(57)【要約】特定のプライム・ブースト計画を利用する、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を誘導する効果的な方法が開示される。その特定のプライム・ブースト計画では、一般的なＨＩＶ抗原をコードする外来性の遺伝物質を含む組み換えアデノウイルスベクターおよび組み換えポックスウイルスベクターを、その順番で投与するという異種のプライム・ブーストプロトコールが採用される。開示された計画に基づいて、脊椎動物の生きている組織内に、好ましくは哺乳動物（たとえば、ヒト、または市販されているかまたは家畜として獣医学的に重要な非ヒトの哺乳動物）の宿主にワクチンを投与することによって、ＨＩＶ−１抗原（たとえばＧａｇ）が発現され、ＨＩＶ−１を特異的に認識する細胞性免疫応答が誘導される。開示されたプライム／ブースト計画によって、今まで感染していない個体に対する予防上の利点および／または感染した個体内でのウイルス負荷レベルを減少させることによる治療効果が提供されること、そしてその結果、ＨＩＶ−１感染の無症候期が延長することが考えられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｅ１の少なくとも一部を欠失しＥ１の活性が奪われた、ＨＩＶ−１抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む組み換えアデノウイルスベクターを、哺乳動物宿主に接種する工程；およびその後に
（ｂ）ＨＩＶ−１抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む組み換えポックスウイルスベクターを含むブースト化免疫物を該哺乳動物宿主に接種する工程；ただし、該ポックスウイルスベクターは哺乳動物宿主おける複製能が損なわれているものとする、
を含む、哺乳動物宿主においてＨＩＶ−１抗原に対する強化された免疫応答を誘導する方法。
【請求項２】
アデノウイルスベクターが血清型５のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組み換えアデノウイルスベクターが野生型血清型５のアデノウイルスゲノムの塩基対４５１から３５１０に対応する塩基対が欠失しているものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
アデノウイルスベクターが血清型６のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＨＩＶ−１抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子の少なくとも一つが、ヒトにおける発現に最適化されたコドンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
組み換えアデノウイルスベクターが、
（ａ）ＨＩＶ−１抗原をコードする核酸；
（ｂ）前記抗原をコードする核酸に作動可能に連結した異種プロモーター；および
（ｃ）転写終結配列：
を含む遺伝子発現カセットを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
組み換えポックスウイルスベクターが、
（ａ）ＨＩＶ−１抗原をコードする核酸；および
（ｂ）前記抗原をコードする核酸に作動可能に連結したプロモーター；ただし、該プロモーターはポックスウイルスに由来するものかまたはそれに固有のものとする：
を含む遺伝子発現カセットを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
組み換えアデノウイルスベクターにおける遺伝子発現カセットがＥ１領域内に挿入されている、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
組み換えアデノウイルスベクターにおける遺伝子発現カセットがＥ１と平行方向にある、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
プロモーターがイントロン配列を欠くサイトメガロウイルスのプロモーターである、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
プロモーターがヒトサイトメガロウイルス即時型プロモーターである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
プロモーターがワクシニアウイルスの合成の初期／後期プロモーターである、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
転写終結配列がウシ成長ホルモンのポリアデニル化および転写終結配列である、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
ＨＩＶ−１抗原がＨＩＶ−１  ｇａｇである、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
ＨＩＶ−１抗原がＨＩＶ−１  ｇａｇである、請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
遺伝子発現カセットが、ＨＩＶ−１  ｇａｇタンパク質または免疫学的に関連するその改変体をコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１７】
遺伝子発現カセットが、ＨＩＶ−１  ｇａｇタンパク質または免疫学的に関連するその改変体をコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１８】
ポックスウイルスベクターが弱毒化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ポックスウイルスベクターが、処置された哺乳動物宿主内でウイルスが複製能欠損性であるように改変されたワクシニアウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ポックスウイルスベクターがアビポックスウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ポックスウイルスベクターが鶏痘ウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
ポックスウイルスベクターがＭＶＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
ポックスウイルスベクターがワクシニアウイルスのＮＹＶＡＣ株である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
ポックスウイルスベクターがＡＬＶＡＣである、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
（ａ）Ｅ１の少なくとも一部を欠失しＥ１の活性が奪われた、ＨＩＶ−１  ｇａｇ抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む血清型５の組み換えアデノウイルスベクターを、哺乳動物宿主に接種する工程；およびその後に
（ｂ）ＨＩＶ−１  ｇａｇ抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む組み換えポックスウイルスベクターを含むブースト化免疫化物を該哺乳動物宿主に接種する工程；ただし、該ポックスウイルスベクターは哺乳動物宿主における複数能が損なわれているものとする、
を含む、哺乳動物宿主においてＨＩＶ−１  ｇａｇ抗原に対する強化された免疫応答を誘導する方法。
【請求項２６】
（ａ）Ｅ１の少なくとも一部を欠失しＥ１の活性が奪われた、ＨＩＶ−１抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む組み換えアデノウイルスベクターを、哺乳動物宿主に接種する工程；およびその後に
（ｂ）ＨＩＶ−１抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む組み換えＡＬＶＡＣベクターを含むブースト化免疫物を該哺乳動物宿主に接種する工程、
を含む、哺乳動物宿主においてＨＩＶ−１抗原に対する強化された免疫応答を誘導する方法。
【請求項２７】
（ａ）Ｅ１の少なくとも一部を欠失しＥ１の活性が奪われた、ＨＩＶ−１  ｇａｇ抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む組み換えアデノウイルスベクターを、哺乳動物宿主に接種する工程；およびその後に
（ｂ）ＨＩＶ−１  ｇａｇ抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む組み換えＡＬＶＡＣベクターを含むブースト化免疫物を該哺乳動物宿主に接種する工程、
を含む、哺乳動物宿主においてＨＩＶ−１  ｇａｇ抗原に対する強化された免疫応答を誘導する方法。
【請求項２８】
（ａ）Ｅ１の少なくとも一部を欠失しＥ１の活性が奪われた、ＨＩＶ−１抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む組み換えアデノウイルスベクターを、哺乳動物宿主に接種する工程；およびその後に
（ｂ）ＨＩＶ−１  ｇａｇ抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む組み換えＭＶＡベクターを含むブースト化免疫物を該哺乳動物宿主に接種する工程、
を含む、哺乳動物宿主においてＨＩＶ−１抗原に対する強化された免疫応答を誘導する方法。
【請求項２９】
（ａ）Ｅ１の少なくとも一部を欠失しＥ１の活性が奪われた、ＨＩＶ−１  ｇａｇ抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む組み換えアデノウイルスベクターを、哺乳動物宿主に接種する工程；およびその後に
（ｂ）ＨＩＶ−１  ｇａｇ抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む組み換えＭＶＡベクターを含むブースト化免疫物を該哺乳動物宿主に接種する工程、
を含む、哺乳動物宿主においてＨＩＶ−１  ｇａｇ抗原に対する強化された免疫応答を誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願についての相互参照）
本出願は、それぞれ２００２年３月１３日および２００２年６月２７日に出願された米国仮出願第６０／３６３，８７０号および第６０／３９２，５８１号についての優先権を主張するものであり、これらは参照して本明細書に組み込まれる。
（連邦政府から資金を受けている研究開発に関する陳述）
適用されない
（マイクロフィッシュ・アペンディクスへの言及）
適用されない
【０００２】
本発明は、特定の順序で異種のプライム・ブースト投与を行う際に、ＨＩＶ抗原をコードする外来性の遺伝物質を含む組み換えアデノウイルスベクターおよび組み換えポックスウイルスベクターを利用する、ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）に対する免疫応答を誘導するための強化された方法に関する。本出願人らは、このスキームにてポックスウイルスを投与することによって、アデノウイルスでプライムされたＨＩＶに対する免疫応答を極めて効果的にブーストできることを見出した。本発明で用いられるウイルスとしては、利用される特定のウイルスがそのウイルス配列内に導入された外来性の遺伝物質を発現させる能力を有する限り、あらゆるアデノウイルスまたはポックスウイルスが可能である。さらに、ウイルスは、複製能を欠くか、宿主が限定されるか、または処置された哺乳動物宿主細胞内でそのウイルスが自由に複製できなくなるように改変されることが必須である。本発明の特定の実施態様では、複製能を欠き、そしてプライム化投与の際にＥ１活性が特異的に奪われるアデノウイルス媒体が採用される。本発明のさらに特定の実施態様では、ブースト化投与において、改変されたワクシニアウイルス（たとえば、改変されたワクシニアウイルスのＡｎｋａｒａ株（「ＭＶＡ」）、またはワクシニアウイルスの高度弱毒株であるＮＹＶＡＣ株）が採用される。他に採り得る実施態様では、たとえば、（ＡＬＶＡＣなどの）カナリアポックスウイルス、その他の鶏痘ウイルスおよび牛痘ウイルスからなる群より選択されるポックスウイルスが採用される。出願人らは、抗原（特にＨＩＶ抗原）をコードする外来性の遺伝物質を含む組み換えアデノウイルス媒体を投与し、次いでその抗原を含む組み換えポックスウイルスを投与すると、初期投与からの応答が、プライム化の投与およびブースト化の投与の両者のために組み換えアデノウイルスまたは組み換えポックスウイルスを介して独立に、抗原を独立して投与する場合に見られる以上に著しく増幅され、それゆえに、強化された免疫応答が提供されることを見出した。アデノウイルスでプライムされた免疫応答を、ポックスウイルスで効果的にブースト化を行うことで、細胞性免疫応答において特に明白な、ＨＩＶを特異的に認識することができる顕著に強化された免疫応答が導かれる。上記の発見事項に基づけば、開示されたプライム／ブースト計画によって、今まで感染していない個体に対する予防上の利点および／または感染した個体内でのウイルス負荷レベルを減少させることによる治療効果が提供されるだろうこと、そしてその結果、ＨＩＶ−１感染の無症候期が延長すると考えられる。
【背景技術】
【０００３】
ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）は、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）および関連する疾患の病原因子である。ＨＩＶ−１はレトロウイルス科のＲＮＡウイルスであり、すべてのレトロウイルスの５’ＬＴＲ−ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ−ＬＴＲ３’の構成を示す。プロウイルスとして知られているＨＩＶ−１の完全型の長さは約９．８Ｋｂである。ウイルスのゲノムのそれぞれの末端には、長末端反復（ＬＴＲ）として知られているフランキング配列が含まれている。ＨＩＶの遺伝子は少なくとも九種のタンパク質をコードしており、そしてこの遺伝子は三種のクラスに分類される；主要構造タンパク質（Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖ）、調節タンパク質（ＴａｔおよびＲｅｖ）；ならびにアクセサリータンパク質（Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、ＶｉｆおよびＮｅｆ）である。
【０００４】
ＨＩＶ−１が感染した個体についての効果的な治療計画を利用できるようにはなった。しかしながら、これらの薬物は、世界の多くの地域の疾患に顕著な影響を与えることはなく、これらの薬物は、ヒト集団の範囲内での感染の広がりを食い止める最小限の効果しか与えない。その他の多くの感染症でそうであるように、効果的なワクチンの開発および導入の後にのみ、ＨＩＶ−１感染の広がりに対して疫学的に顕著な効果を与える。現在までワクチンの開発が成功しないことに寄与する因子は数多く存在する。たとえば、慢性的な感染者ではＨＩＶ−１に対する体液性免疫応答および細胞性免疫応答が存在し、かつウイルス感染細胞が破壊されているにも拘らず、一定量のウイルス生産の存在が、現在では明らかになっている。その他の感染症の場合のように、疾患の成り行きは、免疫応答の速度論および規模、病原体の複製の速度、ならびに免疫応答に対する影響の受けやすさの間のバランスの結果である。成立した感染によって免疫応答を発達させることよりも、急性感染による、免疫を予め存在させる方がより効果的である。第二の因子は、ウイルスの遺伝的変異性の著しさである。ＨＩＶ−１の感染力を中和することができる抗ＨＩＶ−１抗体は細胞培養液中に存在するが、これらの抗体は一般的に、それらの活性において、単離されたウイルスに特異的である。従来の方法を用いてＨＩＶ−１の血清学上の分類を明らかにすることは不可能であることが分かった。より正確に言えば、このウイルスは血清学上の「連続体」を明らかにするようであり、従って個々の中和抗体の応答は、せいぜいわずかなウイルスの変異株に対してのみ効果的である。後者の見解を考えれば、抗ＨＩＶ−１細胞性免疫応答を惹起させるであろう免疫原および関連する送達技術を特定することに役立つ。ＣＴＬ応答を生じさせるためには、抗原を細胞内で合成するかまたは合成して細胞内に導入する必要があり、その後にプロテアソーム複合体によって小ペプチドに加工され、最終的に主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩタンパク質と結合のために、小胞体／ゴルジ複合体分泌経路内に移されることが知られている。ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびＣＤ８細胞表面タンパク質とを介してクラスＩ  ＭＨＣと結合した抗原を認識する。活性化したエフェクター細胞または記憶細胞内で未処置のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化させるには、一般的に、上記の抗原のＴＣＲとの会合ならびに共刺激タンパク質の会合の両者が必要である。ＣＴＬ応答の最適な惹起には、通常、ＣＤ４＋Ｔリンパ球からのサイトカイン形態の「援助」が必要であり、ここでこのＴリンパ球は、ＴＣＲおよびＣＤ４の会合を介してＭＨＣクラスＩＩ分子と結合した抗原を認識する。
【０００５】
アデノウイルスベクターは、ＨＩＶを含む種々の外来性の抗原を送達し発現させるための、生きているウイルスベクターとして開発され、そして処置された個体内でのＣＴＬ応答を効果的に惹起することが証明されてきた。アデノウイルスはエンベロープを持たないウイルスであり、約３６ｋｂの直鎖状二本鎖のゲノムを含む。このベクターは高いウイルス力価を達成し、幅広い細胞親和性を有し、そして非分裂細胞に感染することもできる。アデノウイルスベクターは遺伝子導入のための極めて効果的な媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）であり、臨床での遺伝子治療の研究に高い頻度で用いられている。さらに、アデノウイルスは、多数の有望なウイルス免疫化プロトコールの基礎を形成してきた。
【０００６】
（１９９５年２月１５日に公開された）欧州特許出願第０  ６３８  ３１６号および（１９９４年３月９日に公開された）第０  ５８６  ０７６号（両者ともアメリカン・ホーム・プロダクツ社（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｏｍｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に譲渡された）には、ｅｎｖまたはｇａｇを含むＨＩＶ遺伝子を保持するアデノウイルスベクターを複製することが記載されている。チンパンジーおよびイヌを用いて、これらのベクターに基づいた種々の治療計画を行なつた。計画のうちのいくつかには、アデノウイルスまたはタンパク質のブーストに加えて、ミョウバン処理を行うことが含まれていた。
【０００７】
たとえばＥ１領域の欠失を宿している、複製能を欠くアデノウイルスベクターは、それらが複製する対応物に対するさらに安全な代替物を構成する。最近のアデノウイルスベクターでは、公知のパッケージングリピートがそれらのベクター内に組み込まれている；たとえば、塩基対４５９から３３２８のＥ１配列が欠失したアデノウイルスベクターが特に開示されているＥＰ  ０  ７０７  ０７１号；および塩基対４５９から３５１０が欠失したアデノウイルスベクターが特に開示されている米国特許第６，０３３，９０８号を参照すること。アデノウイルスのパッケージングの効率は、組み込まれた個々のＡ（パッケージング）リピートの数に依存すると教えられてきた；たとえば、グレーブルおよびヒアリング（Ｇｒａｂｌｅ  ａｎｄ  Ｈｅａｒｉｎｇ）、１９９０  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４  （５）：２０４７−２０５６；グレーブルおよびヒアリング、１９９２  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６（２）：７２３−７３１を参照すること。
【０００８】
ワクシニアウイルスおよびその他のポックスウイルス（アビポックスウイルスなど）は、それらによるタンパク質の高レベルの発現を実証するための有望なワクチンの候補として開示され、最近になってＨＩＶ抗原の送達および発現に用いることが考えられた。ポックスウイルスはその末端が共有結合的に閉じられた二本鎖ＤＮＡを持つ、エンベロープに包まれた大型のウイルスである。これらのウイルスは複数の外来性の遺伝子を挿入する高い収容能力を持ち、そしてこれらのウイルスによって、外来性の外性遺伝物質の細胞質での高レベル発現が達成される。１９８０年代の前半から、ワクチンとしてこれらを用いることが知られていた；たとえば、パニカーリ（Ｐａｎｉｃａｌｉ）ら、１９８３  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：５３６４−５３６８を参照すること。組み換え生ワクチンが臨床試験で試験されており、免疫応答を惹起させるために、ＨＩＶ−１エンベロープ、エプスタイン−バーウイルスの主な膜糖タンパク質または狂犬病ウイルス糖タンパク質を発現させるための組み換えワクシニアウイルスまたは組み換えカナリアポックスウイルスが用いられている；たとえば、パオレッティ（Ｐａｏｌｅｔｔｉ）、１９９６  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１１３４９−５３；グ（Ｇｕ）ら、１９９５  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．８４：１７１−７；およびフリース（Ｆｒｉｅｓ）ら、１９９６  Ｖａｃｃｉｎｅ  １４：４２８−３４など。
【０００９】
現在までのウイルスワクチンベクターを用いた投与プロトコールでは、種々のプライム・ブースト接種法のスキームを採用してきた。二種の一般的なスキームが頻繁に用いられている：（１）同じウイルス媒体を用いて、哺乳動物宿主のプライム化およびブースト化の両者を成し遂げる、および（２）異なる媒体を利用してプライム化およびブースト化を実施し、ここではウイルス媒体に限定する必要はない。後者の例としては、具体的には、ＤＮＡでプライムしウイルスでブーストすることから構成されるスキーム、およびウイルスでプライムしウイルスでブーストすることから構成されるスキームであって、互いに異なるウイルスを用いるスキームである。最近になって、後者のスキームであるところの、上記２ウイルスの組み合わせ、つまりアデノウイルスおよびポックスウイルスの順番を変えた組み合わせ（すなわち、アデノウイルス−プライム、ポックスウイルス−ブースト；およびポックスウイルス−プライム、アデノウイルス−ブースト）を採用するプライム・ブースト法での投与計画を利用して、ネズミマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ）のＣＳ遺伝子（Ａｄ−ＰｂＣＳ）をマウスに送達して発現させた；ギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）ら、２００２  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：１０３９−４５。この計画では、マウスにおけるマラリアに対する保護作用が開示された；たとえば、ギルバートら、２００２  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：１０３９−４５を参照すること。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＨＩＶ感染に対する強力な細胞性免疫応答を生じさせることを可能とする、予防薬および／または治療薬に基づくＨＩＶワクチン計画を開発することは、ＡＩＤＳに対する戦いにおいて極めて重要となる。通常のＨＩＶ抗原をコードする外来性の遺伝物質を含む組み換えアデノウイルスベクターおよび組み換えポックスウイルスベクターを投与することに基づく異種のプライム・ブーストＨＩＶ免疫化計画を開示することによって、本発明はこれらの必要性に取り組み、満足させる。特定のプライム・ブーストワクチン計画は、組み換えアデノウイルスベクターで個体のプライム化を行い、次いでブースト化投与量の組み換えポックスウイルスベクターを与えるというものである。この内容に合致するワクチンプロトコールは、出願人が承知している限り、ＨＩＶについては実証されていない。このワクチン・プライム・ブースト計画では宿主、たとえばヒトに投与してもよい。
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）に対する免疫応答を生じさせるための強化された方法に関する。この方法は、ＨＩＶ抗原をコードする異種の遺伝物質を含む組み換えアデノウイルスベクターおよび組み換えポックスウイルスベクターによる異種のプライム・ブースト投与に基づくものであり、いずれかのベクターにより独自に単一様式のプライム・ブースト免疫化スキームにて得ることができる免疫応答よりも、ＨＩＶに対するより明白な免疫応答をもたらす。最初に、哺乳動物宿主に、プライム化投与量の、ＨＩＶ抗原をコードする遺伝子を含むアデノウイルスを投与し、一定期間の後、ブースト化投与量の、ＨＩＶ抗原をコードする遺伝子を保持するポックスウイルスを投与する。投与を区分する最低限の時間を予め定めてもよく、この時間は本質的に免疫的な休止を考慮に入れたものである。特定の実施態様において、この休止は少なくとも４ヶ月の期間である。複数回のプライム化、通常は１から４回が採用されるが、さらに多くてもよい。プライム化とブースト化との間の期間の長さは、通常、約四ヶ月から一年の間であるが、その他の期間を用いてもよい。出願人らは、アデノウイルスでプライムされた応答を、ポックスウイルスを用いてこのような方法でブースト化することによって、ＨＩＶ抗原に対する免疫応答を著しく増幅させることを見出した。このように、本発明は、アデノウイルスおよびポックスウイルスによるＨＩＶワクチンをこのような方法で投与することに関するものである。
【００１２】
従って、本発明は、哺乳動物宿主においてＨＩＶ−１抗原に対する強化された免疫応答を誘導する方法であって、（ａ）Ｅ１の少なくとも一部を欠失しＥ１の活性が奪われた、ＨＩＶ−１抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む組み換えアデノウイルスベクターを、哺乳動物宿主に接種する工程；およびその後に（ｂ）ＨＩＶ−１抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む組み換えポックスウイルスベクターを含むブースト化免疫物を該哺乳動物宿主に接種する工程、を含む方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の免疫化計画で利用されるアデノウイルスベクターおよびポックスウイルスベクターには、複製能を欠くあらゆるアデノウイルスベクター、および複製能を欠くか、複製能が機能しないかまたは宿主が限定されるあらゆるポックスウイルスベクターが含まれてもよく、ウイルスの大規模な生産および精製を経験しても遺伝的に安定なもとする。換言すれば、本発明の方法に用いることに適した組み換えアデノウイルスベクターおよび組み換えポックスウイルスベクターは、複製能を欠くか、複製能が機能しないかまたは宿主が限定される、精製されたあらゆる組み換えウイルスでもよく、細胞培養で複数の継代を重ねても遺伝的に安定なことが示され、大規模な生産および精製処理の間でもそれを維持するウイルスである。このような組み換えウイルスベクターおよび収集されるウイルスワクチンは、効果的な一価または多価のＨＩＶワクチンに求められる大規模な用量の充填およびそれに続く世界的な流通過程に適するものである。本発明では、複製能を欠く組み換えアデノウイルスベクターおよび病原性が弱められた組み換えポックスウイルスベクターの使用に基づいた免疫化計画の説明に従って、このような基本的な要求が達成される。
【００１４】
ポックスウイルスは、ウイルスの病原性を減少させることを意図する遺伝子工学上の種々の努力の対象であった。たとえば、ワクシニアウイルスを用いて、ウイルスのチミジンキナーゼの遺伝子、成長因子の遺伝子、赤血球凝集素の遺伝子、１３．８ｋＤの分泌性タンパク質の遺伝子およびリボヌクレオチドレダクターゼの遺伝子を標的化する努力がなされた；ブラー（Ｂｕｌｌｅｒ）ら、１９８５  Ｎａｔｕｒｅ  ３１７（６０４０）：８１３−８１５；ブラーら、１９８８  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２（３）：８６６−７４；フレクスナー（Ｆｌｅｘｎｅｒ）ら、１９８７  Ｎａｔｕｒｅ  ３３０（６１４５）：２５９−６２；シダ（Ｓｈｉｄａ）ら、１９８８  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２（１２）：４４７４−８０；コットワル（Ｋｏｔｗａｌ）ら、１９８９  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１７１（２）：５７９−８７；およびチャイルド（Ｃｈｉｌｄ）ら、１９９０  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７４（２）：６２５−９を参照すること。改変されたワクシニアウイルスは、特に米国特許第５，１８５，１４６号；第５，１１０，５８７号；第４，７２２，８４８号；第４，７６９，３３０号；第５，１１０，５８７号；および第４，６０３，１１２号の主題を形成する。アビポックスウイルスも対象である。というのは、これらの宿主範囲は限定的であり、それゆえにヒトの細胞内で自由に複製することはないからである。組み換えアビポックスウイルスは、特に米国特許第５，５０５，９４１号；第５，１７４，９９３号；第５，９４２，２３５号；第５，８６３，５４２号；および第５，１７４，９９３号の主題である。米国特許第５，２６６，３１３号では、アライグマのポックスウイルスに基づく、狂犬病ウイルス用のワクチンが開示されている。ＨＩＶのトランスジーンを保持するアデノウイルス媒体の事前投与により活性化された免疫応答を、最適なポックスウイルスベクターを投与してブーストする。
【００１５】
本発明で用いるアデノウイルスベクターは、Ｅ１の少なくとも一部を欠失し、Ｅ１の活性が奪われたものである。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞などのＥ１が補われたセルライン中で、本明細書に基づくベクターを容易に増殖させることができる。
【００１６】
本出願で用いられる組み換えアデノウイルスベクターおよび組み換えポックスウイルスベクターには、ＨＩＶ抗原をコードする遺伝子が含まれている。特定の実施態様において、ＨＩＶ抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子には、哺乳動物宿主（ヒトなど）内での発現を最適化されたコドンが含まれている。好ましい実施態様において、アデノウイルスベクターおよび／またはポックスウイルスベクターには、（ａ）ＨＩＶ抗原（ＨＩＶタンパク質など）または生物活性的および／または免疫学的に関連するその部分／その改変体をコードする核酸；（ｂ）ａ）部の核酸が作動可能に連結した異種（外来）プロモーターまたは改変された固有のプロモーター；ならびに（ｃ）転写終結配列を含む遺伝子発現カセットが含まれている。ただし、組み換えポックスウイルスベクターについての遺伝子発現カセット内に含まれる核酸の発現を制御するために利用されるあらゆるプロモーターは、対象のポックスウイルスに固有のものか、もしくはそれに由来するものか、または別のポックスウイルスの一部分である、のいずれかであるものとする。ワクシニアウイルスについての、天然型でオーバーラップがなく、直列した中程度の強さの初期／後期プロモーターが記載されており（たとえば、コクラン（Ｃｏｃｈｒａｎ）ら、１９８５  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５４：３０−３７；およびレーゼル（Ｒｏｓｅｌ）ら、１９８６  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６０：４３６−９を参照すること）、そしてかかるプロモーターが遺伝子発現に用いられている。改変された固有のプロモーターの一例としては、実施例２の合成の初期／後期プロモーターがあり、このものはチャクラバルティ（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ）ら、１９９７  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３（６）：１０９４−９７にて既に記述されている。異種プロモーターとしては、用いる予定のウイルスに固有のものでないか、またはそれに由来するものではない、この世のありとあらゆる（改変されたまたは非改変の）プロモーターが可能である。組み換えポックスウイルス内で用いられる遺伝子発現カセットとしては、（ａ）ＨＩＶ抗原（ＨＩＶタンパク質など）または生物活性的および／または免疫学的に関連するその部分／その改変体をコードする核酸；ならびに（ｂ）（別のポックスウイルス種に由来する）異種プロモーター、または対象のポックスウイルスに固有のもしくはそれに由来するプロモーターを含むものが好ましい。
【００１７】
本発明において用いられるＨＩＶ抗原としては、種々のＨＩＶタンパク質、免疫学的に関連する改変体、および免疫原性を有するその部分が挙げられる。従って、本発明には、コドンに最適化された種々の形態のＨＩＶ−１  ｇａｇ（コドンに最適化された全長（「ＦＬ」）Ｇａｇのｐ５５型およびｔＰＡ−Ｇａｇ融合タンパク質が含まれるが、これらに限定されない）、ＨＩＶ−１  ｐｏｌ、ＨＩＶ−１  ｎｅｆ、ＨＩＶ  ｅｎｖ、上記構築物の融合体、および上記の免疫学的に関連する選択された改変体が包含される。ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖおよび／またはＮｅｆの融合タンパク質の具体例としては、ウイルス抗原のコーディング領域のＮＨ２−末端部分におけるリーダーペプチドまたはシグナルペプチドの融合体が挙げられるが、これらに限定されない。このようなリーダーペプチドとしてはｔＰＡリーダーペプチドが挙げられるが、これに限定されない。
【００１８】
本開示に基づく組み換えウイルスベクターは、本発明の一つの側面を形成する。本発明のその他の側面は、当該アデノウイルスベクターおよび／またはポックスウイルスベクターを含む宿主細胞；当該ベクターを含むワクチン組成物；ならびに（ａ）アデノウイルスベクターおよび／またはポックスウイルスベクターを宿主細胞内に導入する工程、および（ｂ）その結果生じるベクターを回収する工程を含むベクターを作製する方法である。
【００１９】
本発明はプライム・ブースト計画にも関し、ここでは、組み換えアデノウイルスベクターおよび組み換えポックスウイルスベクターは上記ＨＩＶ抗原の種々の組み合わせを含む。特にヒトＭＨＣや循環するウイルスの遺伝的多様性を考えれば、このようなＨＩＶ免疫化計画によって、宿主への投与後に、強化された細胞性免疫応答が提供される。具体的には、二価ワクチン（たとえば、ｇａｇとｎｅｆ、ｇａｇとｐｏｌ、またはｐｏｌとｎｅｆの成分）組成物または三価ワクチン（たとえばｇａｇ、ｐｏｌとｎｅｆの成分）組成物を提供する多価ワクチン組成物であって、ウイルスベクターを基礎とするものが含まれるが、これに限定されない。このような多価ワクチンを単回投与用に調合してもよく、または個別に調合された成分のそれぞれを複数回接種するように作製してもよい。この目的のための、本発明の方法の範囲内で用いられる好ましいワクチン組成物は、複数かつ異なるクラスのＨＩＶ抗原を含むアデノウイルスベクターおよびポックスウイルスベクターである。それぞれのクラスのＨＩＶ抗原は配列決定操作の対象となり、その結果、可能性のあるワクチンの多数の組み合わせが提供でき；そしてそのような組み合わせは本発明の範囲内である。このように組み合わされた様式を利用することによって、単一様式の計画による接種の場合と比較してはるかに強力な細胞性免疫応答を惹起する可能性が高まる。
【００２０】
本明細書に開示されたような「組み合わされた様式」の概念は、他に採り得る投与形式にまで及ぶものであり、その投与形式によって、複数のオープンリーディングフレームを含む組み換えウイルスベクターの作製に適したシャトルプラスミド内に、複数のＨＩＶ−１ウイルス抗原を連結させることができる。たとえば、三価のベクターにはｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆ融合体が含まれてもよく、あるいは、「２＋１」二価ワクチンが含まれてもよい。ここで、この二価ワクチンは、たとえば、同じバックボーン内にｇａｇ−ｐｏｌ融合体（たとえば、コドンに最適化されたｐ５５  ｇａｇおよび不活性化され最適化されたｐｏｌ）を含み、異なるプロモーターおよび転写終結配列が作動可能に連結したそれぞれのオープンリーディングフレームを伴うものである。あるいは、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）が作動可能に連結したオープンリーディングフレームと共に、二つのオープンリーディングフレームが単一のプロモーターに作動可能に連結してもよい。
【００２１】
開示された異種の手段を介して、組み換えアデノウイルスベクターおよび組み換えポックスウイルスベクターを投与することによって、改良された細胞性免疫応答が提供され、これは単一様式の計画によって生じた応答よりも明白な応答である。改良されたワクチン（アデノウイルス性ＨＩＶでプライムし、そしてポックスウイルス性ＨＩＶでブーストするもの）の効果は、ＨＩＶ−１感染の無症候期間が延長するように、今まで感染していない個体に対しては低い感染速度で（すなわち予防上の応用）、および／または感染した個体内ではウイルス負荷レベルを減少させる（すなわち治療上の応用）べきである。このような方法でワクチンの投与、細胞内送達および発現を行うことによって、宿主のＣＴＬ応答およびＴｈ応答を惹起する。ワクチン接種を受けた個々の個体または（本明細書で述べられるような）哺乳動物宿主としては、市販されているかまたは家畜として獣医学的に重要な非ヒトの哺乳動物だけでなく、霊長類（ヒトおよび非ヒトの両方）が可能である。
【００２２】
本明細書の観点からは、本発明は、効果的な免疫学的予防を提供し、ＨＩＶ−１に暴された後のこのウイルス感染の成立を妨げるためのアデノウイルスワクチンおよびポックスウイルスワクチンの投与についての方法論に関するものであり、または長期間の有利な結果を伴うウイルス負荷の減少を成立させるように、ＨＩＶ−１の急性感染症を緩和するためのＨＩＶ感染後の治療用ワクチンとしての方法論に関するものである。このような治療計画には、一価もしくは多価の組成物、および／または種々に組み合わされた様式の応用が含まれてもよい。従って、本発明によって、開示されたＨＩＶワクチンの投与スキームを利用する方法が提供され、該投与スキームは本明細書で開示された種々のパラメータの範囲内で利用され、ならびに哺乳動物の組織内に導入されると単数（または複数）のＨＩＶ抗原の細胞内発現と、単数（または複数）のＨＩＶ抗原のそれぞれに対して効果的な免疫応答とを誘導する、当分野で公知の任意の補助的なパラメータの範囲内でも利用される。
【００２３】
このために、本発明は一部、ワクチン接種を受けた個体、好ましくはワクチン接種を受けたヒトにおいて細胞性免疫応答を生じさせる方法に関する。ここで、この個体には、開示された異種のプライム・ブースト免疫化計画に従う組み換えアデノウイルスおよびポックスウイルスのＨＩＶワクチンが投与される。
【００２４】
明細書および請求の範囲を通して用いられるように、次の定義および略語が用いられる：
「ＨＡＡＲＴ」とは、−−高活性高レトロウイルス療法−−を表す。
【００２５】
「第一世代」のベクターには複製能を欠くという特徴がある。これらのＥ１遺伝子領域は通常、欠失しているか不活性であり、そのうえＥ３遺伝子領域も欠失しているか不活性であることが多い。
【００２６】
「ＡＥＸ」とは、陰イオン交換クロマトグラフィーを表す。
【００２７】
「ＱＰＡ」とは、Ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲに基づく効力検定を表す。
【００２８】
「ｂｐｓ」とは、塩基対を表す。
【００２９】
「ｓ」または「ｓｔｒ」とは、トランスジーンがＥ１と平行である、すなわち「直線」方向にあることを意味する。
【００３０】
「ＰＢＭＣｓ」とは、末梢血単球を表す。
【００３１】
「ＦＬ」とは、全長を表す。
【００３２】
「ＦＬｇａｇ」とは、図２に示されるような、最適化された全長ｇａｇ遺伝子を表す。
【００３３】
「Ａｄ５−Ｆｌｇａｇ」とは、血清型５のアデノウイルスであって、ＣＭＶプロモーターの制御下にある最適化された全長ｇａｇ遺伝子を含む発現カセットを保持する、複製能を欠くウイルスを表す。
【００３４】
「プロモーター」とは、その部位にＲＮＡポリメラーゼが結合するところの、ＤＮＡ鎖上の認識部位を意味する。このプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼと共に開始複合体を形成し、そして転写活性を開始し駆動する。エンハンサーなどの配列を活性化させるか、またはサイレンサーなどの配列を抑制することによって、この複合体を改変することができる。
【００３５】
「リーダー」とは、構造遺伝子と共に転写される、その遺伝子の５’末端におけるＤＮＡ配列を意味する。これは通常、Ｎ−末端ペプチドの延長部を有するタンパク質となり、多くの場合、プロ配列と呼ばれる。
【００３６】
「イントロン」とは、遺伝子の中間に存在するＤＮＡの区画であって、遺伝子産物におけるアミノ酸をコードしていないものを意味する。イントロンの前駆体ＲＮＡは切除されるため、ｍＲＮＡに転写されたり、またはタンパク質に翻訳されることはない。
【００３７】
ウイルスタンパク質との関連で用いる場合の「免疫学的に関連する」または「生物活性的」とは、投与時に、ウイルスの増殖および／または拡散を遅延させたり、および／または個体内に存在するウイルス負荷を減少させるのに十分な測定できる程度の免疫応答を、タンパク質がその個体内で惹起させることができることを意味する。同じ用語がヌクレオチド配列に関連して用いられる場合、配列が、上記のことが可能なタンパク質をコードできることを意味する。
【００３８】
「カセット」とは、転写制御配列および翻訳制御配列と共にある、発現される核酸配列を表す。カセットを変更することによって、ベクターは異なる配列を発現させることができる。
【００３９】
「ｂＧＨｐＡ」とは、ウシ成長ホルモンの転写終結／ポリアデニル化配列を表す。
【００４０】
「ｔＰＡｇａｇ」とは、組織プラスミノゲンアクチベーターのリーダー配列と、最適化されたＨＩＶのｇａｇ遺伝子との融合体を表す。
【００４１】
「ＩＡ」または「ｉｎａｃｔ」が用いられている場合、これらは、遺伝子の不活性型（たとえばＩＡｐｏｌ）を表す。
【００４２】
「ＭＣＳ」とは「マルチクローニング部位」である。
【００４３】
一般的に、アデノウイルス構築物、遺伝子構築物の名称は、その中に含まれる遺伝子を引用して付けられる。たとえば：
「Ａｄ５  ＨＩＶ−１  ｇａｇ」は、最初のＨＩＶ−１  ｇａｇアデノウイルスベクターとも呼ばれ、ｈＣＭＶイントロンＡプロモーター、ヒトのコドンに最適化された全長型のＨＩＶ−１  ｇａｇ遺伝子、およびウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルからなるトランスジーンカセットを含むベクターである。
【００４４】
「ＭＲＫ  Ａｄ５  ＨＩＶ−１  ｇａｇ」は、「ＭＲＫＡｄ５ｇａｇ」または「Ａｄ５ｇａｇ２」とも呼ばれ、Ｅ１が欠失している、アデノウイルスの塩基対１から４５０と塩基対３５１１から３５２３を含むアデノウイルスベクターであり、このベクターは、イントロンＡを含まないＣＭＶプロモーターの制御下にある、Ｅ１と平行方向の遺伝子であって、ヒトのコドンに最適化されたＨＩＶ−１  ｇａｇ遺伝子を伴う。この構築物にもウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルが含まれている。
【００４５】
「ｐＶ１ＪｎｓＨＩＶｇａｇ」は、「ＨＩＶＦＬｇａｇＰＲ９９０１」とも呼ばれ、ＣＭＶ即時型（ＩＥ）プロモーターおよびイントロンＡ、コドンに最適化された全長ＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子、ウシ成長ホルモンに由来するポリアデニル化・転写終結配列、ならびに最小限のｐＵＣバックボーンを含むプラスミドである。
【００４６】
「ｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡ」は、ＣＭＶのイントロンＡ部分が欠失し、かつ全長ＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子を含むｐＶ１ＪｎｓＨＩＶｇａｇに由来するプラスミドである。このプラスミドは、「ｐＶ１ＪｎｓＨＩＶｇａｇ−ｂＧＨｐＡ」、「ｐＶ１Ｊｎｓ−ｈＣＭＶ−ＦＬ−ｇａｇ−ｂＧＨｐＡ」および「ｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（イントロンなし）＋ＦＬｇａｇ＋ｂＧＨｐＡ」とも呼ばれている。
【００４７】
「ｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ＳＰＡ」は、ＳＰＡ終止配列がｂＧＨｐＡの配列に取って代わった以外はｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡと同じ構成のプラスミドである。このプラスミドは、「ｐＶ１Ｊｎｓ−ＨＩＶｇａｇ−ＳＰＡ」およびｐＶ１Ｊｎｓ−ｈＣＭＶ−ＦＬｇａｇ−ＳＰＡ」とも呼ばれている。
【００４８】
「ｐｄｅｌＥ１ｓｐ１Ａ」は、発現カセットを持たない（すなわちプロモーターまたはポリＡがない）汎用的なシャトルベクターである。このベクターには、血清型５の野生型アデノウイルス（Ａｄ５）のｂｐ１からｂｐ３４１とｂｐ３５２４からｂｐ５７９８の配列が含まれ、そして３４１ｂｐで終わり３５２４ｂｐで始まるＡｄ５配列の間にマルチクローニング部位がある。このプラスミドは、最初のＡｄ５シャトルベクターとも呼ばれている。
【００４９】
「ＭＲＫｐｄｅｌＥ１ｓｐ１Ａ」または「ＭＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ４５０）」または「ＭＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ４５０）Ｃｌａ１」は、発現カセットを持たない（すなわちプロモーターまたはポリＡがない）汎用的なシャトルベクターであり、血清型５の野生型アデノウイルス（Ａｄ５）のｂｐ１からｂｐ４５０とｂｐ３５１１からｂｐ５７９８の配列を含む。このベクターには、４５０ｂｐで終わり３５１１ｂｐで始まるＡｄ５配列の間にマルチクローニング部位がある。このシャトルベクターを用いて、ＣＭＶプロモーターおよびｂＧＨｐＡ断片を、両者とも直線（「ｓｔｒ．」すなわちＥ１と平行）方向に挿入してもよく、または反対（ｏｐｐ．すなわちＥ１と逆平行）方向に挿入してもよい。
【００５０】
「ＭＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ４５０）＋ＣＭＶｍｉｎ＋ＢＧＨｐＡ（ｓｔｒ．）」はさらに別のシャトルベクターであり、このベクターはＣＭＶプロモーター（イントロンＡなし）およびｂＧＨｐＡ断片を含む改変されたベクターである。選択した遺伝子を唯一のＢｇｌＩＩ部位に挿入することによって、ＭＲＫｐＡｄ５（Ｅ１／Ｅ３＋）Ｃｌａ１プレプラスミド内に挿入した時にトランスジーンがＡｄ５  Ｅ１と平行になる転写方向が確実となるように、ｈＣＭＶプロモーター（イントロンＡなし）およびウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルを含む発現単位をシャトルベクター内に挿入した。
【００５１】
「ＭＲＫｐｄｅｌＥ１−ＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡ」は、塩基対１から４５０および塩基対３５１１から５７９８のＡｄ５配列を含むシャトルであり、イントロンＡを含まないヒトＣＭＶ、ヒトのコドンに最適化された全長ＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子およびウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルを含む発現カセットを伴う。このプラスミドは、「ＭＲＫｐｄｅｌＥ１シャトル＋ｈＣＭＶ−ＦＬ−ｇａｇ−ＢＧＨｐＡ」とも呼ばれている。
【００５２】
「ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３＋ＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡ」は、Ｅ１領域（４５１から３５１０）を包含するヌクレオチド以外のＡｄ５配列のすべて、イントロンＡを含まないヒトＣＭＶプロモーター、ヒトのコドンに最適化された全長ＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子、およびウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルを含むアデノウイルスベクターである。このベクターは、「ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３＋ｈＣＭＶ−ＦＬ−ｇａｇ−ＢＧＨｐＡ」、「ＭＲＫｐＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇ」、「ＭＲＫｐＡｄ５ｇａｇ」、「ｐＭＲＫＡｄ５ｇａｇ」または「ｐＡｄ５ｇａｇ２」とも呼ばれている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
（発明の詳細な説明）
ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）に対する免疫応答を生じさせるための強化された方法を記載する。この方法は、対象の一つ（または複数）のＨＩＶ抗原をコードする外来性の遺伝物質を含む組み換えアデノウイルスベクターおよび組み換えポックスウイルスベクターを採用した、異種のプライム・ブースト免疫化スキームに基づく。プライム化投与量の一つ（または複数）のＨＩＶ抗原を、組み換えアデノウイルスベクターを用いて最初に運搬する。この投与量によって、効果的に免疫応答をプライムできるので、循環する免疫系においてその後に抗原が特定されるとすぐに、この免疫応答によって、宿主内の抗原を直ちに認識して応答することが可能となる。次いで、一回（または複数回）のプライム化投与量の後に、抗原をコードする外来性の遺伝物質を含有する、組み換えポックスウイルスベクターのブースト化投与量が続く。ＨＩＶ抗原と関連するので、本明細書に基づく投与の結果、接種された哺乳動物宿主内で見られる免疫応答を著しく高める、相加効果ではなく有意な相乗効果が生じることが分かった。この効果は、接種後に生じる細胞性免疫応答において特に明白である。従って、開示された免疫化計画によって、今まで感染していない個体に対する予防上の利点、およびウイルスが既に感染した個体におけるウイルス負荷レベルを減少させることによる治療効果が提供され、それゆえにＨＩＶ−１感染の無症候期が延長する。
【００５４】
従って、本発明は、哺乳動物宿主においてＨＩＶ−１抗原に対する強化された免疫応答を誘導する方法であって、（ａ）Ｅ１の少なくとも一部を欠失しＥ１活性が奪われた、ＨＩＶ−１抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む組み換えアデノウイルスベクターを、哺乳動物宿主に接種する工程；およびその後に（ｂ）ＨＩＶ−１抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子を含む組み換えポックスウイルスベクターを含むブースト化免疫物を、その哺乳動物宿主に接種する工程を含む方法に関し、ここで、当該組み換えポックスウイルスベクターは哺乳動物宿主における複製能が損なわれている。この文脈において「複製能が損なわれている」とは幅広い意味を持ち、一般的には、処置される特定の哺乳動物種において、（１）これらのベクターが複製が不可能なように弱められているか改変されている；（２）これらのベクターが複製が機能しないように弱められているか改変されている；および（３）これらのベクターが単に複製しないだけか、またはこれらのベクターの複製のレベルがはるかに減少している、と説明される。たとえば、アビポックスウイルスの複製は、鳥類の種に限定されると思われる。従って、アビポックスウイルスは、哺乳動物内で用いるための極めて安全なベクターとしての候補である。初期プロモーターのみを使用することを考慮すれば、複製は、恐らくはウイルスＤＮＡが合成される前の工程で阻止されると思われる；たとえば、モス，ビー（Ｍｏｓｓ，Ｂ．）、１９９３  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ．３：８６−９０；およびテイラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら、１９９１  Ｖａｃｃｉｎｅ  ９：１９０−３を参照すること。しかしながら、このレベルの複製には注意を払われて予防的免疫接種が行われてきた；たとえば、ワイルド（Ｗｉｌｄ）ら、１９９０  Ｖａｃｃｉｎｅ  ８：４４１−４４２；および１９９２  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８７：３２１−２８；ならびにカドッツ（Ｃａｄｏｚ）ら、１９９２  Ｌａｎｃｅｔ  ３３９：１４２９−３２を参照すること。ポックスウイルスは本発明の方法に必須の要素を形成する。というのは、このウイルスは、アデノウイルスでプライムされたＨＩＶに対する免疫応答を有意にブーストする驚くべき能力を発揮することが分かったからである。本発明の特定の実施態様では、本発明のブースト化での投与に、改変されたワクシニアウイルス（たとえば、改変されたワクシニアウイルスのＡｎｋａｒａ株（「ＭＶＡ」）、米国特許第５，１８５，１４６号の対象；および特に、タルタグリア（Ｔａｒｔａｇｌｉａ）ら、１９９２  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８８：２１７−２３２に開示されたワクシニアウイルスの高度弱毒株であるＮＹＶＡＣなど）が採用されるが、対象の抗原の送達と発現とを実現することができ、かつ意図された哺乳動物宿主内での病原性が弱められたあらゆるポックスウイルス、特にワクシニアウイルスが本発明に包含される。改変されたワクシニアウイルスおよび種々の方法におけるそれらの使用についても技術的に説明されており、たとえば、米国特許第５，１８５，１４６号；第５，１１０，５８７号；第４，７２２，８４８号；第４，７６９，３３０号；第５，１１��，５８７号；および第４，６０３，１１２号を参照すること。組み換えワクシニアウイルスを構築するための一般化された方法についても、このことは同じく正しい；たとえば、アール（Ｅａｒｌ）ら、分子生物学における最新のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、ニューヨーク：グリーン・パブリッシング・アソシエイツ・アンド・ウィリー・インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）社；１９９１年：１６．１６．１から１６．１６．７を参照すること。本出願のさらなる実施態様では、開示された方法のブースト化での投与において、他に採り得るポックスウイルスベクターが利用される。具体的に言及すると、（特に米国特許第５，５０５，９４１号；第５，１７４，９９３号；第５，９４２，２３５号；第５，８６３，５４２号；および第５，１７４，９９３号の対象である）ＡＬＶＡＣなどのアビポックスウイルスである。既述のとおりＡＬＶＡＣは、ニワトリの胚線維芽細胞内で２００回継代した後の野生株から得られた弱毒化カナリアポックスウイルスに由来する、プラーク精製されたクローンである。ＡＬＶＡＣ組み換え体およびその使用は、本発明の別の側面を形成する。このようなＡＬＶＡＣ組み換え体の具体例としてはｖＣＰ２０５がある。ｖＣＰ２０５（ＡＴＣＣ登録番号ＶＲ−２５４７）は、簡単に言えば、ＨＩＶ１（ＩＩＩＢ）ｇａｇ（およびプロテアーゼ）タンパク質、ならびにその中でｇｐ１２０がｇｐ４１に由来する膜貫通アンカー配列と融合しているＨＩＶ１（ＭＮ）エンベロープ糖タンパク質の一つの型を発現するＡＬＶＡＣ組み換え体（ＡＬＶＡＣ−ＭＮ１２０ＴＭＧ）である。ＡＬＶＡＣバックボーン内にＨＩＶ遺伝子を組み込むことは、発行された米国特許第５，８６３，５４２号（たとえば実施例１４を参照すること）に記載されている。ｐＨＩＶ３２プラスミドとＡＬＶＡＣのゲノムＤＮＡとの間の相同組み換えによって、組み換えカナリアポックスウイルスＡＬＶＡＣ−ＨＩＶ（ｖＣＰ２０５）を得た。ｐＨＩＶ３２プラスミドは、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０−ＭＮおよびｇｐ４１のアンカー領域（ＨＩＶ−１  ｇｐ４１  ＬＡＩの膜貫通糖タンパク質）、その発現がそれぞれＨＧおよびＩ３Ｌワクシニアプロモーターの制御下にあるＧａｇ  ｐ５５−ポリタンパク質およびプロテアーゼ−ＬＡＩをそれぞれコードしている。ｐＨＩＶ３２内に含まれる、プロモーターがＨ６であるＨＩＶ１  ｇｐ１２０（＋膜貫通）遺伝子のヌクレオチド配列およびプロモーターがＩ３ＬのＨＩＶ１ｇａｇ（＋ｐｒｏ）遺伝子のヌクレオチド配列は、参照して本明細書に組み込まれる米国特許第５，８６３，５４２号の図１４Ａから図１４Ｃに開示されている。多くのＨＩＶが感染した被験者では、ｖＣＰ２０５内で正確に削除されたｇｐ４１の免疫優性領域に対して向けられた抗体が示されることから、ｇｐ４１のエクトドメインの欠失によって、感染した被験者と予防接種を受けた被験者との区別が容易になると考えられている。
【００５５】
組み換えポックスウイルスの構築に必要な方針は公知であり、たとえば、パニカーリおよびパオレッティ（Ｐａｎｉｃａｌｉ  ａｎｄ  Ｐａｏｌｅｔｔｉ）、１９８２  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：４９２７−３１；ナカノ（Ｎａｋａｎｏ）ら、１９８２  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：１５９３−９６；ピッシーニ（Ｐｉｃｃｉｎｉ）ら、酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、ウーおよびグロスマン（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓｍａｎ）編、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）社、サンディエゴ、１５３：５４５−６３；米国特許第号４，６０３，１１２号；サッター（Ｓｕｔｔｅｒ）ら、１９９４  Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：１０３２−４０；ならびにワイアット（Ｗｙａｔｔ）ら、１９９６  Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：１４５１−８を参照すること。合成の組み換えポックスウイルスを作製するための方法も、米国特許第４，７６９，３３０号；第４，７２２，８４８号；第４，６０３，１１２号；第５，１１０，５８７号；および第５，１７４，９９３号に開示されている；これらの開示は参照して本明細書に組み込まれる。ＨＩＶ  ｇａｇをコードする外来性の遺伝物質を含む組み換えＭＶＡおよびＡＬＶＡＣ組み換えウイルスの構築は、本明細書のそれぞれ実施例２および１０に記載されている。当業者であれば、外来性の遺伝物質の挿入を、ポックスウイルスのゲノムの数え切れないほどの位置に向けることが可能であることを認識する。ただし、その位置が、遺伝物質を発現させるウイルスの能力を打ち消す位置でない限りにおいて。ウイルスの感染力を確保し、その結果として構築物を発現させるためには、挿入をゲノムのサイレント領域内または非必須遺伝子内に行う必要がある。本明細書で開示される組み換えＭＶＡ構築物には、たとえば、チミジンキナーゼ領域内および欠失ＩＩ領域内（領域は、特にメイヤー（Ｍｅｙｅｒ）ら、１９９１  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１０３１−８で規定されている）に外来性の遺伝物質組み込まれている；実施例２を参照すること。
【００５６】
組み換えアデノウイルスベクターは本発明の方法に必須の要素を形成する。というのは、このウイルスは、対象の特定の抗原に対する免疫応答を極めて効果的にプライムすることが分かったからである。Ｅ１領域における欠失／Ｅ１領域の活性化がベクターのＥ１活性を奪う（すなわち本質的に奪う）という理由で、本発明の好ましい実施態様では複製能を欠くアデノウイルスベクターを採用する。哺乳動物宿主免疫応答のプライム化を十分に行うために外来性の遺伝物質（特にＨＩＶ抗原）を十分に発現させるという目的にとって、血清型５のアデノウイルスが、極めて効果的なアデノウイルス媒体であることが分かった。しかしながら、ＨＩＶ抗原を発現させる能力を持ち、複製能を欠くアデノウイルス媒体の代替物も、本明細書にて用いるのに適している。
【００５７】
血清型５の野生型アデノウイルスの配列は公知であり、技術的に説明されている；参照して本明細書に組み込まれるクロボチェック（Ｃｈｒｏｂｏｃｚｅｋ）ら、１９９２  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８６：２８０を参照すること。従って、本発明の好ましい実施態様は、プライム化での投与において、血清型５の野生型アデノウイルスの配列に基づくベクターを採用した免疫化スキームである；このウイルスの一つは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（「ＡＴＣＣ」）で、ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−５にて寄託されている。しかしながら、当業者であれば、代替可能な血清型（たとえば、血清型２、４、６、１２、１６、１７、２４、３１、３３および４２）のアデノウイルスを容易に特定することができ、そして開示された異種のプライム・ブースト免疫化スキームにおいて同様に組み込むことができる。従って、本発明は、Ｅ１が部分的に欠失したアデノウイルスベクターのすべてを本発明の投与スキームに採用する方法を包含する。
【００５８】
Ｅ１領域内に含まれたもの以外に欠失を含む組み換えアデノウイルスベクターを、本発明の方法の範囲内で用いることも意図される。たとえば、Ｅ１およびＥ３の両方に欠失が含まれるベクターを、本発明の方法の範囲内で用いることが意図される。このようなベクターは、より多量の外来性のＤＮＡ挿入物（すなわち外来性の遺伝物質）を収容する能力を持つ。
【００５９】
公知の技術（たとえば、参照して本明細書に組み込まれるヒット（Ｈｉｔｔ）ら、１９９７年、「哺乳動物細胞の中に遺伝子を導入するためのヒトアデノウイルスベクター（Ｈｕｍａｎ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ）」、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４０：１３７−２０６で概説された技術）を用いて、本発明の方法で用いられるアデノウイルスベクターを構築することができる。
【００６０】
アデノウイルスバックボーン（たとえばＭＲＫＨＶＥ３）および適切なシャトルベクターを用いた相同組み換えによって、アデノウイルスプレプラスミド（たとえばｐＭＲＫＡｄ５ｇａｇ）を作製することができる。直鎖状のこのプラスミドは、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞に入った後に複製する能力を有するものであり、そしてウイルスが生産される。次いで、ウイルスの複製が完了した後で、感染細胞および培地を回収する。
【００６１】
公知のセルライン２９３およびＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）を含む種々のＥ１が相補化セルラインウイルスベクター中で増殖させることができる。これらのセルラインの両者は共に、アデノウイルスのＥ１の遺伝子産物を発現する。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）は、ＷＯ９７／００３２６号（１９９７年１月３日に公開されたもの）および発行された米国特許第６，０３３，９０８号に記載されており、これらの両者は参照して本明細書に組み込まれる。このものは、複製能を欠く（ＦＧ）アデノウイルスの産生を相補化するＥ１遺伝子セグメントが形質導入された初代ヒトレチノブラストのセルラインであるが、相同組み換えによって複製能を有するアデノウイルスが出現しないように設計されている。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）の４５９ｂｐから３５１０ｂｐまでのような、ＡＤ５Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子をコードするトランスジーンを用いて、特に対象となる細胞を安定して形質転換してきた。２９３細胞は、グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら、１９７７  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ  ３６：５９−７２に記載されており、このものは参照して本明細書に組み込まれる。上述のように、用いられる、相補化セルラインに存在するアデノウイルスの配列には配慮を払う必要がある。組み換えの可能性を最小限にする場合、ベクター内に存在する配列と重複しない配列が好ましい。
【００６２】
本発明で用いられるアデノウイルスベクターおよびポックスウイルスベクターには、ＨＩＶ−１抗原または免疫学的に関連するその改変体をコードする遺伝子が含まれている。対象のＨＩＶ抗原としては、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖなどのＨＩＶの主要な構造タンパク質、免疫学的に関連する改変体、および免疫原性を有するその部分が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明には、コドンに最適化された種々の形態のＨＩＶ−１  ｇａｇ（コドンに最適化された全長（「ＦＬ」）Ｇａｇのｐ５５型およびｔＰＡ−Ｇａｇ融合タンパク質が含まれるが、これらに限定されない）、ＨＩＶ−１  ｐｏｌ、ＨＩＶ−１  ｎｅｆ、ＨＩＶ  ｅｎｖ、および上記の免疫学的に関連する選択された改変体が包含される。対象のタンパク質をコードする外来性の遺伝物質は発現カセットの形態で存在することができる。遺伝子発現カセットとしては、（ａ）対象のタンパク質をコードする核酸；（ｂ）そのタンパク質をコードする核酸が作動可能に連結した異種（外来）プロモーターまたは改変された固有のプロモーター；および（ｃ）転写終結配列を含むものが好ましい；ただし、組み換えポックスウイルスベクターについての遺伝子発現カセット内に含まれる核酸の発現を駆動するために利用されるあらゆるプロモーターは、対象のポックスウイルスに固有のものか、もしくはそれに由来するものか、または別のポックスウイルスの一部分である、のいずれかである。ワクシニアウイルスについての、天然型でオーバーラップがなく、直列した中程度の強さの初期／後期プロモーターが記載されており（たとえば、コクランら、１９８５  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５４：３０−３７；およびレーゼルら、１９８６  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６０：４３６−９を参照すること）、そしてかかるプロモーターが遺伝子発現に用いられている。改変された固有のプロモーターの一例としては、実施例２の合成の初期／後期プロモーターがあり、このものはチャクラバルティら、１９９７  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３（６）：１０９４−９７にて既に記述されている。組み換えポックスウイルス内で用いられる遺伝子発現カセットとしては、（ａ）ＨＩＶ抗原（ＨＩＶタンパク質など）をコードする核酸、または生物学的活性および／または免疫学的に関連するその部分をコードする核酸；ならびに（ｂ）（別のポックスウイルス種に由来する）異種プロモーター、または対象のポックスウイルス固有のもしくはそれに由来するプロモーターを含むものが好ましい。
【００６３】
組み換えアデノウイルスベクターの転写プロモーターとしては、真核生物のＲＮＡポリメラーゼによって認識されるものが好ましい。好ましい実施態様において、プロモーターは「強力」または「効果的」なプロモーターである。強力なプロモーターの一例は、ヒトサイトメガロウイルス即時型プロモーター（チャップマン（Ｃｈａｐｍａｎ）ら、１９９１  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９：３９７９−３９８６、このものは参照して本明細書に組み込まれる）であり、イントロン配列がないものが好ましい。すぐに使えるアデノウイルスベクターの範囲内で最も好ましく用いられるものは、イントロンＡのようなイントロン配列がないヒトＣＭＶプロモーターである。出願人らは、イントロンＡ、すなわちヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ｈＣＭＶ）の一部が、アデノウイルスベクターについての不安定な領域を構築していることを見出した。イントロンＡがないＣＭＶが、ＨＩＶ  ｇａｇの発現を駆動する場合に、インビトロで同程度の発現能力を発揮すること、そしてさらには、試験を行ったプラスミドＤＮＡの両方の投与量（２０μｇおよび２００μｇ）におけるそれらの抗体とＴ細胞の応答に関して、そのようなＣＭＶが、インビボのＢａｌｂ／ｃマウスにおけるイントロンＡを含む構築物と同等に機能することが見出された。当業者であれば、その他の多数の公知のプロモーター（たとえば強力な免疫グロブリンプロモーター、またはその他の真核生物の遺伝子プロモーター）のいずれかを用いてもよいことを認識する。そしてＥＦ１アルファプロモーター、マウスＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＳＶ４０初期／後期プロモーターおよびベータアクチンプロモーターも含まれる。好ましい実施態様において、プロモーターには、Ｔｅｔオペレーター配列などの制御可能な配列が含まれてもよい。たとえば、遺伝子産物によって、望まれた結果以外の結果がもたらされ、抑制が求められる場合においては、このことは極めて有用なものとなる。遺伝子発現カセット内に存在する好ましい転写終結配列は、ウシ成長ホルモンの終結／ポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）、および長さが５０ヌクレオチドという短い合成ポリＡシグナル（ＳＰＡ）であり、このポリＡシグナルは次のように規定される：ＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧ（配列番号４）。ＣＭＶプロモーター（イントロンＡ領域は奪われている）を含む発現カセットを伴う組み換えアデノウイルスベクターとＢＧＨターミネーターとによって、本発明の特定の側面が形成されるが、その他のプロモーター／ターミネーターの組み合わせを用いることもできる。その他の実施態様では、リーダーペプチドまたはシグナルペプチドがトランスジーン内に組み込まれる。好ましいリーダーは、組織特異的プラスミノゲンアクチベータータンパク質、すなわちｔＰＡに由来するものである。
【００６４】
本開示に基づく組み換えウイルスベクターは、本発明の一つの側面を形成する。本発明のその他の側面は、当該アデノウイルスベクターおよび／またはポックスウイルスベクターを含む宿主細胞；当該ベクターを含むワクチン組成物；ならびに（ａ）アデノウイルスベクターおよび／またはポックスウイルスベクターを宿主細胞内に導入する工程、および（ｂ）その結果生じるベクターを回収する工程を含むベクターを作製する方法である。
【００６５】
本発明の方法に従うウイルスベクターの投与によって、ウイルス感染が継続する可能性を小さくするところの、および／またはＨＩＶ感染の対象となるウイルス負荷を臨床的に有意に減少させることを確立させるところのＨＩＶに対する細胞性免疫応答が強力かつ広範囲に惹起するはずであり、あるいはその投与をＨＡＡＲＴでの治療と組み合わせることで、既に成立したＨＩＶ感染の影響を緩和する（抗ウイルス免疫療法（ＡＲＩ））。あらゆるＨＩＶ抗原（たとえば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆ、ｇｐ１６０、ｇｐ４１、ｇｐ１２０、ｔａｔ、ｒｅｖなど）を、本発明の方法で用いられる組み換えウイルスベクター内に組み込んでもよく、その一方、好ましい実施態様には、コドンに最適化されたｐ５５  ｇａｇ抗原、ｐｏｌおよびｎｅｆが挙げられる。本発明のアデノウイルスベクターおよび／またはポックスウイルス媒体では、コドンに最適化されてもよく、またはされていなくてもよい異種の核酸を利用することができる。本発明の特定の実施態様において、コドンに最適化された異種の核酸を含むアデノウイルスベクターで個体をプライムし、そしてコドンに最適化されていない核酸を含むポックスウイルスベクターでブーストすることができる。複数の抗原を投与することには、種々の異なる組み合わせの、コドンに最適化された配列およびコドンに最適化されていない配列を活用するための可能性がある。
【００６６】
ＨＩＶ−１の異なるクレードに基づいた配列は、本発明での使用に適したものであり、特に好ましいものはクレードＢおよびクレードＣである。特に好ましい実施態様は、コンセンサスクレードＢ配列に基づいたそれらの配列（特に、コドンに最適化された配列）である。ウイルスワクチンの好ましい型は、ｐｏｌまたはｎｅｆの改変型をコードするものである。ＨＩＶエンベロープ遺伝子およびその改変体を保持するウイルスワクチンの好ましい実施態様のものには、それぞれ１９９７年８月２８日（ＷＯ９７／３１１１５号）および１９９７年１２月２４日に公開されたＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／０２２９４号およびＰＣＴ／ＵＳ９７／１０５１７号の、ＨＩＶコドンに最適化されたｅｎｖ配列が含まれる；両文献は参照して本明細書に組み込まれる。
【００６７】
多数のＨＩＶ株の数多くの遺伝子配列は、ＧＥＮＢＡＮＫにおいて公的に入手可能であり、そして最初に野外から分離されたＨＩＶは、これらの株が利用できるようにクオリティー・バイオロジカル（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）社（ゲーサーズバーグ、メリーランド州）と契約を締結した国立アレルギー感染病研究所（ＮＩＡＩＤ）から入手することができる。世界保健機構（ＷＨＯ）、ジュネーブ、スイスから株を入手することもできる。ＨＩＶ−１の株（ＣＡＭ−１；マイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）ら編、「ヒトレトロウイルスおよびＡＩＤＳ（Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ）：１９９５年、ＩＩＡ３からＩＩＡ１９、このものは参照して本明細書に組み込まれる）に由来するｇａｇ遺伝子が好ましい。この遺伝子は、クレードＢ（北米／欧州）配列についてのコンセンサスアミノ酸配列と極めてよく似ている。従って、特定のＨＩＶ  ｇａｇ抗原、または免疫学的に関連するその部分をコードするヌクレオチド配列を適切に選択することは、当業者の範囲内である。ｐ５５  ｇａｇ抗原に基づくクレードＢまたはクレードＣは、地球的規模で有用となるかもしれない。開示された方法の範囲内で用いられたベクター内への挿入に最適なトランスジーンは、コドンに最適化された型のｐ５５  ｇａｇである。
【００６８】
アデノウイルスベクターおよびポックスウイルスベクターによって送達される、対象の単一のＨＩＶ抗原に加えて、別々の媒体または同じ媒体のいずれかを介して、二以上の抗原を送達することができる。たとえば、本発明に基づくプライム化投与量には、ｎｅｆおよびｐｏｌの両方を、あるいは二以上の他に採り得るＨＩＶ−１抗原をコードする遺伝子を含む組み換えウイルスベクターが含まれ得る。次いで、ブースト化投与量には、ｎｅｆおよびｐｏｌの両方をコードする遺伝子を含む組み換えポックスウイルスベクターが含まれ得た（二以上のＨＩＶ−１抗原のどちらかがプライム化投与量において用いられた）。他に採り得る筋書きにおいて、プライム化投与量には、異なるＨＩＶ−１抗原をコードする遺伝子をそれぞれ含む別々のアデノウイルス媒体の混合物が含まれ得る。このような場合において、ポックスウイルスのブースト化投与量には、別々のＨＩＶ−１抗原をコードする遺伝子をそれぞれ含むポックスウイルスベクターの混合物も含まれ得たが、これは、ブースト化投与量が、プライム化投与量にて送達されたのと同一の抗原をコードする遺伝物質を含む組み換えウイルスベクターを投与する場合に限られる。あるいは、ＨＩＶ−１抗原のすべてを発現するポックスウイルスベクターを作製して、ワクチン接種用のブースト化剤として機能させることができるかもしれない。上記の技術を組み合わせることによって、これらの二価（たとえば、ｇａｇとｎｅｆ、ｇａｇとｐｏｌ、またはｐｏｌとｎｅｆの成分）ワクチンまたは三価（たとえばｇａｇ、ｐｏｌとｎｅｆの成分）ワクチンをさらに投与することができる。従って、本発明の好ましい側面は、本発明の方法によって投与することができる種々のワクチン製剤である。ある特定の抗原から複数であるが区別可能な成分を含む複合様式の計画に着手することも、本発明の範囲内である。
【００６９】
二以上の抗原から構成される融合構築物を採用する、開示される免疫化計画も、本明細書に包含される。たとえば、複数のオープンリーディングフレームを含むプレウイルスプラスミドの作製に適したシャトルプラスミド内に、複数のＨＩＶ−１ウイルス抗原が連結してもよい。たとえば、三価のベクターにはｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆ融合体が含まれてもよく、あるいは、「２＋１」二価ワクチンが含まれてもよい。ここで、この二価ワクチンは、たとえば、ｇａｇ−ｐｏｌ融合体（たとえば、コドンに最適化されたｐ５５  ｇａｇおよび不活性化され最適化されたｐｏｌ）を含み、異なるプロモーターおよび転写終結配列が作動可能に連結したそれぞれのオープンリーディングフレームを伴うものである。あるいは、国際公開番号ＷＯ９５／２４４８５号（このものは参照して本明細書に組み込まれる）に開示されたように、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）が作動可能に連結したオープンリーディングフレームと共に、同じ構築物における二つのオープンリーディングフレームが単一のプロモーターに作動可能に連結してもよい。ＩＲＥＳに基づく技術が使えない場合、ベクターの安定性を最も高く維持できるように、異なるプロモーターを用いて、それぞれのオープンリーディングフレームを個別に支持することが好ましい。可能性のある複数のトランスジーンワクチンとして、ｇａｇｐｏｌ融合体およびｎｅｆ遺伝子が同じベクター内に含まれ、ｇａｇｐｏｌ融合体およびｎｅｆ遺伝子について異なるプロモーター配列および終止配列が用いられるような、三種のトランスジーンベクターを挙げることができるが、例示としてであり、限定とすることはありえない。さらに、可能性のある本発明の「２＋１」二価ワクチンは、ｇａｇおよびｎｅｆを含み別個のプロモーター配列および終止配列を伴った単一の構築物と、それに組み合わせて投与される、ｐｏｌ遺伝子を含みプロモーター配列および終止配列を伴った構築物であるかもしれない。上記のｇａｇ−ｐｏｌ融合体以外の融合体も、種々の二価ワクチン計画に用いることに適しており、そしてそのような融合体は、任意の二種のＨＩＶ抗原が互いに融合し合ったものから構成され得る（たとえば、ｎｅｆ−ｐｏｌおよびｇａｇ−ｎｅｆ）。接種時に生じる免疫応答を多様化させるためには、これらの組成物を、上記のように付加的なＨＩＶ抗原を含むウイルス組成物と一緒に送達することが好ましい。従って、単独で、またはもしかすれば第二のウイルスベクターと共に送達される多価ワクチンは、本発明の一部として確かに意図される。組み換えアデノウイルスベクターについての挿入物を決定することに関して、ウイルス媒体の制限されたパッケージングを効率的にするための正当な検討に専念すべきである、ということに言及することは重要である。たとえば、アデノウイルスのクローン化の容量の上限値は、野生型のＡｄ５の配列の約１０５％を示すことが明らかにされている。
【００７０】
発現のために選択される遺伝子に関係なく、ある特定の実施態様では、哺乳動物（たとえば、ヒトの細胞環境内で発現するために「最適化」された配列が好ましく、アデノウイルス構築物が特に好ましい。考えられる四種のヌクレオチド塩基の「トリプレット」コドンが、６４種の変異型内に存在し得る。これらの変異型によって、２０種のみの異なるアミノ酸（ならびに転写開始および転写終結）のメッセージが与えられることは、いくつかのアミノ酸が二以上のコドンによってコードされていることがあることを意味する。実際のところ、いくつかのアミノ酸は六種もの「重複」した、代替可能なコドンを有している。その一方、その他のいくつかのものは唯一つの必須のコドンを有する。その理由が完全に理解されているわけではないが、異なるタイプの細胞の内因性ＤＮＡにおいて代替可能なコドンがすべて均等に存在しているわけではなく、そしてあるタイプの細胞における特定のコドンに関しての気まぐれな自然の階層性、すなわち「好み」が存在するようである。一例として、アミノ酸のロイシンでは、ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＴＴＡ、およびＴＴＧ（これらはそれぞれ、ｍＲＮＡのコドンのＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ、ＵＵＡおよびＵＵＧに対応する）を含む六種のＤＮＡのコドンのいずれかが指定されている。微生物のゲノムのコドンの頻度の徹底的な分析から、大腸菌の内因性ＤＮＡではロイシンを指定するコドンとしてＣＴＧが最も広く含まれ、その一方酵母および粘菌ＤＮＡではロイシンを指定するコドンとしてＴＴＡが最も広く含まれていることが明らかになった。この階層性を考慮すると、大腸菌の宿主によってロイシンに富むポリペプチドを高レベルで発現させることの可能性は、コドンが用いられる頻度にある程度は依存するだろうことが一般的に考えられる。たとえば、ＴＴＡコドンに富む遺伝子の大腸菌内での発現は、ほぼ確実に弱い。それに対してＣＴＧに富む遺伝子は、おそらくポリペプチドを多く発現する。同様に、ロイシンに富むポリペプチドを発現させるための宿主細胞として、酵母細胞を計画的に形質転換する場合、挿入されるＤＮＡにおいて好ましく用いられるコドンはＴＴＡとなる。
【００７１】
組み換えＤＮＡ技術に関する、コドンが選り好みされる現象の意味合いは明らかである。そしてこの現象が、形質転換が成功した宿主生物において、外来性の遺伝子を高レベルで発現させることに以前から数多く失敗していることの説明に役立つかもしれない、即ち、より「好み」ではないコドンが、挿入された遺伝子内に繰り返し存在するのかもしれず、そして発現のための宿主細胞の機構が効果的に機能しないのかもしれない。この現象は、宿主細胞の好ましいコドンが計画的に含まれるように設計された合成遺伝子によって、組み換えＤＮＡ技術を実施するために好ましい形態の外来性の遺伝物質の好ましい形態が提供されることを示唆する。従って、本発明の一つの側面はワクチン投与プロトコールであり、ここで、アデノウイルスベクターおよびポックスウイルスベクターの両方は、ヒトの細胞環境内での発現に最適化されたコドンである遺伝子を特に含む。本明細書で述べたように、本発明での使用に好適な遺伝子はコドンに最適化されたＨＩＶ遺伝子であり、特にＨＩＶｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖまたはｎｅｆであるが、上記で述べたように、本発明の一種以上のウイルス媒体は、コドンに最適化されてもよく、されていなくてもよい異種の核酸を利用することができる。本発明の特定の実施態様において、コドンに最適化された異種の核酸を含むアデノウイルスベクターを用いて個体をプライムすることができ、そしてコドンに最適化されていない核酸を含むポックスウイルスベクターを用いてブーストすることができる。複数の抗原を投与することによって、コドンに最適化された配列およびコドンに最適化されていない配列の種々の異なる組み合わせを利用するための可能性が生じる。
【００７２】
本発明に従う、プライム化またはブースト化のいずれかの投与量の組み換えウイルスベクターを含むワクチン組成物には、生理的に許容され得る成分、たとえば緩衝液、標準的な生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水、ショ糖、その他の塩類およびポリソルベートが含まれてもよい。組み換えアデノウイルスベクターに好ましい一つの製剤には：２．５から１０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液、好ましくは約５ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液；２５から１００ｍＭのＮａＣｌ、好ましくは約７５ｍＭのＮａＣｌ；２．５から１０％のショ糖、好ましくは約５％のショ糖；０．０１から２ｍＭのＭｇＣｌ２；および０．００１％から０．０１％のポリソルベート８０（植物に由来するもの）が含まれる。ｐＨの範囲は約７．０から９．０とすべきであり、約８．０が好ましい。当業者であれば、その他の従来のワクチン用賦形剤を用いてこの製剤を調製してもよいことを認識する。好ましい製剤には、ｐＨが８．０であって、５ｍＭのＴＲＩＳ、７５ｍＭのＮａＣｌ、５％のショ糖、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．００５％のポリソルベート８０が含まれる。このもののｐＨと二価カチオン組成は、Ａｄ５が安定する最適条件に近く、そしてウイルスがガラスの表面に吸着する可能性を最小化している。このものが筋肉注射時に組織の炎症を生じさせることはない。使用まで凍結することが好ましい。
【００７３】
ワクチンを接種される個体に導入されるワクチン組成物内のウイルス粒子の量は、用いられる転写プロモーターおよび翻訳プロモーターの強さと、発現される遺伝子産物の免疫原性に依存することになる。一般的に、免疫学的または予防的に有効な投与量の１×１０７から１×１０１２粒子、好ましくは約１×１０１０から１×１０１１粒子を、筋肉組織に直接投与する。皮下注射、皮内注射、皮膚を介する圧着、およびその他の投与形式（たとえば、腹腔内投与、静脈内投与または吸入による投与）も検討される。本発明のワクチン組成物を非経口的に導入するのと同時にまたはその後に、インターロイキン−１２タンパク質の非経口投与（たとえば、静脈内、筋肉内、皮下またはその他の投与手段）を行うことも有利である。
【００７４】
本発明の投与スキームは、一つ（または複数）のＨＩＶ抗原をコードする遺伝子を含むアデノウイルス媒体による免疫応答のプライム化と、所定の長さの時間の経過後における、アデノウイルスでプライムされた応答の、一つ（または複数）のＨＩＶ抗原をコードする遺伝子を含むポックスウイルスベクターによるブースト化に基づくものである。たいていの場合、複数回のプライム化（通常は１から４回）を用いるが、より多く用いてもよい。プライム化とブースト化との間の期間の長さは、通常、約四ヶ月から一年の間で変わることがあるが、その他の期間を用いてもよい。時間間隔を選択して、ブースト化の投与量を繰り返してもよい。
【００７５】
大型のヒトおよび動物のデータから、ＨＩＶ感染の制御（または解消）時の細胞性免疫応答、特にＣＴＬの重要性が支持される。ヒトにおいて、初感染後にＣＴＬが極めて高レベルに発生し、ウイルス血症の制御と相関する。個体の小さな群のいくつかにおいて、繰り返しＨＩＶにさらされるが、非感染を維持する者について記載されている；これらの一団のいくつかにおいて、ＣＴＬが言及されている。ＨＩＶ感染のＳＩＶモデルにおいて、初感染後にＣＴＬが同様に発生し、そして抗ＣＤ８モノクローナル抗体の添加によって、このような感染の制御が破棄され、そして病気が進行に向かうことが実証されている。
【００７６】
次の非限定的な実施例を示して本発明をより良く説明する。
【実施例１】
【００７７】
ＨＩＶ−１  Ｇａｇ遺伝子
ヒトにおいて頻繁に用いられるコドンを利用して、ＨＩＶ−１株であるＣＡＭ−１からＨＩＶ  ｇａｇについての合成遺伝子を構築した；ケルバー（Ｋｏｒｂｅｒ）ら、１９９８年、ヒトレトロウイルスおよびＡＩＤＳ（Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ）、ロスアラモス国立研究所、ロスアラモス、ニューメキシコ州；ならびにレース，アール（Ｌａｔｈｅ，Ｒ．）、１９８５  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８３：１−１２を参照すること。図２には、例示された、コドンに最適化された全長型ｐ５５  ｇａｇのヌクレオチド配列が図示されている。クレードＢ（北米／欧州）配列（ロスアラモスＨＩＶデータベース）についてのコンセンサスアミノ酸配列と極めてよく似ているので、ＨＩＶ−１株であるＣＡＭ−１のｇａｇ遺伝子を選択した。ワクチン成分としてのこの「コドンに最適化された」ＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子の利点は、マウスにおける免疫学的研究において実証されている。ＤＮＡワクチンとして送達した場合、野生型ＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子よりも、「コドンに最適化された」ＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子の方が、細胞性免疫を誘導することが５０倍以上強いことが示された。
【００７８】
発現を最適化するために、ｇａｇ遺伝子の開始ＡＴＧの前にコザック配列（ＧＣＣＡＣＣ）を導入した。Ｖ１Ｊｎｓ−ＨＩＶ  ｇａｇベクターからＰＣＲにより、コザック配列を伴うＨＩＶ  ｇａｇ断片を増幅させた。ｐＶ１ＪｎｓＨＩＶｇａｇは、ＣＭＶ即時型（ＩＥ）プロモーターおよびイントロンＡ、コドンに最適化された全長ＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子、ウシ成長ホルモンに由来するポリアデニル化・転写終結配列、ならびに最小限のｐＵＣバックボーンを含むプラスミドである；プラスミドバックボーンの記述についてのモントゴメリー（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ）ら、１９９３  ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：７７７−７８３を参照すること。
【実施例２】
【００７９】
組み換えＭＶＡの構築と精製
コザック配列を伴うＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子断片を用いて、二つの組み換えＭＶＡ構築物を構築した。ここで、この遺伝子断片は、制限酵素認識部位の適切なリンカー配列を伴うＭＶＡゲノムの二箇所の異なる位置（それぞれウイルスのチミジンキナーゼ領域（ＭＶＡ−ＨＩＶ  ｇａｇ  ＴＫ）および欠失ＩＩ領域（ＭＶＡ−ＨＩＶ  ｇａｇ  ｄＩＩ））内にクローン化されたものである。シャトルベクターｐＳＣ５９（チャクラバルティら、１９９７  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３（６）：１０９４−１０９７を参照すること）を、唯一のＸｈｏＩ部位に挿入されたＨＩＶ  ｇａｇ断片と共に利用して、チミジンキナーゼ領域の挿入を達成した。ＨＩＶ  ｇａｇ断片が唯一のＰｍｅＩ部位に挿入されたｐＬＷ２１を利用して、欠失ＩＩ領域の挿入を達成させた。ｐＬＷ２１は基本的に、合成の初期／後期プロモーターを一つとクローン化用の唯一のＰｍｅＩ部位とを含むｐＧＥＭ４ベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社）由来のプラスミドである。相同組み換え事象の時に、ＭＶＡゲノムのセルラインＩＩ領域の中に標的を挿入するために、プロモーターおよびクローニング部位の両側はＭＶＡウイルス配列に挟まれている。ワクシニアウイルスについて既に記載された合成の初期／後期プロモーター（チャクラバルティら、上掲）によって、両構築物内のトランスジーンの発現を駆動する。挿入物のフランキング領域に固有の配列は、一般的にランスジーンの転写物の転写終結・ポリアデニル化を行うことに十分であると考えられていたので、ウイルスの転写終結配列およびポリアデニル化シグナル配列は、挿入された断片内には含まれていなかった（ビー・モス（Ｂ  Ｍｏｓｓ）、微生物学および免疫学における最新のトピックス（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、１５８：２５、１９９２年を参照すること）。ポックスウイルスベクターを介して発現したトランスジーン産物の確実性は、トランスジーンのＯＲＦの３’末端における翻訳終止コドン（ＴＡＡ）によって保証されているわけではなかった。ＤＮＡシークエンシングによって、挿入物の配向性および確実性を確認した。
【００８０】
組み換えＭＶＡを作製する方法は既に記載されている（たとえば、サッターら、１９９４  Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：１０３２−１０４０；ワイアットら、１９９６  Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：１４５１−１４５８を参照すること）。簡単に言えば、２５ｃｍ２の細胞培養フラスコ内のサブコンフルエントな初代ニワトリの胚線維芽細胞（ＣＥＦ）を、二時間の感染効率（「ｍ．ｏ．ｉ．」）が０．０５での野生型ＭＶＡで感染させ、次いで、リポフェクチン（ギブコ・ビーアールエル（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）社）で沈殿させたシャトルベクターＤＮＡの約２０ｍｃｇを用いて、この細胞にトランスフェクトした。この細胞を二日間培養し、次いで、１ｍＬのＰＢＳ／ＢＳＡ内で凍結−解凍を繰り返すことによって、細胞ペレットを溶解させた。細胞溶解物を用いて、６ウェルプレート内でＣＥＦを感染させた。ここで、１：３、１：９および１：２７に希釈したものを二通り用いた。二日後に培地を除去し、そして単層の細胞をＰＢＳにて二回洗浄した。次いで、細胞の凍結と解凍を三回行い、そして組み換えＭＶＡが感染した細胞を含むプラークを免疫染色法によって特定した。ここで、この方法は、ＨＩＶ  ｇａｇに対するモノクローナル抗体（アドバンスト・バイオテクノロジー（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社）およびペルオキシダーゼ（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）社）が結合したヤギの抗マウスＩｇＧ抗体、そして基質としてのｏ−ジアニシジンの連続的なインキュベーションを行って実施した。感染細胞によって形成される青色のプラークを倒立顕微鏡下で選び出し、そして１ｍＬのＰＢＳで細胞を希釈した。凍結−解凍によってこの細胞を溶解させ、そして１：５、１：２０および１：８０の希釈物を利用して、ＣＥＦ内で組み換えＭＶＡをさらに精製し、さらに５回行った。次いで、２５ｃｍ２の組織培養フラスコ内で、ＣＥＦ中にて組み換えＭＶＡを展開し、そして異なる希釈度のＭＶＡが感染したＣＶ−１細胞内でのウエスタンブロット分析によって、ＨＩＶ  ｇａｇの発現を確認した。４０から８０個の１５０ｃｍ２のＣＥＦのフラスコ内で、最終的なウイルスのストックを調製し、そして免疫染色法を利用するプラークアッセイによってウイルスの力価を測定した。
【００８１】
下記で検討する免疫化においては、欠失ＩＩ領域内に挿入物を伴う組み換えＭＶＡ構築物を用いた。
【実施例３】
【００８２】
アデノウイルスベクター構築物の作製
Ａ．ｈＣＭＶプロモーターのイントロンＡ部分の除去
ｈＣＭＶプロモーターを増幅するための出発材料として、ＧＭＰグレードのｐＶ１ＪｎｓＨＩＶｇａｇを用いた。ｈＣＭＶプロモーターの横側に安定的に位置したプライマーを用いて増幅を実施した。５’プライマーは、ｈＣＭＶプロモーターのＭｓｃ１部位の上流側に設けられ、そして（ＢｇｌＩＩ認識配列を含むように設計された）３’プライマーはｈＣＭＶプロモーターの３’の位置に設けられた。（高忠実度Ｔａｑポリメラーゼを用いて）得られた、（イントロンＡを除いた）ｈＣＭＶプロモーターの全体を包含するＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ  ＰＣＲ平滑末端ベクター内にクローン化し、Ｍｓｃ１とＢｇｌＩＩとの二重消化によって除去した。次いで、この断片を当初のＧＭＰグレードのｐＶ１ＪｎｓＨＩＶｇａｇプラスミド内にクローン化して戻した。このプラスミドからは、Ｍｓｃ１およびＢｇｌＩＩ消化後に、当初のプロモーター、イントロンＡ、およびｇａｇ遺伝子が除去されていた。この連結反応の結果、当初のｐＶ１ＪｎｓＨＩＶｇａｇベクターバックボーン内に、ｈＣＭＶプロモーター（イントロンＡを除いた）＋ｂＧＨｐＡ発現カセットが構築された。このベクターをｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（イントロンなし）と称する。
【００８３】
ＢｇｌＩＩ消化を利用してｐＶ１ＪｎｓＨＩＶｇａｇからＦＬｇａｇ遺伝子を切り出し、この１，５２６ｂｐの遺伝子をゲルで精製し、そしてｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（イントロンなし）のＢｇｌＩＩ部位内にクローン化した。Ｓｍａ１制限酵素を用いてコロニーを選別し、正しい配向性にてＦＬｇａｇ遺伝子を保持するクローンを特定した。ｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡと称するこのプラスミド全体の配列を決定して、配列の完全性を確認した。
【００８４】
Ｂ．改変されたシャトルベクター−「ＭＲＫｐｄｅ１Ｅ１シャトル」の構築
当初のＡｄ５シャトルベクター（ｐｄｅ１Ｅ１ｓｐ１Ａ；塩基対１から３４１および塩基対３５２４から５７９８のＡｄ５配列を含むベクターであって、Ａｄ５のヌクレオチドの３４１から３５２４の間のマルチクローニング領域を伴うベクターの、次の三種の操作を含めた、次のような連続したクローン化工程にて行った：
（１）左側のＩＴＲ領域を延長して、ベクターバックボーンとアデノウイルスの左側のＩＴＲ配列との間にある接合部でＰａｃ１部位を含むようにした。これによって、細菌の相同組み換え系を用いてさらに簡単に操作することができる。
【００８５】
（２）パッケージング領域を延長して、野生型（ＷＴ）アデノウイルスの３４２ｂｐから４５０ｂｐまでの配列を含むようにした。
【００８６】
（３）ｐＩＸの下流領域を１３ヌクレオチド分（すなわちヌクレオチド３５１１から３５２３まで）延長した。
【００８７】
これらの改変（図４）によって、形質転換されたＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）セルライン内に存在するＥ１Ａ／Ｅ１Ｂ遺伝子の部分を少しもオーバーラップさせることなく、Ｅ１欠失のサイズを効果的に縮小した。ＡｄシャトルベクターｐｄｅｌＥ１ｓｐ１Ａを改変することによって、すべての操作を実施した。
【００８８】
一旦シャトルベクターに改変を行うと、化学的なコンピテント細胞の大腸菌ＢＪ５１８３を用いる細菌の相同組み換えによって、当初のＡｄ５アデノベクターバックボーンｐＡｄＨＶＥ３の中にその変化が組み込まれた。
【００８９】
Ｃ．改変されたアデノベクターバックボーンの構築
Ｅ１領域への改変が含まれるように、（Ｅ１領域を包含するヌクレオチド以外のすべてのＡｄ５配列を含む）当初のアデノベクターｐＡＤＨＶＥ３を再構築した。新たに改変されたシャトルベクター（ＭＲＫｐｄｅｌＥ１シャトル）を、Ｐａｃ１およびＢｓｔＺ１１０１を用いて消化し、そしてアデノウイルス配列に対応する２，７３４ｂｐの断片を単離することによって、このことを達成した。Ｃｌａ１で直線化されたｐＡｄＨＶＥ３（Ｅ３＋アデノベクター）からのＤＮＡと共に、この断片を、大腸菌ＢＪ５１８３コンピテント細胞内に同時形質転換を行った。形質転換から少なくとも二つのコロニーを選択し、そしてＴｅｒｒｉｆｉｃ（商標）ブロス内で、濁度が到達するまで６から８時間培養した。それぞれの細胞ペレットからＤＮＡを抽出し、次いで大腸菌ＸＬ１コンピテント細胞内に形質転換した。形質転換からの一つのコロニーを選択し、プラスミドＤＮＡを精製するために培養した。制限消化によってプラスミドを分析し、正しいクローンを特定した。改変されたアデノベクターをＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３（Ｅ３＋プラスミド）と称した。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）セルライン内で、昔の型と同じく新規アデノベクター（ＭＲＫＨＶＥ３）からウイルスを作製した。さらに、当初のシャトルベクターのマルチクローニング部位には、ＣｌａＩ部位、ＢａｍＨＩ部位、ＸｈｏＩ部位、ＥｃｏＲＶ部位、ＨｉｎｄＩＩＩ部位、ＳａｌＩ部位、およびＢｇｌＩＩ部位が含まれていた。このＭＣＳは、ＮｏｔＩ部位、ＣｌａＩ部位、ＥｃｏＲＶ部位およびＡｓｃＩ部位を含む新たなＭＣＳに取って代わられた。この新規ＭＣＳは、パッケージング領域およびｐＩＸ遺伝子になされた変異と共にＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３プレプラスミドに導入された。
【００９０】
Ｄ．改変されたｇａｇトランスジーンを含む新規シャトルベクター−「ＭＲＫｐｄｅｌＥ１−ＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡ」の構築
改変されたプラスミドｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡをＭｓｃ１で一晩消化し、次いでＳｆｉ１で５０℃にて２時間消化した。次いで、ＤＮＡをヤエナリのヌクレアーゼで３０℃にて３０分間処理した。Ｑｉａｅｘ  ＩＩキットを用いてＤＮＡ混合物を脱塩し、次いでクレノウ処理を３７℃で３０分間実施し、トランスジーン断片の末端をすべて平滑化した。次いで、２，５５９ｂｐのトランスジーン断片をゲルで精製した。改変されたシャトルベクター（ＭＲＫｐｄｅｌＥ１シャトル）を、ＥｃｏＲＶによる消化によって直線化し、仔ウシの腸のホスファターゼで処理し、次いで、得られた６，４７９ｂｐの断片をゲルで精製した。次いで、二種の精製断片を互いに連結し、そして数ダースのクローンを選別してシャトルベクター内のトランスジーンの挿入について点検した。診断のための制限消化を実施して、Ｅ１と平行方向にてトランスジーンを保持するクローンを特定した。
【００９１】
Ｅ．ＭＲＫ  ＦＧアデノベクターの構築
Ｅ１と平行方向にてＨＩＶ−１  ｇａｇトランスジーンを含むシャトルベクターであるＭＲＫｐｄｅｌＥ１−ＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡをＰａｃ１で消化した。反応混合物をＢｓｆＺ１７１で消化した。５，２９１ｂｐの断片をゲル抽出によって精製した。ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３プラスミドをＣｌａ１で３７℃にて一晩消化し、そしてゲルで精製した。約１００ｎｇの５，２９０ｂｐのシャトル＋トランスジーン断片と、約１００ｎｇの直線化されたＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３  ＤＮＡで、化学的なコンピテント細胞の大腸菌ＢＪ５１８３を同時形質転換した。いくつかのクローンを選択し、そして２ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ（商標）ブロス内で、濁度が到達するまで６から８時間培養した。Ｑｉａｇｅｎアルカリ溶解およびフェノールクロロホルム法を用いて、細胞ペレットからの全ＤＮＡを精製した。イソプロパノールにてＤＮＡを沈殿させ、そして２０μＬのｄＨ２Ｏ内に再懸濁した。このＤＮＡの２μＬのアリコートで、大腸菌ＸＬ−１コンピテント細胞を形質転換した。形質転換から単一のコロニーを選択し、そして３ｍＬのＬＢ＋１００μｇ／ｍＬのアンピシリン内で一晩培養した。Ｑｉａｇｅｎカラムを用いてこのＤＮＡを単離した。プラスミドバックボーンだけでなくｇａｇ遺伝子の内部も切断するという制限酵素ＢｓｔＥＩＩでの消化によって、一つの陽性クローンを特定した。このプレプラスミドクローンをＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３＋ＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡと称し、そしてそのサイズは３７，４９８ｂｐである。
【００９２】
Ｆ．強化されたアデノウイルス構築物−「ＭＲＫ  Ａｄ５  ＨＩＶ−１ｇａｇ」のウイルスによる作製
ＭＲＫ  Ａｄ５  ＨＩＶ−１  ｇａｇには、新規Ｅ３＋アデノベクターバックボーンであるＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３内に、Ｅ１と平行方向に挿入されたｈＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡトランスジーンが含まれる。我々は、このアデノベクターをＭＲＫ  Ａｄ５  ＨＩＶ−１  ｇａｇと命名した。以下にこの構築物の調製についての概略を説明する：
プレプラスミドＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３＋ＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡをＰａｃ１で消化してベクターバックボーンを開放し、そしてリン酸カルシウム法（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．）社）によって、約６０％のコンフルエンスのＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞を含む６ｃｍの皿内で、３．３μｇをトランスフェクトした。一旦ＣＰＥが（７から１０日に）到達すると、培養物の凍結／解凍を三回行って、そして細胞残屑をペレット化した。この細胞溶解物の１ｍＬを用いて、６ｃｍの皿の中の、８０から９０％のコンフルエンスのＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞を感染させた。一旦ＣＰＥが到達すると、培養物の凍結／解凍を三回行い、細胞残屑をペレット化した。次いで、細胞溶解物を用いて、１５ｃｍの皿に含まれる８０から９０％のコンフルエンスのＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞を感染させた。この感染の手順を続けて行い、６回の継代にまで拡大した。次いで、ＣｓＣｌ法によって細胞ペレットからウイルスを抽出した。バンド形成を二回実施した（３種の勾配のＣｓＣｌに続けて、ＣｓＣｌの連続的な勾配）。第二のバンド形成の直後に、Ａ１０５緩衝液内でウイルスを透析した。プロナーゼ処理を利用し、次いでフェノール・クロロホルムによってウイルスＤＮＡを抽出した。次いで、ＨｉｎｄＩＩＩを用いてウイルスＤＮＡを消化し、そして［３３Ｐ］ｄＡＴＰを用いて放射標識化した。ゲル電気泳動で消化産物を分離した後、そのゲルをワットマンろ紙上で乾燥させ、次いでオートラジオグラフィーに供した。この消化産物を、プレプラスミドからの消化産物（標識化の前にＰａｃ１／ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたもの）と比較した。予想されたサイズが観察され、このことは、ウイルスのレスキューが成功したことを示した。
【００９３】
Ｇａｇの発現に関しては、ウエスタンブロット分析によって、すべてのウイルス構築物（アデノウイルスおよびポックスウイルス）を確認した。
【実施例４】
【００９４】
免疫化
アカゲザルの体重を３から１０ｋｇの間とした。すべてのケースにおいて、それぞれのワクチンを１ｍＬの緩衝液中に懸濁させて合計の投与量とした。アカゲザルを（ケタミン／キシラジンで）麻酔して、ワクチンを筋肉内に（「ｉ．ｍ．」）、すなわちツベルクリン用のシリンジ（ベクトン−ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）社、フランクリンレイクス、ニュージャージー州）を用いて、０．５ｍＬのアリコートを両方の三角筋内に投与した。免疫化計画の期間中のいくつかの時点で集めた血液サンプルから末梢血単球（ＰＢＭＣ）を調製した。米国学術研究会議の研究用動物資源協会の、実験動物の世話と使用についてのガイド内に記載された原則に従って、研究機関の動物管理使用委員会に承認された基準に基づいて、すべての動物の世話と処置を行った。
【実施例５】
【００９５】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
既に記述されたプロトコール（アレン（Ａｌｌｅｎ）ら、２００１  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２）：７３８−７４９）に従い、いくつかの変更を加えて、アカゲザルについてのＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。抗原特異的な刺激のために、１０−アミノ酸（「ａａ」）のオーバーラップを伴った、ＨＩＶ−１  ｇａｇ配列の全体（シンペップ（Ｓｙｎｐｅｐ）社、ダブリン、カリフォルニア州）を包含する２０−ａａのペプチドから、ペプチドのプールを調製した。それぞれのウェルに、５０μＬの２〜４×１０５の末梢血単球（ＰＢＭＣｓ）を添加した。８０フェムトリットル（「ｆＬ」）より小さいサイズを切り捨てるように設定したＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｚ２粒子アナライザーを用いて、細胞数を計数した。５０μＬの培地、またはペプチドあたり８μｇ／ｍＬの濃度のｇａｇペプチドプールのいずれかを、ＰＢＭＣに添加した。このサンプルのインキュベーションを３７℃、５％のＣＯ２にて２０から２４時間行った。それに応じて、スポットを展開し、そして特別注文のイメージング装置と、イメージプロ（ＩｍａｇｅＰｒｏ）（シルバースプリング、メリーランド州）のプラットフォームに基づいた自動計数サブルーチンを用いてプレートを処理した。細胞の投入量を１０６として計測値を正規化した。
【実施例６】
【００９６】
抗ｐ２４のＥＬＩＳＡ
Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｐ２４抗原アッセイキット（ベックマン・クールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）社、フラートン、カリフォルニア州）からの試薬を用いて、改変された競合的抗ｐ２４アッセイを開発した。簡単に言えば、２５０μＬの血清サンプルに、２０μＬの溶解緩衝液およびＣｏｕｌｔｅｒキットからの１５μＬのｐ２４抗原（９．３７５ｐｇ）を加えた。混合後、２００μＬのそれぞれのサンプルを、Ｃｏｕｌｔｅｒキットからのマウス抗ｐ２４  ｍＡｂで被覆したウェルに添加し、３７℃で１．５時間のインキュベーションを行った。次いで、このウェルを洗浄し、そしてＣｏｕｌｔｅｒキットからのビオチン試薬（ポリクローナル抗ｐ２４ビオチン）の２００μＬを、それぞれのウェルに添加した。３７℃でのインキュベーションの１時間後、ストレプトアビジン結合ホースラディシュペルオキシダーゼとＴＭＢ基質とを用いて、Ｃｏｕｌｔｅｒキットに記載されたようにして検出を行った。ＯＤ４５０ｎｍの値を記録した。ＨＩＶ−血清反応陽性の個体からの血清を連続的に２倍ずつ希釈したものを用いて、７点の標準曲線を作製した。アッセイについての切捨ての下限値は、自由に裁量して、血清反応陽性なヒトの血清の希釈によって規定される１０ミリメルク単位／ｍＬ（ｍＭＵ／ｍＬ）に設定する。この切捨てによって、希釈物の対照のみから得られ、陽性の分析物では得られないシグナルに対応する最大限に結合した対照シグナルの約６５％にまで低下する。
【実施例７】
【００９７】
細胞内サイトカインの染色
抗−ｈＣＤ２８モノクローナル抗体（クローンＬ２９３、ベクトン−ディッキンソン社）および抗ｈＣＤ４９ｄモノクローナル抗体（クローンＬ２５、ベクトン−ディッキンソン社）を、最終濃度が１μｇ／ｍＬとなるように、（１７×１００ｍｍの丸底のポリプロピレン製試験管（ザルステット（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）社、ニュートン、ノースカロライナ州）の中にある）２×１０６ＰＢＭＣ／ｍＬの完全ＲＰＭＩ培地の１ｍＬに添加した。ｇａｇ特異的な刺激のために、１０μＬのペプチドプール（ペプチドにつき０．４ｍｇ／ｍＬ）を添加した。この試験管のインキュベーションを３７℃で１時間行った。その後、２０μＬの５ｍｇ／ｍＬのブレフェルジンＡ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社）を添加した。細胞のインキュベーションを３７℃で１６時間、５％のＣＯ２、９０％の湿度にて行った。４ｍＬの冷ＰＢＳ／２％のＦＢＳをそれぞれの試験管に添加し、そして細胞を１２００ｒｐｍにて１０分間でペレット化した。細胞をＰＢＳ／２％のＦＢＳ中に再懸濁させ、そしていくつかの蛍光性のタグが付けられたｍＡｂｓを用いて表面マーカーのために染色した（３０分間、４℃）：試験管あたり２０μＬの抗ｈＣＤ３−ＡＰＣ・クローンＦＮ−１８（バイオソース（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）社）；２０μＬの抗ｈＣＤ８−ＰｅｒＣＰ・クローンＳＫ１（ベクトン−ディッキンソン社）；および２０μＬの抗ｈＣＤ４−ＰＥ・クローンＳＫ３（ベクトン−ディッキンソン社）。この段階から、暗所でサンプルを扱った。細胞を洗浄し、そして７５０μＬの１×ＦＡＣＳ  Ｐｅｒｍ緩衝液（ベクトン−ディッキンソン社）中で１０分間、室温にてインキュベーションを行った。細胞をペレット化し、そしてＰＢＳ／２％のＦＢＳ中に再懸濁させ、そして０．１μｇのＦＩＴＣ−抗ｈＩＦＮ−γ・クローンＭＤ−１（バイオソース社）を添加した。３０分間のインキュベーションの後、細胞を洗浄してＰＢＳ中に再懸濁させた。ベクトン−ディッキンソン社のＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ装置の四色のチャネルのすべてを用いて、サンプルを分析した。データを解析するために、最初に、リンパ球の集団を底部の側方散乱光および前方散乱光のゲートで制御し、そしてサイトカインに陽性な事象について遮断される共通する蛍光を、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両集団のために、ならびにサンプルの試験管の偽薬およびｇａｇ−ペプチドの両者のために使用した。
【実施例８】
【００９８】
結果
Ａ．免疫化計画
相同性と、同じコドンに最適化されたＨＩＶ−１  ｇａｇを発現するＭＲＫＡｄ５ベクターおよびＭＶＡベクターに関する同種および異種のプライム・ブースト計画とに従って、３から６匹のアカゲザルの一団を免疫化した。免疫化のスケジュールを表１に記載する。
【００９９】
【表１】
2006503800.tif 000002
【０１００】
Ｂ．Ｔ細胞免疫応答
ワクチンで誘導されるＨＩＶ−１  ｇａｇに対するＴ細胞の応答を、タンパク質配列の全体を包含する２０−ａａのペプチドプールに対するＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを利用して定量した。結果を図５および図６に示す。１００万の末梢血単球（ＰＢＭＣｓ）あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数として表しており、ペプチドプールから偽薬の対照を差し引いたものに対応する。
【０１０１】
図５は、（ａ）１０ｅ９  ｖｐ  ＭＲＫＡｄ５  ＨＩＶ  ｇａｇによる二回のプライム化免疫と、それに続く、１０ｅ９  ｖｐ  ＭＲＫＡｄ５  ＨＩＶ  ｇａｇでのブースト（「１０ｅ９  ｖｐ  ＭＲＫＡｄ５−１０ｅ９  ｖｐ  ＭＲＫＡｄ５」）によって；（ｂ）二回のプライム化投与量の１０ｅ９  ｐｆｕ  ＭＶＡ  ＨＩＶ−１  ｇａｇと、１０ｅ９  ｐｆｕ  ＭＶＡ  ＨＩＶ−１  ｇａｇでの一回のブースト（「１０ｅ９  ｐｆｕ  ＭＶＡ−１０ｅ９  ｐｆｕ  ＭＶＡ」）によって；または（ｃ）二回のプライム化投与量の１０ｅ９  ｖｐ  ＭＲＫＡｄ５  ＨＩＶ−１  ｇａｇと、それに続く、１０ｅ９  ｐｆｕ  ＭＶＡ  ＨＩＶ−１  ｇａｇでの一回のブースト投与（「１０ｅ９  ｖｐ  ＭＲＫＡｄ５−１０ｅ９  ｐｆｕ  ＭＶＡ」）によって誘導されるＴ細胞の応答を示す図である。最後のプライム化投与量と、ブースト化投与量との間の休止期間は、２０から２３週間の間で変化した（ＭＶＡ−ＭＶＡの対象物については２０週間；ＭＲＫＡｄ５−ＭＲＫＡｄ５群の対象物の９９Ｄ２６２、９９Ｃ１１７、および９９Ｄ２２７については２２週間；そして残りの対象物については２３週間）。約６ヶ月目に同じ投与量のＭＲＫＡｄ５  ＨＩＶ−１  ｇａｇを投与した結果、ブーストの直前のレベルよりもわずかに上昇した；ブースト後のレベルは、ブースト前の最高値のレベルにおおむね匹敵していたか、そのレベルよりも小さい場合はなかった。このことは、最初の二回の免疫化によって作製されたベクターに対する免疫を中和する存在が原因かもしれない。ブースト後の応答は、６匹のサルのすべてについての平均として１０ｅ６のＰＢＭＣあたり２７５ＳＦＣであり、１０ｅ６のＰＢＭＣあたり５００のｇａｇ特異的Ｔ細胞を上回ることはなかった。１０ｅ９  ｐｆｕ  ＭＶＡ  ＨＩＶ−１  ｇａｇを三回（０ヶ月目、１ヶ月目、６ヶ月目）にサルに与えた場合、１０ｅ６のＰＢＭＣあたり１００ＳＦＣを超えない程度の極めてわずかなＨＩＶ特異的Ｔ細胞の応答が現れた。対照的に、二回のプライム化投与量の１０ｅ９  ｖｐ  ＭＲＫＡｄ５  ＨＩＶ−１  ｇａｇと、１０ｅ９  ｐｆｕ  ＭＶＡ  ＨＩＶ−１  ｇａｇでのブーストの一回接種を動物に与えるという両者の様式を組み合わせると、３匹のサルのすべてについての平均として１０ｅ６のＰＢＭＣあたり１２００ＳＦＣを超える最高値の応答にまで、ｇａｇ特異的Ｔ細胞のレベルが上昇した。ＭＶＡ  ＨＩＶ−１  ｇａｇはどちらかと言えば弱い免疫原であること；同じＭＲＫＡｄ５  ＨＩＶ−１  ｇａｇによるブースト化と比較して極めて大きな利益も提供することを考えれば、ＭＲＫＡｄ５−ｇａｇでプライムされた免疫応答を、さらに効果的にブーストするというＭＶＡ  ＨＩＶ−１  ｇａｇの能力は極めて著しい。プライムされた応答をブーストするというポックスウイルスベクターの能力も、より少量のプライム化投与量の１０７  ｖｐ  ＭＲＫＡｄ５  ＨＩＶ−１  ｇａｇを用いることで明らかとなった（図６）。
【０１０２】
異種のＭＲＫＡｄ５でプライムされＭＶＡブーストする計画のワクチン接種を受けた個体からのＰＢＭＣｓを、プライム化免疫（１３週目）の後、およびブースト化免疫（３１週目）の後の細胞内ＩＦＮ−γ染色について分析した。このアッセイから、末梢血におけるＣＤ４＋ｇａｇ特異的Ｔ細胞およびＣＤ８＋ｇａｇ特異的Ｔ細胞の相対量に関する情報が提供された（表２）。この結果から、異種のプライム・ブースト免疫化のアプローチによって、アカゲザルのＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＨＩＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の両者を惹起できることが示された。
【０１０３】
【表２】
2006503800.tif 000003
【０１０４】
Ｃ．体液性免疫応答
それぞれの動物についてのいくつかの時点におけるｐ２４特異的抗体の力価を測定した。それぞれの一団の幾何平均力価を計算し、図１０に示した。ＭＲＫＡｄ５  ＨＩＶ−１  ｇａｇの二種の投与量によって、中程度のレベルの抗ｐ２４抗体（約１０００ｍＭＵ／ｍＬ）を誘導することができたのに対して、ＭＶＡの二種の投与量によって、検出可能なレベルの抗ｐ２４抗体を誘導することはできないようであった。ＭＶＡ  ＨＩＶ−１  ｇａｇの投与によって、ＭＲＫＡｄ５  ＨＩＶ−１  ｇａｇにてプライムされた体液性免疫応答の約６倍（約７０００ｍＭＵ／ｍＬまで）にまで高めた。このブースト効果は、１０＾９ｖｐの投与量のＭＲＫＡｄ５  ＨＩＶ−１  ｇａｇにより誘導される効果と類似している。しかしながら、これらの動物で見られる、１０＾９  ｖｐ  ＭＲＫＡｄ５  ＨＩＶ−１  ｇａｇによるブースト効果は、Ａｄ５に向けられたより高いレベルの中和活性を対象が持つ場合は（最初の二回のＭＲＫＡｄ５の投与量に対する既往反応のせいで）より小さいと予想される。他方、ＭＶＡ  ＨＩＶ−１  ｇａｇのブースト効果は、予め存在する、Ａｄ５に向けられた中和力価によっては影響を受けないであろう。
【実施例９】
【０１０５】
複製能力が高いワクシニアウイルスを用いる免疫化計画
次の免疫化計画のうちの一つのやり方で、ＢＡＬＢ／ｃマウスの筋肉内にワクチンを接種した：（１）一回のプライム化の投与量が５×１０ｅ８  ｖｐ  Ａｄ５−ｇａｇ（参照して本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ００／１８３３２号に開示されたアデノウイルスベクター）である；（２）一回のプライム化の投与量が５×１０ｅ８  ｖｐ  Ａｄ５−ｇａｇであって、次いで一回のブースト化投与量が５×１０ｅ６  ｐｆｕワクシニア−ｇａｇである；または（３）一回のプライム化の投与量が５×１０ｅ６  ｐｆｕワクシニア−ｇａｇである。完全な未処置の動物における応答のアッセイも行った。図７は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、明確なｇａｇ  ＣＤ８＋エピトープ（ＡＭＱＭＬＫＥＴＩ）に特異的なＴ細胞の、偽薬補正がなされた頻度を示す図である。この結果から、ワクシニア−ｇａｇの投与によって、Ａｄ５でプライムされた免疫応答（１００万あたり約３００）が、有意にブーストされたこと（１００万あたり約１４００まで）が示される。
【０１０６】
このウイルスの複製能力は高いため、（改変せずに）本発明の方法に用いることは適切ではないが、出願人らは、アデノウイルスでプライムされた応答を、どのようにしてポックスウイルスが極めて効果的にブーストするのかについての証明に、異なるポックスウイルス株によるこの例が役立つと考えている。
【０１０７】
本実施例におけるマウスは、一回のプライムしか施していなかったことを言及しておきたい。当業者であれば、このような小動物系には、より大型の非ヒトの霊長類と比較して、免疫化の回数はわずかしか必要でないこと、および／または免疫をプライムするための投与量はより少量しか必要でないこと、という一般的な観察に対して適切な考慮を払う必要があることを認識する。
【実施例１０】
【０１０８】
組み換えＡＬＶＡＣの構築と精製
コドンに最適化されたヒトＨＩＶ−１  ｇａｇオープンリーディングフレーム（配列番号１）を発現する組み換えＡＬＶＡＣ構築物を、技術的に十分に理解され、評価された基本的な手法に従って作製した；たとえば、米国特許第５，８６３，５４２号および第５，７６６，５９８号を参照すること。この手法は一般的に、対象のプロモーター（Ｈ６ワクシニアウイルス初期プロモーターなど）が機能するように、対象の遺伝子配列（ここでは配列番号１）がそのプロモーターと連結または結合した配置を、挿入が望まれるポックスウイルス内のＤＮＡ区画と相同なＤＮＡを含むプラスミド構築物内に配置することを包含する。既に記述したように、この部位には必須の遺伝子座が含まれるべきではない。この第一の（一回または複数回の）段階の後に、大腸菌内での増殖によって得られたプラスミド構築物を増幅させ、そして単離する。次いで、対象の挿入物を含む単離されたプラスミドを、対象のポックスウイルス（ここではＡＬＶＡＣ）と一緒に、細胞培養物、たとえばニワトリの胚線維芽細胞などの中にトランスフェクトする。次いで、組み換えウイルスを選択し、一連のプラーク精製によって精製する。
【実施例１１】
【０１０９】
血清型６のアデノウイルスのベクター構築物の作製
Ａ．Ａｄ６プレアデノウイルスプラスミドの構築
第一世代のＡｄ６ベクターを作製するために用いることができる、Ａｄ６に基づくプレアデノウイルスプラスミドを、Ａｄ５とＡｄ６との間の広範囲の配列の相同性（約９８％）を利用して構築した。相同組み換えを用いて、ｗｔＡｄ６配列を細菌のプラスミド内にクローン化した。
【０１１０】
ｐＡｄ６Ｅ１−Ｅ３＋を細菌プラスミドとして回収するために用いる一般的な計画を、図１１で説明する。ｗｔＡｄ６の精製ウイルスＤＮＡ（ＡＴＣＣ登録番号ＶＲ−６）と、Ａｄ５  ＩＴＲカセットと呼ばれる第二のＤＮＡ断片とによる細菌ＢＪ５１８３の同時形質転換によって、相同組み換えによるウイルスゲノムの環状化が達成された。ＩＴＲカセットは、細菌の複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミド配列によって切り離されたＡｄ５ゲノムの末端の右側（ｂｐ３３７９８から３５９３５）および左側（ｂｐ１から３４１およびｂｐ３５２５から５７６７）の配列を含んでいる。このＩＴＲカセットは、Ａｄ５の３４２から３５２４のＥ１配列が欠失している。ＩＴＲカセット内のＡｄ５配列によって、その中で組み換えが起こり得るＡｄ６の精製ウイルスＤＮＡとの相同性領域が提供される。
【０１１１】
可能性のあるクローンを制限分析によって選別し、そして一つのクローンをｐＡｄ６Ｅ１−Ｅ３＋として選択した。次いで、このクローン全体の配列を決定した。ｐＡｄ６Ｅ１−Ｅ３＋には、Ａｄ５配列のｂｐ１から３４１およびｂｐ３５２５から５５４８、Ａｄ６のｂｐ５５４２から３３７８４、およびＡｄ５のｂｐ３３９６７から３５９３５（ｂｐの数は、Ａｄ５およびＡｄ６についての野生型の配列を引用している）が含まれる。ｐＡｄ６Ｅ１−Ｅ３＋には、その血清型の特異性を構成するＡｄ６ビリオンのすべての構造タンパク質についてのコード配列が含まれる。
【０１１２】
Ｂ．ＨＩＶ−１  ｇａｇ遺伝子を含むＡｄ６プレアデノウイルスプラスミドの構築
（１）アデノウイルスシャトルベクターの構築：
コドンに最適化された全長ＨＩＶ−１  ｇａｇ合成遺伝子を、ＭＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ４５０）＋ＣＭＶｍｉｎ＋ＢＧＨｐＡ（ｓｔｒ．）の中に挿入することによって、シャトルプラスミドＭＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ４５０）＋ＣＭＶｍｉｎＦＬ−ｇａｇ−ｂＧＨｐＡを構築した。ＭＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／Ｐａｃｋ４５０）＋ＣＭＶｍｉｎ＋ＢＧＨｐＡ（ｓｔｒ．）には、Ｅ１配列のｂｐ４５１から３５１０が欠失したＡｄ５配列のｂｐ１から５７９２が含まれている。ＨＣＭＶプロモーターおよびＢＧＨ  ｐＡをＥ１の欠失部の中に、Ｅ１と平行方向にて、唯一のＢｇｌＩＩ部位が両者を引き離すように挿入した。プラスミドｐＶ１Ｊｎｓ−ＨＩＶ−ＦＬｇａｇ−ｏｐｔのＢｇｌＩＩ消化、ゲルでの精製、およびＭＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ４５０）＋ＣＭＶｍｉｎ＋ＢＧＨｐＡ（ｓｔｒ．）中のＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位内への連結から、コドンに最適化された全長ＨＩＶ−１  ｇａｇ合成遺伝子を得、プラスミドＭＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ４５０）＋ＣＭＶｍｉｎＦＬ−ｇａｇ−ＢＧＨｐＡを作製した。ＭＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ４５０）＋ＣＭＶｍｉｎＦＬ−ｇａｇ−ＢＧＨｐＡの遺伝子構造をＰＣＲ分析、制限酵素分析およびＤＮＡ配列分析によって確認した。
【０１１３】
（２）プレアデノウイルスプラスミドの構築：
シャトルプラスミドＭＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ４５０）＋ＣＭＶｍｉｎＦＬ−ｇａｇ−ＢＧＨｐＡを、制限酵素Ｐａｃ１およびＢｓｔ１１０７Ｉで消化し、次いで、直線化された（ＣｌａＩで消化された）アデノウイルスバックボーンプラスミドであるｐＡｄ６Ｅ１−Ｅ３＋と共に、大腸菌のＢＪ５１８３株内に同時形質転換した。得られたｐＭＲＫＡｄ６ｇａｇの遺伝子構造を、制限酵素分析およびＤＮＡ配列分析によって確認した。大規模に生産するために、このベクターをコンピテントな大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ内に形質転換した。回収されたプラスミドを、制限酵素消化分析とＤＮＡ配列分析によって、および一時的なトランスフェクション細胞の培養でのｇａｇトランスジーンの発現によって確認した。
【０１１４】
ｐＭＲＫＡｄ６ｇａｇには、Ａｄ５のｂｐ１から４５０とｂｐ３５１１から５５４８、Ａｄ６のｂｐ５５４２から３３７８４、およびＡｄ５のｂｐ３３９６７から３５９３５（ｂｐの数は、Ａｄ５およびＡｄ６についての野生型の配列を引用している）が含まれる。プラスミドにおいて、ウイルスのＩＴＲｓは細菌の複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミド配列によって結合している。
【０１１５】
Ｃ．リサーチグレードの組み換えＭＲＫＡｄ６ｇａｇの作製
前臨床的な免疫原性を研究するためのウイルスを作製するために、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）の粘着性単層細胞培養の際に、プレアデノウイルスプラスミドｐＭＲＫＡｄ６ｇａｇを感染性ビリオンとしてレスキューした。感染性ウイルスをレスキューするために、１０μｇのｐＭＲＫＡｄ６ｇａｇを制限酵素ＰａｃＩ（ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）社）で消化し、そしてリン酸カルシウム共沈法（Ｃｅｌｌ  Ｐｈｅｃｔトランスフェクションキット、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社）を利用して、６ｃｍの皿の中のＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内にトランスフェクトした。ＰａｃＩ消化によってプラスミド配列からウイルスのゲノムが開放され、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞の中に入った後に、ウイルスの複製が可能になる。完全ウイルスによる細胞障害性効果（ＣＰＥ）が観察された後で、感染細胞および培地を回収した。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞を複数回継代することによって、ウイルスのストックを増幅させた。最後の継代では、ＣｓＣｌ超遠心分離法によって、細胞ペレットからウイルスを精製した。精製ウイルスＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ分析と、インビトロで培養した、ウイルス感染哺乳動物細胞に由来する培養上清のｇａｇのＥＬＩＳＡによって、精製ウイルスの特定と純度を確認した。制限分析のために、消化されたウイルスＤＮＡの末端をＰ３３−ｄＡＴＰで標識化し、アガロースゲル電気泳動によってサイズ分画し、そしてオートラジオグラフィーによって可視化した。
【０１１６】
Ｇａｇの発現に関しては、ウエスタンブロット分析によってすべてのウイルス構築物を確認した。
【実施例１２】
【０１１７】
免疫化
アカゲザルの体重を３から１０ｋｇの間とした。すべてのケースにおいて、それぞれのワクチンを１ｍＬの緩衝液中に懸濁させて合計の投与量とした。アカゲザルを（ケタミン／キシラジンで）麻酔して、ワクチンを筋肉内に（「ｉ．ｍ．」）、すなわちツベルクリン用のシリンジ（ベクトン−ディッキンソン社、フランクリンレイクス、ニュージャージー州）を用いて、０．５ｍＬのアリコートを両方の三角筋内に投与した。免疫化計画の期間中のいくつかの時点（通常は四週間ごと）で集めた血液サンプルから末梢血単球（ＰＢＭＣ）を調製した。米国学術研究会議の研究用動物資源協会の、実験動物の世話と使用についてのガイド内に記載された原則に従って、研究機関の動物管理使用委員会に承認された基準に基づいて、すべての動物の世話と処置を行った。
【実施例１３】
【０１１８】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
既に記述されたプロトコール（アレンら、２００１  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２）：７３８−７４９；カシミロ（Ｃａｓｉｍｉｒｏ）ら、２００２  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１８５−９４）に従い、いくつかの変更を加えて、アカゲザルについてのＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。抗原特異的な刺激のために、１０−アミノ酸（「ａａ」）オーバーラップを伴った、ＨＩＶ−１  ｇａｇ配列の全体（シンペップ社、ダブリン、カリフォルニア州）を包含する２０−ａａのペプチドから、ペプチドのプールを調製した。それぞれのウェルに、５０μＬの２−４×１０５の末梢血単球（ＰＢＭＣｓ）を添加した。８０フェムトリットル（「ｆＬ」）より小さいサイズを切り捨てるように設定したＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｚ２粒子アナライザーを用いて、細胞を計数した。５０μＬの培地、またはペプチドあたり８μｇ／ｍＬの濃度のｇａｇペプチドプールのいずれかを、ＰＢＭＣに添加した。このサンプルのインキュベーションを３７℃、５％のＣＯ２にて２０から２４時間行った。それに応じて、スポットを展開し、そして顕微鏡下で計数した。細胞の投入量を１０６として計測値を正規化した。
【実施例１４】
【０１１９】
細胞内サイトカインの染色
抗−ｈＣＤ２８モノクローナル抗体（クローンＬ２９３、ベクトン−ディッキンソン社）および抗ｈＣＤ４９ｄモノクローナル抗体（クローンＬ２５、ベクトン−ディッキンソン社）を、最終濃度が１μｇ／ｍＬとなるように、（１７×１００ｍｍの丸底のポリプロピレン製試験管（ザルスタット社、ニュートン、ノースカロライナ州）の中にある）２×１０６ＰＢＭＣ／ｍＬの完全ＲＰＭＩ培地の１ｍＬに添加した。ｇａｇ特異的な刺激のために、１０μＬのペプチドプール（ペプチドにつき０．４ｍｇ／ｍＬ）を添加した。この試験管のインキュベーションを３７℃で１時間行った。その後、２０μＬの５ｍｇ／ｍＬのブレフェルジンＡ（シグマ社）を添加した。細胞のインキュベーションを３７℃で１６時間、５％のＣＯ２、９０％の湿度にて行った。４ｍＬの冷ＰＢＳ／２％のＦＢＳをそれぞれの試験管に添加し、そして細胞を１２００ｒｐｍにて１０分間でペレット化した。細胞をＰＢＳ／２％のＦＢＳ中に再懸濁させ、そしていくつかの蛍光性のタグが付けられたｍＡｂｓを用いて表面マーカーのために染色した（３０分間、４℃）：試験管あたり２０μＬの抗ｈＣＤ３−ＡＰＣ・クローンＦＮ−１８（バイオソース社）；２０μＬの抗ｈＣＤ８−ＰｅｒＣＰ・クローンＳＫ１（ベクトン−ディッキンソン社）；および２０μＬの抗ｈＣＤ４−ＰＥ・クローンＳＫ３（ベクトン−ディッキンソン社）。この段階から、暗所でサンプルを扱った。細胞を洗浄し、そして７５０μＬの１×ＦＡＣＳ  Ｐｅｒｍ緩衝液（ベクトン−ディッキンソン社）中で１０分間、室温にてインキュベーションを行った。細胞をペレット化し、そしてＰＢＳ／２％のＦＢＳ中に再懸濁させ、そして０．１μｇのＦＩＴＣ−抗ｈＩＦＮ−γ・クローンＭＤ−１（バイオソース社）を添加した。３０分間のインキュベーションの後、細胞を洗浄してＰＢＳ中に再懸濁させた。ベクトン−ディッキンソン社のＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ装置の四色のチャネルのすべてを用いて、サンプルを分析した。データを解析するために、最初に、リンパ球の集団を底部の側方散乱光および前方散乱光のゲートで制御し、そしてサイトカインに陽性な事象について遮断される共通する蛍光を、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両集団のために、ならびにサンプルの試験管の偽薬およびｇａｇ−ペプチドの両者のために使用した。
【実施例１５】
【０１２０】
結果
Ａ．免疫化計画
０週目、４週目、２６週目に、４匹のアカゲザルの一団に、ＭＲＫＡｄ５−ＨＩＶｇａｇまたはＭＲＫＡｄ６−ＨＩＶｇａｇのいずれかを三（３）種の投与量にて与えた。五十六（５６）週目に、１０＾８  ｐｆｕのＡＬＶＡＣ−ＨＩＶｇａｇの一回量のブースターを筋肉内に与えた。比較のために、０週目、４週目、２７週目に、三（３）匹のサルの別の一団に、同じＡＬＶＡＣ−ＨＩＶｇａｇ（１０＾９ｐｆｕ）を三（３）種の投与量にて与えた。すべてのウイルスベクターは、同じコドンに最適化されたＨＩＶ−１  ｇａｇを発現した。免疫化のスケジュールを表３に記載する。
【０１２１】
【表３】
2006503800.tif 000004
【０１２２】
Ｂ．Ｔ細胞免疫応答
ワクチンで誘導されるＨＩＶ−１  ｇａｇに対するＴ細胞の応答を、タンパク質配列の全体を包含する２０−ａａのペプチドプールに対するＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを利用して定量した。結果を図１２に示す。１００万の末梢血単球（ＰＢＭＣｓ）あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数として表されており、ペプチドプールから偽薬の対照を差し引いたものに対応する。
【０１２３】
図１２は、１０＾７から１０＾９ｖｐの投与量のＭＲＫＡｄ５−ＨＩＶｇａｇまたはＭＲＫＡｄ６−  ＨＩＶｇａｇによって、ｇａｇ特異的Ｔ細胞の応答が６００ＳＦＣ／１０＾ＰＢＭＣを超えないレベルに誘導されたことを示す図である。アデノウイルスに基づくワクチンを二回投与した後の、四匹の動物のうちの三匹のレベルは３００ＳＦＣ／１０＾６ＰＢＭＣを下回っていた。最後のアデノウイルスの投与から約半年の時点でＡＬＶＡＣブーストして免疫化すると、抗原特異的な応答が、これらの動物における検出可能な範囲である１０から１１４ＳＦＣ／１０＾６ＰＢＭＣを維持した。しかしながら、ＡＬＶＡＣを投与した結果、ブーストを行った時点のレベルと比較して、Ｔ細胞の応答が約１０から８０倍高くなった。ＡＬＶＡＣは本来、どちらかと言えば、アカゲザルにおける初代Ｔ細胞の免疫応答を誘導することに関して弱いワクチンベクターであることを考えれば、これらの結果は非常に驚くべきものである。ＡＬＶＡＣ−ＨＩＶｇａｇによる複数回の免疫化が行われた、さらに投与レベルが高い（１０＾９ｐｆｕ）三匹のサルは、抗原に対して（１００ＳＦＣ／１０＾６ＰＢＭＣを下回る）極めて弱い応答を示した（図１２）。
【０１２４】
同じアデノウイルスで、等価の投与レベル（たとえば最初の三回に与えられたもの）による四回目の免疫化によってこれらの大きな応答が惹起される可能性はない、と考えられている。というのは、最初の三回の投与によって、潜在的に効果が大きく、予め存在する抗アデノウイルス免疫が生じるからである。さらにここで留意すべきことは、これらのサルにおいて三回目のアデノウイルスの投与によって生じたレベルは、その後のＡＬＶＡＣのブーストで見られるレベルとは比較にならないということである。これらの結果から、ＡＬＶＡＣに基づくベクターは、初回の免疫応答には弱い誘導因子であるものの、かかるベクターはＨＩＶ抗原に対して既に存在している免疫応答の優れたブースターとして役立つことが明示される。ＭＲＫＡｄに基づくベクターとＡＬＶＡＣとの間には相乗効果が存在することも、それは示している。
【０１２５】
異種のＭＲＫＡｄ５／ＭＲＫＡｄ６−ＡＬＶＡＣブースト計画のワクチン接種を受けた個体からのＰＢＭＣｓを分析した。ここでは、ブースト化（６０週目）後の細胞内ＩＦＮ−γ染色について分析した。このアッセイの結果から、末梢血におけるＣＤ４＋ｇａｇ特異的Ｔ細胞およびＣＤ８＋ｇａｇ特異的Ｔ細胞の相対量に関する情報が提供された（表４）。この結果から、異種のプライム・ブースト免疫化のアプローチによって、アカゲザルのＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＨＩＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の両者を惹起できることが示された。
【０１２６】
【表４】
2006503800.tif 000005
【実施例１６】
【０１２７】
免疫化と結果
Ａ．免疫化
アカゲザルの体重を３から１０ｋｇの間とした。すべてのケースにおいて、それぞれのワクチンを１ｍＬの緩衝液中に懸濁させて合計の投与量とした。アカゲザルを（ケタミン／キシラジンで）麻酔して、ワクチンをｉ．ｍ．にて、すなわちツベルクリン用のシリンジ（ベクトン−ディッキンソン社、フランクリンレイクス、ニュージャージー州）を用いて、０．５ｍＬのアリコートを両方の三角筋内に投与した。免疫化計画の期間中のいくつかの時点で集めた血液サンプルから末梢血単球（ＰＢＭＣ）を調製した。米国学術研究会議の研究用動物資源協会の、実験動物の世話と使用についてのガイド内に記載された原則に従って、研究機関の動物管理使用委員会に承認された基準に基づいて、すべての動物の世話と処置を行った。
【０１２８】
Ｂ．ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
既に記述されたプロトコール（アレンら、２００１  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２）：７３８−７４９）に従い、いくつかの変更を加えて、アカゲザルについてのＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。抗原特異的な刺激のために、１０−ａａのオーバーラップを伴った、ＨＩＶ−１  ｇａｇ配列の全体（シンペップ社、ダブリン、カリフォルニア州）を包含する２０−ａａのペプチドから、ペプチドのプールを調製した。それぞれのウェルに、５０μＬの２〜４×１０５の末梢血単球（ＰＢＭＣｓ）を添加した；８０ｆＬより小さいサイズを切り捨てるように設定したＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｚ２粒子アナライザーを用いて、細胞を計数した。５０μＬの培地、またはペプチドあたり８μｇ／ｍＬの濃度のｇａｇペプチドプールのいずれかを、ＰＢＭＣに添加した。このサンプルのインキュベーションを３７℃、５％のＣＯ２にて２０から２４時間行った。それに応じて、スポットを展開し、そして特別注文のイメージング装置と、イメージプロ（シルバースプリング、メリーランド州）のプラットフォームに基づいた自動計数サブルーチンを用いてプレートを処理した；細胞の投入量を１０６として計測値を正規化した。
【０１２９】
Ｃ．細胞内サイトカインの染色
抗−ｈＣＤ２８モノクローナル抗体（クローンＬ２９３、ベクトン−ディッキンソン社）および抗ｈＣＤ４９ｄモノクローナル抗体（クローンＬ２５、ベクトン−ディッキンソン社）を、最終濃度が１μｇ／ｍＬとなるように、（１７×１００ｍｍの丸底のポリプロピレン製試験管（ザルスタット社、ニュートン、ノースカロライナ州）の中にある）２×１０６ＰＢＭＣ／ｍＬの完全ＲＰＭＩ培地の１ｍＬに添加した。ｇａｇ特異的な刺激のために、１０μＬのペプチドプール（ペプチドにつき０．４ｍｇ／ｍＬ）を添加した。この試験管のインキュベーションを３７℃で１時間行った。その後、２０μＬの５ｍｇ／ｍＬのブレフェルジンＡ（シグマ社）を添加した。細胞のインキュベーションを３７℃で１６時間、５％のＣＯ２、９０％の湿度にて行った。４ｍＬの冷ＰＢＳ／２％のＦＢＳをそれぞれの試験管に添加し、そして細胞を１２００ｒｐｍにて１０分間でペレット化した。細胞をＰＢＳ／２％のＦＢＳ中に再懸濁させ、そしていくつかの蛍光性のタグが付けられたｍＡｂｓを用いて表面マーカーのために染色した（３０分間、４℃）：試験管あたり２０μＬの抗ｈＣＤ３−ＡＰＣ・クローンＦＮ−１８（バイオソース社）；２０μＬの抗ｈＣＤ８−ＰｅｒＣＰ・クローンＳＫ１（ベクトン−ディッキンソン社）；および２０μＬの抗ｈＣＤ４−ＰＥ・クローンＳＫ３（ベクトン−ディッキンソン社）。この段階から、暗所でサンプルを扱った。細胞を洗浄し、そして７５０μＬの１×ＦＡＣＳ  Ｐｅｒｍ緩衝液（ベクトン−ディッキンソン社）中で１０分間、室温にてインキュベーションを行った。細胞をペレット化し、そしてＰＢＳ／２％のＦＢＳ中に再懸濁させ、そして０．１μｇのＦＩＴＣ−抗ｈＩＦＮ−γ・クローンＭＤ−１（バイオソース社）を添加した。３０分間のインキュベーションの後、細胞を洗浄してＰＢＳ中に再懸濁させた。ベクトン−ディッキンソン社のＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ装置の四色のチャネルのすべてを用いて、サンプルを分析した。データを解析するために、最初に、リンパ球の集団を底部の側方散乱光および前方散乱光のゲートで制御した；サイトカインに陽性な事象について遮断される共通する蛍光を、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両集団のために、ならびにサンプルの試験管の偽薬およびｇａｇ−ペプチドの両者のために使用した。
【０１３０】
Ｄ．結果
４匹のサルの一団に、次のブースト用ワクチンの一つを０週目に与えた：（Ａ）ＡＬＶＡＣ  ｖｃｐ２０５、１０＾８ｐｆｕ；（Ｂ）ＡＬＶＡＣ  ｖｃｐ２０５、１０＾７ｐｆｕ；（Ｃ）ＡＬＶＡＣ  ＨＩＶ−１  ｇａｇ、１０＾８ｐｆｕ；（Ｄ）ＡＬＶＡＣ  ＨＩＶ−１  ｇａｇ、１０＾７ｐｆｕ、または（Ｅ）ＭＲＫＡｄ５  ＨＩＶ−１  ｇａｇ、１０＾９ｖｐ。ＡＬＶＡＣ  ｖｃｐ２０５は、ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢ  ｇａｇについての遺伝子をコードしている。ＡＬＶＡＣ  ＨＩＶ−１  ｇａｇは、コドンに最適化されたＨＩＶ−１  ＣＡＭ−１  ｇａｇをコードしている。この免疫化を行う前に、動物には予め、少なくとも１０＾９  ｖｐ  Ａｄ５  ＨＩＶ−１  ｇａｇの投与量を３回与えておいた。Ａｄ５  ＨＩＶ−１  ｇａｇの最後の投与は１年以上前であった。０週目の時点のほんの少し前に、Ａｄ５ベクターに対する中和力価を、すべての動物について測定した。ワクチンで誘導されるＨＩＶ−１  ｇａｇに対するＴ細胞の応答を、タンパク質配列の全体を包含する２０−ａａのペプチドプールに対するＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを利用して定量した。結果を表６に示す；１００万の末梢血単球（ＰＢＭＣｓ）あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数として表されており、ペプチドプールから偽薬の対照を差し引いたものに対応する。
【０１３１】
【表５】
2006503800.tif 000006
表５から、ＭＲＫＡｄ５−ｇａｇまたはＡＬＶＡＣベクターによる同種のブーストを用いて誘導されるＴ細胞の応答が示される。ＥＬＩＳＰＯＴの結果に基づくと、ＡＬＶＡＣによる、特にＡＬＶＡＣ  ＨＩＶ−１  ｇａｇによるブースト化によって、ＭＲＫＡｄ５−ｇａｇよりも強力なブースト応答が生じるようである。
【０１３２】
ワクチン接種を受けた個体からのＰＢＭＣｓを分析した。ここでは、ブースト化免疫から２週間後の細胞内ＩＦＮ−γ染色について分析した。このアッセイから、末梢血におけるＣＤ４＋ｇａｇ特異的Ｔ細胞およびＣＤ８＋ｇａｇ特異的Ｔ細胞の相対量に関する情報が提供された（表６）。この結果から、異種のプライム・ブースト免疫化のアプローチによって、アカゲザルのＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＨＩＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の両者を惹起できることが示された。ＡＬＶＡＣによるブーストによって、ＭＲＫＡｄ５ｇａｇによるものと同程度のｇａｇ特異的なＣＤ８＋  Ｔ細胞が誘導されることも示される。しかしながら、ＡＬＶＡＣによるブーストによって、ＭＲＫＡｄ５−ｇａｇよりも高レベルのヘルパー応答が誘導されてしまう。このアッセイによって測定されるような、誘導された抗原特異的ＣＤ３＋  Ｔ細胞の総量に基づいて、ＡＬＶＡＣ  ＨＩＶ−１  ｇａｇのブーストによって、ＭＲＫＡｄ５−ｇａｇのブーストよりも統計的に有意な６倍の向上（Ｐ＝０．００４）が示される。
【０１３３】
【表６】
2006503800.tif 000007
【実施例１７】
【０１３４】
免疫化計画
次の同種と異種のプライム・ブースト免疫化のスケジュール（表７）に基づいて、３から６匹のアカゲザルの一団を免疫する。ここで、このスケジュールは、コドンに最適化されたＨＩＶ−１  ｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆをそれぞれ発現するＡＤ５−ｇａｇベクター、−ｐｏｌベクター、および−ｎｅｆベクター、ならびに、一つのウイルス中の、別個のプロモーターの制御下にある三遺伝子のすべてを発現するＡＬＶＡＣ−ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆに関するものである。それぞれのワクチンを１ｍＬの緩衝液中に懸濁させて合計の投与量とする。アカゲザルを（ケタミン／キシラジンで）麻酔して、ワクチンを筋肉内に（「ｉ．ｍ．」）、すなわちツベルクリン用のシリンジ（ベクトン−ディッキンソン社、フランクリンレイクス、ニュージャージー州）を用いて、０．５ｍＬのアリコートを両方の三角筋内に投与する。免疫化計画の期間中のいくつかの時点で集めた血液サンプルから末梢血単球（ＰＢＭＣ）を調製する。米国学術研究会議の研究用動物資源協会の、実験動物の世話と使用についてのガイド内に記載された原則に従って、研究機関の動物管理使用委員会に承認された基準に基づいて、すべての動物の世話と処置を行う。
【０１３５】
【表７】
2006503800.tif 000008
【実施例１８】
【０１３６】
ＳＩＶのチャレンジ実験
次の異種プライム・ブースト免疫化のスケジュール（表８）に基づいて、３から６匹のサルの一団を免疫化する。ここで、このスケジュールは、コドンに最適化されたＳＩＶ  ｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆをそれぞれ発現するＡｄ５−ＳＩＶ−ｇａｇベクター、−ｐｏｌベクター、および−ｎｅｆベクター、ならびに、一つのウイルス中の、別個のプロモーターの制御下にある三遺伝子のすべてを発現するＡＬＶＡＣ−ＳＩＶ  ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆに関するものである。ｍａｍｕＡ０１対立遺伝子の存在について、動物を予め選別し、そして分配しておく。それぞれのワクチンを１ｍＬの緩衝液中に懸濁させて合計の投与量とする。アカゲザルを（ケタミン／キシラジンで）麻酔して、ワクチンを筋肉内に（「ｉ．ｍ．」）、すなわちツベルクリン用のシリンジ（ベクトン−ディッキンソン社、フランクリンレイクス、ニュージャージー州）を用いて、０．５ｍＬのアリコートを両方の三角筋内に投与する。免疫化計画の期間中のいくつかの時点で集めた血液サンプルから末梢血単球（ＰＢＭＣ）を調製し、ＳＩＶ特異的Ｔ細胞の応答をモニターする。ＡＬＶＡＣによるブースターの後、動物にＳＩＶｍａｃ２３９株を全身的に接種する。ウイルス学的（すなわちウイルス負荷）および免疫パラメータ（たとえばウイルス特異的Ｔ細胞の応答、ＣＤ４の数、およびリンパ組織の構造）の両方について、動物をモニターする。米国学術研究会議の研究用動物資源協会の、実験動物の世話と使用についてのガイド内に記載された原則に従って、研究機関の動物管理使用委員会に承認された基準に基づいて、すべての動物の世話と処置を行う。
【０１３７】
【表８】
2006503800.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】ＨＩＶ−１  ｇａｇアデノベクター「ＡＤ５ＨＩＶ−１ｇａｇ」を示す図である。このベクターは、１９９９年７月６日に出願された米国仮出願第６０／１４２，６３１号、および１９９９年８月１３日に出願された米国出願第６０／１４８，９８１号についての優先権が主張された、２０００年７月３日に出願されたＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ００／１８３３２号（ＷＯ０１／０２６０７号）に開示されており、三件の出願のすべては参照して本明細書に組み込まれる。
【図２】最適化されたヒトのＨＩＶ−１  ｇａｇのオープンリーディングフレームの核酸配列（配列番号１）を示す図である。
【図３】２００１年９月１４日に出願されたＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／２８８６１号に開示されたトランスジーン構築物の概略を、最初のｇａｇトランスジーンと比較して示す図である。ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／２８８６１号は、それぞれ２０００年９月１５日、２００１年３月２７日、および２００１年９月７日に出願された米国仮出願第６０／２３３，１８０号、第６０／２７９，０５６号、および第６０／３１７，８１４号についての優先権を主張している；上記の出願のすべては参照して本明細書に組み込まれる。
【図４】ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／２８８６１号に開示されたベクターを作製する際のＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇのアデノベクターバックボーンになされた改変を示す図であり、かかるベクターは本発明の特定の例において利用される。
【図５】（ａ）１０ｅ９  ｖｐのＭＲＫＡｄ５  ＨＩＶ−１  ｇａｇによる二回のプライム化投与と、１０ｅ９  ｖｐ  ＭＲＫＡｄ５  ＨＩＶ−１  ｇａｇによる一回のブースト化（「１０ｅ９  ｖｐ  ＭＲＫＡｄ５−１０ｅ９  ｖｐ  ＭＲＫＡｄ５」）；（ｂ）１０ｅ９  ｐｆｕ  ＭＶＡ  ＨＩＶ−１  ｇａｇによる二回のプライム化投与と、１０ｅ９  ｐｆｕ  ＭＶＡ  ＨＩＶ−１  ｇａｇによる一回のブースト化（「１０ｅ９  ｐｆｕ  ＭＶＡ−１０ｅ９  ｐｆｕ  ＭＶＡ」）；または（ｃ）１０ｅ９  ｖｐ  のＭＲＫＡｄ５  ＨＩＶ−１  ｇａｇによる二回のプライム化投与と、それに続く１０ｅ９  ｐｆｕ  ＭＶＡ  ＨＩＶ−１  ｇａｇによる一回のブースト化（「１０ｅ９  ｖｐ  ＭＲＫＡｄ５−１０ｅ９  ｐｆｕ  ＭＶＡ」）で免疫化されたアカゲザルにおけるＧａｇ特異的Ｔ細胞のレベルを示す図である。１００万ＰＢＭＣあたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数として表されるレベルは、免疫化計画の開始前（「処置前」）；最初のプライム化投与から４週間後（「投与量１後」）；第二のプライム化投与から４週間後（「投与量２後」）；ブーストの直前（「ブースト前」）；ブーストから４週間後（「ブースト後４週目」）；およびブーストから８週間後（「ブースト後８週目」）のそれぞれの動物について、偽薬補正がなされた値である。＃９９Ｄ２４１について、ブースト後４週目のデータは入手できなかった（ＮＡ）。というのはＰＢＭＣの採取量が少なかったからである。
【図６】１０ｅ７  ｖｐの投与量のＭＲＫＡｄ５  ＨＩＶ−１  ｇａｇ（０週目；４週目）での二回のプライム化投与、次いで２７週目での１０ｅ７  ｖｐ  ＭＶＡ  ＨＩＶ−１  ｇａｇの投与によって誘導されるＧａｇ特異的Ｔ細胞の応答を示す図である。提供されたレベルは、免疫化計画の開始前（「処置前」）；最初のプライム化投与から４週間後（「投与量１後」）；第二のプライム化投与から４週間後（「投与量２後」）；ブーストの直前（「ブースト前」）；ブーストから４週間後（「ブースト後４週目」）；およびブーストから８週間後（「ブースト後８週目」）の、それぞれの動物について、偽薬補正がなされたレベルである。ブースト直前のレベルと比較して有意に上昇していることに留意すべきである。ＭＶＡ−ＨＩＶｇａｇは、プライム化応答の大幅な増幅を惹起し、１０００ＳＦＣ／１０ｅ６ＰＢＭＣという高いレベルにまで達した。ブースト化のために用いるＭＶＡの投与量では、未処置の動物においてはわずかなまたは検出できない程度の免疫応答しか誘導しない（図５を参照すること）ので、示されたようなブースト後の増加の大部分は、あらたなリンパ球のプライムによるものではなく、記憶Ｔ細胞の増殖によるものと考えられる。
【図７】（１）一回の投与量が５×１０ｅ８  ｖｐのＡｄ５  ＨＩＶ−１  ｇａｇ（「Ａｄ５のプライム−ブーストはなし」）、（２）一回の投与量が５×１０ｅ８  ｖｐのＡｄ５  ＨＩＶ−１  ｇａｇであって、次いで一回のブースト化投与量が５×１０ｅ６ｐｆｕのワクシニア−ｇａｇ（「Ａｄ５のプライム−ワクシニアのブースト」）、または（３）一回の投与量が５×１０ｅ６ｐｆｕのワクシニア−ｇａｇ（「ワクシニアのプライム−ブーストはなし」）で免疫化されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＥＬＩＳＰＯＴ応答を示す図である；Ａｄ５−ｇａｇは本明細書を通して検討された当初のｇａｇベクターである。完全に未処置の動物における応答のアッセイも行った。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、明確なｇａｇ  ＣＤ８＋エピトープ（ＡＭＱＭＬＫＥＴＩ）に特異的なＴ細胞の、偽薬補正がなされた頻度が示されている。Ａｄ５でプライムされた免疫応答（１００万あたり約３００）が、ワクシニア−ｇａｇの投与によって有意にブーストされた（１００万あたり約１４００まで）。
【図８】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターの制限酵素地図を示す図である。
【図９Ａ−１】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−２】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−３】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−４】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−５】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−６】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−７】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−８】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−９】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−１０】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−１１】、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−１２】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−１３】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−１４】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−１５】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−１６】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−１７】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−１８】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−１９】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−２０】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−２１】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−２２】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−２３】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−２４】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−２５】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−２６】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−２７】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−２８】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−２９】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−３０】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−３１】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−３２】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−３３】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−３４】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−３５】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−３６】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−３７】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−３８】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−３９】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−４０】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−４１】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−４２】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−４３】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−４４】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図９Ａ−４５】ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列を図示する図である（配列番号２［コード］および配列番号３［非コード］）。
【図１０】（ａ）１０ｅ９  ｖｐのＭＲＫＡｄ５  ＨＩＶ−１  ｇａｇによる二回のプライム化投与と、１０ｅ９  ｖｐ  ＭＲＫＡｄ５  ＨＩＶ−１  ｇａｇによる一回のブースト化（「１０ｅ９  ｖｐ  ＭＲＫＡｄ５−１０ｅ９  ｖｐ  ＭＲＫＡｄ５」）、（ｂ）１０ｅ９  ｐｆｕ  ＭＶＡ  ＨＩＶ−１  ｇａｇによる二回のプライム化投与と、１０ｅ９  ｐｆｕ  ＭＶＡ  ＨＩＶ−１  ｇａｇによる一回のブースト化（「１０ｅ９  ｐｆｕ  ＭＶＡ−１０ｅ９  ｐｆｕ  ＭＶＡ」）、または（ｃ）１０ｅ９  ｖｐのＭＲＫＡｄ５  ＨＩＶ−１  ｇａｇによる二回のプライム化投与と、それに続く１０ｅ９  ｐｆｕ  ＭＶＡ  ＨＩＶ−１  ｇａｇによる一回のブースト化（「１０ｅ９  ｖｐ  ＭＲＫＡｄ５−１０ｅ９  ｐｆｕ  ＭＶＡ」）で免疫化されたアカゲザルにおけるＧａｇ特異的Ｔ細胞のレベルを示す図である。免疫化計画の開始時（「処置前」）、最初のプライム化投与から４週間後（「４週目」）、第二のプライム化投与から４週間後（「８週目」）、ブーストの直前（「ブースト前」）、およびブーストから８週間後（「ブースト後」）のそれぞれの一団について、幾何平均力価で示されている。
【図１１】本明細書で開示されたｐＡｄ６Ｅｌ−Ｅ３＋を回収するために利用される相同組み換えのプロトコールを示す図である。
【図１２】ＭＲＫＡｄ５−ＨＩＶｇａｇまたはＭＲＫＡｄ６−ＨＩＶｇａｇのいずれかで三回投与し、次いで１０＾８  ｐｆｕのＡＬＶＡＣ−ＨＩＶｇａｇで一回ブーストを行って免疫化したアカゲザルにおけるＧａｇ特異的Ｔ細胞のレベルを示す図である（表４を参照すること）。１０＾９  ｐｆｕ  ＡＬＶＡＣ−  ＨＩＶｇａｇを三回投与されたアカゲザルにおける応答も示されている。示されているレベルは、免疫化計画の開始前（「処置前」）、第二のプライム化投与から４〜８週間後（「投与量２後」）第三のワクチン投与から８週間後（「投与量３後」）、ブーストの直前（「ブースト前」）、ブーストから４週間後（「ブースト後４週目」）のそれぞれの動物について、偽薬補正がなされたレベルで値である。１２７Ｆ、５７Ｔ、および８４ＴＸの対象については、第三のＡＬＶＡＣ投与後にワクチンは与えなかった（ＮＡ−利用できない）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ−１】
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【図９Ａ−２】
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【図９Ａ−３】
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【図９Ａ−４】
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【図９Ａ−５】
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【図９Ａ−６】
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【図９Ａ−７】
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【図９Ａ−８】
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【図９Ａ−９】
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【図９Ａ−１０】
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【図９Ａ−１１】
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【図９Ａ−１２】
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【図９Ａ−１３】
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【図９Ａ−１４】
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【図９Ａ−１５】
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【図９Ａ−１６】
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【図９Ａ−１７】
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【図９Ａ−１８】
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【図９Ａ−１９】
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【図９Ａ−２０】
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【図９Ａ−２１】
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【図９Ａ−２２】
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【図９Ａ−２３】
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【図９Ａ−２４】
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【図９Ａ−２５】
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【図９Ａ−２６】
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【図９Ａ−２７】
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【図９Ａ−２８】
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【図９Ａ−２９】
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【図９Ａ−３０】
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【図９Ａ−３１】
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【図９Ａ−３２】
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【図９Ａ−３３】
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【図９Ａ−３４】
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【図９Ａ−３５】
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【図９Ａ−３６】
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【図９Ａ−３７】
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【図９Ａ−３８】
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【図９Ａ−３９】
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【図９Ａ−４０】
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【図９Ａ−４１】
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【図９Ａ−４２】
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【図９Ａ−４３】
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【図９Ａ−４４】
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【図９Ａ−４５】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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