(57)【要約】化学リンカーを介して共有結合的に連結された２つのヒトＧｌｘＩインヒビターを含む化合物が提供される。上記２つのヒトＧｌｘＩインヒビターのそれぞれは、同じであっても異なっていてもよく、Ｓ置換グルタチオンまたはＳ置換グルタチオンプロドラッグである。上記ＧｌｘＩインヒビターは、それぞれγ−グルタミルアミノ基を有し、上記化学リンカーは、上記γ−グルタミルアミノ基を介して各ＧｌｘＩインヒビターに共有結合し、上記化学リンカーは、少なくとも５０オングストロームの長さを有する。ヒトＧｌｘＩの一価の不可逆的失活剤もまた提供される。上に記載の化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含有する抗新生物組成物が提供される。新生物細胞および／または腫瘍の成長および増殖を防ぐか、または阻害する、インビトロならびにインビボの方法もまた提供される。
2006526632.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物であって、
化学リンカーを介して共有結合される２つのヒトＧｌｘＩインヒビターを含み、該２つのヒトＧｌｘＩインヒビターの各々は、同じであっても異なっていてもよく、Ｓ−置換グルタチオンまたはＳ−置換グルタチオンプロドラッグであり、
該ＧｌｘＩインヒビターは、各々、γ−グルタミルアミノ基を有し、
該化学リンカーは、該γ−グルタミルアミノ基を介して各々のＧｌｘＩインヒビターに共有結合され、そして該化学リンカーは、少なくとも５０オングストロームの長さを有する、化合物。
【請求項２】
前記化学リンカーは、少なくとも７０オングストロームの長さを有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記化学リンカーは、ポリエチレングリコール、ポリ−アラニル、アルキル、アミドおよびエステルからなる群より選択されるメンバーを含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記ポリ−アラニルは、（β−Ａｌａ）５〜７である、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
前記化学リンカーは、式：
（Ｚ１）ａ−（Ｚ２）ｂ−（Ｚ３）ｃ
によって表され、
ここで、Ｚ１、Ｚ２およびＺ３は、同じであっても異なっていてもよく、各々、以下：
Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｄＮＨ、
ＣＯ（ＣＨ２）ｅＣ（Ｏ）、
（ＣＨ２ＣＨ２）ｆＮＨＣ（Ｏ）、
（ＣＨ２ＣＨ２）ｇ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ、
（ＣＨ２）ｈＣ（Ｏ）（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｊＣ（Ｏ）、
ＮＨ（ＣＨ２）ｋ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｌ−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮＨ、
（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｏＮＨ（Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｐＮＨｑＣ（Ｏ）−アルキル、および
Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｒＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｓＣ（Ｏ）（ＮＨＣＨ２ＣＨ２）ｔＮＨ（Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｕＮＨ）ｖＣ（Ｏ）−アルキル
からなる群より選択され、
ここで、下付き文字ａ〜ｖは、独立して、１〜２０である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
前記２つのヒトＧｌｘＩインヒビターのうちの少なくとも１つは、ヒトＧｌｘＩの可逆的競合的インヒビターである、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
前記可逆的競合的インヒビターは、Ｓ−（Ｎ−アリール／アルキル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオンである、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
前記可逆的競合的インヒビターは、以下：
Ｓ−（Ｎ−ｐ−クロロフェニル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン、
Ｓ−（４−クロロフェニル−Ｎ−ヒドロキシフェニル）グルタチオン、
Ｓ−（Ｎ−ｐ−ブロモフェニル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン、
Ｓ−（４−ブロモフェニル−Ｎ−ヒドロキシフェニル）グルタチオン、
Ｓ−（Ｎ−ｐ−ヨードフェニル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン、
Ｓ−（Ｎ−フェニル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン、
Ｓ−ｐ−ブロモベンジル−グルタチオン、
Ｓ−（Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−メチルカルバモイル）グルタチオン、
Ｓ−（Ｎ−メチル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン、
Ｓ−（Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン、
Ｓ−（Ｎ−プロピル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン、
Ｓ−（Ｎ−ブチル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン、
Ｓ−（Ｎ−ペンチル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン、および
Ｓ−（Ｎ−ヘキシル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン
からなる群より選択される、請求項６に記載の化合物。
【請求項９】
前記２つのヒトＧｌｘＩインヒビターのうちの少なくとも１つは、ヒトＧｌｘＩの不可逆的失活剤である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
前記ヒトＧｌｘＩの不可逆的失活剤は、Ｓ−（ブロモアセトキシブチルアセトキシ）グルタチオンまたはＳ−（ブロモアセトキシプロピルアセトキシ）グルタチオンである、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
前記プロドラッグは、ジエチルエステルＳ−置換グルタチオンプロドラッグもしくはモノエチルエステルＳ−置換グルタチオンプロドラッグ、ジｎ−プロピルエステルＳ−置換グルタチオンプロドラッグもしくはモノｎ−プロピルエステルＳ−置換グルタチオンプロドラッグ、ジイソプロピルエステルＳ−置換グルタチオンプロドラッグもしくはモノイソプロピルエステルＳ−置換グルタチオンプロドラッグ、およびジシクロペンチルエステルＳ−置換グルタチオンプロドラッグもしくはモノシクロペンチルエステルＳ−置換グルタチオンプロドラッグからなる群より選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
前記２つのヒトＧｌｘＩインヒビターのうちの少なくとも１つは、ヒトＧｌｘＩＩによって加水分解される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
請求項１に記載の化合物であって、該化合物は、以下の式：
【化１】
2006526632.tif 000032
によって表され、
Ｌは、式（Ｚ１）ａ−（Ｚ２）ｂ−（Ｚ３）ｃによって表される化学リンカーであり、ここで、
Ｚ１、Ｚ２およびＺ３は、同じであっても異なっていてもよく、各々、以下：
Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｄＮＨ、
ＣＯ（ＣＨ２）ｅＣ（Ｏ）、
（ＣＨ２ＣＨ２）ｆＮＨＣ（Ｏ）、
（ＣＨ２ＣＨ２）ｇ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ、
（ＣＨ２）ｈＣ（Ｏ）（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｊＣ（Ｏ）、
ＮＨ（ＣＨ２）ｋ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｌ−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮＨ、
（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｏＮＨ（Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｐＮＨ）ｑＣ（Ｏ）−アルキル、および
Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｒＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｓＣ（Ｏ）（ＮＨＣＨ２ＣＨ２）ｔＮＨ（Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｕＮＨ）ｖＣ（Ｏ）−アルキル
からなる群より選択され、
ここで、下付き文字ａ〜ｖは、独立して、１〜２０であり；
ここで、Ｒ１は、水素あるいは以下：
（１）ハロゲンまたはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換されたアルキル（Ｃ１〜Ｃ１８）；
（２）ハロゲン、アルキル（Ｃ１〜Ｃ１８）またはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換されたシクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ８）；
（３）ハロゲン、アルキル（Ｃ１〜Ｃ１８）またはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換されたシクロアルケニル（Ｃ５〜Ｃ７）；および
（４）ハロゲン、アルキル（Ｃ１〜Ｃ１８）またはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換されたアリール（Ｃ６〜Ｃ２０）
からなる群より選択されるメンバーであり、
ここで、Ｒ２およびＲ３は、同じであっても異なっていてもよく、各々、以下：
（１）ハロゲンまたはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換されたアルキル（Ｃ１〜Ｃ１８）；
（２）ハロゲン、アルキル（Ｃ１〜Ｃ１８）またはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換されたシクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ８）；
（３）ハロゲン、アルキル（Ｃ１〜Ｃ１８）またはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換されたシクロアルケニル（Ｃ５〜Ｃ７）；および
（４）ハロゲン、アルキル（Ｃ１〜Ｃ１８）またはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換されたアリール（Ｃ６〜Ｃ２０）
からなる群より選択される、化合物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の化合物であって、Ｒ２およびＲ３は、同じであっても異なっていてもよく、各々、以下：
（１）ハロゲンまたはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ１０）で必要に応じて置換されたアルキル（Ｃ６〜Ｃ１０）；
（２）ハロゲン、アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）またはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ１０）で必要に応じて置換されたシクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ８）；
（３）ハロゲン、アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）またはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ１０）で必要に応じて置換されたシクロアルケニル（Ｃ６〜Ｃ７）；および
（４）ハロゲン、アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）またはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ１０）で必要に応じて置換されたアリール（Ｃ６〜Ｃ１２）
からなる群より選択される、化合物。
【請求項１５】
請求項１に記載の化合物であって、該化合物は、以下の式：
【化２】
2006526632.tif 000033
によって表され、
Ｌは、式（Ｚ１）ａ−（Ｚ２）ｂ−（Ｚ３）ｃによって表される化学リンカーであり、ここで、
Ｚ１、Ｚ２およびＺ３は、同じであっても異なっていてもよく、各々、以下：
Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｄＮＨ、
ＣＯ（ＣＨ２）ｅＣ（Ｏ）、
（ＣＨ２ＣＨ２）ｆＮＨＣ（Ｏ）、
（ＣＨ２ＣＨ２）ｇ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ、
（ＣＨ２）ｈＣ（Ｏ）（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｊＣ（Ｏ）、
ＮＨ（ＣＨ２）ｋ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｌ−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮＨ、
（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｏＮＨ（Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｐＮＨｑＣ（Ｏ）−アルキル、および
Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｒＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｓＣ（Ｏ）（ＮＨＣＨ２ＣＨ２）ｔＮＨ（Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｕＮＨ）ｖＣ（Ｏ）−アルキル
からなる群より選択され、
ここで、下付き文字ａ〜ｖは、独立して、１〜２０であり；
ここで、Ｒ１は、水素または以下：
（１）ハロゲンまたはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換されたアルキル（Ｃ１〜Ｃ１８）；
（２）ハロゲン、アルキル（Ｃ１〜Ｃ１８）またはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換されたシクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ８）；
（３）ハロゲン、アルキル（Ｃ１〜Ｃ１８）またはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換されたシクロアルケニル（Ｃ５〜Ｃ７）；および
（４）ハロゲン、アルキル（Ｃ１〜Ｃ１８）またはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換されたアリール（Ｃ６〜Ｃ２０）
からなる群より選択されるメンバーであり、
ここで、Ｒ２およびＲ３は、同じであっても異なっていてもよく、各々、以下：
−Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｘ（Ｒ４）Ｘ１Ｃ（Ｏ）Ｙ、［ここで、Ｒ６は、アルキレン（Ｃ１〜Ｃ６）またはアリーレン（Ｃ６〜Ｃ２０）であり；ＸおよびＸ１は、同じであっても異なっていてもよく、Ｏ、ＮまたはＣであり；Ｒ４は、アルキレン（Ｃ１〜Ｃ２０）、（ポリ）エチレングリコール（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１〜２０、（ポリ）エチレンアミン（ＣＨ２ＣＨ２Ｎ）１〜２０、およびアリーレン（Ｃ６〜Ｃ２０）からなる群より選択され；そしてＹは、ハロメチレンまたはアルケニレン（Ｃ１〜Ｃ２０）である］；
−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＨ）Ｘ（Ｒ４）Ｘ１Ｃ（Ｏ）Ｙ、［ここで、ＸおよびＸ１は、同じであっても異なっていてもよく、Ｏ、ＮまたはＣであり；Ｒ４は、アルキレン（Ｃ１〜Ｃ２０）、（ポリ）エチレングリコール（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１〜２０、（ポリ）エチレンアミン（ＣＨ２ＣＨ２Ｎ）１〜２０、およびアリーレン（Ｃ６〜Ｃ２０）からなる群より選択され；そしてＹは、ハロメチレンまたはアルケニレン（Ｃ１〜Ｃ２０）である］；および
−Ｃ（Ｏ）Ｘ（Ｒ４）Ｘ１Ｃ（Ｏ）Ｙ、［ここで、ＸおよびＸ１は、同じであっても異なっていてもよく、Ｏ、ＮまたはＣであり；Ｒ４は、アルキレン（Ｃ１〜Ｃ２０）、（ポリ）エチレングリコール（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１〜２０、（ポリ）エチレンアミン（ＣＨ２ＣＨ２Ｎ）１〜２０、およびアリーレン（Ｃ６〜Ｃ２０）からなる群より選択され；そしてＹは、ハロメチレンまたはアルケニレン（Ｃ１〜Ｃ２０）である］
からなる群より選択される式によって表される、化合物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の化合物であって、Ｒ１は、水素または以下：
水素または以下：
（１）ハロゲンまたはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換されたアルキル（Ｃ１〜Ｃ８）；
（２）ハロゲン、アルキル（Ｃ１〜Ｃ１０）またはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換されたシクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ８）；
（３）ハロゲン、アルキル（Ｃ１〜Ｃ１０）またはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換されたシクロアルケニル（Ｃ５〜Ｃ７）；および
（４）ハロゲン、アルキル（Ｃ１〜Ｃ１０）またはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換されたアリール（Ｃ６〜Ｃ１０）
からなる群より選択されるメンバーであり、
ここで、Ｒ２およびＲ３は、同じであっても異なっていてもよく、各々、以下：
−Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｘ（Ｒ４）Ｘ１Ｃ（Ｏ）Ｙ、［ここで、Ｒ６は、アルキレン（Ｃ３〜Ｃ６）またはアリーレン（Ｃ６〜Ｃ１２）であり；ＸおよびＸ１は、同じであっても異なっていてもよく、Ｏ、ＮまたはＣであり；Ｒ４は、アルキレン（Ｃ１〜Ｃ１０）、（ポリ）エチレングリコール（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１〜１０、（ポリ）エチレンアミン（ＣＨ２ＣＨ２Ｎ）１〜１０、およびアリーレン（Ｃ６〜Ｃ１２）からなる群より選択され；そしてＹは、ハロメチレンまたはアルケニル（Ｃ１〜Ｃ１０）である］；
−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＨ）Ｘ（Ｒ４）Ｘ１Ｃ（Ｏ）Ｙ、［ここで、ＸおよびＸ１は、同じであっても異なっていてもよく、Ｏ、ＮまたはＣであり；Ｒ４は、アルキレン（Ｃ３〜Ｃ１０）、（ポリ）エチレングリコール（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１〜１０、（ポリ）エチレンアミン（ＣＨ２ＣＨ２Ｎ）１〜１０、およびアリーレン（Ｃ６〜Ｃ１２）からなる群より選択され；そしてＹは、ハロメチレンまたはアルケニル（Ｃ１〜Ｃ１０）である］；および
−Ｃ（Ｏ）Ｘ（Ｒ４）Ｘ１Ｃ（Ｏ）Ｙ、［ここで、ＸおよびＸ１は、同じであっても異なっていてもよく、Ｏ、ＮまたはＣであり；Ｒ４は、アルキレン（Ｃ３〜Ｃ１０）、（ポリ）エチレングリコール（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１〜１０、（ポリ）エチレンアミン（ＣＨ２ＣＨ２Ｎ）１〜１０、およびアリーレン（Ｃ６〜Ｃ１２）からなる群より選択され；そしてＹは、ハロメチレンまたはアルケニル（Ｃ１〜Ｃ１０）である］
からなる群より選択される式によって表される、化合物。
【請求項１７】
請求項１５に記載の化合物であって、
Ｒ１は、Ｈまたはエチルであり、
Ｒ２およびＲ３は、同じであって、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＨ）Ｃ６Ｈ４Ｃｌまたは−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＨ）Ｃ６Ｈ４Ｂｒであり、そして
Ｌは、（Ｃ（Ｏ）Ｃ２Ｈ４ＮＨ）ｎＣ（Ｏ）Ｃ６Ｈ１２Ｃ（Ｏ）（ＮＨＣ２Ｈ４Ｃ（Ｏ））ｎであり、ここで、ｎは、６または７である、化合物。
【請求項１８】
式：Ｓ−（ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＲＯＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｘ）グルタチオン
によって表されるＳ−置換グルタチオンまたはＳ−置換グルタチオンプロドラッグであって、ここで、Ｒは、アルキレン（Ｃ１〜Ｃ２０）、ポリエチレングリコール（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１〜２０、ポリエチレンアミン（ＣＨ２ＣＨ２Ｎ）１〜２０およびアリーレン（Ｃ６〜Ｃ２０）からなる群より選択され、ここで、Ｘは、ハロゲンである、Ｓ−置換グルタチオンまたはＳ−置換グルタチオンプロドラッグ。
【請求項１９】
前記Ｓ−置換グルタチオンは、Ｓ−（ブロモアセトキシブチルアセトキシ）グルタチオンまたはＳ−（ブロモアセトキシプロピルアセトキシ）グルタチオンである、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
請求項１に記載の化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項２１】
請求項１８に記載の化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項２２】
前記薬学的に受容可能なキャリアは、水溶性のイソプロピル−β−シクロデキストランである、請求項２０に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
前記薬学的に受容可能なキャリアは、水溶性のイソプロピル−β−シクロデキストランである、請求項２１に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
新生物性状態を有する被験体を処置する方法であって、該方法は、そのような処置を必要とする被験体に、薬学的有効量の請求項２０に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２５】
新生物性状態を有する被験体を処置する方法であって、該方法は、そのような処置を必要とする被験体に、薬学的有効量の請求項２１に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２６】
前記薬学的有効量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの用量である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記薬学的有効量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの用量である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記新生物性状態は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳癌、および造血組織癌からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記新生物性状態は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳癌、および造血組織癌からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は、腫瘍細胞を、該腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効な量の請求項１に記載の化合物と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項３１】
腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は、腫瘍細胞を、該腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効な量の請求項１８に記載の化合物と接触させる工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府の権利）
本発明は、国立保健研究所からの助成金のもと（ＣＡ  ５９６１２）、部分的に合衆国政府からの資金を使用してなされた。従って、合衆国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００２】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００３年６月５日出願の仮出願番号６０／４７５，９４６の利益を主張し、仮出願番号６０／４７５，９４６の開示は、本明細書中に参考として援用される。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、抗腫瘍活性を有する低分子の化学療法剤、およびこれらの薬剤をヒトに投与するための方法に関する。具体的には、本発明は特に、腫瘍後退を引き起こすメチルグリオキサール解毒酵素グリオキサラーゼＩの活性部位を標的化する低分子の化学療法剤の開発および使用、ならびにこれらの化合物をヒトに投与して腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
哺乳動物細胞中でのメチルグリオキサールの代謝の理解における近年の進歩は、グルタチオン（ＧＳＨ）依存性グリオキサラーゼ酵素系が、抗腫瘍薬開発のための有用な標的であることを示唆する（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎら，Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ，２５：３８５−３９２（２０００））。この解毒経路の生理学的機能は、下のスキーム１に示されるように、イソメラーゼグリオキサラーゼＩ（ＧｌｘＩ）およびチオエステルヒドロラーゼグリオキサラーゼＩＩ（ＧｌｘＩＩ）の経時的作用を介して、Ｄ−ラクテートとして、細胞から細胞毒性のメチルグリオキサールを除去することである（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎら，「Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ａｌｄｅｈｙｄｅ  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ」，Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｌｉｅｂｍａｎら（編），；ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，９：３５３−３８６（１９８８））。
【０００５】
（スキーム１）
【０００６】
【化３】
2006526632.tif 000003
メチルグリオキサールは、炭水化物代謝の正常な副生成物として生じる、高反応性のα−ケトアルデヒドであり（Ｒｉｃｈａｒｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：４５８１−４５８５（１９９１））、そして細胞生存に重要なタンパク質および核酸を共有結合的に改変することが可能である（Ｒｅｉｆｆｅｎら，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１０７：２０６−２１９（１９８４）；Ａｙｏｕｂら，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．，１７：３９７−４０１（１９９３）；Ｂａｓｋａｒａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．，２１２：１６６−１７４（１９９０）；Ｒａｙら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４７：６０３−６０９（１９９１）；Ｗｈｉｔｅら，Ｃｈｅｍ−Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．，３８：３３９−３４７（１９８２）；およびＰａｐｏｕｌｉｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４：６４８−６５５（１９９５））。
【０００７】
ＧｌｘＩのインヒビターは、長い間ありうる抗癌剤として追求されてきた。それは、ＧｌｘＩインヒビターの腫瘍細胞中でメチルグリオキサール濃度の上昇を誘導する潜在的能力の理由から（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎら（２０００），前出）、および急速に分裂する腫瘍細胞は、外因性メチルグリオキサールの細胞毒性効果に対して特に感受性であるという知見の理由からである（Ｒａｙら，前出；Ｗｈｉｔｅら，前出；およびＰａｐｏｕｌｉｓら，前出）。この感受性の根拠はよく理解されていないが、しかし、部分的には、メチルグリオキサールにより誘導される、ストレス活性型プロテインキナーゼｃ−Ｊｕｎ  ＮＨ２末端キナーゼ１（ＪＮＫ１）およびｐ３８有糸分裂活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化から生じるようにみえる。この活性化は、腫瘍細胞中でカスパーゼ活性およびアポトーシス（プログラムされた細胞死）を引き起こす（Ｓａｋａｍｏｔｏら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７：２５１３−２５１８（２００１）；およびＳａｋａｍｏｔｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：４５７７０−４５７７５（２００２））。さらに、メチルグリオキサールは、そのＤＮＡ中のヌクレオチド塩基を共有結合的に改変する能力に基づいて、遺伝毒性である可能性が高い（Ｐａｐｏｕｌｉｓら，前出）。
【０００８】
さらに、チオエステルヒドロラーゼＧｌｘＩＩにより加水分解で分解されるｈＧｌｘＩのインヒビターは、腫瘍細胞を特異的に阻害するための選択的な戦略を提供する。なぜならば、正常細胞は、腫瘍細胞よりもはるかに高い濃度のＧｌｘＩＩを含むからである。下の表１は、癌細胞に対する正常細胞におけるＧｌｘＩおよびＧｌｘＩＩの活性の比較を示す（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎら（２０００），前出）。
【０００９】
（表１）
（癌細胞に対する正常細胞の報告されたグリオキサラーゼ活性）
【００１０】
【表１】
2006526632.tif 000004
従って、正常細胞は、対応する腫瘍細胞よりもはるかに急速にｈＧｌｘＩのチオエステルインヒビターを解毒することが可能であるべきであり、腫瘍細胞中でインヒビターのはるかに高い安定な濃度を生じる。この仮定と一致して、Ｓ−（Ｎ−ｐ−クロロフェニル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン（ＣＨＧ）のジエチルエステルプロドラッグ形態は、ｈＧｌｘＩのインヒビターとｈＧｌｘＩＩについての基質との両方であり（Ｍｕｒｔｈｙら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７：２１６１（１９９４））、マウス白血病Ｌ１２１０細胞に対して、培養物中の正常な脾臓リンパ球よりも顕著により細胞毒性である。これは、脾臓リンパ球に対するＬ１２１０細胞におけるｈＧｌｘＩＩの１０倍低い活性を反映している（Ｋａｖａｒａｎａら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４２：２２１−２２８（１９９９））。
【００１１】
理想的な化学療法剤は、癌細胞に対して特異性が高くあるべきであり、従って副作用は最小限であるべきであるので、ＧｌｘＩインヒビターは、正常細胞よりも腫瘍細胞において選択的に蓄積することから、魅力的な抗癌剤である。
【００１２】
さらに、ｈＧｌｘＩを標的化する抗腫瘍戦略は、有糸分裂の種々の段階において急速に分裂する腫瘍細胞を攻撃するより確立された化学療法剤、または細胞周期のある段階で腫瘍細胞を停止するより確立された化学療法剤を超える利点を提供する。例えば、現在使用される低分子の抗腫瘍薬の多くは、直接的かまたは間接的のどちらかで、ＤＮＡ合成および／またはタンパク質合成を阻害することによって、急速に分裂する腫瘍細胞を標的化する。従って、これらの薬物はまた、腸管上皮および骨髄のような急速に分裂する正常細胞に悪影響を与える。結果として、現在使用される抗腫瘍剤の副作用としては、多くの場合、骨髄抑制、腸障害、用量依存性心毒性（ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、肺線維症、アナキラフィシー反応、脱毛症、および食欲不振が挙げられる。
【００１３】
ｈＧｌｘＩの遷移段階のアナログインヒビターの分類は、Ｓ−（Ｎ−アリール／アルキル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオンであることが公知である。詳細には、これらのＧＳＨのチオエステル誘導体は、酵素の反応座標に沿って形成するエン−ジオレート中間体に隣接する、堅く結合した遷移状態種の立体電子的特性を模倣する。従って、このような化合物は、ｈＧｌｘＩの最も強力な公知の競合的インヒビターであり、ナノモーラーの中間（ｍｉｄ−ｎａｎｏｍｏｌａｒ）範囲で阻害定数（Ｋｉｓ）を有する：Ｓ−（Ｎ−ｐ−クロロフェニル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン（ＣＨＧ）、Ｋｉ＝４６ｎＭ；Ｓ−（Ｎ−ｐ−ブロモフェニル−Ｎ−ヒドロキシ−カルバモイル）グルタチオン（ＢＨＧ）、Ｋｉ＝１４ｎＭ；Ｓ−（Ｎ−ｐ−ヨードフェニル−Ｎ−ヒドロキシ−カルバモイル）グルタチオン（ＩＨＧ）、Ｋｉ＝１０ｎＭ；およびＳ−（Ｎ−ヘキシル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン、Ｋｉ＝１６ｎＭ（Ｋａｌｓｉら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４３：３９８１−３９８６（２０００））。これらの遷移状態のアナログインヒビターは、下で「可逆的競合的インヒビター」と言われる。
【００１４】
さらに、この可逆的競合的インヒビターはまた、ウシ肝臓ＧｌｘＩＩについての緩徐型基質（ｓｌｏｗ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）であり、このことは、これらの化合物が正常細胞よりも腫瘍細胞を選択的に阻害し得ることを示唆する（Ｍｕｒｔｈｙら，前出）。
【００１５】
可逆的競合的インヒビターの有効性は、ＧｌｘＩ活性部位についての特異性によって、およびその活性部位を占有する時間によって測定され得、その結果、酵素の天然の基質（ＧＳＨ−メチルグリオキサールチオヘミアセタール）の接近を遮断する。低い競合的阻害定数（Ｋｉ）を有するインヒビターは、より高い親和性およびより高い特異性を有する酵素の活性部位に結合し、そして従って、より高いＫｉ値を有するインヒビターよりも、より長い時間その活性部位を占有する。
【００１６】
競合的インヒビターは、ジエチルエステルプロドラッグとして投与される場合、培養物中の異なるヒト腫瘍細胞株およびマウス腫瘍細胞株に対して致命的であることが示されている（ＵＳ  ５，６１６，５６３）（Ｋａｖａｒａｎａら，前出）。ジエステルまたはモノエステルのプロドラッグは、荷電したグルタチオニルが細胞中への素早い拡散を妨げるという理由で使用される。拡散の後、これらのプロドラッグは、細胞の内部でエステル分解を受ける。Ｓ−（Ｎ−フェニル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン、ＰＨＧ（Ｅｔ）２；Ｓ−（Ｎ−ｐ−ブロモフェニル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン、ＢＨＧ（Ｅｔ）２；およびＳ−（Ｎ−ｐ−クロロフェニル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン、ＣＨＧ（Ｅｔ）２のジエチルエステルプロドラッグは、７２時間のインキュベーションの後、それぞれ６３μＭ、１６μＭ、および５μＭのＩＣ５０値の培養物中で、マウス白血病Ｌ１２１０細胞の増殖を阻害する。
【００１７】
Ｓｈａｒｋｅｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４６：１５６−１６６（２０００）（これは、本明細書において参考として援用される）による、ＣＨＧ（Ｅｔ）２を用いたインビトロ有効性研究もまた、ＧｌｘＩの競合的インヒビターが、重要な抗腫瘍剤である可能性があるという仮説を支持する。例えば、ＣＨＧ（Ｅｔ）２のボーラスｉ．ｖ．投与は、胸腺欠損ヌードマウスにおいて、ヒト前立腺ＰＣ３腫瘍の増殖を阻害した。ＣＧＨ（Ｅｔ）２の効力は、シスプラチン関連性の造血毒性のないポジティブコントロールのシスプラチンと同様であった。しかし、１２日にわたるＣＨＧ（Ｅｔ）２の持続的な注入による効果は観察されなかった。このことは、持続的な注入によって投与された場合、十分でない薬物は、そのように急速に増殖する腫瘍によって吸収されることに使用されてしまうことを示唆する。さらに、（Ｅｓ−１ｅ）マウスの皮下に移植されたマウスメラニン性黒色腫に対するＣＨＧ（Ｅｔ）２の効力もまた、上昇した。その後、予備的な薬物動態学的研究は、ＣＨＧ（Ｅｔ）２のｉ．ｖ．ボーラス投与を受けて、黒色腫において薬物が有意に蓄積し、ＣＨＧ（Ｅｔ）２およびジシクロペンチルジエステルプロドラッグＣＨＧ（シクロペンチル）２の有効性が上昇したことを示した。これらの薬物の全ては、ビヒクルコントロールから、統計学的に有意であるという結果を与えた。ＣＨＧ（Ｅｔ）２およびＣＨＧ（シクロペンチル）２は、ポジティブコントロールのアドリアマイシンと同等に効果的であったが、しかし、その効果ははるかに高い投薬量においてであった。いずれの試験においても、検出可能な副作用は観察されなかった。同様の結果が、ヒト結腸ＨＴ２９腫瘍を有する胸腺欠損ヌードマウスで得られた。この薬物が持続的なｉ．ｖ．注入によって投与された場合、検出可能な副作用は伴わず、効力はポジティブコントロールのビンクリスチンと同等であった。しかし、ボーラス投与による有効性は観察されず、このことは、このゆっくりと増殖する腫瘍は、薬物に対して十分に曝されていないということを示す。従って、薬物送達の方法（ボーラス注入対持続的注入）は、有効性の重要な局面である。
【００１８】
３つ全てのインビトロの有効性研究は、腫瘍増殖を阻害するために、高い用量のプロドラッグを必要とした（８０ｍｇ／ｋｇ体重）。Ｓａｋａｍｏｔｏら（２００１）によるその後の一連の研究は、ＧｌｘＩのより弱い競合的インヒビターであるジシクロペンチルジエステルの（Ｓ−ｐ−ブロモベンジル）グルタチオン（ＢＢＧ）は、インビトロで肺腫瘍細胞株ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ２２６、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＤＭＳ２７３、ＤＭＳ１１４、ＮＣＩ−Ｈ５２２を効果的に阻害し、そしてヒト癌異種移植片を有するヌードマウスでＤＭＳ１４４およびヒト前立腺ＤＵ１４５を効果的に阻害したことを示した。さらに、ＢＢＧは、マウスのヒト肺腫瘍（ＤＭＳ１１４）に対して１００ｍｇ／ｋｇの投薬量で有効であり（Ｓａｋａｍｏｔｏら（２００１）、前出）、２１日間の投与の間、有害な副作用の徴候はなかったことが発見された。まとめると、これらの研究は、ＧｌｘＩの阻害が、癌の制御において、重要な化学療法の戦略であることを示す。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
この抗腫瘍戦略を改善するために、はるかに低い投薬量で効果的な、より効果的なＧｌｘＩインヒビターが開発されなければならない。抗腫瘍活性のために現在必要とされる高い投薬量は、これらの化合物が長期間にわたって使用される場合、有毒な副作用または有害な反応を生み出す可能性を増加させる。従って、当該分野において、ＧｌｘＩの活性部位に対するより強い結合親和性または結合特異性を有し、その結果、腫瘍増殖を効果的に阻害するために、公知のＧｌｘＩインヒビターよりもより低い投薬量で投与され得る、より強力なインヒビターについての必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
（発明の要旨）
本発明の目的は、ｈＧｌｘＩ活性のより強力なインヒビターである分子の分類を提供することである。一つの実施形態において、この目的は、１モノマーにつき１つの活性部位を有するホモダイマー酵素の両方の活性部位に同時に結合する、二価のＧｌｘＩインヒビターによって満たされる。このようなことは、Ｓ置換グルタチオンまたはＳ置換グルタチオンプロドラッグのそれぞれをヒトＧｌｘＩの各活性部位へ同時に結合すること可能にする化学リンカーを介して、Ｓ置換グルタチオンまたはＳ置換グルタチオンプロドラッグを一緒につなぐことによって達成され得る。このことは、一価の可逆的競合的インヒビターと比較して、酵素に対する二価のインヒビターの正味の結合親和性を有意に増加させる。なぜならば、各部位における結合エネルギーは、結合の自由エネルギーの全体の一因となるからである。
本発明の別の実施形態において、上記の目的は、ヒトＧｌｘＩの活性部位を共有結合的に改変することによって、ヒトＧｌｘＩを不可逆的に不活性化する一価のインヒビターの分類（本明細書中で「不可逆的失活剤」と呼ばれる）によって満たされている。
【００２１】
本発明の別の目的は、現在の化学療法剤よりも有害な副作用の少ない、効果的な抗腫瘍薬学的組成物を提供することである。本発明の１つの実施形態に従って、この目的は、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせた二価のＧｌｘＩインヒビターか、または一価の不可逆的失活剤によって満たされている。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、新生物性状態を有する被験体を処置する方法を提供することである。本発明の１つの実施形態に従って、この目的は、ヒトＧｌｘＩの二価のインヒビターまたは一価の不可逆的失活剤を含む、薬学的有効量の薬学的組成物を、新生物性状態を有する被験体に投与する工程を包含する方法によって満たされている。
【００２３】
本発明のなおさらなる目的は、腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供することである。本発明の１つの実施形態に従って、この目的は、腫瘍細胞を、上記腫瘍細胞の増殖を効果的に阻害する量の、ＧｌｘＩの二価のインヒビターまたはＧｌｘＩの一価の不可逆的失活剤と接触させる工程を包含する方法によって満たされている。
【００２４】
本発明の別の、およびさらなる局面、特徴、ならびに利点は、本明細書中に記載される本発明の開示から、当業者に明らかになる。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、抗腫瘍剤として有用な化合物を提供する。この化合物は、化学リンカーを介して共有結合された２つのヒトＧｌｘＩインヒビターを含み、この２つのヒトＧｌｘＩインヒビターの各々は、同じであっても異なっていてもよく、Ｓ置換グルタチオンまたはＳ置換グルタチオンプロドラッグである。このＧｌｘＩインヒビターは、各々、γ−グルタミルアミノ基を有する。上記化学リンカーは、上記γ−グルタミルアミノ基を介して各々のＧｌｘＩインヒビターに共有結合されており、そしてこの化学リンカーは、少なくとも５０Åの長さを有する。
【００２６】
上記ヒトＧｌｘＩインヒビターは、γ−グルタミルアミノ基において連結された、Ｓ置換グルタチオンまたは対応プロドラッグである。活性部位１つ当たり１分子のＳ−（Ｎ−ｐ−クロロフェニル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン（ＣＨＧ）と複合体化しているヒトＧｌｘＩのＸ線結晶構造は、結合したＣＨＧのγ−グルタミルアミノ基が、バルク溶媒に対して露出されていることを示し、従って、そのγ−グルタミルアミノ基における架橋は、インヒビターの結合を妨害するはずはない。さらに、そのγ−グルタミルアミノ基は、約３０Å〜約４０Å離れている（Ｃａｍｅｒｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：１３４８０〜１３４９０（１９９９））。このＸ線構造は、ＣＨＧの［グリシル］カルボキシル基は、別の架橋部位であり得ることを示す。なぜなら、このカルボキシル基は、ｈＧｌｘＩ・ＣＨＧ複合体のＸ線構造において、溶媒−タンパク質境界面にあるからである。しかし、上記グリシルカルボキシル基はまた、その酵素と水素結合を形成するようである。実際、上記グリシルカルボキシル基のエチル化により、結合親和性が１０分の１になる（Ｍｕｒｔｈｙら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７：２１６１〜２１６６（１９９４））。こういう理由で、上記グリシルカルボキシル基は、架橋のための最適な部位ではない。
【００２７】
上記二価インヒビターにおいて使用される特定のＳ置換グルタチオン、Ｓ置換グルタチオンプロドラッグ、またはそれらの組み合わせは、そのＳ置換グルタチオンがヒトＧｌｘＩインヒビターである限り、重要ではない。多数のＳ置換グルタチオンＧｘＩインヒビターが、公知であり、それは、例えば、可逆的競合的インヒビターであり、それらとしては、Ｓ−（Ｎ−ｐ−クロロフェニル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン、Ｓ−（Ｎ−ｐ−ブロモフェニル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン、Ｓ−（Ｎ−ｐ−ヨードフェニル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン、Ｓ−（Ｎ−フェニル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン、Ｓ−ｐ−ブロモベンジル−グルタチオン、およびＳ−（Ｎ−アルキル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン（アルキルは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、およびｎ−ヘキシルである）である。特に好ましいのは、Ｓ−（Ｎ−アリール／アルキル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオンが挙げられる。
【００２８】
本発明の他のＳ置換グルタチオンまたはＳ置換グルタチオンプロドラッグとしては、不可逆的失活剤が挙げられる。本発明の不可逆的失活剤は、式Ｓ−（ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＲＯ  Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｘ）のグルタチオンの化合物であり、この式において、Ｒは、アルキレン（Ｃ１〜Ｃ２０）、（ポリ）エチレングルコール（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１〜２０、ポリ）エチレンアミン（ＣＨ２ＣＨ２Ｎ）１〜２０、およびアリーレン（Ｃ６〜Ｃ２０）からなる群より選択され、Ｘは、ハロゲンである。本発明に従って、不可逆的失活剤は、一価ＧｌｘＩ失活剤として使用され得るか、あるいは、他の不可逆的失活剤または可逆的競合的インヒビターと組み合わせて二価インヒビターとして使用され得る。
【００２９】
好ましい不可逆的失活剤は、式ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｘのグルタチオン化合物であり、この式において、ｎは、２〜６であり、Ｘは、ハロゲンである。特に好ましい不可逆的失活剤は、Ｓ−（ブロモアセトキシブチルアセトキシ）グルタチオンおよびＳ−（ブロモアセトキシプロピルアセトキシ）グルタチオンである。これらの化合物を、ｈＧｌｘＩのＸ線結晶構造とコンピューターにより組み合わせると、上記Ｓ置換基は、理想的には、活性部位にあるＣｙｓ６０のスルフヒドリル基をアルキル化するように位置することが、示される。このＣｙｓ６０は、結合した失活剤のイオウ原子から約１２Å〜約１３Å離れた位置にある。他の不可逆的失活剤は、上記ｈＧｌｘＩ活性部位に収容される。特に、上記Ｓ置換基が、上記活性部位において「弓なり」立体配座を呈することが可能であり、それによってハロアセチル官能基がＣｙｓ６０付近に位置することが可能になる場合には、上記の通りである。
【００３０】
好ましい不可逆的失活剤は、ブロモアセトキシ基、クロロアセトキシ基、アクリロイル基、およびクロトニル基を有する。特に好ましいのは、ブロモアセトキシ基を有する不可逆的失活剤である。
【００３１】
本明細書により参考として援用される米国特許第５，６１６，５６３号は、Ｓ−（Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン誘導体の合成方法を記載している。その誘導体としては、Ｓ−（Ｎ−ｐ−クロロフェニル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン、Ｓ−（Ｎ−ｐ−ブロモフェニル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン、Ｓ−（Ｎ−ｐ−ヨードフェニル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン、Ｓ−（Ｎ−フェニル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオンが、挙げられる。さらに、Ｓ−（Ｎ−アリール／アルキル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオンの合成が、Ｋａｌｓｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０００，４３：３９８１〜３９８６によって記載されている。
【００３２】
本発明に従って、任意のヒトＧｌｘＩインヒビターが一緒に連結されて、そのインヒビターの一価形態よりも、上記酵素に対する結合親和性が増加され得る。特に好ましいのは、比較的高い親和性の可逆的競合的インヒビター（例えば、ＣＨＧ）を、より低親和性の不可逆的失活剤（例えば、Ｓ−（ブロモアセトキシブチルアセトキシ）グルタチオンおよびＳ−（ブロモアセトキシプロピルアセトキシ）グルタチオン）に連結することである。
【００３３】
Ｓ置換グルタチオンが本発明に従って使用され得るが、Ｓ置換基の疎水性が上記ヒトＧｌｘＩ活性部位に対するより高い親和性と相関することを、当業者は理解する（Ｋａｌｓｉ  ２０００（前出））。さらに、上記Ｓ−（Ｎ−アリール−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）−グルタチオン誘導体は、ＧｌｘＩの活性部位に特に緊密に結合する。なぜなら、これらの化合物は、正常な触媒作用の間にその酵素の反応座標に沿って形成される緊密に結合した遷移状態の立体電子的特徴を模倣するからである。
【００３４】
他の好ましい実施形態は、ヒトＧｌｘＩＩにより触媒的に加水分解されるヒトＧｌｘＩインヒビター（一価ＧｌｘＩ失活剤または二価インヒビター／失活剤のいずれか）を使用する。ヒトＧｌｘＩＩは、正常組織中に豊富に存在するが腫瘍組織中では欠損している、チオエステルヒドロラーゼである。これは、腫瘍標的化のために可能な１種の基礎である。なぜなら、そのような化合物は、特に腫瘍細胞において蓄積されると、本明細書中で考えられるからである。例えば、Ｓ−（Ｎ−ｐ−クロロフェニル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン、Ｓ−（Ｎ−ｐ−ブロモフェニル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン、Ｓ−（Ｎ−フェニル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン、およびＳ−（Ｎ−メチル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオンは、ウシ肝臓ＧｌｘＩＩの基質である。これらのＳ置換グルタチオンを二価インヒビター中に組み込んでも、ＧｌｘＩＩがそのＳ置換グルタチオンを加水分解する能力には影響を及ぼさないと、本明細書中で考えられる。これは、ヒトＧｌｘＩＩと複合体化しているＳ−（Ｎ−ｐ−ブロモフェニル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオンのＸ線構造に基づく。このＸ線構造において、このインヒビターのγ−グルタミル残基のαアミノ基は、溶媒の方へ向いている（Ｃａｍｅｒｏｎら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｆｏｌｄ  Ｄｅｓ  １９９９，７，１０６７〜１０７８）。従って、そのアミノ基の共有結合改変は、化学的架橋に起因して、その活性部位への上記Ｓ置換グルタチオンの結合にも、その酵素の触媒活性にも、影響を及ぼさないようである。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｓ置換グルタチオンプロドラッグ」とは、Ｓ置換グルタチオンの任意の［グリシル，グルタミル］ジアルキル、［グリシル，グルタミル］ジアリール、もしくは［グリシル，グルタミル］ジアリールアルキルエステル、あるいは［グリシル］もしくは［グルタミル］モノアルキルエステル、［グリシル］もしくは［グルタミル］モノアリールエステル、または［グリシル］もしくは［グルタミル］モノアリールアルキルエステルを指す。好ましい実施形態としては、モノエチルエステルもしくはジエチルエステル、モノ−ｎ−プロピルエステルもしくはジ−ｎ−プロピルエステル、またはモノイソプロピルエステルもしくはジイソプロピルエステル、およびモノシクロペンチルエステルもしくはジシクロペンチルエステルが挙げられる。上記プロドラッグの細胞蓄積速度は、そのエステル機能の疎水性が大きくなるにつれて速くなると考えられる。なぜなら、蓄積は、細胞膜を通る単純な能動拡散に関与するからである（Ｋａｖａｒａｎａら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２：２２１〜２２８（１９９９））。
【００３６】
上記二価ＧｌｘＩインヒビター中で使用される特定の化学リンカーは、そのリンカーが、ニ量体のヒトＧｌｘＩの活性部位に結合したＳ置換グルタチオンを架橋するための一定の長さである限りは、重要ではない。この化学リンカーは、長さが少なくとも５０Åであることが、好ましい。より好ましくは、この化学リンカーは、少なくとも６０Åの長さである。なおより好ましくは、この化学リンカーは、少なくとも７０Åの長さである。
【００３７】
このリンカーの化学的性質もまた、そのリンカーが、ヒトＧｌｘＩ活性部位に対する上記多価インヒビターの結合を妨害しない限りは、重要ではない。この化学リンカーを構成し得る適切な基の例としては、ポリエチレングリコール、ポリ−β−アラニル、アルキル、アミド、およびエステルが挙げられる。特に好ましいのは、ポリエチレングリコールおよびポリ−β−アラニルを含む、化学リンカーである。より好ましいのは、（β−Ａｌａ）５〜７を含む化学リンカーである。
【００３８】
本発明に従う他の好ましい化学リンカーとしては、式
（Ｚ１）ａ−（Ｚ２）ｂ−（Ｚ３）ｃ
によって表される化学リンカーが挙げられ、この式において、Ｚ１、Ｚ２およびＺ３は、同じであっても異なっていてもよく、Ｚ１、Ｚ２およびＺ３は、各々、
Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｄＮＨ、
ＣＯ（ＣＨ２）ｅＣ（Ｏ）、
（ＣＨ２ＣＨ２）ｆＮＨＣ（Ｏ）、
（ＣＨ２ＣＨ２）ｇ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ、
（ＣＨ２）ｈＣ（Ｏ）（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｊＣ（Ｏ）、
ＮＨ（ＣＨ２）ｋ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｌ−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮＨ、
（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｏＮＨ（Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｐＮＨｑＣ（Ｏ）−アルキル、および
Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｒＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｓＣ（Ｏ）（ＮＨＣＨ２ＣＨ２）ｔＮＨ（Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｕＮＨ）ｖＣ（Ｏ）−アルキル
からなる群より選択され、ここで、下付き文字ａ〜ｖは、独立して、１〜２０である。
【００３９】
好ましい実施形態において、本発明の二価インヒビターは、式：
【００４０】
【化４】
2006526632.tif 000005
によって表され、
Ｌは、式（Ｚ１）ａ−（Ｚ２）ｂ−（Ｚ３）ｃによって表される化学リンカーであり、この化学リンカーの式において、Ｚ１、Ｚ２およびＺ３は、同じであっても異なっていてもよく、Ｚ１、Ｚ２およびＺ３は、各々、
Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｄＮＨ、
ＣＯ（ＣＨ２）ｅＣ（Ｏ）、
（ＣＨ２ＣＨ２）ｆＮＨＣ（Ｏ）、
（ＣＨ２ＣＨ２）ｇ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ、
（ＣＨ２）ｈＣ（Ｏ）（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｊＣ（Ｏ）、
ＮＨ（ＣＨ２）ｋ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｌ−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮＨ、
（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｏＮＨ（Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｐＮＨ）ｑＣ（Ｏ）−アルキル、および
Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｒＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｓＣ（Ｏ）（ＮＨＣＨ２ＣＨ２）ｔＮＨ（Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｕＮＨ）ｖＣ（Ｏ）−アルキル
からなる群より選択され、下付き文字ａ〜ｖは、独立して、１〜２０であり；
上記式において、Ｒ１は、水素であるか、あるいは
（１）ハロゲンまたはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換された、アルキル（Ｃ１〜Ｃ１８）；
（２）ハロゲン、アルキル（Ｃ１〜Ｃ１８）またはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換された、シクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ８）；
（３）ハロゲン、アルキル（Ｃ１〜Ｃ１８）またはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換された、シクロアルケニル（Ｃ５〜Ｃ７）；および
（４）ハロゲン、アルキル（Ｃ１〜Ｃ１８）またはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換された、アリール（Ｃ６〜Ｃ２０）
からなる群より選択されるメンバーであり、
Ｒ２およびＲ３は、同じであっても異なっていてもよく、Ｒ２およびＲ３は、各々、
（１）ハロゲンまたはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換された、アルキル（Ｃ１〜Ｃ１８）；
（２）ハロゲン、アルキル（Ｃ１〜Ｃ１８）またはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換された、シクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ８）；
（３）ハロゲン、アルキル（Ｃ１〜Ｃ１８）またはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換された、シクロアルケニル（Ｃ５〜Ｃ７）；および
（４）ハロゲン、アルキル（Ｃ１〜Ｃ１８）またはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換された、アリール（Ｃ６〜Ｃ２０）
からなる群より選択される。
【００４１】
特に好ましいのは、Ｒ２およびＲ３が、同じであっても異なっていてもよく、そのＲ２およびＲ３が各々、
（１）ハロゲンまたはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ１０）で必要に応じて置換された、アルキル（Ｃ６〜Ｃ１０）；
（２）ハロゲン、アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）またはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ１０）で必要に応じて置換された、シクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ８）；
（３）ハロゲン、アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）またはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ１０）で必要に応じて置換された、シクロアルケニル（Ｃ６〜Ｃ７）；および
（４）ハロゲン、アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）またはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ１０）で必要に応じて置換された、アリール（Ｃ６〜Ｃ１２）
からなる群より選択される、化合物である。
【００４２】
別の好ましい実施形態において、本発明の二価インヒビターは、式：
【００４３】
【化５】
2006526632.tif 000006
によって表され、
この式において、Ｌは、式（Ｚ１）ａ−（Ｚ２）ｂ−（Ｚ３）ｃによって表される化学リンカーであり、この化学リンカーの式において、Ｚ１、Ｚ２およびＺ３は、同じであっても異なっていてもよく、Ｚ１、Ｚ２およびＺ３は各々、
Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｄＮＨ、
ＣＯ（ＣＨ２）ｅＣ（Ｏ）、
（ＣＨ２ＣＨ２）ｆＮＨＣ（Ｏ）、
（ＣＨ２ＣＨ２）ｇ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ、
（ＣＨ２）ｈＣ（Ｏ）（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｊＣ（Ｏ）、
ＮＨ（ＣＨ２）ｋ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｌ−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮＨ、
（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｏＮＨ（Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｐＮＨｑＣ（Ｏ）−アルキル、および
Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｒＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｓＣ（Ｏ）（ＮＨＣＨ２ＣＨ２）ｔＮＨ（Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｕＮＨ）ｖＣ（Ｏ）−アルキル
からなる群より選択され、ここで、下付き文字ａ〜ｖは、独立して、１〜２０であり；
上記式において、Ｒ１は、水素であるか、あるいは
（１）ハロゲンまたはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換された、アルキル（Ｃ１〜Ｃ１８）；
（２）ハロゲン、アルキル（Ｃ１〜Ｃ１８）またはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換された、シクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ８）；
（３）ハロゲン、アルキル（Ｃ１〜Ｃ１８）またはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換された、シクロアルケニル（Ｃ５〜Ｃ７）；および
（４）ハロゲン、アルキル（Ｃ１〜Ｃ１８）またはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換された、アリール（Ｃ６〜Ｃ２０）
からなる群より選択されるメンバーであり、
Ｒ２およびＲ３は、同じであっても異なっていてもよく、Ｒ２およびＲ３は各々、
−Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｘ（Ｒ４）Ｘ１Ｃ（Ｏ）Ｙ［Ｒ６は、アルキレン（Ｃ１〜Ｃ６）またはアリーレン（Ｃ６〜Ｃ２０）であり；ＸおよびＸ１は、同じであっても異なっていてもよく、ＸおよびＸ１は、Ｏ、ＮまたはＣであり；Ｒ４は、アルキレン（Ｃ１〜Ｃ２０）、（ポリ）エチレングリコール（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１〜２０、（ポリ）エチレンアミン（ＣＨ２ＣＨ２Ｎ）１〜２０、およびアリーレン（Ｃ６〜Ｃ２０）からなる群より選択され；そしてＹは、ハロメチレンまたはアルケニレン（Ｃ１〜Ｃ２０）である］；
−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＨ）Ｘ（Ｒ４）Ｘ１Ｃ（Ｏ）Ｙ［ＸおよびＸ１は、同じであっても異なっていてもよく、ＸおよびＸ１は、Ｏ、ＮまたはＣであり；Ｒ４は、アルキレン（Ｃ１〜Ｃ２０）、（ポリ）エチレングリコール（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１〜２０、（ポリ）エチレンアミン（ＣＨ２ＣＨ２Ｎ）１〜２０、およびアリーレン（Ｃ６〜Ｃ２０）からなる群より選択され；そしてＹは、ハロメチレンまたはアルケニル（Ｃ１〜Ｃ２０）である］；ならびに
−Ｃ（Ｏ）Ｘ（Ｒ４）Ｘ１Ｃ（Ｏ）Ｙ［ＸおよびＸ１は、同じであっても異なっていてもよく、ＸおよびＸ１は、Ｏ、ＮまたはＣであり；Ｒ４は、アルキレン（Ｃ１〜Ｃ２０）、（ポリ）エチレングリコール（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１〜２０、（ポリ）エチレンアミン（ＣＨ２ＣＨ２Ｎ）１〜２０、およびアリーレン（Ｃ６〜Ｃ２０）からなる群より選択され；そしてＹは、ハロメチレンまたはアルケニレン（Ｃ１〜Ｃ２０）である］
からなる群より選択される式によって表される。
【００４４】
特に好ましいのは、Ｒ１が、水素であるか、あるいは
（１）ハロゲンまたはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換された、アルキル（Ｃ１〜Ｃ８）；
（２）ハロゲン、アルキル（Ｃ１〜Ｃ１０）またはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換された、シクロアルキル（Ｃ３〜Ｃ８）；
（３）ハロゲン、アルキル（Ｃ１〜Ｃ１０）またはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換された、シクロアルケニル（Ｃ５〜Ｃ７）；および
（４）ハロゲン、アルキル（Ｃ１〜Ｃ１０）またはアリールアルキル（Ｃ６〜Ｃ２０）で必要に応じて置換された、アリール（Ｃ６〜Ｃ１０）
からなる群より選択されるメンバーであり、そして
Ｒ２およびＲ３が、同じであっても異なっていてもよく、Ｒ２およびＲ３が各々、
−Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｘ（Ｒ４）Ｘ１Ｃ（Ｏ）Ｙ［Ｒ６は、アルキレン（Ｃ３〜Ｃ６）またはアリーレン（Ｃ６〜Ｃ１２）であり；ＸおよびＸ１は、同じであっても異なっていてもよく、ＸおよびＸ１は、Ｏ、ＮまたはＣであり；Ｒ４は、アルキレン（Ｃ１〜Ｃ１０）、（ポリ）エチレングリコール（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１〜１０、（ポリ）エチレンアミン（ＣＨ２ＣＨ２Ｎ）１〜１０、およびアリーレン（Ｃ６〜Ｃ１２）からなる群より選択され；そしてＹは、ハロメチレンまたはアルケニル（Ｃ１〜Ｃ１０）である］；
−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＨ）Ｘ（Ｒ４）Ｘ１Ｃ（Ｏ）Ｙ［ＸおよびＸ１は、同じであっても異なっていてもよく、ＸおよびＸ１は、Ｏ、ＮまたはＣであり；Ｒ４は、アルキレン（Ｃ３〜Ｃ１０）、（ポリ）エチレングリコール（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１〜１０、（ポリ）エチレンアミン（ＣＨ２ＣＨ２Ｎ）１〜１０、およびアリーレン（Ｃ６〜Ｃ１２）からなる群より選択され；そしてＹは、ハロメチレンまたはアルケニル（Ｃ１〜Ｃ１０）である］；ならびに
−Ｃ（Ｏ）Ｘ（Ｒ４）Ｘ１Ｃ（Ｏ）Ｙ［ＸおよびＸ１は、同じであっても異なっていてもよく、ＸおよびＸ１は、Ｏ、ＮまたはＣであり；Ｒ４は、アルキレン（Ｃ３〜Ｃ１０）、（ポリ）エチレングリコール（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１〜１０、（ポリ）エチレンアミン（ＣＨ２ＣＨ２Ｎ）１〜１０、およびアリーレン（Ｃ６〜Ｃ１２）からなる群より選択され；そしてＹは、ハロメチレンまたはアルケニル（Ｃ１〜Ｃ１０）である］
からなる群より選択される式によって表される、化合物である。
【００４５】
本発明の他の好ましい二価インヒビターとしては、
【００４６】
【化６】
2006526632.tif 000007
が挙げられ、
この式において、Ｒ１は、Ｈまたはエチルであり、
Ｒ２およびＲ３は、同じであり、Ｒ２およびＲ３は、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＨ）Ｃ６Ｈ４Ｃｌまたは−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＨ）Ｃ６Ｈ４Ｂｒであり、そして
Ｌは、−（Ｃ（Ｏ）Ｃ２Ｈ４ＮＨ）ｎＣ（Ｏ）Ｃ６Ｈ１２Ｃ（Ｏ）（ＮＨＣ２Ｈ４Ｃ（Ｏ））ｎ−であり、ここで、ｎは、６または７である。
【００４７】
本発明の１つの実施形態において、本発明の化合物は、薬学的に受容可能な塩、または水和物の形態をとる。好ましい塩としては、ナトリウムイオンおよびカリウムイオンが挙げられる。
【００４８】
本発明は、一価のＧｌｘＩ不可逆的失活剤または二価のＧｌｘＩインヒビターと、薬学的に受容可能なキャリアとを含有する、薬学的組成物をさらに提供する。薬学的に受容可能なキャリアは、当該分野で公知であるが、本発明にとっては重要でなく、好ましい薬学的に受容可能なキャリアは、イソプロピル−β−シクロデキストラン水溶液である。なぜなら、上記のＧｌｘＩインヒビターは、このビヒクル中に非常に可溶性であるからである。さらに、このビヒクルは、ｉ．ｖ．送達の間、注入部位における局所的な薬物依存性壊死を予防する（Ｓｈａｒｋｅｙら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６：１５６−１６６（２０００））。
【００４９】
本発明は、腫瘍性状態を有する被験体を処置する方法をさらに提供し、この方法は、このような処置を必要としている被験体に、本発明の一価の不可逆的失活剤または二価のインヒビターを含有する、薬学的に有効な量の組成物を投与する工程を包含する。
【００５０】
投与される特定の量は、本発明にとって重要でなく、被験体の年齢、体重、性別、投与様式、および処置されている腫瘍性状態に依存して変化する。
【００５１】
代表的に、薬学的に有効な量は、二価の可逆的ｈＧｌｘＩインヒビターについて０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約５．０ｍｇ／ｋｇの用量である。好ましい用量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇである。薬学有効用量はまた、インビトロ結合データから、および動物研究から推定され得る。例えば、二価の可逆的インヒビターは、対応する一価の可逆的インヒビターに対して約１００倍より密にｈＧｌｘＩに結合するという事実、および腫瘍を有するマウスにおいて、一価の可逆的インヒビターを使用して腫瘍増殖の阻害を生じるのに有用な量は、１２時間毎に２週間、約８０ｍｇ／ｋｇであるという事実（Ｓｈａｒｋｅｙら  ２０００，前出）は、このようなインヒビターについての薬学有効用量を推定するために使用され得る。類似の薬学的に有効な量は、不可逆的失活剤と一緒に使用され得るが、投与はあまり頻繁ではない。好ましい頻度は、１〜５日毎に１度の範囲である。このより少ない投与頻度は、失活剤が持続的に酵素活性を破壊するという事実により予測される。
【００５２】
本発明の組成物は、腫瘍性状態を処置するために投与され得る。一般的に、本発明の組成物は、任意の癌性状態を処置するために使用され得る。好ましい状態は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳の癌、および造血組織の癌からなる群より選択されるメンバーである。より好ましい癌は、前立腺腫瘍、結腸腫瘍および肺腫瘍であり、これらは、ＧｌｘＩを過剰発現する。なぜなら、これらの腫瘍は、競合的なＧｌｘＩインヒビターにより、ＧｌｘＩ阻害に対して特に感受性が高いと以前に示されたからである（Ｓｈａｒｋｅｙら  ２０００，前出；Ｓａｋａｍｏｔｏら  （２００１），前出）。
【００５３】
本発明の組成物は、任意の適切な様式で投与され得るが、一般的な経路としては、経口的、静脈内、皮下、または筋肉内が挙げられる。腫瘍を有するマウスでのインビボ効力研究は、静脈内投与（ｉ．ｖ．）は好ましい経路であることを示す。
【００５４】
本発明の組成物は、腫瘍性状態を有する患者に、連続的ｉ．ｖ注入または
ボーラスｉ．ｖ注入により投与され得る。腫瘍を有するマウスでのインビボ効力研究は、ゆっくり増殖する腫瘍は、好ましくは連続的注入によって処理される一方、速く増殖する腫瘍は、好ましくはｉ．ｖボーラス投与によって処理されることを示す（Ｓｈａｒｋｅｙら  ２０００，前出）。
【００５５】
本発明はまた、腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供し、この方法は、腫瘍細胞と、この腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効な一定量の本発明の組成物とを接触させる工程を包含する。好ましい実施形態において、インビボで腫瘍細胞の増殖を阻害するための有効量は、二価のインヒビターまたは一価の不可逆的失活剤の０．１ｍｇ／ｋｇ／１２時間〜約５ｍｇ／ｋｇ／１２時間の範囲である。別の好ましい実施形態において、二価のインヒビターを使用してインビトロで腫瘍細胞の増殖を阻害するための有効量は、１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲の濃度であり、好ましくは５０ｎＭ未満の濃度である。一価の不可逆的失活剤を使用してインビトロで腫瘍細胞の増殖を阻害するための有効量は、２００ｎＭ未満の濃度であり、好ましくは１００ｎＭ未満の濃度である。
【００５６】
以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を例示する目的で載せられ、いかなる様式においても本発明を限定することは意図されない。
【実施例】
【００５７】
（実施例１）
（不可逆的失活剤の合成）
ｈＧｌｘＩ、Ｓ−（ブロモアセトキシプロピルアセトキシ）グルタチオン（ＢＰＧ）およびＳ−（ブロモアセトキシブチルアセトキシ）グルタチオン（ＢＢＧ）という不可逆的失活剤を調製するために使用した合成経路を、図６に示す。
【００５８】
（ブロモ酢酸３−（２−ブロモアセトキシ）プロピルエステル）
乾燥管を備える１００ｍｌの丸底フラスコに、５０ｍｌの塩化メチレン、塩化ブロモアセチル（１．０３ｇ、２６ｍｍｏｌ）、および１，３−プロパンジオール（１３ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を、窒素下で還流し、シリカゲルＴＬＣ（クロロホルム：メタノール９５：５  ｖ／ｖ）上の塩化ブロモアセチル（Ｒｆ＝０．５）の消失、およびＲｆ＝０．９０の生成物スポットの出現に基づいて、反応を完了するまで続けた（約４８時間）。溶媒を減圧下で取り除き、褐色の油状物として粗製生成物を得た。収率：８４％。
【００５９】
【化７】
2006526632.tif 000008
（ブロモ酢酸４−（２−ブロモアセトキシ）ブチルエステル）
この化合物を、ブロモ酢酸３−（２−ブロモアセトキシ）プロピルエステルの調製に使用した手順と類似の手順によって調製した。混合物を窒素下で還流し、シリカゲルＴＬＣ（クロロホルム：メタノール９０：１０  ｖ／ｖ）上の塩化ブロモアセチル（Ｒｆ＝０．３９）の消失、およびＲｆ＝０．７８の生成物スポットの出現に基づいて、反応を完了するまで続けた（約４８時間）。溶媒を減圧下で取り除き、黄色の結晶として粗製生成物を得た：融点６２〜６２．５℃。収率：約８０％。
【００６０】
【化８】
2006526632.tif 000009
（Ｓ−（ブロモアセトキシプロピルアセトキシ）グルタチオン（ＢＰＧ））
１８ｍｌのアセトン中のブロモ酢酸３−（２−ブロモアセトキシ）プロピルエステル（１．０５ｇ、３．２９ｍｍｏｌ）の溶液に、１モル当量のＮａＯＨを含有する１０ｍｌのＨ２Ｏ中のＧＳＨ（０．２ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）の脱気水溶液をゆっくり添加した。この混合物を、室温で３時間撹拌させた。この混合物をＣＨＣｌ３（４×６０ｍｌ）で洗浄した。水層を有機層からデカントし、そして溶媒をその水層から減圧下で取り除いた。ガラス状の残渣を、Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ：酢酸（８０：２０：１、ｖ／ｖ／ｖ）から構成される溶出溶媒を使用して、逆相ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ｕＢｏｎｄａｐａｋ  Ｇ１８、７．８×３００  ｍｍ）により精製した。収率：１８％。
【００６１】
【化９】
2006526632.tif 000010
（Ｓ−（ブロモアセトキシブチルアセトキシ）グルタチオン（ＢＢＧ））
この化合物を、ＢＰＧを合成するために使用した手順と同じ一般的な手順により合成した。収率：１７％。
【００６２】
【化１０】
2006526632.tif 000011
（実施例２）
（ヒトＧｌｘＩの不可逆的不活性化）
本発明は、ｈＧｌｘＩを不可逆的に不活性化するＳ−置換グルタチオンのクラスを提供する。ＧｌｘＩの不可逆的失活剤は、活性部位に結合し、共有結合修飾によって酵素機能を永遠に無効にする。高親和力（低い解離定数（Ｋｄ））を有する不可逆的失活剤は、先行技術の化合物よりも好ましい。なぜなら、ＧｌｘＩ阻害の効果は、通常、より長く続いているからである。
【００６３】
（不活性化反応速度論）
図７に示すように、Ｓ−（ブロモアセトキシプロピルアセトキシ）グルタチオン（ＢＰＧ）およびＳ−（ブロモアセトキシブチルアセトキシ）グルタチオン（ＢＢＧ）の両方は、ヒトＧｌｘＩを不可逆的に不活性化する（条件：リン酸ナトリウム緩衝水溶液（ｐＨ７）中のグリセロール（２０％）、２５℃）。リン酸緩衝液中の酵素（１０単位／ｍｌ）と既知濃度の失活剤とのインキュベーション混合物を、水浴で２５℃に維持したプラスチックブレットチューブ中で別々にインキュベートした。アリコートを取り除き、１ｍｌのＧＳＨ−メチルグリオキサル−チオヘミアセタールを含む石英キュベットに希釈し、そして生成物形成の速度（ΔＯＤ（２４０））を時間の関数としてモニタリングした。生成物形成の初速度から、上記酵素の活性を計算した。ｌｎ（残っている酵素活性のフラクション）対時間のプロットの傾きは、ｈＧｌｘＩの不活性化についての明確な一次速度定数（ｋｉｎａｃｔ）を与える。ｋｉｎａｃｔ対失活剤濃度のプロット（図７）は、解離定数（Ｋｄおよびｋｉｎａｃｔの最大値）を与える。
【００６４】
両化合物は、活性部位の塩基を共有結合的に修飾することによって酵素を不活性化する可能性がある。なぜなら、可逆的インヒビターＣＨＧは、酵素を不活性化から保護するからである。そして、その不活性化プロセスは飽和反応速度論を与える（図７）。さらに、不活性化酵素のマトリックス支援レーザー脱離（ＭＡＬＤＩ）質量分析は、各モノマーを構成するポリペプチドが、単一の失活剤分子によって（その失活剤から臭素原子が損失することにより）、共有結合修飾されたことを示した。ｈＧｌｘＩの活性部位へのＢＰＧおよびＢＢＧの計算的なドッキングは、Ｃｙｓ（６０）のスルフヒドリル基が、酵素の不活性化の間に結合ＢＢＧと結合ＢＰＧとを反応させる（Ｂｒ−を置換する）ように良好に配置されることを示唆する。
【００６５】
（実施例３）
（ポリ−β−アラニルリンカーを含む二価ＧｌｘＩインヒビターの合成）
ポリ−β−アラニルリンカーを使用して可逆的競合的インヒビターＳ−（４−クロロフェニル−Ｎ−ヒドロキシフェニル）グルタチオン（ＣＨＧ）を架橋することにより、ＧｌｘＩの二価競合的インヒビターを生成するために使用した合成経路を、図１に示す。
【００６６】
（材料および方法）
酸化されたグルタチオンおよび還元されたグルタチオン、スベリン酸ビス（Ｎ−ヒドロキシスクシンイイミドエステル）、ヒトグリオキサラーゼＩおよび酵母グリオキサラーゼＩ、ウシ肝臓グリオキサラーゼＩＩ、ヒト胎盤グルタチオントランスフェラーゼならびに酵母グルタチオンレダクターゼを、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．から購入した。Ｂｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＳｕを、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから購入した。他の試薬全ては、市販されている最も純度の高いものであった。
【００６７】
（分析方法）
ＮＭＲスペクトルを、ＧＥ  ＱＥ−５００  ＮＭＲ分光計で測定した。質量分析データを、生物医学および生物有機質量分析のセンター（ワシントン大学）において得た。ＵＶスペクトルを、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＵ  ６４０分光光度計を使用して記録した。ＨＰＬＣを、６００制御装置、Ｄｅｌｔａ  ６００ポンプ、および９９６光ダイオードアレイ検出器から構成されるＷａｔｅｒｓ高速液体クロマトグラフィーシステムを使用して行った。分析ＨＰＬＣを、Ｎｏｖａ−Ｐａｋ  Ｃ１８、４μｍ、３．９×１５０  ｍｍカラムを使用して行った。調製ＨＰＬＣを、ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ  Ｃ１８、７μｍ、１９×１５０ｍｍカラムを使用して行った。
【００６８】
（ＣＨＧ（β−ａｌａ））
１５ｍｌのＤＭＦと３ｍｌのジイソプロピルエチルアミンとの混合物中のＣＨＧ（１ｇ、２．１ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｂｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＳｕ（９００  ｍｇ、３．６ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を、室温で撹拌し、反応の進行を、溶出溶媒として０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水中の２５％アセトニトリルを使用して、その反応混合物のアリコートのＲＰ−ＨＰＬＣにより得られたＣＨＧピークの消失に従ってモニタリングした。反応が９９％完了した（約１．５時間）後、溶媒を減圧下で取り除き、その残渣を１０ｍｌ  ＴＦＡ中に溶解し、そして１時間室温で撹拌した。ジエチルエーテル（１００ｍｌ）をこの反応混合物に添加し、そして沈殿物を濾過によって収集した。その粗製生成物を、同じ溶出溶媒を使用して、逆相ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  ｐｒｅｐ  Ｃ１８、７μｍ、１９  ×  １５０ｍｍ）により分画した。この生成物のピークを収集し、乾燥するまで蒸発させて、減圧下で一晩維持し、白色の固形物として最終生成物を得た：収率８９％（１．１５ｇ）。
【００６９】
【化１１】
2006526632.tif 000012
（ＣＨＧ（β−ａｌａ）２からＣＨＧ（β−ａｌａ）７）
これらの化合物を、上記の手順を使用して、ＣＨＧ（β−ａｌａ）へのＢｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＳｕの連続的な添加により調製した：ＣＨＧ（β−ａｌａ）２について、収率：７５％（０．８８ｇ）。
【００７０】
【化１２−１】
2006526632.tif 000013
【００７１】
【化１２−２】
2006526632.tif 000014
（［ＣＨＧ（β−ａｌａ）］２スベリン酸ジアミド）
０．３ｍｌ  ＤＭＦと０．１ｍｌジイソプロピルエチルアミンとの混合物中のＣＨＧ（β−ａｌａ）（１４ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）の溶液に、スベリン酸ビス（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（４．７ｍｇ、０．０１３  ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で一晩撹拌した。その溶媒を減圧下で取り除き、そして粗製生成物を、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水中２５〜４０％アセトニトリルの線形勾配を使用して、調製逆相ＨＰＬＣにより分画した。この生成物ピークを収集し、乾燥するまで蒸発させて、減圧下で一晩維持し、白色の固形物として最終生成物を得た：収率２５％（４．１ｍｇ）。
【００７２】
【化１３】
2006526632.tif 000015
（［ＣＨＧ（β−ａｌａ）２］２スベリン酸ジアミドから［ＣＨＧ（β−ａｌａ）７］２スベリン酸ジアミド）
これらの化合物を、［ＣＨＧ（β−ａｌａ）］２スベリン酸ジアミドの調製について上記した手順を使用してＣＨＧ（β−ａｌａ）２−ＣＨＧ（β−ａｌａ）７を架橋することにより調製した：
【００７３】
【化１４−１】
2006526632.tif 000016
【００７４】
【化１４−２】
2006526632.tif 000017
【００７５】
【化１４−３】
2006526632.tif 000018
この化合物の良質なＭＳは得られなかった。しかし、この化合物の［グリシル，グルタミル］テトラ−Ｏ−エチルエステルの良質のＨＲＭＳ（ＥＳＩ）（ｍ／ｚ  １０９９．９４５７  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋（Ｃ９２Ｈ１４０Ｎ２２Ｏ３２Ｓ２Ｃｌ２についての計算値：１０９９．９４２０）により、［ＣＨＧ（β−ａｌａ）７］２スベリン酸ジアミドの同一性を間接的に確認した。テトラＯ−エチルエステルを、エタノール性ＨＣｌ中で［ＣＨＧ（β−ａｌａ）７］２スベリン酸ジアミドをインキュベートすることにより調製した。
【００７６】
（実施例４）
（ポリエチレングリコールリンカーを含有する二価インヒビターの合成）
混合されたポリ−エチレングリコール／スベリン酸ジアミドリンカーを用いて、可逆的競合的インヒビターＳ−（４−ブロモフェニル−Ｎ−ヒドロキシフェニル）−グルタチオン（ＢＨＧ）を、架橋結合することによりＧｌｘＩの２価の競合的インヒビターを産生するのに使用される合成経路が、図２に示される；混合されたポリ−β−アラニル／ヘキサンジオエートジアミドリンカーを用いた対応する二価のインヒビターの合成が、図３に示される。
【００７７】
（ポリＢＨＧ２−６２への経路（図２））
（Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ  Ｏ−アクリロイルテトラエチレングリコールアミン）
Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ  テトラエチレングリコールアミン（９５ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）の、１ｍｌのＤＭＦプラス０．２ｍｌのＤＩＥＡの０℃の溶液に、塩化アクリロイル（３２μｌ）を添加した。この反応混合物を、３０分間攪拌し、この溶媒を減圧除去し、そして、ランニング溶液として、０．１％のＴＦＡを含有する２５％のアセトニトリル水溶液を用いて、この残渣をＲＰ−ＨＰＬＣにより分画した。この生成物のピークを収集し、そして溶媒を除去して、３９ｍｇの生成物を無色の液体として得た。収率：３５％。
【００７８】
【化１５】
2006526632.tif 000019
（Ｎ−（Ｏ−プロパノイルテトラエチレングリコールアミン）ＢＨＧ）
水浴で４０℃に維持した、１．５ｍｌのＤＭＦおよび０．３ｍｌのＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）中のＢＨＧ（１１７ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｏ−アクリルオイルテトラエチレングリコールアミン（３９ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を２４時間攪拌した後、この溶媒を、減圧して除去し、そしてその残渣を、最初に水中２５％のアセトニトリル（０．１％のＴＦＡを含む）での無勾配溶出を用い、引き続いて水中２５％のアセトニトリル（０．１％のＴＦＡを含む）から１００％アセトニトリルの線形勾配を用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分画した。Ｎ−（Ｎ−ｔ−ＢＯＣ  Ｏ−プロパノイルテトラエチレングリコールアミン）ＢＨＧに対応するピークを収集し、その溶媒を除去し、そして減圧下で一晩乾燥した。
【００７９】
【化１６】
2006526632.tif 000020
その残渣を、０．５ｍｌのＴＦＡに溶解し、そして３０分間攪拌した。このＴＦＡ溶液を、同じ溶出溶媒を使用して、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分画した。その生成物ピークをプールし、そして減圧下で乾燥して、９．２ｍｇの最終生成物を得た：収率１１％。
【００８０】
【化１７】
2006526632.tif 000021
（Ｏ，Ｏ−ジプロピルアミンジエチレングリコールビス（スベリン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル））
スベリン酸ビス（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（３７ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）の、０．５ｍｌ  ＤＭＦ中の溶液に、５．５μｌのＯ，Ｏ−（ジプロピルアミン）ジエチレングリコールを添加した。次いで、この反応混合物を３０分間攪拌し、そして最初に水中２５％のアセトニトリル（０．１％のＴＦＡを含む）での無勾配溶出を用い、引き続いて水中２５％のアセトニトリル（０．１％のＴＦＡを含む）から１００％アセトニトリルの線形勾配を用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分画した。その生成物ピークを収集し、減圧下で乾燥させて、１０．３ｍｇの最終生成物を得た。収率５７％。
【００８１】
【化１８】
2006526632.tif 000022
（ＢＨＧ２−６２）
Ｎ−（Ｏ−プロパノイルテトラエチレングリコールアミン）ＢＨＧ（４ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）の、０．２ｍｌのＤＭＦ（ジエチルアミン（ＤＩＥＡ、０．０５ｍｌ）を含む）中の攪拌溶液に、Ｏ，Ｏ−ジプロピルアミンジエチレングリコールビス（スベリン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（１．９ｍｇ、０．００２６ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を、室温で３０分間攪拌した。この反応物を、最初に水中２５％のアセトニトリル（０．１％のＴＦＡを含む）での無勾配溶出を用い、引き続いて水中２５％のアセトニトリル（０．１％のＴＦＡを含む）から１００％アセトニトリルの線形勾配を用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分解した。その生成物ピークを収集し、そしてその溶媒を減圧下で除去して、最終生成物を白色固体として得た（３．９ｍｇ）。収率７２％。
【００８２】
【化１９】
2006526632.tif 000023
（ポリＢＨＧ２−５４への経路（図３））
（Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ  β−ａｌａ  Ｏ−アクリロイルヒドロキシエチルアミド）
１０ｍｌのＤＭＦ中のＮ−ｔ−Ｂｏｃ−β−Ａｌａ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（２ｇ、７ｍｍｏｌ）に、０℃で、エタノールアミン（８５０μｌ、１４ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下し、そして３０分間攪拌した。その白色沈殿物を、濾過によって除去し、そしてその濾液を、減圧下で乾燥させて、反応中間体ｔ−Ｂｏｃ−β−Ａｌａヒドロキシエチルアミドを、淡褐色の油状物として得た。
【００８３】
【化２０】
2006526632.tif 000024
このｔ−Ｂｏｃ−β−Ａｌａヒドロキシエチルアミドを、１５ｍｌのＤＭＦおよび４ｍｌのＤＩＥＡに、０℃で溶解し、そして塩化アクリロイル（７０４μｌ）をゆっくりと滴下した。この反応混合物を、３０分間攪拌し、そしてその溶媒を減圧下で除去し、そしてその残渣を、水中２０％のアセトニトリル（０．１％のＴＦＡ勾配を含む）からなる溶出溶媒中に溶解した。この混合物を、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分画し、そして生成物を含む画分を乾燥させて、１．１２ｇの最終生成物を得た。全体の収率５３％。
【００８４】
【化２１】
2006526632.tif 000025
（Ｎ−ｔ−Ｂｏｃジ−β−ａｌａ  Ｏ−アクリロイルヒドロキシエチルアミド）
Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−β−ａｌａ  Ｏ−アクリロイルヒドロキシエチルアミド（１．１２ｇ、３．９ｍｍｏｌ）に、１０ｍｌのＴＦＡを添加し、そしてこの混合物を、室温で２時間攪拌した。その溶媒を減圧下で除去し、そしてその残渣を、１５ｍｌのＤＭＦおよび５ｍｌのＤＩＥＡに溶解した。この反応混合物に、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−β−Ａｌａ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１．６８ｇ、５．９ｍｍｏｌ）を添加し、そしてこの混合物を、室温で一晩攪拌した。その溶媒を減圧下で除去し、そしてその残渣を、溶出溶媒として水中５０％のアセトニトリル（０．１％のＴＦＡを含む）を使用して、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分画した。全体の収率（０．７７ｇ、５５％）。
【００８５】
【化２２】
2006526632.tif 000026
（Ｎ−（ジ−β−ａｌａヒドロキシエチルアミドＯ−カルボニルエチル）ＢＨＧ）
ＢＨＧ（０．５６ｇ、１．０７ｍｍｏｌ）の、８ｍｌのＤＭＦおよび２ｍｌのＤＩＥＡ中の溶液に、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃジ−β−ａｌａ  Ｏ−アクリロイルヒドロキシエチル−アミド（２００ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を、４５℃で４８時間攪拌し、その溶媒を減圧下で除去し、そしてその残渣を、最初に水中２５％のアセトニトリル（０．１％のＴＦＡを含む）での無勾配溶出を用い、引き続いて水中２５％のアセトニトリル（０．１％のＴＦＡを含む）から１００％アセトニトリルの線形勾配を用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分画した。その生成物を含む試験管をプールし、その溶媒をエバポレートし、そしてその残渣を、２ｍｌのＴＦＡに溶解し、そして室温で１時間インキュベートした。このＴＦＡを減圧下で除去し、そしてその残渣をその溶出溶媒に溶解し、次いで、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分画した。収率４９ｍｇ、５．２％。
【００８６】
【化２３】
2006526632.tif 000027
（Ｎ−（トリ−β−ａｌａヒドロキシエチルアミドＯ−カルボニルエチル）ＢＨＧ）
Ｎ−（ジ−β−ａｌａヒドロキシエチルアミンＯ−カルボニルエチル）ＢＨＧ（４０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）の、２ｍｌのＤＭＦおよび０．５ｍｌのＤＩＥＡ中の溶液に、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−β−Ａｌａ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（２９ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を、室温で一晩攪拌した。その溶媒を減圧下で除去し、そしてその残渣を、１ｍｌのＴＦＡに溶解した。この溶液を１．５時間インキュベートした後に、このＴＦＡを減圧下（ロータリーエバポレーター）で除去し、そしてその残渣を、最初に水中２５％のアセトニトリル（０．１％のＴＦＡを含む）での無勾配溶出を用い、引き続いて水中２５％のアセトニトリル（０．１％のＴＦＡを含む）から１００％アセトニトリルの線形勾配を用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分画した。その生成物ピークを収集し、そして減圧下で一晩乾燥させて、１１ｍｇの最終生成物を得た。収率２５％。
【００８７】
【化２４】
2006526632.tif 000028
（ポリＢＨＧ２−５４）
Ｎ−（トリ−β−ａｌａヒドロキシエチルアミドＯ−カルボニルエチル）−ＢＨＧ（１０ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）の、０．５ｍｌのＤＭＦおよび０．１５ｍｌのＤＩＥＡ中の溶液に、エチレンジアミンビス（ヘキサン二酸（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル））アミド（３ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を３０分間攪拌し、その溶媒を減圧下で除去し、そしてその残渣を、最初に水中２５％のアセトニトリル（０．１％のＴＦＡを含む）での無勾配溶出を用い、引き続いて水中２５％のアセトニトリル（０．１％のＴＦＡを含む）から１００％アセトニトリルの線形勾配を用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分画した。その生成物ピークをプールし、そして減圧下で一晩乾燥させて、１．３ｍｇの最終生成物を得た。収率１１％。
【００８８】
【化２５】
2006526632.tif 000029
（ヘキサン二酸ビス（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル））
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（５ｇ、４２ｍｍｏｌ）の、１００ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２および１０ｍｌのＤＩＥＡ中の溶液に、０℃で、アジポイルクロリド（３．９４ｇ、２１ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。この反応混合物を３０分間攪拌し、その溶媒を減圧下で除去した。その残渣を、アセトンから再結晶して、３．５ｇの所望の生成物を、白色針状晶として得た。収率４８％。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、標準としてＴＭＳ）δ２．７９（ｓ，８Ｈ）、２．７２（ｍ，４Ｈ）、１．７０（ｍ，４Ｈ）。
【００８９】
（エチレンジアミンビス（ヘキサン二酸（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル））アミド）
ヘキサン二酸ビス（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（２７２ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）の、２ｍｌのＤＭＦ中の溶液に、室温で、エチレンジアミン（７．７μｌ、０．３ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を、３０分間攪拌し、次いで、溶出溶媒として水中２５％のアセトニトリル（０．１％のＴＦＡを含む）を使用して、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分画した。その生成物ピークを収集し、減圧下で一晩乾燥させて、９ｍｇの所望の生成物を、白色固体として得た。収率６％。
【００９０】
【化２６】
2006526632.tif 000030
（実施例５）
（二価インヒビターの競合阻害定数）
二価酵素インヒビターおよび一価酵素インヒビターの、ヒトＧｌｘＩまたは酵母ＧｌｘＩ（ｙＧｌｘＩ）との競合阻害定数（Ｋｉｓ）を、インヒビターの存在下または非存在下での、種々の基質濃度での生成物形成の初速度の変化から得た。５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ（２５℃）および様々な濃度のチオヘミアセタール基質を含む１ｍｌのキュベットに、インヒビターの濃度は一定で、約０．０２Ｕの酵素を添加した。生成物形成の初速度を、２４０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて追跡した。その初速度データを、競合阻害についての方程式に当てはめることによって、阻害定数を得た。
【００９１】
二価のＧｌｘＩインヒビター（ＣＨＧ−（β−アラニル）６ｓｕｂ−ＣＨＧ）（図１に示される）は、ヒト赤血球由来のｈＧｌｘＩの競合的インヒビターであることが示された（例えば、図４）。さらに、これらのインヒビターの、ｈＧｌｘＩのＸ線構造へのモデル構築は、４以上のｎを有する二価インヒビターが、活性部位を架橋する能力を有し得ることを示した。実際に、競合阻害定数と、リンカー長さとの比較は、ｎ＝６または７（それぞれ、７０Åおよび８０Åのリンカー長さに対応する）の場合に、結合親和性の劇的な増加を示す（図５、表２）。
【００９２】
【表２】
2006526632.tif 000031
さらに、混合されたポリエチレングリコール／スベリン酸ジアミンリンカーを使用する二価インヒビター（ポリＢＨＧ２−６２（図２））、および混合されたポリ−β−アラニル／ヘキサン二酸ジアミンリンカー（ポリＢＨＧ２−５４（図３））もまた、ヒトＧｌｘＩの強力な競合的インヒビターであることが示され、それぞれ、１．０ｎＭおよび０．３ｎＭのＫｉ値を有する。両方のリンカーは、約６０Åの長さであった。
【００９３】
（競合的インヒビターの特異性）
この二価のインヒビターは、他のＧＳＨ依存性の酵素と比較して、ｈＧｌｘＩに対して非常に特異的である。なぜなら、このデータは、表２のリンカー長を増加させても、酵母ＧｌｘＩと二価のインヒビターとの間に結合親和性が劇的に増加しないことを示すからである。従って、最長の二価のインヒビターのｙＧｌｘＩへの結合が二箇所の活性部位への同時結合を伴うという証拠はない。ＣＨＧがｙＧｌｘＩに結合する７８倍の堅固さでｈＧｌｘＩに結合するように、架橋は、インヒビターの選択性をほとんど１００倍に増加させるが、その一方で、［ＣＨＧ（β−ａｌａ）］６］２スベリン酸ジアミドは、約７５００倍堅固に結合する（表２）。
【００９４】
チオエステルヒドロラーゼウシＧｌｘＩＩについて、ＣＨＧ（β−Ａｌａ）ｎモノマーは、この酵素を阻害するのみならず、ＣＨＧ（表２）をも阻害し、このことは、結合されたインヒビターのγ−グルタミル−ＮＨ２基がおそらくバルク溶媒中に伸びること、およびこの位置での置換基が、結合を妨害しないことを示す。さらに、リンカー長を増加させても、結合の親和性が劇的に増加せず、このことは、ＧｌｘＩＩについての単一の活性部位と完全に一致している。ｈＧｌｘＩに観察されるように、ｂＧｌｘＩＩについての二価のインヒビターの親和性は、ＣＨＧ（β−Ａｌａ）６モノマーについての二価のインヒビターの親和性より、ＣＨＧ基当たりいくらか（７倍）大きい。ｈＧｌｘＩ対ｈＧｌｘＩＩについてのＣＨＧの阻害定数および［ＣＨＧ（β−Ａｌａ）６］２スベリン酸ジアミドの阻害定数を比較して、架橋は、結合の選択性を３７倍から１４８倍へと、４倍に増加させる。最終的に、この二価のインヒビター［ＣＨＧ−（β−ａｌａ）６］２スベリン酸ジアミドは、インヒビターの濃度が２０μＭになるまで、ＧＳＨペルオキシダーゼにもヒト胎盤ＧＳＨトランスフェラーゼにも阻害活性を示さない。従って、この二価のインヒビターの、ｈＧｌｘＩについての改良された特異性は、癌の化学療法において、これらの化合物またはこれらの薬学的処方物の使用に関連する副作用を減少させる。
【００９５】
（実施例６）
（インビトロ有効性およびインビボ有効性の研究）
インビトロ有効性：上記インヒビタ−を、ＭＴＴアッセイを用いて細胞毒性について試験する。前立腺癌細胞、ＰＣ３、ＤＵ１４５およびＬＮＣａＰを、９６ウェル培養プレートにおいて１×１０３細胞／ウェルでプレートする。この細胞を、２４時間プレートに付着させる。２４時間の終わりに、この培養プレートに上記化合物を添加する。ウェルにおける最終濃度の代表的な範囲としては：初期アッセイについて、１００μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭおよび０．１μＭが挙げられる。各濃度を、３個のウェルに添加する。初期アッセイの結果に基づいて、濃度を調整する。７２時間の処置の終わりに、５０μｌの色素を添加し、そしてこの細胞を４時間インキュベートする。４時間のインキュベートの終わりに、このプレートを遠心分離し、培地を除去する。ＤＭＳＯ（１５０μｌ）を各ウェルに添加する。このプレートを約２０分振盪させ、５３０ｎｍおよび５７０ｎｍでプレートリーダー上で読み取る。阻害率を、（平均コントロールＯＤ５３０−平均処置ＯＤ５３０／コントロールＯＤ５３０）×１００＝阻害率として計算する。ＩＣ５０を、プログラムＡＤＡＰＴ  ＩＩにおいてＨｉｌｌ式を用いて計算する。このアッセイを、ＩＣ５０を予測するために、最適濃度で各細胞株につき３回繰り返す。
【００９６】
前立腺癌の異種移植片モデルにおけるインビボ有効性：最も低いＩＣ５０値を示す化合物を、インビボアッセイの結果に基づいて、もっとも敏感な前立腺癌異種移植片を有するＥｓ−１ｅ  Ｃ５７Ｂｌ／６ｎｕ／ｎｕマウスにおいて評価する。第１の研究は、その最大耐量でのｑ４ｄ×３スケジュールの投与で、単回用量での静脈内投与後の薬剤の血漿薬物動態を決定し得る。肝臓、腎臓、脾臓、心臓、肺および腫瘍異種移植片における薬剤ならびに潜在的代謝の濃度を含む、組織分布もまた測定され得る。投薬は、バイオアベイラビリティ研究が他の経路による良好な吸収を示すまで、好ましくは静脈内経路による。薬物動態学研究が、適切な濃度の薬剤が腫瘍中に存在するということを示す場合、薬剤の有効性試験が実施され得る。腫瘍体積に基づいて、５０％またはそれより少ない％Ｔ／Ｃを示す薬剤を、好ましくは、前立腺癌のさらなる異種移植片モデルにおいて評価する。
【００９７】
有効性の決定：有効性を決定するために、各処置群の体重および腫瘍体積を、週に２回測定する。処置／コントロールの体積の割合（％Ｔ／Ｃ）を、各観察日の処置した腫瘍体積の中間値をコントロールの腫瘍体積の中間値によって割り、１００をかけることにより計算する。処置の過程の間に得られた最適値（最小値）を示し、そして最適な％Ｔ／Ｃが現れる日もまた報告する。腫瘍成長の遅延は、処置群の中間値および／またはコントロールと比較して達成される特異的腫瘍体積において、遅延した腫瘍容積による割合として表現される。使用される式は（Ｔ−Ｃ／Ｃ）×１００であり、ここでＴおよびＣは、それぞれ処置群およびコントロール群についての所定の標的腫瘍体積に達するまでの日数の中間時間である。一般的に、この所定の標的は、ゆっくりと成長する腫瘍については６００ｍｍ３であり、そしてより急速に成長する腫瘍については１，０００ｍｍ３である。腫瘍倍化時間をまた、腫瘍体積が３００ｍｍ３から６００ｍｍ３まで増加するのに必要とする時間として計算する。正味の対数の細胞死は、試験薬剤によって死滅される細胞のｌｏｇ１０単位の数の推定値であり、以下の式を用いて計算する：｛［（Ｔ−Ｃ）−処置の継続時間］／倍化時間｝×０．３０１。有効性研究の終わりに、正確な腫瘍重量を腫瘍の除去によって測定し、そして群の間の腫瘍重量の中間値および平均をまた決定する。有効性試験の各処置群からのデータを、以下の統計学的な方法を用いて分析する。
【００９８】
ＰＫ分析：クリアランス、分布の定常状態体積、時間ゼロから無限領域までの曲線下の面積、および最終的な半減期を、ＬＡＧＲＡＮコンピュータープログラムによって実行されるように、ＬａＧｒａｎｇｅ関数を用いて非コンパートメント分析により推定する（Ｒｏｃｃｉ  ａｎｄ  Ｊｕｓｋｏ，Ｃｏｍｐ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ  Ｂｉｏｍｅｄ  １６：２０３（１９８３））。さらに、時間に対して、血漿中で検出される薬物の個々の濃度を、プログラムＡＤＡＰＴ  ＩＩ（Ｄ’Ａｒｇｅｎｉｏ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｍｉｔｚｋｙ，Ｃｏｍｐ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ  Ｂｉｏｍｅｄ．９，１１５（１９７９））で、最大尤度または加重平方推定のいずれかを用いて、種々のコンパートメントモデル、オープンモデル、直線モデルに当てはめる。最も適切なモデルを使用して、Ａｋａｉｋｅ情報量基準に基づいて決定する。非コンパートメント分析を０から測定の終わりまで（ＡＵＣｐ）、または無限領域まで（ＡＵＣ）の時間曲線に対する濃度下の面積、定常状態での分布の体積（Ｖｄｓｓ）、および体全体のクリアランス（ＣＬｔｂ）を計算する。ＣＬｔｂ＝用量／ＡＵＣ、そしてＶｄｓｓ＝用量×（ＡＵＭＣ／ＡＵＣ）であり、ここでＡＵＭＣとは０から無限領域までのモーメント曲線下の面積である。これらの計算は、１５％未満のＡＵＳがＯＰＳ測定の場合には存在し得ない。存在するデータにより推定されることが推測される。これらの計算は、コンパートメント分析を用いて、コンパートメント間の速度定数ならびに個々の排出速度定数および吸収速度定数を推定する。最良のコンパートメントモデルを、Ａｋａｉｋｅ情報量基準（ＡＩＣ＝２ｐ＋ｎ（ｌｎＷＳＳＲ）、ここでｐは選択されたモデルにおいて推定されるパラメーターの数であり、ｎはデータポイントの数であり、そしてＷＳＳＲは残渣平方（ｓｑｕａｒｅｓ  ｒｅｓｉｄｕａｌ）の重み付き合計（ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｓｕｍ）である）に基づいて選択する。
【００９９】
データを、プログラムＭｉｎｉｔａｂ（Ｍｉｎｉｔａｂ，Ｉｎｃ．，Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ，ＰＡ）を用いてパラメトリック試験およびノンパラメトリック試験の両方によって分析する。群比較を、ＡＮＯＶＡまたはＫｒｕｓｋａｌｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験を用いて行う。二つ一組の比較を、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ試験またはＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験を用いて実施する。有意性を、ｐ≦０．０５で設定した。
【０１００】
本明細書において参照される特許または刊行物のいずれも、本発明が属する当該分野のレベルの指標である。これらの特許および刊行物は、個々の刊行物が明確にそして個々に参照として援用されることが示された場合と同じ程度に、本明細書中に参照として援用される。
【０１０１】
当業者は、本発明が目的を実行するように適応しており、そして本明細書中に固有の目的および利点と同様に、言及された目的および利点を得るということを容易に理解する。本明細書中に記載される方法、手順、処置、分子および特定の化合物に沿う本実施例、ならびに他の使用は、特許請求の範囲により規定される本発明の精神の範囲内に包含されるということが、当業者に理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１は、ポリ−β−アラニルリンカーを使用する二価の遷移状態のアナログインヒビターを得るための合成経路を示す。
【図２】図２は、混合されたポリエチレングリコール／スベレートジアミドリンカーを含む二価の遷移状態のアナログＮ−（Ｏ−プロパノイルテトラエチレングリコールアミンＯ，Ｏ’−ジプロピルアミンジエチレングリコールビス（スベリン酸）Ｓ−（Ｎ−ｐ−ブロモ−フェニル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン（下で、ポリＢＨＧ２−６２）を得るための合成経路を示す。
【図３】図３は、混合されたポリ−β−アラニル／ヘキサンジオエートジアミドリンカーを含む二価の遷移状態のアナログＮ−（トリ−β−アラヒドロキシエチルアミドエチレンジアミンビス（ヘキサン二酸Ｏ−カルボニルエチル）Ｓ−（Ｎ−ｐ−ブロモフェニル−Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）グルタチオン（下で、ポリＢＨＧ２−５４）を得るための合成経路を示す。
【図４】図４は、［ＣＨＧ（β−アラニル）６］２スベレートジアミドを種々の固定濃度における、ＧＳＨ−メチルグリオキサールチオヘミアセタールスベレート（Ｓ）の濃度に対するｈＧｌｘＩ反応の初速度の逆数プロットである。
【図５】図５は、ヒトグリオキサラーゼＩ（●）および酵母グリオキサラーゼＩ（▲）に対する、表２の二価のインヒビターについてのリンカーの長さに対するＫｉの対数プロットを示す。塗りつぶしていない記号は、一価のＣＨＧについてのものである。
【図６】図６は、不可逆的失活剤のＳ−（ブロモアセトキシブチルアセトキシ）グルタチオン（ＢＢＧ）およびＳ−（ブロモアセトキシプロピルアセトキシ）グルタチオン（ＢＰＧ）についての合成経路を示す。
【図７】図７は、ＧＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）４ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｂｒの濃度に対するヒトＧｌｘＩの不活性化についての一次速度定数（ｋｏｂｓｄ）を示す（Ｋｄ＝１７７±４３μＭ、Ｋｉｎａｃｔ＝０．０１６０±０．０００７／分）。ＫｄおよびＫｉｎａｃｔの値は、データを以下の式に合わせることによって得られた：ｋｏｂｓｄ＝ｋｉｎａｃｔ［ｉｎａｃｔ］／（Ｋｄ＋［ｉｎａｃｔ．］）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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2006526632.tif 000042