(57)【要約】本発明は酸化剤とグルタチオン還元酵素を用いるグルタチオンの酵素学的定量法に、試料をＧＳＨトラッピング剤で処理する工程を導入することによる酸化型及び還元型グルタチオン（ＧＳＳＧ・ＧＳＨ）の同時定量方法に関する。酸化型及び還元型グルタチオンの迅速定量方法は、（ｉ）組織試料を採取し、その代謝作用を停止させた組織のホモジネートを調製する工程；（ｉｉ）等容量のＧＳＨトラッピング剤を添加したホモジネート画分及び添加しないホモジネート画分を調製し、リン酸緩衝液、蒸留水及びＮＡＤＰＨ溶液を該各画分に添加する工程；（ｉｉｉ）グルタチオン還元酵素及び酸化剤を該各画分に添加し反応を開始する工程；及び（ｉｖ）ＧＳＨトラッピング剤を添加した画分を含む反応混合物の吸光度を測定して酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を定量し、ＧＳＨトラッピング剤を添加しない画分を含む反応混合物の吸光度を測定して総グルタチオンを定量した後、ＧＳＳＧの量を総グルタチオンの量から差し引いて還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を定量する工程を含む。本発明によれば、酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンの量を同時に正確に測定することができるため、それは細胞内の酸化／還元状態の異常によってもたらされる疾患の診断及び治療に実際に応用することが可能である。
2004518426.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化型及び還元型グルタチオンの迅速定量方法であって、以下の工程：
（ｉ）組織試料を採取し、その代謝作用を停止させた組織のホモジネートを調製する工程；
（ｉｉ）等容量のＧＳＨトラッピング剤を添加したホモジネート画分及び添加しないホモジネート画分を調製し、リン酸緩衝液、蒸留水及びＮＡＤＰＨ溶液を該各画分に添加する工程；
（ｉｉｉ）グルタチオン還元酵素及び酸化剤を該各画分に添加し反応を開始する工程；及び
（ｉｖ）ＧＳＨトラッピング剤を添加した画分を含む反応混合物の吸光度を測定して酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を定量し、ＧＳＨトラッピング剤を添加しない画分を含む反応混合物の吸光度を測定して総グルタチオンを定量した後、ＧＳＳＧの量を総グルタチオンの量から差し引いて還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を定量する工程；
を含む上記方法。
【請求項２】
前記組織試料が動物または植物起源から採取したものである、請求項１に記載の酸化型及び還元型グルタチオンの迅速定量方法。
【請求項３】
前記組織のホモジネートが、代謝作用を停止させるために組織試料を−７０℃の温度で凍結乾燥し、５％ＰＣＡ（過塩素酸）溶液で処理することによって得られたものである、請求項１に記載の酸化型及び還元型グルタチオンの迅速定量方法。
【請求項４】
前記ＧＳＨトラッピング剤がＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）である、請求項１に記載の酸化型及び還元型グルタチオンの迅速定量方法。
【請求項５】
前記ＧＳＨトラッピング剤が２０ないし１００ｍＭの最終濃度になるように前記画分に添加される、請求項１に記載の酸化型及び還元型グルタチオンの迅速定量方法。
【請求項６】
２ないし３倍容量のリン酸緩衝液を最終濃度が５０ないし１５０ｍＭになるように前記画分に添加する、請求項１に記載の酸化型及び還元型グルタチオンの迅速定量方法。
【請求項７】
６ないし７倍容量の蒸留水を前記画分に添加する、請求項１に記載の酸化型及び還元型グルタチオンの迅速定量方法。
【請求項８】
２０ないし３０％（ｖ／ｖ）のＮＡＤＰＨ溶液を最終濃度が０．１ないし０．３ｍＭになるように前記画分に添加する、請求項１に記載の酸化型及び還元型グルタチオンの迅速定量方法。
【請求項９】
１０ないし１５％（ｖ／ｖ）のグルタチオン還元酵素を最終濃度が０．０５ないし０．２Ｕ／ｍｌになるように前記画分に添加する、請求項１に記載の酸化型及び還元型グルタチオンの迅速定量方法。
【請求項１０】
前記酸化剤が５、５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）である、請求項１に記載の酸化型及び還元型グルタチオンの迅速定量方法。
【請求項１１】
１０ないし１５％（ｖ／ｖ）の酸化剤を最終濃度が０．０２ないし０．１ｍＭになるように前記画分に添加する、請求項１に記載の酸化型及び還元型グルタチオンの迅速定量方法。
【請求項１２】
前記吸光度が４０５ｎｍで測定される、請求項１に記載の酸化型及び還元型グルタチオンの迅速定量方法。
【請求項１３】
マルチウェルプレートを用いる酸化型及び還元型グルタチオンの迅速定量方法であって、以下の工程：
（１）リン酸緩衝液、蒸留水、及びＤＡＤＰＨ溶液をマルチウェルプレートの各ウェルに分注する工程；
（２）各ウェルに等容量のＮＥＭ−処理または未処理試料を添加し、続いてグルタチオン還元酵素及びＤＴＮＢを各ウェルに添加して反応を開始させる工程；及び
（３）該ＮＥＭ−処理試料を含む反応混合物の吸光度を測定して酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を定量し、該ＮＥＭ−未処理試料を含む反応混合物の吸光度を測定して総グルタチオンを定量した後、ＧＳＳＧの量を総グルタチオンの量から差し引いて還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を定量する工程；
を含む上記方法。
【請求項１４】
２ないし３倍容量のリン酸緩衝液を最終濃度が５０ないし１５０ｍＭになるように前記試料に添加する、請求項１３に記載のマルチウェルプレートを用いる酸化型及び還元型グルタチオンの迅速定量方法。
【請求項１５】
６ないし７倍容量の蒸留水を前記試料に添加する、請求項１３に記載のマルチウェルプレートを用いる酸化型及び還元型グルタチオンの迅速定量方法。
【請求項１６】
２０ないし３０％（ｖ／ｖ）のＮＡＤＰＨ溶液を最終濃度が０．１ないし０．３ｍＭになるように前記試料に添加する、請求項１３に記載のマルチウェルプレートを用いる酸化型及び還元型グルタチオンの迅速定量方法。
【請求項１７】
ＮＥＭを最終濃度が２０ないし１００ｍＭになるように前記試料に添加する、請求項１３に記載のマルチウェルプレートを用いる酸化型及び還元型グルタチオンの迅速定量方法。
【請求項１８】
１０ないし１５％（ｖ／ｖ）のグルタチオン還元酵素を最終濃度が０．０５ないし０．２Ｕ／ｍｌになるように前記試料に添加する、請求項１３に記載のマルチウェルプレートを用いる酸化型及び還元型グルタチオンの迅速定量方法。
【請求項１９】
１０ないし１５％（ｖ／ｖ）のＤＴＮＢを最終濃度が０．０２ないし０．１ｍＭになるように前記試料に添加する、請求項１３に記載のマルチウェルプレートを用いる酸化型及び還元型グルタチオンの迅速定量方法。
【請求項２０】
前記吸光度が４０５ｎｍで測定される、請求項１３に記載のマルチウェルプレートを用いる酸化型及び還元型グルタチオンの迅速定量方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
（技術分野）
本発明は酸化型及び還元型グルタチオン（γ−グルタミルシステニルグリシンの迅速定量方法に関し、さらに詳しくは酸化剤とグルタチオン還元酵素を用いる従来の酵素学定量法に、ＧＳＨトラッピング剤（ｔｒａｐｐｉｎｇ ａｇｅｎｔ）で試料を処理する工程を導入することによる酸化型及び還元型グルタチオン（ＧＳＳＧ・ＧＳＨ）の同時定量方法に関する。
【０００２】
（背景技術）
グルタチオンは、低分子量のチオール化合物であって、細胞内で主には遊離状態で存在するが、一部はシステインや補酵素Ａと混合−ジスルフィド（ｍｉｘｅｄ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）結合を形成する場合もある。該グルタチオンは、細胞の酸化／還元状態により還元型グルタチオン（ｒｅｄｕｃｅｄ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ、ＧＳＨ）と酸化型グルタチオン（ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅまたはｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ、ＧＳＳＧ）の形態で存在する。細胞内の遊離グルタチオンの大部分は通常は還元型（ＧＳＨ）として存在し、一方、酸化型のレベルは極めて低い。例えば、真核細胞におけるＧＳＨは細胞質内の低分子量チオール化合物全量の８０％以上、ミトコンドリア内の低分子量チオール化合物全量の１０％ないし１５％を占めることが知られている。
【０００３】
通常の生理的条件下で産生される活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）によってグルタチオンの酸化が続くにも関わらず、一定の還元型グルタチオンの生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）グルタチオン分布が細胞内グルタチオン還元酵素とＮＡＤＰＨを用いる細胞の抗酸化防御系によって維持されている。健康な好気性生物の場合、ＲＯＳの効果は細胞の抗酸化防御系によって制御されている、即ち、細胞がＲＯＳによって酸化状態になると、ＲＯＳはＧＳＨをＧＳＳＧに酸化し、それによって細胞内のＧＳＨ量が下がるが、続いて通常の細胞であればＧＳＨ／ＧＳＳＧ比を一定に保つように細胞外へＧＳＳＧを分泌する。しかし、放射線、疾患、又は薬物などの種々要因によって引き起こされるＲＯＳの過剰発生は、酸化的ストレス、ＲＯＳと抗酸化防御系の深刻なアンバランスをもたらし、続いて炎症及び免疫損傷、局所貧血（ｉｓｃｈｅｍｉａ）、薬物−及び毒性−誘導反応（ｄｒｕｇ ａｎｄ ｔｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、及び老化など多くの病的状態をもたらす。従って、細胞内の抗酸化防御系は細胞内の恒常性を維持する重要な制御機構の一つである。
【０００４】
細胞のグルタチオンの状態は細胞の酸化／還元状態を反映するので、酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンの定量は、細胞の酸化／還元状態の指標を提供する。細胞内の酸化／還元状態の指標としてグルタチオンを使用するためには、グルタチオンの全量のみならずＧＳＨ／ＧＳＳＧ比、すなわちグルタチオンの酸化程度も重要であり、よって、ＧＳＨとＧＳＳＧを正確に定量することが必須である。
【０００５】
グルタチオンの定量方法は、クロマトグラフィー法、酵素学的及び化学的方法、即ち、ＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いる方法、酵素活性を定量するのに分光分析機を用いる方法、及びグルタチオンと特異的に反応することが知られているＯ−フタルアルデヒド（ＯＰＴ）を用いる方法に分類される（Ｓｉｅｓ， Ｈ．， Ａｓｓａｙ ｏｆ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ， ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ， ａｎｄ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｍｉｘｅｄ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７７：３７３−３８３，１９８１； Ｔｉｅｔｚｅ， Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｎｏｇｒａｍ ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ ｔｏｔａｌ ａｎｄ ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ： ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｔｉｓｓｕｅｓ， Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７：５０２−５２２， １９６９； Ｍｏｋｒａｓｃｈ， ｌ．Ｃ．ａｎｄ Ｔｅｓｃｈｉｋｅ， Ｅ．Ｊ．， Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｒｏｄｅｎｔ ｂｒａｉｎ ｒｅｇｉｏｎｓ： Ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ， Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １４０：５０６−５０９，１９８４を参照）。
【０００６】
ＨＰＬＣを用いるクロマトグラフィー法は、グルタチオン−含有試料を吸光材料又は蛍光材料で処理し、続いてＨＰＬＣによって分離した材料の吸光度または蛍光を測定することによる定量方法であって、１０−９ｍｏｌ程度のわずかな量のグルタチオンも検出できるが、１回のＨＰＬＣ分析に３０分以上かかり、一つの試料中のＧＳＨとＧＳＳＨを別々に測定するためには２回のＨＰＬＣ分析にかけなければならず、従って、大量の試料の分析には非常に時間がかかって不適切である。
【０００７】
また他の定量方法である酵素学的方法には、ＤＴＮＢ（５、５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）などの酸化剤とグルタチオン還元酵素を使用する方法、ＧＳＨとメチルグリオキサール間のグリオキサラーゼＩ−触媒反応（ｇｌｙｏｘａｌａｓｅ Ｉ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって産生されるラクトイルグルタチオン（ｌａｃｔｏｙｌｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）を定量するグリオキサラーゼ法、クロロジニトロベンゼン（ｃｈｌｏｒｏｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅ）とＧＳＨ混合物を産生するＧＳＨトランスフェラーゼを用いる方法などが含まれる。このような酵素学的方法は、試料分析の迅速性（２，３分内）という利便性を有している。しかしながら、それらは試料の取り扱いが非常にむずかしく、場合よっては幾つかの反応工程のために多くの試薬を調製することに労を要したり、試料を分析する毎に各種の試薬を定量に用いる直前に混合しなければならなかったり、温度や他の環境条件に影響を受けやすい酵素及び試薬は一定の間隔で新たに調製しなければならかったりするという意味で、満足のいくものではないことがわかってきた。
【０００８】
もう一つ、比較的簡単なグルタチオン分析法として蛍光定量法があるが、この方法は他の硫黄化合物の不存在下でＧＳＨ又はＧＳＳＨと蛍光複合体を形成するＯＰＴの性質を用いる方法である。ＯＰＴを用いる蛍光定量法は大量の試料を分析するために簡単かつ有効な方法であるが、他の細胞内硫黄化合物とアミノ酸によるＧＳＨ又はＧＳＳＧとのＯＰＴ反応の阻害によって引き起こされる低特異性が現われ、またＯＰＴを用いるＮＥＭ（Ｎ−エチルマレイミド）−処理試料中のＧＳＳＧの測定は高ｐＨ条件下で行われるので組織試料には不適切である。前記方法をマルチウェルプレートに用いる最近の方法もまた適切ではない。
【０００９】
かかる状況下、試料中のＧＳＨ及びＧＳＳＧを簡単かつ正確のやり方で同時に定量するための方法を探索し開発するための強い動機がある。
【００１０】
（発明の開示）
本発明者らは細胞内のＧＳＨ及びＧＳＳＧを定量するための簡単かつ正確な方法を開発するために鋭意研究を行ったところ、試料をＧＳＨトラッピング剤で処理する工程を酸化剤及びグルタチオン還元酵素を用いる従来のグルタチオンの酵素学的定量法に導入することによって、ＧＳＨとＧＳＳＧを簡単かつ正確なやり方で同時に定量できることを発見し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
従って、本発明の主たる目的は、酸化剤、グルタチオン還元酵素及びＧＳＨトラッピング剤を用いた酸化型及び還元型グルタチオンの同時定量方法を提供することにある。
【００１２】
本発明の上記及び他の目的及び特徴は添付する図面と併せて与えられる以下の説明からより明確になる。
【００１３】
（発明の実施形態）
本発明の酸化型及び還元型グルタチオンの迅速定量方法は、以下の工程：組織試料を採取し、その代謝作用を停止させた該組織のホモジネートを調製する工程；等容量のＧＳＨトラッピング剤を添加したホモジネート画分及び添加しないホモジネート画分を調製し、リン酸緩衝液、蒸留水及びＮＡＤＰＨ溶液を該各画分に添加する工程；グルタチオン還元酵素及び酸化剤を該各画分に添加し反応を開始する工程；及びＧＳＨトラッピング剤を添加した画分を含む反応混合物の吸光度を測定して酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を定量し、ＧＳＨトラッピング剤を添加しない画分を含む反応混合物の吸光度を測定して総グルタチオンを定量した後、ＧＳＳＧの量を総グルタチオンの量から差し引いて還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を定量する工程を含む。
【００１４】
細胞内グルタチオンの定量方法をさらに以下の工程によって説明する。
工程１：試料の調製
組織試料を調製し、その代謝作用を停止させた該組織のホモジネートを与える：該組織試料は動物又は植物源から採取し、−７０℃の温度で凍結乾燥し、５％ＰＣＡ（過塩素酸）溶液下で処理してその代謝作用を停止させた組織のホモジネートを与える。
【００１５】
工程２：ＧＳＨの不活性化
等容量のＧＳＨトラッピング剤を添加したホモジネート画分及び添加しないホモジネート画分を調製し、リン酸緩衝液、蒸留水及びＮＡＤＰＨ溶液を該各画分に添加する：Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）がＧＳＨトラッピング剤として使用することが好ましく、それは該画分に最終濃度が２０ないし１００ｍＭとなるように添加することが好ましく、２ないし３倍容量のリン酸緩衝液を最終濃度が５０から１５０ｍＭになるように該画分に添加することが好ましく、６ないし７倍容量の蒸留水を該画分に添加することが好ましく、２０から３０％（ｖ／ｖ）のＮＡＤＰＨ溶液を最終濃度が０．１から０．３ｍＭの濃度になるように該画分に添加することが好ましい。
【００１６】
工程３：反応
反応は各画分にグルタチオン還元酵素及び酸化酵素を添加することによって開始する：１０ないし１５％（ｖ／ｖ）のグルタチオン還元酵素を最終濃度が０．０５ないし０．２Ｕ／ｍｌになるよう該画分に添加することが好ましく、酸化剤として５、５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）を使用することが好ましく、１０ないし１５％（ｖ／ｖ）の酸化剤を最終濃度が０．０２ないし０．１ｍＭになるように該画分に添加することが好ましい。
【００１７】
工程４：吸光度測定
酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）及び総グルタチオンを、ＧＳＨトラッピング剤を添加した画分及び添加しない画分を含む反応混合物の吸光度を測定することによってそれぞれ定量した後、ＧＳＳＧの量を総グルタチオンの量から差し引いて還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の量を測定する：この際吸光度は４０５ｎｍで測定することが好ましい。
【００１８】
組織や細胞中のグルタチオンはグルタチオンの抽出過程において細胞内のグルタチオン代謝−関連酵素の影響を受けやすいので、本発明の方法を用いて酸化型および還元型グルタチオンの定量を行うに際し、その分析結果が組織試料自体の状態を反映しない可能性があることに気をつけなければならない。本発明の方法にあるもうひとつの問題は試料中に存在する酸素及び金属イオンが還元型グルタチオン（ＧＳＨ）のスルフィドリル基と反応し、グルタチオン定量のために試料を処理する工程中に酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）が産生されることである。そのような場合、総グルタチオンの量は同じままであるが、組織中に存在する量よりも低いＧＳＨ値及び高いＧＳＳＨ値になることが予想される。かかる問題は細胞内のＧＳＨ及びＧＳＳＨを正確に測定するために克服しなければならない。このために、本発明者らは組織試料中のＧＳＨ及びＧＳＳＧの量を正確に測定するために動物から採取した組織試料のグルタチオンプールにおける変化を阻止するための戦略を用いた。すなわち、組織試料中のグルタチオンの酸化／還元比は組織試料を動物から採取した後グルタチオン還元酵素及びＮＡＤＰＨのような代謝関連酵素によって変化するので、本発明では、代謝によるグルタチオンの酸化／還元比のそのような変化を採取した組織試料を直ちに凍結−固定化することによって阻止した。組織試料を固定化し、液体窒素を用いて凍結させ、使用するまで−７０℃で保存した。本発明によれば、採取した組織試料の代謝を阻止するためのもう一つの戦略は代謝−関連酵素をタンパク質変性剤である、５％（ｖ／ｖ）ＰＣＡ溶液の存在下で凍結した組織試料をホモジナイズすることによって変性することである。
【００１９】
ＧＳＳＧの定量方法は、試料中のＧＳＨの前−除去が必要である。また、細胞内の酸化型グルタチオンを正確に定量するために、試料を動物から採取した後、ＧＳＨからＧＳＳＧへの人工的酸化を避けなければならず、ＧＳＨの酸化防止はＧＳＨのスルフィドリル基のマスキングによって達成することができる。この目的のために、本発明者らは、スルフィドリル基間のジスルフィド結合の形成をグルタチオンのスルフィドリル基との共有結合によって阻害するＮＥＭのようなＧＳＨトラッピング剤を用いることによって試料中のＧＳＨをマスキングするという戦略を用いた。中性ｐＨにおけるＮＥＭの反応速度は１分に満たないほど速く、その使用を非常は効率的である。ＮＥＭはまたグルタチオン還元酵素の活性を阻害するので、残存ＮＥＭをＧＳＨの完全なマスキングの後除去しなければならず、よって本発明ではＮＥＭを含む反応混合物を等容量のエーテルで抽出して残存ＮＥＭを除去してからＧＳＳＧ定量に使用する。
【００２０】
ＧＳＨの量をＧＳＨ及びＤＴＮＢ間の反応に起因するＤＴＮＢからＴＮＢへの連続還元率によって測定し、そして試料中に含まれるか又はＧＳＨとＤＴＮＢ間の反応によって生成されるＧＳＳＧはグルタチオン還元酵素及びＮＡＤＰＨの反応によってＧＤＨに還元される。よって、総グルタチオン、即ちＧＳＨとＧＳＳＧの量の合計はＴＮＢへの還元率の合計によって表される。ＴＮＢへの還元率は正確に総グルタチオンの量に比例しており、４０５ｎｍにおける吸光度を測定することによって定量する。
【００２１】
ＮＥＭ−未処理試料からグルタチオンの全量が直線的増加の範囲間の吸光度プロットの傾きを測定することによって定量されるが、それは試料中のＧＳＨ及びＧＳＳＧに変換されたＧＳＨ量を表し、そしてＮＥＭ−処理試料から酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を吸光度を測定することによって定量する。
【００２２】
一方、酸化型及び還元型グルタチオンに対する標準曲線を一定量の酸化型及び還元型グルタチオンの吸光度をそれぞれ測定することによって作成した後、総グルタチオン及びＧＳＳＧの吸光度を標準曲線の吸光度と比較することによってＧＳＳＧの量を定量し、試料中のタンパク含量を分析後、ｎｍｏｌグルタチオン／ｍｇタンパク質に換算する。
【００２３】
さらに、酸化型及び還元型グルタチオンに対して大量の試料を分析するためにマルチウェルプレートを用いることもできる。すなわち、大量のサンプルの酸化型及び還元型グルタチオンの定量を以下の工程によって同時に行うことができる：リン酸緩衝液、蒸留水、及びＤＡＤＰＨ溶液をマルチウェルプレートの各ウェルに分注する工程；各ウェルに等容量のＮＥＭ−処理または未処理試料を添加し、続いてグルタチオン還元酵素及びＤＴＮＢを各ウェルに添加して反応を開始させる工程；及び該ＮＥＭ処理試料を含む反応混合物の吸光度を測定して酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を定量し、該ＮＥＭ−未処理試料を含む反応混合物の吸光度を測定して総グルタチオンを定量した後、ＧＳＳＧの量を総グルタチオンの量から差し引いて還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を量を測定する工程：ここで、各工程の条件は上記のグルタチオンの定量方法のそれと同一である。
【００２４】
本発明をさらに以下の実施例において説明するが、これらは本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。
【００２５】
実施例１：グルタチオン定量のための組織試料の採取及びＮＥＭ処理
マウス（Ｃ３Ｈ、Ｃ５７Ｂ／Ｌ）またはＳＤラットから採取した組織の代謝作用を停止させるため、該組織を凍結−固定化させ、−７０℃にて保存した。凍結−固定化した組織の約２０ｍｇをガラスホモジナイザー（ｇｌａｓｓ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）によって５％（ｖ／ｖ）ＰＣＡ（過酢酸）溶液５００μｌにてホモジナイズした。
【００２６】
ＧＳＳＧの正確な測定のために、本発明ではＮＥＭをＧＳＨトラッピング剤として用いた。ＮＥＭ溶液は室温で非常に不安定であるため使用直前に調製し、氷上で保つが、一方、低いｐＨ条件下で比較的安定であるため、５％（ｖ／ｖ）ＰＣＡに２５０ｍＭ濃度になるよう調製した。上記で調製した組織のＰＣＡホモジネートを６０μｌと４００μｌに分け、２５０ｍＭ ＮＥＭ１００μｌをＰＣＡホモジネートのアリコート４００μｌの方にＮＥＭの最終濃度が２５０ｍＭになるよう添加し、それを２Ｍ ＫＨＣＯ３溶液２１０μｌの添加によって直ちに中和化し、室温で３０分間インキュベートした。ＮＥＭ反応の完了がＧＳＨとＧＳＳＧの首尾よい定量のために重要であるので、ＮＥＭで処理した試料及びＮＥＭで処理していない試料をＮＨ２カラムを用いるＨＰＬＣによってＧＳＨ及びＧＳＳＧそれぞれに対して分析した（図１ａ及び図１ｂ）。図１ａは、ＮＥＭで処理していない試料から得たＧＳＳＧ及びＧＳＨのクロマトグラムであり、図１ｂは、ＮＥＭで処理した試料から得たＧＳＳＧ及びＧＳＨのクロマトグラムである。図１ａ及び図１ｂに示されるように、ＧＳＨはＮＥＭ−処理画分では全く検出されず、このことは反応が完了したことを示す。
【００２７】
上記で調製したＮＥＭ−処理及びＮＥＭ−未処理画分をそれぞれ遠心分離し、上澄み液を得た後、ＮＥＭ−未処理試料の上澄み液を１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で５ないし１０倍に希釈し、総グルタチオンの定量のための試料を調製し、そしてＮＥＭ−処理試料の上澄み液を未反応の残存ＮＥＭを除去するための前処理、すなわち等容量のエーテルによる１０回の抽出とそれに続く真空ポンプを用いて乾燥させることによるエーテルの除去操作に供し、ＧＳＳＧの定量のための試料を調製した。また、組織のＮＥＭ−未処理ホモジネートの遠心分離によって得られたタンパク質沈殿物を１Ｎ  ＮａＯＨ１００μｌに溶解し、１０倍に希釈し、その後ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法によるタンパク質の測定に供した。タンパク質標準曲線を表１に示す濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いてブラッドフォード法によって作成した（図３ａ参照）。図３ａは、ブラッドフォード法によって作成したタンパク質の標準曲線である。
【００２８】
【表１】
2004518426.tif 000003
【００２９】
実施例２：マルチウェルプレートを用いたグルタチオンの定量
本発明に従い、組織のグルタチオン量を大量の試料を定量するためのマルチウェルプレートを用いることによって以下のように測定した： まず、５×リン酸緩衝液（５ｍＭ ＥＤＴＡを含む５００ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ７．０）５０μｌ、蒸留水 １２５μｌ、及び１０ｍＭ ＮＡＤＰＨ５μｌの混合物を各ウェルに分注した。次いで、ＮＥＭ−処理試料及びＮＥＭ−未処理試料をそれぞれ２０μｌずつ別々のウェルに添加し、グルタチオンの標準曲線作成のために、１ｍＭ ＧＳＨ（還元型）及び１ｍＭ ＧＳＳＧ（酸化型）を適当に希釈し、そして各々の希釈液２０μｌを別々のウェルに添加した。その後、反応をグルタチオン還元酵素（１．２Ｕ／ｍｌ）２５μｌとＤＴＮＢ（０．６ｍＭ）２５μｌの混合物を添加することによって開始させるが、ここでグルタチオン還元酵素は６ｕｎｉｔｓ／ｍｌの濃度になるようにリン酸緩衝液に溶解し、反応混合物に添加する直前に同じリン酸緩衝液で再び５倍に希釈し、そしてＧＳＨの酸化剤として用いるＤＴＮＢ（５０×）は０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＨＣＯ３溶液に３ｍＭ濃度になるよう溶解し、使用直前に蒸留水で５倍に希釈した。続いて、反応速度論的定量ソフトウェアを具備したマイクロプレートリーダーを用いて吸光度を５分にわたって４０５ｎｍで測定し、吸光度プロットの傾きを直線の範囲で決定した。次いで、グルタチオンの標準曲線を吸光度プロットの傾きの変化から作成した。組織試料の吸光度プロットの傾きの測定値を総グルタチオン又はＧＳＳＧ（ｎｍｏｌ／ｍｌ試料）の量に換算し、それを実施例１のタンパク質濃度の測定に基づいて再びｎｍｏｌグルタチオン／ｍｇタンパク質に換算した（図３参照）。図３は、ＤＴＮＢ及びグルタチオン還元酵素で処理した試料中に生成したＴＮＢの吸光度の一定時間における測定値を示すグラフである。図２に示されるように、吸光度は２ないし３分にわたって直線的に増加し、これは反応条件が適切に最適化されたことを示している。
【００３０】
実施例２−１： 標準曲線の作成
グルタチオン標準曲線を実施例２で調製したグルタチオンの標準溶液の吸光度を測定することによって作成した（参照：表２及び表３、図３ｂ及び図３ｃ参照）。
【００３１】
【表２】
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【００３２】
【表３】
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【００３３】
上記表２及び表３はそれぞれＧＳＨ及びＧＳＳＨの濃度及び対応する標準曲線の傾きをそれぞれ示す。そして図３ａ及び図３ｂはそれぞれＧＳＨの標準曲線及びＧＳＳＧの標準曲線を示す。図３ａにおいて直線的増加の範囲間の吸光度プロットの傾きは３．１８７１と決定され、図３ｂにおいて吸光度プロットの傾きは５．１７９４と決定された。
【００３４】
実施例３：組織試料中のグルタチオンの定量
Ｃ３Ｈマウスから採取した肝組織２０ｍｇを５％（ｖ／ｖ）ＰＣＡ溶液５００μｌにてホモジナイズし、そのホモジネートを実施例１ないし実施例２に記載したように定量反応に供し、直線的増加の範囲間にある吸光度プロットの傾きを決定するために吸光度を測定し、組織試料中の総グルタチオンとＧＳＳＧを実施例２−１で作成した標準曲線から定量した。直線的増加の範囲間にある２０倍希釈した組織試料中の総グルタチオンの吸光度変化は７４．４９と測定され、これは図３ｂの標準曲線を用いて４６７．４５ｎｍｏｌｅ総グルタチオン／ｍｌ試料と換算された。ＧＳＳＧの吸光度変化は２８．４９と測定され、これは図３ｃの標準曲線を用いて９．６３ｎｍｏｌｅＧＳＳＧ／ｍｌ試料と換算された。
【００３５】
実施例４：グルタチオン濃度のグルタチオン量への換算
実施例３で測定した総グルタチオン濃度及びＧＳＳＧ濃度（ｎｍｏｌｅ／ｍｌ試料）をタンパク質１ｍｇ当たりのグルタチオン（ｎｍｏｌ）の量に換算した。ペレット化したタンパク質をＮＥＭ−未処理ホモジネートの遠心分離後に測定した実施例２と同様の手法でタンパク質量をブラッドフォード法と標準曲線によって測定した。タンパク質濃度は１３．８８ｍｇ／ｍｌと測定された、その結果、総グルタチオン濃度値（４６７．４５ｎｍｏｌ／ｍｌ）とＧＳＳＧ濃度値（９．６３ｎｍｏｌ／ｍｌ）はそれぞれ３３．６３ｎｍｏｌ／ｍｇ及び０．６９ｎｍｏｌ／ｍｇに換算された。従って、組織試料中の特異的ＧＳＨ量は３２．９９ｎｍｏｌ／ｍｇであることがわかった。
【００３６】
実施例５：グルタチオン定量方法の検証
組織試料中のグルタチオン定量のための本発明方法の可能性を調べるために、試料の量を増加させながら総グルタチオンとＧＳＳＧを定量した。すなわち、０、１０、２０、３０、４０または５０μｌの試料を添加することを除けば、実施例２と同様な方法で総グルタチオン量とＧＳＳＧ量を測定した（図４ａ及び図４ｂ参照）。図４ａは組織試料の量を増加させながら測定した総グルタチオン量を表す吸光度プロットの傾きの変化を示すグラフである。図４ａ及び図４ｂに示されるように、測定されたグルタチオン量は標準曲線の有効範囲内では試料の増加に伴って増加した。一方、測定されたＧＳＳＧ量は３０ないし４０μｌまでは試料の増加に伴って増加したが、その増加の程度は４０μｌ以上では試料の増加とともに減少した。この結果は、エーテル抽出によって完全に除去されなかったＮＥＭ−処理試料に含まれる残存ＮＥＭ増加量によるグルタチオン還元酵素の阻害によってもたらされると考えられ、よって、定量反応に用いる試料の適切な量は望ましくは２０μｌであることがわかった。上記の結果に基づき、試料２０μｌ中の総グルタチオンとＧＳＳＧの量を測定し、タンパク質の単位重量あたりのグルタチオン量、ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質にも換算することができる。グルタチオン定量のための本発明方法の検出限界は０ないし０．４ｎＭ／試料であり、本発明方法がＨＰＬＣ分析法と同じくらい感度がよいことを示す。
【００３７】
以上に明確に説明及び証明したように、本発明は、試料をＧＳＨトラッピング剤で処理する工程を酸化剤及びグルタチオン還元酵素を用いる従来のグルタチオンの酵素学的定量法に導入することによる、酸化型及び還元型グルタチオンの同時定量方法を提供する。酸化型及び還元型グルタチオンの迅速定量のための本発明の方法は、以下の工程：組織試料を採取し、その代謝作用を停止させた組織のホモジネートを調製する工程；等容量のＧＳＨトラッピング剤を添加したホモジネート画分及び添加しないホモジネート画分を調製し、リン酸緩衝液、蒸留水及びＮＡＤＰＨ溶液を該各画分に添加する工程；グルタチオン還元酵素及び酸化剤を該各画分に添加し反応を開始する工程；及びＧＳＨトラッピング剤を添加した画分を含む反応混合物の吸光度を測定して酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を定量し、ＧＳＨトラッピング剤を添加しない画分を含む反応混合物の吸光度を測定して総グルタチオンを定量した後、ＧＳＳＧの量を総グルタチオンの量から差し引いて還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の量を測定する工程を含む。本発明によれば、酸化型及び還元型グルタチオンの量を簡単かつ正確なやり方で同時に測定でき、それは細胞内の酸化／還元状態の異常によってもたらされる疾患の診断及び治療に実際に応用することが可能である。
【００３８】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１ａはＮＥＭで処理していない試料から得た酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）と還元型グルタチオン（ＧＳＨ）のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２】図１ｂはＮＥＭで処理した試料から得たＧＳＳＧとＧＳＨのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３】図２はＤＴＮＢ及びグルタチオン還元酵素で処理した試料中で産生されたＴＮＢの一定時間の吸光度測定値を示すグラフである。
【図４】図３ａはブラッドフォード法によって作成したタンパク質の標準曲線である。
【図５】図３ｂは吸光度プロットの傾きの変化を示すＧＳＨ標準曲線である。
【図６】図３ｃは吸光度プロットの傾きの変化を示すＧＳＳＧ標準曲線である。
【図７】図４ａは組織試料の量を増加させながら測定した総グルタチオンの量を表す吸光度プロットの傾きの変化を示すグラフである。
【図８】図４ｂは組織試料の量を増加させながら測定したＧＳＳＧの量を表す吸光度プロットの傾きの変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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