(57)【要約】本発明は、一般に、免疫原に関し、特に、広範囲のＨＩＶ初代単離株を中和する抗体を誘導するための免疫原に関する。また、本発明は、このような免疫原を使用して抗ＨＩＶ抗体を誘導する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された免疫原であって、リガンドに結合したＨＩＶエンベロープタンパク質を含み、このリガンドは、前記タンパク質のＣＤ４結合部位およびＣＣＲ５結合部位の少なくとも一つをアップレギュレートする免疫原。
【請求項２】
請求項１に記載の免疫原であって、前記ＨＩＶタンパク質は、ｇｐ１２０、切断されていないｇｐ１４０またはｇｐ４１に非共有結合性に結合したｇｐ１２０である免疫原。
【請求項３】
請求項１に記載の免疫原であって、前記リガンドは、抗体、またはそのＦａｂ２もしくはＦａｂ断片である免疫原。
【請求項４】
請求項２に記載の免疫原であって、前記リガンドは、ｇｐ１２０のＣＣＲ５結合部位に結合し、且つｇｐ１２０のＣＤ４結合部位をアップレギュレートする免疫原。
【請求項５】
請求項４に記載の免疫原であって、前記リガンドは、抗体、またはそのＦａｂ２もしくはＦａｂ断片である免疫原。
【請求項６】
請求項４に記載の免疫原であって、前記リガンドは、モノクロナール抗体（ｍａｂ）１７ｂ、またはそのＦａｂ２もしくはＦａｂ断片、またはその擬態である免疫原。
【請求項７】
請求項１に記載の免疫原であって、前記リガンドは、ｇｐ１２０のＣＣＲ５およびＣＤ４結合部位をアップレギュレートする免疫原。
【請求項８】
請求項７に記載の免疫原であって、前記リガンドは、抗体、またはそのＦａｂ２もしくはＦａｂ断片である免疫原。
【請求項９】
請求項７に記載の免疫原であって、前記リガンドは、ｇｐ１２０におけるｍａｂ Ａ３２が結合する部位に結合する免疫原。
【請求項１０】
請求項９に記載の免疫原であって、前記リガンドは、ｍａｂ Ａ３２、またはそのＦａｂ２もしくはＦａｂ断片、またはその擬態である免疫原。
【請求項１１】
請求項１に記載の免疫原であって、前記タンパク質と前記リガンドは、架橋されている免疫原。
【請求項１２】
請求項１に記載の免疫原であって、前記タンパク質は、可溶型である免疫原。
【請求項１３】
請求項１に記載の免疫原であって、前記タンパク質は、細胞小胞またはリポソームと結合した免疫原。
【請求項１４】
請求項１に記載の免疫原であって、前記タンパク質は、ｇｐ４１に非共有結合性に結合したｇｐ１２０である免疫原。
【請求項１５】
請求項１４に記載の免疫原であって、ｇｐ１２０、ｇｐ４１および前記リガンドは、架橋されている免疫原。
【請求項１６】
請求項１４に記載の免疫原であって、前記免疫原は、前記タンパク質に結合したＨＲ−２ペプチドをさらに含む免疫原。
【請求項１７】
請求項１４に記載の免疫原であって、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、前記リガンドおよび前記ＨＲ−２ペプチドは、架橋されている免疫原。
【請求項１８】
請求項１に記載の免疫原の少なくとも一つおよびキャリアを含む組成物。
【請求項１９】
哺乳類においてＨＩＶに対する中和抗体の産生を誘導する方法であって、前記誘導を生じるために十分な請求項１に記載の前記免疫原の量を前記哺乳類に投与することを含む方法。
【請求項２０】
ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位をアップレギュレートする能力のある化合物をスクリーニングするための方法であって、ｇｐ１２０およびｍａｂ １７ｂ、またはそのＦａｂ２もしくはＦａｂ断片、またはその擬態と、前記化合物とを接触させることと、および前記化合物は、前記ｇｐ１２０のＣＣＲ５結合部位に対する結合について、ｍａｂ １７ｂ、またはその断片もしくは擬態と競合するかどうかを決定することとを含み、ここで、ｍａｂ １７ｂ、またはその断片もしくは擬態と競合する化合物が、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位を潜在的にアップレギュレートする化合物である方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、ｍａｂ １７ｂ、またはその断片もしくは擬態は、検出可能な標識を有する方法。
【請求項２２】
請求項２０に記載の方法であって、ｇｐ１２０は、固体支持体に結合された方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、前記固体支持体は、ＢＩＡＣＯＲＥチップである方法。
【請求項２４】
ｇｐ１２０のＣＤ４およびＣＣＲ５結合部位をアップレギュレートする能力のある化合物をスクリーニングするための方法であって、ｇｐ１２０およびｍａｂ １７ｂ、またはそのＦａｂ２もしくはＦａｂ断片、またはその擬態と、前記化合物とを接触させることと、および前記化合物は、前記ｇｐ１２０に対する結合について、ｍａｂ Ａ３２、またはその断片もしくは擬態と競合するかどうかを決定することを含み、ここで、ｍａｂ Ａ３２、またはその断片もしくは擬態と競合する化合物が、ｇｐ１２０のＣＤ４およびＣＣＲ５結合部位を潜在的にアップレギュレートする化合物である方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、ｍａｂ Ａ３２、またはその断片もしくは擬態は、検出可能な標識を有する方法。
【請求項２６】
請求項２４に記載の方法であって、ｇｐ１２０は、固体支持体に結合された方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、前記固体支持体は、ＢＩＡＣＯＲＥチップである方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０００年９月２２日に出願の仮出願番号第６０／２３４，３２７号、２００１年４月２３日に出願の仮出願番号６０／２８５，１７３、２００１年９月２１日に出願の仮出願番号　　　　、２００２年９月２１日に出願の仮出願番号　　　　による優先権を主張し、これらの出願の全ての内容は、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
【技術分野】
本発明は、一般に、免疫原に関し、特に、広範囲のＨＩＶ初代単離株を中和する抗体を誘導するための免疫原に関する。また、本発明は、このような免疫原を使用して抗ＨＩＶ抗体を誘導する方法に関する。
【０００３】
【背景】
ＨＩＶの流行は、世界的に蔓延し続けているため、有効なＨＩＶワクチンの必要が緊急となったままである。ＨＩＶワクチンの開発において鍵となる障害は、ＨＩＶの異常な多様性、並びにＨＩＶ変異の迅速さおよび程度である（Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ， ＳＳＢ Ｍｏｒｓｅ Ｅｄ． Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ， ｐｇｓ １８５−２０９ （１９９４））。
【０００４】
Ｍｙｅｒｓ、Ｋｏｒｂｅｒと同僚等は、世界中のＨＩＶ配列を分析してＨＩＶ単離株をグループまたはクレードに分け、個々のＨＩＶ単離株の進化の類縁関係をそれぞれ評価するための基礎を提供した（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ （Ｅｄｓ）， Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ＡＩＤＳ （１９９５）， Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｇｒｏｕｐ， Ｔ−１０， Ｍａｉｌ Ｓｔｏｐ Ｋ７１０， Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ， ＮＭ ８７５４５）。
【０００５】
また、ＣＴＬおよびＴヘルパーエピトープを含むＨＩＶタンパク質領域におけるバリエーションの程度は、Ｋｏｒｂｅｒ等によって最近分析されており、ＨＩＶ単離株間の多くのＣＴＬおよびＴヘルパーエピトープにおいて、配列バリエーションが実証された（Ｋｏｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ （Ｅｄｓ）， ＨＩＶ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄａｔａｂａｓｅ （１９９５）， Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｇｒｏｕｐ， Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ， ＮＭ ８７５４５）。
【０００６】
ＨＩＶのクレード間における頻繁な組換えを示すことにより、ＨＩＶバリエーションの複雑度についての新規なレベルが、ハーン等によって最近報告された（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ４０： ２４５−２５９ （１９９５））。これらの著者は、１０％程度のＨＩＶ単離株が組換えモザイクであることを示唆し、１つのＨＩＶクレードのみに基づいたワクチンは、モザイクＨＩＶ単離株から免疫した患者を保護しないであろうことを示唆する（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ４０： ２４５−２５９ （１９９５））。
【０００７】
本発明は、ＨＩＶワクチンのための適切な免疫原に関する。該免疫原は、ヒトにおいて広く交差反応性の中和抗体を誘導し、広範囲のＨＩＶ初代単離株を中和するであろう。
【０００８】
【発明の要旨】
本発明は、広範囲なＨＩＶ初代単離株を中和する抗体を誘導するための免疫原に関する。また、本発明は、このような免疫原を使用して抗ＨＩＶ抗体を誘導する方法に関する。
【０００９】
本発明の目的および利点は、以下の記載から明らかであろう。
【００１０】
【発明の詳細な記載】
本発明は、有効なＡＩＤＳワクチンに必要とされる広範な反応性の中和抗体を誘導する免疫原に関する。一つの態様において、該免疫原は、切断または切断されていないｇｐ１４０またはｇｐ１６０ ＨＩＶエンベロープタンパク質を含む。このタンパク質は、「活性化」されて、通常はＨＩＶビリオンの表面に一時的にのみ、またはほとんど暴露されることがない保存された中和エピトープの中間体コンホメーションを暴露する。該免疫原は、「凍結された」ＨＩＶエンベロープのトリガーされた形態であり、これがＢリンパ球に提示するための有用な特異的エピトープを作り出す。このエピトープ提示の結果、広くＨＩＶを中和する抗体が作成される。
【００１１】
融合中間体免疫原という概念は、ｇｐ４１ ＨＲ−２領域ペプチドＤＰ１７８がｇｐ４１の巻かれてないコンホメーションを捕らえることができ（Ｆｕｒａｔａ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ５： ２７６ （１９９８））、およびホルマリン固定したＨＩＶ感染細胞が広く中和抗体を生じることができる（ＬａＣａｓｓｅ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３： ３５７ （１９９７））という観察と一致している。最近、コイルドコイル領域に対するモノクロナール抗体は、コイルドコイルｇｐ４１構造のＨＲ１およびＨＲ２領域におけるｇｐ４１のコンホメーションの決定因子に結合するが、ＨＩＶを中和しなかった（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． １０２１３ （１９９８））。しかし、この後者の研究は、適正な抗体が生じたならば、コイルドコイル領域は、抗体が結合するために有用であるということを証明した。
【００１２】
ＨＩＶエンベロープの保存された中和部位は、２つの領域上にあることができ；これらはｇｐ４１にあることもでき、これらはｇｐ１２０にあることもできる。
【００１３】
ｉ）コイルドコイル領域のアミノ酸配列は保存されていること、およびｉｉ）膜融合因子エンベロープ複合体の機能は保存されており、ウイルス病原性に必須であることから、ｇｐ１４０またはｇｐ１６０の「トリガリング」（「活性化」）の間に暴露されたｇｐ４１の領域およびコンホメーションは、保存されていることが予測できる。この保存は、広範に中和する抗ＨＩＶ抗体の産生の鍵となる。
【００１４】
本発明の一つの側面における免疫原は、切断または切断されていない可溶性もしくはアンカー型のいずれか、たとえばｇｐ１４０もしくはｇｐ１６０を発現している細胞から作製された細胞小胞か、または脂質二重層貫通（ｔｒａｎｓｌｉｐｉｄ ｂｉｌａｙｅｒ）ＨＩＶ ｇｐ１４０もしくはｇｐ１６０エンベロープを含むリポソーム中のｇｐ１４０またはｇｐ１６０のＨＩＶエンベロープを含む。あるいは、ａｌｄｒｉｔｈｉｏ １−２で不活化されたＨＩＶ−１ビリオンのトリガーされたｇｐ１６０を免疫原として使用することもできる。また、ｇｐ１６０は、ｇｐ１６０またはｇｐ１４０（ｇｐ１４０は、膜貫通領域を有し、且つおそらくその他のｇｐ４１領域が削除されたｇｐ１６０である）のいずれかとして、組換えタンパク質としても存在することができる。組換えＣＣＲ５もしくはＣＸＣＲ４共受容体タンパク質（またはこれらの細胞外ドメインペプチドまたはタンパク質断片）あるいはｇｐ１２０のＣＸＣＲ４結合部位もしくはＣＣＲ５結合部位に結合する抗体またはその他のリガンド、および／または可溶性ＣＤ４、あるいはＣＤ４の結合作用を模倣した抗体もしくはその他のリガンドは、ｇｐ１６０またはｇｐ１４０に結合することができる（図１）。あるいは、ＣＤ４、ＣＣＲ５（もしくはＣＸＣＲ４）を含むベシクルまたはリポソーム（図２）、または可溶性ＣＤ４およびＣＣＲ５もしくはＣＸＣＲ４ ｇｐ１２０結合部位を反映するペプチド（図３）である。
【００１５】
あるいは、最適のＣＣＲ５ペプチドリガンドは、特定のチロシンが硫酸化されたＣＣＲ５のＮ末端に由来するペプチドであることもできる（Ｂｏｒｍｉｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７： ５７６２ （２００１））。図１３のデータでは、トリガーされた免疫原は、膜に結合するために必要はないかもしれないが、溶液中に存在してトリガーされてもよいことを明らかに示している。あるいは、可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）は、ＣＤ４ペプチド擬似エピトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅｓ）によってトリガーされたエンベロープ（ｇｐ１４０またはｇｐ１６０）により、置換されることもできる（Ｖｉｔｒａ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６： １３０１ （１９９９）。また、ｇｐ１６０またはｇｐ１４０を「トリガー」して、ｇｐ１６０の構造に付随して変化を受けさせて、細胞融合を誘導するという、その他のＨＩＶ共受容体分子を使用することもできる（図８も参照）。実施例２に示したデータは、可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）と可溶性ＨＩＶ ｇｐ１４０初代単離株ＨＩＶ ８９．６のエンベロープのライゲーションが、ｇｐ４１のコンホメーション変化を誘導したことを示す（図１３を参照）。
【００１６】
一つの態様において、本発明は、暴露されたＣＣＲ５結合領域をもつ受容体（ＣＤ４）ライゲーションしたエンベロープの特徴を有する免疫原に関するが、ＣＤ４結合部位が遮断されたＣＤ４−ライゲーションタンパク質と異なり、この免疫原は、暴露されたＣＤ４結合部位を有する（オープン）。さらに、この免疫原は、宿主のＣＤ４が欠けていてもよく、これは、宿主に投与すると潜在的に有害な抗ＣＤ４抗体の産生を回避する（図１８−２５を参照する）。
【００１７】
免疫原は、Ａ３２モノクローナル抗体（ｍａｂ）によって認識されるｇｐ１２０上の部位に結合するリガンドとライゲーションしたｇｐ１２０エンベロープを含むことができる（Ｗｙａｔｔ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９： ５７２３ （１９９５）， Ｂｏｏｔｓ ｅｔ ａｌ， ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏ． １３： １５４９ （１９９７）， Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８： ８３５０ （１９９４）， Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ４６９４ （１９９８）， Ｆｏｕｔｓ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１： ２７７９ （１９９７）， Ｙｅ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７４： １１９５５ （２０００））。１つのＡ３２ ｍａｂが、ＣＤ４を模倣することが示され、ｇｐ１２０に結合したときにＣＣＲ５結合部位をアップレギュレートする（暴露する）（Ｗｙａｔｔ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９： ５７２３ （１９９５））。また、このようなリガンドとｇｐ１２０のライゲーションは、ＣＤ４結合部位をアップレギュレートして、ＣＤ４がｇｐ１２０に結合することを遮断しない。有利には、このようなリガンドは、切断ｇｐ１２０、切断されていないｇｐ１４０および切断ｇｐ４１に結合したｇｐ４１のＨＲ−２結合部位をもアップレギュレートし、これにより、これらのタンパク質のＨＲ−２結合部位をさらに暴露し、これらのそれぞれが、抗ＨＩＶ中和抗体の潜在的な標的である。
【００１８】
この態様の特定の側面において、免疫原は、無処置のＡ３２ ｍａｂ、Ａ３２ ｍａｂのＦａｂ２断片、またはＡ３２ ｍａｂのＦａｂ断片とライゲーションした可溶性ＨＩＶ ｇｐ１２０エンベロープを含み、その結果、ＣＤ４結合部位、ＣＣＲ５結合部位およびｇｐ１２０のＨＲ−２結合部位が暴露され／アップレギュレートされる。免疫原は、結合したＡ３２ ｍａｂ（またはその断片）とともにｇｐ１２０を含むことができ、または結合し、且つ３％ホルムアルデヒドなどの架橋剤またはＤＴＳＳＰ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）などのヘテロ二機能性の架橋剤で架橋されたＡ３２ ｍａｂ（またはその断片）とともにｇｐ１２０を含むことができる。免疫原は、また、切断されていないｇｐ１４０または切断されていないｇｐ１４０と、切断ｇｐ４１と、および切断ｇｐ１２０との混合液を含むことができる。ｇｐ１４０および／またはｇｐ１２０に対して、またはｇｐ４１に非共有結合性に結合したｇｐ１２０に対して結合したＡ３２ ｍａｂ（またはその断片）は、ｇｐ４１、ｇｐ１２０および切断されていないｇｐ１４０のＨＲ−２結合部位のアップレギュレーション（暴露）を生じることとなる。また、ｇｐ１２０またはｇｐ１４０に対するＡ３２ ｍａｂ（またはその断片）の結合は、ＣＤ４結合部位およびＣＣＲ５結合部位のアップレギュレーションを生じることとなる。ｇｐ１２０を含む複合体について、切断されていないｇｐ１４０とＡ３２ ｍａｂ（またはその断片）を含む複合体は、架橋されていないか、あるいは３％ホルムアルデヒドまたはＤＴＳＳＰなどの架橋剤で架橋された免疫原として使用することができる。一つの態様において、本発明は、Ａ３２ ｍａｂのＦａｂ断片に結合し、且つ架橋され、任意には、ＨＲ−２結合タンパク質に結合し、且つ架橋された可溶性の切断されていないｇｐ１４０を含む免疫原に関する。
【００１９】
ｇｐ１２０のＡ３２ ｍａｂ結合部位に結合するリガンドでトリガーされたｇｐ１２０またはｇｐ１４０ ＨＩＶエンベロープタンパク質は、少なくとも第二のエンベロープを含む第二の免疫原と組み合わせて投与され、ｍａｂ １７ｂによって認識されるＣＣＲ５結合部位など、Ａ３２ ｍａｂ結合部位と異なった部位に結合するリガンドによってトリガーされることもできる。１７ｂ ｍａｂ（Ｋｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３９３： ６４８ （１９９８） ＡＩＤＳ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ， ＮＩＡＩＤ， ＮＩＨから入手可能）は、ｇｐ１２０に対するｓＣＤ４の結合を増加する。この第二の免疫原（これは、単独でも、または上記記載以外のトリガーされた免疫原と組み合わせても使用することができる）は、たとえば全体１７ｂ ｍａｂ、１７ｂ ｍａｂのＦａｂ２断片、または１７ｂ ｍａｂのＦａｂ断片とライゲーションした可溶性ＨＩＶ ｇｐ１２０エンベロープを含むことができる。その他の抗体（またはその断片）を含むその他のＣＣＲ５リガンド（これは、結果として暴露されたＣＤ４結合部位を生じる）は、１７ｂ ｍａｂの代わりに使用することができる。このさらなる免疫原は、結合した１７ｂ ｍａｂもしくはその断片（もしくは上記のようにその他のＣＣＲ５リガンド）とともにｇｐ１２０を含むことができ、または結合し、且つ３％ホルムアルデヒドなどの架橋剤またはＤＴＳＳＰ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）などのヘテロ二機能性の架橋剤で架橋された１７ｂ ｍａｂもしくはその断片とともにｇｐ１２０を含むことができる。あるいは、このさらなる免疫原は、切断されていないｇｐ１４０を単独で、または切断ｇｐ４１および切断ｇｐ１２０の混合液を含むことができる。このような混合液中でｇｐ１４０および／またはｇｐ１２０に結合したＭａｂ１７ｂまたはその断片（または上記のようにその他のＣＣＲ５リガンド）は、ＣＤ４結合領域の暴露を生じることとなる。１７ｂ ｍａｂまたはその断片（または上記のようにその他のＣＣＲ５リガンド）−ｇｐ１４０複合体は、架橋されていないか、または３％ホルムアルデヒドまたはＤＴＳＳＰなどの試薬で架橋されて存在することもできる。
【００２０】
Ｔ６４９Ｑ２６ＬおよびＤＰ１７８（下記参照）などの可溶性ＨＲ−２ペプチド類は、ｇｐ１２０およびｇｐ４１並びに切断されていないｇｐ１４０分子のエピトープを安定させるために、上記複合体に添加することもでき、架橋されたか、または架橋されていないかのいずれかで複合体とともに投与することもできる。
【００２１】
上記した１７ｂ ｍａｂに加えて、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位に結合したｍａｂ ＩｇＧ１ｂ１２（Ｒｏｂｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８： ４８２ （１９９４）， Ｍｏ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１： ６８６９ （１９９７））、ｇｐ１２０のコンホメーション決定因子に結合したｍａｂ ２Ｇ１２（Ｔｒｋｏｌａ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０： １１００ （１９９６））、ｇｐ４１の膜近位領域に結合した ｍａｂ ２Ｆ５（Ｍｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８： ４０３１ （１９９４））を含む多くのＨＩＶ初代単離株を中和する一連のモノクロナール抗体が作製された。トリガーされたエンベロープ免疫原の混合物は、広範囲のＨＩＶ初代単離株を中和する抗体の誘導を最適化するために使用することができる。このような免疫原は、霊長類に、たとえば全身にまたは粘膜部位のいずれかで投与されるときに、初代ＨＩＶ単離株に対して広く反応性の中和抗体を誘導する。
【００２２】
上記のように、本発明にしたがって膜融合因子エピトープを「凍結」するために、種々のアプローチを使用することができる。たとえば、「凍結」は、コイルドコイル領域部分を提示するＤＰ−１７８またはＴ−６４９Ｑ２６Ｌペプチドの添加により生じさせることができ、ＣＤ４でトリガーされたエンベロープに添加したときは、融合が阻止されることとなる（Ｒｉｍｓｋｙ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ９８６−９９３ （１９９８）（図９および１３を参照）。ｇｐ１４０、ｇｐ４１またはｇｐ１６０に結合したＨＲ−２ペプチドは、免疫原として使用されるか、またはＤＴＳＳＰまたはＤＳＰ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．）、ホルムアルデヒドまたは同様の効果を有するその他の架橋剤などの試薬により架橋されることもできる（下記参照）。
【００２３】
「凍結」は、０．１％から３％のホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドの両タンパク質架橋剤を複合体に添加して、ＣＤ４、ＣＣＲ５もしくはＣＸＣＲ４、ＨＲ−２ペプチドｇｐ１６０複合体を安定させることにより、または「トリガーされた」ｇｐ４１分子を安定させることにより、または両方ともにより行うこともできる（ＬａＣａｓｓｅ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３： ３５７−３６２ （１９９９））。
【００２４】
さらに、ｇｐ４１またはｇｐ１２０融合中間体の「凍結」は、ＤＳＰ（ジチオビス［スクシミジルプロピオネート］）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ． Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬＬ．， Ｎｏ． ２２５８５ＺＺ）または水溶性ＤＴＳＳＰ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．）などのヘテロ二機能性の試薬の添加によって行うことができる。これらの試薬は、２つのＮＨＳエステルを使用し、アミノ基と反応性でＣＤ４、ＣＣＲ５もしくはＣＸＣＲ４、ＨＲ−２ペプチドｇｐ１６０複合体を架橋および安定化するか、またはトリガーされたｇｐ４１分子を安定化するか、または両方を行う。
【００２５】
ＨＩＶクレード間および地理学的に場所が異なる患者からのＨＩＶ単離株間で、ＨＩＶ単離株に固有の相違が存在する。ＨＩＶワクチン開発のためのトリガーされた複合体は、様々なＨＩＶクレードからの、および様々な場所からのＨＩＶエンベロープで作製することができる。上記した複合体の性質を有する組換えタンパク質を産生するために、ＣＣＲ５結合部位、ＣＤ４結合部位もしくは両方ともをアップレギュレートする抗体またはその断片、あるいはＣＤ４誘導可能な抗体もしくはその断片を含むトリガーされた複合体を、たとえばｇｐ１２０と抗体のＦａｂ領域の重鎖および軽鎖との両方のプラスミドにジシストロンな方法で共発現することによって産生することができる。
【００２６】
本発明の免疫原は、当業者に周知の技術を使用して、薬学的に許容可能なキャリアおよび／またはアジュバント（ミョウバンなど）とともに処方することもできる。本免疫原の適切な投与経路は、全身（たとえば筋肉内または皮下）を含む。免疫応答が粘膜免疫系を要求するときは、他の経路を使用することもできる（たとえば、鼻腔内）。
【００２７】
本発明のいくつかの側面は、以下の限定されない実施例においてより詳細に記載される。
【００２８】
実施例１
本発明の免疫原産生アプローチの実施可能性を、ＢｉａＣｏｒｅ ３０００技術を使用して示した。図４では、ＣＤ４はｇｐ１２０に結合できるが、ＣＤ８はできないことを示す。図５，６は、初代単離株とｌａｂ−適合型ＨＩＶ株のエンベロープに対するｇｐ１２０の相互作用における相違を示す。図７は、ＨＩＶ−ＩＩＩＢ ｇｐ１６０でトランスフェクションされたキメラ・ハムスター卵巣細胞由来のベシクルであり、ＢｉａＣｏｒｅ Ｌ１ Ｃｈｉｐに存在するこれらのベシクルは、可溶性ＣＤ４の安定した結合を示すが、ＣＤ８では示さないことを示す。
【００２９】
実施例２
実験の詳細
タンパク質
可溶性の単量体ｇｐ１２０ ＪＲＦＬ、ｇｐ１２０ ＤＨ１２およびｓＣＤ４は、Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓによって産生され、また、ＡＩＤＳ、ＮＩＡＩＤ、ＮＩＨのＤｉｖｉｓｉｏｎによって提供された。ＨＩＶＩＩＩＢ ｇｐ１６０は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから得た。ＨＩＶ ８９．６（クレードＢ）およびＨＩＶ ＣＭ２３５（クレードＥ）初代単離株からのエンベロープタンパク質は、組換えワクシニアウィルス使用してＰａｔ Ｅａｒｌ， ＮＩＨによって産生され、記載された通りに精製した（Ｅａｒｌ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８： ３０１５−３０２６ （１９９４）， Ｅａｒｌ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７５： ６４５−６５３ （２００１））。
【００３０】
簡単には、１６０ｃｍ２フラスコ中のＢＳ−Ｃ−１細胞を、ｖＢＤｌ（ＨＩＶ ８９．６のｇｐ１４０）またはｖＢＤ２（ｇｐ１２０）ワクシニアウィルスで感染させた。２ｈ後、細胞をＰＢＳにて洗浄して２４−２６時間、血清フリーのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）に配置した。次いで、培地を遠心および濾過（０．２ｉｓｍ）によって回収し、次いで、ＴＸ−１００を０．５％（最終濃度（ｖ／ｖ））まで添加した。いくつかの実験については、培地を１５−３０倍に濃縮して多量体ｇｐ１４０糖タンパク質（切断された形態または切断されていない形態の混合物）の供与源として供給された。２工程の手順を使用して、これらの糖タンパク質のさらなる精製を行った。第１の工程において、混入タンパク質を除去して、培地由来の糖タンパク質をレンチルレクチン・カラムに結合させ、メチルα−Ｄ−マンノピラノシドで溶出した。この標品は、〜５０：５０で切断ｇｐ１４０と切断されていないｇｐ１４０とを含み、過精製された培養液上清濃縮物を「切断ｇｐ１４０」と名付けた。最後に、オリゴマーｇｐ１４０およびダイマーｇｐ１４０を分離してサイズ排除クロマトグラフィによって精製した。このｇｐ１４０標品を「切断されていないｇｐ１４０」と名付けた。分画した糖タンパク質をプールしてマイクロ−コンセントレータを使用して濃縮した。
【００３１】
モノクロナール抗体
ｇｐ１２０ Ｖ３ループ（１９ｂ）ＣＣＲ５結合部位（１７ｂ）に対するヒト・モノクロナール抗体およびｇｐ４１の免疫優性領域に対するｍａｂ ７Ｂ２は、Ｊａｍｅｓ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（Ｔｕｌａｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ， ＬＡ）から譲り受けた。Ｍａｂｓ ２Ｆ５、ＩｇＧｌｂｌ２および２Ｇ１２は、ＡＩＤＳ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、ＮＩＡＩＤ、ＮＩＨから得られた。
【００３２】
ＣＣＲ５およびＨＲ−２ペプチド。
【００３３】
合成ペプチドを合成して（ＳｙｎＰｅｐ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｄｕｂｌｉｎ， ＣＡ）、逆相ＨＰＬＣにより精製浄した。この研究で使用したペプチドは、９５％を超えてＨＰＬＣにより決定した純度を有しており、マススペクトル分析によって正しいことを確かめた。ＣＣＲ５−Ｄ１（ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫＱＩＡＡＲ）ペプチドは、ヒトＣＣＲ５のＮ末端に由来した（Ｂｉｅｎｉａｓｚ ｅｔ ａｌ， ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １６： ２５９９−２６０９ （１９９７））。Ｇｐ４１ペプチドＤＰ１７８ ＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦ（Ｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： １２６７６−１２６８０ （１９９４））、Ｔ６４９ ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬ（Ｒｉｍｓｋｙ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ９８６−９９３ （１９９８））、およびＴ６４９−Ｑ２６Ｌ（ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＬＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬ）（Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９： １６３４−１６４２ （２０００））は、ＨＩＶ ８９．６由来のＨＩＶ−１エンベロープｇｐ４１に由来した（Ｃｏｌｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６： ７５１７−７５２１ （１９９２））。ＨＲ−２ペプチドが結合することのコントロールとして、混ぜ合わせた配列のＤＰ１７８ペプチドを同様に作製した。
【００３４】
表面プラスモン共鳴バイオセンサ測定
ＳＰＲバイオセンサ測定は、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ社、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）装置で決定した。ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｇｐ１２０、ｇｐ１４０、ｇｐ１６０）およびｓＣＤ４をｌＯｍＭ Ｎａ−Ａｃｅｔａｔｅバッファ、ｐＨ ４．５中で１００−３００ｍｇ／ｍｌに希釈して、タンパク質固定化のための標準的なアミン・カップリングのプロトコールを使用してＣＭ５センサーに直接固定した（Ａｌａｍ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３８１： ６１６−６２０ （１９９６））。タンパク質とペプチドの結合は、２５℃においてリアルタイムで、且つ５−２０ｍｌ／ｍｉｎのＰＢＳ、ｐＨ ７．４の連続流動系でモニターした。検体（タンパク質およびペプチド）を除去して、センサー表面は、それぞれの結合サイクル後に、再生溶液（１０ｍＭ Ｇ−ＨＣ１、ｐＨ ２．５またはｌＯｍＭ ＮａＯＨ）を一回または二回、５−１０ｍｌパルスすることによって再生した。
【００３５】
全ての解析は、Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ等の非線形適合法（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ ｅｔ ａｌ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０５： １３２−１３６ （１９９２））およびＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．０ソフトウェア（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ）を使用して行った。速度定数および平衡定数は、単一の二分子相互作用（Ａ＋Ｂ＝ＡＢ）のためのラングミュアの式に対するカーブフィッティングに由来した。
【００３６】
予備的なＳＰＲ実験において、ＨＩＶ８９．６のＨＩＶ ｇｐ１２０エンベロープタンパク質は、ＨＩＶ ｇｐ１２０ ＤＨ１２（結合のｔ１／２、２５分）およびＨＩＶ ｇｐ１２０ ＪＲＦＬ（結合のｔ１／２、１４分）と比較して、相対的に少しの基線変動（結合のｔ１／２、１０５分）で、最も強くｓＣＤ４に結合すると決定された。したがって、ＨＩＶ８９．６ ｇｐ１２０およびｇｐ１４０を次の実験のために産生した。
【００３７】
ＨＩＶエンベロープタンパク質の免疫沈降後のウエスタンブロット解析。可溶性ＨＩＶ ８９．６のｇｐ１４０またはｇｐ１２０タンパク質は、２μｇの組換えｓＣＤ４の存在下または非存在下で、およびコントロールとしてビオチン化されたＤＰ１７８またはビオチン化された混ぜ合わせＤＰ１７８のいずれかの用量範囲で、総量５０μｌのＰＢＳ中で２ｈインキューベートした後、５０μｌストレプトアビジン−アガロースビーズの懸濁液とインキュベーション（４ｈ）した（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）。免疫複合体を５００μ１のＰＢＳでｘ３洗浄して、２−ＭＥを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファに再懸濁して５分間沸騰し、４−２０％ポリアクリルアミドゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードした。ｍａｂｓ Ｔ８（抗−ｇｐ１２０ Ｎ末端）または７Ｂ２（抗−ｇｐ４１免疫優性領域）のいずれかによるウエスタンブロット解析のために、ゲルをイムノブロット膜へ移した。
【００３８】
結果
切断および切断されていないＨＩＶエンベロープに対するｓＣＤ４の結合。
【００３９】
予備的なＳＰＲ研究では、ＨＩＶ ｇｐ１２０エンベロープＪＲＦＬ、ＤＨ１２および８９．６、ＨＩＶ ８９．６のｇｐ１２０が、ｓＣＤ４に対して最も安定な結合を示すことをを示した（図１０Ａを参照）。したがって、ｓＣＤ４に結合する切断または主に切断されていないｇｐ１４０を含むＨＩＶ８９．６ ｇｐ１４０エンベロープタンパク質の標品について研究した。非切断ＨＩＶ ＣＭ２３５ ｇｐ１４０と、並びに切断ＨＩＶ ８９．６のｇｐ１４０を、ＳＰＲバイオセンサアッセイのチップに共有結合で固定したｓＣＤ４に結合するそれらの能力について試験した。切断された８９．６のｇｐ１４０は、ｓＣＤ４をよく結合した（図１０Ａ）。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ由来の切断されていないバキュロウイルス産生のＨＩＶ ＩＩＩＢ ｇｐ１６０は、ｓＣＤ４を結合しなかった（Ｍａｓｃｏｌａ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７３： ３４０−３４８ （１９９６）））（図１０Ｂ）。しかし、切断されていないクレード ＥエンベロープＨＩＶ ＣＭ２３５ ｇｐ１４０もｓＣＤ４を結合したので（図１０Ｂ）、ｇｐ１４０がｇｐ１２０および切り取られたｇｐ４１に切断されることは、エンベロープ標品にｓＣＤ４が結合するために絶対的に必要ではなかった。
【００４０】
ＨＩＶ ８９．６のｇｐ１４０エンベロープに対するＮ末端ＣＣＲ５細胞外ドメインペプチドの結合。ＨＩＶ ｇｐ１２０のＣＣＲ５結合部位は、ｓＣＤ４によって誘導可能である（Ｋｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３９３： ６４８−６５９ （１９９８）， Ｒｉｚｚｕｔｏ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０： １９４９−１９５３ （１９９８）， Ｗｙａｔｔ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３９３： ７０５−７１０ （１９９８））。次に、Ｎ末端ＣＣＲ５細胞外ドメインの合成ペプチドがＨＩＶ ８９．６のｇｐ１４０を結合することができるかどうか決定した。３０ａａペプチドをＣＣＲ５のＮ末端から作製し（ＣＣＲ５−Ｄ１と名付けた）、切断されたＨＩＶ ８９．６のｇｐ１４０に結合する能力について試験した。切断ｇｐ１４０に対するＣＣＲ５−Ｄ１ペプチドの恒常的な結合が低いレベルで見られ、その一方で切断ｇｐ１４０エンベロープに対するｓＣＤ４の結合が、ｇｐ１４０に対して結合するＣＣＲ５−Ｄ１のより安定な結合を引き起こした（図１０Ｃおよび１０Ｄ）。Ｄｏｍｓ等は、膜結合エンベロープの環境において、ｇｐ１２０をライゲーションしたｓＣＤ４に対する天然のＣＣＲ５のアフィニティは５００μＭであることを見出した（Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９７： １１２１５−１１２２０ （２０００））。ｓＣＤ４がライゲーションしたｇｐ１４０に対するこのＣＣＲ５−Ｄ１ Ｎ末端ドメインペプチドの結合能は、〜２８０μＭであることが見出された（図１０Ｄ）。
【００４１】
切断されたＨＩＶ ８９．６のｇｐ１４０エンベロープタンパク質に対するＨＲ−２ペプチドの結合に及ぼす可溶性ＣＤ４およびＣＣＲ５−Ｄ１細胞外ドメインペプチドの効果。この研究の主な目的は、ＨＲ−２ペプチド結合のＳＰＲアッセイを使用して、ｇｐ４１の融合−付随（ｆｕｓｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）コンホメーションが検出されるかどうかを決定することであった。これは、ＨＲ−２ペプチドがｇｐ１４０を結合することができる場合、ｇｐ４１コイルドコイル構造は、内在性ＨＲ−２がＨＲ−１に結合されないように解かれなければならないことを理由とする。ＤＰ１７８（Ｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： １２６７６−１２６８０ （１９９４）， Ｒｉｍｓｋｙ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ９８６−９９３ （１９９８））、Ｔ−６４９ （Ｒｉｍｓｋｙ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ９８６−９９３ （１９９８））、およびＴ６４９Ｑ２６Ｌ （Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９： １６３４−１６４２ （２０００））のような３種のＨＲ−２ペプチドを本研究に使用した。ＤＰ１７８は、ＨＲ２のＣ末端アミノ酸を含み（Ｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： １２６７６１２６８０ （１９９４）， Ｒｉｍｓｋｙ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ９８６−９９３ （１９９８））、一方、Ｔ６４９Ｑ２６Ｌは、より多くのＨＲ−２のＮ末端アミノ酸を含む（Ｒｉｍｓｋｙ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ９８６−９９３ （１９９８）， Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９： １６３４−１６４２ （２０００））。切断されたＨＩＶ ８９．６のｇｐ１４０に対して、ＤＰ１７８の低レベルの結合が見られたが（図１１Ａ）、ＤＰ１７８コントロールの混ぜ合わせペプチドでは、全く結合しなかった（図１１Ｃ）。ＨＲ−２ペプチドの結合を、ｓＣＤ４とライゲーションした切断ｇｐ１４０において測定したとき、ｓＣＤ４により、切断ｇｐ１４０におけるＤＰ１７８ ＨＲ−２ペプチドの結合が誘導された（図１１Ａ）。ｓＣＤ４−ｇｐ１４０複合体へのＣＣＲ５−Ｄ１ Ｎ末端ペプチドの添加では、ｇｐ１４０に対するＤＰ１７８の結合のＫｄを有意に変化しなかったが（０．７〜１．１μＭ）、ＤＰ１７８結合の速度を遅くしたことから（７．９ｘ１０−３ Ｍ−１ ｓ−１〜３．４７ｘ１０−３ Ｍ−１ ｓ−１）、おそらくタンパク質コンホメーション変化の誘導を示している（図１１Ａ、１１Ｂおよび図１１内の表）。
【００４２】
Ｔ６４９Ｑ２６Ｌ ＨＲ−２ペプチドは、Ｑ２６Ｌの置換をすることにより、ＨＲ−１に対する結合がより高いアフィニティであるようにデザインされており（Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ ； Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９： １６３４−１６４２ （２０００））、実際に、本研究において、Ｔ６４９Ｑ２６Ｌも、ライゲーションされた切断ＣＤ４−ｇｐ１４０複合体に結合した。可溶性ＣＤ４は、切断ｇｐ１４０に対して結合するＤＰ１７８を最大に、平衡状態（Ｒｍ）を〜１０倍に増加した（ｓＣＤ４が結合していない３５ＲＵ（反応ユニット）のＤＰ１７８結合のＲｍからｓＣＤ４を有する３２０ＲＵのＲｍまで）（図１１））。ＤＰ１７８が、ｓＣＤ４との後に切断ｇｐ１４０に対して結合するｋｄ、ｓ−ｌ（解離速度）は、．００５６であった。切断ｇｐ１４０オリゴマに対するｓＣＤ４の結合は、ＤＰ１７８結合のｔ １／２が１２４秒という結果となった。ｓＣＤ４および切断ｇｐ１４０ ８９．６にライゲーションされたＣＣＲ５−Ｄ１対するＤＰ１７８の結合ｋｄは、１．１μＭであった。ＨＲ−２ペプチドの結合特異性についてのさらなるコントロールは、ＤＰ１７８ ＨＲ−２ペプチドがｓＣＤ４がライゲーションしたｇｐ１２０に結合しなかったという証拠であった。
【００４３】
ＨＩＶエンベロープタンパク質の免疫沈降に対するビオチン化されたＨＲ−２ペプチドの能力。
【００４４】
ＨＲ−２ペプチドが溶液中で結合するｇｐ１４０の成分を同定するために、ｇｐ１４０エンベロープを、ビオチン化したＤＰ１７８ ＨＲ−２ペプチドで免疫沈降し、次いでビオチン化したＨＲ−２に結合したタンパク質をウエスタンブロット解析により解析した。図１２は、切断されたＨＩＶ ８９．６のｇｐ１４０に存在するＨＩＶエンベロープ成分を示す。レーン１０は、抗ｇｐ１２０ ｍａｂ Ｔ８でイムノブロットしたｇｐ１２０およびｇｐ１４０を示す。レーン９は、抗ｇｐ４１ ｍａｂ７Ｂ２でイムノブロットした切断されていないｇｐ１４０およびｇｐ４１を示す。また、図１２は、ビオチン化されたＨＲ−２ペプチドＤＰ１７８は、ｓＣＤ４の非存在下で切断ｇｐ４１（−３３ｋｄ）および切断されていないｇｐ１４０の両方を恒常的に免疫沈降すること（レーン３）、並びにビオチン化されたＨＲ−２によって免疫沈降されたｇｐ１４０およびｇｐ４１のレベルは、ｓＣＤ４によって高められたこと（レーン１）を示す。レーン５および７は、抗ｇｐ１２０ ｍａｂ Ｔ８がビオチン化したＨＲ−２により免疫沈降されたｇｐ１４０タンパク質におけるｇｐ１２０領域を認識したことを示す。混ぜ合わせたビオチン化ＤＰ１７８ペプチドで免疫沈降されたコントロールでは、有意なレベルのＨＩＶエンベロープタンパク質を免疫沈降しなかった（レーン２，４，６および８）。
【００４５】
ＣＤ４で誘導されるＨＩＶ ８９．６ ｇｐ１４０に対する、エンベロープタンパク質ＨＲ−２ペプチドの結合。本研究の主な目的は、ｇｐ４１の融合結合コンホメーションを検出することができるかどうかを、ＨＲ−２ペプチド結合のＳＰＲアッセイを使用して決定することであった。ＨＲ−２ペプチドがｇｐ１４０を結合することができる場合、ｇｐ４１のコイルドコイル構造は、内因性ＨＲ−２がＨＲ−１に結合しないように解かれていなければならないからである。本研究では、２つのこのようなＨＲ−２ペプチドＤＰ１７８（Ｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： １２６７６−１２６８０ （１９９４）， Ｒｉｍｓｋｙ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ９８６９９３ （１９９８））、Ｔ６４９Ｑ２６Ｌ（Ｒｉｍｓｋｙ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ９８６−９９３ （１９９８）， （Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９： １６３４１６４２ （２０００））を使用した。ＤＰ１７８は、ＨＲ−２のＣ末端アミノ酸を含み（Ｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： １２６７６−１２６８０ （１９９４）， Ｒｉｍｓｋｙ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ９８６９９３ （１９９８））、一方、Ｔ６４９Ｑ２６Ｌは、より多くＨＲ−２のＮ末端アミノ酸を含む（Ｒｉｍｓｋｙ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ９８６９９３ （１９９８）， （Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９： １６３４−１６４２ （２０００））。
【００４６】
ＨＩＶエンベロープｇｐ１２０タンパク質は、比較的高いアフィニティでｓＣＤ４に結合する（Ｍｙｓｚｋａ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７： ９０２６−９０３１ （２０００）， Ｃｏｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６： ７５１７−７５２１ （１９９２））。予備実験において、可溶性ＨＩＶ ８９．６ ｇｐ１２０タンパク質は、固定されたｓＣＤ４に対し、Ｋｄ ２３ｎＭで且つ解離速度１．１×１０−４ｓ１で強く結合した。したがって、固定されたＣＤ４表面は、ＨＩＶエンベロープを非常に安定して捕獲することができ、このアプローチは、ＨＩＶ ８９．６エンベロープタンパク質に結合したｓＣＤ４にＨＲ−２ペプチドが結合することをアッセイするために使用された。
【００４７】
ｇｐ１４０およびｇｐ１２０がつながれた等価な表面をＣＭ５センサーチップ上に作製するために、センサーチップ上に固定化されたｓＣＤ４および抗ｇｐ１２０ ｍａｂ Ｔ８を捕獲表面として使用した。ブランクチップは、非特異的結合およびバルク反応の減算のためのインライン基準として供給した。Ｍａｂ Ｔ８は、５．６ｎＭのアフィニティでＨＩＶ ８９．６ ｇｐ１２０を結合した。したがって、ＣＤ４およびｍａｂ Ｔ８は、ＨＩＶエンベロープタンパク質を固着するための安定な表面を提供した。
【００４８】
ＨＩＶ ８９．６ ｇｐ１４０は、切断ｇｐ１４０および切断されていないｇｐ１４０の両方を含むので、ＣＤ４またはｍａｂ Ｔ８表面にｇｐ１４０タンパク質が捕獲された後、ｇｐ４１がＣＤ４−ｇｐ１４０複合体に存在することを示すことが重要である。これらの２つの表面に、同等の反応ユニット（ＲＵ）量のｇｐ１４０タンパク質が捕獲されたとき（図１４Ａ）、同レベルの抗ｇｐ１２０ Ｖ３ ｍａｂ １９ｂおよび抗ｇｐ４１ ｍａｂ ２Ｆ５が結合していることが観察された（図１４Ｂおよび１４Ｃ）。Ｍａｂ ２Ｆ５の反応性は、捕獲された切断ｇｐ４１と反応すること、または切断されていないｇｐ１４０のｇｐ４１に結合することのいずれかであることもできる。それでもなお、これらの表面の両方に捕獲されたｇｐ１４０タンパク質は、それらの反応性が抗ｇｐ１２０および抗ｇｐ４１ ｍａｂｓとほぼ一致していた。
【００４９】
ｍａｂ Ｔ８またはｓＣＤ４表面に捕獲されたｇｐ１４０に対してＨＲ−２ペプチドが結合する能力を試験した。ＨＲ−２ペプチドの結合は、ｍａｂ Ｔ８およびｓＣＤ４結合ｇｐ１４０に対する結合において定性的な相違を示した。Ｔ８−ｇｐ１４０表面（ほぼバックグラウンド結合）と比較して、ＤＰ１７８ ＨＲ−２ペプチドは、特異的にｓＣＤ４ｇｐ１４０表面に結合した（図１４Ｄ）。しかし、混ぜ合わせたＤＰ１７８ペプチドは、ｍａｂ Ｔ８−ｇｐ１４０またはｓＣＤ４−ｇｐ１４０表面に結合しなかった（図１４Ｄ）。ＨＲ−２ペプチドＤＰ１７８の結合と同様に、ＨＲ−２ペプチドＴ６４９Ｑ２６Ｌは、ｍａｂ Ｔ８−ｇｐ１４０表面に結合しないことを示し、ｓＣＤ４−ｇｐ１４０表面に結合することを指示した（図１４Ｆ）。まとめて考えると、これらの結果は、ｓＣＤ４が両方のＨＲ−２ペプチド、ＤＰ１７８およびＴ６４９Ｑ２６ＬのＨＩＶ ８９．６ ｇｐ１４０に対する結合を引き起こすことを示した。
【００５０】
ＣＤ４−ｇｐ１２０複合体と比較したＣＤ４−ｇｐ１４０に対するＨＲ−２ペプチド結合。Ｋｏｗａｌｓｋｉ等は、ｇｐ４１ ＨＲ−２における変異がｇｐ４１−ｇｐ１２０結合を分裂させ、ＨＲ−２は、ｇｐ４１においてｇｐ１２０との非共有相互作用の触覚部位を含むことを示した（Ａｌａｍ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３８１： ６１６−６２０ （１９９６））。したがって、ＳＰＲアッセイにおいて、ｓＣＤ４−ｇｐ１４０複合体に対するＨＲ−２の結合を、ｓＣＤ４−ｇｐ１２０複合体と比較することは重要であった。図１４の実験のように、ＨＩＶ ８９．６ ｇｐ１２０またはｇｐ１４０タンパク質は、ｓＣＤ４固定表面に同等の量が捕獲された。面白いことに、ｓＣＤ４−ｇｐ１４０およびｓＣＤ４−ｇｐ１２０表面において、ＨＲ−２ペプチドの特異的結合が検出された（１５Ａ図および１５Ｂ）。しかし、ｓＣＤ４−ｇｐ１４０表面に対するＤＰ１７８およびＴ６４９Ｑ２６Ｌ ＨＲ−２ペプチドの結合は、ｓＣＤ４−ｇｐ１２０表面と比較して非常に高かった（図１５Ａおよび１５Ｂ）。ｇｐ１２０に対するＨＲ−２ペプチドの結合がｓＣＤ４によって誘導されるかどうかを決定するために、ｓＣＤ４−ｇｐ１２０に対するＨＲ−２結合を、Ｔ８ ｍａｂ表面に捕獲されたｇｐ１２０タンパク質に対するＨＲ２の結合と比較した。図１５Ｃに示すように、ｇｐ１２０に対するＨＲ２ペプチドＤＰ１７８およびＴ６４９Ｑ２６Ｌの両者の結合は、どちらのＨＲ−２ペプチドもＴ８ ｍａｂ表面のｇｐ１２０に結合しなかったので、両者の結合は、ｓＣＤ４により特異的に誘導された。ＣＤ４−ｇｐ１４０またはＣＤ４−ｇｐ１２０に対する混ぜ合わせたＤＰ１７８の結合は、検出されなかった（図１５Ｄ）。
【００５１】
最後に、ＨＲ−２ペプチドとｓＣＤ４間の結合相互作用のアフィニティを評価するために、ＨＩＶ ８９．６ ｇｐ１４０およびｇｐ１２０をトリガーし、ｓＣＤ４−ｇｐ１４０およびｓＣＤ４−ｇｐ１２０に対するＨＲ−２ペプチドＤＰ１７８およびＴ６４９Ｑ２６Ｌ両方の結合について、速度定数および解離定数（Ｋｄ）を測定した（図１５Ａ、１５Ｂおよび１５Ｅ）。ｓＣＤ４−ｇｐ１４０およびｓＣＤ４−ｇｐ１２０に結合するＨＲ−２ペプチドの速度は、少しの相違しかなかったことから、ＣＤ４−ｇｐ１４０に対するＨＲ２ペプチドのより高レベルの結合は、ｇｐ１２０の結合部位に加えて、ＨＲ１−ｇｐ４１に対する結合が誘導されたことによることが示される。ｇｐ１２０およびｇｐ１４０に対するＨＲ−２ペプチドの結合アフィニティーは、１．２−２．５μＭの間であった。ＨＲ−２の結合は、ｓＣＤ４−ｇｐ１２０およびｓＣＤ４ｇｐ１４０複合体両者において、解離速度が比較的遅かった（７．７〜１０．５分のｔ１／２値）。
【００５２】
組換えｇｐ４ｌに対するＨＲ−２ペプチドの結合。ＨＲ−２ペプチドは、精製されたｇｐ４１に対して恒常的に結合することができるかどうかを直接決定するために、組換えＡＤＡ ｇｐ４１をセンサー表面に固定して、ＨＲ−２ペプチドＤＰ１７８の結合を決定した。ＨＲ−２ペプチドＤＰ１７８は、固定されたｇｐ４１によく結合したが（図１６Ａ）、その一方で、混ぜ合わせたＤＰ１７８ペプチドとの結合は観察されなかった（図１６Ｃ）。組換えｇｐ４１に対するＤＰ１７８ ＨＲ−２ペプチドの結合とＨＩＶ ８９．６のｇｐ１４０−ｓＣＤ４複合体に対する結合を比較するために、両者に対するＨＲ−２の結合の平衡結合定数（Ｋｅｑ）を測定した。組換えｇｐ４１に対するＤＰ１７８結合のＫｅｑは、２６．７μＭで弱いが（図１６Ｅ）、ｓＣＤ４−ｇｐ１４０に対するＤＰ１７８の結合のＫｅｑは、１．７μＭで１０倍強かった（図１６Ｆ）。
【００５３】
センサー表面で形成されるｇｐ１２０−ｇｐ４１複合体は、ｓＣＤ４によって誘導されて、ＨＲ−２ペプチド結合をアップレギュレートすることができる。ＨＩＶ ８９．６のｇｐ１４０エンベロープ標品において、切断されていないｇｐ１４０および切断ｇｐ１４０の成分のｇｐ１２０とｇｐ４１とが存在した。したがって、ＨＲ−２ペプチドは、切断されていないｇｐ１４０の結合を誘導ですることができ、および／または切断ｇｐ１２０およびｇｐ４１の結合を誘導することができる可能性がある。ｇｐ４１に非共有結合的に結合したｇｐ１２０に対するｓＣＤ４の結合は、ｓＣＤ４−ｇｐ１２０ ｇｐ４１複合体に対するＨＲ−２ペプチドの結合をアップレギュレートすることができるかどうかを直接決定するために、組換えＡＤＡ ｇｐ４１をセンサーチップに固定して、ＨＩＶ ８９．６ ｇｐ１２０またはｇｐ１２０ ｓＣＤ４混合物をその上に流した。ｇｐ１２０が安定してｇｐ４１に結合することが見出された（図１７）。ＨＲ−２ペプチドＤＰ１７８をｇｐ４１−ｇｐ１２０ ｓＣＤ４複合体上に流したとき、ＨＲ−２の結合は、ｇｐ４１に対しまたはｇｐ４１−ｇｐ１２０複合体に対するＨＲ−２の結合と比較してアップレギュレートされた（図１７）。したがって、ｇｐ４１に非共有結合で結合したｇｐ１２０におけるｓＣＤ４ライゲーションは、ｇｐ４１もしくはｇｐ１２０、または両方のＨＲ−２に対する結合をアップレギュレートすることができる。
【００５４】
ｓＣＤ４と結合する前および後のＨＩＶ ８９．６における中和エピトープ。２Ｆ５（Ｍｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７： ６６４２−６６４７ （１９９３））ｍａｂは、ＨＩＶ初代単離株を中和する。ｓＣＤ４と切断８９．６ ｇｐ１４０のライゲーション前に、２Ｆ５ ｇｐ４１エピトープが暴露されることが見出された。ｓＣＤ４のライゲーションに続いて、１７ｂ ＣＣＲ５結合部位エピトープ（２−４）がアップレギュレートされ、２Ｆ５エピトープが発現され続けた。
【００５５】
実施例３
実験の詳細
タンパク質。可溶性ＣＤ４は、Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ， Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ， ＮＹによって産生され、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＡＩＤＳ， ＮＩＡＩＤ， ＮＩＨによってされた。ＨＩＶ ８９．６の初代単離株からの可溶性エンベロープｇｐ１２０（ＶＢＤ−２）およびｇｐ１４０（ＶＢＤ−１）タンパク質は、組換えワクシニアウィルスを使用して産生されされ、記載された通りに精製した（Ｅａｒｌ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８： ３０１５３０２６ （１９９４）， Ｅａｒｌ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７５： ６４５−６５３ （２００１））。簡潔には、１６０ｃｍ２フラスコのＢＳ−Ｃ−１細胞を、ｖＢＤｌ（ＨＩＶ ８９．６ ｇｐ１４０）またはｖＢＤ２（ｇｐ１２０）ウイルスで感染させた。２時間後、細胞をＰＢＳで洗浄して、血清フリーのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中に２４−２６時間静置した。次いで、培養培地を遠心によって回収し、濾過（０．２ｐｍ）してＴｒｉｔｏｘ−Ｘ １００を０．５％まで添加した。一部の実験については、培地を１５−３０倍に濃縮して、ｇｐ１４０糖タンパク質（切断および切断されていない形態の混合物）の供与源として供給した。レンチルレクチンカラムでは、切断および切断されていないｇｐ１４０が〜５０：５０で含まれるｇｐ１４０を精製した。組換えＨＩＶ ＡＤＡ ｇｐ４１タンパク質は、Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．Ｉｎｃ（Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）から得た。ＨＩＶ−１ ＢＡＬ ｇｐ１２０は、ＡＢＬによって産生され、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＡＩＤＳ， ＮＩＡＩＤ， ＮＩＨによって提供された。
【００５６】
モノクロナール抗体。Ｍａｂ Ａ３２は、Ｊａｍｅｓ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ （Ｔｕｌａｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ， ＬＡ） （Ｂｏｏｔｓ ｅｔ ａｌ， ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｓ． １３： １５４９ （１９９７））から得た。Ａ３２ ｍａｂは、Ｓｔａｐｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｇカラムを使用して血清フリー培地からアフィニティ精製した。
【００５７】
ＨＲ−２ペプチド。合成ペプチドは、合成して（ＳｙｎＰｅｐ， Ｉｎｃ．， Ｄｕｂｌｉｎ， ＣＡ）、逆相ＨＰＬＣによって精製した。本研究において使用したペプチドは、９５％を超えるＨＰＬＣによって測定した純度を有し、マススペクトル分析によって正しいことを確かめた。ｇｐ４１ペプチドＤＰ１７８、ＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦ（Ｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９： １２６７６−１２６８０ （１９９４））、およびＴ６４９−Ｑ２６Ｌ、ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＬＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬ（Ｒｉｍｓｋｙ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ９８６−９９３ （１９９８）， Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９： １６３４−１６４２ （２０００））は、ＨＩＶ ８９．６由来のＨＩＶ−１エンベロープｇｐ４１に由来した（Ｃｏｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６： ７５１７−７５２１ （１９９２））。ＨＲ−２ペプチド結合のコントロールとして、混ぜ合わせた配列ＤＰ１７８ペプチドを作製した。免疫沈降および選択ＳＰＲ実験については、ビオチン化されたＤＰ１７８およびＤＰ１７８混ぜ合わせペプチドを合成した（ＳｙｎＰｅｐ， Ｉｎｃ．）。
【００５８】
表面プラスモン共鳴バイオセンサ測定。
【００５９】
ＳＰＲバイオセンサ測定は、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）装置で決定した。抗ｇｐ１２０ ｍａｂ（Ｔ８）またはｓＣＤ４（１００−３００μｇ／ｍｌ）のｌＯｍＭ 酢酸ナトリウムバッファ、ｐＨ ４．５溶液を、タンパク質固定化のための標準的なアミン共役プロトコールを使用して、ＣＭ５センサーチップに直接固定した（Ａｌａｍ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３８１ ： ６１６−６２０ （１９９６））。非特異的反応またはバルク反応を減算するために、ブランクのインライン基準面（アミン共役について活性化および不活性化された）を使用した。タンパク質およびペプチド（ビオチン化されたか、またはフリーのＤＰ１７８、Ｔ６４９Ｑ２６Ｌ、ＤＰ１７８混ぜ合わせ）の結合は、ＰＢＳ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％の表面活性剤ｐ２０）ｐＨ ７．４の連続フローを１０−３０μ１／ｍｉｎで、２５℃においてリアルタイムでモニターした。検体（タンパク質およびペプチド）を除去して、再生溶液（１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ ２．５またはｌＯｍＭ ＮａＯＨ）の５−１０μｌパルスを一回または二回することによって、各サイクルの結合の後、センサー表面を再生した。
【００６０】
全ての解析は、Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ等の非線形適合法（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ ｅｔ ａｌ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０５： １３２−１３６ （１９９２））、およびＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．０ソフトウェア（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ）を使用して行った。速度定数および平衡定数は、単純二分子相互作用（ｓｉｍｐｌｅ ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）（Ａ＋Ｂ＝ＡＢ）についてのラングミュアの式に対するカーブフィッティングに由来した。
【００６１】
結果
ＣＤ４で誘導される、ＨＩＶ ８９．６のｇｐ１４０エンベロープタンパク質に対するＨＲ−２ペプチドの結合。本研究の主な目的は、ＨＲ−２ペプチド結合のＳＰＲアッセイを使用して、ｇｐ４１の融合−付随コンホメーションを検出することができるかどうかを決定することであった。ＨＲ−２ペプチドがｇｐ１４０を結合することができる場合、ｇｐ４１コイルドコイル構造は、内因性ＨＲ−２がＨＲ−１に結合しないように解かれていなければならないからである。本研究では、２つのこのようなＨＲ−２ペプチド、ＤＰ１７８（Ｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： １２６７６−１２６８０ （１９９４）， Ｒｉｍｓｋｙ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ９８６９９３ （１９９８））、Ｔ６４９Ｑ２６Ｌ（Ｒｉｍｓｋｙ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ９８６−９９３ （１９９８）， （Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９： １６３４１６４２ （２０００））を使用した。ＤＰ１７８は、ＨＲ−２のＣ末端アミノ酸を含み（Ｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： １２６７６−１２６８０ （１９９４）， Ｒｉｍｓｋｙ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ９８６９９３ （１９９８））、一方、Ｔ６４９Ｑ２６Ｌは、より多くＨＲ−２のＮ末端アミノ酸を含む（Ｒｉｍｓｋｙ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ９８６９９３ （１９９８）， （Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９： １６３４−１６４２ （２０００））。
【００６２】
ＨＩＶエンベロープｇｐ１２０タンパク質は、比較的高いアフィニティでｓＣＤ４に結合する（Ｍｙｓｚｋａ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７： ９０２６−９０３１ （２０００）， Ｃｏｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６： ７５１７−７５２１ （１９９２））。予備実験において、可溶性ＨＩＶ ８９．６ ｇｐ１２０タンパク質は、固定されたｓＣＤ４に対し、Ｋｄ ２３ｎＭで且つ解離速度１．１×１０−４ｓ１で強く結合した。したがって、表面に固定されたＣＤ４は、ＨＩＶエンベロープを非常に安定して捕獲することができ、このアプローチは、ＨＩＶ ８９．６エンベロープタンパク質に結合したｓＣＤ４にＨＲ−２ペプチドが結合することをアッセイするために使用した。ｇｐ１４０およびｇｐ１２０がつながれた等価な表面をＣＭ５センサーチップ上に作製するために、センサーチップ上に固定されたｓＣＤ４および抗ｇｐ１２０ ｍａｂ Ｔ８を捕獲表面として使用した。ブランクチップは、非特異的結合およびバルク反応の減算のためのインライン基準として供給した。Ｍａｂ Ｔ８は、５．６ｎＭのアフィニティでＨＩＶ ８９．６のｇｐ１２０を結合した。したがって、ＣＤ４およびｍａｂ Ｔ８は、ＨＩＶエンベロープタンパク質を固着するための安定な表面を提供した。
【００６３】
ＨＩＶ ８９．６ ｇｐ１４０は、切断ｇｐ１４０および切断されていないｇｐ１４０の両方を含むので、ＣＤ４またはｍａｂ Ｔ８表面にｇｐ１４０タンパク質が捕獲された後、ｇｐ４１がＣＤ４−ｇｐ１４０複合体に存在することを示すことが重要である。これらの２つの表面に、同等の反応ユニット（ＲＵ）量のｇｐ１４０タンパク質が捕らえられたとき、同レベルの抗ｇｐ１２０ Ｖ３ ｍａｂ １９ｂおよび抗ｇｐ４１ ｍａｂ ２Ｆ５が結合していることが観察された。Ｍａｂ ２Ｆ５の反応性は、捕獲された切断ｇｐ４１と反応すること、または切断されていないｇｐ１４０のｇｐ４１に結合することのいずれかであり得る。それでもなお、これらの表面の両方に捕獲されたｇｐ１４０タンパク質は、それらの反応性が抗ｇｐ１２０および抗ｇｐ４１ ｍａｂｓにほぼ一致していた。
【００６４】
ｍａｂ Ｔ８またはｓＣＤ４表面に捕獲されたｇｐ１４０に結合するＨＲ−２ペプチドの能力を試験した。ＨＲ−２ペプチドの結合は、ｍａｂ Ｔ８およびｓＣＤ４結合ｇｐ１４０に対する結合に、定性的な相違を示した。Ｔ８−ｇｐ１４０表面（ほぼバックグラウンド結合）と比較して、ＤＰ１７８ ＨＲ−２ペプチドは、特異的にｓＣＤ４ｇｐ１４０表面に結合した。しかし、ｍａｂ Ｔ８−ｇｐ１４０またはｓＣＤ４−ｇｐ１４０表面に対し、混ぜ合わせたＤＰ１７８ペプチドは結合しなかった。ＨＲ−２ペプチドＤＰ１７８の結合と同様に、ＨＲ−２ペプチドＴ６４９Ｑ２６Ｌは、ｍａｂ Ｔ８−ｇｐ１４０表面に対して結合しないことを示し、ｓＣＤ４−ｇｐ１４０表面に結合することを指示した。まとめて考えると、これらの結果は、ｓＣＤ４が、両方のＨＲ−２ペプチド、ＤＰ１７８およびＴ６４９Ｑ２６ＬのＨＩＶ ８９．６ ｇｐ１４０に対する結合を引き起こすことを示した。
【００６５】
Ａ３２ ｍａｂは、ＨＩＶエンベロープのトリガーにおけるｓＣＤ４の効果を再現し、ＣＣＲ５結合部位の有用性をアップレギュレートしたことが報告されている（Ｗｙａｔｔ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ６９： ５７２３ （１９９５））。したがって、Ａ３２ｍａｂがｓＣＤ４を模倣して捕獲されたｇｐ１４０に対するＨＲ−２の結合をアップレギュレートすることができるかどうかを決定するために、Ａ３２ ｍａｂ表面を使用した。ｓＣＤ４と同様に、ｇｐ１４０がｍａｂ Ｔ８表面に捕獲されたときと比較して、ｇｐ１４０（切断されていないｇｐ１４０、切断ｇｐ１２０および切断ｇｐ４１の混合物）がＡ３２ ｍａｂ表面に捕獲されたとき、ＨＲ−２ペプチドの結合は、著しくアップレギュレートされた（図２６）。Ａ３２ ｍａｂおよびｇｐ１２０を使用しても同様の結果が得られた。
【００６６】
引用した全ての文書は、参照によりそれらの全文が本明細書に援用される。
【００６７】
当業者であれば、本開示を読むことにより、本発明の真の範囲から逸脱することなく形態および詳細に種々の変更がなされてもよいことが、認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４共受容体タンパク質（またはそれらのタンパク質もしくはペプチドの断片）およびｇｐ１６０に結合した可溶性ＣＤ４を示す。
【図２】
図２は、ベシクル、リポソームまたは不活化されたビリオン中にｇｐ１６０に結合したＣＤ４、ＣＣＲ５（または、ＣＸＣＲ４）を含むベシクルまたはリポソームを示す。
【図３】
図３は、可溶性ＣＤ４およびｇｐ１６０に結合したＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４のｇｐ１２０結合部位を反映するペプチドを示す。
【図４】
図４は、ＨＩＶ単離株ＤＨ１２の可溶性ｇｐ１２０と可溶性ＣＤ４との間の結合相互作用のＢｌＡｃｏｒｅ測定を示す。
【図５】
図５は、ＨＩＶ ８９．６、ＪＲＦＬおよびＤＨ１の可溶性ｇｐ１２０タンパク質と可溶性ＣＤ４との間の結合相互作用を示す。
【図６】
図６は、ｇｐ１２０とＣＤ４との間の相互作用の速度および結合アフィニティを示す。
【図７】
図７は、ＣＨＯ−ｗｔ（ＨＩＶ ＩＩＩＢ ｇｐ１６０−発現）細胞由来のｇｐ１２０を発現している膜に対する可溶性ＣＤ４の結合を示す。
【図８】
図８は、細胞融合を誘導する能力に対応するｇｐ１６０の構造に付随したｇｐ１６０およびｇｐ１４０の変化を示す。
【図９】
コイルドコイル領域の一部であるＤＰ−１７８またはＴ６４９ペプチドの添加による膜融合因子エピトープの「凍結」を示し、ＣＤ４でトリガーされたエンベロープに添加されたときに融合の阻止を生じる。
【図１０Ａ】
図１０Ａ−１０Ｄは、ＨＩＶ ８９．６ ｇｐ１４０オリゴマに対するＣＤ４およびＣＣＲ５ Ｎ末端ペプチドの結合を示す。図１０Ａ。固定されたＣＤ４とＨＩＶエンベロープタンパク質（８９．６ ｇｐ１２０およびｇｐ１４０）との間の相互作用の結合曲線の重ね合わせ。データは、切断されたＨＩＶ ８９．６ ｇｐ１４０（切断）に対して、およびＨＩＶ ８９．６ ｇｐ１２０タンパク質に対して、ｓＣＤ４が結合したことを示す。ネガティブコントロール（ネガティブコントロール）は、ＣＤ８を固定した表面上に８９．６ ｇｐ１２０タンパク質を注入することによって作製した。ＨＩＶ ＪＲＦＬおよびＤＨ１２ ｇｐ１２０ ｅｎｖタンパク質と比較して、ＨＩＶ ８９．６のｇｐ１２０ ｅｎｖは、比較的高いアフィニティ（ＪＲＦＬ、ＤＨ１２および８９．６ｅｎｖのそれぞれについて、Ｋｄ＝１４６ｎＭ、９６ｎＭおよび２３ｎＭ）でＣＤ４に結合した。Ｋｄのこれらの相違は、主に解離速度の相違によるものであった（ＪＲＦＬ、ＤＨ１２および８９．６ ｇｐ１２０エンベロープタンパク質について、それぞれｋｄ＝ ８．８ｘ１０−４ｓ−１、４．７ｘ１０−４ ｓ−１、１．１ｘ１０−４ ｓ−１）。
【図１０Ｂ】
固定されたＣＤ４に対する切断されていないＣＭ２３５ ｇｐ１４０（切断されていない）およびＩＩＩＢ−ｇｐ１６０（切断されていない）オリゴマの結合。データは、切断されていないＩＩＩＢ−ｇｐ１６０（図１０Ｂ）オリゴマが、ＣＤ４に不十分にしか結合しなかったのに対して、切断されていないＨＩＶ ＣＭ２３５ ｇｐ１４０（図１０Ｂ）オリゴマは、ｓＣＤ４を結合したことを示す。ネガティブコントロールは、ＩＩＩＢｇｐ１６０タンパク質とともに固定された表面上に同じＩＩＩＢｇｐ１６０フローの注入である。
【図１０Ｃ】
ＣＤ４が固定された表面上に可溶性８９．６ ｇｐ１４０オリゴマを注入することにより、ＣＤ４−ｇｐ１４０複合体（矢印で示した）が最初に形成された。次いで、ＣＤ４−ｇｐ１４０複合体に対するその結合をモニターするために、ＣＣＲ５のＮ末端ペプチド（Ｄ１）を注入した。
【図１０Ｄ】
ＣＤ４の存在下および非共存における、８９．６のｇｐ１４０オリゴマに結合するＣＣＲ５のＮ末端ペプチドＤ１の結合曲線の重ね合わせ。ＣＤ４−ｇｐ１４０複合体において、Ｄ１ペプチドは、２８０ｎＭ（ｋａ＝９ｘ１０３ Ｍ−１ｓ−１、ｋｄ＝２．５６ｘ１０−３ｓ−１）の明らかなＫｄで結合する。ＣＤ４の非共存下において、Ｄ１ペプチドは、切断ｇｐ１４０に対して同様の結合速度で、しかしより速い解離速度で、恒常的に結合する（ｋｄ＝０．０１ Ｓ−１；Ｋｄ＝１μＭ）。ＣＤ４の存在下および非共存下におけるＣＣＲ５−Ｄ１ペプチドの定常状態の結合の相違は、定量的な効果である。全てのｇｐ１４０分子がＣＤ４に結合したことを確かめるために、切断ｇｐ１４０タンパク質をＣＤ４固定化センサー表面（ＲＵ＝５３０）に捕らえ、可溶性８９．６のｇｐ１４０タンパク質を同じセンサーチップの隣接したフローセルに直接固定した（ＲＵ＝３３００）。
【図１１Ａ】
図１１Ａ−１１Ｄは、ＣＤ４およびＣＣＲ５細胞外のドメインペプチドが、ＨＩＶ ８９．６のｇｐ１４０に対するＨＲ−２ペプチドの結合を誘導することを示す。図１１Ａ。ＣＤ４に対し（実線）、ＣＤ４およびＣＣＲ５−Ｄ１ペプチドに対し（破線）、ＣＣＲ５−Ｄ１ペプチド（黒丸）、並びにｇｐ１４０オリゴマ単独（破線）に対する８９．６のｇｐ１４０オリゴマの結合後におけるＨＲ−２ペプチドＤＰ１７８の結合。
【図１１Ｂ】
８９．６のｇｐ１４０オリゴマ（破線）、ＣＤ４−ｇｐ１４０複合体（白丸）に対し、およびＣＤ４−ｇｐ１４０−Ｄｌ複合体（実線）に対するＨＲ−２ペプチドＴ６４９ＱＬの結合。８９．６のｇｐ１４０タンパク質およびＣＣＲ５−Ｄ１ペプチドをｓＣＤ４固定化表面上に順番に注入した（図１０Ｃを参照）。
【図１１Ｃ】
ＣＤ４−８９．６ ｇｐ１４０複合体に対するＨＲ−２ペプチドＤＰ１７８およびコントロールの混ぜ合わせＤＰ１７８ペプチドの結合。
【図１１Ｄ】
ＣＤ４およびＣＣＲ５−Ｄ１ペプチドで誘導後の８９．６のｇｐ１４０に対するＨＲ−２ペプチドＤＰ１７８およびＴ６４９ＱＬの結合についての速度データ。Ｒｍは、ｇｐ１４０複合体上に同濃度のＨＲ−２ペプチド（５ｍＭ）を注入する間に定常状態で結合したＲＵを指す。ｎｍ＝ＨＲ−２ペプチドがｇｐ１４０タンパク質に対して極めて低いアフィニティで結合しているために、速度定数を測定することができない。
【図１２】
図１２は、８９．６のｇｐ１４０エンベロープタンパク質の、ＨＲ−２ペプチドによる免疫沈降およびウエスタンブロット解析を示す。ビオチン化されたＨＲ−２ペプチドＤＰ１７８は、恒常的に切断ｇｐ４１および切断されていないｇｐ１４０タンパク質の両方を免疫沈降した。免疫沈降されたｇｐ１４０およびｇｐ４１のレベルは、ｓＣＤ４によって増加した。ＨＩＶ ８９．６のｇｐ１４０タンパク質をｓＣＤ４（２μｇ）の存在下（レーン１および５）または非存在下（レーン３および７）で、２．５μｇのビオチン化されたＤＰ１７８とインキューベートした。また、コントロールとして、ＨＩＶ ８９．６ ｇｐ１４０タンパク質をｓＣＤ４（２μｇ）の存在下（レーン２および６）または非存在下（レーン４および８）で、２．５μｇのビオチン化混ぜ合わせたＤＰ１７８ペプチドとインキューベートした。レーン９は、ｍａｂ ７Ｂ２（抗ｇｐ４１）でイムノブロットしたｇｐ１４０標品内のｇｐ１４０およびｇｐ４１を示し、一方、Ｌａｎｅ １０は、ｍａｂ Ｔ８（抗ｇｐ１２０）反応性のｇｐ１４０標品内のｇｐ１２０を示す。
【図１３】
図１３は、可溶性ＨＩＶ ８９．６ ｇｐ１４０エンベロープに対するＨＲ−２ペプチドの結合の誘導を示す。
【図１４Ａ】
図１４Ａ−１４Ｆは、可溶性ＣＤ４による８９．６のｇｐ１４０に対するＨＲ−２ペプチドの結合の誘導を示す。図１４Ａ。ＣＤ４（実線）およびＴ８（破線）固定化表面上での可溶性８９．６のｇｐ１４０の捕獲。およそ３０００〜５０００ＲＵのｓＣＤ４およびＴ８ ｍａｂをＣＭ５センサーチップに固定した。次いで、可溶性８９．６ ｇｐ１４０タンパク質を両表面に同じレベルに捕獲して、それぞれＣＤ４−ｇｐ１４０およびＴ８−ｇｐ１４０がラベルされる。
【図１４Ｂ】
ＣＤ４−ｇｐ１４０（実線）およびＴ８−ｇｐ１４０（破線）複合体に対する１９ｂ（図１４Ｂ）抗体の結合。ｇｐ１４０捕獲の安定化の後、１９ｂ（抗ｇｐ１２０ Ｖ３）または２Ｆ５（抗ｇｐ４１）抗体（３００ｓｓｇ／ｍｌ）を注入してｇｐ１２０およびｇｐ４１の両表面の相対量を評価した。
【図１４Ｃ】
ＣＤ４−ｇｐ１４０（実線）およびＴ８−ｇｐ１４０（破線）複合体に対する１９ｂ（図１４Ｂ）抗体の結合。ｇｐ１４０捕獲の安定化の後、１９ｂ（抗ｇｐ１２０ Ｖ３）または２Ｆ５（抗ｇｐ４１）抗体（３００ｓｓｇ／ｍｌ）を注入してｇｐ１２０およびｇｐ４１の両表面の相対量を評価した。
【図１４Ｄ】
ＣＤ４−ｇｐ１４０（実線）またはＴ８−ｇｐ１４０（破線）表面に対するＨＲ−２ペプチドＤＰ１７８（図１４Ｄ）、混ぜ合わせＤＰ１７８（図１４Ｅ）およびＴ６４９Ｑ２６Ｌ（図１４Ｅ）の結合。５０μｇ／ｍｌの各ＨＲ−２ペプチドをＣＤ４およびＴ８の両者の表面上に３０μｌ／分で注入した。
【図１４Ｅ】
ＣＤ４−ｇｐ１４０（実線）またはＴ８−ｇｐ１４０（破線）表面に対するＨＲ−２ペプチドＤＰ１７８（図１４Ｄ）、混ぜ合わせＤＰ１７８（図１４Ｅ）およびＴ６４９Ｑ２６Ｌ（図１４Ｆ）の結合。５０μｇ／ｍｌの各ＨＲ−２ペプチドをＣＤ４およびＴ８の両者の表面上に３０μｌ／分で注入した。
【図１４Ｆ】
ＣＤ４−ｇｐ１４０（実線）またはＴ８−ｇｐ１４０（破線）表面に対するＨＲ−２ペプチドＤＰ１７８（図１４Ｄ）、混ぜ合わせＤＰ１７８（図１４Ｅ）およびＴ６４９Ｑ２６Ｌ（図１４Ｆ）の結合。５０μｇ／ｍｌの各ＨＲ−２ペプチドをＣＤ４およびＴ８の両者の表面上に３０μｌ／分で注入した。
【図１５Ａ】
図１５Ａ−１５Ｅは、ＣＤ４−ｇｐ１４０およびＣＤ４−ｇｐ１２０複合体とＨＲ−２ペプチドの結合相互作用を示す。ＨＲ−２ペプチドＤＰ１７８（図１５Ａ）およびＴ６４９Ｑ２６Ｌ（図１５Ｂ）と、ＣＤ４−ｇｐ１２０（破線）およびＣＤ４−ｇｐ１４０（実線）との間の相互作用を示す結合曲線の重ね合わせ。図１５Ａおよび１５Ｂは、ＣＤ４−ｇｐ１４０（実線）およびＣＤ４−ｇｐ１２０（破線）表面上に１２．５〜１００μｇ／ｍｌの間のＨＲ−２ペプチドＤＰ１７８およびＴ６４９Ｑ２６Ｌの滴定を示す。
【図１５Ｂ】
図１５Ａおよび１５Ｂは、ＣＤ４−ｇｐ１４０（実線）およびＣＤ４−ｇｐ１２０（破線）表面上に１２．５〜１００μｇ／ｍｌの間のＨＲ−２ペプチドＤＰ１７８およびＴ６４９Ｑ２６Ｌの滴定を示す。
【図１５Ｃ】
ＣＤ４−ｇｐ１４０またはＴ８−ｇｐ１４０のいずれかに対する混ぜ合わせＤＰ１７８ ＨＲ−２ペプチドの結合はなかった。
【図１５Ｄ】
ＣＤ４は、ｇｐ１２０エンベロープタンパク質に対するＨＲ−２ペプチドの結合を誘導した。Ｔ８−ｇｐ１２０複合体に対するＨＲ−２ペプチドの特異的結合はなかったが、ｓＣＤ４−ｇｐ１２０およびｓＣＤ４−ｇｐ１４０表面は、安定してＨＲ−２ペプチドを結合した。ＣＤ４−ｇｐ１２０と比較して、ＣＤ４−ｇｐ１４０でより高い結合が観察された。
【図１５Ｅ】
図１５Ｅの表は、ＨＲ−２ペプチドおよびＣＤ４−ｇｐ１２０およびＣＤ４−ｇｐ１４０複合体についての結合速度定数および解離定数を示す。データは、２つの別々の実験の代表である。ＨＲ−２ペプチドは、ブランク、ｓＣＤ４およびｓＣＤ４−ｇｐ１２０またはｓＣＤ４−ｇｐ１４０表面上に３０μｌ／分で同時に注入した。示した曲線は、ＣＤ４−ｇｐ１２０またはＣＤ４−ｇｐ１４０に特異的な結合を示し、ブランクおよびｓＣＤ４表面から結合シグナルを減算した後のものに由来する。
【図１６Ａ】
図１６Ａ−１６Ｆは、固定されたｇｐ４１に対するＨＲ−２ペプチドの恒常的結合、およびＣＤ４で誘導されるｇｐ１４０に対する結合を示す。図１６Ａおよび１６Ｂ。固定されたＡＤＡ ｇｐ４１およびＣＤ４−ｇｐ１４０（図１６Ｂ）表面に対するＤＰ１７８（１２．５〜１００μｇ／ｍｌ）の結合。
【図１６Ｂ】
図１６Ａおよび１６Ｂ。固定されたＡＤＡ ｇｐ４１およびＣＤ４−ｇｐ１４０（図１６Ｂ）表面に対するＤＰ１７８（１２．５〜１００ｇ／ｍｌ）の結合。
【図１６Ｃ】
１６Ｃ図および１６Ｄ。固定されたＡＤＡ ｇｐ４１に対する混ぜ合わせＤＰ１７８（１２．５〜１００μｇ／ｍｌ、図１６Ｄ）およびＴ８−ｇｐ１４０表面に対するＨＲ−２ペプチドＤＰ１７８（１２．５〜５０μｇ／ｍｌ）の結合。
【図１６Ｄ】
１６Ｃ図および１６Ｄ。固定されたＡＤＡ ｇｐ４１に対する混ぜ合わせＤＰ１７８（１２．５〜１００μｇ／ｍｌ、図１６Ｄ）およびＴ８−ｇｐ１４０表面に対するＨＲ−２ペプチドＤＰ１７８（１２．５〜５０μｇ／ｍｌ）の結合。
【図１６Ｅ】
ｇｐ４１に対して結合するＤＰ１７８についてのＲＵ対ＲＵ／Ｃのスキャッチャードプロット。データは、２つの別々の実験の代表である。
【図１６Ｆ】
ＣＤ４−ｇｐ１４０に結合するＤＰ１７８についてのＲＵ対ＲＵ／Ｃのスキャッチャードプロット。データは、２つの別々の実験の代表である。
【図１７Ａ】
図１７Ａおよび１７Ｂは、ｇｐ１２０−ｇｐ４１複合体に対するＨＲ−２ペプチド結合の誘導を示す。固定されたｇｐ４１、ｇｐ４１−ｇｐ１２０およびｇｐ４１−ｇｐ１２０−ＣＤ４複合体に対するＨＲ２ペプチドＤＰ１７８（５０μｇ／ｍｌ）の結合。ｇｐ４１表面と比較して、ｇｐ４１−ｇｐ１２０およびｇｐ４１−ｇｐ１２０ ＣＤ４表面において、ＤＰ１７８における高い結合が観察される。可溶性８９．６のｇｐ１２０（１００μｇ／ｍｌ）またはｇｐ１２０−ＣＤ４混合物（０．３ｍｇ／ｍｌのＣＤ４と３０分間プレプレインキュベートしたｇｐ１２０）を、ＡＤＡ ｇｐ４１で固定したセンサー表面上に、５μｌ／分で１０分間注入した。注入の終わりに、表面が基線変動せずに安定するまで、洗浄バッファ（ＰＢＳ）を流した。およそ３００ ＲＵのｇｐ１２０および８５０ ＲＵのｇｐ１２０−ＣＤ４は、固定されたｇｐ４１表面に安定な複合体を形成した。その後、ｇｐ１２０−ＣＤ４の結合は、再生バッファ（ｌＯｍＭグリシン−ＨＣ１、ｐＨ ２．０）を短く注入することにより約３２５ ＲＵ（およそｇｐ４１−ｇｐ１２０表面と同等まで）まで減少させた後、ｇｐ１２０−ＣＤ４混合物を注入した。したがって、両表面は、安定であり、結合したｇｐ１２０またはｇｐ１２０−ＣＤ４を同量有した。
【図１７Ｂ】
図１７Ａおよび１７Ｂは、ｇｐ１２０−ｇｐ４１複合体に結合するＨＲ−２ペプチドの誘導を示す。固定されたｇｐ４１、ｇｐ４１−ｇｐ１２０およびｇｐ４１−ｇｐ１２０−ＣＤ４複合体に対するＨＲ２ペプチドＤＰ１７８（５０μｇ／ｍｌ）の結合。ｇｐ４１表面と比較して、ｇｐ４１−ｇｐ１２０およびｇｐ４１−ｇｐ１２０ ＣＤ４表面において、ＤＰ１７８における高い結合が観察される。可溶性８９．６ ｇｐ１２０（１００μｇ／ｍｌ）またはｇｐ１２０−ＣＤ４混合物（０．３ｍｇ／ｍｌのＣＤ４と３０分間プレプレインキュベートしたｇｐ１２０）を、ＡＤＡ ｇｐ４１で固定したセンサー表面上に、５μｌ／分で１０分間注入した。注入の終わりに、表面が基線変動せずに安定するまで、洗浄バッファ（ＰＢＳ）を流した。およそ３００ ＲＵのｇｐ１２０および８５０ ＲＵのｇｐ１２０−ＣＤ４は、固定されたｇｐ４１表面に安定な複合体を形成した。その後、ｇｐ１２０−ＣＤ４の結合は、再生バッファ（ｌＯｍＭグリシン−ＨＣ１、ｐＨ ２．０）を短く注入することにより約３２５ ＲＵ（およそｇｐ４１−ｇｐ１２０表面と同等まで）まで減少させた後、ｇｐ１２０−ＣＤ４混合物を注入した。したがって、両表面は、安定であり、結合したｇｐ１２０またはｇｐ１２０−ＣＤ４を同量有した。
【図１８】
非共有結合性にｇｐ４１に結合したＨＩＶ ｇｐ１２０に対する可溶性ＣＤ４の結合は、ｇｐ１２０に対するＨＲ−２の結合を生じ、ｇｐ４１−ｇｐ１２０結合をアップレギュレーションする。免疫原は、可溶性形態で架橋されたＣＤ４−ｇｐ１２０−ｇｐ４１である。
【図１９】
非共有結合性にｇｐ４１に結合したＨＩＶ ｇｐ１２０に対するＡ３２の結合は、ｇｐ１２０に対するＨＲ−２の結合を生じ、ｇｐ４１−ｇｐ１２０結合をアップレギュレーションする。免疫原は、可溶性形態で架橋されたＡ３２（総Ｉｇ）−ｇｐ１２０−ｇｐ４１または可溶性形態のＡ３２（ＦａｂまたはＦａｂ２）−ｇｐ１２０−ｇｐ４１である。
【図２０】
可溶性ｇｐ１２０に対する可溶性ＣＤ４の結合は、ＣＣＲ５結合部位およびｇｐ４１ ＨＲ−２結合部位の暴露を生じる。
【図２１】
可溶性ＨＩＶ ｇｐ１２０に対するＡ３２ ｍａｂの結合は、ＣＤ４結合部位およびＣＣＲ５結合部位の暴露を生じる。
【図２２】
可溶性の切断されていないＨＩＶ ｇｐ１４０に対する可溶性ＣＤ４の結合は、ｇｐ４１におけるＨＲ−１に対するＨＲ−２の結合をアップレギュレートし、ＣＣＲ５結合部位を暴露する。免疫原は、ＤＰ１７８またはＴ６４９Ｑ２６Ｌの結合の有無にかかわらず、架橋されたＣＤ４−ｇｐ１４０である。
【図２３】
可溶性切断されていないＨＩＶ ｇｐ１４０に対するＭａｂ Ａ３２の結合は、ｇｐ４１におけるＨＲ−１に対するＨＲ−２の結合をアップレギュレートし、ＣＣＲ５結合部位を暴露する。免疫原は、ｇｐ４１もしくは複合体のどこかに結合したＤＰ１７８またはＴ６４９Ｑ２６Ｌの有無にかかわらず、架橋されたＡ３２またはその断片−ｇｐ１４０である。
【図２４】
非共有結合的にｇｐ４１に結合したＨＩＶ ｇｐ１２０に対する可溶性ＣＤ４の結合は、ｇｐ１２０に対するＨＲ−２の結合を生じ、ｇｐ４１−ｇｐ１２０の結合をアップレギュレーションする。免疫原は、ＨＲ−１に結合したＨＲ−２ペプチドと架橋された可溶性形態のＣＤ４−ｇｐ１２０−ｇｐ４１である。
【図２５】
非共有結合的にｇｐ４１に結合したＨＩＶ ｇｐ１２０に対するＡ３２の結合は、ｇｐ１２０に対するＨＲ−２の結合を生じ、ｇｐ４１−ｇｐ１２０の結合をアップレギュレーションした。免疫原は、可溶性形態で架橋されたＡ３２（総Ｉｇ）−ｇｐ１２０−ｇｐ４１または可溶性形態でＨＲ−１もしくは複合体のどこかに結合したＨＲ−２ペプチドとともにＡ３２（ＦａｂまたはＦａｂ２）−ｇｐ１２０−ｇｐ４１である。
【図２６】
可溶性ＣＤ４によるＨＩＶ ８９．６ ｇｐ１４０に対するＨＲ−２ペプチドの結合の誘導。可溶性８９．６ ｇｐ１４０タンパク質は、三表面に全てで同じレベルに捕獲され、ＣＤ４−ｇｐ１４０、Ｔ８−ｇｐ１４０およびＡ３２ ｇｐ１４０がラベルされた。図は、Ｔ８−ｇｐ１４０（丸）、ＣＤ４−ｇｐ１４０（実線）およびＡ３２ｇｐ１４０（破線）複合体に対するＨＲ−２ペプチドＤＰ１７８の結合を示す。５０μｇ／ｍｌのＨＲ−２ペプチドを、Ａ３２、ＣＤ４およびＴ８表面上に３０μｌ／分で注入した。ｓＣＤ４、Ｔ８およびＡ３２表面に対するＨＲ−２ペプチドのバルク反応および非特異的結合を減算した後、特異的結合のみを示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2004511444.tif 000129
2004511444.tif 000130
2004511444.tif 000131