で公知である。
【００６８】
本発明の核酸分子はまた、目的のタンパク質の発現用の発現カセットに含まれ得る。２つ以上も可能であるが、通常はただ一つの発現カセットである。組換え発現カセットは、異種タンパクのコード配列に加え、以下のエレメントを含む；プロモーター領域、植物５’非翻訳配列、構造遺伝子がそれを備えているかどうかに依存して、開始コドン、ならびに転写および翻訳終結配列。そのカセットの５’および３’末端の独特な制限酵素部位は、既存のベクター内への容易な挿入を可能にする。
【００６９】
異種のコード配列は、本発明に関係する任意のタンパク質のための配列であり得る。目的のタンパクをコードする配列は、そのタンパク質の適切なプロセッシングおよび輸送を可能にするシグナルペプチドをコードし、そして通常、本発明の所望のタンパク質の膜への結合を生じ得る任意の配列を欠いている。翻訳開始領域は、大部分は、発芽中に発現および輸送される遺伝子のためのものであるから、輸送を規定するシグナルペプチドを使用することにより、それはまた、目的のタンパク質の輸送を規定し得る。この方法で、目的のタンパク質は、それらが発現される細胞から輸送され、そして効率的に回収され得る。代表的には、種子における分泌は、種子の胚乳内へ、アリューロン層あるいは胚盤上皮層を通過する。タンパク質がそれが産生された細胞から分泌される必要がない場合、このことは組換えタンパク質の分離および精製を容易にする。
【００７０】
所望の遺伝子産物の最終的な発現が、真核生物におけるものであるために、クローン化した遺伝子の任意の部分が、イントロンのように、宿主のスプライセオソーム（ｓｐｌｉｃｏｓｏｍｅ）機構より、プロセッシングされる配列を含むか否かを決定することが望ましい。そのような場合、「イントロン」領域の部位特異的変異誘発は、仮性イントロンコードとして遺伝的情報の一部を欠失することを防ぐために実施され得る。ＲｅｅｄおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｃｅｌｌ　４１：９５−１０５（１９８５）。
【００７１】
ベクターは、組換えＤＮＡを機械的に転移するためにマイクロピペットを用いて植物細胞内に直接的に微量注入され得る（Ｃｒｏｓｓｗａｙ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ，２０２：１７９−１８５、１９８５）。遺伝子物質はまた、ポリエチレングリコールを用いて植物細胞内に転移され得る（Ｋｒｅｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ，２９６、７２−７４、１９８２）。核酸部分の導入の別の方法は、小さいビーズまたは微粒子のいずれかのマトリックスの内部に、あるいは表面に核酸を有する小さな微粒子による高速バリスティック（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）穿通法である（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３２７，７０−７３，１９８７ならびにＫｎｕｄｓｅｎおよびＭｕｌｌｅｒ，１９９１，Ｐｌａｎｔａ，１８５：３３０−３３６は、大麦胚乳の粒子の照射（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）によりトランスジェニック大麦を作製することを示している）。さらに別の導入方法は、他の物体、いずれかのミニ細胞、細胞、リソソームあるいは他の易融な脂肪表面体とのプロトプラストの融合である（Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，１８５９−１８６３，１９８２）。
【００７２】
ベクターはまた、エレクトロポレーションにより植物細胞内に導入され得る（Ｆｒｏｍｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：５８２４，１９８５）。この技術において、植物プロトプラストは、遺伝子構築物を含むプラスミドの存在中でエレクトロポレート（電気穿孔）される。高い電界の強さの電気インパルス（衝撃）により、生体膜を可逆的に通過できるようにし、プラスミドの導入を可能にする。エレクトロポレートされた植物プロトプラストは細胞壁を再形成し、分裂し、植物カルス形成する。
【００７３】
プロトプラストが単離され得、そして培養されて完全な再生植物を与え得る全ての植物は、本発明により形質転換され得、これによって移入した遺伝子を保持する完全な植物が再生される。実際に、全ての植物は、さとうきび、甜菜、綿、果実および他の樹木、マメ科植物および野菜の全ての主要な種を含むがそれらに限定されない培養細胞あるいは組織から再生され得る。いくつかの適応した植物としては、例えば、以下の属由来の種が挙げられる；Ｆｒａｇａｒｉａ，Ｌｏｔｕｓ，Ｍｅｄｉｃａｇｏ，Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ，Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ，Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ，Ｖｉｇｎａ，Ｃｉｔｒｕｓ，Ｌｉｎｕｍ，Ｇｅｒａｎｉｕｍ，Ｍａｎｉｈｏｔ，Ｄａｕｃｕｓ，Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，Ｂｒａｓｓｉｃａ，Ｒａｐｈａｎｕｓ，Ｓｉｎａｐｉｓ，Ａｔｒｏｐａ，Ｃａｐｓｉｃｕｍ，Ｄａｔｕｒａ，Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ，Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａ，Ｓｏｌａｎｕｍ，Ｐｅｔｕｎｉａ，Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ，Ｍａｊｏｒａｎａ，Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ，Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ，Ｌａｃｔｕｃａ，Ｂｒｏｍｕｓ，Ａｓｐａｒａｇｕｓ，Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ，Ｈｅｒｅｒｏｃａｌｌｉｓ，Ｎｅｍｅｓｉａ，Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ，Ｐａｎｉｃｕｍ，Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ，Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ，Ｓｅｎｅｃｉｏ，Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ，Ｃｕｃｕｍｉｓ，Ｂｒｏｗａａｌｉａ，Ｇｌｙｃｉｎｅ，Ｌｏｌｉｕｍ，Ｚｅａ，Ｔｒｉｔｉｃｕｍ，Ｓｏｒｇｈｕｍ，およびＤａｔｕｒａ。
【００７４】
再生のための手法は、植物の種によって変化するが、しかし一般に異種遺伝子のコピーを含む形質転換されたプロトプラストの懸濁液が最初に提供される。カルス組織は形成され、そしてシュート（苗条）がカルスから誘導され、続いて発根される。あるいは、胚形成がプロトプラスト懸濁液から誘導され得る。これらの胚は、天然の胚として発芽し、植物を形成する。培養培地は、一般に種々のアミノ酸、ならびにオーキシンおよびサイトカイニンのようなホルモンを含有する。またグルタミン酸およびプロリンを培地に添加することは、特にコーン（穀草）およびアルファルファのような種にとって有用である。シュートおよび根は通常、同時に発生する。効果的な再生は培地、遺伝子型、および培養遍歴に依存する。これらの３つの変数が制御される場合は、再生は十分に再現性がありそして繰り返し可能である。
【００７５】
いくつかの植物細胞培養系において、本発明の所望のタンパク質は排出され、あるいはこのタンパク質は植物全体から抽出され得る。本発明の所望のタンパク質は培地内に分泌される場合、これは回収され得る。あるいは、胚および胚のない不完全な種子または他の植物組織は、機械的に破壊され細胞間および組織間の任意の分泌されたタンパク質を放出し得る。その混合物は緩衝液に懸濁され、可溶タンパクを回収し得る。次いで、慣用的なタンパク質分離および精製方法は組換えタンパク質を精製するために使用される。時間、温度、ｐＨ、酸素、および容量のパラメーターは、慣用的な方法によって、異種タンパク質の発現および回収を最適化するように調整される。
【００７６】
（ＩＶ．細菌系）
細菌の発現技術は、当該分野で公知である。細菌のプロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼに結合し得、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流方向（３’方向）へのｍＲＮＡへの転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して存在する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌のプロモーターはまた、オペレーターと呼ばれる第二のドメインを有し、ＲＮＡ合成が始まる近接のＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重複している。オペレーターは、遺伝子リプレッサータンパク質が、オペレーターに結合し、そのため特定の遺伝子の転写を抑制し得るような、負の調節された（誘導性の）転写を可能にする。構成的発現は、オペレーターのような負の調節エレメントの非存在下で起こり得る。さらに、正の調節は、遺伝子アクチベーター（活性化因子）タンパク質結合配列により達成され得、その配列が存在する場合は通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列の（５’）側に近接している。遺伝子アクチベータータンパク質の例としては、異化（カタボライト）活性化タンパク質（ＣＡＰ）があり、それはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）におけるｌａｃオペロンの転写の開始を助ける（Ｒａｉｂａｕｄら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：１７３）。それゆえ、調節される発現は、正または負のいずれかであり得、従って転写を増強するかまたは低下し得るかのいずれかである。
【００７７】
代謝経路の酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）（Ｃｈａｎｇら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ　１９８：１０５６）、およびマルトースのような糖代謝の酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。さらなる例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）（Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら（１９８１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；ＥＰ−Ａ−００３６７７６号およびＥＰ−Ａ−０１２１７７５）のような生合成酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。ｇ−ラクタマーゼ（ｇ−ｌａｏｔａｍａｓｅ）（ｂｌａ）プロモーター系（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「Ｔｈｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｍｉｓｔａｋｅｓ．」Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編））、バクテリオファージλＰＬ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１２８）およびＴ５（米国特許第４，６８９，４０６号）プロモーター系もまた有用なプロモーター配列を提供する。
【００７８】
さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた、細菌のプロモーターとして機能する。例えば、ある細菌（バクテリア）あるいはバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列は、別のバクテリアあるいはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と結合し得、合成ハイブリッドプロモーターを形成する。（米国特許第４，５５１，４３３号）。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｌａｃリプレッサーにより調節されるｔｒｐプロモーター配列およびｌａｃオペロン配列の両方から構成される、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである（Ａｍａｎｎら（１９８３）Ｇｅｎｅ　２５：１６７；ｄｅ　Ｂｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２１）。さらに、ある細菌のプロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼに結合し、そして転写を開始させる能力を有する非細菌起源の天然に存在するプロモーターを含み得る。非細菌起源の天然に存在するプロモーターはまた、原核生物内でいくらかの遺伝子の高いレベルでの発現を生じるために、適合性のあるＲＮＡポリメラーゼと結合され得る。バクテリオファージＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、連結したプロモーター系の例である（Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；Ｔａｂｏｒら（１９８５）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：１０７４）。さらに、ハイブリッドプロモーターはまた、バクテリオファージプロモーターおよびＥ．ｃｏｌｉオペレーター領域から構成され得る（ＥＰＯ−Ａ−０２６７８５１）。
【００７９】
機能性のプロモーター配列に加え、効果的なリボソーム結合部位もまた、原核生物における外来遺伝子の発現に有用である。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、リボソーム結合部位は、シャイン−ダルガノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、そして開始コドン（ＡＴＧ）および開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に位置する長さ３〜９ヌクレオチドの配列を含む（Ｓｈｉｎｅら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ　２５４：３４）。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とＥ．ｃｏｌｉの１６Ｓ　ｒＲＮＡの３’側との間の塩基対形成によりｍＲＮＡのリボソームへの結合を促進すると考えられている（Ｓｔｅｉｔｚら（１９７９）「Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｉｇｎａｌｓ　ａｎｄ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｉｎ　ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ　ＲＮＡ」Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒら編））。弱いリボソーム結合部位を有する真核遺伝子および原核遺伝子の発現のためには（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｌｏｎｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）。
【００８０】
ＤＮＡ分子は、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、直接的にそのＤＮＡ分子と連結され得、この場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸は、常に、ＡＴＧ開始コドンによりコードされるメチオニンである。所望される場合、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーション、あるいは細菌のメチオニンＮ末端ペプチダーゼとのインビボまたはインビトロインキュベーションのいずれかによりタンパク質から切断され得る（ＥＰＯ−Ａ−０２１９２３７）。
【００８１】
融合タンパク質は、直接的発現に代わるものを提供する。通常、内在性の細菌のタンパク質、あるいは他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列は、異種のコード配列の５’末端と融合される。発現の際に、この構築物は、２つのアミノ酸配列の融合を提供する。例えば、バクテリオファージλ細胞遺伝子は、外来遺伝子の５’末端と連結し得、そして細菌において発現され得る。生じた融合タンパク質は、好ましくは、外来遺伝子由来のバクテリオファージタンパク質を切断するための切断酵素（第Ｘａ因子）用の部位を保持する（Ｎａｇａｉら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ　３０９：８１０）。融合タンパク質はまた、ｌａｃＺ（Ｊｉａら（１９８７）Ｇｅｎｅ　６０：１９７）、ｔｒｐＥ（Ａｌｌｅｎら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：９３；Ｍａｋｏｆｆら（１９８９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５：１１）、およびＣｈｅｙ（ＥＰ−Ａ−０３２４６４７）遺伝子由来の配列を用いて作製され得る。２つのアミノ酸配列の接合部でのＤＮＡ配列は、切断部位をコードしてもよいし、あるいはコードしなくてもよい。別の例としては、ユビキチン融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は、好ましくは、外来タンパク質からユビキチンを切断するための切断酵素（例えば、ユビキチン特異的切断プロテアーゼ）用の部位を保持するユビキチン領域と共に作製され得る。この方法を通して、天然外来タンパク質は分離され得る（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　７：６９８）。
【００８２】
あるいは、外来タンパク質はまた、細菌における外来タンパク質の分泌を提供するシグナルペプチド配列フラグメントから構成される、融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することによって、細胞から分泌され得る（米国特許４，３３６，３３６）。シグナル配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を指向する、疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドをコードする。このタンパク質は、増殖培地（グラム陽性細菌）、または細胞の内膜と外膜との間に位置する細胞周辺腔（グラム陰性細菌）のいずれかへ分泌される。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る、このシグナルペプチドフラグメントと外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部位がある。
【００８３】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ外膜タンパク質遺伝子（ｏｍｐＡ）（Ｍａｓｕｉら（１９８３）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｔａｌ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｇｈｒａｙｅｂら（１９８４）ＥＭＢＯ　Ｊ．３：２４３７）およびＥ．ｃｏｌｉアルカリホスファターゼシグナル配列（ｐｈｏＡ）（Ｏｋａら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：７２１２）のような、分泌性細菌タンパク質に関する遺伝子由来であり得る。さらなる例として、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株由来のα−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の異種タンパク質を分泌するために使用され得る（Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−０２４４０４２）。
【００８４】
通常、細菌によって認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する調節領域であり、そして従って、プロモーターとともに、コード配列に隣接する。これらの配列は、そのＤＮＡによってコードされるポリペプチドへと翻訳され得るｍＲＮＡの転写を指向する。転写終結配列は、しばしば、転写の終結を補助するステムループ構造を形成し得る、約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を含む。例は、強力なプロモーターを有する遺伝子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐ遺伝子および他の生合成遺伝子）由来の転写終結配列を含む。
【００８５】
通常、上記の成分（プロモーター、シグナル配列（もし所望ならば）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む）は、組み立てられて発現構築物となる。発現構築物は、しばしば、宿主（例えば細菌）における安定な保持が可能である染色体外エレメント（例えばプラスミド）のような、レプリコンに保持される。このレプリコンは複製系を有し、従って、このことによって、発現またはクローニングおよび増幅のいずれかのために、レプリコンが原核生物宿主において保持されることを可能になる。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまたは低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般に約５〜約２００、そして通常約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有する。高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは少なくとも約１０個、そしてより好ましくは少なくとも約２０個のプラスミドを含む。高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれかが選択され得、それは、宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の効果に依存する。
【００８６】
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて、細菌のゲノムへ組み込まれ得る。組み込みベクターは、通常、ベクターが組み込むのを可能にする、細菌の染色体と相同な少なくとも１つの配列を含む。組み込みは、ベクターにおける相同なＤＮＡと細菌の染色体との間の組換えから生じるようである。例えば、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株からのＤＮＡによって構築される組み込みベクターは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ染色体に組み込まれる（ＥＰ−Ａ−０　１２７　３２８）。組み込みベクターはまた、バクテリオファージまたはトランスポゾン配列から構成され得る。
【００８７】
通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、選択マーカーを含んで、形質転換された細菌株の選択を可能にし得る。選択マーカーは、細菌宿主において発現され得、そして細菌が薬物（例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン（ネオマイシン）、およびテトラサイクリン）に耐性になるようにする遺伝子を含み得る（Ｄａｖｉｅｓら（１９７８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：４６９）。選択マーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシンの生合成経路における生合成遺伝子のような、生合成遺伝子を含み得る。
【００８８】
あるいは、上記の成分のいくつかは、形質転換ベクターにおいて組み立てられ得る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコンにおいて保持されるか、または組み込みベクターへと開発されるかのいずれかの選択マーカー（ｍａｒｋｅｔ）から構成され得る。
【００８９】
発現ベクターまたは形質転換ベクターは、染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれも、多くの細菌への形質転換のために開発されてきた。例えば、発現ベクターは、とりわけ、以下の細菌のために開発されてきた：Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−０　０３６　２５９およびＥＰ−Ａ−０　０６３　９５３；ＷＯ　８４／０４５４１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１２８；Ａｍａｎｎら（１９８５）Ｇｅｎｅ　４０：１８３；Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；ＥＰ−Ａ−０　０３６　７７６、ＥＰ−Ａ−０　１３６　８２９およびＥＰ−Ａ−０　１３６　９０７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｒｅｍｏｒｉｓ（Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５）；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ（Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ（米国特許４，７４５，０５６）。
【００９０】
外来ＤＮＡを細菌宿主へ導入する方法は、当該分野において周知であり、そして通常、ＣａＣｌ２または他の薬剤（例えば、２価の陽イオンおよびＤＭＳＯ）のいずれかで処理された細菌の形質転換を含む。ＤＮＡはまた、エレクトロポレーションによって、細菌細胞へ導入され得る。形質転換の手順は、通常、形質転換される細菌の種によって変化する。例えば以下を参照のこと：（Ｍａｓｓｏｎら（１９８９）ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６０：２７３；Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−０　０３６　２５９およびＥＰ−Ａ−０６３　９５３；ＷＯ　８４／０４５４１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８５６；Ｗａｎｇら（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：９４９、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、（Ｃｏｈｅｎら（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９：２１１０；Ｄｏｗｅｒら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１６：６１２７；Ｋｕｓｈｎｅｒ（１９７８）「ＣｏｌＥ１由来のプラスミドによるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉの形質転換のための改良された方法」Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｈ．Ｗ．ＢｏｙｅｒおよびＳ．Ｎｉｃｏｓｉａ編）；Ｍａｎｄｅｌら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１５９；Ｔａｋｅｔｏ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　９４９：３１８；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、（Ｃｈａｓｓｙら（１９８７）ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４４：１７３　Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）；（Ｆｉｅｄｌｅｒら（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ　１７０：３８、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）；（Ａｕｇｕｓｔｉｎら（１９９０）ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６６：２０３、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、（Ｂａｒａｎｙら（１９８０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：６９８；Ｈａｒｌａｎｄｅｒ（１９８７）「エレクトロポレーションによるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓの形質転換」Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊ．ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＲ．Ｃｕｒｔｉｓｓ　ＩＩＩ編）；Ｐｅｒｒｙら（１９８１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５；Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５；Ｓｏｍｋｕｔｉら（１９８７）Ｐｒｏｃ．４ｔｈ　Ｅｖｒ．Ｃｏｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１：４１２、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）。
【００９１】
（ｖ．酵母発現）
酵母発現系もまた、当業者に公知である。酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼに結合可能であり、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）からｍＲＮＡへの下流の（３’側の）転写を開始し得る、任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端の近位に位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（「ＴＡＴＡボックス」）および転写開始部位を含む。酵母プロモーターはまた、上流アクチベーター配列（ＵＡＳ）と呼ばれる第２のドメインを有し得、これは、もし存在するならば、通常、構造遺伝子とは遠位である。このＵＡＳは、調節される（誘導できる）発現を可能にする。構成的発現は、ＵＡＳの非存在下で生じる。調節される発現は、正または負のいずれかであり得、それによって転写を増加させるかまたは減少させるかのいずれかであり得る。
【００９２】
酵母は、活性な代謝経路を有する発酵性微生物であり、従って、代謝経路における酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、以下が挙げられる：アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（ＥＰ−Ａ−０　２８４　０４４）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（ＥＰＯ−Ａ−０　３２９　２０３）。酵母ＰＨＯ５遺伝子はまた、酸性ホスファターゼをコードし、有用なプロモーター配列を提供する（Ｍｙａｎｏｈａｒａら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：１）。
【００９３】
さらに、天然には生じない合成プロモーターもまた、酵母のプロモーターとして機能する。例えば、ある１つの酵母プロモーターのＵＡＳ配列は、別の酵母プロモーターの転写活性化領域と連結され得、合成ハイブリッドプロモーターを生成し得る。このようなハイブリッドプロモーターの例は、ＧＡＰ転写活性化領域と連結されるＡＤＨ調節配列（米国特許第４，８７６，１９７号および同第４，８８０，７３４号）を含む。ハイブリッドプロモーターの他の例は、ＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、またはＰＨＯ５遺伝子のいずれかの調節配列からなり、ＧＡＰまたはＰｙＫ（ＥＰ−Ａ−０　１６４　５５６）のような解糖酵素遺伝子の転写活性化領域に結合されているプロモーターを含む。さらに、酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼと結合し、そして転写を開始する能力を有する、天然に生じる非酵母起源のプロモーターを含み得る。このようなプロモーターの例としては、とりわけ、以下が挙げられる：（Ｃｏｈｅｎら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７７：１０７８；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ　２８３：８３５；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９８１）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６：１１９；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９７９）「酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける細菌の抗生物質耐性遺伝子の発現」、Ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ａｎｄ　Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ　Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ（Ｋ．Ｎ．ＴｉｍｍｉｓおよびＡ．Ｐｕｈｌｅｒ編）；Ｍｅｒｃｅｒａｕ−Ｐｕｉｇａｌｏｎら（１９８０）Ｇｅｎｅ　１１：１６３；Ｐａｎｔｈｉｅｒら（１９８０）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２：１０９；）。
【００９４】
ＤＮＡ分子は、酵母において、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ分子と直接連結され得、その場合、組換えタンパク質のＮ末端にある最初のアミノ酸は常にＡＴＧ開始コドンによってコードされているメチオニンである。もし所望ならば、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションによって、タンパク質から切断され得る。
【００９５】
融合タンパク質は、酵母発現系について、ならびに哺乳動物、バキュロウイルス、および細菌の発現系において、代替物を提供する。通常、内因性酵母タンパク質、または他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列は、異種コード配列の５’末端に融合される。発現において、この構築物は、２つのアミノ酸配列の融合物を提供する。例えば、酵母またはヒトのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）遺伝子は、外来遺伝子の５’末端に連結され、そして酵母において発現し得る。２つのアミノ酸配列の連結部にあるＤＮＡ配列は、切断部位をコードしてもよいし、コードしなくてもよい。例えば、ＥＰ−Ａ−０　１９６　０５６を参照のこと。別の例はユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、外来タンパク質からユビキチンを切断するプロセシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ）のための部位を好ましくは保持する、ユビキチン領域を伴って作製される。従って、この方法を通じて、ネイティブな融合タンパク質は、単離され得る（例えば、ＷＯ８８／０２４０６６）。
【００９６】
あるいは、外来タンパク質はまた、酵母における外来タンパク質の分泌を提供する、リーダー配列フラグメントから構成される融合タンパク質をコードする、キメラＤＮＡ分子を作製することによって、細胞から増殖培地へ分泌され得る。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは、細胞からのタンパク質の分泌を指向する、疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドを、通常コードする。
【００９７】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌性酵母タンパク質に関する遺伝子由来であり得、その遺伝子は例えば、酵母インベルターゼ遺伝子（ＥＰ−Ａ−０　０１２　８７３；ＪＰＯ．６２，０９６，０８６）およびＡ因子遺伝子（米国特許第４，５８８，６８４号）である。あるいは、インターフェロンリーダーのような、酵母における分泌もまた提供する、非酵母起源のリーダーが存在する（ＥＰ−Ａ−０　０６０　０５７）。
【００９８】
好ましいクラスの分泌リーダーは、酵母α因子遺伝子のフラグメントを使用するリーダーであり、これは「プレ」シグナル配列、および「プロ」領域の両方を含む。用いられ得るこの型のα因子フラグメントは、完全長の、プレ−プロα因子リーダー（約８３アミノ酸残基）および短縮されたα因子リーダー（通常約２５〜約５０アミノ酸残基）を含む（米国特許第４，５４６，０８３号および同第４，８７０，００８号；ＥＰ−Ａ−０　３２４　２７４）。分泌を提供するα因子リーダーフラグメントを使用するさらなるリーダーは、第１の酵母のプレ配列を有するが、第２の酵母α因子からのプロ領域を有しないで作製される、ハイブリッドα因子リーダーを含む（例えば、ＷＯ８９／０２４６３を参照のこと）。
【００９９】
通常、酵母に認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する調節領域であり、従って、プロモーターと共にコード配列に隣接する。これらの配列は、そのＤＮＡにコードされるポリペプチドへと翻訳され得る、ｍＲＮＡの転写を指向する。転写終結配列および他の酵母に認識される終結配列の例は、例えば、解糖酵素をコードする転写終結配列である。
【０１００】
通常、上記の成分（プロモーター、リーダー（もし所望ならば）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む）は、組み立てられて発現構築物になる。発現構築物は、宿主（例えば、酵母または細菌）において安定に保持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコンにおいてしばしば保持される。このレプリコンは、２つの複製系を有し得、従って、このことが、例えば、発現のために酵母において、ならびにクローニングおよび増幅のために原核生物宿主において保持されることを可能にする。このような酵母−細菌シャトルベクターの例としては、以下が挙げられる：ＹＥｐ２４（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら（１９７９）Ｇｅｎｅ　８：１７〜２４）、ｐＣｌ／１（Ｂｒａｋｅら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８１：４６４２〜４６４６）、およびＹＲｐ１７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５８：１５７）。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまたは低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般に約５〜約２００、そして通常約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有し得る。高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは少なくとも約１０個、そしてより好ましくは少なくとも約２０個を有する。高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれかが選択され得、それは、宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の効果に依存する。例えば、Ｂｒａｋｅら、前出を参照のこと。
【０１０１】
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて、酵母のゲノムへ組み込まれ得る。組み込みベクターは、通常、ベクターが組み込むのを可能にする、酵母の染色体と相同な少なくとも１つの配列を含み、そして好ましくは、発現構築物に隣接する２つの相同配列を含む。組み込みは、ベクターにおける相同なＤＮＡと酵母の染色体との間の組換えから生じるようである（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：２２８〜２４５）。組み込みベクターは、そのベクター中に含有するために適切な相同配列を選択することによって、酵母における特定の遺伝子座を指向され得る。Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、前出を参照のこと。１つ以上の発現構築物が組み込まれ得、おそらく産生される組換えタンパク質のレベルに影響を与え得る（Ｒｉｎｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：６７５０）。ベクターに含まれる染色体配列は、ベクターにおける単一セグメント（ベクター全体の組み込みを生じる）、または染色体における隣接セグメントに相同でかつベクターにおける発現構築物に隣接する２つのセグメント（発現構築物のみの安定した組み込みを生じ得る）のいずれかとして生じ得る。
【０１０２】
通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、選択マーカーを含み得、形質転換された酵母株の選択を可能にする。選択マーカーは、酵母宿主において発現され得る生合成遺伝子を含み得、それは例えば、ＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、およびＡＬＧ７、ならびにＧ４１８耐性遺伝子であり、それぞれ、酵母細胞がツニカマイシンおよびＧ４１８に耐性になるようにする。さらに、適切な選択マーカーはまた、金属のような毒性化合物の存在下において増殖する能力を、酵母に提供し得る。例えば、ＣＵＰ１の存在は、酵母が、銅イオンの存在下において増殖することを可能にする（Ｂｕｔｔら（１９８７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５１：３５１）
あるいは、上記成分のうちのいくつかは、組み立てられて形質転換ベクターになり得る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコンにおいて保持されるか、または組み込みベクターに開発されるかのいずれかである、選択マーカーから構成される。
【０１０３】
発現ベクターおよび形質転換ベクターは、染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれかであり、多くの酵母への形質転換のために開発されてきた。例えば、発現ベクターは、とりわけ、以下の酵母のために開発されてきた：Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２）、Ｃａｎｄｉｄａ　ｍａｌｔｏｓａ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）。Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ（Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ（Ｄｅ　Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：７３７；Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：１３５）、Ｐｉｃｈｉａ　ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；米国特許第４，８３７，１４８号および同第４，９２９，５５５号）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７５：１９２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ　３００：７０６）、およびＹａｒｒｏｗｉａ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３８０４７１；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９）。
【０１０４】
外来ＤＮＡを酵母宿主へ導入する方法は、当該分野において周知であり、そして通常、スフェロプラストの、またはアルカリ陽イオンで処置された無傷の酵母細胞のいずれかの形質転換を含む。形質転換の手順は、通常、形質転換される酵母の種によって変化する。例えば以下を参照のこと：（Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２；Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１；Ｃａｎｄｉｄａ）；（Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２；Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）；（Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５；Ｄｅ　Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：１１６５；Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：１３５；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）；（Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１；米国特許第４，８３７，１４８号および同第４，９２９，５５５号；Ｐｉｃｈｉａ）；（Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７５：１９２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）；（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ　３００：７０６；Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）；（Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３９；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９；Ｙａｒｒｏｗｉａ）。
【０１０５】
（薬学的組成物）
薬学的組成物は、本発明のポリペプチド、抗体または核酸のいずれかを含み得る。この薬学的組成物は、治療上有効な量の、本願発明のポリペプチド、抗体、またはポリヌクレオチドのいずれかを含む。
【０１０６】
本明細書において使用される用語「治療上有効な量」とは、所望の疾患または状態を処置、改善、または予防するための治療薬剤の量、または、検出可能な治療効果または予防効果を示すための治療薬剤の量をいう。この効果は、例えば、キメラマーカーまたは抗原レベルによって検出され得る。治療効果はまた、体温低下のような、身体の症状における減少を含む。被験体に関する正確な有効量は、被験体の大きさおよび健康、状態の性質および程度、および投与のために選択される治療または治療の組合せに依存する。従って、あらかじめ正確な有効量を特定することは有用ではない。しかし、所定の情況のための有効量は、慣用的な実験によって決定され得、そして臨床医の判断内である。
【０１０７】
本発明の目的のために、有効な用量は、ＤＮＡ構築物が投与される個体において、ＤＮＡ構築物の約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇまたは０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。
【０１０８】
薬学的組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、抗体またはポリペプチド、遺伝子、および他の治療薬剤のような、治療薬剤の投与のためのキャリアをいう。この用語は、この組成物を受け取る個体に有害な抗体の産生をそれ自体誘導せず、そして過度の毒性を伴わずに投与され得る、任意の薬学的キャリアをいう。適切なキャリアは、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子のように、大きく、遅く代謝される巨大分子であり得る。このようなキャリアは、当業者に周知である。
【０１０９】
薬学的に受容可能な塩が、その中で使用され得る。例えば、塩酸塩、臭化水素塩、リン酸塩、硫酸塩などのような鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような有機酸の塩である。薬学的に受容可能な賦形剤の徹底的な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．１９９１）にて利用可能である。
【０１１０】
治療組成物における薬学的に受容可能なキャリアは、水、生理的食塩水、グリセロールおよびエタノールのような液体を含み得る。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などのような補助物質が、このようなビヒクルに存在し得る。代表的には、治療組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかの、注射可能物質として調製される；注射前に液体ビヒクルに溶解または懸濁するのに適切な固体形態もまた、調製され得る。リポソームは、薬学的に受容可能なキャリアの定義中に含まれる。
【０１１１】
（送達方法）
一旦処方されると、本発明の組成物は、その被験体へ直接投与され得る。処置される被験体は、動物であり得；特に、ヒト被験体が処置され得る。
【０１１２】
その組成物直接送達は、一般的に、皮下的に、腹腔内に、静脈内に、または筋肉内のいずれかでの注入によって達成されるか、あるいは、組織の間質空間へ送達される。この組成物はまた、病巣へ投与され得る。他の投与様式には、経口投与、および肺投与、坐剤、および経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）適用または経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）適用（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照のこと）、針、および遺伝子銃またはハイポスプレー（ｈｙｐｏｓｐｒａｙ）が含まれる。投薬処置は、単回用量スケジュール、または多数回用量スケジュールであり得る。
【０１１３】
（ワクチン）
本発明に従うワクチンは、予防的（すなわち、感染を予防するため）または治療（すなわち、感染後の疾患を処置するため）のいずれかであり得る。
【０１１４】
このようなワクチンは、免疫抗原、免疫原、ポリペプチド、タンパク質または核酸を、通常「薬学的に受容可能なキャリア」とともに含み、このキャリア自体は、その組成物を受ける個体に有害である抗体の産生を誘発しない任意のキャリアを含む。適切なキャリアは、代表的に、大きく、ゆっくり代謝される高分子（例えば、タンパク質、ポリサッカリド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物（例えば、油小滴またはリポソーム）、および不活性ウイルス粒子である。このようなキャリアは、当該分野で周知である。さらに、これらのキャリアは免疫刺激薬剤（「アジュバント」）として機能し得る。さらに、この抗原または免疫原は、細菌毒素（例えば、ジフテリア、破傷風、コレラ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉなどの病原因子からの毒素）と結合体化され得る。
【０１１５】
この組成物の効力を増強するために好ましいアジュバントは、（１）アルミニウム塩（「明礬」）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）、（２）水中油懸濁処方物（他の特定の免疫刺激薬剤（例えば、ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌細胞壁成分）を伴うか伴わない）を包含するが、それらに限定されず、例えば、以下：（ａ）５％スクアレン、０．５％　Ｔｗｅｅｎ　８０、および０．５％　Ｓｐａｎ８５（必要に応じて、種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（以下を参照のこと）を含有するが、必要ではない）を含み、モデル１１０Ｙ微小流体化器（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）のような微小流体化器を用いてμ未満の粒子へと処方されたＭＦ５９ＴＭ（ＷＯ９０／１４８３７；Ｖａｃｃｉｎｅ　ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ　ｓｕｂｕｎｉｔ　ａｎｄ　ａｄｊｕｖａｎｔ　ａｐｐｒｏａｃｈ、編、Ｐｏｗｅｌｌ　＆　Ｎｅｗｍａｎ、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ　１９９５の第１０節）；（ｂ）μ未満のエマルジョンへと微小流体化されたか、またはボルテックスして、より大きな粒子径エマルジョンを生成したかのいずれかである、１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと）を含有するＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、およびモノホスホリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）好ましくはＭＰＬおよびＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）からなる群由来の１つ以上の細菌細胞壁成分を含むＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）；（３）サポニンアジュバント（例えば、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭ）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）を使用し得るか、またはそれから粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激性複合体）を生成し得る；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など；および（６）その組成物の効力を強化するための免疫刺激因子として作用する他の物質を包含するがそれらに限定されない。ミョウバンおよびＭＦ５９ＴＭが好ましい。
【０１１６】
上記で言及したように、ムラミルペプチドは、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などを包含するがそれらに限定されない。
【０１１７】
免疫原性組成物（例えば、免疫化抗原／免疫原／ポリペプチド／タンパク質／核酸、薬学的に受容可能なキャリア、およびアジュバント）は、代表的に、希釈剤（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなど）を含有する。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）は、このようなビヒクルにおいて存在し得る。
【０１１８】
代表的に、免疫原性組成物は、液体溶液または懸濁物として、注射剤として調製され；注射前に液体ビヒクルにおける溶液または懸濁物として適切な固体形態もまた調製され得る。この調製物はまた、薬学的に受容可能なキャリアの下で、上記に記載のように、アジュバント効果の強化のために乳化され得るかまたはリポソーム中にカプセル化され得る。
【０１１９】
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原性または免疫原性のポリペプチド、および任意の他の上記の成分を必要に応じて含む。「免疫学的有効量」とは、その量の個体への投与が、単回用量であれ、一連の（用量の）一部としてであれ、処置または予防に有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康および身体状態、処置される個体の分類学上の群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望される保護の程度、そのワクチンの処方物、処置する医師の医療的状況の評価、および他の関連する因子に依存して変動する。その量は、比較的広い範囲に入り、この量が慣用的な試行を通して決定され得ることが予想される。
【０１２０】
免疫学的組成物は、従来のように、非経口的（例えば、皮下、筋肉内または経皮（ｔｒａｎｓｕｄｅｒｍａｌｌｙ）／経皮（ｔｒａｎｓｕｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）のいずれかでの注射による）（例えば、ＷＯ９８／２０７３４）に投与される）。他の投与様式に適切なさらなる処方物は、経口処方物および肺処方物、坐剤、および経皮適用を含む。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは多数回用量スケジュールであり得る。ワクチンは、他の免疫調節剤とともに投与され得る。
【０１２１】
タンパク質ベースのワクチンの代替として、ＤＮＡワクチンを使用し得る（例えば、ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＴｏｒｒｅｓ（１９９７）Ｓｅｍｉｎａｒｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　９：２７１−２８３；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（１９９７）Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１５：６１７−６４８；本明細書中後半部を参照のこと）。
【０１２２】
（遺伝子送達ビヒクル）
本発明の治療剤のコード配列を含む、哺乳動物における発現のためにその哺乳動物へ送達される構築物の送達のための遺伝子治療ビヒクルは、局所または全身的のいずれかで投与され得る。これらの構築物は、ウイルスベクターアプローチまたは非ウイルスベクターアプローチを、インビボまたはエキソビボの様式で利用し得る。このようなコード配列の発現は、内因性哺乳動物プロモーターまたは外因性プロモーターを用いて誘導され得る。このコード配列のインビボでの発現は、構成性または調節性のいずれかであり得る。
【０１２３】
本発明は、意図された核酸配列を発現し得る遺伝子送達ビヒクルを含む。この遺伝子送達ビヒクルは、好ましくは、ウイルスベクター、およびより好ましくはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクターまたはαウイルスベクターである。このウイルスベクターはまた、アストロウイルスベクター、コロナウイルスベクター、オルトミクソウイルスベクター、パポバウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、パルボウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、またはトガウイルスベクターであり得る。一般的には、Ｊｏｌｌｙ（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　１：５１−６４；Ｋｉｍｕｒａ（１９９４）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　５：８４５−８５２；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ（１９９５）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　６：１８５−１９３；およびＫａｐｌｉｔｔ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　６：１４８−１５３を参照のこと。
【０１２４】
レトロウイルスベクターは、当該分野で周知であり、そして本発明者らは、任意のレトロウイルス遺伝子治療ベクターが本発明において使用可能であることを意図する。これには、Ｂ型、Ｃ型およびＤ型のレトロウイルス、異種栄養性ウイルス（例えば、ＮＺＢ−Ｘ１、ＮＺＢ−Ｘ２およびＮＺＢ９−１（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５３：１６０を参照のこと）多栄養性レトロウイルス（例えば、ＭＣＦおよびＭＣＦ−ＭＬＶ（Ｋｅｌｌｙ（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：２９１を参照のこと）、スプマウイルスおよびレンチウイルスが含まれる。ＲＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｏｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８５を参照のこと。
【０１２５】
レトロウイルス遺伝子治療ベクターの部分は、異なるレトロウイルスに由来し得る。例えば、レトロウイルスＬＴＲは、マウス肉腫ウイルスに由来し得、ｔＲＮＡ結合部位はラウス肉腫ウイルスに由来し得、パッケージングシグナルはマウス白血病ウイルスに由来し得、そして第二の鎖合成の起源はトリ白血病ウイルスに由来し得る。
【０１２６】
これらの組換えレトロウイルスベクターを使用して、適切なパッケージング細胞株へそれらを導入することによって形質導入適合性レトロウイルスベクター粒子を生成し得る（米国特許第５，５９１，６２４号を参照のこと）。レトロウイルスベクターは、レトロウイルス粒子へのキメラインテグラーゼ酵素の組込みによって宿主細胞ＤＮＡへの部位特異的組込みについて構築され得る（ＷＯ９６／３７６２６号を参照のこと）。この組換えウイルスベクターは複製欠損組換えウイルスであることが好ましい。
【０１２７】
上記に記載のレトロウイルスベクターを伴う使用について適切なパッケージング細胞株は、当該分野で周知であり、容易に調製され（ＷＯ９５／３０７６３号およびＷＯ９２／０５２６６号を参照のこと）、そしてこれを使用して、組換えベクター粒子の生産のためのプロデューサー細胞株（これは、ベクター細胞株または「ＶＣＬ」とも称される）を作製し得る。好ましくは、このパッケージング細胞株は、ヒトの親細胞（例えば、ＨＴ１０８０細胞）またはミンク親細胞株から作製され、これは、ヒト血清における不活化を除去する。
【０１２８】
レトロウイルス遺伝子治療ベクターの構築のために好ましいレトロウイルスは、トリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミンク細胞フォーカス形成ウイルス、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス、およびラウス肉腫ウイルスを含む。特に好ましいマウス白血病ウイルスは、４０７０Ａおよび１５０４Ａ（ＨａｒｔｌｅｙおよびＲｏｗｅ（１９７６）Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．１９：１９−２５）、Ａｂｅｌｓｏｎ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９９）、Ｆｒｉｅｎｄ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２４５）、Ｇｒａｆｆｉ、Ｇｒｏｓｓ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５９０）、Ｋｉｒｓｔｅｎ、Ｈａｒｖｅｙ肉腫ウイルスおよびＲａｕｓｃｈｅｒ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９８）およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１９０）を含む。このようなレトロウイルスベクターは、寄託機関または収集機関（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（「ＡＴＣＣ」）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手し得るか、または一般に利用可能な技術を用いて公知の供給源から単離され得る。
【０１２９】
本発明において使用可能な例示的な公知のレトロウイルス遺伝子治療ベクターは、特許出願ＧＢ２２００６５１、ＥＰ０４１５７３１、ＥＰ０３４５２４２、ＥＰ０３３４３０１、ＷＯ８９／０２４６８；ＷＯ８９／０５３４９、ＷＯ８９／０９２７１．ＷＯ９０／０２８０６、ＷＯ９０／０７９３６、ＷＯ９４／０３６２２、ＷＯ９３／２５６９８、ＷＯ９３／２５２３４、ＷＯ９３／１１２３０、ＷＯ９３／１０２１８、ＷＯ９１／０２８０５、ＷＯ９１／０２８２５、ＷＯ９５／０７９９４、米国特許第５，２１９，７４０号、同４，４０５，７１２号、同４，８６１，７１９号、同４，９８０，２８９号、同４，７７７，１２７号、同５，５９１，６２４号に記載されるものを含む。Ｖｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　５３：３８６０−３８６４；Ｖｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５３：９６２−９６７；Ｒａｍ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　５３（１９９３）８３−８８；Ｔａｋａｍｉｙａ（１９９２）Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　Ｒｅｓ　３３：４９３−５０３；Ｂａｂａ（１９９３）Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ　７９：７２９−７３５；Ｍａｎｎ（１９８３）Ｃｅｌｌ　３３：１５３；Ｃａｎｅ（１９８４）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　８１；６３４９；およびＭｉｌｌｅｒ（１９９０）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　１もまた参照のこと。
【０１３０】
ヒトアデノウイルス遺伝子治療ベクターもまた当該分野で公知であり、そして本発明において使用可能である。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：６１６およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２：４３１；ならびにＷＯ９３／０７２８３、ＷＯ９３／０６２２３、およびＷＯ９３／０７２８２を参照のこと。本発明において使用可能な例示的な公知のアデノウイルス遺伝子治療ベクターは、上記に参照される文書およびＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４、ＷＯ９５／００６５５、ＷＯ９５／２７０７１、ＷＯ９５／２９９９３、ＷＯ９５／３４６７１、ＷＯ９６／０５３２０、ＷＯ９４／０８０２６、ＷＯ９４／１１５０６、ＷＯ９３／０６２２３、ＷＯ９４／２４２９９、ＷＯ９５／１４１０２、ＷＯ９５／２４２９７、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／２４２９９、ＷＯ９５／０９２４１，ＷＯ９５／２５８０７、ＷＯ９５／０５８３５、ＷＯ９４／１８９２２およびＷＯ９５／０９６５４において記載されるものを含む。あるいは、Ｃｕｒｉｅｌ（１９９２）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４に記載されるような殺傷したアデノウイルスに連結したＤＮＡの投与が使用され得る。本発明の遺伝子送達ビヒクルはまた、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。本発明における使用のためのこのようなベクターの主要なおよび好ましい例は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ　ＷＯ９３／０９２３９に開示されるＡＡＶ−２ベースのベクターである。最も好ましいＡＡＶベクターは、２つのＡＡＶ逆方向末端反復を含む。ここで、ネイティブＤ配列は、ヌクレオチドの置換によって改変され、その結果、少なくとも５つのネイティブなヌクレオチドおよび１８までのネイティブヌクレオチド、好ましくは少なくとも１０のネイティブヌクレオチドから１８までのネイティブヌクレオチド、最も好ましくは１０のネイティブヌクレオチドが維持され、そしてＤ配列の残りのヌクレオチドが欠失またはネイティブでないヌクレオチドで置換されている。ＡＡＶ逆方向末端反復のネイティブなＤ配列は、各ＡＡＶ逆方向末端反復において（すなわち、各末端に１つの配列が存在する）２０の連続するヌクレオチドの配列であって、これは、ＨＰ形成に関与しない。ネイティブでない置換ヌクレオチドは、同じ位置でのネイティブなＤ配列に見出されるヌクレオチド以外の任意のヌクレオチドであり得る。他の使用可能な例示的なＡＡＶベクターは、、ｐＷＰ−１９、ｐＷＮ−１であり、これらは両方ともＮａｈｒｅｉｎｉ（１９９３）Ｇｅｎｅ　１２４：２５７−２６２に開示される。このようなＡＡＶベクターの別の例は、ｐｓｕｂ２０１（Ｓａｍｕｌｓｋｉ（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６を参照のこと）である。別の例示的なＡＡＶベクターは、Ｄｏｕｂｌｅ−Ｄ　ＩＴＲベクターである。Ｄｏｕｂｌｅ−Ｄ　ＩＴＲベクターの構築は、米国特許第５，４７８，７４５号に開示される。なお他のベクターは、Ｃａｒｔｅｒ　米国特許第４，７９７，３６８号およびＭｕｚｙｃｚｋａ　米国特許第５，１３９，９４１号、Ｃｈａｒｔｅｊｅｅ　米国特許第５，４７４，９３５号ならびにＫｏｔｉｎ　ＷＯ９４／２８８１５７に開示されるものである。本発明において使用可能なＡＡＶベクターのなおさらなる例は、ＳＳＶ９ＡＦＡＢＴＫｎｅｏであり、これは、ＡＦＰエンハンサーおよびアルブミンプロモーターを含み、そして肝臓において優性に発現を指向する。その構造および構築は、Ｓｕ（１９９６）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　７：４６３−４７０に開示される。さらなるＡＡＶ遺伝子治療ベクターは、米国特許第５，３５４，６７８号、同５，１７３，４１４号、同５，１３９，９４１号、および同５，２５２，４７９号に開示される。
【０１３１】
本発明の遺伝子治療ベクターはまた、ヘルペスウイルスベクターを含む。主要なおよび好ましい例は、チミジンキナーゼポリペプチドをコードする配列を含む単純ヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第５，２８８，６４１号、およびＥＰ０１７６１７０（Ｒｏｉｚｍａｎ）に開示されるもの）である。さらなる例示的な単純ヘルペスウイルスベクターは、ＷＯ９５／０４１３９（Ｗｉｓｔａｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に開示されるＨＦＥＭ／ＩＣＰ６−ｌａｃＺ、Ｇｅｌｌｅｒ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：１６６７−１６６９ならびにＷＯ９０／０９４４１およびＷＯ９２／０７９４５に記載されるｐＨＳＶｌａｃ、Ｆｉｎｋ（１９９２）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　３：１１−１９に記載されるＨＳＶ　Ｕｓ３：：ｐｇＣ−ｌａｃＺ、ならびにＥＰ０４５３２４２（Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｅｄ）に記載されるＨＳＶ　７１３４、２ＲＨ　１０５およびＧＡＬ４、ならびにＡＴＣＣに受託番号ＡＴＣＣ　ＶＲ−９７７およびＡＴＣＣ　ＶＲ−２６０として寄託されたものを含む。
【０１３２】
意図されるのはまた、本発明において使用され得るαウイルス遺伝子治療ベクターである。好ましいαウイルスベクターは、シンドビスウイルスベクターである。トガウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ　ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ　ＶＲ−１２４７）、Ｍｉｄｄｌｅｂｅｒｇウイルス（ＡＴＣＣ　ＶＲ−３７０）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ　ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ　ＶＲ−１２４６）、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ　ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ　ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ　ＶＲ−１２４９；ＡＴＣＣ　ＶＲ−５３２）および米国特許第５，００９１，３０９号、同５，２１７，８７９号、およびＷＯ９２／１０５７８に記載されるもの。より詳細には、米国特許出願第０８／４０５，６２７号（１９９５年３月１５日出願）、ＷＯ９４／２１７９２号、ＷＯ９２／１０５７８号、ＷＯ９５／０７９９４号、米国特許第５，０９１，３０９号、および米国特許第５，２１７，８７９号に記載されるそれらのαウイルスベクターが使用可能である。このようなαウイルスは、ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄのような寄託機関または収集機関から入手し得るか、または一般的に利用可能な技術を用いて公知の供給源から単離され得る。好ましくは、細胞傷害性が減少したαウイルスベクターを使用する（米国特許仮出願０８／６７９６４０号を参照のこと）。
【０１３３】
ＤＮＡベクター系（例えば、真核細胞層状発現系）もまた、本発明の核酸の発現について有用である。真核生物層状発現系の詳細な説明についてはＷＯ９５／０７９９４を参照のこと。好ましくは、本発明の真核細胞層状発現系はαウイルスベクターに由来し、そして最も好ましくはシンドビスウイルスベクターに由来する。
【０１３４】
本発明における使用に適切な他のウイルスベクターは、ポリオウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−５８およびＥｖａｎｓ、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３８５およびＳａｂｉｎ（１９７３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ　１：１１５に記載されるもの；リノウイルス、例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−１１１０およびＡｒｎｏｌｄ（１９９０）Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｌ４０１に記載されるもの；ポックスウイルス（例えば、カナリアポックスルウイルスまたはワクシニアウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−１１１およびＡＴＣＣ　ＶＲ−２０１０ならびにＦｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈ（１９８９）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　８６：３１７；Ｆｌｅｘｎｅｒ（１９８９）Ａｎｎ　ＮＹ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　５６９：８６、Ｆｌｅｘｎｅｒ（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅ　８：１７；米国特許第４，６０３，１１２号および同４，７６９，３３０号ならびにＷＯ８９／０１９７３号に記載されるもの））；ＳＶ４０ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−３０５およびＭｕｌｌｉｇａｎ（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ　２７７：１０８およびＭａｄｚａｋ（１９９２）Ｊ　Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ　７３：１５３３に記載されるもの）；インフルエンザウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−７９７および米国特許第５，１６６，０５７号およびＥｎａｍｉ（１９９０）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　．８７：３８０２−３８０５；ＥｎａｍｉおよびＰａｌｅｓｅ（１９９１）Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　６５：２７１１−２７１３およびＬｕｙｔｊｅｓ（１９８９）Ｃｅｌｌ　５９：１１０（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ（１９８３）ＮＥＪ　Ｍｅｄ　３０９：１３ならびにＹａｐ（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ　２７３：２３８およびＮａｔｕｒｅ（１９７９）２７７：１０８もまた参照のこと）に記載されるような逆遺伝子技術を使用して作製した組換えインフルエンザウイルス）；ＥＰ−０３８６８８２およびＢｕｃｈｓｃｈａｃｈｌｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１に記載されるようなヒト免疫不全ウイルス；麻疹ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−６７およびＶＲ−１２４７ならびにＥＰ−０４４０２１９に記載されるもの）；アウラウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−３６８）；ベバルウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−６００およびＡＴＣＣ　ＶＲ−１２４０）；カバス（Ｃａｂａｓｓｏｕ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−９２２）；チクングンヤウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−６４およびＡＴＣＣ　ＶＲ−１２４１）；フォートモーガン（Ｆｏｒｔ　Ｍｏｒｇａｎ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−９２４）；ゲタウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−３６９およびＡＴＣＣ　ＶＲ−１２４３）；キジラガハ（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−９２７）；マヤロウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−６６）；ムカンボウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−５８０およびＡＴＣＣ　ＶＲ−１２４４）；ヌヅムウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−３７１）；ピクスナウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−３７２およびＡＴＣＣ　ＶＲ−１２４５）；トナテ（Ｔｏｎａｔｅ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−９２５）；トリニティウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−４６９）；ユナウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−３７４）；ワタロアウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−９２６）；Ｙ−６２−３３ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−３７５）；オニオニオンウイルス、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−６５およびＡＴＣＣ　ＶＲ−１２４２）；西部ウマ脳脊髄炎ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−７０、ＡＴＣＣ　ＶＲ−１２５１、ＡＴＣＣ　ＶＲ−６２２およびＡＴＣＣ　ＶＲ−１２５２）；ならびにコロナウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−７４０）およびＨａｍｒｅ（１９６６）Ｐｒｏｃ　Ｓｏｃ　Ｅｘｐ　Ｂｉｏｌ　Ｍｅｄ　１２１：１９０に記載のものを含む。
【０１３５】
本発明の組成物の細胞への送達は、上記に言及したウイルスベクターに限定されない。他の送達方法および媒体が使用され得る（例えば、核酸発現ベクター、殺傷したアデノウイルスに連結したかまたは連結してないポリカチオン性縮合ＤＮＡ単独（例えば、米国特許出願番号０８／３６６，７８７（１９９４年１２月３０日出願）およびＣｕｒｉｅｌ（１９９２）Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ　３：１４７−１５４を参照のこと）、リガンド連結ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ（１９８９）Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２６４：１６９８５−１６９８７を参照のこと）、真核生物細胞送達ビヒクル細胞（例えば、米国特許出願番号０８／２４０，０３０（１９９４年５月９日出願）および米国特許出願番号０８／４０４，７９６を参照のこと）、光重合化ヒドロゲル物質の沈着、手動の遺伝子送達粒子銃（米国特許第５，１４９，６５５号に記載されるような）、米国特許第５，２０６，１５２およびＷＯ９２／１１０３３に記載されるような電離放射線、核酸電荷中和または細胞膜との融合）。さらなるアプローチは、Ｐｈｉｌｉｐ（１９９４）Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１４：２４１１−２４１８およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ（１９９４）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　９１：１５８１−１５８５に記載される。
【０１３６】
粒子媒介遺伝子送達が使用され得る（例えば、米国特許出願６０／０２３，８６７号を参照のこと）。手短には、配列を、高レベル発現のための従来の制御配列を含む従来のベクターに挿入し得、次いで細胞標的化リガンド（例えば、アシアロオロソムコイド（ＷｕおよびＷｕ（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２に記載されるような）、Ｈｕｃｋｅｄ（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　４０：２５３−２６３に記載されるようなインスリン、Ｐｌａｎｋ（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ　３：５３３−５３９に記載されるようなガラクトース、ラクトースまたはトランスフェリン）に連結された合成遺伝子送達分子（例えば、重合ＤＮＡ結合カチオン様ポリリジン、プロタミンおよびアルブミン）とともにインキュベートされ得る。
【０１３７】
裸のＤＮＡもまた使用され得る。例示的な裸のＤＮＡ導入方法は、ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載される。取り込み効率は、生体分解性のラテックスビーズを用いて改良され得る。ＤＮＡコートラテックスビーズは、ビーズによるエンドサイトーシス開始の後に効率よく細胞へと輸送される。この方法は、ビーズを処理して疎水性を高め、それによってエンドソームの破壊および細胞質へのＤＮＡの放出を容易にすることによってさらに改良され得る。
【０１３８】
遺伝子送達ビヒクルとして作用し得るリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号、ＷＯ９５／１３７９６、ＷＯ９４／２３６９７、ＷＯ９１／１４４４５、およびＥＰ５２４，９６８に記載される。米国特許出願６０／０２３，８６７に記載されるように、非ウイルス性送達において、ポリペプチドをコードする核酸配列は、高レベル発現のための従来の制御配列を含む従来のベクターへと挿入され得、次いで細胞標的化リガンド（例えば、アシアロオロソムコイド、インスリン、ガラクトース、ラクトースまたはトランスフェリン）に連結された、重合性ＤＮＡ結合カチオン（例えば、ポリリジン、プロタミン、およびアルブミン）のような合成遺伝子伝達分子とともにインキュベートされ得る。他の送達系は、種々の組織特異的または普遍的作用性のプロモーターの制御下に遺伝子を含むＤＮＡをカプセル化するためのリポソームの使用を含む。さらに、使用に適切な非ウイルス送達は、機械的送達系（例えば、Ｗｏｆｆｅｎｄｉｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１（２４）：１１５８１−１１５８５に記載されるアプローチを含む。さらに、コード配列およびそのようなものの発現産物は、光重合化ヒドロゲル物質の沈着を介して送達され得る。コード配列の送達について使用され得る、遺伝子送達のための他の従来の方法は、例えば、手動の遺伝子送達粒子銃（米国特許第５，１４９，６５５号に記載されるような）；移入された遺伝子を活性化するための電離放射線の使用（米国特許第５，２０６，１５２号およびＷＯ９２／１１０３３に記載されるような）を含む。
【０１３９】
例示的なリポソームおよびポリカチオン性遺伝子送達ビヒクルは、米国特許第５，４２２，１２０号および同４，７６２，９１５号；ＷＯ９５／１３７９６；ＷＯ９４／２３６９７；およびＷＯ９１／１４４４５；ＥＰ−０５２４９６８；およびＳｔｒｙｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３６−２４０頁（１９７５）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；Ｓｚｏｋａ（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ　６００：１；Ｂａｙｅｒ（１９７９）　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ　５５０：４６４；Ｒｉｖｎａｙ（１９８７）Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　１４９：１１９；Ｗａｎｇ（１９８７）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　８４：７８５１；Ｐｌａｎｔ（１９８９）Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１７６：４２０に記載されるものである。
【０１４０】
ポリヌクレオチド組成物は、治療有効量（この用語は上記に定義されるとおりである）の遺伝子治療ビヒクルを含み得る。本発明の目的のために、有効用量は、投与される個体において、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇまたは０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇのＤＮＡ構築物である。
【０１４１】
（送達方法）
一旦処方されると、本発明のポリヌクレオチド組成物は、（１）被験体に直接）；（２）エキソビボで被験体由来の細胞に送達されて；または（３）組換えタンパク質の発現のためにインビトロで、投与され得る。処置される被験体は、哺乳動物または鳥類であり得る。ヒト被験体もまた処置され得る。
【０１４２】
この組成物の直接送達は、皮下、腹腔内、静脈内、または筋肉内の注射によって、または組織の間質空間への送達のいずれかによって一般的に達成される。この組成物はまた、病巣へ投与され得る。他の投与様式は、経口投与または肺投与、坐剤、および経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）または経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）適用（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照のこと）、針、および遺伝子銃またはハイポスプレーを含む。投薬治療は、単回用量スケジュールまたは多数回用量スケジュールであり得る。
【０１４３】
エキソビボ送達および被験体への形質転換細胞の再移植のための方法は、当該分野で公知であり、そして例えばＷＯ９３／１４７７８に記載されている。エキソビボ適用に有用である細胞の例は、例えば、幹細胞、特に、造血細胞、リンパ細胞、マクロファージ、樹状細胞または腫瘍細胞を含む。
【０１４４】
一般的に、エキソビボ適用およびインビトロ適用の両方のための核酸の送達は、以下の手順：例えば、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介トランスフェクション、原形質融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソーム内へのカプセル化、およびＤＮＡの核への直接の微量注入（これらはすべて当該分野で周知である）で達成され得る。
【０１４５】
（ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの薬学的組成物）
上記に記載の薬学的に受容可能なキャリアおよび塩に加えて、以下のさらなる薬剤がポリヌクレオチド組成物および／またはポリペプチド組成物とともに使用され得る。
【０１４６】
（Ａ．ポリペプチド）
１つの例は、限定することなく以下を包含する：アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）；トランスフェリン；アシアロ糖タンパク質；抗体；抗体フラグメント；フェリチン；インターロイキン；インターフェロン；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、幹細胞因子およびエリスロポエチン。ウイルス抗原（例えば、エンベロープタンパク質）もまた、使用され得る。また、他の侵襲性生物由来のタンパク質（例えば、ＲＩＩとして知られるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの環境スポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）タンパク質由来の１７アミノ酸ペプチド）。
【０１４７】
（Ｂ．ホルモン、ビタミンなど）
包含され得る他の群は、例えば、ホルモン、ステロイド、アンドロゲン、エストロゲン、甲状腺ホルモン、またはビタミン、葉酸である。
【０１４８】
（Ｃ．ポリアルキレン、ポリサッカリドなど）
また、ポリアルキレングリコールが、所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドとともに含有され得る。好ましい実施態様において、ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールである。さらに、モノサッカリド、ジサッカリド、またはポリサッカリドが含有され得る。この局面の好ましい実施態様において、このポリサッカリドは、デキストランまたはＤＥＡＥデキストランである。また、キトサンおよびポリ（乳酸−コ−グリコリド）。
【０１４９】
（Ｄ．脂質およびリポソーム）
所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドはまた、被験体またはそれに由来する細胞への送達の前に、脂質中にカプセル化され得るか、またはリポソーム中にパッケージングされ得る。
【０１５０】
脂質カプセル化は、一般的に核酸に安定に結合し得るか、または核酸を捕捉もしくは維持し得るリポソームを用いて達成される。縮合ポリヌクレオチドの脂質調製物に対する比は、変動し得るが、一般的に約１：１（ｍｇＤＮＡ：マイクロモル脂質）であるか、またはより多くの脂質である。核酸の送達のためのキャリアとしてリポソーム使用の概説については、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔ（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０９７：１−１７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：５１２−５２７を参照のこと。
【０１５１】
本発明における使用のためのリポソーム調製物は、カチオン性（正に荷電した）アニオン性（負に荷電した）および中性の調製物を包含する。カチオン性リポソームは、機能的な形態で、プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：７４１３−７４１６）；ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：６０７７−６０８１；および精製した転写因子（Ｄｅｂｓ（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１０１８９−１０１９２）の細胞内送達を媒介することが示されている。
【０１５２】
カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは、ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹからの商標リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）の下で入手可能である（Ｆｅｇｎｅｒ前出もまた参照のこと）。他の市販されているリポソームは、トランスフェクテース（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）を含む。他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技法を使用する容易に利用可能な物質から調製され得る。例えば、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記載について、Ｓｚｏｋａ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７５：４１９４−４１９８；ＷＯ９０／１１０９２を参照のこと。
【０１５３】
同様に、アニオン性および中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏｌａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から容易に入手可能であるか、または容易に入手可能な物質を使用してたやすく調製され得る。このような物質には、とりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などが含まれる。これらの物質はまた、適切な比率のＤＯＴＭＡおよびＤＯＴＡＰの出発物質と混合され得る。これらの物質を使用してリポソームを作製する方法は、当該分野で周知である。
【０１５４】
このリポソームは、多重膜のベシクル（ＭＬＶ）、小さな単一膜ベシクル（ＳＵＶ）、または大きな単一膜のベシクル（ＬＵＶ）を含み得る。種々のリポソーム−核酸複合体は当該分野で公知の方法を使用して調製され得る。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０１：５１２−５２７；Ｓｚｏｋａ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７５：４１９４−４１９８；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９７５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　３９２：４８３；Ｗｉｌｓｏｎ（１９７９）Ｃｅｌｌ　１７：７７）；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ（１９７６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏ（１９７７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙ（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７６：３３４８）；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７６：１４５；Ｆｒａｌｅｙ（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７５：１４５；ならびにＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒ（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１５：１６６を参照のこと。
【０１５５】
（Ｅ．リポタンパク質）
さらに、リポタンパク質が、送達されるポリヌクレオチド／ポリペプチドとともに含まれ得る。利用されるリポタンパク質の例は、キロミクロン、ＨＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、およびＶＬＤＬを含む。これらのタンパク質の変異体、フラグメント、または融合物もまた、使用され得る。また、天然に存在するリポタンパク質の改変体（例えば、アセチル化されたＬＤＬ）が使用され得る。これらのリポタンパク質は、リポタンパク質レセプターを発現する細胞へ、ポリヌクレオチドの送達を標的化し得る。好ましくは、リポタンパク質が、送達されるポリヌクレオチドとともに含まれる場合、他の標的化リガンドはその組成物中には含まれない。
【０１５６】
天然に存在するリポタンパク質は、脂質部分およびタンパク質部分を含む。このタンパク質部分は、アポタンパク質として知られる。現在では、アポタンパク質Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥが単離および同定されている。少なくともこれらの２つはいくつかのタンパク質を含み、ローマ数字、ＡＩ、ＡＩＩ、ＡＩＶ；ＣＩ、ＣＩＩ、ＣＩＩＩによって命名されている。
【０１５７】
１つのリポタンパク質は、１を超えるアポタンパク質を含み得る。例えば、天然に存在するキロミクロンはＡ、Ｂ、Ｃ、およびＥからなり、そして時間が経てばこれらのリポタンパク質はＡを欠失し、そしてＣおよびＥアポタンパク質を獲得する。ＶＬＤＬは、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＥアポタンパク質を含み、ＬＤＬはアポタンパク質Ｂを含み；そしてＨＤＬはアポタンパク質Ａ、Ｃ、およびＥを含む。
【０１５８】
これらのアポタンパク質のアミノ酸は公知であり、そして例えば、Ｂｒｅｓｌｏｗ（１９８５）Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ　５４：６９９；Ｌａｗ（１９８６）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１５１：１６２；Ｃｈｅｎ（１９８６）Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２６１：１２９１８；Ｋａｎｅ（１９８０）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　７７：２４６５；Ｕｔｅｒｍａｎｎ（１９８４）Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅｔ　６５：２３２に記載されている。
【０１５９】
リポタンパク質は、トリグリセリド、コレステロール（遊離およびエステル）、およびリン脂質を含む、種々の脂質を含む。この脂質の組成は、天然に存在するリポタンパク質において変化する。例えば、キロミクロンは主としてトリグリセリドを含む。天然に存在するリポタンパク質の脂質含有物のより詳細な記載は、例えば、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２８（１９８６）に見いだされ得る。この脂質の組成は、レセプター結合活性についてアポタンパク質の立体構造において補助するために選択される。脂質組成はまた、ポリヌクレオチド結合分子との疎水性相互作用および会合を容易にするように選択され得る。
【０１６０】
天然に存在するリポタンパク質は、例えば、血清から超遠心分離によって単離され得る。そのような方法は、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（前出）；Ｐｉｔａｓ（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５３：５４５４−５４６０およびＭａｈｅｙ（１９７９）Ｊ　Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ　６４：７４３−７５０に記載される。リポタンパク質はまた、インビトロまたは所望の宿主細胞中のアポタンパク質遺伝子の発現による組換え方法によって産生され得る。例えば、Ａｔｋｉｎｓｏｎ（１９８６）Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｃｈｅｍ　１５：４０３およびＲａｄｄｉｎｇ（１９５８）Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ　３０：４４３を参照のこと。リポタンパク質はまた、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡのような商業的な供給者から購入され得る。さらなるリポタンパク質の記載は、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４４６５に見い出され得る。
【０１６１】
（Ｆ．ポリカチオン性薬剤）
ポリカチオン性薬剤は、送達される所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドを有する組成物中に、リポタンパク質を伴って、またはリポタンパク質を伴わずに含まれ得る。
【０１６２】
ポリカチオン性薬剤は、代表的には、生理的に適切なｐＨにおいて正味の正電荷を示し、そして所望の位置への送達を容易にするための核酸の電荷を中和し得る。これらの薬剤は、インビトロ、エキソビボ、およびインビボ適用のいずれもを有する。ポリカチオン性薬剤は、生きている被験体に、筋肉内、皮下などのいずれかで核酸を送達するために使用され得る。
【０１６３】
以下は、ポリカチオン性薬剤としての有用なポリペプチドの例である：ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、およびプロタミン。他の例は、ヒストン、プロタミン、ヒト血清アルブミン、ＤＮＡ結合タンパク質、非ヒストン染色体タンパク質、ＤＮＡウイルス由来のコートタンパク質（例えば、Ｘ１７４）を含む。転写因子もまた、ＤＮＡに結合するドメインを含み、従って核酸縮合薬剤として有用であり得る。手短に言えば、転写因子（例えば、Ｃ／ＣＥＢＰ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｆｏｓ、ＡＰ−１、ＡＰ−２、ＡＰ−３、ＣＰＦ、Ｐｒｏｔ−１、Ｓｐ−１、Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−２、ＣＲＥＰ、およびＴＦＩＩＤ）は、ＤＮＡ配列に結合する塩基性ドメインを含む。
【０１６４】
有機ポリカチオン性薬剤は、スペルミン、スペルミジン、およびプトレシン（ｐｕｒｔｒｅｓｃｉｎｅ）を含む。
【０１６５】
ポリカチオン性薬剤の大きさおよびその物理的特性は、上記の表から外挿されて、他のポリカチオン性薬剤が構築され得るか、または合成ポリカチオン性薬剤が産生され得る。
【０１６６】
有用な合成ポリカチオン性薬剤は、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレンを含む。ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ、およびｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭは、ポリヌクレオチド／ポリペプチドと組み合わせた場合にポリカチオン性複合体を形成するモノマーである。
【０１６７】
（核酸ハイブリダイゼーション）
「ハイブリダイゼーション」とは、水素結合による２つの核酸配列の互いの会合をいう。代表的には、１つの配列は、固体支持体に固定され、そして他方は溶液中で遊離している。次いで、２つの配列は水素結合に好ましい条件下で互いに接触される。この結合に影響を与える因子は以下を含む：溶媒のタイプおよび容量；反応温度；ハイブリダイゼーションの時間；撹拌；液体相の配列の固体支持体への非特異的な付着をブロックする薬剤（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ試薬またはＢＬＯＴＴＯ）；配列の会合の速度を増大させる化合物（硫酸デキストランまたはポリエチレングリコール）の使用；およびハイブリダイゼーション後の洗浄条件のストリンジェンシー。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）第２巻、第９章、９．４７〜９．５７頁。
【０１６８】
「ストリンジェンシー」とは、異なる配列よりも非常に類似する配列の会合に好ましいハイブリダイゼーション反応における条件をいう。例えば、研究中のハイブリッドの計算されたＴｍより約１２０〜２００℃低い温度および塩濃度の組み合わせが選択されるべきである。温度および塩条件はしばしば、フィルターに固定したゲノムＤＮＡのサンプルが目的の配列にハイブリダイズし、次いで異なるストリンジェンシーの条件下で洗浄される、予備的な実験において経験的に決定され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、９．５０頁を参照のこと。
【０１６９】
例えば、サザンブロットを行う場合、考慮する変数は、（１）ブロットされるＤＮＡの複雑さ、および（２）プローブおよび検出される配列の間の相同性である。研究されるフラグメント全量は、プラスミドまたはファージ消化物については０．１〜１μｇ、高度に複雑な真核生物ゲノム中の単一コピーについては１０−９〜１０−８ｇまで、１０倍変化し得る。より低い複雑さのポリヌクレオチドについては、実質的により短いブロッティング、ハイブリダイゼーション、および曝露回数、より少量の出発ポリヌクレオチド、およびより低い非活性のプローブが使用され得る。例えば、単一コピーの酵母遺伝子は、１μｇの酵母ＤＮＡで開始し、２時間ブロットし、そして４〜８時間１０８ｃｐｍ／μｇを用いてハイブリダイズして、わずか１時間の曝露時間を用いて検出され得る。単一コピーの哺乳動物遺伝子について、保存性のアプローチは、１０μｇのＤＮＡで開始し、一晩ブロットし、そして１０８ｃｐｍ／μｇより多いプローブを用いて１０％硫酸デキストランの存在下で一晩ハイブリダイズし、約２４時間露光時間を生じる。
【０１７０】
いくつかの因子が、プローブと目的のフラグメントとの間のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）、ならびに、結果として、ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての適切な条件に影響を与え得る。多くの場合において、そのプローブはフラグメントに対して１００％相同なわけではない。他の共通して直面する変化には、長さ、ハイブリダイズする配列の全Ｇ＋Ｃ含量、ならびにイオン強度およびハイブリダイゼーション緩衝液のホルムアミド含量が含まれる。これらのすべての因子の効果は、一つの式によって近似され得る：
Ｔｍ＝８１＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｃｉ）＋０．４［（Ｇ＋Ｃ）％］−０．６（ホルムアミド％）−６００／ｎ−１．５（ミスマッチ％）。
ここでＣｉは塩濃度（一価イオン）であり、およびｎは塩基対内のハイブリッドの長さである（ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７／２８４からわずかに改変した）。
【０１７１】
ハイブリダイゼーション実験の設計において、核酸ハイブリダイゼーションに影響を与えるいくつかの因子が簡便に変更され得る。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度ならびに洗浄時の塩濃度を調整するのが最も単純である。ハイブリダイゼーション温度（すなわち、ストリンジェンシー）が上昇するにつれて、非相同的な鎖の間で起こるハイブリダイゼーションは起こりにくくなるようであり、結果として、バックグラウンドが減少する。放射標識したプローブが固定化されたフラグメントと完全に相同ではない場合（遺伝子ファミリーおよび種間のハイブリダイゼーション実験における場合で頻繁であるように）、ハイブリダイゼーション温度は低下されなければならず、そしてバックグラウンドが増大する。洗浄の温度は、類似の様式で、ハイブリダイゼーションバンドの強度、およびバックグラウンドの程度に影響を与える。洗浄のストリンジェンシーはまた、塩濃度の減少とともに増大する。
【０１７２】
一般的に、５０％ホルミアミドの存在下で都合よいハイブリダイゼーション温度は、標的フラグメントに９５％〜１００％相同であるプローブについて４２℃、９０％〜９５％相同性では３７℃、８５％〜９０％相同性については３２℃である。より低い相同性については、上記の式を用いて、適切にホルムアミド含量が低くされ、そして温度が調整されるべきである。プローブと標的フラグメントとの間の相同性が未知である場合、最も単純なアプローチは、ともにストリンジェントではないハイブリダイゼーション条件および洗浄条件で開始することである。オートラジオグラフィー後に非特異的バンドまたは高いバックグラウンドが観察される場合、フィルターは高ストリンジェンシーで洗浄され得、そして再び露光され得る。露光のために必要な時間がこのアプローチを非実用的にする場合、いくつかのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄ストリンジェンシーが並行して試験されるべきである。
【０１７３】
（核酸プローブアッセイ）
本発明に従う核酸プローブを利用する、ＰＣＲ、分枝ＤＮＡプローブアッセイ、またはブロッティング技術のような方法は、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの存在を決定し得る。プローブは、検出されるに十分に安定な、二重鎖または二本鎖複合体を形成し得る場合に、本発明の配列に「ハイブリダイズする」といわれる。
【０１７４】
核酸プローブは、本発明のクラミジアの（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ）ヌクレオチド配列（センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む）にハイブリダイズする。多くの異なるヌクレオチド配列がアミノ酸配列をコードするが、ネイティブなクラミジアの配列は、細胞に存在する実際の配列であるので、好ましい。ｍＲＮＡは、コード配列を表し、従ってプローブはコード配列に相補的であるべきであり、一本鎖ｃＤＮＡはｍＲＮＡに相補的であり、従ってｃＤＮＡプローブは非コード配列に相補的であるべきである。
【０１７５】
プローブ配列はクラミジアの配列（またはその相補物）に同一である必要はない。核酸プローブが標的ヌクレオチドと検出され得る二重鎖を形成し得る場合、配列および長さの変動は、アッセイの感受性の増加をもたらし得る。また、核酸プローブは、形成された二重鎖を安定化するためにさらなるヌクレオチドを含み得る。さらなるクラミジアの配列もまた、形成された二重鎖を検出するための標識としての一助となり得る。例えば、非相補的ヌクレオチド配列が、そのプローブの５’末端に付着され得、ここでそのプローブ配列の残りはクラミジアの配列に相補的である。あるいは、プローブ配列が、それとハイブリダイズし、そしてそれによって検出され得る二重鎖を形成するためにクラミジアの配列との十分な相補性を有する場合、非相補的塩基またはより長い配列は、プローブ中に分散され得る。
【０１７６】
プローブの正確な長さおよび配列は、ハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、塩条件など）に依存する。例えば、診断的適用については、分析物の配列の複雑さに依存して、核酸プローブは、代表的には、少なくとも１０〜２０ヌクレオチド、好ましくは１５〜２５、そして最も好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドを含むが、これよりも短くもあり得る。短いプライマーは、一般的には、鋳型との安定なハイブリッド複合体を形成するのにより低い温度を必要とする。
【０１７７】
プローブは、合成的手順（例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉらのトリエステル法、（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８１）１０３：３１８５））、またはＵｒｄｅａら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０：７４６１）に従って、または市販の自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して、産生され得る。
【０１７８】
プローブの化学的性質は、優先度に従って選択され得る。特定の適用については、ＤＮＡまたはＲＮＡが適切である。他の適用については、改変（例えば、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのようなバックボーンの改変）が組み込まれ得、インビボの半減期を増大させるために使用され得、ＲＮＡ親和性を変化させ、ヌクレアーゼ耐性などを増大させるなどを行い（例えば、ＡｇｒａｗａｌおよびＩｙｅｒ（１９９５）Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　６：１２−１９；Ａｇｒａｗａｌ（１９９６）ＴＩＢＴＥＣＨ　１４：３７６−３８７）；ペプチド核酸のようなアナログもまた使用され得る（例えば、Ｃｏｒｅｙ（１９９７）ＴＩＢＴＥＣＨ１５　２２４−２２９；Ｂｕｃｈａｒｄｔら（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ　１１：３８４−３８６を参照のこと）。
【０１７９】
あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、少量の標的核酸を検出する別の周知の手段である。そのアッセイは、Ｍｕｌｌｉｓら、（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）１５５：３３５−３５０）；米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号に記載されている。２つの「プライマー」ヌクレオチドは、標的核酸とハイブリダイズし、そして反応を開始するために使用される。このプライマーは、増殖標的（またはその相補物）の配列にハイブリダイズしない、二重鎖の安定性を補助するための、または、例えば、首尾よい制限部位を組み込むための配列を含む。代表的には、このような配列は、所望のクラミジアの配列に隣接する。
【０１８０】
熱安定性のポリメラーゼは、もともとの標的核酸を鋳型として使用して、プライマーから標的核酸のコピーを作製する。標的核酸の閾値量がポリメラーゼによって産生された後、それらはより従来的な方法（例えば、サザンブロット）によって検出され得る。サザンブロット法を使用する場合、標識されたプローブは、クラミジアの配列（またはその相補物）にハイブリダイズする。
【０１８１】
また、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載される、従来的なブロッティング技術によって検出され得る。ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡからポリメラーゼ酵素を使用して生成されたｃＤＮＡは、ゲル電気泳動を使用して精製および分離され得る。次いで、ゲル上のこの核酸は、ニトロセルロースのような固体支持体にブロットされる。この固体支持体は、標識されたプローブに曝露され、次いですべてのハイブリダイズしていないプローブを洗浄して除去する。次に、標識プローブを含む二重鎖を検出する。代表的には、そのプローブは、放射活性部分で標識される。
【０１８２】
（実施例）
本実施例は、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質がワクチン産生およびワクチン開発または診断目的のための有用な抗原である見解を支持する証拠とともに、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質を示す。本証拠は、以下の形態をとる。
【０１８３】
・ＣＷＬ０２９株からの配列情報に基づくコンピューター予測（例えば、ｗｗｗ．ｐｓｏｒｔ．ｎｉｂｂ．ａｃ．ｊｐから利用可能であるＰＳＯＲＴアルゴリズムを用いる）。
【０１８４】
・ＩＯＬ２０７株からクローン化されたタンパク質の組換え発現および精製に基づくデータ。
【０１８５】
・血清中の免疫反応性を実証するためのウエスタンブロット（代表的に、組換えタンパク質に対するマウス抗血清を用いて染色した、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　ＦＢ／９６株のＥＢ抽出物のブロット）。
【０１８６】
・免疫系に対する抗原の利用性を確認するためのＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細菌または精製ＥＢのＦＡＣＳ分析（表ＩＩＩもまた参照のこと）。
【０１８７】
・タンパク質が、ＦＢ／９６株由来の精製基本小体からのタンパク質の、２Ｄゲル電気泳動マップからのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって同定されたか否かの指標。これによって、タンパク質がインビボで発現されるか否かを確認する（表Ｖもまた参照のこと）。
【０１８８】
種々の試験を使用して、本実施例において、同定したタンパク質のインビボ免疫原性を評価し得る。例えば、このタンパク質を組換え発現させ、そして免疫ブロットによって患者の血清をスクリーニングするために使用し得る。このタンパク質と患者の血清との間のポジティブな反応は、この患者が問題のタンパク質に対する免疫応答を以前に高めていたこと、すなわち、このタンパク質は、免疫原であることを示す。本方法をまた使用して、免疫優性タンパク質を同定し得る。
【０１８９】
組換えタンパク質もまた好都合に使用して、例えば、マウスにおいて抗体を調製するために調製し得る。これらの抗体は、タンパク質が細胞表面上に位置することの直接的な確認のために使用し得る。標識抗体（例えば、ＦＡＣＳのための蛍光標識）を、インタクトな細菌とインキュベートし得、そして細菌表面上の標識の存在によって、タンパク質の位置を確認する。
【０１９０】
特に、以下の方法（Ａ）〜（Ｏ）を使用して、本発明のタンパク質を発現させ、精製し、そして生化学的に特徴付けた。
【０１９１】
（Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためのＣＰＮ　ＯＲＦのクローニング）
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｃｐｎ）のＯＲＦを、３つの異なる種類のタンパク質を潜在的に得るようにクローニングした：
ａ）Ｃ末端にヘキサ−ヒスチジンタグを有するタンパク質（ｃｐｎ−Ｈｉｓ）
ｂ）Ｎ末端にＧＳＴ融合パートナーを有するタンパク質（Ｇｓｔ−ｃｐｎ）
ｃ）Ｃ末端のヘキサ−ヒスチジンタグおよびＮ末端のＧＳＴの両方を有するタンパク質（ＧＳＴ／Ｈｉｓ融合物；ＮＨ２−ＧＳＴ−ｃｐｎ−（Ｈｉｓ）６−ＣＯＯＨ）。
【０１９２】
ａ）型タンパク質を、ｐＥＴ２１ｂ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にクローニングする際に得た。ｂ）型タンパク質およびｃ）型タンパク質を、改変ｐＧＥＸ−ＫＧベクター［Ｇｕａｎ　＆　Ｄｉｘｏｎ（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２．２６２］へのクローニングの際に得た。例えば、ｐＧＥＸ−ＫＧを改変して、ｐＧＥＸ−ＮＮを得、次いで、ｐＧＥＸ−ＮＮを改変することによってｐＧＥＸ−ＮＮＨを得た。Ｇｓｔ−ｃｐｎタンパク質およびＧｓｔ−ｃｐｎ―Ｈｉｓタンパク質を、それぞれ、ｐＧＥＸ−ＮＮおよびｐＧＥＸ−ＮＮＨ中に得た。
【０１９３】
１個のみの二重制限酵素での消化後に全ての３つのベクターにおいて単一増幅産物をクローニングし、そして最終組換えタンパク質において外来アミノ酸の存在を最小化することを目的として、ｐＧＥＸ−ＫＧベクターの改変バージョンを作製した。
【０１９４】
（（Ａ）ｐＧＥＸ−ＮＮ発現ベクターおよびｐＧＥＸ−ＮＮＨ発現ベクターの構築）
２組の相補鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドを、ＤＮＡ合成機ＡＢＩ３９４（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）およびＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）からの試薬を用いて合成した。等モル量のオリゴ対（各オリゴ５０ｎｇ）を、最終容量５０μｌのＴ４　ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）中で１０分間アニーリングし、次いで、ゆっくりと冷却するために室温に放置した。記載した手順を用いて、以下のＤＮＡリンカーを得た。
【０１９５】
【表１ａ】
2004502415.tif 000003
プラスミドｐＧＥＸ−ＫＧをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして１００ｎｇを、２００ユニットのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて３：１のリンカー／プラスミドのモル比でリンカーｇｅｘＮＮと１６℃で一晩連結させた。Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５における連結産物の形質転換後、ｐＧＥＸ−ＮＮプラスミド（正確なリンカーを有する）を含むクローンを、制限酵素分析およびＤＮＡ配列決定によって選択した。
【０１９６】
新規プラスミドｐＧＥＸ−ＮＮを、ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてｇｅｘＮＮＨと連結した。Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５における連結産物の形質転換後、ｐＧＥＸ−ＮＮＨプラスミド（正確なリンカーを有する）を含むクローンを、制限酵素分析およびＤＮＡ配列決定によって選択した。
【０１９７】
（（Ｂ）染色体ＤＮＡ調製）
Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　１０Ｌ−２０７株の基本小体（ＥＢ）の染色体ＤＮＡを、１．５ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．６％　ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ、ｐＨ８）を４５０μｌ　ＥＢ懸濁液（４００．０００／μｌ）に添加し、そして３７℃で一晩インキュベートすることによって調製した。フェノール、フェノール−クロロホルム、およびクロロホルムを用いた連続抽出の後、ＤＮＡを０．３Ｍ　酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および２容量の無水エタノールを用いて沈澱させた。ＤＮＡペレットを、７０％　エタノールを用いて洗浄した。蒸留水を用いた可溶化および２０μｇ／ｍｌ　ＲＮＡｓｅ　Ａを用いた室温で１時間の処理後、ＤＮＡを再び、フェノール−クロロホルムで抽出し、アルコール沈澱し、そして３００μｌ　１ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に懸濁した。ＤＮＡ濃度を、サンプルのＯＤ２６０を測定することによって評価した。
【０１９８】
（（Ｃ）オリゴヌクレオチド設計）
合成オリゴヌクレオチドプライマーを、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　ＣＷＬ０２９株の配列を用いて各ＯＲＦのコード配列に基づいて設計した。推定リーダー配列の直ぐ下流にある５’末端増幅プライマー配列を推定することによって、任意の推定シグナルペプチドを排除した。ほとんどのＯＲＦに関して、プライマーの５’テイル（表Ｉ）は、制限酵素認識部位を１つだけ含み（遺伝子自体の制限パターンに依存して、ＮｄｅＩ、またはＮｈｅＩ、またはＳｐｅＩ）；３’プライマーテイル（表Ｉ）は、ＸｈｏＩまたはＮｏｔＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含んだ。
【０１９９】
【表１ｂ】
2004502415.tif 000004
制限酵素認識配列を含むことと同様に、プライマーは、増幅される配列にハイブリダイズするヌクレオチドを含んだ。ハイブリダイズするヌクレオチドの数は、記載されるように［（Ｂｒｅｓｌａｕｅｒら（１９８６）ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８３：３７４６−５０）］決定されたプライマーの融解温度に依存した。選択したオリゴの平均融解温度は、ハイブリダイゼーション領域単独については５０〜５５℃であり、全オリゴについては６５〜７５℃であった。表ＩＩは、各増幅に使用した順方向プライマーおよび逆方向プライマーを示す。
【０２００】
（（Ｄ）増幅）
標準的なＰＣＲプロトコールは、以下のようであった：１００μｌの最終容量中、０．２μＭ　各プライマー、２００μＭ　各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｍｇ不含）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、および２ユニットのＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｌａｔｉｎｕｍ　Ｔａｑ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）の存在下、５０ｎｇ　ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用した。各サンプルに、二工程増幅を実施した：第１の５サイクルは、オリゴのうちの１つが制限酵素テイルを排除するようなハイブリダイゼーション温度を用いて実行し、続く２５サイクルは、プライマー全長のハイブリダイゼーション温度に従って実行した。標準的なサイクルは、以下のようであった。
【０２０１】
【表１ｃ】
2004502415.tif 000005
伸長時間は、２０００ｂｐよりも短いＯＲＦについては１分間であり、２０００ｂｐよりも長いＯＲＦについては２分４０秒間であった。増幅を、Ｇｅｎｅ　Ａｍｐ　ＰＣＲシステム９６００（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）を用いて実行した。
【０２０２】
増幅結果の確認をするために、４μｌの各ＰＣＲ産物を、１〜１．５アガロースゲルに充填し、そして増幅フラグメントのサイズを、ＤＮＡ分子量標準と比較した（ＤＮＡマーカーＩＩＩまたはＩＸ、Ｒｏｃｈｅ）。ＰＣＲ産物を、アガロースゲルに充填し、そして電気泳動の後、正確なサイズのバンドを、ゲルから切り出した。ＤＮＡを、製造業者らの指示書に従ってＧｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてアガロースゲルから精製した。ＤＮＡの最終溶出容量は、５０μｌ　ＴＥ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８）であった。１μｌの各精製ＤＮＡを、アガロースゲルに充填し、収量を評価した。
【０２０３】
（（Ｅ）ＰＣＲフラグメントの消化）
１〜２μｇの精製ＰＣＲ産物を、最終容量１００μｌ中、適切な制限緩衝液を用いて適切な制限酵素（各酵素６０ユニット）で、３７℃で一晩二重消化した。制限酵素および消化緩衝液は、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ製であった。消化ＤＮＡの精製（ＰＣＲ　精製キット、Ｑｉａｇｅｎ）および３０μｌ　ＴＥを用いての溶出後、１μｌを、アガロースゲル電気泳動に供し、滴定した分子量標準（ＤＮＡマーカーＩＩＩまたはＩＸ、Ｒｏｃｈｅ）と比較して収量を評価した。
【０２０４】
（（Ｆ）クローニングベクター（ｐＥＴ２１ｂ＋、ｐＧＥＸ−ＮＮ、およびｐＧＥＸ−ＮＮＨ）の消化）
１０μｇのプラスミドを、適切な緩衝液の存在下、４００μｌの反応溶液中に１００ユニットの各制限酵素を用いて、一晩３７℃でのインキュベーションによって二重消化した。１％アガロースゲルでの電気泳動後、消化したベクターに対応するバンドを、Ｑｉａｇｅｎ　Ｑｉａｅｘ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いてゲルから精製し、そしてＤＮＡを、５０μｌ　ＴＥを用いて溶出した。ＤＮＡ濃度を、サンプルのＯＤ２６０を測定することによって評価した。
【０２０５】
（（Ｇ）クローニング）
適切に消化し、そして精製した７５ｎｇのベクターおよび各ＯＲＦに対応する消化し、そして精製したフラグメントを、１：１　フラグメント／ベクターのモル比で１０〜２０μｌの最終容量中、製造業者らによって供給された緩衝液の存在下で４００ユニットのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて連結した。反応物を、１６℃で一晩インキュベートした。
【０２０６】
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５コンピテント細胞における形質転換を、以下のように実施した：連結反応物を、２００μｌのコンピテントＤＨ５細胞と混合し、氷上で３０分間インキュベートし、次いで、４２℃で９０秒間インキュベートした。氷上で冷却した後、０．８ｍｌのＬＢを添加し、そして細胞を振とうさせながら３７℃で４５分間インキュベートした。１００μｌおよび９００μｌの細胞懸濁液を、別々の寒天ＬＢ　１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンプレートに播き、そしてこのプレートを、３７℃で一晩インキュベートした。６ｍｌ　ＬＢ　１００μｇ／ｍｌ　アンピシリン中で無作為に選択したクローンを増殖させ、製造業者らの指示書に従ってＱｉａｇｅｎ　Ｑｉａｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔを用いてＤＮＡを抽出し、そして制限クローニング部位に特異的な制限酵素を用いて２μｌのプラスミドミニ調製物を消化することによって、形質転換体のスクリーニングを実施した。消化したプラスミドミニ調製物のアガロースゲル電気泳動後、ポジティブクローンを、適切な分子量マーカー（ＤＮＡマーカーＩＩＩまたはＩＸ、Ｒｏｃｈｅ）との比較によって評価されるように、制限フラグメントの正確なサイズに基づいて選択した。
【０２０７】
（（Ｈ）発現）
１μｌの各ｒｉｇｈｔプラスミドミニ調製物を、その組換えタンパク質の発現に適したコンピテントＥ．ｃｏｌｉ株２００μｌ中に形質転換した。すべてのｐＥＴ２１ｂ＋組換えプラスミドをＢＬ２１　ＤＥ３（Ｎｏｖａｇｅｎ）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中に形質転換し、一方、すべてのｐＧＥＸ−ＮＮ組換えプラスミドおよびすべてのｐＧＥＸ−ＮＮＨ組換えプラスミドを、ＢＬ２１細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）中に形質転換した。ＬＢ／Ａｍｐ寒天プレート上に形質転換混合物をプレーティングしそして３７℃で一晩インキュベートした後、単コロニーを、３ｍｌのＬＢ　１００μｇ／ｍｌアンピシリン中に接種し、そして３７℃で一晩増殖させた。この一晩培養物７０μｌを、２ｍｌのＬＢ／Ａｍｐ中に接種し、そしてｐＥＴクローンのＯＤ６００が０．４〜０．８の値になるまでかまたはｐＧＥＸクローンのＯＤ６００が０．８〜１の値になるまで、３７℃で増殖させた。その後、そのミニ培養物にＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄチオ−ガラクト−ピラノシド）を添加することによって、タンパク質発現を誘導した。１ｍＭ　ＩＰＴＧを使用してｐＥＴクローンを誘導し、一方、０．２ｍＭ　ＩＰＴＧを使用してｐＧＥＸクローンを誘導した。３７℃で３時間インキュベーションした後、最終ＯＤ６００をチェックし、そしてその培養物を氷上で冷却した。０．５ｍｌ培養物を遠心分離した後、その細胞ペレットを、５０μｌのタンパク質ローディングサンプル緩衝液（６０ｍｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、５％ｗ／ｖ　ＳＤＳ、１０％ｖ／ｖグリシン、０．１％ｗ／ｖブロモフェノールブルー、１００ｍＭ　ＤＴＴ）中に懸濁し、そして、１００℃で５分間インキュベートした。０．１ＯＤ６００培養物に対応する量の煮沸サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色によって分析して、誘導されたタンパク質のバンドの存在を確認した。
【０２０８】
（組換えタンパク質の精製）
単コロニーを、２５ｍｌ　ＬＢ　１００μｇ／ｍｌアンピシリン中に接種し、そして３７℃で一晩増殖させた。この一晩培養物を、５００ｍｌ　ＬＢ／Ａｍｐ中に接種し、そして２５℃で振盪しながら、ｐＥＴクローンについてＯＤ６００が０．４〜０．８の値になるまで、またはｐＧＥＸクローンについてＯＤ６００が０．８〜１の値になるまで、増殖させた。その後、その培養物にＩＰＴＧを添加することによってタンパク質発現を誘導した。ｐＥＴクローンは、１ｍＭ　ＩＰＴＧを使用して誘導し、一方ｐＧＥＸクローンは、０．２ｍＭ　ＩＰＴＧを使用して誘導した。２５℃で４時間インキュベーションした後、最終ＯＤ６００をチェックし、そしてその培養物を氷上で冷却した。６０００ｒｐｍでの遠心分離（ＪＡ１０ローター、Ｂｅｃｋｍａｎ）の後、その細胞ペレットを、精製のために処理するか、または−２０℃で凍結した。
【０２０９】
（（Ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉからの可溶性Ｈｉｓタグ化タンパク質の精製手順）
１．そのペレットを、−２０℃から氷浴へと移し、そして１０ｍｌの５０ｍＭ　ＮａＨＰＯ４緩衝液、３００ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で再構成し、４０〜５０ｍＬ遠心管中に移し、そして以下の概略により細胞を破壊する：
２．Ｆｒｅｎｃｈ　Ｐｒｅｓｓにおいてそのペレットを破壊し、インライン（ｉｎ−ｌｉｎｅ）洗浄しながら３回通過を行う。
３．約３０〜４００００×ｇで１５〜２０分間遠心分離する。可能ならば、ローターＪＡ　２５．５０（２１０００ｒｐｍ、１５分）またはＪＡ−２０（１８０００ｒｐｍ、１５分）を使用する。
４．１ｍｌ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂を含むＰｏｌｙ−Ｐｒｅｐカラムを、５０ｍＭリン酸緩衝液、３００ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化する。
５．遠心分離ペレットを−２０℃で貯蔵し、そしてその上清をカラムにローディングする。
６．フロースルーを収集する。
７．カラムを、１０ｍｌ（２ｍｌ＋２ｍｌ＋４ｍｌ）の５０ｍＭリン酸緩衝液、３００ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄する。
８．１０ｍｌの２０ｍＭイミダゾール緩衝液、５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で再度洗浄する。
９．４．５ｍｌ（１．５ｍｌ＋１．５ｍｌ＋１．５ｍｌ）の２５０ｍＭイミダゾール緩衝液、５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて、カラムに結合したタンパク質を溶出させ、そして、対応する各々約１．５ｍｌの３つの画分を収集する。各管に、１５μｌのＤＴＴ　２００ｍＭ（最終濃度２ｍＭ）を添加する。
１０．最初の２つの画分のタンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いて測定し、各サンプルから１０μｇタンパク質アリコートを収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。（サンプルが希釈され過ぎた場合、２１μｌ＋７μｌローディング緩衝液をローディングすることに注意のこと）。
１１．収集した画分を＋４℃にて貯蔵し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を待つ。
１２．免疫のために、０．５ｍｌ中で各々が４０％グリセロール中１００μｇのアリコート４〜５個を調製する。希釈緩衝液は、上記の溶出緩衝液＋２ｍＭ　ＤＴＴである。免疫するまで、そのアリコートを−２０℃で貯蔵する。
【０２１０】
（（Ｊ）封入体からのＨｉｓタグ化タンパク質の精製）
以下のプロトコルに基本的には従って、精製を実行した：
１．遠心分離によって、５００ｍｌ培養物から細菌を収集する。必要な場合は、細菌ペレットを−２０℃で貯蔵する。抽出のために、氷浴上で、１０ｍｌの５０ｍＭ　ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）中に各細菌ペレットを再懸濁する。
２．再懸濁した細菌を、Ｆｒｅｎｃｈ　Ｐｒｅｓｓで破壊し、２回通過を行う。
３．３５０００×ｇで１５分間遠心分離し、そしてペレットを収集する。ＢｅｃｋｍａｎローターＪＡ　２５．５０（２１０００ｒｐｍ、１５分）またはＪＡ−２０（１８０００ｒｐｍ、１５分）を使用する。
４．５０ｍＭ　ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、１ｍＭ　ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）−ホスフィン塩酸塩、Ｐｉｅｒｃｅ）、６Ｍ塩化グアニジウム（ｐＨ８．５）で遠心分離ペレットを溶解する。磁気棒を用いて約１０分間攪拌する。
５．上記のように遠心分離し、そして上清を収集する。
６．１ｍｌのＮｉｃｈｅｌ飽和Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含むＰｏｌｙ−Ｐｒｅｐ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カラムを、製造業者の推奨に従って、十分な数調製する。５ｍｌのＨ２Ｏでそのカラムを２回洗浄し、そして５０ｍＭ　ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、１ｍＭ　ＴＣＥＰ、６Ｍ塩化グアニジウム（ｐＨ８．５）で平衡化する。
７．工程５からの上清を、このカラム上にローディングし、そして５ｍｌの５０ｍＭ　ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液、１ｍＭ　ＴＣＥＰ、６Ｍ尿素（ｐＨ８，５）で洗浄する。
８．１０ｍｌの２０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ　ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、６Ｍ尿素、１ｍＭ　ＴＣＥＰ（ｐＨ８．５）でカラムを洗浄する。可能なさらなるコントロールのために、最初の５ｍｌを収集して取っておく。
９．４．５ｍｌの緩衝液（２５０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ　ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、６Ｍ尿素、１ｍＭ　ＴＣＥＰ（ｐＨ８．５）を含む）で、カラムに結合したタンパク質を溶出する。３つの１．５ｍｌアリコートにこの溶出緩衝液を添加し、そして対応する３つの画分を収集する。各画分に、１５μｌ　ＤＴＴ（最終濃度２ｍＭ）を添加する。
１０．Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により溶出タンパク質濃度を測定し、そして約１０μｇのタンパク質アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。
１１．４０％（ｖ／ｖ）グリセロール、５０ｍＭ　ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、２Ｍ尿素、０．５アルギニン、２ｍＭ　ＤＴＴ、０．３　ＴＣＥＰ、８３．３ｍＭイミダゾール（ｐＨ８．５）中に、−２０℃でタンパク質を貯蔵する。
【０２１１】
（（Ｋ）Ｅ．ｃｏｌｉからのＧＳＴ−融合タンパク質の精製手順）
１．−２０℃から氷浴へと細菌ペレットを移し、そしてプロテアーゼインヒビター（ＣＯＭＰＬＥＴＥＴＭ−Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、２５ｍｌ緩衝液ごとに１錠）の混合物を添加した７．５ｍｌ　ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で再懸濁する。４０〜５０ｍｌ遠心管へと移し、そして以下の手順に従って超音波処理する：
ａ）プローブを、管の底から約０．５ｃｍの位置にする
ｂ）管をクランプでブロックする
ｃ）管を氷浴に浸す
ｄ）ソニケーターを以下のように設定する：Ｔｉｍｅｒ→Ｈｏｌｄ、Ｄｕｔｙ　Ｃｙｃｌｅ→５５、Ｏｕｔ．Ｃｏｎｔｒｏｌ→６。
【０２１２】
ｅ）時間経過１分で１０インパルスのサイクルを５回実施する（すなわち、１サイクル＝１０インパルス＋約４５秒ホールド；ｂ．１０インパルス＋約４５秒ホールド；ｃ．１０インパルス＋約４５秒ホールド；ｄ．１０インパルス＋約４５秒ホールド；ｅ．１０インパルス＋約４５秒ホールド。
２．約３０〜４００００×ｇで１５〜２０分間遠心分離する。例えば、ローターＢｅｃｋｍａｎ　ＪＡ　２５．５０を２１０００ｒｐｍで１５分間使用する。
３．−２０℃にて遠心ペレットを貯蔵し、そして上清を、以下のようにしてクロマトグラフィーカラムにローディングする。
４．０．５ｍｌ（≡１ｍｌ懸濁物）のＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ樹脂）を含むＰｏｌｙ−Ｐｒｅｐ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カラムを、２ｍｌ（１ｍｌ＋１ｍｌ）Ｈ２Ｏで洗浄し、その後、１０ｍｌ（２ｍｌ＋２ｍｌ＋４ｍｌ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化する。
５．上清をカラムにローディングし、そしてフロースルーを捨てる。
６．カラムを、１０ｍｌ（２ｍｌ＋２ｍｌ＋４ｍｌ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄する。
７．４．５ｍｌの５０ｍＭ　ＴＲＩＳ緩衝液、１０ｍＭ還元グルタチオン（ｐＨ８．０）を１．５ｍｌ＋１．５ｍｌ＋１．５ｍｌのように添加して、カラムに結合したタンパク質を溶出させ、そして、対応する各々約１．５ｍｌの３つの画分を収集する。
８．最初の２つの画分のタンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いて測定し、各サンプルからの１０μｇタンパク質アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。（サンプルが希釈され過ぎた場合、２１μｌ（＋７μｌローディング緩衝液）をローディングすることに、注意すること）。
９．収集した画分を＋４℃にて貯蔵し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を待つ。
１０．免疫する予定の各タンパク質について、０．５ｍｌ中で各々が４０％グリセロール中１００μｇのアリコート４〜５個を調製する。希釈緩衝液は、５０ｍＭ　ＴＲＩＳ・ＨＣＬ、２ｍＭ　ＤＴＴ（ｐＨ８．０）である。免疫するまで、そのアリコートを−２０℃で貯蔵する。
【０２１３】
（血清学）
（（Ｌ）免疫のプロトコル）
１．４匹の６〜７週齢のＣＤ１雌性マウスのグループを、１００μｌ中に再懸濁した組換えタンパク質２０μｇで免疫した。
２．各グループ４匹のマウスに、３回投与を１４日間間隔スケジュールで与えた。
３．免疫は、タンパク質の腹腔内注射を介して行い、最初の投与については等量の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）とともに、そしてその後の２回投与については不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）とともに行った。
４．各免疫の前に血清を収集した。３回目の免疫の１４日後にマウスを屠殺し、そして収集した血清をプールして、−２０℃で貯蔵した。
【０２１４】
（（Ｍ）マウス血清を用いる、Ｃｐｎ基本小体タンパク質のウェスタンブロット分析）
ＳＤＳローディング緩衝液（１×：６０ｍＭ　ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、５％　ｗ／ｖ　ＳＤＳ、１０％　ｖ／ｖグリセリン、０．１％　Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ　Ｂｌｕｅ、１００ｍＭ　ＤＴＴ）と混合し９５℃で５分間煮沸した約４μｇのタンパク質を含む、基本小体のアリコートを、１２％　ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にローディングした。このゲルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動緩衝液（２５０ｍＭ　ＴＲＩＳ，２．５ｍＭ　Ｇｌｙｃｉｎｅおよび０．１％　ＳＤＳを含む）を使用して泳動した。このゲルを、ニトロセルロース膜上に２００ｍＡにて３０分間エレクトロブロットした。この膜を、ＰＢＳ、３％スキムミルク粉末を用いて３０分間ブロックし、そして適切な血清希釈物（１／１００）とともに４℃にて一晩インキュベートした。ＰＢＳ＋０．１％　Ｔｗｅｅｎ（Ｓｉｇｍａ）で２回洗浄した後、１：３０００希釈したペルオキシダーゼ結合体化二次抗マウス抗体（Ｓｉｇｍａ）とともに、この膜を２時間インキュベートした。このニトロセルロースを、ＰＢＳ＋０．１％　Ｔｗｅｅｎ−２０で１０分間２回洗浄し、そして１回ＰＢＳで洗浄し、その後、Ｏｐｔｉ−４ＣＮ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｋｉｔ（Ｂｉｏｒａｄ）により発色させた。
【０２１５】
ウェスタンブロットにて示されるレーンは、（Ｐ）＝免疫前コントロール血清；（Ｉ）＝免疫血清である。
【０２１６】
（（Ｎ）マウス血清を用いる、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ基本小体のＦＡＣＳ分析）
１．２×１０５個の基本小体（ＥＢ）／ウェルを、９６ウェルＵ底プレート中で２００μｌのＰＢＳ−０．１％　ＢＳＡで洗浄し、そして４℃にて１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
２．その上清を捨て、そしてＥ．Ｂ．を、１０μｌのＰＢＳ−０．１％　ＢＳＡ中に再懸濁した。
３．ＰＢＳ−０．１％　ＢＳＡ中に希釈した１０μｌマウス血清を、最終希釈１：４００までＥ．Ｂ．懸濁物に添加し、そして氷上で３０分間インキュベートした。
４．１８０μ　ＰＢＳ−０．１％　ＢＳＡを添加することによってＥＢを洗浄し、そして４℃にて１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
５．上清を捨て、そしてＥ．Ｂ．を、１０μｌのＰＢＳ−０．１％　ＢＳＡ中に再懸濁した。
６．１０μｌのヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆ（ａｂ’）２フラグメント特異的Ｒ−フィコエリトリン結合体化）（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．、カタログ番号１１５−１１６−０７２）を、最終希釈１：１００までこのＥＢ懸濁物に添加し、そして暗いところで３０分間、氷上でインキュベートした。
７．１８０μ　ＰＢＳ−０．１％　ＢＳＡを添加することによってＥＢを洗浄し、そして４℃にて１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
８．５．上清を捨て、そしてＥ．Ｂ．を、１５０μｌのＰＢＳ−０．１％　ＢＳＡ中に再懸濁した。
９．Ｅ．Ｂ．懸濁物を、ＦＡＣＳ　Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ、ＣＡ　ＵＳＡ）のサイトメトリーチャンバーに通し、１０．０００事象を得た。
１０．Ｃｅｌｌ　Ｑｕｅｓｔ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ、ＣＡ　ＵＳＡ）を使用し、Ｅ．Ｂ．シグナルに対する形態学的ドットプロットを（前方散乱パラメーターおよび側方散乱パラメーターを使用して）描くことによって、データを分析した。その後、蛍光対数スケールのＦＬ２強度に対するヒストグラムプロットを作製し、ＥＢの形態学的領域を想起した。
【０２１７】
注意：ＦＡＣＳの結果は、ネイティブ抗原の接近性の程度に依存するだけでなく、組換え抗原により惹起される抗体（これは、ネイティブのタンパク質構造と比較して、変化する程度で正確にフォールディングする構造を有し得る）の質にも依存する。従って、たとえＦＡＣＳアッセイがネガティブに見えても、このことは、そのタンパク質が表面上で豊富でも接近可能でもないとは、必ずしも意味しない。例えば、ＰｏｒＢ抗原は、ＦＡＣＳにおいてネガティブな結果を生じるが、表面に露出された中和抗原である［ＫｕｂｏおよびＳｔｅｐｈｅｎｓ（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３８：７７２〜７８０］。
【０２１８】
（（Ｏ）２次元電気泳動タンパク質マップの質量分析）
ＦＢ／９６株から段階的に精製したＥＢを、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ再水和緩衝液（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、２％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ、２％（ｗ／ｖ）ＡＳＢ　１４）［Ｃｈｅｖａｌｌｅｔら（１９９８）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒ．１９：１９０１〜９］、２％（ｖ／ｖ）Ｃ．Ａ．　３−１０ＮＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）、２ｍＭトリブチルホスフィン、６５ｍＭ　ＤＴＴ）を用いて、最終濃度５．５ｍｇ／ｍｌで可溶化した。サンプル（２５０μｇタンパク質）を、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ　ＤｒｙＳｔｒｉｐｓ（７ｃｍ、ｐＨ３〜１０、非直線）に一晩吸着させた。ＩＰＧｐｈｏｒ　Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　Ｆｏｃｕｓｉｎｇ　Ｕｎｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）にて、等電集束法を実施した。ＰＡＧＥ分離の前に、集束したストリップを、４Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、３０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、５ｍＭトリブチルホスフィン、２．５％（ｗ／ｖ）アクリルアミド、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）中で、記載されるように、インキュベートした［Ｈｅｒｂｅｒｔら（１９９８）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒ．１９：８４５〜５１］。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、９〜１６％の直線アクリルアミド勾配上で実施した。ゲルを、コロイド状のクマシー（Ｎｏｖｅｘ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ）を用いて染色した［Ｄｏｈｅｒｔｙら（１９９８）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒ．１９：３５５〜６３］。染色したゲルを、Ｐｅｒｓｏｎａｌ　Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ　ＳＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて、８ビットおよび５０μｍ／ピクセルにてスキャンした。マップイメージに、ソフトウェアＩｍａｇｅ　Ｍａｓｔｅｒ　２Ｄ　Ｅｌｉｔｅ，ｖｅｒｓｉｏｎ　３．１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて注釈をつけた。タンパク質スポットを、Ｅｔｔａｎ　Ｓｐｏｔ　ｐｉｃｋｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してこのゲルから切り出し、そして真空遠心分離機にて乾燥した。質量分析のためのサンプルのゲル中消化およびペプチド抽出を、Ｗｉｌｍら［Ｎａｔｕｒｅ（１９９６）３７９：４６６〜９］により記載されるように実施した。サンプルを、ＺＩＰ　ＴＩＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて脱塩し、５０％アセトニトリル、０．１％　ＴＦＡ中のα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸飽和溶液を用いて抽出し、そしてＳＣＯＵＴ　３８１マルチプローブプレート（Ｂｒｕｋｅｒ）上に直接ローディングした。Ｂｒｕｋｅｒ　Ｂｉｆｌｅｘ　ＩＩ　ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ上でスペクトルを得た。既知の標準ペプチドの組み合わせを使用して、スペクトルを較正し、サンプルに近接したスポット中に位置付けた。得られた単一同位体ピークについての値を、コンピュータープログラムＭａｓｃｏｔ（ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）を使用するデータベースサーチのために使用した。すべてのサーチを、制約条件として誤差２００〜５００ｐｐｍを使用して実施した。代表的ゲルを、図１９０にて示す。
【０２１９】
（実施例１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６５５２）を発現させた（配列番号１；ｃｐ６５５２）：
【０２２０】
【化１】
2004502415.tif 000006
推定シグナルペプチドが強調されている。
【０２２１】
ｃｐ６５５２ヌクレオチド配列（配列番号２）は、以下である：
【０２２２】
【化２】
2004502415.tif 000007
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜の位置を推定する（０．１２７）。
【０２２３】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図１Ａに示されるようにｈｉｓタグ産物として精製し、そしてまたＧＳＴ融合物としても精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウエスタンブロット（図１Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図１Ｃ）のために使用した。
【０２２４】
このｃｐ６５５２タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定した（Ｃｐｎ０２７８）。
【０２２５】
これらの実験により、ｃｐ６５５２は、表面露出した免疫アクセス可能な（ｉｍｍｕｎｏａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）タンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０２２６】
（実施例２）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６７３６）を発現させた（配列番号３；ｃｐ６７３６）：
【０２２７】
【化３】
2004502415.tif 000008
推定シグナルペプチドが強調されている。
【０２２８】
ｃｐ６７３６ヌクレオチド配列（配列番号４）は、以下である：
【０２２９】
【化４】
2004502415.tif 000009
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、外膜の位置を推定する（０．９１７）。
【０２３０】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図２Ａに示されるようにｈｉｓタグ産物として精製し、そしてまたＧＳＴ融合物としても精製した。両方のタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウエスタンブロット（図２Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図２Ｃ）のために使用した。
【０２３１】
このｃｐ６７３６タンパク質はまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定され（Ｃｐｎ０４５３）、そしてヒト血清（肺炎を有する患者由来の血清を含む）との良好な交差反応性を示した。
【０２３２】
これらの実験により、ｃｐ６７３６は、表面露出した免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０２３３】
（実施例３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６７５１）を発現させた（配列番号５；ｃｐ６７５１）：
【０２３４】
【化５】
2004502415.tif 000010
推定シグナルペプチドが強調されている。
【０２３５】
ｃｐ６７５１ヌクレオチド配列（配列番号６）は、以下である：
【０２３６】
【化６】
2004502415.tif 000011
2004502415.tif 000012
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、外膜の位置を推定する（０．９２３）。
【０２３７】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図３Ａに示されるようにＧＳＴ融合物として精製し、そしてまたｈｉｓタグ化形態で精製した。ＧＳＴ融合組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウエスタンブロット（図３Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図３Ｃ）のために使用した。
【０２３８】
このタンパク質はまた、ヒト血清（肺炎を有する患者由来の血清を含む）との良好な交差反応性を示した。
【０２３９】
これらの実験により、ｃｐ６７５１は、表面露出した免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０２４０】
（実施例４）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６７５２）を発現させた（配列番号７；ｃｐ６７５２）：
【０２４１】
【化７】
2004502415.tif 000013
ｃｐ６７５２ヌクレオチド配列（配列番号８）は、以下である：
【０２４２】
【化８】
2004502415.tif 000014
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質の位置を推定する（０．１３８）。
【０２４３】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図４Ａに示されるようにｈｉｓタグ産物として精製し、そしてまたＧＳＴ融合物としても精製した。これらの組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウエスタンブロット（４Ｂ）において使用し、そしてｈｉｓタグ化タンパク質をＦＡＣＳ分析（４Ｃ）のために使用した。
【０２４４】
このｃｐ６７５２タンパク質はまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定された（Ｃｐｎ０４６７）。
【０２４５】
これらの実験により、ｃｐ６７５２は、表面露出した免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０２４６】
（実施例５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６８５０）を発現させた（配列番号９；ｃｐ６８５０）：
【０２４７】
【化９】
2004502415.tif 000015
推定シグナルペプチドが強調されている。
【０２４８】
ｃｐ６８５０ヌクレオチド配列（配列番号１０）は、以下である：
【０２４９】
【化１０】
2004502415.tif 000016
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜の位置を推定する（０．３２９）。
【０２５０】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図５Ａに示されるようにＧＳＴ融合産物として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウエスタンブロット（図５Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図５Ｂ）のために使用した。ｈｉｓタグ化タンパク質もまた発現させた。
【０２５１】
これらの実験により、ｃｐ６８５０は、表面露出した免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０２５２】
（実施例６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６９００）を発現させた（配列番号１１；ｃｐ６９００）：
【０２５３】
【化１１】
2004502415.tif 000017
ｃｐ６９００ヌクレオチド配列（配列番号１２）は、以下である：
【０２５４】
【化１２】
2004502415.tif 000018
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜の位置を推定する（０．４５２）。
【０２５５】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図６Ａに示されるようにＧＳＴ融合物として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をＦＡＣＳ分析（図６Ｂ）のために使用した。ｈｉｓタグ化タンパク質もまた発現させた。
【０２５６】
このｃｐ６９００タンパク質はまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定された（Ｃｐｎ０６０４）。
【０２５７】
これらの実験により、ｃｐ６９００は、表面露出した免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０２５８】
（実施例７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７０３３）を発現させた（配列番号１３；ｃｐ７０３３）：
【０２５９】
【化１３】
2004502415.tif 000019
ｃｐ７０３３ヌクレオチド配列（配列番号１４）は、以下である：
【０２６０】
【化１４】
2004502415.tif 000020
2004502415.tif 000021
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質の位置を推定する（０．２７２）。
【０２６１】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図７Ａに示されるようにＧＳＴ融合物として精製した。ｈｉｓタグ化タンパク質もまた発現させた。これらの組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をＦＡＣＳ分析（図７Ｂ）、およびウエスタンブロット（図７Ｃ）のために使用した。
【０２６２】
このｃｐ７０３３タンパク質はまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定され（Ｃｐｎ０７２８）、そしてヒト血清（肺炎を有する患者由来の血清を含む）との良好な交差反応性を示した。
【０２６３】
これらの実験により、ｃｐ７０３３は、表面露出した免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０２６４】
（実施例８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　６１７２３２１）を発現させた（配列番号１５；ｃｐ００１７）：
【０２６５】
【化１５】
2004502415.tif 000022
ｃｐ００１７ヌクレオチド配列（配列番号１６）は、以下である：
【０２６６】
【化１６】
2004502415.tif 000023
この配列は、ｃｐ００１６に関してフレームシフトしている。
【０２６７】
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質の位置を推定する（０．０７５）。
【０２６８】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図８Ａに示されるようにＧＳＴ融合物として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウエスタンブロット（図８Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図８Ｃ）のために使用した。ｈｉｓタグ化タンパク質もまた発現させた。
【０２６９】
このタンパク質はまた、ヒト血清（肺炎を有する患者由来の血清を含む）との良好な交差反応性を示した。
【０２７０】
これらの実験により、ｃｐ００１７は、表面露出した免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０２７１】
（実施例９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　６１７２３１５）を発現させた（配列番号１７；ｃｐ００１４）：
【０２７２】
【化１７】
2004502415.tif 000024
ｃｐ００１７ヌクレオチド配列（配列番号１８）は、以下である：
【０２７３】
【化１８】
2004502415.tif 000025
このタンパク質は、ｃｐ００１５に関してフレームシフトしている。
【０２７４】
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜の位置を推定する（０．０４７）。
【０２７５】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図９Ａに示されるようにｈｉｓタグ産物として精製した。ＧＳＴ融合物もまた発現させた。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をイムノアッセイ（図９Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図９Ｃ）のために使用した。
【０２７６】
このタンパク質はまた、ヒト血清（肺炎を有する患者由来の血清を含む）との良好な交差反応性を示した。
【０２７７】
これらの実験は、ｃｐ００１４が有用な免疫原であることを示唆する。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０２７８】
（実施例１０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　６１７２３１７）を発現させた（配列番号１９；ｃｐ００１５）：
【０２７９】
【化１９】
2004502415.tif 000026
この配列は、ｃｐ００１４に関してフレームシフトしている。
【０２８０】
ｃｐ００１５ヌクレオチド配列（配列番号２０）は、以下である：
【０２８１】
【化２０】
2004502415.tif 000027
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質の位置を推定する（０．２７４）。
【０２８２】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図１０Ａに示されるようにＧＳＴ融合物として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウエスタンブロット（図１０Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。ｈｉｓタグ化タンパク質もまた発現させた。
【０２８３】
これらの実験により、ｃｐ００１５は、有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０２８４】
（実施例１１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　６１７２３２５）を発現させた（配列番号２１；ｃｐ００１９）：
【０２８５】
【化２１】
2004502415.tif 000028
この配列は、ｃｐ００１８に関してフレームシフトしている。
【０２８６】
ｃｐ００１９ヌクレオチド配列（配列番号２２）は、以下である：
【０２８７】
【化２２】
2004502415.tif 000029
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質の位置を推定する（０．１８９）。
【０２８８】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図１１Ａに示されるようにＧＳＴ融合物として精製した。このタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウエスタンブロット（図１１Ｂ）および免疫ブロットアッセイ（図１１Ｃ）において使用した。ｈｉｓタグ化タンパク質もまた発現させた。
【０２８９】
これらの実験により、ｃｐ００１９は、有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０２９０】
（実施例１２）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６４６６）を発現させた（配列番号２３；ｃｐ６４６６）：
【０２９１】
【化２３】
2004502415.tif 000030
推定シグナルペプチドが強調されている。
【０２９２】
ｃｐ６４６６ヌクレオチド配列（配列番号２４）は、以下である：
【０２９３】
【化２４】
2004502415.tif 000031
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、このタンパク質が外膜リポタンパク質であることを推定する（０．７９０）。
【０２９４】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そしてＧＳＴ融合産物およびｈｉｓタグ融合産物の両方として精製した。このタンパク質のＧＳＴ融合産物としての精製は、図１２Ａに示される。これらの組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウエスタンブロット（図１２Ｂおよび１２Ｃ）において使用した。ＦＡＣＳ分析もまた行った。
【０２９５】
これらの実験により、ｃｐ６４６６は有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０２９６】
（実施例１３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６４６８）を発現させた（配列番号２５；ｃｐ６４６８）：
【０２９７】
【化２５】
2004502415.tif 000032
推定シグナルペプチドが強調されている。
【０２９８】
ｃｐ６４６８ヌクレオチド配列（配列番号２６）は、以下である：
【０２９９】
【化２６】
2004502415.tif 000033
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、このタンパク質が外膜リポタンパク質であることを推定する（０．７９０）。
【０３００】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図１３Ａに示されるようにＧＳＴ融合産物として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウエスタンブロット（図１３Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。ｈｉｓタグ化タンパク質もまた発現させた。
【０３０１】
これらの実験により、ｃｐ６４６８は、有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０３０２】
（実施例１４）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６４６９）を発現させた（配列番号２７；ｃｐ６４６９）：
【０３０３】
【化２７】
2004502415.tif 000034
推定シグナルペプチドが強調されている。
【０３０４】
ｃｐ６４６９ヌクレオチド配列（配列番号２８）は、以下である：
【０３０５】
【化２８】
2004502415.tif 000035
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、ヘリプラズムの位置を推定する（０．９３４）。
【０３０６】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図１４Ａに示されるようにＧＳＴ融合産物として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウエスタンブロット（図１４Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。ｈｉｓタグ化タンパク質もまた発現させた。
【０３０７】
これらの実験により、ｃｐ６４６９は、有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０３０８】
（実施例１５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６６０２）を発現させた（配列番号２９；ｃｐ６６０２）：
【０３０９】
【化２９】
2004502415.tif 000036
ｃｐ６６０２ヌクレオチド配列（配列番号３０）は、以下である：
【０３１０】
【化３０】
2004502415.tif 000037
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質の位置を推定する（０．０８０）。
【０３１１】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図１５Ａに示されるようにｈｉｓタグ産物およびＧＳＴ融合産物の両方として精製した。組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウエスタンブロット（図１５Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図１５Ｃ）のために使用した。
【０３１２】
このｃｐ６６０２タンパク質はまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定された（Ｃｐｎ０３２４）。
【０３１３】
これらの実験により、ｃｐ６６０２は、表面露出した免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０３１４】
（実施例１６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６７２７）を発現させた（配列番号３１；ｃｐ６７２７）：
【０３１５】
【化３１】
2004502415.tif 000038
推定シグナルペプチドが強調されている。
【０３１６】
ｃｐ６７２７ヌクレオチド配列（配列番号３２）は、以下である：
【０３１７】
【化３２】
2004502415.tif 000039
2004502415.tif 000040
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、外膜の位置を推定する（０．９１５）。
【０３１８】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図１６Ａに示されるようにｈｉｓタグ産物として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウエスタンブロット（図１６Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図１６Ｃ）のために使用した。ＧＳＴ融合タンパク質もまた発現させた。
【０３１９】
このｃｐ６７２７タンパク質はまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定された（Ｃｐｎ０４４４）。
【０３２０】
これらの実験により、ｃｐ６７２７は、表面露出した免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０３２１】
（実施例１７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６７３１）を発現させた（配列番号３３；ｃｐ６７３１）：
【０３２２】
【化３３】
2004502415.tif 000041
推定シグナルペプチドが強調されている。
【０３２３】
ｃｐ６７３１ヌクレオチド配列（配列番号３４）は、以下である：
【０３２４】
【化３４】
2004502415.tif 000042
2004502415.tif 000043
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、外膜の位置を推定する（０．９２６）。
【０３２５】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図１７Ａに示されるようにｈｉｓタグ産物として精製した。ＧＳＴ融合タンパク質もまた発現させた。これらの組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウエスタンブロット（図１７Ｂ；ｈｉｓタグ）においておよびＦＡＣＳ分析（図１７Ｃ；ｈｉｓタグおよびＧＳＴ融合物）のために使用した。
【０３２６】
このＧＳＴ融合タンパク質はまた、ヒト血清（肺炎を有する患者由来の血清を含む）との良好な交差反応性を示した。ｈｉｓ融合物を用いた場合に、交差反応性はほとんど観察されなかった。
【０３２７】
これらの実験により、ｃｐ６７３１は、表面露出した免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０３２８】
（実施例１８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６７３７）を発現させた（配列番号３５；ｃｐ６７３７）：
【０３２９】
【化３５】
2004502415.tif 000044
推定シグナルペプチドが強調されている。
【０３３０】
ｃｐ６７３７ヌクレオチド配列（配列番号３６）は、以下である：
【０３３１】
【化３６】
2004502415.tif 000045
2004502415.tif 000046
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、外膜の位置を推定する（０．９４０）。
【０３３２】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図１８Ａに示されるようにＧＳＴ融合産物として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をイムノブロット分析ブロット（図１８Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図１８Ｃ）のために使用した。ｈｉｓタグ化タンパク質もまた発現させた。
【０３３３】
このｃｐ６７３７タンパク質はまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定され（Ｃｐｎ０４５４）、そしてヒト血清（肺炎を有する患者由来の血清を含む）との良好な交差反応性を示した。
【０３３４】
これらの実験により、ｃｐ６７３７は、表面露出した免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０３３５】
（実施例１９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７０９０）を発現させた（配列番号３７；ｃｐ７０９０）：
【０３３６】
【化３７】
2004502415.tif 000047
推定シグナルペプチドが強調されている。
【０３３７】
ｃｐ７０９０ヌクレオチド配列（配列番号３８）は、以下である：
【０３３８】
【化３８】
2004502415.tif 000048
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、外膜の位置を推定する（０．７９０）。
【０３３９】
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そして図１９Ａに示されるように、ＧＳＴ融合産物として精製した。ヒスチジン標識タンパク質をまた、発現した。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（図１９Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【０３４０】
これらの実験は、ｃｐ７０９０が有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０３４１】
（実施例２０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７７０９１）を発現した＜配列番号３９；ｃｐ７０９１＞：
【０３４２】
【化３９】
2004502415.tif 000049
推定シグナルペプチドを強調する。
【０３４３】
このｃｐ７０９１ヌクレオチド配列＜配列番号４０＞は、以下の通りである：
【０３４４】
【化４０】
2004502415.tif 000050
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜位置を推測する（０．１０９）。
【０３４５】
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そして図２０Ａに示されるように、ＧＳＴ融合産物として精製した。ヒスチジン標識タンパク質をまた発現した。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（図２０Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【０３４６】
これらの実験は、ｃｐ７０９１が有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０３４７】
（実施例２１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６２６０）を発現した＜配列番号４１；ｃｐ６２６０＞：
【０３４８】
【化４１】
2004502415.tif 000051
推定シグナルペプチドを強調する。
【０３４９】
このｃｐ６２６０ヌクレオチド配列＜配列番号４２＞は、以下の通りである：
【０３５０】
【化４２】
2004502415.tif 000052
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、外膜位置を推測する（０．９２１）。
【０３５１】
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてヒスチジン標識産物およびＧＳＴ融合産物として両方を精製した。このＧＳＴ融合物を図２１Ａに示す。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（図２１Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図２１Ｃ）のために使用した。
【０３５２】
これらの実験はまた、肺炎を患った患者由来の血清を含む、ヒト血清と良好な交差反応を示した。
【０３５３】
このタンパク質はまた、ｃｐ６２６０が、表面に露出しており、そして免疫的にアクセス可能なタンパク質であり、そしてこれは有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０３５４】
（実施例２２）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６４５６）を発現した＜配列番号４３；ｃｐ６４５６＞：
【０３５５】
【化４３】
2004502415.tif 000053
このｃｐ６４５６ヌクレオチド配列＜配列番号４４＞は、以下の通りである：
【０３５６】
【化４４】
2004502415.tif 000054
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜位置を推測する（０．１２７）。
【０３５７】
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そして図２２Ａに示されるように、ＧＳＴ融合産物として精製した。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（図２２Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図２２Ｃ）のために使用した。ヒスチジン標識タンパク質をまた発現した。
【０３５８】
これらの実験は、ｃｐ６４５６が、表面に露出しており、そして免疫的にアクセス可能なタンパク質であり、そしてこれは有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０３５９】
（実施例２３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６７２９）を発現した＜配列番号４５；ｃｐ６７２９＞：
【０３６０】
【化４５】
2004502415.tif 000055
推定シグナルペプチドを強調する。
【０３６１】
このｃｐ６７２９ヌクレオチド配列＜配列番号４６＞は、以下の通りである：
【０３６２】
【化４６】
2004502415.tif 000056
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、外膜位置を推測する（０．９２７）。
【０３６３】
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そして図２３Ａに示されるように、ＧＳＴ融合産物として精製した。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（図２３Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図２３Ｃ）のために使用した。ヒスチジン標識タンパク質をまた発現した。
【０３６４】
このｃｐ６７２９タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験（Ｃｐｎ０４４６）において同定し、そして肺炎を患った患者由来の血清を含む、ヒト血清と良好な交差反応を示した。
【０３６５】
これらの実験は、ｃｐ６７２９が、表面に露出しており、そして免疫的にアクセス可能なタンパク質であり、そしてこれは有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０３６６】
（実施例２４）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６８４９）を発現した＜配列番号４７；ｃｐ６８４９＞：
【０３６７】
【化４７】
2004502415.tif 000057
推定シグナルペプチドを強調する。
【０３６８】
このｃｐ６８４９ヌクレオチド配列＜配列番号４８＞は、以下の通りである：
【０３６９】
【化４８】
2004502415.tif 000058
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞膜周辺腔位置を推測する（０．９３）。
【０３７０】
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そして図２４Ａに示されるように、ＧＳＴ融合産物として精製した。また、ヒスチジン標識タンパク質としても精製した。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（図２４Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図２４Ｃ）のために使用した。
【０３７１】
このｃｐ６８４９タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験（Ｃｐｎ０５５７）において同定した。
【０３７２】
これらの実験は、ｃｐ６８４９が、表面に露出しており、そして免疫的にアクセス可能なタンパク質であり、そしてこれは有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０３７３】
（実施例２５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６２７３）を発現した＜配列番号４９；ｃｐ６２７３＞：
【０３７４】
【化４９】
2004502415.tif 000059
推定シグナルペプチドを強調する。
【０３７５】
このｃｐ６２７３ヌクレオチド配列＜配列番号５０＞は、以下の通りである：
【０３７６】
【化５０】
2004502415.tif 000060
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、周辺質位置を推測する（０．９２２）。
【０３７７】
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そして図２５Ａに示されるように、ヒスチジン標識産物としておよびＧＳＴ融合産物として精製した。この組換えＧＳＴ融合物を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（図２５Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図２５Ｃ）のために使用した。
【０３７８】
このタンパク質はまた、肺炎を患った患者由来の血清を含む、ヒト血清と良好な交差反応を示した。
【０３７９】
これらの実験は、ｃｐ６２７３が、表面に露出しており、そして免疫的にアクセス可能なタンパク質であり、そしてこれは有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０３８０】
（実施例２６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６７３５）を発現した＜配列番号５１；ｃｐ６７３５＞：
【０３８１】
【化５１】
2004502415.tif 000061
推定シグナルペプチドを強調する。
【０３８２】
このｃｐ６７３５ヌクレオチド配列＜配列番号５２＞は、以下の通りである：
【０３８３】
【化５２】
2004502415.tif 000062
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、外膜位置を推測する（０．９２２）。
【０３８４】
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そして図２６Ａに示されるように、ヒスチジン標識産物としておよびＧＳＴ融合産物として精製した。この組換えＧＳＴ融合タンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（図２６Ｂ）において使用した。
【０３８５】
これらの実験は、ｃｐ６７３５が、表面に露出しており、そして免疫的にアクセス可能なタンパク質であり、そしてこれは有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０３８６】
（実施例２７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６７８４）を発現した＜配列番号５３；ｃｐ６７８４＞：
【０３８７】
【化５３】
2004502415.tif 000063
推定シグナルペプチドを強調する。
【０３８８】
このｃｐ６７８４ヌクレオチド配列＜配列番号５４＞は、以下の通りである：
【０３８９】
【化５４】
2004502415.tif 000064
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、周辺質位置を推測する（０．８９４）。
【０３９０】
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そして図２７Ａに示されるように、ヒスチジン標識産物としておよびＧＳＴ融合産物として精製した。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（図２７Ｂ）において使用した。このＧＳＴ融合産物を、ＦＡＣＳ分析（図２７Ｃ）のために使用した。
【０３９１】
このｃｐ６７８４タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験（Ｃｐｎ０４９８）において同定した。
【０３９２】
これらの実験は、ｃｐ６７８４が、表面に露出しており、そして免疫的にアクセス可能なタンパク質であり、そしてこれは有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０３９３】
（実施例２８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６９６０）を発現した＜配列番号５５；ｃｐ６９６０＞：
【０３９４】
【化５５】
2004502415.tif 000065
推定シグナルペプチドを強調する。
【０３９５】
このｃｐ６９６０ヌクレオチド配列＜配列番号５６＞は、以下の通りである：
【０３９６】
【化５６】
2004502415.tif 000066
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質周辺腔位置を推測する（０．９３０）。
【０３９７】
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そして図２８Ａに示されるように、ヒスチジン標識産物としておよびＧＳＴ融合産物として精製した。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（図２８Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図２８Ｃ）のために使用した。
【０３９８】
このｃｐ６９６０タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定した。
【０３９９】
これらの実験は、ｃｐ６９６０が、表面に露出しており、そして免疫的にアクセス可能なタンパク質であり、そしてこれは有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０４００】
（実施例２９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６９６８）を発現した＜配列番号５７；ｃｐ６９６８＞：
【０４０１】
【化５７】
2004502415.tif 000067
推定シグナルペプチドを強調する。
【０４０２】
このｃｐ６９６８ヌクレオチド配列＜配列番号５８＞は、以下の通りである：
【０４０３】
【化５８】
2004502415.tif 000068
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜位置を推測する（０．７９０）。
【０４０４】
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そして図２９Ａに示されるように、ヒスチジン標識産物としておよびＧＳＴ融合産物として精製した。この組換えＧＳＴ融合物を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（図２９Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図２９Ｃ）のために使用した。
【０４０５】
このタンパク質はまた、肺炎を患った患者由来の血清を含む、ヒト血清と良好な交差反応を示した。
【０４０６】
これらの実験は、ｃｐ６９６８が、表面に露出しており、そして免疫的にアクセス可能なタンパク質であり、そしてこれは有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０４０７】
（実施例３０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６９９８）を発現した＜配列番号５９；ｃｐ６９９８＞：
【０４０８】
【化５９】
2004502415.tif 000069
推定シグナルペプチドを強調する。
【０４０９】
このｃｐ６９９８ヌクレオチド配列＜配列番号６０＞は、以下の通りである：
【０４１０】
【化６０】
2004502415.tif 000070
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、外膜位置を推測する（０．７０７）。
【０４１１】
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ融合産物（図３０Ａ）としておよびヒスチジン標識産物として精製した。この組換えＧＳＴ融合タンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（図３０Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図３０Ｃ）のために使用した。
【０４１２】
このｃｐ６９９８タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験（Ｃｐｎ０６９５）において同定し、そして肺炎を患った患者由来の血清を含む、ヒト血清と良好な交差反応を示した。
【０４１３】
これらの実験は、ｃｐ６９９８が、表面に露出しており、そして免疫的にアクセス可能なタンパク質であり、そしてこれは有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０４１４】
（実施例３１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７７１０２）を発現した＜配列番号６１；ｃｐ７１０２＞：
【０４１５】
【化６１】
2004502415.tif 000071
推定シグナルペプチドを強調する。
【０４１６】
このｃｐ７１０２ヌクレオチド配列＜配列番号６２＞は、以下の通りである：
【０４１７】
【化６２】
2004502415.tif 000072
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜位置を推測する（０．３３８）。
【０４１８】
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてヒスチジン標識産物としておよびＧＳＴ融合産物として精製した。この精製したＧＳＴ融合産物を、図３１Ａに示す。この組換えＧＳＴ融合タンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブロットにおいておよびＦＡＣＳ分析（図３１Ｂ）のために使用した。
【０４１９】
これらの実験は、ｃｐ７１０２が、表面に露出しており、そして免疫的にアクセス可能なタンパク質であり、そしてこれは有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０４２０】
（実施例３２）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７７１０６）を発現した＜配列番号６３；ｃｐ７１０６＞：
【０４２１】
【化６３】
2004502415.tif 000073
このｃｐ７１０６ヌクレオチド配列＜配列番号６４＞は、以下の通りである：
【０４２２】
【化６４】
2004502415.tif 000074
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質位置を推測する（０．２２４）。
【０４２３】
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてヒスチジン標識産物としておよびＧＳＴ融合産物として精製した。この精製したＧＳＴ融合産物を、図３２Ａに示す。この組換えＧＳＴ融合タンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（図３２Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図３２Ｃ）のために使用した。
【０４２４】
このタンパク質はまた、肺炎を患った患者由来の血清を含む、ヒト血清と良好な交差反応を示した。
【０４２５】
これらの実験は、ｃｐ７１０６が、表面に露出しており、そして免疫的にアクセス可能なタンパク質であり、そしてこれは有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０４２６】
（実施例３３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７７２２８）を発現した＜配列番号６５；ｃｐ７２２８＞：
【０４２７】
【化６５】
2004502415.tif 000075
このｃｐ７２２８ヌクレオチド配列＜配列番号６６＞は、以下の通りである：
【０４２８】
【化６６】
2004502415.tif 000076
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜位置を推測する（０．０４０）。
【０４２９】
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そして図３３Ａに示されるようにヒスチジン標識産物としておよびＧＳＴ融合産物として精製した（ヒスチジン標識＝左側の矢印、ＧＳＴ＝右側の矢印）。このタンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（図３３Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【０４３０】
これらの実験は、ｃｐ７２２８が、表面に露出しており、そして免疫的にアクセス可能なタンパク質であり、そしてこれは有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０４３１】
（実施例３４）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７７１７０）を発現した＜配列番号６７；ｃｐ７１７０＞：
【０４３２】
【化６７】
2004502415.tif 000077
推定シグナルペプチドを強調する。
【０４３３】
このｃｐ７１７０ヌクレオチド配列＜配列番号６８＞は、以下の通りである：
【０４３４】
【化６８】
2004502415.tif 000078
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細菌の外膜位置を推測する（０．９３６）。
【０４３５】
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてヒスチジン標識産物としておよびＧＳＴ融合産物として精製した。この精製したＧＳＴ融合タンパク質を、図３４Ａに示す。このＧＳＴ融合タンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（図３４Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図３４Ｃ）のために使用した。
【０４３６】
このｃｐ７１７０タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験（Ｃｐｎ０８５４）において同定した。
【０４３７】
これらの実験は、ｃｐ７１７０が、表面に露出しており、そして免疫的にアクセス可能なタンパク質であり、そしてこれは有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０４３８】
（実施例３５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７７０７２）を発現した＜配列番号６９；ｃｐ７０７２＞：
【０４３９】
【化６９】
2004502415.tif 000079
推定シグナルペプチドを強調する。
【０４４０】
このｃｐ７０７２ヌクレオチド配列＜配列番号７０＞は、以下の通りである：
【０４４１】
【化７０】
2004502415.tif 000080
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、周辺質位置を推測する（０．６８８）。
【０４４２】
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてヒスチジン標識産物（図３５Ａ）としておよびＧＳＴ融合産物（図３５Ｂ）として精製した。この組換えヒスチジン標識タンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（図３５Ｃ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【０４４３】
これらの実験は、このｃｐ７０７２タンパク質が有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０４４４】
（実施例３６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６８７９）を発現した＜配列番号７１；ｃｐ６８７９＞：
【０４４５】
【化７１】
2004502415.tif 000081
このｃｐ６８７９ヌクレオチド配列＜配列番号７２＞は、以下の通りである：
【０４４６】
【化７２】
2004502415.tif 000082
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜位置を推測する（０．６４６）。
【０４４７】
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてヒスチジン標識産物としておよびＧＳＴ融合産物として精製した。この精製されたＧＳＴ融合産物を図３６Ａに示す。この組換えＧＳＴ融合タンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（図３６Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【０４４８】
これらの実験は、このｃｐ６８７９タンパク質が有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０４４９】
（実施例３７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６７６７）を発現した＜配列番号７３；ｃｐ６７６７＞：
【０４５０】
【化７３】
2004502415.tif 000083
このｃｐ６７６７ヌクレオチド配列＜配列番号７４＞は、以下の通りである：
【０４５１】
【化７４】
2004502415.tif 000084
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜位置を推測する（０．０８３）。
【０４５２】
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてヒスチジン標識産物としておよびＧＳＴ融合産物として精製した。この精製されたヒスチジン標識産物を図３７Ａに示す。この組換えヒスチジン標識タンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（図３７Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図３７Ｃ）のために使用した。このＧＳＴ融合物をまた、ウエスタンブロット（図３７Ｄ）において使用した。
【０４５３】
このｃｐ６７６７タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定し、そして肺炎を患った患者由来の血清を含む、ヒト血清と良好な交差反応を示した。
【０４５４】
これらの実験は、このｃｐ６７６７が有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０４５５】
（実施例３８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６７１７）を発現した＜配列番号７５；ｃｐ６７１７＞：
【０４５６】
【化７５】
2004502415.tif 000085
推定シグナルペプチドを強調する。
【０４５７】
このｃｐ６７１７ヌクレオチド配列＜配列番号７６＞は、以下の通りである：
【０４５８】
【化７６】
2004502415.tif 000086
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、周辺質位置を推測する（０．９３９）。
【０４５９】
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ融合産物（図３８Ａ）として、ヒスチジン標識産物としてそしてＧＳＴ／ヒスチジン融合産物として精製した。このタンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（図３８Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【０４６０】
これらの実験は、このｃｐ６７１７が有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０４６１】
（実施例３９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６５７７）を発現した＜配列番号７７；ｃｐ６５７７＞：
【０４６２】
【化７７】
2004502415.tif 000087
推定シグナルペプチドを強調する。
【０４６３】
このｃｐ６５７７ヌクレオチド配列＜配列番号７８＞は、以下の通りである：
【０４６４】
【化７８】
2004502415.tif 000088
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞膜周辺腔位置を推測する（０．９３２）。
【０４６５】
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてヒスチジン標識産物（図３９Ａ）としておよびＧＳＴ融合産物（図３９Ｂ）として精製した。この組換えＧＳＴ融合タンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（図３９Ｃ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【０４６６】
このｃｐ６５７７タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定した。
【０４６７】
これらの実験は、ｃｐ６５７７が、有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０４６８】
（実施例４０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６４４６）を発現した＜配列番号７９；ｃｐ６４４６＞：
【０４６９】
【化７９】
2004502415.tif 000089
推定シグナルペプチドを強調する。
【０４７０】
このｃｐ６４４６ヌクレオチド配列＜配列番号８０＞は、以下の通りである：
【０４７１】
【化８０】
2004502415.tif 000090
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜位置を推測する（０．１７７）。
【０４７２】
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてヒスチジン標識産物としておよびＧＳＴ融合産物として精製した。この組換えＧＳＴ融合タンパク質を、図４０Ａに示す。この組換えヒスチジン標識タンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（図４０Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【０４７３】
これらの実験は、ｃｐ６４４６が、有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０４７４】
（実施例４１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７７１０８）を発現した＜配列番号８１；ｃｐ７１０８＞：
【０４７５】
【化８１】
2004502415.tif 000091
推定シグナルペプチドを強調する。
【０４７６】
このｃｐ７１０８ヌクレオチド配列＜配列番号８２＞は、以下の通りである：
【０４７７】
【化８２】
2004502415.tif 000092
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、外膜位置を推測する（０．９２１）。
【０４７８】
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そして図４１Ａに示されるように、ＧＳＴ融合産物として精製した。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（図４１Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図４１Ｃ）のために使用した。ヒスチジン標識タンパク質をまた発現した。
【０４７９】
このｃｐ７１０８タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定した。
【０４８０】
これらの実験は、ｃｐ７１０８が、表面に露出しており、そして免疫的にアクセス可能なタンパク質であり、そしてこれは有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０４８１】
（実施例４２）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７７２８７）を発現した＜配列番号８３；ｃｐ７２８７＞：
【０４８２】
【化８３】
2004502415.tif 000093
推定シグナルペプチドを強調する。
【０４８３】
このｃｐ７２８７ヌクレオチド配列＜配列番号８４＞は、以下の通りである：
【０４８４】
【化８４】
2004502415.tif 000094
2004502415.tif 000095
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜位置を推測する（０．１０６）。
【０４８５】
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、図４２Ａに示されるようにＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図４２Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図４２Ｃ）に用いた。ｈｉｓタグ化したタンパク質もまた、発現させた。
【０４８６】
ｃｐ７２８７タンパク質もまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験で同定し、肺炎を有する患者由来の血清を含むヒト血清と良好な交叉反応性を示した。
【０４８７】
これらの実験により、ｃｐ７２８７は表面が露出しており、免疫的に利用しやすいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかでない。
【０４８８】
（実施例４３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７７１０５）を発現させた＜配列番号８５；ｃｐ７１０５＞：
【０４８９】
【化８５】
2004502415.tif 000096
ｃｐ７１０５ヌクレオチド配列＜配列番号８６＞は、以下のとおりである：
【０４９０】
【化８６】
2004502415.tif 000097
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、内部膜位置が推定される（０．１００）。
【０４９１】
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、図４３Ａに示されるようにＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図４３Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図４３Ｃ）に用いた。ｈｉｓタグ化したタンパク質もまた、発現させた。
【０４９２】
このタンパク質もまた、肺炎を有する患者由来の血清を含むヒト血清と良好な交叉反応性を示した。
【０４９３】
これらの実験により、ｃｐ７０１５は表面が露出しており、免疫的に利用しやすいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかでない。
【０４９４】
（実施例４４）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６８０２）を発現させた＜配列番号８７；ｃｐ６８０２＞：
【０４９５】
【化８７】
2004502415.tif 000098
推定シグナルペプチドは、強調されている。
【０４９６】
ｃｐ６８０２ヌクレオチド配列＜配列番号８８＞は、以下のとおりである：
【０４９７】
【化８８】
2004502415.tif 000099
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、内部膜位置が推定される（０．０６０）。
【０４９８】
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、図４４Ａに示されるようにＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図４４Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図４４Ｃ）に用いた。ｈｉｓタグ化したタンパク質もまた、発現させた。
【０４９９】
これらの実験により、ｃｐ６８０２は表面が露出しており、免疫的に利用しやすいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかでない。
【０５００】
（実施例４５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６３９０）を発現させた＜配列番号８９；ｃｐ６３９０＞：
【０５０１】
【化８９】
2004502415.tif 000100
推定シグナルペプチドは、強調されている。
【０５０２】
ｃｐ６３９０ヌクレオチド配列＜配列番号９０＞は、以下のとおりである：
【０５０３】
【化９０】
2004502415.tif 000101
2004502415.tif 000102
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、ペリプラズム位置が推定される（０．９３２）。
【０５０４】
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、図４５Ａに示されるようにＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図４５Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図４５Ｃ）に用いた。ｈｉｓタグ化したタンパク質もまた、発現させた。
【０５０５】
このタンパク質もまた、肺炎を有する患者由来の血清を含むヒト血清と良好な交叉反応性を示した。
【０５０６】
これらの実験により、ｃｐ６３９０は表面が露出しており、免疫的に利用しやすいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかでない。
【０５０７】
（実施例４６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６２７２）を発現させた＜配列番号９１；ｃｐ９２７２＞：
【０５０８】
【化９１】
2004502415.tif 000103
推定シグナルペプチドは、強調されている。
【０５０９】
ｃｐ６２７２ヌクレオチド配列＜配列番号９２＞は、以下のとおりである：
【０５１０】
【化９２】
2004502415.tif 000104
2004502415.tif 000105
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、外部膜位置が推定される（０．４８）。
【０５１１】
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、図４６Ａに示されるようにＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図４６Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図４６Ｃ）に用いた。ｈｉｓタグ化したタンパク質もまた、発現させた。
【０５１２】
このタンパク質もまた、肺炎を有する患者由来の血清を含むヒト血清と良好な交叉反応性を示した。
【０５１３】
これらの実験により、ｃｐ６２７２は表面が露出しており、免疫的に利用しやすいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかでない。
【０５１４】
（実施例４７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７７１１１）を発現させた＜配列番号９３；ｃｐ７１１１＞：
【０５１５】
【化９３】
2004502415.tif 000106
推定シグナルペプチドは、強調されている。
【０５１６】
ｃｐ７１１１ヌクレオチド配列＜配列番号９４＞は、以下のとおりである：
【０５１７】
【化９４】
2004502415.tif 000107
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、内部膜位置が推定される（０．１００）。
【０５１８】
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、図４７Ａに示されるようにＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図４７Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図４７Ｃ）に用いた。ｈｉｓタグ化したタンパク質もまた、発現させた。
【０５１９】
このｃｐ７１１１タンパク質もまた、２Ｄ−ＰＡＧＥにおいて同定し、肺炎を有する患者由来の血清を含むヒト血清と良好な交叉反応性を示した。
【０５２０】
これらの実験により、ｃｐ７１１１は表面が露出しており、免疫的に利用しやすいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかでない。
【０５２１】
（実施例４８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４４５５８８６）を発現させた＜配列番号９５；ｃｐ００１０＞：
【０５２２】
【化９５】
2004502415.tif 000108
推定シグナルペプチドは、強調されている。
【０５２３】
ｃｐ００１０ヌクレオチド配列＜配列番号９６＞は、以下のとおりである：
【０５２４】
【化９６】
2004502415.tif 000109
2004502415.tif 000110
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、外部膜位置が推定される（０．９２２）。
【０５２５】
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、図４８Ａに示されるようにＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図４８Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図４８Ｃ）に用いた。ｈｉｓタグ化したタンパク質もまた、発現させた。
【０５２６】
このｃｐ００１０タンパク質もまた、２Ｄ−ＰＡＧＥにおいて同定し、肺炎を有する患者由来の血清を含むヒト血清と良好な交叉反応性を示した。
【０５２７】
これらの実験により、ｃｐ００１０は表面が露出しており、免疫的に利用しやすいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかでない。
【０５２８】
（実施例４９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６２９６）を発現させた＜配列番号９７；ｃｐ６２９６＞：
【０５２９】
【化９７】
2004502415.tif 000111
ｃｐ６２９６ヌクレオチド配列＜配列番号９８＞は、以下のとおりである：
【０５３０】
【化９８】
2004502415.tif 000112
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、細胞質位置が推定される（０．５２３）。
【０５３１】
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、図４９Ａに示されるようにＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図４９Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図４９Ｃ）に用いた。ｈｉｓタグ化したタンパク質もまた、発現させた。
【０５３２】
これらの実験により、ｃｐ６２９６は表面が露出しており、免疫的に利用しやすいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかでない。
【０５３３】
（実施例５０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６６６４）を発現させた＜配列番号９９；ｃｐ６６６４＞：
【０５３４】
【化９９】
2004502415.tif 000113
ｃｐ６６６４ヌクレオチド配列＜配列番号１００＞は、以下のとおりである：
【０５３５】
【化１００】
2004502415.tif 000114
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、内部膜位置が推定される（０．２６８）。
【０５３６】
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、ＧＳＴ融合産物（図５０Ａ）として、ｈｉｓタグ化したタンパク質として、そしてＧＳＴ／ＨＩＳ融合物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図５０Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図５０Ｃ）に用いた。ｈｉｓタグ化したタンパク質もまた、発現させた。
【０５３７】
ｃｐ６６６４タンパク質もまた、２Ｄ−ＰＡＧＥにおいて同定し（Ｃｐｎ０３８５）、肺炎を有する患者由来の血清を含むヒト血清と良好な交叉反応性を示した。
【０５３８】
これらの実験により、ｃｐ６６６４は表面が露出しており、免疫的に利用しやすいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかでない。
【０５３９】
（実施例５１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６６９６）を発現させた＜配列番号１０１；ｃｐ６６９６＞：
【０５４０】
【化１０１】
2004502415.tif 000115
推定シグナルペプチドは、強調されている。
【０５４１】
ｃｐ６６９６ヌクレオチド配列＜配列番号１０２＞は、以下のとおりである：
【０５４２】
【化１０２】
2004502415.tif 000116
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、内部膜位置が推定される（０．４６３）。
【０５４３】
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、図５１Ａに示されるようにＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図５１Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図５１Ｃ）に用いた。ｈｉｓタグ化したタンパク質もまた、発現させた。
【０５４４】
このタンパク質もまた、肺炎を有する患者由来の血清を含むヒト血清と良好な交叉反応性を示した。
【０５４５】
これらの実験により、ｃｐ６６９６は表面が露出しており、免疫的に利用しやすいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかでない。
【０５４６】
（実施例５２）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６７９０）を発現させた＜配列番号１０３；ｃｐ６７９０＞：
【０５４７】
【化１０３】
2004502415.tif 000117
ｃｐ６７９０ヌクレオチド配列＜配列番号１０４＞は、以下のとおりである：
【０５４８】
【化１０４】
2004502415.tif 000118
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、内部膜位置が推定される（０．１５１）。
【０５４９】
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、ＧＳＴ融合産物として（図５２Ａ）、およびｈｉｓタグ化した産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図５２Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図５２Ｃ）に用いた。ｈｉｓタグ化したタンパク質もまた、発現させた。
【０５５０】
ｃｐ６７９０タンパク質もまた、２Ｄ−ＰＡＧＥにおいて同定した（Ｃｐｎ０５０３）。
【０５５１】
これらの実験により、ｃｐ６７９０は表面が露出しており、免疫的に利用しやすいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかでない。
【０５５２】
（実施例５３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６８７８）を発現させた＜配列番号１０５；ｃｐ６８７８＞：
【０５５３】
【化１０５】
2004502415.tif 000119
ｃｐ６８７８ヌクレオチド配列＜配列番号１０６＞は、以下のとおりである：
【０５５４】
【化１０６】
2004502415.tif 000120
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、内部膜位置が推定される（０．２０４）。
【０５５５】
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、ｈｉｓタグ化産物として（図５３Ａ）、そしてＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図５３Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に用いた。
【０５５６】
これらの実験により、ｃｐ６８７８は表面が露出しており、免疫的に利用しやすいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかでない。
【０５５７】
（実施例５４）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７７２２４）を発現させた＜配列番号１０７；ｃｐ７２２４＞：
【０５５８】
【化１０７】
2004502415.tif 000121
ｃｐ７２２４ヌクレオチド配列＜配列番号１０８＞は、以下のとおりである：
【０５５９】
【化１０８】
2004502415.tif 000122
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、内部膜位置が推定される（０．１６４）。
【０５６０】
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、図５４Ａに示されるようにＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図５４Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図５４Ｃ）に用いた。ｈｉｓタグ化したタンパク質もまた、発現させた。
【０５６１】
このタンパク質もまた、肺炎を有する患者由来の血清を含むヒト血清と良好な交叉反応性を示した。
【０５６２】
これらの実験により、ｃｐ７２２４は表面が露出しており、免疫的に利用しやすいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかでない。
【０５６３】
（実施例５５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７７１４０）を発現させた＜配列番号１０９；ｃｐ７１４０＞：
【０５６４】
【化１０９】
2004502415.tif 000123
推定シグナルペプチドは、強調されている。
【０５６５】
ｃｐ７１４０ヌクレオチド配列＜配列番号１１０＞は、以下のとおりである：
【０５６６】
【化１１０】
2004502415.tif 000124
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、内部膜位置が推定される（０．６５０）。
【０５６７】
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、図５５Ａに示されるようにＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図５５Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図５５Ｃ）に用いた。ｈｉｓタグ化したタンパク質もまた、発現させた。
【０５６８】
これらの実験により、ｃｐ７１４０は表面が露出しており、免疫的に利用しやすいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかでない。
【０５６９】
（実施例５６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７７３０６）を発現させた＜配列番号１１１；ｃｐ７３０６＞：
【０５７０】
【化１１１】
2004502415.tif 000125
推定シグナルペプチドは、強調されている。
【０５７１】
ｃｐ７３０６ヌクレオチド配列＜配列番号１１２＞は、以下のとおりである：
【０５７２】
【化１１２】
2004502415.tif 000126
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、ペリプラズム位置が推定される（０．９２３）。
【０５７３】
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、ｈｉｓタグ産物として（図５６Ａ）およびＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図５６Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図５６Ｃ）に用いた。
【０５７４】
ｃｐ７３０６タンパク質もまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定し（Ｃｐｎ０９７９）、肺炎を有する患者由来の血清を含むヒト血清と良好な交叉反応性を示した。
【０５７５】
これらの実験により、ｃｐ７３０６は表面が露出しており、免疫的に利用しやすいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかでない。
【０５７６】
（実施例５７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７７１３２）を発現させた＜配列番号１１３；ｃｐ７１３２＞：
【０５７７】
【化１１３】
2004502415.tif 000127
推定シグナルペプチドは、強調されている。
【０５７８】
ｃｐ７１３２ヌクレオチド配列＜配列番号１１４＞は、以下のとおりである：
【０５７９】
【化１１４】
2004502415.tif 000128
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、ペリプラズム位置が推定される（０．９１５）。
【０５８０】
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、ｈｉｓタグ化産物として（図５７Ａ）またはＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図５７Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図５７Ｃ）に用いた。
【０５８１】
これらの実験により、ｃｐ７１３２は表面が露出しており、免疫的に利用しやすいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかでない。
【０５８２】
（実施例５８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６７３３）を発現させた＜配列番号１１５；ｃｐ６７３３＞：
【０５８３】
【化１１５】
2004502415.tif 000129
推定シグナルペプチドは、強調されている。
【０５８４】
ｃｐ６７３３ヌクレオチド配列＜配列番号１１６＞は、以下のとおりである：
【０５８５】
【化１１６】
2004502415.tif 000130
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、外部膜位置が推定される（０．９２４）。
【０５８６】
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、図５８Ａに示されるようにｈｉｓタグ産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図５８Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図５８Ｃ）に用いた。ＧＳＴ融合タンパク質もまた、発現させた。
【０５８７】
ｃｐ６７３３タンパク質もまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定した（Ｃｐｎ０４５１）。
【０５８８】
これらの実験により、ｃｐ６７３３は表面が露出しており、免疫的に利用しやすいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかでない。
【０５８９】
（実施例５９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６８１４）を発現させた＜配列番号１１７；ｃｐ６８１４＞：
【０５９０】
【化１１７】
2004502415.tif 000131
ｃｐ６８１４ヌクレオチド配列＜配列番号１１８＞は、以下のとおりである：
【０５９１】
【化１１８】
2004502415.tif 000132
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、内部膜位置が推定される（０．０７０）。
【０５９２】
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、ＧＳＴ融合産物として（図５９Ａ）またはｈｉｓタグ化産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図５９Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図５９Ｃ）に用いた。
【０５９３】
これらの実験により、ｃｐ６８１４は表面が露出しており、免疫的に利用しやすいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかでない。
【０５９４】
（実施例６０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６８３０）を発現させた＜配列番号１１９；ｃｐ６８３０＞：
【０５９５】
【化１１９】
2004502415.tif 000133
推定シグナルペプチドは、強調されている。
【０５９６】
ｃｐ６８３０ヌクレオチド配列＜配列番号１２０＞は、以下のとおりである：
【０５９７】
【化１２０】
2004502415.tif 000134
2004502415.tif 000135
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、外部膜位置が推定される（０．９２６）。
【０５９８】
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、ＧＳＴ融合産物として（図６０Ａ）またはｈｉｓタグ化産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図６０Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図６０Ｃ）に用いた。
【０５９９】
ｃｐ６８３０タンパク質もまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定し（Ｃｐｎ０５４０）、肺炎を有する患者由来の血清を含むヒト血清と良好な交叉反応性を示した。
【０６００】
これらの実験により、ｃｐ６８３０は表面が露出しており、免疫的に利用しやすいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかでない。
【０６０１】
（実施例６１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６８５４）を発現させた＜配列番号１２１；ｃｐ６８５４＞：
【０６０２】
【化１２１】
2004502415.tif 000136
ｃｐ６８５４ヌクレオチド配列＜配列番号１２２＞は、以下のとおりである：
【０６０３】
【化１２２】
2004502415.tif 000137
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、内部膜位置が推定される（０．４６１）。
【０６０４】
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、図６１Ａに示されるようにＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図６１Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図６１Ｃ）に用いた。ｈｉｓタグ化したタンパク質もまた、発現させた。
【０６０５】
これらの実験により、ｃｐ６８５４は表面が露出しており、免疫的に利用しやすいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかでない。
【０６０６】
（実施例６２）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７７１０１）を発現させた＜配列番号１２３；ｃｐ７１０１＞：
【０６０７】
【化１２３】
2004502415.tif 000138
ｃｐ７１０１ヌクレオチド配列＜配列番号１２４＞は、以下のとおりである：
【０６０８】
【化１２４】
2004502415.tif 000139
2004502415.tif 000140
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、細胞質位置が推定される（０．２０６）。
【０６０９】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物（図６２Ａ）またはｈｉｓタグ産物として精製した。このタンパク質を使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図６２Ｂ）およびＦＡＣＳ（図６２Ｃ）分析において使用した。
【０６１０】
このタンパク質はまた、肺炎を有する患者由来の血清を含むヒト血清との良好な交差反応性を示した。
【０６１１】
これらの実験は、ｃｐ７１０１が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能な（ｉｍｍｕｎｏａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）タンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０６１２】
（実施例６３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７１０７）を、発現させた＜配列番号１２５；ｃｐ７１０７＞：
【０６１３】
【化１２５】
2004502415.tif 000141
ｃｐ７１０７ヌクレオチド配列＜配列番号１２６＞は、以下である：
【０６１４】
【化１２６】
2004502415.tif 000142
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、内膜位置を予測する（０．１００）。
【０６１５】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物（図６３Ａ）またはｈｉｓタグ産物として精製した。このタンパク質を使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図６３Ｂ）およびＦＡＣＳ（図６３Ｃ）分析において使用した。
【０６１６】
これらの実験は、ｃｐ７１０７が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０６１７】
（実施例６４）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６４６７）を、発現させた＜配列番号１２７；ｃｐ６４６７＞：
【０６１８】
【化１２７】
2004502415.tif 000143
推定シグナルペプチドが強調される。
【０６１９】
ｃｐ６４６７ヌクレオチド配列＜配列番号１２８＞は、以下である：
【０６２０】
【化１２８】
2004502415.tif 000144
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、外膜のリポタンパク質を予測する（０．７９０）。
【０６２１】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてｈｉｓタグ産物およびＧＳＴ融合タンパク質として、図６４Ａに示すように精製した。この組換えｈｉｓタグタンパク質を使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図６４Ｂ）において使用した。この組換えＧＳＴ融合タンパク質をまた使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図６４Ｃ）においておよびＦＡＣＳ分析（図６４Ｄ）のために使用した。
【０６２２】
これらの実験は、ｃｐ６４６７が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０６２３】
（実施例６５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６６７９）を、発現させた＜配列番号１２９；ｃｐ６６７９＞：
【０６２４】
【化１２９】
2004502415.tif 000145
推定シグナルペプチドが強調される。
【０６２５】
ｃｐ６６７９ヌクレオチド配列＜配列番号１３０＞は、以下である：
【０６２６】
【化１３０】
2004502415.tif 000146
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、内膜位置を予測する（０．１４９）。
【０６２７】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてｈｉｓタグ産物（図６５Ａ）およびＧＳＴ融合産物（図６５Ｂ）として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図６５Ｃ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【０６２８】
これらの実験は、ｃｐ６６７９が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０６２９】
（実施例６６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６８９０）を、発現させた＜配列番号１３１；ｃｐ６８９０＞：
【０６３０】
【化１３１】
2004502415.tif 000147
推定シグナルペプチドが強調される。
【０６３１】
ｃｐ６８９０ヌクレオチド配列＜配列番号１３２＞は、以下である：
【０６３２】
【化１３２】
2004502415.tif 000148
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、外膜位置を予測する（０．９４０）。
【０６３３】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として、図６６Ａに示すように精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図６６Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。ｈｉｓタグタンパク質もまた発現された。
【０６３４】
これらの実験は、ｃｐ６８９０が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０６３５】
（実施例６７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　６１７２３２３）を、発現させた＜配列番号１３３；ｃｐ００１８＞：
【０６３６】
【化１３３】
2004502415.tif 000149
推定シグナルペプチドが強調される。
【０６３７】
ｃｐ００１８ヌクレオチド配列＜配列番号１３４＞は、以下である：
【０６３８】
【化１３４】
2004502415.tif 000150
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、外膜を予測する（０．９３５）。
【０６３９】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精製した（図６７Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図６７Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【０６４０】
これらの実験は、ｃｐ００１８が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０６４１】
（実施例６８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６２６２）を、発現させた＜配列番号１３５；ｃｐ６２６２＞：
【０６４２】
【化１３５】
2004502415.tif 000151
推定シグナルペプチドが強調される。
【０６４３】
ｃｐ６２６２ヌクレオチド配列＜配列番号１３６＞は、以下である：
【０６４４】
【化１３６】
2004502415.tif 000152
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、内膜を予測する（０．６６０）。
【０６４５】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精製した（図６８Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図６８Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【０６４６】
これらの実験は、ｃｐ６２６２が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０６４７】
（実施例６９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６２６９）を、発現させた＜配列番号１３７；ｃｐ６２６９＞：
【０６４８】
【化１３７】
2004502415.tif 000153
ｃｐ６２６９ヌクレオチド配列＜配列番号１３８＞は、以下である：
【０６４９】
【化１３８】
2004502415.tif 000154
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、細胞質位置を予測する（０．４１２）。
【０６５０】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精製した（図６９Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図６９Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【０６５１】
これらの実験は、ｃｐ６２６９が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０６５２】
（実施例７０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６２７０）を、発現させた＜配列番号１３９；ｃｐ６２７０＞：
【０６５３】
【化１３９】
2004502415.tif 000155
推定シグナルペプチドが強調される。
【０６５４】
ｃｐ６２７０ヌクレオチド配列＜配列番号１４０＞は、以下である：
【０６５５】
【化１４０】
2004502415.tif 000156
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、外膜を予測する（０．９２）。
【０６５６】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精製した（図７０Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロットにおいておよびＦＡＣＳ分析のために使用した（図７０Ｂ）。
【０６５７】
ｃｐ６２７０タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定した（Ｃｐｎ００１３）。
【０６５８】
これらの実験は、ｃｐ６２７０が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０６５９】
（実施例７１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６４０２）を、発現させた＜配列番号１４１；ｃｐ６４０２＞：
【０６６０】
【化１４１】
2004502415.tif 000157
ｃｐ６４０２ヌクレオチド配列＜配列番号１４２＞は、以下である：
【０６６１】
【化１４２】
2004502415.tif 000158
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、細胞質を予測する（０．１５８）。
【０６６２】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精製した（図７１Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図７１Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【０６６３】
これらの実験は、ｃｐ６４０２が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０６６４】
（実施例７２）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６５２０）を、発現させた＜配列番号１４３；ｃｐ６５２０＞：
【０６６５】
【化１４３】
2004502415.tif 000159
ｃｐ６５２０ヌクレオチド配列＜配列番号１４４＞は、以下である：
【０６６６】
【化１４４】
2004502415.tif 000160
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、細胞質を予測する（０．２６５）。
【０６６７】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精製した（図７２Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図７２Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【０６６８】
これらの実験は、ｃｐ６５２０が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０６６９】
（実施例７３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６５６７）を、発現させた＜配列番号１４５；ｃｐ６５６７＞：
【０６７０】
【化１４５】
2004502415.tif 000161
ｃｐ６５６７ヌクレオチド配列＜配列番号１４６＞は、以下である：
【０６７１】
【化１４６】
2004502415.tif 000162
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、内膜を予測する（０．６９４）。
【０６７２】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精製した（図７３Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図７３Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【０６７３】
これらの実験は、ｃｐ６５６７が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０６７４】
（実施例７４）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６５７６）を、発現させた＜配列番号１４７；ｃｐ６５７６＞：
【０６７５】
【化１４７】
2004502415.tif 000163
推定シグナルペプチドが強調される。
【０６７６】
ｃｐ６５７６ヌクレオチド配列＜配列番号１４８＞は、以下である：
【０６７７】
【化１４８】
2004502415.tif 000164
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、外膜を予測する（０．７６５８）。
【０６７８】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物（図７４Ａ）、ｈｉｓタグ産物およびｈｉｓタグ／ＧＳＴ融合産物として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図７４Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図７４Ｃ）のために使用した。
【０６７９】
ｃｐ６５７６タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定した（Ｃｐｎ０３００）。
【０６８０】
これらの実験は、ｃｐ６５７６が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０６８１】
（実施例７５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６６０７）を、発現させた＜配列番号１４９；ｃｐ６６０７＞：
【０６８２】
【化１４９】
2004502415.tif 000165
推定シグナルペプチドが強調される。
【０６８３】
ｃｐ６６０７ヌクレオチド配列＜配列番号１５０＞は、以下である：
【０６８４】
【化１５０】
2004502415.tif 000166
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、ぺリプラズムを予測する（０．９３４）。
【０６８５】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてｈｉｓタグ産物（図７５Ａ）として、またＧＳＴ融合産物として精製した。このＧＳＴ融合タンパク質を使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図７５Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【０６８６】
これらの実験は、ｃｐ６６０７が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０６８７】
（実施例７６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６６２４）を、発現させた＜配列番号１５１；ｃｐ６６２４＞：
【０６８８】
【化１５１】
2004502415.tif 000167
ｃｐ６６２４ヌクレオチド配列＜配列番号１５２＞は、以下である：
【０６８９】
【化１５２】
2004502415.tif 000168
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、内膜を予測する（０．１６８）。
【０６９０】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてｈｉｓタグ産物として精製した（図７６Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図７６Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【０６９１】
ｃｐ６６２４タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定した。
【０６９２】
これらの実験は、ｃｐ６６２４が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０６９３】
（実施例７７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６７２８）を、発現させた＜配列番号１５３；ｃｐ６７２８＞：
【０６９４】
【化１５３】
2004502415.tif 000169
ｃｐ６７２８ヌクレオチド配列＜配列番号１５４＞は、以下である：
【０６９５】
【化１５４】
2004502415.tif 000170
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、内膜を予測する（０．１８７）。
【０６９６】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精製した（図７７Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図７７Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【０６９７】
ｃｐ６７２８タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定した。
【０６９８】
これらの実験は、ｃｐ６７２８が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０６９９】
（実施例７８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６８４７）を、発現させた＜配列番号１５５；ｃｐ６８４７＞：
【０７００】
【化１５５】
2004502415.tif 000171
推定シグナルペプチドが強調される。
【０７０１】
ｃｐ６８４７ヌクレオチド配列＜配列番号１５６＞は、以下である：
【０７０２】
【化１５６】
2004502415.tif 000172
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、ぺリプラズムを予測する（０．９３２）。
【０７０３】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精製した（図７８Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図７８Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【０７０４】
これらの実験は、ｃｐ６８４７が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０７０５】
（実施例７９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６９６９）を、発現させた＜配列番号１５７；ｃｐ６９６９＞：
【０７０６】
【化１５７】
2004502415.tif 000173
　推定シグナルペプチドが強調される。
【０７０７】
ｃｐ６９６９ヌクレオチド配列＜配列番号１５８＞は、以下である：
【０７０８】
【化１５８】
2004502415.tif 000174
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、内膜を予測する（０．１２６）。
【０７０９】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精製した（図７９Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図７９Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【０７１０】
これらの実験は、ｃｐ６９６９が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０７１１】
（実施例８０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７１０９）を、発現させた＜配列番号１５９；ｃｐ７１０９＞：
【０７１２】
【化１５９】
2004502415.tif 000175
推定シグナルペプチドが強調される。
【０７１３】
ｃｐ７１０９ヌクレオチド配列＜配列番号１６０＞は、以下である：
【０７１４】
【化１６０】
2004502415.tif 000176
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、外膜を予測する（０．８８７）。
【０７１５】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精製した（図８０Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図８０Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【０７１６】
これらの実験は、ｃｐ７１０９が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０７１７】
（実施例８１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７１１０）を、発現させた＜配列番号１６１；ｃｐ７１１０＞：
【０７１８】
【化１６１】
2004502415.tif 000177
推定シグナルペプチドが強調される。
【０７１９】
ｃｐ７１１０ヌクレオチド配列＜配列番号１６２＞は、以下である：
【０７２０】
【化１６２】
2004502415.tif 000178
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、外膜を予測する（０．８２７）。
【０７２１】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精製した（図８１Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図８１Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【０７２２】
これらの実験は、ｃｐ７１１０が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０７２３】
図１９１は、それぞれが本明細書中で同定された、ｃｐ７１０５、ｃｐ７１０６、ｃｐ７１０７、ｃｐ７１０８、ｃｐ７１０９およびｃｐ７１１０の間の構造的関係の模式図を示す。これら６つのタンパク質を、関連の外膜結合タンパク質の新規ファミリーにグループ分けし得る。これらのタンパク質は、一般に反復構造を有する（ｐｍｐファミリーを参照のこと）。
【０７２４】
（実施例８２）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７１２７）を、発現させた＜配列番号１６３；ｃｐ７１２７＞：
【０７２５】
【化１６３】
2004502415.tif 000179
推定シグナルペプチドが強調される。
【０７２６】
ｃｐ７１２７ヌクレオチド配列＜配列番号１６４＞は、以下である：
【０７２７】
【化１６４】
2004502415.tif 000180
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、ぺリプラズムを予測する（０．９２０）。
【０７２８】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物（図８２Ａ）として、そしてまたｈｉｓタグ形態で精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図８２Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【０７２９】
これらの実験は、ｃｐ７１２７が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０７３０】
（実施例８３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７１３３）を、発現させた＜配列番号１６５；ｃｐ７１３３＞：
【０７３１】
【化１６５】
2004502415.tif 000181
推定シグナルペプチドが強調される。
【０７３２】
ｃｐ７１３３ヌクレオチド配列＜配列番号１６６＞は、以下である：
【０７３３】
【化１６６】
2004502415.tif 000182
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、外膜を予測する（０．９２）。
【０７３４】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物（図８３Ａ）として、そしてまたｈｉｓタグ形態で精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図８３Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【０７３５】
これらの実験は、ｃｐ７１３３が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０７３６】
（実施例８４）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７２２２）を、発現させた＜配列番号１６７；ｃｐ７２２２＞：
【０７３７】
【化１６７】
2004502415.tif 000183
推定シグナルペプチドが強調される。
【０７３８】
ｃｐ７２２２ヌクレオチド配列＜配列番号１６８＞は、以下である：
【０７３９】
【化１６８】
2004502415.tif 000184
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、ぺリプラズムを予測する（０．９３５）。
【０７４０】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物（図８４Ａ）として、そしてまたｈｉｓタグ形態で精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図８４Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【０７４１】
これらの実験は、ｃｐ７２２２が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０７４２】
（実施例８５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７２２５）を、発現した＜配列番号１６９；ｃｐ７２２５＞；
【０７４３】
【化１６９】
2004502415.tif 000185
ｃｐ７２２５ヌクレオチド配列＜配列番号１７０＞は、以下である：
【０７４４】
【化１７０】
2004502415.tif 000186
2004502415.tif 000187
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．１６）。
【０７４５】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてｈｉｓタグ産物として精製した（図８５Ａ）。組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図８５Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０７４６】
これらの実験は、ｃｐ７２２５が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０７４７】
（実施例８６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７２４８）を、発現した＜配列番号１７１；ｃｐ７２４８＞；
【０７４８】
【化１７１】
2004502415.tif 000188
推定シグナルペプチドを、ハイライトにする。
【０７４９】
ｃｐ７２４８ヌクレオチド配列＜配列番号１７２＞は、以下である：
【０７５０】
【化１７２】
2004502415.tif 000189
2004502415.tif 000190
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、ペリプラズムと推定する（０．９３２）。
【０７５１】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物として（図８６Ａ）およびｈｉｓタグ化形態においても精製した。組換えタンパク質を使用してマウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図８６Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０７５２】
ｃｐ７２４８タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定した。
【０７５３】
これらの実験は、ｃｐ７２４８が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０７５４】
（実施例８７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７２４９）を、発現した＜配列番号１７３；ｃｐ７２４９＞；
【０７５５】
【化１７３】
2004502415.tif 000191
ｃｐ７２４９ヌクレオチド配列＜配列番号１７４＞は、以下である：
【０７５６】
【化１７４】
2004502415.tif 000192
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．５７１）。
【０７５７】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物として精製した（図８７Ａ）。組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図８７Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０７５８】
これらの実験は、ｃｐ７２４９が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０７５９】
（実施例８８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７２６１）を、発現した＜配列番号１７５；ｃｐ７２６１＞；
【０７６０】
【化１７５】
2004502415.tif 000193
ｃｐ７２６１ヌクレオチド配列＜配列番号１７６＞は、以下である：
【０７６１】
【化１７６】
2004502415.tif 000194
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．８４８）。
【０７６２】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物として精製した（図８８Ａ）。組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図８８Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０７６３】
これらの実験は、ｃｐ７２６１が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０７６４】
（実施例８９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７３０５）を、発現した＜配列番号１７７；ｃｐ７３０５＞；
【０７６５】
【化１７７】
2004502415.tif 000195
ｃｐ７３０５ヌクレオチド配列＜配列番号１７８＞は、以下である：
【０７６６】
【化１７８】
2004502415.tif 000196
2004502415.tif 000197
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．５０８）。
【０７６７】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物として（図８９Ａ）および二重ＧＳＴ／ｈｉｓ融合体としても精製した。組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図８９Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０７６８】
これらの実験は、ｃｐ７３０５が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０７６９】
（実施例９０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７３４７）を、発現した＜配列番号１７９；ｃｐ７３４７＞；
【０７７０】
【化１７９】
2004502415.tif 000198
推定シグナルペプチドを、ハイライトにする。
【０７７１】
ｃｐ７３４７ヌクレオチド配列＜配列番号１８０＞は、以下である：
【０７７２】
【化１８０】
2004502415.tif 000199
2004502415.tif 000200
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞膜周辺腔と推定する（０．２４９７）。
【０７７３】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物として（図９０Ａ）およびｈｉｓタグ形態においても精製した。組換えタンパク質を使用してマウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図９０Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０７７４】
これらの実験は、ｃｐ７３４７が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０７７５】
（実施例９１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７３５３）を、発現した＜配列番号１８１；ｃｐ７３５３＞；
【０７７６】
【化１８１】
2004502415.tif 000201
ｃｐ７３５３ヌクレオチド配列＜配列番号１８２＞は、以下である：
【０７７７】
【化１８２】
2004502415.tif 000202
2004502415.tif 000203
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質と推定する（０．１３０８）。
【０７７８】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物として精製した（図９１Ａ）。組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図９１Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０７７９】
これらの実験は、ｃｐ７３５３が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０７８０】
（実施例９２）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７４０８）を、発現した＜配列番号１８３；ｃｐ７４０８＞；
【０７８１】
【化１８３】
2004502415.tif 000204
ｃｐ７４０８ヌクレオチド配列＜配列番号１８４＞は、以下である：
【０７８２】
【化１８４】
2004502415.tif 000205
　ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．１２３）。
【０７８３】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてｈｉｓタグ産物として精製した（図９２Ａ）。組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図９２Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０７８４】
これらの実験は、ｃｐ７４０８が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０７８５】
（実施例９３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６４２４）を、発現した＜配列番号１８５；ｃｐ６４２４＞；
【０７８６】
【化１８５】
2004502415.tif 000206
ｃｐ６４２４ヌクレオチド配列＜配列番号１８６＞は、以下である：
【０７８７】
【化１８６】
2004502415.tif 000207
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質と推定する（０．２５０２）。
【０７８８】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物として（図９３Ａ）およびｈｉｓタグ形態においても精製した。組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図９３Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図９３Ｃ；ＧＳＴ融合体）に使用した。
【０７８９】
これらの実験は、ｃｐ６４２４が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０７９０】
（実施例９４）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６４４９）を、発現した＜配列番号１８７；ｃｐ６４４９＞；
【０７９１】
【化１８７】
2004502415.tif 000208
ｃｐ６４４９ヌクレオチド配列＜配列番号１８８＞は、以下である：
【０７９２】
【化１８８】
2004502415.tif 000209
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．２０８４）。
【０７９３】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物として（図９４Ａ）およびｈｉｓタグ形態においても精製した。組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図９４Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図９４Ｃ；ＧＳＴ融合体）に使用した。
【０７９４】
これらの実験は、ｃｐ６４４９が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０７９５】
（実施例９５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６４９５）を、発現した＜配列番号１８９；ｃｐ６４９５＞；
【０７９６】
【化１８９】
2004502415.tif 000210
ｃｐ６４９５ヌクレオチド配列＜配列番号１９０＞は、以下である：
【０７９７】
【化１９０】
2004502415.tif 000211
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質と推定する（０．２８０）。
【０７９８】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物として精製した（図９５Ａ）。組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図９５Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図９５Ｃ）に使用した。
【０７９９】
これらの実験は、ｃｐ６４９５が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０８００】
（実施例９６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６５０６）を、発現した＜配列番号１９１；ｃｐ６５０６＞；
【０８０１】
【化１９１】
2004502415.tif 000212
ｃｐ６５０６ヌクレオチド配列＜配列番号１９２＞は、以下である：
【０８０２】
【化１９２】
2004502415.tif 000213
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞膜周辺腔と推定する（０．５７１）。
【０８０３】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてｈｉｓタグ（図９６Ａ）およびＧＳＴ癒合産物（図９６Ｂ）としても精製した。ＧＳＴ融合タンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図９６Ｃ）およびＦＡＣＳ分析（図９６Ｄ）に使用した。
【０８０４】
これらの実験は、ｃｐ６５０６が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０８０５】
（実施例９７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６８８２）を、発現した＜配列番号１９３；ｃｐ６８８２＞；
【０８０６】
【化１９３】
2004502415.tif 000214
ｃｐ６８８２ヌクレオチド配列＜配列番号１９４＞は、以下である：
【０８０７】
【化１９４】
2004502415.tif 000215
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質と推定する（０．３６２）。
【０８０８】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物として精製した（図９７Ａ）。このタンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図９７Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図９７Ｃ）に使用した。
【０８０９】
これらの実験は、ｃｐ６８８２が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０８１０】
（実施例９８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６９７９）を、発現した＜配列番号１９５；ｃｐ６９７９＞；
【０８１１】
【化１９５】
2004502415.tif 000216
ｃｐ６９７９ヌクレオチド配列＜配列番号１９６＞は、以下である：
【０８１２】
【化１９６】
2004502415.tif 000217
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質と推定する（０．３６０）。
【０８１３】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物として精製した（図９８Ａ）。ＧＳＴ融合体タンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図９８Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図９８Ｃ）に使用した。
【０８１４】
これらの実験は、ｃｐ６９７９が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０８１５】
（実施例９９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７０２８）を、発現した＜配列番号１９７；ｃｐ７０２８＞；
【０８１６】
【化１９７】
2004502415.tif 000218
ｃｐ７０２８ヌクレオチド配列＜配列番号１９８＞は、以下である：
【０８１７】
【化１９８】
2004502415.tif 000219
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質と推定する（０．１４５３）。
【０８１８】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物として精製した（図９９Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図９９Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図９９Ｃ）に使用した。
【０８１９】
これらの実験は、ｃｐ７０２８が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０８２０】
（実施例１００）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７３５５）を、発現した＜配列番号１９９；ｃｐ７３５５＞；
【０８２１】
【化１９９】
2004502415.tif 000220
ｃｐ７３５５ヌクレオチド配列＜配列番号２００＞は、以下である：
【０８２２】
【化２００】
2004502415.tif 000221
2004502415.tif 000222
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．１４３）。
【０８２３】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物（図１００Ａ）およびｈｉｓタグ産物として精製した。このタンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図１００Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図１００Ｃ）に使用した。
【０８２４】
これらの実験は、ｃｐ７３５５が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０８２５】
（実施例１０１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７３８０）を、発現した＜配列番号２０１；ｃｐ７３８０＞；
【０８２６】
【化２０１】
2004502415.tif 000223
ｃｐ７３８０ヌクレオチド配列＜配列番号２０２＞は、以下である：
【０８２７】
【化２０２】
2004502415.tif 000224
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．１３６２）。
【０８２８】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物として精製した（図１０１Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図１０１Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図１０１Ｃ）に使用した。
【０８２９】
これらの実験は、ｃｐ７３８０が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０８３０】
（実施例１０２）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６９０４）を、発現した＜配列番号２０３；ｃｐ６９０４＞；
【０８３１】
【化２０３】
2004502415.tif 000225
ｃｐ６９０４ヌクレオチド配列＜配列番号２０４＞は、以下である：
【０８３２】
【化２０４】
2004502415.tif 000226
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質と推定する（０．０３５８）。
【０８３３】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてｈｉｓタグ産物として精製した（図１０２Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図１０２Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０８３４】
ｃｐ６９０４タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定した。
【０８３５】
これらの実験は、ｃｐ６９０４が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０８３６】
（実施例１０３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６９６４）を、発現した＜配列番号２０５；ｃｐ６９６４＞；
【０８３７】
【化２０５】
2004502415.tif 000227
ｃｐ６９６４ヌクレオチド配列＜配列番号２０６＞は、以下である：
【０８３８】
【化２０６】
2004502415.tif 000228
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．０９１）。
【０８３９】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物として（図１０３Ａ）およびｈｉｓタグ形態においても精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図１０３Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図１０３Ｃ）に使用した。
【０８４０】
これらの実験は、ｃｐ６９６４が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０８４１】
（実施例１０４）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７３８７）を、発現した＜配列番号２０７；ｃｐ７３８７＞；
【０８４２】
【化２０７】
2004502415.tif 000229
ｃｐ７３８７ヌクレオチド配列＜配列番号２０８＞は、以下である：
【０８４３】
【化２０８】
2004502415.tif 000230
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．０４３）。
【０８４４】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてｈｉｓタグ化融合産物（図１０４Ａ）としておよびＧＳＴ融合体（図１０４Ｂ）としても精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロットおよびＦＡＣＳ分析（図１０４Ｃ；ｈｉｓタグ化）に使用した。
【０８４５】
これらの実験は、ｃｐ７３８７が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０８４６】
（実施例１０５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６２８１）を、発現した＜配列番号２０９；ｃｐ６２８１＞；
【０８４７】
【化２０９】
2004502415.tif 000231
ｃｐ６２８１ヌクレオチド配列＜配列番号２１０＞は、以下である：
【０８４８】
【化２１０】
2004502415.tif 000232
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．５３７３）。
【０８４９】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物として精製した（図１０５Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図１０５Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０８５０】
これらの実験は、ｃｐ６２８１が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０８５１】
（実施例１０６および実施例１０７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６３０６）を、発現した＜配列番号２１１；ｃｐ６３０６＞；
【０８５２】
【化２１１】
2004502415.tif 000233
ｃｐ６３０６ヌクレオチド配列＜配列番号２１２＞は、以下である：
【０８５３】
【化２１２】
2004502415.tif 000234
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質と推定する（０．１６７）。
【０８５４】
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６４３４）もまた、発現した＜配列番号２１３；ｃｐ６４３４＞；
【０８５５】
【化２１３】
2004502415.tif 000235
ｃｐ６４３４ヌクレオチド配列＜配列番号２１４＞は、以下である：
【０８５６】
【化２１４】
2004502415.tif 000236
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．６８５９）。
【０８５７】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてｈｉｓタグ産物（図１０６Ａ；６３０６＝レーン２〜４；６４３４＝レーン８〜１０）として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図１０６Ｂおよび１０７）ならびにＦＡＣＳ分析に使用した。
【０８５８】
これらの実験は、ｃｐ６３０６およびｃｐ６４３４が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０８５９】
（実施例１０８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７４００）を、発現した＜配列番号２１５；ｃｐ７４００＞；
【０８６０】
【化２１５】
2004502415.tif 000237
ｃｐ７４００ヌクレオチド配列＜配列番号２１６＞は、以下である：
【０８６１】
【化２１６】
2004502415.tif 000238
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞膜周辺腔と推定する（０．９２４）。
【０８６２】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物として精製した（図１０８Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図１０８Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０８６３】
これらの実験は、ｃｐ７４００が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０８６４】
（実施例１０９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６３９５）を、発現した＜配列番号２１７；ｃｐ６３９５＞；
【０８６５】
【化２１７】
2004502415.tif 000239
ｃｐ６３９５ヌクレオチド配列＜配列番号２１８＞は、以下である：
【０８６６】
【化２１８】
2004502415.tif 000240
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．６３０７）。
【０８６７】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物として精製した（図１０９Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図１０９Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０８６８】
これらの実験は、ｃｐ６３９５が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０８６９】
（実施例１１０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６３９６）を、発現した＜配列番号２１９；ｃｐ６３９６＞；
【０８７０】
【化２１９】
2004502415.tif 000241
2004502415.tif 000242
ｃｐ６３９６ヌクレオチド配列＜配列番号２２０＞は、以下である：
【０８７１】
【化２２０】
2004502415.tif 000243
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．６０９５）。
【０８７２】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物として精製した（図１１０Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図１１０Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０８７３】
これらの実験は、ｃｐ６３９６が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０８７４】
（実施例１１１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６４０８）を、発現した＜配列番号２２１；ｃｐ６４０８＞；
【０８７５】
【化２２１】
2004502415.tif 000244
ｃｐ６４０８ヌクレオチド配列＜配列番号２２２＞は、以下である：
【０８７６】
【化２２２】
2004502415.tif 000245
2004502415.tif 000246
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質と推定する（０．２１７１）。
【０８７７】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物（図１１１Ａ）およびｈｉｓタグ化融合体としても精製した。このｈｉｓタグタンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図１１１Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０８７８】
これらの実験は、ｃｐ６４０８が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０８７９】
（実施例１１２）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６４３０）を、発現した＜配列番号２２３；ｃｐ６４３０＞；
【０８８０】
【化２２３】
2004502415.tif 000247
ｃｐ６４３０ヌクレオチド配列＜配列番号２２４＞は、以下である：
【０８８１】
【化２２４】
2004502415.tif 000248
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．５１４０）。
【０８８２】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物として精製した（図１１２Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図１１２Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０８８３】
これらの実験は、ｃｐ６４３０が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０８８４】
（実施例１１３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６４３９）を、発現した＜配列番号２２５；ｃｐ６４３９＞；
【０８８５】
【化２２５】
2004502415.tif 000249
ｃｐ６４３９ヌクレオチド配列＜配列番号２２６＞は、以下である：
【０８８６】
【化２２６】
2004502415.tif 000250
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質と推定する（０．１６２８）。
【０８８７】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物として精製した（図１１３Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図１１３Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０８８８】
これらの実験は、ｃｐ６４３９が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０８８９】
（実施例１１４）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６４４０）を、発現した＜配列番号２２７；ｃｐ６４４０＞；
【０８９０】
【化２２７】
2004502415.tif 000251
ｃｐ６４４０ヌクレオチド配列＜配列番号２２８＞は、以下である：
【０８９１】
【化２２８】
2004502415.tif 000252
2004502415.tif 000253
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質と推定する（０．０４８１）。
【０８９２】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物（図１１４Ａ）としておよびｈｉｓタグ化産物としても精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図１１４Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０８９３】
これらの実験は、ｃｐ６４４０が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０８９４】
（実施例１１５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６４７５）を、発現した＜配列番号２２９；ｃｐ６４７５＞；
【０８９５】
【化２２９】
2004502415.tif 000254
ｃｐ６４７５ヌクレオチド配列＜配列番号２３０＞は、以下である：
【０８９６】
【化２３０】
2004502415.tif 000255
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．５３７３）。
【０８９７】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物として精製した（図１１５Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図１１５Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０８９８】
これらの実験は、ｃｐ６４７５が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０８９９】
（実施例１１６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６４８２）を、発現した＜配列番号２３１；ｃｐ６４８２＞；
【０９００】
【化２３１】
2004502415.tif 000256
ｃｐ６４８２ヌクレオチド配列＜配列番号２３２＞は、以下である：
【０９０１】
【化２３２】
2004502415.tif 000257
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質と推定する（０．４６０７）。
【０９０２】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物として精製した（図１１６Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図１１６Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０９０３】
これらの実験は、ｃｐ６４８２が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
【０９０４】
（実施例１１７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６４８６）が発現された（配列番号２３３；ｃｐ６４８６）：
【０９０５】
【化２３３】
2004502415.tif 000258
2004502415.tif 000259
ｃｐ６４８６ヌクレオチド配列（配列番号２３４）は、以下である：
【０９０６】
【化２３４】
2004502415.tif 000260
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．７４７４）を予測する。
【０９０７】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精製した（図１１７Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図１１７Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０９０８】
これらの実験は、ｃｐ６４８６が表面に露出しており、そして免疫接触可能タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０９０９】
（実施例１１８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６５２６）が発現された（配列番号２３５；ｃｐ６５２６）：
【０９１０】
【化２３５】
2004502415.tif 000261
ｃｐ６５２６ヌクレオチド配列（配列番号２３６）は、以下である：
【０９１１】
【化２３６】
2004502415.tif 000262
2004502415.tif 000263
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質（０．１２９６）を予測する。
【０９１２】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物（図１１８Ａ）として、およびヒスチジン（ｈｉｓ）タグ化産物として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図１１８Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０９１３】
これらの実験は、ｃｐ６５２６が表面に露出しており、そして免疫接触可能タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０９１４】
（実施例１１９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６５２８）が発現された（配列番号２３７；ｃｐ６５２８）：
【０９１５】
【化２３７】
2004502415.tif 000264
ｃｐ６５２８ヌクレオチド配列（配列番号２３８）は、以下である：
【０９１６】
【化２３８】
2004502415.tif 000265
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質（０．１６６８）を予測する。
【０９１７】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精製した（図１１９Ａ）この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図１１９Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０９１８】
これらの実験は、ｃｐ６５２８が表面に露出しており、そして免疫接触可能タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０９１９】
（実施例１２０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６６２７）が発現された（配列番号２３９；ｃｐ６６２７）：
【０９２０】
【化２３９】
2004502415.tif 000266
ｃｐ６６２７ヌクレオチド配列（配列番号２４０）は、以下である：
【０９２１】
【化２４０】
2004502415.tif 000267
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．７１９８）を予測する。
【０９２２】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精製した（図１２０Ａ）この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図１２０Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０９２３】
これらの実験は、ｃｐ６６２７が表面に露出しており、そして免疫接触可能タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０９２４】
（実施例１２１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６６２９）が発現された（配列番号２４１；ｃｐ６６２９）：
【０９２５】
【化２４１】
2004502415.tif 000268
ｃｐ６６２９ヌクレオチド配列（配列番号２４２）は、以下である：
【０９２６】
【化２４２】
2004502415.tif 000269
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．５７７６）を予測する。
【０９２７】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合タンパク質として精製した（図１２１Ａ）この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図１２１Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０９２８】
これらの実験は、ｃｐ６６２９が表面に露出しており、そして免疫接触可能タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０９２９】
（実施例１２２）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６７３２）が発現された（配列番号２４３；ｃｐ６７３２）：
【０９３０】
【化２４３】
2004502415.tif 000270
2004502415.tif 000271
ｃｐ６７３２ヌクレオチド配列（配列番号２４４）は、以下である：
【０９３１】
【化２４４】
2004502415.tif 000272
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質（０．２１９６）を予測する。
【０９３２】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精製した（図１２２Ａ）この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図１２２Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０９３３】
これらの実験は、ｃｐ６７３２が表面に露出しており、そして免疫接触可能タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０９３４】
（実施例１２３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６７３８）が発現された（配列番号２４５；ｃｐ６７３８）：
【０９３５】
【化２４５】
2004502415.tif 000273
ｃｐ６７３８ヌクレオチド配列（配列番号２４６）は、以下である：
【０９３６】
【化２４６】
2004502415.tif 000274
2004502415.tif 000275
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質（０．１５８７）を予測する。
【０９３７】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精製した（図１２３Ａ）この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図１２３Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０９３８】
これらの実験は、ｃｐ６７３８が表面に露出しており、そして免疫接触可能タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０９３９】
（実施例１２４）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６７３９）が発現された（配列番号２４７；ｃｐ６７３９）：
【０９４０】
【化２４７】
2004502415.tif 000276
ｃｐ６７３９ヌクレオチド配列（配列番号２４８）は、以下である：
【０９４１】
【化２４８】
2004502415.tif 000277
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．２１９０）を予測する。
【０９４２】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精製した（図１２４Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図１２４Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０９４３】
これらの実験は、ｃｐ６７３９が表面に露出しており、そして免疫接触可能タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０９４４】
（実施例１２５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６７４１）が発現された（配列番号２４９；ｃｐ６７４１）：
【０９４５】
【化２４９】
2004502415.tif 000278
ｃｐ６７４１ヌクレオチド配列（配列番号２５０）は、以下である：
【０９４６】
【化２５０】
2004502415.tif 000279
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．２８６９）を予測する。
【０９４７】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精製した（図１２５Ａ）この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図１２５Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０９４８】
これらの実験は、ｃｐ６７４１が表面に露出しており、そして免疫接触可能タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０９４９】
（実施例１２６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６７４２）が発現された（配列番号２５１；ｃｐ６７４２）：
【０９５０】
【化２５１】
2004502415.tif 000280
ｃｐ６７４２ヌクレオチド配列（配列番号２５２）は、以下である：
【０９５１】
【化２５２】
2004502415.tif 000281
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．２３３８）を予測する。
【０９５２】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精製した（図１２６Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図１２６Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０９５３】
これらの実験は、ｃｐ６７４２が表面に露出しており、そして免疫接触可能タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０９５４】
（実施例１２７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６７４４）が発現された（配列番号２５３；ｃｐ６７４４）：
【０９５５】
【化２５３】
2004502415.tif 000282
ｃｐ６７４４ヌクレオチド配列（配列番号２５４）は、以下である：
【０９５６】
【化２５４】
2004502415.tif 000283
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質（０．３８３３）を予測する。
【０９５７】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精製した（図１２７Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図１２７Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０９５８】
これらの実験は、ｃｐ６７４４が表面に露出しており、そして免疫接触可能タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０９５９】
（実施例１２８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６７４５）が発現された（配列番号２５５；ｃｐ６７４５）：
【０９６０】
【化２５５】
2004502415.tif 000284
ｃｐ６７４５ヌクレオチド配列（配列番号２５６）は、以下である：
【０９６１】
【化２５６】
2004502415.tif 000285
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．２２５３）を予測する。
【０９６２】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精製した（図１２８Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図１２８Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０９６３】
これらの実験は、ｃｐ６７４５が表面に露出しており、そして免疫接触可能タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０９６４】
（実施例１２９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６７４７）が発現された（配列番号２５７；ｃｐ６７４７）：
【０９６５】
【化２５７】
2004502415.tif 000286
ｃｐ６７４７ヌクレオチド配列（配列番号２５８）は、以下である：
【０９６６】
【化２５８】
2004502415.tif 000287
2004502415.tif 000288
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．１４４７）を予測する。
【０９６７】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物（図１２９Ａ）として、およびヒスチジン（ｈｉｓ）タグ化産物として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図１２９Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０９６８】
これらの実験は、ｃｐ６７４７が表面に露出しており、そして免疫接触可能タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０９６９】
（実施例１３０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６７５６）が発現された（配列番号２５９；ｃｐ６７５６）：
【０９７０】
【化２５９】
2004502415.tif 000289
ｃｐ６７５６ヌクレオチド配列（配列番号２６０）は、以下である：
【０９７１】
【化２６０】
2004502415.tif 000290
2004502415.tif 000291
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．３９９４）を予測する。
【０９７２】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精製した（図１３０Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図１３０Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０９７３】
これらの実験は、ｃｐ６７５６が表面に露出しており、そして免疫接触可能タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０９７４】
（実施例１３１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６７６１）が発現された（配列番号２６１；ｃｐ６７６１）：
【０９７５】
【化２６１】
2004502415.tif 000292
ｃｐ６７６１ヌクレオチド配列（配列番号２６２）は、以下である：
【０９７６】
【化２６２】
2004502415.tif 000293
2004502415.tif 000294
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．１５７４）を予測する。
【０９７７】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物（図１３１Ａ）として、ヒスチジン（ｈｉｓ）タグ化産物として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図１３１Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０９７８】
これらの実験は、ｃｐ６７６１が表面に露出しており、そして免疫接触可能タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０９７９】
（実施例１３２）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６７６６）が発現された（配列番号２６３；ｃｐ６７６６）：
【０９８０】
【化２６３】
2004502415.tif 000295
ｃｐ６７６６ヌクレオチド配列（配列番号２６４）は、以下である：
【０９８１】
【化２６４】
2004502415.tif 000296
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．６１５８）を予測する。
【０９８２】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物（図１３２Ａ）として、およびヒスチジン（ｈｉｓ）タグ化産物として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図１３２Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０９８３】
これらの実験は、ｃｐ６７６６が表面に露出しており、そして免疫接触可能タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０９８４】
（実施例１３３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６８０４）が発現された（配列番号２６５；ｃｐ６８０４）：
【０９８５】
【化２６５】
2004502415.tif 000297
ｃｐ６８０４ヌクレオチド配列（配列番号２６６）は、以下である：
【０９８６】
【化２６６】
2004502415.tif 000298
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．０６０）を予測する。
【０９８７】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精製した（図１３３Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図１３３Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０９８８】
これらの実験は、ｃｐ６８０４が表面に露出しており、そして免疫接触可能タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０９８９】
（実施例１３４）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６８０５）が発現された（配列番号２６７；ｃｐ６８０５）：
【０９９０】
【化２６７】
2004502415.tif 000299
ｃｐ６８０５ヌクレオチド配列（配列番号２６８）は、以下である：
【０９９１】
【化２６８】
2004502415.tif 000300
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．７１１）を予測する。
【０９９２】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精製した（図１３４Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図１３４Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０９９３】
これらの実験は、ｃｐ６８０５が表面に露出しており、そして免疫接触可能タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０９９４】
（実施例１３５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６８１３）が発現された（配列番号２６９；ｃｐ６８１３）：
【０９９５】
【化２６９】
2004502415.tif 000301
ｃｐ６８１３ヌクレオチド配列（配列番号２７０）は、以下である：
【０９９６】
【化２７０】
2004502415.tif 000302
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．４２９１）を予測する。
【０９９７】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精製した（図１３５Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図１３５Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【０９９８】
これらの実験は、ｃｐ６８１３が表面に露出しており、そして免疫接触可能タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【０９９９】
（実施例１３６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６８４４）が発現された（配列番号２７１；ｃｐ６８４４）：
【１０００】
【化２７１】
2004502415.tif 000303
ｃｐ６８４４ヌクレオチド配列（配列番号２７２）は、以下である：
【１００１】
【化２７２】
2004502415.tif 000304
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．１７８６）を予測する。
【１００２】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物（図１３６Ａ）として、およびヒスチジンタグ化産物として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図１３６Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【１００３】
これらの実験は、ｃｐ６８４４が表面に露出しており、そして免疫接触可能タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【１００４】
（実施例１３７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７２０１）が発現された（配列番号２７３；ｃｐ７２０１）：
【１００５】
【化２７３】
2004502415.tif 000305
2004502415.tif 000306
ｃｐ７２０１ヌクレオチド配列（配列番号２７４）は、以下である：
【１００６】
【化２７４】
2004502415.tif 000307
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．３１０２）を予測する。
【１００７】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精製した（図１３７Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図１３７Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【１００８】
これらの実験は、ｃｐ７２０１が表面に露出しており、そして免疫接触可能タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【１００９】
（実施例１３８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７２５１）が発現された（配列番号２７５；ｃｐ７２５１）：
【１０１０】
【化２７５】
2004502415.tif 000308
ｃｐ７２５１ヌクレオチド配列（配列番号２７６）は、以下である：
【１０１１】
【化２７６】
2004502415.tif 000309
2004502415.tif 000310
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．４５４５）を予測する。
【１０１２】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精製した（図１３８Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図１３８Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【１０１３】
これらの実験は、ｃｐ７２５１が表面に露出しており、そして免疫接触可能タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【１０１４】
（実施例１３９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７２８８）が発現された（配列番号２７７；ｃｐ７２８８）：
【１０１５】
【化２７７】
2004502415.tif 000311
ｃｐ７２８８ヌクレオチド配列（配列番号２７８）は、以下である：
【１０１６】
【化２７８】
2004502415.tif 000312
2004502415.tif 000313
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．５９８９）を予測する。
【１０１７】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精製した（図１３９Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図１３９Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【１０１８】
これらの実験は、ｃｐ７２８８が表面に露出しており、そして免疫接触可能タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【１０１９】
（実施例１４０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７３５９）が発現された（配列番号２７９；ｃｐ７３５９）：
【１０２０】
【化２７９】
2004502415.tif 000314
ｃｐ７３５９ヌクレオチド配列（配列番号２８０）は、以下である：
【１０２１】
【化２８０】
2004502415.tif 000315
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．７４５３）を予測する。
【１０２２】
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精製した（図１４０Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図１４０Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【１０２３】
これらの実験は、ｃｐ７３５９が表面に露出しており、そして免疫接触可能タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
【１０２４】
（実施例１４１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７３７４）が発現された（配列番号２８１；ｃｐ７３７４）：
【１０２５】
【化２８１】
2004502415.tif 000316
ｃｐ７３７４ヌクレオチド配列（配列番号２８２）は、以下である：
【１０２６】
【化２８２】
2004502415.tif 000317
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質（０．２９３０）を予測する。
【１０２７】
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこのタンパク質を、ＧＳＴ融合産物として（図１４１Ａ）、またｈｉｓタグ化形態で精製した。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１４１Ｂ）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【１０２８】
これらの実験は、ｃｐ７３７４が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能な（ｉｍｍｕｎｏａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）タンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列からだけでは明らかとならない。
【１０２９】
（実施例１４２）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７３７７）が発現された（配列番号２８３；ｃｐ７３７７）：
【１０３０】
【化２８３】
2004502415.tif 000318
ｃｐ７３７７ヌクレオチド配列（配列番号２８４）は以下である：
【１０３１】
【化２８４】
2004502415.tif 000319
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．２９２６）。
【１０３２】
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこのタンパク質を、ＧＳＴ融合産物として（図１４２Ａ）、またｈｉｓタグ化形態で精製した。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１４２Ｂ）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【１０３３】
これらの実験は、ｃｐ７３７７が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列からだけでは明らかとならない。
【１０３４】
（実施例１４３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７４０７）が発現された（配列番号２８５；ｃｐ７４０７）：
【１０３５】
【化２８５】
2004502415.tif 000320
ｃｐ７４０７ヌクレオチド配列（配列番号２８６）は以下である：
【１０３６】
【化２８６】
2004502415.tif 000321
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．１３１９）。
【１０３７】
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこのタンパク質を、ＧＳＴ融合産物として精製した（図１４３Ａ）。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１４３Ｂ）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【１０３８】
これらの実験は、ｃｐ７４０７が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列からだけでは明らかとならない。
【１０３９】
（実施例１４４）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６４３２）が発現された（配列番号２８７；ｃｐ６４３２）：
【１０４０】
【化２８７】
2004502415.tif 000322
ｃｐ６４３２ヌクレオチド配列（配列番号２８８）は以下である：
【１０４１】
【化２８８】
2004502415.tif 000323
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．５３９４）。
【１０４２】
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこのタンパク質を、ｈｉｓタグ化産物として精製した（図１４４Ａ）。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１４４Ｂ）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【１０４３】
これらの実験は、ｃｐ６４３２が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列からだけでは明らかとならない。
【１０４４】
（実施例１４５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６４３３）が発現された（配列番号２８９；ｃｐ６４３３）：
【１０４５】
【化２８９】
2004502415.tif 000324
ｃｐ６４３３ヌクレオチド配列（配列番号２９０）は以下である：
【１０４６】
【化２９０】
2004502415.tif 000325
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．４０６８）。
【１０４７】
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこのタンパク質を、ｈｉｓタグ化産物として精製した（図１４５Ａ）。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１４５Ｂ）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【１０４８】
これらの実験は、ｃｐ６４３３が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列からだけでは明らかとならない。
【１０４９】
（実施例１４６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６６４３）が発現された（配列番号２９１；ｃｐ６６４３）：
【１０５０】
【化２９１】
2004502415.tif 000326
ｃｐ６６４３ヌクレオチド配列（配列番号２９２）は以下である：
【１０５１】
【化２９２】
2004502415.tif 000327
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．６８５９）。
【１０５２】
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこのタンパク質を、ｈｉｓタグ化産物として精製した（図１４６Ａ）。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１４６Ｂ）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【１０５３】
これらの実験は、ｃｐ６６４３が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列からだけでは明らかとならない。
【１０５４】
（実施例１４７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６７２２）が発現された（配列番号２９３；ｃｐ６７２２）：
【１０５５】
【化２９３】
2004502415.tif 000328
ｃｐ６７２２ヌクレオチド配列（配列番号２９４）は以下である：
【１０５６】
【化２９４】
2004502415.tif 000329
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．６６６８）。
【１０５７】
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこのタンパク質を、ｈｉｓタグ化産物として精製した（図１４７Ａ）。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１４７Ｂ）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【１０５８】
これらの実験は、ｃｐ６７２２が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列からだけでは明らかとならない。
【１０５９】
（実施例１４８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７２５３）が発現された（配列番号２９５；ｃｐ７２５３）：
【１０６０】
【化２９５】
2004502415.tif 000330
ｃｐ７２５３ヌクレオチド配列（配列番号２９６）は以下である：
【１０６１】
【化２９６】
2004502415.tif 000331
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．５３９４）。
【１０６２】
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこのタンパク質を、ｈｉｓタグ化産物として精製した（図１４８Ａ）。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１４８Ｂ）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【１０６３】
これらの実験は、ｃｐ７２５３が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列からだけでは明らかとならない。
【１０６４】
（実施例１４９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６２６４）が発現された（配列番号２９７；ｃｐ６２６４）：
【１０６５】
【化２９７】
2004502415.tif 000332
ｃｐ６２６４ヌクレオチド配列（配列番号２９８）は以下である：
【１０６６】
【化２９８】
2004502415.tif 000333
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．２８１７）。
【１０６７】
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこのタンパク質を、ｈｉｓタグ化産物として精製した（図１４９Ａ）。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１４９Ｂ）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【１０６８】
これらの実験は、ｃｐ６２６４が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列からだけでは明らかとならない。
【１０６９】
（実施例１５０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６２６６）が発現された（配列番号２９９；ｃｐ６２６６）：
【１０７０】
【化２９９】
2004502415.tif 000334
ｃｐ６２６６ヌクレオチド配列（配列番号３００）は以下である：
【１０７１】
【化３００】
2004502415.tif 000335
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．３５９０）。
【１０７２】
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこのタンパク質を、ｈｉｓタグ化産物として精製した（図１５０Ａ）。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１５０）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【１０７３】
これらの実験は、ｃｐ６２６６が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列からだけでは明らかとならない。
【１０７４】
（実施例１５１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６８９５）が発現された（配列番号３０１；ｃｐ６８９５）：
【１０７５】
【化３０１】
2004502415.tif 000336
ｃｐ６８９５ヌクレオチド配列（配列番号３０２）は以下である：
【１０７６】
【化３０２】
2004502415.tif 000337
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．３２６４）。
【１０７７】
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこのタンパク質を、ｈｉｓタグ化産物として精製した（図１５１Ａ）。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１５１Ｂ）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【１０７８】
これらの実験は、ｃｐ６８９５が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列からだけでは明らかとならない。
【１０７９】
（実施例１５２および実施例１５３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６２８２）が発現された（配列番号３０３；ｃｐ６２８２）：
【１０８０】
【化３０３】
2004502415.tif 000338
ｃｐ６２８２ヌクレオチド配列（配列番号３０４）は以下である：
【１０８１】
【化３０４】
2004502415.tif 000339
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．３６２）。
【１０８２】
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７３７３）もまた発現された（配列番号３０５；ｃｐ７３７３）：
【１０８３】
【化３０５】
2004502415.tif 000340
ｃｐ７３７３ヌクレオチド配列（配列番号３０６）は以下である：
【１０８４】
【化３０６】
2004502415.tif 000341
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．１０６９）。
【１０８５】
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこれらのタンパク質を、ｈｉｓタグ化産物として精製した（図１５２Ａ；６２８２＝レーン８および９；７３７３＝レーン２〜４）。これらの組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１５２Ｂおよび１５３）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【１０８６】
これらの実験は、ｃｐ６２８２およびｃｐ７３７３が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列からだけでは明らかとならない。
【１０８７】
（実施例１５４、実施例１５５、実施例１５６、実施例１５７および実施例１５８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６４１２）が発現された（配列番号３０７；ｃｐ６４１２）：
【１０８８】
【化３０７】
2004502415.tif 000342
ｃｐ６４１２ヌクレオチド配列（配列番号３０８）は以下である：
【１０８９】
【化３０８】
2004502415.tif 000343
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．４８６４）。
【１０９０】
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６４３１）もまた発現された（配列番号３０９；ｃｐ６４３１）：
【１０９１】
【化３０９】
2004502415.tif 000344
ｃｐ６４３１ヌクレオチド配列（配列番号３１０）は以下である：
【１０９２】
【化３１０】
2004502415.tif 000345
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．２１１５）。
【１０９３】
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６４４３）もまた発現された（配列番号３１１；ｃｐ６４４３）：
【１０９４】
【化３１１】
2004502415.tif 000346
　ｃｐ６４４３ヌクレオチド配列（配列番号３１２）は以下である：
【１０９５】
【化３１２】
2004502415.tif 000347
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．５５８５）。
【１０９６】
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６４９６）もまた発現された（配列番号３１３；ｃｐ６４９６）：
【１０９７】
【化３１３】
2004502415.tif 000348
ｃｐ６４９６ヌクレオチド配列（配列番号３１４）は以下である：
【１０９８】
【化３１４】
2004502415.tif 000349
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．５９８９）。
【１０９９】
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６６５４）もまた発現された（配列番号３１５；ｃｐ６６５４）：
【１１００】
【化３１５】
2004502415.tif 000350
ｃｐ６６５４ヌクレオチド配列（配列番号３１６）は以下である：
【１１０１】
【化３１６】
2004502415.tif 000351
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．０７３０）。
【１１０２】
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこれらのタンパク質を、ｈｉｓタグ化産物として精製した（図１５４Ａ；６４１２＝レーン２〜３；６４３１＝レーン１１〜１２；６４４３＝レーン５〜６；６４９６＝レーン８〜９；６６５４＝レーン１０；レーン１、４、７におけるマーカー）。これらの組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１５４Ｂおよび１５５、１５６、１５７および１５８）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【１１０３】
これらの実験は、ｃｐ６４１２、ｃｐ６４３１、ｃｐ６４４３、ｃｐ６４９６およびｃｐ６６５４が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、これらの配列からだけでは明らかとならない。
【１１０４】
（実施例１５９および実施例１６０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６４７７）が発現された（配列番号３１７；ｃｐ６４７７）：
【１１０５】
【化３１７】
2004502415.tif 000352
ｃｐ６４７７ヌクレオチド配列（配列番号３１８）は以下である：
【１１０６】
【化３１８】
2004502415.tif 000353
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．１２８）。
【１１０７】
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６４３５）もまた発現された（配列番号３１９；ｃｐ６４３５）：
【１１０８】
【化３１９】
2004502415.tif 000354
ｃｐ６４３５ヌクレオチド配列（配列番号３２０）は以下である：
【１１０９】
【化３２０】
2004502415.tif 000355
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞膜周辺腔を予測する（０．４０４４）。
【１１１０】
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこれらのタンパク質を、ｈｉｓタグ化産物として精製した（図１５９Ａ；６４３５＝レーン２〜４；６４７７＝レーン５〜７）。これらの組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１５９Ｂおよび１６０）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【１１１１】
これらの実験は、ｃｐ６４７７およびｃｐ６４３５が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列からだけでは明らかとならない。
【１１１２】
（実施例１６１、実施例１６２および実施例１６３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６４４１）が発現された（配列番号３２１；ｃｐ６４４１）：
【１１１３】
【化３２１】
2004502415.tif 000356
ｃｐ６４４１ヌクレオチド配列（配列番号３２２）は以下である：
【１１１４】
【化３２２】
2004502415.tif 000357
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細菌内膜を予測する（０．１３２）。
【１１１５】
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６７４８）もまた発現された（配列番号３２３；ｃｐ６７４８）：
【１１１６】
【化３２３】
2004502415.tif 000358
ｃｐ６７４８ヌクレオチド配列（配列番号３２４）は以下である：
【１１１７】
【化３２４】
2004502415.tif 000359
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．１７０）。
【１１１８】
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６８８１）もまた発現された（配列番号３２５；ｃｐ６８８１）：
【１１１９】
【化３２５】
2004502415.tif 000360
ｃｐ６８８１ヌクレオチド配列（配列番号３２６）は以下である：
【１１２０】
【化３２６】
2004502415.tif 000361
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．２４９）。
【１１２１】
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこれらのタンパク質を、ｈｉｓタグ化産物として精製した（図１６１Ａ；６４４１＝レーン７〜９；６７４８＝レーン２〜３；６８８１＝レーン４〜６）。これらの組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１６１Ｂ、１６２および１６３）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【１１２２】
これらの実験は、ｃｐ６４４１、ｃｐ６７４８およびｃｐ６８８１が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列からだけでは明らかとならない。
【１１２３】
（実施例１６４、実施例１６５および実施例１６６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６４４４）が発現された（配列番号３２７；ｃｐ６４４４）：
【１１２４】
【化３２７】
2004502415.tif 000362
ｃｐ６４４４ヌクレオチド配列（配列番号３２８）は以下である：
【１１２５】
【化３２８】
2004502415.tif 000363
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．２０３１）。
【１１２６】
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６４１３）もまた発現された（配列番号３２９；ｃｐ６４１３）：
【１１２７】
【化３２９】
2004502415.tif 000364
ｃｐ６４１３ヌクレオチド配列（配列番号３３０）は以下である：
【１１２８】
【化３３０】
2004502415.tif 000365
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．６１８０）。
【１１２９】
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７３９１）もまた発現された（配列番号３３１；ｃｐ７３９１）：
【１１３０】
【化３３１】
2004502415.tif 000366
ｃｐ７３９１ヌクレオチド配列（配列番号３３２）は以下である：
【１１３１】
【化３３２】
2004502415.tif 000367
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．１４８９）。
【１１３２】
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこれらのタンパク質を、ｈｉｓタグ化産物およびＧＳＴ融合産物として精製した（図１６４Ａ；６４４４＝レーン１１〜１２；７３９１＝レーン２〜３；６４１３＝レーン４〜６）。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１６４Ｂ、１６５および１６６）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【１１３３】
これらの実験は、ｃｐ６４４４、ｃｐ６４１３およびｃｐ７３９１が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列からだけでは明らかとならない。
【１１３４】
（実施例１６７、実施例１６８、実施例１６９および実施例１７０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６４６３）が発現された（配列番号３３３；ｃｐ６４６３）：
【１１３５】
【化３３３】
2004502415.tif 000368
ｃｐ６４６３ヌクレオチド配列（配列番号３３４）は以下である：
【１１３６】
【化３３４】
2004502415.tif 000369
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．１５１０）。
【１１３７】
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６５４０）もまた発現された（配列番号３３５；ｃｐ６５４０）：
【１１３８】
【化３３５】
2004502415.tif 000370
ｃｐ６５４０ヌクレオチド配列（配列番号３３６）は以下である：
【１１３９】
【化３３６】
2004502415.tif 000371
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．３０８６）。
【１１４０】
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６７４３）もまた発現された（配列番号３３７；ｃｐ６７４３）：
【１１４１】
【化３３７】
2004502415.tif 000372
ｃｐ６７４３ヌクレオチド配列（配列番号３３８）は以下である：
【１１４２】
【化３３８】
2004502415.tif 000373
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．２７６９）。
【１１４３】
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７０４１）もまた発現された（配列番号３３９；ｃｐ７０４１）：
【１１４４】
【化３３９】
2004502415.tif 000374
　ｃｐ７０４１ヌクレオチド配列（配列番号３４０）は以下である：
【１１４５】
【化３４０】
2004502415.tif 000375
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．１０２２）。
【１１４６】
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこれらのタンパク質を、ｈｉｓタグ化産物として精製した（図１６７Ａ；６４６３＝レーン２〜４；６５４０＝レーン５〜７；６７４３＝レーン８〜９；７０４１＝レーン１０〜１１）。これらの組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１６７Ｂ、１６８、１６９および１７０）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【１１４７】
これらの実験は、ｃｐ６４６３、ｃｐ６５４０、ｃｐ６７４３およびｃｐ７０４１が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列からだけでは明らかとならない。
【１１４８】
（実施例１７１、実施例１７２および実施例１７３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６６３２）が発現された（配列番号３４１；ｃｐ６６３２）：
【１１４９】
【化３４１】
2004502415.tif 000376
ｃｐ６６３２ヌクレオチド配列（配列番号３４２）は以下である：
【１１５０】
【化３４２】
2004502415.tif 000377
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．３６２７）。
【１１５１】
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６６４８）もまた発現された（配列番号３４３；ｃｐ６６４８）：
【１１５２】
【化３４３】
2004502415.tif 000378
　ｃｐ６６４８ヌクレオチド配列（配列番号３４４）は以下である：
【１１５３】
【化３４４】
2004502415.tif 000379
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．６０７４）。
【１１５４】
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６４９７）もまた発現された（配列番号３４５；ｃｐ６４９７）：
【１１５５】
【化３４５】
2004502415.tif 000380
ｃｐ６４９７ヌクレオチド配列（配列番号３４６）は以下である：
【１１５６】
【化３４６】
2004502415.tif 000381
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．１４５）。
【１１５７】
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこれらのタンパク質を、ｈｉｓタグ化産物として精製した（図１７１Ａ；６６３２＝レーン５〜７；６６４８＝レーン８〜１０；６４９７＝レーン２〜４）。これらの組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１７１Ｂ、１７２および１７３）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【１１５８】
これらの実験は、ｃｐ６６３２、ｃｐ６６４８およびｃｐ６４９７が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列からだけでは明らかとならない。
【１１５９】
（実施例１７４、実施例１７５、実施例１７６、実施例１７７および実施例１７８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７２００）が発現された（配列番号３４７；ｃｐ７２００）：
【１１６０】
【化３４７】
2004502415.tif 000382
ｃｐ７２００ヌクレオチド配列（配列番号３４８）は以下である：
【１１６１】
【化３４８】
2004502415.tif 000383
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．３６７２）。
【１１６２】
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７２３５）もまた発現された（配列番号３４９；ｃｐ７２３５）：
【１１６３】
【化３４９】
2004502415.tif 000384
ｃｐ７２３５ヌクレオチド配列（配列番号３５０）は以下である：
【１１６４】
【化３５０】
2004502415.tif 000385
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．３２１４）。
【１１６５】
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７２６８）もまた発現された（配列番号３５１；ｃｐ７２６８）：
【１１６６】
【化３５１】
2004502415.tif 000386
ｃｐ７２６８ヌクレオチド配列（配列番号３５２）は以下である：
【１１６７】
【化３５２】
2004502415.tif 000387
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．１２３５）。
【１１６８】
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７３７５）もまた発現された（配列番号３５３；ｃｐ７３７５）：
【１１６９】
【化３５３】
2004502415.tif 000388
ｃｐ７３７５ヌクレオチド配列（配列番号３５４）は以下である：
【１１７０】
【化３５４】
2004502415.tif 000389
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．００４９）。
【１１７１】
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７３８８）もまた発現された（配列番号３５５；ｃｐ７３８８）：
【１１７２】
【化３５５】
2004502415.tif 000390
ｃｐ７３８８ヌクレオチド配列（配列番号３５６）は以下である：
【１１７３】
【化３５６】
2004502415.tif 000391
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．４６１）。
【１１７４】
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこれらのタンパク質を、ｈｉｓタグ化産物として精製した（図１７４；７２００＝レーン２〜３；７２３６＝レーン４〜５；７２６８＝レーン６〜８；７３７５＝レーン９〜１０；７３８８＝レーン１１〜１２）。これらの組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１７４、１７５、１７６、１７７および１７８）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【１１７５】
これらの実験は、ｃｐ７２００、ｃｐ７２３５、ｃｐ７２６８、ｃｐ７３７５およびｃｐ７３８８が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列からだけでは明らかとならない。
【１１７６】
（実施例１７９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６７２３）が発現された（配列番号３５７；ｃｐ６７２３）：
【１１７７】
【化３５７】
2004502415.tif 000392
ｃｐ６７２３ヌクレオチド配列（配列番号３５８）は以下である：
【１１７８】
【化３５８】
2004502415.tif 000393
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．６０９５）。
【１１７９】
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこのタンパク質を、ｈｉｓタグ化産物として精製した（図１７９Ａ）。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１７９Ｂ）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【１１８０】
これらの実験は、ｃｐ６７２３が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列からだけでは明らかとならない。
【１１８１】
（実施例１８０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６７４９）が発現された（配列番号３５９；ｃｐ６７４９）：
【１１８２】
【化３５９】
2004502415.tif 000394
　ｃｐ６７４９ヌクレオチド配列（配列番号３６０）は以下である：
【１１８３】
【化３６０】
2004502415.tif 000395
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．２９９６）。
【１１８４】
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこのタンパク質を、ｈｉｓタグ化産物として精製した（図１８０Ａ）。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１８０Ｂ）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
【１１８５】
これらの実験は、ｃｐ６７４９が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列からだけでは明らかとならない。
【１１８６】
（実施例１８１、実施例１８２、実施例１８３、実施例１８４および実施例１８５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６３０１）が発現された（配列番号３６１；ｃｐ６３０１）：
【１１８７】
【化３６１】
2004502415.tif 000396
ｃｐ６３０１ヌクレオチド配列（配列番号３６２）は以下である：
【１１８８】
【化３６２】
2004502415.tif 000397
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．４６２１）。
【１１８９】
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６５５８）もまた発現された（配列番号３６３；ｃｐ６５５８）：
【１１９０】
【化３６３】
2004502415.tif 000398
ｃｐ６５５８ヌクレオチド配列（配列番号３６４）は以下である：
【１１９１】
【化３６４】
2004502415.tif 000399
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．４６３０）。
【１１９２】
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６６３０）もまた発現された（配列番号３６５；ｃｐ６６３０）：
【１１９３】
【化３６５】
2004502415.tif 000400
ｃｐ６６３０ヌクレオチド配列（配列番号３６６）は以下である：
【１１９４】
【化３６６】
2004502415.tif 000401
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．７０９２）。
【１１９５】
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６６３３）もまた発現された（配列番号３６７；ｃｐ６６３３）：
【１１９６】
【化３６７】
2004502415.tif 000402
ｃｐ６６３３ヌクレオチド配列（配列番号３６８）は以下である：
【１１９７】
【化３６８】
2004502415.tif 000403
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．７２８３）。
【１１９８】
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６６４２）もまた発現された（配列番号３６９；ｃｐ６６４２）：
【１１９９】
【化３６９】
2004502415.tif 000404
ｃｐ６６４２ヌクレオチド配列（配列番号３７０）は、以下である：
【１２００】
【化３７０】
2004502415.tif 000405
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは内膜を予測する（０．５２８８）。
【１２０１】
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉ中で発現させ、ＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を、マウスを免疫するために使用し、その血清をウエスタンブロット（図１８１〜１８５）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【１２０２】
これらの実験は、ｃｐ６３０１、ｃｐ６５５８、ｃｐ６６３０、ｃｐ６６３３およびｃｐ６６４２が表面露出され、免疫利用可能なタンパク質であり、そしてこれらが有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、これらの配列単独からは明らかでない。
【１２０３】
（実施例１８６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６３８９）を発現した（配列番号３７１；ｃｐ６３８９）：
【１２０４】
【化３７１】
2004502415.tif 000406
ｃｐ６３８９ヌクレオチド配列（配列番号３７２）は、以下である：
【１２０５】
【化３７２】
2004502415.tif 000407
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは細胞質を予測する（０．３１９３）。
【１２０６】
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉ中で発現させ、ＧＳＴ融合産物として（図１８６Ａ）、そしてまたｈｉｓタグ化形態で精製した。組換えタンパク質を、マウスを免疫するために使用し、その血清をウエスタンブロット（図１８６Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【１２０７】
これらの実験は、ｃｐ６３８９が表面露出され、免疫利用可能なタンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、この配列単独からは明らかでない。
【１２０８】
（実施例１８７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６７９２）を発現した（配列番号３７３；ｃｐ６７９２）：
【１２０９】
【化３７３】
2004502415.tif 000408
ｃｐ６７９２ヌクレオチド配列（配列番号３７４）は、以下である：
【１２１０】
【化３７４】
2004502415.tif 000409
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは細胞質を予測する（０．１８０）。
【１２１１】
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉ中で発現させ、ｈｉｓタグ化産物として精製した（図１８７Ａ；レーン２〜４）。組換えタンパク質を、マウスを免疫するために使用し、その血清をウエスタンブロット（図１８７Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【１２１２】
これらの実験は、ｃｐ６７９２が表面露出され、免疫利用可能なタンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、この配列単独からは明らかでない。
【１２１３】
（実施例１８８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６８６８）を発現した（配列番号３７５；ｃｐ６８６８）：
【１２１４】
【化３７５】
2004502415.tif 000410
ｃｐ６８６８ヌクレオチド配列（配列番号３７６）は、以下である：
【１２１５】
【化３７６】
2004502415.tif 000411
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは細菌の細胞質を予測する（０．３２５）。
【１２１６】
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉ中で発現させ、ｈｉｓタグ化産物として精製した（図１８８Ａ；レーン２〜３）。組換えタンパク質を、マウスを免疫するために使用し、その血清をウエスタンブロット（図１８８Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【１２１７】
これらの実験は、ｃｐ６８６８が表面露出され、免疫利用可能なタンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、この配列単独からは明らかでない。
【１２１８】
（実施例１８９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７６８９４）を発現した（配列番号３７７；ｃｐ６８９４）：
【１２１９】
【化３７７】
2004502415.tif 000412
ｃｐ６８９４ヌクレオチド配列（配列番号３７８）は、以下である：
【１２２０】
【化３７８】
2004502415.tif 000413
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは内膜を予測する（０．１６２）。
【１２２１】
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉ中で発現し、ｈｉｓタグ化産物として（図１８９Ａ）、そしてまたＧＳＴ／ｈｉｓ形態で精製した。組換えタンパク質を、マウスを免疫するために使用し、その血清をウエスタンブロット（図１８９Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
【１２２２】
これらの実験は、ｃｐ６８９４が表面露出され、免疫利用可能なタンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、この配列単独からは明らかでない。
【１２２３】
（実施例１９０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ　４３７７１９３）を、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定した（配列番号３７９；ｃｐ７１９３）：
【１２２４】
【化３７９】
2004502415.tif 000414
推定リーダーペプチドに下線を引く。
【１２２５】
ｃｐ７１９３ヌクレオチド配列（配列番号３８０）は、以下である：
【１２２６】
【化３８０】
2004502415.tif 000415
ＰＳＯＲＴアルゴリズムはペリプラズムを予測する（０．９２５）。
【１２２７】
これは、ｃｐ７１９３が、ＥＢにおいて免疫利用可能なタンパク質であり、これが有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、タンパク質の配列単独からは明らかでない。
【１２２８】
本発明が、例のみのために記載されており、そして改変が本発明の精神および範囲内に維持されながらなされ得ることが、理解される。
【１２２９】
表ＩＩ−Ｃｐｎ遺伝子を増幅するために用いられたプライマーの配列
【１２３０】
【表２】
2004502415.tif 000416
2004502415.tif 000417
2004502415.tif 000418
表ＩＩＩ−ＦＡＣＳ分析での最良の結果を有するタンパク質
【１２３１】
【表３】
2004502415.tif 000419
2004502415.tif 000420
表ＩＶ−Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓにおいて見出されないＦＡＣＳ陽性タンパク質
【１２３２】
【表４】
2004502415.tif 000421
表Ｖ−２Ｄ電気泳動に続くＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって同定されたタンパク質
【１２３３】
【表５】
2004502415.tif 000422
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、実施例１に関するデータを示す。
【図２】
図２は、実施例２に関するデータを示す。
【図３】
図３は、実施例３に関するデータを示す。
【図４】
図４は、実施例４に関するデータを示す。
【図５】
図５は、実施例５に関するデータを示す。
【図６】
図６は、実施例６に関するデータを示す。
【図７】
図７は、実施例７に関するデータを示す。
【図８】
図８は、実施例８に関するデータを示す。
【図９】
図９は、実施例９に関するデータを示す。
【図１０】
図１０は、実施例１０に関するデータを示す。
【図１１】
図１１は、実施例１１に関するデータを示す。
【図１２】
図１２は、実施例１２に関するデータを示す。
【図１３】
図１３は、実施例１３に関するデータを示す。
【図１４】
図１４は、実施例１４に関するデータを示す。
【図１５】
図１５は、実施例１５に関するデータを示す。
【図１６】
図１６は、実施例１６に関するデータを示す。
【図１７】
図１７は、実施例１７に関するデータを示す。
【図１８】
図１８は、実施例１８に関するデータを示す。
【図１９】
図１９は、実施例１９に関するデータを示す。
【図２０】
図２０は、実施例２０に関するデータを示す。
【図２１】
図２１は、実施例２１に関するデータを示す。
【図２２】
図２２は、実施例２２に関するデータを示す。
【図２３】
図２３は、実施例２３に関するデータを示す。
【図２４】
図２４は、実施例２４に関するデータを示す。
【図２５】
図２５は、実施例２５に関するデータを示す。
【図２６】
図２６は、実施例２６に関するデータを示す。
【図２７】
図２７は、実施例２７に関するデータを示す。
【図２８】
図２８は、実施例２８に関するデータを示す。
【図２９】
図２９は、実施例２９に関するデータを示す。
【図３０】
図３０は、実施例３０に関するデータを示す。
【図３１】
図３１は、実施例３１に関するデータを示す。
【図３２】
図３２は、実施例３２に関するデータを示す。
【図３３】
図３３は、実施例３３に関するデータを示す。
【図３４】
図３４は、実施例３４に関するデータを示す。
【図３５】
図３５は、実施例３５に関するデータを示す。
【図３６】
図３６は、実施例３６に関するデータを示す。
【図３７】
図３７は、実施例３７に関するデータを示す。
【図３８】
図３８は、実施例３８に関するデータを示す。
【図３９】
図３９は、実施例３９に関するデータを示す。
【図４０】
図４０は、実施例４０に関するデータを示す。
【図４１】
図４１は、実施例４１に関するデータを示す。
【図４２】
図４２は、実施例４２に関するデータを示す。
【図４３】
図４３は、実施例４３に関するデータを示す。
【図４４】
図４４は、実施例４４に関するデータを示す。
【図４５】
図４５は、実施例４５に関するデータを示す。
【図４６】
図４６は、実施例４６に関するデータを示す。
【図４７】
図４７は、実施例４７に関するデータを示す。
【図４８】
図４８は、実施例４８に関するデータを示す。
【図４９】
図４９は、実施例４９に関するデータを示す。
【図５０】
図５０は、実施例５０に関するデータを示す。
【図５１】
図５１は、実施例５１に関するデータを示す。
【図５２】
図５２は、実施例５２に関するデータを示す。
【図５３】
図５３は、実施例５３に関するデータを示す。
【図５４】
図５４は、実施例５４に関するデータを示す。
【図５５】
図５５は、実施例５５に関するデータを示す。
【図５６】
図５６は、実施例５６に関するデータを示す。
【図５７】
図５７は、実施例５７に関するデータを示す。
【図５８】
図５８は、実施例５８に関するデータを示す。
【図５９】
図５９は、実施例５９に関するデータを示す。
【図６０】
図６０は、実施例６０に関するデータを示す。
【図６１】
図６１は、実施例６１に関するデータを示す。
【図６２】
図６２は、実施例６２に関するデータを示す。
【図６３】
図６３は、実施例６３に関するデータを示す。
【図６４】
図６４は、実施例６４に関するデータを示す。
【図６５】
図６５は、実施例６５に関するデータを示す。
【図６６】
図６６は、実施例６６に関するデータを示す。
【図６７】
図６７は、実施例６７に関するデータを示す。
【図６８】
図６８は、実施例６８に関するデータを示す。
【図６９】
図６９は、実施例６９に関するデータを示す。
【図７０】
図７０は、実施例７０に関するデータを示す。
【図７１】
図７１は、実施例７１に関するデータを示す。
【図７２】
図７２は、実施例７２に関するデータを示す。
【図７３】
図７３は、実施例７３に関するデータを示す。
【図７４】
図７４は、実施例７４に関するデータを示す。
【図７５】
図７５は、実施例７５に関するデータを示す。
【図７６】
図７６は、実施例７６に関するデータを示す。
【図７７】
図７７は、実施例７７に関するデータを示す。
【図７８】
図７８は、実施例７８に関するデータを示す。
【図７９】
図７９は、実施例７９に関するデータを示す。
【図８０】
図８０は、実施例８０に関するデータを示す。
【図８１】
図８１は、実施例８１に関するデータを示す。
【図８２】
図８２は、実施例８２に関するデータを示す。
【図８３】
図８３は、実施例８３に関するデータを示す。
【図８４】
図８４は、実施例８４に関するデータを示す。
【図８５】
図８５は、実施例８５に関するデータを示す。
【図８６】
図８６は、実施例８６に関するデータを示す。
【図８７】
図８７は、実施例８７に関するデータを示す。
【図８８】
図８８は、実施例８８に関するデータを示す。
【図８９】
図８９は、実施例８９に関するデータを示す。
【図９０】
図９０は、実施例９０に関するデータを示す。
【図９１】
図９１は、実施例９１に関するデータを示す。
【図９２】
図９２は、実施例９２に関するデータを示す。
【図９３】
図９３は、実施例９３に関するデータを示す。
【図９４】
図９４は、実施例９４に関するデータを示す。
【図９５】
図９５は、実施例９５に関するデータを示す。
【図９６】
図９６は、実施例９６に関するデータを示す。
【図９７】
図９７は、実施例９７に関するデータを示す。
【図９８】
図９８は、実施例９８に関するデータを示す。
【図９９】
図９９は、実施例９９に関するデータを示す。
【図１００】
図１００は、実施例１００に関するデータを示す。
【図１０１】
図１０１は、実施例１０１に関するデータを示す。
【図１０２】
図１０２は、実施例１０２に関するデータを示す。
【図１０３】
図１０３は、実施例１０３に関するデータを示す。
【図１０４】
図１０４は、実施例１０４に関するデータを示す。
【図１０５】
図１０５は、実施例１０５に関するデータを示す。
【図１０６】
図１０６は、実施例１０６に関するデータを示す。
【図１０７】
図１０７は、実施例１０７に関するデータを示す。
【図１０８】
図１０８は、実施例１０８に関するデータを示す。
【図１０９】
図１０９は、実施例１０９に関するデータを示す。
【図１１０】
図１１０は、実施例１１０に関するデータを示す。
【図１１１】
図１１１は、実施例１１１に関するデータを示す。
【図１１２】
図１１２は、実施例１１２に関するデータを示す。
【図１１３】
図１１３は、実施例１１３に関するデータを示す。
【図１１４】
図１１４は、実施例１１４に関するデータを示す。
【図１１５】
図１１５は、実施例１１５に関するデータを示す。
【図１１６】
図１１６は、実施例１１６に関するデータを示す。
【図１１７】
図１１７は、実施例１１７に関するデータを示す。
【図１１８】
図１１８は、実施例１１８に関するデータを示す。
【図１１９】
図１１９は、実施例１１９に関するデータを示す。
【図１２０】
図１２０は、実施例１２０に関するデータを示す。
【図１２１】
図１２１は、実施例１２１に関するデータを示す。
【図１２２】
図１２２は、実施例１２２に関するデータを示す。
【図１２３】
図１２３は、実施例１２３に関するデータを示す。
【図１２４】
図１２４は、実施例１２４に関するデータを示す。
【図１２５】
図１２５は、実施例１２５に関するデータを示す。
【図１２６】
図１２６は、実施例１２６に関するデータを示す。
【図１２７】
図１２７は、実施例１２７に関するデータを示す。
【図１２８】
図１２８は、実施例１２８に関するデータを示す。
【図１２９】
図１２９は、実施例１２９に関するデータを示す。
【図１３０】
図１３０は、実施例１３０に関するデータを示す。
【図１３１】
図１３１は、実施例１３１に関するデータを示す。
【図１３２】
図１３２は、実施例１３２に関するデータを示す。
【図１３３】
図１３３は、実施例１３３に関するデータを示す。
【図１３４】
図１３４は、実施例１３４に関するデータを示す。
【図１３５】
図１３５は、実施例１３５に関するデータを示す。
【図１３６】
図１３６は、実施例１３６に関するデータを示す。
【図１３７】
図１３７は、実施例１３７に関するデータを示す。
【図１３８】
図１３８は、実施例１３８に関するデータを示す。
【図１３９】
図１３９は、実施例１３９に関するデータを示す。
【図１４０】
図１４０は、実施例１４０に関するデータを示す。
【図１４１】
図１４１は、実施例１４１に関するデータを示す。
【図１４２】
図１４２は、実施例１４２に関するデータを示す。
【図１４３】
図１４３は、実施例１４３に関するデータを示す。
【図１４４】
図１４４は、実施例１４４に関するデータを示す。
【図１４５】
図１４５は、実施例１４５に関するデータを示す。
【図１４６】
図１４６は、実施例１４６に関するデータを示す。
【図１４７】
図１４７は、実施例１４７に関するデータを示す。
【図１４８】
図１４８は、実施例１４８に関するデータを示す。
【図１４９】
図１４９は、実施例１４９に関するデータを示す。
【図１５０】
図１５０は、実施例１５０に関するデータを示す。
【図１５１】
図１５１は、実施例１５１に関するデータを示す。
【図１５２】
図１５２は、実施例１５２に関するデータを示す。
【図１５３】
図１５３は、実施例１５３に関するデータを示す。
【図１５４】
図１５４は、実施例１５４に関するデータを示す。
【図１５５】
図１５５は、実施例１５５に関するデータを示す。
【図１５６】
図１５６は、実施例１５６に関するデータを示す。
【図１５７】
図１５７は、実施例１５７に関するデータを示す。
【図１５８】
図１５８は、実施例１５８に関するデータを示す。
【図１５９】
図１５９は、実施例１５９に関するデータを示す。
【図１６０】
図１６０は、実施例１６０に関するデータを示す。
【図１６１】
図１６１は、実施例１６１に関するデータを示す。
【図１６２】
図１６２は、実施例１６２に関するデータを示す。
【図１６３】
図１６３は、実施例１６３に関するデータを示す。
【図１６４】
図１６４は、実施例１６４に関するデータを示す。
【図１６５】
図１６５は、実施例１６５に関するデータを示す。
【図１６６】
図１６６は、実施例１６６に関するデータを示す。
【図１６７】
図１６７は、実施例１６７に関するデータを示す。
【図１６８】
図１６８は、実施例１６８に関するデータを示す。
【図１６９】
図１６９は、実施例１６９に関するデータを示す。
【図１７０】
図１７０は、実施例１７０に関するデータを示す。
【図１７１】
図１７１は、実施例１７１に関するデータを示す。
【図１７２】
図１７２は、実施例１７２に関するデータを示す。
【図１７３】
図１７３は、実施例１７３に関するデータを示す。
【図１７４】
図１７４は、実施例１７４に関するデータを示す。
【図１７５】
図１７５は、実施例１７５に関するデータを示す。
【図１７６】
図１７６は、実施例１７６に関するデータを示す。
【図１７７】
図１７７は、実施例１７７に関するデータを示す。
【図１７８】
図１７８は、実施例１７８に関するデータを示す。
【図１７９】
図１７９は、実施例１７９に関するデータを示す。
【図１８０】
図１８０は、実施例１８０に関するデータを示す。
【図１８１】
図１８１は、実施例１８１に関するデータを示す。
【図１８２】
図１８２は、実施例１８２に関するデータを示す。
【図１８３】
図１８３は、実施例１８３に関するデータを示す。
【図１８４】
図１８４は、実施例１８４に関するデータを示す。
【図１８５】
図１８５は、実施例１８５に関するデータを示す。
【図１８６】
図１８６は、実施例１８６に関するデータを示す。
【図１８７】
図１８７は、実施例１８７に関するデータを示す。
【図１８８】
図１８８は、実施例１８８に関するデータを示す。
【図１８９】
図１８９は、実施例１８９に関するデータを示す。
【図１９０】
図１９０は、基本小体中のタンパク質の代表的な２Ｄゲルを示す。
【図１９１】
図１９１は、本発明の５個（６個）のタンパク質における配列の整列を示す。
【図１】
2004502415.tif 000428
【図２】
2004502415.tif 000429
【図３】
2004502415.tif 000430
【図４】
2004502415.tif 000431
【図５】
2004502415.tif 000432
【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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