(57)【要約】本発明は、核酸サンプル（例えば、血液、精液、唾液、細胞、…）中の多型性の検出するための方法および装置に関する。既知の方法（例えば、ＤＧＧＥ、ＳＳＣＰおよびＴＧＧＥ）の効率および信頼性を促進するため、実際の検出前の増幅工程（例えば、ＰＣＲ）をポリアクリルアミドゲル中またはポリアクリルアミドゲル上で行う。複数の勾配（化学的変性、熱変性およびゲルマトリクスの空隙率による勾配）を、ゲルスラブ上のゾーン電気泳動により、またはキャピラリー電気泳動により、ＤＮＡフラグメントの分離に使用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の核酸フラグメント中の１つまたはそれより多い変異を検出する方法であって、適当な配列において行う以下のステップ：
（ａ）サンプル中に存在する核酸フラグメントを増幅すること、
（ｂ）ゲル中の特定位置に、部分的に融解した核酸フラグメントを固定する目的のため、ステップ（ａ）で形成した二本鎖核酸フラグメントの少なくとも部分的融解を生ずる勾配の存在下、ゲル電気泳動の手段により核酸フラグメントを分離すること、および
（ｃ）分離核酸フラグメントを検出すること、
を含み、当該増幅ステップ（ａ）はゲル中またはゲルにおいて行うことを特徴とする、当該方法。
【請求項２】
当該方法が更に、
（ｄ）（ｂ）の前に、当該サンプル中に存在する二本鎖核酸フラグメントを一本鎖核酸フラグメントへ完全に融解すること、およびこれらの一本鎖核酸フラグメントから二本鎖フラグメントを再形成することを含み、ここで、ホモ二重二本鎖核酸フラグメントに加えてヘテロ二重二本鎖核酸フラグメントを形成すること特徴とする、請求項１の方法。
【請求項３】
ゲル電気泳動が、キャピラリーゲル電気泳動であることを特徴とする、請求項１または２の方法。
【請求項４】
当該方法が更に：
（ｅ）少なくとも部分的に融解した核酸フラグメントを再び二本鎖とするように、ステップ（ｂ）後に電気泳動条件を変え、それにより、分離核酸フラグメントが、実際には等速で電気泳動ゲル中の特定位置から移動すること、
を含むことを特徴とする、請求項１、２または３の方法。
【請求項５】
分離核酸フラグメントを、キャピラリーから排出される時に検出することを特徴とする、請求項３または４の何れかの方法。
【請求項６】
当該方法が、分離核酸フラグメントをゲルから単離することを更に含むことを特徴とする、請求項１−５の何れかの方法。
【請求項７】
二本鎖核酸フラグメントに少なくとも部分的な融解を生ずるゲル中の勾配が温度勾配であることを特徴とする、請求項１−６の何れかの方法。
【請求項８】
二本鎖核酸フラグメントに少なくとも部分的な融解を生ずる勾配が化学勾配であることを特徴とする、請求項１−６の何れかの方法。
【請求項９】
化学勾配が尿素およびホルムアミドにより形成されることを特徴とする、請求項８の方法。
【請求項１０】
当該勾配が、温度勾配および化学勾配の組合せからなることを特徴とする、請求項７、８または９の方法。
【請求項１１】
少なくとも部分的に融解した核酸フラグメントが再び二本鎖核酸フラグメントを形成するように電気泳動条件を変えることに、電気泳動ゲルの温度を下げることが含まれることを特徴とする、請求項２−１０の何れかの方法。
【請求項１２】
当該サンプルが、個体由来の遺伝学的材料を含み、ここで、遺伝学的材料は核酸型で、血液、精液、唾液および／または組織細胞などで存在することを特徴とする、請求項１−１１の何れかの方法。
【請求項１３】
サンプル中の核酸フラグメント中の１つまたはそれより多い変異を検出するための装置であって、
ゲルを配置した多数のキャピラリーであり、当該キャピラリー中のゲルの上側部および下側部は両方とも、電極を配置した液体バスと接触している当該キャピラリー、
ゲル全体に電圧をかけるための電圧源、
電気泳動の間に電気泳動条件を変えるための手段および分離ＤＮＡフラグメントを検出するための手段、
を含む、当該装置。
【請求項１４】
当該キャピラリー中のゲルの上側部が、実質的に全キャピラリー用の１つの集合液体バスに接触し、ここで電極は集合液体バス中に配置されており、そして当該キャピラリー中の各ゲルの下側部が、別の液体バスと接触し、ここで電極はそれぞれ別の液体バス中に配置されていることを特徴とする、請求項１３の装置。
【請求項１５】
当該キャピラリー中の電気泳動条件を変えるための手段が、当該キャピラリー中の温度を変えるための手段であることを特徴とする、請求項１３または１４の装置。
【請求項１６】
温度を変えるための手段がペルティエ素子を含むことを特徴とする、請求項１５の装置。
【請求項１７】
温度を測定するための手段を、少なくとも１つのキャピラリー中で配置することを特徴とする、請求項１３−１６の何れかの装置。
【請求項１８】
温度を測定するための手段が、少なくとも１つのキャピラリー中で配置した白金抵抗ワイヤを含むことを特徴とする、請求項１７の装置。
【請求項１９】
当該キャピラリーが、サンプル中に存在する当該核酸フラグメントをゲル中で増幅するためのプライマーおよびｄＮＴＰで被覆されていることを特徴とする、請求項１３−１８の何れかの装置。
【請求項２０】
当該キャピラリーが更に、サンプル中に存在する当該核酸フラグメントをゲル中で増幅するためのポリメラーゼで被覆されていることを特徴とする、請求項１３−１９の装置。
【請求項２１】
当該キャピラリーがプライマーおよびｄＮＴＰで被覆されていることを特徴とする、請求項１−１２の何れかの方法および／または請求項１３−２０の何れかの装置において使用するためのキャピラリー。
【請求項２２】
当該キャピラリーがポリメラーゼで更に被覆されていることを特徴とする、請求項２１のキャピラリー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、サンプル中の核酸フラグメント中の１つまたはそれより多い変異を検出するための方法および装置に関連し、ここで、当該方法は、適当な配列において行う以下のステップ：
（ａ）サンプル中に存在する核酸フラグメントを増幅すること、
（ｂ）ゲル中の特定位置に、部分的に融解した核酸フラグメントを固定する目的のため、ステップ（ａ）で形成した二本鎖核酸フラグメントの少なくとも部分的融解を生ずる勾配の存在下、ゲル電気泳動の手段により核酸フラグメントを分離すること、および
（ｃ）分離核酸フラグメントを検出すること、
を含む。
【０００２】
その方法は、例えば、核酸フラグメント、特にＤＮＡフラグメントの特定の変異のためのスクリーニングのために既知である。当該ＤＮＡ中の変異は、遺伝性疾患および／または特定の癌を生じ得る。それにより、患者のサンプル中のＤＮＡ中の変異を明らかにすることは、患者が、決められた遺伝性疾患に応答する異常遺伝子の保持者であるかどうかの確認、または信頼性のある診断に重要となり得る。ＤＮＡ変異研究はまた、例えば、特定型の癌の進行の危険性の決定、腫瘍の場合の処置計画、疾患と特定遺伝学的欠損との関連の科学的研究および組織分類に重要となり得る。
【０００３】
サンプル中の、例えばＤＮＡのような核酸フラグメント中の変異の検出を可能とするため、非常に少数のコピー中の、または巨大核酸フラグメントの一部として通常サンプル中に存在する、当該サンプル中に存在する核酸フラグメントを最初に増幅させ、十分な材料を得なければならない。この目的の為に、例えばＰＣＲのような通常の増幅技術が一般に用いられる。増幅ステップの後、増幅二本鎖ＤＮＡフラグメントは、検出前に、互いから分離されなければならない。この目的の為に、ゲル電気泳動に基づく技術が一般的に用いられる。しかし、本方法の欠点は、増幅ステップと分離ステップの両方が時間がかかる工程であり、そのため、当該方法を行うためには長い処理時間を必要とすることである。しばしば、非常に多数のサンプルをスクリーニングしなければならないため、非常に多数のサンプルが、サンプル中に存在する核酸フラグメント中の１つまたはそれより多い変異の存在を迅速におよび単純な方法で試験し得る方法の開発が望まれる。
【０００４】
そのため、本発明の目的は、サンプル中の核酸フラグメント中の１つまたはそれより多い変異を検出するための方法であって、非常に多数のサンプルが短時間で変異の存在または非存在に関し試験され得る当該方法を提供することである。
【０００５】
この目的は、本発明により、増幅ステップ（ａ）をゲル中またはゲル上で行う本発明によって達成される。
【０００６】
ゲル中またはゲル上で増幅ステップを行うことより、当該方法は、短時間で行われ得る。増幅ステップ直後、当該増幅後、ゲル全体に電圧をかけ、電気泳動を開始することにより、当該増幅核酸フラグメントを互いから分離する。そのため、増幅ステップを行った後、当該サンプルをゲルに置き、その後、電気泳動ステップを行う必要性はもはやない。ゲルにおける増幅の間、ＰＣＲミックス（一般に、酵素、プライマー、ヌクレオチドなどからなる）をゲルの上部に配置する。当該ＰＣＲミックスは、例えば、ゲルのアクリルアミドと、境界表面においてのみ接触する。ゲル中での増幅の場合、ＰＣＲミックスはゲル中に位置する。当該ＰＣＲミックスはアクリルアミドと完全接触している。
【０００７】
変異を有する核酸フラグメントと変異を有さない核酸フラグメントの大きさには全く相違がないか殆ど相違がないため、本発明の別のフラグメントは、結合エネルギーの相違に基づき互いから分離される。結合エネルギーは当該フラグメントの核酸組成に依存する。変異、例えばヌクレオチドの置換が核酸フラグメント中に存在するとき、当該結合エネルギーは、変異のないフラグメントの結合エネルギーと相違する。
【０００８】
変異のない核酸フラグメントから変異のある核酸フラグメントを分離するため、二本鎖核酸フラグメントの少なくとも部分的な融解を生ずる勾配、例えば温度が増加する勾配（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ）を適用する。変異のある二本鎖核酸フラグメントは、変異のない二本鎖核酸フラグメントの結合エネルギーと相違する結合エネルギーを有するため、当該フラグメントは、種々の温度で少なくとも部分的に一本鎖となる（融解する）。少なくとも部分的融解により、当該フラグメントはゲル中の特定位置で固定化される。結合エネルギーの相違により、変異のない二本鎖核酸フラグメントは、変異のあるフラグメントとは異なるゲル中の位置で固定化される。そのため、この方法において、変異のある核酸フラグメントは、ゲルにおいて、変異のない核酸フラグメントから分離され得る（図１）。
【０００９】
当該フラグメントをゲル中の特定位置に確実に固定化するため、二本鎖フラグメントは、少なくとも部分的な融解を生ずる勾配の影響の下では完全には融解してはならない。この目的のため、ＧＣリッチテール（「ＧＣクランプ」；約１５から６０のＧＣ対）を、例えば、１つの増幅プライマーに加え得る。ＧＣクランプは、少なくとも部分的な融解を生ずる勾配中で二本鎖を維持する。
【００１０】
次いで、相互に分離したフラグメントは通常の方法でゲル中で検出し得る。この目的の為に、例えば、核酸フラグメントに結合するエチジウムブロミドを、電気泳動ステップ前またはその間に加え、それにより当該フラグメントは、ＵＶ光を用い見ることができる。しかし、他の検出の既知の方法もまた、本発明により使用し得る。
【００１１】
特に適当な好ましい、本発明による方法の態様では、当該方法は、以下のステップ：
（ｄ）ステップ（ｂ）の前に、当該サンプル中に存在する二本鎖核酸フラグメントを一本鎖核酸フラグメントへ完全に融解すること、およびこれらの一本鎖核酸フラグメントから二本鎖フラグメントを再形成することを含み、ここで、ホモ二重二本鎖核酸フラグメントに加えてヘテロ二重二本鎖核酸フラグメントを形成する。
【００１２】
ホモ二重二本鎖核酸フラグメント（以下、ホモ二重フラグメントと称する）は、２つの「通常の」（すなわち、変異のない）一本鎖核酸フラグメントまたは２つの変異一本鎖核酸フラグメントが対となり二本鎖核酸フラグメントを形成するとき、生ずる。ヘテロ二重二本鎖核酸フラグメント（以下、ヘテロ二重フラグメントと称する）は、通常の一本鎖核酸フラグメントが変異一本鎖核酸フラグメントと対となるときに、形成される（図２）。次いで、両鎖は、厳密には相補的でないため、ヘテロ二重フラグメントはホモ二重フラグメントよりも低い結合エネルギーを有する。
【００１３】
二本鎖核酸フラグメントを一本鎖フラグメントに完全に融解すること、およびこれらの一本鎖フラグメントから二本鎖核酸フラグメントを再形成することから、例えば、当該サンプルの加熱し、それによって、二本鎖フラグメントは融解し、次いで当該サンプルを更に冷却し、それによって、一本鎖フラグメントが再び二本鎖核酸フラグメントを形成し、次いで、ゲル電気泳動を用い互いから分離することにより、行われ得る。
【００１４】
上記のように、次いで、異なる核酸フラグメントは、当該フラグメントの部分的融解を生ずる勾配中の結合エネルギーの相違に基づき相互に分離される。当該ヘテロ二重フラグメントは、ホモ二重フラグメントより低い結合エネルギーを有し、そのため、部分的に融解し、ゲル中に直ぐに固定化する。
【００１５】
ヘテロ接合性変異が存在するとき、４種の二本鎖核酸フラグメントが形成され、２つのホモ二重フラグメントおよび２つの二重ヘテロ二重フラグメントを、図２に示すように形成する。ヘテロ二重フラグメントは、少なくとも１塩基が対とならず、すなわち、反対塩基と結合し得ないという事実により特徴付けられる。２つのヘテロ二重フラグメントはより低い結合エネルギーを有し、そのため、ホモ二重フラグメントよりも直ぐに部分的に融解し、ゲル中の異なる特定位置で固定化される。塩基対は隣接塩基対（すぐに隣接する塩基対はより強く、それより離れた塩基対ではより弱く）の結合エネルギーに影響を与えるため、２種のヘテロ二重フラグメントは別の結合エネルギーを有する。２つのヘテロ二重フラグメントの結合エネルギーの相対的な相違により、これらは、ゲル中の異なる位置（すなわち、例えば、異なる温度）で融解し、そのため、異なる位置で固定化する。この手法で、異なる対立遺伝子は、例えば、互いから分離され得る。
【００１６】
本発明による当該で行った電気泳動は、好ましくはキャピラリー電気泳動である。この技術は、ゲルの配置に基づき、例えば、キャピラリー中のポリアクリルアミドに基づく。当該サンプルは、キャピラリー中に配置され、次いで、電圧は、キャピラリー全体にかけられる。当該サンプル中に存在する分子は、特に大きさおよび／または荷電に基づき異なるスピードでキャピラリー中のゲルを通って移動し、そのため、互いから分離される。キャピラリー電気泳動の利点は、核酸フラグメントの場合、キャピラリー中のゲル全体により高い電圧をかけることが出来るため、分子が当該キャピラリー中をより早く移動し得るという事実である。そのため、電気泳動ステップは、相当短時間で行うことができる。これは、キャピラリーが非常に細く、それにより、キャピラリー中のゲルの耐性が高いという事実の結果である。ゲル全体に高い電圧がかかるとき、電流、およびそれより生ずる熱は、低い。キャピラリーの体積に対する表面領域の割合は、より高く、そのため、生ずる熱は、より迅速により早く放出され得る。非常に低粘度（実質的には液体）のゲルがまたキャピラリー中に配置され得る。そのため、低密度で固体性のゲルマトリクスを選択し得る。更なる利点は、非常に少量のサンプルを分析し得ることであり、それは、僅かな材料を利用するときに特に重要となる。
【００１７】
キャピラリーの非常に薄い壁および領域：体積の高い比により、さらに、直ちに生ずる熱転移が可能であり、急な温度勾配を適用し得る。そのため、非常に早い増幅ステップが可能であり、本発明による方法は相当早く行うことができる。
【００１８】
更に利点のある態様では、当該方法は更に、（ｅ）少なくとも部分的に融解した核酸フラグメントを再び二本鎖とするように、ステップ（ｂ）後に電気泳動条件を変え、それにより、分離核酸フラグメントが、実際には等速で電気泳動ゲル中の特定位置から移動することを含む。
【００１９】
分離核酸フラグメントは、それらがキャピラリーから排出されるときに、好ましくは、検出される。更に分離核酸フラグメントを電気泳動することにより、異なるフラグメントが、一定の順序でキャピラリーから排出される。当該フラグメントは、例えば、蛍光標識による分離前に核酸フラグメントを標識することにより、そして、それらがキャピラリーから排出される直前または排出されるときに正確な波長のレーザーで当該フラグメントを励起することにより、自動的に検出し得る。次いで、蛍光を、光感受性細胞を用い検出し得る。ＤＮＡフラグメントの標識の場合、蛍光物質が使用し得るが、他の型の標識もまた可能である。フラグメントを標識することにより、当該方法は、より感受的となり、材料は少なくて済む。
【００２０】
しかし、例えば、キャピラリー中のフラグメントの移動の間、実質的に既知の他の型の検出もまた可能である。異なる時間ＵＶ光を当該キャピラリーにさらすことも可能であり、ここで、記録は、カメラを用い行い得る。この方法では、例えば、ゲル中のフラグメントの特定位置も決定し得る。
【００２１】
本発明による方法の特に適当な好ましい実施態様には更に、ゲルから分離核酸フラグメントの単離が含まれる。その後、単離フラグメントを、例えば配列決定のような更なる分析に用い得る。
【００２２】
例えば、分離核酸フラグメントは、それがキャピラリーから排出されるときに単離され得る。単離の他の方法は、キャピラリー中の特定位置を決定した後にゲルからフラグメントを単離することからなる（例えば、上記のようにカメラを用いる）。この目的の場合、（使い捨ての）キャピラリーは、例えば、正確な位置で切断され得、その後、核酸フラグメントはキャピラリー片のゲル残留物（ｇｅｌ ｒｅｍｎａｎｔｓ）から単離し得る。分離対立遺伝子は、例えば、この方法で分類し得る。
【００２３】
本発明により、二本鎖核酸フラグメントの少なくとも部分的融解を生ずる勾配は、好ましくは温度勾配である。温度の漸進的または段階的増加により、それらの結合エネルギーによって二本鎖核酸フラグメントが融解し、ゲル中の特定位置に固定化することを単純な方法で達成可能である。当該温度勾配は、例えば、キャピラリーの上側部からその下側部へ適用するが、例えば、時間内に、すなわち実験の始めから終わりまでの時間、適用する温度勾配でもあり得る。
【００２４】
他の特に適当な、本発明による方法の態様では、少なくとも部分的に融解を生ずる勾配は、化学的勾配である。
【００２５】
本明細書では、化学的勾配は、好ましくは、尿素およびホルムアミドにより形成される。尿素およびホルムアミドの増加する濃度において、核酸フラグメントは、当該フラグメントはより低い結合エネルギーを有するため、融解し、より迅速にゲル中に固定化される。
【００２６】
上記勾配に加えて、二本鎖フラグメントの融解を生ずる他の勾配もまた、本発明により適用され得る。本発明の他の好ましい態様は、部分的に融解を生ずる勾配が、温度勾配および化学的勾配の組合せからなるとき、得られる。
【００２７】
本発明による方法の特に好ましい態様では、一旦、核酸フラグメントが互いに分離され、ゲル中の特定位置で固定化されると、電気泳動条件は、部分的融解核酸フラグメントが再び二本鎖となりそれにより分離フラグメントが更に同じ速度でキャピラリー中の特定位置から移動するように、上記のように変更する。ここで、電気泳動条件の変更は、好ましくは、温度を下げることからなる。キャピラリー中の温度を減少させることにより、部分的融解フラグメントは、再び二本鎖となり、更にゲル中の特定位置から、同じ相対的速度で移動し、一定の順序でキャピラリーから排出される。その相対的速度は、変異を有する二本鎖核酸フラグメントの大きさは、変異を有しない核酸フラグメントの大きさとは相違しないか殆ど相違しないのため、同じである。
【００２８】
ゲル中の核酸フラグメントの分離を、化学的または他の勾配を提供することにより行うとき、当該温度は分離後同じ挙動で減少し、少なくとも部分的に融解したフラグメントは再び二本鎖となる。
【００２９】
核酸中の１つまたはそれより多い変異を検出することが望ましいサンプルは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡのように核酸の型で遺伝学的材料が存在する、個体由来の任意の適当な材料、例えば、血液、精液、唾液および／または多様な組織細胞からなり得る。当該サンプルは、核酸を単離するために最初に処理され得る。核酸の抽出および精製は、当業者に既知の標準的プロトコールにより行う。サンプル中に存在する核酸が一本鎖フラグメントからなるとき、例えば、ＲＮＡの場合のように、二本鎖核酸フラグメントが最初に既知技術を用い作成される。ＲＮＡの場合、この目的のため、例えば事実上既知のＰＴ−ＰＣＲ技術を使用し得る。
【００３０】
本発明の出願では、「変異」なる語句は、「通常」（野生型）遺伝学的物質に関連する核酸フラグメント中の任意の変化をいう。ここで、変異核酸のヌクレオチド配列は、相当する非変異核酸のヌクレオチド配列とは、１つのまたはそれより多い相違を示す。その変異は、例えば、点変異（単一塩基対は一般的に相違し、通常他の塩基対で置換される）または１つもしくはそれより多いヌクレオチドの挿入もしくは欠失であり得る。本発明により、変異なる用語は更にまた、いわゆる多型性、すなわち、ある決定遺伝子の天然の群中で生ずる対立遺伝子の相違をいう。
【００３１】
本発明は更に、上記方法が行える装置に関連し、その装置を提供する。
【００３２】
本発明の装置は、ゲルを配置した多数のキャピラリーであり、当該キャピラリー中のゲルの上側部および下側部は両方とも、電極を配置した液体バスと接触している当該キャピラリー、電気泳動ゲル全体に電圧をかけるための電圧源、電気泳動の間に電気泳動条件を変えるための手段および分離ＤＮＡフラグメントを検出するための手段を含む。当該装置を用い、本発明の方法は、簡単に非常に迅速に行い得る。
【００３３】
本発明の装置の好ましい態様では、当該装置は、非常に多数のキャピラリーを含むが、ここで、当該キャピラリー中のゲルの上側部が、実質的に全キャピラリー用の１つの集合液体バスに接触し、ここで電極は集合液体バス中に配置されており、そして当該キャピラリー中の各電気泳動ゲルの下側部が、別の液体バスと接触し、ここで電極はそれぞれ別の液体バス中に配置されている。
【００３４】
適当な一体型電圧源の手段により、電圧は、キャピラリー中のゲル全体に、電極間にかけられ得る。当該電圧はゲル全体にかけ得るが、可変でなければならないということはない。
【００３５】
本発明の装置で使用し得る検出手段は、例えば、クロマトグラフィーで通常使用される通常の検出手段であり、例えば、ＵＶ／可視光スペクトロホトメーターのようなものである。蛍光検出手段は、好ましくは、より感度がよいために使用される。しかし、サンプル中の核酸フラグメントは、この目的のため、最初に標識されなければならない。
【００３６】
本発明により、キャピラリー中の電気泳動条件を変更する手段は、好ましくは、電気泳動の間、キャピラリー中の温度を変更する手段からなる。
【００３７】
本発明の装置において、温度を変更する手段は、好ましくは、キャピラリーをクランプするいわゆるペルティエ素子、またはキャピラリーの周りに巻かれたペルティエコイルを含む。ペルティエ素子は、２種の型の金属のストリップからなる。この素子を介する電流の強さおよび／または方向を変えることにより、当該素子は、冷却および過熱の両方となる（いわゆるペルティエ効果）。キャピラリー中の温度を電気泳動の間に変える他の手段も可能であり、キャピラリーを取り囲む領域を加熱する加熱手段のようなもの（例えば、（ハロゲン）ランプといったもの）、および冷風をキャピラリーに吹きつけキャピラリーの温度を下げる冷却手段のようなもの（例えば、ファン）である。
【００３８】
キャピラリー中の各ゲルの下側部が分離液体バスと接触するため、分離核酸フラグメントは、特定フラグメントがキャピラリーから排出された後、液体バスを交換することにより簡単に単離することが出来る。液体バスは、沈殿または濃縮のような実質的に既知の技術を用い単離核酸フラグメントが回収され、更に分析に使用される通常の実質的に既知の電気泳動緩衝液を含む。
【００３９】
特に適当な好ましい態様では、温度を測定する装置手段が少なくとも１つのキャピラリー中に配置される。増幅ステップの間、キャピラリー中の温度は、迅速に、できる限り正確に調節されなければならない。キャピラリー中の温度を測定する手段を配置することにより、非常に信頼性のある表示から、増幅ステップの間、キャピラリー中の主な温度が得られる。
【００４０】
ここで、温度を測定するための手段が、この目的のため、適当な任意の手法で具現化され得る。温度を測定する手段は、好ましくは、少なくとも１つのキャピラリー中に配置した白金抵抗ワイヤを含む。ここで、当該キャピラリーは、例えば、水で満たされ得、シールされ得、それによって、キャピラリーが得られ、そのキャピラリーは実質的に他のキャピラリーと同じ熱許容量を有する。
【００４１】
更に特に好ましい装置の態様では、当該キャピラリーは、サンプル中に存在する核酸フラグメントをキャピラリー中、ゲル中、またはゲル上で増殖するためのプライマーおよびｄＮＴＰで被覆されている。この手法では、変異が検出されるサンプルのみおよびポリメラーゼをキャピラリーに負荷しなければならない。より好ましくは当該キャピラリーは、プライマー、ｄＮＴＰおよびポリメラーゼで被覆されている。
【００４２】
本発明はまた、上記の方法および装置において使用するキャピラリーに関係し、そのキャピラリーを提供し、ここで、当該キャピラリーは、プライマーおよびｄＮＴＰで、ならびにより好ましくはプライマー、ｄＮＴＰおよびポリメラーゼで被覆されている。この目的のため、例えば、内側を被覆した使い捨てキャピラリーを使用し得る。
【００４３】
本発明は更に、添付の図を参照することにより説明され、ここで、
図１は、部分的に融解したＤＮＡフラグメントの概要図を示しており（本発明の方法のステップｂ）、
図２は、ホモ二重およびヘテロ二重の形成を概略的に示しており（本発明の方法のステップｄ）、
図３は、本発明の装置の好ましい態様の概要図（部分的に断面図）を示しており、
図４は、図３の詳細を示しており、そして
図５は、本発明の装置の他の適当な好ましい態様の概要図（部分的に断面図）を示している。
【００４４】
図３に示すように、装置１は、コンテナー３中に非常に多数のキャピラリー２を含み、ここで、ゲルは、キャピラリー中に配置される。キャピラリー２中のゲルの上側部４と下側部５の両方が、カソード８およびアノード９がそれぞれ配置されている液体バス６、７と接触している。キャピラリー２中のゲルの上側部４は、カソード８を有するキャピラリー用集合液体バス６と接触し、各キャピラリー２のゲルの下側部５は、分離液体バス７と接触し、ここで、アノード９は各分離液体バス７中に配置されている。これを図４により詳細に示す。装置１は更に、電圧源１０、ならびにキャピラリーが固定化されるようにクランプしているいわゆるペルティエブロックからなる温度を変えるための手段１１（また、図４に概略を示す）を含む。
【００４５】
図４中に示す好ましい態様では、手段１２は更に、分離核酸フラグメントを検出するために存在し、その手段は、キャピラリー２から排出されるとき核酸フラグメントを検出する。当該検出手段は、例えば、標識核酸フラグメントを励起するダイオードレーザー１３を含み、ここで当該フラグメントにより放出する蛍光は蛍光ディテクター１２により検出される。
【００４６】
図５は、本発明の装置の他の利点のある態様を示す。同様に、装置１は、ゲルを配置した多くのキャピラリー２を含み、その上側部４は、全キャピラリー用の１つの、カソード８を配置した集合液体バス６と接触しており、その下側部５は、分離アノード９を配置した分離液体バス７と接触している。温度を変えるための手段１１は、キャピラリー中の温度を増加する加熱手段（示さず）、およびキャピラリーに冷風を吹きつける冷却手段による、この態様で形成される。
【００４７】
本発明による方法の検出方法のように、例えば、ＵＶ露光およびハイレゾリューションＣＣＤカメラを使用し得る。ＥｔＢｒまたはＳｙＢｒ−ｇｏｌｄ標識フラグメントは、例えば、それらにより検出され得る。蛍光標識したフラグメントは、例えば、カラーＣＣＤカメラを用い検出され得、ＵＶ光を遮断するフィルターを使用する。その後、異なる色が、この目的に適当なソフトウェアを用い見ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、部分的に融解したＤＮＡフラグメントの概要図を示す。
【図２】図２は、ホモ二重およびヘテロ二重の形成を概略的に示す。
【図３】図３は、本発明の装置の好ましい態様の概要図を示す。
【図４】図４は、図３の詳細を示す。
【図５】図５は、本発明の装置の他の適当な好ましい態様の概要図を示す。
【図１】
2004512850.tif 000002
【図２】
2004512850.tif 000003
【国際公開パンフレット】
2004512850.tif 000004
2004512850.tif 000005
2004512850.tif 000006
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【手続補正書】
【提出日】平成15年3月25日(2003.3.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の核酸フラグメント中の１つまたはそれより多い変異を検出する方法であって、適当な配列において行う以下のステップ：
（ａ）サンプル中に存在する核酸フラグメントを増幅すること、
（ｂ）電気泳動ゲル中の特定位置に、部分的に融解した核酸フラグメントを固定する目的のため、ステップ（ａ）で形成した二本鎖核酸フラグメントの少なくとも部分的融解を生ずる勾配の存在下、ゲル電気泳動の手段により核酸フラグメントを分離すること、および
（ｃ）分離核酸フラグメントを検出すること、
を含み、当該増幅ステップ（ａ）は電気泳動ゲル中または電気泳動ゲル上において行うことを特徴とする、当該方法。
【請求項２】
当該方法が更に、
（ｄ）ステップ（ｂ）の前に、当該サンプル中に存在する二本鎖核酸フラグメントを一本鎖核酸フラグメントへ完全に融解すること、およびこれらの一本鎖核酸フラグメントから二本鎖フラグメントを再形成することを含み、ここで、ホモ二重二本鎖核酸フラグメントに加えてヘテロ二重二本鎖核酸フラグメントを形成すること特徴とする、請求項１の方法。
【請求項３】
ゲル電気泳動が、キャピラリーゲル電気泳動であることを特徴とする、請求項１または２の方法。
【請求項４】
当該方法が更に：
（ｅ）少なくとも部分的に融解した核酸フラグメントを再び二本鎖とするように、ステップ（ｂ）後に電気泳動条件を変え、それにより、分離核酸フラグメントが、実際には等速で電気泳動ゲル中の特定位置から移動すること、
を含むことを特徴とする、請求項１、２または３の方法。
【請求項５】
分離核酸フラグメントを、キャピラリーから排出される時に検出することを特徴とする、請求項３または４の何れかの方法。
【請求項６】
当該方法が、分離核酸フラグメントを電気泳動ゲルから単離することを更に含むことを特徴とする、請求項１−５の何れかの方法。
【請求項７】
二本鎖核酸フラグメントに少なくとも部分的な融解を生ずる電気泳動ゲル中の勾配が温度勾配であることを特徴とする、請求項１−６の何れかの方法。
【請求項８】
二本鎖核酸フラグメントに少なくとも部分的な融解を生ずる勾配が化学勾配であることを特徴とする、請求項１−６の何れかの方法。
【請求項９】
化学勾配が尿素およびホルムアミドにより形成されることを特徴とする、請求項８の方法。
【請求項１０】
当該勾配が、温度勾配および化学勾配の組合せからなることを特徴とする、請求項７、８または９の方法。
【請求項１１】
少なくとも部分的に融解した核酸フラグメントが再び二本鎖核酸フラグメントを形成するように電気泳動条件を変えることに、電気泳動ゲルの温度を下げることが含まれることを特徴とする、請求項２−１０の何れかの方法。
【請求項１２】
当該サンプルが、個体由来の遺伝学的材料を含み、ここで、遺伝学的材料は核酸型で、血液、精液、唾液および／または組織細胞などで存在することを特徴とする、請求項１−１１の何れかの方法。
【請求項１３】
サンプル中の核酸フラグメント中の１つまたはそれより多い変異を検出するための装置であって、
電気泳動ゲルを配置した多数のキャピラリーであり、当該キャピラリー中の電気泳動ゲルの上側部および下側部は両方とも、電極を配置した液体バスと接触している当該キャピラリー、
電気泳動ゲル全体に電圧をかけるための電圧源、
電気泳動の間に電気泳動条件を変えるための手段および分離ＤＮＡフラグメントを検出するための手段、
を含み、
当該キャピラリー中のゲルの上側部が、実質的に全キャピラリー用の１つの集合液体バスに接触し、ここで電極は集合液体バス中に配置されており、そして当該キャピラリー中の各電気泳動ゲルの下側部が、別の液体バスと接触し、ここで電極はそれぞれ別の液体バス中に配置されていることを特徴とする、
当該装置。
【請求項１４】
当該キャピラリー中の電気泳動条件を変えるための手段が、当該キャピラリー中の温度を変えるための手段であることを特徴とする、請求項１３の装置。
【請求項１５】
温度を変えるための手段がペルティエ素子を含むことを特徴とする、請求項１４の装置。
【請求項１６】
温度を測定するための手段を、少なくとも１つのキャピラリー中で配置することを特徴とする、請求項１３−１５の何れかの装置。
【請求項１７】
温度を測定するための手段が、少なくとも１つのキャピラリー中で配置した白金抵抗ワイヤを含むことを特徴とする、請求項１６の装置。
【請求項１８】
当該キャピラリーが、サンプル中に存在する当該核酸フラグメントを電気泳動ゲル中で増幅するためのプライマーおよびｄＮＴＰで被覆されていることを特徴とする、請求項１３−１７の何れかの装置。
【請求項１９】
当該キャピラリーが更に、サンプル中に存在する当該核酸フラグメントを電気泳動ゲル中で増幅するためのポリメラーゼで被覆されていることを特徴とする、請求項１３−１８の装置。
【請求項２０】
当該キャピラリーがプライマーおよびｄＮＴＰで被覆されていることを特徴とする、請求項１−１２の何れかの方法および／または請求項１３−１９の何れかの装置において使用するためのキャピラリー。
【請求項２１】
当該キャピラリーがポリメラーゼで更に被覆されていることを特徴とする、請求項２０のキャピラリー。
【国際調査報告】
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