(57)【要約】本発明は、神経原線維変化の形成を阻害する方法、および、対象者においてアポリポ蛋白質Ｅ（ａｐｏＥ）に関連した疾患を治療する方法を提供する。これらの方法は、一般的に、対象者の神経細胞におけるカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの量を低下させることを含む。さらに、本発明は、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥをコードする核酸分子を含む単離細胞、および、この細胞を用いて化合物をスクリーニングする方法を提供する。本発明は、さらに、ａｐｏＥ切断酵素を阻害し、神経細胞における神経原線維変化の形成を低下させる化合物を提供する。さらに、本発明は、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥをコードする核酸を導入遺伝子として含む、ヒト以外のトランスジェニック動物、および、トランスジェニック動物を使用して化合物をスクリーニングする方法を提供する。
2004516825.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
各個体において神経原線維変化が形成されるのを阻害する方法であって、その個体のニューロンにおいてカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの形成を低下させる工程を含む方法。
【請求項２】
神経細胞においてタンパク質分解によるａｐｏＥの分解を触媒する酵素のタンパク質分解活性を低下させる作用薬を各個体に投与する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの形成が低下することによって、各個体におけるａｐｏＥ関連疾患が治療される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
疾患が、アルツハイマー病、冠状動脈疾患、頭蓋骨損傷、および脳梗塞からなる群より選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ａｐｏＥがａｐｏＥ４である、請求項３記載の方法。
【請求項６】
カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥ４がａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ゲノムの中に安定的に組み込まれた導入遺伝子を含む、ヒト以外のトランスジェニック動物であって、該導入遺伝子が、該動物のニューロンにおいてカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥをコードする配列が発現して、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥタンパク質が合成されるよう、機能可能なようにプロモーターに結合している、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥをコードする塩基配列を含み、さらに、該カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥタンパク質が合成される結果、該トランスジェニック動物がＡＤの症状を発症する、ヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項８】
カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥをコードする導入遺伝子の塩基配列が過剰発現される結果、該導入遺伝子を持たない同種動物と比較してカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの量が上昇する、請求項７記載のヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項９】
ａｐｏＥがａｐｏＥ４である、請求項７記載のヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項１０】
カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥ４がａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）である、請求項９記載のヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項１１】
ＡＤの症状が、神経細胞に神経原線維変化が存在することである、請求項７記載のヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項１２】
アルツハイマー病（ＡＤ）に随伴する現象を調節する生物活性作用薬をスクリーニングする方法であって、
（ａ）カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥを産生する細胞を被検作用薬と接触させる工程、および、
（ｂ）該作用薬が細胞におけるカルボキシル末端側ａｐｏＥ量に与える効果を測定する工程
を含む方法。
【請求項１３】
細胞が、ａｐｏＥをコードする塩基配列を含む核酸を導入遺伝子として含む、ヒト以外のトランスジェニック動物中の細胞であり、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの量が減少することによって神経原線維変化の減少がもたらされる、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
細胞がインビトロの細胞である、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
神経細胞においてタンパク質分解によるａｐｏＥの分解を触媒する酵素のタンパク質分解活性を低下させる生物活性作用薬をスクリーニングする方法であって、
該酵素を被検作用薬と、該酵素による作用を受けると検出可能な生成物を生じる基質とに接触させる工程、および、
検出可能な生成物の形成に対する被検作用薬の効果があるようならば、その効果を測定する工程
を含む方法。
【請求項１６】
基質が、（Ｐ３）ｎＰ２Ｐ１−Ｘという化学式をもち、ここでＰ４Ｐ３Ｐ２Ｐ１がペプチドであり、Ｘがペプチドのカルボキシル末端に結合する部分（「タグ基」）であり、また、酵素による作用を受けて該ペプチドから切断されると検出可能なシグナルをもたらすペプチドであって、Ｐ１が、ロイシン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群より選択される疎水性残基であり、Ｐ２がプロリンであり、Ｐ３がアラニンであり、さらに、ｎ≧２である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥをコードする塩基配列を含む核酸分子を含む単離細胞。
【請求項１８】
ａｐｏＥがａｐｏＥ４である、請求項１７記載の単離細胞。
【請求項１９】
カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥ４がａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）である、請求項１７記載の単離細胞。
【請求項２０】
細胞が神経細胞である、請求項１７記載の単離細胞。
【請求項２１】
各個体において神経原線維変化が形成されるのを阻害する方法であって、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥが、神経原線維変化の別の成分と相互作用するのを阻害する工程を含む方法。
【請求項２２】
神経原線維変化の別の成分が、リン酸化されたｔａｕおよびリン酸化されたＮＦ−Ｈからなる群より選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
各個体の神経細胞の中で神経原線維変化が形成されるのを阻害する方法であって、神経細胞を、細胞の中でａｐｏＥの切断を触媒してカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥが生成されるのを触媒する神経細胞内酵素の酵素活性を阻害する作用薬と接触させる工程を含む方法。
【請求項２４】
作用薬が、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：１）、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（配列番号：３）、およびＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：４）からなる群より選択されるペプチドである、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
薬学的組成物であって、
ａ）キモトリプシン様プロテアーゼインヒビターのインヒビター、
ｂ）アセチルコリンエステラーゼインヒビター、非ステロイド系抗炎症剤、シクロオキシゲナーゼ−２インヒビター、およびモノアミンオキシダーゼインヒビターからなる群より選択される作用薬、および
ｃ）薬学的に許容される賦形剤
を含む薬学的組成物。
【請求項２６】
アルツハイマー病を治療する方法であって、
ａ）神経細胞中にカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥが存在するのを測定する工程、
ｂ）神経細胞においてカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥが形成されるのを触媒する酵素のインヒビターを投与する工程
を含む方法。
【請求項２７】
神経細胞においてカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥが形成されるのを触媒する酵素のインヒビター、および薬学的に許容される賦形剤を含む組成物、ならびに、組成物を必要としている個体に該組成物を投与するための指示書を含むキット。
【請求項２８】
アルツハイマー病を治療する方法であって、キモトリプシン様セリンプロテアーゼのインヒビターを、神経細胞においてカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥが形成されるのを触媒する酵素を効果的に阻害できる量投与する工程を含む方法であり、該酵素が阻害されて、各個体における神経細胞において神経原線維変化の量が低下する方法。
【請求項２９】
ａ）神経細胞においてカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥが形成されるのを触媒する酵素を阻害する作用薬、および、
ｂ）薬学的に許容される賦形剤
を含む組成物。
【請求項３０】
作用薬が、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：１）、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ（配列番号：２）、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（配列番号：３）、およびＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：４）からなる群より選択される、請求項２９記載の組成物。
【請求項３１】
神経細胞中のカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの量を減少させる方法であって、Ａβ１−４２により神経細胞内でカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥが形成されるのを触媒する酵素の活性化を抑制する作用薬と細胞を接触させる工程を含み、酵素の活性化を抑制することによって、細胞内のカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥ量の減少がもたらされる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０００年１１月３日に出願された米国特許仮出願第６０／２４５，７３７号の利益を主張するものである。この文献は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる
【０００２】
発明の属する技術分野
本発明はアポリポ蛋白質Ｅに関するものであり、特に、ａｐｏＥに関連した疾患を治療する方法に関する。
【０００３】
発明の背景
ヒトアポリポ蛋白質（ａｐｏ）Ｅには３つの主要なアイソフォーム、ａｐｏＥ２、ａｐｏＥ３、およびａｐｏＥ４がある（総説としては、ＭａｈｌｅｙとＨｕａｎｇ（１９９９）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｌｉｐｉｄｏｌ． １０： ２０７−２１７を参照のこと）。ａｐｏＥ４は、血漿コレステロール値の上昇、および冠状動脈性心臓病を発病するリスクが高くなることに関連することが確認されている。Ｄａｌｌｏｎｇｅｖｉｌｌｅ（１９９２）Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． ３３：４４７−４５４。また、ａｐｏＥ４はアルツハイマー病の病因とも関連する。ａｐｏＥ４対立遺伝子は、散発性または家族性アルツハイマー病の約４０〜６５％の症例に関係する主要な危険因子または感受性遺伝子であり、この遺伝子は、この病気の発症を増加せるとともに、発病年齢を低下させる。Ｃｏｒｄｅｒら、（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：９２１−９２３。さらに、ａｐｏＥ４対立遺伝子は、急性頭蓋骨損傷および脳梗塞の患者における臨床結果の不良にも関連する。Ｓｌｏｏｔｅｒら、（１９９７）ＪＡＭＡ ２７７：８１８−８２１、およびＮｉｃｏｌｌら、（１９９６）Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ２２：５１５−５１７。
【０００４】
アルツハイマー病の神経病理学的に顕著な特徴は、脳内における神経突起のアミロイド斑および神経原繊維変化である。Ｓｅｌｋｏｅ、（１９９１）Ｎｅｕｒｏｎ ６：４８７−４９８、およびＲｏｓｅｓら、（１９９４）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５：６６３−６６７。神経突起上の斑点はアミロイドの細胞外沈着を示すものである。この沈着物の主要な成分はアミロイドのベータ（Ａβ）ペプチド（ＤＳ４８７）で、これは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のタンパク質分解産物である。アミロイド斑とは対照的に、神経原線維変化は、大部分が、高度にリン酸化された微小管結合タンパク質であるｔａｕ（ｐ−ｔａｕ）、およびそれほどまではリン酸化されていないＮＦ−Ｈ（ｐ−ＮＦ−Ｈ）からなる、主に細胞内の沈着物である。ＡｐｏＥは、アミロイド斑と神経原線維変化の両方に存在する。
【０００５】
ａｐｏＥ４対立遺伝子とアルツハイマー病の進行との関わりを説明するための仮説は、脳におけるアミロイドβ（Ａβ）沈着またはクリアランス排除をａｐｏＥ４が調節するというもの、また、ａｐｏＥ４が、微小管に結合して安定させる微小管結合タンパク質であるｔａｕとの相互作用を失うというものなど、数多くある。
【０００６】
アルツハイマー病は、現在のところ治療法がない潜行性で進行性の神経疾患である。アルツハイマー病に対する適切な治療法がないため、この神経疾患に対する新規の治療法が必要とされている。本発明は、ａｐｏＥ４に関連する疾患を治療する方法、および、アルツハイマー病に伴う神経原線維変化を減少させる方法を提供する。
【０００７】
参考文献
Ｈｕａｎｇら、（２００１）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９８：８８３８−８８４３；米国特許第６，０４６，３８１号。
【０００８】
発明の概要
本発明は、神経原線維変化の形成を阻害する方法、および、対象者においてアポリポ蛋白質Ｅ（ａｐｏＥ）に関連した疾患を治療する方法を提供する。これらの方法は、一般的に、対象者の神経細胞におけるカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの量を低下させることを含む。さらに、本発明は、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥをコードする核酸分子を含む単離細胞、および、この細胞を用いて化合物をスクリーニングする方法を提供する。本発明は、さらに、ａｐｏＥ切断酵素を阻害し、神経細胞における神経原線維変化の形成を低下させる化合物を提供する。さらに、本発明は、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥをコードする核酸を導入遺伝子として含む、ヒト以外のトランスジェニック動物、および、トランスジェニック動物を使用して化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明は、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥが、培養神経細胞において神経原線維変化様構造物の形成を誘導するという観察結果に基づくものである。ａｐｏＥのカルボキシル末端から３０番目までのアミノ酸を切断すると、培養神経細胞において細胞内封入体が形成される。本発明者らは、完全長のａｐｏＥではなくＣ末端側切断型のａｐｏＥが、微小管結合タンパク質ｐ−ｔａｕのリン酸化型、および高分子量のリン酸化された神経繊維フィラメントｐ−ＮＦ−Ｈと相互作用して、細胞において神経原線維変化（ＮＦＴ）様構造物を誘導することを発見した。この作用は神経細胞特異的である。
【００１０】
Ｃ末端側切断型ａｐｏＥによって誘導されるＮＦＴ様構造物は、アルツハイマー病（ＡＤ）患者の脳に見られるＮＦＴにいくつかの点で類似している。第一に、Ｃ末端側切断型ａｐｏＥによって誘導されるＮＦＴ様構造物は神経細胞特異的である。第二に、このＮＦＴ様構造物は、ＡＤ脳におけるＮＦＴの主要成分であるｐ−ｔａｕと、ＡＤ脳中のＮＦＴにも見られるｐＮＦ−Ｈを含む。第三に、電子顕微鏡によって、切断型ａｐｏＥによって誘導されるＮＦＴ様構造物は、多数の不規則なフィラメントからできており、直径１０〜２０ ｎｍであり、ヒトＡＤ脳で見られるＮＦＴのあるものに類似している。
【００１１】
本発明は、神経原線維変化の形成を阻害する方法、および、対象者においてアポリポ蛋白質Ｅ（ａｐｏＥ）に関連した疾患を治療する方法を提供する。これらの方法は、一般的に、対象者の神経細胞におけるカルボキシル末端（Ｃ末端）側切断型ａｐｏＥの量を低下させること、および／または、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥがｐ−ｔａｕおよび／またはｐ−ＮＦ−Ｈと相互作用するのを妨害することを含む。
【００１２】
さらに、本発明は、Ｃ末端側切断型ａｐｏＥをコードする核酸分子を含む単離細胞を提供する。本細胞は、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥがｐ−ｔａｕおよび／またはｐ−ＮＦ−Ｈと相互作用するのを妨害し、それによって、神経原線維変化の形成を低下させる化合物をスクリーニングするのに役立つ。
【００１３】
本発明は、さらに、細胞内においてカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの形成を低下させ、および／または、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥがｐ−ｔａｕおよび／またはｐ−ＮＦ−Ｈと相互作用するのを妨害する化合物をインビトロでスクリーニングする方法を提供する。カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの形成を低下させる化合物を同定するためのインビトロスクリーニング法では、完全長のａｐｏＥであって、その後タンパク質分解処理されてカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥを産生する宿主細胞が使用される。カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥがｐ−ｔａｕおよび／またはｐ−ＮＦ−Ｈと相互作用するのを妨害する化合物を同定するためのインビトロスクリーニング法では、通常、本宿主細胞であって、Ｃ末端側切断型ａｐｏＥをコードする核酸分子を含む細胞が使用される。本発明に係るインビトロスクリーニング測定法を用いて同定される化合物が、ＡＤなど、Ｃ末端側切断型ａｐｏＥが神経細胞に存在するために生じる疾患を治療するための候補化合物となる。
【００１４】
さらに、本発明は、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥをコードする核酸を導入遺伝子として含む、ヒト以外のトランスジェニック動物を提供する。これらヒト以外のトランスジェニック動物は、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥがｐ−ｔａｕおよび／またはｐ−ＮＦ−Ｈと相互作用するのを妨害する化合物をスクリーニングするのに役立つ。
【００１５】
さらに、本発明は、細胞内においてカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの形成を低下させ、および／または、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥがｐ−ｔａｕおよび／またはｐ−ＮＦ−Ｈと相互作用するのを妨害する化合物をインビボでスクリーニングする方法を提供する。カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの形成を低下させる化合物を同定するためのインビボスクリーニング法では、完全長のａｐｏＥをコードする核酸を導入遺伝子として含むヒト以外のトランスジェニック動物であって、神経細胞の中でその後タンパク質分解処理されてカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥとなる完全長のａｐｏＥを産生するトランスジェニック動物が使用される。カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥがｐ−ｔａｕおよび／またはｐ−ＮＦ−Ｈと相互作用するのを妨害する化合物を同定するためのインビボスクリーニング法では、通常、Ｃ末端側切断型ａｐｏＥをコードする核酸を導入遺伝子として含むヒト以外のトランスジェニック動物であって、神経細胞の中でカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥを産生するトランスジェニック動物が使用される。本発明に係るインビボスクリーニング測定法を用いて同定される化合物が、ＡＤなど、Ｃ末端側切断型ａｐｏＥが神経細胞に存在するために生じる疾患を治療するための候補化合物となる。
【００１６】
本発明は、さらに、ａｐｏＥ切断酵素を阻害する化合物、および、この化合物を含む組成物、例えば、薬学的組成物を提供する。これらの化合物は、ＡＤなどの疾患を治療するのに有用である。
【００１７】
定義
本明細書において、「ＡｐｏＥに関連する疾患」、「カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥに関系した疾患」、および「カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥに関連する病気」という語は、各個体においてカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥが存在することに随伴する病気または疾患を意味するものとして互換的に使用される。カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥに関係する病気または疾患は、個体中にカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥが存在することで直接的または間接的にもたらされることがある。例えば、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥに関係する病気または疾患は、神経細胞の中で神経原線維変化が形成される結果として生じる病気または疾患である。また、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥに関係する病気または疾患とは、例えば、各個体にカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥが存在することが各個人の病気または疾患を進行させる危険性を増大させる危険因子であるという、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥが危険因子である病気または疾患でもある。カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥに関連する病気または疾患には、散発性アルツハイマー病、家族性アルツハイマー病、例えば冠状動脈疾患など、血漿コレステロール値の上昇に伴う病気、急性頭蓋骨損傷患者における臨床結果の不良、および脳梗塞患者における臨床結果の不良などがあるが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
本明細書において、「アルツハイマー病」（本明細書においては「ＡＤ」と略記する）という語は、学習・記憶機能障害だけでなく、主に海馬および大脳皮質において、アミロイドβタンパク質を含む神経突起状の斑点が形成されることを伴う症状を意味する。ここで「ＡＤ」とは、ＡＤとともにＡＤ型病変をも含む意味である。
【００１９】
本明細書において、「アルツハイマー病に関連した現象」という語は、ＡＤに随伴する構造的、分子的、または機能的な事象、特に、動物モデルで容易に測定することができる事象などを意味する。そのような事象には、アミロイド沈着、神経病理学的症状の進行、学習および記憶上の欠陥、および他のＡＤに関連した特徴などであるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
本明細書において、「測定」、「測量」「評価」および「アッセイ」という語は互換的に使用され、定量的測定および定性的測定の両方を意味する。
【００２１】
「生物試料」は、個体から得られるさまざまな試料タイプを含み、診断や観察のためのアッセイに使用することができる。この定義には、生物に由来する血液およびその他の液体試料、例えば、生検標本または組織培養物、それから得られた細胞、およびその後代などの固体組織試料が含まれる。また、この定義には、試料が得られた後、例えば、ポリヌクレオチドなど一定の成分について、試薬による処理、可溶化、または濃縮などの方法で処理された試料も含まれる。「生物試料」という語は臨床試料を含み、また、培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生物の体液、および組織などの試料も含む。
【００２２】
本明細書において、「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」という語は互換的に使用され、あらゆる長さのヌクレオチドの重合体を意味する。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそれらの類似体を含むことができる。ヌクレオチドは、そのような三次元構造を採っていてもよく、既知であると未知であるといずれの機能を果たすこともできる。「ポリヌクレオチド」という語には、一本鎖、二本鎖、三本鎖の分子が含まれる。「オリゴヌクレオチド」は、通常、約５〜約１００ヌクレオチドの一本鎖または二本鎖のＤＮＡからなるポリヌクレオチドを意味する。しかし、本開示の目的にとって、オリゴヌクレオチドの長さに上限はない。また、オリゴヌクレオチドは、オリゴマーまたはオリゴとしても知られており、遺伝子から単離されたり、当技術分野において既知の方法により化学合成される。
【００２３】
本明細書において、「ポリペプチド」および「タンパク質」という語は互換的に使用され、あらゆる長さのアミノ酸重合体であって、コードされたアミノ酸および非コードアミノ酸、化学的または生化学的に修飾または誘導されたアミノ酸、および修飾されたペプチドの骨組みをもつポリペプチドを含む重合体を意味する。この語は、異種由来のアミノ酸配列との融合タンパク質、異種由来または同種由来の先導配列、Ｎ末端にメチオニン残基があるものとないもの、免疫学的に標識したタンパク質、例えば、融合パートナーとして蛍光性タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどを含む融合タンパク質のような、検出可能な融合パートナーをもつ融合タンパク質などであるが、これらに限定されない融合タンパク質を含む。
【００２４】
本明細書において、「単離された」という語は、天然に存在する環境とは異なった環境に存在するようになった、目的とする化合物を表すものである。「単離された」とは、目的とする化合物が実質的に濃縮されており、および／または、その中で目的とする化合物が部分的または実質的に精製されている試料の中に存在する化合物を含む意味である。
【００２５】
本明細書において、「実質的に純粋な」という語は、天然の環境から取り出された化合物であって、天然に結合している他の成分から少なくとも６０％、好ましくは７５％、最も好ましくは９０％解離している化合物を意味する。
【００２６】
本明細書において、「導入遺伝子」という語は、生きた動物に移植するために、細胞、特に哺乳動物細胞のゲノムに人為的に挿入されているか、または、挿入されようとしている遺伝物質を表すために使用される。導入遺伝子は、外来ＤＮＡを取り込んだ後に細胞の中で永久的または一時的な遺伝的変化、好ましくは、永久的な遺伝的変化が誘導されることを意図して、細胞の形質転換に用いられる。永久的な遺伝的変化は、通常、ＤＮＡを細胞のゲノムの中に導入することによって行なわれる。安定に組み込ませるためのベクターには、プラスミド、レトロウイルス、およびその他の動物ウイルス、ＹＡＣｓなどがある。目的とするのは、例えば、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマなど、特に、例えば、ラットやマウスなどの齧歯類のトランスジェニック哺乳動物である。
【００２７】
本明細書において、「治療」や「治療する」などという語は、哺乳動物、特にヒトにおける病気または症状を治療することを含んで使用されており、ａ）病気に対する素因をもつ可能性があるが、まだ発病していると診断されていない対象者において、その病気、症状、またはその病気または症状の病徴が起きるのを防止すること、ｂ）病気、症状、またはその病気または症状の病徴を阻害すること、例えば、患者においてその進展を停止させること、および／またはその開始または発現を遅延させること、および／またはｃ）病気、症状、またはその病気または症状の病徴を軽減させること、例えば、症状または病気、および／または病徴の退行をもたらすことを含む。
【００２８】
本明細書において、「対象者」、「宿主」、「患者」、および「個体」という語は互換的に使用され、診断または治療が望ましい哺乳類の被検動物、特にヒトを意味する。この他の被検動物には、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマなどがある。
【００２９】
本発明についてさらに詳しく説明する前に、本発明は、記載されている特定の態様に制限されるものではなく、当然ながら、さまざまなものがありうると解されるべきである。また、本発明の範囲は、本明細書に付記した請求の範囲によってのみ制限されるものであるから、本明細書において使用されている用語は、特定の態様を説明するためだけのものであり、制限的になることを意図したものではないと解されるべきである。
【００３０】
数値範囲が示されている場合、その範囲の上限値と下限値、およびその表示された範囲内にある、表示されているか、その間にある別の数値との間にあるあらゆる数値が、文中に別段の記載がない限り、下限値の単位の１０分の１の単位まで本発明に含まれると解される。この表示された範囲において具体的に除外される限界値にしたがって、このより狭い範囲の上限値および下限値を、別個にこのより狭い範囲に含ませることもできる。この表示された範囲が限界値の一方または両方を含む場合は、これら包含される限界値の一方または両方を除外した範囲も本発明に含まれる。
【００３１】
別段の定義がない限り、本明細書において使用される科学技術用語はすべて、本発明が属する技術分野において一般的に理解されていると同じ意味である。また、本明細書に記載されている方法および材料と類似または同等のものも、本発明を実施または試験するときに使用することができるが、好ましい方法および材料は以下に記載する通りである。本明細書に記載された刊行物はすべて、該刊行物を引用した方法および／または材料を開示・記載するために参照として本明細書に組み入れられる。
【００３２】
本明細書および本請求の範囲において、「一つの」、「および」、「その」という単数形は、別段の記載がない限り、複数形の対象物も含むことに留意されたい。したがって、例えば、「カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥ」というときには、このタンパク質が複数の場合を含み、「その細胞」というときには、一個以上の細胞、および、当技術分野において既知のその同等物を含み、以下同様である。
【００３３】
本明細書において検討されている刊行物は、本出願の出願日前に開示されていたため提示したものに過ぎない。本明細書のいかなる記述も、本発明が先行発明によって、このような刊行物に先行するものとなりえないことを認めるものと解さるべきではない。さらに、表示された出版日は、実際の出版日と異なることがあるので、それぞれ別個に確認する必要があるかもしれない。
【００３４】
ａｐｏＥポリペプチド断片
本発明は、単離されたａｐｏＥポリペプチド断片、および、そのようなポリペプチド断片を含む組成物を提供する。ａｐｏＥポリペプチド断片には、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥ、および、ａｐｏＥの少なくとも第２４４〜２６０番目のアミノ酸を含む断片などがある。カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチドは、以下に述べるように、神経原線維変化の形成を低下させる作用薬を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて有用である。ａｐｏＥの少なくとも第２４４〜２６０番目のアミノ酸を含む断片は、ａｐｏＥがｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈに結合するのを阻害して、神経原線維変化の形成を低下させるのに役立つ。
【００３５】
ａｐｏＥのカルボキシル末端側切断型には、ｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈの両方に結合して、神経細胞中にカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥ、ｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈを含む神経原線維変化が形成されるのを誘導するカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥが含まれる。所定のカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチドがｐ−ｔａｕに結合し、ｐ−ＮＦ−Ｈに結合して、神経細胞の中で神経原線維変化を形成するか否かは、既知のアッセイ法を用いて当業者が容易に判定することができる。例えば、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチド、ｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈを含む複合体の形成は、例えば、実施例の記載に従って、これらのタンパク質のそれぞれに特異的な抗体を用い、例えば、確立された細胞染色技術、確立された共免疫沈殿技術、タンパク質（「ウェスタン」）ブロッティングなどを用いて検出することができる。例えば、神経細胞内の細胞内封入体を観察することによって神経原線維変化の形成を可視的に測定することができる。このような神経原線維変化がカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥ、ｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈを含むか否かを、各タンパク質に特異的な抗体を用いて判定することができる。
【００３６】
ａｐｏＥ３またはａｐｏＥ４のカルボキシル末端から約２８〜約３０個、約３０〜約３５個、約３５〜約４０個、約４０〜約４５個、または約４５〜約４８個のアミノ酸を欠失させると、ｐ−ｔａｕに結合し、ｐ−ＮＦ−Ｈに結合し、神経細胞における神経原線維変化の形成を誘導するするカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥが得られる。神経原線維変化を生じさせる特異的なカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチドには、ａｐｏＥ４Δ２７２−２９９、ａｐｏＥ３Δ２７２−２９９、ａｐｏＥ４Δ２６１−２９９、およびａｐｏＥ４Δ２５２−２９９などがあるが、これらに限定されない。
【００３７】
さらに、本発明はｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈと相互作用するａｐｏＥの部位に相当するａｐｏＥの断片を提供する。このような断片は、ａｐｏＥポリペプチドの少なくとも第２４４〜２６０番目のアミノ酸（ａｐｏＥ２４４−２６０）を含む。また、ａｐｏＥ２４４−２６０断片に含まれるのは、さらに約１〜約５個、約５〜約１０個、約１０〜約１５個、約１５〜約２０個のアミノ酸がカルボキシル末端および／またはアミノ末端に付加したａｐｏＥ２４４−２６０断片である。このような断片は、ａｐｏＥがｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈに結合するのを阻害するのに役立つ。
【００３８】
核酸および宿主細胞
本発明は、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸とともに、該核酸を含む宿主細胞を提供する。いくつかの態様では、宿主細胞が単離されている。別の態様では、本発明に係る核酸を導入遺伝子として含むヒト以外のトランスジェニック動物の一部である。
【００３９】
核酸
本核酸分子は、後述するように、本発明に係るヒト以外のトランスジェニック動物を作製するときに使用するため、または、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチドを産生する組換え宿主細胞を作製するためのベクター（「構築物」）の一部であってもよい。さらに、本発明に係る核酸分子は、本発明に係るカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチドの全部または一部をコードすることができるため、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチドを産生させるときに発現ベクターの一部として役に立つ。
【００４０】
マウスａｐｏＥ遺伝子の配列がＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｄ００４６６として存在する。さまざまな霊長類のａｐｏＥ遺伝子の配列が、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ２００５０８、ＡＦ２００５０７、ＡＦ２００５０６、およびＡＨ００９９５３（ヒロバテス・ラル（Ｈｙｌｏｂａｔｅｓ ｌａｒ）、すなわちギボン）、ＡＨ００９９５２、ＡＦ２００５０３、ＡＦ２００５０４、およびＡＦ２００５０５（ポンゴ・ピグマエウス（Ｐｏｎｇｏ ｐｙｇｍａｅｕｓ）、すなわちオランウータン）、ＡＨ００９９５１、ＡＦ２００５００、ＡＧ２００５０１、およびＡＦ２００５０２（ゴリラ・ゴリラ（Ｇｏｒｉｌｌａ ｇｏｒｉｌｌａ））、ＡＨ００９９５０、ＡＦ２００４９７、ＡＦ２００４９８、およびＡＦ２００４９９（パン・トログロディテス（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）すなわちチンパンジー）として存在する。どのａｐｏＥコード配列を改変しても、上記したようなカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチドをコードさせることができる。
【００４１】
いくつかの態様において、本発明に係る核酸は、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチドをコードする読み枠（オープンリーディングフレーム）、１個以上のイントロンを含み、さらに、発現の調節に関係する隣接５’および３’の非コード塩基配列を含むことも可能であり、一般的には全長約１０ ｋｂまでであるが、もっと長くすることも可能である。組換えａｐｏＥの全部または一部をコードするＤＮＡ配列はゲノムＤＮＡ、またはその断片である。カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥをコードするａｐｏＥ遺伝子は、染色体外で維持するため、または宿主に組み込むために適当なベクターの中に導入することができる。
【００４２】
目的とするゲノム配列は、開始コドンと終止コドンの間に存在し、本来の染色体に通常存在しているイントロンのすべてを含む核酸であるが、上記したように、カルボキシル末端側アミノ酸をコードするヌクレオチドを含まない。さらに、成熟ｍＲＮＡに存在する３’側および５’側の非翻訳領域を含んでいてもよい。さらに、転写領域の３’末端または５’末端のいずれかに隣接する約１ ｋｂ、場合によってはそれ以上の長さを含む、プロモーター、エンハンサーなど、転写および翻訳を特異的に調節する配列を含んでいてもよい。ゲノムＤＮＡは、隣接する染色体配列を実質的に含むことなく、１００ ｋｂｐ以下の断片として単離することができる。
【００４３】
この５’側領域の配列、さらに５’側上流配列および３’側下流配列は、ａｐｏＥを発現する組織内での発現を行わせる、エンハンサー結合部位などのプロモーター因子として利用することができる。組織特異的発現は、発現パターンを決定するのに役立ち、また、本来の発現パターンを模倣するプロモーターを提供するのにも役立つ。プロモーター領域における自然な多型性は、発現の自然変異、特に、病気と関係する変異を判定するのに役立つ。または、突然変異をプロモーター領域に導入して、発現を変化させた場合の効果を、実験的に規定した系の中で測定することも可能である。例えば、既知の結合モチーフとの配列類似性、ゲル遅延分析研究など、転写因子の結合に関与する特異的ＤＮＡモチーフを同定する方法が当技術分野において知られている。例えば、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌら、Ｍｏｌ Ｍｅｄ １：１９４−２０５ （１９９５） ； Ｍｏｒｔｌｏｃｋら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６：３２７−３３ （１９９６）； およびＪｏｕｌｉｎとＲｉｃｈａｒｄ−Ｆｏｙ， Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２３２：６２０−６２６ （１９９５）を参照のこと。
【００４４】
調節配列を用いて、特に、発生の異なった組織や段階においてａｐｏＥ発現の転写または翻訳の調節に必要なｃｉｓ作用配列を同定し、また、発現を調節または媒介するするｃｉｓ作用配列またはｔｒａｎｓ作用因子を同定することができる。このような転写または翻訳の調節領域は、培養細胞、または胚、胎児、もしくは成人の組織において遺伝子治療のためカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥ、またはそれ以外の目的とするタンパク質の発現を促進させるために、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチドをコードするａｐｏＥ遺伝子に機能可能なように結合させることができる。
【００４５】
いくつかの態様において、調節因子としては、機能可能なように結合した、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥをコードする核酸を神経細胞で特異的に発現させる調節因子などがある。神経細胞特異的調節因子（プロモーター、エンハンサーなど）は当業者に知られている。神経細胞特異的調節因子には、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）遺伝子（Ｈａｎｎａｓ−Ｄｊｅｂａｒｒａら、（１９９７） Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｍｏｌ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ４６：９１−９９）；ＰＤＧＦ遺伝子；Ｔｈ１遺伝子（例えば、マウスＴｈｙ１．２（Ｃａｒｏｎｉら、（１９９７） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｍｅｈｔｏｄｓ ７１：３−９）；神経フィラメント遺伝子（例えば、ＮＦ−Ｌ、ＮＦ−Ｍ、およびＮＦ−Ｌ）；グリアフィランメント酸性タンパク質遺伝子；ミエリン塩基性タンパク質遺伝子；微小管結合タンパク質遺伝子；シナプトフィジン遺伝子；チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子などの調節因子がある。
【００４６】
別の態様において、本発明に係る核酸分子は、本発明に係るカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥタンパク質をコードする配列を含むｃＤＮＡを含む。本発明において使用される核酸組成物は、必要に応じて、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチドの全部または一部をコードすることができる。常法にしたがってオリゴヌクレオチドを化学合成したり、制限酵素消化、ＰＣＲ増幅などによってＤＮＡ配列の断片を得ることができる。大抵の場合、ＤＮＡ断片は少なくとも１５ヌクレオチド（ｎｔ）、普通は少なくとも１８ ｎｔ、より普通には少なくとも約５０ ｎｔであろう。このような小さなＤＮＡ断片は、ＰＣＲプライマーやハイブリダイゼーションスクリーニング法などに有用である。より大きなＤＮＡ断片、例えば１００ ｎｔよりも大きな断片は、コードされたポリペプチドを産生させるのに有用である。ＰＣＲなどの増幅反応には、一対のプライマーを使用する。
【００４７】
いくつかの態様において、本発明に係る核酸分子は、ゲノムのａｐｏＥ遺伝子の塩基配列を、上記したように、コードされているａｐｏＥタンパク質がカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチドになるよう改変したものを含む。別の態様において、本発明に係る核酸分子は、コードされているａｐｏＥタンパク質がカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチドになるよう改変したａｐｏＥ遺伝子のコード領域を含む（例えば、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥをコードするｃＤＮＡ分子）。
【００４８】
さらに、本発明は、ｐ−ｔａｕに結合し、ｐ−ＮＦ−Ｈに結合して、神経細胞の中で神経原線維変化が形成されるのを誘導するカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥタンパク質をコードする塩基配列であって、コードされているａｐｏＥタンパク質がカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチドになるよう改変されているマウスのゲノムａｐｏＥ遺伝子の一つとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする塩基配列、および、コードされているａｐｏＥタンパク質がカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチドになるよう、上記したように改変されているマウスａｐｏＥ遺伝子のコード領域を含む核酸分子を提供する。ストリンジェントな条件の例は、０．１ｘＳＳＣ（９ ｍＭ ＮａＣｌ／０．９ ｍＭクエン酸ナトリウム）の中で５０℃以上でハイブリダイゼーションと洗浄を行なうものである。
【００４９】
さらに、本発明は、ｐ−ｔａｕに結合し、ｐ−ＮＦ−Ｈに結合して、神経細胞の中で神経原線維変化が形成されるのを誘導するカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸分子であって、コードされているａｐｏＥタンパク質がカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチドになるよう改変されているマウスのゲノムａｐｏＥ遺伝子の一つと少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、またそれよりも高い塩基配列一致率をもつ核酸分子、および、コードされているａｐｏＥタンパク質がカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチドになるよう、上記したように改変されているマウスａｐｏＥ遺伝子のコード領域を含む核酸分子を提供する。
【００５０】
本核酸分子には、これら以外に、あらゆる長さのａｐｏＥでない核酸分子（異種由来の核酸分子）が含まれる。例えば、本核酸分子は、その５’および／または３’末端が、約１ ｎｔ〜約１０ ｎｔ、約１０ ｎｔ〜約２０ ｎｔ、約２０ ｎｔ〜約５０ ｎｔ、約５０ ｎｔ〜約１００ ｎｔ、約１００ ｎｔ〜約２５０ ｎｔ、約２５０ ｎｔ〜約５００ ｎｔ、または約５００ ｎｔ〜約１０００ ｎｔ、またはそれ以上の長さをもつ異種の核酸分子に隣接していてもよい。例えば、本核酸分子にハイブリダイズできる核酸分子を検出するためのプローブとして使用する場合、本核酸分子は、どのような長さの異種配列に隣接していてもよい。異種配列には、レポータータンパク質などをコードする配列があるが、これらに限定されない。
【００５１】
また、本核酸分子は、当技術分野においてさまざまなものが知られており、ここで詳しく説明する必要もないベクターの一部として提供することもできる。ベクターには、プラスミド、コスミド、ウイルスベクター、人工染色体（ＹＡＣ、ＢＡＣなど）、ミニ染色体等があるが、これらに限定されない。ベクターは、例えば、分子生物学の簡易プロトコール（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、（１９９９） Ｆ． Ａｕｓｕｂｅｌら編、ワイリー・アンド・サンズ社（Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）など、当業者に周知の数多くの刊行物に十分に説明されている。本核酸分子を発現させるため、もしくは本核酸分子を増加させるため、またはその両方のためにベクターを提供することができる。
【００５２】
本核酸分子は、通常、完全な染色体以外のものとして、実質的に純粋な形で単離して得られる。普通、ＤＮＡは、本遺伝子のＤＮＡの配列または断片を含まない他の塩基配列から実質的に分離して得られ、一般的には、少なくとも約５０％、大抵は少なくとも約９０％純粋で、典型的には「組換え」られている。すなわち、天然の染色体上では通常結合していないヌクレオチドに隣接している。
【００５３】
本核酸分子組成物は、上記したように、本発明に係るカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチドの全部または一部を調製するときに利用することができる。発現のためには、発現カセットを用いることができる。発現ベクターは、コード領域が転写開始領域の転写調節の下で機能に結合している、誘導型または定常型の転写および翻訳の開始領域、および転写および翻訳の終結領域を提供する。これらの調節領域は、本ペプチドをコードする遺伝子に本来備わっているものでも、外来の由来源から得られたものでもよい。
【００５４】
発現ベクターは、通常、プロモーター配列の近傍に位置する便利な制限酵素部位を持ち、異種タンパク質をコードする塩基配列の挿入を可能にさせる。発現宿主の中で機能する選抜マーカーが存在する。発現ベクターは、融合タンパク質を産生させるために用いることもでき、その場合には、外来の融合ペプチドが付加的な機能、すなわち、タンパク質合成の増加、安定性、一定の血清との反応性、酵素、または、例えばβ−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼなど、その他のタンパク質マーカーを提供する。
【００５５】
転写開始領域、その遺伝子またはその断片、および転写終結領域を含む発現カセットを調製することができる。特に関心の対象となるのは、機能的なエピトープまたはドメインの発現を可能にする配列であって、普通、長さが少なくとも約８アミノ酸、より普通には、少なくとも長さ約１５アミノ酸から約２５アミノ酸まで、または、上記の断片のいずれかの配列、およびその遺伝子の完全なオープンリーディングフレームまでの配列を使用することである。ＤＮＡを導入した後、選抜マーカーという手段によって、この構築物を含む細胞を選抜し、細胞を展開させてから発現に使用することができる。
【００５６】
タンパク質およびポリペプチドは、発現目的に応じて、常法にしたがい、原核生物または真核生物の中で発現させることができる。大規模なタンパク質生産を行なうためには、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、出芽酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの単細胞生物、昆虫細胞をバキュロウイルスベクターと組み合わせたもの、脊椎動物などの高等生物の細胞、特に、例えばＣＯＳ ７細胞、Ｎｅｕｒｏ−２Ａ細胞など、哺乳動物の細胞を発現宿主細胞として使用することができる。場合によっては、コードされたタンパク質が本来のフォールディングと翻訳後修飾が行なわれるという利点があるため、真核生物細胞の中でその遺伝子を発現させるのが望ましいこともある。また、小さなペプチドを実験室で合成することもできる。本タンパク質の全長配列の部分集合であるポリペプチドを用いて、機能に重要なタンパク質部分を同定・調査することができる。
【００５７】
目的とする特異的発現系には、バクテリア、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞に由来する発現系などがある。当業者にとって、このような発現系にはさまざまなものが知られている。
【００５８】
宿主細胞
本核酸分子を含む組換え宿主細胞は、本発明に係るカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの由来源として用いることができる。また、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥ４が、神経細胞においてｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈに結合するのを減少させる作用薬を同定するための薬剤スクリーニングアッセイ法において使用することもできる。
【００５９】
いくつかの態様において特に関心の対象となるのは、正常にａｐｏＥを産生する哺乳動物細胞、および、外部環境からａｐｏＥを正常に取り込む細胞である。このような細胞の例には、神経細胞、ミクログリア細胞、および星状細胞がある。不死化された神経細胞、ミクログリア細胞、および星状細胞も関心の対象である。
【００６０】
トランスジェニック非ヒト動物
本発明は、トランスジェニック非ヒト動物、特に、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチドのコード領域を含む外来核酸を導入遺伝子として含むトランスジェニック非ヒト動物を提供する。本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物は、神経細胞におい、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥ４のｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈへの結合を低下させ、それによって、神経原線維変化の形成を低下させる作用薬をスクリーニングするのに役立つ。このような化合物は、アルツハイマー病、およびそれに随伴する病状を治療するのに有用な候補作用薬である。
【００６１】
多くの態様において、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥをコードする導入遺伝子は、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥが主に神経細胞の中で産生されるようにするため、神経細胞特異的調節因子を含む。ただし、神経原線維変化はｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈを産生する細胞、すなわち神経細胞の中でのみ形成されるものであるため、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥをコードする導入遺伝子は、必ずしも神経細胞特異的調節因子を含まなくてもよい。
【００６２】
トランスジェニック非ヒト動物、特に、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する方法は当技術分野において既知である。例えば、米国特許第６，２６８，５４５号、第６，２５５，５５４号、第６，２２２，０９４号、および第６，２０４，４３号；「トランスジェニック動物技術（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」Ｃ．Ａ． Ｐｉｎｋｅｒｔ編（１９９７）、アカデミックプレス社（Ａｃａｄ． Ｐｒｅｓｓ）；「遺伝子ノックアウトプロトコール（Ｇｅｎｅ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」Ｍ．Ｊ． Ｔｙｍｍｓら編（２００１）、ヒューマナプレス社（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）；および「遺伝子ターゲティング：実際的方法（Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」Ａ．Ｌ． Ｊｏｙｎｅｒ編（２０００）、オクスフォード大学出版（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ． Ｐｒｅｓｓ）を参照のこと。
【００６３】
トランスジェニック動物は、染色体外因子として存在するか、または、その細胞の全部または一部、特に生殖細胞に安定的に組み込まれた外来核酸配列を含む。別段の記載がない限り、トランスジェニック動物は生殖系列の配列に安定した変化を有する。この動物を最初に構築する際、一部の細胞だけが変更されたゲノムをもつ「キメラ」または「キメラ動物」を作製する。キメラは、主に、所望のトランスジェニック動物を作出するという育種目的で使用される。キメラを育種することによって、ヘテロ接合的な変異をもつ動物を作製する。ホモ接合動物を作製するため、一般的には、オスとメスのヘテロ接合体を育種する。
【００６４】
いくつかの態様において、内在するａｐｏＥ遺伝子がノックアウトされている（例えば、無機能化されている）。本発明において、トランスジェニックノックアウト動物は、内在ａｐｏＥ遺伝子の一方の対立遺伝子または両方の対立遺伝子において、一部または完全に機能を失っている。
【００６５】
トランスジェニック動物がノックアウト動物である場合、標的遺伝子の発現は検出できないか、僅かなものである。内在ａｐｏＥ遺伝子をノックアウトするとは、内在ａｐｏＥタンパク質の機能が実質的に減少して、発現を検出できないか、ごく僅少量存在することを意味する。これは、例えば、１個以上の終止コドンを挿入したり、ＤＮＡ断片などを挿入したり、コード配列を欠失させたり、コード配列の停止コドンを置換したりなど、さまざまなメカニズムによって実施することができる。いくつかの場合、外来の導入遺伝子の配列は最終的にゲノムから消失し、本来の配列に対して最終的な変化が残る。さまざまな方法を用いて「ノックアウト」を達成することができる。米国特許第５，４６４，７６４号、第５，６２７，０５９号、および、Ｃａｐｅｃｃｈｉらに関連する特許および刊行物を参照のこと。非コード領域、特にプロモーター領域、３’側調節配列、エンハンサーを欠失させること、または、ａｐｏＥ遺伝子の発現を活性化する遺伝子を欠失させることなども含み、本来の遺伝子の全部または一部が染色体上から欠失するのを誘発することができる。
【００６６】
また、機能的なノックアウトは、アンチセンス構築物を導入することによっても行なうことができる（例えば、ＬｉおよびＣｏｈｅｎ， Ｃｅｌｌ ８５：３１９−３２９ （１９９６）を参照のこと）。また、「ノックアウト」には、例えば、標的遺伝子の変化を促進する基質に動物を曝すと、標的遺伝子に変化が生じる場合のような条件的ノックアウト、標的遺伝子部位における組換えを促進する酵素（例えばＣｒｅ −ｌｏｘ系におけるＣｒｅ）を導入する方法、または、出生後に標的遺伝子の変化を誘発する別の方法などもある。
【００６７】
ａｐｏＥ導入遺伝子はカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥをコードし、上記したような遺伝子操作された配列であり、コードされるタンパク質がカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥタンパク質となるよう、コード領域の中に欠失を含む。導入される配列は、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチドをコードしていて、さらに、例えば、レセプタータンパク質（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質など）をコードするヌクレオチドなど、さらに別のコード配列を含むことができる。導入遺伝子は、定常型または誘導型のプロモーター、および、それ以外の調節配列で宿主動物の中で発現するのに必要な配列に機能可能なように結合している、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥをコードする塩基配列を含む。「機能可能なように結合している」とは、例えば、転写活性化因子タンパク質など適当な分子が調節配列に結合したとき遺伝子発現が可能なように、ＤＮＡ配列と調節配列が連結していることを意味する。
【００６８】
相同的組換えのためのＤＮＡ構築物は、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥをコードする塩基配列を含み、標的遺伝子座に相同的な領域を含む。ランダムに組み込むためのＤＮＡ構築物は、組換えを仲介するための相同性領域を含む必要はない。適宜、積極的または消極的な選抜を行なうためのマーカーを含ませることもできる。相同的組換えによって標的遺伝子に改変箇所をもつ細胞を作製する方法が当技術分野において知られている。哺乳動物細胞を形質転換させるためのさまざまな技術については、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：５２７−５３７ （１９９０）を参照のこと。
【００６９】
胚幹（ＥＳ）細胞については、ＥＳ細胞系列を用いることができる。または、例えば、マウス、ラット、モルモットなどの宿主から胚細胞を新鮮な形で得ることができる。このような細胞は、適当な線維芽支持細胞層上で増殖させるか、白血病抑制因子（ＬＩＦ）などの適当な成長因子存在下で増殖させる。ＥＳ細胞を形質転換したら、トランスジェニック動物を作出するために用いることができる。トランスジェニック動物を作出する方法については、米国特許第５，３８７，７４２号、第４，７３６，８６６号、および第５，５６５，１８６号を参照のこと。形質転換後、細胞は適当な培地の中、支持細胞層上で培養する。選抜培地を用いて、構築物を含む細胞を検出することができる。コロニーが成長するのに十分な時間経過した後、それらを取り出し、相同的組換えの発生または構築物の組み込みについて解析する。そして、胚の操作および胚盤胞注入のために陽性コロニーを使用することができる。４〜６週齢の過剰排卵されたメスから胚盤胞を得る。ＥＳ細胞をトリプシン化処理し、改変された細胞を胚盤胞の胞胚腔の中に注入する。注入後、胚盤胞を偽妊娠させたメスの各子宮角に戻す。そして、メスに分娩させ、生まれた仔をスクリーニングして、構築物をもつ変異細胞がないかを調べる。異なった表現型の胚盤胞およびＥＳ細胞を提供することによって、キメラ後代を容易に検出することができる。
【００７０】
改変遺伝子の存在を調べるためにキメラ動物をスクリーニングし、改変されたオスとメスを交配してホモ接合体の後代を作出する。遺伝子の変化が発生のいずれかの時点で致死をもたらす場合には、組織または器官を、アレルギー誘発性または類似遺伝子型の移植片または移植物として、またはインビトロ培養で維持することができる。
【００７１】
組成物
本発明は、さらに、本発明に係る作用薬、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、および宿主細胞を含む、薬学的組成物などの組成物を提供する。これらの組成物は、作用薬、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、または宿主細胞の所望の用途に応じて選ばれる緩衝液を含むことができ、目的とする用途に適した別の物質を含むこともできる。非常に多様な緩衝液が知られているが、当業者は、目的とする用途に合った適当な緩衝液を容易に選択することができる。場合によっては、この組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含むことができるが、さまざまな賦形剤が当技術分野において知られており、本明細書において詳細に検討する必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、Ａ． Ｇｅｎｎａｒｏ （１９９５） 「レミントン：薬剤の科学と実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐａｒｍａｃｙ）」、第１９版、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス社（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）など、さまざまな刊行物に十分に記載されてきている。
【００７２】
スクリーニングアッセイ法
本発明は、神経細胞における神経原線維変化の形成を低下させる化合物を同定する方法を提供する。細胞内の神経原線維変化の量を低下させる作用薬には、ａｐｏＥのタンパク質分解を低下させる作用薬、および、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥがｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈと相互作用するのを低下させる作用薬などがある。本発明に係るアッセイ法において有効な被検作用薬が、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥに関連した疾患を治療するための候補薬となる。
【００７３】
いくつかの態様において、このアッセイ法は、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの形成を低下させ、および／または、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥがｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈと相互作用するのを阻害する化合物を同定するための、インビトロで細胞を利用するスクリーニング法である。
【００７４】
いくつかの態様において、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの形成を低下させる化合物を同定するための、インビトロで細胞を利用するスクリーニング法は、後にタンパク質分解によるプロセッシングを受けてカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥとなる完全長ａｐｏＥを産生する宿主細胞を使用することを含む。この方法は、通常、細胞質の中でカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの形成を誘導する細胞を候補作用薬と接触させること、および、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの量、および／または細胞内の神経原線維変化の量に対する候補作用薬の効果を対照と比較して測定することを含む。適当な対照は被検作用薬を欠く。
【００７５】
別の態様において、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥがｐ−ｔａｕおよび／またはｐ−ＮＦ−Ｈと相互作用するのを阻害する化合物を同定するための、インビトロで細胞を利用するスクリーニング法は、通常、Ｃ末端側切断型のａｐｏＥをコードする核酸を含む本宿主細胞を使用することを含む。この方法は、通常、細胞質の中でカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの形成を誘導する細胞を候補作用薬と接触させること、および、ａｐｏＥのｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈに対する結合、および／または細胞内の神経原線維変化の量に対する候補作用薬の効果を対照と比較して測定することを含む。適当な対照は被検作用薬を欠く。
【００７６】
別の態様において、本発明に係るスクリーニングアッセイ法は、インビトロの無細胞法である。インビトロの無細胞スクリーニング法は、通常、ａｐｏＥのタンパク質分解による切断を仲介する酵素を、（１）酵素が活性になったとき検出可能なシグナルを提供する、この酵素の基質、および（２）被検作用薬と接触させることを含む。対照用の試料は、酵素と基質は含むが、被検作用薬は含まない。酵素は精製することができるが、精製する必要はない。この酵素は、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥを産生する細胞の溶解物の中に存在ことがあり、部分的に単離することもでき、または、実質的に（例えば、純度約９０％、約９５％、または約９８％に）単離することもできる。
【００７７】
本発明に係るインビトロのスクリーニングアッセイ法を用いて同定された化合物は、ＡＤなど、神経細胞中にＣ末端側切断型のａｐｏＥが存在することが原因で起きる疾患を治療するための候補化合物となる。
【００７８】
別の態様において、スクリーニングアッセイ法はインビボのスクリーニングアッセイ法である。いくつかの態様において、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの形成を低下させる化合物を同定するためのインビボスクリーニングアッセイ法は、完全長のａｐｏＥをコードする核酸を導入遺伝子として含み、神経細胞の中で、後にタンパク質分解によるプロセッシングを受けてカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥとなる完全長のａｐｏＥを産生するトランスジェニック非ヒト動物を使用することを含む。別の態様において、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥがｐ−ｔａｕおよび／またはｐ−ＮＦ−Ｈと相互作用するのを阻害する化合物を同定するためのインビボのスクリーニング法は、通常、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥをコードする核酸を導入遺伝子として含み、神経細胞の中でカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥを産生する本トランスジェニック非ヒト動物を使用することを含む。
【００７９】
これらの方法は、通常、トランスジェニック非ヒト動物を被検作用薬に接触させること、および、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの量、および／または細胞内の神経原線維変化の量に対する候補作用薬の効果があるようならば、それを対照と比較して測定する。適当な対照は、被検作用薬と接触させていないトランスジェニック動物などである。本発明に係るインビボスクリーニングアッセイ法を用いて同定された化合物は、ＡＤなど、神経細胞中にＣ末端側切断型のａｐｏＥが存在することが原因で起きる疾患を治療するための候補化合物となる。
【００８０】
候補作用物質（本明細書において「被検作用薬」とも称する）には多数の化学的分類が含まれるが、典型的にはそれらは有機分子、例えば分子量が５０を上回って約２，５００ダルトン未満である低分子有機化合物である。候補作用物質は通常、蛋白質との構造的相互作用、例えばファンデルワールス相互作用および水素結合に必要な官能基を含み、少なくとも１つのアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基を含んでいてもよく、これらの官能化学基のうち少なくとも２つを含んでいてもよい。候補作用物質はしばしば、上記の官能基の１つまたは複数が置換された形で環状炭素もしくは複素環式構造および／または芳香族もしくは多環芳香族構造を含む。また、候補作用物質は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造類似体または組み合わせを非制限的に含む生体分子からも見出される。
【００８１】
候補作用物質は、合成または天然化合物のライブラリーを含む、非常に多岐にわたる源から入手しうる。例えば、非常に多岐にわたる有機化合物および生体分子のランダムおよび定方向（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）合成には、ランダム化されたオリゴペプチドの発現を含む多数の手段を用いることができる。または、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態にある天然化合物のライブラリーが入手可能であり、または容易に作製しうる。さらに、天然または合成的に作製されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的手段によって容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリーを作製するために用いることもできる。既知の薬理作用物質に対して、構造的類似体を作製するためにアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などの定方向性またはランダムな化学修飾を行ってもよい。新たな治療薬となる可能性のある作用物質を、推論的（ｒａｔｉｏｎａｌ）薬物設計またはコンピュータモデル化などの方法を用いて作り出すこともできる。
【００８２】
スクリーニングは、既知の薬理学的活性化合物、およびその化学的類似体に対して、または、合理的薬剤設計によって作出された作用薬など、未知の特性をもつ新規の作用薬に対して行なうことができる。効果的な候補薬は表現形質によって同定することができる。すなわち、野生型動物と本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物とを比較して、特定の認知行動の停止または逆転によって同定することができる。
【００８３】
本発明に係るアッセイ法において効果をもつ作用薬は、周知のアッセイ法を用いて、さらに、細胞毒性、生物学的利用能などについて調べることができる。本発明に係るアッセイ法において有効な作用薬に、アシル化、アルキル化、エステル化、アミディフィケーション（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などの特異的またはランダム、および／または特異的化学修飾を行なって、構造類似体を作製することができる。このような構造類似体には、生物学的利用能が高まり、および／または細胞毒性が低下したものがある。当業者は、非常に多様な構造類似体を容易に考え出して作製することができ、生物学的利用能の増加、および／または細胞毒性の低下、および／または血液脳関門を通過する能力など、所望の特性について調べることができる。
【００８４】
スクリーニングアッセイ法に種々のその他の試薬を含めてもよい。これらには、最適な蛋白質−蛋白質結合の促進および／または非特異的もしくはバックグラウンド相互作用の軽減のために用いられる、塩類、アルブミンなどの中性蛋白質、界面活性剤などの試薬が含まれる。プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤などのアッセイ法の効率を改善させる試薬を用いることができる。成分の混合物は、必要な結合がもたらされる任意の順序で添加される。インキュベーションは任意の適した温度、典型的には４℃から４０℃の間で行われる。インキュベーション期間は最適な活性に関して選択されるが、迅速な高スループットスクリーニングが促進されるように最適化してもよい。典型的には０．１から１時間の間で十分と考えられる。
【００８５】
インビトロでの細胞を用いたスクリーニングアッセイ法
いくつかの態様において、本発明は、細胞内で神経原線維変化が形成されるのを抑制する化合物を同定する方法であって、一般的に、インビトロの細胞を被検作用薬に接触させること、また、細胞内における神経原線維変化の形成に対して被検作用薬に効果があれば、それを測定することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、この方法は、細胞内でのカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの存在および／または量を検出する方法であって、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの量が減少すると、通常、神経原線維変化の量の減少がもたらされる方法を提供する。カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの量を減少させる被検作用薬は、通常、細胞内における神経原線維変化の形成を低下させる作用薬である。
【００８６】
いくつかの態様において、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの形成を低下させる化合物を同定するためのインビトロでの細胞を用いたスクリーニング法は、その後、タンパク質分解によってカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥにプロセッシングされる完全長ａｐｏＥを産生する宿主細胞の使用を含む。このような宿主細胞は、全長ａｐｏＥをコードする核酸を適当な細胞の中に導入することによって作出される。この方法は、一般的に、細胞質の中でカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの形成を誘導する細胞を候補作用薬と接触させること、および、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの量、および／または細胞内の神経原線維変化の量に対する候補作用薬の効果を対照と比較して測定することを含む。適当な対照は被検作用薬を欠く。
【００８７】
別の態様において、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥがｐ−ｔａｕおよび／またはｐ−ＮＦ−Ｈと相互作用するのを阻害する化合物を同定するための、インビトロで細胞を利用するスクリーニング法は、通常、Ｃ末端側切断型のａｐｏＥをコードする核酸を含む本宿主細胞を使用することを含む。適当な細胞には、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥをコードする核酸を含む本宿主細胞などがある。この方法は、通常、細胞質の中でカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの形成を誘導する細胞を候補作用薬と接触させること、および、ａｐｏＥのｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈに対する結合、および／または細胞内の神経原線維変化の量に対する候補作用薬の効果を対照と比較して測定することを含む。適当な対照は被検作用薬を欠く。
【００８８】
スクリーニング法において使用される細胞は、細胞質にカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥを含み、ｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈも産生する細胞である。通常、細胞は神経細胞であり、多くの態様においては、細胞は神経細胞系である。神経細胞系は、当技術分野において周知されており、ｎｅｕｒｏ−２Ａ細胞、Ｂ１０３、ＰＣ１２、ＮＴ２などがあるが、これらに限定されない。
【００８９】
スクリーニング法に使用される細胞は、細胞質の中にカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥを含んでいる。カルボキシル側切断型ａｐｏＥは、この細胞によって産生するか、外来のものとして調達することができる。
【００９０】
いくつかの態様において、ａｐｏＥをコードする塩基配列含む核酸を、上記したように細胞の中に導入して、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥをコードする核酸を一過的または安定的に細胞内で発現させる。
【００９１】
別の態様において、完全長ａｐｏＥをコードする塩基配列を含む核酸を細胞に導入すると、産生される完全長ａｐｏＥポリペプチドは細胞内でタンパク質分解による切断を受け、細胞質でカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチドが得られる。
【００９２】
別の態様において、細胞をカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチド（「外来のカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチド」）と接触させる。細胞は、培地から外来のカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチドを取り込む。外来のカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチドの取り込みを促進するために、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチドを、真核細胞への取り込みを促進する化合物と複合させることができる。このような化合物には、例えばβ−ＶＬＤＬのような超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、リン脂質／ａｐｏＥ複合体、カチオン性脂質、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸−グリコール酸コポリマー、デキストランなどがあるが、これらに限定されない。
【００９３】
既知の技術を用いて、被検作用薬が細胞内での神経原線維変化の形成に対して作用するか否かを判定する。例えば、ｐ−ｔａｕ、ｐ−ＮＦ−Ｈ、またはａｐｏＥに特異的で、検出用に標識された抗体で細胞を染色して、神経原線維変化の細胞内封入体を可視化するなどする。
【００９４】
いくつかの態様において、細胞を解析して、被検作用薬がカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの量に対して効果をもつか否かを判定する。被検作用薬がカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチドの量を低下させるのに有効であるか否かは、一般的に、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの存在および／または量について細胞を解析することによって判定する。
【００９５】
インビトロでの無細胞アッセイ法
別の態様において、本発明に係るスクリーニングアッセイ法は、インビトロの無細胞法である。インビトロの無細胞スクリーニング法は、通常、ａｐｏＥのタンパク質分解による切断を仲介する酵素を、（１）酵素が活性になったとき検出可能なシグナルを提供する、この酵素の基質、および（２）被検作用薬と接触させることを含む。対照用の試料は、酵素と基質は含むが、被検作用薬は含まない。
【００９６】
酵素は精製することができるが、精製する必要はない。この酵素は、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥを産生する細胞の溶解物の中に存在ことがあり、部分的に単離することもでき、または、実質的に（例えば、純度約９０％、約９５％、または約９８％に）単離することもできる。
【００９７】
適当な基質とは、該基質が酵素による作用を受けたとき検出可能なシグナルをもたらす基質である。このような基質の非限定的な例は、（Ｐ３）ｎＰ２Ｐ１−Ｘという化学式をもち、ここでＰ４Ｐ３Ｐ２Ｐ１がペプチドであり、Ｘがペプチドのカルボキシル末端に結合する部分（「タグ基」）であり、また、酵素による作用を受けて該ペプチドから切断されると検出可能なシグナルをもたらすペプチドである。なお、Ｐ１は、ロイシン、フェニルアラニン、およびメチオニンなどの疎水性残基であり、Ｐ２はプロリン、Ｐ３は、アラニンなどの疎水アミノ酸、また、ｎ≧２である。適当なペプチドの非限定的な例には、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：１）、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ（配列番号：２）、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（配列番号：３）、およびＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：４）などがある。
【００９８】
Ｘは、放射性標識されたタグ、光化学的タグ、比色タグ、発色性タグ、蛍光性タグ、蛍光発生タグ、燐光性タグ、電気化学的タグ、化学発光性タグ、または生物発光性タグを検出するアッセイ法によって検出することができるタグ基である。
【００９９】
化合物は、ペプチドのＣ−末端部位にタグを有する。タグは、酵素アッセイ法に使用される、当業者に既知のものである。タグには、放射性標識によって、または、光化学法、比色法、発色法、蛍光法、蛍光発生法、燐光法、電気化学法、化学発光法、もしくは生物発光法、もしくは免疫アッセイ法によって、通常は定量的に測定することができるタグがあるが、これらに限定されない。典型的なタグは、比色、発色、蛍光、蛍光発生、燐光、化学発光、もしくは生物発光によるアッセイ法で検出可能なタグである。さらに典型的なタグは、放射性標識された基、または蛍光発生タグ、発色性タグ、または化学発光性タグとなりうるタグ基を含むタグである。これらの指標はすべて、Ｐ１アミノ酸とアミド結合またはエステル結合を形成し、これらの結合が酵素によって切断できるようになっている。
【０１００】
発色性および蛍光発生性の標識、ならびにその用途が当技術分野において知られている（例えば、さまざまなタンパク質分解酵素用の特異的な発色性または蛍光発生性の基質のリストを含む、米国特許第４，４４８，７１５号、第３，８８４，８９６号、第３，８８６，１３６号、第４，０１６，０４２号、第４，０２８，３１８号、第４，１１９，６２０号、第４，１４７，６９２号、第４，１５５，９１６号、第４，１９１，８０８号、第４，１９１，８０９号、第４，２０７，２３２号、および第４，１６７，４４９号を参照のこと；比色性物質は、米国特許第４，２１７，２６９号、第４，２１０，４９７号、および第４，２２１，７０６号に表されている）。
【０１０１】
本発明に係る方法において使用するのに適した蛍光発生性または蛍光性のタグは、放射性ハロゲンまたは３Ｈで標識したダンシル基、４−メチルクマリル−７−アミノ基、４−トリフルオロメチルクマリル−７−アミノ基、ナフチルアミノ基、７−オキシクマリル基、５−アミノ−イソ−フタル酸ジ（低級アルキル基、好ましくはメチル基またはエチル基）エステル、クマリル−７−アミノ基、または、放射性ハロゲンまたは３Ｈで標識したナフチルアミノ基であるが、これらに限定されない。典型的な蛍光発生性タグは、４−メチルクマリル−７−アミノ基または４−トリフルオロメチルクマリル−７−アミノ基である。タグは、蛍光発生性タグの場合、４−メチルクマリル−７−アミノ基、４−トリフルオロメチルクマリル−７−アミノ基、ナフチルアミノ基、７−オキシ−クマリル基、５−アミノ−イソフタル酸ジエチルエステル、ダンシル基、クマリル−７−アミノ基、４−トリフルオロメチルクマリル−７−アミノ基、２−メチルアントラニル酸などでありうる。
【０１０２】
本発明に係る方法において使用するのに適した比色性または発色性のタグは、放射性ハロゲンで標識されたパラ−ニトロアニリノ基、パラ−ニトロフェノキシ基、オルト−ニトロフェノキシ基、オルト−カルボキシフェノキシ基、ニトロフェニルアミノ基、１−カルボキシ−２−ニトロフェン−５−イルアミノ基、１−スルフォ−２−ニトロフェン−５−イルアミノ基、ナフチルアミノ基、μ−ナフチルアミノ基、β−ナフチルアミノ基、ニトロナフチルアミノ基、５−ニトロ−α−ナフチルアミノ基、メトキシナフチルアミノ基、４−メトキシ−μ−ナフチルアミノ基、キノニルアミノ基、キノン−５−イルアミノ基、ニトロキノニルアミノ基、８−ニトロキノン−５−イルアミノ基、４−メチルクマリル−７−アミノ基、４−トリフルオロメチルクマリル−７−アミノ基、およびナフチルアミノ基などであるが、これらに限定されない。
【０１０３】
タグが発色性タグの場合、例えば、ｐ−ニトロ−アニリノ基、ｐ−ニトロ−フェノキシ基、ニトロフェニルアミノ基、ナフチルアミノ基、メトキシナフチルアミノ基、キノリルアミノ基、ニトロキノリルアミノ基、４−トリフルオロメチルクマリル−７−アミノ基、またはナフチルアミノ基でありうる。
【０１０４】
本発明に係る方法において使用するのに適した化学発光性のタグは、ルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタルアジンジオン）、イソ−ルミノール（６−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタルアジンジオン）、およびＮ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチル−イソ−ルミノール（６−（Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルアミノ）−２，３−ジヒドロフタルアジン−１，４−ジオン）などであるが、これらに限定されない。Ｓｉｍｐｓｏｎら、（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２７９：６４６を参照のこと。
【０１０５】
本発明に係る方法において使用するのに適した放射性標識されたタグは、１４Ｃ−または３Ｈで標識されたアニリノ基、ベンジルアミノ基、または低級アルコキシ基、または、ヒドロキシアニリノ基、ナフチルアミノ基、ヒドロキシベンジルアミノ基、またはクマリル−７−アミノ基の中のハロ標識などであるが、これらに限定されない。
【０１０６】
または、タグは、アミノ−イソルミノール、アミノ−ルミノール、もしくはその他のルミノール誘導体などの化学発光性タグ、または、ルシフェリン、特に、セレンテラジン、またはルシフェラーゼなど、切断されると、それぞれ適当なルシフェラーゼおよびルシフェリンと反応することができる生物発光性タグのようなレポーターでもよい。また、考えられるのは、レポーターで標識した抗体（または抗原、すなわちリガンド）がＸ上の抗原（レセプター）に結合する免疫レポーターで。およびビオチン／アビジンに結合したレポーターである。
【０１０７】
インビボでのスクリーニングアッセイ法
いくつかの態様において、アッセイ法は、本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物を被検作用薬と接触させること、および、動物において神経原線維変化の形成、または、神経原線維変化の存在に伴う疾患に対してその作用薬に効果があれば、それを測定することを含む。
【０１０８】
いくつかの態様において、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの形成を低下させる化合物を同定するためのインビボスクリーニングアッセイ法は、完全長のａｐｏＥをコードする核酸を導入遺伝子として含み、神経細胞の中で、後にタンパク質分解によるプロセッシングを受けてカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥとなる完全長のａｐｏＥを産生するトランスジェニック非ヒト動物を使用することを含む。完全長のａｐｏＥをコードする塩基配列を含む核酸を導入遺伝子として含むトランスジェニック非ヒト動物が当技術分野において知られている。例えば、米国特許第６，０４６，３８１号、Ｒａｂｅｒら、（１９９８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１０９１４−１０９１９、Ｍｕｔｔｉｎｉ（１９９９）Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １９：４８６７−４８８０を参照のこと。
【０１０９】
別の態様において、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥがｐ−ｔａｕおよび／またはｐ−ＮＦ−Ｈと相互作用するのを阻害する化合物を同定するためのインビボのスクリーニング法は、通常、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥをコードする核酸を導入遺伝子として含み、神経細胞の中でカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥを産生する本トランスジェニック非ヒト動物を使用することを含む。
【０１１０】
これらの方法は、通常、トランスジェニック非ヒト動物を被検作用薬に接触させること、および、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの量、および／または細胞内の神経原線維変化の量に対する候補作用薬の効果があるようならば、それを対照と比較して測定する。適当な対照は、被検作用薬と接触させていないトランスジェニック動物などである。本発明に係るインビボスクリーニングアッセイ法を用いて同定された化合物は、ＡＤなど、神経細胞中にＣ末端側切断型のａｐｏＥが存在することが原因で起きる疾患を治療するための候補化合物となる。
【０１１１】
本発明のトランスジェニック動物を用いるスクリーニングには、動物モデルで容易に評価しうる、学習障害、痴呆または認知障害に伴うあらゆる現象を用いることができる。これらのスクリーニングには、１）分子マーカー（例えば、脳組織におけるカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥタンパク質のレベル、および神経突起斑の形成）の分析、２）記憶および学習に関連した行動上の症状の評価、３）大脳辺縁系の連合新皮質および前脳基底核の進行性および不可逆性の求心路遮断を特徴とする神経変性の検出（神経変性は例えば、脳組織におけるシナプトフィジンの発現の検出によって測定しうる）（例えば、Ｇａｍｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：５２３〜７（１９９５）を参照されたい）を非制限的に含む現象の評価が含まれうる。これらの現象はスクリーニング解析において単独または任意の組み合わせによって測定しうる。
【０１１２】
一般的に、スクリーニングには対照値（例えば、被験化合物の非存在下での被験動物における神経原線維変化形成レベル）が含まれると考えられる。陽性と考えられる、すなわちアポＥを介した疾患の治療に有益である可能性が高いと思われる被験物質は、神経原線維変化の形成および関連した疾患に対して実質的な効果をもつもの（例えば、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの生成によって生じる行動障害を更生しうる被験作用物質）と考えられる。
【０１１３】
これらの現象を評価するための方法、およびアポＥに関連した障害の治療のための候補作用物質に関して予想される効果は、当技術分野で公知である。例えば、ＡＤに対する効果に関する化合物の試験などのための種々のスクリーニング解析においてトランスジェニック動物を用いるための方法は、１９９６年１２月１９日に発行された国際公開公報第９６４０８９６号、１９９６年１２月１９日に発行された国際公開公報第９６４０８９５号、１９９５年５月４日に発行された国際公開公報第９５１１９９４号（Ａβのインビボでのモニタリングのための方法および組成物を記載したもの；これらはそれぞれこのようなスクリーニング解析および技法のための方法および組成物の開示に関して参照として本明細書に組み入れられる）に見いだされる。これらの現象の評価の例は以下に提供されるが、これは制限を目的としたものではない。
【０１１４】
病理学的試験
候補作用物質に対して曝露した後に動物を屠殺し、１）神経原線維変化（ＮＦＴ）、ならびに／または ２）カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥのレベルを免疫組織学的に分析する。脳組織を固定（例えば４％パラホルムアルデヒド中にて）および切片化し、切片をカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥ、および／またはｐ−ｔａｕ、および／またはｐ−ＮＦ−Ｈと反応する抗体により染色する。一次抗体の検出には、フルオレセイン、ローダミン、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼを結合させた二次抗体を用いる。これらの実験により、神経原線維変化の同定およびこれらのＮＦＴを脳の特定領域に対して位置づけることが可能となる。
【０１１５】
Ａｌｚ−５０、Ａ２Ｂ５、Ａβ、ニューロン特異的エノラーゼおよび神経変性の特徴であるその他のものなどの抗原を認識するその他の診断的抗体で切片を染色することもできる。神経炎性局面およびＮＴＦ内部のＡβ沈着の共存を分析するために、チオフラビンおよびコンゴーレッドによる染色を行うこともできる。
【０１１６】
カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥ産生の解析
ウエスタンブロット分析：ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）ら、抗体：実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８８）、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ４０：２９９〜３０８（１９８３）、テート−オストロフ（Ｔａｔｅ−Ｏｓｔｒｏｆｆ）ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８６：７４５〜７４９（１９８９）、およびファン（Ｈｕａｎｇ）ら（２００１）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９８：８８３８〜８８４３により記載された通りに、組織ホモジネートおよび細胞可溶化物から蛋白質画分を単離して、ウエスタンブロット分析に用いることができる。以下には簡単な説明を示す。
【０１１７】
蛋白質画分はレムリ試料緩衝液中にて変性させ、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動にかけることができる。続いてエレクトロブロッティングによって蛋白質をニトロセルロースフィルターに移行させる。フィルターをブロックし、一次抗体とともにインキュベートし、酵素を結合させた二次抗体と最後に反応させる。引き続いて適切な基質（この基質は検出可能なシグナルを提供する）とインキュベートすることにより、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥ蛋白質の位置が明らかとなる。
【０１１８】
行動試験
学習および記憶能の低下を評価するためにデザインされた行動試験を用いることができる。このような試験の１つの例にモリス水迷路（Ｍｏｒｒｉｓ Ｌｅａｒｎ Ｍｏｔｉｖａｔ １２：２３９〜２６０（１９８１））がある。この手順では、脱出用プラットフォームが水の表面の直下に隠されている、水を満たした環状のプールに動物を入れる。プラットフォーム上には視認しうるマーカーが配置され、動物が近くの視覚的手がかりを求めて動き回ることによってそれを見いだせるようになっている。または、プラットフォームの位置を示す正式な手がかりがない、より複雑な形式の試験を動物に行うことも考えられる。この形式では、動物は遠方の視覚的手かがりに対する相対的なプラットフォームの位置を学習しなければならない。または、もしくはこれに加えて、学習記憶障害に関する３走路パネル（３ ｒｕｎｗａｙ ｐａｎｅｌ）を用いて記憶および学習能の低下を検討することもできる（４つの選択ポイントに３つのパネルゲートがあり、うち２つが誤ったパネルであるものを通過させる試行）（Ｏｈｎｏら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｅｈａｖ ５７：２５７〜２６１（１９９７））。
【０１１９】
神経細胞障害の動物モデルの検討
外傷性事象によって生じる神経細胞障害の程度におけるアポＥ３およびアポＥ４の役割、ならびにこの種の傷害によるニューロンのリモデリング、修復および回復におけるそれらの役割を明らかにすることを目的として、神経細胞障害、例えば脳虚血のために生じる神経細胞障害の齧歯類モデルを検討することができる。全体的虚血（ｇｌｏｂａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ）および限局性虚血（ｆｏｃａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ）の双方に関する脳虚血の齧歯類モデルは、脳虚血の発生を司る機序、および虚血性事象によって生じる損傷の治療に関する可能性のある治療戦略を研究するために有用である。通常は一過性である全体的虚血に関する動物モデルでは、脳の領域が広く侵されるが、典型的には選択的に易損性の脳領域にニューロンの変質が生じる。このようなモデルの例には、前脳虚血の二枝閉塞モデル、前脳虚血の四枝閉塞モデル、および脳脊髄液圧上昇が関与する虚血モデルが非制限的に含まれる。参照として本明細書に組み入れられるギンズバーグ（Ｇｉｎｓｂｅｒｇ）およびブスト（Ｂｕｓｔｏ）、Ｓｔｒｏｋｅ ２０：１６２７〜１６４２（１９８９）を参照のこと。限局性虚血のモデルは虚血脳卒中損傷に類似していると考えられ、典型的には限局的な脳梗塞が生じる。限局性虚血のモデルの例には、中大脳動脈閉塞、光化学的に誘発される限局性脳血栓、血栓塞栓、マイクロスフェア塞栓などが非制限的に含まれる。参照として本明細書に組み入れられるマコーリー（ＭｃＡｕｌｅｙ）、Ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃ． Ｂｒａｉｎ Ｍｅｔａｂ． Ｒｅｖｉｅｗ ７：１５３〜１８０（１９９５）を参照されたい。
【０１２０】
神経原線維変化の形成を阻害する方法
本発明は、神経細胞において神経原線維変化の形成を阻害する方法を提供する。これらの方法は、一般的に、神経細胞におけるカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの形成を減少させることを含む。
【０１２１】
神経細胞における神経原線維変化量の減少は、以下によって行なうことができる。（１）カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチドの量を減少させること、（２）ａｐｏＥポリペプチドがタンパク質分解によってカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチドに切断されるのを減少すること、（３）カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチドがｐ−ｔａｕと相互作用するのを減少させること、（４）カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチドがｐ−ＮＦ−Ｈと相互作用するのを減少させること、（５）ａｐｏＥを切断してカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥを生成させる酵素の量および／またはタンパク質分解活性を低下させること。
【０１２２】
いくつかの態様において、本方法は、ａｐｏＥの少なくとも２４４〜２６０番目のアミノ酸を含むペプチドであって、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥがｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈに結合するのを阻害するペプチドを感染した細胞の中に導入することを含む。
【０１２３】
別の態様において、本方法は、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥを産生する細胞を、ａｐｏＥを切断してカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥを生成させる酵素のタンパク質分解活性を阻害する作用薬に接触させることを含む。いくつかの態様において、作用薬はキモトリプシン様セリンプロテアーゼのインヒビターである。キモトリプシン様セリンプロテアーゼを阻害し、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの形成を阻害する作用薬を、本発明に係る方法において使用することができる。
【０１２４】
キモトリプシン様セリンプロテアーゼのインヒビターである作用薬は、米国特許第５，２８８，７０７号、第６，１２７，３４０号および第６，２８１，２０６号で開示されているものなどである。キモトリプシン様セリンプロテアーゼを阻害する作用薬はＸ−（ａａ４）ｍ−（ａａ３）ｎ−（ａａ２）−（ａａ１）−Ｚなどであるが、これに限定されない。ここでａａ１、ａａ２およびａａ３は、天然または非天然の酸残基であり、（ａａ４）ｍは、ａａ３のアミノ基に結合した１個以上の選択的アミノ酸残基を表している。または、１個以上の選択的アミノ酸（ａａ）群は、α位の水素が置換基に置き換えられている、アミノ酸残基の類似体でもよい。Ｘは、Ｎ末端アミノ基のＨまたは置換基を表し、Ｚは、例えば、当技術分野において知られているような−−ＣＯＯＨまたはＣ末端伸長基（カルボキシ置換基）である。化合物によっては、Ｚは、ヘテロアトム原子酸基（ｈｅｔｅｒｏａｔｏｍ ａｃｉｄ ｇｒｏｕｐ）、例えば、−−Ｂ（ＯＨ）２、−−Ｐ（ＯＨ）２、もしくはＰＯ（ＯＨ）、またはそれらの誘導体、例えば、カルボキシル酸エステル、ジオキソ−ボロネート［−−Ｂ（Ｏ置換基）２］、またはリン酸［−−ＰＯ（Ｏ置換基）２］またはＢＦ２である。典型的なヘテロ原子類似体群は、−−Ｂ（ＯＨ）２および−Ｐ（Ｏ）（ＯＭ）２ Ｓ（Ｏ）２ＯＨである。いくつかの態様において、Ｐ２−Ｐ１天然ペプチド結合は、Ｎ置換Ｐ２−Ｐ１天然ペプチド結合以外の他の結合部分により置換される。
【０１２５】
いくつかの態様において、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの形成を阻害する作用薬はペプチドインヒビターである。このようなインヒビターの非限定的な例は、（Ｐ３）ｎＰ２Ｐ１という化学式をもつペプチドである。ここで、Ｐ４Ｐ３Ｐ２Ｐ１がペプチドであり、Ｐ１は、ロイシン、フェニルアラニン、およびメチオニンなどの疎水性残基であり、Ｐ２はプロリン、Ｐ３はアラニンなどの疎水アミノ酸、また、ｎ≧２である。適当なペプチドの非限定的な例には、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：１）、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ（配列番号：２）、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（配列番号：３）、およびＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：４）などがある。
【０１２６】
治療薬
本発明は、本明細書に記載する方法を用いて同定された作用薬を提供する。ａｐｏＥ４関連疾患を治療するためにカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの量および／または活性を低下させる作用薬を使用する。有効な用量の活性成分を宿主に投与するが、ここで、「有効な用量」とは、所望の結果を生むのに十分な投薬量を意味する。通常、所望の結果とは、対照と比較すると、神経細胞の中で少なくとも、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥ量の低下、および／または神経原線維変化の量が低下することである。通常、より詳しく後述するように、本発明に係るスクリーニング法によって同定される作用薬は、１種類以上の薬学的に許容される賦形剤とともに処方される。
【０１２７】
本発明は、神経細胞におけるカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの形成を減少させる治療薬を提供する。治療薬には、神経細胞内でａｐｏＥのタンパク質分解を触媒して、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥ断片を産生させる酵素（「ａｐｏＥ切断酵素」）や、神経細胞におけるＡβ１−４２によるａｐｏＥ切断酵素の活性化を抑制し、および／またはａｐｏＥ切断酵素とＡβ１−４２との相互作用を阻害する作用薬などがある。治療薬は特異的であって、例えば、神経細胞において神経原線維変化の形成を誘導するカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥ断片を産生するａｐｏＥ切断酵素を阻害するが、神経細胞内の他の酵素は阻害しない、および／または、神経細胞においてＡβ１−４２によるａｐｏＥ切断酵素の活性化を抑制するが、神経細胞内における他の酵素の活性化には実質的な影響を与えない、および／または、神経細胞においてａｐｏＥ切断酵素とＡβ１−４２との相互作用を阻害するが、神経細胞における他のタンパク質−タンパク質相互作用は阻害しない。これらの治療薬は、神経細胞内にカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥが存在することに関係する疾患を治療するための本発明に係る方法において有用である。
【０１２８】
いくつかの態様において、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの形成を阻害する作用薬はペプチドインヒビターである。このようなインヒビターの非限定的な例は、（Ｐ３）ｎＰ２Ｐ１という化学式をもつペプチドである。ここで、Ｐ４Ｐ３Ｐ２Ｐ１がペプチドであり、Ｐ１は、ロイシン、フェニルアラニン、およびメチオニンなどの疎水性残基であり、Ｐ２はプロリン、Ｐ３はアラニンなどの疎水アミノ酸、また、ｎ≧２である。適当なペプチドの非限定的な例には、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：１）、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ（配列番号：２）、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（配列番号：３）、およびＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：４）などがある。
【０１２９】
多くの態様において、作用薬は、薬学的に許容される賦形剤とともに調剤される。さまざまな調剤法が当業者に知られており、詳しくは後述する。
【０１３０】
本発明は、キモトリプシン様プロテアーゼインヒビターのインヒビター、および、アセチルコリンエステラーゼインヒビター、非ステロイド系抗炎症剤、シクロオキシゲナーゼ−２インヒビター、およびモノアミンオキシダーゼインヒビターからなる群より選択される作用薬、および、薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的製剤を提供する。
【０１３１】
いくつかの態様において、本発明は、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの形成を触媒する酵素のインヒビター、および、少なくとも１種類の他の治療薬剤よりなる組成物を提供する。ａｐｏＥ切断酵素を阻害する作用薬は上述した。カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの形成を触媒する酵素のインヒビターとともに調剤することのできる別の治療薬には、ＡＤに罹った個体を治療するために使用される作用薬があるが、それに限定されず、そのような作用薬には、アリセプト（Ａｒｉｃｅｐｔ）（ドネペジル（ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ））、エクセロン（Ｅｘｃｅｌｏｎ）（リバスティグミン（ｒｉｖａｓｔｉｇｍｉｎｅ））、メトリフォネート（ｍｅｔｒｉｆｏｎａｔｅ）、およびタクリン（ｔａｃｒｉｎｅ）（コグネクス社（Ｃｏｇｎｅｘ））などのアセチルコリンエステラーゼインヒビター、イブプロフェン（ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ）およびインドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ）などの非ステロイド系抗炎症剤、セレブレックス（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）などのシクロオキシゲナーゼ−２（Ｃｏｘ２）インヒビター、および、セレギレン（Ｓｅｌｅｇｉｌｅｎｅ）（エルデプリル（Ｅｌｄｅｐｒｙｌ）およびデプレニル（Ｄｅｐｒｅｎｙｌ））などのモノアミンオキシダーゼインヒビターがあるが、これらに限定されない。キモトリプシン様プロテアーゼの既知のインヒビターは、ＡＤを治療するために使用される別の治療薬とともに調剤することができる。上記作用薬のそれぞれについての投薬量は当技術分野において知られており、ａｐｏＥ切断酵素インヒビターとともに薬学的製剤に使用することができる。例えば、アリセプトは、通常、１日当たり５０ ｍｇを６週間経口投与し、個体が十分に耐えられるようならば、その後、１日当たり１０ ｍｇを投与する。
【０１３２】
薬学的に許容される賦形剤は当業者に知られており、例えば、Ａ． Ｇｅｎｎａｒｏ （１９９５） 「レミントン：薬剤の科学と実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐａｒｍａｃｙ）」、第１９版、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス社（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）など、さまざまな刊行物に十分に記載されている。
【０１３３】
さらに、本発明は、神経細胞においてａｐｏＥ切断酵素を阻害する作用薬を含むキットを提供する。この作用薬は薬学的に許容される賦形剤とともに調剤することができる。さらに、本キットは、上記したような（例えば、アセチルコリンエステラーゼインヒビター、非ステロイド系抗炎症剤、Ｃｏｘ−２インヒビター、モノアミンオキシダーゼインヒビターなど）ＡＤを治療する別の作用薬を含むことができ、薬学的に許容される賦形剤とともに調剤することができる。さらに、本キットは、調剤を各個体に投与するための装置を含むことができる。装置は、針、注射器、カテーテルなどであるが、これらに限定されない。本キットは、さらに、服用量、投与法などの関する情報など、キットの成分を使用するために情報を含むことができる。この情報は、印刷物などの形で提供することができるが、印刷物には限定されない。
【０１３４】
ａｐｏＥ関連疾患の治療法
本発明は、各個体におけるａｐｏＥ関連疾患（例えば、各個体の神経細胞の中にカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥが存在することに随伴する疾患；ＡＤなど）を治療する方法を提供する。本方法は、通常、ａｐｏＥ関連疾患をもつ個体に、神経細胞内でのカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの形成を低下させ、および／または神経原線維変化の形成を低下させ、および／またはｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈへのカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの結合を低下させる化合物を有効量投与することを含む。
【０１３５】
「有効量」の化合物とは、化合物が存在しないときの各個体の神経細胞におけるカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの量、および／または神経原線維変化の量、および／またはｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈへのカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの結合と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、またはそれ以上、各個体の神経細胞内におけるカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの形成を低下させ、および／または神経原線維変化の形成を低下させ、および／またはｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈへのカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの結合を低下させる量のことである。
【０１３６】
いくつかの態様において、本発明はアルツハイマー病の治療法を提供する。いくつかの態様において、本方法は、神経細胞におけるカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの存在を測定すること、および、神経細胞内でカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの形成を触媒する酵素のインヒビターを投与することを含む。別の態様において、本方法は、キモトリプシン様プロテアーゼのインヒビターを、神経細胞内でのカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの形成を触媒する酵素を阻害するのに有効な量投与して、酵素を阻害し、各個体の神経細胞における神経原線維変化の量を低下させることを含む。
【０１３７】
さらに、本発明は、神経細胞においてカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥが存在していることに関連する症状にあると臨床的に診断された個体を治療する方法を提供する。本方法は、通常、神経細胞においてカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥが存在していることに関連したａｐｏＥ関連疾患をもつと臨床的に診断された個体の神経細胞を含む生体試料を解析することを含む。神経細胞にカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥが存在することが、ａｐｏＥに伴う症状の臨床的診断の確認となる。
【０１３８】
次に、神経細胞において検出されたカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥに基づいて、ａｐｏＥに関連する症状をもつと臨床的に診断された各個体に最も有効な治療計画を選択する。治療には、神経細胞におけるａｐｏＥ切断酵素を阻害する作用薬を含む組成物を投与することが含まれる。
【０１３９】
上記のようにして得られた情報を用いて、各作用薬に対する各個体の反応を予測することができる。このように、本発明は、さらに、ａｐｏＥに関連する症状の薬物治療に対する患者の応答可能性を予測する方法であって、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥが神経細胞内に存在するか否かを判定し、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥが存在すれば、その症状の薬物治療に対して応答する可能性があると予測できる方法を提供する。
【０１４０】
調剤、投薬量、および投薬経路
本発明は、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの量および／または活性を低下させる作用薬を含む、薬学的調剤などの調剤を提供する。「有効な量」とは、例えば、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの量および／または活性の低下、神経原線維変化の減少、学習や記憶などの改善などという所望の結果を生むのに十分な投薬量を意味する。通常、所望の結果とは、対照と比較すると、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの量および／または活性が低下することである。カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの量および／または活性を低下させる作用薬は、詳しく後述するように、血液脳関門を回避するようにして送達することができる。カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの量および／または活性を低下させる作用薬は、より詳しく後述するように、該作用薬が血液脳関門を通過することができるように調剤および／または改変することができる。
【０１４１】
調剤
本発明の方法において、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの量および／または活性の所望の低下、ａｐｏＥ４関連神経疾患の軽減、ａｐｏＥ４関連活性の低下などをもたらすことができる方法を適宜用いて、活性成分を宿主に投与することができる。
【０１４２】
したがって、治療用に投与するために、作用薬をさまざまな調剤に組み入れることができる。具体的には、本発明に係る作用薬は、薬学的に許容される適当な担体または希釈剤と組み合わせて薬学的組成物に調剤することができ、錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、軟膏、液剤、坐薬、注射液、吸入剤、およびエアロゾルなど、固体、半固体、液体、または気体という形状の製剤に処方することができる。
【０１４３】
薬剤投与形態で、作用薬は、薬学的に許容される塩の形で投与することができ、または、単独、もしくは、他の薬学的な活性化合物と併用するだけでなく、適当に結合させて用いることもできる。以下の方法および賦形剤は単なる例示であり、決して制限的なものではない。
【０１４４】
経口用製剤としては、錠剤、粉剤、顆粒剤、またはカプセル剤にするため、本作用薬を単独、または適当な添加剤と組み合わせて用いることができる。例えば、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ、またはジャガイモデンプンなどの通常の添加剤、例えば、結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチンなどの結合剤、例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤、例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および、望ましい場合には、希釈剤、緩衝剤、保湿剤、保存剤、および香料と組み合わせることができる。
【０１４５】
本作用薬は、水性溶媒、または、植物油もしくはその他同類の油脂、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステル、もしくはプロピレングリコールなどの非水性溶媒に、望ましい場合には、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤、および保存剤など通常の添加剤とともに溶解、懸濁、または乳化することによって注射用製剤に調剤することができる。
【０１４６】
本作用薬は、吸入によって投与されるエアロゾル調製剤にして利用することができる。本発明に係る化合物は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの許容される加圧噴霧剤に調剤することができる。
【０１４７】
さらに、本作用薬は、乳化基剤、または水溶性基剤などさまざまな基剤と混合することによって坐薬にすることができる。本発明に係る化合物は、坐薬によって直腸に投与することができる。坐薬は、ココアバター、カーボワックス、およびポリエチレングリコールなど、体温では溶けるが室温では固化する媒体を含むことができる。
【０１４８】
シロップ、エリキシル、および懸濁剤など、経口または直腸経由で投与するための単位投薬形態であって、例えば、ティースプーン１杯分、テーブルスプーン１杯分、錠剤、または坐薬という各剤形単位が、１種類以上のインヒビターを含む組成物を所定量含む単位剤形を提供することができる。同様に、注射または静脈内投与のための単位剤形は、滅菌水、通常の生理食塩水、またはそれ以外の薬学的に許容される担体中の溶液として、組成物中にインヒビターを含むことができる。
【０１４９】
本明細書において、「単位剤形」とは、ヒトまたは動物の被検体にとって単位用量として適した物理的に分離した単位量であって、各単位が、薬学的に許容される希釈剤、担体、または媒体とともに所望の効果を生じるのに十分量となるよう計算された、所定量の本発明に係る化合物を含むを意味する。本発明に係る新規の単位剤形に関する明細は、使用される特定の化合物、および達成されるべき効果に依存し、宿主における各化合物に関連する薬力学に依存する。
【０１５０】
別の投薬方式も、本発明で使用される。例えば、本発明に係る作用薬は、坐薬に調剤することができ、場合によっては、エアロゾルおよび鼻腔内組成物として調剤することができる。坐薬用には、媒体の組成物は、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドなどの伝統的な結合剤および担体を含む。このような坐薬は、約０．５％から約１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約１％から約２％の範囲で活性成分を含む混合物から形成することができる。
【０１５１】
経鼻投与用調製剤は、普通、鼻粘膜を刺激せず、毛様体の機能を大きく損なわない媒体を含む。水、生理食塩水、またはこれら以外の既知の物質を本発明で使用することができる。経鼻用調製剤も、クロロブタノールおよび塩化ベンザルコニウムなどの保存剤を含むことがある。界面活性剤を入れて、鼻粘膜による本発明のタンパク質の吸収を促進することができる。
【０１５２】
本発明に係る作用薬を注射剤として投与することができる。一般的には、注射用組成物は、溶液または懸濁液として調製されるが、注射前に液状媒体に入れて溶液または懸濁液にするのに適した固体も調製することができる。この調製物は乳化することもでき、また、その活性成分をリポソーム媒体に封入することもできる。
【０１５３】
適当な賦形剤となる媒体は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、および、それらを併用したものである。さらに、所望であれば、この媒体は、湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝剤など少量の補助物質を含むことができる。このような剤形を調製する実際の方法は、当業者にとって既知であるか明白である。例えば、レミントンの薬剤科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ペンシルバニア州イーストン（Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、マックパブリッシングカンパニー社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）、第１７版、１９８５；レミントン：薬剤の科学と実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐａｒｍａｃｙ）」、Ａ．Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ （２０００） リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス社（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）を参照のこと。投与される組成物または調製剤は、いずれにせよ、治療を受けている対象者において所望の状態を実現するのに適した一定量の作用薬を含む。
【０１５４】
媒体、アジュバント、担体、または希釈剤など、薬学的に許容される賦形剤は、一般人が簡単に利用できる。その上、ｐＨ調整剤および緩衝剤、張性調整剤、安定剤、湿潤剤など、薬学的に許容される補助物質は一般人が簡単に利用できる。
【０１５５】
投薬量
用いられる投薬量は到達しようとする臨床目的に応じて変化するが、適当な投薬量の範囲は、神経原線維変化の形成を低下させる、および／または、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの量を低下させる、および／または、ａｐｏＥとｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈとの相互作用を低下させる作用薬を約１μｇから約１，０００μｇまたは約１０，０００μｇまで提供する投薬範囲であり、一回用量にして投与することができる。または、神経原線維変化の形成を低下させる、および／または、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの量を低下させる、および／または、ａｐｏＥとｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈとの相互作用を低下させる作用薬の標的用量は、作用薬を投与してから最初の２４〜４８時間内に採血した宿主の血液試料中約０．１〜１０００μＭ、約０．５〜５００μＭ、約１〜１００μＭ、または約５〜５０μＭの範囲にあると考えることができる。
【０１５６】
当業者は、投薬量は、具体的な化合物、病状の重さ、および副作用に対する対象者の感受性の関数として多様であると、容易に理解することができよう。所定の化合物にとって好ましい投薬量は、さまざまな方法によって当業者が容易に決定することができる。
【０１５７】
投薬経路
インビボおよびエクスビボの方法など、また、全身および局所投与経路など、薬剤送達に適した方法および経路で利用できるものを用いて、神経原線維変化の形成を低下させる、および／または、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの量を低下させる、および／または、ａｐｏＥとｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈとの相互作用を低下させる作用薬を各個体に投与する。
【０１５８】
通常の薬学的に許容される投与経路には、鼻腔内、筋肉内、気管内、腫瘍内、皮下、皮内、局所施用、静脈内、経直腸、経鼻、経口、および、これら以外の非経口投与経路がある。投与経路は、望ましい場合には、作用薬および／または所望の効果に応じて併用したり、調整することができる。組成物は、一回投与量または複数回投与量にして投与することができる。
【０１５９】
全身経路または局所経路など、通常の薬剤を送達するのに適した利用可能な通常の方法および経路を用いて、作用薬を宿主に投与することができる。通常、本発明が想定する投与経路は、経腸経路、非経口経路、または吸入経路であるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１６０】
吸入経路以外の非経口投与経路は、局所経路、経皮経路、皮下経路、筋肉内経路、眼窩内経路、関節内経路、脊髄内経路、および静脈経路、すなわち、消化管を経由しない投与経路であり、必ずしもこれらに限定されない。非経口投与は、作用薬の全身または局所への送達をもたらすように行なうことができる。全身への送達が望ましい場合、投与は、一般的に、侵襲的、または全身に吸収される局所または粘膜への薬剤投与を含む。
【０１６１】
また、本作用薬は、腸への投与によっても対象者に送達することができる。腸からの投与経路とは、経口および直腸から（例えば、坐薬を用いて）送達することであるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１６２】
皮膚または粘膜を経由する薬剤投与法は、適当な薬剤の局所施用、経皮透過、注射、および上皮への投与などであるが、必ずしもこれらに限定されない。経皮透過させには、吸収促進またはイオン導入法が適した方法である。イオン導入による透過は、数日以上の間、電気パルスによって傷んでいない皮膚を通して生成物を継続的に送達する市販の「パッチ」を用いて行なうことができる。
【０１６３】
改善が広義で用いられ、例えば、ａｐｏＥ４関連神経疾患およびそれに伴う痛みなど、治療を受けている病理状態に伴う症状などのパラメータの程度を少なくとも軽減することを意味する場合、治療とは、宿主を苦しめている病理状態に関連した症状を改善することを意味する。したがって、治療は、病理状態、または、少なくともそれに伴う症状を完全に阻害する、例えば、発症を防止したり、停止する、例えば、終結させると、宿主はその病理状態、または、少なくとも、その病理状態を特徴づけている症状に苦しむことはなくなる。
【０１６４】
さまざまな宿主（ここで、「宿主」という語は、「対象者」および「患者」と互換的に使用される）は、本発明の方法によって治療することが可能である。通常、このような宿主は「哺乳動物」または「哺乳類」であるが、これらの用語は、広く、食肉目（例えば、イヌおよびネコ）、齧歯目（例えば、マウス、モルモット、およびラット）、霊長目（例えば、ヒト、チンパンジー、およびサル）など、哺乳類に含まれる生物を表すために使用される。多くの態様において、宿主はヒトである。
【０１６５】
例えば、経口用量または注射用量など、単位投薬量の活性成分を含むキットが提供される。このようなキットは、単位用量を含む容器以外に、対象とする病理状態を治療する際の使用法および該薬剤の副次的利益について記載した能書からなる。
【０１６６】
血液脳関門の通過
血液脳関門は、多くの治療薬が通常の循環から脳および脊髄に取り込まれるのを制限している。血液脳関門を通過する分子は、２つの主要なメカニズム、すなわち、自由な拡散（ｆｒｅｅ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）および促進輸送を利用する。血液脳関門があるため、中枢神経系（ＣＮＳ）において所定の治療薬が有益な濃度になるには、薬剤輸送方法を用いる必要があるかもしれない。ＣＮＳへの治療薬の輸送は、いくつかの方法によって達成することができる。
【０１６７】
一つの方法は神経外科的技術に基づく。自己の犠牲者やさまざまなタイプの痴呆を患う重篤な患者の場合、手術による介入は、それに伴うリスクがあるにもかかわらず正当なものと見なされる。例えば、薬剤の脳室内注入またはくも膜下注入など、ＣＮＳに直接物理的に導入することによって、治療薬を輸送することができる。脳室内注入は、例えば、オンマヤ（Ｏｍｍａｙａ）リザーバーのようなリザーバーに接続している脳室内カテーテルによって促進することができる。また、導入方法は、再充填可能か生物分解性の装置によって行なうことができる。別の方法は、血液脳関門の透過性を上昇させる物質によって血液脳関門を破壊する方法である。例としては、マンニトールのような難拡散性薬剤、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）のような脳血管透過性を上昇させる薬剤、または、ロイコトリエンなどの血管作用薬を動脈内注入することなどがある。ＮｅｕｗｅｌｔとＲａｐｐｏｐｏｒｔ（１９８４）Ｆｅｄ． Ｐｒｏｃ． ４３：２１４−２１９； Ｂａｂａら、（１９９１）Ｊ． Ｃｅｒｅｂ． Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ． １１：６３８−６４３；およびＧｅｎｎｕｓｏら、（１９９３） Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ． １１：６３８−６４３。
【０１６８】
さらに、薬剤は、治療を必要としている領域に局所的に投与することが望ましいことがあり、例えば、手術中の局所注入、注射、カテーテルという手段、または、シラスティック膜や繊維などの多孔性、無孔性、またはゼラチン状素材などのインプラントという手段によって行なうことができる。
【０１６９】
また、治療用化合物は、化学修飾、または血液脳関門を通過する類似化合物をスクリーニングするなどの薬理学的技術を用いて送達することもできる。化合物を修飾して、分子の疎水性を増強したり、分子の正味電荷または分子量を減少させたり、分子を修飾したりして、正常に血液脳関門を通過する化合物に似せることができる。Ｌｅｖｉｎ （１９８０） Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２３：６８２−６８４； Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ （１９９１） 「脳へのペプチド薬輸送（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｔｈｅ Ｂｒａｉｎ）」より；およびＫｏｓｔｉｓら、（１９９４）Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３４：９８９−９９６。
【０１７０】
リポソームなどの疎水環境に薬剤を封入することも、ＣＮＳに薬剤を送達するのに効果的である。例えば、ＷＯ ９１／０４０１４は、正常に血液脳関門を通過して輸送される分子が添加されているリポソームの中に薬剤を封入するリポソーム送達系を記載している。
【０１７１】
血液脳関門を通過する薬剤を調剤する別の方法は、シクロデキストリンの中に薬剤を封入することである。Ｊ−シクロデキストリン、Ｋ−シクロデキストリン、およびそれらの誘導体など、血液脳関門を通過する適当なシクロデキストリンを用いることができる。一般的には、米国特許第５，０１７，５６６号、第５，００２，９３５号、および第４，９８３，５８６号を参照のこと。また、このような組成物も、米国特許第５，１５３，１７９号に記載されているようなグリセロール誘導体を含むことができる。
【０１７２】
また、治療薬を可搬剤に接合させて新しいキメラ可搬治療薬を得て送達を行なうこともできる。例えば、血管作用性小腸ペプチドアナログ（ＶＩＰａ）は、特異的な担体分子であるトランスフェリンレセプターに対するモノクローナル抗体（Ｍａｂ）に接合して始めてその血管作用性効果を発揮することができ、血液脳関門を通過してＶＩＰａ−Ｍａｂ接合体の吸収を促進した。Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ （１９９１）；およびＢｉｃｋｅｌら、（１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：２６１８〜２６２２。この他いくつかの特異的輸送系が同定されている。これらは、インシュリン、またはインシュリン様成長因子ＩおよびＩＩを移動させる系であるが、それらに限定されない。この以外の安定した非特異的担体には、ピリジニウム、脂肪酸、イノシトール、コレステロール、およびグルコース誘導体などがあるが、これらに限定されない。中枢神経系に入り込んだところで、薬剤が担体から切断されて活性薬になるという、ある種のプロドラッグについて記載がある。米国特許第５，０１７，５６６号。
【０１７３】
本発明に係る治療薬による治療に適した対象者
さまざまな対象者が本発明に係る方法によって同定された作用薬による治療に適している。適当な対象者は、ａｐｏＥ関連疾患を患う個体、ａｐｏＥ関連疾患を発症する危険のある個体、ａｐｏＥ関連疾患を患ったことがあり、ａｐｏＥ関連疾患を再発する危険のある個体、または、ａｐｏＥ関連疾患から回復しつつある個体、特にヒトなどである。
【０１７４】
このような対象者には、アルツハイマー病であると診断された個体、１回以上脳梗塞を起こしたことのある個体、外傷性頭蓋骨傷害を受けたことのある個体、血清コレステロール値の高い個体、脳組織にＡβ沈着がある個体、１回以上心臓病を起こしたことのある個体、心臓手術を受けた対象者、および多発性硬化症患者などであるが、それらに限定されない。
【０１７５】
実施例
以下の実施例は、本発明の実施方法を当業者に完全に開示・説明するために提示するものであって、本発明者らが発明と見なすものの範囲を限定するものではなく、また、以下の実験は、実施したすべて、または唯一の実験であることを示すものである。用いられた数字（例えば、量、温度など）に関する正確さを保証するために努力が払われてきたが、実験誤差および偏差もあると見なされるはずである。別段の記載がない限り、割合は重量による割合であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏で表記されており、また、圧力はほぼ気圧である。
【０１７６】
実施例１：神経細胞におけるカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの特徴づけ
材料と方法
最少必須培地（ＭＥＭ）、Ｎ２−培地添加物、およびウシ胎児血清（ＦＢＳ）をライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）から購入した。パラホルムアルデヒド、ストレプトリシン−Ｏ（ＳＴＰ−Ｏ）、およびトリトン−１００をシグマ社（Ｓｉｇｍａ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ））から購入した。ウエスタンブロット用の増強化学発光（ＥＣＬ）検出キットをアマーシャム・ライフサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）から購入した。プロテイン−Ａアガロースをベーリンガー・マンハイム社（Ｂｅｏｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）から購入した。組換えヒトａｐｏＥ３、ａｐｏＥ４、ａｐｏＥ３（Δ２７２−２９９）、またはａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）を大腸菌の中で発現させて、確立された技術を用いて精製した。
【０１７７】
ポリクローナル抗ヒトａｐｏＥ抗体をカリバイオケム社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）から購入した。抗ａｐｏＥ−カルボキシ末端抗体（アミノ酸番号２７２〜２９９）は、ポリクローナル抗ａｐｏＥ抗体を、ａｐｏＥ３（Δ２７２−２９９）およびａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）の混合物を結合したセファロースＣＬ−４Ｂカラムに３回通して得られた。非結合画分を抗ａｐｏＥ−カルボキシ末端抗体として用いた。完全長のａｐｏＥ、およびａｐｏＥ（Δ２７２−２９９）に対するウエスタンブロッティングによって、ａｐｏＥのアミノ末端部位（アミノ酸番号１〜２７１）に対する抗体が完全に除去されたことを確認した。
【０１７８】
リン酸化依存型モノクローナル抗ｔａｕ抗体であるＡＴ８（ｐ−Ｓｅｒ２０２およびｐ−Ｔｈｒ２０５）、ＡＴ１００（ｐ−Ｓｅｒ２１２およびｐ−Ｔｈｒ２１４）、ＡＴ１８０（ｐ−Ｔｈｒ２３１）、ＡＴ２７０（ｐ−Ｔｈｒ１８１）などはエンドゲン社（Ｅｎｄｏｇｅｎ）から購入した。リン酸化依存型モノクローナル抗ｔａｕ抗体であるｔａｕ−１（ｄｅ−ｐ−Ｓｅｒ２０２およびｄｅ−ｐ−Ｔｈｒ２０５）およびリン酸化依存型モノクローナル抗ＮＦ−Ｈ抗体ＲＴ９７をベーリンガー・マンハイム社から購入した。リン酸化依存型モノクローナル抗ＮＦ−Ｈ抗体ＳＭ−３１は、スターンバーガー・モノクローナルズ社（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ Ｉｎｃ．）から購入した。モノクローナル抗ＮＦ−６８抗体、ＮＲ４抗体、抗ＮＦ−１６０抗体、ＮＮ１８抗体、抗ＮＦ−２００（ＮＦ−Ｈ）抗体、Ｎ５２抗体、およびモノクローナル抗ＦＬＡＧタグ抗体のＭ２をシグマ社から購入した。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−、ローダミン−、またはＣｙ５−に結合した抗ウサギまたは抗マウスのＩｇＧをベクター社（Ｖｅｃｔｏｒ）から購入した。ＨＲＰ−結合抗ウサギまたは抗マウスＩｇＧをダコー社（Ｄａｋｏ）から購入した。
【０１７９】
ａｐｏＥ発現ベクターの調製−ポリメラーゼ連鎖反応を利用した分子クロニーング法を用いてさまざまなａｐｏＥ発現ベクターを構築した。野生型または改変型のａｐｏＥ３またはａｐｏＥ４をコードするＰＣＲ産物を、Ｎ末端ＦＬＡＧ融合ペプチドおよびプレプロトリプシンシグナル配列を持つため、発現されたタンパク質の分泌をもたらすｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−３ベクター（シグマ社）、または、Ｎ末端ＦＬＡＧ融合ペプチドは持つが、シグナル配列を持たないため、細胞質内でのタンパク質発現をもたらすｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−４ベクター（シグマ社）にサブクロニーングした。いくつかの実験では、野生型または改変型のａｐｏＥ３またはａｐｏＥ４をコードするＰＣＲ産物を、アミノ末端にシグナル配列なしに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の融合タンパク質をもつため、ＧＦＰ−ａｐｏＥ融合タンパク質の細胞質内での発現がもたらされるｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクター（クローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））にサブクロニーングした。全てのベクターで、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の最初期プロモーターがタンパク質の発現を促進している。本研究で使用されたＤＮＡ構築物のすべてとそれらの性質を表１に示した。
【０１８０】
【表１】
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【０１８１】
細胞培養−マウス神経芽細胞腫（Ｎｅｕｒｏ−２ａ）細胞をアメリカン・タイプカルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ））から購入した。Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞は、非必須アミノ酸、ペニシリン、およびストレプトマイシンを添加した１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭの中で、加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃で維持した。
【０１８２】
ヒト奇形癌細胞（ＮＴ２）を、５％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ−Ｉ（ギブコ社（ＧＩＢＣＯ））の中で維持した。レチノイン酸処理によってＮＴ２細胞を分化させた。簡単に説明すると、ＮＴ２細胞を１μＭレチノイン酸で週２回インキュベートし、これを４週間続ける。そして、１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ高グルコース（ＤＭＥＭ／ＨＧ）の中で細胞を再培養した。１日後、ＮＴ２細胞をマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）でコートした培養皿（コラボレーティブ・リサーチ社（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ））上で再培養した。その後２週間、分化したＮＴ２（ＮＴ２−Ｎ）細胞を、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン（１μＭ）、フルオロデオキシウリジン（１０μＭ）、およびウリジン（１０μＭ）を含むＤＭＥＭ／ＨＧの中で維持した。その後、５％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ−Ｉの中でＮＴ２−Ｎ細胞を維持した。
【０１８３】
前述したように、１７日齢のマウス胚から皮質ニューロンの一次培養物を調製した。Ｆｉｕｍｅｌｌｉら（１９９９）Ｅｕｒ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １１：１６３９−１６４６。簡単に説明すると、切り開いた大脳皮質を２．５％トリプシン溶液に３７℃で１５分間懸濁し、無カルシウムおよび無マグネシウムのハンクス平衡塩類液（Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で３回洗浄してから、ガラスピペットで粉砕して細胞を分離させた。次に、ポリリジン処理した培養皿またはチャンバー・スライド上に２×１０５／ｃｍ２の密度で塗末植菌し、１ ｍＭグルタミン、７．５ ｍＭ炭酸水素ナトリウム、５ ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．０）、０．１ ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．０６ ｍｇ／ｍｌペニシリンを添加したＤＭＥ培地の中で細胞を培養した。２５μｇ／ｍｌインシュリン、１００μｇ／ｍｌトランスフェリン、６０μＭプトレシン、２０ ｎＭプロゲステロン、および３０ ｎＭセレン酸ナトリウムを含む、ホルモンと塩の混合液を培養培地に加えた。細胞を、加湿した９５％大気および５％ＣＯ２の中で３７℃に６日間置いた。以前にも報告されているように（ＮＳ３３０７）、６日間インビトロで培養した皮質培養を細胞特異的抗体で免疫染色すると９０％よりも高い収率でニューロン特異的なエノラーゼ−免疫反応性細胞が得られる。
【０１８４】
細胞の一過的形質転換−Ｎｅｕｒｏ−２ａ， ＮＴ２−Ｎ， または培養マウス一次ニューロンを、表１に列挙してあるよう、さまざまなａｐｏＥ構築物によってリポフェクタミン法を用いて一時的に形質転換した。簡単に説明すると、２μｇのａｐｏＥ ＤＮＡを、Ｎ２補助剤を含む、２００μｌの無血清ＭＥＭに７μｌのリポフェクタミンを入れたものと室温で３０分間インキュベートした。Ｎ２補助剤を含む無血清ＭＥＭを８００μｌ加えた後、この混合液を無血清ＭＥＭで３回洗浄した細胞に加えた。１０〜４８時間後、形質転換細胞をさまざまな実験に用いた。
【０１８５】
免疫細胞化学法−Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞を２穴チャンバースライドの中で２４時間増殖させてから、上記したとおり、さまざまなａｐｏＥ３またはａｐｏＥ４のＤＮＡ構築物で一過的に形質転換した。形質転換細胞は、ＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ中３％パラホルムアルデヒドによって室温で３０分間固定した後、ＰＢＳで２回洗浄してから、トリトンＸ１００で５分間透過処理し、その後ＰＢＳで３回洗浄した。
【０１８６】
非特異的反応を阻害するために、すべてのスライドは、２％ＢＳＡと、二次抗体の由来源と同一の生物種（ヒツジまたはウサギ）に由来する１０％正常血清（ベクター社）とを含むＰＢＳとともに室温で１時間インキュベートした後、２％ＢＳＡを含むＰＢＳの中で一次抗体（単一特異性ウサギ抗ヒトａｐｏＥ、１：５００；モノクローナル抗ｐ−ｔａｕ、１：１００〜１：１０００、抗ｐ−ＮＦ−Ｈ、１：１００〜１：５００）とともに１時間インキュベートした。
【０１８７】
次に、２％ＢＳＡを含むＰＢＳでスライドを３回洗浄し、二次抗体（抗原結合抗ヒトａｐｏＥを検出するためにはＦＩＴＣ−結合抗ウサギＩｇＧ、抗原結合抗−ｐ−ｔａｕまたは抗−ｐ−ＮＦ−Ｈを検出するにはローダミンまたはＣｙ５を結合した抗マウスＩｇＧ）とともに室温で１時間インキュベートした。２％ＢＳＡを含むＰＢＳで３回洗浄した後、免疫蛍光標識したスライドをベクタシールド（ＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ）（ベクター社）にマウントし、オプティフォト−２（Ｏｐｔｉｐｈｏｔ−２）顕微鏡（ニコン社（Ｎｉｋｏｎ）、東京）に取り付けたＭＲＣ−１０２４レーザー走査共焦点装置（バイオラド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））を用いて観察した。
【０１８８】
二重標識するには（ａｐｏＥおよびｐ−ｔａｕ、ｐ−ＮＦ−Ｈ、またはＦＬＡＧタグ）、ＦＩＴＣおよびＣｙ５またはローダミンというチャンネルを個別に観察し、得られた画像にアドビ・フォトショップ（Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ）（バージョン５．５、アドビシステム社（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍ）、カリフォルニア州サンノゼ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ））を用いて緑色（ＦＩＴＣ）または赤色（Ｃｙ５またはローダミン）で模擬彩色した。
【０１８９】
ＧＦＰ−ａｐｏＥ ＤＮＡ構築物で一過的に形質転換した細胞については、３％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで２回洗浄した後、前記したＭＲＣ−１０２４レーザー走査共焦点装置（バイオラド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））で緑色蛍光を直接観察した。実験によっては、ＧＦＰ−ａｐｏＥ断片を発現する、一過的に形質転換されたＮｅｕｒｏ−２ａ細胞を、上記したようにｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈについて免疫染色して、ａｐｏＥ断片と、ｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈが同一部位に局在するのを検出した。
【０１９０】
ストレプトリシン−Ｏおよびトリトンｘ−１００による細胞の示差的透過処理−いくつかの実験では、細胞内封入体が細胞質に存在するのか、細胞成分オルガネラに存在するのかを判定するため、ａｐｏＥ４またはａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）を発現するＮｅｕｒｏ−２ａ細胞をセラミン処理して、細胞表面に結合したａｐｏＥを除去し、３％パラホルムアルデヒドで固定してから、５００ Ｕ／ｍｌのストレプトリシン−Ｏ（ＳＴＰ−Ｏ）によって４℃で１５分間インキュベートして、細胞成分オルガネラの膜を破壊することなく細胞の原形質膜を透過処理するか、または、０．５％トリトンｘ−１００で処理して、原形質膜と細胞成分膜の両方を透過処理する。そして、上記のようにして抗ａｐｏＥ免疫染色を行なった。
【０１９１】
免疫沈殿およびウエスタンブロッティング−Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞を６穴プレートまたは１５−ｃｍシャーレの中で８０％コンフルエントな状態になるまで増殖させた後、上記したようにして、さまざまなａｐｏＥ ＤＮＡ構築物で一過的に形質転換した。２４時間から４８時間後に細胞を回収し、氷冷したリーシス緩衝液中に３０分間置いて細胞溶解させた。核を除去するために遠心した（１３，０００ ｒｐｍで１５分間）後、上清中のａｐｏＥを単一特異性ウサギ抗ヒトａｐｏＥ抗体およびプロテインＡアガロースビーズで免疫沈殿した。免疫沈殿物をリーシス緩衝液で２回、ＰＢＳで３回洗浄した。免疫沈殿物の中にａｐｏＥ、ｐ−ｔａｕ、またはｐ−ＮＦ−Ｈが存在しているかを、対応する抗体を用いてウエスタンブロッティングによって解析した。または、細胞溶解液の上清をモノクローナル抗ｐ−ｔａｕまたは抗ｐ−ＮＦ−Ｈ抗体で免疫沈殿してから、抗ａｐｏＥウエスタンブロッティングによりａｐｏＥの存在を解析した。
【０１９２】
いくつかの実験について、正常な個体またはアルツハイマー病患者からの脳組織を、氷冷したリーシス緩衝液Ｉ（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ， ｐＨ ８．０， １５０ ｍＭ ＮａＣｌ， ０．１％ ＳＤＳ， ０．５％ ノニデットＰ−４０、０．５％ デオキシコール酸ナトリウム、およびプロテアーゼ阻害剤の混合液）の中でホモジナイズした。４℃、１４，０００ ｒｐｍで３０分間遠心して、可溶化タンパク質（上清）を得た後、沈殿物を氷冷リーシス緩衝液ＩＩ（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ， ｐＨ ８．０， １５０ ｍＭ ＮａＣｌ， ４％ ＳＤＳ， １％ ノニデットＰ−４０、１％ デオキシコール酸ナトリウム、およびプロテアーゼ阻害剤の混合液）の中でさらにホモジナイズした。上清も可溶化した沈殿物もＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って、上記したようにウエスタンブロットで解析した。
【０１９３】
電子顕微鏡解析−ＧＦＰまたはａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）をコードするＤＮＡ構築物で一過的に形質転換したＮｅｕｒｏ−２ａ細胞を、０．０５％トリプシンおよび０．０５ ｍＭ ＥＤＴＡを用いて、プレートから取り出した。蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）によってＧＦＰ陽性の細胞を選別し、遠心分離によって沈殿させた。そして、０．１ Ｍカコジル酸緩衝液中２．５％グルタルアルデヒドによって細胞を１時間固定し、２％ ＯｓＯ４の中で１時間再固定した。細胞を脱水し、エポン（Ｅｐｏｎ）８１２に包埋し、ライヘルト・ウルトラカットＥ（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｕｌｔｒａｃｕｔ Ｅ）を用いて切片（８０ ｎｍ）を作製し、さらに、酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色した。そして、ジオル（ＪＥＯＬ）ＣＣＸ−１００ＩＩ電子顕微鏡を用いて細胞を撮影した。
【０１９４】
結果
ａｐｏＥ４の発現は、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞において細胞内封入体の形成を誘導する。
ＮＦＴ形成におけるａｐｏＥの役割を評価するために、ａｐｏＥ３またはａｐｏＥ４のｃＤＮＡ構築物（表１）によって一過的に形質転換したマウス神経芽細胞腫細胞（Ｎｅｕｒｏ−２ａ）におけるａｐｏＥ３またはａｐｏＥ４とｔａｕタンパク質との相互作用を調べた。ａｐｏＥ４を発現するＮｅｕｒｏ−２ａ細胞をポリクローナル抗ａｐｏＥ抗体とモノクローナル抗ｐ−ｔａｕ抗体で二重免疫染色したところ、ａｐｏＥおよびｐ−ｔａｕの免疫反応性細胞内封入体はどちらも形質転換された細胞の成分内にあることが明らかになった。また、これらの細胞内封入体は、ｐ−ＮＦ−Ｈに対するモノクローナル抗体によっても認識された。アルカリホスファターゼ処理によって、細胞内封入体におけるｔａｕまたはＮＦ−Ｈのリン酸化が確認され、それによって、抗ｐ−ｔａｕまたは抗ｐ−ＦＮ−Ｈの免疫染色は無効になった。これらの結果は、ａｐｏＥ、ｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈを含む複合体が少数のａｐｏＥ４形質転換細胞の中に存在することを示唆している。しかし、ａｐｏＥ３を発現するＮｅｕｒｏ−２ａ細胞を免疫染色しても、細胞内封入体の形成は明らかでなかった。
【０１９５】
アミロイド−ベータ（Ａβ）および小胞体（ＥＲ）ストレスは、ａｐｏＥ４を発現するＮｅｕｒｏ−２ａにおける細胞内封入体の形成を増加させる。
Ａβ沈着がアルツハイマー病患者の脳内における主要な病態学的要素であるため、本発明者らは、ａｐｏＥを発現するＮｅｕｒｏ−２ａにおけるａｐｏＥおよびｐ−ｔａｕの免疫反応性細胞内封入体の形成に対するＡβ処理の効果を測定した。結果を図１に示す。Ａβ１−４２処理によって、封入体陽性ａｐｏＥ４を発現する細胞の数は２．７±１．２％から６．７±１．５％（Ｐ＜０．００１）に、ａｐｏＥ３を発現する細胞の数は０％から２．８±０．６％（Ｐ＜０．００１）に明らかに増加した。これらの結果は、Ａβ１−４２が、ａｐｏＥを発現するＮｅｕｒｏ−２ａにおける細胞内封入体の形成を増強することを示唆している。
【０１９６】
細胞をＡβ処理するとＥＲストレスを生じることがある（ＴＮ９８）ため、ブレフェルジン（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ）Ａ（ＢｆＡ）やツニカマイシン（ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ）（ＴＮ９８）などの他のＥＲストレス誘導物質を用いて、ＥＲストレスがａｐｏＥで形質転換されたＮｅｕｒｏ−２ａ細胞において細胞内封入体の形成を増加させることができるかを判定した。ＢｆＡまたはツニカマイシンでインキュベートすると、封入体陽性細胞が、ａｐｏＥ４発現細胞では２．７±１．２％から７．２±２．１％（Ｐ＜０．００１）に、ａｐｏＥ３発現細胞では０％から３．２±１．１％（Ｐ＜０．００１）に増加した。
【０１９７】
ａｐｏＥが直接的にｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈと相互作用するか否かを調べるために、Ａβ１−４２またはＢｆＡで処理した、ａｐｏＥ４により形質転換されたＮｅｕｒｏ−２ａ細胞の細胞溶解液に対して共免疫沈殿実験を行なった。抗ｐ−ｔａｕを用いた免疫沈殿によって、ウエスタンブロット上で抗ｐ−ｔａｕ抗体によって検出されるバンドが２〜３本（分子量５０〜６０ Ｋｄ）存在することが明らかになった。さらに、この複合体において、ｐ−ＮＦ−Ｈ（分子量〜２００ Ｋｄ）も検出された。しかし、抗ａｐｏＥウエスタンブロッティングでは、完全長のａｐｏＥは明らかにならず、より分子量の低いバンド（３４ Ｋｄではなく〜３０ Ｋｄ）が明らかになった。これらの結果、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞の細胞内封入体がｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈよりなることが確認され、また、この複合体中のａｐｏＥ４は、全長ａｐｏＥよりも１０〜１５％小さい分子量をもつ切断型であることが実証された。
【０１９８】
カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥは、Ｎｅｕｒｏ−２ａにおける細胞内封入体の形成を誘導する。
ａｐｏＥのアミノ末端側とカルボキシル末端側のどちらが細胞内封入体の形成を誘導することができるのかを判定するために、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞を、ａｐｏＥのアミノ末端切断型またはカルボキシル末端切断型を有する構築物で形質転換した。ａｐｏＥ４のアミノ末端側アミノ酸を最大２８個まで（〜１０％）欠失させたところ、細胞内封入体の形成は起きなかった。しかし、カルボキシル末端側アミノ酸を２８個（〜１０％）欠失させると、ａｐｏＥ３（Δ２７２−２９９）またはａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）で形質転換された細胞のそれぞれ３２±５％または７８±８％が細胞内フィラメント状封入体の存在を示した。ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）で形質転換したＮｅｕｒｏ−２ａ細胞における細胞内封入体は抗−ａｐｏＥ、抗−ｐ−ｔａｕ、および抗−ｐ−ＮＦ−Ｈと免疫反応性であった。抗−ａｐｏＥおよび抗−ｐ−ｔａｕについて示されたように、封入体の免疫反応性は完全に併合しており、ａｐｏＥとｐ−ｔａｕが同一場所に局在することを示している。ａｐｏＥ３（Δ２７２−２９９）によって誘導される細胞内封入体も同様であるが、より小さく、ずっと少ない数の細胞でしか見られなかった。これらの結果は、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥ、特にａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）が、細胞質にあるｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈと相互作用して、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞における細胞内封入体の形成を誘導することを示唆している。
【０１９９】
ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）で形質転換したＮｅｕｒｏ−２ａ細胞を示差的透過処理し、その後、抗ａｐｏＥ免疫蛍光染色によって、封入体の局在をより正確に確認した。細胞成分オルガネラ膜を透過させることなく原形質膜を透過させるストレプトリシン−Ｏ（ＳＴＰ−Ｏ）処理は、ａｐｏＥ４で形質転換したＮｅｕｒｏ−２ａ細胞における抗ａｐｏＥ免疫反応性を有意にもたらすことはなかったが、ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）で形質転換した細胞における細胞内封入体の強度の抗ａｐｏＥ免疫反応性をもたらした。このことは、封入体が細胞質に分布していることを示唆している。しかしながら、トリトンＸ−１００処理によって原形質膜と細胞成分オルガネラ膜の両方を透過処理すると、ａｐｏＥ４およびａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）で形質転換した両方の細胞において強度の抗ａｐｏＥ免疫反応性がもたらされた。総合すれば、これらの結果は、細胞内封入体が細胞質に分布していることを示しており、また、小胞体（ＥＲ）で合成されたａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）が分泌経路を逃れて細胞質に入り込むために、細胞質にあるｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈとの相互作用が生じることを示唆している。または、分泌されたａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）が再吸収され、エンドソーム−リソソーム経路を逃れて細胞質に入り込む。第一の可能性を支持する根拠は、ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）で形質転換された細胞では、ａｐｏＥ ｍＲＮＡレベルがａｐｏＥ４細胞と同じであるにもかかわらず、培地に分泌されるａｐｏＥがずっと少なかったという観察結果に基づく。
【０２００】
細胞質ａｐｏＥ（Δ２７２−２９９）はＮｅｕｒｏ−２ａ細胞において細胞内封入体の形成を誘導する。
次に、本発明者らは、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞の細胞質でａｐｏＥ（Δ２７２−２９９）を直接に発現させると、大量の細胞内封入体の形成を誘導するか否かを調べた。シグナルペプチドをコードする配列を持たないＧＦＰ− ａｐｏＥ３（Δ２７２−２９９）またはＧＦＰ− ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）のＤＮＡ構築物でＮｅｕｒｏ−２ａ細胞を形質転換した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をａｐｏＥのＮ−末端に融合して細胞内分布を観察した。ａｐｏＥは培地内に分泌されなかった。Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞を一過的に形質転換すると、ＧＦＰだけが細胞全体に非常に拡散して分布した。一方、ＧＦＰ− ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）を細胞質で発現させると、細胞体の中で大量の細胞内フィラメント状封入体が形成され、そのうちの一部が神経突起の中にまで伸長したのに対して、ＧＦＰ− ａｐｏＥ３（Δ２７２−２９９）は、ＧＦＰ− ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）に較べると、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞において細胞内封入体の形成を誘導することができなかった。
【０２０１】
これに対して、ＧＦＰ− ａｐｏＥ３（全長）は、点状または小胞状の分布パターンを示しながら、細胞質の核の周囲、および神経突起に分布していた。他方、ＧＦＰ− ａｐｏＥ４（全長）の分布はＧＦＰ− ａｐｏＥ３に較べれば点状ではなかった。神経原線維変化様封入体を含む細胞の割合は、図２に示すように、ＧＦＰ− ａｐｏＥ３（Δ２７２−２９９）で形質転換された細胞では、ＧＦＰ− ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）で形質転換された細胞に較べて低かった。これらの結果は、ａｐｏＥのカルボキシ末端側２８アミノ酸が、ａｐｏＥがｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈと相互作用するのを防いでおり、それによって、細胞内封入体の形成が防止される。
【０２０２】
ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）を発現するＮｅｕｒｏ−２ａ細胞において形成される細胞内封入体は、ヒトアルツハイマー病の脳で見られる神経原線維変化に類似した超構造的および生化学的特徴を有する。
細胞質ＧＦＰ−ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）を発現するＮｅｕｒｏ−２ａ細胞において形成される細胞内封入体の超構造および組成を決定した。超構造分析については、電子顕微鏡によって、ＧＦＰ−ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）を発現するＮｅｕｒｏ−２ａ細胞において形成されるフィラメント状の集合体が明らかになったが、これらはＧＦＰだけを発現する細胞では見られなかった。フィラメントは勝手な方向を向いており、膜には結合していなかった。高倍率にしたところ、封入体は、直径１０〜２０ ｎｍの多数の直線状フィラメントで構成されていることが明らかになったが、これらはアルツハイマー病の脳に見られる濃縮体のあるものに似ている。また、ＧＦＰ−ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）を発現する細胞も、高電子密度の膜結合したオルガネラを示し、変性したオルガネラを連想させた。
【０２０３】
細胞内封入体の組成の特徴をより詳しく調べるために、２組のモノクローナル抗体を用いた（表２）。すなわち、ｔａｕタンパク質のさまざまな位置にあるリン酸化されたセリンまたはスレオニン残基を認識する抗−ｐ−ｔａｕ抗体（ＡＴ８， ＡＴ１００， ＡＴ１８０， ＡＴ２７０，およびｔａｕ−２）、および、非リン酸化ｔａｕタンパク質を認識するｔａｕ−１、ならびに、リン酸化されたＮＦ−Ｈを認識する抗神経フィラメント抗体ＲＴ９７およびＮ１４、および非リン酸化ＮＦ−Ｈを認識するＮ５２を用いた。
【０２０４】
【表２】
2004516825.tif 000004
＊ヒトｔａｕまたはＮＦ−Ｈの残基またはモチーフ
【０２０５】
アルツハイマー病患者の脳における濃縮体がｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈの両方を含んでいることが報告されている。ＧＦＰ−ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）を発現するＮｅｕｒｏ−２ａ細胞を免疫蛍光染色したところ、ヒトアルツハイマー病脳における対らせん状フィラメント（ＰＨＦ）中のｐ−ｔａｕを認識するモノクローナル抗体のすべてではないが、それらの一部に対して封入体が陽性を示すことが明らかになり（表２）、ｔａｕタンパク質のすべてではないが、その一部が、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞中の細胞内封入体においてリン酸化されていることが示唆された。抗−ｐ−ＮＦ−Ｈ抗体であるＲＴ９７で免疫染色したところ、細胞内封入体にはｐ−ＮＦ−Ｈも含まれていることが明らかになった。
【０２０６】
ｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈの存在を確認するために、ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）で形質転換されたＮｅｕｒｏ−２ａ細胞から得られた封入体を含む細胞溶解物を抗−ａｐｏＥ抗体で免疫沈殿した。そして、抗−ｐ−ｔａｕ抗体によるウエスタンブロッティングによって、ｐ−ｔａｕタンパク質である、分子量４０〜６０ Ｋｄのタンパク質の存在が明らかになった。同様に、抗−ｐ−ＮＦ−Ｈ抗体（ＲＴ９７）によるウエスタンブロッティングによって、分子量２００ Ｋｄをもつｐ−ＮＦ−Ｈの存在が明らかになった。分子量４０〜６０ Ｋｄで、ｔａｕアイソフォームの特徴をもつ別のバンドもモノクローナル抗体ＲＴ９７によって認識された。モノクローナル抗体ＲＴ９７はリン酸化されたｔａｕと交差反応することが報告されているため、これらのバンドはｐ−ｔａｕタンパク質である可能性がある。
【０２０７】
一方、ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）で形質転換された細胞溶解物を、ｐ−ｔａｕまたはｐ−ＮＦ−Ｈに対するモノクローナル抗体で免疫沈殿させると、抗−ａｐｏＥによるウエスタンブロッティングは、〜３０ ＫＤの分子量をもつバンド、すなわちａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）が存在することを明らかにした。総合すると、これらの結果は、ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）がｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈと複合体を形成して、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞の中で細胞内封入体を形成することを示唆している。これらの細胞内封入体は、ヒトアルツハイマー病の脳で見られる神経原線維変化（ＮＦＴ）に類似した超構造的および生化学的特徴もつ。
【０２０８】
ａｐｏＥの２４４〜２６０番目のアミノ酸は、ｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈと相互作用して、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞の中でＮＦＴ様構造体を形成する。
ｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈと直接に相互作用してＮＦＴ様構造体を形成するａｐｏＥの領域を決定するために、ＧＦＰ−ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９） ＤＮＡ構築物（シグナルペプチドなし）に対するカルボキシ末端側切断物の別のシリーズを調製して、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞を形質転換した。切断部位を図３Ａに示す。結果を図３Ｂに示す。アミノ酸番号２６０で切断したもの（ａｐｏＥ４（Δ２６１−２９９）は、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥ４がＮＦＴ様構造体の形成を誘導する能力を変えることはなかったが、一方、アミノ酸番号２５２で切断したもの（ａｐｏＥ４（Δ２５２−２９９）は、細胞内ＮＦＴ様構造体の形成を僅かに低下させた。しかし、アミノ酸番号２４４で切断したもの（ａｐｏＥ４（Δ２４４−２９９）は、細胞内ＮＦＴ様構造体を形成しなくなった。このことは、２４４〜２６０番目の領域に、ｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈと結合してＮｅｕｒｏ−２ａ細胞においてＮＦＴ様構造体を形成するのに関与する重要な残基が存在することを示唆している。
【０２０９】
この観察結果を確認するために、ａｐｏＥの３８アミノ酸のみ（アミノ酸番号２３３〜２７１）（シグナルペプチドなし）をコードするＧＦＰ−ａｐｏＥ（Δ１〜２３２、Δ２７２−２９９）ＤＮＡ構築物をＮｅｕｒｏ−２ａ細胞に形質転換した。結果は図３Ｂに示す。ａｐｏＥ（Δ１〜２３２、Δ２７２−２９９）は、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞においてＮＦＴ様構造体の形成を誘導した。ただし、ＧＦＰ−ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）で形質転換された細胞と比較すると、これらの構築物はずっと小さくて、幾分少ない形質転換細胞の中で生じた。このように、これらの結果は、ａｐｏＥの２４４〜２６０番目のアミノ酸がＮｅｕｒｏ−２ａ細胞においてＮＦＴ様構造体の形成を誘導するのに必要であり、また、ａｐｏＥのアミノ末端側ドメインがＮＦＴ様構造体の形成程度に影響を与えるという結論を支持している。
【０２１０】
ａｐｏＥのアミノ末端側ドメインは、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥがＮＦＴ様構造体を形成する能力を変更する。
２４４〜２６０番目のアミノ酸配列はａｐｏＥ３とａｐｏＥ４で同一であるため、なぜａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）の方がａｐｏＥ３（Δ２７２−２９９）よりもＮＦＴ様構造体を形成する能力が高いのかという疑問が生じる。ａｐｏＥのアミノ末端側ドメインが、ＮＦＴ様構造体の形成を誘導する２４４〜２６０番目のアミノ酸の能力を変更することができるか否かを判定するために、図３Ａに示すように、ＧＦＰ−ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）ＤＮＡ構築物の一連のアミノ末端側切断物を作製した。結果を図３Ｃに示す。最初の２０アミノ酸（Δ１〜２０、Δ２７２−２９９）、最初のα−ヘリックス（Δ１〜４５、Δ２７２−２９９）、および二番目のα−ヘリックス（Δ１〜８４、Δ２７２−２９９）を切断しても、ＧＦＰ−ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）がＮｅｕｒｏ−２ａ細胞においてＮＦＴ様構造体の形成を誘導する能力に変更を与えなかった。しかし、三番目のα−ヘリックス（Δ１〜１２６、Δ２７２−２９９）を除去すると、ＮＦＴ様構造体の形成を誘導するＧＦＰ−ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）の能力を劇的に低下させた。四番目のα−ヘリックス（Δ１〜１７０、Δ２７２−２９９）を切断しても、ＮＦＴ様構造体の形成をそれ以上低下させることはなかった。これらの結果は、ａｐｏＥ３ではシステイン、ａｐｏＥ４ではアルギニンである第１１２位のアミノ酸を含む、三番目のα−ヘリックス（アミノ酸番号８５〜１２６）中の配列が、ＮＦＴ様構造体の形成を誘導するａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）の能力を変更することを示唆している。
【０２１１】
ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）によって誘導されるＮＦＴ様構造体の形成はニューロンに特異的である。
ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）によって誘導されるＮＦＴ様構造体の形成がニューロンに特異的であるか否かを判定するために、本発明者らは、初代培養マウス胚脳ニューロン、および分化したヒト奇形癌ＮＴ２細胞（ＮＴ２−Ｎ）という、さらに２種類の神経細胞、および、４種類の非神経細胞をＧＦＰ−ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）（シグナルペプチドなし）で形質転換した（表３）。
【０２１２】
【表３】
2004516825.tif 000005
ＮＦＴ様構造体は、実験手順に記載されたように、抗ａｐｏＥおよび抗ｐ−ｔａｕ二重免疫蛍光染色によって測定した。
【０２１３】
上記表３に示されているように、細胞質におけるＧＦＰ−ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）の発現は、神経細胞においてＮＦＴ様構造体の形成を誘導したが、非神経細胞においては誘導しなかった。これらの結果は、ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）によって誘導されるＮＦＴ様構造体の形成はニューロン特異的であり、これは、ｔａｕおよびＮＦ−Ｈの発現がニューロン特異的であることと一致している。
【０２１４】
内部移行した外来性ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）は、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞におけるＮＦＴ様構造体の形成を誘導することができる。
ヒトニューロンはａｐｏＥを産生することができるが、ヒトの脳において、ａｐｏＥは、主に星状細胞によって合成および分泌される。分泌されたａｐｏＥはニューロンによって内部移行しうる。内部移行したａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）が、ニューロンにおいてＮＦＴ様構造体の形成を誘導することができるか否かを判定するために、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞を、脂質輸送用媒体β−ＶＬＤＬと複合体を形成している組換えａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）とともにインキュベートした。３０時間インキュベートした後、細胞における神経突起の成長とＮＦＴ様構造体の形成を測定した。脂質輸送用媒体のみと３０時間インキュベートしたＮｅｕｒｏ−２ａ細胞は、神経突起の成長を示した。しかし、外来性ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）とインキュベートした細胞は細胞の形態を変えたが、神経突起の成長は示さなかった。このことは、内部移行したａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）が、細胞骨格の構造と機能を損なう可能性を示唆している。抗ａｐｏＥ免疫蛍光染色によって、外来性ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）とインキュベートしたＮｅｕｒｏ−２ａ細胞においてＮＦＴ様構造体が形成されることが明らかになった。こららの構造体は、細胞質でＧＦＰ−ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）を発現するＮｅｕｒｏ−２ａ細胞の中で形成される濃縮体様構造と一致していた。したがって、内部移行したａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）は、エンドソーム−リソソーム経路を逃れて、細胞質のｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈと相互作用することができる。
【０２１５】
カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥはニューロンの内部で生成されうる。
カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥがニューロンの内部で自然に生成されるか否かを判定するために、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞を全長ａｐｏＥ３またはａｐｏＥ４（シグナルペプチドなし）で形質転換するか、または、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞を外来性の全長ａｐｏＥ３またはａｐｏＥ４とともにインキュベートした。細胞を溶解させてから、細胞内ａｐｏＥを単一特異的抗ａｐｏＥ抗体で免疫沈殿させた。抗ａｐｏＥウエスタンブロッティングによって、全長ａｐｏＥのバンドと、それよりも小さな分子量、ａｐｏＥ（Δ２７２−２９９）と同じ分子量（〜３０ Ｋｄ）のバンドの存在が明らかになった。ａｐｏＥ３よりもａｐｏＥ４からより多くの断片が生じた。アミノ末端側１５アミノ酸を認識するモノクローナル抗体６Ｃ５によって検出すると、分子量の低い方のバンドはカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥを表していた。したがって、短い方の断片は、約２７０アミノ酸からなるカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥである。この結論は、形質転換した、アミノ末端ＦＬＡＧタグとともにａｐｏＥ４を発現するＮｅｕｒｏ−２ａ細胞において確認された。抗ＦＬＡＧ抗体も、分子量〜３０ Ｋｄのタンパク質バンドを認識した。
【０２１６】
Ａβ１−４２は、ａｐｏＥ４を発現するＮｅｕｒｏ−２ａ細胞において細胞内封入体が形成されるのを増加したため、本発明者らは、次に、形質転換細胞をＡβで処理すると、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥが生成されるのを促進するか否かを判定した。ａｐｏＥ３またはａｐｏＥ４を発現するＮｅｕｒｏ−２ａ細胞をＡβ１−４２とインキュベートした後、細胞内ａｐｏＥを免疫沈殿し、抗ａｐｏＥウエスタンブロッティングによって検出した。形質転換細胞をＡβ１−４２で処理すると、ａｐｏＥ３およびａｐｏＥ４とも、カルボキシル末端側切断型の量が有意に増加したが、ａｐｏＥ４の方がより多く増加した。同様の結果が、外来のａｐｏＥ３またはａｐｏＥ４を、Ａβ１−４２存在下でＮｅｕｒｏ−２ａ細胞とインキュベートしたときにも得られた。これらの結果は、Ａβ１−４２が、ａｐｏＥ、特にａｐｏＥ４を、そのカルボキシル末端で切断する未知のタンパク質分解性酵素を活性化して、生物活性のある切断型を生成させうることを示唆している。
【０２１７】
カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥはアルツハイマー病患者の脳で見られる。
カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥをヒトの脳においてインビボで生成することができるか否かを判定するために、本発明者らは、全長ａｐｏＥまたはａｐｏＥのカルボキシル末端部位（アミノ酸番号２７２〜２９９）に対するポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングによって、正常者またはアルツハイマー病患者の脳溶解物におけるａｐｏＥを解析した。結果を図４Ａ〜Ｅに示す。
【０２１８】
ポリクローナル抗ａｐｏＥによって、全長ａｐｏＥは、正常者またはアルツハイマー病患者から得た脳溶解物の上清および沈殿の両方に存在することが明らかになった。分子量〜２９ ＫｄのａｐｏＥ断片も、正常者およびアルツハイマー病患者の脳から得た上清においてポリクローナル抗ａｐｏＥによって認識されたが、アルツハイマー病患者の脳の方がより程度が高かった。２９ ＫｄのａｐｏＥ断片は、アルツハイマー病脳の沈殿物中にも見られたが、正常者の脳の沈殿物には見られなかった。さらに、分子量〜１４〜１９ Ｋｄのより短い断片は、アルツハイマー病脳の上清および沈殿物の両方で見られたが、正常脳では見られなかった。
【０２１９】
しかし、ａｐｏＥのカルボキシル末端部位（アミノ酸番号２７２〜２９９）に対するポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングは、全長ａｐｏＥが存在するのを明らかにしたのみで、上清および沈殿物の両方でａｐｏＥ断片が存在することを明らかにすることはできなかった。このことは、それらの断片がカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥであることを示唆している。また、抗全長ａｐｏＥおよび抗ｐ−ｔａｕによって、アルツハイマー病脳の沈殿物において大きな複合体（２２０ Ｋｄよりも大きな分子量）が検出されたが、抗カルボキシル末端ａｐｏＥによっては検出されなかった。このことは、これら大きな複合体がカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥとｐ−ｔａｕを含んでいることを示唆している。総合すると、これらの結果は、アルツハイマー病脳において、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥが、正常脳におけるよりもずっと高い程度生成され、それらの大部分が不溶性型で存在し、おそらくｐ−ｔａｕと複合体を形成することを示唆している。
【０２２０】
実施例２：ａｐｏＥ３またはａｐｏＥ４を特にＣＮＳニューロンで発現するトランスジェニックマウスの解析
トランスジェニックマウスの作製
ａｐｏＥ３またはａｐｏＥ４を特に中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロンで発現するトランスジェニックマウスは、以前報告したように（Ｒａｂｅｒ Ｊ． ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ， Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９９８， ９５：１０９１４−１０９１９； Ｍｕｔｔｉｎｉ Ｍ．ら、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １９９９， １９：４８６７−４８８０）、グラッドストーン研究所（Ｇｌａｄｓｔｏｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ）で作製された。ａｐｏＥ導入遺伝子の発現は、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターによって促進した。導入遺伝子の脳内での発現レベルが同程度であるＮＳＥ−ａｐｏＥ３系統およびＮＳＥ−ａｐｏＥ４系統を選抜して、ジャクソン研究所（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（メイン州バーハーバー（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ， ＭＥ））から入手したａｐｏＥ−／−マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ａｐｏＥｔｍｌＵｎｃ）と交配させた。得られた子孫の間で２世代交配させて野生型ａｐｏＥ対立遺伝子を消失させた後、トランスジェニックマウスをさらにａｐｏＥ−／−マウスと交配して、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの遺伝的背景を少なくとも９５％もつＮＳＥ−ａｐｏＥ３マウスおよびＮＳＥ−ａｐｏＥ４マウスを作出した。ＮＳＥ−ａｐｏＥ３またはＮＳＥ−ａｐｏＥ４をジャクソン研究所から入手したＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ａｐｏｅｔｍｌＵｎｃマウスと交配させるとａｐｏＥ−／−同腹子も得られたので、対照として使用した。
【０２２１】
トランスジェニックマウスの遺伝子型判定
ヒトａｐｏＥに対するＤＮＡプローブを用いたゲノムテールＤＮＡをサザンブロット解析法によってＮＳＥ−ａｐｏＥ３またはＮＳＥ−ａｐｏＥ４を遺伝子導入したマウスを同定した。ＮＳＥ−ａｐｏＥ３マウスおよびＮＳＥ−ａｐｏＥ４マウスをＰＣＲによって識別した。ヒトａｐｏＥの第３イントロンはＮＳＥ−ａｐｏＥ４構築物に含まれるが、ＮＳＥ−ａｐｏＥ３構築物には含まれないため、第３イントロンにかかるプライマー（フォワードプライマー：ヌクレオチド番号３１５８〜３１７５；リバースプライマー：ヌクレオチド番号３８１５〜３８３４、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ１００６５）によって生成されるアンプリコンは、ＮＳＥ−ａｐｏＥ４マウスでは６７０塩基対（ｂｐ）、ＮＳＥ−ａｐｏＥ３マウスでは１００ ｂｐであった。プロテイナーゼＫで消化した尻尾の組織（１：１００希釈、２μｌ）に対し、各プライマー（０．２μＭ）、ｄＮＴＰｓ（それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、および０．１５μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ ＧｏｌｄＲ ＤＮＡポリメラーゼ（パーキン・エルマー社製（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、コネティカット州ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ））を用いて全反応用量２５μｌでタッチダウンＰＣＲを行なった。反応は、ジーンアンプＰＣＲ装置９６００サーモサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００ ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）（パーキン・エルマー社製）上で行なった。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物を１．５％アガロースゲル上で解析した。
【０２２２】
ＮＳＥ−ａｐｏＥ４トランスジェニックマウスの脳におけるＣ末端側切断型ａｐｏＥ４の年齢依存的蓄積
メスのＮＳＥ−ａｐｏＥ４マウスだけが、６月齢を過ぎた後神経変性表現型を示すため（Ｒａｂｅｒ Ｊ．ら、（１９９８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１０９１４−１０９１９、Ｍｕｔｔｉｎｉ Ｍ．ら、（１９９９）Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １９：４８６７−４８８０）、本発明者らは、Ｃ末端側切断型ａｐｏＥ４がこれらのマウスに存在しうるか否かを判定した。抗全長ａｐｏＥ免疫ブロットによって、分子量１４〜２０ ｋＤａのＣ末端側切断型ａｐｏＥ断片が７月齢のＮＳＥ−ａｐｏＥ４マウスの脳溶解物で顕著に蓄積するが、同月齢のＮＳＥ−ａｐｏＥ３マウスの脳溶解物には蓄積しないことが明らかになった。ＮＳＥ−ａｐｏＥ４マウスの脳の上清画分と可溶化した沈殿物画分の両方でＣ末端側切断型ａｐｏＥ４断片が年齢に応じて蓄積した。図５に示すように、老齢のＮＳＥ−ａｐｏＥ３マウスの脳ではずっと少ない量のＣ末端側切断型ａｐｏＥ３断片が存在した。これらの結果は、ヒトＡＤ脳におけると同様、ＮＳＥ−ａｐｏＥ４マウスの脳においてもＣ末端側切断型ａｐｏＥ４断片が年齢依存的に直積したことを示していた。
【０２２３】
ＮＳＥ−ａｐｏＥ４トランスジェニックマウスの脳におけるｐ−ｔａｕの年齢依存的蓄積
抗−ｐ−ｔａｕ（ＡＴ８）免疫ブロットによって、９月齢になるまでの年齢では、ＮＳＥ−ａｐｏＥ４マウスの脳溶解物の上清画分と沈殿物画分の両方において可溶性ｐ−ｔａｕ（〜５０〜６０ ｋＤａ）が蓄積するが、ＮＳＥ−ａｐｏＥ３マウスでは蓄積しないことが明らかになった。可溶性ｐ−ｔａｕ（〜５０〜６０ ｋＤａ）の量は、１８月齢のＮＳＥ−ａｐｏＥ４マウス脳溶解物の上清において減少したが、同年齢のＮＳＥ−ａｐｏＥ４マウス脳溶解物の上清においては増加した。しかし、図６に示すように、１８月齢のＮＳＥ−ａｐｏＥ４マウスの脳溶解物の沈殿物において不溶性ｐ−ｔａｕ（＞２００ ｋＤａ）が劇的に蓄積した。不溶性ｐ−ｔａｕ（＞２００ ｋＤａ）は、１８月齢のＮＳＥ−ａｐｏＥ３マウスの脳溶解物の沈殿物においても増加したが、同年齢のＮＳＥ−ａｐｏＥ４マウスと比較するとずっと低い程度までであった。このように、ＮＳＥ−ａｐｏＥ４トランスジェニックマウスの脳において、不溶性ｐ−ｔａｕと可溶性ｐ−ｔａｕがともに年齢依存的に蓄積したが、この結果は、ヒトＡＤ脳で得られた観察結果と同じであった。
【０２２４】
ＮＳＥ−ａｐｏＥ４トランスジェニックマウスの海馬におけるｐ−ｔａｕ（ＡＴ８）陽性細胞内封入体の出現
ＮＦＴにおけるｔａｕのリン酸化したｓｅｒ２０２残基とｓｅｒ２０５残基を認識するモノクローナル抗体ＡＴ８で脳切片を免疫染色したところ、ＮＳＥ−ａｐｏＥ４マウスの海馬におけるＣＡ３領域と歯状回門に神経細胞内封入体が存在することが明らかになった。これらのｐ−ｔａｕ陽性神経細胞内封入体は、Ｃ末端側切断型のａｐｏＥも含んでいた。図７に示すように、ＮＳＥ−ａｐｏＥ３マウスの海馬では、ずっと少ないｐ−ｔａｕ陽性神経細胞内封入体が見られた。したがって、Ｃ末端側切断型のａｐｏＥは、ｔａｕのリン酸化を促進し、ＮＳＥ−ａｐｏＥ４マウスにおいてｐ−ｔａｕ陽性神経細胞内封入体を誘導することができる。
【０２２５】
マウス脳溶解物におけるａｐｏＥ切断酵素の存在
ＮＳＥ−ａｐｏＥ４トランスジェニックマウスの脳にＣ末端側切断型のａｐｏＥ４が蓄積することは、マウス脳の中にａｐｏＥ４を優先的に切断するａｐｏＥ切断酵素が存在することを示唆している。この仮説を調べるために、精製したヒトａｐｏＥ３またはａｐｏＥ４をａｐｏＥノックアウトマウスの脳溶解物と３７℃で３時間インキュベートして、抗ａｐｏＥウエスタンブロットによってａｐｏＥのタンパク質分解を解析した。抗ａｐｏＥは、全長ａｐｏＥ、２８〜３０ ｋＤａのａｐｏＥ断片、および１４〜２０ ｋＤａの断片が存在し、ａｐｏＥ３よりもａｐｏＥ４からずっと多くの断片が生成されることを明らかにした。抗Ｃ末端側ａｐｏＥウエスタンブロットは、これらの断片がＣ末端側切断型ａｐｏＥであることを示した。これらの結果は、ａｐｏＥを切断して、ヒトＡＤ脳およびＮＳＥ−ａｐｏＥ４トランスジェニックマウスにおいてみられる断片と同じＣ末端側切断断片を生成する酵素がマウスの脳に存在することを示唆している。これらの結果は、ａｐｏＥ４がタンパク質分解による切断により感受性が強う遺伝子ことも示唆している。
【０２２６】
実施例３：ａｐｏＥ切断酵素の特徴づけ
ａｐｏＥ切断酵素はセリンプロテアーゼである。
推定ａｐｏＥ切断酵素の生化学的性質を決定するために、本発明者らは、４つの主な分類に属するにプロテアーゼ、すなわちセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼに対するさまざまな既知のインヒビターの効果を調べた。ＥＤＴＡとＥＧＴＡはどちらもａｐｏＥ４の切断を阻害しなかったが、このことは、この酵素がメタロプロテアーゼであることを示唆している。同様に、ペプスタイン（ｐｅｐｓｔａｉｎ）およびインドアセチミド（Ｉｎｄｏａｃｅｔｉｍｉｄｅ）、またはＥ−６４もａｐｏＥ４の切断を阻害しなかった。このことは、この酵素がアスパラギン酸プロテアーゼでもシステインプロテアーゼでもないことを示している。ＰＭＳＦは切断活性を完全に奪うが。このことは、この酵素がセリンプロテアーゼであることを示唆している。この結論と整合して、ＰＭＳＦを含む完全なインヒビターの混合液もａｐｏＥ４の切断を有意に阻害した。
【０２２７】
ａｐｏＥ切断酵素はキモトリプシン様セリンプロテアーゼである。
セリンプロテアーゼは、塩基性残基（すなわちＡｒｇまたはＬｙｓ）のカルボキシル側基で切断するトリプシン様セリンプロテアーゼ、芳香族側鎖（すなわち、ＰｈｅまたはＴｒｐ）のカルボキシル側基で切断するキモトリプシン様セリンプロテアーゼ、より長い側鎖をもつ疎水基（すなわちＭｅｔ）のカルボキシル側基で切断するキモトリプシン様セリンプロテアーゼ、および疎水基（すなわちＡｌａまたはＶａｌ）のカルボキシル側基で切断するエラスターゼ様セリンプロテアーゼという４つのグループに分類することができる。ａｐｏＥ切断酵素の特異性を調べるために、本発明者らは、それぞれ、トリプシン様、キモトリプシン様、およびエラスターゼ様のセリンプロテアーゼの基質となる可能性のある、Ｃ末端にＡｒｇ／Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ／Ａｌａをもつ多数のトリペプチドまたはテトラペプチドを、粗精製したａｐｏＥ切断酵素とインキュベートした。
【０２２８】
切断活性を観察するために、発色団（ｐ−ニトロアニリド（ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ））をＣ末端の最後のカルボキシル測基を付加した。酵素が、最後のアミノ酸とｐ−ニトロアニリドとの間の結合を切断したら、解離したｐ−ニトロアニリドによって黄色を発色し、分光光度計によって約３９０〜４１０ ｎｍのところで観察することができる。図８は、これらのペプチド基質から得られた典型的な結果を示している。
【０２２９】
これらの結果は、推定ａｐｏＥ切断酵素が芳香族側鎖（フェニルアラニン、Ｐｈｅ）のカルボキシル側基、およびより長い側鎖をもつ疎水基（ロイシン、Ｌｅｕ；メチオニン、Ｍｅｔ）のカルボキシル側基で切断するため、この酵素はキモトリプシン様セリンプロテアーゼであることを示している。重要なのは、Ｐ２位にあるプロリンと、Ｐ３およびＰ４位にある２つの疎水性アミノ酸（アラニン、Ａｌａなど）が、切断の効率を決定する上で非常に重要だということである。総合すると、推定ａｐｏＥ切断酵素はキモトリプシン様セリンプロテアーゼで、基質ペプチドまたはタンパク質中にあるＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：１）、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ（配列番号：２）、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（配列番号：３）というモチーフ、またはこれらの類似配列を認識する。Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリドを基質として用いて、ａｐｏＥ切断活性を阻害する薬剤、作用薬、または化合物をスクリーニングするための大量高速処理方として発色アッセイ法を用いることができる。約３９０〜４１０ ｎｍで分光光度測定法によってパラ−ニトロアニリドを検出する。
【０２３０】
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：１）、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：４）、およびＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（配列番号：３）はａｐｏＥ切断酵素のペプチドインヒビターである。
１ ｍＭのＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリドを基質として用いる発色アッセイ法を用いて、本発明者らは、ａｐｏＥ切断酵素の活性を阻害するために多くのペプチドをスクリーニングした。図９に示したように、６ ｍＭのＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：１）、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：４）、およびＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（配列番号：３）というペプチドが、２０時間インキュベートしたところでａｐｏＥ切断酵素の活性を、それぞれ６７％、５８％、および５６％阻害した。興味深いことに、７μＭのａｐｏＥ４がａｐｏＥ切断酵素の活性を８９％阻害した。
【０２３１】
ペプチドＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：１）とＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（配列番号：３）を、さらにａｐｏＥ切断の阻害について試験した。ペプチド（１ ｍＭ）を４μｇのａｐｏＥ４とともに３時間３７℃にて部分的に精製したａｐｏＥ切断酵素の存在下でインキュベートした後、抗ａｐｏＥウェスタンブロットにより、両ペプチドによりａｐｏＥ切断が有意に阻害されることが明らかになった。このように、ペプチドＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：１）とＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（配列番号：３）はともに、ａｐｏＥ切断酵素のペプチドインヒビターとして使用することができる。
【０２３２】
上記実施例から、本発明が、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチド、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥを誘導する宿主細胞、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの形成を抑制する化合物を同定するためにカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥトランスジェニック動物モデルを使用する方法、および、ａｐｏＥの形成を阻害する化合物を提供していることは明らかである。カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥポリペプチドは、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥがｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈ ａｐｏＥと相互作用するのを阻害する化合物を選抜するスクリーニング法に使用するための、ａｐｏＥを含む宿主細胞を作製する上で有用である。カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥがｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈ ａｐｏＥと相互作用するのを阻害する化合物、および、カルボキシル末端側切断型ａｐｏＥの形成を抑制する化合物は、神経原線維変化の形成を抑制し、したがって、アルツハイマー病、およびそれに関連した疾患など、神経原線維変化の形成に関連した疾患を治療するのに有用である。
【０２３３】
本発明を具体的態様を参照しつつ説明したが、当業者は、この発明の真の精神と範囲に反することなく種々に変更を加えたり、同等物と置き換えることができる。さらに、本発明の目的、精神、および範囲に適合するよう、特定の状況、材料、物質組成、方法、または工程に種々の変更を加えることができるものである。そのような変更はすべて、本明細書に添付した請求の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ａｐｏＥを産生するＮｅｕｒｏ−２Ａ細胞における細胞内封入体形成に対するＡβ１−４２の効果を示すグラフである。
【図２】神経原線維変化を含むＧＦＰ−ａｐｏＥ３（Δ２７２−２９９）形質転換細胞およびＧＦＰ−ａｐｏＥ４（Δ２７２−２９９）形質転換細胞の割合を示すグラフである。
【図３Ａ〜Ｃ】ａｐｏＥの構造（図３Ａ）、ｐ−ｔａｕおよびｐ−ＮＦ−Ｈと相互作用するａｐｏＥのアミノ酸を示す結果（図３Ｂ）、および神経原線維変化の形成において、ａｐｏＥのアミノ末端ドメインが果たす役割を示す結果（図３Ｃ）である。
【図４】正常な個体（Ｎ１およびＮ２）とアルツハイマー病の個体（ＡＤ１、ＡＤ２、およびＡＤ３）から得た脳溶解物を抗ａｐｏＥ抗体で免疫沈殿したタンパク質ブロットを示す。
【図５】ＮＳＥ−ａｐｏＥ３マウスおよびＮＳＥ−ａｐｏＥ４マウスの脳におけるカルボキシル末端側切断型ａｐｏＥ３およびａｐｏＥ４を示すグラフである。
【図６】ＮＳＥ−ａｐｏＥマウスの脳におけるｐ−ｔａｕが月齢に依存して蓄積することを示すグラフである。
【図７】ＮＳＥ−ａｐｏＥ４トランスジェニックマウスの海馬においてｐ−ｔａｕ陽性の神経細胞内封入体が発生することを示すグラフである。
【図８】ａｐｏＥのタンパク質切断を触媒する酵素の酵素活性に対するさまざまな作用薬の効果を示すグラフである。
【図９】さまざまなペプチドによってａｐｏＥ切断酵素を阻害した結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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