(57)【要約】本発明は、図１〜４中に記載されたヌクレオチド配列を有するＤＮＡ配列並びに配列表１〜４中に記載されたＤＮＡ配列からのプライマー対をＰＣＲ反応において使用する、エシェリキア・コリ菌株ＤＳＭ６６０１の同定法に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エシェリキア・コリ菌株ＤＳＭ６６０１の同定法において、ＰＣＲ反応において、配列表１〜４中に記載されたＤＮＡ配列を有するＭｕｔａ１からＭｕｔａ１０までのプライマー対を使用することを特徴とする、エシェリキア・コリ菌株ＤＳＭ６６０１の同定法。
【請求項２】
ＰＣＲ反応を以下の温度：
ａ）  ９５℃で３分間
ｂ）  ９５℃で４５秒間
ｃ）  ５８℃で４５秒間
ｄ）  ７２℃で４５秒間
で実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ｂ）からｃ）までを少なくとも２０回繰り返す、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
図１中に記載したヌクレオチド配列を有するか又は該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡ配列。
【請求項５】
図２中に記載したヌクレオチド配列を有するか又は該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡ配列。
【請求項６】
図３中に記載したヌクレオチド配列を有するか又は該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡ配列。
【請求項７】
図４中に記載したヌクレオチド配列を有するか又は該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡ配列。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株ＤＳＭ６６０１の同定法に関するものである。
【０００２】
エシェリキア・コリは、グラム陰性菌でり、人間及び動物の腸内細菌中あるいはまた腸管外に存在している。Ｅ．ｃｏｌｉは、今日では、遺伝子工学の微生物クローニングシステムにおいて、異種タンパク質の発現並びにクローニング及びＤＮＡ増幅のための極めて重要な宿主生物である。
【０００３】
Ｅ．ｃｏｌｉには、多数の変種が存在しており、カプセル抗原（Ｋ−抗原）、表面抗原（Ｏ−抗原）及び鞭毛抗原（Ｈ−抗原）の点で異なっており、従って、多数の血清学的タイプに分類することができる。しかし、血清型による分類では、病原体の種々の毒性について明言するものではない。１つの同じ血清型の代表は、人体並びに動物の体内で、種々の病原性ポテンシャルを有していることがあり、極端な場合には、無毒から高度な毒性にまで達することがある。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＤＳＭ６６０１は、人間又は動物の病原体ではないと評価されていることは公知である。
【０００４】
従って、非病原性Ｅ．ｃｏｌｉ菌株についての証明法についての需要も存在する。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株が病原体であるか又は非病原体であるかを評価するための唯一の方法としての血清型分類では、十分ではない。同じ血清型でも、病原性変異菌並びに非病原性変異菌が発生していることは既に指摘されていた。従って、医学における診断目的及び治療目的あるいはまた遺伝子工学の目的に対する使用については、ここの菌株を疑いなく同定できるようにすることが望ましい。
【０００５】
それ故、本発明により、ＰＣＲ反応において、細菌ＤＮＡのプラスミドもしくはｆｉｍＡ−配列及びｆｏｃＡ−配列からの特定のプライマー対を使用することによって特徴付けられるＥ．ｃｏｌｉ菌株ＤＳＭ６６０１の同定法を提案する。
【０００６】
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）は、任意のゲノムＤＮＡ配列の数個の僅かな分子を、極めて短時間で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１０６〜１０８倍にも増大させることができる方法である。本発明による検証法は、Ｒ．Ｋ．Ｓａｉｋｉ他により、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７〜４９１（１９８８）中に記載された方法によるものである。
【０００７】
ＰＣＲの実施のためには、プライマーは、通常、ヌクレオチド約１５〜３０個の長さを有し、その配列が増幅すべきＤＮＡの姉妹染色分体の開始配列もしくは終了配列に対して相補性であるオリゴヌクレオチドを必要とする。
【０００８】
まず、増幅すべき配列の二本鎖ＤＮＡは昇温によって変性されるので、これは、分離して一本鎖になる。テンプレート又は母型と呼称される核酸の一本鎖領域により、相補鎖が後の過程で形成される。昇温による変性後に、プライマーとの混合物を冷却するが、この場合、プライマーヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡの末端において雑種化され、それによって、本来のＤＮＡ一本鎖の再統合が、妨げられる。これに引き続き、温度の上昇後に４種のＤＮＡ型のヌクレオチド−５′−トリホスフェートの混合物及び温度安定性のＤＮＡポリメラーゼを加える。９５℃を上回る間での短時間の加熱をも克服する極端な好熱性微生物テルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）からのＴａｑ−ポリメラーゼが特に適していることが判明した。７２℃で、ＤＮＡ一本鎖のポリメラーゼによって、プライマーが配置された２つの末端の間で補足されて二本鎖になる。
【０００９】
熱変性、プライマーアニーリング及び重合の３つの処理工程を、バッチが使い尽くされるまで繰り返すことができる。個々の工程のそれぞれの場合に、ＤＮＡ量の倍増が行われるので、約２０周期後には、理論的に約１０６の増殖因子に達する。
【００１０】
本発明の場合、プライマー対として、菌株ＤＳＭ６６０１のＭｕｔａ１及び２という名称のｆｉｍＡ配列からのもの（図１）と、Ｍｕｔａ３及び４という名称のｆｏｃＡ配列からのもの（図２）を使用する。これらのＤＮＡ配列は、別の腸内細菌の遺伝子と部分的な一致を示しているが、他方で、別の腸内細菌の場合には観察することができなかったいくつかの部位に塩基が存在している。
【００１１】
他のプライマー対のＭｕｔａ５及び６（図３）、Ｍｕｔａ７及び８並びにＭｕｔａ９及び１０（図４）を、菌株ＤＳＭ６６０１のプラスミドｐＭＵＴ１（図５）及びｐＭＵＴ２（図６）のＤＮＡ配列から選択した。これらのプライマー対も同様に腸内細菌の場合にこれまで見出されていなかったヌクレオチド配列を有している。
【００１２】
プライマーＭｕｔａ１からＭｕｔａ１０の配列は、添付した図１〜４中に詳細に記載されている。
【００１３】
本発明を、以下に実施例に基づき詳細に説明する：
Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＤＳＭ６６０１のコロニーを寒天プレートから取り出し、ニド蒸留した水１００μｌ中で懸濁させる。この懸濁液を１０分間で９５℃にまで昇温させ、引き続き、氷上で冷却する。細菌懸濁液１μｌをテンプレートＤＮＡとしてＰＣＲに使用する。
【００１４】
これに引き続き、以下のＰＣＲ反応バッチＰＣＲ反応容器の中にピペットで入れる：
Ｈ２Ｏｂｉｄｅｓｔ                        ２８μｌ
５×ＰＣＲ緩衝液                    １０μｌ
１．２５ｍＭのｄＮＴＰｓ              ８μｌ
プライマー（０．５μｇ／μｌ）      各１μｌ
テンプレート                          １μｌ
Ｔａｑ−ポリメラーゼ（１Ｕ／μｌ）    １μｌ
ＰＣＲ反応のために以下の条件を選択した：
ａ．  ９５℃で３分間（変性）
ｂ．  ９５℃で４５秒間（変性）
ｃ．  ５８℃で４５秒間（プライマーのアニーリング）
ｄ．  ７２℃で４５秒間（Ｔａｑ−ポリメラーゼの反応温度）
工程ｂ．からｄ．を少なくとも２０回繰り返す。
【００１５】
この後、最終生成物を、例えばエシェリキア・コリ菌株ＤＳＭ６６０１の同定に使用することができるかあるいはまた自体公知の方法で配列決定し、試験すべきＥ．ｃｏｌｉ菌株からの相応して製造されたＤＮＡ配列の試験に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
菌株ＤＳＭ６６０１のタイプ１のフィムブリエクラスター（ｆｉｍＡ）の主要構造のヌクレオチド配列並びにＥ．ｃｏｌｉ菌株ＨＢ１０１のヌクレオチド配列の比較するものであり、プライマー対Ｍｕｔａ１及び２の位置を記入してある図である。
【図２】
菌株ＤＳＭ６６０１のＦ１Ｃ−フィムブリエクラスター（ｆｏｃＡ）の主要構造のヌクレオチド配列並びにＥ．ｃｏｌｉ菌株ＡＤ１１０のヌクレオチド配列の比較するものであり、プライマー対Ｍｕｔａ３及び４の位置を記入してある図である。
【図３】
菌株ＤＳＭ６６０１の約３ｋｂの大きさのプラスミドｐＭＵＴ１のヌクレオチド配列を示す図である。
【図４】
菌株ＤＳＭ６６０１の約５ｋｂの大きさのプラスミドｐＭＵＴ２のヌクレオチド配列を示す図である。
【図５】
黒く太い部位が、別の腸内細菌のプラスミドのＤＮＡ配列に対する既存のＤＮＡ配列相同部を表しており、関連した制限切断部位を記載するプラスミドｐＭＵＴ１の制限図である。
【図６】
太く黒い部位が、別の腸内細菌のプラスミドのＤＮＡ配列に対する既存のＤＮＡ配列相同部を表しており、関連した制限切断部位を記載するプラスミドｐＭＵＴ２の制限図である。
【図７】
菌株ＤＳＭ６６０１の約３ｋｂの大きさのプラスミドｐＭＵＴ１のヌクレオチド配列を示し、プライマー対Ｍｕｔａ５及び６の位置を記入してある図である。
【図８】
菌株ＤＳＭ６６０１の約５ｋｂの大きさのプラスミドｐＭＵＴ１のヌクレオチド配列を示し、プライマー対Ｍｕｔａ７〜１０の位置を記入してある図である。
【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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