(57)【要約】本発明は、細胞、組織、または動物における一以上の代謝関連表現型に対する化合物の影響を測定するための、いくつかのアッセイフォーマットを提供する。アッセイフォーマットは、癌原遺伝子Ｃｂｌが、ベースのグルコース取込み、代謝率、脂肪生成、筋肉熱産生、ミトコンドリアの構造および機能、除脂肪筋肉量対体脂肪比、および食行動を調整することに関与しているという発見に基づいている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における食行動、脂肪沈着、代謝率、または除脂肪筋肉量対体脂肪比を調整することが可能な化合物を同定する方法であって、前記方法が、そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的修飾を含んでいる、遺伝的に修飾された非ヒト動物に関して測定された代謝関連表現型を測定するためのアッセイを行なうことであって、前記遺伝的修飾が、前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止し、かつ前記アッセイは、検査されるべき化合物の存在および非存在下に行なわれること、および、前記表現型に対する前記化合物の効果を測定することであって、変化した表現型は、前記化合物が患者の食行動、脂肪沈着、代謝率、または除脂肪筋肉量対体脂肪比を調整することが可能であることを示すこと、を含む方法。
【請求項２】
代謝関連表現型を測定するためのアッセイが、前記化合物の存在および非存在下に、インスリン受容体のＣｂｌ介在性のユビキチン化を測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記アッセイが：
（ａ）インスリン受容体のｃ−Ｃｂｌ介在性のユビキチン化を果たすことが可能な細胞を提供すること；
（ｂ）該細胞を、検査されるべき化合物の存在および非存在下にインキュベートすること；および
（ｃ）該化合物の存在および非存在下にインスリン受容体のｃ−Ｃｂｌ介在性のユビキチン化を測定することであって、インスリン受容体のｃ−Ｃｂｌ介在性のユビキチン化の変化したレベルが、該化合物が患者における食行動、脂肪沈着、代謝率、または除脂肪筋肉量対体脂肪比を調整することができることを示すこと、
を含む方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記化合物がインスリン受容体のＣｂｌ介在性のユビキチン化を低減または防止し、それにより、前記化合物が患者における食行動を増進することができることを示す方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法であって、前記化合物がインスリン受容体のＣｂｌ介在性のユビキチン化を低減または防止し、それにより、前記化合物が患者における脂肪沈着を低減することができることを示す方法。
【請求項６】
請求項３に記載の方法であって、前記化合物がインスリン受容体のＣｂｌ介在性のユビキチン化を低減または防止し、それにより、前記化合物が患者における代謝率を増大することができることを示す方法。
【請求項７】
請求項３に記載の方法であって、前記化合物がインスリン受容体のＣｂｌ介在性のユビキチン化を低減または防止し、それにより、前記化合物が患者における除脂肪筋肉量対体脂肪比を増大することができることを示す方法。
【請求項８】
請求項３に記載の方法であって、前記化合物がインスリン受容体のＣｂｌ介在性のユビキチン化を増大またはアゴナイズし、それにより、前記化合物が患者における食行動を低減し、および／または、患者における脂肪沈着を増大し、および／または、患者における代謝率を低減し、および／または患者における除脂肪筋肉量対体脂肪比を低減することができることを示す方法。
【請求項９】
請求項３に記載の方法であって、イムノアッセイを行なうことであって、インスリン受容体のｃ−Ｃｂｌ介在性のユビキチン化のレベルが、前記インスリン受容体を、ユビキチンと結合する抗体と、抗原−抗体複合体を形成するに充分な条件下に接触させることによって測定されること、および前記受容体に結合した抗体を検出すること、を含む方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記インスリン受容体を、前記インスリン受容体と結合する抗体と、抗原−抗体複合体を形成するに充分な条件下に接触させることをさらに含む方法。
【請求項１１】
請求項３に記載の方法であって、
（ａ）インスリン受容体のｃ−Ｃｂｌ介在性のユビキチン化を果たすことが可能な細胞を提供すること；
（ｂ）前記細胞を、検査されるべき化合物の存在および非存在下にインキュベートすること；
（ｃ）インスリン受容体を含んでいる細胞の抽出物を、インスリン受容体と結合する抗体と、抗原−抗体複合体を形成するに充分な条件下に接触させ、それによりインスリン受容体を捕捉すること；
（ｄ）捕捉されたインスリン受容体を、ユビキチンと結合する抗体と、抗原−抗体複合体を形成するに充分な条件下に接触させること；および
（ｅ）（ｄ）で結合した抗体を検出すること、
を含むプロセスにより、イムノアッセイ行なうことを含む方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、（ｄ）において結合した抗体が、前記抗体を、検出可能なシグナルを発生することが可能な第三の抗体と接触させることにより検出される方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、代謝関連表現型を測定するためのアッセイが、前記化合物の存在および非存在下に、Ｃｂｌタンパク質上のチロシン残基のリン酸化を測定する方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、代謝関連表現型を測定するためのアッセイが、前記化合物の存在下および非存在下に、前記細胞内のＣｂｌタンパク質の量を測定する方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記アッセイが：
（ａ）ｃ−Ｃｂｌタンパク質を発現することが可能な細胞を提供すること；
（ｂ）該細胞を、検査されるべき化合物の存在および非存在下にインキュベートすること；および
（ｃ）該化合物の存在および非存在下に細胞内のｃ−Ｃｂｌタンパク質の量を測定することであって、ｃ−Ｃｂｌタンパク質の変化したレベルが、該化合物が患者における食行動、脂肪沈着、代謝率、または除脂肪筋肉量対体脂肪比を調整することができることを示すこと、
を含む方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記化合物が、細胞における低減されたＣｂｌタンパク質の量によって測定されるような、Ｃｂｌの発現を低減または阻害しており、それにより、前記化合物が患者における食行動を増大することができることを示す方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法であって、前記化合物が、細胞における低減されたＣｂｌタンパク質の量によって測定されるような、Ｃｂｌの発現を低減または阻害しており、それにより、前記化合物が患者における脂肪沈着を低減することができることを示す方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載の方法であって、前記化合物が、細胞における低減されたＣｂｌタンパク質の量によって測定されるような、Ｃｂｌの発現を低減または阻害しており、それにより、前記化合物が患者における代謝率を増大することができることを示す方法。
【請求項１９】
請求項１５に記載の方法であって、前記化合物が、細胞における低減されたＣｂｌタンパク質の量によって測定されるような、Ｃｂｌの発現を低減または阻害しており、それにより、前記化合物が患者における除脂肪筋肉量対体脂肪比を増大することができることを示す方法。
【請求項２０】
請求項１５に記載の方法であって、前記化合物が、細胞における増大されたＣｂｌタンパク質の量によって測定されるような、Ｃｂｌの発現を増大またはアゴナイズしており、それにより、前記化合物が患者における食行動を低減し、および／または、患者における脂肪沈着を増大し、および／または、患者における代謝率を低減し、および／または患者における除脂肪筋肉量対体脂肪比を低減することができることを示す方法。
【請求項２１】
請求項１５に記載の方法であって、イムノアッセイを行なうことであって、ｃ−Ｃｂｌの量が、前記Ｃｂｌタンパク質を、Ｃｂｌに結合する抗体と、抗原−抗体複合体を形成するに充分な条件下に接触させることにより測定されること、および、Ｃｂｌタンパク質に結合した抗体を検出すること、を含む方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、Ｃｂｌタンパク質に結合した抗体が、前記抗体を検出可能なシグナルを発生することが可能な第二の抗体と接触させることにより検出される方法。
【請求項２３】
請求項１５に記載の方法であって、イムノアッセイを行なうことであって、ｃ−Ｃｂｌの量が、前記Ｃｂｌタンパク質を、各々Ｃｂｌに結合する第一の抗体および第二の抗体と、抗原−抗体複合体を形成するに充分な条件下に接触させることにより測定されること、および、Ｃｂｌタンパク質に結合した抗体を検出すること、を含む方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、Ｃｂｌタンパク質に結合した抗体が、前記抗体を検出可能なシグナルを発生することが可能な第二の抗体と接触させることにより検出される方法。
【請求項２５】
請求項２３に記載の方法であって、第一および第二の抗体がＣｂｌタンパク質の異なるエピトープと結合する方法。
【請求項２６】
請求項１５に記載の方法であって：
（ａ）ｃ−Ｃｂｌタンパク質を発現することが可能な細胞を提供すること；
（ｂ）該細胞を、検査されるべき化合物の存在および非存在下にインキュベートすること；および
（ｃ）Ｃｂｌタンパク質を含んでいる細胞の抽出物を、Ｃｂｌタンパク質と結合する抗体と、抗原−抗体複合体を形成するに充分な条件下に接触させ、それによりＣｂｌタンパク質を捕捉すること；および
（ｄ）（ｅ）で結合した抗体を検出すること、
を含むプロセスにより、イムノアッセイを行なうことを含む方法。
【請求項２７】
請求項１５に記載の方法であって：
（ａ）ｃ−Ｃｂｌタンパク質を発現することが可能な細胞を提供すること；
（ｂ）該細胞を、検査されるべき化合物の存在および非存在下にインキュベートすること；
（ｃ）Ｃｂｌタンパク質を含んでいる細胞の抽出物を、Ｃｂｌタンパク質と結合する抗体と、抗原−抗体複合体を形成するに充分な条件下に接触させ、それによりＣｂｌタンパク質を捕捉すること；
（ｄ）捕捉されたＣｂｌタンパク質を、Ｃｂｌタンパク質と結合する抗体と、抗原−抗体複合体を形成するに充分な条件下に接触させることであって、前記抗体は、（ｃ）の抗体に対し、Ｃｂｌ上の異なるエピトープに結合しており、；および
（ｅ）（ｄ）で結合した抗体を検出すること、
を含むプロセスによりイムノアッセイを行なうことを含む方法。
【請求項２８】
請求項２６または２７に記載の方法であって、前記抗体が、検出可能なシグナルを発生することができる抗体との接触により検出される方法。
【請求項２９】
請求項１に記載の方法であって、代謝関連表現型を測定するためのアッセイが、前記化合物の存在および非存在下における細胞内のＣｂｌ介在性の脂肪および／またはグルコース代謝を測定する方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、代謝関連表現型を測定するためのアッセイが、前記化合物の存在および非存在下に、脂肪量、グルコース輸送、筋肉熱産生、ミトコンドリア構造、ミトコンドリア機能、およびミトコンドリア呼吸率からなる群より選ばれる表現型を測定する方法。
【請求項３１】
請求項２９または３０に記載の方法であって、前記アッセイが、前記化合物の存在または非存在下に、細胞における筋肉熱産生を測定する方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、前記化合物の存在または非存在下における筋肉熱産生が、細胞のプロトンリークカイネティクスを前記化合物の存在または非存在下に測定することを含むプロセスによって測定される方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法であって：
（ａ）ｃ−Ｃｂｌタンパク質を発現することが可能な、筋原細胞系列の細胞を提供すること；
（ｂ）該細胞を、検査されるべき化合物の存在および非存在下にインキュベートすること；および
（ｃ）該化合物の存在および非存在下に、細胞の呼吸率および／または膜電位を測定することであって、変化した呼吸率および／または膜電位が、該化合物が患者における食行動、脂肪沈着、代謝率、または除脂肪筋肉量対体脂肪比を調整することができることを示していること、
を含む方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、前記化合物が細胞の呼吸率および／または膜電位を増大し、それにより前記化合物が、患者における食行動を増進することができることを示す方法。
【請求項３５】
請求項３３に記載の方法であって、前記化合物が細胞の呼吸率および／または膜電位を増大し、それにより前記化合物が、患者における脂肪沈着を低減することができることを示す方法。
【請求項３６】
請求項３３に記載の方法であって、前記化合物が細胞の呼吸率および／または膜電位を増大し、それにより前記化合物が、患者における代謝率を増大することができることを示す方法。
【請求項３７】
請求項３３に記載の方法であって、前記化合物が細胞の呼吸率および／または膜電位を増大し、それにより前記化合物が、患者における除脂肪筋肉量対体脂肪比を増大することができることを示す方法。
【請求項３８】
請求項３３に記載の方法であって、前記化合物が細胞の呼吸率および／または膜電位を低減または阻害し、それにより前記化合物が患者における食行動を低減し、および／または、患者における脂肪沈着を増大し、および／または、患者における代謝率を低減し、および／または患者における除脂肪筋肉量対体脂肪比を低減することができることを示す方法。
【請求項３９】
請求項２９または３０に記載の方法であって、前記アッセイが：
（ａ）検査されるべき化合物を、機能性のＣｂｌタンパク質を発現する動物患者に与えること；および
（ｂ）該動物の細胞または組織中の代謝関連表現型を測定することであって、該化合物の存在下に変化した表現型が、該化合物が患者における食行動、脂肪沈着、代謝率、または除脂肪筋肉量対体脂肪比を調整することができることを示していること、
を含む方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法であって、前記代謝関連表現型が、脂肪量、グルコース輸送、筋肉熱産生、ミトコンドリア構造、ミトコンドリア機能、およびミトコンドリア呼吸率からなる群より選ばれる方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法であって、前記代謝関連表現型が、筋肉熱産生である方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の方法であって、前記化合物の存在下での筋肉熱産生が、動物の細胞または組織のプロトンリークカイネティクスを測定することを含む方法。
【請求項４３】
請求項４１または４２に記載の方法であって、筋肉熱産生が、動物からの細胞の呼吸率および／または膜電位を測定することによって求められ、変化した呼吸率および／または膜電位が、該化合物が患者における食行動、脂肪沈着、代謝率、または除脂肪筋肉量対体脂肪比を調整することができることを示す方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法であって、前記化合物が細胞の呼吸率および／または膜電位を増大し、それにより、前記化合物が患者における食行動を増進することができることを示す方法。
【請求項４５】
請求項４３に記載の方法であって、前記化合物が細胞の呼吸率および／または膜電位を増大し、それにより、前記化合物が患者における脂肪沈着を低減することができることを示す方法。
【請求項４６】
請求項４３に記載の方法であって、前記化合物が細胞の呼吸率および／または膜電位を増大し、それにより、前記化合物が患者における代謝率を増大することができることを示す方法。
【請求項４７】
請求項４３に記載の方法であって、前記化合物が細胞の呼吸率および／または膜電位を増大し、それにより、前記化合物が患者における除脂肪筋肉量対体脂肪比を増大することができることを示す方法。
【請求項４８】
請求項４３に記載の方法であって、前記化合物が細胞の呼吸率および／または膜電位を低減または阻害し、それにより前記化合物が患者における食行動を低減し、および／または、患者における脂肪沈着を増大し、および／または、患者における代謝率を低減し、および／または患者における除脂肪筋肉量対体脂肪比を低減することができることを示す方法。
【請求項４９】
前記動物患者が、非ヒト動物患者である。請求項３９に記載の方法。
【請求項５０】
前記非ヒト動物患者が、内在性の天然のＣｂｌタンパク質を発現する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記非ヒト動物患者が、導入されたヒトＣｂｌタンパク質を発現する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記非ヒト動物が哺乳類である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記哺乳類が、げっ歯類、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、およびヤギからなる群より選ばれる、請求項５２の方法。
【請求項５４】
前記げっ歯類が、ウサギ、ラット、モルモット、およびマウスからなる群より選ばれる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記げっ歯類がマウスである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記化合物が、動物患者の筋肉組織へ投与される、請求項３９に記載の方法。
【請求項５７】
前記代謝関連表現型が、動物患者の筋肉組織において測定される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
請求項１に記載の方法であって、代謝関連表現型に対する前記化合物の効果を、そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的修飾を含んでいる遺伝的に修飾された非ヒト動物に関する代謝関連表現型に対して比較することを含んでおり、前記遺伝的修飾が、前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており、前記化合物の、前記遺伝的に修飾された非ヒト動物の表現型を模するかまたは再生する能力が、前記化合物が患者における食行動を増大し、および／または、脂肪沈着を低減し、および／または、代謝率を増大し、および／または除脂肪筋肉量対体脂肪比を増大することができることを示す方法。
【請求項５９】
請求項１に記載の方法であって、代謝関連表現型に対する前記化合物の効果を、機能性Ｃｂｌタンパク質を発現する非ヒト動物に関する代謝関連表現型に対して比較することを含んでおり、前記化合物の、前記非ヒト動物の表現型を模するかまたは再生する能力が、前記化合物が患者における食行動を低減し、および／または、脂肪沈着を増大し、および／または、代謝率を低減し、および／または除脂肪筋肉量対体脂肪比を低減することができることを示す方法。
【請求項６０】
食行動を抑制または低減する化合物を同定する方法であって：
（ａ）そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的な修飾を含んでいる遺伝的に修飾された非ヒト動物へ化合物を投与することであって、前記遺伝的な修飾が前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており；
（ｂ）前記動物の食行動を測定することであって、前記化合物が投与されていないＣｂｌ欠損動物の食欲または食事摂取量に比較して、低減された前記動物の食欲または食事摂取量が、前記化合物が食行動を抑制または低減することを示していること、
を含む方法。
【請求項６１】
食行動を抑制または低減する化合物を同定する方法であって、前記方法が、前記化合物の存在および非存在下に、Ｃｂｌタンパク質のユビキチンリガーゼ活性を測定することを含んでおり、前記化合物の存在下に増大されたＣｂｌタンパク質のユビキチンリガーゼ活性が、前記化合物が食行動を抑制または低減することを示す方法。
【請求項６２】
食行動を抑制または低減する化合物を同定する方法であって、前記方法が、前記化合物の存在および非存在下に、Ｃｂｌタンパク質のチロシンリン酸化のレベルを測定することを含んでおり、前記化合物の存在下に増大されたＣｂｌタンパク質におけるチロシン残基の増大されたリン酸化が、前記化合物が食行動を抑制または低減することを示す方法。
【請求項６３】
食行動を増大する化合物を同定する方法であって：
（ａ）そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的な修飾を含んでいる遺伝的に修飾された非ヒト動物へ食欲または食事摂取量を抑制する化合物を投与することであって、前記遺伝的な修飾が前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており、さらに、前記動物の食行動を測定すること；
（ｂ）前記化合物を前記動物へ投与して前記動物の食行動を測定することであって、（ａ）に比較して増大された（ｂ）における食欲または食事摂取量が、前記化合物が食行動を増進することを示していること、
を含む方法。
【請求項６４】
食行動を増大する化合物を同定する方法であって、前記化合物の存在および非存在下に、Ｃｂｌタンパク質のユビキチンリガーゼ活性を測定することを含んでおり、前記化合物の存在下にＣｂｌタンパク質の低減されたユビキチンリガーゼ活性が、前記化合物が食行動を増進することを示す方法。
【請求項６５】
食行動を増大する化合物を同定する方法であって、前記化合物の存在および非存在下に、Ｃｂｌタンパク質のチロシンリン酸化のレベルを測定することを含んでおり、前記化合物の存在下にＣｂｌタンパク質におけるチロシン残基の低減されたリン酸化が、前記化合物が食行動を増進することを示す方法。
【請求項６６】
食行動を調整する化合物を同定する方法であって：
（ａ）機能性のＣｂｌタンパク質を発現している非ヒト動物へ化合物を投与すること、および前記動物の食行動を測定すること；
（ｂ）そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的な修飾を含んでいる遺伝的に修飾された非ヒト動物の食行動を測定することであって、前記遺伝的な修飾が前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており；さらに、
（ｃ）前記動物の食行動を（ａ）および（ｂ）において比較することであって、（ａ）および（ｂ）の間における同等の食行動が、前記化合物が食行動を調整することを示すこと、
を含む方法。
【請求項６７】
食行動を調整する化合物を同定する方法であって、前記化合物の存在および非存在下に、Ｃｂｌタンパク質のユビキチンリガーゼ活性を測定することを含んでおり、前記化合物の存在下おけるＣｂｌタンパク質の変化したユビキチンリガーゼ活性が、前記化合物が食行動を増進することを示す方法。
【請求項６８】
食行動を調整する化合物を同定する方法であって、前記化合物の存在および非存在下に、Ｃｂｌタンパク質のチロシンリン酸化のレベルを測定することを含んでおり、前記化合物の存在下におけるＣｂｌタンパク質のチロシン残基の変化したリン酸化が、前記化合物が食行動を調整することを示す方法。
【請求項６９】
脂肪沈着を増大するか、除脂肪筋肉量を低減するか、体脂肪対筋肉比を増大するか、または代謝率を低減する化合物を同定する方法であって：
（ａ）そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的な修飾を含んでいる遺伝的に修飾された非ヒト動物へ化合物を投与することであって、前記遺伝的な修飾が前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており；
（ｂ）前記動物の脂肪含有量を測定することであって、前記化合物が投与されていないＣｂｌ欠損動物の脂肪含有量に比較して、増大された前記動物の脂肪含有量が、前記化合物が脂肪沈着を増大するか、除脂肪筋肉量を低減するか、体脂肪対筋肉比を増大するか、または代謝率を低減することを示していること、
を含む方法。
【請求項７０】
脂肪沈着を増大するか、除脂肪筋肉量を低減するか、体脂肪対筋肉比を増大するか、または代謝率を低減する化合物を同定する方法であって、前記化合物の存在および非存在下にＣｂｌタンパク質のユビキチンリガーゼ活性を測定することを含んでおり、前記化合物の存在下におけるＣｂｌタンパク質の増大されたユビキチンリガーゼ活性が、前記化合物が、脂肪沈着を増大するか、除脂肪筋肉量を低減するか、体脂肪対筋肉比を増大するか、または代謝率を低減することを示している方法。
【請求項７１】
脂肪沈着を増大するか、除脂肪筋肉量を低減するか、体脂肪対筋肉比を増大するか、または代謝率を低減する化合物を同定する方法であって、前記化合物の存在および非存在下にＣｂｌタンパク質のチロシンリン酸化のレベルを測定することを含んでおり、前記化合物の存在下におけるＣｂｌタンパク質のチロシン残基の増大されたリン酸化が、前記化合物が、脂肪沈着を増大するか、除脂肪筋肉量を低減するか、体脂肪対筋肉比を増大するか、または代謝率を低減することを示している方法。
【請求項７２】
脂肪沈着を低減するか、除脂肪筋肉量を増大するか、体脂肪対筋肉比を低減するか、または代謝率を増大する化合物を同定する方法であって：
（ａ）そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的な修飾を含んでいる遺伝的に修飾された非ヒト動物へ、脂肪沈着またはグルコース取込みを増大する化合物を投与することであって、前記遺伝的な修飾が前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており、さらに前記動物の脂肪含有量を測定すること；および
（ｂ）前記動物へ化合物を投与すること、および前記動物の脂肪含有量を測定することであって、（ａ）に比べて（ｂ）における同等かまたは低減された脂肪含有量が、前記化合物が脂肪沈着を低減するか、除脂肪筋肉量を増大するか、体脂肪対筋肉比を低減するか、または代謝率を増大ことを示していること、
を含む方法。
【請求項７３】
脂肪沈着を低減するか、除脂肪筋肉量を増大するか、体脂肪対筋肉比を低減するか、または代謝率を増大する化合物を同定する方法であって：
（ａ）機能性のＣｂｌタンパク質を発現している非ヒト動物へ化合物を投与すること、および前記動物の脂肪含有量を測定すること；
（ｂ）そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的な修飾を含んでいる遺伝的に修飾された非ヒト動物の脂肪含有量を測定することであって、前記遺伝的な修飾が前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており；さらに、
（ｃ）前記動物の脂肪含有量を（ａ）および（ｂ）において比較することであって、（ａ）および（ｂ）の間における同等の脂肪含有量が、前記化合物が脂肪沈着を低減するか、除脂肪筋肉量を増大するか、体脂肪対筋肉比を低減するか、または代謝率を増大することを示すこと、
を含む方法。
【請求項７４】
脂肪沈着を低減するか、除脂肪筋肉量を増大するか、体脂肪対筋肉比を低減するか、または代謝率を増大する化合物を同定する方法であって、前記化合物の存在および非存在下にＣｂｌタンパク質のユビキチンリガーゼ活性を測定することを含んでおり、前記化合物の存在下におけるＣｂｌタンパク質の低減されたユビキチンリガーゼ活性が、前記化合物が、脂肪沈着を低減するか、除脂肪筋肉量を増大するか、体脂肪対筋肉比を低減するか、または代謝率を増大することを示している方法。
【請求項７５】
脂肪沈着を低減するか、除脂肪筋肉量を増大するか、体脂肪対筋肉比を低減するか、または代謝率を増大する化合物を同定する方法であって、前記化合物の存在および非存在下にＣｂｌタンパク質のチロシンリン酸化のレベルを測定することを含んでおり、前記化合物の存在下におけるＣｂｌタンパク質のチロシン残基の低減されたリン酸化が、前記化合物が、脂肪沈着を低減するか、除脂肪筋肉量を増大するか、体脂肪対筋肉比を低減するか、または代謝率を増大することを示している方法。
【請求項７６】
グルコース取込みを増大する化合物を同定する方法であって：
（ａ）そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的な修飾を含んでいる遺伝的に修飾された非ヒト動物へ、化合物を投与することであって、前記遺伝的な修飾が前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており；および
（ｂ）前記動物の肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを測定することであって、前記化合物がそれへ投与されていないＣｂｌ欠損動物の、肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みに比較して増大された取込みが、前記化合物がグルコース取込みを増大することを示すこと、
を含む方法。
【請求項７７】
グルコース取込みを増大する化合物を同定する方法であって、前記化合物の存在および非存在下にＣｂｌタンパク質のユビキチンリガーゼ活性を測定することを含んでおり、前記化合物の存在下におけるＣｂｌタンパク質の低減されたユビキチンリガーゼ活性が、前記化合物が、脂肪沈着を低減するか、グルコース取込みを増大することを示している方法。
【請求項７８】
グルコース取込みを増大する化合物を同定する方法であって、前記化合物の存在および非存在下にＣｂｌタンパク質のチロシンリン酸化のレベルを測定することを含んでおり、前記化合物の存在下におけるＣｂｌタンパク質のチロシン残基の低減されたリン酸化が、前記化合物が、グルコース取込みを増大することを示している方法。
【請求項７９】
肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込み低減する化合物を同定する方法であって、
（ａ）そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的な修飾を含んでいる遺伝的に修飾された非ヒト動物へ、グルコース取込みを増大する化合物を投与することであって、前記遺伝的な修飾が前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており、さらに肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを測定すること；および
（ｂ）前記動物へ化合物を投与すること、および、前記動物の肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを測定することであって、（ａ）に比較して（ｂ）における同等かまたは低減された取込みが、前記化合物が、肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを低減することを示すこと、
を含む方法。
【請求項８０】
肝臓、脂肪、または筋肉細胞へグルコース取込を低減する化合物を同定する方法であって：
（ａ）機能性のＣｂｌタンパク質を発現している非ヒト動物へ化合物を投与すること、および前記動物の肝臓、脂肪、または筋肉細胞へグルコース取込みを測定すること；
（ｂ）そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的な修飾を含んでいる遺伝的に修飾された非ヒト動物の、肝臓、脂肪、または筋肉細胞へグルコース取込みを測定することであって、前記遺伝的な修飾が前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており；さらに
（ｃ）前記動物の肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを（ａ）および（ｂ）の間で比較することであって、（ａ）および（ｂ）の間の同等の取込みが、前記化合物が肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを低減することを示すこと、
を含む方法。
【請求項８１】
グルコース取込みを低減する化合物を同定する方法であって、前記化合物の存在および非存在下にＣｂｌタンパク質のユビキチンリガーゼ活性を測定することを含んでおり、前記化合物の存在下におけるＣｂｌタンパク質の増大されたユビキチンリガーゼ活性が、前記化合物が、グルコース取込みを低減することを示している方法。
【請求項８２】
グルコース取込みを低減する化合物を同定する方法であって、前記化合物の存在および非存在下にＣｂｌタンパク質のチロシンリン酸化のレベルを測定することを含んでおり、前記化合物の存在下におけるＣｂｌタンパク質のチロシン残基の増大されたリン酸化が、前記化合物が、グルコース取込みを低減することを示している方法。
【請求項８３】
検査される前記化合物がタンパク質である、請求項１〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記タンパク質がＣｂｌの優性ネガティブ突然変異体である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記Ｃｂｌの優性ネガティブ突然変異体が、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８、および配列番号２６０からなる群より選らばれるアミノ酸配列を含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８４】
検査される前記化合物が核酸である、請求項１〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記核酸が、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡを含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記核酸が、配列番号４〜２３９のいずれか一つに示されたヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
検査される前記化合物が有機低分子である、請求項１〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記化合物が、Ｃｂｌタンパク質と結合する抗体である、請求項１〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
同定された化合物を、非ヒト動物またはヒトへの投与のため、製剤することをさらに含む、請求項１〜８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記化合物を、産生するかまたは合成することをさらに含む、請求項１〜８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
患者における食行動、脂肪沈着、代謝率、または除脂肪筋肉量対体脂肪比を調整する化合物を同定または測定するためのプロセスであって：
（ａ）請求項１〜９０のいずれか１項に記載の方法を行なうこと；
（ｂ）任意に、前記化合物の構造を測定すること；および
（ｃ）前記化合物か、または前記化合物の名前若しくは構造を提供すること、
を含むプロセス。
【請求項９２】
前記化合物名または構造が、紙形式、機械読み取り可能形式、またはコンピュータ読み取り可能形式において提供される、請求項９１に記載のプロセス。
【請求項９３】
前記化合物構造が既知である、請求項９０または９１に記載のプロセス。
【請求項９４】
前記化合物、または化合物の名前若しくは構造が、その使用に関する指示とともに提供される、請求項９０〜９２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項９５】
患者における食行動、脂肪沈着、代謝率、または除脂肪筋肉量対体脂肪比を調整する化合物を製造するためのプロセスであって：
（ａ）請求項１〜９０のいずれか１項に記載の方法を行ない、それにより化合物を同定または測定すること；
（ｂ）任意に、前記化合物またはモジュレーターの構造を測定すること；
（ｃ）任意に、前記化合物またはモジュレーターの名前または構造を提供すること；および、
（ｄ）前記化合物またはモジュレーターを製造すること、
を含むプロセス。
【請求項９６】
前記化合物名または構造が、紙形式、機械読み取り可能形式、またはコンピュータ読み取り可能形式において提供される、請求項９５に記載のプロセス。
【請求項９７】
前記化合物、または化合物の名前若しくは構造が、その使用に関する指示とともに提供される、請求項９５または９６に記載のプロセス。
【請求項９８】
前記化合物を、適当な希釈剤または賦形剤中に製剤することをさらに含む、請求項９７に記載のプロセス。
【請求項９９】
配列番号４〜２３９のいずれか一つに示されたヌクレオチド配列を含む、単離されたｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの、細胞、組織、または動物患者における代謝関連表現型を調整するための使用。
【請求項１００】
配列番号２４７、２４９、２５２、２５３、２５５、２５７、または２５９のいずれか一つに示されたヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子の、細胞、組織、または動物患者において代謝関連表現型を調整することができる優性ネガティブ阻害剤分子を製造するための使用。
【請求項１０１】
代謝関連表現型に対する調節が、
（ａ）インスリン受容体のＣｂｌ介在性のユビキチン化の阻害または低減；
（ｂ）Ｃｂｌタンパク質レベルの阻害または低減；および
（ｃ）増大された筋肉熱産生、
からなる群より選ばれる、請求項９９または１００に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的には、ヒトおよび他の動物における、たとえば、糖尿病、肥満症、食欲不振症、または大食症といった、摂食障害およびグルコース取込みまたは代謝の障害の治療に関する。さらに具体的には、本発明は脂肪組織を（たとえば、糖尿病、肥満症、または低脂血症の治療に関連して）、および／または摂食行動を（たとえば、過食症、大食症、または食欲不振症の治療に関連して）修正する方法を提供する。本発明はまた、本文に記述された治療法において有用な、たとえば非ヒト動物モデルを用いた、グルコース取込みまたは代謝のモジュレーターを同定する方法にも関係する。
【背景技術】
【０００２】
１．全般
本明細書は、本文においてクレームの後に呈示された、ＰａｔｅｎｔＩｎ  バージョン３．１を用いて作成されたヌクレオチドおよびアミノ酸配列情報を含む。各ヌクレオチド配列は、数字表示＜２１０＞とそれに続く配列識別子（たとえば、＜２１０＞１、＜２１０＞２、＜２１３＞など）によってリストされた配列において同定される。配列の長さおよびタイプ（ＤＮＡ、タンパク質（ＰＲＴ）など）、および各ヌクレオチド配列の供給源生物は、数字表示欄＜２１１＞、＜２１２＞、および＜２１３＞に各々与えられた情報により同定される。明細書において参照されるヌクレオチド配列は、「配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）」とそれに続く配列識別子により定義される（たとえば、配列番号１は、＜４００＞１のように指定された配列表中の配列を指す）。
【０００３】
本文において参照されるヌクレオチド残基の名称は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（Biochemical Nomenclature Commission）により推奨されたものであり、Ａはアデニンを表し、Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表し、Ｔはチミンを表し、Ｙはピリミジン残基を表し、Ｒはプリン残基を表し、Ｍはアデニンまたはシトシンを表し、Ｋはグアニンまたはチミンを表し、Ｓはグアニンまたはシトシンを表し、Ｗはアデニンまたはチミンを表し、Ｈはグアニン以外のヌクレオチドを表し、Ｂはアデニン以外のヌクレオチドを表し、Ｖはチミン以外のヌクレオチドを表し、Ｄはシトシン以外のヌクレオチドを表し、Ｎは任意のヌクレオチド残基を表す。
【０００４】
本文において使用されるように、用語「に由来する」は、ある特定のものが特定の供給源から得られうるが必ずしもその供給源から直接でなくてもよいことを示す、と解釈されるものとする。
【０００５】
任意の一つの態様について本文に記述された本発明の態様は、本文に記述された本発明の任意の他の態様へ準用されるものとする。
【０００６】
本明細書の全体にわたり、特に他を必要とする状況がない限り、用語「含む（comprise）」あるいは、「含む（comprises）」または「含んでいる（comprising）」といった変形物（バリエーション）は、述べられた段階または要素またはもの、あるいは段階または要素またはものの群の包含を意味するが、何ら他の段階または要素またはもの、あるいは段階または要素またはものの群の排除を意味するものではないことが理解されよう。
【０００７】
当業者には、本文に記述された本発明が、明確に記述されたもの以外の変形および変更が可能であることが理解されよう。本発明がかかる変形および変更のすべてを包含することが理解されるべきである。本発明はまた、本明細書において言及されるかまたは示されたすべての段階、特徴、組成物、および化合物を、個別的または集合的に、また前記段階または特徴の任意およびすべての組合せか、または任意の二以上を包含する。
【０００８】
本発明は、本文に記述された特定の態様によって範囲が限定されるべきではなく、それらは説明のみの目的のために意図されたものである。機能上同等な生成物、組成物、および方法は、明らかに、本文に記述されたような本発明の範囲内にある。
【０００９】
本発明は、他に示さない限り、分子生物学、微生物学、ウイルス学、組換えＤＮＡ技術、溶液中でのペプチド合成、固相ペプチド合成、および免疫学の通常の技術を用いて、必要過度の実験なしに実行される。かかる手法は、たとえば、参照により取入れられる以下のテキストに記述されている：
１．  サムブルック（Sambrook）、フリッチ（Fritsch）、マニアティス（Maniatis）著、「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ（Cold Spring Harbor Laboratories）、ニューヨーク、１９８９年、全第Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ巻；
２．  グローバー（D. N. Glover）編、「ＤＮＡクローニング：ア・プラクティカル・アプローチ（DNA Cloning: A Practical Approach）」、ＩＲＬプレス、オックスフォード、１９８５年、第ＩおよびＩＩ巻、全文；
３．  ゲイト（M. J. Gait）編、「オリゴヌクレオチド・シンセシス：ア・プラクティカル・アプローチ（Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach）」、ＩＲＬプレス、オックスフォード、１９８４年、全文、およびその中の特にゲイト、ｐ．１〜２２；アトキンソン（Atkinson）ら、ｐ．３５〜８１；スプロート（Sproat）ら、ｐ．８３〜１１５；ウー（Wu）ら、ｐ．１３５〜１５１、による論文；
４．  ハメス（B. D. Hames）＆ヒギンス（S. J. Higgins）共編、「ヌクレイック・アシド・ハブリダイゼーション：ア・プラクティカル・アプローチ（Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach）」、ＩＲＬプレス、オックスフォード、１９８５年、全文；
５．  ジョン Ｒ．Ｗ．マスターズ（John R. W. Masters）編、「アニマル・セル・カルチャー：プラクティカル・アプローチ（Animal Cell Culture: Practical Approach）」、第３版、ＩＳＢＮ  ０１９９６３７９７０、２０００年、全文；
６．「イモービライズド・セルズ・アンド・エンザイムズ：ア・プラクティカル・アプローチ（Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach）」、ＩＲＬプレス、オックスフォード、１９８６年、全文；
７．  パーバル（Perbal, B）著、「ア・プラクティカル・ガイド・トゥ・モレキュラー・クローニング（A practical Guide to Molecular Cloning）」、１９８４年；
８．  「メソッド・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）」、コロウィック（S. Colowich）＆カプラン（N. Kaplan）共編、アカデミック・プレス・インク（Academic Press, Inc.）、全文；
９．  ラマロ・オルティガオ（J. F. Ramalho Ortigao）著、「ザ・ケミストリー・オブ・ペプチド・シンセシス（The Chemistry of Peptide Synthesis）」、ノリッジ・データベース・オブ・アクセス・トゥ・バーチャル・ラボラトリー・ウェブサイト（Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website）」（インテラクティバ（Interactiva）、ドイツ）；
１０．  サカキバラ（Sakakibara, D.）、タイクマン（Teichman, J.）、リエン（Lien, E.）、ランド・フェニケル（Land Fenichel, R. L.）著、「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochem. Biophys. Res. Commun.）」、１９７６年、第７３巻、ｐ．３３６〜３４２；
１１．  メリフィールド（Merrifield, R. B.）著、「ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（J. Am. Chem. Soc.）」、１９６３年、第８５巻、ｐ．２１４９〜２１５４；
１２．  バラニー（Barany, G.）＆メリフィールド（Merrifield, R. B.）共著、「ザ・ペプタイズ（The Peptides）」、グロス（Gross）およびマイエンホッファー（Meienhofer）共編、アカデミック・プレス、ニューヨーク１９７９年、第２巻、ｐ．１〜２８４；
１３．  ビュンシェ（Wunsch, E）編、「シンテーゼ・フォン・ペプチデン（Synthese von Peptiden）、フーベン−ヴァイルズ・メトデン・デア・オルガニッシェン・ケミー（Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie）（ミュラー（Muler, E.）編、における）、第４版、第１および２部、ティーマ（Thieme）、シュツットガルト、１９７４年、第１５巻；
１４．  ボダンツキー（Bodanszky, M.）著、「プリンシプルズ・オブ・ペプチド・シンセシス（Principles of Peptide Synthesis）」、スプリンガー・ヴァーラグ（Springer-Verlag）、ハイデルベルク、１９８４年；
１５．  ボダンツキー（Bodanszky, M.）＆ボダンツキー（Bodanszky, A.）共著、「ザ・プラクティス・オブ・ペプチド・シンセシス（The Practice of Peptide Synthesis）」、スプリンガー・ヴァーラグ（Springer-Verlag）、ハイデルベルク、１９８４年；
１６．  ボダンツキー（Bodanszky, M.）著、「インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプチド・アンド・プロテイン・リサーチ（International Journal of Peptide and Protein Research）」１９８５年、第２５巻、ｐ．４４９〜４７４；
１７．  ウィア（D. M. Weir）＆ブラックウェル（C. C. Blackwell）共編、「ハンドブック・オブ・エクスペリメンタル・イムノロジー（Handbook of Experimental Immunology）」、ブラックウェル・サイエンティフィック・パブリケーションズ（Blackwell Scientific Publications）、１９８６年、第Ｉ−ＩＶ巻。
【００１０】
２．関連技術の記載
ｃ−Ｃｂｌタンパク質はマルチアダプタータンパク質であり、受容体チロシンキナーゼのリガンド誘導性のダウンレギュレーションに関係する。ｃ−Ｃｂｌとその多くの結合相手との間の相互作用には、特定のｃ−Ｃｂｌタンパク質ドメインが関係する。すべてのＣｂｌタンパク質は、そのチロシンキナーゼ結合性の、リンカーおよびＲＩＮＧフィンガードメインとの間に、高度な配列相同性があり、ほとんどがそのカルボキシ末端側の半分に広範囲のプロリンに富む領域を有する。チロシンキナーゼ結合性ドメインは、４本へリックスバンドル、Ｃａ2+−結合性ＥＦハンド、および、短いリンカードメインによりＲＩＮＧフィンガーへ結合される異型または変異体のＳｒｃホモロジー領域２（ＳＨ２）ドメインを含む、三つの相互作用ドメインからなる。ｃ−Ｃｂｌ、Ｃｂｌ−ｂ、およびＤ−Ｃｂｌのカルボキシル末端のユビキチン結合（ＵＢＡ）／ＬＺドメインは、既知のユビキチン結合ドメインおよびロイシン・ジッパーと相同性を有しており、かつＣｂｌ介在性の活性受容体のユビキチン化に関与すると信じられており、そのことが受容体の分解および代謝回転に本質的であって、それにより受容体から下流のシグナリングの中止をもたらす（スーベイラン（Soubeyran）ら、「ネイチャー（Nature）」、２００２年、第４１６巻、ｐ．１８３〜１８７）。
【００１１】
糖尿病、およびそれに関連した肥満のような症状は、世界中の主要な健康懸念であり、罹患率および死亡率の一因となっている。非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭまたはＩＩ型糖尿病）は、先進国における糖尿病の主要な形態であるが、有効な治療的介入のための手段を欠いている。多数の環境および遺伝的要因が合衆国におけるＮＩＤＤＭのリスクに寄与しているが、持続性の肥満は群をぬいて最大のリスク因子である。
【００１２】
座位中心ライフスタイル、高脂肪または高炭水化物食を含めた様々な因子が、研究室動物、ならびにヒトにおけるインスリン抵抗性に寄与している。このようなリスク因子に共通した特徴は、通常は脂質の形態にあるエネルギー貯蔵を優先しているエネルギーバランスのシフトである。脂質の細胞内蓄積は、膵臓のβ膵島細胞のような多くの細胞にとって有毒であり、このことがＮＩＤＤＭの進行における重要な因子であると考えられている。
【００１３】
これらの問題に取組むため、製薬産業はインスリン抵抗性、摂食、栄養吸収を含めた種々の代謝のエンドポイントを標的とする化合物を同定することにその努力を傾けてきた。しかしながら、臨床試験に合格することができた薬物はかなり少なく、またそれらのほとんどに不快な副作用がある。肥満およびＮＩＤＤＭの双方に関連したインスリン抵抗性を標的とすることが同定されているインスリン感受性化化合物は、しばしば体重増加をもたらし、そのような障害に関連した問題のいくつかを最終的に悪化させることがある。インスリン感受性化化合物は、脂肪細胞の分化を増大させるようである。
【００１４】
糖尿病の発症前には、多くの肥満患者はインスリンの作用に対し末梢抵抗性を生じる。肥満症におけるインスリン抵抗性の分子基盤は、集中的な研究の対象となってきたにもかかわらず、わかりにくいままである。肥満とインスリン抵抗性との間の接点に関する成分および機構への洞察は、肥満に誘発されるインスリン抵抗性を示す肥満のマウスモデルから得られている。様々なマウスの肥満モデルについての分子基盤は、広範囲の機構をカバーしている；それにもかかわらず、それらはすべて、肥満の開始前または後のいずれかに糖尿病を発症する。
【００１５】
ヒトおよびげっ歯類における肥満もまた共通して、脂肪および筋肉細胞におけるインスリン抵抗性と関連づけられる（ルロイス（LeRoith）ら著、「ダイアビーティーズ・メリタス：ア・ファンダメンタル・アンド・クリニカル・テキスト（Diabetes Mellitus: a Fundamental and Clinical Text）」（リピンコット・レイブン（Lippincott-Raven）、フィラデルフィア、１９９６年）；デフロンゾ（DeFronzo）ら著、「ダイアビーティーズ・ケア（Diabetes Care）」、１９９２年、第１５巻、ｐ．３１８〜６８；リフキン（Rifkin）ら著、「ダイアビーティーズ・メリタス（Diabetes Mellitus）」、エルゼビア（Elsevier）、ニューヨーク、１９９０年）。
【００１６】
多くの研究が、インスリン感受性グルコース輸送担体ＧＬＵＴ４に焦点を合わせてきた（ワトソンおよびペシン（Watson & Pessin）著、エクスペリメンタル・セル・リサーチ（Exp. Cell Res. ）、２００１年、第２７１巻、ｐ．７５〜８３；ボーガン（Bogan）らの公表した米国特許出願第２００２００５２０１２号）。インスリンは、形質膜においてインスリン受容体（ＩＲ）に結合し、そこで、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ ３−Ｋ）に仲介されるＧＬＵＴ４の細胞表面へのリクルートメントを含む事象のカスケードにおいて、チロシンキナーゼを活性化する  ミン（Min）ら著、「モレキュラー・セル（Mol. Cell）」、１９９９年、第３巻、ｐ．７５１〜７６０；オルソン（Olson）ら著、「モレキュラー・セル・バイオロジー（Mol. Cell Biol.）」、１９９７年、第１７巻、ｐ．２４２５〜２４３５；ハウスドルフ（Hausdorff）ら著、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）」、１９９５年、第２７０巻、ｐ．１２９６５〜１２９６８；エルメンドルフ（Elmendorf）ら著、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」、１９９８年、第２７３巻ｐ．１３２８９〜１３２９６；ホルマン（Holman）ら著、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」、１９９０年、第２６５巻、ｐ．１８１７２〜１８１７９；パイパー（Piper）ら著、「アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー（Am. J. Physiol.）」、第２６０巻、Ｃ５７０〜Ｃ５８０）。ＰＩ ３−Ｋの活性化
しかしながら、ＰＩ ３−Ｋに介在されるＧＬＵＴ４のトラフィッキングは、インスリン抵抗性の程度を説明するには充分ではない（ペシン（Pessin）ら著、「ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（J. Clin. invest.）」、２０００年、第１０６巻、ｐ．１６５〜１６９）。たとえば、他の成長因子、およびＰＩ ３−Ｋおよびその下流のキナーゼ（すなわち、ＡＫＴ、プロテインキナーゼＣζ／λ（ＰＫＣζ／λ）を活性化することの可能な接着分子は、グルコース輸送またはＧＬＵＴ４トランスロケーションには何ら影響を及ぼさない。さらに、ＧＬＵＴ４を欠く突然変異マウスは、軽度の高インスリン血症しか発症しない（カーツ（Katz）ら著、「ネイチャー（Nature）」、１９９５年、第３７７巻、ｐ．１５１〜１５５）。
【００１７】
インスリン受容体へのｃ−Ｃｂｌのリクルートメントによって開始される、第二のＰＩ ３−Ｋ非依存性のシグナリングカスケード（ラングドン（Langdon）ら著、「ジャーナル・オブ・ビロロジー（J. Virol.）」、１９８９年、第６３巻、ｐ．５４２０〜５４２４；ラングドンら著、「プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）」、１９８９年、第８６巻、ｐ．１１６８〜１１７２）が、脂肪および筋肉細胞におけるインスリンに刺激されるグルコースの輸送および取込みに関与することが想定されてきた。この経路においては、ｃ−Ｃｂｌタンパク質はまた、アダプタータンパク質ＣＡＰとの相互作用により、ＣＡＰのカルボキシル末端の三つのＳＨ３ドメインの一つを介してインスリン受容体へリクルートされる。ｃ−Ｃｂｌは次いで受容体によりリン酸化され、ＣＡＰ−Ｃｂｌ複合体がインスリン受容体から分離し、カベオリン富化トリトン不溶性膜分画へ移動する。インビトロのタンパク質−タンパク質結合を測定するツーハイブリッドアッセイのデータに基づき、バウマン（Baumann）ら、「ネイチャー」、２０００年、第４０７巻、ｐ．２０２〜２０７は、ｃ−Ｃｂｌが他の二つのタンパク質、ＣＡＰおよびフローチリンと、三重複合体を形成することを示した。フローチリンとの相互作用は、ＣＡＰ−Ｃｂｌ複合体を、形質膜の脂質ラフトサブドメインへ向かわせる。バウマン（Baumann）ら、「ネイチャー」、２０００年、第４０７巻、ｐ．２０２〜２０７はまた、インスリンに刺激されるグルコース輸送および、細胞表面へのＧＬＵＴ４のトランスロケーションの双方が、ＳＨ３ドメインを欠くトランケート（切断）されたＣＡＰタンパク質（すなわち、ＣＡＰΔＳＨ３）の発現により、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞において約５０％まで減じられることを示した。もしこの経路がインビボの脂肪細胞および／または筋肉細胞において作動するなら、インスリンに誘導されるグルコース取込みおよび、それに続くグリコーゲンおよび脂質の双方への取込みは、ｃ−Ｃｂｌ−ＣＡＰ−フローチリン複合体の形成または活性を破壊する状況において損なわれうることが予期される。
【００１８】
ｃ−Ｃｂｌと、ＰＨドメインおよびＳＨ２ドメインを有するアダプタータンパク質、ＡＰＳ（アーメド（Ahmed）ら著、「バイオケミカル・ジャーナル（Biochem. J.）」、１９９９年、第３４１巻、ｐ．６６５〜６６８）との間の相互作用は、ｃ−Ｃｂｌの、形質膜の脂質ラフトドメインのサブセットである小胞の小さな陥入の中のインスリン受容体への結合に必要である。この経路においては、ＡＰＳはそのＳＨ２ドメインを介して、リン酸化されたインスリン受容体と相互作用し、続いて該タンパク質のＣ−末端の特定の残基においてチロシンリン酸化を受ける。リン酸化すると、ＡＰＳはｃ−Ｃｂｌを、ｃ−Ｃｂｌの異型のＳＨ２ドメインを介して受容体へリクルートする（サルティエルおよびペシン（Saltiel & Pessin）著、「トレンズ・セル・バイオロジー（TRENDS Cell Biol.）」、２００２年、第１２巻、ｐ．６５〜７１）。
【００１９】
コロカリゼーション研究に基づき、チャーング（Chiang）ら、「ネイチャー」、２００１年、第４１０巻、ｐ．９４４〜９４８はまた、インスリンに刺激されるｃ−Ｃｂｌの移動の時間経過が、ＳＨ２含有性のアダプタータンパク質ＣｒｋＩＩ、およびグアニルヌクレオチド交換因子Ｃ３Ｇの、カベオリン富化トリトン不溶性膜分画への動きと同じであることを示した。チャーングらはまたＣ３Ｇが、ＧＬＵＴ４輸送を調節するロー（Rho）ファミリーＧＴＰ−結合タンパク質、ＴＣ１０上で、ＧＴＰをＧＤＰへ交換することも示した。この経路においては、リン酸化されたｃ−Ｃｂｌは、Ｃ３Ｇと一緒にＣｒｋＩＩを脂質ラフトへリクルートし、Ｃ３ＧによるＴＣ１０の活性化を促進する（チャーングら著、「ネイチャー」、２００１年、第４１０巻、ｐ．９４４〜９４８）。
【００２０】
インビボの筋肉および脂肪細胞では、グルコース取込みまたはＧＬＵＴ４トランスロケーションの調節におけるｃ−Ｃｂｌの直接的な役割は証明されていない。この理由は、バウマンらおよびチャーングら、上記、による結合研究が、単離された３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞において行なわれており、動物の筋肉および脂肪細胞の双方においては言うまでもなく、インビボで同等の効果が生じることを示唆していないからである。バウマンらにより報告された、単離された脂肪細胞におけるＣＡＰΔＳＨ３タンパク質の過剰発現に対する効果が、ｃ−ＣｂｌへのＣＡＰの結合の欠陥の直接的な結果であったのか、あるいは突然変異体ＣＡＰΔＳＨ３タンパク質の発現の二次的な影響であったのかもまた不明である。たとえば、発現されたＣＡＰΔＳＨ３タンパク質は、内在性のＣＡＰの、脂質ラフトまたは細胞内の別の場所において他のタンパク質に結合する能力が変更されているのかもしれない。ＣＡＰΔＳＨ３タンパク質の過剰発現もまた、インスリンに刺激されるＣ３Ｇの脂質ラフトへのリクルートメントを減少させ、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞における活性化されたＴＣ１０のベースのレベルを減少させる（チャーングら、「ネイチャー」、２００１年、第４１０巻、ｐ．９４４〜９４８）。したがって、動物の脂肪細胞および筋肉細胞の双方では、グルコース取込みおよび脂質への取込みの調整において、ｃ−Ｃｂｌについて何ら明確な直接的な役割は浮かび上がっていない。このように、損なわれたｃ−Ｃｂｌ−ＣＡＰ−フローチリン複合体の形成および活性が、ヒトおよび他の動物においてインスリン抵抗性を生じるに充分であると結論づけることは、現在は可能ではない。
【００２１】
遺伝的な肥満−糖尿病症候群を有する数多くのマウスモデルが開発されてきた（ハーバーグ（Herberg）ら著、「メタボリズム（Metabolism）」、１９７７年、第２６巻、ｐ．５９〜９９）。マウスは、典型的には高血糖症、高インスリン血症、および肥満を有するが、程度は異なり、発病の時間も異なり、また原因も異なっている。黄色の肥満マウス（Ａy/a）では、優性の突然変異が、異所性、汎存性の、アグチタンパク質の発現を引き起こし、結果として成人発症肥満および非インスリン依存性糖尿病に類似した症状を生じる（ミーショウ（Michaud）ら著、「プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス」、１９９４年、第９１巻、ｐ．２５６２〜２５６６）。肥満（ｏｂ／ｏｂ）（チャン（Zhang）ら著、「ネイチャー」、１９９４年、第３７２巻、ｐ．４２５〜４３２）：糖尿病（ｄｂ／ｄｂ）（タータグリア（Tartaglia）ら著、セル（Cell）、１９９５年、第８３巻、ｐ．１２６３〜１２７１）、脂肪（ｃｐｅ／ｃｐｅ）（ナガート（Naggert）ら著、「ネイチャー・ジェネティクス（Nat. Genet.）」、１９９５年、第１０巻、ｐ．１３５〜１４２）、およびタビー（ｔｕｂ／ｔｕｂ）（クレイン（Kleyn）ら著、「セル」、１９９６年、第８５巻、ｐ．２８１〜２９０；ノーベン−トラウス（Noben-Trauth）ら著、「ネイチャー」、１９９６年、第３８０巻、５３４〜５４８）は、各々レプチン、レプチン受容体、カルボキシペプチダーゼＥをコードしている遺伝子、およびタビー様タンパク質をコードしている遺伝子の新規なファミリーの一員の突然変異である。肥満マウスは、高血糖症、グルコース不耐症、および血漿インスリンの上昇を呈するが、それは肥満症の発病の後に発症する。ｄｂ／ｄｂマウスでは、血漿インスリンの上昇は２週齢で起こり、３〜４週での肥満症の発病および４〜８週での血糖値の上昇に先行する。脂肪マウスは、一過性の高血糖症とともに、ランゲルハンス島の肥大および過形成に関連して、一生を通じて高インスリン血症を有する。タビーマウスは、正常な血中グルコースを有するが、血漿インスリンは肥満の明らかな徴候に先行して上昇し、ランゲルハンス島は肥大する。
【００２２】
グルコース取込みの損なわれたマウスモデルが強く要望される。それらの表現型を調べることにより、かかるモデルは、異常なグルコース代謝に関連した広範囲な疾病の治療法のための適切な標的の決定において、また治療術の有効性または特異性の決定のため、有用性をもつであろう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明に至る研究において、本発明者らは、細胞、組織、または動物における、一以上の代謝関連の表現型の調整におけるＣｂｌ、特にｃ−Ｃｂｌの役割について、たとえばインビボのインスリン抵抗性、肥満、および糖尿病において研究した。驚いたことに、本発明者らは、マウスにおけるＣｂｌ遺伝子座の、機能性Ｃｂｌタンパク質が発現されるのを妨げるに充分な標的破壊が、ベースのまたはインスリン誘導性のグルコース取込み、および脂肪細胞における脂質へのグルコースの取込みを混乱させず、ほとんどまたは全く欠陥を生じないことを発見した。筋肉細胞では、Ｃｂｌ欠損マウスは、増大された代謝率と一致して、ベースのグルコース取込みの上昇があることが判明した。Ｃｂｌ欠損マウスは、およその体重が等しい野生型の対照物よりも、有意に小さい脂肪細胞を有していた。この結論と一致して、Ｃｂｌ欠損マウスはまた、正常マウスに比べて体温が高く、Ｃｂｌ欠損マウスにおける体脂肪に対する除脂肪筋肉量の増大された比が、増大された代謝率の結果であることを示唆している。Ｃｂｌ欠損マウスは、１日あたり消費される食物の量（食事摂取量）によって測定されるような、著しく増進された食欲を示したことから、動物の食行動が著しく調整されたこともまた驚きであった。これらのデータはまた、たとえばｃ−ＣｂｌのようなＣｂｌが、動物の食行動の調整に、また哺乳類の脂肪細胞における脂肪沈着の調節に、直接関与していることを示している。Ｃｂｌタンパク質およびＣｂｌ欠損マウスモデルは、それゆえ、たとえば、食行動（たとえば食欲不振または大食症の治療における）、脂肪沈着、代謝率、除脂肪筋肉量対体脂肪比、またはグルコース取込み（たとえば、肥満症またはＩＩ型糖尿病の治療における）といった、Ｃｂｌ介在性の特徴を特異的に調整する化合物の同定に有用である。このようなモジュレーターは、適当な動物モデル、たとえばＣｂｌ-/-マウスモデルか、またはヒトのｃ−Ｃｂｌタンパク質を発現しているその派生物の、表現型に対するそれらの影響について、動物をスクリーニングすることにより、あるいは、たとえば、結合活性、ユビキチンリガーゼ活性といったＣｂｌの任意の特定の既知の機能を含むがそれに限定されない変更された機能について、Ｃｂｌタンパク質を直接スクリーニングすることにより、または、Ｃｂｌのチロシンリン酸化の程度に対する化合物の影響をスクリーニングすることによって同定される。
【００２４】
マウスモデルの代謝関連表現型に対する化合物の影響を測定するための方法は、実施例１〜４において本文に記述された、形態学および筋肉の熱発生表現型から明らかであろう。「代謝関連表現型」により、Ｃｂｌの活性および／または発現それ自体に関連した表現型、たとえば、インスリン受容体のＣｂｌ介在性のユビキチン化、Ｃｂｌのチロシンリン酸化、Ｃｂｌタンパク質レベル、および／または、たとえば脂肪量、グルコース輸送、筋肉の熱発生、筋肉温度、ミトコンドリア構造、ミトコンドリア機能、およびミトコンドリアの呼吸率からなる群より選ばれる表現型といった、Ｃｂｌ介在性の脂肪および／またはグルコース代謝が意味される。
【００２５】
したがって、本発明の一つの観点は、たとえば、肥満症の治療におけるような、食行動を抑制または低減する化合物を同定する方法であって、前記方法が：（ａ）そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的修飾を含んでいる、遺伝的に修飾された非ヒト動物へ化合物を投与することであって、前記遺伝的修飾が、前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており；および（ｂ）該動物における食行動を測定することであって、該化合物が投与されていないＣｂｌ欠損動物の食欲または食事摂取量に比較して、該動物の低減された食欲および食事摂取量が、該化合物が食行動を抑制または低減することを示していること、を含む方法を提供する。
【００２６】
別の態様においては、本発明は、たとえば肥満症の治療において、食行動を抑制または低減する化合物を同定するための方法であって、前記方法が、該化合物の存在および非存在下にＣｂｌタンパク質のユビキチンリガーゼ活性を測定することを含んでおり、該化合物の存在下でのＣｂｌタンパク質の増大されたユビキチンリガーゼ活性が、前記化合物が食行動を抑制または低減することを示している方法を提供する。別の態様においては、本発明は、化合物の存在および非存在下にＣｂｌタンパク質のチロシンリン酸化のレベルを測定することを含んでいる、食行動を抑制または低減する化合物を同定するための方法であて、該化合物の存在下でのＣｂｌタンパク質におけるチロシン残基の増大されたリン酸化が、該化合物が食行動を抑制または低減することを示している方法を提供する。
【００２７】
本発明のもう一つの態様は、たとえば、食欲不振または大食症の治療におけるような、食行動を増大する化合物を同定する方法であって、前記方法が：（ａ）食欲または食事摂取量を抑制する化合物を、そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的修飾を含んでいる、遺伝的に修飾された非ヒト動物へ投与することであって、前記遺伝的な修飾が前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており、さらに該動物の食行動を測定すること；（ｂ）該動物へ化合物を投与すること、および該動物の食行動を測定することであって、（ｂ）における、（ａ）に比較して増進された食欲または食事摂取量が、該化合物が食行動を増大することを示していること、を含む方法を提供する。
【００２８】
別の態様においては、本発明は、化合物の存在および非存在下に、Ｃｂｌタンパク質のユビキチンリガーゼ活性を測定することを含む、食行動を増大する化合物の同定法であって、該化合物の存在下にＣｂｌタンパク質の低減されたユビキチンリガーゼ活性が、該化合物が食行動を増大することを示す方法を提供する。
【００２９】
別の態様においては、本発明は、化合物の存在および非存在下に、Ｃｂｌタンパク質のチロシンリン酸化のレベルを測定することを含む、食行動を増大する化合物の同定のための方法であって、該化合物の存在下にＣｂｌタンパク質におけるチロシン残基の低減されたリン酸化が、該化合物が食行動を増大することを示す方法を提供する。
【００３０】
別の態様においては、本発明は、たとえば、食欲不振または大食症の治療におけるような、食行動を調整する化合物を同定する方法であって、前記方法が：（ａ）化合物を、機能性のＣｂｌタンパク質を発現している非ヒト動物へ投与すること、および前記動物の食行動を測定すること；（ｂ）そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的修飾を含んでいる、遺伝的に修飾された非ヒト動物の食行動を測定することであって、前記遺伝的修飾が前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており；および（ｃ）該動物の食行動を（ａ）および（ｂ）において比較することであって、（ａ）および（ｂ）の間の同等の食行動が、該化合物が食行動を調整することを示していること、を含む方法を提供する。
【００３１】
本文に記述された、動物ベースのアッセイにおいては、用語「内在Ｃｂｌ」が、動物の天然のゲノムによってコードされた、一般にヒトＣｂｌ以外の、Ｃｂｌを指すことが理解されるべきである。
【００３２】
本発明の特に好ましい態様においては、動物ベースのアッセイは、機能性の内在Ｃｂｌの発現を欠きかつヒトのＣｂｌタンパク質をコードしている遺伝子を含んでいる、遺伝的に修飾された動物を利用して使用される。かかる動物モデルは、調節性化合物の同定のため、および／または、動物ベースのアッセイ（すなわち、Ｃｂｌ-/-マウス）またはインビトロのアッセイ系を用いて同定される任意の化合物またはモジュレーターの有効性を評価するために特に好ましい。特に、ヒトＣｂｌタンパク質を異所性に発現するか、またはそうすることが可能な動物の使用は、当業者に、化合物またはモジュレーターが、ヒトＣｂｌ遺伝子の発現またはヒトＣｂｌタンパク質の活性を標的とするか、またはヒトＣｂｌの発現および／または活性に選択的であることを測定できるようにする。
【００３３】
別の態様においては、本発明は、化合物の存在下または非存在下にＣｂｌタンパク質のユビキチンリガーゼ活性を測定することを含む摂食を調整する化合物の同定法であり、該化合物の存在下でのＣｂｌタンパク質の変化したユビキチンリガーゼ活性が、該化合物が食行動を増大することを示している方法、を提供する。
【００３４】
別の態様においては、本発明は、化合物の存在下または非存在下にＣｂｌタンパク質のチロシンリン酸化レベルを測定することを含む摂食を調整する化合物の同定法であり、該化合物の存在下でのＣｂｌタンパク質のチロシン残基の変化したリン酸化が、該化合物が食行動を調整することを示している方法、を提供する。
【００３５】
本発明のさらなる観点は、たとえば、低脂血症（たとえば、無βリポタンパク血症、栄養失調症、または、急性骨髄性白血病または慢性骨髄性白血病のような血液学的悪性疾患を患っている患者において観察されるような）の治療におけるような、脂肪沈着を増大するか、除脂肪筋肉量を低減するか、体脂肪対筋肉比を増大するか、または代謝率を低減する化合物を同定する方法であって、前記方法が：（ａ）そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的な修飾を含んでいる遺伝的に修飾された非ヒト動物へ、前記化合物を投与することであって、前記遺伝的な修飾が前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており；および（ｂ）該動物の脂肪含有量を測定することであって、該化合物がそれへ投与されていない、Ｃｂｌ欠損動物の脂肪含有量に比較した、該動物の増大された脂肪含有量が、該化合物が脂肪沈着を増大するか、除脂肪筋肉量を低減するか、体脂肪対筋肉比を増大するか、または代謝率を低減することを示していること、を含む方法を提供する。
【００３６】
別の態様においては、本発明は、化合物の存在および非存在下に、Ｃｂｌタンパク質のユビキチンリガーゼ活性を測定することを含む、脂肪沈着を増大するか、除脂肪筋肉量を低減するか、体脂肪対筋肉比を増大するか、または代謝率を低減する化合物を同定する方法であって、該化合物の存在下でのＣｂｌタンパク質の増大されたユビキチンリガーゼ活性が、該化合物が脂肪沈着を増大するか、除脂肪筋肉量を低減するか、体脂肪対筋肉比を増大するか、または代謝率を低減することを示している方法を提供する。
【００３７】
別の態様においては、本発明は、化合物の存在および非存在下に、Ｃｂｌタンパク質のチロシンリン酸化レベルを測定することを含む、脂肪沈着を増大するか、除脂肪筋肉量を低減するか、体脂肪対筋肉比を増大するか、または代謝率を低減する化合物を同定する方法であって、該化合物の存在下でのＣｂｌタンパク質におけるチロシン残基の増大されたリン酸化が、該化合物が脂肪沈着を増大するか、除脂肪筋肉量を低減するか、体脂肪対筋肉比を増大するか、または代謝率を低減することを示している方法を提供する。
【００３８】
別の態様においては、本発明は、たとえば、肥満症または神経変性性疾患の治療におけるか、またはボディビルディングまたは減量といった美容上の目的のため、脂肪沈着を低減するか、除脂肪筋肉量を増大するか、体脂肪対筋肉比を減少させるか、または代謝率を増大する化合物を同定する方法であって、前記方法が（ａ）そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的な修飾を含んでいる遺伝的に修飾された非ヒト動物へ、脂肪沈着またはグルコース取込みを増大する化合物を投与することであって、前記遺伝的な修飾が前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止し、かつ該動物の脂肪含有量を測定すること；（ｂ）該動物へ化合物を投与しかつ該動物の脂肪含有量を測定することであって、（ａ）に比べて（ｂ）における同等のまたは低減された脂肪含有量が、該化合物が脂肪沈着を低減するか、除脂肪筋肉量を増大するか、体脂肪対筋肉比を低減するか、または代謝率を増大することを示していること、を含む方法を提供する。
【００３９】
別の態様においては、脂肪沈着を低減するか、除脂肪筋肉量を増大するか、体脂肪対筋肉比を減少させるか、または代謝率を増大する化合物を同定する方法であって、前記方法が：（ａ）化合物を、機能性のＣｂｌタンパク質を発現している非ヒト動物へ投与すること、および該動物の脂肪含有量を測定すること；（ｂ）そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的修飾を含んでいる、遺伝的に修飾された非ヒト動物の脂肪含有量を測定することであって、前記遺伝的修飾が前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており；および（ｃ）該動物の脂肪含有量を（ａ）および（ｂ）において比較することであって、（ａ）および（ｂ）の間の同等の脂肪含有量が、該化合物が脂肪沈着を低減するか、除脂肪筋肉量を増大するか、体脂肪対筋肉比を低減させるか、または代謝率を増大することを示していること、を含む方法を提供する。
【００４０】
別の態様においては、本発明は、化合物の存在および非存在下に、Ｃｂｌタンパク質のユビキチンリガーゼ活性を測定することを含む、脂肪沈着を低減するか、除脂肪筋肉量を増大するか、体脂肪対筋肉比を低減するか、または代謝率を増大する化合物を同定する方法であって、該化合物の存在下でのＣｂｌタンパク質の低減されたユビキチンリガーゼ活性が、該化合物が脂肪沈着を低減するか、除脂肪筋肉量を増大するか、体脂肪対筋肉比を低減するか、または代謝率を増大することを示している方法を提供する。
【００４１】
別の態様においては、本発明は、化合物の存在および非存在下に、Ｃｂｌタンパク質のチロシンリン酸化レベルを測定することを含む、脂肪沈着を低減するか、除脂肪筋肉量を増大するか、体脂肪対筋肉比を低減するか、または代謝率を増大する化合物を同定する方法であって、該化合物の存在下でのＣｂｌタンパク質におけるチロシン残基の低減されたリン酸化が、該化合物が脂肪沈着を低減するか、除脂肪筋肉量を増大するか、体脂肪対筋肉比を低減するか、または代謝率を増大することを示している方法を提供する。
【００４２】
本発明のさらなる観点は、たとえば、低脂血症（たとえば、無βリポタンパク血症、栄養失調症、または、急性骨髄性白血病または慢性骨髄性白血病のような血液学的悪性疾患を患っている患者において観察されるような）の治療におけるような、グルコース取込みを増大する化合物を同定する方法であって、前記方法が：（ａ）そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的な修飾を含んでいる遺伝的に修飾された非ヒト動物へ、化合物を投与することであって、前記遺伝的な修飾が前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており；および（ｂ）該動物の肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを測定することであって、該化合物がそれへ投与されていない、Ｃｂｌ欠損動物の肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みに比較して、増大された取込みが、該化合物がグルコース取込みを増大することを示していること、を含む方法を提供する。
【００４３】
別の態様においては、本発明は、化合物の存在および非存在下に、Ｃｂｌタンパク質のユビキチンリガーゼ活性を測定することを含む、グルコース取込みを増大する化合物を同定する方法であって、該化合物の存在下でのＣｂｌタンパク質の低減されたユビキチンリガーゼ活性が、該化合物が脂肪沈着を低減するか、グルコース取込みを増大することを示している方法を提供する。
【００４４】
別の態様においては、本発明は、化合物の存在および非存在下に、Ｃｂｌタンパク質のチロシンリン酸化レベルを測定することを含む、グルコース取込みを増大する化合物を同定するための方法であって、該化合物の存在下でのＣｂｌタンパク質におけるチロシン残基の低減されたリン酸化が、該化合物がグルコース取込みを増大することを示している方法を提供する。
【００４５】
別の態様においては、本発明は、たとえば、肥満症の治療におけるように、肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを低減する化合物を同定する方法であって、前記方法が（ａ）そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的な修飾を含んでいる遺伝的に修飾された非ヒト動物へ、グルコース取込みを増大する化合物を投与することであって、前記遺伝的な修飾が前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており、かつ肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを測定すること；（ｂ）該動物へ化合物を投与すること、および該動物の肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを測定することであって、（ａ）に比べて（ｂ）における同等かまたは低減された取込みが、該化合物が肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを低減することを示していること、を含む方法を提供する。
【００４６】
別の態様においては、本発明は、肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを低減する化合物を同定する方法であって、前記方法が（ａ）機能性のＣｂｌタンパク質を発現している非ヒト動物へ化合物を投与すること、および該動物の肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを測定すること；（ｂ）そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的修飾を含んでいる、遺伝的に修飾された非ヒト動物の肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを測定することであって、前記遺伝的修飾が前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており；および（ｃ）該動物の肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを（ａ）および（ｂ）において比較することであって、（ａ）および（ｂ）の間の同等のとりこみが、該化合物が肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを低減することを示していること、を含む方法を提供する。
【００４７】
別の態様においては、本発明は、化合物の存在および非存在下に、Ｃｂｌタンパク質のユビキチンリガーゼ活性を測定することを含む、グルコース取込みを低減する化合物を同定する方法であって、該化合物の存在下でのＣｂｌタンパク質の増大されたユビキチンリガーゼ活性が、該化合物がグルコース取込みを低減することを示している方法を提供する。
【００４８】
別の態様においては、本発明は、化合物の存在および非存在下に、Ｃｂｌタンパク質のチロシンリン酸化レベルを測定することを含む、グルコース取込みを低減する化合物を同定するための方法であって、該化合物の存在下でのＣｂｌタンパク質におけるチロシン残基の増大されたリン酸化が、該化合物がグルコース取込みを低減することを示している方法を提供する。
【００４９】
スクリーニングアッセイにおける特に好ましい態様において、本発明は、患者における食行動、脂肪沈着、代謝率、または除脂肪筋肉量対体脂肪比を調整することが可能な化合物を同定する方法であって、前記方法が、そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的修飾を含んでいる遺伝的に修飾された非ヒト動物について測定ずみの、代謝関連表現型を測定するためのアッセイを行なうことであって、前記遺伝的修復が前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており、かつ前記アッセイが検査されるべき化合物の存在また非存在下に行なわれていること、および該表現型に対する該化合物の影響を測定することを含んでおり、変化した表現型が、該化合物が患者における食行動、脂肪沈着、代謝率、または除脂肪筋肉量対体脂肪比を調整することができることを示している方法を提供する。
【００５０】
一つの態様において、代謝関連表現型を測定するためのアッセイは、化合物の存在および非存在下に、インスリン受容体のＣｂｌ介在性のユビキチン化を測定する。好ましくは、アッセイは：
（ａ）インスリン受容体のｃ−Ｃｂｌ介在性のユビキチン化を果たすことが可能な細胞を提供すること；
（ｂ）該細胞を、検査されるべき化合物の存在および非存在下にインキュベートすること；および
（ｃ）該化合物の存在および非存在下にインスリン受容体のｃ−Ｃｂｌ介在性のユビキチン化を測定することであって、インスリン受容体のｃ−Ｃｂｌ介在性のユビキチン化の変化したレベルが、該化合物が患者における食行動、脂肪沈着、代謝率、または除脂肪筋肉量対体脂肪比を調整することができることを示していること、
を含む。
【００５１】
好ましくは、化合物はインスリン受容体のＣｂｌ介在性のユビキチン化を低減または阻害し、それにより前記化合物が患者における食行動を増大し、患者における脂肪沈着を低減し、患者における代謝率を増大し、または患者における除脂肪筋肉量対体脂肪比を増大することができることを示す。
【００５２】
別法として、化合物はインスリン受容体のＣｂｌ介在性のユビキチン化を増大するかまたはアゴナイズし（必死にさせ（agonize））、それにより前記化合物が患者における食行動を低減し、および／または患者における脂肪沈着を増大し、および／または患者における代謝率を低減し、および／または患者における除脂肪筋肉量対体脂肪比を低減することができることを示す。
【００５３】
特に好ましい態様においては、アッセイは、イムノアッセイ（免疫学的測定法）を含んでおり、インスリン受容体のｃ−Ｃｂｌ介在性のユビキチン化のレベルは、インスリン受容体を、ユビキチンと結合する抗体と、抗原−抗体複合体を形成するに充分な条件下に接触させること、および受容体に結合した抗体を検出することにより測定される。好ましくは、アッセイはさらに、インスリン受容体を、インスリン受容体と結合する抗体と、抗原−抗体複合体を形成するに充分な条件下に接触させることを含む。
【００５４】
別の態様においては、方法は：
（ａ）インスリン受容体のｃ−Ｃｂｌ介在性のユビキチン化を果たすことが可能な細胞を提供すること；
（ｂ）該細胞を、検査されるべき化合物の存在および非存在下にインキュベートすること；
（ｃ）インスリン受容体を含んでいる細胞の抽出物を、インスリン受容体と結合する抗体と、抗原−抗体複合体を形成するに充分な条件下に接触させ、それによりインスリン受容体を捕捉すること；
（ｄ）捕捉されたインスリン受容体を、ユビキチンと結合する抗体と、抗原−抗体複合体を形成するに充分な条件下に接触させること；および
（ｅ）（ｄ）で結合した抗体を検出すること、
を含むプロセスにより、イムノアッセイ行なうことを含む。
この態様によれば、（ｄ）で結合した抗体は、一般に、検出可能なシグナルを発生することが可能な第三の抗体と接触させることにより検出される。
【００５５】
本発明のさらなる態様においては、代謝関連表現型を測定するためのアッセイは、化合物の存在および非存在下に、Ｃｂｌタンパク質のチロシン残基のリン酸化を測定する。
【００５６】
本発明のさらなる態様においては、代謝関連表現型を測定するためのアッセイは、化合物の存在および非存在下に、細胞内のＣｂｌタンパク質の量を測定する。好ましくは、この態様によるアッセイフォーマットは：
（ａ）ｃ−Ｃｂｌタンパク質を発現することが可能な細胞を提供すること；
（ｂ）該細胞を、検査されるべき化合物の存在および非存在下にインキュベートすること；および
（ｃ）該細胞中のｃ−Ｃｂｌタンパク質の量を、該化合物の存在および非存在下に測定することであって、ｃ−Ｃｂｌタンパク質の変化したレベルが、該化合物が患者における食行動、脂肪沈着、代謝率、または除脂肪筋肉量対体脂肪比を調整することができることを示していることを含む。
【００５７】
好ましくは、細胞内のＣｂｌタンパク質の低減された量によって測定されるような、Ｃｂｌの発現を低減または阻害する化合物は、患者における食行動を増大し、脂肪沈着を低減し、代謝率を増大し、あるいは除脂肪筋肉量対体脂肪比を増大することができる。
【００５８】
別法として、細胞内のＣｂｌタンパク質の増大した量によって測定されるような、Ｃｂｌの発現を増大またはアゴナイズする化合物は、患者における食行動を低減すること、および／または患者における脂肪沈着を増大すること、および／または患者における代謝率を低減すること、および／または患者における除脂肪筋肉量対体脂肪比を低減することができる。
【００５９】
特に好ましい態様においては、細胞内のＣｂｌタンパク質の量はイムノアッセイを行なうことによって測定され、ｃ−Ｃｂｌの量は、Ｃｂｌタンパク質を、Ｃｂｌと結合する抗体と、抗原−抗体複合体を形成するに充分な条件下に接触させること、およびＣｂｌタンパク質に結合した抗体を検出することによって測定される。好ましくは、Ｃｂｌタンパク質に結合した抗体は、該抗体を、検出可能なシグナルを発生することが可能な二次抗体と接触させることにより検出される。
【００６０】
別の態様においては、Ｃｂｌタンパク質を、抗原−抗体複合体を形成するに充分な条件下に、各々がＣｂｌと結合する一次および二次抗体と接触させること、およびＣｂｌタンパク質に結合した抗体を検出することによってｃ−Ｃｂｌタンパク質の量が測定されるイムノアッセイが行なわれる。Ｃｂｌタンパク質に結合した抗体は一般に、抗体を、検出可能なシグナルを発生することが可能な二次抗体と接触させることにより検出される。一次および二次抗体は、一般にＣｂｌタンパク質上の異なるエピトープに結合するであろう。
【００６１】
さらなる態様においては、細胞内のＣｂｌタンパク質の量は：
（ａ）ｃ−Ｃｂｌタンパク質を発現することが可能な細胞を提供すること；
（ｂ）該細胞を、検査されるべき化合物の存在および非存在下にインキュベートすること；
（ｃ）Ｃｂｌタンパク質を含んでいる細胞の抽出物を、Ｃｂｌタンパク質と結合する抗体と、抗原−抗体複合体を形成するに充分な条件下に接触させ、それによりＣｂｌタンパク質を捕捉すること；および
（ｄ）（ｃ）で結合した抗体を検出すること、
を含むイムノアッセイによって検出される。
【００６２】
さらなる態様においては、細胞内のＣｂｌタンパク質の量は：
（ａ）ｃ−Ｃｂｌタンパク質を発現することが可能な細胞を提供すること；
（ｂ）該細胞を、検査されるべき化合物の存在および非存在下にインキュベートすること；
（ｃ）Ｃｂｌタンパク質を含んでいる細胞の抽出物を、Ｃｂｌタンパク質と結合する抗体と、抗原−抗体複合体を形成するに充分な条件下に接触させ、それによりＣｂｌタンパク質を捕捉すること；
（ｄ）捕捉されたＣｂｌタンパク質を、Ｃｂｌタンパク質と結合する抗体と、抗原−抗体複合体を形成するに充分な条件下に接触させることであって、前記抗体は、（ｃ）の抗体に対し、Ｃｂｌ上の異なるエピトープに結合しており、；および
（ｅ）（ｄ）で結合した抗体を検出すること、
を含むイムノアッセイにより検出される。
【００６３】
これらの、および他の、好ましいイムノアッセイについてと同様に、抗体は一般に、検出可能なシグナルを発生することが可能な抗体と、該抗体を接触させることによって検出される。
【００６４】
本発明のさらなる態様においては、代謝関連表現型を測定するためのアッセイは、化合物の存在および非存在下に、細胞内のＣｂｌ介在性の脂肪および／またはグルコース代謝を測定する。好ましくは、代謝関連表現型を測定するためのアッセイは、該化合物の存在および非存在下に、脂肪量、グルコース輸送、筋肉の熱発生、ミトコンドリア構造、ミトコンドリア機能、およびミトコンドリアの呼吸率からなる群より選ばれる表現型を測定する。好ましくは、これらのパラメータは、該化合物の存在および非存在下に、細胞、組織、または動物において測定される。
【００６５】
本文において例示されるように、たとえば、試験化合物の存在および非存在下での筋肉の熱発生は、細胞のプロトンリークカイネティクスを測定することを含むプロセスによって測定される。したがって、細胞内の筋肉の熱発生の測定についての一つの特に好ましい態様は：
（ａ）ｃ−Ｃｂｌタンパク質を発現することが可能な、筋原細胞系列の細胞を提供すること；
（ｂ）該細胞を、検査されるべき化合物の存在および非存在下にインキュベートすること；および
（ｃ）該化合物の存在および非存在下に、細胞の呼吸率および／または膜電位を測定することであって、変化した呼吸率および／または膜電位が、該化合物が患者における食行動、脂肪沈着、代謝率、または除脂肪筋肉量対体脂肪比を調整することができることを示していること、
を含む。
【００６６】
この態様によれば、細胞の呼吸率および／または膜電位を増大する化合物は、患者における食行動を増進し、脂肪沈着を低減し、代謝率を増大し、または除脂肪筋肉量対体脂肪比を増大することができる。
【００６７】
対照的に、細胞の呼吸率および／または膜電位を低減または阻害する化合物は、患者における食行動を低減し、および／または患者における脂肪沈着を増大し、および／または患者における代謝率を低減し、および／または患者における除脂肪筋肉量対体脂肪比を低減することができる。
【００６８】
特に好ましい態様においては、推定上の調整化合物を検査または確認するため、動物モデルが使用される。一つの態様においては、代謝関連表現型に対する化合物の影響を測定するアッセイは：
（ａ）検査されるべき化合物を、機能性のＣｂｌタンパク質を発現する動物患者に与えること；および
（ｂ）該動物の細胞または組織中の代謝関連表現型を測定することであって、該化合物の存在下に変化した表現型が、該化合物が患者における食行動、脂肪沈着、代謝率、または除脂肪筋肉量対体脂肪比を調整することができることを示していること、
を含む。
【００６９】
好ましくは、アッセイのリードアウト（表示された測定結果）として測定される代謝関連表現型は、脂肪量、グルコース輸送、筋肉の熱発生、ミトコンドリア構造、ミトコンドリア機能、およびミトコンドリアの呼吸率からなる群より選ばれる。本文に記述された他の態様についてと同様に、化合物の存在下における筋肉の熱発生は、好ましくは、動物の細胞または組織のプロトンリークカイネティクスを測定することを含むプロセスによって測定される。さらに好ましくは、筋肉の熱発生は、動物由来の細胞の呼吸率および／または膜電位を測定することによって求められ、変化した呼吸率および／または膜電位が、該化合物が患者における食行動、脂肪沈着、代謝率、または除脂肪筋肉量対体脂肪比を調整することができることを示している。
【００７０】
この態様によれば、細胞の呼吸率および／または膜電位を増大する化合物は、患者における食行動を増進し、脂肪沈着を低減し、代謝率を増大し、または除脂肪筋肉量対体脂肪比を増大することができる。
【００７１】
対照的に、細胞の呼吸率および／または膜電位を低減または阻害する化合物は、それにより、前記化合物が食行動を低減し、および／または患者における脂肪沈着を増大し、および／または患者における代謝率を低減し、および／または患者における除脂肪筋肉量対体脂肪比を低減することができることを示している。
【００７２】
本発明により提供されるスクリーンにおいて用いられる動物患者が、非ヒト動物患者であること、好ましくは、たとえばげっ歯類（たとえば、ウサギ、ラット、モルモット、またはマウス）、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、およびヤギといった哺乳類、さらに好ましくはウサギ、ラット、またはマウスであることが特に好ましい。
【００７３】
一つの態様においては、非ヒト動物患者は内在性の天然のＣｂｌタンパク質を発現する（すなわち、それはＣｂｌ発現に関して野生型の動物である）。本発明は明らかに、導入されたヒトＣｂｌタンパク質を発現するＣｂｌ−ノックイン動物の使用を提供する。
【００７４】
好ましくは、試験化合物は動物患者の筋肉組織へ投与される。核酸の場合には、これらは注射により与えられることが特に好ましい。好ましくは、核酸はウイルスベクター、特にアデノウイルス内に含有される。当業者には周知のように、かかるアデノウイルスは注射部位に局在されたまま残留する傾向がある。したがって、代謝関連表現型は一般に、ウイルスベクターが投与された動物患者の筋肉組織において測定されるであろう。
【００７５】
本発明のさらなる観点は：（ｉ）Ｃｂｌ−ＡＰＳ複合体；（ｉｉ）Ｃｂｌ−ＣＡＰ複合体；（ｉｉｉ）Ｃｂｌ−ＣＡＰ−フロチリン複合体；（ｉｖ）Ｃｂｌ−Ｃ３Ｇ複合体；（ｖ）Ｃｂｌ−ＣｒｋＩＩ複合体；および（ｖｉ）Ｃｂｌ−Ｃ３Ｇ−ＣｒｋＩＩ複合体からなる群より選ばれるタンパク質複合体の、活性、形成、または安定性のモジュレーターを測定するための方法を提供する。
【００７６】
本発明は、本文に記述されたスクリーニング法を、かかるスクリーンにおいて同定される阻害性化合物のパイロットスケールでの製造または工業スケールでの製造に移すための、任意のインシリコの分析法および／または工業的なプロセスの使用を明らかに包含する。本発明はまた、任意のかかる製造のための情報の提供にも対応している。したがって、本発明のさらなる観点は、上記の化合物またはモジュレーターを同定または測定するためのプロセスを提供することであり、前記方法は：
（ｉ）  本文に記述された方法を行なうことであって、それにより化合物またはモジュレーターを同定または測定すること；
（ｉｉ）  任意に、該化合物またはモジュレーターの構造を決定すること；および
（ｉｉｉ）  化合物またはモジュレーター、あるいは、たとえば紙形式、機械読み取り可能形式、またはコンピュータ読み取り可能形式といった、化合物またはモジュレーターの名前または構造を提供すること、
を含む。
必然的に、たとえ既知であっても本発明によって提供されるスクリーンを用いてその機能が前もって検査されなかった化合物については、該化合物の構造の決定が上記の段階（ｉ）中に暗に示されている。このことは、スクリーンを行なう時点で、当業者は化合物の名称および／または構造を認識することになるからである。
【００７７】
本文において用いられるように、用語「化合物またはモジュレーターを提供すること」は、前記化合物またはモジュレーターを製造するための化学的または組換え合成手段か、あるいは、任意の人または手段によって先に合成された化合物またはモジュレーターの供給を含むものと解釈されるものとする。
【００７８】
好ましい態様においては、化合物またはモジュレーターか、あるいは化合物またはモジュレーターの名前または構造は、たとえば、本文に記述されたスクリーンによって測定されるような、その用途に関する指示とともに提供される。
【００７９】
本発明のさらなる観点は、上記の化合物またはモジュレーターを製造するためのプロセスを提供することであり、前記方法は：
上記の化合物またはモジュレーターを同定または測定するためのプロセスを含んでおり、前記方法は：
（ｉ）本文に記述された方法を行なうことであって、それにより化合物またはモジュレーターを同定または測定すること；
（ｉｉ）任意に、該化合物またはモジュレーターの構造を決定すること；
（ｉｉｉ）任意に、たとえば、紙形式、機械読み取り可能形式、またはコンピュータ読み取り可能形式の、といった、化合物またはモジュレーターの名前または構造を提供すること；および
（ｉｖ）該化合物またはモジュレーターを製造または合成すること、
を含む。
【００８０】
好ましい態様においては、合成された化合物またはモジュレーターか、あるいは化合物またはモジュレーターの名前または構造は、たとえば本文に記述されたスクリーンによって測定されるような、用途に関する指示とともに提供される。
【００８１】
さらなる観点においては、本発明は動物またはヒトの患者の治療に関連した方法であって、Ｃｂｌの発現または活性を調整する（すなわち、増大するかまたは低減するかまたは防止する）化合物が該動物に投与される方法を提供する。かかる方法は、たとえば、高血糖症、高インスリン血症、肥満症、成人発症肥満、非インスリン依存性糖尿病、ＩＩ型糖尿病、グルコース不耐性、ランゲルハンス島の肥大または過形成といった、Ｃｂｌ機能に関連した広範囲の症状の治療のため、またはたとえば、ボディビルディングまたは体重管理（すなわち、減量または増量）といった美容上の目的のために準用される。本発明のかかる適用が、たとえば、その沈着する脂肪量、またはその脂肪対筋肉量比を調整するためといった、資源動物および家畜（たとえば、酪農および食肉用のウシ、ブタ、ウマ、ヒツジなど）の生産性にも関係することが理解されるべきである。本発明のこの観点によれば、患者におけるＣｂｌの発現または活性を調整するべく有効な量のＣｂｌのアゴニストまたはアンタゴニストの量が、動物またはヒトの患者へ投与される。
【００８２】
もう一つの態様においては、本発明はまた、患者における低減された食事摂取量または抑制された食欲によって特徴づけられる摂食障害の治療法であって、前記方法が、患者の食欲または食事摂取量を増大するべく有効な量のＣｂｌアンタゴニストを患者に投与することを含む方法も提供する。本発明の方法は、食欲不振または大食症の治療に特に適している。
【００８３】
関連する態様においては、本発明はまた、患者における低減された食事摂取量または抑制された食欲によって特徴づけられる摂食障害の治療法であって、前記方法が、患者の食欲または食事摂取量を増大するべく有効な量の、機能性Ｃｂｌの発現を低減する化合物を患者に投与することを含む方法も提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８４】
本発明の一つの観点は、たとえば、肥満症の治療におけるような、食行動を抑制または低減する化合物を同定する方法であって、前記方法が：（ａ）そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的修飾を含んでいる、遺伝的に修飾された非ヒト動物へ化合物を投与することであって、前記遺伝的修飾が、前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており；および（ｂ）該動物における食行動を測定することであって、該化合物が投与されていないＣｂｌ欠損動物の食欲または食事摂取量に比較して、該動物の低減された食欲および食事摂取量が、該化合物が食行動を抑制または低減することを示していること、を含む方法を提供する。
【００８５】
本文において用いられるように、用語「Ｃｂｌ」は、配列番号２または３に示されたようなヒトまたはマウスのｃ−Ｃｂｌポリペプチドのアミノ酸配列に、少なくとも約８０％のアミノ酸配列の同一性を有している、任意のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を意味するものとする。用語「Ｃｂｌ」はまた、Ｃｂｌの既知の生物活性か、またはｃ−Ｃｂｌを含めたＣｂｌの既知の結合特異性を有している、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を含むものとする。命名の目的のため、マウスおよびヒトのＣｂｌポリペプチドのアミノ酸配列は、各々配列番号２および3として本文に例示されている。好ましくは、配列番号２または3に対するパーセント同一性は、少なくとも約８５％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、なおさらに好ましくは、少なくとも約９５％、その上にさらに好ましくは、少なくとも約９９％である。
【００８６】
「Ｃｂｌ」タンパク質は一般に、９０６個のアミノ酸残基の長さを含む。完全長のタンパク質は一般に、チロシンキナーゼ結合性ドメインを含んでおり、それはこのタンパク質をホスホチロシン残基に結合させ、それによりＣｂｌを増殖因子受容体のシグナリングへカップリングする。たとえば、ｃ−Ｃｂｌは増殖因子に反応して３〜４のチロシン残基においてリン酸化され、リン酸化された残基は、ＰＩ ３′キナーゼおよびＣｒｋ ＩＩのようなＳＨ２ドメイン含有性タンパク質に対する結合性ドメインを表す。チロシンキナーゼ結合性ドメインは、一般に、４本へリックスバンドル、ＥＦハンドドメイン、および、ＳＨ２ドメインを含むであろう。チロシンキナーゼ結合性ドメインの下流は、一般に、ユビキチンリガーゼタンパク質中に見出されるものと高い配列類似性を有するＣ３ＨＣ４ ＲＩＮＧフィンガードメインである。このタンパク質のＣ末端部分には一般に、ＳＨ３ドメイン含有性タンパク質（たとえば、ＣＡＰ）と結合することが可能な、プロリンに富む領域（ＰＲＲ）がある。Ｃｂｌの一番端のＣ末端には、一般に、ロイシン・ジッパー・ドメイン（ｂ−Ｚｉｐ）および、Ｃｂｌのホモ２量体化を調節するユビキチン結合ドメインがある。
【００８７】
食行動（たとえば、肥満症、食欲不振、大食症の治療における）、脂肪沈着，代謝率、除脂肪筋肉量対体脂肪比、またはグルコース取込み（たとえば、肥満症またはＩＩ型糖尿病の治療における）を調整する化合物の同定に向けられた本発明の種々の態様はまた、脂肪細胞または筋肉細胞へのグルコース取込みの間に修正される、Ｃｂｌタンパク質の物理的性質か、あるいはＣｂｌタンパク質の触媒活性を測定することにより実行されることも可能である。
【００８８】
食行動を増大し、脂肪沈着を低減し、代謝率を増大し、あるいは除脂肪筋肉量対体脂肪比を増大する化合物の能力は、したがって該化合物が、Ｃｂｌ−欠損マウスモデルにおいて破壊されるＣｂｌ活性を低減するかどうかを測定することにより容易にアッセイされる。たとえば、Ｃｂｌタンパク質の低減されたユビキチンリガーゼ活性か、またはＣｂｌタンパク質におけるチロシン残基の低減されたリン酸化（たとえば、ｃＡＭＰ介在性のリン酸化を測定することによるような、増殖受容体介在性のシグナリング事象にリンクして）、またはＣｂｌのＳＨ３含有タンパク質への低減された結合は、これら効果をもたらす化合物の能力を示すであろう。Ｃｂｌのチロシンリン酸化、Ｃｂｌタンパク質におけるチロシンリン酸化の受容体介在性のシグナリング、Ｃｂｌのユビキチンリガーゼ活性、またはＣｂｌのＳＨ３ドメインへの結合を測定するための標準的なアッセイは、当業者には周知である。
【００８９】
同様に、食行動を低減し、脂肪沈着を増大し、代謝率を低減し、あるいは除脂肪筋肉量対体脂肪比を増大する化合物の能力は、該化合物が、Ｃｂｌタンパク質のユビキチンリガーゼ活性を増大するか、またはＣｂｌタンパク質におけるチロシン残基のリン酸化を増大するか（たとえば、ｃＡＭＰ介在性のリン酸化を測定することによるような、増殖受容体介在性のシグナリング事象にリンクして）、またはＣｂｌのＳＨ３含有タンパク質への結合を増大するかどうかを測定することにより、アッセイされることが可能である。
【００９０】
「Ｃｂｌ欠損性」により、グルコース代謝の障害に苦しんでいない野生型の動物において検出されるグルコース取込みまたはグリコーゲン合成または脂質生成のレベルを促進するためには不充分な、機能性Ｃｂｌタンパク質が産生されることが意味される。グルコース取込み、グリコーゲン合成、または脂質生成は、たとえば、ラーザー（Lazar）ら、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）」、１９９５年、第２７０巻，ｐ．２０８０１〜２０８０７によって記述されたような、インスリン存在下および非存在下における、単離された肝臓、脂肪、または筋肉細胞への２−デオキシグルコース取込みおよび／またはグリコーゲン合成および／または脂質生成を測定することによるといった、既知の方法を用いて容易に測定されることが可能である。
【００９１】
好ましくは、Ｃｂｌ欠損性は、遺伝的に修飾された動物の、少なくとも肝臓，脂肪、または筋肉細胞において，好ましくは脂肪、骨格筋、および心筋からなる群より選ばれる組織において、低減されたＣｂｌ発現を引き起こす。たとえば、免疫細胞または脳といった、他の細胞または組織におけるＣｂｌ発現の影響は、本発明の範囲から除外されるべきではない。
【００９２】
一つの態様においては、Ｃｂｌ欠損性の表現型を生じることが可能な遺伝的修飾は、Ｃｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内におけるヌクレオチドの欠失、挿入、置換、および逆位からなる群より選ばれる。もう一つの態様においては、遺伝的修飾は、Ｃｂｌ遺伝子座の二つの対立遺伝子内のヌクレオチド配列の欠失であって、その欠失が結果として、動物による機能性または完全長のＣｂｌタンパク質の発現の欠如を生じる。好ましい態様においては、遺伝的修飾は、Ｃｂｌ機能を妨げるに充分な、Ｃｂｌ遺伝子のタンパク質をコードしている領域をコードしているヌクレオチド配列の欠失を含むか、あるいは、Ｃｂｌ遺伝子のタンパク質をコードしている領域における、Ｃｂｌをコードしている対立遺伝子の一方または双方により機能性のＣｂｌの発現を妨げるに充分な位置における、フレーム内停止コドンの導入を含む。なおさらに好ましくは、遺伝的修飾は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでいるトランケートされたＣｂｌタンパク質を生じる、Ｃｂｌ遺伝子座における一つまたは二つの対立遺伝子の標的破壊を含む。
【００９３】
好ましくは、遺伝的修飾はＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子の双方においてである（すなわち、動物はその遺伝的修飾に関してホモ接合である）。
【００９４】
非ヒト動物は、たとえば、げっ歯類、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、またはヤギといった、任意の哺乳類である。一つの態様においては、該動物はウサギ、ラット、モルモット、およびマウスからなる群より選ばれるげっ歯類である。利便的には、該動物はマウスである。
【００９５】
この状況において用いられたＣｂｌ欠損性の「対照」動物は、低減されたＣｂｌ発現を有する任意の他の動物であることが可能であり、かつ化合物がそれに対して検査される動物（すなわち、「試験」動物）に対しアイソジェニック（同質遺伝子型）である必要はない。好ましくは、対照および試験動物は、同様のレベルの機能性Ｃｂｌを発現する。さらに好ましくは、対照および試験動物はアイソジェニックである。好ましくは、動物の食欲または食事摂取量は、野生型動物の食欲または食事摂取量に匹敵するレベルに修正され、動物の食欲または食事摂取量を完全に抑制することはない。
【００９６】
「食行動」により、特定の時間間隔における動物の食欲または食物消費量か、または、絶対量かあるいは全体積に対する比で表されたその食事摂取量が意味される。食事摂取量もまた一般に、特定の時間間隔（たとえば、１時間あたり、１日あたり、など）に関して求められる。ほとんどの非ヒト動物においては、食事摂取量が好ましい尺度である。
【００９７】
食行動を調整するための、本文において企図された化合物の範囲は、Ｃｂｌに由来するペプチド、およびＣｂｌ欠損性を補うことのできるペプチドを含めたペプチド；たとえば、Ｃｂｌペプチドミメティクスのような非Ｃｂｌペプチド；たとえば、公的入手可能なコンビナトリアル・ライブラリに由来するような有機低分子；および、Ｃｂｌ由来の前記ペプチドか、または前記非Ｃｂｌペプチドをコードしている核酸を含めた核酸を含む。
【００９８】
一つの態様においては、本件の方法はさらに、非ヒト動物またはヒトへの投与のため、同定された化合物を製剤することを含む。製剤は、皮下、静脈内、鼻腔内、または腹腔内などの経路による注入による投与に向けて適合されることが可能である。別法として、飼料添加物、錠剤，トローチなどの形状での経口投与に向けて適合されることが可能である。
【００９９】
化合物は、たとえば、水性溶媒、非水性溶媒、食塩のような非毒性の賦形剤、保存料，緩衝液などといった、適当な賦形剤または希釈剤中に便利に製剤される。非水性溶媒の実例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。水性溶媒は、水，アルコール性／水性溶液、食塩水、塩化ナトリウムのような非経口用媒介物、リンガー（Ringer）のデキストロースなどを含む。保存料は、抗菌剤、酸化防止剤，キレート剤、および不活性ガスを含む。動物への投与に適した製剤の種々の成分のｐＨおよび正確な濃度は、この技術において慣例的な技能により調整される。非経口、皮内、または皮下への適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことが可能である：注射剤のための水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶剤といった無菌の希釈剤；ベンジルアルコールまたはパラオキシ安息香酸メチルのような抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤；酢酸、クエン酸、またはリン酸塩のような緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような張度の調整のための薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのような、酸または塩基を用いて調整されることが可能である。非経口用の調剤は、カプセル、ディスポーザブル注射筒、またはガラスまたはプラスチック製の複数投与用バイアル内に密閉されることが可能である。製薬上適合する結着剤および／またはアジュバント物質が、組成物の一部として含まれることが可能である。錠剤，丸薬、カプセル、トローチなどは、任意の以下の成分か、または類似の性質の化合物を含むことが可能である：微結晶セルロース，トラガカントガム、またはゼラチンのような結着剤；デンプンまたはラクトースのような賦形剤、アルギニン酸、プリモゲル（Primogel）、またはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロテス（Sterotes）のような潤滑剤；コロイド二酸化ケイ素のようなグライダント（glidant）；スクロースまたはサッカリンのような甘味料；ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料のような着香料。吸入による投与用には、化合物は、適当な噴射剤、たとえば二酸化炭素のようなガスを含んでいる加圧容器またはティスペンサーか、またはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形状で送達される。経粘膜または経皮投与のためには、透過されるべきバリアに適した浸透剤が製剤に使用される。かかる浸透剤は、一般にこの技術において周知であり、たとえば、経粘膜投与用には、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻内スプレーまたは坐剤の使用によって遂行されることが可能である。経皮投与用には、有効化合物は一般にこの技術において周知のような、軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤される。
【０１００】
任意に、製剤はまた、たとえばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、オボアルブミン、マウス血清アルブミン，ウサギ血清アルブミンなどの担体を含むことができる。ペプチドを担体タンパク質へコンジュゲートするための手段もまた、この技術において周知であり、グルタールアルデヒド、ｍ−マレイミドベンコイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステエル、カルボジイミド、およびビス−二窒素化ベンジジン（bis-biazotized benzidine）を含む。
【０１０１】
もう一つの態様においては、本件の方法はさらに、遺伝的に修飾された動物について検査される化合物を製造または合成することを含む。
【０１０２】
ペプチジル化合物は、メリフィールド合成法（メリフィールド（Merrifield）著、「ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（J. Am. Chem. Soc.）」、１９６３年、第８５巻、ｐ．２１４９〜２１５４）およびその技術に対する種々様々な有効な改良といった、標準的なペプチド合成によって便利に製造される（たとえば、グラント（Grant）ら編、「シンセティック・ペプタイズ：ア・ユーザーズ・ガイド（Synthetic Peptides: A User's Guide）」、フリーマン・アンド．カンパニー（W. H. Freeman & Co.）、ニューヨーク、１９９２年、ｐ．３８２；ジョーンズ（Jones）著、「ザ・ケミカル・シンセシス・オブ・ペプタイズ（The Chemical Synthesis of Peptides）」、クラレンドン・プレス（Clarendon Press）、オックスフォード、１９９４年、ｐ．２３０；バラニー（Barany, G.）＆メリフィールド（Merrifield, R. B.）共著、「ザ・ペプタイズ（The Peptides）」、グロス（Gross, E）およびマイエンホッファー（Meienhofer, J）共編、アカデミック・プレス、ニューヨーク、１９７９年、第２巻、ｐ．１〜２８４；ビュンシェ（Wunsch, E）編、「シンテーゼ・フォン・ペプチデン・イン・フーベン−ヴァイルズ・メトデン・デア・オルガニッシェン・ケミー（Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie）」、（ミューラー（Muler, E.）編）、第１５巻、第4版、第１および２部、ティーマ（Thieme）、シュツットガルト、１９７４年；ボダンツキー（Bodanszky, M.）著、「プリンシプルズ・オブ・ペプチド・シンセシス（Principles of Peptide Synthesis）」、スプリンガー・ヴァーラグ（Springer-Verlag）、ハイデルベルク、１９８４年；ボダンツキー（Bodanszky, M.）＆ボダンツキー（Bodanszky, A.）共著、「ザ・プラクティス・オブ・ペプチド・シンセシス（The Practice of Peptide Synthesis）」、スプリンガー・ヴァーラグ（Springer-Verlag）、ハイデルベルク、１９８４年；ボダンツキー（Bodanszky, M.）著、「インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプチド・アンド・プロテイン・リサーチ（International Journal of Peptide and Protein Research）」１９８５年、第２５巻、ｐ．４４９〜４７４）。
【０１０３】
好ましくは、ペプチドは、たとえばジビニルベンゼン，好ましくは1％（Ｗ．Ｗ）ジビニルベンゼンと架橋されたポリスチレンを含んでいる、ポリスチレンゲルビーズのような固相支持体であって、たとえばジクロロメタンまたはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）といった親油性の溶媒を用いてさらに膨潤されている支持体上で合成される。ポリスチレンは、クロロメタンまたはアミノメチル基の添加によって官能基化されることが可能である。別法として、架橋された官能基化されたポリジメチル−アクリルアミドゲルは、いったん膨潤されかつＤＭＦまたは双極性非プロトン溶媒を用いて溶媒和されれば、使用されることが可能である。たとえば、不活性のポリスチレンビーズの表面にポリエチレングリコールをグラフトすることによって生成された、ポリエチレングリコール由来のビーズのような、当業者に周知の他の固相支持体もまたペプチド合成に使用されることが可能である。好ましい市販の固相支持体は、ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ、ＰＡＣ−ＰＥＧ−ＰＳ、ＫＡ、ＫＲ、またはＴＧＲ（アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）、ＣＡ９４４０４、米国）を含む。
【０１０４】
固相ペプチド合成用には、成長しつつあるペプチド鎖のアミノブロック基の除去に、および反復されるアミノ酸カップリングに必要な、反復される処理に対して安定なブロック基が、合成の間のアミノ酸側鎖の保護のため、またα−アミノ、カルボキシル、または側鎖官能基の望ましくない反応性のマスキングのために使用される。ブロック基（また保護基またはマスキング基とも呼ばれる）は、したがって、カップリング反応に関与する活性化されたカルボキシル基を有するアミノ酸のアミノ基を保護するか、またはカップリング反応に関与するアシル化されたアミノ基を有するアミノ酸のカルボキシル基を保護する。
【０１０５】
合成の間、カップリングは、ブロック基の除去に続いて、ペプチド結合の破壊またはペプチドの別の部分に結合された任意の保護基の破壊なしに行なわれる。さらに、ペプチドのＣ−末端を保護するペプチド−樹脂アンカーは、樹脂からの切断が必要になるまで、合成プロセスの全体を通して保護されている。したがって、オルソゴナルに保護されたα−アミノ酸の適切な判断による選択により、所望の場所において、成長しつつあるペプチドへ、それがまだ樹脂に結合されている間にアミノ酸が添加される。
【０１０６】
好ましいアミノブロック基は、容易に除去可能であるが、カップリング反応および、たとえば、側鎖基の修飾のような他の操作のための条件を乗り切るべく充分に安定である。一つの態様においては、アミノブロック基は：（ｉ）室温および常圧における触媒水素化により、あるいは液体アンモニア中のナトリウム、および酢酸中の臭素化水素酸を用いて、容易に除去されるベンジルオキシカルボニル基（Ｚまたはカルボベンゾキシ）；（ｉｉ）ウレタン誘導体；（ｉｉｉ）ｔ−ブトキシカルボニルアジドまたはジ−ｔ−ブチルジカルボネートを用いて導入され、かつ、たとえば、トリフルオロ酢酸（ジクロロメタン中の５０％ＴＦＡ）または、酢酸／ジオキサン／酢酸エチル中のＨＣｌのような、穏やかな酸を用いて除去されるｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）；（ｉｖ）たとえば、第一級または二級アミン（たとえば、ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジン）のような、穏和な塩基性、非加水分解性の条件下に分解される、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）；（ｖ）２−（４−ビフェニリル）プロピル（２）オキシカルボニル基（Ｂｐｏｃ）；（ｖｉ）２−ニトロフェニルスルフェニル基（Ｎｐｓ）；（ｖｉｉ）ジチア−スクシオニル（succionyl）基（Ｄｔｓ）、からなる群より選ばれる。Ｂｏｃは、Ｆｍｏｃ化学においてＮ−末端を保護するべく広く用いられるか、あるいはＦｍｏｃは、Ｂｏｃ化学においてＮ−末端を保護するべく広く用いられる。
【０１０７】
側鎖保護基は、合成されているペプチドを形成するアミノ酸の、機能性の側鎖によって異なるであろう。側鎖保護基は、一般にＢｚｌ基またはｔＢｕ基に基づいている。側鎖内にアルコールまたはカルボン酸を有するアミノ酸は、Ｂｚｌエーテル、Ｂｚｌエステル、ｃＨｅｘエステル、ｔＢｕエーテル、またはｔＢｕエステルとして保護される。Ｆｍｏｃアミノ酸の側鎖保護は、理想的には塩基安定性および弱酸（ＴＦＡ）不安定性であるブロック基を必要とする。ペプチド合成のための多くの異なる保護基は、既に記述されている（グロス（Gross）ら共編、「ザ・ペプタイズ（The Peptides）」、アカデミック・プレス、ニューヨーク１９８１年、第３巻、参照のこと）。たとえば、4−メトキシ−２，３，６−トリメチルフェニルフルホニル（Ｎｄ−Ｍｔｒ）基は、アルギニンの側鎖保護に有用であるが、Ａｒｇ（Ｍｔｒ）の脱保護は長時間のＴＦＡ処理を必要とする。多くのやわらかい酸（ＴＦＡ、タリウム（ＩＩＩ）トリフルオロ酢酸／ＴＦＡ）に不安定な基、またはＴＦＡに安定であるがタリウム（ＩＩＩ）トリフルオロ酢酸／ＴＦＡに不安定な基、またはやわらかい酸に安定な基が、シスチンを保護するべく用いられる。
【０１０８】
二つの最も広く用いられる保護戦略は、Ｂｏｃ／Ｂｚｌ−およびＦｍｏｃ／ｔＢｕ−戦略である。Ｂｏｃ／Ｂｚｌにおいては、Ｂｏｃはアミノ保護に用いられ、種々のアミノ酸の側鎖は、Ｂｚｌ−またはｃＨｅｘベースの保護基を用いて保護される。Ｂｏｃ基は、触媒水素化条件下に安定であり、オルソゴナルにＺ基とともに、多くの側鎖基の保護のために用いられる。Ｆｍｏｃ／ｔＢｕにおいては、Ｆｍｏｃはアミノ保護に用いられ、側鎖はｔＢｕベースの保護基で保護される。
【０１０９】
別法として、ペプチジル化合物は、前記ペプチドのアミノ酸配列をコードしている核酸の組換え発現によって生成される。ランダムペプチドをコードしているライブラリーは、かかる目的のために特に好ましく、その理由は、検査されるべき広範囲の異なる化合物をそれらが提供するからである。別法として、天然に生じる核酸がスクリーンされることが可能である。この態様によれば、ペプチジル化合物をコードしている核酸は、標準的なオリゴヌクレオチド合成により生成されるか、または天然の供給源から由来しており、かつ適当な発現ベクターへ、プロモーターかまたは、無細胞系または細胞系における発現を調節することができる他の調節配列と作動可能な接続においてクローニングされる。
【０１１０】
オリゴヌクレオチドは好ましくは、次に続く適当なベクター系へのクローニングを促進するべく、５′−および３′−末端におけるリンカーまたはアダプター配列とともに、標準的な技術を用いて合成される。
【０１１１】
核酸分子を調節制御下、すなわちプロモーター配列「と作動可能な接続に」置くことは、一般に、プロモーターを、ペプチドをコードしている配列の５′（上流）にポジショニングすることにより、プロモーター配列によって発現が調節されるようにする、前記分子のポジショニングを意味する。
【０１１２】
大腸菌（E. coli）のような細菌の中で天然のペプチドを産生するための必要条件は、有効なリボソーム結合部位をもつ強力なプロモーターの使用である。大腸菌ような細菌細胞における発現に適した典型的なプロモーターは、これに限定されないが、ｌａｃｚプロモーター、温度感受性λLまたはλRプロモーター、Ｔ７プロモーター、またはＩＰＴＧ誘導可能なｔａｃプロモーターを含む。本発明の核酸分子を大腸菌において発現するための多くの他のベクター系は、この技術において周知であり、たとえば、オーズベル（Ausubel）ら著、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology）」、ワイリー・インターサエンス（Wiley Interscience）、ＩＳＢＮ  ０４７１５０３３８、１９８７年、または、サムブルック（Sambrook）ら著、「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、ニューヨーク、コールドスプリングハーバー、１９８９年）において記述されている。数ある中で、たとえば、ｐＫＣ３０（λL：シマタケ＆ローゼンバーグ（Shimatake and Rosenberg）共著、「ネイチャー」、１９８１年、第２９２巻、ｐ．１２８）；ｐＫＫ１７３−３（ｔａｃ：アマン＆ブロシウス（Amann and Brosius）共著、「ジーン（Gene）」、１９８５年、第４０巻、ｐ．１８３）；ｐＥＴ−３（Ｔ７：ステュディエ＆モーファット（Studier and Moffat）共著、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）」、１９８６年、第１８９巻、ｐ．１１３）；アラビノース誘導可能なプロモーターを含んでいるｐＢＡＤ／ＴＯＰＯ、またはｐＢＡＤ／Ｔｈｉｏ−ＴＯＰＯシリーズ（インビトロジェン（Invitrogen）、カールスバッド（Carlsbad）、カリフォルニア州）、後者はチオレドキシンとともに融合タンパク質も産生するべく指定されており、発現されたタンパク質の可溶性を増大する；ｐＦＬＥＸシリーズの発現ベクター（ファイザー・インク（Pfizer Inc.）、米国、コネティカット州）；またはｐＱＥシリーズの発現ベクター（キアゲン（Qiagen）、カリフォルニア州）、のような、細菌における発現に適したプロモーター配列および、有効なリボソーム結合部位をもつ多数のプラスミドが記述されている。
【０１１３】
真核細胞のウイルス、および真核細胞における発現に適した典型的なプロモーターは、数ある中で、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＣＭＶ−ＩＥ（サイトメガロウイルス前初期）プロモーター、Ｈ１−ＲＮＡプロモーター、およびＵ６核低分子ＲＮＡプロモーターを含む。哺乳類細胞（たとえば、ヒーラ（HeLa）細胞、ＨＵＶＥＣ細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ．Ｔ細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、分化された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞、１０Ｔ細胞）における発現に適したベクターは、これに限定されないが、インビトロジェンにより供給されるｐｃＤＮＡベクター一式、特に、ＣＭＶプロモーターを含みかつＣ−末端の６ｘＨｉｓおよびＭＹＣｔａｇをコードしているｐｃＤＮＡ ３．１ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ｔａｇ；およびレトロウイルスベクター、ｐＳＲαｔｋｎｅｏを含む（ミュラー（Muller）ら著、「モレキュラー・セル・バイオロジー（Mol. Cell. Biol.）」、１９９１年、第１１巻、ｐ．１７８５）。ベクター、ｐｃＤＮＡ ３．１ｍｙｃ−Ｈｉｓ（インビトロジェン）は、２９３Ｔ細胞において分泌された形状のペプチドを発現するために特に好ましく、その場合、発現されたペプチドまたはタンパク質は、Ｈｉｓ ｔａｇを介してタンパク質を結合するためのニッケルカラムを使用した標準的なアフィニティ技術を用いて、同種のタンパク質なしに精製されることが可能である。
【０１１４】
ペプチドの発現に適した広範囲のさらなる宿主／ベクター系が、公的に入手可能であり、たとえば、サムブルック（Sambrook）ら著、「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、ニューヨーク、コールドスプリングハーバー、１９８９年)に記述されている。
【０１１５】
核酸か、またはそれを含んでいる遺伝子構築物を、発現のため細胞へ導入するための手段は、当業者には周知である。所与の生物のために使用される技術は、既知の好首尾の技術に依存する。組換えＤＮＡを動物細胞へ導入するための手段は、数ある中で、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストランに仲介されるトランスフェクション、リポフェクトアミン（ギブコ（Gibco）、米国、メリーランド州）および／またはセルフェクチン（ギブコ、米国、メリーランド州）の使用によるようなリポソームによって仲介されるトランスフェクション、ＰＥＧ介在性のＤＮＡ取込み、エレクトロポレーション、およびＤＮＡコートされたタングステンまたは金粒子の使用によるような、微粒子ボンバード法（アグラセタス・インク（Agracetus Inc、）米国、ウィスコンシン州）を含む。
【０１１６】
低分子有機化合物を合成するための技術は、化合物に依存してかなり変わるであろうが、かかる方法は当業者には周知であろう。一つの態様においては、コンビナトリアルライブラリを製作するため、既知の化合物から適当なケミカルビルディングブロックを選ぶべくインフォマティクスが用いられる。たとえば、ＱＳＡＲ（定量的構造活性相関（Quantitative Structure Activity Relationship））モデリング法は、化合物構造の線形回帰または回帰木を用いて適合性を測定する。ケミカル・コンピューティング・グループ・インク（Chemical Computing Group, Inc.）（カナダ、モントリオール）のソフトウエアは、活性ならびに不活性化合物についてのハイスループットスクリーニングの実験データを使用して、確立的ＱＳＡＲモデルを作成しており、それは次にリード化合物を選択するために使用される。バイナリ（Binary）ＱＳＡＲ法は、特定の化合物が必要な機能を行なうことができるか否かという可能性についての「ディスクリプタ（descriptor）」を形成する化合物の三つの固有性：部分電荷、モル屈折度（結合相互作用）、およびｌｏｇＰ（分子の親脂性）に基づいている。各々の原子は、その分子内に表面積を有しており、それはそれに伴うこれら三つの性質をもつ。ある範囲内に部分荷電を有する化合物のすべての原子が測定され、表面積（ファンデルワールス表面積ディスクリプタ）が合算される。バイナリＱＳＡＲモデルは次に、活性モデルまたはＡＤＭＥＴモデルを作成するべく用いられ、それらはコンビナトリアルライブラリを造るべく用いられる。したがって、最初のスクリーンで同定されたリード化合物を含め、既知の食欲抑制剤および非抑制剤からの情報は、スクリーンされる化合物のリストを、それによって非常に活性のある化合物を同定するべく拡張するために用いられることが可能である。
【０１１７】
本発明のもう一つの態様は、たとえば、食欲不振または大食症の治療におけるような、食行動を増大する化合物を同定する方法であって、前記方法が：（ａ）食欲または食事摂取量を抑制する化合物を、そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的修飾を含んでいる、遺伝的に修飾された非ヒト動物へ投与することであって、前記遺伝的な修飾が前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており、さらに該動物の食行動を測定すること；（ｂ）該動物へ化合物を投与すること、および該動物の食行動を測定することであって、（ａ）に比較して（ｂ）における増進された食欲または食事摂取量が、該化合物が食行動を増大することを示していること、を含む方法を提供する。
【０１１８】
必然的に、（ｂ）で投与される化合物は、（ａ）で投与される化合物と異なるであろう。
【０１１９】
好ましくは、食欲または食事摂取量を抑制する化合物は、Ｃｂｌ介在性の機構によって作用しており、そのことは、本発明に記述された方法にしたがってＣｂｌ欠損マウスの食欲または食事摂取量を抑制する該化合物の能力を測定することによるといった、遺伝的に修飾されたＣｂｌ欠損動物を用いて立証されることが可能である。この場合、上記の段階（ａ）の、食欲または食事摂取量を抑制する化合物を、遺伝的に修飾された非ヒト動物へ投与することは：（ｉ）そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的修飾を含んでいる遺伝的に修飾された非ヒト動物へ化合物を投与することであって、前記遺伝的な修飾が前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており；および（ｉｉ）前記動物の食行動を測定することであって、該化合物が投与されていないＣｂｌ欠損動物に比較して低減された該動物の食欲または食事摂取量が、該化合物が食欲または食事摂取量を抑制することを示していること、を含むであろう。
【０１２０】
別の態様においては、本発明は、たとえば、食欲不振または大食症の治療におけるような、食行動を調整する化合物を同定する方法であって、前記方法が：（ａ）化合物を、機能性のＣｂｌタンパク質を発現している非ヒト動物へ投与すること、および前記動物の食行動を測定すること；（ｂ）そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的修飾を含んでいる、遺伝的に修飾された非ヒト動物の食行動を測定することであって、前記遺伝的修飾が前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており；および（ｃ）該動物の食行動を（ａ）および（ｂ）において比較することであって、（ａ）および（ｂ）の間の同等の食行動が、該化合物が食行動を調整することを示していること、を含む方法を提供する。
【０１２１】
一つの態様においては、本件の方法はさらに、上記のような非ヒト動物またはヒトへの投与のために、同定された化合物を製剤することを含む。
【０１２２】
もう一つの態様においては、本件の方法はさらに、遺伝的に修飾された動物に対して検査された化合物を、製造または合成することを含む。
【０１２３】
企図された化合物は、Ｃｂｌ阻害化合物か、またはＣｂｌの生物学的機能のアンタゴニストを含む。一つの態様においては、化合物は、Ｃｂｌに由来しかつ、ＣＡＰ、ＣｒｋＩＩ、およびＣ３Ｇからなる群より選ばれるタンパク質への結合を含めたＣｂｌ機能を、阻害するか、低減するか、または抑制することができるペプチドを含めたペプチド；Ｃｂｌ優性ネガティブ突然変異体；Ｃｂｌの非Ｃｂｌペプチド阻害剤；Ｃｂｌに結合しかつＣｂｌ機能を阻害する抗体または抗体フラグメント；有機低分子、およびＣｂｌに由来する前記ペプチドまたは前記非Ｃｂｌペプチド阻害剤をコードしている核酸、ＣｂｌをコードしているｍＲＮＡに対して指示されたアンチセンス核酸、またはアンチＣｂｌリボザイム、またはＣｂｌ遺伝子発現を標的とする低分子干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）を含めた核酸からなる群より選ばれる。
【０１２４】
用語「アンチセンス核酸」は、特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部に対して相補的であって（ワイントラウブ（Weintraub）著、「サイエンティフィックアメリカン（Scientific American）」、１９９０年、第２６２巻、ｐ．４０）、かつｍＲＮＡの翻訳のような転写後の事象を妨害することができるＤＮＡまたはＲＮＡ分子を意味するものとする。ＣｂｌをコードしているｍＲＮＡの少なくとも約１５個の隣接したヌクレオチドに相補的なアンチセンスオリゴマーが好ましく、その理由は、それらが容易に合成され、かつ標的のＣｂｌ産生細胞へ導入された際に大きい分子よりも問題を引き起こすことが少ないようであるからである。アンチセンス法の使用は、この技術において周知である（マルクス−サクラ（Marcus-Sakura）著、「アナリティカル・バイオケミストリー（Anal. Biochem.）」、１９８８年、第１７２巻、ｐ．２８９）。好ましいアンチセンス核酸は、配列番号２または３に示されたアミノ酸配列をコードしている配列の、少なくとも１５個の隣接したヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチド配列を含むであろう。
【０１２５】
本文において用いられるように、「リボザイム」は、特定の核酸配列に対してヌクレアーゼ活性を有する核酸分子である。ＣｂｌをコードしているｍＲＮＡに対して特異的なリボザイムは、たとえば、ｍＲＮＡの特定の領域に結合して切断し、それによりそれを翻訳不能にさせる。特異的に行なうためには、好ましいリボザイムは、配列番号２または３に示されたアミノ酸配列をコードしている配列の、少なくとも約１２〜１５個の隣接したヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチド配列を含むであろう。
【０１２６】
本文において用いられるように、用語「低分子干渉ＲＮＡ」（「ｓｉＲＮＡ」）、短いヘアピンＲＮＡ（「ｓｈＲＮＡ」）、および「ＲＮＡｉ」は、遺伝子産物を特異的に標的とするホモ二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を指し、それにより、結果として無効なまたは低次形態の表現型を生じる。特に、ｄｓＲＮＡは、Ｃｂｌをコードしている標的ＲＮＡに由来し、かつそれらがアニールすることができるような自己相補性を有する二つの短いヌクレオチド配列を含み、おそらく転写後のレベルにおいて標的遺伝子の発現を妨害する。ＲＮＡｉ分子は、ファイア（Fire）ら、「ネイチャー」、１９９８年、第３９１巻、ｐ．８０６〜８１１により記述されており、またシャープ（Sharp）、「ジーンズ＆ディベロップメント（Genes & Development）」、１９９９年、第１３巻、ｐ．１３９〜１４１により総説されている。当業者には周知のように、短いヘアピンＲＮＡ（「ｓｈＲＮＡ」）はｓｉＲＮＡと類似しているが、一本鎖の核酸を含んでおり、相補的な配列は介在するヘアピンループでもって分離されており、細胞への導入の後、ヘアピンループの開裂によってｓｉＲＮＡへプロセスされるようにする。したがって、本文に記述された各々の、およびすべての態様は、等しくｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡへ適用可能である。
【０１２７】
好ましいｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡの約１９〜２１個の隣接したヌクレオチドと同等なヌクレオチド配列を含む。好ましくは、ＣｂｌｍＲＮＡ中の標的配列は、ジヌクレオチドＡＡで始まり、約３０〜７０％（好ましくは３０〜６０％、さらに好ましくは４０〜６０％、最も好ましくは約４５〜５５％）のＧＣ含有量を含んでおり、かつ、たとえば、標準的なＢＬＡＳＴサーチによって測定されるような、それが導入されるべき動物のゲノム中の、ｃ−Ｃｂｌ癌原遺伝子以外の任意のヌクレオチド配列に対して、高いパーセンテージの同一性を有していない。
【０１２８】
ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、好ましくは、細胞内でのヒトｃ−Ｃｂｌの発現をダウンレギュレートすることができる。このことは、マウスおよびヒトのｃ−Ｃｂｌコード遺伝子の間の、特にコード領域における高いパーセンテージの保存を考慮して、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡへの要求が、ヒトｃ−Ｃｂｌコード遺伝子に特異的であることを示すものとされるべきではない。本文に記述された細胞ベースのモデルおよび動物のモデルにおいては、ある状況下では、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ分子にとって、内在性のマウスｃ−Ｃｂｌならびに、細胞内で異所性に発現されたヒトｃ−Ｃｂｌの双方の発現を低減することは可能であり適切である。ヒトのｃ−Ｃｂｌに対する任意のアンタゴニストの比活性の確認は、ヒトのｃ−Ｃｂｌを発現するべく設計されたｃ−Ｃｂｌ-/-マウスに由来する細胞において、阻害剤の活性を評価することにより測定される。
【０１２９】
本文に例示されるように、ｃ−Ｃｂｌをコードしている遺伝子に対して好ましいｓｉＲＮＡは、配列番号４〜２３９の任意の一つに示される２１個のヌクレオチド配列を含む。この関係において、配列番号４〜１２１の各々は、（ｉ）ヒトｃ−ＣｂｌｍＲＮＡ標的配列に相当する、前記ｍＲＮＡ標的中のジヌクレオチドＡＡの隣接および下流の１９個のヌクレオチド配列；および（ｉｉ）３′−延長ジヌクレオチドＴＴを含む。配列番号１２２〜２３９は、各々、（ｉ）配列番号４〜１２１に各々含まれていたヒトｃ−ＣｂｌｍＲＮＡ標的配列に対して相補的な１９個のヌクレオチド配列、および（ｉｉ）３′−延長ジヌクレオチドＴＴを含む。
【０１３０】
配列番号４〜２３９に示された、例示されたｓｉＲＮＡからｓｈＲＮＡを産生するためには、センスおよびアンチセンス鎖は、それらが介在するループ配列の両側面に隣接するようにポジショニングされる。好ましいループ配列は：
（ｉ）ＣＣＣ（配列番号２４０）；
（ｉｉ）ＴＴＣＧ（配列番号２４１）；
（ｉｉｉ）ＣＣＡＣＣ（配列番号２４２）；
（ｉｖ）ＣＴＣＧＡＧ（配列番号２４３）；
（ｖ）ＡＡＧＣＴＴ（配列番号２４４）；
（ｖｉ）ＣＣＡＣＡＣＣ（配列番号２４５）；および
（ｖｉｉ）ＴＴＣＡＡＧＡＧＡ（配列番号２４６）
からなる。これらのループ配列のうち、配列番号２４６に示された配列は、細胞、組織（たとえば、骨格筋、または全生物体）におけるヒトｃ−Ｃｂｌの発現を調整するために特に好ましい。
【０１３１】
マウスｃ−Ｃｂｌ発現に比較して、ヒトｃ−Ｃｂｌ発現に対して選択的に活性のある好ましいｓｉＲＮＡ分子は、ヒトｃ−Ｃｂｌ遺伝子の５′の非コードおよび／または３′の非コード領域の配列に由来する。かかる特異的ｓｉＲＮＡは、たとえば、配列番号５７〜５９、１１７〜１２１、１７５〜１７７、および２３５〜２３９を含む。
【０１３２】
アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、ｃ−Ｃｂｌをむき出しのＤＮＡとして発現することができる細胞または無細胞抽出物へ直接導入されることが可能である。別法として、核酸阻害分子をコードしているＤＮＡは、適当なプロモーターおよび転写ターミネーター配列と作動可能な関係において細胞内へ導入され、阻害核酸の発現を促進する。Ｃｂｌを発現する哺乳類細胞における発現のために好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ユビキチンプロモーター、Ｕ６核低分子ＲＮＡプロモーター（リー（Lee）ら著、「ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotech.）」、２００２年、第２０巻、ｐ．５００〜５０５；ミヤギシ（Miyagishi）ら著、「ネイチャー・バイオテクノロジー」、２００２年、第２０巻、ｐ．４９７〜５００；ポール（Paul）ら著、「ネイチャー・バイオテクノロジー」、２００２年、第２０巻、ｐ．５０５〜５０８；およびユー（Yu）ら著、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）」、２００２年、第９９巻、ｐ．６０４７〜６０５２）、Ｈ１−ＲＮＡプロモーター（ブラメルカンプ（Brummelkamp）ら著、「サイエンス」、２００２年、第２９６巻、ｐ．５５０〜５５３）、または他のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含む。ｐｏｌ ＩＩＩターミネーターもまた、かかる適用には好ましい。他のプロモーターおよびターミネーターが除外されるものではない。
【０１３３】
一つの態様においては、阻害核酸をコードしているＤＮＡは、必要なプロモーターおよび転写ターミネーター配列を含んでいる適当なベクター内へクローニングすることにより、プロモーターおよびターミネーター調節配列へ、作動できるように接続され、組換えベクターは次いで、プラスミドＤＮＡの一過性のトランスフェクションによるか、永続性の細胞系を確立することによるか、あるいはレトロウイルス発現ベクターを用いた感染において、細胞、組織、または臓器へ導入される（バートン（Barton）ら著、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）」、２００２年、第９９巻、ｐ．１４９４３〜１４９４５；デブロエ（Devroe）ら著、「ＢＭＣバイオテクノロジー（BMC Biotech.）」、２００２年、第２巻、ｐ．１５）。
【０１３４】
ハイスループット一次アッセイにおいては、少なくとも、インビトロの無細胞系か、またはＣｂｌ活性がアッセイされる細胞ベースの系を使用することが好ましい。この目的のため、たとえば、アンビオン（Ambion）により供給されるｐＳｉｌｅｎｓｅｒシリーズのベクター（ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２．０、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２．１、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ３．０、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ３．１、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０−Ｕ６）を含めたいくつかのベクターが知られている。
【０１３５】
たとえば、ハイスループットスクリーンにおいて、リン酸カルシウム沈殿（ケテラー（Ketteler）ら著（「ジーン・セラピー（Gene Ther.）」、２００２年、第９巻、ｐ．４７７〜４８７）により、単離された細胞内へ一過性にトランスフェクトするため、あるいは、低速スループットスクリーニングまたは一次スクリーンの結果の確認のための、形質導入性の上清の産生のため（ケテラー（Ketteler）ら著（「ジーン・セラピー（Gene Ther.）」、２００２年、第９巻、ｐ．４７７〜４８７）に好ましいレトロウイルスベクターは、ｐＢＡＢＥ（モーガンスタン（Morgenstern）ら著、「ヌクレイック・アシズ・リサーチ（Nuc. Acids res.）」、１９９０年、第１８巻、ｐ．３５８７〜３５９６）、およびＪＺｅｎＮｅｏを含む。
【０１３６】
ｐＢａｂｅレトロウイルスベクター構築物は、挿入された遺伝子を高力価に伝播し、Ｍｏ ＭｕＬＶロング・ターミナル・リピート（ＬＴＲ）から発現する。ｐＢａｂｅベクターは優性に作用する４つの異なる選択可能なマーカーのうちの一つを含んでおり、感染された哺乳類細胞が、Ｇ４１８、ハイグロマイシンＢ、ブレオマイシン／フレオマイシンまたはピュロマイシンの存在下に増殖できるようにする。高力価、エコトロピック、ヘルパーフリーのパッケージング細胞系、オメガ（omega）Ｅは、相同性の組換え事象により野生型のＭｏ ＭｕＬＶが発生するリスクを低減する。合わせて、ｐＢａｂｅベクターおよびオメガＥ細胞系は、単一細胞において、ヘルパーウイルスのコンタミネーションの最小限のリスクをもって、高頻度の遺伝子トランスファーおよび／またはｃ−Ｃｂｌと、一以上の他の遺伝子（たとえば、ＡＰＳおよび／またはインスリン受容体βサブユニット）との同時発現を提供する。
【０１３７】
低速スループット一次スクリーニングまたは確認用アッセイのためには、アデノウイルスベクターｐＡｄＴｒａｃｋ、およびｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ（ヒー（He）ら著、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.  USA）」、１９９８年、第９５巻、ｐ．２５０９〜２５１４）、ｐＡｄＴｒａｃｋ−ＨＰ（チャオ（Zhao）ら著、「ジーン」、２００３年、第３１６巻、ｐ．１３７〜１４１）、Ａｄ５ＣＭＶをベースとするベクター、たとえば、Ａｄ５ＣＭＶ−ＧＦＰ（スオカ（Suoka）ら著、「アメリカン・ジャーナル・オブ・レスピレーション・セル・モレキュラー・バイオロジー（Am. J. Repir. Cell Biol.）」）、２０００年、第２３巻、ｐ．２９７〜３０３）、およびｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ａｄｅｎｏ １．０−ＣＭＶ（アンビオン）が、特定の臓器または組織、特にマウスモデルの筋肉組織における送達および発現に好ましい。
【０１３８】
ｐＡｄＴｒａｃｋおよびｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶベクターは、トランスフェクションまたは形質導入効率の標準化を必要とする適用、たとえば、トランスジェニックマウスモデルの後脚筋肉へのアデノウイルスの注射に特に好ましい。ｐＡｄＴｒａｃｋベクターは、選択されたプロモーターの支配下にあるトランス遺伝子を含んでいる、ＧＦＰ追跡可能なウイルスの産生に使用される。それは、増大されたＧＦＰをコードする遺伝子、外来性トランス遺伝子の挿入のための、アデノウイルス配列（「アーム」）に囲まれたポリリンカーを含んでおり、ｐＡｄＥａｓｙ−１との相同組み換えを可能にする。左アームは、大腸菌におけるｐＡｄＥａｓｙベクターとの相同組み換えを仲介するＡｄ５ヌクレオチド３４，９３１〜３５，９５３、プラス逆向きの末端反復（ＩＴＲ）、および哺乳類細胞におけるウイルス産生に必要なパッケージングシグナル配列（Ａｄ５のヌクレオチド１〜４８０）を含む。右アームはＡｄ５ヌクレオチド３，５３４〜５，７９０を含んでおり、それはｐＡｄＥａｓｙベクターとの相同組み替えを仲介する。人為的に作成されたＰａｃｌ部位が、双方のアームを取囲む。ｐＡｄＴｒａｃｋプラスミドはまた、ｐＺｅｒｏ ２．１（インビトロジェン）からのカナマイシン耐性遺伝子、およびｐＢＲ３２２（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies））からの複製起点を含む。この起点を用いて産生されるプラスミドの比較的低いコピー数は、大腸菌における大きい構築物の安定性に必須である。ｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびポリアデニル化部位（双方ともｐＥＧＦＰ−Ｃ１、クロンテック（Clontech））の添加を除き、ｐＡｄＴｒａｃｋと同等である。ポリリンカーが、ＣＭＶプロモーターとポリアデニル化部位との間に存在する。
【０１３９】
当業者には周知のように、かかるアデノウイルスベクターもまた細胞系のトランスフェクションに適している。
【０１４０】
用語「優性ネガティブ突然変異体」は、その天然の状態から変異しており、かつＣｂｌが普通には相互作用するタンパク質と相互作用し、それにより内在性の天然のＣｂｌが相互作用を形成することを妨げているＣｂｌポリペプチドを指す。好ましい優性ネガティブ突然変異体は、ＣＡＰ、ＣｒｋＩＩ、およびＣＧ３からなる群より選ばれるタンパク質と相互作用するＣｂｌの部位を欠くであろう。
【０１４１】
好ましい優性ネガティブ突然変異体は、たとえば、置換または欠失突然変異といった天然のＣｂｌタンパク質の変異体を含んでおり、Ｃｂｌ機能の優性ネガティブ突然変異体として作用する。たとえば、優性ネガティブ突然変異体は、ｃ−ＣｂｌのＲＩＮＧドメイン内に一以上のアミノ酸の置換を含んでよい。細胞内で発現された場合、かかる優性ネガティブ突然変異タンパク質は、ＡＰＳタンパク質および／またはインスリン受容体βサブユニットに関して天然の内在性のｃ−Ｃｂｌと競合するが、受容体に関して低減されたＥ３ユビキチンリガーゼ活性をもつか、または活性がない。別の態様においては、優性ネガティブ突然変異体は、正常には細胞内でリン酸化されることとなるチロシン残基の１または２または3個の置換を含む。突然変異した核酸を産生するための手段は、当業者には周知であり、たとえば、ストラタジーン（Stratagene）、米国、カリフォルニア州、ラホヤ）により供給される、クイック・チェンジ・ミュータジェネシス・キット（Quick Change Mutagenesis kit）を、製造業者の指示に従って使用することにより容易に達成されてよい。
【０１４２】
優性ネガティブ突然変異タンパク質は、本質的に本文において細胞におけるペプチドの発現について前述されたように、突然変異タンパク質をコードしている核酸の発現により産生される。ｃ−Ｃｂｌの代表的な優性ネガティブ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号２４８（ｃ−Ｃｂｌ  Ｇ３０６Ｅ）、配列番号２５０（ｃ−Ｃｂｌ  Ｃ３８１Ａ）、配列番号２５２（ｃ−Ｃｂｌ  Ｙ７００Ｆ）、配列番号２５４（ｃ−Ｃｂｌ  Ｙ７３１Ｆ）、配列番号２５６（ｃ−Ｃｂｌ  Ｙ７７４Ｆ）、配列番号２５８（ｃ−Ｃｂｌ  Ｙ７００Ｆ／Ｙ７３１Ｆ／Ｙ７７４Ｆ）、および配列番号２６０（ｃ−Ｃｂｌ４８０、すなわち、天然のヒトｃ−Ｃｂｌの残基４８０においてトランケートされている）に示されている。
【０１４３】
本文において企図された「抗体」は、Ｃｂｌポリペプチドかまたはその機能性のフラグメントと免疫反応性である。異なるエピトープ特異性をもつプールされたモノクローナル抗体、ならびに別個のモノクローナル抗体標品から本質的に構成される抗体が企図される。モノクローナル抗体は、一以上のＢ細胞エピトープを含むＣｂｌタンパク質のフラグメントから、当業者には周知の方法により産生される（コーラ（Kohler）ら著、「ネイチャー」、１９７５年、第２５６巻、ｐ．４９５）。用語「抗体」は、本文において用いられるように、インタクトな分子、ならびに、ＦａｂおよびＦ（ａｂ′）2、Ｆｖ、およびＣｂｌのエピトープ決定基と結合することができる単鎖抗体フラグメントのような、そのフラグメントを含む。
【０１４４】
「Ｆａｂフラグメント」は、抗体分子の一価の抗原結合性フラグメントからなり、酵素パパインを用いた抗体分子全体の消化により産生されることが可能であり、インタクトな軽鎖および重鎖の一部からなるフラグメントを生じる。
【０１４５】
抗体分子の「Ｆａｂ′フラグメント」は、ペプシンを用いて抗体分子全体を処理すること、およびそれに続く還元により取得されることが可能であり、インタクトな軽鎖および重鎖の一部からなる分子を生じる。この方式で処理された抗体分子あたり、２個のＦａｂ′フラグメントが得られる。
【０１４６】
抗体の「Ｆ（ａｂ′）2フラグメント」は、二つのジスルフィド結合によって結び合わされた二つのＦａｂ′フラグメントのダイマーからなり、酵素ペプシンを用いて抗体分子全体を処理することにより、その後の還元なしに得られる。（Ｆａｂ′）ｓｕｂ．２フラグメント。
【０１４７】
Ｆｖフラグメントは、軽鎖の可変領域および２つの鎖で表される重鎖の可変領域を含んでいるフラグメントとして遺伝子工学的に設計される。
【０１４８】
「短鎖抗体」（ＳＣＡ）は、適当な、フレキシブルなポリペプチドリンカーにより連結された、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含んでいる単鎖分子として遺伝子工学的に設計される。
【０１４９】
一つの態様においては、ペプチジルＣｂｌ阻害剤は、Ｃｂｌ配列（配列番号２または３）にまたがるオリゴペプチド（長さ約１０〜２５アミノ酸）として、化学的または組換えにより合成される。別法として、Ｃｂｌフラグメントは天然の、または組換えにより産生されたＣｂｌの、たとえば、プロテアーゼ、たとえばトリプシン、サーモリシン、キモトリプシン、またはペプシンを使用することによる消化によって産生される。コンピュータ分析（市販のソフトウエア、たとえば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、Ｏｍｅｇａ、ＰＣＧｅｎｅ、モレキュラー・シミュレーション・インク（Molecular Simulation, Inc.）を用いた）は、タンパク質分解による切断部位を同定するべく用いられる。タンパク質分解または合成フラグメントは、Ｃｂｌ機能を部分的にまたは完全に阻害するために必要な程の、多くのアミノ酸残基を含むことができる。好ましいフラグメントは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、またはそれより多いアミノ酸の長さを含むであろう。
【０１５０】
一つの態様においては、哺乳類へ投与された時、抗体を誘発するための充分な数のＢ細胞エピトープを含むペプチドが選ばれる。かかるペプチドは、単独か、またはアジュバントと併用して、あるいはアジュバント（たとえば、ハプテン）に結合されたペプチドを用いて、哺乳類を免疫することにより同定される。免疫された動物からの血清は、抗Ｃｂｌ抗体について検査される。好ましいペプチドは、Ｃｂｌ機能を阻害する抗Ｃｂｌ抗体を生じる。
【０１５１】
好ましいペプチジルＣｂｌ阻害剤はまた、アルゴリズム（ロスバード＆テイラー（Rothbard and Taylor）共著、「ＥＭＢＯジャーナル（EMBO J.）」、１９８８年、第７巻、ｐ．９３〜１００；ベルゾフスキー（Berzofsky）著、「フィロソフィカル・トランスアクションズ・オブ・ザ・ロイヤル・ソサイエティ．オブ・ロンドン（Phios Trans R. Soc. Lond.）」、１９８９年、第３２３巻、ｐ．５３５〜５４４；ロスバード著、「ファースト・フォーラム・イン・ビロロジー、アナルズ・オブ・ザ・パスツール・インスティテュート（1 st Forum in Virology, Annals of the Pasteur Institute）」、１９８６年１２月、ｐ．５１８〜５２６；ロスバード＆テイラー共著、「Ｅｍｂｏ」、１９８８年、第７巻、ｐ．９３〜１００；欧州特許第０  ３０４  ２７９号；およびマルガリット（Margalit）ら著、「ジャーナル・オブ・イムノロジー（J. Immunol.）」、１９８７年、第１３８巻、ｐ．２２１３〜２２２９）を用いたエピトープ予測か、または、ペプチド阻害剤をヒトＴ細胞刺激活性またはＴ細胞増殖アッセイに関してスクリーニングすること（たとえば、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.  USA）」、１９８９年、第８６巻、ｐ．１３３３）のような、多くの既知の技術のいずれかを用いて測定される際に、Ｔ細胞介在性の（たとえば、サイトカイン）反応を誘導するべく充分な数のＴ細胞エピトープを含まないであろう。
【０１５２】
他の好ましいＣｂｌのペプチド阻害剤は、Ｃｂｌタンパク質の表面の、たとえば、親水性領域、ならびに、高い抗原性を持つ領域に局在するか、あるいは高い表面確率のスコアをもつフラグメントは、当業者には周知のコンピュータ分析プログラム（ホップ＆ウッド（Hopp and Wood）共著、「モレキュラー・イムノロジー（Mol. Immunol.）」、１９８３年、第２０巻、ｐ．４８３〜９；カイト＆ドゥリトル（Kyte and Doolittle）共著、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）」、１９８２年、第１５７巻、ｐ．１０５〜３２；コリガン＆ホアング（Corrigan and Huang）共著、「コンピュータ・プログラムズ・イン・バイオメディスン（Comput. Programs Biomed.）」、１９８２年、第3巻、ｐ．１６３〜８）を用いて同定されることが可能である。
【０１５３】
抗Ｃｂｌ抗体または抗体フラグメントは、完全なＣｂｌポリペプチドか、またはその免疫原性フラグメントを用いて（単独で、または適切な担体またはハプテンへ結合されて）産生され、被験者（たとえば、これに限定されないが、ウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳類を含む哺乳類）を免疫する。たとえば、米国特許第５，４２２，１１０，；５，８３７，２６８；５，７０８，１５５；５，７２３，１２９；および５，８４９．５３１号に記述された方法が使用可能であり、本文において参照により取入れられている。好ましい態様においては、免疫される哺乳類は、内在性のＣｂｌを含まない（たとえば、Ｃｂｌ欠損性の、遺伝的に修飾された動物）。免疫原標本はさらに、フロイント（Freund）の完全または不完全アジュバントのようなアジュバントか、または類似の免疫刺激剤を含むことができる。免疫原性の、タンパク質分解または合成によるＣｂｌペプチド標品を用いた、適当な被験者の免疫化は、ポリクローナルな抗Ｃｂｌ抗体反応を誘導する。免疫された被験者における抗Ｃｂｌ抗体の力価は、一般に、固定されたＣｂｌを用いたエンザイム・リンクド・イムノソルベント・アッセイ（enzyme linked immunosorbent assay）（ＥＬＩＳＡ）を用いるような、標準的な技術により、ある期間にわたってモニターされる。その後、免疫された被験者からの血清は、Ｃｂｌ阻害活性について検査されることが可能である。
【０１５４】
別法として、リシグリアーノ（Ricigliano）らの米国特許第５，７９５，８７２号か、あるいはロビンソン（Robinson）らの米国特許第５，６４３，５７８号に開示されたような、ＤＮＡ免疫技術を用いて、Ｃｂｌを発現する核酸を用いて被験者を免疫化することも可能である。
【０１５５】
Ｃｂｌに向けられた抗体分子は、哺乳類から（たとえば、血液から）単離され、ＩｇＧ分画を得るためのプロテインＡクロマトグラフィーのような、周知の技術によってさらに精製されることが可能である。免疫化後の適当な時間に、たとえば抗Ｃｂｌ抗体の力価が最高である時、抗体産生細胞が被験者から得られ、以下の公表されたものにおいてオリジナルに記述された、ハイブリドーマ技術のような、標準的な技術により、たとえばモノクローナル抗体を調製するべく使用される：コーラ＆ミルスタイン（Kohler and Milstein）共著、「ネイチャー」、１９７５年、第２５６巻、ｐ．４９５〜４９７；ブラウン（Brown）ら著、「ジャーナル・オブ・イムノロジー（J. Immunol.）」、１９８１年、第１２７巻、ｐ．５３９４６；ブラウンら著、１９８０年、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol Chem. ）」、１９８０年、第２５５巻、ｐ．４９８０〜４９８３；イエイ（Yeh）ら著、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）」、１９７６年、第７６巻、ｐ．２９２７〜２９３１）；イエイら著、「インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Int. J. Cancer）」、１９８２年、第２９巻、ｐ．２６９〜２７５；コズボー（Kozbor）ら著、「イムノロジー・トゥデイ（Immunol Today）」、１９８３年、第4巻、ｐ．７２；コール（Cole）ら著、「モノクローナル・アンチボディズ・アンド・キャンサー・セラピー（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy）」、アラン・Ｒ・リス・インク（Alan R Liss, Inc）、１９８５年、ｐ．７７〜９６。モノクローナル抗体ハイブリドーマを産生するための技術は、この技術分野において周知である。手短かに言えば、不死の細胞系（典型的にはミエローマ）が、上記のようなＣｂｌペプチド免疫原で免疫された哺乳類からのリンパ球（典型的には脾細胞）へ融合され、結果として得られたハイブリドーマ細胞の培養上清が、Ｃｂｌと結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定するべくスクリーンされる。
【０１５６】
リンパ球および不死化された細胞系を融合するために使用された任意の既知のプロトコールが、抗Ｃｂｌモノクローナル抗体を産生する目的のために適用されることが可能である（たとえば、ガルフル（G. Galfre）ら著、「ネイチャー」、１９７０年、第２６６巻、ｐ．５５０〜５５２参照）。さらに、当業者は、かかる方法には多くの変形があり、それらもまた有用となることを認識するであろう。典型的には、不死細胞系（たとえば、ミエローマ細胞系）は、リンパ球と同じ哺乳類種から由来する。たとえば、マウスハイブリドーマは、本発明の免疫原標品により免疫されたマウスからのリンパ球を、不死化されたマウス細胞系と融合させることによって作成されることが可能である。好ましい不死細胞系は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含有する培地（「ＨＡＴ培地」）に対して感受性であるマウスミエローマ細胞系である。標準的な技術により、任意の多くのミエローマ細胞系、たとえば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３、またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４ミエローマ細胞系が、融合相手として使用可能である。これらのミエローマ細胞系は、ＡＴＣＣから入手可能である。典型的には、ＨＡＴ感受性のマウスミエローマ細胞が、マウス脾細胞へ、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を用いて融合される。融合の結果生じたハイブリドーマ細胞は、次に、未融合および非生産性に融合したミエローマ細胞を殺す、ＨＡＴ培地を用いて選択される（未融合の脾細胞は、それらがトランスフォームされていないため、数日後に死ぬ）。本発明のモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマ細胞は、ハイブリドーマの培養上清を、たとえば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて、Ｃｂｌと結合する抗体についてスクリーニングすることにより検出される。次いで、抗体はＣｂｌ阻害活性について検査されることが可能である。
【０１５７】
一つの態様においては、本発明の有機低分子阻害剤またはｃ−Ｃｂｌのアンタゴニストは、ｃ−ＣｂｌのＥ３ユビキチンリガーゼ活性を低減する化合物であり、それによりｃ−Ｃｂｌによるインスリン受容体βサブユニットのユビキチン化が低減される。好ましくは、有機低分子は、ユビキチンおよびインスリン受容体βサブユニットに関して、ｃ−Ｃｂｌの非競合性阻害剤である。好ましい態様においては、有機低分子はｃ−ＣｂｌのＲＩＮＧフィンガードメイン（すなわち、配列番号３のほぼ位置３８０からほぼ位置４２１までの残基を含むかまたはその中に含まれるアミノ酸配列）に結合する化合物の部類、たとえば、ベンズスルホンアミド、尿素、またはイミダゾロンに属する。
【０１５８】
本発明のさらなる観点は、たとえば、低脂血症（たとえば、無βリポタンパク血症、栄養失調症、または、急性骨髄性白血病または慢性骨髄性白血病のような血液学的悪性疾患を患っている患者において観察されるような）の治療におけるような、脂肪沈着を増大するか、除脂肪筋肉量を低減するか、体脂肪対筋肉比を増大するか、または代謝率を低減する化合物を同定する方法であって、前記方法が：（ａ）そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的な修飾を含んでいる遺伝的に修飾された非ヒト動物へ、化合物を投与することであって、前記遺伝的な修飾が前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており；および（ｂ）該動物の脂肪含有量を測定することであって、該化合物がそれへ投与されていない、Ｃｂｌ欠損動物の脂肪含有量に比較した、該動物の増大された脂肪含有量が、該化合物が脂肪沈着を増大するか、除脂肪筋肉量を低減するか、体脂肪対筋肉比を増大するか、または代謝率を低減することを示していること、を含む方法を提供する。
【０１５９】
「脂肪沈着」により、肝臓、脂肪、または筋肉細胞において、沈着される脂肪の量、または脂肪が沈着される速度が意味される。当業者に周知の標準的な手段が、脂肪沈着を測定するべく使用される。「除脂肪筋肉量」は、実質的に脂肪のない筋肉組織を意味する。「体脂肪対筋肉量比」は、全非脂肪組織に対する全体脂肪の相対的な量を意味する。「代謝率」は、かかる食事摂取量を体脂肪として貯蔵するよりも、むしろ即時のエネルギー要求のために食事摂取量を利用する、患者の能力を意味する。
【０１６０】
遺伝的に修飾された動物、およびＣｂｌ欠損動物は、前文に記述されている。
【０１６１】
脂肪沈着を増大するか、または除脂肪筋肉量を低減するか、または体脂肪対筋肉比を増大するか、または代謝率を低減するために、本文において企図された化合物の範囲は、Ｃｂｌに由来しかつＣｂｌ欠損性を補うことができるペプチドを含めたペプチド；たとえば、Ｃｂｌペプチド模倣物のような、非Ｃｂｌペプチド；たとえば、公に入手可能なコンビナトリアル・ライブラリに由来するような有機低分子；およびＣｂｌに由来する前記ペプチドかまたは前記非Ｃｂｌペプチドをコードしている核酸を含めた核酸、を含む。かかる化合物は、前文に記述されている。
【０１６２】
一つの態様においては、本件の方法はさらに、同定された化合物を非ヒト動物またはヒトへの投与のために製剤することを含む。かかる製剤は、前文に記述されている。
【０１６３】
もう一つの態様においては、本件の方法はさらに、遺伝的に修飾された動物に対して検査される化合物を産生または合成することを含む。かかる方法は、前文に記述されている。
【０１６４】
別の態様においては、本発明は、たとえば、肥満症の治療におけるような、脂肪沈着を低減するか、除脂肪筋肉量を増大するか、体脂肪対筋肉比を減少させるか、または代謝率を増大する化合物を同定する方法であって、前記方法が（ａ）そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的な修飾を含んでいる遺伝的に修飾された非ヒト動物へ、脂肪沈着またはグルコース取込みを増大する化合物を投与することであって、前記遺伝的な修飾が前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており、かつ該動物の脂肪含有量を測定すること；（ｂ）該動物へ化合物を投与しかつ該動物の脂肪含有量を測定することであって、（ａ）に比べて（ｂ）における同等のまたは低減された脂肪含有量が、該化合物が脂肪沈着を低減するか、除脂肪筋肉量を増大するか、体脂肪対筋肉比を低減するか、または代謝率を増大することを示していること、を含む方法を提供する。
【０１６５】
好ましくは、動物は、高いグリセミック指数の食物、たとえば、ニンジンか、またはスクロースが補われた食物を含む食餌で維持される。
【０１６６】
好ましくは、脂肪沈着を増大するか、または除脂肪筋肉量を低減するか、または体脂肪対筋肉比を増大するか、または代謝率を低減する化合物は、Ｃｂｌ介在性の機構によって作用しており、そのことは、遺伝的に修飾されたＣｂｌ欠陥動物を用いて、該化合物の、Ｃｂｌ欠損マウスの脂肪含有量を増大する能力を、本文に記述された方法に従って測定することなどにより、確証されることが可能である。この場合、上記、段階（ａ）の脂肪沈着またはグルコース取込みを増大する化合物を投与することは、（ｉ）そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的な修飾を含んでいる遺伝的に修飾された非ヒト動物へ、化合物を投与することであって、前記遺伝的な修飾が前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており；および（ｉｉ）該動物の脂肪含有量を測定することであって、該化合物が投与されていない、Ｃｂｌ欠損動物の脂肪含有量に比較して、該動物の増大された脂肪含有量が、該化合物が脂肪沈着を増大するか、除脂肪筋肉量を低減するか、体脂肪対筋肉比を増大するか、または代謝率を低減することを示していること、を含む。
【０１６７】
別の態様においては、本発明は、脂肪沈着を低減するか、除脂肪筋肉量を増大するか、体脂肪対筋肉比を減少させるか、または代謝率を増大する化合物を同定する方法であって、前記方法が：（ａ）化合物を、機能性のＣｂｌタンパク質を発現している非ヒト動物へ投与すること、および該動物の脂肪含有量を測定すること；（ｂ）そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的修飾を含んでいる、遺伝的に修飾された非ヒト動物の脂肪含有量を測定することであって、前記遺伝的修飾が前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており；および（ｃ）該動物の脂肪含有量を（ａ）および（ｂ）において比較することであって、（ａ）および（ｂ）の間の同等の脂肪含有量が、該化合物が脂肪沈着を低減するか、除脂肪筋肉量を増大するか、体脂肪対筋肉比を低減させるか、または代謝率を増大することを示していること、を含む方法を提供する。
【０１６８】
好ましくは、動物は、類似した、または同一の食餌で、さらに好ましくは、高いグリセミック指数の食物を含む食餌で維持される。
【０１６９】
本文において企図された化合物は、Ｃｂｌ阻害化合物か、またはＣｂｌの生物学的機能のアンタゴニストを含む。一つの態様においては、化合物は、Ｃｂｌに由来しかつ、ＣＡＰ、ＣｒｋＩＩ、およびＣ３Ｇからなる群より選ばれるタンパク質への結合を含めたＣｂｌ機能を、阻害するか、低減するか、または抑制することができるペプチドを含めたペプチド；Ｃｂｌ優性ネガティブ突然変異体；Ｃｂｌの非Ｃｂｌペプチド阻害剤；Ｃｂｌに結合しかつＣｂｌ機能を阻害する抗体または抗体フラグメント；有機低分子、およびＣｂｌに由来する前記ペプチドまたは前記非Ｃｂｌペプチド阻害剤をコードしている核酸、ＣｂｌをコードしているｍＲＮＡに対して指示されたアンチセンス核酸、またはアンチＣｂｌリボザイム、ＲＮＡｉ、またはｓｉＲＮＡを含めた核酸からなる群より選ばれる。
【０１７０】
一つの態様においては、本件の方法はさらに、同定された化合物を非ヒト動物またはヒトへの投与のために製剤することを含む。かかる製剤は、前文に記述されている。
【０１７１】
もう一つの態様においては、本件の方法はさらに、遺伝的に修飾された動物に対して検査される化合物を産生または合成することを含む。かかる方法は、前文に記述されている。
【０１７２】
本発明のさらなる観点は、たとえば、低脂血症（たとえば、無βリポタンパク血症、栄養失調症、または、急性骨髄性白血病または慢性骨髄性白血病のような血液学的悪性疾患を患っている患者において観察されるような）の治療におけるような、グルコース取込みを増大する化合物を同定する方法であって、前記方法が：（ａ）そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的な修飾を含んでいる遺伝的に修飾された非ヒト動物へ、化合物を投与することであって、前記遺伝的な修飾が前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており；および（ｂ）該動物の肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを測定することであって、該化合物が投与されていない、Ｃｂｌ欠損動物の肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みに比較して、増大された取込みが、該化合物がグルコース取込みを増大することを示していること、を含む方法を提供する。
【０１７３】
グルコース取込みを測定するための手段は、この技術分野において周知である。好ましくはプロセスは、あらかじめ動物から単離されていた肝臓、脂肪、または筋肉細胞を用いて、エクスビボで行なわれる。一つの態様においては、グルコース取込みは、基準のグルコース取込み（すなわち、外来性に投与されたインスリンの不在下に測定されるグルコース取込み）である。もう一つの態様においては、グルコース取込みはインスリン介在性のグルコース取込み（すなわち、インスリンの投与の後に測定されるグルコース取込み）である。本文に記述された、本発明のすべての態様は、他に述べられない限り、基準のグルコース取込み、およびインスリン介在性のグルコース取込みの双方に準用される。
【０１７４】
遺伝的に修飾された動物、およびＣｂｌ欠損動物は、前文に記述されている。
【０１７５】
グルコース取込みを増大するために、本文において企図された化合物の範囲は、Ｃｂｌに由来しかつＣｂｌ欠損性を補うことができるペプチドを含めたペプチド；たとえば、Ｃｂｌペプチド模倣物のような、非Ｃｂｌペプチド；たとえば、公に入手可能なコンビナトリアル・ライブラリに由来するような有機低分子；およびＣｂｌに由来する前記ペプチドかまたは前記非Ｃｂｌペプチドをコードしている核酸を含めた核酸、を含む。かかる化合物は、前文に記述されている。
【０１７６】
一つの態様においては、本件の方法はさらに、同定された化合物を非ヒト動物またはヒトへの投与のために製剤することを含む。かかる製剤は、前文に記述されている。
【０１７７】
もう一つの態様においては、本件の方法はさらに、遺伝的に修飾された動物に対して検査される化合物を産生または合成することを含む。かかる方法は、前文に記述されている。
【０１７８】
別の態様においては、本発明は、たとえば、肥満症の治療におけるように、肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを低減する化合物を同定する方法であって、前記方法が（ａ）そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的な修飾を含んでいる遺伝的に修飾された非ヒト動物へ、グルコース取込みを増大する化合物を投与することであって、前記遺伝的な修飾が前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており、かつ肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを測定すること；（ｂ）該動物へ化合物を投与すること、および該動物の肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを測定することであって、（ａ）に比べて（ｂ）における同等かまたは低減された取込みが、該化合物が肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを低減することを示していること、を含む方法を提供する。
【０１７９】
好ましくは、動物は、高いグリセミック指数の食物、たとえば、ニンジンか、またはスクロースが補われた食物を含む食餌で維持される。
【０１８０】
好ましくは、肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを増大する化合物は、Ｃｂｌ介在性の機構によって作用しており、そのことは、遺伝的に修飾されたＣｂｌ欠損動物を用いて、該化合物の、Ｃｂｌ欠損マウスの肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを増大する能力を、本文に記述された方法に従って測定することなどにより、確証されることが可能である。この場合、上記段階（ａ）の肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを増大する化合物を投与することは、（ｉ）そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的な修飾を含んでいる遺伝的に修飾された非ヒト動物へ、化合物を投与することであって、前記遺伝的な修飾が前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており；および（ｉｉ）該動物の肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを測定することであって、該化合物が投与されていないＣｂｌ欠損動物に比較して、該動物の肝臓、脂肪、または筋肉細胞への増大されたグルコース取込みが、該化合物が肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを増大することを示していること、を含む。
【０１８１】
別の態様においては、本発明は、肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを低減する化合物を同定する方法であって、（ａ）機能性の内在Ｃｂｌタンパク質を発現している非ヒト動物へ化合物を投与すること、および該動物の肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを測定すること；（ｂ）そのＣｂｌ遺伝子座の対立遺伝子内に遺伝的修飾を含んでいる、遺伝的に修飾された非ヒト動物の肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを測定することであって、前記遺伝的修飾が前記動物における機能性の内在Ｃｂｌの発現を低減または防止しており；および（ｃ）該動物の肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを（ａ）および（ｂ）において比較することであって、（ａ）および（ｂ）の間の同等のとりこみが、該化合物が肝臓、脂肪、または筋肉細胞へのグルコース取込みを低減することを示していること、を含む方法を提供する。
【０１８２】
好ましくは、動物は、類似した、または同一の食餌で、さらに好ましくは、高いグリセミック指数の食物を含む食餌で維持される。
【０１８３】
本文において企図された化合物は、Ｃｂｌ阻害化合物か、またはＣｂｌの生物学的機能のアンタゴニストを含む。一つの態様においては、化合物は、Ｃｂｌに由来しかつ、ＣＡＰ、ＣｒｋＩＩ、およびＣ３Ｇからなる群より選ばれるタンパク質への結合を含めたＣｂｌ機能を、阻害するか、低減するか、または抑制することができるペプチドを含めたペプチド；Ｃｂｌ優性ネガティブ突然変異体；Ｃｂｌの非Ｃｂｌペプチド阻害剤；Ｃｂｌに結合しかつＣｂｌ機能を阻害する抗体または抗体フラグメント；有機低分子、およびＣｂｌに由来する前記ペプチドまたは前記非Ｃｂｌペプチド阻害剤をコードしている核酸、ＣｂｌをコードしているｍＲＮＡに対して指示されたアンチセンス核酸、またはアンチＣｂｌリボザイムを含めた核酸からなる群より選ばれる。
【０１８４】
一つの態様においては、本件の方法はさらに、同定された化合物を非ヒト動物またはヒトへの投与のために製剤することを含む。かかる製剤は、前文に記述されている。
【０１８５】
もう一つの態様においては、本件の方法はさらに、遺伝的に修飾された動物に対して検査される化合物を産生または合成することを含む。かかる方法は、前文に記述されている。
【０１８６】
別の態様においては、上記のスクリーニングアッセイは、ＣｂｌのＥ３ユビキチンリガーゼ活性を測定するフォーマットを用いてインビトロで行なわれる。かかるアッセイは、ＡＰＳアダプタータンパク質が、前駆体インスリン受容体βサブユニットを、ｃ−Ｃｂｌのリン酸化へ結びつけ、かつインスリン受容体（ＩＲ−β）のリガンド刺激によるユビキチン化を促進するという知識に基づいている（アーメド（Ahmed）ら著、「ＦＥＢＳレターズ（FEBS Letts）」、２０００年、第４７５巻、ｐ．３１〜３４）。従って、ｃ−Ｃｂｌによるインスリン受容体のユビキチン化を測定するために、ＡＰＳ、ｃ−ＣｂｌおよびＩＲ−βのいずれかを発現する細胞が必要とされる。ＣＨＯ．Ｔ細胞はＩＲ−β前駆体タンパク質を過剰発現することが知られているので、この目的のために特に好ましい。
【０１８７】
一つの態様においては、試験試料は、適当な検査条件下に、試験化合物と接触され、該試験試料はＡＰＳタンパク質、ｃ−Ｃｂｌタンパク質、インスリン受容体（ＩＲ−β）タンパク質、ＥＩ酵素、ユビキチン接合酵素、ユビキチン、およびアデノシン５′三リン酸（ＡＴＰ）を含む。ＩＲ−βのユビキチン化が測定され、試験試料中のＩＲ−βのユビキチン化のレベルは、試験化合物の不在下に同じ検査条件でインキュベートされたＩＲ−βのユビキチン化とともに測定される。試験化合物の存在下でのＩＲ−βのユビキチン化のレベルは、試験化合物の、ｃ−Ｃｂｌのユビキチンリガーゼ活性を調整する能力の指標である。ユビキチン化のレベルにおける増大は、ｃ−Ｃｂｌのユビキチンリガーゼ活性が増大されたことの指標であり、一方、ユビキチン化のレベルにおける低減は、ｃ−Ｃｂｌのユビキチンリガーゼ活性が阻害されたことの指標である。
【０１８８】
Ｅ１酵素は、当業者に周知である（ハーシュコ（Hershko）ら著、「アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（Ann. Rev. Biochem.）」、１９９２年、第６１巻、ｐ．７６１〜８０７；モニア（Monia）ら著、「バイオテクノロジー（Biotechnol.）」、１９９０年、第８巻、ｐ．２０９〜２１５、参照により本文に取入れられている）。Ｅ１酵素は、ユビキチンを活性化することにより、ユビキチン化のプロセスを開始する。この技術において既知のいずれのＥ１酵素も、使用に適している。
【０１８９】
ユビキチン接合酵素は、適当な基質のリジン残基へユビキチンを転移する。それらはまた、自己ユビキチン化を受ける。本発明の方法において使用されることが可能な、適当なユビキチン接合酵素は、Ｃｄｃ３４、ＵｂｃＨ１、ＵｂｃＨ２、ＵｂｃＨ３、ＵｂｃＨ４、ＵｂｃＨ５、ＵｂｃＨ６、ＵｂｃＨ７、ＵｂｃＨ１０、Ｌ−ＵＢＣなどを含む（カイザー（Kaiser）ら著、「ＦＥＢＳレターズ（FEBS Letts）」、１９９４年、第３５０巻、ｐ．１−４；カイザーら著、「ＦＥＢＳレターズ」、１９９５年、第３７７巻、ｐ．１９３〜１９６；ヌーバ（Nuber）ら著、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol Chem）」、１９９６年、第２７１巻、ｐ．２７９５〜２８００；ジェンセン（Jensen）ら著、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」、１９９５年、第２７０巻、ｐ．３０４０８〜３０４１４；ロビンソン（Robinson）ら著、「マンマリアン・ゲノム（Mamm Genome）」１９９５年、第６巻、ｐ．７２５〜７３１；およびプロン（Plon）ら著、「プロシーデシングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）」、第９０巻、ｐ．１０４８４〜１０４８８、これらはすべて、参照により本文に取入れられている）。「Ｃｄｃ３４」は、酵母から単離されたユビキチン接合性酵素を指す。
【０１９０】
一つの態様においては、ユビキチンは、容易に同定される標識へ接合された、誘導体化された（derivatized）ユビキチンである。たとえば、誘導体化されたユビキチンは、［125Ｉ］−ユビキチン、蛍光性のユビキチン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの接合されたユビキチン、またはビオチン化されたユビキチンであることが可能である。この技術において周知のアッセイを用いて、標識の存在、およびしたがって誘導体化されたユビキチン化の量が同定されることが可能である。
【０１９１】
ユビキチン化は、その結果として、ＩＲ−βポリペプチドの分子量の増加を生じる。したがって、ＩＲ−βポリペプチドの分子量を測定する、たとえば、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、質量分析法、またはその変形（ＭＡＬＤＩ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＭＳ／ＭＳなど）といった任意のアッセイが、ユビキチン化を測定するべく用いられることが可能である。たとえば、ＭＳ／ＭＳおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦといったハイスループット法は特に好ましい。
【０１９２】
ユビキチン化アッセイは、それを固相フォーマットに転換することにより、化合物ライブラリの大規模なスクリーニングへ容易に適合される。一つの特定の制限しない実例においては、ユビキチン化アッセイは、誘導体化されたユビキチンの存在下に、マイクロタイタープレート上に固定された、適当に設計されたキメラＩＲ−βタンパク質を用いて行なわれることが可能である。この状況における「キメラＩＲ−βタンパク質」は、異種のペプチドまたはポリペプチドを含んでいるＩＲ−β前駆体ポリペプチドである。この状況における好ましい異種ペプチドは、ＩＲ−βのＣ−末端に位置されたｍｙｃエピトープ−ヘキサヒスチジンタグ（すなわち、ＩＲ−β−ｍｙｃ−Ｈｉｓ6）を含む。
【０１９３】
ＩＲ−βユビキチン化のためのハイスループットスクリーニングの一つの態様においては、反応混合物の成分が接触され、ユビキチン化アッセイのアリコートは、その上にＩＲ−βタンパク質の結合を可能にする適当な表面をもつマイクロタイタープレートへ移される。好ましくは、反応は、そのウエルが抗ＩＲ−β抗体か、または抗ｍｙｃ抗体でコートされたマイクロタイタープレートへ移される。未結合のタンパク質を洗い落とした後、サブストレートのコートされたウエルは、直接イメージされる（たとえば、蛍光性または放射能標識されたユビキチンによって行なわれる反応による）。アッセイは、レプリカプレートにおいて（たとえば、検査されるべき一連の化合物の存在または非存在下で）おこなうことができる。
【０１９４】
一つの別の態様においては、化合物の存在下でのＩＲ−β基質のユビキチン化は、細胞ベースのアッセイを用いて測定される。かかるアッセイにとってただ一つの必要条件は、検査されるべき化合物が細胞に侵入することができることである。したがって、かかるアッセイは、細胞内への、たとえばリボザイム、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、優性ネガティブ調節性のトランスフェクションまたは形質導入の後に効率よく発現されることが可能な、ペプチジルおよび核酸調整化合物を同定するために、特に有用である。かかるアッセイはまた、抗体または有機低分子の有効性を測定するために適用されてよい。この態様は、ＩＲ−β前駆体の、検出可能なｃ−Ｃｂｌ介在性のユビキチン化が、ｍｙｃタグされたＡＰＳを発現するＣＨＯ．Ｔ細胞において起こるという発見に基づいている（アーメド（Ahmed）ら著、「ＦＥＢＳレターズ（FEBS Letts）」、２０００年、第４７５巻、ｐ．３１〜３４）。
【０１９５】
一つの態様においては、ＡＰＳ、ｃ−Ｃｂｌ、およびＩＲ−β前駆体を発現することが可能な細胞は、ユビキチンまたは誘導体化されたユビキチン、および検査されるべき化学的化合物の存在下に、ＩＲ−β前駆体のｃ−Ｃｂｌ介在性のユビキチン化が起こるのに充分な時間および条件下にインキュベートされ、ＩＲ−β前駆体へ結合したユビキチンの量が測定される。
【０１９６】
前文に記述された無細胞系とは対照的に、細胞内では他のタンパク質がユビキチン化されることが可能であることから、ユビキチン化されたＩＲ−β前駆体の特異的な検出が必要である。したがって、インスリン受容体完全タンパク質か、またはＩＲ−β前駆体ポリペプチドを、抗体（たとえば、抗インスリン受容体抗体８３−１４、アブカム・インク（Abcam Inc）、米国、ＭＡ ０２１３９、ケンブリッジ；または、たとえば、ラブ・ビジョン・コープ（Lab Vision Corp.）（米国、ＣＡ ９４５３９、フレモント）により供給されるような、特異的な抗ＩＲ−β抗体）を用いて第一に捕捉すること、および次に、それに結合したユビキチンの量を、ユビキチンに特異的に結合する第二の抗体（サンタクルズ・バイオテクノロジー（SantaCruz Biotechnology）、米国、カリフォルニア州、サンタクルズ）を用いて検出することにより、ＩＲ−β前駆体へ結合したユビキチンの量を測定することが特に好ましい。上記の無細胞アッセイ系についてと同様に、誘導体化されたユビキチンは直接イメージされてよい。
【０１９７】
特に好ましい態様においては、インスリン受容体へ結合する抗体は、固形のサブストレート、たとえば、マイクロタイターウエルのサブストレート上に固定され、抗原−抗体複合体を形成するに充分な時間および条件下に細胞抽出物と接触され、それによりインスリン受容体を捕捉する。未結合のタンパク質を洗い落とした後、ウエルは直接イメージされるか（たとえば、蛍光性または放射能標識されたユビキチンを用いて行なわれた反応による）、または、抗ユビキチン抗体と、抗原−抗体複合体を形成するに充分な時間および条件下に接触される。抗ユビキチン抗体の結合は、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素へ接合された第二の抗体か、または他の検出可能な標識を用いて検出される。
【０１９８】
アッセイは、レプリカプレートにおいて、たとえば、検査されるべき一連の化合の存在または非存在下に行なわれ、検査されるべき該化合物の存在および非存在下での受容体のユビキチン化の量の比較を容易にするようにしてもよい。
【０１９９】
さらなる態様においては、第一のレプリカプレートは、インスリン受容体の捕捉の後に第二の抗体と接触され、第二のレプリカプレートは抗ユビキチン抗体の結合の後に第二の抗体と接触される。この態様によれば、第一および第二のレプリカプレートへ結合した第二の抗体の量の比の測定値は、細胞または試料中の全インスリン受容体量に対するユビキチン化されたインスリン受容体の相対量を示す。かかる測定は、試料のバリエーションを修正するために特に有用である。ハイスループット分析を容易にするため、第二の抗体は異なる色の色素または蛍光体を用いて標識され、それらの同時の検出を可能にすることが特に好ましい。
【０２００】
本発明のさらなる観点は、（ｉ）Ｃｂｌ−ＡＰＳ複合体；（ｉｉ）Ｃｂｌ−ＣＡＰ複合体；（ｉｉｉ）Ｃｂｌ−ＣＡＰ−フロチリン複合体；（ｉｖ）Ｃｂｌ−Ｃ３Ｇ複合体；（ｖ）Ｃｂｌ−ＣｒｋＩＩ複合体；および（ｖｉ）Ｃｂｌ−Ｃ３Ｇ−ＣｒｋＩＩ複合体からなる群より選ばれるタンパク質複合体の、活性のモジュレーター、形成、または安定性を測定するための方法を提供する。
【０２０１】
その一般的な形状においては、本発明の方法は、候補化合物または候補抗体の存在および非存在下に、タンパク質複合体の会合または分離、または複合体の構造を測定することを含む。本文に記述された態様によれば、候補化合物または候補抗体の存在下での、タンパク質複合体の変化した会合、分離、または構造は、該候補がタンパク質複合体のモジュレーターであることを示す。
【０２０２】
複合体の会合、分離、または構造は、たとえば、候補の存在および非存在下に、リアルタイムの会合または分離の定数か、または複合体の立体構造エピトープを認識する抗体の、変化した結合を測定することのような、直接的な手段により測定されてよい。候補化合物または抗体の存在または非存在下に、本質的に、本文において前文に記述されたように用いられるバイオセンサーは、かかる適用に特に適している。
【０２０３】
別法として、複合体の会合、分離、または構造は、たとえば、タンパク質リクルートメント系、ｎ−ハイブリッドスクリーン、逆ｎ−ハイブリッドスクリーン、寒天板拡散アッセイ、ＥＬＩＳＡ、または、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための、他の周知のアッセイフォーマットを用いるような、間接的な手段により測定されてよい。かかる間接的な手段は一般に、レポーター系を使用してタンパク質複合体の形成または分解を検出する。
【０２０４】
標準的な固相ＥＬＩＳＡアッセイフォーマットは、タンパク質−タンパク質相互作用のアンタゴニストを同定するために特に有用である。この態様によれば、結合相手の一つ（たとえば、ＡＰＳまたはＣＡＰまたはＣｒｋＩＩまたはＣ３Ｇか、またはそれらの部分）は、たとえば、ポリマーピンのアレイか、またはガラス支持体といった、固体マトリックス上に固定される。都合の良いことに、固定される結合相手はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを含む融合ポリペプチド（ＧＳＴ；たとえば、ＣＡＰ−ＧＳＴ融合）であって、ＧＳＴ成分は固相支持体へのタンパク質の固定を促進する。溶液中の第二の結合相手（たとえば、Ｃｂｌ）は、固定されたタンパク質との物理的関係にもっていかれ、タンパク質複合体を形成し、その複合体が、第二の結合相手に対して指示された抗体を用いて検出される。抗体は一般に、蛍光性分子で標識されるか、または酵素（たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）ヘ接合されるか、あるいは別法として、第二の標識された抗体が用いられることが可能であり、それが第一の抗体へ結合する。便利なことに、第二の結合相手はＦＬＡＧまたはオリゴヒスチジンペプチドタグか、あるいは他の適当な免疫原性ペプチドとの融合ポリペプチドとして発現され、ペプチドタグに対して指示された抗体が、結合相手を検出するべく用いられる。別法として、オリゴ−Ｈｉｓタグされたタンパク質複合体が、ニッケル−ＮＴＡ樹脂（キアゲン（Qiagen））へのそれらの結合により検出されるか、あるいはＦＬＡＧ標識されたタンパク質複合体が、そのＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティゲル（Affinity Gel）（コダック（Kodak））への結合によって検出されることが可能である。当業者には、本文に記述されたアッセイフォーマットが、たとえば、結合したペプチドまたは融合タンパク質のマイクロアレイを用いた、試料のハイスループットスクリーニングへ適用可能であることが明らかであろう。
【０２０５】
ツーハイブリッドアッセイは、参照により本文に取入れられた、パヤン（Payan）らの米国特許第６，３１６，２２３号に記述されている。パヤンらによって記述された基本的な機構は、酵母のツーハイブリッド系に類似している。ツーハイブリッド系では、結合相手は哺乳類宿主細胞において、二つの別々の融合タンパク質として発現される。標準的なツーハイブリッドスクリーンの、この目的のための改造において、第一の融合タンパク質は、結合相手の一つと融合されたＤＮＡ結合ドメインからなり、第二の融合タンパク質は、他の結合相手へ融合された転写活性化ドメインからなる。ＤＮＡ結合ドメインは、一以上のレポーター遺伝子の発現を調節するオペレーター配列へ結合する。転写活性ドメインは、結合相手間の機能的相互作用を介してプロモーターへリクルートされる。続いて、転写活性ドメインは、細胞の基本的な転写機構と相互作用し、それにより、レポーター遺伝子の発現を活性化し、その発現が測定されることが可能である。結合相手間のタンパク質−タンパク質相互作用を調整する候補生物活性物質は、宿主細胞とともにインキュベートされたとき、レポーター遺伝子の転写を調整するその能力によって同定される。アンタゴニストはレポーター遺伝子の発現を防止または低減することとなり、一方、アゴニストはレポーター遺伝子の発現を増大することとなる。低分子のモジュレーターの場合には、これらは細胞培地へ直接添加され、レポーター遺伝子の発現が測定される。一方、ペプチドモジュレーターは、宿主細胞へトランスフェクトされる核酸から発現可能であり、レポーター遺伝子の発現が測定される。事実上、全ペプチドライブラリが、トランスフェクトされた細胞においてスクリーンされることが可能である。
【０２０６】
別法として、たとえば、バイダル（Vidal）ら著、「プロシーデシングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）」、１９９６年、第９３巻、ｐ．１０３１５〜１０３２０、によって記述されたような、逆ツーハイブリッドスクリーンが、アンタゴニスト分子を同定するべく用いられてよい。逆ツーハイブリッドスクリーンは、それらがタンパク質−タンパク質相互作用を背景として選択するために、たとえば、ＣＹＨ２またはＬＹＳ２といった、逆選択可能なレポーター遺伝子を用いる限りにおいて、上述の前向きスクリーンと異なっている。細胞の生存または増殖は、逆選択可能なレポーター遺伝子産物の非毒性の基質の存在下に低減または防止され、それは前記遺伝子産物により、毒性化合物へ転換される。したがって、その中で本発明のタンパク質−タンパク質相互作用が起きなかった、前記相互作用のアンタゴニストの存在下にあるような細胞は、基質の存在下に生存するが、その理由はそれが毒性の産物に転換されることがないからである。たとえば、ＡＰＳまたはＣＡＰまたはＣｒｋＩＩまたはＣ３Ｇと結合するＣｂｌの部分／フラグメントが、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインとの、というようなＤＮＡ結合ドメイン融合物として発現され；Ｃｂｌに結合するＡＰＳまたはＣＡＰまたはＣｒｋＩＩまたはＣ３Ｇの部分が、適当な転写活性ドメイン融合ポリペプチド（たとえば、ＧＡＬ４の転写活性ドメインとの）として発現される。融合ポリペプチドは、ＵＲＡ３逆選択可能なレポーター遺伝子との作動可能な接続において酵母内で発現され、ＵＲＡ３の発現は、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと転写活性ドメインとの間の物理的な関係を必要とする。この物理的関係は、たとえば、レポーター遺伝子の発現を、ＧＡＬ４がそれに結合するヌクレオチド配列を含んでいるプロモーターの支配下に置くことによって達成される。その中でレポーター遺伝子が発現される細胞は、ウラシルおよび５−フルオロロティックアシド（fluororotic acid）（５−ＦＯＡ）の存在下に増殖しないが、それは５−ＦＯＡが毒性化合物へ転換されるからである。候補ペプチド阻害剤は、かかる細胞のライブラリ中で発現され、ウラシルおよび５−ＦＯＡの存在下に増殖する細胞は、たとえば、候補ペプチド阻害剤をコードしている核酸の分析のような、さらなる分析のため保持される。低分子アンタゴニストは、該低分子の存在下に細胞をインキュベートすること、および、ウラシルおよび５−ＦＯＡの存在下に増殖または生存する細胞を選択することによって測定される。
【０２０７】
別法として、カーリン（Karin）らへの米国特許第５，７７６，６８９号に記述されたような、タンパク質リクルートメント系が使用される。標準的なタンパク質リクルートメント系においては、タンパク質−タンパク質相互作用は細胞内で、転写因子ではないエフェクタータンパク質の、特定の細胞コンパートメントへのリクルートメントによって検出される。エフェクタータンパク質の、細胞コンパートメントへのトランスロケーションに際し、エフェクタータンパク質はそのコンパートメント内に存在するレポーター分子を活性化し、該レポーター分子の活性化が、たとえば、細胞の生存度によって検出可能であって、タンパク質−タンパク質相互作用の存在を示している。
【０２０８】
さらに明確には、タンパク質リクルートメント系の成分は、エフェクタータンパク質および結合相手の一つ（たとえば、ＡＰＳまたはＣＡＰまたはＣｒｋＩＩまたはＣ３Ｇ、またはその部分）を含む第一の融合タンパク質をコードしている第一の発現可能な核酸と、細胞コンパートメント局在化ドメインおよび他の結合相手（たとえば、Ｃｂｌまたはその部分）を含む第二の融合タンパク質をコードしている第二の発現可能な核酸を含む。内在性のエフェクタータンパク質の活性が欠損または欠如しており、タンパク質−タンパク質相互作用の不在下ではレポーター分子が発現されないようにした細胞系または細胞株（たとえば、酵母細胞または他の非哺乳類細胞）もまた必要である。
【０２０９】
結合相手の間の相互作用の結果として、融合ポリペプチドの間で複合体が形成され、それにより複合体は、細胞コンパートメント局在化ドメイン（たとえば形質膜局在化ドメイン、核局在化ドメイン、ミトコンドリア膜局在化ドメインなど）により仲介された、適当な細胞コンパートメントへのトランスロケーションに向かい、そこで次にエフェクタータンパク質はレポーター分子を活性化する。かかるタンパク質リクルートメント系は、たとえば、哺乳類、鳥類、昆虫、および細菌の細胞を含めた本質的に任意のタイプの細胞において、種々のエフェクタータンパク質／レポーター分子系を用いて実行されることが可能である。
【０２１０】
たとえば、酵母細胞をベースとするアッセイが行なわれるが、これにおいては、Ｃｂｌと一以上のその結合相手との間の相互作用が、結果としてグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦまたはＣ３Ｇ）の形質膜へのリクルートメントを生じ、そこでＧＥＦまたはＣ３Ｇは、Ｒａｓのようなレポーター分子を活性化し、それにより、さもなければ特定の細胞培養条件下では生存しない細胞の生存を生じる結果となる。この目的に適した細胞は、たとえば、３６℃において、機能性のＧＥＦがそこに発現されている場合にのみ増殖する酵母（Saccharomyces cerevisiae）ｃｄｃ２５−２細胞を含む（プティジャン（Petitjean）ら著、「ジェネティクス（Genetics）」、１９９０年、第１２４巻、ｐ．７９７〜８０６）。形質膜へのＧＥＦのトランスロケーションは、形質膜局在化ドメインにより促進される。Ｒａｓの活性化は、たとえば、細胞内の環状ＡＭＰレベルを、市販のアッセイキットおよび／または試薬を用いて測定することにより検出される。本発明のタンパク質−タンパク質相互作用のアンタゴニストを検出するためには、試験化合物の存在および非存在下に、あるいは候補アンタゴニストペプチドの細胞内における発現の存在または非存在下に、二重のインキュベーションが行なわれる。候補化合物または候補ペプチドの存在下での細胞の低減された生存または増殖は、該ペプチドまたは化合物が、Ｃｂｌと一以上のその結合相手との間の相互作用のアンタゴニストであることを示している。
【０２１１】
「逆」タンパク質リクルートメント系もまた企図され、細胞の変化した生存または変化した増殖は、候補化合物または候補ペプチドによるタンパク質−タンパク質相互作用の破壊を条件とする。たとえば、ＧＥＦの存在下に活性化されたＲａｓを本質的に発現するＮＩＨ ３Ｔ３細胞が使用されることが可能であり、細胞の形質転換がないことが、候補化合物またはペプチドによるタンパク質複合体の破壊の指標である。対照的に、ＧＥＦの存在下に活性化されたＲａｓを構成的に発現するＮＩＨ ３Ｔ３細胞は、形質転換された表現型を有する（アロンハイム（Aronheim）ら著、「セル（Cell）」、１９９４年、第７８巻、ｐ．９４９〜９６１）。
【０２１２】
さらにもう一つの態様においては、低分子は、参照により本文に取入れられている、バイダル＆エンドー（Vidal and Endoh）共著、「ＴＩＢＳ」、１９９９年、第１７巻、ｐ．３７４〜３８１によって記述された、寒天板拡散アッセイの適用により、本発明のタンパク質複合体を分離するその能力について検査される。
【０２１３】
本発明のさらなる態様は、ＣｂｌまたはＣｂｌの部分と、ＡＰＳ、ＣＡＰ、ＣｒｋＩＩ、およびＣ３Ｇか、または前記ポリペプチドの部分からなる群より選ばれるポリペプチドとの間の相互作用のモジュレーターを測定するための方法であって、前記方法が：
（ｉ）（ｉ）ＣｂｌとＡＰＳを含んでいる複合体；（ｉｉ）ＣｂｌとＣＡＰを含んでいる複合体；（ｉｉｉ）ＣｂｌとＣｒｋＩＩを含んでいる複合体；（ｉｖ）ＣｂｌとＣ３Ｇを含んでいる複合体；（ｖ）ＣｂｌおよびＣＡＰおよびフロチリンを含んでいる複合体；および（ｖｉ）ＣｂｌおよびＣｒｋＩＩおよびＣ３Ｇを、候補化合物または候補抗体の非存在下に含んでいる複合体、からなる群より選ばれるタンパク質複合体のレベルを測定すること；および
（ｉｉ）前記タンパク質複合体のレベルを、候補化合物の存在下に、または候補抗体の存在下に測定すること、
を含んでおり、（ｉ）および（ｉｉ）における前記タンパク質複合体のレベルの差が、該候補化合物または候補抗体が前記相互作用のモジュレーターであることを示している方法を提供する。
【０２１４】
本発明のこの態様は、任意の一以上のタンパク質結合相手（すなわち、Ｃｂｌ、ＡＰＳ、ＣＡＰ、ＣｒｋＩ、またはＣ３Ｇ）の部分を含んでいるタンパク質複合体の測定にも準用される。
【０２１５】
この目的のため、本文において前述されたような、アンタゴニストのための任意の一以上のアッセイ法が適用可能であることを、当業者は理解するであろう。この理由は、候補化合物または抗体の存在または非存在下でのタンパク質複合体のレベルが、ＥＬＩＳＡの場合には抗体の結合に、ハイブリッドスクリーンまたはタンパク質リクルートメントアッセイの場合には細胞の生存または増殖に関係するからである。ＥＬＩＳＡをベースとするアッセイフォーマットは特にこの目的に適しているが、その理由は、それらが、抗体がそれに結合する既知の量の基準タンパク質に対して検出系をキャリブレートすることにより、容易に定量化され得るからである。かかる定量化は、当業者には周知である。
【０２１６】
モジュレーターは、複合体形成または安定性のアンタゴニストまたは阻害剤であること、あるいは、複合体形成および安定性のアゴニストまたはプロモーターであることが可能であることが理解されるべきである。
【０２１７】
本文に記述された方法を用いて同定されたモジュレーターは、たとえば、脂肪沈着または除脂肪筋肉量または体脂肪対筋肉比または代謝率、あるいは異常なグルコース取込み、または食行動を調整するといった、Ｃｂｌ機能に関連した疾病の治療または予防的治療のために有用である。一つの態様においては、化合物は、高血糖症、高インスリン血症、肥満症、成人発症肥満、非インスリン依存性糖尿病、ＩＩ型糖尿病、グルコース不耐性、およびランゲルハンス島の肥大または過形成からなる群より選ばれる症状の治療に使用される。
【０２１８】
もう一つの態様においては、化合物は、たとえば、ボディビルダーかまたは、彼らの体重あるいは脂肪または筋肉の身体含有量を調整することを望んでいるヒトによる、美容上の目的のために有用である。
【０２１９】
したがって、本発明のもう一つの観点は、有効な量のＣｂｌアンタゴニストを動物またはヒトの患者へ投与して、該患者におけるＣｂｌの発現または活性を阻害または低減することを含む方法を提供する。好ましくは、患者は、高められたグルコース取込み、低減された食欲または食事摂取量、高血糖症、高インスリン血症、増大された脂肪沈着または肥満症、成人発症肥満、非インスリン依存性糖尿病、ＩＩ型糖尿病、グルコース不耐性、およびランゲルハンス島の肥大または過形成からなる群より選ばれる症状を患っている患者のような、治療を必要とする患者である。
【０２２０】
一つの態様においては、本発明はまた、患者における低減された食事摂取量または抑制された食欲によって特徴づけられる、摂食障害を治療する方法であって、前記方法が、該患者の食欲または食事摂取量を増進するために有効な量のＣｂｌアンタゴニストを該患者に投与することを含む方法を提供する。本発明の方法は、食欲不振または大食症の治療に特に適している。
【０２２１】
関連する態様において、本発明はまた、患者における低減された食事摂取量または抑制された食欲によって特徴づけられる、摂食障害を治療する方法であって、前記方法が、該患者の食欲または食事摂取量を増進するために有効な量の、機能性のＣｂｌ発現を低減する化合物を、該患者に投与することを含む方法を提供する。
【０２２２】
好ましくは、化合物またはＣｂｌアンタゴニストは、本文に記述されたスクリーニング法を用いて同定される化合物またはアンタゴニストである。
【０２２３】
治療のために適当な用量を測定するためには、細胞培養アッセイまたは、動物研究からのデータが使用され、適切な容量は、ほとんどまたは全く毒性のない活性化合物のＥＤ50を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、用いられる剤形および、利用される投与経路に依存して、この範囲内で変化してよい。本発明の方法において使用される任意のＣｂｌ阻害剤またはアンタゴニストについては、治療上有効な用量が、最初に細胞培養アッセイから推定されることが可能である。用量は、動物モデル（たとえば、高血糖症、高インスリン血症、および肥満症といった、遺伝的な肥満性糖尿病症候群を有している、任意の一以上の上記のマウスモデル）において、細胞培養において測定されたようなＩＣ50（すなわち、最大の症状の半分の阻害を達成する試験Ｃｂｌ阻害剤の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するべく製剤される。かかる情報は、ヒトにおける有用な用量をさらに正確に決定するべく用いられることが可能である。血漿中のレベルは、たとえば、高速液体クロマトグラフィーにより測定されてよい。
【０２２４】
別の態様においては、本発明は、高められたグルコース取込み、低減された食欲または食事摂取量、高血糖症、高インスリン血症、増大された脂肪沈着または肥満症、成人発症肥満、非インスリン依存性糖尿病、ＩＩ型糖尿病、グルコース不耐性、およびランゲルハンス島の肥大または過形成、からなる群より選ばれる症状の治療のための薬物の調製におけるＣｂｌアンタゴニストの使用を提供する。
【０２２５】
動物へ投与される化合物を同定するための、本文に記述された本発明の種々の態様はまた、あらかじめ動物から取出されていた単離された細胞か、または単離された細胞として容易に入手可能な細胞を用いて、適切に行なわれる。唯一の要件は、該細胞がアッセイを行うために必要とされるＣｂｌ表現型を有していることである。一つの態様においては、単離された細胞は骨格筋細胞、心筋細胞、線維芽細胞、または脂肪細胞（adipocytes）である。野生型または、Ｃｂｌ欠損性のない正常な動物を使用する代わりに、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞が使用可能である。様々な態様が、かかる単離された細胞の使用に準用される。
【０２２６】
本発明は、以下の実施例および添付の図面を参照して、さらに記述される。
【実施例１】
【０２２７】
方法
動物は、ガーバン・インスティテュート・オブ・メディカル・リサーチ（Garvan Institute of Medical Research）、オーストラリア、ニューサウスウェールズ州、シドニー、のＢＴＦ施設に収容された。これらの動物において着手されたすべての方法は、ガーバン・インスティテュートの倫理委員会によって審査ずみである。動物は、標準的なげっ歯類用飼料を自由に食べさせられ、１２時間の明／暗サイクルにおいて収容された。体重および食事摂取量は、離乳から１２週間にわたり、一週間ごとにモニターされた。
【０２２８】
グルコース耐性を測定するためには、動物は一晩断食された。グルコース（２ｇ／ｋｇ体重）は、基本のグルコース濃度を調べるために血液試料を採取した後、腹腔内へ投与された。血液試料は、その後の９０分間にわたり、１５分間隔で採取された。グルコースアッセイは、グルコースオキシダーゼ法を用いて行なわれた。
【０２２９】
断食中の血液試料はまた、循環中の脂質およびサイトカインの測定用に採取された。脂肪沈着、筋肉、肝臓、脳は切除され、秤量され、その後の生化学分析用に凍結された。
【０２３０】
温度は、光サイクルの最初および最後に、レクタル（Rectal）プローブ（ＢＡＴ−１０、フィジテンプ（Physitemp））を用いて測定された。
【０２３１】
筋肉および脂肪組織におけるグルコース輸送を測定するためには、動物は一晩断食され、ヒラメ筋全体、または生殖腺の白色脂肪組織外植片が、インビトロにおいて、クレブスリンガー緩衝液中のインスリンの不在または存在下にインキュベートされた。
【０２３２】
グルコース取込みは、放射能標識２−デオキシグルコース法を用いて測定された。
【０２３３】
脂肪細胞のサイズを測定するためには、脂肪細胞はコラゲナーゼ法を用いて単離され、２％の四酸化オスミウム中で、３７℃において一晩インキュベートされた。細胞はスライド上にマウントされ、明視野顕微鏡を用いて画像を得た。細胞の直径は、アドビ・フォトショップ（Adobe Photoshop）ソフトウエアを用いて測定された。
【０２３４】
結果
図１〜６は、Ｃｂｌ欠損マウスが、他のアイソジェニックな同性の非突然変異動物に比較して、有意に高い体重および食事摂取量を有するが、低減された脂肪沈着および、より小さい脂肪細胞を有することを示している。Ｃｂｌ欠損動物の体温も上昇した。驚いたことに、また予想に反してＣｂｌ遺伝子の破壊は、脂肪細胞および筋肉細胞の双方への、増大された基本のグルコース取込みをもたらした。結果は、以下の表１にも要約されている。
【０２３５】
【表１】
2006509510.tif 000002
【０２３６】
二つの独立した実験において、Ｃｂｌ欠損性の雄および雌の平均体温は、以下の表２に示されたように増加した。
【０２３７】
【表２】
2006509510.tif 000003
【実施例２】
【０２３８】
ｃ−ＣＢＬ-/-マウスから単離された筋肉におけるグルコース輸送
一晩断食されたマウス（１６〜１８週齢）は、頸部脱臼により犠牲にされ、ひらめ筋（ＳＯＬ）および長指伸筋（ＥＤＬ）の筋肉は、直ちにインビトロのインキュベーションに移された。切除の後、ＳＯＬおよびＥＤＬは、３０℃の振盪している水槽中に置かれた、２ｍｌの酸素添加された培地を含んでいる個別の２５ｍｌフラスコに移された。すべてのインキュベート培地は、２ｍＭピロベート（pyrovate）、８ｍＭマンニトール、および０．１％ｗ／ｖウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が補われた、クレブス−ヘンゼライト・バイカルボネート緩衝液（Krebs-Henseleit Bicarbonate buffer）（ＫＨＢ）（１１８．５ｍＭ  ＮａＣｌ、２４．７ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、４．７４ｍＭ  ＫＣｌ、１．１８ｍＭ  ＭｇＳＯ3、１．１８ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4および２．５ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐ．７．４）の、プレガスされた（９５％Ｏ2／５％ＣＯ2）ストックから調製された。フラスコ内の気相は、実験を通して９５％Ｏ2／５％ＣＯ2に維持された。
【０２３９】
筋肉は、最後の筋肉の除去の後、回復のため１０分間静置された。２−デオキシグルコース（２−ＤＯＧ）取込みアッセイは、一度に4匹のマウスからの１６個の筋肉を用いて行なわれた。筋肉はインスリンがないか、または３００μＵ／ｍｌ（２．２ｎＭ）インスリン、または１００００ μＵ／ｍｌ（７２ｎＭ）インスリンを用いた新たな培地中に、３０分間置かれた。３００μＵ／ｍｌのインスリン濃度が選ばれたのは、これが、パイロット実験でのＳＯＬにおける、インスリン刺激性の最大のグルコース取込みの半分を誘発することが見出されたインスリンレベルであったためである。１００００ μＵ／ｍｌのインスリン濃度は、最大のインスリン刺激性のグルコース輸送を確保するために使用された。
【０２４０】
３０分間のインキュベーション期間の後、培地は、２ｍＭピロベート、８ｍＭマンニトール、０．１％ｗ／ｖ ＢＳＡ、１ｍＭ ２−ＤＯＧ、各々比活性０．１２８μＣｉ／ｍｌおよび０．０８３μＣｉ／ｍｌまでの、［１−14Ｃ］−マンニトール（Mannitol）および２−［２−６3Ｈ］−ＤＯＧ（アマシャム・ファルマシア・バイオテック・インク（Amersham Pharmacia Biotech Inc.）、英国、リトルシャフトン（Little Chafton））を含むＫＨＢに換えられた。与える場合には、インスリン濃度は先の３０分間のインキュベーション期間と同様であった。標識された２−ＤＯＧは、筋細胞膜のグルコーストランスポータを通して筋肉細胞内へ拡散し、２−ＤＯＧ−６−リン酸としてトラップされるが、標識されたマンニトールの形質膜を横切る拡散は制限され、それを細胞外マーカーとして適切なものにしている。１６分間の同位体への暴露の後、筋肉は氷冷されたＫＨＢで簡単に洗浄され、ペーパー上にブロットされ、エッペンドルフチューブ（Eppendorf tube）内に置かれ、液体窒素内で直ちに凍結された。筋肉は、加工されるまで−８０℃で貯蔵された。
【０２４１】
凍結された筋肉は、秤量され、新しいエッペンドルフチューブへ移された。２５０μｌの１Ｎ ＮａＯＨの添加の後、筋肉は６５℃において、時々ボルテックスしながら溶解するまでインキュベートされた。次いで、２５０μｌの１Ｎ ＨＣｌが添加され、試料は１７０００ｇで３分間遠心分離された。結果として得られた３５０μｌの上清のアリコートか、または標準（１０ｍｌのミリＱ（Milli Q）水中の［１−14Ｃ］−マンニトール（Mannitol）および２−［２−６3Ｈ］−ＤＯＧの、５μｌ）のアリコート、または培地またはバックグラウンド試料（ミリＱ水）のアリコートが、β−シンチレーションバイアルへ移された。次いで、４．５ｍｌのシンチレーション液（ウルティマ・ゴールド（Ultima Gold）ＸＲ、パーキン・エルマー・ライフ・サイエンス（Perkin Elmer Life Science）、米国、マサチューセッツ州、ボストン）が各バイアルに添加され、混合の後、チューブは各々３分間にわたり、β−シンチレーションカウンター（ベックマン（Beckman）ＬＳ６０００ ＳＣ、ベックマン・クールター・インク（Beckman Coulter, Inc.）、米国、カリフォルニア州、フラートン（Fullerton））でカウントされた。
【０２４２】
図７に示されたように、２−デオキシグルコース取込みの速度は、ｃ−ＣＢＬ-/-マウスから単離されたＳＯＬにおいて、対照ｃ−ＣＢＬ+/+に比較して有意にアップレギュレートされており、ｃ−ＣＢＬ欠損マウスにおける増大された代謝率を示している。３００μＭ／ｍｌのインスリン（サブマックス）の存在下では、ｃ−ＣＢＬ+/+マウスに比較して、ｃ−ＣＢＬ-/-マウスから単離されたＳＯＬおよびＥＤＬの双方において、２−デオキシグルコース取込みが有意に増加した。充分なインスリンレベルへ暴露して、最大のインスリン刺激性グルコース輸送を確保した場合には（すなわち、１０００μＵ／ｍｌのインスリン）、ｃ−ＣＢＬ+/+マウスに比較して、ｃ−ＣＢＬ-/-マウスから単離されたＳＯＬにおいて、２−デオキシグルコース輸送に有意な増加があった。
【０２４３】
これらの結果は、単離されたＳＯＬおよびＥＤＬ筋肉において、ｃ−ＣＢＬ-/-マウスが増大されたインスリン刺激性グルコース取込み（約３０％増加）を有しており、それにより、ｃ−ＣＢＬ-/-マウスが増大された末梢インスリン感受性を有することを示している。
【実施例３】
【０２４４】
ｃ−ＣＢＬ-/-マウスからの脂肪外植片におけるグルコース輸送
動物は、実施例２のように犠牲にされ、精巣上体脂肪体は切除され、２ｍＭピルビン酸ナトリウム、および２％ＢＳＡが補充された、ヘペス・クレブス・リンガー・ホスフェート・バッッファー（Hepes Krebs Ringer Phosphate Buffer）（ＨＫＲＰ）（１２．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ｐＨ７．４、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ4、１ｍＭ ＣａＣｌ2、０．４ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、０．６ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4）を含んでいる１５ｍｌチューブ内に置かれた。組織は次いでハサミを用いてピンヘッドサイズの片が得られるまで切り刻まれた。約５０μｌの脂肪外植片が、０．４５ｍｌのＨＫＲＰ緩衝液を含んでいる２４ウエルプレートに置かれた。外植片は、インスリンの不在下または０．０５ｎＭまたは１ｎＭの存在下に、３７℃において１５分間インキュベートされた。グルコース輸送は、本質的には実施例２に記述された２−デオキシグルコース法を用いてアッセイされた。アッセイは、１００μＭ ２−デオキシ−［3Ｈ］グルコース（１．５μ  Ｃｉ／ｍｌ）の添加によって開始された。非特異的な２−デオキシ−［3Ｈ］グルコースの取込みは、サイトカラシン（Cytochalasin）Ｂ（５０μＭ）の存在下に測定された。１０分後、アッセイは、氷冷されたリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で細胞を素早く3回洗浄することによって終止された。ウエル中の脂肪外植片は集められ、秤量された。外植片は次いで、シンチレーション液を含んでいるバイアル内に置かれ、翌朝、上記のようにカウントされた。3Ｈｃｐｍは、組織重によってノーマライズされた。スチューデント（Student）のｔ検定（シグマ・プロット・ソフトウエア（Sigma Plot software））を用いて、統計学的分析が行なわれた。
【０２４５】
図８に示されたように、ｃ−ＣＢＬ-/-（ＫＯ）マウスから脂肪外植片へ取込まれた２−デオキシグルコースの量は、ｃ−ＣＢＬ+/+（ＷＴ）マウスに比較して、０．０５ｎＭおよび０．１ｎＭの双方のインスリンの存在下に増加した。これらのデータは、ｃ−ＣＢＬ+/+マウスに比較して、ｃ−ＣＢＬ-/-マウスが、増大されたインスリン刺激性のグルコース取込みを、脂肪外植片に有することを示しており、ノックアウトマウスにおける増大された末梢インスリン感受性を示している。
【実施例４】
【０２４６】
ｃ−ＣＢＬ-/-マウスの安静時代謝量の測定
マウスの安静時代謝量（すなわち、筋肉の熱産生）の測定は、事実上、ウィザーズ（Withers, P. C.）著、「オーストラリアン・ジャーナル・オブ・ズオロジー（Australian Journal of Zoology）」、２００１年、第４９巻、ｐ．４４５〜４６１に記述されたように行なわれた。手短に言えば、開放回路の呼吸測定法を用いて、酸素消費量（ＶＯ2）および二酸化炭素産生量（ＶＣＯ2）の比が、調節された２５（＋／−１℃）の温度において測定された。
【０２４７】
マウスは彼らの巣箱から移され、±０．１ｇまで秤量され、次いで、ゴム栓で密閉された５００ｍｌのガラスびんからなる代謝チャンバー内に置かれた。ブルックス（Brooks）５８７１−Ａマスフローコントローラにより調節された圧縮空気が、４００ｍＬ  ｍｉｎ-1でチャンバーを通され,２０％より高いＯ2および１％未満のＣＯ2レベルを維持した。流出空気は、ドライアライトカラムを通過して水蒸気を除去し、次にＱｕｂｉｔ Ｓ１５２赤外線ＣＯ2アナライザ、次いでサーボメックス（Servomex）ＯＡ １８４パラマグネティックＯ2アナライザを通過した。試験の終わりに、マウスはチャンバーから除去され、そのＴｂは、ＲＳコンポーネンツ（Components）６１１２３４熱電対メータを具備したプラスチックシース熱電対を用いて直ちに測定された。バックグラウンドのＯ2およびＣＯ2のベースライン値は、各代謝試験の前後の少なくとも１５分間にわたり設定された。アナログ電圧出力は、プロテック（Protek）５０６（ＣＯ2用）および、ソルバイ（Thurlby）１９０５ａ（Ｏ2用）ディジタルマルチメータを用いて記録され、それらのＲＳ２３２出力は、特注のビジュアルベ−シックプログラム（Visual Basic Program）を用いたＰＣで記録された。代謝系は、ブタン炎（ウィザーズ（Withers）２００１）を用いてキャリブレートされた。安静時ＶＯ2およびＶＣＯ2は、ウィザーズ（２００１）の処方を用いた特注のビジュアルベ−シックプログラムを使用して測定された。
【０２４８】
表３に示されたように、ｃ−ＣＢＬ-/-マウスはｃ−ＣＢＬ+/+マウスに比較して、増大された酸素消費量を示しており、すなわち、ｃ−ＣＢＬ-/-マウスは増大されたＶＯ2およびＶＣＯ2を示す。
【０２４９】
ｃ−ＣＢＬ-/-動物において観察された増大された酸素消費量は、安静時の代謝率の上昇を示す。この結果は、ｃ−ＣＢＬ-/-マウスにおいて、ｃ−ＣＢＬ+/+マウスに比較して観察された、低い血漿および組織脂質レベル（実施例２および３で記述された）と一致する。
【０２５０】
【表３】
2006509510.tif 000004
【実施例５】
【０２５１】
ＣｂｌＥ３ユビキチンリガーゼ活性測定のためのインビトロアッセイの開発
抗体
抗ユビキチン抗体は、サンタ・クルズ・ラボラトリー（Santa Cruz Laboratory）から入手される。抗インスリン受容体抗体８３−１４は、アブカム・インク（Abcam, Inc）、米国、ＭＡ ０２１３９、ケンブリッジから入手される。
【０２５２】
発現ベクターおよび細胞系
ＣＨＯ．Ｔ−ＡＰＳ細胞
ベクターｐｌＲＥＳ Ｈｙｇｒｏ（クロンテック（Clontech））からのＭｙｃタグされたラットＡＰＳを安定に発現しているＣＨＯ．Ｔ細胞（エビナ（Ebina）ら著、「プロシーデシングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）」、１９８５年、第８２巻、ｐ．８０１４〜８０１８）は、アーメドら著、「FEBS Letts」」、２０００年、第４７５巻、ｐ．３１〜３４）によって記述されたように産生される。手短かに言えばｍｙｃタグされたＡＰＳ（キアン（Qian）ら著、「ニューロン（Neuron）」、１９９８年、第２１巻、ｐ．１０１７〜１０２９）は、ｐＩＲＥＳ Ｈｙｇｒｏへサブクローンされ、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（キアゲン）を用いてＣＨＯ．Ｔ細胞へトランスフェクトされ、トランスフェクトされた細胞は、約８００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含む培地中で選択される。クローンは限界希釈により精製され、公的に入手可能な９Ｅ１０ハイブリドーマから調製された、抗ｍｙｃ９Ｅ１０モノクローナル抗体を用いてスクリーンされる。クローンは、約４００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含む培地中で維持される。
【０２５３】
ヒトｃ−Ｃｂｌおよび優性ネガティブｃ−Ｃｂｌ突然変異を発現するＣＨＯ．Ｔ−ＡＰＳ細胞
ヒトｃ−Ｃｂｌのいくつかの優性ネガティブ突然変異が文献に記述されており、ｃ−Ｃｂｌ Ｇ３０６Ｅ（配列番号２４８）、ｃ−Ｃｂｌ Ｃ３８１Ａ（配列番号２５０）、ｃ−Ｃｂｌ Ｙ７００Ｆ（配列番号２５２）、ｃ−Ｃｂｌ Ｙ７３１Ｆ（配列番号２５４）、ｃ−Ｃｂｌ Ｙ７７４Ｆ（配列番号２５６）、およびｃ−Ｃｂｌ ４８０（配列番号２６０）を含む。これらの既知の突然変異体は、単離された細胞におけるＩＲ−βのｃ−Ｃｂｌ介在性のユビキチン化の推定上の阻害剤の能力を査定するための、有用な陰性対照を提供する。したがって、これらの優性ネガティブ突然変異体をコードしているオープンリーディングフレーム（各々、配列番号２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、および２５９）は、レトロウイルスの発現ベクターｐＢａｂｅ−Ｐｕｒｏレトロウイルス発現ベクター（モーガンスタン＆ランド（Morgenstern and Land）共著、「ヌクレイック・アシズ・リサーチ（Nuc. Acids Res.）」、１９９０年、第１８巻、ｐ．３５８７〜３５９６））へ、別々にサブクローンされ、対照ベクターｐＢａｂｅ−Ｃｂｌ  Ｇ３０６Ｅ、ｐＢａｂｅ−Ｃ３８１Ａ、ｐＢａｂｅ−Ｃｂｌ Ｙ７００Ｆ、ｐＢａｂｅ−Ｃｂｌ Ｙ７３１Ｆ、ｐＢａｂｅ−Ｙ７７４Ｆ、ｐＢａｂｅ−Ｃｂｌ ４８０を生じる。
【０２５４】
完全長のヒトｃ−Ｃｂｌのオープンリーディングフレームを含んでいる、さらなる対照プラスミドもまた、ｐＢａｂｅベクターにおいて産生される。
【０２５５】
ｃ−Ｃｂｌ Ｙ７００Ｆ／Ｙ７３１Ｆ／Ｙ７７４Ｆ（配列番号２５８）と呼ばれる、ヒトｃ−Ｃｂｌのさらなる推定上の優性ネガティブ突然変異を発現することが可能な試験プラスミドも産生される。この突然変異体は、ｃ−Ｃｂｌのオープンリーディングフレーム内に突然変異を有しており、その結果として、正常にはリン酸化される三つのチロシン残基がフェニルアラニンに置換されている。ｃ−Ｃｂｌ Ｙ７００Ｆ／Ｙ７３１Ｆ／Ｙ７７４Ｆをコードしているオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列は、配列番号２５７に示されている。この突然変異体は、ストラタジーン・クイック・チェンジ（Stratagene Quick Change）突然変異誘発キットを用いて、製造業者の指示に従って産生される。正しい突然変異の確認は、標準的な配列分析によって得られる。ｃ−Ｃｂｌ Ｙ７００Ｆ／Ｙ７３１Ｆ／Ｙ７７４Ｆをコードしているオープンリーディングフレームは、ｐＢａｅ−Ｐｕｒｏへクローンされ、試験ベクターｐＢａｂｅ−Ｃｂｌ Ｙ７００Ｆ／Ｙ７３１Ｆ／Ｙ７７４Ｆを生じる。
【０２５６】
ＢＯＳＣ２３パッケージング細胞（ピア（Pear）ら著、「プロシーデシングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）」、１９９３年、第９０巻、ｐ．８３９２〜８３９６）は、１０％ＦＢＳを含有しているＤＭＥＭ中で、３７℃において、加湿された１０％ＣＯ2雰囲気下に維持される。細胞は次に、１０μｇの各プラスミドを用いたリン酸カルシウム共沈法によりトランスフェクトされる。
【０２５７】
一過性に産生されるウイルス上清は、４μｇ／ｍｌのポリブレン（Polybrene）の存在下にＣＨＯ．Ｔ−ＡＰＳ細胞へ感染するべく用いられる。ピュロマイシンによる未感染細胞の除去の後、安定な細胞系は１０％ＦＢＳを含有しているＤＭＥＭ中で維持される。
【０２５８】
別法として、ＣＨＯ．Ｔ−ＡＰＳ細胞はスーパーフェクト（Superfect）（キアゲン）を用いてトランスフェクトされ、トランスフェクトされた細胞は選択され、限界希釈法により精製され、ピュロマイシンおよび、４００μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含んでいる培地中に維持される。
【０２５９】
ヒトｃ−Ｃｂｌ発現を標的とするｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを発現するＣＨＯ．Ｔ−ＡＰＳ細胞
天然のヒトｃ−Ｃｂｌ遺伝子配列（配列番号２６１：ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号Ｘ５７１１０）は、アンビオン・インク（Ambion, Inc）（米国、テキサス州、オースチン）から市販されるｓｉＲＮＡターゲット・ファインダー（Target Finder）ソフトウエアを用いて分析され、ｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡ（表４；配列番号２〜２３９）を産生するべく用いられた場合、ｃ−Ｃｂｌの発現を最も沈黙（サイレンシング）させやすい配列を測定するようにした。ＢＬＡＳＴプログラムを用いたさらなる配列分析は、これらの配列のいくつか、特に配列番号５７〜５９、１１７〜１２１、１７５〜１７７、および２３５〜２３９は、マウスｃ−Ｃｂｌ遺伝子中に存在しなかったことを示した。
【０２６０】
表４に示されたヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド分子は、化学的に合成される。示されたｓｉＲＮＡ分子のセンスおよびアンチセンス鎖はアニールされ、直接ＣＨＯ．Ｔ−ＡＰＳ細胞へ導入される。手短かに言えば、ＣＨＯ．Ｔ−ＡＰＳ細胞は、トランスフェクションの約２４時間前に、９６ウェル組織培養プレートに播かれ、約３０〜７０％のコンフルエンスまで増殖される。トランスフェクションに先立ち、単鎖ｓｉＲＮＡ分子は、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ １低血清培基（アンビオン）中に、約０．５μＭの最終濃度に希釈される。ｓｉＲＮＡ溶液は次に、あらかじめＯＰＴＩ−ＭＥＭ １低血清培地培基中に希釈されていたｓｉＰＯＲＴリピド（Lipid）(アンビオン)へ添加される。この最終的な溶液は、次に室温において約２０分間インキュベートされる。
【０２６１】
ＣＨＯ．Ｔ−ＡＰＳ細胞は、次いでＯＰＴＩ−ＭＥＭ １低血清培基で洗浄され、新鮮なＯＰＴＩ−ＭＥＭ １低血清培基が重層される。トランスフェクション剤／ｓｉＲＮＡ複合体が、次にプレートの各ウエルに添加され、プレートは５％ＣＯ2が補足され、３７℃において4時間インキュベートされる。4時間後、さらなるＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳが補足された）が各ウエルに添加され、細胞は５％ＣＯ2が補足され、３７℃において培養される。
【０２６２】
ｓｈＲＮＡを構築するためには、ループ配列（ＴＴＣＡＡＧＡＧＡ、配列番号２４６）は、ヘアピン形成を容易にするべく、相補的なセンスおよびアンチセンス鎖（配列番号４〜２３９）の間に位置される。組立てられたｓｈＲＮＡに対して相補的なオリゴヌクレオチドもまた、合成により産生される。各ｓｈＲＮＡ分子の双方の鎖は、次に等モルずつ混合され、９５℃に１０分間加熱され、冷めるまで静置される。二重鎖ｓｈＲＮＡをコードしているＤＮＡは、ｐＡｄＴｒａｃｋ−ＨＰ発現ベクター（チャオ（Zhao）ら著、「ジーン（Gene）」、２００３年、第３１６巻、ｐ．１３７〜１４１）、Ｐｏｌ ＩＩＩ転写終結配列の上流へクローンされる。ｐＡｄＴｒａｃｋ−ＨＰ発現ベクターは、Ｐｏｌ  ＩＩＩ転写終結のｓｈＲＮＡ上流の指向性クローニングを容易にするためにＢｇ／ＩＩやＨｉｎｄ／ＩＩＩ認識配列を含んでいる。
【０２６３】
完全長のヒトｃ−Ｃｂｌオープンリーディングフレームをセンスおよびアンチセンス方向に含んでいる対照プラスミドもまた、ｐＡｄＴｒａｃｋ−ＨＰ発現ベクターにおいて産生される。
【０２６４】
ｓｈＲＮＡ構築物を含んでいるアデノウイルスは、事実上、ヒー（He）ら著、「プロシーデシングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）」、１９９８年、第９５巻、ｐ．２５０９〜２５１４によって記述されたように産生される。手短かに言えば、対照ベクターおよび、ｐＡｄＴｒａｃｋ−ｓｈＲＮＡベクターのライブラリーは、ＰｍｅＩにより線形化され、ＡｄＥａｓｉｅｒ−１細胞か、またはｐＡｄＥａｓｙ−１プラスミドをもつ大腸菌ＢＪ５１８３細胞へトランスフェクトされる。ｐＡｄＥａｓｙ−１アデノウイルスプラスミドは、ヌクレオチド１〜３，５３３（Ｅ１遺伝子を含む）およびヌクレオチド２８，１３０〜３０，８２０（Ｅ３遺伝子を含む）を除き、すべてのＡｄ５配列を含む。組換えウイルスゲノムはＰａｃＩにより線形化され、６ウェルプレート中の２９３細胞へ、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン（Invitrogen））を用いてトランスフェクトされる。トランスフェクションの8日後、組換えウイルスは集められ、Ｔ−２５フラスコにおいて、１．５×１０6個の２９３細胞を用いて、１ラウンドの増幅を受け、結果として２ｍｌのウイルスストックを生じる。９６ウェルプレート中のＣＨＯ．Ｔ−ＡＰＳ細胞は、ｐＡＤＴｒａｃｋ−ｓｈＲＮＡライブラリーを含んでいるアデノウイルスを用いて２時間にわたって感染され、洗浄され、さらに培地を用いて4日間インキュベートされる。
【０２６５】
ライゼート調製およびサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ
優性ネガティブｃ−Ｃｂｌタンパク質か、またはヒトｃ−Ｃｂｌに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの存在または非存在下にＡＰＳを発現するための、上記のように産生されたＣＨＯ．Ｔ−ＡＰＳ細胞は、インスリンを用いて３７℃において１０〜１６分間刺激され、コタニ（Kotani）ら著、「バイオケミカル・ジャーナル（Biochem. J.）」、１９９８年、第３３５巻、ｐ．１０３〜１０９；およびアーメド（Ahmed）ら著、「バイオケミカル・ジャーナル」、１９９１年、第３４１巻、ｐ．６６５〜６６８によって記述されたように、ライゼートが調製される。手短かに言えば、細胞は氷冷されたリン酸緩衝食塩水で洗浄され、次いで、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１３５ｍＭ ＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ、１．０ｍＭピロリン酸ナトリウム、１．０ｍＭナトリウム・オルトバナデート、１０ｍＭ ＮａＦ、およびプロテアーゼ阻害剤（ロシュ・ダイアグノスティクス（Roche Diagnostics）；緩衝液７ｍｌあたり１錠）を含んでいる緩衝液を用いて、約３０分間、４℃において溶解される。
【０２６６】
抗インスリン受容体抗体８３−１４は、コーティング溶液（５０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６；または２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５；または１０ｍＭＰＢＳ、ｐＨ７．２）中に、約１〜１０μｇ／ｍｌタンパク質の濃度まで希釈される。希釈された抗体は、９６または２５６ウェルマイクロタイタープレートのウエル上へ、コーティング溶液中の５０〜１００μｌの抗体をウエルに添加すること、および室温で約１時間インキュベートすることによって吸着される。プレートは空にされ、次いで３００μｌのブロッキング溶液（コーティング溶液中の１〜１０％（w／v）ＢＳＡ、またはコーティング溶液中の１〜１０％（w／v）の脱脂粉乳、またはコーティング溶液中の１〜１０％（w／v）カゼイン、またはコーティング溶液中の１〜１０％（w／v）ゼラチン）が、ウエルに添加される。プレートは、再度室温で約１時間インキュベートされる。プレートは空にされ、洗浄毎に３００μｌの洗浄液（０．１Ｍリン酸緩衝食塩水またはトリス緩衝食塩水（ｐＨ７．４）、０．０２〜０．０５％（v／v）ツイーン（Tween）２０）を用いて３〜５回洗浄される。細胞のライゼートは、任意に１〜１０％（w／v）のＢＳＡを含んでいるレプリカプレートのウエルに添加され、プレートは４℃で一晩か、または室温で１時間〜一晩インキュベートされる。プレートは再度空にされ、前と同様に３〜５回洗浄される。１ｘブロッキング溶液中の濃度０．１〜１．０μｇ／ｍｌタンパク質の抗ユビキチン抗体がウエルに添加され、プレートは約１時間にわたり、室温でインキュベートされる。プレートは、再び前と同様に洗浄される。
【０２６７】
プレートに結合した抗ユビキチン抗体を検出するため、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素へコンジュゲートされたヤギ抗マウス抗体Ｉｇを含んでいる第三の抗体溶液（たとえば、アルファ・ダイアグノスティック・インタナショナル・インク（Alpha Diagnostic International, Inc.）、米国、ＴＸ ７８２３８、サンアントニオ）が用いられる。第三の抗体は、１ｘブロッキング溶液中で、約０．１〜１．０μｇ／ｍｌタンパク質の最終濃度に希釈される。約１００μｌの希釈された第三の抗体が各ウエルに添加され、プレートは約１時間にわたり、室温でインキュベートされる。プレートは再度空にされ、洗浄され、かつ、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素基質（ＫＰＬ、米国、ＭＡ ２０８７９−４１７４、グーザーズバーグ）と反応される。反応は停止され、各ウエルの吸光度はプレートリーダーを用いて測定される。使用される波長は、用いられる基質、たとえば、ＡＢＴＳ（４０５〜４１０ｎｍ）、ＴＭＢ（非停止６２０〜６５０ｎｍ、停止４５０ｎｍ）、ＯＰＤ（非停止４５０ｎｍ、停止４９０ｎｍ）、ｐＮＰＰ（４０５〜４１０ｎｍ）、ＢｌｕｅＰｈｏｓＯ（５９５〜６５０ｎｍ）に依存するであろう。
【０２６８】
結果
トランスフェクトされていないＣＨＯ．Ｔ−ＡＰＳ細胞か、またはヒトｃ−Ｃｂｌをセンス方向に発現する対照ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ．Ｔ−ＡＰＳ細胞に由来する細胞ライゼートは、サンドイッチＥＬＩＳＡによって検出されるような、インスリン受容体のインスリン誘導性のユビキチン化の、検出可能なレベルをもつこととなる。著しく対照的に、優性ネガティブ突然変異構築物、ｐＢａｂｅ−Ｃｂｌ  Ｇ３０６Ｅ、ｐＢａｂｅ−Ｃ３８１Ａ、ｐＢａｂｅ−Ｃｂｌ Ｙ７００Ｆ、ｐＢａｂｅ−Ｃｂｌ Ｙ７３１Ｆ、ｐＢａｂｅ−Ｙ７７４Ｆ、ｐＢａｂｅ−Ｃｂｌ ４８０を含んでいる細胞に由来する細胞ライゼートは、インスリン受容体の抗体補足に続き、低減されたかまたは検出不能なレベルの抗ユビキチン抗体を結合することとなる。ｃ−ＣｂｌのＲＩＮＧドメインに突然変異をもつｐＢａｂｅ−Ｃ３８１Ａベクターでトランスフェクトされた細胞からの細胞ライゼートは、特に低いレベルのインスリン受容体のユビキチン化をもつこととなる。
【０２６９】
かかるデータは、インスリン誘導性のＣＨＯ．Ｔ−ＡＰＳ細胞が、インスリン受容体のｃ−Ｃｂｌ介在性のユビキチン化をアッセイするための有用な細胞系を提供することを示唆している。かかるデータはまた、サンドイッチＥＬＩＳＡが、インスリン受容体のｃ−Ｃｂｌ介在性のユビキチン化のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するための有用なスクリーンを提供することを示唆している。
【０２７０】
これを基盤にさらに前進すれば、ｃ−ＣｂｌアンチセンスＲＮＡか、または優性ネガティブ突然変異体ｃ−Ｃｂｌ Ｙ７００Ｆ／Ｙ７３１Ｆ／Ｙ７７４Ｆを発現する細胞がＣＨＯ．Ｔ−ＡＰＳ細胞へ導入され、インスリン誘導性の、インスリン受容体のユビキチン化が、本文のサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを用いて、対照プラスミドと同様にアッセイされる。完全長のｃ−Ｃｂｌオープンリーディングフレームをセンス方向に発現している細胞からのライゼート中の、受容体に結合したユビキチンのレベルに比較して、低減された、インスリン受容体に結合したユビキチンレベルは、これらの分子もまたｃ−Ｃｂｌ介在性のユビキチン化の効果的なアンタゴニストであることを示している。
【０２７１】
さらに、ヒトｃ−Ｃｂｌの発現に対して設計された一連のｐＡＤＴｒａｃｋ−ｓｈＲＮＡを発現する、アデノウイルス（Ａｄ５）ライブラリ（表４）は、ＣＨＯ．Ｔ−ＡＰＳ細胞ヘショットガンクローンされ、インスリン受容体の、インスリン誘導性のユビキチン化が測定される。野生型ヒトｃ−Ｃｂｌの完全長のオープンリーディングフレームを含んでいる対照プラスミドもまた導入される。空のベクターの対照、およびトランスフェクトされていない対照もまた用いられる。サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定されるような、インスリン受容体の低減されたユビキチン化レベルをもつライゼートを産生する細胞は、確認のため動物モデルへ導入されるためといった、さらなる分析に向けて保持される。別法として、または加えて、対応するｓｈＲＮＡが、筋肉の熱産生に対するそれらの影響を査定するため、ｐＢａｂｅベクターにおいてＣ２Ｃ１２細胞へ導入される。
【０２７２】
【表４】
2006509510.tif 000005
【表５】
2006509510.tif 000006
【表６】
2006509510.tif 000007
【実施例６】
【０２７３】
ｃ−Ｃｂｌ発現の核酸阻害剤の効果を測定するためのＥＬＩＳＡ
抗体
ヒトｃ−Ｃｂｌタンパク質の残基５９５〜８１０に対するマウス抗体は、クロンテック（Clontech）から入手された。かかる抗体は、ニワトリ、イヌ、マウス、およびラットからのｃ−Ｃｂｌタンパク質と交差反応性がある。ヒトｃ−Ｃｂｌタンパク質の残基６９５〜７０５に対して反応性であるマウスモノクローナル抗体は、ＡＧサイエンティフィック・インク（AG Scientific, Inc）によって供給される。ヒトｃ−ＣｂｌのＣ−末端領域へ結合するウサギまたはヤギ抗体は、完全長のｃ−Ｃｂｌタンパク質の検出に有用である（サンタクルズ・バイオテクノロジー・インク（Santa Cruz Biotechnology, Inc））。
【０２７４】
発現ベクターおよび細胞系
Ｃ２Ｃ１２細胞
Ｃ２Ｃ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７７２；ヤフェ（Yaffe）ら著、「ネイチャー」、１９７７年、第２７０巻、ｐ．７２５〜７２７；ヤフェら著、「ディフェレンシエーション（Differentiation）」、１９７７年、第７巻、ｐ．１５９〜１６６）は、マウス筋芽細胞の細胞系であって、迅速に分化して収縮性の筋管を形成し、かつ特徴的な筋肉タンパク質を産生する。培養物は、筋芽細胞の消耗を防ぐため、コンフルエントではない培養物として維持される。筋管形成は、細胞が、ウシ胎児血清の代わりに１０％（v／v）ウマ血清が補足された培地において増殖される場合に促進される。
【０２７５】
ヒトｃ−Ｃｂｌおよび優性ネガティブｃ−Ｃｂｌ突然変異を発現するＣ２Ｃ１２細胞
ヒトｃ−Ｃｂｌの優性ネガティブ突然変異体は、ｃ−Ｃｂｌ Ｇ３０６Ｅ（配列番号２４８）、ｃ−Ｃｂｌ Ｃ３８１Ａ（配列番号２５０）、ｃ−Ｃｂｌ Ｙ７００Ｆ（配列番号２５２）、ｃ−Ｃｂｌ Ｙ７３１Ｆ（配列番号２５４）、およびｃ−Ｃｂｌ Ｙ７７４Ｆ（配列番号２５６）と呼ばれ、レトロウイルス発現ベクターｐＢａｂｅ−Ｐｕｒｏ（モーガンスタン＆ランド（Morgenstern and Land）共著、「ヌクレイック・アシズ・リサーチ（Nuc. Acids Res.）」、１９９０年、第１８巻、ｐ．３５８７〜３５９６））から発現され、事実上、先行する実施例に記述されたように、対照ベクターｐＢａｂｅ−Ｃｂｌ  Ｇ３０６Ｅ、ｐＢａｂｅ−Ｃ３８１Ａ、ｐＢａｂｅ−Ｃｂｌ Ｙ７００Ｆ、ｐＢａｂｅ−Ｃｂｌ Ｙ７３１Ｆ、ｐＢａｂｅ−Ｙ７７４Ｆを生じる。
【０２７６】
完全長のヒトｃ−Ｃｂｌオープンリーディングフレームを含んでいるさらなる対照プラスミドもまた、ｐＢａｂｅベクターにおいて産生される。
【０２７７】
ｃ−Ｃｂｌ Ｙ７００Ｆ／Ｙ７３１Ｆ／Ｙ７７４Ｆ（配列番号２５８）と呼ばれる、ヒトｃ−Ｃｂｌのさらなる推定上の優性ネガティブ突然変異を発現することが可能な試験プラスミドもまた、先行する実施例に記述されたように産生される。
【０２７８】
ＢＯＳＣ２３パッケージング細胞（ピア（Pear）ら著、「プロシーデシングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）」、１９９３年、第９０巻、ｐ．８３９２〜８３９６、）は、１０％ＦＢＳを含有しているＤＭＥＭ中で、３７℃において、加湿された１０％ＣＯ2雰囲気下に維持される。細胞は次に、１０μｇの上記の各プラスミドを用いたリン酸カルシウム共沈法によりトランスフェクトされる。
【０２７９】
一過性に産生されるウイルス上清は、４μｇ／ｍｌのポリブレン（Polybrene）の存在下にＣ２Ｃ１２細胞へ感染するべく用いられる。ピュロマイシンによる未感染細胞の除去の後、安定な細胞系は１０％ＦＢＳを含有しているＤＭＥＭ中で維持される。
【０２８０】
別法として、Ｃ２Ｃ１２細胞はスーパーフェクト（Superfect）（キアゲン）を用いてトランスフェクトされ、トランスフェクトされた細胞は選択され、限界希釈法により精製され、ピュロマイシンおよび、４００μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含んでいる培地中に維持される。
【０２８１】
ヒトｃ−Ｃｂｌ発現を標的とするｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを発現するＣ２Ｃ１２細胞
ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡおよび対照ベクターは、先行する実施例において記述されたように産生される。
【０２８２】
ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｃ２Ｃ１２細胞を、トランスフェクションの約２４時間前に、９６ウェル組織培養プレートに播くこと、細胞を約３０〜７０％のコンフルエンスまで増殖させること（筋芽細胞の消耗を防ぐため、コンフルエンスに達しないことが好ましい）、および、トランスフェクションの直前に、単鎖ｓｉＲＮＡ分子をＯＰＴＩ−ＭＥＭ １低血清培基（アンビオン）中に、最終濃度約０．５μＭまで希釈すること、ｓｉＲＮＡ溶液を、あらかじめＯＰＴＩ−ＭＥＭ １低血清培地培基中に希釈されていたｓｉＰＯＲＴリピド（Lipid）(アンビオン)へ添加すること、および反応混合物を室温において約２０分間インキュベートすることにより、Ｃ２Ｃ１２細胞へ直接導入される。
【０２８３】
Ｃ２Ｃ１２細胞は、次いでＯＰＴＩ−ＭＥＭ １低血清培基で洗浄され、新鮮なＯＰＴＩ−ＭＥＭ １低血清培基が重層される。トランスフェクション剤／ｓｉＲＮＡ複合体が、次にプレートの各ウエルに添加され、プレートは５％ＣＯ2が補足され、３７℃において4時間インキュベートされる。4時間後、さらなるＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳが補足された）が各ウエルに添加され、細胞は５％ＣＯ2が補足され、３７℃において培養される。
【０２８４】
ｓｈＲＮＡをＣ２Ｃ１２細胞へ安定に導入するためには、先行する実施例において記述されたように産生されたｐＡＤＴｒａｃｋ−ｓｈＲＮＡライブラリーを含んでいるアデノウイルスが用いられ、９６ウェルプレートにおいてＣ２Ｃ１２細胞に２時間感染し、その後細胞は洗浄され、培地中で4日間インキュベートされる。
【０２８５】
ライゼート調製
上記のように産生されたＣ２Ｃ１２細胞は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１３５ｍＭ ＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ、１．０ｍＭピロリン酸ナトリウム、１．０ｍＭナトリウム・オルトバナデート、１０ｍＭ ＮａＦ、およびプロテアーゼ阻害剤（ロシュ・ダイアグノスティクス（Roche Diagnostics）；緩衝液７ｍｌあたり１錠）を含んでいる緩衝液を用いて、約３０分間、４℃において溶解される。
【０２８６】
ＥＬＩＳＡアッセイフォーマットＩ
細胞ライゼートは、コーティング溶液（５０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６；または２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５；または１０ｍＭＰＢＳ、ｐＨ７．２）中に、約０．１〜１０μｇ／ｍｌタンパク質の濃度まで希釈される。希釈された抗原は、９６または２５６ウェルマイクロタイタープレートのウエル上へ、コーティング溶液中の５０〜１００μｌの抗原をウエルに添加すること、および室温で約１時間インキュベートすることによって吸着される。プレートは空にされ、次いで３００μｌのブロッキング溶液（コーティング溶液中の１〜１０％（w／v）ＢＳＡ、またはコーティング溶液中の１〜１０％（w／v）の脱脂粉乳、またはコーティング溶液中の１〜１０％（w／v）カゼイン、またはコーティング溶液中の１〜１０％（w／v）ゼラチン）が、ウエルに添加される。プレートは、再度室温で約１時間インキュベートされる。プレートは空にされ、洗浄毎に３００μｌの洗浄液（０．１Ｍリン酸緩衝食塩水またはトリス緩衝食塩水（ｐＨ７．４）、０．０２〜０．０５％（v／v）ツイーン（Tween）２０）を用いて３〜５回洗浄される。ブロッキング溶液中の濃度０．１〜１．０μｇ／ｍｌタンパク質の抗Ｃｂｌ抗体が、レプリカプレートのウエルに添加され、プレートは４℃で一晩か、または室温で１時間〜一晩インキュベートされる。精度を増すためおよび結果を確認するため、異なる抗Ｃｂｌ抗体が、この段階で各レプリカプレートへ添加されることが可能である。プレートは再度空にされ、前と同様に３〜５回洗浄される。プレートに結合した抗Ｃｂｌ抗体を検出するため、第一の抗体と結合する抗体（たとえば、ヤギ抗マウスＩｇ抗体、またはヤギ抗ウサギＩｇ抗体）を含んでいる、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素（たとえば、アルファ・ダイアグノスティック・インタナショナル・インク（Alpha Diagnostic International, Inc.）、米国、ＴＸ ７８２３８、サンアントニオ）へコンジュゲートされた第二の抗体溶液が用いられる。第二の抗体は、１ｘブロッキング溶液中で、約０．１〜１．０μｇ／ｍｌタンパク質の最終濃度に希釈される。約１００μｌの希釈された第二の抗体が各ウエルに添加され、プレートは約１時間にわたり、室温でインキュベートされる。プレートは再度空にされ、洗浄され、かつ、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素基質（ＫＰＬ、米国、ＭＡ ２０８７９−４１７４、グーザーズバーグ）と反応される。反応は停止され、各ウエルの吸光度はプレートリーダーを用いて測定される。使用される波長は、用いられる基質、たとえば、ＡＢＴＳ（４０５〜４１０ｎｍ）、ＴＭＢ（非停止６２０〜６５０ｎｍ、停止４５０ｎｍ）、ＯＰＤ（非停止４５０ｎｍ、停止４９０ｎｍ）、ｐＮＰＰ（４０５〜４１０ｎｍ）、ＢｌｕｅＰｈｏｓＯ（５９５〜６５０ｎｍ）に依存するであろう。
【０２８７】
ＥＬＩＳＡアッセイフォーマットＩＩ（２サイトＥＬＩＳＡ法）
マウス、ウサギ、またはヤギの抗ヒトＣｂｌ抗体は、コーティング溶液（５０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６；または２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５；または１０ｍＭＰＢＳ、ｐＨ７．２）中に、約１〜１０μｇ／ｍｌタンパク質の濃度に希釈される。希釈された抗体は、９６または２５６ウェルマイクロタイタープレートのウエル上へ、コーティング溶液中の５０〜１００μｌの抗体をウエルに添加すること、および室温で約１時間インキュベートすることによって吸着される。プレートは空にされ、次いで３００μｌのブロッキング溶液（コーティング溶液中の１〜１０％（w／v）ＢＳＡ、またはコーティング溶液中の１〜１０％（w／v）の脱脂粉乳、またはコーティング溶液中の１〜１０％（w／v）カゼイン、またはコーティング溶液中の１〜１０％（w／v）ゼラチン）が、ウエルに添加される。プレートは、再度室温で約１時間インキュベートされる。プレートは空にされ、洗浄毎に３００μｌの洗浄液（０．１Ｍリン酸緩衝食塩水またはトリス緩衝食塩水（ｐＨ７．４）、０．０２％〜０．０５％（v／v）ツイーン（Tween）２０）を用いて３〜５回洗浄される。細胞ライゼートは、任意に１〜１０％（w／v）ＢＳＡを含んでいるレプリカプレートのウエルに添加され、プレートは４℃で一晩か、または室温で１時間〜一晩インキュベートされる。プレートは再度空にされ、前と同様に３〜５回洗浄される。使用された第一の抗体とは異なり、かつＣｂｌタンパク質の異なる部位へ結合する第二の抗Ｃｂｌ抗体が、１ｘブロッキング溶液中の約０．１〜１．０μｇ／ｍｌタンパク質の濃度において、ウエルに添加され、プレートは約１時間にわたり、室温でインキュベートされる。プレートは前と同様に再度洗浄される。
【０２８８】
プレートに結合した第二の抗Ｃｂｌ抗体を検出するため、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素（たとえば、アルファ・ダイアグノスティック・インタナショナル・インク（Alpha Diagnostic International, Inc.）、米国、ＴＸ ７８２３８、サンアントニオ）へコンジュゲートされた第三の抗体（たとえば、ヤギ抗マウスＩｇ、またはヤギ抗ウサギＩｇ）溶液が用いられる。第三の抗体は、１ｘブロッキング溶液中で、約０．１〜１．０μｇ／ｍｌタンパク質の最終濃度に希釈される。約１００μｌの希釈された第三の抗体が各ウエルに添加され、プレートは約１時間にわたり、室温でインキュベートされる。プレートは再度空にされ、洗浄され、かつ、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素基質（ＫＰＬ、米国、ＭＡ ２０８７９−４１７４、グーザーズバーグ）と反応される。反応は停止され、各ウエルの吸光度はプレートリーダーを用いて測定される。使用される波長は、用いられる基質、たとえば、ＡＢＴＳ（４０５〜４１０ｎｍ）、ＴＭＢ（非停止６２０〜６５０ｎｍ、停止４５０ｎｍ）、ＯＰＤ（非停止４５０ｎｍ、停止４９０ｎｍ）、ｐＮＰＰ（４０５〜４１０ｎｍ）、ＢｌｕｅＰｈｏｓＯ（５９５〜６５０ｎｍ）に依存するであろう。
【０２８９】
結果
トランスフェクトされていないＣ２Ｃ１２細胞か、またはヒトｃ−Ｃｂｌをセンス方向に発現する対照ベクターでトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞に由来する細胞ライゼートは、ＥＬＩＳＡアッセイフォーマットＩまたはＩＩによって測定されるような、検出可能なレベルのヒトｃ−Ｃｂｌを有することとなる。著しく対照的に、優性ネガティブ突然変異構築物、ｐＢａｂｅ−Ｃｂｌ  Ｇ３０６Ｅ、ｐＢａｂｅ−Ｃ３８１Ａ、ｐＢａｂｅ−Ｃｂｌ Ｙ７００Ｆ、ｐＢａｂｅ−Ｃｂｌ Ｙ７３１Ｆ、ｐＢａｂｅ−Ｙ７７４Ｆを含んでいる細胞に由来する細胞ライゼートは、アッセイフォーマットＩにおいて、またはアッセイフォーマットＩＩにしたがってＣｂｌの抗体補足およびそれに続く２サイトＥＬＩＳＡの後に、低減されたかまたは検出不能なレベルの抗Ｃｂｌ抗体と結合することとなる。
【０２９０】
かかるデータは、ｃ−Ｃｂｌ発現の阻害剤の効果が、標準的なＥＬＩＳＡアッセイフォーマットにおいて、トランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞からの細胞ライゼート中のｃ−Ｃｂｌタンパク質レベルを測定することにより、直接的に測定されることが可能であることを示唆している。他のイムノアッセイフォーマットもまた、この点に関して適用可能であると考えられる。
【０２９１】
これを基盤にさらに前進すれば、ｃ−Ｃｂｌタンパク質レベルは、ｃ−ＣｂｌアンチセンスＲＮＡか、または優性ネガティブ突然変異ｃ−Ｃｂｌ Ｙ７００Ｆ／Ｙ７３１Ｆ／Ｙ７７４Ｆを発現しているＣ２Ｃ１２細胞において、本文のサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを用いてアッセイされる。完全長のｃ−Ｃｂｌオープンリーディングフレームをセンス方向に発現している細胞からのライゼート中の、受容体に結合したユビキチンのレベルに比較して、これらの分子を発現するＣ２Ｃ１２細胞において検出可能な、低減されたｃ−Ｃｂｌタンパク質レベルは、これらの分子もまたｃ−Ｃｂｌ発現の効果的なアンタゴニストであることを示している。
【０２９２】
さらに、ヒトｃ−Ｃｂｌの発現に対して設計された一連のｐＡＤＴｒａｃｋ−ｓｈＲＮＡを発現する、アデノウイルス（Ａｄ５）ライブラリ（表４）は、Ｃ２Ｃ１２細胞ヘショットガンクローンされ、ｃ−Ｃｂｌタンパク質のレベルが測定される。野生型ヒトｃ−Ｃｂｌの完全長のオープンリーディングフレームを含んでいる対照プラスミドもまた導入される。空のベクターの対照、およびトランスフェクトされていない対照もまた用いられる。ＥＬＩＳＡアッセイフォーマットＩおよび／またはＥＬＩＳＡアッセイフォーマットＩＩによって測定されるような、低減されたレベルのｃ−Ｃｂｌタンパク質を有するライゼートを生じる細胞は、確認のための動物モデルへの導入のためといった、さらなる分析に向けて保持される。別法として、または加えて、対応するｓｈＲＮＡは、筋肉の熱産生に対するそれらの影響を査定するため、ｐＢａｂｅベクターにおいてＣ２Ｃ１２細胞へ導入される。
【実施例７】
【０２９３】
筋肉の熱産生に関しての、Ｃ２Ｃ１２細胞をベースとするアッセイ
発現ベクターおよび細胞系
Ｃ２Ｃ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７７２；ヤフェ（Yaffe）ら著、「ネイチャー」、１９７７年、第２７０巻、ｐ．７２５〜７２７；ヤフェら著、「ディフェレンシエーション（Differentiation）」、１９７７年、第７巻、ｐ．１５９〜１６６）は、入手され、維持され、かつヒトｃ−Ｃｂｌおよび優性ネガティブｃ−Ｃｂｌ突然変異体、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ、を発現するべく、先行する実施例に記述されたように修飾される。
【０２９４】
プロトンリークカイネティクス
Ｃ２Ｃ１２細胞におけるプロトンリークカイネティクスは、事実上、ブランド（Brand M.）著、［「ミトコンドリア：アプラクティカルアプローチ（Mitochondria: A practical approach）（ブラウン＆クーパー（Brown G and Cooper, C）共編）、オックスフォードユニバーシティプレス（Oxford Univ. Press）、オックスフォード、１９９５年、ｐ．３９〜６２」］によって記述されたように測定される。細胞は、０．２μＣｉ／ｍｌ［3Ｈ］−トリフェニルメチルホスホニウム（ＴＰＭＰ）、０．２μＭ ＴＰＭＰ、および担体として、１．５μＭ テトラフェニルボロン、ならびに２．５μｇのオリゴマイシンとともに３０分間インキュベートされる。
【０２９５】
細胞の呼吸率および膜電位は、以下のように測定される：各曲線の出発点（安静時代謝率）は、オリゴマイシンの存在下に測定されるものとして求められる。増加しつつあるミクソチアゾールの濃度（０〜０．０７２μＭ）は、膜電位および呼吸率を低減するべく添加される。最後に、２．５μＭミクソチアゾールおよび２μＭカルボニルシアニドp−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾンが、非ミトコンドリア呼吸を確認するべく添加される。非ミトコンドリア呼吸は、次いで全呼吸から引算され、ミトコンドリア呼吸の推定値を得る。膜電位は、サンピエール（St Pierre）ら著、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）」、２００３年、第２７８巻、ｐ．２６５９７〜２６６０３によって記述されたように推定される。
【０２９６】
これらの測定値は、ミトコンドリア呼吸の評価および、ミトコンドリア脱共役の程度を、プロトンリークカイネティクスによって評価されるものとして提供する。
【０２９７】
結果
トランスフェクトされていないＣ２Ｃ１２細胞、およびヒトｃ−Ｃｂｌをセンス方向に発現する対照ベクターでトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞は、それらのプロトンリークカイネティクスによって測定されるような、ミトコンドリア機能および熱産生活性の正常なベースラインを提供することとなる。著しく対照的に、優性ネガティブ突然変異構築物、ｐＢａｂｅ−Ｃｂｌ  Ｇ３０６Ｅ、ｐＢａｂｅ−Ｃ３８１Ａ、ｐＢａｂｅ−Ｃｂｌ Ｙ７００Ｆ、ｐＢａｂｅ−Ｃｂｌ Ｙ７３１Ｆ、ｐＢａｂｅ−Ｙ７７４Ｆを含んでいるＣ２Ｃ１２細胞は、トランスフェクトされていない対照か、またはＣｂｌタンパク質を異所性に発現する細胞に比較して、増大されたミトコンドリア呼吸率に一致するプロトンリークカイネティクスを示す。
【０２９８】
かかるデータは、ｃ−Ｃｂｌ発現の阻害剤の効果が、トランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞のプロトンリークカイネティクスを測定することにより、直接的にアッセイされることが可能であることを示唆している。
【０２９９】
これを基盤にさらに前進すれば、プロトンリークカイネティクスは、ｃ−ＣｂｌアンチセンスＲＮＡか、または優性ネガティブ突然変異ｃ−Ｃｂｌ Ｙ７００Ｆ／Ｙ７３１Ｆ／Ｙ７７４Ｆを発現しているＣ２Ｃ１２細胞において測定される。完全長のｃ−Ｃｂｌオープンリーディングフレームをセンス方向に発現している細胞の呼吸率に比較して、これらの分子を発現するＣ２Ｃ１２細胞の増大されたミトコンドリア呼吸率は、これらの分子もまたｃ−Ｃｂｌ発現の効果的なアンタゴニストであることを示している。
【０３００】
さらに、ヒトｃ−Ｃｂｌの発現に対して設計された一連のｐＡＤＴｒａｃｋ−ｓｈＲＮＡを発現する、アデノウイルス（Ａｄ５）ライブラリ（表４）は、Ｃ２Ｃ１２細胞ヘショットガンクローンされ、トランスフェクトされた細胞のプロトンリークカイネティクスが測定される。野生型ヒトｃ−Ｃｂｌの完全長のオープンリーディングフレームを含んでいる対照プラスミドもまた導入される。空のベクターの対照、およびトランスフェクトされていない対照もまた用いられる。増大されたミトコンドリア呼吸率に一致したプロトンリークカイネティクスを示す細胞は、確認のための動物モデルへの導入のためといった、さらなる分析に向けて保持される。
【実施例８】
【０３０１】
動物モデルでおこなわれるスクリーニングアッセイ
ヒトｃ−Ｃｂｌノックインマウスモデルの産生
マウスｃ−Ｃｂｌ遺伝子の上流の配列（約２〜３ｋｂｐ）を含んでおり、かつエクソン１およびイントロン１の５′部分を含んでいる、５′−Ｃｂｌストレイン１２９マウスゲノムフラグメントは、マウス染色体ＤＮＡか、またはｃ−Ｃｂｌ遺伝子およびフランキング配列を含んでいる染色体９ＢＡＣから、ＰＣＲによって産生される。マウスｃ−Ｃｂｌ遺伝子の、最終エクソンの３′半分と、３′−フランキング配列とを含んでいる、３′−Ｃｂｌストレイン１２９マウスゲノムフラグメント（約２〜３ｋｂｐ）もまた、ＰＣＲにより派生される。
【０３０２】
ヒトｃ−Ｃｂｌ遺伝子の、イントロン１の３′部分を通して含んでおり、かつ最終エクソンを含んでいるヒトゲノムフラグメントは、プラスミドからの連続的な消化により単離される。
【０３０３】
遺伝子ターゲティング構築物を得るためには、５′−Ｃｂｌマウスゲノムフラグメントおよびヒトゲノムフラグメントは、ｐＰＮ２Ｔ（パスツィー（Paszy）ら、「ネイチャー・ジェネティクス（Nat. Genet.）」、１９９５年、第１１巻、ｐ．３３〜３９）ベクター、ネオマイシン耐性遺伝子の上流へ挿入される。マウス３′−Ｃｂｌゲノムフラグメントは、ネオマイシン耐性遺伝子の下流に挿入される。ターゲティングベクター内のインサートの配置は、マウスの５′−Ｃｂｌおよび３′−Ｃｂｌのホモロジーアームが、ヒトＣｂｌ遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子に割り込まれるようになっており、かつこのカセットはベクター内のチミジンキナーゼ遺伝子の上流にある。ターゲティングベクターは線形化され、精製され、エレクトロポレーション用にＴＥ（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．１、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再溶解される。
【０３０４】
マウスストレイン１２９胚性幹細胞系のサブクローン、ＥＳＶＪ（Ｇｏ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ、ゲノムシステムズ・インク（GenomeSystems, Inc.）は、ネオマイシン耐性マウス線維芽細胞フィーダー層上で培養され、事実上、コラー（Koller）ら著、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）」、１９９１年、第８８巻、ｐ．１０７３０〜１０７３４に記述されたように、２０μｇの線形化されたターゲティングベクターを用いてエレエクトロポレートされる。適当なインテグランツは、ポジティブ−ネガティブ選択により、ネオマイシン（Ｇ４１８−Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、インビトロジェン）を２００μｇ／ｍｌの最終濃度で、また２μＭのガンシクロビル（ＦＩＡＵ、モラベク・バイオケミカルズ（Moravek Biochemicals）、カリフォルニア州、ブレア）を用いて選択される。１０〜１２日後、コロニーは９６ウェルプレートに移され、首尾よいターゲティングおよび導入されたヒトＣｂｌ遺伝子の再配列の欠如について、通常の方法を用いたサザンブロッティングにより検査される。
【０３０５】
約１０〜１５個のターゲットされた胚性幹細胞が、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ胚の胞胚腔内へ注射される。生存している胚盤胞は、擬妊娠のＣＤ−１雌へ移される。毛皮の色によるキメラ動物は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ動物へ交配され、それらの生殖細胞系の能力が測定される。ヘテロ接合性の突然変異体は、尾から単離されたＤＮＡのサザンブロッティングにより同定され、同胞交配が行なわれ、ヒトｃ−Ｃｂｌを発現しているホモ接合性のノックイン突然変異マウス系を生じる。
【０３０６】
Ｃｂ+/+マウスおよびヒトｃ−Ｃｂｌノックインマウスにおける優性ネガティブＣｂｌ突然変異体の発現
後肢筋肉へのアデノウイルス送達における変動のため、レポーター遺伝子の発現の定量化を可能にする発現ベクター、例えば、ｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶベクターを用いることが好ましい。したがって、実施例５において記述されたような、ｃ−Ｃｂｌ Ｇ３０６Ｅ（配列番号２４８）、ｃ−Ｃｂｌ Ｃ３８１Ａ（配列番号２５０）、ｃ−Ｃｂｌ Ｙ７００Ｆ（配列番号２５２）、ｃ−Ｃｂｌ Ｙ７３１Ｆ（配列番号２５４）、ｃ−Ｃｂｌ Ｙ７７４Ｆ（配列番号２５６）、ｃ−Ｃｂｌ ４８０（配列番号２６０）、およびｃ−Ｃｂｌ Ｙ７００Ｆ／Ｙ７３１Ｆ／Ｙ７７４Ｆ（配列番号２５８）と呼ばれる、ヒトｃ−Ｃｂｌの優性ネガティブ突然変異をコードしているオープンリーディングフレームは、シャトルベクターｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶへ別々にサブクローンされ、それらの発現を、ＣＭＶプロモーターの支配下にあるＧＦＰ融合タンパク質として可能にする。ＧＦＰタグは、Ｃｂｌタンパク質部分の機能には重要ではない。結果として得られるプラスミドは、ｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ−Ｇ３０６Ｅ−ＧＦＰ、ｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ−Ｃ３８１Ａ−ＧＦＰ、ｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ−Ｙ７００Ｆ−ＧＦＰ、ｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ−Ｙ７３１Ｆ−ＧＦＰ、ｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ−Ｙ７７４Ｆ−ＧＦＰ、ｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ−Ｃｂｌ ４８０−ＧＦＰ、およびｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ−Ｙ７００Ｆ／Ｙ７３１Ｆ／Ｙ７７４Ｆ−ＧＦＰと呼ばれる。
【０３０７】
完全長のヒトｃ−Ｃｂｌオープンリーディングフレームを含んでいるさらなる対照プラスミドもまた、ｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶベクターにおいて産生される。このプラスミドはｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ−Ｃｂｌ−ＧＦＰと呼ばれる。
【０３０８】
これらの構築物を含んでいるアデノウイルスは、事実上、ヒー（He）ら著、「プロシーデシングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc． Natl. Acad. Sci. USA）」、１９９８年、第９５巻、ｐ．２５０９〜２５１４によって記述されたように産生される。手短かに言えば、ｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶをベースとするベクターは、ＰｍｅＩにより線形化され、ＡｄＥａｓｉｅｒ−１細胞か、またはｐＡｄＥａｓｙ−１プラスミドをもつ大腸菌ＢＪ５１８３細胞へトランスフェクトされる。ｐＡｄＥａｓｙ−１アデノウイルスプラスミドは、ヌクレオチド１〜３，５３３（Ｅ１遺伝子を含む）およびヌクレオチド２８，１３０〜３０，８２０（Ｅ３遺伝子を含む）を除き、すべてのＡｄ５配列を含む。組換えウイルスゲノムはＰａｃＩにより線形化され、６ウェルプレート中のアデノウイルスパッケージング２９３細胞へ、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン）を用いてトランスフェクトされる。トランスフェクションの8日後、組換えウイルスは集められ、Ｔ−２５フラスコにおいて、１．５×１０6個の２９３細胞を用いて、１ラウンドの増幅を受け、結果として２ｍｌのウイルスストックを生じる。
【０３０９】
優性ネガティブＣｂｌ突然変異を発現するアデノウイルスは、野生型および上記のｃ−Ｃｂｌノックインマウスの双方へ、事実上、オーラマン（Allamand）ら著、「ジーン・セラピー（Gene Ther.）」、２０００年、第７巻、ｐ．１３８５〜１３９１に記述されたように導入される。これはマウス後肢骨格筋における高い効率（７０〜１００％）の核酸のトランスファーおよび発現のための強力な系であり、アデノウイルスを注射された筋肉に限定されるが、発現は感染後8週より長く維持される。手短かに言えば、マウス（２〜４日齢）は、低体温により麻酔され、ｓｈＲＮＡを含んでいる感染性アデノウイルス（２×１０9）が、食塩水中で、後肢内のいくつかの筋肉へ経皮的に注射される。子マウスは再び母親にもどされ、４〜８週齢において調べられる。関連する筋肉は、注射後の異なる時間に切除される（１、２、４、および8週）。
【０３１０】
Ｃｂｌ+/+マウスおよびヒトｃ−ＣｂｌノックインマウスにおけるｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの発現
実施例５において記述されたような、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを発現するアデノウイルスは、野生型マウスおよび上記のｃ−Ｃｂｌノックインマウスの双方へ導入され、マウスは事実上、先行する段落に記述されたように処理および分析される。
【０３１１】
Ｃｂｌ-/-マウスおよびヒトｃ−Ｃｂｌノックインマウスの表現型に対する優性ネガティブＣｂｌ突然変異体、ｓｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡの影響
阻害性核酸が、Ｃｂｌ-/-マウスモデルの表現型を模す能力は、野生型（Ｃｂｌ+/+マウス）および／または、マウスＣｂｌ遺伝子がヒトＣｂｌをコードしている遺伝子で置換えられたマウス（すなわち、Ｃｂｌノックインマウス）へ投与された場合のそれらの影響によって測定される。後者のマウスモデルは、ヒトｃ−Ｃｂｌに対する影響をヒトにおいて予測するために特に望ましい。食事摂取量、体重、中心体温、酸素消費量、インビボのグルコース耐性、および全身の脂肪蓄積は、１週齢からのマウスについて測定される。
【０３１２】
増大した熱産生を示す様々なパラメータはまた、単離された後肢筋肉において、ミトコンドリアサイズ、数、および機能、ミトコンドリアの酸化状態の指標としてのマロニルＣｏＡレベル、細胞内トリグリセリド、およびグリコーゲンレベルを含めた標準的な方法で容易に評価される。
【０３１３】
プロトンリークカイネティクスは、種々のヌクレオチド阻害剤で処理されたマウスの後肢筋肉から単離されたミトコンドリアについて測定される。ミトコンドリアは、先に記述されたように（サンピエール（St Pierre）ら著、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）」、２００３年、第２７８巻、ｐ．２６５９７〜２６６０３）筋肉から単離される。脚の筋肉は、動物から除去され、分離緩衝液（１００ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭトリス、２ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）中で、４℃においてホモジナイズされる。ホモジェネートは２０００ｘｇにおいて５分間遠心分離される。上清は１０，０００ｘｇにおいて１０分間遠心分離される。この回転からの沈殿は洗浄され、分離緩衝液中に再懸濁される。酸素消費量は、クラーク（Clark）型電極を用いて測定され、膜電位はＴＰＭＰ電極を用いて測定される。ロテノン（５μＭ）、オリゴマイシン（１μｇ／ｍｇミトコンドリアタンパク質）およびニゲリシン（８０ｎｇ／ｍｌ）が、アッセイの開始時に添加される。ＴＰＭＰは、キャリブレーションのため、１．３μＭまで添加されることとなる。ミトコンドリアは９４ｍＭコハク酸塩が与えられ、阻害剤マロン酸塩は、１．３ｍＭまで徐々に添加され、ミトコンドリアの呼吸および膜電位を阻害する。最後に、ｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（０．１５μＭ）が添加されてＴＰＭＰ電極のドリフトを測定する。この影響が筋肉に特異的であることを測定するため、他の組織から単離されたミトコンドリアを用いて同様の研究が行なわれる。
【０３１４】
結果
野生型マウス、および完全長の天然のヒトｃ−Ｃｂｌをセンス方向に発現するアデノウイルスでトランスフェクトされたＣｂｌノックインマウスは、脂肪沈着、代謝、および後肢筋肉における代謝率に関して正常な表現型を有する。これらの動物はまた、後肢筋肉から単離された細胞のプロトンリークカイネティクスによって測定されるような、ミトコンドリア機能および熱産生活性の正常なベースラインを提供する。著しく対照的に、優性ネガティブ突然変異構築物、ｐＢａｂｅ−Ｃｂｌ  Ｇ３０６Ｅ、ｐＢａｂｅ−Ｃ３８１Ａ、ｐＢａｂｅ−Ｃｂｌ Ｙ７００Ｆ、ｐＢａｂｅ−Ｃｂｌ Ｙ７３１Ｆ、ｐＢａｂｅ−Ｙ７７４Ｆを発現するアデノウイルスを投与された動物は、実施例１〜４に記述されたＣｂｌ-/-マウスの除脂肪筋肉表現型を、部分的または完全に模している。さらに、これらの動物の後肢筋肉から単離された細胞のプロトンリークカイネティクスは、対照動物に比較して増大されたミトコンドリア呼吸率と一致する。
【０３１５】
かかるデータは、ｃ−Ｃｂｌ発現の阻害剤の効果が、適当なマウスモデルの後肢筋肉において、核酸阻害剤を発現すること、および、脂肪、グルコース取込み、脂肪および／または筋肉へのグルコース輸送、筋肉温度、および、動物からの後肢筋肉の安静時代謝率のレベルを測定することにより、分析または確証されることが可能である。さらに後肢筋肉のプロトンリークカイネティクスはまた、阻害剤分子の評価有効性の手段を提供する。
【０３１６】
これを基盤にさらに前進すれば、ｃ−ＣｂｌアンチセンスＲＮＡか、または優性ネガティブ突然変異ｃ−Ｃｂｌ Ｙ７００Ｆ／Ｙ７３１Ｆ／Ｙ７７４Ｆを発現するアデノウイルスを投与された動物からの脂肪、グルコース取込み、脂肪および／または筋肉へのグルコース輸送、筋肉温度、および、動物からの後肢筋肉の安静時代謝率のレベル。プロトンリークカイネティクスは、後肢筋肉細胞についても測定される。完全長のｃ−Ｃｂｌオープンリーディングフレームをセンス方向に発現するアデノウイルスを投与された動物についてのパラメータのレベルに比較して、低減された脂肪量および／または、脂肪または筋肉への増大されたグルコース輸送および／または上昇された筋肉温度および／または、これらの分子を発現している後肢筋肉の増大されたミトコンドリア呼吸率は、これらの分子もまたｃ−Ｃｂｌ発現の効果的なアンタゴニストであることを示している。
【０３１７】
ヒトｃ−Ｃｂｌ発現に対して設計された一連のｓｈＲＮＡ（表４）を発現するアデノウイルス（Ａｄ５）もまた（表４）、ヒトＣｂｌ遺伝子に対するインビボの効果を測定するべく、この動物モデルにおいて検査される。完全長のｃ−Ｃｂｌオープンリーディングフレームをセンス方向に発現するアデノウイルスを投与された動物についてのパラメータのレベルに比較して、低減された脂肪量および／または上昇された温度および／または、脂肪または筋肉への増大されたグルコース輸送および／または上昇された筋肉温度および／または、これらの分子を発現している後肢筋肉の増大されたミトコンドリア呼吸率は、これらの分子もまたｃ−Ｃｂｌ発現の効果的なアンタゴニストであることを示している。
【０３１８】
動物モデルにおいて、このような所望の効果の一以上をもたらす分子が臨床試験に入れられる。
【実施例９】
【０３１９】
ミトコンドリア機能のアッセイ
発現ベクターおよび細胞系
Ｃ２Ｃ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７７２；ヤフェ（Yaffe）ら著、「ネイチャー」、１９７７年、第２７０巻、ｐ．７２５〜７２７；ヤフェら著、「ディフェレンシエーション（Differentiation）」、１９７７年、第７巻、ｐ．１５９〜１６６）は、入手され、維持され、かつヒトｃ−Ｃｂｌおよび優性ネガティブｃ−Ｃｂｌ突然変異体、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを発現するべく、実施例６に記述されたように修飾される。
【０３２０】
電子顕微鏡
ｃ−Ｃｂｌ欠失の、ミトコンドリアの構造および機能に対する影響を調べるため、優性ネガティブ突然変異体、ｓｈＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡを発現するＣ２Ｃ１２細胞は、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４中の、２．５％グルタールアルデヒド、１％パラホルムアルデヒド、および、０．０３％ピクリン酸により固定され、０．１Ｍカコジル酸緩衝液中で洗浄され、１％四酸化オスミウム／１．５％フェロシアン化カリウムで１時間、後固定され、水で洗浄され、１％酢酸ウラニルで３０分間染色され、続いてアルコール中で再水和される。試料はエポン中に包埋され、ウルトラマイクロトームを用いて６０ｎｍの切片が切り出される。細胞の、ミトコンドリア体積密度、およびクリステ表面密度は、ウィーベル（Wiebel）著、「ステレオロジカル・メソズ：プラクティカル・メソズ・フォー・バイオロジカル・モルフォメトリー（Stereological methods: Practical methods for Biological morphometry）」、アカデミックプレス、ロンドン、１９７９年、により記述されたように測定される。
【０３２１】
ミトコンドリアタンパク質のレベル
ミトコンドリアタンパク質（チトクロームＣ、ＡＴＰシンターゼ、ＵＣＰ２、ＵＣＰ３、ＰＧＣ１、ならびに反応性酸素分子種（ＲＯＳ）の代謝に関係する酵素の範囲）の範囲のレベルは、ウェスタンブロッティングにより容易に測定される。
【０３２２】
本発明者らの観察を説明するための一つの仮説は、ｃ−Ｃｂｌが反応性酸素分子種（ＲＯＳ）の産生を調節するかもしれないことである。このことは、チロシンキナーゼＧＦ受容体が、ＥＧＦＲのように、Ｈ2Ｏ2の産生を調製するからである。ｃ−Ｃｂｌのないバックグラウンドではこれらの受容体のレベルが増加することから、ＲＯＳのレベルも上昇するであろう。ＲＯＳは、ミトコンドリアの非共役タンパク質を、ＦＦＡ依存性の様式で活性化することが先に示されている（エクタイ、ルーゼル、サンピエールら（Ectay, Roussel, St Pierre et al）著、「ネイチャー」、２００１年）。この仮説を検証するため、ｃ−Ｃｂｌ-/-マウスにおける、ならびにｃ−Ｃｂｌを欠失したＣ２Ｃ１２細胞におけるＲＯＳのレベルが、アーシニエビク（Arsenijevic）ら著、「ネイチャー・ジェネティクス（Nature Genetics）」、２０００年、第２６巻、ｐ．４３５〜４３９、によって記述された方法を用いて測定される。
【図面の簡単な説明】
【０３２３】
【図１】野生型（白抜きの記号）の雄（丸）および雌（三角）、およびＣｂｌ遺伝子座における双方の対立遺伝子における突然変異に関してホモ接合であるＣｂｌ欠損性（塗りつぶしの記号）の雄（丸）および雌（三角）マウスの、グラムでの体重（縦座標）を示しているグラフ図である。マウスの体重は、離乳から１６週齢まで毎週測定された（x軸）。データは、Ｃｂｌ欠損性の雄マウスが、その野生型の相当物よりも、調べられた期間を通して有意に高い体重を有することを示す。Ｃｂｌ欠損性の雌マウスの体重は、野生型雌の体重と同じである。
【図２】野生型（白抜きの記号）の雄（丸）おおよび雌（三角）、およびＣｂｌ遺伝子座における双方の対立遺伝子における突然変異に関してホモ接合であるＣｂｌ欠損性（塗りつぶしの記号）の雄（丸）および雌（三角）マウスの、１日あたりのグラムでの食事摂取量（縦座標）を示しているグラフ図である。食事摂取量は、５週齢から１６週齢まで毎週測定された（x軸）。データは、Ｃｂｌ欠損性の雄および雌のマウスが、その野生型の相当物よりも、調べられた期間を通して有意に高い増大された食事摂取量（すなわち、増進された食欲）を有することを示す。Ｃｂｌ欠損性の雌のマウスの食事摂取量はまた、野生型の雄の食事摂取量よりも有意に高い。
【図３】野生型（白抜きの記号）の雄（丸）おおよび雌（三角）、およびＣｂｌ遺伝子座における双方の対立遺伝子における突然変異に関してホモ接合であるＣｂｌ欠損性（塗りつぶしの記号）の雄（丸）および雌（三角）マウスの、体重と比較した食事摂取量（縦座標）を示しているグラフ図である。体重に対する食事摂取量は、５週齢から１６週齢まで毎週測定された（ｘ軸）。データは、Ｃｂｌ欠損性の雄および雌のマウスが、その野生型の相当物よりも、調べられた期間を通して有意に高い増大された比食事摂取量（すなわち、体重と比較した食事摂取量で測定された、増進された食欲）を有することを示す。
【図４】野生型マウスおよびＣｂｌ遺伝子座における双方の対立遺伝子における突然変異に関してホモ接合であるＣｂｌ欠損性のマウス（塗りつぶしの記号）の組織重（平均＋／−ＳＥＭ（標準誤差））を示している、表で示した図である。ＷＡＴ、白色脂肪組織；ＢＡＴ、褐色脂肪組織；ＱＵＡＤ；大腿四頭筋。データは、野生型の動物に比較して、Ｃｂｌ欠損動物の低減された脂肪組織重を示す。
【図５】野生型マウス（左）およびＣｂｌ遺伝子座における双方の対立遺伝子における突然変異に関してホモ接合であるＣｂｌ欠損性のマウス（右）における、脂肪細胞のサイズを示している写真図である。
【図６】Ｃｂｌ遺伝子座における双方の対立遺伝子における突然変異に関してホモ接合であるＣｂｌ欠損性（ＫＯ）の雄（上パネル）および雌（下パネル）マウスと比較した野生型（ＷＴ）の雄（上パネル）おおよび雌（下パネル）の、脂肪細胞の直径（μｍ）、脂肪細胞の体積（ｐｌ／細胞）、および脂質含有量（ｎｇ／細胞）を示している、表で示した図である。データは、平均値＋／−ＳＥＭを示す。データは、Ｃｂｌ欠損性のマウスでは、野生型のマウスに比較して、雄および雌の双方に関して、脂肪細胞のサイズおよび体積における有意な低減、および脂肪細胞の低減された脂質含有量があることを示す。
【図７Ａ】ｃ−ＣＢＬ-/-マウスのひらめ筋におけるグルコース輸送を示しているグラフ図である。ひらめ筋は、ｃ−ＣＢＬ-/-マウスおよび野生型ｃ−ＣＢＬ+/+マウスから除去され、標識された２−デオキシグルコースおよびインスリンなし（ベーサル）、３００μＵ／ｍｌのインスリン（サブマックス）、および１０００μＵ／ｍｌのインスリン（スープラマックス）の存在下にインキュベートされた。次いで筋肉は液化され、筋肉によって取込まれた標識された２−デオキシグルコースの量が、液体シンチレーションカウンターを用いて測定された。この量＋／−ＳＥＭが、グラフにより表された。＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１
【図７Ｂ】ｃ−ＣＢＬ-/-マウスの長指伸筋におけるグルコース輸送を示しているグラフ図である。長指伸筋は、ｃ−ＣＢＬ-/-マウスおよび野生型ｃ−ＣＢＬ+/+マウスから除去され、標識された２−デオキシグルコースおよびインスリンなし（ベーサル）、３００μＵ／ｍｌのインスリン（サブマックス）、および１０００μＵ／ｍｌのインスリン（スープラマックス）の存在下にインキュベートされた。次いで筋肉は液化され、筋肉によって取込まれた標識された２−デオキシグルコースの量が、液体シンチレーションカウンターを用いて測定された。この量＋／−ＳＥＭが、グラフにより表された。＊，ｐ＜０．０５。
【図８】ｃ−ＣＢＬ-/-マウスから採られた脂肪外植片におけるグルコース輸送を示しているグラフ図である。精巣上体脂肪体は、ｃ−ＣＢＬ-/-マウスおよび野生型ｃ−ＣＢＬ+/+マウスから除去され、切り刻まれた。試料は次いで、標識された２−デオキシグルコースおよびインスリンなし（０）、０．０５ｎＭインスリン（０．０５）、および１ｎＭインスリン（１）の存在下にインキュベートされた。脂肪外植片によって取込まれた標識された２−デオキシグルコースの量が、液体シンチレーションカウンターを用いて測定された。この量＋／−ＳＥＭが、グラフにより表された。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【国際調査報告】
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