(57)【要約】本発明は、熱ショックタンパク質受容体としてのＣＤ３６（「ＣＤ３６」）受容体の使用、ＨＳＰに結合したＣＤ３６を発現する細胞、ならびにＣＤ３６−ＨＳＰ複合体に結合する抗体および他の分子に関する。本発明は、ＣＤ３６と相互作用し、ＣＤ３６とそのリガンド（ＨＳＰ等）との相互作用をモジュレートする化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ、ならびにＣＤ３６受容体配列を含む組成物を、免疫障害、増殖性障害および感染性疾患の診断および治療のために使用する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）試験化合物と、熱ショックタンパク質およびＣＤ３６とを接触させること；ならびに
（ｂ）ＣＤ３６活性または発現のレベルを測定すること；
を含み、（ｂ）で測定した活性または発現のレベルが、該試験化合物の不在下でのＣＤ３６活性のレベルと異なる場合には、ＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセスをモジュレートする化合物が同定されたとする、ＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセスをモジュレートする化合物の同定方法。
【請求項２】
前記同定される化合物が、熱ショックタンパク質とＣＤ３６との相互作用を妨害するアンタゴニストである、請求項１に記載の方法であって、
（ｃ）前記レベルが熱ショックタンパク質とＣＤ３６との相互作用を妨害するか否かを決定するステップ；
をさらに含む、方法。
【請求項３】
前記試験化合物が、ＣＤ３６に特異的な抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試験化合物が、熱ショックタンパク質に特異的な抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試験化合物が小分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記試験化合物がペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドが、ＣＤ３６の少なくとも５つの連続したアミノ酸を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチドが、ＣＤ３６の少なくとも１０の連続したアミノ酸を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ペプチドが、熱ショックタンパク質の配列の少なくとも５つの連続したアミノ酸を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物が、熱ショックタンパク質とＣＤ３６との相互作用を増強するアゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセスが、自己免疫障害、シグナル伝達物質活性の破壊を伴う疾患もしくは障害、サイトカインクリアランスもしくは炎症を伴う疾患もしくは障害、増殖性障害、ウイルス性障害もしくは他の感染性疾患、高コレステロール血症、アルツハイマー病、糖尿病、または骨粗しょう症に影響を及ぼす、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）試験化合物と、熱ショックタンパク質およびＣＤ３６発現細胞とを接触させること；ならびに
（ｂ）該細胞中のＣＤ３６活性または発現のレベルを測定すること；
を含み、（ｂ）で測定した活性または発現のレベルが、該試験化合物の不在下でのＣＤ３６活性のレベルと異なる場合には、ＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセスをモジュレートする化合物が同定されたとする、ＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセスをモジュレートする化合物の同定方法。
【請求項１３】
測定されるＣＤ３６活性は、熱ショックタンパク質と相互作用する能力である、請求項１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
熱ショックタンパク質は抗原ペプチドと非共有的結合で会合しており、測定されるＣＤ３６活性はシグナル伝達活性を誘導する能力である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
熱ショックタンパク質は抗原ペプチドと非共有的結合で会合しており、測定されるＣＤ３６活性は抗原ペプチドに対する細胞障害性Ｔ細胞応答を刺激する能力である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）試験化合物の存在下で、熱ショックタンパク質と、ＣＤ３６、またはその断片、類似体、誘導体もしくは模倣体とを接触させること；ならびに
（ｂ）ＣＤ３６、またはその断片、類似体、誘導体もしくは模倣体に結合した熱ショックタンパク質の量を測定すること；
を含み、（ｂ）で測定した結合熱ショックタンパク質の量が、該試験化合物の不在下で結合した熱ショックタンパク質の量と異なる場合には、ＨＳＰのＣＤ３６への結合をモジュレートする化合物が同定されたとする、熱ショックタンパク質とＣＤ３６との結合をモジュレートする化合物の同定方法。
【請求項１７】
前記ステップ（ａ）で接触させるＣＤ３６が細胞表面上にある、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＣＤ３６が固体表面に固定化されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記固体表面がマイクロタイターディッシュである、請求項１８および７２に記載の方法。
【請求項２０】
細胞を、熱ショックタンパク質特異的抗体と接触させることにより、前記結合した熱ショックタンパク質の量を測定する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記熱ショックタンパク質を標識化し、該標識を検出することにより前記結合した熱ショックタンパク質の量を測定する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記熱ショックタンパク質を蛍光標識で標識する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）試験化合物を、ＣＤ３６発現細胞と、抗原分子に非共有結合で会合した熱ショックタンパク質から本質的になる複合体との混合物に、ＣＤ３６介在型シグナル伝達を促す条件下で添加すること；
（ｂ）ＣＤ３６発現細胞による刺激のレベルを測定すること；
を含み、（ｂ）で測定したレベルが、該試験化合物の不在下での該刺激と異なる場合、ＣＤ３６発現細胞による熱ショックタンパク質介在型シグナル伝達をモジュレートする化合物が同定されたとする、ＣＤ３６発現細胞による熱ショックタンパク質介在型シグナル伝達をモジュレートする化合物の同定方法。
【請求項２４】
ＣＤ３６発現細胞による抗原特異的な細胞障害性Ｔ細胞の刺激を測定する前記ステップ（ｂ）は、
（ｉ）前記ステップ（ａ）で形成したＣＤ３６発現細胞を、Ｔ細胞に、Ｔ細胞の活性化を促す条件下で添加すること；および
（ｉｉ）該細胞障害性Ｔ細胞の活性化レベルを、前記試験化合物の不在下で形成したＣＤ３６発現細胞によるＴ細胞の活性化レベルと比較すること；
を含み、Ｔ細胞活性化のレベルの上昇または低下は、ＣＤ３６発現細胞による熱ショックタンパク質介在型シグナル伝達をモジュレートする化合物が同定されたことを示す、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記シグナル伝達活性が、一酸化窒素の産生である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記シグナル伝達活性が、ＭＣＰ−１ケモカインの産生である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記熱ショックタンパク質がｇｐ９６である、請求項１、１７、７１または２３に記載の方法。
【請求項２８】
患者サンプル中のＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセス由来の活性のレベルを測定することを含み、該測定レベルが、臨床的に正常な個体で認められるレベルと異なる場合に、熱ショックタンパク質−ＣＤ３６関連障害が検出されたとする、哺乳動物における熱ショックタンパク質−ＣＤ３６関連障害の検出方法。
【請求項２９】
患者から得たサンプルと、ＣＤ３６に特異的な抗体とを、該抗体の免疫特異的結合を促す条件下で接触させることを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
患者から得たサンプルと、熱ショックタンパク質に特異的な抗体とを、該抗体の免疫特異的結合を促す条件下で接触させることを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
患者から得たサンプルと、ＨＳＰ−ＣＤ３６複合体に特異的な抗体とを、該抗体の免疫特異的結合を促す条件下で接触させることを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
哺乳動物に、熱ショックタンパク質とＣＤ３６との相互作用をモジュレートする精製化合物を投与することを含む、免疫応答をモジュレートする方法。
【請求項３３】
前記化合物が、熱ショックタンパク質とＣＤ３６との相互作用を増強するアゴニストである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
治療を必要とする哺乳動物に、熱ショックタンパク質とＣＤ３６との相互作用を妨害する精製化合物を投与することを含む、自己免疫障害の治療方法。
【請求項３５】
前記化合物が、熱ショックタンパク質とＣＤ３６との相互作用を妨害するアンタゴニストである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記アンタゴニストが、ＣＤ３６に特異的な抗体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記アンタゴニストが、熱ショックタンパク質に特異的な抗体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記アンタゴニストが小分子である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記アンタゴニストがペプチドである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記ペプチドは、ＣＤ３６の少なくとも５つの連続したアミノ酸を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ペプチドは、熱ショックタンパク質配列の少なくとも５つの連続したアミノ酸を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ペプチドは、熱ショックタンパク質配列の少なくとも１０の連続したアミノ酸を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
治療を必要とする哺乳動物に、機能的ＣＤ３６によるシグナル伝達活性を低下させる、ＣＤ３６を発現する組換え細胞を投与することを含む、自己免疫障害の治療方法。
【請求項４４】
癌細胞または感染細胞の免疫力を高める方法であって、
（ｉ）プロモーターに作用可能に連結し、（ｉｉ）ＣＤ３６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で、該細胞を形質転換することを含む、方法。
【請求項４５】
癌細胞または感染細胞の免疫力を高める方法であって、高い免疫応答を得るために
（ａ）（ｉ）プロモーターに作用可能に連結し、（ｉｉ）ＣＤ３６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
を含む核酸で、細胞を形質転換すること；および
（ｂ）該細胞を、治療を必要とする個体に投与すること；
を含む、方法。
【請求項４６】
（ｉ）プロモーターに作用可能に連結し、（ｉｉ）ＣＤ３６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された、組換え癌細胞。
【請求項４７】
（ｉ）プロモーターに作用可能に連結し、（ｉｉ）ＣＤ３６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された、組換え感染細胞。
【請求項４８】
ヒト細胞である、請求項４６または４７に記載の組換え細胞。
【請求項４９】
（ａ）抗ＣＤ３６抗体またはＣＤ３６の核酸にハイブリダイズ可能な核酸プローブ；（ｂ）精製熱ショックタンパク質、熱ショックタンパク質をコードする核酸、または熱ショックタンパク質を発現する細胞；および（ｃ）熱ショックタンパク質−ＣＤ３６関連障害を検出する際の使用指示書を、１つまたは複数の容器に含む、キット。
【請求項５０】
前記抗体または核酸プローブが、検出可能マーカーで標識化されている、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
標識化ＣＤ３６ポリペプチドをさらに含む、請求項４９に記載のキット。
【請求項５２】
（ａ）精製熱ショックタンパク質、熱ショックタンパク質をコードする核酸、または熱ショックタンパク質を発現する細胞；および（ｂ）ＣＤ３６ポリペプチド、ＣＤ３６ポリペプチドをコードする核酸、またはＣＤ３６ポリペプチドを発現する細胞を、１つまたは複数の容器に含む、キット。
【請求項５３】
前記ＣＤ３６ポリペプチド、ＣＤ３６ポリペプチドをコードする核酸、またはＣＤ３６ポリペプチドを発現する細胞が精製されている、請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
自己免疫障害、感染性疾患、または増殖性障害を治療する際の使用指示書をさらに含む、請求項５２に記載のキット。
【請求項５５】
（ａ）熱ショックタンパク質またはそのペプチド結合断片を、１つ以上のＣＤ３６断片と接触させること；および
（ｂ）該熱ショックタンパク質またはそのペプチド結合断片と特異的に結合するＣＤ３６断片を同定すること；
を含む、熱ショックタンパク質との結合が可能なＣＤ３６断片の同定方法。
【請求項５６】
（ａ）熱ショックタンパク質を、ＣＤ３６断片を発現する細胞と接触させること；および
（ｂ）該細胞中のＣＤ３６活性を測定すること；
を含み、（ｂ）で測定したＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセスのレベルまたは活性のレベルが、ＣＤ３６断片の不在下でのＣＤ３６活性のレベルを上回る場合、ＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセスを誘導可能なＣＤ３６断片が同定されたとする、ＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセスを誘導可能なＣＤ３６断片の同定方法。
【請求項５７】
前記測定されるＣＤ３６活性は、熱ショックタンパク質と相互作用する能力である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記熱ショックタンパク質は抗原ペプチドと非共有的結合で会合し、前記測定されるＣＤ３６活性はシグナル伝達活性を刺激する能力である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記シグナル伝達活性は、一酸化窒素の産生である、請求項５８の方法。
【請求項６０】
前記シグナル伝達活性は、ＭＣＰ−１ケモカインの産生である、請求項５８の方法。
【請求項６１】
前記熱ショックタンパク質は抗原ペプチドと非共有的結合で会合し、前記測定されるＣＤ３６活性は該抗原ペプチドに対する細胞障害性Ｔ細胞応答を刺激する能力である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６２】
（ａ）ＣＤ３６を、１つ以上の熱ショックタンパク質断片と接触させること；および
（ｂ）ＣＤ３６に特異的に結合する熱ショックタンパク質断片を同定すること；
を含む、ＣＤ３６と結合可能な熱ショックタンパク質断片の同定方法。
【請求項６３】
（ａ）ＣＤ３６断片を、熱ショックタンパク質を発現している細胞と接触させること；および
（ｂ）該細胞中のＣＤ３６活性のレベルを測定すること；
を含み、（ｂ）において測定されるＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセスまたは活性のレベルが、該熱ショックタンパク質断片の不在下でのＣＤ３６活性のレベルを上回る場合、ＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセスを誘導可能な熱ショックタンパク質断片が同定されたとする、ＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセスを誘導可能な熱ショックタンパク質断片の同定方法。
【請求項６４】
前記測定するＣＤ３６活性は、熱ショックタンパク質断片と相互作用する能力である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記熱ショックタンパク質断片は抗原ペプチドと非共有的結合で会合し、前記測定するＣＤ３６活性は、シグナル伝達物質活性を刺激する能力である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記熱ショックタンパク質断片は抗原ペプチドと非共有的結合で会合し、前記測定するＣＤ３６活性は、該抗原ペプチドに対する細胞障害性Ｔ細胞応答を刺激する能力である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
（ａ）ＣＤ３６を、１つ以上の試験分子と、結合を促す条件下で接触させること；および
（ｂ）ＣＤ３６に特異的に結合する１つ以上の試験分子を同定すること；
を含む、ＣＤ３６に特異的に結合する分子の同定方法。
【請求項６８】
前記試験分子は、可能性のある免疫療法薬である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
（ａ）ＣＤ３６を、１つ以上の試験分子と、結合を促す条件下で接触させること；および
（ｂ）該試験分子のいずれかがＣＤ３６と特異的に結合しているかどうかを決定すること；
を含む、ＣＤ３６に特異的に結合する分子のスクリーニング方法。
【請求項７０】
（ａ）ＣＤ３６を、ＣＤ３６リガンドまたはそのＣＤ３６結合断片、類似体、誘導体もしくは模倣体と、１つ以上の試験化合物の存在下で接触させること；および
（ｂ）ＣＤ３６に結合した、ＣＤ３６リガンドまたはその断片、類似体、誘導体もしくは模倣体の量を測定すること；
を含み、（ｂ）で測定した結合ＣＤ３６リガンドの量が、該試験化合物の不在下で測定した結合ＣＤ３６の量と異なる場合、ＣＤ３６リガンドとＣＤ３６との結合をモジュレートする化合物が同定されたとする、ＣＤ３６リガンドとＣＤ３６との結合をモジュレートする化合物の同定方法。
【請求項７１】
前記ステップ（ａ）で接触させるＣＤ３６は細胞表面上にある、請求項７０の方法。
【請求項７２】
前記ＣＤ３６は固体表面に固定化されている、請求項７０の方法。
【請求項７３】
（ａ）ＣＤ３６を、１つ以上の試験化合物と接触させること；および
（ｂ）ＣＤ３６活性または発現のレベルを測定すること；
を含み、（ｂ）で測定した活性または発現のレベルが、該１つ以上の試験化合物の不在下での活性のレベルと異なる場合、ＣＤ３６とＣＤ３６リガンドとの相互作用をモジュレートする化合物が同定されたとする、ＣＤ３６とＣＤ３６リガンドとの相互作用をモジュレートする化合物の同定方法。
【請求項７４】
（ａ）１つ以上の試験化合物を、ＣＤ３６発現細胞と、ＣＤ３６リガンドおよび抗原分子の複合体との混合物に、ＣＤ３６介在型シグナル伝達を促す条件下で添加すること；
（ｂ）ＣＤ３６発現細胞による抗原特異的細胞障害性Ｔ細胞の刺激のレベルを測定すること；
を含み、（ｂ）で測定したレベルが、該１つ以上の試験化合物の不在下での該刺激のレベルと異なる場合、ＣＤ３６発現細胞によるシグナル伝達をモジュレートする化合物が同定されたとする、ＣＤ３６発現細胞によるシグナル伝達をモジュレートする化合物の同定方法。
【請求項７５】
哺乳動物に、ＣＤ３６に結合する精製化合物を、該哺乳動物において免疫応答をモジュレートするのに有効な量で投与することを含む、免疫応答をモジュレートする方法。
【請求項７６】
哺乳動物に、ＣＤ３６に結合する精製化合物を、該哺乳動物において疾患または障害を治療または予防するのに有効な量で投与することを含む、疾患または障害を治療または予防する方法。
【請求項７７】
前記疾患または障害は、癌または感染性疾患である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
治療を必要とする哺乳動物に、ＣＤ３６に結合する精製化合物を、該哺乳動物において自己免疫障害を治療するのに有効な量で投与することを含む、自己免疫障害の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０００年１０月６日に出願された米国特許出願第６０／２３８，８６５号（参照により全体的に本明細書に援用する）の恩典を主張する。
【０００２】
１．  序文
本発明は、熱ショックタンパク質受容体としてのＣＤ３６の使用、ＨＳＰに結合したＣＤ３６を発現する細胞、ならびにＣＤ３６−ＨＳＰ複合体に結合する抗体および他の分子に関する。本発明はまた、ＨＳＰとＣＤ３６との相互作用をモジュレートする化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ、ならびに免疫障害、増殖性障害および感染性疾患の診断および治療のためにＣＤ３６−受容体配列を含む組成物を使用する方法にも関する。
【０００３】
２．  発明の背景
２．１．  熱ショックタンパク質
ストレスタンパク質とも呼ばれる熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）は、最初、熱ショックに応答して細胞によって合成されるタンパク質として同定された。Ｈｓｐは、分子量に応じて５つのファミリー（Ｈｓｐ１００、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０およびｓｍＨｓｐ）に分類されている。これらのファミリーの多くのメンバーは、栄養欠乏、代謝障害（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）、酸素ラジカル、および細胞内病原体による感染を含む他のストレス性刺激に応答して誘導されることがその後分かった（Ｗｅｌｃｈ， １９９３年５月， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ５６−６４；Ｙｏｕｎｇ， １９９０， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８：４０１−４２０；Ｃｒａｉｇ， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１９０２−１９０３；Ｇｅｔｈｉｎｇら， １９９２， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：３３−４５；およびＬｉｎｄｑｕｉｓｔら， １９９８， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２２：６３１−６７７を参照）。
【０００４】
熱ショックタンパク質は、既存する最も高度に保存されたタンパク質の１つである。例えば、ＤｎａＫ、すなわち大腸菌由来のＨｓｐ７０は、瘡痕（ｅｘｃｏｒｉａｔｅｓ）由来のＨｓｐ７０タンパク質と約５０％のアミノ酸配列同一性を有する（Ｂａｒｄｗｅｌｌら， １９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：８４８−８５２）。Ｈｓｐ６０およびＨｓｐ９０ファミリーも同様の高レベルのファミリー内保存性を示す（Ｈｉｃｋｅｙら， １９８９， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ９：２６１５−２６２６；Ｊｉｎｄａｌ， １９８９， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ９：２２７９−２２８３）。さらに、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ９０ファミリーは、ストレスタンパク質に配列が関係する（例えば、３５％を上回るアミノ酸同一性を有する）が、ストレスにより発現レベルが変化しないタンパク質からなることが発見されている。
【０００５】
熱ショックおよび他の生理学的ストレスに対する細胞応答に関する研究により、ＨＳＰが、これらの悪条件に対する細胞保護だけではなく、非ストレス細胞中での必須生化学的および免疫学的プロセスにも関与することが示された。ＨＳＰは、異なる種類のシャペロン機能を遂行する。例えば、細胞質、核、ミトコンドリアまたは小胞体に位置するＨｓｐ７０ファミリーのメンバー（Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔら， １９８８， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２２：６３１−６７７）は、免疫系の細胞に対する抗原の提示に関与し、また、正常細胞におけるタンパク質の輸送（ｔｒａｎｓｆｅｒ）、折り畳みおよびアセンブリーにも関与する。ＨＳＰは、タンパク質またはペプチドに結合し、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）または低いｐＨの存在下で、結合したタンパク質またはペプチドを放出することが可能である。
【０００６】
２．２．  ＨＳＰ−ペプチド複合体の免疫原性
Ｓｒｉｖａｓｔａｖａらは、近交系マウスのメチルコラントレン誘導型肉腫に対する免疫応答を実証した（１９８８， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ９：７８−８３）。これらの研究では、これらの腫瘍の個々に異なる免疫原性に関与する分子が、９６ ｋＤａの糖タンパク質（ｇｐ９６）および８４〜８６ ｋＤａの細胞内タンパク質であることが分かった（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら， １９８６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：３４０７−３４１１；Ｕｌｌｒｉｃｈら， １９８６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：３１２１−３１２５）。特定の腫瘍から単離されたｇｐ９６またはｐ８４／８６でのマウスの免疫化は、マウスをその特定の腫瘍に対して免疫にするが、抗原的に異なる腫瘍に対しては免疫にしない。ｇｐ９６およびｐ８４／８６をコードする遺伝子の単離および特徴決定から、それらの間の有意な相同性が明らかになり、ｇｐ９６およびｐ８４／８６がそれぞれ、同じ熱ショックタンパク質の小胞体および細胞質ゾル対応部分であることが示された（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら， １９８８， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ２８：２０５−２０７；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら， １９９１， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６７：１０９−１２３）。さらに、Ｈｓｐ７０は、それが単離された腫瘍に対しては免疫性を引き出すが、抗原的に異なる腫瘍に対しては免疫性を引き出さないことが示された。しかし、ペプチドが枯渇したＨｓｐ７０は、その免疫原性活性を失うことが分かった（ＵｄｏｎｏおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９３， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７８：１３９１−１３９６）。これらの観察は、熱ショックタンパク質がそれ自体で免疫原性なのではなく、抗原ペプチドと非共有結合複合体を形成することでこの複合体が抗原ペプチドに対して特異的な免疫性を引き出すことができることを示唆した（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９３， Ａｄｖ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６２：１５３−１７７；Ｕｄｏｎｏら， １９９４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５２：５３９８−５４０３；Ｓｕｔｏら， １９９５， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６９：１５８５−１５８８）。
【０００７】
癌細胞から精製されたＨＳＰおよびペプチドの非共有結合複合体は、癌を治療および予防するために使用でき、１９９６年４月１１日付けのＰＣＴ公報第ＷＯ ９６／１０４１１号、および１９９７年３月２０日付けの同第ＷＯ ９７／１０００１号（１９９８年４月１２日に発行された米国特許第５，７５０，１１９号、および１９９８年１１月１７日に発行された米国特許第５，８３７，２５１号（それぞれ参照により全体的に本明細書に援用する））に記載されている。例えば病原体感染細胞由来のストレスタンパク質−ペプチド複合体の単離および精製については説明されており、ウイルス等の病原体、ならびに細菌、原生動物、菌類および寄生生物等の他の細胞内病原体により生じる感染の治療および予防のために使用できる（例えば、１９９５年９月２１日付けのＰＣＴ公報第ＷＯ ９５／２４９２３号を参照）。免疫原性ストレスタンパク質−ペプチド複合体はまた、ストレスタンパク質と抗原性ペプチドとのｉｎ ｖｉｔｒｏ複合化によっても調製でき、このような複合体を癌および感染性疾患の治療および予防のために使用することが、１９９７年３月２０日付けのＰＣＴ公報第ＷＯ ９７／１００００号（２０００年２月２９日に発行された米国特許第６，０３０，６１８号）に記載されている。養子免疫療法において使用する抗原提示細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで感作するためにストレスタンパク質−ペプチド複合体を使用することが、１９９７年３月２０日付けのＰＣＴ公報第ＷＯ ９７／１０００２号（１９９９年１１月１６日に発行された米国特許第５，９８５，２７０号も参照）に記載されている。
【０００８】
２．３．  ＣＤ３６
ＣＤ３６は、クラスＢスカベンジャー受容体ファミリーのメンバーであり、毛細血管血管内皮細胞、乳房分泌上皮細胞、分化した脂肪細胞、Ｂ細胞、マクロファージおよび数種類の腫瘍細胞中で主に発現する。ＣＤ３６は、血小板粘着および凝集、アポトーシス細胞のファゴサイトーシス、ならびに長鎖脂肪酸の代謝において役割を果たすと考えられている。ＣＤ３６は、カベオラと呼ばれる微小ドメイン中の血漿膜に位置し、これは、細胞輸送およびシグナリング経路に関与すると見なされている。構造的に、ＣＤ３６は大きい（４６３ ａａ）細胞外ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、および推定上のチロシンキナーゼドッキング部位を含む短い細胞質尾部（ｔａｉｌ）を有する。ＣＤ３６のアミノ酸残基＃１８４〜２０４は、血漿膜と会合している可能性が最も高い受容体の疎水性配列（ｓｔｒｅｔｃｈ）を構成する。抗ＣＤ３６同種抗体は、免疫優性（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ）ドメインとして知られる、アミノ酸１５５〜１８３にある高抗原性構造を認識する。
【０００９】
ＣＤ３６は、単球および巨核球系統（ｌｉｎｅａｇｅ）の両方において発現され、分化の間、上方調節される。ＣＤ３６の単球発現は、Ｍ−ＣＳＦおよびＩＬ−４、ならびに活性化内皮細胞への接着を介して調節される（Ｙｅｓｎｅｒら， １９９６， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ． １６：１０１９−１０２５；Ｈｕｈら， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：６２６７−６２７１）。ＣＤ３６欠損細胞におけるマウスまたはヒトＣＤ３６の発現により、酸化ＬＤＬの特異的かつ高親和性の結合、続いてＬＤＬ内在化および分解が生じる（Ｅｎｄｅｍａｎｎら， １９９３， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１１８１１−１１８１６；Ｎａｖａｚｏら， １９９６， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ． １６：１０３３−１０３９）。ＣＤ３６はまた、長鎖脂肪酸にも結合し、その発現は脂肪酸輸送および代謝に関与する組織中の内皮細胞において上方調節されることが示されている（Ｇｒｅｅｎｗａｌｔら， １９９５， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９６：１３８２−１３８８）。
【００１０】
ヒトにおけるＣＤ３６欠損は、日本の人口の約３％および白色人種の０．３％に見られる。罹患者（ａｆｆｌｉｃｔｅｄ ｐｅｏｐｌｅ）は、表現型的には正常であるが、一部の被検体は酸化ＬＤＬに結合およびそれを内在化する能力が低い（Ｎｏｚａｋｉら， １９９５， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９６：１８５９−１８６５）。
【００１１】
ＣＤ３６はまた、熱帯熱マラリア原虫（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に感染した赤血球への細胞接着（ｃｙｔｏａｄｈｅｒｅｎｃｅ）において役割を果たすことが示されている。感染後、熱帯熱マラリア原虫は、微小血管系内に隔離され、これにより脾臓におけるクリアランスが妨げられて細菌の生存が助長される。ＣＤ３６は、感染した赤血球中の熱帯熱マラリア原虫により産生されるＰｆＥＭＰ１タンパク質に結合する。この結合により、単球および血小板活性化の酸化バースト（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｂｕｒｓｔ）を誘導できる（Ｏｋｅｎｈｏｕｓｅら， １９８９， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８４：４６８−４７５；Ｈｕａｎｇら， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：７８４４−７８４８）。
【００１２】
２．４．  ＧＰ９６
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子は、抗原提示細胞の細胞表面上で抗原を提示する。次いで、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）がＭＨＣ分子およびそれらの関連ペプチドを認識し、標的細胞を殺す。抗原は、それらの由来源が細胞内または細胞外であるかに応じて、２つの異なる抗原処理経路により処理される。細胞内または内因性タンパク質抗原（すなわち、抗原提示細胞内で合成される抗原）は、ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ Ｉ）分子により、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球に提示される。他方、細胞外または外因的に合成される抗原決定基は、ＭＨＣクラスＩＩ分子により、「特殊（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ）」または「専門（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ）」ＡＰＣ（例えばマクロファージ）の細胞表面上で、ＣＤ４＋Ｔ細胞に提示される（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｗ．Ｅ． Ｐａｕｌ（編）， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， １９８４を全般的に参照のこと）。抗原処理経路のこの分画分離（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）は、組織破壊を防ぐために重要でり、さもなくば隣接細胞ＭＨＣ Ｉ抗原の脱落（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）により免疫応答の間に組織破壊が生じ得る。
【００１３】
熱ショックタンパク質ｇｐ９６は、ｇｐ９６が単離される由来源に応じて多様なペプチドをシャペロンする（概要については、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら， １９９８， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８： ６５７−６６５を参照）。腫瘍誘導型ｇｐ９６は、腫瘍抗原ペプチドを担持し（Ｉｓｈｉｉら， １９９９， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６２：１３０３−１３０９）；ウイルス感染細胞由来のｇｐ９６調製物はウイルスエピトープを担持し（ＳｕｔｏおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：１５８５−１５８８；Ｎｉｅｌａｎｄら， １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１８００−１８０５）、オボアルブミンまたはβガラクトシダーゼ等のモデル抗原でトランスフェクトされた細胞由来のｇｐ９６調製物は、対応するエピトープと会合している（Ａｒｎｏｌｄら， １９９５， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８２：８８５−８８９；Ｂｒｅｌｏｅｒら， １９９８， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２８：１０１６−１０２１）。ｇｐ９６とペプチドとの会合はｉｎ ｖｉｖｏで生じる（ＭｅｎｏｒｅｔおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９９， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎ． ２６２：８１３−８１８）。Ｇｐ９６−ペプチド複合体は、細胞から単離されたものであっても（Ｔａｍｕｒａら， １９９７， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：１１７−１２０）またはｉｎ ｖｉｔｒｏで再構成されたものであっても（Ｂｌａｃｈｅｒｅら， １９９７， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６：１１８３−１４０６）優秀な免疫原であり、ｇｐ９６−シャペロン抗原ペプチドに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を引き出すために幅広く使用されている。
【００１４】
ｇｐ９６−ペプチド複合体が免疫応答を誘起する能力は、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩ分子へのペプチドの輸送に依存する（ＳｕｔｏおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９５， 前掲）。小胞体［ＥＲ］中でｇｐ９６によりシャペロンされた内因的合成抗原は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（またはＭＨＣ Ｉ−制限ＣＴＬ）をｉｎ ｖｉｖｏで初回免疫（ｐｒｉｍｉｎｇ）できる；ＣＤ８＋Ｔ細胞のこの初回免疫はマクロファージを必要とする。しかし、外因的に導入されたｇｐ９６−ペプチド複合体が抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を引き出すプロセスは、細胞外抗原のクラスＩ提示機構への転位について確立された経路がないために、完全には理解されていない。それでも、ＨＳＰに会合した細胞外由来源の抗原ペプチドは、何らかの形でマクロファージにより救出（ｓａｌｖａｇｅ）され、内因性経路に送られ（ｃｈａｎｎｅｌ）、ＭＨＣ Ｉ分子により提示され、ＣＤ８＋リンパ球に認識される（ＳｕｔｏおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９５， 前掲；Ｂｌａｃｈｅｒｅら， １９９７， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６：１３１５−２２）。
【００１５】
抗原提示されるための細胞外ペプチドの送達を説明するためにいくつかのモデルが提議されている。「直接輸送」モデルとして知られるある提議は、ＨＳＰシャペロンペプチドが、マクロファージの細胞表面上のＭＨＣ Ｉ分子に輸送され、ＣＤ８＋Ｔリンパ球に提示されることを示唆する。別に示唆されるのは、可溶性細胞外タンパク質が、骨髄誘導型マクロファージおよび樹状細胞中の構成的マクロピノサイトーシスを介して細胞質ゾルに転送され得るということである（Ｎｏｒｂｕｒｙら， １９９７， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２７：２８０−２８８）。さらに別に提議される機構は、ＨＳＰが、マクロファージのＭＨＣクラスＩ分子に摂取され、これにより適切なＴ細胞が刺激されるというものである（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら， １９９４， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３９：９３−９８）。他は、新規細胞内転送経路が、細胞外媒体からＥＲの内腔へのペプチドの輸送に関与し得ることを示唆している（Ｄａｙら， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９４：８０６４−８０６９；Ｎｉｃｃｈｉｔｔａ， １９９８， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０：１０３−１０９）。さらに示唆されているものとしては、（ａ）タンパク質をファゴソームから細胞質ゾルに向かわせる（そこで該タンパク質は正常クラスＩ経路に入る）明白でない経路を有し；（ｂ）リソソーム中の摂取物質を消化し、ペプチドを放出して（ｒｅｇｕｒｇｉｔａｔｅ）クラスＩ分子に対して表面上に載せる、食細胞の関与が挙げられる（Ｂｅｖａｎ， １９９５， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８２：６３９−４１）。
【００１６】
さらに他には、細胞外ペプチドを、抗原提示のためにＡＰＣの細胞表面に送達する受容体介在型経路が提議されている。免疫化に必要なｇｐ９６−シャペロン抗原ペプチドが極少量であること（Ｂｌａｃｈｅｒｅら， １９９７， 前掲）、およびｇｐ９６−ペプチド複合体の免疫原性が機能的抗原提示細胞（ＡＰＣ）に完全に依存すること（Ｕｄｏｎｏら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９１：３０７７−３０８１）を考慮して、ＡＰＣは、ｇｐ９６に対する受容体を有することが提議されている（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら， １９９４， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３９：９３−９８）。このような受容体は、最近、α（２）マクログロブリン受容体またはＣＤ９１として同定および決定された（Ｂｉｎｄｅｒら， ２０００， Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １：１５１−１５５）。ｇｐ９６は、ＣＤ９１を介して細胞中までペプチドを担持し、これらのペプチドを、樹状細胞および抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩ分子に輸送することが提議されている。
【００１７】
ペプチドのＨＳＰ介在型抗原提示に関与する特定の分子の同定および特徴決定により、ＨＳＰおよびＨＳＰ−ペプチド複合体により特定の免疫を引き出すため、ならびに新規診断および治療方法を開発するために有用な試薬および技術が得られるかもしれない。
【００１８】
本明細書中での参考文献の引用および議論は、それらが本発明の先行技術であると自認したものと見なされるべきではない。
【００１９】
３．  発明の要旨
本発明は、ＣＤ３６を熱ショックタンパク質受容体として使用する組成物および方法に関する。本発明は、ＣＤ３６が熱ショックタンパク質の細胞表面受容体であるという出願人の発見に一部基づいている。特に、出願人は、本明細書において、熱ショックタンパク質ｇｐ９６がＣＤ３６発現細胞に結合して、シグナル伝達カスケードを開始して、サイトカイン、ケモカインおよび一酸化窒素産生を生じることを示している。
【００２０】
本発明は、ＨＳＰとＣＤ３６との複合体を含む組成物、ならびにＣＤ３６複合体に結合する抗体および他の分子を提供する。本発明はまた、ＣＤ３６を熱ショックタンパク質受容体として使用する方法も包含し、ＨＳＰとＣＤ３６との相互作用をモジュレートする化合物についてのスクリーニング方法、ならびにＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセスおよびＨＳＰ−ＣＤ３６関連障害／症状（自己免疫障害、増殖性障害および感染疾患等）の治療および検出方法が挙げられる。
【００２１】
本発明は、（ａ）試験化合物と、熱ショックタンパク質およびＣＤ３６とを接触させること；ならびに（ｂ）ＣＤ３６活性または発現のレベルを測定することを含み、（ｂ）で測定した活性または発現のレベルが、該試験化合物の不在下でのＣＤ３６活性のレベルと異なる場合には、ＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセスをモジュレートする化合物が同定されたとする、ＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセスをモジュレートする化合物の同定方法を提供する。本方法の一実施形態では、同定される化合物が、熱ショックタンパク質とＣＤ３６との相互作用を妨害するアンタゴニストであり、（ｃ）前記レベルが熱ショックタンパク質とＣＤ３６との相互作用を妨害するものであるか否かを決定するステップをさらに含む。別の実施形態では、試験化合物は、ＣＤ３６に特異的な抗体である。別の実施形態では、試験化合物は、熱ショックタンパク質に特異的な抗体である。別の実施形態では、試験化合物は小分子である。さらに別の実施形態では、試験化合物はペプチドである。別の実施形態では、ペプチドは、ＣＤ３６の少なくとも５つの連続したアミノ酸を含む。さらに別の実施形態では、ペプチドは、熱ショックタンパク質配列の少なくとも５つの連続したアミノ酸を含む。別の実施形態では、化合物は、熱ショックタンパク質とＣＤ３６との相互作用を増強するアゴニストである。別の実施形態では、ＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセスは、自己免疫障害、細胞シグナリングが関与する疾患もしくは障害、サイトカインクリアランスもしくは炎症を伴う疾患もしくは障害、増殖性障害、ウイルス性障害もしくは他の感染性疾患、高コレステロール血症、アルツハイマー病、糖尿病、または骨粗しょう症に影響を及ぼす。
【００２２】
本発明はまた、（ａ）試験化合物と、熱ショックタンパク質およびＣＤ３６発現細胞とを接触させること；ならびに（ｂ）該細胞中のＣＤ３６活性または発現のレベルを測定することを含み、（ｂ）で測定した活性または発現のレベルが、該試験化合物の不在下でのＣＤ３６活性のレベルと異なる場合には、ＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセスをモジュレートする化合物が同定されたとする、ＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセスをモジュレートする化合物の同定方法も提供する。別の実施形態では、測定されるＣＤ３６活性は、熱ショックタンパク質と相互作用する能力である。
【００２３】
本発明はまた、（ａ）試験化合物の存在下で、熱ショックタンパク質と、ＣＤ３６、またはその断片、類似体、誘導体もしくは模倣体とを接触させること；ならびに（ｂ）ＣＤ３６、またはその断片、類似体、誘導体もしくは模倣体に結合した熱ショックタンパク質の量を測定することを含み、（ｂ）で測定した結合熱ショックタンパク質の量が、該試験化合物の不在下で結合した熱ショックタンパク質の量と異なる場合には、ＨＳＰとＣＤ３６との結合をモジュレートする化合物が同定されたとする、熱ショックタンパク質とＣＤ３６との結合をモジュレートする化合物の同定方法も包含する。別の実施形態では、ステップ（ａ）で接触させるＣＤ３６は細胞表面上にある。別の実施形態では、ＣＤ３６は固体表面に固定化されている。別の実施形態では、固体表面はマイクロタイターディッシュである。別の実施形態では、細胞を、熱ショックタンパク質特異的抗体と接触させることにより、前記結合した熱ショックタンパク質の量を測定する。さらに別の実施形態では、熱ショックタンパク質を標識化し、該標識を検出することにより前記結合した熱ショックタンパク質の量を測定する。別の実施形態では、熱ショックタンパク質を蛍光標識で標識化する。
【００２４】
本発明はさらに、（ａ）試験化合物を、ＣＤ３６発現細胞と、抗原分子に会合した熱ショックタンパク質から本質的になるものとの混合物に、ＣＤ３６介在性シグナル伝達物質産生を促す条件下で添加すること；（ｂ）ＣＤ３６発現細胞によるシグナル伝達物質のレベルを測定することを含み、（ｂ）で測定したレベルが、該試験化合物の不在下での該刺激と異なる場合、ＣＤ３６発現細胞による熱ショックタンパク質介在型シグナル伝達物質刺激をモジュレートする化合物が同定されたとする、ＣＤ３６発現細胞による熱ショックタンパク質介在型細胞シグナリングをモジュレートする化合物の同定方法を提供する。本方法の一実施形態では、シグナル伝達物質刺激のレベルを測定するステップ（ｂ）は、（ｉ）ステップ（ａ）で形成したＣＤ３６発現細胞を、Ｔ細胞に、シグナル伝達物質刺激を促す条件下で添加すること；および（ｉｉ）該Ｔ細胞のシグナル伝達物質活性化のレベルを、前記試験化合物の不在下で形成したＣＤ３６発現細胞によるＴ細胞の活性化のレベルと比較することを含み、Ｔ細胞活性化のレベルの上昇または低下は、ＣＤ３６発現細胞による熱ショックタンパク質介在型シグナル伝達をモジュレートする化合物が同定されたことを示す。
【００２５】
様々な実施形態において、本発明の方法で使用する熱ショックタンパク質はｇｐ９６である。
【００２６】
別の実施形態では、本発明は、患者サンプル中のＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセスのレベルを測定することを含み、該測定レベルが、臨床的に正常な個体で認められるレベルと異なる場合に、熱ショック−ＣＤ３６関連障害が検出されたとする、哺乳動物における熱ショックタンパク質−ＣＤ３６関連障害の検出方法を提供する。
【００２７】
本発明はまた、本発明の組成物を含むキットも包含する。一実施形態では、（ａ）精製熱ショックタンパク質、熱ショックタンパク質をコードする核酸、または熱ショックタンパク質を発現する細胞；および（ｂ）ＣＤ３６ポリペプチド、ＣＤ３６ポリペプチドをコードする核酸、またはＣＤ３６ポリペプチドを発現する細胞が、１つまたは複数の容器にパッケージングされた、キットを提供する。一実施形態では、ＣＤ３６ポリペプチド、ＣＤ３６ポリペプチドをコードする核酸、またはＣＤ３６ポリペプチドを発現する細胞は精製されている。別の実施形態では、キットは、自己免疫障害、感染性疾患、または増殖性障害を治療する際の使用指示書をさらに含む。
【００２８】
本発明はまた、哺乳動物に、熱ショックタンパク質とＣＤ３６との相互作用をモジュレートする精製化合物を投与することを含む、免疫応答をモジュレートする方法も提供する。一実施形態では、化合物は、熱ショックタンパク質とＣＤ３６との相互作用を増強するアゴニストである。本方法の別の実施形態では、化合物は、熱ショックタンパク質とＣＤ３６との相互作用を妨害するアンタゴニストである。
【００２９】
本発明はさらに、治療を必要とする哺乳動物に、熱ショックタンパク質とＣＤ３６との相互作用を妨害する精製化合物を投与することを含む、自己免疫障害の治療方法を提供する。本方法の一実施形態では、化合物は、熱ショックタンパク質とＣＤ３６との相互作用を妨害するアンタゴニストである。別の実施形態では、アンタゴニストは、ＣＤ３６に特異的な抗体である。別の実施形態では、アンタゴニストは、熱ショックタンパク質に特異的な抗体である。別の実施形態では、アンタゴニストは小分子である。別の実施形態では、アンタゴニストはペプチドである。別の実施形態では、ペプチドは、ＣＤ３６の少なくとも５つの連続したアミノ酸を含む。別の実施形態では、ペプチドは、熱ショックタンパク質配列の少なくとも５つの連続したアミノ酸を含む。
【００３０】
本発明はさらに、癌細胞または感染細胞の免疫力を高める方法であって、（ｉ）プロモーターに作用可能に連結し、（ｉｉ）ＣＤ３６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で、該細胞を形質転換することを含む、方法を提供する。
【００３１】
本発明はさらに、癌細胞または被感染細胞の免疫力を高める方法であって、高い免疫応答を得るために（ａ）（ｉ）プロモーターに作用可能に連結し、（ｉｉ）ＣＤ３６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で、該細胞を形質転換すること；および（ｂ）該細胞を、治療を必要とする個体に投与することを含む、方法を提供する。
【００３２】
本発明はまた、（ｉ）プロモーターに作用可能に連結し、（ｉｉ）ＣＤ３６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された、組換え癌細胞も提供する。一実施形態では、組換え細胞はヒト細胞である。
【００３３】
さらに別の実施形態では、本発明は、（ｉ）プロモーターに作用可能に連結し、（ｉｉ）ＣＤ３６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された、組換え感染細胞を提供する。一実施形態では、組換え細胞はヒト細胞である。
【００３４】
別の実施形態では、本発明は、（ａ）ＣＤ３６を、１つ以上の試験分子と、結合を促す条件下で接触させるステップ；および（ｂ）該試験分子のいずれかがＣＤ３６と特異的に結合しているかどうかを決定するステップを含む、ＣＤ３６に特異的に結合する分子のスクリーニング方法を提供する。本方法の一実施形態では、試験分子は、免疫療法薬としての可能性のあるものである。
【００３５】
本発明はまた、（ａ）ＣＤ３６を、ＣＤ３６リガンドまたはそのＣＤ３６結合断片、類似体、誘導体もしくは模倣体と、１つ以上の試験化合物の存在下で接触させること；および（ｂ）ＣＤ３６に結合した、ＣＤ３６リガンドまたはその断片、類似体、誘導体もしくは模倣体の量を測定することを含み、（ｂ）で測定した結合ＣＤ３６リガンドの量が、該試験化合物の不在下で測定した結合ＣＤ３６の量と異なる場合、ＣＤ３６リガンドとＣＤ３６との結合をモジュレートする化合物が同定されたとする、ＣＤ３６リガンドとＣＤ３６との結合をモジュレートする化合物の同定方法も提供する。
【００３６】
別の実施形態では、（ａ）ＣＤ３６を、１つ以上の試験化合物およびＣＤ３６リガンドと接触させること；ならびに（ｂ）活性または発現のレベルを測定することを含み、（ｂ）で測定した活性または発現のレベルが、該１つ以上の試験化合物の不在下でのＣＤ３６活性のレベルと異なる場合、ＣＤ３６とＣＤ３６リガンドとの相互作用をモジュレートする化合物が同定されたとする、ＣＤ３６とＣＤ３６リガンドとの相互作用をモジュレートする化合物の同定方法を提供する。
【００３７】
別の実施形態では、本発明は、哺乳動物に、ＣＤ３６に結合する精製化合物を、該哺乳動物において免疫応答をモジュレートするのに有効な量で投与することを含む、免疫応答をモジュレートする方法を提供する。
【００３８】
さらに別の実施形態では、哺乳動物に、ＣＤ３６に結合する精製化合物を、該哺乳動物において疾患または障害を治療または予防するのに有効な量で投与することを含む、疾患または障害を治療または予防する方法を提供する。一実施形態では、疾患または障害は、癌または感染性疾患である。
【００３９】
さらなる実施形態では、治療を必要とする哺乳動物に、ＣＤ３６に結合する精製化合物を、該哺乳動物において自己免疫障害を治療するのに有効な量で投与することを含む、自己免疫障害の治療方法を提供する。
【００４０】
本明細書中で使用する「ＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセス」という用語は、ＨＳＰとＣＤ３６との相互作用に対して直接的または間接的に依存および／または応答するプロセスを指す。このようなプロセスとしては、様々なＣＤ３６リガンド（リポタンパク質複合体、トロンボスポンジン１、熱帯熱マラリア原虫赤血球膜タンパク質１（ＰｆＥＭＰ１）、ＬＤＬおよびリン脂質が挙げられるがこれらに限定されない）の結合に関係するシグナル伝達刺激活性等、ＣＤ３６の異常レベルの発現、合成および／または活性から生じるプロセスが挙げられる。このようなプロセスとしては、アポトーシス細胞の食作用および長鎖脂肪酸の代謝が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
本明細書で使用する「ＨＳＰ−ＣＤ３６関連障害」および「ＨＳＰ−Ｃ３６関連症状」という用語は、ＨＳＰ−ＣＤ３６相互作用が関与する障害および症状をそれぞれ指す。このような障害および症状は、例えば、正常で、影響を受けておらず、損なわれていない個体で認められるレベル、臨床的に正常な個体で認められるレベル、ならびに／または基準線、平均ＨＳＰおよび／もしくはＣＤ３６レベルを表すレベルの集団で認められるレベルと比べて、ＨＳＰおよび／またはＣＤ３６の発現、合成および／または活性のレベルが異常であることがおそらく原因である、ＨＳＰと相互作用するＣＤ３６の異常な能力により生じ得る。このような障害としては、自己免疫障害、細胞シグナリングまたは成長妨害を伴う疾患および障害、サイトカインクリアランスおよび／または炎症を伴う疾患および障害、増殖性障害、ウイルス障害および他の感染性疾患、高コレステロール血症、アルツハイマー病、糖尿病、ならびに骨粗しょう症が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４２】
本明細書で使用する「ＣＤ３６リガンド」という用語は、ＣＤ３６に結合可能な分子を指す。このようなＣＤ３６リガンドとしては、公知のリガンドと共に、リポタンパク質複合体、トロンボスポンジン１、熱帯熱マラリア原虫赤血球膜タンパク質１（ＰｆＥＭＰ１）、およびリン脂質が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、ＣＤ３６リガンドとしては、当該分野で周知の標準的な結合アッセイを用いてＣＤ３６リガンドとして容易に同定される分子も挙げられる。このようなＣＤ３６リガンドは、典型的に、ＣＤ３６に結合する際に細胞によりエンドサイトーシスにより取り込まれる。
【００４３】
４．  図面の簡単な説明
図面の簡単な説明については後述する。
【００４４】
５．  発明の詳細な説明
本発明は、熱ショックタンパク質（「ＨＳＰ」）受容体としてＣＤ３６を使用する組成物および方法に関する。特に、本発明は、単離ＣＤ３６−リガンド複合体（例えば、ＣＤ３６−ＨＳＰ複合体）（単離および／または組換え細胞、ならびにＣＤ３６とＨＳＰ等のＣＤ３６リガンドとの相互作用をモジュレートする抗体、分子および化合物が挙げられる）を含む組成物を提供する。本発明は、ＣＤ３６を熱ショックタンパク質受容体として使用する方法をさらに包含し、ＣＤ３６とＨＳＰまたは他のＣＤ３６リガンドとの相互作用をモジュレートする化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ、ならびにこれらの分子および複合体を免疫障害、増殖性障害および感染性疾患の診断および治療のために使用する方法が挙げられる。
【００４５】
本明細書で使用する「ＣＤ３６リガンド」という用語は、ＣＤ３６に結合可能な分子を指す。このようなＣＤ３６リガンドとしては、公知のリガンドと共に、リポタンパク質複合体、トロンボスポンジン、熱帯熱マラリア原虫赤血球膜タンパク質１（ＰｆＥＭＰ１）、ＬＤＬ、およびリン脂質が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、ＣＤ３６リガンドは、当該分野で周知の標準的な結合アッセイを用いてＣＤ３６リガンドとして容易に同定される分子も含む。
【００４６】
本発明の実施において有用なＨＳＰは、以下の基準を満たす任意の細胞タンパク質から選択され得る：すなわち、細胞がストレス性刺激に曝されるとＨＳＰの細胞内濃度が増加すること；ＨＳＰが他のタンパク質もしくはペプチドに結合でき、そしてアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下もしくは低いｐＨにて結合したタンパク質もしくはペプチドを放出できること；またはＨＳＰが、上記性質のいずれかを有する任意の細胞タンパク質と少なくとも３５％の相同性を有すること。本発明の組成物および方法において使用するＨＳＰとしては、ＨＳＰ９０、ｇｐ９６、ＢｉＰ、Ｈｓｐ７０、ＤｎａＫ、Ｈｓｃ７０、ＰｈｏＥカルレティキュリン、ＰＤＩ、またはｓＨｓｐを単独でまたは組み合わせたものが好ましい（ただしこれらに限定されない）。
【００４７】
好適な実施形態では、ＨＳＰは、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマなどの家畜）のものであり、最も好ましくはヒトのものである。
【００４８】
本発明の実施において有用なＨｓｐとしては、ＨＳＰ６０ファミリー、ＨＳＰ７０ファミリー、ＨＳＰ９０ファミリー、ＨＳＰ１００ファミリー、ｓＨＳＰファミリーのメンバー、カルレティキュリン、ＰＤＩ、ならびにチオレドキシン様ドメインを含む小胞体に入った他のタンパク質（ＥＲｐ７２およびＥＲｐ６１等、ただしこれらに限定されない）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４９】
ＨＳＰ類似体、突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ）、誘導体および断片も、本発明のＨＳＰの代わりに使用できる。本発明で使用するＨＳＰペプチド結合「断片」とは、ペプチドと非共有的結合で会合して、免疫応答を誘導可能な複合体を形成できるＨＳＰペプチド結合ドメインを含むポリペプチドを指す。一実施形態では、ＨＳＰペプチド結合断片は、約１００〜２００のアミノ酸のＨＳＰペプチド結合ドメインを含むポリペプチドである。
【００５０】
類似する配列をアライメントスコアおよび統計によりランク付けするＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴ等のプログラムを使用してデータベースを検索し、照会配列に対して様々な程度の類似性を有する配列を同定することもできる。本発明の方法で使用するＨＳＰの調製のために使用できる限定しないＨＳＰの例に対するこのようなヌクレオチド配列としては以下のものがある：ヒトＨｓｐ７０、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５３４５、Ｓａｒｇｅｎｔら， １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８６：１９６８−１９７２；ヒトＨｓｐ９０、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ１５１８３、Ｙａｍａｚａｋｉら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：７１０８；ヒトｇｐ９６：Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ１５１８７、Ｍａｋｉら， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ．， ８７：５６５８−５５６２；ヒトＢｉＰ：Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１９６４５；Ｔｉｎｇら， １９８８， ＤＮＡ ７：２７５−２８６；ヒトＨｓｐ２７、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ２４７４３；Ｈｉｃｋｅｙら， １９８６， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：４１２７−４５；マウスＨｓｐ７０：Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ３５０２１、Ｈｕｎｔら， １９９０， Ｇｅｎｅ， ８７：１９９−２０４；マウスｇｐ９６：Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１６３７０、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら， １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８５：３８０７−３８１１；およびマウスＢｉＰ：Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ１６２７７、Ｈａａｓら， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８５：２２５０−２２５４。遺伝子コードの縮重のため、本明細書で使用する「ＨＳＰ配列」という用語は、天然型アミノ酸およびヌクレオチド配列のみではなく、ＨＳＰをコードするその他全ての縮重配列も包含する。
【００５１】
上記ＨＳＰファミリーは、ＨＳＰに配列が関係する（例えば、３５％を上回るアミノ酸同一性を有する）が、ストレスによって発現レベルが変化しないタンパク質も含む。従って、本明細書で使用する熱ショックタンパク質またはストレスタンパク質の定義は、ストレス性刺激に応答して細胞中での発現レベルが増強するファミリーのメンバーと少なくとも３５％〜５５％、好ましくは５５％〜７５％、そして最も好ましくは７５％〜８５％のアミノ酸同一性を有する他のタンパク質、変異体、類似体、およびその変種を包含することを意図する。２つの配列間の同一性％の決定は、数学的アルゴリズムを用いても達成できる。２つの配列を比較するために利用する数学的アルゴリズムの好ましい限定しない例としては、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７に記載されるように改変された、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら， １９９０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、文字長さ＝１２で行い、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、文字長さ＝３で行い、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較する目的でギャップド（ｇａｐｐｅｄ）アライメントを得るために、ギャップドＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら， １９９７， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２に記載されるように利用できる。あるいはまた、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の距離関係を検出する反復検索を実施できる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら， １９９７， 前掲）。ＢＬＡＳＴ、ギャップドＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用できる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照）。配列の比較に利用する数学的アルゴリズムの別の好ましい限定しない例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ， １９８８， ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためのＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み付け残基テーブル（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、ギャップ長さペナルティー：１２、およびギャップペナルティー：４を使用できる。
【００５２】
本発明の免疫原性ＨＳＰ−ペプチド複合体は、ＨＳＰ、および哺乳動物において免疫応答を誘導可能なペプチドを含む任意の複合体を含み得る。ペプチドは、ＨＳＰと非共有的結合で会合することが好ましい。好ましい複合体としては、ｇｐ９６−ペプチド複合体、ＨＳＰ９０−ペプチド複合体、ＨＳＰ７０−ペプチド複合体、ＨＳＰ６０−ペプチド複合体、ＨＳＰ１００−ペプチド複合体、カルレティキュリン−ペプチド複合体、およびｓＨＳＰ−ペプチド複合体が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、真核生物細胞の小胞体中に存在し、細胞質ＨＳＰ９０に関係するＨＳＰ ｇｐ９６を使用して、ｇｐ９６−ペプチド複合体を含む有効なワクチンを産生できる。
【００５３】
本発明で使用するＨＳＰ、ＣＤ３６および／または抗原分子は、天然の由来源から精製、化学的に合成、または組換えにより作製できる。ＨＳＰは、患者に対して同種のもの（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）であってもよいが、好適な実施形態では、ＨＳＰはそれを投与する患者に対して同原のもの（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）である。
【００５４】
５．１．  本発明の組成物
本発明は、ＣＤ３６とＣＤ３６リガンド（例えば、ＨＳＰ等）との相互作用をモジュレートする組成物を提供する。このような組成物は、免疫応答を誘導またはモジュレートする方法において使用できる。このような組成物は、ＨＳＰ−ＣＤ３６複合体、ＨＳＰ−ＣＤ３６複合体を発現する単離細胞、ならびに組換えＣＤ３６およびＨＳＰ配列を含む単離および組換え細胞を特異的に認識する抗体も含む。さらに、本発明の様々な方法において、ＣＤ３６をコードする配列、ＨＳＰ、およびＣＤ３６を免疫療法に使用する。このような組成物は、例えば、増殖性障害、感染性疾患および他のＨＳＰ−ＣＤ３６関連障害に対する免疫療法のために使用できる。このような組成物の合成および作製の方法は、本明細書に記載している。
【００５５】
５．１．１．  組換え発現
本発明の様々な実施形態では、ＣＤ３６、ＨＳＰまたは他のＣＤ３６リガンドをコードする配列を、発現ベクターに挿入して、組換え細胞中で増殖および発現させる。従って、一実施形態では、ＣＤ３６、ＨＳＰ、または他のＣＤ３６リガンドコード領域を、組換え細胞中での発現のために非天然型プロモーターと連結させる。
【００５６】
出願人の発見に基づくと、ＣＤ３６の細胞外部分はＨＳＰおよびＨＳＰ−抗原ペプチド複合体を認識および結合する役目をおそらく負っている。ＣＤ３６とＨＳＰとの相互作用は、免疫応答を刺激するシグナル伝達経路を誘発する。本発明に基づき、ＣＤ３６およびＨＳＰ相互作用のアゴニストおよびアンタゴニストを含む組成物を用いて、免疫応答をモジュレートできる。従って、組換えＣＤ３６ポリペプチド、ＣＤ３６とＨＳＰとの複合体またはＨＳＰ−抗原ペプチド複合体、ならびにＣＤ３６を発現する組換え細胞を、本明細書に記載する免疫療法のための方法および診断方法に使用できる。
【００５７】
本発明の様々な実施形態では、ＣＤ３６および／もしくは熱ショックタンパク質をコードする配列、またはそれらの断片を発現ベクターに挿入して、組換え細胞中で増殖および発現させる。本明細書で使用する発現構築物とは、適切な宿主細胞中でのコード遺伝子産物の発現を可能にする１つ以上の調節領域と作用可能に会合するＣＤ３６またはＨＳＰ等の特定の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を指す。「作用可能に会合する」とは、調節領域、および発現される遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列が転写、そして最終的に翻訳可能なように連結および位置する会合を指す。
【００５８】
ＤＮＡは、当該分野で公知の標準的な手順により配列データベースから得た公知の配列に基づき、ＤＮＡ増幅または分子クローニングにより、組織、細胞培養物またはクローン化ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ「ライブラリー」）から直接得てもよい。任意の真核生物細胞が、ｈｓｐ遺伝子のコード領域を得るための核酸由来源の役目を果たし得る。ＨＳＰをコードする核酸配列は、脊椎動物、哺乳動物、および霊長類由来源（ヒトを含む）から単離できる。ゲノムＤＮＡから誘導されるクローンは、コード領域に加えて調節およびイントロンＤＮＡ領域を含み得る；ｃＤＮＡから誘導されるクローンは、エキソン配列のみを含む。由来源に関わらず、ｈｓｐ遺伝子は、遺伝子の増殖のために適切なベクターにクローニングされるべきである。
【００５９】
大腸菌を利用したベクターは、外来タンパク質の高レベル発現のために最も一般的かつ用途が広い系である（Ｍａｋｒｉｄｅｓ， １９９６， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ， ６０：５１２−５３８）。大腸菌中の発現のために使用できる調節領域の限定しない例としては、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ｔａｃ、λＰＬ、ならびにファージＴ３およびＴ７プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない（Ｍａｋｒｉｄｅｓ， １９９６， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ， ６０：５１２−５３８）。原核生物発現ベクターの限定しない例としては、λｇｔ１１等のλｇｔベクターシリーズ（”ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”， Ｖｏｌ． Ｉ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｄ． Ｇｌｏｖｅｒ編）， ｐｐ． ４９−７８， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄに掲載のＨｕｙｎｈら， １９８４）、およびｐＥＴベクターシリーズ（Ｓｔｕｄｉｅｒら， １９９０， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １８５：６０−８９）が挙げられ得る。しかし、原核生物宿主ベクター系の潜在的な欠点は、哺乳動物細胞の多くの翻訳後処理事象を行うことができないことである。従って、真核生物宿主ベクター系が好ましく、哺乳動物宿主ベクター系がより好ましく、ヒト宿主ベクター系が最も好ましい。
【００６０】
例えば、ＣＤ３６配列の転写に必要な調節領域を、発現ベクターは備えることができる。翻訳開始コドン（ＡＴＧ）も、開始コドンを欠くＣＤ３６をコードするヌクレオチド配列を発現するために備えてもよい。互換性のある宿主構築物系では、転写のために必要な細胞タンパク質（ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子等）は、発現構築物上の調節領域に結合して、宿主生物中でＣＤ３６配列の転写をもたらす。遺伝子発現のために必要な調節領域の厳密な性質は、宿主細胞により異なり得る。一般的に、ＲＮＡポリメラーゼに結合して、作用可能に会合した核酸配列の転写を開始できるプロモーターが必要とされる。このような調節領域は、転写および翻訳の開始に関与する５’非コード配列（ＴＡＴＡボックス、キャップ部位、ＣＡＡＴボックス等）を含み得る。コード配列の３’側の非コード領域は、転写終結調節配列（ターミネーターおよびポリアデニル化部位等）を含み得る。
【００６１】
構成的および誘導可能調節領域の両方とも、ＣＤ３６、ＨＳＰまたは他のＣＤ３６リガンドの発現のために使用され得る。組換え細胞の成長のために最適な条件と、遺伝子産物の高レベル発現のための条件が異なる場合には、誘導可能プロモーターを使用することが望ましいかもしれない。有用な調節領域の例は、以下次節において記載する。
【００６２】
哺乳動物宿主細胞中でのＣＤ３６、ＨＳＰまたは他のＣＤ３６リガンド遺伝子産物の発現のためには、例えば、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）極初期プロモーター、ならびにラウス肉腫ウイルス長末端反復配列（ＲＳＶ−ＬＴＲ）プロモーター等の様々な調節領域が使用できる。哺乳動物細胞において有用であり得る誘導可能なプロモーターとしては、メタロチオネインＩＩ遺伝子、マウス乳腺癌ウイルスグルココルチコイド応答型長末端反復配列（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ）、βインターフェロン遺伝子、およびＨｓｐ７０遺伝子を伴うものが挙げられるがこれらに限定されない（Ｗｉｌｌｉａｍｓら， １９８９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４９：２７３５−４２；Ｔａｙｌｏｒら， １９９０， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １０：１６５−７５）。熱ショックプロモーターまたはストレスプロモーターを使用して、組換え宿主細胞中でＣＤ３６の発現を駆動することが有利かもしれない。
【００６３】
組織特異性を示し、トランスジェニック動物で利用されてきた以下の動物調節領域も、特定の組織種類の腫瘍細胞において使用できる：すなわち、膵臓腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら， １９８４， Ｃｅｌｌ ３８：６３９−６４６；Ｏｒｎｉｔｚら， １９８６， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ， １９８７， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５）；膵臓β細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−１２２）；リンパ球において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら， １９８４， Ｃｅｌｌ ３８：６４７−６５８；Ａｄａｍｅｓら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら， １９８７， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７：１４３６−１４４４）；精巣、胸、リンパ球および肥満細胞において活性なマウス乳腺癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら， １９８６， Ｃｅｌ ４５：４８５−４９５）；肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら， １９８７， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． １：２６８−２７６）；肝臓において活性なαフェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら， １９８５， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：１６３９−１６４８；Ｈａｍｍｅｒら， １９８７， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８）；肝臓において活性なα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら， １９８７， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． １：１６１−１７１）；骨髄細胞において活性なβグロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａｓら， １９８６， Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）；脳中の稀突起膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら， １９８７， Ｃｅｌｌ ４８：７０３−７１２）；骨格筋において活性なミオシン軽鎖２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−２８６）；ならびに視床下部において活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｃ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら， １９８６， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−１３７８）。
【００６４】
宿主細胞中でのＣＤ３６の発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント（ＳＶ４０ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、免疫グロブリン遺伝子、メタロチオネイン、βアクチンにおいて認められるもの等）を発現ベクターに含むことにより増強され得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら， １９８７， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３：５１６−５４４；Ｇｏｒｍａｎ， １９９０， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １：３６−４７を参照）。
【００６５】
発現ベクターは、１種類を上回る宿主細胞中でのベクターの維持および複製、または宿主染色体へのベクターの組込みを可能にする配列も含み得る。このような配列としては、複製起点、自律複製配列（ＡＲＳ）、セントロメアＤＮＡおよびテロメアＤＮＡが挙げられるがこれらに限定されない。少なくとも２種類の宿主細胞において複製および維持可能なシャトルベクターを使用することも有利であり得る。
【００６６】
さらに、発現ベクターは、ＣＤ３６をコードするＤＮＡを含む宿主細胞をまず最初に単離または同定するために、選択可能またはスクリーニング可能マーカー遺伝子を含み得る。ＣＤ３６の長期に及ぶ高収率生成のためには、哺乳動物細胞中での安定した発現が好ましい。多数の選択系が哺乳動物細胞のために使用でき、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら， １９７７， Ｃｅｌｌ １１：２２３）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＳｚｙｂａｌｓｋｉおよびＳｚｙｂａｌｓｋｉ， １９６２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ４８：２０２６）、ならびにアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら， １９８０， Ｃｅｌｌ ２２：８１７）遺伝子がそれぞれｔｋ、ｈｇｐｒｆまたはａｐｒｔ細胞において採用できるがこれらに限定されない。また、メトトレキセートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）（Ｗｉｇｌｅｒら， １９８０， Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：３５６７；Ｏ’Ｈａｒｅら， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：１５２７）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：２０７２）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら， １９８１， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１）；ならびにハイグロマイシンに対する耐性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）（Ｓａｎｔｅｒｒｅら， １９８４， Ｇｅｎｅ ３０：１４７）の選択の基準として、代謝拮抗物質耐性を用いることができる。ヒスチジノールおよびＺｅｏｃｉｎＴＭ等（これらに限定されない）の他の選択可能なマーカーも使用できる。
【００６７】
ＣＤ３６、ＨＳＰ、または他のＣＤ３６リガンドをコードするＤＮＡ配列をベクターのクローニング部位に挿入するためには、プロモーター等の調節機能を有するＤＮＡ配列を、ＣＤ３６、ＨＳＰ、または他のＣＤ３６リガンドをそれぞれコードするＤＮＡ配列に付着しなければならない。このためには、適切な適合制限部位を提供するリンカーまたはアダプターを、当該分野で周知の技術により、ＣＤ３６をコードするｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡの端部にライゲートし得る（Ｗｕら， １９８７， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５２：３４３−３４９）。制限酵素での切断の後に修飾を行って、ライゲート前に一本鎖ＤＮＡ末端を消化または埋めて、平滑末端を作ってもよい。あるいはまた、所望の制限酵素部位を含むプライマーでのＰＣＲを使用してＤＮＡを増幅することにより、所望の制限酵素部位をＤＮＡの断片に導入できる。
【００６８】
一実施形態では、調節領域に作用可能に会合したＣＤ３６配列を含む発現構築物を、適切な宿主細胞に直接導入して、それ以上クローニングすること無くＣＤ３６を発現および産生できる（例えば、米国特許第５，５８０，８５９号を参照）。発現構築物はまた、ＣＤ３６配列を（例えば、相同組換えを介して）宿主細胞のゲノムに組み込み易くするＤＮＡ配列を含み得る。この場合、宿主細胞中でＣＤ３６を増殖および発現させるために、適切な宿主細胞に適した複製起点を含む発現ベクターを採用する必要はない。
【００６９】
ＣＤ３６、ＨＳＰ、または他のＣＤ３６リガンドをコードするクローニングされたヌクレオチド配列を含む発現構築物は、当該分野で公知の様々な技術により宿主細胞に導入することができ、原核生物細胞については細菌形質転換（Ｈａｎａｈａｎ， １９８５， ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， １：１０９−１３６に掲載）、ならびに真核生物細胞についてはリン酸カルシウム介在型トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒら， １９７７， Ｃｅｌｌ １１：２２３−２３２）、リポソーム介在型トランスフェクション（Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら， １９８２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１５：１６６−１６８）、エレクトロポーレーション（Ｗｏｌｆｆら， １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８４：３３４４）およびマイクロインジェクション（Ｃａｐｐｅｃｈｉ， １９８０， Ｃｅｌｌ ２２：４７９−４８８）等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７０】
正しく処理されたＣＤ３６、ＨＳＰまたは他のＣＤ３６リガンドの長期に及ぶ高収率産生のためには、哺乳動物細胞中で安定して発現することが好ましい。ＣＤ３６、ＨＳＰもしくは他のＣＤ３６リガンドまたはＣＤ３６−ペプチド複合体を安定して発現する細胞系を、選択可能マーカーを含むベクターを用いて操作してもよい。限定しない例として、発現構築物の導入後、操作された細胞を富化培地中で１〜２日間成長させてから、選択的培地に入れ代えてもよい。発現構築物中の選択可能マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞が染色体に発現構築物を安定して組み込み、培養成長し、細胞系に拡張することを最適に可能にすることが好ましい。このような細胞は、長期にわたり培養でき、その間所望の遺伝子産物は連続的に発現する。
【００７１】
組換え細胞は、標準的条件の温度、インキュベーション時間、光学密度および培地組成で培養され得る。あるいはまた、癌細胞または被感染細胞の栄養および生理学的要件を真似た条件下で、組換え抗原細胞を培養してもよい。しかし、組換え細胞の成長条件は、ＣＤ３６、ＨＳＰもしくは他のＣＤ３６リガンド、または抗原ペプチドの発現のためのものとは異なり得る。
【００７２】
５．１．２  ペプチド合成
ＨＳＰ、ＣＤ３６、または他のＣＤ３６配列リガンドを含むペプチドおよびポリペプチドを組換え技術により産生することに代わるものとして、ペプチド合成がある。例えば、本明細書に記載する治療方法においてアンタゴニストとして使用できる、受容体結合ドメインを含むＨＳＰまたはＣＤ３６ペプチドの一部に対応するペプチドは、ペプチド合成器を使用して合成できる。本明細書に記載の治療方法に有用なＣＤ３６配列に対応する合成ペプチドも合成により産生できる。従来のペプチド合成、または当該分野で周知の他の合成プロトコールを使用し得る。
【００７３】
例えば、ＣＤ３６、ＨＳＰもしくは他のＣＤ３６リガンドのアミノ酸配列、またはそれらの類似体、突然変異タンパク質、断片もしくは誘導体を有するペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， １９６３， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８５：２１４９に記載される手順に類似した手順を用いて固相ペプチド合成により合成し得る。合成の間、保護された側鎖を有するＮ−α−保護アミノ酸を、成長ポリペプチド鎖（Ｃ末端に連結）、および不溶性ポリマー支持体（すなわち、ポリスチレンビーズ）に段階的に付加する。Ｎ−α−脱保護アミノ酸のアミノ基を、ジシクロヘキシルカルボジイミド等の試薬との反応により活性化されたＮ−α−保護アミノ酸のα−カルボキシル基に連結することにより、ペプチドを合成する。活性化カルボキシルへの遊離アミノ基の付着により、ペプチド結合形成が生じる。最もよく使用されるＮ−α−保護基としては、酸不安定性のＢｏｃ、および塩基不安定性のＦｍｏｃが挙げられる。適切な化学物質、樹脂、保護基、保護アミノ酸および試薬の詳細は、当該分野で周知であるため、本明細書では詳細には議論しない（Ａｔｈｅｒｔｏｎら， １９８９， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、およびＢｏｄａｎｓｚｋｙ， １９９３， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ， 第２版， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇを参照）。
【００７４】
得られたＣＤ３６、ＨＳＰまたは他のＣＤ３６リガンドペプチドの精製は、ゲル浸透、分配および／またはイオン交換クロマトグラフィーを使用した調製用（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）ＨＰＬＣ等の従来の手順を用いて達成される。適切なマトリックスおよび緩衝液の選択は、当該分野で周知であるため、本明細書では詳細には記載しない。
【００７５】
さらに、ＣＤ３６、ＨＳＰまたは他のＣＤ３６リガンドタンパク質の類似体および誘導体は化学的に合成できる。さらに、所望であれば、非古典アミノ酸または化学アミノ酸類似体を、置換または付加として、ＣＤ３６、ＨＳＰまたは他のＣＤ３６リガンド配列に導入できる。非古典アミノ酸としては、共通アミノ酸のＤ−核異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン（ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、デザイナー（ｄｅｓｉｇｎｅｒ）アミノ酸（β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸）、および一般的なアミノ酸類似体が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７６】
５．１．３  ＣＤ３６−ＨＳＰ複合体に特異的な抗体
ＣＤ３６エピトープ、ＨＳＰ−ＣＤ３６複合体エピトープ、または受容体もしくは受容体複合体の保存された変種もしくはペプチド断片のエピトープを特異的に認識できる抗体の産生方法を本明細書に記載する。このような抗体は、本発明の治療および診断方法において有用である。
【００７７】
このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化もしくはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、および上記いずれかのエピトープ結合断片が挙げられるがこれらに限定されない。このような抗体は、例えば、生物学的サンプル中のＣＤ３６またはＨＳＰ−ＣＤ３６複合体の検出において使用し得る。このような抗体はまた、例えば、以下の５．２節に記載するように、ＨＳＰとＣＤ３６との相互作用に対する試験化合物の影響を評価するために、化合物スクリーニングスキームと共に利用できる。
【００７８】
抗−ＣＤ３６−ＨＳＰ複合体抗体は、異常な受容体産物活性を阻害する方法としてさらに使用できる。従って、このような抗体は、ＨＳＰ−ＣＤ３６関連障害（例えば、自己免疫障害）の治療方法の一部として利用され得る。
【００７９】
ＣＤ３６または受容体複合体に対する抗体を産生するために、様々な宿主動物を、ＣＤ３６もしくはＨＳＰ−ＣＤ３６、またはその一部で注射することにより免疫化できる。ＣＤ３６またはＨＳＰ−ＣＤ３６複合体の抗原部分は、当該分野で公知のアルゴリズムにより容易に予測できる。
【００８０】
宿主動物としては、ウサギ、マウスおよびラットが挙げられるがこれらはほんの一部であり、これらに限定されない。免疫学的応答を高めるために宿主種に応じて様々なアジュバントを使用することができ、フロイント（完全および不完全）、ミネラルゲル（水酸化アルミニウム等）、表面活性物質（リゾレシチン等）、プルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ｐｏｌｙｏｌ）、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、スカシガイ（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびに有用な可能性のあるヒトアジュバント（ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびコリネバクテリウム・パルヴァム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ））が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８１】
ポリクローナル抗体は、ＣＤ３６またはＨＳＰ−ＣＤ３６複合体等の抗原、またはその抗原機能性誘導体で免疫化された動物の血清から誘導された抗体分子の異種集団である。ポリクローナル抗体を産生するために、上記したような宿主動物を、同じく上記したアジュバントを補足したＣＤ３６もしくはＨＳＰ−ＣＤ３６複合体、またはその一部を注射することで免疫化し得る。
【００８２】
特定の抗原に対する抗体の同種集団であるモノクローナル抗体は、連続継代細胞系培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ）により抗体分子を産生する任意の技術により得られる。これらとしては、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ技術（１９７５， Ｎａｔｕｒｅ ２５６， ４９５−４９７；および米国特許第４，３７６，１１０号）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら， １９８３， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２；Ｃｏｌｅら， １９８３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０， ２０２６−２０３０）、ならびにＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら， １９８５， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ． ７７−９６）が挙げられるがこれらに限定されない。これらの抗体は、どの免疫グロブリンクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそれらのあらゆるサブクラスを含む）のものであってもよい。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで培養し得る。高力価のｍＡｂがｉｎ ｖｉｖｏで産生されることから、これは現時点で好ましい産生方法である。
【００８３】
さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら， １９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら， １９８４， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４）を使用できる。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種から誘導される分子であり、マウスｍＡｂから誘導された可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するもの等がある（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら， 米国特許第４，８１６，５６７号；およびＢｏｓｓら， 米国特許第４，８１６，３９７号（参照により全体的に本明細書に援用する）を参照）。
【００８４】
本発明のさらなる実施形態では、無菌動物においてモノクローナル抗体を産生できる（１９８９年１２月１２日に公開されたＰＣＴ国際公報第ＷＯ ８９／１２６９０号を参照）。本発明によれば、ヒト抗体を使用してもよく、これは、ヒトハイブリドーマを使用して（Ｃｏｔｅら， １９８３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８０：２０２６−２０３０）、またはヒトＢ細胞をＥＢＶウイルスでｉｎ ｖｉｔｒｏ形質転換することで（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， ｐｐ． ７７−９６に掲載のＣｏｌｅら， １９８５）得ることができる。ＣＤ３６−ＨＳＰ複合体に特異的なマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら， １９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら， １９８４， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４）も使用できる；このような抗体は本発明の範囲内にある。
【００８５】
ヒト化抗体も提供される（Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号を参照）。免疫グロブリン軽鎖または重鎖可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される３つの超可変領域により妨害される「フレームワーク」領域からなる。フレームワーク領域の範囲およびＣＤＲは明確に定義されている（”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”， Ｋａｂａｔ， Ｅ．ら， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ （１９８３）を参照）。簡単に言うと、ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上のＣＤＲ、およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する非ヒト種由来の抗体分子である。このようなＣＤＲ移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）抗体は、様々な抗原に対して都合よく構築されており、例えば、Ｑｕｅｅｎら， １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：１００２９に記載のＩＬ−２受容体に対する抗体；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら， １９８８， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３に記載の細胞表面受容体ＣＡＭＰＡＴＨに対する抗体；Ｃｏら， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：２８６９に記載のＢ型肝炎に対する抗体；ならびにＴｅｍｐｅｓｔら， １９９１， Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：２６７に記載の呼吸系合胞体（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ）ウイルスのウイルス抗原に対する抗体等がある。ヒトにおける治療用途のためにはヒト化抗体が最も好ましい。
【００８６】
あるいはまた、一本鎖抗体の産生について記載される技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎら， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３；およびＷａｒｄら， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４−５４６）を適用して、ＣＤ３６もしくはＨＳＰ−ＣＤ３６複合体、またはそれらの一部分の一本鎖抗体を産生できる。一本鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖および軽鎖フラグメントをアミノ酸架橋を介して連結して一本鎖ポリペプチドを得ることにより形成する。
【００８７】
特異的なエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術により作製してもよい。例えば、このようなフラグメントとしては、抗体分子のペプシン消化により生成可能なＦ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成可能なＦａｂフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない。あるいはまた、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して（Ｈｕｓｅら， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４６： １２７５−１２８１）、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの高速かつ簡単な同定を可能にしてもよい。
【００８８】
代わりに、ＣＤ３６に対する抗体を利用して、当業者に周知の技術により、ＣＤ３６を「模倣する」抗イディオタイプ抗体を作製できる（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ， １９９３， ＦＡＳＥＢ Ｊ ７（５）：４３７−４４４；ならびにＮｉｓｓｉｎｏｆｆ， １９９１， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７（８）：２４２９−２４３８を参照）。例えば、ＣＤ３６ ＥＣＤに結合し、ＨＳＰがＣＤ３６に結合するのを競合的に阻害する抗体を用いて、ＥＣＤを「模倣し」、従ってＨＳＰに結合および中和する抗イディオタイプを作製できる。このような中和抗イディオタイプ、またはこのような抗イディオタイプのＦａｂフラグメントを治療内容に使用して、天然型リガンドを中和し、ＨＳＰ−ＣＤ３６関連障害（免疫学的障害、増殖性障害、および感染性疾患等）を治療できる。
【００８９】
あるいはまた、ＣＤ３６活性のアゴニストとして作用できる、ＣＤ３６に対する抗体を作製できる。このような抗体は、ＣＤ３６に結合し、受容体のシグナル伝達活性を活性化する。さらに、ＣＤ３６活性のアンタゴニストとして作用する（すなわち、ＣＤ３６の活性化を阻害する）抗体は、自己免疫障害、増殖性障害（癌等）、および感染性疾患を治療するために特に有用である。このようなアゴニストおよびアンタゴニストをアッセイする方法は、以下の５．２節に詳細に記載する。
【００９０】
５．２  ＣＤ３６と相互作用する化合物を同定するためのアッセイ
本発明は、ＣＤ３６がＨＳＰ−抗原ペプチド複合体を認識し、免疫応答を引き出すシグナル伝達経路を誘導するという発見に基づいている。従って、受容体と相互作用するか、または受容体の機能を増強もしくはブロックする化合物を同定する方法が本発明に含まれる。本発明は、ＣＤ３６と相互作用するか、またはＣＤ３６の活性およびＣＤ３６とＨＳＰもしくはＨＳＰ−ペプチド複合体との相互作用をモジュレートする化合物または組成物を同定するために使用できる、以下の副節に記載するｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイ系を提供する。
【００９１】
本発明は、ＣＤ３６と相互作用するか、またはＨＳＰとＣＤ３６との相互作用をモジュレートする小分子、タンパク質、および他の化合物の同定に有用なスクリーニング方法論を提供する。このような化合物は、異なる親和性でＣＤ３６遺伝子または遺伝子産物と結合し、免疫応答をモジュレートするのに有用な治療的用途を有する受容体活性のｉｎ ｖｉｖｏレギュレーターとして役目を果たし得る。例えば、受容体機能を阻害する特定の化合物を患者に使用して、ＨＳＰの細胞放出により生じる破壊的免疫応答を下方調節することができる。
【００９２】
ＣＤ３６と相互作用するか、またはＣＤ３６発現および活性をモジュレートする能力について可能性のある薬剤をスクリーニングする方法は、受容体について、およびＨＳＰもしくはＨＳＰ−ペプチド複合体結合および認識におけるその役割についての本発明者らの発見に基づいて設計できる。ＣＤ３６タンパク質、核酸、および誘導体をスクリーニングアッセイに使用して、ＨＳＰタンパク質、誘導体または核酸に特異的に結合し、従って、ＣＤ３６のアゴニストまたはアンタゴニストとして免疫応答をモジュレートする潜在的な用途を有する分子を検出できる。好適な実施形態では、このようなアッセイは、抗自己免疫疾患剤、抗癌剤および抗感染剤（抗ウイルス剤および抗生物質等）としての潜在的な効用を有する分子、または薬剤開発のためのリード化合物についてスクリーニングするために行う。例えば、ＣＤ３６の核酸を発現する組換え細胞を使用して、これらのアッセイにおいてＣＤ３６を組換え産生し、ＨＳＰとＣＤ３６との結合を妨害する分子についてスクリーニングできる。同様の方法を使用して、ＣＤ３６誘導体または核酸に結合する分子についてスクリーニングできる。上記のことを実施するために使用できる方法は、当該分野で一般的に知られている。
【００９３】
ＣＤ３６に特異的に結合可能な化合物は、免疫療法のために有用であり得る。一実施形態では、ＣＤ３６に特異的に結合する化合物を同定するためのアッセイであって：（ａ）ＣＤ３６と１つ以上の試験化合物とを、結合をもたらす条件下で接触させること；および（ｂ）ＣＤ３６に特異的に結合する１つ以上の試験化合物を同定することを含み、該ＣＤ３６に特異的に結合可能な化合物は免疫療法のために有用な化合物として同定される、アッセイを開示する。
【００９４】
免疫療法に有用な、本発明が包含する、別の化合物同定方法は、ＣＤ３６リガンドとＣＤ３６との結合をモジュレートする化合物を同定することを伴う。本明細書に記載する「ＣＤ３６リガンド」という用語は、ＣＤ３６に結合可能なＣＤ３６分子を指す。このようなＣＤ３６リガンドとしては、リポタンパク質複合体、トロンボスポンジン１、熱帯熱マラリア原虫赤血球膜タンパク質１（ＰｆＥＭＰ１）、ＬＤＬ、およびリン酸脂質が挙げられるが、これらに限定されない。本方法は、（ａ）ＣＤ３６を、１つ以上の試験化合物の存在下で、ＣＤ３６リガンド、またはその断片、類似体、誘導体もしくは模倣体と接触させるステップ；および（ｂ）ＣＤ３６に結合したＣＤ３６リガンド、またはその断片、類似体、誘導体もしくは模倣体の量を測定するステップを含み、（ｂ）で測定した結合ＣＤ３６リガンドの量が該試験化合物の不在下で測定した結合ＣＤ３６の量と異なる場合に、ＣＤ３６リガンドとＣＤ３６との結合をモジュレートする免疫療法に有用な化合物が同定されたとする。
【００９５】
別の実施形態では、ＣＤ３６とＣＤ３６リガンドとの相互作用をモジュレートする免疫療法に有用な化合物の同定方法が本発明により提供される。この方法は、（ａ）ＣＤ３６を１つ以上の試験化合物と接触させるステップ；および（ｂ）ＣＤ３６活性または発現のレベルを測定するステップを含み、（ｂ）で測定した活性または発現のレベルが、該１つ以上の試験化合物の不在下でのＣＤ３６活性のレベルと異なる場合、ＣＤ３６とＣＤ３６リガンドとの相互作用をモジュレートする化合物が同定されたとする。
【００９６】
別の実施形態では、ＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセスをモジュレートする化合物を同定するためのアッセイを開示する。本アッセイは：（ａ）試験化合物を、ＨＳＰおよびＣＤ３６と接触させること；ならびに（ｂ）ＣＤ３６活性または発現のレベルを測定することを含み、（ｂ）で測定した活性または発現のレベルが、該試験化合物の不在下でのＣＤ３６活性のレベルと異なる場合に、ＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセスをモジュレートする化合物が同定されたとする。同定される化合物が、ＨＳＰとＣＤ３６との相互作用を妨害するアンタゴニストである別の実施形態では、本方法は、前記レベルがＨＳＰとＣＤ３６との相互作用を妨害するか否かを決定するステップをさらに含む。
【００９７】
別の実施形態では、ＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセスをモジュレートする化合物を同定する細胞利用型方法を記載する。本方法は：（ａ）試験化合物を熱ショックタンパク質およびＣＤ３６発現細胞と接触させるステップ；ならびに（ｂ）該細胞中のＣＤ３６活性または発現のレベルを測定するステップを含み、（ｂ）で測定した活性または発現のレベルが、該試験化合物の不在下でのＣＤ３６活性のレベルと異なる場合に、ＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセスをモジュレートする化合物が同定されたとする。
【００９８】
別の実施形態では、ＣＤ３６と相互作用するか、またはＨＳＰとＣＤ３６との結合をモジュレートする化合物を同定するための受容体−リガンド結合アッセイを記載する。このような方法の１つは：（ａ）ＨＳＰを、試験化合物の存在下で、ＣＤ３６、またはその断片、類似体、誘導体もしくは模倣体と接触させること；および（ｂ）ＣＤ３６、またはその断片、類似体、誘導体もしくは模倣体に結合した熱ショックタンパク質の量を測定することを含み、（ｂ）で測定した結合熱ショックタンパク質の量が、該試験化合物の不在下で測定した結合熱ショックタンパク質の量と異なる場合に、ＨＳＰとＣＤ３６との結合をモジュレートする化合物が同定されたとする。
【００９９】
別の実施形態では、ＣＤ３６発現細胞によるシグナル伝達をモジュレートする化合物を同定する方法が本発明により提供される。一実施形態では、このような方法は：（ａ）１つ以上の試験化合物を、ＣＤ３６発現細胞、およびＣＤ３６リガンドと抗原分子とを含む複合体の混合物に、ＣＤ３６介在型シグナル伝達刺激を促す条件下で添加すること；（ｂ）ＣＤ３６発現細胞によるシグナル伝達活性のレベルを測定することを含み、（ｂ）で測定したレベルが、該１つ以上の試験化合物の不在下での該刺激のレベルと異なる場合、ＣＤ３６発現細胞による熱ショックタンパク質介在型シグナル伝達刺激をモジュレートする化合物が同定されたとする。別の実施形態では、試験化合物を、ＣＤ３６介在型シグナル伝達刺激を促す条件下で、ＣＤ３６発現細胞、および抗原分子と非共有的結合で会合したＨＳＰから本質的になる複合体の混合物に添加し；ＣＤ３６発現細胞によるシグナル伝達刺激のレベルを測定し、測定したレベルが、該試験化合物の不在下での該刺激のレベルと異なる場合、ＣＤ３６発現細胞によるＨＳＰ介在型シグナル伝達刺激をモジュレートする化合物が同定されたとする。
【０１００】
本発明のアッセイは、最初は小規模で（すなわち、試験管内で）最適化されて、その後ハイスループットアッセイのために規模を大きくしてもよい。様々な実施形態では、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイは、精製成分または細胞溶解物を用いて行い得る。別の実施形態では、スクリーニングアッセイは、培養無傷細胞および動物モデルにおいて実施され得る。本発明によれば、本明細書に記載するようにＣＤ３６の活性をモジュレートすることがｉｎ ｖｉｔｒｏで示された試験化合物をさらにｉｎ ｖｉｖｏ（培養細胞および動物モデルを含む）でアッセイして、試験化合物がｉｎ ｖｉｖｏで同様の影響を有するか否かを決定し、ならびにサイトカイン放出、細胞内Ｃａ＋＋放出、Ｔ細胞障害性、腫瘍発達、一酸化窒素放出、ケモカイン放出、陽性および陰性レギュレーターの蓄積または分解、細胞増殖等に対する試験化合物の影響を決定してもよい。
【０１０１】
５．２．１  ＣＤ３６−リガンド結合アッセイ
本明細書に記載するスクリーニングアッセイは、ＣＤ３６と相互作用するか、またはＨＳＰとＣＤ３６との相互作用をモジュレートするペプチドおよび有機非タンパク質分子等の化合物および組成物を同定するために使用できる。組換え、合成、または外因性化合物は結合能力を有し得るため、医薬剤の候補となり得る。あるいはまた、タンパク質および化合物は、同定された遺伝子およびタンパク質とｉｎ ｖｉｖｏで相互作用する内因性細胞成分を含む。このような内因性成分は、医薬的および治療的介入のための新しい標的を提供し得る。
【０１０２】
従って、好適な実施形態では、天然型および／または合成化合物の両方（例えば、小分子またはペプチドのライブラリー）を、ＣＤ３６との相互作用および／またはＣＤ３６活性のモジュレートについてスクリーニングしてもよい。別の一連の実施形態では、細胞溶解物または組織ホモジネートを、正常または変異型遺伝子およびポリペプチドの１つに結合するタンパク質または他の化合物についてスクリーニングしてもよい。
【０１０３】
本明細書に記載するスクリーニングアッセイは、ＣＤ３６と相互作用する、および／またはＨＳＰとＣＤ３６活性との相互作用をモジュレートする、小分子、ペプチドもしくはタンパク質、またはそれらの誘導体、類似体および断片を同定するために使用し得る。このような化合物は、ＨＳＰおよびＨＳＰ複合体等のＣＤ３６リガンドと細胞表面受容体との結合に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして使用し得る。例えば、ＣＤ３６−リガンド相互作用をモジュレートする化合物としては、ＣＤ３６に結合して、それによりＨＳＰおよびＨＳＰ複合体等のリガンドと受容体との結合を阻害（アンタゴニスト）または増強（アゴニスト）する化合物、ならびに例えばＨＳＰ等のリガンドと結合して、それによりリガンドと受容体との結合を防止または増強する化合物が挙げられるがこれらに限定されない。（遺伝子発現に作用することにより）遺伝子活性に影響を及ぼす化合物（転写に作用するかまたはスプライシング事象を妨害して完全長または平滑末端形態のＣＤ３６の発現をモジュレートできる分子（例えば、タンパク質または有機小分子）が挙げられる）も、本発明のスクリーニングにより同定できる。さらに、記載するアッセイは、ＣＤ３６リガンド（例えば、ＨＳＰ）、ＣＤ３６によるシグナル伝達をモジュレートする化合物（例えば、ＣＤ３６シグナル伝達経路において下流シグナリングに作用する化合物）も同定できることを付記しておく。ＣＤ３６の下流においてシグナリング事象に作用し、従って免疫応答に対する受容体の影響をモジュレートするこのような化合物の同定および使用は、本発明の範囲内にある。
【０１０４】
（ＣＤ３６遺伝子発現に作用することにより）ＣＤ３６遺伝子活性に影響を及ぼす化合物（転写に作用するかまたはスプライシング事象を妨害して完全長または平滑末端形態のＣＤ３６の発現をモジュレートできる分子（例えば、タンパク質または有機小分子）が挙げられる）も、本発明のスクリーニングにより同定できる。しかし、記載するアッセイは、ＣＤ３６シグナル伝達をモジュレートする化合物（例えば、ＣＤ３６と結合したリガンドにより活性化される下流シグナリング事象に作用する化合物）も同定できることを付記しておく。ＣＤ３６の下流においてシグナリング事象に作用し、従ってアレルギー性応答（ａｌｌｅｒｇｅｎｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）に対する受容体の影響をモジュレートするこのような化合物の同定および使用は、本発明の範囲内にある。
【０１０５】
本明細書に記載するスクリーニングアッセイは、リガンド−受容体相互作用（ＨＳＰ−ＣＤ３６相互作用等）をモジュレート（すなわち、妨害または増強）する化合物を検出するように設計されている。以下に詳細に記載するように、このようなアッセイは、ハイスループットスクリーニング方法論に適用できる機能的アッセイ（結合アッセイ等）である。
【０１０６】
結合アッセイを用いて、リガンド（例えばＨＳＰ）とＣＤ３６との相互作用をモジュレートする化合物を同定できる。本発明の一態様では、スクリーニングは、ＣＤ３６とリガンド（例えば、ＨＳＰ、またはＨＳＰもしくは別のＣＤ３６リガンドから誘導されたペプチド等）との相互作用を破壊する化合物を同定するように設計され得る。このような化合物は、ＨＳＰ−ＣＤ３６関連障害および症状（免疫障害、増殖性障害および感染性疾患等）のアンタゴニストのためのリード化合物として有用である。
【０１０７】
結合アッセイは、直接結合アッセイまたは競合結合アッセイのいずれによっても行われ得る。直接結合アッセイでは、試験化合物を、ＣＤ３６またはＣＤ３６リガンド（ＨＳＰ等）のいずれかとの結合について試験する。次いで、第２のステップでは、試験化合物を、リガンド−ＣＤ３６相互作用をモジュレートする能力について試験する。他方で、競合結合アッセイは、ＣＤ３６との結合について、リガンド（すなわちＨＳＰ）と競合する試験化合物の能力を評価する。
【０１０８】
直接結合アッセイでは、リガンドおよび／またはＣＤ３６のいずれかを、試験化合物に、試験化合物がリガンドまたは受容体と結合できるような条件下で接触させる。結合は溶液中または固体表面上で起こり得る。試験化合物は検出のために予め標識化されることが好ましい。任意の検出可能な化合物が標識化のために使用でき、例えば、発光、蛍光もしくは放射性同位体、またはそれらを含むグループ、または非同位体標識（酵素または染料等）が挙げられるがこれらに限定されない。結合が起こるのに十分なインキュベーション期間の後、反応物を、過剰なまたは非特異的に結合した試験化合物を除去する条件および操作に供する。これは、典型的に、適切な緩衝液での洗浄を伴う。最終的に、リガンド−試験化合物（例えば、ＨＳＰ−試験化合物）またはＣＤ３６試験化合物複合体の存在を検出する。
【０１０９】
競合結合アッセイでは、試験化合物を、リガンド（例えば、ＨＳＰ）とＣＤ３６との結合を破壊または増強する能力についてアッセイする。標識化リガンド（例えば、ＨＳＰ）をＣＤ３６またはその断片もしくは誘導体と混合し、試験化合物を添加しても添加しなくてもそれらの相互作用が通常生じるような条件下に置いてもよい。ＣＤ３６に結合する標識化リガンド（例えば、ＨＳＰ）の量を、試験化合物の存在下または不在下において結合する量と比較してもよい。
【０１１０】
好適な実施形態では、複合体形成および検出を容易にするために、固体表面上に固定化された１つ以上の成分を用いて結合アッセイを行う。様々な実施形態では、固体支持体は、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラス、ニトロセルロース、デキストラン、ナイロン、ポリアクリルアミド、およびアガロースであり得るがこれらに限定されない。支持体構造物としては、ビーズ、膜、微粒子、反応容器の内面（マイクロタイタープレート等）、試験管、または他の反応容器が挙げられる。ＣＤ３６または他の成分の固定化は、共有的または非共有的な付着により達成できる。一実施形態では、付着は間接的であって（すなわち付着した抗体を介して）もよい。別の実施形態では、ＣＤ３６および陰性対照は、エピトープ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等）をタグ付けされており、固体表面への付着が市販の抗体（抗ＧＳＴ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）等）により介在され得るようにする。
【０１１１】
例えば、このような親和性結合アッセイは、固体支持体に固定化されたＣＤ３６を用いて行うことができる。典型的に、結合反応の非固定化成分（この場合、リガンド（例えばＨＳＰ）または試験化合物のいずれか）を標識化して、検出可能にする。発光、発色団、蛍光もしくは放射性同位体、またはそれらを含むグループ、および非同位体標識（酵素または染料等）等の様々な標識化方法が利用可能で使用できる。好適な実施形態では、試験化合物を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓから入手可能）等の発蛍光団で標識化する。
【０１１２】
次いで、標識化試験化合物またはリガンド（例えば、ＨＳＰ）および試験化合物を、固体支持体に、特異的結合を生じさせるような条件下で接触させる。結合反応が起こった後、表面を洗浄することにより、非結合および非特異的結合試験化合物を分離させる。固相と結合パートナーとの付着は、当業者に公知の様々な方法により達成でき、化学架橋、プラスチック表面への非特異的接着、固相に付着した抗体との相互作用、結合パートナーに付着したリガンド（ビオチン等）と、固相に付着したリガンド結合タンパク質（アビジンまたはストレプトアビジン等）との相互作用等が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１３】
最後に、固体表面上に残った標識を、当該分野で公知の任意の検出方法により検出し得る。例えば、試験化合物を発蛍光団で標識化した場合、蛍光光度計を使用して複合体を検出してもよい。
【０１１４】
ＣＤ３６は、ＣＤ３６を発現する無傷細胞またはＣＤ３６を含む単離膜の形態で結合アッセイに添加することが好ましい。従って、ＣＤ３６への直接結合または試験化合物がリガンド−ＣＤ３６複合体（例えば、ＨＳＰ−ＣＤ３６複合体）をモジュレートする能力を、試験化合物の存在下または不在下で、培養無傷細胞または動物モデルにおいてアッセイしてもよい。標識化リガンド（例えば、ＨＳＰ）を、ＣＤ３６を発現する細胞、またはそのような細胞から得た粗抽出物と混合し、試験化合物を添加してもよい。単離膜は、ＣＤ３６と相互作用する化合物を同定するために使用し得る。例えば、単離膜を使用する典型的な実験では、細胞を遺伝子操作して、ＣＤ３６を発現させる。膜を標準的な技術により回収し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて使用できる。標識化リガンド（例えば、１２５Ｉ標識化ＨＳＰ）を膜に結合させ、特定の活性についてアッセイする；過剰な非標識化（放射性同位元素を含まない（ｃｏｌｄ））リガンドの存在下で行った結合アッセイと比べて特異的結合を決定する。あるいはまた、可溶性ＣＤ３６を組換え発現させ、非細胞利用型アッセイで利用して、ＣＤ３６と結合する化合物を同定してもよい。ＣＤ３６の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む組換え発現させたＣＤ３６ポリペプチドもしくは融合タンパク質、またはその１つ以上のサブドメインを、非細胞利用型スクリーニングアッセイに使用できる。あるいはまた、ＣＤ３６の１つ以上のＣＤに対応するペプチド、またはＣＤ３６の１つ以上のＣＤを含む融合タンパク質を、非細胞利用型アッセイ系に使用して、ＣＤ３６の細胞質部分に結合する化合物を同定できる；このような化合物は、ＣＤ３６のシグナル伝達経路をモジュレートするのに有用であり得る。非細胞利用型アッセイでは、当業者に周知の手段により（Ａｕｓｕｂｅｌら、前掲を参照）、組換え発現したＣＤ３６を、試験管、マイクロタイターウェル、またはカラム等の固体基板に付着させる。その後、試験化合物を、それらがＣＤ３６に結合する能力についてアッセイする。
【０１１５】
あるいはまた、結合反応を溶液中で行ってもよい。このアッセイでは、標識化成分を、その結合パートナーと溶液中で相互作用させる。標識化成分とその結合パートナーとの大きさの差により分離が可能な場合には、結合反応生成物を（非結合標識化成分は通すが、その結合パートナーまたはパートナーに結合した標識化成分は通さない孔を有する）限外濾過装置に通すことにより分離を達成できる。分離はまた、標識化成分の結合パートナーを溶液から捕捉できる任意の試薬（結合パートナーに対する抗体、予め結合パートナーに付着したリガンドと相互作用できるリガンド結合タンパク質等）を使用することによっても達成できる。
【０１１６】
一実施形態では、例えば、連続ファージ展示（ｄｉｓｐｌａｙ）ライブラリー由来のファージを、固相（プラスチックビーズ等）に連結した精製ＣＤ３６またはその誘導体、類似体、断片もしくはドメインを含むカラムに通すことにより、ファージライブラリーをスクリーニングできる。洗浄緩衝液のストリンジェンシーを変えることで、ＣＤ３６に対して高い親和性を有するペプチドを発現するファージについて富化することが可能である。カラムから単離したファージをクローニングし、短いペプチドの親和性を直接測定できる。１つを上回るオリゴヌクレオチドの配列を組み合わせて、ＣＤ３６へのさらに高い親和性結合について試験できる。どのアミノ酸配列がＣＤ３６に対する最も強い結合を寄与するのかを知っている場合、コンピュータモデルを使用して、ＣＤ３６と試験化合物との分子接触を同定できる。これにより、この接触を模倣する非タンパク質化合物の設計が可能になる。このような化合物は、ペプチドと同じ活性を有し、治療的に使用でき、効率的かつ費用をかけずに作製できるという利点を有する。
【０１１７】
本発明の本態様の別の特定の実施形態では、固体支持体は、マイクロタイターディッシュに付着したＣＤ３６を含む膜である。例えば、ライブラリーメンバーを発現する細胞等の試験化合物を、マイクロタイターディッシュ中でのライブラリーメンバーの発現を可能にする条件下で培養する。タンパク質（または核酸もしくは誘導体）に結合するライブラリーメンバーを回収する。このような方法は、例えば、ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ， １９８８， Ｇｅｎｅ ７３：３０５−３１８；Ｆｏｗｌｋｅｓら， １９９２， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４２２−４２７；ＰＣＴ公報第ＷＯ ９４／１８３１８号；ならびに上記引用した参照文献に記載されている。
【０１１８】
本発明の別の実施形態では、ＣＤ３６またはリガンド（例えば、ＨＳＰ）と試験化合物との相互作用をｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイしてもよい。既知または未知の分子を、結合を促す条件下でのＣＤ３６の核酸、タンパク質または誘導体との特異的な結合についてアッセイして、ＣＤ３６に特異的に結合する分子を同定する。２つの成分は様々な手法により測定できる。１つのアプローチは成分の一方を容易に検出可能な標識で標識化し、結合を生じさせる条件下で試験成分と一緒に置き、結合標識化成分を非結合標識化成分と分離させる分離ステップを行い、次いで、結合成分の量を測定する。一実施形態では、ＣＤ３６を標識化し、結合を生じさせる条件を採用して、試験物質に添加する。試験物質の結合は、ポリアクリルアミドゲル分析を用いて、試験物質の存在下または不在下において形成される複合体を比較することにより決定できる。
【０１１９】
さらに別の実施形態では、動物モデル中の無傷細胞において、リガンド（例えば、ＨＳＰ）とＣＤ３６との結合をアッセイしてもよい。標識化リガンド（例えば、ＨＳＰ）を、試験化合物と共にまたは試験化合物無しで、動物に直接投与してもよい。リガンド（例えば、ＨＳＰ）のシグナル伝達刺激を、試験化合物の存在下および不在下で測定してもよい。これらのアッセイのために、試験化合物を添加する宿主細胞を、遺伝子操作して、ＣＤ３６および／またはリガンド（例えば、ＨＳＰ）を発現（一過性、誘導型、構成的、または安定性のものであり得る）させてもよい。本発明のスクリーニング方法の目的のために、様々な種類の宿主細胞を使用でき、組織培養細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞および細菌が挙げられるがこれらに限定されない。マクロファージ等の哺乳動物細胞またはＣＤ３６を発現する他の細胞（すなわち、単球細胞系統の細胞、肝臓実質細胞、繊維芽細胞、角化細胞、神経細胞および胎盤合胞体栄養細胞）は、本発明のアッセイを中で実施するのに好ましい細胞型であり得る。細菌および酵母は、比較的培養し易いが、哺乳動物細胞とはタンパク質の処理が異なる。
【０１２０】
５．２．２  活性アッセイ
ＣＤ３６との相互作用、またはリガンド（例えば、ＨＳＰ）とＣＤ３６との相互作用をモジュレートする試験化合物の同定後、試験化合物をさらに特徴決定して、ＣＤ３６活性およびリガンド−ＣＤ３６細胞シグナリング経路に対する影響を測定できる。例えば、試験化合物は、リガンド（例えば、ＨＳＰ）ＣＤ３６細胞活性に対する影響をｉｎ ｖｉｖｏで試験することにより特徴決定できる。このようなアッセイとしては、下流シグナリングアッセイ、細胞障害性Ｔ細胞の抗原特異的活性化についてのアッセイ、一酸化窒素アッセイ、ケモカインアッセイ等が挙げられる。
【０１２１】
様々な実施形態では、一次アッセイで同定された候補化合物を、本質的なＣＤ３６シグナリング伝達活性に対する影響について試験し得る。例えば、アッセイできる活性化の下流シグナリング影響としては、マクロファージの増強された移動運動（ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎ）および走化性（Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒら， １９８３， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５０：２５１−２５９）、プロテイナーゼ合成の下方調節、ならびに細胞内カルシウム、イノシトールリン酸および環状ＡＭＰの上昇（Ｍｉｓｒａら， １９９３， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ２９０：８８５−８９１）が挙げられるがこれらに限定されない。試験できる他の本質的な免疫応答は、サイトカイン（すなわち、ＩＬ−１２、ＩＬ１β、ＧＭＣＳＦおよびＴＮＦα）の放出、一酸化窒素の放出、およびケモカインの放出である。従って、二次アッセイとして、同定された任意の候補化合物を、存在下および不在下でのこのような活性の変化について試験できる。
【０１２２】
例えば、一実施形態では、走化性アッセイを使用して、第一のスクリーニングアッセイにより同定された候補をさらに特徴決定できる。走化性移動をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験するために、多数の技術が使用できる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ６．１２．１−６．１２．２８， Ｃｏｌｉｇａｎら編， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９９５に掲載のＬｅｏｎａｒｄら， １９９５， ”Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ α ａｎｄ β Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ”を参照）。例えば、一実施形態では、マルチウェルボイデン走化性チェンバー中でケモカイン勾配を使用して、候補化合物を、受容体を発現する細胞の移動を誘導するＣＤ３６の能力をモジュレートする能力について試験できる。この方法の具体例では、一次スクリーニングで同定されたリガンド（例えば、ＨＳＰ）／ＣＤ３６アンタゴニストまたはアゴニスト試験化合物の連続希釈液を、ボイデン走化性チェンバーの底ウェルに入れる。定量のリガンドも一連の希釈液に添加する。対照として、少なくとも１つのアリコートはリガンド（例えば、ＨＳＰ）しか含まない。リガンド（例えば、ＨＳＰ）のみを含むアリコートの膜フィルターの底面上の移動細胞の数を、試験化合物およびリガンド（例えば、ＨＳＰ）を含むアリコート中の細胞の数と比較することにより、ＣＤ３６の走化性活性に対するアンタゴニストまたはアゴニスト化合物の寄与を測定する。試験化合物をリガンド（例えば、ＨＳＰ）溶液に添加することで、リガンド（例えば、ＨＳＰ）しか含まない溶液を使用して検出された細胞数と比較した膜上で検出される細胞の数が減少する場合、ＣＤ３６発現細胞の走化性活性のリガンド（例えば、ＨＳＰ）誘導のアンタゴニストが同定されたことになる。
【０１２３】
別の実施形態では、カルシウム流動（ｆｌｕｘ）アッセイを二次スクリーニングとして使用して、リガンド−ＣＤ３６相互作用のモジュレーターをさらに特徴決定できる。細胞内カルシウムイオン濃度は、リガンドの存在下、試験化合物の存在下および不在下で、ＣＤ３６を発現する細胞中で測定できる。例えば、細胞内にトラップされる蛍光色素で標識化することで、カルシウム移動をフローサイトメトリーにより検出および測定できる。インド１（Ｉｎｄｏ−１）などの蛍光色素は、カルシウムと結合することで発光スペクトルの変化を示し、カルシウム結合色素により生成される蛍光と、非結合色素により生成される蛍光との比率を使用して細胞内カルシウム濃度を推定してもよい。具体的な実施形態では、細胞をキュベットに入ったインド１含有培地中で３７℃にてインキュベートおよび励起し、蛍光光度計（Ｐｈｏｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して蛍光を測定する。試験化合物の存在下および不在下にてリガンドを特定の時点で添加し、ＥＧＴＡをキュベットに添加して合計カルシウムを放出およびキレート化し、応答を測定する。リガンドの結合により、ＣＤ３６を発現する細胞中のＣａ２＋濃度が高まる。アゴニストは、細胞内Ｃａ２＋濃度の相対的な上昇を生じ、アンタゴニストは細胞内Ｃａ２＋濃度の相対的な低下を生じる。
【０１２４】
一酸化窒素の増加もＣＤ３６活性化の指標である。従って、別の実施形態では、一酸化窒素アッセイをスクリーニングに用いて、リガンド−ＣＤ３６相互作用のモジュレーターを特徴決定できる。一酸化窒素濃度は、リガンドの存在下、または試験化合物の存在下および不在下で、ＣＤ３６を発現する細胞中で測定できる。例えば、２０時間のインキュベーション後、上清を回収し、グリース（Ｇｒｅｉｓｓ）試薬と反応させることができる（Ｎｉｍｓ， Ｒ．Ｗ．ら， １９９６． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６８， ９３）。このような反応は、分光光度測定法により定量できる。
【０１２５】
ＭＣＰ−１ケモカインの増加もＣＤ３６活性化の指標である。従って、別の実施形態では、ＭＣＰ−１ケモカインアッセイをスクリーニングに用いて、リガンド−ＣＤ３６相互作用のモジュレーターを特徴決定できる。ＭＣＰ−１ケモカイン濃度は、リガンドの存在下、または試験化合物の存在下および不在下で、ＣＤ３６を発現する細胞中で測定できる。例えば、２０時間のインキュベーション後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸収剤アッセイ）により、ＭＣＰ−１ケモカインに特異的な抗体を用いて分析できる。
【０１２６】
５．２．３  本発明によりスクリーニングできる化合物
本明細書に記載するスクリーニングアッセイを用いて、ＣＤ３６と相互作用、またはリガンド（例えば、ＨＳＰ）とＣＤ３６との相互作用をモジュレートする、小分子、ペプチドもしくはタンパク質、またはそれらの誘導体、類似体および断片を同定できる。本発明によりスクリーニングし得る化合物としては、ＣＤ３６のＥＣＤに結合し、天然型リガンドにより引き起こされる活性を阻止するか（すなわちアンタゴニスト）、または天然型リガンドにより引き起こされる活性を模倣する（すなわちアゴニスト）、小分子、ペプチド、抗体およびそれらのフラグメント、ならびに他の有機化合物（例えば、ペプチド模倣体）が、小分子、ペプチド、抗体またはそれらのフラグメント、ならびに他の有機化合物と共に挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態では、このような化合物は、ＨＳＰ、ＬＤＬなどの天然型リガンドに結合または「中和」できるＣＤ３６のＥＣＤ（またはその一部）等のＣＤ３６の配列を含む。別の実施形態では、このような化合物は、ＣＤ３６の活性部位に結合して、その活性をブロックできるＨＳＰ配列等のリガンド配列を含む。
【０１２７】
スクリーニングに使用し得る化合物としては、例えば可溶性ペプチド等のペプチド（ランダムペプチドライブラリーのメンバーが挙げられるがこれらに限定されない）（例えば、Ｌａｍら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８６を参照）、Ｄ−および／またはＬ−構造アミノ酸からなるコンビナトリアル化学誘導型分子ライブラリーメンバー、ホスホペプチド（ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅ）（ランダムまたは部分的に縮重した標的（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ホスホペプチドライブラリーのメンバーが挙げられるがこれらに限定されない；例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇら， １９９３， Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７８を参照）、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラまたは一本鎖抗体、ＦＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦＡｂ発現ライブラリー断片、およびそれらのエピトープ結合断片が挙げられるがこれらに限定されない）、ならびに有機または無機の小分子が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２８】
本発明の一実施形態では、ペプチドライブラリーを、ＣＤ３６相互作用（ＨＳＰ−ＣＤ３６等）のモジュレーターについてスクリーニングするのに使用できる試験化合物のソースとして使用できる。ランダムまたはコンビナトリアルペプチドまたは非ペプチドライブラリー等の多様性ライブラリーを、ＣＤ３６に特異的に結合する分子についてスクリーニングできる。多くの使用可能なライブラリーが当該分野で公知である。（例えば、化学合成ライブラリー、組換え（例えばファージ展示ライブラリー）、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳利用型ライブラリー）。
【０１２９】
化学合成ライブラリーの例は、Ｆｏｄｏｒら， １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７−７７３；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８６；Ｌａｍら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４；Ｍｅｄｙｎｓｋｉ， １９９４， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：７０９−７１０；Ｇａｌｌｏｐら， １９９４， Ｊ． Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７（９）：１２３３−１２５１；Ｏｈｌｍｅｙｅｒら， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１０９２２−１０９２６；Ｅｒｂら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１１４２２−１１４２６；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら， １９９２， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２；Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１６１４−１６１８；Ｓａｌｍｏｎら， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１１７０８−１１７１２；ＰＣＴ公報第ＷＯ ９３／２０２４２号；ならびにＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５３８１−５３８３に記載されている。
【０１３０】
ファージ展示ライブラリーの例は、ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎら， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９：４０４−４０６；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら， １９９２， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７：７１１−７１８；Ｌｅｎｓｔｒａ， １９９２， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． １５２：１４９−１５７；Ｋａｙら， １９９３， Ｇｅｎｅ １２８：５９−６５；ならびに１９９４年８月１８日付けのＰＣＴ公報第ＷＯ ９４／１８３１８号に記載されている。
【０１３１】
非ペプチドライブラリーの限定しない例として、ベンゾジアゼピンライブラリー（例えば、Ｂｕｎｉｎら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：４７０８−４７１２を参照）を適用して使用できる。ペプトイド（ｐｅｐｔｏｉｄ）ライブラリー（Ｓｉｍｏｎら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：９３９７−９３７１）も使用できる。ペプチド中のアミド官能性を完全メチル化して、化学的に形質転換されたコンビナトリアルライブラリーを作製する、使用可能なライブラリーの別の例がＯｓｔｒｅｓｈら（１９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１１１３８−１１１４２）に記載されている。
【０１３２】
ライブラリーのスクリーニングは、よく知られている様々な方法のいずれによって果たしてもよい。例えば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを開示する以下の参考文献を参照のこと：すなわち、ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ， １９８９， Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ２５１：２１５−２１８；ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｆｏｗｌｋｅｓら， １９９２； ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４２２−４２７；Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５３９３−５３９７；Ｙｕら， １９９４， Ｃｅｌｌ ７６：９３３−９４５；Ｓｔａｕｄｔら， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５７７−５８０；Ｂｏｃｋら， １９９２， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：５６４−５６６；Ｔｕｅｒｋら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：６９８８−６９９２；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎら， １９９２， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：８５０−８５２；Ｌａｄｎｅｒらに発行された米国特許第５，０９６，８１５号、米国特許第５，２２３，４０９号および米国特許第５，１９８，３４６号； ＲｅｂａｒおよびＰａｂｏ， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：６７１−６７３；ならびにＰＣＴ公報第ＷＯ ９４／１８３１８号。
【０１３３】
本発明の別の実施形態では、標識化リガンド（例えば、ＨＳＰ）をウサギ網状赤血球溶解物（ＲＲＬ）系などのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系に添加し、次いでｉｎ ｖｉｔｒｏ初回免疫反応を続けて行うことにより、スクリーニングを行ってもよい。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳利用型ライブラリーとしては、１９９１年４月１８日付けのＰＣＴ公報第ＷＯ ９１／０５０５８号；およびＭａｔｔｈｅａｋｉｓら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：９０２２−９０２６に記載されるものが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３４】
本明細書に記載の方法により試験および同定できる化合物としては、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， ＷＩ ５３２３３）、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ（Ｂｕｃｈｓ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．（Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ， ＮＹ）、Ｅａｓｔｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｋｉｎｇｓｐｏｒｔ， ＴＮ）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｔａｋａｓａｇｏ（Ｒｏｃｋｌｅｉｇｈ， ＮＪ）、ＳＳＴ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃｌｉｆｔｏｎ， ＮＪ）、Ｆｅｒｒｏ（Ｚａｃｈａｒｙ， ＬＡ ７０７９１）、Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅＨａｅｎ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ（Ｓｅｅｌｚｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＰＰＧ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ （Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， ＰＡ １５２７２）を含む任意の商業元から得られる化合物が挙げられるがこれらに限定されない。細菌、菌類、植物または動物抽出物を含むさらに任意の種類の天然の生成物が、本発明の方法を用いてスクリーニングされ得る。
【０１３５】
さらに、小分子試験化合物を含む試験化合物の多様なライブラリーを利用してもよい。例えば、ライブラリーは、Ｓｐｅｃｓ ａｎｄ ＢｉｏＳｐｅｃｓ Ｂ．Ｖ．（Ｒｉｊｓｗｉｊｋ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）、Ｃｏｎｔｒａｃｔ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｄｏｌｇｏｐｒｕｄｎｙ， Ｍｏｓｃｏｗ Ｒｅｇｉｏｎ， Ｒｕｓｓｉａ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ ＵＳＡ Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ， ＮＪ）、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．（Ｃｏｒｎｗａｌｌ ＰＬ３４ ＯＨＷ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）およびＡｓｉｎｅｘ（Ｍｏｓｃｏｗ， Ｒｕｓｓｉａ）から購入してもよい。
【０１３６】
さらに、以下を含む（ただしこれらに限定されない）当該分野で公知のコンビナトリアルライブラリー方法が利用できる：すなわち、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス指定可能な平行固相または溶相（ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ）ライブラリー；デコンボリューション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）を必要とする合成ライブラリー方法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー方法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリー方法。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定され、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー、または小分子の化合物ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ， １９９７， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． １２：１４５）。小分子試験化合物を含む試験化合物のコンビナトリアルライブラリーが利用でき、例えば、ＥｉｃｈｌｅｒおよびＨｏｕｇｈｔｅｎ， １９９５， Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． Ｔｏｄａｙ １：１７４−１８０；Ｄｏｌｌｅ， １９９７， Ｍｏｌ． Ｄｉｖｅｒｓ． ２：２２３−２３６；ならびにＬａｍ， １９９７， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． １２：１４５−１６７に開示されるように作製され得る。
【０１３７】
分子ライブラリーの合成方法の例は、例えば、ＤｅＷｉｔｔら， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６９０９；Ｅｒｂら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら， １９９４， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：２６７８；Ｃｈｏら， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら， １９９４， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら， １９９４， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら， １９９４， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：１２３３等、当該分野において見つけることができる。
【０１３８】
化合物のライブラリーは溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ， １９９２， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１）、またはビーズ（Ｌａｍ， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ， １９９３， Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、孔（米国特許第５，５７１，６９８号；同第５，４０３，４８４号；および同第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９）、またはファージ（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：６３７８−６３８２；およびＦｅｌｉｃｉ， １９９１， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：３０１−３１０）上に存在し得る。
【０１３９】
ライブラリーのスクリーニングは、一般的に知られている様々な方法により達成できる。例えば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを開示する以下の参考文献を参照のこと：すなわち、ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ， １９８９， Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ２５１：２１５−２１８；ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｆｏｗｌｋｅｓら， １９９２； ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４２２−４２７；Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５３９３−５３９７；Ｙｕら， １９９４， Ｃｅｌｌ ７６：９３３−９４５；Ｓｔａｕｄｔら， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５７７−５８０；Ｂｏｃｋら， １９９２， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：５６４−５６６；Ｔｕｅｒｋら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：６９８８−６９９２；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎら， １９９２， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：８５０−８５２；Ｌａｄｎｅｒらに発行された米国特許第５，０９６，８１５号、同第５，２２３，４０９号および同第５，１９８，３４６号；ＲｅｂａｒおよびＰａｂｏ， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：６７１−６７３；ならびにＰＣＴ公報第ＷＯ ９４／１８３１８号。
【０１４０】
５．３  免疫療法に有用な、ＣＤ３６および／またはＣＤ３６リガンド（ＨＳＰ等）の断片の同定
本発明は、リガンド結合ＣＤ３６断片（「ＨＳＰ結合ドメイン」等）、およびＣＤ３６リガンドペプチド（ＨＳＰペプチド複合体等）に結合可能なその類似体、突然変異タンパク質または誘導体の同定方法も包含する。その後、このようなリガンド結合ＣＤ３６断片（例えば、ＨＳＰ結合ドメイン）を、上記５．２．１節に記載したＣＤ３６／リガンド結合アッセイを用いて、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性について試験できる。一実施形態では、熱ショックタンパク質に結合可能なＣＤ３６断片のこのような同定方法は：（ａ）熱ショックタンパク質を１つ以上のＣＤ３６断片と接触させるステップ；および（ｂ）熱ショックタンパク質に特異的に結合するＣＤ３６ポリペプチド断片を同定するステップを含む。
【０１４１】
リガンド−抗原ペプチド複合体（ＨＳＰ−抗原ペプチド複合体等）に結合可能なＣＤ３６のリガンド結合ドメイン（例えば、ＨＳＰ結合ドメイン）を、上記５．２．２節に記載したようなｉｎ ｖｉｖｏ結合アッセイまたはＣＴＬアッセイのいずれかを用いて、活性についてさらに試験できる。例えば、ＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセスを誘導可能なＣＤ３６断片のこのような同定方法の１つは：（ａ）熱ショックタンパク質を、ＣＤ３６断片を発現する細胞と接触させるステップ；および（ｂ）該細胞中のＣＤ３６活性のレベルを測定するステップを含み、（ｂ）で測定したＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセスまたは活性のレベルが、ＣＤ３６断片の不在下でのＣＤ３６活性のレベルを上回る場合には、ＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセスを誘導可能なＣＤ３６断片が同定されたこととする。このようなアッセイにおける作用に応じて、このような分子を、ｉｎ ｖｉｖｏで投与または発現させて受容体の機能を増強あるいはまたブロックするためのいずれかに使用できる。例えば、これらのアッセイを、ＨＳＰ−抗原複合体に結合でき、シグナル伝達活性を負に妨害できるＣＤ３６−ＨＳＰ結合ドメインを同定するために使用できる。これらのアンタゴニストを使用して、ＨＳＰの細胞放出により生じる免疫応答を下方調節し得る。あるいはまた、特定のＣＤ３６ ＨＳＰ結合ドメインを使用して、ＨＳＰ−抗原複合体摂取およびシグナリングを増強してもよい。このようなアゴニストは、被検体中で投与または発現されて、目的の抗原に対する免疫応答を引き出し得る。
【０１４２】
別の実施形態では、本発明は、ＣＤ３６（「ＣＤ３６結合ドメイン」）、およびその類似体、突然変異タンパク質または誘導体に結合可能なリガンド断片（ＨＳＰ断片等）の同定方法を包含する。上記ＣＤ３６関連ポリペプチドについてのアッセイについて記載したように、その後、このようなＣＤ３６結合ドメインを、上記５．２．１節に記載した結合アッセイを用いて、活性についてｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで試験できる。例えば、ＣＤ３６に結合可能な熱ショックタンパク質断片のこのような同定方法の１つは：（ａ）ＣＤ３６を１つ以上の熱ショックタンパク質断片と接触させること；および（ｂ）ＣＤ３６に特異的に結合する熱ショックタンパク質断片同定することを含む。
【０１４３】
上記５．２．２節に記載したようなｉｎ ｖｉｖｏ結合アッセイ、またはＣＴＬアッセイを用いて、目的のリガンド断片（ＨＳＰ断片等）を細胞中でさらに試験してもよい。例えば、一実施形態では、ＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセスを誘導可能な熱ショックタンパク質断片のこのような同定方法は：（ａ）断片を、熱ショックタンパク質を発現する細胞と接触させること；および（ｂ）該細胞中のＣＤ３６活性のレベルを測定することを含み、（ｂ）で測定したＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセスまたは活性のレベルが、該熱ショックタンパク質断片の不在下でのＣＤ３６活性のレベルを上回る場合には、ＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセスを誘導可能なＨＳＰ断片が同定されたとする。あるいはまた、ＣＤ３６結合ドメインを使用して、ＣＤ３６によるＨＳＰ摂取をブロックしてもよい。一実施形態では、ＣＤ３６結合ドメイン配列を含むこのようなＨＳＰ断片を使用して、熱ショックタンパク質ＣＤ３６結合ドメインおよび抗原ペプチド配列からなる組換え融合タンパク質を構築してもよい。このような組換え融合タンパク質を使用して、免疫応答を引き出したり、ならびに免疫疾患および障害を治療または予防してもよい（Ｓｕｚｕｅら， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４：１３１４６−５１）。
【０１４４】
本発明のＣＤ３６断片、類似体、突然変異タンパク質および誘導体、ならびに／またはリガンド（例えば、ＨＳＰ）断片、類似体、突然変異タンパク質および誘導体は、組換えＤＮＡ技術、合成方法、または天然型ＣＤ３６および／またはリガンド（例えば、ＨＳＰ）の酵素的もしくは化学的切断により生成され得る。
【０１４５】
あらゆる真核生物細胞が、ＣＤ３６リガンド（例えば、ＨＳＰ）遺伝子のコード領域を得るための核酸由来源としての役割を果たし得る。リガンド（例えば、ＨＳＰ）および／またはＣＤ３６をコードする核酸配列は、脊椎動物、哺乳動物、および霊長類由来源（ヒトを含む）から単離できる。天然型リガンド（例えば、ＨＳＰ）およびＣＤ３６のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ等の配列データベースから一般的に入手可能である。
【０１４６】
ＤＮＡは、ＤＮＡ増幅または分子クローニングにより、当該分野で公知の標準的手順で、組織、細胞培養物、またはクローン化ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ「ライブラリー」）から直接得られる。ゲノムＤＮＡから誘導されたクローンは、コード領域に加えて、調節およびイントロンＤＮＡ領域を含み得る；ｃＤＮＡから誘導されたクローンはエキソン配列しか含まない。好適な実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により、リガンド（例えば、ＨＳＰまたは他のＣＤ３６リガンド）の公知配列から設計したプライマーを用いて、ゲノムまたはｃＤＮＡからＤＮＡを増幅できる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、目的の遺伝子または遺伝子断片を得るために一般的に使用される。例えば、任意の所望の長さの断片をコードするヌクレオチド配列が、ペプチド結合ドメインをコードするヌクレオチド配列に隣接するＰＣＲプライマーを用いて生成できる。あるいはまた、ＣＤ３６リガンド（例えば、ＨＳＰ）または他のＣＤ３６リガンド受容体遺伝子配列を、適切な部位があればそのような部位において制限エンドヌクレアーゼで切断して、ペプチド結合ドメインをコードするＤＮＡ断片を放出する。都合の良い制限部位がなければ、そのような部位を、当該分野で公知の部位特異的突然変異誘発および／またはＤＮＡ増幅方法により、適切な位置において作ってもよい（例えば、Ｓｈａｎｋａｒａｐｐａら， １９９２， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ． １：２７７−２７８を参照）。次いで、リガンド（例えば、ＨＳＰ）またはＣＤ３６遺伝子の断片をコードするＤＮＡ断片を単離し、適切な翻訳リーディングフレームが確実に維持されるように注意しながら適切な発現ベクターにライゲートする。ゲノムＤＮＡを単離する代わりに、公知配列から遺伝子配列自体を化学合成すること、またはｃＤＮＡを、リガンド（例えば、ＨＳＰ）および／もしくはＣＤ３６をコードするｍＲＮＡにすることが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４７】
発現させるペプチド配列中にアミノ酸置換を生じるか、または制限部位を作製／欠失してさらなる操作を容易にする目的で、当該分野で公知の任意の突然変異誘発技術を使用して、ＤＮＡ配列中の個々のヌクレオチドを改変できる。このような技術としては、化学突然変異誘発、ｉｎ ｖｉｔｒｏ部位特異的突然変異誘発（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ， Ｃ．ら， １９７８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２５３：６５５１）、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発（Ｓｍｉｔｈ， １９８５， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． １９：４２３−４６３；Ｈｉｌｌら， １９８７， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５５：５５８−５６８）、ＰＣＲ利用型重複伸長（Ｈｏら， １９８９， Ｇｅｎｅ ７７：５１−５９）、ＰＣＲ利用型メガプライマー（ｍｅｇａｐｒｉｍｅｒ）突然変異誘発（Ｓａｒｋａｒら， １９９０， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ８：４０４−４０７）等が挙げられるがこれらに限定されない。改変は、二本鎖ジデオキシＤＮＡ配列決定により確認できる。
【０１４８】
組換え技術によりＣＤ３６および／またはリガンド（例えば、ＨＳＰ）断片を生成する代わりとして、ペプチド合成がある。例えば、基質結合ドメインを含むか、もしくはｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドと結合するＣＤ３６および／またはリガンド（例えば、ＨＳＰ）の一部に対応するペプチドを、ペプチド合成器を用いて合成できる。従来のペプチド合成、または当該分野で周知の他の合成プロトコールが使用できる。
【０１４９】
さらに、ＣＤ３６および／またはリガンド（例えば、ＨＳＰ）の類似体または誘導体を化学的に合成できる。さらに、所望であれば、非古典アミノ酸または化学アミノ酸類似体を、ＣＤ３６および／またはリガンド（例えば、ＨＳＰ）配列に、置換または付加として導入できる。非古典アミノ酸としては、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、α−イソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸等）、ならびに一般的なアミノ酸類似体が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１５０】
ＣＤ３６および／もしくはリガンド（例えば、ＨＳＰ）ペプチド、またはそれらの変異体もしくは誘導体は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， １９６３， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８５：２１４９に記載されるものと同様の手順により、固相ペプチド合成により合成され得る。合成の間、保護された側鎖を有するＮ−α−保護アミノ酸を、Ｃ末端で連結した成長ポリペプチド鎖、および不溶性ポリマー支持体（すなわち、ポリスチレンビーズ）に段階的に添加する。Ｎ−α−脱保護アミノ酸のアミノ基を、ジシクロヘキシルカルボジイミド等の試薬と反応することで活性化されたＮ−α−保護アミノ酸のα−カルボキシル基に連結することにより、ペプチドを合成する。活性化カルボキシルへの遊離アミノ基の付着により、ペプチド結合形成が生じる。最もよく使用されるＮ−α−保護基としては、酸不安定性のＢｏｃ、および塩基不安定性のＦｍｏｃが挙げられる。適切な化学物質、樹脂、保護基、保護アミノ酸および試薬は、当該分野で周知であるため、本明細書では詳細に議論しない（Ａｔｈｅｒｔｏｎら， １９８９， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、およびＢｏｄａｎｓｚｋｙ， １９９３， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ， 第２版， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇを参照）。
【０１５１】
得られる断片の精製は、ゲル浸透、分配および／またはイオン交換クロマトグラフィーを用いた分取ＨＰＬＣ等の従来の手順を用いて行う。適切なマトリックスおよび緩衝液の選択は、当該分野で周知であるため、本明細書では詳細に記載しない。
【０１５２】
代替的な実施形態では、ＣＤ３６および／またはリガンド（例えば、ＨＳＰ）の断片は、天然型または組換え型ＣＤ３６および／またはリガンド（例えば、ＨＳＰ）分子の化学的または酵素的切断により得ることができる。具体的な化学的切断は、臭化シアン、ＮａＢＨ４、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシン存在下での代謝合成等により行うことができる。特異的な部位を切断するエンドプロテアーゼも使用できる。このようなプロテアーゼは当該分野で公知であり、トリプシン、α−キモトリプシン、Ｖ８プロテアーゼ、パパインおよびプロテイナーゼＫが挙げられるがこれらに限定されない（”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １７．４．６−１７．４．８に掲載のＡｕｓｕｂｅｌら（編）を参照）。目的のＣＤ３６および／またはリガンド（例えば、ＨＳＰ）アミノ酸配列を、これらのプロテアーゼの認識部位について検査できる。酵素は、ペプチド結合ドメインまたはペプチド結合断片を放出できるものが選択される。次いで、ＣＤ３６および／またはリガンド（例えば、ＨＳＰ）分子を、プロテアーゼによる消化および特異的に指定されたペプチド結合断片の放出を引き起こす条件下で、プロテアーゼとインキュベートする。あるいはまた、このようなプロテアーゼ消化は、特異的または全般的な（ｇｅｎｅｒａｌ）特異性を有するプロテアーゼ（プロテイナーゼＫまたはプロナーゼ）を用いて、盲検的に（すなわち、どの消化生成物がペプチド結合ドメインを含むか分からないまま）実施できる。
【０１５３】
断片を調製後、上述したように消化生成物を精製して、その後、ペプチドに結合する能力または免疫原性について試験してもよい。細胞障害性試験によるリガンド（例えば、ＨＳＰ）複合体の免疫原性の決定方法は、５．２．２節に記載している。
【０１５４】
５．４  薬物設計
ＣＤ３６と相互作用するか、またはＣＤ３６リガンド（ＨＳＰ等）とＣＤ３６との相互作用をモジュレートする化合物の同定の際に、このような化合物をさらに調査して、免疫応答を変化させる能力について試験できる。特に、例えば、本発明の方法により同定された化合物を、ＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセスならびにＨＳＰ−ＣＤ３６関連障害（例えば、免疫障害、増殖性障害および感染性疾患）の許容動物モデルにおいて、さらにｉｎ ｖｉｖｏ試験できる。
【０１５５】
コンピュータモデリングおよび検索技術により、ＣＤ３６とそのリガンド（例えば、ＨＳＰ）との相互作用をモジュレートできる化合物の同定、または既に同定された化合物の改善が可能になる。このような化合物または組成物を同定して、活性部位または領域を同定する。このような活性部位は、典型的にはリガンド結合部位である。活性部位は、例えば、ペプチドのアミノ酸配列から、核酸のヌクレオチド配列から、または関連する化合物もしくは組成物とその天然型リガンドとの複合体についての調査から等、当該分野で公知の方法を用いて同定できる。後者の場合、化学的またはＸ線結晶学的方法を用いて、因子（ｆａｃｔｏｒ）上のどこに複合化リガンドが認められるかを見つけることで、活性部位を探すことができる。
【０１５６】
次に、活性部位の三次元幾何学構造を決定する。これは、完全分子構造を決定できるＸ線結晶法等の公知の方法により行うことができる。一方、固相または液相ＮＭＲを使用して、特定の分子内（ｉｎｔｒａ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）距離を決定できる。構造決定の任意の他の実験方法を使用して、部分的または完全な幾何学構造を得ることができる。幾何学構造は、決定された活性部位構造の精度を高め得る天然または人工の複合化リガンドを用いて測定することができる。
【０１５７】
不完全または精度が不充分な構造が決定された場合、コンピュータ利用型数値モデリングの方法を使用して、構造を完成するかまたはその精度を改善できる。タンパク質または核酸などの特定の生物高分子に特異的なパラメータ化（ｐａｒａｍｅｔｅｒｉｚｅｄ）モデル、演算式（ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）分子運動に基づく分子力学モデル、熱的アンサンブル（ｔｈｅｒｍａｌ ｅｎｓｅｍｂｌｅｓ）に基づく統計力学（ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｍｅｃｈａｎｉｃｓ）モデル、または組合せモデルを含む認知されている任意のモデリング方法を使用し得る。ほとんどの種類のモデルについて、構成原子および基の間の力を表す標準的分子力場（ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄ）が必要であり、物理化学の分野で公知の力場から選択できる。不完全または精度が低い実験構造は、これらのモデリング方法により演算された完全かつより精度の高い構造に対する制約になってしまう。
【０１５８】
最後に、実験的にモデリングによりまたは組合せにより活性部位の構造を決定してから、化合物をそれらの分子構造についての情報と共に含むデータベースを検索することで、候補モジュレート化合物を同定できる。このような検索では、決定された活性部位構造と合致し、活性部位を規定する基と相互作用する構造を有する化合物を見つける。このような検索は手動で行ってもよいが、コンピュータで支援される方が好ましい。この検索で見つけたこれらの化合物は、可能性のあるＣＤ３６モジュレート化合物である。
【０１５９】
あるいはまた、既知のモジュレート化合物またはリガンドから、上記方法を用いて、改善されたモジュレート化合物を同定できる。既知化合物の組成を改変し、新規組成物に適用した上記実験的およびコンピュータモデリング方法により改変による構造的影響を決定できる。次に、変化した構造を、化合物の活性部位構造と比較して、改善された適合（ｆｉｔ）または相互作用が生じるか否かを決定する。このようにして、側基（ｓｉｄｅ ｇｒｏｕｐ）の変化等による組成物中の体系的な（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ）変化を迅速に評価して、特異性または活性が改善された改変型モジュレート化合物またはリガンドを得ることができる。
【０１６０】
ＣＤ３６またはＨＳＰのいずれか、ならびに他のリガンドおよびそれらの類似体の活性部位の同定に基づきモジュレート化合物を同定するのに有用なさらなる実験およびコンピュータモデリング方法は、当業者に明らかであろう。
【０１６１】
分子モデリング系の例として、ＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラム（Ｐｏｌｙｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）がある。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化および分子力学機能を行う。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構築、画像モデリングおよび分析を行う。ＱＵＡＮＴＡは、分子間相互作用の相互的な構築、改変、視覚化および分析を可能にする。
【０１６２】
Ｒｏｔｉｖｉｎｅｎら（１９８８， Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｅｎｎｉｃａ ９７：１５９−１６６）；Ｒｉｐｋａ（１９８８ Ｎｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ ５４−５７）；ＭｃＫｉｎａｌｙおよびＲｏｓｓｍａｎｎ（１９８９， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｉｏｌ． ２９：１１１−１２２）；ＰｅｒｒｙおよびＤａｖｉｅｓ， ＯＳＡＲ： Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ｐｐ． １８９−１９３ Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． １９８９；ＬｅｗｉｓおよびＤｅａｎ（１９８９， Ｐｒｏｃ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄ． ２３６：１２５−１４０および１４１−１６２）等の多数の論文が特定のタンパク質と相互作用する薬剤のコンピュータモデリングについて概要を記載している。核酸成分のモデル受容体に関しては、Ａｓｋｅｗら（１９８９， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１１：１０８２−１０９０）が概要を記載している。化学物質をスクリーニングし画像に示す他のコンピュータプログラムは、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ， Ｉｎｃ．（Ｐａｓａｄｅｎａ， ＣＡ）、Ａｌｌｅｌｉｘ， Ｉｎｃ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ， Ｏｎｔａｒｉｏ， Ｃａｎａｄａ）およびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ， Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｏｎｔａｒｉｏ）等の会社から入手可能である。これらは、特定のタンパク質に特異的な薬剤に適用するために主に設計されているが、ＤＮＡまたはＲＮＡの領域が同定されればその領域に特異的な薬剤の設計に適用できる。
【０１６３】
５．５  診断的用途
ＣＤ３６は、最初、もっぱら細胞内において存在し、アポトーシス細胞死ではなく壊死の結果放出されるｇｐ９６との相互作用によって、熱ショックタンパク質受容体として同定された。従って、ＣＤ３６に結合したｇｐ９６は、壊死細胞死のセンサとして作用し得る。このように、ＣＤ３６−リガンド複合体を使用して、増殖性障害（癌等）、自己免疫障害および感染性疾患を検出および診断してもよい。従って、ＣＤ３６タンパク質、類似体、誘導体およびそれらのサブ配列、ＣＤ３６核酸（およびそれに相補的な配列）、ならびに抗ＣＤ３６抗体は、このような障害を検出および診断するのに有用である。
【０１６４】
ＣＤ３６およびＣＤ３６核酸をアッセイに使用して、腫瘍形成、癌、腺腫等およびウイルス性疾患を生じ得る免疫系障害を、検出、予後判定または診断できる。
【０１６５】
本発明の分子をイムノアッセイ等のアッセイに使用して、発現に影響を及ぼす様々な症状、疾患および障害を検出、予後判定、診断もしくはモニターするか、またはその治療をモニターできる。特に、このようなイムノアッセイは、患者から得たサンプルを、ＨＳＰ−ＣＤ３６特異的抗体と、免疫特異的結合が生じ得る条件下で接触させること、ならびに抗体による任意の免疫特異的結合の量を検出または測定すること、を含む方法により実施する。特定の態様では、組織切片中のこのような抗体結合を用いて、異常な局在化（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）または異常な（例えば、低いまたは不在である）ＣＤ３６レベルを検出する。特定の実施形態では、ＣＤ３６の抗体を使用して、患者組織または血清サンプルを、ＣＤ３６の存在についてアッセイできる（この場合、ＣＤ３６の異常レベルは疾患症状を示す）。「異常レベル」とは、障害のない身体の一部または被検体から得た同様のサンプルにおけるレベル（またはそれを代表する標準的レベル）と比べてレベルが高いまたは低いことを意味する。
【０１６６】
使用できるイムノアッセイとしては、ウェスタンブロット、免疫組織化学ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定化アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ等の技術を使用した競合および非競合アッセイ系が一部として挙げられるがこれらに限定されない。
【０１６７】
ＣＤ３６遺伝子ならびに関連する核酸配列およびサブ配列（相補配列も含む）もハイブリダイゼーションアッセイに使用できる。ＣＤ３６核酸配列、または少なくとも約８ヌクレオチドを含むそのサブ配列は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。ハイブリダイゼーションアッセイを使用して、上記したような発現および／または活性の異常な変化に伴う症状、障害または疾患状態を、検出、予後判定、診断またはモニターできる。特に、このようなハイブリダイゼーションアッセイは、核酸を含むサンプルを、ＣＤ３６ ＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズ可能な核酸プローブと、ハイブリダイゼーションが生じ得る条件下で接触させること、ならびにその結果生じる任意のハイブリダイゼーションを検出または測定すること、を含む方法により実施する。
【０１６８】
特定の実施形態では、ＣＤ３６タンパク質、ＣＤ３６ ＲＮＡまたはＣＤ３６機能活性（例えば、ＨＳＰへの結合、抗体結合活性等）のレベルの低下を検出することで、またはＣＤ３６の発現もしくは活性を低くするＣＤ３６ ＲＮＡ、ＤＮＡもしくはＣＤ３６タンパク質における突然変異（例えば、ＣＤ３６核酸における転位、ＣＤ３６遺伝子またはタンパク質における平滑末端化、野生型ＣＤ３６と比べたヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変化）を検出することにより、感染または悪性障害の間の免疫応答性が低い疾患および障害を診断でき、推測されるそれらの存在についてスクリーニングでき、またはこのような障害を患う素因を検出できる。このような疾患および障害としては、５．７、５．８および５．９節に記載のものが挙げられるがこれらに限定されない。例として、ＣＤ３６タンパク質のレベルはイムノアッセイにより検出でき、ＣＤ３６ ＲＮＡのレベルはハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンブロット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）により検出でき、ＣＤ３６活性はｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合活性を測定することでアッセイできる。ＣＤ３６核酸における転位、欠失および点突然変異誘発は、サザンブロット、ＦＩＳＨ、ＲＦＬＰ分析、ＳＳＣＰ、プライマーを用いたＰＣＲ（好ましくは、少なくともＣＤ３６遺伝子のほぼ全体にわたる断片を生成するプライマー）、患者から得たＣＤ３６ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡの配列決定等により検出できる。
【０１６９】
好適な実施形態では、患者サンプル中のＣＤ３６ ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを、悪性腫瘍または過剰増殖性障害を患っていない被検体から得た同様のサンプルにおけるレベルと比較して検出または測定する。レベルの低下は、被検体が、ウイルス性感染、悪性腫瘍または過剰増殖性障害を患うか、またはそれらを患う素因を有し得ることを示す。
【０１７０】
別の特定の実施形態では、ＣＤ３６タンパク質、ＲＮＡまたはＣＤ３６機能活性（例えば、ＨＳＰ結合または抗体等）のレベルの上昇を検出することにより、またはＣＤ３６の発現もしくは活性を高くするＣＤ３６ ＲＮＡ、ＤＮＡもしくはタンパク質における突然変異（例えば、ＣＤ３６核酸における転位、遺伝子またはタンパク質におけるトランケーション、野生型と比べたヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変化）を検出することにより、細胞増殖を生じる免疫応答性の欠損を伴うか、または細胞増殖が治療のために望ましい疾患および障害を診断でき、推測されるそれらの存在についてスクリーニングでき、またはこのような障害を患う素因を検出できる。このような疾患および障害としては、５．７、５．８および５．９節に記載のものが挙げられるがこれらに限定されない。例として、ＣＤ３６タンパク質のレベル、ＣＤ３６ ＲＮＡのレベル、ＣＤ３６結合活性、および転位または点突然変異の存在は、上述したように決定できる。
【０１７１】
特定の実施形態では、障害の無い患者から得た同様のサンプルにおけるレベルと比べた、患者サンプル中のＣＤ３６ ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを検出または測定する（この場合、レベルの上昇は、被検体が、自己免疫障害を患っているか、またはそれを患う素因を有していることを示す）。
【０１７２】
抗ＣＤ３６抗体、および任意に、該抗体に対する標識化結合パートナーが１つ以上の容器に入った診断的用途のキットも提供する。あるいはまた、抗ＣＤ３６抗体を（検出可能マーカー（例えば化学発光、酵素、蛍光、または放射活性部分）で）標識化できる。ＣＤ３６ ＲＮＡにハイブリダイズ可能な核酸プローブが１つ以上の容器に入ったキットも提供する。特定の実施形態では、キットは、核酸の少なくとも一部の適切な反応条件下で、（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、Ｉｎｎｉｓら， １９９０， ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡを参照）、リガーゼ連鎖反応（ＥＰ ３２０，３０８を参照）、Ｑβレプリカーゼの使用、環状プローブ反応、または当該分野で公知の他の方法により）増幅を開始可能な１対のプライマー（例えば、それぞれ６〜３０ヌクレオチドの大きさ）を１つ以上の容器に含み得る。キットは、所定量の精製ＣＤ３６タンパク質または核酸を（例えば、標準または対照として）、容器中にさらに任意に含み得る。
【０１７３】
５．６  治療的用途
本発明は、免疫応答をモジュレートする方法をさらに包含する。免疫系を刺激し、免疫応答を引き起こす目的のために、ＣＤ３６は、ｇｐ９６等のＨＳＰタンパク質を認識し、ケモカインおよび一酸化窒素放出を刺激する（例えば、ＨＳＰ−抗原ペプチド複合体）。従って、本発明の組成物および方法を、ＨＳＰ−ＣＤ３６関連障害および症状（自己免疫疾患、癌および感染性疾患等）の治療に使用してもよい。特に、以下に詳細に記載するように、ＣＤ３６と相互作用するか、またはＣＤ３６とそのリガンド（例えば、ＨＳＰ）との相互作用をモジュレートするＨＳＰ−抗原ペプチド複合体、抗体、および他の化合物、ならびにＨＳＰ−ＣＤ３６介在型プロセスをモジュレートする他の化合物等のＣＤ３６複合体を含む組換え細胞を、免疫応答を引き出すかブロックして、このようなＨＳＰ−ＣＤ３６関連障害および症状を治療するために使用してもよい。
【０１７４】
５．６．１  同定したアゴニストおよびアンタゴニストの治療的用途
ＣＤ３６と相互作用するか、またはＣＤ３６とそのリガンド（例えば、ＨＳＰ）との相互作用をモジュレートする化合物（本明細書で提供するスクリーニング方法により同定されるもの等）は、治療薬として有用であり得る。このような化合物としては、アゴニスト、アンタゴニスト（抗体等）、アンチセンスＲＮＡおよびリボザイムが挙げられるがこれらに限定されない。リガンド（例えば、ＨＳＰ）ＣＤ３６相互作用を妨げる化合物は、免疫応答をブロックするために使用でき、自己免疫応答および症状を治療するために使用できる。他の抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、アンチセンスＲＮＡおよびリボザイムは、リガンド（例えば、ＨＳＰ）−ＣＤ３６相互作用、活性、または発現を上方調節でき、抗原複合体（例えば、ＨＳＰ−抗原複合体）の摂取を増強し、従って、ワクチンの投与に先立ってまたはそれと同時に宿主の免疫系を刺激するのに有用であり得る。以下に記載するのは、このような化合物をＨＳＰ−ＣＤ３６関連障害（免疫障害、増殖性障害および感染性疾患等）の治療において使用する方法および組成物である。
【０１７５】
一実施形態では、ＣＤ３６−リガンド（例えば、ＨＳＰ−ＣＤ３６）相互作用のアンタゴニストを使用して、免疫応答をブロックする。このようなアンタゴニストとしては、ＣＤ３６、リガンドまたはリガンド−ＣＤ３６複合体に結合するのに競合して、リガンド（例えば、ＨＳＰ）が受容体に結合することを妨げる化合物が挙げられる。
【０１７６】
一実施形態では、アンタゴニストはＣＤ３６、またはＨＳＰリガンド結合部位を含むその断片に特異的な抗体である。別の実施形態では、アンタゴニストは、ＨＳＰが受容体に結合するのを妨げる、ＨＳＰに特異的な抗体である。
【０１７７】
別の実施形態では、アンタゴニストは、ＨＳＰ配列の少なくとも１０の連続したアミノ酸を含むペプチドである。このようなペプチドは、ＣＤ３６のリガンド結合部位に結合して、ＨＳＰまたはＨＳＰ複合体の相互作用をブロックできる。別の実施形態では、アンタゴニストは、ＣＤ３６配列の少なくとも１０の連続したアミノ酸を含むペプチドであり、これはＨＳＰと同様、ＣＤ３６に結合して、結合およびシグナル伝達活性を妨げることができる。さらに別の実施形態では、アンタゴニストは、ＣＤ３６配列の少なくとも１０の連続したアミノ酸を含むペプチド、特に、天然型リガンド（ＨＳＰ、ＬＤＬ等）に結合および「中和」できるＣＤ３６（もしくはその一部）のＥＣＤである。
【０１７８】
このようなペプチドは、合成によっても、または標準的な分子生物学的技術を用いることによっても生成され得る。天然型ＣＤ３６リガンド（ＨＳＰ等）のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等の配列データベースから一般的に入手可能である。Ｅｎｔｒｅｚ等のコンピュータプログラムを使用して、データベースをブラウジングしたり、任意のアミノ酸配列および目的の遺伝子配列データを受託番号から検索できる。このようなペプチドの組換えおよび合成生成の方法は、５．１．１および５．１．２節に記載している。
【０１７９】
さらに、上記５．２節に記載したような技術を介して同定される、ＣＤ３６遺伝子生成物活性をモジュレートすることができる化合物を、当業者に周知の標準的技術を用いて投与できる。
【０１８０】
５．６．１．１  ＣＤ３６−リガンド相互作用の競合的アンタゴニスト
一実施形態では、ＣＤ３６−リガンド（例えば、ＨＳＰ−ＣＤ３６）相互作用のアンタゴニストを使用して、（例えば、自己免疫障害を治療するために）抗原複合体に対する免疫応答をブロックする。このようなアンタゴニストとしては、ＣＤ３６に結合することにより結合を妨げて、リガンド（例えば、ＨＳＰ）が受容体に結合するのを妨害する分子が挙げられる。この種の競合インヒビターの例は、ＣＤ３６、またはＨＳＰリガンド結合部位を含むＣＤ３６の断片に対する抗体である。
【０１８１】
ＣＤ３６−リガンド（例えば、ＨＳＰ）競合インヒビターは、任意の種類の分子（タンパク質、核酸または薬剤が挙げられるがこれらに限定されない）であり得る。好適な実施形態では、ＨＳＰ−ＣＤ３６競合インヒビターは、ＣＤ３６結合またはＨＳＰ結合ペプチドである。このようなペプチドの例を以下に提供する。
【０１８２】
５．６．１．１．１  ＨＳＰ結合ペプチド
ＣＤ３６ペプチド
本発明の一実施形態では、ＨＳＰ−ＣＤ３６競合アンタゴニストは、ＨＳＰに結合してＨＳＰが天然型受容体に結合するのを競合的に阻害するＣＤ３６ペプチド、好ましくは可溶性ペプチドである。
【０１８３】
ＣＤ３６のＨＳＰ結合部分の機能的発現が行われることが好ましい。簡単に言うと、適切な折り畳みを維持するために、タンパク質をＧＳＴ融合体として発現、組換え発現させ、ＧＳＴ部分を切断し、非切断タンパク質を、ＧＳＨ−セファロース上で除き、切断タンパク質を再折り畳みさせる。補体反復配列（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｒｅｐｅａｔ）はカルシウムに結合するので、適切な折り畳みは、再折り畳みタンパク質とカルシウムとの結合を測定することによりアッセイする。
【０１８４】
本実施形態の特定のモードでは、ＣＤ３６のＨＳＰ結合部分は、少なくとも１つの補体反復配列からなるか、またはそれを含む。本実施形態の別の特定のモードでは、ＣＤ３６のＨＳＰ結合部分は、補体反復配列のクラスター、最も好ましくはＣ１−ＩＩを含む。本実施形態の別のモードでは、ＨＳＰ結合部分は、少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０、さらにより好ましくは少なくとも３０、さらにより好ましくは少なくとも４０そして最も好ましくは少なくとも８０の（連続）アミノ酸を含む。本実施形態の特定のモードでは、このような断片は、４０〜４５アミノ酸以下である。本実施形態の他の特定のモードでは、このような断片は８０〜９０アミノ酸以下である。
【０１８５】
ＣＤ３６のＨＳＰ結合部分の誘導体または類似体も、ＨＳＰ−ＣＤ３６複合体の競合的アンタゴニストとして意図されている。このような誘導体または類似体としては、ＣＤ３６の細胞外ドメインもしくはその断片に実質的に相同な（例えば、様々な実施形態では、同じ大きさのアミノ酸配列と、もしくは当該分野で公知のコンピュータ相同性プログラムによりアライメントが行われたアライメント配列と比較して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％同一性）領域を含む分子、またはストリンジェント、中度にストリンジェントもしくは非ストリンジェント条件下で、コード核酸がＣＤ３６ ＨＳＰ結合配列をコードする配列にハイブリダイズ可能なものが挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、ＣＤ３６誘導体は、異なるタンパク質のアミノ酸配列に、ペプチド結合を介してアミノ末端またはカルボキシ末端において連結したＣ１−ＩＩの少なくとも１つの補体反復配列から好ましくはなる、ＣＤ３６のＨＳＰ結合部分を含むキメラまたは融合タンパク質である。このようなキメラタンパク質は、切断再精製ステップを省略することにより、上述のように組換え産生できる。
【０１８６】
他のＨＳＰ結合ＣＤ３６誘導体は、機能的に等価の分子を提供する置換、付加または欠失により、ＣＤ３６コード配列を変えることで作製できる。ヌクレオチドコード配列の縮重のために、ＣＤ３６遺伝子または遺伝子断片と実質的に同じアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を、本発明の実施において使用し得る。ＨＳＰ結合ＣＤ３６誘導体の適切な改変および産生の選択は、ＣＤ３６誘導体について上述したのと同じ原理を適用し、ならびに５．１．１および５．１．２節に記載した一般的な方法を用いることにより実施できる。
【０１８７】
ＨＳＰペプチド
本実施形態の別のモードでは、アンタゴニストは、ＨＳＰ配列の少なくとも１０の連続アミノ酸を含むペプチドである。このようなペプチドは、ＣＤ３６のリガンド結合部位と結合して、ＨＳＰまたはＨＳＰ複合体の相互作用をブロックできる。
【０１８８】
このようなペプチドは、合成によっても、または標準的な分子生物学的技術を用いても生成することができる。天然型ＨＳＰのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等の配列データベースから一般的に入手可能である。Ｅｎｔｒｅｚ等のコンピュータプログラムを使用して、データベースをブラウジングしたり、任意のアミノ酸配列および目的の遺伝子配列データを受託番号から検索できる。このようなペプチドの組換えおよび合成生成の方法は、５．１．１および５．１．２節に記載している。
【０１８９】
さらに、遺伝子生成物活性をモジュレート可能な、上記５．２節に記載するような技術を介して同定される化合物は、当業者に周知の標準的技術を用いて投与できる。
【０１９０】
５．６．２  癌および感染性疾患に対するＣＤ３６の治療的用途
別の実施形態では、腫瘍形成または癌を生じる特定のＣＤ３６遺伝子障害（自己免疫障害、または増殖性もしくは分化障害）の症状を、ＣＤ３６遺伝子発現および／またはＣＤ３６遺伝子生成物活性のレベルをモジュレートすることにより緩和し得る。一実施形態では、例えば、ＣＤ３６遺伝子発現の低下は、ＣＤ３６活性を低下して、自己免疫障害の症状を緩和するのに有用であり得る。この場合、ＣＤ３６遺伝子発現のレベルは、ＣＤ３６遺伝子配列を、周知のアンチセンス遺伝子「ノックアウト」リボザイムおよび／または三重らせん方法と共に使用することにより低下し得る。別の実施形態では、ＣＤ３６遺伝子発現の上昇は、ＨＳＰ−ＣＤ３６介在型経路において変異型または損傷遺伝子を補償するため、およびＨＳＰ−ＣＤ３６関連障害の症状を緩和するために望ましいことがある。
【０１９１】
活性、ＣＤ３６発現またはＣＤ３６遺伝子の合成をモジュレートする能力（ＨＳＰ関連障害の症状を緩和する能力を含む）を示し得る化合物には、アンチセンス、リボザイムおよび三重らせん分子が含まれる。このような分子は、非損傷標的遺伝子活性、または適切であれば変異型標的遺伝子活性のいずれかを低下または阻害するように設計され得る。このような分子の生成および使用のための技術は、当業者に周知である。
【０１９２】
アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子は、標的化ｍＲＮＡにハイブリダイズしてタンパク質翻訳を予防することにより、ｍＲＮＡの翻訳を直接ブロックするように作用する。アンチセンスアプローチは、標的遺伝子ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドの設計を伴う。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補標的遺伝子ｍＲＮＡ転写産物に結合して、翻訳を妨げる。絶対的な相補性は好ましいが必須ではない。
【０１９３】
本明細書で言及するＲＮＡの一部に「相補的な」配列は、ＲＮＡにハイブリダイズして、安定した二重らせんを形成するのに十分な相補性を有する配列を意味する；従って、二本鎖アンチセンス核酸の場合、二重らせんＤＮＡの一本鎖を試験するか、または三重らせん形成をアッセイしてもよい。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補性の程度および長さの両方に依存する。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長ければ長いほど、ＲＮＡとの塩基ミスマッチがより多く含まれた上で安定した二重らせん（場合によっては三重らせん）を形成する。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を決定する標準的な手順を使用して、寛容できるミスマッチの程度を確認できる。
【０１９４】
一実施形態では、ＣＤ３６遺伝子の非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチドを、アンチセンスアプローチに使用して、内因性ＣＤ３６ ｍＲＮＡの翻訳を阻害してもよい。アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチドの長さで、６〜約５０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであることが好ましい。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０１９５】
本発明の一実施形態では、ＨＳＰ受容体リガンド結合ドメインをコードする核酸に相補的なオリゴヌクレオチドを使用する。
【０１９６】
標的配列の選択に関わらず、ｉｎ ｖｉｔｒｏ調査を最初に行い、アンチセンスオリゴヌクレオチドが遺伝子発現を阻害する能力を定量することが好ましい。これらの研究において、アンチセンス遺伝子阻害とオリゴヌクレオチドの非特異的生物学的影響とを区別する対照を利用することが好ましい。これらの調査において、標的ＲＮＡまたはタンパク質のレベルを、内部（ｉｎｔｅｒｎａｌ）対照ＲＮＡまたはタンパク質のレベルと比較することも好ましい。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて得た結果を、対照オリゴヌクレオチドを用いて得た結果と比較することが想定される。対照オリゴヌクレオチドが試験オリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さであること、およびオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が、標的配列との特異的なハイブリダイゼーションを妨げる以上にはアンチセンス配列と異ならないことが好ましい。
【０１９７】
オリゴヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖の、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらのキメラ混合物、誘導体もしくは改変型変種であり得る。オリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格において改変されて、例えば、分子、ハイブリダイゼーション等の安定性を改善できる。オリゴヌクレオチドは、（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏで宿主細胞受容体を標的化するために）ペプチド等の他の付属基、細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら， １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６， ６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら， １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８４， ６４８−６５２；１９８８年１２月１５日に発行されたＰＣＴ公報第ＷＯ ８８／０９８１０号を参照）もしくは血液脳関門（例えば、１９８８年４月２５日に発行されたＰＣＴ公報第ＷＯ ８９／１０１３４号を参照）を通りぬける輸送を容易にする薬剤、ハイブリダイゼーション誘発型切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら， １９８８， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６， ９５８−９７６を参照）、または挿入剤（例えば、Ｚｏｎ， １９８８， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ５， ５３９−５４９を参照）を含み得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドを別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発型架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発型切断剤等）とコンジュゲートしてもよい。
【０１９８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンからなる（ただしこれらに限定されない）群より選択される、少なくとも１つの改変型塩基部分を含み得る。
【０１９９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースからなる（ただしこれらに限定されない）群より選択される少なくとも１つの改変された糖部分も含み得る。
【０２００】
さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート（Ｓ−ＯＤＮ）、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロアミダイト、ホスホロジアミダイト、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびそれらのホルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）もしくは類似体からなる群より選択される少なくとも１つの改変されたリン酸骨格を含む。
【０２０１】
さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、この中では、通常のβユニットとは対照的に、鎖が互いに平行に伸びている（Ｇａｕｔｉｅｒら， １９８７， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５， ６６２５−６６４１）。オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら， １９８７， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５， ６１３１−６１４８）、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅら， １９８７， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２１５， ３２７−３３０）である。
【０２０２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、当該分野で公知の標準的な方法（例えば（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ等から市販されている）自動化ＤＮＡ合成器の使用）により合成され得る。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎら （１９８８， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６， ３２０９） の方法により合成することができ、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御された （ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ） 孔ガラスポリマー支持体の使用により調製することができる（Ｓａｒｉｎら， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５， ７４４８−７４５１）。
【０２０３】
標的遺伝子コード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドが使用できる一方で、転写非翻訳領域に相補的なものが最も好ましい。
【０２０４】
本発明の一実施形態では、特定の標的ｍＲＮＡが、アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（Ｓ−ＯＤＮ）とハイブリダイズした後に、ＲＮアーゼＨにより消化されて、遺伝子発現下方調節が実行される。どのアンチセンスＳ−ＯＤＮがより都合が良いかを予測する規則はないため、最良の戦略は完全に経験的なものであり、いくつかのアンチセンスＳ−ＯＤＮを試すことからなる。アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（Ｓ−ＯＤＮ）は、目的のｍＲＮＡの特定の領域を標的化するように設計される。アンチセンスＳ−ＯＤＮの無秩序な寄せ集めの（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）配列からなる対照Ｓ−ＯＤＮも、ヌクレオチド内容が確実に同一になるようにし、核酸内容に潜在的に負う差異が最小になるように設計される。全てのＳ−ＯＤＮが、Ｏｌｉｇｏｓ Ｅｔｃ．（Ｗｉｌｓｏｎｖｉｌｌｅ， ＯＲ）により合成できる。調査目的のアッセイまたはｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子療法プロトコール等、培養細胞に適用した場合のアンチセンス分子の有効性を試験するために、細胞を１００ ｍｍ組織培養プレート上で６０〜８０％の集密性まで培養し、ＰＢＳで濯ぎ、８ ｍｌ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、５２．８μｌリポフェクチンからなるリポフェクションミックス（最終濃度２００ ｎＭ Ｓ−ＯＤＮ）をかぶせる。リポフェクションは、リポフェクチン試薬およびＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を使用して実施する。細胞を、リポフェクションミックスの存在下で５時間インキュベートする。インキュベートの後、培地を完全ＤＭＥＭと置き換える。細胞を、リポフェクション後の異なる時点において回収し、ウェスタンブロットによりタンパク質レベルを分析する。
【０２０５】
アンチセンス分子は、ｉｎ ｖｉｖｏで直接被検体に対して、または培養細胞（ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子療法プロトコール等）に対してのいずれかで、標的遺伝子を発現する細胞を標的化するべきである。アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に送達するために、多数の方法が開発されている；例えば、アンチセンス分子を組織部位に直接注射するか、または所望の細胞（例えば、標的細胞表面上で発現する受容体または抗原に特異的に結合するペプチドまたは抗体に連結したアンチセンス）を標的化するように設計された改変型アンチセンス分子を全身投与できる。
【０２０６】
しかし、内因性ｍＲＮＡの翻訳を抑制するのに十分なアンチセンスの細胞内濃度を得ることは難しいことが多い。従って、好適なアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なｐｏｌ ＩＩＩまたはｐｏｌ ＩＩプロモーターの制御下に置かれた組換えＤＮＡ構築物を利用する。このような構築物を使用して患者中の標的細胞をトランスフェクトすることにより、内因性標的遺伝子転写産物と相補的塩基対を形成し、標的遺伝子ｍＲＮＡの翻訳を妨ぐ、十分な量の一本鎖ＲＮＡの転写が生じる。例えば、ベクターを、例えば、細胞に摂取されてアンチセンスＲＮＡの転写を指示するように導入できる。このようなベクターは、所望のアンチセンスＲＮＡを生成するように転写できる限り、エピソームのままであっても、染色体に取り込まれてもよい。このようなベクターは、当該分野で標準的な組換えＤＮＡ技法により構築できる。ベクターは、哺乳動物細胞中での複製および発現に使用される、プラスミド、ウイルスのものまたは当該分野で公知のその他のものであり得る。アンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、哺乳動物（好ましくはヒト細胞）中で作用することが当該分野で知られている任意のプロモーターにより行われ得る。このようなプロモーターは、誘導可能または構成的であり得る。このようなプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ， １９８１， Ｎａｔｕｒｅ ２９０， ３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復配列に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら， １９８０， Ｃｅｌｌ ２２， ７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７８， １４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら， １９８２， Ｎａｔｕｒｅ ２９６， ３９−４２）等が挙げられるがこれらに限定されない。任意の種類のプラスミド、コスミド、ＹＡＣまたはウイルスベクターを使用して、組織部位に直接導入可能な組換えＤＮＡ構築物を調製できる。あるいはまた、所望の組織に選択的に感染するウイルスベクターを使用できる（この場合には、別の経路で（例えば全身的に）投与する）。
【０２０７】
標的遺伝子ｍＲＮＡ転写産物を触媒的に切断するように設計されたリボザイム分子も、標的遺伝子ｍＲＮＡの翻訳、従って標的遺伝子生成物の発現を防ぐために使用できる。（例えば、１９９０年１０月４日に発行されたＰＣＴ国際公報第ＷＯ ９０／１１３６４号；Ｓａｒｖｅｒら， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７， １２２２−１２２５を参照）。本発明の一実施形態では、ＨＳＰ受容体遺伝子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを、ＨＳＰ受容体リガンド結合ドメインをコードする核酸に相補的になるように設計する。
【０２０８】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的な切断を触媒可能な酵素ＲＮＡ分子である。（概要については、Ｒｏｓｓｉ， １９９４， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４， ４６９−４７１を参照）。リボザイム作用のメカニズムは、リボザイム分子と相補標的ＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーション、その後の内ヌクレオチド結合分解的（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）切断事象を伴う。リボザイム分子の組成物は、標的遺伝子ｍＲＮＡに相補的な１つ以上の配列を含まなければならず、ｍＲＮＡ切断を引き起こす周知の触媒配列を含まなければならない。この配列については、例えば、米国特許第５，０９３，２４６号（参照により全体的に本明細書に援用する）を参照のこと。
【０２０９】
部位特異的認識配列においてｍＲＮＡを切断するリボザイムを使用して標的遺伝子ｍＲＮＡを破壊できるが、ハンマーヘッドリボザイムを使用することが好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する隣接領域により規定される位置においてｍＲＮＡを切断する。唯一の要件は、標的ｍＲＮＡが２塩基配列「５’−ＵＧ−３’」を有することである。ハンマーヘッドリボザイムの構築および生成は当該分野で周知であり、Ｍｙｅｒｓ， １９９５， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（特に、図４、ｐ．８３３を参照）、ならびにＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ， １９８８， Ｎａｔｕｒｅ， ３３４， ５８５−５９１（参照により全体的に本明細書に援用する）においてより完全に記載されている。
【０２１０】
リボザイムは、切断認識部位が標的遺伝子ｍＲＮＡの５’端付近に位置する（すなわち効率を高め、非機能ｍＲＮＡ転写産物の細胞内蓄積を最小にする）ように操作されることが好ましい。
【０２１１】
本発明のリボザイムとしてはまた、テトラヒメナ・サーモフィラ（ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）（ＩＶＳまたはＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡとして知られる）中で天然に生じるもの、及び、Ｔｈｏｍａｓ Ｃｅｃｈおよび共同研究者ら（Ｚａｕｇら， １９８４， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２４， ５７４−５７８；ＺａｕｇおよびＣｅｃｈ， １９８６， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３１， ４７０−４７５；Ｚａｕｇら， １９８６， Ｎａｔｕｒｅ ３２４， ４２９−４３３；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｔｅｎｔｓ Ｉｎｃ．による国際特許出願公報第ＷＯ ８８／０４３００号；ＢｅｅｎおよびＣｅｃｈ， １９８６， Ｃｅｌｌ， ４７， ２０７−２１６）により広範囲に記載されているもの等のＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以下、「チェック型リボザイム」）が挙げられる。チェック型リボザイムは、標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズして、標的ＲＮＡの切断が生じる８つの塩基対活性部位を有する。本発明は、標的遺伝子に存在する８つの塩基対活性部位配列を標的化するチェック型リボザイムを包含する。
【０２１２】
アンチセンスアプローチにおいては、リボザイムは、（例えば、改善された安定性、標的化等のための）改変型オリゴヌクレオチドからなり、標的遺伝子を発現する細胞にｉｎ ｖｉｖｏ送達されるべきである。好ましい送達方法は、強力な構成ｐｏｌ ＩＩＩまたはｐｏｌ ＩＩプロモーターの制御下でリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を使用し、トランスフェクトされた細胞が十分な量のリボザイムを生成して、内因性標的遺伝子メッセージを破壊し、翻訳を破壊する。アンチセンス分子とは違い、リボザイムは触媒性であるため、効率のために必要な細胞内濃度はより低い。
【０２１３】
内因性標的遺伝子発現は、標的化相同組換えを用いて標的遺伝子またはそのプロモーターを不活化または「ノックアウト」することによっても低くできる（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１７， ２３０−２３４；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ， １９８７， Ｃｅｌｌ ５１， ５０３−５１２；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら， １９８９， Ｃｅｌｌ ５， ３１３−３２１を参照；それぞれ参照により全体的に本明細書に援用する）。例えば、内因性標的遺伝子に相同的なＤＮＡ（標的遺伝子のコード領域または調節領域のいずれか）に隣接した変異型非機能的標的遺伝子（または完全に無関係なＤＮＡ配列）を、選択可能マーカーおよび／または陰性選択可能マーカーと共にまたはそれら無しに使用して、標的遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで発現する細胞をトランスフェクトできる。標的化相同組換えを介したＤＮＡ構築物の挿入により、標的遺伝子の不活化が生じる。このようなアプローチは、ＥＳ（胚幹）細胞に対する特に適した改変であり、不活性標的遺伝子を有する動物子孫を作るのに使用できる （例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ， １９８７、ならびにＴｈｏｍｐｓｏｎ， １９８９，前掲を参照）。しかし、このアプローチは、組換えＤＮＡ構築物を、適切なウイルスベクターを用いてｉｎ ｖｉｖｏで必要な部位に直接投与するかまたは標的化させるという前提のもとで、ヒトにおける使用に適用できる。
【０２１４】
あるいはまた、標的遺伝子の調節領域（すなわち、標的遺伝子プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を標的化することにより、身体の標的細胞中の標的遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成して、内因性標的遺伝子発現を低くすることができる。（Ｈｅｌｅｎｅ， １９９１， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．， ６（６）， ５６９−５８４；Ｈｅｌｅｎｅら， １９９２， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ６６０， ２７−３６；ならびにＭａｈｅｒ， １９９２， Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４（１２）， ８０７−８１５を全般的に参照）。
【０２１５】
転写を阻害するための三重らせん形成において使用する核酸分子は、一本鎖であり、デオキシリボヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、一般的にプリンまたはピリミジンのいずれかの大きな配列（ｓｔｒｅｔｃｈ）が二重らせんの一方の鎖の上に存在する必要があるフーグスティーン型塩基対規則を介して三重らせん形成を促すように設計されなければならない。ヌクレオチド配列は、ピリミジン利用型で、これは得られる三重らせんの３本の会合した鎖にわたりＴＡＴおよびＣＧＣ＋トリプレットを生じる。ピリミジン富化分子は、二重らせんの一方の鎖のプリン富化領域に相補的な塩基を該鎖と平行な方向に提供する。さらに、プリンに富んだ（例えば、Ｇ残基の配列を含む）核酸分子が選択できる。これらの分子は、ＧＣ対が豊富なＤＮＡ二重らせんと三重らせんを形成し、この中ではほとんどのプリン残基が標的化二重らせんの一方の鎖に位置し、三重らせんの３本の鎖にわたりＧＧＣトリプレットが生じる。
【０２１６】
あるいはまた、三重らせん形成のために標的化できる可能性のある配列は、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を作製することにより増加させることができる。スイッチバック分子を、交互に５’−３’、３’−５’の様式で合成して、二重らせんの最初の一方の鎖と塩基対を作り、次いで他方と作り、プリンまたはピリミジンのいずれかの大きな配列が二重らせんの一方の鎖に存在する必要がない。
【０２１７】
本明細書に記載するアンチセンス、リボザイム、および／または三重らせん分子を利用して、変異型遺伝子発現を阻害する場合、本技術により、正常標的遺伝子対立遺伝子により生成されるｍＲＮＡの転写（三重らせん）および／または翻訳（アンチセンスリボザイム）があまりに効率的に低下または阻害されるため、存在する正常標的遺伝子生成物の濃度が正常表現型に必要なものよりも低い可能性が生じ得る。このような場合、実質的に正常なレベルの標的遺伝子活性が確実に維持されるように、正常な標的遺伝子活性を示す標的遺伝子ポリペプチドをコードおよび発現する核酸分子を、以下の５．６．３節に記載するような遺伝子療法を介して、利用している任意のアンチセンス、リボザイムまたは三重らせん治療に感受性のある配列を含まない細胞に導入してもよい。あるいはまた、標的遺伝子が細胞外タンパク質をコードする場合、正常標的遺伝子タンパク質を同時投与して、標的遺伝子活性の必須レベルを維持することが好ましい。
【０２１８】
本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、リボザイム、ならびに三重らせん分子は、上記議論したように当該分野で公知のＤＮＡおよびＲＮＡ分子の任意の合成方法により調製され得る。これらとしては、当該分野で周知のオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成する技術（例えば、固相ホスホロアミダイト化学合成等）が挙げられる。あるいはまた、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ転写により産生され得る。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーター等の適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを取り込んだ様々なベクターに取り込まれ得る。あるいはまた、使用するプロモーターに応じてアンチセンスＲＮＡを構成的または誘導的に合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物を、細胞系に安定して導入できる。
【０２１９】
５．６．３  遺伝子置換療法
正常ＣＤ３６遺伝子発現および／またはＣＤ３６遺伝子生成物活性のレベルの上昇については、ＣＤ３６遺伝子核酸配列を、例えば、癌等の増殖性障害を生じる免疫障害の治療に利用できる。このような治療は、例えば、遺伝子置換療法の形態で施すことができる。具体的に、正常ＣＤ３６遺伝子機能を示すＣＤ３６遺伝子生成物の産生を指示する正常ＣＤ３６遺伝子またはＣＤ３６遺伝子の一部の１つ以上のコピーを、ベクター（アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されない）を用いて、ＤＮＡを細胞に導入する他の粒子（リポソーム等）と共に患者の適切な細胞に挿入してもよい。
【０２２０】
遺伝子置換療法技術は、ＣＤ３６遺伝子配列を、患者においてＨＳＰ受容体を発現する細胞型に送達できなければならない。従って、一実施形態では、当業者に周知の技術（例えば、１９８８年４月２５日に発行されたＰＣＴ公報第ＷＯ８９／１０１３４号を参照）を用いて、ＣＤ３６遺伝子配列が、骨髄性系統（ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｉｎｅａｇｅ）の発生細胞（例えば骨髄）に送達され得るようにできる。別の特定の実施形態では、マクロファージをｉｎ ｖｉｔｒｏで使用し、養子免疫療法の技術を用いて患者に送達することで遺伝子置換を行うことができる。
【０２２１】
別の実施形態では、送達技術は、このような遺伝子配列を、ＣＤ３６遺伝子配列が（例えば、腫瘍部位において直接）発現される細胞部位へ直接投与することを伴う。
【０２２２】
ＣＤ３５遺伝子発現および／またはＣＤ３６遺伝子生成物活性の全体的なレベルを高めるために利用され得るさらなる方法としては、適切なＣＤ３６発現細胞（好ましくは同原細胞）を、ＣＤ３６障害の症状を緩和するような位置および十分な数で患者に導入することが挙げられる。このような細胞は、組換え細胞または非組換え細胞のいずれであってもよい。
【０２２３】
患者におけるＣＤ３６遺伝子発現の全体的なレベルを高めるために投与され得る細胞には、通常ＣＤ３６遺伝子を発現する細胞が含まれる。
【０２２４】
あるいはまた、細胞（好ましくは同原細胞）を、ＣＤ３６遺伝子配列を発現するように操作し、その後ＣＤ３６障害または増殖性もしくはウイルス性疾患（例えば、癌および腫瘍形成）の症状を緩和するのに適した位置で患者に導入してもよい。あるいはまた、非損傷ＣＤ３６遺伝子を発現し、ＭＨＣが合致する個体に由来する細胞が利用でき、例えば脳細胞が挙げられる。ＣＤ３６遺伝子配列の発現は、適切な遺伝子調節配列により制御されて、必要な細胞型におけるこのような発現を可能にする。このような遺伝子調節配列は当業者に周知である。このような細胞利用型遺伝子療法技術は当業者に周知である（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ， 米国特許第５，３９９，３４９号を参照）。
【０２２５】
投与される細胞が非同原細胞である場合、導入細胞に対して宿主免疫応答が発生するのを防ぐ周知の技術を用いて投与できる。例えば、細胞は、直に接した細胞外環境と成分の交換を可能にしつつ宿主免疫系に導入細胞を認識させないカプセル化形態で導入してもよい。
【０２２６】
５．６．４  可溶性ポリペプチドの送達
可溶性ＥＣＤまたは融合タンパク質（例えば、融合Ｉｇ分子）を発現する遺伝子操作された細胞を、可溶性分子の供給を送達する「バイオリアクター」として機能し得るｉｎ ｖｉｖｏで投与できる。このような可溶性ＣＤ３６ポリペプチドおよび融合タンパク質は、適切な濃度で発現されると、ＨＳＰまたはＣＤ３６に対する他の天然型リガンドを中和するか「吸い取り（ｍｏｐ ｕｐ）」、活性のインヒビターとして作用し、従ってＨＳＰ−ＣＤ３６関連障害および疾患（自己免疫障害、増殖性障害および感染性疾患等）を治療するために使用され得る。
【０２２７】
５．６．５  優性ネガティブ変異体の送達
本発明の別の実施形態では、優性ネガティブ変異体（「優性ネガティブ」）を治療のために使用して、ＨＳＰ−抗原複合体に対する免疫応答を（例えば、自己免疫障害を治療するために）ブロックしてもよい。一般的に、このような優性ネガティブは、発現された場合に、リガンド（すなわち、ＨＳＰ−抗原分子複合体）と相互作用するが、正常ＣＤ３６の１つ以上の機能（すなわち、成長因子産生および／またはシグナリング機能）を欠く変異体である。このような変異体は、同じ細胞または異なる細胞中の正常なＣＤ３６の機能を妨害する（例えば、野生型受容体由来のＨＳＰ−ペプチド複合体の消費（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）による）。このような突然変異は、例えば、細胞外、膜貫通または細胞内ドメインのいずれかにおける１つ以上の点突然変異、欠失、挿入または他の突然変異であり得る。
【０２２８】
細胞におけるこのような優性ネガティブ突然変異の発現は、利用可能なリガンドの総量を消費し尽くす（ｔｉｔｒａｔｉｎｇ ｏｕｔ）ことで、同じまたは隣接する細胞中の正常な機能的受容体によるリガンドの摂取をブロックできる。従って、このような優性ネガティブを発現する組換え抗原提示細胞は、自己免疫障害の治療が必要な患者に投与した場合に、ＨＳＰ−抗原分子複合体を消費し尽くすのに使用できる。
【０２２９】
５．７  標的自己免疫疾患
本発明の方法により治療できる自己免疫疾患としては、インスリン依存型糖尿病（すなわち、ＩＤＤＭ、すなわち自己免疫糖尿病）、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、多発性筋炎、慢性活動性肝炎、混合結合組織病、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、自己免疫甲状腺炎、突発性アディソン病、白斑、グルテン感受性腸症、グレーヴス病、重症筋無力症、自己免疫好中球減少症、突発性血小板減少性紫斑病、慢性関節リウマチ、肝硬変、尋常性天疱瘡、自己免疫不妊症、グッドパスチャー病、水疱性類天疱瘡、円盤状狼瘡（ｄｉｓｃｏｉｄ ｌｕｐｕｓ）、潰瘍性大腸炎、およびデンスデポジット糸球体腎炎 （ｄｅｎｓｅ ｄｅｐｏｓｉｔ ｄｉｓｅａｓｅ） が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書で言及する上記疾患は、このような疾患についての動物モデルにより示されるもの（例えば、ＩＤＤＭについての非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス、および多発性硬化症についての実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウス）も含む。
【０２３０】
本発明の方法を使用して、患者自身の組織に対する免疫応答を低下または無くすこと、あるいはまた自己免疫応答により損傷した自己組織または器官を置き換えるように移植された組織または器官に向けられた既存の自己免疫応答を低下または無くすことにより、このような自己免疫疾患を治療できる。
【０２３１】
５．８  標的感染性疾患
本発明の方法および組成物を使用して治療または予防できる感染性疾患としては、ウイルス、細菌、原生動物および細胞内寄生生物等の細胞内病原体が原因となるものが挙げられる。ウイルスとしては、Ｂ型肝炎ウイルス、パルボウイルス（アデノ随伴ウイルスおよびサイトメガロウイルス等）、パポバウイルス（パピローマウイルス等）、ポリオーマウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ−Ｉ）、単純ヘルペスＩＩ型（ＨＳＶ−ＩＩ））およびエプスタイン−バーウイルス等）、ポックスウイルス（痘瘡（天然痘）およびワクシニアウイルス等）、ＲＮＡウイルス（ヒト免疫欠損ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）、ヒト免疫欠損ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）、ヒトＴ細胞リンパ球向性（ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）およびヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルスＩＩ型（ＨＴＬＶ−ＩＩ）が挙げられるがこれらに限定されない）；インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、センダイウイルス、ピコルナウイルス（ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、ライノウイルス等）、レオウイルス、トガウイルス（風疹ウイルス（風疹（ｇｅｒｍａｎ ｍｅａｓｌｅ））およびセムリキ森林熱ウイルス）、アルボウイルス、ならびにＡ型肝炎ウイルス等が原因となるウイルス性疾患が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２３２】
別の実施形態では、化膿レンサ球菌、肺炎レンサ球菌、淋菌、骨髄炎菌、ジフテリア菌、ボツリヌス菌、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｅｓ）、破傷風菌、インフルエンザ菌、肺炎桿菌、クレブシエラ・オゼネ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｚａｅｎａｅ）、クレブシエラ・ライノスケロマチス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｒｈｉｎｏｓｃｌｅｒｏｍｏｔｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス、コレラ菌、大腸菌、緑膿菌、カンピロバクター（ビブリオ）・フィタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ （Ｖｉｂｒｉｏ） ｆｅｔｕｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ、アエロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、セレウス菌、エドワードシエラ・タルダ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ）、エルネシア・エンテロコリチカ、ペスト菌、偽結核菌、志賀赤痢菌、フレクスナー赤痢菌、ソンネ赤痢菌、ネズミチフス菌、チフス菌、梅毒トレポネーマ、地域流行性梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、スピロヘータ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｃａｒａｔｅｎｅｕｍ）、ボレリア・ビンチェンティ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ）、ボレリア・バルドフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、黄疸出血性レプトスピラ症、結核菌、トキソプラスマ、ニューモシスチス・カリニ、野兎病菌、ウシ流産菌、ブタ流産菌、ヤギ流産菌、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．）、発疹チフスリケッチア、恙虫病リケッチア、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐｐ．）、およびヘリコバクター・ピロリ等（ただしこれらに限定されない）の病原体細菌により生じる障害等（ただしこれらに限定されない）の細菌感染が治療または予防できる。
【０２３３】
別の好適な実施形態では、赤痢アメーバー、口腔トリコモナス、腸トリコモナス、膣トリコモナス、ガンビアトリパノソーマ、ローデシアトリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、ドノバンリーシュマニア、熱帯リーシュマニア、ブラジルリーシュマニア、ニューモシスチス肺炎（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、三日熱マラリア原虫、熱帯熱マラリア原虫、および四日熱マラリア原虫等（ただしこれらに限定されない）の病原性原生動物により生じる感染を治療または予防するために上記方法を使用できる。
【０２３４】
５．９  標的増殖性細胞障害
ＨＳＰ−ＣＤ３６活性に関連する特定の増殖性および腫瘍形成疾患に関して、本発明の方法により治療または予防できる疾患としては、ヒト肉腫および癌（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原生肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫、頸部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌（ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫；白血病（例えば、急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病））；慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病）；ならびに真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、およびＨ鎖病が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２３５】
細胞増殖の欠損に関与するか、または治療または予防のために細胞増殖が望ましく、ＣＤ３６機能を阻害することにより治療または予防できる疾患および障害としては、変性障害、成長欠損、低増殖性障害（ｈｙｐｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、身体的外傷、病変および創傷が挙げられるがこれらに限定されない（例えば、創傷治癒を促すか、または変性、病変もしくは損傷した組織等における再生を促す）。
【０２３６】
５．１０  医薬剤形および投与方法
ＣＤ３６遺伝子発現または遺伝子生成物活性に影響を及ぼすと判断された化合物を、治療的に有効な用量で患者に投与して、細胞増殖性障害を治療または緩和できる。治療的に有効な用量とは、このような障害の症状の緩和をもたらすのに十分な化合物の量を指す。
【０２３７】
５．１０．１  有効用量
このような化合物の毒性および治療的効力は、細胞培養物または実験動物において（例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に対して治療有効性のある用量）を決定するための）標準的な製薬手順により決定できる。毒性と治療効果との用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用してもよいが、害された組織の部位にこのような化合物を標的化させる送達系を設計する際に非感染細胞への可能性のある損傷を最小限にして副作用を低下するように注意を払わなくてはならない。
【０２３８】
細胞培養アッセイおよび動物調査から得られたデータを、ヒトに対して使用する各種投薬量を処方するのに使用できる。このような化合物の投薬量は、毒性がほとんどまたは全く無い、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投薬量は、採用する投薬形態および利用する投薬経路に応じてこの範囲内で変化し得る。本発明の方法において使用される任意の化合物について、治療的に有効な用量は、まず細胞培養アッセイから推定できる。細胞培養で決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の半値阻害（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）が達成される試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を得るように、動物モデルにおいて用量を処方し得る。このような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定できる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。
【０２３９】
５．１０．２  処方および使用
本発明により使用する医薬組成物は、１つ以上の生理学的に許容可能な担体または賦形剤を使用して、従来の様式により処方され得る。
【０２４０】
従って、（口または鼻のいずれかを介した）吸入もしくは注入による投与、または経口、非経口もしくは直腸投与のために、化合物ならびにそれらの生理学的に許容可能な塩および溶媒和物を処方してもよい。
【０２４１】
経口投与のために、医薬組成物は、例えば、結合剤（例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースもしくはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンもしくはグリコールデンプンナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｓｔａｒｃｈ ｇｌｙｃｏｌａｔｅ）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）等の製薬的に許容可能な賦形剤と共に、従来手段により調製する錠剤もしくはカプセルの形態を取り得る。錠剤は、当該分野で周知の方法により被覆され得る。経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の形態を取り得るか、または使用前に水もしくは他の適切なビヒクルにより再生される乾燥品として提供され得る。このような液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水溶性ビヒクル（例えば、アーモンドオイル、油性エステル、エチルアルコールまたは分別植物油）；および保存剤（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）等の製薬的に許容可能な添加物と共に従来手段により調製され得る。調製物はまた、緩衝塩、香味料、着色料および甘味料も必要に応じて含み得る。
【０２４２】
経口投与のための調製物は、活性化合物の制御放出が得られるように適切に処方され得る。
【０２４３】
頬腔投与のために、組成物は、従来の様式で処方された錠剤またはロゼンジの形態を取り得る。
【０２４４】
吸入による投与のために、本発明により使用する化合物は、適切な推進剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガス）を使用して、圧縮パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレーによる提供の形態で都合よく送達される。圧縮エアロゾルの場合、投薬量単位は、定量を送達する弁を設けることで決定され得る。吸入器または注入器で使用する例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物、およびラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基質の粉末混合物を含むように処方され得る。
【０２４５】
化合物は、注射（例えばボーラス注射または連続的輸液）による非経口投与用に処方され得る。注射用の処方は、保存料を添加されて（例えばアンプルまたは多用量容器に入れられて）単位投薬量形態で提供され得る。組成物は、油性または水性ビヒクルに入った懸濁液、溶液またはエマルジョンの形態等を取り、懸濁剤、安定剤および／または分散剤等の処方（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ）剤を含み得る。あるいはまた、活性成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば、滅菌パイロジェンフリー水）により再生される粉末形態であり得る。
【０２４６】
化合物はまた、（例えば、カカオバターまたは他のグリセリド等の従来からの座剤基質を含む）座剤または停留浣腸等の直腸組成物として処方され得る。
【０２４７】
先に記載した処方物に加えて、化合物は、蓄積剤形としても処方され得る。このような長期作用型処方物は、（例えば、皮下もしくは筋内）移植、または筋内注射により投与され得る。従って、例えば、化合物は適切な高分子もしくは疎水性材料と共に（例えば、許容可能な油中のエマルジョンとして）、イオン交換樹脂、または難溶性誘導体（例えば難溶性塩）として処方され得る。
【０２４８】
所望であれば、組成物は、活性成分を含む１つ以上の単位投薬量形態を含み得るパックまたは分配器に入れられて提供され得る。パックは、例えば、金属またはプラスチックホイル（ブリスター包装等）を含み得る。パックまたは分配器に、投与についての指示書を添付してもよい。
【０２４９】
６．  実施例：ＨＳＰ受容体としてのＣＤ３６の同定
６．１  序文
本明細書で提示する実施例は、マクロファージおよび樹状細胞中のｇｐ９６とＣＤ３６受容体との相互作用の好結果の同定を記載する。本明細書で提示する実験は、ＣＤ３６受容体ポリペプチドの単離、ならびに本発明のスクリーニング、診断および治療方法の基礎をなす。
【０２５０】
本発明の出願人は、特定の観察が、ＨＳＰシャペロン（ｃｈａｐｅｒｏｎｅｄ）ペプチド抗原提示の「直接輸送」モデルと食い違っていることに気づいた。第一に、ＨＳＰ調製物の免疫原性は、機能的食細胞の存在に依存しており、Ｂ細胞または他の非プロフェッショナル抗原提示細胞には依存しない（ＵｄｏｎｏおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９３， 前掲；ＳｕｔｏおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９５， 前掲）が、遊離ペプチドは全ての細胞型を感作できる。第二に、極少量のＨＳＰ−ペプチド複合体が、特異的な免疫性を引き出すのに有効であり（すなわち、ｇｐ９６シャペロンペプチドは遊離ペプチドよりも、ＣＴＬ認識のためにマクロファージを感作するのに数百倍有効であった）、特異的な摂取メカニズムの可能性を示唆した。第三に、ｇｐ９６シャペロンペプチドは、ペプチドの大きさによって限定されないＭＨＣ Ｉ応答を引き出した。最後に、マクロファージ中のｇｐ９６−ペプチド複合体の処理は、ゴルジ装置を通過する輸送をブロックするブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）に感受性を有することが分かり、処理が細胞内メカニズムを介して生じることを示唆した。これらの観察は、ＨＳＰシャペロンペプチドが、ＭＨＣクラスＩ分子により内部的に処理され、マクロファージの細胞表面上に再提示され得るという仮説を導いた（ＳｕｔｏおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９５， 前掲）。マンノース受容体が、ｇｐ９６の摂取において使用されるという仮説もあるが、ＨＳＰ７０等の非グリコシル化ＨＳＰについてのメカニズムは提議されていない（Ｃｉｕｐｉｔｕら， １９９８， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８７：６８５−６９１）。他は、新規の細胞内転送経路が、細胞外媒体からＥＲの内腔へのペプチドの輸送に関与し得ることを示唆している（Ｄａｙら， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９４：８０６５−８０６９；Ｎｉｃｃｈｉｔｔａ， １９９８， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０：１０３−１０９）。さらなる示唆としては、（ａ）タンパク質をファゴソームから細胞質ゾルに向かわせる（そこで該タンパク質は正常クラスＩ経路に入る）明白でない経路を有し；（ｂ）リソソーム中の摂取物質を消化し、ペプチドを放出して、クラスＩ分子に対して表面上に載せる（Ｂｅｖａｎ， １９９， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９２：６３９−４１）食細胞の関与が挙げられる。熱ショックタンパク質に対する受容体の発見は、ＨＳＰと複合化された細胞外抗原ペプチドが、どのように免疫応答を刺激し得るのかという逆説を解明する助けとなる。さらに、細胞表面受容体は、シグナル伝達経路を誘導するなどの他の機能を有し得る。本明細書に開示するＣＤ３６は、このような受容体として同定されている。
【０２５１】
６．２  材料および方法
マクロファージ単離．野生型およびＣＤ３６ヌルマウスを、０．２ ｍｌのプリスタンで接種した。５日後、腹腔膜灌流からマクロファージを抽出し、標準的な細胞培養技術を用いて３〜４時間塗布培養した。
【０２５２】
樹状細胞単離．野生型およびＣＤ３６ヌルマウスの大腿骨から骨髄細胞を抽出した。細胞を、ＧＭ−ＣＳＦの存在下で６日間インキュベートした。６日後、細胞をさらに１日再プレート化して、非接着樹状細胞について選択した。
【０２５３】
ＭＣＰ−１ケモカインアッセイ．９６ウェルプレートの各ウェルにつき１×１０５の野生型およびＣＤ３６ヌル樹状細胞またはマクロファージを調製し、増加（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）濃度のｇｐ９６、ＬＰＳ、ＨＳＰ７０、ＴＮＦ−αおよびＢＳＡと２０時間インキュベートした。上清を回収し、ＭＣＰ−１サンドウィッチＥＬＩＳＡ（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により製造元の指示書に従って分析し、光学密度を４５０ ｎｍにて測定した。
【０２５４】
一酸化窒素アッセイ．上述のように、野生型およびＣＤ３６ヌルマクロファージおよび樹状細胞を調製し、９６ウェルプレートで１×１０５細胞で、増加濃度のｇｐ９６、ＬＰＳ、ＨＳＰ７０、ＴＮＦ−αおよびＢＳＡとインキュベートした。２０時間後、上清を回収し、酵素的グリースアッセイ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）により製造元の指示書に従って分析した。光学密度を５４０ ｎｍにて測定した。
【０２５５】
結合アッセイ．ＦｕＧＥＮＥ ６（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、およびＣＤ３６ ｃＤＮＡを含むプラスミド構築物（ＣＤ３６ ｃＤＮＡがｐＣＤＮＡ ３．１発現ベクターにクローニングされたもの）を用いて、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。トランスジーンを二日間発現させた後、細胞を回収し、様々な濃度の蛍光タンパク質プローブ（ＧＰ９６−ＦＩＴＣ、ヒストンＦＩＴＣ、ＡｃＬＤＬ−ＤｉＩ、Ｏｖａ−ＦＩＴＣおよびＢＳＡ（脂肪酸非含有）−ＦＩＴＣ）とインキュベートした。いくつかの実験は、抗ＣＤ３６モノクローナル抗体のみを添加して行い、次いで第２の蛍光標識化抗マウス抗体を添加してＣＤ３６発現を検出した。細胞をフローサイトメトリーで分析した。低および高ＣＤ３６発現集団を、表示したタンパク質の結合について選択（ｇａｔｅ）し、分析した。各集団の平均蛍光強度をプロットした。細胞を４℃にて、５０ ｕｇ／ｍｌの正常／改変型ＬＤＬまたは２５ ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ３６抗体と前インキュベートすることにより、競合的阻害実験を行った。
【０２５６】
６．３  結果
ｇｐ９６がＣＤ３６に結合するという判定．ｇｐ９６の同種調製物を、ＦＩＴＣに結合させ、ｇｐ９６−ＦＩＴＣを用いてＨＥＫ２９３細胞およびＨＥＫ２９３ ＣＤ３６トランスフェクタントを染色した。ＣＤ３６発現細胞はｇｐ９６−ＦＩＴＣに結合し、非発現およびＣＤ３６ｌｏｗは結合しなかった（図１Ａ）。この結合は、ヒストン−ＦＩＴＣ、Ｏｖａ−ＦＩＴＣ、ＢＳＡ（ｆａｆ）−ＦＩＴＣに対するＨＥＫ２９３細胞のいずれの染色も欠いていることから示されるように、ＧＰ９６について特異的であった（図１Ｂ〜Ｄ）。陽性対照、アセチル化低密度リポタンパク質は、ＣＤ３６発現細胞を染色したが、非発現ＣＤ３６ｌｏｗ細胞は染色せず（図１Ｅ）、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞が、機能的ＣＤ３６タンパク質を発現し、ＧＰ９６結合がＣＤ３６に特異的であることを実証した。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞がＣＤ３６を正しく発現していることを確認するために、ＨＥＫ２９３トランスフェクト細胞および偽トランスフェクト細胞を、マウス抗ＣＤ３６抗体とインキュベートし、次いで抗マウスＦＩＴＣ抗体で染色した。偽トランスフェクト細胞は染色されず（図８Ａ）、トランスフェクト細胞は染色された（図８Ｃおよび８Ｄ）。ｇｐ９６−ＦＩＴＣを野生型およびＣＤ３６ヌルマクロファージとインキュベートした場合、ＣＤ３６ヌル細胞により、ｇｐ９６への結合について野生型細胞と比べて５２％の損失が示された（図９）。ＬＤＬまたは抗ＣＤ３６をｇｐ９６結合の競合的インヒビターとして使用した場合には、阻害は生じなかった（図１０Ａおよび１０Ｂ）。これは、ｇｐ９６が、試験した条件下では、アミノ酸１５５〜１８３またはアミノ酸２８〜９３（抗ＣＤ３６抗体およびＬＤＬのそれぞれの結合領域）においてＣＤ３６と結合しないことを示す。
【０２５７】
ＣＤ３６へのｇｐ９６結合は、マクロファージおよび樹状細胞におけるケモカイン産生を誘導する．野生型およびＣＤ３６ヌルマウスの両方に０．２ ｍｌプリスタンを注射した。これらのマウスからマクロファージを抽出した。樹状細胞を、非プリスタン注射マウスの骨髄から抽出し、培養した。マクロファージおよび樹状細胞を、増加濃度の様々な天然型および変性タンパク質（３０分間煮沸）の存在下で２０時間インキュベートした。標準的ＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイを用いて、マウスからのケモカイン産生のレベルを測定した。天然型ｇｐ９６は、ＣＤ３６ヌル集団と比べて、野生型マクロファージおよび樹状細胞の両方において強いケモカイン産生を引き起こした（図２Ａおよび３Ａ）。煮沸ｇｐ９６は、野生型マクロファージおよび樹状細胞、またはＣＤ３６ヌルマクロファージおよび樹状細胞のいずれにおいてもケモカイン産生を全く引き起こさなかった（図２Ａおよび３Ａ）。ＬＰＳはケモカイン産生を誘導したが、これはＣＤ３６によるものでなかった。なぜなら、ケモカイン産生のレベルが、野生型細胞よりもＣＤ３６ヌル細胞において高かったからである（図２Ｂおよび３Ｂ）。さらに、ＬＰＳの天然型および煮沸サンプルの両方においてケモカインのレベルは同じであった（図２Ｂおよび３Ｂ）。天然型および煮沸ＨＳＰ７０の両方が、野生型およびＣＤ３６ヌル細胞の両方のマクロファージおよび樹状細胞において同量のケモカインを誘導し、この誘導がＣＤ３６に無関係であることを実証した（図２Ｃおよび３Ｃ）。ＴＮＦ−αおよびＢＳＡは、野生型およびＣＤ３６ヌル細胞の両方において、等量のケモカイン産生を誘導し、これらもＣＤ３６を介してケモカイン産生を作用しないことを実証した（図２Ｄおよび３Ｄ）。
【０２５８】
ＣＤ３６へのｇｐ９６結合は、マクロファージおよび樹状細胞における一酸化窒素の生成を誘導する．同じ実験を行って、野生型およびＣＤ３６ヌル細胞により生成される一酸化窒素のレベルを測定した。マクロファージおよび樹状細胞を、増加濃度の様々な天然型および変性タンパク質（３０分間煮沸）の存在下で２０時間インキュベートし、酵素的グリースアッセイにより一酸化窒素生成のレベルを測定した。天然型ｇｐ９６は、ＣＤ３６ヌル細胞と比べて、マクロファージおよび野生型樹状細胞の両方において強い一酸化窒素生成を引き起こした（図４Ａおよび５Ａ）。煮沸ｇｐ９６は、野生型マクロファージおよび樹状細胞、またはＣＤ３６ヌルマクロファージおよび樹状細胞のいずれにおいても一酸化窒素生成を全く引き起こさなかった（図４Ａおよび５Ａ）。ＬＰＳは一酸化窒素生成を誘導したが、これもＣＤ３６によるものでなかった。なぜなら、一酸化窒素生成のレベルが、野生型細胞よりもＣＤ３６ヌル細胞において高かったからである（図４Ｂおよび５Ｂ）。天然型および煮沸ＨＳＰ７０の両方が、野生型およびＣＤ３６ヌル細胞の両方のマクロファージおよび樹状細胞において同量の一酸化窒素を誘導し、この誘導がＣＤ３６に無関係であることを実証した（図４Ｃおよび５Ｃ）。ＴＮＦ−αおよびＢＳＡは、野生型およびＣＤ３６ヌル細胞の両方において、等量の一酸化窒素生成を誘導し、同じくＣＤ３６発現細胞における一酸化窒素の誘導がｇｐ９６−ＣＤ３６相互作用によるものであることを実証した（図２Ｄおよび３Ｄ）。
【０２５９】
６．４  考察
本明細書で報告する調査は、熱ショックタンパク質ｇｐ９６が、ＣＤ３６受容体の追加のリガンドであることを示す。ヒトｇｐ９６コード遺伝子は、本発明者らにより第１２染色体において既にマッピングされている（ｑ２４．２→ｑ２４．３）（Ｍａｋｉら， １９９３， Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． １９：７３−８１）。
【０２６０】
本明細書に示すように、ｇｐ９６−ＣＤ３６受容体相互作用は、ＣＤ３６受容体に対して新しい種類の機能を（すなわち、既知の血漿利用型リガンドとの細胞外環境のセンサーの機能だけではなく、細胞内環境のセンサーの機能も）提供する。ｇｐ９６等のＨＳＰは、絶対細胞内分子であり、（アポトーシスではなく）壊死細胞死の条件下においてのみ細胞外環境に放出される。従って、最近同定されたホスファチジルセリン結合タンパク質がアポトーシス細胞死のセンサーおよびアポトーシス細胞の受容体として作用するのとまさに同様に、ＣＤ３６受容体は壊死細胞死のセンサーとして作用し得る（Ｓａｖｉｌｌら， １９９２， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９０：１５１３−１５２２；Ｆａｄｏｋら， ２０００， Ｎａｔｕｒｅ ４０５：８５−９０）。マクロファージとアポトーシス細胞との相互作用は、ＴＮＦ等の炎症性サイトカインの下方調節をもたらすが（Ｆａｄｏｋら， ２０００， 前掲）、一方でｇｐ９６−ＡＰＣ相互作用はシグナル伝達経路を誘導して、抗原特異的Ｔ細胞の刺激（ＳｕｔｏおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９５， 前掲）、さらにＴＮＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１２等の炎症性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインの分泌を生じる。
【０２６１】
従って、ＣＤ３６受容体により、ＡＰＣが、（ｉ）ＣＤ３６および他の血漿リガンドを介して血液の細胞外環境を、ならびに（ｉｉ）ＨＳＰ（特にｇｐ９６ファミリーのもの）を介して組織の細胞外環境を、サンプリングできる。前者は、ＡＰＣが始原性食作用機能を実行することを可能にし、後者は固有かつ適応する免疫学的機能を実行することを可能にする。別の視点から見ると、ホスファチジルセリンを介したＡＰＣによるアポトーシス細胞の認識は抗炎症性シグナルに至り、ＣＤ３６受容体を介したＡＰＣと壊死細胞との相互作用は炎症性免疫応答に至る（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら， １９９８， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８： ６５７−６６５を参照）。
【０２６２】
本発明は、本発明の個々の局面の単一の例示として意図される記載の特定の実施形態の範囲により限定されず、機能的に等価である方法および構成要素は本発明の範囲内にある。実際に、本発明の様々な改変は、本明細書に示し記載したものに加えて、上記記載および添付の図面から当業者に明らかとなろう。このような改変は請求の範囲内にあることを意図する。
【０２６３】
特許出願、特許および他の文献を含む本明細書で引用する全ての参考文献が、あらゆる目的のために参照により全体的に本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａ〜Ｅは、一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞のＣＤ３６発現選択（ｇａｔｅｄ）集団に対する蛍光タンパク質プローブの結合を示す。黒塗りの（ｓｈａｄｅｄ）点および黒塗りの棒グラフは、ＣＤ３６発現細胞を表す。白抜きの（ｕｎｓｈａｄｅｄ）点および白抜きの棒グラフは、非発現およびＣＤ３６ｌｏｗ細胞を表す。横軸はタンパク質濃度をマイクログラム／マイクロリットルで表し、縦軸は平均蛍光強度を表している。Ａ．Ｇｐ９６−ＦＩＴＣ。Ｂ．ヒストン−ＦＩＴＣ。Ｃ．アセチル化低密度リポタンパク質−Ｄｉｌ（ＡｃＬＤＬ−Ｄｉｌ）。Ｄ．Ｏｖａ−ＦＩＴＣ。Ｅ．ＢＳＡ（ｆａｆ）−ＦＩＴＣ。
【図２】
図２Ａ〜Ｄは、様々な刺激に応答した、ＣＤ３６ヌルマクロファージおよび野生型マクロファージによるＭＣＰ−１ケモカイン産生の比較。黒塗りの点は野生型マクロファージを表し、白抜きの点はＣＤ３６ヌルマクロファージを表す。横軸は、Ａ、ＣおよびＤではタンパク質濃度をマイクログラム／マイクロリットルで表し、Ｂでは内毒素をユニット／ミリリットルで表している：横軸はタンパク質濃度をピコグラム／ミリリットルで表している。Ａ．天然型ｇｐ９６および煮沸したｇｐ９６とインキュベートしたマクロファージ。Ｂ．天然型ＬＰＳおよび煮沸したＬＰＳとインキュベートしたマクロファージ。Ｃ．天然型ＨＳＰ７０および煮沸したＨＳＰ７０とインキュベートしたマクロファージ。Ｄ．ＴＮＦ−αおよびＢＳＡとインキュベートしたマクロファージ。
【図３】
図３Ａ〜Ｄは、様々な刺激に応答した、ＣＤ３６ヌル樹状細胞および野生型樹状細胞によるＭＣＰ−１ケモカイン産生の比較の結果である。黒塗りの点は野生型マクロファージを表し、白抜きの点はＣＤ３６ヌルマクロファージを表す。横軸は、Ａ、ＣおよびＤではタンパク質濃度をマイクログラム／マイクロリットルで表し、Ｂでは内毒素をユニット／ミリリットルで表している。Ａ．天然型ｇｐ９６および煮沸したｇｐ９６とインキュベートしたマクロファージ。Ｂ．天然型ＬＰＳおよび煮沸したＬＰＳとインキュベートしたマクロファージ。Ｃ．天然型ＨＳＰ７０および煮沸したＨＳＰ７０とインキュベートしたマクロファージ。Ｄ．ＴＮＦ−αおよびＢＳＡとインキュベートしたマクロファージ。
【図４】
図４Ａ〜Ｄは、様々な刺激に応答した、ＣＤ３６ヌルマクロファージおよび野生型マクロファージによる一酸化窒素の産生の比較の結果を示す。黒塗りの点は野生型マクロファージを表し、白抜きの点はＣＤ３６ヌルマクロファージを表す。横軸は、Ａ、ＣおよびＤではタンパク質濃度をマイクログラム／マイクロリットルで表し、Ｂでは内毒素をユニット／ミリリットルで表している。Ａ．天然型ｇｐ９６および煮沸したｇｐ９６とインキュベートしたマクロファージ。Ｂ．天然型ＬＰＳおよび煮沸したＬＰＳとインキュベートしたマクロファージ。Ｃ．天然型ＨＳＰ７０および煮沸したＨＳＰ７０とインキュベートしたマクロファージ。Ｄ．ＴＮＦ−αおよびＢＳＡとインキュベートしたマクロファージ。
【図５】
図５Ａ〜Ｅは、様々な刺激に応答した、ＣＤ３６ヌル樹状細胞および野生型樹状細胞による一酸化窒素の産生の比較の結果を示す。黒塗りの点は野生型マクロファージ表し、白抜きの点はＣＤ３６ヌルマクロファージを表す。横軸は、Ａ、ＣおよびＤではタンパク質濃度をマイクログラム／マイクロリットルで表し、Ｂでは内毒素をユニット／ミリリットルで表している。Ａ．天然型ｇｐ９６および煮沸したｇｐ９６とインキュベートしたマクロファージ。Ｂ．天然型ＬＰＳおよび煮沸したＬＰＳとインキュベートしたマクロファージ。Ｃ．天然型ＨＳＰ７０および煮沸したＨＳＰ７０とインキュベートしたマクロファージ。Ｄ．ＴＮＦ−αおよびＢＳＡとインキュベートしたマクロファージ。
【図６】
図６Ａ〜Ｅは、ヒトＣＤ３６ ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｌ０６８５０）、およびＣＤ３６タンパク質の推測オープンリーディングフレーム（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＡ１６０６８）を示す。
【図７】
図７Ａ〜Ｃは、非発現対照と比較した、ＣＤ３６発現細胞へのｇｐ９６の結合の増加。黒塗りの点は偽（ｍｏｃｋ）トランスフェクトされた細胞を表し、白抜きの点はＣＤ３６トランスフェクト細胞を表す。縦軸は平均蛍光強度を表し、横軸はタンパク質濃度をマイクログラム／マイクロリットルで表す。Ａ．Ｇｐ９６−ＦＩＴＣ。Ｂ．トランスフェリン−ＦＩＴＣ。Ｃ．ヒストン−ＦＩＴＣ。
【図８】
図８Ａ〜Ｅは、ＨＥＫ２９３トランスフェクタントおよび対照細胞系の細胞表面上でのＣＤ３６トランスジーンの発現を示す。横軸は蛍光強度を表し、縦軸は細胞の数を表している。Ａ．ＨＥＫ２９３偽トランスフェクト細胞。Ｂ．Ｕ９３７細胞（陽性対照）．Ｃ．ＣＤ３６ ＨＥＣＫ２９３トランスフェクト細胞。Ｄ．ＣＤ３６ ＨＥＣＫ２９３トランスフェクト細胞。
【図９】
図９は、ＨＥＫ２９３トランスフェクト細胞および対照細胞系の細胞表面上でのＣＤ３６トランスジーンの発現を示す。横軸は蛍光強度を表し、縦軸は細胞の数を表す。黒塗りの領域は染色されていないＣＤ３６細胞を表している。最も左に位置する最初の白抜きの領域は、染色されていないＣＤ３６野生型細胞を表す。真中の白抜きの領域は、ｇｐ９６−ＦＩＴＣで染色されたＣＤ３６ヌル細胞を表す。最も右に位置する白抜きの領域は、ｇｐ９６−ＦＩＴＣで染色されたＣＤ３６野生型細胞を表す。
【図１０】
図１０Ａ、Ｂは、推定上の競合体によるｇｐ−ＦＩＴＣ結合のブロッキングの分析。Ａ．黒塗りの四角は、ＰＣ９３偽トランスフェクト細胞を表す。白抜きの四角は前インキュベートしていないＣＤ３６トランスフェクト細胞を表す。白塗りの三角は、アセチル化ＬＤＬと前インキュベートしたＣＤ３６トランスフェクト細胞を表す。白塗りの丸は、酸化ＬＤＬと前インキュベートしたＣＤ３６トランスフェクト細胞を表す。Ｂ．黒塗りの四角は、ＰＣ９３偽トランスフェクト細胞を表す。白抜きの四角は前インキュベートしていないＣＤ３６トランスフェクト細胞を表す。白抜きの三角は、抗ＣＤ３６抗体と前インキュベートしたＣＤ３６トランスフェクト細胞を表す。白抜きの丸は、抗ＣＤ３６抗体と前インキュベートしたＣＤ３６トランスフェクト細胞を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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