(57)【要約】ピロリン酸を産生する前進的な核酸ポリメラーゼ反応の程度を測定するための方法は、核酸合成の進行に必要なすべての成分の存在下で行うことができ、該成分は、ｄＡＴＰまたはｄＡＴＰアナログのいずれかである核酸ポリメラーゼ反応の基質を含んでなる。該方法は、ピロリン酸をＡＴＰに変換するステップおよびルシフェラーゼとＡＴＰとの生体発光反応によって生じた光を検出するステップを含んでなるピロリン酸分析を含み、以下の１つまたは両方が該当する：ａ）ルシフェラーゼをＡＴＰおよび基質と反応させて、スペクトルの重複が、野生型Photinus pyralisルシフェラーゼと、ＡＴＰおよびｄＡＴＰそれぞれとの反応の出力の間のスペクトルの重複と比較して減少する；ｂ）ルシフェラーゼが基質と反応して、野生型Photinus pyralis ルシフェラーゼとｄＡＴＰとの反応によって生じる発光と比較して減少した生体発光を生じる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸合成の進行に必要なすべての成分の存在下での、ピロリン酸を産生する前進的な核酸ポリメラーゼ反応の程度を測定するための方法であって、該成分が、ｄＡＴＰまたはｄＡＴＰアナログのいずれかである核酸ポリメラーゼ反応の基質を含んでなり、ピロリン酸をＡＴＰに変換するステップおよびルシフェラーゼとＡＴＰとの生体発光反応によって生じた光を検出するステップを含んでなるピロリン酸分析を含み、以下の１つまたは両方が当てはまる方法：
ａ）ルシフェラーゼをＡＴＰおよび基質と反応させて、スペクトルの重複が、野生型Photinus pyralisルシフェラーゼと、ＡＴＰおよびｄＡＴＰそれぞれとの反応の出力の間のスペクトルの重複と比較して減少する；
ｂ）ルシフェラーゼが基質と反応して、野生型Photinus pyralis ルシフェラーゼとｄＡＴＰとの反応によって生じる発光と比較して減少した生体発光を生じる。
【請求項２】
基質がｄＡＴＰである請求項１記載の方法。
【請求項３】
基質がｄＡＴＰアナログである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ｄＡＴＰアナログがｄ−α−Ｓ−ＡＴＰである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ルシフェラーゼが甲虫類ルシフェラーゼである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ルシフェラーゼがPhotinus pyralisルシフェラーゼの変異体または突然変異体である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ルシフェラーゼが野生型Photinus pyralis ルシフェラーゼである、請求項３または４記載の方法。
【請求項８】
生体反応によって生じる光が波長特異的光検出を用いて検出される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
光フィルタをピロリン酸分析に用いる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ルシフェラーゼが熱安定性のルシフェラーゼである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸ポリメラーゼが熱安定性である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記変換がＡＴＰスルフリラーゼの添加を含んでなる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記ＡＴＰスルフリラーゼが熱安定性である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ピロリン酸分析の成分が固定化されている、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記ピロリン酸分析の成分が凍結乾燥によりまたは安定化因子の存在により安定化されている、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
それぞれ、
ａ）核酸ポリメラーゼ、Ｍｇ源、デオキシヌクレオチドの緩衝化された混合物であって、デオキシヌクレオチドが請求項１において定義された基質を含んでなる混合物；および
ｂ）ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびＡＴＰ基質
を含有する容器を含んでなる、前記請求項のいずれかにおいて定義される方法に使用するのに適したキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸のイン・ビトロＤＮＡ重合によって製造された試料、好ましくはＤＮＡ重合の産物、特にポリメラーゼ連鎖反応の産物、の分析方法に関する。本発明はさらに、そのような方法を利用したキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
イン・ビトロＤＮＡ重合は、一般に、分子生物学の分野で定着したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の様式で行われている。ＰＣＲによって、必要であればごく少量のＤＮＡから、精密に定義されたＤＮＡ配列の増幅（および修飾）が可能である。
【０００３】
一般に、ＰＣＲは、ＤＮＡの存在を染色するための蛍光染料（臭化エチジウム等）を用いたゲル電気泳動（アガロースまたはアクリルアミドベース）を用いて解析される。この方法を用いて、増幅されたＰＣＲ産物の数、量、大きさを示すことができる。しかしながら、ゲル電気泳動を用いたＰＣＲ反応の調製、実施および解析は、手作業による様々な介入および有害な試薬を要し、時間がかかる(典型的には合計約１時間）。さらに、検出可能な産物を調製するために、複数のＰＣＲサイクル（典型的には３０サイクル）が必要である。
【０００４】
近年の方法は、ＰＣＲの解析に電気泳動の工程を用いない。そのような方法では、いくつかの手段によってＰＣＲ産物の蓄積に関連した蛍光変化をモニターすることにより行われる。
【０００５】
二本鎖ＤＮＡに結合する染料、ドナーおよびアクセプターフルオロフォアを含む特異的なハイブリダイゼーションプローブまたはドナーおよびアクセプターフルオロフォアを含むＰＣＲプライマープローブを用いたＰＣＲの間の、ＤＮＡの増幅をモニターするための手段は、ＷＯ−Ａ−９７／４４４４８６, ＷＯ−Ａ−９９／４２６１１およびＵＳ−Ａ−６１７４６７０に記載されている。
【０００６】
そのような方法は、液体をサンプリングすることなしにＰＣＲを追跡することが可能であり、反応物をリアルタイムで追跡することができる点でゲル電気泳動よりも便利である。これによって、ＰＣＲ産物を、より少ないサイクルで迅速に検出することができ、アニーリング／融解の動力学についての情報を直接得ることができる。
【０００７】
しかしながら、蛍光による方法は重要な短所を有する。特に、特別な装置と試薬が必要である。その方法は終点で解析するために用いるよりも、リアルタイムでＰＣＲを追跡することが多いので、普通、コンピュータで動作する統合型のサーモサイクラー−蛍光計が必要とされる。結果としてそのようなシステムの入手のしやすさ（コスト）と携帯性を譲歩することになる。検出はＰＣＲ装置内で行われるため、そのような方法は、適切な設備の整った実験室でのみ利用可能である。
【０００８】
さらに、蛍光を基礎とするシステムの利用が、装置の許容度の限界と高い費用によって阻まれるかもしれない。最後に、蛍光試薬、特に蛍光標識されたプライマー、にかかる費用は高く、試料調製が重荷になることがある。
【０００９】
ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼの特徴は、それらによって、新たな塩基が伸長中のＤＮＡ／ＲＮＡ分子に組み込まれるたびに、ピロリン酸(PPi）が遊離するという事実である。
【化１】
2004531233.tif 000002
【００１０】
ピロリン酸の高感度分析は、Enzymatic Luminometric Inorganic Pyrophosphate Detection Assay（ELIDA）にあるように知られている;Nyren et al, Anal. Biochem. 220:（1）39-45（1994）参照。この分析は２つのステップからなる：（１）酵素ＡＴＰスルフリラーゼによるピロリン酸（PPi）のＡＴＰへの変換、および（２）ホタルルシフェラーゼ（当分野で周知）によって触媒される、ルシフェラーゼおよび酸素の存在下で光を発するためのＡＴＰの利用。
【００１１】
ELIDAは、ポリメラーゼによる１個のヌクレオチドのＤＮＡへの組み込みを追跡するために利用されている；ＵＳ−Ａ−５５３４４２４、ＵＳ−Ａ−５４９８５２３、ＷＯ−Ａ−９８／２８４４０およびＷＯ−Ａ−９８／１３５２３を参照。ELIDAを基礎とする方法は、一塩基多型の同定、ならびにＤＮＡの短い領域の配列決定に利用可能である。この手段はもともと反復的な性格のもので、組み込まれた個々のヌクレオチドを検出する。その定義からして、そのような利用は、前進的な核酸ポリメラーゼ活性を検出するものではない。
【００１２】
ポリメラーゼ連鎖反応の１つの成分は、ルシフェラーゼの基質でもあるデオキシヌクレオチドｄＡＴＰである。したがって、ＤＮＡ重合反応のピロリン酸分析において遭遇する本質的は問題は、ルシフェラーゼとｄＡＴＰとの反応によってもたらされるスペクトルの干渉である。
【００１３】
ＤＮＡ重合反応を検出するための方法は、ＷＯ−Ａ−９２／１６６５４およびTabary et al, J. Immunological Methods, 156（1992）55-60の文献に記載されている。この方法は、ｄＡＴＰ干渉の問題に直接対峙するものではないが、複数の試薬の添加が関わる多くの段階的分析を用いてその影響を減らそうというものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明によれば、核酸合成の進行に必要なすべての成分の存在下での、ピロリン酸を産生する前進的な核酸ポリメラーゼ反応の程度を測定するための方法は、該成分が、ｄＡＴＰまたはｄＡＴＰアナログのいずれかである核酸ポリメラーゼ反応の基質を含んでなり、ピロリン酸をＡＴＰに変換するステップおよびルシフェラーゼとＡＴＰとの生体発光反応によって生じた光を検出するステップを含んでなるピロリン酸分析を含み、以下の１つまたは両方が該当する：
ａ）ルシフェラーゼをＡＴＰおよび基質と反応させて、スペクトルの重複が、野生型Photinus pyralisルシフェラーゼと、ＡＴＰおよびｄＡＴＰそれぞれとの反応の出力の間のスペクトルの重複と比較して減少する；
ｂ）ルシフェラーゼが基質と反応して、野生型Photinus pyralis ルシフェラーゼとｄＡＴＰとの反応によって生じる発光と比較して減少した生体発光を生じる。
【００１５】
本発明は、ゲル電気泳動ベースおよび蛍光ベース両方の技術に対する、単純で、安価で迅速な別の方法を提供する。この方法は、携帯性と小型化および高スループットシステムへの容易な統合の可能性を有する、単純で安価な必要なハードウエアを用いて、ＰＣＲ反応が起こるか起こらないか（および／またはＰＣＲ反応の程度を定量するかしないか）を区別することができる。本方法は、改善されたシグナル安定性および改善されたシグナル／バックグラウンド比をもたらすことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の説明
本発明は、核酸のイン・ビトロの酵素による合成を分析し、新たに核酸が重合した程度を定量するための方法を提供する。本発明は、核酸重合の結果として生じるピロリン酸の検出を包含する。
【００１７】
好ましくは、本分析は、ＤＮＡ分子がイン・ビトロで増幅されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の結果を解析するために用いる。この分析は、必要なヌクレオチドを含む重合反応のすべての成分の存在下で行うことができる。
【００１８】
１つの態様では、本発明は、以下のステップを含んでなる：
（１）ピロリン酸を酵素ＡＴＰスルフリラーゼを用いてＡＴＰに変換すること
（２）好ましくは、ＡＴＰと適当な基質の存在下で光を生じる酵素、より好ましくはホタルルシフェラーゼによりＡＴＰを検出することであって、ステップ（１）の結果として生じたＡＴＰを、ポリメラーゼ酵素によって利用されるかもしれないｄＡＴＰまたはそのアナログと区別することができる。
【化２】
2004531233.tif 000003
【００１９】
本発明により、ステップ１で産生したＡＴＰを、ポリメラーゼ酵素の基質として存在するヌクレオチドと区別することが可能になる。これらの方法は、以下の選択肢を含んでなる：
（ａ）ステップ２のＡＴＰから生じた光の波長を、ＤＮＡ重合反応バッファー中に存在するヌクレオチドに対する酵素反応によって生じた光と区別するための光学的方法：
（ｂ）ステップ２で用いた酵素の有効な基質ではない重合反応におけるヌクレオチドの利用：
（ｃ）ステップ２におけるｄＡＴＰの基質としての利用を減少させる酵素変異体の利用。
【００２０】
本発明は、前進的核酸ポリメラーゼ酵素の程度を測定するための手段としてのピロリン酸の検出を包含する。本明細書中で用いられる「前進的」とは、バッファー成分の更なる添加または操作なしに１を越えるヌクレオチド付加サイクルを行うことができる条件下で酵素が作用することを意味する。
【００２１】
本発明は、好ましくは酵素が必要とする成分の存在下で、核酸ポリメラーゼ酵素によって生じるピロリン酸を検出することに関する。より好ましくは、ピロリン酸は、最初にＡＴＰに変換される（例えばＡＴＰスルフリラーゼによって）。次いで、好ましくは生体発光反応によって、より好ましくはカブトムシルシフェラーゼ、最も好ましくはホタルルシフェラーゼを用いて、ＡＴＰを検出する。
【００２２】
この新規な分析は、核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子の前進的重合、より好ましくはポリメラーゼ連鎖反応の適用後に行う。さらに、本分析法を、ＤＮＡ合成に必要な成分の存在下で、酵素的ＤＮＡ合成に用いられる反応混合物に対して行う。
【００２３】
酵素的ＤＮＡ合成反応の成分は、典型的には、緩衝液、ＭｇＣｌ2、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、プライマー、ＤＮＡテンプレートおよびポリメラーゼを含有する。そのような混合物は、特に、ホタルルシフェラーゼとｄＡＴＰが直接反応して光を生じるので、ピロリン酸のELIDA分析と干渉する。そのような反応に典型的に用いられるｄＡＴＰの濃度が高ければ（例えば０.２ｍＭ）、ルシフェラーゼと直接反応するｄＡＴＰからの光の発生が、検出される光に有意に影響し、特に低いピロリン酸濃度でピロリン酸に対する分析を混乱させる。
【００２４】
本発明は、ピロリン酸の産生の結果として生じる光を過度に干渉することなしに、酵素的ＤＮＡ合成に必要な試薬の存在下でピロリン酸を分析する方法を具現化する。したがって、上記の最初の反応式を考慮して、本発明は、試料、好ましくはＰＣＲ反応物において、ＤＮＡ重合が起こった程度を評価するために使用することができる。このように、本発明は、ＰＣＲ反応によってＰＣＲ産物を生じたか否か、またどの程度ＰＣＲ産物が産生したか、を調べるために使用することができる。ＰＣＲ条件が既に十分に最適化されている多くの応用（例えば、病因に関連したＤＮＡの迅速な検出）においては、標的ＤＮＡ配列が試料中に存在したことを確認するための唯一必要な情報は、ＤＮＡ重合が起こることである。
【００２５】
本発明の１つの態様では、波長特異的な光検出を用いて、ＡＴＰによって生じた（それゆえにピロリン酸から生じた）光とｄＡＴＰによって生じた光とを区別することができる。ホタルルシフェラーゼは、ＡＴＰと反応して黄緑色の光を発するが、ｄＡＴＰと反応して赤色の光を発する。結果として、試料がＡＴＰとｄＡＴＰの両者を含有する場合、ルシフェラーゼの存在下で生じる光がｄＡＴＰからのものである程度を、適当なフィルタまたを用いるか、またはＡＴＰと比較して記録されたシグナルに対するｄＡＴＰの影響がほとんどない波長での発光を測定することによって評価することができる。このように、ｄＡＴＰがルシフェラーゼと直接反応することによって生じる光を、十分に最小限度にして、ピロリン酸濃度が低い場合であっても、ＰＣＲ反応におけるピロリン酸の検出を可能にすることができる。
【００２６】
本発明の別の態様では、ｄＡＴＰをｄ−α−ＳＡＴＰに置きかえる。ｄ−α−ＳＡＴＰは、ｄＡＴＰよりも約１００倍も弱いルシフェラーゼの基質であり、ｄ−α−ＳＡＴＰとルシフェラーゼとの直接反応による光の発生は非常に低い。それでもやはり、ｄ−α−ＳＡＴＰは、ＤＮＡ増幅反応に適した基質である。ＤＮＡポリメラーゼによってｄ−α−ＳＡＴＰをＤＮＡ鎖に導入することができることは知られている。ｄ−α−ＳＡＴＰが導入されたＤＮＡ（それにより硫黄原子を含む）は、更なるＤＮＡ合成を指揮するテンプレートとして作用することができ；このことはＰＣＲ反応の前提条件である。ｄ−α−ＳＡＴＰを用いたＰＣＲ反応は効率的であるが、ｄＡＴＰを欠いているために、ＥＬＩＤＡ試薬に添加したときに有意の発光が本質的に起こらない。このように、ＰＣＲ反応にｄ−α−ＳＡＴＰを用いた場合、得られる試料は、ピロリン酸が生じたならば、例えば、ＰＣＲ産物が増幅されたならば、有意の光を発するのみであろう。ＰＣＲに対する基質であるが、そのホタルルシフェラーゼとの反応がｄＡＴＰに対するよりも低い比活性を示すｄ−α−ＳＡＴＰ以外のヌクレオチドもこの目的に使用することができることは、当業者には自明であろう。
【００２７】
本発明の別の態様は、ｄＡＴＰを用いた生体発光の色がＡＴＰと比較して大きく異なるか、またはｄＡＴＰまたはＡＴＰのいずれかと親和性が異なるホタルルシフェラーゼ突然変異体またはカブトムシルシフェラーゼ変異体の増幅である。ｄＡＴＰとＡＴＰとの間のルシフェラーゼの最大蛍光の波長の違いが野生型酵素よりも大きい、突然変異体のルシフェラーゼを用いて、ｄＡＴＰに対するＡＴＰから生じる光の区別を改善することができる。さらに、ＡＴＰと比較してｄＡＴＰが発光に関して弱い基質である変異体を同様に用いることができる。この態様では、ＡＴＰとの反応に関して、活性または生じた光の波長のいずれかにおいて他のヌクレオチドをより区別する、任意のルシフェラーゼ突然変異体を用いることができる。そのようなルシフェラーゼ突然変異体を得るまたは同定するための方法は当分野で知られている（例えば、ＷＯ−Ａ-９６／２２３７６およびＷＯ−Ａ-９９／１４３３６）。
【００２８】
本発明の特徴は、合成されたＤＮＡがゲル電気泳動によって検出不可能な場合に、ＤＮＡ合成によるピロリン酸を検出することができ、感度を高め、ＰＣＲ分析の増幅時間を短縮することができるということである。さらに、検出されたピロリン酸の量は、適当な条件がＤＮＡ合成されたＤＮＡの量に比例する。したがって、ピロリン酸の検出を用いてＰＣＲ反応を数値化することができる。
【００２９】
本発明の更なる特徴は、ＰＣＲ反応の条件に耐えうるピロリン酸分析の成分の利用である。このピロリン酸分析の成分は、凍結乾燥または安定化因子の存在によって安定化することができ、および／または熱安定性であってよく、特に熱安定性のＡＴＰスルフリラーゼおよび熱安定性のルシフェラーゼ。核酸ポリメラーゼもまた熱安定性であってよい。
【００３０】
ＰＣＲ試料の解析は、単純に、いくつかのＰＣＲ試料をＥＬＩＤＡ試薬と混合することを必要とする。混合物からの発光は、急速で、複合的な光検出機器が必要とする十分な規模のものであり：ＣＣＤカメラまたは写真フィルムを用いて結果を解析することができる。
【００３１】
さらに、ＥＬＩＤＡ反応による光シグナルは、２、３分間は安定であり、分析を測定することができる有用な時間帯である。このことは、例えば、マルチウェルプレート形式で行なわれるＰＣＲ反応が、すべてのウェルにＥＬＩＤＡ試薬を加え（これは単純な液体取扱装置を用いて簡単に同時に行われる）、ＣＣＤカメラの下に２、３分間置くだけで、完全な結果が得られるということを意味する。したがって、高スループットな分析についての潜在性は明らかで、液体の取扱が、ハードウエアと同様簡便で、何百という試料を同時に容易に分析することができる。
【００３２】
さらに、分析が簡便であることは、ＰＣＲおよび他の技術の利用しやすさおよび携帯性をさらに増大させる。特に、この分析を、ＰＣＲ反応を行う小型の「液体」回路に統合することができる。実際、この分析は、蛍光オリゴを用いる方法のように、内蔵型の蛍光計を必要とせず、開示した発明からの結果を解析するために単純な光電子増倍管または写真フィルムで十分である、という利点をもたらす。
【００３３】
以下の実施例は、本発明を説明する。
【００３４】
実施例１
ｄＡＴＰ刺激による生体発光による光の影響を除くためのフィルタの使用
ピロリン酸分析バッファー（ＰＡＢ）を以下のように調製した：
０.１Ｍ                 Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７.７５）         Sigma
２ｍＭ                  ＥＤＴＡ                               〃
１０ｍＭ                酢酸マグネシウム                       〃
０.１％                 ウシ血清アルブミン                     〃
５μＭ                  アデノシン ５'リン酸                   〃
０.４ｍｇ／ｍＬ         ポリビニルピロリドン（360,000）        〃
０.３Ｕ／ｍＬ           ＡＴＰスルフリラーゼ                   〃
１００ｍｇ／ｍＬ        Ｄ−ルシフェリン                      Europa
５.５×１０-8光単位     Photinus pyralis ルシフェラーゼ      Promega
１ｍＭ                  ジチオスレイトール                   Melford
【００３５】
ピロリン酸ナトリウム（Sigma）の溶液を新たに調製し、氷上で暗所にて保存した。
【００３６】
ＰＡＢ５０μＬを９６ウェルプレートの２個のウェルに加えた。一方の試料には、１μＬの０．１ｍＭピロリン酸ナトリウムを加え、もう一方の試料には、２ｍＭｄＡＴＰ１μＬを加えた。生じた発光を、シグナルを統合する黒と白のＣＣＤカメラを備えたSyngene light-boxを用いて５秒間観察した。ピロリン酸を加えた試料がずっと明るいが、ｄＡＴＰ試料からかなりの発光がある。加えたｄＡＴＰの量は、標準的な５０μＬのＰＣＲ反応において用いた量の１／５に等しい。したがって、生体発光に対するｄＡＴＰの影響は有意である。
【００３７】
緑のフィルタをＣＣＤカメラのレンズの前に設置し、上記試料をもう１回観察した。緑のフィルタの存在によって、ピロリン酸試料と比較してｄＡＴＰ試料のシグナルが顕著に減少したことが明らかに認められた。これは、ｄＡＴＰ試料からの発光が６２０ｎｍで最大発光を有するのに対し、ＡＴＰの発光が５５０ｎｍ（ｐＨ７．８）で最大であり、緑のフィルタがｄＡＴＰ試料からの光をよりブロックすることによる。
【００３８】
実施例２  ｄＡＴＰのアナログｄ−α−ＳＡＴＰを用いたＰＣＲ
以下を含有する５０μＬのＰＣＲ反応
５μＬ       Ｔｒｉｓ−ＨＣl             １００ｍＭ         Sigma
４μＬ       塩化マグネシウム              ５０ｍＭ         Gibco
５μＬ       ｄ-α-ＳＡＴＰ                  ２ｍＭ         Glen research
５μＬ       ｄＣＴＰ                        ２ｍＭ         Pharmacia
５μＬ       ｄＧＴＰ                        ２ｍＭ         Pharmacia
５μＬ       ｄＴＴＰ                        ２ｍＭ         Pharmacia
１μＬ       テスト・プラスミド pPw601a  ０.５ｎｇ／μＬ
１.２５μＬ  プライマー１                １０μＬ
１.２５μＬ  プライマー２                １０μＬ
０.５μＬ    Ｔａｑポリメラーゼ          ５Ｕ／μＬ         Roche
１９μＬ     Milli-Q 水
【００３９】
プライマー１および２の配列およびテスト・プラスミドをそれぞれ、配列番号１、２および３に示す。予想されるＰＣＲ産物の大きさは１５８ｂｐである。
【００４０】
Eurogentecの「スマート−ラダー」分子量マーカーをゲル電気泳動に用いた。１０ｍｇ／ｍＬ臭化エチジウム２μＬをアガロースゲルおよびゲル・ランニング・バッファーに加えた。
【００４１】
９５℃にて３０分間加熱した後、Ｔａｑポリメラーゼを試料に加えた。以下のサイクルパラメータをPerkin−Elmer GeneAmp ＰＣＲ system 2400に対して実行した。
【化３】
2004531233.tif 000004
【００４２】
得られたＰＣＲ反応物１０μLを臭化エチジウムを含有する１０％アガロースゲルに、分子量マーカーとともに添加した。ゲルを６０Ｖで５０分間電気泳動に付し、トランスイルミネーターで可視化した。ｄＡＴＰの代わりにｄ−α−ＳＡＴＰを用いてＰＣＲ産物が生じていることが認められた。同じ条件下で、ｄＡＴＰを代わりに、通常の濃度の１／１０の０．２ｍＭで用いた場合、ＰＣＲ産物は検出されなかった。ｄ−α−ＳＡＴＰの純度が９８％以上であったので、これは、単に、ｄ−α−ＳＡＴＰを用いて得られたＰＣＲ産物にｄ−α−ＡＴＰとしてｄＡＴＰが混入した結果ではなく、したがってＰＣＲ産物はｄＡＴＰの混入のために生じたものではないことを示している。
【００４３】
実施例３
ｄ−α−ＳＡＴＰを用いたＰＣＲ反応由来のピロリン酸の検出
３つのＰＣＲ反応を実施例２に記載のとおり設定した。試料の１つを熱サイクルに付さず、残りの試料は熱サイクルに付すが、１つはＴａｑタグを付さなかった。予想される結果は、Ｔａｑ有りで熱サイクルに付された試料がＰＣＲ産物を生じるであろうというものであった。このことをゲル電気泳動によって確認した。ＰＣＲ反応物各５μLを、９６ウェルプレートにて２５μLのＥＬＩＤＡバッファーに加えた。試料からの発光をＣＣＤカメラで測定し、試料からの発光が、ピロリン酸について分析したところ、明らかにゲルの結果に対応していることが示された。
【００４４】
実施例４  ＡＴＰを用いたＰＣＲ反応からのピロリン酸の検出
ｄＡＴＰをｄ−α−ＳＡＴＰの代わりに用いたことを除いて、ＰＣＲ反応を実施例２に記載したように設定した。即ち、標準のＰＣＲ反応条件を用いた。一方は（用いたプライマーに関して）正しいＤＮＡテンプレートが存在し、他方は正しいＤＮＡテンプレートが存在しない、２つの試料を調製した。予想される結果は、正しいテンプレートを有する試料がＰＣＲ産物を生じるであろうということである。ＰＣＲ反応を実施し、試料をゲル電気泳動で分析した。次いで、各ＰＣＲ反応物５μＬをＥＬＩＤＡ分析試薬２５μＬに添加し、実施例１のように、緑のフィルタを設置したＣＣＤカメラで発光を検出した。検出された発光は、ゲル電気泳動のものと対応し、ＥＬＩＤＡ分析はどの試料がＰＣＲ産物の産生に成功したかを正確に示すことが可能である。
【００４５】
実施例５  ＰＣＲ産物検出の数値化および感度
７つのＰＣＲ試料を実施例２のように調製した（即ち、ｄ−α−ＳＡＴＰを用いて）。熱サイクルの間、ＰＣＲ反応の５サイクル毎に３５サイクルまで試験管を１本取り出し、氷上に置いた。ＰＣＲ産物の産生をゲル電気泳動を用いて分析した。各試料５μＬをＥＬＩＤＡバッファー２５μＬに添加し、発光をＣＣＤカメラで記録した。図１（ＰＣＲサイクルの数に対する光のグラフ）は、ＥＬＩＤＡ分析による発光がサイクル数に応じて増加するだけでなく、ＰＣＲ産物をゲルで検出し得る前に発光が増大することを示している。
【００４６】
実施例６  ｄＡＴＰと比較したｄ−α−ＳＡＴＰを含有するＰＣＲ反応のＥＬＩＤＡ分析による発光の安定性
実施例５に記載したように、ＰＣＲ反応を設定し実施する。各ＰＣＲ試料の解析を、ＰＣＲ反応１μＬをＥＬＩＤＡ分析バッファー２０μＬと混合することによって開始する。次いで、試料からの発光を、１分間に光を連続的に４回読み取るLabsystems Luminoscan Ascent照度計で測定した。各光の読み取りは、試料からの発光が１０秒間隔で収束することを示した（機器の既定PMT電圧を用いて）。
【００４７】
図２（時間に対する相対的な光単位のグラフ）は、ｄＡＴＰまたはｄ−α−ＳＡＴＰを用いた５および３５サイクルのＰＣＲ反応のＥＬＩＤＡ分析による４つの連続的な光の読取に対する発光の規模を示している。ｄＡＴＰで行ったＰＣＲ反応は、時間に対して発光の有意な減衰を示す。この効果は、ＰＣＲのサイクル数に応じて大きくなる。結果として、５と３５サイクルの間の発光の差異は有意に減少する。したがって、ｄ−α−ＳＡＴＰを用いた場合、時間に対する発光は、５サイクルと３５サイクルの両試料について一定に近づく。結果として、行った４回の読取で、５サイクルと３５サイクルの読取の間の差異の程度は、ほぼ一定である（５％の差異に過ぎない）。
【００４８】
実施例７  ｄＡＴＰと比較したｄ−α−ＳＡＴＰを含有するＰＣＲ反応のＥＬＩＤＡ分析におけるバックグラウンド／シグナル比
０．５ｐｇのテスト・プラスミドｐＰｗ６０１aのみを用いたことを除いて、実施例２に記載のようにＰＣＲ反応を設定した。さらに、ＰＣＲ反応に、ｄ−α−ＳＡＴＰまたはｄＡＴＰを含有させた。ｄ−α−ＳＡＴＰまたはｄＡＴＰを含有する反応しなかったＰＣＲ混合物のＥＬＩＤＡ分析からの発光を実施例６のように測定した。ＰＣＲ反応を３０サイクル行った（およびアガロースゲル分析によって判断されるようにアプリコンと同じ量を産生した）後、ＥＬＩＤＡ分析を同じ試料に対してさらに行った。反応したＰＣＲ混合物に対する反応しなかったＰＣＲ混合物からの発光の比を図３に示す（シグナル：バクグラウンド比を示す）。ｄ−α−ＳＡＴＰの使用はシグナル：バックグラウンド比をかなり改善することを示すことができる。これは、ｄ−α−ＳＡＴＰが、ｄＡＴＰと同じ程度にルシフェラーゼと反応しないという事実による。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
（なし）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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