(57)【要約】本発明は組織適合性の大複合体（ＭＨＣ）内の遺伝的、後天的、主要パラメーターによる診断のための、核酸、オリゴヌクレオチッド、ＰＮＡ−オリゴマー及び診断方法に関する。【解決手段】組織適合性の大複合体（ＭＨＣ）内の遺伝的、後天的パラメーターの診断のために、核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱＩＤ−ＮＯ：１またはＳＥＱＩＤ−ＮＯ：２に適合する、化学処理されたゲノムＤＮＡの相補的または同一の、少なくとも２０塩基対長の一つの断片を含む組織適合性の大複合体（ＭＨＣ）内の遺伝的パラメーターの一組の診断のための核酸。
【請求項２】
ＳＥＱＩＤ−ＮＯ：１またはＳＥＱＩＤ−ＮＯ：２に適合する、塩基配列の少なくとも一つのＣｐＧジヌクレオチッドを含む断片に対して、相補的または同一の、少なくとも１３ヌクレオチッド長を有する、少なくとも一つの塩基配列を、その都度含む、予め、処理されたゲノムＤＮＡ中のシトシンのメチル化状態の検査のためのオリゴヌクレオチッド。
【請求項３】
ＣｐＧジヌクレオチッドのシトシンが１３ｍｅｒｓの５’−末端の５．−９．ヌクレオチッドであることを特徴とする請求項２に記載のオリゴヌクレオチッド。
【請求項４】
ＳＥＱＩＤ−ＮＯ：１またはＳＥＱＩＤ−ＮＯ：２の一つのＣｐＧジヌクレオチッド毎に一つのヌクレオチッドが存在することを特徴とする請求項２に記載のオリゴヌクレオチッドの一組。
【請求項５】
ＳＥＱＩＤ−ＮＯ：１またはＳＥＱＩＤ−ＮＯ：２に適合する、塩基配列の少なくとも一つのＣｐＧジヌクレオチッドを含む断片に対して、相補的または同一の、少なくとも９ヌクレオチッド長を有する、少なくとも一つのＰＮＡ塩基配列を含む、予め、化学処理されたゲノムＤＮＡ中のシトシンのメチル化状態の検査のためのＰＮＡ（ペプチッド核酸）オリゴマー。
【請求項６】
ＣｐＧジヌクレオチッドのシトシンが９ｍｅｒｓ　の５’−末端の４．−６．ヌクレオチッドであることを特徴とする請求項５に記載のオリゴヌクレオチッド。
【請求項７】
ＳＥＱＩＤ−ＮＯ：１またはＳＥＱＩＤ−ＮＯ：２に適合する一つの塩基配列のＣｐＧジヌクレオチッド毎に一つのオリゴヌクレオチッドが存在することを特徴とする請求項５に記載のＰＮＡ−オリゴマーの一組。
【請求項８】
請求項２乃至７の何れか１項に記載の、少なくとも１０個のオリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ配列を含む、シトシンのメチル化状態の検査のためのオリゴマーソンデの一組及び／または化学的前処理されたゲノムＤＮＡ中の単一多形性ヌクレオチッドの一組。
【請求項９】
固相の一定の位置に結合していることを特徴とする請求項２乃至８の何れか１項に記載の、異なるオリゴヌクレオチッド及び／またはＰＮＡ−オリゴマー配列の配置。
【請求項１０】
直角または６角形の格子形で、平坦な固相上に、配置されていることを特徴とする請求項９に記載の、異なるオリゴヌクレオチッド及び／またはＰＮＡ−オリゴマー配列の配置。
【請求項１１】
その配列がその都度、少なくとも、ＳＥＱＩＤ−ＮＯ：１またはＳＥＱＩＤ−ＮＯ：２に適合する塩基配列の１８塩基対長の塩基配列の断片に、順または逆相補的である、少なくとも二つのオリゴヌクレオチッドを含むプライマーオリゴヌクレオチッドの一組。
【請求項１２】
ＣｐＧジヌクレオチッドを含まないことを特徴とする請求項１１に記載のプライマーオリゴヌクレオチッドの一組。
【請求項１３】
少なくとも、一つのプライマーが一つの固相に結合することを特徴とする請求項１１または１２の何れか１項に記載のプライマーオリゴヌクレオチッドの一組。
【請求項１４】
ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析により、自己免疫性疾病の診断のために、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項１５】
ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析により、リューマチ性関節炎の診断のために、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項１６】
ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析により、糖尿病の診断のために、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項１７】
糖尿病において、タイプＩ糖尿病またはインスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）が問題であることを特徴とする、請求項１６に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項１８】
ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析により、遺伝性の血色素症の診断のために、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項１９】
遺伝的血色素症において、遺伝子血色素症（ＧＨ）またはマイルドタイプ血色素症が問題であることを特徴とする、請求項１８に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項２０】
ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析により、精神分裂症の診断のために、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項２１】
ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析により、多発性硬化症の診断のために、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項２２】
ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析により、Ｓｙｓｔｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｌｕｐｕｓ紅斑症の診断のために、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項２３】
ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析により、サルコイド症の診断のために、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項２４】
ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析により、胆嚢硬変症の診断のために、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項２５】
ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析により、筋炎の診断のために、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項２６】
ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析により、乾癬の診断のために、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項２７】
ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析により、腎炎の診断のために、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項２８】
ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析により、癌の診断のために、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項２９】
癌の種類において、頚部および頭部のガンが問題であることを特徴とする、請求項２８に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項３０】
ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析により、ＩｇＡ腎障害の診断のために、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項３１】
ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析により、高血圧症の診断のために、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項３２】
ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析により、ベーチェット病の診断のために、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項３３】
ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析により、ゲー−ホイプナー−ヘルター−タイゼン−病（Ｚｏｅｌｉａｋｉｅ）の診断のために、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項３４】
ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析により、筋無力症の診断のために、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項３５】
ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析により、脊椎関節炎の診断のために、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項３６】
ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析により、結核の診断のために、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項３７】
ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析により、心筋肥大症の診断のために、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項３８】
ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析により、バセドウ氏病の診断のために、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項３９】
ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析により、若年性リュウマチ性関節炎の診断のために、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項４０】
ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析により、癲癇の診断のために、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項４１】
癲癇において特発性全身性癲癇または若年性筋痙攣性癲癇が問題であることを特徴とする、請求項４０に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項４２】
ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析により、タカヤス（Ｔａｋａｙａｓｕ）−病の診断のために、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項４３】
ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析により、多発性免疫不全症の診断のために、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項４４】
ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析により、レプラ感受性体質の診断のために、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項４５】
ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析により、マラリア感受性体質の診断のために、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項４６】
ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析により、リーシュマニア感受性体質の診断のために、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用すること。
【請求項４７】
ＭＨＣ内の遺伝的主要パラメーターによる診断のために請求項１に記載の核酸を使用すること。
【請求項４８】
下記各段階よりなることを特徴とする、ＭＨＣ内の遺伝的パラメーターにより、シトシンのメチル化の解析により、請求項１乃至４７の何れか１項に記載のオリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡオリゴマーの組で行う、診断方法。
ａ）ゲノムＤＮＡ試料において、化学処理により、５−位置の非メチル化シトシン塩基をウラシルに変換する。
ｂ）この化学前処理されたゲノムＤＮＡを請求項１１または１２記載のプライマーオリゴヌクレオチッドの組及びポリメラーゼを使用し、増幅して断片とする。
ｃ）請求項２乃至８の何れか１項に記載のオリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡゾンデの一組によって、増幅産物をハイブリッド化する。
ｄ）ハイブリッド化された増幅産物を検出し、映像化する。
【請求項４９】
各々が１００〜２，０００の塩基対長である、異なる、１０を超える断片が増幅されることを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
重亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、酸性亜硫酸塩の１種の溶液による化学処理を実施することを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
ポリメラーゼが耐熱性ＤＮＡ−ポリメラーゼであることを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
増幅がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行なわれることを特徴とする請求項４８乃至５１の何れか１項に記載の方法。
【請求項５３】
増幅産物に付加される標識は、一つのオリゴヌクレオチッド配列が存在する固相の各位置を確認することができるものであることを特徴とする請求項４８乃至５２の何れか１項に記載の方法。
【請求項５４】
請求項９または１０に記載の配置を使用し、固相表面がシリカ、ガラス、ポリスチロール、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金からなることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
多くのＤＮＡ−断片の増幅が一つの反応器中で行なわれることを特徴とする請求項４８乃至５４の何れか１項に記載の方法。
【請求項５６】
増幅産物の標識がフルオレスセンスによる標識であることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
増幅産物の標識が放射性核種による標識であることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
増幅産物の標識が質量分析計で実証される、標準的質量の、除去可能な分子断片であることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
増幅産物または増幅産物の断片が質量分析計で実証されることを特徴とする請求項４８、４９または５３の何れか１項に記載の方法。
【請求項６０】
質量分析計での検知能力の更なる改善のために、生成された各断片が、陽または陰荷電を示すことを特徴とする請求項５８または５９の何れか１項に記載の方法。
【請求項６１】
マトリックス補助レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ）または電子散布質量分析（ＥＳＩ）による検知が行なわれ、映像化されることを特徴とする請求項５８乃至６０の何れか１項に記載の方法。
【請求項６２】
ゲノムＤＮＡがＤＮＡ試料から得られ、ＤＮＡの供給源が例えば、細胞列、生検、血液、喀痰、便、尿、脳脊髄液；パラフィン埋め込み組織、例えば、眼、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房または肝臓の組織；組織の顕微鏡スライドガラス及びこれらから得られる全ての可能な組み合わせであることを特徴とする請求項４８乃至６１の何れか１項に記載の方法。
【請求項６３】
異常がＭＨＣ内のメチル化サンプルと関連するものである、請求項４８乃至６２の何れか１項に記載の、患者または健常者個人に発生した異常に対する診断及び／または予備診断方法。
【請求項６４】
ＭＨＣ内の遺伝的主要パラメーターを診断することを特徴とする請求項４８乃至６３の何れか１項に記載の方法。
【請求項６５】
重亜硫酸塩を含む反応剤、請求項１１または１２に記載の増幅産物製造のためのプライマー１式、請求項２乃至８の何れか１項に記載のオリゴヌクレオチッド及び／またはＰＮＡ−オリゴマー及び請求項４８乃至６３の何れか１項に記載の方法の実施及び評価用の手引書からなるキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は組織適合性の大複合体（ＭＨＣ）内の遺伝的主要パラメーターによる診断のための核酸、オリゴヌクレオチッド、ＰＮＡ−オリゴマー及び方法に関する。
【０００２】
昨年の方法開発後の分子生物学で成功した研究段階は、遺伝子自体、ＲＮＡにおける遺伝子の翻訳及びそれから生成する蛋白質である。個々の開発経過における何時、どの遺伝子が評価されたか、いかにして特定の細胞及び組織の特定の遺伝子の活性化及び阻害が制御されるかは、遺伝子またはゲノムのメチル化の程度及び特性に相関する。その限りでは、個々の遺伝子またはゲノムの変化したメチル化サンプルにおける病原状態が表現される。
【０００３】
組織適合性の大複合体（ＭＨＣ）は免疫的及び非免疫的機能を有する遺伝子グループであり、全ての脊椎動物に見られる［”Ｂｏｔｈ ｍａｎ ＆ ｂｉｒｄ ＆ ｂｅａｓｔ”：ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＨＣ ｇｅｎｅｓ．１９９５、Ｔｒｏｗｓｄａｌｅ Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ；４１：１〜１７；組織適合性大複合体についての将来の展望。
１９９７、Ｇｒｕｅｎ ＪＲ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｍａｎ ＳＭ、Ｂｌｏｏｄ；９０：４２５２〜４２６５］。人間の場合には、それは染色体６（６ｐ２１．３）の短いアーム上で３，６００，０００塩基対の範囲まで広がり、本質的に免疫応答に関与する。それは完全に配列されており、多角形で、人間の全ゲノム中で最高の遺伝子密度を示す。それで、染色体６全体としては、見積数として３，５００遺伝子、２２４の同定遺伝子坐がＭＨＣに加算される。これはその大きさに基づいて期待されるように、３倍の数の遺伝子がＭＨＣの領域に局在することを意味する。ＭＨＣはクラス１、２及び３の、３つに区分される。クラス１の全遺伝子は３〜６ｋｂの大きさである。それらは細胞毎に存在し、移植抗原と呼ばれる。即ち、異組織に対する拒絶作用をその役割とする。クラス２の遺伝子は４〜１１ｋｂの大きさである。その遺伝子産物は細胞間の、免疫応答に必要な相互作用に関与する。クラス３の遺伝子は最高の遺伝子密度を示す。ここでは、遺伝子は局在し、免疫システムには含まれず、血清の成分として抗体抗原複合体と相互作用をする相補因子として働く。
【０００４】
ＭＨＣ分子の第一の免疫学的機能は、抗原蛋白質が細胞表面に結合する。これはリンパ球の特殊なＴ−細胞受容体の抗原を認識する役を演じる。Ｔ−細胞の意義は、これが細胞内感染及び腫瘍と密接に関連することである。ＭＨＣ分子は免疫応答の調節で中心的役割を演じるので、多分、疾病に対しての制御及びそれに対する感受性に決定的影響力を有するであろう。ＭＨＣは以下の遺伝的疾病及びその他の多くの疾病に相関があると見なされている。即ち、リュウマチ性関節炎［東フランスにおける、ＨＬＡ−ＤＭ遺伝子とリュウマチ性関節炎との関連。２０００、Ｔｏｕｓｓｉｒｏｔ Ｅ ｅｔ ａｌ．、Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ；６１（３）：３０３〜３０８］、糖尿病［ヒト組織適合性白血球抗原（ＨＬＡ）−ＤＱ分子の糖尿病の進行への影響の生体内での証明。２０００、Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ；１９１（１）：９７〜１０４］、特殊タイプＩ糖尿病［タイプＩ糖尿病の原因。１９９９、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ＴＡ、Ｍｉｊｏｖｉｃ ＣＨ、Ｂａｒｎｅｔｔ ＡＨ、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔｂ．；１３（２）：１８１〜１９５］、及びインスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）［先天性ハプロタイプ類遺伝性マップによるインスリン依存型糖尿病のための新感受性坐の同定。１９９５、Ｉｋｅｇａｍｉ Ｈ、Ｍａｋｉｎｏ Ｓ、Ｙａｍｏｔｏ Ｅ、ｋａｗａｇｕｃｈｉ Ｙ、Ｕｅｄａ Ｈ、Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｔ、Ｔａｋｅｋａｗａ Ｋ、Ｏｇｉｈａｒａ Ｔ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．；９６（４）：１９３６〜１９４２］、遺伝性血色素症［新世紀の血色素症。２０００、Ｐｏｗｅｌｌ ＬＷ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ；３２（１Ｓｕｐｐｌ）：４８〜６２］、特殊遺伝性血色素症（ＧＨ）［ＨＦＥ ｃｏｄｏｎ ６３／２８２（Ｈ６３Ｄ／Ｃ２８２Ｙ）ドイツの遺伝性血色素症患者の二形性。１９９８、Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ Ｒ、Ｓｅｉｄｌ Ｃ、Ｌｏｆｆｌｅｒ Ｔ、Ｓｅｉｆｒｉｅｄ Ｅ、Ｈｏｅｌｚｅｒ Ｄ、Ｋａｌｔｗａｓｓｅｒ ＪＰ、Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ；５１（３）：２７０〜２７５］及びマイルド型血色素症。［７１１人の血色素症発端者におけるＨＦＥ突然変異の解析：マイルド型血色素症におけるＳ６５Ｃについての推測の証明。１９９９、Ｍｕｒａ Ｃ、Ｒａｇｕｅｎｅｓ Ｏ、Ｆｅｒｅｃ Ｃ、 Ｂｌｏｏｄ；９３（８）：２５０２〜２５０５］、精神分裂症［精神分裂症、リュウマチ性関節炎及び自然抵抗性遺伝子。１９９７、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ Ｇ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒ Ｒｅｓ；２５（３）：１７７〜１８１］、ＨＩＶ［ヒト免疫不全タイプＩウィールス（ＨＩＶ−１）Ｖｐｕ蛋白が組織適合性大複合体（ＭＨＣ）のクラスＩ分子の生合成の初期段階を妨害する。１９９７、Ｋｅｒｋａｕ Ｔ ｅｔ ａｌ．、Ｅｘｐ Ｍｅｄ；１８５（７）：１２９５〜１３０５］、筋炎［ヒト組織適合性大複合体における細胞内封入体筋炎への感受性の候補領域の地図。１９９９、Ｋｏｋ ＣＣ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ；４９（６）：５０８〜５１６］、乾癬［ＨＬＡ−Ｃ末端小粒６０−ｋｂ間隔の乾癬感受性ＰＳＯＲＳ１坐の位置確認。２０００；Ｎａｉｒ ＲＰ ｅｔ ａｌ．、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ Ｊｕｎ；６６（６）：１８３３〜１８４４］、システムＬｕｐｕｓ紅斑症［システムルーパス紅斑症の遺伝子。１９９９、Ｌｉｎｄｑｖｉｓｔ ＡＫ、Ａｌａｒｃｏｎ−Ｒｉｑｕｅｌｍｅ ＭＥ；Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ；５０（６）：５６２〜５７１］、ＩｇＡ腎炎［ＩｇＡ腎炎の進行遺伝因子の証明。２０００、Ｈｓｕ ＳＩ ｅｔ ａｌ．、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ；５７（５）：１８１８〜１８３５．Ｒｅｖｉｅｗ］、高血圧症［組織適合性大複合体の内部または近傍に存在する染色体６の遺伝子の高血圧症の進行に及ぼす影響。２０００、Ｖｉｄａｎ−Ｊｅｒａｓ Ｂ ｅｔ ａｌ．、Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ；４３９（３Ｓｕｐｐｌ）：Ｒ６０〜６２］、ベーチェット病［ベーチェット病の、組織適合性大複合体における臨界的領域は、精製ミクロサテライト図を使用する結合解析によって、ＨＬＡ−Ｂの動原体切片４６―ｋｂまで減らされた。１９９９、Ｏｔａ Ｍ ｅｔ ａｌ．、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ；６４（５）：１４０６〜１４１０］、ゲー−ホイプナー−ヘルター−タイゼン−病［ＣＴＬＡ−４多形遺伝子はセリアック病の疾病素因と関連する。１９９８、Ｄｊｉｌａｌｉ Ｓａｉａｈ Ｉ ｅｔ ａｌ．、Ｇｕｔ；４３（２）：１８７〜１８９］、筋無力症、脊椎関節炎［脊椎関節炎の遺伝子。１９９８、Ｗｏｒｄｓｗｏｒｔｈ Ｐ．、Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ；２４（４）：８４５〜８６３．Ｒｅｖｉｅｗ］、結核［特殊Ｔ細胞の結核患者及び健康なドナーにおけるマイコバクテリウムツベルクロシスへの応答。１９９８、Ｕｌｒｉｃｈｓ Ｔ ｅｔ ａｌ．、 Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ；２８（１２）：３９４９〜３９５８］、心筋肥大症［心筋トロポニンＩ遺伝子の突然変異が心筋肥大症と関連する。１９９７、Ｋｉｍｕｒａ Ａ．、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１６（４）：３７９〜３８２］、バセドウ氏病［グレーヴス病におけるヨー化物、サイトカイン及びＴＳＨ−受容体表現。１９９６、Ｓｃｈｕｐｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．、Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｄｉａｂｅｔｅｓ．１０４（Ｓｕｐｐｌ４：６８〜７４）］、若年性リュウマチ性関節炎［ｐａｕｃｉａｒｔｉｃｕｌａｒ−ｏｎｓｅｔ若年性リュウマチ性関節炎におけるＨＬＡ及びＴ細胞多形受容体。１９９１、Ｎｅｐｏｍ ＢＳ、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．３４（１０）：１２６０〜１２６７］、癲癇、特発性全身性癲癇［表現型スペクトルはヒトの癲癇感受性遺伝子ＥＪＭ１に関連する。１９９５、Ｓａｎｄｅｒ Ｔ、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ； ３８（２）：２１０〜２１７］、若年性筋痙攣性癲癇［染色体６の癲癇感受性ＥＪＭ１遺伝子坐の精製地図。１９９７、Ｓａｎｄｅｒ Ｔ、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．４９（３）：８４２〜８４７］、タカヤス−病、多発性免疫不全症［８．１遺伝性ハプロタイプ（Ａ１、Ｂ８、ＤＲ３）の多発性免疫不全症との関連についての遺伝的ベース。１９９９、Ｐｒｉｃｅ Ｐ、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．１６７：２５７〜２７４］、頭部及び頚部の癌［腫瘍の懐死因子多形ミクロサテライトの頭部及び頚部の癌ヘの影響。１９９８；ヒトのレプラ感受性。１９９６；Ｌａｇｒａｎｇｅ ＰＨｅｔ ａｌ．、Ａｃｔａ Ｌｅｐｒｏｌ；１０（１）：１１〜２７］、Ｍａｌａｒｉａ［マラリア及び他の感染症に対する遺伝的感受性：ＭＨＣから全ゲノムまで。１９９６；Ｈｉｌｌ ＡＶ、Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ；１１２ Ｓｕｐｐｌｅ：７５〜８４、ヒト個体群におけるマラリアに対する感受性／抵抗性の研究における遺伝的流行病。１９９９；Ａｂｅｌ Ｌ、Ｂｕｌｌ Ｓｏｃ Ｐａｔｈｏｌ Ｅｘｏｔ；９２（４）：２５６〜６０］、リューシュマニア［病原体の中間マクロファージへの宿主抵抗性または感受性の遺伝学：北東ブラジルにおける結核、レプラ、リュ−主マニア家族の複数例の研究。１９９８；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ ＪＭ、Ｉｎｔ Ｊ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ；２８（１）：２１〜２８］、類肉種症［類肉腫における多形性ＴＡＰ１及びＴＡＰ２の抗原処理されたコード化ＭＨＣの解析。１９９９；Ｆｏｌｅｙ ＰＪ ｅｔ ａｌ．、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ；１６０（３）：１００９〜１０１４］、多発性硬化症［サルジニア島のヒト集団におけるＤＲＢ１−ＤＱＡ１−ＤＱＢ１遺伝子坐及び多発性硬化症の疾病素因。１９９８；Ｍａｒｒｏｓｕ ＭＧ ｅｔ．ａｌ．、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ；７（８）：１２３５〜１２３７］、原発性胆嚢硬変症［原発性胆嚢硬化症の遺伝的感受性。１９９９；Ａｇａｒｗａｌ Ｋ ｅｔ ａｌ ．、Ｅｕｒ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｊｕｎ；１１（６）：６０３〜６０６］、腎炎［狼蒼腎炎への遺伝的感受性。１９９８；Ｔｓａｏ ＢＰ 、Ｌｕｐｕｓ；７（９）：５８５〜５９０］及びその他の多くの疾病が関連する。
【０００５】
ＭＨＣ遺伝子の転写に負の影響を与える表現がＣｐＧジヌクレオチッドのメチル化に結び付くことを実証する研究がある。転写因子が直接ＤＮＡに付加され得ないか、または、間接に、メチル化ＣｐＧに結合する抑制分子に付加される。［いかにしてしてメチル化が転写を抑制するか。１９９７；Ｋａｓｓ ＳＵ ｅｔ ａｌ．、 Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ；１１：４４４〜４４９］。
【０００６】
多くの成果が免疫学的疾病とメチル化の間の関連性を裏付けている。ＨＬＡ−ＤＲ抗原の表現とＨＬＡ−ＤＲα遺伝子のメチル化の間の関連はシステムルーパス紅斑症―これは全身性自発免疫疾病の１種であるが―について研究されている［ヒトの組織適合性白血病抗原−ＤＲの僅少の表現は、システムルーパス紅斑病患者のＢ細胞の組織適合性白血病の抗原α遺伝子の領域と関連する。１９８５；Ｓａｎｏ Ｈ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、７６（４）：１３１４〜１３２２］。ＤＮＡメチル化の異常型ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子表現ヘの関与は、ＭＨＣクラスＩＩ欠損症候の患者について研究された。［ＭＨＣクラスＩＩ欠損症候：５−アザデオキシシチジンへの応答レベルの異質性。１９９０；Ｌａｍｂｅｒｔ Ｍ ｅｔ ａｌ．、 Ｒｅｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１（２）：１２９〜１４０］。ＭＨＣ遺伝子の調整の証明は後成説のメカニズムの一つによって行われる［クラスＩＩ転移活性因子プロモーターＩＶのメチル化：ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子制御の新規なメカニズム。２０００、Ｍｏｒｒｉｓ ＡＣ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ；１６４（８）：４１４３〜４１４９］。転写因子がクラスＩＩ転移活性因子（ＣＩＩＴＡ）プロモーターに結合しないときは、ＭＨＣ遺伝子の表現は阻害される。阻害はｐＩＶプロモーター中のＣｐＧジヌクレオチッドのメチル化に基づいて行なわれる。それに対して、ＣＩＩＴＡ遺伝子の再表現のメチル化の阻害が行なわれる。その他に、転移性の移入の試験で、表現はメチル化ｐＩＶＤＮＡによっては刺激されない。この結果はＣＩＩＴＡの後成性調整を裏付けし、この後成性調整が理論的にＭＨＣクラスＩＩの遺伝子であるという結論に導く。
【０００７】
５−メチルシトシンは真核生物の細胞のＤＮＡでは最も頻繁に共有変換される塩基である。これは遺伝子印刷及び腫瘍発生時に一つの役割を演じる。遺伝情報の構成部分としての５−メチルシトシンの同定はそれ故、興味あるものである。５−メチルシトシンはシトシンと同じ塩基対挙動を示すので、配列によってはこれを同定することはできない。更に、ＰＣＲ増幅では、５−メチルシトシンが有する後成説の情報が完全に失われる。
【０００８】
比較的新しく、そうこうするうちに最も頻繁に使用される、ＤＮＡの５−メチルシトシンに関する研究は、重亜硫酸塩とシトシンとの特殊反応に基ずいている。このシトシンはそれに続くアルカリ加水分解反応で、ウラシルに変換され、このウラシルはその塩基対挙動がチミジンのそれに相当する。それに対して、５−メチルシトシンはこの条件下では変換されない。最初のＤＮＡは変化しないので、最初に、そのハイブリッド化挙動によってはシトシンと区別できないメチルシトシンは、今や、通常の分子生物学的技法によって、唯一残っているシトシンとして、例えば、増幅及びハイブリッド化または配列によって証明される。これらの全ての技法は、今や完全に利用されている塩基対に基づくものである。感度に間する現在の技術水準は研究対象のＤＮＡをアガロースマトリックスに封入する方法によって規定されている。それによってＤＮＡ（重亜硫酸塩は単鎖のＤＮＡのみと反応する）の浸透と再生は阻害され、全ての沈殿プロセスと精製プロセスの替わりとして、迅速な透析が行なわれる（Ｏｌｅｋ Ａ． ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ ．Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． １９９６、２４、５０６４〜５０６６）。この方法によって、個々の細胞が研究でき、方法のポテンシャルを具体的に説明される。勿論、これまでも、約３，０００の塩基対長の各領域が研究されているが、数千に及ぶ細胞のグロバルな研究は可能ではない。勿論、この方法は微少量の試料からの非常に小さい断片では信頼性のある解析はできない。浸透防止をしてもマトリックスを通して試料が失われる。
【０００９】
その他の、公知の５−メチルシトシン証明法に関する概観は下記の概観刊行物から知ることができる。Ｒｅｉｎ、Ｔ．、ＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ、Ｍ． Ｌ．、Ｚｏｒｂａｓ、Ｈ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９８、２６、２２５５。
【００１０】
重亜硫酸塩の技法はこれまで、ほんの僅かの例外が研究に使用されていた［（例えば、Ｚｅｃｈｎｉｇｋ、Ｍ．ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ． Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．１９９７、５、９４〜９８］。
しかし、常に、既知の遺伝子の短く、特殊な断片で、重亜硫酸処理の後、増幅され完全に配列されるか［Ｏｌｅｋ、Ａ．ｕｎｄ Ｗａｌｔｅｒ、Ｊ．、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９７、１７、２７５〜２７６］または個々のシトシン位置をプライマー−伸長−反応［Ｇｏｎｚａｌｇｏ、Ｍ．Ｌ．ｕｎｄ Ｊｏｎｅｓ、Ｐ．Ａ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７、２５、２５２９〜２５３１、ＷＯ−特許９５００６６９］または一つの酵素断片［Ｘｉｏｎｇ、Ｚ．ｕｎｄ Ｌａｉｒｄ、Ｐ．Ｗ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９７、２５、２５３２〜２５３４］で実証された。それについてはハイブリッド化による実証が発表されている［Ｏｌｅｋ ｅｔ ａｌ．、ＷＯ９９ ２８４９８］。
【００１１】
個々の遺伝子のメチル化の実証のための重亜硫酸塩技法の使用に関するその他の刊行物は以下のものである。：Ｘｉｏｎｇ、Ｚ．ｕｎｄ Ｌａｉｒｄ、Ｐ．Ｗ．（１９９７）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５、２５３２；Ｇｏｎｚａｌｇｏ、Ｍ．Ｌ．ｕｎｄ Ｊｏｎｅｓ Ｐ．Ａ．（１９９７）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５、２５２９；Ｇｒｉｇｇ、Ｓ．ｕｎｄ Ｃｌａｒｋ、Ｓ．（１９９４）、Ｂｉｏａｓｓａｙ１６、４３１；Ｚｅｓｃｈｎｉｋ、Ｍ ｅｔ ａｌ．（１９９７）、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６、３８７；Ｔｅｉｌ、Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２、６９５；Ｍａｒｔｉｎ、Ｖ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）、Ｇｅｎｅ１５７、２６１；ＷＯ９７ ４６７０５、ＷＯ９５ １５３７３ ｕｎｄ ＷＯ４５５６０。
【００１２】
マトリックス補助レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は分子生物学上の解析のために非常に有用である［Ｋａｒａｓ、Ｍ．ｕｎｄ ＨｉｌｌｅｎＫａｍｐ、Ｆ．（１９８８）、分子状蛋白質のレーザー脱離イオン化は１０，０００ダルトンを超える。Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６０：２２９９〜２３０１］。ある分析体は光吸収マトリックスに埋め込まれる。短いレーザーパルスでマトリックスが蒸発し、被分析分子は分解せずにガス相に送られる。マトリックス分子との衝突によって被分析分子のイオン型が達成される。設定された電圧でイオンは飛行管へと加速される。イオンはその質量の差により、異なる強さで加速される。より小さいイオンはより大きいイオンよりも早く検出器に到達する。
【００１３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光分析はペプチッド及び蛋白質の分析に優れている。核酸の分析にはＤＮＡ及びマトリックス補助レーザー脱離／イオン化質量分析よりやや困難である［Ｇｕｔ、Ｉ．Ｇ．ｕｎｄ Ｂｅｃｋ、Ｓ．（１９９５）］。ＤＮＡ及びマトリックス補助レーザー脱離／イオン化質量分析。［分子生物学：現在の技術革新及び将来の動向１：１４７〜１５７．］。核酸分析には、ペプチッド分析に比較して感度が約１００倍悪く、断片の大きさが増加するにしたがって、感度は不釣合いに減少する。骨格に負電荷を帯びている核酸分析では、マトリックスによるイオン化プロセスが本質的に非効率である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光分析では、マトリックスの選択が重要な役割をする。ペプチッドの脱離では、非常に細かい結晶を与える、幾つかの非常に有用なマトリクスが発見された。ＤＮＡについては、使用しても感度差が減少しない、幾つかのマトリックスがある。感度差は、ＤＮＡをペプチッド類似物に化学変換することにより減少させ得る。通常の骨格のホスフェートがチオホスフェートによって置換される、ホスホロチオエイト核酸は、簡単なアルキル化剤により荷電していないＤＮＡに変換される［Ｇｕｔ、Ｉ．Ｇ．ｕｎｄ Ｂｅｃｋ、Ｓ．（１９９５）、選択的ＤＮＡのアルキル化方法及び質量分析による検出。Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：１３６７〜１３７３］。“Ｃｈａｒｇｅ ｔａｇがこの変換されたＤＮＡに結合した結果得られる感度の上昇程度はペプチッドに結合した結果得られる程度に匹敵する。この“ｃｈａｒｇｅ ｔａｇｇｉｎｇの更なる利点は、非変換基質の検出を著しく困難にする不純物の分析安定性を高めるということである。
【００１４】
ゲノムＤＮＡは標準的方法により、細胞、組織または他の試験試料から得られる。この標準的方法はフリッチェアンドマニアテイス発行の、分子クローン：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１９８９のような文献に記載されている。
【００１５】
本発明の課題は、シトシンメチル化のためのオリゴヌクレオチッド及び／またはＰＮＡ−オリゴマーであり、及びＭＨＣ内の遺伝的、後天的パラメーターによる診断に好適な方法を用意することにある。
【００１６】
本発明の課題は、ＳＥＱＩＤ−ＮＯ：１またはＳＥＱＩＤ−ＮＯ：２に適合する、化学処理されたゲノムＤＮＡの相補的または同一の、少なくとも２０塩基対の長さの一つの断片を含む組織適合性の大複合体（ＭＨＣ）内の遺伝的パラメーターの一組の診断のための核酸によって解決する。
【００１７】
本発明の対象は、ＳＥＱＩＤ−ＮＯ：１またはＳＥＱＩＤ−ＮＯ：２に適合する、塩基配列の少なくとも一つのＣｐＧジヌクレオチッドを含む断片に対して、相補的または同一の、少なくとも１３ヌクレオチッド長さを有する、少なくとも一つの塩基配列を、その都度含む、予め、処理されたゲノムＤＮＡ中のシトシンのメチル化状態の検査のためのオリゴヌクレオチッドである。
【００１８】
その際、ＣｐＧジヌクレオチッドのシトシンが１３ｍｅｒｓ　の５’−末端の５．−９．ヌクレオチッドであることが好ましい。
【００１９】
更に、本発明においてはＳＥＱＩＤ−ＮＯ：１またはＳＥＱＩＤ−ＮＯ：２の一つのＣｐＧ　ジヌクレオチッド毎に一つのヌクレオチッドが存在することが好ましい。
【００２０】
本発明の対象は、ＳＥＱＩＤ−ＮＯ：１またはＳＥＱＩＤ−ＮＯ：２に適合する、塩基配列の少なくとも一つのＣｐＧジヌクレオチッドを含む断片に対して、相補的または同一の、少なくとも９ヌクレオチッド長を有する、少なくとも一つのＰＮＡ塩基配列を含む、予め、化学処理されたゲノムＤＮＡ中のシトシンのメチル化状態の検査のためのＰＮＡ（ペプチッド核酸）オリゴマーである。
【００２１】
本発明においては、ＣｐＧジヌクレオチッドのシトシンが９ｍｅｒｓ　の５’−末端の４．−６．ヌクレオチッドであることが好ましい。
【００２２】
更に本発明においては、ＳＥＱＩＤ−ＮＯ：１またはＳＥＱＩＤ−ＮＯ：２に適合する一つの塩基配列のＣｐＧジヌクレオチッド毎に一つのオリゴヌクレオチッドが存在することが好ましい。
【００２３】
本発明の対象は、少なくとも１０個の本発明のオリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ配列を含む、シトシンのメチル化状態の検査のためのオリゴマーソンデの一組及び／または化学的前処理されたゲノムＤＮＡ中の単一多形性ヌクレオチッドの一組である。
【００２４】
本発明の対象は、固相の一定の位置に結合している本発明の、異なるオリゴヌクレオチッド及び／またはＰＮＡ−オリゴマー配列の配置であって、好ましくは、直角または６角形の格子形で、平坦な固相上に、配置されている、異なるオリゴヌクレオチッド及び／またはＰＮＡ−オリゴマー配列の配置である。
【００２５】
本発明の対象は、その配列がその都度少なくとも、ＳＥＱＩＤ−ＮＯ：１またはＳＥＱＩＤ−ＮＯ：２に適合する塩基配列の１８塩基対長の塩基配列の断片に順または逆相補的であって、少なくとも二つのオリゴヌクレオチッドを含むプライマーオリゴヌクレオチッドの一組であって、好ましくは、ＣｐＧジヌクレオチッドを含まないこと、更に好ましくは、少なくとも一つのプライマーが一つの固相に結合するプライマーオリゴヌクレオチッドの一組。
【００２６】
本発明の特に好ましい対象は、ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析により、本発明の核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを、以下に列挙する諸疾病、諸症等の診断のために使用することである。自己免疫性疾病の診断のために使用すること。リューマチ性関節炎の診断のために使用すること。糖尿病の診断のために使用すること。糖尿病において、タイプＩ糖尿病またはインスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）の診断のために使用すること。遺伝性の血色素症の診断のために使用すること。遺伝的血色素症において、遺伝子血色素症（ＧＨ）またはマイルドタイプ血色素症の診断のために使用すること。精神分裂症の診断のために使用すること。多発性硬化症の診断のために使用すること。Ｓｙｓｔｅｍｉｓｃｈｅｍ Ｌｕｐｕｓ紅斑症の診断のために使用すること。サルコイド症の診断のために使用すること。胆嚢硬変症の診断のために使用すること。筋炎の診断のために使用すること。乾癬の診断のために使用すること。腎炎の診断のために使用すること。癌の診断のために使用すること。癌の種類において、頚部および頭部のガンの診断のために使用すること。ＩｇＡ腎障害の診断のために使用すること。高血圧症の診断のために使用すること。ベーチェット病の診断のために使用すること。ゲー−ホイプナー−ヘルター−タイゼン−病（Ｚｏｅｌｉａｋｉｅ）の診断のために使用すること。筋無力症の診断のために使用すること。
脊椎関節炎の診断のために使用すること。結核の診断のために使用すること。
心筋肥大症の診断のために使用すること。バセドウ氏病の診断のために使用すること。若年性リュウマチ性関節炎の診断のために使用すること。癲癇の診断のために使用すること。癲癇において特発性全身性癲癇または若年性筋痙攣性癲癇の診断のために使用すること。タカヤス（Ｔａｋａｙａｓｕ）−病の診断のために使用すること。多発性免疫不全症の診断のために使用すること。レプラ感受性体質の診断のために使用すること。マラリア感受性体質の診断のために使用すること。リーシュマニア感受性体質の診断のために使用すること。
【００２７】
本発明の更なる対象は、ＳＥＱＩＤ−ＮＯ：１またはＳＥＱＩＤ−ＮＯ：２に適合する核酸をＭＨＣ内の遺伝的に重要なパラメーターの診断のために使用することである。
【００２８】
本発明の更なる対象は、ＭＨＣ内の遺伝的に重要なパラメーターの診断方法であって、シトシンのメチル化の解析により、オリゴヌクレオチッドまたかＰＮＡオリゴマーの組で行う、請求項１乃至４７の何れか１項に記載の診断方法において、下記の各段階からなることを特徴とするものである。
ａ）ゲノムＤＮＡ試料において、化学処理により、５−位置の非メチル化シトシン塩基をウラシルに変換する。
ｂ）この化学前処理されたゲノムＤＮＡを請求項１１または１２記載のプライマーオリゴヌクレオチッドの組及びポリメラーゼを使用し、増幅して断片とする。
ｃ）請求項２乃至８の何れか１項に記載のオリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡゾンデの一組によって、増幅産物をハイブリッド化する。
ｄ）ハイブリッド化された増幅産物を検出し、映像化する。
【００２９】
本発明においては、好ましくは、各々が１００〜２，０００の塩基対長さである、異なる、１０を超える断片が増幅され、更に好ましくは、重亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、酸性亜硫酸塩の１種の溶液による化学処理が行なわれ、特に好ましくは、ポリメラーゼが耐熱性ＤＮＡ−ポリメラーゼであることである。
【００３０】
本発明においては、増幅がポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により行なわれることが好ましく、更に好ましくは、増幅産物に付加される標識は、一つのオリゴヌクレオチッド配列が存在する固相の各位置を確認可能であり、更に、本発明の配置を使用し、固相表面がシリカ、ガラス、ポリスチロール、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金からなることが特に好ましい。
【００３１】
多くのＤＮＡ−断片の増幅が一つの反応器中で行なわれることが好ましく、増幅産物の標識がフルオレスセンスによる標識であることがまた好ましく、増幅産物の標識が放射性核種標識であることが更に好ましく、増幅産物の標識が質量分析計で実証される、標準的質量の、除去可能な分子断片であることがまた好ましく、増幅産物または増幅産物の断片が質量分析計で実証されることが本発明では特に好ましく、質量分析計での検知能力の更なる改善のために、生成された各断片が、陽または陰に荷電していることが、本発明では有益である。
【００３２】
本発明においてはマトリックス補助レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ）または電子散布質量分析（ＥＳＩ）による検知が行なわれ、映像化されることが、極めて、特に好ましい。
【００３３】
本発明の方法においては、ゲノムＤＮＡがＤＮＡ試料から得られ、ＤＮＡの供給源が例えば、細胞列、生検、血液、喀痰、便、尿、脳脊髄液；パラフィン埋め込み組織、例えば、眼、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房または肝臓の組織；組織の顕微鏡スライドガラス及びこれらから得られる全ての可能な組み合わせであることが好ましい。
【００３４】
本発明の方法においては、異常がＭＨＣ内のメチル化サンプルと関連する、患者または健常者個人に発生した異常に対する診断及び／または予備診断方法が好ましい。
【００３５】
本発明の対象は、ＭＨＣ内の遺伝的主要パラメーターを診断する本発明の方法を使用することである。
【００３６】
本発明の更なる対象は、重亜硫酸塩を含む反応剤、本発明の増幅産物製造のための本発明のプライマー１式、オリゴヌクレオチッド及び／またはＰＮＡ−オリゴマー及び本発明の方法の実施及び評価用の手引書からなるキットである。
【００３７】
本発明は、化学的前処理されたゲノムＤＮＡ（ＳＥＱＩＤ−ＮＯ：１またはＳＥＱＩＤ−ＮＯ：２）中の、シトシンのメチル化状態の検査のために使用される、少なくとも１０オリゴマーゾンデ（オリゴヌクレオチッド及び／またはＰＮＡ−オリゴマー）からなる一組を含み、このゾンデによって、組織適合性の大複合体（ＭＨＣ）内の遺伝的、後天的パラメーターの診断が可能になる。更に、この方法では、診断のためにＭＨＣ内の遺伝的、後天的パラメーターが決定される。
【００３８】
前記化学的前処理されたＤＮＡから得られる、ＳＥＱＩＤ−ＮＯ：１またはＳＥＱＩＤ−ＮＯ：２からなる少なくとも２０塩基対長の断片が診断に使用される。この断片の検出には１３個のヌクレオチッドからなる相補的または同一のオリゴヌクレオチッド使用されるか、または、９個のヌクレオチッドからなる相補的または同一のＰＮＡオリゴマーが使用される。
【００３９】
オリゴヌクレオチッドもＰＮＡ−オリゴマーも共に、少なくとも一つのＣｐＧジヌクレオチッドを含む。ＣｐＧジヌクレオチッドに対応するシトシンはオリゴヌクレオチッドの５’−末端から得られる５〜９のヌクレオチッドとみなされる。それとは逆に、ＣｐＧジヌクレオチッドのシトシンは、ＰＮＡオリゴマーの５’−末端から得られる４〜６ヌクレオチッドとみなされる。オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡオリゴマーのその都度の一組には、ＣｐＧジヌクレオチッド毎に、ＳＥＱＩＤ−ＮＯ：１またはＳＥＱＩＤ−ＮＯ：２からなる一つのオリゴヌクレオチッドが存在することが重要である。
【００４０】
更にこの関係で重要なのは、ＭＨＣ内の遺伝的パラメーターの診断のために、個々のＣｐＧジヌクレオチッドではなくて、配列内にある多数のＣｐＧジヌクレオチッドを解析しなければならぬことである。特に好ましい本発明の変形は配列内の全てのＣｐＧジヌクレオチッドを研究することである。
【００４１】
好ましい本発明の方法の変形はオリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーを固相の一定の位置に結合させることである。
【００４２】
複数の増幅産物が直角または６角形の格子形固相平面上にあることが好ましい。
【００４３】
本発明においては、核酸、オリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーが、ＭＨＣ内のメチル化サンプルの解析による以下に列挙する諸病の診断に優先的に使用される。リューマチ性関節炎、糖尿病、遺伝性の血色素症、精神分裂症、多発性硬化症、Ｓｙｓｔｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｌｕｐｕｓ紅斑症、サルコイド症、胆嚢硬変症、筋炎、乾癬、腎炎、癌、特に、頚部及び頭部のガン、ＩｇＡ腎障害、高血圧症、ベーチェット病、ゲー−ホイプナー−ヘルター−タイゼン−病（Ｚｏｅｌｉａｋｉｅ）、筋無力症、脊椎関節炎、結核、心筋肥大症、バセドウ氏病、若年性リュウマチ性関節炎、癲癇、癲癇において特発性全身性癲癇または若年性筋痙攣性癲癇、タカヤス（Ｔａｋａｙａｓｕ）−病、多発性免疫不全症、レプラ感受性体質、マラリア感受性体質、リーシュマニア感受性体質。
【００４４】
ＳＥＱＩＤ−ＮＯ：１またはＳＥＱＩＤ−ＮＯ：２に適合する、最初にリストアップされた核酸が、組織適合性の大複合体（ＭＨＣ）内の遺伝的、後天的パラメーターの診断のために使用される。
【００４５】
更に、本発明には、ＭＨＣ内の、重要な、遺伝的パラメーターが、シトシンのメチル化及びゲノムＤＮＡ−試料中の単一多形性ヌクレオチッドの解析による、診断のために使用される方法が含まれる。それについては、次ぎの段階で
述べる。
【００４６】
最初の段階で、５’−位置がメチル化されないシトシン塩基が、シトシンに類似しないハイブリッド化挙動を示す、ウラシル、チミンまたは他の塩基に変換されるように、化学処理される。
【００４７】
解析されるゲノムＤＮＡは例えば、通常のＤＮＡ供給源の、細胞列、生検、血液、喀痰、便、尿、脳脊髄液；パラフィン埋め込み組織、例えば、眼、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房または肝臓の組織；組織の顕微鏡スライドガラス及びこれら全ての可能な組合わせから得られる。
【００４８】
上述のゲノムＤＮＡは重亜硫酸塩（亜硫酸水素塩、酸性亜硫酸塩）処理され、次いで、アルカリ加水分解されて、非メチル化シトシン核塩基がウラシルに変換される。
【００４９】
第二段階では、化学的に全処理されたゲノムＤＮＡ断片がプライマーオリゴヌクレオチッドの使用下に増幅される。
【００５０】
好ましくは１００〜２，０００の塩基対長であって、１０種以上の断片が増幅される。
【００５１】
本発明の方法の好ましい変形では、増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行なわれ、その際、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが使用されることが好ましい。
【００５２】
本発明においては、多数のＤＮＡ−断片の増幅が一つの反応器中で行われることが好ましい。
【００５３】
本発明の好ましい変形の一つでは、その配列がその都度、ＳＥＱＩＤ−ＮＯ：１またはＳＥＱＩＤ−ＮＯ：２に適合する塩基配列の、少なくとも１８塩基対長の断片に相補的であるかまたは同一である配列の、少なくとも２個のオリゴヌクレオチッドを含むプライマーオリゴヌクレオチッドの一組である。プライマーオリゴヌクレオチッドは、好ましくは、ＣｐＧジヌクレオチッドを含まない。
【００５４】
本発明においては、少なくとも一つのプライマーが固相に結合することが好ましい。
【００５５】
更に、本発明においては、複数のオリゴヌクレオチッド及び／またはＰＮＡ−オリゴマー配列が直角または６角形の格子状の固相上に配置されることが好ましい。
【００５６】
本発明においては、固相表面がシリカ、ガラス、ポリスチロール、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金からなることが好ましい。
【００５７】
第３段階では、少なくとも、１０個のオリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡ−オリゴマーゾンデの組で、増幅産物がハイブリッド化される。
【００５８】
前記オリゴヌクレオチッドは、最初に記載された塩基配列の、少なくとも一つのＣｐＧジヌクレオチッドを含む、断片に対して相補的であるか、または同一の、１３ヌクレオチッド長の少なくとも一つの塩基配列を含む。ＣｐＧジヌクレオチッドのシトシンは１３ｍｅｒｓの５’末端から得られる５〜９ヌクレオチッドであるとみなされる。ＣｐＧジヌクレオチッド毎に一つのオリゴヌクレオチッドが存在する。
【００５９】
前記ＰＮＡ−オリゴマーは９ヌクレオチッド長の塩基配列を少なくとも一つ含み、それは、ＳＥＱＩＤ−ＮＯ：１またはＳＥＱＩＤ−ＮＯ：２に適合し塩基配列の、少なくとも一つのＣｐＧジヌクレオチッドを含む、断片に対して相補的であるか、または同一である。ＣｐＧジヌクレオチッドのシトシンは９ｍｅｒｓの５’−末端から得られる４〜６ヌクレオチッドであるとみなされる。ＣｐＧジヌクレオチッド毎に一つのオリゴヌクレオチッドが存在する。
【００６０】
第４段階ではハイブリッド化されない増幅産物が除去される。
【００６１】
最終段階ではハイブリッド化された増幅産物が検出される。
【００６２】
本発明においては、オリゴヌクレオチッド配列が存在する、固相の各位置で増幅産物に付加される標識は同定が可能であることが好ましい。
【００６３】
本発明においては、増幅産物の標識はフルオレスセンス標識であることが好ましい。
【００６４】
本発明においては、増幅産物の標識は放射性核種の標識であることが好ましい。
【００６５】
本発明においては、増幅産物の標識が質量分析計で実証される、標準的質量の、除去可能な分子断片であることが好ましい。
【００６６】
本発明においては、増幅産物、増幅産物の断片または増幅産物に相補的な断片が質量分析計で実証されることが好ましい。
【００６７】
本発明においては、質量分析計での検知能力の更なる改善のために、生成された各断片が、陽または陰荷電を示すことが好ましい。
【００６８】
本発明においては、マトリックス補助レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ）または電子散布質量分析（ＥＳＩ）による検知が行なわれ、映像化されることが好ましい。
【００６９】
本発明においては、患者または健常者各個人に発生した異常に対する診断及び／または予備診断方法で、その際、この異常がＭＨＣ内の重要な、遺伝的パラメーターと関連があるものであることが好ましい。
【００７０】
本発明においては、ＭＨＣ内の遺伝的、主要パラメーターを診断する方法の使用が好ましい。
【００７１】
本発明の対象は、重亜硫酸塩を含む反応剤、増幅産物製造のための、その配列が、少なくとも１個の１８塩基対長の、ＳＥＱＩＤ−ＮＯ：１またはＳＥＱＩＤ−ＮＯ：２に適合する塩基配列の断片であるか、または、それに相補的である、増幅産物製造用の、少なくとも２個のオリゴヌクレオチッドを含むプライマーオリゴヌクレオチッド１式、オリゴヌクレオチッド及び／またはＰＮＡ−オリゴマー及び本発明の方法の実施及び評価用の手引書からなるキットである。
【００７２】
下記の例はメチル化による特定のＣＧ−位置を調べるＨＬＡ−Ａ遺伝子断片に関するものである。
【００７３】
第１段階では、重亜硫酸塩（亜硫酸水素塩、酸性亜硫酸塩）の使用、並びに次ぎのアルカリ加水分解によってゲノム配列が変化する。この変化したＤＮＡは、メチル化したシトシンを証明するのに使用される。この場合は、鎖長３２０１のＨＬＡ−Ａ遺伝子ノシトシンが調べられる。そのために、特殊プライマーＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＡＴＴＴＡＧＡＴＴＴＧＧ及びＡＡＡＴＡＡＡＣＴＣＴＣＴＡＡＣＴＡＣＴＣの鎖長８７４の特定断片によって増幅される。この増幅産物は、例えば、ＴＡＧＧＴＣＧＴＴＴＡＴＡのような、これに先だって、固相に結合オリゴヌクレオチッドをハイブリッド化する、試料として使用される。その際、証明すべきシトシンは増幅産物の４８７の位置に存在する。ハイブリッド化により生成した産物は、増幅に使用される、Ｃｙ３及びＣｙ５フルオレスセンス標識化プライマーによって証明される。重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡのみが、この位置にメチル化シトシンを有し、増幅されたＤＮＡのハイブリッド化がオリゴヌクレオチッドによってなされる。このようにして、その都度調べられるシトシンのメチル化状態がハイブリッド化産物を経て決定される。
【００７４】
以下の実施例により本発明を詳細に説明する。
【００７５】
実施例１：ＭＨＣ中に存在するＤＡＸＸ遺伝子のメチル化解析の実施。
図１はメチル化における特定のＣＧ−位置が調べられる遺伝子ＤＡＸＸの断片に関する。
第１段階では、ゲノム配列が重亜硫酸塩（亜硫酸水素塩、酸性亜硫酸塩）の使用して処理され、塩基の５−位置のメチル化シトシンは全て変化しない。５−位置のメチル化シトシンが変化しないのに対して、塩基対の挙動に関して異なる塩基が生成する。重亜硫酸塩が反応に使用されると、メチル化されないシトシン塩基に付加反応が起こる。そのためには、変性剤または溶剤及びラジカル捕捉剤が必要である。これに続くアルカリ加水分解は非メチル化核塩基をウラシルに変える。この変化したＤＮＡはメチル化シトシンを証明するのに使われる。反応の第２段階では、処理されたＤＮＡ試料が水または水性溶液で希釈される。それに続いてＤＮＡの脱亜硫酸化が優先的に行なわれる。反応の第３段階では、ＤＮＡ試料がポリメラーゼ連鎖反応で、好ましくは耐熱性ポリメラーゼを使用して増幅される。この場合、ＤＡＸＸ遺伝子のシトシンが調べられる。それには、特殊なプライマーオリゴヌクレオチッドＴＴＡＧＧＴＴＴＴＧＧＴＴＴＧＴＴＧＡＴＧＡＧ及びＣＣＣＴＡＡＣＴＣＣＴＣＴＡＡＡＣＣＴＣＡで、８８０ｂｐ長の特定の断片が増幅される。この増幅産物は予め固相に結合しているオリゴヌクレオチッドに、例えば、ＴＡＡＡＧＡＧＧＣＧＧＡＴＴＡＧＴＴのような二重構造の形成下、ハイブリッド化する試料として使用され、その際、増幅産物の１４２位置に証明すべきシトシンが存在する。ハイブリッド化により生成した産物は、増幅に使用される、Ｃｙ３及びＣｙ５フルオレスセンス標識化プライマーオリゴヌクレオチッドによって証明される。重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡのみが、この位置にメチル化シトシンを有し、増幅されたＤＮＡのハイブリッド化がオリゴヌクレオチッドによってなされる。このようにして、その都度調べられるシトシンのメチル化状態がハイブリッド化産物を経て決定される。この場合、オリゴマーで非メチル化状態が証明される。
【００７６】
実施例２：ＭＨＣ中に存在するＲＸＲＢ遺伝子のメチル化解析の実施。
図２はメチル化における特定のＣＧ−位置が調べられる遺伝子ＲＸＲＢの断片に関する。
【００７７】
第１段階で、ゲノム配列が重亜硫酸塩（亜硫酸水素塩、酸性亜硫酸塩）の使用して処理され、塩基の５−位置のメチル化シトシンは全て変化しない。５−位置のメチル化シトシンが変化しないのに対して、塩基対の挙動に関して異なる塩基が生成する。重亜硫酸塩が反応に使用されると、メチル化されないシトシン塩基に付加反応が起こる。そのためには、変性剤または溶剤及びラジカル捕捉剤が必要である。これに続くアルカリ加水分解は非メチル化核塩基をウラシルに変える。この変化したＤＮＡはメチル化シトシンを証明するのに使われる。反応の第２段階では、処理されたＤＮＡ試料が水または水性溶液で希釈される。それに続いてＤＮＡの脱亜硫酸化が優先的に行なわれる。反応の第３段階では、ＤＮＡ試料がポリメラーゼ連鎖反応で、好ましくは耐熱性ポリメラーゼを使用して増幅される。この場合、ＲＸＲＢ遺伝子のシトシンが調べられる。それには、特殊なプライマーオリゴヌクレオチッドＡＴＡＴＴＧＧＴＡＡＡＧＧＴＡＴＴＡＧＧＧ及びＡＣＴＴＡＡＣＴＣＡＡＣＴＣＴＡＴＡＣＣＴＡＣで、３８５ｂｐ長の特定の断片が増幅される。この増幅産物は予め固相に結合しているオリゴヌクレオチッドに、例えば、ＡＧＧＴＧＧＡＡＣＧＧＧＡＡＴＴＴＴＴのような二重構造の形成下、ハイブリッド化する試料として使用され、その際、増幅産物の３３位置に証明すべきシトシンが存在する。ハイブリッド化により生成した産物は、増幅に使用される、Ｃｙ３及びＣｙ５フルオレスセンス標識化プライマーオリゴヌクレオチッドによって証明される。重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡのみが、この位置にメチル化シトシンを有し、増幅されたＤＮＡのハイブリッド化がオリゴヌクレオチッドによってなされる。このようにして、その都度調べられるシトシンのメチル化状態がハイブリッド化産物を経て決定される。この場合、オリゴマー写像Ａがで非メチル化状態がオリゴマー写像Ｂで部分的にメチル化された状態が証明される。
【００７８】
実施例３：ＭＨＣ中に存在するＢＡＴ５遺伝子のメチル化解析の実施。
図２はメチル化における特定のＣＧ−位置が調べられる遺伝子ＢＡＴ５の断片に関する。
【００７９】
第１段階で、ゲノム配列が重亜硫酸塩（亜硫酸水素塩、酸性亜硫酸塩）の使用して処理され、塩基の５−位置のメチル化シトシンは全て変化しない。５−位置のメチル化シトシンが変化しないのに対して、塩基対の挙動に関して異なる塩基が生成する。重亜硫酸塩が反応に使用されると、メチル化されないシトシン塩基に付加反応が起こる。そのためには、変性剤または溶剤及びラジカル捕捉剤が必要である。これに続くアルカリ加水分解は非メチル化核塩基をウラシルに変える。この変化したＤＮＡはメチル化シトシンを証明するのに使われる。反応の第２段階では、処理されたＤＮＡ試料が水または水性溶液で希釈される。それに続いてＤＮＡの脱亜硫酸化が優先的に行なわれる。反応の第３段階では、ＤＮＡ試料がポリメラーゼ連鎖反応で、好ましくは耐熱性ポリメラーゼを使用して増幅される。この場合、ＢＡＴ５遺伝子のシトシンが調べられる。それには、特殊なプライマーオリゴヌクレオチッドＡＧＡＡＧＡＧＡＡＴＧＴＧＧＧＴＡＧＧＡ及びＡＡＡＡＣＣＴＡＣＴＴＡＴＣＡＡＡＣＣＡＡＴで、５３９ｂｐ長の特定の断片が増幅される。この増幅産物は予め固相に結合しているオリゴヌクレオチッドに、例えば、ｉ）ＴＧＡＧＡＡＡＧＣＧＧＴＡＡＡＧＡＧ
またはｉｉ）ＡＴＴＴＡＡＧＧＣＧＡＧＧＧＴＡＡＡのような二重構造の形成下、ハイブリッド化する試料として使用され、その際、増幅産物の２１１位置のオリゴマーＴＧＡＧＡＡＡＧＣＧＧＴＡＡＡＧＡＧまたは増幅産物の４３１位置のオリゴマーＡＴＴＴＡＡＧＧＣＧＡＧＧＧＴＡＡＡに証明すべきシトシンが存在する。ハイブリッド化により生成した産物は、増幅に使用される、Ｃｙ３及びＣｙ５フルオレスセンス標識化プライマーオリゴヌクレオチッドによって証明される。重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡのみが、この位置にメチル化シトシンを有し、増幅されたＤＮＡのハイブリッド化がオリゴヌクレオチッドによってなされる。このようにして、その都度調べられるシトシンのメチル化状態がハイブリッド化産物を経て決定される。この場合、両オリゴマーのうち、写像Ａで部分的にメチル化された状態が証明され、写像Ｂで非メチル化状態がそれぞれ証明される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
メチル化における特定のＣＧ−位置が調べられる遺伝子ＤＡＸＸの断片に関する。
【図２】
Ａはメチル化における特定のＣＧ−位置が調べられる遺伝子ＲＸＲＢの断片である。
Ｂはメチル化における特定のＣＧ−位置が調べられる遺伝子ＢＡＴ５の断片である。
【図１】
2004511217.tif 000002
【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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