(57)【要約】本発明は、単一チューブアッセイとして、抗ウイルス効果を有する阻害物質を検出するための複製アッセイであって、天然のウイルス分離株、浮遊標的細胞及び５容量％以下のウシ胎仔血清を含有する細胞培養培地からなるアッセイを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ウイルス効果を有する阻害物質を検出するための複製アッセイであって、天然のウイルス分離株、浮遊標的細胞及びウシ胎仔血清を含有する細胞培養培地を含み、該ウシ胎仔血清濃度が５容量％以下であることを特徴とするアッセイ。
【請求項２】
ウイルス分離株がＨＩＶ分離株である、請求項１記載のＨＩＶ阻害物質を検出するためのアッセイ。
【請求項３】
ウイルス分離株が天然のＨＩＶ分離株である、請求項１または２記載のＨＩＶ阻害物質を検出するためのアッセイ。
【請求項４】
ウイルス分離株がＨＩＶのＬＡＶ分離株である、請求項１〜３のいずれかに記載のＨＩＶ阻害物質を検出するためのアッセイ。
【請求項５】
ウシ胎仔血清濃度が２容量％以下であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項６】
１つまたはそれ以上の検出用色素をも含有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項７】
検出用色素としてａｌａｍａｒＢｌｕｅまたはフルオレスセイン・ジアセテートを含有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項８】
標的細胞としてＨ９Ｔリンパ球を含有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載のアッセイのＨＴＳにおける使用。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかに記載のアッセイを用いて検出されたウイルス複製阻害物の、感染症の予防および治療のための医薬の製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、抗ウイルス的に有効な阻害物質を検出（発見）するための複製アッセイに関し、天然のウイルス分離株（ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅ）、浮遊標的細胞（ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ）及び濃度５容量％以下のウシ胎仔血清を含有する細胞培養培地の組合わせからなる。
【０００２】
（背景技術）
ウイルス感染、特にＨＩＶ感染の治療における治療剤として使用しうる、新規でより活性であり、より認容される活性物質の探索は薬学研究における急務であり、それには、数十万の試験化合物に関する有効性の試験を必要とする。
【０００３】
この目的のために、通常、酵素検定法でウイルスに特異的な転写酵素又はプロテアーゼに対する作用を検討するか、またはインビトロモデルで、適当な標的細胞における天然の非−変更ウイルスおよびその挙動に対する試験物質の作用を検討している。
【０００４】
膨大な数の試験試料があることは、かなりロジスティカルな問題であり、その問題は試験工程の自動化によってのみ解決することができる。
酵素検定においては最先端技術にかかる「高速大量処理スクリーニング法（ＨＴＳ法）」を用いて大量の試料を試験する。この種のアッセイはＨＩＶ酵素の場合にも行われている。最近、ＨＴＳ法によりウイルス酵素インテグラーゼの検定（アッセイ）が行われた（Ｙｖｅｓ Ｐｏｍｍｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４７ （２０００） １３９−１４８； Ｈａｚｕｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１， ７００５−７０１１； Ｈａｚｕｄａ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｃｈｅｍ． Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． １０， ６３−７０）。
【０００５】
タンパク及び酵素に基づくアッセイは、例えば蛍光測定による光学的な方法のように、読み出し（リードアウト）として、正確で迅速に評価しうる方法が利用可能であることから、ＨＴＳによって行うのに特に適している。適当な変色指示薬を選択することで、良好なシグナル：ノイズ比を達成できる。しかしながら、原則的に、酵素分析は複製サイクルに関与する全ウイルス及び細胞系のごく小部分を含むにすぎないという不都合がある。
【０００６】
これに対して、細胞培養におけるウイルス複製の検討によれば、原則として、天然の条件下におけるウイルス増殖に関与する全段階（ステップ）を同時にチェックすることができる（複製アッセイ）。
【０００７】
従って、複製アッセイによれば、酵素検定法では原則として検出できない、未知の、ウイルスによりコードされている及び／または宿主に関連した工程（プロセス）をも検出することができる。
【０００８】
ＨＩＶに関しては、該工程は、例えば、感染すべき細胞への付着、進入、及びウイルス因子と細胞因子の相互作用にかかる、ウイルス特異的な制御メカニズムまたはプロセスの作用である。
【０００９】
インビトロで進行するそのようなウイルス関連ステップは、もしあったとして、複製アッセイで、適当な宿主細胞内で非常に複雑な反応付加物が複製（再生）され、ＨＩＶ複製プロセスで適切に機能することが追加されるだけである。
【００１０】
その上、複製アッセイでは同時に試験化合物の細胞毒性（選択的指数）に関す情報が得られるので、活性化合物の可能性を評価するための一次（最初の）手段となる。
このような状況のもと、複製アッセイは新規でより効果的かつより良く認容されるＨＩＶ阻害物質の検出に特に適している。
【００１１】
しかしながら、複製アッセイの終点、ウイルスに暴露された細胞の挙動の評価、をＨＴＳ法では未だ決定することができないという不都合な点がある。例えば、通常、ルシフェラーゼ遺伝子等の適当な指示システムを付与された、遺伝的に改変されたＨＩＶ変異体が用いられるが、そのようなリポーター遺伝子の挿入により改変されたＨＩＶ変異体は、変更されていない（非改変、ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ）ＨＩＶ株と同じ挙動を示さない。
【００１２】
非改変ＨＩＶの複製に基づいた、インビトロで用いられる現在の複製アッセイは、時間がかかり資源を消費する方法であり、大量の試験化合物の研究に求められる自動化ができず、従って、既知の、多くの物質ライブラリーのアッセイ方法には不適当である。
【００１３】
その理由は、就中、生きたＨＩＶのインビトロでの挙動である。ＨＩＶは様々な細胞、とりわけ免疫系の細胞、例えばＨ９Ｔリンパ球、に対して特徴的な細胞病理学的（細胞変性）効果を及ぼし、光学顕微鏡下で合胞体形成、ウイルスが誘発する大きい細胞集合（アグリゲート）、を誘発する。現在の方法では、通例、合胞体形成が一般にＨＩＶウイルスの培養細胞への細胞病理学的作用の評価における終点となっており、特定の時間経過後の顕微鏡観察が必須である。このようなウイルス増殖または阻害の決定法は主観的であり、非常に時間がかかる方法である。従って、工業規模での大量の試験には、光学顕微鏡による終点の分析は不適当である。
【００１４】
直接的な顕微鏡分析以外の、細胞培養物におけるＨＩＶ−特異的変化を評価する既知の方法は「二次アッセイ（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｓｓａｙ）」と呼ばれる方法であり、該方法は細胞培養上清の、ウイルスに特異的なタンパクの測定（例、ＥＬＩＳＡ法で）、酵素活性の測定（例、ＨＩＶ逆転写酵素）またはウイルス性核酸の測定（例、ＰＣＲ）等を含む。
しかしながら、これらの方法は全て、非常に資源を消費する方法であり、大量物質のライブラリーのアッセイには不適切である。
【００１５】
（発明の開示）
従って、本発明の目的は高速大量処理スクリーニング法（ＨＴＳ法）に適した、天然ＨＩＶと浮遊宿主細胞（例えば永久細胞株内で維持されたにヒトＴリンパ球）を用い、良好なシグナル対ノイズ比を有する光学的なリードアウトを用いる一次（基礎）アッセイとして実施しうる、複製アッセイを確立することである。
【００１６】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明において、適当な複製アッセイとは浮遊細胞を用いる、さらなる仕上げ処置（ｗｏｒｋ ｕｐ ｓｔｅｐ）を必要としない単一チューブ（ｓｉｎｇｌｅ ｔｕｂｅ）アッセイを意味する。
【００１７】
本発明の範囲内で、驚くべきことに、、従来、先行文献で用いられているよりも実質上低い濃度の血清の存在下でさえ、ＨＩＶ、特にＨＩＶのＬＡＶ分離株が増殖することが見出された。従来、ＨＩＶ宿主細胞にとって一般的な増殖条件は、少なくとも２０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有する培養培地であった。
【００１８】
浮遊細胞でのウイルス複製系における細胞培養培地中の高濃度の血清は、蛍光または吸光度測定法に基づく光学的検出法にとって不適当であることから、上記は重要である。その理由は、ＦＣＳ中に妨害（干渉）性のタンパク、及びそれらに由来する酵素活性が存在することにある。従って、これまで光学的検出法の適用は、光学的なアッセイを妨害するタンパク（これらは培養上清中に存在する）をピペッティングで容易に除去することができる、接着細胞を用いる細胞培養系に限定されていた。
【００１９】
本研究により、極めて低濃度の血清でもＨＩＶ、特にＨＩＶのＬＡＶ分離株を増殖させるのに充分であることが示された。実際、驚くべきことに、例えばこれまで達成されなかった０．２〜２％という、ＦＣＳ中に含有される妨害性タンパクが光学的検出法をもはや妨害しない低濃度のＦＣＳ血清の存在下、浮遊細胞中でＨＩＶが増殖するということが分かった。
【００２０】
この観察に基づいて、本発明は、新規なＨＩＶ阻害物資を検出するための、迅速で費用効果のある、２００，０００以上、好ましくは５００，０００以上の試験化合物を含む大量物質ライブラリー、さらには１００万以上の試験化合物を含む大量物質ライブラリーの感染−関連試験のための（ＨＴＳ）スクリーニング法を提供する。該方法は、従来から文献既知であり、抗ＨＩＶ活性化合物の試験において従来は小規模でのみ使用可能であったインビトロＨＩＶ増殖の複製アッセイが、今や特殊なアッセイ条件の改変を行うことでＨＴＳとして実施可能であるとの事実に基づくものである。
【００２１】
さらに、本発明の範囲内で、本発明の低血清濃度条件下で、感染後、代謝プロセスを変化させて宿主細胞に支障をもたらし影響を及ぼすものであり、ウイルス−破壊工程の検出に使用しうるＨＩＶ分離株が存在することが見出された。
【００２２】
本発明に従って、低ＦＣＳ濃度で使用しうるＨＩＶ分離株の例として、ＨＩＶのＬＡＶ分離株が挙げられる。これはＨ９Ｔ−リンパ球細胞株を変化させ、呈色試薬を用いる光学アッセイにおける生物化学的工程の変化を介してウイルス感染を視覚化することができる。というのは、低濃度のＦＣＳ濃度存在下、Ｈ９細胞はＨＩＶのＬＡＶ分離株に感染すると、感染した細胞が、保護された細胞とウイルスで破壊された細胞とを呈色試薬を用いて識別できるような生理学的状態に変化するからである。
【００２３】
驚いたことに、これらの条件下、適当な呈色試薬は、例えば、ＸＴＴ，ＭＴＴ、ニュートラルレッド、及び特にａｌａｍａｒＢｌｕｅ （ａｌａｍａｒＢｌｕｅ ＴＭ、Ｌａｂｏｓｅｒｖ ＧｍｂＨ， Ｇｉｅｓｓｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ； ＵＳＰ ５５０１９５９）または蛍光色素（フルオレセイン・ジアセテート等）等である。
【００２４】
このタイプの検出における前提（必須）条件は、ある感染−関連ＨＩＶ株、例えばＬＡＶ分離株が、必須成長因子として、ごく少量のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）しか含有しない培養培地中の細胞内でも増殖するという驚くべき知見である。従来、これまで必須とみなされてきたかなり高濃度のＦＣＳは呈色試薬と干渉しその使用が除外されていたことから、この知見は本発明方法における必須の前提条件である。
【００２５】
本発明に係るＦＣＳ濃度で本発明の呈色試薬と関連してＬＡＶ分離株によって誘発される細胞病理学的及び細胞毒性作用を検出する本発明により、ＨＴＳを抗ＨＩＶ活性物質の検出のための複製アッセイとして実施することが可能となった。
【００２６】
さらに、驚いたことには、あるＨＩＶ分離株、特にＬＡＶ分離株は、さもなくば記載された方法では使用できなかった色素（染料）を用いて損傷の検出を可能にするように、インビトロで宿主細胞を特異的に損傷させるということも見出された。
【００２７】
また、本発明において使用できる色素は、ＨＴＳ法を用いて光学的な手法により、浮遊細胞中で測定できるａｌａｍａｒＢｌｕｅ、及び例えばフルオレセイン・ジアセテート等の蛍光性色素であることも見出された。
【００２８】
さらに、天然のＨＩＶ分離株、本発明の低濃度ＦＣＳ含有細胞培養培地、本発明の検出用色素、及び浮遊Ｈ９Ｔリンパ球からなる創意工夫に富む組合わせにより、３８４−ウエルプレートまたは１５３６−ウエルプレートで実施しうる、単一工程法のＨＴＳを構成しうるということも見出された。
【００２９】
さらにまた、天然のＨＩＶ分離株、本発明の低濃度ＦＣＳ含有細胞培養培地、本発明の検出用色素、及び浮遊Ｈ９Ｔリンパ球からなる創意工夫に富む組合わせにより、新規な抗ＨＩＶ活性物質の迅速かつ費用効果のある検出に使用しうる、単一工程法のＨＴＳを構成しうるということも見出された。
【００３０】
本発明の新規で活性な物質はＨＩウイルス複製に介入（干渉）し特異的にその複製を阻害する、低分子量の活性物質であることが好ましい。本発明に関して低分子量とは、分子量範囲が約１００〜５００または約１００〜１０００およびそれ以上であることを意味する。
【００３１】
しかしながら、適当な潜在的な阻害物質は、例えば、ライブラリー中で多数生産されうる抗体のような、高分子量の化合物でありうる。
【００３２】
さらに、このアッセイは日常の臨床ルーティンで患者から得られる大量の試験試料（例えば、患者の血清試料、血漿試料）をチェックするのに適する。そのような患者とは進行をコントロールするためにウイルス負荷量を決定するため、また治療の必要な時期を決定するため、ウイルス力価の測定が必要な患者である。同様に、臨床におけるルーチンでは、耐性の進行をチェックする必要の有る患者から多数の試験試料が得られる。
【００３３】
しかしながら、本発明の検定法（アッセイ）は、大きい物質ライブラリーのアッセイ、従って、抗ＨＩＶ作用を有する新規な物質群の検出に用いるのに好適である。
【００３４】
本発明のアッセイ法とは、特に、天然のウイルス、特にＨＩウイルス類に対して感受性である標的細胞、特にＨ９Ｔリンパ球のようなリンパ球を、マルチウエルプレート中で、ごく少量（例えば０．１〜５容量％、好ましくは１〜２容量％）の成長因子、例えばウシ胎仔血清、を含有する例えばＲＰＭＩ培地等の細胞培養培地中、該ウイルス及び試験化合物または参照化合物と一緒に、２０〜４０℃、好ましくは３０〜４０℃、最も好ましくは３５〜３８℃の温度範囲、ＣＯ２濃度２〜８％、好ましくは５％において、２〜２０日間、好ましくは５〜１０日間、特定の温度における飽和湿度の下で浮遊培養中で培養し、次いで、呈色試薬、好ましくはａｌａｍａｒＢｌｕｅまたはフルオレスセイン・ジアセテートをリードアウト（読み出し）用に添加し、再度混合物をインキュベートした後、ＨＴＳの方法で光学的に測定することを含むアッセイ法を意味する。
【００３５】
実施例
例としての詳細な方法は、各場合において、３×１０３のＨＩＶ−感染Ｈ９細胞を３８４−ウエルのマイクロタイタープレート中の、適当に希釈された試験物質または参照物資を含有する各ウエルに播種する。
【００３６】
本発明において「適当に希釈された」とは、試験化合物の濃度として、０．１〜５０μｍの間、好ましくは１〜２０μｍの使用を意味する。
【００３７】
次いで、試験プレートをインキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ２、飽和湿度の下で７日間インキュベートする。次いで、ウエル内容物の１／１０容量の検出用色素（ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）またはフルオレスセイン・ジアセテート（ＰＢＳ中２００μｇ／ｍｌ））を加えて、試験化合物の抗ウイルス作用または細胞適合性を決定する。これには、ａｌａｍａｒＢｌｕｅの場合、上記の条件下、さらに５〜７時間、２４時間までの間インキュベートすることにより行う。次いで、吸光度または発光を測定し、光度測定法により評価する。フルオレスセイン・ジアセテートの場合、蛍光の発光は２０〜６０分間インキュベーションした後、もう測定する。
【００３８】
これらのアッセイ条件下、対照細胞に関しては、１．９（吸光度単位）の光学密度が測定され、一方、対照ウイルスは、光学密度０．０２吸光度単位を有していた。この１：１００という驚異的に好都合なシグナル対ノイズ比は、目的のセットに従い、ＨＩＶを用いてＨＴＳアッセイを行う上で最適な必須（前提）条件である。
【００３９】
対照的に、当該技術におけるこれまでの通例である高ＦＣＳ濃度（ＦＣＳ２０容量％）を用いるＨＩＶ感染細胞培養では、対照細胞に関して１．５吸光度単位の吸光度が得られ、対照ウイルスに関して０．４吸光度単位が得られた。
約１：４という低いシグナル対ノイズ比は感度の良いＨＴＳを実施するには不十分である。
【国際公開パンフレット】
2004516026.tif 000002
2004516026.tif 000003
2004516026.tif 000004
2004516026.tif 000005
2004516026.tif 000006
2004516026.tif 000007
2004516026.tif 000008
2004516026.tif 000009
2004516026.tif 000010
2004516026.tif 000011
2004516026.tif 000012
2004516026.tif 000013
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004516026.tif 000014
【国際調査報告】
2004516026.tif 000015
2004516026.tif 000016
2004516026.tif 000017
2004516026.tif 000018
2004516026.tif 000019
2004516026.tif 000020
2004516026.tif 000021
2004516026.tif 000022
2004516026.tif 000023
2004516026.tif 000024