(57)【要約】本発明は、新規なビリンレダクターゼファミリーを特定する。本明細書でＨＹビリンレダクターゼと称される本発明の酵素は、ビリベルジンのフィトビリンへの変換およびホロフィトクロムまたはフィトフルアの会合を含む（ただしこれらに限定されない）多様な分野で有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
図５または図１０に示すアミノ酸コンセンサス配列を含み、さらにビリンレダクターゼ活性を有する単離されたＨＹ２ファミリーのビリンレダクターゼ。
【請求項２】
前記ビリンレダクターゼが、ｈｖｒｃｃｒまたはａｔｒｃｃｒ１ではない請求項１のビリンレダクターゼ。
【請求項３】
前記ビリンレダクターゼが、ｒｃｃｒ＿ｈｏｒｖｕまたはｒｃｃｒ＿ａｒａｔｈではない請求項１のビリンレダクターゼ。
【請求項４】
前記ビリンレダクターゼが、ｙｃｐ２＿ｓｙｎｐｙまたはｙｃｐ３＿ｓｙｎｐｙではない請求項１のビリンレダクターゼ。
【請求項５】
前記ビリンレダクターゼが、図１０に示すように少なくとも５０％の配列保存を含む請求項１のビリンレダクターゼ。
【請求項６】
前記ビリンレダクターゼが、図１０に示すように少なくとも７０％の配列保存を含む請求項１のビリンレダクターゼ。
【請求項７】
前記ビリンレダクターゼが、図１０に示すように少なくとも９０％の配列保存を含む請求項１のビリンレダクターゼ。
【請求項８】
前記ビリンレダクターゼが、図５に示すように少なくとも８０％の配列保存を含む請求項１のビリンレダクターゼ。
【請求項９】
前記ビリンレダクターゼが、図５に示すように少なくとも１００％の配列保存を含む請求項１のビリンレダクターゼ。
【請求項１０】
前記ビリンレダクターゼがＰｅｂＡである請求項１のビリンレダクターゼ。
【請求項１１】
前記ビリンレダクターゼがＰｅｂＢである請求項１のビリンレダクターゼ。
【請求項１２】
ＨＹ２＿ＡＲＡＴＨ、ＹＣＰ２＿ＳＹＮＰＹ、ＹＨＰ２＿ＰＲＯＭＡ、ＹＨＰ３＿ＰＲＯＭＡ、ＹＣＰ３＿ＳＹＮＰＹ、ＳＬＲ０１１６、ＰｃｙＡ＿ＡＮＡＳＰ、ＰｃｙＡ＿ＮＯＳＰＵ、ＰｃｙＡ＿ＳｙＮＹ３、ＰｃｙＡ＿ＳＹＮ８．１、ＰｃｙＡ＿ＰＲＯＭＥ、ＰｅｂＡ＿ＳＹＮＰＹ、ＰｅｂＡ＿ＳＹＮ８．１、ＰｅｂＡ＿ＰＲＯＭＡ、ＰｅｂＡ＿ＰＲＯＭＥ、ＰｅｗｂＢ＿ＮＯＳＰＵ、ＨＹ２＿ＡＲＡＴＨ、ＲＣＣＲ＿ＡＲＡＴＨおよびＲＣＣＲ＿ＨＯＲＶＵから成る群から選択される酵素と少なくとも１５％の配列同一性を有するフェレドキシン依存ビリンレダクターゼであって、さらにＨＹ２とアラインメントを実施したとき、１３７位、１５７位、１５８位、２５６位および３１４位に保存された疎水性残基を含む前記ビリンレダクターゼ。
【請求項１３】
前記ビリンレダクターゼが、ＨＹ２とアラインメントを実施したとき、Ｐｒｏ−１５１、Ｐｈｅ−２２１、Ｓｅｒ２２２およびＡＳＰ−１７１から成る群から選択される残基を含む請求項１２のビリンレダクターゼ。
【請求項１４】
前記ビリンレダクターゼが、ＨＹ２とアラインメントを実施したとき、Ｐｒｏ−１５１、Ｐｈｅ−２２１、Ｓｅｒ−２２２およびＡＳＰ−１７１を含む請求項１３のビリンレダクターゼ。
【請求項１５】
前記ビリンレダクターゼが、ｈｖｒｃｃｒまたはａｔｒｃｃｒ１ではない請求項１２のビリンレダクターゼ。
【請求項１６】
前記ビリンレダクターゼが、ｒｃｃｒ＿ｈｏｒｖｕまたはｒｃｃｒ＿ａｒａｔｈではない請求項１２のビリンレダクターゼ。
【請求項１７】
前記ビリンレダクターゼが、ｙｃｐ２＿ｓｙｎｐｙまたはｙｃｐ３＿ｓｙｎｐｙではない請求項１２のビリンレダクターゼ。
【請求項１８】
前記ビリンレダクターゼがＨＹ２ではない請求項１２のビリンレダクターゼ。
【請求項１９】
ビリンレダクターゼ活性を有し、さらに、ＨＹ２、ａｔｈｙ２、ｓｌｒ０１１６、ｃ３６２＿ａｎａｂ、ｙｃｐ２＿ｓｙｎｐｙ、ｙｃｐ３＿ｓｙｎｐｙ、ＰｃｙＡ＿ＡＮＡＳＰ、ＰｃｙＡ＿ＮＯＳＰＵ、ＰｃｙＡ＿ＳＹＮＹ３、ＰｃｙＡ＿ＳＹＮ８１、ＰｃｙＡ＿ＰＲＯＭＥ、ＰｅｂＡ＿ＳＹＮＰＹ、ＰｅｂＡ＿ＳＹＮ８１、ＰｅｂＡ＿ＰＲＯＭＡ、ＰｅｂＡ＿ＰＲＯＭＥ、ＰｅｂＡ＿ＮＯＳＰＵ、ＰｅｂＢ＿ＳＹＮＰＹ、ＰｅｂＢ＿ＳＹＮ８１、ＰｅｂＢ＿ＰＲＯＭＡ、ＰｅｂＢ＿ＰＲＯＭＥ、ＰｅｂＢ＿ＮＯＳＰＵ、ＨＹ２＿ＡＲＡＴＨ、ＲＣＣＲ＿ＡＲＡＴＨおよびＲＣＣＲ＿ＨＯＲＶＵから成る群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列またはその保存的置換を含む単離されたビリンレダクターゼ。
【請求項２０】
前記ビリンレダクターゼが、ａｔｈｙ２、ｓｌｒ０１１６、ｃ３６２＿ａｎａｂ、ｙｃｐ２＿ｓｙｎｐｙ、ｙｃｐ３＿ｓｙｎｐｙ、ＰｃｙＡ＿ＡＮＡＳＰ、ＰｃｙＡ＿ＮＯＳＰＵ、ＰｃｙＡ＿ＳＹＮＹ３、ＰｃｙＡ＿ＳＹＮ８１、ＰｃｙＡ＿ＰＲＯＭＥ、ＰｅｂＡ＿ＳＹＮＰＹ、ＰｅｂＡ＿ＳＹＮ８１、ＰｅｂＡ＿ＰＲＯＭＡ、ＰｅｂＡ＿ＰＲＯＭＥ、ＰｅｂＡ＿ＮＯＳＰＵ、ＰｅｂＢ＿ＳＹＮＰＹ、ＰｅｂＢ＿ＳＹＮ８１、ＰｅｂＢ＿ＰＲＯＭＡ、ＰｅｂＢ＿ＰＲＯＭＥ、ＰｅｂＢ＿ＮＯＳＰＵ、ＨＹ２＿ＡＲＡＴＨ、ＲＣＣＲ＿ＡＲＡＴＨおよびＲＣＣＲ＿ＨＯＲＶＵから成る群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列を含む請求項１９のビリンレダクターゼ。
【請求項２１】
請求項１のビリンレダクターゼをビリベルジンと接触させ、それによって前記ビリベルジンをフィトビリンに変換することを含む、ビリベルジンをフィトビリンに変換する方法。
【請求項２２】
前記ビリンレダクターゼがシアノバクテリアのビリンレダクターゼである請求項１９の方法。
【請求項２３】
前記ビリンレダクターゼが藻類のビリンレダクターゼである請求項１９の方法。
【請求項２４】
前記ビリンレダクターゼが植物のビリンレダクターゼである請求項１９の方法。
【請求項２５】
前記ビリンレダクターゼがリコンビナントによって発現される請求項２１の方法。
【請求項２６】
前記接触がｅｘ ｖｉｖｏで実施される請求項２１の方法。
【請求項２７】
前記接触が細胞内で実施され、さらに前記ビリンレダクターゼが異種ポリペプチドである請求項２１の方法。
【請求項２８】
さらに、前記フィトクロモビリンを第二のビリンレダクターゼと接触させてフィトクロムを生成することを含む請求項２１の方法。
【請求項２９】
さらに、前記フィトクロモビリンを第二のビリンレダクターゼと接触させてフィトフルアを生成することを含む請求項２１の方法。
【請求項３０】
前記第二のビリンレダクターゼがＰｅｂＢである請求項２９の方法。
【請求項３１】
前記ビリンレダクターゼがｙｃｐ２−ｓｎｐｙである請求項２１の方法。
【請求項３２】
前記ビリンレダクターゼがｙｃｐ３−ｓｎｐｙである請求項２９の方法。
【請求項３３】
請求項１から２０のいずれか記載のビリンレダクターゼをコードする核酸を含む核酸。
【請求項３４】
前記核酸がベクターである請求項３３の核酸。
【請求項３５】
請求項１から２０のいずれか記載のビリンレダクターゼをコードする核酸を含む異種核酸を含む細胞。
【請求項３６】
前記細胞が、藻類細胞、植物細胞、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞、および哺乳類細胞から成る群から選択される請求項３５の細胞。
【請求項３７】
請求項１から２０のいずれか記載の核酸とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズし、さらにビリンレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含む核酸であって、ｈｖｒｃｃｒまたはａｔｒｃｃｒポリペプチドをコードしない前記核酸。
【請求項３８】
前記核酸がベクターである請求項３７の核酸。
【請求項３９】
以下の工程を含むポリペプチドの発現を検出する方法：
アポフィトクロムをコードする核酸；および前記アポフィトクロムと会合してフィトフルアを生成するフィトビリンを生じるビリンレダクターゼをコードする核酸を含む細胞を提供する工程；さらに
前記フィトフルアによって生成される光学シグナルを検出する工程。
【請求項４０】
細胞内で、ヘムオキシゲナーゼ；アポフィトクロム；およびフェレドキシン依存ビリンレダクターゼを同時発現させ、それによって前記細胞が前記光活性ホロフィトクロムを産生し、さらに、ここで前記アポフィトクロムおよび前記フェレドキシン依存ビリンレダクターゼの１つまたは２つ以上が異種核酸によって発現されることを含む光活性ホロフィトクロムを生成する方法。
【請求項４１】
前記細胞が、藻類細胞、酵母細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、および哺乳類細胞から成る群から選択される請求項４０の方法。
【請求項４２】
前記フェレドキシン依存ビリンレダクターゼがＨＹ２ファミリーのビリンレダクターゼである請求項４０の方法。
【請求項４３】
前記アポフィトクロムおよび前記フェレドキシン依存ビリンレダクターゼが両方とも異種核酸によって発現される請求項４０の方法。
【請求項４４】
前記ヘムオキシゲナーゼが異種核酸によって発現される請求項４０の方法。
【請求項４５】
前記光活性ホロフィトクロムがフィトフルアではない請求項４０の方法。
【請求項４６】
前記フェレドキシン依存ビリンレダクターゼがＨＹ２ファミリーメンバーである請求項４５の方法。
【請求項４７】
前記フェレドキシン依存ビリンレダクターゼがＨＹ２である請求項４５の方法。
【請求項４８】
前記フェレドキシン依存ビリンレダクターゼがｐｃｙＡである請求項４５の方法。
【請求項４９】
前記光活性ホロフィトクロムがフィトフルアである請求項４０の方法。
【請求項５０】
前記アポフィトクロムが、前記フィトフルアで標識されるべきタンパク質との融合タンパク質として発現される請求項４９の方法。
【請求項５１】
前記方法が、フェレドキシン依存ビリンレダクターゼｐｅｂＡまたはｐｅｂＢを発現させることを含む請求項４９の方法。
【請求項５２】
前記方法が、フェレドキシン依存ビリンレダクターゼｐｅｂＡおよびｐｅｂＢの両方を発現させることを含む請求項５１の方法。
【請求項５３】
前記細胞が細菌細胞である請求項５１の方法。
【請求項５４】
前記方法が、さらに前記細胞から前記光活性ホロフィトクロムを回収することを含む請求項４０の方法。
【請求項５５】
ヘムオキシゲナーゼ；アポフィトクロム；およびフェレドキシン依存ビリンレダクターゼを含む細胞であって、前記細胞が光活性ホロフィトクロムを産生し、さらに、この場合前記アポフィトクロムおよび前記フェレドキシン依存ビリンレダクターゼの１つまたは２つ以上が異種核酸によって発現される前記細胞。
【請求項５６】
前記細胞が、藻類細胞、酵母細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、および哺乳類細胞から成る群から選択される請求項５５の細胞。
【請求項５７】
前記フェレドキシン依存ビリンレダクターゼがＨＹ２ファミリーのビリンレダクターゼである請求項５５の細胞。
【請求項５８】
前記アポフィトクロムおよび前記フェレドキシン依存ビリンレダクターゼが両方とも異種核酸によって発現される請求項５５の細胞。
【請求項５９】
前記ヘムオキシゲナーゼが内因性ヘムオキシゲナーゼである請求項５５の細胞。
【請求項６０】
前記ヘムオキシゲナーゼが異種核酸によって発現される請求項５５の細胞。
【請求項６１】
前記光活性ホロフィトクロムがフィトフルアではない請求項５５の細胞。
【請求項６２】
前記フェレドキシン依存ビリンレダクターゼがＨＹ２ファミリーメンバーである請求項６１の細胞。
【請求項６３】
前記フェレドキシン依存ビリンレダクターゼがＨＹ２である請求項６１の細胞。
【請求項６４】
前記フェレドキシン依存ビリンレダクターゼがｐｃｙＡである請求項６１の細胞。
【請求項６５】
前記光活性ホロフィトクロムがフィトフルアである請求項５５の細胞。
【請求項６６】
前記アポフィトクロムが、前記フィトフルアで標識されるべきタンパク質との融合タンパク質として発現される請求項６５の細胞。
【請求項６７】
前記細胞が、フェレドキシン依存ビリンレダクターゼｐｅｂＡまたはｐｅｂＢを発現することを含む請求項６５の細胞。
【請求項６８】
前記細胞が、フェレドキシン依存ビリンレダクターゼｐｅｂＡおよびｐｅｂＢの両方を発現することを含む請求項６７の細胞。
【請求項６９】
前記細胞が細菌細胞である請求項６７の細胞。
【請求項７０】
ヘムオキシドレダクターゼをコードする核酸およびフェレドキシン依存ビリンレダクターゼをコードする核酸を含むリコンビナント核酸であって、前記核酸が機能的ヘムオキシドレダクターゼおよび機能的ビリンレダクターゼを発現する前記リコンビナント核酸。
【請求項７１】
前記ヘムオキシドレダクターゼおよび前記ビリンレダクターゼが同じプロモータの制御下にある請求項７０の核酸。
【請求項７２】
前記プロモータが構成的プロモータである請求項７１の核酸。
【請求項７３】
前記プロモータが誘発性プロモータである請求項７１の核酸。
【請求項７４】
前記プロモータが組織特異的プロモータである請求項７１の核酸。
【請求項７５】
前記核酸が細胞内に存在する請求項７０の核酸。
【請求項７６】
前記細胞が、藻類細胞、細菌細胞、植物細胞、酵母細胞、哺乳類細胞および昆虫細胞から成る群から選択される請求項７５の核酸。
【請求項７７】
前記核酸が、ＨＯ１、ＨＹ２、ＰｃｙＡ、ＰｅｂＡ、およびＰｅｂＢから成る群から選択される遺伝子を含む請求項７５の核酸。
【請求項７８】
前記核酸がＨＯ１コード領域およびｐｃｙＡコード領域を含む請求項７７の核酸。
【請求項７９】
前記核酸がさらにｐｃｙＢを含む請求項７８の核酸。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互引用
本出願は、米国特許出願（２００１年５月２９日出願）（表題：ビリンレダクターゼＨＹ２ファミリー）および米国特許出願６０／２１０，２８６号（２０００年６月８日出願）に対して優先権を主張する（前記の特許文献は全て参照により本明細書に含まれる）。
国の研究開発支援により達成された発明についての権利に関する記述
本発明は、部分的には、グラント番号：９８−３５３０４−６４６０およびＡＭＤ−９８０１７６８（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）により政府の支援を受けて達成された。合衆国政府は本発明に関して一定の権利を有する。
【０００２】
本発明はフィトクロムの分野に関する。特に、本発明は、フィトクロモビリンシンターゼおよび光合成を行う原核細胞の同族群（ファミリー）関連酵素の発見に関する。前記は、ビリベルジンをフィトクロムおよびフィコビリタンパク質発色団前駆体（フィトクロモビリン、フィコシアノビリンおよびフィコエリスロビリン）に変換することができる。
【０００３】
【従来技術】
フィトクロムは、植物をそれらの主たる光環境に順応させるビリタンパク質光受容体の同族体（ファミリー）の１つを構成する（Ｋｅｎｄｒｉｃｋ ａｎｄ Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ （１９９４） Ｋｅｎｄｒｉｃｋ， Ｐｐ．８２８ ”Ｐｈｏｔｏｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ”， Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ： Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）。フィトクロムは、赤色光吸収Ｐｒ型と近赤外光吸収Ｐｆｒ型との間で効率的に光により相互変換（ｐｈｏｔｏｉｎｔｅｒｃｏｎｖｅｒｔ）する能力を有する。前記能力は、大型のアポタンパク質と直鎖状テトラピロール（ビリンまたはフィトビリン）の共有結合によって付与される特性である。シアノバクテリアから緑藻類および高等植物のフィトクロムは、良好に保存されたＮ末端ポリペプチド（長さはざっと３９０から６００アミノ酸）（米国特許６，０４６，０１４号参照）にフィトビリン補欠分子団、例えばフィトクロモビリン（ＰΦＢ）またはフィトシアノビリン（ＰＣＢ）が結合したものから成る。
【０００４】
フィトビリンは、植物、藻類、およびシアノバクテリアによって合成される直鎖状テトラピロール分子である。前記分子は、集光フィコビリタンパク質および光受容体フィトクロムの発色団の直接の前駆体として機能する（Ｂｅａｌｅ （１９９３） Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９３：７８５−８０２； Ｈｕｇｈｅｓ ａｎｄ Ｌａｍｐａｒｔｅｒ （１９９９） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １２１：１０５９−１０６８）。フィトビリン生合成経路は、植物および藻類の生化学的分画化によって、外因性仮定的中間体による遮断工程を克服することによって、さらに直鎖状テトラピロール欠損変異体の分析によって解明された（Ｂｅａｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｊｏ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２３２８−２２３３２； Ｂｅａｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｊｏ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２３３３−２２３４０； Ｂｅａｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｊｏ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２３４１−２２３４５； Ｔｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３０６：１−１５）。これらの研究によって、フィトビリンの生合成は、ヘムおよびクロロフィル生合成経路とプロトポルフィリンＩＸの段階まで共通の中間体を共有し、この時点で後者の２つの経路は鉄またはマグネシウムによるメタル化によって分岐することが示された（Ｂｅａｌｅ （１９９３） Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９３：７８５−８０２）。フィトビリンはヘムから派生する。前記は、フィトビリンの生合成で引き渡される最初の中間体であるビリベルジンＩＸａ（ＢＶ）に変換される。紅藻類、シアノバクテリアおよび植物では、この相互変換は、哺乳類のヘムオキシゲナーゼと連続的な関係を有するフェレドキシン依存ヘムオキシゲナーゼによって達成される（Ｃｏｒｎｅｊｏ ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｐｌａｎｔ Ｊ． １５：９９−１０７； Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ９６：６５４１−６５４６； Ｍｕｒａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １１：３３５−３４７）。それらは同じ反応を触媒するが、哺乳類のヘムオキシゲナーゼはＮＡＤＰＨ依存チトクロームＰ４５０レダクターゼを利用し、ヘムの異化作用のための還元力を生じる（Ｍａｉｎｅｓ （１９８８） ＦＡＳＥＢ Ｊ． ２：２５５７−２５６８）。
【０００５】
ＢＶの代謝の結果は哺乳類、シアノバクテリアおよび植物で異なり、ＢＶは固有の二重結合特異性をもつ異なるレダクターゼによって代謝される（図１）。Ｃ１０メチン架橋でＢＶの二電子還元を触媒してビリルビンＩＸａ（ＢＲ）を生じる哺乳類のビリベルジンＩＸａレダクターゼ（ＢＶＲ）（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存酵素）は、これらの酵素で最初に発見されたものであった（Ｍａｉｎｅｓ ａｎｄ Ｔｒａｋｓｈｅｌ （１９９３） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３００：３２０−３２６）。遺伝子ｂｖｄＲによってコードされる同様な酵素がシアノバクテリアで特定された（Ｓｃｈｌｕｃｈｔｅｒ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１３５６２−１３５６９）。シアノバクテリアおよび紅藻類もまた、それらのフィコビリタンパク質直鎖状テトラピロール前駆体合成のためのフェレドキシン依存ビリンレダクターゼを有する（Ｂｅａｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｊｏ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２３２８−２２３３２； Ｂｅａｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｊｏ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２３３３−２２３４０； Ｂｅａｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｊｏ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２３４１−２２３５； Ｃｏｒｎｅｊｏ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｌａｎｔ Ｊ． １５：９９−１０７）。主として、紅藻類、シアニジウム＝カルダリウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ ｃａｌｄａｒｉｕｍ）に関する研究を基に、前記の研究者らは、これら２つの主要なフィコビリタンパク質の発色団前駆体、フィコエリスロビリン（ＰＥＢ）およびフィコシアノビリン（ＰＣＢ）の生合成は、２つのフェレドキシン依存ビリンレダクターゼおよびいくつかの二重結合イソメラーゼを利用すると提唱した。最初のビリンレダクターゼは、Ｃ１５メチン架橋でＢＶの二電子還元を触媒してＢＲ異性体１５，１６−ジヒドロビリベルジン（ＤＨＢＶ）を生成し、一方、二番目のビリンレダクターゼは、１５，１６−ＤＨＢＶの３Ｚ−ＰＥＢへの変換（Ｃ２およびＣ３ジエン系の正式な二電子還元）を触媒する。Ｃ．カルダリウムでは、さらに別の酵素が３Ｚ−ＰＥＢから３Ｚ−ＰＣＢへの異性化を仲介する（３Ｚ−ＰＥＢおよび３Ｚ−ＰＣＢは両者とも、発生期フィコビリタンパク質のアポタンパク質との会合前にそれらの対応する３Ｅ異性体に異性化されるようである）（Ｂｅａｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｊｏ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２３２８−２２３３２； Ｂｅａｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｊｏ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２３３３−２２３４０； Ｂｅａｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｊｏ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２３４１−２２３５）。
【０００６】
より最近の研究の多くは、シアノバクテリアのＰＣＢおよびＰＥＢ合成の同様な経路に対して支持を与えている（Ｃｏｒｎｅｊｏ ａｎｄ Ｂｅａｌｅ （１９９７） Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈ． Ｒｅｓ． ５１：２２３−２３０）。哺乳類およびフィコビリタンパク質含有生物とは対照的に、植物および緑藻類は、フェレドキシン非依存酵素ＰΦＢシンターゼによってＢＶを３Ｚ−ＰＦＢに還元する（前記酵素は２，３，３１，３２−ジエン系を還元のための標的とする）（Ｔｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．（ １９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：１１１１１−１１１１８； Ｗｏｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２５７００−２５７０５）。植物では、３Ｚ−ＰＦＢはその３Ｅ異性体に異性化されるが、前記異性体はフィトクロム発色団の直前の前駆体のようである（上掲書）。緑藻類、メゾテニウム＝カルダリオルム（Ｍｅｓｏｔａｅｎｉｕｍ ｃａｌｄａｒｉｏｒｕｍ）は、ＰＦＢの１８−ビニル基の還元を触媒して３Ｚ−ＰＣＢを生じる第二のビリンレダクターゼ活性を有する（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２５７００−２５７０５）。これらの研究によってもまた、３Ｅ−ＰＣＢは、前記生物で天然のフィトクロム発色団の前駆体であることが明らかになった。
植物、藻類およびシアノバクテリアにおけるフィトビリン生合成経路の豊富な生化学的分析にもかかわらず、ビリンレダクターゼの発現レベルの低さによって、これらの酵素をクローニングしようとする努力はこれまで妨げられてきた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ビリンレダクターゼファミリー（本明細書ではＨＹ２ファミリーと称する）の単離および性状決定に関する。これらビリンレダクターゼはビリベルジンのフィトビリンへの変換を触媒し、フィトクロム生合成経路の成分を生成することができる。本発明のビリンレダクターゼは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで用いて、ビリベルジンを単純にフィトビリンに変換するか、またはフィトクロム合成経路の他の酵素と組み合わせて完全なフィトクロムおよび／またはフィトフルア（ｐｈｙｔｏｆｌｕｏｒ）を合成することができる。
【０００８】
実施態様の１つでは、本発明は、図５または図１０に示すアミノ酸コンセンサス配列を含み、ビリンレダクターゼ活性を有する、単離されたＨＹ２ファミリーに属するビリンレダクターゼを提供する。或る実施態様では、前記ビリンレダクターゼは、図１０に示すように少なくとも５０％の配列保存，好ましくは少なくとも７０％の配列保存、もっとも好ましくは少なくとも９０％の配列保存を含み、および／または図５に示すように少なくとも８０％の配列保存、より好ましくは少なくとも１００％の配列保存を含む。
【０００９】
別の実施態様では、本発明はフェレドキシン依存ビリンレダクターゼを提供し、前記は、ＨＹ２＿ＡＲＡＴＨ、ＹＣＰ２＿ＳＹＮＰＹ、ＹＨＰ２＿ＰＲＯＭＡ、ＹＨＰ３＿ＰＲＯＭＡ、ＹＣＰ３＿ＳＹＮＰＹ、ＳＬＲ０１１６、ＰｃｙＡ＿ＡＮＡＳＰ、ＰｃｙＡ＿ＮＯＳＰＵ、ＰｃｙＡ＿ＳｙＮＹ３、ＰｃｙＡ＿ＳＹＮ８．１、ＰｃｙＡ＿ＰＲＯＭＥ、ＰｅｂＡ＿ＳＹＮＰＹ、ＰｅｂＡ＿ＳＹＮ８．１、ＰｅｂＡ＿ＰＲＯＭＡ、ＰｅｂＡ＿ＰＲＯＭＥ、ＰｅｗｂＢ＿ＮＯＳＰＵ、ＨＹ２＿ＡＲＡＴＨ、ＲＣＣＲ＿ＡＲＡＴＨおよびＲＣＣＲ＿ＨＯＲＶＵから成る群から選択される酵素と少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、およびもっとも好ましくは少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％配列同一性を有し、さらに、ＨＹ２とアラインメントを実施したとき、１３７位、１５７位、１５８位、２５６位および３１４位に保存された疎水性残基を含む。好ましい実施態様では、前記ビリンレダクターゼは、ＨＹ２とアラインメントを実施したとき、Ｐｒｏ−１５１、Ｐｈｅ−２２１、Ｓｅｒ−２２２およびＡＳＰ−１７１から成る群から選択される残基を含み、より好ましくは、ＨＹ２とアラインメントを実施したときＰｒｏ−１５１、Ｐｈｅ−２２１、Ｓｅｒ−２２２およびＡＳＰ−１７１を含む。
或る実施態様では、本発明のＨＹ２ビリンレダクターゼ（ＨＹ２ファミリーメンバー）から以下の１つまたは２つ以上が除外（条件排除）される：ｈｙｒｃｃｒ、ａｔｒｃｃｒ、ｒｃｃｒ＿ｈｏｒｖｕ、ｒｃｃｒ＿ａｒａｔｈ、ｙｃｐ２＿ｓｙｎｐｙ、ｙｃｐ３＿ｓｙｎｐｙおよびＨＹ２。
【００１０】
さらに別の実施態様では、本発明は、ビリンレダクターゼ活性を有し、さらに以下から成る群から選択されるポリペプチドアミノ酸配列またはその保存的置換を含む単離されたビリンレダクターゼを提供する：ＨＹ２、ａｔｈｙ２、ｓｌｒ０１１６、ｃ３６２＿ａｎａｂ、ｙｃｐ２＿ｓｙｎｐｙ、ｙｃｐ３＿ｓｙｎｐｙ、ＰｃｙＡ＿ＡＮＡＳＰ、ＰｃｙＡ＿ＮＯＳＰＵ、ＰｃｙＡ＿ＳＹＮＹ３、ＰｃｙＡ＿ＳＹＮ８１、ＰｃｙＡ＿ＰＲＯＭＥ、ＰｅｂＡ＿ＳＹＮＰＹ、ＰｅｂＡ＿ＳＹＮ８１、ＰｅｂＡ＿ＰＲＯＭＡ、ＰｅｂＡ＿ＰＲＯＭＥ、ＰｅｂＡ＿ＮＯＳＰＵ、ＰｅｂＢ＿ＳＹＮＰＹ、ＰｅｂＢ＿ＳＹＮ８１、ＰｅｂＢ＿ＰＲＯＭＡ、ＰｅｂＢ＿ＰＲＯＭＥ、ＰｅｂＢ＿ＮＯＳＰＵ、ＨＹ２＿ＡＲＡＴＨ、ＲＣＣＲ＿ＡＲＡＴＨおよびＲＣＣＲ＿ＨＯＲＶＵ。好ましい実施態様では、前記ビリンレダクターゼは以下から成る群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列を含む：ａｔｈｙ２、ｓｌｒ０１１６、ｃ３６２＿ａｎａｂ、ｙｃｐ２＿ｓｙｎｐｙ、ｙｃｐ３＿ｓｙｎｐｙ、ＰｃｙＡ＿ＡＮＡＳＰ、ＰｃｙＡ＿ＮＯＳＰＵ、ＰｃｙＡ＿ＳＹＮＹ３、ＰｃｙＡ＿ＳＹＮ８１、ＰｃｙＡ＿ＰＲＯＭＥ、ＰｅｂＡ＿ＳＹＮＰＹ、ＰｅｂＡ＿ＳＹＮ８１、ＰｅｂＡ＿ＰＲＯＭＡ、ＰｅｂＡ＿ＰＲＯＭＥ、ＰｅｂＡ＿ＮＯＳＰＵ、ＰｅｂＢ＿ＳＹＮＰＹ、ＰｅｂＢ＿ＳＹＮ８１、ＰｅｂＢ＿ＰＲＯＭＡ、ＰｅｂＢ＿ＰＲＯＭＥ、ＰｅｂＢ＿ＮＯＳＰＵ、ＨＹ２＿ＡＲＡＴＨ、ＲＣＣＲ＿ＡＲＡＴＨおよびＲＣＣＲ＿ＨＯＲＶＵ。
【００１１】
本発明はまたビリベルジンをフィトビリンに変換する方法を提供する。本方法は、本発明のビリンレダクターゼ（例えばＨＹ２ファミリーのビリンレダクターゼ）をビリベルジンと接触させ、それによって前記ビリベルジンがフィトビリンに変換されることを含む。或る実施態様では、前記ビリンレダクターゼはシアノバクテリアのビリンレダクターゼ、および／または藻類のビリンレダクターゼ、および／または植物のビリンレダクターゼである。前記ビリンレダクターゼはリコンビナントによって発現されたビリンレダクターゼであってもよい。前記接触は、ｉｎ ｖｉｖｏでもｅｘ ｖｉｖｏでもよい。或る実施態様では、前記接触は細胞内であり、ビリンレダクターゼは異種ポリペプチドである。本方法はさらに、フィトクロモビリンを第二のビリンレダクターゼと接触させてフィトクロムを生成することを含むことができる。或る実施態様では、本方法は、さらにフィトクロモビリンを第二のビリンレダクターゼ（例えばＰｅｂＢ）と接触させてフィトフルアを生成することを含む。或る実施態様では、前記ビリンレダクターゼはｙｃｐ２−ｓｎｐｙおよび／またはｙｃｐ３−ｓｎｐｙである。
【００１２】
本発明はまた、本明細書に記載するビリンレダクターゼ（例えばＨＹ２ファミリーメンバー）をコードする単離された核酸を提供する。
さらにまた、本明細書に記載するビリンレダクターゼ（例えばＨＹ２ファミリーメンバー）をコードする核酸を含む異種核酸を含む細胞が提供される。好ましい細胞には、藻類細胞、植物細胞、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
さらに別の実施態様では、本発明は、本明細書に記載するビリンレダクターゼのいずれかをコードする核酸とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズし、さらにビリンレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を提供する。或る実施態様では、前記核酸から以下の１つまたは２つ以上をコードする核酸は除外（条件排除）される：ｈｖｒｃｃｒ、ａｔｒｃｃｒ、ｒｃｃｒ＿ｈｏｒｖｕ、ｒｃｃｒ＿ａｒａｔｈ、ｙｃｐ２＿ｓｙｎｐｙ、ｙｃｐ３＿ｓｙｎｐｙ、およびＨＹ２。好ましい核酸はベクター（例えばプラスミド、コスミドなど）である。
【００１３】
なお別の実施態様では、本発明は、ポリペプチドの発現を検出する方法を提供する。本方法は、アポフィトクロムをコードする核酸、およびフィトビリン（前記アポフィトクロムと会合してホロフィトクロムまたはフィトフルアを生じる）を生じるビリンレダクターゼをコードする核酸を含む細胞を提供し、さらに前記ホロフィトクロムまたはフィトフルアによって生成される光学シグナルを検出することを含む。
【００１４】
本発明はまた、光活性（ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖｅ）ホロフィトクロムを生成する方法を提供する。本方法は、ヘムオキシゲナーゼ、アポフィトクロムおよびフェレドキシン依存ビリンレダクターゼを１つの細胞（例えば藻類細胞、酵母細胞、細菌細胞、植物細胞、哺乳類細胞）内で同時発現させ、それによって細胞が光活性ホロフィトクロムを産生し、さらにこの場合、１つまたは２つ以上のアポフィトクロムおよびフェレドキシン依存ビリンレダクターゼが異種核酸によって発現されることを含む。好ましい実施態様では、フェレドキシン依存ビリンレダクターゼはＨＹ２ファミリーのビリンレダクターゼ（例えばＨＹ２、ｐｃｙＡなど）である。好ましい実施態様では、アポフィトクロムおよびフェレドキシン依存ビリンレダクターゼは両方とも異種核酸によって発現される。或る実施態様では、ヘムオキシゲナーゼは異種核酸によって発現される。特に好ましい或る実施態様では、光活性ホロフィトクロムはフィトフルアではなく、一方、他の実施態様では、光活性ホロフィトクロムはフィトフルアである。アポフィトクロムは、フィトフルアまたはホロフィトクロムで標識されるべきタンパク質との融合タンパク質として発現させることができる。或る好ましい実施態様では、本方法は、フェレドキシン依存ビリンレダクターゼｐｅｂＡおよび／またはｐｅｂＢを発現させることを含む。特に好ましい実施態様では、細胞は細菌細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌））である。本方法はさらに、光活性ホロフィトクロムまたはフィトフルアを前記細胞から回収することを含むことができる。
【００１５】
別の実施態様では、本発明は、ヘムオキシゲナーゼ、アポフィトクロムおよびフェレドキシン依存ビリンレダクターゼを含む細胞（例えば藻類細胞、酵母細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞）を提供し、それによって、細胞は光活性ホロフィトクロムを産生し、さらにこの場合アポフィトクロムおよびフェレドキシン依存ビリンレダクターゼの１つまたは２つ以上は異種核酸によって発現される。前記フェレドキシン依存ビリンレダクターゼは、好ましくはＨＹ２ファミリーのビリンレダクターゼ（例えばＨＹ２、ｐｃｙＡなど）である。或る実施態様では、アポフィトクロムおよびフェレドキシン依存ビリンレダクターゼは両方とも異種核酸によって発現される。それらは、両方とも同じ異種核酸によって発現されてあってもよい。或る細胞では、ヘムオキシゲナーゼは内因性ヘムオキシゲナーゼである。他の細胞では、ヘムオキシゲナーゼは異種核酸によって発現される。或る実施態様では、前記発現されたホロフィトクロムはフィトフルアではなく、他の実施態様ではフィトフルアである。或る好ましい細胞はｐｅｂＡおよび／またはｐｅｂＢを発現する。好ましい細胞の１つは細菌細胞（例えば大腸菌）である。
【００１６】
本発明はまた、ヘムオキシドレダクターゼをコードする核酸およびフェレドキシン依存ビリンレダクターゼをコードする核酸を含む単離された核酸を提供し、この場合、前記核酸は機能的なヘムオキシドレダクターゼおよび機能的なビリンレダクターゼを発現する。前記ヘムオキシドレダクターゼおよびビリンレダクターゼは同じプロモータのコントロール下にあっても、または異なるプロモータのコントロール下にあってもよい。前記プロモータは構成的プロモータ、誘発性プロモータまたは組織特異的プロモータを含むことができる。前記核酸は細胞（例えば細菌細胞、植物細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞など）内に存在することができる。好ましい核酸は、ＨＯ１、ＨＹ２、ＰｃｙＡ、ＰｅｂＡ、およびＰｅｂＢから成る群から選択される１つまたは２つ以上の遺伝子を含む。好ましい核酸の１つは、ＨＯ１コード領域および／またはｐｃｙＡコード領域および／またはｐｃｙＢを含む。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
定義
“蛍光性アダクツ”という用語は、“ビリン”成分に結合した“アポタンパク質”（アポフィトクロムとも称される）成分（前記両成分は下記で説明する）を含む蛍光性分子（すなわち、１つの波長をもつ光を吸収し、第二の波長をもつ光を放出することができる分子）を指す。前記蛍光性フィトクロム−ビリン結合物質（例えばフィトクロム−ＰＥＢアダクツ）はまた、本明細書では“フィトフルア”（ｐｈｙｔｏｆｌｕｏｒ）とも称される。前記二成分が結合してアダクツを形成する態様は本発明とは無関係である。典型的には、前記２つの成分は共有結合的相互作用を介して偶発的にアダクツを形成する。前記成分はまた、共有結合により意図的に（例えば架橋剤を使用して）連結されてもよい。本発明の蛍光性アダクツはその対応する天然のビリンとアポタンパク質との対合形成を必要としない。対照的に、本発明は、種々の生物に由来するビリン、または天然に存在しない合成された直鎖状オリゴピロールまたはオリゴピロール類似体を含む天然に存在するアポタンパク質または遺伝子工学的に操作したアポタンパク質から成るアダクツを包含する。
【００１８】
本明細書で用いられる“アポタンパク質”、“アポフィトクロム”または“アポタンパク質ポリペプチド”という用語は、真核生物（例えば維管束植物、非維管束植物および藻類）または原核生物（例えばシアノバクテリアおよび原核緑色植物）に由来するポリペプチドを指す。前記用語は、天然に存在するアポタンパク質および変種のポリペプチド（例えば突然変異を介して派生したもの）の両方を含む。アポタンパク質は、ビリン成分とともにアダクツを形成することができる疎水性ポケット（発色団結合部位と称される）を有する。本発明のアポタンパク質は、典型的には長さが約１１００アミノ酸のホモダイマータンパク質で、各サブユニットは２つの主要なドメインで構成される。球状の７０ｋＤのＮ末端ドメインは前記疎水性ポケットを含み、一方、より細長い５５ｋＤのカルボキシル末端のドメインは、２つのサブユニットが結合する部位を含む。好ましい類似体は、米国特許６，０４６，０１４号の図６のコンセンサス配列によって識別されしたがってこれを含む。前記アポタンパク質は、維管束植物および非維管束植物、緑藻類または細菌に由来するものでもよく、リコンビナントにより発現させても、または化学的にｄｅ ｎｏｖｏで合成してもよい。
【００１９】
好ましいアポタンパク質は、植物遺伝子、藻類遺伝子、細菌遺伝子またはシアノバクテリア遺伝子によってコードされる。特に好ましいアポタンパク質には、本明細書もしくは米国特許６，０４６，０１４号に記載されたアポタンパク質の一切、または米国特許６，０４６，０１４号の配列リストに挙げたものもしくはこれら配列の保存的置換が含まれる。もっとも好ましいアポタンパク質には、植物（約１１００アミノ酸残基を有するアポタンパク質を含むエンバク）、緑藻類（例えばメゾテニウム＝カルダリオルム（Ｍｅｓｏｔａｅｎｉｕｍ ｃａｌｄａｒｉｏｒｕｍ））、またはシアノバクテリア（米国特許６，０４６，０１４号に示したもの）由来のアポタンパク質、または保存的置換を含む関連するタンパク質が含まれる。
【００２０】
発色団ドメインから成る切端形アポタンパク質、リアーゼ活性のために十分なアポタンパク質のＮ末端サブ配列が特に好ましい。好ましいＮ末端サブ配列の１つは、約６００未満のＮ末端アミノ酸、より好ましくは約５１５未満のＮ末端アミノ酸、もっとも好ましくは約４００未満のＮ末端アミノ酸から成る。アポフィトクロムは、問題のポリペプチド配列を米国特許６，０４６，０１４号の図６に提示されたアポフィトクロムのコンセンサス配列と標準的な配列比較方法を用いて比較することによって当業者には容易に識別することができる。アポタンパク質の構造および機能に関する一般的な考察については以下を参照されたい：Ｑｕａｉｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ， ２０：６５７−６６５。
【００２１】
本発明のアダクツの“ビリン”成分は、アポタンパク質と結合したとき、蛍光を発することができるか、または分光光度法的に異なる形態間で光により相互変換することができる直鎖状のポリピロール（例えばジ、トリまたはテトラピロール）である。典型的には、本発明のビリン成分は維管束植物、藻類、またはシアノバクテリアから標準的な技術にしたがって単離される。前記ビリン成分はまたｄｅ ｎｏｖｏで合成することができる。本発明で有用なビリンの一般的な考察については以下を参照されたい：Ｆａｌｋ （１９８９） Ｐｐ．３５５−３９９， ”Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｌｉｎｅａｒ Ｏｌｉｇｏｐｙｒｒｏｌｅｓ ａｎｄ Ｂｉｌｅ Ｐｉｇｍｅｎｔｓ”， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｖｉｅｎｎａ。
【００２２】
“発色団ドメイン”または“最小発色団ドメイン”という用語は、リアーゼ活性（ビリンの存在下で偶発的に会合してフィトフルアを形成する能力）のために十分なアポタンパク質のＮ末端のサブ配列を指す。発色団ドメインは、典型的にはアポタンパク質のＮ末端の約６００未満のアミノ酸、好ましくは約５１５未満のアミノ酸、より好ましくは約４５０未満のアミノ酸、もっとも好ましくは約４００、３９０、３５０未満または“ビリンリアーゼドメイン”として知られる１９７個のＮ末端アミノ酸を含む（例えば以下を参照されたい：Ｗｕ ａｎｄ Ｌａｇａｒｉａｓ （２０００） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：１３４８７−１３４９５）。好ましい発色団ドメインの１つは、シアノバクテリアのフィトクロムの５１４個のＮ末端アミノ酸を含む。
【００２３】
“ポリペプチド”、“ペプチド”および“タンパク質”は本明細書では相互に用いられ、アミノ酸残基ポリマーを指す。前記用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーと同様に、その中の１つまたは２つ以上のアミノ酸残基が対応する天然のアミノ酸の人工的化学類似体であるアミノ酸ポリマーにも用いられる。前記用語はまた、ポリペプチドを構成するアミノ酸を結合させる通常のペプチド結合による変種を含む。
【００２４】
“核酸”または“オリゴヌクレオチド”という用語は、共有結合によって共に連結された少なくとも２つのヌクレオチドを指す。本発明の核酸は、好ましくは一本鎖または二本鎖で、一般にホスホジエステル結合を含むが、いくつかの事例では下記に概略するように、例えば以下を含むまた別の骨格を有する核酸類似体が含まれる：ホスホロアミド（Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９（１０）：１９２５およびその中の引用文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ （１９７０） Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ３５：３８００；Ｓｐｒｉｎｚｌ ｅｔ ａｌ．（１９７７） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ８１：５７９；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８６） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：３４８７；Ｓａｗａｉ ｅｔ ａｌ．（１９８４） Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ８０５；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１０：４４７０；Ｐａｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６） Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃｒｉｐｔａ ２６：１４１９）、ホスホロチオエート（Ｍａｇ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：１４３７；米国特許５，６４４，０４８）、ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１１：２３２１）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、およびペプチド核酸骨格および結合（Ｅｇｈｏｌｍ （１９９２） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１４：１８９５；Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３１：１００８；Ｎｉｅｌｓｅｎ （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ， ３６５：５６６；Ｃａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｎａｔｕｒｅ ３８０：２０７）。
【００２５】
他の核酸類似体には以下が含まれる：陽性の骨格をもつもの（Ｄｅｎｐｃｙ ｅｔ ａｌ．（１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：６０９７）、非イオン性骨格をもつもの（米国特許５，３８６，０２３号、同５，６３７，６８４号、同５，６０２，２４０号、同５，２１６，１４１号および同４，４６９，８６３号；Ａｎｇｅｗ （１９９１） Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔｌ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌｉｓｈ ３０：４２３；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１０：４４７０；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ １３：１５９７；Ｃｈａｐｔｅｒ２および３， ＡＳＣ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０， ”Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”， Ｅｄ． Ｙ．Ｓ． Ｓａｎｇｈｕｉ ａｎｄ Ｐ． Ｄａｎ Ｃｏｏｋ； Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ４：３９５；Ｊｅｆｆｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ ３４：１７；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． （１９９６）３７：７４３）および非リボース骨格をもつもの（米国特許５，２３５，０３３号および同５，０３４，５０６号、Ｃｈａｐｔｅｒ６および７， ＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｅｄ． Ｙ．Ｓ． Ｓａｎｇｈｕｉ ａｎｄ Ｐ． Ｄａｎ Ｃｏｏｋに記載されたものを含む）。１つまたは２つ以上の炭素環式糖を含む核酸もまた核酸の定義内に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５） Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｒｅｖ． ｐｐ１６９−１７６）。いくつかの核酸類似体が以下の文献に記載されている：Ｒａｗｌｓ， Ｃ ＆ Ｅ Ｎｅｗｓ， Ｊｕｎｅ ２， １９９７ ｐａｇｅ ３５。リボース−リン酸骨格のこれらの改変は付加的成分（例えば標識）の添加をさらに促進するために、または前記の成分の安定性および半減期を生理学的環境下で延長させるために実施することができる。
【００２６】
核酸配列（例えばコード配列および制御配列）に関連して“異種の”という用語は、リコンビナント構築物の領域と通常は結合していない配列、または特定の細胞に通常は付随していない配列を指す。したがって、核酸構築物の“異種”領域とは、天然には他方の分子と結合した状態で見出されることがないもう１つの核酸内に存在するか、または前記核酸と結合している識別可能な核酸セグメントのことである。例えば、構築物の異種領域は、天然には結合した状態で見出されることがない配列と直接接しているコード配列を含むことができるであろう。異種コード配列のもう１つの例は、前記コード配列それ自体が天然には見出されない（例えば天然の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）構築物である。同様に、通常はホスト細胞に存在しない構築物で形質転換されたホスト細胞は、本発明の目的では異種と考えられるであろう。
【００２７】
“単離された”、“精製された”または“生物学的に純粋”とは、天然の状態で通常付随する成分を実質的に、または本質的に含有しない物質を指す。核酸および／またはポリペプチドに関して、前記用語は、天然の状態では典型的にはそれらと直接接している配列とはもはや直接接していない核酸またはポリペプチドを指す。
“リコンビナント”または“リコンビナントによって発現される”という用語は、細胞について用いられる場合は、前記細胞が核酸を複製もしくは発現させるか、またはその起源が前記細胞にとって外因性である核酸によってコードされるペプチドまたはタンパク質を発現させることを指す。リコンビナント細胞は、前記細胞の天然（非リコンビナント）形の中では見出されない遺伝子を発現させることができる。リコンビナント細胞はまた、天然形の細胞で見出される遺伝子を、前記遺伝子が人工的手段（例えば異種プロモータの制御下）で細胞に再導入される場合には発現させることができる。
【００２８】
“ＨＹ２関連遺伝子”または“ＨＹ２ファミリーメンバー”とは、フェレドキシン依存ビリンレダクターゼをコードし、さらに直鎖状テトラピロールの二または四電子還元を触媒して、フィトクロムまたはフィコビリタンパク質の生物学的に活性な発色団前駆体を生じる遺伝子を指す。典型的には長さが２００から３００アミノ酸であり、これらの酵素は、図５および図１０に示した特徴的なシグナチャー配列によって識別することができる。
【００２９】
“ストリンジェントな条件”または“ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション”とは、プローブが優先的にその標的配列とハイブリダイズし、他の配列とはより低い度合いでハイブリダイズするか、または全くハイブリダイズしない条件を指す。核酸のハイブリダイゼーション実験（例えばサザンハイブリダイゼーションおよびノザンハイブリダイゼーション）の場合の“ストリンジェントなハイブリダイゼーション”および“ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件”は配列によって左右され、異なる環境パラメーター下では異なってくる。核酸のハイブリダイゼーションについての広範囲の手引きは以下で見出される：Ｔｉｊｓｓｅｎ （１９９３） Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ， ｐａｒｔ Ｉ， Ｃｈａｐｔｅｒ ２， Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、限定された範囲のイオン強度およびｐＨにおける個々の配列についての熱溶融点（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、完全に適合しているプローブと標的配列の５０％がハイブリダイズする温度（限定範囲のイオン強度およびｐＨで）である。 非常にストリンジェントな条件は、個々のプローブのＴｍと等しくあるように選択される。
【００３０】
１００個以上の相補性残基を有する相補性核酸をフィルター上でサザンブロットまたはノザンブロットでハイブリダイズさせるためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、ヘパリン１ｍｇを含む４２℃の５０％ホルムアミドであり、ハイブリダイゼーションは一晩実施される。高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、７２℃の０．１５ＭのＮａＣｌで約１５分である。ストリンジェントな洗浄条件の例は、０．２×ＳＳＣによる６５℃１５分の洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の説明については以下を参照されたい：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ ｅｄ．） Ｖｏｌ． １−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ）。しばしば、高度にストリンジェントな洗浄の前に低度にストリンジェントな洗浄を実施して、バックグラウンドのプローブシグナルを除去する。例えば１００ヌクレオチド以上の二重体（デュープレックス）のための中等度にストリンジェントな洗浄の例は、４５℃の１×ＳＳＣで１５分である。例えば１００ヌクレオチド以上のデュープレックスのための低度にストリンジェントな洗浄の例は、４０℃の４から６×ＳＳＣで１５分である。一般に、個々のハイブリダイゼーションアッセイで無関係のプローブについて観察されるシグナル対ノイズ比よりも２倍（またはそれ以上）のシグナル対ノイズ比は、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示している。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸も、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合は実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが遺伝暗号により許容される最大コドン縮退を用いて作製されたときに生じる。
【００３１】
本明細書で用いられるように、保存的置換という用語は、タンパク質中のアミノ酸が、前記タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない別のアミノ酸で置換されることをいう。したがって、例えば、極性アミノ酸は極性アミノ酸と置換することが可能であり、非極性アミノ酸は非極性アミノ酸と置換することが可能である、ｅｔｃ。以下の６つの群は互いに保存的置換であるアミノ酸を含んでいる：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００３２】
本発明は、１つのファミリー（本明細書ではＨＹ２ファミリーと称する）のビリンレダクターゼの単離および性状決定に関する。或る実施態様では、これらのビリンレダクターゼはビリベルジンをフィトビリンに変換してフィトクロム生合成経路の成分の１つを生成する。本発明のビリンレダクターゼはｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで用いて、ビリベルジンを単純にフィトビリンに変換するか、またはフィトクロム生合成経路の他の酵素と組み合わせて完全なフィトクロムおよび／またはフィトフルアを合成することができる。本発明はまた、フィトクロムまたはフィトフルアのリコンビナント合成に関する。
【００３３】
図１に示したフィトクロム発色団の生合成経路は、外因性の仮定的中間体を用いて遮断された工程を克服するという古典的なアプローチによって（Ｔｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ３０６：１−１５）、およびフィトクロム−発色団欠損変異体の分析によって（Ｔｅｒｒｙ （１９９７） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ．， ２０：７４０−７４５）解明された。この経路は、共通の中間体をプロトポルフィリンＩＸの段階までヘムおよびクロロフィル生合成と共有し、前記時点で後者の２つの経路は鉄またはマグネシウムによるメタル化により分岐する（Ｂｅａｌｅ （１９９３） Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖ．， ９３：７８５−８０２； Ｐｏｒｒａ （１９９７） Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．， ６５：４９２−５１６； Ｒｅｉｎｂｏｔｈｅ ａｎｄ Ｒｅｉｎｂｏｔｈｅ （１９９６） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２３７：３２３−３４３）。図１に示したように、ヘムはビリベルジンＩＸα（ＢＶ）に変換される（ビリベルジンＩＸαは、シアノバクテリア、紅藻類および地中植物におけるフィトクロムおよび集光フィコビリタンパク質の発色団の生合成経路に委ねられる最初の中間体である）。この反応は、紅藻類およびシアノバクテリアではフェレドキシン依存ヘムオキシゲナーゼにより（Ｒｈｉｅ ａｎｄ Ｂｅａｌｅ （１９９５） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ３２０：１８２−１９４； Ｃｏｒｎｅｊｏ ａｎｄ Ｂｅａｌｅ （１９９７） Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｒｅｓ．， ５１：２２３−２３０）、および植物では構造的に類似しているように思われる酵素によって（Ｔｅｒｒｙ （１９７７） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ．， ２０：７４０−７４５）達成される。これは、哺乳類系で見出されたヘムオキシゲナーゼとは対照的である（前記は、ヘムからＢＶへの酸素要求変換にチトクロームＰ４５０レダクターゼを利用する（Ｍａｉｎｅｓ （１９９７） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌ．， ３７：５１７−５５４）。
【００３４】
模式図１（図１）に示したように、ＢＶ代謝の行方は、緑色植物、シアノバクテリアおよび哺乳類で異なり、ＢＶは固有の二重結合特異性を有する別個のレダクターゼによって代謝される。哺乳類のビリベルジンＩＸαレダクターゼ（ＢＶＲ）（Ｃ１０メチン架橋で還元を触媒してビリルビン（ＢＲ）を生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存酵素）が、発見された最初のものであった（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｓｔｅｒ （１９６５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２４０：４７８０−４７８９）。哺乳類のＢＶＲは、ただ１つのＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよびビリン結合サブユニットから成る小型の可溶性酵素である（Ｋｕｔｔｙ ａｎｄ Ｍａｉｎｅｓ （１９８１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５６：３９５６−３９６２； Ｍａｉｎｅｓ ａｎｄ Ｔｒａｋｓｈｅｌ （１９９３） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ３００：３２０−３２６）。ラットとヒトの活性を有するリコンビナント型がクローニングされ、大腸菌で発現された（Ｆａｋｈｒａｉ ａｎｄ Ｍａｉｎｅｓ （１９９２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：４０２３−４０２９； ＭｃＣｏｕｂｒｅｙ ａｎｄ Ｍａｉｎｅｓ （１９９４） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２２２：５９７−６０３； Ｍａｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２３５：３７２−３８１）。シアノバクテリアのシネコシスチス亜種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ）ＰＣＣ６８０３の遺伝子ｂｖｄＲの予期せぬ発見により、この酵素は太古に発生起源を有することが確認された（前記遺伝子ｂｖｄＲは、ＢＶのＣ１０メチン架橋のＮＡＤＰＨ依存還元もまた触媒するＢＶＲをコードする（Ｓｃｈｌｕｃｈｔｅｒ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２：１３５６２−１３５６９）。興味深いことには、ｂｖｄＲは、このシアノバクテリアのフィコビリタンパク質生合成の調節で重要な役割を果たす。なぜならば、その不活化はフィコシアニン蓄積の低下をもたらすからである（Ｓｃｈｌｕｃｈｔｅｒ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２：１３５６２−１３５６９）。
【００３５】
シアノバクテリアは、それらのフィコビリタンパク質集光触角複合体の直鎖状テトラピロール前駆体の合成のためにさらに別のビリンレダクターゼを有する（Ｃｏｒｎｅｊｏ ａｎｄ Ｂｅａｌｅ （１９９７） Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５１：２２３−２３０）。これらの研究および紅藻類、シアニジウム＝カルダリウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ ｃａｌｄａｒｉｕｍ）に関する以前の研究（Ｂｅａｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｊｏ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６６：２２３２８−２２３３２； Ｂｅａｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｊｏ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６６：２２３３３−２２３４０； Ｂｅａｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｊｏ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６６：２２３４１−２２３４５）を基にして、Ｂｅａｌｅと共同研究者らは、フィコビリタンパク質の発色団前駆体（フィコエリスロビリン（ＰＥＢ）およびヒコシアノビリン（ＰＣＢ））の生合成は、２つのフェレドキシン依存ビリンレダクターゼを必要とするということを提唱した。これら酵素のうち前者は、Ｃ１５メチン架橋でＢＶの還元を触媒し１５，１６−ジヒドロビリベルジンを生成し（すなわちＤＨＢＶシンターゼ）、一方、後者は、Ｃ２二重結合で１５，１６−ジヒドロビリベルジン（ＤＨＢＶ）を還元して３Ｚ−ＰＥＢを生成する（模式図１を参照）。シアニジウムでは、さらに別の酵素が、３Ｚ−ＰＥＢから３Ｚ−ＰＣＢへの異性化を仲介するようである。３Ｚ−ＰＥＢおよび３Ｚ−ＰＣＢの両者は、フィコビリタンパク質の初期アポタンパク質と会合する前に、それぞれの対応する３Ｅ異性体にさらに異性化されるようである。
【００３６】
哺乳類およびフィコビリタンパク質含有生物と対比して、植物および緑藻類ではＢＶはＣ２二重結合で還元され、フェレドキシン依存酵素ＰΦＢによって３Ｚ−ＰΦＢが生成される（Ｔｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０：１１１１１−１１１１８； Ｗｕ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２：２５７００−２５７０５）。高等および下等植物（例えばコケ、シダ）の両植物で、３Ｚ−ＰΦＢおよび／またはその３Ｅ異性体はフィトクロム発色団の直前の前駆体であることが確認された（Ｔｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ３０６：１−１５）。最近の研究によって、ＰＣＢは緑藻類、メゾテニウム＝カルダリオルム（Ｍｅｓｏｔａｅｎｉｕｍ ｃａｌｄａｒｉｏｒｕｍ）の天然のフィトクロムの発色団前駆体であることが確認され、さらに、３Ｚ−ＰΦＢシンターゼおよび３Ｚ−ＰΦＢレダクターゼ（この酵素は３Ｚ−ＰΦＢから３Ｚ−ＰＣＢへの還元的変換を触媒する）の両酵素が、前記生物のクロロプラストの可溶性タンパク抽出物で検出された（Ｗｕ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２：２５７００−２５７０５）。３Ｚから３ＥへのＰΦＢイソメラーゼの存在が仮定されているが、この酵素は植物の抽出物でまだ特定されていない（Ｔｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ３０６：１−１５； Ｂｅａｌｅ （１９９３） Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖ．， ９３：７８５−８０２）。フィトクロム発色団の生合成の最終工程は、ＰΦＢまたはＰＣＢのアポフィトクロムへの共有結合による付加である。
【００３７】
公知のフィトクロム発色団欠損変異体の生化学的分析は、これら変異体は、ヘムオキシゲナーゼまたはＰΦＢシンターゼのための構造遺伝子内の欠損を反映しているという結論を支持している（以下の文献で概説されている：Ｔｅｒｒｙ （１９７７） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ．， ２０：７４０−７４５）。前記変異体には以下が含まれる：シロイヌナズナ（Ａ．タリアナ（Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ））のｈｙ１およびｈｙ２変異体（Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆ ｅｔ ａｌ． （１９８０） Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ ｆｕｒ Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， １００：１４７−１６０； Ｃｈｏｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， １：８６７−８８０）、トマトのａｕｒｅａおよびｙｇ２変異体（Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｊ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １２０：１５３−１６５； Ｖａｎ Ｔｕｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， ９：１７３−１８２； Ｔｅｒｒｙ ａｎｄ Ｋｅｎｄｒｉｃｋ （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１：２１６８１−２１６８６）、エンドウのｐｃｄ１およびｐｃｄ２変異体（Ｗｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ８：５５−６７； Ｗｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐｌａｎｔ Ｊ．， １１：１１７１−１１８６）。実際、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＨＹ１遺伝子座は、フェレドキシン依存ヘムオキシゲナーゼをコードすることが示された。
【００３８】
本発明は、ＨＹ２のクローニングおよび配列分析に関し、さらにＨＹ２遺伝子座がフィトクロモビリンシンターゼ（ＢＶをＰΦＢに変換するフェレドキシン依存ビリンレダクターゼ酵素）をコードすることを示す。さらにまた、ＨＹ２の近縁タンパク質もまたビリベルジン（ＢＶ）レダクターゼであることを示す。
【００３９】
Ｉ．ＨＹ２およびＨＹ２ファミリーメンバー
Ａ）ＨＹ２
ＨＹ２のゲノム配列およびタンパク質配列が図３Ｂに提示されている。ｃＤＮＡの配列分析によれば、ＨＹ２タンパク質は、計算分子量が３８．１ｋＤである３２９残基を含む。そのＮ末端に、ＨＹ２タンパク質配列は豊富なセリンを有し、酸性残基は少なく（４５残基のうち６つのセリンおよび１つのアスパラギン酸）、このことは、色素体への局在のための輸送ペプチドの可能性を示している（Ｇｒａｖｅｌ ａｎｄ ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ （１９９０） ＦＥＢＥＳ Ｌｅｔｔ． ２６１：４５５−４５８）。開始メチオニンの次の二番目のアミノ酸はアラニンであり、これはしばしば色素体輸送ペプチドで認められる。
【００４０】
ＨＹ２の輸送ペプチドを予想するためにプログラムＣＨＬＯＲＯＰも用い、ＨＹ２タンパク質の最初の４５アミノ酸残基は葉緑体の輸送ペプチドを形成することが示された（Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．， ８：９７８−９８４；　ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ ”ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＣｈｌｏｒｏＰ／” ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＣｈｌｏｒｏＰ／）。
成熟ＨＹ２タンパク質の計算分子量は３３．０ｋＤで、その予想されるｐＩは５．６６であり、前記は、エンバクの苗木から精製されたＰΦＢシンターゼの分子量およびｐＩと類似している。ＨＹ２タンパク質はまた、予想されるトランスメンブレンらせんをもたず、このことはまた、エンバクＰΦＢシンターゼが可溶性タンパク質であるという観察と一致している。
Ｂ．ＨＹ２ファミリーおよびファミリーメンバー
照会配列としてＨＹ２タンパク質配列を用い、非重複ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬデータベースの反復ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索により、例えばデフォルトパラメーターを用いてＨＹ２ファミリーメンバーを特定する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４２０）。この検索では、ＨＹ２関連遺伝子は、ほぼ完全なシロイヌナズナのゲノムでは特定されなかった。対照的に、この検索によって２つの海洋シアノバクテリア、プロクロロコッカス＝マリヌス亜種（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｐ．）ＳＳ１２０（ＥＭＢＬ承認番号ＣＡＢ９５７００．１およびＣＡＢ９５７０１．１）およびシネココッカス亜種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＷＨ８０２０（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ承認番号Ｑ０２１８９およびＱ０２１９０）由来のＨＹ２関連配列、並びにシアノバクテリア、シネコシスチス亜種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３由来の関連タンパク質配列（シアノベース遺伝子座ｓｌｒ０１１６；Ｐｒｏｔｅｉｎｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ承認番号Ｓ７６７０９）が特定された。
【００４１】
前記海洋シアノバクテリアは両者とも、マルチ遺伝子オペロンの一部分であるように思われる２つのＨＹ２関連ＯＲＦを有する。シネココッカスのＯＲＦ（ｙｃｐ２＿ｓｙｎｐｙおよびｙｃｐ３＿ｓｙｎｐｙ）は、フィコビリタンパク質生合成に必要とされる遺伝子クラスター内に位置し（Ｗｉｌｂａｎｋｓ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ （１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１２２６−１２３５）、一方、プロクロロコッカスのＯＲＦ（我々はこれをｙｈｐ２＿ｐｒｏｍａおよびｙｐｐ３＿ｐｒｏｍａと名付けた）は、ヘムオキシゲナーゼ（ＧＢ：ＡＪ２７８４９９．１）関連遺伝子の直ぐ下流に位置する。これらの観察によって、これら遺伝子はフィコビリン生合成に必要であると考えられる。
【００４２】
完全なＨＹ２ファミリー内の高度に保存された残基およびビリンレダクターゼの５つのクラスの各々の中の高度に保存された残基の調査によって、このタンパク質の構造、フェレドキシンとの相互作用部位、および基質／生成物特異性にとって重要な残基に関する情報が提供される。これに関しては、ほんの少数の残基が完全なＨＹ２ファミリーの酵素で保存されている。これらには１３７位、１５７位、１５８位、２５６位および３１４位の疎水性残基、Ｐｒｏ１５１、Ｐｈｅ２２１、Ｓｅｒ２２２、およびＡｓｐ１７１が含まれる（図１０）。塩基性残基がほとんど保存されていないということによって、ビリン基質のプロピオニル部分は、酵素と塩結合を形成しないと考えられる。前記保存された疎水性残基プロリンおよびフェニルアラニンは、全体的なタンパク質の構造（すなわち折り畳み）におそらく必要とされるであろう。また別に、それらは、種々のビリン基質の保存領域と疎水性相互反応を形成するかもしれない。
【００４３】
シロイヌナズナのフィトクロモビリンシンターゼのｈｙ２−１およびｈｙ２−１０４対立遺伝子座の機能欠損によって、ＨＹ２の構造におけるＰｒｏ１５１の決定的な役割が支持される。保存されたセリンおよびアスパルテート残基は、おそらく触媒的な役割（例えば基質との水素結合および／または基質のプロトン付加）を果たし、結合ビリンをより優れた電子受容体にするのであろう。ＨＹ２ファミリーの広い分岐にもかかわらず、これらの保存残基はこのクラスの全メンバーの活性部位が類似していることを示していると我々は考える。ＢＶレダクターゼ（すなわちＰｃｙＡ、ＰｅｂＡ、ＨＹ２）、１５，１６−ＤＨＢＶレダクターゼ（すなわちＰｅｂＢ）およびＰＣＣＲファミリーのそれぞれ別個の二重結合還元特異性は、触媒ポケット内のそれぞれの基質の配置を反映していると我々は考えている。ＢＶのＡ／Ｂ環およびＣ／Ｄ環は非常に類似しているが同一ではないので、ＰｅｂＡおよびＨＹ２酵素の基質結合部位はそれぞれに都合よく調節されて、ＢＶを反対の向きに配置させ、それぞれビリンのＣ／Ｄ環またはＡ環への電子伝達を促進すると考えられる。これが正しいならば、ＰｅｂＢクラスは、その１５，１６−ＤＨＢＶ基質をＨＹ２ファミリーの基質と同様な向きに拘束し、一方、ＲＣＣは、ＢＶがＰｅｂＡに連結される態様と同様な態様でＲＣＣＲに結合されるであろう。
１）ｐｃｙＡ
我々は、シアノバクテリアのシネコシスチス亜種ＰＣＣ６８０３、アナベナ亜種ＰＣＣ７１２０およびノストク＝パンクチフォルム（Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）のｐｃｙＡ遺伝子は、ＢＶから３Ｚ−ＰＣＢへの四電子還元を触媒するビリンレダクターゼをコードすると報告した。ＰＣＢは、フィコビリタンパク質のフィコシアニンおよびアロフィコシアニン（これらは３つのシアノバクテリアの全てで豊富である）の発色団の前駆体である。ｐｃｙＡ酵素は、他の全てのものは二電子還元を触媒するので変則的なビリンレダクターゼである。形式上、これらの酵素は、ＢＶのＡ環およびＤ環の両方の二電子還元を触媒する。しかしながら、我々は、半分還元された中間体（例えばＰΦＢおよび１８１，１８２−ＤＨＢＶ）の生成を検出できなかった。したがって、部分的に還元された中間体は前記酵素にしっかりと結合しているように思われる。これらのシアノバクテリアにおけるＢＶからＰＣＢへの直接変換は、紅藻類、Ｃ．カルダリウム（ＰＥＢの中間体を含む）、および緑藻類、Ｍ．カルダリオルム（３Ｚ−ＰΦＢは単離可能な中間体である）における提唱された生合成経路とは対照的である。ｐｃｙＡ関連遺伝子はまた、オキシフォトバクテリア、プロクロロコッカス亜種ＭＥＤ４にも存在し、本生物ではフィコビリタンパク質は存在しないのでこれは予期せぬ所見である。我々は、プロクロロコッカス亜種ＭＥＤ４のｐｃｙＡ遺伝子をクローニングし、前記をＮ末端のＧＳＴ融合物として発現させることができた。我々の標準的なフィトクロム系アッセイでリコンビナントＰｃｙＡ＿ＰＲＯＭＥはＢＶをＰＣＢに還元することができることが認められた（データは示されていない）。したがって、前者は、調べられた他のＰｃｙＡ酵素と同じ酵素活性を有する。
【００４４】
２）ｐｅｂＡおよびｐｅｂＢ
我々は、シアノバクテリアのシネココッカス亜種ＷＨ８０２０およびＮ．パンクチフォルムのｐｅｂＡおよびｐｅｂＢ遺伝子が、それぞれＢＶから１５，１６−ＤＨＢＶおよび１５，１６−ＤＨＢＶから３ＺＰＥＢの変換を触媒するビリンレダクターゼをコードすることを認めた（図１）。したがって、ＰｅｂＡは１５，１６−ＤＨＢＶ：フェレドキシンオキシドレダクターゼであり、一方、ＰｅｂＢは３Ｚ−ＰＥＢ：フェレドキシンオキシドレダクターゼである。両活性は、紅藻類Ｃ．カルダリウムにおけるＰＥＢ生合成経路と一致する。前記２つのｐｅｂ遺伝子はまた、両方のフィコエリスリン酸性シアノバクテリアで同じオペロン中で見出され、それらが主要なフィコビリタンパク質遺伝子クラスターと密接に結びついているということによって、フィコビリタンパク質生合成におけるそれらの役割が肯定される。
【００４５】
特定の理論に拘束されないが、我々は、前記２つの酵素を一緒にインキュベートしたときに観察されるＢＶの共助的代謝ゆえに、ＰｅｂＡおよびＰｅｂＢは二種酵素複合体として機能すると考える。ｐｅｂオペロンは、フィコエリスリンを欠く生物であるシアノバクテリアシネコシスチス亜種ＰＣＣ６８０３のゲノムには存在しない。このことは、ＰＣＢは、Ｃ．カルダリウムで見出されたＰＥＢ経路とは全く異なるＰｃｙＡ依存経路を介してＰＣＢが前記シアノバクテリアで合成されることを強く示唆している。これに関しては、シネコシスチス亜種ＰＣＣ６８０３の粗抽出物の生化学的分析は、ＰＥＢの生成についての証拠を提供していない。オキシフォトバクテリア、プロクロロコッカスのＭＥＤ４およびＳＳ１２０亜種はまた、それらはヘムオキシゲナーゼ関連遺伝子を上流にもつことを除いて、シネココッカス亜種ＷＨ８０２０およびＷＨ８１０２のそれと非常に類似するｐｅｂオペロンをもつ。このことは、両オキシフォトバクテリア亜種はＰＥＢを合成できることを強く示唆している。
我々はまた、プロクロロコッカスのＰｅｂＡおよびＰｅｂＢはおそらくシネココッカスおよびノストクの酵素の機能的なオルソロガス体であると考える。これら酸素発生系光合成生物には、おそらく多数のビリンイソメラーゼが存在するのであろう。
【００４６】
Ｃ）ＨＹ２ファミリーの他のメンバーの特定
ビリンレダクターゼのＨＹ２ファミリーの他のメンバーもまた、本明細書に記載した方法（例えば実施例２を参照されたい）を用いて容易に特定することができる。好ましい実施態様では、そのような方法は、本明細書に記載したＨＹ２ファミリーの１つまたは２つ以上のメンバーとアラインメントアルゴリズムを用いて核酸および／またはタンパク質データバンクを検索し、関連遺伝子および／またはポリペプチドを特定することを必要とする。
前記仮定的ビリンレダクターゼの活性は、例えば標準的なビリンレダクターゼ活性のアッセイを用いて確認することができる。そのようなビリンレダクターゼアッセイの１つは実施例１および２に詳細に記載されている。基本的には、仮定的ビリンレダクターゼは、酵素活性と適合する緩衝系でビリベルジンと一緒にされる。前記アッセイ混合物を或る時間インキュベートする。生成物の分析は、直接ＨＰＬＣアッセイ（実施例１を参照されたい）を用いるか、または適切なアポフィトクロム（例えばリコンビナントシアノバクテリア系フィトクロム（例えばＣｐｈ１））の添加後に分光光度法を用いて共役アッセイによって達成できる。
【００４７】
ＩＩ．ＨＹ２の使用
本発明のＨＹ２ビリンレダクターゼは複数の用途で有用なツールである。任意のビリベルジン産生生物でフィコエリスロビリン（ＰＥＢ）の生合成を巧妙に操作することは、１つまたは２つの遺伝子の導入により今や実現可能である。同様に、光活性ホロフィトクロム（例えばアポフィトクロムに結合したビリン色素）は、任意のフェレドキシン含有生物で産生させることができる。
ビリンレダクターゼ遺伝子をアポフィトクロムと同時発現させることによって、我々は、藻類細胞、植物細胞、細菌、酵母、脊椎動物細胞（哺乳類細胞を含む）、昆虫細胞などを含む（ただしこれらに限定されない）広範囲の細胞タイプでホロフィトクロムを製造することができる。これによって、フィトクロムの三次元構造分析が促進されるだけでなく、我々が分子遺伝学の分析能力を利用することができる非植物系でのフィトクロムのシグナリングの再構成が促進される。リコンビナントによって発現されるフィトクロムは、したがって多様な研究のために役立つ優れたモデル系を提供する。同様なアプローチが、ステロイドレセプターファミリーの構造−機能分析について計り知れないほど重要であることが証明された。
【００４８】
ｐｃｙＡ遺伝子を野生型植物および発色団欠損変異体植物に導入することによって、フィトクロムの波長特異性を変化させることができる。前記は、野外環境での植物の増殖および生育を有利に変化させることができる。ｐｅｂＡおよびｐｅｂＢ遺伝子の植物への導入によって、ＢＶからＰＥＢへの変換の側路を作り、蛍光性フィトクロムを含む、遺伝学的に光学的構造を変化させた植物を作製することができる。これは、植物におけるフィトクロムの時間的および空間的発現パターンの分析に特に有用である。
【００４９】
Ａ）ビリベルジンからフィトビリンのｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏ変換
或る実施態様では、本発明のビリンレダクターゼのＨＹ２ファミリーを簡便な試薬（還元剤）として用いて、ビリベルジンをフィトビリンに変換することができる。本酵素はｉｎ ｖｉｖｏ（例えば植物）で、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば細胞培養）で、またはｅｘ ｖｉｖｏで簡便な試薬として用いることができる。したがって、例えば、適切な緩衝系で（例えば典型的にはフェレドキシンの存在下で）１つまたは２つ以上のビリンレダクターゼをビリベルジンとｅｘ ｖｉｖｏで接触させて、ビリベルジンをフィトビリンに変換させることができる（例えば実施例１を参照されたい）。続いて実施例で述べるように、例えばＨＰＬＣを用いて前記フィトビリンは容易に精製される。
【００５０】
また別には、ホスト細胞に１つまたは２つ以上の本発明のビリンレダクターゼおよび／またはフィトクロムの生合成経路の他の成分をコードする核酸をトランスフェクトしてもよい。ビリンレダクターゼはホスト細胞内で発現され、フェレドキシンの存在下では、それらは前記細胞内でビリベルジンをフィトビリンに変換する。そのような方法を簡単に用いてフィトビリンを製造するか、またはホロフィトクロムもしくはフィトフルアの発現／産生の増加に（例えば植物細胞、藻類細胞、光活性細菌細胞などに既に存在するフィトクロム合成機構を強化することによって）用いることができる。
好ましいホスト細胞は、ヘムおよび／またはヘムオキシゲナーゼおよび／またはフェレドキシンを本来提供する細胞である。好ましい種々の細胞には、或る実施態様では通常はフィトクロムを産生しない細胞（例えばある種の細菌細胞、哺乳類細胞など）が含まれ、さらに別の実施態様では典型的にフィトクロムを発現する細胞（例えば植物細胞、藻類細胞など）が含まれる。
【００５１】
Ｂ）ホロフィトクロムの発現
ビリンレダクターゼおよび本明細書で特定される他の酵素を用いて、光活性発色団前駆体および蛍光性フィトフルア発色団前駆体を含む光活性ホロフィトクロムを会合させることができる。ビリン合成経路の成分（例えばＨＯ１、ＰｃｙＡおよび／またはＨＹ２）をコードする核酸、およびアポフィトクロムをコードする核酸をトランスフェクトした細胞は、アポフィトクロムと会合するフィトクロモビリンを発現して、光活性ホロフィトクロム（例えば発色団またはフィトフルア）を生成するということは本発明の驚くべき発見であった（前記アポフィトクロムは、例えばＣｐｈ１、天然またはリコンビナントエンバクフィトクロムＡ（ＡＳＰＨＹＡＳＴ）、アベナ＝サティバ（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）ｐｈｙＡ（Ａｓｐｈｙａ）、シロイヌナズナｐｈｙＡ（ＡｔｐｈｙＡ）、メゾテニウム＝カルダリオルムｐｈｙ１ｂ（Ｍｃｐｈｙ１ｂ）、シネコシスチス亜種６８０３ｐｈｙ１（Ｓ６８０３ ｐｈｙ１）など（米国特許６，０４６，０１４号を参照されたい）を含む）。
【００５２】
ホロフィトクロムは、発色団であれフィトフルアであれ極めて有用である。特に好ましい使用では、発色団またはフィトフルアは検出可能な標識（例えば比色標識または蛍光標識）として有用である。そのような標識は、結合させたリガンドの視覚化および／または位置の特定および／または単離に有用である。特に好ましい実施態様では、アポフィトクロムは、標識しようとするポリペプチドとの融合タンパク質として発現される。アポフィトクロムはポリペプチドと直かに融合されるか、またはペプチドリンカーによって分離されている。融合タンパク質が発現されるときは、アポフィトクロム成分はビリンと結びつき、発色団またはフィトフルアを生成し、これは続いて前記ポリペプチドのための標識として作用する。
【００５３】
特に好ましい実施態様では、ホロフィロクロムはフィトフルアである。フィトフルアは蛍光性アポフィトクロム−ビリン共役物（例えばアポフィトクロム−ＰＥＢアダクツ）であり、これは、強い蛍光を発する光学的に安定なタンパク質で蛍光標識として（例えば生物学的研究のためのプローブとして（例えば米国特許６，０４６，０１４号を参照されたい））有用である。
或る実施態様では、ホスト細胞にｐｅｂＡおよびｐｅｂＢ遺伝子がトランスフェクトされ、ビリベルジンからＰＥＢへの変換に側路が形成され蛍光性フィトフルアが生成される。
【００５４】
Ｃ）モデル系としての異種ホロフィトクロム
本発明の方法を用いて、本質的に任意の細胞（それらの本来の状態でフィトクロムを含まない細胞を含む）でホロフィトクロムを発現させることができる。リコンビナントホロフィトクロムを含む細胞は、広範囲に使用されるモデル系を提供する。例えば、そのような細胞は、フィトクロムの活性および／または感度スペクトルを変化させる薬剤のスクリーニングに用いることができる。そのようなアッセイでは、細胞を問題の薬剤と接触させ、続いて生理学的活性の変化および／またはフィトクロムの分布または構造の変化および／またはスペクトルの特徴の変化についてアッセイされる。
【００５５】
そのようなモデル系はまた、フィトクロムが関与する代謝経路の分析に有用である。
本発明のリコンビナントホロフィトクロムは、通常フィトクロムを含む植物、藻類などにも同様に導入することができる。そのような導入された異種フィトクロムは植物の波長特異性を変化させ、野外環境における植物の増殖および生育を有利に変化させることができる。そのような方法を用いて、種々の植物のホスト域を改善することができる。
【００５６】
ＩＩＩ．ＨＹ２タンパク質およびフィトクロム生合成経路の他の酵素のクローニングと発現
本発明の単離されたフェレドキシン依存ビリンレダクターゼ（例えばＨＹ２ファミリーメンバー）および／またはホロフィトクロム（例えば発色団またはフィトフルア）を提供することはしばしば所望されることである。これらのポリペプチドおよび／またはフィトクロムを用いて免疫反応を惹起し、それによってフィトクロムまたは生合成系の成分に特異的な抗体を産生し、これを用いて細胞内でそのような成分の位置の特定および／または視覚化を達成できる。さらに、上記で示したように、単離フィトクロムを種々の部分に共役させ検出可能な標識として機能させることができる。ビリン合成経路の酵素成分は化学的試薬として用いることができる。
下記で説明するように、ホロフィトクロム並びにフィトクロムおよび／またはビリン合成経路の成分は、化学的合成またはリコンビナント発現の方法を用いて簡便に生成することができる。無傷の完全長ポリペプチドの他に、いくつかの実施態様では、免疫学的に関連性を有するフラグメント（例えば特異的抗体を作製するために用いることができるフラグメント）を発現させることがしばしば所望される。
【００５７】
Ａ）化学的なＤｅ ｎｏｖｏ合成
フィトクロム経路の成分および／またはアポフィトクロムの活性ビリンリアーゼドメインまたは他のサブ配列は、標準的な化学的ペプチド合成技術を用いて合成できる。所望されるサブ配列が比較的短い場合（例えば特定の抗原決定基が所望されるとき）、前記分子は単一の連続ポリペプチドとして合成できる。より大きな分子が所望される場合は、サブ配列を別々に（１つまたは２つ以上のユニットで）合成し、続いて１つの分子のアミノ末端を他の分子のカルボキシル末端と縮合させることによって融合させ、それによってペプチド結合を形成することができる。
【００５８】
前記配列のＣ−末端のアミノ酸を不溶性の支持体に結合させ、続いて残りのアミノ酸を連続的に付加させる固相合成は、本発明のポリペプチドの化学的合成で好ましい方法である。固相合成の技術は以下の文献に記載されている：Ｂａｒａｎｙ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ； ｐｐ． ３−２８４， ”Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｂｉｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ．２； Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｐａｒｔ Ａ．， Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， ｅｔ ａｌ． （１９６３） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８５：２１４９−２１５６； Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｎｄ ｅｄ． Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ． Ｃｏ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， Ｉｌｌ．
【００５９】
Ｂ）リコンビナントの発現
好ましい実施態様では、本発明のホロフィトクロムおよび／またはフィトクロム合成経路の成分（例えばＨＹ２ファミリーのレダクターゼ）は、リコンビナント発現系を用いて合成される。一般的には、これは、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を作製し、前記ＤＮＡを特定のプロモータの制御下で発現カセットに配置し、前記タンパク質をホストで発現させ、さらに所望する場合には前記発現タンパク質を単離することを含む。
１）核酸
本明細書で提供される情報（例えばＨＹ２ファミリーメンバーの配列、プライマーなど）を用いて、核酸（例えばアポタンパク質、ＨＹ２ファミリーのレダクターゼなどをコードするもの）を当業者に公知の標準的方法により調製できる。例えば、ＨＹ２ファミリーの核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写型増幅系（ＴＡＳ）、自家保持（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ）配列複製系（ＳＳＲ）など）によってクローニングまたは増幅させることができる。多様なクローニングおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅方法が当業者には公知である。ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅方法について当業者の手引きとなる十分な技術の例は以下の文献で見出される：Ｂｅｒｇｅｒ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ， ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ（１９９０） （Ｉｎｎｉｓ）； Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， （１９８７） 米国特許４，６８３，２０２号； Ａｒｎｈｅｉｍ ＆ Ｌｅｖｉｎｓｏｎ （Ｏｃｔｏｂｅｒ １， １９９０） Ｃ ＆ ＥＮ ３６−４７； Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＮＩＨ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （１９９１） ３：８１−９４； Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：１１７３； Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：１８７４； Ｌｏｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．， ３５：１８２６； Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４１：１０７７−１０８０； Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ （１９９０） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ８：２９１−２９４； Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ （１９８９） Ｇｅｎｅ， ４：５６０； Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｇｅｎｅ， ８９：１１７。
【００６０】
本明細書に記載された所望のタンパク質をコードするＤＮＡは、上記で述べたような適切な方法のいずれかによって調製できる。これらの方法には、例えば適切な配列のクローニングおよび制限、または例えば以下の方法のような直接的化学合成が含まれる：ホスホトリエステル法（Ｎａｒａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９７９） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８：９０−９９）、ホスホジエステル法（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ． （１９７９） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８：１０９−１５１）、 ジエチルホスホロアミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９８１） Ｔｅｔｒａ Ｌｅｔｔ．， ２２：１８５９−１８６２）および固相支持法（米国特許４，４５８，０６６号）。
【００６１】
化学合成によって一本鎖のオリゴヌクレオチドが生成される。これは、相補鎖とのハイブリダイゼーションによって、または鋳型として前記一本鎖を用いてＤＮＡポリメラーゼによるポリマー化によって二本鎖に変換できる。当業者には、ＤＮＡの化学合成は約１００塩基の配列に限定され、より長い配列はより短い配列の連結によって得ることができることは理解されよう。
また別には、サブ配列をクローニングし、適切なサブ配列は適切な制限酵素で切断できる。続いて前記フラグメントをつないで所望のＤＮＡ配列を生成することができる。
【００６２】
実施態様の１つでは、本発明の核酸は、ＤＮＡ増幅方法（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））を用いてクローニングすることができる（例えば実施例１を参照されたい）。したがって、例えば核酸配列またはサブ配列は、１つの制限部位（例えばＮｄｅＩ）を含むセンスプライマーおよび別の１つの制限部位（例えばＨｉｎｄＩＩＩ）を含むアンチセンスプライマーを用いて増幅される。これによって、所望の配列（例えばＨＹ２配列）またはサブ配列をコードし、さらに末端の制限部位を有する核酸が生成される。続いて、この核酸は、第二の分子をコードし、さらに適切な対応する制限部位を有する核酸を含むベクターに容易に連結することができる。適切なＰＣＲプライマーは、配列情報を用いて当業者が決定することができるし、さらに本明細書では代表的なプライマーが提供される。適切な制限部位もまた、位置特異的突然変異誘発によって所望のタンパク質またはタンパク質のサブ配列をコードする核酸に付加することができる。所望の配列またはサブ配列（例えばＨＹ２ビリンレダクターゼ配列）を含むプラスミドは、標準的な方法にしたがって適切な制限エンドヌクレアーゼで切断し、続いて第二の分子をコードするベクターに連結される。
【００６３】
所望のタンパク質またはタンパク質サブ配列をコードする核酸配列は、多様なホスト細胞（大腸菌、他の細菌ホスト、酵母、および高等な真核細胞、例えばＣＯＳ、ＣＨＯおよびＨｅＬａ細胞株およびミエローマ細胞株を含む）で発現させることができる。リコンビナントタンパク質遺伝子は、各ホストのために適切な発現コントロール配列に機能することができるように連結されるであろう。大腸菌の場合は、前記コントロール配列には、プロモータ（例えばＴ７、ｔｒｐまたはラムダプロモータ）、リボソーム結合部位および好ましくは転写終止シグナルが含まれる。真核細胞の場合は、コントロール配列には、プロモータおよびしばしばエンハンサー（例えば免疫グロブリン、ＳＶ４０、サイトメガロウイルス遺伝子由来のエンハンサーなど）、およびポリアデニル化配列が含まれ、さらにスプライスドナーおよびアクセプター配列も含むことができる。
ＨＹ２核酸の単離および発現は実施例１および２で説明されている。
【００６４】
２）発現ベクター
フィトクロム生合成経路の１つまたは２つ以上の酵素（例えば上記で述べたもの）をコードする本発明の核酸は、ホスト細胞内での前記酵素の発現に適した形態で（さらに或る実施態様では、ホロフィトクロムの会合に適した形態で）リコンビナント発現ベクターに取り込ませることができる。“ホスト細胞での融合タンパク質の発現に適した形態で”という用語は、リコンビナント発現ベクターが、ｍＲＮＡへの核酸の転写および対象タンパク質へのｍＲＮＡの翻訳を可能にする態様で前記酵素をコードする核酸に機能できるように連結されている１つまたは２つ以上の調節配列を含むことを意味する。“調節配列”という用語は専門用語で、プロモータおよび／またはエンハンサーおよび／または他の発現コントロールエレメント（例えばポリアデニル化シグナル）を含むことを意図している。そのような調節配列は当業者には公知である（例えば以下の文献を参照されたい：Ｇｏｅｄｄｅｌ （１９９０） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａ： Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ− Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ ｅｄ．） Ｖｏｌ， １−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ， など）。
【００６５】
発現ベクターのデザインは、トランスフェクトされるべきホストおよび／または発現されるべき具体的なタンパク質の選択のような要因にしたがって左右されるであろう。哺乳類細胞で用いられるときは、リコンビナント発現ベクターのコントロール機能は、しばしばウイルスの遺伝物質によって提供される。好ましいプロモータには、ＣＭＶ極初期プロモータ、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来ＬＴＲおよびマウスメタロチオネイン−Ｉが含まれるが、ただしこれらに限定されない。適切な調節エレメントの使用によって、多様なホスト細胞での高レベルのポリペプチド発現が可能になる。多数の適切な発現系が市販されている。好ましい実施態様の１つでは、所望のポリペプチドをコードする配列は、例えば実施例３に記載されているように、ＴＡクローニングプラスミド、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で発現される。
【００６６】
所望のポリペプチドは、高レベルの連続的発現のために構成的プロモータに機能的に連結させることができることは理解されよう。また別には誘発性および／または組織特異性プロモータも利用することができる。
実施態様の１つでは、本発明のリコンビナント発現ベクターはプラスミドまたはコスミドである。また別には、本発明のリコンビナント発現ベクターは、ウイルス核酸に導入された核酸の発現を許容するウイルスまたはその一部でもよい。例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ付随ウイルスを用いることができる。
クローニング方法についての技術例および当業者のための十分な指示は以下の文献で見出される：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ ｅｄ．） Ｖｏｌ． １−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ． とＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃとの合同事業；米国特許５，０１７，４７８号；および欧州特許０，２４６，８６４号。
３）ホスト細胞
ハロフィトクロムおよび／またはフィトクロム生合成経路の成分は実質的にいずれの細胞でも発現させることができる。しかしながら、好ましい細胞は、内因性のヘムおよび／またはフェレドキシンを含むか、またはヘムおよび／またはフェレドキシンを含むように改変される。特に好ましい細胞には藻類細胞、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、および哺乳類細胞（ヒトの細胞を含む）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
ハロフィトクロムおよび／またはフィトクロム生合成経路の成分は、対象のポリペプチドをコードする核酸をホスト細胞に導入することによってホスト細胞で発現させる。この場合、前記核酸は、前記ホスト細胞内で対象のポリペプチドの発現に適した形態にある。例えば、対象のポリペプチドをコードする、本発明のリコンビナント発現ベクターがホスト細胞に導入される。また別には、対象のポリペプチドをコードする核酸が調節配列（例えばプロモータ配列）に機能できるように連結されているが、別に付加されたベクター配列を含まないものがホスト細胞に導入されてもよい。
【００６７】
本明細書で用いられるように、“ホスト細胞”という用語は、発現されるべきタンパク質、選択された選別系、または用いられる培養系に不適合でないかぎり、いずれの細胞または細胞株も含むことを意図する。上記で示されたように、適切な細胞には、藻類細胞、細菌細胞（大腸菌）、酵母細胞、例えば、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ． ｐｏｍｂｅ、Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋ． ｌａｃｔｉｓ、Ｈ． ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（例えば以下の文献を参照されたい：Ｆｌｅｅｒ （１９９２） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ３（５）：４８６−４９６）、真菌細胞、植物細胞（例えばシロイヌナズナ）、非脊椎動物細胞（例えば昆虫細胞）、および脊椎動物細胞（哺乳類細胞を含む）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。使用することができる哺乳類細胞株の非限定的な例を挙げれば、ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０）、２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ． （１９７７） Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ３６：５９）またはミエローマ細胞（例えばＳＰ２またはＮＳ０（Ｇａｌｆｒｅ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （１９８１） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ７３（Ｂ）：３−４６））などが含まれる。
ビール酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現用ベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｅｍｂｏ Ｊ． ６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ， （１９８２） Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。所望のポリペプチドは、バキュロウイルス発現ベクター（Ｏｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ）を用いて昆虫細胞で発現させることができる。
４）ホスト細胞への核酸の導入
アポフィトクロムおよび／またはビリン生合成経路の成分をコードする核酸は、細胞のトランスフェクション用の標準的な技術によってホスト細胞に導入することができる。“トランスフェクトする”または“トランスフェクション”という用語は、ホスト細胞に核酸を導入するための全ての通常の技術を包含する。前記技術には、リン酸カルシウム同時沈殿、ＤＥＡＥデキストラン仲介トランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔（エレクトロポレーション）およびマイクロインジェクションが含まれる。ホスト細胞のトランスフェクションに適した方法は以下の文献で見出すことができる：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ， および他の実験室用テキスト。
【００６８】
本発明の核酸で形質転換されるホスト細胞の数は、少なくとも部分的には使用されるリコンビナント発現ベクターのタイプおよび用いられるトランスフェクション技術のタイプによって左右されるであろう。核酸はホスト細胞に一過性にまたは長期間にわたって導入することができる。長期系では、核酸は安定にホスト細胞のゲノムに組み込まれるか、またはホスト細胞内で安定なエピソームとして維持される。
【００６９】
ある種のベクターは極めて低い頻度でホスト細胞に組み込まれた。これら組み込まれたものを特定するために、一般的には、選別可能マーカー（例えば薬剤耐性）を含む遺伝子を問題の核酸と一緒にホスト細胞に導入する。好ましい選別可能マーカーには、ある種の薬剤（例えばＧ４１８およびヒグロマイシン）に対する抵抗性を付与するものが含まれる。選別可能マーカーは問題の核酸とは別のプラスミドで導入しても、同じプラスミドで導入してもよい。本発明の核酸（例えばリコンビナント発現ベクター）および選別可能マーカー遺伝子をトランスフェクトされたホスト細胞は、前記選別可能マーカーを用いて細胞を選別することによって特定することができる。例えば、選別マーカーがネオマイシン耐性を付与する遺伝子の場合、核酸を取り込んだホスト細胞はＧ４１８により選別することができる。選別マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存し、一方他の細胞は死滅する。
【００７０】
本発明のポリペプチドをコードする核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養増殖している細胞に通常のトランスフェクション技術（例えばリン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション、エレクトロポレーションなど）によって導入することができる。核酸はまた、例えば核酸の細胞内ｉｎ ｖｉｖｏ導入に適したデリバリー機構、例えばレトロウイルスベクター（例えば以下を参照されたい：Ｆｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８：８３７７−８３８１； Ｋａｙ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１−６４７）、アデノウイルスベクター（例えば以下を参照されたい：Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ （１９９２） Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５； Ｈｅｒｚ ａｎｄ Ｇｅｒａｒｄ （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：２８１２−２８１６）、レセプター仲介ＤＮＡ取り込み（例えば以下を参照されたい：Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ （１９８８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：１４６２１； Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：９６３−９６７； および米国特許５，１６６，３２０号）、ＤＮＡの直接注入（例えば以下を参照されたい：Ａｃｓａｄｉ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３３２：８１５−８１８； Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５−１４６８）または粒子爆撃（バイオリスティクス）（例えば以下を参照されたい：Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：４４５５−４４５９； Ｚｅｌｅｎｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９３） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ． ３１５：２９−３２）を用いて、細胞内にｉｎ ｖｉｖｏで移すことができる。
【００７１】
５）発現されたポリペプチドまたはホロフィトクロムの回収
いくつかの事例では、発現されたポリペプチド（例えばＨＹ２ファミリーのレダクターゼ）および／または会合したホロフィトクロムまたはホロフィトクロム標識ポリペプチドを回収することが所望される。いったん発現されると、前記所望のタンパク質および／またはホロフィトクロムは当技術分野で標準的な方法にしたがって精製することができる。前記方法には、硫安沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などが含まれる（一般的には以下を参照されたい：Ｒ． Ｓｃｏｐｅｓ （１９８２） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎ．Ｙ． ； Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １８２： Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． Ｎ．Ｙ．）。或る実施態様では、少なくとも約９０から９５％の均質性を有する実質的に純粋な組成物が好ましく、９８から９９％またはそれ以上の均質性がもっとも好ましい。ＨＹ２ファミリーメンバーのクローニングおよび発現は実施例１および２で説明され、ホロフィトクロムの発現は実施例３で説明されている。
【００７２】
アポフィトクロムおよび／またはＨＹ２レダクターゼ（またはフィトクロム合成経路の他の成分）を、それらの生物学的活性を低下させることなく改変することができることは当業者には理解されよう。いくつかの改変は、対象分子のクローニングおよび発現を促進するために実施することができる。そのような改変は当業者には周知で、例えば、アミノ末端にメチオニンを添加して開始部位を提供すること、またはどちらかの末端にアミノ酸を添加して制限部位または終止コドンまたは精製配列を都合のよい場所に配置することが含まれる。
【００７３】
ＩＶ．フィトクロムおよびフィトフルアの会合
或る好ましい実施態様では、本発明はホロフィトクロムの会合を提供する。ビリン合成経路の成分（例えばＨＯ１、ＰｃｙＡおよび／またはＨＹ２）をコードする核酸およびアポフィトクロム（例えばＣｐｈ１）をトランスフェクトした細胞は、アポフィトクロムと会合するフィトクロモビリンを発現して光活性なホロフィトクロムを生成するということは、本発明の驚くべき発見であった。
微生物で産生されたリコンビナントアポフィトクロムは、ビリン、フィトシアノビリン、フィトクロモビリンおよびフィコエリスロビリンとともに自家会合して光可逆的ホロフィトクロムおよび強い蛍光を発するフィトフルアをｉｎ ｖｉｔｒｏで生成できることが示された（Ｗａｈｌｅｉｔｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８：１０３８７−１０３９１； Ｌｉ ａｎｄ Ｌａｇａｒｉａｓ （１９９２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６７：１９２０４−１９２１０； Ｍｕｒｐｈｙ ａｎｄ Ｌａｇａｒｉａｓ （１９９７） Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ７：８７０−８７６； 米国特許６，０４６，０４１号）。
【００７４】
本発明はさらに、ビリベルジンをフィトクロモビリン、フィコシアノビリンまたはフィコエリスロビリンに変換するフェレドキシン依存ビリンレダクターゼをコードする遺伝子を提供する（図１参照）。或る特徴では、本発明は、ホロフィトクロムのｉｎ ｖｉｖｏ発現系について述べる。
好ましいアプローチの１つは、シネコシスチス亜種ＰＣＣ６８０３由来のＨＯ１およびＰｃｙＡコード領域を含む合成オペロンのデザインを含む（Ｙａｎｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ９：６６４７−６６６７； Ｂａｎｅｙｘ （１９９９） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １０：４１１−４２１； Ｙｅｈ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７７：１５０５−１５０８）。シネコシスチス亜種ＰＣＣ６８０３のｈｏ１およびｐｃｙＡ遺伝子のプラスミドｐＰＲＯＬａｒＡ１２２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でのクローニングでは、これらの遺伝子はＡｒａ／Ｌａｃ二重プロモータのコントロール化に置かれる。Ｃｐｈ１発現プラスミド、ｐＢＡＤ／Ｃｐｈ１（５１４）を宿す大腸菌細胞へ前記プラスミドを導入したとき、光活性なホロフィトクロムがｉｎ ｖｉｖｏで発現／会合する。
【００７５】
実施例３に示されるもう１つの特に好ましいアプローチは、シネコシスチス亜種ＰＣＣ６８０３のＨＯ１およびアラビドプシス＝タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の成熟ＨＹ２コード領域（ｍＨＹ２）（これは色素体ターゲッティング配列を欠く）で構成される合成オペロンの作製を含む。ＨＯ１およびＨＹ２開放読み枠のプラスミド、ｐＰＲＯＬａｒＡ１２２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）へのクローニングでは、このオペロンはＡｒａ／Ｌａｃ二重プロモータの調節制御下に置かれる。Ｃｐｈ１発現プラスミド、ｐＢＡＤ／Ｃｐｈ１（５１４）を宿す大腸菌細胞へ前記プラスミド（このプラスミド内でＣｐｈ１（Ｎ５１４）はＡｒａプロモータの調節制御下にある）を導入したとき、光活性なホロフィトクロムのｉｎ ｖｉｖｏ産生が観察された。
【００７６】
これらのアプローチは例示であって、これに限定しようとするものではない。本明細書で開示した事柄を用いて、多数の他のアプローチが当業者には利用可能であろう。例えば、天然にＨＯ１を宿している細胞株を用いて、この酵素を異種核酸から提供する必要性を排除することができる。また別には、多様なトランスフェクション試薬（例えば陽イオン性脂質、リポフェクタミン（登録商標）、シャリオト（Ｃｈａｒｉｏｔ）（登録商標）など）を用いて外因性ビリベルジンを細胞に提供してもよい。
他のビリンレダクターゼを用いてもよい。多数のアポタンパク質、またはホロフィトクロムおよび／またはフィトフルアを形成するために十分なその最小ドメインを用いてもよい。さらにビリン生合成経路の他の成分を異種核酸によって提供してもよい。例えば、アポフィトクロム、ＨＯ１、ｐｅｂＡおよびｐｅｂＢを発現している細胞はフィトフルアをｉｎ ｖｉｖｏで生成するであろう。同様に、フィコビリタンパク質、フィコビリタンパク質ビリンリアーゼのための構造遺伝子およびヘムからのフィトビリン生合成経路に必要な遺伝子の同時発現によって、生細胞で蛍光性フィコビリタンパク質が生成されるであろう。
【００７７】
Ｖ．キット
本発明はまた、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。実施態様の１つでは、本キットは、１つまたは２つ以上の本発明のビリンレダクターゼ（例えばＨＹ２ファミリーメンバー）、および／または本発明の１つまたは２つ以上のビリンレダクターゼをコードする核酸を含む容器を含む。或る実施態様では、本キットは、ホスト細胞でホロフィトクロム（例えばビリン発色団またはフィロフルア）を発現および会合させるために十分な核酸を含む容器を含む。そのようなキットは、場合によってアポタンパク質をコードするベクターを含み、さらに場合によって前記ベクターに核酸を挿入するために制限部位を含み、それによって前記異種核酸がアポタンパク質との融合タンパク質を発現する。
【００７８】
前記キットは、本発明の方法の実施を容易にするために場合によって装置および試薬を含む。そのような装置および試薬には、マイクロタイタープレート（例えば高処理用）、培養プレート、培養液、細胞株、緩衝液、標識などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
さらに、キットは場合によって、本発明の方法を実施するための標識および／または指示（すなわちプロトコル）を提供する説明物を含む。好ましい説明物には、ビリンレダクターゼの発現および／または、ホロフィトクロムおよび／またはフィトフルアのｉｎ ｖｉｖｏ発現／会合、および／またはホロフィトクロムまたはフィトフルアで標識された（融合タンパク質として）ポリペプチドの発現が記載されている。
説明物は典型的にはタイプで打たれたものまたは印刷物を含むが、そのようなものに限定されない。そのような説明を保存しさらにそれらを末端ユーザーに伝えることができるいずれの媒体も本発明に包含される。そのような媒体には、電子保存媒体（例えば磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えばＣＤＲＯＭ）などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。そのような媒体には、前記説明物を提供するインターネットサイトへのアドレスを含むことができる。
【００７９】
【実施例】
以下の実施例は例示のために提供されるが、本発明の請求の範囲を限定するものではない。
実施例１
シロイヌナズナのＨＹ２遺伝子はフィトクロモビリンシンターゼ、フェレドキシン依存ビリベルジンレダクターゼをコードする
植物の光受容体、フィトクロムによる光の感知にはテトラピロール発色団、フィトクロモビリン（ＰΦＢ）が要求され、前記は大きなアポタンパク質に共有結合により付着している。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の変異体ｈｙ１およびｈｙ２（前記はＰΦＢ生合成に欠損を有する）は、光活性フィトクロムにおける欠損のために光に対して異なる反応を示す。本実施例では、遺伝子地図を基にしたクローニングによるＨＹ２遺伝子の単離を述べる。ｈｙ２変異体の対立遺伝子座は、この遺伝子座の中に変化を有し、前記変化のいくつかはＨＹ２転写物の発現に影響を与える。ＨＹ２は、仮定的なＮ−末端色素体輸送ペプチドをもつ３８ｋＤの可溶性タンパク質前駆体をコードする。前記ＨＹ２輸送ペプチドは、レポーター緑色蛍光タンパク質を色素体に配置するために十分である。精製した成熟リコンビナントＨＹ２タンパク質は、ＰΦＢシンターゼ活性（すなわち、ビリベルジンＩＸαのＰΦＢへのフェレドキシン依存還元）を示す（前記の活性は、ＨＰＬＣによって、さらにビリン反応生成物がアポフィトクロムと一緒になって光活性ホロフィトクロムを産生する能力によって確認された）。データベース検索およびハイブリダイゼーション実験によって、ＨＹ２は、酸素放出型光合成細菌で見出されるタンパク質ファミリーと関連する、シロイヌナズナのゲノムに固有の遺伝子であると考えられる。
【００８０】
序
植物はそれらの環境に対して極めて鋭敏である。植物は固着性で、さらに光合成のためのエネルギー源として光を利用するので、それらは、その増殖と生育を調節するために非常に洗練された光受容体およびシグナリング系を発達させてきた。フィトクロムのファミリー（これらは赤色光および近赤外光に対する感覚性光受容体である）は、植物の生育中に光の質、量、方向および時間に対する反応の仲介に重要な役割を果たす（Ｋｅｎｄｒｉｃｋ ａｎｄ Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ （１９９４） ”Ｐｈｏｔｏｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ” （Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｍｄｓ：Ｍａｒｔｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）； Ｑｕａｉｌ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：６７５−６８０； Ｆｕｒｕｙａ ａｎｄ Ｓｃｈａｅｆｅｒ （１９９６） Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． １：３０１−３０７； Ｎｅｆｆ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １４：２５７−２７１）。植物のフィトクロムは、各々が約１２５ｋＤのサブユニットで構成されるホモダイマーで、チオエーテル連結されたフィトクロモビリン（ＰΦＢ）補欠分子団を有する（Ｌａｇａｒｉａｓ ａｎｄ Ｒａｐｏｐｏｒｔ （１９８０） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０２：４８２１−４８２８）。フィトクロムの作用は、赤色光吸収型と近赤外光吸収型との間で光により変換されるその能力に左右される。前記能力は、ホロフィトクロム中で共有結合により結合したＰΦＢによって付与される特性である。
【００８１】
ホロフィトクロムの生合成には２つの経路が含まれる。１つはアポタンパク質のための経路（アポタンパク質は小さなマルチ遺伝子ファミリーによってコードされる、例えばシロイヌナズナのＰＨＹＡ−Ｅ）（Ｓｈａｒｒｏｃｋ ａｎｄ Ｑｕａｉｌ （１９８９） Ｇｅｎｓ Ｄｅｖ． ３：１７４５−１７５７； Ｃｌａｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２５：４１３−４２７）であり、他方はＰΦＢの合成のための経路である（Ｔｅｒｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３０６：１−１５）。アポフィトクロムは細胞質ゾル中で合成され、一方、ＰΦＢは色素体の中で完全に合成され、続いて細胞質ゾル中に遊離され、細胞質ゾルでホロフィトクロムの会合が生じる（図２）。精製フィトクロムの分光光学的実験を基に、リコンビナントアポフィトクロムを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏのビリン会合実験および発色団欠損変異体の生理学的分析によって、ＰΦＢは、全ての高等植物および地中植物のフィトクロムの直接の発色団前駆体のように思われる（Ｔｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３０６：１−１５； Ｔｅｒｒｙ （１９９７） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ． ２０：７４０−７４５）。
【００８２】
ＰΦＢは５−アミノレブリン酸から合成され、葉緑素およびヘム生合成経路と多くの中間体を共有する（Ｅｌｉｃｈ ａｎｄ Ｌａｇａｒｉａｓ （１９８７） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ８４：３０４−３１０； Ｅｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：１８３−１８９）。これらの分析によって、ビリベルジンＩＸα（ＢＶ）はＰΦＢ前駆体であることが確立され、フィトクロム発色団生合成経路のヘムの中間物質性を示唆した。実際、ＰΦＢ生合成の最初の付託工程は、フェレドキシン依存ヘムオキシゲナーゼによって触媒され、前記酵素は、シロイヌナズナのＨＹ１遺伝子およびコメではそのオルソロガス体によってコードされる（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９６：６５４１−６５４６； Ｍｕｒａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １１：３３５−３４７； Ｉｚａｗａ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２２：３９１−３９９）。フェレドキシン依存ヘムオキシゲナーゼは先ず初めに紅藻類およびシアノバクテリアで特定された。前記生物では、それらはヘムからＢＶへの酸素依存変換を触媒する（Ｂｅａｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｊｏ （１９８４） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２３５：３７１−３８４； Ｃｏｒｎｅｊｏ ａｎｄ Ｂｅａｌｅ （１９８８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：１１９１５−１１９２１； Ｃｏｒｎｅｊｏ ａｎｄ Ｂｅａｌｅ （１９９７） Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈ． Ｒｅｓ． ５１：２２３−２３０； Ｃｏｒｎｅｊｏ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｌａｎｔ Ｊ． １５：９９−１０７）。したがって、ＢＶは、フィコビリンのフィコシアニンおよびフィコエリスロビリンの生合成経路と同様に、ＰΦＢの生合成経路で最初に付託される中間体である（フィコシアニンおよびフィコエリスロビリンは、シアノバクテリア、紅藻類および地中単細胞生物のフィコビリタンパク質の集光補欠分子団の前駆体である）（Ｂｅａｌｅ （１９９３） Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９３：７８５−８０２）。
【００８３】
植物では、ＢＶは、フェレドキシン依存ビリンレダクターゼＰΦＢシンターゼ（これはまだクローニングされていない）によって続いて３Ｚ−ＰΦＢに還元される（Ｔｅｒｒｙ ａｎｄ Ｌａｇａｒｉａｓ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２２１５−２２２２１）。３Ｚ−ＰΦＢは、フィトクロム発色団の機能的前駆体として作用することができるが、３Ｅ−ＰΦＢ（これもフィトクロム発色団の前駆体である）へのその容易な異性化はおそらく植物内で行われるであろう（Ｔｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：１１１１１−１１１１８）。フェレドキシン依存ビリンレダクターゼはまたシアノバクテリアおよび紅藻類にも存在し、これら生物で、前記酵素はＢＶからフィコビリンへの変換を触媒する（以下の文献によって概論されている：Ｂｅａｌｅ （１９９３） Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９３：７８５−８０２）。これらビリンレダクターゼのいずれもこれまでクローニングされていない。
【００８４】
植物における光形態形成についての我々の理解は、光に対する反応が傷害された５つの古典的なシロイヌナズナの光形態形成変異体（ｈｙ１からｈｙ５）の単離によって大きく促進された（Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆ ｅｔ ａｌ． （１９８０） Ｚ． Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ． １００：１４７−１６０）。光受容体欠損変異体は、光受容体が特定の光形態形成反応を仲介することを調べるための強力なツールであることを証明した（Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆ ａｎｄ Ｋｅｎｄｒｉｃｋ （１９９４） Ｐｈｏｔｏｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ． Ｐｐ．６０１−６２８， ”Ｐｈｏｔｏｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ”， Ｒ．Ｅ． Ｋｅｎｄｒｉｃｋ ａｎｄ Ｇ．Ｈ．Ｍ． Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ， ｅｄｓ Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ： Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂ．； Ｗｈｉｔｅｌａｍ ａｎｄ Ｄｅｖｌｉｎ （１９９７） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ． ２０：７５２−７５８）。
【００８５】
フィトクロム発色団欠損変異体（シロイヌナズナのｈｙ１およびｈｙ２、トマトのｙｇ−２およびａｕｒｅａ、エンドウのｐｃｄ１およびｐｃｄ２、並びにニコチアナ＝プラムバギニフォリア（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）のｐｅｗ１およびｐｅｗ２を含む）は、しばしばフィトクロム欠損変異体として用いられてきた（以下の文献に概略されている：Ｔｅｒｒｙ （１９９７） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ． ２０：７４０−７４５）。トマトのａｕｒｅａ変異体は、フィトクロムの生理学的研究、他の光受容体の研究、およびフィトクロムシグナリングの研究に広く用いられてきた（Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｌａｎｔａ １８８：３９−４７； Ｂｏｗｌｅｒ ａｎｄ Ｃｈｕａ （１９９４） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ６：１５２９−１５４１）。これら変異体の分子レベルの情報は、これら変異体に関する生理学的実験の解釈に役立つであろう。生化学的分析によって、ｈｙ１、ｐｃｄ１およびｙｇ−２変異体は、ＢＶがヘムから合成される工程で欠陥を有し、一方、ｐｃｄ２およびａｕｒｅａ変異体はＰΦＢをＢＶから合成することができないことが確認された（Ｔｅｒｒｙ ａｎｄ Ｋｅｎｄｒｉｃｋ （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：２１６８１−２１６８６； ｖａｎ Ｔｕｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ９：１７３−１８２； Ｗｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：５５−６７； Ｗｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐｌａｎｔ Ｊ． １１：１１７７−１１８６）。ＨＹ１のクローニングは、第一番目に付託されるフィトクロム発色団生合成酵素、ヘムオキシゲナーゼに対する貴重な理解を提供した（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９６：６５４１−６５４６； Ｍｕｒａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． （１９９９） ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １１：３３５−３４７）。
【００８６】
５つの古典的光形態形成変異体のうち、ｈｙ２のみがまだクローニングされていない。ＨＹ２はＰΦＢシンターゼをコードすると広く信じられている。しかしながら、ｈｙ２変異体はＢＶ処理によって部分的に“救済”されるという所見は他の可能性も示唆している（Ｐａｒｋｓ ａｎｄ Ｑｕａｉｌ （１９９１） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３：１１７７−１１８６）。ｈｙ２変異体はｈｙ１変異体と類似しているが、ｈｙ２変異体の葉緑素欠損表現型は典型的には過酷さは少ない（Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆ ｅｔ ａｌ． （１９８０） Ｚ． Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ． １００：１４７−１６０； Ｃｈｏｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：８６７−８８０）。シロイヌナズナのＨＹ２の遺伝子の特定はこれらのパラドックスを解明するために役立つはずである。本実験では、我々は、シロイヌナズナのｈｙ２変異体のフィトクロム欠損表現型の分子的基礎について述べる。我々は、ＨＹ２遺伝子は、ＰΦＢシンターゼ（色素体におけるフィトクロム発色団生合成の最初の工程に必要なフェレドキシン依存ＢＶレダクターゼ）をコードすることを示す。この実験によって、我々は、フィコビリタンパク質産生光合成生物における、ＨＹ２に関連するフェレドキシン依存ビリンレダクターゼファミリーの他のメンバーを特定することができた。
【００８７】
結果
細密マッピングによってＨＹ２遺伝子の位置は２つのオーバーラップする細菌人工染色体クローンに存在することが判明した
我々は位置クローニング手法を用いてＨＹ２遺伝子（以前にマッピングにより染色体３に位置することが判明した）を単離した。ｈｙ２の長い胚軸表現型は幼苗でスコアをつけるのが容易であるので、ＨＹ２遺伝子座は古典的マッピングの有用な目印として役立った。細密マッピングのために、我々は、ランズバーグ（Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ）のｅｒｅｃｔａ（Ｌｅｒ）生態型を野生型コロンビア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ）生態型と交配し、ｈｙ２表現型をもつ分断Ｆ２集団をＤＮＡ調製に用いた。第一に、約４００の植物からＤＮＡを調製し、切断増幅された多形性配列（ｃｌｅａｖｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ， ＣＡＰＳ）マーカー（Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙ ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９３） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ４：４０３−４１０）（前記は我々が開発し、シロイヌナズナ情報リソース（ ＴＡＩＲ；　ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ ”ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／ｍａｐｓ／ＣＡＰＳ＿Ｃｈｒ３．ｈｔｍｌ” ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／ｍａｐｓ／ＣＡＰＳ＿Ｃｈｒ３．ｈｔｍｌ）のデータベースで入手することができる）を用いてｈｙ２の遺伝子マッピングを実施した。約４００の植物を用いて、我々は、位置決めマーカーｃＭＬＰ３Ｅ−１およびｃＦ３Ｌ２４間の約３６０ｋｂの間隔をＨＹ２についてマッピングし（図３Ａ）、この領域の組換え頻度は予想よりもはるかに低いことが示された。したがって、我々はマッピング集団サイズを約２０００植物に増やした。このアプローチによって、我々は、マーカーｃＭＺＢ１０およびｃＦ３Ｌ２４間の約６６ｋｂの間隔をＨＹ２遺伝子座についてマッピングすることができた。
【００８８】
これらのマッピング実験の間に、２つの細菌人口染色体クローン、ＭＺＢ１０およびＦ３Ｌ２４（上記で遺伝的に特定されたＨＹ２遺伝子座に広がっている）の配列がＧｅｎＢａｎｋデータベースに寄託された（承認番号ＡＣ００９３２６およびＡＣ０１１４３６）。もっとも近傍の組換え間の領域には少なくとも２１の仮定的遺伝子が存在する。我々は以下の予想を基にＨＹ２候補遺伝子をスクリーニングした。第一に、いずれのフェレドキシン依存ビリンレダクターゼの遺伝子配列もタンパク質配列も知られていないので、ＨＹ２は仮定的遺伝子として分類されるべきである。第二に、ＰΦＢシンターゼの酵素活性は色素体で検出されたので（Ｔｅｒｒｙ ａｎｄ Ｌａｇａｒｉａｓ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２２１５−２２２１１）、ＨＹ２は色素体輸送ペプチドを有しているはずである。第三に、ＨＹ２関連ビリンレダクターゼ活性はシアノバクテリアで報告されたので（Ｃｏｒｎｅｊｏ ａｎｄ Ｂｅａｌｅ （１９９７） Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈ． Ｒｅｓ． ５１：２２３−２３０）、ＨＹ２と未特定の開放読み枠（ＯＲＦ）との間で弱い配列類似性が完全に配列決定されたシアノバクテリアの細菌ゲノムで検出できる可能性がある。ＨＹ２領域の２１の全ての遺伝子についての予想アミノ酸配列をＴＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０）およびＣＨＬＯＲＯＰ（Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ８：９７８−９８４； ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＣｈｌｏｒｏＰ／）分析に用いた。これらの基準によって、２つの別個の注釈をもつこれら遺伝子、ＭＺＢ１０．１８（ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＡＣ００９３２６−１８）またはＦ３Ｌ２４．１（ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＡＣ００１１４３６−１）の１つがＨＹ２の強力な候補であるように思われた。
【００８９】
ＨＹ２遺伝子は野生型および変異体の対立遺伝子座のＤＮＡ配列によって特定される
ＨＹ２遺伝子の特定を容易にするために、プローブとしてＭＺＢ１０．１８／Ｆ３Ｌ２４．１のｃＤＮＡを用いて、野生型およびｈｙ２変異体の幼苗のＲＮＡゲルブロット分析を実施した。ｈｙ２表現型は幼苗で容易に観察されるので、我々は、シロイヌナズナの幼苗の転写物の蓄積を分析した（図４）。転写物は検査した３つの生態型の野生型で検出された。ＣｏｌのｍＲＮＡの低速移動はゲルの人工的産物であることが立証された（データは示されていない）。ＲＮＡゲルブロッティングによって、転写物のレベルはｈｙ２−１、ｈｙ２−１０６、およびｈｙ２−１０７変異体で極めて減少し、他の変異体株ではわずかに減少することが示された。その結果、我々はＭＺＢ１０．１８／Ｆ３Ｌ２４．１遺伝子に注目した。変異がＨＹ２変異体のＭＺＢ１０．１８／Ｆ３Ｌ２４．１遺伝子に存在するのか否かを決定するために、種々のｈｙ２対立遺伝子座の上流の遺伝子の末端から下流の遺伝子の開始までの領域に一致するＤＮＡフラグメントをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅させた。ＰＣＲ生成物からヌクレオチド配列を直接決定した。検査した全てのｈｙ２対立遺伝子座で、ヌクレオチド置換または欠失が検出された（図３Ａおよび３Ｂ）。これらのデータおよび下記に提示する生化学的データを基にして、我々は、ＭＺＢ１０．１８／Ｆ３Ｌ２４．１遺伝子座はＨＹ２遺伝子に一致すると結論する。
【００９０】
ＭＺＢ１０．１８およびＦ３Ｌ２４．１のＨＹ２遺伝子の注釈における矛盾の結果として（すなわち、前者は２７３アミノ酸のタンパク質をコードし、後者は３２９アミノ酸のタンパク質をコードする）、我々はＨＹ２遺伝子の構造を実験的に立証しようと試みた。前記目的のために、コロンビアの幼苗のｍＲＮＡから調製した７つのｃＤＮＡクローンを、調査した約３０００００クローンから単離した。それぞれ別個のｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を決定した。それらは、Ｆ３Ｌ２４．１の注釈のそれと適合するただ１つの読み枠を明らかにした。ＨＹ２遺伝子は、５１ヌクレオチドから２２２ヌクレオチドの範囲の８つの小さなエクソンを含み、前記エクソンは７４から１８３ヌクレオチドの範囲の７つのイントロンによって分離されている。もっとも長いｃＤＮＡ挿入物は、完全長の９９０ｂｐのＯＲＦ、９５ｂｐの５´非翻訳領域、２３１ｂｐの３´非翻訳領域、およびポリ（Ａ）＋ストレッチを図５に示すように含んでいた（日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）承認番号ＡＢ０４５１１２）。
【００９１】
図３Ａは、ｈｙ２対立遺伝子座に変異位置をもつＨＹ２遺伝子のゲノム構造を示している。２つのｈｙ２対立遺伝子座、ｈｙ２−１０２およびｈｙ２−１０７は、それぞれ７番目および５番目のイントロンの３´スプライス部位に点変異をもつことが分かった。３´スプライス部位の必須のＡＧジヌクレオチドのＧにおけるそのような変異は、下流のＡＧで誤スプライシングを発生させ、タンパク質のフレームシフトが生じることが報告されている（Ｂｒｏｗｎ （１９９６） Ｐｌａｎｔ． Ｊ． １０：７７１−７８０）。ｈｙ２−１０５はもう１つの可能なスプライシング変異体であり、第二のイントロンに２５ｂｐの欠失を有していた。この変異体は、末端が切断され５７ヌクレオチドで、シロイヌナズナのイントロンの平均サイズ（２４０ヌクレオチド）よりはるかに小さい。イントロンスプライシングの効率は、最小イントロンサイズ要件（Ｄｅｕｔｓｃｈ ａｎｄ Ｌｏｎｇ （１９９９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７：３２１９−３２２８）のために低下するかもしれない。ただし、我々は、欠損の重要性をプレ−ｍＲＮＡスプライシングで実験的にチェックをしなかった。高速ニュートロン生成対立遺伝子座、ｈｙ２−１０６は第一のエクソンに５ｂｐの欠失を含み、即終止コドン（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ）を形成している。４つのエチルメタンスルホネート生成対立遺伝子座、ｈｙ２−１、ｈｙ２−１０１、ｈｙ２−１０３、およびｈｙ２−１０４はただ１つのヌクレオチド変化を有し、対応する野生型と比較してアミノ酸置換を生じる。これらの対立遺伝子座のうち２つ、ｈｙ２−１およびｈｙ２−１０４は同じ変異（Ｐ１２８Ｌ）を有し、一方、ｈｙ２−１０１およびｈｙ２−１０３はＧ１８１ＲおよびＲ２５２Ｑ置換をそれぞれ有する。
【００９２】
ＨＹ２タンパク質はシアノバクテリアタンパク質ファミリーと関連を有する
ｃＤＮＡ配列分析によれば、ＨＹ２タンパク質は、計算分子量が３８．１ｋＤの３２９残基を含む。そのＮ末端に、ＨＹ２タンパク質配列は豊富なセリンを有し、酸性残基はわずかであり（４５残基のうちセリンが６つ、アスパラギン酸が１つ）、このことは、色素体に配置させるための輸送ペプチドの可能性を示唆している（Ｇｒａｖｅｌ ａｎｄ ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ （１９９０） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２６１：４５５−４５８）。開始メチオニンの次の第二のアミノ酸はアラニンで、これは、色素体輸送ペプチドではしばしば観察される。ＣＨＬＯＲＯＰプログラムを再度使用して、ＨＹ２の輸送ペプチドを予測したところ、ＨＹ２タンパク質の最初の４５アミノ酸残基は葉緑体輸送ペプチドを形成することが示された（Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ８：９７８−９８４； ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＣｈｌｏｒｏＰ／）。計算で得た成熟ＨＹ２タンパク質の分子量は３３．０ｋＤで、その予想ｐＩは５．６６である。これらの値は、エンバクの幼苗から精製したＰΦＢシンターゼのものと類似している。ＨＹ２タンパク質は予想されるトランスメンブレンらせんをもたず、このことは、エンバクのＰΦＢシンターゼが可溶性タンパク質であるという観察とも一致している。
【００９３】
照会配列としてＨＹ２タンパク質配列を用いて、我々は、非冗長ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬデータベース（ ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ ”ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｐｓｉｂｌａｓｔ．ｃｇｉ” ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｐｓｉｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）の反復ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索をデフォルト検索パラメータを用いて実施した（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２）。驚くべきことに、ＨＹ２関連遺伝子は、この検索によってほぼ完全なシロイヌナズナゲノムで特定されなかった。対照的に、この検索により２つの海洋シアノバクテリア、プロクロロコッカス＝マリヌス亜種ＳＳ１２０（ＥＭＢＬ承認番号ＣＡＢ９５７００．１およびＣＡＢ９５７０１．１）およびシネココッカス亜種ＷＨ８０２０（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ承認番号Ｑ０２１８９およびＱ０２１９０）からＨＹ２関連配列、並びにシアノバクテリアシネコシスチス亜種ＰＣＣ６８０３から関連タンパク質配列（シアノベース遺伝子座ｓｌｒ０１１６；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ承認番号Ｓ７６７０９）が特定された。両海洋シアノバクテリアは、マルチ遺伝子オペロンの一部分であると思われる２つのＨＹ２関連ＯＲＦを所有する。興味深いことには、シネココッカスのＯＲＦ、ｙｃｐ２＿ｓｙｎｐｙおよびｙｃｐ３＿ｓｙｎｐｙは、フィコビリタンパク質生合成に関与する遺伝子クラスター内に位置し（Ｗｉｌｂａｎｋｓ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ （１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１２２６−１２３５）、一方、プロクロロコッカスＯＲＦ（我々はこれらをｙｈｐ２＿ｐｒｏｍａおよびｙｈｐ３＿ｐｒｏｍａと称する）は、ヘムオキシゲナーゼ関連遺伝子（ＧＢ：ＡＪ２７８４９９．１）の直ぐ下流に位置する。
【００９４】
図５は、ＣＬＵＳＴＡＬＷプログラム（Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：３８３−４０２）、手動アラインメントを助けるＭＥＭＥプログラム（ ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ ”ｈｔｔｐ：／／ｍｅｍｅ．ｓｄｓｃ．ｅｄｕ／ｍｅｍｅ／ｗｅｂｓｉｔｅ／” ｈｔｔｐ：／／ｍｅｍｅ．ｓｄｓｃ．ｅｄｕ／ｍｅｍｅ／ｗｅｂｓｉｔｅ／）、およびハイライト用ＧＥＮＥＤＯＣプログラム（ ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ ”ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｓｃ．ｅｄｕ／ｂｉｏｍｅｄ／ｇｅｎｅｄｏｃ” ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｓｃ．ｅｄｕ／ｂｉｏｍｅｄ／ｇｅｎｅｄｏｃ）を用いた、ＨＹ２およびＨＹ２関連シアノバクテリア配列の最適化マルチ配列アラインメントを示している。予想されたように、ＨＹ２関連シアノバクテリアタンパク質は、ＨＹ２のＮ末端に見出される仮定的色素体輸送ペプチド配列を欠いている。ＨＹ２とシアノバクテリアＯＲＦとの間には対形式の配列同一性は極めて低い（＜２０％）。ただしＹＣＰ２＿ＳＹＮＰＹとＹＨＰ２＿ＰＲＯＭＡとの間、およびＹＣＰ３＿ＳＹＮＰＹとＹＨＰ３＿ＰＲＯＭＡとの間の類似性は、これらのタンパク質対が類似の機能を有することを示唆している。ｈｙ２−１およびｈｙ２−１０４対立遺伝子座における変異（Ｐ１２８Ｌ）が保存プロリン残基に存在するということは、酵素構造におけるこの残基の決定的な役割と一致する。プロリン残基は典型的にはｃｉｓ−ペプチド結合（前記はβターンに生じる）に含まれる。他の２つのミスセンス対立遺伝子座におけるアミノ酸変化（ｈｙ２−１０１のＧ１８１Ｒおよびｈｙ２−１０３のＲ２５２Ｑ）の調査によって、このタンパク質ファミリーではいずれの変異も強力に保存された残基と一致しないことが明らかになった。
【００９５】
ＨＹ２タンパク質は色素体に存在する
ＨＹ２のＮ末端には、葉緑体輸送ペプチドの特色を有する４５アミノ酸のストレッチが存在する。このペプチドが機能的な色素体ターゲッティング配列であるか否かを決定するために、我々は、ＨＹ２の輸送ペプチドコード領域を、クラゲの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の改変遺伝子に改変カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター（Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ６：３２５−３３０）の制御下で融合させた。この構築物をタマネギの外皮細胞およびタバコの葉にＤＮＡ被覆粒子爆撃によって導入し、一過性発現を共焦点レーザー走査顕微鏡法を用いて分析した。仮定的輸送ペプチドを含まないコントロール構築物は、タマネギ細胞の細胞質および核の全体にＧＦＰ蛍光を示したが（図６Ａ）、仮定的輸送ペプチドをＧＦＰに融合させたときは、ＧＦＰ蛍光が小さな点（おそらく色素体）に明瞭に限局するのが観察された（図６Ｂ）。より明瞭な視覚化のために、我々はまた前記構築物をタバコの葉に導入した（タバコの葉では葉緑体は保護細胞内で良好な発達を示す）。ＧＦＰ蛍光は、葉緑体の葉緑素から発する赤色の自家蛍光（図６Ｄ）と一致する卵形の構造物に重点的に局在し（図６Ｃ）、前記融合タンパク質は効率的に葉緑体に集中することを示した。この発見によって機能的な輸送ペプチドの存在が確認され、ＨＹ２遺伝子生成物は葉緑体に局在することが暗示される。
【００９６】
リコンビナントＨＹ２はＰΦＢシンターゼ活性を示す
方法の項で述べるように、輸送ペプチドを欠くＨＹ２タンパク質、ｍＨＹ２をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として合成し、アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ＧＳＴタグは位置特異的プロテアーゼ消化によって除去した。二回目のアフィニティークロマトグラフィーにより＞９０％の均質性でタンパク質が得られた。図７は、前記タンパク質の精製およびプロセッシングの結果をＳＤＳ−ＰＡＧＥで示している。１リットルの細菌培養によって約１ｍｇのリコンビナントタンパク質が得られた。ｃＤＮＡから推定されるシロイヌナズナのｍＨＹ２の分子量は３３ｋＤである。しかしながら、ｐＧＥＸ−６ｐ−１を用いるｍＨＹ２のｃＤＮＡのクローニングおよび発現戦略は、プロテアーゼ処理の後、さらに別の５つのＮ−末端アミノ酸（ＧＰＬＧＳ）を必要とした。
【００９７】
ｍＨＹ２がＰΦＢシンターゼ活性を有するか否かを決定するために、ＢＶをＰΦＢに還元する能力を先ず“共役”ホロフィトクロム会合アッセイを用いて評価した（前記アッセイでは、反応生成物をリコンビナントシアノバクテリアフィトクロム１（Ｃｐｈ１）アポタンパク質とインキュベートした（Ｙｅｈ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１５０５−１５０８））。
図８は、ＧＳＴ−ｍＨＹ２を発現している細菌の細胞非含有粗抽出物のＰΦＢシンターゼアッセイのビリン生成物とともにアポＣｐｈ１をインキュベートした後で得られたフィトクロム識別スペクトルを示している。前記識別スペクトルは６７６ｎｍにピークを、７２４ｎｍに谷を有する。これはＰΦＢ−Ｃｐｈ１アダクツと一致する（Ｙｅｈ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１５０５−１５０８）。前記の活性は未精製大腸菌溶解物の成分によるものではないことを確認するために、ＢＶからＰΦＢに還元する精製ｍＨＹ２の能力を、共役会合アッセイをＨＰＬＣアッセイとともに用いて分析した。図８に示したものと同一のフィトクロム識別スペクトルが得られた（データは示されていない）。ＰΦＢシンターゼアッセイ混合物のＨＰＬＣの結果は図９に示されている。標準的ＰΦＢシンターゼアッセイ条件下でＨＹ２を３０分インキュベートした後、全てのＢＶがＰΦＢに変換された。興味深いことには、３Ｚ−および３Ｅ−ＰΦＢ両異性体が生成された。但し３Ｅ−ＰΦＢ異性体の相対量は個々のＨＹ２サンプルについて変動し、残留するグルタチオンの存在による人工産物であるのかもしれない。
【００９８】
考察
シロイヌナズナのｈｙ２変異体は、Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆら（Ｚ． Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ． １００：１４７−１６０（１９８０））によって最初に同定された５つの古典的長胚軸変異体の１つである。ｈｙ２変異体はフィトクロムの欠損のために光形態形成が遺伝学的に傷害されているということは、生理学的および光生物学的な分析によって十分に証明されている（Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆ ｅｔ ａｌ． （１９８０） Ｚ． Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ． １００：１４７−１６０； Ｃｈｏｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：８６７−８８０； Ｐａｒｋｓ ａｎｄ Ｑｕａｉｌ （１９９１） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３：１１７７−１１８６； Ｇｏｔｏ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． ５７：８６７−８７１）。前記文献（Ｐａｒｋｓ ａｎｄ Ｑｕａｉｌ （１９９１） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３：１１７７−１１８６）では、ｈｙ１およびｈｙ２変異体の長い胚軸表現型は、ＢＶ供与によって部分的に“救済”されることが示され、これらの変異体はフィトクロム発色団の生合成経路に損傷を有すると提唱された。実際、ＨＹ１は、色素体に局在するヘムオキシゲナーゼ（ヘムの切断を触媒してＢＶを形成する）をコードする（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９６：６５４１−６５４６； Ｍｕｒａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １１：３３５−３４７）。本実施例によって、ＨＹ２は、ＰΦＢシンターゼ（ＢＶからＰΦＢへのフェレドキシン依存変換に必要な色素体に局在する酵素）をコードすることが確認された。相補性実験は現在進行中であるが、８つの変異体の対立遺伝子座の配列分析は、分子の損傷がＨＹ２遺伝子内に存在することを明らかにした。ｈｙ２対立遺伝子座の多くはまた、ＨＹ２転写物の発現の変化を示し、この遺伝子の発現低下は長胚軸の表現型の要件であるという強力な証拠を提示した。
【００９９】
機能的な色素体ターゲッティング配列がＨＹ２に存在することを根拠に、我々は、ＰΦＢの完全な生合成経路は色素体の中で生じると確信的に結論することができる。にもかかわらず、また別の経路が細胞下区画に存在する可能性を完全には排除することはできない。これに関しては、シロイヌナズナにはＨＹ１の他に３つのヘムオキシゲナーゼ遺伝子が存在し、それらの生成物がまた別の回路で役割を果たすかもしれない（Ｍ． Ｍａｓｕｄａ， Ｔ． Ｍｕｒａｍｏｔｏ ａｎｄ Ｔ． Ｋｏｈｃｈｉ， 未発表データ）。しかしながら、我々のデータベース検索は、ＨＹ２と統計的に有意の類似性を示す他の遺伝子はシロイヌナズナゲノムには存在しないことを示した。ＨＹ２と葉緑素の異化作用に関与するフェレドキシン依存ビリンレダクターゼ（赤色葉緑素異化物レダクターゼ）との間には弱い類似性がプロフィール分析で示されたが、赤色葉緑素異化物レダクターゼはＢＶからＰΦＢへの還元を触媒しない（Ｗｕｔｈｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２１：１８９−１９８）。したがって、ＨＹ２はシロイヌナズナで唯一のＰΦＢシンターゼ遺伝子であるように思われる。
【０１００】
ｈｙ１とｈｙ２変異体の生理学的比較は、ｈｙ１植物はより過酷なフィトクロム欠損表現型をもつことを示している（Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆ ｅｔ ａｌ． （１９８０） Ｌ． Ｈｅｙｎｈ． Ｚ． Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ． １００：１４７−１６０； Ｃｈｏｒｙ （１９８９） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：８６７−８８０）。これらの観察は、シロイヌナズナにおけるＨＹ２遺伝子の明白な固有性および多数のＨＹ１関連タンパク質の存在から見れば幾分驚くべきことである。しかしながら、これは、調べられたｈｙ１およびＨＹ２対立遺伝子座の強さを反映しているのかもしれない。これに関しては、ＢＶで処理したｈｙ２−１変異体の部分的救済（Ｐａｒｋｓ ａｎｄ Ｑｕａｉｌ （１９９１） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３：１１７７−１１８６）は、Ｐ１３１Ｌミスセンス変異は、ＢＶに対してより低い親和性を有する部分的に活性な酵素を生じるという仮説によって説明することができる。また別の選択肢として、シロイヌナズナでＢＶはＨＹ２と無関係の酵素によってＰΦＢに変換されるのかもしれない。フィトクロム発色団生合成の変異体は他の植物種でも特定された（Ｔｅｒｒｙ （１９９７） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ． ２０：７４０−７４５）。全ての事例で、２つの変異体クラスが特定された。すなわちヘムオキシゲナーゼに欠損をもつ変異体およびＰΦＢシンターゼに欠損をもつ変異体である。生化学的分析によれば、トマトのａｕｒｅａ変異体およびエンドウのｐｃｄ２変異体はＰΦＢシンターゼ活性に欠損を有する（ｖａｎ Ｔｕｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ９：１７３−１８２； Ｗｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐｌａｎｔ Ｊ． １１：１１７７−１１８６）。これらの植物種における対応するヘムオキシゲナーゼ変異体（すなわち、それぞれｙｇ−２およびｐｃｄ１）はより過酷でない表現型を示し、このことは、この２つの遺伝子座の相対的な対立遺伝子座の強度が表現型を決定するという仮説をさらに支持する。ｈｙ１およびｈｙ２のヌル対立遺伝子座（例えばｈｙ２−１０６およびｈｙ２−１０７）の表現型の比較はこの疑問の解明に役立つはずである。
【０１０１】
シロイヌナズナのＨＹ２遺伝子のクローニングは、ＰΦＢシンターゼ遺伝子を他の植物種から識別し、ａｕｒｅａおよびｐｃｄ２における変異は相同遺伝子で生じることを確認するために役立つであろう。トマトのａｕｒｅａ変異体を重点的に用いてフィトクロムのシグナルトランスダクションが分析され（Ｂｏｗｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｃｅｌｌ ７７：７３−８１）、この変異の分子レベルの情報は非常に興味深いものであった。そのような変異の分子レベルの理解は、タンパク質対タンパク質相互作用（すなわちＨＹ２とフェレドキシンとの間またはＨＹ１とＨＹ２との間の相互作用）と同様に、基質および／または潜在的な補助因子（すなわち金属イオンまたは有機単一電子担体）との相互作用に対して必須である残基についての洞察を与えるはずである。ＨＹ１−およびＨＹ２−特異的ｃＤＮＡプローブおよび両酵素に対する特異的抗体の利用可能性は、フィトクロム発色団の生合成の調節を調べる実験を容易にするであろう。そのようなプローブを用いて、いくつかの重要な問題を取り扱うことができる。この２つの酵素は全ての組織で統合的に発現されるのか。それらの発現は空間的および時間的に調節されるのか。ＨＹ１およびＨＹ２タンパク質は、ヘムからＰΦＢへの変換のルートである色素体で二種酵素複合体を形成するのか。ＨＹ１の発現はＨＹ２の発現に影響を与えるのか、またその反対はどうか。
【０１０２】
ＨＹ２の分子クローニングは、一般的なビリン生合成に関する我々の情報に飛躍的な突破口を提供した。我々の生物学的情報は、ＨＹ２が未知の機能をもつ多くのシアノバクテリアの遺伝子と関係を有することを明らかにした（図５）。実際、我々は、これらのＨＹ２関連タンパク質は集光フィコビリタンパク質フィコシアノビリンおよびフィコエリスロビリンの発色団前駆体の生合成に必要な酵素であると考えている。種々の基質／生成物特異性を有する酵素の場合に期待されるように、これらのタンパク質はＨＹ２から非常に分岐している（配列同一性は＜２０％）。これらのタンパク質とＨＹ２との間の同一性レベル（これらは図５に示されている）はおそらく、全体的なタンパク質の折り畳みおよび／または全酵素ファミリーに共通のフェレドキシンとの相互作用に必要な残基を反映している。実施例２では、我々は、これらＨＹ２関連タンパク質は、その数が増えつづけている種々の二重結合特異性を有するフェレドキシン依存ビリンレダクターゼファミリーのメンバーであることを明らかにする。
【０１０３】
図１に示したフィトクロム発色団生合成経路は明瞭に証明された。フィトクロム発色団生合成経路の２つの重要な遺伝子がクローニングされたので、我々はビリン生合成がどのようにして植物全体で調節されるかという、光に反応する植物の能力にとって極めて重要な過程を説明することができる。第二のメッセンジャーとしてのビリンの可能な役割（これは、哺乳類のビリベルジンレダクターゼを発現している遺伝子導入（トランスジェニック）植物の最近の研究によって提示された（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １２１：６２９−６３９））は、植物の種々の細胞および組織内でＨＹ１およびＨＹ２遺伝子の発現を巧妙に操作することによって取り扱うことができる。終わりに当たって、フィトクロム発色団生合成および葉緑素生合成の関係を取り扱うことは、それらが生合成中間体を共有するという理由のためだけではなく、それぞれの経路が他の経路にどのように影響を及ぼすかを決定するために特に重要であろう。
【０１０４】
方法
植物材料：アラビドプシス＝タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の生態型、コロンビア（Ｃｏｌ）、ランズバーグ（Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ）ｅｒｅｃｔａ（Ｌｅｒ）、およびワシルースカヤ（Ｗａｓｓｉｌｅｗｓｋｉｊａ）（Ｗｓ）は、我々の研究室ストックから得た。本実験で用いた変異体は以下から得た：ｈｙ２−１はＭａａｒｔｅｎ Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆから（シロイヌナズナ生物学的ストックセンター（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｃｏｌｕｍｂｕｓ， ＯＨ）からＣＳ６８として配布された；Ｌｅｒ生態型）；ｈｙ２−１０１（Ｊ． Ｒｅｅｄによって最初に単離されたＥＭＳ８９Ｓ７３Ｓ−Ｅ；Ｃｏｌ生態型）、ｈｙ２−１０２（Ｊ． Ｒｅｅｄによって単離されたＥＭＳ１９５；Ｃｏｌ生態型）、ｈｙ３−１０３（Ａｌｌｉｓｏｎ Ｗｉｌｓｏｎによって単離されたＩＡＡＲ−７；Ｃｏｌ生態型）、ｈｙ２−１０５（Ｊ． Ｒｅｅｄによって単離されたγ１０−９；Ｃｏｌ生態型）およびｈｙ２−１０６（Ａｒｏｎ Ｓｉｌｖｅｒｓｔｏｎｅによって単離されたＦＮ１６−３；Ｌｅｒ生態型）はＪａｓｏｎ Ｒｅｅｄから；並びにｈｙ２−１０７（Ｎａｍ−Ｈａｉ Ｃｈｕａの研究室でＴ−ＤＮＡ系統からＨＹ２を分離させたもの；ＷＳ生態型）はＮａｍ−Ｈａｉ Ｃｈｕａから得た。植物は長日条件下で２２℃で生育室で育成した。
【０１０５】
マップ依拠クローニング：ｈｙ２−１変異体は野生型Ｃｏｌ生態型と異系交配し、長胚軸の表現型もつＦ２ファミリーからマッピング集団を選択した。ゲノムＤＮＡは文献（Ｅｄｗａｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：１３４９）に記載されたプロトコルを用いて調製した。我々は、切断増幅させた多形性配列（ＣＡＰＳ）マーカーをＣｏｌとＬｅｒとの間で用いた（Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙ ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９３） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ４：４０３−４１０）。シロイヌナズナデータベースの２つのＣＡＰＳマーカー（Ｃ６およびマンガン−スーパーオキシドジスムターゼ）、および７つの新規なＣＡＰＳマーカーはこの実験中に開発された。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅用のプライマー配列は消化に使用した酵素（括弧内に表示されている）とともに下記に挙げた：ｃ４５３は、５´−ＡＣＡＧＣＧＡＧＡＴＴＣＡＡＡＧＧＴＣＣＡＴＴＡＡＣＣＧＧＡ−３´（配列識別番号：１）および５´−ＧＧＧＣＴＴＡＣＡＧＴＧＡＴＡＴＣＴＧＣＡＡＧＡＣＴＴＣＴＡ３´（ＨｐａＩＩ）（配列識別番号：２）；ｃＭＬＰ３Ｅは、５´−ＴＡＡＴＧＣＴＴＧＣＧＡＣＡＡＡＣＡＧＧ−３´（配列識別番号：３）および５´−ＧＴＴＣＡＴＣＴＣＡＧＧＧＣＣＡＡＡＡＡ−３´（ＲｓａＩ）（配列識別番号：４）；ｃＭＸＫ７は、５´−ＧＣＴＴＴＣＡＧＡＡＡＴＣＡＧＡＣＣＴＣＡＡ−３´（配列識別番号：５）および５´−ＣＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＡＴＣＧＡＡＴＣＴ−３´（ＤｄｅＩ）（配列識別番号：６）；ｃＭＺＢ１０は５´ＣＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡＴＴＴＧＧＴＴ−３´（配列識別番号：７）および５´−ＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＴＣＴ−３´（ＢｓｒＩ）（配列識別番号：８）；ｃＭＺＢ１０．１８（＝ＨＹ２）は、５´−ＣＡＡＴＧＣＡＧＧＴＴＴＡＡＣＴＴＣＡＧＣＡ−３´（配列識別番号：９）および５´−ＣＣＡＴＧＧＧＡＡＡＧＴＣＴＧＣＡＡＡＴ−３´（ＤｄｅＩ）（配列識別番号：１０）；ｃＦ３Ｌ２４は、５´−ＴＣＡＡＧＣＣＣＴＴＴＴＣＣＡＡＣＡＴＣ−３´（配列識別番号：１１）および５´−ＴＴＣＣＣＣＡＴＣＴＧＡＡＣＴＣＡＡＣＣ−３´（ＨｉｎｆＩ）（配列識別番号：１２）；およびｃＦ８Ａ２４は、５´−ＡＡＴＧＡＴＧＣＡＴＧＧＴＧＴＴＧＧＴＧ−３´（配列識別番号：１３）および５´−ＧＣＴＣＧＡＧＧＡＡＡＡＧＴＣＡＴＣＣＡ−３´（ＭｂｏＩ）（配列識別番号：１４）。
【０１０６】
ＨＹ２遺伝子座の配列分析：プライマー対（５´−ＣＧＴＴＴＧＴＣＴＣＡＣＴＧＡＡＡＣＴＧ−３´（配列識別番号：１５）および５´−ＣＡＡＴＣＡＴＣＴＴＧＡＡＡＴＧＣＡＧＡ−３´（配列識別番号：１６））を用いて、変異体およびそれらの対応する野生型植物のＭＺＢ１０．１８領域の１．９８ｋｂフラグメントを増幅した。前記ＰＣＲ生成物をいくつかのプライマーを用いて配列決定サイクルプロトコルに直接付し、ＡＢＩ３７３Ｓ配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）で前記反応を分析した。
【０１０７】
ＨＹ２ｃＤＮＡの単離：ｃＤＮＡライブラリーは、Ｋ． Ａｎｄｏ（Ｎａｒａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によってＣｏｌ幼苗からλＺＡＰＩＩで製造元の指示にしたがって構築された。上記に記載したＭＺＢ１０．１８を含むＤＮＡフラグメントをプローブとして用い、プラークハイブリダイゼーションによって約３０００００のｃＤＮＡクローンをスクリーニングした。いくつかのｃＤＮＡプラスミドを製造元の指示にしたがってｉｎ ｖｉｖｏ切り出しによって回収した。
【０１０８】
ＲＮＡの単離および分析：ＲＮＡは、Ｉｓｏｇｅｎ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）を用い、１週齢のシロイヌナズナの全幼苗から酸グアニジニウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出法によって単離した。全ＲＮＡ（１０μｇ／レーン）を１．２％ホルムアルデヒド／アガロースゲルで電気泳動し、ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ； Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．）に移した。続いて予備ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションをチャーチ（Ｃｈｕｒｃｈ）ハイブリダイゼーション溶液（Ｃｈｕｒｃｈ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ８１：１９９１−１９９５）を用い、放射性プローブ（３×１０６から５×１０６ｃｐｍ／ｍＬ）を使用して実施した。ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ消化によって生成されたｃＤＮＡフラグメントをハイブリダイゼーションプローブとして用いた。フィルターを１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌおよび０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウムである）、０．１％のＳＤＳで室温で３回、さらに０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで（６５℃１５分）２回、ストリンジェントな条件下で洗浄した。ローディングが等しいことを示すために、ｒＲＮＡプローブをハイブリダイゼーションのために用いた。
【０１０９】
緑色蛍光タンパク質との融合による細胞内分布場所決定実験：仮定的輸送ペプチドのためのＨＹ２コード領域およびＰＣＲによって単離したフランキングアミノ酸残基（アミノ酸１から６２）、をｐＴＨ２ＸＡ（３５ＳΩ−ｓＧＦＴ−Ｓ６５Ｔに由来する改変緑色蛍光タンパク質ベクター（Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ６：３２５−３３０））でクローニングした。ｐＴＨ２ＸＡでは、５つのグリシン残基がＧＦＰとの融合結合部に含まれていた（Ｍ． Ｔａｋｅｍｕｒａ， 未発表データ）。改変ＧＦＰ遺伝子のＮ末端に融合させたＨＹ２輸送ペプチドをカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターの制御下で発現することができる前記構築物を、タマネギの鱗茎およびタバコの葉に導入した。粒子爆撃の条件は文献（Ｍｕｒａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １１：３３５−３４７）に記載されたものと同じであった。一過性発現が一晩インキュベートした後、共焦点レーザー走査顕微鏡法（ＬＳＭ５１０； Ｃａｒ Ｚｅｉｓｓ， Ｊｅｎａ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて観察された。
【０１１０】
ｐＧＥＸ−ｍＨＹ２発現ベクターの構築：ｍＨＹ２（予想される葉緑体輸送ペプチドを含まない成熟ＨＹ２遺伝子）を大腸菌発現ベクター、ｐＧＥＸ−６−Ｐ１（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）でサブクローニングし、ｐＧＥＸ−ｍＨＹ２を得た。ｍＨＹ２は、ｍＨＹ２ＢｇｌＩＩ順方向プライマー（５´−ＧＡＡＧＡＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＴＡＴＡＡＧＧ−３´、配列識別番号：１７）およびＨＹ２ＳｍａＩ逆方向プライマー（５´−ＴＣＣＣＣＣＧＧＧＴＴＡＧＣＣＧＡＴＡＡＡＴＴＧＴＣＣＴＧＴＴＡＡＡＴＣ−３´、配列識別番号：１８）を用いて増幅させ（前記プライマーはＢｇｌＩＩおよびＳｍａＩ部位（下線部）をそれぞれ含む）、ＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ消化ｐＧＥＸ−６−Ｐ１でクローニングし、ｐＧＥＸ−ｍＨＹ２を得た。前記構築物の完全性は制限分析および挿入物の完全なＤＮＡ配列決定（Ｄａｖｉｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ， Ｉｎｃ．， Ｄａｖｉｓ， ＣＡ）によって立証した。構築ベクターは、Ｐｔａｃプロモーターの制御下でシストソーマ＝ジャポニカム（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子の３´に配置されたｍＨＹ２配列を含む。プレシジョン（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ）プロテアーゼ（これもまたＧＳＴ融合タンパク質である）のための認識配列はｍＨＹ２の上流に位置している。タンパク分解切断によって、Ｎ末端に伸長した５つアミノ酸（ＧＰＬＧＳ）を有する天然のシロイヌナズナｍＨＹ２が得られる。
【０１１１】
リコンビナントｍＨＹ２の発現と精製：ｐＧＥＸ−ｍＨＹ２を含む大腸菌株ＤＨ５αを、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むルリア−ベルターニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培養液の５００ｍＬバッチで３７℃でＯＤ５７８が０．６になるまで増殖させた。１ｍＭのイソプロピルチオ−β−ガラクトシドを添加して培養を誘発し、さらに３時間インキュベートし、続いて遠心沈殿によって細菌を採集した。３リットルの培養から得た細菌のペレットを２０ｍＬの溶解緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％トリトンＸ−１００、１ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭベンゾアミダイン、２ｍＭのＰＭＳＦ、ロイペプチン（２．０μｇ／ｍＬ）、およびペプスタチンＡ（３μｇ／ｍＬ））に再懸濁させ、フレンチプレス（３×２００００ｐ．ｓ．ｉ）で破壊した。細胞屑を１０００００ｇ、３０分の遠心沈殿で除去した。得られた上清を、５カラム容積のＰＢＳで平衡化させたグルタチオン−アガロース（Ｓｉｇｍａ）カラム（１ｃｍ×３ｃｍ）に直接ロードした。未結合タンパク質は５カラム容積のＰＢＳで洗浄して除去した。ＧＳＴ−ｍＨＹ２融合タンパク質は、１０ｍＭの還元グルタチオンを含む５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶出させた。ＧＳＴ−ｍＨＹ２含有分画を一緒にし、切断緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍＭのＤＴＴ）に対して一晩透析した。融合タンパク質の消化は、１００μｇの融合タンパク質につき２単位のプレシジョンプロテアーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を添加し、４℃で５時間インキュベートして実施した。未切断融合タンパク質および切り出されたＧＳＴの除去は、消化混合物を第二のグルタチオン−アガロースカラム（１ｃｍ×３ｃｍ）にロードして実施した。リコンビナントｍＨＹ２はフロースルーで検出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析してセントリプレップ（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ）−１０濃縮装置（Ａｍｉｃｏｎ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）を用いて濃縮した。１リットルの細菌培養から約１ｍｇの精製タンパク質が得られた。
【０１１２】
タンパク質濃度の決定：タンパク質濃度は文献の方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ （１９７６） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７２：２４８−２５４）または、精製ｍＨＹ１については２８０ｎｍの吸収（１吸収単位は０．６４ｍｇ／ｍＬのｍＨＹ２を示す（Ｇｉｌｌ ａｎｄ ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ （１９８９） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８２：３１９−３２６））によって決定した。
【０１１３】
ＰΦＢシンターゼ活性アッセイ：ＰΦＢシンターゼアッセイに使用した全ての酵素はシグマ（Ｓｉｇｍａ）から入手した。ＰΦＢシンターゼの１ｍＬアッセイの場合は、アッセイされるべきタンパク質分画を、ＮＡＤＰＨ再生系（６．５ｍＭグルコース−６−ホスフェート、０．８２ｍＭのＮＡＤＰ＋、トルーラ（Ｔｏｒｕｌａ）酵母菌由来の１．１単位／ｍＬのグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼＸＩＩ型（ＥＣ１．１．１．４９））、フェレドキシン還元系（４．６μＭのホウレンソウフェレドキシン、０．０２５単位／ｍＬのホウレンソウフェレドキシン：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ（ＥＣ１．１８．１．２））および１０μＭのＢＳＡ（Ｖ分画、熱ショック）を含む、５０ｍＭのＴｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．３）で希釈した。グルコース−６−ホスフェートおよびＮＡＤＰ＋は、それぞれ１００ｍＭおよび２５ｍＭストックを水で調製し、両ストックを４℃で保存した。グルコース−６−ホスフェートストックは保存の前にフィルター滅菌した。グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼは、５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）中の５００単位／ｍＬストックとして調製し、４℃で保存した。ホウレンソウのフェレドキシン：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼは、滅菌水による１０単位／ｍＬストックとして調製し、４℃で保存した。ＢＳＡは、０．１Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ７．４）中の１００μＭストック溶液として作製し、４℃または−２０℃で保存した。反応は、５μＬのＤＭＳＯ中の５μＭ（最終濃度）の精製ビリベルジンＩＸαの添加によって開始させた（ＭｃＤｏｎａｇｈ ａｎｄ Ｐａｌｍａ （１９８０） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １８９：１９３−２０８）。アッセイ混合物を、２８℃の水浴中で緑色安全光の下、または抑制光の下で所望の時間インキュベートした。アッセイはそれらを氷上に静置することによって停止させた。生成物の分析には直接ＨＰＬＣアッセイを用いるか、または、リコンビナントシアノバクテリアアポフィトクロム１（Ｃｐｈ１）を添加した後共役アッセイを実施し識別分光法（下記を参照されたい）を用いた。
【０１１４】
直接ＨＰＬＣアッセイ：ＰΦＢシンターゼ活性の定量的分析の場合は、アッセイ混合物（上記で概略）を、以下のように予備条件付けしたウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ， Ｍｉｌｆｏｒｄ， ＭＡ）Ｃ１８セプパックライト（Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｌｉｇｈｔ， カタログ番号：ＷＡＴ０２３５０１）にロードした：セプパックを湿らすためにアセトニトリルによる３ｍＬ洗浄、ミリＱ水による３ｍＬ洗浄、さらに５０ｍＭの４−メチルモルフォリン／氷酢酸（ｐＨ７．７）による３ｍＬ洗浄。サンプルをセプパックにロードした後、セプパックを３ｍＬの４−メチルモルフォリン／氷酢酸（ｐＨ７．７）で洗浄し、続いて０．１％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸３ｍＬで洗浄した。溶出物を、スピードバク（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ）凍結乾燥装置で乾燥させた。前記乾燥サンプルをＨＰＬＣによって分析した。
【０１１５】
サンプルは先ず１０μＬのＤＭＳＯに溶解し、続いて２００μＬのＨＰＬＣ移動相（アセトン：２０ｍＭギ酸（５０：５０，ｖ／ｖ））で希釈した。サンプルを溶解した後、それらを簡単に遠心沈殿させ、０．４５μｍのポリテトラフルオロエチレン注射筒フィルターに通し、ベアリアン（Ｖａｒｉａｎ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）５０００液体クロマトグラフを用いてクロマトグラフィーを実施した。カラム溶出液をベアリアンＵＶ１００フロースルー吸収検出装置を用いて３８０ｎｍでモニターした。ピーク領域を３３６５ケムステーション（Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ）ＩＩ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ， Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて定量した。全ての分析で用いたＨＰＬＣカラムは、フェノメネックス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ， Ｔｏｒｒａｎｃｅ， ＣＡ）ウルトラカーブ（Ｕｌｔｒａｃａｒｂ）５μｍＯＤＳ（２０）４．６−ｍｍ×２５０−ｍｍ分析用カラムで、同じ材料の４．６−ｍｍ×３０−ｍｍの保護カラムを有する。このカラムに用いた移動相は、アセトン：２０ｍＭギ酸（５０：５０，ｖ／ｖ）であった。流速は０．８ｍＬ／分であった。
【０１１６】
共役識別スペクトルアッセイ：ＰΦＢシンターゼ活性の直接分析に対する別の選択肢は、共役（または間接）アッセイである。このアッセイは、以前に概略された方法（Ｔｅｒｒｙ ａｎｄ Ｌａｇａｒｉａｓ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２２１５−２２２２１）をベースにしている。ＰΦＢシンターゼのための上記のアッセイは、セプパックによってサンプルを取り扱う代わりにリコンビナントアポフィトクロム（シネコシスチス亜種ＰＰＣ６８０３由来のＣｐｈ１）の部分標本をサンプルに添加し、以前のように実施した。サンプルを緑色安全光の下でさらに２０から３０分室温でインキュベートし、続いて識別スペクトルを得た。識別分光分析のための方法は以前に報告された（Ｔｅｒｒｙ ａｎｄ Ｌａｇａｒｉａｓ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２２１５−２２２２１）。
【０１１７】
実施例２
酸素放出型光合成生物のフェレドキシン依存ビリンレダクターゼのＨＹ２ファミリーの機能的ゲノム分析
フィトビリンは、植物のフィトクロム光受容体、並びにシアノバクテリア、紅藻類および地中単細胞のフィコビリタンパク質の光合成触角の集光補欠分子団の直鎖状テトラピロール前駆体である。以前の生化学的研究によって、フィトビリンは、ビリベルジンＩＸαを媒介してヘムから合成され、前記は、続いて種々の二重結合特異性を有するフェレドキシン依存ビリンレダクターゼによって還元される。シロイヌナズナのフィトクロモビリンシンターゼ（ＨＹ２）（ＢＶからフィトクロム発色団前駆体フィトクロモビリンへのフェレドキシン依存変換を触媒する酵素）の配列を利用することによって、仮定的ビリンレダクターゼをコードする遺伝子が、種々のシアノバクテリア、オキシフォト細菌および植物のゲノムで特定された。系統的分析はＨＹ２関連遺伝子を４つのクラスに分けた。その１つは、赤色葉緑素異化物レダクターゼをコードする。前記レダクターゼは、植物の葉緑素異化作用に必要なビリンレダクターゼである。これらの仮定的酵素の触媒活性をテストするために、各クラスの代表的ＨＹ２関連遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応で増幅させ、大腸菌で発現させた。共役アポフィトクロム会合アッセイおよびＨＰＬＣアッセイを用いて、我々は、リコンビナントタンパク質のＢＶからフィトビリンへのフェレドキシン依存還元能力を調べた。これらの研究によって、フィコビリタンパク質の発色団前駆体フィコエリスロビリンおよびフィコシアノビリンの生合成に必要とされるそれぞれ異なる基質／生成物特異性を有する新規な３つのクラスのビリンレダクターゼが特定された。これらの結果に包含されるものが、フィトビリン生合成経路およびそれらの進化に関して考察される。
【０１１８】
序
フィトビリンは、集光フィコビリタンパク質および光受容体フィトクロムの発色団の直接前駆体として機能する、植物、藻類およびシアノバクテリアによって合成される直鎖状テトラピロール分子である（Ｂｅａｌｅ （１９９３） Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９３：７８５−８０２； Ｈｕｇｈｅｓ ａｎｄ Ｌａｍｐａｒｔｅｒ （１９９９） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｏｌ． １２１：１０５９−１０６８）。フィトビリン生合成経路は、植物および藻類の抽出物の生化学的な分画によって、外因性仮定的中間体による遮断工程の克服によって、さらに直鎖状テトラピロール欠損変異体の分析によって解明された（Ｂｅａｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｊｏ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２３２８−２２３３２； Ｂｅａｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｊｏ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２３３３−２２３４０； Ｂｅａｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｊｏ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２３４１−２２３４５； Ｔｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３０６：１−１５）。これらの研究によって、フィトビリンの生合成は、ヘムおよび葉緑素の生合成経路とプロトポルフィリンＩＸのレベルまで共通の中間体を共有することが示された。プロトポルフィリンの時点で、後者の２つの経路は鉄またはマグネシウムのメタル化によって分岐する（Ｂｅａｌｅ （１９９３） Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９３：７８５−８０２）。
【０１１９】
フィトビリンはヘムに由来する。ヘムは、フィトビリンの生合成で最初に付託される中間体であるビリベルジンＩＸ（ＢＶ）に変換される。紅藻類、シアノバクテリアおよび植物では、この変換は、哺乳類のヘムオキシゲナーゼと配列関連性を有するフェレドキシン依存ヘムオキシゲナーゼによって達成される（Ｃｏｒｎｊｏ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｌａｎｔ Ｊ． １５：９９−１０７； Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ９６：６５４１−６５４６； Ｍｕｒａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １１：３３５−３４７）。前記は同じ反応を触媒するが、哺乳類のヘムオキシゲナーゼはＮＡＤＰＨ依存チトクロームＰ４５０レダクターゼを用いて、ヘム異化作用のためのエネルギーを生成する（Ｍａｉｎｅｓ （１９８８） ＦＡＳＥＢ Ｊ． ２：２５７７−２５６８）。
【０１２０】
ＢＶの代謝の行方は、哺乳類、シアノバクテリアおよび植物で異なり、ＢＶは固有の二重結合特異性を有する種々のレダクターゼによって代謝される（図１）。哺乳類のビリベルジンＩＶレダクターゼ（ＢＶＲ）（これは、Ｃ１０メチン架橋でＢＶの二電子還元を触媒しビリルビンＩＸ（ＢＲ）を生成する酵素である）は、これら酵素のうち発見された最初の酵素であった（Ｍａｉｎｅｓ ａｎｄ Ｔｒａｋｓｈｅｌ （１９９３） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３００：３２０−３２６）。遺伝子ｂｖｄＲによってコードされる同様な酵素がシアノバクテリアで最近特定された（Ｓｃｈｌｕｃｔｅｒ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１３５６２−１３５６９）。シアノバクテリアおよび紅藻類もまた、それらのフィコビリタンパク質集光触角複合体の直鎖状テトラピロール前駆体の合成のための新規なフェレドキシン依存ビリンレダクターゼをもつ（Ｂｅａｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｊｏ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２３２８−２２３３２； Ｂｅａｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｊｏ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２３３３−２２３４０； Ｂｅａｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｊｏ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２３４１−２２３４５； Ｃｏｒｎｅｊｏ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｌａｎｔ Ｊ． １５：９９−１０７）。
【０１２１】
最初、紅藻類シアニジウム＝カルダリウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ ｃａｌｄａｒｉｕｍ）に関する研究を基にして、これらの研究者らは、２つの主要なフィコビリタンパク質発色団前駆体、フィコエリスロビリン（ＰＥＢ）およびフィコシアノビリン（ＰＣＢ）の生合成は、２つのフェレドキシン依存ビリンレダクターゼおよびいくつかの二重結合イソメラーゼを必要とすると提唱した。第一のビリンレダクターゼはＣ１５メチン架橋でＢＶの二電子還元を触媒して、ＢＲ異性体１５，１６−ジヒドロビリベルジン（ＤＨＢＶ）を生成し、一方、第二のビリンレダクターゼは１５，１６−ＤＨＢＶから３Ｚ−ＰＥＢの変換（Ｃ２およびＣ３１ジエン系の正式な二電子還元）を触媒する。Ｃ．カルダリウムでは、さらに別の酵素が３Ｚ−ＰＥＢから３Ｚ−ＰＣＢへの異性化を仲介する（前記は両方とも、初期フィコビリタンパク質のアポタンパク質と会合する前にそれらの対応する３Ｅ異性体に異性化されるらしい）（Ｂｅａｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｊｏ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２３２８−２２３３２； Ｂｅａｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｊｏ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２３３３−２２３４０； Ｂｅａｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｊｏ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２３４１−２２３４５）。
【０１２２】
より最近の研究の多くは、シアノバクテリアのＰＣＢおよびＰＥＢ合成の同様な経路に対して支持を与えている（Ｃｏｒｎｅｊｏ ａｎｄ Ｂｅａｌｅ （１９９７） Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈ． Ｒｅｓ． ５１：２２３−２３０）。哺乳類およびフィコビリタンパク質含有生物とは対照的に、植物および緑藻類は、フェレドキシン非依存酵素ＰΦＢシンターゼによってＢＶを３Ｚ−ＰＦＢに還元する（前記酵素は２，３，３１，３２−ジエン系を還元のための標的とする）（Ｔｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．（ １９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：１１１１１−１１１１８； Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２５７００−２５７０５）。植物では、３Ｚ−ＰΦＢはその３Ｅ異性体に異性化される（前記異性体はフィトクロム発色団の直前の前駆体のようである（Ｔｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．（ １９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：１１１１１−１１１１８）。緑藻類メゾテニウム＝カルダリオルム（Ｍｅｓｏｔａｅｎｉｕｍ ｃａｌｄａｒｉｏｒｕｍ）は、ＰΦＢの１８−ビニル基の還元を触媒して３Ｚ−ＰＣＢを生じる第二のビリンレダクターゼ活性を有する（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｒ１５Ｒ１５）。これらの研究もまた、３Ｅ−ＰＣＢは、前記生物で天然のフィトクロム発色団の前駆体であることを示した。
【０１２３】
植物、藻類およびシアノバクテリアにおけるフィトビリン生合成経路の豊富な生化学的分析にもかかわらず、ビリンレダクターゼの発現レベルの低さによって、これらの酵素をクローニングしようとする努力はこれまで妨げられてきた。遺伝学的アプローチを用いて、シロイヌナズナのＨＹ２遺伝子座（これは酵素ＰΦＢシンターゼをコードする）をクローニングした（実施例１）。
ここに報告する実験は、タンパク質データベースおよび核酸データベースのＨＹ２関連遺伝子を特定するために実施した。クローニング、発現および生化学的性状決定を用いて、我々は、固有の基質特異性または生成物特異性を有する、３つの新規なフェレドキシン依存ビリンレダクターゼクラスを明らかにした。
【０１２４】
結果
シアノバクテリア、オキシフォト細菌および植物のＨＹ２関連遺伝子ファミリー
実施例１ではシロイヌナズナのＨＹ２遺伝子のクローニングを述べた。ＨＹ２の推定タンパク質配列を用いて、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０； Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２）を実施し、国立バイオテクノロジー情報センター非冗長（ｎｏｎｒｅｄｕｎｄａｎｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）データベース、シアノベース（ＣｙａｎｏＢａｓｅ）（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． ２０００ Ｒ２０Ｒ２０）、および合同ゲノム研究所微生物ゲノム（Ｊｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｇｅｎｏｍｅ）データベース（ ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ ”ｈｔｔｐ：／／ｓｐｉｄｅｒ．ｊｇｉ−ｐｓｆ．ｏｒｇ／ＪＧＩｍｉｃｒｏｂｉａｌ／ｈｔｍｌ” ｈｔｔｐ：／／ｓｐｉｄｅｒ．ｊｇｉ−ｐｓｆ．ｏｒｇ／ＪＧＩｍｉｃｒｏｂｉａｌ／ｈｔｍｌ）で仮定的ビリンレダクターゼを特定した。これらの検索によって、種々の光合成細菌から１５の仮定的タンパク質が、さらに植物から２つの公知のタンパク質が特定された。
【０１２５】
図１０は、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：３８３−４０２）、ＭＥＭＥを用いる手動アジャストメント（Ｂａｉｌｅｙ ａｎｄ Ｅｌｋａｎ （１９９５） ｐｐ． ２１−２９， ”Ｐｒｏｃ． Ｔｈｉｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔ． Ｃｏｎｆ． Ｏｎ Ｉｎｔｅｌｌｅｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， ＣＡ； Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｉｎｔｅｌｌｅｇｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ）、およびＧＥＮＥＤＯＣプログラム（ ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ ”ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｓｃ．ｅｄｕ／ｂｉｏｍｅｄ／ｇｅｎｅｄｏｃ” ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｓｃ．ｅｄｕ／ｂｉｏｍｅｄ／ｇｅｎｅｄｏｃ）による強調付与を用いた、このタンパク質ファミリーのマルチ配列アラインメントを示している。このアラインメントによって、平均的なペアワイズ類似性スコアが２５％の、高度に分岐した領域が点在する強い類似性を有する領域が明らかにされた。哺乳類のビリベルジンレダクターゼに関してはこれらのタンパク質の配列類似性は観察されなかった。
【０１２６】
本明細書に提示した生化学的データを基に、我々はこれらのＨＹ２関連シアノバクテリア遺伝子座を、ＰＣＢ（すなわちｐｃｙＡ）およびＰＥＢ（すなわちｐｅｂＡおよびｐｅｂＢ）の生合成におけるそれらの役割の後ろに示している。これらのタンパク質の１つ、シアノバクテリアシネコシスチス亜種ＰＣＣ６８０３のゲノム中の遺伝子座ｓｌｒ０１１６（すなわちｐｃｙＡ）の生成物は、６２ｂｐ上流に位置する仮定的反応調節物質をもつオペロンの一部であるように思われる（Ａｓｈｂｙ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ （１９９９） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． １８１：２５３−２６０）。興味深いことには、この反応調節物質は、それに対する変異（ｙｃｆ２７）はフィコビリソームからフォトシステムＩへのエネルギー移転の低下をひき起こすことが示されたＯｍｐＲサブファミリーに属する（Ａｓｈｂｙ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ （１９９９） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． １８１：２５３−２６０）。ｐｃｙＡ関連開放読み枠（ｏｒｆ）はまた、オキシフォト細菌プロクロロコッカス亜種ＭＥＤ４（ＣＣＭＰ１３７８）（これはまたプロクロロコッカス＝マリヌスＭＥＤ４としても知られている）で、海洋シアノバクテリアシネココッカス亜種ＷＨ８１０２で、さらに窒素固定異質細胞形成糸状シアノバクテリアアナベナ亜種ＰＣＣ７１２０およびノストク＝パンクチフォルメ（Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）で見出された。他の特定されたＨＹ２関連遺伝子には、とりわけ海洋シアノバクテリアシネココッカス亜種ＷＨ８０２０に由来する２つのｏｒｆ（ｏｒｆ２３６およびｏｒｆ２５７）があり、これらは主要フィコビリタンパク質遺伝子クラスター内に互いに近傍に存在する（Ｗｉｌｂａｎｋｓ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ （１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１２２６−１２３５； Ｗｉｌｂａｎｋｓ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ （１９９３ｂ） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１２３６−１２４１）。これらのｏｒｆ（タンパク質Ｙｃｐ２＿ＳＹＮＰＹおよびＹｃｐ３＿ＳＹＮＰＹをコードする）は、未知の機能をもつ上流ｏｒｆ（ｏｒｆ２００）を含む３遺伝子オペロンの一部分であるように思われる。同様なオペロンがシネココッカス亜種ＷＨ８１０２で特定された。Ｎ．パンクチフォルメおよびプロクロロコッカスＭＥＤ４およびＳＳ１２０（ＣＣＭＰ１３７５）の両亜種のゲノムもまた同様なオペロンを含む。Ｎ．パンクチフォルメおよびアナベナのオペロンとは対照的に、プロクロロコッカスオペロンの上流ｏｒｆは、フェレドキシン依存ヘムオキシゲナーゼ遺伝子ＨＹ１（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ９６：６５４１−６５４６； Ｍｕｒａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １１：３３５−３４７）およびシアノバクテリアシネコシスチス亜種ＰＣＣ６８０３におけるその相同体（Ｃｏｒｎｅｊｏ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｌａｎｔ Ｊ． １５：９９−１０７）と顕著な類似性を示す。本研究で示されたＰＥＢ生合成におけるそれらの役割を基に、我々はこれらのＯＲＦをｐｅｂＡおよびｐｅｂＢ と呼ぶ。
【０１２７】
反復ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴによってもまた、ＨＹ２とエンバクおよびシロイヌナズナの赤色葉緑素異化物レダクターゼ（ＲＣＣＲ）との弱い関連性が特定された。ＲＣＣＲは、葉緑素異化作用に必要で、直鎖状テトラピロール（赤色葉緑素異化物（ＲＣＣ））のフェレドキシン依存還元を触媒して、一次蛍光葉緑素異化物を生じる（Ｗｕｔｈｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２１：１８９−１９８）。これらの研究者らは、ＲＣＣＲはＢＶをビリルビンにもＰＢにも還元することができないことを示した（Ｗｕｔｈｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２１：１８９−１９８）。興味深いことには、ＲＣＣＲと他のＨＹ２関連タンパク質との間の配列類似性は非常に低いので、２つのＲＣＣＲ配列を用いるＴＢＬＡＳＴＮ検索は、ＨＹ２または公的に利用可能なデータベースに存在する他のＨＹ２関連タンパク質を特定することができなかった（Ｗｕｔｈｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２１：１８９−１９８）。この分岐は、明らかに、葉緑素異化作用に由来するビリンに対するＲＣＣＲの例外的な基質特異性を反映している。
【０１２８】
改変ＰＡＭ２５０ウェイティング（ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ）マトリックスおよびプログラムＰＡＵＰ＊バージョン４．０による発見的最節約検索を用いて、ＨＹ２関連タンパク質ファミリーの系統的分析を実施した（方法の項を参照されたい）。この分析で得られたただ１つの系統樹（図１１）によって、強いブーツストラップの支持をもつ４つのＨＹ２関連タンパク質クレードが明らかにされた。すなわちｐｃｙＡ、ＰｅｂＡ、ＰｅｂＢおよびＲＣＣＲである。我々は、ＨＹ２はＰｅｂＢクレードに存在すること示した。
【０１２９】
リコンビナントＨＹ２関連タンパク質はビリンレダクターゼである
ＨＹ２関連シアノバクテリアｏｒｆをポリメラーゼ連鎖反応で増幅し、大腸菌発現ベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１でクローニングした。前記ベクターは、ｍＨＹ２（実施例１）で述べたベクターと同様である。このベクターを用いて、前記タンパク質を、アフィニティークロマトグラフィーによるそれらの精製を可能にするグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合物として発現させた。ＧＳＴタグは、位置特異的プロテアーゼ消化によって除去した。前記消化によって、クローニングのためのさらに別の５から８つのＮ−末端アミノ酸が得られた。図１２は、ＰｃｙＡ、ＰｅｂＡ、ＰｅｂＢおよびＨＹ２サブファミリーの代表的な精製リコンビナントタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示している。１リットルの細菌培養によって、発現されるタンパク質に応じて１から１０ｍｇの可溶性リコンビナントタンパク質が得られた。リコンビナントタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認された（図１２）推定分子量は以下のとおりである：アナベナのＰｃｙＡ，２８．７ｋＤ；シネコシスチスのＰｃｙＡ，２８．９ｋＤ；シネココッカス亜種ＷＨ８０２０のＰｅｂＡ，２８ｋＤ；シネココッカス亜種ＷＨ８０２０のＰｅｂＢ，３０．３ｋＤ；およびシロイヌナズナのｍＨＹ２，３３．４ｋＤ
【０１３０】
リコンビナントＨＹ２関連タンパク質がビリンレダクターゼ活性を有するか否かを決定するために、我々は共役ホロフィトクロム会合アッセイを用いて、これらのタンパク質を発現している大腸菌の粗タンパク質抽出物を、標準的ＰＢシンターゼアッセイ条件下でＢＶをフィトビリンに変換する能力について分析した。図１３Ａでは、ｍＨＹ２およびＰｃｙＡ＿ＳＹＮＹ３（ＰｃｙＡ＿ＡＮＡＳＰ；これは示されていない）のＧＳＴ融合物を含む粗細菌抽出物は全てＢＶレダクターゼ活性を有し、シアノバクテリアのフィトクロムＣｐｈ１アポタンパク質（アポＣｐｈ１）と結合してフィトクロム識別スペクトルを生じることができるフィトビリン生成物をもたらすことが示されている。アポＣｐｈ１とインキュベートされたビリン代謝物は種々の最大最小を生じ、多様なタンパク質がＢＶをそれぞれ異なる別個の生成物に還元したことを示唆している。両ＰｃｙＡ含有抽出物が、アポＣｐｈ１のＰＣＢアダクツのスペクトルと同一のスペクトル（６５５ｎｍの最大識別および７０５ｎｍの最小識別）を生じるＢＶ代謝物を生成した（Ｙｅｈ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１５０５−１５０８）。図１３Ａは、ｍＨＹ２代謝物の両識別ピークは顕著に赤色側にシフトしていることを示し（６７０および７３０ｎｍで最大）、これは、アポＣｐｈ１のＰΦＢアダクツの特徴である（Ｙｅｈ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１５０５−１５０８；実施例１）。同一の結果が、精製リコンビナントＨＹ２およびＰｃｙＡタンパク質を用いて得られた（データは示されていない）。同様に、ＨＹ２またはＰｃｙＡタンパク質を欠く大腸菌抽出物は、アポＣｐｈ１と機能的に会合するビリン生成物をＢＶから代謝することができなかった（データは示されていない）。
【０１３１】
ＰｃｙＡおよびＨＹ２についての結果とは対照的に、ＰｅｂＢ＿ＳＹＮＰＹ、ＰｅｂＢ＿ＳＹＮＰＹ、または２つのシネココッカス由来タンパク質の１：１混合物を含む反応物由来ＢＶ代謝物をアポＣｐｈ１とインキュベートしたときは、フィトクロム識別スペクトルは観察されなかった。ＧＳＴとの融合がこれらタンパク質の酵素活性の抑制の原因であるか否かを決定するために、ＧＳＴをプロテアーゼ消化で除去し、完全長のタンパク質を精製した（図１２）。精製タンパク質もＰｅｂＡおよびＰｅｂＢの１：１混合物も、アポＣｐｈ１との光活性アダクツを生じるビリン生成物にＢＶを変換することはできなかった（図１３Ａ）。１：１の比率のＰｅｂＡおよびＰｅｂＢとＢＶとの同時にインキュベーションによって、青緑色から桃色へアッセイ混合物の色が変化するという観察は、これらタンパク質は、光によって変換することができるホロフィトクロムを形成することができないビリンにＢＶを変換したことを示唆した。この顕著な色の変化は、ＰｅｂＡまたはＰｅｂＢのどちらかを別々にアッセイしたときは観察されなかったということは特記に値する。このことは、ＰｅｂＡ／ＰｅｂＢ混合物はＢＶをＰＥＢ（フィコビリタンパク質Ｃ−フィコエリスリンの前駆体）に変換することができることを強く暗示している。
【０１３２】
この仮説を調べるために、ＰｅｂＡ、ＰｅｂＢおよびＰｅｂＡ／ＰｅｂＢから得たＢＶ由来ビリン代謝物をアポＣｐｈ１とインキュベートし、蛍光性ＰＥＢ−アポＣｐｈ１、“フィトフルア”アダクツの生成について混合物を蛍光分光測定により分析した（Ｍｕｒｐｈｙ ａｎｄ Ｌａｇａｒｉａｓ （１９７７） Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ７：８７０−８７６）。ＰｅｂＡ／ＰｅｂＢ生成物の混合物のみが強い蛍光性化合物を生じ、その励起および放出スペクトルはフィトフルアの形成と一致していた（図１３Ｂ）．この結果は、ＰｅｂＡおよびＰｅｂＢは両方ともＢＶからＰＥＢへの変換に必要であることを示唆している。
【０１３３】
ＨＰＬＣはＨＹ２ファミリーの各メンバーについてそれぞれ異なる別個の基質／生成物特異性があることを示した
ＰＢ、ＰＣＢおよびＰＥＢの３Ｅおよび３Ｚ異性体を分離することができるクロマトグラフィー系を用いるＨＰＬＣ分析を実施し、ＨＹ２ファミリーメンバーのビリン代謝物を特定した。実施例１で示したように、リコンビナントｍＨＹ２は、２つの電子によってＢＶを効率的に還元してＰＢの両異性体の混合物を生じた。比較すれば、両ＰｃｙＡタンパク質は、ＰＣＢの３Ｅおよび３Ｚ異性体の混合物にＢＶを変換した（４電子還元）（図１４）。経時的実験を実施し、他の色のビリン中間体の証拠は得られなかった（データは示されていない）。ＰｅｂＡ＿ＳＹＮＰＹをＢＶとインキュベートすることによって、５６０ｎｍでのみ検出され３８０ｎｍでは検出できない初期に溶出する生成物が形成された（図１４）。光学分光分析によって、この生成物は、アセトン：２０ｍＭギ酸（５０：５０，ｖ／ｖ）中では５７５ｎｍで最大吸収を有することが示された（データは示されていない）。その吸収スペクトル（データは示されていない）、初期保持時間、および下記に示した結果を基にして、この生成物は１５，１６−ＤＨＢＶであると決定した。ＤＨＢＶの同様な吸収スペクトルがこれまでに報告されている（Ｂｅａｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｊｏ （１９９１ｂ） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２３３３−２２３４０）。ＰｅｂＡ＿ＳＹＮＰＹとは対照的に、ＰｅｂＢ＿ＳＹＮＰＹはＢＶを代謝することができなかった（図１４）。同一の結果は、Ｎ．パンクチフォルメのＰｅｂＡおよびＰｅｂＢ相同体で観察された（データは示されていない）。
【０１３４】
ＰｅｂＡおよびＰｅｂＢの混合物は、全てのＢＶを２つの着色色素（１つは紫色で保持時間９分、および他方は桃色で保持時間１０．５分）に効率的に変換し、それらの保持時間は１５，１６−ＤＨＢＶの保持時間とは異なっていた（図１４）。両ビリン代謝物は、アセトン：２０ｍＭギ酸（５０：５０，ｖ／ｖ）中で５８０ｎｍ近くで最大吸収を有する（データは示されていない）。ＰｅｂＢはＢＶを代謝することはできなかったので、これらの結果は、ＰｅｂＡの１５，１６−ＤＨＢＶ生成物はＰｅｂＢによって紫色および桃色のビリンに代謝されたか、またはＰｅｂＢはＰｅｂＡとの複合体を形成してその生成物プロフィールを変化させたかのどちらかであることを示唆している。１５，１６−ＤＨＢＶはＰｅｂＢの基質であるということは、ＰｅｂＢをＨＰＬＣ精製５，１６−ＤＨＢＶとインキュベートすることによって示された。この場合には、同じ２つのビリン生成物が観察された（データは示されていない）。ＨＰＬＣ同時溶出実験によって、紫色および桃色の色素は、それぞれＰＥＢの３Ｅおよび３Ｚ異性体であることが示された（データは示されていない）。両色素はＨＰＬＣ移動相の中で化学的に安定であり、精製および再注入後に単一ピークとして溶出する。さらにまた、両ＨＰＬＣ精製色素はアポＣｐｈ１とのインキュベーションに際してフィトフルアを形成し、このことは、ＰＥＢの立体配置性異性体であることを示している。ＢＶのＰｅｂＡ仲介還元から得られるＨＰＬＣ精製１５，１６−ＤＨＢＶは、しかしながら、アポＣｐｈ１と蛍光性アダクツを形成することができなかった（データは示されていない）。
【０１３５】
藻類および植物のフェレドキシン依存ビリンレダクターゼの生化学的実験によって、ＰＥＢ、ＰＣＢおよびＰＢの３Ｚ異性体はこれらの酵素の一次代謝物であり、３Ｅ異性体の生成は別個のビリンイソメラーゼを必要とすることを示した（Ｂｅａｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｊｏ （１９９１ａ） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２３２８−２２３３２； Ｂｅａｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｊｏ （１９９１ｂ） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２３３３−２２３４０； Ｂｅａｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｊｏ （１９９１ｃ） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２３４１−２２３４５； Ｃｏｒｎｅｊｏ ａｎｄ Ｂｅａｌｅ （１９９７） Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈ． Ｒｅｓ． ５１：２２３−２３０）。我々の結果は、両ビリンイソメラーゼはリコンビナントＨＹ２、ＰｃｙＡ、およびＰｅｂＡ／ＰｅｂＢタンパク質で生成されることを示している。我々は、３Ｅ異性体の生成は、アッセイ混合物中にグルタチオンが存在したために、さらにスピードバク（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ）濃縮装置で加熱したために生じたと考えている。これに関しては、フィコビリンの３Ｚから３Ｅへのグルタチオン仲介異性化が、Ｃ．カルダリウムのビリンレダクターゼについて報告されている（ Ｂｅａｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｊｏ （１９９１ｃ） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２３４１−２２３４５）。還元されたグルタチオンと接触させなかったＧＳＴ融合タンパク質を用いて実施するか、またはプロテアーゼ消化によってアフィニティーカラムから溶出させたタンパク質を用いて実施した予備実験では、生成された３Ｚ異性体の相対量は顕著に増加した（データは示されていない）。濃縮中に生じる加熱はまた３Ｅ異性体の形成に貢献した。乾燥時間を短縮した場合、３Ｚ異性体のみが検出された（データは示されていない）。したがって、我々は、全ての事例で、３Ｚ異性体はこれらレダクターゼの一次反応生成物であり、３Ｅ異性体の生成は、加熱と還元グルタチオンによって生じた非酵素仲介副反応によってひき起こされると結論した。
【０１３６】
ビリンレダクターゼのＨＹ２ファミリーはフェレドキシン依存である
ここに示したＢＶと１５，１６−ＤＨＢＶの還元性相互変換のいずれも還元フェレドキシンに依存し、このことは、フェレドキシン：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼおよびＮＡＤＰＨ−再生系がアッセイ混合物に含まれることを必要とした。実際、フェレドキシンまたはＮＡＤＰＨ−再生系がアッセイ混合物から省略されたときは、還元ビリン代謝物はいずれもＨＰＬＣで検出されなかった（データは示されていない）。これらの結果は、植物および藻類のビリンレダクターゼのフェレドキシン依存性と一致する（Ｂｅａｌｅ （１９９３） Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９３：７８５−８０２）。したがって、このタンパク質ファミリーは、新規なビリン：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．３．７．ｎ）クラスを構成する。
【０１３７】
考察
ゲノムデーターベースのタンパク質依拠パターン検索、系統発生分析および生化学的性状決定を組み合わせた研究によって、フェレドキシン依存ビリンレダクターゼのＨＹ２ファミリーは、ＰｃｙＡ、ＰｅｂＡ、ＰｅｂＢ、ＨＹ２およびＲＣＣＲファミリーの５つのクラスにさらに分割される（図１１）。この分類系は、各ビリンレダクターゼサブファミリーの代表的メンバーのそれぞれ異なる基質嗜好性および二重結合部分特異性によって支持される。ＰｃｙＡ、ＰｅｂＡおよびＨＹ２は全て基質としてＢＶを認識し、しかも各々は異なるビリン生成物を生じる。ＰｅｂＢおよびＲＣＣＲは固有のビリン基質（すなわち、それぞれ１５，１６−ＤＨＢＶおよびＲＣＣ）を有し、いずれもＢＶを代謝しない（Ｗｕｔｈｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２１：１８９−１９８； 本実験）。ここで特定したこれら３つのビリンレダクターゼクラスの代表的なもの、ＰｃｙＡ、ＰｅｂＡおよびＰｅｂＢの生化学的分析は、フィコビリタンパク質発色団前駆体ＰＣＢおよびＰＥＢの生合成にそれらが必要であることを証明した。
【０１３８】
フェレドキシン依存ＢＶレダクターゼのＰｃｙＡファミリーはＰＣＢ生合成で重要な役割を果たす
本実験で、我々は、シアノバクテリアシネコシスチス亜種ＰＣＣ６８０３、アナベナ亜種ＰＣＣ７１２０およびＮ．パンクチフォルメ（データは示されていない）のｐｃｙＡ遺伝子は、ＢＶから３Ｚ−ＰＣＢへの４電子還元を触媒するビリンレダクターゼをコードすることを証明した。ＰＣＢは、３つのシアノバクテリアの全てで豊富なフィコビリタンパク質フィコシアニンおよびアロフィコシアニンの発色団前駆体である。ＰｃｙＡ酵素は非定型的なビリンレダクターゼである。なぜならば、他の全ての酵素は二電子還元を触媒するからである。正式には、これらの酵素は、ＢＶのＡおよびＤ環の両方の二電子還元を触媒する。しかしながら、半分還元された中間体（例えばＰＢおよび１８１，１８２−ＤＨＢＶ）の生成を我々は検出していない。したがって、部分的に還元された中間体はしっかりと酵素に結合しているように思われる。これらのシアノバクテリアにおけるＢＶからＰＣＢへの直接変換は、紅藻類Ｃ．カルダリウム（これはＰＥＢの介在性を必要とする（Ｂｅａｌｅ （１９９３） Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９３：７８５−８０２））および緑藻類Ｍ．カルダリオルム（この場合３Ｚ−ＰΦＢが単離可能な中間体である（Ｗｕ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２５７００−２５７０５））のＰＣＢ生合成の提唱経路と対照的である。ｐｃｙＡ関連遺伝子はまた、オキシフォト細菌プロクロロコッカス亜種ＭＥＤ４にも存在し、これは、前記生物はフィコビリタンパク質を欠いているので予期せぬ所見である。系統発生分析では、このオキシフォト細菌のタンパク質は、ＰＣＢ：フェレドキシンオキシドレダクターゼのＰｃｙＡクレードに配置される。我々はまた、プロクロロコッカス亜種ＭＥＤ４のｐｃｙＡ遺伝子をクローニングし、これをＮ−末端のＧＳＴ融合物として発現させることができた。我々の標準的なフィトクロム系アッセイで、我々は、リコンビナントＰｃｙＡ＿ＰＲＯＭＥはＢＶをＰＣＢに還元することができると決定した（データは示されていない）。したがって、前記は調べた他の全てのＰｃｙＡ酵素と同じ酵素活性を有する。
【０１３９】
ｐｅｂオペロンはＰＥＢ生合成に必要とされるビリンレダクターゼをコードする　我々の観察では、シアノバクテリアシネココッカス亜種ＷＨ８０２０およびＮ．パンクチフォルメのｐｅｂＡおよびｐｅｂＢ遺伝子は、ＢＶから１５，１６−ＤＨＢＶへの変換、および１５，１６−ＤＨＢＶから３Ｚ−ＰＥＢへの変換をそれぞれ触媒するビリンレダクターゼをコードした（図１）。したがって、ＰｅｂＡは１５，１６−フェレドキシンオキシドレダクターゼであり、一方、ＰｅｂＢは３Ｚ−ＰＥＢ：フェレドキシンオキシドレダクターゼである。両活性は、紅藻類Ｃ．カルダリウムのＰＥＢ生合成経路と一致する（Ｂｅａｌｅ （１９９３） Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９３：７８５−８０２）。２つのｐｅｂ遺伝子はまた、フィコエリスリンを産生する両シアノバクテリアの同じオペロンで見出され、主要フィコビリタンパク質遺伝子クラスターとのそれらの緊密な関係はフィコビリタンパク質生合成におけるそれらの役割を支持する（Ｗｉｌｂａｎｋｓ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ （１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１２３６−１２４１）。我々は、これら２つの酵素を同時にインキュベートしたときに観察されるＢＶの協調的代謝から考えて、ＰｅｂＡおよびＰｅｂＢは二種酵素複合体として機能すると仮説をたてた。ｐｅｂオペロンはシアノバクテリアシネコシスチス亜種ＰＣＣ６８０３（フィコエリスリンを欠く）のゲノムには存在しない。このことは、Ｃ．カルダリウムで見出されたＰＥＢ経路とは対照的に、前記シアノバクテリアではＰＣＢはＰｃｙＡ依存経路を介して合成されることを強く示唆している（Ｂｅａｌｅ （１９９３） Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９３：７８５−８０２）。これに関して、シネコシスチス亜種ＰＣＣ６８０３の粗抽出物の生化学的分析ではＰＥＢの生成についての証拠は提供されていない（Ｃｏｒｎｅｊｏ ａｎｄ Ｂｅａｌｅ （１９９７） Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈ． Ｒｅｓ． ５１：２２３−２３０）。
【０１４０】
オキシフォト細菌プロクロロコッカスのＭＥＤ４およびＳＳ１２０亜種もまた、シネココッカス亜種ＷＨ８０２０およびＷＨ８１０２のｐｅｂオペロンと非常に類似するオペロンを有するが、ただし前者はヘムオキシゲナーゼと関連を有する上流遺伝子をもつ点が異なる。このことは、オキシフォト細菌の両亜種はＰＥＢを合成することができることを強く示唆している。これに関しては、新規なフィコエリスリンのαおよびβサブユニットをコードする遺伝子が、プロクロロコッカスのＳＳ１２０亜種で特定された（Ｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｒ２９Ｒ２９； Ｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．（１９９９） Ｒ３０Ｒ３０）。この例外的なフィコエリスリンはこの生態型で集光の役割を果たすこともまた示され（Ｌｏｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｙｓ． Ａｃｔａ １４１０：９７−９８）、これは光が制限される深海の光合成無機栄養性増殖のために適合する。この観察は、注目のフィコエリスリン遺伝子の欠如（順応ＭＥＤ４生態型）と一致する。プロクロロコッカスのＰｅｂＡおよびＰｅｂＢの酵素活性は実験的にはまだ決定されていないが、我々の系統発生の再構築は、これらのタンパク質はシネココッカスおよびノストク酵素の機能的なオルソロガス体であろうと提案したい。より短い波長を吸収するフィコウロビリン発色団はそれらのフィコエリスリンの主要構成成分であるので、プロクロロコッカスおよび海洋シアノバクテリア（例えばシネココッカス亜種ＷＨ８０２０）のビリン生合成経路の更なる分析は興味深いものであろう（Ｏｎｇ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：９５１５−９５２７； Ｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ９３：１１１２６−１１１３０）。我々は、両生物のＰＣＢおよびＰＥＢ生合成酵素を特定したが、これらの酵素または他の酵素のどちらがフィコウロビリン生合成に役割を果たすのかは今後決定されるであろう。
【０１４１】
フィコビリンイソメラーゼ：それらは必要か
ＰｃｙＡ、ＨＹ２およびＰｅｂＢは、それらの対応する生成物の３Ｚ異性体を生成するビリン還元を仲介する。多くの研究によって、より熱力学的に安定な３Ｅ異性体がフィコビリタンパク質およびフィトクロムホロタンパク質の会合のためにふさわしい基質であることが確認されたので、この相互反応を仲介する固有の３Ｚ／３Ｅイソメラーゼの存在が提唱された（Ｂｅａｌｅ （１９９３） Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９３：７８５−８０２； Ｔｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ａｔｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３０６：１−５）。ＰＢの３Ｚ異性体はアポフィトクロムの基質であることが示されたことは特記されるべきである（Ｔｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：１１１１１−１１１１８）。しかしながら、これらの研究者らは、３Ｅ異性体の異性化はホロフィトクロム発色団の正確な立体化学を得るために必要であると提唱した。そのようなイソメラーゼ活性は、紅藻類Ｃ．カルダリウムの抽出物で特定された。しかしながら、この反応はまた還元されたグルタチオンによっても仲介され得る（Ｂｅａｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｊｏ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２３３３−２２３４０）。この理由のために、３Ｚ／３Ｅイソメラーゼの必要性は疑われている。ｈｙ変異体遺伝子座は今や全てシロイヌナズナからクローニングされたが、これら遺伝子のいずれもビリンイソメラーゼをコードしないようである。したがって、３Ｚ−ＰΦＢの異性化は化学的に生じる可能性があり、また遺伝的に重複したビリンイソメラーゼファミリーによって触媒される可能性もある。
【０１４２】
フィコビリタンパク質のＸ線結晶解析によって、それぞれ異なる別個のシステイン残基とのチオエーテル結合の立体化学は全てが同じというわけではないことが明らかになった（Ｓｃｈｉｒｍｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：６７７−６９５； Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｚ． Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ． ４２Ｃ：８４５−８４８）。したがって、我々は、異なる立体化学は、それぞれ異なるシステイニル部分との会合のための基質としてフィコビリン前駆体の３Ｚおよび３Ｅ異性体を用いることにより生じると提案したい。Ｂｅａｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｊｏ（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２３３３−２２３４０（１９９１））は、Ｃ．カルダリウムで３Ｚ−ＰＥＢから３Ｚ−ＰＣＢへの変換を触媒するビリンイソメラーゼを特定した（前記変換は、この生物でＰＣＢ生合成のための唯一の経路のようである）。より最近になって、ＰＣＢのフィコビオロビリンへの異性化とアポフィコエリスロシアニンへのその共有結合による付加の両方に必要とされるシアノバクテリアマスチゴクラダス＝ラミノサス（Ｍａｓｔｉｇｏｃｌａｄｕｓ ｌａｍｉｎｏｓｕｓ）のリアーゼ／イソメラーゼが記載された（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． （２０００） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４６９：９−１３）。これらの結果および海洋シアノバクテリア、地中単細胞およびオキシフォト細菌のフィコビリタンパク質で見出されたビリン異性体の多様性（Ｏｎｇ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：９５１５−９５２７； Ｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９３：１１１２６−１１１３０； Ｗｅｄｅｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈ． Ｒｅｓ． ４８：１６３−１７０）を基にすれば、多数のビリンイソメラーゼが酸素放出光合成生物で存在することはありそうなことである。
【０１４３】
ビリンレダクターゼのＨＹ２ファミリーの分子の進化
ブーツストラップレプリケートに関して良好な支持を示すただ１つの系統樹がＨＹ２ファミリーについて得られた（図１１）。この系統樹は、ビリンレダクターゼの４つのクレードを正確に表し、それは、還元に対する酵素の二重結合特異性と良好に一致する。ＨＹ２は、１５，１６−ＤＨＢＶからＰＥＢへの還元を触媒する酵素のＰｅｂＢクレードともっとも近縁であるように思われる。我々は、フィトクロモビリンシンターゼは、それらの強いＢＶ基質特異性にために、他の植物種のＨＹ２オルソロガス体が特定される場合は別個の異なるクレードを形成するであろうと予測する。ＨＹ２とＰｅｂＡとの関連性は合理性がある。なぜならば、両ファミリーはビニルピロールＡ環の還元を仲介してエチリデン部分を形成するからである。我々は、これら２つのクラスは、ＢＶを基質として利用する共通の祖先から発したのではないかと考える。この考えは、ビリンレダクターゼのＰｅｂＡファミリーもまた基質としてＢＶを認識するという観察を基にしている。
【０１４４】
ＨＹ２およびＰｅｂＢと異なり、ＰｅｂＡファミリーのメンバーは還元のためにＢＶの１５，１６二重結合を標的にする。ＰｅｂＡおよびＰｅｂＢ／ＨＹ２サブファミリーを導き出すために、我々は、フェレドキシン依存ＢＶレダクターゼ遺伝子の複製およびその後の光が制限されている環境で生育する海洋シアノバクテリアでの分岐を考えてみた。そのような環境は、ＰＥＢのための生合成経路の進化にふさわしい選別圧を与えるであろう（ＰＥＢのフィコエリスリンへの取り込みはそれらのフィコビリソームの集光波長域を広げる）。ＨＹ２ファミリー樹のルーティング（ｒｏｏｔｉｎｇ）に応じて、系統樹上のＰｅｂＡおよびＰｅｂＢ／ＨＹ２ファミリーの相対的な枝の長さは、Ａ環レダクターゼはより以前に、１５，１６レダクターゼはより最近に進化したことを示唆する。これらの推論を基に、我々は、植物の葉緑体の先祖のシアノバクテリアはＡ環レダクターゼの部分特異性を有するビリンレダクターゼをもっていたのではないかと考える。今日のシアノバクテリアの先祖はおそらく、それらのアロフィコシアニン含有フィコビリソームコアの必須の成分であるＰＣＢを合成する能力を有していたのであろう。したがって、共通のｐｅｂＡ／ｐｅｂＢの先祖は今日のｐｃｙＡ遺伝子（ＢＶからＰＣＢへの四電子還元を触媒する非定型的ＢＶレダクターゼをコードする）と類似していたかもしれない。今日までのところ、ｐｃｙＡ遺伝子は全てのシアノバクテリアに存在するようであり、一方、ｐｅｂオペロンはフィコエリスリン欠損シアノバクテリアシネコシスチス亜種ＰＣＣ６８０３では欠落している。
【０１４５】
プロクロロコッカス亜種ＭＥＤ４のｐｅｂＡ、ｐｅｂＢおよびｐｃｙＡ遺伝子の役割は不可解なままである。この属のメンバーは、ジビニル葉緑素ａ２およびｂ２を含む完全な膜触角複合体の存在によって、さらにフィコビリソームの欠落によって識別される（Ｐａｒｔｅｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ６３：１０６−１２７）。機能的なフィコエリスリンはＳＳ１２０亜種についてのみ検出された。したがって、これらの生物は、その内部共生が高等植物の葉緑体をもたらした原核細菌光合成生物のクラスの子孫であると或る人々には考えられてきた。１６ＳｒＲＮＡを用いた系統発生分析によって、これはこの事例にはおそらく当てはまらないことが示された。なぜならば、プロクロロコッカス種は、葉緑体よりも海洋性シネココッカス種により類似しているように思われるからである（Ｕｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ４６：１８８−２０１）。これらの分析もまた、プロクロロコッカスは、海洋性シネココッカス種に類似するフィコビリソームを含有する先祖からより最近になって進化したことを示唆している。
【０１４６】
この先祖におけるフィコビリン生合成のためのｐｅｂＡ、ｐｅｂＢおよびｐｃｙＡ遺伝子の必要性は自明であり、そのような遺伝子はプロクロロコッカス種から失われてなかったかもしれない。これらのＢＶレダクターゼは、光レセプター（例えばフィトクロム）のビリン発色団前駆体を作るために要求されると考えることができる（Ｈｕｇｈｅｓ ａｎｄ Ｌａｍｐａｒｔｅｒ （１９９９） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １２１：１０５９−１０６８）。フィトクロム様遺伝子はいくつかのシアノバクテリアゲノムで豊富であるが、プロクロロコッカス亜種ＭＥＤ４のゲノムには存在しない（データは示されていない）。また別には、ＢＶレダクターゼはヘムオキシゲナーゼを駆動するために要求されるかもしれない。ヘムオキシゲナーゼの鉄代謝における役割は十分に証明されている（Ｐｏｓｓ ａｎｄ Ｔｏｎｅｇａｗａ （１９９７ａ） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９４：１０９１９−１０９２４； Ｐｏｓｓ ａｎｄ Ｔｏｎｅｇａｗａ （１９９７ｂ） ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９４：１０９２５−１０９３０； Ｒｉｃｈａｕｄ ａｎｄ Ｚａｂｕｌｏｎ （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９４：１１７３６−１１７４１； Ｓｃｈｍｉｔｔ （１９９７） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７９：８３８−８４５）。
【０１４７】
フィトビリン生合成に必要とされるビリンレダクターゼの他に、葉緑素の分解に必要なビリンレダクターゼの別のクラスが存在する（Ｈｏｅｒｔｅｎｓｔｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１５３３５−１５３３９； Ｗｕｔｈｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２１：１８９−１９８）。植物の老化で生じる葉緑素分解経路はヘム分解経路と類似している（Ｍａｔｉｌｅ ａｎｄ Ｈｏｅｒｔｅｎｓｔｅｉｎｅｒ （１９９９） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５０：６７−９５）。脱フィチル化およびマグネシウム除去の後、葉緑素の大環式環は、未だクローニングされていないモノオキシゲナーゼによって開環される（Ｈｏｅｒｔｅｎｓｔｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１５３３５−１５３３９）。この後に、ＲＣＣＲによって触媒されるビリン生成物のフェレドキシン依存還元が続く（Ｈｏｅｒｔｅｎｓｔｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ． ２：６３−６７； Ｗｕｔｈｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２１：１８９−１９８）。ＲＣＣＲは、フェレドキシン依存ビリンレダクターゼファミリーのもっとも多様なメンバーである。実際、これらの酵素は顕著に多様な基質特異性を有する。ＲＣＣＲはＰｅｂＡファミリーによって仲介される還元（すなわち１５，１６二重結合還元）と非常に類似する還元を触媒するということは注目に値する。ＲＣＣＲ固有の基質特異性および二重結合の部分特異性をもたらす構造決定基を発見することは重要なことである。おそらく、葉緑素の異化作用は葉緑素含有原核細胞にとって重要であろう。しかしながら、今日まで、ＲＣＣＲ遺伝子はいずれの光合成原核細胞のゲノムにおいても容易には特定できていない。ＲＣＣＲ遺伝子は失われたか、また別に、それらは隠花植物および植物で見出されるので、葉緑体の内部共生祖先のＨＹ２様遺伝子から最近になって進化した可能性もある（Ｈｏｅｒｔｅｎｓｔｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ． ２：６３−６７）。
【０１４８】
機構的考察
フェレドキシン依存ビリンレダクターゼは、直鎖状テトラピロールの二および四電子還元を触媒する。フェレドキシンは一電子担体であるので、これらの酵素は、ＢＶレダクターゼのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存ＢＶＲ／ＢｖｒＤファミリーとは機構的に全く異なる。今日までの予備的分析では、本明細書に報告したリコンビナント酵素のいずれにおいても金属またはフラビン補助因子を特定することができなかった。このことは、おそらく酵素内のアミノ酸残基の還元を介して電子はビリン部分に直接伝達されることを示唆している。この発見はビリンラジカル中間体の存在を提唱しているが、さらに別の実験がこの仮説の評価に必要である。ＲＣＣＲの酸素感受性は、ビリンラジカル（これは分子酸素と反応する）はＲＣＣ異化作用の間に生成されるという仮説を支持する（Ｗｕｔｈｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２１：１８９−１９８）。
【０１４９】
完全なＨＹ２ファミリーの高度に保存された残基およびビリンレダクターゼの５つのクラスの各々のそれら残基の調査によって、タンパク質の構造、フェレドキシンとの相互作用部位、および基質／生成物特異性に対して重要な残基に関する情報が提供される。これに関しては、ほんの少数の残基が完全なＨＹ２酵素ファミリーで保存されているだけである。これらには、１３７位、１５７位、１５８位、２５６位および３１４位の疎水性残基、Ｐｒｏ−１５１、Ｐｈｅ−２２１、Ｓｅｒ−２２２およびＡｓｐ−１７１が含まれる（図１０）。保存された塩基性残基の顕著な欠如は、ビリン基質のプロピオニル部分は酵素と塩結合を形成しないことを示唆している。保存された疎水性残基プロリンおよびフェニルアラニンは、おそらく全体的なタンパク質構造（すなわち折り畳み）に必要とされるのであろう。また別には、それらは、種々のビリン基質の保存領域との疎水性相互作用を形成するのかもしれない。シロイヌナズナのフィコクロモビリンの機能喪失ｈｙ２−１およびｈｙ２−１０４対立遺伝子座は、ＨＹ２の構造におけるＰｒｏ−１５１の必須の役割を支持している。保存されたセリンおよびアスパルテート残基はおそらく触媒的役割（例えば基質との水素結合および／または基質のプロトン付加）を果たして、結合ビリンをより優れた電子受容体にするのであろう。
【０１５０】
ＨＹ２ファミリーの広い分岐にもかかわらず、我々は、これらの保存残基はこのクラスの全てのメンバーの活性部位が類似していることを示しているものと考えている。我々は、ＢＶレダクターゼ（すなわちＰｃｙＡ、ＰｅｂＡ、ＨＹ２）、１５，１６−ＤＨＢＶレダクターゼ（すなわちＰｅｂＢ）およびＲＣＣＲファミリーのそれぞれ異なる二重結合還元特異性は、対応する基質の触媒ポケット内の配置場所を反映しているのではないかと考える。ＢＶのＡ／ＢおよびＣ／Ｄ環は非常に類似しているが同一ではないので、ＰｅｂＡおよびＨＹ２の基質結合部位はＢＶを反対方向に配置するために個々に調節され、それぞれビリンＣ／Ｄ環またはＡ環への電子伝達を有利にすると考えられる。これが正しいならば、ＰｅｂＢクラスは、その１５，１６−ＤＨＢＶ基質をＨＹ２ファミリーのそれと類似の方向につなぎ、一方、ＲＣＣはＲＣＣＲに、ＢＶがＰｅｂＡに結合される方向と類似の態様で結合される。将来の研究は、ドメイン交換、位置特異的突然変異誘発、合成ビリベルジン基質およびＸ線結晶学を用いて固有の基質／生成物特異性に向けられるであろう。
【０１５１】
バイオテクノロジーに関する考察
ＰΦＢ、ＰＣＢおよびＰＥＢの生合成を仲介するビリンレダクターゼの遺伝子を利用することが可能になったことによって、多数のバイオテクノロジーに関する応用に有用なツールが提供された。任意のＢＶ産生生物でＰＥＢの生合成を巧妙に操作する能力は、今や１つまたは２つの遺伝子を導入することによって実現可能である。このようにして、フィトフルアはいずれのフェレドキシン含有生物においても産生させることができる。ビリンレダクターゼ遺伝子のアポフィトクロムとの同時発現によって、細菌および酵母でのホロフィトクロムの産生が可能になるはずである。これによって、フィトクロムの三次元構造解析だけでなく、我々が分子遺伝学的分析のパワーを利用することができる非植物系におけるフィトクロムのシグナリングの再構築が容易になる。このアプローチは、ステロイドホルモンレセプターファミリーの構造−機能分析で計り知れない価値を有することを証明した。ｐｃｙＡ遺伝子を野生型および発色団欠損変異体植物に導入することによって、フィトクロムの波長特異性を変化させることができるはずである。波長特異性の変化は野外環境での植物の増殖および生育を有利に変えることができる。ｐｅｂＡおよびｐｅｂＢ遺伝子の植物への導入によって、ＢＶからＰＥＢへの変換の側道が形成され、蛍光性フィトフルアをもつ光形態形成的に新しい植物が得られる。これは、植物におけるフィトクロム発現の時間的および空間的パターンの分析に特に有用であろう。
【０１５２】
方法
試薬：グルタチオンアガロースを含む全ての化学物質はシグマ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）から購入し、アメリカ化学会グレードまたはそれ以上であった。制限酵素およびＴａｑポリメラーゼはジブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ， ＯＨ）から得た。ＨＰＬＣグレードのアセトンおよび８０％ギ酸はフィッシャーサイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｐｉｔｔｓｕｂｕｒｇ， ＰＡ）から購入した。発現ベクター、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１およびプレシジョンプロテアーゼはアマーシャムファルマシアバイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）から入手した。セントリコン−１０濃縮装置はアミコン（Ａｍｉｃｏｎ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）から購入した。
【０１５３】
バイオインフォメーション：タンパク質および核酸データベース検索は、公共に開放されているワールドワイドウェッブサイトのプログラムを用いて実施した。予備配列データはＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｅｒｇｙ Ｊｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ ”ｈｔｔｐ：／／ｓｐｉｄｅｒ．ｊｇｉ−ｐｓｆ．ｏｒｇ／ＪＧＩ” ｈｔｔｐ：／／ｓｐｉｄｅｒ．ｊｇｉ−ｐｓｆ．ｏｒｇ／ＪＧＩ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ／ｈｔｍｌ／）から入手した。マルチ配列アラインメントは、ＣＬＵＳＴＳＡＬＷ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６）Ｒ２１Ｒ２１）、ＧＥＮＥＤＯＣ（ ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ ”ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｓｃ．ｅｄｕ／ｂｉｏｍｅｄ／ｇｅｎｅｄｏｃ” ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｓｃ．ｅｄｕ／ｂｉｏｍｅｄ／ｇｅｎｅｄｏｃ）、および手動アラインメント用ＭＥＭＥプログラム（Ｂａｉｌｅｙ ａｎｄ Ｅｌｋａｎ （１９９５） ｐｐ．２１−２９， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｉｒｄ Ｉｎｔｅｒ−ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｉｎｔｅｌｌｅｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， ＣＡ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｉｎｔｅｌｌｅｇｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ）を用いて実施した。図１０に示したアラインメントを基にしたＨＹ２関連タンパク質ファミリーの系統発生分析は、改変ＰＡＭ２５０ウェイティングマトリックス（Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ． （１９７８） Ｐｐ．３４５−３５２， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｍ．Ｏ． Ｄａｙｈｏｆｆ， ｅｄ．， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ： Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）による発見的最節約検索を用い、プログラムＰＡＵＰ＊バージョン４．０（Ｓｗｏｆｆｏｒｄ （１９９３） Ｊ． Ｇｅｎ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０２：９Ａ）によって実施した。
【０１５４】
ＰＡＭ２５０マトリックスには負の値が存在するので、もっとも大きな負のペナルティーをゼロに設定し、他の全ての値はそれに対応させて増加させた。ギャップへのおよびギャップからの遷移（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）に対するスコアは最初のマトリックスでは限定せず、それらは、マトリックスで規定されたもっとも損害の大きい遷移（２５）に等しく設定した。アラインメントの１から６５まで、および３２３から３６８までの記号は我々の分析から除外した。なぜならば、それらは、Ｎ−およびＣ−末端の伸長部分に該当し、ＨＹ２ファミリーの全メンバーに共通ではないからである（すなわち、色素体輸送ペプチドはＨＹ２および赤色葉緑素異化物レダクターゼ（ＲＣＣＲ）で見出され、Ｃ−末端伸長部はＨＹ２のみで見出される）。ホルデウム＝ブルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）のＲＣＣＲの場合は、失われた６５から１１６の記号は疑問符で置き換えられている。前記はゼロとして操作（ｗｅｉｇｈｔ）した。修正一致指数は記号ウェイティングに用いた。
【０１５５】
発現ベクターの構築：シネコシスチス亜種ＰＣＣ６８０３、シネココッカス亜種ＷＨ８０２０およびアナベナ亜種ＰＣＣ７１２０のＨＹ２関連遺伝子を、以下のプライマーを用いて染色体ＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させた（前記プライマーは下線を施した表示の制限部位を含む）：シネコシスチスｐｃｙＡ，ＢａｍＨＩｆｗｄ：５´−ＡＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＣＧＴＣＡＣＴＧＡＴＴＴＡＡＧ−３‘（配列識別番号：１９），ＳａｌＩｒｅｖ：５´−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＴＴＡＴＴＧＧＡＴＡＡＣＡＴＣＡＡＡＴＡＡＧＡＣ−３´（配列識別番号：２０）；シネココッカスｐｅｂＡ，ＥｃｏＲＩｆｗｄ：５´−ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＣＴＴＴＧＡＴＴＣＡＴＴＴＣＴＣＡＡＴＧ−３´（配列識別番号：２１），ＮｏｔＩｒｅｖ：５´−ＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＧＴＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣ−３´（配列識別番号：２２）；シネココッカスｐｅｂＢ，ＥｃｏＲＩｆｗｄ：５´−ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＣＡＡＡＴＣＡＡＡＧＡＴＴＣＡＡＡＡＧＣ−３´（配列識別番号：２３），ＮｏｔＩｒｅｖ：５´−ＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＡＧＡＴＣＡＡＡＡＡＧＣＡＣＡＧＴＧＴＧＧ−３´（配列識別番号：２４）；およびアナベナｐｃｙＡ，ＥｃｏＲＩｆｗｄ：５´−ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＣＴＣＡＣＴＴＡＣＴＴＣＣＡＴＴＣＣＣＴＣ−３´（配列識別番号：２５），ＮｏｔＩｒｅｖ：５´−ＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＴＣＴＧＧ−ＧＡＧＡＴＣＡＡＡＴＡＡＣ−３´（配列識別番号：２６）。続いて、ポリメラーゼ連鎖反応生成物を表示の酵素で切断し、同様に制限消化したｐＧＥＸ−６Ｐ−１に挿入した。プラスミド構築物の完全性は、挿入物の完全なＤＮＡ配列決定によって実証した（Ｄａｖｉｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ， Ｄａｖｉｓ， ＣＡ）。全ての構築物は、ＨＹ２関連遺伝子をシストゾーマ＝ジャポニカム（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子の下流で前記ＧＳＴ遺伝子の枠内に、Ｐｔａｃプロモーターの制御下に置いた。プレシジョンプロテアーゼのための認識配列は前記クローン化遺伝子の上流に配置された。タンパク分解切断によって、小さなＮ−末端伸長を有する無傷のタンパク質が得られた。全ての事例で、本来の開始メチオニンはイソロイシンに変更された。
【０１５６】
発現および精製：発現および精製は、製造元（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）が供給した指示にしたがい、実施例１で述べたように実施した。細菌培養１リットルあたり１から１０ｍｇの精製タンパク質が得られた。
タンパク質の測定：タンパク質濃度は、標準物質としてＢＳＡを用いるＢｒａｄｆｏｒｄの方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ （１９７６） Ｒ４８Ｒ４８）によるか、または２８０ｎｍでの吸収を測定し、各々個々のタンパク質について算出した２８０ｎｍを用いて（Ｇｉｌｌ ａｎｄ Ｈｉｐｐｅｌ （１９８９） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８２：３１９−３２６）決定した。
ビリンレダクターゼ活性標準アッセイ：ビリンレダクターゼ活性についてのアッセイは、ＰΦＢシンターゼについて述べたように実施した（実施例１を参照されたい）。
【０１５７】
直接ＨＰＬＣアッセイ：ビリンレダクターゼアッセイ混合物を、以下のように予備条件付けしたウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ， Ｍｉｌｆｏｒｄ， ＭＡ）Ｃ１８セプパックライト（Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｌｉｇｈｔ）にロードした：セプパックを湿らすためにアセトニトリルによる３ｍＬ洗浄、ミリＱ水による３ｍＬ洗浄、さらに５０ｍＭの４−メチルモルフォリン／氷酢酸（ｐＨ７．７）による３ｍＬ洗浄。サンプルをセプパックにロードした後、それを３ｍＬの４−メチルモルフォリン／氷酢酸（ｐＨ７．７）で洗浄し、続いて０．１％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸３ｍＬで洗浄した。続いてビリン代謝物を２ｍＬの１００％アセトニトリルによりセプパックから溶出させた。前記溶出物をスピードバク（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ）凍結乾燥装置で乾燥させ、前記乾燥サンプルをＨＰＬＣによって分析した。
【０１５８】
サンプルは先ず１０μＬのＤＭＳＯに溶解し、続いて２００μＬのＨＰＬＣ移動相（５０：５０ｖ／ｖのアセトン：２０ｍＭギ酸）で希釈した。サンプルを溶解させた後、それらを簡単に遠心沈殿させてサンプルを採集し、０．４５μｍのポリテトラフルオロエチレン注射筒フィルターに通し、ベアリアン（Ｖａｒｉａｎ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）５０００液体クロマトグラフを用いてクロマトグラフィーを実施した。全ての分析に用いたＨＰＬＣカラムは、フェノメネックス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ， Ｔｏｒｒａｎｃｅ， ＣＡ）ウルトラカーブ（Ｕｌｔｒａｃａｒｂ）５μｍＯＤＳ２０４．６×２５０−ｍｍ分析用カラムで、同じ材料の４．６×３０−ｍｍの保護カラムを有する。このカラムに用いた移動相は、アセトン：２０ｍＭギ酸（５０：５０，ｖ／ｖ）であった。流速は０．８ｍＬ／分であった。溶出物は、ベアリアンＵＶ１００フロースルー吸収検出装置を用いて、最初の１１．５分については５６０ｎｍで、さらに、残りの時間については３８０ｎｍでモニターした。ピーク領域は、ヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）モデル３３６５ケムステーションＩＩを用いて定量した。
【０１５９】
共役分光測定分析および分光蛍光測定分析：リコンビナントＣｐｈ１アポタンパク質の粗部分標本２０μｇ（Ｙｅｈ ａｎｄ Ｌａｇａｒｉａｓ （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ９５：１３９７６−１３９８１）を１ｍＬのビリンレダクターゼアッセイ混合物に緑色安全光の下で添加した。混合物を３０分室温でインキュベートして、フィトビリン結合を可能にした。フィトクロム識別スペクトルを以前に記載されたように得た（Ｔｅｒｒｙ ａｎｄ Ｌａｇａｒｉａｓ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２２１５−２２２２１）。分光蛍光測定アッセイを用い、Ｃｐｈ１の強い蛍光性フィコエリスロビリン（ＰＥＢ）アダクツの生成を検出した（Ｍｕｒｐｈｙ ａｎｄ Ｌａｇａｒｉａｓ （１９９７） Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ７：８７０−８７６）。放射スペクトルは、５４５ｎｍの励起波長でＳＬＭアミコバウマン（Ａｍｉｃｏ Ｂｏｗｍａｎ）ＡＢ２スペクトロフルオロメーター（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ）を用いて得られた。
【０１６０】
実施例３
生細胞における機能的フィトクロムの産生
高等植物では、２つの酵素がフィトクロモビリンＰΦＢ（フィトクロムの発色団前駆体）の生合成に委ねられる。これらの酵素はヘムオキシゲナーゼ（アラビドプシス＝タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）のＨＹ１によってコードされる（Ｍｕｒａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １１：３３５−３４７））（前記酵素は、ヘムからビリベルジンＩＸαへのフェレドキシンイゾン変換を触媒する）、およびシロイヌナズナのフィトクロモビリン：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰΦＢシンターゼ）（シロイヌナズナのＨＹ２によってコードされる）（前記酵素はＢＶからＰΦＢへのフェレドキシン依存変換を触媒する）ＨＹ１タンパク質の相同体、ＨＯ１（これは、シアノバクテリアシネコシスチス亜種ＰＣＣ６８０３のシアノベース遺伝子座ＳＬＬ１１８４によってコードされる）は、機能的なフェレドキシン依存ヘムオキシゲナーゼであることが示された。ここでは、我々は、シアノバクテリアフィトクロムＣｐｈ１とともに生合成酵素ＨＯ１およびＨＹ２を同時発現させることによって、光可逆的ホロフィトクロムが大腸菌で生成されることを示す。前記生成されたホロフィトクロムは、フィトクロモビリンアダクツの生成と一致する分光特性を示す。
【０１６１】
本実験は合成オペロンの作製を必要とし、本オペロンは、シネコシスチス亜種ＰＣＣ６８０３のＨＯ１、および、色素体ターゲッティング配列を欠くアラビドプシス＝タリアナの成熟ＨＹ２コード領域（ｍＨＹ２）で構成されている。ＨＯ１およびｍＨＹ２開放読み枠のプラスミドｐＲＲＯＬａｒＡ１２２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でのクローニングによって、このオペロンはＡｒａ／Ｌａｃ二重プロモーターの調節制御下に置かれた。Ｃｐｈ１−発現プラスミド、ｐＢＡＤ／Ｃｐｈ１（５１４）（このプラスミドでは、Ｃｐｈ１（Ｎ５１４）はＡｒａプロモーターの調節制御下にある）を宿している大腸菌細胞に前記プラスミドを導入したとき、光活性ホロフィトクロムのｉｎ ｖｉｖｏ生成が決定された。
【０１６２】
方法
プラスミド構築物：以下のように、ＨＯ１およびｐｃｙＡコード領域から成る合成オペロンを発現ベクターｐＰＲＯｌａｒＡ１２２でクローニングして、プラスミドｐＰＲＯｌａｒＡ１２２／ＨＯ１−ＲＢＳ−ＳＬＲ０１１６（配列識別番号：２７）を作製した。センスプライマーＰｈｏ１−Ｓ１Ｋ，５´−ＡＴＣＧＧＴＡＣＣＡＴＧＡＧＴＧＴＣＡＡＣＴＴＡＧＣＴＴＣ−３´（配列識別番号：２８）（ＫｐｎＩ制限部位を含む）およびアンチセンスプライマーＰｈｏ１−ＡｒＢ，５´−ＡＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＴＡＡＣＴＡＧＣＣＴＴＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡ−３´（配列識別番号：２９）（合成リボソーム結合部位をＢａｍＨＩ制限部位の上流に含む）を用い、鋳型としてシネコシスチス亜種ＰＣＣ６８０３の染色体ＤＮＡを用いてシネコシスチス亜種ＰＣＣ６８０３のＨＯ１遺伝子を先ず初めにＰＣＲ増幅させた。前記反応は、標準的な反応混合物、Ｔａｑポリメラーゼ、およびアニーリング温度５０℃での３０サイクル工程で実施した。続いて遺伝子をＴＡクローニングプラスミド、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）でクローニングし、プラスミドｐＣＲ２．１／ＨＯ１−ＲＢＳ（本明細書には提示していない）を得た。
【０１６３】
シネコシスチス亜種ＰＣＣ６８０３（Ｃｏｒｎｅｊｏ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｌａｎｔ Ｊ． １５：９９−１０７）のＨＯ１およびＨＹ２コード領域から成る合成オペロンは、ｍＨＹ２をプラスミドｐＣＲ２．１／ＨＯ１−ＲＢＳでクローニングし、プラスミドｐＣＲ２．１／ＨＯ１−ＲＢＳ−ＨＹ２を作製することによって得た。特に、シロイヌナズナのｍＨＹ２ｃＤＮＡは、クローンｐＧＥＸ−ｍＨＹ２（実施例２）（前記クローンは完全長のｍＨＹ２ｃＤＮＡから輸送ペプチドを除いたものをＧＳＴ融合ベクター中に含む）のプラスミドＤＮＡを用い、センスプライマーｍＨＹ２−ＥｃｏＲＶ：５´−ＣＧＧＡＴＡＴＣＡＴＧＴＣＣＣＣＴＡＴＡＣＴＡ−３´（配列識別番号：３０）およびアンチセンスプライマーｍＨＹ２−ＮｏｔＩ：５´−ＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＧＣＣＧＡＴＡＡＡＴＴＧＴＣＣ−３´（配列識別番号：３１）により標準的な条件下でＰＣＲ増幅させた。前記反応は、標準的な反応混合物、Ｐｆｕポリメラーゼ、およびアニーリング温度５５℃での３５サイクル工程で実施した。ＰＣＲ生成物は、ＥｃｏＲＶおよびＮｏｔＩで制限消化し、続いてプラスミドｐＣＲ２．１／ＨＯ１−ＲＢＳでサブクローニングし、プラスミドｐＣＲ２．１／ＨＯ１−ＲＢＳ−ＨＹ２を作製した。最後に、ｐＣＲ２．１／ＨＯ１−ＲＢＳ−ＨＹ２をＫｐｎＩ／ＮｏｔＩで制限消化し、得られたフラグメントをＫｐｎＩ／ＮｏｔＩ制限消化したｐＰＲＯＬａｒＡ１２２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により連結してｐＰＲＯＬａｒＡ１２２／ＨＯ１−ＲＢＳ−ＨＹ２を得た。
【０１６４】
大腸菌株、培養液および形質転換：プラスミドｐＰＲＯＬａｒＡ１２２／ＨＯ１−ＲＢＳ−ＨＹ２で、アポフィトクロム発現プラスミドｐＢＡＤ／Ｃｐｈ１（５１４）を含む大腸菌株ＬＭＧ１９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のコンピテント細胞を形質転換させた。最小ＲＭ培養液を用い、アンピシリンおよびカナマイシンの二重選別を実施して形質転換体を単離した。
【０１６５】
タンパク質発現：プラスミドｐＢＡＤ／Ｃｐｈ１（５４１）およびｐＰＲＯｌａｒＡ１２２／ＨＯ１−ＲＢＳ−ＨＹ２の両プラスミドを含む大腸菌株ＬＭＧ１９４を３７℃で３ｍＬのＲＭ培養液（２５μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）で一晩増殖させた。前記培養の部分標本１ｍＬを１００ｍＬのＲＭ培養液に移し、ＯＤ６００が約０．５に達するまで３７℃で増殖させた。続いて、前記培養の５０ｍＬを２５μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培養液４５０ｍＬに移した。３０℃で１時間インキュベートした後、アラビノースを最終濃度０．００２％に添加してアポＣｐｈ１の発現を誘発した。前記培養を３０℃で５時間増殖させ、その後、細胞を遠心沈殿によって採集し、さらに１０ｍＬの溶解緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）のＮＰ４０、２μｇ／ｍＬのロイペプチン、２ｍＭのベンゾアミジン、２ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのＤＴＴ、３μｇ／ｍＬのペプスタチンＡ）に再懸濁させた。６．８９５×１０７Ｐａ（１００００ｐｓｉ）でフレンチプレスにより細胞を溶解させて細胞溶解物を得た。不溶性物質を遠心沈殿によって除去した後、粗ホモジネートを氷上に静置し４℃で分光測定によりホロフィトクロムを調べた。
【０１６６】
タンパク質の精製：粗可溶性分画をタロン（Ｔａｌｏｎ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）金属アフィニティーカラム（５ｍＬのベッド容積）に流し、２０ｍＬの抽出／洗浄緩衝液で洗浄し、さらに２ベッド容積の１×溶出緩衝液（２００ｍＭのイミダゾールを含むＥＷ緩衝液）で溶出させた。得られた溶液を１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）の２Ｌに対して一晩透析し、続いてアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）限外ろ過セルを用いて濃縮した。
【０１６７】
結果と考察：３０℃で５時間誘発した後、ｐＢＡＤ／Ｃｐｈ１（５１４）およびｐＰＲＯｌａｒＡ１２２／ＨＯ１−ＲＢＳ−ＨＹ２プラスミドの両プラスミドを含む培養は青緑色になった。識別スペクトル（図１５）に示したように、ｐＢＡＤ／Ｃｐｈ１（５１４）およびｐＰＲＯｌａｒＡ１２２／ＨＯ１−ＲＢＳ−ＨＹ２の同時発現によって、光活性ホロフィトクロムを含む粗細胞抽出物が得られた。これらの細胞から得られた精製ホロＣｐｈ１（Ｎ５１４）のスペクトルは、Ｐｒ型の最大吸収を６６０ｎｍで、さらにＰｆｒ型のそれを７１０ｎｍで示し、フィトクロモビリン（ＰΦＢ）アダクツのｉｎ ｖｉｖｏ形成と一致した。前記は、ＰＣＢオペロン（すなわちＨＯ１およびＰｃｙＡ）を同時発現しているＣｐｈ１（Ｎ５１４）発現大腸菌細胞で形成される、青色にシフトしたフィコシアノビリン（ＰＣＢ）とは対照的である（図１６）（Ｙｅｈ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７７：１５０５−１５０８）。
本明細書で述べた実施例および実施態様は例示を目的としており、それらを参考に種々の改変または変更が当業者に示唆されるであろうが、それらは本発明の範囲内および添付の請求の範囲に包含されることは理解されよう。全ての文献、特許および特許出願は参照によりその全体が本明細書に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ビリン色素の生合成経路を示す。哺乳類の胆汁色素ビリルビン並びに植物、藻類およびシアノバクテリアのフィトクロムおよびフィコビリタンパク質発色団の直鎖状テトラピロール前駆体は、共通の中間体ビリベルジンＩＸａを共有する。ＨＹ２，フィトクロモビリンシンターゼまたは３Ｚ−フィトクロモビリン：フェレドキシンオキシドレダクターゼ；ＰｃｙＡ，３Ｚ−フィコシアノビリン：フェレドキシンオキシドレダクターゼ；ＰｅｂＡ，１５，１６−ジヒドロビリベルジン：フェレドキシンオキシドレダクターゼ；ＰｅｂＢ，３Ｚ−フィコエリスロビリン：フェレドキシンオキシドレダクターゼ；ＢＶＲ／ＢｖｄＲ，ビリベルジンＩＸａ：ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシドレダクターゼ。疑問符の付いた点線の矢印は、仮定的３Ｚ−フィコシアノビリン：フェレドキシンオキシドレダクターゼの第二のタイプを示している。点線の矢印は、仮定的フィコエリスロビリン−フィコシアノビリンイソメラーゼを示している（Ｂｅａｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｊｏ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２２３３３−２２３４０）。
【図２】
図２はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のフィトクロム生合成を示している。
【図３】
図３Ａおよび図３Ｂは、シロイヌナズナのＨＹ２遺伝子座を示している。図３Ａは、ＨＹ２を含む染色体３の領域のマップを示す。２つの別個のマッピング集団をスクリーニングし、分子マーカーを含むマッピングの結果を模式的に要約した。それは、ＨＹ２は長さが６６ｋｂの領域に存在することを示している。文字ｃで始まるマーカーはこの実験の間に開発されたＣＡＰＳマーカーである。細菌の人工的染色体（ＢＡＣ）、ＭＺＢ１０およびＦ３Ｌ２４はＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪで入手できる。変異を有するＨＹ２遺伝子構造は下部に示されている。エクソンは黒四角および太線として表されている。前記はそれぞれコード領域および５９／３９非翻訳領域を反映している。点線はイントロンを示している。図３Ｂは、コロンビア（Ｃｏｌ）生態型のＨＹ２のゲノム配列および推定されるＨＹ２タンパク質配列を示す。大文字は、ＨＹ２ｃＤＮＡの配列分析によって決定したエクソンを表す。イントロンおよびスペーサー配列は小文字で示されている。終止コドンは二重下線で示されている。ｈｙ２対立遺伝子座の変異はボールド体の文字で示されている。ＬｅｒおよびＷｓ（Ｗａｓｓｉｌｅｗｓｋｉｊａ）両生態型の単一ヌクレオチド多形現象は以下を含む：Ｔ挿入（ヌクレオチド２３４位）、Ａｓｎへのアミノ酸変更をもつＧ３６４Ｔ変換、およびＧ１１８２Ａ変換（サイレント）。Ｌｅｒ生態型のみの単一ヌクレオチド多形現象は以下を含む：Ｃ５１５Ａ（イントロン内）、Ｇ８８４Ａ（サイレント）、Ｃ１１４５Ｔ（イントロン内）、およびＧ１７１７Ａ（イントロン内）。Ｗｓ生態型のみの単一ヌクレオチド多形現象はＣ１９１９Ｔ（サイレント）である。
【図４】
図４Ａおよび４ＢはＭＺＢ１０．１８／Ｆ３Ｌ２４．１のＲＮＡゲルブロットハイブリダイゼーションを示す。図４Ａ：プローブとしてＭＺＢ１０．１８／Ｆ３Ｌ２４．１ｃＤＮＡを用いて、１週齢の幼苗の全ＲＮＡをＲＮＡゲルブロッテイングによって分析した。ＲＮＡは、ｈｙ２変異体および対応する野生型植物の幼苗から調製した。図４Ｂ：同じＲＮＡゲルブロットをＲＮＡのローディングコントロールとしてｒＤＮＡをプローブとして調べた。
【図５】
図５は、ＨＹ２およびＨＹ２関連タンパク質のアラインメントを示す。ＰＳＩＢＬＡＳＴにより特定された酸素放出型光合成細菌由来の未知の機能をもつタンパク質とのＨＹ２のアラインメント。アラインメントを実施した配列の１００または８０％の保存残基が、それぞれ大文字または小文字で示したコンセンサス中に示されている。コンセンサス配列内に示されている配列類似性をもつ群は配列の１００％の保存を反映している。これらは以下のように標識されている：１，Ｄ５Ｎ；４，Ｒ５Ｋ；５，Ｆ５Ｙ５Ｗ；および６，Ｌ５Ｉ５Ｖ５Ｍ。白文字をもつ黒塗り、白文字をもつ灰色塗り、および黒文字をもつ灰色塗りは、それぞれ１００％、８０％および６０％の配列保存を反映している。配列識別子は、シネココッカス亜種ＷＨ８０２０（ＹＣＰ２＿ＳＹＮＰＹおよびＹＣＰ３＿ＳＹＮＰＹ）、プロクロロコッカス（ＹＨＰ２＿ＰＲＯＭＡおよびＹＨＰ３＿ＰＲＯＭＡ）、およびシネコシスチス亜種ＰＣＣ６８０遺伝子（シアノベース遺伝子座ｓｌｒ０１１６； ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ ”ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｙａｎｏ．ｈｔｍｌ” ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｙａｎｏ．ｈｔｍｌを参照されたい）の仮定的タンパク質と一致する。データベース承認番号は、ＨＹ２（ＤＤＢＪ）についてはＡＢ０４５１１２、ＹＣＰ２＿ＳＹＮＰＹ（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ）についてはＱ０２１８９、ＹＣＰ３＿ＳＹＮＰＹ（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ）についてはＱ０２１９０、ＹＨＰ２＿ＰＲＯＭＡ（ＥＭＢＬ）についてはＣＡＢ９５７００．１、ＹＨＰ３＿ＰＲＯＭＡ（ＥＭＢＬ）についてはＣＡＢ９５７０１．１、およびｓｌｒ０１１６（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）についてはＳ７６７０９である。星印は２０残基ごとに示されている。
【図６】
図６Ａから６Ｄは、タマネギの細胞およびタバコの細胞でのＧＦＰ融合物の一過性発現を示している。図６Ａから６Ｃ：ＧＦＰ（タマネギ）（図６Ａ）、ＧＦＰに融合させたＨＹ２葉緑体輸送ペプチド（ＨＹ２ＴＰ−ＧＦＰ）（タマネギ）（図６Ｂ）、およびＨＹ２ＴＰ−ＧＦＰ（タバコ）（図６Ｃ）を発現している細胞を、ＧＦＰのための緑色チャネルを用いて蛍光顕微鏡によって分析した。図６Ｄ：（Ｃ）と同じサンプルを葉緑素のための赤色チャネルを用いて画像化した。（６Ａ）および（６Ｂ）中の棒線は５１００ｍｍであり、（６Ｃ）および（６Ｄ）中の棒線は５１０ｍｍである。
【図７】
図７は、精製されたシロイヌナズナのリコンビナントｍＨＹ２のＳＤＳＰＡＧＥを示す。レーン１は、ｐＧＥＸｍＨＹ２を宿す未誘発大腸菌ＤＨ５ａ株のセルフリー抽出物；レーン２は、イソプロピルチオβガラクトシドで誘発したｐＧＥＸｍＨＹ２を宿す大腸菌ＤＨ５ａ株のセルフリー抽出物；レーン３は、誘発細菌の可溶性分画；レーン４は、グルタチオンアガロースアフィニティークロマトグラフィー後のＧＳＴｍＨＹ２；レーン５は、プレシジョン（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ）プロテアーゼ処理後のＧＳＴｍＨＹ２；レーン６は、２回目のグルタチオンアガロースアフィニティークロマトグラフィー後の精製リコンビナントｍＨＹ２；レーンＭは、分子量標準物質。右側の数字は、分子量マーカー（Ｓｉｇｍａ， ＳＤＳ７）の位置をキロダルトンで示す。
【図８】
図８は、ＢＶ代謝物質とインキュベートした後のｃｐｈ１のフィトクロム識別スペクトルを示す。イソプロピルチオβガラクトシド２で誘発したｐＧＥＸｍＨＹ２を宿す大腸菌ＤＨ５ａの可溶性タンパク質抽出物を、ここで述べるようにＰΦＢシンターゼ活性についてアッセイした。リコンビナントＣｐｈ１をビリン反応混合物に添加し、これをさらに３０分室温で緑色安全光の下でインキュベートし、フィトクロム識別スペクトルを得た。吸収の最大および最小はｎｍで示されている。
【図９】
図９は、ＨＰＬＣで検出されたとおり、ＨＹ２はＢＶをＰΦＢに変換することを示している。精製リコンビナントＨＹ２タンパク質（４０ｍｇ）を、ここで述べるようにＰＦＢシンターゼ活性についてアッセイした。セプパック（ＳｅｐＰａｋ）Ｃ１８逆相カートリッジを用いて、ビリンをインキュベーション混合物から抽出し、ここで述べるように逆相ＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣ溶媒はアセトン：２０ｍＭギ酸（５０：５０（Ｖ／Ｖ））で、溶出液を３８０ｎｍでモニターした。３回目のトレースで、ＢＶをＨＹ２とインキュベートした後で得られたビリン代謝物質が示された。一番下のトレースは内部標準としてＢＶをさらに含んでいる。
【図１０】
図１０は、特定されたビリンレダクターゼのマルチ配列アラインメントを示す。特定された配列の全てをＣＬＵＳＴＡＬＷおよびＭＥＭＥプログラムを用いてアラインメントを実施した。整列比較配列の９０または７０％の保存残基が、それぞれ大文字または小文字でコンセンサス配列中に示されている。コンセンサス配列中に示されている配列類似群（１（Ｄ，Ｅ）、２（Ｒ，Ｋ）、３（Ｆ，Ｙ，Ｗ）、および４（Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｍ）と標識されている）は、９０％を越える配列で保存を示している。白文字を含む黒塗り、白文字を含む灰色塗りおよび黒文字を含む灰色塗りは、それぞれ９０、７０および５０％の配列保存を示している。ＳＹＮＹ３，シネコシスチス亜種ＰＣＣ６８０３；ＳＹＮＰＹ，シネココッカス亜種ＷＨ８０２０；ＳＹＮ８１，シネココッカス亜種ＷＨ８１０２；ＰＲＯＭＡ，プロクロロコッカス亜種ＳＳ１２０；ＰＲＯＭＥ，プロロコッカス亜種ＭＥＤ４；ＮＯＳＰＵ，ノストク＝パンクチフォルム；ＡＮＡＳＰ，アナベナ亜種ＰＣＣ７１２０；ＡＲＡＴＨ，アラビドプシス＝タリアナ；およびＨＯＲＶＵ，ホルデウム＝ブルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）。データベース承認番号は以下のとおりである：ＰｃｙＡ＿ＡＮＡＳＰについてはＧＢ：ＡＦ３３９０５６（ＣｙａｎｏＢａｓｅ ｃｏｎｔｉｇ ３６２）、ＰｃｙＡ＿ＮＯＳＰＵについてはＧＢ：ＡＦ３３９０５７（ＪＧＩ ｃｏｎｔｉｇ ６３２）、ＰｃｙＡ＿ＳＹＮＹ３についてはＰＩＲ：Ｓ７６７０９、ＰｃｙＡ＿ＳＹＮ８１はＪＧＩ ｃｏｎｔｉｇ ５１にあり、ＰｃｙＡ＿ＰＲＯＭＥについてはＧＢ：ＡＦ３５２０５０（ＪＧＩ ｃｏｎｔｉｇ ２６）、ＰｅｂＡ＿ＳＹＮＰＹについてはＳＷ：Ｑ０２１８９、ＰｅｂＡ＿ＳＹＮ８１についてはＰＩＲ：Ｓ３１０７５（フラグメント）／ＪＧＩｃｏｎｔｉｇ７２、ＰｅｂＡ＿ＰＲＯＭＡについてはＥＭＢ：ＣＡＢ９５７００．１、ＰｅｂＡ＿ＰＲＯＭＥはＪＧＩｃｏｎｔｉｇ２６にあり、ＰｅｂＡ＿ＮＯＳＰＵ（ＪＧＩ ｃｏｎｔｉｇ ６２２）についてはＧＢ：ＡＦ３５２０４９、ＰｅｂＢ＿ＳＹＮＰＹについてはＳＷ：Ｑ０２１９０、ＰｅｂＢ＿ＳＹＮ８１はＪＧＩｃｏｎｔｉｇ７２にあり、ＰｅｂＢ＿ＰＲＯＭＡについてはＥＭＢ：ＣＡＢ９５７０１．１、ＰｅｂＢ＿ＰＲＯＭＥはＪＧＩｃｏｎｔｉｇ２６にあり、ＰｅｂＢ＿ＮＯＳＰＵ（ＪＧＩ ｃｏｎｔｉｇ ６２２）についてはＧＢ：ＡＦ３３９０５８、ＨＹ２＿ＡＲＡＴＨについてはＤＤＢＪ：ＡＢ０４５１１２、ＲＣＣＲ＿ＨＯＲＶＵについてはＥＭＢ：ＣＡＢ７７７０５．１、ＲＣＣＲ＿ＡＲＡＴＨについてはＥＭＢ：ＣＡＢ１６７６３．１。星印は１０アミノ酸ごとに示されている。ダッシュはギャップを示す。線の上の数字は、１で始まるアミノ酸配列の番号付けを示している。
【図１１】
図１１は、フェレドキシン依存ビリンレダクターゼのＨＹ２ファミリーの系統発生樹を示す。
【図１２】
図１２は、アフィニティー精製ビリンレダクターゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。レーン１、グルタチオンアガロースアフィニティークロマトグラフィー後のＧＳＴ−ＰｃｙＡ＿ＳＹＮＹ３；レーン２、２回目のグルタチオンアガロースアフィニティークロマトグラフィー後の精製リコンビナントＰｃｙＡ＿ＡＮＡＳＰ；レーン３、ｍＨＹ２；レーン４、ＰｅｂＡ＿ＳＹＮＰＹ；レーン５、ＰｅｂＢ＿ＳＹＮＰＹ。ＳＴＤは分子量標準物質（キロダルトン）。
【図１３】
図１３Ａおよび１３Ｂは、反応代謝物質とともにインキュベートしたリコンビナントシアノバクテリアのフィトクロム（Ｃｐｈ１）のフィトクロム識別スペクトルおよびフィトフルア蛍光スペクトルを示す。図１３Ａ：イソプロピルチオガラクトピラノシドで誘発したｐＧＥＸＮＮを宿す大腸菌ＤＨ５ａ株の可溶性タンパク質抽出物とともにＢＶを標準的なＰＦＢシンターゼアッセイの条件下で２８℃３０分、緑色安全光の下でインキュベートした。リコンビナントアポＣｐｈ１を前記反応に添加し、さらに３０分室温で緑色安全光の下でインキュベートし、フィトクロムの識別スペクトルを得た。実線で示した識別スペクトルは、ｐｃｙＡ＿ＳＹＮＵ３代謝物質とインキュベートしたアポＣｐｈ１により得られ、点線で示したスペクトルはｍＨＹ２代謝物により得られた。吸収の最大および最小はｎｍで示されている。ＰｅｂＡ＿ＳＹＮＰＹ、ＰｅｂＢ＿ＳＹＮＰＹまたは両者の混合物のいずれも光変換可能なホロフィトクロムを形成することができなかった（識別スペクトルは示されていない）。図１３Ｂ：ＰｅｂＡおよびＰｅｂＢ代謝物質とともにインキュベートしたリコンビナントシアノバクテリアフィトクロム（Ｃｐｈ１）のフィトフルア蛍光スペクトル。蛍光励起およびフィトフルアの放出スペクトルが、ＰｅｂＡ＿ＳＹＮＰＹおよびＰｅｂＢ＿ＳＹＮＰＹの反応代謝物質とともにアポＣｐｈ１をインキュベートした後で得られた。実線は、放出波長５９０ｎｍでモニターした励起スペクトルを表している。点線は、励起波長５４５ｎｍで得た放出スペクトルを示している。
【図１４】
図１４は、ＰｅｂＡ、ＰｅｂＢ、ＰｃｙＡおよびＨＹ２ビリンレダクターゼのＢＶ代謝物のＨＰＬＣ分析を示す。４０μｇの精製タンパク質を緑色安全光の下で５ｍＬの全アッセイ容積で２８℃でインキュベートした。アッセイ系は、ＮＡＤＰＨ再生系、ホウレンソウのフェレドキシン−ＮＡＤＰ＋−レダクターゼ、ホウレンソウフェレドキシおよびＢＳＡを含んでいた。反応は５ｍＭのＢＶの添加によって開始し、混合物を氷上に静置することによって停止させた。ビリンは、セプパック（ＳｅｐＰａｋ）Ｃ１８逆相カラムを用いてインキュベーション混合物から抽出し、フェノメネクスウルトラカーブ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｕｌｔｒａｃａｒｂ）５ｍｍＯＤＳ２０、４．６ｍｍ３２５０ｍｍカラム（４．６ｍｍ３３０ｍｍガードカラム付き）上でＨＰＬＣによって分析した。ＨＰＬＣ溶媒はアセトン：２０ｍＭギ酸（５０：５０，ｖ／ｖ）で、溶出液は最初の１１．５分は５６０ｎｍで、残りの時間については３８０ｎｍでモニターした。ＳＴＤＳ，種々のビリン標準物質の混合物；ＨＹ２，ｍＨＹ２によって得られた代謝物質；ＰｃｙＡ，ＰｃｙＡ＿ＳＹＮＹ３によって得られた代謝物質；ＰｅｂＡ，ＰｅｂＡ＿ＳＹＮＰＹによって得られた代謝物質；ＰｅｂＡ１Ｐｅｂ，ＰｅｂＡ＿ＳＹＮＰＹおよびＰｅｂＢ＿ＳＹＮＰＹの１：１混合物によって得られた代謝物質。記号はピークをより明瞭に視覚化させるために用いられている。単一記号は３Ｅ異性体を示し（１５，１６−ＤＨＢＶおよびＢＶは除く）、二重記号は３Ｚ異性体をそれぞれ示す。
【図１５】
図１５は、アポＣｐｈ１、ＨＯ１およびＨＹ２を発現させるために誘発した大腸菌ＬＭＧ１９４株から精製したタンパク質から得られたホロフィトクロムの識別スペクトルを示す。
【図１６】
図１６は、ＨＯ１とＨＹ２またはＨＯ１とＰｃｙＡのどちらかとともにアポＣｐｈ１を発現させるために誘発した大腸菌ＬＭＧ１９４株から単離したタンパク質から得られたホロフィトクロムの識別スペクトルを示す。
【図１】
2004511214.tif 000002
【図２】
2004511214.tif 000003
【図３Ａ】
2004511214.tif 000004
【図８】
2004511214.tif 000005
【図９】
2004511214.tif 000006
【図１１】
2004511214.tif 000007
【図１３Ａ】
2004511214.tif 000008
【図１３Ｂ】
2004511214.tif 000009
【図１４】
2004511214.tif 000010
【図１５】
2004511214.tif 000011
【図１６】
2004511214.tif 000012
【国際公開パンフレット】
2004511214.tif 000013
2004511214.tif 000014
2004511214.tif 000015
2004511214.tif 000016
2004511214.tif 000017
2004511214.tif 000018
2004511214.tif 000019
2004511214.tif 000020
2004511214.tif 000021
2004511214.tif 000022
2004511214.tif 000023
2004511214.tif 000024
2004511214.tif 000025
2004511214.tif 000026
2004511214.tif 000027
2004511214.tif 000028
2004511214.tif 000029
2004511214.tif 000030
2004511214.tif 000031
2004511214.tif 000032
2004511214.tif 000033
2004511214.tif 000034
2004511214.tif 000035
2004511214.tif 000036
2004511214.tif 000037
2004511214.tif 000038
2004511214.tif 000039
2004511214.tif 000040
2004511214.tif 000041
2004511214.tif 000042
2004511214.tif 000043
2004511214.tif 000044
2004511214.tif 000045
2004511214.tif 000046
2004511214.tif 000047
2004511214.tif 000048
2004511214.tif 000049
2004511214.tif 000050
2004511214.tif 000051
2004511214.tif 000052
2004511214.tif 000053
2004511214.tif 000054
2004511214.tif 000055
2004511214.tif 000056
2004511214.tif 000057
2004511214.tif 000058
2004511214.tif 000059
2004511214.tif 000060
2004511214.tif 000061
2004511214.tif 000062
2004511214.tif 000063
2004511214.tif 000064
2004511214.tif 000065
2004511214.tif 000066
2004511214.tif 000067
2004511214.tif 000068
2004511214.tif 000069
2004511214.tif 000070
2004511214.tif 000071
2004511214.tif 000072
2004511214.tif 000073
2004511214.tif 000074
2004511214.tif 000075
2004511214.tif 000076
2004511214.tif 000077
2004511214.tif 000078
2004511214.tif 000079
2004511214.tif 000080
2004511214.tif 000081
2004511214.tif 000082
2004511214.tif 000083
2004511214.tif 000084
2004511214.tif 000085
2004511214.tif 000086
2004511214.tif 000087
2004511214.tif 000088
2004511214.tif 000089
2004511214.tif 000090
2004511214.tif 000091
2004511214.tif 000092
2004511214.tif 000093
2004511214.tif 000094
2004511214.tif 000095
2004511214.tif 000096
2004511214.tif 000097
2004511214.tif 000098
2004511214.tif 000099
2004511214.tif 000100
2004511214.tif 000101
2004511214.tif 000102
2004511214.tif 000103
2004511214.tif 000104
2004511214.tif 000105
2004511214.tif 000106
2004511214.tif 000107
2004511214.tif 000108
2004511214.tif 000109
2004511214.tif 000110
2004511214.tif 000111
2004511214.tif 000112
2004511214.tif 000113
2004511214.tif 000114
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004511214.tif 000115
【国際調査報告】
2004511214.tif 000116
2004511214.tif 000117
2004511214.tif 000118