(57)【要約】アデノウイルス遺伝子送達粒子などの送達ベクターを選択した細胞種にターゲッティングする方法および産物が提供される。本方法はベクター粒子表面のタンパク質、またターゲッティングされた細胞表面タンパク質と特異的に複合化する二官能性分子によるターゲッティングによるものである。ターゲッティングされた細胞表面タンパク質はホスファチジルイノシトール−３−ＯＨキナーゼを活性化するいずれのものであってもよい。該二官能性分子、組成物、キット、ならびに遺伝子治療のためのベクター／二官能性分子の製造および使用方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体またはその抗原結合部分およびターゲッティングエージェントを含んでなり、
該抗体が、αｖインテグリンと結合するタンパク質の抗原と特異的に結合し、
該ターゲッティングエージェントが、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）シグナル伝達経路を活性化する細胞表面タンパク質と特異的に結合する、二官能性分子。
【請求項２】
ターゲッティングエージェントまたはその一部がホスファチジルイノシトール−３−ＯＨキナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の活性化を誘発する、請求項１に記載の二官能性分子。
【請求項３】
抗体またはその抗原結合部分をターゲッティングエージェントに連結するリンカーをさらに含む、請求項１に記載の二官能性分子。
【請求項４】
融合タンパク質を含む、請求項１に記載の二官能性分子。
【請求項５】
化学的にコンジュゲートされたポリペプチドを含む、請求項１に記載の二官能性分子。
【請求項６】
リンカーが単一のアミノ酸またはペプチドである、請求項１に記載の二官能性分子。
【請求項７】
抗体がＨ鎖またはターゲッティングエージェントとの抗原結合融合に十分なその部分を含む、請求項１に記載の二官能性分子。
【請求項８】
抗体部分がＦａｂ’２フラグメントである、請求項１に記載の二官能性分子。
【請求項９】
抗体部分が抗原認識に十分なＨ鎖およびＬ鎖可変領域の部分を含む、請求項１に記載の二官能性分子。
【請求項１０】
抗体が配列番号２もしくは配列番号６で示されるアミノ酸配列、または抗原認識に十分なそれらの部分を含む、請求項１に記載の二官能性分子。
【請求項１１】
抗体が配列番号４で示されるアミノ酸配列、または抗原認識に十分なその部分を含む、請求項１に記載の二官能性分子。
【請求項１２】
抗体部分がＦａｂフラグメントである、請求項１に記載の二官能性分子。
【請求項１３】
抗体部分をコードする核酸が
（ａ）配列番号１または配列番号５で示されるヌクレオチド配列のコード部分、
（ｂ）（ａ）の１以上の縮重コドンを含むヌクレオチド配列、および
（ｃ）抗体の抗原結合部分をコードするに十分な（ａ）または（ｂ）の部分と高いストリンジェント条件下でその全長にわたってハイブリダイズするヌクレオチド配列から選択される、請求項１０に記載の二官能性分子。
【請求項１４】
抗体部分をコードする核酸が
（ａ）配列番号３で示されるヌクレオチド配列のコード部分、
（ｂ）（ａ）の１以上の縮重コドンを含むヌクレオチド配列、および
（ｃ）抗体の抗原結合部分をコードするに十分な（ａ）または（ｂ）の部分と高いストリンジェント条件下でその全長にわたってハイブリダイズするヌクレオチド配列から選択される、請求項１１に記載の二官能性分子。
【請求項１５】
ターゲッティングされたレセプターとの特異的結合のため、配列番号７〜１４のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の二官能性分子。
【請求項１６】
αｖインテグリンと結合するタンパク質が個々のウイルスもしくは細菌のインターナリゼーションのためにαｖインテグリンと反応するウイルスタンパク質または細菌タンパク質である、請求項１に記載の二官能性分子。
【請求項１７】
ウイルスがアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスから選択される、請求項１６に記載の二官能性分子。
【請求項１８】
抗体またはその部分がアデノウイルスのペントンベースと特異的に結合する、請求項１に記載の二官能性分子。
【請求項１９】
抗体またはその部分がＲＧＤモチーフを含む抗原と特異的に結合する、請求項１に記載の二官能性分子。
【請求項２０】
ターゲッティングエージェントが、シグナル伝達にＰＩ３シグナル伝達経路を用いるＧタンパク質結合レセプター、癌遺伝子産物レセプター、ホルモンレセプターまたはサイトカインレセプターと結合するタンパク質の全部、またはその十分な部分を含み、その十分な部分がその細胞表面レセプターと特異的に結合し、結合したウイルスまたは細菌粒子をインターナライズする、請求項１に記載の二官能性分子。
【請求項２１】
ターゲッティングエージェントが、シグナル伝達にＰＩ３シグナル伝達経路を用いるＧタンパク質結合レセプターと結合するタンパク質の全部、またはその十分な部分を含み、その十分な部分がその細胞表面レセプターと特異的に結合し、結合したウイルスまたは細菌粒子をインターナライズする、請求項１に記載の二官能性分子。
【請求項２２】
ターゲッティングエージェントがホルモンまたは増殖因子またはサイトカインの全部またはその十分な部分を含み、その十分な部分がその細胞表面レセプターと特異的に結合し、結合したウイルスまたは細菌粒子をインターナライズする、請求項１に記載の二官能性分子。
【請求項２３】
ターゲッティングエージェントまたはその部分が腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インスリンまたは血清細胞因子（ＳＣＦ）である、請求項６に記載の二官能性分子。
【請求項２４】
ターゲッティングエージェントまたはその部分がインスリン、ＩＧＦ−１、ＴＮＦ−α、ＳＣＦ、ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ヘパリン結合上皮増殖因子（ＨＥＧＦ）、ＶＥＧＦまたはそれらの二量体である、請求項６に記載の二官能性分子。
【請求項２５】
ターゲッティングエージェントまたはその部分がＴＮＦ−α、ＩＧＦ−１、ＳＣＦまたはＥＧＦである、請求項６に記載の二官能性分子。
【請求項２６】
ターゲッティングされた細胞表面タンパク質がＰＤＧＦレセプター、ＩＧＦ−１レセプター、ＥＧＦレセプター、ＦＧＦレセプターファミリーのメンバー、ＴＮＦレセプター、ＣＳＦ−１レセプター、インスリンレセプター、ＩＧＦ−１レセプター、ＮＧＦレセプター、ＩＩ−２レセプター、ＩＩ−３レセプター、ＩＩ−４レセプター、ＩｇＭレセプター、ＣＤ４レセプター、ＣＤ２レセプター、ＣＤ３／Ｔ細胞レセプター、Ｇタンパク質結合トロンビンレセプター、ＡＴＰレセプター、およびｆＭＬＰレセプターの中から選択される、請求項１に記載の二官能性分子。
【請求項２７】
ターゲッティングされる細胞表面タンパク質が、活性化された際にＰｔｄｌｎｓ（３，４，５）Ｐ３の集積の上昇をもたらし、ＰＩ３Ｋを刺激してリン酸化ホスファチジルイノシトール（３，４，５）Ｐ３ （Ｐｔｄｌｎｓ（３，４，５）Ｐ３）を集積するｓｒｃファミリー非レセプター型チロシンキナーゼと会合したレセプターであるチロシンキナーゼレセプターの中から選択される、請求項１に記載の二官能性分子。
【請求項２８】
請求項１に記載の二官能性分子をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２９】
請求項１に記載の二官能性分子、および
ウイルスまたは細菌ベクター
を含む、ターゲッティングされた送達ベクター。
【請求項３０】
遺伝子送達ベクターが治療産物をコードする、請求項２９に記載のターゲッティングされた送達ベクター。
【請求項３１】
ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項２９に記載のターゲッティングされた送達ベクター。
【請求項３２】
ベクターが無繊維アデノウイルスベクターである、請求項２９に記載のターゲッティングされた送達ベクター。
【請求項３３】
二官能性分子およびウイルスまたは細菌ベクターが、二官能性分子の抗体部分とウイルスまたは細菌表面タンパク質との相互作用によって複合化される、請求項２９に記載のターゲッティングされた送達ベクター。
【請求項３４】
二官能性分子の抗体部分がウイルスまたは細菌表面タンパク質と共有結合される、請求項１２に記載のターゲッティングされた送達ベクター。
【請求項３５】
請求項１に記載の二官能性分子をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項３６】
ターゲッティングされた細胞へ遺伝子産物を送達する送達ベクター、および
請求項１に記載の二官能性分子
を含む組合せ。
【請求項３７】
二官能性分子およびターゲッティングされた細胞へ遺伝子産物を送達する送達ベクターが複合化される、請求項３６に記載の組合せ。
【請求項３８】
請求項３６に記載の組合せを投与することを含む、ターゲッティングされた遺伝子療法。
【請求項３９】
請求項３７に記載の組合せを投与することを含む、ターゲッティングされた遺伝子療法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本明細書に記載の研究はＮＩＨ助成金ＥＹ１１４３１およびＨＬ５４３５２の支援を受けたものである。政府は本件において一定の権利を有する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は遺伝子療法、特にアデノウイルスベクターに基づく遺伝子療法に関する。詳しくは、治療用その他の産物のターゲッティング送達のために二官能性分子と複合化されたアデノウイルスベクターが提供される。アデノウイルス送達粒子と複合化した二官能性分子はコクサッキー・アデノウイルス・レセプター（ＣＡＲ）およびインテグリンの相互作用を回避してかかる粒子による遺伝子送達を改良する。遺伝子療法のための二官能性分子、組成物、キットおよびベクター／二官能性分子の製造および使用方法が提供される。
【０００３】
（発明の背景）
アデノウイルス送達ベクター
アデノウイルスは３６キロベース（ｋｂ）のゲノムを有するＤＮＡウイルスであり、極めてよく特性決定され、その遺伝的性質および遺伝子構成が分かっている。アデノウイルス遺伝子構成は大きなウイルスＤＮＡ断片を外来のＤＮＡで置換することを可能とする。また、組換えアデノウイルスは構造上安定であり、増幅拡張すると再構成されたウイルスが見られる。
【０００４】
アデノウイルスは真核細胞に目的遺伝子を導入する送達ビヒクルとして用いられている。アデノウイルスはかかる遺伝子を細胞レセプターと結合させた後にインターナリゼーションさせることで真核細胞へ送達する。アデノウイルス繊維タンパク質が細胞との結合を担う。この繊維タンパク質はロッド状シャフトタンパク質とレセプター結合領域を含む球形ヘッドタンパク質の２つのタンパク質を有する。この繊維スパイクはホモ三量体であって、ビリオン当たり１２のスパイクがある。ヒトアデノウイルスは広範な培養細胞系統および様々な種に由来する一次組織に結合して感染する。
【０００５】
２型アデノウイルス３５，０００＋塩基対（ｂｐ）ゲノムが配列決定され、主要コートタンパク質（ヘキソン、ファイバーおよびペントンベース）の推定アミノ酸配列が記載されている（例えば、Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ｅｌ．， Ｇｅｎｅ ６９： １５３−１５７ （１９８８）； Ｈｅｒｉｓｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ９： ４０２３−４０４１ （１９８１）； Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５９： １３９６８−１３９７５ （１９８４）； Ｋｉｎｌｏｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５９：６４３１−６４３６ （１９８４）；およびＣｈｒｏｂｏｃｚｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌ． １６１．５４９−５５４， １９８７参照）。
【０００６】
Ａｄ５ ＤＮＡの３５，９３５ｂｐの配列も公知であり、その他多くのアデノウイルスゲノムの部分も配列決定されている。アデノウイルスビリオンのパッケージング上限は野生型ゲノム長の約１０５％である（例えば、Ｂｅｔｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７（１０）：５９１１−２１， １９９３）。従ってＡｄ２およびＡｄ５であれば、これはＤＮＡで約３８ｋｂのパッケージング上限となる。
【０００７】
アデノウイルスはまた、血清型にもよるが約１００から１５０ｂｐの範囲の大きさの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）も含む。この逆方向末端反復配列により、それらの末端配列が塩基対合してウイルスＤＮＡの複製に必要な塩基対の「パンハンドル」構造を形成することで、ウイルスＤＮＡの一本鎖を環化することができる。
【０００８】
有効なパッケージングのためには、ＩＴＲおよびパッケージングシグナル（数百ｂｐの長さ）はゲノム核酸の複製およびパッケージングアデノウイルス粒子へのパッケージングの「最小必要条件」を含む。全てのウイルスＯＲＦを欠いているが、これらの必須のｃｉｓエレメント（ＩＴＲおよび隣接するパッケージング配列）を含むヘルパー依存性ベクターが構築されている。
【０００９】
Ａｄベクターは遺伝子送達ビヒクルとしていくつかの利点を有する。例えば、かかるベクターの組換えがまれであること、一般的なヒトのアデノウイルス感染にもかかわらず、ヒトの悪性疾患とアデノウイルス感染との関連は知られていないこと、そのゲノムが適切な実質的な大きなの外来遺伝子の収容能力を持つように操作可能であること、また、アデノウイルスタンパク質の発現のために宿主の増殖を必要としないことである。アデノウイルス（Ａｄ）に基づく遺伝子送達ベクターは種々の細胞および組織に効率的に感染する。しかしながらこの広範な親和性は医送達が特的の標的細胞に向けられないことを意味する。静脈投与したアデノウイルスの大部分は肝臓に留まり、望ましくない副作用をもたらし得る。アデノウイルスは免疫応答を誘導し得る。例えば、５型アデノウイルス（Ａｄ５）はまた、極めて効果的に抗原を提示する樹状細胞を変換し、それによりおそらくベクターに対する免疫応答を増強する。種々のターゲテッィング効率を有するベクターがこれらの問題をなくし、総粒子量を少なくし、より特異性の高いターゲッティングを可能とするものと提案される（例えば、米国出願番号０９／４８２，６８２参照）。
【００１０】
アデノウイルス構造および感染機構に関する情報、非分裂細胞のその効果的な感染、およびその大きな遺伝的能力の価値はアデノウイルスを公知の遺伝子療法ベクターとする。アデノウイルスが結合するレセプターの広い発現はアデノウイルスベクターをターゲッティングすることを困難にする。特に、Ａｄレセプター（ＣＡＲ）は広範に分布するため、現行のアデノウイルス（Ａｄ）ベクターは特定の細胞種にターゲッティングすることができない（例えば、Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：１３２０−１３２３； Ｔｏｍｋｏ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：３３５２−３３５６参照）。さらに、ＣＡＲおよび／またはインターナリゼーションレセプター（αｖインテグリン）（Ｗｉｃｋｈａｍ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃｅｌｌ ７３：３０９−３１９参照）は存在しないか、またはいくつかの細胞種で低レベルでしか存在せず、これによりそれらはＡｄを媒介とする遺伝子送達の妨げとなる。
【００１１】
ＮＩＨ組換えＤＮＡ安全委員会に登録されている全ての遺伝子療法の臨床試験のおよそ２０％が複製欠陥アデノウイルスベクターを使用している（組換えＤＮＡデータベース事務局）。特に腫瘍管理の分野で成功が報告されているが（例えば、Ｂｉｌｂａｏ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ４５１：３６５−３７４； Ｇｏｍｅｚ−Ｎａｖａｒｒｏ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ３５：８６７−８８５参照）、アデノウイルス遺伝子送達ベクターの使用はそれらのウイルスまたはコードされている導入遺伝子産物に対する宿主の炎症応答によって妨げられる（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：１２７４４−１２７４６）。さらに、いくつかの細胞種ではＡｄ結合レセプター、コクサッキーアデノウイルスレセプター（ＣＡＲ； Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：１３２０−１３２３； Ｔｏｍｋｏ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：３３５２−３３５６）、またはウイルスインターナリゼーションレセプターとして機能するインテグリンαｖβ３およびαｖβ５（Ｗｉｃｋｈａｍ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃｅｌｌ ７３：３０９−３１９）のいずれかを欠いている。例えば、気道上皮はそれらの頂端表面でＣＡＲおよびインテグリンを発現しないので（Ｇｏｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９：５９５１−５９５８； Ｇｒｕｂｂ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｎａｔｕｒｅ ３７１：８０２−８０６）、アデノウイルスベクターを用いた嚢胞性繊維症の治療を目的とした臨床試験では変動があって一般的に低い効率が報告されている（Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６； Ｃｒｙｓｔａｌ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔ． ４：４２−５１）。
【００１２】
このようにアデノウイルスベクターおよびその他は治療適用に極めて有望でありながら、それらの有用性は、特定の細胞種への送達を制限するＣＡＲの広範な組織分布により、また、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてある細胞にはＣＡＲおよび／またはαｖインテグリンレセプターが存在しないことにより制限される。種々の細胞レセプターにベクターを再ターゲッティングするために１以上のＡｄ外部キャプシドタンパク質を改変することでこれらの制限を克服する試みがなされてきた。遺伝子送達の改良は実現されてきたが、各方法はその制限を持っている。また、遺伝子送達を促進する基調因子はまだ明らかに定義されておらず、そのことがＡｄベクターの開発のさらなる進展の妨げとなっており、ターゲッティングの特異性にはさらなる改良を要する。
【００１３】
従って送達およびアデノウイルス遺伝子送達ベクターをはじめとする遺伝子送達ベクターのターゲッティングを改良する必要があり、またその基調となる基礎を理解する必要がある。ゆえに特定の細胞および組織を特異的にターゲッティングすることができ、かつ、かかるベクターの改良された送達およびインターナリゼーションを与える方法およびベクターを提供することが本明細書の目的である。また、基調にあるインターナリゼーション機構を同定すること、およびそれをもとにした送達方法および送達ベクターを提供することも本明細書の目的である。
【００１４】
（発明の概要）
αｖインテグリンおよび細胞表面タンパク質ならびにリガンドの相互作用の際にホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）またはホスファチジルイノシトール３（ＰＩ３）シグナル伝達経路を活性化するレセプターの連結によって開始される一般的な細胞シグナル伝達経路を利用するベクターターゲッティング法が提供される。ターゲッティングを達成するための二官能性分子（または多官能性分子）およびウイルス粒子または細菌表面タンパク質とコンジュゲートした二官能性分子を含む複合体が提供される。また、遺伝子送達および遺伝子療法の方法も提供される。好ましい実施形態では、送達用の、二官能性分子が特異的に結合するウイルスはアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスである。より好ましくは、ウイルスは無線異性ウイルス粒子を含むアデノウイルスである。
【００１５】
特に抗体またはその抗原結合部分およびターゲッティングエージェントを含む二官能性分子が提供される。この抗体はαｖインテグリンと結合するタンパク質の抗原と特異的に結合し、ターゲッティングエージェントはホスファチジルイノシトール３（ＰＩ３）シグナル伝達経路を活性化する細胞表面タンパク質と特異的に結合する。特にこのターゲッティングエージェントは、ホスファチジルイノシトール−３−ＯＨキナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の活性化を誘導する細胞表面タンパク質と結合する。
【００１６】
このように二官能性分子は、ＰＩ３Ｋの活性化を誘導する細胞表面タンパク質と特異的に結合する部分であるターゲッティングエージェントと、ウイルス粒子または細菌細胞表面上のタンパク質と特異的に結合する結合部分（本明細書では「Ｐ」と呼ぶ）を含む。一般にかかるウイルスまたは細菌表面タンパク質はαｖインテグリンまたはその他ウイルスまたは細菌の細胞へのインターナリゼーションを促進または達成するターゲッティングされた細胞の表面上のタンパク質と特異的に結合する。
【００１７】
これらの二官能性分子は所望により、抗体またはその抗原結合部分をターゲッティングエージェントに結合するリンカーまたは複数のリンカーを含んでもよい。このリンカーは好ましくは２から１００、より好ましくは３から５０、より好ましくは５から２０のアミノ酸のペプチド、単一のアミノ酸、または架橋剤もしくはヘテロ二官能性架試薬と反応させることで作製されるものなどの化学リンカーであってよい。これらの二官能性分子は融合タンパク質、化学コンジュゲートもしくはその混合物、単一のアミノ酸またはペプチドであってもよい。
【００１８】
従って二官能性剤は式：（Ｐ）ｎ −（Ｌ）ｑ−（ＴＡ）ｍ（式中、ｍおよびｎは１以上の整数、通常には１であり、ｑは０または１以上の整数、通常には１または２である）で表すことができる。例えば、ｎおよびｍの一方または双方が１より大きければ、得られる分子は技術上多官能性分子となる。各Ｐおよび各ＴＡは同じであっても異なっていてもよい。
【００１９】
αｖインテグリンと結合するタンパク質は個々のウイルスまたは細菌のインターナリゼーションのためにαｖインテグリンと相互作用するウイルスタンパク質または細菌タンパク質である。二官能性分子の「Ｐ」部分がかかるタンパク質と相互作用する。このＰ部分は通常には抗体またはその部分または抗体の結合特異性を有する組換え分子である。二官能性分子の抗体または抗体結合部分は、例えばアデノウイルスのペントンタンパク質などのウイルスタンパク質であるタンパク質と特異的に結合する。
【００２０】
この二官能性分子の抗体または抗体結合部分はＨ鎖またはターゲッティングエージェントとの抗原結合融合に十分なその部分を含んでもよいし、あるいはＦａｂまたはＦａｂ’２フラグメントであってもよいし、あるいは抗原との特異的相互作用に十分なＨ鎖およびＬ鎖可変領域の部分などの抗体フラグメントを含む合成または組換え分子であってもよい。
【００２１】
ターゲッティングされる細胞表面タンパク質は、それへの結合が特にＰＩ３Ｋを含むシグナル伝達経路を介してインターナリゼーションを促進するいずれかの細胞表面タンパク質である。かかる表面タンパク質としては、限定されるものではないが、ＰＤＧＦレセプター、ＩＧＦ−１レセプター、ＥＧＦレセプター、ＦＧＦレセプターファミリーのメンバー、ＴＮＦレセプター、ＣＳＦ−１レセプター、インスリンレセプター、ＩＧＦ−１レセプター、ＮＧＦレセプター、ＩＩ−２レセプター、ＩＩ−３レセプター、ＩＩ−４レセプター、ＩｇＭレセプター、ＣＤ４レセプター、ＣＤ２レセプター、ＣＤ３／Ｔ細胞レセプター、Ｇタンパク質結合トロンビンレセプター、ＡＴＰレセプター、ｆＭＬＰレセプターなどのサイトカインレセプター、成長ホルモンレセプターおよびその他の非ステロイド系ホルモンレセプター、および活性化された際にＰｔｄｌｎｓ（３，４，５）Ｐ３の集積の上昇をもたらす、ＰＩＳＫを刺激してホスファチジルイノシトール（３，４，５）Ｐ３ （Ｐｔｄｌｎｓ（３，４，５）Ｐ３）の集積をもたらすｓｒｃファミリー非レセプター型チロシンキナーゼと会合したレセプターであるチロシンキナーゼレセプターが挙げられる。
【００２２】
例としての実施形態では、ＴＮＦ−α、ＩＧＦ−１、ＳＣＦ、ＰＤＧＦおよびＥＧＦなどの増殖因子／サイトカイン、インスリンなどのホルモン、およびアデノウイルスのインターナリゼーションに関与するシグナル伝達分子であるホスファチジルイノシトール−３−ＯＨキナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の活性化を誘導するその他の分子またはその部分を、アデノウイルスの場合にはウイルスのペントンベースである、αｖインテグリンと相互作用するウイルス粒子タンパク質に特異的なモノクローナル抗体と融合させる。これらの二官能性ｍＡｂと複合化したＡｄベクターはαｖインテグリンを欠いたヒトメラノーマ細胞に対して約１０〜５０倍の遺伝子送達上昇を示す。この二官能性Ｍａｂはまた、ＣＡＲとは結合できない無繊維アデノウイルス粒子による遺伝子送達を促進する。遺伝子送達の改良はウイルスのインターナリゼーションと接着ならびにＰＩ３Ｋ活性の上昇と相関する。特定の細胞シグナル伝達経路を誘導するための二官能性ｍＡｂの使用は遺伝子送達における正常なＡｄレセプターを迂回して遺伝子導入の選択性を高め得る広く適用できる方法を与える。
【００２３】
二官能性分子をコードする単離された核酸分子も提供される。「Ｐ」部分が抗体またはその部分であるいくつかの例では、二官能性分子は２鎖を含み、これらは個別に発現させてもよいし、選択された発現系によるなどして再構成されたものであってもよい。好ましい発現系はバキュロウイルス系である。
【００２４】
また、二官能性分子およびウイルスまたは細菌ベクターを含む組合せも提供される。これらの組合せの成分は個別であっても、二官能性分子がウイルス粒子または細菌細胞と複合化されている単一の組成物として組み合わされたものであってもよい。これらの組合せを含むキットは所望により投与および／または複合化の説明書を含んでもよく、このようなキットも提供される。二官能性分子およびウイルスまたは細菌ベクターを複合化すれば、得られた複合体は治療、遺伝子療法および／またはトランスジェニック動物の作出のためなどの遺伝子産物の送達に使用できる。本明細書において好ましい送達ベクターは無繊維アデノウイルスベクターをはじめとするアデノウイルスベクターである。
【００２５】
また、ウイルス粒子または細菌細胞と複合化した二官能性分子を含むターゲッティング遺伝子送達ベクターを投与することによる遺伝子療法も提供される。
【００２６】
例としての実施形態では、二官能性分子およびアデノウイルス送達ベクターとのその複合体が提供される。例としての実施形態では、アデノウイルスのペントンベースタンパク質のＲＧＤモチーフを認識する二官能性分子を、ＴＮＦ−αなどの成熟型のレセプターターゲッティング分子と融合させる。これらの二官能性分子を非溶解性バキュロウイルス発現系を用い、昆虫細胞で発現させた。特にこの二官能性はＡｄ２、Ａｄ３、Ａｄ４およびＡｄ５をはじめとするアデノウイルス株の表面のペントンベースと特異的に相互作用する、ＤＡＶ−１と呼ばれるモノクローナル抗体から作製されたものであった。特にこの抗体は配列番号２もしくは配列番号６で示されるアミノ酸配列、または抗原認識に十分なその部分を含むか、あるいは低いストリンジェント、より好ましくは中程度のストリンジェント、最も好ましくは高いストリンジェント条件下で抗体の抗原結合部分をコードするに十分な配列番号１または５の部分とその全長にわたってハイブリダイズする核酸にコードされている。抗体またはその部分はまた、配列番号４で示されるアミノ酸配列、あるいは低いストリンジェント、より好ましくは中程度のストリンジェント、最も好ましくは高いストリンジェント条件下で、結果としての分子が抗体の抗原結合部分をコードするに十分な配列番号３の部分とその全長にわたってハイブリダイズする核酸の全部または部分を含むＬ鎖を含む。
【００２７】
ターゲッティングエージェントまたはその部分は例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インスリンおよび幹細胞因子（ＳＣＦ）の中から選択することができる。
【００２８】
例としての実施形態では、二官能性分子はαｖインテグリンを欠き、またＴＮＦα死滅を受けにくいＭ２１−Ｌ１２メラノーマ細胞の感染を促進することができた。Ｍ２１はアデノウイルスベクターによる形質転換を比較的受けにくい。ＬａｃＺをコードするＡｄを元のモノクローナル抗体単独とともにインキュベートしたところ、遺伝子送達を促進する効果はほとんどなかった。これに対し、Ａｄ．ｌａｃＺ粒子を二官能性抗体とともにプレインキュベートしたところ、ウイルスを媒介とする遺伝子送達には２０倍の増強がもたらされた。これらの二官能性抗体によるウイルス感染の増強はウイルスの接着とインターナリゼーションの組合せによるものであった。インターナリゼーションの増強はＴＮＦαレセプターの結合によるＰＩ３Ｋの活性化の増強により生じたものであった。レセプターリガンドを含むその他の二官能性分子もＰＩ３Ｋを活性化して遺伝子送達を増強することができた。
【００２９】
これらの結果は、ＰＩ３Ｋを活性化するレセプターの活性化がウイルス侵入を促進するためのαｖインテグリン、すなわちアデノウイルスではＣＡＲの必要を迂回することを示している。レセプターのバイパスはサイトカインまたは増殖因子が結合したウイルス粒子の近傍で活性化された場合に極めて有効であった。
【００３０】
（発明の詳細な説明）
Ａ．　定義
特に断りのない限り、本明細書で用いられる全て技術用語および科学用語は本発明が属する分野の熟練者に共通に理解されているものと同義である。全ての特許、出願、公開出願およびその他の刊行物、ならびにＧｅｎＢａｎｋその他本明細書の開示のいずれかの箇所に記載されるデータベースの配列は出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる。
【００３１】
本発明において、本明細書に見られる種々のアミノ酸配列で存在するアミノ酸はそれらの周知の三文字または一文字略号により示される。種々のＤＮＡ配列で存在するヌクレオチドは当技術分野で通常用いられる標準的な一文字表記で示される（表１参照）。
【００３２】
本発明においてアミノ酸残基とは、そのペプチド結合におけるポリペプチドの化学消化（加水分解）の際に生じるアミノ酸をさす。本明細書に記載のアミノ酸残基は「Ｌ」型であるのが好ましい。しかし、ポリペプチドに所望の機能的特性が保持されている限り、いずれのＬ−アミノ酸残基も「Ｄ」型の残基で置換することができる。ＮＨ２はポリペプチドのアミノ末端に存在するフリーのアミノ酸基をさす。ＣＯＯＨはポリペプチドのカルボキシル末端に存在するフリーのカルボキシ基をさす。Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２４３：３５５２−５９ （１９６９）に記載され、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ． §§１．８２１−１．８２２に採用されている標準的なポリペプチド命名法に準じて、アミノ酸残基の略号を下表に示す。
【表１】
2004502450.tif 000002
【表２】
2004502450.tif 000003
【００３３】
本明細書に式で示される全てのアミノ酸残基配列はアミノ末端からカルボキシル末端の通常の方向で左から右方向に示すことに留意すべきである。また、「アミノ酸残基」とは広義には、対応表に示されたアミノ酸および出典明示により本明細書に組み入れる３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ． §§１．８２１−１．８２２に記載されているものなどの改変された非必須アミノ酸を含むものと定義される。さらに、アミノ酸残基配列の最初または終わりのダッシュはさらなる１以上のアミノ酸残基配列への、またはＮＨ２などのアミノ末端基もしくはＣＯＯＨなどのカルボキシル末端基へのペプチド結合を示すことに留意すべきである。
【００３４】
ペプチドまたはタンパク質においては、アミノ酸の好適な保存的置換が当業者に知られており、これらは一般に得られた分子の生物活性を変化させずになされる。当業者ならば一般にポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換は生物活性を実質的に変化させないことを認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９８７， Ｔｈｅ Ｂｅｊａｃｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ． ｃｏ．， ｐ．２２４参照）。
【００３５】
かかる置換は以下のように表２に示されているものに準じて行うのが好ましい。
【表３】
2004502450.tif 000004
【表４】
2004502450.tif 000005
その他の置換も許容され、経験的に、あるいは既知の保存的置換に準じて決定できる。
【００３６】
本明細書において、補足プラスミドとは細胞ゲノム内の染色体への安定組込みのためにパッケージング細胞系へ核酸を送達するプラスミドベクターをさす。
【００３７】
本明細書において、送達プラスミドとは、治療産物もしくはその前駆体、または調節遺伝子もしくは限定されるものではないがパッケージング細胞系などの細胞系へｉｎ ｖｉｖｏ送達して治療用ウイルスベクターを増殖させた場合に治療効果をもたらすその他の因子をコードする治療遺伝子または遺伝子をコードする核酸を運搬または送達するプラスミドベクターである。
【００３８】
本明細書では多様なベクターが記載されている、例えばあるベクターは、染色体への安定組込みのためにパッケージング細胞へ特定の核酸分子を送達するのに用いられる。これらのタイプのベクターは本明細書では一般に補足プラスミドとされている。本明細書に記載のさらなるタイプのベクターは治療用ウイルスベクターを増殖させる目的で細胞系（例えば、パッケージング細胞系）に核酸分子を運搬または送達することから、これらのベクターは本明細書では一般に送達プラスミドと呼ぶ。本明細書に記載の３つめのタイプのベクターは、治療を要する被験者の特定の細胞または細胞種に、治療タンパク質もしくはポリペプチドまたは調節タンパク質もしくは調節配列をコードする核酸分子を運搬するのに用いられ、これらのベクターは本明細書では一般に治療用ウイルスベクターまたは組換えアデノウイルスベクターまたはアデノウイルス由来ベクターと呼ばれ、治療遺伝子を発現するための発現カセットを含むウイルス核酸を封入するウイルス粒子の形態にある。
【００３９】
本明細書において、ＤＮＡまたは核酸ホモログとは治療ポリペプチドをコードする配列など、予め選択した保存されたヌクレオチド配列を含む核酸をさす。「実質的に相同」とは、それと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の相同性、または相同性もしくは同一性のパーセンテージは低いが生物活性または機能は保存されていることを意味する。
【００４０】
「相同性」と「同一性」は互換的に用いられることが多い。この点で、相同性または同一性％は例えばＧＡＰコンピュータープログラムを用いて配列情報を比較することで決定することができる。ＧＡＰプログラムはＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ （Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２ （１９８１）により訂正されたＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ （Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３ （１９７０）のアライメント法を用いるものである。要するにＧＡＰプログラムでは、類似性を整列させた記号（すなわちヌクレオチドまたはアミノ酸）の同じもの数をその２配列のうち短い方の記号総数で割ったものと定義する。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターとしては、（１） Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ， ｅｄｓ．， ＡＴＬＡＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＤ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， ｐｐ．３５３−３５８ （１９７９）に記載のＧｒｉｂｓｋｏｖ ａｎｄ Ｂｕｒｇｅｓｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：６７４５ （１９８６）の単一要素からなる比較マトリックス（同一なものは１、同一でないものは０の値を含む）およびウエイト比較マトリックス；（２）ギャップごとにペナルティー３．０で、各ギャップの各記号にはさらにペナルティー０．１０；および（３）末端ギャップにはペナルティーなしが挙げられる。
【００４１】
いずれか２つの核酸分子が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％「同一」であるヌクレオチド配列を持っているかどうかは、例えばＰｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４ （１９８８）のようなデフォルトパラメーターを用い、「ＦＡＳＴ Ａ」プログラムなどの公知のコンピューターアルゴリズムを用いて決定することができる。あるいは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｄａｔａｂａｓｅのＢＬＡＳＴ機能を同一性の決定に用いてもよい。
【００４２】
一般に配列はより高次のマッチが得られるように整列させる。「同一性」はそれ自体当技術分野で認知された意味を持ち、公開されている技術を用いて算出することができる（例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， Ａ．Ｍ．， ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ． Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８； Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．Ｗ．， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３； Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ Ｉ， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ．Ｍ．， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｈ．Ｇ．， ｅｄｓ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， １９９４； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７； ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｄｓ．， Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１参照）。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の同一性を測定するにはいくつかの方法が存在するが、「同一性」とは当業者に周知のものである（Ｃａｒｉｌｌｏ． Ｈ． ＆ Ｌｉｐｔｏｎ， Ｄ．， ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３ （１９８８））。２つの配列間の同一性または類似性を決定するのに一般に用いられる方法としては、限定されるものではないが、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ， Ｍａｒｔｉｎ Ｊ． Ｂｉｓｈｏｐ， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９４、およびＣａｒｉｌｌｏ， Ｈ． ＆ Ｌｉｐｔｏｎ， Ｄ．， ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３ （１９８８）に記載のものが挙げられる。同一性および類似性を決定する方法はコンピュータープログラムに体系化されている。２つの配列間の同一性または類似性を決定するのに好ましいコンピュータープログラム法としては、限定されるものではないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）：３８７ （１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ （Ａｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌｅｃ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３ （１９９０））が挙げられる。
【００４３】
従って本明細書において、「同一性」とは、試験ポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよび参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの間の比較を示す。例えば、試験ポリペプチドが参照ポリペプチドと９０％以上同一であるポリペプチドであると決定される。
【００４４】
本明細書において、少なくとも「９０％同一である」とは、参照ポリペプチドと９０から９９．９９までの同一性％を示す。９０％以上のレベルでの同一性は、例えば１００アミノ酸長の試験および参照ポリヌクレオチドが比較されるとすれば、ということを示す。試験ポリペプチドのアミノ酸１０％だけ（すなわち、１００のうち１０）が参照ポリペプチドのものと異なっている。試験ポリヌクレオチドと参照ポリヌクレオチドの間でも同様の比較がなされる。このような違いはアミノ酸配列の全長にわたってランダムに分布した点突然変異としても表され得るし、あるいは最大許容値、例えば１０／１００アミノ酸の違い（およそ９０％の同一性）までの種々の長さの１以上の場所でクラスターとなっていてもよい。違いは核酸またはアミノ酸置換または欠失として定義される。
【００４５】
本明細書において、ストリンジェント条件とは、非特異的プローブを徐供するための洗浄条件であって、以下に記載の高、中、または低ストリンジェントに相当する条件をさす。
１）　高ストリンジェント： ０．１ ｘ ＳＳＰＥ， ０．１％ ＳＤＳ， ６５℃
２）　中ストリンジェント： ０．２ ｘ ＳＳＰＥ， ０．１％ ＳＤＳ， ５０℃
３）　低ストリンジェント： １．０ ｘ ＳＳＰＥ， ０．１％ ＳＤＳ， ５０℃
相当するストリンジェンシーは選択的バッファー、塩および温度を用いて達成し得ると考えられる。
【００４６】
本明細書において、遺伝子療法はかかる治療誘導体が求められる疾患または症状を有する哺乳類、特にヒトの特定の細胞、標的細胞に異種ＤＮＡを導入することを含む。ＤＮＡは、異種ＤＮＡが発現され、それにコードされている治療産物が産生されるような様式で、選択された標的細胞に導入される。あるいは異種ＤＮＡは、いくつかの方法で治療産物をコードするＤＮＡの発現を媒介することができ、いくつかの方法で治療産物の発現を直接的または間接的に媒介するペプチドまたはＲＮＡなどの産物をコードするものであってもよい。遺伝子療法はまた、遺伝子産物をコードする核酸で欠陥遺伝子を置換したり、それが導入される哺乳類または細胞により産生される遺伝子産物を補足したりするために用いてもよい。導入される核酸はその増殖因子もしくはその阻害剤、または腫瘍壊死因子もしくはその阻害剤（そのレセプターなど）のような治療化合物、すなわち哺乳類宿主では通常産生されないか、あるいは治療上有効な量では、または治療上有用な時には産生されないものをコードするものであってもよい。治療産物をコードする異種ＤＮＡは該産物またはその発現を増強する、あるいは変更するために罹患宿主の細胞に導入する前に改変してもよい。
【００４７】
本明細書において、異種ＤＮＡとは、それが発現する細胞には通常ｉｎ ｖｉｖｏでは産生されないＲＮＡおよびタンパク質をコードするか、あるいは転写、翻訳またはその他調節可能な生化学プロセスに影響を及ぼすことで内在するＤＮＡの発現を変更する媒介となる、またはメディエーターをコードすＤＮＡである。異種ＤＮＡはまた外来ＤＮＡとも呼ぶ。当業者が発現させる細胞に対して異種または外来と認識する、またはみなすＤＮＡはいずれも本明細書においては異種ＤＮＡに包含される。異種ＤＮＡの例としては、限定されるものではないが、薬剤耐性を付与するタンパク質などの追跡マーカータンパク質をコードするＤＮＡ、抗癌剤、酵素およびホルモンなどの治療上有効な物質をコードするＤＮＡ、ならびに抗体などのその他のタイプのタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。異種ＤＮＡによりコードされる抗体は、異種ＤＮＡが導入された細胞から分泌または細胞表面で発現する場合がある。
【００４８】
従って本明細書において異種ＤＮＡまたは外来ＤＮＡとは、対応する野生型アデノウイルスで見られる対応ＤＮＡ分子と同じ厳密な方向および位置には存在しないＤＮＡ分子をさす。またそれは別の生物または種（すなわち、外因性）由来の、または別のＡｄ血清型由来のＤＮＡ分子もさす。
【００４９】
本明細書において、治療上有効な産物とは、そのＤＮＡを宿主に導入した際に産物が発現し、症状、遺伝性または後天性の疾病の発現を効果的に緩和または軽減する、あるいは該疾病を治癒させる異種ＤＮＡによりコードされる産物である。
【００５０】
典型的には、所望の異種ＤＮＡをコードするＤＮＡはプラスミドベクターへクローニングし、リン酸カルシウムを媒介とするＤＮＡ取り込み（（１９８１） Ｓｏｍａｔ． Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． ７：６０３−６１６）またはマイクロインジェクションなどの常法によってパッケージング細胞などの産生細胞へ導入する。産生細胞で増幅させた後、異種ＤＮＡを含むベクターを選択した標的細胞へ導入する。
【００５１】
本明細書において、発現または送達ベクターとは、好適な宿主細胞での発現のために外来または異種ＤＮＡが挿入できるいずれかのプラスミドまたはウイルスをさし、すなわち、このＤＮＡによりコードされるタンパク質またはポリペプチドは宿主細胞系で合成される。１以上のタンパク質をコードするＤＮＡセグメント（遺伝子）の発現を指示し得るベクターは本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。また、逆方向写酵素を用いて、産生されたｍＲＮＡからｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）のクローニングを可能とするベクターも含まれる。
【００５２】
本明細書において、遺伝子とは、そのヌクレオチド配列がＲＮＡまたはポリペプチドをコードする核酸分子である。遺伝子はＲＮＡであってもＤＮＡであってもよい。遺伝子はコード領域の前後の領域（リーダーおよびテーラー）ならびに個々のコードセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）を含んでもよい。
【００５３】
本明細書において、アデノウイルスに対する親和性とは、ファイバータンパク質、特にノブを含むＣ末端部分によって粒子に付与される選択的感染性または結合性をさす。
【００５４】
本明細書において、核酸分子またはポリペプチドまたはその他の生体分子に対して単離されたとは、その核酸またはポリペプチドが、そのポリペプチドまたは核酸が得られた遺伝的環境から分離されていることを意味する。それはまた天然状態からの変更も意味する場合もある。例えば、本用語を本明細書で用いる場合、生体動物に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離された」ものではないが、その天然状態の共存物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離された」ものである。従って組換え宿主細胞内で産生され、かつ／またはそこに含まれるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは単離されたものであるとみなされる。また「単離されたポリペプチド」または「単離されたポリヌクレオチド」としては、組換え宿主細胞から、または天然源から部分的または実質的に精製されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドも含まれる。例えば、ある化合物の組換え産生された形態はＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０ （１９８８）に記載の一段階法によって実質的に精製することができる。単離および精製されたとはときおり互換的に用いられる。
【００５５】
このように「単離された」とは、その核酸が、生物の天然に存在するゲノムのおいて（あるにしても）目的核酸をコードする遺伝子にすぐ隣接する遺伝子のコード配列を含まないことを意味する。単離されたＤＮＡは一本鎖であっても二本鎖であってもよく、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えハイブリッドＤＮＡまたは合成ＤＮＡであってもよい。それは天然のＤＮＡ配列と同一であってよいし、１以上のヌクレオチドの欠失、付加または置換によってこのような配列と異なっていてもよい。
【００５６】
生体細胞または宿主から作製した調製物についていう場合、単離または精製されたとは、目的のＤＮＡまたはタンパク質の粗抽出物をはじめ、示されたＤＮＡまたはタンパク質を含有するいずれかの細胞抽出物を意味する。例えばタンパク質の場合、精製調製物は個々のまたは一連の分取または生化学的技術の後に得られ、目的のＤＮＡまたはタンパク質はこれらの調製物中に様々な純度で存在し得る。これらの手法としては、限定されるものではないが例えば、硫酸アンモニウム分画法、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、密度勾配遠心分離および電気泳動が挙げられる。
【００５７】
「実質的に純粋」または「単離された」ＤＮＡまたはタンパク質の調製物は、かかるＤＮＡまたはタンパク質が通常には天然では会合していな天然物質を含まない調製物を意味するものと理解すべきである。「実質的に純粋」とは、少なくとも９５％の目的ＤＮＡまたはタンパク質を含む「高度に」精製された調製物を意味するものと理解すべきである。
【００５８】
目的のＤＮＡまたはタンパク質を含む細胞抽出物とは、そのタンパク質を発現する、または目的のＤＮＡを含む細胞から得られたホモジネート調製物または細胞フリー調製物を意味するものと理解すべきである。「細胞抽出物」とは、細胞が除去された培地、特に使用済み培地を含むものとする。
【００５９】
本明細書において、パッケージング細胞系は存在しない遺伝子産物またはその同等物を提供する細胞系である。
【００６０】
本明細書において、アデノウイルス粒子はウイルスの最小構造または機能単位である。ウイルスとは単一の粒子、粒子ストックまたはウイルスゲノムをさし得る。アデノウイルス（Ａｄ）粒子は相対的に複合体であり、種々の部分構造に還元することができる。
【００６１】
本明細書において、「ペントン」または「ペントン複合体」は本明細書ではペントンベースおよびファイバーを示すのに優先的に用いられる。また「ペントン」とは、ペントン複合体と同様にペントンベースを示すためにも用いられる。「ペントン」単独の意味はそれが用いられる文脈から明らかになるはずである。
【００６２】
本明細書において、プラスミドとは、自己複製する染色体外の環状核酸分子、典型的にはＤＮＡをさす。
【００６３】
本明細書において、転写後調節エレメント（ＰＲＥ）とは、スプライシングされないウイルスまたは細胞メッセンッジャーＲＮＡ、すなわちイントロンを含まないメッセージに見られる調節エレメントである。限定されるものではないが例として、ヒト肝炎ウイルス、ウッドチャック肝炎ウイルス、ＴＫ遺伝子およびマウスヒストン遺伝子が挙げられる。ＰＲＥはポリＡ配列の前、異種ＤＮＡ配列の後に配置すればよい。
【００６４】
本明細書において、シュードタイピングとは改変されたキャプシドタンパク質またはベクター自身の血清型とは異なる血清型に由来するキャプシドタンパク質を有するアデノウイルスの作出をいう。一例としてＡｄ３７ファイバータンパク質を含むアデノウイルス５ベクター粒子の作出がある。これは種々のファイバータンパク質を発現するパッケージング細胞系でアデノウイルスベクターを作出することにより達成され得る。
【００６５】
本明細書においては、本明細書の目的プロモーターは誘導性のものであっても構成的なものであってもよい。誘導プロモーターは付加的な分子の存在下でのみ転写を開始し、構成プロモーターは遺伝子発現を調節するために付加的な分子の存在を必要としない。調節または誘導プロモーターはまた、ＲＮＡポリメラーゼ結合および開始の速度または程度が外部刺激によって調節されるプロモーターであるといってもよい。かかる刺激としては、限定されるものではないが、種々の化合物または組成物、光、熱、ストレスおよび化学エネルギー源が挙げられる。誘導、抑制および抑圧プロモーターは調節プロモーターであると考えられる。本明細書において好ましいプロモーターとしては、眼球細胞、特に光受容細胞で選択的に発現するプロモーターがある。
【００６６】
本明細書において、レセプターとは、他の分子と特異的に結合する生物活性分子をさす。「レセプタータンパク質」とは、特定のレセプターのタンパク質性をより明確に示すのに用いられる。
【００６７】
本明細書において、組換え体とは、遺伝子操作の結果生じた後代をさす。これはまた、パッケージング細胞におけるプラスミドの組換えにより生じたウイルスをいうためにも用いることがある。
【００６８】
本明細書において、導入遺伝子または治療核酸分子としてはＲＮＡまたはポリペプチドをコードするＤＮＡおよびＲＮＡ分子を含む。かかる分子は「天然」または天然由来の配列であってもよいし、それらは天然または組換え由来の「非天然」または「外来」のものであってもよい。「導入遺伝子」とは本明細書では「治療核酸分子」と互換的に用いてもよく、しばしばウイルスベクターによって運搬され、宿主細胞に導入される異種または外来（外因性）遺伝子をいうのに用いられる。
【００６９】
従って治療ヌクレオチド核酸分子としては、アンチセンス配列またはアンチセンス配列へと転写され得るヌクレオチド配列を含む。治療ヌクレオチド配列（または導入遺伝子）は全て、該治療配列が送達される細胞または細胞核で望ましい効果をもたらす働きをする核酸分子を含む。例えば、治療核酸分子は機能的なタンパク質を産生することができない細胞への送達を意図した機能的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでよい。
【００７０】
本明細書において、プロモーター領域とは、それが作動可能なように連結されているＤＮＡの転写を制御する遺伝子のＤＮＡ部分をさす。プロモーター領域はＲＮＡポリメラーゼの認識、結合および転写の開始に十分な特定のＤＮＡ配列を含む。このプロモーター領域の部分をプロモーターと呼ぶ。また、プロモーター領域はこのＲＮＡポリメラーゼの認識、結合および転写を調節する配列を含む。これらの配列はシス作用であってもよいし、トランス作用因子に応答するものであってもよい。プロモーターは調節の特性によって構成型のものであっても調節型のものであってもよい。
【００７１】
本明細書において、「作動可能なように連結される」とは一般に、それらの配列またはセグメントが一本鎖型であれ二本鎖型であれ一片のＤＮＡに共有結合されており、それによりあるセグメント上の制御配列は発現もしくは複製またはその他、他のセグメントのこのような制御を制御することを意味する。この２つのセグメントは必ずしも隣接している必要はない。
【００７２】
本明細書において、外因性とは、本明細書で提供される治療方法によって投与されるいずれの治療組成物も包含する。従って外因性とは本明細書では外来または非天然その他同等の表現でも記載されることがある。
【００７３】
本明細書において、抗体とは、特異的結合能を保持するその誘導体を含め、天然のものであれ部分的または完全に合成されたものであれ免疫グロブリンをさす。よって抗体は免疫グロブリン結合ドメインと相同または実質的に相同な結合ドメインを有するいずれのタンパク質も含む。抗体としては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥをはじめ、いずれの免疫グロブリンクレームのメンバーも含む。
【００７４】
本明細書において、抗体フラグメントとは、全長抗体の特異的結合能の少なくとも一部を保持する全長よりも短い抗体のいずれの誘導体もさす。抗体フラグメントの例としては、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦＶ）、ＦＶ、ｄｓＦＶジアボディーおよびＦｄフラグメントならびにその他結合特異性を保持する、または示す組換え形態の抗体が挙げられる。
【００７５】
このフラグメントはジスルフィド橋によるなどしてともに連結された複数の鎖を含んでもよい。抗体フラグメントは一般に少なくとも約５０のアミノ酸、典型的には少なくとも２００のアミノ酸を含む。本明細書の目的では、αｖインテグリン結合タンパク質に対する特異的結合を保持するいずれの断片も考えられる。かかるフラグメントは化学的または組換え的手段によって作出してもよい。
【００７６】
本明細書において、Ｆｖ抗体フラグメントは非共有結合的によって連結された１つのＨドメイン（ＶＨ）と１つの可変Ｌドメインからなる。
【００７７】
本明細書において、ｄｓＦＶとは、ＶＨ−ＶＬ対を安定化する操作された分子内ジスルフィド結合を有するＦｖをさす。
【００７８】
本明細書において、Ｆ（ａｂ）２フラグメントとはｐＨ４．０〜４．５にて免疫グロブリンをペプシンで消化することで生じる抗体フラグメントであり、組換え産生してもよい。
【００７９】
このように本明細書で例示されるＤＡＶ−１抗体に関して、Ｆａｂ部分は全Ｌ鎖およびＤＡＶ−１ Ｈ鎖のアミノ酸１〜２２９（配列番号１および２）である。このＦａｂフラグメントは抗体の分泌のためのシグナルペプチド配列をなす最初の１９のアミノ酸を除いて抗原結合に関与する。Ｆａｂフラグメントはパパイン消化によって作出することができる。
【００８０】
Ｆａｂ’２部分はＦａｂフラグメントと、Ｆａｂ抗原結合部分を補体の活性化およびマクロファージの結合に関与するＦｃ部分と連結するヒンジ領域である。ＤＡＶ−１ Ｈフラグメントのアミノ酸２３０〜２４２はＤＡＶ−１のヒンジ領域をなす。クローニングによって作出されたこの原稿で用いられるＦａｂ’２フラグメントはＤＡＶ−１ Ｈ鎖配列の酸１〜２４７を含む。Ｆａｂ’２フラグメントはペプシン消化によって作出することができる。
【００８１】
本明細書において、Ｆａｂフラグメントは免疫グロブリンをパパインで消化することで生じる抗体フラグメントであり、組換え産生してもよい。
【００８２】
本明細書において、ｓｃＦＶとは、いずれの順序であってもポリペプチドリンカーによって共有結合された可変Ｌ鎖（ＶＬ）および可変Ｈ鎖（ＶＨ）を含む抗体フラグメントをさす。このリンカーは、２つの可変ドメインが実質的な妨害なく架橋するような長さのものである。好ましいリンカーは可溶性を高めるために全域に分散させたいくつかのＧｌｕまたはＬｙｓ残基を含む（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ残基である。
【００８３】
本明細書において、ジアボディーとは二量体ｓｃＦＶであり、ジアボディーは典型的にはｓｃＦｖよりも短いペプチドを有し、それらは優先的に二量化する。
【００８４】
本明細書において、ヒト化抗体とは、ヒトに対して投与しても免疫応答を引き起こさないよう「ヒト」配列のアミノ酸を含むように改変された抗体をさす。かかる抗体の製造方法は公知である。例えばモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマは、不変領域のアミノ酸組成はヒト抗体に基づいている抗体を発現するように組換えＤＮＡ技術によって改変する。かかる領域を同定するためコンピュータープログラムが設計されている。ヒトの治療では、ヒト化抗体が好ましい。
【００８５】
本明細書において、組換えＤＮＡ法を用いる組換え手段による産生は、遺伝子のクローニング発現ならびに所望の特異性に関するスクリーニングを伴った遺伝子シャッフリングおよびファージディスプレーなどの方法をはじめ、クローニングされたＤＮＡによりコードされているタンパク質を発現させるための分子生物学の周知の方法の使用を意味する。
【００８６】
本明細書において、「コンジュゲート」とはイオン結合または共有結合などの安定な結合をさす。
【００８７】
本明細書において、組成物とは２以上の産物または化合物のいずれの混合物もさす。それは溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性またはそのいずれかの組合せであってよい。
【００８８】
本明細書において、組合せとは２以上のものの間のいずれかの会合をさす。
【００８９】
本明細書において、流体とは流動性のいずれかの組成物をさす。従って流体には、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリームの形態にある組成物およびその他のかかる組成物が含まれる。
【００９０】
本明細書において、ある産物と実質的に同じとは、目的の特性が、その産物の代わりに実質的に同じ産物を使用できるように十分な変更に留まっているという点で十分同じであることを意味する。
【００９１】
Ｂ． アデノウイルス送達およびインターナリゼーション
接着およびインターナリゼーション
アデノウイルスの細胞への接着は細長いファイバーによって媒介されるが、これはウイルスの細胞レセプターへの最初の接着を媒介する。このファイバーは種々のウイルス血清型で長さが異なる細長い中央シャフトドメインを有するホモ三量体である。このタンパク質のＣ末端はノブとして知られる球形のドメインを含み、これがレセプターの相互作用を担う。Ｎ末端はこのタンパク質をペントンベースタンパク質との相互作用を介してウイルス表面に固定する。
【００９２】
ファイバーによって認識される細胞レセプターは、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーであって２つの細胞外ドメインを含むコクサッキーアデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）として知られている。このＮ末端ドメインはファイバーの相互作用を媒介するに十分なものである。ウイルスのペントンベースタンパク質のαｖインテグリンとの二次的な相互作用は、クラスリンコートピットおよびエンドソームへのウイルスのインターナリゼーションを促進する。
【００９３】
ビリオンは、初期エンドソームを破壊することができ、大多数のビリオン粒子を細胞質に放逸させる。次にウイルス粒子は微小管に沿って核膜抗複合体へと輸送され、ビリオンＤＮＡは核へ移動する。
【００９４】
Ａｄはクラスリンコートピット経路によって細胞へ侵入する。Ａｄのインターナリゼーションは複雑なプロセスであって、いくつかの点で特定の病原性細菌による細胞侵入に関して記載されているものと同様であることが本明細書で見出されている。αｖインテグリン（ＣＡＲではない）のクラスター形成の結果、少なくとも３つの主要な成分（ｃＳＲＣ、ＣＡＳ、ＰＩ３Ｋ）を含む細胞質シグナル伝達複合体が生じる。このシグナル伝達複合体は、その活性化が最終的にはアクチン細胞骨格の再構成およびウイルスのインターナリゼーションの増強をもたらすＲｈｏファミリーの小ＧＴＰアーゼ（ＲＡＣ、ＣＤＣ４２）をさらに活性化することができる。
【００９５】
クラスリンコートピット経路を介した細胞アデノウイルスのインターナリゼーション（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ６４：１０９１−１０９９； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：３４５５−３４５８）はホスファチジルイノシトール３−ＯＨキナーゼ（ＰＩ３Ｋ； Ｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：２０５５−２０６１）およびＲｈｏファミリーの小ＧＴＰアーゼ（Ｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：８８０６−８８１２）を含むいくつかのシグナル伝達分子の活性化を必要とする。このシグナル伝達経路の主要下流標的はウイルスの取り込みを促進するアクチン細胞骨格である。
【００９６】
ＰＩ３Ｋ
ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３キナーゼまたはＰＩ３Ｋ）は、ホルモンおよび増殖因子ならびに癌遺伝子産物の細胞質ドメインと会合していることが見出されている偏在性のヘテロ二量体脂質キナーゼファミリーである。ホスホイノシチド３−ＯＨ−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）は少なくとも１つの細胞ホスホイノシチドを三リン酸化することができる大きな酵素ファミリーをなしている（Ｗｈｉｔｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３２：６４４−６４６）。三リン酸化ホスホイノシチドは全ての高等真核細胞に見られる。
【００９７】
ＰＩ３Ｋは上記レセプターの下流エフェクターとして働き、レセプター刺激時に補充され、イノシトールのリン酸化誘導体の産生を介してセカンドメッセンジャーシグナル伝達経路の活性化を媒介する。ＰＩ３Ｋは増殖因子を媒介とする細胞の形質転換、有糸分裂誘発、タンパク質輸送、細胞の生存および増殖、ＤＮＡ合成、アポトーシス、神経突起の成長、一酸化窒素シグナル伝達、およびインスリンにより刺激されるグルコース輸送をはじめとする多くの細胞活動に関連づけられている。
【００９８】
ＰＩ３Ｋはホスファチジルイノシトール（Ｐｔｄｌｎｓ）をイノシトール環の３’−水酸基でリン酸化し、基質としてはＰｔｄｌｎｓ、Ｐｔｌｎｓ（４）リン酸Ｐｔｄｌｎｓ（４，５）ビホスフェートおよびＰｔｄｌｎｓ（３，４，５）トリホスフェートが挙げられ、主要な産物はＰｔｄｌｎｓ（３，４，５）三リン酸である（例えば、Ｆｒｙ （１９９４） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔｓ． １２２６： ２３７−２６８参照）。ＰＩ３Ｋおよびこの酵素の脂質産物であるホスファチジルイノシトール（３，４，５）三リン酸（以下、「Ｐｔｄｌｎｓ（３，４，５）Ｐ３」）は細胞シグナル伝達の重要なセカンドメッセンジャー系の一部である。Ｐｔｄｌｎｓ（３，４，５）Ｐ３は極めて多様なシグナル伝達経路のセカンドメッセンジャーであると思われる。
【００９９】
本明細書に記載のように、ＰＩ３Ｋはｐ８５調節サブユニットとｐ１１０触媒サブユニットを含む脂質キナーゼファミリーのメンバーである（Ｔｏｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３８７：６７３ （１９９７））。ＰＩ３Ｋのｐ８５サブユニットはリン酸化されたＦＡＫ９と直接結合する（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１：２６３２９ （１９９６））。ＰＩ３Ｋ活性化の産物であるホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸およびホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸は活性化されていて休止していない細胞の原形質膜で増強され、細胞運動、Ｒａｓ経路、小胞輸送および分泌、アポトーシス、オルガネラ膜の運動、細胞骨格アクチンの再配列による形状の変化、形質転換、走化性、細胞周期の進行および細胞内のタンパク質輸送をはじめとするいくつかの細胞機能のセカンドメッセンジャーとして働くことが示唆されている（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ８：１５３ （１９９６）； Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ８５：５７３ （１９９６）； Ｗｅｎｎｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ．， ４：３８５ （１９９４）； Ｔｏｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３８７：６７３ （１９９７））。リン脂質セカンドメッセンジャーであるホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸およびホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸はタンパク質キナーゼＢならびに小ＧＴＰ結合タンパク質Ｒａｓ、Ｒｈｏ、ＲａｃおよびＣＤＣ４２の活性化によって細胞機能およびプロセスを媒介する（Ｈａｌｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７９：５０９ （１９９８）； Ｋａｒｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：１９２７ （１９９７）； Ｔａｐｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ９：８６ （１９９５））。ＲａｃおよびＣＤＣ４２の活性化は単量体アクチンの重合を誘導して、原形質膜の基礎となるアクチンフィラメントの稠密なネットワークを形成し、このアクチンが豊富な領域が膜状仮足（「膜の波打ち運動」）および糸状仮足（「毛様構造」）として知られる様々な膜の拡張部を形成する（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３７９：８３７ （１９９６））。Ｒｈｏの活性化はアクチンに関連するストレスファイバーの形成に関連している（Ｎｏｂｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ８１：５３ （１９９５）； Ｒｉｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ７０：３８９ （１９９２））。重合したアクチンフィラメントは表面突出構造を維持する。ＰＩ３Ｋの活性化によって開始されるこのアクチンの構築は指定された細胞移動（Ｚｉｇｍｏｎｄ， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ．， ８：６６ （１９９６））、ニューロン細胞における軸索の案内（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， ８：１７８７ （１９９４））、およびいくつかの異なる細菌による細胞侵入（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７４：２１１５ （１９９６）； Ｈｏｒｄｉｊｋ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７８：１４６４ （１９９８））をはじめとするいくつかの生体プロセスおよび／または病原プロセスに重要な役割を果たす。細菌の研究では、アクチンの重合はま��クラスリンを媒介とするエンドサイトーシスを助長することが示されている（Ｂｅｎｍｅｒａｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １４０：１０５５ （１９９８）； Ｌａｍａｚｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２：２０３３２ （１９９７）； Ｗｉｔｋｅ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １７：９６７ （１９９８））。
【０１００】
いくつかの刺激性アゴニストはＰＩ３Ｋを媒介とするシグナル伝達経路を活性化する。グルコースおよび脂質代謝に対するインスリンの作用の多くはＰＩ３Ｋの活性化を介して誘起される（Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ３３３（３）：４７１ （１９９８））。ＩＧＦ−１、ＰＤＧＦおよびＥＧＦはＰＩ３Ｋ活性の増強を介して大グリア細胞の細胞増殖を刺激する（Ｐｏｍｅｒａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｒｅｓ．， ４０：７３７ （１９９５））。インスリンまたはＩＧＦ−１によって誘導される膜の波打ち運動はＰＩ３Ｋの活性化を介して媒介される（Ｋｏｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １３（１０）：２３１３ （１９９４））。ＰＩ３Ｋと会合したｐ８５はそれぞれＥＧＦまたはＰＤＧＦで刺激した際にＥＧＦＲおよびＰＤＧＦＲと会合する（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １２：９８１ （１９９２））。ＩＬＫ（インテグリン結合キナーゼ）のフィブロネクチン、インスリンおよびＰＤＧＰ刺激はＰＩ３Ｋの活性に依存する（Ｄｅｌｃｏｍｍｅｎｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１１２１１ （１９９８））。特定の細胞種のＴＮＦ−αによる刺激はＰＩ３Ｋを活性化することが示されている（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：６１５ （１９９６））。ＰＩ３Ｋはまた細菌の侵入に関与する細菌表面タンパク質であるインターナリンによっても活性化される（Ｉｒｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７４：７８０ （１９９６））。
【０１０１】
アデノウイルスのエンドサイトーシスもまたＰＩ３Ｋの活性化を必要とする（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：２０５５ （１９９８））。アデノウイルスのエンドサイトーシスは、ＣＡＲとして知られる細胞表面タンパク質レセプターである細長いファイバータンパク質を介したその細胞への接着で始まる多段階のプロセスである（Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ； ２７５：１３２０ （１９９７））。それらのＲＧＤモチーフを介したウイルスペントンベースタンパク質の細胞表面上のαｖインテグリンとの二次的な相互作用はレセプターを媒介とするエンドサイトーシス経路を介したクラスリンコートピットおよびエンドソームへのウイルスのインターナリゼーションを促進する。ＰＩ３Ｋの活性化にはファイバー結合は必要とされないが、アデノウイルスペントンベースタンパク質のαｖインテグリンとの相互作用はＰＩ３Ｋを刺激する（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：２０５５ （１９９８））。ＰＩ３Ｋの刺激はウイルスの侵入に不可欠であることが示されており、細胞をＰＩ３Ｋ特異的阻害剤ウォルトマンニンおよびＬＹ２９４００２で処理した場合には、アデノウイルスのインターナリゼーションは阻害された（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：２０５５ （１９９８））。αｖインテグリンのクラスター形成は少なくとも３つの主要成分：ｃＳＲＣ、ＣＡＳおよびＰＩ３Ｋを含む細胞質シグナル伝達複合体の形成をもたらす。このシグナル伝達複合体は、その活性化が最終的にアクチン細胞骨格の認識およびウイルスのインターナリゼーションの増強をもたらすＲｈｏファミリーの小ＧＴＰアーゼ（Ｒａｃ、ＣＤＣ４２）のさらなる活性化が可能である。
【０１０２】
このように腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）および上皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプター（Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ２４：４８５４−４８５８； Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：６１５−６１８； Ｐｏｍｅｒａｎｃｅ ｅｔ ａｌ． （１９９５ Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ４０：７３７−７４６； Ｋｏｔａｎｉ， ｅｔ ａｌ． （１９９４） ＥＭＢＯ Ｊ． １３：２３１３−２３２１；およびＨｕ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２：９８１−９９０）をはじめとする増殖因子／サイトカインレセプターによって活性化されるシグナル伝達経路は、ＰＩ３Ｋの活性化に集束する一連のシグナル伝達を開始する。
【０１０３】
本明細書では、ＰＩ３キナーゼおよびαｖインテグリンにより媒介されるウイルスのインターナリゼーションを活性化する細胞表面レセプターによって誘起されるシグナル伝達プロセスが同様であるという利点があり、これが本明細書で提供される方法およびベクターの基礎となり、Ａｄインテグリンの相互作用を迂回して胃送達を容易にすることが示される。本明細書では、ＰＩ３シグナル伝達経路に関与するレセプターと結合してそれを活性化する分子を用いて、アデノウイルス粒子などの結合部分をホルモンおよび増殖因子レセプター、その他のＧタンパク質結合レセプターおよび種々の癌遺伝子のレセプターを含むレセプターにターゲッティングしてインターナリゼーションを達成することができる。
【０１０４】
１．　二官能性分子
本明細書では、αｖインテグリン結合タンパク質（本明細書では「Ｐ」成分と呼ぶ）と特異的に結合、抗体またはそのフラグメントなどのエージェントと、αｖインテグリン結合タンパク質と特異的に結合するタンパク質と連結した部分を、ターゲッティングエージェントが特異的に結合する表面レセプターを発現する細胞へターゲッティングするエージェント（ＴＡと呼ぶ）のコンジュゲートである二官能性分子が提供される。ＴＡとＰは典型的には共有結合により直接連結するか、あるいはリンカーＬを介して連結する。
【０１０５】
本明細書の目的では、これらのコンジュゲートは二官能性分子と呼ばれ、以下の成分： （ＴＡ）ｎ、ＰｍおよびＬｑ（式中、ｎおよびｍは１以上の整数、典型的には１または２であり、ｑは０または１以上の整数である）を含む。これらの成分は、得られる分子がウイルス粒子または細菌上のタンパク質と結合するまたは相互作用して複合体を形成し、さらに得られた複合体を、ＰＩ３Ｋを活性化し、かつ、得られた複合体がインターナライズされるようにターゲッティングエージェントに認識される細胞表面タンパク質へターゲッティングするように選択される。ｎおよびｍが１以外である場合には得られる分子は多機能性となり、このような場合、１以上のＴＡおよび／またはＰ部分が使用でき、各々は同じであっても異なっていてもよい。成分ＴＡ、ＰおよびＬは共有結合、イオン結合または接着をもたらすその他のいずれかの結合によってコンジュゲートすればよい。
【０１０６】
Ｐおよびターゲッティングエージェント（またはリンカーおよびターゲッティングエージェント）は、得られるコンジュゲートがそのレセプターを有する細胞において複合化したウイルス粒子または細菌細胞とターゲッティング的に結合してそれをインターナライズするレセプターと結合する限り、いずれの順序で、いずれの適当なリンカーによって連結してもよい。
【０１０７】
一般にＰはアデノウイルスのペントンタンパク質などのαｖインテグリン結合タンパク質と特異的に結合する抗体またはそのフラグメントである。Ｐは好ましくは、選択された抗原と特異的に結合するに十分な抗体鎖部分を含むモノクローナル抗体もしくはそのフラグメント、または合成抗体または組換え抗体である。この場合、抗原はウイルス粒子または細菌とαｖインテグリンとの結合を媒介するウイルス粒子または細菌表面上のタンパク質に存在するものである。
【０１０８】
ａ．　抗原結合部分
好ましい実施形態では、αｖインテグリンと相互作用するタンパク質と結合する部分（Ｐ）はモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである。アデノウイルスのペントンタンパク質など、αｖインテグリンと相互作用してウイルス粒子または細菌のインターナリゼーションを容易にするタンパク質はウイルス粒子および細菌細胞表面上に存在する。それに対して特異的な抗体は、ハイブリドーマ技術の使用などの標準法、または組換え抗体もしくはそのフラグメントを作製し、さらにファージディスプレー技術によるなど、ウイルスまたは細菌表面タンパク質との結合に関してスクリーニングすることで作製することができる。次にこの抗体もしくはそのフラグメントまたはその組換え型を、増殖因子もしくはホルモンまたはＰＩ３Ｋシグナル伝達経路を活性化するレセプターと結合するその他のタンパク質などのターゲッティングエージェントを含むように改変する。得られた二官能性分子はペントンなどのウイルスまたは細菌表面タンパク質と特異的に結合し、また、ターゲッティングレセプターを発現する選択されたターゲッティング細胞と特異的に結合する。
【０１０９】
ｂ．　ターゲッティングエージェント
ターゲッティングエージェントはホルモン、増殖因子およびサイトカインをはじめ、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路を活性化するレセプターと特異的に結合してそれらを活性化するリガンドである。従ってターゲッティングエージェントはレセプターと結合するように選択される。ターゲッティングエージェントの選択は癌および炎症性疾患をはじめとする脈管形成疾患などの特定の疾患で過剰発現するものであってよい。造血系の細胞、特に好中球、単球および他のタイプの白血球におけるＰＩ３Ｋ活性は急性および慢性炎症に関連する非記憶性免疫応答の多くに関与している。
【０１１０】
レセプターとしては、限定されるものではないが、ＰＤＧＦレセプター、ＥＧＦレセプター、ＦＧＦレセプターファミリーのメンバー、ＣＳＦ−１レセプター、インスリンレセプター、ＩＧＦ−１レセプター、ＳＣＦ（幹細胞因子）レセプター、ＴＮＦレセプター（ＴＮＦ−αレセプターなど）およびＮＧＦレセプターなどの、活性化された際にＰｔｄｌｎｓ（３，４，５）Ｐ３の集積の上昇をもたらすチロシンキナーゼレセプター；ＩＩ−２レセプター、ＩＩ−３レセプター、ｍｌｇＭレセプター、ＣＤ４レセプター、ＣＤ２レセプターおよびＣＤ３／Ｔ細胞レセプターなどの、Ｐｔｄｌｎｓ（３，４，５）Ｐ３の集積を刺激するｓｒｃファミリー非レセプター型チロシンキナーゼと会合したレセプターが挙げられる。本明細書では、サイトカインＩＩ−４レセプターおよびＧタンパク質結合トロンビンレセプター、ＡＴＰレセプター、およびＦｍｌｐレセプターなどの、ＰＩ３Ｋの活性を刺激して次にＰｔｄｌｎｓ（３，４，５）Ｐ３の集積をもたらすその他のレセプターも意図される。
【０１１１】
ターゲッティングエージェントはかかる細胞表面タンパク質と結合するように選択し、これは次にターゲッティングエージェントおよびそれと結合されているいずれかのもののインターナリゼーションを助長しなければならない。
【０１１２】
結果として提供されたコンジュゲートを用いて、かかるレセプターを発現する細胞へ遺伝子および産物を送達することができる。従ってこれは遺伝子療法を達成するため、かつ／または広範な疾患および症状のアレイに含まれる細胞に産物を送達するため、広範な細胞アレイに、植物ならびに動物をはじめとする広範な生物において遺伝子および産物を特異的にターゲッティングする手段を提供する。
【０１１３】
２．　二官能性分子の製造
αｖインテグリンと結合するタンパク質と結合する抗体およびその抗原結合フラグメントなどの抗原結合タンパク質の製造方法は当業者に公知である。二官能性分子は組換え法および／または化学法によって製造することができる。二官能性分子は標準的な組換え法を用いて作製できる融合タンパク質であってもよい。二官能性分子はヘテロ二官能性試薬およびリンカーまたはその他の好適な化学コンジュゲート剤を用いて製造してもよい。二官能性分子の製造は本明細書に例示され、挙げられている方法は所望の二官能性分子のいずれかの製造のために適合させることができる。
【０１１４】
二官能性分子をコードする構築物の発現のためのプラスミドおよび宿主細胞
抗体、通常にはＨ鎖またはその部分などの選択された「Ｐ」部分をコードする核酸は好適なベクターに挿入し、好適な原核または真核宿主で発現させる。抗体発現のためには、例えばＬ鎖を別のプラスミドに挿入することができる。多くの好適な宿主およびベクターが知られており、当業者に利用でき、商業的に購入できるか、あるいは周知で利用可能な出発材料を用い、公開されているプロトコールに従って構築することができる。好適な真核宿主細胞としては、昆虫細胞、酵母細胞、および動物細胞が挙げられる。現在のところ昆虫細胞および細菌宿主細胞が好ましい。好適な原核宿主細胞としては、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、バチルス属およびストレプトミセス属系が挙げられる。本明細書の目的では、バキュロウイルス発現系が好ましい。
【０１１５】
ＤＮＡ構築物は選択された宿主での発現に好適なプラスミドに導入する。プロモーターおよびオペレーターなどの調節領域であるプラスミド中のヌクレオチド配列は転写のため互いに作動可能なように連結する。Αｖインテグリン結合タンパク質（Ｐと呼ぶ）をコードするヌクレオチド配列はまた分泌シグナルをコードするＤＮＡを含むことができ、それにより得られたペプチドは前駆タンパク質である。使用に好適な分泌シグナルは広く利用でき、当技術分野で周知である。大腸菌で機能する原核性および真核性の分泌シグナルが使用できる。現在のところ好ましい分泌シグナルとしては、限定されるものではないが、以下の大腸菌遺伝子：ｏｍｐＡ、ｏｍｐＴ、ｏｍｐＦ、ｏｍｐＣ、β−ラクタマーゼ、ｐｅｌＢおよび細菌のアルカリ性ホスファターゼなどによってコードされているものが挙げられる（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ （１９８５） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８４：９９−１０５）。また、昆虫で機能する細菌のｐｅｌＢ遺伝子分泌シグナル（Ｌｅｉ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６９：４３７９）、ｐｈｏＡ分泌シグナルおよびｃｅｋ２分泌シグナルを用いてもよい。細菌発現に最も好ましい分泌シグナルは大腸菌ｏｍｐＡ分泌シグナルである。真核発現系、特に昆虫細胞系では、インスリン、成長ホルモン、メリチンおよび哺乳類アルカリ性ホスファターゼなどの分泌タンパク質由来のシグナルが本明細書では注目される。当業者に公知のその他の原核および真核分泌シグナルを使用してもよい（例えば、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ （１９８５） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８４：９９−１０５参照）。当業者ならば本明細書に記載の方法を用いて酵母、昆虫または哺乳類細胞のいずれかで機能する分泌シグナルを置き換えてそれらの細胞から異種タンパク質を分泌させることができる。生じたプロセッシングを受けたタンパク質は周縁質空間または発酵培地もしくは増殖培地から回収すればよい。
【０１１６】
これらのプラスミドは宿主内で機能する選択マーカー遺伝子を含んでもよい。選択マーカー遺伝子としては、形質転換された細菌細胞の識別し、極めて多数の非形質転換細胞の中から選択的に増殖させることを可能とする表現型を細菌に付与するいずれの遺伝子も含む。細菌宿主に好適な選択マーカー遺伝子としては、例えばアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ’）、テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃ’）およびカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎ’）が挙げられる。現在のところカナマイシン耐性遺伝子が好ましい。
【０１１７】
本明細書で用いられるプラスミドは好ましくは目的のタンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡと作動可能なように連結されたプロモーターを含み、細菌宿主でのタンパク質発現のために設計される。サポリンの発現のためには厳格に調節できるプロモーターが好ましいことが分かっている。本発明のタンパク質およびポリペプチドの発現に好適なプロモーターは広く利用でき、当技術分野で周知である。これらのタンパク質の発現のためには、かかるプロモーターはｌａｃオペロンなどの制御領域と作動可能なように連結されたプラスミドに挿入する。好ましいプロモーター領域は大腸菌で誘導でき機能するもの、あるいはウイルス起点のベクターの初期遺伝子がある。好適な誘導プロモーターおよびプロモーター領域の例としては、限定されるものではないが、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドに応答する大腸菌ｌａｃオペレーター（ＩＰＴＧ；例えば、Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． （１９７９） Ｃｅｌｌ １８：１１０９−１１１７参照）、重金属（例えば亜鉛）誘導に応答するメタロチオネインプロモーター金属調節エレメント（例えば、Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第４，８７０，００９号参照）、ＩＰＴＧに応答するファージＴ７ｌａｃ（例えば、米国特許第４，９５２，４９６；およびＳｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｍａｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５：６０−８９参照）およびＴＡＣプロモーターが挙げられる。その他のプロモーターとしては、限定されるものではないが、Ｔ７ファージプロモーター、ならびにＴ３、Ｔ５およびＳＰ６プロモーターなどのその他のＴ７様ファージプロモーター、大腸菌由来のｔｒｐ、ｌｐｐおよびｌａｃプロモーター（ｌａｃＵＶ５など）、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のＰ１０またはポリヘドリン遺伝子プロモーター（例えば、米国特許第５，２４３，０４１号、同第５，２４２，６８７号、同第５，２６６，３１７、同第４，７４５，０５１号および同第５，１６９，７８４号参照）、ならびにその他の真核発現系由来の誘導プロモーターが挙げられる。
【０１１８】
大腸菌細胞の形質転換に特に好ましくはプラスミドとしてはｐＥＴ発現ベクターが挙げられる（米国特許第４，９５２，４９６号； ＮＯＶＡＧＥＮ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩから入手可能； また、この系について述べたＮｏｖａｇｅｎから発表されている文献も参照）。かかるプラスミドとしては、Ｔ７ｌａｃプロモーター、Ｔ７ターミネーター、誘導性大腸菌ｌａｃオペレーターおよびｌａｃレプレッサー遺伝子を含むｐＥＴ １１ａ；Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネーターおよび大腸菌ｏｍｐＴ分泌シグナルを含むｐＥＴ １２ａ−ｃ；およびａＨｉｓカラムによる精製に用いられるＨｉｓ−Ｔａｇ（商標）リーダー配列（配列番号２３）およびカラム精製後の切断を可能とするトロンビン切断部位、Ｔ７−ｌａｃプロモーター領域およびＴ７ターミネーターを含むｐＥＴ １５ｂ（ＮＯＶＡＧＥＮ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）が挙げられる。
【０１１９】
その他の好ましいプラスミドとしてはｐＫＫプラスミド、特にｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能；また、Ｂｒｏｓｉｕｓ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｐｒｏｃ．． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：６９２９； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ；米国特許第５，１２２，４６３号、同第５，１７３，４０３号、同第５，１８７，１５３号、同第５，２０４，２５４号、同第５，２１２，０５８号、同第５，２１２，２８６号、同第５，２１５，９０７号、同第５，２２０，０１３号、同第５，２２３，４８３および同第５，２２９，２７９号も参照）が挙げられ、これはＴＡＣプロモーターを含む。プラスミドｐＫＫはＥｃｏＲＩ粘着末端を有するカナマイシン耐性カセット（Ｐｈａｒｍａｃｉａから購入；ｐＵＣ４Ｋから得られたもの；例えば、Ｖｉｅｉｒａ ｅｔ ａｌ． （１９８２） Ｇｅｎｅ １９：２５９−２８８；および米国特許第４，７１９，１７９号参照）をアンピシリン耐性マーカー遺伝子へ挿入することで改変されている。
【０１２０】
その他の好ましいベクターとしては、ｐＰＬ−ラムダ誘導性発現ベクターおよびｔａｃプロモーターベクターｐＤＲ４５０（例えば、米国特許第５，２８１，５２５号、同第５，２６２，３０９号、同第５，２４０，８３１号、同第５，２３１，００８号、同第５，２２７，４６９号、同第５，２２７，２９３号参照；Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｐ．Ｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手可能；また、Ｍｏｔｔ， ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８２：８８；およびＤｅ Ｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８０：２１も参照）；およびｐＢｌｕｅＢａｃ ＩＩＩをはじめとするｐＢｌｕｅＢａｃベクター（ｐＪＶＥＴＬおよびその誘導体とも呼ばれる；例えば、米国特許第５，２７８，０５０号、同第５，２４４，８０５号、同第５，２４３，０４１号、同第５，２４２，６８７号、同第５，２６６，３１７号、同第４，７４５，０５１および同第５，１６９，７８４号参照）などのバキュロウイルスベクターがが挙げられる。
【０１２１】
その他のプラスミドとしては、ｐＩＮ−ＩＩＩｏｍｐＡ２などのｐＩＮ−ＩＩＩｏｍｐＡプラスミド（Ｉｎｏｕｙｅに対する米国特許第４，５７５，０１３号参照；また、Ｄｕｆｆａｕｄ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． １５３：４９２−５０７も参照）が挙げられる。ｐＩＮ−ＩＩＩｏｍｐＡプラスミドは大腸菌のリポタンパク質遺伝子に由来する機能的断片と転写読み取り枠で連結された異種ＤＮＡの挿入部位を含む。これらのプラスミドはまた、目的のポリペプチドがそのアミノ末端のｏｍｐＡシグナルペプチドによって発現されるように置かれた、大腸菌のｏｍｐＡタンパク質のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ断片を含み、これにより細胞質膜を経た効率的な分泌が可能となる。これらのプラスミドはさらに大腸菌ｌａｃオペレーターの特異的セグメントをコードするＤＮＡを含み、これは目的ポリペプチドの転写発現に適切な配向に置かれるとともに、ｌａｃオペロンインデューサーの不在下ではｌａｃプロモーター−オペレーターと相互作用してそれからの転写を妨げる会合型レプレッサー分子をコードする機能的大腸菌ｌａｃＩ遺伝子を分離している。目的ポリペプチドの発現はリポタンパク質（ｌｐｐ）プロモーターおよびｌａｃプロモーター−オペレーターの制御下にあるが、いずれかのプロモーターからの転写は通常はレプレッサー分子により遮断されている。このレプレッサーは、両プロモーターからの目的ポリペプチドの転写発現を誘導するインデューサー分子の手段によって選択的に不活性化される。
【０１２２】
このレプレッサータンパク質はレプレッサータンパク質をコードする遺伝子を含む構築物を含有するプラスミドすなわち第二のプラスミドによってコードされていてもよい。レプレッサータンパク質は、そのレプレッサータンパク質が結合するヌクレオチド配列を含むプロモーターの転写を抑制することができる。このプロモーターは細胞の生理条件を変更することで脱抑制することができる。この変更は、例えばオペレーターと、または調節タンパク質もしくはそのＤＮＡの他の領域と相互作用する能力を阻害する分子を増殖培地に添加することで、あるいは増殖培地の温度を変更することで達成できる。好ましいレプレッサータンパク質としては、限定されるものではないが、ＩＰＴＧの誘導に応答する大腸菌ｌａｃＩレプレッサー、温度感受性ｃｌ８５７レプレッサーが挙げられる。大腸菌ｌａｃＩレプレッサーが好ましい。
【０１２３】
特定の好ましい実施形態では、これらの構築物はまた転写ターミネーター配列も含む。これらのプロモーター領域および転写ターミネーターはそれぞれ独立に同じ遺伝子または異なる遺伝子から選択される。いくつかの実施形態では、このＤＮＡ断片を細菌細胞、好ましくは大腸菌で複製する。このＤＮＡ断片はまた典型的には、細菌の世代から世代へのＤＮＡ断片の維持が確実となるように細菌の複製起点も含む。このように、細菌中での複製によって大量のＤＮＡ断片が生産できる。好ましい細菌複製起点としては、限定されるものではないが、ｆ１−ｏｒｉおよびｃｏｌ Ｅ１複製起点が挙げられる。
【０１２４】
好ましい細菌宿主はｌａｃＵＶプロモーターなどの誘導プロモーターと作動可能なように連結されたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡの染色体コピーを含む（米国特許第４，９５２，４９６号参照）。かかる宿主としては、限定されるものではないが、溶原性大腸菌株ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）が挙げられる。ＢＬ２１（ＤＥ３）株が好ましい。ＰＬｙｓ株はＴ７ポリメラーゼの天然阻害剤である低レベルのＴ７ライソザイムを提供する。好ましい真核宿主は昆虫細胞スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）である（ｓｆ９細胞；例えば、Ｌｕｃｋｏｗ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７−５５および米国特許第４，７４５，０５１号参照）。
【０１２５】
現在のところ好ましい昆虫宿主では、ｐｌＺなどのバキュロウイルスベクター（例えば、米国特許第５，２７８，０５０号、同第５，２４４，８０５号、同第５，２４３，０４１号、同第５，２４２，６８７号、同第５，２６６，３１７号、同第４，７４５，０５１号および同第５，１６９，７８４号参照； ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏから入手可能）もポリペプチドの発現に用いてよい。ＰＢｌｕｅＢａｃＩＩＩベクターは二プロモーター性のベクターであり、このプラスミドがβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）が昆虫の認識可能なＥＴＬプロモーターの制御下にあってＩＰＴＧで誘導され得る場合に、青／白スクリーニングによる組換え体の選択を提供する。ＤＮＡ構築物をバキュロウイルスベクターｐＢｌｕｅｂａｃ ＩＩＩ （ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）に導入した後、野生型ウイルスとともに昆虫細胞スポドプテラ・フルギペルダ（ｓｆ９細胞；例えば、Ｌｕｃｋｏｗ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７−５５および米国特許第４，７４５，０５１号参照）へ同時トランスフェクトする。
【０１２６】
特に分泌が望まれる場合には、ｐＰｂａｃおよびｐＭｂａｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡから入手可能、また、Ｌｅｒｎｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ６：２０−２１およびｔｈｅ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃａｔａｌｏｇ ｐａｇｅ ２１８も参照）などのその他のバキュロウイルスベクターも本明細書における使用に好適であり、これらはｐＪＶＰ１０Ｚ（例えば、Ｋａｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １８１：７５６−６３， Ｕｅｄａ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｇｅｎｅ １４０：２６７−２７２参照）のそれぞれＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩ部位に挿入された分泌シグナルであるヒトアルカリ性ホスファターゼ（例えば、Ｂａｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６：２２−２６参照）およびメリチン（例えば、Ｔｅｓｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｇｅｎｅ ９８：１７７−１８３参照）を含む。これらのベクターのＳｍａＩ／ＢａｍＨＩ部位へ遺伝子を挿入すると、成熟ペプチドまたは融合タンパク質が増殖培地中に分泌するようにプロポリペプチドをプロセッシングする昆虫細胞分泌経路へ向けられる融合タンパク質が生じる。インスリンシグナル配列（シグナル配列をコードするＤＮＡに関しては、例えば、米国特許第４，４３１，７４６号参照）、成長ホルモンシグナル配列、哺乳類アルカリ性ホスファターゼ、メリチンシグナル配列、およびその他昆虫細胞によってプロセッシングされるものなどのその他の異種シグナル配列も使用される。
【０１２７】
本明細書で提供される構築物は名称ｐＢＬＵＥＢＡＣＩＩＩ （ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ；ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＣＡＴＡＬＯＧ参照； Ｖｉａｌａｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｖｉｏｌ． ６４：３７参照；また、米国特許第５，２７０，４５８号；米国特許第５，２４３，０４１号；および米国特許出願番号０７／７９２，６００に基づく公開国際ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１０１３９も参照）で市販されているバキュロウイルスベクターに挿入することができる。ＰＢｌｕｅＢａｃＩＩＩベクターは二プロモーター性のベクターであり、このプラスミドがβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）が昆虫の認識可能なＥＴＬプロモーターの制御下にあってＩＰＴＧで誘導され得る場合に、青／白スクリーニングによる組換え体の選択を提供する。目的構築物をこのベクターのポリヘドリンプロモーターの制御下に挿入する。次にこのＤＮＡをＣａ（ＰＯ４）２もしくはリン酸カルシウムトランスフェクションまたはリポソームによるなどして野生型バキュロウイルスとともにスポドプテラ・フルギペルダ細胞（ｓｆ９細胞）へ同時トランスフェクトし、組織培養フラスコまたは懸濁培養で増殖させる。ウイルスを含まず青色を含むプラークを選抜し、プラークを精製して発現に関してスクリーニングする。詳細な実施例に示されている。
【０１２８】
コンビナトリアル法
目的の特異性を有する分子は、抗体分子の部分が組み合わさって抗原結合分子を形成する種々のプロトコールを用いて作製し、目的の特異性に関してスクリーニングすることができる。一般にファージディスプレーライブラリーでは、ヘテロ二量体抗体フラグメントの分泌が含まれることから、少なくともＦａｂフラグメントが必要である。
【０１２９】
Ｆａｂフラグメントに存在する相補性決定領域（ＣＤＲ）はランダム突然変異誘発（「合成抗体ライブラリー」の作出）により、あるいはその他の方法により可変である。Ｈ鎖抗体フラグメントをｐＩＩＩファージコートタンパク質ドメインとのＮ末端融合物として発現するように設計されたｐＣｏｍｂＩＩＩなどのファージミド（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８：７９７８）は、細菌を用いるファージ表面のＦａｂ抗体フラグメント（またはＦａｂ’２抗体フラグメント）のライブラリーのヘテロ二量体発現に使用できる。
【０１３０】
このように例えば、そのレセプターとの結合に関与する増殖因子または増殖因子の部分と融合したＤＡＶ−１ Ｈ鎖を用いてファージディスプレーライブラリーを形成してもよく、次にこのライブラリーを、アデノウイルス表面タンパク質と増殖因子／サイトカインレセプターの双方に高い特異性で結合する二官能性抗体に関して「パンニング」する。
【０１３１】
リンカーおよび化学コンジュゲート
融合タンパク質ではリンカーはペプチドであり、化学コンジュゲート分子ではリンカーはその他の部分であってもよい。また、化学コンジュゲート分子と組換え産生部分（組換え産生抗体もしくはフラグメントまたはその他の抗原結合分子など）の組合せを合し、増殖因子またはホルモンなどのターゲッティングエージェントと化学的に融合させてもよい。リンカーを用いる場合、そのコンジュゲートと細胞表面タンパク質の相互作用の際にターゲッテッドエージェントの活性を妨げないように選択する。当業者に公知のいずれの適当なリンカーを使用してもよい。リンカーはターゲッテッドエージェントをウイルスまたは細菌ベクターと複合化させることで活性を改良するように選択すればよく、ある場合には、リンカーは特異性、毒性、溶解度、血清安定性、および／またはターゲッティングされる部分の細胞アベラビリティーを向上させるように選択する。いくつかの実施形態では、各リンカーの所望の特性を利用するために数種のリンカーを含めてもよい。単独または本明細書で意図される他のリンカーとともに用いるにはフレキシブルリンカーおよびコンジュゲートの溶解度を高めるリンカーが考えられる。
【０１３２】
化学コンジュゲートでは、二官能性分子の成分は直接結合させてもよいし、リンカーを介して結合させてもよい。化学結合コンジュゲートに好適なリンカーとしては、限定されるものではないが、アミン基とチオール基などのフリーの反応基の間のジスルフィド結合、チオエーテル結合、ヒンダードジスルフィド結合、エステルおよび共有結合が挙げられる。これらの結合は、ヘテロ二官能性試薬を用いて一方または双方のポリペプチド上に反応性チオール基を作出した後、一方のポリペプチド上のチオール基を他方の反応性チオール基またはアミン基と反応させて作出する。他のリンカーとしては、限定されるものではないが、ビスマレイミドエトキシプロパンなどの酸切断リンカー；より強い酸性の環境で切断される酸不安定性トランスフェリンコンジュゲートおよびアジピン酸ジヒドラジド；可視光または紫外線によって切断される光切断性架橋剤が挙げられる。
【０１３３】
化学結合コンジュゲートに好適なリンカーとしては、限定されるものではないが、アミン基とチオール基などのフリーの反応基の間のジスルフィド結合、チオエーテル結合、ヒンダードジスルフィド結合、および共有結合が挙げられる。これらの結合は、ヘテロ二官能性試薬を用いて一方または双方のポリペプチド上に反応性チオール基を作出した後、一方のポリペプチド上のチオール基を、反応性マレイミド基またはチオール基が他方に結合することができる反応性チオール基またはアミン基と反応させて作出する。他のリンカーとしては、ビスマレイミドエトキシプロパンなどの酸切断リンカー；より強い酸性の細胞内コンパートメントで切断される酸不安定性トランスフェリンコンジュゲートおよびアジピン酸ジヒドラジド；紫外線または可視光に露光した際に切断される架橋剤；およびヒトＩｇＧ１の不変領域由来のＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３のような種々のドメインなどのリンカー（Ｂａｔｒａ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３０：３７９−３８６参照）が挙げられる。いくつかの実施形態では、各リンカーの所望の特性を利用するために数種のリンカーを含めてもよい。
【０１３４】
化学リンカーおよびペプチドリンカーは、リンカーをＴＡおよびＰ部分（抗体などのαｖインテグリンタンパク質結合部分）に共有結合させることで挿入すればよい。以下に記載されるヘテロ二官能性剤を用いてかかる共有結合を達成してもよい。ペプチドリンカーはまた、リンカーおよびＴＡ、リンカーおよびＰ、またはリンカー、ターゲッテッドエージェントおよびＴＡをコードするＤＮＡを融合タンパク質として発現させることで結合させてもよい。
【０１３５】
アミノ基とチオール基の間に共有結合を形成するため、およびチオール基をタンパク質に導入するために用いられる多くのヘテロ二官能性架橋試薬が当業者に公知である（例えば、かかる試薬の製造および使用について記載し、かかる試薬の商業ソースを示すｔｈｅ ＰＩＥＲＣＥ ＣＡＴＡＬＯＧ， ＩｍｍｕｎｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔａｌｏｇ ＆ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， １９９２−１９９３参照、また、例えば、Ｃｕｍｂｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ３：３９７−４０１； Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４７：５９２４−５９３１； Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．　（１９８７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８４：３０８−３１２； Ｗａｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２：１９１−１９７； Ｃａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９７８） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １７３： ７２３−７３７； Ｍａｈａｎ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２：１６３−１７０； Ｗａｗｒｙｚｎａｃｚａｋ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ６６：３６１−３６６； Ｆａｔｔｏｍ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ＆ Ｉｍｍｕｎ． ６０：５８４−５８９も参照）。これらの試薬はＴＡとターゲッテッドエージェントの間に共有結合を形成するために使用できる。これらの試薬としては、限定されるものではないが、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ；ジスルフィドリンカー）；スルホスクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）；スクシンイミジルオキシカルボニルα−メチルベンジルチオスルフェート（ＳＭＢＴ、ヒンダードジスルフェートリンカー）；スクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）；スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）；スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＰＤＢ；ヒンダードジスルフィド結合リンカー）；スルホスクシンイミジル２−（７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセトアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ＳＡＥＤ）；スルホ−スクシンイミジル７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセテート（ＳＡＭＣＡ）；スルホスクシンイミジル６−［α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）；１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ブタン（ＤＰＤＰＢ）；４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ、ヒンダードジスルフェートリンカー）；スルホ−スクシンイミジル６［α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）； ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）；Ｎ−スク���ンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ；チオエーテルリンカー）；スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）；スクシンイミジル４（ρ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）；スルホスクシンイミジル４−（ρ−マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ−ＳＭＰＢ）；アジドベンゾイルヒドラジド（ＡＢＨ）が挙げられる。
【０１３６】
特にターゲッテッドエージェントを切断するためにより容易に反応に接近できるようにようにする必要がある場合には、酸切断リンカー、光切断性および熱感受性リンカーも使用できる。酸切断リンカーとしては、限定されるものではないが、ビスマレイミドエトキシプロパンおよびアジピン酸ジヒドラジドリンカー（例えば、Ｆａｔｔｏｍ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ＆ Ｉｍｍｕｎ． ６０：５８４−５８９参照）および細胞内トランスフェリン回路に入らせるに十分なトランスフェリン部分を含む酸不安定性トランスフェリンコンジュゲート（例えば、Ｗｅｌｈｏｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：４３０９−４３１４参照）が挙げられる。
【０１３７】
光切断性リンカーは露光した際に切断され（例えば、Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ． ３：１０４−１０７参照、なおこのリンカーは出典明示により本明細書の一部とする）、それにより露光した際に二官能性分子および複合体からターゲッティングエージェントを放出するリンカーである。露光した際に切断される光切断性リンカーは公知であり（例えば、システインに対する光切断性保護基としてのニトロベンジル基の使用を記載しているＨａｚｕｍ ｅｔ ａｌ． （１９８１） ｉｎ Ｐｅｐｔ．， Ｐｒｏｃ． Ｅｕｒ． Ｐｅｐｔ． Ｓｙｍｐ．， １６ｔｈ， Ｂｒｕｎｆｅｌｄｔ， Ｋ （Ｅｄ）， ｐｐ．１０５−１１０；ヒドロキシプロピルメタクリルアミドコポリマー、グリシンコポリマー、フルオレセインコポリマーおよびメチルローダミンコポリマーをはじめとする水溶性光切断性コポリマーを記載しているＹｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍａｋｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ １９０：６９−８２；近紫外線（３５０ｎｍ）に露光した際に光分解を受ける架橋剤および試薬を記載しているＧｏｌｄｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ． ３：１０４−１０７；および光切断性結合を形成する塩化ニトロベンジルオキシカルボニル架橋試薬を記載しているＳｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ ４２：２３１−２３７参照）、それにより露光した際にターゲッテッドエージェントを放出する。かかるリンカーは光ファイバーを用いて露光することができる皮膚科または眼科症状を治療する上で特定の用途を有する。コンジュゲートを投与した後、眼または皮膚その他の身体部位を露光すると、コンジュゲートからターゲッテッド部分が放出し得る。かかる光切断性リンカーは、ターゲッティングエージェントを除去して動物の身体から迅速にクリアランスさせることが望ましい診断プロトコールに関して有用である。
【０１３８】
３．　二官能性分子とウイルスベクター粒子または細菌粒子との複合体の製造
二官能性分子とベクターとの間の複合体は、ベクターおよび二官能性分子を複合体を形成させるのに好適な条件下でインキュベートすることで製造することができる。
【０１３９】
活性のアッセイ
得られた複合体の遺伝子送達能を評価するいずれかのアッセイ。かかるアッセイは当業者に公知であり、いくつかは本明細書で例示されている（実施例参照）。
【０１４０】
４．　ターゲッティングのためのＤＡＶ−１構築物およびその使用の実施形態の例
本明細書で意図される実施形態の例は、ＰＩ３Ｋを活性化するレセプターと結合することが知られている増殖因子などのターゲッティングエージェントを、種々のアデノウイルス血清型のペントンタンパク質と特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分に連結することで形成される二官能性分子である。これらの実施形態は例であり、ウイルス粒子もしくは細菌細胞または細胞への送達が意図されるその他の部分上のタンパク質と結合するいずれかの抗体を用い、ターゲッティングエージェントと細胞表面レセプターの相互作用によってかかる部分を細胞に特異的にターゲッティングすることができると考えられる。現在のところ好ましいのは、アデノウイルス粒子およびウイルスのインターナリゼーションを促進するαｖインテグリンとの相互作用を担うそのペントンタンパク質である。
【０１４１】
２／５型アデノウイルス粒子のインテグリン結合部位を認識し（Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９９７） ＥＭＢＯ Ｊ． １６：１１８９−１１９８；実施例１）、ペントンベースと高い親和性で結合するがウイルス感染は阻害しないペントンベースモノクローナル抗体ＤＡＶ−１は本明細書では再操作されている（実施例１参照）。ＤＡＶ−１ Ｈ鎖をコードする核酸（例えば、配列番号５参照）はＰＩ３Ｋを活性化することが知られている数種の異なるサイトカイン／増殖因子の１つと融合されており、このコードされている融合タンパク質は昆虫細胞においてＤＡＶ−１ Ｌ鎖とともに同時発現する。得られた二官能性分子は免疫反応性とサイトカイン機能を保持する。
【０１４２】
これらの二官能性分子はアデノウイルスと複合化されており、αｖインテグリンを欠く細胞、ならびにαｖインテグリンを発現し、ＰＩ３Ｋの活性化を明示する細胞に対して高い遺伝子送達をもたらすことが示されている。二官能性分子との複合化はまた、ＣＡＲと結合する能力を欠いた無繊維Ａｄベクターによる遺伝子送達を可能とする（実施例５および６参照）。
【０１４３】
ａ．　二官能性シグナル伝達抗体の解析
ＤＴ（ＴＮＦ−αと融合したＤＡＶ−１）、ＤＩ（ＩＧＦ−１と融合したＤＡＶ−１）、およびＤＥ（ＥＧＦと融合したＤＡＶ−１）で示されるＤＡＶ−１二官能性シグナル伝達抗体は昆虫細胞で分泌タンパク質として発現し、Ｌタンパク質アフィニティーカラムで精製した。ＤＴ Ｈ鎖（ＤＨＴ）の見かけの分子量は約７０ｋＤａであり、ＤＡＶ−１γ Ｈ鎖（５３ｋＤａ）と単量体ＴＮＦ−αリガンド（１７ｋＤａ）を合わせた大きさである。ＤＡＶ−１ （ＤＬ）のκ鎖の見かけの分子量は組換えＤＴ分子（約２５ｋＤａ）と同じであった。ウエスタンブロット解析では、ＤＡＶ−１ ｍＡｂ （Ｄ）およびＤＴ分子が抗マウスＩｇＧ抗体によっては認識されたが、ＤＴ分子だけが抗ＴＮＦ−αポリクローナル抗体によって認識されたことが示された。
【０１４４】
ＤＴ分子はＥＬＩＳＡにおいて固定化されたペントンベースまたはＡｄ粒子と結合することができ、ＴＮＦ−α感受性細胞系ＭＣＦ−７に対する細胞傷害性を誘起したが、このことはＤＴ二官能性分子がウイルスおよびサイトカインレセプター結合機能を保持していることを示している。
【０１４５】
ｂ．　二官能性分子はＡｄを媒介とするαｖインテグリンを欠いた細胞への遺伝子送達を促進する
ＤＴとともにＲＳＶ駆動型ＬａｃＺレポーター遺伝子を含有する第一世代のアデノウイルスベクターを、ＲＧＤモチーフ当たり２抗体分子の割合でプレインキュベートした。次にこの複合体を、αｖインテグリンを発現しないＭ２１−Ｌ１２ヒトメラノーマ細胞（Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８９：２０１８−２０２２）に添加したが、効率的なウイルス結合の助けとはなり得ない（Ｗｉｃｋｈａｍ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃｅｌｌ ７３：３０９−３１９）。Ｄ単独ではなくＤＴと複合化したＡｄは、感染４８時間後に導入遺伝子の発現によって測定すると、Ａｄを媒介とするＭ２１−Ｌ１２細胞への遺伝子送達が有意に上昇する。ウイルス単独またはウイルス＋Ｄとともにインキュベートした細胞の３％未満に対して、Ａｄ＋ＤＴとともにインキュベートした細胞の約６０％がβ−ガラクトシダーゼに関して陽性染色された。３時間アデノウイルス単独を感染させた後にＤＴを添加したＭ２１−Ｌ１２細胞は、感染４８時間後には遺伝子送達において極めて小さな上昇しか示さなかったことから、このＤＴによる遺伝子送達の上昇はＴＮＦレセプターの連結の結果としてのＲＳＶ ＬＴＲ導入遺伝子プロモーターの活性化の上昇によるものではなかった。この結果は、二官能性分子が細胞への侵入に関連した１以上のステップを増強することでアデノウイルスを媒介とする遺伝子送達を高めることを示す。
【０１４６】
Ｃ．　ＤＴ分子はＡｄ結合およびインターナリゼーションを増強する
以下の実験は、遺伝子送達のＤＴ増強がＭ２１−Ｌ１２細胞へのウイルスの接着の上昇と関連があることを示した。１２５Ｉ標識Ａｄ粒子をＤ分子ではなくＤＴとともにプレインキュベートしたところ、ウイルス結合は約５倍上昇した。結合の上昇にあずかる分子を検討するために競合実験を行った。細胞に対するＡｄ−ＤＴ結合は、５０倍過剰量の組換え型ファイバータンパク質または抗ＴＮＦ−αまたはこれら分子の組合せの存在下で測定した。組換え型ファイバーまたは抗ＴＮＦ−α抗体のいずれか単独は細胞に対するＡｄ−ＤＴ結合の２０〜２５％を阻害できたに過ぎなかった。これに対し、ファイバーと抗ＴＮＦ−αの組合せによれば約７０％の結合を阻害することができた。これらの知見は、細胞に対するＡｄ−ＤＴ結合はＣＡＲ−ファイバー相互作用ならびにＴＮＦ−αレセプター会合によって媒介されることを示す。
【０１４７】
ｄ．　ＤＴ分子はトリプシン消化耐性によって測定した場合に１２５Ｉ標識ウイルス粒子のインターナリゼーションを増強する
初期の研究で証明されているように（Ｗｉｃｋｈａｍ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃｅｌｌ ７３：３０９−３１９）、Ｍ２１−Ｌ１２細胞は比較的低レベルのアデノウイルスのインターナリゼーションを助ける。これはαｖインテグリンの不在によるものではない。ＤＴ分子はこれらの細胞へのアデノウイルスのインターナリゼーションの速度および程度を有意に高めた。これとともにこれらの知見は、ＤＴ分子がウイルスの結合ならびにウイルスのインターナリゼーションを促進することで遺伝子送達を増強することを示す。
【０１４８】
ｅ．　遺伝子送達のＤＴによる増強はＰＩ３Ｋの活性化と関連している
αｖインテグリンを介した効率的なＡｄのインターナリゼーションには鍵となる細胞シグナル伝達分子であるＰＩ３Ｋの活性化が必要である。ＤＴによる遺伝子送達の増強もＰＩ３Ｋに関連することを示すために、Ｍ２１−Ｌ１２細胞をウイルス感染に先立ってＰＩ３Ｋ阻害剤であるウォルトマンニンまたはＬＹ２９２００４で処理した。ウォルトマンニンおよびＬＹ２９２００４はＡｄを媒介とする遺伝子送達をそれぞれ約７０％および５０％を阻害したが、このことはＰＩ３Ｋの活性がＤＴによる遺伝子送達の増強に主要な役割を果たしていることを示している。
【０１４９】
遺伝子送達の増強におけるＰＩ３Ｋ依存性シグナル伝達の役割をさらに証明するため、そのサイトカイン／増殖因子ドメインがＰＩ３Ｋを活性化することが知られているその他の二官能性分子による、Ａｄ媒介型の遺伝子送達を測定した。ＤＴ、ＤＥおよびＤＩ分子は遺伝子送達をそれぞれ約３０、１０および５倍高めた。また、これらの分子による遺伝子送達の増強はウォルトマンニンで細胞を前処理することで阻害された。これらの知見はさらに、ＰＩ３Ｋの活性化がＡｄによる遺伝子送達を促進することを示す。
【０１５０】
ｆ．　二官能性分子は無繊維アデノウイルス粒子による遺伝子送達を可能とする
ＣＡＲと結合できない無繊維アデノウイルスベクターを構築した（例えば、同時係属米国出願番号０９／４８２，６８２および同０９／５６２，９３４参照；また、Ｖｏｎ Ｓｅｇｇｅｒｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｖｉｏｌ． ７３：１６０１−１６０８も参照）。これらの粒子の構造は野生型ビリオンの構造とほとんど同じである。無繊維粒子単独では、たとえこれらの細胞がＣＡＲおよびインテグリンαｖβ５の両者を発現するとしても、ＳＷ４８０上皮細胞への導入遺伝子の送達はほとんど示さなかった（Ｖｏｎ Ｓｅｇｇｅｒｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３：１６０１−１６０８）。
【０１５１】
ＤＴ分子は無繊維ウイルスの遺伝子送達を増強した。ＤＴまたはＤＩ分子と複合化した無繊維粒子は複合化していない無繊維粒子に比べて遺伝子送達の上昇をそれぞれ約１０〜１５、３および５倍阻害した。これらの知見は、無繊維粒子がシグナル伝達抗体を介して細胞に再ターゲッティング可能であることを示す。遺伝子送達のための無繊維アデノウイルスベクターの使用は、次に特異的ターゲッティング戦略を採用し、ウイルスファイバータンパク質とＣＡＲレセプターの間の相互作用を無効にすることで選択された細胞種に対するウイルスの親和性を制限することができることから望ましい。
【０１５２】
ｇ．　結果の要約
本明細書では、二官能性分子と複合化したＡｄベクターはαｖインテグリンを欠くヒトメラノーマ細胞への遺伝子送達を有意に高め、かかる二官能性分子を含まないＡｄベクターに比べてウイルスの結合およびインターナリゼーションの双方の上昇に関連していたことが示される。重要なこととしては、ＰＩ３Ｋの薬理阻害剤で細胞を処理した後では送達に有意な低下が見られたので、ＰＩ３Ｋの活性化はこのプロセスの鍵となる役割を果たす。さらに、異なる増殖因子リガンドを提示する二官能性分子（これらは各々ＰＩ３Ｋを活性化することが分かっている）もまた遺伝子送達を高めた。種々の二官能性分子による遺伝子送達の変動は、種々の細胞種に対する増殖因子／サイトカインレセプターの発現の違い、または各リガンドによって誘導されるＰＩ３Ｋの活性化の程度によるものである可能性が最も高い。
【０１５３】
特定の細胞種への遺伝子送達の達成は、複数の細胞種で発現するファイバーレセプター（ＣＡＲ）によって妨げられてきた。この問題を回避するため、無繊維アデノウイルスベクターを、二官能性分子を用いて再ターゲッティングした。数種の異なる二官能性分子と複合化した無繊維アデノウイルスによる遺伝子送達の有意な増強が検出された。これらの研究は無繊維アデノウイルス粒子の構造的および機能的完全性を確認し、遺伝子送達の再ターゲッティングに関するそれらの有用性を示すものである。
【０１５４】
ＰＩ３Ｋ依存性シグナル伝達経路はその他のウイルスベクターの取り込みを高めるにも有用であるはずである。例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）も感染にαｖインテグリンを用いることが報告されている。種々の細菌およびウイルス病原体は宿主細胞への侵入にインテグリンおよび／またはＰＩ３Ｋの活性化を用いることから、ＰＩ３Ｋ依存性シグナル伝達経路のターゲッティング非ウイルスベクターの細胞への侵入を促進するための一般スキームとしても使用可能であることを示す。例としての方法および二官能性分子はインターナリゼーションのためにＰＩ３Ｋ依存性シグナル伝達経路を用いるその他のウイルスベクターおよび細菌ベクターの侵入を促進する使用にも適合させることができる。
【０１５５】
Ｃ．　ウイルス粒子の構築
１．　ウイルスゲノムとファイバータンパク質の選択
遺伝子産物の送達のための組換えアデノウイルスベクターを作製する方法は周知である。中でも好ましいのは、本明細書で例示され（実施例参照）、同時係属米国出願番号０９／４８２，６８２（２０００年１月１４日出願の国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ００／００２６５としても出願、なおこれは米国出願番号０９／４８２，６８２同様、米国仮出願番号６０／１１５，９２０の優先権を主張するものである）にも記載の方法である。
【０１５６】
記載のように、目的の組換えアデノウイルスは、ウイルスゲノムが光受容細胞に対して選択的結合をもたらすファイバータンパク質の少なくとも一部を含むキャプシドにパッケージングされる限りは本明細書の方法で用いられると考えられる。このファイバータンパク質は好ましくはＤ血清型アデノウイルスに由来するものであり、好ましくはＡｄ３７ファイバーである。このファイバータンパク質はタイプ特異的抗原を含むＤ型アデノウイルス由来のＣ末端にノブ領域（「ヘッドドメイン」）を保持しているべきであり、細胞表面レセプターへの結合を担う。ゆえにファイバータンパク質は光受容細胞に特異的に結合するに十分なＤ血清型の部分を保持している限り、キメラファイバータンパク質であってもよい。一般にこの保持部分はノブ領域の全部または一部である。必要とされるノブ領域の厳密な量はその部分を含め、Ｄ血清型Ａｄ、好ましくはＡｆ３７から最小の残基を同定することで経験的に決定して、パッケージビリオンを水性体液に導入した際に眼の光受容体に対する、かかるファイバーとともにパッケージングされたビリオンの選択的ターゲッティングを行うことができる。
【０１５７】
遺伝的欠陥を修正する遺伝子などの目的産物をコードする異種核酸を含む組換えアデノウイルスは、当業者に公知のいずれの方法によって作製してもよい。これらのウイルスは好適な細胞系にパッケージングされる。
【０１５８】
アデノウイルス科には少なくとも５１の既知の血清型のヒトアデノウイルス（Ａｄ １〜Ａｄ４７）（Ｓｈｅｎｋ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｃｈａｐｔｅｒ ６７， ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， １９９６）を含む多くのメンバー、ならびにヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌおよびオポッサムウイルスをはじめとするマストアデノウイルス属のメンバーおよび鳥類ウイルス、例えばＣＥＬＯをはじめとするアビアデノウイルス属のメンバーが含まれる。このように本明細書の方法はいずれのアデノウイルス種に由来するいずれの組換えウイルスベクターにも適用できると考えられる。当業者ならば種々のアデノウイルスに関する知識を持っており（例えば、Ｓｈｅｎｋ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｃｈａｐｔｅｒ ６７， ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， １９９６参照）、かかるウイルスのいずれかのゲノムの一部を含む組換えウイルスでも構築することができる。本明細書の方法はまた、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路を用いる、特にその過程でαｖインテグリンを用いるレセプターを介してインターナライズするいずれかの送達ビヒクルを伴う使用のために適合させることができる。
【０１５９】
２．　パッケージング
組換えアデノウイルスベクターは通常少なくともＥ１（Ｅ１ａおよびＥ１ｂ領域を含む）と呼ばれる第一のウイルス初期遺伝子領域に欠損を有する。ウイルスＥ１領域の欠損は組換えアデノウイルスを複製欠陥型とし、続いて感染させた標的細胞では感染力のあるウイルス粒子は産生できない。このようにＥ１欠損型のアデノウイルスのゲノム複製を生じさせてウイルス粒子を産生させるには、欠損したＥ１遺伝子産物を与える補足系が必要となる。Ｅ１の補足は典型的にはヒト胎生期腎臓パッケージング細胞系、すなわち２９３と呼ばれる上皮細胞系など、Ｅ１を発現する細胞系によって与えられる。２９３細胞系はＥ１遺伝子領域産物を与えてその細胞系でＥ１欠損型ウイルスの増殖を「助ける」アデノウイルスのＥ１領域を含む（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｏｌ． ３６：５９−７１， １９７７参照）。また、アデノウイルスＥ４領域の一部を有する欠陥アデノウイルスの産生に使用できる細胞系が報告されている（ＷＯ９６／２２３７８）。複数欠陥型アデノウイルスベクターと補足細胞系も報告されている（ＷＯ９５／３４６７１、米国特許第５，９９４，１０６号）。
【０１６０】
同時係属米国出願番号０９／４８２，６８２（２０００年１月１４日出願の国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ００／００２６５としても出願）はヘルパーウイルスを必要としない、ウイルスゲノムの主要部分の欠損を有するウイルスベクターを助けるパッケージング細胞系を提供し、また、ヘルパー依存性ベクターとともに用いるための細胞系およびヘルパーウイルスも提供する。
【０１６１】
この同時係属出願は、細胞ゲノムの染色体に安定して組み込まれた異種ＤＮＡを有するパッケージング細胞系を提供する。この異種ＤＮＡ配列は複製およびパッケージングするアデノウイルスベクターゲノムにおいて欠損または突然変異した遺伝子を補足する１以上のアデノウイルス調節および／または構造ポリペプチドをコードする。このパッケージング細胞系は例えば１以上のアデノウイルス構造タンパク質、ポリペプチド、またはその断片、例えばペントンベース、ヘキソン、ファイバー、ポリペプチドＩＩＩａ、ポリペプチドＶ、ポリペプチドＶＩ、ポリペプチドＶＩＩ、ポリペプチドＶＩＩＩ、およびその生物学的に活性な断片を発現する。この発現は構成的なものであっても、調節プロモーターの制御下にあってもよい。これらの細胞系は特に治療産物の送達を意図した組換えアデノウイルスの発現のために設計されている。
【０１６２】
特定のパッケージング細胞系が、アデノウイルス構造タンパク質、調節ポリペプチドＥ１ＡおよびＥ１Ｂ、および／または下記のタンパク質またはポリペプチド：Ｅ２、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ４またはその断片の１以上をコードするＤＮＡ配列の欠損または突然変異を有するウイルスベクターを補足する。
【０１６３】
パッケージング細胞系は、各ＤＮＡ分子を細胞へ、次に個別の補足プラスミドによってゲノムへ導入することで作出され、あるいは補足タンパク質をコードする複数のＤＮＡ分子を単一の補足プラスミドによって導入することもできる。
【０１６４】
治療適用では、送達プラスミドはさらに外来ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。送達プラスミドの例としてはｐＤＶ４４、ｐＥ１Ｂ ｇａｌおよびｐＥ１ｓｐ１Ｂがある。同等または類似の方法では、治療遺伝子を導入してもよい。
【０１６５】
細胞はさらに本明細書で意図されるようなファイバーをコードする補足プラスミドを含み、プラスミドまたはその一部は細胞の細胞ゲノム染色体へ組み込まれる。
【０１６６】
ある実施形態では、組成物は第一および第二の送達プラスミドを含有する細胞を含み、ここで第一の送達プラスミドはファイバーをコードするヌクレオチド配列を欠いていて第二の送達プラスミドの不在下では新たなウイルス粒子のパッケージングを指示することができないアデノウイルスゲノムを含み、第二の送達プラスミドは第一の送達プラスミドの存在下で新たなウイルス粒子のパッケージングを指示することができるアデノウイルスゲノムを含む。
【０１６７】
このパッケージング細胞系は原核細胞系に由来するものであっても真核細胞系に由来するものであってもよい。種々の実施形態が哺乳類細胞、より詳しくは上皮細胞系の使用を示唆しているが、その他多様な非上皮細胞系も種々の実施形態で用いられる。
【０１６８】
３．　粒子中に含まれる核酸分子の成分
本明細書で用いる組換えウイルスベクターまたは治療用ウイルスベクターは典型的には治療適用に用いることを意図したタンパク質もしくはポリペプチド分子、またはその生物学的活性な断片、またはその他の調節配列をコードする核酸断片を含む。
【０１６９】
ウイルス粒子にパッケージングされる核酸分子はまた、３’または５’に位置して、その産物がタンパク質である場合には治療産物をコードする核酸分子の発現を制御するエンハンサーエレメントおよび／またはプロモーターを含んでもよい。さらに、本明細書の目的では、その産物の発現を制御するプロモーターおよび／またはその他の転写および翻訳調節配列は、ロドプシン遺伝子プロモーターなどの光受容体特異的プロモーターのようなターゲッティングされた細胞で特異的に発現するものであることが好ましい。
【０１７０】
ウイルスキャプシドにパッケージングされる核酸分子は、少なくとも２つの異なる、作動可能なように連結されたプロモーターを含む。このＤＮＡは本明細書にキシアのＰＣＲにより、また、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９）に記載のものなどの標準的な技術を用いて操作・増幅することができる。典型的には、かかる分子を作製するためには、選択されたポリペプチドおよびプロモーターまたはエンハンサーをコードする配列を、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで細胞内で自己複製可能なＤＮＡ分子と作動可能なように連結する。エンハンサーエレメントまたはプロモーターおよび核酸分子をベクターに作動可能なように連結することで、連結されたセグメントはベクター配列とともに複製する。
【０１７１】
このように組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）は、通常天然にはともに見られない少なくともヌクレオチド配列を含むハイブリッドＤＮＡ分子である。種々の好ましい実施形態では、配列の１つはＡｄ由来のポリペプチド、タンパク質またはその断片をコードする配列である。パッケージングが意図される核酸分子は約２０ｂｐから約４０，０００ｂｐ長、好ましくは約５０ｂｐから約３８，０００ｂｐ長である。種々の実施形態では、この核酸分子は１以上のアデノウイルスタンパク質またはその機能的ポリペプチド部分をコードするに十分な長さのものである。個々のＡｄポリペプチドは約１９アミノ酸残基から約９６７アミノ酸残基まで様々であるので、ウイルスベクターにおいて治療産物をコードする核酸分子で「置換」される個々のポリペプチドコード配列の数および大きさに応じて、コード核酸分子は約５０ｂｐから約３０００ｂｐまでである。
【０１７２】
好ましくはこの分子は、パッケージング細胞系での発現に好適なＲＮＡプロセッシングシグナル（例えばスプライス供与部位またはスプライス受容部位など）を含むイントロンと作動可能なように連結されたアデノウイルス三部分リーダー（ＴＰＬ）核酸配列を含む。より好ましくは、このイントロンはスプライス供与部位またはスプライス受容部位を含む。あるいはＴＰＬヌクレオチド配列はイントロンを含まなくてもよい。イントロンは、パッケージング細胞系でスプライシングシグナルをはじめとするＲＮＡプロセッシングシグナルを提供する働きをするいずれのヌクレオチド配列を含んでもよい。イントロンは多数の構造遺伝子からよく同定されており、限定されるものではないが、Ａｄ５’ｓ ＴＰＬイントロン１などのアデノウイルス由来天然イントロン１が挙げられ、他にはＳＶ４０ ＶＰイントロン、ウサギβ−グロブリンイントロン、および合成イントロン構築物がある（例えば、Ｐｅｔｉｔｃｌｅｒｃ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌ．， ４０：１６９；およびＣｈｏｉ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １１：３０７０参照）。
【０１７３】
ＴＰＬをコードする核酸分子は（ａ）第一および第二のＴＰＬエクソン、または（ｂ）第一、第二および第三のＴＰＬエクソンのいずれかを含み、ここで配列中の各ＴＰＬエクソンは完全ＴＰＬエクソン１、部分的ＴＰＬエクソン１、完全ＴＰＬエクソン２および完全ＴＰＬエクソン３の中から選択される。完全エクソンとは、野生型ウイルスゲノムで見られる配列に基づいた完全な核酸配列を含むものである。好ましくはＴＰＬエクソンはＡｄ２、Ａｄ３、Ａｄ５、Ａｄ７などに由来するものであるが、本明細書に記載のいずれのＡｄ血清型に由来してもよい。好ましい部分的ＴＰＬエクソン１は実施例に記載されている。部分的エクソン１を含むＴＰＬの使用が報告されている（国際ＰＣＴ出願ＷＯ９８／１３４９９）。
【０１７４】
イントロンおよびＴＰＬエクソンは機能的ＴＰＬヌクレオチド配列を得るために種々の構成で作動可能なように連結することができる。イントロンはその構築物の一部でなくともよい。例えば、イントロンはＴＰＬエクソン１、２または３のいずれの間に配置してもよく、エクソンは第一・第二、または第一／第二／第三のいずれの順序であってもよい。またイントロンは最初のＴＰＬエクソンの前、または最後のＴＰＬエクソンの後に置いてもよい。好ましい実施形態では、完全ＴＰＬエクソン３に作動可能なように連結された完全ＴＰＬエクソン２に完全ＴＰＬエクソン１が作動可能なように連結されている。好ましい変形では、アデノウイルスＴＰＬイントロン１が完全ＴＰＬエクソン１と完全ＴＰＬエクソン２の間に置かれている。また、狂犬病ウイルスなどの他のウイルス系に由来する類似の翻訳レギュレーターを用いることもできる。
【０１７５】
４．　補足プラスミド
また、アデノウイルス構造タンパク質または調節タンパク質の発現が可能な、典型的にはＤＮＡプラスミドベクターの形の核酸分子の使用も意図される。これらの発現プラスミドは組換えアデノウイルスベクターゲノムの欠陥遺伝子を補足するのに用いられることから、これらのプラスミドは補足プラスミドと呼ばれる。
【０１７６】
補足プラスミドは核酸分子によってコードされているタンパク質産物を発現し得るヌクレオチド配列である発現カセットを含む。発現カセットは典型的にはプロモーターと、プロモーターと作動可能なように連結された構造遺伝子を含む。補足プラスミドはさらに、アデノウイルスのゲノム複製とパッケージングに関して用いる場合、構造遺伝子産物の発現を増強するためにＴＰＬヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０１７７】
補足プラスミドは、限定されるものではないがペントンベース、ヘキソン、ファイバー、ポリペプチドＩＩＩａ、ポリペプチドＶ、ポリペプチドＶＩ、ポリペプチドＶＩＩ、ポリペプチドＶＩＩＩ、およびその生物学的に活性な断片などのアデノウイルスの構造ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と作動可能なように連結されたプロモーターを含んでもよい。別の変形では、補足プラスミドはまた、第一のアデノウイルス調節ポリペプチド、第二の調節ポリペプチドおよび／または第三の調節ポリペプチド、あるいは上記のいずれかの組合せをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０１７８】
５．　核酸分子の合成
合成オリゴヌクレオチドを含む核酸分子はホスホトリエステルまたはホスホジエステル法（例えば、Ｎａｒａｎｇ （１９７９） ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ６８：９０；米国特許第４，３５６，２７０号；およびＢｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， （１９７９） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ６８：１０９参照）などのいずれの好適な方法を用いて作製してもよい。オリゴヌクレオチドでは、そのファミリーメンバーの合成は１つの反応容器で同時に行ってもよいし、あるいはそれぞれ合成した後に予め選択したモル比で混合してもよい。同時合成では、ファミリーメンバーの配列の予め選択した位置において保存されているヌクレオチド残基を、オリゴヌクレオチドの位置番号が生長中のオリゴヌクレオチドポリマーに化学的に付加されている固相オリゴヌクレオチド反応混合物へ予め選択した単一のヌクレオチド前駆体を加えることにより、化学合成プロトコールにて同時に変異体へ導入することができる。様々な配列の位置に対するヌクレオチド残基の付加は、予め選択した複数のヌクレオチド前駆体の一定量、好ましくは等モル量を化学合成の際に固相オリゴヌクレオチド反応混合物に加えることで同時に導入することができる。例えば、存在し得る４つの天然ヌクレオチド（Ａ、Ｔ、ＧおよびＣ）の全てを予め選択した位置に付加するとすれば、それらの前駆体をオリゴヌクレオチド合成反応のそのステップに加えて同時に４種の変異体を形成する（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｕｐｐｌ． ８． ｐ．２．１１．７， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１）。
【０１７９】
通常の４つのヌクレオチド（Ａ、Ｔ、ＧおよびＣ）以外のヌクレオチド塩基、またはＲＮＡの同等のヌクレオチドのウラシル（Ｕ）も使用できる。例えば、イノシン（Ｉ）はＣ以外のＡ、ＴおよびＧとハイブリダイズし得ることが周知である。他の有用なヌクレオチド類似体の例も当技術分野で公知であり、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ． §１．８２２にも記載が見出せる。
【０１８０】
このように、４つの通常ヌクレオチドの全てがオリゴヌクレオチドファミリーのある１つの位置を占める場合、すなわち、予め選択したヌクレオチド配列が、ある位置で異なる４つの配列とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドを含むように設計される場合、いくつかの異なるオリゴヌクレオチド構造が考えられる。この組成物は、予め選択した位置にＡ、Ｔ、ＧまたはＣを含む４つのメンバーを含み得る。あるいは組成物は、予め選択した位置にＩまたはＣを含み、存在し得る通常の４つのヌクレオチドの全てとその位置でハイブリダイズする能力を持つ２つのヌクレオチド配列メンバーを含み得る。最後に、その他のヌクレオチドは、イノシン同様に通常のヌクレオチドの１以上と、安定してハイブリダイズする能力を有する、予め選択した位置に組み込むことができる。
【０１８１】
同様に、より大きな核酸分子も合成オリゴヌクレオチド片として構成し、周知のように相補的ハイブリダイゼーションと連結によって構築することができる。
【０１８２】
Ｄ．　アデノウイルス発現ベクター系
ウイルス粒子に封入され、遺伝子療法下で外来遺伝子を発現するアデノウイルスベクターゲノムはこの系の鍵となる要素であり、これらの系は周知であって容易に利用できる。このように組換えアデノウイルスベクターゲノムの要素としては、選択されたアデノウイルス構造遺伝子を発現する能力、目的の外来タンパク質を発現する能力、およびゲノムが遺伝子送達ベクター粒子にパッケージングされるに十分な複製およびパッケージングシグナルを含む能力が挙げられる。好ましい複製シグナルは周知のようにアデノウイルス複製起点を含むアデノウイルス逆方向末端反復である。
【０１８３】
アデノウイルスは多くのタンパク質を含むが、組換えアデノウイルス粒子（ベクター）の構築に全てのアデノウイルスタンパク質が必要とされるわけではない。従って組換えＡｄベクターから適当な遺伝子を欠失させると、いっそう大きな「外来」ＤＮＡ配列の適合を可能とする。
【０１８４】
特に、アデノウイルスベクターゲノムは機能的なアデノウイルスファイバータンパク質をコードしていない、上記のようなヘルパー依存型の系が考えられる。非機能性ファイバー遺伝子とはアデノウイルスファイバー遺伝子に対する欠失、突然変異またはその他の改変をさし、その結果、補足プラスミドまたはパッケージング細胞系によるファイバー遺伝子が補足されなければ、ファイバーを含むアデノウイルス粒子をパッケージングするいずれのアデノウイルスファイバータンパク質も発現しないか、あるいは不十分なアデノウイルスファイバータンパク質しか発現しない。かかるゲノムは「無繊維」ゲノムと呼ばれ無繊維粒子と混同してはならない。あるいは、ファイバータンパク質はコードされていてもよいが、ファイバーを含む粒子を生じるには十分な発現をしない。
【０１８５】
このように使用が意図される送達ベクターとしては、（ａ）全てのアデノウイルス構造遺伝子産物を発現するが、該ファイバー遺伝子が補足されなければファイバーを含むアデノウイルス粒子をパッケージングするのに十分なアデノウイルスファイバータンパク質を発現しない遺伝子、（ｂ）外来タンパク質を発現する遺伝子、および（ｃ）アデノウイルスパッケージングシグナルおよびアデノウイルス複製起点を含む逆方向末端反復を含むヘルパー非依存性無繊維組換えアデノウイルスベクターゲノムがある。
【０１８６】
アデノウイルスベクターゲノムはゲノムを含むｒＤＮＡプラスミドの形態で実験にて増殖させ、適当な宿主に導入すると、プラスミドに基づく増殖というよりもウイルスの遺伝エレメントがウイルスゲノムの複製とパッケージングをもたらす。Ａｄベクターゲノムを作製する方法例は実施例に記載されている。
【０１８７】
本明細書のベクターは細胞内で自己複製可能な核酸（好ましくはＤＮＡ）分子を含み、これにＤＮＡセグメント、例えば遺伝子またはポリヌクレオチドを、連結されたセグメントの複製が起こるように作動可能なように連結させることができる。本明細書の目的では、ベクター配列に作動可能なように連結されるヌクレオチドセグメントの１つが少なくとも治療核酸分子の一部をコードする。上記のように、治療核酸分子としては、タンパク質をコードするもの、また、ターゲッティングされた細胞で遺伝子産物の発現または発現の阻害もしくは変更をもたらし得る調節遺伝子をコードするものが含まれる。
【０１８８】
１．　核酸遺伝子発現カセット
種々の実施形態では、治療遺伝子のペプチドコード配列を発現ベクターに挿入して発現させるが、さらにいくつかの非コード配列もまた含む発現ベクターを構築することもできる。しかしながら好ましくは、非コード配列は除かれる。また、可溶型ポリペプチドのヌクレオチド配列を使用してもよい。もう１つの好ましい治療ウイルスベクターとしては、治療ヌクレオチド配列のコード配列の発現のための発現ベクターと作動可能なように連結された治療ヌクレオチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列が挙げられる。
【０１８９】
治療核酸分子が作動可能なように連結されたウイルスベクターの選択は、当技術分野では十分に公知であるように、直接、目的の機能特性、例えばベクター複製およびタンパク質発現、ならびに形質転換する宿主細胞よって異なる。本明細書では特定のアデノウイルス血清型を具体例の形で挙げているが、ハイブリッドおよびその誘導体をはじめとするいずれのアデノウイルス血清型の使用も意図されることは考えるべきである。
【０１９０】
翻訳可能なヌクレオチド配列は、ある読み取り枠であるポリペプチドをコードする少なくとも８コドンの連続配列を提供する一連の線状ヌクレオチド配列である。このヌクレオチド配列はＤＮＡ配列であるのが好ましい。ベクター自体が、ウイルスベクター（ＲＮＡまたはＤＮＡ）、裸の直鎖もしくは環状ＤＮＡ、または核酸材料および細胞に挿入されるいずれかのポリペプチドを含む小胞もしくは包膜などのいずれの好適な種類のものであってもよい。
【０１９１】
２．　プロモーター
本明細書の別の場所で記載するように、Ａｄ由来のベクターの発現核酸はまた、プロモーター、特に組織または細胞特異的プロモーター、好ましくはターゲッティングされた細胞で発現されるものを含んでよい。
【０１９２】
プロモーターは、プロモーターの３’または下流に位置する遺伝子の発現を制御するＤＮＡ配列を含む核酸断片である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合してその遺伝子（典型的にはプロモーターの３’に位置するもの）のＲＮＡ合成（転写）を開始するＤＮＡ配列である。また、プロモーターはＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合するものをはじめ、転写の開始を指示するＤＮＡ配列も含む。特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードする１以上の核酸配列が１つの治療ウイルスベクターまたはヌクレオチド配列に含まれる場合、１以上のプロモーターまたはエンハンサーエレメントを含んでもよく、特にそのことによって発現効率が上昇する。調節（誘導）、ならびに構成プロモーターは個別のベクターまたは同じベクターのいずれで使用してもよい。
【０１９３】
例えば、有用な調節プロモーターのいくつかはＣＲＥＢにより調節される遺伝子ファミリーのものであり、インヒビン、ゴナドトロピン、シトクロムＣ、グルカゴンなどが挙げられる（例えば、国際ＰＣＴ出願ＷＯ９６／１４０６１参照）。好ましくは、プロモーターはロドプシン遺伝子などの光受容体特異的遺伝子またはロドプシン発現を調節するタンパク質をコードする遺伝子から選択される。
【０１９４】
調節または誘導プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ結合および開始速度が外部刺激により調節されるプロモーターであるといえる（例えば、米国特許第５，７５０，３９６号および同第５，９９８，２０５号参照）。かかる刺激としては、種々の化合物または組成物、光、熱、ストレス、化学エネルギー源などが挙げられる。誘導、抑制および抑圧プロモーターは調節プロモーターであると考えられる。
【０１９５】
また、調節プロモーターとしては、組織特異的プロモーターが挙げられる。組織特異的プロモーターは特定の細胞種に作動可能なように連結された遺伝子の発現を指示する。組織特異的プロモーターはその３’に置かれた遺伝子を、他を排除するものではないが優先的にプロモーターがその内在遺伝子を発現した特定の細胞で発現させる。典型的には、組織特異的プロモーターがその３’に置かれた遺伝子を発現するとしても、それは適切な細胞種で適宜発現されると考えられる（例えば、Ｐａｌｍｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ２０： ４６５−４９９参照）。
【０１９６】
Ｅ．　剤形および投与
ＩＧＦ−１レセプターおよびＴＮＦ−αレセプターなどのターゲッティングされたレセプターを発現する細胞への治療遺伝子産物の送達のための治療上有効な濃度の組換えアデノウイルス送達ベクターを含む組成物
【０１９７】
好ましい投与様式としては、限定されるものではないが、筋肉、静脈、腹膜および網膜下注射、特に硝子体注射などの局部および局所投与様式が挙げられる。
【０１９８】
組換えウイルス組成物を前眼房または後眼房、特に硝子体腔をはじめとする組織への埋植用にコラーゲンスポンジなどの生分解性支持材に吸着させたような徐放性製剤、またはリポソームに調製してもよい。徐放性製剤は複数回投与用に調製できるので、１ヶ月または約１年までといったように選択された期間に数回の投与が施される。よって、例えばリポソームを、１回の注射での単一用量が合計約２〜約５回以上施されるよう調製すればよい。ベクターは選択された投与経路のための医薬上許容される担体で、かかる経路に好適な量で調製すればよい。
【０１９９】
組成物を調製するには、ウイルス粒子を好適な医薬上許容される担体中に透析してもよいし、またはウイルス粒子を濃縮かつ／またはそれと混合してもよい。得られた混合物は溶液、懸濁液またはエマルションであってもよい。さらに、ウイルス粒子を組成物中単独の医薬上有効成分として調製してもよいし、または治療する特定の疾患に有効なその他の薬剤と組み合わせてもよい。
【０２００】
好適な担体としては、限定されるものではないが、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、平衡塩溶液（ＢＳＳ）、乳酸リンガー液、ならびにグルコース、ポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコールなどの増粘剤および可溶化剤を含む溶液およびその混合物が挙げられる。リポソーム懸濁液は医薬上許容される担体としても好適である。これらは当業者に公知な方法によって調製し得る。
【０２０１】
組成物は徐放性製剤またはコーティングなど、体内から急速に排泄されることを防ぐ担体とともに調製することができる。かかる担体としては、限定されるものではないが、マイクロカプセル送達系などの徐放性製剤、ならびにエチレンビニルアセテート、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ乳酸および目的とする体または組織に直接配置することができる他の種類のインプラントなどの生分解性、生体適合性ポリマーが挙げられる。
【０２０２】
リポソーム懸濁液は医薬上許容される担体としても好適である。好ましくは、かかるリポソーム。例えば、リポソーム製剤は当業者に公知な方法によって調製し得る［例えば、Ｋｉｍｍ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｂｉｏｃｈ． Ｂｉｏｐｈ． Ａｃｔａ ７２８： ３３９−３９８； Ａｓｓｉｌ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ａｒｃｈ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． １０５： ４００； および米国特許第４，５２２，８１１号参照］。ウイルス粒子は水相リポソーム系でカプセル化してもよい。活性剤は目的の作用を損なわないその他の有効剤、または目的の作用を補助するもしくは抗腫瘍薬などの別の作用を有する材料と混合することもできる。
【０２０３】
本明細書における目的では、パッケージング前または使用直前にウイルスまたはその他の粒子を二官能性分子と複合化（コンジュゲート）してもよい。そこで、選択された送達ベクターと二官能性分子の組合せおよびその組合せを含むキットもまた提供される。二官能性分子および送達ベクターは個別の組成物としてまたは単一の組成物としてパッケージングしてもよい。所望により、キットにその組合せの使用および投与についての説明書を添付してもよい。
【０２０４】
組成物はガラス、プラスチック、もしくはその他の好適な材料かならるアンプル、ディスポーザブルシリンジまたは複数回投与もしくは単一投与用バイアルに封入することができる。このように封入された組成物はキットとして提供してもよい。特に、治療する症状に応じた目的量を送達するに十分な組成物量が入ったバイアル、アンプルまたはその他の容器、好ましくはディスポーザブルバイアルもしくは容器またはその他のパッケージングを含むキット。
【０２０５】
最後に、これらの組合せおよびその成分組成物はパッケージング材、典型的にはバイアルまたは容器、ウイルス粒子を含む医薬上許容される組成物およびその組成物の治療使用を表示したラベルを含む製品としてパッケージングすればよい。
【０２０６】
また、本明細書の方法を実施するキットも提供される。これらのキットは一回の投与に十分な組成物を含んだ１以上の容器（密閉バイアルなど）を含む。
【０２０７】
投与
これらの化合物を含有する組成物は好適ないずれかの経路で全身投与してもよいし、慢性関節リウマチの治療には滑液への注射、眼疾患またはベクターが眼から適宜ターゲッティングできる疾患の治療には浸透性点眼剤の形などで局所投与してもよい。
【０２０８】
さらには、いずれの特定の被験者および疾患に対しても、具体的な投与計画は個々の必要性および組換えウイルスの投与者もしくは専門家の専門的判断に従って経時的な調節すべきであり、本明細書に示される濃度範囲は一例に過ぎず、本明細書で提供される方法の範囲または実施を限定するものではないと考えられる。
【０２０９】
Ｆ．　疾病、疾患および治療産物
本明細書で提供される二官能性分子はターゲッティングされたレセプターを発現する細胞にウイルスおよび細菌ベクターをターゲッティングすることを可能とする。ターゲッティングされたレセプターＰＩ３Ｋシグナル伝達経路を活性化してそれにより結合したリガンドをインターナライズさせるものである。かかるレセプターは多様で広範なものであるので、二官能性分子の使用は、細胞および組織への遺伝子送達および治療産物送達の柔軟な手段となる。増殖因子およびホルモンなどのターゲッティングエージェントのレセプターは種々の疾患および症状に関連する細胞および／または選択された細胞種のみで過剰発現する。
【０２１０】
目的の増殖因子レセプターまたはサイトカインレセプターまたはＰＩ３Ｋ経路を活性化するその他の細胞表面レセプターを過剰発現する細胞種へアデノウイルスベクターを計画送達するＰＩ３Ｋシグナル伝達法を用いれば、かかるレセプターを介したインターナリゼーションが可能となる。アデノウイルスの結合およびインターナリゼーションは、それらが細胞表面に存在する場合には、ＣＡＲおよびインテグリンとの付加的な相互作用を利用することでさらに増強させることができる。本明細書で提供される二官能性分子はウイルスのファイバータンパク質とは結合しないことから、ＣＡＲとの相互作用が見込まれる。また、好ましい二官能性分子は５つの「ＲＧＤ」インテグリン結合部位を有するペントンベースタンパク質と結合する。５つの「ＲＧＤ」部位は全てではないが分子全体で結合することから、二官能性分子が存在してもＣＡＲの相互作用もインテグリンの相互作用も排除されず、しかも特異的な増殖因子／サイトカイン−レセプター結合相互作用も与えられる。この点で、一度ターゲッティングが達成されれば、結合およびインターナリゼーションのレベルの増強については「三刃の剣」のようなものである。また、インテグリンはそれ自体シグナル伝達するだけでなく増殖因子レセプターの最適な活性化を促進することが知られているので、アデノウイルスのインテグリンαｖとの相互作用を排除しないターゲッティング戦略を採るのが有利である（Ｖｕｏｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６６：１５７６ （１９９４）； Ｃｙｂｕｌｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ９４：６８ （１９９４）； Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １３９：２７９ （１９９７）； Ｍｉｙａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １３５：１６３３ （１９９６）； Ｓｃｈｎｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １６：５６００ （１９９７）； Ｗｏｏｄａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．， １１１：４６９ （１９９８）； Ｍｏｒｏ ｅｔ ａｌ． ＥＭＢＯ Ｊ．， １７：６６２２ （１９９８）； Ｓｏｌｄｉ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １８：８８２ （１９９９））。
【０２１１】
１．　疾病および疾患
本明細書では遺伝子産物、特に治療産物の送達のため組換えアデノウイルスベクターを特異的にターゲッティングする方法が提供される。これらの方法は、本明細書で提供される二官能性分子が選択的に結合して結合している送達ベクターのインターナリゼーションを生じるレセプターを発現する細胞をターゲッティングするのに特に好適である。現在のところアデノウイルスが好ましい。ターゲッティング可能な疾病としては、限定されるものではないが、癌、血管疾患、糖尿病性網膜症、再狭窄、眼疾患、過増殖性疾患、およびホルモン障害が挙げられる。本明細書で提供される方法および二官能性分子は特定の疾患に関連する限定された細胞群のターゲッティングを可能とする。
【０２１２】
脈管形成
健康な成人において脈管形成は厳格に調節されており創傷治癒、妊娠および子宮周期に限定される。脈管形成は塩基性および酸性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンギオゲニン、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のような特定の脈管形成分子により開始される。脈管形成はインターフェロン−α、トロンボスポンジン−１、アンギオスタチンおよびエンドスタチンのような阻害分子により抑制することができる。これらの天然の刺激剤と阻害剤のバランスが、本来休止している毛細脈管構造を制御する。ある疾病状態におけるように、このバランスが混乱した時に毛細血管内皮細胞の増殖、移動、そして最終的には分化が誘発される。
【０２１３】
癌および新血管形成を含む種々の疾患において脈管形成は中心的な役割を果たしている。多種多様な腫瘍の持続的増殖および転移はまた、腫瘍由来脈管形成因子に応答した新しい宿主血管の腫瘍中への増殖に依存することが示されている。種々の刺激に応答した新血管の増殖は、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、加齢性黄斑変性（ＡＲＭＤ）、血管新生緑内障（ｒｕｂｅｏｔｉｃ ｇｌａｕｃｏｍａ）、間質性角膜炎および未熟児網膜症を含む大多数の眼科疾患および盲目に認められる主要な所見である。これらの疾患では組織の損傷が脈管形成因子の放出を刺激し、その結果毛細血管の増殖が起こる。ＶＥＧＦは虹彩の新血管形成と血管新生網膜症において主要な役割を果たす。眼内のＶＥＧＦレベルと虚血性網膜症の眼の新血管形成との間の相関を明らかに示す報告がある一方で、ＦＧＦも役割を果たしている可能性がある。塩基性および酸性ＦＧＦは正常な成人の網膜に存在することが知られているが、たとえ検出可能なレベルでも常に新血管形成と相関するわけではない。これは主としてＦＧＦが細胞外マトリックスの荷電した成分と極めて強固に結合しており、眼内液の標準アッセイにより検出される自由拡散型として容易に利用できないためであろう。
【０２１４】
脈管形成反応における最終の一般的経路にはインテグリンを媒介とする細胞外マトリックスと増殖型血管内皮細胞との間の情報交換が含まれる。インテグリンと称されるこのクラスの接着レセプターは、すべての細胞上でαおよびβサブユニットを有するヘテロ二量体として発現される。かかるインテグリンの１つ、αｖβ３はこのファミリーのメンバーの中でも最も不規則なものであり、内皮細胞を多様な細胞外マトリックス成分と相互作用させる。このインテグリンのペプチドおよび抗体アンタゴニストは増殖型血管内皮細胞のアポトーシスを選択的に誘発して脈管形成を阻害する。脈管形成には２つのサイトカイン依存性経路が存在し、それらは異なる血管細胞インテグリンαｖβ３およびαｖβ５への依存性により特徴付けられる。具体的には、ウサギ角膜およびヒヨコ絨毛尿膜（ＣＡＭ）モデルにおいてそれぞれのインテグリンの抗体アンタゴニストが選択的にこれらの脈管形成経路の１つを遮断するため、塩基性ＦＧＦ−およびＶＥＧＦ−誘発脈管形成はそれぞれインテグリンαｖβ３およびαｖβ５に依存する。すべてのαｖインテグリンを遮断するペプチドアンタゴニストはＦＧＦ−およびＶＥＧＦ−刺激による脈管形成を阻害する。正常なヒトの眼血管は両インテグリンを提示しないが、αｖβ３およびαｖβ５インテグリンは能動的に血管を新生する眼疾患患者の組織中の血管に選択的に提示される。αｖβ３のみがＡＲＭＤの患者由来の組織に常に認められるが、αｖβ３およびαｖβ５はＰＤＲの患者由来の組織に存在していた。網膜脈管形成モデルマウスにインテグリンのペプチドアンタゴニストを全身投与すると新血管形成が遮断された。
【０２１５】
上記の接着ということに加え、細胞外マトリックスを通る細胞移動もまた、タンパク質分解に依存する。マトリックスメタロプロテイナーゼは、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼおよびストロメリジンを含む亜鉛要求性マトリックス分解酵素ファミリーに属し、それらはすべて細胞の侵襲性行動に関係している。腫瘍の転移および脈管形成のような細胞の侵襲プロセスはインテグリンおよびＭＭＰ−２の発現と関連することが認められている。ＭＭＰ−２は眼の到る所で認められ、バランスが崩れるまで休止している脈管構造を維持するために相互作用し、その結果、病的な脈管形成が起こる。ＭＭＰ−２の非触媒性Ｃ末端ヘモペキシン様ドメイン（ＰＥＸ）は、インテグリンαｖβ３との相互作用を介して侵襲性細胞表面へのＭＭＰ−２の局在化を阻止することにより、ＣＡＭモデルにおいて細胞表面のコラーゲン分解性活性を遮断し、脈管形成を阻害し得る。
【０２１６】
抗脈管形成薬は栄養および増殖因子の損傷効果を防止し網膜変性を治療する役割を持つ。脈管形成薬はまた、細胞への血流を増加させて網膜変性を抑制し、望ましい脈管形成を促進する。
【０２１７】
増殖因子／サイトカインと病態
ＥＧＦレセプター
ＥＧＦレセプターは神経膠芽腫、膀胱腫瘍、進行性胃腫瘍および子宮頚癌において過剰に発現される（Ｇｕｌｌｉｃｋ （１９９１） Ｂｒ． Ｍｅｄ． Ｂｕｌｌ．， ４７：８７）。ＥＧＦレセプターは肺癌患者由来の腫瘍標本の６３％で過剰に発現され（Ｐａｓｔｏｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｕｐｐｌ．， １７Ｆ：２３７）、また星状細胞神経膠腫においても過剰に発現される（Ｇｏｕｓｓｉａ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｏｎｃｏｌ． Ｒｅｐ． ７：４０１）。過剰発現はまた、ヒト食道癌および胃癌の腫瘍浸潤および進行とも相関する（Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｐａｔｈｏｌ．， ４０：２９１（１９９０））。
【０２１８】
ＦＧＦ レセプター
これらのレセプターはヒト膵臓腺癌（Ｋｏｂｒｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５３：４７４１（１９９３））、ヒト乳癌および婦人科癌（Ｊａａｋｋｏｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ５４：３７８ （１９９３））、ヒト星状細胞腫（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏ−ｏｎｃｏｌ．， １８：２０７（１９９４））； およびヒトメラノーマ組織（Ｘｅｒｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｒｅｓ．， ６：２２３（１９９６））において過剰に発現される。ＦＧＦレセプター発現細胞はまた、再狭窄、カポジ肉腫、糖尿病性網膜症および多くの眼疾患とも関連がある。
【０２１９】
ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲおよびＩＧＦ−１Ｒ
ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲおよびＩＧＦ−１Ｒは膵臓癌において過剰に発現される（Ｋｏｒｃ， Ｓｕｒｇ． Ｏｎｃｏｌ． Ｃｌｉｎ． Ｎ． Ａｍ．， ７：２５ （１９９８））。
【０２２０】
ＩＧＦ−１Ｒ
ＩＧＦ−１Ｒは初期の乳癌において過剰に発現され、高度にリン酸化される（Ｓｕｒｍａｃｚ， Ｊ． Ｍａｍｍ． Ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ． Ｎｅｏｐｌａｓｉａ， ５：９５ （２０００））。
【０２２１】
ＴＮＦＲ
ＴＮＦαレセプター、ｐ５５およびｐ７５の過剰発現はリンパ性白血病の患者由来の新生細胞において認められる（Ｗａａｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， ８０：２５７７ （１９９２））。ＴＮＦα ｐ５５レセプターは乳癌において過剰に発現される（Ｐｕｓｚｔａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ７０：２８９（１９９４））。ＴＮＦＲは正常および悪性骨髄細胞、例えばＨＬ−６０前骨髄細胞において過剰に発現される（Ｍｕｎｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， ７０：１７３０ （１９８７））。
【０２２２】
ＳＣＦ レセプター
骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の患者における肥満細胞症（種々の器官への肥満細胞の異常な浸潤）の発症は、ｃ−ｋｉｔ（ＳＣＦレセプター）の突然変異によりＳＣＦに過敏感になることが原因である（Ｄｒｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｈａｅｍａｔｏｌ．， １０８：７２９ （２０００））。従ってかかる細胞に治療産物を送達するためにＳＣＦ由来の二官能性分子を使用できる。良性および悪性の卵巣腫瘍はｃ−ｋｉｔ（ＳＣＦレセプター）を発現するが正常組織は発現しない（Ｔｏｎａｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ８９：２４２（２０００））。
【０２２３】
２．　治療産物
使用が意図される治療産物をコードするＤＮＡとしては、嚢胞性繊維症に関連する欠陥遺伝子（ＣＦＴＲ）（例えば、米国出願番号０７／７４５，９００に基づく国際出願ＷＯ９３／０３７０９；およびＲｉｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：１０６６−１０７３参照）のような欠陥遺伝子の正確なコピーをコードするＤＮＡ、および腫瘍壊死因子のような抗癌薬、ならびに細胞傷害薬である。治療産物としては、制限されるものではないが、欠陥遺伝子産物または遺伝的欠陥を修正するに十分なそれらの断片のような目標とされる眼疾患において欠陥を有する野生型の遺伝子、増殖因子を含む栄養因子、栄養因子の阻害薬および作用薬、抗アポトーシス因子ならびに本明細書の他の製品、または選択された疾患の治療に有用な当業者に公知の製品が含まれる。
【０２２４】
実施例
以下に示す実施例は例示のためだけに示すものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【０２２５】
実施例１
ＤＡＶ−１の作製および同定
本実施例で記載するように、モノクローナル抗体（ＤＡＶ−１と呼ぶ）がこれまでに得られ、同定されている（Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９９７） ＥＭＢＯ Ｊ． １６： １１８９−１１９８参照）。ＤＡＶ−１のＨ鎖およびＬ鎖の核酸およびタンパク質配列は配列番号１〜４で示され；さらに実質的に全長のＨ鎖を含む融合タンパク質例に用いられる部分の核酸およびタンパク質配列は配列番号５および６で示される。
【０２２６】
材料および方法
細胞系、ウイルスおよび組換えタンパク質
Ａ５４９、ＨｅＬａ、Ｈ２９８１およびＳＷ４８０細胞系、アデノウイルス血清型Ａｄ２、Ａｄ３およびＡｄ４はｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）から購入した。ウイルス単離のため、ＨｅＬａ細胞にＡｄ２、Ａｄ３またはＡｄ４のいずれかを１０ｐ．ｆ．ｕ．／細胞の多重度で感染させた後、４８〜７２時間後に回収した。細胞を５回凍結融解して細胞内ウイルス粒子を放出させた。高速遠心分離により細胞残渣を除去した後、これまでに報告されたように（Ｅｖｅｒｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９７７）、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．１（ＴＢＳ）中１５〜４０％塩化セシウム勾配で分画することでビリオンを単離した。分画されたビリオンを取り出した後、ＣｓＣｌをｐＨ８．１のリン酸バッファーを用いるＭｉｃｒｏｃｏｎ １００（Ａｍｉｃｏｎ）濾過装置にて複数回遠心工程を行うことで除去するクライオ電子顕微鏡法以外は、１０％グリセロール含有ＴＢＳバッファーで透析した。これまでに報告されているように（Ｎｅｍｅｒｏｗ ｅｔ ａｌ．， １９９３）； Ｗｉｃｋｈａｍ ｅｔ ａｌ．， １９９３）、バキュロウイルスを用いてＳｆ９昆虫細胞において５７１アミノ酸を含む組換えＡｄ２ペントンベース（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８）を作製した。
【０２２７】
ＤＡＶ−１抗ペントンベースｍＡｂの作製および同定
γ１κサブタイプのｍＡｂを分泌するハイブリドーマ（ＤＡＶ−１と呼ぶ）を標準的な技術により作製した。ＤＡＶ−１ ｍＡｂをＧタンパク質−セファロース（ＨｉＴｒａｐ ＧＩＩ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて腹水から精製した。ＤＡＶ−１ ｍＡｂのＦａｂフラグメントをパパイン消化により作製した。要するに、８％ｗ／ｗ可溶性パパイン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）の存在下、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ｌ−システイン、３ｍＭ ＥＤＴＡ中１〜５ｍｇ／ｍｌの精製ＤＡＶ−１ ＩｇＧを３７℃で７時間インキュベートした。３０ｍＭヨードアセトアミドの添加により反応を停止させ、次いで、Ｆａｂ抗体フラグメントを５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．０で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｓ ＦＰＬＣ カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で単離した。精製したＦａｂフラグメントをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した後、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ １０膜限外濾過装置（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて２．２ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。
【０２２８】
ＤＡＶ−１ ｍＡｂの異なるアデノウイルス血清型との反応性をＥＬＩＳＡ法により定量した。９６ウェルポリスチレンプレート（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ， Ｄｙｎａｔｅｃｈ）をＰＢＳ中１μｇのペントンベースまたは５μｇの精製Ａｄ２、Ａｄ３またはＡｄ４で４℃にて１８時間コーティングした。非特異的結合部位を２％脱脂粉乳でブロッキングした後、１０μｇ／ｍｌの精製ＤＡＶ−１ ｍＡｂまたは無関係の対照抗体を２２℃で６０分間ウェルに加えた。ヤギ抗マウスＩｇＧと結合させたアルカリ性ホスファターゼ、続いて基質（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を添加して抗体結合を検出した。基質の発現をＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ， Ｆｌｏｗ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にて４０５ｎｍで測定した。
【０２２９】
ＤＡＶ−１ ｍＡｂがＲＧＤを含む細胞マトリックスタンパク質も認識したかどうかを調べるため、ウエスタンブロット法で１〜２μｇの組換えペントンベースタンパク質、またはフィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン（１型）および繊維素をＤＡＶ−１ ｍＡｂと反応させた。組換えペントンベースまたは細胞マトリックスタンパク質を８〜１５％勾配ＳＤＳゲル（Ｎｏｖｅｘ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）で電気泳動した後、ニトロセルロースフィルター（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ， Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。非特異的結合部位を１％脱脂粉乳（Ｂｌｏｔｔｏ）でブロッキングした後、フィルターを１０μｇ／ｍｌのＤＡＶ−１ ｍＡｂと反応させ、続いて、ヤギ抗マウスＩｇＧと結合させたアルカリ性ホスファターゼ（Ｔｒｏｐｉｘ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）、次いで、化学発酵基質（ＣＤＰ）とともにインキュベートした。
【０２３０】
ＤＡＶ−１ ｍＡｂの機能解析
細胞表面αｖインテグリンと結合するペントンベースに対するＤＡＶ−１ ｍＡｂの作用を以下のように調べた。１×１０６ Ａ５４９上皮細胞に１０μｇ／ｍｌの精製ＤＡＶ−１ ＩｇＧまたはＤＡＶ−１ ｍＡｂのＦａｂフラグメントを加えた。次いで、異なる量の１２５Ｉ−標識ペントンベース（１０μＣｉ／μｇ）を５０倍過剰の非標識ペントンベースの存在または不在下で細胞に加え、４℃で６０分間インキュベートした。１：１グリセロール／鉱油クッション上で細胞サンプルを遠心分離することにより結合していないペントンベースを除去し、γカウンターで細胞ペレットを計数して細胞と会合したペントンベース量を測定した。
【０２３１】
アデノウイルス感染に対するＤＡＶ−１ ｍＡｂの作用をプラークアッセイにより定量した。Ａ５４９細胞を６ウェルプレートに播種し、９０％集密まで培養した。３μｇ／ｍｌのＤＡＶ−１ Ｆａｂまたは１８μｇの全ＩｇＧ ＤＡＶ−１抗体を細胞培養物に加え、続いて、精製した１００ｐ．ｆ．ｕ． Ａｄ２を添加し、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、Ａｄ２および抗体混合物を取り出し、ＤＭＥＭ培地中０．５％アガロースおよび１０％ＦＣＳを含有する８ｍｌの重層培地を各ウェルに加えた。感染５日後、細胞に４ｍｌの重層培地を加えた。感染１０日後にプラークを評価した。
【０２３２】
ペントンベースと結合するＤＡＶ−１のエピトープマッピングおよび動態解析
上記のように、アフィニティーによる質量分析法によりＡｄ２ペントンベースのＤＡＶ−１結合部位を同定した。これらの研究のため、ＲＧＤを含むエピトープ配列のほぼ全体にわたるペントンベースの領域を選択した。Ａｄ２ペントンベースＲＧＤ配列、４８０ＭＮＤＨＡＩＲＧＤＴＦＡＴＲＡ４９４（配列番号１９）のＮ末端またはＣ末端領域において１つのアミノ酸が異なる一連の重複する合成ペプチドを固相プロトコールにより作製した後、ＤＡＶ−１エピトープの正確な境界をアフィニティーによる質量分析法により決定した（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６６： ３７２３−３７２６； Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９３： ４０２０−４０２４参照）。
【０２３３】
ＤＡＶ−１とペントンベースタンパク質との相互作用を自動バイオセンサーシステム（ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてＳＰＲ（Ｋａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １４５： ２２９−２４０）により正確に測定した。要するに、６０μｇ／ｍｌの組換えペントンベースを１０ｍＭ ＮａＣｌ含有１０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．５中、カルボキシメチルデキストランコーティングしたバイオセンサーチップに固定化した。ペントンベースのアミン結合後、異なる量の精製Ｆａｂフラグメント（３．６〜５７．０μｇ／ｍｌ）またはＩｇＧ分子（３６〜５７６μｇ／ｍｌ）各々を４０μｌ／分の速度でペントンベースに流した。動態結合データ（Ｋｏｎ、ＫｏｆｆおよびＫＤ）をＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン２．１）を用いて得た。化学量論データは、飽和結合状態でのＳＰＲの変化を観察し、ペントンベースの分子量を３５０ｋＤａ、Ｆａｂフラグメントを４３ｋＤａおよびＩｇＧ分子を１５０ｋＤａと想定することにより得た。ＤＡＶ−１により認識された配列はＩＲＧＤＴＦＡＴＲ（配列番号２０を参照）であった。
【０２３４】
実施例２
二官能性シグナル伝達抗体の作製および解析
Ａ．　ＤＡＶ−１をコードするｃＤＮＡのクローニング
実施例１で記載したように、γ１κタイプのモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ（ＤＡＶ−１と呼ぶ）を作製した（Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９９７） ＥＭＢＯ Ｊ． １６： １１８９−１１９８参照）。全ＲＮＡをＤＡＶ−１ハイブリドーマ細胞系（Ｔｒｉｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ， Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）から単離し、ｃＤＮＡを実質的に記載されているように（Ｕｅｍａｔｓｕ， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， ３４： １７４−１７８（１９９１））、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔプラスミドシステムキット（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて作製した。ＤＡＶ−１ Ｈ鎖はプライマー５’−ＣＣＴ ＧＣＴ ＣＴＧ ＴＧＴ ＴＴＡ ＣＡＴ ＧＡＧ ＧＧ（ＣＨ３領域）（配列番号１５）； ５’−ＣＣＣ ＡＧＧ ＧＴＣ ＡＴＧ ＧＡＧ ＴＴＡ Ｇ（ＣＨ１領域）（配列番号１６）を用いてＰＣＲ増幅し； κ（Ｌ）鎖の増幅ではプライマー５’−ＡＡＧ ＡＴＧ ＧＡＴ ＡＣＡ ＧＴＴ ＧＧＴ ＧＣ（ＣＬ−Ａ）（配列番号１７）および５’−ＴＧＴ ＣＡＡ ＧＡＧ ＣＴＴ ＣＡＡ ＣＡＧ ＧＡ（ＣＬ−Ｂ）（配列番号１８）を使用した。パラメーター９４℃で１分間、６３℃で１分間、および７２℃で１分間、全３０サイクルを用いてＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ産物をＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を用いてｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）に連結した後、自動シーケンシングによって配列決定した。完全ＤＡＶ−１ ＨおよびＬ鎖を得るためのさらなる増幅を上記の標準ＰＣＲ反応を用いて行った。
【０２３５】
コードするＤＡＶ−１のγ Ｈ鎖およびκＬ鎖をコードするｃＤＮＡを昆虫細胞発現用Ｚｅｏｃｉｎ選択マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＣＡ）を含む発現ベクター（ｐＩＺと呼ぶ）にサブクローニングした。種々のサイトカインまたは増殖因子との融合タンパク質を作製するのに使用するＤＡＶ−１ Ｈ鎖の部分は全長Ｈ鎖から最後の１８個のアミノ酸を除いたものであり（アミノ酸１〜４３８をコードする配列番号１のコード部分、および配列番号５）、ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩ部位をそれぞれ５’および３’末端に導入することで、これをそのＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位の間のｐＩＺ発現ベクターにクローニングした（配列番号５参照）。これはクローニングに先立ち、配列番号５で示されるＤＡＶ−１ Ｈ鎖配列の一部のＰＣＲ増幅のため、ＫｐｎＩ制限部位を有する「センス」プライマー５’−ＧＧＴ ＡＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＧＡ ＴＧＧ ＡＧＣ ＴＧＧ ＡＴＣ Ｔ（配列番号２１）、およびＥｃｏＲＩ制限部位を有する「アンチセンス」プライマー５’−ＧＡＡ ＴＴＣ ＡＴＧ ＴＡＡ ＣＡＣ ＡＧＡ ＧＣＡ ＧＧＡ（配列番号２２）を用いて達成した。ＤＡＶ−１ Ｌ鎖（配列番号３）は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位を、Ｌ鎖をコードするＤＮＡの５’および３’末端に導入することでｐＩＺ発現ベクターのＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位にクローニングした（配列番号３参照）。これはクローニングに先立ち、配列番号３で示されるＤＡＶ−１ Ｌ鎖配列のＰＣＲ増幅のため、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を有する「センス」ＰＣＲプライマー５’−ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＧ ＡＣＡ ＧＡＣ ＡＣＡ ＡＴＣ ＣＴＧ ＣＴ（配列番号２３）、およびＸｂａＩ制限部位を有する「アンチセンス」プライマー５’−ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＧＴ ＣＴＣ ＴＡＡ ＣＡＣ ＴＣＡ ＴＴＣ ＣＴＧ Ｔ（配列番号２４）を用いて達成した。得られたベクターを各々、Ｈ鎖およびＬ鎖構築物、ｐＩＺ−γ、ｐＩＺ−κとした。
【０２３６】
ＤＡＶ−１抗体のＦａｂ’２形態もまたアミノ酸２４７番においてＤＡＶ−１ γ−Ｈ鎖のＣ末端欠失を起こすことによりＰＣＲ増幅し（配列番号１参照）、配列番号２１で示される「センス」プライマー配列（ＫｐｎＩ制限部位を有する）、および「アンチセンス」プライマー５’−ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＧＡ ＴＡＣ ＴＴＣ ＴＧＧ ＧＡＣ ＴＧＴ（ＥｃｏＲＩ制限部位を有する配列番号２５）を用いてｐＩＺベクターのＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩ部位の間にクローニングした。
【０２３７】
Ｂ．　二官能性シグナル伝達抗体のクローニング
全長成熟ヒトＴＮＦ−α、ＩＧＦ−１、ＥＧＦおよびＳＣＦペプチドをコードするＤＮＡは、ＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍｄ）から入手したヒトＴＮＦ−αをコードするｃＤＮＡ、ヒトＩＧＦ−１に関してはＵ９３７細胞から単離した全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ、ＳＣＦに関してはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡから入手したｃＤＮＡ、およびＥＧＦに関しては１８ｂｐの重複を有する２つのオリゴヌクレオチド（配列番号３０および３１）をアニーリングすることにより作製された合成鋳型のＰＣＲ増幅により得た。融合タンパク質の構築では、全長成熟ヒトＴＮＦ−α、ＩＧＦ−１およびＥＧＦペプチドをコードするＤＮＡ配列（それぞれ配列番号７、８および９に記載されるペプチド配列）を融合タンパク質の作製に使用するＤＡＶ−１ Ｈ鎖部分（配列番号５）の下流（３’末端）にあるｐＩＺ−γのＥｃｏＲＩ部位にフレーム内連結した。
【０２３８】
全長成熟ペプチドのｐＩＺ−γベクターＤＡＶ−１ Ｈ鎖配列３’ＥｃｏＲＩ部位へのクローニングを促進するため、以下のプライマー： ＴＮＦ−αの増幅に関しては「センス」プライマー５’−ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＴＣ ＡＧＡ ＴＣＡ ＴＣＴ ＴＣＴ ＣＧＡ ＡＣ（配列番号２６）および「アンチセンス」プライマー５’−ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＡＣ ＡＧＧ ＧＣＡ ＡＴＧ ＡＴＣ ＣＣＡ ＡＡ（配列番号２７）； ＩＧＦ−１の増幅に関しては「センス」プライマー５’−ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＧＡ ＣＣＧ ＧＡＧ ＡＣＧ ＣＴＣ ＴＧＣ ＧＧ（配列番号２８）および「アンチセンス」プライマー５’−ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＡＡ ＧＣＴ ＧＡＣ ＴＴＧ ＧＣＡ ＧＧＣ ＴＴ（配列番号２９）； ＥＧＦの増幅に関しては「センス」プライマー５’−ＧＡＡ ＴＴＣ ＡＡＴ ＡＧＴ ＧＡＣ ＴＣＴ ＧＡＡ ＴＧＴ ＣＣＣ ＣＴＧ ＴＣＣ ＣＡＣ ＧＡＴ ＧＧＧ ＴＡＣ ＴＧＣ ＣＴＣ ＣＡＴ ＧＡＴ ＧＧＴ ＧＴＧ ＴＧＣ ＡＴＧ ＴＡＴ ＡＴＴ ＧＡＡ ＧＣＡ ＴＴＧ ＧＡＣ ＡＡＧ ＴＡＴ ＧＣＡ（配列番号３０）および「アンチセンス」プライマー５’−ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＡＧ ＣＧＣ ＡＧＴ ＴＣＣ ＣＡＣ ＣＡＣ ＴＴＣ ＡＧＧ ＴＣＴ ＣＧＧ ＴＡＣ ＴＧＡ ＣＡＴ ＣＧＣ ＴＣＣ ＣＣＧ ＡＴＧ ＴＡＧ ＣＣＡ ＡＣＡ ＡＣＡ ＣＡＧ ＴＴＧ ＣＡＴ ＧＣＡ ＴＡＣ ＴＴＧ ＴＣＣ ＡＡＴ ＧＣＴ ＴＣ（配列番号３１）を用いてＰＣＲ増幅することにより全長成熟ペプチドＴＮＦ−α、ＩＧＦ−１およびＥＧＦの各々をコードする核酸の５’および３’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入した。融合タンパク質の配向はＰＣＲ解析により決定した。全ての配列を自動ＤＮＡシーケンシングにより確認した。
【０２３９】
融合タンパク質は配列番号６で示されるＤＡＶ−１ Ｈ鎖配列の一部、続いてＤＡＶ−１および増殖因子配列（配列番号１１、１２および１３のアミノ酸４３９（Ｇｌｕ）および４４０（Ｐｈｅ）参照）の間にあるＥｃｏＲＩ部位によって生じた２つのアミノ酸「リンカー」配列、続いてフレーム内全長成熟増殖因子ペプチドを含んでいる。ＴＮＦ−α、ＩＧＦ−１およびＥＧＦについてのＤＡＶ−１ Ｈ鎖の融合タンパク質配列はそれぞれ配列番号１１、１２および１３で示されている。
【０２４０】
ＤＡＶ−１ Ｈ鎖のＳＣＦとの融合タンパク質の構築では、全長成熟ＳＣＦペプチド（配列番号１０で示されるペプチド配列）をコードするＤＮＡ配列を、融合タンパク質の作製に用いるＤＡＶ−１ Ｈ鎖部分（配列番号５）の下流（３’末端）にあるｐＩＺ−γベクターのＮｏｔＩおよびＸｂａＩ部位の間にフレーム内連結した。全長成熟ＳＣＦペプチドのｐＩＺ−γベクターＤＡＶ−１ Ｈ鎖配列３’ＮｏｔＩおよびＸｂａＩ部位へのクローニングを容易にするため、以下のプライマー： 「センス」プライマー５’−ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＡ ＡＧＧ ＧＡＴ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＡＡ ＴＣＧ（配列番号３２）および「アンチセンス」プライマー５’−ＴＣＴ ＡＧＡ ＧＴＧ ＣＡＡ ＣＡＧ ＧＧＧ ＧＴＡ ＡＣＡ ＴＡ（配列番号３３）を用いてＰＣＲ増幅することにより全長成熟ペプチドをコードするＳＣＦ配列の５’および３’末端にＮｏｔＩおよびＸｂａＩ部位を導入した。全長ＳＣＦをコードする核酸の５’末端にＮｏｔＩ部位を生じさせることで野生型配列（配列番号＞１０の最初のアミノ酸を参照）のグルタミン酸（Ｇｌｕ）から融合タンパク質（配列番号１４のアミノ酸４５０を参照）のグルタミン（Ｇｌｎ）への最初のアミノ酸の変化が生じた。得られた融合構築物は配列番号６で示されるＤＡＶ−１ Ｈ鎖ペプチド配列の一部、続いて「リンカー」配列の１１のアミノ酸（配列番号１４のアミノ酸４３９〜４４９）、さらにＳＣＦ成熟ペプチドを含んでいる。得られた融合タンパク質配列は配列番号１４で示されている。
【０２４１】
同様のクローニング法を用いて、ＤＡＶ−１抗体のＦａｂ’２形態の３’末端と融合するＴＮＦ−α、ＩＧＦ−１、ＥＧＦおよびＳＣＦなどの増殖因子を作製した。
【０２４２】
Ｃ．　分泌二官能性抗体融合タンパク質の作製
ＤＡＶ−１ Ｈ鎖−ＴＮＦ、Ｈ鎖−ＩＧＦ−１またはＨ鎖−ＥＧＦ発現ベクターおよびＤＡＶ−１ Ｌ鎖発現ベクターをＳＦ９昆虫細胞に同時トランスフェクトした。ＳＦ９昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２００μｌ ＤＭＥＭ（血清フリー）中１５μｌ Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＨ鎖−増殖因子／サイトカイン融合物およびＬ鎖ベクターを含む全３μｇプラスミドＤＮＡで室温にて１５分間トランスフェクトした後、ＳＦ９細胞単層（約９０％集密）の新鮮な培養物に加えた。次いで、トランスフェクト細胞に対し、ペントンベースＥＬＩＳＡアッセイにより二官能性分子の産生に関するＺｅｏｃｉｎ選抜（６００μｇ／ｍｌ）を行った。さらに、陽性Ｚｅｏｃｉｎ耐性細胞のプールを融合タンパク質の産生に関して選抜した。
【０２４３】
Ｄ．　二官能性分子の精製および機能解析
トランスフェクトＳＦ９細胞の上清を、これまでに報告され（Ｍａｔｈｉａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７２（１１）： ８６６９（１９９８））かつ本実施例で記載するように、固定化ペントンベースを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより二官能性抗体産生についてアッセイした。組換えＡｄ２ペントンベースをバキュロウイルスベクターｐＢｌｕｅＢａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を用いてＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ Ｔｎ ５Ｂ１−４昆虫細胞（Ｗｉｃｋｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｐｒｏｇ．， ８： ３９１−３９６（１９９２））で産生させた。９６ウェルプラスチック組織培養プレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ−４， Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を組換えＡｄ２ペントンベースで、１μｇタンパク質／ウェルの濃度にてコーティングした。ブロッキング剤（Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ； Ｐｉｅｒｃｅ）とともにインキュベーションすることにより非特異的結合部位をクエンチした後、ＳＦ９細胞培養上清をプレートに加え、２２℃で１時間インキュベートした。結合した抗体をＨＲＰ結合ウサギ抗マウス抗体（全分子）を用いて検出した。二官能性抗体に対する陽性評価を試験した培養物上清をＰｒｏｔｅｉｎ Ｌ（Ａｃｔｉｇｅｎ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ）アフィニティーカラムに通した。結合した抗体を５０ｍＭジエチルアミン（ｐＨ９．７）または０．１Ｍクエン酸−０．１５Ｍ 塩化ナトリウム（ｐＨ３．０）のいずれかで溶出し、プールした画分をＰＢＳ（１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｎＭ ＮａＣＩ、ｐＨ７．２）で透析した。精製した融合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法によりさらに同定した。
【０２４４】
ＴＮＦ−αレセプターとの相互作用の結果として生じるＤＴ二官能性モノクローナル抗体（ＤＡＶ−１−ＴＮＦα二官能性抗体）の細胞傷害性を、これまでに報告されたように（Ｘｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ５３： ３（１９９７）、ＴＮＦ感受性ＭＣＦ−７細胞系を用いてアッセイした。
【０２４５】
ＳＦ９細胞上清または精製した二官能性タンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、クーマシーブルーで染色するかまたはＰＶＤＦメンブランフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移し、ウサギ抗マウス（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）またはヤギ抗ヒトＴＮＦ−α（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ， Ｔｅｍｅｃｕｌａ， ＣＡ）抗体、続いて、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）と結合した二次抗体でプロービングし、化学発光試薬（Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ， Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）で検出した。ウエスタンブロット解析では、抗マウスＩｇＧ抗体によりＤＡＶ−１モノクローナル抗体（Ｄ分子）およびＤＡＶ−１−ＴＮＦα二官能性抗体（ＤＴ分子）は両者とも認識されるが、抗ＴＮＦαポリクローナル抗体によってはＤＴ分子しか認識されないことが示された。
【０２４６】
実施例３
遺伝子送達ベクターおよび二官能性分子との複合化
Ａ．　アデノウイルスの増殖
アデノウイルスの増殖に一般に使用される細胞系は、アデノウイルスパッケージング細胞系調製用の宿主細胞として有用である。好ましい細胞としては、２９３細胞、ＡＴＣＣから入手した受託番号ＣＲＬ１５７３のアデノウイルス形質転換ヒト胎生期腎細胞系、ヒト上皮癌細胞系ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−２）、ヒト肺癌細胞系Ａ５４９（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ１８８９）；およびその他の上皮由来細胞系が挙げられる。アデノウイルス形質転換の結果として、２９３細胞はＥ１初期領域調節遺伝子を含む。特に断りのない限り、細胞は全て完全ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清で維持した。
【０２４７】
これらの細胞系により、予め選択した遺伝子領域に欠失を有し、かつアデノウイルス遺伝子の細胞補足作用によって得られたアデノウイルスに基づく送達ベクターの産生および増殖が可能となる。かかる単位としては、限定されるものではないが、Ｅ１初期領域、Ｅ４およびウイルスファイバー遺伝子が挙げられる。
【０２４８】
２型アデノウイルス（Ａｄ２、ＡＴＣＣ）をＡ５４９（ＡＴＣＣ ＃ＣＣＬ１８５）上皮細胞で増殖させ、これまでに報告され（Ｗｉｃｋｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ７３： ３０９（１９９３））かつ本実施例で記載するように精製した。細胞にＡｄ２を感染多重度（ＭＯＩ）１０で感染させた後、２〜３日後に回収した。細胞を５回凍結融解して細胞内粒子を放出させた後、遠心分離により細胞残渣を除去した。細胞溶解液に２５％〜４０％塩化セシウム勾配での密度勾配超遠心分離を行い、ウイルスバンドを取り出し、１０％グリセロール含有４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝生理食塩水、ｐＨ８．１で透析した。
【０２４９】
Ｂ．　アデノウイルス遺伝子送達ベクター
治療遺伝子などの遺伝子送達のためのアデノウイルスベクター、ならびにそれらの構築および増殖方法は周知であり、容易に利用できる（例えば、同時係属米国出願番号０９／４８２，６８２、国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ００／００２６５、および米国出願番号０９／５６２，９３４参照）。その他の送達ベクターを用いてもよい。種々のＡｄ送達ベクターが知られ、利用可能である。
【０２５０】
一般に、ファイバー発現および無繊維組換えアデノウイルスベクターの例が報告されている（Ｖｏｎ Ｓｅｇｇｅｒｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７３： １６０１（１９９９）； ２０００年１月１４日出願の同時係属米国出願番号０９／４８２，６８２、さらに２０００年１月１４日出願の国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ００／００２６５）。本明細書ではＡｄ５．βｇａｌ．ｗｔおよびＡｄ５．βｇａｌ．ΔＦ（１９９９年１月１５日寄託、ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ２６３６）の構築を記載する。Ａｄ２またはＡｄ５ベクターは、上記出願にて報告されている類似のＡｄ５に基づくベクターと同様に、ＳＶ４０プロモーターの代わりにＲＳＶ ＬＴＲを用いて構築することができる。本明細書の実施例中の試験ではかかるベクターを使用した。本明細書で記載するように、ｇｕｔｔｅｄ Ａｄベクターはほぼ全てのウイルス遺伝子を欠失させたものである。それらは「ヘルパー」ウイルスに（Ｅ１欠失Ａｄベクターを用いて）産生細胞を同時感染させることにより増殖させる。ヘルパーウイルスは粒子の構築に必要なウイルス構造タンパク質の産生をはじめ、失われたＡｄ機能をトランス補足するものである。ヘルパーウイルスはファイバー欠損Ａｄ（Ｖｏｎ Ｓｅｇｇｅｒｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３： １６０１−１６０８（１９９９）で報告されたものなど）であり得る。ベクターはファイバー発現細胞系で製造される（例えば、Ｖｏｎ Ｓｅｇｇｅｒｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７９： １４６１−１４６８； Ｖｏｎ Ｓｅｇｇｅｒｎ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７４： ３５４−３６２参照）。ファイバーを除く全ての必須Ａｄタンパク質がファイバー欠損ヘルパーウイルスにより提供され、宿主細胞により発現される特定の繊維が粒子にもたらされる。
【０２５１】
ヘルパーアデノウイルスベクターゲノムおよびｇｕｔｌｅｓｓアデノウイルスベクターゲノムはパッケージング細胞系へ送達される（例えば、２０００年１月１４日出願の国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ００／００２６５参照）。細胞は標準的な細胞維持または増殖条件下で維持し、これによりヘルパーベクターゲノムおよびパッケージング細胞が協働してアデノウイルスベクター粒子のパッケージングのための補足タンパク質をもたらす。かかるｇｕｔｌｅｓｓアデノウイルスベクター粒子を標準的な技術で回収する。ヘルパーベクターゲノムは標準的なトランスフェクション技術によりプラスミドまたは同様の構築物の形で送達してもよいし、あるいは、ゲノムを含むウイルス粒子による感染を介して送達してもよい。かかるウイルス粒子を一般にヘルパーウイルスと呼んでいる。同様に、ｇｕｔｌｅｓｓアデノウイルスベクターゲノムもトランスフェクションまたはウイルス感染により細胞に送達し得る。
【０２５２】
ヘルパーウイルスゲノムは無繊維アデノウイルスベクターゲノムであるのが好ましい。かかるゲノムはアデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂタンパク質をコードする遺伝子も欠失していることが好ましい。ゲノムはアデノウイルスＥ３タンパク質をコードするアデノウイルス遺伝子もさらに欠失していることがさらに好ましい。また、かかるタンパク質をコードする遺伝子が存在してもよいが、それらが機能的Ｅ１Ａ、Ｅ１ＢおよびＥ３タンパク質をコードしないよう変異させる。さらに、かかるベクターゲノムはＥ２Ａ、Ｅ２Ｂ、およびＥ４タンパク質などのその他の機能的初期タンパク質をコードしていなくてもよい。また、このようなその他の初期タンパク質をコードする遺伝子が存在してもよいが、それらが機能的タンパク質をコードしないよう変異させる。
【０２５３】
パッケージング細胞はまた、ｇｕｔｌｅｓｓベクターゲノムを含むアデノウイルス粒子が産生されるようにｇｕｔｌｅｓｓベクターの補足作用に必要なタンパク質も提供する。このように、パッケージング細胞系は野生型または改変型のファイバータンパク質を提供できる。あるいはこの細胞系は、それ自体で使用できる、またはそれに外から与えられたファイバーを加えることができる無繊維粒子をパッケージングできる。
【０２５４】
Ｇｕｔｌｅｓｓベクターを作製する際にはヘルパーウイルスゲノムもパッケージングされ、これによりヘルパーウイルスが産生する。産生されるヘルパーウイルスの量を最小限にし、かつ産生されるｇｕｔｌｅｓｓベクター粒子の量を最大にするためには、ヘルパーウイルスゲノムのパッケージング配列を欠失させるか、そうでなければ改変して、ゲノムのパッケージングを妨げるまたは制限することが好ましい。Ｇｕｔｌｅｓｓベクターゲノムはパッケージング配列を有するため、優先的にパッケージングされる。
【０２５５】
これを行う１つの方法が、この配列を含む１以上のヌクレオチドの欠失、あるいはこの配列を変異させてパッケージング機能を不活性化するまたは妨げることによってパッケージング配列を変異させることである。別のアプローチでは、リコンビナーゼターゲッティング部位がパッケージング配列にフランキングするようにヘルパーゲノムを操作し、パッケージング細胞にリコンビナーゼを提供する。リコンビナーゼのかかる部位での作用によってヘルパーウイルスゲノムからパッケージング配列が除去される。リコンビナーゼをコードするパッケージング細胞のヌクレオチド配列によってリコンビナーゼが提供されることが好ましい。かかる配列がパッケージング細胞のゲノムに安定して組み込まれることが最も好ましい。様々な種類のリコンビナーゼが当業者に公知である。好ましいリコンビナーゼは、上記のようにパッケージング配列のいずれの側ででも操作される、いわゆるｌｏｘ部位で作用するＣｒｅリコンビナーゼである。Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換えの使用についてさらに詳しくは、米国特許第５，９１９，６７６号およびＭｏｒｓｙ ａｎｄ Ｃａｓｋｅｙ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｔｏｄａｙ， Ｊａｎ．１９９９， ｐｇｓ． １８−２４に記載されている。
【０２５６】
ｇｕｔｌｅｓｓベクターは多数のまたは全てのＡｄ遺伝子を欠失しているため、失われたＡｄ機能を提供できるヘルパーウイルスの存在下で混合培養物としてそれらを増殖させる必要がある。現在までに、かかるヘルパーウイルスがＥ１を除く全てのＡｄ機能を提供しており、Ｅ１は２９３細胞またはその同等物での増殖により補われている。得られたウイルス粒子を回収し、典型的にはヘルパーウイルスをＣｓＣｌ勾配遠心分離により除去する（ベクター染色体は一般にヘルパー染色体より短く、２粒子間で浮遊密度差が生じる）。
【０２５７】
ｇｕｔｌｅｓｓ遺伝子送達ベクターの例としてｐＡｄΔＲＳＶＤｙｓ（Ｈａｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７： １９０７−１９１４）がある。このプラスミドはＲＳＶプロモーターにより駆動され、Ａｄ逆方向末端反復配列およびパッケージングシグナルがフランキングする全長ヒトジストロフィンｃＤＮＡを含む。細胞への送達に向けた目的の治療タンパク質およびその他の産物はこのベクターのジストロフィン遺伝子と容易に置換することができる。
【０２５８】
２９３細胞をヘルパーウイルスとして働く第一世代のＡｄで感染させ、次いで、精製したベクターＤＮＡでトランスフェクトする。ヘルパーＡｄゲノムおよび送達ベクターＤＮＡをＡｄ染色体として複製し、ヘルパーウイルスにより産生させたウイルスタンパク質を用いて粒子中にパッケージングする。粒子を単離し、送達ベクターを含有する粒子は、それらのゲノムサイズが小さいこと、従ってＣｓＣｌ勾配での密度差によってヘルパーと分離する。
【０２５９】
ベクターを６３３または７０５細胞のいずれかで増殖させ、Ａｄ５．βｇａｌ．ΔＦをヘルパーウイルスとして用い、ヘルパーおよび送達ベクターゲノムの双方を複製し、粒子中にパッケージングする。このヘルパーウイルスはファイバーを除く全ての必須Ａｄタンパク質を提供し、ファイバータンパク質は細胞（６３３細胞ではＡｄ５ファイバー、また７０５細胞ではＡｄ３７ファイバー）により産生される。次に、パッケージングされたウイルス粒子を遠心分離によって単離する。
【０２６０】
本明細書で例示される実験では、以下の第一世代組換えウイルスおよびその無繊維誘導体を使用した。第一世代Ａｄ２ウイルスＡｄ．ＲＳＶ．β−ｇａｌは、Ｅ−１およびＥ−３を欠失し、複製能を欠いた、ラウス肉腫ウイルス調節配列駆動ＬａｃＺリポーター遺伝子を含む組換えベクターである（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ９０： ６２６（１９９２））。
【０２６１】
まず、Ｅ１ａおよびＥ１ｂ（ｍｕ１．３−９．４）の代わりにラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列（ＲＳＶ−ＬＴＲ）により駆動されるＳＶ４０初期領域ポリアデニル化シグナルを有するＬａｃＺ遺伝子が５型アデノウイルス（Ａｄ５）ゲノムの左末端から１．３マップ単位（ｍｕ）下流に挿入されている組換えプラスミドｐＡｄ．ＲＳＶβ−ｇａｌを構築した。リポーター遺伝子の後には組換えアデノウイルスの作出のためにアデノウイルスゲノムとの相同組換えを可能とするＡｄ５のｍｕ９．４−１７が続く。組換えアデノウイルスはプラスミドｐＡｄ．ＲＳＶβ−ｇａｌとＡｄ５ ｄＩ３２７、Ａｄ５のＥ−３欠失変異体（Ｔｒｏｕｓｄａｔｅ， Ｍ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｒｎｅａ， １４： ２８０（１９９５））の間でのｉｎ ｖｉｖｏ相同組換えにより構築した。
【０２６２】
要するに、細胞を５μｇの線状ｐＡｄ．ＲＳＶβ−ｇａｌと５μｇのＡｄ５ ＤＮＡ ２．６−１００ｍｕ断片とで同時トランスフェクトした。寒天を重層し、３７℃で１０日間インキュベートした後、組換えアデノウイルスを含むプラークを採取し、核β−ガラクトシダーゼ活性に関してスクリーニングした。Ａｄ．ＲＳＶβ−ｇａｌΔＦベクターは無繊維ビリオンを生じるファイバーが欠損している以外は第一世代ウイルスと同じである。
【０２６３】
これらおよびその他のファイバー発現および無繊維組換えアデノウイルスベクターの例が報告されている（Ｖｏｎ Ｓｅｇｇｅｒｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７３： １６０１（１９９９）； ２０００年１月１４日出願の同時係属米国出願番号０９／４８２，６８２、さらに２０００年１月１４日出願の国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ００／００２６５）ことに留意のこと。
【０２６４】
Ｃ．　アデノウイルス送達ベクター粒子の二官能性分子との複合化
組換えアデノウイルスベクターの二官能性分子との複合化を以下のように行った。ＬａｃＺをコードするＥ１欠失アデノウイルスベクターを、Ｅ１の代わりにＲＳＶ ＬＴＲの制御下で（上記のＡｄ．ＲＳＶ．β−ｇａｌベクター）、アデノウイルスＲＧＤモチーフ当たり２抗体分子の割合でＤＡＶ−ＴＮＦ（ＤＴ分子）または対照ＤＡＶ（Ｄ分子）抗体とともに、ＥＸＥＬ−４００培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｌｅｎｅｘａ， ＫＳ）またはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）のいずれかで室温にて３０分間インキュベートした。
【０２６５】
実施例４
アデノウイルス、遺伝子発現、細胞結合およびインターナリゼーションアッセイＡ．　遺伝子送達および発現アッセイ
次いで、実施例３Ｃの複合体をαｖβ３およびαｖβ５インテグリンを欠損するＭ２１−Ｌ１２ヒトメラノーマ細胞と氷上で６０分間混合した（Ｗｉｃｋｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ７３： ３０９（１９９３））。結合していないウイルスを氷冷ＰＢＳでの洗浄により除去し、回数を変えて細胞を３７℃まで加温した後、組織培養プレートに播種した。Ａｄに媒介される遺伝子導入を感染２４または４８時間後に、これまでに報告されたように、細胞を発色基質として３．５ｍＭのｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を加え、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０含有バッファーで３７℃で６０分間インキュベートすることによってβ−ガラクトシダーゼ活性に関して染色することで調べた（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７２： ２０５５ （１９９８）； Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７０： ４５０２（１９９６））。
【０２６６】
Ｂ．　結合アッセイ
アデノウイルスの細胞への結合を測定するため、５００μｇアリコートのアデノウイルスベクターを１ｍＣｉのＮａ１２５Ｉの入ったＩｏｄｏｇｅｎコート試験管でＩｏｄｏｇｅｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）とともにインキュベートすることにより１２５Ｉ標識した。報告されているように（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３： ２７９８−２８０２）、ゲル濾過によりヨウ素化タンパク質を遊離１２５Ｉから分離した。次いで、Ｍ２１−Ｌ１２細胞に対する放射性標識アデノウイルスの結合をこれまでに報告され（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３： ２７９８−２８０２）かつ本実施例で記載のように定量した。懸濁状態の１０６細胞を１０６ｃｐｍ（ウイルス粒子を通常５×１０６〜８×１０６ｃｐｍ／μｇの比放射能まで標識した）の標識ウイルスタンパク質とともに４℃で２時間インキュベートした。非特異的結合を細胞および標識タンパク質を１００倍過剰の非標識ウイルスまたはファイバータンパク質の存在下でインキュベートすることにより確認した。細胞を氷冷リン酸緩衝生理食塩水で４回洗浄した後、全結合ｃｐｍから非特異的結合を差し引いて特異的結合を算出した。
【０２６７】
Ｃ．　インターナリゼーションアッセイ
ウイルスのエンドサイトーシスを評価するため、細胞を複合化した１２５Ｉ−標識アデノウイルスとＤＡＶ−ＴＮＦまたは対照抗体とともに０．５％精製ウシ血清アルブミン（ＧＳＡ）添加ＤＭＥＭ中、４℃で６０分間インキュベートした。結合していないウイルスを氷冷ＰＢＳでの洗浄により除去した後、回数を変えて細胞を３７℃まで加温した。細胞ペレットの計数前に、インターナライズされたビリオンをトリプシン−ＥＤＴＡとともに室温で５分間インキュベートすることにより除去した。
【０２６８】
実施例５
ＰＩ３Ｋの活性化によりリガンドのインターナリゼーションを促進するレセプターへターゲッティングされた二官能性分子と複合化されたアデノウイルスは、ターゲッティングされたレセプターとの結合を介してインターナライズされる。
【０２６９】
二官能性シグナル伝達抗体の解析
ＤＡＶ−１二官能性シグナル伝達抗体（ＤＴ（ＴＮＦ−αと融合したＤＡＶ−１）、ＤＩ（ＩＧＦ−１と融合したＤＡＶ−１）、およびＤＥ（ＥＧＦと融合したＤＡＶ−１）と呼ぶ）を、タンパク質を分泌する昆虫細胞で発現させ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌアフィニティーカラムで精製した。ＤＴ Ｈ鎖（ＤＨＴ）の見かけの分子量は約７０ｋＤａであり、ＤＡＶ−１ γＨ鎖（５３ｋＤａ）と単量体ＴＮＦ−αリガンド（１７ｋＤａ）を合わせたサイズに一致した。ＤＡＶ−１ κＬ鎖（ＤＬ）の見かけの分子量は組換えＤＴ分子（約２５ｋＤａ）のものと一致した。ウエスタンブロット解析では、抗マウスＩｇＧ抗体によりＤＡＶ−１ ｍＡｂ（Ｄ）およびＤＴ分子が認識されるが、抗ＴＮＦ−αポリクローナル抗体によってはＤＴ分子しか認識されないことが示された。
【０２７０】
ＤＴ分子はＥＬＩＳＡにおいて固定化ペントンベースまたはＡｄ粒子との結合が可能であり、ＴＮＦ−α感受性細胞系、ＭＣＦ−７に対する細胞傷害性を誘導したが、このことはＤＴ二官能性分子がウイルスおよびサイトカインレセプター結合機能を保持することを示している。
【０２７１】
二官能性分子はＡｄを媒介とするαｖインテグリンへの遺伝子送達を促進する
ＲＳＶ駆動ＬａｃＺリポーター遺伝子を含む第一世代アデノウイルスベクターを、ＲＧＤモチーフ当たり２抗体分子の割合でＤＴとともにプレインキュベートした。次いで、この複合体を、αｖインテグリンは発現しない（Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８９： ２０１８−２０２２）が、効率的なウイルス結合を助けることができるＭ２１−Ｌ１２ヒトメラノーマ細胞に加えた（Ｗｉｃｋｈａｍ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃｅｌｌ ７３： ３０９−３１９）。Ｄ単独ではなくＤＴと複合化されたＡｄは、感染４８時間後に導入遺伝子発現により評価されるように、Ａｄを媒介とするＭ２１−Ｌ１２細胞への遺伝子送達を有意に増強している。ＡｄとＤＴとともにインキュベートした細胞の約６０％がβ−ガラクトシダーゼに対して陽性を示したが、これに対し、ウイルス単独またはウイルスとＤとともにインキュベートした細胞では３％未満であった。アデノウイルス単独で３時間感染させた後、ＤＴを加えたＭ２１−Ｌ１２細胞では、感染４８時間後において遺伝子送達の増強がほとんど示されなかったため、ＤＴによる遺伝子送達の増強がＴＮＦレセプター連結の結果として起こるＲＳＶ ＬＴＲ導入遺伝子プロモーターの活性化の高まりによるものではなかった。この結果によって、二官能性分子が細胞侵入に関連する１以上のステップを強化することによりアデノウイルスを媒介とする遺伝子送達を増強することが分かった。
【０２７２】
ＤＴ分子がＡｄ結合およびインターナリゼーションを増強する
以下の実験では、ＤＴによる遺伝子送達の増強がウイルスのＭ２１−Ｌ１２細胞への接着の高まりと関連していることが示された。１２５Ｉ−標識Ａｄ粒子単独またはＤもしくはＤＴ分子との複合体をＭ２１−Ｌ１２細胞への結合について解析した。また、Ｍ２１−Ｌ１２細胞に加える前に、ＤＴ分子と複合化された１２５Ｉ−Ａｄの結合を過剰の組換えＡｄ５ファイバータンパク質、ポリクローナル抗ヒトＴＮＦ−α抗体またはＴＮＦ−α抗体およびファイバータンパク質との組合せの不在または存在下で調べた。Ｍ２１−Ｌ１２細胞に加えて氷上で６０分間インキュベートする前に、１２５Ｉ−標識ＡｄをＤＴまたはＤ分子とともにインキュベートした。結合していないＡｄを洗浄により除去し、回数を変えて細胞を３７℃まで加温してトリプシン処理に対する耐性により評価されるウイルスインターナリゼーションを可能にした。これらの試験の結果から、１２５Ｉ−標識Ａｄ粒子をＤ分子ではなくＤＴとともにプレインキュベートすることによりウイルス結合が約５倍強化されることが分かった。
【０２７３】
結合の上昇を担う分子を調べるため、競合実験を行った。細胞へのＡｄ−ＤＴ結合を５０倍過剰の組換えファイバータンパク質または抗ＴＮＦ−αまたはこれらの分子の組合せの存在下で測定した。組換えファイバーおよび抗ＴＮＦ−α抗体はいずれも、単独では細胞へのＡｄ−ＤＴ結合の２０〜２５％しか遮断できなかった。これに対し、ファイバーと抗ＴＮＦ−αとの組合せによって約７０％の結合が阻害できた。これらの知見は、細胞へのＡｄ−ＤＴ結合がＣＡＲ−ファイバーインターナリゼーションならびにＴＮＦ−α−レセプターの会合によって媒介されることを示す。
【０２７４】
ＤＴ分子はトリプシン消化耐性で評価される１２５Ｉ標識ウイルス粒子のインターナリゼーションを増強する
初期の研究で証明されているように（Ｗｉｃｋｈａｍ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃｅｌｌ ７３： ３０９−３１９）、Ｍ２１−Ｌ１２細胞はαｖインテグリンを発現しないため、これらの細胞によっては比較的低いレベルのアデノウイルスインターナリゼーションが起こる（Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８９： ２０１８−２０２２）。ＤＴ分子はこれらの細胞へのアデノウイルスインターナリゼーションの速度および程度を有意に高めた。これらの知見は、ＤＴ分子がウイルス結合ならびにウイルスインターナリゼーションを促進することにより遺伝子送達を増強することを示す。
【０２７５】
ＤＴによる遺伝子送達の増強はＰＩ３Ｋ活性化と関連する
αｖインテグリンを介した効率的なＡｄインターナリゼーションでは鍵となる細胞シグナル伝達分子であるＰＩ３Ｋの活性化が必要である。ＤＴによる遺伝子送達の増強がＰＩ３キナーゼにより媒介されることを証明する実験を行った。これらの実験では、ＤＴによる遺伝子送達の増強がＰＩ３Ｋとも関係があることを示すため、ＤまたはＤＴ分子と複合化したＡｄ．ＲＳＶ．β−ｇａｌを加える前に、Ｍ２１−Ｌ１２メラノーマ細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤ウォルトマンニン（３０ｎＭ）またはＬＹ２９２００４（２０μＭ）で３０分間前処理した。Ａｄを媒介とする遺伝子送達を感染４８時間後に解析した。これらの結果は、ウォルトマンニンおよびＬＹ２９２００４がＡｄを媒介とする遺伝子送達をそれぞれ約７０％および５０％阻害したことが示され、このことはＰＩ３Ｋ活性がＤＴによる増強または遺伝子送達において主要な役割を果たしていることを示す。
【０２７６】
遺伝子送達の増強におけるＰＩ３Ｋ依存性シグナル伝達の役割をさらに証明するため、そのサイトカイン／増殖因子ドメインがＰＩ３Ｋを活性化することが知られているその他の二官能性分子による、Ａｄを媒介とする遺伝子送達を測定した。ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路（ＤＴ＝ＤＡＶ−１−ＴＮＦ； ＤＥ＝ＤＡＶ１−ＥＧＦ； ＤＩ＝ＤＡＶ−１−ＩＧＦ−１）をターゲッティングする二官能性分子もまたＡｄを媒介とするＭ２１−Ｌ１２細胞への遺伝子送達を高める。ＤＴ、ＤＥおよびＤＩ分子はそれぞれ約３０、１０および５倍遺伝子送達を高めた。これらの分子により増強された遺伝子送達もまたウォルトマンニンでの細胞の前処理により阻害された。これらの知見は、ＰＩ３Ｋの活性化がＡｄによる遺伝子送達を促進することをさらに示している。
【０２７７】
実施例６
増殖因子レセプターを介するターゲッティング送達の例示
二官能性分子が無繊維アデノウイルス粒子による遺伝子送達を可能にする
ＣＡＲと結合できない無繊維アデノウイルスベクターを構築した（実施例３、さらに、例えば、同時係属米国出願番号０９／４８２，６８２および同０９／５６２，９３４参照；また、Ｖｏｎ Ｓｅｇｇｅｒｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３： １６０１−１６０８も参照）。これらの粒子構造は野生型ビリオンのものとほぼ同じである。無繊維粒子単独では、これらの細胞がＣＡＲおよびインテグリンαｖβ５を発現するとしてもＳＷ４８０上皮細胞への導入遺伝子の送達はほとんど示されなかった（Ｖｏｎ Ｓｅｇｇｅｒｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３： １６０１−１６０８）。二官能性分子が無繊維Ａｄベクターによる遺伝子送達を促進することを示すため、ＣＡＲおよびαｖインテグリン発現ＳＷ４８０細胞をウイルス粒子当たり１抗体分子の割合でＤＴ分子と複合化した無繊維アデノウイルスまたは無繊維ウイルスに感染させた。リポーター遺伝子発現を感染４８時間後にβ−ｇａｌ染色により調べた。ＳＷ４８０細胞とともに３７℃で１５分間インキュベートする前に、無繊維ウイルスを二官能性分子とともにインキュベートした。Ａｄが媒介する遺伝子送達を感染４８時間後に調べた。
【０２７８】
これらの結果は、ＤＴ分子が無繊維ウイルスの遺伝子送達を増強したことを示した。ＤＴまたはＤＩ分子と複合化した無繊維粒子は複合化していない無繊維粒子に対し、それぞれ約１０〜１５、３〜５倍の遺伝子送達の増強を示した。これらの知見は、シグナル伝達抗体を介して無繊維粒子を細胞に再ターゲッティングできることを示す。
【０２７９】
本発明は添付の請求項の範囲によってのみ制限されるものであり、改変は当業者には明らかである。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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