(57)【要約】本発明は、忠実度が増加した（または誤取り込み率が低下した）ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼに関する。特に、本発明は、ポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を上昇または増強させることにより、例えば、あるポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを、別のポリメラーゼに由来する望ましい活性を備えた３’−５’エキソヌクレアーゼドメインで置換することにより、このようなポリメラーゼを作製する方法に関する。本発明は、本発明のポリメラーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ分子、このようなＤＮＡ分子を含む宿主細胞、および、このような宿主細胞を用いてポリメラーゼを作製するための方法にも関する。本発明のポリメラーゼは、核酸合成、配列決定、増幅、およびｃＤＮＡ合成に特に適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
忠実度が増加または向上するように改変または変異が加えられたポリメラーゼ。
【請求項２】
核酸合成時のヌクレオチドの誤取り込み（ｍｉｓｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が減少または消失するように、改変または変異が加えられたポリメラーゼ。
【請求項３】
ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１または２記載のポリメラーゼ。
【請求項４】
中温性または耐熱性である、請求項３記載のポリメラーゼ。
【請求項５】
Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ、ＶＥＮＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体、変種（ｖａｒｉａｎｔ）、および誘導体からなる群から選択される、請求項３記載のポリメラーゼ。
【請求項６】
（ａ）ポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性；および（ｂ）１つまたは複数のジデオキシヌクレオチドに対する識別活性
からなる群から選択される活性を低下または消失させる、１つまたは複数の改変または変異をさらに含む、請求項１または２記載のポリメラーゼ。
【請求項７】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が上昇するように改変または変異が加えられた、請求項６記載のポリメラーゼ。
【請求項８】
識別活性が低下または消失するように改変または変異が加えられた、請求項６記載のポリメラーゼ。
【請求項９】
５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が低下または消失するように、改変または変異が加えられた、請求項６記載のポリメラーゼ。
【請求項１０】
ポリメラーゼの３’−５’ドメインに１つまたは複数の変異または改変を含む、請求項３記載のポリメラーゼ。
【請求項１１】
変異または改変が、高い３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する３’−５’エキソヌクレアーゼドメインによる、３’−５’−エキソヌクレアーゼドメインの置換である、請求項１０記載のポリメラーゼ。
【請求項１２】
Ｔａｑである、請求項１１記載のポリメラーゼ。
【請求項１３】
高い活性を有する３’−５’エキソヌクレアーゼドメインがＴｎｅポリメラーゼに由来する、請求項１２記載のポリメラーゼ。
【請求項１４】
請求項１および２のいずれか一項記載のポリメラーゼをコードする遺伝子を含むベクター。
【請求項１５】
遺伝子がプロモーターと機能的に結合している、請求項１４記載のベクター。
【請求項１６】
プロモーターが、λ−ＰＬプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーターおよびｔｒｃプロモーターからなる群から選択される、請求項１５記載のベクター。
【請求項１７】
請求項１４記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
ポリメラーゼを生産する方法であって、
（ａ）請求項１７記載の宿主細胞を培養する段階；
（ｂ）該遺伝子を発現させる段階；および
（ｃ）該宿主細胞から該ポリメラーゼを単離する段階
を含む方法。
【請求項１９】
宿主細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
核酸分子を合成する方法であって、
（ａ）核酸テンプレートを請求項１または２記載の１つまたは複数のポリメラーゼと混合する段階；および
（ｂ）該テンプレートの全体または一部に対して相補的な核酸分子を生成するのに十分な条件下で、該混合物をインキュベートする段階
を含む方法。
【請求項２１】
混合物が、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＩＴＰ、７−デアザ（ｄｅａｚａ）−ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、ｄｄＴＴＰ、［α−Ｓ］ｄＡＴＰ、［α−Ｓ］ｄＴＴＰ、［α−Ｓ］ｄＧＴＰおよび［α−Ｓ］ｄＣＴＰからなる群から選択される、１つまたは複数のヌクレオチドをさらに含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ヌクレオチドの１つまたは複数が検出可能なように標識される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
ＤＮＡ分子の配列を決定する方法であって、
（ａ）プライマーを第１のＤＮＡ分子とハイブリダイズさせる段階；
（ｂ）段階（ａ）のＤＮＡ分子をデオキシリボヌクレオシド三リン酸、請求項１または２のいずれか一項記載のＤＮＡポリメラーゼ、およびターミネーターヌクレオチドと接触させる段階；
（ｃ）合成されるＤＮＡ分子の長さが該第１のＤＮＡ分子よりも短く、該合成されるＤＮＡ分子が５’末端にターミネーターヌクレオチドを含み、該第１のＤＮＡ分子に対して相補的なＤＮＡ分子の無作為な集団を合成するのに十分な条件下で、段階（ｂ）の混合物をインキュベートする段階；ならびに
（ｄ）該第１のＤＮＡ分子のヌクレオチド配列の、少なくとも一部を決定できるように、該合成されたＤＮＡ分子をサイズにより分離する段階
を含む方法。
【請求項２４】
デオキシリボヌクレオシド三リン酸が、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＩＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ、［α−Ｓ］ｄＡＴＰ、［α−Ｓ］ｄＴＴＰ、［α−Ｓ］ｄＧＴＰおよび［α−Ｓ］ｄＣＴＰからなる群から選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ターミネーターヌクレオチドがｄｄＴＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰまたはｄｄＣＴＰである、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
デオキシリボヌクレオシド三リン酸の１つまたは複数に検出可能な標識がなされている、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
ターミネーターヌクレオチドの１つまたは複数が検出可能なように標識される、請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
二本鎖ＤＮＡ分子を増幅するための方法であって、
（ａ）第１および第２のプライマーを提供する段階であって、第１のプライマーは該ＤＮＡ分子の第１鎖の３’末端の内部または３’末端または近傍の配列に対して相補的であり、かつ第２のプライマーは該ＤＮＡ分子の第２鎖の３’末端の内部または３’末端または近傍の配列に対して相補的である段階；
（ｂ）該第１鎖の全体または一部に対して相補的な第３のＤＮＡ分子、および該第２鎖の全体または一部に対して相補的な第４のＤＮＡ分子が合成される条件下で、請求項１または２のいずれか一項記載のＤＮＡポリメラーゼの存在下において、該第１のプライマーを該第１鎖に、該第２のプライマーを該第２鎖にハイブリダイズさせる段階；
（ｃ）該第１および第３鎖、ならびに該第２および第４鎖を変性させる段階；ならびに
（ｄ）（ａ）から（ｃ）までの段階を１回または複数回繰り返す段階
を含む方法。
【請求項２９】
条件が、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＩＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ、［α−Ｓ］ｄＡＴＰ、［α−Ｓ］ｄＴＴＰ、［α−Ｓ］ｄＧＴＰ、および［α−Ｓ］ｄＣＴＰからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在を含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
請求項１または２のいずれか一項記載の１つまたは複数のポリメラーゼを含む、ＤＮＡ分子の配列を決定するためのキット。
【請求項３１】
１つもしくは複数のジデオキシリボヌクレオシド三リン酸、および／または１つもしくは複数のデオキシリボヌクレオシド三リン酸をさらに含む、請求項３０記載のキット。
【請求項３２】
請求項１および２のいずれか一項記載の１つまたは複数のポリメラーゼを含む、核酸分子の増幅または合成のためのキット。
【請求項３３】
１つまたは複数のデオキシリボヌクレオシド三リン酸をさらに含む、請求項３２記載のキット。
【請求項３４】
ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製する方法であって、
（ａ）１つまたは複数のｍＲＮＡテンプレートを、請求項１または２記載の１つまたは複数のポリメラーゼと混合する段階；および
（ｂ）該テンプレートの全体または一部に対して相補的なｃＤＮＡ分子を合成するのに十分な条件下で、該混合物をインキュベートする段階
を含む方法。
【請求項３５】
合成されたｃＤＮＡを二本鎖ｃＤＮＡが生成される条件下でインキュベートする段階をさらに含む、請求項３４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、忠実度の高い実質的に純粋なポリメラーゼに関する。特に、本発明のポリメラーゼは、ポリメラーゼの忠実度が増加し（非改変型または非変異型のポリメラーゼと比べて）、それによって誤取り込み率（ｍｉｓｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）が低いポリメラーゼが得られるように改変されたポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼ）である。本発明のポリメラーゼは耐熱性または中温性のポリメラーゼであることが好ましい。本発明は、本発明のポリメラーゼのクローニングおよび発現、クローニングされた遺伝子を含むＤＮＡ分子、ならびに前記遺伝子を発現する宿主にも関する。本発明のポリメラーゼは、ＤＮＡ配列決定、増幅反応、核酸合成およびｃＤＮＡ合成に用いうる。
【０００２】
本発明は、１つまたは複数の追加的な変異または改変を有する本発明のポリメラーゼにも関する。このような変異または改変には、（１）ポリメラーゼが、ジデオキシヌクレオチドおよび他の修飾ヌクレオチドをデオキシヌクレオチドと同程度の効率でＤＮＡ分子に取り込む能力を増強または増大させるもの；ならびに（２）５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に低下させるものが含まれる。本発明のポリメラーゼは、これらの特性の１つまたは複数を有しうる。これらのポリメラーゼを、ＤＮＡ配列決定、増幅反応、核酸合成およびｃＤＮＡ合成に用いてもよい。
【０００３】
関連技術
ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡテンプレートに対して相補的なＤＮＡ分子の形成を司る。プライマーが一本鎖ＤＮＡテンプレートとハイブリダイズすると、ポリメラーゼはＤＮＡを５’から３’の向きに合成し、成長する鎖の３’−ヒドロキシル基にヌクレオチドを連続的に付加する。このようにして、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）およびプライマーの存在下で、一本鎖ＤＮＡテンプレートに対して相補的な新たなＤＮＡ分子の合成が可能になる。
【０００４】
多数のＤＮＡポリメラーゼが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの中温性微生物から単離されている。これらの中温性ＤＮＡポリメラーゼの多くに対してはクローニングも行われている。リン（Ｌｉｎ）らは、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼをクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させている（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：７０００〜７００４（１９８７））。タボール（Ｔａｂｏｒ）ら（米国特許第４，７９５，６９９号）はクローニングしたＴ７ ＤＮＡポリメラーゼを記載しており、ミンクレー（Ｍｉｎｋｌｅｙ）ら（Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５９：１０３８６〜１０３９２（１９８４））およびチャタジー（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ）（米国特許第５，０４７，３４２号）はそれぞれ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、およびＴ５ ＤＮＡポリメラーゼのクローニングを記載している。
【０００５】
好熱菌由来のＤＮＡポリメラーゼも記載されている。チェン（Ｃｈｉｅｎ）ら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １２７：１５５０〜１５５７（１９７６）は、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）からポリメラーゼを入手するための精製方法を記載している。この結果得られたタンパク質の分子量はゲル濾過分析によれば約６３，０００ダルトンであり、ショ糖勾配遠心分離によれば６８，０００ダルトンであった。カレージン（Ｋａｌｅｄｉｎ）ら、Ｂｉｏｋｈｙｍｉｙａ ４５：６４４〜５１（１９８０）は、Ｔ．アクアティカス（Ｔ． ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＹＴ１株からＤＮＡポリメラーゼを単離するための精製手順を開示している。精製された酵素は６２，０００ダルトンの単量体タンパク質であると報告されている。ゲルファント（Ｇｅｌｆａｎｄ）ら（米国特許第４，８８９，８１８号は）は、サーマス・アクアティカスの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子をクローニングした。このタンパク質の分子量は約８６，０００〜９０，０００ダルトンであることが判明した。シンプソン（Ｓｉｍｐｓｏｎ）らは、テルモトーガ属（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｓｐｅｃｉｅｓ）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを精製し、その特徴を一部明らかにしている（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８６：１２９２〜１２９６（１９９０））。シンプソンらによって単離された精製ＤＮＡポリメラーゼの分子量は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびサイズ排除クロマトグラフィーによる評価では８５，０００ダルトンであった。この酵素の基質非存在下における半減期は９５℃で３分間、５０℃で６０分間であり、至適ｐＨはｐＨ ７．５〜８．０の範囲であった。トリトンＸ−１００はこの酵素の耐熱性を強めるように思われた。シンプソンらによって記載された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの入手のために用いられた菌株は、テルモトーガ属ＦｊＳＳ３−Ｂ．１株であった（Ｈｕｓｓａｒら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３７：１２１〜１２７（１９８６））。また別の研究者らは、テルモトーガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをクローニングし、その配列を決定している（米国特許第５，３７４，５５３号、これは明確に参照として本明細書に組み入れられる）。
【０００６】
その他のＤＮＡポリメラーゼは、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅｒａｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）を含む好熱菌（Ｓｔｅｎｅｓｈら、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ２７２：１５６〜１６６（１９７２）；およびＫａｂｏｅｖら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １４５：２１〜２６（１９８１））およびいくつかの古細菌から同定されている（Ｒｏｓｓｉら、Ｓｙｓｔｅｍ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７：３３７〜３４１（１９８６）；Ｋｌｉｍｃｚａｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：４８５０〜４８５５（１９８６）；およびＥｌｉｅら、Ｅｕｒ． Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １７８：６１９〜６２６（１９８９））。最も高度に精製された古細菌ＤＮＡポリメラーゼの半減期は８７℃で１５分間と報告されている（Ｅｌｉｅら（１９８９）、前記）。イニス（Ｉｎｎｉｓ）ら、「ＰＣＲプロトコール：方法および増幅の手引き（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｍｐｌｆｉｃａｔｉｏｎ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９０）は、超高温で生育可能な超好熱性の真正細菌および古細菌がいくつか存在することを指摘し（Ｂｅｒｇｑｕｉｓｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｇｅｎｅｔ． Ｅｎｇ． Ｒｅｖ． ５：１９９〜２４４（１９８７）；およびケリー（Ｋｅｌｌｙ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． ４：４７−６２（１９８８））、これらの生物が極めて耐熱性の強いＤＮＡポリメラーゼを含む可能性を示唆している。
【０００７】
既知のポリメラーゼの多くには、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する１つのドメイン、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するもう１つのドメイン、ポリメラーゼ活性を有する第３のドメインという、３つのドメインが存在する。
【０００８】
５’−３’エキソヌクレアーゼドメインはポリメラーゼのＮ末端領域に存在する（Ｏｌｌｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３１３：７６２〜７６６（１９８５）；Ｆｒｅｅｍｏｎｔら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １：６６〜７３（１９８６）；Ｊｏｙｃｅ、Ｃｕｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． １：１２３〜１２９（１９９１））。いくつかのアミノ酸は、その変異によって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を低下させると考えられている（Ｇｕｔｍａｎ ＆ Ｍｉｎｔｏｎ、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１：４４０６〜４４０７（１９９３））。これらのアミノ酸には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのＴｙｒ７７、Ｇｌｙ１０３、Ｇｌｙ１８４およびＧｌｙ１９２が含まれる。５’−エキソヌクレアーゼドメインは必須ではないことが知られている。その最もよく知られた例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリメラーゼＩのクレノー断片である。クレノー断片は、５’−エキソヌクレアーゼ活性のない天然のタンパク質分解性断片である（Ｊｏｙｃｅら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５７：１９５８〜６４（１９９０））。この活性を持たないポリメラーゼはＤＮＡ配列決定に有用である。
【０００９】
ｄＮＴＰ結合ドメインを含むポリメラーゼの活性部位は通常、ポリメラーゼのカルボキシ末端領域に存在する（Ｏｌｌｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３１３：７６２〜７６６（１９８５）；Ｆｒｅｅｍｏｎｔら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １：６６〜７３（１９８６））。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリメラーゼＩのＰｈｅ７６２はヌクレオチドと直接相互作用するアミノ酸の１つであることが示されている（Ｊｏｙｃｅ ＆ Ｓｔｅｉｔｚ、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｉｎ． ６３：７７７〜８２２（１９９４）；Ａｓｔａｔｋｅ、Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：１９４５〜５４（１９９５））。このアミノ酸をＴｙｒに変換することにより、ジデオキシヌクレオチドを識別しない変異型ＤＮＡポリメラーゼが生じる。米国特許第５，６１４，３６５号、第５，９１２，１５５号、第５，９３９，３０１号、第６，０１５，６６８号および第５，９４８，６１４号、ならびに本明細書に参照として明確に組み入れられる、１９９５年９月８日に提出された「変異型ＤＮＡポリメラーゼおよびその使用（Ｍｕｔａｎｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｕｓｅ Ｔｈｅｒｅｏｆ）」と題するチャタジー（Ｄｅｂ Ｋ． Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ）による同時係属出願中の米国特許出願第０８／５２５，０５７号を参照されたい。
【００１０】
ほとんどのＤＮＡポリメラーゼは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性も含む。このエキソヌクレアーゼ活性はＤＮＡポリメラーゼにプルーフリーディング能力を与える。サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、核酸合成反応に最も用いやすく、このためポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に最も広く用いられているが、プルーフリーディング能力はない。他の酵素と比較した場合、Ｔａｑポリメラーゼの相対平均誤り率をプルーフリーディング能力のあるＰｆｕ、ＶｅｎｔおよびＤｅｅｐ Ｖｅｎｔポリメラーゼと比べるとそれぞれ８×１０−６、１．３×１０−６、２．８×１０−６および２．７×１０−６である（Ｃｌｉｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４：３５４６〜３５５１（１９９６））。これは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼには３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に必要な重要な３つのモチーフのすべてに欠失があるという事実に起因する（Ｌａｗｙｅｒら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ６４２７〜６４３７（１９８９））。興味深いことに、これらの欠失があるにもかかわらず、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼはクレノー断片と比べて、残存する３’−５’エキソヌクレアーゼドメインには非常に大きな変化があるものの、全体的な三次元構造は維持している（Ｋｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ ３７６：６１２〜６１６（１９９５）；Ｅｏｍら、Ｎａｔｕｒｅ ３８２：２７８〜２８１（１９９６））。
【００１１】
複数のポリメラーゼが知られているものの、当技術分野には、核酸合成、配列決定および増幅の目的にさらに適したポリメラーゼを開発することに対する需要が存在する。このようなポリメラーゼは、誤り率が低い、すなわち核酸合成時のヌクレオチドの誤取り込み率が低い、および／または重合の忠実度が高いと考えられる。
【００１２】
発明の概要
本発明は、分子生物学において有用なさらなるポリメラーゼを提供することにより、当技術分野における需要を満たす。特に、本発明は、忠実度が高められた耐熱性および中温性のポリメラーゼを含む。このようなポリメラーゼは、酵素の忠実度が増加または向上するように３’−５’エキソヌクレアーゼドメインが改変されている。改変には、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の上昇をもたらす３’−５’エキソヌクレアーゼドメインの変異、または３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の高いポリメラーゼに由来する３’−５’エキソヌクレアーゼドメインによる３’−５’エキソヌクレアーゼドメインの部分的もしくは完全な置換が含まれる。
【００１３】
本発明において、本発明者らは、Ｔａｑポリメラーゼの不活性型３’−５’−エキソヌクレアーゼドメインが別の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの活性型３’−５’−エキソヌクレアーゼドメインによって置換された、ハイブリッド型Ｔａｑポリメラーゼを作製した。本発明者らは最近、テルモトーガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであるＴｎｅ ＤＮＡポリメラーゼを報告した（米国特許第５，９１２，１５５号、第５，９３９，３０１号、第６，０１５，６６８号および第５，９４８，６１４号）。Ｔａｑポリメラーゼと同様に、ＴｎｅポリメラーゼもＰｏｌ Ｉファミリーに属する。しかし、Ｔａｑポリメラーゼとは異なり、Ｔｎｅポリメラーゼには活性型３’−５’−エキソヌクレアーゼドメインがある。本発明者らは、ハイブリッド型Ｔａｑポリメラーゼが５’−３’−エキソヌクレアーゼ活性、３’−５’−エキソヌクレアーゼ活性およびポリメラーゼ活性という３つの活性をすべて発揮することを示しており、このことからドメインの再編成を行っても構造的な完全性が損なわれない可能性が示唆された。本発明者らは、プルーフリーディング活性およびポリメラーゼの両者が協調的に作用することも示しており、このことはハイブリッド型ポリメラーゼが真の高忠実度ポリメラーゼのように作用することを意味する。このため、ハイブリッド型ポリメラーゼはＰＣＲまたは他の用途に極めて有用であると考えられる。
【００１４】
本発明において特に関心が持たれるＤＮＡポリメラーゼ（耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む）には、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｂｒ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、ＶＥＮＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、クレノー断片ＤＮＡポリメラーゼ、シュトッフェル断片ＤＮＡポリメラーゼおよびそれらの変異体、断片または誘導体が含まれる。本発明によれば、関心対象の酵素の忠実度を高めるために、このようなポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを改変または変異させる。
【００１５】
本発明は特に、核酸合成、配列決定および増幅における酵素の正確性を向上させる（忠実度を高くする）１つまたは複数のアミノ酸の変化が３’−５’エキソヌクレアーゼドメインに加えられた、変異型ＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ）に関する。３’−５’エキソヌクレアーゼドメインは、触媒性アミノ酸のすべてを含む領域と定義される（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６２：３６３〜３８５（１９９５）；Ｂｌａｎｃｏら、Ｇｅｎｅ １１２：１３９〜１４４（１９９２））。特に、ＤＮＡポリメラーゼのサブドメインにはＥｘｏＩ、ＥｘｏＩＩおよびＥｘｏＩＩＩの３つがある。ＥｘｏＩはｐｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼの場合、３５０Ｐから３６０Ｓまでの領域と定義され、ＥｘｏＩＩは４１６Ｋから４２９Ａまで、ＥｘｏＩＩＩは４９２Ｅから５０５Ｔからまでの領域と定義される。他のＤＮＡポリメラーゼにも対応する領域が認められる。完全な３’−５’活性のためには、３’−５’エキソドメインにある３つのサブドメインがすべて存在する必要がある。本発明によれば、当技術分野で周知の技法を用いて、これらのサブドメインにおける特定のアミノ酸または領域を変異させることにより、エキソ活性を修飾することが可能である。
【００１６】
本発明に従って、忠実度が高められたポリメラーゼに対して、他の機能的な変化を加えることもできる。例えば、５’エキソヌクレアーゼ活性を低下させるため、および／またはｄｄＮＴＰに対する識別性を低下させるために、ポリメラーゼを改変してもよい。
【００１７】
特に、本発明は、
（ａ）ポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が上昇する様式；
（ｂ）ポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が低下または消失する様式；
（ｃ）ジデオキシヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドに対する識別的挙動が低下または消失する様式、および
（ｄ）核酸合成時の不正確なヌクレオチドの誤取り込みが低下または消失する様式、
からなる群から選択される、少なくとも１つの様式で改変された、変異型または改変型のＤＮＡポリメラーゼに関する。
【００１８】
本発明は、本発明の変異型または改変型のポリメラーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ分子（好ましくはベクター）、およびこのようなＤＮＡ分子を含む宿主細胞にも向けられる。関心対象の遺伝子を発現させるためには、原核細胞および真核細胞を含むさまざまな宿主を用いてよい。本発明のポリメラーゼを発現させるためには原核細胞を用いることが好ましい。本発明による好ましい原核生物宿主は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
【００１９】
本発明は、本発明のポリメラーゼを生産する方法であって、
（ａ）本発明のポリメラーゼをコードする遺伝子を含む宿主細胞を培養する段階；
（ｂ）前記遺伝子を発現させる段階；および
（ｃ）前記宿主細胞から前記ポリメラーゼを単離する段階
を含む方法にも関する。
【００２０】
本発明は、核酸分子を合成する方法であって、
（ａ）核酸テンプレート（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）を１つまたは複数の本発明のポリメラーゼと混合する段階；および
（ｂ）前記テンプレートの全体または一部に対して相補的な核酸分子が合成されるのに十分な条件下で、前記混合物をインキュベートする段階
を含む方法にも関する。このような条件には、１つまたは複数のデオキシ−またはジデオキシリボヌクレオシド三リン酸とのインキュベーションが含まれる。このようなデオキシ−およびジデオキシリボヌクレオシド三リン酸には、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＩＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、７−デアザ−ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、ｄｄＴＴＰ、［α−Ｓ］ｄＡＴＰ、［α−Ｓ］ｄＴＴＰ、［α−Ｓ］ｄＧＴＰおよび［α−Ｓ］ｄＣＴＰが含まれる。
【００２１】
本方法は、ＤＮＡ分子の配列を決定する方法であって、
（ａ）プライマーを第１のＤＮＡ分子とハイブリダイズさせる段階；
（ｂ）段階（ａ）の前記分子をデオキシリボヌクレオシド三リン酸、１つまたは複数の本発明のＤＮＡポリメラーゼ、および１つまたは複数のターミネーターヌクレオチドと接触させる段階；
（ｃ）合成されるＤＮＡ分子の長さが前記第１のＤＮＡ分子よりも短く、合成されるＤＮＡ分子が３’末端にターミネーターヌクレオチドを含む、前記第１のＤＮＡ分子に対して相補的なＤＮＡ分子の無作為な集団が合成されるのに十分な条件下で、段階（ｂ）の混合物をインキュベートする段階；ならびに
（ｄ）前記第１のＤＮＡ分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部を決定できるように、前記合成されたＤＮＡ分子をサイズ別に分離する段階
を含む方法にも関する。このようなターミネーターヌクレオチドには、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰまたはｄｄＣＴＰが含まれる。
【００２２】
本発明は、二本鎖ＤＮＡ分子を増幅するための方法であって、
（ａ）前記ＤＮＡ分子の第１鎖の３’末端の内部または３’末端または近傍の配列に対して相補的な第１のプライマー、および前記ＤＮＡ分子の第２鎖の３’末端の内部または３’末端または近傍の配列に対して相補的な第２のプライマーである、第１および第２のプライマーを提供する段階；
（ｂ）前記第１鎖の全体または一部に対して相補的な第３のＤＮＡ分子、および前記第２鎖の全体または一部に対して相補的な第４のＤＮＡ分子が合成される条件下で、１つまたは複数の本発明のポリメラーゼの存在下において、前記第１のプライマーを前記第１鎖と、前記第２のプライマーを前記第２鎖とハイブリダイズさせる段階；
（ｃ）前記第１および第３鎖、ならびに前記第２および第４鎖を変性させる段階；ならびに
（ｄ）（ａ）から（ｃ）までの段階を１回または複数回繰り返す段階
を含む方法にも関する。
【００２３】
したがって、本発明は一般に、
（ａ）配列決定を行おうとする１つまたは複数のテンプレートまたは核酸分子を、１つまたは複数の本発明のポリメラーゼと混合する段階、および
（ｂ）前記テンプレートの全体もしくは一部の増幅、または前記核酸分子の全体もしくは一部の配列決定が十分に行われる条件下で、前記混合物をインキュベートする段階
を含む、核酸分子の増幅または配列決定に関する。
【００２４】
本発明は、核酸分子の配列決定、増幅または合成のためのキットであって、１つまたは複数の本発明のポリメラーゼ、ならびに
（ａ）１つまたは複数のジデオキシリボヌクレオシド三リン酸；
（ｂ）１つまたは複数のデオキシリボヌクレオシド三リン酸；
（ｃ）１つまたは複数のプライマー；
（ｄ）１つまたは複数の適した緩衝液または緩衝塩；
（ｅ）１つまたは複数のヌクレオチド；および
（ｆ）本発明の方法を実施するための指示
からなる群から選択される１つまたは複数の他の構成要素（またはそれらの組み合わせ）を含むキットにも関する。
【００２５】
本発明は、本発明の方法を実施するために生成された組成物、および本発明の方法の実施時に生成された組成物にも関する。このような組成物は、１つまたは複数の本発明のポリメラーゼ、１つまたは複数のヌクレオチド、１つまたは複数のテンプレート、１つまたは複数の反応緩衝液または緩衝塩、１つまたは複数のプライマー、本発明の方法によって生成された１つまたは複数の核酸生成物などから選択される、１つまたは複数の構成要素を含みうる。
【００２６】
発明の詳細な説明
定義
以下の説明には、組換えＤＮＡ技術において用いられるさまざまな用語を頻繁に用いる。明細書および特許請求の範囲に関して明確かつ一貫した理解が得られるように、このような用語に与えられる範囲を含め、以下の定義を提示する。
【００２７】
クローニングベクター
宿主細胞における自律複製が可能であり、ベクターの本質的な生物機能を失わずにその箇所で確定的な様式でＤＮＡ配列を切断しうる１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位があることを特徴とし、複製およびクローニングを行うために内部にＤＮＡをスプライス挿入することができる、プラスミド、コスミドまたはファージＤＮＡまたは他のＤＮＡ分子。クローニングベクターは、クローニングベクターによる形質転換がなされた細胞の同定に用いるのに適したマーカーをさらに含んでもよい。マーカーは例えば、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性である。
【００２８】
発現ベクター
クローニングベクターと類似しているが、宿主に形質転換導入された後に、内部にクローニングされた遺伝子の発現を増強させうるベクター。クローニングされる遺伝子は通常、プロモーター配列などの特定の制御配列の制御下に置かれる（すなわち、機能的に結合される）。
【００２９】
組換え宿主
発現ベクター、クローニングベクターまたは任意のＤＮＡ分子中に望ましいクローニングされた遺伝子を含む、任意の原核生物または真核生物または微生物。「組換え宿主」という用語は、宿主染色体またはゲノムに望ましい遺伝子を含むように遺伝的に操作された宿主細胞も含むものとする。
【００３０】
宿主
複製可能な発現ベクター、クローニングベクターまたは任意のＤＮＡ分子のレシピエントである、任意の原核生物性または真核生物性微生物。ＤＮＡ分子は、構造遺伝子、プロモーターおよび／または複製起点を非制限的に含みうる。
【００３１】
プロモーター
遺伝子の５’領域として一般に説明され、開始コドンの近位部に位置するＤＮＡ配列。隣接する遺伝子の転写はプロモーター領域で開始される。
【００３２】
遺伝子
ポリペプチドまたはタンパク質の発現に必要な情報を含むＤＮＡ配列。これはプロモーターおよび構造遺伝子のほか、タンパク質の発現に関与する他の配列を含む。
【００３３】
構造遺伝子
メッセンジャーＲＮＡへと転写され、続いて特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸の配列へと翻訳されるＤＮＡ配列。
【００３４】
機能的に結合している
本明細書で用いる場合、プロモーターが、構造遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現開始を制御する位置にあることを意味する。
【００３５】
発現
発現とは、遺伝子がポリペプチドを産生する過程のことである。これには、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写、およびこのようなｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が含まれる。
【００３６】
実質的に純粋である
本明細書で用いる「実質的に純粋である」とは、望まれる精製タンパク質に、望まれるタンパク質に自然下で付随している細胞性混入物が本質的に混入していないことを意味する。混入性の細胞成分には、ホスファターゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼまたは望ましくないＤＮＡポリメラーゼ酵素が非制限的に含まれる。
【００３７】
プライマー
本明細書で用いる「プライマー」とは、ＤＮＡ分子の増幅または重合の際にヌクレオチド単量体の共有結合によって伸長する一本鎖オリゴヌクレオチドのことを指す。
【００３８】
テンプレート
本明細書で用いる「テンプレート」という用語は、増幅、合成または配列決定を行おうとする、二本鎖または一本鎖の核酸（ＤＮＡまたはｍＲＮＡなどのＲＮＡ）分子のことを指す。二本鎖核酸分子の場合には、これらの分子の増幅、合成または配列決定を行う前に、第１および第２鎖を形成させるためにその鎖を変性させる。テンプレートの一部に対して相補的なプライマーを適切な条件下でハイブリダイズさせると、続いて本発明のポリメラーゼが前記テンプレートまたはその一部に対して相補的な分子を合成する。本発明に従って新たに合成された分子の長さは、元のテンプレートと同じまたはより短いと考えられる。さらに、新たに合成された核酸分子は本発明に従ってさらに合成を行うためのテンプレートとしても役立つと思われる。新たに合成される分子の合成時または伸長時のミスマッチ取り込みは、１つまたは複数のミスマッチ塩基対をもたらすと思われる。したがって、合成される分子はテンプレートに対して厳密に相補的であるとは限らない。
【００３９】
取り込み
本明細書で用いる「取り込み」という用語は、ＤＮＡ分子またはプライマーの一部になることを意味する。
【００４０】
増幅
本明細書で用いる「増幅」とは、ＤＮＡポリメラーゼを用いてヌクレオチド配列のコピー数を増やすことを目的とする任意のインビトロの方法のことを指す。核酸の増幅により、ＤＮＡ分子またはプライマーへのヌクレオチドの取り込みが起こり、それによってＤＮＡテンプレートに対して相補的な新たなＤＮＡ分子が形成される。形成されたＤＮＡ分子およびそのテンプレートは、別のＤＮＡ分子を合成するためのテンプレートとして用いることができる。本明細書で用いる場合、１つの増幅反応は、多数回のＤＮＡ複製から構成されうる。ＤＮＡ増幅反応には例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が含まれる。１つのＰＣＲ反応は、２０〜１００「サイクル」にわたるＤＮＡ分子の変性および合成から構成されうる。
【００４１】
オリゴヌクレオチド
「オリゴヌクレオチド」とは、１つのヌクレオチドのペントースの３’位と隣接するヌクレオチドのペントースの５’位との間のホスホジエステル結合によって連結されたヌクレオチドの共有結合配列を含む、合成性または天然の分子のことを指す。
【００４２】
ヌクレオチド
本明細書で用いる「ヌクレオチド」とは、塩基−糖−リン酸の組み合わせのことを意味する。ヌクレオチドは核酸配列（ＤＮＡおよびＲＮＡ）の単量体単位である。ヌクレオチドという用語には、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰなどのデオキシリボヌクレオシド三リン酸またはそれらの誘導体が含まれる。このような誘導体には、例えば、［αＳ］ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰおよび７−デアザ−ｄＡＴＰが含まれる。本明細書で用いるヌクレオチドという用語は、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）およびそれらの誘導体のことも指す。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の具体的な例には、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰおよびｄｄＴＴＰが非制限的に含まれる。本発明によれば、「ヌクレオチド」は標識されていないものでもよく、または周知の技法によって直接標識されたものでもよい。検出可能な標識には、例えば、放射性同位体、蛍光性標識、化学発光性標識、生物発光性標識および酵素標識が含まれる。
【００４３】
耐熱性
本明細書で用いる「耐熱性」とは、熱による失活に対する耐性のあるＤＮＡポリメラーゼのことを指す。ＤＮＡポリメラーゼは、５’から３’の向きにプライマーを伸長させることにより、一本鎖ＤＮＡテンプレートに対して相補的なＤＮＡの形成を司る。中温性ＤＮＡポリメラーゼの場合、この活性は熱処理によって失活する可能性がある。例えば、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼの活性は本酵素を９０℃の温度に３０秒間曝露させることによって完全に失活する。本明細書で用いる場合、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの活性は、中温性ＤＮＡポリメラーゼよりも熱失活に対する耐性が強い。しかし、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは熱失活に対して完全に耐性のある酵素を指すものではなく、このため、熱処理によってＤＮＡポリメラーゼ活性がある程度低下する可能性はある。また、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの至適温度は一般に中温性ＤＮＡポリメラーゼよりも高い。
【００４４】
ハイブリダイゼーション
「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリダイズすること」という用語は、相補的一本鎖核酸分子（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）の対合によって二本鎖分子が生じることを指す。本明細書で用いる場合、塩基対合が完全に相補的でなくとも２つの核酸分子はハイブリダイズしうる。したがって、当技術分野で周知の適切な条件を用いるという前提であれば、ミスマッチ塩基は２つの核酸分子のハイブリダイゼーションを妨げない。
【００４５】
３’→５’（３’−ｔｏ−５’）エキソヌクレアーゼ活性
「３’→５’エキソヌクレアーゼ活性」は、当技術分野で周知の酵素活性である。この活性はＤＮＡポリメラーゼにしばしばみられ、ＤＮＡ複製の「編集」または修正機構に関与すると考えられている。
【００４６】
「３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が上昇したＤＮＡポリメラーゼ」は、本明細書において、対応する変異していない野生型酵素と比べて、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が約１０％もしくはそれ以上高い、または好ましくは約２５％、３０％、５０％、１００％、１５０％、２００％もしくは３００％もしくはそれ以上高い、変異型ＤＮＡポリメラーゼと定義される。本発明のポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を、対応する非改変型または野生型ポリメラーゼとの比較による相対的活性によって評価してもよい。好ましくは、このような相対的活性の上昇は、本発明のポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を対応する非変異型または非改変型の酵素と比較して、１．５、２、５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００または３００倍である。または、本発明のポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を比活性として直接測定してもよく、その範囲は約０．００５、０．０１、０．０５、０．７５、０．１、０．１５、０．４、０．５、０．７５、０．９、１．０、１．２、１．５、１．７５、２．０、３．０、５．０、７．５、１０、１５、２０、３０単位／ｍｇタンパク質でよい。３’→５’エキソヌクレアーゼの活性の１単位は、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）によって３’末端を［３Ｈ］ｄＴＴＰで標識したλＤＮＡのＨｈａＩ断片を用いる、「ＢＲＬ １９８９年版カタログおよび参考文献の手引き（ＢＲＬ １９８９ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ＆ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｇｕｉｄｅ）」の５ページに記載されたアッセイで、１０ナノモルの基質末端が３７℃、６０分間で溶解する活性の量と定義される。タンパク質はブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７２：２４８（１９７６）の方法によって測定する。比較の手段として、天然の野生型Ｔ５−ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡＰ）またはｐＴＴＱ１９−Ｔ５−２によってコードされるＴ５−ＤＮＡＰの比活性は約１０単位／ｍｇタンパク質であるが、一方、ｐＴＴＱ１９−Ｔ５−２（Ｅｘｏ−）（米国特許第５，２７０，１７９号）によってコードされるＤＮＡポリメラーゼの比活性は約０．０００１単位／ｍｇタンパク質であり、すなわち非改変型酵素の０．００１％、１０５分の１に低下する。
【００４７】
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性
「５’→３’エキソヌクレアーゼ活性」も当技術分野で周知の酵素活性である。この活性は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰｏｌｌＩおよびＰｏｌＩＩＩなどのＤＮＡポリメラーゼでしばしばみられる。
【００４８】
「５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が実質的に低下したＤＮＡポリメラーゼ」は、（１）５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が対応する変異していない野生型酵素の約１０％もしくはそれ未満、または好ましくは約１％もしくはそれ未満である変異型ＤＮＡポリメラーゼ、または（２）５’→３’エキソヌクレアーゼ比活性が約１単位／ｍｇタンパク質未満、または好ましくは約０．１単位／ｍｇタンパク質もしくはそれ未満であるＤＮＡポリメラーゼ、のいずれかと定義される。
【００４９】
３’→５’および５’→３’エキソヌクレアーゼ活性はいずれも、配列決定用ゲル上で観察することができる。活性の高い５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、伸長するプライマーの５’末端からヌクレオチドを除去することにより、配列決定用ゲル中に非特異的な梯子状パターン（ｌａｄｄｅｒ）を生じさせると考えられる。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性は、配列決定用ゲル中の放射標識プライマーの分解を追跡することによって測定可能である。このため、例えば野生型ポリメラーゼと変異型ポリメラーゼを比較することにより、これらの相対的な量をルーチンの実験の範囲内で決定することができる。
【００５０】
忠実度
忠実度とは、テンプレートに対して相補的な核酸分子（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）を合成する際の、重合の正確性、またはポリメラーゼが正しい基質（例えば、ヌクレオチド）を不正確な基質と識別する能力のことを指す。ポリメラーゼの忠実度が高いほど、ポリメラーゼが核酸合成時に伸長する鎖中にヌクレオチドの誤取り込みを行うことが少なくなる；すなわち、忠実度の増加または向上は、誤り率の低い（誤取り込み率の低い）正確なポリメラーゼにつながる。
【００５１】
忠実度が増加した／向上した／高いＤＮＡポリメラーゼは、任意の長さの任意の核酸分子の合成時に誤取り込みされるヌクレオチドの数が、約２〜約１０，０００分の１、約２〜約５，０００分の１または約２〜約２０００分の１（好ましくは約５分の１未満、より好ましくは約１０分の１未満、さらにより好ましくは約５０分の１未満、さらに好ましくは約１００分の１未満、さらにより好ましくは約５００分の１未満、最も好ましくは約１０００分の１未満）に減少したヌクレオチドと定義される。例えば、変異型ポリメラーゼが１０００塩基の合成時に１つのヌクレオチドを誤取り込みし、これに対して、非変異型ポリメラーゼが１０ヌクレオチドを誤取り込みする場合が考えられる。このような変異型ポリメラーゼは忠実度が１０倍に増大したと言える。
【００５２】
誤取り込みが減少したＤＮＡポリメラーゼは、本明細書において、対応する変異していない非改変型または野生型酵素と比べて、誤取り込みが約５０％もしくはそれ未満、または好ましくは約２５％もしくはそれ未満、より好ましくは約１０％もしくはそれ未満、最も好ましくは約１％もしくはそれ未満である、変異型または改変型のＤＮＡポリメラーゼと定義される。忠実度の低いＤＮＡポリメラーゼも、不正確なヌクレオチド取り込みを伴うＤＮＡ合成を開始しうる（Ｐｅｒｒｉｏｎ ＆ Ｌｏｅｂ、１９８９、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：２８９８〜２９０５）。
【００５３】
ポリメラーゼの忠実度または誤取り込み率は、配列決定または当技術分野で知られた他の方法によって評価可能である（ＥｃｋｅｒｔおよびＫｕｎｋｅｌ、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３７３９〜３７４４（１９９０））。１つの例では、非変異型および変異型ポリメラーゼによって合成されたＤＮＡ分子の配列を、予想される（既知の）配列を比較することができる。これにより、誤り（誤取り込み）の数を各酵素に関して決定し、比較することができる。もう１つの例では、非変異型および変異型ポリメラーゼを用いて、既知の配列を有するＤＮＡ分子の配列を決定する。配列決定の誤り（誤取り込み）の数を比較することにより、酵素の忠実度または誤取り込み率を決定可能である。忠実度または誤取り込み率を決定する他の手段も当業者は認識していると考えられる。
【００５４】
１．ポリメラーゼの由来
ポリメラーゼ活性を有する種々のポリペプチドが、本発明によれば有用である。これらのポリペプチドに含まれるものには、核酸ポリメラーゼ（ＤＮＡポリメラーゼを含む）などがある。このようなポリメラーゼには、テルムス・テルモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、テルモトーガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）（Ｔｎｅ）ＤＮＡポリメラーゼ、テルモトーガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、テルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（ＴｌｉまたはＶＥＮＴ（商標））ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオース（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス・ウージ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｏｓｉｉ）（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、バチルス・ステロテルモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、バチルス・カルドフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｂｃａ）ＤＮＡポリメラーゼ、スルホロバス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）（Ｓａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、テルモプラズマ・アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）（Ｔａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、テルムス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）（Ｔｆｌ／Ｔｕｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、テルムス・ルベル（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ）（Ｔｒｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、テルムス・ブロキアヌス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）（ＤＹＮＡＺＹＭＥ（商標））ＤＮＡポリメラーゼ、メタノバクテリウム・テルモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）（Ｍｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、マイコバクテリウムＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｔｂ、Ｍｌｅｐ）、ならびにそれらの変異体、および変種、および誘導体が非制限的に含まれる。
【００５５】
本発明に従って用いられるポリメラーゼは、典型的には５’から３’の向きに、核酸テンプレートから核酸分子を合成することができる任意の酵素でありうる。本発明に用いる核酸ポリメラーゼは中温性でも好熱性でもよく、好熱性であることが好ましい。好ましい中温性ＤＮＡポリメラーゼには、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノー断片ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩなどが含まれる。本発明の方法に用いうる好ましい耐熱性ＤＮＡポリメラーゼには、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、Ｔｆｌ、Ｔｔｈ、シュトッフェル断片、ＶＥＮＴ（商標）およびＤＥＥＰＶＥＮＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体、変種、および誘導体が含まれる（米国特許第５，４３６，１４９号；米国特許第４，８８９，８１８号；米国特許第４，９６５，１８８号；米国特許第５，０７９，３５２号；米国特許第５，６１４，３６５号；米国特許第５，３７４，５５３号；米国特許第５，２７０，１７９号；米国特許第５，０４７，３４２号；米国特許第５，５１２，４６２号；国際公開公報第９２／０６１８８号；国際公開公報第９２／０６２００号；国際公開公報第９６／１０６４０号；Ｂａｒｎｅｓ， Ｗ．Ｍ．、Ｇｅｎｅ １１２：２９〜３５（１９９２）；Ｌａｗｙｅｒ， Ｆ．Ｃ．ら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈ． Ａｐｐｌ． ２：２７５〜２８７（１９９３）；Ｆｌａｍａｎ， Ｊ．−Ｍら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２（１５）：３２５９〜３２６０（１９９４））。長い核酸分子（例えば、約３５Ｋｂ長よりも長い核酸分子）の増幅のためには、少なくとも２つのＤＮＡポリメラーゼ（一方は３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠き、もう一方は３’エキソヌクレアーゼ活性を有する）が一般に用いられる。米国特許第５，４３６，１４９号；米国特許第５，５１２，４６２号；ファーン（Ｆａｒｎｅｓ， Ｗ．Ｍ．）、Ｇｅｎｅ １１２：２９〜３５（１９９２）；および２０００年１２月２１日に提出された、同時係属中の米国特許出願第０９／７４１，６６４号を参照されたい（これらの開示内容はその全体が参照として本明細書に組み入れられる）。３’エキソヌクレアーゼを実質的に欠くＤＮＡポリメラーゼの例には、Ｔａｑ、Ｔｎｅ（ｅｘｏ−）、Ｔｍａ（ｅｘｏ−）、Ｐｆｕ（ｅｘｏ−）、Ｐｗｏ（ｅｘｏ−）およびＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体、変種、および誘導体が非制限的に含まれる。
【００５６】
核酸ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを、本方法では、溶液中にて約０．１〜２００単位／ｍｌ、約０．１〜５０単位／ｍｌ、約０．１〜４０単位／ｍｌ、約０．１〜３．６単位／ｍｌ、約０．１〜３４単位／ｍｌ、約０．１〜３２単位／ｍｌ、約０．１〜３０単位／ｍｌ、または約０．１〜２０単位／ｍｌの最終濃度で用いることが好ましく、最も好ましくは約２０単位／ｍｌの濃度で用いる。当然ながら、本発明における使用に適した核酸ポリメラーゼの他の適した濃度は、当業者には明らかであると考えられる。
【００５７】
本発明の１つの好ましい面においては、変異型または改変型ポリメラーゼを組換え法によって作製する。クローニングされたさまざまなポリメラーゼ遺伝子が入手可能である、または標準的な組換え法を用いて入手することができる。
【００５８】
本発明に従って改変されるＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子のクローニングのためには、ポリメラーゼ遺伝子を含む単離されたＤＮＡを用いて、ベクター中に組換えＤＮＡライブラリーを構築する。当技術分野で周知の任意のベクターを、関心対象のＤＮＡポリメラーゼのクローニングに用いることができる。しかし、用いるベクターは、組換えＤＮＡライブラリーによる形質転換を行う予定の宿主と適合性がある必要がある。
【００５９】
プラスミドライブラリーの構築用の原核生物ベクターには、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における複製が可能なプラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＵＣベクターなどが含まれる（ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９など：「分子クローニング、実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）；およびサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング、実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（第２版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９））。桿菌プラスミドにはｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＣ２１７などが含まれる。この種のプラスミドは、グリチャン（Ｇｌｙｃｚａｎ， Ｔ）、「桿菌の分子生物学（Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｂａｃｉｌｌｉ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｙｏｒｋ（１９８２）、３０７〜３２９に開示されている。適したストレプトミセス属プラスミドには、ｐＩＪ１０１（Ｋｅｎｄａｌｌら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １６９：４１７７〜４１８３（１９８７））が含まれる。シュードモナス属プラスミドに関しては、ジョン（Ｊｏｈｎ）ら（Ｒａｄ． Ｉｎｓｅｃ． Ｄｉｓ． ８：６９３〜７０４（１９８６））およびイガキ（Ｉｇａｋｉ）（Ｊｐｎ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ３３：７２９〜７４２（１９７８））に総説がある。ｐＣＰ１３（ＤａｒｚｉｎｓおよびＣｈａｋｒａｂａｒｂａｒｙ、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５９：９〜１８、１９８４）などの宿主範囲の広いプラスミドまたはコスミドを、本発明のために用いることもできる。本発明の遺伝子のクローニングのために好ましいベクターは原核生物ベクターである。好ましくは、本発明の遺伝子のクローニングには、ｐＣＰ１３およびｐＵＣベクターを用いることが好ましい。
【００６０】
関心対象のポリメラーゼ遺伝子のクローニングの目的に好ましい宿主は原核生物宿主である。最も好ましい原核生物宿主は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。しかし、本発明の望ましいポリメラーゼ遺伝子を、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）およびプロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）を非制限的に含む、他の原核生物宿主にクローニングしてもよい。特に関心が持たれる細菌宿主には、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のライフテクノロジー部門（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手可能な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂが含まれる。
【００６１】
関心対象のポリメラーゼのクローニングおよび発現を目的とする真核生物宿主には、酵母、真菌および哺乳動物細胞が含まれる。このような真核細胞における望ましいポリメラーゼの発現には、真核生物プロモーターを含む真核生物調節領域を用いることが必要な場合がある。真核細胞におけるポリメラーゼ遺伝子のクローニングおよび発現は、周知の真核生物ベクター系を用いる周知の技法によって行える。
【００６２】
ＤＮＡライブラリーが特定のベクター中に構築されたところで、周知の技法により、適切な宿主への形質転換導入を行う。形質転換されたコロニーをペトリ皿１枚当たり約２００〜３００コロニーの密度で播く。耐熱性ポリメラーゼの選択の場合には、続いて、形質転換がなされた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニーをニトロセルロース膜に移すことにより、コロニーを熱安定性のあるＤＮＡポリメラーゼの発現に関してスクリーニングする。移した細胞をニトロセルロース上で増殖させた後（約１２時間）に、細胞を標準的な方法によって溶解し、続いて内因性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）酵素を失活させるために膜を９５℃で５分間処理する。用いる宿主およびクローニングするポリメラーゼの温度安定性によっては、宿主ポリメラーゼを失活させるために他の温度を用いてもよい。続いて、当技術分野で周知の技法を用いるポリメラーゼ活性の存在に関するアッセイにより、安定なポリメラーゼ活性を検出する。サグナー（Ｓａｇｎｅｒ）ら、Ｇｅｎｅ ９７：１１９〜１２３（１９９１）（これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）。本発明のポリメラーゼをコードする遺伝子は、サグナー（Ｓａｇｎｅｒ）ら、前記によって記載された手順を用いてクローニング可能である。
【００６３】
２．ポリメラーゼの改変または変異
本発明によれば、忠実度が増加または向上した（誤取り込み率が低下した）変異型または改変型のポリメラーゼが生じるような様式で、関心対象のポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを改変または変異させる。３’−５’エキソヌクレアーゼドメインは、ｅｘｏＩ、ｅｘｏＩＩおよびｅｘｏＩＩＩという３つのサブドメインから構成され（Ｂｌａｎｃｏら、Ｇｅｎｅ １１２：１３９〜１４４（１９９２））、それらの中にエキソヌクレアーゼ活性にとって重要な触媒性アミノ酸が見いだされている。これらの触媒性アミノ酸は金属イオンと相互作用する。エキソヌクレアーゼドメインに変異を導入する際には、触媒性アミノ酸が金属イオンとの相互作用を維持することが好ましい。本発明による酵素の忠実度を高めるために、任意のポリメラーゼのエキソヌクレアーゼドメインに１つまたは複数の変異を加えることができる。このような変異には、点変異、フレームシフト変異、欠失および挿入が含まれる。本発明による、忠実度が向上もしくは増大した、または３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が上昇もしくは向上したポリメラーゼを作製するためには、１つまたは複数のアミノ酸置換が生じる１つまたは複数の点変異を用いることが好ましい。本発明の１つの好ましい面においては、望ましい結果を得るために１つまたは複数の変異を加える。
【００６４】
３．３’−５’エキソヌクレアーゼドメインの置換
新たな特性を１つの酵素から関連性のある別の酵素に新たに加えることは、タンパク質工学の興味深い可能性の一つである。新たな特性を得るために用いられてきた従来のある種のアプローチは、無作為変異誘発、および関心対象のわずかな変異体を分離するための多数の変異体のスクリーニングを必要とした。もう１つのアプローチは、構造情報に基づいて、新しくはあるが関連性はあるタンパク質または酵素に特定のドメインを組み込むことである（Ｐｉｅｒｒｅ Ｂｅｇｕｉｎによる総説、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １０：３３６〜３４０（１９９９））。
【００６５】
当技術分野で周知の技法を用いて（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（第２版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）、ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを、望ましい３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する、別のポリメラーゼに由来する３’−５’エキソヌクレアーゼドメインと置換することができる。種々のポリメラーゼのドメインを表１に示す。
【００６６】
【表１】種々のポリメラーゼの近似したドメイン
2004502443.tif 000002
【００６７】
本発明は、１つのドメインの全体または一部と、異なるドメインとのドメイン置換を考えている。ある種のポリメラーゼの任意のドメイン（またはその部分）を、第２のポリメラーゼのドメイン（またはその部分）と置換することができる。このような置換は、望ましい３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が生じるタンパク質の正しいフォールディングが置換によってもたらされるように行うことが好ましい。
【００６８】
４．ポリメラーゼのそのほかの改変または変異
本発明によれば、誤取り込みが少ない、または忠実度が向上したポリメラーゼを作製するための上記の変異に加えて、１つまたは複数のそのほかの変異または改変（またはそれらの組み合わせ）を関心対象のポリメラーゼに加えてもよい。特に関心が持たれる変異または改変には、（１）５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が消失または低下する；および（２）ジデオキシヌクレオチドの識別性が低下する（すなわち、ジデオキシヌクレオチドの取り込みが増える）、改変または変異が含まれる。
【００６９】
ポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性は、ポリメラーゼ遺伝子を変異させることにより、または５’→３’エキソヌクレアーゼドメインを除去することにより、低下または消失させることができる。このような変異には、点変異、フレームシフト変異、欠失および挿入が含まれる。５’−３’エキソヌクレアーゼ活性をコードする領域を、当技術分野で周知の技法を用いて除去することが好ましい。本発明の態様では、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性にかかわる６つの保存的なアミノ酸の任意の１つを変異させることができる。Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼに関するこれらの保存的なアミノ酸の例には、Ａｓｐ８、Ｇｌｕ１１２、Ａｓｐ１１４、Ａｓｐ１１５、Ａｓｐ１３７およびＡｓｐ１３９が含まれる。変異が考えられる他の部位にはＧｌｙ１０２、Ｇｌｙ１８７およびＧｌｙ１９５がある。
【００７０】
他のポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を低下または消失させるための標的となる、対応するアミノ酸は以下の通りである：
2004502443.tif 000003
【００７１】
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基は、米国特許第５，０７９，３５２号に列挙された通りである。テルモトーガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基は米国特許第５，３７４，５５３号に列挙された通りである。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を低下させる標的になりうる、他のアミノ酸の例
2004502443.tif 000004
【００７２】
肺炎球菌、Ｔ．フラバス（Ｔ． ｆｌａｖｕｓ）、Ｄ．ラジオデュランス（Ｄ． ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．カルドテナクス（Ｂ． ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）と同等のもの（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）は、ガットマン（Ｇｕｔｍａｎ）およびミントン（Ｍｉｎｔｏｎ）（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１：４４０６〜４４０７（１９９３））から入手した。Ｔ．テルモフィラス（Ｔ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の座標は国際公開公報第９２／０６２００号から入手した。
【００７３】
ジデオキシヌクレオチドなどの非天然型ヌクレオチドに対する識別性を持たないような、ポリメラーゼ変異体を作製することもできる（米国特許第５，６１４，３６５号）。ポリメラーゼを非識別性とするために、Ｏ−ヘリックスの内部に他の点変異、欠失および挿入などの変化を加えることができる。例えば、この特性を有するＴｎｅ ＤＮＡポリメラーゼの一種では、Ｏ−ヘリックス内のＰｈｅ７３０がＴｙｒなどの天然でないアミノ酸によって置換されている。
【００７４】
一般に、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性、識別活性および忠実度は、異なる特性を一般に有するアミノ酸の置換によって影響を受ける。例えば、Ａｓｐなどの酸性アミノ酸を塩基性、中性または極性非荷電アミノ酸残基、例えばＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ（塩基性）；Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ（中性）；またはＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、ＡｓｎもしくはＧｌｎ（極性非荷電）に変化させてもよい。ＧｌｕをＡｓｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ 、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、ＡｓｎまたはＧｌｎに変化させてもよい。
【００７５】
コード性ＤＮＡ分子に沿った任意の規定された部位に、すべての可能な種類の塩基対変化を生じさせることが可能な変異型ポリメラーゼを作製するためには、オリゴヌクレオチド指定変異誘発法を用いることが好ましい。一般に、この技法は、関心対象のＤＮＡポリメラーゼをコードする一本鎖ヌクレオチド配列に対して相補的な（１つまたは複数のミスマッチを除く）オリゴヌクレオチドをアニーリングさせることを含む。続いて、このミスマッチのあるオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼによって伸長させ、一方の鎖の配列に望ましい変化を含む二本鎖ＤＮＡ分子を生成させる。この配列の変化は、当然ながら、アミノ酸の欠失、置換または挿入を引き起こす。続いて、この二本鎖ポリヌクレオチドを適切な発現ベクター中に挿入し、変異型ポリペプチドを産生させることができる。上記のオリゴヌクレオチド指定変異誘発法は、当然ながら、ＰＣＲによって行うことができる。【００７６】
５．ポリメラーゼの発現の増強
本発明のポリメラーゼの発現を最適化するためには、誘導性または構成性のプロモーターが周知であり、組換え宿主においてポリメラーゼ構造遺伝子を高レベルに発現させるために用いることができる。同様に、高い発現レベルを実現するために、当技術分野で周知の高コピー数ベクターを用いてもよい。誘導性の高コピー数を有するベクターは、組換え宿主における本発明のポリメラーゼの発現を増強するためにも有用と思われる。
【００７７】
原核細胞（大腸菌、枯草菌、シュードモナス菌など）内で望ましい構造遺伝子を発現させるためには、望ましい構造遺伝子を機能的な原核生物プロモーターと機能的に結合させることが必要である。しかし、ポリメラーゼ遺伝子の天然のプロモーターは、原核生物宿主内で作用してポリメラーゼ遺伝子を発現させる可能性がある。このため、ポリメラーゼ遺伝子を発現させるために天然プロモーターまたは他のプロモーターを用いてもよい。このような他のプロモーターは発現を増強させるために用いてもよく、構成性または調節性（すなわち、誘導性または抑制性）プロモーターのいずれでもよい。構成性プロモーターの例には、バクテリオファージλのｉｎｔプロモーター、およびｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーターが含まれる。誘導性原核生物プロモーターの例には、バクテリオファージλの主要な右側および左側プロモーター（ＰＲおよびＰＬ）、ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ｌａｄ、ｔｅｔ、ｇａｌ、ｔｒｃおよびｔａｃプロモーターが含まれる。枯草菌プロモーターには、α−アミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １６２：１７６〜１８２（１９８５））および桿菌バクテリオファージプロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ， Ｔ．、「桿菌の分子生物学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｉ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２））が含まれる。ストレプトミセス属プロモーターは、ワード（Ｗａｒｄ）ら、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２０３：４６８４７８（１９８６）に記載されている。原核生物プロモーターに関しては、グリック（Ｇｌｉｃｋ）、Ｊ． Ｉｎｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １：２７７〜２８２（１９８７）；セナティエンプト（Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｔｏ， Ｙ．）、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ６８：５０５〜５１６（１９８６）；およびゴッテスマン（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ）、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． １８：４１５〜４４２（１９８４）にも総説がある。原核細胞における発現のためには、遺伝子コード配列の上流にリボソーム結合部位の存在も必要である。このようなリボソーム結合 部位は、例えば、ゴールド（Ｇｏｌｄ）ら、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３５：３６５４０４（１９８１）に開示されている。
【００７８】
真核細胞における本発明のポリメラーゼの発現を増強させるために、周知の真核生物プロモーターおよび宿主を用いてもよい。しかし、ポリメラーゼの増強発現は原核生物宿主において行うことが好ましい。本酵素を過剰発現させるのに好ましい原核生物宿主は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
【００７９】
６．ポリメラーゼの単離および精製
本発明の酵素は、望ましいＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有および発現している、組換え宿主の発酵によって生産することが好ましい。しかし、本発明のＤＮＡポリメラーゼを、本発明のポリメラーゼを産生する任意の菌株から単離することもできる。ポリメラーゼの断片も本発明に含まれる。このような断片には、タンパク質分解による断片およびポリメラーゼ活性を有する断片が含まれる。
【００８０】
クローニングされたポリメラーゼ遺伝子を含む宿主によって同化されうる任意の栄養分を培地に添加してよい。最適な培養条件は、用いる菌株および培地の組成に応じて個別的に選択する必要がある。発現させようとする望ましい遺伝子を含むベクターＤＮＡが確実に維持されるように、増殖培地に抗生物質を加えてもよい。培地の配合は、ＤＳＭまたはＡＴＣＣのカタログおよびサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング、実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（第２版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）に記載されている。
【００８１】
本発明のポリメラーゼを産生する組換え宿主細胞は、例えば遠心分離により、液体培養物から分離することができる。一般には、収集した微生物細胞を適した緩衝液中に分散させた後に、緩衝液による酵素の抽出が可能となるように、超音波処理または他の周知の手順によって破壊する。超遠心または遠心分離によって細胞片を除去した後に、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などの標準的なタンパク質精製法により、ポリメラーゼを精製することができる。精製中にポリメラーゼの存在を検出するためのアッセイは当技術分野で周知であり、これらの酵素の存在を判定するために従来の生化学的な精製法の際に用いることができる。
【００８２】
７．ポリメラーゼの用途
本発明のポリメラーゼは、周知の核酸の合成、配列決定、標識、増幅およびｃＤＮＡ合成反応に用いうる。３’−５’−エキソヌクレアーゼ活性が上昇している、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性がない、もしくは実質的に低下しており、または酵素のｄＮＴＰおよびｄｄＮＴＰに対する識別性をなくす、１つもしくは複数の変異をＯ−ヘリックス内に含むか、または誤取り込みが減少したもしくは忠実度が高くなった酵素を生じる、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインの変異を含む、ポリメラーゼ変異体は、合成、配列決定、標識、増幅およびｃＤＮＡ合成のために特に有用である。さらに、これらの特性の２つまたはそれ以上を含む本発明のポリメラーゼも、合成、配列決定、標識、増幅またはｃＤＮＡ合成反応に特に有用である。よく知られているように、配列決定反応（等温ＤＮＡ配列決定およびＤＮＡのサイクル配列決定）には、ポリメラーゼを用いる必要がある。ジデオキシ法による配列決定は、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長のための特異的プライマー、塩基特異的連鎖ターミネーターを用いる連鎖停止法の使用、および、元のＤＮＡ分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部を決定できるように、新たに合成された連鎖停止後のＤＮＡ分子をサイズ別に分離するためのポリアクリルアミドゲルの使用を伴う。特に、ＤＮＡ分子の配列決定は、異なる塩基特異的ターミネーターをそれぞれが含む、４種の別々のＤＮＡ配列反応（または、蛍光ターミネーターを用いる場合には１つの反応）を用いることによって行われる。例えば、第１の反応物がＧ特異的ターミネーターを含み、第２の反応物がＴ特異的ターミネーターを含み、第３の反応物がＡ特異的ターミネーターを含み、第４の反応物がＣ特異的ターミネーターを含むことが考えられる。好ましいターミネーターヌクレオチドには、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰおよびｄｄＣＴＰなどのジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）が含まれる。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の類似体を用いてもよく、これらは当技術分野で周知である。
【００８３】
ＤＮＡ分子の配列決定を行う場合、ｄｄＮＴＰにはデオキシリボース塩基の３’位にヒドロキシル残基がなく、このため、それらは伸長するＤＮＡ鎖にＤＮＡポリメラーゼによって組み込まれても、３’ヒドロキシル残基がないために次のホスホジエステル結合の形成が妨げられ、その結果、ＤＮＡ分子の伸長が停止する。したがって、配列決定用の反応混合物中に少量の１種類のｄｄＮＴＰを含めると、連鎖の伸長と塩基特異的停止との競合が起こり、配列決定を行おうとするＤＮＡテンプレートよりも長さが短い合成ＤＮＡ分子の集団が生じる。４種の異なるｄｄＮＴＰを４つの別々の酵素反応に用いることにより、元のＤＮＡ分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部を決定できるように合成ＤＮＡ分子の集団をサイズ別に分離することができる。ジデオキシ−ヌクレオチドによるＤＮＡ配列決定は周知であり、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング、実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）に記載されている。容易に認識されるであろうが、本発明のポリメラーゼを、このような配列決定反応に用いてもよい。
【００８４】
よく知られているように、配列決定反応には一般に、検出可能な標識がなされたヌクレオチドが含まれる。放射性同位体、蛍光性標識、化学発光性標識、生物発光性標識および酵素標識を非制限的に含むさまざまな標識ヌクレオチドを、配列決定（または標識）反応に用いることができる。例えば、本発明のポリメラーゼは、配列決定（または標識）反応時にαＳヌクレオチド（［αＳ］ｄＡＴＰ、［αＳ］ｄＴＴＰ、［αＳ］ｄＣＴＰおよび［αＳ］ｄＧＴＰ）を取り込ませるために有用と思われる。
【００８５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は周知のＤＮＡ増幅法であり、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸を用いて標的ＤＮＡテンプレートを増幅する工程である。この種のＰＣＲ反応では、増幅しようとするＤＮＡ分子の第１鎖の３’末端（または３’末端の近傍）に対して相補的な１つのプライマー、および増幅しようとするＤＮＡ分子の第２鎖の３’末端（または３’末端の近傍）に対して相補的な第２のプライマーという２つのプライマーを、それぞれのＤＮＡ鎖とハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの後に、デオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下で、ＤＮＡポリメラーゼにより、増幅しようとするＤＮＡ分子の第１鎖の全体または一部に対して相補的な第３のＤＮＡ分子、および第２鎖の全体または一部に対して相補的な第４のＤＮＡ分子を合成させる。この合成により、２つの二本鎖ＤＮＡ分子が生じる。続いて、このような二本鎖ＤＮＡ分子は、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸を提供することにより、別のＤＮＡ分子の合成のためのＤＮＡテンプレートとして役立つ。よく知られているように、追加的な合成は最初の反応の「サイクリング」によって（過剰なプライマーおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸を用いる）、変性および合成の段階を多数行うことによって行われる。一般に、一本鎖ＤＮＡテンプレートを形成させるための二本鎖ＤＮＡ分子の変性は高温で行われる。本発明のＤＮＡポリメラーゼは熱安定性のあるＤＮＡポリメラーゼであることが好ましく、このため、ＤＮＡ増幅反応時のこのような熱サイクリングにも耐えると考えられる。このように、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ反応のために、特に増幅時にＤＮＡ分子を変性させるために高温を用いる場合に、理想的に適している。
【００８６】
８．キット
ＤＮＡの配列決定用のキットは、さまざまな容器手段を含みうる。第１の容器手段は、例えば、本発明のポリメラーゼの実質的に精製された試料を含む。第２の容器手段は、ＤＮＡテンプレートに対して相補的なＤＮＡ分子を合成するために必要な１つまたは複数の種類のヌクレオチドを含みうる。第３の容器手段は、１つまたは複数の異なる種類のターミネーター（ジデオキシヌクレオシド三リン酸など）を含みうる。第４の容器手段は、ピロフォスターゼを含みうる。以上の容器手段に加えて、１つまたは複数のプライマーおよび／または適した配列決定緩衝液を含む別の容器手段をキットに含めてもよい。
【００８７】
核酸の増幅または合成のために用いられるキットは、例えば、実質的に純粋な本発明のポリメラーゼを含む第１の容器手段、および一種類のヌクレオチドまたはヌクレオチドの混合物を含む１つまたは複数の追加的な容器手段を含むと考えられる。キットには、適した増幅用または合成用の緩衝液に加えて、種々のプライマーを含めてもよい。
【００８８】
必要に応じて、本発明のキットに、核酸分子の合成または配列決定の際に用いうる検出可能な標識がなされたヌクレオチドを含む容器手段を含めてもよい。複数の標識のうち１つはこのようなヌクレオチドを検出するために用いてよい。標識の例には、放射性同位体、蛍光性標識、化学発光性標識、生物発光性標識および酵素標識が非制限的に含まれる。
【００８９】
本発明の一般的な説明を行ってきたが、これは以下の実施例を参照することによってさらに容易に理解されると考えられる。これらは例示のために提供するものであり、別に特記する場合を除き、本発明を制限することを意図したものではない。
【００９０】
実施例１
ハイブリッド型Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの構築
Ｔａｑポリメラーゼの３つのドメインはすべて、キム（Ｋｉｍ）らにより、結晶構造を元に記載されている（Ｎａｔｕｒｅ ３７６：６１２〜６１６（１９９５））。活性のある５’−３’エキソヌクレアーゼドメインは１〜２８９アミノ酸に位置し、活性のない３’−５’エキソヌクレアーゼドメインは２９４〜４２２アミノ酸に、活性のあるポリメラーゼドメインは４２４〜８３１アミノ酸に位置する。ＴａｑおよびＴｎｅ ＤＮＡポリメラーゼの間のアミノ酸アライメントにより、本発明者らは、Ｔｎｅポリメラーゼに関する対応領域は以下の通りであると推定した：１〜２９１アミノ酸（５’−３’−エキソヌクレアーゼ）、２９２〜４８５アミノ酸（３’−５’−エキソヌクレアーゼ）および４８６〜８９３アミノ酸（ポリメラーゼ）。第１に、本発明者らは、Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’−エキソヌクレアーゼドメインをＴａｑポリメラーゼの５’−３’−エキソヌクレアーゼドメインによって置換しようと考えた。Ｔｎｅポリメラーゼの５’−３−エキソヌクレアーゼドメイン内には好都合なＢｓｒＧＩがあったため （アミノ酸２０４〜２０６）、本発明者らはこの部位をドメイン交換のために利用した。Ｔａｑポリメラーゼの５’−３’−エキソヌクレアーゼドメインは以下のオリゴを用いて増幅した：
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【００９１】
オリゴ＃１はＳｓｔＩ（太い下線を付した）およびＮｄｅＩ（太字のイタリック体）という２つの制限部位を含み、オリゴ＃２はＰＣＲ断片のクローニングが容易になるＢｓｒＧＩ部位を含む。増幅にはＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を用い、各プライマーの濃度は１μＭとした。９４℃ ２分間（１サイクル）、９４℃ １５秒間、５５℃ １５秒間、７２℃ ４５秒間（１５サイクル）；７２℃ ２分間（１サイクル）というＰＣＲプログラムを、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）社のサーマルサイクラーにて用いた。ＰＣＲ産物をＳｓｔＩおよびＢｓｒＧＩで消化し、ｐＴＴＱＴｎｅ（ＰＴＴＱ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中にクローニングした。このプラスミドをｐＴｎｅ７９と命名した。このプラスミドは３’−５’−エキソヌクレアーゼ活性を失活させる変異を含む。３’−５’−エキソヌクレアーゼ活性を回復させるために、ｐＴｎｅ７９のＢｓｒＧＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、野生型Ｔｎｅポリメラーゼ遺伝子由来の同一の断片によって置換した。このプラスミドをｐＴｎｅ８０と呼んだ。このクローンは、Ｔａｑポリメラーゼの５’−３’−エキソヌクレアーゼドメイン、ならびにＴｎｅポリメラーゼ由来の活性のある３’−５’エキソヌクレアーゼドメインおよびポリメラーゼドメインを含む。ｐＴｎｅ８０由来のポリメラーゼドメインを置換するために、本発明者らはＴｎｅポリメラーゼのアミノ酸５１５〜８９３をＴａｑポリメラーゼアミノ酸４５４〜８３１によって置換した。Ｔａｑポリメラーゼドメインは以下のオリゴを用いて増幅した：
2004502443.tif 000006
【００９２】
ＰＣＲ産物のクローニングによってｐＴｎｅ８０のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎＤＩＩＩ断片を置換しうるように、オリゴ＃３にＥｃｏＲＩ部位を作製し、オリゴ＃４にはＨｉｎｄＩＩＩ部位を作製した。Ｔｎｅポリメラーゼドメインには２つのＥｃｏＲＩ部位がある（それぞれアミノ酸５１６〜５１７および６２１〜６２２内）。ＨｉｎｄＩＩＩ部位はポリメラーゼ遺伝子の外側にあり、ベクター中に存在する。ＰＣＲは上記の通りに行った。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＴｎｅ ８０中にクローニングした。このプラスミドをｐＴｎｅ８６と呼んだ。これはＴａｑポリメラーゼ由来の５’−３’−エキソヌクレアーゼドメインおよびポリメラーゼドメイン、ならびにＴｎｅポリメラーゼ由来の３’−５’−エキソヌクレアーゼドメインを含む。オリゴ＃３には、ＴａｑポリメラーゼにおけるＡＧＧ（アミノ酸４５７）の代わりにアルギニンとなるＣＧＧを用いた。本構築物において、ポリメラーゼドメインの接合部はβ−シート６とヘリックスＨとの間にある。もう１つのハイブリッドも異なる位置に作製した（実施例４参照）。
【００９３】
３’−５’−エキソヌクレアーゼドメインおよびポリメラーゼドメインの接合部の配列は以下の通りである：
2004502443.tif 000007
【００９４】
太字イタリック体の配列はＴａｑポリメラーゼに由来し、他のものはＴｎｅポリメラーゼに由来する。数字はそれぞれのポリメラーゼのアミノ酸番号に対応する。
【００９５】
実施例２
ハイブリッドのポリメラーゼ活性に関する予備的スクリーニング
以下の通りに構築物を耐熱性ポリメラーゼ活性に関してアッセイした：アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むサークルグロー（ＣＧ）培地中にて培養物を３０℃で一晩培養した（２ｍｌ）。４０ｍｌのＣＧ＋Ａｍｐ１００に対して、一晩培養したもの１ｍｌを添加し、Ｏ．Ｄが約１．０（Ａ５９０）に到達するまで培養物を３７℃で増殖させた。この培養物を２０ｍｌずつの２つのアリコートに分け、第１のアリコート（非誘導）は３７℃に保った。もう一方のアリコートには、ＩＰＴＧを最終濃度が２ｍＭになるように添加し、培養物を３７℃でインキュベートした。３時間後に培養物を卓上遠心機により４℃、３５００ｒｐｍで２０分間遠心した。上清を廃棄し、細胞ペレットを−７０℃で保存した。細胞ペレットを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０、１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、１０ｍＭβ−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）を含む緩衝液中に懸濁した。細胞懸濁液（５００μｌ）を水浴中で７４℃に２０分間加熱した。チューブを氷上に１０分間置いた後、４℃、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心した。この清澄な上清を７２℃でのポリメラーゼ活性のアッセイのために採取した。ポリメラーゼ活性アッセイ用の反応混合物は、２５ｍＭ ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ ９．３）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、５００μｇ／ｍｌ ＤＮアーゼＩ処理サケ精子ＤＮＡ、２１ｍＣｉ／ｍｌ α３２ＰｄＣＴＰ、および各実施例に明記した種々の量の酵素を最終容積２５μｌ中に含む。７２℃で１０分間インキュベートした後、５μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡをチューブに添加した。２５μｌの反応混合物を用いてＧＦ／ＣフィルターにおけるＴＣＡ沈殿カウント（ＴＣＡ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｂｌｅ ｃｏｕｎｔ）を測定した。
【００９６】
実施例３
ｐＴｎｅ８６からのハイブリッド型ポリメラーゼの精製
細胞をサークルグロー（Ｃｉｒｃｌｅ Ｇｒｏｗ）培地（Ｂｉｏ １０１、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中にて３０℃で増殖させ、１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導を加えた。クローニングした変異型Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼを発現する細胞２〜３グラムを１５〜２０ｍｌの超音波処理用緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、１０％グリセロール、５ｍＭ β−Ｍｅ、５０ＭＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５ｍＭ ＰＭＳＦ）中に再懸濁し、５５０型ソニックディスメンブレーター （５５０ Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ）により超音波処理を行った。超音波処理を行った試料を７５℃に３０分間加熱した。塩化ナトリウム溶液を試料に添加して濃度を２００ｍＭに増大させ、５％ＰＥＩ（ポリエチルイミン）溶液を最終濃度０．２％となるように滴下した。この試料を１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。硫酸アンモニウム（３０５ｍｇ／ｍｌ）を上清に添加した。ペレットを遠心処理によって採取し、５ｍｌのＭｏｎｏＱカラム用緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０％グリセロール、５ｍＭ β−ＭＥ、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁した。試料を２５０ｍｌのＭｏｎｏＱ緩衝液に対して一晩透析した。不溶性物質を除去するために試料を１３，０００ｒｐｍで遠心した後に、ＭｏｎｏＱカラム（ＨＲ５／５、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に載せた。Ａ２８０がベースラインになるまでカラムをＭｏｎｏＱカラム用緩衝液で洗浄し、続いてカラム２０倍量の５０〜３００ｍＭ ＮａＣｌ（ＭｏｎｏＱカラム用緩衝液中）の直線勾配により、溶出させた。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、上記の通りに耐熱性ポリメラーゼ活性に関してアッセイした。
【００９７】
実施例４
ポリメラーゼドメインの新たな接合部からのハイブリッド型Ｔａｑポリメラーゼ
この場合には、接合部をヘリックスＦとヘリックスＧとの間に作製する。２つのドメインを連結するためにＣｌａＩ部位を作製する。ＰＣＲ用のオリゴは以下の通りとした：
2004502443.tif 000008
【００９８】
このオリゴはＴｎｅ ３’−５’−エキソヌクレアーゼドメインのアミノ末端とアニーリングする。
2004502443.tif 000009
【００９９】
このオリゴはＴｎｅ ３’エキソドメインのカルボキシル末端とアニーリングする。
2004502443.tif 000010
【０１００】
このオリゴはＴａｑポリメラーゼドメインのアミノ末端とアニーリングする。
【０１０１】
オリゴの中の制限酵素部位は太字イタリック体としている。オリゴ＃５はＢｓｒＧＩ部位を含み、オリゴ＃６および＃７はＣｌａＩ部位を含む。ＰＣＲスーパーミックス（ＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）を増幅に用い、各プライマーの濃度は１μＭとした。９４℃ ２分間；９４℃ １５秒間、５５℃ １５秒間、７２℃ ４５秒間（１５回）；７２℃ ２分間というＰＣＲプログラムを、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）社（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のサーマルサイクラーにて用いた。Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をテンプレートとして用いるオリゴ＃５および＃６による増幅では８５０ｂｐの産物が得られ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をテンプレートとして用いるオリゴ＃７および＃４による増幅では、１３００ｂｐのＰＣＲ産物が得られる。これらをそれぞれ、制限酵素ＢｓｒＧＩ／ＣｌａＩおよびＣｌａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ベクターｐＴｎｅ８６をＢｓｒＧＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、３つの断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。クローンを制限酵素分析によって分析した。このクローンはｐＴｎｅ１７３と命名され、上記の活性型ポリメラーゼを産生する。
【０１０２】
３’−５’−エキソヌクレアーゼドメイン接合部の配列はｐＴｎｅ８６と類似している。ポリメラーゼ接合部の配列は以下の通りである：
2004502443.tif 000011
【０１０３】
本発明者らは、３’−５’−エキソヌクレアーゼ接合部のｐＴｎｅ８６との類似性を保ちながらポリメラーゼドメインを異なる接合部をする類似の技法を用いて他のハイブリッドも作製した。いくつかの構築物のポリメラーゼ接合部の配列は以下の通りである：
2004502443.tif 000012
【０１０４】
ｐＴｎｅ８７およびｐＴｎｅ９０は上記のアッセイによる活性型ポリメラーゼを産生する。
【０１０５】
実施例５
ハイブリッド型Ｔａｑポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性アッセイ
ｐＴｎｅ８６から精製したハイブリッド型ポリメラーゼを触媒活性に関して詳細に検討した。組換えポリメラーゼの編集機能（３’−５’エキソヌクレアーゼ活性）は、プライマーの３’末端に４つのミスマッチ塩基対がある３６／６０量体プライマー／テンプレートである二本鎖ＤＮＡを用いて定量的に測定した。野生型Ｔａｑポリメラーゼおよびキメラ酵素の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は６０℃でアッセイした。対照として、２つのＴｎｅポリメラーゼ変異体の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性もアッセイした。第１の変異型誘導体はＤ１３７Ａの変異のために５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠き、第２のものはそれぞれＤ３２３ＡおよびＤ１３７Ａでの二重置換のために、３’−５’および５’−３’エキソヌクレアーゼ活性がいずれもない。
【０１０６】
４塩基のミスマッチがある以下のＤＮＡ基質をアッセイに用いた：
2004502443.tif 000013
【０１０７】
ＭｇＣｌ２の存在下でポリメラーゼを添加することにより、プライマー鎖の３’末端の分解を開始させた。反応混合物は約２０ｎＭのＤＮＡを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．４、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２および５０ｍＭ ＫＣｌ中に含む。前定常状態条件下でホスホジエステル結合の切断を触媒するように、ポリメラーゼはＤＮＡ基質に対して大過剰量とした。ポリメラーゼの添加から２０秒後、１分後および２分後に１．５μｌの試料を採取し、ホルムアミド、ＥＤＴＡ、ＳＤＳ、ブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノールＦＦを含む停止液３μｌと混合することによって反応を停止させた。最後に試料を変性８％ポリアクリルアミドゲルにより分画した。
【０１０８】
ＤＮＡ基質の調製
オリゴヌクレオチド（プライマー鎖およびテンプレート鎖）は、インビトロジェン社ライフテクノロジー部門（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）のカスタムプライマー（Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ）を利用して注文した。プライマー鎖はＨＰＬＣ精製し、テンプレート鎖はＰＡＧＥで精製した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてプライマーを５’標識し、テンプレートとアニーリングさせた。
【０１０９】
結果
キメラ型ポリメラーゼは、本発明者らの実験条件下で、Ｔｎｅポリメラーゼと同程度の効率でミスマッチ塩基を分解する（図１）。予想された通り、野生型ＴａｑおよびＴｎｅ（３’−５’エキソヌクレアーゼを欠く変異型）ポリメラーゼはプライマーの切断を触媒しなかった。この結果はキメラ型ポリメラーゼが酵素活性を持つことを示しており、Ｔａｑポリメラーゼがミスマッチを編集しうることを示唆する。
【０１１０】
実施例６
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の定量アッセイ
野生型Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ（５’−ｅｘｏ−、３’−５’−ｅｘｏ＋）およびＴａｑ／Ｔｎｅハイブリッド型ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を、３’標識二本鎖ＤＮＡを用いて測定した。用いた基質はＴａｑＩ制限酵素で消化し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩの存在下で３ＨｄＧＴＰおよび３ＨｄＣＴＰにより３’末端を標識したλＤＮＡ断片とした。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を、約２．５単位の種々のポリメラーゼとともに含む５０μｌの反応物に対して、１ｐｍｏｌの基質を用いた。野生型Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの場合には、約２１単位も含めた。反応物を７２℃で１時間インキュベートした。チューブを氷上に置き、１０μｌの各反応物をＰＥＩプレート上に滴下した。薄層クロマトグラフィーを２Ｎ ＨＣｌ中で行った。末端標識の遊離を液体シンチレーションによって測定した。
【０１１１】
結果
予想された通り、２．６単位または２１単位の酵素を用いた場合、Ｔｎｅポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ変異体および野生型Ｔａｑポリメラーゼによって遊離した、標識ヌクレオチドの量は、無視しうる程度であった（表２）。しかし、３’−５’−エキソヌクレアーゼ活性の高いＴｎｅポリメラーゼおよびＴａｑ／Ｔｎｅハイブリッド型ＤＮＡポリメラーゼ（またはｐＴｎｅ８６から産生されるＴａｑハイブリッド）は、ほぼ等量の標識ヌクレオチドを遊離させた。ハイブリッド型ポリメラーゼではＴｎｅポリメラーゼの完全な３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が回復していることが明らかである。ハイブリッド型ポリメラーゼにおける３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の上昇は野生型Ｔａｑポリメラーゼの４０倍と推定された。
【０１１２】
【表２】３’二本鎖ＤＮＡ基質に対するエキソヌクレアーゼアッセイ
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【０１１３】
実施例７
ポリメラーゼ／エキソヌクレアーゼ共役活性の測定
本発明者らは、ハイブリッド型ポリメラーゼがミスマッチプライマー末端を分解すると同時に、相補的テンプレートとアニーリングしたプライマーを伸長させる能力を調べるための実験を設計した。エキソヌクレアーゼにより導かれるプライマーの分解に引き続いて起こる重合反応を、上記とほぼ同じ条件下で上記のＤＮＡ基質を用いてアッセイした。異なる点は、プライマーを伸長させるためにこの反応混合物にはｄＮＴＰが存在することである。ｄＮＴＰの最終濃度は２５０μＭとした。
【０１１４】
結果
キメラ型ポリメラーゼは、本発明者らの実験条件下では、Ｔｎｅポリメラーゼとほぼ同様の効率でプライマー３’末端のミスマッチ塩基を分解し、それを伸長させる（図２）。予想された通り、野生型Ｔａｑ（３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く）およびＴｎｅ（３’−５’エキソヌクレアーゼを欠く変異型）ポリメラーゼはプライマーの３’末端を切断しなかった。この結果もキメラ型ポリメラーゼが酵素活性を持つことを示しており、正しくフォールディングが行われたことを示唆する。
【０１１５】
実施例８
定常状態Ｋｃａｔの測定
キメラ型ＤＮＡポリメラーゼの定常状態Ｋｃａｔを、ポレスキー（Ｐｏｌｅｓｋｙ）ら、１９９０年の記載の通りに６０℃で測定した。（ｄＧ）３５が約１に対してテンプレートＧ残基が１００のモル比で（ｄＧ）３５をポリ（ｄＣ）とアニーリングさせることによってＤＮＡ基質を調製した。速度を測定したＤＮＡおよびｄＮＴＰの濃度は、それぞれ２．５μＭおよび２５０μＭ ｄＮＴＰであった。
【０１１６】
結果
キメラ型ＤＮＡポリメラーゼのｄＧＴＰ取り込みに関する定常状態ｋ（ｃａｔ）は約２５／秒である。この結果はＴｎｅおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼから得られる値と同じであり、キメラＤＮＡポリメラーゼが親タンパク質の本来の構造と同様にフォールディングしたことを示唆する。
【０１１７】
理解を容易にする目的で、本発明を例示および実施例によってある程度詳細に説明してきたが、本発明の範囲またはその何らかの特定の態様に影響を及ぼさずに、幅広い等価な条件、配合および他のパラメーターの範囲内で、本発明を修正または変更することによって同じことを行えることは当業者には明らかであると考えられ、このような修正または変更は添付する特許請求の範囲に含まれることを意図している。
【０１１８】
本明細書で言及したすべての刊行物および特許出願は、本発明が属する当業者のレベルを示すものであり、すべての刊行物および特許出願は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が参照として組み込まれるように特定的および個別に示されている場合と同程度に、参照として本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】３６／６４量体プライマー−テンプレート基質を用いて６０℃で定量的に評価した、Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ、およびプライマー鎖の３’末端に４塩基のミスマッチがある変異型誘導体の、相対的３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示すゲルを図示したものである。ＴｎｅＡは、Ｄ１３７ＡおよびＤ３２３Ａを有するＴｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ変異体（５’−３’エキソヌクレアーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く）を表す；ＴｎｅＢは、Ｄ１３７Ａを有し、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ変異体を表す；Ｃｈｉは以下に述べるＴａｑ／Ｔｎｅキメラ型ＤＮＡポリメラーゼを表し、Ｔａｑは野生型Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼである。各図の３つのレーンは、左から右の順に、反応を停止させる２０秒前、１分前および２分前である。Ｐはプライマーの位置を表し、Ｃ（２つのレーン）は反応混合物に酵素を添加しなかった対照である。
【図２】３６／６４量体プライマー−テンプレート基質を用いて６０℃で定量的に評価した、Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ、およびプライマー鎖の３’末端に４塩基のミスマッチがある変異型誘導体が、プライマー末端からのミスマッチを分解してｄＮＴＰを取り込む能力を示したグラフを図示したものである。ＴｎｅＡは、Ｄ１３７ＡおよびＤ３２３Ａを有し、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ変異体を表す；ＴｎｅＢは、Ｄ１３７Ａを有し、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ変異体を表す；Ｔａｑは野生型Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼであり、Ｃｈｉは以下に述べるＴｎｅ−Ｔａｑキメラ型ＤＮＡポリメラーゼを表す。各図の４つのレーンは、左から右の順に、反応を停止させる２０秒前、１分前、２分前および５分前である。Ｐはプライマーの位置を表し、Ｃ（２つのレーン）は反応混合物に酵素を添加しなかった対照である。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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