(57)【要約】本発明は、遺伝的修飾が、Ｒ１タンパク質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする外因性核酸分子の導入を含む、遺伝的に修飾された単子葉植物の細胞および植物体に関する。本発明はさらに、これらを生産する手段および方法に関する。この種の植物細胞および植物体は、対応する遺伝的に修飾されていない単子葉植物体のデンプンと比較して、リン酸含量が高いこと、および／またはリン酸化パターンが修飾されていること、および／またはＲＶＡプロファイルにおける最終粘性が高いこと、および／またはＤＳＣ解析におけるピーク温度が低いこと、および／またはテクスチャー解析におけるゲル強度が高いことを特徴とする修飾型デンプンを合成する。したがって本発明は、本発明の植物細胞および植物体から合成されるデンプン、ならびに該デンプンを生産する方法にも関する。本発明はさらに、このような修飾型デンプンを含む小麦粉、ならびにこのような小麦粉および／またはデンプンを含む食品およびパン製品に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝的修飾が少なくとも１種の外因性核酸分子の導入を含み、外因性核酸分子が以下からなる群より選択される、遺伝的に修飾された単子葉植物細胞：
（ａ）配列番号：１に記載されたヌクレオチド配列のコード領域を含む核酸分子；（ｂ）配列番号：２に記載されたアミノ酸配列を有するジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）のＲ１タンパク質をコードする核酸分子；
（ｃ）配列番号：１に記載されたヌクレオチド配列の誘導体を構成する核酸分子；および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載された核酸分子の断片を構成する核酸分子。
【請求項２】
対応する遺伝的に修飾されていない野生型植物細胞と比較して、Ｒ１タンパク質の高い生物学的活性を示す、請求項１記載の植物細胞。
【請求項３】
対応する遺伝的に修飾されていない野生型植物細胞のデンプンと比較して、グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が高いデンプンを合成する、請求項１または２のいずれか一項記載の植物細胞。
【請求項４】
対応する遺伝的に修飾されていない野生型植物細胞のデンプンと比較して、最終粘性が高いデンプンおよび／またはピーク温度が低いデンプンを合成する、請求項１〜３のいずれか一項記載の植物細胞。
【請求項５】
膠着後に、対応する遺伝的に修飾されていない野生型植物細胞のデンプンのゲルと比較して、ゲル強度が高いゲルを形成するデンプンを合成する、請求項１〜４のいずれか一項記載の植物細胞。
【請求項６】
コムギ、イネ、オオムギ、オーツムギ、ミレット、ライムギ、およびトウモロコシからなる群より選択される植物体に起源を有する、請求項１〜５のいずれか一項記載の植物細胞。
【請求項７】
コムギ植物体に起源を有する、請求項１〜５のいずれか一項記載の植物細胞。
【請求項８】
グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が少なくとも０．１ ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプンであるデンプンを合成する、請求項７記載の植物細胞。
【請求項９】
単子葉植物の細胞が遺伝的に修飾され、また遺伝的修飾が少なくとも１種の外因性核酸分子の導入を含む、請求項１〜８のいずれか一項記載の植物細胞を生産する方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項記載の植物細胞を含む植物体。
【請求項１１】
デンプン貯蔵器官において、対応する遺伝的に修飾されていない野生型植物体のデンプン貯蔵器官に由来するデンプンと比較して、グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が高いデンプンが合成される、請求項１０記載の植物体。
【請求項１２】
イネ、コムギ、またはトウモロコシの植物体である、請求項１０〜１１のいずれか一項記載の植物体。
【請求項１３】
（ａ）単子葉植物の細胞が遺伝的に修飾され（遺伝的修飾は少なくとも１種の外来製核酸分子の導入を含む）；
（ｂ）段階（ａ）の細胞から植物体が再生され、また任意選択で
（ｃ）段階（ｂ）で作製された植物体からさらに植物体が生産される、
請求項１０〜１２のいずれか一項記載の植物体を生産する方法。
【請求項１４】
外因性核酸分子が、デンプン貯蔵組織におけるＲ１遺伝子の発現を器官特異的に促進するプロモーターの制御下にある、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
コムギ植物体に関する、請求項１３〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれか一項記載の植物細胞を含む、請求項１０〜１２のいずれか一項記載の植物体の増殖材料。
【請求項１７】
請求項１０〜１２のいずれか一項記載の単子葉植物体、または請求項１〜８のいずれか一項記載の単子葉植物細胞の作製を目的とする、請求項１記載の核酸分子の使用。
【請求項１８】
請求項１〜８のいずれか一項記載の植物細胞、または請求項１０〜１２のいずれか一項記載の植物体から得られるデンプン。
【請求項１９】
対応する野生型植物体のデンプンと比較して、グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が高いこと、および／または最終粘性が高いこと、および／またはピーク温度が低いことを特徴とする、請求項１８記載のデンプン。
【請求項２０】
対応する野生型植物体のデンプンと比較して、グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が高いこと、および／または最終粘性が高いこと、および／またはピーク温度が低いことを特徴とするデンプン。
【請求項２１】
グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が少なくとも０．１ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプンであることを特徴とするデンプン。
【請求項２２】
最終粘性が少なくとも５０％高いこと、および／または少なくとも１．５℃低いピーク温度を有することを特徴とする、請求項２１記載のデンプン。
【請求項２３】
膠着後にデンプンが、グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が同じである対応する化学的にリン酸化されたデンプンのゲルと比較して、および／または対応する遺伝的に修飾されていない植物体のデンプンのゲルと比較して、高いゲル強度を示すゲルを形成することを特徴とする、請求項１８〜２２のいずれか一項記載のデンプン。
【請求項２４】
デンプンのアミロース成分の総リン酸含量が、化学的にリン酸化されたデンプンのアミロース成分と比較して低いことを特徴とする、請求項１８〜２３のいずれか一項記載のデンプン。
【請求項２５】
化学的にリン酸化されたデンプンと比較して、修飾されたリン酸化パターンを示すことを特徴とする、請求項１８〜２４のいずれか一項記載のデンプン。
【請求項２６】
コムギのデンプンであることを特徴とする、請求項１８〜２５のいずれか一項記載のデンプン。
【請求項２７】
請求項１０〜１２のいずれか一項記載の植物体からのデンプンの抽出を含む、請求項１８〜２６のいずれか一項記載のデンプンを生産する方法。
【請求項２８】
工業分野において、好ましくは食料品の製造を目的とする、請求項１８〜２６のいずれか一項記載のデンプンの使用。
【請求項２９】
請求項１８〜２６のいずれか一項記載のデンプンを含む小麦粉。
【請求項３０】
請求項１〜８のいずれか一項記載の植物細胞から、または請求項１０〜１２のいずれか一項記載の植物体から、または請求項１６記載の増殖材料から得られる小麦粉。
【請求項３１】
ベーキングミクスチャーの作製、および／または食品の生産を目的とする、請求項２９もしくは３０記載の小麦粉、または請求項１８〜２６のいずれか一項記載のデンプンの使用。
【請求項３２】
請求項２９もしくは３０記載の小麦粉、または請求項１８〜２６のいずれか一項記載のデンプンを含むベーキングミクスチャー
【請求項３３】
請求項２９もしくは３０記載の小麦粉を用いて、および／または請求項３２記載のベーキングミクスチャーを用いて、および／または請求項１８〜２６のいずれか一項記載のデンプンを用いて生産された食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、遺伝的修飾が、Ｒ１タンパク質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする外因性核酸分子の導入を含む、遺伝的に修飾された単子葉植物の細胞および植物体に関する。本発明はさらに、これらを作製する手段および方法に関する。この種の植物細胞および植物体は、対応する遺伝的に修飾されていない単子葉植物に由来するデンプンと比較して、リン酸含量が高いこと、および／またはリン酸化パターンが修飾されていること、および／またはＲＶＡプロファイルにおける最終粘性が高いこと、および／またはＤＳＣ解析におけるピーク温度が低いこと、および／またはテクスチャー解析におけるゲル強度が高いことを特徴とする修飾型デンプンを合成する。したがって本発明は、本発明の植物細胞および植物体から合成されるデンプンに関し、またこのようなデンプンを作製する方法にも関する。本発明はさらに、このような修飾型デンプンを含む小麦粉に関し、またこのような小麦粉および／またはデンプンを含む食品およびパン製品に関する。
【０００２】
原材料の再生可能な供給源として植物内容物に最近付け加えられた高い重要性に関して、生物工学的研究の課題の一つは、このような植物原材料の、これらを加工する業界の求める要件への適合を試みることである。できるだけ多くの使用分野において、再生可能な原材料の使用を促進するためには、極めて多様な物質を提供することも必要である。
【０００３】
油分、脂肪、およびタンパク質に加えて、多糖類は、植物に由来する重要な再生可能原材料を構成する。セルロースに加えて、高等植物の極めて重要な貯蔵材料の１種であるデンプンは、多糖類の中心的存在と考えられている。
【０００４】
多糖であるデンプンは、化学的に均一な基本成分、すなわちグルコース分子の重合体である。しかしデンプンは、重合およびグルコース鎖における分枝領域の出現の程度が異なる、さまざまな形状の分子の極めて複雑な混合物である。したがってデンプンは均一な原材料を含まない。区別は、デンプンの２種の化学的に異なる成分（アミロースおよびアミロペクチン）間においてなされる。トウモロコシ、コムギ、ジャガイモなどの、デンプン生産に使用される典型的な植物体では、合成されたデンプンは、最大約２０〜３０％のアミロースデンプン、および最大約７０〜８０％のアミロペクチンデンプンを含む。
【０００５】
アミロースは、α−１，４−グリコシド結合で結合されたα−Ｄ−グルコース単量体を含む直鎖状の重合体であると長く考えられてきた。しかし最近の研究で、α−１，６−グリコシド結合分岐部位の存在率が約０．１％であることが明らかにされた（ＨｉｚｕｋｕｒｉおよびＴａｋａｇｉ、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ． １３４．（１９８４）、１〜１０；Ｔａｋｅｄａら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ． １３２、（１９８４）、８３〜９２）。しかし基本的には、アミロースとアミロペクチンを完全に分離することは極めて困難であり、このためアミロースの質は、選択される分離法の種類によって大きく変わる。アミロースとは対照的に、アミロペクチンは、より強く枝分かれしており、付加的なα−１，６−グリコシド結合によって形成される分岐部位の約４％を含む。アミロペクチンは、さまざまな分岐状のグルコース鎖の複合混合物を含む。
【０００６】
以上２種の分子間におけるさらに重要な差が分子量である。デンプンの起源に依存するアミロースの分子量が５×１０５〜１０６ Ｄａであるのに対し、アミロペクチンの分子量は１０７〜１０８ Ｄａである。これら２種の巨大分子は、その分子量により、また異なるヨウ素結合特性の差によって最も容易に明らかとなる物理化学的性質の差により区別することができる。
【０００７】
アミロースとアミロペクチンのさらに重要な差は、これらの巨大分子と結合して存在する場合がある微量物質の相対量である。アミロースは、疎水性分子に対して親和性が高い。特に穀物類では、アミロースは、比較的多量の脂質と複合体を形成する場合がある（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｃｅｒｅａｌ Ｆｏｏｄｓ Ｗｏｒｌｄ ４０、（１９９５）、４３７〜４４６）。一方、アミロペクチンは、共有結合で結合された無機リン酸を、デンプンのリン酸モノエステルの状態で含む場合がある（この知見は、これまでアミロースについては報告されていない）。高量のリン酸モノエステルは、塊茎から得られるデンプン中に特に見出される。市販のデンプンのなかでは、ジャガイモのデンプンのリン酸含量が最も高く、その範囲はデンプン１ ｍｇあたり１０〜３０ ｎｍｏｌである。ある種のウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ）では、リン酸含量は２〜４倍高くなることがある（Ｂａｙ−Ｓｍｉｄｔら、第５回ＩＳＰＭＰ会議予稿集、（１９９７）、７４１）一方で、穀物類では約１００倍少ない（ＫａｓｅｍｓｕｗａｎおよびＪａｎｅ、Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍ． ７３、（１９９６）、７０２〜７０７）。塊茎、根およびマメ科植物に由来するデンプン対して、穀物類（単子葉植物）のデンプンに含まれる検出可能なリン酸は、デンプンモノエステル誘導体の状態ではほとんどみられず、主にリン脂質の状態で存在する（Ｊａｎｅら、Ｃｅｒｅａｌ Ｆｏｏｄｓ Ｗｏｒｌｄ ４１、（１９９６）、８２７〜８３２）。
【０００８】
アミロース／アミロペクチン比、およびリン酸含量とは異なり、デンプンの機能的特性は、分子量、側鎖分布のパターン、イオン含量、脂質およびタンパク質の含量などの影響を受ける。本明細書で言及すべき重要な機能的特性は、可溶性、老化挙動、吸水能、造膜特性、粘性、膠着特性、凍結融解安定性、酸に対する安定性、ゲル強度などである。デンプン粒の大きさも、さまざまな応用上、重要な場合がある。
【０００９】
原理的には、リン酸含量は、遺伝子工学的なアプローチにより、または天然デンプンの化学的なリン酸化により修飾することができる（例えば、Ｓｔａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒ．Ｌ．Ｗｈｉｓｔｌｅｒ、Ｊ．Ｎ．ＢｅＭｉｌｌｅｒ、およびＥ．Ｆ．Ｐａｓｃｈａｌｌ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８、３４９〜３６４を参照）。しかし、化学的な修飾は一般に費用および時間がかかり、物理化学的特性がインビボで修飾されたデンプンの特性とは異なるデンプンが生じる。
【００１０】
野生型の単子葉植物に由来するデンプン、特に穀物類の植物（コムギ、イネ、トウモロコシ、オーツムギ、ミレット、ライムギ）のデンプンは、デンプンのリン酸モノエステルの状態で極めて少量のリン酸しか含まないので（Ｌｉｍら、Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍ． ７１、（１９９４）、４８８）、本発明の一つの目的は、対応する野生型の植物細胞および植物体と比較して、高いリン酸含量（デンプンのリン酸モノエステルの量）、および修飾された物理化学的特性を有するデンプンを合成する単子葉植物を提供することにある。
【００１１】
したがって本発明の基本的な目的は、対応する遺伝的に修飾されていない野生型の植物細胞および植物体と比較して、修飾された構造および／または機能的特性を有するデンプンを合成する遺伝的に修飾された単子葉植物の細胞および植物体を提供すること、および構造および／または機能の特性が、対応する遺伝的に修飾されていない野生型の植物細胞および植物体のデンプンの特性、および化学的に修飾されたデンプンの特性とは異なることから一般的および／または特別の工業的な使用目的により適しているデンプンを提供することである。
【００１２】
以上の目的は、特許請求の範囲に記載された態様を提供することで達成される。というのは驚くべきことに、外因性核酸分子の単子葉植物の細胞および植物体のゲノムへの導入が、このような単子葉植物の細胞および植物体で合成されるデンプンの構造および／または機能の特性に修飾を生じることがわかっているからである。
【００１３】
外因性核酸分子の発現は主に、単子葉植物、特にコムギ植物体のデンプン貯蔵器官に有利であり、対応する遺伝的に修飾されていない野生型の植物体、特にコムギ植物体のデンプン貯蔵器官から単離可能なデンプンと比較して、デンプン貯蔵器官から単離可能なデンプンのリン酸含量および粘性特性の修飾を高める。また本発明のデンプンは、修飾されたリン酸化パターンおよび修飾された粘性特性によって、化学的にリン酸化されたデンプンと区別され、またデンプンの膠着反応およびゲル形成の後では、修飾されたゲル強度によっても区別される。
【００１４】
したがって本発明は、遺伝的修飾が、少なくとも１種の外因性核酸分子の導入を含み、このような外因性核酸分子が以下からなる群より選択される、遺伝的に修飾された単子葉植物の細胞に関する：
ａ）配列番号：１に記載されたヌクレオチド配列のコード領域を含む核酸分子；
ｂ）本明細書２に記載されたアミノ酸配列を有するジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）のＲ１タンパク質をコードする核酸分子；
ｃ）配列番号：１に記載されたヌクレオチド配列の誘導体を含む核酸分子；および
ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）記載の核酸分子の断片を含む核酸分子。
【００１５】
本発明では、「遺伝的に修飾された」という表現は、植物細胞の遺伝情報が、外因性核酸分子の導入によって修飾されること、また外因性核酸分子の存在または発現が表現型の修飾をもたらすことを意味する。「表現型の修飾」という用語は、好ましくは、細胞の一つまたは複数の機能の測定可能な修飾を意味する。例えば、本発明の遺伝的に修飾された植物細胞は、修飾された発現パターンを示す。本発明では、「遺伝的に修飾された」という表現は、本発明の単子葉植物の細胞が、ゲノムに安定に組み込まれた少なくとも１個の外因性核酸分子を含むことを意味する。
【００１６】
本発明では、「外因性核酸分子」という用語は、対応する遺伝的に修飾されていない野生型植物細胞に天然には存在しないＲ１タンパク質、好ましくはジャガイモのＲ１タンパク質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を意味すると理解される。外因性核酸分子は好ましくは、植物細胞に天然にみられない異なる配列、組み合わせ、または特異的な空間配置を含む組換え体分子である。本発明の単子葉植物の細胞は少なくとも１種の外因性核酸分子を含む（後者は好ましくは、植物細胞における転写を確実なものとする調節性ＤＮＡ配列（特にプロモーター）に連結される）。
【００１７】
ジャガイモのＲ１タンパク質をコードする外因性核酸分子の例を配列番号：１に示す。ジャガイモのＲ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、国際公開公報第９７／１１１８８ Ａ１号、およびローバース（Ｌｏｒｂｅｒｔｈ）らの論文（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １６． （１９９８）、４７３〜４７７）にも記載されている。
【００１８】
ジャガイモのＲ１タンパク質の重要な特徴は、（ｉ）アミノ酸配列（例えば配列番号：２を参照）；（ｉｉ）植物細胞の色素体のストロマにおける位置（デンプン粒に結合した状態、また可溶性の状態の両方で存在する場合がある）；ならびに（ｉｉｉ）植物体に含まれるデンプンのリン酸化の程度に影響を及ぼす能力。例えば、トランスジェニックジャガイモ植物体のジャガイモのＲ１タンパク質をコードするＲ１遺伝子が抑制されると、ジャガイモの塊茎から単離可能なデンプンのリン酸含量が低下する。またローバースらは、ジャガイモのＲ１タンパク質が、対応するＲ１ ｃＤＮＡを大腸菌で発現させた場合に細菌由来のグリコーゲンをリン酸化する能力をもつことを報告している（Ｌｏｒｂｅｒｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １６、（１９９８）、４７３〜４７７）。
【００１９】
リッテ（Ｒｉｔｔｅ）ら（Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２１、（２０００）、３８７〜３９１）は、ジャガイモのＲ１タンパク質が、ジャガイモの植物体に含まれるデンプン粒に可逆的に結合することを報告している（デンプン粒に対する結合強度は植物体の代謝状態によって変わる）。デンプン粒に結合した状態では、ジャガイモ植物体に含まれるタンパク質は、暗条件で維持される葉に主に存在する。しかし、葉に光を照射すると、このタンパク質は、デンプン粒に結合していない可溶性状態で主に存在する。また、トランスジェニックジャガイモ植物体のジャガイモのＲ１遺伝子の発現を抑制すると、「デンプンが過剰な」表現型となる。すなわち、対応する植物体の葉に含まれるデンプン量が多くなる（Ｌｏｒｂｅｒｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １６、（１９９８）、４７３〜４７７）。また、このようなジャガイモ植物体の塊茎は、冷所保存後に「冷却による甘味発生」の低下を示す点で区別される（Ｌｏｒｂｅｒｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １６、（１９９８）、４７３〜４７７）。
【００２０】
原理的には、Ｒ１タンパク質をコードする外因性核酸分子は、任意の種類のジャガイモまたはジャガイモ植物体、好ましくは、トメンサ（Ｔｏｍｅｎｓａ）、デジレ（Ｄｅｓｉｒｅｅ）、テンポラ（Ｔｅｍｐｏｒａ）、およびソマナ（Ｔｈｏｍａｎａ）の各品種のジャガイモに起源を有する場合がある。
【００２１】
一つの好ましい態様では、このような外因性核酸分子は、配列番号：１に記載されたヌクレオチド配列を有する。
【００２２】
さらに好ましい態様では、外因性核酸分子は、配列番号：１に記載されたヌクレオチド配列を有する
【００２３】
本発明のさらに好ましい態様では、外因性核酸分子は、配列番号：２に記載されたアミノ酸配列を有する、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｓｕｍ）に由来するＲ１タンパク質をコードする。
【００２４】
本発明のさらに別の態様では、外因性核酸分子は、成熟型（色素体シグナルペプチドを含まない）タンパク質のコード領域（配列番号：１に記載されたヌクレオチド配列のｂｐ ４４７〜ｂｐ ４６０７）を含む。ジャガイモのＲ１タンパク質の色素体のＮ末端シグナルペプチド（配列番号：１に記載されたヌクレオチド配列のヌクレオチド２１６〜４４６にコードされたアミノ酸１〜７７）の代わりに、本発明のこの態様では、外因性核酸分子は、異種の色素体シグナル配列、すなわち、成熟型Ｒ１タンパク質と関連する、天然には存在しないシグナル配列を含む。色素体のシグナル配列は当業者に周知である。
【００２５】
例えばホウレンソウのフェレドキシン：ＮＡＤＰ＋酸化還元酵素（ＦＮＲ）のようなシグナル配列は、色素体シグナル配列として使用されることがある。この配列は、ホウレンソウの色素体タンパク質フェレドキシン：ＮＡＤＰ＋酸化還元酵素のｃＤＮＡの５’側の非翻訳領域、ならびに隣接する輸送ペプチド配列を含む（ヌクレオチド −１７１〜＋１６５；Ｊａｎｓｅｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３、（１９８８）、５１７〜５２２）。
【００２６】
また例えば、トウモロコシのｗａｘｙタンパク質の輸送ペプチド＋成熟型ｗａｘｙタンパク質の先頭の３４アミノ酸がシグナル配列として使用されることがある（Ｋｌｏｓｇｅｎら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ． ２１７、（１９８９）、１５５〜１６１）。また、トウモロコシのｗａｘｙタンパク質の輸送ペプチドは、成熟型ｗａｘｙタンパク質の先頭の３４アミノ酸を必要とすることなく使用される場合がある。
【００２７】
本発明のさらに好ましい態様では、外因性核酸分子は、配列番号：１に記載されたヌクレオチド配列の誘導体を含む。
【００２８】
本発明では、「誘導体」という用語は、配列番号：１に記載されたヌクレオチド配列とは１個または複数の位置が異なり、配列番号：１に記載されたヌクレオチド配列のコード領域と高度の相同性を示す分子の配列を意味する。また誘導体は、それらがＲ１タンパク質、好ましくはジャガイモのＲ１タンパク質の生物学的特性を有するタンパク質をコードする点において区別される。本発明では、「相同性」とは、ヌクレオチド配列の、少なくとも６５％、特に少なくとも８５％、より詳細には少なくとも９０％の同一性、好ましくは９５％以上、また最も好ましくは９８％以上の配列の同一性を意味する。上述の核酸分子との差は、欠失、付加、置換、挿入、または組換えによって生じる場合がある。
【００２９】
相同性の程度は好ましくは、個々のヌクレオチド配列を、配列番号：１のコード領域、特に配列番号：１に記載されたヌクレオチド配列の成熟型タンパク質をコードする配列番号：１の領域（ｂｐ４４７〜ｂｐ４６０７）と比較することで決定される。比較対象の配列が異なる長さをもつ場合は、相同性の程度は、好ましくは、より長い配列のヌクレオチドと同一な短いヌクレオチド配列中においてこのようなヌクレオチドが存在するパーセンテージで表される（すなわち配列の同一性は、個々のヌクレオチド配列が重複する領域に関して決定される）。配列の比較は、トンプソン（Ｊｕｌｉｅ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）（Ｔｈｏｍｆｉｓｏｎ＠ＥＭＢＬ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ＤＥ）、およびギブソン（Ｔｏｂｙ Ｇｉｂｓｏｎ）（Ｇｉｂｓｏｎ＠ＥＭＢＬ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ＤＥ；Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｍｅｙｅｒｈｏｆｓｔｒａｓｓｅ １、Ｄ６９１１７ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から配布されているＣｌｕｓｔａｌ Ｗプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２、（１９９４）、４６７３〜４６８０）などの既知のコンピュータプログラムを用いて行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗは、さまざまなインターネットサイト（例えばＩＧＢＭＣ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｄｅ Ｇｅｎｅｔｉｑｕｅ ｅｔ ｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ ｅｔ Ｃｅｌｌｕｌａｉｒｅ、Ｂ．Ｐ．１６３、６７４０４ Ｉｌｌｋｉｒｃｈ Ｃｅｄｅｘ、Ｆｒａｎｃｅ；ｆｔｐ：／／ｆｔｐ−ｉｇｂｍｃ．ｕ−ｓｔｒａｓｂｇ．ｆｒ／ｐｕｂ／）のサイト、およびＥＢＩ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のサイト（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／）、ならびにＥＢＩ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃａｍｐｕｓ、Ｈｉｎｘｔｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＣＢ１０ １ＳＤ、ＵＫ）にリンクされているインターネットサイト）からダウンロードすることもできる。
【００３０】
Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラム（バージョン１．８）を使用する際には、さまざまなパラメータのデフォルト値を使用する。ＤＮＡ配列を比較する場合は、このようなパラメータは以下の値をとる：ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＴＯＰＤＩＡＧＳ＝４、ＰＡＩＲＧＡＰ＝５、ＤＮＡＭＡＴＲＩＸ：ＩＵＢ、ＧＡＰＯＰＥＮ＝１０、ＧＡＰＥＸＴ＝５、ＭＡＸＤＩＶ＝４０、ＴＲＡＮＳＩＴＩＯＮＳ：非荷重。
【００３１】
タンパク質配列を比較する場合は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムのパラメータのデフォルト値を同様に使用する。このようなパラメータは以下の値をとる：ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＴＯＰＤＩＡＧ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝５、ＰＡＩＲＧＡＰ＝３、ＧＡＰＯＰＥＮ＝１０、ＧＡＰＥＸＴＥＮＤ＝０．０５、ＧＡＰＤＩＳＴ＝８、ＭＡＸＤＩＶ＝４０、ＭＡＴＲＩＸ＝ＧＯＮＮＥＴ、ＥＮＤＧＡＰＳ（ＯＦＦ）、ＮＯＰＧＡＰ、ＮＯＨＧＡＰ。
【００３２】
相同性の程度は、例えばＭｖｉｅｗ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｃｅｅｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ／ｓｅｑｓｏｆｔｗａｒｅ／ｍｖｉｅｗ；Ｂｒｏｗｎ、Ｎ．Ｐ．、Ｌｅｒｏｙ Ｃ．、Ｓａｎｄｅｒ Ｃ． （１９９８）、ＭＶｉｅｗ：ａ ｗｅｂ−ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｖｉｅｗｅｒ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１４（４）：３８０〜３８１）などの既知のコンピュータプログラムを用いて決定することができる。
【００３３】
本発明では、「相同性」は、機能および／または構造が個々の核酸分子間、または核酸分子がコードするタンパク質間で等価であることも意味する。配列番号：１に記載された核酸分子に相同な核酸分子、およびこれらの分子の誘導体を含む核酸分子は、同じ生物学的機能を果たす修飾、およびインビボにおいて単子葉植物に含まれるデンプンのリン酸含量を上昇させる能力を含む、このような分子の変形例である。これらは、天然の変形例、例えば他の種類のジャガイモに由来する配列、または変異である場合がある（このような変異は天然に形成される場合があるほか、標的変異誘発で導入される場合がある）。
【００３４】
本発明のさらに別のの態様では、配列番号：１の誘導体は、配列番号：１に記載された核酸分子の対立遺伝子変異体を含む。
【００３５】
このような対立遺伝子変異体は、デンプンのリン酸含量を上昇可能な天然の変異体である。
【００３６】
本発明の他の態様では、外因性核酸分子は、本発明で定義される外因性核酸分子の断片を含む。
【００３７】
本発明では、「断片」という用語は、Ｒ１タンパク質の生物学的に活性のある部分、好ましくは酵素活性をもつ部分をコードする外因性核酸分子の一部を意味する。
【００３８】
Ｒ１タンパク質の生物学的に活性のある部分は、植物では、外因性核酸分子の過剰発現によってリン酸含量の上昇を招くことが可能な点によって、および／または大腸菌における発現後にグリコーゲンのリン酸化を促進する点によって区別される（国際公開公報第９７／１１１８８ Ａ１号、実施例９を参照）。
【００３９】
外因性核酸分子のさまざまな異型（断片、誘導体、対立遺伝子変異体）にコードされているタンパク質は、特定の一般的な特徴を示す。後者の例には、タンパク質の相同性を比較する上述の方法で調査可能な生物学的活性、酵素活性、または類似の一次構造が含まれる。このようなタンパク質のアミノ酸配列は相互に少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８５％、特に少なくとも９５％、また最も好ましくは少なくとも９７％の相同性を示す。
【００４０】
上述の特徴に加えて、外因性核酸分子は、以下の特徴的なペプチドモチーフの少なくとも１個、好ましくは少なくとも５個、特に少なくとも１０個、また最も好ましくはすべてを含むＲ１タンパク質の生物学的活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする場合がある：
2004512048.tif 000002
【００４１】
他の差には、本発明の植物細胞は、天然には同細胞に存在しない外因性核酸分子を含む点により、またはこのような分子が、天然には存在しない、細胞のゲノム中のある位置（すなわち異なるゲノム環境）に組み込まれる点により、天然の植物細胞と区別できるものもある。また、本発明のこの種のトランスジェニック植物細胞は、ゲノムに安定に組み込まれる少なくとも１コピーの外因性核酸分子を含む点で、また任意選択で、細胞内に天然に存在するこのような分子のコピーに加えて含む点で、天然の植物細胞と区別することができる。細胞に導入される核酸分子が、既に細胞内に天然に存在する分子の付加的なコピーである場合、本発明の植物細胞は、特に天然の植物細胞と、付加的なコピーが、天然には存在しないゲノム上のある部位に位置する点で区別することができる。これは後に、例えばサザンブロッティング解析により検出することができる。
【００４２】
また、本発明に係る植物細胞は好ましくは、以下の少なくとも一つの特徴により、天然の植物細胞と区別される：導入される核酸分子が植物体に関して異種である場合、本発明のトランスジェニック植物の細胞が、導入される核酸分子の転写物を含むこと、実際には野生型の植物体で転写物が検出されない器官であっても含むこと。本発明の植物細胞は好ましくは、外因性核酸分子の転写物を含む。これは例えばノーザンブロッティング解析で検出することができる。本発明の植物細胞は、好ましくは、導入された外因性核酸分子にコードされるタンパク質を含む。このような付加的なタンパク質は、免疫学的方法、例えば特にウェスタンブロッティング解析で検出することができる。
【００４３】
一つの好ましい態様では、本発明の植物細胞および植物体は、対応する遺伝的に修飾されていない野生型植物細胞および野生型植物体と比較して、Ｒ１タンパク質の高い生物学的活性を示す。本発明に関連して、「Ｒ１タンパク質の高い生物学的活性」は例えば、本発明の植物細胞および植物体で合成されるデンプンのリン酸含量を測定することで決定することができる。対応する遺伝学的に修飾されていない野生型の植物細胞のデンプンと比較して、Ｒ１タンパク質の高い生物学的活性を示す、本発明の植物細胞のデンプンは、これが、リン酸含量が高いデンプン、好ましくはグルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が高いデンプンを合成する点で区別される。
【００４４】
また、Ｒ１タンパク質の生物学的活性の上昇は、Ｒ１転写物の量を例えばノーザンブロッティング解析で測定して、対応する遺伝的に修飾されていない野生型植物体のＲ１転写物の量と比較することで決定することができる。
【００４５】
また、Ｒ１タンパク質の高い生物学的活性は、Ｒ１タンパク質の量を例えばウェスタンブロッティング解析で測定して、対応する遺伝的に修飾されていない野生型植物体のＲ１タンパク質の量と比較することで決定することができる。
【００４６】
本発明に係る単子葉植物の細胞が、対応する遺伝的に修飾されていない野生型植物体の植物細胞のデンプンと比較して、グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量の上昇、および／または修飾されたリン酸化パターン、および／または修飾された粘性特性を有するデンプンを合成することがわかっている。
【００４７】
したがって本発明は好ましくは、対応する遺伝的に修飾されていない野生型植物体の植物細胞のデンプンと比較して、グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が高く、および／または修飾されたリン酸化パターンを有し、および／または修飾された粘性特性を有するデンプンを合成する、本発明の植物細胞に関する。
【００４８】
本発明では、「リン酸含量」という用語は、デンプンのリン酸モノエスエルの状態で共有結合で結合されたリン酸の量を意味する。
【００４９】
本発明では、「Ｃ６位」という用語は、炭素原子の「６」位において、デンプンのグルコース単量体に結合されるリン酸基を意味すると理解される。
【００５０】
本発明に関連して、「Ｃ６位におけるリン酸含量の上昇」という用語は、グルコース単量体のリン酸基が、光学的−酵素学的試験により、Ｃ６位で検出可能であることを意味すると理解される（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０５、（１９９４）、１１１〜１１７、方法を参照）。「Ｃ６位におけるリン酸含量の上昇」という用語は、好ましくは、対応する遺伝的に修飾されていない野生型植物体のデンプンのリン酸含量と比較して、グルコース単量体のＣ６位におけるデンプンのリン酸含量の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、また最も好ましくは少なくとも１００％の上昇を意味すると理解される。
【００５１】
原理的には、グルコース単位のＣ２位、Ｃ３位、およびＣ６位が、インビボにおいてデンプン中でリン酸化される場合がある。本発明に関連して、Ｃ６位におけるリン酸含量（＝Ｃ６ Ｐ含量）は、光学的−酵素学的試験を用いるグルコース−６−リン酸の決定により決定することができる（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０５、（１９９４）、１１１〜１１７）（方法参照）。
【００５２】
本発明では、「修飾されたリン酸化パターン」という用語は、対応する遺伝的に修飾されていない植物体のデンプンから作製される化学的にリン酸化されたデンプンと比較して、デンプン粒のさまざまな層内においてデンプンに共有結合で結合されるリン酸基の総リン酸含量が修飾されていることを意味する。化学的にリン酸化されたデンプンは、デンプン粒内のリン酸勾配により区別される（外側の層は内側の層より一般に強くリン酸化されている）。これに対して本発明のデンプンは、リン酸基が、デンプン粒のさまざまな層に異なって分布する点で区別される。すなわち本発明のデンプンは、化学的にリン酸化されたデンプンに典型的にみられる外側から内側への勾配を含まないことを特徴とするといえる。
【００５３】
デンプンのリン酸化パターンを調べる方法は当業者に周知である（例えば、ＪａｎｅおよびＳｈｅｎ、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４７、（１９９３）、２７９〜２９０；ＧｏｕｇｈおよびＰｙｂｕｓ、Ｓｔａｅｒｋｅ ２５、（１９７３）、１２３〜１３０を参照）。これらの方法は、内部でデンプン粒の膠着層が機械的に段階的に除かれる、デンプン粒のさまざまな層の段階的な化学的膠着を基礎としている。このような脱殻的手法（ｓｈｅｌｌｉｎｇ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）に続いて、さまざまなデンプン粒の層の総リン酸含量が標準的な方法で決定される。
【００５４】
本発明では、「化学的にリン酸化されたデンプン」という用語は、対応する遺伝的に修飾されていない植物細胞および／または植物体の天然のデンプンの化学的なリン酸化で作られるデンプンを意味すると理解される。本発明に関連して、化学的にリン酸化されたデンプンは、好ましくは、本発明のデンプンのアミロース含量と同等のアミロース含量と区別される。天然のデンプンの化学的リン酸化の間、Ｃ６位におけるリン酸含量は、適切な試験条件を選択して、化学的にリン酸化されたデンプンのＣ６位におけるリン酸含量が、本発明のデンプンのグルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量と同一および／または同等になるように調節される。
【００５５】
本発明に関連して、「修飾された粘性特性」という用語は、ＲＶＡプロファイルにおける最終粘性の上昇、および／またはＤＳＣ解析におけるピーク温度の低下を特に意味すると理解される。
【００５６】
他の好ましい態様では、本発明の植物細胞は、対応する遺伝的に修飾されていない野生型植物体のデンプンと比較して、最終粘性が高いデンプンを合成する。
【００５７】
本発明に関連して、「最終粘性」という用語は、粘性プロファイル（図１参照）を元に決定可能で、また図１で「最終粘性＝Ｆｉｎ」と示されている粘性を意味すると理解される。粘性プロファイルは、ラピッドビスコアナライザー（Ｒａｐｉｄ Ｖｉｓｃｏ Ａｎａｌｙｚｅｒ；ＲＶＡ）（Ｎｅｗｐｏｒｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｔｙ Ｌｔｄ、Ｉｎｖｅｓｔｍｅｎｔ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｇｒｏｕｐ、Ｗａｒｒｉｅｗｏｏｄ、ＮＳＷ２１０２、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して得られる。コムギデンプンの解析では、粘性プロファイルは以下の手順で決定される：２．５ ｇのデンプン（乾燥物質）を２５ ｍｌのＨ２Ｏに溶解し、ラピッドビスコアナライザー（Ｎｅｗｐｏｒｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｔｙ Ｌｔｄ．、Ｉｎｖｅｓｔｍｅｎｔ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｇｒｏｕｐ、Ｗａｒｒｉｅｗｏｏｄ ＮＳＷ ２１０２、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）による解析に用いる。同装置は、製造業者の指示書通りに操作する。完全な温度プログラムを図１に示す。ＲＶＡ解析の実施の詳細は後述する（方法参照）。
【００５８】
本発明では、「最終粘性の上昇」という用語は、最終粘性が、対応する遺伝的に修飾されていない野生型植物の細胞に由来するデンプンと比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、特に少なくとも５０％、また最も好ましくは少なくとも８０％上昇することを意味する（最終粘性は、対応する遺伝的に修飾されていない野生型植物の細胞のデンプンと比較して、最大１０００％、好ましくは最大５００％、特に最大２５０％上昇する場合がある）。
【００５９】
他の好ましい態様では、本発明の植物細胞は、対応する遺伝的に修飾されていない野生型植物のデンプンと比較して、および／または化学的にリン酸化されたデンプンと比較して、グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が同一または同等のデンプン、および／またはピーク温度が低いデンプンを合成する。
【００６０】
本発明では、「ピーク温度」という用語は、当業者に周知の差分走査熱量測定（ＤＳＣ）で決定可能な温度Ｔｐを意味すると理解されるべきである。ピーク温度は、ＤＳＣ曲線の最初のピーク極大を一般に指す温度である。これは例えば、大容量カプセルを用いて、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから入手される装置（装置番号：ＤＳＣ−７）を用いて決定することができる（調査対象の試料は、デンプン：総水量の比が約１：４であり、測定は１０℃／分の加熱速度で温度範囲１０〜１６０℃で実施される）（実施例４参照）。
【００６１】
「ピーク温度Ｔｐの低下」という用語は、対応する遺伝的に修飾されていない野生型植物細胞のデンプンと比較して、ピーク温度Ｔｐが少なくとも１．５℃、好ましくは少なくとも２．５℃、特に少なくとも４℃、また最も好ましくは少なくとも６℃低下すること、および最大５℃、１２℃、または９℃低下することを意味する。
【００６２】
他の好ましい態様では、本発明は、膠着後にゲルを形成し、対応する遺伝的に修飾されていない野生型植物の細胞のデンプンから形成されるゲルと比較して、高いゲル強度を有するデンプンを合成する本発明の植物細胞に関する。
【００６３】
本発明では、「ゲル強度の上昇」という用語は、対応する遺伝的に修飾されていない野生型植物の細胞のデンプンのゲル強度と比較して、ゲル強度の上昇が少なくとも２０％、特に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％、また最も好ましくは少なくとも１００％であり、最大低下率が５００％、または最大２５０％であることを意味すると理解される。
【００６４】
本発明に関連して、ゲル強度は、後述する条件下におけるテクスチャー解析法で決定することができる（方法参照）。
【００６５】
本発明の別の態様では、デンプンのリン酸含量の上昇は、デンプンのアミロペクチン成分に関する場合がある。
【００６６】
したがって本発明は、デンプンを合成する本発明の植物細胞にも関し、このアミロペクチン成分はリン酸化されており、またこのアミロース成分の総リン酸含量は、グルコース単量体のＣ６位におけるデンプンのリン酸含量が同じである、対応する化学的にリン酸化されたデンプンのアミロース成分と比較して低い。
【００６７】
したがって、グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が同じである化学的にリン酸化されたデンプンに対し、本発明の植物細胞のデンプンは、デンプンから作られ、好ましくは対応する遺伝的に修飾されていない植物体と同等のアミロース量を有するグルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が同じである、化学的に合成されたデンプンのアミロース成分と比較して、本発明の植物細胞のデンプンのアミロース成分の総リン酸含量が低い点、および／またはグルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が低い点において区別される。
【００６８】
本発明に関連して、「総リン酸含量」という用語は、グルコース単位のＣ２位、Ｃ３位、およびＣ６位におけるデンプンのリン酸モノエステルの状態で共有結合で結合されたリン酸の量を意味すると理解される。本発明では、リン酸化された非グルカン（リン脂質など）の量は、「総リン酸含量」という用語には含まれない。したがって、リン酸化された非グルカンは、総リン酸含量を決定する前に量的に分離されなければならばい。リン酸化された非グルカン（例えばリン脂質）をデンプンから分離する方法は当業者に周知である。
【００６９】
本発明では、「総リン酸含量の低下」という用語は、対応する遺伝的に修飾されていない植物体に由来するデンプンから作られるＣ６位のリン酸含量が同じ化学的にリン酸化されたデンプンのアミロース成分の総リン酸含量と比較して、少なくとも５％、特に少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、また最も好ましくは少なくとも８０％の総リン酸含量の低下を意味すると理解される。
【００７０】
総リン酸含量を決定する方法は当業者に周知であり、後述する（方法参照）。
【００７１】
本発明では、「グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量の低下」という表現は、対応する遺伝的に修飾されていない植物体に由来するデンプンから作られるＣ６位におけるリン酸含量が同じ化学的にリン酸化されたデンプンのアミロース成分のグルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量と比較して、アミロース成分のグルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が少なくとも１０％、特に少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、また最も好ましくは少なくとも８０％低下することを意味すると理解されるべきである。グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量を決定する方法は当業者に周知であり、後述する（方法参照）。
【００７２】
本発明では、「アミロペクチン成分」という用語は、デンプンのアミロペクチンを意味すると理解される。
【００７３】
本発明では、「アミロース成分」という用語は、デンプンのアミロースを意味すると理解される。
【００７４】
アミロースとアミロペクチンを分離する方法は当業者に周知である。例えばアミロース成分は、例えばロジャー（Ｒｏｇｅｒ）およびコロナ（Ｃｏｌｏｎｎａ）（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １９、（１９９６）、５１〜６１）に記載されている手順で、デンプンの水性リーチング（ａｑｕｅｏｕｓ ｌｅａｃｈｉｎｇ）で得られる。
【００７５】
本発明の他の好ましい態様では、本発明のデンプンは、デンプンのＣ６位におけるグルコース単量体のＣ６位のリン酸含量に対するアミロース成分のＣ６位におけるグルコース単量体のＣ６リン酸含量の比が０．７５未満、特に０．５未満、好ましくは０．２５未満、また最も好ましくは０．２０未満であることをさらに特徴とする。化学的にリン酸化されたデンプンに対し、本発明のデンプンは、グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸の主要な部分が、デンプンのアミロペクチン成分に検出され、アミロース成分に検出されない点で区別される。
【００７６】
本発明の植物細胞は、単子葉植物に起源を有する。これらは好ましくは、農業分野で使用される植物、すなわち栄養分を得る目的、または技術上の目的（特に工業的な目的）で、人間によって栽培される植物に由来する植物細胞である。したがって本発明は、好ましくは、デンプンを合成する植物、またはデンプンを貯蔵する植物（例えば、ライムギ、オオムギ、オーツムギ、コムギ、ミレット、イネ、またはトウモロコシ）に由来する植物細胞に関する。
【００７７】
本発明の一つの好ましい態様では、本発明の植物細胞は、コムギ、イネ、オオムギ、オーツムギ、ライムギ、およびトウモロコシからなる群より選択される植物体に起源を有する。コムギ、イネ、およびトウモロコシの植物体の植物細胞が好ましく；コムギ植物体の植物細胞が特に好ましい。
【００７８】
特に好ましい一つの態様では、本発明の植物細胞は、グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が少なくとも０．１ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプン、特に少なくとも０．５ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１、好ましくは少なくとも１ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプン、より好ましくは少なくとも２ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプン、最も好ましくは少なくとも５ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプン、最も詳細には好ましくは少なくとも１０ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプンであるデンプンを合成する（本発明の植物細胞は、グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が最大１００ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプン、詳細には最大５０ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプン、また最も詳細には最大２５ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプンであるデンプンを合成する）。
【００７９】
本発明の他の態様では、本発明の植物細胞は、グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が少なくとも１５ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプンであるデンプンを合成する場合がある（本発明の植物細胞は、グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が最大１００ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプン、詳細には最大５０ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプン、また最も詳細には最大２５ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプンであるデンプンを合成する）。
【００８０】
他の態様では、本発明は、本発明の植物細胞を作製する方法に関し、単子葉植物の細胞が遺伝的に修飾され、またこの遺伝的修飾は少なくとも１個の外因性核酸分子の導入を含む。
【００８１】
植物の宿主細胞へＤＮＡを輸送する際に利用可能な多様な手法がある。このような手法には、形質転換の媒介物としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはアグロバクテリウム・リゾジェネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を用いるＴ−ＤＮＡによる植物細胞の形質転換、プロトプラストの融合、注入、ＤＮＡのエレクトロポレーション、微粒子銃を用いた手段によるＤＮＡの導入、および他の可能な手法が含まれる。
【００８２】
アグロバクテリウムにより促進される植物細胞の形質転換の使用は詳しく検討されており、また欧州特許１２０５１６号；フーケマ（Ｈｏｅｋｅｍａ）、「Ｔｈｅ Ｂｉｎａｒｙ Ｐｌａｎｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｏｆｆｓｅｔｄｒｕｋｋｅｒｉｊ Ｋａｎｔｅｒｓ Ｂ．Ｖ．、Ａｌｂｌａｓｓｅｒｄａｍ （１９８５）、第Ｖ章；フレイリー（Ｆｒａｌｅｙ）ら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． ４、１〜４６、およびアン（Ａｎ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ． ４、（１９８５）、２７７〜２８７に詳述されている。ジャガイモの形質転換については、例えばロシュソサ（Ｒｏｃｈａ−Ｓｏｓａ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ． ８、（１９８９）、２９〜３３を参照されたい。
【００８３】
一方、単子葉植物の形質転換は、微粒子銃を用いた手段で、またアグロバクテリウムを用いた手段で日常的に達成されている（Ｋｏｍａｒｉら、（１９９８）、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｃｅｒｅａｌ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １、１６１、以下参照；Ｂｉｌａｎｇら（１９９９）、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｒｅａｌｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１２、１１３〜１４８、ＪＫ Ｓｅｔｌｏｗ編、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。アグロバクテリウムに基づくベクターについては諸文献に記載されている（Ｃｈａｎら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２、（１９９３）、４９１〜５０６；Ｈｉｅｉら、Ｐｌａｎｔ Ｊ． ６、（１９９４） ２７１〜２８２；Ｄｅｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ３３、（１９９０）、２８〜３４、Ｗｉｌｍｉｎｋら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １１、（１９９２）、７６〜８０；Ｍａｙら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３、（１９９５）、４８６〜４９２；ＣｏｎｎｅｒおよびＤｏｍｉｓｓｅ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． １５３ （１９９２）、５５０〜５５５；Ｒｉｔｃｈｉｅら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ． ２、（１９９３）、２５２〜２６５）。単子葉植物の形質転換の別の系には、微粒子銃を用いた手段による形質転換（ＷａｎおよびＬｅｍａｕｘ、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０４、（１９８４）、３７〜４８；Ｖａｓｉｌら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１ （１９９３）、１５５３〜１５５８；Ｒｉｔａｌａら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４、（１９９４）、３１７〜３２５；Ｓｐｅｎｃｅｒら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ． ７９、（１９９０）、６２５〜６３１）、プロトプラストによる形質転換、部分透過性をもつ細胞を対象としたエレクトロポレーション、およびガラス繊維を用いたＤＮＡの導入などがある。特にトウモロコシの形質転換については諸文献に数回にわたって記載されている（例えば、国際公開公報第９５／０６１２８号、欧州特許第０５１３８４９号、ＥＯ ０４６５８７５、欧州特許第２９２４３５号；Ｆｒｏｍｍら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８、（１９９０）、８３３〜８４４；Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２、（１９９０）、６０３〜６１８；Ｋｏｚｉｅｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１ （１９９３）、１９４〜２００；Ｍｏｒｏｃら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ． ８０、（１９９０）、７２１〜７２６を参照）。
【００８４】
他の種の穀物類の形質転換がうまくゆくことについても、例えばオオムギ（ＷａｎおよびＬｅｍａｕｘ、上述；Ｒｉｔａｌａら、上述；Ｋｒｅｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２９６、（１９８２）、７２〜７４）、およびコムギ（Ｂｅｃｋｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｊ． ５ （２）、（１９９４）、２２９〜３０７；Ｎｅｈｒａら、Ｐｌａｎｔ Ｊ． ５、（１９９４）、２８５〜２９７）について報告されている
【００８５】
イネについては、さまざまな形質転換法、例えばアグロバクテリウムによって促進される形質転換（Ｈｉｅｉら、Ｐｌａｎｔ Ｊ． ６ （１９９４）、２７１〜２８２；Ｈｉｅｉら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３５ （１９９７）、２０５〜２１８；Ｐａｒｋら、Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ． ３８ （１９９５）、３６５〜３７１）、プロトプラストを用いた形質転換（Ｄａｔｔａ、「Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｐｌａｎｔｓ」、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、１９９５、６６〜７５；Ｄａｔｔａら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２０ （１９９２）、６１９〜６２９；Ｓａｄａｓｉｖａｍら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． １３ （１９９４）、３９４〜３９６）、微粒子銃を用いる植物形質転換法（Ｌｉら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． １２ （１９９３）、２５０〜２５５；Ｃａｏら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． １１ （１９９２）、５８６〜５９１；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． （１９９７）、１９７〜２０３）、およびエレクトロポレーション（Ｘｕら、「Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｐｌａｎｔｓ」、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、１９９５、２０１〜２０８）が報告されている。
【００８６】
本発明はさらに、本発明の植物細胞を含む植物体、および／または本発明の植物細胞から再生させることで作製可能な植物体に関する。このような植物体は好ましくは有用な単子葉植物、例えばライムギ、オオムギ、オーツムギ、コムギ、ミレット、イネ、およびトウモロコシである。コムギ、イネ、およびトウモロコシが好ましく；コムギが特に好ましい。
【００８７】
本発明の植物体は、修飾型のデンプンを合成する。このようなデンプンのリン酸含量、および／またはリン酸化パターン、および／または粘性特性は、本発明の植物細胞に関連して記載されているように、対応する遺伝的に修飾されていない野生型植物体のデンプンとは異なる。
【００８８】
したがって本発明は、対応する遺伝的に修飾されていない植物体のデンプンと比較して、グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が高いデンプン、および／または修飾されたリン酸化パターンを示すデンプン、および／または修飾された粘性特性を示すデンプンを合成する本発明の植物体にも関する。
【００８９】
本発明の植物細胞に関連してなされた記述は、デンプンのグルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量の上昇、デンプンのリン酸化パターンの修飾、およびデンプンの粘性特性の修飾についても言える。
【００９０】
本発明は好ましくは、対応する遺伝的に修飾されていない野生型植物体のデンプンから形成されるゲルと比較して、膠着後にゲル強度が高いゲルを形成するデンプンを合成する本発明の植物体に関する。
【００９１】
「高いゲル強度」という用語は、本発明の植物細胞に関連して定義されている。
【００９２】
本発明の他の好ましい態様では、本発明の植物体、好ましくはコムギ植物体は、グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が少なくとも０．１ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプン、特に少なくとも０．５ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１、好ましくは少なくとも１ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプン、最も好ましくは少なくとも２ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプン、特に少なくとも５ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプン、極めて最も好ましくは少なくとも１０ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプンであるデンプン、好ましくはコムギデンプンを合成する（本発明の植物体は、グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が、最大１００ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプン、特に最大５０ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプン、または最大２５ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプンであるデンプンを合成する）。
【００９３】
本発明の他の態様では、本発明の植物体は、グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が少なくとも１５ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプンであるデンプンを合成することができる（本発明の植物体は、グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が最大１００ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプン、特に最大５０ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプン、または最大２５ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプンであるデンプンを合成する）。
【００９４】
本発明の他の好ましい態様では、本発明の植物体は、本発明の植物体のデンプン貯蔵器官内に本発明のデンプンを合成する。
【００９５】
最も好ましい態様では、本発明の植物体は、そのデンプン貯蔵器官内で、対応する遺伝的に修飾されていない野生型植物体のデンプン貯蔵器官に存在するデンプンと比較して、グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が上昇したデンプン、および／または修飾型のリン酸化パターンを有するデンプン、および／または修飾型の粘性特性を有するデンプンを合成する。
【００９６】
これと関連して、「デンプン貯蔵器官」という用語は、デンプンを一過的にのみ合成する葉などの器官に対して、貯蔵型デンプンを取り込む器官、例えばトウモロコシ、イネ、コムギの植物体の種子を意味すると理解される。
【００９７】
外因性核酸分子の発現は、単子葉植物、特にコムギ植物体のデンプン貯蔵器官内で特に有利であり、対応する遺伝的に修飾されていない野生型植物体（特にコムギ植物体）のデンプン貯蔵器官から単離可能なデンプンと比較して、デンプン貯蔵器官から単離可能なデンプンのリン酸含量の上昇を招く。
【００９８】
単子葉植物のデンプン貯蔵器官内における外因性核酸分子の発現は、構成的プロモーター、例えばカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ ＲＮＡのプロモーター（例えば米国特許Ａ−５，３５２，６０５号を参照）、およびトウモロコシのユビキチンプロモーター（例えば米国特許Ａ−５，６１４，３９９号を参照）を使用することで初めて達成される。
【００９９】
プロモーターは好ましくは、デンプン貯蔵器官に特異的なもの、例えばｇｌｕｔｅｌｉｎプロモーター（Ｌｅｉｓｙら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １４、（１９９０）、４１〜５０；Ｚｈｅｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｊ． ４、（１９９３）、３５７〜３６６；Ｙｏｓｈｉｈａｒａら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３８３、（１９９６）、２１３〜２１８）、ｓｈｒｕｎｋｅｎ−１プロモーター（Ｗｅｒｒら、ＥＭＢＯ Ｊ． ４、（１９８５）、１３７３〜１３８０）、コムギのＨＭＷプロモーター（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ９６、（１９９８）、５６８〜５７６、Ｔｈｏｍａｓ、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２ （１２）、（１９９０）、１１７１〜１１８０）、ＵＳＰプロモーター、ファゼオリンプロモーター（Ｓｅｎｇｕｐｔａ−Ｇｏｐａｌａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２ （１９８５） ３３２０〜３３２４、Ｂｕｓｔｏｓ、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １ （９）（１９８９）、８３９〜８５３）などの胚乳特異的なプロモーター、またはトウモロコシのｚｅｉｎ遺伝子のプロモーター（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、Ｃｅｌｌ ２９、（１９８２）、１０１５〜１０２６；Ｑｕａｔｒｏｃｃｉｏら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １５ （１９９０）、８１〜９３）、またはＧＢＳＳＩ（顆粒性デンプン合成酵素Ｉ）（ＤＥ１００４１８６１．９）およびコムギのＳＳＩＩ（可溶性デンプン合成酵素ＩＩ）（ＤＥ１００３２３７９．０）の穎花特異的プロモーターが使用される。
【０１００】
一つの特に好ましい態様では、本発明の植物体は、植物体のデンプン貯蔵器官内でＲ１遺伝子の発現を示す。
【０１０１】
Ｒ１遺伝子の発現は、例えばＲ１転写物の量を例えばノーザンブロッティング解析で測定し、野生型植物体のＲ１転写物の量と比較することで決定することができる。
【０１０２】
また本発明に関連して、Ｒ１遺伝子の発現は、Ｒ１タンパク質の量を例えばウェスタンブロッティング解析で測定することで決定することができる。Ｒ１タンパク質の量は好ましくは、胚乳の植物細胞から単離されるタンパク質抽出物を対象に決定される。
【０１０３】
本発明の他の態様では、本発明の植物体は、植物体のデンプン貯蔵器官内でＲ１遺伝子の発現を示し、この発現は、対応する遺伝的に修飾されていない野生型植物体のデンプン貯蔵器官内におけるＲ１遺伝子の発現と比較して、好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも１００％、特に少なくとも２５０％、また最も詳細には少なくとも５００％上昇している。
【０１０４】
一つの最も好ましい態様では、本発明の植物体は、本発明の植物体のデンプン貯蔵器官内における外因性核酸分子の器官特異的な発現を示す。
【０１０５】
本発明では、「器官特異的」という用語は、選択されたプロモーターが、成熟した葉と比較して、デンプン貯蔵器官内における外因性核酸分子の発現に望ましく、また少なくとも２〜５倍、好ましくは５〜１０倍、最も好ましくは１０〜１００倍上昇する発現レベルといった、発現の程度の有意な上昇をもたらすことを意味すると理解される。
【０１０６】
本発明のこの態様では、本発明の植物体は、それが示す外因性核酸分子の器官特異的な発現が、対応する遺伝的に修飾されていない野生型植物体のデンプン貯蔵器官内における内因性Ｒ１遺伝子の遺伝子発現と比較して、デンプン貯蔵器官内におけるＲ１遺伝子の発現を上昇させるという点で区別される。本発明のこの態様では、本発明の植物体の葉におけるＲ１遺伝子発現の上昇は、デンプン貯蔵器官内における発現と同程度に検出されない。Ｒ１遺伝子発現の上昇は好ましくは、デンプン貯蔵器官のみと関連する。
【０１０７】
本発明の好ましい態様では、本発明の植物体は、コムギ、イネ、オオムギ、ミレット、オーツムギ、ライムギ、およびトウモロコシからなる群より選択される植物体である。コムギ、イネ、およびトウモロコシの植物体が好ましく；コムギ植物体が特に好ましい。
【０１０８】
本発明は、以下のように、本発明で定義される植物体を作製する方法にも関する：
（ａ）単子葉植物の細胞が遺伝的に修飾され、遺伝的修飾が少なくとも１種の外因性核酸分子の導入を含み；
（ｂ）段階（ａ）の細胞から植物体が再生され；また任意選択で
（ｃ）段階（ｂ）で作製された植物体から他の植物体を作製する。
【０１０９】
本発明はさらに、植物のデンプン貯蔵器官で、以下のように野生型植物体のデンプン貯蔵器官のデンプンと比較して、リン酸含量が高いデンプン、および／またはリン酸化パターンが修飾されたデンプン、および／または最終粘性が高いデンプン、および／またはピーク温度が低いデンプンが合成される、本発明で定義される植物体を作製する方法に関する：
（ａ）単子葉植物の細胞が遺伝的に修飾され、遺伝的修飾が本発明で定義される少なくとも１種の外因性核酸分子の導入を含み；
（ｂ）段階（ａ）の細胞から植物体が再生され；また任意選択で
（ｃ）段階（ｂ）で作製された植物体から他の植物体を作製する。
【０１１０】
同じことが、本発明の植物細胞および植物体に関連して既に説明したように、段階（ａ）で導入される遺伝的修飾について適用できる。
【０１１１】
段階（ｂ）の植物体の再生は、当業者に周知の方法で達成することができる。
【０１１２】
本発明の方法の段階（ｃ）の他の植物体の作製は例えば、栄養繁殖（例えば、挿し木、塊茎またはカルスの栽培、および植物体全体の再生）により、または種子繁殖により達成することができる。種子繁殖は好ましくは、制御された状態で行う。すなわち性質が明らかな選択された植物体を相互に交配させて繁殖させる。
【０１１３】
本発明の一つの好ましい態様では、本発明の方法は、段階（ａ）の植物細胞に導入される外因性核酸分子が以下からなる群より選択される点で区別される：
（ｉ）配列番号：１に記載されたヌクレオチド配列のコード領域を含む核酸分子；
（ｉｉ）配列番号：２に記載されたアミノ酸配列を有するジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）のＲ１タンパク質をコードする核酸分子；
（ｉｉｉ）配列番号：１に記載されたヌクレオチド配列の誘導体を含む核酸分子；および
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）に記載された核酸分子の断片を含む核酸分子。
【０１１４】
一つの特に好ましい態様では、本発明の方法は、外因性核酸分子が、プロモーター、好ましくは、デンプン貯蔵組織においてＲ１遺伝子の発現を器官特異的に促進する、胚乳特異的なプロモーター、および／または穎花特異的なプロモーターの制御下にあるという点で区別される。
【０１１５】
胚乳特異的なプロモーター、また穎花特異的なプロモーターなどの、この種のプロモーターは、本発明の植物体に関連して既に本明細書で例示されている。
【０１１６】
他の態様では、本発明の方法は、有用な単子葉植物、例えば、ライムギ、オオムギ、オーツムギ、コムギ、ミレット、イネ、およびトウモロコシに関する。コムギ、イネ、およびトウモロコシが好ましく；コムギが特に好ましい。
【０１１７】
本発明は、本発明の方法で得られる植物体にも関する。
【０１１８】
本発明は、本発明の植物細胞を含む植物体の増殖材料にも関し、また本発明の方法で作製される植物体に関する。本発明では、「増殖材料」という用語は、栄養的経路または生殖的経路による作製または増殖に適した植物体の任意の構成成分を含む。例えば、挿し木、カルス培養、根茎、または塊茎は栄養繁殖に適している。他の増殖材料には例えば、果実、種子、シュート、プロトプラスト、細胞培養などがある。種子は好ましい増殖材料である。
【０１１９】
一つの好ましい態様では、本発明はトウモロコシの種子に関する。
【０１２０】
最も好ましい態様では、本発明はコムギの種子に関する。
【０１２１】
本発明のトウモロコシおよびコムギの種子は、飼料および食品の生産に特に適している。
【０１２２】
本発明はさらに、本発明の植物体、好ましくはコムギ、トウモロコシ、およびイネの植物体、最も好ましくはコムギ植物体の作製に関連して、または本発明の単子葉植物細胞の作製に関連して本発明で定義される外因性核酸分子の使用に関する。
【０１２３】
本発明の植物細胞および植物体は、特にデンプン貯蔵器官において、物理化学的性質、特にリン酸含量、および／または粘性挙動、および／またはリン酸化パターンが、野生型植物体で合成されたデンプンと比較して、また化学的にリン酸化されたデンプンと比較して修飾されているデンプンを合成する。
【０１２４】
したがって本発明は、本発明の植物細胞、植物体、および／または増殖材料から得られるデンプンにも関する。
【０１２５】
本発明の一つの好ましい態様では、本発明のデンプンは、対応する遺伝的に修飾されていない野生型植物体のデンプンと比較して、グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が高いこと、および／またはリン酸化パターンが修飾されていること、および／または最終粘性が高いこと、および／またはピーク温度が低いことを特徴とする。
【０１２６】
本発明はまた、対応する遺伝的に修飾されていない野生型植物体のデンプンと比較して、グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が高いこと、および／またはリン酸化パターンが修飾されていること、および／または最終粘性が高いこと、および／またはピーク温度が低いことを特徴とするデンプンにも関する。
【０１２７】
本発明の植物細胞に関連してなされる記述は、Ｃ６位におけるリン酸含量の上昇、リン酸化パターンの修飾、および粘性特性（最終粘性、ピーク温度）の修飾にあついても言える。
【０１２８】
他の態様では、本発明は、グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が少なくとも０．１ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプン、特に少なくとも０．５ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプン、好ましくは少なくとも１ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプン、最も好ましくは少なくとも２ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプン、最も詳細には少なくとも５ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプン、かなり最も好ましくは少なくとも１０ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプンであること、および／または最終粘性が高いこと、および／またはピーク温度が低いことを特徴とするデンプン、好ましくはコムギデンプンに関する（グルコース単量体のＣ６位において、本発明のデンプンのリン酸含量は最大１００ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプン、特に最大５０ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプン、または最大２５ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプンである）。
【０１２９】
本発明の他の態様では、本発明のデンプンは、グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が少なくとも１５ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプンであることを特徴とする場合がある（グルコース単量体のＣ６位において、本発明のデンプンのリン酸含量は最大１００ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプン、特に最大５０ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプン、または最大２５ｎｍｏｌ Ｃ６ Ｐ ｍｇ−１ デンプンである）。
【０１３０】
他の好ましい態様では、本発明のデンプン、好ましくはコムギのデンプンは、膠着後に本発明のデンプンが、同じリン酸含量の対応する化学的にリン酸化されたデンプンのゲルと比較して、および／または対応する遺伝的に修飾されていない植物体のデンプンのゲルと比較して、高いゲル強度を示すゲルを形成することを特徴とする。
【０１３１】
本発明の他の好ましい態様では、本発明のデンプンは、リン酸基の大部分がデンプンのアミロペクチン成分に結合されており、アミロースは、共有結合で結合されたデンプンのモノリン酸エステルを極めて少量しか有さないことを特徴とする場合がある。Ｃ６リン酸含量が同等の化学的にリン酸化されたデンプンと比較して、本発明の植物細胞の本発明のデンプンは、本発明のデンプンのアミロースがアミロペクチン成分ほど強くリン酸化されていない点において区別される。
【０１３２】
本発明の他の態様では、本発明のデンプンは、化学的にリン酸化されたデンプンのアミロース成分と比較して、アミロース成分に含まれる総リン酸含量が低いこと、好ましくは、グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が同じであることを特徴とする場合がある。
【０１３３】
総リン酸含量を決定する方法は当業者に周知であり、後述する（方法参照）。
【０１３４】
本発明の他の態様では、本発明のデンプンは、デンプンのアミロース成分の３１Ｐ ＮＭＲ （ＫａｓｅｍｓｕｗａｎおよびＪａｎｅ （Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７３ （６）、（１９９６）、７０２〜７０７）で検出可能な総リン酸含量が、対応する遺伝的に修飾されていない植物体のデンプンから作られる、グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が同じ化学的にリン酸化されたデンプンのアミロース成分と比較して、少なくとも５％、好ましくは少なくとも２０％、特に少なくとも５０％、まと最も好ましくは少なくとも８０％低いことを特徴とする場合がある。
【０１３５】
本発明の一つの好ましい態様では、本発明のデンプンは、化学的にリン酸化されたデンプンと比較して、修飾されたリン酸化パターンを示すことを特徴とする場合がある。
【０１３６】
「リン酸化パターンの修飾」という用語は、本発明の植物細胞に関連して既に定義した。
【０１３７】
本発明の一つの好ましい態様では、デンプンは、ライムギ、オオムギ、オーツムギ、コムギ、ミレット、イネ、トウモロコシのデンプンなどの有用な単子葉植物のデンプンである。コムギ、イネ、およびトウモロコシのデンプンが好ましく；コムギデンプンが特に好ましい。
【０１３８】
本発明はさらに、上述の植物体および植物細胞から、および／または、このような植物体のデンプン貯蔵部分から、および／または本発明の増殖材料からデンプンを抽出する段階を含む、本発明のデンプンを作製する方法に関する。このような方法は、好ましくは、栽培された植物体、および／または同植物体のデンプン貯蔵部分を回収してからデンプンを抽出する段階も含み、また最も好ましくは、本発明の植物体、および／または本発明の増殖材料を栽培してから収穫する段階をさらに含む。植物体、または植物体のデンプン貯蔵部分からデンプンを抽出する段階は当業者に周知である。さまざまなデンプン貯蔵性植物からデンプンを抽出する方法は例えば、「Ｓｔａｒｃｈ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｗｈｉｓｔｌｅｒ、ＢｅＭｉｌｌｅｒおよびＰａｓｃｈａｌｌ編、（１９９４）、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ． Ｌｏｎｄｏｎ Ｌｔｄ；ＩＳＢＮ ０−１２−７４６２７０−８；第ＸＩＩ章の４１２〜４６８参照：トウモロコシおよびソルガムのデンプン：生産；Ｗａｔｓｏｎ；第ＸＩＩＩ章の４６９〜４７９：タピオカ、クズウコン、およびサゴのデンプン：生産；ＣｏｒｂｉｓｈｌｅｙおよびＭｉｌｌｅｒ；第ＸＩＶ章の４７９〜４９０：ジャガイモのデンプン：生産および使用；Ｍｉｌｃｈ；第ＸＶ章の４９１〜５０６：コムギのデンプン：生産、修飾、および使用；ＫｎｉｇｈｔおよびＯｓｏｎ；ならびに第ＸＶＩ章の５０７〜５２８：イネのデンプン：生産および使用；ＲｏｈｍｅｒおよびＫｌｅｍ；ならびにＭａｉｚｅ ｓｔａｒｃｈｅｓ：Ｅｃｋｈｏｆｆら、Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍ． ７３ （１９９６） ５４〜５７参照）に記載されている。トウモロコシデンプンの工業スケールにおける抽出は一般に、いわゆる「湿式粉砕」により行われている。植物材料からデンプンを抽出する方法に一般に使用されている装置には、ミル、セパレーター、デカンター、ハイドロサイクロン、スプレー乾燥機、および流動層乾燥機などがある。
【０１３９】
本発明は、上述の本発明の方法で得られる本発明のデンプンにも関する。
【０１４０】
本発明のデンプンは次に、当業者に周知の方法で修飾することが可能であり、未修飾状態および修飾状態のデンプンは、食品産業部門または非食品産業部門におけるさまざまな使用に適している。
【０１４１】
したがって本発明は、後に化学的に修飾、および／または物理的に修飾された、本発明で定義されるデンプンにも関する。
【０１４２】
化学的および／または物理的な修飾に使用可能なさまざまな選択肢については詳しく後述する。
【０１４３】
植物体を対象とした遺伝子工学的操作による修飾型デンプンの作製では第一に、植物体から得られるデンプンの性質を修飾することが可能であり、化学的方法または物理的方法によるさらなる修飾は必要でないように思われる。第二に、遺伝子工学的な方法で修飾されたデンプンを対象に、さらに化学的修飾および／または物理的修飾を行うことが可能であり、結果的に、上述した使用のいくつかの領域における質に関連して付加的な改善が得られる。このような化学的修飾および物理的修飾は基本的に既知である。特にこのような修飾は、以下の方法による修飾を含む：
−加熱処理、
−酸処理、
−デンプンエーテル、デンプンのアルキルエーテル、Ｏ−アリルエーテル、ヒドロキシアルキルエーテル、Ｏ−カルボキシメチルエーテル、Ｎ含有デンプンエーテル、Ｐ含有デンプンエーテル、Ｓ含有デンプンエーテルの生産、
−架橋デンプンの生産、
−デンプンのグラフトポリマーの生産
−酸化、および
−デンプンのリン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、キサントゲン酸塩、酢酸塩、およびクエン酸塩の生産目的で使用されるエステル化操作。エステル化には他の有機酸も使用可能である。
【０１４４】
他の態様では、本発明は、工業分野、好ましくは食品材料を生産するための、本発明のデンプンの使用に関する。
【０１４５】
他の態様では、本発明は、本発明のデンプンを含む小麦粉に関する。他の性質のなかでは、本発明の小麦粉は、従来の小麦粉と比較して、修飾されたベーキング特性により区別される。コムギの種子から小麦粉を生産する方法は当業者に周知である。そのような方法により、本発明の小麦粉は、本発明の植物細胞および植物体から、また本発明の増殖材料から単離することができる。
【０１４６】
したがって本発明は、本発明の植物細胞および植物体から、また本発明の増殖材料から得られる小麦粉にも関する。
【０１４７】
対応する遺伝的に修飾されていない野生型植物体に由来する小麦粉と比較して、本発明の小麦粉は、特に高い吸水能をもつ点で区別される。吸水能を決定する方法は当業者に周知であり、詳しく後述する（方法参照）。
【０１４８】
本発明の一つの好ましい態様では、小麦粉は、対応する遺伝的に修飾されていないコムギ植物体に由来する小麦粉と比較して、少なくとも５％、特に少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％、また最も好ましくは少なくとも２５％高い吸水能を示す。
【０１４９】
吸水能が高いため、本発明の小麦粉は、パン生地の準備段階において水をそれほど多く含まないパン生地を小麦粉に提供しなければならない工業生産上の利点がある。
【０１５０】
他の態様では、本発明は、ベーキングミクスチャーを生産する目的、および／または食品を生産する目的における本発明の小麦粉の使用、および／または本発明のデンプンの使用に関する。
【０１５１】
他の態様では、本発明は、包装材料を被覆する目的における本発明の小麦粉の使用、および／または本発明のデンプンの使用に関する。
【０１５２】
特に好ましい態様では、本発明は、本発明の小麦粉、および／または本発明のデンプンを含むベーキングミクスチャーに関する。これに関連して、「ベーキングミクスチャー」という用語は、パン生地（例えばイースト生地、パスタ生地、タルト生地、サワードウなど）、および／またはパン製品（例えばパン、ケーキ、ロールパン、クロワッサンなど）の生産に使用可能な任意の混合物を意味すると理解される。
【０１５３】
他の特に好ましい態様では、本発明は、本発明の小麦粉、および／または本発明のベーキングミクスチャー、および／または本発明のデンプンを用いて生産される食品、好ましくはパン製品、およびパン生地製品（例えばパスタ）に関する。
【０１５４】
対応する遺伝的に修飾されていない野生型のコムギ植物体に由来する小麦粉から作られるパン製品と比較して、本発明のパン製品および／または食品は、保存時にパン製品が受ける老化過程を遅らせる点で区別される。
【０１５５】
パン製品の老化過程は、デンプンのアミロペクチン成分の老化（再結晶）の程度に密接に関連している。パン製品および／または食品の老化過程は、アミロペクチン成分の老化の程度が高くなると、さらに進行すると推定されている。ＤＳＣで決定することができるアミロペクチンの融合エンタルピーは、アミロペクチンの老化の程度に関する情報となる。したがって、パン製品の老化は、ＤＳＣ（＝差分走査熱量測定）解析（方法参照）による任意の時点におけるアミロペクチンの融合エンタルピーの決定により決定することができる。
【０１５６】
本発明のパン製品、および／または食品のアミロペクチンの融合エンタルピーが、保存の例えば３日後、および／または７日後、および／または１３日後に決定される場合、同じ期間保存され、対応する遺伝的に修飾されていない野生型植物体の小麦粉の元となる、パン製品および／または食品のアミロペクチンの融合エンタルピーと比較して、アミロペクチンの融合エンタルピーが低下していることがわかる。これは、本発明のパン製品および食品が、従来製品と比較して緩やかな老化過程により区別されることを意味する。
【０１５７】
方法：
デンプンのグルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量（＝Ｃ６ Ｐ含量）の決定（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０５、（１９９４）、１１１〜１１７）：
デンプンのＣ６ Ｐ 含量を決定するために、５０ ｍｇのデンプンを、５００ μｌの０．７ Ｍ ＨＣｌ中で９５℃で４時間かけて加水分解した。このバッチを次に１５，５００ｇで１０分間遠心して上清を分離した。７ μｌの上清を、１９３ μｌのイミダゾール緩衝液（１００ ｍＭ イミダゾール、ｐＨ ７．４；５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．４ ｍＭ ＮＡＤ）と混合した。測定はフォトメーターを用いて３４０ ｎｍで行った。基礎吸収を決定した後に、２ Ｕのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手）を添加して酵素反応を開始させた。吸収の変化は、デンプンのＣ−６ Ｐ含量の濃度に正比例していた。
【０１５８】
デンプンの総リン酸含量の決定：
デンプンの総リン酸含量を決定する前に、デンプンは、リン脂質などのリン酸化された非グルカンと完全に分離する必要があった。総リン酸含量の決定は、以下に述べるエームズ（Ａｍｅｓ）（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ＶＩＩＩ、（１９６６）、１１５〜１１８）の方法で行った：約５０ ｍｇのデンプンを、３０ μｌの１０％ 硝酸マグネシウムエタノール溶液で処理し、マッフル炉内で３時間加熱した。残渣を５００ μｌの０．５ Ｍ 塩酸で処理し、６０℃で３０分間インキュベートした。次に、２０μｌのアリコートを０．５Ｍ 塩酸で３００μｌにメスアップし、１００μｌの１０％アスコルビン酸、および６００μｌの０．４２％モリブデン酸アンモニウム（溶媒：１Ｍ 硫酸）の混合物に添加し、４５℃で２０分間インキュベートした。次に、標準としてリン酸較正段階を用いて、吸光光度法により８２０ ｎｍで測定した。
【０１５９】
ゲル強度の決定（テクスチャーアナライザー）：
２．５ｇのデンプン（ＴＳ）を、ＲＶＡ装置内で２５ｍｌのＨ２Ｏ中で膠着させ（Ｒａｐｉｄ Ｖｉｓｃｏ Ａｎａｌｙｚｅｒ （ＲＶＡ）による粘性特性の決定を参照）、続いて室温で２４時間保存した。この試料を、Ｓｔａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ （Ｓｕｒｒｅｙ、英国）から入手したＴＡ−ＸＴ２テクスチャーアナライザーのセンサー（表面が平らな円筒型プランジャー）の下に固定し、ゲル強度を以下の装置設定を用いて決定した：
−試験速度　０．５ ｍｍ／秒
−浸透深度　７ ｍｍ
−接触面積　１１３ ｍｍ２
−圧力　２ｇ
【０１６０】
ラピッドビスコアナライザー（Ｒａｐｉｄ Ｖｉｓｃｏ Ａｎａｌｙｚｅｒ；ＲＶＡ）による粘性特性（例えば最終粘性）の決定：
２．５ｇ（乾燥重量）のデンプンを２５ｍｌのＨ２Ｏに溶解し、ラピッドビスコアナライザー（Ｎｅｗｐｏｒｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｔｙ Ｌｔｄ．、Ｉｎｖｅｓｔｍｅｎｔ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｇｒｏｕｐ、Ｗａｒｒｉｅｗｏｄ ＮＳＷ ２１０２、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）による解析に使用した。同装置の操作は、製造業者の指示書にしたがった。デンプン水溶液の粘性を決定するために、デンプン懸濁液を最初に１分間５０℃に加熱したのちに、５０℃から９５℃に１２℃／分の速度で加熱した。次に同温度を９５℃で２．５分間維持した。その後、同溶液を９５℃から５０℃へ、１２℃／分の速度で冷却した。最後に同温度を５０℃で６分間維持した。粘性は、試験時間全体を対象に決定した。
【０１６１】
水性リーチングによるデンプンのアミロース成分の単離：
水性リーチングにより、アミロースがデンプンから得られることが知られている（ＲｏｇｅｒおよびＣｏｌｏｎｎａ （Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １９、（１９９６）、５１〜６１）。
【０１６２】
デンプンのアミロース成分を単離するために、２５ ｍｌの水性デンプン懸濁液（１０％ ｗ／ｖ）を調製し、以下のプロファイルで攪拌しながらＲＶＡ（Ｎｅｗｐｏｒｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で加熱した：
2004512048.tif 000003
【０１６３】
懸濁液または溶液の粘性が２００ ｃＰを越えた直後にプログラムを終了し、デンプンの懸濁液または溶液を、冷却した５０ｍｌ反応容器に移し、２５ｍｌの冷水と混合し、１０分間氷浴中でほぼ室温（ＲＴ）になるまで冷却した。次に、溶解しなかったグルカンのペレットを遠心（２０分、２３００ｇ、室温）して形成させ、清澄な上清を１０ｍｇ ＮａＣｌ／ｍｌで処理した。溶解したグルカンを次に氷上で８０％エタノールから沈殿させ、エタノールで再洗浄し、３７℃で３日間かけて乾燥した。次にこのペレットをすりつぶし（１５秒、３０Ｈｚ、Ｒｅｔｓｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手した振動ミル中でタングステンカーバイドボールを使用）、２５ｍｇのペレットを５００μｌの０．７Ｍ ＨＣｌに懸濁して、９５℃で４時間かけて加水分解を行った。不溶性粒子を次に遠心して除き、グルコース−６Ｐ含量を、酵素を用いて決定した（「グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量の決定」を参照）。
【０１６４】
コムギを対象とした小規模吸水試験の手順：
材料
スクリューキャップ付きのエッペンドルフカップ（２ｍｌ；Ｓａｒｓｔｅｄ）
エッペンドルフ遠心機（Ｓｉｇｍａ ２０２）
ボルテックス（Ｗｉｌｔｅｎ）
化学天秤（Ｍｅｔｔｌｅｒ）
方法
エッペンドルフカップの重量を化学天秤で小数点以下４桁まで測定する。
カップに１００〜１１０ｍｇのコムギを満たし、正確な重量を記載する。
コムギを詰めたカップをボルテックスミキサーで攪拌し、攪拌しながら１．０ｍｌの水を加える。
１０秒間攪拌を続ける。
０．９ｍｌの水を加え、カップをスクリューキャップで閉じる。
１０分間静置する。
カップを遠心機内の６＊１０ローター（スイング型）に据える。
１０，０００ ｒｐｍで３０分間遠心を行う（約８，６００＊ｇ）。
カップから水を除く。
カップの内側の水分を濾紙を用いて除く（水分を含んだ残渣がはがれないように注意する）。
水分を含んだコムギを含むエッペンドルフカップの重量を化学天秤で小数点以下４桁まで測定する。
吸収された水の重量を計算する。
個々のコムギの吸水量を１０回決定して平均値を得る。
【０１６５】
差分走査熱量測定：｛ｔｃ「差分走査熱量測定」＼１２｝
差分走査熱量測定（ＤＳＣ）は、ブレッドクラムに関して熱の熱転移を調べる手法である。
【０１６６】
この手法を用いることで、試料への熱流が連続的な（比較的低い）加熱速度で決定される。ピーク（ベースラインとの差（吸熱））またはベースラインにおける段階（ガラス転移）のいずれかにより転移が決定される。
【０１６７】
ベースラインにピーク面積を組み入れることで転移のエンタルピーが得られる。ブレッドクラムについては、アミロペクチンの融解熱として４０〜７０℃（ピークは６０℃）、またアミロース−脂質の複合体の融解（ｄｅｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ）として約１２０℃が一般に観察されている。
【０１６８】
さまざまなコムギ試料間にみられるアミロペクチンの融解熱に差があることは、老化挙動に差があることを意味し、ひいてはパンが傷むことを意味する。アミロペクチン結晶の融合のエンタルピーは、パンを焼いた後の保存期間が長くなるほど大きくなる。保存中における融合のエンタルピーの上昇は、時間の経過とともに再結晶したアミロペクチン量の増加の尺度の一つである。含水量の差を補正するために、同エンタルピー（ｊ／ｇ）は、乾燥重量ベースで計算した。
【０１６９】
ＤＳＣ測定は、熱量計（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｔｙｐｅ ２９２０）にＬＮＣＡ冷却装置を接続して行った。この冷却装置は、実験後の急速冷却用に液体窒素を用いる。
【０１７０】
試料（４０〜５０ｍｇのブレッドクラム）をＤＳＣパン上に据え、手の爪を使って押しつぶした。ＤＳＣパンを圧縮装置で密封した後に試料をＤＳＣ装置内に据えた。
【０１７１】
試料（４０〜５０ｍｇのブレッドクラム）を、ステンレス鋼製の密封状態のパン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）内で２０℃から１６０℃に７．５℃／分の速度で加熱した。１００ ｍｇのアルミニウムを充填した中程度の圧力パン（容量１２０ μｌ）を参照用に使用した。
【０１７２】
ミニローフのクラムのエンタルピーを、保存開始から１日後、３日後、７日後、および１４日後に１回測定した。
【０１７３】
以下の実施例は本発明を説明するためのものであって、何ら制限する意図はない。
【０１７４】
実施例１
コムギ植物体の形質転換用ベクターｐＵｂｉＲ１の作製
ベクターｐＵｂｉＲ１を作製するために、最初にベクターｐＵｂｉ．ｃａｓを以下の手順で作製した：ベクターｐＵｂｉ２ａｆｐ（図２参照）を、制限酵素ＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩで部分切断した。結果として得られた４．１９ Ｋｂの断片（ｐＵＣ１９ベクター（Ｙａｎｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、１９８５、Ｇｅｎｅ ３３：１０３〜１１９）、１．５ Ｋｂのユビキチンプロモーター、ならびにｕｂｉ遺伝子の第一エキソン、および短縮型のユビキチン１イントロン（ＣｌａＩ欠損）（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １８、（１９９２）、６７５〜６８９）を含む）をゲルから溶出して使用した。
【０１７５】
ｎｏｓターミネーターをＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ断片として、ベクターｐＡｃｔ．ｃａｓ （Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｕｍｂｅｒ Ｃａｍｂｉａ ＴＧ００６３、Ｃａｍｂｉａ、ＧＰＯ Ｂｏｘ ３２００、Ｃａｎｂｅｒｒａ ＡＣＴ ２６０１、Ａｕｓｔｒａｌｉａから入手）から単離し、２つの断片を連結させてベクターｐＵｂｉ．ｃａｓを得た。
【０１７６】
次に、ジャガイモのＲ１遺伝子（配列番号：１）のｃＤＮＡを、部分切断断片（ＳｍａＩ／Ａｓｐ７１８断片）としてベクターｐＲＬ２（国際公開公報第９７／１１１８８号、実施例４、Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓにＤＳＭ番号１０２２５として登録）から単離し、ベクターｐＵｂｉ．ｃａｓ （ＳｍａＩ／Ａｓｐ７１８で切断）に組み込んだ。結果として得られたコンストラクトをｐＵｂｉＲｑと命名した（図３参照）。このコンストラクトは、ジャガイモのＲ１ ｃＤＮＡのコード領域を、ユビキチンプロモーター（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、１９９２、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １８：６７５〜６８９）の制御下に含むほか、付加的な調節単位としてｕｂｉ遺伝子（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １８、（１９９２）、６７５〜６８９）の第一エキソン、および短縮型の第１イントロン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １８、（１９９２）、６７５〜６８９）（内部のＣｌａＩ断片が欠損したもの）も含む。
【０１７７】
実施例２
ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）のＲ１遺伝子を発現するコムギ植物体の作製、および同植物体のデンプンのリン酸含量の解析
コムギの形質転換には微粒子銃による形質転換法を用いた（Ｂｅｃｋｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｊ． ５ （２）、（１９９４）、２２９〜３０７）。ベクターｐＵｂｉＲ１、および微粒子銃による同時形質転換用にはベクターｐ３５ＳＡｃＳ（図４参照）、またはベクターｐＡｃｔ１−Ｆｎｅｏ／Ｃａｌｇｕｓ （Ｍｕｌｌｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１４、（１９９６）、７１〜８２、図５参照）をＤＮＡ粒子沈殿バッチ中で同一のモル比で使用した。ベクターｐ３５ＳＡｃＳは以下の手順で作製した：土壌細菌の１種（Ｓ． ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）のｐａｔ遺伝子（Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎら、Ｇｅｎｅ ７０、（１９８８）、２５〜３７）をポリメラーゼ連鎖反応で増幅した。使用したプライマーは、ＢａｍＨＩ切断部位が増幅産物の両側に生じるように設計した。次にＢａｍＨＩ断片をベクターｐＤＨ５１ （Ｐｉｅｔｚｒａｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １４、（１９８６）、５８５７〜５８６８）の３５Ｓプロモーターと３５Ｓターミネーターの間にあるＢａｍＨＩ切断部位にクローン化した。３５Ｓプロモーター、ｐａｔ遺伝子、および３５Ｓターミネーターを含むカセットをＥｃｏＲＩ断片として切り出し、ベクターｐＵＣ１８ （Ｐｉｅｔｚｒａｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １４、（１９８６）、５８５７〜５８６８）のＥｃｏＲＩ切断部位にクローン化した。
【０１７８】
１４日齢のコムギ植物体の未熟胚である胚盤を形質転換の標的細胞として使用した。形質転換後に、２ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ （＝２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）を含むＭＳ−培地（ＰＣＴ／ＥＰ９７／０２７９３）でインビトロ培養を行った。形質転換の２週間後に継代培養を同じ培地で行った。同培地には、２ｍｇ／ｌ ホスフィノトリシン、または１５０ｍｇ／ｌ 硫酸カナマイシンを事前に添加しておいた。さらに２週間後に、発生中のカルスを再生用培地（０．１ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、および２ｍｇ／ｌ ＰＰＴ、または１５０ｍｇ／ｌ カナマイシンを含むＭＳ−培地）に移した。発生中のシュートを、２，４−Ｄ、およびホスフィノトリシンまたはカナマイシンを含まない半濃縮状態のＭＳ−培地に移した後に、土壌に移植した。土壌に移植してから約１４日後に、それぞれ１５０ｍｇ／ｌおよび２００ｍｇ／ｌのホスフィノトリシン、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０ （ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ、ポリソルベート２０に対応）を含む水溶液を２回噴霧するか、２．５％ 硫酸カナマイシン、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を２回噴霧するかしてトランスジェニック植物体を同定した。
【０１７９】
Ｔ０植物体におけるジャガイモのＲ１遺伝子の発現
トランスジェニックコムギのＴ０植物体におけるジャガイモのＲ１遺伝子の発現は、ノーザンブロッティング解析およびウェスタンブロッティング解析により、また穎花のデンプンのグルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量の酵素学的測定によって検出した（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０５、（１９９４）、１１１〜１１７）。Ｒ１タンパク質は、抗ジャガイモＲ１タンパク質抗体（Ｒｉｔｔｅら、Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２１（４）、（２０００）、３８７〜３９１）を用いてトランスジェニックコムギ植物体で検出した。約２０日齢の未成熟の穎花の胚乳に由来するタンパク質抽出物を対象に、トランスジェニック植物体のスクリーニングを行った。
【０１８０】
トランスジェニックＴ０植物体のデンプンを未成熟のコムギ穎花および成熟したコムギ穎花から単離して、Ｃ６リン酸量を決定した。穎花は、乳鉢で摩砕して粉末状にした。１５ｍｌの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ ８．０を添加後、懸濁液を１００μｍのフィルターで濾過し、遠心（２６００ｇ、５分、４℃）してデンプンをペレットとして得た。上清は廃棄した。次に、このデンプンのペレットを、２ｍｌの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ ８．０に再懸濁し、８ｍｌのパーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）勾配に移した。デンプンを、１７０ｇで４℃で１５分間遠心してペレットとして得た。次に、このデンプンのペレットを、１０ｍｌの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ ８．０で３回洗浄した。最後に、このデンプンをアセトンとインキュベートして脱脂し、乾燥した。
【０１８１】
Ｃ６ Ｐ含量は、光学的−酵素学的試験（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０５、（１９９４）、１１１〜１１７）によるグルコース−６−リン酸を測定することにより上述の手順で決定した。
【０１８２】
この試験の結果、サザンブロッティング解析で陽性結果を示すコムギのＴ０植物体のうち約５０％の系列では、穎花で、対応する遺伝的に修飾されていないフロリダ種の野生型植物体のデンプンと比較して、グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が高くなったデンプンが合成されることがわかった。選択した一部の系列のデータを表１に示す。
【０１８３】
天然の子孫の解析
Ｒ１を発現する親系列から天然に得られた種子を蒔き、分離比を決定した。Ｒ１遺伝子の組込みと、さらには発現の両方を、さまざまな系列のＴ１子孫を対象に、サザンブロッティング解析およびノーザンブロッティング解析で検出することができた。これらの系列の、デンプンのＣ６位におけるリン酸含量を決定した。数種の選択された系列のデータを表１に示す。
【表１】
2004512048.tif 000004
【０１８４】
実施例３
ジャガイモのＲ１遺伝子を発現するトランスジェニックコムギ植物体のデンプンを対象としたＲＶＡ解析、およびゲル強度の調査
実施例１および２に記載されたコムギ植物体のデンプンを対象にＲＶＡ解析を行った。
【０１８５】
ＲＶＡ解析の結果（実験法参照）、ジャガイモのＲ１遺伝子を発現するトランスジェニックコムギ植物体のデンプンの粘性挙動が、対応する遺伝的に修飾されていない野生型のコムギ植物体（フロリダ種）のデンプンと比較して大きく修飾されていたことがわかる（表２参照）。
【０１８６】
【表２】
2004512048.tif 000005
【０１８７】
レジェンド：
ＲＶＡ＝ラピッドビスコアナライザー（Ｒａｐｉｄ Ｖｉｓｃｏ Ａｎａｌｙｚｅｒ）
Ｍａｘ＝図１参照
Ｍｉｎ＝図１参照
Ｆｉｎ＝最終粘性、図１参照
Ｓｅｔ＝Ｓｅｔｂａｃｋ＝最小値と最終値の差、図１参照
Ｔ＝膠着温度、図１参照
パーセンテージは、野生型（＝１００％）に対する値
【０１８８】
ジャガイモのＲ１遺伝子を発現するトランスジェニックコムギ植物体のデンプンのゲル強度（ゲル強度の決定：方法参照）は、対応する遺伝的に修飾されていない野生型コムギ植物体（フロリダ種）のデンプンと、後に化学的にリン酸化された野生型のデンプン（フロリダ種）の両方と異なっていた（表３参照）。
【０１８９】
グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が同等である化学的にリン酸化されたデンプンとは対照的に、膠着後における、本発明のデンプンのゲルは、野生型植物体のデンプンのゲルと比較して高いゲル強度を示した。この結果とは対照的に、リム（Ｌｉｍ）による方法で作製された化学的にリン酸化されたデンプンは、野生型植物体のデンプンのゲルと同等であった。
【０１９０】
【表３】
2004512048.tif 000006
ＴＡ＝テクスチャーアナライザー
パーセンテージは、野生型（＝１００％）に対する値
【０１９１】
実施例４
ジャガイモのＲ１遺伝子を発現するトランスジェニックコムギ植物体のデンプンを対象としたＤＳＣ解析
実施例１および２に記載されたコムギ植物体のデンプンを対象にＤＳＣ解析を実施した。
【０１９２】
ピーク温度は、大容量のカプセルを用いて、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから入手した装置（装置番号：ＤＳＣ−７）で決定した（調査対象のカプセルは、デンプンと総含水量を約１：４の比で含み、測定は、１０〜１６０℃の温度範囲を対象に１０℃／分の加熱速度で行った）
【０１９３】
ＤＳＣ解析の結果（表４）から、ジャガイモのＲ１遺伝子を発現するトランスジェニックコムギ植物体のデンプンのピーク温度が、対応する遺伝的に修飾されていない野生型コムギ植物体（フロリダ種）のデンプンと比較して、また後に化学的にリン酸化されたグルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量が同等のデンプンとも比較して、低いピーク温度Ｔｐを示すことわかる。
【０１９４】
【表４】
2004512048.tif 000007
＊化学的にリン酸化されたデンプンであるＳＴＭＰ２の、Ｃ６位におけるリン酸含量は３．０μｍｏｌ リン酸／ｇ デンプンであった。他のすべてのリン酸に関するデータは表３に示す。
【０１９５】
実施例５
さまざまなデンプンのアミロース成分のＣ６ Ｐ含量の決定
ジャガイモのＲ１遺伝子を発現するトランスジェニックコムギ植物体のデンプンのほかに、２種の化学的にリン酸化されたデンプン（ＳＴＭＰ３およびＳＴＰＰ４）を調べた。化学的リン酸化は、リム（Ｌｉｍ）およびセイブ（Ｓｅｉｂ）（Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍ． ７０ （２）、（１９９３）、１３７〜１４４）に記載された方法で行った（ＳＴＭＰ３は、デンプンをｐＨ ６で２時間かけて反応させて作製し、ＳＴＰＰ４は、ｐＨ ８で３０分間かけて反応させて作製した）。ＳＴＭＰという省略形は、「選択リン酸化試薬（ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ）すなわちトリメタリン酸ナトリウム」を表し、ＳＴＰＰは、トリポリリン酸ナトリウムを表す。
【０１９６】
さまざまなデンプンのアミロース成分は、上述の手順（水性リーチングによるデンプンのアミロース成分の単離）で単離した。Ｃ６位におけるリン酸含量は、上述の手順（グルコース単量体のＣ６位におけるリン酸含量の決定）で決定した。
【０１９７】
【表５】
2004512048.tif 000008
化学的にリン酸化されたデンプンのＣ６ Ｐ含量に対するアミロースのＣ６ Ｐ含量の比は、ジャガイモのＲ１遺伝子を過剰に発現するトランスジェニックコムギ植物体のデンプンよりかなり大きいと考えられる。化学的にリン酸化されたデンプンは、リン酸化されたアミロースの量が、トランスジェニックコムギ植物体のデンプンと比べて多い。
【０１９８】
実施例６
さまざまな起源をもつ小麦粉から作製されたマイクロローフのブレッドクラムを対象としたＤＳＣ解析
コムギの野生型植物体（フロリダ種）に由来する小麦粉、およびジャガイモのＲ１遺伝子を過剰に発現する遺伝的に修飾されたコムギ植物体に由来する小麦粉を用いて、以下の手順でマイクロローフを作製した：
小麦粉　　　　 １０．００ ｇ
酵母　　　　　　０．２５ ｇ
塩　　　　　　　０．２０ ｇ
デキストロース　０．１０ ｇ
アスコルビン酸　２０ ｐｐｍ
水　吸水試験で決定され、硬度について補正された水量（方法の「小麦粉を対象とした小規模吸水試験の手順」を参照）
【０１９９】
遺伝的に修飾されたコムギ植物体のパン生地は、混合過程中に非常に粘性が高くなった。適切な取り扱い特性をもつパン生地を得るために少量の水を使用した。パン生地の硬度は、パン生地の堅さの技術的な知覚によって補正した。
【０２００】
パン生地は、プルーフィングキャビネット内で４５分間（２８℃）保つことで酵母のはたらきを調べ、次に手を使って１５分間（２８℃）かけて酵母のはたらきを調べ、型を整えてスズ製のパン型に入れた。次にパン生地を対象に、６０分間（２８℃）かけて最終的に酵母のはたらきを調べた。このローフを、湿らせた木枠にパン型を埋込んだオーブンで１５分間（２００℃）かけて焼いた。このように埋込むことで、パン型が多量の放射熱から保護されるようにした。最後に、ローフを木枠なしで５分間かけて焼き、パン生地を膨らませた。
【０２０１】
差分走査熱量測定（ＤＳＣ）（方法参照）で、ブレッドクラムの熱転移を決定した。ローフのクラムのエンタルピーを、保存開始から１日後、３日後、７日、および１４日後に測定した（図６）。
【０２０２】
図６は、保存開始から１日後、３日後、７日、および１３日後における保存されたブレッドクラムにおけるアミロペクチンの融合のピーク（４０〜７０℃）のエンタルピーを示しており、対象が傷んでいることがわかる。野生型（フロリダ種）の小麦粉から作ったローフのブレッドクラムのエンタルピーは、ジャガイモのＲ１遺伝子を過剰に発現する遺伝的に修飾されたコムギ植物体の２種の異なる系列（ＧＭＯ１およびＧＭＯ２）の小麦粉から作った同齢のブレッドクラムより高い。これは、再結晶デンプンのレベルが低く、デンプンの老化が弱く、またパンがそれほど傷んでいないことを意味する。
【０２０３】
配列プロトコル：
2004512048.tif 000009
2004512048.tif 000010
2004512048.tif 000011
2004512048.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【図１】ＲＶＡプロファイルの略図である。
【図２】ベクターｐＵｂｉ２ａｆｐのプラスミドマップである。
【図３】ベクターｐＵｂｉＲ１のプラスミドマップである。
【図４】ベクターｐ３５ＳＡｃＳのプラスミドマップである（ｐＵＣ１８の誘導体（Ｐｉｅｔｒｚａｋ Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４、（１９８６）、５８５７〜５８６８）：ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの制御下に、ストレプトマイセス・ビリドクロモジェネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）に由来するｐａｔ遺伝子を含む（Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎら、Ｇｅｎｅ ７０、（１９８８）、２５〜３７）。
【図５】ベクターｐＡｃｔ１−Ｆｎｅｏ／Ｃａｌｇｕｓのプラスミドマップである（ｐＵＣ１９誘導体（Ｙａｎｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、１９８５、Ｇｅｎｅ ３３：１０３〜１１９）：ｐＡｃｔ１−Ｆｎｅｏ（Ｍｕｌｌｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１４、（１９９６）、７１〜８２）、およびＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを含むｐＣａｌｇｕｓ（例えば米国特許Ａ−５，３５２，６０５号を参照）、トウモロコシのＡｄｈ１のイントロン（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １９８７ Ｄｅｃ；１ （１０）：１１８３〜２００）、ならびにベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子（植物遺伝子発現研究用ツールとしてのＧＵＳレポーターシステム（Ｔｈｅ ＧＵＳ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ ａｓ ａ Ｔｏｏｌ ｔｏ Ｓｔｕｄｙ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）：「ＧＵＳプロトコル：遺伝子発現のレポーターとしてＧＵＳ遺伝子を使用（ＧＵＳ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＧＵＳ Ｇｅｎｅ ａｓ ａ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｏｆ Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９９２）、２３〜４３）から作製）。
【図６】保存開始から１日後、３日後、７日後、および１３日後の間におけるブレッドクラムのエンタルピーを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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