(57)【要約】本発明は、大腸菌から単離される、Ｂ２＋　Ａ−型の産物、ならびにその生物学的応用、特には、その医学的（治療、ワクチンおよび診断）応用および生物工学的応用に関する。本願において、「Ｂ２＋　Ａ−　型」という表現で、ＥＣＯＲコレクションのＢ２グループの大腸菌株中では１０％以上の頻度で、また同コレクションのＡグループの大腸菌株中で１０％未満の頻度で存在することを表している。特に、９９％以上の確度で、大腸菌種のグループＡ、Ｂ１、Ｂ２およびＤを、迅速かつ容易に識別することを可能とする、系統発生の決定方法が記載される。
2004512817.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型を示すポリヌクレオチドからなる、大腸菌株のＤＮＡ断片ライブラリー。
【請求項２】
大腸菌　Ｃ５＋　Ａ−　ライブラリー、大腸菌　ＣＦＴ０７３＋　Ｋ１２−　ライブラリー、大腸菌ＲＳ２１８＋　Ｋ１２−　ライブラリー、あるいは、大腸菌　ＣＦＴ０７３＋　Ｋ１２−　とＲＳ２１８＋　Ｋ１２−　ライブラリーからなる群から選択されている、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項３】
Ｏ１５７：Ｈ７−　のポリヌクレオチドは含まれていない、請求項１または２に記載のライブラリー。
【請求項４】
ランダムな剪断を受けた、グループＡの１つまたは複数の大腸菌株のポリヌクレオチド群を、３００〜５００ｂｐ程度の平均値を有する、およそ１００〜１５００ｂｐの断片を生じさせることが可能な制限酵素によって切断された、グループＢ２またはＤの１つまたは複数の大腸菌株のポリヌクレオチド群から取り除き、必要であれば、前記取り除きを反復的に繰り返すことを含んでなる、
大腸菌から、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型を示す、染色体およびプラスミドのポリヌクレオチドの全セットを単離する方法。
【請求項５】
前記取り除きを受ける大腸菌株は、大腸菌Ｃ５株または大腸菌ＲＳ２１８株であり、また、グループＡの大腸菌株は、ＥＣＯＲコレクションのものである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
以下の群：
−　配列番号：１〜１５３の配列、
−　グループＢ２またはグループＤの大腸菌の全ＤＮＡを制限酵素を用いて消化し、得られた該断片のうち、配列番号：１３４、１４４、１０９、１１５、１４０、１３５、３３、５６、１２２、１３０、１４１、２５、４８、５１、５７、１２１、４４、４５、１１３、１１９、１２０、２３、５２からなる群から選択される、少なくとも１つの配列とハイブリダイズするものを選択することにより取得可能なポリヌクレオチド配列、および
−　前記配列のうちの１つを含んでいるｏｒｆの配列、
または、前記配列の、該型を保存する変異型または断片化配列
から選択される配列を含む、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型を示す単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
人間または動物の血清の存在下、かかるポリヌクレオチドを含む遺伝子において、その転写が増大される、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項６または７に記載のポリヌクレオチドの増幅が可能なプライマー対。
【請求項９】
配列番号：１６４および１６５に相当している、請求項８に記載のプライマー対。
【請求項１０】
請求項６または７に記載のポリヌクレオチドに基づき作製されるプローブ。
【請求項１１】
配列番号：１６０と１６１；配列番号：１６２と１６３；配列番号：１６４と１６５を含んでなる群から選択されるプライマー対を用いた増幅により取得される請求項６または７に記載のポリヌクレオチドの、プローブとしての使用。
【請求項１２】
請求項６または７に記載のポリヌクレオチドのアンチセンスに相当する配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項６または７に記載のポリヌクレオチドによってコードされているポリペプチドと、血清、精製血清、抗体およびモノクローナル抗体を含んでなる群から選択されるリガンドであって、大腸菌の腸外成長などの生物学的機能に対する阻害能を有する該リガンドとの組み合わせ。
【請求項１４】
請求項６、７または１１に記載の少なくとも１個のポリヌクレオチドを含んでなるベクター、ならびに、かかるベクターでトランスフェクトされている細胞。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の該ライブラリーから単離された、少なくとも１個のポリヌクレオチドの使用を含んでなる、大腸菌菌株の系統発生を決定する方法。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドが、請求項６または７に記載のポリヌクレオチド、または以下の群から選択されるポリヌクレオチドを含む群から選択される請求項１５に記載の方法：
−　ｃｈｕＡ遺伝子およびそのオペロンに対応するポリヌクレオチド、
−　その配列が、配列番号：１７０、１７１、１７４、１７５、１７８、１７９、１８３、１８５、１８６、１９０、１９１、１９３、１９４、１９５、１９６、１９９、２００、２０２、２０５、２０６、２０８、２０９、２１１、２１４、２１８、２２０、２２１、２３３、２３４、２３５、２４１、２４４、２４６、２４７、２４８および２５０に相当しているポリヌクレオチド、
−　グループＢ２またはＤの大腸菌の全ＤＮＡを、ＮｏｔＩとＢｌｎＩからなる群から選択される制限酵素で消化し、取得される断片のうち、配列番号：１２５、１２３、１１６、４３、４０、１２７、１３３、２７、３４、３６、４２、４６、５４、５５、３８、１２８および１５１からなる群から選択される、少なくとも１つの配列にハイブリダイズするものを選択することにより取得することができ、但し、ｓｆａ、ｈｌｙ、ｃｎｆ１、ｐａｐ／ｐｒｓ、ｈｒａ、およびｉｂｅ１０のポリヌクレオチドは除外される、ポリヌクレオチド、
−　その配列は、上述の３つのパラグラフに挙げられている、該ポリヌクレオチドのうちの１つの配列を含んでなるｏｒｆに相当しているポリヌクレオチド、
−　これらのポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つの配列（および、特には、配列番号：２４１、１９５、１８５および２４８）の、該型を保存する変異型または断片化配列に、その配列が対応しているポリヌクレオチド、
−　その配列は、これらのポリヌクレオチドに由来している、プライマー対、プローブならびにアンチセンスのポリヌクレオチド、
−　Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型を示すポリヌクレオチドによってコードされている、ポリペプチドとの結合能を有している、結合性の産物。
【請求項１７】
ｙｊａＡの検出を含んでなる、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
ｙｊａＡは、プローブ、配列番号：１６２、１６３などのプライマー対によって検出されるか、あるいは、そのコードしているタンパク質が特異的抗体により検出されるかである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の該ライブラリーの、有効量のポリヌクレオチド、あるいはそのコードしているタンパク質を、不活性担体と組み合わせて含んでなる、医薬組成物。
【請求項２０】
前記ポリヌクレオチドは、請求項６または７によるもの、請求項１４に記載のベクターもしくは細胞、あるいは、請求項１２に記載のアンチセンスである、請求項１９の医薬組成物。
【請求項２１】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号：７１、１１４、１３、７７、８、３６、１２０および１３０のポリヌクレオチドを含んでなる群から選択される、請求項２０の医薬組成物。
【請求項２２】
大腸菌の腸外感染の治療および／または緩和および／または予防用の、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
大腸菌の腸外感染の予防および／また治療用の医薬を製造するための、以下の群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドの使用：
−　ｃｈｕＡ遺伝子およびそのオペロンに対応するポリヌクレオチド、
−　配列番号：１７０、１７１、１７４、１７５、１７８、１７９、１８３、１８５、１８６、１９０、１９１、１９３、１９４、１９５、１９６、１９９、２００、２０２、２０５、２０６、２０８、２０９、２１１、２１４、２１８、２２０、２２１、２３３、２３４、２３５、２４１、２４４、２４６、２４７、２４８および２５０に、その配列が相当しているポリヌクレオチド、
−　グループＢ２またはＤの大腸菌の全ＤＮＡを、ＮｏｔＩとＢｌｎＩからなる群から選択される制限酵素で消化し、取得された断片のうち、配列番号：１２５、１２３、１１６、４３、４０、１２７、１３３、２７、３４、３６、４２、４６、５４、５５、３８、１２８および１５１からなる群から選択される少なくとも１つの配列にハイブリダイズするものを選択することにより取得することができ、但し、ｓｆａ、ｈｌｙ、ｃｎｆ１、ｐａｐ／ｐｒｓ、ｈｒａ、およびｉｂｅ１０のポリヌクレオチドは除外する、ポリヌクレオチド、
−　その配列は、上述の３つのパラグラフに挙げられている、該ポリヌクレオチドのうちの１つの配列を含んでなるｏｒｆに相当しているポリヌクレオチド、
−　これらのポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つの配列（および、特には、配列番号：２４１、１９５、１８５および２４８）の、該型を保存する変異型または断片化配列に、その配列が対応しているポリヌクレオチド、
−　その配列は、これらのポリヌクレオチドに由来している、プライマー対、プローブならびにアンチセンスのポリヌクレオチド、
−　新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型を示すポリヌクレオチドによってコードされている、ポリペプチドとの結合能を有している、結合性の産物。
【請求項２４】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号：１７４、２０２、１７８、２２１、２０６、１７５、１９６および１７０のポリヌクレオチドを含んでなる群から選択される、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
敗血症、腎盂腎炎および新生児脳膜炎の治療用の、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の医薬組成物、あるいは、請求項２３または２４によって得られる薬剤。
【請求項２６】
試料中において、大腸菌汚染または腸管外大腸菌などの望ましくない大腸菌の有無の診断用の、請求項１〜３のいずれか一項に記載の該ライブラリーのポリヌクレオチドまたはそのアンチセンスの使用。
【請求項２７】
前記ＤＮＡポリヌクレオチドは、請求項６または７によるものか、あるいは、請求項１４に記載のベクターもしくは細胞中のものかである、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記ポリヌクレオチドは、以下の群から選択される、請求項２７に記載の使用：
−　ｃｈｕＡ遺伝子およびそのオペロンに対応するポリヌクレオチド、
−　配列番号：１７０、１７１、１７４、１７５、１７８、１７９、１８３、１８５、１８６、１９０、１９１、１９３、１９４、１９５、１９６、１９９、２００、２０２、２０５、２０６、２０８、２０９、２１１、２１４、２１８、２２０、２２１、２３３、２３４、２３５、２４１、２４４、２４６、２４７、２４８および２５０に、その配列が相当しているポリヌクレオチド、
−　グループＢ２またはＤの大腸菌の全ＤＮＡを、ＮｏｔＩとＢｌｎＩからなる群から選択される制限酵素で消化し、取得された断片のうち、配列番号：１２５、１２３、１１６、４３、４０、１２７、１３３、２７、３４、３６、４２、４６、５４、５５、３８、１２８および１５１からなる群から選択される少なくとも１つの配列にハイブリダイズするものを選択することにより取得することができ、但し、ｓｆａ、ｈｌｙ、ｃｎｆ１、ｐａｐ／ｐｒｓ、ｈｒａ、およびｉｂｅ１０のポリヌクレオチドは除外する、ポリヌクレオチド、
−　その配列は、上述の３つのパラグラフに挙げられている、該ポリヌクレオチドのうちの１つの配列を含んでなるｏｒｆに相当しているポリヌクレオチド、
−　これらのポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つの配列（および、特には、配列番号：２４１、１９５、１８５および２４８）の、該型を保存する変異型または断片化配列に、その配列が対応しているポリヌクレオチド、
−　その配列は、これらのポリヌクレオチドに由来している、プライマー対、プローブならびにアンチセンスのポリヌクレオチド、
−　新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型を示すポリヌクレオチドによってコードされている、ポリペプチドとの結合能を有している、結合性の産物。
【請求項２９】
少なくとも以下の１つの化合物の検出を含んでなる、大腸菌の腸外成長を阻害可能な化合物を識別する方法：
ｉ．　以下のものからなる群から選択される、少なくとも１個のポリヌクレオチドとの結合能を有しているもの：
−　新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型を示す新規なポリヌクレオチド、すなわち、
・　配列番号：１〜１５３の配列、
・　グループＢ２またはＤの大腸菌（例えば、敗血症性または髄膜の感染症に罹患している患者の血液から単離された大腸菌株など）の全ＤＮＡを、ＮｏｔＩとＢｌｎＩからなる群から選択される制限酵素で消化し、得られる断片のうち、配列番号：１３４、１４４、１０９、１１５、１４０、１３５、３３、５６、１２２、１３０、１４１、２５、４８、５１、５７、１２１、４４、４５、１１３、１１９、１２０、２３、５２からなる群から選択した少なくとも１つの配列とハイブリダイズするものを選択し、そして、選択された断片の配列決定することにより取得可能なポリヌクレオチド配列、
ならびに
・　これら配列のうちの１つを含むｏｒｆ（オープン・リーディング・フレーム）の配列、
・　これらの配列の、該型を保存する変異型または断片化配列、
−　ｃｈｕＡ遺伝子およびそのオペロンに対応するポリヌクレオチド、
−　その配列は、配列番号：１７０、１７１、１７４、１７５、１７８、１７９、１８３、１８５、１８６、１９０、１９１、１９３、１９４、１９５、１９６、１９９、２００、２０２、２０５、２０６、２０８、２０９、２１１、２１４、２１８、２２０、２２１、２３３、２３４、２３５、２４１、２４４、２４６、２４７、２４８および２５０に相当しているポリヌクレオチド、
−　グループＢ２またはＤの大腸菌の全ＤＮＡを、ＮｏｔＩとＢｌｎＩからなる群から選択される制限酵素で消化し、取得された断片のうち、配列番号：１２５、１２３、１１６、４３、４０、１２７、１３３、２７、３４、３６、４２、４６、５４、５５、３８、１２８および１５１からなる群から選択される少なくとも１つの配列にハイブリダイズするものを選択することにより取得することができ、但し、ｓｆａ、ｈｌｙ、ｃｎｆ１、ｐａｐ／ｐｒｓ、ｈｒａ、およびｉｂｅ１０のポリヌクレオチドは除外する、ポリヌクレオチド、
・　前の４つのパラグラフで挙げたポリヌクレオチドのうちの１つの配列を含んでなるｏｒｆに、その配列が相当するポリヌクレオチド、
・　これらのポリヌクレオチド、および特に、配列番号：２４１、１９５、１８５および２４８の少なくとも１つの配列の、該型を保存する変異型または断片化配列に、その配列が対応しているポリヌクレオチド、
および
ｉｉ．　このポリヌクレオチドの正確な転写および／または翻訳を阻害することができるもの。
【請求項３０】
そのｏｒｆは、請求項２９に記載の方法で使用されるポリヌクレオチドを含んでなる、タンパク質の活性を阻害することのできる少なくとも１個の化合物の検出を含んでなる、大腸菌の腸外成長を阻害することができる化合物を同定する方法。
【請求項３１】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のライブラリーの少なくとも１個のポリヌクレオチドを含んでなる、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載される方法の実施用の、または請求項２６〜２８に記載される使用のためのキット。
【請求項３２】
配列番号：１６０と１６１、配列番号：１６２と１６３ならびに配列番号：１６４と１６５のプライマー対の少なくとも１つを含んでなる、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
有効成分として、請求項１〜３のいずれか一項に記載のライブラリーから単離される免疫原性ポリヌクレオチドまたはその不活性化された同質遺伝子的変異体、あるいは対応するＯＲＦを不活性担体と組み合わせて含んでなる、大腸菌の腸外成長の予防、緩和または対処用のワクチン組成物。
【請求項３４】
前記ポリヌクレオチドは、以下のものからなる群から選択されるポリヌクレオチドである請求項３３に記載のワクチン組成物：
−　新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型を示す新規なポリヌクレオチド、すなわち、
・　配列番号：１〜１５３の配列、
・　グループＢ２またはＤの大腸菌（例えば、敗血症性または髄膜の感染症に罹患している患者の血液から単離された大腸菌株など）の全ＤＮＡを、ＮｏｔＩとＢｌｎＩからなる群から選択される制限酵素で消化し、得られる断片のうち、配列番号：１３４、１４４、１０９、１１５、１４０、１３５、３３、５６、１２２、１３０、１４１、２５、４８、５１、５７、１２１、４４、４５、１１３、１１９、１２０、２３、５２からなる群から選択した少なくとも１つの配列とハイブリダイズするものを選択し、そして、選択された断片の配列決定することにより取得可能なポリヌクレオチド配列、
ならびに
・　これらの配列のうちの１つを含むｏｒｆ（オープン・リーディング・フレーム）の配列、
・　これらの配列の、該型を保存する変異型または断片化配列、
−　ｃｈｕＡ遺伝子およびそのオペロンに対応するポリヌクレオチド、
−　その配列は、配列番号：１７０、１７１、１７４、１７５、１７８、１７９、１８３、１８５、１８６、１９０、１９１、１９３、１９４、１９５、１９６、１９９、２００、２０２、２０５、２０６、２０８、２０９、２１１、２１４、２１８、２２０、２２１、２３３、２３４、２３５、２４１、２４４、２４６、２４７、２４８および２５０に相当しているポリヌクレオチド、
−　グループＢ２またはＤの大腸菌の全ＤＮＡを、ＮｏｔＩとＢｌｎＩからなる群から選択される制限酵素で消化し、取得された断片のうち、配列番号：１２５、１２３、１１６、４３、４０、１２７、１３３、２７、３４、３６、４２、４６、５４、５５、３８、１２８および１５１からなる群から選択される少なくとも１つの配列にハイブリダイズするものを選択することにより取得することができ、但し、ｓｆａ、ｈｌｙ、ｃｎｆ１、ｐａｐ／ｐｒｓ、ｈｒａ、およびｉｂｅ１０のポリヌクレオチドは除外する、ポリヌクレオチド、
−　これらのポリヌクレオチドのうちの１つの配列を含んでなる（オープン・リーディング・フレーム）に、その配列が対応しているポリヌクレオチド、
−　これらのポリヌクレオチドの少なくとも１つの配列の、該型を保存する変異型または断片化配列に、その配列が対応しているポリヌクレオチド。
【請求項３５】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号：７１、１１４、１３、７７、８、３６、１２０、１３０、１７４、２０２、１７８、２２１、２０６、１７５、１９６および１７０を含んでなる群から選択される、請求項３４のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、概括的には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から分離される、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型のポリヌクレオチド、ならびに、これらのポリヌクレオチドおよびそれらがコードしているポリペプチドの生物学的使用、特には、医学的および生物工学的使用に関する。本発明において、「Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型」という表現は、グループＡのＥＣＯＲ大腸菌中で観察される頻度（ＥＣＯＲ　Ａ頻度）を考慮すると、グループＢ２のＥＣＯＲ大腸菌中（ＥＣＯＲ　Ｂ２頻度）および／またはグループＤのＥＣＯＲ大腸菌中（ＥＣＯＲ　Ｄ頻度）において、より高い頻度で、該ポリヌクレオチドが存在していることを表すものである。好ましくは、ＥＣＯＲ　Ｂ２頻度および／またはＥＣＯＲ　Ｄ頻度は、ＥＣＯＲ　Ａ頻度よりも、２倍、好ましくは３倍、より好ましくは３．５倍、非常に好ましくは４倍大きい。本発明によって提供される、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型のポリヌクレオチドの一群は、特に、そのＥＣＯＲ　Ｂ２頻度および／またはＥＣＯＲ　Ｄ頻度は１０％より大きく、そのＥＣＯＲ　Ａ頻度は２５％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％、非常に好ましくは５％未満であり、なお、常にＥＣＯＲ　Ｂ２頻度および／またはＥＣＯＲ　Ｄ頻度より小さい保たれている産物を含んでなる。
【０００２】
ＥＣＯＲコレクションは、大腸菌種の遺伝的多様性を代表するコレクションであり、ＡＴＣＣなどの寄託バンクから入手可能である。
【０００３】
大腸菌種は、現在、グループＡ、Ｂ１、Ｂ２およびＤと名付けられた４つの系統発生上の主要グループに分けられている。所与の大腸菌株の系統発生グループを決定するための現在知られている手法には、多座酵素電気泳動（ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、またはＭＬＥＥ、ならびにリボタイピング（ｒｉｂｏｔｙｐｉｎｇ）が含まれる。これらの技術は、特に、ＭＬＥＥに関しては、Ｈｅｒｚｅｒ　ｅｔ　ａｌ．　１９９０　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１７２：　６１７５〜６１８１およびＳｅｌａｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ．　１９８６　Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　５１：　８７３〜８８４に、また、リボタイピングに関しては、Ｂｉｎｇｅｎ　ｅｔ　ａｌ．　１９９４　Ｃｌｉｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｒｅｖ．　７：３１１〜３１７，　Ｂｉｎｇｅｎ　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｄｉｓ．　２２：　１５２〜１５６，　Ｂｉｎｇｅｎ　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｄｉｓ．　１７７　：６４２〜６５０およびＤｅｓｊａｒｄｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ．　１９９５　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｅｖｏｌ．　４１：　４４０〜４４８に記載されている。簡潔に言えば、ＭＬＥＥは、細菌酵素のマイグレーション多型（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）分析に基づく。各菌株について、該種に特徴的な多数の酵素（多くの場合、２０またはそれ以上）を、それらの電気泳動における移動性によって、特定する。これらの酵素おける、マイグレーション変異体の存在が、電気泳動のタイプによる、各株の特徴付けを可能としている。リボタイピングに関しては、これは、１６Ｓならびに２３Ｓ　ＲＮＡをコードしている遺伝子を含む、染色体領域の制限多型（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）の分析に基づくものである。この多型は、様々な制限酵素によるこのＤＮＡの消化とサザン・トランスファーの後に、研究対象とする菌株のＤＮＡに対してハイブリダイズすることが可能な、大腸菌の１６Ｓおよび２３Ｓ　ＲＮＡから調製される、標識化ｃＤＮＡプローブを使用して、明らかにされる。
【０００４】
しかし、従来技術の手法は、医療環境での解析またはクローニングなどの生物工学的手法用の対象とする菌株の大規模スクリーニングなどの、工業的な応用として実施する上では複雑すぎる。さらに、これらの手法は長ったらしく、また、参照株（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｓｔｒａｉｎ）のコレクションが入手可能性が必須となる。
【０００５】
また、ＥＣＯＲと名付けられたコレクションは、大腸菌種の遺伝的多様性を代表するような方法で構成されている。このコレクションは、特には、ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．３５３２０〜Ｎｏ．３５３９１）から入手可能である。それは、次のものを含んでなる：
−　グループＡの２５種類の大腸菌株、
−　グループＢ１の１６種類の大腸菌株、
−　グループＢ２の１５種類の大腸菌株、
−　グループＤの１２種類の大腸菌株、
ならびに
−　Ａ、Ｂ１、Ｂ２およびＤの４つのグループのいずれにも帰属されない４種類の大腸菌株。
【０００６】
所与の大腸菌株の系統発生を決定するという問題に対する、より効果的な解決策を提供するために、本発明は、上に定義されたＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型を示す、そのポリヌクレオチドの全セットを分離する、独創的でかつ適切な選択を行う。出願人の知る限り、かかる解決策はこれまで提案されていない。そして、本発明は、この独特な選択は、所与の大腸菌株の系統発生決定という問題を解決することを可能とするだけでなく、大腸菌の望ましくない成長、より詳しくは、人間または動物の腸管外の区画中での大腸菌の成長（敗血症、腎盂腎炎または新生児脳膜炎などの、全身的で下痢を伴わない感染症）の検出および治療を可能とすることを立証している。本発明は実際に、大腸菌に対する診断ならびに治療の一般的な手段に加え、腸管外の区画に感染し得る大腸菌（グループＢ２およびＤの大腸菌）と人間および動物の正常な生理学的フローラの要素をなす大腸菌との間の区別という利点を有する、特異的な診断ならびに治療手段を提供する。かかる治療は、腸管外の大腸菌感染症に罹患した患者に、その健康への有害効果の軽減を及ぼすことに加え、本発明にかかる、これらの特異的な診断法および治療は、広域な抗生物質治療を使用する際に、ますます頻繁に観察されている、細菌の薬剤耐性の拡大を制限することを可能としている。
【０００７】
従って、本発明者らは、上に定義される、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型のポリヌクレオチドの全セットへのアクセスを可能とする手段を開発した。本出願人の知る限りでは、これは、かかる手段について初めて述べたものであり、かかる一群の産物について初めて述べたものである。これらの手段は、さらにＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型のゲノム領域が存在することを証明している。
【０００８】
科学文献では、少数の産物が、グループＢ２またはＤの１種または複数種の大腸菌株中に存在している、また、Ａの１種または複数種の大腸菌株には一般に存在していないことが、個別的に記載されている。それは、特に、ソルボース代謝に関与する遺伝子である、ｓｆａ、ｉｂｅ１０、ｈｌｙ、ｐａｐ、ｐｒｓおよびｋｐｓ遺伝子の事例である。しかし、系統発生のマーカーとしての、これらの産物の信頼度は、未だ実証されてはいない。とにかく、これらの産物が大腸菌の様々な系統発生のグループ間の有効な識別が可能であることを暗示するものは何もない。加えて、これらの産物は個別に分離されており、グループＢ２またはＤの１種または複数種の大腸菌株中での存在、ならびに、試験がなされたグループＡの少数の大腸菌株中での不存在の観察が、その後に行われただけである。従って、当業者は、従来技術では、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型を示す可能性のある他の産物を取得するための手段を有していなかった。
【０００９】
本発明の様々な形態に共通する考え方は、上で定義する、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型の、大腸菌の染色体とプラスミドＤＮＡ断片の群を分離するための選択により、大腸菌の系統発生のマーカーを作製すること、この目的のために、これら断片の全セットの分離を可能にする方法を開発することに相当する。
【００１０】
使用する方法は、平均値３００〜５００ｂｐ程度の、およそ１００〜１５００ｂｐからなる断片の生成を可能とする、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＭｓｐＩまたはＭａｅＩＩなどの制限酵素（例えば、ｂｐ程度と、短い制限部位の任意の制限酵素）によって開裂させ、グループＢ２またはＤの１つまたは複数の大腸菌株のポリヌクレオチドの全体群から、ランダムに剪断された、グループＡの１つまたは複数の大腸菌株のポリヌクレオチドの全体群を除去することにある。この方法は、上に定義される、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型の産物のライブラリーを取得することを可能とする。下記の実施例１は、その実例を与えており、その際に、除去がなされる大腸菌株は、大腸菌株Ｃ５である。この特定の菌株は、参照技術によれば、系統発生のグループＢ２に分類されているものの、特に、プラスミド・レベルでは、それは、Ｄ起源のＤＮＡをも含んでいる。従って、大腸菌Ｃ５を特に選択することは、単一の株を使用して、Ｂ２＋　Ａ−　型、および／またはＤ＋　Ａ−　型のポリヌクレオチドの分離という特長を有している。
【００１１】
かかる取り除きは、所望の水準の徹底性が達成されるまで（ライブラリーの徹底性の水準は、ｓｆａ、ｉｂｅ１０など、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型を示すことが知られている産物の有無を検索することにより見積もることができる）、反復して繰り返すことができる。徹底性の水準を増加させたい場合には、様々な取り除きの繰り返しの間では、異なる制限酵素を使用することが望ましい。かかる方法の履行の例は、後述の実施例１に記載されている。
【００１２】
ある細菌中には存在し、かつ他の細菌中には存在しないＤＮＡを分離するための、様々な取り除きの方法は、従来技術に記述されている。しかし、本発明以前には、かかる取り除きの方法は、大腸菌種へ適用されたことはないし、また、かかる方法が、一般に系統発生のマーカーを特定するという問題、特には、大腸菌種の系統発生のマーカーを特定するという問題に対する解決策を提供できるとは予想もされていなかった。さらには、本発明は、第１に、新生児脳膜炎に関係するグループＢ２の大腸菌の単離株（系統発生のグループＢ２に帰属され、特にプラスミド・レベルでは、Ｄ起源のＤＮＡをも含んでいる大腸菌Ｃ５）、そして第２に、ＥＣＯＲコレクションからのグループＡの大腸菌株を選択する、大腸菌株の特異的な選択に対して、取り除き方法を適用することを初めて提案する。
【００１３】
従って、本発明は、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型の産物全てを取得するための手段を提供する。そのため、本願が目標としているポリヌクレオチドは、新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型のポリヌクレオチドの一群に相当する。これらのポリヌクレオチドのうちあるものは、それ自身、新規である産物に相当する（配列番号：１〜１５３、以下の例において、特定される領域１、３、４および５に対応する配列、これらの配列を含んでいるｏｒｆ配列）。また、他のものは、既知の産物との相同性を有するものの、新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型の産物に相当する（特には、配列番号：１７０、１７１、１７４、１７５、１７８、１７９、１８３、１８５、１８６、１９０、１９１、１９３、１９４、１９５、１９６、１９９、２００、２０２、２０５、２０６、２０８、２０９、２１１、２１４、２１８、２２０、２２１、２３３、２３４、２３５、２４１、２４４、２４６、２４７、２４８、２５０、ｃｈｕＡ遺伝子、ならびに、配列番号：２４１、１９５、１８５または２４８などのこのＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型を保持しているｃｈｕＡ遺伝子の断片）。
【００１４】
従って、本出願の対象は、新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型で、かつそれ自体、新規な産物に相当する、単離されたポリヌクレオチドのいずれもである。それは特に、以下ものからなる群から選択される配列に相当する、いずれかの単離されたポリヌクレオチドを目的としている。
【００１５】
−　配列番号：１〜１５３の配列、
−　グループＢ２またはグループＤの大腸菌（例えば、敗血症性または髄膜の感染症に罹患している患者の血液から単離された大腸菌株など）の全ＤＮＡを、ＮｏｔＩとＢｌｎＩからなる群から選択される制限酵素で消化し、得られる断片のうち、配列番号：１３４、１４４、１０９、１１５、１４０、１３５、３３、５６、１２２、１３０、１４１、２５、４８、５１、５７、１２１、４４、４５、１１３、１１９、１２０、２３、５２からなる群から選択した少なくとも１つの配列とハイブリダイズするものを選択することにより取得可能なポリヌクレオチド配列、
ならびに
−　前記配列のうちの１つを含んでいるｏｒｆ（オープン・リーディング・フレーム）の配列、
−　これら配列の、該型を保存する変異型または断片化配列。
【００１６】
このポリヌクレオチド群の生成は、以下の例において、詳細に記述する。それは、新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型で、かつ産物としても新規である、ポリヌクレオチドに相当する。配列番号：１〜１５３の単離された断片以外に、それは、本発明に従って、特定された新規な領域１、３、４および５、およびこれらのポリヌクレオチド上で同定することができるｏｒｆを含んでいる（実施例を参照）。
【００１７】
「配列の型を保持している配列」という表現は、ここでは、この親配列に対応するポリヌクレオチドの（上に定義した）Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型を保持している、いずれの配列をも意味するものである。「変異体」という用語は、ここでは、該親配列に対して、塩基の挿入および／または欠失および／または置換を有している、いずれの配列をも意味するものである、これは、親配列に相補的なすべての配列をも含む。「断片化」という用語は、ここでは、該親配列のいずれの断片も意味するものである。
【００１８】
本出願においては、いずれの菌株も、Ｂｅｒｇｅｙの系統的細菌学マニュアル（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）（特に、第１巻参照）によって与えられた基準に従って、大腸菌種に属すると考えられる場合には、大腸菌であると考える。
【００１９】
同様に、いずれの大腸菌株も、例えば、多座酵素電気泳動（ＭＬＥＥ）および／またはリボタイピングなどの、Ｂ２／ＤとＡとの弁別に適している系統発生参照試験（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｃ　ｔｅｓｔ）を実施した結果、そうである考えられる場合には、グループＢ２にまたはグループＡに属すると考える。かかる系統発生的手法は当業者には周知である。適切なプロトコルの例は、ＭＬＥＥについて、Ｈｅｒｚｅｒ　ｅｔ　ａｌ．　１９９０　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１７２：６１７５〜６１８１およびＳｅｌａｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ．　１９８６　Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　５１：８７３〜８８４に、また、リボタイピングについて、Ｂｉｎｇｅｎ　ｅｔ　ａｌ．　１９９４　Ｃｌｉｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｒｅｖ．　７：３１１〜３１７，　Ｂｉｎｇｅｎ　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｄｉｓ．２２：１５２〜１５６，Ｂｉｎｇｅｎ　ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．　１７７：６４２〜６５０およびＤｅｓｊａｒｄｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ．　１９９５　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｅｖｏｌ．　４１：４４０〜４４８に記載されている。
【００２０】
かかる決定の例は、以下の実施例に与えられる。
【００２１】
与えられた細菌の菌株または試料中に存在する、あるいは存在しないという事実は、当業者に共通の一般的概念に相当する。所与のポリヌクレオチドが、所与の大腸菌株中に存在しているか否かを決定するためには、特には、前記大腸菌株のヌクレオチド全体群のサザン・トランスファーと、このトランスファーに、試験すべきポリヌクレオチドまたはこのポリヌクレオチドに由来するプローブを、ポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーション反応に適する条件下で、接触させることにより、該決定を行うことができる。かかるプローブとこのような条件の例は、実施例１に与えられる。そして、陽性なハイブリダイゼーションは、前記大腸菌株中における前記ポリヌクレオチドの存在と解釈でき、また、そして、陰性あるいはバック・グラウンド・ノイズに対して有意ではないハイブリダイゼーションは、前記大腸菌株中に前記ポリヌクレオチドの不在と解釈できる。決定は、また、かかる全体群より、かかるプライマーを使用して、目標の増幅に好適な条件下で、前記ポリヌクレオチドに基づいて構築され、また、前記大腸菌株のヌクレオチド全体群に接触させた増幅プライマーを使用して、陽性の、あるいは、陰性の増幅かのＰＣＲ検出によって実施することもできる。かかりＰＣＲ手順の実例は、以下の実施例において与えられる。
【００２２】
本発明にかかる、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型のポリヌクレオチドの大多数は、グループＢ２のＥＣＯＲ大腸菌中において、１０％を超える、特に４０％を超える、好ましくは５０％を超える、より好ましくは６０％を超える、そしてさらに好ましくは７０％を超える頻度（実施例２および表３を参照）で存在することが有利である。それらのうちのいくつかは、８０％を超える頻度、または、１００％と等しい頻度でさえ、グループＢ２のＥＣＯＲ大腸菌中に存在し、一方、その際、グループＡのＥＣＯＲ大腸菌の中では、５％未満、または３％未満しか、あるいは０％に等しい頻度でしか存在していない。
【００２３】
本発明にかかる、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型のポリヌクレオチドは、グループＢ２またはＤの大腸菌の存在を、少なくとも９０％の確率（前記ポリヌクレオチドの存在において）で簡単に検出するために利用することもできる。また、これらを組み合わせて、または他の産物とともに用いると、それらは、グループＡ、Ｂ１、Ｂ２およびＤの大腸菌間での完全な識別を可能にする（実施例５参照）。それらは、また、重要性のある治療、緩和および／または予防的な適用を有している。これらのポリヌクレオチドを、これ以降、新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型の新規なポリヌクレオチドと称する。
【００２４】
本願は、また、上に定義される、新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型の新規なポリヌクレオチドの少なくとも１つのＰＣＲ増幅を可能にする、プライマー対のいずれをも対象とする。適切なＰＣＲ実験条件の設定は、当業者には容易に入手可能である（特に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　−　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｍａｎｉａｔｉｓ，ａｎｄ　ｉｎ　ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ　Ｖｏｌ．２，　Ｃｈａｐ．１４　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ参照。また、Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．　１９８９　Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ；　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ　Ｅｄ．，ａｎｄ　ｉｎ　ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ　Ｖｏｌ．２　Ｃｈａｐ．１５　参照）。その例は、以下の実施例において与えられる。
【００２５】
本願は、特には、配列番号：１６４と１６５の対に対応するプライマー対を対象とする。この特定のプライマー対は、配列番号：１１９の断片（クローンＴｓｐＥ４Ｃ２）の増幅を可能とする。
【００２６】
本願はまた、上に定義される、新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型の新規なポリヌクレオチドの少なくとも１個を含んでなるヌクレオチド・プローブのいずれをも対象とする。本願は、特に、（配列番号：１６０；１６１）（配列番号：１６２；１６３）または（配列番号：１６４；１６５）などの、本発明による少なくとも１対のプライマーを使用して、特にはＰＣＲ増幅によって（実施例参照）、取得されるプローブのいずれをも対象とする。
【００２７】
一般に、上で述べた条件下で、少なくとも１個の新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型のポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅を可能にするプライマー対のいずれも、およびかかるポリヌクレオチドに対するプローブのいずれも、およびかかるポリヌクレオチドによってコードされているポリペプチドに対する抗体のいずれもは、本発明に従って、大腸菌種の細菌の系統発生の決定のために使用することができる。本発明は、さらに、ｙｊａＡ遺伝子（配列番号：２５４；配列番号：２５５のタンパク質）が、大腸菌に対して、重要な系統発生決定用ツールであることを示す。従って、ｙｊａＡの検出（実施例５参照）を可能とする産物のいずれもの、大腸菌の系統発生決定のための、使用は、本願の領域中に入る。本願は、特には、１対のプライマー（例えば、配列番号：１６２；１６３）、プローブまたは特異的抗体などの産物を含んでなる医薬組成物のいずれをも対象とする。
【００２８】
本願は、また、その配列が、新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型新規なポリヌクレオチドの少なくとも１個のアンチセンス配列に相当していることを特徴とするアンチセンス・ポリヌクレオチドのいずれか、ならびに、そのアミノ酸配列が、普遍的な遺伝暗号に従い、また、このコードの縮退を考慮に入れることにより、新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型の新規なポリヌクレオチドの少なくとも１個によって、コードされる配列に相当していることを特徴とする単離されたポリペプチドのいずれをも対象とする。
【００２９】
本願は、また、実施例６中に開示されるような、血清中での成長による腸外成長、あるいは、動物中での増殖などの、重要な生物学的機能を阻害するであろう、新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型の新規なポリペプチドの少なくとも１個に対して結合が可能な、結合性産物と、本発明のポリヌクレオチドによってコードされた該ポリペプチドとの組み合わせのいずれをも対象とする。かかる産物は、特に、抗体またはモノクローン抗体、および該ポリペプチドの生物学的機能を阻害する化合物に対応する。本発明にかかる該ポリペプチドを使用して、かかる結合性の産物の製造方法は、当業者には利用可能である。それらは、特に、ウサギなどの動物の免疫、生産された血清の採取、場合によっては、取得される血清の精製を引き続いて行うことを含んでなる、常用の方法である。モノクローン抗体の生成に適する手法は、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ　１９７５，　２５６：４９５〜４９７）のものである。
【００３０】
本発明においては、「結合の可能な」という表現は、前記結合性の産物を、人間または動物の生体に投与する際には、生理学的タイプの状態（ｉｎ　ｖｉｖｏまたは擬似的なｉｎ　ｖｉｖｏ状態）を、また、例えば、大腸菌細菌の系統発生グループ決定のため、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの分析および方法において、前記結合力のある産物を使用する際には、ＥＬＩＳＡタイプの状態を意味するものである。
【００３１】
本願は、また、新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型の新規なポリヌクレオチドの少なくとも１個を含んでなるベクターのいずれをも、ならびに、新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型の新規なポリヌクレオチドの少なくとも１個および／または本発明にかかるベクター少なくとも１個を、トランスフェクションによって含んでいること、かつ／または前記形質転換により新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型の新規なポリヌクレオチドに対応するポリペプチドの少なくとも１個の、この細胞による生産の誘導がなされていることを特徴とする、遺伝子操作により形質転換された細胞のいずれをも対象とする。
【００３２】
本出願の対象は、また、新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型の該新規なポリヌクレオチド、新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型の新規なポリヌクレオチドの少なくとも１個に対応する該ポリペプチド、ならびに、上述の本発明にかかる該ベクターおよび細胞からなる群から選択される、少なくとも１個の合成物を含んでなる、組成物、特には、医薬組成物のいずれもである。かかる組成物は、特には、大腸菌感染、特に腸管外の大腸菌感染（全身的で下痢を伴わない感染）の治療および／または緩和および／または予防に有用である。前記合成物が免疫原性である、あるいは免疫原性とされている場合には、これらの組成物はワクチンに相当することができる。
【００３３】
また、本出願の対象は、新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型の該新規なポリヌクレオチド、上記の本発明にかかるプライマー対およびプローブ、および上述の本発明による結合性の産物からなる群から選択される少なくとも１個の合成物を含んでなる、組成物、特には、医薬組成物のいずれもである。かかる組成物は、特に、大腸菌細菌の系統発生決定に有用である。従って、それは、診断のキットまたは組成物に相当することができる。
【００３４】
また、本出願の対象は、不活性な担体と組み合わせて、上記の本発明によるアンチセンス・ポリヌクレオチド、および上述の発明による結合性の産物からなる群から選択される少なくとも１個の合成物を含んでなる、組成物、特には、医薬組成物のいずれもである。かかる組成物も、大腸菌細菌の系統発生決定のために使用することができ、また、診断のキットや組成物の形態をとることができる。それらは、さらに、衛生上の汚染、大腸菌感染、特には、腸管外の大腸菌の存在（実施例参照）のような、大腸菌の望ましくない生育の処置および／または軽減かつ／または防止するため、治療的なキャパシティー内で使用することができる。
【００３５】
さらに、本出願の対象は、かかる組成物を製造するための、これらの本発明による産物の使用のいずれもである。
【００３６】
本発明は、また、その配列は既知の産物との相同性を示すが、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型であることは新規なことである、産物をも提供する。特に、配列番号：１７０、１７１、１７４、１７５、１７８、１７９、１８３、１８５、１８６、１９０、１９１、１９３、１９４、１９５、１９６、１９９、２００、２０２、２０５、２０６、２０８、２０９、２１１、２１４、２１８、２２０、２２１、２３３、２３４、２３５、２４１、２４４、２４６、２４７、２４８、２５０、これらの配列を含んでいるｏｒｆ（オープン・リーディング・フレーム）、ｃｈｕＡ遺伝子、この遺伝子のオペロン、ならびに、該型を保持している断片および変異体、および以下の実施例１に記述される、大腸菌の領域２、６ａおよび６ｂに対応するポリヌクレオチド（ただし、ポリヌクレオチド　ｓｆａ、ｈｌｙ、ｃｎｆ１、ｐａｐ／ｐｒｓ、ｈｒａおよびｉｂｅ１０は除外する）がある。これらの産物を、これ以降、「相同性を示すものの、新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型の産物」と称する。
【００３７】
該ｃｈｕＡ遺伝子は、既知の産物（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｕ６７９２０）であり、それは、腸および腸管外の感染の原因となる少数の大腸菌中、鉄の代謝に関わるＳｈｉｇｅｌｌａ遺伝子中にあると記述されており、また、Ｙｅｒｓｉｎｉａ遺伝子と相同的であると記載されている。しかし、それは系統発生のマーカーとして記載されたことはない。そして、本発明は、初めて、尿路病原性大腸菌株Ｊ９６中におけるその存在を報告するとともに、それは、ＥＣＯＲコレクションの、Ｂ２およびＤでは１００％で、また、ＡおよびＢ１では０％で、存在していることを初めて報告する。Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型の、ｃｈｕＡの４個の断片が、また記述される（配列番号：２４１、１９５、１８５および２４８）。
【００３８】
相同性を示すものの、新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型の、本発明にかかる該ポリヌクレオチドの大多数は、グループＢ２のＥＣＯＲ大腸菌中に、４０％を超える、好ましくは５０％を超える、より好ましくは６０％を超える、そしてさらに好ましくは７０％を超える頻度で存在することが有利である。それらのうちのいくつかは、グループＢ２のＥＣＯＲ大腸菌中に、８０％を超える頻度で、あるいは１００％に等しい頻度ですら存在するものの、同時に、グループＡのＥＣＯＲ大腸菌中では、５％未満、または３％未満でしか、さらには０％と等しい頻度でしか存在していない（実施例２参照）。
【００３９】
従って、本願は、大腸菌細菌の系統発生決定のため、汚染大腸菌や腸管外大腸菌などの、望ましくない大腸菌細菌の有無の診断のため、および／または大腸菌感染の診断のため、および／またはかかる系統発生の決定および／またはかかる診断を用途とする組成物の製造のために、新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型の合成物の使用のいずれをも対象とする。
【００４０】
それは、特には、以下のものからなる群から選択される、少なくとも１個の合成物の使用のいずれをも対象とする。
【００４１】
−　ｃｈｕＡ遺伝子およびそのオペロンに対応するポリヌクレオチド、
−　配列番号：１７０、１７１、１７４、１７５、１７８、１７９、１８３、１８５、１８６、１９０、１９１、１９３、１９４、１９５、１９６、１９９、２００、２０２、２０５、２０６、２０８、２０９、２１１、２１４、２１８、２２０、２２１、２３３、２３４、２３５、２４１、２４４、２４６、２４７、２４８および２５０に、その配列が相当しているポリヌクレオチド、
−　グループＢ２またはＤの大腸菌の全ＤＮＡをＮｏｔＩとＢｌｎＩからなる群から選択される制限酵素で消化し、得られる断片のうち、配列番号：１２５、１２３、１１６、４３、４０、１２７、１３３、２７、３４、３６、４２、４６、５４、５５、３８、１２８および１５１からなる群から選択される少なくとも１つの配列にハイブリダイズするものを選択することにより取得することができ、但し、ｓｆａ、ｈｌｙ、ｃｎｆ１、ｐａｐ／ｐｒｓ、ｈｒａ、およびｉｂｅ１０のポリヌクレオチドは除外される、ポリヌクレオチド、
−　前の３つのパラグラフに挙げた、該ポリヌクレオチドのうちの１つの配列を含んでなるｏｒｆに、その配列が相当しているポリヌクレオチド、
−　これらのポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つの配列（および、特には、配列番号：２４１、１９５、１８５および２４８）の、該型を保存する変異型または断片化配列に、その配列が対応しているポリヌクレオチド、
−　その配列は、これらのポリヌクレオチドに由来している、プライマー対、プローブおよびアンチセンスのポリヌクレオチド、
−　新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと結合することができる、大腸菌細菌の系統発生決定のための、結合性の産物。
【００４２】
本発明はまた、汚染大腸菌や腸管外大腸菌などの、望ましくない大腸菌の有無の診断のため、および／または大腸菌感染の診断のための、これらの合成物の少なくとも１種類の使用を対象とする。それはまた、かかる系統発生決定および／またはかかる診断を用途とする組成物の製造のために、これらの合成物の少なくとも１種類の使用のいずれをも対象とする。
【００４３】
これら合成物、ｃｈｕＡ、配列番号：１７０、１７１、１７４、１７５、１７８、１７９、１８３、１８５、１８６、１９０、１９１、１９３、１９４、１９５、１９６、１９９、２００、２０２、２０５、２０６、２０８、２０９、２１１、２１４、２１８、２２０、２２１、２３３、２３４、２３５、２４１、２４４、２４６、２４７、２４８、２５０、ならびにこれらの産物の該型を保持する変異体または断片は、実際にも、（上に定義される）新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型の産物に対応している。かかる合成物の有無の検出は、特には、ヌクレオチド・ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ増幅またはそれらのポリペプチド産物の検出により行うことができる。かかる合成物の存在の検出は、Ｂ２またはＤ大腸菌が存在していると結論することを可能とする。これらの合成物の組み合わせた使用、あるいは、これらの化合物の１種類以上の、特には、ｙｊａＡなどの他の産物と組み合わせた使用は、該系統発生の分類の精査を可能とする。ｃｈｕＡならびにｙｊａＡ（配列番号：２５４）の有無の検出の組み合わせた使用は、特には、グループＢ２の大腸菌および／またはグループＤの大腸菌が存在するか存在しないかに関して、結論することを可能とする（実施例５参照）。
【００４４】
本願はまた、大腸菌感染、腸管外大腸菌の存在または衛生上の汚染などの、大腸菌の望ましくない生育を軽減しかつ／または防止しかつ／または処置することを目的とする、組成物、特には医薬組成物の製造のための、新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型の合成物の使用のいすれをも対象とする。
【００４５】
それは、以下のものからなる群から選択される、少なくとも１個の合成物の使用のいずれをも対象とする。
【００４６】
−　ｃｈｕＡ遺伝子およびそのオペロンに対応するポリヌクレオチド、
−　その配列が、配列番号：１７０、１７１、１７４、１７５、１７８、１７９、１８３、１８５、１８６、１９０、１９１、１９３、１９４、１９５、１９６、１９９、２００、２０２、２０５、２０６、２０８、２０９、２１１、２１４、２１８、２２０、２２１、２３３、２３４、２３５、２４１、２４４、２４６、２４７、２４８および２５０に相当しているポリヌクレオチド、
−　グループＢ２またはＤの大腸菌の全ＤＮＡをＮｏｔＩとＢｌｎＩからなる群から選択される制限酵素で消化し、得られる断片のうち、配列番号：１２５、１２３、１１６、４３、４０、１２７、１３３、２７、３４、３６、４２、４６、５４、５５、３８、１２８および１５１からなる群から選択される少なくとも１つの配列にハイブリダイズするものを選択することにより取得することができ、但し、ｓｆａ、ｈｌｙ、ｃｎｆ１、ｐａｐ／ｐｒｓ、ｈｒａ、およびｉｂｅ１０のポリヌクレオチドは除外される、ポリヌクレオチド、
−　前の３つのパラグラフで挙げられた、該ポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つの配列を含んでなるｏｒｆ（オープン・リーディング・フレーム）に、その配列が対応しているポリヌクレオチド、
−　これらのポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つの配列（および、特には、配列番号：２４１、１９５、１８５および２４８）の、該型を保存する変異型または断片化配列に、その配列が対応しているポリヌクレオチド、
−　この群の該ポリヌクレオチドのアンチセンス・ポリヌクレオチドであるポリヌクレオチド、
−　その配列が、普遍的な遺伝暗号に従い、かつこのコードの縮退を考慮に入れた際、これらのポリヌクレオチドに対応しているポリペプチド、
−　新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型のポリヌクレオチドによってコードされているポリペプチドに対して結合することができる、結合性の産物（例えば、抗体）、
−　これらのポリヌクレオチドの少なくとも１つを含んでなるベクター、
−　少なくとも１個のこれらのポリヌクレオチドおよび／または少なくとも１個のベクターを含んでなり、および／または、大腸菌感染、腸管外大腸菌の存在あるいは衛生上の汚染などの、大腸菌の望ましくない生育を軽減しかつ／または防止しかつ／または処置することを目的とする、組成物、特には医薬組成物の製造のための、少なくとも１個のこれらのポリペプチドの産生を、その形質転換が誘導する、遺伝子操作により形質転換された細胞。
【００４７】
別の適用形態に従うと、本出願は、大腸菌の成長を阻害することができる、特に、その腸管外の増殖を阻害することができる化合物の特定を可能とする方法のいずれをも対象とし、それは、以下の少なくとも１個の化合物の検出を含んでなる。
【００４８】
ｉ．　以下のものからなる群から選択される、少なくとも一つのポリヌクレオチドと結合することができるもの。
【００４９】
−　新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型の新規なポリヌクレオチド、すなわち、
・　配列番号：１〜１５３の配列、
・　グループＢ２またはＤの大腸菌（例えば、敗血症性または髄膜の感染症に罹患している患者の血液から単離された大腸菌株など）の全ＤＮＡを、ＮｏｔＩとＢｌｎＩからなる群から選択される制限酵素で消化し、得られる断片のうち、配列番号：１３４、１４４、１０９、１１５、１４０、１３５、３３、５６、１２２、１３０、１４１、２５、４８、５１、５７、１２１、４４、４５、１１３、１１９、１２０、２３、５２からなる群から選択した少なくとも１つの配列とハイブリダイズするものを選択し、そして、選択された断片の配列決定することにより取得可能なポリヌクレオチド配列、
ならびに
・　これらの配列のうちの１つを含むｏｒｆ（オープン・リーディング・フレーム）の配列、
・　これらの配列の、該型を保存する変異型または断片化配列、
−　ｃｈｕＡ遺伝子およびそのオペロンに対応するポリヌクレオチド、
−　その配列は、配列番号：１７０、１７１、１７４、１７５、１７８、１７９、１８３、１８５、１８６、１９０、１９１、１９３、１９４、１９５、１９６、１９９、２００、２０２、２０５、２０６、２０８、２０９、２１１、２１４、２１８、２２０、２２１、２３３、２３４、２３５、２４１、２４４、２４６、２４７、２４８および２５０に相当しているポリヌクレオチド、
−　グループＢ２またはグループＤの大腸菌の全ＤＮＡを、ＮｏｔＩとＢｌｎＩからなる群から選択される制限酵素で消化し、取得された断片のうち、配列番号：１２５、１２３、１１６、４３、４０、１２７、１３３、２７、３４、３６、４２、４６、５４、５５、３８、１２８および１５１からなる群から選択される少なくとも１つの配列にハイブリダイズするものを選択することにより取得することができ、但し、ｓｆａ、ｈｌｙ、ｃｎｆ１、ｐａｐ／ｐｒｓ、ｈｒａ、およびｉｂｅ１０のポリヌクレオチドは除外する、ポリヌクレオチド、
−　前の４つのパラグラフで挙げたポリヌクレオチドのうちの１つの配列を含んでなるｏｒｆに、その配列が相当するポリヌクレオチド、
−　これらのポリヌクレオチド、および特に、（配列番号：２４１、１９５、１８５および２４８）の少なくとも１つの配列の、該型を保存する変異型または断片化配列に、その配列が対応しているポリヌクレオチド、
および
ｉｉ．　このポリヌクレオチドの正確な転写および／または翻訳を阻害することができるもの。
【００５０】
本発明はまた、そのｏｒｆは、以下の群から選択されるポリヌクレオチドを含んでなる、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の活性を阻害することができる少なくとも１個の化合物の検出を含んでなることを特徴とする、大腸菌細菌の生育、特には、その腸管外での増殖を阻害することができる化合物を特定することを可能とする方法のいすれをも対象とする。
【００５１】
−　新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型の新規なポリヌクレオチド、すなわち、
・　配列番号：１〜１５３の配列、
・　グループＢ２またはグループＤの大腸菌（例えば、敗血症性または髄膜の感染症に罹患している患者の血液から単離された大腸菌株など）の全ＤＮＡを、ＮｏｔＩとＢｌｎＩからなる群から選択される制限酵素で消化し、得られる断片のうち、配列番号：１３４、１４４、１０９、１１５、１４０、１３５、３３、５６、１２２、１３０、１４１、２５、４８、５１、５７、１２１、４４、４５、１１３、１１９、１２０、２３、５２からなる群から選択した少なくとも１つの配列とハイブリダイズするものを選択し、そして、選択された断片の配列決定することにより取得可能なポリヌクレオチド配列、
ならびに
・　これら配列のうちの１つを含むｏｒｆ（オープン・リーディング・フレーム）の配列、
・　これらの配列の、該型を保存する変異型または断片化配列、
−　ｃｈｕＡ遺伝子およびそのオペロンに対応するポリヌクレオチド、
−　その配列は、配列番号：１７０、１７１、１７４、１７５、１７８、１７９、１８３、１８５、１８６、１９０、１９１、１９３、１９４、１９５、１９６、１９９、２００、２０２、２０５、２０６、２０８、２０９、２１１、２１４、２１８、２２０、２２１、２３３、２３４、２３５、２４１、２４４、２４６、２４７、２４８および２５０に相当しているポリヌクレオチド、
−　グループＢ２またはＤの大腸菌の全ＤＮＡを、ＮｏｔＩとＢｌｎＩからなる群から選択される制限酵素で消化し、取得された断片のうち、配列番号：１２５、１２３、１１６、４３、４０、１２７、１３３、２７、３４、３６、４２、４６、５４、５５、３８、１２８および１５１からなる群から選択される少なくとも１つの配列にハイブリダイズするものを選択することにより取得することができ、但し、ｓｆａ、ｈｌｙ、ｃｎｆ１、ｐａｐ／ｐｒｓ、ｈｒａ、およびｉｂｅ１０のポリヌクレオチドは除外する、ポリヌクレオチド、
−　その配列は、これらのポリヌクレオチドの少なくとも１つの配列を含んでなるｏｒｆ（オープン・リーディング・フレーム）に対応しているポリヌクレオチド、
−　これらのポリヌクレオチドの少なくとも１つの配列の、該型を保存する変異型または断片化配列に、その配列が対応しているポリヌクレオチド。
【００５２】
かかる化合物は、特に、化学的なおよび／または生物学的ライブラリーをスクリーニングすることにより取得することができる。
【００５３】
本願はまた、これらの方法のいずれかにより特定されるような化合物のいずれか、ならびに、少なくとも１個のかかる化合物を含んでなる、組成物、特には、医薬組成物のいずれをも対象とする。かかる組成物は、特に、大腸菌感染、または大腸菌汚染などの大腸菌の望ましくない生育を治療しかつ／または軽減しかつ／または防止するために有用であり、特には、腸管外の大腸菌細菌の存在を治療しかつ／または軽減しかつ／または予防するために有用である。
【００５４】
本発明の対象はまた、本発明の特に際立った形態に従って、以下の新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型の少なくとも１個のポリヌクレオチド（これらのポリヌクレオチドは産物として新規であるか、あるいは、既知の産物との相同性を示すかのいずれか）の有無の検出を実行する、系統発生的な識別方法である。
【００５５】
−　本発明による新規なポリヌクレオチド、すなわち、
・　配列番号：１〜１５３の配列、
・　グループＢ２またはグループＤの大腸菌（例えば、敗血症性または髄膜の感染症に罹患している患者の血液から単離された大腸菌株など）の全ＤＮＡを、ＮｏｔＩとＢｌｎＩからなる群から選択される制限酵素で消化し、得られる断片のうち、配列番号：１３４、１４４、１０９、１１５、１４０、１３５、３３、５６、１２２、１３０、１４１、２５、４８、５１、５７、１２１、４４、４５、１１３、１１９、１２０、２３、５２からなる群から選択した少なくとも１つの配列とハイブリダイズするものを選択し、そして、選択された断片の配列決定することにより取得可能なポリヌクレオチド配列、
ならびに
・　これら配列のうちの１つを含むｏｒｆ（オープン・リーディング・フレーム）の配列、
・　これらの配列の、該型を保存する変異型または断片化配列、
−　ｃｈｕＡ遺伝子およびそのオペロンに対応するポリヌクレオチド、
−　その配列は、配列番号：１７０、１７１、１７４、１７５、１７８、１７９、１８３、１８５、１８６、１９０、１９１、１９３、１９４、１９５、１９６、１９９、２００、２０２、２０５、２０６、２０８、２０９、２１１、２１４、２１８、２２０、２２１、２３３、２３４、２３５、２４１、２４４、２４６、２４７、２４８および２５０に相当しているポリヌクレオチド、
−　グループＢ２またはＤの大腸菌の全ＤＮＡを、ＮｏｔＩとＢｌｎＩからなる群から選択される制限酵素で消化し、取得された断片のうち、配列番号：１２５、１２３、１１６、４３、４０、１２７、１３３、２７、３４、３６、４２、４６、５４、５５、３８、１２８および１５１からなる群から選択される少なくとも１つの配列にハイブリダイズするものを選択することにより取得することができ、但し、ｓｆａ、ｈｌｙ、ｃｎｆ１、ｐａｐ／ｐｒｓ、ｈｒａ、およびｉｂｅ１０のポリヌクレオチドは除外する、ポリヌクレオチド、
−　その配列は、これらのポリヌクレオチドの少なくとも１つの配列を含んでなるｏｒｆ（オープン・リーディング・フレーム）に対応しているポリヌクレオチド、
−　これらのポリヌクレオチドの少なくとも１つの配列の、該型を保存する変異型または断片化配列に、その配列が対応しているポリヌクレオチド。
【００５６】
この検出は、前記ポリヌクレオチド、またはその断片の直接の検出、あるいはそれに対応している１つまたは複数のポリペプチド（新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型のポリヌクレオチドによってコードされているポリペプチド）の検出によって行うことができる。特に、本願は、以下のものからなる群から選択される少なくとも１個の合成物の使用を含んでなることを特徴とする、系統発生的な識別方法のいずれをも対象とする。
【００５７】
−　新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型を示す新規なポリヌクレオチド、すなわち、
・　配列番号：１〜１５３の配列、
・　グループＢ２またはグループＤの大腸菌（例えば、敗血症性または髄膜の感染症に罹患している患者の血液から単離された大腸菌株など）の全ＤＮＡを、ＮｏｔＩとＢｌｎＩからなる群から選択される制限酵素で消化し、得られる断片のうち、配列番号：１３４、１４４、１０９、１１５、１４０、１３５、３３、５６、１２２、１３０、１４１、２５、４８、５１、５７、１２１、４４、４５、１１３、１１９、１２０、２３、５２からなる群から選択した少なくとも１つの配列とハイブリダイズするものを選択し、そして、選択された断片の配列決定することにより取得可能なポリヌクレオチド配列、
ならびに
・　これら配列のうちの１つを含むｏｒｆ（オープン・リーディング・フレーム）の配列、
・　これらの配列の、該型を保存する変異型または断片化配列、
−　ｃｈｕＡ遺伝子およびそのオペロンに対応するポリヌクレオチド、
−　その配列は、配列番号：１７０、１７１、１７４、１７５、１７８、１７９、１８３、１８５、１８６、１９０、１９１、１９３、１９４、１９５、１９６、１９９、２００、２０２、２０５、２０６、２０８、２０９、２１１、２１４、２１８、２２０、２２１、２３３、２３４、２３５、２４１、２４４、２４６、２４７、２４８および２５０に相当しているポリヌクレオチド、
−　グループＢ２またはＤの大腸菌の全ＤＮＡを、ＮｏｔＩとＢｌｎＩからなる群から選択される制限酵素で消化し、取得された断片のうち、配列番号：１２５、１２３、１１６、４３、４０、１２７、１３３、２７、３４、３６、４２、４６、５４、５５、３８、１２８および１５１からなる群から選択される少なくとも１つの配列にハイブリダイズするものを選択することにより取得することができ、但し、ｓｆａ、ｈｌｙ、ｃｎｆ１、ｐａｐ／ｐｒｓ、ｈｒａ、およびｉｂｅ１０のポリヌクレオチドは除外する、ポリヌクレオチド、
−　その配列が、この一群のポリヌクレオチドの配列（特には、配列番号：２４１、１９５、１８５および２４８）の、該型を保存する変異型または断片化配列に対応しているポリヌクレオチド、
−　この一群のポリヌクレオチドの配列を含んでなるｏｒｆに、その配列が相当しているポリヌクレオチド、
−　上で定義される、新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型を示すポリヌクレオチドの増幅を可能とするプライマー対、
−　上で定義される、新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型を示すポリヌクレオチドを含んでなるプローブ、
−　上で定義される、新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型のポリヌクレオチドのアンチセンス・ポリヌクレオチドであるポリヌクレオチド、
−　本発明にかかる、大腸菌の生育を阻害することが可能な化合物の識別方法によって特定される化合物、
−　上で定義される、新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型のポリヌクレオチドに対して結合が可能な結合性の産物、
−　上で定義される、新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型のポリヌクレオチドによってコードされているポリペプチドに対して結合が可能な結合性の産物（例えば、抗体）。
【００５８】
この実施は、前記「少なくとも１個の化合物」により、生物学的試料中の、その目標を構成する、ポリヌクレオチド（１個または複数）、または適当であれば、ポリペプチド（１個または複数）を検出することが可能であるような、当業者に既知の手法のいずれか：抗体−抗原タイプの反応用のＥＬＩＳＡ、ポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーションおよび／または増幅タイプの反応用のサザンタイプのハイブリダイゼーションまたはＰＣＲによって、行うことが可能である。
【００５９】
適切な生物学的試料は、特に、通常無菌状態である（血液、脳脊髄液−ＣＳＦ−、滲出部からの液体、等）、または無菌でない（大便、中咽頭、皮膚、等）、各部位から生じた人間起源の試料全て、またさらに、環境の起源（土壌、水など）の、食物起源の、動物起源の試料ならびに微生物学的培養物をも含む。
【００６０】
この方法は、前記検出が陽性である際には、グループＢ２および／またはＤの大腸菌細菌が存在すると結論を下すことを可能とする。ｃｈｕＡの有無の検出だけでも、この方法は、この検出結果が陽性である際に、グループＢ２またはＤの大腸菌細菌が存在すると結論を下すことを可能とする。この検出結果が陰性である場合、かつ、該試料が実際に大腸菌を含んでいる限り、それは、グループＢ１またはＡの細菌が存在していると結論を下すことを可能とする。
【００６１】
この方法はまた、例えば、ｃｈｕＡ遺伝子の有無、ならびに、配列番号：１１９の断片の有無を検出するような方法における、前記化合物のいくつかの使用を含むことができる。それは、以下のように結論を下すことを可能とする。
【００６２】
−　この検出が、ｃｈｕＡには陰性で、配列番号：１１９には陽性である場合には、グループＢ１の大腸菌細菌が存在している。
【００６３】
−　この検出が、ｃｈｕＡには陰性で、配列番号：１１９では陰性である場合には、グループＡの大腸菌細菌が存在している。
【００６４】
かかる方法ならびに検出の例は、以下の例において与えられる。ｃｈｕＡ遺伝子の有無の検出を可能とする、配列番号：１６０と１６１のプライマー対、ならびに、配列番号：１１９（ＴｓｐＥ４．Ｃ２）の有無の検出を可能とする、配列番号：１６４および１６５のプライマー対が、特に記載されている。
【００６５】
本発明による、系統発生的な識別方法は、さらに、ｙｊａＡ遺伝子の有無の検出を達成することができる。ｙｊａＡ遺伝子（図５参照）は、従来技術の中では、大腸菌株Ｋ１２（グループＡ）中に存在することが知られている。それが、グループＢ２とグループＤの間の識別が可能な、発生系統的マーカーを構成することを示唆するものは、従来技術には全くない。
【００６６】
図５は、ｙｊａＡ配列（配列番号：２５４）および、その対応するＯＲＦ（配列番号：２５５）を示す。
【００６７】
ｙｊａＡ遺伝子の有無の検出は、当業者が容易に入手可能な技術のいずれかによって実施することができる、それは、特に、ポリヌクレオチド、またはその断片（配列番号：２５４）の検出により、あるいは、それに対応するポリペプチド（配列番号：２５５）の検出により行うことができる。かかる検出を可能とする試薬：ポリヌクレオチド検出用の増幅プローブまたはプライマー、ポリペプチド検出用の血清または抗体型の化合物、の開発は、当業者には容易に達成可能である。ポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーション反応は、例えば、サザンおよび／またはＰＣＲにより行うことができ、また、抗原−抗体タイプのものは、ＥＬＩＳＡにより行うことができる。かかる検出過程の実施の例は、以下の例において与えられる。ｙｊａＡの増幅を可能とする、プライマー対（配列番号：１６２と１６３）は、特に記述されている。
【００６８】
本発明はまた、少なくともｙｊａＡ遺伝子の有無の検出を達成できる、系統発生的な識別方法のいずれをも対象とする。この検出は、グループＢ２の大腸菌とグループＤの大腸菌との間の区別を可能にする（実施例参照）。
【００６９】
とりわけ、本発明は、大腸菌グループＡ、Ｂ１、Ｂ２およびＤを完全に弁別することを可能にする、系統発生的な検出方法を提供する。この方法は、ｃｈｕＡ遺伝子、ｙｊａＡ遺伝子、および配列番号：１１９の有無の検出を行う。この方法は、実施例中に詳細に記述される。有利なＰＣＲ条件は、特に、そこで言及される（「単純化されたＰＣＲ」）。
【００７０】
有利には、この検出はＰＣＲ増幅によって行うことができる。適切なＰＣＲ条件の例は、実施例中に、純粋に例示として、与えられている。
【００７１】
本出願は、特に、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型の前記ポリヌクレオチドの１つまたは複数、ならびに、ｙｊａＡの同時検出を、好ましくは三重ＰＣＲによって、実施する、上に定義されるような識別方法を対象とする。特に有利には、この方法は、細菌または分析試料に対して直接適用することができる。それは、参照株コレクションの利用可能性を必要とはしない。
【００７２】
本願はまた、本発明にかかる系統発生的な識別方法を履行する、大腸菌の望ましくない生育を検出する方法、大腸菌感染を診断する方法、衛生的なコントロールまたは検出（食品、消費用液体、土壌）の方法、ならびに、生物工学的操作に適した大腸菌株を選択する方法のいずれをも対象とする。
【００７３】
さらに、それは、大概、その使用指示書を付随している、本発明による系統発生的な識別、診断および／または選択の方法を実施するためのキットのいずれをも対象とする。かかるキットは、特に、前記方法において使用される化合物の少なくとも１つを含むことができる。さらに、それらは、図４（実施例５参照）に与えられている、１つまたは複数のプロフィールを特記する、あるいは、これらのプロフィールの１つまたは複数について記述している、使用指示書を含むことができる。
【００７４】
有利なキットは、プライマー対（配列番号：１６０、１６１）、（配列番号：１６２、１６３）および（配列番号：１６４、１６５）の少なくとも１つを、好ましくはこれらの対の２つを、より好ましくは３つのプライマー対を含む。
【００７５】
本発明は、以下の実施例により具体的に説明されるが、それらは本発明を制限するものではない。
【００７６】
他の利点ならびに実施の変形は、当業者であれば、これらの実施例から読み取ることができる。かかる変形も、本願は対象としている。
【００７７】
これらの実施例において、次の図が言及される：
−　図１は、大腸菌株ＲＳ２１８の染色体に沿った、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　クローンの配置を表す。
【００７８】
−　図２は、単離されたＢ２／Ｄ＋　Ａ−　断片の配列リストを与え、また、それぞれの配列番号を表示する。
【００７９】
−　図３は、大腸菌株の系統発生分析用の決定ダイアグラムを例示する。
【００８０】
−　図４は、本発明にかかる三重ＰＣＲ法を用いて取得される、様々な系統発生的プロフィールを示す（レーン１および２：グループＡ；レーン３：グループＢ１；レーン４および５：グループＤ；レーン６および７：グループＢ２）。
【００８１】
−　図５は、ｙｊａＡ遺伝子（配列番号：２５４）のポリヌクレオチド配列およびその対応するＯＲＦ配列を示す。
【００８２】
−　図６は、図２のクローンを使用して取得さえる、ＣＴＦ０７３＋　Ｋ１２−　領域およびＲＳ２１８＋　Ｋ１２−　領域の配列を示す。
【００８３】
−　図７は、大腸菌　Ｋ１２株の染色体上における、大腸菌　ＣＦＴ０７３およびＲＳ２１８株に特有なゲノム断片の位置を示す。
実施例１：　Ｃ５＋　Ａ−　ライブラリーおよびＲＳ２１８＋　Ｋ１２−　ライブラリーの作成
材料および方法
細菌の菌株。
このサブストラクティブ・ハイブリダイゼーションのために使用した株は、新生児の脳脊髄液（ＣＳＦ）から単離した大腸菌（血清型Ｏ１８：ＫＩ：Ｈ７の大腸菌　Ｃ５株；グループＢ２）および、ＥＣＯＲコレクション（ＡＴＣＣ）に属している、グループＡの２種類の大腸菌株、ＥＣＯＲ４およびＥＣＯＲ１５である。大腸菌Ｃ５は、Ｋ１莢膜抗原、ｓｆａオペロン、ｉｂｅ　１０遺伝子、Ｐａｐ線毛およびヘモリジン（ｈａｅｍｏｌｙｓｉｎ）（ｈｌｙ）遺伝子などの、いくつかの病毒性の因子を秘めている。この株は、系統発生的なグループＢ２に属する。さらに、系統発生的なグループＡに属している、該ＥＣＯＲ４とＥＣＯＲ１５の株は、識別された毒性因子を発現しない。他の大腸菌株も使用し、ＲＳ２１８株（血清型Ｏ１８：ＫＬ：Ｈ７）、新生児ＣＳＦからの単離株、特に、Ｈｕａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．１９９５（Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．　６３：　４４７０〜４４７５）に記載されており、また、Ｃ５株と同じ毒性因子を秘めている；また、大腸菌Ｋ−１２の実験室株　ＭＧ１６５５（グループＡ）、そのゲノムは、最近配列決定された（Ｂｌａｔｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．　１９９７，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７７：　１４５３〜１４６１）。
【００８４】
加えて、我々は、脳膜炎に罹患した新生児（年齢層：１〜２８日）のＣＳＦから取得され、また、系統発生的なグループＢ２に属する、新生児脳膜炎に関係している可能性がある、５４のＮＭＥＣ大腸菌の一群を使用した。この一群を、それら自体は、脳膜炎に関連していない、ＥＣＯＲコレクションから抽出した７２菌株のうちの、系統発生的なグループＢ２に属する１５種の大腸菌株と比較した。このコレクション（ＡＴＣＣ番号３５２０〜３５３９１）は、ＡＴＣＣから入手可能である。様々な宿主および様々な地理的なサイトから単離された、これら参照菌株は、大腸菌種の中における変異範囲の代表であり、また、４つの主要な系統発生グループ（Ａ、Ｂ１、Ｂ２およびＤ）に分けられるが、それら４種類は、さらに細分されてはいない。
【００８５】
細菌は、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ　液体培地中またはＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ　寒天培地上で、３７℃で培養を行った。必要に応じて、１ｍｌ当たり１００μｇの濃度でアンピシリンを使用した。
サザン・トランスファー。
サザン・トランスファーは、正帯電ナイロン薄膜上に、キャピラリー・トランスファーによって行った。ハイブリダイゼーションは、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中−１Ｍ　ＮａＣｌ−５０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣ１（ｐＨ７．５）−１％のブロッキング試薬（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、マンハイム、ドイツ）中、６５℃で実施した。膜は、最初、２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムに相当する）中、室温１５分間洗浄し、次いで、２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ中、６５℃で３０分間洗浄し、最後に０．１×ＳＳＣ中、室温で５分間洗浄した。核酸用ＤＩＧルミネセンス検出キット（ベーリンガーマンハイム）を用いて、該メーカーの指示書に従って、化学ルミネセンスによる検出を実施した。既述の増幅方法（Ｂｉｎｇｅｎ　ｅｔ　ａｌ．　１９９７，　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　３５：　２９８１〜２９８２）およびプライマーを使用したＰＣＲによって、Ｓｆａおよびｉｂｅ１０プローブを作製した。
表現型上の差異分析。
ＥＣＯＲ株の染色体ＤＮＡは、およそ３から１０ｋｂの間の長さを持つ断片が得られるように、皮下注射針に繰り返しそれを押すことにより分断した。この消化されたＤＮＡは、フェノール抽出によって精製した。該大腸菌Ｃ５の染色体ＤＮＡは、Ｓａｕ３ＡＩまたはＴｓｐ５０９１制限酵素で開裂させた。制限を、ＳａｕＡＩまたはＴｓｐ５０９１でそれぞれ実施した際、このＤＮＡ（２０μｇ）は、１０ｎｍｏｌのハイブリダイズされたオリゴヌクレオチド　ＲＢａｍ１２（５’−ＧＡＴＣＣＴＣＧＧＴＧＡ−３’；　配列番号：１５４）とＲＢａｍ２４（５’−ＡＧＧＡＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＴＣＡＣＣＧＡＧ−３’；　配列番号：１５５）；あるいは、ＲＥｃｏ１２（５’−ＡＡＴＴＣＴＣＧＧＴＧＡ−３’；　配列番号：１５６）とＲＥｃｏ２４（５’−ＡＧＣＡＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＴＣＡＣＣＧＡＧ−３’；　配列番号：１５７）とライゲートさせた。該ＤＮＡは、２％の低融点アガロースゲル中での電気泳動によって、余剰のプライマーから分離した。２００ｂｐより長い断片を含むゲルの部分を、切断し、そして、β−アガラーゼで消化した。このＤＮＡを、フェノール抽出によって精製した。
【００８６】
サブストラクティブ・ハイブリダイゼーション（第１ラウンド）については、オリゴヌクレオチドにライゲートされている、大腸菌Ｃ５　ＤＮＡの０．２μｇを、全体積８μｌの３×ＥＥバッファー（１×ＥＥバッファーは、１０ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシメチル）ピペラジン−Ｎ’−（３−プロパンスルホン酸）；１ｍＭ　ＥＤＴＡ［ｐＨ　８．０］に相当する）中で、ＥＣＯＲ４またはＥＣＯＲ１５の断片化ＤＮＡ４０μｇと混合した。この溶液を、鉱油で覆い、そして、１００℃で２分間加熱することにより、該ＤＮＡを変性し、５Ｍ　ＮａＣｌ　２μｌを加え、そして該混合物を５５℃で４８時間保持し、ハイブリダイズさせた。該反応混合液を、予め加熱した３×ＥＥバッファー−１Ｍ　ＮａＣｌ中で１０倍に希釈し、直ちに氷上に置いた。稀釈液の一部（１０μｌ）を、４００μｌ　のＰＣＲ反応混合液（１０のｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣ１［ｐＨ　９．０］、５０ｍＭ　ＫＣ１、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００、各デオキシヌクレオチド三リン酸塩の０．２５ｍＭ濃縮液、および１ｍｌ当たりＴａｑポリメラーゼ５０Ｕ）に加え、そして、該混合液全体を、再ハイブリダイズされた大腸菌Ｃ５断片の両末端を満たすために、７０℃で３分間インキュベートした。９４℃５分間の変性後に、ＲＢａｍ２４またはＲＥｃｏ２４のオリゴヌクレオチド（１００μｌ当たり０．１ｍｍｏｌ）を添加し、該ハイブリダイズ物を、ＰＣＲ（ＧｅｎｅＡｍｐ　９６００　ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ［パーキン・エルマー］中、９４℃１分、７０℃１分および７２℃３分、次に９４℃１分および７２℃１０分の３０のサイクル）によって増幅した。該ＰＣＲ産物は、プライマーおよび高分子量のＥＣＯＲサブトラクションＤＮＡから、該大腸菌Ｃ５断片を分離するために、ゲル上で精製した。サブストラクティブ・ハイブリダイゼーションの第２ラウンドは、４０μｇの断片化したＥＣＯＲ４またはＥＣＯＲ１５大腸菌ＤＮＡおよび、第１ラウンドで得られたＲＢａｍ２４またはＲＥｃｏ２４にライゲートされたＤＮＡ　２５ｎｇを使用して、実施した。該サブトラクションの第２ラウンドの産物は、一括して放射化標識し、該増幅された断片が確かにＢ２株のＤＮＡに固有のもので、かつグループＡの株では存在していないことを確認するために、サザン・ハイブリダイゼーション実験において、プローブとして使用した。かくして、４つのサブトラクティブ・ライブラリーを作成した。
【００８７】
サブトラクティブ・ライブラリーに由来するクローンの解析。
該サブトラクティブ・ライブラリーのＤＮＡを、ｐＵＣ１９（ニュー　イングランド・バイオラブ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ）、ベヴァリー、マサチューセッツ州）のＢａｍＨ１（Ｓａｕ３ＡＩ　ライブラリー）またはＥｃｏＲｌ（Ｔｓｐ５０９１　ライブラリー）サイトにクローン化し、そして、次いで、Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ　ｃｏｌｉ　ＸＬ２−Ｂｌｕｅ　超コンピテント細胞（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）中に形質転換した。該挿入物は、形質転換されたコロニーに対して、次のプライマー：Ｐ１（５’−ＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴ−３’；　配列番号：１５８）とＰ２（５’−ＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ−３’；　配列番号：１５９）を使用して、実施したＰＣＲ反応によって増幅した。該クローンは、次の方法に従って（順番に）：使用した制限酵素（「Ｔｓｐ」または「Ｓａｕ」）、サブトラクション法に使用した株（Ｅ４またはＥ１５）および英数字の名前、命名した。
【００８８】
（ｉ）ＤＮＡ配列決定。
固相上可逆的に不動化することによりＰＣＲ産物を精製した後、精製したＰＣＲ断片は、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７７　ＸＬ自動化ＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー）上で、ＡｍｐｌｉＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（パーキン・エルマー）付きのＢｉｇ−Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔを用いて、メーカーの指示書に従って配列決定した。所与のプライマーでは良質の配列を得る上で問題に直面した際には、ｄＧＤＴ　Ｂｉｇ−Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（パーキン・エルマー）にて、配列決定の反応を行った。配列は、ＢＬＡＳＴＮとＢＬＡＳＴＸのコンピュータ・プログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｒｅ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＮＣＢＩ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．１９９７，Ｓ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：　３３８９〜３４０２）を使用し、既に公表されている配列との相同性についてスクリーニングした。
【００８９】
（ｉｉ）サザンブロット・ハイブリダイゼーション。
それらの特異性を検証するために、Ｐ１およびＰ２プライマーを使用して、形質転換体コロニーから取得されるＰＣＲ産物に、ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ−１１−ｄＵＴＰ（ベーリンガーマンハイム）の組み込みにより標識し、そして、大腸菌　Ｃ５、ＥＣＯＲ４およびＥＣＯＲ１５株、ならびに大腸菌Ｋ−１２のＭＧ１６５５株に由来するＤｒａＩ消化染色体ＤＮＡのサザンブロット分析用のプローブとして使用した。
【００９０】
（ｉｉｉ）パルス・フィールド　ゲル電気泳動およびクローンのＲＳ２１８およびＣ５株の染色体上でのマッピング。
クローニングされた差異産物に対応するＤＮＡ配列の位置を、パルス・フィールド　アガロースゲルのサザン・トランスファーをプロービングすることにより、大腸菌　ＲＳ２１８の遺伝子地図（Ｒｏｄｅ　ｅｔ　ａｌ．　１９９９，　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．　６７：２３０〜２３６）に対して決定した。ＲＳ２１８株のＤＮＡは、ＢｌｎＩ、ＮｏｔＩおよびＸｂａＩで消化し、パルス・フィールド　ゲル電気泳動にかけ、ＢｌｎＩおよびＮｏｔＩで消化した、Ｃ５株のＤＮＡも、同様に電気泳動にかけた。ゲルは、０．５×Ｔｒｉｓ−硼酸−ＥＤＴＡバッファー中の１％アガロースであり、それらを、２〜４９秒の間で、直線的に変化するパルス持続時間で、６Ｖ／ｃｍ、２７時間の電気泳動を施した。各クローンとの反応性を示す配列のＲＳ２１８染色体上の位置は、該ＢｌｎＩおよびＮｏｔＩで認識される制限断片と、公表されたマクロな制限サイト・マップ（Ｒｏｄｅ　ｅｔ　ａｌ．１９９９）との対比により決定した。
【００９１】
結果
グループＡの大腸菌のゲノム中には見出されない、グループＢ２のＣ５株のＤＮＡ断片のライブラリーの作成。
表現型上の差異分析手法を用いて、我々は、グループＢ２の株（Ｃ５株）の染色体からグループＡ（ＥＣＯＲ４およびＥＣＯＲ１５）の２つの株の染色体を差し引いた。４つのライブラリーが作成され、そして、該Ｃ５株の染色体を消化した酵素およびサブトラクションに用いた菌株に従って、ＳａｕＥ４、ＳａｕＥ１５、ＴｓｐＥ４およびＴｓｐＥ１５と命名した。個々において、サブトラクションの第２ラウンドにおいて増幅された差異産物は、標識化し、そして、Ｃ５、ＲＳ２１８、ＥＣＯＲ４およびＥＣＯＲ１５のＤｒａＩ消化ＤＮＡに対するプローブとして使用した。グループＢ２の菌株の染色体との強い反応性が観察された。加えて、取り除く菌株（グループＡ）に対応するレーンでは、信号はほとんどなかった。取得された４９４のクローンは、配列決定のために単離した。それらの中で、１４０個は、大腸菌Ｋ−１２の配列と有意な相同性を示し、除去された。残りの３５４の断片中、２５９の配列（配列番号：１〜１５３および１７０〜２５３）は、固有のものであった。下記の表１に、既に記載されている遺伝子と有意な相同性を示すクローンの全てを示す。
【００９２】
【表１】
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【００９３】
【表２】
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【００９４】
【表３】
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【００９５】
【表４】
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【００９６】
【表５】
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【００９７】
【表６】
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【００９８】
【表７】
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【００９９】
【表８】
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【０１００】
【表９】
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【０１０１】
【表１０】
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【０１０２】
クローンのうちのいくつかは、ｐａｐ、ｈｌｙおよびｋｐｓなどの、Ｃ５株中に存在していると既に知られている遺伝子に相当する。４９４のクローンの中には、ｓｆａまたはｉｂｅ１０に相同的であると判明したものはなかった。サブトラクションのラウンドの追加、および／または追加のクローンの配列決定は、これが完全となるまで、より大きな徹底性を達成することを可能とする。加えて、現在まで、新生児脳膜炎に関連付けられたことのない菌株において、記述された病毒性の因子に相当する配列が見出されている：（ｉ）ｐｒｓ、ｃｎｆおよびｈｒａ、これらの全ては、尿路病原性の大腸菌株Ｊ９６中のＰＡＩ（病原性島）の一部を形成する；（ｉｉ）ｃｈｕＡ、鉄輸送系に含まれ、腸内出血性病原性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７中に見出される遺伝子；ならびに（ｉｉｉ）ｓｅｎＢ、侵入性大腸菌およびＳｈｉｇｅｌｌａの毒性プラスミド上で、エンテロトキシン（腸毒素）をコードしている遺伝子。最後に、配列決定された１５３の断片（配列番号：１〜１５３）は、公表された配列のいずれとも、なんら有意な相同性を示さなかった。
【０１０３】
大腸菌の染色体上における、ＮＭＥＣに特異的な配列のマッピング。
大腸菌　ＲＳ２１８の染色体の物理地図が入手可能であり（Ｒｏｄｅ　ｅｔ　ａｌ．１９９９，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：　２３０〜２３６）、上で言及した配列の配置の研究が可能となった。この目的のために選択された、６４のクローンのうち、７個は、既知の病毒性の因子（ｋｐｓ、ｈｌｙ、ｐｒｓ、ｈｒａ、ｃｎｆ１、ｃｈｕＡおよびｓｅｎＢ）と相同性を示し、また、５７個は、なんらの既知の相同性を示さない。この後者のクローンは、ＴｓｐＥ４とＳａｕＥ１５のライブラリーから無作為に選ばれている。これらの２つのライブラリーは、それらがＢ２中に予想される遺伝子（例えばｐａｐ、ｈｌｙおよびｋｐｓ）の大半を含んでいるため、選択され、従って、典型とするのに十分に完全であると考えられた。該クローンのすべては、ＲＳ２１８株の染色体に対して、サザン・ハイブリダイゼーションにおいて、相同性を示した。これらのクローンのＰＣＲ産物は、標識化し、ＢｌｎＩ、ＮｏｔＩ、およびＸｂａＩ酵素（低頻度で切断する酵素）で消化したＲＳ２１８　ＤＮＡのサザン・トランスファーをプローブするために使用した。ｓｆａおよびｉｂｅ１０の両方の位置が決定された。そのＢ２＋　Ａ−　特異性を評価するために、これらのクローンの各々を、ＥＣＯＲ４、ＥＣＯＲ１５およびＭＧ１６５５株のＤｒａＩ消化ＤＮＡをプローブするために使用し、それらは、これらの菌株に関しては、非反応性であると確認された。
【０１０４】
これらのクローンのマッピングは、Ｃ５＋　Ａ−　型配列の非無秩序的な分布を明らかにした。この分布は、図１により、図示されている。この図中、上部の矢印は、この研究において見出された、Ｃ５に特異的なクローンが高密度を示すＮｏｔＩとＢｌｎＩの断片によって代表される、６つの領域を示す。ｓｆａおよびｉｂｅ１０プローブの位置のように、既知の相同性を示すクローンを、表示してある。領域６は、様々なＸｂａＩ断片上におけるクローンのマッピングに従って、２つの細分領域に分割された。クローンの名称に付す注釈は、下記を表す：１、ＴｓｐＥ４．Ａ７は、ＳａｕＥ１５．Ｆ１２とオーバーラップする位置にある；２、ＳａｕＥ１５．Ｆ１２は、また、該プラスミド上でも反応性を示す；３．ＴｓｐＥ４．Ａ８は、ＮｏｔＩ断片　Ｐ上でも、弱い反応性を示す。
【０１０５】
４４個のクローンは、染色体上で、６つの別個のグループ中に、集積されている。腸内出血性大腸菌中で見出されるｃｈｕＡ遺伝子の一部をコードするクローンは、これらクラスターのいずれとも付随しておらず、孤立したままであった。領域１は、ＢｌｎＩ断片　ｍ（８５ｋｂ）中に含まれている。領域２のクローンは、ＮｏｔＩ断片　ｐとｎ（〜２４０ｋｂ）上にマッピングされた。領域３は、ＮｏｔＩ断片　ａ（〜３１０ｋｂ）中に含まれ、また、領域４は、ＢｌｎＩ断片　ｈ（２１０ｋｂ）中に含まれる。領域５は、ＢｌｎＩ断片　ｊ（１３５ｋｂ）上に位置付けられる。ＮｏｔＩ断片　ｂとＢｌｎＩ断片　ｂ（〜５５０ｋｂ）にオーバーラップしている、領域６は、ＸｂａＩ酵素によって、２つの細分領域、領域６ａと６ｂに分割された。この後者の細分領域は、Ｃｎｆ１、ｈｌｙ、ｐｒｓおよびｈｒａとの相同性を示すクローンを含んでいる。ｓｆａとｉｂｅ１０プローブは、それぞれ、領域２と６ａにハイブリダイズする。莢膜をコードする遺伝子は、これらの領域のいずれにも連関されなかった。既知の配列との相同性を示さない６つのクローンおよびｓｅｎＢ遺伝子は全て、ＲＳ２１８株中に存在している大きなプラスミド上に位置付けられた。
【０１０６】
大腸菌株の２種のコレクションにおける、Ｃ５＋　Ａ−　ゲノム領域の分布。
【０１０７】
診断と病原性の観点での、これらの領域の関連を精査にするために、我々は、新生児脳膜炎に関係しており、系統発生的なグループＢ２に属する、５４種類の大腸菌のコレクション（５４個のＮＭＥＣ）中において、領域１、３、４、５および６ｂに位置しているクローンならびにｃｈｕＡ遺伝子の部分を含んでいるクローンの出現頻度を決定した。我々は、それらがｓｆａとｉｂｅ１０の遺伝子を含んでおり、また、グループＢ２の大腸菌株全般でのそれらの分布の確立が可能であったため、領域２および６ａをこの研究から除外した。各領域について、独立に、２〜４個のクローンを使用して、ＮＭＥＣ単離株のゲノムＤＮＡのサザン・トランスファーに対するスクリーニングを行った。対照群は、ＥＣＯＲコレクションの１５種類のＢ２株に相当しており；これらの株は、現在まで、脳膜炎に関係付けられていない。結果を、下記の表２に示す。
【０１０８】
【表１１】
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【０１０９】
脳膜炎に関連した菌株では出現が低下している領域６ｂは例外として、上で言及した領域は全て、ＮＭＥＣの中に広く存在する。加えて、領域１、３および４は、他Ｂ２株中よりも、ＮＭＥＣの中において、顕著により高い（ｐ＜０．０５）頻度で現れており、従って、これらの領域は、ＮＭＥＣ−特異的な因子をコードしているＤＮＡを含むことを示唆している。従って、これらの領域、それらの部分、およびそれらが含んでいるクローンは、新生児脳膜炎に関与するポリヌクレオチド源を構成する。従って、それらは、抗新生児脳膜炎ワクチン中の有効成分として使用でき、また、これらのポリヌクレオチドの転写および／または翻訳を減速またはブロックする、あるいはそれらがコードしているポリペプチドの活性を低減またはブロックする産物を使用して、新生児脳膜炎の予防、軽減または治療を目的とする医薬製品の開発を可能とすることができる。
【０１１０】
考察
これらの研究において、我々は、興味のある系統発生上の属性をコードすることが可能な染色体の領域を特定するために、サブストラクティブ・ハイブリダイゼーションを実行した。我々は、Ｂ２大腸菌（新生児脳膜炎に関連している大腸菌　Ｃ５）のＤＮＡ群をグループＡの大腸菌株のものとの差し引きを選択する、２ラウンドのサブストラクティブ・ハイブリダイゼーションを実行した。そして、我々は、その中には、特異的なＮＭＥＣクローンも特定され得る、１００〜５００ｂｐ長の範囲の挿入片を含んでいるＣ５＋　Ａ−　クローンのライブラリーを得た。これらのライブラリーを代表する２５９のクローンのうち、１５３個（配列番号：１〜１５３）は、産物として新規であり、他の断片は、既知の産物との相同性を示す。該相同性を有する断片のうち、あるものは、初めてＣ５＋　Ａ−　型であることが記載され；これは、特に、ｃｈｕＡ（ＡＴＣＣ登録番号Ｕ６７９２０）およびそれに対応していると見られる４個のクローン：ＴｓｐＥ４Ｊ６（配列番号：２４１、２２１ｂｐ、確率　ｅ−１０２、スコア３７５）、ＳａｕＥ１５．Ｉ１１（配列番号：１９５、１６２ｂｐ、確率　ｅ−８２、スコア３０５）、ＳａｕＥ１５．Ｆ３（配列番号：１８５、４２２ｂｐ、確率　ｅ−２０、スコア９８）およびＴｓｐＥ１５．Ｄ９（配列番号：２４８、２３０ｂｐ、確率　ｅ−１８、スコア８９）の事例である。島部　ＰＡＩＶ、および特定された領域１、６ａおよび６ｂ（実施例参照）の事例も、それである。本発明は、これらのＤＮＡ断片は、大腸菌染色体上において無秩序に分布しているのではなく、そして、Ｃ５＋　Ａ−　型を示す、大腸菌の染色体の領域（領域１、２、３、４、５、６ａおよび６ｂ）が存在することも実証する。
【０１１１】
該サブトラクティブ・ライブラリーの特異性は、（ｉ）非病原性株によるサザン・トランスファー、および（ｉｉ）クローンの７２％は、大腸菌Ｋ−１２の公表された配列と相同性を示さないことを示した配列分析により、検証された。いくつかのクローンは、病毒性に関連した遺伝子（ｋｐｓ、ｐａｐおよびｈｌｙ）に対応している。他方では、我々は、ｓｆａとｉｂｅ１０の遺伝子に対応するクローンを分離していない。しかし、これらの２つの遺伝子を含む領域に由来するクローンは取得された。これらを合わせて考えれば、これらのデータは、これらのライブラリーの完全性を確認するものである。
【０１１２】
加えて、上に記載した実施例においては、４９４個のクローンを、配列決定するために分離し、そして、大腸菌Ｋ１２との有意な相同性を示さず、かつ互いに相異なっている２５９個のクローンを取得することを可能としたが、必要によっては、最初に分離し、配列決定を行うクローンの初期の数を、相当に増やすこと、例えば、４９４個に代えて、３０００個またはそれ以上のクローンから開始することも可能であることは、当業者には明白であろう。自動配列決定機は、かかる多数のクローンをも簡単に処理することを可能にする。最初に配列決定されるクローン数の増加は、特に、互いに異なり、かつ大腸菌Ｋ１２との有意な相同性を示さないクローンの最終セットを増加させることを可能とする。これは、得られるセットの徹底性のレベルを上昇させることを可能にする。その代わりに、または、組み合わせて、該ＤＮＡ群が起源としている菌株（Ｂ２大腸菌）の数を増加させる、かつ／または、（他の制限酵素を使用して）調製されるサブトラクティブ・ライブラリーの数を増加させることを選択することも可能である。得られる特異性のレベルを増加させるために、サブトラクション・サイクルを倍化させることを選択することも可能である。上記の実施例においては、前記２５９個のクローンを取得するのに２サイクルだけが必要であったが、しかし、３番目または４番目のサイクルを実行することを選択することも可能である。また、他の制限酵素を使用することを選択することも可能であり、先見的に、およそ３００〜５００ｂｐの平均値を持つ、およそ１００〜１５００ｂｐの断片を得るとが可能である任意の酵素（つまり、例えば、４ｂｐなどの、短い制限部位を有する任意の制限酵素、例えば、Ｔｓｐ５０９ＩやＳａｕ３ＡＩ、またはＭｓｐＩやＭａｅＩＩ）が最も適当である。有利には、２〜３ラウンドのサブトラクションの後、該クローンのうち、大腸菌Ｋ１２など、グループＡの株と相同性を示すものを除去することで、非常に良好な特異性レベルが得られる。使用する制限酵素の性質を特に、各サブトラクション・サイクル間で、変えることで、得られるセットの徹底性および／または特異性のレベルがさらに増加する。効率的に得られる徹底性のレベルを評価するために、この評価は、ｓｆａまたはｉｂｅ１０などの既知のマーカーの有無を調べることにより行うことができる。
【０１１３】
ここで単離されたＣ５＋　Ａ−　セット中、特に識別性を有するＤＮＡが特定できる（上記の表２参照）。実際に、それらの大半（それらの８０％超）は、ＥＣＯＲコレクションのグループＢ２の大腸菌中に、４０％を超える頻度で存在しており（領域１、４、５および６ｂのクローン）、そのあるものは、５０％を超える、あるいは８０％を超える頻度ですら存在しており（領域５のクローン、およびｃｈｕＡに対応するクローン）、得られるセットのおよそ１５％においては、１００％のＢ２頻度に達している（領域５のあるクローンおよびｃｈｕＡに対応する単離されたクローン）。
【０１１４】
７つのＣ５＋　Ａ−　領域（領域１、２、３、４、５、６ａおよび６ｂ）も特定された。ＮＭＥＣ（新生児脳膜炎と関連付けることが可能な大腸菌）の感染プロセスにおける、これらの領域の役割を研究するために、疫学的なアプローチを試みた。ＮＭＥＣの大多数は、系統発生的なグループＢ２に属することが判っており、我々は、グループＢ２のＮＭＥＣの中における、および脳膜炎に関連付けられていないグループＢ２の株（ＥＣＯＲコレクション）の中における、各領域の、および同ｃｈｕＡの分布を決定した。小さいものの、該種の遺伝子型の多様性の範囲を代表していると考えられる、ＥＣＯＲコレクションに由来する参照株から構成されるので、この対照群を選択した。我々は、２つのグループに属する単離体から調製されるゲノムＤＮＡのサザン・トランスファーに対するプローブとして、各領域の２〜４個のクローン、ならびに、ｃｈｕＡのホモローグである、ＴｓｐＥ４．Ｊ６クローン（配列番号：２４１）を使用した。脳膜炎の単離体中における、このクローンの存在は、これらの領域全てが、領域６ｂは例外として、ＮＭＥＣの中において、広範に表出していることを示し、従って、これらの菌株の病原性における、これらの領域によってコードされた遺伝子の関与を示唆している。他方、驚いたことに、ＰＡＩ　Ｖに類似している、領域６ｂは、ＮＭＥＣ中では低い遍在度（１７％）を示し、ＥＣＯＲコレクションのグループＢ２株中では、広く表出している（４７％）。領域５は、高い遍在度を有するものの、それは、両方のコレクションにおいて類似しており、また、従って、大腸菌のグループＡに対して、系統発生グループＢ２の高度に特徴的なセグメントに相当しているのかもしれない。そして、大腸菌の領域５は、ＥＣＯＲコレクションのグループＢ２の大腸菌大多数（８０％超）中に存在しており、また、ＥＣＯＲコレクションのグループＡの大多数の大腸菌では存在しない、ＤＮＡ断片の有利な源であると思われる。ｃｈｕＡについても、同じ分布が観察されたが、興味深いことに、これらの遺伝子は、試験したグループＢ２の菌株全ての中に、例外なく存在した。領域１、３および４に関しては、ＮＭＥＣ中においては、その別のＢ２大腸菌中よりも、それらは、明らかにより一般的であるようである。さらには、領域１、３および４は、なんら既知の病毒性の因子を含んでいないことが判明しており、これらの領域は、幼児と新生児における、大腸菌による髄膜侵入に関連したＤＮＡ島に相当すると思われる。
【０１１５】
従来技術では、領域１、３、４および５の配列は、入手可能でなく、それらは記述されてもなかったし、単離されてもなく、また、それらの機能は知られていなかったことは、特記することができる。従って、領域１、３、４および５は、新規であると考えられる。また、領域２、６ａおよび６ｂに関しては、既知のＤＮＡを産物として含んでいるが、本願は、かかる領域の存在を初めて記述するものであり、また、それらのＣ５＋　Ａ−　型の最初の記述である。
【０１１６】
実施例２：　ＥＣＯＲ株中におけるＣ５＋　Ａ−　断片の分布
次に、グループのＢ１とＤのＥＣＯＲ大腸菌中における、実施例１で得られた断片（Ｃ５＋　Ａ−　断片）の存在の頻度を、実施例１に記載されるサザン・ハイブリダイゼーションにより測定した。それらのうちの１４個（配列番号：５６、１１６、４３、５１、１４１、１３０、４５、５０、５２、１１９、１２７、１２５、５５および３７）について、得られた結果を、下記の表３に示す。
【０１１７】
【表１２】
2004512817.tif 000014
【０１１８】
試験した断片の大多数（９０％超）は、ＥＣＯＲコレクションに含まれる、１６種類のグループＡの大腸菌株に存在しないこと（存在頻度０％）、ならびに、それらは、全て、ＥＣＯＲコレクションに含まれる、１５種類のグループＢ２の大腸菌株中では、１０％を超える頻度で存在することが観察される。該グループＢ２のＥＣＯＲコレクション大腸菌株１５種中には、７５％を超える断片が、４０％を超える頻度で存在し、それらの５０％は、７０％を超える頻度で存在し、また、それらのおよそ３５％は、８０％に等しいまたはそれを超える頻度で存在している。
【０１１９】
これら断片のうちのあるものは、また、グループＢ１のＥＣＯＲ大腸菌株の中に、および／またはグループＤのＥＣＯＲ大腸菌株中にも存在することも観察される。特に、ＴｓｐＥ４．Ｃ２クローン（配列番号：１１９）は、９０％を超える頻度でグループＢ１のＥＣＯＲ大腸菌の中に存在し、一方では、グループＡのＥＣＯＲ大腸菌には完全に存在しないことが注目される。ＳａｕＥ１５．Ｉ１２クローン（配列番号：３７）は、それ自体、グループＤのＥＣＯＲ大腸菌中において１００％の頻度で、また、グループＢ２のＥＣＯＲ大腸菌中において１００％の頻度で存在し、一方では、グループＡのＥＣＯＲ大腸菌中には完全に存在せず、また、グループＢ１のＥＣＯＲ大腸菌中には僅かに存在するのみである。
【０１２０】
ここに試験した断片の全ては、共通して、それらはグループＢ２のＥＣＯＲ大腸菌中では、１０％を超える頻度で、また、グループＡのＥＣＯＲ大腸菌中では、２５％未満、特に１０％未満、顕著には５％未満の頻度で、存在しているという事実を有している。
【０１２１】
ＥＣＯＲコレクションは、大腸菌種の遺伝的多様性を代表するので、得られた様々な結果は、本発明にかかる、一群の単離されたＤＮＡは、単独でまたは組み合わせることで、大腸菌株の系統発生の同定用の、特に適切なツールを構成することを示す。
【０１２２】
単離された断片の系統発生的な分布の知見をさらに精査するために、他の何種類かのＣ５＋　Ａ−　クローンに対しても、疫学的な研究を遂行した。結果を、下記の表４に示す（グループＡ、Ｂ１、Ｂ２、およびＤ、これら４つのグループのうちの何れにも帰属されないＥＣＯＲコレクションの４つの菌株を含むグループＸ）。
【０１２３】
【表１３】
2004512817.tif 000015
【０１２４】
先に試験した断片と同様に、大半の断片は、グループＢ２の大腸菌の中では、１０％を超える頻度で、また、グループＡの大腸菌の中では、１０％未満の頻度で、存在していることを観察することができる。特に、ＳａｕＥ１５．Ｃ１２、ＳａｕＥ１５．Ａ１２およびＳａｕＥ１５．Ｂ２クローンは、グループＢ２のＥＣＯＲ大腸菌中では、それぞれ、１００％、９３．３％および９３．３％の頻度で存在し、そして、それら３つ全ては、グループＡのＥＣＯＲ大腸菌中では、頻度が０％であることが注目される。
【０１２５】
しかし、１個のクローン、ＴｓｐＥ１５．Ｇ６は、グループＡの大腸菌の中では、１２％の頻度で、グループＢ２のＥＣＯＲ大腸菌の中では、５３．３％の頻度で、また、グループＤのＥＣＯＲ大腸菌の中では、８３．３％の頻度で存在している。
【０１２６】
他の４個のクローン、すなわち、ＳａｕＥｌ５．Ｂ１０、ＳａｕＥ４．Ａ２、ＳａｕＥ１５．Ｃ７およびＴｓｐＥ４．Ｂ９は、それら自身は、グループＢ２のＥＣＯＲ大腸菌の中に存在しないようである；しかしながら、これらのクローンは、グループＤのＥＣＯＲ大腸菌の中では１０％を超える頻度（４１．７％）で、また、グループＡのＥＣＯＲ大腸菌の中では１０％未満の頻度（４％）で存在している。
【０１２７】
これらの断片の単離を可能とした、サブストラクティブ・ハイブリダイゼーション（上記の実施例１参照）における、グループＢ２の菌株としての大腸菌　Ｃ５株の選択は、これらの結果と恐らく無関係ではない。実際、該大腸菌　Ｃ５株は、系統発生のグループＢ２に属するものの、その配列のいくつかは、グループＤの大腸菌中にも存在する（４１％の頻度）、プラスミドを含んでいる。
【０１２８】
従って、グループＡのＥＣＯＲ大腸菌には、極く一般に存在しない、一群の断片を単離するための、かかる菌株の選択は、グループＡのＥＣＯＲ大腸菌に対して、グループＢ２および／またはＤのＥＣＯＲ大腸菌中において、より大きな頻度で存在する、断片の全セットを単離することを可能とする。しかも、試験した断片の大半は、グループＡのＥＣＯＲ大腸菌には完全に存在しない。グループＡのＥＣＯＲ大腸菌中での存在頻度が０でない場合であっても、それは、依然低く（本例の断片において測定された最大値は、２４％）、また、それは、常に、グループＢ２のＥＣＯＲ大腸菌中のまたはグループＤのＥＣＯＲ大腸菌中の、あるいは、それらの各々の中で観察される頻度よりも、およそ３分の１または４分の１と、低い。
【０１２９】
大腸菌の腸管外病原性は、グループＡの菌株ではなく、グループＢ２またはＤの菌株に付随しているため、本発明に従って、大腸菌Ｃ５などのＢ２／Ｄ大腸菌株を使用して単離される断片は、系統発生の診断での適用に加えて（下記の実施例５参照）、大腸菌の腸管外の成長（全身的かつ下痢を引き起こさない成長）を予防し、軽減し、ならびに対処する目的の特に価値のある適用を有している。
【０１３０】
もっとも、ここにおいては、大腸菌Ｃ５株に用いて、報告されている例を、ＲＳ２１８など、大腸菌ＣＦＴ０７３など、Ｂ２／Ｄ型の別の大腸菌株、および／またはＤ型の菌株を用いて、同様のやり方で実行できることは当業者には明らかに明白であろう。
【０１３１】
結論として、本発明に従って単離された該Ｃ５＋　Ａ−　断片は、ＥＣＯＲ大腸菌のグループＡ中では、グループＢ２のＥＣＯＲ大腸菌中および／またはグループＤのＥＣＯＲ大腸菌中において観察することができるものよりも、低い頻度で存在している（＝Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型）ことを、得られた該結果は示している。
【０１３２】
グループＡのＥＣＯＲ大腸菌中における、それらの存在頻度は、一般に０であり；仮に、そうでない場合でも、それは、グループＢ２および／またはＤのＥＣＯＲ大腸菌の中で観察されるものよりも、少なくとも２分の１、好ましくは３分の１、より好ましくは３．５分の１、そして非常に好ましくは４分の１で、低い。特に、本発明にかかる、このＢ２／Ｄ＋　Ａ−　のセットは、主として、グループＢ２および／またはＤのＥＣＯＲ大腸菌中では、１０％を超える頻度で、またグループＡのＥＣＯＲ大腸菌中では、２５％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、そしてさらに好ましくは５％未満の頻度（但し、このＡ頻度は、Ｂ２および／またはＤ中のものより常に低い）で存在している、断片を含んでいる。
【０１３３】
本発明は、さらに、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型を示すポリヌクレオチドの全セットを手にする手段を提供する。
【０１３４】
実施例３：　単離されたＢ２／Ｄ＋　Ａ−　断片の医学的適用の例（腸管外部位における、大腸菌の全身的で下痢を伴わない成長）
Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　大腸菌は、特に腸管外感染の要因となるものであるため、我々は、このように単離されたＢ２／Ｄ＋　Ａ−　断片のうちのあるものが、実際に、大腸菌の腸管外感染プロセス、すなわち、血液中での生存および増殖にとって不可欠なステップに関与しているか否かを決定することを試みた。
【０１３５】
利用したアプローチは、この過程の間に誘導される転写産物を明らかにすることにある、特異的な転写の分析（ＤＴＡ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ）の方法である。さらに、血清のいかなる特性が、該大腸菌の遺伝子発現レベルの変異に影響しているかを決定するために、以下の成長条件下でＤＴＡを実施した。
【０１３６】
−　栄養液体培地は対照を構成する。
【０１３７】
−　菌血症過程は、ヒト血清存在下における細菌の成長と比較される。
【０１３８】
−　血清中での培養が引き起こす鉄分欠乏は、鉄のキレート化剤を添加した栄養液体培地中における培養に使用して再現する。
【０１３９】
−　補体の影響は、補体除去した血清存在下での成長を使用して研究する。
【０１４０】
これらの各培養条件において得られる全転写産物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓ）の対比は、血清中での成長に特異的に関与している遺伝子を明らかにすること、ならびに、鉄分含有量や、血清の殺菌活性により誘起されるストレスなどの、同一の調節因子に影響される、遺伝子の機能性グループを作成することを可能にする。
【０１４１】
素材および手法
１．細菌菌株、培地およびサブトラクティブ・クローン
大腸菌　Ｃ５株（血清型０１８：Ｋ１：Ｈ７）は、新生児のＣＳＦから単離した。この病毒性の菌株は、系統発生のグループＢ２に属し、また、次の病毒性因子：Ｋ１莢膜多糖、Ｓアドヘジン、Ｉｂｅ１０インバジン、タイプＰ繊毛およびヘモリジンを示すが、しかし、アエロバクチン（ａｅｒｏｂａｃｔｉｎ）は産生しない。該Ｃ５株を使用して、サブトラクティブ断片ライブラリーを取得した。使用した非病原性菌株は、ＥＣＯＲ参照コレクションに由来する、所謂、非病原性の系統発生のグループＡに属している、ＥＣＯＲ１５株と大腸菌Ｋ１２　ＭＧ１６５５株である。
【０１４２】
細菌の種菌は、トリプトカゼイン−大豆　寒天培地（Ｓａｎｏｆｉ　Ｐａｓｔｅｕｒ）上での１８時間培養物より、該コロニーを滅菌水に再分散して調製した。ＯＤを測定した後に、純粋または希釈された、この細菌懸濁液を使用して、様々な培地中に、常に、最終体積の１／１０未満となるようにな量を加えて、接種原を調製した。
【０１４３】
純粋な栄養液体培地（Ｓａｎｏｆｉ　Ｐａｓｔｅｕｒ）または鉄のキレート化剤（濃度２００μＭの２，２’−ジピリジル（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を添加した栄養液体培地のいずれかを使用して、振とうしつつ３７℃で細菌培養物を調製した。細菌菌株は、ヒト血清存在下でも培養した。２種類のタイプの血清を入手した：一方は、ドナー血液に由来する４つの血清のプールからなり、他方は、単一ドナーから得たものである。乾燥チューブに血液を採取し、室温でおよそ３時間、自発的な凝縮を起こさせ、次に、上澄みを取ることで、血清を回収した。その後、血清は、２．５ｍｌに小分けした形で、−８０℃で保存した。補体除去した血清は、該プールから、３０分間５６℃のインキュベーションして得た。
【０１４４】
該Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　ライブラリーのクローンのサブカルチャーは、３７℃でアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を付加した栄養液体培地中で調製した。
【０１４５】
２．血清の殺菌効果の研究
一方では、血清の殺菌効果に対する大腸菌　Ｃ５株の抵抗性を、そして、他方では、血清中での補体の本来の活性を評価するため、成長曲線を作成した。細菌の成長は、ＥＣＯＲ１５、Ｋ１２およびＣ５株の様々な接種物を用い、また、純粋な血清中また補体除去した血清中での培養物の細菌の計数を実行することにより、分析した。これらの計数は、「螺旋状のメーター」システムを使用して、ペトリ皿上に、純粋なまたは系列的に希釈した培養液を塗布することにより、０時間、３時間、６時間および２４時間に相当する時刻において行った。
【０１４６】
３．大腸菌Ｋ１に特異的なサブトラクティブなＤＮＡ断片の増幅および高密度薄膜の製造
ａ．サブトラクティブなＤＮＡ断片のＰＣＲ
プラスミドｐＵＣ１９中にクローン化した、該サブトラクティブなＤＮＡ断片は、ＤＮＡ抽出を行わずに、各クローンの１８時間培養培地の１０分の１希釈液から直接、ＰＣＲ反応で増幅した。この細菌溶液５μｌを、反応混合物に加え、最終体積を５０μｌとし、１×ＰＣＲバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１　ｐＨ　９；　１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２；　５０ｍＭ　ＫＣｌ；　１％　ＴｒｉｔｏｎＸ１００；　０．１％のゼラチン）；　２Ｕ　ＳｕｐｅｒＴａｑポリメラーゼ（ＡＴＣＧ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ）；　２００μＭ　デオキシヌクレオチド三リン酸塩；　６μＭの特異的プライマーを含んでいる。使用したプライマーは、以下のとおりである：
Ｐ１（５’−ＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴ−３’；　配列番号：７２８）
Ｐ２（５’−ＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ−３’；　配列番号：７２９）。
【０１４７】
ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒（変性）、５５℃で３０秒（ハイブリダイゼーション）および７２℃で３０秒（延長）の３０サイクルからなる。
【０１４８】
ｂ．高密度薄膜の調製
大腸菌Ｃ５株の特異的な増幅された断片のセットを含んでなる薄膜は、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社によって製造された。該ＰＣＲ産物各１８０ｎｌを、１１ｃｍ×６ｃｍのナイロン薄膜上に、マイクロスポットの形で、二重に沈積された。それぞれの逆転写において、検出される信号の正規化を図るために、一方では、大腸菌Ｃ５株の染色体ＤＮＡの４倍系列的な稀釈物、他方では、１６ＳリボソームＲＮＡのＰＣＲ産物の稀釈物で構成されるスポットを、置いた。加えて、１７ｂｐのサブトラクティブ断片のＰＣＲ産物に対応する、ネガティブ・コントロールも置いた。これらの薄膜は、＋４℃で、密閉保存する。
【０１４９】
４．３３Ｐ標識化逆転写物の合成
ａ．全ＲＮＡの抽出
ＲＮＡｓｅｓによるＲＮＡの分解を防ぐために、抽出ステップの全てを、グローブおよびＲＮＡｓｅを含まない材料を使用して、氷冷下で行った。ＲＮＡは、４時間培養物（およそ１０８ＣＦＵ／ｍｌ）５ｍｌを遠心分離（４℃、３分間、４７００ｒｐｍ）して得られる細菌ペレットから抽出した。
【０１５０】
抽出方法の影響を評価する目的で、２つの手法、ＴＲＩＺＯＬ試薬およびＢＩＯＲＡＤキットを、全ＲＮＡを抽出するために使用した。
【０１５１】
−　ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）：この試薬は、グアニジン　イソチオシアネートならびにフェノールの単相の溶液からなり、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉとＳａｃｃｈｉによって開発された方法によって、単一ステップで全ＲＮＡの抽出を可能にする。細菌細胞は、ＴＲＩＺＯＬ試薬を加えることにより溶解され、３０秒ボルテックスにかけ、そして、熱衝撃（６５℃のインキュベーション後、−８０℃で冷凍）を施す。それ以降のステップは、従来のフェノール−クロロホルム抽出のものである。最終的に、回収された水相はＲＮＡを含んでいる。
【０１５２】
−　ＢＩＯＲＡＤキット：このキットは、フェノールをベースとする溶液を含んでいない。それは、５分間６５℃でインキュベーションの間に、細胞を溶解させることの可能な溶液を使用することからなる。次に、ＤＮＡおよびタンパク質の沈澱用の溶液が、水相にあるＲＮＡを回収することを可能とする。
【０１５３】
これらの２つの方法において、ＲＮＡの沈澱ステップおよび可溶化ステップは同一である。ＲＮＡは、イソプロピルアルコールを使用して沈澱させる：イソプロピルアルコールは、ＲＮＡを含んでいる水溶液に、等体積量で加える。この混合物を、およそ１５時間−２０℃でインキュベートし、そして、遠心分離（４℃、１３０００ｒｐｍで５分間）後、ＲＮＡは、ペレットの形で得られる。その後、ＲＮＡを７０％のエタノールで洗浄し、そして、遠心分離（４℃、１３　０００ｒｐｍで２分間）によって沈澱させる。最後に、ＲＮＡは、第１のケース（ＴＲＩＺＯＬ）では水に、または第２のケース（ＢＩＯＲＡＤ）では、再水和作用溶液中で可溶化される。該ＲＮＡ試料は、−８０℃で保存する。
【０１５４】
ｂ．得られたＲＮＡ試料の分析
−ＲＮＡ検定および純度
ＲＮＡは、２６０ｎｍに吸光度を測定することにより、分光光度計を使用して分析され、２６０ｎｍにおける光学密度の値は、４０μｇ／ｍｌのＲＮＡ濃度に相当することが知られている。試料の純度は、ＯＤ２６０ｎｍ／ＯＤ２８０ｎｍ比を計算することより評価され、１．６を超える比率は、許容できる純度を反映している。
【０１５５】
−ＲＮＡ品質
およそ０．３μｇのＲＮＡを、２％アガロースゲル電気泳動（８０ボルト）によって分析する。得られたＲＮＡ調製物が良好な品質である場合には、得られたイメージは、主として、２３ＳリボソームＲＮＡおよび１６ＳリボソームＲＮＡに対応するバンド、および、５ＳＲＮＡと、およびトランスファーＲＮＡとに対応するバンドの可視化を可能にする（図参照）。
【０１５６】
ｃ．３３Ｐ標識ｃＤＮＡプローブの合成
ランダムなプライミングを使用して、ｃＤＮＡプローブを合成する。１０μｇＲＮＡを、１０μｇのランダム・ヘキサマー；　ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰ（ベーリンガーマンハイム）、最終濃度１０μＭ；　４０　Ｕの　Ｒｎａｓｉｎリボヌクレアーゼ抑制剤２Ｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）；　１×　ＲＴバッファー；　１０μｇの牛の血清アルブミン（Ｐｒｏｍｅｇａ）と、混合して、最終体積５０μｌとする。この反応混合物は、ｍＲＮＡを線形化するために５分間５０Ｃでインキュベートし、次いで、氷中の＋４℃に戻す。最後に、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）１００Ｕおよび、５０μＣｉの［α−３３Ｐ］ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を加える。最後に、この反応混合液を、３７℃で２時間インキュベートする。
【０１５７】
５．分子間ハイブリダイゼーション
−　プレハイブリダイゼーション
予め、ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔのハイブリダイゼーション・バッファー（０．５Ｍ　ＮａＰｉ、ｐＨ　７．２；　１ｍＭ　ＥＤＴＡ；　０．７％　ＳＤＳ）５ｍｌ中において、６５℃で最小３０分間、該薄膜をプレハイブリダイズ処理する。
【０１５８】
−　ハイブリダイゼーション
（９５℃、５分間）変性後、３３Ｐ標識ｃＤＮＡプローブを、直接ハイブリダイゼーション・バッファー５ｍｌに加える。ハイブリダイゼーション反応は、６５℃で１５〜１８時間行う。
【０１５９】
−　洗浄
薄膜を、洗浄用バッファー（４０ｍＭ　ＮａＰｉ、ｐＨ　７．２；１ｍＭ　ＥＤＴＡ；１％ＳＤＳ）で、先ず２度すすぐ。次いで、４回の洗浄ステップを行う（６５℃、３０分間）。
【０１６０】
−　暴露
サラン（食品用フィルムラップ）で包んだ上で、薄膜を４８時間〜９０時間、３３Ｐ感受性スクリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ）に暴露する。
【０１６１】
−　脱ハイブリダゼーション
薄膜を０．２Ｎ　ＮａＯＨおよび０．１％のＳＤＳの溶液存在下、３７℃で１５分間、２度インキュベートし、次いで、蒸留水で５分間濯ぐ。
【０１６２】
６．全転写産物の分析
−　データ収集
暴露された３３Ｐ感受性スクリーンを、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｓｔｏｒｍ　８４０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用して５０μｍのピクセルサイズで走査し、そして、得られるイメージを、ＸｄｏｔｓＲｅａｄｅｒソフトウェア（Ｃｏｓｅ）を使用して分析する。このソフトウェアによって、スポットの自動認識が可能で、スポットの各々について、ピクセル密度を計算することができる。また、それは、バックグラウンド・ノイズの差し引きと、信号強度の正規化も可能である。各スポットについて、局所的なバックグラウンド・ノイズを差し引き、また、信号強度は、４００倍希釈の染色体の信号を使用して正規化した。
【０１６３】
−　データ分析
初めに、同じクローンに由来する２つのスポット間の不一致を計算して、異常信号を反映している、顕著な不一致を有するスポットを除去した。次いで、同じペアからの信号強度の平均値を定義した。つまり、データ分析において考慮されるものは、ネット（局所的なバックグラウンド・ノイズの差し引き後）であり、かつ、正規化されている、この平均強度である。１７ｂｐのクローンについて得られた強度は、陽性閾値を定義することを可能とし、かかる強度より低い信号は、陰性か「非検出」と考えられる。
【０１６４】
結果
１．血清の殺菌効果を検討するためのモデルの有効性確認
大腸菌Ｃ５の血清中での増殖能。
新生児脳膜炎の原因である大腸菌株Ｃ５、ならびに、非病原性の大腸菌Ｋ１２とＥＣＯＲ１５株について、１０７ＣＦＵ／ｍｌで接種して、作成された成長曲線は、ヒト血清の存在下で、大腸菌Ｃ５は、生存し、増加することが可能であり、一方、大腸菌Ｋ１２は、２時間未満で死滅し、また、ＥＣＯＲ１５株は、２時間で、２桁以上の生存の減少を受け、１０４〜１０５のＣＦＵ／ｍｌのレベルで残存することを示す。より低い接種（１０３または１０５ＣＦＵ／ｍｌ）では、Ｃ５株は、培養当初の２時間は増殖せずに生存し、そして、その後、４時間で１桁の増殖を遂げる。従って、全転写産物研究では、１０７ＣＦＵ／ｍｌの接種原を選択した。
【０１６５】
補体除去された血清では、Ｋ１２およびＥＣＯＲ１５株の成長は、Ｃ５株のそれと同様であり、これは、観察された殺菌効果は、補体の細胞溶解活性に因ることを示唆する。
【０１６６】
培養の２時間と６時間の間におけるＣ５株の生存は、３７℃での補体の変態に起因するか否かを決定するために、３７℃で前もって２時間、４時間および６時間インキュベートした血清の存在下において、Ｋ１２株について成長曲線を作成した。この実験の結果は、３７℃で６時間予めインキュベートした後でさえ、血清は、まだその殺菌活性を有することを示す。
【０１６７】
２．ＲＮＡの単離および２つの抽出方法の比較
ＲＮＡの抽出ステップは、ＤＴＡの基本的ステップであるので、我々には、抽出モードが、全転写産物の結果に影響を有するか、否かを決定するために、２つの抽出方法を比較することが必要であると思われた。良好な品質の調製物は、２３Ｓ、１６Ｓおよび５ＳｒＲＮＡの存在によって特徴付けられ、アガロースゲル電気泳動における、クリアバンドの形成において、検出される。ジピリジルを添加した栄養液体培地培養物から、ＢｉｏｒａｄキットおよびＴｒｉｚｏｌ試薬を用いて抽出したＲＮＡを、非変性条件下、２％のアガロースゲル上で分析した。２３Ｓと１６ＳのｒＲＮＡについて得られるバンド、および、５ＳｒＲＮＡと、ｔＲＮＡとに対応するバンドは、ＲＮＡ調製の良好な品質と、抽出方法の同等性を反映している。加えて、低分子量ＲＮＡの検出は、他のシステム、特に、２００ｂｐより長いｍＲＮＡだけを保持するカラムを使用するものと異なり、該抽出方法は、サイズの小さいｍＲＮＡを単離することが可能であることを示す。しかし、染色体ＤＮＡに対応する高分子量バンドが、Ｂｉｏｒａｄキットを使用して得られたＲＮＡのレーンに明白に現れる。これらの２タイプのＲＮＡから得られた、２種類の全転写産物は、（信号を積分することなく）視覚的に比較し、そして、同一に見える。これらの結果は、抽出方法の影響がないこと、特に、染色体のＤＮＡ汚染の影響がないことを示唆する。後のポイントはさらに、ＤＮＡｓｅ処理のある、なしで、Ｂｉｏｒａｄ　ＲＮＡを使用して得られたプローブ間の比較を行うことにより確認された。
【０１６８】
３．新生児脳膜炎の原因である、大腸菌Ｋ１に特異的なＤＮＡ断片に対応する転写産物の特異的な発現
Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　ライブラリーのクローンのセットを含んでなる高密度薄膜上、２つの異なる培養条件下の、大腸菌Ｃ５に由来する逆転写物のハイブリダイゼーションによって取得された全転写産物を、その信号はすべての信号の平均値に近い、染色体の４００倍希釈を正規化スポットとして使用して、Ｃｏｓｅソフトウェアの助けを借りて、分析した。幾らかのスポットは、信号を欠いていることが明白に認められる。陰性か「検出なし」であると考えられる、逆転写物を客観的に決定するために、１７ｂｐクローン上で検出される正規化強度（０．０５）を使用した。安全を期すため、この閾値を２倍にし、従って、０．１未満の強度のスポットは、「検出なし」であると考えられる。
【０１６９】
少なくとも１つの培養条件下において、その転写が検出された、クローンの全てについて得られた信号の正規化強度は、３つのそれぞれの実験条件：栄養液体培地中、２，２’−ジピリジル（鉄のキレート化剤）を添加した栄養液体培地中、および血清中の成長の過程における、一群のサブトラクティブ・クローンの転写レベルを視覚化することを可能にする。検出される信号のほとんどは、培養条件に関わらず同様の強度を有するが、ある断片は、培養条件に応じて、１０倍程度変動する、転写レベルを示していることが注目される。従って、これらの結果は、該手法のよい再現性を示唆するとともに、異なる転写レベルを検出する能力があることを示唆している。
【０１７０】
栄養液体培地中で得られた全転写産物は、好適な培地中における、該細菌の転写の基礎レベルを反映していると考えられた。血清中での培養による、ストレス条件下で得られた発現プロフィールを、この対照全転写産物に対して、分析した。加えて、栄養液体培地と鉄キレート化剤の中で培養した際に得られた全転写産物も、鉄分欠乏、および血清中の補体のそれぞれの役割を決定するために、調製された。
【０１７１】
下記の表５は、栄養液体培地（ＮＢ）中での成長により代表される対照条件に対する、様々な実験条件下で、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　ライブラリーのいくつかのクローンにおいて、得られた信号強度の比率を示す。全体として、ＳａｕＥ１５．Ａ１２、ＳａｕＥ４．Ｅ６、ＳａｕＥ４．Ｃ１１およびＴｓｐＥ１５．Ｇ６クローンを例外として、血清（ｓｅｒ）中で誘導される転写は、ジピリジル（ｄｉｐ）および補体除去した血清（ＤＣ　ｓｅｒｕｍ）の存在下でも、概ね共通して誘導されているように見える。
【０１７２】
これらの４つのクローンは、鉄欠乏以外の血清因子によって誘導される転写物を有することは、ジピリジルの存在下では、それらの転写レベルは、変化しないか、寧ろ、減少してさえいる（表５参照）ので、特筆するほど興味深い。これらクローンのうちの２つ（ＳａｕＥ１５．Ａ１２とＳａｕＥ４．Ｃ１１）の転写は、補体除去された血清中では誘導されず、従って、それらは、補体抵抗性に対する優れた候補である遺伝子を表わす。
【０１７３】
【表１４】
2004512817.tif 000016
【０１７４】
再現性
この手法の再現性を確認し、また、検出された転写レベルの差は、使用した血清プールに特有の因子と連関していないことを証明するために、一人のドナーに由来する血清中における、大腸菌Ｃ５の培養物から新たなプローブを調製した。この新たなプローブを用いて得られた全転写産物を、いくつかの血清からなるプールを用いて作製した全転写産物と比較した。得られた回帰直線および、０．８５のその回帰係数は、該手法の優れた再現性を示す。
【０１７５】
正規化された強度と逆転写産物の量との関係：
実際に、正規化された強度と逆転写産物の量との間に線形性があることを確認する目的で、１／１００、１／４００および１／６００の稀釈からなる染色体範囲ポイントにおいて得られた強度を、グラフに記録した。得られたグラフは、これらの値の間に線形関係が存在することを示しており、記録された正規化強度から直接、誘導ファクターを推定することを可能としている。
【０１７６】
結論
従って、ここに記載のＤＴＡ技術は、大腸菌Ｃ５より得られるＢ２／Ｄ＋　Ａ−　ライブラリーから、血清存在下において、その転写量が増加する、ＤＮＡ断片を選択する信頼できる方法であると思われる。これらの断片は、人間および動物中での、全身的かつ下痢を伴わない大腸菌の腸外成長に特異的に関わる遺伝子を構成する。これらの遺伝子は、当業者には慣用の手法に従って（実施例６参照）、血清存在下において、その転写が増加する、前記ＤＮＡ断片を使用して、単離することができる。
【０１７７】
これらの断片およびそれを内在している遺伝子は、人間または動物の腸外部位における、大腸菌の全身的かつ下痢を伴わない成長を予防し、軽減しまたは対処することを目的とする、ワクチン組成物中の有効成分として（真核生物のプロモーターの制御下に置かれた裸のＤＮＡの形で、または細胞に感染したＤＮＡの形で）使用することができる。この目的のために、これらの断片および遺伝子は、必要に応じて、例えば、不活性化された同質遺伝子的変異体を生産するように、改変することができる。
【０１７８】
それらがコードするポリペプチドも、不活性化された免疫原の形で、かかるワクチン組成物中に使用することができる。
【０１７９】
これらのＤＮＡ断片およびこれらの遺伝子は、（腸内領域ではなく、腸外領域における大腸菌の成長を抑制する目的で）抗病原性ターゲットとしても使用することができる：それらは、それらの転写および／または翻訳を特異的に阻害することができる化合物、あるいは、これらの遺伝子によってコードされたタンパク質の活性を阻害することができる化合物の特定を可能とする。かかる化合物は、人間または動物の腸管外部位における、大腸菌の全身的かつ下痢を伴わない成長を予防し、軽減し、または処置するための、医薬組成物（薬効産物）中の有効成分として利用することができる。
【０１８０】
Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型を示し、ならびに、その転写物は血清中では増加する、断片の中でも、例えば、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７などの、腸内に局在する感染の主体となる大腸菌中には存在しないものは、特により好ましい。
【０１８１】
腸外部位における、大腸菌の全身的かつ下痢を伴わない成長は、特に、新生児脳膜炎、菌血症、敗血症または腎盂腎炎などの疾病に関係して、観察される。かかるワクチンおよび医薬組成物は、特に、院内感染の情況において有用である。かかるワクチンは、出産時における新生児の汚染を回避するために、腎盂腎炎の予防として、女性（思春期から成人まで、中でも特に妊娠前および妊娠期間中に）に対する予防接種用に、最も特に有益がある。
【０１８２】
従って、本発明にかかるワクチンおよび医薬組成物は、かかる病理に特に適している。
【０１８３】
従って、本発明は、以下の手順で取得できるポリヌクレオチドのいずれをも対象とする。
【０１８４】
−　１種類以上のグループＡの大腸菌株に対する、グループＢ２またはＤの大腸菌株のサブストラクティブ・ハイブリダイゼーション、
−　サブトラクションＤＮＡ断片の単離、および
−　標準栄養素培地に対して、血清存在下において、その転写が活性化されるものの選択。
【０１８５】
上記表５中で挙げるＤＮＡは、かかるポリヌクレオチドの例である。
【０１８６】
本願は、従って、以下のものを対象とする。
【０１８７】
−　特に、人間または動物の腸管外部位における大腸菌の（全身的で下痢を伴わない）成長の予防、軽減、または対処するための、かかるポリヌクレオチド、あるいは、かかるポリヌクレオチドの不活性化された同質遺伝子的変異体（予測される病原性の不活性化）を含んでなるワクチン組成物のいずれも、
−　かかるポリヌクレオチドまたは変異体の転写および／または翻訳を阻害することができる、あるいは、かかるポリヌクレオチドまたは変異体によってコードされるポリペプチドの活性を阻害することができる化合物を含んでなる医薬組成物のいずれも。
【０１８８】
本発明はまた、人間または動物の腸管外部位における大腸菌の成長（全身的で下痢を伴わない感染症）を予防、軽減または対処することを目標とした医薬組成物（薬効産物）中で有効成分として利用することが可能な化合物を特定する方法を対象とする。この方法は、前記ポリヌクレオチドの転写および／または翻訳を阻害することができる、あるいは、それらがコードするポリペプチドの活性を阻害することができる化合物を検出し選択することを含んでなる。本発明はまた、この方法の実施に適しているキットのいずれをも対象とし、前記キットは、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの少なくとも１つを含んでなる。その中に、前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つ、または同質遺伝子的な変異体が、トランスフェクトされている、遺伝子組換え細胞および非ヒト遺伝子組換え動物のいずれをも、また、本願の領域へ入る。かかる細胞および遺伝子組換え動物は、関心のある有効成分を選択する上で特に有用である。
【０１８９】
実施例４：　Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型領域の配列の作成
実施例１には、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型の２５９個のＤＮＡ断片（それらのうちの１５３個は、産物として新規である）の単離および配列が記載され、また、これらの産物の全セットを作成する手段が提供されている。
【０１９０】
当業者は、これらのＤＮＡ断片を使用して、記述された領域１、２、３、４、５、６ａおよび６ｂのそれぞれの配列、ならびに、それらに対応するＯＲＦを、特定し、単離し、ならびに配列決定することができることを理解するであろう。
【０１９１】
実施例１と図１は、領域１に属する８個の（新規な）断片の配列（配列番号：１３４、１４４、１０９、１１５、１４０、１３５、３３および５６）を与える。領域２については、５個の新規な断片（配列番号：１２５、１２３、１１６、４３および４０）、ならびに、ｓｆａ遺伝子の存在が示されている。領域３については、７個の（新規な）断片（配列番号：１２２、１３０、１４１、２５、４８、５１および５７）が示される。領域４については、３個の（新規な）断片（配列番号：１２１、４４および４５）が示される。領域５については、５個の（新規な）断片（配列番号：１１３、１１９、１２０、２３および５２）が示される。領域６ａについては、８個の新規な断片（配列番号：１２７、１３３、２７、３４、３　６、４２、４６および５４）、ならびに既知のｉｂｅ１０産物の存在が示される。領域６ｂについては、４個の（新規な）断片（配列番号：５５、３８、１２８および１５１）、ならびに４つの既知の産物（配列番号：２１２、２２６、２０１および２２９）の存在が示される。
【０１９２】
該配列の提供は、当業者に、慣用の技術によって、対応する領域の完全な配列を取得すること、また、これらの領域中において、可能性のあるオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の存在を特定することを可能とする。
【０１９３】
該慣用技術の１つは、この領域の断片の配列に基づいて、所望の領域を増幅するためプライマーを開発する、そして、前記プライマーの様々な組み合わせを用いて、グループＢ２またはＤ大腸菌株（ＥＣＯＲであってもなくてもよい）のポリヌクレオチド全体群に接触させて、従来のＰＣＲ条件下で、ＰＣＲ増幅を実行することからなる。オーバーラップする該ＰＣＲ産物は、連鎖終端法および自動化配列決定を使用して、両方のストランド上の配列決定される。
【０１９４】
必要に応じて、前記ポリヌクレオチド群に制限を施すことで得られる、およそ１５ｋｂの部分的な断片を、例えば、ラムダＤＡＳＨ−ＩＩ中に、クローニングすることによって、入手可能なクローンの範囲を超えて、得られた配列を拡張することができる。次いで、所望の領域にオーバーラップしている挿入物は、この領域のクローンとのハイブリダイゼーションにより同定される。次いで、挿入されたＤＮＡは、挿入片の端部から配列決定され、そして、これらの配列は、染色体の（および非ファージの）ＤＮＡを直接増幅するために用いられる、新規なプライマーを開発するために使用される。次いで、これらの新規なプライマー、および既に得られていたより短い配列のものを使用して、染色体ＤＮＡの増幅が達成される。これらのＰＣＲストランドは、さらに両方のストランド上の配列決定がなされ、これで、所望な領域の完全な配列が作成される。
【０１９５】
代わりに、かかる領域の配列は、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型のクローンが位置する点から、グループＢ２またはＤの大腸菌株の染色体の配列決定を延長することにより取得することもできる（下記実施例６参照）。
【０１９６】
次いで、該領域について取得された配列のオープン・リーディング・フレームは、ＯＲＦを検索する常法に従って、解析することができる。検索を、特に、ＡＴＧまたはＣＴＧで開始し、また、高いコドン使用指数を有するＯＲＦについて実施する。
【０１９７】
実施例５：　大腸菌株の系統発生的グループを同定する方法およびキット
実施例１、２および３中に示すように、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型を示すポリヌクレオチドは、いずれかの大腸菌株の系統発生的グループを決定するために利用することができる。それらは、目的とする系統発生の正確さおよび結果に応じて、単独で、組み合わせて、あるいは、他の産物と併用して、使用することができる。陽性検出の場合には、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型のＤＮＡのセットは、菌株がグループＡに属するという仮説を排除することを可能とする。より正確には、ｃｈｕＡ遺伝子、あるいは、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型の断片（特に、配列番号：２４１、１９５、１８５および２４８）の有無は、それぞれ、一方は、グループＡまたはＢ１、他方は、グループＢ２またはＤと、その間の完全な区別を可能とする。ＴｓｐＥ４．Ｃ２断片（配列番号：１１９）、それに対応する遺伝子、あるいはこの遺伝子中の、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型を示すその他の断片の有無は、グループＡおよびグループＢ１の間における完全な区別を可能とする。ＳａｕＥ１５．Ｉ１２断片（配列番号：３７）、それに対応する遺伝子、あるいはこの遺伝子中の、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型を示すその他の断片の有無は、グループＢ２またはＤとグループＡの間における完全な区別を可能とする。かかる有無の検出は、当業者に入手可能な手段いずれによっても行うことができる。それは、特に、前記ポリヌクレオチドをプローブとして使用して（サザン技術）、あるいは、前記ポリヌクレオチドのうちの１つを増幅することができる増幅プライマーの構築し、ＰＣＲを実施することにより実施することができる。該プローブおよびプライマーの構築は、当業者に既知の手法のいずれかにより行うことができ；かかる構築の例を、下に挙げる。これらのポリヌクレオチドが、コード領域のポリヌクレオチドである際には、（これらのポリペプチドを対象とする抗体を使用して）対応するポリペプチドの検出は、実施手段の変形を構成する。
【０１９８】
本願中に与えられる教示を利用して、当業者は、目的とする系統発生の正確さのレベルに対応する、決定の系統図を設計することができる。
【０１９９】
大腸菌について、少なくとも９９％の系統発生的な確度を可能とする系統発生の同定法の例を、特にここで詳細に記載する。この方法は、その配列は既知であるものの、新規な型である、２つの遺伝子（ｃｈｕＡとｙｊａＡ）のＰＣＲ検出、ならびに、ＴｓｐＥ４．Ｃ２の新規なＤＮＡ断片（配列番号：１１９）の検出に基づいている。この方法を、参照方法（多座酵素電気泳動、ＭＬＥＥおよび／またはリボタイピング）を併用して、既にグループ化されている、２２０の菌株を試験することにより検証した。発明者らは、実際に、既知のｃｈｕＡ遺伝子は、グループＤのＥＣＯＲ株の１００％中に、グループＢ２のＥＣＯＲ株の１００％中に、また、グループＡのＥＣＯＲ株ならびにグループＢ１のＥＣＯＲ株の０％に存在することを証明した。かれらは、また、その配列は既知である、ｙｊａＡ遺伝子は、ＥＣＯＲ　Ｂ２株の１００％中に、また、グループＤのＥＣＯＲ株の０％中に存在していることを証明した。該ｙｊａＡ遺伝子は、それまで、大腸菌株Ｋ１２（グループＡ）中に存在するは知られているものの、しまし、なんらの機能も知られていなかった。また、該ＴｓｐＥ４．Ｃ２の新規な断片は、グループＢ１のＥＣＯＲ株のおよそ９４％中に、また、グループＡのＥＣＯＲ株の０％中に存在していることも明らかにされた。これら系統発生の３つのマーカーの組み合わせは、９９％を超える、グループＡとＢ１、Ｂ２、Ｂ２およびＤの間での弁別の有効性レベルを達成することを可能にする。技術的に非常に有利である、この組み合わせを満足させる技術的手段：三重ＰＣＲも、記載する。この新規な方法は、迅速で単純であり、それは、直接細菌コロニーに対して、使用することができ、また、それは、従来技術の手法、あるいは、特にＭＬＥＥやリボタイピングとは異なり、参照株コレクションの所持を必要としない。従って、記載する該方法は、日常的な分析用の、実際的な臨床のツールを構成することが可能な、最初の方法に当たる。
【０２００】
材料および方法
細菌菌株。
ＥＣＯＲコレクションの７２種類の菌株は、ＡＴＣＣから入手可能である。様々な宿主および様々な地理的位置から単離された、これらの参照株は、該種の遺伝子型多様性の範囲を代表している。これら菌株の６８種類は、４つの主要な系統発生のグループ（Ａ、Ｂ１、Ｂ２およびＤ）に属しており、また、４種類は、分類不能である。
【０２０１】
新生児脳膜炎（ＮＭＥＣ）を引き起した、８６種類の大腸菌株、脳膜炎を伴わない新生児敗血症の原因である３４種類の大腸菌株、健康な新生児から単離された３０種類の大腸菌株、および尿路病原性大腸菌　Ｊ９６（０４：Ｋ６）株の一群も、試験した。該８６のＮＭＥＣ菌株のうち、６９種類の系統発生的グループの分布は、既に記載されている（Ｂｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．１９９８，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７７：６４２〜６５０）。他の１７のＮＭＥＣ、および残る６５種類の臨床的に単離株は、既に、Ｂｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（上記参照）に記載されるような、リボタイピング法によって分類した。さらに、系統発生のグループＡに属する、研究室大腸菌　Ｋ−１２　ＭＧ１６５５株も、使用した。
【０２０２】
細菌は、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ液体培地または寒天培地上で、３７℃で培養した。必要に応じて、アンピシリン（１ｍｌ当たり１００μｇ）を使用した。
【０２０３】
ＰＣＲ増幅。
第１ステップでは、標準プロトコルに従って、ＰＣＲを実施した。反応は、１０×バッファー（Ｔａｑポリメラーゼに添付の）２μｌ、各プライマー　２０　ｐｍｏｌ、各ｄＮＴＰ　２μＭ、Ｔａｑポリメラーゼ（ＡＴＧＣ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ，　Ｎｏｉｓｙ−ｌｅ−Ｇｒａｎｄ，　Ｆｒａｎｃｅ）２．５ＵおよびゲノムＤＮＡの２００ｎｇを含む、２０μｌ容で行った。ＰＣＲは、ＭｉｃｒｏＡｍチューブを用いて、パーキン・エルマーＧｅｎｅＡｍｐ　９６００　熱サイクル装置を使用し、次の条件下：
９４℃で５分間の変性、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で３０秒間を３０サイクル、および７２℃で７分間の最終伸長ステップ、
下記のプライマー対使用して、実施した。
【０２０４】
ｃｈｕＡについては
ｃｈｕＡ．１（５’−ＧＡＣＧＡＡＣＣＡＡＣＧＧＴＣＡＧＧＡＴ−３’；　配列番号：１６０）および
ｃｈｕＡ．２（５’−ＴＧＣＣＧＣＣＡＧＴＡＣＣＡＡＡＧＡＣＡ−３’；　配列番号：１６１）
ｙｊａＡについては
ｙｊａＡ．１（５’−ＴＧＡＡＧＴＧＴＣＡＧＧＡＧＡＣＧＣＴＧ−３’；　配列番号：１６２）および
ｙｊａＡ．２（５’−ＡＴＧＧＡＧＡＡＴＧＣＧＴＴＣＣＴＣＡＡＣ−３’；　配列番号：１６３）
ＴｓｐＥ４Ｃ２（配列番号：１１９）については
ＴｓｐＥ４Ｃ２．１（５’−ＧＡＧＴＡＡＴＧＴＣＧＧＧＧＣＡＴＴＣＡ−３’；　配列番号：　１６４）および
ＴｓｐＥ４Ｃ２．２（５’−ＣＧＣＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＴＡＴＴＡＣＧ−３’；　配列番号：　１６５）。
【０２０５】
これらのプライマー対は、増幅によって、それぞれ、２７９ｂｐ、２１１ｂｐおよび１５２ｂｐの断片を生成する。
【０２０６】
単純化されたプロトコルに従って、２ステップの三重ポリメラーゼ反応を使用した。反応の構成は、以下の点を除き、標準プロトコルでのと同じである。
【０２０７】
（ｉ）ＤＮＡは、３μｌの細菌溶解物あるいはコロニー画分により、直接提供した；
（ｉｉ）上記の６個のプライマーは、一緒に混合した；
（ｉｉｉ）ＰＣＲステップは、下記の通りである：９４℃で４分間の変性、９４℃で５秒間および５９℃で１０秒間の３０サイクル、および７２℃で５分間の最終伸長ステップ。
【０２０８】
サザン・トランスファー。
サザン・トランスファーは、正に帯電したナイロン薄膜上に毛細管トランスファーによって行った。ハイブリダイゼーションは、１％のＳＤＳ／１Ｍ　ＮａＣｌ／５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣ１、ｐＨ　７．５／１％のブロッキング剤（ベーリンガーマンハイム、マンハイム、ドイツ）中で、６５℃で実施した。薄膜を、２×ＳＳＣ中、室温で１５分間洗浄し；次いで、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、６５℃で３０分間、および最後に０．１×ＳＳＣ中、室温で５分間洗浄した。メーカーの指示書（核酸用ＤＩＧルミネセンス検出キット（ベーリンガーマンハイム））に従って、化学ルミネセンスによる検出を行った。該プローブは、該標準プロトコルにおいて、上述したプライマー、および増幅手順を使用し、メーカーの指示書（ＰＣＲ用ＤＩＧプローブ合成検出キット（ベーリンガーマンハイム））に従って、ＰＣＲにより作製した。
【０２０９】
結果
２２０の菌株を分析した。参照方法によって決定された、それらの系統発生のグループは、以下のとおりである：４３種類の菌株が、グループＡに、２３種類がグループＢ１に、４１種類がグループＤに、１１３種類がグループＢ２に属する。
【０２１０】
【表１５】
2004512817.tif 000017
【０２１１】
上記表６は、菌株の完全なセットに関して、系統発生のグループに従って、本発明にかかる方法および参照方法を用いて得られた結果を示す。ｃｈｕＡ遺伝子は、グループＢ２およびＤに属する菌株全て中に存在し、グループＡおよびＢ１の菌株全てに存在していない。これは、グループＡ／Ｂ１からグループＢ２／Ｄを有効に分けることを可能にする。同様に、ｙｊａＡ遺伝子は、グループＢ２（１００％陽性株）とグループＤ（１００％陰性株）の間での、完全な区別を可能とする。最後に、新規なＴｓｐＥ４．Ｃ２クローンは、２種類を除いてグループＢ１の菌株全てに存在し、また、グループＡの菌株全てに存在していない。ＰＣＲの結果全ては、サザン・ハイブリダイゼーションによって確認された。これら３つの増幅の結果は、系統発生の分類のための、二分岐決定の系統図を確立することを可能にした。この決定の系統図は、特に図３に図解してある。この系統図に従って、試験した２２０菌株のうちの２１８（９９％）は、参照方法に対しても、正確に分類され、参照方法に従って、グループＢ１に属すると考えられる２つの菌株だけが、本発明による手法では、グループＡに由来すると同定されている。標準および単純化ＰＣＲプロトコルでは、同一の結果が得られた。図４は、４つの系統発生のグループについて、該三重ＰＣＲによって得られた、様々なプロフィールを例示している。従って、これらの新規なプロフィールは、大腸菌の系統発生分類のための分析上の基準となる。
【０２１２】
考察
本発明者らは、大腸菌株の系統発生グループを迅速に決定するＰＣＲ法を開発した。２つの遺伝子、ｃｈｕＡとｙｊａＡ、ならびにＴｓｐＥ４．Ｃ２（配列番号：１１９、実施例１参照）と命名された新規なＤＮＡ断片を使用して、前もって、既知の方法を使用して決定された系統発生のグループに帰属がなされている、２２０菌株の系統発生のグループを決定した。本発明によって得られた分析の確度は、従来技術の方法で確立され分類に対して、９９％を超える。加えて、同じ結果が、直接細菌コロニーに使用される、技術的に非常に単純な三重ＰＣＲ方法で観察された。
【０２１３】
少数の遺伝子型、表現型上の特徴に基づく、大腸菌株の系統発生の同定は、従来技術では、非常に困難であると思われていた。かかる遺伝子型の特徴（例えば、遺伝子の有無）は、系統発生の同定に利用しえるためには、様々な基準を充足する必要がある。第１に、それが特徴付けるグループが出現した際には、該遺伝子は、獲得されているか、あるいは、欠失されているかの何れかでなければならない。第２に、この同じ遺伝子は、後天的な欠失あるいは他の系統発生グループに属する細菌への水平的移動などの現象を除外するように、「安定化されている」必要がある。最後に、該候補遺伝子中において、組換え現象は極めて稀でなければならない。換言すれば、該遺伝子産物は、新規な遺伝子的組換えに好ましいような、自然淘汰の標的であってはならない。従来技術では、表現型または遺伝子型に基づく、系統発生グループの特徴を特定する試みは、十分な識別力を有することは示されていない。技術的に非常に単純な方法において、良好な効率性で、系統発生グループの決定を可能にする、２つの遺伝子、および新規なＤＮＡ断片の組み合わせ使用が、初めて、ここに記載される。
【０２１４】
しかし、従来の技術によれば、系統発生のグループＢ１に属している、２種類の菌株（ＥＣＯＲ　７０および一つのＮＭＥＣ）は、本発明による方法では、グループＡに分類された。この分析上の相違は、これらの２つの菌株のグループに共通の中間の遺伝的基礎が存在するかもしれないという事実、または、本発明による方法を使用して研究した領域（ｃｈｕＡ、ｙｊａＡおよびＴｓｐＥ４．Ｃ２は、大腸菌　Ｋ１２のゲノム上では、それぞれ７８．７分、９０．８分およびほぼ８７分に位置している）は、従来技術の方法を使用して研究された領域より、グループＡに接近しているかもしれないという事実によって説明されるかもしれない。具体的には、グループＡおよびＢ１は、姉妹グループであることが実証されている。加えて、多数の染色体塩基配列に関する最近の解析は、ＥＣＯＲ　７０は、その中の、数種類のハウスキーピング遺伝子はグループＡのＥＣＯＲ株に共通する塩基配列を有しており、また、その中の、他の数種類の遺伝子は、グループＢ１のＥＣＯＲ株に共通している塩基配列を有している、「雑種」菌株と考えることが可能であることを示している。グループＢ１とするＥＣＯＲ　７０の系統発生分類は、明確には決定されてはなく；いずれにせよ、それは、本発明による方法を使用すれば、グループＡの一部と考えられる。
【０２１５】
我々の新規なＰＣＲ方法の迅速さに加えて、本発明は、ＥＣＯＲ株などの参照コレクションまたは別のコレクションの利用を必要とはしないという長所を有しており、それは、研究室において、特に、ルーチン的な分析のため、該分析を、容易に実施することが可能であるということを意味する。さらに、他の方法と異なり、系統発生のグループへの割付けは、あいまいでない。特に、今まで、ＥＣＯＲコレクションにおいて、分類不能とされていた４つの菌株（Ｅ３１、Ｅ３７、Ｅ４２およびＥ４３）は、本発明の方法を使用して分類することができ；最初の３つの株は、グループＤに、第４の株は、グループＡに属している。後者の菌株中の、研究されたハウスキーピング遺伝子の配列全てが、グループＡの菌株で見出されるものに特徴的であるらしいことも、特記することができる。
【０２１６】
結論として、この単純で迅速な系統発生分類手法は、多くの実用的な用途を有している。第１の用途は、もちろん、系統発生のグループと、予想される毒性または危険性との間で確立可能な関連性を考慮に入れる、生物臨床的（ｂｉｏｃｌｉｎｉｃａｌ）な用途である。第２の用途は、候補菌株がクローニングのために探索する際、強い病原性の菌株、つまり、非常に危険な菌株、を除去することを可能にする、生物工学的スクリーニング・ツールに相当する。従来技術でも、例えば、ＰＣＲによって大腸菌　Ｋ１２株を識別する、あるいは、それまで、逆ドット・ブロッティング手順により知られていた毒性遺伝子のいずれも示さない、大腸菌株を検出するための、かかるスクリーニング・ツールを開発することは可能であった。ここに記載した方法は、大腸菌　Ｋ１２以外の非病原性株の特定を可能にする、また、大規模な菌株のスクリーニングに適しているという顕著な利点を有する。
【０２１７】
実施例６：　７０個のＣＦＴ０７３＋　Ｋ１２−　ゾーンおよび３１個のＲＳ２１８＋／Ｋ１２−　ゾーンの作成
これまでの実施例で、大腸菌Ｃ５株（グループＢ２に属する大腸菌株）とグループＡの大腸菌株（非病原性大腸菌　ＥＣＯＲ４およびＥＣＯＲ１５株）の間でのサブストラクティブ・ハイブリダイゼーションによる、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型を示す、クローンのライブラリーの作成を、述べた。これらのクローンの配列は、図２（配列番号：１〜１５３および１６９〜２５３）中に与えられる。
【０２１８】
これらのクローンは、グループＡのＥＣＯＲ大腸菌に対して、グループＢ２のＥＣＯＲ大腸菌および／またはグループＤのＥＣＯＲ大腸菌中で、より大きな頻度（好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上、さらにより好ましくは３．５倍以上、そして非常に好ましくは４倍以上）で存在する。それらは、特に、グループＢ２のＥＣＯＲ大腸菌中および／またはグループＤのＥＣＯＲ大腸菌中では、１０％を超える頻度で、また、グループＡのＥＣＯＲ大腸菌中では、２５％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、さらに好ましくは５％未満の頻度で存在しており、そのグループＡのＥＣＯＲ大腸菌中で観察される頻度は、グループＢ２のＥＣＯＲ大腸菌中および／またはグループＤのＥＣＯＲ大腸菌中で観察されるそれよりも常に低く保たれている。
【０２１９】
さらに、これらのクローンの存在は、当初、これらのクローンの単離に使用した、大腸菌Ｃ５株が関係しているものとは、全く異なる病理的症状に関与している、様々なグループＢ２またはＤの大腸菌株の中で確認できるかもしれない。例えば、これらのクローンの存在は、大腸菌　ＣＦＴ０７３（成人腎盂腎炎に関わるグループＢ２大腸菌）中で確認された。
【０２２０】
その際、これらのクローンのいくつかは、大腸菌ＣＦＴ０７３の染色体のレベルでは、大腸菌　Ｋ１２　ＭＧ１６５５においては見出されていないポリヌクレオチド・ゾーン内に、存在していることが観察された。すなわち、ＣＦＴ０７３＋　Ｋ１２−　ゾーンは、Ｂ２／Ｃ＋　Ａ−　型の前記断片（大腸菌Ｃ５から単離された；実施例１参照）の近くに、単離された。その７０個について、ここに説明が与えられる。
【０２２１】
次いで、これらの７０個のＣＦＴ０７３＋　Ｋ１２−　ゾーン個々の染色体上の位置は、当該分野における基準となる、大腸菌　Ｋ１２の染色体地図に対して決定した（下記の表８中の「Ｋ１２座標」欄）。そして、存在するかもしれないオープン・リーディング・フレーム（ｏｒｆ／ＯＲＦ）の有無を決定するため、これらの７０個のＣＦＴ０７３＋　Ｋ１２−　ゾーンを、ＣｏｄｏｎＵｓｅ（商標）（Ｅ．ｃｏｌｉ　ｃｏｄｏｎ　ｕｓｅ）およびＯＲＦファインダ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｇｏｒｆ．ｈｔｍｌ、細菌の遺伝暗号）などのプログラムを使用して解析した。対応するタンパク質配列（ＯＲＦ）を、既知の配列と比較して相同性を検索するために、抽出し、様々なデータベースと比較した。これら７０個のゾーン、およびそれらのＯＲＦの配列を、図６に示す。各ゾーンについて、特定されたオープン・リーディング・フレームのタンパク質配列（ＯＲＦ）およびポリヌクレオチド配列（ｏｒｆ）を、取り扱たゾーンの全配列に対する、これらのフレームの開始および終了位置（Ｐｏｓ．）を表示して、示してある。これらＯＲＦのいくつかは、実際には、該領域の表示された配列と相補的なストランド上に位置されている、ｏｒｆｓによってコードされている（この場合、「フレーム開始」位置は、「フレーム終了」位置より大きな数を有する）。
【０２２２】
同じプロトコルをＲＳ２１８大腸菌クローンに適用した。ＲＳ２１８＋／Ｋ１２−　ゾーンも、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型の断片の近傍に単離された。
【０２２３】
下記表７に、７０個のＣＦＴ０７３＋　Ｋ１２−　ゾーンの個々およびそのＯＲＦおよびｏｒｆ、ならびに３１個のＲＳ２１８＋／Ｋ１２−　ゾーンの個々に割り当てられた配列番号をまとめて示す。
【０２２４】
【表１６】
2004512817.tif 000018
【０２２５】
【表１７】
2004512817.tif 000019
【０２２６】
【表１８】
2004512817.tif 000020
【０２２７】
【表１９】
2004512817.tif 000021
【０２２８】
【表２０】
2004512817.tif 000022
【０２２９】
【表２１】
2004512817.tif 000023
【０２３０】
【表２２】
2004512817.tif 000024
【０２３１】
下記の表８および９は、これらの配列番号について得られた結果をまとめてあり、下記の事項を示す。
【０２３２】
−　表８：　各ＣＦＴ０７３＋　Ｋ１２−　ゾーンとＲＳ２１８＋／Ｋ１２−　ゾーンの同定を可能としたクローンの配列番号および名前、このゾーンに割り当てられる番号、大腸菌　Ｋ１２染色体地図に対する、各ゾーンの座標、各ゾーンのそれぞれのサイズ、断片の数、前記ゾーンが位置している領域の番号（上記実施例１および実施例３においてに同定される領域１、２、３、４、５、６ａまたは６ｂ；または、ゾーンが領域内にない場合には、この欄には、このゾーンが位置するレベルに位置している大腸菌ＲＳ２１８断片の名前が示されている。大腸菌ＲＳ２１８断片の名前については図１参照）
−　表９：　大腸菌ＲＳ２１８、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、大腸菌ＣＦＴ０７３との相同性。
【０２３３】
【表２３】
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【０２３４】
【表２４】
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【０２３５】
【表２５】
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【０２３６】
【表２６】
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【０２３７】
【表２７】
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【０２３８】
【表２８】
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【０２３９】
【表２９】
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【０２４０】
【表３０】
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【０２４１】
【表３１】
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【０２４２】
ゾーン２４ならびに既知のＢ２＋　Ａ−　型を示す、既知の産物に相当するそのｏｒｆ／ＯＲＦは別として、ここで同定された配列のいずれも、（プロセスの機能とは無関係に、それらの全長にわたるヌクレオチド列の比較では）従来技術の配列とは厳密には一致していない。しかし、これらのＣＦＴ０７３＋　Ｋ１２−　ゾーンおよびＲＳ２１８＋　Ｋ１２−　ゾーンの全配列と、大腸菌株０１５７：Ｈ７（系統発生的なグループは明確には決定されていない菌株であり、腸内での感染を要因となる）に対して示されるものとを比較すると、上記表９よりみられるようにいくつかの相同性が見出される。
【０２４３】
前記の各ゾーン上において同定された該ＯＲＦに関しては、データベース上での比較によって、ポリペプチドレベルで得られた同一性パーセンテージ（％ｉｄ）、および類似性パーセンテージ（％ｓｉｍ）を、図６に示す。
【０２４４】
そうであっても、ここで単離された各ＣＦＴ０７３＋　Ｋ１２−　ゾーン、および、ここで同定された各ｏｒｆ／ＯＲＦについての（ゾーン２４およびそのｏｒｆ／ＯＲＦは除き）、ならびに、単離された各ＲＳ２１８＋／　Ｋ１２−　ゾーンも同様に、それぞれ、ＣＦＴ０７３＋　Ｋ１２−　またはＲＳ２１８＋／Ｋ１２−　型の初めての記述である。従って、これらのゾーン、ｏｒｆおよびＯＲＦは、これらの産物は、非常に異なる病原性を備えた２つの大腸菌株の区別を可能にするので、最低限でも、系統発生の領域における適用（診断への適用）を有する。また、抗ＣＦＴ０７３や抗ＲＳ２１８ワクチンへの適用も想定できるであろう。
【０２４５】
加えて、ここで単離したＣＦＴ０７３＋　Ｋ１２−　およびＲＳ２１８＋／Ｋ１２−　ゾーンはすべて、その染色体の近傍において、上に定義されるＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型を示す、少なくとも１個のＤＮＡ断片を含んでいる（ＥＣＯＲ　Ｂ２頻度および／またはＥＣＯＲ　Ｄ頻度がＥＣＯＲ　Ａ頻度よりも高い、配列番号１〜５５０、ここで単離されたゾーンおよびｏｒｆは、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型のポリヌクレオチドとして優れた候補である）。それらの配列中に、上記実施例１で定義されるＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型のクローンを含んでいる、これらのＣＦＴ０７３＋　Ｋ１２−　ＯＲＦおよびｏｒｆ（配列番号１２５〜２５３）の産物は、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型を示す産物である確率がさらに高い。
【０２４６】
ここに単離されたＣＦＴ０７３＋　Ｋ１２−　またはＲＳ２１８＋／Ｋ１２−　ゾーン、ＯＲＦおよびｏｒｆが、実効的にはＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型であることの証明は、系統発生の領域における常法に従って、当業者には容易に実施することができる。１つの確認方法は、例えば、少なくとも、別の１種類のグループＢ２またはＤの大腸菌株、例えば、大腸菌Ｃ５に、ここで、大腸菌ＣＦＴ０７３およびＲＳ２１８株について記述した手順を、大腸菌Ｃ５には存在し、かつ大腸菌Ｋ１２（または他のグループＡに属する大腸菌株）には存在しないゾーン、ＯＲＦおよびｏｒｆを同定、単離するように、適用することである。次いで、これらのＣ５＋／Ｋ１２−　ゾーン、ＯＲＦおよびｏｒｆを、相同的な配列および配列断片を探索しつつ、ここに記載するＣＦＴ０７３＋　Ｋ１２−　またはＲＳ２１８＋／Ｋ１２−　と比較する。この比較は、例えば、ＢＬＡＳＴプログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｒｅ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，　ＮＣＢＩ，　Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．　１９９７，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：　３３８９〜３４０２）を使用して、Ｃ５＋　Ｋ１２−　グループの配列を、ＣＦＴ０７３＋　Ｋ１２−（またはＲＳ２１８＋　Ｋ１２−）グループのものと対比させて、行うことができる。
【０２４７】
ポリヌクレオチド配列、またはポリヌクレオチド配列の断片が、偶然に有意な相同性（例えば、８０％以上の同一性）を示す確率は低く、上に定義される、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型を示すとして選択することができる。必要であれば、グループＢ２またはＤの４番目または５番目の大腸菌株についても、該プロセスを繰り返すことができる。
【０２４８】
かかるＢ２／Ｄ＋　Ａ−　産物は、大腸菌の系統発生決定に特に有用である。
【０２４９】
Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型のポリヌクレオチド、その不活性化された同質遺伝子的変異体は、単離されたＤＮＡ（真核生物のプロモーターの制御下に置かれ、あるいは細胞にトランスフェクトされたＤＮＡの形で）の形で、大腸菌の望ましくない成長、特には腸外部位における大腸菌の成長を予防し、軽減しまたは対処することを目的とするワクチン組成物中の有効成分として使用することができる。場合によっては不活性化された、免疫原の形式で投与される、ＯＲＦはそれ自身、大腸菌の望ましくない成長、特には、腸外部位における大腸菌の成長を予防し、軽減しまたは対処することを目的とするワクチン組成物の開発には非常に有望な有効成分である。
【０２５０】
Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型を示すポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、また、抗病原性の標的（腸管外標的および非腸管外標的）として使用することができる。それらは、活性な有効成分候補から、これらのゾーンまたはｏｒｆｓの正確な転写および／または翻訳を阻害またはブロックするもの、あるいは、ＯＲＦの活性を阻害またはブロックするものを選択することにより、大腸菌の成長、および、その腸管外成長を顕著に阻害することを目的とする医薬組成物（特には、薬効産物）において使用することができる、有望な有効成分を特定および単離することを可能にする。
【０２５１】
本出願は、これらＣＦＴ０７３＋　Ｋ１２−　またはＲＳ２１８＋／Ｋ１２−　ゾーンの各々、番号１〜２３、２５〜４８、４９〜１０１、ならびに、産物として、それらのＯＲＦおよびｏｒｆを目的とする。それはまた、大腸菌の望ましくない成長、特には、大腸菌の腸管外の成長を予防、軽減または対処するための、前記ゾーンの少なくとも１つまたは前記ｏｒｆおよびＯＲＦの少なくとも１つを含んでなる、ワクチンまたは医薬組成物のいずれをも対象とする。
【０２５２】
ＣＦＴ０７３＋　Ｋ１２−　かつＲＳ２１８＋　Ｋ１２−　である、ゾーン、ＯＲＦおよびｏｒｆが、特に対象とされる。目的とする適用が、腸管外部位での大腸菌の成長（全身的で下痢を伴わない大腸菌感染）に関する際には、前記ＣＦＴ０７３＋　Ｋ１２−　、ＲＳ２１８＋　Ｋ１２−　ゾーン、ｏｒｆｓおよびＯＲＦのうち、さらにＯ１５７：Ｈ７−　でもあるものが好ましい。
【０２５３】
従って、本願は、その配列が以下にようにして取得できる、単離されたポリヌクレオチドのいずれをも対象とする。
【０２５４】
ｉ．以下の手順によって、グループＢ２またはＤの菌株（大腸菌ＲＳ２１８、大腸菌ＣＦＴ０７３または大腸菌Ｃ５など）の一群のポリヌクレオチド配列を単離する。
【０２５５】
−　グループＢ２のこの大腸菌株の染色体上に、配列番号１〜１５３および１７０〜２５３配列と、この相同性が偶然によっている確率は極めて低いような相同性、例えば同一性が８０％以上の相同性を示す配列を捜し出すこと、そして、
−　捜し出された該相同性配列の各々を使用して、５’および３’の方向に、グループＢ２またはＤの大腸菌株の染色体を配列決定し、大腸菌Ｋ１２などのグループＡの大腸菌株の染色体中に含まれる配列と、同一性が８０％以上の有意な相同性を示す配列に到達した際にはただちに配列決定を中止すること。
【０２５６】
ｉｉ．グループＢ２またはＤの他の少なくとも１種類の大腸菌株に対して、上記ｉで示した操作を繰り返す。
【０２５７】
ｉｉｉ．試験したグループＢ２またはＤの大腸菌株それぞれについて得られた配列を、試験したグループＢ２またはＤの様々な大腸菌株のなかで、（例えば、ＢＬＡＳＴなどのプログラムを使用して、）相同な配列あるいは配列断片を探索するべく比較する。
【０２５８】
ｉｖ．ｉで得られたセットに由来する配列または配列断片とｉｉで得た配列または配列断片と間で、測定された相同性のうち、偶々、同一性の８０％以上の有意な相同性を示す配列と配列断片を選択し単離する。
【０２５９】
本願はまた、このようなポリヌクレオチド上で同定される有力なｏｒｆおよびこれらのｏｒｆによってコードされるポリペプチドおよびＯＲＦを対象とする。
【０２６０】
上に示すように、本願はまた、これらの産物の、系統発生の決定、診断および治療上の適用および使用を対象とする。
【０２６１】
実施例７：　新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　産物の治療上の適用
本発明に従って単離されたＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型ＤＮＡは、大腸菌の望ましくない成長、特には、大腸菌の腸管外の成長（全身的で下痢を伴わない大腸菌感染）を予防、軽減または対処するための、ワクチン組成物における有効成分として有用である。そして、それらは、単離された（「裸の」ＤＮＡ）の形で、または生理学的な無害さ、および、トランスフェクトさせたＢ２／Ｄ＋　Ａ−　断片によンコードされたポリペプチドの分泌能力によりを選択された細胞中にトランスフェクトさせたＤＮＡの形で使用することができる。
【０２６２】
Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型のＤＮＡによってコードされるポリペプチドもまた、このようなワクチン組成物おける、有効成分として使用することができる。その際、それらは、不活性化された免疫原の形で使用する。
【０２６３】
大腸菌の腸管外成長の例は、特に、敗血症、腎盂腎炎および新生児髄膜感染を含む。顕在化したまたは潜在的な院内感染は、最も一般的には、かかる大腸菌の腸管外成長の結果である。
【０２６４】
腸管外での適用については、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型であり、かつ、Ｏ１５７；Ｈ７などの、腸内における感染の原因となる大腸菌株中には存在しない、および／または、標準栄養培地上の培養と比較して。血清中でその転写産物が増加する（上記の実施例３参照）、ＤＮＡ、およびポリペプチドのものが、特により好ましい。
【０２６５】
領域５（特に、前記の例参照）は、広スペクトルな抗−Ｂ２−大腸菌産物の製造用の有利なソースとなるように思われる。領域１、３および４に関しては、それらが、脳膜炎を伴う敗血症に対する、特には、新生児および大人における脳膜炎に対する産物の製造用の有利なソースであるように思われる。
【０２６６】
本発明は、特には、前記新規なＤＮＡの少なくとも１つ、または前記新規なＯＲＦまたは少なくとも１つ、あるいは普遍的な遺伝暗号に従って、かつこのコードの縮退を考慮して、これらのＤＮＡまたはＯＲＦのうちの１つとその配列が対応すると考えることができるポリペプチドの少なくとも１つを含んでなる、組成物、特には、ワクチンおよび医薬組成物を対象とする。それはまた、かかる組成物の製造における、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型をしめす、ｃｈｕＡ、ｃｈｕＡ断片などの、新規なＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型の既知のＤＮＡ、ならびにこれらのＤＮＡに対応するポリペプチドの使用をも対象とする。
【０２６７】
あるいは、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型の該ＤＮＡまたはポリペプチドは、それらに結合することができ、かつ（これらのＤＮＡの正確な転写および／または翻訳をブロックすることにより、またはそれらがコードしているポリペプチドの活性をブロックすることにより）大腸菌の望ましくない成長をブロックすることのできる化合物を同定するように、化学的および／または生物学的ライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。
【０２６８】
目標とする医薬的処方、所望の投与方法、また、考慮している患者（年齢、体重、性別、症状）の目的に従って、当業者は、そうした組成物の調剤および服用量を、開発し調節することができる。
【０２６９】
これらの組成物は、１種類以上の生理学的に不活性なビヒクル、そして特に、製薬的調剤、および／または所望の投与方法（錠剤、パッチ、ゼラチン・カプセル、パウダー、スプレー、飲用可能溶液、注射可能な溶液、コロイド）に適合する賦形剤をさらに含むことができる。それらは、また、本発明にかかるＢ２／Ｄ＋　Ａ−　化合物の活性の強度を変更する、その活性システムを限定する、あるいは、その活性の及ぶ標的を変更するために、１種類以上の活性な共同作用薬剤を含むことができる。それらはまた、本発明にかかるＢ２／Ｄ＋　Ａ−　化合物との相互作用を有する薬剤ではなく、感染の予防または軽減または対処に有用であるその他の薬剤を含むことができる。
【０２７０】
好ましくは、本発明にかかる、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　型のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ｉｎ　ｖｉｖｏまたは該ｉｎ　ｖｉｖｏ状態をできるだけ模倣した条件下において、そのＯＲＦは、本発明にかかるＢ２／Ｄ＋　Ａ−　型のポリヌクレオチドを含んでいる、タンパク質の活性を阻害することができる化合物を、例えば、化学的および／または生物学的ライブラリーをスクリーニングすることによって、特定するために使用される。かかる化合物は、特に、大腸菌の成長、特に、その腸管外での成長を阻害することを目的とする、組成物中、特には、医薬組成物中で使用することができる。本発明の目的は、かかる特定方法、かかる方法によって得られる化合物、ならびに、かかる組成物である。
【０２７１】
実施例８：　大腸菌の病毒性を研究するための動物モデル
１．新生のラット（Ｓｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙ−１月繁殖）をケージ（ａｎｉｍａｌ　ｈｏｕｓｅ）で２４時間順応させた後、生後５日目に感染させた。注入した接種原は、生理学的血清を栄養培地で稀釈した液を２時間おいたものから調製した。動物は、エーテル麻酔後、腹膜内ルートによって感染させ、一かえりの１０匹の仔を無作為に混ぜた後、その母親の元に戻した。
【０２７２】
１８時間後の菌血症の計数は、尾部の切開後、血液５μｌを採ることにより、行った。
【０２７３】
生後４日目のラットの、様々な大腸菌の菌株を腹膜内注入した後、１８時間後における菌血症（％）。
【０２７４】
【表３２】
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【０２７５】
２．成体マウスの、３種類の大腸菌を腹膜内注入した後、７日後における死亡率（％）
接種原は、上記と同様に調製し、腹膜内ルートで注入した。
【０２７６】
【表３３】
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【０２７７】
前記結果からは、新生児感染の原因である大腸菌Ｂ２（Ｃ５株）は、新生のラットにおける弱い接種原の注入後において、菌血症を引き起こす能力を有し、かつ、マウスにおける死亡率は１０倍高いように思われる。ＣＦＴ０７３、つまり成人の敗血症の原因である大腸菌Ｂ２では、より強い接種原を使用する必要がある。しかし、前記大腸菌は、マウスにおいても依然病原性である。グループＡの大腸菌は、マウスにおいては、もはや病原性はない。
【０２７８】
従って、請求の範囲に掲げた配列を用いて、その病毒性を前記動物モデルにおいて試験することができる、変異体を創製することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、大腸菌株ＲＳ２１８の染色体に沿った、Ｂ２／Ｄ＋　Ａ−　クローンの配置を表す。
【図２】図２は、単離されたＢ２／Ｄ＋　Ａ−　断片の配列リストを与え、また、それぞれの配列番号を表示する。
【図３】図３は、大腸菌株の系統発生分析用の決定ダイアグラムを例示する。
【図４】図４は、本発明にかかる三重ＰＣＲ法を用いて取得される、様々な系統発生的プロフィールを示す（レーン１および２：グループＡ；レーン３：グループＢ１；レーン４および５：グループＤ；レーン６および７：グループＢ２）。
【図５】図５は、ｙｊａＡ遺伝子（配列番号：２５４）のポリヌクレオチド配列およびその対応するＯＲＦ配列を示す。
【図６】図６は、図２のクローンを使用して取得さえる、ＣＴＦ０７３＋　Ｋ１２−　領域およびＲＳ２１８＋　Ｋ１２−　領域の配列を示す。
【図７】図７は、大腸菌　Ｋ１２株の染色体上における、大腸菌　ＣＦＴ０７３およびＲＳ２１８株に特有なゲノム断片の位置を示す。
【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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