(57)【要約】間歇的に付与した静水圧によって軟骨及びコラーゲンを生体内、生体外及び試験管内で再生し、関節の軟骨及びコラーゲンを生体内、生体外及び試験管内で再生する方法。外部からの間隔をあけた負荷を付与する場合、静水圧を繰り返し付与し、静水圧付与後で静水圧付与の間に回復期を置く工程からなる。生理学的レベルの５−１０ＭＰａで４期間の期間で間歇的に静水圧を付与し、その後約２０時間までの回復期間を置く。該静水圧は、試験管内で軟骨細胞に、生体外及び生体内で軟骨の外植片に、及び可動関節の関節の空隙内に残っている無傷の軟骨に付与する。間をあけて負荷を付与することによって，炎症のある細胞を関節の空隙に集めるマトリックスを変性する酵素、前炎症性サイトキニン及びケモカインを選択的に阻止できる。また、タイプＩＩコラーゲンの発現を阻止する成長因子の遺伝子発現を選択的に低減する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
変質した、あるいは罹患したあるいは損傷した関節の軟骨を生体内、生体外および試験管内で修復及び再生あるいは軟骨、コラーゲン、索靭帯、腱あるいは骨を新たに生成する方法であって、該方法は、変質した、あるいは罹患したあるいは損傷した関節の軟骨、軟骨移植片（ｇｒａｆｔ）あるいは軟骨細胞あるいは他の間葉細胞由来の（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｌｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ）細胞に対して約２〜約８時間毎日断続的に約０．５から約３０ＭＰａの静水圧（ＩＨＰ）をかけ、その後約４日間〜約１００日間あるいは必要に応じて約１６時間〜約２２時間の回復期を置く、方法。
【請求項２】
前記圧力を約０．１〜１０Ｈｚの周波数で付与する、請求項１の方法。
【請求項３】
前記新規な形成方法が、間葉細胞あるいは間葉細胞由来の細胞の懸濁液を有するマトリックスに対して前記静水圧を付与する、請求項２の方法。
【請求項４】
前記圧力が約１ＭＰａから約１０ＭＰａの間であり、該圧力を約４時間断続的に付与し、回復期間を約２０時間とする、請求項２の方法。
【請求項５】
前記圧力が約５ＭＰａ〜１０ＭＰａの間である、請求項４の方法。
【請求項６】
前記圧力を付与するために外部装置を用いて、前記軟骨に対してその場でＩＨＰを付与する、請求項５の方法。
【請求項７】
前記軟骨に対して生体外でＩＨＰを付与し、再生後に、処置した関節に戻す、請求項５の方法。
【請求項８】
軟骨細胞をＩＨＰに曝すことによって、前記軟骨を試験管内で再生する、請求項５の方法。
【請求項９】
悪化した、あるいは罹患したあるいは損傷した関節の機能を回復させる方法であって、該方法は以下の工程からなる方法。
（ａ）該関節から取り出した悪化した、あるいは罹患したあるいは損傷した軟骨あるいは軟骨移植片（ｇｒａｆｔ）、あるいは軟骨細胞に対して約１〜約８時間毎日断続的に約０．５から約３０ＭＰａの静水圧（ＩＨＰ）をかけ、
（ｂ）約１６〜２２時間回復期としてＩＨＰを除去し、そして
（ｃ）約４日〜約１００日の期間あるいは必要応じて工程（ａ）と（ｂ）とを繰り返す。
【請求項１０】
前記圧力を約０．１〜１０Ｈｚの周波数で付与する、請求項１の方法。
【請求項１１】
前記関節に再生した軟骨細胞を含むマトリックスを移植して前記関節の機能を回復する、請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記圧力は約１〜約１０ＭＰａで、約４時間断続的に付与し、前記回復期が約２０時間である、請求項１１の方法。
【請求項１３】
前記圧力が５ＭＰａ〜１０ＭＰａの間である、請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記圧力を付与するために外部装置を用いて、前記軟骨に対してその場で断続的に静水圧（ＩＨＰ）を付与する、請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記軟骨に対して、生体外でＩＨＰを付与して再生し、処置した関節に戻す、請求項１４の方法。
【請求項１６】
軟骨細胞に対して静水圧を付与して、前記軟骨を試験管内で再生する、請求項１５の方法。
【請求項１７】
罹患が、変形性関節症及び骨関節症である、請求項１の方法。
【請求項１８】
悪化が、変形性関節疾患である、請求項１の方法。
【請求項１９】
罹患が、コラーゲン不全症である、請求項の１の方法。
【請求項２０】
関節の損傷が、負荷による軟骨あるいは損傷した軟骨である、請求項１の方法。（ｔｈｅ ｊｏｉｎｔ ｉｎｊｕｒｙ ｉｓ ｌｏａｄｅｄ ｏｒ ｄａｍａｇｅｄ ｃａｒｔｒｉｌａｇｅ）。
【請求項２１】
変質した、あるいは罹患したあるいは損傷した関節の軟骨、軟骨移植片（ｇｒａｆｔ）あるいは軟骨細胞あるいは他の間葉細胞由来の（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｌｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ）細胞に対して約２〜約８時間毎日断続的に約０．５から約３０ＭＰａの静水圧（ＩＨＰ）をかけ、その後約４日間〜約１００日間あるいは必要に応じて約１６時間〜約２３時間の回復期を置くことによって、軟骨の機械的及びバイオケミカル的機能性を再生した軟骨。
【請求項２２】
前記圧力を約１Ｈｚの周波数で付与する、請求項２１の軟骨。
【請求項２３】
前記圧力を約４時間断続的に付与し、回復期間を約２０時間とする、請求項２２の軟骨。
【請求項２４】
前記圧力が約０．１ＭＰａ〜１０ＭＰａの間である、請求項２３の軟骨。
【請求項２５】
前記圧力が約５ＭＰａ〜１０ＭＰａの間である、請求項２４のの軟骨。
【請求項２６】
前記圧力を付与するために外部装置を用いて、前記軟骨に対してその場でＩＨＰを付与する、請求項２５の軟骨。
【請求項２７】
前記軟骨に対して生体外でＩＨＰを付与し、処置した関節に戻す、請求項２５の軟骨。
【請求項２８】
軟骨細胞に対してＩＨＰを付与して試験管内で軟骨を再生した、請求項２５の軟骨。
【請求項２９】
コラーゲンのｍＲＮＡ、ｍＲＮＡのアグレカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）、ＴＧＦ，ＭＭＰ−１，ＭＭＰ−２あるいはＩＬ−６の発現レベルを決定することによって、ＩＨＰ処置後の軟骨の機能性あるいは損傷の程度あるいはコラーゲンの機能性あるいは損傷の程度を決定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、疾患のあるあるいは正常な間葉細胞あるいは間葉細胞由来の細胞、軟骨、コラーゲン及び骨の生体内、生体外および試験管内での修復、再生、新規な形成及び再形成する方法に関する。特に、本発明は、断続的に静水圧を付与することによって、生体内、生体外および試験管内での関節における軟骨及びコラーゲンの修復及び再生並びに骨再形成方法に関する。本方法は、静水圧付与期間を繰り返し、静水圧付与後回復期間を置きかつ回復期間によって間をあけることから成る外部からの間隔をあけて負荷を付与することからなる。具体的には、本方法は１−８時間に渡って０．５−３０ＭＰａのレベルで断続的に静水圧を付与し、静水圧付与後に約１６−２３時間までの回復期を置く工程を含み、該圧力は試験管内の軟骨及び骨細胞に対して、生体外及び生体内の軟骨の該植片及び骨移植片に対して、可動関節の関節空間内に無傷のままの軟骨に対して、あるいは生体内で骨に対して付与する。間を空けて負荷をかけることによって、軟骨及び骨の特有な表現型性質を与えるたんぱく質の発現を増加させ、炎症細胞を関節の空隙に引き寄せるマトリックス退化酵素、前炎症細胞サイトキニン及びケモカインを選択的に抑制し、細胞外マトリックス修復及び再生を阻止する成長因子の遺伝子発現を選択的に減少させることになる。
【０００２】
本発明は、また、関節の軟骨及びコラーゲンの再生、回復及び移植の治療方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
関節炎疾患、特に変形性関節症は、他のどの病気よりもより多くの人を悩ませている。変形性関節症は、多くの関節でスローではあるが進行性の劣化を示す軟骨機能の喪失を含む。変形性関節症は非炎症性疾患であると考えられているが、ある程度の炎症が生ずる。変形性関節症は、慢性の炎症性関節疾患であるリュウマチ様関節炎と区別されている。
【０００４】
変形性関節炎は、中年後半世代の大部分の人を悩ませている。変形性関節症関連症状は、個人の生産性及び人生の質を低減し、高齢化社会においては、例えば、骨粗鬆症等の他の慢性症状の発生を増加させることにより男女の疾病率および死亡率を高める。現在のところ、最終段階の関節疾患に対しての唯一成功している処置では、全体的に関節を取り替えることを含めた大きな外科手術が必要となるが、このような全体的に関節を取り替えることは感染、無菌弛緩及び苦痛等の複合した合併症なしに行なえない。これらの合併症は、矯正のための関節形成が必要となる可能性がある。関節を取り替える必要性をなくした新規な外科技法によって早期の初めの変形性関節症を除去することが現在まさに実験段階にある。
【０００５】
関節内での外科技法が現在開発されつつあるが、このような技法は、関節の機能を回復させるために、健康な関節領域から疾患表面に軟骨細胞を移送することを含む。この場合、開口する外科的手順を用いて、軟骨細胞あるいは軟骨の小領域を関節表面の欠陥の厚さの一部あるいは全厚さに配置する。そして、適所に縫合した骨膜組織によって細胞構築物を適所に保持する。しかしながら、通常の重量を支える際に細胞の移植あるいは自己のあるいは同種移植の軟骨で表面を覆いなおすことになる。多くの場合、これらの移植片は早急にフィブリル化し劣化する。他の方法において、モザイク成形法では、関節表面の一領域から他の表面に軟骨の複数の小移植片を移動させ、重量に耐える元の状態にもどるのを助ける。軟骨を交換するいずれのタイプのものでも、使用する前に正常な軟骨の余剰の細胞マトリックス構造が再生された後に、修復の効果が非常に高まるであろう。
【０００６】
したがって、変形性関節症や他の関節再生疾患によりかかりやすいより高齢化世代にとっては、軟骨、コラーゲン及び骨の疾患は、主要な医療問題を提起するものであり、関節の軟骨及びコラーゲンの再生及び骨の再形成をする手段を利用できるようにすることは重要であろう。
【０００７】
関節の軟骨は長尺の骨の端部を覆っており、力を関節表面に渡って分配することによってより剛性の高い下に位置する骨を保護する負荷負担組織である。また、該軟骨によって日々の生活での通常の活動の際に関節がスムーズに関節運動し折曲がることが可能とする。
【０００８】
関節の軟骨を再生する試みも継続的に行なわれている。例えば、特許文献１は、多孔質コラーゲンのスポンジとコラーゲン膜とを組み合わせて形成したコラーゲンテンプレートを記載している。特許文献２は、関節の軟骨の欠陥を修復するための方法及び組成物を記載している。特許文献３は、軟骨の欠陥あるいは損傷を処置あるいは修復するための方法及び組成物を開示している。特許文献４は、軟骨細胞構造を成長させ移植するために細胞培地から生体内で軟骨を新たに形成することに関連する。しかしながら、これらのいずれの特許も、疾病軟骨を機能状態にまで再生する方法を開示するものではなく、このような方法は依然存在していない。
【０００９】
【特許文献１】
米国特許Ｎｏ．６，０８０，１９４
【特許文献２】
米国特許Ｎｏ．５，７８６，２１７
【特許文献３】
米国特許Ｎｏ．５，２０６，０２３
【特許文献４】
米国特許Ｎｏ．５，０４１、１３８
【００１０】
人における臨床経験及び動物モデルに関する実験的研究によって、機械的に負荷をかけることによって、正常な関節軟骨のホメオスタシスの維持に対して本質的な刺激が得られることが確認されている。非特許文献１。
【００１１】
【非特許文献１】
Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１９０：２７５（１９８９）
【００１２】
運動不足による関節負荷の変化（非特許文献２）、索靭帯のゆるみ（非特許文献３）、過度の衝撃（非特許文献４）あるいは亜軟骨（ｓｕｂｃｈｏｎｄｒａｌ　ｂｏｎｅ）の剛性の上昇（非特許文献５）によれば、変形性関節症の軟骨特性が病理学的に変化していた。
【００１３】
【非特許文献２】
（Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．，２１９：２８）１９８７７）
【非特許文献３】
（Ｉｂｉｄ，２１３：６９（１９８６））
【非特許文献４】
（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ，６：５１（１９７３））
【非特許文献５】
（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈａｉｃｓ，２８：３５７（１９９５））
【課題を解決するための手段】
【００１４】
軟骨が迅速かつ可逆的に形状を変化することができるのは、コラーゲンである非可溶性のファイバーネットワークに捕捉された非常に可溶性に富むプロテオグリカンを多く含有する弾力、弾性のあるマトリックスによるものである。軟骨の組織内に存在するプロテオグリカン、コラーゲン及び他の分子は間葉細胞由来の軟骨の細胞、軟骨細胞によって形成される。
【００１５】
試験管内での研究により、軟骨細胞、関節軟骨細胞は、同化反応あるいは異化反応を通して特定の負荷状況に応答し、このような同化反応あるいは異化反応は物理的刺激によって細胞に付与される応力や歪に起因する（非特許文献６〜８）。
【００１６】
【非特許文献６】
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４０：２１６（１９９７）
【非特許文献７】
Ｓｐｉｎｅ、２２：１０８５（１９９７）
【非特許文献８】
Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．，１５：１８９（１９９７）
【０００１７】
関節の軟骨細胞の代謝の調整において機械的な負荷が延ずる役割が、関節の表面に渡たる力の分配状態を数学的に解析することによって部分的に認識されてきた（非特許文献９）。
【００１８】
【非特許文献９】
Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ．２２：８５３（１９８９）
【００１９】
非特許文献１０に記載されている生体機械的な分析によれば、可動関節の軟骨における軟骨細胞は７〜１０ＭＰａのオーダーの静水圧のレベルを経験することが確かめられている。７〜１０ＭＰａのオーダーの静水圧は、日常生活の通常の活動で生ずるものである。組織分化に対する機械的力の影響を調べた研究では、断続的な高い圧縮静水圧に曝された可動関節領域で軟骨の厚さが増大することが判明した。より低い静水圧を経験し関節表面に対して接線方向の引張り力を有する領域では軟骨の厚さが薄くなっている（非特許文献１１）。
【００２０】
【非特許文献１０】
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，８１：５３５（１９９６）
【非特許文献１１】
Ｂｏｎｅ，１１：１２７（１９９０）
【００２１】
非特許文献１２に記載されている実験的研究では、静水圧が試験管内で付与された場合静水圧によって関節の軟骨マトリックスの代謝に影響を与えることが確認されており、また５−１５ＭＰａのレベルの静水圧が試験管内で成牛の関節軟骨内における３５ＳＯ４と３Ｈ−プロリンの組み込み率を調節することが確かめられている。
【００２２】
【非特許文献１２】
Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．，９：１−１０
【００２３】
非特許文献１３に記載されている組織培養実験では、純粋に静水圧の領域とプロテオグリカンが生成される部位とが一致していることが立証された。非特許文献１４に記載されているように、負荷を与えた後直ちに測定した場合、生理学上レベルの静水圧によって、アグレカン及びタイプＩＩのコラーゲンのｍＲＮＡのシグナルレベルが上がる。牛の軟骨の外植片においてアグレカンｍＲＮＡの発現を負荷を制御して抑制する研究では、負荷１時間後に一時的な上昇調整が見られた。
【００２４】
【非特許文献１３】
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：１５４９０（１９８７）
【非特許文献１４】
Ｊ．Ｏｒｔｈｏ．Ｒｅｓ．，１４：５３（１９９６）
【００２５】
【発明が解決しようとする課題】
上記研究では軟骨及びタイプＩＩのコラーゲンの正常な機能に対して静水圧が重要性であることを記載かつ認識しているが、しかしながら連続的に静水圧を付与すると軟骨の代謝能力を疲弊させ、軟骨が損傷することになり、また短い期間（１時間未満）静水圧を付与する場合には種々の細胞応答を引き起こし、この応答によって軟骨細胞の代謝及びホメオスタシスを乱すことになるので、上記認識を臨床的に応用することはできなかった。例えば、短期間静水圧を付与する場合には、タイプＩＩのコラーゲンｍＲＮＡの発現量が増加し、一方連続的に負荷を付与するとこのような発現の増加は維持されない。一方、付与する期間中、アグレカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）シグナルの発現が増加し続ける。これらの結果は、アグレカンとタイプＩＩのコラーゲンとの間の細胞上の平衡を乱すことは明らかである。軟骨細胞は、予想できない態様で多重刺激に応答し、応答の可変性は、負荷の時間、強度及び周波数に依存する。このような非予測性のため、連続的に長期間にせよ短期間にせよ変形性関節症の治療や損傷した軟骨の再生のために無差別に静水圧を負荷することを阻止する（非特許文献１５）。
【００２６】
【非特許文献１５】
Ｊ．Ｒｅｈａｂ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，３７：１５３−１６１（２０００）
【００２７】
変形性関節症及び他の軟骨、コラーゲンあるいは骨の疾患が深刻であり無能かするという影響を考慮すると、軟骨あるいはコラーゲンを再生しかつ骨を再形成することを可能とするような方法を提供することが重要であろうと思われる。
【００２８】
最近まで、一旦支持繊維の配列が乱れてしまうと、関節の軟骨は自身でもはや回復することができないと信じられていた。非特許文献１５。
【００２９】
【非特許文献１６】
Ａｒｔｉｃｕｌａｒ　Ｃａｒｔｉｌａｇｅ　ａｎｄ　Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　Ｈｏｅｃｈｓｔ　ａｎｄ　Ｗｅｒｋ，Ｋａｌｌｅ−Ａｌｂｅｒｔ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ　Ｍａｙ　１２−１６、１９９１、Ｅｄｓ．Ｋｕｅｔｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｒｏｓｅｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ
【００３０】
繊維芽細胞、繊維軟骨細胞あるいは軟骨細胞等の間葉細胞あるいは間葉細胞由来の細胞に対して断続的に静水圧を付与した特定の領域では上記再生が可能であるということが今まさに発見された。したがって、本発明の第１の目的は、変形性関節症及び他の軟骨およびコラーゲンの疾患において再生、新生及び骨の再形成を促すことによって該変形性関節症及び他の軟骨およびコラーゲンの疾患を治療する方法を提供することにあり、該方法は成人の軟骨及び骨の細胞を再生しかつ修復させる確固たる機械的な負荷付与環境を提供する。
【００３１】
【発明の概要】
本発明の第１の視点は、軟骨の修復、再生及び新規な形成、軟骨細胞の補充、タイプＩＩのコラーゲンの沈積、刺激の付与および骨の再形成をする方法にある。
【００３２】
本発明の他の視点は、所定の負荷の間隔内で断続的に所定の期間の静水圧の付与を繰り返し行ない負荷後回復期間を置く負荷付与方式によって、軟骨及びコラーゲンの再生を刺激し、骨を再形成し、軟骨、コラーゲンあるいは骨の病気を治療する方法にある。
【００３３】
本発明のさらに別の視点は、軟骨組織を生体内、生体外あるいは試験管内で修復、再生及び新規に形成する方法であって、本来の場であるいはそれ以外の場所で軟骨あるいは軟骨細胞に対して、あるいは試験管内で軟骨あるいは軟骨細胞に対して、断続的に所定の期間の静水圧の付与を繰り返し行ない静水圧付与後回復期間を置く負荷付与方式によって該再生を行なう。
【００３４】
本発明のさらに別の視点は、生体内あるいは生体外で、軟骨の修復、再生及び新規な形成方法にあり、該方法は再生の必要のある軟骨組織に対してその場で、あるいは当該その場から取り出した軟骨に対して、あるいはマトリックスに付着した軟骨細胞、繊維芽細胞あるいは繊維軟骨細胞に対して静水圧を付与する工程を含み、静水圧を約１〜８時間断続的に付与し、その後約１６〜２３時間回復期を置くことからなる。
【００３５】
本発明のさらに別の視点は、修復及び再生の必要のある軟骨組織、軟骨細胞、他の間葉細胞由来細胞あるいはコラーゲン組織に静水圧を付与する、生体内におけるコラーゲン回復方法にある。
【００３６】
本発明のさらに別の視点は、生体内において骨を回復する方法にあり、該方法は、骨の骨芽細胞に対して約１〜８時間静水圧を断続的に付与し、その後約１６〜２３時間の回復期を置くことを含む方式を用いて、軟骨の再生の必要性のある前駆組織としての骨の部位に対して静水圧あるいは直接機械的刺激を付与する工程を含む。
【００３７】
本発明のさらに別の視点は、疾患にかかった関節を再生させる方法にあり、該方法においては、軟骨の移植片に対して断続的に静水圧の負荷を与えて、健全な負荷支持マトリックスに回復させ、それを疾患の関節に配置することによってその正常な機能を回復させる。
【００３８】
本発明のさらに別の視点は、疾患のある軟骨から健全な負荷支持機能を回復させた軟骨にあり、正常な機械的かつ生化学的性質が回復するまで該疾患のある軟骨に断続的に静水圧を付与し、静水圧付与後回復期間を置く。
【００３９】
本発明のさらに別の視点は、疾患のある軟骨あるいは骨に対して断続的に静水圧を付与し、静水圧付与後回復期を置いた後、軟骨細胞あるいは骨劣化酵素、サイトカインおよびそれらのインヒビターあるいは成長促進物質、成長因子及びホルモンの相対的レベルあるいは発現レベルを決定することによって、軟骨の機能性を検出する方法にある。
【００４０】
定義
本明細書で使用するように、
「網目状の」（“Ｃａｎｃｅｌｌｏｕｓ”）は、格子状あるいはスポンジ状の構造を有する骨を意味する。
「間葉」（“ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ“）、「間葉茎細胞」（”ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ“）あるいは「間葉細胞由来細胞」（”ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｌｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｃｅｌｌ”）は、軟骨組織（軟骨細胞）、連結組織（繊維芽細胞）、繊維軟骨（繊維軟骨細胞）、腱（ｔｅｎｄｏｎ）（腱細胞（ｔｅｎｏｃｙｔｅｓ））及び骨（骨芽細胞及び骨細胞）のマトリックス内にあり、該細胞外液（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）マトリックスを生成する。
【００４１】
「負荷を付与する」あるいは「負荷付与の間隔」は、付与するＩＨＰ負荷あるいは組織内の刺激の期間を意味し、その後に外部圧力をかけないで圧力を待機条件にまで戻す回復期が置かれる。
【００４２】
「間隔をあける」とは、必要な回数だけ負荷と回復期間とを繰り返す組み合わせを意味する。
「新たに形成する」とは、負荷期間に曝した後、支持構造（足場あるいはコラーゲンマトリックス）内で軟骨組織、繊維芽細胞）、繊維軟骨（繊維軟骨細胞）、腱（ｔｅｎｄｏｎ）（腱細胞（ｔｅｎｏｃｙｔｅｓ））及び骨（骨芽細胞及び骨細胞）によって付着した結果、軟骨連結組織、繊維軟骨組織、腱（ｔｅｎｄｏｎ）、および骨細胞を生成することを意味する。
【００４３】
「骨芽細胞」は、間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｅ）（繊維芽細胞）由来の骨形成細胞を意味し、小骨（ｏｓｓｅｎｏｕｓ）マトリックスを形成する。該マトリックスでは、骨芽細胞は骨細胞として包含されるようになる。
「繊維芽細胞」あるいは「繊維細胞」は、コーラゲンを形成できる連結細胞に存在する細胞工程による、星状あるいはスピンドル形状の細胞を意味する。
【００４４】
「アグレカン」は、圧縮性弾力を関節軟骨組織に付与する際に役割を演ずる大きな集合性プロテオグリカンを意味し、負荷に耐えることを可能とする。アグレカンは、全総プロテオグリカンの約８５％を占める豊富なプロテオグリカンである。
「タイプＩＩコラーゲン」は、単一の遺伝子ＣＯＬ２Ａｌの生成物であるα１（１１）のホモポリマー分子を意味する。タイプＩＩのコラーゲンは、全ての他のコラーゲンのタイプの中で最も豊富にあり、総コラーゲンの約９５％を占める。
【００４５】
「マトリックス　メタロプロテイナーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）」あるいは「ＭＭＰ」は、疾患にかかった関節の軟骨組織の劣化を引き起こし、かつ軟骨組織の劣化と関連するプロテアーゼを意味する。ＭＭＰは、さらにＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９等として識別することができる。
【００４６】
「マクロファージ　化学誘引（ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ）プロテイン−１」あるいは「ＭＣＰ−１」は、組織の免疫状態に影響を与える前炎症性メディエータを意味する。その上昇レベルは、細胞破壊が開始することあるいは増加することと関連づけられ、その減少レベルは組織の損傷の減少即ち治癒と関連付けられる。
【００４７】
「形質転換成長因子−β」あるいは「ＴＧＦ−β」は、断続的に静水圧を付与することによって細胞が放出する因子を意味し、細胞代謝における変化を意味する。
【００４８】
「繊維芽細胞成長因子１」あるいは「ＦＧＦ−１」は、軟骨細胞あるいは骨芽様細胞の増殖に関与していることは知られていない成長因子を意味する。
「ＭＰａ」は、メガパスカルを意味する。１ＭＰａは、１４５ｐｓｉに等しい。
「ＧＡＧ」は、グリコースアミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ）を意味する。
「ＩＨＰ」は、断続的な静水圧を意味する。
「ＧＡＰＤＨ」は、グリセルアルデヒドー３−フォスフェートデヒドロゲネートを意味する。
「ＡＰＭＡ」は、活性酵素に対する潜在的な酵素前駆体のアクチベータである４−アミノフェニル第２水銀アセテートを意味する。
【００４９】
【発明の実施の態様】
本明細書に記載する発明は、間を空けて負荷を与える期間に断続的に繰り返し静水圧を付与すると、関節の軟骨細胞遺伝子の発現に影響を与え、負荷依存コラーゲンタイプＩＩの発現を刺激し、マトリックスのメタロプロテイナーゼの軟骨及びコラーゲンを減少させ、マトリックス内の間葉細胞あるいは間葉由来の細胞を新規に形成することが可能となり、かつ骨の再形成に影響を与えるという発見に関する。この発見は、変形性関節症等の変性性骨の病気、関節、関節の軟骨組織の損傷、変形性の骨の疾患、関節の取替え、コラーゲン及び骨の修復及びに骨の取替え、骨の再構築及び他の軟骨組織、コラーゲン及び骨の治療に適する。
【００５０】
Ｉ．軟骨及びコラーゲンの再生及び骨の再形成方法
上に列記した病気の治療のための軟骨細胞およびコラーゲン再生及び骨の際形成方法は、そのより広い範囲に、本発明の間をあけて負荷を与える方式は，生体内において損傷部位、移植可能な人の変形性関節症の移植可能な全厚さの人の変形性関節炎あるいは疾患のある軟骨組織あるいは骨に生体外で、あるいは健全なあるいは病気の軟骨細胞から分離した細胞、試験管内でコラーゲン及び骨に対して付与する工程を含む。
【００５１】
Ａ．軟骨組織の再生の一般的な条件に対する治療方式
治療方式は、治療した組織あるいは分離した細胞に対して静水圧の付与期間を繰り返すことによる刺激を与え、静水圧後に回復期間（負荷付与インターバル）を置くことからなる。圧力は、各負荷付与期間内に断続的に付与することが好ましい。圧力、頻度、間隔の長さ、断続性及び回復期間等の方法上のパラメータは、再生するのに選択した方法に基づいて選択する。即ち、生体内においてその場で、生体外あるいは試験管内並びに病気及び軟骨組織の変性の重篤性に基づいて選択する。
【００５２】
１．静水圧
無傷の軟骨、無傷の骨、軟骨及び骨移植断片及び細胞を修復し、再生しあるいは新規に生成する方法は、０．５〜３０ＭＰａ、好ましくは１ＭＰａ〜２０ＭＰａ、最も好ましくは５ＭＰａと１０ＭＰａとの間の静水圧を１Ｈｚの周波数で断続的に間隔をあけて付与する。
【００５３】
典型的には、約３０ＭＰａより高い圧力は、当該圧力によって細胞を損傷させる可能性もあり、使用あるいは推奨できない。一方、０．１ＭＰａより低い圧力は細胞あるいは組織を再生するのに有効ではないかもしれない。５〜１０ＭＰａ近辺の圧力が、生体内で関節の軟骨組織が経験する正常な生理的なレベルに対応している。
【００５４】
２．ＩＨＰ及び回復期の時期
高圧力の間隔は、一般的には数分から約８時間の長さであり、好ましくは１〜８時間、さらに好ましくは１〜８時間であり、最も好ましくは４時間である。
回復期間において、注目している組織／細胞を待機のあるいは十分に低い一定の圧力に置く。回復期間は、一般には数分から数十時間の間とすることができ、好ましくは約１６〜約２３時間、好ましくは約２０時間である。
【００５５】
３．周波数
断続的な静水圧間隔内において、０．１Ｈｚと１０Ｈｚの間の周波数で、好ましくは１Ｈｚのオーダーで圧力を断続的に付与する。軟骨細胞に対する好ましい実施態様では、少なくとも４日連続で、典型的には１Ｈｚで１０ＭＰａの負荷付与をし約４時間間隔をあけた負荷付与方式を取り、負荷付与後で一定大気圧で約２０時間回復させる。
【００５６】
４．処置時間
軟骨の治療時間は、軟骨の変性の程度及び重篤性、コラーゲン損失の程度、骨の病気の重篤性あるいは関節の損傷の程度及び重篤性に完全に依存している。典型的には、ＩＨＰ負荷によって約４回治療後、即ち、典型的には、治療後４日後に軟骨の機能性およびその再生の改良が見られる。さらに変性し、病気の進んだあるいは損傷した軟骨の場合には、当該治療を１００日もの間続ける。この場合、何ら否定的な結果は伴わない。軟骨及び／またはコラーゲン機能が慢性的に損なわれた場合には、明確ではないが当該治療を継続することもできる。好ましい治療は、７〜３０日連続で、この期間でうまくいくであろう。
【００５７】
新規な形成の場合には、コラーゲンマトリックスに健全なあるいは病気にかかった被処理細胞を付与し、新しい組織が形成されるまで治療を継続する。
【００５８】
５．機能性試験
処置の長さは、機能性回復の速度に依存する。軟骨の機能性は、負荷支持マトリックスの回復性及び／または再形成及び／または形成に依存する。軟骨の変性は、細胞の変形によるもの、マトリックスにかかる剪断応力のレベルが不適切によるもの、および代謝シフトによる変性による。
【００５９】これらの代謝シフトは、アグレカンとコラーゲン、特にタイプＩＩコラーゲン、及びＴＧＦ−β等のある種の成長因子に関し、軟骨細胞の遺伝子発現に影響を与える。これらのシフト及び軟骨細胞の代謝も、健全な機能の軟骨細胞では通常は発現しないかあるいは発現してもより少量しか発現しないタンパク質を発現させたりあるいは過剰に発現させることになる。これらのタンパク質としてはメタロプロテイナーゼＭＭＰ−１，ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９及びＩＬ−１およびＩＬ−６等の前炎症性サイトカインがある。
【００６０】
その結果、ＩＨＰ負荷処置の間におよび特にその後に、上記因子の幾つかあるいは全てを試験して、活性が増加したかにつき、それらが存在するかどうかを評価する。活性がないかあるいは活性が減少すれば、軟骨組織の一体性及び負荷支持機能が再生されたことになる。
【００６１】
【表１】
2004512031.tif 000002
【００６２】
ここに示す機能性の試験は、アグレカンやタイプＩＩコラーゲン等の細胞外液（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）マトリックス成分、ＭＭＰ−１，ＭＭＰ−２及びＩＬ−９等のプロテアーゼ、ＩＬ−１およびＭＣＰ１等のサイトカインの相対値を決定することを含む。これらの値は、使用した組織調製片及び方法によって異なってくるが、傾向は同一、即ち、損傷した、あるいは変質した軟骨およびコラーゲンにおいて、細胞外液マトリックスプロテインのレベルは減少し、プロテナーゼ及びサイトカインのレベルは上昇する。再生中には、当該レベルはそれぞれの正常な生理学的範囲に戻る。
【００６３】
本発明に従って付与する負荷方式によって、関節軟骨組織、コラーゲン組織、骨組織及び／またはそれらのそれぞれの分離した細胞の再生に刺激を与えることが分かった。間歇的に負荷を与える方式は、関節の軟骨の機能的細胞外液マトリックスを形成するプロテインに対する遺伝子の発現を増加させることも分かった。本発明の間歇的負荷付与方式を適用後に、カチオン性染料でマトリックスを染めることによって、細胞外液マトリックスの量が増えたことを確認した。
【００６４】
さらに、間歇的に負荷を与える方式によって、炎症性細胞を関節の空隙に集めるマトリックス劣化酵素、前炎症サイトカインおよびケモトカインを選択的に阻止することになる。さらに、間歇的に負荷を与える方式によって、タイプＩＩコラーゲンの発現が阻止され、また形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ）成長因子−β１（ＴＧＦ−β１）、例えばＭＭＰ−１，ＭＭＰ−２，ＭＭＰ−９及び金属プロテインナーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）の組織インヒビター（ＴＩＭＰ）等のマトリックス金属プロテイナーゼの発現に影響を与えることが分かった。これらのファクタ及び他のファクタを用いて表１に示すように軟骨及び骨の機能性を評価することが便宜的かもしれない。
【００６５】
限定はされないが、機能性を決定するパラメータを見地するのに用いる方法にはＲＴ−ＰＣＲ、酵素図法、生物化学法、染色法、ＥＬＩＳＡ法、遺伝子配列法及びプロテオミックス法が含まれる。
【００６６】
Ｂ．試験管内処置
試験管内処置については、損傷した軟骨組織を外科手段によって患者から取り出す。生体外処置の場合、骨軟骨移植片（ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒｏｃａｒｔｉｌａｇｅ　ｇｒａｆｔ）等の無傷の組織に間歇的負荷を付与する。試験管内処置の場合、正常なあるいは疾患のある軟骨マトリックスが変性し、足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）／支持内あるいは単一層として懸濁させて培養して得た軟骨細胞に間歇的な負荷付与方式を付与する。負荷付与方式を適用した後、その結果新たに形成された組織あるいは細胞の集合を患者に再度移植する。必ずしも必須ではないが、移植を自生のものですることが好ましい。
【００６７】
外科的手法は、一般的には、骨軟骨症移植法を用いて関節鏡視下インターベンション（ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）に対して開発され使用されてきている技法に従う。この技法では、軟骨の全厚さのサンプルを関節表面の周辺領域から取り出した後、円形の欠損部に移送する。典型的には、ホスト部位は挿入物質よりも小さな周辺を有するので、ホスト部位と置換組織との間の結合は抵抗嵌合となる。完結的な負荷付与に応答して製造される物質中では、回復した軟骨材料は関節の表面形状に合うサイズに調整される。これはサイズの大きい移植片が周囲の軟骨の表面に２−３ｍｍ上になったままとされる骨軟骨症移植の通常の手法と異なっている。通常の関節の負荷に耐えることができるタイプＩＩコラーゲン系細胞外液マトリックスが形成されることによって、移植片を圧入して、通常の関節表面の厚さに適合させることができる。この厚さは、通常の関節の局所の変化に対応する自然の厚さに対応するものである。
細胞、細胞の単層、細胞培養の試験管内処置はセクションＩＩで記載したものと本質的に同じである。
【００６８】
Ｃ．生体外処置
例えば、細かく切れたあるいは引裂かれた関節間軟骨等の関節軟骨の損傷の場合軟骨の一部のみが損傷している可能性があるが軟骨の他の残部は健全で機能をするが、このような場合の処置に特に適合する生体外処置の場合には、引裂かれたあるいは細かく切断された軟骨を外科的に軟骨移植片として取り出し、ＩＨＰ負荷付与方式にかける。表１に示すように、基準が正常な健全な軟骨レベルに達するまで、軟骨移植片の機能性を周期的に試験する。その後、その当初の形状及び寸法を保持する移植片は関節に再度移植する。ＩＨＰ生体外処置、外科的取り出し及び際移植は殺菌状態で行なう。
【００６９】
組織は自生であり、損傷を受けた組織のみに処置を施し外植片の形状及び寸法は同一のままであるので、多かれ少なかれ追加された軟骨組織はないということが、生体外処置の利点である。さらに、組織が十分に再生された場合のみ組織を再度移植する。この方法の欠点は、手術を２重に行なうという点である。しかしながら、広範囲に関節が損傷した場合、この方法は関節を取り替える方法や軟骨あるいは軟骨の一部を伴わずに関節をすべて放置する方法よりも依然好ましい。
【００７０】
Ｄ．生体内処置
生体内軟骨再生あるいは骨の再形成方法において好ましいものとしては、本発明の間歇的負荷付与方式によって、前述の静水圧を患者の関節及び／または手足の軟骨組織あるいは骨に付与することを含む。物理療養士によって操作は手動で行なうこともできるし、あるいは動力装置によって自動的に行なうこともできる。
【００７１】
Ｅ．静水圧の間歇的静水圧負荷付与装置
生体内、生体外及び試験管内処置の際に関節軟骨マトリックス及び／または細胞を再生する器具及び装置は、実質的には静水圧発生装置、周波数カウンター、タイマー及び温度制御装置からなる。
【００７２】
好適な試験管内装置は、当該組織、細胞あるいは細胞培地（ｃｕｌｔｕｒｅ）を保持する加圧チェンバー、静水圧負荷装置（加圧装置）と制御電子機器からなり、該静水圧負荷装置は加圧チェンバーと液体連通状態となっていて加圧チェンバを当該所定の圧力に加圧するものであり、該制御電子機器は負荷付与機器と電気的に連通して負荷付与機器が所定の間歇的負荷方式を当該組織あるいは細胞に適用するよう制御するためのものである。
【００７３】
図１に試験管内で処置を行なうために分離した関節軟骨細胞に対して間歇的に静水圧を与えるに好適な装置を示す。図１に示す具体的装置は、サーボ静水圧負荷付与装置にインターフェースした市販のステンレス鋼圧力容器である。このデザインのものは、純粋に静水圧を付与することになるシステムからの空気を完全に脱気することができる。
【００７４】
図１に示す装置は例示的なものに過ぎず、どのように変更するかによらず、同様な構成部材を有しかつ同様な結果を付与するものであればいずれの器具及び装置でも本発明の範囲内であることを意図すると理解すべきである。好適な生体内器具は、患者の関節あるいは手脚を保持するホルダーあるいは患者の組織に取付ける手段，ホルダーと組み合わされ所定の軌道に沿ってホルダーを動かすモータ、電子的にモータに連結されモータを制御して患者の手足を動かし本発明の完結的負荷付与方式を当該軟骨組織に適用する制御電子機器とからなる。
【００７５】
問題の可動関節（ｄｉａｒｔｈｒｏｄｉａｌ）を跨る装置によって関節に対して生体内負荷付与をする。例えば、膝については、当該装置はでん部から足底までの距離に跨り、対応して、伸ばした脚を維持するという制限がある。該装置は、収縮機構を含み、この機構によって０．１から１０Ｈｚの周波数で大腿骨顆状軟骨を半月板（ｍｅｎｉｓｃｕｓ）を通って頚骨プラトー（ｔｉｂｉａｌ　ｐｌａｔｅａｕ）軟骨に並置することができ、外層値は１〜８時間の上記時間間隔で、さらに詳しくは１日当たり約４時間通常の日常活動において１〜２０ＭＰａの範囲で圧力を発生する。
【００７６】
ＩＩ．人の正常かつ変形性関節症軟骨細胞に対する間隔を置いた負荷の付与
関節の軟骨細胞に関節の軟骨の細胞外液マトリックス内でかかる機械的負荷の主要な成分は、静水圧である。日常活動の際に関節に通常かかる負荷によって、関節軟骨には高いレベルの間歇的静水圧がかかる。本セクションで記載する研究によって、積極的な代謝活性を増大させて破壊酵素の発現を減少させることによって、試験管内で維持される変形性関節症にある軟骨細胞は付与された静水圧に応答することが示されている。
【００７７】
分離した成人の関節の軟骨細胞において軟骨マトリックスプロテインの合成における間歇的な静水圧の影響は、タイプＩＩのコラーゲン、アグレカン及びＭＭＰ−２、ＴＧＦ−β、ＭＣＰ−１及びＦＧＦ−１等の他の変性および成長促進プロテインのｍＲＮＡの発現に集中した。これらの研究の結果を図２−図７に示す。
【００７８】
この一連の研究において、１ＭＰａあるいは１０ＭＰａの静水圧で５分あるいは４時間で４日間刺激を与えることによって正常で健康な人の軟骨細胞と変形性関節症の人の軟骨細胞のアグレカン、タイプＩＩコラーゲン、ＭＭＰ−２、ＴＧＦ−β、ＭＣＰ−１及びＦＧＦ−１のｍＲＮＡ発現を、対照例におけるｍＲＮＡ発現と比較した。１，５，１０ＭＰａの範囲で投与応答態様で負荷を与えかつ１ＭＰａ及び１０ＭＰａの圧力で一日当たり断続的に５分あるいは断続的に４時間静水圧を限定した場合、図２に示すように、アグレカンｍＲＮＡシグナルは１ＭＰａ、５ＭＰａ及び１０ＭＰａの負荷の順に増大したことが観察された。
【００７９】
図２に示す結果によれば、この断続的な負荷付与方式によってアグレカン及びタイプＩＩのコラーゲンの遺伝子発現が増大したことが確認されたことは明らかである。アグレカンは大きくかつ最も豊富な凝集性プロテオグリカンであり、このプロテオグリカンは関節の軟骨に対して圧縮性弾力を付与するのに基本的な役割を示し、負荷耐性を持続することを可能とする。タイプＩＩコラーゲンによって、組織に引張り強度を付与する。従って、本発明の処置は、軟骨の弾力を増大することになり、また大きな負荷に耐える能力を増大させる。
【００８０】
図３は２、人の骨軟骨症関節の軟骨細胞における細胞内参照プロテインβ−アクチンに対するアグレカンあるいはタイプＩＩコラーゲンの比として表して、静水圧（ＩＨＰ）１０ＭＰａを４日間間歇的に負荷をかけた場合の、アグレカンあるいはタイプＩＩコラーゲンもｍＲＮＡの発現に対する影響を示す。
【００８１】
これらに結果によって、ＩＨＰ処置後に、罹患した変形性関節症の人の軟骨細胞において、軟骨細胞外液マトリックス中の主要な高分子プロテインである、アグレカン及びタイプＩＩコラーゲンの両方の発現が増大したことが明瞭に確認された。
【００８２】
図３Ａと図３Ｂに見られるように、間歇的に静水圧を付与することによって、β−アクチンシグナルに対するアグレカンの生成比は約０．１から約０．５、即ち約５倍に増大した。図３Ｂに示すように、β−アクチンシグナルに対するタイプＩＩコラーゲンの比は約０．０１から約０．１２にさらに増大した。
【００８３】
軟骨細胞における静水圧の影響も免疫組織化学的に分析研究した。免疫組織化学によって、機械的負荷に対する細胞外液マトリックスの応答の指標を与える。上記負荷付与条件の場合、免疫組織化学的分析によって、静水圧付与によって細胞外液マトリックスにおけるプロテオグリカン及びコラーゲンの析出が増大したことが示された（データは示していない）。
【００８４】
ＩＨＰも軟骨に対する分子欠陥の発現に影響があるかどうかを調べるため、一連の実験を行なってプロテアーゼと成長因子の放出と効果的な間歇的な負荷付与を評価した。
【００８５】
図２に記載したと同一の条件下において静水圧の影響を試験して、マトリックスのメタロプロテイナーゼのｍＲＮＡ発現を阻止する場合に、間歇的な静水圧の負荷を間隔を置いて付与することによって影響があるかどうかを決定した。
【００８６】
結果を図４に示す。図４は正常な人の関節の軟骨細胞からマトリックスのメタロプロテイナーゼー２の放出における異なった強度の間歇的な静水圧の負荷を間隔を置いて付与した場合の影響を示す。
・・・細胞外液のマトリックスコラーゲン・・・、疾患のある関節で軟骨の変性と関連があることが知られている幾つかの酵素の一つである。１０ＭＰａでＩＨＰを４時間４日間の間付与した後にこの酵素のレベルが減少していたが、このことは細胞外液のマトリックスの回復と再生が進んだことを示す。図４に示す中性メタロプロテイナーゼの発現の酵素図解析によって、４時間間歇的に静水圧を付与してその後で２０時間の回復と行いこれを４日間付与したＡＰＭＡは、ゼラチン様（ｇｅｌａｔｉｎｏｌｙｔｉｃ）活性のレベルを減少させたことが示された。
【００８７】
形質転換成長因子β１（ＴＧＦ−β１）は、促進したマトリックス吸収に関連する代謝変化に関与することが知られており、該マトリックス吸収は、例えば、アグレカン代謝の同化促進路及び異化路の両方が活性化される変形性関節炎で生ずる。このように、ＴＧＦ−β１は軟骨の恒常性に影響を与える。
【００８８】
ＴＧＦ−β１の役割は、例えば、骨の周囲の骨膜領域等の前駆細胞において最も顕著である。分離した軟骨細胞に対するＴＧＦ−β１による直接の影響は、生成されたプロテインのレベルによって変わる。というのは、生成されたプロテインが異なった細胞の多面的な活動を示すからである。培地中の関節軟骨細胞に対してＴＧＦ−β１を加えると、マトリックスの生成に対して対抗して生じるタイプＩＩコラーゲンの発現が減少する。
【００８９】
図５は、正常な人の関節軟骨細胞から放出されるＴＧＦ−β１に対して異なった強度の間歇的な静水圧の負荷を間を置いて付与する場合の影響を示す。
図５に見られるＴＧＦ−βの放出に対する間歇的静水圧の影響とは、細胞の代謝が機械的な刺激によって調節されることを意味する。上記成長因子の生成率の減少は、細胞の代謝における他の変化と関連づけられることは明らかである。
【００９０】
図５に示すように、正常な軟骨細胞に４時間ＩＨＰを付与した場合、より長い時間より高い圧力（１０ＭＰａ）を間歇的に付与した場合プロテインの合成が減少したことを示す。これらの結果により、ＩＨＰによる刺激が時間及び投与に依存する態様で軟骨の代謝状態に異なった影響を与えることが判明した。下記から分かるように、骨芽細胞様細胞にＩＨＰで刺激を与えた場合に、同様の結果が観察された。
【００９１】
図６に、異なった強度で間歇的に静水圧の負荷を間を置いて付与した場合の、正常な人の関節軟骨細胞からマクロファージの化学独立栄養生物のプロテイン−１（ＭＣＰ−１）が放出されることに対する影響を示す。
【００９２】
ＭＣＰ−１は、素子この免疫状態に影響を与える多数の前炎症性メディエータの一つを示す。細胞代謝及び軟骨の変性あるいは損傷に付随する炎症工程の終了における変化の指標として、軟骨細胞においてＭＣＰ−１が減少することは重大なことである。ＭＣＰ−１が放出される現象は、通常組織の破壊における役割をする免疫系の細胞、単球及びマクロファージの斬増と関連している。その発現が減少することは、軟骨の損傷の回復の兆しである。
【００９３】
図６に示すように、正常の人の関節軟骨細胞からのＭＣＰ−１の放出は、顕著におよそ８倍であり、ＩＨＰを１０ＭＰａで４時間付与すると減少する。
【００９４】
ＭＣＰ−１の放出が減少したことが観察されたが、これは軟骨の抗炎症あるいは抗損傷機構の活性化が減少し、それによって軟骨の変性及び破壊の程度がより小さくなる。
【００９５】
ＩＨＰに続いてＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２あるいはＴＧＦ−βの放出が減少することが軟骨が変性するのに関与するこれらのプロテインに対して選択的であるかどうかを決定するために、繊維芽細胞成長因子１に関して研究を行なった。この成長因子１は、このような工程に関与しておらず、従って、成長因子１は・・・反応すべきではない。
【００９６】
図７は、正常な人の関節軟骨細胞からの繊維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ−１）に対する異なった強度で間歇的に静水圧の負荷を間隔をあけて付与した場合に影響がなかったことを示す。
【００９７】
図７は、全ての成長因子が間歇的な静水圧に対して応答したわけではなく、軟骨の変性あるいは再生に関与する因子のみが応答する。さらに、図７は、軟骨細胞はＩＨＰによって損傷を受けないこと、及びＭＭＰ−２、ＴＧＦ−β及びＭＭＰ−１の放出が減少したのは軟骨が損傷したことによることを示す。
【００９８】
図２乃至図７に記載した研究の目的は、分離した成人の関節軟骨細胞において軟骨細胞に対して間歇的に静水圧を付与することによってマトリックスプロテインの合成に変化があるかどうかということを調べることにあった。
【００９９】
図２乃至図７において、関節の軟骨に過剰あるいは不十分（１０ＭＰａで５分あるいは１ＭＰａで４時間）な負荷を与えても、軟骨の修復あるいは再生に対して十分な刺激が得られないこと、場合によっては、このような負荷では変性度を増したり機能を喪失させることにもなることが累積的に示されている。図２乃至図７に示す結果によって、ＩＨＰと軟骨の再生につながる軟骨細胞の代謝工程における有益な変化が生ずることの間には相関関係があることが確認される。
【０１００】
関節の機能のリハビリは、罹患した軟骨の修復及び回復如何による。上記種々の実験手法によって、機械的な負荷付与によって関節軟骨細胞の細胞外液マトリックス成分、即ち、アグレカンとタイプＩＩコラーゲンの合成に影響を与えることが確認された。しかしながら、今日まで、機械的なＩＨＰの刺激が軟骨の修復及び再生に対して機動力として働くことを立証する、軟骨マトリックスの遺伝子発現を機械的に誘起して調整することの明白な関連性は示されなかった。上記の結果により、生体内、試験管内及び生体外での治療の介入が可能となる。
【０１０１】
ＩＩＩ．タイプＩＩコラーゲン及びアグレカンのｍＲＮＡ発現に対するＩＨＰの時間従属効果
本発明につながった当初の研究により、連続的に静水圧を付与しても、関連するプロテインの合成の代謝活性が増減することによって測定できるような軟骨の修復及び再生にはならないということが示された。短時間このような圧力を付与すると、タイプＩＩコラーゲンのｍＲＮＡの発現が増大する一方、このように連続的に負荷を付与してもこのような発現上昇を維持しなかった。一方、負荷の期間中、アグレカンシグナルの発現は継続して増大した。
【０１０２】
セクションＩＩで述べた研究により、ＩＨＰと軟骨細胞の代謝工程との間には関係があることが示された。
このセクションに記載した研究では、試験管内で正常な成牛の関節軟骨細胞におけるタイプＩＩのコラーゲン及びアグレカンのｍＲＮＡにおけるＩＨＰの時間に依存する影響を調べた。
【０１０３】
本研究の目的は、軟骨細胞に間歇的に付与した圧力によって、タイプＩのコラーゲンのｍＲＮＡに刺激を与えずに、タイプＩＩコラーゲン及びアグレカンのｍＲＮＡを増量するかどうかということを試験することである。内部参照シグナルとしてベータ−アクチンのｍＲＮＡに関して、コラーゲンとアグレカンのｍＲＮＡレベルを相対的に定量するためＲＴ−ＰＣＲを使用することにより本実験方法を行なった。
【０１０４】
特に、本研究により、正常な成牛の関節軟骨細胞におけるタイプＩＩコラーゲンとアグレカンのｍＲＮＡの発現に対する間歇的な静水圧の負荷付与の２つの方式の影響を調べた。実施例１では、軟骨細胞を分離した。成牛の関節軟骨細胞に対して定量的に負荷を与えるシステムは、高密度単層培地（１．７５ｘ１０５　細胞／ｃｍ２）あるいはアグレカン細胞クラスターを用いた。
【０１０５】
２４時間に渡って連続的パターンであるいは実施例３に従って１日４時間負荷を間を置いて付与する方式で間歇的な静水圧の負荷を細胞に付与した。タイプＩＩコラーゲン、アグレカン及びβ−アクチンのｍＲＮＡシグナルについては、準定量的逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）測定法によって、関節軟骨細胞の代謝応答を決定した。結果を図８乃至図１２に示した。
【０１０６】
図８に、２−２４時間の所定の試験期間の間中維持された非負荷、高活性の軟骨細胞培地におけるタイプＩＩ及びタイプＩコラーゲンとβ―アクチンの発現のＲＴ−ＰＣＲシグナルレベルを示すグラフである。
図９は、ＩＨＰに曝した細胞のβ−アクチンに対するシグナルレベル及び負荷を与えなかった対照細胞におけるβ−アクチンに対するシグナルレベルを示す。
【０１０７】
図８は、実施例３において２，４，８，１２，２４時間刺激を与えずに対照細胞で得られたタイプＩＩコラーゲン及びβ−アクチン発現に対するＲＴ−ＰＣＲによって決定したシグナルレベルを示す。ＲＴ−ＰＣＲ条件は、実施例４に記載した通りであった。
【０１０８】
図８は、タイプＩＩとタイプＩのコラーゲンのＲＴ−ＰＣＲシグナルレベルを示すが、負荷を与えなかった対照細胞におけるβ−アクチンの発現は明らかに検出可能であり、変化はしなかった。
【０１０９】
関節軟骨細胞を大気圧で高密度単層培地（負荷を与えない対照培地）として塗布し維持したが、タイプＩＩコラーゲンのｍＲＮＡあるいはβ−アクチンのｍＲＮＡのシグナルレベルに関しては、大きな変化を示さなかった。図８に示すように、これらの観察結果は２，４，８，１２及び２４時間に渡ってもそのまま当てはまった。
【０１１０】
参照ｍＲＮＡは付与したＩＨＰに応答して変化しないので比較として参照点を与えるが、この参照ｍＲＮＡを決定するため、β−アクチンを選択した。理由は、β−アクチンはｍＲＮＡが相対的に豊富であり、またその位置による。
【０１１１】
図９に間歇的に静水圧に曝した細胞におけるβ−アクチンの発現及び負荷を与えなかった対照細胞におけるβ−アクチンの発現に対するＲＴ−ＰＣＲレベルを示す。
図９に示すように、負荷を与えなかった対照細胞に比較して、軟骨細胞を間歇的な静水圧に曝しても、２，４，８，１２及び２４時間に渡ってβ−アクチンのｍＲＮＡのシグナルレベルに変化をきたさなかった。
【０１１２】
それに対して、単層培地あるいは集合培地で正常な軟骨細胞にＩＨＰを付与した場合、４と８時間の負荷付与時間ではタイプＩＩコラーゲンのｍＲＮＡシグナルは現れず、その後減少することが立証された。一方、同一の条件でアグレカンのｍＲＮＡは異なったプロフィルを示し、２４時間継続的に増加した。
【０１１３】
タイプＩＩコラーゲンの発現に関する結果によって、ＩＨＰを４時間の複数回付与し、ＩＨＰ後回復期を設けた間隔を置く負荷付与法についての調べが促進された。
軟骨細胞培養集合体に２４時間を通して間歇的に静水圧を付与した。図１０と図１１に結果を示す。
【０１１４】
図１０は、一日４時間で負荷を付与しその後２０時間回復期をおくことを４日間おこなう間隔を置く静水圧付与を高密度単層培養物に対して行なった場合における、アグレカンに対するＲＴ−ＰＣＲシグナルレベルを示す。
図１１は、一日４時間で負荷を付与しその後２０時間回復期をおくことを４日間おこなう間歇的な静水圧を高密度単層培地に対して行なった後のタイプＩＩコラーゲンに対するＲＴ−ＰＣＲシグナルレベルを示す。
【０１１５】
こられの負荷付与条件下に、負荷を与えなかった対照例に比較して、アグレカンのｍＲＮＡのシグナルレベルは約４倍増大した（図１０）。負荷付与の方法が変わることによって、負荷を与えなかった対照例に比較して、タイプＩＩコラーゲンのｍＲＮＡのシグナルレベルは約７倍増大した（図１１）。
【０１１６】
上記しかつ図８−図１１に示す研究結果によれば、軟骨細胞は負荷付与方法を４時間間歇的に静水圧に曝した後２０時間回復期を置くパターンに変更したことに応答し、かつタイプＩＩのｍＲＮＡに寄与するＲＴ−ＰＣＲシグナルはβ−アクチンのｍＲＮＡを示すシグナルに比較して顕著に上昇したことが立証された。アグレカンのｍＲＮＡのシグナルも上昇した。
【０１１７】
これらのデータによって、適当なタイプの刺激によって機械的ＩＨＰの負荷を付与することにより、関節軟骨細胞マトリックスの高分子の発現を調整する作用が発揮されることが示された。得られた結果により、特定の負荷付与方式を採用することによって関節軟骨の修復と再生とが促進され、かつ複合移植可能な軟骨移植片を成功裏に生産することに寄与することが確認された。
軟骨細胞に対する静水圧の上記した影響によれば、特定の負荷付与方式により効果的な刺激がえられ、軟骨に細胞外マトリックスの高分子の合成を調節し損傷した軟骨の修復と再生およびタイプＩＩコラーゲンに関連する反応を開始させる。
【０１１８】
ＩＶ．骨芽細胞様細胞におけるＴＧＦ−β１及びＭＭＰ−２の発現に対する間歇的静水圧付与の影響
通常の重量負担活動の際に発生する機械的応力が、骨芽細胞の形成及び破骨細胞の吸収を通して骨の構造及び機能に寄与する。負荷付与履歴に応答する通常の骨の恒常性を維持するためには、多数のホルモン、サイトカイン及び成長因子が関与する。
【０１１９】
上記発見後に、本研究は間歇的に静水圧（ＩＨＰ）を付与することによって多面的な成長因子、細胞ＭＧ−６３，ＨＯＳ，ＴＥ８５の発現が調整されるかどうか、及びＩＨＰは骨の細胞の代謝を調整する機械的シグナルとして機能するかどうかを研究した。この目的のため、ＴＧＦ−β１の骨芽細胞の発現に対するＩＨＰの影響を試験した。ＴＧＦ−β１は、骨芽細胞の増殖に影響を与えることが知られており、骨の特定プロテインの表現型の発現を調べた。さらに、マトリックスメタロプロテイナーゼＭＭＰ−２が発現しているかどうかも調べた。
【０１２０】
結果を図１２乃至図１４に示す。図１２乃至図１４は、骨芽細胞様細胞ＭＧ−６３においてＴＧＦ−βプロテインの生成あるいはＭＭＰ−２の発現に対するＩＨＰの影響を説明する。
【０１２１】
図１２は、１０ＭＰａのＩＨＰに曝したＭＧ−６３細胞からのＴＧＦ−β１の放出を時間的経過で分析したものである。図１３は、ＭＧ−６３細胞からのＴＧＦ−β１の放出に対するＩＨＰの投与応答効果を示す。図１２と図１３における棒線と縦線は、対照例と比較して、平均±ＳＤ、それぞれ（ｎ＝３）、ｐ＜０．０５を示す。
【０１２２】
ＭＧ−６３の調節して培地におけるＴＧＦ−β１プロテインの濃度をＥＬＩＳＡによって調べた。ＭＧ−６３細胞については、図１２に示すように、１２時間ＩＨＰに曝した後にもＴＧＦ−β１の放出に関しては大きな変化は観察されなかった。しかしながら、図１２に示すように、負荷を与えなかった細胞に比較して、ＩＨＰを２４時間及び４８時間付与した場合には、ＭＧ−６３からのＴＧＦ−β１の放出は６５％（ｐ＜０．０５）及び５３％（ｐ＜０．０５）減少した。ＨＯＳ　ＴＥ８５細胞についても同様の結果が観察された（データは示さず）。
【０１２３】
図１３に示す第２の一連の研究によって、ＭＧ−６３細胞についてＴＧＦ−β１の発現に対するＩＨＰの投与応答効果を調べた。１ＭＰａと１０ＭＰａのレベルでＩＨＰに１２時間曝した場合には、ＴＧＦ−β１の放出に関して変化を与えなかった。１ＭＰａあるいは１０ＭＰａのいずれについても２４時間付与後に、図１３に示すように、負荷を与えなかった細胞と比較して、ＴＧＦ−β１の培地への放出はそれぞれ２３％と３１％阻止された。
【０１２４】
図１４は、ＭＭＰ−２についてのＥＬＩＳＡによる時間経過の分析結果を示す。
図２０は、調整した培地におけるＭＭＰ−２の放出をＥＬＩＳＡによって定量化した結果を示す。酵素図分析において同様のパターンが観察された（データは示さず）。図２０に示すように、ＩＨＰに２４時間及び４８時間曝した後、対照例と比較して、ＭＭＰ−２の放出がそれぞれ４６％と２８％大幅に阻止された。ＴＩＭＰ−１の放出についても、骨芽細胞様細胞の調整培地において、同一の条件でＩＨＰを付与した場合減少した。ＩＨＰに２４時間及び４８時間投与した後、対照例と比較して、ＴＩＭＰ−１の放出がそれぞれ６３％と２９％大幅に阻止された。ＭＭＰ−１とＭＭＰ−９は、ＩＨＰに曝した細胞も曝さなかった細胞もいずれの時間でも細胞からの培地サンプル中に検出されなかった（データは示さず）。
【０１２５】
図示した酵素図分析によって、ＭＭＰ−２はＭＧ−６３によって放出される主要なマトリックスメタロプロテイナーゼであることが示された。ＩＨＰの存在下で、負荷を与えなかった細胞からのサンプルに比較して、２４時間及び４８時間ＩＨＰに曝した細胞からの培地サンプル中において、ＭＭＰ−２の潜在的な７２ｋＤ形及び活性化両形の６８ｋＤと６２ｋＤの放出が阻止されることが酵素図によって立証された。
【０１２６】
ＶＩ．治療有用性
本発明の治療方法は、整形外科、リウマチ、スポーツ及びリハビリ医療分野で有益である。本発明の方法によって、罹患したあるいは損傷した軟骨、特に関節の軟骨を新生および再生することができる。本方法によって、外部から装置を当てて罹患あるいは損傷した関節に間歇的に数時間静水圧を付与しその後回復期を置くことによってその場で軟骨を外部から処置することが可能となる。また、本方法によって、罹患あるいは損傷した関節から取り出した軟骨あるいは使用可能な軟骨移植片を生体外で再生することが可能となり、軟骨の機械的および生化学的性質が正常なレベルまで回復する程度までこのような軟骨あるいは移植片を回復させ、かつ一旦軟骨のコラーゲンマトリックスが回復した後には関節に対して移植片を戻すことが可能となる。さらに、本方法によって、軟骨、骨細胞及び細胞培養物を試験管内で処置することにより、健康で正常に機能する軟骨及び他の間葉由来の細胞の移植、新生及び生成するのに適した機能的組織にすることを可能とする。
【０１２７】
（実施例１）軟骨細胞の分離
本実施例は、軟骨細胞を分離するために使用する手順を記載する。
地方の食肉処理場から新鮮な状態で得たぎょう骨手根関節から切り取った前厚さの軟骨から成牛の関節軟骨細胞を分離した。
【０１２８】
ダルベコの変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）１５ｍｌで培養することによって軟骨細胞をマトリックスから放出させた。該培地は、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）と以下の混合物を含んでいた。該混合物は、ダルベコの修正イーグル培地／Ｈａｍ‘ｓ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２，Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）１５ｍｌ中各々０．６ｍｌの最終濃度でバクテリア性コラゲナーゼ、タイプＩＩ及びタイプＩＶ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ、ＮＹ）からなり、ゲノトマイシン２５μｇ／ｍｌ含んでいた。軟骨サンプルを３７℃で７．５％ＣＯ２、１００％の湿度において総時間１８時間培養して、完全な消化を行なった。マトリックスから離間した軟骨細胞をナイロンメメッシュフィルタでろ過して単一の細胞を分離した。その後で、６００ｘｇで繰り返し遠心分離して細胞を集めた。細胞はダルベコのリン酸塩緩衝食塩水（３ｘ５０ｍｌ）中に再懸濁させて集めた。
【０１２９】
最終の細胞ペレットを血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２倍地に懸濁させて、トリパン・ブルー排除法によって存続性（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）評価し細胞をヘマサイトメータ（ｈｅｍａｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）において計数した。これらの条件で軟骨細胞に対して得られた正常な存続性は９５％より大きかった。
【０１３０】
その後、軟骨細胞を６０ｍＭの組織プレートに写し、培養物を３７℃で７．５％ＣＯ２の湿気を与えた空気雰囲気中で保持した。血清フリー状態に付けるため、個々のプレートをポリ−Ｄ−リシン（シグマ、０．１ｍｇ／ｍｌ）によって一晩前処理し、カルシウムもマグネシウムも含まないＰＢＳによって２度洗浄した。細胞を１ｘ１０５細胞／ｃｍ２の密度で塗布した。
【０１３１】
（実施例２）血清含有培地あるいは血清フリー培地
本実施例は、血清含有培地あるいは血清フリー培地の組成を記載する。
血清を含有するダルベコの変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）は透析した熱不活性の胎児牛の血清を１０％ｖ／ｖの濃度で含んでいた。血清フリー培地はセレニウムとリポゾームを加えたハムのＦ１２（Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２）／ＤＭＥＭの１：１混合物からなる。リポゾームは、レシチン、コレステロール、スフィンゴミエリシン及びビタミンＥのアセテートをＮ２下に乾燥させた２：１のクロルフォルムとメタノール（ｖｏｌ；ｖｏｌ）に溶解させて準備した。ＤＭＥＭ／Ｄ１２の１ｍｌを加え、脂質混合物を加え、その後脂質混合物に対して各々３分の間隔で７０％デューテイサイクルによりマイクロチップで３回超音波を付与した。このポゾームのストックは、１０００ｘ最終濃度となるようにし、窒素下に保って４℃で貯蔵した。実験によっては、アスコルビン酸塩を培地に５０μｇ／ｍｌの濃度で加えた。
【０１３２】
（実験３）間歇的な静水圧による機械的負荷の付与
本実施例は、間歇的に静水圧を付与するための負荷付与手順及び条件を記載する。
静水圧は、負荷付与量が１０ＭＰで１Ｈｚの周波数で周期的に付与した。間歇的な・・・２，４，８，１２及び２４時間で・・・取り出し、あるいは間歇的負荷付与方法で静水圧を一日当たり４時間に限って付与し、その後２０時間の回復期を置くことを４日間おこなった後細胞を取り出した。上記の操作を４日間あるいはそれより長い間毎日繰り返した。各実験時点を３重に試験し、各実験を最小３回独立試行の形で行なった。
【０１３３】
図１に示すサーボ方水圧負荷付与装置にインターフェースした市販のステンレス鋼製の圧力容器で圧力を発生させた。システムから空気を完全に除去するデザインとし、圧力の付与を純粋に水圧のみとした。培地プレートを５５ｍｌの培地を含む殺菌した熱シールのバッグ内に入れた（ＤＭＥＭ／Ｆ１２　１：１で、二酸化炭素がなくともｐＨ安定性とするため、３０ｍＭのＨＥＰＥＳによりｐＨ７．４に調節した）。
【０１３４】
水圧負荷容器を循環式水浴内に部分的に浸漬することによって温度の制御を行ない、３７℃に保った。９６時間までの負荷付与期間にわたって測定可能な温度変化は生じなかった。対照培地を熱シールしたバックにおいて同一の状態に保ち、負荷を与えた培地と同一の温度に制御した水浴中に置いた容器中に入れた。
【０１３５】
（実施例４）アグレカンとタイプＩＩコラーゲンのｍＲＮＡシグナルレベルの分析（ＲＴ−ＰＣＲ）
本実施例は、アグレカンとタイプＩＩコラーゲンのｍＲＮＡシグナルレベルのＲＴ−ＰＣＲによる分析法を用いた手順を記載する。
各負荷付与条件で複数のサンプルを試験することを可能とするために、アグレカンとタイプＩＩコラーゲンのｍＲＮＡシグナルレベルを分析するためにＪ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．１５：９４に記載された準定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いる実験法を使用した。負荷付与し、間歇的静水圧に曝した細胞と負荷を与えなかった細胞からの総ＲＮＡを、市販の３重試薬（シグマ、セントルイス、ＭＯ）を用いてＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８：５２９６（１９７９）に記載されたクアニディニウム（ｑｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ）イソチオシアネート法によって細胞から抽出した。６０ｍｍプレート当たりの細胞性ＲＮＡの典型的な収率は５μｇであった。
【０１３６】
リボソームＲＮＡをまとめるため、全てのＲＮＡ調合物は、常法によりアガロースゲル状でスクリーニングした。分光測定法によって総ＲＮＡの濃度を決定し、ランダムな６量体のプライマー法を用いて逆転写によって２００ｎｇ／ｕｌの調整した。Ｒナーゼ（ＲＮａｓｅ）インヒビター（５−Ｐｒｉｍｅ，３−Ｐｒｉｍｅ社、Ｂｏｕｌｄｅｒ社）の存在下及び５００ｕＭのｄＮＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）の存在下に、ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素を用いてｍＲＮＡを単一鎖のｃＤＮＡに変えた。反応を１５分３７℃、１０分４２℃で、１０分４７℃で、かつ最後に９９℃に上げて逆転写酵素を不活性化した。反応混合物を１０倍に薄めＰＣＲに用いた。
【０１３７】
配列特異的なオリゴヌクレチドプライマーを用いて、逆転写されたｃＤＮＡサンプル中ターゲット配列をＰＣＲで増殖した。該プライマーはアグレカンゲノムあるいはタイプＩＩコラーゲンゲノム内のスパンの異なるエクソンを跨る約２００ｂｐの配列を生ずるように設計されたものである（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２５：３３５（１９９６）及び（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、３１４：９０（１９９４））。アグレカン及びタイプＩＩコラーゲンについてのプライマーセットは、これらの遺伝子について発表された公表配列データに基づくものである。
【０１３８】
特定の産物のＤＮＡのサイズの分析とＤＮＡの配列によってプライマーセットを用いて生成された産物の有効性を決定した。
ＰＣＲマスター混合物１．５ｕｌを含む０．５ｍｌの反応管内において、１．０ｕｌのｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行なった。反応を６５℃で開始し非特異的にアニ−ルが起こることを防止した。ＰＣＲマスター混合物は、１２５ｍＭのトリスＨＣｌ、５０ｍＭのアンモニウム、各下流及び上流のプライマー及び０．６２５Ｕ／ｍｌのＴｆ１のＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を含んでいた。３２Ｐ−α−ｄＣＴＰを３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ＮＥＮ−社）をマスター混合物に加え、増幅される生成物をランダムに放射性同位元素でラベルするため最終濃度を０．１ｍＣｉ／ｍｌとした。ＰＣＲの開始時の反応体積は２．５ｍｌであった。
【０１３９】
相対的な発現を比較するために、β−アクチンの３’非翻訳領域を増幅するために９００ｎＭのオリゴヌクレチドプライマーセット、５０ｍＭトリスＨＣｌ、２０ｍＭ硫酸アンモニウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウムを含む０．５ｍｌのプライマー溶液を０．５ｍｌを１０回目のサイクルで加えて、同一の反応管で増幅をした。β−アクチンｍＲＮＡシグナルは、増幅条件において反応管対反応管によるばらつき及びｃＤＮＡの最初の濃度あるいは添加量差異をモニターするための内部コントロールとして働いた。温度サイクルプログラムは、最初の加熱は９５℃で３分間の１サイクルを含み、その後９５℃で１分間６５℃で１分間のサイクルを繰り返した。最終的な継続は、７２℃で５分間行なった。本研究で用いた総サイクル数は、アグレカン及びタイプＩＩコラーゲンについては３０サイクル、β−アクチンについては２６サイクルであった。
【０１４０】
ＰＣＲからの増幅産物を５％のポリアクリルアミドゲル状で分離し、フォスホイメージャ（ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて直接分析した。ｍＲＮＡの相対的発現量は、特異的シグナルレベルおよびβ−アクチンに対するアグレカンとタイプＩＩのシグナルの比として表わした。
【０１４１】
（実施例５）統計的方法
本実施例は、実施例３と実施例４において得られた結果を評価するために用いた統計的方法の詳細について記載する。
負荷を与えたサンプルと負荷を与えなかったサンプルとの間の重要な差異について、多重比較試験のためのワンコレクションのための一般線形方法（ｇｅｎｅｒａｌ ｌｉｎｅａｒ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｏｎｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｅｓｔｉｎｇ）を用いて調べた（ＳＡＳ，Ｇａｒｙ，ＮＣ）。
【０１４２】
準定量的ＲＴ−ＰＣＲ法によってｍＲＮＡシグナルレベルを決定することによって、処置したサンプルと非処置サンプルとの間に十分な相違が出てき、それによって５つの独立の試行に対して、ｐ＜０．０５で有意差を決定するためのパワーレベルが得られた。ｍＲＮＡの定量化の場合、β−アクチンの発現する場合に比較して、マトリックス遺伝子の発現に変化が生じるというのが試験の仮説であった。β−アクチンの発現は、間歇的な静水圧に応答して変化しないと決定された。これは、異なった培養サンプルからの有意差を試験するために、対にした試験を採用することを可能とるものである。
【０１４３】
（実施例６）人の繊維芽細胞培養物
本実施例は、人の繊維芽細胞培養物を調整するために用いた手順を記載する。
人の繊維芽様細胞、ＭＧ−６３とＨＯＳ　ＴＥ８５，はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から購入した。
【０１４４】
１０％の牛の胎児の血清（Ｇｉｂｃｏ）と抗体性抗カビ（Ｇｉｂｃｏ，１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌのアンフォテリシン　Ｂ）を含むアルファ最小必須培地（アルファーＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ　ＮＹによって６０ｍＭの皿で３７℃、５％のＣＯ２を含む空気の大気中で細胞を培養した。
【０１４５】
合流させた培地を、血清がない状態でさらに２４時間培養し、成長停止を確認した。培養培地を除去して、各培養プレートを０．１％ＢＳＡ，１５ｍＭＨＥＰＥＳ、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）及びＮａ−β−グリセロールフォスフェ−ト（１０ｍＭ）で補強した血清フリーのアルファーＭＥＭ４０ｍｌを含む熱シールしたバッグ中に入れた。熱シールバックを水を満たした高圧容器内に浸漬し、ＩＨＰ（１Ｈｚの周波数で１あるいは１０ＭＰａ）を・・・間付与した。
【０１４６】
対照培養物は、大気圧で保持した。圧力容器及び負荷を与えない対照培養物はともに大気圧で維持した。圧力容器及び負荷を与えない対照培養物を試験期間中水浴ｃｈ空に保持し温度を３７℃に保った。培養培地サンプルを図１３乃至図１８の図の説明で特定した時間で集めた。
【０１４７】
ｍＲＮＡの安定性を研究するため、アクチノマイシンＤ（２．５ｍｇ／ｍｌ）をメタノールに溶解し、最終濃度が５μＭとして培養物に加えた。
人の軟骨細胞を同様の方法によって得たが、トリプトシン０．１ｍｇ／ｍｌで前処理し、プロテアーゼとコラーゲンインヒビターを除去した。
【０１４８】
（実施例７）調整した培地におけるＴＧＦ−βプロテインレベルの測定
本実施例は、培地中のＴＧＦ−βプロテインレベルの測定に用いた方法を記載する。
ＴＧＦ−β１に対してマッチングさせた対の抗体をＲ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。１ＨＣｌによって、調整培地における潜在的なＴＧＦ−β１を活性化し、１．２ＭＮａＯＨ／０．５Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液によって調整培地サンプルを中性にした。酵素結合イムノソルベント測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて総ＴＧＦ−β１を測定した。全てのサンプルを３重に分析した。５９５ｎＭでバックグランドの補正をし、４５０ｎＭでＥＬＩＳＡリーダによって光学的密度を決定した。
【０１４９】
（実施例８）ＴＧＦ−βに対するノーザンブロット分析
本実施例は、ＴＧＦ−βのノーザン部ロット分析に用いた条件を記載する。
総ＲＮＡを・・・方法によって細胞から抽出した。
ノーザンブロット分析を行なうため、１０μｇの総ＲＮＡを変性し、１％アガロース１．１Ｍホルムアルデヒドゲルで分画し臭化エチジウムで染色して２８Ｓと１８Ｓのバンドを一体的に決定した。標準的方法によってナイロンへの移送を行なった。膜をＴＧＦ−β１（ＡＴＣＣ）とＧＡＰＤＨ（ＡＴＣＣ）に対する３２ＰでラベルしたｃＤＮＡプローブに対してハイブリダイズした。
フォスファメイジャー（ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、ハイブリダイズした各プローブの放射性活性を分析した。
【０１５０】
（実施例９）統計的分析方法
本実施例は、実施例７と実施例８に記載した研究の統計的分析法を記載する。
ＡＮＯＶＡを使用して処置したグループと対象グループの間の有意性を決定し、対としなかった学生の２サンプルのｔ−試験（２つのテイルのある）を、多重比較のためのボンフェローニ近似法によって決定した。全ての値が平均±ＳＤとして与えられる。ノーザンブロットの結果を、ハウスキーピングｍＲＮＡシグナル（ＧＡＰＤＨ）に対するターゲットのｍＲＮＡシグナル（ＴＧＦ−β１）の比として表わした。マン−ウイットニーＵテストを用いて有意さを示すｐ＜０．０５で、ＩＨＰ処置をした場合としない場合について観察されたｍＲＮＡの比の相違を評価した。
【０１５１】
（実施例１０）酵素図法
本実施例は、酵素図法に用いる条件を記載する。
１．０ｍＭの４−アミノ酢酸フェニル水銀（ＡＰＭＡ）中３７℃で１時間培養することによって培地サンプルを活性化した。その後、サンプルをサンプル緩衝液と混合し、１ｍｇ／ｍｌゼラチンを含浸させた１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミノゲル中で試験した。ゲルを水洗いし、水中２．５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００に１時間浸漬した。３７℃で１６時間基質緩衝液（０．０５ＭトリスーＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭＣａＣｌ２、曝した後、・・・３０％エタノール及び１０％酢酸中でコマシーブルー（Ｃｏｍｍａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅ）Ｒ−２５０・・・、その後で水中において洗浄しゼラチンに対する（ｇｅｌａｔｉｎｏｌｙｔｉｃ）活性を顕在化した。
【０１５２】
（実施例１１）調整培地におけるＭＭＰｓとＴＩＭＰ−１のペプチドの測定
本実施例は、培地中にＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９及びＴＩＭＰ−１プロテインが存在するかどうかを決定するために用いた方法を記載する。
負荷付与完了後、各バッグから培地サンプルを集め、製造業者の指示に従って酵素結合イムノソルベント測定法（ＥＬＩＳＡ）キット（Ｏｎｃｏｃｇｅｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を用いて、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９及びＴＩＭＰ−１プロテインの濃度を測定した。
【０１５３】
（実施例１２）ＭＭＰ−２及びＴＩＭＰ−１に対するノーザンブロット分析
本実施例は、ＭＭＰ−２及びＴＩＭＰ−１に対するノーザンブロット分析の条件を記載する。
実施例８に記載したのと同一の方法によって、細胞から総ＲＮＡを抽出した。ノーザンブロット分析をするために、総ＲＮＡ１０μｇを変性し１％アガロース１．１Ｍホルムアルデヒドゲルで分画し、臭化エチジウムで染色し、２８Ｓと１８Ｓのバンドを一体的に標準的方法で決定した。
【０１５４】
膜をＭＭＰ−２とＴＩＭＰ−１（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）に対する３２ＰでラベルしたｃＤＮＡプローブに対してハイブリダイズした。フォスファメイジャー（ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、ハイブリダイズした各プローブの放射性活性を分析した。
【０１５５】
（実施例１３）ｍＲＮＡの安定性の決定
本実施例は、ｍＲＮＡの安定性を決定するのに用いる方法を記載する。
実施例６に従って細胞にアクチノマイシンＤを加えることによって、２４時間機械的負荷付与の試験期間後のｍＲＮＡの安定性を決定した。
血清フリー培養培地４ｍｌ中、ｍｌ当たり・・・ｍｇ・・・。総細胞ＲＮＡを分離する前に、細胞を０，１，２及び４時間の試験期間保持した。ｍＲＮＡシグナルレベルの分析は、ノーザンブロットについての実施例１１に記載した通りに行なった。対照培養物中のｍＲＮＡの安定性は、ＩＨＰに曝さなかった細胞に関して述べた通り決定した。
【０１５６】
（実施例１４）統計的分析
本実施例は、実施例１０乃至実施例１２に記載した研究結果の統計的分析法を記載する。
ＡＮＯＶＡを使用して処置したグループと対象グループの間の有意性を決定し、対としなかった学生の２サンプルのｔ−試験（２つのテイルのある）を、多重比較のためのボンフェローニ近似法によって決定した。全ての値が平均±ＳＤとして与えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、関節の軟骨細胞に対して断続的に静水圧を付与するのに適したサーボ油圧負荷装置の模式図である。
【図２】図２は、断続的に異なった強度の静水圧負荷を間隔をおいて付与した場合の、正常な人の関節の軟骨細胞におけるアグレカン（図２Ａ）及びタイプＩＩコラーゲン（図２Ｂ）の発現に対する影響を示すグラフである。
【図３】図３は、人の変形性関節炎の関節の軟骨細胞におけるアグレカン及びタイプＩＩのコラーゲンのｍＲＮＡシグナルの発現に対する間隔をあけた静水圧の影響を示すグラフである。
【図４】ＥＬＩＳＡ（図４Ａ）及び活性化した（＋ＡＰＭＡ）及び活性化していないプレパラート（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）（図４Ｂ）に対するザイモグラムを用いる酵素活性を使用して正常な人の関節軟骨細胞からのマトリックスのメタロプロテナーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）の放出に対する断続的な異なった強度の静水圧の負荷を間をあけて付与した場合の影響を示すグラフである。
【図５】正常な人の関節軟骨細胞からの形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）の放出に対して、断続的な異なった強度の静水圧の負荷を間を置いた付与した場合の影響を示すグラフである。
【図６】正常な人の関節軟骨細胞からのマクロファージの化学受容吸引（ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ）のタンパク質−１（ＭＣＰ−１）の放出に対して、断続的な異なった強度の静水圧の負荷を間を置いた付与した場合の影響を示すグラフである。
【図７】正常な人の関節軟骨細胞からの繊維芽細胞の成長因子−１（ＦＧＦ−１）に対して、断続的な異なった強度の静水圧での間を置いた負荷の付与を付与した場合に影響がないことを示すグラフである。
【図８】負荷を与えない対象細胞におけるタイプＩＩとタイプＩのコラーゲン及びβ−アクチンの発現に対してのＲＴ−ＰＣＲシグナルレベルを示すグラフである。
【図９】ＩＨＰに曝した細胞及び負荷を与えなかった対象細胞におけるベータアクチンの発現に対するシグナルレベルを示す。
【図１０】高密度の単層培地をＩＨＰに曝した後のアグレカンに対するＲＴ　ＰＣＲシグナルレベルを示す。
【図１１】高密度の単層培地をＩＨＰに曝した後のタイプＩＩのコラーゲンに対するＲＴ　ＰＣＲシグナルレベルを示す。
【図１２】断続的に静水圧（１０ＭＰａ）に曝したＭＧ−６３細胞からのＴＧＦ−ベータの放出を時間の経過と共に分析した結果を示す。
・・・ＭＧ−６３細胞からのＴＧＦ−ベータの放出にたいする、静水圧・・・。
【図１４】ＩＨＰに曝したＭＧ−６３細胞からのＭＭＰ−２の放出を時間の経過と共に分析した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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