(57)【要約】アルファウイルス・レプリコン粒子を高収量で生成する方法が提供される。レプリコンＲＮＡは、許容状態細胞中に電気穿孔され、ここで該細胞は、比較的高密度であり、少なくとも１のヘルパー核酸であって、パッケージングに必須の機能を与える核酸を伴う。適切な培地中の成長期間の後に、アルファウイルス・レプリコン粒子は、細胞表面から収集される。ここでアルファウイルス・レプリコン粒子は、塩濃度が約０.２〜約５Ｍの特に塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、酢酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウムである塩洗浄液を使用して生成される。必要であるならば希釈の後、粒子は適切なクロマトグラフィー技術により精製される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルファウイルス・レプリコン粒子(ＡＲＰｓ)の製造方法であって、該方法が以下のステップ：
(ａ)  アルファウイルス・レプリコン核酸を宿主細胞中に導入し、該レプリコン核酸は少なくともウイルス・パッケージング・シグナル及び該アルファウイルス・レプリコン核酸中で発現できる少なくとも１の異種性コード配列を含み、ここで改変宿主細胞を作り出すために該宿主細胞が少なくとも１のヘルパー機能を含み；
(ｂ)  上記少なくとも１のヘルパー機能の発現を許容し、上記アルファウイルス・レプリコン核酸の複製及び該アルファウイルス・レプリコン核酸のパッケージングを許容する条件下で上記改変宿主細胞を培養して、ＡＲＰｓを形成し；
(ｃ)  ステップ(ｂ)の後に上記改変宿主細胞を、０.２Ｍ〜５Ｍのイオン強度を有する水溶液と接触して、上記ＡＲＰｓを該水溶液中に放出させて、ＡＲＰを含む溶液を作り出し；
(ｄ)  ステップ(ｃ)のＡＲＰを含む溶液からＡＲＰｓを回収するステップ
を含む前記方法。
【請求項２】
１ｍｌあたり５×１０7〜５×１０8のステップ(ａ)に記載の宿主細胞における前記少なくとも１のヘルパー機能が、該宿主細胞のゲノム中に安定して組み込まれた核酸配列によりコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記宿主細胞中の前記少なくとも１のヘルパー機能が、前記アルファウイルス・レプリコン核酸を結合できるキャプシドタンパク質をコードする少なくとも１のヘルパー核酸、及び少なくとも１のアルファウイルス糖タンパク質に基いて導入され、ここで該アルファウイルス糖タンパク質が、該アルファウイルス・レプリコン核酸及び該キャプシドタンパク質と会合し、ここで該少なくとも１のヘルパー核酸分子が該アルファウイルス・レプリコン核酸と共に該宿主細胞中へと導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１のヘルパー機能が、少なくとも２個のヘルパー核酸分子によりコードされ、ここで該２個のヘルパー核酸分子の各々が、少なくとも１のウイルス・ヘルパー機能をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記イオン強度が０.５Ｍ〜５Ｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１のヘルパー機能が、ＤＮＡ分子中にコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記アルファウイルス・レプリコン核酸が、電気穿孔により前記宿主細胞中に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記宿主細胞が、１ｍｌあたり５×１０7〜５×１０8の濃度で電気穿孔混合液中に存在する、請求項８に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主細胞が、１ｍｌあたり５×１０7〜１.５×１０8の濃度で電気穿孔混合液中に存在する、請求項９に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のステップ(ｃ)の前に、細胞洗浄ステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記アルファウイルスが、ベネズエラ・ウマ脳炎ウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞洗浄溶液が塩を含まず、かつデオキシリボヌクレアーゼをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヘルパー核酸が、キャップなしＲＮＡ分子である、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項１４】
アルファウイルス・レプリコンＲＮＡ及び第一ヘルパーＲＮＡ分子及び第二ＲＮＡヘルパー分子は、１：０.３：０：０.３〜１：２０：２０の比で電気穿孔混合液に存在する、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
前記比が、１：０.５：０.５である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記比が、１：５：５である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
アルファウイルス・レプリコン粒子の製造方法であって、アルファウイルス・レプリコン・ベクター及び１以上のヘルパー核酸分子を、電気穿孔を介してアルファウイルス-許容状態細胞へと導入することを含み、ここで、電気穿孔の間の培養培地中の該アルファウイルス許容状態細胞の濃度が、５×１０7〜５×１０8細胞/ｍｌであり、かつ電気穿孔前に該細胞に加えられた該アルファウイルスＲＮＡレプリコン・ベクターの濃度が、約３５μｇ/ｍｌである、前記方法。
【請求項１８】
前記電気穿孔が、電気穿孔チャンバー内で行われ、ここで電極間のギャップが０.４〜１.０ｃｍである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヘルパー機能が、全てのアルファウイルス構造タンパク質をコードするシングルＤＮＡヘルパー分子内にコードされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＤＮＡヘルパー分子の濃度が、少なくとも１００μｇ/ｍｌである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記アルファウイルス-許容状態細胞が、ベロ細胞である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ(ｄ)の後に、イオン交換、ヘパリン・アフィニティー・クロマトグラフィー、アフィニティー又は疎水性クロマトグラフィーステップが行われる、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記アルファウイルスが、弱毒化アルファウイルスである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記アルファウイルスが、ベネズエラ・ウマ脳炎ウイルス(ＶＥＥ)である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記塩洗浄ステップにおいて前記塩が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2、ＣａＣｌ2、ＮＨ4Ｃｌ、(ＮＨ4)2ＳＯ4、酢酸アンモニウム、及び炭酸水素アンモニウムである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
アルファウイルス・レプリコン粒子(ＡＲＰｓ)の製造方法であって、該方法が以下のステップ：
(ａ)  アルファウイルス・レプリコン核酸を宿主細胞中へ導入し、該レプリコン核酸が、少なくともウイルス・パッケージング・シグナルと該アルファウイルス・レプリコン核酸中に発現する少なくとも１の異種性コード配列を含み、ここで改変宿主細胞を作り出すために該宿主細胞が少なくとも１のヘルパー機能を含み、ここで上記レプリコン核酸が、１ｍｌあたり５×１０7〜５×１０8細胞濃度で、宿主細胞を電気穿孔することにより該宿主細胞中に導入され；
(ｂ)  上記少なくとも１のヘルパー機能の発現を許容し、上記アルファウイルス・レプリコン核酸の複製及び該アルファウイルス・レプリコン核酸のパッケージングを許容する条件下で上記改変宿主細胞を培養して、ＡＲＰｓを形成し；
(ｃ)  ステップ(ｂ)の後に上記改変宿主細胞を、０.２Ｍ〜５Ｍのイオン強度を有する水溶液と接触して、上記ＡＲＰｓを該水溶液中に放出させて、ＡＲＰを含む溶液を作り出し；
(ｄ)  ステップ(ｃ)のＡＲＰを含む溶液からＡＲＰｓを回収するステップ
を含む前記方法。
【請求項２７】
前記宿主細胞が、１ｍｌあたり５×１０7〜１.５×１０8の濃度で、電気穿孔混合液中に存在する、請求項９に記載の方法。
【請求項２８】
前記アルファウイルスが、ベネズエラ・ウマ脳炎ウイルス(ＶＥＥ)である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ヘルパー核酸が、キャップなしＲＮＡ分子である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法により製造されるアルファウイルス・レプリコン粒子調製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えＤＮＡ技術、及び特に外来核酸を真核細胞中に導入すること、並びにより特異的に感染性のウイルス粒子又はウイルス様粒子、特に免疫治療及び/又は遺伝子治療適用に有用である粒子を高い収量で生成する方法に関する。特に、本発明は、ヒト及び獣医薬として使用することに適した高純度のアルファウイルス・レプリコン粒子(ＡＲＰ)調製品を製造する方法であって、高収量で、ＧＭＰ-適合性で、商業的に実行可能な方法を開示する。
【背景技術】
【０００２】
アルファウイルス属は、種々のウイルスを含み、それらの全ては、トガウイルス科のメンバーである。アルファウイルスは、東部ウマ脳炎ウイルス(ＥＥＥ)、ベネズエラ・ウマ脳炎ウイルス、エバーグレード・ウイルス(Everglades Virus)、ムカンボ・ウイルス(Mucambo Virus)、ピクスナ・ウイルス(Pixuna Virus)、西部ウマ脳炎ウイルス(WEE)、シンドビス・ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ミデルブルグ・ウイルス(Middleburg Virus)、チクングニア・ウイルス、オニョンニョン・ウイルス、ロスリバー・ウイルス、バーマ森林ウイルス(Barmah Forest Virus)、ゲタ・ウイルス、サギヤマ・ウイルス、ベバル・ウイルス(Bebaru Virus)、マヤロ・ウイルス、ウナ・ウイルス(Una Virus)、アウラ・ウイルス(Aura Virus)、ワタロア・ウイルス(Whataroa Virus)、ババンキー・ウイルス(Babanki Virus)、キジラガッチェ・ウイルス(Kyzylagach Virus)、ハイランドＪウイルス(Highlands J virus)、フォート・モーガン・ウイルス(Fort Morgan Virus)、ヌヂュム・ウイルス(Ndumu Virus)、及びバギー・クラーク・ウイルス(Buggy Creek Virus)を含む。このウイルスゲノムは、一本鎖のメッセンジャーセンスＲＮＡであって、５’末端においてメチル化キャップで修飾されており、そして３’末端において種々の長さのポリ(Ａ)鎖で修飾されているＲＮＡである。１のウイルスタンパク質、キャプシドを含む構造サブユニットは、２０面体のヌクレオキャプシド中にＲＮＡゲノムを伴う。ビリオン中では、キャプシドは、整然と多数並んだ膜貫通タンパク質スパイクで覆われる脂質外被により取り囲まれ、該膜貫通タンパク質スパイクの各々は、二種の糖タンパク質、Ｅ１及びＥ２のヘテロダイマー複合体からなった(Pedersen et al., J. Virol 14 : 40 (1974)を参照のこと)。シンドビス・ウイルスとセムリキ森林ウイルスは、原型のアルファウイルスと考えられており、そして広く研究された(Schlesinger, The Togaviridae and Flaviviridae, Plenum Publishing Corp. , New York (1986)を参照のこと)。ＶＥＥウイルスは、広く研究された(例えば米国特許5,185,440号を参照のこと)。 
【０００３】
これらのウイルスの研究は、アルファウイルス病に対するワクチン化技術の発展を導き、さらに外来遺伝子の導入用のアルファウイルス・ベクターの使用を介して別の疾患に対するワクチン化技術の発展を導いた。Davis et al.,に対する米国特許第5,185,440号及びPCT公開WO 92/10578を参照のこと。外来遺伝子を真核生物において発現させるために、アルファウイルス・ベクターを使用することは、高い関心の題目となった。生弱毒化ウイルスワクチンは、ウイルス疾患を制御する最も成功した方法の一つであるということがよく知られている。しかしながら、幾つかのウイルス病原体については、生ウイルスの株での免疫化は、実用的でないか又は安全ではないかのどちらかであることがある。代替の戦略の一つは、そうした病因の免疫抗原をコードする配列を、生きた増殖株である別のウイルスへと入れ込むことである。生ＶＥＥベクターを使用するこうしたシステムの一つは、Johnston et al.,に対する米国特許第5,505,947号及び第5,643,576号において開示される。別のこうしたシステムは、Hahn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2679-2683 (1992)において開示され、ここでシンドビス・ウイルス・コンストラクトは、インフルエンザ・ヘマグルチニン・タンパク質の切断された形を発現する。別のシステムは、アルファウイルス・レプリコン・システムであり、Garoff et al.,に対する米国特許第6,190,666号、Johnston et al.,に対する米国特許第5,792,462号及び第6,156,558号、Dubensky et al.,に対する米国特許第5,814,482号、第5,843,723号、第5,789,245号、第6,015,694号、第6,105,686号、及び第6,376,236号；米国出願公開第2002-0015945 A1(Polo et al.)、米国出願公開第2001-0016199(Johnston et al.)、Frolov et al.(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11371-11377 、及びPushko et al. (1997) Virology 239: 389-401に開示される。
【０００４】
従って、感染性があり、高い免疫原性のアルファウイルス粒子及びその誘導体であって、高純度及び高収量、特にワクチン製剤において使用される高純度なものを製造可能にする方法に対し、当該技術分野における必要性が残っている。
【発明の開示】
【０００５】
発明の要約
本発明は、ヒト及び獣医薬における使用に適した高純度なアルファウイルス・レプリコン粒子(ＡＲＰ)又はウイルスの調製品の製造方法であって、高収量、ＧＭＰ互換性、商業的に実行可能な方法を提供する。本発明は、生弱毒化アルファウイルス・ワクチン及び同じ物を含む免疫原組成物の製造にも適用可能であり、ここで、米国特許第5,643,576号において記載されるように、弱毒化されたアルファウイルスは、ワクチンにおいて発現させるために、異種遺伝子を持つこともあるし又は持たないこともある。本発明の方法は、以下のステップ
(ａ)  アルファウイルス・レプリコン核酸(又はアルファウイルス核酸)を宿主細胞へと導入し、ここで前記レプリコン核酸は、少なくともアルファウイルス・パーケージング・シグナル及び少なくとも１の関心の遺伝子のコード配列であって前記アルファウイルスレプリコン核酸において発現できる配列を含み、ここで該宿主細胞は、ＡＲＰｓを作り出すために必要とされるアルファウイルス・構造タンパク質を発現でき、改変宿主細胞を作り出し；
(ｂ)  構造タンパク質の発現及びアルファウイルス・レプリコン核酸の複製、そして次にアルファウイルス・レプリコン核酸のパーケージングを可能にする条件下の培地中で前記改変宿主細胞を培養して、ＡＲＰｓを形成し；
(ｃ)  場合により、培地から改変宿主細胞を分離し；そして
(ｄ)  ステップ(ｂ)又は(ｃ)の後に、改変宿主細胞を少なくとも約０.２０Ｍ、又は約０.２Ｍ〜約５Ｍのイオン強度を有する水溶液(本明細書中で「放出培地」と呼ぶ)と接触して、ＡＲＰｓを水溶液中に放出して、ＡＲＰを含む溶液を作り出すステップ
を含む。
放出培地のイオン強度は、ビリオン又はＡＲＰｓと不活性化しない塩を使用して達成され、そして適切な塩は、非限定的に塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、及び炭酸水素アンモニウムを含む。都合よく、放出培地(塩洗浄液)は、約６〜約９、望ましくは約６.５〜８.５のｐＨを有する緩衝液を含む。該細胞が培地から分離されない場合、培地のイオン強度は、固体の塩を加えること又は濃縮緩衝液を加える事により増加されて、細胞からのＡＲＰｓ(又はビリオン)を放出するためのイオン強度の増大を与えた。特にＡＲＰ表面上に特定の表面荷電が存在するとき、産生細胞を、放出培地で塩洗浄することはＡＲＰの回収率を改善するようである；ＶＥＥの場合、Ｅ２-２０９及び/又はＥ２-１２０のアミノ酸残基は、正荷電の導入に適した部位を提供するようである。特定の弱毒化ウイルス変異体における荷電の変化をもたらすアミノ酸置換は、ＡＲＰｓの塩洗浄回収率を改良した。１６ｍＭのリン酸ナトリウム、０.５Ｍ・ＮａＣｌは、塩洗浄において使用される典型的な放出培地である。
【０００６】
ＡＲＰｓ又はウイルス粒子は、ウイルス又はレプリコンの核酸を感染性粒子内にパッケージングすることを可能にする細胞中、つまりアルファウイルス-許容状態細胞中で生成される。アルファウイルス・レプリコンＲＮＡベクター(又は、レプリコン核酸)は、数ある中でＶＥＥ、シンドビス・ウイルス、特にＴＲ３３９、南アフリカ・アルボウイルスＮｏ.８６、セムリキ森林ウイルス由来でありうる。レプリコン核酸が使用される場合、パッケージング機能が細胞において存在し、ここで粒子は、トランスにおいて細胞中に導入されるか又は既に細胞内に存在している核酸(単数又は複数）から作られる。ある異種性のコード配列を伴う幾つかのアルファウイルス・レプリコン・ベクターについて、発明者は、アルファウイルス糖タンパク質ヘルパー核酸の比率の増大は、パッケージング及び/又はＡＲＰ収量を改良することを観測した。
【０００７】
有利なことに、ＡＲＰｓが生成される細胞は、培養哺乳動物細胞であるが；例えばベロ(Vero)細胞、ハムスター仔腎臓(ＢＨＫ)細胞、トリ胚線維芽細胞(ＣＥＦ)細胞、ＤＦ-１、２９３、２９３Ｔ、チャイニーズ・ハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、並びに培養昆虫細胞は特に好ましい。適切であり利用可能である培養昆虫細胞は、非限定的にＳＦ２１、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)；Ｃ６/３６、アエデス・アルボピクツス(Aedes albopictus)；ＴＲＡ-１７１、トキソリンチテス・アムボイネシス(Toxorhynchites amboinensis)；ＲＭＬ-１２、アエデス・アエギプチ(Aedes aegypti)；ＡＰ-６１、アエデス・シュードスキュテラリス(Aedes pseudoscutellaris)；及びＭＯＳ-５５、アノフレス・ガムビアエ(Anopheles gambiae)細胞を含む。 
【０００８】
有利なことに、ＡＲＰｓが生成される細胞は、アルファウイルス・レプリコン・ベクター及びヘルパー核酸(単数又は複数）で電気穿孔される前に、細胞周期のＧ２/Ｍフェーズで同調される。いずれの特定の理論により束縛されることなく、電気穿孔された細胞の電気穿孔効率及び核酸の核への移動率の高さは(核の活性を含む本発明のこうした実施態様において)、こうしたＧ２/Ｍフェーズの細胞において達成される。
【０００９】
アルファウイルスのレプリコン核酸は、宿主細胞において発現される関心のヌクレオチド配列を含みうる。該ヌクレオチド配列は、数ある中で免疫原性のポリペプチド、サイトカイン、又は治療用タンパク質をコードし、或いはヌクレオチド配列は、宿主細胞中で転写されて、機能性ＲＮＡ、例えばリボザイム、干渉又はアンチセンス分子を作り出す。アルファウイルスの核酸が使用される場合、アルファウイルスは、野生型のウイルス又は上記関心のヌクレオチド配列を含む組換えウイルスでありうるし、或いはアルファウイルスは、宿主細胞において免疫応答を作り出すために有用である弱毒化ウイルスでありうる。
【００１０】
ウイルス・レプリコン核酸及び/又はヘルパー核酸(単数又は複数）が、電気穿孔により導入される場合、十分なレプリコン及び効果的なパッケージングを可能にするヘルパー核酸(単数又は複数）が存在する電気穿孔培地中で、１ｍｌあたり約１０7〜約１０9、望ましくは約５×１０7〜約１.５×１０8個の細胞の濃度で、細胞を電気穿孔することは特に効果的である。ヘルパーＲＮＡ分子(単数又は複数）は、キャップ付加される必要はない。
【００１１】
ＡＲＰｓが作られる細胞中に、核酸が導入された後に、細胞は、成長培地を含む培養容器中に配置される。これらの細胞は、接着細胞として最も成長するので、該容器は、成長、レプリコンＲＮＡの複製、発現タンパク質のパーケージング、及びウイルス・レプリコン粒子の生成を許容するために十分な成長培地、並びに細胞が接着しそして成長するために十分な表面積を含む。表面は、容器、フラスコ又はプレート壁であることもあり、或いはホロー・ファイバー(hollow fiber)、ビーズ若しくは付着細胞成長に適した物質の別の微小担体は、容器の中に配置されうる。微小担体(ビーズ又はディスク)上で成長したベロ細胞又は別の細胞は、担体上で首尾よく電気穿孔され、そして培養されて、未付着細胞で達成された電気穿孔と比較できるレベルでＡＲＰｓを作り出すことができる。ホロー・ファイバー成長チャンバー又は”細胞キューブ”もまた有用である。細胞が成長しそして粒子を生成した後に、典型的には約１２〜４８時間で、粒子は収集される。細胞は、成長培地から分離され、好ましくは、細胞片及び外来の物質を取り除くために前洗浄され、そして次に少量の放出培地で洗浄され、結果として、ＡＲＰｓは、細胞及び/又は細胞片から遊離され、そして精製され濃縮された溶液中に回収される。粒子は、当該技術分野に周知である多くの技術のいずれかを使用してさらに精製され、ここで該技術は、非限定的に免疫親和性クロマトグラフィー、ヘパリン・アフィニティー・クロマトグラフィー、又はイオン交換クロマトグラフィーなどを含んだ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
発明の詳細な記載
以下の議論及び定義は、当業者への本開示の明確さを改良するために提供される。
【００１３】
本出願の文脈では、ｎｍはナノメートルを意味し、ｍｌはミリメートルを意味し、ＶＥＥはベネズエラ・ウマ脳炎ウイルスを意味し、ＥＭＣは脳心筋炎ウイルスを意味し、ＢＨＫはハムスター仔腎臓細胞を意味し、ＨＡはヘマググルチニン遺伝子を意味し、ＧＦＰはグリーン蛍光タンパク質遺伝子を意味し、Ｎはヌクレオキャプシドを意味し、ＦＡＣＳは蛍光活性化セルソーターを意味し、ＩＲＥＳは内部リボソーム侵入部位を意味し、ｐｆｕはプラーク形成単位を意味し、ｉｕは感染単位を意味し、そしてＦＢＳはウシ胎児血清を意味する。「Ｅ２アミノ酸(例えばＬｙｓ、Ｔｈｒなど)数字」という表現は、Ｅ２タンパク質の指示された残基での指示されたアミノ酸のことを指し、そしてＥ３又はＥ１タンパク質における特定の残基におけるアミノ酸のことを指すためにも使用される。
【００１４】
本明細書中で使用されるとき、「アルファウイルス」という用語は、当該技術分野における慣用的な意味を有し、そしてＶＥＥウイルス、セムリキ森林ウイルス(ＳＦＶ)、シンドビス、ロス・リバー・ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、チクングニア・ウイルス、Ｓ.Ａ.ＡＲ８６、エバーグレード・ウイルス、ムカンボ・ウイルス、バルマ森林ウイルス、ミデルブルグ・ウイルス、ピクスナ・ウイルス、オニョンニョン・ウイルス、ゲタ・ウイルス、サギヤマ・ウイルス、ベバル・ウイルス、マヤロ・ウイルス、ウナ・ウイルス、アウラ・ウイルス、ワタロア・ウイルス、ババンキー・ウイルス、キジラガッチェ・ウイルス、ハイランドＪウイルス、フォート・モーガン・ウイルス、ヌジュム・ウイルス、及びバギー・クラーク・ウイルスなどの種々のウイルス種を含む。特許請求される発明のコンストラクト及び方法において使用される好ましいアルファウイルスは、ＶＥＥ、Ｓ.Ａ.ＡＲ８６、シンドビス(例えばＴＲ３３９、米国特許第6,008,035号を参照のこと)、及びＳＦＶである。
【００１５】
「５’アルファウイルス複製認識配列」及び「３’アルファウイルス複製認識配列」という用語は、アルファウイルスにおいて見られる配列、又はそれらに由来する配列のことを指し、それらは非構造的なアルファウイルス・レプリカーゼタンパク質により認識され、そしてウイルスＲＮＡの複製を導く。これらはしばしば５’及び３’末端、又はアルファウイルス５’及び３’配列と呼ばれる。本発明のコンストラクトにおいては、これらの５’及び３’末端の使用は、この２個の末端の間でコードされるＲＮＡ配列の複製をもたらす。アルファウイルスにおいて見つかる３’アルファウイルス複製認識配列は、典型的に３００ヌクレオチド長であり、これは、さらに詳しく確定されている最小３’複製認識配列を含む。最小３’複製認識配列は、アルファウイルスの間で保存されており、１９のヌクレオチド配列である(Hill et al., J. Virology, 2693-2704, 1997)。これらの配列は、さらに組換えの可能性を最小限にし又はクローニング部位を導入するように標準分子生物学的技術により改変されるが、但し、該配列は、アルファウイルス複製機構により認識されなければならない。
【００１６】
「最小５’アルファウイルス複製認識配列」は、アルファウイルスの非構造タンパク質により認識をされるが、該配列を含むＲＮＡ分子の有意なパッケージング/組換えをもたらさない最小配列のことを指す。好ましい実施態様では、最小５'アルファウイルス複製認識配列は、その配列を含むＲＮＡのパッケージング/組換えの観測される頻度の５０〜１００倍の減少をもたらす。ヘルパーのパッケージング/組換えは、幾つかの方法、例えばＬｕ及びSilver(J. Virol. Methods 2001, 91 (1) : 59-65)により記載された方法により評価される。
【００１７】
「アルファウイルスＲＮＡレプリコン」、「アルファウイルス・レプリコンＲＮＡ」、「アルファウイルスＲＮＡベクター・レプリコン」、及び「ベクター・レプリコンＲＮＡ」は、互いに置き換えることができ、ＲＮＡ分子がそれ自身を複製(増幅)させることができ、そして少なくとも、５’及び３’アルファウイルス複製認識配列(該配列は、上で定義されるように最小配列でありうるが、代わりにアルファウイルス由来の領域全体でありうる)、アルファウイルス非構造タンパク質のコード配列、及びポリアデニル化鎖を含むように非構造タンパク質遺伝子を発現するＲＮＡ分子を指す。該ＲＮＡ分子は、さらにプロモーター又はＩＲＥＳを含むこともある。該ＲＮＡ分子はまた、アルファウイルス構造タンパク質を発現するように設計される。Johnston et al.,及びPolo et al.,(背景技術で援用済み)は、そうしたアルファウイルスＲＮＡレプリコンの多くのコンストラクトを記載し、そしてそうしたコンストラクトは、本明細書中に援用される。特許請求される発明において使用されるアルファウイルスＲＮＡレプリコンの特定の実施態様は、１以上の弱毒化突然変異であって、ここで弱毒化突然変異がヌクレオチド欠失、付加、又は１以上のヌクレオチドの置換である変異、或いは適切な野生型アルファウイルスと比較して突然変異を含む生ウイルスにおける病原性の欠失をもたらす再配列又はキメラ構成を含む突然変異を含みうる。(レプリコンにおけるアミノ酸変化をもたらす)弱毒化ヌクレオチド置換の例は、アルファウイルスＳ.Ａ.ＡＲ８６におけるｎｓＰ１アミノ酸位５３８、ｎｓＰ２アミノ酸位９６、又はｎｓＰ２アミノ酸位３７２での突然変異を含み、そしてレプリコン核酸の非コード領域における弱毒化突然変異の例は、ＶＥＥにおけるヌクレオチド３でのＡ又はＣの置換である。
【００１８】
「アルファウイルス構造タンパク質/タンパク質(単数又は複数）」という用語は、アルファウイルスによりコードされる構造タンパク質の１つ又は組合せを指す。これらはウイルスにより、ポリタンパク質として生成され、そして一般的に文献においてＣ-Ｅ３-Ｅ２-６ｋ-Ｅ１として表される。Ｅ３及び６ｋは、２個の糖タンパク質、Ｅ２とＥ１の膜貫通/輸送シグナルとしての役目を果たす。こうして、本明細書中のＥ１という用語の使用は、Ｅ１、Ｅ３-Ｅ１、６ｋ-Ｅ１、又はＥ３-６ｋ-Ｅ１の事を指し、そして本明細書中でＥ２という用語の使用は、Ｅ２、Ｅ３-Ｅ２、６ｋ-Ｅ２、又はＥ３-６ｋ-Ｅ２のことを指すこともある。弱毒化突然変異は、１以上のアルファウイルス構造タンパク質のいずれかに導入されうる。
【００１９】
「ヘルパー(単数又は複数）」という用語は、１以上のアルファウイルス構造タンパク質を発現することができる核酸分子を指す。 
【００２０】
「ヘルパー細胞」及び「パッケージング細胞」という用語は、本明細書中で互いに置き換え可能なように使用され、そしてアルファウイルス・レプリコン粒子が生成される細胞のことを指す。ヘルパー細胞は、１以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードするヘルパーのセットを含む。本明細書中に開示されるとき、ヘルパーは、ＲＮＡ又はＤＮＡでありうる。細胞は、アルファウイルス-許容状態である細胞のいずれかであり、つまりウイルスＲＮＡ転写産物を導入した際にアルファウイルス粒子を生成することができる細胞でありうる。アルファウイルス許容状態である細胞は、非限定的にベロ、ハムスター仔腎臓(ＢＨＫ)、２９３、２９３Ｔ、トリ胚線維芽細胞(ＣＥＦ)、及びチャイニーズ・ハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞を含む。特許請求される発明の特定の実施態様では、ヘルパー又はパッケージング細胞は、さらに異種性のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ及び/又は配列特異的プロテアーゼを含む。
【００２１】
「アルファウイルス・レプリコン粒子」、「ウイルス・レプリコン粒子」、又は「組換えアルファウイルス粒子」という用語は、本明細書中に互いに置き換え可能なように使用され、異種性のＲＮＡ配列を発現するアルファウイルス・レプリコンＲＮＡを取り込むビリオン様構造複合体を意味する。典型的に、ウイルス様構造複合体は、脂質外被中に埋めこまれる１以上のアルファウイルス構造タンパク質を含み、ここで該脂質外皮はヌクレオキャプシドを封入し、次に該ヌクレオキャプシドはＲＮＡを封入する。脂質外被は、典型的に該粒子が生成される細胞の原形質膜由来である。好ましくは、アルファウイルス・レプリコンＲＮＡは、アルファウイルス・キャプシドタンパク質から構成されるヌクレオキャプシド構造によりとり囲まれ、そしてアルファウイルス糖タンパク質は、細胞由来の脂質外皮中に埋め込まれる。構造タンパク質及びレプリコンＲＮＡは、同じ又は異なるアルファウイルス由来でありうる。特異的な実施態様では、レプリコンＲＮＡは、ＶＥＥ由来であり、そして構造タンパク質は、シンドビス・ウイルス(例えばDubensky et al.,米国特許第6,376,236号を参照のこと)由来である。アルファウイルス・レプリコン粒子は、感染性であるが、伝播性が欠損しており、つまり、レプリコンＲＮＡは、アルファウイルス構造タンパク質をコードするヘルパー核酸(単数又は複数）が存在しない場合、粒子が最初に感染した宿主細胞を超えて伝播することができない。
【００２２】
「ヘルパー・コンストラクト」、つまりアルファウイルス構造タンパク質を発現する組換えＤＮＡ分子は、in vivoにおいて２個の分離した分子へと分解するシングル・ヘルパーから作られうる。こうして、製造の容易さ及び生成効率の点で、シングル・ヘルパーを使用する利点が維持される一方で、２連のヘルパーシステムの利点が、２連の発現システムを使用することなく獲得される。ＤＮＡヘルパー・コンストラクトは使用され、一方第二セットではＲＮＡヘルパーベクターは使用される。複製及び転写についてのアルファウイルス認識シグナルを使用しないＤＮＡヘルパー・コンストラクトの場合では、組換えの理論的な頻度は、そうしたシグナルを使用する２連のＲＮＡヘルパー・システムより低い。
【００２３】
ＤＮＡからＲＮＡの、つまりＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ転写を指図するプロモーターは、本発明のヘルパー核酸及びアルファウイルス・レプリコンを生成するために使用される。本明細書中の文脈では、プロモーターは、ポリメラーゼにより認識される核酸配列であり、そして(下流側に)付随している配列の転写を引き起こすために十分である。特許請求される発明の幾つかの実施態様では、プロモーターは恒常的である(以下を参照のこと)。或いは、プロモーターは、制御を受ける場合もあり、つまりプロモーターは、付随する配列の転写を引き起こすように恒常的に作用しない。誘導性であるなら、発現の制御を調節する配列が存在し、その結果付随された配列が、(ｉ)  インデューサー分子が、細胞を培養する培地中に存在するとき、又は(ii)  細胞が晒される条件が、誘導条件へと変化されるときにのみ転写される。本文脈では、転写制御配列は、プロモーター配列を含み、そして周囲のシグナルに応答して、付随する配列の発現を制御するためのシス-活性化配列をさらに含みうる。
【００２４】
ＲＮＡヘルパーの実施態様において及びレプリコンＲＮＡを生成ために、プロモーターは、in vitro転写反応においてＲＮＡを合成するために使用され、そしてこの使用に適した特異的なプロモーターは、ＳＰ６、Ｔ７、及びＴ３ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを含む。ＤＮＡヘルパーの実施態様では、プロモーターは、細胞内で、ＲＮＡを転写させるように機能する。コンストラクトのin vivo転写の潜在的なプロモーターは、真核生物のプロモーター、例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、又はウイルスのプロモーター、例えばＭＭＴＶ及びＭｏＳＶ ＬＴＲ、ＳＶ４０アーリーリージョン(early reagion)、ＲＳＶ、又はＣＭＶを含む。本発明の多くの別の適切な哺乳動物及びウイルスプロモーターは、当該技術分野で利用可能である。或いは、細菌又はバクテリオファージ由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター、例えば、ＳＰ６、Ｔ７、及びＴ３は、ｉｎ ｖｉｖｏでの使用に用いられる。ここで、適合したＲＮＡポリメラーゼは、分離プラスミド、ＲＮＡベクター、又はウイルスベクターを介して細胞中へと提供される。特異的実施態様では、適合したＲＮＡポリメラーゼは、誘導性プロモーターの制御の下でヘルパー細胞系列中に安定して形質導入される。
【００２５】
細胞内で機能するＤＮＡコンストラクトは、細胞内にトランスフェクションされた自律性プラスミドとして機能しうるか、又はそれらは、安定してゲノム中に取り込まれうる。これらの実施態様では、プロモーターは恒常的プロモーター、つまり細胞に導入され、そして発現可能なように下流配列に結合されるとき、インデューサー分子の添加誘導条件の変化を必要とせず、細胞内に導入された際に下流配列を直接的に転写をさせるプロモーターである。或いは、プロモーターは誘導性であることもあり、その結果、細胞は、細胞が適切な刺激(インデューサー)に晒されたときのみ、コンストラクトによりコードされる機能的なメッセンジャーＲＮＡを作り出す。誘導性プロモーターを使用するとき、ヘルパー・コンストラクトは、インデューサーへ晒されると同時に、前に、又は後で、パッケージング細胞中へと導入され、そしてコンストラクト及びインデューサーの両方が存在するとき、アルファウイルス構造タンパク質の発現が起こる。或いは、細胞中で機能するように設計されたコンストラクトは、ウイルスベクター、例えばアデノウイルス、ポックスウイルス、アデノ-随伴ウイルス、ＳＶ４０、レトロウイルス、ノダウイルス(nodavirus)、ピコルナウイルス、水疱性口内炎ウイルス、及び哺乳動物ｐｏｌＩＩプロモーターを有するバキュロウイルスを介して、細胞中へと導入される。
【００２６】
いったん、ヘルパーをコードするＲＮＡ転写物(ｍＲＮＡ)又は本発明のＲＮＡレプリコン・ベクターが、(上記のin vitro又はin vivo手法を介して)ヘルパー細胞中に存在すると、そのうちコードされたポリペプチド又はタンパク質を作るようになる。特定の実施態様では、ＲＮＡベクター・レプリコンは、ＤＮＡプラスミドからin vitroで転写され、そして次に電気穿孔によりヘルパー細胞中へと導入される。別の実施態様では、本発明のＲＮＡベクター・レプリコンは、ヘルパー細胞へとトランスフェクションされたＤＮＡベクター・プラスミドからin vivoで転写される(例えば、米国特許第5,814,482号を参照のこと)か或いは、ウイルス又はウイルス様粒子を介してヘルパー細胞へとデリバリーされる。
【００２７】
アルファウイルスＲＮＡベクターレプリコンは、１以上の異種性コード配列(単数又は複数）又は関心の機能性ＲＮＡ(単数又は複数）を発現するために設計され、ここでこれらは、本明細書中で異種性ＲＮＡ又は異種性配列と呼ばれ、ウイルス、原核生物、真核生物由来の広範な配列から選ばれる。異種性配列のカテゴリーの例は、非限定的に、免疫原(例えば、未変性、改変又は合成抗原性タンパク質、ペプチド、エピトープ、又は免疫原性断片)、サイトカイン、トキシン、治療用タンパク質、酵素、アンチセンス配列、及び免疫応答調節因子を含む。
【００２８】
明細書中に記載されるアミノ酸配列中のアミノ酸の全ては、当該技術分野においてルーチンに使用される通常の３文字及び１文字表記を有する：Ａ、Ａｌａ、アラニン；Ｃ、Ｃｙｓ、システイン；Ｄ、Ａｓｐ、アスパラギン酸；Ｅ、Ｇｌｕ、グルタミン酸；Ｆ、Ｐｈｅ、フェニルアラニン；Ｇ、Ｇｌｙ、グリシン；Ｈ、Ｈｉｓ、ヒスチジン；Ｉ、Ｉｌｅ、イソロイシン；Ｋ、Ｌｙｓ、リジン；Ｌ、Ｌｅｕ、ロイシン；Ｍ、Ｍｅｔ、メチオニン；Ｎ、Ａｓｎ、アスパラギン；Ｐ、Ｐｒｏ、プロリン；Ｑ、Ｇｌｎ、グルタミン；Ｒ、Ａｒｇ、アルギニン；Ｓ、Ｓｅｒ、セリン；Ｔ、Ｔｈｒ、スレオニン；Ｖ、Ｖａｌ、Ｖａバリン；Ｗ、Ｔｒｙ、トリプトファン；Ｙ、Ｔｙｒ、チロシン。
【００２９】
本明細書中に使用されるとき、特定の配列により起こる発現は、付随する下流配列の転写である。適切なでありかつ付随される配列が所望されるなら、発現という用語はまた、転写され又は導入されたＲＮＡの翻訳(タンパク質合成)も包含する。或いは、異なる配列は、転写及び翻訳させるために使用されうる。
【００３０】
本発明の方法において使用されるアルファウイルス-許容状態細胞は、完全なウイルスＲＮＡ転写物をトランスフェクションされた際に、ウイルス粒子を作り出すことができる細胞である。アルファウイルスは、広い宿主範囲を有する。適切なパッケージング細胞の例は、非限定的に、ベロ細胞、ハムスター仔腎臓(ＢＨＫ)細胞、トリ胚線維芽細胞、ＤＦ-１、２９３、２９３Ｔ、チャイニーズ・ハムスター・卵巣(ＣＨＯ)細胞、及び昆虫細胞を含む。
【００３１】
本明細書中に使用される「構造タンパク質」又は「アルファウイルス構造タンパク質」というフレーズは、ＲＮＡレプリコンをパッケージングするために必要とされる１以上のアルファウイルス-コードタンパク質を指し、そして典型的には、成熟アルファウイルスにおけるキャプシド・タンパク質、Ｅ１糖タンパク質、及びＥ２糖タンパク質を含む(特定のアルファウイルス、例えばセムリキ森林ウイルスは、更なるタンパク質であるＥ３を、成熟コート中に含む)。「アルファウイルス構造タンパク質(単数又は複数）」という用語は、アルファウイルスによりコードされる構造タンパク質の１つ又は組み合わせを指す。これらは、ポリタンパク質としてウイルスゲノムから合成され、そして文献において一般的にＣ-Ｅ３-Ｅ２-６ｋ-Ｅ１として表される。Ｅ３及び６ｋは、２個の糖タンパク質Ｅ２及びＥ１の膜貫通/輸送シグナルとしての役目を果たす。こうして、本明細書中での用語Ｅ１の使用は、Ｅ１、Ｅ３-Ｅ１、６ｋ-Ｅ１、又はＥ３-６ｋ-Ｅ１を指し、そして本明細書中での用語Ｅ２の使用は、Ｅ２、Ｅ３-Ｅ２、６ｋ-Ｅ２、又はＥ３-６ｋ-Ｅ２を指す。
【００３２】
本明細書中で記載されるとき、アルファウイルスの構造的なタンパク質は、１以上のヘルパー・核酸分子の間に分配される(例えば、第一ヘルパーＲＮＡ(又はＤＮＡ)及び第二ヘルパーＲＮＡ(又はＤＮＡ))。付け加えて、少なくとも１の構造タンパク質が、レプリコンＲＮＡから欠失し、その結果、レプリコンが及び得られたアルファウイルス粒子が複製できないようになるならば、１以上の構造タンパク質は、レプリコン核酸として、同じ分子上に存在しうる。本明細書中に使用されるとき、「欠失された」又は「欠失」は、特定の断片の完全な欠失か、又は特定の断片の一部の欠失であって、標準の仕様に従って断片を動作不能又は機能がなくなるようにするために十分な欠失を意味する。例えばTermin et al.,に対する米国特許第4,650,764号を参照のこと。本明細書中に使用される「複製欠損」という用語は、「伝播欠損」と同意義であり、そして規定の宿主細胞中で作られた粒子が、ヘルパー機能の欠失、つまりレプリコン核酸のパッケージングするために必要とされるアルファウイルス構造タンパク質がないことから、宿主細胞中に子孫粒子(progeny particle)を作り出すことができないことを意味する。しかしながら、レプリコン核酸は、それ自身を複製することができ、そして導入された宿主細胞中に発現されることができる。
【００３３】
ヘルパー細胞はまた、パッケージング細胞とも呼ばれ、感染性複製欠損アルファウイルス粒子を作り出すために使用され、レプリコン核酸をパッケージングするために十分なアルファウイルス構造タンパク質を発現しなければならないか又は発現できなければならない。構造タンパク質は、セットのＲＮＡ、典型的には、ヘルパー細胞にレプリコンベクターの導入と同時に、又は導入前に導入される２つのＲＮＡから作られうる。第一ヘルパーＲＮＡは、少なくとも１のアルファウイルス構造タンパク質をコードするが、全てのアルファウイルス構造タンパク質をコードしないＲＮＡを含む。第一ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルスＥ１糖タンパク質をコードするが、アルファウイルス・キャプシド・タンパク質及びアルファウイルスＥ２糖タンパク質をコードしないＲＮＡを含みうる。或いは、第一ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルスＥ２糖タンパク質をコードするが、アルファウイルス・キャプシド・タンパク質及びアルファウイルスＥ１糖タンパク質をコードしないＲＮＡを含みうる。更なる実施態様では、第一ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルスＥ１糖タンパク質及びアルファウイルスＥ２糖タンパク質をコードするが、アルファウイルス・キャプシド・タンパク質をコードしないＲＮＡを含みうる。第四の態様では、第一ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルスキャプシドをコードするが、アルファウイルス糖タンパク質をコードのどれもコードしないＲＮＡを含みうる。第５の実施態様では、第一ヘルパーＲＮＡは、キャプシド及び糖タンパク質の１つ、つまりＥ１又はＥ２のいずれかをコードするが、両方をコードしないＲＮＡを含みうる。
【００３４】
これらのヘルパーＲＮＡのいずれか１つと組み合わせて、第二ヘルパーＲＮＡは、少なくとも１のアルファウイルス構造タンパク質であって、第一ヘルパーＲＮＡによりコードされていないものをコードする。 たとえば、第一ヘルパーＲＮＡが、アルファウイルスＥ１糖タンパク質のみをコードする場合、第二ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルスキャプシドタンパク質とアルファウイルスＥ２糖タンパク質のうちの１つ又は両方をコードしうる。第一ヘルパーＲＮＡが、アルファウイルス・キャプシドタンパク質のみをコードする場合、第二ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルス糖タンパク質のうちの１つ又は両方をコードするＲＮＡを含みうる。第一ヘルパーＲＮＡが、アルファウイルスＥ２糖タンパク質のみをコードする場合、第二ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルス・キャプシド・タンパク質とアルファウイルスＥ１糖タンパク質のうちの１つ又は両方をコードしうる。第一ヘルパーＲＮＡが、キャプシドとアルファウイルスＥ１糖タンパク質の両方をコードする場合、第二ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルス・キャプシド・タンパク質とアルファウイルスＥ２糖タンパク質の１つ又は両方をコードするＲＮＡを含みうる。
【００３５】
全てのヘルパー核酸において、これらの分子は、コードされた構造タンパク質配列がヘルパー細胞中において発現(翻訳及び適切である場合転写又は複製シグナルを含む)されるために必要とされる配列をさらに含むということは理解される。そうした配列は、例えば、(ウイルス、原核生物、又は真核生物の誘導性又は恒常性の)プロモーター、及び５’及び３’ウイルスのレプリカーゼ認識配列を含む。１以上の糖タンパク質を発現するヘルパー核酸の場合、これらの配列は、核酸コンストラクト中の構造タンパク質のコード領域のＮ末端でのリーダー又はシグナル配列を伴って有利に発現されるということが理解される。リーダー又はシグナル配列は、アルファウイルス由来、例えばＥ３又は６ｋでありうるし、或いは組織プラスミノーゲン・アクティベーターシグナルペプチドなどの異種性配列又は合成配列でありうる。こうして、一の例として、第一ヘルパー核酸は、キャプシド-Ｅ３-Ｅ１をコードするＲＮＡ分子であり、かつ第二ヘルパー核酸は、キャプシド-Ｅ３-Ｅ２をコードするＲＮＡ分子であることもある。或いは、第一ヘルパーＲＮＡは、キャプシドのみをコードし、そして第二ヘルパーＲＮＡは、Ｅ３-Ｅ２-６ｋ-Ｅ１をコードしうる。さらに、パッケージングシグナル、つまりウイルスゲノム中に存在する「キャプシド化(encapsidation)配列」は、全てのヘルパー核酸において存在しない。好ましくは、パッケージング・シグナルは、全てのヘルパー核酸から欠失される。
【００３６】
これらのＲＮＡヘルパーは、多くの方法で細胞中へ導入されうる。該ＲＮＡヘルパーは、細胞内に安定的に形質導入された１以上の発現カセットから発現されて、それによりパッケージング細胞系列を確立する(例えば、米国特許第6,242,259号を参照のこと)。或いは、ＲＮＡは、ヘルパー細胞内で、細胞のゲノム中に組み込まれることなく発現されるＲＮＡ又はＤＮＡ分子として導入されうる。導入方法は、電気穿孔、ウイルスベクター(例えば、ＳＶ４０、アデノウイルス、ノダウイルス、アストロウイルス)、及び脂質媒介トランスフェクションを含む。
【００３７】
複数のヘルパーＲＮＡの代替は、ウイルス・レプリコンＲＮＡを感染性アルファウイルス・レプリコン粒子中へパッケージングするために必要なポリペプチドの全てをコードするシングルＤＮＡ分子を使用することである。シングルＤＮＡヘルパーは、非限定的に電気穿孔、脂質-媒介性トランスフェクション(リポフェクション)、ウイルスベクター(例えば、アデノウイルス又はＳＶ-４０)、又はリン酸カルシウム-媒介性トランスフェクションを含む当該技術分野に既知の方法のいずれかによりパッケージング細胞中に導入される。好ましくは、ＤＮＡは、本発明の電気穿孔に基く方法を介して導入される。ＤＮＡは典型的に、ＲＮＡの取り込みに必要とされる電圧及び電気容量と比べて減少された電圧及び増加した電気容量で細胞中へと電気穿孔で入れられる。全ての電気穿孔において、電圧及び電気容量の値は、感染性アルファウイルス粒子を作り出すパッケージング(宿主)細胞の能力を破壊することを避けるようにセットされなければならない。或いは、このフォーマットにおいて及び誘導性のプロモーターの下でのヘルパー機能は、ＲＮＡベクター・レプリコンの導入/発現の前に、パッケージング細胞のゲノム中へと取り込まれ、そしてＲＮＡベクター・レプリコンの導入の前に、同時に、又は後に適切な刺激で導入される。
【００３８】
有利なことに、アルファウイルス構造タンパク質、つまりキャプシド、Ｅ１糖タンパク質及びＥ２糖タンパク質、又はレプリコン・コンストラクトをコードする核酸の１以上は、１以上の弱毒化突然変異を含む。本明細書中で使用される「弱毒化突然変異」及び「弱毒化アミノ酸」というフレーズは、(ポリペプチドをコードするウイルスゲノムの領域中に存在するか又は存在しない)ヌクレオチド突然変異、又はヌクレオチド突然変異によりコードされるアミノ酸を意味し、該ヌクレオチド突然変異は、該突然変異が置換突然変異であろうと、イン-フレーム欠失若しくは突然変異の添加であろうと、当該技術分野の専門用語に従って(例えば、B. Davis, et al., Microbiology 156-158(4th ed. 1990)を参照のこと)、アルファウイルスが、その宿主において疾患を引き起こす可能性の低下(つまり病原性の低下)をもたらす。「弱毒化突然変異」という用語は、そうした突然変異が、弱毒化されたにもかかわらずウイルスの生存を可能にする「修復」突然変異と組み合わせて使用されない限り、ウイルスにとって致命的である突然変異を除外する。アルファウイルス・ゲノムにおいて適切な弱毒化突然変異を同定する方法は、当該技術分野に既知である。Olmsted et al.,(1984; Science 225: 424)は、細胞培養において成長の早さについて選別することにより、シンドビス・ウイルスにおいて弱毒化突然変異を同定する方法を記載する。Johnston及びSmith(1988; Virology 162: 437)は、ＢＨＫ細胞の浸透を促進するために選択的な圧力を直接適用することにより、ＶＥＥにおける弱毒化突然変異を同定することを記載する。アルファウイルスにおける弱毒化突然変異は、当該技術分野に記載される。例えば、White et al. 2001 J. Virology 75: 3706; Kinney et al. 1989 Virology 70: 19; Heise et al. 2000 J. Virology 74: 4207; Bernard et al 2000 Virology 276: 93; Smith et al 2001 J Virology 75: 11196; Heidner and Johnston 1994 J.Virology 68: 8064; Klimstra et al. 1999 J. Virology 73: 10387; Glasgow et al. 1991 Virology 185: 741; Polo and Johnston 1990 J. Virology 64: 4438; and Smerdou and Liljestrom 1999 J. Virology 73 : 1092 である。
【００３９】
特定の実施態様では、レプリコンＲＮＡは、少なくとも１の弱毒化突然変異を含む。別の特異的実施態様では、ヘルパー核酸(単数又は複数）は、少なくとも１の弱毒化突然変異を含む。２個のヘルパー核酸分子を含む実施態様では、少なくとも１の分子は、少なくとも１の弱毒化突然変異を含むか、又は両方とも少なくとも１の弱毒化突然変異をコードしうる。或いは、ヘルパー核酸又は第一若しくは第二ヘルパー核酸のうちの少なくとも１は、少なくとも２個の又は複数の弱毒化突然変異を含む。適切な弱毒化突然変異は、使用されるアルファウイルスに左右される。例えば、アルファウイルスがＶＥＥである場合、適切な弱毒化突然変異は、Ｅ２アミノ酸位７６でのコドンであって、弱毒化アミノ酸、好ましくはリジン、アルギニン、又はヒスチジンをＥ２アミノ酸７６として指定するコドン；Ｅ２アミノ酸位１２０でのコドンであって、弱毒化アミノ酸、好ましくはリジンをＥ２アミノ酸１２０として指定するコドン；Ｅ２アミノ酸位２０９でのコドンであって、弱毒化アミノ酸、好ましくはリジン、アルギニン、又はヒスチジンをＥ２アミノ酸２０９として指定するコドン；Ｅ１アミノ酸位２７２でのコドンであって、弱毒化突然変異、好ましくはスレオニン又はセリンをＥ１アミノ酸２７２として指定するコドン；Ｅ１アミノ酸位８１でのコドンであって、弱毒化突然変異、好ましくはイソロイシン又はロイシンをＥ１アミノ酸８１として指定するコドン、並びにＥ１アミノ酸位２５３でのコドンであって、弱毒化突然変異、好ましくはセリン又はスレオニンをＥ１アミノ酸２５３として指定するコドンからなる群から選ばれうる。Ｅ３/Ｅ２のポリタンパク質が切断されないように、更なる弱毒化突然変異がＥ３とＥ２との間の切断ドメインにおける欠失又は置換突然変異を含む；Ｅ１-２５３での突然変異と組み合わせた突然変異は、本発明中で使用される好ましい弱毒化株である。同様に、現存の生ワクチン株中、例えばＴＣ８３株(Kinney et al., 1989, Virology 170: 19-30、特にヌクレオチド３での突然変異)中に存在する突然変異はまた、本発明の方法により精製された粒子中に有利に使用された。
【００４０】
アルファウイルスが、南アフリカ・アルボウイルスＮｏ.８６(Ｓ.Ａ.ＡＲ８６)である場合、適切な弱毒化突然変異は、
ｎｓＰ１アミノ酸位５３８でのコドンであって、弱毒化アミノ酸、好ましくはイソロイシンをｎｓＰ１アミノ酸５３８として指定するコドン；
Ｅ２アミノ酸位３０４でのコドンであって、弱毒化アミノ酸、好ましくはスレオニンをＥ２アミノ酸３０４として指定するコドン；
Ｅ２アミノ酸位３１４でのコドンであって、弱毒化アミノ酸、好ましくはリジンをＥ２アミノ酸３１４として指定するコドン；
Ｅ２アミノ酸位３７６でのコドンであって、弱毒化アミノ酸、好ましくはアラニンをＥ２アミノ酸３７６として指定するコドン；
Ｅ２アミノ酸位３７２でのコドンであって、弱毒化アミノ酸、好ましくはロイシンをＥ２アミノ酸３７２として指定するコドン；
ｎｓＰ２アミノ酸位９６でのコドンであって、弱毒化アミノ酸、好ましくはグリシンをｎｓＰ２アミノ酸９６として指定するコドン；
ｎｓＰ２アミノ酸位３７２でのコドンであって、弱毒化アミノ酸、好ましくはバリンをｎｓＰ２アミノ酸３７２として指定するコドン；
からなる群から選ばれうる。別のアルファウイルスが使用される実施態様に有用な適切な弱毒化突然変異は、当業者に周知である。
【００４１】
弱毒化突然変異は、既知の方法に従って、ＲＮＡをコードするｃＤＮＡ上での特定部位突然変異誘導によりＲＮＡ中に導入されうる。Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1985)を参照のこと、該開示は、その全てを本明細書中に援用される。或いは、既知の方法に従って、ＲＮＡをコードするｃＤＮＡ中における相同制限酵素断片を置き換えることにより、又は変異誘発性ポリメラーゼ・チェーン反応を使用して突然変異はＲＮＡへと導入されうる。
【００４２】
本発明は、感染性、伝播欠損性、高免疫原性のアルファウイルス・レプリコン粒子を、高収量で製造する改良された方法を提供する。アルファウイルス・レプリコン粒子(ＡＲＰｓ)において、本明細書中でレプリコンと呼ばれるアルファウイルス・ベクターは、関心の１以上の遺伝子を含み及び発現するように遺伝子工学により操作され、ここで該関心の遺伝子は、例えば、抗原、ケモカイン、サイトカイン、リボザイム、又は酵素をコードしうる。アルファウイルス・レプリコン・ベクターは、アルファウイルスのいずれか、例えば、ベネズエラ・ウマ・脳炎(ＶＥＥ)ウイルス、シンドビス・ウイルス、例えば、ＴＲ３３９株、南アフリカ・アルボウイルスＮｏ.８６、及びセムリキ森林ウイルス由来でありうる。ベクターは、培養中の細胞へと導入され、これは、アルファウイルスの複製を可能にし、ここでアルファウイルスの構造タンパク質は発現され、その結果、該ベクターは、構造タンパク質によって、細胞から即座に放出されるＡＲＰｓ中へとパッケージされる。本発明はまた、生きた、米国特許第5,643,576号に記載される粒子を含む弱毒化されたアルファウイルス粒子、並びにアルファウイルスに対するワクチンとして使用される弱毒化アルファウイルス株の調製及び収集にも適用できる。
【００４３】
ＡＲＰを生成及び収集する従来の方法は高価であり、非効率的であり、そして労力がかかったので、本発明者は、方法を単純化し、そしてＡＲＰあたりの値段を低減する一方、改良されたＡＲＰ収量を達成するために、種々のパラメーターを試験した。新規の方法は、核酸調製、細胞培養、ＡＲＰｓを生成するための細胞操作、ＡＲＰ収集、及びＡＲＰ形成のステップにおける革新を含み、そして該方法は、ＡＲＰｓの収量の増加及びＡＲＰあたりかなりのコスト低下の利益を有する。
【００４４】
全ての以前の報告では、ＡＲＰｓは、ＡＲＰｓを生成する細胞が成長する培地又は培養上清から精製された。驚くべきことに、本発明者が、通常の成長培地に典型的に使用される塩濃度より高い水溶液でＡＲＰｓ生成細胞を洗浄したとき、かなりの数の感染性ＡＲＰｓが、細胞及び/又は細胞片から放出された。塩洗浄の後に集められたＡＲＰｓの免疫原性は、既知の方法に従って作られたＡＲＰｓの免疫原性と比較され、そして塩洗浄で集められたＡＲＰｓに対する強度は、塩洗浄の前に培地中に最初に放出されたＡＲＰ粒子と同等であるか、又はそれより良かった。
【００４５】
多くの用途において、本明細書中に記載されるように、ＡＲＰｓを収集するための塩洗浄処理の使用は、塩洗浄の前に細胞により保持される多数の粒子のため、細胞培養培地からＡＲＰｓを集める必要性を避けうる。塩洗浄の前の培地中に存在するＡＲＰｓと細胞により保持されそして塩洗浄により放出されるＡＲＰｓとの比は、細胞型、細胞成長条件、及び塩洗浄条件に左右されて、１：１〜１：４００でありうる。ベロ細胞では、この比率は、典型的には少なくとも１：３であり、通常１：１０、１：１００；又は１：４００であり(図４を参照のこと)、特許請求される発明の別のパラメーターの最適化度合いに左右される。
【００４６】
それゆえ、以下のステップ：
(ａ)  アルファウイルス・レプリコン核酸を宿主細胞中に導入し、ここで該レプリコン核酸が、少なくともアルファウイルス・パッケージング・シグナル及び少なくとも１の前記アルファウイルス・レプリコン核酸中に発現される関心の遺伝子(単数又は複数）のコード配列の少なくとも１を含み、ここで前記宿主細胞が、ＡＲＰｓを生成するために必要とされるアルファウイルス構造タンパク質を発現することができて、改変宿主を作り出し、
(ｂ)  構造タンパク質の発現及びアルファウイルス・レプリコン核酸の複製を可能にし、そして次にアルファウイルス・レプリコン核酸をパッケージングする条件下の培地中で前記改変宿主を培養して、ＡＲＰｓを形成し；
(ｃ)  改変宿主細胞を培地から分離し；そして
(ｄ)  ステップ(ｃ)の後に、改変された宿主細胞を、少なくとも約０.２０Ｍのイオン強度を有する緩衝溶液(本明細書中で「放出培地」と呼ばれる)と接触して、ＡＲＰｓを放出し、そしてＡＲＰを含む溶液を生成するステップ
を含むＡＲＰｓの調製方法(単数又は複数）が本明細書中に開示される。
【００４７】
ステップ(ｄ)は、多数の異なる放出培地のいずれか１つで行われ、そしてＡＲＰ「塩-洗浄」収量(つまり、放出培地中に集められたＡＲＰｓ)は、一部については細胞が放出培地に晒される時間の長さの関数のである。この時間は、１分〜数時間であることもあり；５〜２０分が典型的である。好ましい実施態様では、０.５Ｍ塩溶液が使用され、そして細胞は、この溶液中で約５分間インキュベーションされた。放出培地の塩濃度とインキュベーション時間との最適な組合せは、当業者により直接的に決定され、そしてさらに細胞型と細胞支持装置の更なる関数となりうる。
【００４８】
多くのＡＲＰｓが細胞により保持されるという驚くべき観測により、塩を含む溶液中でＡＲＰｓが細胞から放出される前に、細胞を完全に洗浄する機会が提供され、こうしてＡＲＰｓの下流における精製の必要性をかなり減らした。細胞単層は、こうしてＡＲＰｓについてのアフィニティ・マトリックスとして効果的に使用された。
【００４９】
こうして、好ましい実施態様では、細胞は、上記ステップ(ｂ)において記載されるように容器中、例えば細胞培養フラスコ、ローラー・ボトル、細胞-立方体装置、付着細胞成長用のビーズを備える培養容器(バイオリアクター及びスピナー・フラスを含む)、又はホロー・ファイバー中で培養され、ここで該細胞は、約１２〜４８時間、好ましくは１６〜２４時間インキュベーションされて、ＡＲＰｓを生成する。哺乳動物が使用される場合では、該細胞は典型的に容器の内部表面に付着されるか、又は、非限定的にビーズ、ポリスチレン粒子、ホロー・ファイバーなどを含む別の固体支持体へと結合され、そして必須のインキュベーション期間の後、培地は、細胞から望ましくは(デカンタにより又は吸引により)取り出されて、そして保存されるか又は捨てられ、それにより改変宿主細胞を、細胞培養培地からから分離する。或いは、懸濁培養中で成長する細胞は、遠心分離をして成長培地から細胞を取り出すことができる。細胞は次に「細胞洗浄」溶液で過度に洗浄される。該溶液は、低濃度の塩を含むか、又は塩を含まない培地であって、外部の物質、例えばＤＮａｓｅ調製品又は残りの細胞性ＤＮＡ又はプロテイナーゼを取り除く別の化学物質を取り除くことを手助けする培地である。市販のＤＮａｓｅは、ベンゾアーゼであり、セラチア・マルセシェンス(Serratia marcescens)デオキシリボヌクレアーゼは、Novagen/EMD Bioscience, Madison, WIから得られる(米国特許第5,173,318号を参照のこと)。ＤＮａｓｅは、電気穿孔後の培地中に約１０〜１０００ユニット/ｍｌの濃度で取り込まれうる。ＤＮａｓｅ、例えばベンゾナーゼがＡＲＰ粒子中に取り込まれる場合、ＤＮａｓｅは、１００〜５０００ユニット/ｍｌ、望ましくは約５００ユニット/ｍｌの濃度で使用され、３０〜３７℃で１０〜９０分間、望ましくは約３０分間インキュベーションされた。有用な放出培地(結合されたＡＲＰｓの放出するための細胞洗浄液)の例は、図４において示される。細胞基質によりＡＲＰｓ(又はアルファウイルス粒子)の保持を最大限にし、そして放出培地の添加の前に倍地中への放出を最小限にするために、細胞洗浄溶液は、各細胞-アルファウイルス種の組合せについて最適化されうるということを、これらの結果は示す。細胞によるＡＲＰ保持を最大化することにより、細胞培養培地中に存在する粒子のずっと少ない数を収集することは、効率的ではないこともあるし又は経済的ではないこともある。
【００５０】
この過度の洗浄の後に、細胞は次に放出培地に晒され、そしてＡＲＰｓは、宿主細胞から倍地中へと放出される。好ましい実施態様では、放出培地は、少なくとも約０.２０Ｍ塩、好ましくは０.２５Ｍ〜５Ｍ塩を含む水溶液であり、そして細胞が成長する培地の体積より典型的にずっと少ない体積であり、例えば、体積で１０〜５０倍少ない。放出培地は、更なる構成要素、例えば(特に、細胞洗浄液中に使用されないなら)ＤＮａｓｅ及び安定化剤、例えばＨＳＡ及びスクロースを含みうる。放出ステップの温度は決定的ではなく、４℃、室温、及び３７℃で同様の結果を得た。同様の結果は、１０〜３０分の(放出培地中の)塩洗浄で得られる。
【００５１】
放出培地は、非限定的に以下：ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2、ＣａＣｌ2、ＮＨ4Ｃｌ、ＮＨ4ＳＯ4、ＮＨ4ＣＨ3ＣＯＯ、及びＮＨ4ＨＣＯ3を含む所望のイオン強度に作られうる。望ましくは、放出培地のｐＨは、細胞の完全性を維持するｐＨ、例えば約６〜約９.０又は約６.５〜約８.５に合わせられる。特定の実施態様では、放出培地中の揮発性塩、例えば揮発性のアンモニウム塩、特に酢酸アンモニウム又は重炭酸アンモニウムの使用は、濃縮されたＡＲＰ調製液から塩を取り除く結果として、ＡＲＰを含む溶液が凍結乾燥されることを可能にする。
【００５２】
幾つかの塩は、電気穿孔後１６及び２４時間でのベロ細胞からＡＲＰｓの収集及び回収を増進するための能力について試験された。１Ｍ・ＮａＣｌｐＨ７.２、１Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ７.３５、１Ｍ炭酸アンモニウムｐＨ７.４、１Ｍ塩化マグネシウムｐＨ７.２、１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ７.３５、及び１Ｍ硫酸アンモニウムｐＨ７.３５の全ては、同等かつ良好な結果を与えた。放出培地の塩濃度０.５Ｍから５Ｍに増加することは、ＡＲＰｓの収量に影響しなかった。低い有効量に対する濃度を使用することは、クロマトグラフィー媒体上にロードされる物質の多量の希釈体積の必要性を妨げる。２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７.２、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６.５、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７.２、及び０.１％トウィーン８０を伴う２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７.２は、生成細胞からのＡＲＰｓの放出するように効果的に働かなかった。放出培地中での洗浄は、４℃、室温、３７℃で行われ、洗浄温度は収量に影響を与えなかった。
【００５３】
細胞が電気穿孔後即座に配置される培地、つまり電気穿孔後培地の効果も研究された。実施例３を参照のこと。驚くべきことに、無血清培地の使用により良好な収量が得られ、しばしば血清を含む培地と同程度であり、使用される生成物の潜在的な安全性に関して、並びにアルファウイルス-許容状態細胞及びウイルス粒子若しくはウイルス様粒子と結びつくタンパク質の量を低減するという点で利点を与える。
【００５４】
特定の実施態様では、上記のステップ(ｃ)で、細胞から分離された培養培地は、本明細書上記のＡＲＰを含む溶液と混合され、そしてＡＲＰｓは、前で分離された２の分画から同時に生成されうる。或いは、ＡＲＰｓは、培養培地から別々に精製され、そして次に塩洗浄により取り出された粒子と混合される。
【００５５】
一般的に、特許請求される発明の全てのステップは、ＡＲＰ生成前の細胞の成長を含み、無血清培地中で行われうる。
【００５６】
核酸分子を宿主細胞中に導入するための多くの方法が知られているが、特に有用な方法は電気穿孔法である。電気穿孔混合液中の細胞及び導入核酸の両方が以前に推奨されるか又は使用された濃度よりも高い濃度で存在した場合に、改良されたＡＲＰ収量が得られると本発明者により測定された。
【００５７】
一般的に、電気穿孔の機能は、核酸の浸入を可能にするために十分な、細胞膜における孔又は開口部を作り出すための電場を使用することである。現在、細胞を電気穿孔するための多くの装置が市販され、(典型的には０.８〜４ｍｌの培地を保つ)使い捨てのキュベット、ペトリ皿電極、及びフロー・スルー・アパラッチ(flow-through apparati)又は別の電気穿孔チャンバーを含む。遺伝子形質転換するための細胞の電気穿孔用装置を最適化する際、電圧、パルス期間、装置配置、必要とされる電界強度(これは、各細胞型の関数であり、そして細胞の半径及び破壊電圧に左右される)、並びに電極間の距離などのパラメーターを変化する際に、当該技術分野におけるさらなる教示が存在する。さらに、細胞の密度もまた、因子であり、そして製品の推薦は、ベロ及びＮＩＨ-３Ｔ３細胞について１〜５×１０6細胞/ｍｌであり、そしてＢＨＫ及びＣＨＯ細胞について少し高かった。ＢＨＫ及びＣＨＯ細胞は両方ともベロ細胞より小さかった(例えば、Multiporator(商標)のキュベットマニュアル, Brinkmann, Westbury, NY; Genetronics, San Diego, CA 、the ElectroCell Manipulator (ECM(商標)) 又はElectroSquarePoratorm(商標)についての(BTX Division)プロトコル; Parham, J. et al.1999 CytoTechnology 28: 1-9)を参照のこと。)。これらの推薦された細胞密度より高い細胞密度は、電気穿孔環境における不均一な電場状況であって、細胞融合を導きうる状況をもたらしうるということを当該技術分野は示す。Liljestrom及びGaroff, J. Virology 65: 4107- 4113,1991は、５×１０6細胞/ｍｌの濃度のＢＨＫ細胞中へ、１のキャップされたＲＮＡヘルパー及びセムリキ森林ウイルス・レプリコンＲＮＡを導入するために電気穿孔を使用した。
【００５８】
同様に、当該技術分野で使用される核酸濃度は、実験的に決定され、そして一般的に１ｍｌの電気穿孔緩衝液あたり５〜２０μｇのＤＮＡが推薦され；さらに多い量は、大きい核酸について有効であると考えられる。Lijestrom及びGaroff(1991)は、電気穿孔におけるRNA濃度の効果を研究し、そして取り込み効率は、ＲＮＡ濃度に直線的に関連せず、そして２μｇは、キュベット電気穿孔における１００％のトランスフェクション効率を得るために十分であった。
【００５９】
本発明では、１ｍｌの電気穿孔培地あたり約１×１０7〜約１×１０9の細胞密度で宿主細胞を使用して電気穿孔を行うとき、改良された結果(宿主細胞あたりのＡＲＰ生成)が得られた。より好ましくは、電気穿孔環境における細胞密度は、１ｍｌあたり約５×１０7〜５×１０8細胞である。本明細書中に特異的に例示されるように、電気穿孔は、電気穿孔キュベット中で行われるが、ペトリ皿又は流水式電気穿孔装置もまた使用されうる。これらの両方とも市販されている。電気穿孔チャンバーの別の型は使用されうる。改良された結果は、１ｍｌあたり約１×１０7〜５×１０8のベロ細胞濃度で得られた。例えば、０.４ｃｍギャップ・キュベットにおける１０8細胞において、１０10〜１０11ＡＲＰｓが１回の電気穿孔から得られた。細胞及び容積基準に基く同等の収量は、別の電気穿孔装置におけるパラメーターを適切に変化することにより得られる。或いは、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＥＦ、２９３Ｔ、及びトリ胚線維芽細胞は、使用されうる。本明細書の上部で議論された培養昆虫細胞も使用されうる。
【００６０】
レプリコン-ヘルパー電気穿孔についての、最適化された細胞濃度範囲では、各インプット・ヘルパーＲＮＡは、約１０〜５０、望ましくは約３５μｇ/ｍｌで存在し、そしてレプリコンＲＮＡは、約１０〜１５０μｇ/ｍｌ、望ましくは約３５μｇ/ｍｌで存在する。別の実施態様では、１以上のＤＮＡヘルパーが使用される。電気穿孔において使用されるＤＮＡヘルパー(単数又は複数）の濃度は、ＲＮＡヘルパーに使われる濃度より高く、例えば１００〜２００μｇ/ｍｌである。ＲＮＡ又はＤＮＡヘルパーを使用し、電気穿孔前に細胞に加えられるアルファウイルスＲＮＡレプリコンの量は、少なくとも約３５μｇ/ｍｌである。
【００６１】
電気穿孔を介して、アルファウイルス-許容状態細胞培養へとアルファウイルス・レプリコン・ベクターを導入することを含む、ＡＲＰｓ製造方法であって、電気穿孔の間培養培地中の細胞濃度が、少なくとも１０7細胞/ｍｌ培地、好ましくは５×１０7〜５×１０8細胞/ｍｌ培地である方法が本明細書中に開示される。特許請求される発明の好ましい方法は、細胞中に導入されるレプリコンＲＮＡを使用することを含む一方で、別のアプローチは、レプリコンＲＮＡをコードするｃＤＮＡ分子を介してレプリコンＲＮＡを導入することである。このアプローチは、ときおり真核細胞レイヤード・ベクター・イニシエーション・システム(eukaryotic layered vector initiation system)(ELVIS)と呼ばれ、米国特許第5,814,482号及び第6,015,686号に記載される。
【００６２】
宿主細胞中に生成されるアルファウイルス構造タンパク質は、該宿主細胞のゲノム中に安定して組み込まれた１以上の核酸配列(単数又は複数）によってコードされるか、又はそれ/それらは、アルファウイルスレプリコン核酸の導入と同時に又はその前において、一過性の形態で宿主細胞に導入されうる。望ましくは、宿主細胞中に提供されるアルファウイルス構造タンパク質は、アルファウイルス・レプリコン核酸を結合できるアルファウイルスキャプシドタンパク質及び少なくとも１のアルファウイルス・糖タンパク質をコードする１又は２個の核酸分子(ＲＮＡ又はＤＮＡ)から発現される。ここで当該アルファウイルス糖タンパク質は、アルファウイルスレプリコン核酸及びキャプシド・タンパク質と一緒に行動する。電気穿孔を介して核酸として加えたとき、１以上のヘルパー核酸は、レプリコンＲＮＡと共に電気穿孔されうる。シングル・ヘルパー核酸で、本発明の方法を実行する際、レプリコンＲＮＡ：ヘルパー核酸のモル比の有効な範囲は、１：２〜１：８であり、そしてレプリコンＲＮＡ：第一ヘルパー：第二ヘルパーのモル比の有効な範囲は１：２：２〜１：５：５である。一般的に、各ヘルパーの濃度は、ルーチンな実験により最適化され、そして特に１のヘルパーがＲＮＡ分子でありかつもう一方がＤＮＡ分子であるなら、両方のヘルパーが等量で使用されるということは必要でなくまた予期もされない。ＡＲＰｓの最高濃度を作り出すヘルパーの濃度を決定するために、ヘルパー分子(単数又は複数）の量は、レプリコン核酸の量と関連するが、２個のヘルパーの場合互いに独立して増大されうる。全てのアルファウイルス構造タンパク質を発現するシングルＤＮＡヘルパー(例えば、ＶＥＥ構造タンパク質の全てを発現するヘルパーは、約８.７ｋｂの長さである)の特異的な実施態様において、レプリコンＲＮＡ：ＤＮＡヘルパーの有効なモル比は、約１：６である。同様に、ＨＩＶｇａｇタンパク質をコードする３０μｇのＶＥＥレプリコン・ベクター及び１００〜１５０μｇのＤＮＡヘルパー(ＣＭＶプロモーター)は、ＡＲＰ生成のためベロ細胞中に電気穿孔された。ＤＮＡは、毒性汚染物質を取り除くためにかなり精製され、そして電気穿孔前に約５ｍｇ/ｍｌへと濃縮された。一般的に、ＤＮＡを１〜８ｍｇ/ｍｌへと、好ましくは５〜８ｍｇ/ｍｌへと濃縮することが好ましい。ＤＮＡヘルパーは、０.８ｍｌの電気穿孔混合液あたり約２０〜５００、望ましくは約５０〜３００、例えば約１５０μｇで、電気穿孔混合液中に存在し、望ましくは約５×１０7〜約２×１０8細胞、例えば約１.２×１０8細胞を含む。
【００６３】
レプリコン及び/又はヘルパーを使用するこれらの実施態様では、本発明の効果的な方法の一の態様は、制限酵素切断により直線にされた後のＤＮＡを精製することなく、レプリコン及びヘルパー核酸をコードする直線化ＤＮＡから転写を行うことである。同じＲＮＡ転写緩衝液中での制限酵素切断及びＲＮＡ転写についてプロトコル(共役反応)は開発された。ＲＮＡの収量は、インプットＤＮＡの重さに対して計算するなら、直線化の後でかつＲＮＡ転写の前にＤＮＡが精製される従来の方法に比べて、当該共役反応では２〜３倍高かった。
【００６４】
本発明における値段、試薬、及び労力のさらなる節約は、キャップなしヘルパーＲＮＡ(単数又は複数）が電気穿孔反応において使用されうるという発見から生じる。実施例１は、レプリコンＲＮＡと共に電気穿孔において使用されるキャップなしＲＮＡ(単数又は複数）の効率を測定するために行われた実験を記載する。
【００６５】
ヘルパーＲＮＡが複製されるため、及びレプリコンＲＮＡをパッケージする構造タンパク質を提供するために、キャップ構造がヘルパーＲＮＡ上に必要とされるかどうかを我々は試験した(実施例１）。キャップ・ヘルパーＲＮＡに対する理論的な必要性はないにも関わらず、本発明者の研究室並びに別の研究室からの現存するデーターにより、キャップなしヘルパーは、ＡＲＰｓを作り出すとき、効率的に(或いは、全く)働かないということが示された。それにもかかわらず、ヘルパーＲＮＡにキャップをつけることに付随する値段の高さのため、並びにもしキャップアナログを使用しない場合、転写反応からＲＮＡ収量をかなり増やせる可能性のため、ＡＲＰｓを生成するためのキャップなしヘルパーの使用についての研究が開始された。ベロ細胞は、キャップ有り又はキャップなしヘルパーＲＮＡと共にレプリコンＲＮＡで電気穿孔された。驚くべきことに、同等のタイターのＡＲＰｓは、キャップなし又はキャップ有りＲＮＡヘルパーで作り出された(図１)。但し、ＲＮＡヘルパーは、電気穿孔前に十分に精製された。キャップなしヘルパーでのＡＲＰｓの生成は、別の細胞型(ＣＨＯ、２９３Ｔ、及びＤＦ-１細胞)において試みられて、この結果はベロ細胞に限られないことを確かめた。キャップなしヘルパーＲＮＡは、ベロ、ＣＨＯ、ＤＦ-１、及び２９３Ｔ細胞においてＡＲＰｓを作り出すために使用された。キャップなしＲＮＡヘルパーで生成されたＡＲＰｓは、試験された細胞型の全てにおいて、キャップ有りＲＮＡヘルパーで生成されたＡＲＰｓとタイターの点で同等である(図１)。キャップなしヘルパーＲＮＡ分子を使用する能力は、試薬とＲＮＡ収量との観点でかなりのコストの節約を可能にする。対照的に、収量は、キャップなしレプリコンＲＮＡについてより、キャップ有りレプリコンＲＮＡについてのほうが高かった。キャップは、Ｇキャップ、Ｃキャップ、Ａキャップ、メチル化Ｇ(ｍ7Ｇ(５’ｐｐｐ(５’)ｐｐｐＧ(５)Ａ)、非メチル化Ｇ(Ｇ(５’ｐｐｐ(５’)Ａ)；ＡＲＣＡ(抗-リバース・キャップ・アナログ、３-Ｏ-Ｍｅ-ｍ7Ｇ(５’)ｐｐｐＧ(５)を含む。キャップ化試薬は、当該技術分野に周知であり、そして例えばPromega, Madison, WI及びAmbion, Austin, TXから市販される。ＲＮＡ生成のコストは、かなり削減される。なぜなら、キャップアナログ試薬は、当該方法の高価な要素であるからであり、そして各転写反応は、より多くのＲＮＡを産生するからである。
【００６６】
電気穿孔における精製及び未精製ＲＮＡの結果を比較する際、(非限定的にサイズ排除クロマトグラフィー、シリカ・カラム・クロマトグラフィー、又はＬｉＣｌを含む市販のキット及び方法を使用する)少なくとも部分的なＲＮＡ精製は、良好なＡＲＰ収量に必要であった。精製は、電気穿孔から得られるトランスフェクション効率についての有害な効果を引き起こすこと(例えばBrinkmannの装置取り扱い説明書を参照のこと)が知られているＥＤＴＡ、ＨＥＰＥＳ、及びＴＲＩＳなどの分子(核酸操作における通常の構成物)、並びにＲＮＡを作り出すために使用される転写緩衝液(図２を参照のこと)の構成要素を取り除く。電気穿孔において使用される核酸調製品は、好ましくは、Ａ260/Ａ280比で約１.７〜１.９であり、そして電気穿孔前に蒸留水中に懸濁される。ＲＮＡ精製は、ＲＮＡ溶液の濃度に達するという付加的な利点を有する。電気穿孔培地において細胞に加えられるＲＮＡ溶液の体積が小さほど、より多くの細胞は、電気穿孔において使用されうる。いずれの特定の論理により束縛されることなく、電気穿孔の前に二価Ｍｇカチオンを取り除くこと又はＭｇ二価カチオンを５ｍＭ未満の濃度に低減することは、最終的なＡＲＰ収量を改良する。
【００６７】
関心の配列を運搬するアルファウイルス・レプリコンＲＮＡと共に電気穿孔されるとき、１のＤＮＡヘルパーは、ＡＲＰｓを生成するために使用される。方形波及び指数波の電気穿孔は、類似の結果を与える一方、ＤＮＡヘルパーの純度が大きくなるほど、ＡＲＰ収量はより良くなった。(高電気容量)低電圧は、ＲＮＡ分子のみを細胞に導入する場合と比較して、ＤＮＡ分子を細胞に効率的に導入するために好ましいということが発見された。
【００６８】
ＡＲＰｓが、塩洗浄により細胞から集められた後に、そして場合により細胞を含まない上清から集められた後に、ＡＲＰｓは、非限定的にイオン交換クロマトグラフィー及びヘパリン・アフィニティー・クロマトグラフィーを含む１以上のステップにより精製されうる。ヘパリンクロマトグラフィーは、ＡＲＰＳ中に取り込まれる弱毒化突然変異アルファウイルス構造タンパク質のいくつかに作用するが、ＶＥＥ３０００ウイルス構造タンパク質には作用しない。
【００６９】
本発明中で使用される好ましいアルファウイルスは、ベネズエラ・ウマ脳炎ウイルスである。好ましくは、ＡＲＰｓを生成する際に使用されるＶＥＥ株は、少なくとも１の弱毒化突然変異を含む。そうした弱毒化突然変異の代表的なクラスでは、最初に「迅速-貫通(rapid-penetration)」ミュータント(Johnston and Smith, Virology 162: 437-443,1988)として名付けられ、それらの多くは、後に全体として正荷電をもたらすＥ２糖タンパク質における突然変異を有することが示され(Davis et al., Virology 183: 20-31,1991)、そして、グリコサミノグリカン、例えばヘパラン硫酸に結合する能力を亢進させた(Klimstra, WB et al. 1998 72: 7357-7366; Bernard et al., Virology 276: 93-103,2000を参照のこと)。類似の突然変異は、別のアルファウイルス、例えばシンドビス(Olmsted et al., Virology 148: 245, 1986; Davis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 6771,1986)において知られており、特に典型的なヘパリン結合性弱毒化ＶＥＥ突然変異体は、３０１４株である。ウイルス又はそれらから由来されるＡＲＰｓであって、グリコサミノグリカン結合能力を与える突然変異を有するものは、塩洗浄ステップを使用する精製に特によく適しており、そしてそれらはヘパリン・アフィニティー・クロマトグラフィーを使用してさらに精製されうる。
【００７０】
本発明の文脈では、ヘルパー細胞は、その中にヘルパー及びレプリコン核酸が存在するとき、アルファウイルス・レプリコン粒子を作り出す細胞である。ヘルパー機能が１以上の安定に組み込まれた配列上にコードされる細胞は、ＡＲＰｓをパッケージするために使用されうる。ＤＮＡ又はＲＮＡは、特定の細胞型に適した方法であって、当該技術分野に知られたいずれかの方法、例えば、非限定的に形質転換、リポフェクション、又は電気穿孔により誘導される。或いは、レプリコン核酸をウイルス粒子へとパッケージするために必要とされる構造遺伝子がゲノム中に組み込まれた安定形質転換細胞は、本明細書中に開示される方法を使用してＡＲＰｓを調製するために使用されうる。
【００７１】
遺伝コードの縮重及びコドン使用頻度のため、コード配列が変わりうるということは、当業者により認識される。関心の抗原又は別のポリペプチド又はタンパク質をコードする全ての同義配列は、本発明の範囲内に含まれる。
【００７２】
これらの配列がコードするペプチドのアミノ酸配列の活性を有意に変化させないコード配列中に、対立遺伝子変異が生じうるということは、当業者により認識される。そうした同等のＤＮＡ配列の全ては、本発明の範囲内及びプロモーターの定義内に含まれる。
【００７３】
クローニング、ＤＮＡ単離、増幅、及び精製について、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを含む酵素反応についての標準技術、並びに種々の分離技術は、当業者に知られ、そして通常に使用される。標準技術の多くは、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Maniatis et al.(1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Wu (ed. ) (1993) Meth. Enzymol. 218, Part I ; Wu (ed. ) (1979) Meth. Enzymol. 68; Wu et al. (eds.) (1983) Meth. Enzymol. 100 and 101; Grossman and Moldave (eds. ) Meth. Enzymol. 65; Miller (ed.) (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Old and Primrose (1981) Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley; Schleif and Wensink (1982) Practical Methods in Molecular Biology ; Glover (ed. ) (1985) DNA Cloning Vol.I and 11, IRL Press, Oxford, UK; Hames and Higgins (eds.) (1985) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK; Setlow and Hollaender (1979) Genetic Engineering : Principles and Methods, Vols. 1-4, Plenum Press, New York; and Ausubel et al. (1992) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York, NY.において記載される。使用される略記及び命名法は、当該技術分野に標準なものとみなされ、そして本明細書中で引用する専門論文において通常使用される。
【００７４】
ワクチン、又は別の免疫原性組成物などの本発明の医薬製剤は、免疫原性の量の感染性伝播欠損性アルファウイルス・レプリコン粒子又は生きた弱毒化粒子を、医薬として許容される担体と組み合わせて含む。「免疫原性の量」は、医薬製剤が投与される対象に免疫応答を誘発するために十分な感染性アルファウイルス粒子の量である。約１０4〜１０9、特に１０6〜１０8の量の感染ユニット、又は投与量あたりのＡＲＰｓは、治療される対象の年齢及び種に依存して適していると信じられている。医薬として許容される担体の例は、非限定的に滅菌、パイロジェンフリーの水、及び滅菌パイロジェン生理食塩水を含む。免疫原性の量の本発明の感染性、複製欠損アルファウイルス粒子を投与された対象は、ヒト及び動物(例えば、犬、ネコ、ウシ、ウマ、ロバ、マウス、ハムスター、サル、ギニアブタ、トリ、卵)対象を含む。投与は、腹腔内、筋肉内、皮内、鼻腔内、経膣、経直腸、皮下、又は静脈内いずれかの適切な方法により行われうる。
【００７５】
１以上の免疫増強分子、例えばケモカイン及び/又はサイトカインは、本明細書中に記載されるように調製されたアルファウイルス・レプリコン粒子を含む免疫原性組成物中に取り込まれうる。或いは、免疫原性組成物は、アルファウイルスレプリコン粒子であって、組成物が投与される患者又は動物中に１以上のケモカイン及び/又はサイトカインを発現させる粒子を含みうる。ケモカイン及びサイトカインのれイは、非限定的に、インターロイキン-４、インターロイキン１２、γインターフェロン、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子、及びＦＬＴ-３リガンドを含む。サイトカイン及び/又はケモカインの選択は、免疫応答に標的とされる腫瘍症、寄生生物、又は病原菌に左右されて変わりうるということは理解される。
【００７６】
本発明の方法を使用して生成されたＡＲＰｓ(であって、該組成物がヒト又は動物へと投与されるとき、関心の配列(単数又は複数）を発現させるＡＲＰｓ)を含む免疫原性組成物は、当該技術分野に周知の方法のいずれかにより剤形される。そうした組成物、特にワクチンは、典型的に注射液、液体溶液又は懸濁液として製造されうる。注射前に液体中の適切な溶液又は懸濁液を形成する固体もまた、製造されうる。凍結乾燥された製剤も適している。
【００７７】
活性免疫原性成分(ＡＲＰｓ)は、医薬として許容されかつ活性成分と適合性のある賦形剤又は担体と混合される。適切な賦形剤は、非限定的に滅菌水、塩類溶液、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びそれらの組合せ、並びに安定化剤、例えばＨＳＡ又は別の適切なタンパク質及び還元糖を含む。
【００７８】
付け加えて、所望されるならば、ワクチンは、少量の補助物質、例えば湿潤又は乳濁剤、ｐＨ緩衝剤、及び/又はワクチンの有効性を高めるアジュバントを含むこともある。有効である賦形剤の例は、非限定的に、水酸化アルミニウム；Ｎ-アセチル-ムラミル-Ｌ-スレオニル-Ｄ-イソグルタミン(ｔｈｒ-ＭＤＰ)；Ｎ-アセチル-ノル-ムラミル-Ｌ-アラニル-Ｄ-イソグルタミン(ＣＧＰ１１６３７、ｎｏｒ-ＭＤＰと呼ばれる)；Ｎ-アセチルムラミル-Ｌ-アラニル-Ｄ-イソグルタミニル-Ｌ-アラニン-２-(１’-２'-ジパルミトイル-ｓｎ-グリセロ-３ヒドロキシホスホリルオキシ)-エチルアミン(ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ-ＰＥと呼ばれる)；及びバクテリアから抽出される３種の構成要素、モノホスホリル・リピドＡ、トレハロース・ジミコレート、及び細胞壁骨格(ＭＰＬ+ＴＤＭ+ＣＷＳ)を、２％スクアレン/Ｔｗｅｅｎ８０中に含むＲＩＢＩを含む。アジュバントの有効性は、種々のアジュバントを含むワクチン中の免疫原の投与から得られるＡＲＰ免疫原性生成物に対する抗体量を計測することにより測定されうる。当該技術分野に既知である投与のさらなる製剤及びモードも使用されうる。
【００７９】
免疫原性(又はそうでなければ生理的に活性である)ＡＲＰを含む組成物は、投与製剤と適合性のある方式で、及び予防的及び/又は治療的に効果的である量で投与される。投与される量は、一般的に投与量１ｍｌあたり約１０4〜１０9感染ユニットの範囲であり、治療される対象、ＡＲＰｓが投与される経路、発現産物の免疫原性、所望されるエフェクター免疫応答の類型、そして所望される保護の程度に左右される。投与されるために必要とされる活性成分の正確な量は、医師、獣医師、又は他の保健従事者の判断に依存し、各個人について固有であるが、そうした決定はそうした従事者の技術の範囲内である。
【００８０】
ワクチン又は別の免疫原性組成物は、１回投与又は複数回投与スケジュールにおいて与えられうる。複数回投与スケジュールは、ワクチンの初回治療単位が１〜１０又はそれ以上の分けられた投与、続いて免疫応答を維持及び/又は増強するために必要とされる時間期間、例えば毎週又は２回目の投与として１〜４ヶ月目で投与される投与、そして所望されるなら、さらに数ヶ月/数年後の次の投与(単数又は複数）を含みうるスケジュールである。
【００８１】
本出願中に引用される全ての参考文献は、本開示と矛盾がない程度に本明細書中に援用される。
【００８２】
以下の実施例は、例示の目的に提供され、そして本明細書中に特許請求される発明の範囲を制限することを意図しない。例示的な物品及び方法のいずれの変動であって、当業者が思いつくものは、本発明の範囲内に含まれる。
【実施例】
【００８３】
実施例１  ＡＲＰ収量に影響するＲＮＡパラメーター
Ａ.  種々の細胞型におけるキャップなしヘルパーＲＮＡの使用
２９３Ｔ細胞
２９３Ｔ細胞を１０％ＦＢＳを伴うＤＭＥＭ培地中で成長させた。電気穿孔を、ＰＢＳ中の４.８×１０7細胞と以下の３種のＲＮＡ(各３０μｇ)(ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉ ＫＩＴ＃75142、Qiagen Corp., Valencia, CAを使って精製済み)：ＶＥＥキャプシドヘルパー、ＶＥＥ糖タンパク質ヘルパー、及びＶＥＥ・ＧＦＰレプリコンとを使用してＢＴＸ方形波電気穿孔器(Model 830; Genetronics, Inc., San Diego, CA)で、０.４ｃｍのギャップ・キュベット中で行った。ヘルパーＲＮＡを、転写反応液中のキャップ付き-Ｇヌクレオチドを加えて(キャップ有り)、又は加えることなく(キャップなし)in vitro転写により調製した。キャップアナログを含む反応において、ｒＧＴＰの濃度は、比例して減少した。４５０μ秒のパルス長での３６０Ｖでの４回のパルスが使用された。電気穿孔の後、細胞を２５ｍｌ培地を含むＴ７５フラスコ中へと蒔いた。ＡＲＰｓを該培地から収集し、そしてベロ細胞上でタイターを調べた。
【００８４】
ＣＨＯ細胞
ＣＨＯ細胞を１０％ＦＢＳを伴うＦ-１２培地上で成長させた。電気穿孔を、ＰＢＳ中の１.２×１０7細胞及び各々３０μｇの以下の３種のＲＮＡ：ＶＥＥキャプシド・ヘルパー、ＶＥＥ糖タンパク質ヘルパー、及びＶＥＥ・ＧＦＰレプリコンを使用して、ＢＴＸ方形波電気穿孔装置上で行った。４５０μ秒のパルス長での５８０Ｖでの４回のパルスが使用された。電気穿孔の後、細胞を２５ｍｌ培地を含むＴ７５フラスコ中へと蒔いた。ＡＲＰｓを該培地から収集し、そしてベロ細胞上でタイターを調べた。
【００８５】
ＤＦ-１(ニワトリ)
ＤＦ-１細胞を１０％ＦＢＳを伴うＤＭＥＭ培地上で成長させた。条件はＣＨＯ細胞について記載したとおりである。
【００８６】
ベロ
ベロ細胞を１０％ＦＢＳを伴うＥＭＥＭ培地中で成長させた。条件は、ＣＨＯ細胞について記載したとおりである。
結果を図１に載せ、指示された細胞型においてキャップなし対キャップありヘルパーＲＮＡを使用したときに得られたＩＦＵ/ｍｌを示した。
【００８７】
Ｂ.  ＡＲＰ収量に関するＲＮＡ精製とキャップの効果 
ＨＩＶ-ｇａｇをコードするレプリコン・ベクターＲＮＡ及びＶＥＥキャプシド及び糖タンパク質遺伝子をコードする２個のヘルパーＲＮＡを使用する実験において、in vitro転写反応を、プロメガ・コーポレーションから市販されるキット(Madison, WI; カタログ番号Ｐ１３００)を使用して行った。調製されたキャップ有りヘルパー及びレプリコンＲＮＡに対して、キャップ付き-Ｇを転写反応に加え、そしてｒＧＴＰ濃度を、別のｒＮＴＰに比較して１.４ｍＭ分低減した。キャップなしヘルパーＲＮＡを調製するために、４個のｒＮＴＰを等モル濃度で使用した。ＲＮＡ精製は、プロメガＳＶトータルＲＮＡアイソレーション・システム(Promega SV total RNA isolation System)(Promega Corp., Madison, WI;カタログ番号Z3100、シリカ・レジン)を使用し、そしてＲＮＡをＲＮＡｓｅ-フリー水中に溶出することにより達成した。例えばサイズ排除クロマトグラフィーなどのＲＮＡ精製の別の方法もまた適切であるが、キーパラメーターは、かなり純粋で、濃縮されたＲＮＡ溶液、つまり少なくとも０.５μｇ／μｌ、好ましくは少なくとも２〜３μｇ/μｌを作り出す方法を使用することである。分光光度計を使用して精製ＲＮＡの濃度を測定し、一方、既知のＲＮＡ量の一定量とともに１μｌの量をホルムアルデヒドゲル中で泳動することにより、未精製ＲＮＡの濃度を見積もった。
【００８８】
キャップあり又はキャップなしの各ヘルパーＲＮＡの等量、５又は３０μｇを、３０μｇのレプリコン・ベクターＲＮＡをコードするＨＩＶ-ｇａｇとともに、０.４ｃｍギャップ電気泳動キュベットを使用して(５８０Ｖ、２５μＦで4回のパルス)、８００μｌの終体積中の１.２×１０7ＶＥＲＯ細胞中へ電気穿孔した。電気穿孔の後に、細胞を２５ｍｌＨｙＱＭＥＭ+１０％ＦＢＳで満たしたＴ７５フラスコ中へ蒔き、そして一晩３７℃かつ５％ＣＯ2でインキュベーションした。ＡＲＰｓを２４時間で収集し、ろ過し、そしてベロ細胞上でタイターを調べた。結果を表1に載せる。
【００８９】
【表１】
2006509524.tif 000002
【００９０】
細胞への電気穿孔の前にＲＮＡ(ヘルパー及びベクター・レプリコンＲＮＡの両方とも)を精製することにより、ＡＲＰｓの収量が劇的に改良される(行１及び２と行３及び４とを、並びに行５及び６と行７及び８とを比較のこと)。さらに、精製ＲＮＡを使用すると、ヘルパーＲＮＡのキャップ付加は、高いＲＮＡ濃度では必要とれなかった(行１と行２、行３と行４、行５と行６、及び行７と８を比較のこと)。
【００９１】
ＰＳＭＡ(前立腺癌抗原)をコードする配列が挿入されるアルファウイルス・レプリコン・ベクターとともにキャップなしヘルパーＲＮＡを使用して、同様の結果を得た。
【００９２】
実施例２.  ＲＮＡ精製におけるキー・パラメーター
レプリコン及びヘルパーＲＮＡを、実施例１に記載するように調製した。電気穿孔では、３０μｇの各レプリコン及びヘルパーＲＮＡを、ＲＮａｓｅフリーのマイクロ遠心チューブ中で混合した。コントロールのチューブは、精製済み又は未精製のＲＮＡのみを有し、一方残りのチューブは、５×転写反応緩衝液[４００ｍＭ・ＨＥＰＥＳ-ＫＯＨ(ｐＨ７.５)；１２０ｍＭ・ＭｇＣｌ2；１０ｍＭスペルミジン；２００ｍＭ・ＤＴＴ]、ＮｏｔＩ制限酵素、Ｔ７酵素混合液(Ｔ７・ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ阻害剤、ピロホスファターゼ)、またはこれら３種の組み合わせをさらに入れられた。各転写反応要素の終濃度は、未精製ＲＮＡの等体積における終濃度とおおよそ同じであった。１.２×１０7ベロ細胞を各マイクロ遠心チューブに加え、そして混合液を０.４ｃｍギャップ電気穿孔キュベット中に移した。細胞を５８０Ｖかつ２５μＦｄｅ４回パルスをかけ、そして室温で１０分間回復させた。電気穿孔された細胞を１０％ウシ胎児血清及び抗体を伴う２５ｍｌ・ＨｙＱＭＥＭを含むＴ７５フラスコ中に蒔いた。電気穿孔効率の分析のため、一定量を９６ウェル・プレート中に蒔いた。
【００９３】
９６ウェルプレート中のベロ細胞を、ＭｅＯＨで固定し、そして免疫蛍光アッセイ(ＩＦＡ)によりレプリコン又はヘルパータンパク質の発現について分析した。精製済ＲＮＡからの効率は、三種のＲＮＡ全てについて９０％超であったが、一方、未精製ＲＮＡコントロールからの効率は５０％以下であった。精製ＲＮＡにＮｏｔＩ又はＴ７酵素混合液のみを加えることは、電気穿孔効率にほとんど影響を与えないか、全く影響を与えない。転写緩衝液のみ又は他の転写反応構成要素とあわせて添加することにより、電気穿孔効率は１０％以下に低減された。
【００９４】
培養培地を、Ｔ７フラスコから回収し、そしてろ過して細胞片を取り除いた。各電気穿孔からのＡＲＰ収量を、９６ウェル・プレート中のベロ細胞上でタイターを調べることにより測定した。表２に示されるように、未精製ＲＮＡを使用した際のＡＲＰ収量は、精製ＲＮＡを使用する際の収量と比較して２ログ分減少した。ＮｏｔＩ又はＴ７酵素混合液は、精製ＲＮＡのみに加えられるとき、ＡＲＰ収量に有意な影響を与えなかった。しかしながら、いずれかの組み合わせにおけるＴ７転写反応緩衝液を加えることにより、精製ＲＮＡと比較してＡＲＰ収量の４ログ以上の減少をもたらした。
【００９５】
これらの結果により、転写反応緩衝液の１以上の構成要素が、電気穿孔効率にそして最終的にＡＲＰ収量にマイナスの影響を持ちうるということが示された。Ｔ７転写緩衝液が、精製ＲＮＡに加えられるとき、Ｔ７転写緩衝液を含む未精製ＲＮＡに比較したＡＲＰ収量のかなりの低下により、効果が定量的であるということが示された。何故なら、緩衝液構成要素の濃度が、精製ＲＮＡサンプル中より高いからである。
【００９６】
【表２】
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【００９７】
実施例３  ＡＲＰ収量に関する電気穿孔条件の効果
電気穿孔するためのある細胞系列、例えば２９３Ｔ及びＣＥＦ細胞を電気穿孔する最初の実験において、電気穿孔混合液中の細胞濃度を増加し、一方入力核酸を同じ量に維持することにより、高いＡＲＰ収量が得られるということが観測された。
Ａ.  実験１
３０μｇレプリコンＲＮＡ(癌腫瘍抗原をコードする)、２６.８μｇＶＥＥキャプシドＲＮＡヘルパー、及び５５.６μｇＶＥＥ糖タンパク質ＲＮＡヘルパーを伴うＰＢＳ中で、０.４ｃｍギャップ・キュベット中に、ベロ細胞を指示された濃度に再懸濁した。電気穿孔に続いて、１.４×１０5細胞／ｃｍ2の成長領域の密度で、１ｃｍ2あたり約０.３ｍｌの成長培地で、必要に応じ細胞を１以上のフラスコ中に蒔いた。電気穿孔後２４時間において、培地を各フラスコから回収し、そして細胞単層を約１０ｍｌの無血清培地で洗浄した。この洗浄溶液を各フラスコから回収された培地中に加えた。各フラスコにおいて、１０分間０.５Ｍ・ＮａＣｌを使用することにより塩洗浄を行った。塩洗浄液を回収し、そして別々に分析した。指示された場合、２回目の塩洗浄を行い、そして別々に分析した。ＡＲＰ収量を一回のキュベット電気穿孔から得られた粒子の全数として、表３中に載せた。
【００９８】
【表３】
2006509524.tif 000004
【００９９】
こうして、細胞濃度の５倍の増加は、電気穿孔において使用されるＲＮＡ量を増やすことなくＡＲＰ収量の１０倍近い増加をもたらす。
【０１００】
Ｂ．  ＡＲＰｓのシングルＤＮＡヘルパーでのパッケージング
ベロ細胞を指示された細胞密度でInVitrus無血清培地中で懸濁した。３０μgのＶＥＥ・ＨＩＶ−ｇａｇレプリコンＲＮＡ、及びＣＭＶプロモーターの下でＶＥＥ構造タンパク質の全てを発現する１００〜１５０μｇのＶＥＥ・ＤＮＡヘルパーを使用して、細胞を電気穿孔した。ＤＮＡヘルパーを精製し、そして電気穿孔での使用前に少なくとも５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【０１０１】
電気穿孔後、細胞を室温で１０分間インキュベーションし、そして次に細胞を４ｍｌオプティプロ(OptiPro)へと移し、次にそれを各々１００ｍｌのオプティプロを含む２個のＴ３００フラスコへと分けた。該細胞を３７℃かつ５％ＣＯ2で一晩インキュベーションした。まず細胞から培地を吸引し、そして培地を０.２ミクロンのフィルターを通して滅菌容器に移すことにより、ＡＲＰｓを収集した。フラスコ中の細胞を、２０ｍＭ・ＮａＰｉ中の１０ｍｌの１Ｍ・ＮａＣｌ溶液、ｐＨ７.２〜７.４で室温で５分間洗浄した。塩洗浄液を使用されたフィルターへと移し、そして室温で５分間インキュベーションした。この塩洗浄液をフィルターに通して、きれいかつ培地から分離された容器に入れた。培地及び塩洗浄液を保存し、そして別々にタイターを調べた。表４において報告されるように全ＩＦＵは、塩洗浄液及び培地の合計を表し、一般的に、培地は、塩洗浄液に比較して取るに足らない数のＡＲＰを含んだ。同様の結果は、０.５Ｍ・ＮａＣｌの塩洗浄液を使用することにより得られた。
【０１０２】
Ｃ.  実験３
コーニング・セル・キューブ(Corning Cell Cube)(Corning, Inc., Acton, MA)を使用して、大量の細胞を育てた。１ｃｍのギャップ電気穿孔キュベットにおいて５×１０8ベロ細胞を使用して、一回の電気穿孔を行った。バイオ-ラド電気穿孔器(Gene Pulser II, BioRad Laboratories, Inc., Hercules, CA; カタログ番号165-2105)上で１１５０Ｖ、２５μＦで４回のパルスを使用して、各１５０μｇのＶＥＥレプリコン(ＨＩＶ-ｇａｐをコードする)、ＶＥＥキャプシド・ヘルパー、及びＶＥＥ糖タンパク質ヘルパーを細胞中へと電気穿孔した。電気穿孔後、細胞を１００ｍｌのオプティプロＳＦＭ(Invitrogen, Carlsbad, CA; カタログ番号12309019)を含む５Ｔ-３００フラスコ中へと蒔いた。電気穿孔後２４時間に、培地を核フラスコから回収し、そしてタイターを調べるために混合した。各フラスコにおいて２０ｍｌの１.０Ｍ・ＮａＣｌを使用して塩洗浄を各フラスコにおいて行い、そして塩洗浄液をタイターを調べるために混合した。培地中のＡＲＰの全収量は１×１０8ｉ.ｕ.であり；塩洗浄液中のＡＲＰの全収量は、２.２×１０11ｉ.ｕ.であった。
【０１０３】
実施例４.電気穿孔後の培養パラメーター
Ａ.  電気穿孔後の成長培地
ＡＲＰ生成の以前のレポートにおいて、電気穿孔後に１０％ＦＢＳを含む培地中に細胞を蒔いた。ＡＲＰ収量に関する血清の効果を試験するため、種々の濃度の血清を含む異なる培地中に細胞を蒔いた。電気穿孔後の最適な培地は、血清の使用を必要とせず、かつ低タンパク質濃度を有する。低濃度血清を有する培地並びに３種の無血清培地は、高い細胞密度における電気穿孔での使用を試験された。オプティプロ無血清培地(Gibco Cell Culture/Invitrogen, San Diego, CA); VP-SFM, VP無血清培地(Gibco Cell Culture/Invitrogen, San Diego, CA); Ex-Cell 505(JRH Biosciences, Lenexa, KS); 及びInVitrus化学的に規定された細胞培養培地(InVitrus chemically defined cell culture medium)(Cell Culture Technologies GmbH, Zurich, CH; カタログ番号ＩＶＴ)。これらの培地の全てはｐH７.０〜７.４に緩衝されたｐHを有する。ベロ細胞をヘルパー及びレプリコンＲＮＡで電気穿孔した。電気穿孔混合液を異なる培地を含む８個のＴ−７５フラスコに分配した。細胞を３７℃で１８〜２４時間培養した。ＡＲＰ収量の分析により、ＥＭＥＭ中の血清レベルが、ＡＲＰ収量の有意な低下をもたらさずに１０％から１％へと減少されうるということが明らかにされた。また、オプティプロ培地は、ＥＭＥＭ+１０％ＦＢＳと同等のＡＲＰ収量を与えた。オプティプロは、ヒト及び／又は動物タンパク質を含まず、いくつかの異なるＡＲＰｓについて、ＥＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを使用して得られる収量と同等のＡＲＰ収量を与える。電気穿孔後の成長及びＡＲＰ生成に有用である無血清培地は、いくつかの市販の培地を含む。
【０１０４】
Ｂ.  電気穿孔後の成長培地ｐＨの効果
ＡＲＰ収量に関する電気穿孔後の培地のｐＨの効果を試験した。ベロ細胞をペトリ皿電極装置中で電気穿孔し、そして一定分量を関心のｐＨに調節された完全成長培地中に蒔かれた。結果を図４に示した。
【０１０５】
Ｃ.  電気穿孔後の細胞成長のためのホロー・ファイバー・カートリッジ(Hollow Fiber Cartridge)
電気穿孔された細胞は、ポリスルホン・ファイバー、例えばファイバーセルHFカートリッジ(Fibercell Systems, Inc.; Frederick, MO;カタログ番号：4300-C2011)に素早く接着することが発見された。電気穿孔された細胞をホローファイバーに配置することにより、ホロー・ファイバーにおける細胞により生成されるＡＲＰｓを回収する利点を与える。ＡＲＰｓが溶出される終体積は、最低４０ｍｌ(１０9細胞まで保持することができる小さいカートリッジの使用)〜１００ｍｌ(５×１０10細胞まで保持することができる大きなカートリッジの使用)でありうる。
【０１０６】
【表４】
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【０１０７】
実施例５  ＡＲＰ収量に関するヘルパーＲＮＡ濃度の効果
１×１０8ベロ細胞を使用して、０.４ｃｍギャップ・キュベット中で電気穿孔を行った。各電気穿孔は、各３０μｇのＨＩＶ-ｇａｇ・ＶＥＥレプリコンＲＮＡ及びＶＥＥ糖タンパク質ヘルパーを含んだ。ＶＥＥキャプシド・ヘルパーの濃度は、指示されるように変化させた。以下の条件：５８０Ｖ、２５μＦで４回のパルス(パルスの長さ：約０.８ｍｓ)を使用してバイオ-ラド装置上で電気穿孔を行った。指示したように、細胞をＴ１７５フラスコ中の５０ｍｌ・ＥＭＥＭ+ＦＢＳ又はオプティプロに蒔いた。電気穿孔後２４時間において、各フラスコからの培地を収集し、そしてろ過した。５ｍｌの１Ｍ・ＮａＣｌを各フラスコに加え、そして接着細胞と５分間インキュベーションさせた。塩洗浄溶液を次に取り出し、そして以前に回収された培地に使用されたのと同じフィルターを通してろ過された。
【０１０８】
【表５】
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【０１０９】
実施例６  ＤＮＡヘルパー及び電気穿孔条件
典型的に、ＲＮＡヘルパーに使用される量及び条件に比較して、多くのＤＮＡ及びいくらか異なる電気穿孔条件は、ＤＮＡヘルパーをベロ細胞中へ効率的に電気穿孔をするために必要とされる。例えば、ＤＮＡヘルパーは、２５０Ｖ、９５０μＦ又は２５０Ｖ８００μＦで２〜３回のパルス(３０ｍ秒)を使用して電気穿孔される一方、ＲＮＡヘルパーは、５８０Ｖ２５μＦ(４回のパルス)を使用して電気穿孔される。
【０１１０】
ＲＮＡと同様に、ＤＮＡヘルパー(又はヘルパー(複数))は、電気穿孔前に望ましくは精製される。１×１０8ベロ細胞及び全てのＶＥＥ構造タンパク質をコードするシングルＤＮＡヘルパーを含む０.４ｃｍギャップ電気穿孔キュベット中において、異なる２個の電気穿孔装置を使用して電気穿孔を行った。第一機械は、指数関数的に減少する初期電圧パルスを提供する。１００又は１５０μｇのＤＮＡ(少なくとも５ｍｇ／ｍｌの濃度での精製された溶液由来)を使用し、有用な条件のセットは、２５０Ｖ、９５０μＦで一回のパルスであり、これは約２０〜３０μ秒のパルスを供給した。電気容量は、例えば８００μＦへと低減されうるし、そして２５０Ｖでの２〜３回のパルスは、おおよそ同じＡＲＰ収量を提供した。方形波の形態の電圧を供給する第二機械上では、３００Ｖでの２０〜５０ｍ秒のパルスが、第一機械と同様の結果を与える。この方法は、パルスの長さ、形、電圧、電気容量、及び数を変化することにより、全ての細胞型について最適化されうる。ベロ細胞は、典型的に４００Ｖ以上の２５ｍ秒のパルスを生き残ることができない。これらの条件は、ベクター・レプリコンを導入するために必要な条件より強い条件であるので、ＤＮＡヘルパーを使用して調製された粒子は、ＤＮＡについて最適化された条件で電気穿孔され、そしてベクターレプリコンＲＮＡは、これらの条件において効率的に細胞に入る。
【０１１１】
０.８ｍｌ中の１０8細胞は、３０μｇのＶＥＥ・ＨＩＶ-ｇａｇレプリコンＲＮＡとＣＭＶプロモーターの制御調節下でＶＥＥ構造タンパク質の全てを発現する１５０μｇのＶＥＥ・ＤＮＡヘルパーを使用して電気穿孔された。電気穿孔後、細胞を取り扱い、そしてＡＲＰｓを回収し、そして上で記載されたようにタイターを調べ、そして結果を以下の表に示した。
【０１１２】
【表６】
2006509524.tif 000007
【０１１３】
データーが上に載せられる実験において、ＤＮＡヘルパー調製品の不十分な純度は、比較的低い総収量の原因となると信じられているが、これらのデーターは、電気穿孔パラメーターの相対的な効果を記録するということが留意される。
【０１１４】
実施例７  ＡＲＰ生成のための細胞の同期化
電気穿孔効率に関する細胞周期Ｇ２／Ｍ期へ細胞を同期化する効果が試験された。細胞を植え付けた２時間後に、ＤＭＳＯ中の１μｇ／ｍｌのアフィジコリン(Sigma Chemical Co., St. Louis MO)で２０時間処理し、４時間回復させ、そして電気穿孔用に収集した(Golzio et al., (2002) Biochem. Biophys. Acta 1563:23-28)。(レプリコンＲＮＡと共に)ヘルパーＤＮＡ電気穿孔を本明細書中に記載されるように行った。処理過程を通して、細胞を成長及び細胞形態学について観察した。細胞の各群において、ＤＭＳＯ処理のコントロールを含むフラスコは、アフィジコリン／ＤＭＳＯ処理フラスコと共に行われた。試験又はコントロール・フラスコにおける処理の間、細胞の一般的な健康に関して、マイナスの効果は無かった。同期化プロトコルを開始する前の２時間のインキュベーションのうちにコンフルエントな状態を得ることは有利であるということが測定された。アフィジコリン処理の開始前に、９０〜１００％で細胞を敷き詰めることが最良である。何故なら更なる細胞分裂は、この処理により妨げられるからである。ベロ細胞を使用するとき、４.０×１０5細胞／ｃｍ2の密度は高すぎるということが分かり；細胞密度１.１×１０4細胞／ｃｍ2は、９０％の密集度を二時間のうちにもたらす。
【０１１５】
実施例８  前洗浄とＡＲＰ収量
電気穿孔された細胞によりＡＲＰが生成されたのち、細胞を細胞洗浄溶液で過度に洗浄して、ＡＲＰｓを収集する前に余分な物質を取り除いた。細胞洗浄液の選択は、この前洗浄ステップの間に放出されるＡＲＰｓの数に影響する。
【０１１６】
１×１０8ベロ細胞並びに各３０μｇづつのＶＥＥ・ＨＩＶ-ｇａｇレプリコンＲＮＡ、ＶＥＥキャプシド・ヘルパーＲＮＡ、及びＶＥＥ糖タンパク質ヘルパーＲＮＡを使用して、１回の電気穿孔を、０.４ｃｍギャップ・キュベット中で行った。細胞を８個のＴ-７５フラスコに等しく蒔き、各々のフラスコは、２５ｍｌ・オプティプロ培地を含んだ。２４時間後、培地を取り除き、細胞単層を６ｍｌの指示された細胞洗浄溶液で洗浄し、そして細胞を最終的に６ｍｌの(リン酸でｐＨ７.２に緩衝化された)１Ｍ・ＮａＣｌで洗浄した。培地、細胞洗浄液、塩洗浄液を、ＶＥＲＯ細胞上でタイターを調べることにより、ＡＲＰ収量について別々に分析した。結果は、図４において表される。
【０１１７】
実施例９  塩洗浄パラメーター
Ａ.  塩組成
５×１０8ベロ細胞、１５０μｇづつのＨＩＶ-ｇａｇ・ＶＥＥレプリコンＲＮＡ、ＶＥＥキャプシド・ヘルパーＲＮＡ、及びＶＥＥ糖タンパク質ヘルパーＲＮＡを使用して、１０ｍｍギャップ・キュベット中で電気穿孔を行った。１１５０Ｖ、２５μＦで４回のパルスを使用して電気穿孔を行った。電気穿孔された細胞を４０個のＴ-７５フラスコに均等に蒔いた。１のフラスコを１６時間で収集し、新たな培地で再び栄養を与え、そして電気穿孔後２４時間で収集した。他のフラスコを２４時間で収集した。培地を各フラスコから取り除き、そして５ｍｌの指示された塩溶液を各フラスコに加え、そして５分間インキュベーションした。塩洗浄溶液を次に取り出し、そしてタイターを調べた。これらの異なる洗浄溶液を使用して得られた結果を図５に示した。細胞から成長培地へと放出されたＡＲＰｓの量(タイターにより計測されるとき)は、ｐＨ７.０〜８.０の範囲内で穏やかに影響をうけた(図３を参照のこと)。
【０１１８】
Ｂ.  放出培地中の塩濃度
【表７】
2006509524.tif 000008
【０１１９】
実施例１０.  ＡＲＰ精製
ＡＲＰは、種々のレジンを使用してアフィニティークロマトグラフィーにより精製されうる。一般的に、溶出条件の範囲は、選んだレジンに左右され、ＡＲＰを約６以下のｐＨにかけないように気をつけながら使用されうる。レプリコンＲＮＡによりコードされる抗原は、通常ＡＲＰｓ中に含まれ；該抗原の性質は、精製の間のＡＲＰｓの行動に影響しうるということが知られている。当業者は、そうした影響の認識の仕方、そしてそれによるＡＲＰ精製方法の改変の仕方を知っている。
【０１２０】
Ａ.  ヘパリン・アフィニティー・クロマトグラフィー
塩洗浄溶液中のＡＲＰを、５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７.４で、塩化ナトリウムの含有量が０.１２Ｍ以下になるまで希釈した。溶液を次に、ヘパリン・セファロース・ファスト・フロー・レジン(Amersham, Pharmacia Biotech, Inc, Piscataway, NJ; カタログ番号17-0998-01）又はヘパリン・ハイパーＤ・Ｍ(Biosepra, Mariboro, MA)レジンを含むカラム上に、線速度１００ｃｍ/ｈｒ以下でロードした。例えば、ＶＥＥ3014ＡＲＰｓは、約０．３Ｍ、ｐＨ７．４の塩化ナトリウム濃度で溶出した。ＶＥＥ3014ＡＲＰｓを回収し、そして直接希釈又はダイアフィルトレーションにより処方した。該方法により精製されるＡＲＰの典型的収量は、７０％である。ステップ又は直線的塩勾配は、ＡＲＰｓを溶出するために使用されうる。
【０１２１】
血清及びベロ細胞からの多くの汚染は、ヘパリン・クロマトグラフィーステップにより低減され；そうした汚染の多くはレジンに結合しない。
【０１２２】
Ｂ.  硫酸セルフィン(Cellufine Sulfate)アフィニティー・クロマトグラフィー
塩洗浄溶液中のＡＲＰｓを、５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７.４で、塩化ナトリウム含有量が０.２５Ｍ以下になるまで希釈した。この溶液を次に、塩化ナトリウム含有量増加勾配における硫酸セルフィン・レジン(Millipore)を含むカラム中へとロードした。ｐＨ７.４、約０.７Ｍ塩化ナトリウム濃度で、ＡＲＰｓは溶出した。ＡＲＰｓを回収し、そして直接希釈又はダイアフィルトレーションにより処方した。この方法により精製されるＡＲＰｓの典型的な収量は、８５％である。
【０１２３】
Ｃ.  疎水性相互作用クロマトグラフィー
塩洗浄溶液中のＡＲＰｓを、５Ｍ・ＮａＣｌ/２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７.４で、終ＮａＣｌ濃度３Ｍまで希釈する。ＡＲＰｓを、線速度１００ｃｍ/ｈｒでトヨピール・フェニル(Toyopearl phenyl 650-Mレジンを含むカラム上にロードし、そして３Ｍ〜０Ｍ塩化ナトリウムの線勾配で溶出する。この方法によるＡＲＰｓ回収率は、約７７％である。
【０１２４】
Ｄ.  アニオン交換クロマトグラフィー
ＡＲＰｓを直接、又は適切な希釈の後に、アニオン交換レジン、例えばトヨピール・スーパーＱ(Toyopearl super Q)またはアマシャムＱセファロース(Amersham Q Sepharose)、又はアニオン交換膜、例えばムスタングＱ(Mustang Q)(Pall Trincor, Exton, PA)上にロードした。Ｑクロマトグラフィー物質は、該物質を通過する物質上の酸性基に結合する４級アミンに頼る。ロード条件は、ＡＲＰｓの多くの型への結合又は流出をもたらすように操作される。ここで結合性質は、アルファウイルス・レプリコン・ベクターによりコードされ、そしてＡＲＰｓが生成される細胞内で発現される関心のタンパク質の発現により影響される。特定の場合では、アニオン交換レジンは、一回の生成ステップで十分であり、血清タンパク質、宿主細胞タンパク質、及びＤＮＡの低減をもたらす。規定のレジン領域機能上のＡＲＰ結合性質は、選ばれたレジン、ＡＲＰ種、及びＡＲＰ標本を含む溶液のｐＨ及び塩濃度の関数である。
【０１２５】
例えば、マルバーグ・ムソーク(Marburg Musoke)タンパク質(糖タンパク質)が、関心の抗原をコードし、そしてＡＲＰコート・タンパク質がＶＥＥ３０１４コートタンパク質である場合、ＡＲＰｓは、塩洗浄方法を使用して収集される。塩洗浄物質(ＡＲＰ標本)を、ムスタングＱ膜上に直接ロードした。塩洗浄物質からのタンパク質は、膜を通過し、そして膜を０.５Ｍ・ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウムで洗浄して全てのＤＮＡを溶出した。次に段階的勾配を使用して、１.５Ｍ・ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウムでＡＲＰｓを溶出した。
【０１２６】
実施例１１  異なるキャプシド・ヘルパーの効果
アルファバックス(AlphaVax)ＷＣＢｐ１４６細胞を、ＰＢＳ中に１.６×１０8細胞/ｍｌへと再懸濁した。電気穿孔１〜４用に、レプリコンＲＮＡ(ヘルペスウイルスｇＤコード配列を有する)をＧ-キャップ付加し、そしてサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。電気穿孔１〜３用に、ヘルパーＲＮＡのキャップを外し、そしてＬｉＣｌ沈殿により精製した。電気穿孔４用に、ヘルパーＲＮＡのキャップを外し、そしてサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。７００μｌの細胞(１.１×１０8細胞)を、ＲＮＡと混合し、そして０.４ｃｍキュベット中で電気穿孔した(BioRad電気穿孔器、５８０V、２５μFｄ、４回のパルス)。細胞を、各々１００ｍｌオプティプロ培地を含む２個のＴ３００ｃｍ2フラスコ中に蒔いた。電気穿孔後約１８時間で、ＡＲＰｓを３０ｍｌの０.５Ｍ・ＮａＣｌ/１０ｍＭ・ＮａＰＯ4中において収集し、そして０.２μｍフィルターを通してろ過した。
【０１２７】
【表８】
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【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】図１は、異なる培養細胞型におけるキャップありヘルパーＲＮＡｓ(各ペアの左の棒)及びキャップなしＲＮＡｓ(各ペアの右の棒)を使用したＡＲＰｓの生成を示す。細胞をキャップありレプリコンＲＮＡ及びキャップなしヘルパーＲＮＡ分子で電気穿孔した。ＡＲＰｓを電気穿孔後２４時間の培養上清から収集し、そして新鮮なベロ細胞上でタイターを調べた。
【図２】図２は、ＡＲＰ生成についての電気穿孔後の成長培地の効果を示す。結果を、培養培地におけるタイター、ペレットにされた細胞を１Ｍ・ＮａＣｌ洗浄した際のタイター、及び全タイター(培地+洗浄)を示した。
【図３】図３は、ＡＲＰ生成についての成長培地の効果を示す。ベロ細胞をペトリ皿電極を使用して電気穿孔し、そして特定のｐＨ値に調節された完全成長培地で、フラスコ中へ接種した。
【図４】図４は、ＡＲＰｓを放出培地で溶出する直前に使用される異なる細胞洗浄溶液の効果を示し；詳細は、本明細書中の実施例７において記載する。
【図５】図５は、ＡＲＰ生成についての、放出培地における異なる塩組成を使用する効果を示す。種々の放出培地の濃度及びｐＨ値が示される。
【図６】図６は、放出培地におけるＮａＣｌの濃度の範囲を使用するＡＲＰｓの生成を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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