(57)【要約】本発明は、ＡＢＣＡ７遺伝子の転写を調節することができる核酸に関し、当該核酸は、脂質代謝および／または免疫系および炎症を含むプロセスに介在することができるキャリアータンパク質をコードする。加えて、第１９染色体のｑ１３における遺伝子の位置により、ＡＢＣＡ７は、上記遺伝子座に遺伝的に関連する他の病状に関与する可能性がある。また、本発明は、ＡＢＣＡ７遺伝子を調節する核酸の制御下に置かれた、所定のポリペプチドまたは核酸をコードするポリヌクレオチドを含むヌクレオチド構成物に関する。さらに、本発明は、ＡＢＣＡ７遺伝子の転写を調節する核酸および／または前記ヌクレオチド構成物を含む、組換えベクター、形質転換された宿主細胞、および、非ヒトトランスジェニック哺乳動物に関し、および、ＡＢＣＡ７遺伝子を調節する核酸の活性をモジュレートすることができる分子または物質をスクリーニングする方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜５から選択されるヌクレオチド配列を有する少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含む核酸、または、相補配列を有する核酸。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸と少なくとも８０％のヌクレオチド同一性を有する核酸。
【請求項３】
高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、請求項１または２に記載の核酸とハイブリダイズする、核酸。
【請求項４】
制御下に置かれたポリヌクレオチドの転写をモジュレートすることができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５】
配列番号１で示されるヌクレオチドの１１１２位に位置する、転写された第一のヌクレオチドに対して−１位のヌクレオチド〜−１１１１位のヌクレオチドの範囲のポリヌクレオチドを含む、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
制御下に置かれた所定のポリヌクレオチドの転写を活性化することができる、請求項４に記載の核酸。
【請求項７】
制御下に置かれた所定のポリヌクレオチドの転写を阻害することができる、請求項４に記載の核酸。
【請求項８】
ａ）請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸；および、
ｂ）所定のポリペプチドまたは核酸をコードするポリヌクレオチド、
を含む核酸。
【請求項９】
所定の核酸が、センスまたはアンチセンス型のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸を含む、組換えクローニングおよび／または発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸、または、請求項１０に記載の組換えベクターで形質転換された、宿主細胞。
【請求項１２】
体細胞および／または生殖細胞が、請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸、または、請求項１０に記載の組換えベクターで形質転換された、非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
【請求項１３】
請求項８に記載の核酸の構成的ポリヌクレオチドの転写をモジュレートする物質または分子をスクリーニングする方法であって、工程：
ａ）請求項１１に記載の形質転換された宿主細胞を培養すること；
ｂ）候補物質または分子の存在下で、形質転換された宿主細胞をインキュベートすること；
ｃ）所定のポリヌクレオチドの発現を検出すること；
ｄ）工程ｃ）で得られた検出結果と、前記候補分子または物質の非存在下で前記形質転換宿主細胞を培養することによって得られた検出結果とを比較すること、を含むことを特徴とする、上記方法。
【請求項１４】
請求項８に記載の核酸の構成的ポリヌクレオチドがコードする所定のポリペプチドの転写をモジュレートする候補分子または物質をインビトロでスクリーニングするキットまたはボックスであって、
ａ）請求項１１に記載の形質転換された宿主細胞；
ｂ）必要に応じて、請求項８に記載の核酸の所定の構成的ポリヌクレオチドの転写の検出に必要な手段、
を含む、上記キットまたはボックス。
【請求項１５】
請求項８に記載の核酸の所定の構成的ポリヌクレオチドの転写をモジュレートする物質または分子をインビボでスクリーニングする方法であって、工程：
ａ）請求項１２に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物に、候補物質または分子を投与すること；
ｂ）工程ａ）で処理されたトランスジェニック哺乳動物中で、所定のポリヌクレオチドの発現を検出すること；
ｃ）工程ｂ）の検出結果と、候補物質または分子が投与されていない請求項１２に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物で得られた結果とを比較すること、
を含むことを特徴とする、上記方法。
【請求項１６】
請求項８に記載の核酸の所定の構成的ポリヌクレオチドの転写をモジュレートする候補分子または物質をインビボでスクリーニングするキットまたはボックスであって、
ａ）請求項１２に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物；
ｂ）必要に応じて、上記所定のポリヌクレオチドの転写の検出に必要な手段、
を含む、上記キットまたはボックス。
【請求項１７】
請求項８に記載の核酸の所定の構成的ポリヌクレオチドの転写をモジュレートする、物質または分子。
【請求項１８】
請求項１３または請求項１５の方法に従って選択されることを特徴とする、請求項１７に記載の物質または分子。
【請求項１９】
請求項１７または１８に記載の物質または分子を活性成分として含む、医薬組成物。
【請求項２０】
脂質代謝の欠陥、または、免疫系および炎症を含むメカニズムの欠陥の治療および／または予防を目的とすることを特徴とする、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
医薬品の活性成分としての、請求項１７または１８に記載の物質または分子。
【請求項２２】
工程：
ａ）試験される被験者から得られる生体物質から、トータルメッセンジャーＲＮＡを抽出すること；
ｂ）上記生体物質に存在するＡＢＣＡ７に関するメッセンジャーＲＮＡを定量すること；
ｃ）工程ｂ）で得られたＡＢＣＡ７に関するメッセンジャーＲＮＡの量と、正常な被験者から抽出されたＡＢＣＡ７に関するメッセンジャーＲＮＡの量とを比較すること、
を含む、被験者のＡＢＣＡ７遺伝子転写の欠陥を検出する方法。
【請求項２３】
工程：
ａ）試験される被験者から得られる生体物質から、ＡＢＣＡ７遺伝子の転写開始部位の上流に位置するポリヌクレオチドを配列解析すること；
ｂ）ａ）で得られたヌクレオチド配列と、配列番号１とを並べること；
ｃ）試験される被験者の生体物質から得られた配列解析されたポリヌクレオチドと、参照の配列番号１との間の様々なヌクレオチドを決定すること、
を含む、被験者のＡＢＣＡ７遺伝子転写の欠陥を検出する方法。
【請求項２４】
試験される被験者から得られる生体物質において、ＡＢＣＡ７に関するメッセンジャーＲＮＡを定量するのに必要な手段を含む、被験者のＡＢＣＡ７遺伝子転写の欠陥を検出するためのキットまたはボックス。
【請求項２５】
試験される被験者のＡＢＣＡ７遺伝子の転写開始部位の上流に位置するポリヌクレオチドを配列解析するのに必要な手段を含む、被験者のＡＢＣＡ７遺伝子転写の欠陥を検出するためのキットまたはボックス。
【請求項２６】
請求項８に記載の核酸の所定の構成的ポリヌクレオチドの転写をモジュレートする分子または物質をスクリーニングする方法であって、工程：
ａ）請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸または請求項１０に記載の組換えベクターを、試験される候補分子または物質と共にインキュベートすること；
ｂ）候補分子または物質と、候補分子または物質とで形成される複合体を検出すること、
を含む、上記方法。
【請求項２７】
請求項８に記載の核酸の所定の構成的ポリヌクレオチドの転写をモジュレートする候補分子または物質をスクリーニングするキットまたはボックスであって、
ａ）請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸または請求項１０に記載の組換えベクター；
ｂ）必要に応じて、上記候補分子または物質と上記核酸とで形成される複合体の検出に必要な手段、
を含む、上記キットまたはボックス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＡＢＣＡ７遺伝子転写を調節することができる核酸に関し、ここで、ＡＢＣＡ７遺伝子とは、造血組織の脂質代謝、同様に、免疫反応および炎症に関する細胞のシグナル伝達メカニズムに関与する遺伝子である。
また、本発明は、配列または発現の欠陥によって、第１９染色体の遺伝子座ｑｌ３に関連する病気に影響を与える可能性のあるポリペプチドおよびポリヌクレオチドを記述する。
【０００２】
また、本発明は、ヒトまたはマウスＡＢＣＡ７遺伝子を調節する核酸の制御下に置かれた、所定のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または、所定の核酸を生産するポリヌクレオチドを含むヌクレオチド構成物に関する。
また、本発明は、ヒトおよびマウスＡＢＣＡ７遺伝子または上述のヌクレオチド構成物の転写を調節する核酸を含む組換えベクター、形質転換宿主細胞、および非ヒトトランスジェニック哺乳動物に関し、同様に、ＡＢＣＡ７遺伝子を調節する核酸の活性をモジュレートすることができる分子または物質をスクリーニングする方法に関する。
【０００３】
加えて、本発明は、ＡＢＣＡ７遺伝子転写の欠陥を検出すること、それにより、造血組織レベルの脂質代謝、および、免疫性の細胞のシグナル伝達メカニズムにおいて可能性のある機能障害を診断することを可能にする方法に関する。
また、本発明の目的は、ＡＢＣＡ７遺伝子転写を調節する核酸の活性をモジュレートする物質または分子、同様に、このような物質または分子を含む医薬組成物である。
【０００４】
ＡＢＣ（ＡＴＰ結合カセット）輸送タンパク質は、細菌からヒトに至るまで進化中に非常によく保存されたスーパーファミリーを構成する。これらのタンパク質は、様々な物質（例えばイオン、アミノ酸、ペプチド、糖類、ビタミンまたはステロイドホルモン）の膜輸送に関与する（Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ， ８，（１９９２）６７−１１３）。
【０００５】
いくつかのＡＢＣ輸送体の完全なアミノ酸配列を特徴付けることによって、共通の一般構造を定義することができ、その構造は、特に、ウォーカーのＡおよびＢ型ユニットを含む２種のヌクレオチド結合フォールド（ＮＢＦ）、および、２種の膜貫通ドメイン（それぞれ６個のヘリックスからなる膜貫通ドメイン）からなる（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， ＢＢＡ， １４６１（１９９９）， ２３７−２６２）。様々な輸送された分子に対するＡＢＣ輸送体の特異性は、膜貫通ドメインの構造によって決定されるようだが、その一方で、輸送活性に必要なエネルギーは、ＮＢＦフォールドレベルでのＡＴＰ分解によって供給される（Ｄｅａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖ． ５（１９９５）７７９−７８５）。
【０００６】
数種のＡＢＣ輸送タンパク質がヒトで同定されており、その多くが様々な病気に関与している。
例えば、嚢胞性線維症は、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維性膜貫通調節因子）遺伝子の変異によって発症し、ＣＦＴＲ遺伝子はまた、ＡＢＣＣ７とも呼ばれており、その上、腫瘍細胞におけるいくつかの多剤耐性の表現型は、ＭＤＲ（多剤耐性）タンパク質をコードする遺伝子の変異に関連しており、ＭＤＲタンパク質はまた、ＡＢＣＢとも呼ばれており、これもＡＢＣ輸送体構造を有する。
他のＡＢＣ輸送体は、神経および腫瘍の状態に関連したものであり（米国特許第５，８５８，７１９号）、または、金属の恒常性の欠陥による病気に関与する可能性があり、特に、ＡＢＣ−３タンパク質が挙げられる。
同様に、他のＡＢＣ輸送体は、ＰＦＩＣ２またはＡＢＣＢ１１と呼ばれ、進行性の家族性肝内胆汁うっ滞の形成に関与するようであり、このタンパク質は、ヒトにおいて、胆汁酸塩の輸送に関与する可能性がある。
【０００７】
また、ＡＢＣＡと呼ばれるＡＢＣ輸送体のサブファミリーＡも同定されている。これは、２つのＮＢＦユニットに結合した２つの膜貫通ドメイン間に高い疎水性のセグメント（ＨＨ１：高い疎水性の）が存在することを特徴とする（Ｂｒｏｃｃａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．， ＢＢＡ １４６１（１９９９）３９５−４０４）。これまで、このサブファミリーのうち４つのメンバーが特徴付けられている。それらは、輸送体ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＡ２（いずれも第９染色体のそれぞれ遺伝子座９ｑ２２−９ｑ３１および９ｑ３４に位置している）、同様に、輸送体ＡＢＣＡ３（染色体の１６ｐｌ３．３に位置する）、最後に、輸送体ＡＢＣＡ４またはＡＢＣＲ（染色体の１ｐ２２に位置する）である（Ｂｒｏｃｃａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。また、このサブファミリーのメンバーは、多細胞真核生物の進化中で高く保存されている。一例として、最もよく知られた輸送体ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＡ４は、それらのマウスオーソログと、それぞれ９５％および８８％の同一性を示す。加えて、例えば輸送体ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＡ４は、５０．９％のタンパク質配列同一性、および、非常に似通ったゲノム構成を示すため、このサブファミリーのメンバーは、密接に関連している（Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．（１９９７）１５， ２３６−２４６；Ｂｒｏｃｃａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ（１９９９）１４６１， ３９５−４０４；Ｌｕｃｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（１９９４）２１（１）、１５０−９；Ｒｅｍａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９９９）９６（２２）、１２６８５−９０）。
【０００８】
その上、サブファミリーＡのメンバーは、膜脂質およびリン脂質の輸送のレベルで、類似した機能的特異性を示すようである。実際に、これら輸送体の機能が失われると、細胞膜の二分子層のリン脂質の再生に影響を及ぼすことが示されている。ＡＢＣＡ４の場合、まず、棒細胞中の膜部分のホスファチジル−エタノールアミン（ＰＥ）の正常な再生が観察され、それにより、一連の事象を経て失明に至る（Ｗｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ（１９９９）９８（１）、１３−２３）。ＡＢＣＡ１の場合、細胞質膜層における膜リン脂質の異常分布が観察され、それにより、より正確には、外層により大量のホスファチジルセリンが存在するようになり、Ｃａ２＋濃度を乱れさせる。
【０００９】
輸送体ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＡ４が特に研究されている。ＡＢＣＡ１遺伝子は、実際に、コレステロール代謝性機能障害に関する病状に関与するようであり、これらは、例えばアテローム性動脈硬化症、または、家族性ＨＤＬ欠損症（ＦＨＤ）（例えばタンジール病）のような病気を誘発させる（ＦＲ９９／７６８４０００；Ｒｕｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．， ２２（１９９９）３５２−３５５；Ｂｒｏｏｋｓ−Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．， ２２（１９９９）３３６−３４５；Ｂｏｄｚｉｏｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ２２（１９９９）３４７−３５１；Ｏｒｓｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ， ２４（２０００）１９２−１９６）。タンジール病は、細胞コレステロールの転位に関する細胞性の欠陥に関連するようであり、このような欠陥は、ＨＤＬ分解の原因となり、それによりリポタンパク質代謝が乱れる。すなわち、周辺の細胞からのコレステロールを取り込まないＨＤＬ粒子は正しく代謝されないが、これに反して、体外に迅速に排除されると考えられる。それゆえに、このような患者の血漿のＨＤＬ濃度は極端に減少し、もはやＨＤＬは、肝臓へのコレステロールの戻しを確実には行われない。このコレステロールは、その周辺の細胞に蓄積され、特徴的な臨床的症状の発現（例えばオレンジ色の口蓋扁桃の形成）を引き起こす。その上、例えばトリグリセリドの過剰生産、および、リン脂質の細胞内合成や異化の増加のような、他のリポタンパク質の乱れが観察される。
【００１０】
その上、ＡＢＣＡ４輸送体は、消耗性および炎症性の眼病に関連しており、例えば劣性のシュタルガルト病（Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ ｅｔ ａｌ．， １９９７）や、加齢による網膜黄斑の領域の分解（ＡＭＤ）がある（Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５（１９９７）２３６−２４６；Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７７（１９９７）１８０５−１８０７；Ｃｒｅｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．（１９９８）， ７（３）， ３５５−６２；Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｍｉｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １８（１９９８）１１−１２；Ｗｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ（１９９９）９８（１）， １３−２３）。
【００１１】
ヒトにおいて、近年、ＡＢＣ（ＡＴＰ結合カセット）輸送体のＡサブファミリーの新しいメンバーの、全オープンリーディングフレームを含むｃＤＮＡがヒトマクロファージＲＮＡからクローニングされており、ＡＢＣＡ７と呼ばれる（Ｋａｍｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， ＢＢＲ， ２７３（２０００）， ５３２−５３８）。
【００１２】
ＡＢＣＡ７の完全なアミノ酸配列の特徴付けによれば、タンパク質産物はＡＢＣＡ輸送体の一般構造特徴を有することが示されており、すなわち、２つの膜貫通ドメインと２つのＮＢＦユニットとを含む対称的な構造を有する。これらの特徴的なユニットに加えて、ＡＢＣＡ７タンパク質は、ＡＢＣＡ輸送体に特徴的であると近年認められた他のユニット、すなわち、ＨＨ１領域とホットスポット（ｈｏｔ ｓｐｏｔ）領域を有する（Ｂｒｏｃｃａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ（１９９９）１４６１， ３９５−４０４）。
【００１３】
ＡＢＣ輸送体のＡサブファミリーの他のメンバーのように、ＡＢＣＡ７タンパク質の配列は、マウスとヒトにおいて高く保存されており、種間の同一性は７９％である。その上、ＡＢＣＡ７タンパク質は、ＡＢＣＡサブファミリーメンバーのイントロン−エキソン構成の特徴を示し、同様に、高い配列相同性を示し、特に、ヒト輸送体のＡＢＣＡ１およびＡＢＣＡ４では、それぞれ５４％および４９％である。
【００１４】
その上、タンパク質輸送体ＡＢＣＡ７は、ステロールの流れに依存した調節の特性を示すようであり、Ａサブファミリーの他のメンバー、特にＡＢＣＡ１輸送体と類似している（Ｌａｎｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ＢＢＲ Ｃｏｍ；２５７（１９９９）， ２９−３３；Ｌａｕｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， ９７（２０００）８１７−８２２）。実際に、Ｋａｍｉｎｓｋｉ等（上述）が調査したところによれば、ステロール取り込みを誘発させるアセチル化した低密度リポタンパク質（ＡｃＬＤＬ）の存在下でヒトマクロファージをインキュベーションすると、ＡＢＣＡ７発現が増加すること、同様に、ステロール取り込み減少を引き起こすＨＤＬ３コレステロール受容体の存在下では発現が減少することがわかった。
【００１５】
その上、ＡＢＣＡ７は、他のＡＢＣＡメンバーのように、その組織発現に関してある程度の分化を示し、ＡＢＣＡ７メッセンジャーは、主に、リンパ球、顆粒球、胸腺、脾臓、骨髄または胎児組織からなる造血組織に存在し、それに対して、ＡＢＣＡ１の発現は、マクロファージと胎盤で優勢であり、ＡＢＣＡ４の発現は、網膜に限定される（Ｒｕｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ， ２２，（１９９９）３５２−３５５）。
【００１６】
タンパク質配列の同一性、調節メカニズム、および、発現の特異性に関する全ての上述したデータにより、ＡＢＣＡ７遺伝子はＡサブファミリーの他の輸送体を構成し、他の輸送体の機能、特に、ＡＢＣＡ１輸送体の機能に類似した、またはより豊富な機能を有する、ということが示される。
【００１７】
それゆえに、この輸送体は、おそらく脂質代謝のメディエイターとして作用する可能性があり、ＡＢＣＡ１輸送体と同じように、ある種の代謝性機能障害または欠損症に関与する可能性が大いにある。その上、ＡＢＣＡ７輸送体発現の分化（ｓｐｅｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、後者がＫａｍｉｎｓｋｉ等（上述）によって示されたように、おそらく、例えばアテローム性動脈硬化症の病因の場合において、造血組織での脂質の膜貫通輸送（輸出）の役割を有し、さらにリンパ球の免疫性シグナル伝達メカニズムにも役割を有する可能性があることを示す。
【００１８】
ヒトＡＢＣＡ７遺伝子の発現が、細胞型または特定の細胞型の代謝状態に従って調節されるようであるにもかかわらず、その配列がこの遺伝子を調節することを可能にしているかどうかは、わかっていない。
しかしながら、当業界の状況において、これら調節配列を同定することが以下の理由のため必要である。
【００１９】
ａ）これらの配列を、脂質や可能なＡＢＣＡ７タンパク質基質の輸送の欠陥に関する症状に罹った患者、または、このような病状を発症させている可能性のある患者に、変異させることができる。
ヒトＡＢＣＡ７遺伝子の調節配列の特徴付けは、患者の変異を検出することを可能にし、特に潜在的に危険なファミリー群に属する個体を診断することを可能にする。加えて、これら調節配列を分離すれば、目標の治療手段（例えば遺伝子治療を目的とした手段）の構成に基づき、診断された変異によって誘発される代謝性機能障害を補填できる機能的な配列を有する変異配列を補完することができる。
【００２０】
ｂ）ＡＢＣＡ７遺伝子の調節配列の特徴付けにより、当業者は、遺伝子工学により構築できる手段を利用することが可能になり、それにより、定義された遺伝子を、好ましくはＡＢＣＡ７遺伝子が発現される細胞型中で発現させることができる。
ｃ）その上、ＡＢＣＡ７遺伝子の調節配列のいくつかの部分は、発現が高レベルな構成的プロモーター配列を構築することができ、この配列は、細胞で、定義された配列の新規の発現手段を構築させ、既存のあらゆる手段を補うことができるタイプのものである。
【００２１】
しかしながら、今までなされた努力にもかかわらず、ＡＢＣＡ７遺伝子の調節配列は、これまでまったく未知のままであったことを特記しなければならない。
この度、発明者等は、３３．５ｋｂのヒトゲノムＤＮＡ（ＡＢＣＡ７遺伝子のオープンリーディングフレームの４６個のエキソンを含む）と、同様に、エキソン１の５′側で転写部位から＋１上流に位置し、ヒトＡＢＣＡ７遺伝子を調節するシグナルを含む約１．１ｋｂの非転写（ｎｏｎ転写された）領域とを単離し、続いて分析した。
【００２２】
また、発明者等は、ＡＢＣＡ７遺伝子のオープンリーディングフレームの４５個のエキソンを含む２０ｋｂのマウスゲノムＤＮＡと、同様に、エキソン１の５′側で転写部位から＋１上流に位置し、マウスＡＢＣＡ７遺伝子を調節するシグナルを含むマウスの約１．２ｋｂの非転写領域とを、単離し、続いて分析した。
【００２３】
全般的な定義
本発明の目的のための「単離された」という用語は、それ本来の環境（それが天然に存在する環境）から取り出された生体物質（核酸またはタンパク質）を示す。
例えば、植物または動物中に天然状態で存在するポリヌクレオチドは、単離されたとはいわない。
植物または動物のゲノムに天然に挿入されている同ポリヌクレオチドが、隣接する核酸から分離された場合、「単離された」ものとする。
このようなポリヌクレオチドは、ベクターに含ませることができ、および／または、このようなポリヌクレオチドは、組成物に含ませることもできるが、ベクターまたは組成物はその自然な環境を構成しないため、単離された状態のままである。
【００２４】
「精製された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」という用語において、物質は、他の化合物の存在が排除された完全に純粋な形態で存在する必要はない。当該用語は、むしろ相対的な定義である。
ポリヌクレオチドは、出発原料または天然物質を少なくとも１桁、好ましくは２または３桁、さらに好ましくは４または５桁の規模で精製した後、「精製された」状態である。
本発明を説明する目的において、「ヌクレオチド配列」という表現は、ポリヌクレオチドまたは核酸のいずれかを示すために用いることができる。
「ヌクレオチド配列」という表現は、遺伝物質そのものを含み、従って、その配列に関する情報に限定されない。
【００２５】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」という用語は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列、あるいは、２以上のヌクレオチドのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含み、一本鎖または二本鎖形態のいずれでもよい。
「ヌクレオチド」という用語は、天然のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）、および、改変ヌクレオチドの両方を示し、ここで改変ヌクレオチドとは、少なくとも１つの改変、例えば（１）プリン類似体、（２）ピリミジン類似体、または（３）類似の糖を含み、このような改変ヌクレオチドの例は、例えばＰＣＴ出願ＷＯ９５／０４０６４に記載される。
【００２６】
本発明の目的において、第一のポリヌクレオチドは、第二のポリヌクレオチドに「相補」的であるとみなされ、この場合、第一のヌクレオチドの各塩基は、方向が逆の第二のポリヌクレオチドの相補塩基と対になっている。相補塩基とは、ＡとＴ（またはＡとＵ）、もしくはＣとＧである。
【００２７】
本発明に係る核酸の「変異形」とは、参照のポリヌクレオチドに対して１またはそれ以上の塩基が異なる核酸を意味するものと理解される。変異形核酸は、天然由来、例えば天然に存在する対立遺伝子の変異形でもよく、または、例えば変異導入技術によって得られる非天然の変異形でもよい。
【００２８】
一般的に、参照の核酸と変異核酸との間の相違は、参照の核酸と変異核酸とのヌクレオチド配列が多くの領域で同一であるような低さで非常に類似しているものである。変異核酸に存在するヌクレオチドの改変は、サイレントでもよく、このサイレントとは、前記変異核酸でコードされたアミノ酸配列を変化させないことを意味する。
しかしながら、変異核酸中のヌクレオチドの変化はまた、参照の核酸がコードするペプチドに関する変異核酸がコードするポリペプチドに、置換、付加または欠失を生じさせる。加えて、このようなコーディング領域中のヌクレオチドの改変により、アミノ酸配列中に保存的または非保存的置換が生じる可能性がある。
【００２９】
好ましくは、本発明に係る変異核酸は、参照の核酸のポリペプチドと同じ機能または生物活性、あるいは、初めの核酸がコードするポリペプチドに対して向けられた抗体で認識される能力を実質的に保存したポリペプチドをコードする。
従って、いくつかの変異核酸は、ポリペプチドの変異形態をコードし、その系統的な研究により、問題のタンパク質の構造−活性関係を推測することを可能にする。研究されている病気に関するこれら変異体の知識は、病状の分子的な原因の理解を可能にするため、重要である。
【００３０】
「断片」は、本発明に係る参照の核酸、参照の核酸に比べて短い長さのヌクレオチド配列および共通部分にわたって参照の核酸と同一な共通部分を包含したヌクレオチド配列を意味するものと理解される。
本発明に係るこのような核酸の「断片」は、場合によってはそれを一つの構成要素とするより大きいポリヌクレオチドに含まれてもよい。
このような断片は、本発明に係る核酸のヌクレオチドが２０〜２５、３０、４０、５０、７０、８０、１００、２００、５００、１０００または１５００の連続した長さのオリゴヌクレオチドを含むか、あるいは、当該オリゴヌクレオチドからなる。
【００３１】
本発明に係る転写を調節する酸の「生物学的に活性な断片」は、その制御下に置かれたＤＮＡ配列の転写をモジュレートすることができる核酸を意味するものと理解される。このような生物学的に活性な断片は、本発明の説明で定義されたコアプロモーターおよび／または調節要素を含む。
本発明に係る「調節核酸」は、選択され、その制御下に置かれたＤＮＡ配列の発現を活性化および／または調節する核酸を意味するものと理解される。
【００３２】
「プロモーター」は、遺伝子の転写開始に関与する細胞のタンパク質により認識されるＤＮＡ配列を意味するものと理解される。コアプロモーターとは、その制御下に置かれた限定されたＤＮＡ配列の転写を開始させることができる最小限の調節核酸である。一般的に、コアプロモーターは、転写開始部位上流のゲノムＤＮＡ領域からなり、そこには、ＣＡＡＴ配列（そこで１またはそれ以上の転写タンパク質因子が結合する）が頻繁に存在し、同様に、いくつかのハウスキーピング遺伝子のようにまれな場合を除いて、ＴＡＴＡまたは「ＴＡＴＡボックス」配列または関連するボックスが存在する。ＲＮＡポリメラーゼ、同様に、１またはそれ以上の転写因子、例えば「ＴＡＴＡ」ボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）が結合するのは、このボックスレベルである。
【００３３】
ヌクレオチド配列は、調節核酸の「制御下に置かれ」ており、この場合、この調節核酸は、ヌクレオチド配列の転写開始をＲＮＡポリメラーゼにより制御するような様式でヌクレオチド配列と関連して配置される。
【００３４】
本発明の目的のための「調節要素」または「調節配列」は、コアプロモーターで開始される転写をモジュレートすることができる要素を含む核酸を意味するものと理解され、当該要素としては、例えば、様々な転写因子の結合部位、転写を増すための「エンハンサー」配列、または、転写を抑制するための「サイレンサー」配列がある。
「エンハンサー」配列は、コアプロモーターで開始される転写を増すか、または、刺激することができる調節核酸に含まれるＤＮＡ配列を意味するものと理解される。
【００３５】
「サイレンサー」配列は、コアプロモーターで開始される転写を減少させるか、または、抑制することができる調節核酸に含まれるＤＮＡ配列を意味するものと理解される。
調節要素は、転写開始部位の５′側に位置する配列の外側に存在してよく、例えば、コーディング配列に含まれるイントロンおよびエキソンに存在し得る。
好ましくは特定の細胞（例えば組織特異的な細胞）中で、つまり、もっぱら特定の組織の細胞で、または、組織により異なる転写レベルでのいずれかで、コアプロモーターおよび調節要素より、それらの制御下に置かれた限定されたＤＮＡ配列が転写される場合、コアプロモーターおよび調節要素は、「１またはそれ以上の組織に特異的」であり得る。
【００３６】
「転写因子」は、好ましくは本発明に係る調節核酸を調節する要素と相互作用するタンパク質、および、転写を刺激する、またそれに反して抑制するタンパク質を意味するものと理解される。いくつかの転写因子は、単量体の形態で活性であり、他方は、ホモ二量体またはヘテロ二量体の形態で活性である。
「モジュレートすること（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」という用語は、転写の正の調節（増加させる、刺激する）、または、転写の負の調節（減少させる、抑制する、妨害する）のいずれかを意味する。
【００３７】
本発明の目的において、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の「同一性の割合」は、比較用ウィンドウを介して最適に並べられた２つの配列を比較することによって決定することができる。
従って、比較用ウィンドウ中のヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適なアライメントが得られるように、参照配列（これらの付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（例えば「ギャップ」）を含んでもよい。
【００３８】
上記割合は、配列の同一性の割合を求めるために、比較される２つの配列（核酸またはペプチド）で同一な核酸塩基または同一なアミノ酸残基が観察される位置の数を決定し、次に、２つの塩基またはアミノ酸残基の間で同一な位置の数を、比較用ウィンドウ中の位置の総数で割り、次に、その結果に１００を掛けることによって計算される。
最適な比較用配列アライメントは、既知のアルゴリズムで補助されたコンピューターを用いて達成することができ、このようなアルゴリズムは、ＷＩＳＣＯＮＳＩＮ ＧＥＮＥＴＩＣＳ ＳＯＦＴＷＡＲＥ ＰＡＣＫＡＧＥ， ＧＥＮＥＴＩＣＳ ＣＯＭＰＵＴＥＲ ＧＲＯＵＰ（ＧＣＧ）（５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｏｃｔｏｒ（Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩＳＣＯＮＳＩＮ）という会社からのパッケージに含まれる。
【００３９】
例として、ＢＬＡＳＴソフトウェア（１９９６年３月のＢＬＡＳＴ１．４．９、１９９８年２月のＢＬＡＳＴ２．０．４、および、１９９８年９月のＢＬＡＳＴ２．０．６のバージョン）の補助で、もっぱらデフォルトパラメーターのみを用いて、配列同一性の割合を得ることができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９７）２５：３３８９−３４０２）。ＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等（上述）のアルゴリズムの補助で、参照の「リクエスト」配列に類似／相同な配列を検索する。
用いられるリクエスト配列およびデータ−ベースは、ペプチドまたは核酸タイプであり、どのような組み合わせでも可能である。
本発明の目的のための「高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、以下の条件を意味するものと理解される。
【００４０】
１−メンブレンの競合およびプレハイブリダイゼーション：
４０μｌのサケ精子ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）＋４０μｌのヒト胎盤ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を混合する、
９６℃で５分間変性させ、次にその混合物を氷に浸す、
２×ＳＳＣ緩衝液を除去し、４ｍｌのホルムアミドミックスを、メンブレンを含むハイブリダイゼーションチューブに注ぐ、
２種の変性ＤＮＡの混合物を加える、
４２℃で５〜６時間、回転させながらインキュベーションする。
【００４１】
２−標識プローブの競合；
標識した精製プローブに、非特異的ハイブリダイゼーションの量に応じて１０〜５０μｌのＣｏｔＩ　ＤＮＡを加える、
９５℃で７〜１０分間変性させる、
６５℃で２〜５時間インキュベートする。
【００４２】
３−ハイブリダイゼーション：
プレハイブリダイゼーションミックスを除去する、
４０μｌのサケ精子ＤＮＡ＋４０μｌのヒト胎盤ＤＮＡを混合物し；９６℃で５分間変性させ、次に氷に浸す、
ハイブリダイゼーションチューブに、４ｍｌのホルムアミドミックス、２種のＤＮＡと変性した標識プローブ／ＣｏｔＩ　ＤＮＡとの混合物を加える、
４２℃で１５〜２０時間、回転させながらインキュベートする。
【００４３】
４−洗浄：
室温で２×ＳＳＣで１回洗浄することによりリンスする、
２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳとで、室温で５分間、２回洗浄する、
０．１×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳとで、６５℃で１５分間、２回洗浄する、
サラン（Ｓａｒａｎ）でメンブレンを包み、露光する。
【００４４】
上述のハイブリダイゼーション条件は、高ストリンジェントな条件下での、２０個のヌクレオチド〜数百のヌクレオチドの範囲の様々な長さの核酸分子のハイブリダイゼーションに適合する。
上述のハイブリダイゼーション条件は、当業者既知の技術に従って、ハイブリダイゼーションを探す核酸の長さの機能や、選択された標識化のタイプの機能に応じて調節できることは言うまでもない。
適切なハイブリダイゼーション条件は、例えば、ＨＡＭＥＳおよびＨＩＧＧＩＮＳ（１９８５）のマニュアル（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｉａｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｅｄ．， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ）、または、Ｆ． ＡＵＳＵＢＥＬ等（１９９９）のマニュアル（Ｃｕｒｒｅｎｔｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ）に記載の教示に合わせることができる。
【００４５】
本発明の目的のための「形質転換」は、核酸（または組換えベクター）を宿主細胞へ導入することを意味するものと理解される。また、「形質転換」という用語は、外来性の核酸により細胞の遺伝子型が改変された状態も含み、このようにして形質転換された細胞は、その外来性の核酸を、例えば組換えポリペプチドの形態またはセンスまたはアンチセンス核酸の形態で発現する。
本発明の目的のための「トランスジェニック動物」は、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物を意味するものと理解され、この場合、それらの１またはそれ以上の細胞が、当業者周知の遺伝子導入技術のような人間の介入により導入された異種核酸を含む。異種核酸は、例えばマイクロインジェクション、または、組換えウイルスでの感染のような遺伝子工学によって、直接的または間接的に、細胞または細胞前駆体中に導入される。異種核酸は、染色体に統合されてもよいし、染色体外で複製されるＤＮＡの形態で供給されてもよい。
【００４６】
ＡＢＣＡ７遺伝子を調節する核酸
ヒトおよびマウスのゲノム原料から調製されたＢＡＣタイプベクターライブラリーを用いて、発明者等は、ヒトおよびマウスＡＢＣＡ７遺伝子を調節する核酸の単離に成功した。
発明者等は、ヒトおよびマウスのゲノム配列の比較分析によって、特にヒトおよびマウスで保存された２種の調節モジュールを含む調節核酸を決定した。それによって、発明者等は、ＡＢＣＡ７遺伝子の転写を調節する核酸が、最も広く定義した場合に、５′末端から３′末端の間に、
ＡＢＣＡ７遺伝子の転写開始部位上流に位置する約１．２ｋｂの非転写領域、および、
ＡＢＣＡ７遺伝子の第一のエキソンの部分配列、
を含むポリヌクレオチドで構成されることを決定した。
【００４７】
その最も広い定義において、ＡＢＣＡ７遺伝子の転写を調節する核酸は、上記で定義された全てのヌクレオチド領域を含み、本発明に係る配列番号１と同一であるとみなす。
従って、本発明の第一の目的は、少なくとも２０の連続したヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド配列を有する）を有するポリヌクレオチドを含む核酸、または、相補配列を有する核酸からなる。
【００４８】
また、ＡＢＣＡ７遺伝子の転写開始部位上流に位置し、コアプロモーターと転写を調節する複数の要素とを含む約１．１ｋｂの領域は、本発明に係る配列番号２と同定した配列に含まれる。
より正確には、配列番号２の配列の１の位置のヌクレオチドは、ＡＢＣＡ７遺伝子の転写開始部位に対して−１１１１の位置のヌクレオチドである。
第二の観点に従って、本発明は、少なくとも２０の連続したヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド配列を有する）を有するポリヌクレオチドを含む核酸、または、相補配列を有する核酸に関する。
【００４９】
すでに上記で特定したように、配列番号１の配列を有するＡＢＣＡ７遺伝子転写を調節する核酸はまた、非転写５′調節領域に加えて、ヒトＡＢＣＡ７遺伝子の第一のエキソンの５′部分も含む。
ＡＢＣＡ７遺伝子の第一のエキソンの部分配列は、配列番号３と定義される。
第三の観点に従って、本発明は、少なくとも２０の連続したヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド配列を有する）を有するポリヌクレオチドを含む核酸、または、相補配列を有する核酸に関する。
【００５０】
好ましくは、本発明に係る核酸は、単離および／または精製された形態である。
また、本発明の構成部分は、上記で定義された核酸の全ての「生物学的に活性な」断片である。
さらなる他の観点に従って、本発明は、上記で定義された核酸と、少なくとも８０％のヌクレオチド同一性を有する核酸に関する。
【００５１】
特に、この核酸は、マウス由来であってもよく、
５′〜３′末端を含む配列番号４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド：
マウスＡＢＣＡ７遺伝子の転写開始部位上流に位置する約１．２ｋｂの非転写領域、および、
ＡＢＣＡ７遺伝子の第一のエキソンの部分配列、
を含む。
【００５２】
また、ＡＢＣＡ７遺伝子の転写開始部位上流に位置し、コアプロモーターと転写を調節する複数の要素とを含む約１．２ｋｂの領域は、本発明に係る配列番号５と同一な配列にも含まれる。
また、本発明は、本発明に係る核酸のいずれかと、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする核酸も含む。
また、本発明は、ヌクレオチド配列番号１〜配列番号５からなる群より選択されたポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続したヌクレオチドを含む核酸と、少なくとも８０％、有利には９０％、好ましくは９５％、最も好ましくは９８％のヌクレオチド同一性を有する核酸に関する。
【００５３】
配列番号２および配列番号５の詳細な分析
主な特徴に従って、配列番号２の配列を有する核酸（配列番号１の配列を有するヒトＡＢＣＡ７遺伝子を調節する核酸に含まれる）は、コアプロモーターの構成要素を含み、それぞれ転写開始部位の３０ｂｐ上流に縮重「ＴＡＴＡ」ボックス（ＴＴＡＡＧ）が位置する。同様に、縮重「ＴＡＴＡ」ボックス（ＴＴＡＡＡ）は、配列番号５の配列を有するマウス核酸の転写開始部位の３０ｂｐ上流に位置し、配列番号４の配列を有するマウスＡＢＣＡ７遺伝子を調節する核酸に含まれる。ヒトおよびマウスＡＢＣＡ７遺伝子のプロモーター上の「ＴＡＴＡ」ボックス、同様に、転写開始部位の位置を、図１に示す。
【００５４】
また、調節配列番号２および配列番号５の調節配列は、コアプロモーターの活性を正または負に調節できる様々な転写因子の結合部位を多数含む。
従って、配列番号２および配列番号５の配列における、様々な転写因子の結合部位の様々な配列の特徴が、以下に示す詳細な様式で、発明者等により同定された。
配列番号２および配列番号５の配列を参照配列として用いて、ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒソフトウェアパッケージ（Ｑｕａｎｄｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ（１９９５）２３（２３）， ４８７８−４８８４）のアルゴリズムに従って処理し、例えばＴｒａｎｓｆａｃなどの数種のデータ−ベースに保存されたデータと比較し、配列番号２および５の配列に特徴的な様々な部位の存在および位置、特に、転写因子の結合部位の存在および位置を、当業者周知の方法に従って決定した。
【００５５】
より詳しくは、ソフトウェアパッケージＮＮＰＰ（Ｒｅｅｓｅ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ．（１９９７）４（３）３１１−２３）、ＴＳＳＧおよびＴＳＳＷ（Ｓｏｌｏｒｙｅｖ ｅｔ ａｌ．， Ｉｓｍｂ（１９９５）， ５， ２９４−３０２）を用いて、それぞれ配列番号２および５の配列の開始部位上流の１．１ｋｂおよび１．２ｋｂに関して詳細な分析を行い、それにより、検索の第一段階で、ヒトおよびマウスにおいて１９３および２３３の転写因子に結合する推定部位を同定することができた。これを表１および２にまとめる。上述のように資料を集め、フィルタリングし、ヒトおよびマウス調節配列を比較することによって、ヒトおよびマウス調節配列に共通の２つのモジュールを含むことが決定され、様々な転写因子と結合することができる５および３個の部位が、ヒトおよびマウス配列で、それぞれモジュール１および２中に選択された。本発明に係る配列番号２の配列の１１１１ｂｐで同定された転写因子結合部位、同様に、本発明に係る配列番号５の配列の１２２０ｂｐで同定された転写因子結合部位に関するフィルトレーションスコアを有する位置を、表３に示す。また、様々な結合部位を、概略的に図１に示す。
【００５６】
それぞれの転写因子結合部位における開始ヌクレオチドの位置は、転写開始部位＋１（配列番号１および番号４の配列に含まれる）に対して、配列番号２および番号５の配列のヌクレオチドの番号付けを基準にして図１で示される。
図２は、配列番号１の配列を示し、当該配列は、配列番号２の配列を含む。また、図２の配列の５′位にある第一のヌクレオチドは、配列番号１および配列番号２の配列で示されるヌクレオチド配列のいずれか一つの５′位にある第一のヌクレオチドでもある。図２において、転写因子結合部位を太字で示すことにより、それらそれぞれの位置の境界を定めており、それらのそれぞれの表示は、上記それぞれの対応するボックスに示される。図２で示される配列のヌクレオチドの番号付けは、転写開始部位は「＋１」と番号付けされ、ヌクレオチド＋１の５′にあるヌクレオチドは、それ自身を「−１」と番号付けされたことに相対させて行われた。
【００５７】
図３は、配列番号４の配列を示し、当該配列は、配列番号５を含む。また、図３の配列の５′位にある第一のヌクレオチドは、配列番号４および配列番号５の核酸配列のいずれか一つの５′位にある第一のヌクレオチドでもある。図３において、転写因子結合部位を太字で示すことにより、それらそれぞれの位置の境界を定めており、それらそれぞれの表示は、上記それぞれの対応するボックスに示される。図３に示される配列のヌクレオチドの番号付けは、転写開始部位は「＋１」と番号付けされ、ヌクレオチド＋１の５′にあるヌクレオチドは、それ自身を「−１」と番号付けされたことに相対させて行われた。
【００５８】
配列番号２および５のヒトおよびマウス配列を調節する核酸のゲノム分析により、モジュール１およびモジュール２と記載される、特にヒトおよびマウスで保存されている２つの調節モジュールを明らかにした。これら２つの調節モジュールは、遍在的な転写因子結合部位（例えばＮＦ１、ＮＦＹおよびＡＰ４）、同様に、肝臓に特異的な転写因子結合部位（例えばＣＥＢＰおよびＨＮＦ３Ｂ）を含む。これは、下記実施例３に示す実験的な発現データに適合しており、さらに、Ｋａｍｉｎｓｋｉ等が提供する発現データ（上述）とも適合しており、ここでは、ヒト胎児肝臓組織でＡＢＣＡ７遺伝子の発現がみられる。
【００５９】
また、マウスおよびヒトで保存された２つの調節モジュールは、転写因子結合部位（例えばＧＦ１１やＮＦカッパＢ（ＮＦｋＢ））を含んでもよく、これらは本質的にリンパ系の臓器に存在する。
図２および３ならびに表３で示される各転写因子の結合部位の特徴の記載は、当業者であれば簡単に見出すことができる。それらのいくつかの簡単な記載を以下に示す。
【００６０】
ＮＦ１因子；
ＮＦ１因子の結合特性は、特に、以下のＭｅｄｌｉｎｅデータベースのエントリー：８８３１９９４１、９１２１９４５９、８６１４０１１２、８７２３７８７７、９０１７４９５１、８９２８２３８７、９０１５１６３３、８９２６１８１３６、８６２７４６３９、８７０６４４１４、８９２６３７９１で見出すことができる。ＮＦ１因子は、以下の反復配列「ＴＧＧＣＡＮＮＮＴＧＣＣＡ（ＮＮＴＴＧＧＣＮＮＮＮＮＮＮＮＣＣＮＮ）」を認識し、当該反復配列は、ウイルス性および細胞性プロモーター中に、２型アデノウイルスの複製起点のレベルで存在する。これらのタンパク質は、転写および複製を活性化することができる。ＮＦ１因子は、ホモ二量体の形態でＤＮＡに結合する。
【００６１】
ＮＦＹ因子：
ＮＦＹ因子は、特に、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースのエントリー番号Ｐ２５．２０８に記載される。ＮＦＹ因子は、プロモーター配列（例えば、１型コラーゲン、アルブミンおよびβ−アクチンをコードする遺伝子のプロモーター配列）にある「ＣＣＡＡＴ」ユニットを認識する因子である。ＮＦＹ因子は、転写の刺激物質である。
【００６２】
ＡＰ４因子：
当業者は、Ｍｅｄｌｉｎｅデータベースの以下のエントリー：２１２３４６６、２８３３７０４、８５３００２４に対応する論文を有利に参照することができる。ＡＰ４因子は、「ヘリックス・ループ・ヘリックス」（ｂＨＬＨ）型のＤＮＡに結合するドメイン、および、２つの二量体化ドメインを含む。ＡＰ４因子のコンセンサス部位は、以下の「ＣＷＣＡＧＣＴＧＧＮ」であり、後半は通常ＡＰ１因子の結合部位とオーバーラップする。
【００６３】
ＣＥＢＰ
ＣＥＢＰ因子への結合の特徴は、特に、Ｍｅｄｌｉｎｅデータベースの以下のエントリー：９３３１５４８９、９１２４８８２６、９４１９３７２２、９３２１１９３１、９２３９０４０４、９０２５８８６３、９４０８８５２３、９０２６９２２５および９６１３３９５８で見出すことができる。ＣＥＢＰ因子は、免疫性および炎症性反応に関与する遺伝子の調節における重要な転写活性化因子である。ＣＥＢＰ因子は、ＩＬ−６に関する遺伝子にあるＩＬ−１応答要素に特異的に結合する。ＣＥＢＰ因子はおそらく、炎症の急性期の調節や造血（ｈｅｍａｐｏｉｅｓｉｓ）に関与している。コンセンサス認識部位は、以下の：「Ｔ（Ｔ／Ｇ）ＮＮＧＮＡＡ（Ｔ／Ｇ）」である。
【００６４】
ＨＮＦ３Ｂ因子：
当業者は、ＯＶＥＲＤＩＥＲ等による論文（１９９４， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． Ｖｏｌ． １４：２７５５−２７６６）、同様に、Ｍｅｄｌｉｎｅデータベースの以下のエントリー：９１３５２０６５、９１０３２９９４、９２３４５８３７、８９１６０８１４、９１１８７６０９、９１１６０９７４、９１０２９４７７、９４３０１７９８および９４２１８２４９を有利に参照することができる。この転写因子は、肝臓にある多数の遺伝子（例えばＡＦＴ遺伝子）、および、アルブミンおよびチロシンアミノトランスフェラーゼに関する遺伝子の活性化因子として作用し、これら遺伝子のシス作用性の調節領域と相互作用する。
【００６５】
ＧＦＩ１
ＧＦＩ１因子の結合に関する特徴は、特に、Ｍｅｄｌｉｎｅデータベースの以下のエントリー：１０７６２６６１、９９３１４４６、９５７１１５７、９２８５６８５、９０７０６５０および７７８９１８６で見出すことができる。ＧＦＩ１遺伝子は、転写調節に関与する、より特定にはインターロイキン−２シグナル伝達経路に関与する亜鉛フィンガータンパク質をコードする。コンセンサス認識部位は、以下の「ＮＮＮＮＮＮＡＡＡＴＣＡＮＮＧＮＮＮＮＮＮＮ」である。
【００６６】
ＮＦカッパ−Ｂ因子；
当業者は、Ｍｅｄｌｉｎｅデータベースの以下のエントリー：９５３６９２４５、９１２０４０５８、９４２８０７６６、８９３４５５８７、９３０２４３８３、８８２４８０３９、９４１７３８９２、９１０８８５３８、９１２３９５６１、９１２１８８５０、９２３９０４０４、９０１５６５３５、９３３７７０７２、９２０９７５３６、９３３０９４２９、９３２６７５１７、９２０３７５４４、９１４２６６９１１、９１１０５８４８および９５０７３９９３に対応する論文を有利に参照することができる。ＮＦカッパ−Ｂ因子は、ヘテロ二量体であり、５０ｋＤａの第一のサブユニットと、６５ｋＤａの第二のサブユニットとからなる。
【００６７】
２つのヘテロ二量体は、不安定な四量体を形成することができる。そのＤＮＡへの結合は、亜鉛（Ｚｎ＋＋）の存在に依存する。ＮＦカッパ−Ｂ因子は、例えばＴＮＦ、ＰＫＡまたはＰＫＣなどの多数の因子によって誘導される。ＮＦカッパ−Ｂ因子は、感染、炎症およびストレス応答に関与する遺伝子の重要な調節因子である。
【００６８】
本発明に係る調節核酸の主要な特徴、より特定には、配列番号２の配列および配列番号５の配列の両方に含まれる転写開始部位の上流に位置する配列の主要な特徴は、Ｔリンパ球の遺伝子発現に関与する転写因子（例えば転写因子ＣＥＢＰ、ＮＦＫＢおよびＧＦＩ１）への推定の結合部位に関するモチーフ特性の存在である。
【００６９】
ＧＦＩ１は、サイトカインシグナル伝達経路と、Ｔ細胞のクローン増幅とに関与する亜鉛フィンガー核タンパク質をコードする癌原遺伝子である（Ｚｗｅｉｄｌｅｒ−ＭｃＫａｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． （１９６６）， １６（８）， ４０２４−４０３４）。転写因子ＧＦＩ１は、Ｔ細胞および腫瘍形成の活性化を抑制する遺伝子の転写抑制因子として作用する。転写因子ＧＦＩ１は、特に胸腺、脾臓およびＴリンパ球に存在する。
【００７０】
胸腺、脾臓およびＴリンパ球で発現される転写因子ＣＥＢＰおよびＮＦカッパＢは当業者周知であり、Ｔリンパ球（Ｒｕｎｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９４）およびＨｅｐＢ３細胞（Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， （１９９４）１４９， ３０５−３１０）の遺伝子発現の誘導を介在させて共同で作用する。
【００７１】
開始ヌクレオチドの位置は、ヒト調節モジュール上のＣＥＢＰ部位の−４９８および−４６９、ＮＦｋＢ部位の−２６０、ならびに、ＣＥＢＰ部位の−７８７および−７６０、ならびに、ＮＦＫＢ部位の−３０１にある転写開始部位に対しており、２つの調節部位は、マウスプロモーターにおいてはより遠くにあることがわかる。しかしながら、２つの因子ＣＥＢＰおよびＮＦｋＢにより共活性化できるように、２つの部位は三次元構造においてはより近くにあるようである。
【００７２】
本発明に係る調節核酸に関してヒトおよびマウスで保存される様式で、これらＣＥＢＰおよびＮＦｋｂに結合する可能性のある部位の存在は、観察結果と一致しており、それによれば、ヒトＡＢＣＡ７タンパク質をコードする遺伝子発現は、造血組織およびＴリンパ球において優勢であり、免疫に関する細胞性介在、特に、アテローム性動脈硬化症の病因に関与する可能性が最も高いと考えられる（上述のＫａｍｉｎｓｋｉ等）。
【００７３】
すでに上述したように、本発明は、配列番号１または２および配列番号４または５のヌクレオチド配列のいずれか一つの、少なくとも２０の連続したヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含む核酸、同様に、相補配列を有する核酸に関する。
【００７４】
配列番号１または２および配列番号４または５の配列のいずれか一つの、１またはそれ以上の「生物学的に活性な」断片を含む核酸が、上述の定義に含まれる。当業者は、特に上記表３、ならびに、図２および３を参照することによって、これらの配列の生物学的に活性な断片を容易に得ることができ、当該配列には、ＡＢＣＡ７遺伝子を調節する配列の様々な特徴的なユニットが存在する。従って、当業者は、対応するポリヌクレオチドを全部または部分的に化学合成することによって、または、所望のＤＮＡ断片を得るために制限エンドヌクレアーゼを作用させることによって、このような生物学的に活性な断片を得ることができ、配列番号１〜配列番号５の配列に存在する制限部位を、汎用の制限マッピング用ソフトウェアパッケージ（例えばＧＣＧバージョン９．１マップモジュール）の補助により配列情報から容易に発見することができる。
【００７５】
制限エンドヌクレアーゼの補助で定義された核酸断片を製造することは、例えばＳＡＭＢＲＯＯＫ等によるマニュアルに説明される（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ２ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９））。
【００７６】
それゆえに、本発明はまた、その制御下に置かれたポリヌクレオチドの転写をモジュレートすることができる、上記で定義された核酸に関する。
【００７７】
第一の好ましい実施形態に従って、本発明に係る転写を調節する核酸の生物学的に活性な断片は、第一の保存されたモジュール（モジュール２）を含み、当該モジュールは、転写開始部位に対して−１位のヌクレオチド〜−３９０位のヌクレオチドの範囲のコアプロモーター（ＴＡＴＡボックス）を含み、転写される最初のヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列の１１１２位のヌクレオチド、または、配列番号４のヌクレオチド配列の１２２１位のヌクレオチドである。
【００７８】
第二の実施形態に従って、本発明に係る転写を調節する核酸の生物学的に活性な断片は、転写開始部位に対して−１位のヌクレオチド〜−８６０位のヌクレオチドの保存されたモジュール１および２（図１）を含み、転写される最初のヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列の１１１２位のヌクレオチド、または、配列番号４で示されるヌクレオチド配列の１２２１位のヌクレオチドである。
【００７９】
第三の実施形態に従って、本発明に係る転写を調節する核酸の、このような生物学的に活性な断片はまた、コアプロモーターおよび近傍の調節要素とに加えて、他の調節要素（例えば様々な部位、ＧＦＩ１、ＨＮＦ３Ｂ、ＣＥＢＰＢ、ＮＦ１）を含み、−１位のヌクレオチドから、転写開始部位に対して−１１１１位のヌクレオチドまで伸長し、転写される最初のヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列の１１１２位のヌクレオチドであり、および−１位のヌクレオチドから、転写開始部位に対して、−１２２０位のヌクレオチドまで伸長し、転写される最初のヌクレオチドは、配列番号４のヌクレオチド配列の１２２１位のヌクレオチドである。
【００８０】
エキソン１の分析
本出願人はまた、転写開始部位の下流に位置し、エキソン１の５′末端に相当するヌクレオチド配列を、ＡＢＣＡ７タンパク質をコードするヒトおよびマウス遺伝子と同定した。
より正確には、エキソン１の５′末端は、１２１０のヌクレオチドの大きさであり、配列番号１の配列の１１１２位のヌクレオチドから始まり、配列番号１の配列の２３２２位のヌクレオチドで終わっている。エキソン１の５′末端は、配列番号３の配列であると同定され、エキソン１の完全配列は、配列番号６の配列であると同定される。
【００８１】
エキソン１は、ヒトＡＢＣＡ７遺伝子のオープンリーディングフェーズの開始を含み、ＡＴＧコドンのヌクレオチドＡは、配列番号３および６の配列の１２０８位に位置する。エキソン１は、配列番号７の配列を有するポリペプチドをコードする。
エキソン１は、ＡＢＣＡ７遺伝子の発現を調節する要素、特に、増幅するエンハンサー型の要素および／またはサイレンサーまたは抑制因子型の要素を含む可能性がある。
その結果として、本発明に係る転写を調節する核酸はまた、配列番号１の配列の生物学的に活性な断片に加えて、ヌクレオチド断片、または、配列番号２〜配列番号３および６の配列の全体を含んでもよい。
【００８２】
配列番号１〜配列番号３および６のヌクレオチド配列同様に、それらの断片は、特に、サンプル中のＡＢＣＡ７遺伝子の少なくとも１つのコピーの存在を検出するためのヌクレオチドプローブまたはプライマー、または、ＡＢＣＡ７遺伝子を調節する配列中に定義された標的配列を増幅するためのヌクレオチドプローブまたはプライマーとして用いることができる。
それゆえに、本発明の目的はまた、上記で定義された核酸と、少なくとも８０％のヌクレオチド同一性を有し、特に配列番号１〜配列番号３および６の配列のいずれか一つから得られた核酸である。
【００８３】
また、本発明は、本発明に係る核酸、特に、配列番号１〜配列番号３および６の配列から選択された配列から得られた核酸のいずれか一つと、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸に関する。
また、本発明は、上記で定義された核酸に関し、加えて、その制御下に置かれた所定のポリヌクレオチドの転写をモジュレートすることができることを特徴とする。
【００８４】
第一の観点に従って、このような核酸は、その制御下に置かれた所定のポリヌクレオチドの転写を活性化することができる。
第二の観点に従って、本発明に係る調節核酸は、その制御下に置かれた所定のポリヌクレオチドの転写を阻害できることを特徴とし得る。
好ましくは、本発明に係る転写を調節する核酸は、発現が検索される所定のポリヌクレオチドに関して適切に配置されている場合、構造的または誘導的のいずれかで、前記所定のポリヌクレオチドを転写させ得る。
【００８５】
本発明に係る調節核酸で開始される転写の誘導性の特徴は、１またはそれ以上の調節要素により付与され、例えば、配列番号１または配列番号２の配列における上記で定義された１またはそれ以上の部位の存在が挙げられる。
その上、所定のポリヌクレオチドの組織特異的な発現は、本発明に係る調節核酸の制御下にこの所定のポリヌクレオチドを置くことにより検索することができ、これにより、例えば、特に、細胞の特定のカテゴリー、例えば造血組織の細胞（例えば末梢白血球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ）、胸腺細胞、脾臓細胞および骨髄）において、この所定のポリヌクレオチドの転写を開始させることができる。
【００８６】
好ましくは、本発明に係る調節核酸は、エンハンサーおよびサイレンサー要素のような、１またはそれ以上の「別個の」調節要素を含み得る。特に、このような調節核酸は、図２で定義された転写因子と結合する可能性のある１またはそれ以上の部位を含み得る。
また、本発明に係る調節核酸は、コアプロモーターを含まない配列、すなわち、転写開始部位に対して−１位のヌクレオチド〜−２５位のヌクレオチドの範囲の配列を含む。
【００８７】
次に、このような調節核酸は、好ましくは、いわゆる「異種の」コアプロモーター、すなわち、ＡＢＣＡ７遺伝子を調節する核酸由来ではない「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ホメオボックス」を含むポリヌクレオチドを含み得る。
また、本発明の構成部分として、例えば１またはそれ以上のヌクレオチドの付加、欠失または置換により改変された配列番号１の配列の全部または部分を含む、転写を調節する核酸がある。このような改変により、プロモーターまたは調節要素の活性を増加または逆に減少させることによって、転写活性をモジュレートできる。
【００８８】
また、このような改変は、プロモーターまたは調節要素の組織特異性に影響を与えることができる。すなわち、例えば、本発明に係る調節核酸は、１つの組織だけで転写を刺激し、自然に発現させるように改変することができる。
また、本発明に係る転写を調節する核酸は、改変させることができ、さらに、特定の化合物によって、例えば特定の治療化合物により配列中に誘導性の部位を形成することによって、誘導させることができる。
【００８９】
配列の改変は、配列番号１の配列の全部または部分を含み、プロモーターまたは調節要素を含ませることは、当業者周知の方法（例えば突然変異誘発）により実行することができる。次に、改変プロモーターまたは調節要素の活性は、例えば、レポーター遺伝子上流の改変プロモーターをクローニングすること、得られたＤＮＡ構成物を宿主細胞にトランスフェクトすること、および、トランスフェクトされた宿主細胞中のレポーター遺伝子の発現レベルを測定することによって、試験することができる。また、改変プロモーターの活性は、トランスジェニック動物で、インビボで分析できる。機能的試験を用いてスクリーニングすることができる改変断片のライブラリーを構築することもでき、その試験において、例えば、所望の活性を有するプロモーターまたは調節要素のみが選択される。
【００９０】
このような試験は、例えば、定義された化合物、例えば抗生物質に対する耐性を付与するレポーター遺伝子の使用に基づいてもよい。続いて、調節核酸／レポーター遺伝子構造を有し、所望の改変を有するプロモーターまたは調節要素を含む細胞の選択は、上記構造で形質転換した宿主細胞を、定義された化合物、例えば定義された抗生物質の存在下で培養することによって単離することによりなされる。
また、レポーター遺伝子は、容易に検出可能なタンパク質のどれでもコードすることが可能であり、当該タンパク質としては、例えば視覚的に検出可能なタンパク質（例えばルシフェラーゼ）がある。
【００９１】
その結果として、本発明の目的はまた、
ａ）上記で定義された転写を調節する核酸；および、
ｂ）所定のポリペプチドまたは核酸をコードする所定のポリヌクレオチド、
を含む核酸である。
【００９２】
第一の観点に従って、転写が望まれる所定のポリヌクレオチドは、タンパク質またはペプチドをコードする。当該タンパク質は、いかなるタイプのものでよく、例えば、サイトカイン、構造タンパク質、受容体または転写因子などの治療目的のタンパク質が挙げられる。例えば、特定の組織での特異的な転写が望まれる場合（例えば造血組織、すなわち脾臓、骨髄の細胞、または、末梢白血球において）、転写を調節する核酸は、配列番号１または２の配列の転写開始部位に相関させた、−１位のヌクレオチド〜−１１１１位のヌクレオチドの範囲の核酸と、配列番号４または５の配列の転写開始部位に相関させた、−１位のヌクレオチド〜−１２２０位のヌクレオチドの範囲の核酸とを有利に含む。
この場合、所定のポリヌクレオチドは、炎症の除去に関与する遺伝子、例えばサイトカインの受容体またはスーパーオキシドジスムターゼの受容体をコードし得る。次に、抗腫瘍効果が望まれる場合、特定の腫瘍抗原に特異的な細胞障害性Ｔリンパ球の数と活性化を刺激することを検索することができる。
【００９３】
他の実施形態において、本発明に係る調節核酸は、ＡＢＣＡ７タンパク質をコードする所定のポリヌクレオチドと組み合わせて用いることができる。
また、所定のポリヌクレオチドは、センス型のオリゴヌクレオチドであってもよい。
すでに上述したように、所定のポリヌクレオチドはまた、核酸、例えば遺伝子に特異的なアンチセンス核酸を生産することができ、この場合、その翻訳の阻害を検索する。
【００９４】
他の観点に従って、転写が調節核酸で調節される所定のポリヌクレオチドは、レポーター遺伝子であり、例えば検出可能なタンパク質をコードする遺伝子のいずれかである。
好ましいレポーター遺伝子のなかでも、特に、ルシフェラーゼに関する遺伝子、β−ガラクトシダーゼに関する遺伝子（ＬａｃＺ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）に関する遺伝子、もしくは、特定の化合物、特に抗生物質に対して耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子のいずれかが挙げられる。
【００９５】
組換えベクター
本発明の目的のための「ベクター」という用語は、一本鎖または二本鎖の形態のいずれかの、環状または直鎖状ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を意味するものと理解される。
第一の実施形態に従って、本発明に係る組換えベクターは、その中に挿入された、本発明に係る調節核酸を所望の宿主細胞への形質転換またはトランスフェクションの後に、増幅するために用いることができる。
第二の実施形態によれば、上記組換えベクターは、本発明に係る調節核酸と、宿主細胞または定義された多細胞生物中でその発現が検索される配列とを含む発現ベクターに相当する。
【００９６】
有利な実施形態に従って、本発明に係る組換えベクターは、特に、以下の要素：
（１）本発明に係る調節核酸；
（２）このようなベクターに挿入される核酸に含まれるコーディング配列を含む所定のポリヌクレオチド（前記コーディング配列は、（１）に記載の調節シグナルを伴うフェーズに置かれる）；および、
（３）転写の開始および終結に適切な配列、
を含み得る。
加えて、本発明に係る組換えベクターは、１またはそれ以上の、それらの増幅または発現が検索される宿主細胞中の複製起点、マーカーまたは選択可能なマーカーを含み得る。
【００９７】
一例として、細菌性プロモーターとしては、ＬａｃＩまたはＬａｃＺプロモーター、Ｔ３またはＴ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、λファージＰＲまたはＰＬプロモーターが挙げられる。
真核細胞用のプロモーターとしては、ＨＳＶウイルスチミジンキナーゼプロモーター、あるいは、マウスメタロチオネイン−Ｌプロモーターが挙げられる。
通常、適切なプロモーターの選択のために、当業者は、上記で引用したＳａｍｂｒｏｏｋ等の教本（１９８９）、または、Ｆｕｌｌｅｒ等が説明する技術（１９９６；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）を有利に参照することができる。
【００９８】
ＡＢＣＡ７遺伝子のゲノム配列の発現を求める場合、好ましくは、大きい挿入配列を含ませることができるベクターを利用することができる。この特定の実施形態において、バクテリオファージベクター、例えばベクターｐｌ５８またはベクターｐｌ５８／ｎｅｏ８のようなＰ１バクテリオファージベクターが好ましく用いることができ、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇにより説明されている（Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，（１９９２）８：１−１６；Ｍａｉｍｎ． Ｇｅｎｏｍｅ（１９９４）５：３９７−４０４）。
【００９９】
本発明に係る好ましい細菌性ベクターとしては、例えば、ベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）、あるいは、例えばｐＡＡ２２３−３（ファルマシア社， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）、およびｐＧＥＭ１（プロメガバイオテク社， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ）のようなベクターが挙げられる。
また、他の市販のベクター、例えばベクターｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ９（キアゲン社）、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＡ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴＩ、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａ ｇｅｎｅ）も挙げられる。
【０１００】
また、Ｎｏｒｄｅｅｎ ＳＫ等（Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（１９８８）， ６：４５４−４５７）で説明された組換えベクターＰＸＰ１も挙げられる。
また、バキュロウイルス型のベクターも挙げられ、例えば、ベクターｐＶＬ１３９２／１３９３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）であり、これはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来のＳｆ９系のトランスフェクト細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７１１）に用いられる。
また、２または５型のヒトアデノウイルスのようなアデノウイルスベクターも挙げられる。
また、本発明に係る組換えベクターとしては、レトロウイルスベクターまたはアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）も挙げられる。このようなアデノ随伴ベクターは、例えばＦｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｌｒ．， Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．（１９９２）７：３４９−３５６；Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．（１９８９）６３：３８２２−３８２８；または、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．（１９９６）５９：５６１−５６９）で説明される。
【０１０１】
本発明に係る調節核酸の制御下で、所定のポリヌクレオチドを発現させるために、調節配列とコーディング配列とを含むポリヌクレオチド構成物を、宿主細胞に導入しなければならない。このような本発明に係るポリヌクレオチド構成物の宿主細胞への導入は、細胞を形質転換またはトランスフェクトする当業者周知の技術に従って、基本的な培養、または、細胞系の形態のいずれかにおいて、インビトロで行うことができる。また、ＡＢＣＡ７タンパク質輸送の欠陥に関する病気の予防または治療のために、本発明に係るポリヌクレオチドのインビボまたはエクスビボでの導入を行うこともできる。
【０１０２】
ポリヌクレオチドまたはベクターを宿主細胞に導入するために、当業者は、様々な技術を有利に参照することができ、例えば、リン酸カルシウムを用いた沈殿技術（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９７３）５２：４５６−４５７；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．（１９８７）７：２７４５−２７５２）、ＤＥＡＥデキストラン（Ｇｏｐａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．，（１９８５）５：１１８８−１１９０）、エレクトロポレーション（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌ． Ｂｉｏｌ，（１９８６）６：７１６−７１８．；Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９８４）， ８１（２２）， ７１６１−５）、ダイレクトマイクロインジェクション（Ｈａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９８５）１０１：１０９４−１０９５）、ＤＮＡを充填したリポソーム（Ｎｉｃｏｌａｕ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８７）１４９：１５７−７６；Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９７９）７６：３３４８−３３５２）が挙げられる。
【０１０３】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入したら、細胞のゲノムに安定して統合され得る。統合は、相同組換えによりゲノムの正確な部位で達成されてもよいし、または、ランダムに統合されてもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、エピソーム断片の形態で宿主細胞に安定して維持することができ、当該エピソームは、独立して、または、細胞周期と同調させる様式のいずれかで、後半部分の保持および複製を可能にする配列を含む。
【０１０４】
特定の実施形態に従って、本発明に係るポリヌクレオチドを、宿主細胞、特に哺乳動物から得られた宿主細胞にインビボで導入する方法は、その工程中に、医薬的に適合可能なベクター、および、適切な調節配列の制御下に置かれた本発明に係る「裸の」ポリヌクレオチドを含む調製物が、選択された組織（例えば平滑筋組織）のレベルに局所注射することによって導入され、当該「裸の」ポリヌクレオチドがこの組織の細胞に吸収される工程を含む。
インビトロおよびインビボで用いられる、「裸の」ポリヌクレオチドを含む組成物は、例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ９５／１１３０７で説明され、同様に、Ｔａｃｓｏｎ等（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．（１９９６）２（８）， ８８８−８９２）およびＨｕｙｇｅｎ等（Ｎａｔ． Ｍｅｄ．（１９９６）２（８）， ８９３−８９８）による論文で説明される。
【０１０５】
本発明の特定の実施形態に従って、組成物は、所定のタンパク質のインビボ生産のために提供される。この組成物は、溶液中で、生理学的に許容できるベクター中に、本発明に係る調節配列の制御下に置かれた所定のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
選択された宿主生物に注入されるベクターの量は、注入部位に応じて変えられる。ガイドによれば、約０．１〜約１００μｇの調節配列／コーディング配列ポリヌクレオチド構成物を動物の体に注入する。
本発明に係る調節核酸が、ＡＢＣＡ７タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む配列の転写を制御できるような様式でポリヌクレオチド構成物（またはベクター）に位置する場合、好ましくは、当該ベクターは、ＡＢＣＡ７タンパク質における欠陥に関連する病気を発症させる可能性のある患者の体に注入される。
【０１０６】
その結果として、本発明はまた、ＡＢＣＡ７タンパク質の機能障害に罹った被験者の予防または治療を目的とした医薬組成物に関し、当該医薬組成物は、１またはそれ以上の生理学的に適合可能な賦形剤と組み合わせて、本発明に係る調節核酸と、ＡＢＣＡ７タンパク質をコードする所定のポリヌクレオチドとを含む。
有利に、このような組成物は、配列番号１または２および配列番号４または５の配列のいずれか一つで定義された調節核酸、または、この調節核酸の生物学的に活性な断片を含み得る。
加えて、本発明の目的は、脂質代謝の機能障害に罹った被験者の予防または治療を目的とした医薬組成物であり、当該医薬組成物は、１またはそれ以上の生理学的に適合可能な賦形剤と組み合わせて、上記で定義された組換えベクターを含む。
【０１０７】
また、本発明の目的は、免疫系および炎症を含むプロセスの機能障害に罹った被験者の予防または治療を目的とした医薬組成物であり、当該医薬組成物は、１またはそれ以上の生理学的に適合可能な賦形剤と組み合わせて、上記で定義された組換えベクターを含む。
また、本発明は、脂質代謝の機能障害に罹った被験者、または、免疫学的または炎症性が原因の問題を患う被験者の予防または治療を目的とした医薬品の製造のための、ＡＢＣＡ７遺伝子を調節する核酸、および、ＡＢＣＡ７タンパク質をコードする配列を含む、本発明に係るポリヌクレオチド構成物の使用に関する。
また、本発明は、本発明に係る組換えベクターの使用に関し、当該組換えベクターは、本発明の調節核酸と、免疫系および炎症を含むプロセスの機能障害に罹った被験者の予防または治療を目的とした医薬品製造のためのＡＢＣＡ７タンパク質をコードする核酸とを含む。
【０１０８】
体の遺伝子治療方法に有用なベクター、および、このようなベクターを含む組成物
また、本発明は、脂質代謝に関連する病状の治療および／または予防のための、同様に、炎症のリンパ球介在のメカニズムにおける機能障害に関する病状の治療および／または予防のための、新規の治療方法に関する。本発明は、遺伝子治療、ポリヌクレオチド構成物のインビボでの輸送および発現により、特に、骨髄性リンパ組織における脂質代謝の機能障害に関連する病状を治療する可能性を実証することにより、従来技術の不利益に対して、有利な解決を提供するものであり、当該ポリヌクレオチド構成物は、本発明に係る調節核酸、および、脂質輸送および／または脂質代謝に関与する可能性が高いＡＢＣＡ７タンパク質をコードする配列を含む。従って、本発明は、免疫系および炎症を含むプロセスの機能障害に罹った被験者の、特異的で効果的な治療を可能にする簡単な手段を提供する。
遺伝子治療は、遺伝情報を病気に罹った細胞または臓器に導入することによって欠陥または異常（変異、異常発現など）を修正すること、または、治療目的のタンパク質の発現を発生させることである。この遺伝情報は、臓器から抽出された細胞にエクスビボで導入し、次に改変細胞を体に再導入されるか、または、適切な組織に直接的にインビボで導入させるかのいずれかである。
【０１０９】
この第二の場合において、様々な技術が存在し、なかでも、ＤＮＡおよびＤＥＡＥ−デキストランの複合体（Ｐａｇａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． １（１９６７）８９１）、ＤＮＡおよび核タンパク質の複合体（Ｋａｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３（１９８９）３７５）、ＤＮＡおよび脂質の複合体（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ８４（１９８７）７４１３）を用いた様々なトランスフェクション技術、リポソームの使用（Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２５５（１９８０）１０４３１）などがある。ごく近年、遺伝子輸送のためのベクターとしてウイルスを用いる技術が、これらの物理的なトランスフェクション技術にかわる有望な代替法として登場してきた。それに関して、様々なウイルスが、特定の細胞集団に感染することができる能力に関して試験された。特に、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＨＭＳ、ＭＭＳなど）、ＨＳＶウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびアデノウイルスである。
【０１１０】
それゆえに、本発明はまた、脂質輸送に関連する病状の治療のための新規の治療方法に関し、本発明に係る調節核酸の制御下に置かれたＡＢＣＡ７をコードする遺伝子をインビボで輸送および発現させることを含む。本発明に係る調節核酸を含むＤＮＡ配列と、脂質代謝に関与するＡＢＣＡ７タンパク質をコードする配列とを含む組換えウイルスを構築し、これら組換えウイルスをインビボで投与することが特に有利であり、このように投与することで、細胞病理学的な影響を与えずに、生物学的に活性なＡＢＣＡ７タンパク質のインビボでの安定で効果的な発現を可能にする。
【０１１１】
アデノウイルスは、特に、ＡＢＣＡ７遺伝子の輸送および発現のための効率的なベクターを構成する。特に、ベクターとして組換えアデノウイルスを使用することにより、所望の治療効果を得るのに十分に高いレベルの所定の遺伝子発現を得ることができる。遺伝子の安定な発現を可能にする、他のウイルスベクター、例えばレトロウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）も特許請求される。
従って、本発明は、脂質代謝の機能障害に関連する病状、および、炎症に関するリンパ球によるシグナル伝達経路の機能障害に関連する病状の、新規の治療および予防方法を提供する。
それゆえに、本発明の目的はまた、欠損組換えウイルスであり、当該欠損組換えウイルスは、本発明に係る調節核酸と、脂質代謝に関与する、または免疫系および炎症を含むプロセスに関与するＡＢＣＡ７タンパク質をコードする核酸配列とを含む。
【０１１２】
また、本発明は、リンパ球による炎症のシグナル伝達の機能障害の治療および／または予防を目的とした医薬組成物を調製するための、このような欠損組換えウイルスの使用に関する。
また、本発明は、エクスビボで上述のウイルスで遺伝学的に改変された細胞、または、このようなウイルスを生産する細胞の使用に関し、これらを体に移植することによって、インビボでの生物学的に活性なＡＢＣＡ７タンパク質の持続的で効果的な発現を可能にする。
【０１１３】
本発明は、ＡＢＣＡ７をコードするＤＮＡ配列を、上記で定義された調節核酸の制御下に、ウイルスベクターへ組み込むことが可能であり、および、これらベクターは、生物学的に活性な成熟形態を効果的に発現させることができる、ということを示す。より特定には、本発明が示すところによれば、ＡＢＣＡ７のインビボでの発現は、アデノウイルスの直接投与により、もしくは、生産細胞、またはこのようなＤＮＡに組み込まれたアデノウイルスやレトロウイルスにより遺伝学的に改変された細胞を移植することにより、得ることができる。
【０１１４】
本発明は、有害な影響を与えない制御されたＡＢＣＡ７発現を、このタンパク質の発現に通常は関与しない臓器において誘導することが可能であるため、特に有利である。特に、ＡＢＣＡ７タンパク質の顕著な放出は、本発明のベクターを生産する細胞、または、エクスビボで本発明のベクターで感染させた細胞を移植することによって得られる。
【０１１５】
本発明に関して生産される脂質代謝のメディエイター活性は、ヒトまたは動物のＡＢＣＡ７型であり得る。本発明に関して用いられる核酸配列としては、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＲＮＡ（レトロウイルスの場合）、または、例えば１またはそれ以上のイントロンが挿入されたｃＤＮＡを含むハイブリッド構造が可能である。また本発明は、合成または半合成の配列を含み得る。特に有利な形態において、ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡが用いられる。特に、ｇＤＮＡの使用により、ヒト細胞においてより優れた発現が可能である。それらを本発明に係るウイルスベクターに組み込むことによって、これらの配列は、特に、適切な制限部位を挿入するために、例えば部位特異的突然変異誘発により、有利に改変される。実際には、従来技術に記載の配列は本発明に係る用途のためには構成されておらず、適応する前に、実質的な発現を得るために必要性を検証してもよい。本発明に関して、ヒトＡＢＣＡ７タンパク質をコードした核酸配列の使用が好ましい。その上、これらＡＢＣＡ７タンパク質の誘導体をコードする構成物を用いることも可能であり、これらＡＢＣＡ７タンパク質の誘導体は、例えば、野生型配列に対する変異、欠失および／または付加により得られるすべての配列、および、脂質代謝のメディエイターの活性を維持する生産物をコードする配列を含む。これらの改変は、当業者既知の技術によってなされ得る（下記の一般的な分子生物学的な技術を参照）。次に、このようにして得られた誘導体の生物活性を、特に細胞からの脂質の流出の測定を説明した実施例において示すように、容易に測定することができる。また、本発明の目的のための誘導体は、プローブとして野生型配列またはそれらの断片を用いて、核酸ライブラリーからハイブリダイゼーションすることによって得ることができる。
【０１１６】
これらの誘導体は、特に、それらの結合部位に対するより高い親和性を有する分子、より大きいプロテアーゼ耐性を示す分子、より高い治療効率、もしくはより少ない副作用を有する分子、または必要に応じて新規の生物学的特性を有する分子である。また、当該誘導体は、インビボでの発現を改善できる改変ＤＮＡ配列も含まれる。
【０１１７】
第一の実施形態において、本発明は、本発明に係る調節核酸、および、コレステロールの輸送および代謝に関与するＡＢＣＡ７タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を含む欠損組換えウイルスに関する。本発明の他の好ましい実施形態において、ＤＮＡ配列は、ｇＤＮＡ配列である。ＡＢＣＡ７タンパク質をコードし、本発明に係るベクターで用いることができるｃＤＮＡ配列は、有利には、配列番号８の配列である。
【０１１８】
本発明のベクターは、様々なタイプのウイルスから調製できる。好ましくは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）／ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）またはレトロウイルス由来のベクターが用いられる。直接投与や、移植される予定の細胞のエクスビボでの改変のためには、アデノウイルスを用い、もしくは、生産細胞の移植のためには、レトロウイルスを用いることが、特に最も有利である。
【０１１９】
本発明に係るウイルスは、欠損しており、すなわち、標的細胞中で自立的に複製することができない。通常、本発明で用いられる欠損ウイルスのゲノムは、それゆえに、少なくとも感染細胞で前記ウイルスを複製するのに必要な配列が欠失している。これらの領域は、除去される（完全または部分的に）、または、非機能的にされる、または、他の配列で、特にＡＢＣＡ７タンパク質をコードする核酸配列で置換される、のいずれかであり得る。好ましくは、上記欠損ウイルスは、そのゲノムのウイルス粒子のキャプシド化に必要な配列をそれでもなお保持する。
【０１２０】
より特定的にアデノウイルスに関しては、様々な血清型を特徴とし、その構造および特性がいくぶん多様である。これら血清型のなかでも、２または５型のヒトアデノウイルス（Ａｄ２またはＡｄ５）、または、動物起源のアデノウイルス（出願ＷＯ９４／２６９１４を参照）が、本発明で好ましく用いられる。本発明に関して動物起源のアデノウイルスのなかでも、イヌ、ウシ、マウス（例えば、Ｍａｖ１がある：Ｂｅａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５（１９９０）８１）、ヒツジ、ブタ、鳥類またはサル（例えば、ＳＡＶ）起源のアデノウイルスが挙げられる。動物起源のアデノウイルスとして好ましくは、イヌのアデノウイルスであり、より好ましくはＣＡＶ２アデノウイルス［例えば、ＭａｎｈａｔｔａｎまたはＡ２６／６１系（ＡＴＣＣ　ＶＲ−８００）］である。好ましくは、ヒトもしくはイヌ、または、複合起源のアデノウイルスが、本発明に関して用いられる。好ましくは、本発明の欠損アデノウイルスは、ＩＴＲ、キャプシド化させる配列、および、本発明に係る核酸の制御下に置かれたＡＢＣＡ７タンパク質をコードする配列を含む。本発明のアデノウイルスのゲノムにおいて、有利には、少なくともＥ１領域が非機能化される。本発明のアデノウイルスのゲノムにおいて、さらにより好ましくは、Ｅ１遺伝子、および、Ｅ２、Ｅ４およびＬ１−Ｌ５遺伝子の少なくとも一つが、非機能的である。考慮されたウイルス遺伝子は、当業者既知のいかなる技術によって非機能化できる、特に、考慮された遺伝子で、全て抑制、置換、部分的欠失、または、１またはそれ以上の塩基を付加することによって、非機能化できる。このような改変は、例えば、遺伝子工学技術により、または、変異誘発物質での処理により、インビトロ（単離されたＤＮＡに）、または、インサイチュで達成できる。また、他の領域も改変することができ、特に、Ｅ３（Ｗ０９５／０２６９７）、Ｅ２（Ｗ０９４／２８９３８）、Ｅ４（Ｗ０９４／２８１５２、Ｗ０９４／１２６４９、Ｗ０９５／０２６９７）およびＬ５（Ｗ０９５／０２６９７）領域である。好ましい実施形態に従って、本発明に係るアデノウイルスは、Ｅ１およびＥ４領域に欠失を含み、ＡＢＣＡ７をコードする配列は、不活性化したＥ１領域のレベルに挿入される。他の好ましい実施形態に従って、本発明に係るアデノウイルスは、Ｅ４領域とＡＢＣＡ７をコードする配列（フランス国特許出願ＦＲ９４１３３５５）とが挿入されるレベルで、Ｅ１領域に欠失を含む。
【０１２１】
本発明に係る欠損組換えアデノウイルスは、当業者既知のいかなる技術によっても調製することができる（Ｌｅｖｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ（１９９１）１０１：１９５， ＥＰ１８５５７３；Ｇｒａｈａｍ， ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８４）３：２９１７）。特に、当該アデノウイルスは、アデノウイルスと、とりわけ、ＡＢＣＡ７タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドとの間の相同組換えによって、調製することができる。相同組換えは、前記アデノウイルスおよびプラスミドを適切な細胞系にコトランスフェクションすることによって達成される。用いられる細胞系は、好ましくは、（ｉ）前記要素によって形質転換可能でなければならない、および、（ｉｉ）組換えのリスクを回避するために、欠損アデノウイルスゲノムの部分を補足できる配列を、好ましくは統合された形態で含まなければならない。系の例としては、ヒト胎児腎臓系２９３（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．（１９７７）３６：５９）が挙げられ、この系は、特に、そのゲノムに統合された、Ａｄ５アデノウイルスのゲノムの左の部分（１２％）を含み、または、特に出願番号ＷＯ９４／２６９１４およびＷ０９５／０２６９７で説明されたＥ１およびＥ４の機能を補足することができる系が挙げられる。
【０１２２】
次に、増殖したアデノウイルスは、従来の分子生物学的な技術に従って、実施例で説明したように回収、精製される。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に関しては、比較的サイズが小さいＤＮＡウイルスであり、これらは、安定な部位特異的な方法で、それらが感染する細胞のゲノムに統合される。アデノ随伴ウイルスは、細胞性成長、形態学または分化にいかなる影響を誘発させることなく、広範な細胞に感染することができる。その上、アデノ随伴ウイルスは、ヒトでの病状に関与しないと思われる。ＡＡＶのゲノムが、クローン化され、配列解析され、特徴付けられている。ＡＡＶは、約４７００の塩基からなり、各末端に、ウイルスの複製起点として作用する約１４５塩基の逆位反復領域（ＩＴＲ）を含む。そのゲノムの残りは、キャプシド化機能を有する２つの主要な領域に分けられ、ゲノムの左側の部分は、ウイルス性複製とウイルス性遺伝子の発現とに関与するｒｅｐ遺伝子を含み、ゲノムの右側の部分は、ウイルスキャプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を含む。
【０１２３】
インビトロおよびインビボでの遺伝子輸送のための、ＡＡＶ由来のベクターの使用が、文献で説明されている（特に、ＷＯ９１／１８０８８；ＷＯ９３／０９２３９；ＵＳ４，７９７，３６８、ＵＳ５，１３９，９４１、ＥＰ４８８５２８を参照）。これらの文書は、ＡＡＶ由来の様々な構成物を説明しており、それにおいて、ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子が除去され、所定の遺伝子で置換されており、それらの使用は、前記所定の遺伝子をインビトロで（培養物中の細胞に）またはインビボで（直接的に生物に）輸送するためである。しかしながら、これら文書のいずれも、インビボまたはエクスビボでのＡＢＣＡ７タンパク質の輸送および発現のための組換えＡＡＶの使用、または、このような輸送の利益について、記載も示唆もしていない。本発明に係る欠損組換えＡＡＶは、ヒトヘルパーウイルス（例えばアデノウイルス）を感染させた細胞系へ、２つのＡＡＶ逆位反復領域（ＩＴＲ）に隣接したＡＢＣＡ７タンパク質をコードする配列を含むプラスミドと、ＡＡＶキャプシド化遺伝子（ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）を含むプラスミドとをコトランスフェクションすることによって、調製することができる。次に、作製された組換えＡＡＶは、従来の技術により精製される。
【０１２４】
ヘルペスウイルスおよびレトロウイルスに関しては、組換えベクターの構築は、広く文献で説明されており、特に、Ｂｒｅａｋｆｉｅｌｄ等（Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ３（１９９１）２０３）；ＥＰ４５３２４２、ＥＰ１７８２２０、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ等（Ｇｅｎｅｔ． Ｅｎｇ． ７（１９８５）２３５）；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，（ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３（１９８５）６８９）などを参照できる。
【０１２５】
特に、レトロウイルスは、統合型のウイルス（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ）であり、分裂した細胞に感染する。レトロウイルスのゲノムは、本質的には、２つのＬＴＲ、キャプシド化配列、および、３つのコーディング領域（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を含む。レトロウイルス由来の組換えベクターにおいて、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子は、一般的に完全または部分的に欠失しており、所定の異種核酸配列で置換されている。これらベクターは、様々なタイプのレトロウイルス、例えば、特にＭｏＭｕＬＶ（「マウスモロニー白血病ウイルス」、または、ＭｏＭＬＶとも呼ばれる）、ＭＳＶ（「マウスモロニー肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「ハーベイ肉腫ウイルス」）；ＳＮＶ（「脾臓ネクローシスウイルス」）；ＲＳＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）またはフレンドウイルスから生産することができる。
【０１２６】
本発明に係る調節核酸の制御下に置かれたＡＢＣＡ７タンパク質をコードする配列を含む組換えレトロウイルスを構築するために、一般的に、特にＬＴＲ、キャプシド化配列および前記コーディング配列を含むプラスミドが構築され、プラスミド中にレトロウイルス機能の欠損をｔｒａｎｓ位に提供することができ、いわゆるキャプシド化細胞系にトランスフェクトするのに用いられる。通常、キャプシド化系は、それゆえに、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を発現することができる。このようなキャプシド化系は、従来技術で説明されており、特に、ＰＡ３１７系（ＵＳ４，８６１，７１９）、ＰｓｉＣＲＩＰ系（ＷＯ９０／０２８０６）、および、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２系（ＷＯ８９／０７１５０）である。その上、組換えレトロウイルスは、転写活性を抑制するために、ＬＴＲのレベルでの改変を含ませることができ、同様に、ｇａｇ遺伝子の部分を含む拡張されたキャプシド化配列を含ませることができる（Ｂｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１（１９８７）１６３９）。作製された組換えレトロウイルスは、次に、従来の技術で精製される。
【０１２７】
本発明を実施するために、欠損組換えアデノウイルスを用いることが特に最も有利である。以下で得られた結果によれば、実際に、脂質代謝メディエイター活性を有するタンパク質をインビボで発現させるアデノウイルスの特に有利な特性を示す。本発明に係るアデノウイルスベクターは、それらの移植を考慮すると、精製懸濁液のインビボでの直接投与、または、細胞（特に自己由来の細胞）のエクスビボでの形質転換が、特に有利である。その上、本発明に係るアデノウイルスベクターは、多くの利点に加え、相当な利益を示し、例えば、特にそれらの非常に高い感染効率を示し、それにより少量のウイルス性懸濁液を用いて感染を行うことが可能である。
【０１２８】
他の特に有利な本発明の実施形態に従って、本発明に係る調節核酸とＡＢＣＡ７タンパク質をコードする配列とを含むレトロウイルスベクターを生産する系が、インビボでの移植に用いられる。この目的に用いることができる系は、特に、ＰＡ３１７（ＵＳ４，８６１，７１９）、ＰｓｉＣｒｉｐ（ＷＯ９０／０２８０６）およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２（ＵＳ５，２７８，０５６）であり、これらは本発明に係るＡＢＣＡ７タンパク質をコードする核酸配列を含むレトロウイルスが生産されるように改変された細胞である。例えば、全能性幹細胞、血液細胞系の前駆体を、被験者から回収し、単離することができる。これらの細胞を培養する場合、細胞は、次に、それ自身のプロモーターの制御下にＡＢＣＡ７タンパク質をコードする配列を含むレトロウイルスベクターで感染させることができる。次に、これら細胞は、被験者に再導入される。これら細胞の分化は、ＡＢＣＡ７タンパク質を発現する造血組織の細胞、特に炎症のシグナル伝達に関与するＴリンパ球に関与する可能性がある。
【０１２９】
有利に、本発明のベクターにおいて、ＡＢＣＡ７タンパク質をコードする配列は、感染細胞でそれを発現させる調節要素、最も特には、ＮＦカッパＢ、ＣＥＢＰおよびＧＦＩ１型の調節要素を含む本発明に係る調節核酸の制御下に置かれる。
上述したように、また、本発明は、脂質代謝に関連する病状、または、免疫系および炎症を含むプロセスに関連した機能障害の治療および／または予防を目的とした医薬組成物を調製するための、上述のウイルスの使用のすべてに関する。
【０１３０】
また、本発明は、１またはそれ以上の上述の欠損組換えウイルスを含む医薬組成物に関する。これらの医薬組成物を、局所的、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内または経皮などによる投与のために配合することができる。好ましくは、本発明の医薬組成物は、注射可能な製剤用、特に例えば患者の門脈への静脈注射用の製薬上許容できる賦形剤を含む。それらは特に、等張滅菌溶液、または、乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物に関連し、これらは、滅菌水または生理食塩水に加えることによって、注射用溶液を調製することができる。患者の門脈への直接注射は、肝臓のレベルでの感染を標的化し、それによりこの臓器のレベルでの治療効果を高めることを可能にするため、有利である。
【０１３１】
注射に用いられる欠損組換えウイルスの用量は、様々なパラメーターの機能、および、特に、用いられるウイルスベクター、投与様式、関連のある病状、または、所望の治療継続時間の機能などに応じて、調節することができる。一般的に、本発明に係る組換えアデノウイルスは、１０４〜１０１４ｐｆｕ／ｍｌ、好ましくは１０６〜１０１０ｐｆｕ／ｍｌの用量の形態で配合され、投与される。ｐｆｕ（「プラーク形成単位」）という用語は、ウイルス溶液の感染力に対応し、適切な細胞培養に感染させ、一般的に４８時間後、感染細胞のプラーク数を測定することによって測定される。ウイルス溶液のｐｆｕタイターを測定する技術は、文献でよく説明される。
【０１３２】
レトロウイルスに関しては、本発明に係る組成物は、それらの移植を目的とすると、直接、生産細胞を含んでよい。
これに関して、本発明の他の目的は、１またはそれ以上の上述の欠損組換えウイルスで感染させたすべての哺乳動物細胞に関する。より特定には、本発明は、これらのウイルスで感染させたすべてのヒト細胞集団に関する。哺乳動物細胞としては、特に、血液起源の細胞（全能性幹細胞または前駆体）、線維芽細胞、筋原細胞、肝細胞、ケラチノサイト、平滑筋および内皮細胞、グリア細胞などが挙げられる。
【０１３３】
本発明に係る細胞は、初代培養物から得ることができる。これらを、当業者既知のいかなる技術によって回収し、次に、それらを増殖させる条件下で培養することができる。より特定に線維芽細胞に関しては、これらは、容易にバイオプシーから得ることができ、例えばＨａｍにより説明された技術に従ってなされる（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９８０）２１ａ：２５５）。これら細胞は、ウイルス感染に直接用いてもよいし、または、その後の使用を考慮して、自己由来のライブラリー構築のために、例えば凍結することによって保存してもよい。本発明に係る細胞は、例えば予め構築しておいたライブラリーから得られた二次培養でもよい（例えば、ＥＰ２２８４５８、ＥＰ２８９０３４、ＥＰ４０００４７、ＥＰ４５６６４０を参照）。
【０１３４】
次に、培養中の細胞を組換えウイルスで感染させ、生物学的に活性なＡＢＣＡ７タンパク質を生産する能力をそれらに付与する。感染は、当業者既知の技術に従って、インビトロで行われる。特に、用いられる細胞のタイプ、および求められた細胞あたりのウイルスコピー数に応じて、当業者は、感染の多重度や、必要に応じて、生産される感染サイクル数を、調節することができる。これら工程は、細胞をインビボでの投与を目的とする場合、適切な無菌条件下で行わなければならないことは言うまでもない。細胞の感染に用いられる組換えウイルスの用量は、所望の目的に従って当業者により調節することができる。上述のインビボ投与での条件は、インビトロでの感染に適応させることができる。レトロウイルスでの感染に関して、本発明に係る組換えレトロウイルスを生産する細胞で感染させることが望ましい細胞を共培養させることもできる。それにより、レトロウイルスの精製を省くことを可能にする。
【０１３５】
本発明の他の目的は、１またはそれ以上の上述の欠損組換えウイルスで感染させた哺乳動物細胞、または、組換えウイルスを生産する細胞、および、細胞外基質を含むインプラントに関する。好ましくは、本発明に係るインプラントは、１０５〜１０１０個の細胞を含む。より好ましくは、それらは、１０６〜１０８個の細胞を含む。
より特定には、本発明のインプラントにおいて、細胞外基質は、ゲル化化合物、および、必要に応じて、細胞を固定させる支持体を含む。
【０１３６】
本発明に係るインプラントの調製のために、様々なタイプのゲル化剤を用いることができる。ゲル化剤は、ゲルの性質を有するマトリックスに細胞を封入するのに用いられ、必要に応じて、細胞の支持体への固定を強化するのに用いられる。それゆえに、様々な細胞の接着剤をゲル化剤として用いることができ、例えば、特にコラーゲン、ゼラチン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、レクチンなどが挙げられる。好ましくは、コラーゲンが本発明で用いられる。これは、ヒト、ウシまたはマウス由来のコラーゲンであり得る。より好ましくは、Ｉ型コラーゲンが用いられる。
【０１３７】
上述したように、本発明に係る組成物は、有利には、細胞を固定させる支持体を含む。固定という用語は、細胞の支持体への接着および／または付着を起こさせる生物学的および／または化学的および／または物理的相互作用のすべての形態を示す。その上、細胞は、用いられる支持体を被覆する、もしくは、この支持体の内部に浸透する、またはその両方のいずれかが可能である。本発明に関して、固体の非毒性および／または生体適合性の支持体を用いることが好ましい。特に、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）繊維、または、生物学的な起源の支持体を用いることが可能である。
【０１３８】
従って、本発明は、コレステロールの輸送に関連した病状（特に肥満症、高トリグリセリド血症）の治療または予防、または、心臓血管の状態、心筋梗塞、口峡炎、突然死、心不全および脳血管発作の分野における治療または予防に関する、非常に効果的な手段を提供する。
加えて、この治療は、ヒトおよびすべての動物（例えばヒツジ、ウシ、家畜（イヌ、ネコなど）、ウマ、魚類など）のいずれにも適応させることができる。
【０１３９】
組換え宿主細胞
また、本発明は、配列番号１〜配列番号６の配列を有する本発明の核酸のいずれか一つを含む組換え宿主細胞に関し、より特定には、配列番号１〜配列番号３の配列を有する核酸に関する。
他の観点に従って、本発明はまた、上述の組換えベクターを含む組換え宿主細胞に関する。
本発明に係る好ましい宿主細胞としては、例えば、以下のものがあげられる。
ａ）原核宿主細胞：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌ系（ＤＨ５−ＣＸ株）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｌｌｌｓ系、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ系、または、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ種の系；
ｂ）真核宿主細胞：ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２）、Ｃｖ１細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０）、Ｓｆ−９細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７１１）、ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−６１）もしくは３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−６３６１）、または、Ｈｅｐａ１−６系の細胞であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）で参照される；
ｃ）初代培養細胞は、本発明に係る調節核酸の制御下に置かれた所定の核酸の発現が検索された個体から得られた。
ｄ）無制限に増殖した細胞（細胞系）は、当業者周知の技術に従って、上記のｃ）初代培養細胞から得られる。
【０１４０】
スクリーニング方法
インビトロでのスクリーニング方法
本発明は、ＡＢＣＡ７タンパク質の発現レベルに関連した病状に罹った被験者を治療する方法を提供する。特に、このような治療方法は、ＡＢＣＡ７遺伝子の発現をモジュレートする化合物を被験者に投与することからなり、当該方法は、以下で定義されたように、インビトロでスクリーニングする様々な方法によって同定することができる。
第一の方法は、ＡＢＣＡ７遺伝子の発現をモジュレートする化合物同定することからなる。
このような方法に従って、ＡＢＣＡ７遺伝子を発現する細胞は、試験される候補物質または分子と共にインキュベートされ、続いて、ＡＢＣＡ７に関するメッセンジャーＲＮＡの発現レベル、または、ＡＢＣＡ７タンパク質の生産レベルが測定される。
【０１４１】
ＡＢＣＡ７に関するメッセンジャーＲＮＡのレベルは、当業者周知のノーザンタイプのゲルハイブリダイゼーションによって測定することができる。また、ＡＢＣＡ７に関するメッセンジャーＲＮＡのレベルは、ＰＣＲまたはＷＥＢＢ等により説明された技術（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ（１９９６）， ｖｏｌ． １：１１９）を用いた方法で測定することもできる。
ＡＢＣＡ７タンパク質の生産レベルは、特異的にＡＢＣＡ７タンパク質を認識する抗体を用いた免疫沈降反応または免疫化学によって、測定することができる。
【０１４２】
本発明に係る調節核酸の活性をモジュレートする候補分子または物質の他のスクリーニング方法に従って、上記で定義されたヌクレオチド構成物が用いられ、当該構成物は、本発明に係る調節核酸と、調節核酸の制御下に置かれたレポーターポリヌクレオチドとを含み、前記調節核酸は、少なくとも１つのコアプロモーターと、配列番号１〜配列番号３の配列のいずれか一つを調節する少なくとも１つの要素を含む。レポーターポリヌクレオチドは、検出可能なタンパク質をコードする遺伝子、例えばルシフェラーゼをコードする遺伝子であり得る。
このようなスクリーニング方法に従って、本発明に係る調節核酸と、レポーターポリヌクレオチドとを、安定で一過性の様式で含むポリヌクレオチド構成物を、細胞に感染させる。
形質転換細胞を、次に、試験される候補分子または物質の存在下または非存在下で、十分な時間インキュベートし、次に、レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。次に、レポーター遺伝子の発現において統計的に顕著な変化を誘発させる（レポーター遺伝子の発現の増加か、または減少のいずれか）化合物を同定し、必要に応じて、選択する。
【０１４３】
従って、本発明の目的はまた、本発明に係る調節核酸の活性をモジュレートする分子または物質、特に、本発明に係るポリヌクレオチド構成物の構成的レポーターポリヌクレオチドの転写をモジュレートする分子または物質を、インビトロでスクリーニングする方法であり、当該方法は、
ａ）本発明に係る調節核酸の制御下に置かれた所定のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞を培養すること；
ｂ）試験される物質または分子と共に組換え宿主細胞をインキュベートすること；
ｃ）所定のポリヌクレオチドの発現を検出すること；
ｄ）工程ｃ）で得られた結果と、組換え宿主細胞が、試験される候補分子または物質の非存在下で培養された場合に得られた結果とを比較すること、
からなる工程を含むことを特徴とする。
【０１４４】
また、本発明は、本発明に係る調節核酸の活性をモジュレートすることができる候補分子または物質をインビトロでスクリーニングするためのキットまたはボックスに関し、当該キットまたはボックスは、
ａ）本発明に係る調節核酸の制御下に置かれた所定のレポーターポリヌクレオチドを含む、上記で定義されたポリヌクレオチド構成物で形質転換された宿主細胞：および、
ｂ）必要に応じて、所定のレポーターポリヌクレオチドの発現を検出する手段、
を含む。
好ましくは、所定のレポーターポリヌクレオチドは、ルシフェラーゼコーディング配列である。この場合、本発明に係る調節核酸は、ルシフェラーゼをコードする配列の上流でベクターに挿入される。これは、例えば、プロメガ社（Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）が市販するベクターｐＧＬ３−ベーシック（ｐＧＬ３−ｂ）であり得る。
【０１４５】
この場合、本発明に係る調節核酸の制御下に置かれたルシフェラーゼコーディング配列を含む組換えベクターは、組換え宿主細胞にトランスフェクトされ、次に、試験される候補物質または分子の存在下または非存在下で培養した後、そのルシフェラーゼ活性を測定する。
この場合、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＡｐｏＡＩプロモーターを含むｐＧＬ３−ｂベクター、または、プロモーターを含まないｐＧＬ３−ｂベクターのいずれかを、コントロールとして用いることができる。ルシフェラーゼ活性を試験するため、トランスフェクトされた細胞を、ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、５００μｌのリシス緩衝液（５０ｍＭトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％アジ化ナトリウム、１％のＮＰ−４０、１００μｇ／ｍｌのＡＥＢＳＦおよび５μｇ／ｍｌのロイペプチン）で溶解させる。
【０１４６】
得られた５０μｌの細胞溶解物を、次に、１００μｌのルシフェラーゼ基質（プロメガ社）に加え、細胞溶解物を添加した後５分間、分光光度マイクロプレートリーダーで活性測定を行う。
そのデータは、ルシフェラーゼ活性の相対単位で表す。トランスフェクトされた細胞中で、高レベルのルシフェラーゼ活性を生み出すポリヌクレオチド構成物は、配列番号１の配列に含まれる本発明に係る調節核酸を含むものであり、当該調節核酸は、転写を刺激することができる。
本発明に係るスクリーニング方法において、メッセンジャーＲＮＡの発現レベルを測定するために、所定のレポーターポリヌクレオチドに関するメッセンジャーＲＮＡに特異的なプローブをまず第一に調製し、例えば、マルチプライムラベリングキット（アマシャムライフサイエンス社（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ， Ｏｈｉｏ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）により市販される）の補助により調製できる。
【０１４７】
インビボでのスクリーニング方法
本発明の他の観点に従って、本発明に係る調節核酸の活性をモジュレートする組成物を、非ヒトトランスジェニック動物中で、インビボで同定することができる。
このような方法に従って、非ヒトトランスジェニック動物、例えばマウスは、試験される候補分子または物質で処理され、例えば、上記で定義されたインビトロでのスクリーニング方法により前もって選択された候補物質または分子で処理される。
所定の期間の後、本発明に係る調節核酸の活性レベルを測定し、候補分子または物質を取り込んでいない同一の非ヒトトランスジェニック動物、例えば同一のトランスジェニックマウスの活性と比較する。
トランスジェニック動物において機能的な、本発明に係る調節核酸の活性を、様々な方法で測定することができ、例えば、ノーザン型ハイブリダイゼーション、または、インサイチュハイブリダイゼーション、または、非侵襲性のバイオフォトイメージング（ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃ ｉｍａｇｉｎｇ）（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって、前記調節核酸の制御下に置かれた所定のレポーターポリヌクレオチドに対応するメッセンジャーＲＮＡのレベルを測定する。
【０１４８】
別法として、本発明に係る調節核酸の活性を、所定のレポーターポリヌクレオチドがコードするタンパク質の発現レベルを測定することによって、決定することができ、例えば、免疫組織化学で測定することができ、その場合、所定のレポーターポリヌクレオチドは、このような技術で検出可能なタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。
本発明に係る調節核酸の活性をモジュレートする候補物質または分子をインビボでスクリーニングする方法を実行するためには、非ヒト哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモットまたはウサギが好ましく、この場合、それら動物のゲノムは、本発明に係る調節核酸の制御下に置かれた所定のレポーターポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構成物を挿入することによって改変されている。
【０１４９】
本発明に係るトランスジェニック動物は、それらの体細胞および／または生殖細胞の多数に、導入遺伝子、すなわち上述のポリヌクレオチド構成物を含む。
本発明に係るトランスジェニック動物構築は、当業者周知の従来の技術に従って行うことができる。当業者は、特に、米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９年１０月１０日に特許付与）、米国特許第５，４６４，７６４号（１９９５年１１月７日に特許付与）および米国特許第５，７８９，２１５号（１９９８年８月４日に特許付与）で説明されたトランスジェニック動物の生産、特に、トランスジェニックマウスの生産を参照することができ、これら文書の内容は、本明細書に引用することにより援用される。
簡単に言うと、本発明に係る調節核酸と、その後ろの制御下に置かれた所定のレポーターポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチド構成物は、ＥＳ型幹細胞系に挿入される。ポリヌクレオチド構成物の挿入は、好ましくは、Ｔｈｏｍａｓ等（１９８７， Ｃｅｌｌ， Ｖｏｌ． ５１：５０３−５１２）が説明するようなエレクトロポレーションにより実行される。
【０１５０】
次に、エレクトロポレーション工程を受けた細胞は、ポリヌクレオチド構成物の存在に関してスクリーニングされ（例えば、マーカーの補助による選択、または、ＰＣＲ、または、電気泳動ゲル上でのＤＮＡのサザン型分析により）、外来のポリヌクレオチド構成物をそれらのゲノムに統合した陽性の細胞を選択することができ、必要に応じて、その後に相同組換え工程を行う。このような技術は、例えば、ＭＡＮＳＯＵＲ等（Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３６：３４８−３５２）により説明される。
次に、陽性と選択された細胞を単離し、クローニングし、３．５日齢のマウス胚盤胞に注入する、これは、ＢＲＡＤＬＥＹ（１９８７、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｈｌｍａｅｒｉｃ ｍｉｃｅ． Ｉｎ：Ｅ． Ｊ． ＲＯＢＥＲＴＳＯＮ（Ｅｄ．， ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ． ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， ｐａｇｅ １１３）で説明される。その胚盤胞を、次に、メスの宿主動物に導入し、所定期間、胎芽を発達させ続けた。
あるいは、陽性に選択されたＥＳ型細胞と、８〜１６の細胞段階（桑実胚）の２．５日齢の胎芽とを接触させ、これは、ＷＯＯＤ等（１９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔａｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ｖｏｌ．９０：４５８２−４５８５）またはＮＡＧＹ等（１９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ｖｏｌ．９０：８４２４−８４２８）により説明されており、ＥＳ細胞は、生殖細胞系を生産する細胞を含む胚盤胞を広範囲に定着させるように取り込まれる。
【０１５１】
次に、その後代を、試験して、ポリヌクレオチド構成物（導入遺伝子）を統合した後代を決定する。
それゆえに、本発明の目的はまた、非ヒトトランスジェニック動物であり、その体細胞および／または生殖細胞は、本発明に係る核酸またはポリヌクレオチド構成物で形質転換されている。
また、本発明は、上述のトランスジェニック動物から得られる組換え宿主細胞に関する。本発明に係るトランスジェニック動物から得られる組換え細胞系は、例えば腫瘍遺伝子を発現するベクターで初代細胞培養をトランスフェクションすることによって、このようなトランスジェニック動物のすべての組織から長期間の培養で確立することができ、例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原であり、例えばＣＨＯＵ（１９８９， Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｖｏｌ． ３：１５１１−１５１４）およびＳＣＨＡＹ等（１９９１， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， ｖｏｌ． １０７２：１−７）で説明されている。
また、本発明は、本発明に係る調節核酸の活性をモジュレートする候補分子または物質をインビボでスクリーニングする方法に関し、当該方法は、以下の工程、ａ）候補物質または分子を、上記で定義されたトランスジェニック動物に投与すること；ｂ）調節核酸の制御下に置かれた所定のレポーターポリヌクレオチドの発現レベルを検出すること；ｃ）ｂ）で得られた結果と、候補物質または分子を取り入れていないトランスジェニック動物で得られた結果とを比較すること、を含む。
【０１５２】
加えて、本発明は、本発明に係る核酸を含む所定のポリヌクレオチドの転写をモジュレートする物質または分子をインビボでスクリーニングする方法に関し、当該方法は、（ａ）候補物質または分子を、上記で定義された非ヒトトランスジェニック哺乳動物に投与すること；（ｂ）工程ａ）で処理されたトランスジェニック哺乳動物中で、所定のポリヌクレオチドの発現を検出すること；および（ｃ）工程（ｂ）の検出結果と、上記で定義された候補物質または分子が投与されていない非ヒトトランスジェニック哺乳動物で観察された結果とを比較すること、からなる工程を含むことを特徴とする。
また、本発明は、本発明に係る調節核酸の活性をモジュレートする候補分子または物質をインビボでスクリーニングするためのキットまたはボックスに関し、当該キットまたはボックスは、ａ）上記で定義されたトランスジェニック動物；ｂ）必要に応じて、所定のレポーターポリヌクレオチドの発現レベルを検出する手段を含む。
【０１５３】
医薬化合物および医薬組成物
また、本発明は、脂質代謝の欠陥、または、免疫系および炎症を含むプロセスの機能障害の予防または治療を目的とした医薬組成物に関する。
第一に、本発明の目的はまた、本発明に係る調節核酸の活性をモジュレートする候補物質または分子である。
最も好ましくは、本発明はまた、本発明に係る調節核酸の活性、最も特定には配列番号１、２、４または５の配列を含む調節核酸の活性を増加させることを特徴とする候補物質または分子に関する。
好ましくは、本発明に係る調節核酸の活性をモジュレートすることができるこのような物質または分子は、上記で定義されたインビトロまたはインビボでのスクリーニング方法のいずれか一つに従って選択された。
従って、脂質代謝または免疫性シグナル伝達に障害を有する被験者は、本発明に係る調節核酸の活性をモジュレートする化合物の有効量をこの被験者に投与することによって処置される。
従って、弱いＡＢＣＡ７プロモーター活性を有する患者は、ＡＢＣＡ７プロモーター活性を増加させるために、上述の分子または物質で処置することができる。
【０１５４】
あるいは、異常に高いＡＢＣＡ７プロモーター活性を有する患者は、ＡＢＣＡ７プロモーター活性を減少またはブロックすることができる化合物で処置することができる。
従って、本発明はまた、医薬品の活性成分として用いられる物質または分子に関する。
このような化合物は、少なくとも１つの転写因子と、ＡＢＣＡ７プロモーターまたは本発明に係る調節核酸の調節要素との相互作用をモジュレートする化合物であり得る。
例えば、当該化合物は、表１に記載された転写因子のいずれか一つと、本発明に係る調節核酸との相互作用を阻害することができる。
【０１５５】
また、当該化合物は、ＡＢＣＡ７プロモーターまたはその後ろに存在する調節要素に結合する転写因子活性をモジュレートする化合物であり得る。
また、本発明に係る治療目的の化合物は、第一の転写因子と第二の転写因子との相互作用をモジュレートする化合物であり得る。
配列番号１、２、４または５の配列に結合できる様々な転写因子の分析で詳細に述べるように、いくつかの転写因子は、他の転写因子と組み合わされた場合のみ活性である。
本発明に係る治療目的の化合物は、好ましくは、核酸、ペプチド、および、低分子物質から選択される。
例えば、このような化合物は、ＡＢＣＡ７プロモーターの一つの領域、または、ＡＢＣＡ７を調節し、プロモーター活性を阻害または減少させる核酸の調節要素に、特異的に結合するアンチセンス核酸であり得る。
【０１５６】
この治療目的の化合物は、アンチセンス核酸と、ＡＢＣＡ７プロモーターに結合する転写因子をコードする遺伝子との相互作用により、この転写因子の生産を減少させ、その転写因子がＡＢＣＡ７プロモーター活性を増加させるか、または減少させるかに応じて、ＡＢＣＡ７プロモーター活性を増加または減少させるような方式で、ＡＢＣＡ７プロモーター活性をモジュレートする転写因子をコードする遺伝子と特異的に相互作用するアンチセンス核酸であり得る。
本発明に係る治療用化合物の毒性および治療効率は、標準的な薬学的プロトコールに従って、培養物または実験動物中の細胞で測定することができ、例えば、致死量ＬＤ５０（すなわち試験された集団の５０％が死亡する用量）、および、有効量ＥＤ５０（すなわち試験された集団の５０％において治療上有効である用量）を測定することができる。
【０１５７】
全ての本発明に係る治療目的の化合物に関して、治療的な有効量は、初めは、細胞培養で行われたインビトロの試験から推定することができる。
また、本発明の目的はは、本発明に係る治療目的の物質または分子の治療的な有効量を含む医薬組成物である。
本発明に係る医薬組成物は、より特定には、脂質代謝の欠損、または、免疫系および炎症を含むメカニズムの欠損の治療および／または予防を目的とする。
このような医薬組成物は、１またはそれ以上の生理学的に許容できるベクターまたは賦形剤を用いる従来の様式で配合することができる。
従って、本発明に係る治療目的の化合物、同様に、それらの生理学的に許容できる塩および溶媒化合物は、注射や吸入により投与するため、または、経口、バッカル、非経口または直腸内投与により投与するために配合することができる。本発明に係る医薬組成物を調製する技術は、当業者により容易に見出すことができ、例えば、Ｒｅｍｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓのマニュアルに見出すことができる。
全身投与のためには、注射が好ましく、例えば筋肉内、静脈内、腹膜内および皮下注射が挙げられる。この場合、本発明に係る医薬組成物は、液剤の形態で配合することができ、好ましくは、生理学的に適合可能な溶液または緩衝液の形態である。
【０１５８】
ヒトＡＢＣＡ７遺伝子の転写の欠陥の検出方法
さらに、本発明の目的は、被験者が、脂質代謝の欠陥に関連した病状、または、免疫系および炎症を含むプロセスの欠陥に関連した病状を発症する危険があるかどうかを決定する方法である。
このような方法は、試験される被験者から得られる生物学的サンプルの細胞において、遺伝子の欠陥の存在または非存在を、発現がＡＢＣＡ７プロモーターで調節される遺伝子の発現が欠陥していることを特徴として、検出することを含む。
例として、前記配列番号１、２、３または６の配列において、ＡＢＣＡ７を調節する核酸の配列における１またはそれ以上のヌクレオチドの欠失の存在、１またはそれ以上のヌクレオチドの添加の存在、または、１またはそれ以上のヌクレオチドの置換の存在を決定する目的でこのような遺伝子の欠陥が検出され得る。
【０１５９】
被験者において、ＡＢＣＡ７遺伝子転写の欠陥を検出する方法の特定の実施形態に従って、遺伝的な欠陥は、配列番号１の配列の全部または部分、あるいは、少なくとも配列番号２の配列の全部または部分の配列解析を含む方法に従って同定される。
配列解析用プライマーは、配列番号１の配列の定義された領域とハイブリダイズするように構築することができる。このような配列解析用プライマーは、好ましくは、配列番号１の配列の約３００〜約５００個のヌクレオチド断片または相補配列断片を増幅するように構築することができる。
次に、例えばＰＣＲ方法によって増幅された断片を、配列解析し、得られた配列を参照の配列番号１の配列と比較することによって、試験された被験者から得られる生物学的サンプルに含まれるＤＮＡからの増幅された配列に、ヌクレオチドの１またはそれ以上の欠失、付加または置換が見出されるかどうかを決定することができる。
【０１６０】
それゆえに、本発明はまた、被験者においてＡＢＣＡ７遺伝子転写の欠陥を検出する方法に関し、当該方法は、以下の工程：
ａ）本発明に係る配列番号１または配列番号２の配列とハイブリダイズする少なくとも１つのヌクレオチドプライマーの補助により増幅可能な核酸断片を配列解析すること、
ｂ）ａ）で得られた配列と、配列番号１または配列番号２の配列とを並べること；
ｃ）参照の配列番号１または配列番号２の配列に対して、前記核酸断片の配列における少なくとも１つのヌクレオチドの１またはそれ以上の欠失、付加または置換の存在を決定すること、
を含む。
【０１６１】
また、本発明は、被験者において、ＡＢＣＡ７遺伝子転写の欠陥を検出するキットまたはボックスに関し、当該キットまたはボックスは、１またはそれ以上の配列解析用プライマーを含み、当該プライマーは、配列番号１の配列の領域とハイブリダイズすることができ、それにより試験される被験者において、ＡＢＣＡ７遺伝子転写の開始部位の上流に位置するポリヌクレオチドの配列解析が可能である。
加えて、本発明の構成部分はまた、配列番号１または配列番号２の配列の領域とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブであり、ここで、配列中の欠陥は、上述の検出方法の実行中に決定されている。
【０１６２】
あるいは、本発明の構成部分はまた、被験者において、少なくとも１つのヌクレオチドの１またはそれ以上の欠失、付加または置換が決定されている、配列番号１または配列番号２の配列の対応する領域と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブである。
このようなオリゴヌクレオチドプローブは、ＡＢＣＡ７遺伝子を調節する配列の欠陥を検出する手段を構成するものであり、それゆえに、脂質代謝の欠陥または免疫系および炎症を含むプロセスにおける機能障害に関連する病状を発症する傾向を検出する手段をも構成する。
【０１６３】
それゆえに、本発明の目的はまた、被験者において、ＡＢＣＡ７遺伝子転写の欠陥を検出するキットまたはボックスであり、当該キットまたはボックスは、
ａ）配列番号１または配列番号２の配列の領域とハイブリダイズする１またはそれ以上のプライマー；
ｂ）必要に応じて、増幅反応を行うのに必要な手段、
を含む。
【０１６４】
本発明の目的はまた、被験者において、ＡＢＣＡ７遺伝子の転写の欠陥を検出するキットまたはボックスであり、当該キットまたはボックスは、
ａ）上記で定義された１またはそれ以上のオリゴヌクレオチドプローブ；
ｂ）必要に応じて、ハイブリダイゼーション反応を行うのに必要な試薬、
を含む。
【０１６５】
本発明の目的はまた、被験者において、ＡＢＣＡ７遺伝子転写の欠陥を検出するキットまたはボックスであり、当該キットまたはボックスは、配列番号１で示される配列または配列番号２の配列の領域とハイブリダイズする１またはそれ以上のプローブを含み、それにより、試験される前記被験者から得られる生体物質において、ＡＢＣＡ７に関するメッセンジャーＲＮＡを定量することを可能にする。
それゆえに、配列番号１〜６のヌクレオチド配列のいずれか一つ由来の核酸断片は、サンプル中に、ＡＢＣＡ７遺伝子を調節するヌクレオチド配列、または、それらの断片もしくは変異体（変異または多型を含む）の少なくとも１つのコピーの存在を検出するのに有用である。
【０１６６】
本発明に係るヌクレオチドプローブまたはプライマーは、配列番号１〜５の配列からなる群より選択された核酸、または、相補配列を有する核酸の、少なくとも８個の連続したヌクレオチドを含む。
好ましくは、本発明に係るヌクレオチドプローブまたはプライマーは、１０、１２、１５、１８または２０〜２５、３５、４０、５０、７０、８０、１００、２００、５００、１０００、１５００の、本発明に係る核酸の、特に配列番号１〜５の配列から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸の、連続したヌクレオチドの長さを有する。
【０１６７】
あるいは、本発明に係るヌクレオチドプローブまたはプライマーは、１２、１５、１８、２０、２５、３５、４０、５０、１００、２００、５００、１０００、１５００の本発明に係る核酸の、より特定には配列番号１〜５の配列から選択される核酸の、または、相補配列を有する核酸の、連続したヌクレオチドの長さを有する断片からなる、および／または、それを含む。
それゆえに、本発明に係るヌクレオチドプローブまたはプライマーの定義は、上記で定義された高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１〜５、６または８の配列から選択される核酸、または、それらの相補配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。
【０１６８】
ＡＢＣＡ７遺伝子の様々な領域を増幅することのできるプライマーおよびプライマー対の例を、以下に示す。
例えば、配列番号９の配列を有するプライマー：ＡＧＣＣＡＧＣＡＡＣＧＣＡＡＴＣＣＴＣＣ、および、配列番号１０の配列を有するプライマー：ＣＧＣＡＣＣＡＴＧＴＣＡＡＴＧＡＧＣＣＣにより示されるプライマー対を含む。
【０１６９】
本発明に係るヌクレオチドプライマーまたはプローブを、当業者周知のすべての適切な方法によって調製することができ、例えば、クローニングや制限酵素の作用によって、または、例えば、Ｎａｒａｎｇ等（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９７９）６８：９０−９８）もしくはＢｒｏｗｎ等（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９７９）６８：１０９−１５１）によるホスホジエステル方法、Ｂｅａｕｃａｇｅ等（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ（１９８０）２２：１８５９−１８６２）によるジエチルホスホラミデート方法のような技術による直接的な化学合成によって、または、特許ＥＰ０，７０７，５９２に記載の固体支持体に関する技術によって調製できる。
【０１７０】
上述のオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーを含む本発明に係る核酸のいずれかを、必要に応じて、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的な手段によって検出可能なマーカーを取り込ませることによって、標識することができる。
例えば、このようなマーカーとしては、放射性アイソトープ（３２Ｐ、３３Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ）、蛍光性分子（５−ブロモデオキシウリジン、フルオレセイン、アセチルアミノフルオレン、ジゴキシゲニン）、または、リガンド、例えばビオチンが挙げられる。
【０１７１】
プローブの標識化は、好ましくは、プライマーの伸長により標識した分子をポリヌクレオチドに取り込むこと、または、５′もしくは３′末端への付加、または、「ニックトランスレーション」により実行される。
核酸断片の非放射性の標識化の例は、特に、フランス国特許第７８１０９７５号、または、Ｕｒｄｅａ等（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ（１９８８）１１：４９３７−４９５７）またはＳａｎｃｈｅｚ−ｐｅｓｃａｄｏｒ等（Ｊ． Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９８８）２６（１０）１９３４−１９３８）による論文に記載される。
有利に、本発明に係るプローブは、シグナルを増幅させるタイプの構造的な特徴を有してもよく、例えば、Ｕｒｄｅａ等（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｌｏｌ．，（１９９１）６：７１６−７１８）、あるいは、欧州特許第ＥＰ０，２２５，８０７号（ＣＨＩＲＯＮ）に記載されたプローブがある。
【０１７２】
本発明に係るオリゴヌクレオチドプローブは、特にゲノムＤＮＡを用いたサザン型ハイブリダイゼーション、あるいは、ＲＮＡを用いたノーザン型ハイブリダイゼーションにおいて用いることができる。
本発明に係るプローブは、ＰＣＲ増幅産物の検出、あるいは、ミスマッチ検出に用いることができる。
本発明に係るヌクレオチドプローブまたはプライマーは、固体支持体に固定することができる。このような固体支持体は当業者周知であり、マイクロタイタープレートのウェル表面、ポリスチレンベッド、磁気ベッド、ニトロセルロースバンド、または、超微粒子（例えばラテックス粒子）が挙げられる。
【０１７３】
その結果として、本発明はまた、サンプル中に上述の核酸の存在を検出する方法に関し、当該方法は、工程：
１）１またはそれ以上の本発明に係るヌクレオチドプローブと、試験されるサンプルとを接触させること；
２）プローブとサンプル中に存在する核酸とで形成され得る複合体を検出すること、
を含む。
【０１７４】
本発明に係る検出方法の特定の実施形態に従って、上記オリゴヌクレオチドプローブは、支持体に固定される。
他の観点に従って、上記オリゴヌクレオチドプローブは、検出可能なマーカーを含む。
【０１７５】
加えて、本発明は、サンプル中で、本発明に係る核酸の存在を検出するためのボックスまたはキットに関し、当該ボックスは、
ａ）１またはそれ以上の上述のヌクレオチドプローブ；
ｂ）必要に応じて、ハイブリダイゼーション反応に必要な試薬、
を含む。
【０１７６】
第一の観点に従って、上記検出ボックスまたはキットは、プローブが支持体に固定されることを特徴とする。
第二の観点に従って、上記検出ボックスまたはキットは、オリゴヌクレオチドプローブが検出可能なマーカーを含むことを特徴とする。
上述の検出キットの特定の実施形態に従って、このようなキットは、本発明に係る多数のオリゴヌクレオチドプローブを含み、当該オリゴヌクレオチドプローブは、所定の標的配列を検出すること、あるいは、本発明に係る核酸、より特定には、配列番号１〜５、６および８の配列を有する核酸、または、相補配列を有する核酸のコーディング領域もしくは非コーディング領域における変異を検出することに、用いることができる。
【０１７７】
従って、支持体に固定された本発明に係るプローブは、「ＤＮＡチップ」のようなマトリックスに並べることができる。このように並べられたマトリックスは、特に、米国特許第５，１４３，８５４号、ＰＣＴ出願ＷＯ９０／１５０７０および９２／１００９２に記載されている。
オリゴヌクレオチドプローブが高密度に固定された支持体マトリックスは、例えば、米国特許第５，４１２，０８７号およびＰＣＴ出願ＷＯ９５／１１９９５に記載される。
【０１７８】
本発明に係るヌクレオチドプライマーは、本発明に係る核酸のいずれか一つ、より特定には、配列番号１〜５の配列を有する核酸の全部または部分、あるいは、それらの変異形を増幅するのに用いることができる。
本発明の他の目的は、サンプル中に含まれる、本発明に係る核酸、より特定には、配列番号１〜５の配列を有する核酸、または、それらの断片もしくは変異形を増幅する方法に関し、前記方法は、
ａ）増幅反応に必要な試薬の存在下で、標的核酸の存在が疑われるサンプルと、ヌクレオチドプライマー対とを接触させること、ここで当該ヌクレオチドプライマー対のハイブリダイゼーション位置は、それぞれ増幅が検索される標的核酸の領域の５′側および３′側に位置し：および、
ｂ）増幅された核酸を検出すること、
からなる工程を含む。
【０１７９】
上記で定義された増幅方法を実行するために、上述のヌクレオチドプライマーのいずれか一つを有利に用いることができる。
加えて、本発明の目的は、本発明に係る核酸、より特定には、配列番号１〜５の配列を有する核酸の全部または部分を増幅するためのボックスまたはキットであり、前記ボックスまたはキットは、
ａ）本発明に係るヌクレオチドプライマー対、ここで当該ヌクレオチドプライマー対のハイブリダイゼーション位置は、それぞれ増幅が検索される標的核酸の５′側および３′側に位置し；
ｂ）必要に応じて、増幅反応に必要な試薬
を含む。
このような増幅ボックスまたはキットは、有利には、少なくとも１対の上述のヌクレオチドプライマー対を含む。
下記の図面および実施例によりさらに本発明を説明するが、これらに限定されない。
【０１８０】
実施例：
実施例１：ＡＢＣＡ７に関するｃＤＮＡの５′末端の決定
ＲＴ−ＰＣＲ（ＲＡＣＥ）によるｍＲＮＡ末端の増幅を、ＳＭＡＲＴ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ増幅キット（クロンテック社， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を用いて行った。ヒト脾臓組織から抽出された（ポリＡ）ｍＲＮＡをテンプレートとして用いて、製造者説明書に従ってＳＭＡＲＴ５′ｃＤＮＡライブラリーを作製した。第一の増幅プライマーと内部プライマーとをｃＤＮＡ配列から選択した。ＰＣＲ増幅のための内部プライマーを用いてなされた増幅物をクローニングした。次に、特定のクローンをプライマーを用いて増幅し、ここで当該プライマーの配列は、それぞれ（ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ）および（ＧＣＣＡＧＴＧＴＧＡＴＧＧＡＴＡＴ）であり、続いて、２つのストランドを配列解析した。最終的に、以下のプライマー、ＡＢＣＡ７Ｌ１：ＧＣＧＧＡＡＡＧＣＡＧＧＴＧＴＴＧＴＴＣＡＣ（配列番号１１）およびＡＢＣＡ７Ｌ２：ＣＧＡＴＧＧＣＡＧＴＧＧＣＴＴＧＴＴＴＧＧ（配列番号１２）を用いて、ヒトＡＢＣＡ７ｃＤＮＡの末端を同定した。
【０１８１】
実施例２：ヒトおよびマウスＡＢＣＡ７遺伝子のプロモーターの分析
以下の３つのソフトウェアパッケージ：ＴＳＳＧおよびＴＳＳＷ（Ｓｏｌｏｖｙｅｖ ｅｔ ａｌ．， Ｉｓｍｂ（１９９７）５， ２９４−３０２）およびＮＮＰＰ（Ｒｅｅｓｅ ＭＧ， ｅｔ ａｌ．， １９９９）を用いて、転写開始部位をＡＢＣＡ７に関するヒトおよびマウス遺伝子のプロモーター上に設置した。ヒトおよびマウス転写因子の結合部位を、モチーフ検索用のＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒプログラム（Ｑｕａｎｄｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９５）２３（２３）４８７８−８４）を用いて予測した。転写因子の各結合部位に関するスコア計算を、式：（Ｏｆ−Ｔｆ）／（Ｔｆ）１／２を用いて行い、当該式中、Ｏｆは、モチーフが観察された頻度であり、Ｔｆは、コンセンサスモチーフの計算された頻度である。関連がないと思われるモチーフを分離するため、第一のフィルトレーション工程を、上記のＭａｔｌｎｓｐｅｃｔｏｒプログラム「テンプレート類似性」スコアを０．８５に、上記の「コア類似性」スコアを０．９９に調節することにより行った。最終的に、類似したモチーフを有する部位を含む転写モジュール、および、ヒトおよびマウス両方の配列における、ＡＢＣＡ７遺伝子の上流の配列の存在を定義するために、Ｗｅｒｎｅｒ Ｔ（Ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ， Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ（１９９９）１０：１６８−１７５）で説明されたように、種間のプロモーターの比較分析を行った。
【０１８２】
実施例３：造血組織における、好ましいヒトおよびマウスＡＢＣＡ７遺伝子の発現
本発明に係るポリヌクレオチドの発現の特徴を、逆転写ＰＣＲおよびノーザンブロット分析のプロトコールに従って測定し、これらプロトコールは、特にＳａｍｂｒｏｏｋ等（ｒｅｆ． ＣＳＨ Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．（１９８９）．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，” ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ．）で説明される。
例えば、逆転写による分析の場合、プライマー対を、ヒトおよびマウスＡＢＣＡ７遺伝子の各完全長ｃＤＮＡから合成し、対応するｃＤＮＡを検出した。これらプライマーの配列を、表４に示す。
レトロ転写（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）されたポリＡ＋ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡテンプレートに関して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う。ｃＤＮＡへの逆転写は、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＩＩ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）という酵素を用い、製造者により説明された条件に従って行われる。
【０１８３】
ポリメラーゼ連鎖反応は、２５ｎｇのｃＤＮＡ調製物を含む２０μｌの反応混合物中で、標準的な条件で行われる。その反応混合物は、４００μＭの各ｄＮＴＰ、２ユニットのＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ；パーキンエルマー社製）、０．５μＭの各プライマー、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、およびＰＣＲ緩衝液からなる。パーキンエルマー社製の９７００サーモサイクラーで、９４℃で１０分間の第一の変性工程の後に、３０サイクルのＰＣＲ（９４℃で３０秒の変性、３０秒のアニーリング（３０サイクル中、以下のように分けられる：６４℃で２サイクル、６１℃で２サイクル、５８℃で２サイクル、および、５５℃で２８サイクル）、ならびに、７２℃で１キロベースあたり１分の伸長）を行う。ＰＣＲ反応は、電気泳動によりアガロースゲル上で可視化される。得られたｃＤＮＡ断片は、ノーザンブロット分析のプローブとして用いることができ、ポリヌクレオチド配列の正確な決定に用いることができる。
【０１８４】
ノーザンブロット分析の場合、上述のように作製されたｃＤＮＡプローブは、ＤＮＡ標識化システムのＨｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ（ベーリンガー社製）により製造者による説明書に従って、３２Ｐで標識される。標識した後、そのプローブを、セファデックスＧ５０マイクロカラム（ファルマシア社製）を用いて製造者による説明書に従って精製する。次に、標識した精製プローブは、様々な組織におけるｍＲＮＡの発現の検出に用いられる。
【０１８５】
様々なヒト組織のＲＮＡサンプル、参照サンプル（ヒトＩＩ、７７５９−１、ヒト７７６０−１、およびヒト胎児ＩＩ７７５６−１、クロンテック社製）を含むノーザンブロット（複数の組織のノーザンまたはＭＴＮ）を、指定された特定のＡＢＣＡ７に関する標識プローブ（２６３７〜４８８１ｂｐ）でハイブリダイズする。
ハイブリダイゼーションおよび洗浄後のプロトコールは、製造者により説明されたプロトコール（取り扱い説明書ＰＴ１２００−１）を直接用いても、または、当業者既知の方法を用いたこのプロトコールを適用してもよく、例えばＦ． Ａｕｓｕｂｅｌ等（Ｃｕｒｒｅｎｔｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ ＮＹ（１９８９））により説明されている。従って、例えば、ホルムアミドの存在下で、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション温度を変化させることができる。
【０１８６】
例えば、以下のプロトコールを用いることができる：
１−メンブレンの競合およびプレハイブリダイゼーション；
４０μｌのサケ精子ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）＋４０μｌのヒト胎盤ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を混合する、
９６℃で５分間変性させ、次にその混合物を氷に浸す、
２×ＳＳＣを除去し、４ｍｌのホルムアミドミックスを、メンブレンを含むハイブリダイゼーションチューブに注ぐ、
２種の変性ＤＮＡの混合物を加える、
４２℃で５〜６時間、回転させながらインキュベーションする。
２−標識プローブの競合：
標識した精製プローブに、反復配列の量に応じて１０〜５０μｌのＣｏｔＩ　ＤＮＡを加える、
９５℃で７〜１０分間変性させる、
６５℃で２〜５時間インキュベートする。
【０１８７】
３−ハイブリダイゼーション：
プレハイブリダイゼーションミックスを除去する、
４０μｌのサケ精子ＤＮＡ＋４０μｌのヒト胎盤ＤＮＡを混合し、９６℃で５分間変性させ、次に氷に浸す、
ハイブリダイゼーションチューブに、４ｍｌのホルムアミドミックス、２種のＤＮＡと変性した標識プローブ／ＣｏｔＩ　ＤＮＡとの混合物を加える、
４２℃で１５〜２０時間、回転させながらインキュベートする。
４−洗浄：
室温で２×ＳＳＣで１回洗浄することによりリンスする、
２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳとで、室温で５分間、２回洗浄する、
０．１×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳとで、６５℃で１５分間、２回洗浄する。
ハイブリダイゼーションおよび洗浄後、一晩露光させた後、Ｓｔｏｒｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）の補助により露出させたリンスクリーン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｓｃｒｅｅｎ）と接触させることによってブロットを分析する。
【０１８８】
図５に示された結果によれば、マウスＡＢＣＡ７遺伝子が成体組織で発現されたことがわかる。
より大量のマウスＡＢＣＡ７ｍＲＮＡを、造血組織（例えば脾臓および胸腺）で検出し、その結果は、骨髄単球性の系およびリンパ球性の系で観察されたＡＢＣＡ７の発現と一致する。線維芽細胞系の細胞系では、ＡＢＣＡ７遺伝子の発現は検出されなかった。
図４は、類似しているが胎児性肝臓において、強いハイブリダイゼーションシグナルを有するヒトＡＢＣＡ７遺伝子の発現パターンを示す。
【０１８９】
実施例４：脂質代謝の機能障害、または、炎症シグナル伝達の機能障害に関する遺伝子発現特性の分析
ＡＢＣＡ７遺伝子の発現レベルの欠陥の検証を、以下に説明される方法に従って、これらの配列と、罹患した、またはしていない被験者の造血組織から得られるｍＲＮＡに対応するプローブとをハイブリダイゼーションさせることによって測定することができる。
１．トータルＲＮＡ、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡプローブの調製
トータルＲＮＡは、グアニジンイソチオシアネート方法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８７）１６２：１５６−１５９）により、正常な被験者または高度に罹患した被験者の造血組織から得られる。
ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡは、オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムによるアフィニティークロマトグラフィーにより得られ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−ｍａｎｕａｌ． ２ｅｄ． Ｃｏｌｄ． Ｓｐｒｉｎｇ− Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、プローブとして用いられるｃＤＮＡは、蛍光性の製品（アマシャムファルマシアバイオテク社製の、ＣｙＤｙｅ：登録商標）で標識されたオリゴヌクレオチドを用いたＲＴ−ＰＣＲにより得られる（ＤｅＲｉｓｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７８：６８０−６８６）。
２．ハイブリダイゼーションおよび発現の検出レベル
本発明に係るＡＢＣＡ７遺伝子に対応する配列を含むスライドガラスを、分析される細胞のメッセンジャーＲＮＡから調製されたヌクレオチドプローブでハイブリダイズする。アマシャム社製の分子力学的システム（Ａｖａｌａｎｃｈｅ Ｍｉｃｒｏｓｃａｎｎｅｒ：登録商標）の使用により、健康な細胞型または罹患した細胞型における配列の生産物の発現を微分的に定量化することができる。
【０１９０】
実施例５：ＡＢＣＡ７遺伝子の発現を活性化または阻害する分子のスクリーニングを目的とした試験
スクリーニング試験により、ＡＢＣＡ７タンパク質を合成する活性をモジュレートすることができる配列を同定することが可能である。
５．１　ヒトＡＢＣＡ７遺伝子を調節する核酸を含む発現プラスミドの構築
ヒトＡＢＣＡ７遺伝子を調節する核酸の、転写開始部位に対して−１１１１位のヌクレオチドから−１位のヌクレオチドの範囲の領域を、上述の領域に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ技術によって、ヒトＢＡＣベクターコレクションのＢＡＣベクターに存在するヒトゲノムＤＮＡから増幅することができる。
増幅されたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＳａｌ１で消化し、続いて、Ｎｏｒｄｅｅｎ等により説明されたベクターＰＸＰ１（Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， （１９８８）６：４５４−４５７）に、このベクターのＳａｌ１制限部位のレベルで挿入する。次に、挿入部分を配列解析した。
【０１９１】
５．２　細胞培養およびトランスフェクション
ＣＨＯまたはＨＥＬＡ系細胞（ＡＴＣＣ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ， ＵＳＡ）を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ， Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， ＭＤ）を添加したＥ−ＭＥＭ培地（Ｅａｒｌｅ’ｓ塩を含む最小必須培地）中で培養した。約１．５×１０５細胞を、１２−ウェル培養プレート（２．５ｃｍ）の各ウェルに分配し、約５０〜７０％の集団になるまで培養し、１μｇのプラスミドＳａｌ−Ｌｕｃｉｆおよび０．５μｇのコントロールベクターｐＢｅｔａｇａｌ（クロンテックラボラトリーズ社， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）で、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔｉｎ試薬キット（キアゲン社， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて共形質転換した。ＤＮＡ添加後２時間で、培養液を除去し、完全ＡＭＥＭ培地（最小必須培地のＥａｇｌｅ’ｓアルファ改変）で置き換える。２０時間後、細胞を、様々な濃度の分子の存在または非存在下で、２μｇ／ｍｌのグルタミン、１００ユニット／ｍｌのストレプトマイシンおよび０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、フラクションＶ）を添加したＤＭＥＭ型（ダルベッコ最小必須培地）の新鮮培地で置き換える。
【０１９２】
最後の培地交換後１６時間してから、Ｔｒｏｐｉｘルシフェラーゼ分析キット（Ｔｒｏｐｉｘ社， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ， ＵＳＡ）から得られるリシス溶液を用いて細胞を回収する。細胞の溶解産物をアリコートフラクションに分配し、これは、ＭｉｃｒｏＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ社， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ， ＵＳＡ）を用いてタンパク質を定量するのに用いられ、同様に、ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼの生産を、それぞれＴｒｏｐｉｘルシフェラーゼ分析キットおよびＧａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ Ｐｌｕｓキットを用いて定量するのに用いられる。製造者の推奨に従って試験を行う。次に、ＡＢＣＡ７プロモーターに関して活性な分子を、「ルシフェラーゼ活性／β−ガラクトシダーゼ活性」の割合に応じて選択する。
【０１９３】
実施例６：インサイチュハイブリダイゼーション実験
パラフィン中の関連のある組織サンプルを、放射性標識した相補ＲＮＡプローブとハイブリダイズさせた。より正確には、ＮＭ−０１９１１２と示されるＧｅｎＢａｎｋ配列のヌクレオチド５９４〜ヌクレオチド１０５５の範囲のヌクレオチド配列に対応するＡＢＣＡ７遺伝子の断片を、プラスミドｐＣＲＩＩ（インビトロジェン社）にサブクローニングした。
次に、３５Ｓウリジン三リン酸で標識したアンチセンスＲＮＡプローブをＲＮＡポリメラーゼＳＰ６およびＴ７を用いて生成させ、次に、様々な組織切片とハイブリダイズさせた。
【０１９４】
様々な組織切片をプロテイナーゼＫで消化し、約３．５×１０７ｄｐｍ／ｍｌと等しい濃度の上述のプローブと、６５℃で１８時間ハイブリダイズさせた。次に、そのスライドをＲＮＡアーゼＡで処理し、０．１×ＳＳＣで７０℃で２時間洗浄し、コダック社製ＮＴＢ−２写真乳剤でコーティングし、４℃で７日間露光し、次に、コダック社製Ｄ−１９溶液を用いて可視化した。
最終的に、それらをヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、そのイメージを、ニコン社製顕微鏡と連結させたＤＶＣデジタルフォトカメラを用いて作製した。
【０１９５】
図６は、膝下を切断し、動脈硬化と急性炎症に罹った９２歳男性の動脈の断面図である。血栓および外膜への炎症性の浸潤の部位において、マクロファージの弱い特異的標識化がみられる。
図７は、６３歳の喘息の女性の病理解剖で得られた気管支の断面図であり、粘膜下の炎症性の浸潤における、リンパ球およびマクロファージの弱い標識化がみられる。
図８は、クローン病の臨床診断を示す８１歳女性の手術中に得られた結腸の断面図である。粘膜固有層における、マクロファージおよびリンパ球のサブファミリーの標識化が観察される。
図９は、４８歳男性の手術中に得られたリンパ節の断面図に相当する。反応性胚芽中心において、神経節の細胞の標識化は弱く、また単離されたマクロファージも、リンパ節中で標識される。
図１０は、リウマチ様関節炎の臨床診断を示す２５歳女性の滑膜の断面図を示し、滑膜下（ｓｕｂｓｙｎｏｖｉａｌ）の組織球およびマクロファージの強い標識化を示す。
図１１は、乾癬に罹った５５歳女性のバイオプシーで得られた皮膚の断面図を示し、血管周辺の炎症性の浸潤におけるマクロファージの中程度の標識化を示す。血管周辺で単離されたリンパ球も標識される。
【０１９６】
【表１】
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【０１９７】
【表２】
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【０１９８】
【表３】
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【０１９９】
【表４】
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【０２００】
【表５】
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【０２０１】
【表６】
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【０２０２】
【表７】
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【０２０３】
【表８】
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【０２０４】
【表９】
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【０２０５】
【表１０】
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【０２０６】
【表１１】
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【０２０７】
【表１２】
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【０２０８】
【表１３】
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【０２０９】
【表１４】
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【０２１０】
【表１５】
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【０２１１】
【表１６】
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【０２１２】
【表１７】
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【０２１３】
【表１８】
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【０２１４】
【表１９】
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【０２１５】
【表２０】
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【０２１６】
【表２１】
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【０２１７】
【表２２】
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【０２１８】
【表２３】
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【０２１９】
【表２４】
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【０２２０】
【表２５】
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【０２２１】
【表２６】
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【０２２２】
【表２７】
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【０２２３】
【表２８】
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【０２２４】
【表２９】
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【０２２５】
【表３０】
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【０２２６】
【表３１】
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【０２２７】
【表３２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
ヒトおよびマウスで見出されたＡＢＣＡ７遺伝子のプロモーター領域における転写因子部位を示す図式的な説明である。
【図２Ａ】
配列番号１の配列を示し、様々な転写因子に結合する各特徴的なユニットの位置は太字で示し、対応する配列に特異的な転写因子の記号表示は、そのヌクレオチド配列の上に示す。
【図２Ｂ】
図２Ａの続きである。
【図３Ａ】
配列番号４の配列を示し、様々な転写因子に結合する各特徴的なユニットの位置は太字で示し、対応する配列に特異的な転写因子の記号表示は、そのヌクレオチド配列の上に示す。
【図３Ｂ】
図３Ａの続きである。
【図４】
配列番号９および１０のプライマーを用いて作製されたアンプライマー（表４）とハイブリダイズした、様々な成体および胎児組織のノーザンブロット（クロンテック社）上のヒトＡＢＣＡ７遺伝子の発現パターンを示す。
【図５】
マウス転写物に特異的なプライマーを用いて作製されたアンプライマーとハイブリダイズした様々な成体組織のノーザンブロット上のマウスＡＢＣＡ７遺伝子の発現パターンを示す。
【図６】
炎症を起こした動脈の断面図における、ＡＢＣＡ７タンパク質をコードする遺伝子の発現のプロフィールを、ＡＢＣＡ７アンチセンスプローブとのインサイチュハイブリダイゼーションにより示す。
【図７】
喘息患者の気管支チューブの断面図における、ＡＢＣＡ７タンパク質をコードする遺伝子の発現のプロフィールを、ＡＢＣＡ７アンチセンスプローブとのインサイチュハイブリダイゼーションにより示す。
【図８】
クローン病に罹った患者の結腸の断面図における、ＡＢＣＡ７タンパク質をコードする遺伝子の発現のプロフィールを、ＡＢＣＡ７アンチセンスプローブとのインサイチュハイブリダイゼーションにより示す。
【図９】
リンパ節の断面図における、ＡＢＣＡ７タンパク質をコードする遺伝子の発現のプロフィールを、ＡＢＣＡ７アンチセンスプローブとのインサイチュハイブリダイゼーションにより示す。
【図１０】
リウマチ様関節炎に罹った患者の滑膜の断面図における、ＡＢＣＡ７タンパク質をコードする遺伝子の発現のプロフィールを、ＡＢＣＡ７アンチセンスプローブとのインサイチュハイブリダイゼーションにより示す。
【図１１】
乾癬に罹った患者の皮膚の断面図における、ＡＢＣＡ７タンパク質をコードする遺伝子の発現のプロフィールを、ＡＢＣＡ７アンチセンスプローブとのインサイチュハイブリダイゼーションにより示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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