(57)【要約】ヒトを含む哺乳動物における血管新生及び／又は心臓血管形成を刺激又は阻害するための組成物及び方法が開示される。製薬組成物は、これらの用途の一又は複数について同定されたポリペプチド又はそれに対するアンタゴニストに基づく。ここでの組成物により診断、予防又は治療される疾患は、創傷等の外傷、種々の癌、及びアテローム性硬化症及び心臓肥大を含む血管疾患を含む。さらに、本発明は新規なポリペプチド及びこれらのポリペプチドをコードする核酸分子に係る。またここで、これらの核酸配列を含むベクター及び宿主細胞、異種ポリペプチドに融合した本発明のポリペプチドを含むキメラポリペプチド分子、本発明のポリペプチドに結合する抗体、及び本発明のポリペプチドの製造方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｉｇ ２ （配列番号：２）， Ｆｉｇ ４ （配列番号：４）， Ｆｉｇ ６ （配列番号：６）， Ｆｉｇ ８ （配列番号：８）， Ｆｉｇ １０ （配列番号：１０）， Ｆｉｇ １２ （配列番号：１２）， Ｆｉｇ １４ （配列番号：１４）， Ｆｉｇ １６ （配列番号：１６）， Ｆｉｇ １８ （配列番号：１８）， Ｆｉｇ ２０ （配列番号：２０）， Ｆｉｇ ２２ （配列番号：２２）， Ｆｉｇ ２４ （配列番号：２４）， Ｆｉｇ ２６ （配列番号：２６）， Ｆｉｇ ２８ （配列番号：２８）， Ｆｉｇ ３０ （配列番号：３０）， Ｆｉｇ ３２ （配列番号：３２）， Ｆｉｇ ３４ （配列番号：３４）， Ｆｉｇ ３６ （配列番号：３６）， Ｆｉｇ ３８ （配列番号：３８）， Ｆｉｇ ４０ （配列番号：４０）， Ｆｉｇ ４２ （配列番号：４２）， Ｆｉｇ ４４ （配列番号：４４）， Ｆｉｇ ４６ （配列番号：４６）， Ｆｉｇ ４８ （配列番号：４８）， Ｆｉｇ ５０ （配列番号：５０）， Ｆｉｇ ５２ （配列番号：５２）， Ｆｉｇ ５４ （配列番号：５４）， Ｆｉｇ ５６ （配列番号：５６）， Ｆｉｇ ５８ （配列番号：５８）， Ｆｉｇ ６０ （配列番号：６０）， Ｆｉｇ ６２ （配列番号：６２）， Ｆｉｇ ６４ （配列番号：６４）， Ｆｉｇ ６６ （配列番号：６６）， Ｆｉｇ ６８ （配列番号：６８）， Ｆｉｇ ７０ （配列番号：７０）， Ｆｉｇ ７２ （配列番号：７２）， Ｆｉｇ ７４ （配列番号：７４）， Ｆｉｇ ７６ （配列番号：７６）， Ｆｉｇ ７８ （配列番号：７８）， Ｆｉｇ ８０ （配列番号：８０），  Ｆｉｇ ８２ （配列番号：８２）， Ｆｉｇ ８４ （配列番号：８４）， Ｆｉｇ ８６ （配列番号：８６）， Ｆｉｇ ８８ （配列番号：８８）， Ｆｉｇ ９０ （配列番号：９０）， Ｆｉｇ ９２ （配列番号：９２）， Ｆｉｇ ９４ （配列番号：９４）， Ｆｉｇ ９６ （配列番号：９６）， Ｆｉｇ ９８ （配列番号：９８）， Ｆｉｇ １００ （配列番号：１００）， Ｆｉｇ １０２ （配列番号：１０２）， Ｆｉｇ １０４ （配列番号：１０４）， Ｆｉｇ １０６ （配列番号：１０６）， Ｆｉｇ １０８ （配列番号：１０８）， Ｆｉｇ １１０ （配列番号：１１０）， Ｆｉｇ １１２ （配列番号：１１２）， Ｆｉｇ １１４ （配列番号：１１４）， Ｆｉｇ １１６ （配列番号：１１６）， Ｆｉｇ １１８ （配列番号：１１８）， Ｆｉｇ １２０ （配列番号：１２０）， Ｆｉｇ １２２ （配列番号：１２２）， Ｆｉｇ １２４ （配列番号：１２４）， Ｆｉｇ １２６ （配列番号：１２６）， Ｆｉｇ １２８ （配列番号：１２８）， Ｆｉｇ １３０ （配列番号：１３０）， Ｆｉｇ １３２ （配列番号：１３２）， Ｆｉｇ １３４ （配列番号：１３４）， Ｆｉｇ １３６ （配列番号：１３６）， Ｆｉｇ １３８ （配列番号：１３８）， Ｆｉｇ １４０ （配列番号：１４０）， Ｆｉｇ １４２ （配列番号：１４２）， Ｆｉｇ １４４ （配列番号：１４４）， Ｆｉｇ １４６ （配列番号：１４６）， Ｆｉｇ １４８ （配列番号：１４８）， Ｆｉｇ １５０ （配列番号：１５０）， Ｆｉｇ １５２ （配列番号：１５２）， Ｆｉｇ １５４ （配列番号：１５４）， Ｆｉｇ １５６ （配列番号：１５６）， Ｆｉｇ １５８ （配列番号：１５８）， Ｆｉｇ １６０ （配列番号：１６０）， Ｆｉｇ １６２ （配列番号：１６２）， Ｆｉｇ １６４ （配列番号：１６４）， Ｆｉｇ １６６ （配列番号：１６６）， Ｆｉｇ １６８ （配列番号：１６８）， Ｆｉｇ １７０ （配列番号：１７０）， Ｆｉｇ １７２ （配列番号：１７２）， Ｆｉｇ １７４ （配列番号：１７４）， Ｆｉｇ １７６ （配列番号：１７６）， Ｆｉｇ １７８ （配列番号：１７８）， Ｆｉｇ １８０ （配列番号：１８０），  Ｆｉｇ １８２ （配列番号：１８２）， Ｆｉｇ １８４ （配列番号：１８４）， Ｆｉｇ １８６ （配列番号：１８６）， Ｆｉｇ １８８ （配列番号：１８８）， Ｆｉｇ １９０ （配列番号：１９０）， Ｆｉｇ １９２ （配列番号：１９２）， Ｆｉｇ １９４ （配列番号：１９４）， Ｆｉｇ １９６ （配列番号：１９６）， Ｆｉｇ １９８ （配列番号：１９８）， Ｆｉｇ ２００ （配列番号：２００）， Ｆｉｇ ２０２ （配列番号：２０２）， Ｆｉｇ ２０４ （配列番号：２０４）， Ｆｉｇ ２０６ （配列番号：２０６）， Ｆｉｇ ２０８ （配列番号：２０８）， Ｆｉｇ ２１０ （配列番号：２１０）， Ｆｉｇ ２１２ （配列番号：２１２）， Ｆｉｇ ２１４ （配列番号：２１４）， Ｆｉｇ ２１６ （配列番号：２１６）， Ｆｉｇ ２１８ （配列番号：２１８）， Ｆｉｇ ２２０ （配列番号：２２０）， Ｆｉｇ ２２２ （配列番号：２２２）， Ｆｉｇ ２２４ （配列番号：２２４）， Ｆｉｇ ２２６ （配列番号：２２６）， Ｆｉｇ ２２８ （配列番号：２２８）， Ｆｉｇ ２３０ （配列番号：２３０）， Ｆｉｇ ２３２ （配列番号：２３２）， Ｆｉｇ ２３４ （配列番号：２３４）， Ｆｉｇ ２３６ （配列番号：２３６）， Ｆｉｇ ２３８ （配列番号：２３８）， Ｆｉｇ ２４０ （配列番号：２４０）， Ｆｉｇ ２４２ （配列番号：２４２）， Ｆｉｇ ２４４ （配列番号：２４４）， Ｆｉｇ ２４６ （配列番号：２４６）， Ｆｉｇ ２４８ （配列番号：２４８）， Ｆｉｇ ２５０ （配列番号：２５０）， Ｆｉｇ ２５２ （配列番号：２５２）， Ｆｉｇ ２５４ （配列番号：２５４）， Ｆｉｇ ２５６ （配列番号：２５６）， Ｆｉｇ ２５８ （配列番号：２５８）， Ｆｉｇ ２６０ （配列番号：２６０）， Ｆｉｇ ２６２ （配列番号：２６２）， Ｆｉｇ ２６４ （配列番号：２６４）， Ｆｉｇ ２６６ （配列番号：２６６）， Ｆｉｇ ２６８ （配列番号：２６８）， Ｆｉｇ ２７０ （配列番号：２７０）， Ｆｉｇ ２７２ （配列番号：２７２）， Ｆｉｇ ２７４ （配列番号：２７４）， Ｆｉｇ ２７６ （配列番号：２７６）， Ｆｉｇ ２７８ （配列番号：２７８）， Ｆｉｇ ２８０ （配列番号：２８０），  Ｆｉｇ ２８２ （配列番号：２８２）， Ｆｉｇ ２８４ （配列番号：２８４）， Ｆｉｇ ２８６ （配列番号：２８６）， Ｆｉｇ ２８８ （配列番号：２８８）， Ｆｉｇ ２９０ （配列番号：２９０）， Ｆｉｇ ２９２ （配列番号：２９２）， Ｆｉｇ ２９４ （配列番号：２９４）， Ｆｉｇ ２９６ （配列番号：２９６）， Ｆｉｇ ２９８ （配列番号：２９８）， Ｆｉｇ ３００ （配列番号：３００）， Ｆｉｇ ３０２ （配列番号：３０２）， Ｆｉｇ ３０４ （配列番号：３０４）， Ｆｉｇ ３０６ （配列番号：３０６）， Ｆｉｇ ３０８ （配列番号：３０８）， Ｆｉｇ ３１０ （配列番号：３１０）， Ｆｉｇ ３１２ （配列番号：３１２）， Ｆｉｇ ３１４ （配列番号：３１４）， Ｆｉｇ ３１６ （配���番号：３１６）， Ｆｉｇ ３１８ （配列番号：３１８）， Ｆｉｇ ３２０ （配列番号：３２０）， Ｆｉｇ ３２２ （配列番号：３２２）， Ｆｉｇ ３２４ （配列番号：３２４）， Ｆｉｇ ３２６ （配列番号：３２６）， Ｆｉｇ ３２８ （配列番号：３２８）， Ｆｉｇ ３３０ （配列番号：３３０）， Ｆｉｇ ３３２ （配列番号：３３２）， Ｆｉｇ ３３４ （配列番号：３３４）， Ｆｉｇ ３３６ （配列番号：３３６）， Ｆｉｇ ３３８ （配列番号：３３８）， Ｆｉｇ ３４０ （配列番号：３４０）， Ｆｉｇ ３４２ （配列番号：３４２）， Ｆｉｇ ３４４ （配列番号：３４４）， Ｆｉｇ ３４６ （配列番号：３４６）， Ｆｉｇ ３４８ （配列番号：３４８）， Ｆｉｇ ３５０ （配列番号：３５０）， Ｆｉｇ ３５２ （配列番号：３５２）， Ｆｉｇ ３５４ （配列番号：３５４）， Ｆｉｇ ３５６ （配列番号：３５６）， Ｆｉｇ ３５８ （配列番号：３５８）， Ｆｉｇ ３６０ （配列番号：３６０）， Ｆｉｇ ３６２ （配列番号：３６２）， Ｆｉｇ ３６４ （配列番号：３６４）， Ｆｉｇ ３６６ （配列番号：３６６）， Ｆｉｇ ３６８ （配列番号：３６８）， Ｆｉｇ ３７０ （配列番号：３７０）， Ｆｉｇ ３７２ （配列番号：３７２）及びＦｉｇ ３７４ （配列番号：３７４）中に示されるアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列と少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する単離された核酸分子。
【請求項２】
Ｆｉｇ １ （配列番号：１）， Ｆｉｇ ３ （配列番号：３）， Ｆｉｇ ５ （配列番号：５）， Ｆｉｇ ７ （配列番号：７）， Ｆｉｇ ９ （配列番号：９）， Ｆｉｇ １１ （配列番号：１１）， Ｆｉｇ １３ （配列番号：１３）， Ｆｉｇ １５ （配列番号：１５）， Ｆｉｇ １７ （配列番号：１７）， Ｆｉｇ １９ （配列番号：１９）， Ｆｉｇ ２１ （配列番号：２１）， Ｆｉｇ ２３ （配列番号：２３）， Ｆｉｇ ２５ （配列番号：２５）， Ｆｉｇ ２７ （配列番号：２７）， Ｆｉｇ ２９ （配列番号：２９）， Ｆｉｇ ３１ （配列番号：３１）， Ｆｉｇ ３３ （配列番号：３３）， Ｆｉｇ ３５ （配列番号：３５）， Ｆｉｇ ３７ （配列番号：３７）， Ｆｉｇ ３９ （配列番号：３９）， Ｆｉｇ ４１ （配列番号：４１）， Ｆｉｇ ４３ （配列番号：４３）， Ｆｉｇ ４５ （配列番号：４５）， Ｆｉｇ ４７ （配列番号：４７）， Ｆｉｇ ４９ （配列番号：４９）， Ｆｉｇ ５１ （配列番号：５１）， Ｆｉｇ ５３ （配列番号：５３）， Ｆｉｇ ５５ （配列番号：５５）， Ｆｉｇ ５７ （配列番号：５７）， Ｆｉｇ ５９ （配列番号：５９）， Ｆｉｇ ６１ （配列番号：６１）， Ｆｉｇ ６３ （配列番号：６３）， Ｆｉｇ ６５ （配列番号：６５）， Ｆｉｇ ６７ （配列番号：６７）， Ｆｉｇ ６９ （配列番号：６９）， Ｆｉｇ ７１ （配列番号：７１）， Ｆｉｇ ７３ （配列番号：７３）， Ｆｉｇｓ ７５Ａ−７５Ｂ （配列番号：７５）， Ｆｉｇ ７７ （配列番号：７７）， Ｆｉｇ ７９ （配列番号：７９），  Ｆｉｇ ８１ （配列番号：８１）， Ｆｉｇ ８３ （配列番号：８３）， Ｆｉｇ ８５ （配列番号：８５）， Ｆｉｇ ８７ （配列番号：８７）， Ｆｉｇ ８９ （配列番号：８９）， Ｆｉｇ ９１ （配列番号：９１）， Ｆｉｇ ９３ （配列番号：９３）， Ｆｉｇ ９５ （配列番号：９５）， Ｆｉｇ ９７ （配列番号：９７）， Ｆｉｇ ９９ （配列番号：９９）， Ｆｉｇ １０１ （配列番号：１０１）， Ｆｉｇ １０３ （配列番号：１０３）， Ｆｉｇ １０５ （配列番号：１０５）， Ｆｉｇ １０７ （配列番号：１０７）， Ｆｉｇ １０９ （配列番号：１０９）， Ｆｉｇ １１１ （配列番号：１１１）， Ｆｉｇ １１３ （配列番号：１１３）， Ｆｉｇ １１５ （配列番号：１１５）， Ｆｉｇ １１７ （配列番号：１１７）， Ｆｉｇ １１９ （配列番号：１１９）， Ｆｉｇ １２１ （配列番号：１２１）， Ｆｉｇ １２３ （配列番号：１２３）， Ｆｉｇ １２５ （配列番号：１２５）， Ｆｉｇ １２７ （配列番号：１２７）， Ｆｉｇ １２９ （配列番号：１２９）， Ｆｉｇ １３１ （配列番号：１３１）， Ｆｉｇ １３３ （配列番号：１３３）， Ｆｉｇ １３５ （配列番号：１３５）， Ｆｉｇ １３７ （配列番号：１３７）， Ｆｉｇ １３９ （配列番号：１３９）， Ｆｉｇ １４１ （配列番号：１４１）， Ｆｉｇ １４３ （配列番号：１４３）， Ｆｉｇ １４５ （配列番号：１４５）， Ｆｉｇ １４７ （配列番号：１４７）， Ｆｉｇ １４９ （配列番号：１４９）， Ｆｉｇ １５１ （配列番号：１５１）， Ｆｉｇ １５３ （配列番号：１５３）， Ｆｉｇ １５５ （配列番号：１５５）， Ｆｉｇ １５７ （配列番号：１５７）， Ｆｉｇ １５９ （配列番号：１５９）， Ｆｉｇ １６１ （配列番号：１６１）， Ｆｉｇ １６３ （配列番号：１６３）， Ｆｉｇ １６５ （配列番号：１６５）， Ｆｉｇ １６７ （配列番号：１６７）， Ｆｉｇ １６９ （配列番号：１６９）， Ｆｉｇ １７１ （配列番号：１７１）， Ｆｉｇ １７３ （配列番号：１７３）， Ｆｉｇ １７５ （配列番号：１７５）， Ｆｉｇ １７７ （配列番号：１７７）， Ｆｉｇ １７９ （配列番号：１７９），  Ｆｉｇ １８１ （配列番号：１８１）， Ｆｉｇ １８３ （配列番号：１８３）， Ｆｉｇ １８５ （配列番号：１８５）， Ｆｉｇ １８７ （配列番号：１８７）， Ｆｉｇ １８９ （配列番号：１８９）， Ｆｉｇ １９１ （配列番号：１９１）， Ｆｉｇ １９３ （配列番号：１９３）， Ｆｉｇ １９５ （配列番号：１９５）， Ｆｉｇ １９７ （配列番号：１９７）， Ｆｉｇ １９９ （配列番号：１９９）， Ｆｉｇ ２０１ （配列番号：２０１）， Ｆｉｇ ２０３ （配列番号：２０３）， Ｆｉｇ ２０５ （配列番号：２０５）， Ｆｉｇ ２０７ （配列番号：２０７）， Ｆｉｇ ２０９ （配列番号：２０９）， Ｆｉｇ ２１１ （配列番号：２１１）， Ｆｉｇ ２１３ （配列番号：２１３）， Ｆｉｇ ２１５ （配列番号：２１５）， Ｆｉｇ ２１７ （配列番号：２１７）， Ｆｉｇ ２１９ （配列番号：２１９）， Ｆｉｇ ２２１ （配列番号：２２１）， Ｆｉｇ ２２３ （配列番号：２２３）， Ｆｉｇ ２２５ （配列番号：２２５）， Ｆｉｇ ２２７ （配列番号：２２７）， Ｆｉｇ ２２９ （配列番号：２２９）， Ｆｉｇ ２３１ （配列番号：２３１）， Ｆｉｇ ２３３ （配列番号：２３３）， Ｆｉｇ ２３５ （配列番号：２３５）， Ｆｉｇ ２３７ （配列番号：２３７）， Ｆｉｇ ２３９ （配列番号：２３９）， Ｆｉｇ ２４１ （配列番号：２４１）， Ｆｉｇ ２４３ （配列番号：２４３）， Ｆｉｇ ２４５ （配列番号：２４５）， Ｆｉｇ ２４７ （配列番号：２４７）， Ｆｉｇ ２４９ （配列番号：２４９）， Ｆｉｇ ２５１ （配列番号：２５１）， Ｆｉｇ ２５３ （配列番号：２５３）， Ｆｉｇ ２５５ （配列番号：２５５）， Ｆｉｇ ２５７ （配列番号：２５７）， Ｆｉｇ ２５９ （配列番号：２５９）， Ｆｉｇ ２６１ （配列番号：２６１）， Ｆｉｇ ２６３ （配列番号：２６３）， Ｆｉｇ ２６５ （配列番号：２６５）， Ｆｉｇ ２６７ （配列番号：２６７）， Ｆｉｇ ２６９ （配列番号：２６９）， Ｆｉｇ ２７１ （配列番号：２７１）， Ｆｉｇ ２７３ （配列番号：２７３）， Ｆｉｇ ２７５ （配列番号：２７５）， Ｆｉｇ ２７７ （配列番号：２７７）， Ｆｉｇ ２７９ （配列番号：２７９），  Ｆｉｇ ２８１ （配列番号：２８１）， Ｆｉｇ ２８３ （配列番号：２８３）， Ｆｉｇ ２８５ （配列番号：２８５）， Ｆｉｇ ２８７ （配列番号：２８７）， Ｆｉｇｓ ２８９Ａ−２８９Ｂ （配列番号：２８９）， Ｆｉｇ ２９１ （配列番号：２９１）， Ｆｉｇ ２９３ （配列番号：２９３）， Ｆｉｇ ２９５ （配列番号：２９５）， Ｆｉｇ ２９７ （配列番号：２９７）， Ｆｉｇ ２９９ （配列番号：２９９）， Ｆｉｇ ３０１ （配列番号：３０１）， Ｆｉｇ ３０３ （配列番号：３０３）， Ｆｉｇ ３０５ （配列番号：３０５）， Ｆｉｇ ３０７ （配列番号：３０７）， Ｆｉｇ ３０９ （配列番号：３０９）， Ｆｉｇｓ ３１１Ａ−３１１Ｂ （配列番号：３１１）， Ｆｉｇ ３１３ （配列番���：３１３）， Ｆｉｇ ３１５ （配列番号：３１５）， Ｆｉｇ ３１７ （配列番号：３１７）， Ｆｉｇ ３１９ （配列番号：３１９）， Ｆｉｇ ３２１ （配列番号：３２１）， Ｆｉｇ ３２３ （配列番号：３２３）， Ｆｉｇ ３２５ （配列番号：３２５）， Ｆｉｇ ３２７ （配列番号：３２７）， Ｆｉｇ ３２９ （配列番号：３２９）， Ｆｉｇ ３３１ （配列番号：３３１）， Ｆｉｇ ３３３ （配列番号：３３３）， Ｆｉｇ ３３５ （配列番号：３３５）， Ｆｉｇ ３３７ （配列番号：３３７）， Ｆｉｇ ３３９ （配列番号：３３９）， Ｆｉｇ ３４１ （配列番号：３４１）， Ｆｉｇ ３４３ （配列番号：３４３）， Ｆｉｇ ３４５ （配列番号：３４５）， Ｆｉｇ ３４７ （配列番号：３４７）， Ｆｉｇ ３４９ （配列番号：３４９）， Ｆｉｇｓ ３５１Ａ−３５１Ｂ （配列番号：３５１）， Ｆｉｇ ３５３ （配列番号：３５３）， Ｆｉｇ ３５５ （配列番号：３５５）， Ｆｉｇ ３５７ （配列番号：３５７）， Ｆｉｇ ３５９ （配列番号：３５９）， Ｆｉｇ ３６１ （配列番号：３６１）， Ｆｉｇ ３６３ （配列番号：３６３）， Ｆｉｇ ３６５ （配列番号：３６５）， Ｆｉｇ ３６７ （配列番号：３６７）， Ｆｉｇ ３６９ （配列番号：３６９）， Ｆｉｇ ３７１ （配列番号：３７１）及びＦｉｇ ３７３ （配列番号：３７３）中に示されるヌクレオチド配列からなるグループから選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する単離された核酸分子。
【請求項３】
Ｆｉｇ １ （配列番号：１）， Ｆｉｇ ３ （配列番号：３）， Ｆｉｇ ５ （配列番号：５）， Ｆｉｇ ７ （配列番号：７）， Ｆｉｇ ９ （配列番号：９）， Ｆｉｇ １１ （配列番号：１１）， Ｆｉｇ １３ （配列番号：１３）， Ｆｉｇ １５ （配列番号：１５）， Ｆｉｇ １７ （配列番号：１７）， Ｆｉｇ １９ （配列番号：１９）， Ｆｉｇ ２１ （配列番号：２１）， Ｆｉｇ ２３ （配列番号：２３）， Ｆｉｇ ２５ （配列番号：２５）， Ｆｉｇ ２７ （配列番号：２７）， Ｆｉｇ ２９ （配列番号：２９）， Ｆｉｇ ３１ （配列番号：３１）， Ｆｉｇ ３３ （配列番号：３３）， Ｆｉｇ ３５ （配列番号：３５）， Ｆｉｇ ３７ （配列番号：３７）， Ｆｉｇ ３９ （配列番号：３９）， Ｆｉｇ ４１ （配列番号：４１）， Ｆｉｇ ４３ （配列番号：４３）， Ｆｉｇ ４５ （配列番号：４５）， Ｆｉｇ ４７ （配列番号：４７）， Ｆｉｇ ４９ （配列番号：４９）， Ｆｉｇ ５１ （配列番号：５１）， Ｆｉｇ ５３ （配列番号：５３）， Ｆｉｇ ５５ （配列番号：５５）， Ｆｉｇ ５７ （配列番号：５７）， Ｆｉｇ ５９ （配列番号：５９）， Ｆｉｇ ６１ （配列番号：６１）， Ｆｉｇ ６３ （配列番号：６３）， Ｆｉｇ ６５ （配列番号：６５）， Ｆｉｇ ６７ （配列番号：６７）， Ｆｉｇ ６９ （配列番号：６９）， Ｆｉｇ ７１ （配列番号：７１）， Ｆｉｇ ７３ （配列番号：７３）， Ｆｉｇｓ ７５Ａ−７５Ｂ （配列番号：７５）， Ｆｉｇ ７７ （配列番号：７７）， Ｆｉｇ ７９ （配列番号：７９），  Ｆｉｇ ８１ （配列番号：８１）， Ｆｉｇ ８３ （配列番号：８３）， Ｆｉｇ ８５ （配列番号：８５）， Ｆｉｇ ８７ （配列番号：８７）， Ｆｉｇ ８９ （配列番号：８９）， Ｆｉｇ ９１ （配列番号：９１）， Ｆｉｇ ９３ （配列番号：９３）， Ｆｉｇ ９５ （配列番号：９５）， Ｆｉｇ ９７ （配列番号：９７）， Ｆｉｇ ９９ （配列番号：９９）， Ｆｉｇ １０１ （配列番号：１０１）， Ｆｉｇ １０３ （配列番号：１０３）， Ｆｉｇ １０５ （配列番号：１０５）， Ｆｉｇ １０７ （配列番号：１０７）， Ｆｉｇ １０９ （配列番号：１０９）， Ｆｉｇ １１１ （配列番号：１１１）， Ｆｉｇ １１３ （配列番号：１１３）， Ｆｉｇ １１５ （配列番号：１１５）， Ｆｉｇ １１７ （配列番号：１１７）， Ｆｉｇ １１９ （配列番号：１１９）， Ｆｉｇ １２１ （配列番号：１２１）， Ｆｉｇ １２３ （配列番号：１２３）， Ｆｉｇ １２５ （配列番号：１２５）， Ｆｉｇ １２７ （配列番号：１２７）， Ｆｉｇ １２９ （配列番号：１２９）， Ｆｉｇ １３１ （配列番号：１３１）， Ｆｉｇ １３３ （配列番号：１３３）， Ｆｉｇ １３５ （配列番号：１３５）， Ｆｉｇ １３７ （配列番号：１３７）， Ｆｉｇ １３９ （配列番号：１３９）， Ｆｉｇ １４１ （配列番号：１４１）， Ｆｉｇ １４３ （配列番号：１４３）， Ｆｉｇ １４５ （配列番号：１４５）， Ｆｉｇ １４７ （配列番号：１４７）， Ｆｉｇ １４９ （配列番号：１４９）， Ｆｉｇ １５１ （配列番号：１５１）， Ｆｉｇ １５３ （配列番号：１５３）， Ｆｉｇ １５５ （配列番号：１５５）， Ｆｉｇ １５７ （配列番号：１５７）， Ｆｉｇ １５９ （配列番号：１５９）， Ｆｉｇ １６１ （配列番号：１６１）， Ｆｉｇ １６３ （配列番号：１６３）， Ｆｉｇ １６５ （配列番号：１６５）， Ｆｉｇ １６７ （配列番号：１６７）， Ｆｉｇ １６９ （配列番号：１６９）， Ｆｉｇ １７１ （配列番号：１７１）， Ｆｉｇ １７３ （配列番号：１７３）， Ｆｉｇ １７５ （配列番号：１７５）， Ｆｉｇ １７７ （配列番号：１７７）， Ｆｉｇ １７９ （配列番号：１７９），  Ｆｉｇ １８１ （配列番号：１８１）， Ｆｉｇ １８３ （配列番号：１８３）， Ｆｉｇ １８５ （配列番号：１８５）， Ｆｉｇ １８７ （配列番号：１８７）， Ｆｉｇ １８９ （配列番号：１８９）， Ｆｉｇ １９１ （配列番号：１９１）， Ｆｉｇ １９３ （配列番号：１９３）， Ｆｉｇ １９５ （配列番号：１９５）， Ｆｉｇ １９７ （配列番号：１９７）， Ｆｉｇ １９９ （配列番号：１９９）， Ｆｉｇ ２０１ （配列番号：２０１）， Ｆｉｇ ２０３ （配列番号：２０３）， Ｆｉｇ ２０５ （配列番号：２０５）， Ｆｉｇ ２０７ （配列番号：２０７）， Ｆｉｇ ２０９ （配列番号：２０９）， Ｆｉｇ ２１１ （配列番号：２１１）， Ｆｉｇ ２１３ （配列番号：２１３）， Ｆｉｇ ２１５ （配列番号：２１５）， Ｆｉｇ ２１７ （配列番号：２１７）， Ｆｉｇ ２１９ （配列番号：２１９）， Ｆｉｇ ２２１ （配列番号：２２１）， Ｆｉｇ ２２３ （配列番号：２２３）， Ｆｉｇ ２２５ （配列番号：２２５）， Ｆｉｇ ２２７ （配列番号：２２７）， Ｆｉｇ ２２９ （配列番号：２２９）， Ｆｉｇ ２３１ （配列番号：２３１）， Ｆｉｇ ２３３ （配列番号：２３３）， Ｆｉｇ ２３５ （配列番号：２３５）， Ｆｉｇ ２３７ （配列番号：２３７）， Ｆｉｇ ２３９ （配列番号：２３９）， Ｆｉｇ ２４１ （配列番号：２４１）， Ｆｉｇ ２４３ （配列番号：２４３）， Ｆｉｇ ２４５ （配列番号：２４５）， Ｆｉｇ ２４７ （配列番号：２４７）， Ｆｉｇ ２４９ （配列番号：２４９）， Ｆｉｇ ２５１ （配列番号：２５１）， Ｆｉｇ ２５３ （配列番号：２５３）， Ｆｉｇ ２５５ （配列番号：２５５）， Ｆｉｇ ２５７ （配列番号：２５７）， Ｆｉｇ ２５９ （配列番号：２５９）， Ｆｉｇ ２６１ （配列番号：２６１）， Ｆｉｇ ２６３ （配列番号：２６３）， Ｆｉｇ ２６５ （配列番号：２６５）， Ｆｉｇ ２６７ （配列番号：２６７）， Ｆｉｇ ２６９ （配列番号：２６９）， Ｆｉｇ ２７１ （配列番号：２７１）， Ｆｉｇ ２７３ （配列番号：２７３）， Ｆｉｇ ２７５ （配列番号：２７５）， Ｆｉｇ ２７７ （配列番号：２７７）， Ｆｉｇ ２７９ （配列番号：２７９），  Ｆｉｇ ２８１ （配列番号：２８１）， Ｆｉｇ ２８３ （配列番号：２８３）， Ｆｉｇ ２８５ （配列番号：２８５）， Ｆｉｇ ２８７ （配列番号：２８７）， Ｆｉｇｓ ２８９Ａ−２８９Ｂ （配列番号：２８９）， Ｆｉｇ ２９１ （配列番号：２９１）， Ｆｉｇ ２９３ （配列番号：２９３）， Ｆｉｇ ２９５ （配列番号：２９５）， Ｆｉｇ ２９７ （配列番号：２９７）， Ｆｉｇ ２９９ （配列番号：２９９）， Ｆｉｇ ３０１ （配列番号：３０１）， Ｆｉｇ ３０３ （配列番号：３０３）， Ｆｉｇ ３０５ （配列番号：３０５）， Ｆｉｇ ３０７ （配列番号：３０７）， Ｆｉｇ ３０９ （配列番号：３０９）， Ｆｉｇｓ ３１１Ａ−３１１Ｂ （配列番号：３１１）， Ｆｉｇ ３１３ （配列番���：３１３）， Ｆｉｇ ３１５ （配列番号：３１５）， Ｆｉｇ ３１７ （配列番号：３１７）， Ｆｉｇ ３１９ （配列番号：３１９）， Ｆｉｇ ３２１ （配列番号：３２１）， Ｆｉｇ ３２３ （配列番号：３２３）， Ｆｉｇ ３２５ （配列番号：３２５）， Ｆｉｇ ３２７ （配列番号：３２７）， Ｆｉｇ ３２９ （配列番号：３２９）， Ｆｉｇ ３３１ （配列番号：３３１）， Ｆｉｇ ３３３ （配列番号：３３３）， Ｆｉｇ ３３５ （配列番号：３３５）， Ｆｉｇ ３３７ （配列番号：３３７）， Ｆｉｇ ３３９ （配列番号：３３９）， Ｆｉｇ ３４１ （配列番号：３４１）， Ｆｉｇ ３４３ （配列番号：３４３）， Ｆｉｇ ３４５ （配列番号：３４５）， Ｆｉｇ ３４７ （配列番号：３４７）， Ｆｉｇ ３４９ （配列番号：３４９）， Ｆｉｇｓ ３５１Ａ−３５１Ｂ （配列番号：３５１）， Ｆｉｇ ３５３ （配列番号：３５３）， Ｆｉｇ ３５５ （配列番号：３５５）， Ｆｉｇ ３５７ （配列番号：３５７）， Ｆｉｇ ３５９ （配列番号：３５９）， Ｆｉｇ ３６１ （配列番号：３６１）， Ｆｉｇ ３６３ （配列番号：３６３）， Ｆｉｇ ３６５ （配列番号：３６５）， Ｆｉｇ ３６７ （配列番号：３６７）， Ｆｉｇ ３６９ （配列番号：３６９）， Ｆｉｇ ３７１ （配列番号：３７１）及びＦｉｇ ３７３ （配列番号：３７３）中に示されるヌクレオチド配列の全長コード化配列からなるグループから選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する単離された核酸分子。
【請求項４】
表７に示されるいずれかのＡＴＣＣアクセッション番号の下、寄託されたＤＮＡの全長コード化配列と少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する単離された核酸分子。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸を含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項７】
前記細胞がＣＨＯ細胞である請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
前記細胞が大腸菌である請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項９】
前記細胞が酵母細胞である請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
前記ＰＲＯポリペプチドの発現に適する条件下で請求項６に記載の宿主細胞を培養し、前記ＰＲＯポリペプチドを細胞培養物から回収することを含むＰＲＯポリペプチドを生産する方法。
【請求項１１】
Ｆｉｇ ２ （配列番号：２）， Ｆｉｇ ４ （配列番号：４）， Ｆｉｇ ６ （配列番号：６）， Ｆｉｇ ８ （配列番号：８）， Ｆｉｇ １０ （配列番号：１０）， Ｆｉｇ １２ （配列番号：１２）， Ｆｉｇ １４ （配列番号：１４）， Ｆｉｇ １６ （配列番号：１６）， Ｆｉｇ １８ （配列番号：１８）， Ｆｉｇ ２０ （配列番号：２０）， Ｆｉｇ ２２ （配列番号：２２）， Ｆｉｇ ２４ （配列番号：２４）， Ｆｉｇ ２６ （配列番号：２６）， Ｆｉｇ ２８ （配列番号：２８）， Ｆｉｇ ３０ （配列番号：３０）， Ｆｉｇ ３２ （配列番号：３２）， Ｆｉｇ ３４ （配列番号：３４）， Ｆｉｇ ３６ （配列番号：３６）， Ｆｉｇ ３８ （配列番号：３８）， Ｆｉｇ ４０ （配列番号：４０）， Ｆｉｇ ４２ （配列番号：４２）， Ｆｉｇ ４４ （配列番号：４４）， Ｆｉｇ ４６ （配列番号：４６）， Ｆｉｇ ４８ （配列番号：４８）， Ｆｉｇ ５０ （配列番号：５０）， Ｆｉｇ ５２ （配列番号：５２）， Ｆｉｇ ５４ （配列番号：５４）， Ｆｉｇ ５６ （配列番号：５６）， Ｆｉｇ ５８ （配列番号：５８）， Ｆｉｇ ６０ （配列番号：６０）， Ｆｉｇ ６２ （配列番号：６２）， Ｆｉｇ ６４ （配列番号：６４）， Ｆｉｇ ６６ （配列番号：６６）， Ｆｉｇ ６８ （配列番号：６８）， Ｆｉｇ ７０ （配列番号：７０）， Ｆｉｇ ７２ （配列番号：７２）， Ｆｉｇ ７４ （配列番号：７４）， Ｆｉｇ ７６ （配列番号：７６）， Ｆｉｇ ７８ （配列番号：７８）， Ｆｉｇ ８０ （配列番号：８０），  Ｆｉｇ ８２ （配列番号：８２）， Ｆｉｇ ８４ （配列番号：８４）， Ｆｉｇ ８６ （配列番号：８６）， Ｆｉｇ ８８ （配列番号：８８）， Ｆｉｇ ９０ （配列番号：９０）， Ｆｉｇ ９２ （配列番号：９２）， Ｆｉｇ ９４ （配列番号：９４）， Ｆｉｇ ９６ （配列番号：９６）， Ｆｉｇ ９８ （配列番号：９８）， Ｆｉｇ １００ （配列番号：１００）， Ｆｉｇ １０２ （配列番号：１０２）， Ｆｉｇ １０４ （配列番号：１０４）， Ｆｉｇ １０６ （配列番号：１０６）， Ｆｉｇ １０８ （配列番号：１０８）， Ｆｉｇ １１０ （配列番号：１１０）， Ｆｉｇ １１２ （配列番号：１１２）， Ｆｉｇ １１４ （配列番号：１１４）， Ｆｉｇ １１６ （配列番号：１１６）， Ｆｉｇ １１８ （配列番号：１１８）， Ｆｉｇ １２０ （配列番号：１２０）， Ｆｉｇ １２２ （配列番号：１２２）， Ｆｉｇ １２４ （配列番号：１２４）， Ｆｉｇ １２６ （配列番号：１２６）， Ｆｉｇ １２８ （配列番号：１２８）， Ｆｉｇ １３０ （配列番号：１３０）， Ｆｉｇ １３２ （配列番号：１３２）， Ｆｉｇ １３４ （配列番号：１３４）， Ｆｉｇ １３６ （配列番号：１３６）， Ｆｉｇ １３８ （配列番号：１３８）， Ｆｉｇ １４０ （配列番号：１４０）， Ｆｉｇ １４２ （配列番号：１４２）， Ｆｉｇ １４４ （配列番号：１４４）， Ｆｉｇ １４６ （配列番号：１４６）， Ｆｉｇ １４８ （配列番号：１４８）， Ｆｉｇ １５０ （配列番号：１５０）， Ｆｉｇ １５２ （配列番号：１５２）， Ｆｉｇ １５４ （配列番号：１５４）， Ｆｉｇ １５６ （配列番号：１５６）， Ｆｉｇ １５８ （配列番号：１５８）， Ｆｉｇ １６０ （配列番号：１６０）， Ｆｉｇ １６２ （配列番号：１６２）， Ｆｉｇ １６４ （配列番号：１６４）， Ｆｉｇ １６６ （配列番号：１６６）， Ｆｉｇ １６８ （配列番号：１６８）， Ｆｉｇ １７０ （配列番号：１７０）， Ｆｉｇ １７２ （配列番号：１７２）， Ｆｉｇ １７４ （配列番号：１７４）， Ｆｉｇ １７６ （配列番号：１７６）， Ｆｉｇ １７８ （配列番号：１７８）， Ｆｉｇ １８０ （配列番号：１８０），  Ｆｉｇ １８２ （配列番号：１８２）， Ｆｉｇ １８４ （配列番号：１８４）， Ｆｉｇ １８６ （配列番号：１８６）， Ｆｉｇ １８８ （配列番号：１８８）， Ｆｉｇ １９０ （配列番号：１９０）， Ｆｉｇ １９２ （配列番号：１９２）， Ｆｉｇ １９４ （配列番号：１９４）， Ｆｉｇ １９６ （配列番号：１９６）， Ｆｉｇ １９８ （配列番号：１９８）， Ｆｉｇ ２００ （配列番号：２００）， Ｆｉｇ ２０２ （配列番号：２０２）， Ｆｉｇ ２０４ （配列番号：２０４）， Ｆｉｇ ２０６ （配列番号：２０６）， Ｆｉｇ ２０８ （配列番号：２０８）， Ｆｉｇ ２１０ （配列番号：２１０）， Ｆｉｇ ２１２ （配列番号：２１２）， Ｆｉｇ ２１４ （配列番号：２１４）， Ｆｉｇ ２１６ （配列番号：２１６）， Ｆｉｇ ２１８ （配列番号：２１８）， Ｆｉｇ ２２０ （配列番号：２２０）， Ｆｉｇ ２２２ （配列番号：２２２）， Ｆｉｇ ２２４ （配列番号：２２４）， Ｆｉｇ ２２６ （配列番号：２２６）， Ｆｉｇ ２２８ （配列番号：２２８）， Ｆｉｇ ２３０ （配列番号：２３０）， Ｆｉｇ ２３２ （配列番号：２３２）， Ｆｉｇ ２３４ （配列番号：２３４）， Ｆｉｇ ２３６ （配列番号：２３６）， Ｆｉｇ ２３８ （配列番号：２３８）， Ｆｉｇ ２４０ （配列番号：２４０）， Ｆｉｇ ２４２ （配列番号：２４２）， Ｆｉｇ ２４４ （配列番号：２４４）， Ｆｉｇ ２４６ （配列番号：２４６）， Ｆｉｇ ２４８ （配列番号：２４８）， Ｆｉｇ ２５０ （配列番号：２５０）， Ｆｉｇ ２５２ （配列番号：２５２）， Ｆｉｇ ２５４ （配列番号：２５４）， Ｆｉｇ ２５６ （配列番号：２５６）， Ｆｉｇ ２５８ （配列番号：２５８）， Ｆｉｇ ２６０ （配列番号：２６０）， Ｆｉｇ ２６２ （配列番号：２６２）， Ｆｉｇ ２６４ （配列番号：２６４）， Ｆｉｇ ２６６ （配列番号：２６６）， Ｆｉｇ ２６８ （配列番号：２６８）， Ｆｉｇ ２７０ （配列番号：２７０）， Ｆｉｇ ２７２ （配列番号：２７２）， Ｆｉｇ ２７４ （配列番号：２７４）， Ｆｉｇ ２７６ （配列番号：２７６）， Ｆｉｇ ２７８ （配列番号：２７８）， Ｆｉｇ ２８０ （配列番号：２８０），  Ｆｉｇ ２８２ （配列番号：２８２）， Ｆｉｇ ２８４ （配列番号：２８４）， Ｆｉｇ ２８６ （配列番号：２８６）， Ｆｉｇ ２８８ （配列番号：２８８）， Ｆｉｇ ２９０ （配列番号：２９０）， Ｆｉｇ ２９２ （配列番号：２９２）， Ｆｉｇ ２９４ （配列番号：２９４）， Ｆｉｇ ２９６ （配列番号：２９６）， Ｆｉｇ ２９８ （配列番号：２９８）， Ｆｉｇ ３００ （配列番号：３００）， Ｆｉｇ ３０２ （配列番号：３０２）， Ｆｉｇ ３０４ （配列番号：３０４）， Ｆｉｇ ３０６ （配列番号：３０６）， Ｆｉｇ ３０８ （配列番号：３０８）， Ｆｉｇ ３１０ （配列番号：３１０）， Ｆｉｇ ３１２ （配列番号：３１２）， Ｆｉｇ ３１４ （配列番号：３１４）， Ｆｉｇ ３１６ （配���番号：３１６）， Ｆｉｇ ３１８ （配列番号：３１８）， Ｆｉｇ ３２０ （配列番号：３２０）， Ｆｉｇ ３２２ （配列番号：３２２）， Ｆｉｇ ３２４ （配列番号：３２４）， Ｆｉｇ ３２６ （配列番号：３２６）， Ｆｉｇ ３２８ （配列番号：３２８）， Ｆｉｇ ３３０ （配列番号：３３０）， Ｆｉｇ ３３２ （配列番号：３３２）， Ｆｉｇ ３３４ （配列番号：３３４）， Ｆｉｇ ３３６ （配列番号：３３６）， Ｆｉｇ ３３８ （配列番号：３３８）， Ｆｉｇ ３４０ （配列番号：３４０）， Ｆｉｇ ３４２ （配列番号：３４２）， Ｆｉｇ ３４４ （配列番号：３４４）， Ｆｉｇ ３４６ （配列番号：３４６）， Ｆｉｇ ３４８ （配列番号：３４８）， Ｆｉｇ ３５０ （配列番号：３５０）， Ｆｉｇ ３５２ （配列番号：３５２）， Ｆｉｇ ３５４ （配列番号：３５４）， Ｆｉｇ ３５６ （配列番号：３５６）， Ｆｉｇ ３５８ （配列番号：３５８）， Ｆｉｇ ３６０ （配列番号：３６０）， Ｆｉｇ ３６２ （配列番号：３６２）， Ｆｉｇ ３６４ （配列番号：３６４）， Ｆｉｇ ３６６ （配列番号：３６６）， Ｆｉｇ ３６８ （配列番号：３６８）， Ｆｉｇ ３７０ （配列番号：３７０）， Ｆｉｇ ３７２ （配列番号：３７２） 及びＦｉｇ ３７４ （配列番号：３７４）中に示されるアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
表７に示されるいずれかのＡＴＣＣアクセッション番号の下、寄託されたＤＮＡの全長コード化配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
異種性のアミノ酸配列と融合された請求項１１に記載のポリペプチドを含むキメラ分子。
【請求項１４】
前記異種性のアミノ酸配列がエピトープタグ配列である請求項１３に記載のキメラ分子。
【請求項１５】
前記異種性のアミノ酸配列がイムノグロブリンのＦｃ領域である請求項１３に記載のキメラ分子。
【請求項１６】
請求項１１に記載のポリペプチドと特異的に結合する抗体。
【請求項１７】
前記抗体がモノクローナル抗体、ヒト化抗体又は一本鎖抗体である請求項１６に記載の抗体。
【請求項１８】
（ａ）Ｆｉｇ ２ （配列番号：２）， Ｆｉｇ ４ （配列番号：４）， Ｆｉｇ ６ （配列番号：６）， Ｆｉｇ ８ （配列番号：８）， Ｆｉｇ １０ （配列番号：１０）， Ｆｉｇ １２ （配列番号：１２）， Ｆｉｇ １４ （配列番号：１４）， Ｆｉｇ １６ （配列番号：１６）， Ｆｉｇ １８ （配列番号：１８）， Ｆｉｇ ２０ （配列番号：２０）， Ｆｉｇ ２２ （配列番号：２２）， Ｆｉｇ ２４ （配列番号：２４）， Ｆｉｇ ２６ （配列番号：２６）， Ｆｉｇ ２８ （配列番号：２８）， Ｆｉｇ ３０ （配列番号：３０）， Ｆｉｇ ３２ （配列番号：３２）， Ｆｉｇ ３４ （配列番号：３４）， Ｆｉｇ ３６ （配列番号：３６）， Ｆｉｇ ３８ （配列番号：３８）， Ｆｉｇ ４０ （配列番号：４０）， Ｆｉｇ ４２ （配列番号：４２）， Ｆｉｇ ４４ （配列番号：４４）， Ｆｉｇ ４６ （配列番号：４６）， Ｆｉｇ ４８ （配列番号：４８）， Ｆｉｇ ５０ （配列番号：５０）， Ｆｉｇ ５２ （配列番号：５２）， Ｆｉｇ ５４ （配列番号：５４）， Ｆｉｇ ５６ （配列番号：５６）， Ｆｉｇ ５８ （配列番号：５８）， Ｆｉｇ ６０ （配列番号：６０）， Ｆｉｇ ６２ （配列番号：６２）， Ｆｉｇ ６４ （配列番号：６４）， Ｆｉｇ ６６ （配列番号：６６）， Ｆｉｇ ６８ （配列番号：６８）， Ｆｉｇ ７０ （配列番号：７０）， Ｆｉｇ ７２ （配列番号：７２）， Ｆｉｇ ７４ （配列番号：７４）， Ｆｉｇ ７６ （配列番号：７６）， Ｆｉｇ ７８ （配列番号：７８）， Ｆｉｇ ８０ （配列番号：８０），  Ｆｉｇ ８２ （配列番号：８２）， Ｆｉｇ ８４ （配列番号：８４）， Ｆｉｇ ８６ （配列番号：８６）， Ｆｉｇ ８８ （配列番号：８８）， Ｆｉｇ ９０ （配列番号：９０）， Ｆｉｇ ９２ （配列番号：９２）， Ｆｉｇ ９４ （配列番号：９４）， Ｆｉｇ ９６ （配列番号：９６）， Ｆｉｇ ９８ （配列番号：９８）， Ｆｉｇ １００ （配列番号：１００）， Ｆｉｇ １０２ （配列番号：１０２）， Ｆｉｇ １０４ （配列番号：１０４）， Ｆｉｇ １０６ （配列番号：１０６）， Ｆｉｇ １０８ （配列番号：１０８）， Ｆｉｇ １１０ （配列番号：１１０）， Ｆｉｇ １１２ （配列番号：１１２）， Ｆｉｇ １１４ （配列番号：１１４）， Ｆｉｇ １１６ （配列番号：１１６）， Ｆｉｇ １１８ （配列番号：１１８）， Ｆｉｇ １２０ （配列番号：１２０）， Ｆｉｇ １２２ （配列番号：１２２）， Ｆｉｇ １２４ （配列番号：１２４）， Ｆｉｇ １２６ （配列番号：１２６）， Ｆｉｇ １２８ （配列番号：１２８）， Ｆｉｇ １３０ （配列番号：１３０）， Ｆｉｇ １３２ （配列番号：１３２）， Ｆｉｇ １３４ （配列番号：１３４）， Ｆｉｇ １３６ （配列番号：１３６）， Ｆｉｇ １３８ （配列番号：１３８）， Ｆｉｇ １４０ （配列番号：１４０）， Ｆｉｇ １４２ （配列番号：１４２）， Ｆｉｇ １４４ （配列番号：１４４）， Ｆｉｇ １４６ （配列番号：１４６）， Ｆｉｇ １４８ （配列番号：１４８）， Ｆｉｇ １５０ （配列番号：１５０）， Ｆｉｇ １５２ （配列番号：１５２）， Ｆｉｇ １５４ （配列番号：１５４）， Ｆｉｇ １５６ （配列番号：１５６）， Ｆｉｇ １５８ （配列番号：１５８）， Ｆｉｇ １６０ （配列番号：１６０）， Ｆｉｇ １６２ （配列番号：１６２）， Ｆｉｇ １６４ （配列番号：１６４）， Ｆｉｇ １６６ （配列番号：１６６）， Ｆｉｇ １６８ （配列番号：１６８）， Ｆｉｇ １７０ （配列番号：１７０）， Ｆｉｇ １７２ （配列番号：１７２）， Ｆｉｇ １７４ （配列番号：１７４）， Ｆｉｇ １７６ （配列番号：１７６）， Ｆｉｇ １７８ （配列番号：１７８）， Ｆｉｇ １８０ （配列番号：１８０），  Ｆｉｇ １８２ （配列番号：１８２）， Ｆｉｇ １８４ （配列番号：１８４）， Ｆｉｇ １８６ （配列番号：１８６）， Ｆｉｇ １８８ （配列番号：１８８）， Ｆｉｇ １９０ （配列番号：１９０）， Ｆｉｇ １９２ （配列番号：１９２）， Ｆｉｇ １９４ （配列番号：１９４）， Ｆｉｇ １９６ （配列番号：１９６）， Ｆｉｇ １９８ （配列番号：１９８）， Ｆｉｇ ２００ （配列番号：２００）， Ｆｉｇ ２０２ （配列番号：２０２）， Ｆｉｇ ２０４ （配列番号：２０４）， Ｆｉｇ ２０６ （配列番号：２０６）， Ｆｉｇ ２０８ （配列番号：２０８）， Ｆｉｇ ２１０ （配列番号：２１０）， Ｆｉｇ ２１２ （配列番号：２１２）， Ｆｉｇ ２１４ （配列番号：２１４）， Ｆｉｇ ２１６ （配列番号：２１６）， Ｆｉｇ ２１８ （配列番号：２１８）， Ｆｉｇ ２２０ （配列番号：２２０）， Ｆｉｇ ２２２ （配列番号：２２２）， Ｆｉｇ ２２４ （配列番号：２２４）， Ｆｉｇ ２２６ （配列番号：２２６）， Ｆｉｇ ２２８ （配列番号：２２８）， Ｆｉｇ ２３０ （配列番号：２３０）， Ｆｉｇ ２３２ （配列番号：２３２）， Ｆｉｇ ２３４ （配列番号：２３４）， Ｆｉｇ ２３６ （配列番号：２３６）， Ｆｉｇ ２３８ （配列番号：２３８）， Ｆｉｇ ２４０ （配列番号：２４０）， Ｆｉｇ ２４２ （配列番号：２４２）， Ｆｉｇ ２４４ （配列番号：２４４）， Ｆｉｇ ２４６ （配列番号：２４６）， Ｆｉｇ ２４８ （配列番号：２４８）， Ｆｉｇ ２５０ （配列番号：２５０）， Ｆｉｇ ２５２ （配列番号：２５２）， Ｆｉｇ ２５４ （配列番号：２５４）， Ｆｉｇ ２５６ （配列番号：２５６）， Ｆｉｇ ２５８ （配列番号：２５８）， Ｆｉｇ ２６０ （配列番号：２６０）， Ｆｉｇ ２６２ （配列番号：２６２）， Ｆｉｇ ２６４ （配列番号：２６４）， Ｆｉｇ ２６６ （配列番号：２６６）， Ｆｉｇ ２６８ （配列番号：２６８）， Ｆｉｇ ２７０ （配列番号：２７０）， Ｆｉｇ ２７２ （配列番号：２７２）， Ｆｉｇ ２７４ （配列番号：２７４）， Ｆｉｇ ２７６ （配列番号：２７６）， Ｆｉｇ ２７８ （配列番号：２７８）， Ｆｉｇ ２８０ （配列番号：２８０），  Ｆｉｇ ２８２ （配列番号：２８２）， Ｆｉｇ ２８４ （配列番号：２８４）， Ｆｉｇ ２８６ （配列番号：２８６）， Ｆｉｇ ２８８ （配列番号：２８８）， Ｆｉｇ ２９０ （配列番号：２９０）， Ｆｉｇ ２９２ （配列番号：２９２）， Ｆｉｇ ２９４ （配列番号：２９４）， Ｆｉｇ ２９６ （配列番号：２９６）， Ｆｉｇ ２９８ （配列番号：２９８）， Ｆｉｇ ３００ （配列番号：３００）， Ｆｉｇ ３０２ （配列番号：３０２）， Ｆｉｇ ３０４ （配列番号：３０４）， Ｆｉｇ ３０６ （配列番号：３０６）， Ｆｉｇ ３０８ （配列番号：３０８）， Ｆｉｇ ３１０ （配列番号：３１０）， Ｆｉｇ ３１２ （配列番号：３１２）， Ｆｉｇ ３１４ （配列番号：３１４）， Ｆｉｇ ３１�� （配列番号：３１６）， Ｆｉｇ ３１８ （配列番号：３１８）， Ｆｉｇ ３２０ （配列番号：３２０）， Ｆｉｇ ３２２ （配列番号：３２２）， Ｆｉｇ ３２４ （配列番号：３２４）， Ｆｉｇ ３２６ （配列番号：３２６）， Ｆｉｇ ３２８ （配列番号：３２８）， Ｆｉｇ ３３０ （配列番号：３３０）， Ｆｉｇ ３３２ （配列番号：３３２）， Ｆｉｇ ３３４ （配列番号：３３４）， Ｆｉｇ ３３６ （配列番号：３３６）， Ｆｉｇ ３３８ （配列番号：３３８）， Ｆｉｇ ３４０ （配列番号：３４０）， Ｆｉｇ ３４２ （配列番号：３４２）， Ｆｉｇ ３４４ （配列番号：３４４）， Ｆｉｇ ３４６ （配列番号：３４６）， Ｆｉｇ ３４８ （配列番号：３４８）， Ｆｉｇ ３５０ （配列番号：３５０）， Ｆｉｇ ３５２ （配列番号：３５２）， Ｆｉｇ ３５４ （配列番号：３５４）， Ｆｉｇ ３５６ （配列番号：３５６）， Ｆｉｇ ３５８ （配列番号：３５８）， Ｆｉｇ ３６０ （配列番号：３６０）， Ｆｉｇ ３６２ （配列番号：３６２）， Ｆｉｇ ３６４ （配列番号：３６４）， Ｆｉｇ ３６６ （配列番号：３６６）， Ｆｉｇ ３６８ （配列番号：３６８）， Ｆｉｇ ３７０ （配列番号：３７０）， Ｆｉｇ ３７２ （配列番号：３７２） 又はＦｉｇ ３７４ （配列番号：３７４）中に示されるポリペプチドであって、その付随するシグナルペプチドを欠くポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）Ｆｉｇ ２ （配列番号：２）， Ｆｉｇ ４ （配列番号：４）， Ｆｉｇ ６ （配列番号：６）， Ｆｉｇ ８ （配列番号：８）， Ｆｉｇ １０ （配列番号：１０）， Ｆｉｇ １２ （配列番号：１２）， Ｆｉｇ １４ （配列番号：１４）， Ｆｉｇ １６ （配列番号：１６）， Ｆｉｇ １８ （配列番号：１８）， Ｆｉｇ ２０ （配列番号：２０）， Ｆｉｇ ２２ （配列番号：２２）， Ｆｉｇ ２４ （配列番号：２４）， Ｆｉｇ ２６ （配列番号：２６）， Ｆｉｇ ２８ （配列番号：２８）， Ｆｉｇ ３０ （配列番号：３０）， Ｆｉｇ ３２ （配列番号：３２）， Ｆｉｇ ３４ （配列番号：３４）， Ｆｉｇ ３６ （配列番号：３６）， Ｆｉｇ ３８ （配列番号：３８）， Ｆｉｇ ４０ （配列番号：４０）， Ｆｉｇ ４２ （配列番号：４２）， Ｆｉｇ ４４ （配列番号：４４）， Ｆｉｇ ４６ （配列番号：４６）， Ｆｉｇ ４８ （配列番号：４８）， Ｆｉｇ ５０ （配列番号：５０）， Ｆｉｇ ５２ （配列番号：５２）， Ｆｉｇ ５４ （配列番号：５４）， Ｆｉｇ ５６ （配列番号：５６）， Ｆｉｇ ５８ （配列番号：５８）， Ｆｉｇ ６０ （配列番号：６０）， Ｆｉｇ ６２ （配列番号：６２）， Ｆｉｇ ６４ （配列番号：６４）， Ｆｉｇ ６６ （配列番号：６６）， Ｆｉｇ ６８ （配列番号：６８）， Ｆｉｇ ７０ （配列番号：７０）， Ｆｉｇ ７２ （配列番号：７２）， Ｆｉｇ ７４ （配列番号：７４）， Ｆｉｇ ７６ （配列番号：７６）， Ｆｉｇ ７８ （配列番号：７８）， Ｆｉｇ ８０ （配列番号：８０），  Ｆｉｇ ８２ （配列番号：８２）， Ｆｉｇ ８４ （配列番号：８４）， Ｆｉｇ ８６ （配列番号：８６）， Ｆｉｇ ８８ （配列番号：８８）， Ｆｉｇ ９０ （配列番号：９０）， Ｆｉｇ ９２ （配列番号：９２）， Ｆｉｇ ９４ （配列番号：９４）， Ｆｉｇ ９６ （配列番号：９６）， Ｆｉｇ ９８ （配列番号：９８）， Ｆｉｇ １００ （配列番号：１００）， Ｆｉｇ １０２ （配列番号：１０２）， Ｆｉｇ １０４ （配列番号：１０４）， Ｆｉｇ １０６ （配列番号：１０６）， Ｆｉｇ １０８ （配列番号：１０８）， Ｆｉｇ １１０ （配列番号：１１０）， Ｆｉｇ １１２ （配列番号：１１２）， Ｆｉｇ １１４ （配列番号：１１４）， Ｆｉｇ １１６ （配列番号：１１６）， Ｆｉｇ １１８ （配列番号：１１８）， Ｆｉｇ １２０ （配列番号：１２０）， Ｆｉｇ １２２ （配列番号：１２２）， Ｆｉｇ １２４ （配列番号：１２４）， Ｆｉｇ １２６ （配列番号：１２６）， Ｆｉｇ １２８ （配列番号：１２８）， Ｆｉｇ １３０ （配列番号：１３０）， Ｆｉｇ １３２ （配列番号：１３２）， Ｆｉｇ １３４ （配列番号：１３４）， Ｆｉｇ １３６ （配列番号：１３６）， Ｆｉｇ １３８ （配列番号：１３８）， Ｆｉｇ １４０ （配列番号：１４０）， Ｆｉｇ １４２ （配列番号：１４２）， Ｆｉｇ １４４ （配列番号：１４４）， Ｆｉｇ １４６ （配列番号：１４６）， Ｆｉｇ １４８ （配列番号：１４８）， Ｆｉｇ １５０ （配列番号：１５０）， Ｆｉｇ １５２ （配列番号：１５２）， Ｆｉｇ １５４ （配列番号：１５４）， Ｆｉｇ １５６ （配列番号：１５６）， Ｆｉｇ １５８ （配列番号：１５８）， Ｆｉｇ １６０ （配列番号：１６０）， Ｆｉｇ １６２ （配列番号：１６２）， Ｆｉｇ １６４ （配列番号：１６４）， Ｆｉｇ １６６ （配列番号：１６６）， Ｆｉｇ １６８ （配列番号：１６８）， Ｆｉｇ １７０ （配列番号：１７０）， Ｆｉｇ １７２ （配列番号：１７２）， Ｆｉｇ １７４ （配列番号：１７４）， Ｆｉｇ １７６ （配列番号：１７６）， Ｆｉｇ １７８ （配列番号：１７８）， Ｆｉｇ １８０ （配列番号：１８０），  Ｆｉｇ １８２ （配列番号：１８２）， Ｆｉｇ １８４ （配列番号：１８４）， Ｆｉｇ １８６ （配列番号：１８６）， Ｆｉｇ １８８ （配列番号：１８８）， Ｆｉｇ １９０ （配列番号：１９０）， Ｆｉｇ １９２ （配列番号：１９２）， Ｆｉｇ １９４ （配列番号：１９４）， Ｆｉｇ １９６ （配列番号：１９６）， Ｆｉｇ １９８ （配列番号：１９８）， Ｆｉｇ ２００ （配列番号：２００）， Ｆｉｇ ２０２ （配列番号：２０２）， Ｆｉｇ ２０４ （配列番号：２０４）， Ｆｉｇ ２０６ （配列番号：２０６）， Ｆｉｇ ２０８ （配列番号：２０８）， Ｆｉｇ ２１０ （配列番号：２１０）， Ｆｉｇ ２１２ （配列番号：２１２）， Ｆｉｇ ２１４ （配列番号：２１４）， Ｆｉｇ ２１６ （配列番号：２１６）， Ｆｉｇ ２１８ （配列番号：２１８）， Ｆｉｇ ２２０ （配列番号：２２０）， Ｆｉｇ ２２２ （配列番号：２２２）， Ｆｉｇ ２２４ （配列番号：２２４）， Ｆｉｇ ２２６ （配列番号：２２６）， Ｆｉｇ ２２８ （配列番号：２２８）， Ｆｉｇ ２３０ （配列番号：２３０）， Ｆｉｇ ２３２ （配列番号：２３２）， Ｆｉｇ ２３４ （配列番号：２３４）， Ｆｉｇ ２３６ （配列番号：２３６）， Ｆｉｇ ２３８ （配列番号：２３８）， Ｆｉｇ ２４０ （配列番号：２４０）， Ｆｉｇ ２４２ （配列番号：２４２）， Ｆｉｇ ２４４ （配列番号：２４４）， Ｆｉｇ ２４６ （配列番号：２４６）， Ｆｉｇ ２４８ （配列番号：２４８）， Ｆｉｇ ２５０ （配列番号：２５０）， Ｆｉｇ ２５２ （配列番号：２５２）， Ｆｉｇ ２５４ （配列番号：２５４）， Ｆｉｇ ２５６ （配列番号：２５６）， Ｆｉｇ ２５８ （配列番号：２５８）， Ｆｉｇ ２６０ （配列番号：２６０）， Ｆｉｇ ２６２ （配列番号：２６２）， Ｆｉｇ ２６４ （配列番号：２６４）， Ｆｉｇ ２６６ （配列番号：２６６）， Ｆｉｇ ２６８ （配列番号：２６８）， Ｆｉｇ ２７０ （配列番号：２７０）， Ｆｉｇ ２７２ （配列番号：２７２）， Ｆｉｇ ２７４ （配列番号：２７４）， Ｆｉｇ ２７６ （配列番号：２７６）， Ｆｉｇ ２７８ （配列番号：２７８）， Ｆｉｇ ２８０ （配列番号：２８０），  Ｆｉｇ ２８２ （配列番号：２８２）， Ｆｉｇ ２８４ （配列番号：２８４）， Ｆｉｇ ２８６ （配列番号：２８６）， Ｆｉｇ ２８８ （配列番号：２８８）， Ｆｉｇ ２９０ （配列番号：２９０）， Ｆｉｇ ２９２ （配列番号：２９２）， Ｆｉｇ ２９４ （配列番号：２９４）， Ｆｉｇ ２９６ （配列番号：２９６）， Ｆｉｇ ２９８ （配列番号：２９８）， Ｆｉｇ ３００ （配列番号：３００）， Ｆｉｇ ３０２ （配列番号：３０２）， Ｆｉｇ ３０４ （配列番号：３０４）， Ｆｉｇ ３０６ （配列番号：３０６）， Ｆｉｇ ３０８ （配列番号：３０８）， Ｆｉｇ ３１０ （配列番号：３１０）， Ｆｉｇ ３１２ （配列番号：３１２）， Ｆｉｇ ３１４ （配列番号：３１４）， Ｆｉｇ ３１�� （配列番号：３１６）， Ｆｉｇ ３１８ （配列番号：３１８）， Ｆｉｇ ３２０ （配列番号：３２０）， Ｆｉｇ ３２２ （配列番号：３２２）， Ｆｉｇ ３２４ （配列番号：３２４）， Ｆｉｇ ３２６ （配列番号：３２６）， Ｆｉｇ ３２８ （配列番号：３２８）， Ｆｉｇ ３３０ （配列番号：３３０）， Ｆｉｇ ３３２ （配列番号：３３２）， Ｆｉｇ ３３４ （配列番号：３３４）， Ｆｉｇ ３３６ （配列番号：３３６）， Ｆｉｇ ３３８ （配列番号：３３８）， Ｆｉｇ ３４０ （配列番号：３４０）， Ｆｉｇ ３４２ （配列番号：３４２）， Ｆｉｇ ３４４ （配列番号：３４４）， Ｆｉｇ ３４６ （配列番号：３４６）， Ｆｉｇ ３４８ （配列番号：３４８）， Ｆｉｇ ３５０ （配列番号：３５０）， Ｆｉｇ ３５２ （配列番号：３５２）， Ｆｉｇ ３５４ （配列番号：３５４）， Ｆｉｇ ３５６ （配列番号：３５６）， Ｆｉｇ ３５８ （配列番号：３５８）， Ｆｉｇ ３６０ （配列番号：３６０）， Ｆｉｇ ３６２ （配列番号：３６２）， Ｆｉｇ ３６４ （配列番号：３６４）， Ｆｉｇ ３６６ （配列番号：３６６）， Ｆｉｇ ３６８ （配列番号：３６８）， Ｆｉｇ ３７０ （配列番号：３７０）， Ｆｉｇ ３７２ （配列番号：３７２） 又はＦｉｇ ３７４ （配列番号：３７４）中に示さるポリペプチドの細胞外ドメインであって、その付随するシグナルペプチドを持つものをコードするヌクレオチド配列；又は
（ｃ）Ｆｉｇ ２ （配列番号：２）， Ｆｉｇ ４ （配列番号：４）， Ｆｉｇ ６ （配列番号：６）， Ｆｉｇ ８ （配列番号：８）， Ｆｉｇ １０ （配列番号：１０）， Ｆｉｇ １２ （配列番号：１２）， Ｆｉｇ １４ （配列番号：１４）， Ｆｉｇ １６ （配列番号：１６）， Ｆｉｇ １８ （配列番号：１８）， Ｆｉｇ ２０ （配列番号：２０）， Ｆｉｇ ２２ （配列番号：２２）， Ｆｉｇ ２４ （配列番号：２４）， Ｆｉｇ ２６ （配列番号：２６）， Ｆｉｇ ２８ （配列番号：２８）， Ｆｉｇ ３０ （配列番号：３０）， Ｆｉｇ ３２ （配列番号：３２）， Ｆｉｇ ３４ （配列番号：３４）， Ｆｉｇ ３６ （配列番号：３６）， Ｆｉｇ ３８ （配列番号：３８）， Ｆｉｇ ４０ （配列番号：４０）， Ｆｉｇ ４２ （配列番号：４２）， Ｆｉｇ ４４ （配列番号：４４）， Ｆｉｇ ４６ （配列番号：４６）， Ｆｉｇ ４８ （配列番号：４８）， Ｆｉｇ ５０ （配列番号：５０）， Ｆｉｇ ５２ （配列番号：５２）， Ｆｉｇ ５４ （配列番号：５４）， Ｆｉｇ ５６ （配列番号：５６）， Ｆｉｇ ５８ （配列番号：５８）， Ｆｉｇ ６０ （配列番号：６０）， Ｆｉｇ ６２ （配列番号：６２）， Ｆｉｇ ６４ （配列番号：６４）， Ｆｉｇ ６６ （配列番号：６６）， Ｆｉｇ ６８ （配列番号：６８）， Ｆｉｇ ７０ （配列番号：７０）， Ｆｉｇ ７２ （配列番号：７２）， Ｆｉｇ ７４ （配列番号：７４）， Ｆｉｇ ７６ （配列番号：７６）， Ｆｉｇ ７８ （配列番号：７８）， Ｆｉｇ ８０ （配列番号：８０），  Ｆｉｇ ８２ （配列番号：８２）， Ｆｉｇ ８４ （配列番号：８４）， Ｆｉｇ ８６ （配列番号：８６）， Ｆｉｇ ８８ （配列番号：８８）， Ｆｉｇ ９０ （配列番号：９０）， Ｆｉｇ ９２ （配列番号：９２）， Ｆｉｇ ９４ （配列番号：９４）， Ｆｉｇ ９６ （配列番号：９６）， Ｆｉｇ ９８ （配列番号：９８）， Ｆｉｇ １００ （配列番号：１００）， Ｆｉｇ １０２ （配列番号：１０２）， Ｆｉｇ １０４ （配列番号：１０４）， Ｆｉｇ １０６ （配列番号：１０６）， Ｆｉｇ １０８ （配列番号：１０８）， Ｆｉｇ １１０ （配列番号：１１０）， Ｆｉｇ １１２ （配列番号：１１２）， Ｆｉｇ １１４ （配列番号：１１４）， Ｆｉｇ １１６ （配列番号：１１６）， Ｆｉｇ １１８ （配列番号：１１８）， Ｆｉｇ １２０ （配列番号：１２０）， Ｆｉｇ １２２ （配列番号：１２２）， Ｆｉｇ １２４ （配列番号：１２４）， Ｆｉｇ １２６ （配列番号：１２６）， Ｆｉｇ １２８ （配列番号：１２８）， Ｆｉｇ １３０ （配列番号：１３０）， Ｆｉｇ １３２ （配列番号：１３２）， Ｆｉｇ １３４ （配列番号：１３４）， Ｆｉｇ １３６ （配列番号：１３６）， Ｆｉｇ １３８ （配列番号：１３８）， Ｆｉｇ １４０ （配列番号：１４０）， Ｆｉｇ １４２ （配列番号：１４２）， Ｆｉｇ １４４ （配列番号：１４４）， Ｆｉｇ １４６ （配列番号：１４６）， Ｆｉｇ １４８ （配列番号：１４８）， Ｆｉｇ １５０ （配列番号：１５０）， Ｆｉｇ １５２ （配列番号：１５２）， Ｆｉｇ １５４ （配列番号：１５４）， Ｆｉｇ １５６ （配列番号：１５６）， Ｆｉｇ １５８ （配列番号：１５８）， Ｆｉｇ １６０ （配列番号：１６０）， Ｆｉｇ １６２ （配列番号：１６２）， Ｆｉｇ １６４ （配列番号：１６４）， Ｆｉｇ １６６ （配列番号：１６６）， Ｆｉｇ １６８ （配列番号：１６８）， Ｆｉｇ １７０ （配列番号：１７０）， Ｆｉｇ １７２ （配列番号：１７２）， Ｆｉｇ １７４ （配列番号：１７４）， Ｆｉｇ １７６ （配列番号：１７６）， Ｆｉｇ １７８ （配列番号：１７８）， Ｆｉｇ １８０ （配列番号：１８０），  Ｆｉｇ １８２ （配列番号：１８２）， Ｆｉｇ １８４ （配列番号：１８４）， Ｆｉｇ １８６ （配列番号：１８６）， Ｆｉｇ １８８ （配列番号：１８８）， Ｆｉｇ １９０ （配列番号：１９０）， Ｆｉｇ １９２ （配列番号：１９２）， Ｆｉｇ １９４ （配列番号：１９４）， Ｆｉｇ １９６ （配列番号：１９６）， Ｆｉｇ １９８ （配列番号：１９８）， Ｆｉｇ ２００ （配列番号：２００）， Ｆｉｇ ２０２ （配列番号：２０２）， Ｆｉｇ ２０４ （配列番号：２０４）， Ｆｉｇ ２０６ （配列番号：２０６）， Ｆｉｇ ２０８ （配列番号：２０８）， Ｆｉｇ ２１０ （配列番号：２１０）， Ｆｉｇ ２１２ （配列番号：２１２）， Ｆｉｇ ２１４ （配列番号：２１４）， Ｆｉｇ ２１６ （配列番号：２１６）， Ｆｉｇ ２１８ （配列番号：２１８）， Ｆｉｇ ２２０ （配列番号：２２０）， Ｆｉｇ ２２２ （配列番号：２２２）， Ｆｉｇ ２２４ （配列番号：２２４）， Ｆｉｇ ２２６ （配列番号：２２６）， Ｆｉｇ ２２８ （配列番号：２２８）， Ｆｉｇ ２３０ （配列番号：２３０）， Ｆｉｇ ２３２ （配列番号：２３２）， Ｆｉｇ ２３４ （配列番号：２３４）， Ｆｉｇ ２３６ （配列番号：２３６）， Ｆｉｇ ２３８ （配列番号：２３８）， Ｆｉｇ ２４０ （配列番号：２４０）， Ｆｉｇ ２４２ （配列番号：２４２）， Ｆｉｇ ２４４ （配列番号：２４４）， Ｆｉｇ ２４６ （配列番号：２４６）， Ｆｉｇ ２４８ （配列番号：２４８）， Ｆｉｇ ２５０ （配列番号：２５０）， Ｆｉｇ ２５２ （配列番号：２５２）， Ｆｉｇ ２５４ （配列番号：２５４）， Ｆｉｇ ２５６ （配列番号：２５６）， Ｆｉｇ ２５８ （配列番号：２５８）， Ｆｉｇ ２６０ （配列番号：２６０）， Ｆｉｇ ２６２ （配列番号：２６２）， Ｆｉｇ ２６４ （配列番号：２６４）， Ｆｉｇ ２６６ （配列番号：２６６）， Ｆｉｇ ２６８ （配列番号：２６８）， Ｆｉｇ ２７０ （配列番号：２７０）， Ｆｉｇ ２７２ （配列番号：２７２）， Ｆｉｇ ２７４ （配列番号：２７４）， Ｆｉｇ ２７６ （配列番号：２７６）， Ｆｉｇ ２７８ （配列番号：２７８）， Ｆｉｇ ２８０ （配列番号：２８０），  Ｆｉｇ ２８２ （配列番号：２８２）， Ｆｉｇ ２８４ （配列番号：２８４）， Ｆｉｇ ２８６ （配列番号：２８６）， Ｆｉｇ ２８８ （配列番号：２８８）， Ｆｉｇ ２９０ （配列番号：２９０）， Ｆｉｇ ２９２ （配列番号：２９２）， Ｆｉｇ ２９４ （配列番号：２９４）， Ｆｉｇ ２９６ （配列番号：２９６）， Ｆｉｇ ２９８ （配列番号：２９８）， Ｆｉｇ ３００ （配列番号：３００）， Ｆｉｇ ３０２ （配列番号：３０２）， Ｆｉｇ ３０４ （配列番号：３０４）， Ｆｉｇ ３０６ （配列番号：３０６）， Ｆｉｇ ３０８ （配列番号：３０８）， Ｆｉｇ ３１０ （配列番号：３１０）， Ｆｉｇ ３１２ （配列番号：３１２）， Ｆｉｇ ３１４ （配列番号：３１４）， Ｆｉｇ ３１�� （配列番号：３１６）， Ｆｉｇ ３１８ （配列番号：３１８）， Ｆｉｇ ３２０ （配列番号：３２０）， Ｆｉｇ ３２２ （配列番号：３２２）， Ｆｉｇ ３２４ （配列番号：３２４）， Ｆｉｇ ３２６ （配列番号：３２６）， Ｆｉｇ ３２８ （配列番号：３２８）， Ｆｉｇ ３３０ （配列番号：３３０）， Ｆｉｇ ３３２ （配列番号：３３２）， Ｆｉｇ ３３４ （配列番号：３３４）， Ｆｉｇ ３３６ （配列番号：３３６）， Ｆｉｇ ３３８ （配列番号：３３８）， Ｆｉｇ ３４０ （配列番号：３４０）， Ｆｉｇ ３４２ （配列番号：３４２）， Ｆｉｇ ３４４ （配列番号：３４４）， Ｆｉｇ ３４６ （配列番号：３４６）， Ｆｉｇ ３４８ （配列番号：３４８）， Ｆｉｇ ３５０ （配列番号：３５０）， Ｆｉｇ ３５２ （配列番号：３５２）， Ｆｉｇ ３５４ （配列番号：３５４）， Ｆｉｇ ３５６ （配列番号：３５６）， Ｆｉｇ ３５８ （配列番号：３５８）， Ｆｉｇ ３６０ （配列番号：３６０）， Ｆｉｇ ３６２ （配列番号：３６２）， Ｆｉｇ ３６４ （配列番号：３６４）， Ｆｉｇ ３６６ （配列番号：３６６）， Ｆｉｇ ３６８ （配列番号：３６８）， Ｆｉｇ ３７０ （配列番号：３７０）， Ｆｉｇ ３７２ （配列番号：３７２） 又はＦｉｇ ３７４ （配列番号：３７４）中に示されるポリペプチドの細胞外ドメインであって、その付随するシグナルペプチドを欠くものをコードするヌクレオチド配列：
と少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する単離された核酸分子。
【請求項１９】
（ａ）Ｆｉｇ ２ （配列番号：２）， Ｆｉｇ ４ （配列番号：４）， Ｆｉｇ ６ （配列番号：６）， Ｆｉｇ ８ （配列番号：８）， Ｆｉｇ １０ （配列番号：１０）， Ｆｉｇ １２ （配列番号：１２）， Ｆｉｇ １４ （配列番号：１４）， Ｆｉｇ １６ （配列番号：１６）， Ｆｉｇ １８ （配列番号：１８）， Ｆｉｇ ２０ （配列番号：２０）， Ｆｉｇ ２２ （配列番号：２２）， Ｆｉｇ ２４ （配列番号：２４）， Ｆｉｇ ２６ （配列番号：２６）， Ｆｉｇ ２８ （配列番号：２８）， Ｆｉｇ ３０ （配列番号：３０）， Ｆｉｇ ３２ （配列番号：３２）， Ｆｉｇ ３４ （配列番号：３４）， Ｆｉｇ ３６ （配列番号：３６）， Ｆｉｇ ３８ （配列番号：３８）， Ｆｉｇ ４０ （配列番号：４０）， Ｆｉｇ ４２ （配列番号：４２）， Ｆｉｇ ４４ （配列番号：４４）， Ｆｉｇ ４６ （配列番号：４６）， Ｆｉｇ ４８ （配列番号：４８）， Ｆｉｇ ５０ （配列番号：５０）， Ｆｉｇ ５２ （配列番号：５２）， Ｆｉｇ ５４ （配列番号：５４）， Ｆｉｇ ５６ （配列番号：５６）， Ｆｉｇ ５８ （配列番号：５８）， Ｆｉｇ ６０ （配列番号：６０）， Ｆｉｇ ６２ （配列番号：６２）， Ｆｉｇ ６４ （配列番号：６４）， Ｆｉｇ ６６ （配列番号：６６）， Ｆｉｇ ６８ （配列番号：６８）， Ｆｉｇ ７０ （配列番号：７０）， Ｆｉｇ ７２ （配列番号：７２）， Ｆｉｇ ７４ （配列番号：７４）， Ｆｉｇ ７６ （配列番号：７６）， Ｆｉｇ ７８ （配列番号：７８）， Ｆｉｇ ８０ （配列番号：８０），  Ｆｉｇ ８２ （配列番号：８２）， Ｆｉｇ ８４ （配列番号：８４）， Ｆｉｇ ８６ （配列番号：８６）， Ｆｉｇ ８８ （配列番号：８８）， Ｆｉｇ ９０ （配列番号：９０）， Ｆｉｇ ９２ （配列番号：９２）， Ｆｉｇ ９４ （配列番号：９４）， Ｆｉｇ ９６ （配列番号：９６）， Ｆｉｇ ９８ （配列番号：９８）， Ｆｉｇ １００ （配列番号：１００）， Ｆｉｇ １０２ （配列番号：１０２）， Ｆｉｇ １０４ （配列番号：１０４）， Ｆｉｇ １０６ （配列番号：１０６）， Ｆｉｇ １０８ （配列番号：１０８）， Ｆｉｇ １１０ （配列番号：１１０）， Ｆｉｇ １１２ （配列番号：１１２）， Ｆｉｇ １１４ （配列番号：１１４）， Ｆｉｇ １１６ （配列番号：１１６）， Ｆｉｇ １１８ （配列番号：１１８）， Ｆｉｇ １２０ （配列番号：１２０）， Ｆｉｇ １２２ （配列番号：１２２）， Ｆｉｇ １２４ （配列番号：１２４）， Ｆｉｇ １２６ （配列番号：１２６）， Ｆｉｇ １２８ （配列番号：１２８）， Ｆｉｇ １３０ （配列番号：１３０）， Ｆｉｇ １３２ （配列番号：１３２）， Ｆｉｇ １３４ （配列番号：１３４）， Ｆｉｇ １３６ （配列番号：１３６）， Ｆｉｇ １３８ （配列番号：１３８）， Ｆｉｇ １４０ （配列番号：１４０）， Ｆｉｇ １４２ （配列番号：１４２）， Ｆｉｇ １４４ （配列番号：１４４）， Ｆｉｇ １４６ （配列番号：１４６）， Ｆｉｇ １４８ （配列番号：１４８）， Ｆｉｇ １５０ （配列番号：１５０）， Ｆｉｇ １５２ （配列番号：１５２）， Ｆｉｇ １５４ （配列番号：１５４）， Ｆｉｇ １５６ （配列番号：１５６）， Ｆｉｇ １５８ （配列番号：１５８）， Ｆｉｇ １６０ （配列番号：１６０）， Ｆｉｇ １６２ （配列番号：１６２）， Ｆｉｇ １６４ （配列番号：１６４）， Ｆｉｇ １６６ （配列番号：１６６）， Ｆｉｇ １６８ （配列番号：１６８）， Ｆｉｇ １７０ （配列番号：１７０）， Ｆｉｇ １７２ （配列番号：１７２）， Ｆｉｇ １７４ （配列番号：１７４）， Ｆｉｇ １７６ （配列番号：１７６）， Ｆｉｇ １７８ （配列番号：１７８）， Ｆｉｇ １８０ （配列番号：１８０），  Ｆｉｇ １８２ （配列番号：１８２）， Ｆｉｇ １８４ （配列番号：１８４）， Ｆｉｇ １８６ （配列番号：１８６）， Ｆｉｇ １８８ （配列番号：１８８）， Ｆｉｇ １９０ （配列番号：１９０）， Ｆｉｇ １９２ （配列番号：１９２）， Ｆｉｇ １９４ （配列番号：１９４）， Ｆｉｇ １９６ （配列番号：１９６）， Ｆｉｇ １９８ （配列番号：１９８）， Ｆｉｇ ２００ （配列番号：２００）， Ｆｉｇ ２０２ （配列番号：２０２）， Ｆｉｇ ２０４ （配列番号：２０４）， Ｆｉｇ ２０６ （配列番号：２０６）， Ｆｉｇ ２０８ （配列番号：２０８）， Ｆｉｇ ２１０ （配列番号：２１０）， Ｆｉｇ ２１２ （配列番号：２１２）， Ｆｉｇ ２１４ （配列番号：２１４）， Ｆｉｇ ２１６ （配列番号：２１６）， Ｆｉｇ ２１８ （配列番号：２１８）， Ｆｉｇ ２２０ （配列番号：２２０）， Ｆｉｇ ２２２ （配列番号：２２２）， Ｆｉｇ ２２４ （配列番号：２２４）， Ｆｉｇ ２２６ （配列番号：２２６）， Ｆｉｇ ２２８ （配列番号：２２８）， Ｆｉｇ ２３０ （配列番号：２３０）， Ｆｉｇ ２３２ （配列番号：２３２）， Ｆｉｇ ２３４ （配列番号：２３４）， Ｆｉｇ ２３６ （配列番号：２３６）， Ｆｉｇ ２３８ （配列番号：２３８）， Ｆｉｇ ２４０ （配列番号：２４０）， Ｆｉｇ ２４２ （配列番号：２４２）， Ｆｉｇ ２４４ （配列番号：２４４）， Ｆｉｇ ２４６ （配列番号：２４６）， Ｆｉｇ ２４８ （配列番号：２４８）， Ｆｉｇ ２５０ （配列番号：２５０）， Ｆｉｇ ２５２ （配列番号：２５２）， Ｆｉｇ ２５４ （配列番号：２５４）， Ｆｉｇ ２５６ （配列番号：２５６）， Ｆｉｇ ２５８ （配列番号：２５８）， Ｆｉｇ ２６０ （配列番号：２６０）， Ｆｉｇ ２６２ （配列番号：２６２）， Ｆｉｇ ２６４ （配列番号：２６４）， Ｆｉｇ ２６６ （配列番号：２６６）， Ｆｉｇ ２６８ （配列番号：２６８）， Ｆｉｇ ２７０ （配列番号：２７０）， Ｆｉｇ ２７２ （配列番号：２７２）， Ｆｉｇ ２７４ （配列番号：２７４）， Ｆｉｇ ２７６ （配列番号：２７６）， Ｆｉｇ ２７８ （配列番号：２７８）， Ｆｉｇ ２８０ （配列番号：２８０），  Ｆｉｇ ２８２ （配列番号：２８２）， Ｆｉｇ ２８４ （配列番号：２８４）， Ｆｉｇ ２８６ （配列番号：２８６）， Ｆｉｇ ２８８ （配列番号：２８８）， Ｆｉｇ ２９０ （配列番号：２９０）， Ｆｉｇ ２９２ （配列番号：２９２）， Ｆｉｇ ２９４ （配列番号：２９４）， Ｆｉｇ ２９６ （配列番号：２９６）， Ｆｉｇ ２９８ （配列番号：２９８）， Ｆｉｇ ３００ （配列番号：３００）， Ｆｉｇ ３０２ （配列番号：３０２）， Ｆｉｇ ３０４ （配列番号：３０４）， Ｆｉｇ ３０６ （配列番号：３０６）， Ｆｉｇ ３０８ （配列番号：３０８）， Ｆｉｇ ３１０ （配列番号：３１０）， Ｆｉｇ ３１２ （配列番号：３１２）， Ｆｉｇ ３１４ （配列番号：３１４）， Ｆｉｇ ３１�� （配列番号：３１６）， Ｆｉｇ ３１８ （配列番号：３１８）， Ｆｉｇ ３２０ （配列番号：３２０）， Ｆｉｇ ３２２ （配列番号：３２２）， Ｆｉｇ ３２４ （配列番号：３２４）， Ｆｉｇ ３２６ （配列番号：３２６）， Ｆｉｇ ３２８ （配列番号：３２８）， Ｆｉｇ ３３０ （配列番号：３３０）， Ｆｉｇ ３３２ （配列番号：３３２）， Ｆｉｇ ３３４ （配列番号：３３４）， Ｆｉｇ ３３６ （配列番号：３３６）， Ｆｉｇ ３３８ （配列番号：３３８）， Ｆｉｇ ３４０ （配列番号：３４０）， Ｆｉｇ ３４２ （配列番号：３４２）， Ｆｉｇ ３４４ （配列番号：３４４）， Ｆｉｇ ３４６ （配列番号：３４６）， Ｆｉｇ ３４８ （配列番号：３４８）， Ｆｉｇ ３５０ （配列番号：３５０）， Ｆｉｇ ３５２ （配列番号：３５２）， Ｆｉｇ ３５４ （配列番号：３５４）， Ｆｉｇ ３５６ （配列番号：３５６）， Ｆｉｇ ３５８ （配列番号：３５８）， Ｆｉｇ ３６０ （配列番号：３６０）， Ｆｉｇ ３６２ （配列番号：３６２）， Ｆｉｇ ３６４ （配列番号：３６４）， Ｆｉｇ ３６６ （配列番号：３６６）， Ｆｉｇ ３６８ （配列番号：３６８）， Ｆｉｇ ３７０ （配列番号：３７０）， Ｆｉｇ ３７２ （配列番号：３７２） 又はＦｉｇ ３７４ （配列番号：３７４）中に示されるポリペプチドであって、その付随するシグナルペプチドを欠くポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｂ）Ｆｉｇ ２ （配列番号：２）， Ｆｉｇ ４ （配列番号：４）， Ｆｉｇ ６ （配列番号：６）， Ｆｉｇ ８ （配列番号：８）， Ｆｉｇ １０ （配列番号：１０）， Ｆｉｇ １２ （配列番号：１２）， Ｆｉｇ １４ （配列番号：１４）， Ｆｉｇ １６ （配列番号：１６）， Ｆｉｇ １８ （配列番号：１８）， Ｆｉｇ ２０ （配列番号：２０）， Ｆｉｇ ２２ （配列番号：２２）， Ｆｉｇ ２４ （配列番号：２４）， Ｆｉｇ ２６ （配列番号：２６）， Ｆｉｇ ２８ （配列番号：２８）， Ｆｉｇ ３０ （配列番号：３０）， Ｆｉｇ ３２ （配列番号：３２）， Ｆｉｇ ３４ （配列番号：３４）， Ｆｉｇ ３６ （配列番号：３６）， Ｆｉｇ ３８ （配列番号：３８）， Ｆｉｇ ４０ （配列番号：４０）， Ｆｉｇ ４２ （配列番号：４２）， Ｆｉｇ ４４ （配列番号：４４）， Ｆｉｇ ４６ （配列番号：４６）， Ｆｉｇ ４８ （配列番号：４８）， Ｆｉｇ ５０ （配列番号：５０）， Ｆｉｇ ５２ （配列番号：５２）， Ｆｉｇ ５４ （配列番号：５４）， Ｆｉｇ ５６ （配列番号：５６）， Ｆｉｇ ５８ （配列番号：５８）， Ｆｉｇ ６０ （配列番号：６０）， Ｆｉｇ ６２ （配列番号：６２）， Ｆｉｇ ６４ （配列番号：６４）， Ｆｉｇ ６６ （配列番号：６６）， Ｆｉｇ ６８ （配列番号：６８）， Ｆｉｇ ７０ （配列番号：７０）， Ｆｉｇ ７２ （配列番号：７２）， Ｆｉｇ ７４ （配列番号：７４）， Ｆｉｇ ７６ （配列番号：７６）， Ｆｉｇ ７８ （配列番号：７８）， Ｆｉｇ ８０ （配列番号：８０），  Ｆｉｇ ８２ （配列番号：８２）， Ｆｉｇ ８４ （配列番号：８４）， Ｆｉｇ ８６ （配列番号：８６）， Ｆｉｇ ８８ （配列番号：８８）， Ｆｉｇ ９０ （配列番号：９０）， Ｆｉｇ ９２ （配列番号：９２）， Ｆｉｇ ９４ （配列番号：９４）， Ｆｉｇ ９６ （配列番号：９６）， Ｆｉｇ ９８ （配列番号：９８）， Ｆｉｇ １００ （配列番号：１００）， Ｆｉｇ １０２ （配列番号：１０２）， Ｆｉｇ １０４ （配列番号：１０４）， Ｆｉｇ １０６ （配列番号：１０６）， Ｆｉｇ １０８ （配列番号：１０８）， Ｆｉｇ １１０ （配列番号：１１０）， Ｆｉｇ １１２ （配列番号：１１２）， Ｆｉｇ １１４ （配列番号：１１４）， Ｆｉｇ １１６ （配列番号：１１６）， Ｆｉｇ １１８ （配列番号：１１８）， Ｆｉｇ １２０ （配列番号：１２０）， Ｆｉｇ １２２ （配列番号：１２２）， Ｆｉｇ １２４ （配列番号：１２４）， Ｆｉｇ １２６ （配列番号：１２６）， Ｆｉｇ １２８ （配列番号：１２８）， Ｆｉｇ １３０ （配列番号：１３０）， Ｆｉｇ １３２ （配列番号：１３２）， Ｆｉｇ １３４ （配列番号：１３４）， Ｆｉｇ １３６ （配列番号：１３６）， Ｆｉｇ １３８ （配列番号：１３８）， Ｆｉｇ １４０ （配列番号：１４０）， Ｆｉｇ １４２ （配列番号：１４２）， Ｆｉｇ １４４ （配列番号：１４４）， Ｆｉｇ １４６ （配列番号：１４６）， Ｆｉｇ １４８ （配列番号：１４８）， Ｆｉｇ １５０ （配列番号：１５０）， Ｆｉｇ １５２ （配列番号：１５２）， Ｆｉｇ １５４ （配列番号：１５４）， Ｆｉｇ １５６ （配列番号：１５６）， Ｆｉｇ １５８ （配列番号：１５８）， Ｆｉｇ １６０ （配列番号：１６０）， Ｆｉｇ １６２ （配列番号：１６２）， Ｆｉｇ １６４ （配列番号：１６４）， Ｆｉｇ １６６ （配列番号：１６６）， Ｆｉｇ １６８ （配列番号：１６８）， Ｆｉｇ １７０ （配列番号：１７０）， Ｆｉｇ １７２ （配列番号：１７２）， Ｆｉｇ １７４ （配列番号：１７４）， Ｆｉｇ １７６ （配列番号：１７６）， Ｆｉｇ １７８ （配列番号：１７８）， Ｆｉｇ １８０ （配列番号：１８０），  Ｆｉｇ １８２ （配列番号：１８２）， Ｆｉｇ １８４ （配列番号：１８４）， Ｆｉｇ １８６ （配列番号：１８６）， Ｆｉｇ １８８ （配列番号：１８８）， Ｆｉｇ １９０ （配列番号：１９０）， Ｆｉｇ １９２ （配列番号：１９２）， Ｆｉｇ １９４ （配列番号：１９４）， Ｆｉｇ １９６ （配列番号：１９６）， Ｆｉｇ １９８ （配列番号：１９８）， Ｆｉｇ ２００ （配列番号：２００）， Ｆｉｇ ２０２ （配列番号：２０２）， Ｆｉｇ ２０４ （配列番号：２０４）， Ｆｉｇ ２０６ （配列番号：２０６）， Ｆｉｇ ２０８ （配列番号：２０８）， Ｆｉｇ ２１０ （配列番号：２１０）， Ｆｉｇ ２１２ （配列番号：２１２）， Ｆｉｇ ２１４ （配列番号：２１４）， Ｆｉｇ ２１６ （配列番号：２１６）， Ｆｉｇ ２１８ （配列番号：２１８）， Ｆｉｇ ２２０ （配列番号：２２０）， Ｆｉｇ ２２２ （配列番号：２２２）， Ｆｉｇ ２２４ （配列番号：２２４）， Ｆｉｇ ２２６ （配列番号：２２６）， Ｆｉｇ ２２８ （配列番号：２２８）， Ｆｉｇ ２３０ （配列番号：２３０）， Ｆｉｇ ２３２ （配列番号：２３２）， Ｆｉｇ ２３４ （配列番号：２３４）， Ｆｉｇ ２３６ （配列番号：２３６）， Ｆｉｇ ２３８ （配列番号：２３８）， Ｆｉｇ ２４０ （配列番号：２４０）， Ｆｉｇ ２４２ （配列番号：２４２）， Ｆｉｇ ２４４ （配列番号：２４４）， Ｆｉｇ ２４６ （配列番号：２４６）， Ｆｉｇ ２４８ （配列番号：２４８）， Ｆｉｇ ２５０ （配列番号：２５０）， Ｆｉｇ ２５２ （配列番号：２５２）， Ｆｉｇ ２５４ （配列番号：２５４）， Ｆｉｇ ２５６ （配列番号：２５６）， Ｆｉｇ ２５８ （配列番号：２５８）， Ｆｉｇ ２６０ （配列番号：２６０）， Ｆｉｇ ２６２ （配列番号：２６２）， Ｆｉｇ ２６４ （配列番号：２６４）， Ｆｉｇ ２６６ （配列番号：２６６）， Ｆｉｇ ２６８ （配列番号：２６８）， Ｆｉｇ ２７０ （配列番号：２７０）， Ｆｉｇ ２７２ （配列番号：２７２）， Ｆｉｇ ２７４ （配列番号：２７４）， Ｆｉｇ ２７６ （配列番号：２７６）， Ｆｉｇ ２７８ （配列番号：２７８）， Ｆｉｇ ２８０ （配列番号：２８０），  Ｆｉｇ ２８２ （配列番号：２８２）， Ｆｉｇ ２８４ （配列番号：２８４）， Ｆｉｇ ２８６ （配列番号：２８６）， Ｆｉｇ ２８８ （配列番号：２８８）， Ｆｉｇ ２９０ （配列番号：２９０）， Ｆｉｇ ２９２ （配列番号：２９２）， Ｆｉｇ ２９４ （配列番号：２９４）， Ｆｉｇ ２９６ （配列番号：２９６）， Ｆｉｇ ２９８ （配列番号：２９８）， Ｆｉｇ ３００ （配列番号：３００）， Ｆｉｇ ３０２ （配列番号：３０２）， Ｆｉｇ ３０４ （配列番号：３０４）， Ｆｉｇ ３０６ （配列番号：３０６）， Ｆｉｇ ３０８ （配列番号：３０８）， Ｆｉｇ ３１０ （配列番号：３１０）， Ｆｉｇ ３１２ （配列番号：３１２）， Ｆｉｇ ３１４ （配列番号：３１４）， Ｆｉｇ ３１�� （配列番号：３１６）， Ｆｉｇ ３１８ （配列番号：３１８）， Ｆｉｇ ３２０ （配列番号：３２０）， Ｆｉｇ ３２２ （配列番号：３２２）， Ｆｉｇ ３２４ （配列番号：３２４）， Ｆｉｇ ３２６ （配列番号：３２６）， Ｆｉｇ ３２８ （配列番号：３２８）， Ｆｉｇ ３３０ （配列番号：３３０）， Ｆｉｇ ３３２ （配列番号：３３２）， Ｆｉｇ ３３４ （配列番号：３３４）， Ｆｉｇ ３３６ （配列番号：３３６）， Ｆｉｇ ３３８ （配列番号：３３８）， Ｆｉｇ ３４０ （配列番号：３４０）， Ｆｉｇ ３４２ （配列番号：３４２）， Ｆｉｇ ３４４ （配列番号：３４４）， Ｆｉｇ ３４６ （配列番号：３４６）， Ｆｉｇ ３４８ （配列番号：３４８）， Ｆｉｇ ３５０ （配列番号：３５０）， Ｆｉｇ ３５２ （配列番号：３５２）， Ｆｉｇ ３５４ （配列番号：３５４）， Ｆｉｇ ３５６ （配列番号：３５６）， Ｆｉｇ ３５８ （配列番号：３５８）， Ｆｉｇ ３６０ （配列番号：３６０）， Ｆｉｇ ３６２ （配列番号：３６２）， Ｆｉｇ ３６４ （配列番号：３６４）， Ｆｉｇ ３６６ （配列番号：３６６）， Ｆｉｇ ３６８ （配列番号：３６８）， Ｆｉｇ ３７０ （配列番号：３７０）， Ｆｉｇ ３７２ （配列番号：３７２） 又はＦｉｇ ３７４ （配列番号：３７４）中に示されるポリペプチドの細胞外ドメインであって、その付随するシグナルペプチドを持つもののアミノ酸配列；又は
（ｃ）Ｆｉｇ ２ （配列番号：２）， Ｆｉｇ ４ （配列番号：４）， Ｆｉｇ ６ （配列番号：６）， Ｆｉｇ ８ （配列番号：８）， Ｆｉｇ １０ （配列番号：１０）， Ｆｉｇ １２ （配列番号：１２）， Ｆｉｇ １４ （配列番号：１４）， Ｆｉｇ １６ （配列番号：１６）， Ｆｉｇ １８ （配列番号：１８）， Ｆｉｇ ２０ （配列番号：２０）， Ｆｉｇ ２２ （配列番号：２２）， Ｆｉｇ ２４ （配列番号：２４）， Ｆｉｇ ２６ （配列番号：２６）， Ｆｉｇ ２８ （配列番号：２８）， Ｆｉｇ ３０ （配列番号：３０）， Ｆｉｇ ３２ （配列番号：３２）， Ｆｉｇ ３４ （配列番号：３４）， Ｆｉｇ ３６ （配列番号：３６）， Ｆｉｇ ３８ （配列番号：３８）， Ｆｉｇ ４０ （配列番号：４０）， Ｆｉｇ ４２ （配列番号：４２）， Ｆｉｇ ４４ （配列番号：４４）， Ｆｉｇ ４６ （配列番号：４６）， Ｆｉｇ ４８ （配列番号：４８）， Ｆｉｇ ５０ （配列番号：５０）， Ｆｉｇ ５２ （配列番号：５２）， Ｆｉｇ ５４ （配列番号：５４）， Ｆｉｇ ５６ （配列番号：５６）， Ｆｉｇ ５８ （配列番号：５８）， Ｆｉｇ ６０ （配列番号：６０）， Ｆｉｇ ６２ （配列番号：６２）， Ｆｉｇ ６４ （配列番号：６４）， Ｆｉｇ ６６ （配列番号：６６）， Ｆｉｇ ６８ （配列番号：６８）， Ｆｉｇ ７０ （配列番号：７０）， Ｆｉｇ ７２ （配列番号：７２）， Ｆｉｇ ７４ （配列番号：７４）， Ｆｉｇ ７６ （配列番号：７６）， Ｆｉｇ ７８ （配列番号：７８）， Ｆｉｇ ８０ （配列番号：８０），  Ｆｉｇ ８２ （配列番号：８２）， Ｆｉｇ ８４ （配列番号：８４）， Ｆｉｇ ８６ （配列番号：８６）， Ｆｉｇ ８８ （配列番号：８８）， Ｆｉｇ ９０ （配列番号：９０）， Ｆｉｇ ９２ （配列番号：９２）， Ｆｉｇ ９４ （配列番号：９４）， Ｆｉｇ ９６ （配列番号：９６）， Ｆｉｇ ９８ （配列番号：９８）， Ｆｉｇ １００ （配列番号：１００）， Ｆｉｇ １０２ （配列番号：１０２）， Ｆｉｇ １０４ （配列番号：１０４）， Ｆｉｇ １０６ （配列番号：１０６）， Ｆｉｇ １０８ （配列番号：１０８）， Ｆｉｇ １１０ （配列番号：１１０）， Ｆｉｇ １１２ （配列番号：１１２）， Ｆｉｇ １１４ （配列番号：１１４）， Ｆｉｇ １１６ （配列番号：１１６）， Ｆｉｇ １１８ （配列番号：１１８）， Ｆｉｇ １２０ （配列番号：１２０）， Ｆｉｇ １２２ （配列番号：１２２）， Ｆｉｇ １２４ （配列番号：１２４）， Ｆｉｇ １２６ （配列番号：１２６）， Ｆｉｇ １２８ （配列番号：１２８）， Ｆｉｇ １３０ （配列番号：１３０）， Ｆｉｇ １３２ （配列番号：１３２）， Ｆｉｇ １３４ （配列番号：１３４）， Ｆｉｇ １３６ （配列番号：１３６）， Ｆｉｇ １３８ （配列番号：１３８）， Ｆｉｇ １４０ （配列番号：１４０）， Ｆｉｇ １４２ （配列番号：１４２）， Ｆｉｇ １４４ （配列番号：１４４）， Ｆｉｇ １４６ （配列番号：１４６）， Ｆｉｇ １４８ （配列番号：１４８）， Ｆｉｇ １５０ （配列番号：１５０）， Ｆｉｇ １５２ （配列番号：１５２）， Ｆｉｇ １５４ （配列番号：１５４）， Ｆｉｇ １５６ （配列番号：１５６）， Ｆｉｇ １５８ （配列番号：１５８）， Ｆｉｇ １６０ （配列番号：１６０）， Ｆｉｇ １６２ （配列番号：１６２）， Ｆｉｇ １６４ （配列番号：１６４）， Ｆｉｇ １６６ （配列番号：１６６）， Ｆｉｇ １６８ （配列番号：１６８）， Ｆｉｇ １７０ （配列番号：１７０）， Ｆｉｇ １７２ （配列番号：１７２）， Ｆｉｇ １７４ （配列番号：１７４）， Ｆｉｇ １７６ （配列番号：１７６）， Ｆｉｇ １７８ （配列番号：１７８）， Ｆｉｇ １８０ （配列番号：１８０），  Ｆｉｇ １８２ （配列番号：１８２）， Ｆｉｇ １８４ （配列番号：１８４）， Ｆｉｇ １８６ （配列番号：１８６）， Ｆｉｇ １８８ （配列番号：１８８）， Ｆｉｇ １９０ （配列番号：１９０）， Ｆｉｇ １９２ （配列番号：１９２）， Ｆｉｇ １９４ （配列番号：１９４）， Ｆｉｇ １９６ （配列番号：１９６）， Ｆｉｇ １９８ （配列番号：１９８）， Ｆｉｇ ２００ （配列番号：２００）， Ｆｉｇ ２０２ （配列番号：２０２）， Ｆｉｇ ２０４ （配列番号：２０４）， Ｆｉｇ ２０６ （配列番号：２０６）， Ｆｉｇ ２０８ （配列番号：２０８）， Ｆｉｇ ２１０ （配列番号：２１０）， Ｆｉｇ ２１２ （配列番号：２１２）， Ｆｉｇ ２１４ （配列番号：２１４）， Ｆｉｇ ２１６ （配列番号：２１６）， Ｆｉｇ ２１８ （配列番号：２１８）， Ｆｉｇ ２２０ （配列番号：２２０）， Ｆｉｇ ２２２ （配列番号：２２２）， Ｆｉｇ ２２４ （配列番号：２２４）， Ｆｉｇ ２２６ （配列番号：２２６）， Ｆｉｇ ２２８ （配列番号：２２８）， Ｆｉｇ ２３０ （配列番号：２３０）， Ｆｉｇ ２３２ （配列番号：２３２）， Ｆｉｇ ２３４ （配列番号：２３４）， Ｆｉｇ ２３６ （配列番号：２３６）， Ｆｉｇ ２３８ （配列番号：２３８）， Ｆｉｇ ２４０ （配列番号：２４０）， Ｆｉｇ ２４２ （配列番号：２４２）， Ｆｉｇ ２４４ （配列番号：２４４）， Ｆｉｇ ２４６ （配列番号：２４６）， Ｆｉｇ ２４８ （配列番号：２４８）， Ｆｉｇ ２５０ （配列番号：２５０）， Ｆｉｇ ２５２ （配列番号：２５２）， Ｆｉｇ ２５４ （配列番号：２５４）， Ｆｉｇ ２５６ （配列番号：２５６）， Ｆｉｇ ２５８ （配列番号：２５８）， Ｆｉｇ ２６０ （配列番号：２６０）， Ｆｉｇ ２６２ （配列番号：２６２）， Ｆｉｇ ２６４ （配列番号：２６４）， Ｆｉｇ ２６６ （配列番号：２６６）， Ｆｉｇ ２６８ （配列番号：２６８）， Ｆｉｇ ２７０ （配列番号：２７０）， Ｆｉｇ ２７２ （配列番号：２７２）， Ｆｉｇ ２７４ （配列番号：２７４）， Ｆｉｇ ２７６ （配列番号：２７６）， Ｆｉｇ ２７８ （配列番号：２７８）， Ｆｉｇ ２８０ （配列番号：２８０），  Ｆｉｇ ２８２ （配列番号：２８２）， Ｆｉｇ ２８４ （配列番号：２８４）， Ｆｉｇ ２８６ （配列番号：２８６）， Ｆｉｇ ２８８ （配列番号：２８８）， Ｆｉｇ ２９０ （配列番号：２９０）， Ｆｉｇ ２９２ （配列番号：２９２）， Ｆｉｇ ２９４ （配列番号：２９４）， Ｆｉｇ ２９６ （配列番号：２９６）， Ｆｉｇ ２９８ （配列番号：２９８）， Ｆｉｇ ３００ （配列番号：３００）， Ｆｉｇ ３０２ （配列番号：３０２）， Ｆｉｇ ３０４ （配列番号：３０４）， Ｆｉｇ ３０６ （配列番号：３０６）， Ｆｉｇ ３０８ （配列番号：３０８）， Ｆｉｇ ３１０ （配列番号：３１０）， Ｆｉｇ ３１２ （配列番号：３１２）， Ｆｉｇ ３１４ （配列番号：３１４）， Ｆｉｇ ３１�� （配列番号：３１６）， Ｆｉｇ ３１８ （配列番号：３１８）， Ｆｉｇ ３２０ （配列番号：３２０）， Ｆｉｇ ３２２ （配列番号：３２２）， Ｆｉｇ ３２４ （配列番号：３２４）， Ｆｉｇ ３２６ （配列番号：３２６）， Ｆｉｇ ３２８ （配列番号：３２８）， Ｆｉｇ ３３０ （配列番号：３３０）， Ｆｉｇ ３３２ （配列番号：３３２）， Ｆｉｇ ３３４ （配列番号：３３４）， Ｆｉｇ ３３６ （配列番号：３３６）， Ｆｉｇ ３３８ （配列番号：３３８）， Ｆｉｇ ３４０ （配列番号：３４０）， Ｆｉｇ ３４２ （配列番号：３４２）， Ｆｉｇ ３４４ （配列番号：３４４）， Ｆｉｇ ３４６ （配列番号：３４６）， Ｆｉｇ ３４８ （配列番号：３４８）， Ｆｉｇ ３５０ （配列番号：３５０）， Ｆｉｇ ３５２ （配列番号：３５２）， Ｆｉｇ ３５４ （配列番号：３５４）， Ｆｉｇ ３５６ （配列番号：３５６）， Ｆｉｇ ３５８ （配列番号：３５８）， Ｆｉｇ ３６０ （配列番号：３６０）， Ｆｉｇ ３６２ （配列番号：３６２）， Ｆｉｇ ３６４ （配列番号：３６４）， Ｆｉｇ ３６６ （配列番号：３６６）， Ｆｉｇ ３６８ （配列番号：３６８）， Ｆｉｇ ３７０ （配列番号：３７０）， Ｆｉｇ ３７２ （配列番号：３７２） 又はＦｉｇ ３７４ （配列番号：３７４）中に示されるポリペプチドの細胞外ドメインであって、その付随するシグナルペプチドを欠くもののアミノ酸配列：
と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
Ｆｉｇ ２ （配列番号：２）， Ｆｉｇ ４ （配列番号：４）， Ｆｉｇ ６ （配列番号：６）， Ｆｉｇ ８ （配列番号：８）， Ｆｉｇ １０ （配列番号：１０）， Ｆｉｇ １２ （配列番号：１２）， Ｆｉｇ １４ （配列番号：１４）， Ｆｉｇ １６ （配列番号：１６）， Ｆｉｇ １８ （配列番号：１８）， Ｆｉｇ ２０ （配列番号：２０）， Ｆｉｇ ２２ （配列番号：２２）， Ｆｉｇ ２４ （配列番号：２４）， Ｆｉｇ ２６ （配列番号：２６）， Ｆｉｇ ２８ （配列番号：２８）， Ｆｉｇ ３０ （配列番号：３０）， Ｆｉｇ ３２ （配列番号：３２）， Ｆｉｇ ３４ （配列番号：３４）， Ｆｉｇ ３６ （配列番号：３６）， Ｆｉｇ ３８ （配列番号：３８）， Ｆｉｇ ４０ （配列番号：４０）， Ｆｉｇ ４２ （配列番号：４２）， Ｆｉｇ ４４ （配列番号：４４）， Ｆｉｇ ４６ （配列番号：４６）， Ｆｉｇ ４８ （配列番号：４８）， Ｆｉｇ ５０ （配列番号：５０）， Ｆｉｇ ５２ （配列番号：５２）， Ｆｉｇ ５４ （配列番号：５４）， Ｆｉｇ ５６ （配列番号：５６）， Ｆｉｇ ５８ （配列番号：５８）， Ｆｉｇ ６０ （配列番号：６０）， Ｆｉｇ ６２ （配列番号：６２）， Ｆｉｇ ６４ （配列番号：６４）， Ｆｉｇ ６６ （配列番号：６６）， Ｆｉｇ ６８ （配列番号：６８）， Ｆｉｇ ７０ （配列番号：７０）， Ｆｉｇ ７２ （配列番号：７２）， Ｆｉｇ ７４ （配列番号：７４）， Ｆｉｇ ７６ （配列番号：７６）， Ｆｉｇ ７８ （配列番号：７８）， Ｆｉｇ ８０ （配列番号：８０），  Ｆｉｇ ８２ （配列番号：８２）， Ｆｉｇ ８４ （配列番号：８４）， Ｆｉｇ ８６ （配列番号：８６）， Ｆｉｇ ８８ （配列番号：８８）， Ｆｉｇ ９０ （配列番号：９０）， Ｆｉｇ ９２ （配列番号：９２）， Ｆｉｇ ９４ （配列番号：９４）， Ｆｉｇ ９６ （配列番号：９６）， Ｆｉｇ ９８ （配列番号：９８）， Ｆｉｇ １００ （配列番号：１００）， Ｆｉｇ １０２ （配列番号：１０２）， Ｆｉｇ １０４ （配列番号：１０４）， Ｆｉｇ １０６ （配列番号：１０６）， Ｆｉｇ １０８ （配列番号：１０８）， Ｆｉｇ １１０ （配列番号：１１０）， Ｆｉｇ １１２ （配列番号：１１２）， Ｆｉｇ １１４ （配列番号：１１４）， Ｆｉｇ １１６ （配列番号：１１６）， Ｆｉｇ １１８ （配列番号：１１８）， Ｆｉｇ １２０ （配列番号：１２０）， Ｆｉｇ １２２ （配列番号：１２２）， Ｆｉｇ １２４ （配列番号：１２４）， Ｆｉｇ １２６ （配列番号：１２６）， Ｆｉｇ １２８ （配列番号：１２８）， Ｆｉｇ １３０ （配列番号：１３０）， Ｆｉｇ １３２ （配列番号：１３２）， Ｆｉｇ １３４ （配列番号：１３４）， Ｆｉｇ １３６ （配列番号：１３６）， Ｆｉｇ １３８ （配列番号：１３８）， Ｆｉｇ １４０ （配列番号：１４０）， Ｆｉｇ １４２ （配列番号：１４２）， Ｆｉｇ １４４ （配列番号：１４４）， Ｆｉｇ １４６ （配列番号：１４６）， Ｆｉｇ １４８ （配列番号：１４８）， Ｆｉｇ １５０ （配列番号：１５０）， Ｆｉｇ １５２ （配列番号：１５２）， Ｆｉｇ １５４ （配列番号：１５４）， Ｆｉｇ １５６ （配列番号：１５６）， Ｆｉｇ １５８ （配列番号：１５８）， Ｆｉｇ １６０ （配列番号：１６０）， Ｆｉｇ １６２ （配列番号：１６２）， Ｆｉｇ １６４ （配列番号：１６４）， Ｆｉｇ １６６ （配列番号：１６６）， Ｆｉｇ １６８ （配列番号：１６８）， Ｆｉｇ １７０ （配列番号：１７０）， Ｆｉｇ １７２ （配列番号：１７２）， Ｆｉｇ １７４ （配列番号：１７４）， Ｆｉｇ １７６ （配列番号：１７６）， Ｆｉｇ １７８ （配列番号：１７８）， Ｆｉｇ １８０ （配列番号：１８０），  Ｆｉｇ １８２ （配列番号：１８２）， Ｆｉｇ １８４ （配列番号：１８４）， Ｆｉｇ １８６ （配列番号：１８６）， Ｆｉｇ １８８ （配列番号：１８８）， Ｆｉｇ １９０ （配列番号：１９０）， Ｆｉｇ １９２ （配列番号：１９２）， Ｆｉｇ １９４ （配列番号：１９４）， Ｆｉｇ １９６ （配列番号：１９６）， Ｆｉｇ １９８ （配列番号：１９８）， Ｆｉｇ ２００ （配列番号：２００）， Ｆｉｇ ２０２ （配列番号：２０２）， Ｆｉｇ ２０４ （配列番号：２０４）， Ｆｉｇ ２０６ （配列番号：２０６）， Ｆｉｇ ２０８ （配列番号：２０８）， Ｆｉｇ ２１０ （配列番号：２１０）， Ｆｉｇ ２１２ （配列番号：２１２）， Ｆｉｇ ２１４ （配列番号：２１４）， Ｆｉｇ ２１６ （配列番号：２１６）， Ｆｉｇ ２１８ （配列番号：２１８）， Ｆｉｇ ２２０ （配列番号：２２０）， Ｆｉｇ ２２２ （配列番号：２２２）， Ｆｉｇ ２２４ （配列番号：２２４）， Ｆｉｇ ２２６ （配列番号：２２６）， Ｆｉｇ ２２８ （配列番号：２２８）， Ｆｉｇ ２３０ （配列番号：２３０）， Ｆｉｇ ２３２ （配列番号：２３２）， Ｆｉｇ ２３４ （配列番号：２３４）， Ｆｉｇ ２３６ （配列番号：２３６）， Ｆｉｇ ２３８ （配列番号：２３８）， Ｆｉｇ ２４０ （配列番号：２４０）， Ｆｉｇ ２４２ （配列番号：２４２）， Ｆｉｇ ２４４ （配列番号：２４４）， Ｆｉｇ ２４６ （配列番号：２４６）， Ｆｉｇ ２４８ （配列番号：２４８）， Ｆｉｇ ２５０ （配列番号：２５０）， Ｆｉｇ ２５２ （配列番号：２５２）， Ｆｉｇ ２５４ （配列番号：２５４）， Ｆｉｇ ２５６ （配列番号：２５６）， Ｆｉｇ ２５８ （配列番号：２５８）， Ｆｉｇ ２６０ （配列番号：２６０）， Ｆｉｇ ２６２ （配列番号：２６２）， Ｆｉｇ ２６４ （配列番号：２６４）， Ｆｉｇ ２６６ （配列番号：２６６）， Ｆｉｇ ２６８ （配列番号：２６８）， Ｆｉｇ ２７０ （配列番号：２７０）， Ｆｉｇ ２７２ （配列番号：２７２）， Ｆｉｇ ２７４ （配列番号：２７４）， Ｆｉｇ ２７６ （配列番号：２７６）， Ｆｉｇ ２７８ （配列番号：２７８）， Ｆｉｇ ２８０ （配列番号：２８０），  Ｆｉｇ ２８２ （配列番号：２８２）， Ｆｉｇ ２８４ （配列番号：２８４）， Ｆｉｇ ２８６ （配列番号：２８６）， Ｆｉｇ ２８８ （配列番号：２８８）， Ｆｉｇ ２９０ （配列番号：２９０）， Ｆｉｇ ２９２ （配列番号：２９２）， Ｆｉｇ ２９４ （配列番号：２９４）， Ｆｉｇ ２９６ （配列番号：２９６）， Ｆｉｇ ２９８ （配列番号：２９８）， Ｆｉｇ ３００ （配列番号：３００）， Ｆｉｇ ３０２ （配列番号：３０２）， Ｆｉｇ ３０４ （配列番号：３０４）， Ｆｉｇ ３０６ （配列番号：３０６）， Ｆｉｇ ３０８ （配列番号：３０８）， Ｆｉｇ ３１０ （配列番号：３１０）， Ｆｉｇ ３１２ （配列番号：３１２）， Ｆｉｇ ３１４ （配列番号：３１４）， Ｆｉｇ ３１６ （配���番号：３１６）， Ｆｉｇ ３１８ （配列番号：３１８）， Ｆｉｇ ３２０ （配列番号：３２０）， Ｆｉｇ ３２２ （配列番号：３２２）， Ｆｉｇ ３２４ （配列番号：３２４）， Ｆｉｇ ３２６ （配列番号：３２６）， Ｆｉｇ ３２８ （配列番号：３２８）， Ｆｉｇ ３３０ （配列番号：３３０）， Ｆｉｇ ３３２ （配列番号：３３２）， Ｆｉｇ ３３４ （配列番号：３３４）， Ｆｉｇ ３３６ （配列番号：３３６）， Ｆｉｇ ３３８ （配列番号：３３８）， Ｆｉｇ ３４０ （配列番号：３４０）， Ｆｉｇ ３４２ （配列番号：３４２）， Ｆｉｇ ３４４ （配列番号：３４４）， Ｆｉｇ ３４６ （配列番号：３４６）， Ｆｉｇ ３４８ （配列番号：３４８）， Ｆｉｇ ３５０ （配列番号：３５０）， Ｆｉｇ ３５２ （配列番号：３５２）， Ｆｉｇ ３５４ （配列番号：３５４）， Ｆｉｇ ３５６ （配列番号：３５６）， Ｆｉｇ ３５８ （配列番号：３５８）， Ｆｉｇ ３６０ （配列番号：３６０）， Ｆｉｇ ３６２ （配列番号：３６２）， Ｆｉｇ ３６４ （配列番号：３６４）， Ｆｉｇ ３６６ （配列番号：３６６）， Ｆｉｇ ３６８ （配列番号：３６８）， Ｆｉｇ ３７０ （配列番号：３７０）， Ｆｉｇ ３７２ （配列番号：３７２） 又はＦｉｇ ３７４ （配列番号：３７４）中に示されるポリペプチドの治療的有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における心臓血管性、内皮性又は血管形成疾患を治療する方法。
【請求項２１】
哺乳動物がヒトである請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ヒトが心筋梗塞を患っている請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ヒトが心肥大、外傷、癌又は加齢黄斑変性症を患っている請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
心肥大がＰＧＦ２αの上昇したレベルでの存在により特徴づけられる請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ポリペプチドが心臓血管性、内皮性又は血管形成の薬剤と共に投与される請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
ポリペプチドが一次血管形成術に従い投与される請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
心臓血管性、内皮性又は血管形成疾患が癌である請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
ポリペプチドが化学治療剤、成長抑制剤又は細胞障害性薬剤と組合わせて投与される請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記アゴニストが前記ポリペプチドに対する抗体である請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記アンタゴニストが前記ポリペプチドに対する抗体である請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
Ｆｉｇ ２ （配列番号：２）， Ｆｉｇ ４ （配列番号：４）， Ｆｉｇ ６ （配列番号：６）， Ｆｉｇ ８ （配列番号：８）， Ｆｉｇ １０ （配列番号：１０）， Ｆｉｇ １２ （配列番号：１２）， Ｆｉｇ １４ （配列番号：１４）， Ｆｉｇ １６ （配列番号：１６）， Ｆｉｇ １８ （配列番号：１８）， Ｆｉｇ ２０ （配列番号：２０）， Ｆｉｇ ２２ （配列番号：２２）， Ｆｉｇ ２４ （配列番号：２４）， Ｆｉｇ ２６ （配列番号：２６）， Ｆｉｇ ２８ （配列番号：２８）， Ｆｉｇ ３０ （配列番号：３０）， Ｆｉｇ ３２ （配列番号：３２）， Ｆｉｇ ３４ （配列番号：３４）， Ｆｉｇ ３６ （配列番号：３６）， Ｆｉｇ ３８ （配列番号：３８）， Ｆｉｇ ４０ （配列番号：４０）， Ｆｉｇ ４２ （配列番号：４２）， Ｆｉｇ ４４ （配列番号：４４）， Ｆｉｇ ４６ （配列番号：４６）， Ｆｉｇ ４８ （配列番号：４８）， Ｆｉｇ ５０ （配列番号：５０）， Ｆｉｇ ５２ （配列番号：５２）， Ｆｉｇ ５４ （配列番号：５４）， Ｆｉｇ ５６ （配列番号：５６）， Ｆｉｇ ５８ （配列番号：５８）， Ｆｉｇ ６０ （配列番号：６０）， Ｆｉｇ ６２ （配列番号：６２）， Ｆｉｇ ６４ （配列番号：６４）， Ｆｉｇ ６６ （配列番号：６６）， Ｆｉｇ ６８ （配列番号：６８）， Ｆｉｇ ７０ （配列番号：７０）， Ｆｉｇ ７２ （配列番号：７２）， Ｆｉｇ ７４ （配列番号：７４）， Ｆｉｇ ７６ （配列番号：７６）， Ｆｉｇ ７８ （配列番号：７８）， Ｆｉｇ ８０ （配列番号：８０），  Ｆｉｇ ８２ （配列番号：８２）， Ｆｉｇ ８４ （配列番号：８４）， Ｆｉｇ ８６ （配列番号：８６）， Ｆｉｇ ８８ （配列番号：８８）， Ｆｉｇ ９０ （配列番号：９０）， Ｆｉｇ ９２ （配列番号：９２）， Ｆｉｇ ９４ （配列番号：９４）， Ｆｉｇ ９６ （配列番号：９６）， Ｆｉｇ ９８ （配列番号：９８）， Ｆｉｇ １００ （配列番号：１００）， Ｆｉｇ １０２ （配列番号：１０２）， Ｆｉｇ １０４ （配列番号：１０４）， Ｆｉｇ １０６ （配列番号：１０６）， Ｆｉｇ １０８ （配列番号：１０８）， Ｆｉｇ １１０ （配列番号：１１０）， Ｆｉｇ １１２ （配列番号：１１２）， Ｆｉｇ １１４ （配列番号：１１４）， Ｆｉｇ １１６ （配列番号：１１６）， Ｆｉｇ １１８ （配列番号：１１８）， Ｆｉｇ １２０ （配列番号：１２０）， Ｆｉｇ １２２ （配列番号：１２２）， Ｆｉｇ １２４ （配列番号：１２４）， Ｆｉｇ １２６ （配列番号：１２６）， Ｆｉｇ １２８ （配列番号：１２８）， Ｆｉｇ １３０ （配列番号：１３０）， Ｆｉｇ １３２ （配列番号：１３２）， Ｆｉｇ １３４ （配列番号：１３４）， Ｆｉｇ １３６ （配列番号：１３６）， Ｆｉｇ １３８ （配列番号：１３８）， Ｆｉｇ １４０ （配列番号：１４０）， Ｆｉｇ １４２ （配列番号：１４２）， Ｆｉｇ １４４ （配列番号：１４４）， Ｆｉｇ １４６ （配列番号：１４６）， Ｆｉｇ １４８ （配列番号：１４８）， Ｆｉｇ １５０ （配列番号：１５０）， Ｆｉｇ １５２ （配列番号：１５２）， Ｆｉｇ １５４ （配列番号：１５４）， Ｆｉｇ １５６ （配列番号：１５６）， Ｆｉｇ １５８ （配列番号：１５８）， Ｆｉｇ １６０ （配列番号：１６０）， Ｆｉｇ １６２ （配列番号：１６２）， Ｆｉｇ １６４ （配列番号：１６４）， Ｆｉｇ １６６ （配列番号：１６６）， Ｆｉｇ １６８ （配列番号：１６８）， Ｆｉｇ １７０ （配列番号：１７０）， Ｆｉｇ １７２ （配列番号：１７２）， Ｆｉｇ １７４ （配列番号：１７４）， Ｆｉｇ １７６ （配列番号：１７６）， Ｆｉｇ １７８ （配列番号：１７８）， Ｆｉｇ １８０ （配列番号：１８０），  Ｆｉｇ １８２ （配列番号：１８２）， Ｆｉｇ １８４ （配列番号：１８４）， Ｆｉｇ １８６ （配列番号：１８６）， Ｆｉｇ １８８ （配列番号：１８８）， Ｆｉｇ １９０ （配列番号：１９０）， Ｆｉｇ １９２ （配列番号：１９２）， Ｆｉｇ １９４ （配列番号：１９４）， Ｆｉｇ １９６ （配列番号：１９６）， Ｆｉｇ １９８ （配列番号：１９８）， Ｆｉｇ ２００ （配列番号：２００）， Ｆｉｇ ２０２ （配列番号：２０２）， Ｆｉｇ ２０４ （配列番号：２０４）， Ｆｉｇ ２０６ （配列番号：２０６）， Ｆｉｇ ２０８ （配列番号：２０８）， Ｆｉｇ ２１０ （配列番号：２１０）， Ｆｉｇ ２１２ （配列番号：２１２）， Ｆｉｇ ２１４ （配列番号：２１４）， Ｆｉｇ ２１６ （配列番号：２１６）， Ｆｉｇ ２１８ （配列番号：２１８）， Ｆｉｇ ２２０ （配列番号：２２０）， Ｆｉｇ ２２２ （配列番号：２２２）， Ｆｉｇ ２２４ （配列番号：２２４）， Ｆｉｇ ２２６ （配列番号：２２６）， Ｆｉｇ ２２８ （配列番号：２２８）， Ｆｉｇ ２３０ （配列番号：２３０）， Ｆｉｇ ２３２ （配列番号：２３２）， Ｆｉｇ ２３４ （配列番号：２３４）， Ｆｉｇ ２３６ （配列番号：２３６）， Ｆｉｇ ２３８ （配列番号：２３８）， Ｆｉｇ ２４０ （配列番号：２４０）， Ｆｉｇ ２４２ （配列番号：２４２）， Ｆｉｇ ２４４ （配列番号：２４４）， Ｆｉｇ ２４６ （配列番号：２４６）， Ｆｉｇ ２４８ （配列番号：２４８）， Ｆｉｇ ２５０ （配列番号：２５０）， Ｆｉｇ ２５２ （配列番号：２５２）， Ｆｉｇ ２５４ （配列番号：２５４）， Ｆｉｇ ２５６ （配列番号：２５６）， Ｆｉｇ ２５８ （配列番号：２５８）， Ｆｉｇ ２６０ （配列番号：２６０）， Ｆｉｇ ２６２ （配列番号：２６２）， Ｆｉｇ ２６４ （配列番号：２６４）， Ｆｉｇ ２６６ （配列番号：２６６）， Ｆｉｇ ２６８ （配列番号：２６８）， Ｆｉｇ ２７０ （配列番号：２７０）， Ｆｉｇ ２７２ （配列番号：２７２）， Ｆｉｇ ２７４ （配列番号：２７４）， Ｆｉｇ ２７６ （配列番号：２７６）， Ｆｉｇ ２７８ （配列番号：２７８）， Ｆｉｇ ２８０ （配列番号：２８０），  Ｆｉｇ ２８２ （配列番号：２８２）， Ｆｉｇ ２８４ （配列番号：２８４）， Ｆｉｇ ２８６ （配列番号：２８６）， Ｆｉｇ ２８８ （配列番号：２８８）， Ｆｉｇ ２９０ （配列番号：２９０）， Ｆｉｇ ２９２ （配列番号：２９２）， Ｆｉｇ ２９４ （配列番号：２９４）， Ｆｉｇ ２９６ （配列番号：２９６）， Ｆｉｇ ２９８ （配列番号：２９８）， Ｆｉｇ ３００ （配列番号：３００）， Ｆｉｇ ３０２ （配列番号：３０２）， Ｆｉｇ ３０４ （配列番号：３０４）， Ｆｉｇ ３０６ （配列番号：３０６）， Ｆｉｇ ３０８ （配列番号：３０８）， Ｆｉｇ ３１０ （配列番号：３１０）， Ｆｉｇ ３１２ （配列番号：３１２）， Ｆｉｇ ３１４ （配列番号：３１４）， Ｆｉｇ ３１６ （配���番号：３１６）， Ｆｉｇ ３１８ （配列番号：３１８）， Ｆｉｇ ３２０ （配列番号：３２０）， Ｆｉｇ ３２２ （配列番号：３２２）， Ｆｉｇ ３２４ （配列番号：３２４）， Ｆｉｇ ３２６ （配列番号：３２６）， Ｆｉｇ ３２８ （配列番号：３２８）， Ｆｉｇ ３３０ （配列番号：３３０）， Ｆｉｇ ３３２ （配列番号：３３２）， Ｆｉｇ ３３４ （配列番号：３３４）， Ｆｉｇ ３３６ （配列番号：３３６）， Ｆｉｇ ３３８ （配列番号：３３８）， Ｆｉｇ ３４０ （配列番号：３４０）， Ｆｉｇ ３４２ （配列番号：３４２）， Ｆｉｇ ３４４ （配列番号：３４４）， Ｆｉｇ ３４６ （配列番号：３４６）， Ｆｉｇ ３４８ （配列番号：３４８）， Ｆｉｇ ３５０ （配列番号：３５０）， Ｆｉｇ ３５２ （配列番号：３５２）， Ｆｉｇ ３５４ （配列番号：３５４）， Ｆｉｇ ３５６ （配列番号：３５６）， Ｆｉｇ ３５８ （配列番号：３５８）， Ｆｉｇ ３６０ （配列番号：３６０）， Ｆｉｇ ３６２ （配列番号：３６２）， Ｆｉｇ ３６４ （配列番号：３６４）， Ｆｉｇ ３６６ （配列番号：３６６）， Ｆｉｇ ３６８ （配列番号：３６８）， Ｆｉｇ ３７０ （配列番号：３７０）， Ｆｉｇ ３７２ （配列番号：３７２） 又はＦｉｇ ３７４ （配列番号：３７４）中に示されるポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストをコードする核酸分子を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における心臓血管性、内皮性又は血管形成疾患を治療する方法。
【請求項３２】
前記アゴニストが前記ポリペプチドの抗体である請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記アンタゴニストが前記ポリペプチドの抗体である請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
哺乳動物がヒトである請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
核酸分子がエクスヴィボ遺伝子治療によって投与される請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
ＰＲＯ２２９， ＰＲＯ２３８， ＰＲＯ２４７， ＰＲＯ４４４， ＰＲＯ７２０， ＰＲＯ８２７， ＰＲＯ１００７， ＰＲＯ１０２９， ＰＲＯ１０７５， ＰＲＯ１１８４， ＰＲＯ１１９０， ＰＲＯ１１９５， ＰＲＯ１２７４， ＰＲＯ１２７９， ＰＲＯ１４１９， ＰＲＯ１４７４， ＰＲＯ１４７７， ＰＲＯ１４８８， ＰＲＯ１７８２， ＰＲＯ１８９０， ＰＰＲＯ４３０２， ＰＲＯ４４０５， ＰＲＯ５７２５， ＰＲＯ５７７６， ＰＲＯ６００６， ＰＲＯ７４３６， ＰＲＯ９７７１， ＰＲＯ１０００８， ＰＲＯ２１３８４ 又は ＰＲＯ２８６３１ポリペプチド又はそのアゴニストを哺乳動物に投与することを含む哺乳動物における内皮性細胞の増殖を阻害する方法であって、前記哺乳動物における内皮性細胞の増殖が阻害される方法。
【請求項３７】
哺乳動物にＰＲＯ２１， ＰＲＯ１８１， ＰＲＯ２０５， ＰＲＯ２１４， ＰＲＯ２２１， ＰＲＯ２３１， ＰＲＯ２３８， ＰＲＯ２４１， ＰＲＯ２４７， ＰＲＯ２５６， ＰＲＯ２５８， ＰＲＯ２６３， ＰＲＯ２６５， ＰＲＯ２９５， ＰＲＯ３２１， ＰＲＯ３２２， ＰＲＯ３３７， ＰＲＯ３６３， ＰＲＯ３６５， ＰＲＯ５３３， ＰＲＯ６９７， ＰＲＯ７２５， ＰＲＯ７７１， ＰＲＯ７８８， ＰＲＯ７９１， ＰＲＯ８１９， ＰＲＯ８２８， ＰＲＯ８３６， ＰＲＯ８４６， ＰＲＯ８６５， ＰＲＯ１００５， ＰＲＯ１００６， ＰＲＯ１０２５， ＰＲＯ１０５４， ＰＲＯ１０７１， ＰＲＯ１０７９， ＰＲＯ１０８０， ＰＲＯ１１１４， ＰＲＯ１１３１， ＰＲＯ１１５５， ＰＲＯ１１６０， ＰＲＯ１１８６， ＰＲＯ１１９２， ＰＲＯ１２４４， ＰＲＯ１２７２， ＰＲＯ１２７３， ＰＲＯ１２７９， ＰＲＯ１２８３， ＰＲＯ１２８６， ＰＲＯ１３０６， ＰＲＯ１３０９， ＰＲＯ１３２５， ＰＲＯ１３２９， ＰＲＯ１３４７， ＰＲＯ１３５６， ＰＲＯ１３７６， ＰＲＯ１３８２， ＰＲＯ１４１１， ＰＲＯ１４１２， ＰＲＯ１５０８， ＰＲＯ１５５０， ＰＲＯ１５５６， ＰＲＯ１７６０， ＰＲＯ１７８７， ＰＲＯ１８０１， ＰＲＯ１８６８， ＰＲＯ１８８７， ＰＲＯ３４３８， ＰＲＯ３４４４， ＰＲＯ４３２４， ＰＲＯ４３３３， ＰＲＯ４３４１， ＰＲＯ４３４２， ＰＲＯ４３５３， ＰＲＯ４３５４， ＰＲＯ４３５６， ＰＲＯ４３７１， ＰＲＯ４４０８， ＰＲＯ４４２２， ＰＲＯ４４２５， ＰＲＯ４４９９， ＰＲＯ５７２３， ＰＲＯ５７３７， ＰＲＯ６０２９， ＰＲＯ６０７１， ＰＲＯ９８２１， ＰＲＯ９８７３， ＰＲＯ１０００８， ＰＲＯ１００９６， ＰＲＯ１９６７０， ＰＲＯ２００４０， ＰＲＯ２００４４， ＰＲＯ２１０５５ 又は ＰＲＯ２１３８４ポリペプチド、又はそのアゴニストを投与することを含む哺乳動物におけるに内皮性細胞の増殖を刺激する方法であって、前記哺乳動物における内皮性細胞の増殖が刺激される方法。
【請求項３８】
哺乳動物にＰＲＯ２１ポリペプチド又はそのアゴニストを投与することを含む哺乳動物における心肥大を誘導する方法であって、前記哺乳動物における心肥大が誘導される方法。
【請求項３９】
哺乳動物においてＰＲＯ１３７６又はＰＲＯ１４４９によって誘導される血管形成を刺激する方法であって、前記ポリペプチドの治療的有効量を哺乳動物に投与することを含み、前記血管形成が刺激される方法。
【請求項４０】
内皮性細胞にＰＲＯ４３０２ポリペプチド又はそのアゴニストを投与することを含む内皮性細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、前記内皮性細胞におけるアポトーシスが誘導される方法。
【請求項４１】
平滑筋細胞にＰＲＯ１６２， ＰＲＯ１８２， ＰＲＯ２０４， ＰＲＯ２２１， ＰＲＯ２３０， ＰＲＯ２５６， ＰＲＯ２５８， ＰＲＯ５３３， ＰＲＯ６９７， ＰＲＯ７２５， ＰＲＯ７３８， ＰＲＯ８２６， ＰＲＯ８３６， ＰＲＯ８４０， ＰＲＯ８４６， ＰＲＯ８６５， ＰＲＯ９８２， ＰＲＯ１０２５， ＰＲＯ１０２９， ＰＲＯ１０７１， ＰＲＯ１０８３， ＰＲＯ１１３４， ＰＲＯ１１６０， ＰＲＯ１１８２， ＰＲＯ１１８４， ＰＲＯ１１８６， ＰＲＯ１１９２， ＰＲＯ１２７４， ＰＲＯ１２７９， ＰＲＯ１２８３， ＰＲＯ１３０６， ＰＲＯ１３０８， ＰＲＯ１３２５， ＰＲＯ１３３７， ＰＲＯ１３３８， ＰＲＯ１３４３， ＰＲＯ１３７６， ＰＲＯ１３８７， ＰＲＯ１４１１， ＰＲＯ１４１２， ＰＲＯ１４１５， ＰＲＯ１４３４， ＰＲＯ１４７４， ＰＲＯ１５５０， ＰＲＯ１５５６， ＰＲＯ１５６７， ＰＲＯ１６００， ＰＲＯ１７５４， ＰＲＯ１７５８， ＰＲＯ１７６０， ＰＲＯ１７８７， ＰＲＯ１８６５， ＰＲＯ１８６８， ＰＲＯ１９１７， ＰＲＯ１９２８， ＰＲＯ３４３８， ＰＲＯ３５６２， ＰＲＯ４３３３， ＰＲＯ４３４５， ＰＲＯ４３５３， ＰＲＯ４３５４， ＰＲＯ４４０８， ＰＲＯ４４３０， ＰＲＯ４５０３， ＰＲＯ６７１４， ＰＲＯ９７７１， ＰＲＯ９８２０， ＰＲＯ９９４０， ＰＲＯ１００９６， ＰＲＯ２１０５５， ＰＲＯ２１１８４ 又は ＰＲＯ２１３６６ポリペプチド又はそのアゴニストを投与することを含む平滑筋細胞の増殖を刺激する方法であって、前記平滑筋細胞における平滑筋細胞の増殖が刺激される方法。
【請求項４２】
平滑筋細胞における平滑筋細胞増殖が促進される、平滑筋細胞にＰＲＯ１８１， ＰＲＯ１９５， ＰＲＯ１０８０， ＰＲＯ１２６５， ＰＲＯ１３０９， ＰＲＯ１４８８， ＰＲＯ４３０２， ＰＲＯ４４０５ 又は ＰＲＯ５７２５ポリペプチド、又はそのアゴニストを投与することを含む平滑筋細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項４３】
ＰＲＯ１７８， ＰＲＯ１９５， ＰＲＯ２２８， ＰＲＯ３０１， ＰＲＯ３０２， ＰＲＯ５３２， ＰＲＯ７２４， ＰＲＯ７３０， ＰＲＯ７３４， ＰＲＯ７９３， ＰＲＯ８７１， ＰＲＯ９３８， ＰＲＯ１０１２， ＰＲＯ１１２０， ＰＲＯ１１３９， ＰＲＯ１１９８， ＰＲＯ１２８７， ＰＲＯ１３６１， ＰＲＯ１８６４， ＰＲＯ１８７３， ＰＲＯ２０１０， ＰＲＯ３５７９， ＰＲＯ４３１３， ＰＲＯ４５２７， ＰＲＯ４５３８， ＰＲＯ４５５３， ＰＲＯ４９９５， ＰＲＯ５７３０， ＰＲＯ６００８， ＰＲＯ７２２３， ＰＲＯ７２４８又はＰＲＯ７２６１ポリペプチド又はそのアゴニストを内皮性細胞に投与することを含む内皮性細胞管形成を誘導する方法であって、前記内皮性細胞における管形成が誘導される方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
１．発明の分野
本発明は、かかる生物学的効果を必要とする哺乳動物において血管形成及び／又は心臓血管新生の調節（例えば、促進又は阻害）に有用な組成物及び方法に関する。さらに、本発明は、血管形成に関与する疾患（例えば、心臓血管並びに腫瘍学的疾患）の診断及び治療に関する。
【０００２】
２．発明の背景
２．１．血管形成
血管形成誘導は、既存の血管から新しい血管の増殖又は出芽（ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ）として定義され、胚発育期間に主として生じる複雑な過程である。成人の正常な生理学的状態下では、血管形成は、髪の毛の成長及び創傷治癒などの非常に限定された状況下においてのみ生じる（Ａｕｅｒｂａｃｈ， Ｗ．及びＡｕｅｒｂａｃｈ， Ｒ．， １９９４， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ６３（３）：２６５−３ １１；Ｒｉｂａｔｔｉ等， １９９１， Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ７６（４）：３ １１−２０；Ｒｉｓａｕ， １９９７， Ｎａｔｕｒｅ ３８６（６６２６）：６７ １−４）。制御されない血管形成が、限定はしないが、心臓血管疾患、癌、関節リウマチ、乾癬及び糖尿病網膜症を含む広い範囲の疾患の原因であることが徐々に認識されてきた（Ｆｏｌｋｍａｎ， １９９５， Ｎａｔ Ｍｅｄ １（１）：２７−３１；Ｉｓｎｅｒ， １９９９， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９９（１３）：１６５３−５；Ｋｏｃｈ， １９９８， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４１（６）：９５１−６２；Ｗａｌｓｈ， １９９９， Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ （Ｏｘｆｏｒｄ） ３８（２）：１０３−１２；Ｗａｒｅ及びＳｉｍｏｎｓ， １９９７， Ｎａｔ Ｍｅｄ ３（２）：１５８−６４）。
２．２．心疾患及び要因
約５００万人のアメリカ人が心不全にかかり、毎年約４００，０００人が心不全の新しい患者となる。アメリカ合衆国における６５歳以上の人々の入院の単独では最多の原因である。急性心筋梗塞を含む急性心不全に対する対応の最近の進歩の結果、慢性の心不全が発症した患者数が拡大している。１９７９年から１９９５年まで、鬱血性心不全（ＣＨＦ）の患者は３７７，０００人から８７２，０００人（１３０パーセント増）に昇り、ＣＨＦによる死亡は１１６パーセント増えた。
ＣＨＦは、左心室の機能不全、運動耐性（ｅｘｅｒｃｉｓｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）の低下、生命水準の悪化、顕著な寿命の低下により特徴付けられる症候群である。心不全の必須条件は、心臓が体組織の代謝必要量を満たすのに十分な速度で血液を押し出すことが不可能であることである（換言すれば、心拍出量の不足である）。
末梢血管収縮、心拍数の増加、心収縮性の増加、血漿容量の増加を含む、少なくとも４種の主要な補償メカニズムが心不全の場合に活性化される。これらの効果は、交感神経系とレニン−アンジオテンシン系により主に媒介される。Ｅｉｃｈｈｏｒｎ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， １０４： １６３−１６９（１９９８）参照。交感神経系からの出力が増えると脈拍、心拍数、及び収縮性が上昇する。アンジオテンシＩＩは、１）血管平滑筋収縮を直接刺激し、２）アルドステロンと抗利尿ホルモン分泌を刺激することにより血漿容量の拡大を促進させ、３）交感神経媒介血管緊張を刺激し、４）血管拡張とナトリウム利尿活性を有するブラジキニンの変性を触媒することにより、血圧を上昇させる。Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｖａｕｇｈａｎ， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ９７： １４１１−１４２０（１９９８）による検討を参照。以下に記載するように、アンジオテンシンＩＩはまた、ミオサイト壊死（心臓収縮機能の悪化）及び心臓線維症（心臓拡張及び場合によっては収縮機能の悪化）を促進することで直接的に有害な影響を有する。Ｗｅｂｅｒ， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ９６： ４０６５−４０８２（１９９８）参照。
【０００３】
鬱血性心不全（ＣＨＦ）の共通した特徴は心臓肥大であり、心臓の拡大は力学的及びホルモン的刺激の両方により活性化され、心臓が心拍出量の増加の要求に適合できるようにする。Ｍｏｒｇａｎ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ８３： １３−２５ （１９９１）。この肥大反応は、多くの場合、高血圧、大動脈弁狭窄症、心筋梗塞、心筋症、弁膜逆流、及び心内短絡のような様々な特徴的な病状に関わり、その全てが慢性的な血行動態過負荷となる。
肥大は通常、腫瘍形成を含まず、自然成長に関与しない器官又は構造の大きさの増大として定義される。心臓の肥大は、個々の細胞（ミオサイト）の質量の増加、又は組織を形成する細胞数の増加（過形成）のどちらか又は両方により起こる。胎児心臓の拡大は主にミオサイト数の増加（出生直後まで続く）に依存するが、出生後の心臓ミオサイトは増殖能力を失う。更なる発達は個々の細胞の肥大を通して起こる。
成人のミオサイトの拡大は最初に個々の筋繊維の負担を少なくすることを可能にすることにより、障害性心機能に対しては短時間の応答として最初は有益である。しかしながら、過酷で長時間の過負荷を受けると、肥大細胞は劣化し始め、死亡する。Ｋａｔｚ， ”Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌｕｒｅ”， ｉｎ： Ｋａｔｚ Ａ．Ｍ． ｅｄ．， Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅａｒｔ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， １９９２）ｐｐ． ６３８−６６８。心臓肥大は、心不全の臨床経過での死亡率及び罹患率にとって重大な危険因子である。Ｋａｔｚ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｍｅｄ．，５： ３７−４４ （１９９５）。心臓肥大の原因及び症状の更なる詳細については、例えばＨｅａｒｔ Ｄｉｓｅａｓｅ， Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｂｒａｕｎｗａｌｄ， Ｅ． ｅｄ． （Ｗ．Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．， １９８８），Ｃｈａｐｔｅｒ １４， ”Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌｕｒｅ”。
細胞レベルでは、心臓はミオサイト及び包括的に非ミオサイトと呼ばれる周囲の支持細胞で構成される。非ミオサイトは最初線維芽細胞／間葉細胞であり、またそれらは内皮及び平滑筋細胞を含む。実際、ミオサイトは成人心筋質量の大部分を形成しているが、心臓に存在する全細胞数の約３０％にしか相当しない。ホルモン的、生理的、血行力学的、及び病理学的な刺激に対する反応では、成人心室筋細胞は、肥大化プロセスの活性化を通して負担が増えるのに適合することができる。この反応は、細胞の分裂及び心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）の遺伝子を含む胎児遺伝子の活性化の付随なしに起こる、個々の心筋細胞の収縮性タンパク質の含有量とミオサイトの細胞サイズの増加により特徴付けられる。Ｃｈｉｅｎ等， ＦＡＳＥＢ Ｊ．， ５： ３０３７−３０４６（１９９１）； Ｃｈｉｅｎ等， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ５５： ７７−９５（１９９３）。細胞外マトリックス内及び心筋内冠動脈の周りにある間質性コラーゲンの蓄積と関連したミオサイトの大きさの増大の結果として起こる心筋質量の増加は、ヒトにおいて圧負荷に引き続いて起こる左心室肥大において記述されている。Ｃａｓｐａｒｉ等， Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．， １１：５５４−５５８（１９７７）； Ｓｃｈｗａｒｚ等， Ａｍ． Ｊ． Ｃａｒｄｉｏｌ．， ４２： ８９５−９０３（１９７８）； Ｈｅｓｓ等， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ６３： ３６０−３７１（１９８１）； Ｐｅａｒｌｍａｎ等， Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ４６ １５８−１６４（１９８２）。
【０００４】
また非ミオサイト支持細胞によって産生されたパラ分泌因子はさらに心臓肥大の発達に関わり得ることが示唆され、さらに様々な非ミオサイト由来肥大因子、例えば白血球抑制因子（ＬＩＦ）及びエンドセリン等が同定されている。Ｍｅｔｃａｌｆ， Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ， ７： １６９−１７３（１９９２）； Ｋｕｒｚｒｏｃｋ等， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ， １２： ２０８−２１７（１９９１）； Ｉｎｏｕｅ等， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８６： ２８６３−２８６７（１９８９）； Ｙａｎａｇｉｓａｗａ ａｎｄ Ｍａｓａｋｉ， Ｔｒｅｄｓ Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．， １０： ３７４−３７８（１９８９）； 米国特許第５５７３７６２（１９９６年１１月１２日公開）。心臓肥大の潜在的な介在物質とされる更なる例示的な因子は、カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）（Ｐｅｎｎｉｃａ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９２： １１４２−１１４６（１９９５））、カテコールアミン類、副腎皮質ステロイド類、アンジオテンシン、及びプロスタグランジン類を含む。
現在のところ、心肥大の治療は潜在的な心臓疾患に依存して異なる。カテコールアミン類、副腎皮質ステロイド類、アンジオテンシン、プロスタグランジン類、ＬＩＦ、エンドセリン、（エンドセリン−１、−２、及び−３及び大（ｂｉｇ）エンドセリンを含む）及びＣＴ−１は、肥大の潜在的な介在物質とされる因子にはいる。例えば、β−アドレナリン受容体遮断薬（β−遮断薬、例えばプロプラノロール、チモロール、タートアルオロール（ｔｅｒｔａｌｏｌｏｌ）、カルテオロール、ナドロール、ベタキソロール、ペンブトロール、アセトブトロール、アテノロール、メトプロロール、カルベジロール、等）及びベラパミルは、肥大型心筋症の治療に広く用いられている。症状（例えば胸痛）及び運動負荷でのβ−遮断薬の有益な効果は、主に心拍数を減らすことに依存し、その結果弛緩期を延長し、受動的に心室充満を増大する。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等， Ｂｒ． Ｈｅａｒｔ Ｊ．， ４４： ４８８−９８（１９８０）； Ｈａｒｒｉｓｏｎ等， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ２９： ８４−９８ （１９６４）。ベラパミルは心室充満を向上させ、恐らく心筋虚血を減少させるということが記載されている。Ｂｏｎｏｗ 等， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ７２： ８５３−６４（１９８５）。
またニフェジピン及びジルチアゼムは時に肥大型心筋症の治療に利用される。Ｌｏｒｅｌｌ等， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ６５：４９９−５０７（１９８２）； Ｂｅｔｏｃｃｈｉ等， Ａｍ． Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，７８：４５１−４５７（１９９６）。しかしながら、強力な血管拡張特性のために、特に流出障害をもつ患者には、ニフェジピンは害になりうる。ジソピラミドはその負の筋収縮特性によって症状を和らげるのに使用される。Ｐｏｌｌｉｃｋ， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３０７： ９９７−９９９（１９８２）。しかしながら、多くの患者において、最初の効果は徐々に減ってくる。Ｗｉｇｌｅ等，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ９２： １６８０−１６９２（１９９５）。抗高血圧薬治療は、血圧の上昇に関連する心臓肥大に有益な効果を有することが報告されている。抗高血圧治療に使用される、単独で又は組み合わせて使用される薬の例としては、カルシウムアンタゴニスト、例えばニトレンジピン；アドレナリン受容体阻害薬、例えば上に挙げたもの；例えばキナプリル、カプトプリル、エナラプリル、ラミプリル、ベナゼプリル、ホシノプリル、リシノプリルのようなアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬；利尿薬、例えばクロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチルクロチアジド（ｍｅｔｈｙｌｃｈｌｏｔｈｉａｚｉｄｅ）、ベンズチアジド、ジクロロフェナミド、アセタゾラミド、及びインダパミド；及びカルシウムチャネル阻害剤、例えばジルチアゼン、ニフェジピン、ベラパミル、及びニカルジピンがある。
例えば、ジルチアゼン及びカプトリルを用いた高血圧の治療は、左心室筋質量の減少を示すが、心臓拡張機能のドップラー指数は正常にならなかった。Ｓｚｌａｃｈｃｉｃ等， Ａｍ． Ｊ． Ｃａｒｄｉｏｌ．，６３： １９８−２０１（１９８９）； Ｓｈａｈｉ等， Ｌａｎｃｅｔ， ３３６： ４５８−４６１（１９９０）。これらの発見は、過剰量となった間質性コラーゲンが左心室肥大の退化後に残りうることを表すと解釈される。Ｒｏｓｓｉ等， Ａｍ． Ｈｅａｒｔ Ｊ．， １２４： ７００−７０９（１９９２）。上掲のＲｏｓｓｉ等は、実験用ラットにおいて、圧負担心臓肥大での間質性線維症及び心筋細胞肥大の抑制及び退化でのカプトプリルの影響を研究した。
【０００５】
心筋収縮能を直接増加する薬剤（変力剤）は、初め、心不全を持つ患者に、短期間において心拍出量を改善するために有用であると思われていた。しかしながら、ジゴキシゲニンを除いた全ての陽性変力剤は、短期的に心臓の性能を改善するにしても、長期的には死亡率を高める。Ｍａｓｓｉｅ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． ｉｎ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ， １２： ２０９−２１７（１９９７）； Ｒｅｄｄｙ等， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃａｒｄｉｏｌ．， １２：２３３−２４１（１９９７）。最近、β−アドレナリン受容体阻害剤は心不全での利用が提唱されている。臨床試験から明らかになったことは、心臓機能の改善が死亡率を増加させずに達成されうることが示唆されるが、患者の生存率が向上することは未だ実証されていない。また、ＣＨＦ治療のカルジオトロピン−１又はそのアンタゴニスト、又は成長ホルモン及び／又はインシュリン様成長因子−Ｉに関する米国特許第５９３５９２４号、５６２４８０６号；５６６１１２２号；及び５６１０１３４号及び国際公開第９５／２８１７３号参照。他の治療様式は心臓移植であるが、これはドナー心臓の入手可能性により制限がある。
エンドセリンは２１アミノ酸を含んでなる血管収縮ペプチドであり、ブタ動脈内皮培養上清から単離され、構造的に決定される。Ｙａｎａｇｉｓａｗａ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２： ４１１−４１５ （１９９８）。エンドセリンは後に様々な作用が発見され、エンドセリンアンタゴニストのようなエンドセリン抗体は心筋梗塞、腎不全、及び他の病気の治療に有効であることが証明されている。エンドセリンは生体内に存在し、血管収縮活性を示すため、それは循環系の調節に関する内生要因であることが予想され、さらに高血圧、心筋梗塞のような心疾患、急性腎不全のような腎臓病に関与しうる。エンドセリンアンタゴニストは、例えば米国特許第５７７３４１４号；日本特許公開３１３０２９９／１９９１号、欧州特許４５７１９５号、欧州特許４６０６７９号；及び欧州特許５５２４８９号に記載されている。エンドセリン受容体アンタゴニストを同定するための新規のエンドセリンＢ受容体は米国特許番号５７７３２２３号に記載されている。
心疾患の現在の治療は主に、カプトプリル、及び利尿薬のようなアンジオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）抑制剤の使用に向けられている。これらの薬剤は、血流力学的側面、及び運動負荷を改善し、ＣＨＦを持つ患者の死亡率及び発病率を減少させる。Ｋｒａｍｅｒ等， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ６７（４）： ８０７−８１６（１９８３）； Ｃａｐｔｏｐｒｉｌ Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒｏｕｐ， Ｊ．Ａ．Ｃ．Ｃ．， ２（４）： ７５５−７６３（１９８３）； Ｔｈｅ ＣＯＮＳＥＮＳＵＳ Ｔｒｉａｌ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３１６（２３）： １４２９−１４３５（１９８７）； Ｔｈｅ ＳＯＬＶＤ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３２５（５）： ２９３−３０２（１９９１）。さらにそれらは高血圧、左心室機能障害、アテローム硬化性血管疾患、及び糖尿病性ネフロパシーに利用される。上掲のＢｒｏｗｎ及びＶａｕｇｈａｎ。しかしながら、効果が証明されたにも関わらず、ＡＣＥ抑制剤の反応は限度がある。例えば、心不全の状況で延命したとき、ＡＣＥ抑制剤は末期心不全への進行を遅らせるようだが、ＡＣＥ抑制剤に関し大多数の患者が機能的クラスＩＩＩの心不全を有する。
さらに、機能的許容能力の改善及び運動時間はほんのわずかで、死亡率は減少はするが、依然として高い。Ｔｈｅ ＣＯＮＳＥＳＵＳ Ｔｒｉａｌ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３１６（２３）： １４２９−１４５３（１９８７）； Ｔｈｅ ＳＯＬＶＤ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３２５（５）： ２９３−３０２（１９９１）； Ｃｏｈｎ等， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３２５（５）： ３０３−３１０（１９９１）； Ｔｈｅ Ｃａｐｔｏｐｒｉｌ−Ｄｉｇｏｘｉｎ Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒｏｕｐ， ＪＡＭＡ， ２５９（４）： ５３９−５４４（１９８８）。従って、ＡＣＥ抑制剤は心不全患者の６０％以上において症状を緩和することができず、約１５−２０％まで心不全の死亡率を減少させるにすぎないようである。さらに副作用については、上掲のＢｒｏｕｎ及びＶａｕｇｈａｎ参照。
【０００６】
ＡＣＥ抑制剤の代替物は、特定のＡＴ１受容体アンタゴニストによって表される。臨床研究では、心臓血管及び腎臓の疾患の治療において、これら２つの様態の効果の比較が計画されている。しかしながら、動物モデルのデータはＡＣＥ／ＡｎｇＩＩ経路が、心臓肥大に明確に関係しているが、唯一のものではないか、この役割での活性な主要経路ではないことを示唆する。マウス遺伝子「ノックアウト」モデルは経路の個々の成分を試験するために作成されている。あるそのようなモデルで、ＡｎｇＩＩに対する主要な心臓病受容体、ＡＴｓｕｂ１Ａが遺伝学的に欠失された；これらのマウスは、ＡｎｇＩＩが実験的に与えられたとき 、肥大が発達しなかった（ＡｎｇＩＩの二次的な肥大除去におけるモデルでの基本的な成功を確認）。しかしながら、大動脈がこれらの動物（高血圧心臓ストレスモデル）で収縮されたとき、心臓はなおも肥大性になる。このことは、このレセプター（ＡＴｓｕｂ１Ａ）に無関係な別のシグナル伝達経路が高血圧において活性化されていることを示唆している。ＡＣＥ抑制剤は恐らくこれらの経路を抑制することはできないであろう。Ｈａｒａｄａ等， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ９７： １９５２−１９５９（１９９８）参照。また、心臓肥大の過程及び機構に関連する謎に関してはＨｏｍｃｙ， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ９７： １８９０−１８９２（１９９８）参照。
毎年約７５０，０００人の患者が急性心筋梗塞（ＡＭＩ）に懸かり、アメリカ合衆国での全死亡のおよそ４分の１がＡＭＩによるものである。近年、血栓溶解剤、例えばストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、及び特に組織プラスミノゲン活性剤（ｔ−ＰＡ）は、心筋梗塞に罹患した患者の生存率を大きく向上させた。１．５から４時間の連続静脈注射として投与したとき、ｔ−ＰＡは治療を施した患者の６９％から９０％が９０分で冠血管解放を引き起こす。Ｔｏｐｏｌ等， Ａｍ． Ｊ． Ｃａｒｄｉｏｌ．， ６１： ７２３−７２８（１９８８）； Ｎｅｕｈａｕｓ等， Ｊ． Ａｍ． Ｃｏｌｌ． Ｃａｒｄｉｏｌ．，１２： ５８１−５８７（１９８８）； Ｎｅｕｈａｕｓ等， Ｊ． Ａｍ． Ｃｏｌｌ． Ｃａｒｄｉｏｌ．， １４： １５６６−１５６９（１９８９）。最も高い開放率は、高い投与量又は急速な投与療法において報告されている。Ｔｏｐｏｌ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｏｌｌ． Ｃａｒｄｉｏｌ．， １５： ９２２−９２４（１９９０）。またｔ−ＰＡは一回のボーラスとして投与され得るし、それに関連する短い半減期に依存しているが、注入療法に適している。Ｔｅｂｂｅ等， Ａｍ． Ｊ． Ｃａｒｄｉｏｌ．， ６４： ４４８−４５３（１９８９）。ｔ−ＰＡ変異体は、特に長い半減期及び高いフィブリン特異性を有するように作成されているが、ＴＮＫｔ−ＰＡ（ａＴ１０３Ｎ， Ｎ１１７Ｑ， ＫＨＲＲ（２９６−２９９）ＡＡＡＡｔ−ＰＡ変異体、Ｋｅｙｔ等， ＰＲＯｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１： ３６７０−３６７４（１９９４））は特にボーラス投与に適している。しかしながら、これら全ての発達にもかかわらず、患者の生存の長期予後は、心臓肥大の監視及び治療を含む患者の注入後の監視及び治療にかなり依存する。
【０００７】
２．３．成長因子
報告によると、様々な自然発生ポリペプチドが内皮細胞の増殖を誘導する。これらのポリペプチドは、塩基性の及び酸性の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）（Ｂｕｒｇｅｓｓ及びＭａｃｉａｇ， Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ５８：５７５（１９８９））、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）（Ｉｓｈｉｋａｗａ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３３８： ５５７（１９８９））、及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）である。Ｌｅｕｎｇ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４６： １３０６（１９８９）； Ｆｅｒｒａｒａ及びＨｅｎｚｅｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １６１：８５１（１９８９）；Ｔｉｓｃｈｅｒ等， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １６５： １１９８（１９８９）； １９９６年７月３１日に特許付与された欧州特許第４７１７５４Ｂ号。
ヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ）ｃＤＮＡで核酸移入した細胞による条件培地は毛細血管内皮細胞の増殖を促進するのに対し、コントロールではそうではなかった。Ｌｅｕｎｇ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６： １３０６（１９８９）。いくつかの付加ｃＤＮＡはｈＶＥＧＦの１２１−、１８９−、及び２０６−アミノ酸アイソフォーム（また集合的にｈＶＥＧＦ関連タンパク質と呼ばれる）をコードするヒトｃＤＮＡライブラリで同定された。１２１−アミノ酸タンパク質は、ｈＶＥＧＦの残基１１６及び１５９の間の４４アミノ酸が欠失している特徴によってｈＶＥＧＦと異なる。１８９−アミノ酸タンパク質は、ｈＶＥＧＦの残基１１６で２４アミノ酸が挿入している特徴によってｈＶＥＧＦと異なり、明らかにヒト血管透過性因子（ｈＶＰＦ）と同一である。２０６−アミノ酸タンパク質は、ｈＶＥＧＦの残基１１６で４１アミノ酸が挿入している特徴によってｈＶＥＧＦと異なる。Ｈｏｕｃｋ等， Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．， ５： １８０６（１９９１）； Ｆｅｒｒａｒａ等， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ４７：２１１（１９９１）；Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ， １３：１８（１９９２）； Ｋｅｃｋ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４６： １３０９（１９８９）； Ｃｏｎｎｏｌｌｙ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６４： ２００１７（１９８９）； １９９０年５月３０日に公開された欧州特許第３７０９８９号。
現在、前から存在する内皮からの新しい血管の形成を含む脈管形成は、様々な疾患の病因と関連しているということがかなり証明されている。これらは、固形腫瘍及び転移、アテローム性動脈硬化症、水晶体後線維増殖症、血管腫、慢性炎症、増殖性網膜症（例えば糖尿病性網膜症）のような眼内新生血管症候群、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、血管新生緑内障、移植された角膜細胞及び他の細胞の免疫反応、リウマチ様関節炎、及び乾癬を含む。Ｆｏｌｋｍａｎ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６７： １０９３１−１０９３４（１９９２）； Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ等， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ５３： ２１７−２３９（１９９１）； 及びＧａｒｎｅｒ Ａ．， ”Ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ”， Ｉｎ： Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｏｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅ． Ａ Ｄｙｎａｍｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｇａｒｎｅｒ Ａ．， Ｋｌｉｎｔｗｏｒｔｈ ＧＫ， ｅｄｓ．， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， ＮＹ， １９９４）， ｐｐ １６２５−１７１０。
腫瘍成長の場合には、脈管形成は過形成から腫瘍形成への変化、固形腫瘍の成長用の滋養物の提供に非常に重要であると思われる。Ｆｏｌｋｍａｎ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３３９： ５８（１９８９）。新血管新生は、正常な細胞に比べて腫瘍細胞の成長を有利にし、増殖自立性を与える。通常、腫瘍は、利用可能な毛細血管床からの距離に依存した、たかだか数立方ミリメートルの大きさにのみ増殖可能な異常な単一細胞として発症し、長期間、更なる増殖及び汎発を伴わない「休眠状態」で留まることができる。その後、特定の腫瘍は、内皮細胞を活性化する血管原性表現型にスイッチし、新規の毛細血管中へと成長し、成熟を行う。これら新規形成された血管は、原発腫瘍の成長の継続を可能ならしめるだけでなく、転移性腫瘍細胞の汎発及び再コロニー化も可能にする。従って、腫瘍部分の微細血管密度と乳癌並びにいくつかの他の腫瘍での患者生存率の間には相関関係が見られる。Ｗｅｉｄｎｅｒ等， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ， ３２４： １−６（１９９１）； Ｈｏｒａｋ等， Ｌａｎｃｅｔ， ３４０： １１２０−１１２４（１９９２）； Ｍａｃｃｈｉａｒｉｎｉ等， Ｌａｎｃｅｔ， ３４０： １４５−１４６（１９９２）。血管形成スイッチをコントロールする正確なメカニズムはよく理解されていない、しかし、腫瘍塊の新血管形成の結果、多くの血管形成の刺激因子及び阻害因子の正味のバランスが保たれることになる（Ｆｏｌｋｍａｎ， １９９５， Ｎａｔ Ｍｅｄ １（１）：２７−３１）。
脈管形成の正の制御因子を探求することで、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＨＧＦ、ＴＮＦ−α、アンジオテンシン、ＩＬ−８、等を含む多くの候補が与えられた。上掲のＦｏｌｋｍａｎ等， Ｊ． Ｂ． Ｃ．、及び上掲のＫｌａｇｓｂｒｕｎ等。これまでに定義された負の制御因子はトロンボスポンジン（Ｇｏｏｄ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， ８７： ６６２４−６６２８（１９９０））、プロラクチンの１６−キロダルトンＮ−末端断片（Ｃｌａｐｐ等， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ， １３３： １２９２−１２９９（１９９３））、アンジオスタチン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ等， Ｃｅｌｌ， ７９： ３１５−３２８（１９９４））、及びエンドスタチン。Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ等， Ｃｅｌｌ， ８８： ２７７−２８５（１９９６）。
【０００８】
ここ数年の研究で、血管内皮細胞の増殖を刺激するだけでなく、血管浸透及び脈管形成を誘発することのＶＥＧＦの重要な役割が明らかになっている。Ｆｅｒｒａｒａ等， Ｅｎｄｏｃｒ． Ｒｅｖ．， １８： ４−２５（１９９７）。一つのＶＥＧＦ対立遺伝子さえ喪失すると胎児死亡に至るという知見は、血管系の発達と分化におけるこの因子が担っている代替のない役割を示している。さらに、ＶＥＧＦは腫瘍及び眼内疾患に関連した新血管新生の重要な媒介物であることが示されている。Ｆｅｒｒａｒａ等， Ｅｎｄｏｃｒ． Ｒｅｖ．， 上掲。ＶＥＧＦｍＲＮＡは検査した多くのヒト腫瘍で過剰発現している。Ｂｅｒｋｍａｎ等， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ９１：１５３−１５９（１９９３）；Ｂｒｏｗｎ等， Ｈｕｍａｎ Ｐａｔｈｏｌ．， ２６：８９−９１（１９９５）；Ｂｒｏｗｎ等， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５３：４７２７−４７３５（１９９３）；Ｍａｔｔｅｒｎ等， Ｂｒｉｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ７３：９３１−９３４（１９９６）；Ｄｖｏｒａｋ等， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．， １４６：１０２９−１０３９（１９９５）。
また、眼の流体中のＶＥＧＦの濃度レベルは、糖尿病及び他の虚血関連網膜症を有する患者における血管の活性増殖の存在性と高い相関関係がある。Ａｉｅｌｌｏ等， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３３１：１４８０−１４８７（１９９４）。さらに、近年の研究により、ＡＭＤの影響を受けている患者の脈絡膜新生血管膜にＶＥＧＦが局在化していることが示されている。Ｌｏｐｅｚ等， Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ．， ３７：８５５−８６８（１９９６）。
抗−ＶＥＧＦ中和抗体は、ヌードマウスにおいて、様々なヒト腫瘍株化細胞の成長を抑制し（Ｋｉｍ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３６２：８４１−８４４（１９９３）；Ｗａｒｒｅｎ等， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ９５：１７８９−１７９７（１９９５）；Ｂｏｒｇｓｔｒｏｍ等， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５６：４０３２−４０３９（１９９６）；Ｍｅｌｎｙｋ等， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５６：９２１−９２４（１９９６））、また虚血性網膜疾患における眼内血管形成を阻害する。Ａｄａｍｉｓ等， Ａｒｃｈ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．， １１４：６６−７１（１９９６）。よって、抗−ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はＶＥＧＦ作用に対する他のインヒビターは、固形腫瘍及び種々の眼内新血管疾患の治療用の候補薬とされている。このような抗体は、例えば１９９８年１月１４日に公開されたＥＰ８１７，６４８及び１９９８年１０月１５日に共に公開された国際公開第９８／４５３３１号及び国際公開第９８／４５３３２号に記載されている。
【０００９】
ある種の細胞により発現する遺伝子の複合体を素早く誘導することができる、トランスフォーミング発ガン遺伝子を含む、いくつかの他の成長因子及び分裂促進因子が存在する。Ｌａｕ及びＮａｔｈａｎｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ， ６：１６５−２０２（１９９１）。前初期遺伝子又は初期反応遺伝子と命名されているこれらの遺伝子は、新規タンパク質合成と無関係に、成長因子又は分裂促進因子と接触後数分間で転写的に活性化される。これらの前初期遺伝子のグループは、分化及び増殖、再生、及び傷治療等の複雑な生物学的プロセスを調整するのに必要な、分泌性の細胞外タンパク質をコードする。Ｒｙｓｅｃｋ等， Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．， ２：２３５−２３３（１９９１）。
このグループに属する高度に関連したタンパク質には、ｃｅｆ１０（Ｓｉｍｍｏｎｓ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８６：１１７８−１１８２（１９８９））、血清−又は血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）により素早く活性化されるｃｙｒ６１（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ等， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １０：３５６９−３５７７（１９９０））、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）による活性化後に高レベルでヒト血管内皮細胞により分泌され、ＰＤＧＦ様の生物学的及び免疫学的活性を示し、特定の細胞表面レセプターに対してＰＤＧＦと競合するヒト結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）（Ｂｒａｄｈａｍ等， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １１４：１２８５−１２９４（１９９１））、ｆｉｓｐ−１２（Ｒｙｓｅｃｋ等， Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．， ２：２３５−２３３（１９９１））、ヒト血管ＩＢＰ−様成長因子（ＶＩＧＦ）（ＷＯ９６／１７９３１）、及び通常は成人腎臓細胞に静止され、骨髄芽球−関連−ウイルスＩ型誘発腎芽細胞腫において過剰発現することが見出されているｎｏｖが含まれる。Ｊｏｌｏｉｔ等， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １２：１０−２１（１９９２）。
これらの前初期遺伝子の発現は、成長因子により誘発される事象のカスケードにおける「第３のメッセンジャー」として作用する。また、それらは複雑な生物学的プロセス、例えば分化及び細胞増殖が通常の事象である傷治療を統合及び調整するのに必要であると考えられている。
付加的な分裂促進因子として、インシュリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰｓ）が、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）との複合体において、線維芽細胞及び平滑筋細胞表面レセプターへのＩＧＦの結合性を増加させるように刺激することが示されている。Ｃｌｅｍｍｏｎｓら．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ７７： １５４８（１９８６）。様々なインビトロでのＩＧＦ作用に対するＩＧＦＢＰの阻害効果は、脂肪細胞によるグルコース輸送の刺激、軟骨細胞によるサルフェートの取り込み、及び線維芽細胞中へのチミジンの取り込みを含む。Ｚａｐｆ等， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ６３：１０７７（１９７９）。さらに、正常な細胞での、成長因子媒介性分裂促進因子活性におけるＩＧＦＢＰの阻害効果が示されている。
【００１０】
２．４．さらなる治療の必要性
多くの病気及び疾患における血管内皮細胞の成長及び血管形成の役割に鑑みると、これらのプロセスに起因する一又は複数の生物学的影響を低減又は抑制する手段を有していることが好ましい。また、正常及び病気の状態、特にガンにおいて病原性ポリペプチドの存在を検査する手段を有していることも望ましい。さらに、特定の側面では、心臓肥大の治療には一般的に適用できる治療法がないので、心臓ミオサイト肥大を防止又は低減可能な因子を同定することは、病態生理学的な心臓成長を阻害するための新規な治療方策の開発において非常に重要である。様々な心臓血管及び発癌遺伝子疾患のためのいくつかの治療様式が存在するが、さらなる治療的アプローチがなお必要とされている。
【００１１】
３．発明の概要
本発明は、哺乳類における血管形成及び／又は心臓血管新生を調節（例えば、促進又は阻害）するための組成物及び方法に関する。本発明は、ある種の生物学的活性の調節（例えば、促進又は阻害）をテストする種々の心臓血管アッセイにおいて陽性であることをテストする化合物（即ち、タンパク質）の同定に基づく。従って、血管形成の促進又は阻害、血管内皮細胞成長の阻害又は刺激、血管内皮細胞の成長又は増殖の刺激、腫瘍成長の阻害、血管形成依存性組織成長の阻害、血管形成依存性組織成長の刺激、心臓肥大の阻害及び心臓肥大の刺激、例えば鬱血性心不全の治療等の効果が望まれているところでは、当該化合物は、ある効果、例えば、血管形成の促進又は阻害、血管内皮細胞増殖の阻害又は刺激、血管内皮細胞の生育又は増殖の刺激、腫瘍成長の阻害、血管形成依存性組織成長、例えばうっ血性心不全の治療の心肥大の阻害及び心肥大の刺激などが望まれる、疾患の診断及び／又は治療（予防及び寛解を含む）に有用な薬剤及び／又は薬物成分であると考えられる。さらに、本発明の組成物及び方法は、血管形成関連疾患の治療のため、臨床試験における効果をモニタリングするため、及びそのような血管形成関連疾患になり易い患者を同定するための臨床的評価を受ける患者の診断上のモニタリングを提供する。
一実施態様において、本発明は薬剤的に許容される担体と混合されたＰＲＯポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗−ＰＲＯ抗体を含んでなる組成物を提供する。一態様では、組成物は治療的有効量のポリペプチドを含有する。他の態様では、組成物はさらなる活性成分、すなわち、心臓血管、内皮又は血管形成薬又はアンジオスタチック（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃ）薬、好ましくは血管形成又はアンジオスタティック薬を含有する。好ましくは組成物は無菌である。ＰＲＯポリペプチド、アゴニスト、アンタゴニスト又は抗体は、液状の製薬調製物の形態で投与することができ、これは、貯蔵安定性が延びるように保存できる。保存された液状の製薬調製物は複数回投与用のＰＲＯポリペプチド、アゴニスト、アンタゴニスト又は抗体を含有していてもよく、よって繰り返し使用に適している。好ましい実施態様において、組成物は抗体を含み、抗体はモノクローナル抗体、抗体断片、ヒト化抗体又は一本鎖抗体である。
【００１２】
さらなる実施態様において、本発明は薬剤的に許容される担体と、治療的有効量のＰＲＯポリペプチド、アゴニスト、アンタゴニスト又は抗体との混合物を含有する、心臓血管、内皮又は血管形成疾患の治療に有用なこのような組成物の調製方法を提供する。
またさらなる態様において、本発明は：
（ａ）ＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストを含有する物質の組成物；
（ｂ）該組成物を収容する容器；及び
（ｃ）心臓血管、内皮又は血管形成疾患の治療における該ＰＲＯポリペプチドの使用を記した、該容器に添付されるラベル又は当該容器に収納される包装挿入物を具備する製造品を提供し、前記アゴニスト又はアンタゴニストはＰＲＯポリペプチドに結合する抗体であってよい。該組成物は、治療的有効量のＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストを含んでいてよい。
他の実施態様において、本発明は、ＰＲＯポリペプチドのアゴニストを同定する方法を提供し、それは：
（ａ）細胞とスクリーニングすべき試験化合物とを、ＰＲＯポリペプチドによって通常誘発される細胞性反応の誘発に適した条件下で接触させ；そして
（ｂ）前記細胞性反応の誘発を測定して、試験化合物が有効なアゴニストであるか否かを決定することを含んでなり、前記細胞性反応の誘発が前記試験化合物が有効なアゴニストであることを示す。
他の実施態様において、本発明は、ＰＲＯポリペプチドのアゴニストを同定する方法を提供し、それは：
（ａ）細胞とスクリーニングすべき試験化合物とを、ＰＲＯポリペプチドによる細胞増殖の刺激に適した条件下で接触させ；そして
（ｂ）前記細胞の増殖を測定して、試験化合物が有効なアゴニストであるか否かを決定することを含んでなり、当該細胞増殖の刺激が前記試験化合物が有効なアゴニストであることを示す。
【００１３】
他の実施態様では、本発明はＰＲＯポリペプチドの活性を阻害する化合物の同定方法を提供し、それは、試験化合物をＰＲＯポリペプチドと、試験化合物とポリペプチドとが相互作用するのに十分な条件及び時間で接触させ、ＰＲＯポリペプチドの活性が阻害されるか否かを測定することを含む。特に好ましい態様では、試験化合物又はＰＲＯポリペプチドのいずれかが固体支持体に固定化される。他の好ましい態様では、非固定化成分は検出可能な標識を担持する。好ましい態様では、この方法は：
（ａ）細胞とスクリーニングすべき試験化合物とを、ＰＲＯポリペプチドの存在下で、ＰＲＯポリペプチドによって通常誘発される細胞性反応の誘発に適した条件下で接触させ；そして
（ｂ）前記細胞性反応の誘発を測定して、試験化合物が有効なアゴニストであるか否かを決定する工程を含む。
他の好ましい態様においては、この方法は：
（ａ）細胞とスクリーニングすべき試験化合物とを、ＰＲＯポリペプチドの存在下で、ＰＲＯポリペプチドによる細胞増殖の刺激に適した条件下で接触させ；そして
（ｂ）前記細胞の増殖を測定して、試験化合物が有効なアゴニストであるか否かを決定する工程を含む。
他の実施態様では、本発明は、通常はＰＲＯポリペプチドを発現する細胞における当該細胞の発現を阻害する化合物の同定方法を提供し、当該方法は、細胞と試験化合物とを接触させ、ＰＲＯポリペプチドの発現が阻害されるか否かを測定することを含む。好ましい態様では、この方法は：
（ａ）細胞とスクリーニングすべき試験化合物とをＰＲＯポリペプチドを発現させるのに適した条件下で接触させ；そして
（ｂ）前記ポリペプチドの発現の阻害を測定する工程を含む。
またさらなる実施態様では、本発明は、前掲の方法により同定された化合物等の、ＰＲＯポリペプチドの発現を阻害する化合物を提供する。
【００１４】
本発明の他の態様は、前掲の方法により同定されてもよいＰＲＯポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストに向けられる。
ＰＲＯポリペプチドの一又は複数の機能又は活性を阻害するＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストの一種は抗体である。よって、他の態様では、本発明はＰＲＯポリペプチドに結合する単離された抗体を提供する。好ましい態様において、抗体はモノクローナル抗体であり、好ましくは非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）残基及びヒトフレームワーク領域（ＦＲ）残基を有する。抗体は標識されていても固体支持体上に固定化されていてもよい。さらなる態様では、抗体は抗体断片、一本鎖抗体、又はヒト化抗体である。好ましくは、抗体はポリペプチドに特異的に結合する。
またさらなる態様において、本発明はＰＲＯポリペプチドをコードする核酸配列中の変異に関連した疾患又は疾患に対する感受性を診断する方法であって、ＰＲＯポリペプチドコード化核酸配列中の前記変異の存在又は非存在を決定することを含んでなり、前記変異の存在または非存在が前記疾患又は前記疾患に対する感受性の存在を示す方法を提供する。
またさらなる態様において、本発明は、哺乳動物における心臓血管、内皮又は血管形成疾患を診断する方法を提供し、それは、（ａ）前記哺乳動物から得た組織細胞の試験試料、及び（ｂ）同じ細胞型の公知の正常組織細胞の対照試料におけるＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを分析することを含んでなり、対照試料に比較した場合の試験試料中の発現レベルの高低が、前記哺乳動物における心臓血管、内皮又は血管形成疾患の存在を示す。ＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、場合によっては、対照試料と比較した際の試験試料中のｍＲＮＡ又はポリペプチドのレベルの測定によってなされてもよい。
またさらなる態様において、本発明は、哺乳動物における心臓血管、内皮又は血管形成疾患を診断する方法を提供し、それは、前記哺乳動物から得た組織細胞の試験試料におけるポリペプチドの有無を検出することを含んでなり、前記試験試料における前記ポリペプチドの有無が前記哺乳動物における心臓血管、内皮又は血管形成疾患の存在を示す。
【００１５】
またさらなる態様では、本発明は、哺乳動物における心臓血管、内皮又は血管形成疾患を診断する方法を提供し、それは、（ａ）前記哺乳動物から得た組織細胞の試験試料を抗−ＰＲＯ抗体と接触させ、そして（ｂ）試験試料中での前記抗体とＰＲＯポリペプチドとの複合体形成を検出することを含んでなり、前記複合体の形成が前記哺乳動物における心臓血管、内皮又は血管形成疾患の存在を示す。検出は、定性的でも定量的でもよく、同じ細胞型の公知の正常組織細胞の対照試料における複合体形成のモニタリングと比較して実施してもよい。試験試料における複合体形成量の多少が、試験組織細胞を得た当該哺乳動物における心臓血管、内皮又は血管形成不全の存在を示す。抗体は、好ましくは検出可能な標識を担持している。複合体形成は、例えば、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光定量法、又はこの分野で知られた他の技術によってモニターできる。試験試料は通常、心臓血管、内皮又は血管形成疾患を持つと推定される個体から得る。
他の実施態様では、本発明は、試料中のＰＲＯポリペプチドの存在を測定する方法を提供し、それは、ＰＲＯポリペプチドを含有すると推測される試料を抗−ＰＲＯ抗体と接触させ、前記抗体の前記試料の成分への結合を測定することを含んでなる。特別な態様では、当該試料はＰＲＯポリペプチドを含むと推定される細胞を含み、抗体は細胞に結合する。抗体は、好ましくは検出可能に標識され及び／又は固体支持体に固定化される。
さらなる態様において、本発明は、抗−ＰＲＯ抗体と担体とを適切な包装内に具備してなる心臓血管、内皮又は血管形成疾患の診断キットを提供する。好ましくは、そのようなキットは、前記抗体をＰＲＯポリペプチド存在検出に使用するための指示書をさらに具備する。好ましくは、担体は例えばバッファーである。好ましくは、心臓血管、内皮又は血管形成疾患は癌である。
さらに他の実施態様では、本発明は、哺乳動物における心臓血管、内皮又は血管形成疾患を治療する方法を提供し、それは、ＰＲＯポリペプチドの有効量を当該哺乳動物に投与することを含んでなる。好ましくは、疾患は心臓肥大、創傷又は火傷などの外傷、又は癌の一型である。さらなる態様では、心臓血管、内皮又は血管形成疾患が癌の一型であるならば、哺乳動物は、血管形成術、又は心臓血管、内皮又は血管形成疾患を治療するための薬剤、例えばＡＣＥインヒビター、又は化学治療薬にさらに曝露される。好ましくは哺乳動物はヒト、好ましくは心臓肥大を起こす危険性のあるヒト、より好ましくは心筋梗塞を罹患しているヒトである。
他の好ましい態様において、心臓肥大は、ＰＥＧ２αレベルの上昇が存在することにより特徴付けられる。あるいは、心臓肥大は心筋梗塞により誘発され、ここで、好ましくはＰＲＯポリペプチドの投与は、心筋梗塞に続いて４８時間、好ましくは２４時間以内に開始される。
【００１６】
他の好ましい実施態様において、心臓血管、内皮又は血管形成疾患は心臓肥大であり、前記ＰＲＯポリペプチドは心臓血管、内皮又は血管形成薬と共に投与される。この目的のために好ましい心臓血管、内皮又は血管形成薬は、抗高血圧薬、ＡＣＥインヒビター、エンドセリンレセプターアンタゴニスト及び血栓溶解剤からなるグループから選択される。血栓溶解剤が投与される場合、好ましくは、ＰＲＯポリペプチドはこのような薬剤の投与後に投与される。より好ましくは、血栓溶解剤は組換えヒト組織プラスミノーゲン活性化因子である。
他の好ましい態様において、心臓血管、内皮又は血管形成疾患は心臓肥大であり、ＰＲＯポリペプチドは急性心筋梗塞の治療のための一次血管形成術に続いて投与され、ここで好ましくは、当該哺乳動物は血管形成術又は心臓血管、内皮又は血管形成薬にさらに曝露される。
他の好ましい実施態様において、心臓血管、内皮又は血管形成疾患は癌であり、ＰＲＯポリペプチドは化学治療薬、成長阻害薬又は細胞毒性薬と組合せて投与される。
さらなる実施態様において、本発明は、哺乳動物の心臓血管、内皮又は血管形成疾患の治療方法を提供し、それは、ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニスト又は抗体の有効量を当該哺乳動物に投与することを含んでなる。好ましくは、心臓血管、内皮又は血管形成疾患は心臓肥大、外傷、癌、又は加齢性黄斑変性である。また好ましくは哺乳動物はヒトであり、有効量の血管形成又はアンジオスタチック薬はアゴニスト、アンタゴニスト又は抗体と共に投与される。
【００１７】
またさらなる実施態様において、本発明は、心臓血管、内皮又は血管形成疾患を患っている哺乳動物の心臓血管、内皮又は血管形成疾患の治療方法を提供し、それは、（ａ）ＰＲＯポリペプチド、（ｂ）ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト、又は（ｃ）ＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストのいずれかをコードする核酸分子を哺乳動物に投与することを含んでなり、ここで前記アゴニスト又はアンタゴニストは抗−ＰＲＯ抗体であってよい。好ましい実施態様において哺乳動物はヒトである。他の好ましい実施態様において、遺伝子は、エキソビボの遺伝子治療を介して投与される。さらなる好ましい実施態様において、遺伝子はベクター、より好ましくはアデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、又はレトロウイルスベクター内に包含される。
また、他の態様において、本発明は、プロモータ、（ａ）ＰＲＯポリペプチド、（ｂ）ＰＲＯポリペプチドのアゴニストポリペプチド、又は（ｃ）ＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストポリペプチドをコードする核酸分子、及びポリペプチドの細胞分泌のためのシグナル配列から本質的になるレトロウイルスベクターを含有する組換えレトロウイルス粒子を提供し、ここでレトロウイルスベクターはレトロウイルス構造タンパク質を付随している。好ましくは、シグナル配列は哺乳動物、例えば天然ＰＲＯポリペプチドからのものである。
また、さらなる実施態様において、本発明は、レトロウイルス構造タンパク質を発現する核酸構造体を含有し、プロモータ、（ａ）ＰＲＯポリペプチド、（ｂ）ＰＲＯポリペプチドのアゴニストポリペプチド、又は（ｃ）ＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストポリペプチドをコードする核酸分子、及びポリペプチドの細胞分泌のためのシグナル配列から本質的になるレトロウイルスベクターをさらに含有するエキソビボ産生細胞（Ｐｒｏｄｕｃｅｒ ｃｅｌｌ）を提供し、ここで当該産生細胞は、組換えレトロウイルス粒子を生産させる構造タンパク質を付随するレトロウイルスベクターを包含する。
また他の実施態様において、本発明は、哺乳動物の内皮細胞の成長を阻害する方法を提供し、それは（ａ）ＰＲＯポリペプチド、（ｂ）ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト、又は（ｃ）ＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなり、当該哺乳動物の内皮細胞の成長は阻害され、前記アゴニスト又はアンタゴニストは抗−ＰＲＯ抗体であってよい。好ましくは、哺乳動物はヒトであり、内皮細胞の成長は腫瘍又は網膜疾患に関連している。
また他の実施態様において、本発明は、哺乳動物の内皮細胞の成長を刺激する方法を提供し、それは（ａ）ＰＲＯポリペプチド、（ｂ）ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト、又は（ｃ）ＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなり、当該哺乳動物の内皮細胞の成長が刺激され、前記アゴニスト又はアンタゴニストは抗−ＰＲＯ抗体であってよい。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
また他の実施態様において、本発明は、哺乳動物の心臓肥大を阻害する方法を提供し、それは（ａ）ＰＲＯポリペプチド、（ｂ）ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト、又は（ｃ）ＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなり、前記哺乳動物の心臓肥大が阻害され、前記アゴニスト又はアンタゴニストは抗−ＰＲＯ抗体であってよい。好ましくは、哺乳動物はヒトであり、心臓肥大は心筋梗塞によって誘発されたものである。
【００１８】
また他の実施態様において、本発明は、哺乳動物の心臓肥大を刺激する方法を提供し、それは（ａ）ＰＲＯポリペプチド、（ｂ）ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト、又は（ｃ）ＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなり、前記哺乳動物の心臓肥大が刺激され、前記アゴニスト又はアンタゴニストは抗−ＰＲＯ抗体であってよい。好ましくは、哺乳動物は鬱血性心不全を罹患したヒトである。
また他の実施態様では、本発明は、哺乳動物においてＰＲＯポリペプチドにより誘発される血管形成を阻害する方法を提供し、それは、当該哺乳動物に治療的有効量の抗−ＰＲＯ抗体を投与することを含んでなる。好ましくは、哺乳動物は鬱血性心不全を罹患したヒトである。
また他の実施態様では、本発明は、哺乳動物においてＰＲＯポリペプチドにより誘発される血管形成を刺激する方法を提供し、それは、当該哺乳動物に治療的有効量のＰＲＯポリペプチドを投与することを含んでなる。好ましくは、哺乳動物はヒトであり、より好ましくは血管形成は組織再生又は外傷治癒を促進する。
また他の実施態様では、本発明は、哺乳動物へのＰＲＯ２１， ＰＲＯ１８１， ＰＲＯ２０５， ＰＲＯ２１４， ＰＲＯ２２１， ＰＲＯ２２９， ＰＲＯ２３１， ＰＲＯ２３８， ＰＲＯ２４１， ＰＲＯ２４７， ＰＲＯ２５６， ＰＲＯ２５８， ＰＲＯ２６３， ＰＲＯ２６５， ＰＲＯ２９５， ＰＲＯ３２１， ＰＲＯ３２２， ＰＲＯ３３７， ＰＲＯ３６３， ＰＲＯ３６５， ＰＲＯ４４４， ＰＲＯ５３３， ＰＲＯ６９７， ＰＲＯ７２０， ＰＲＯ７２５， ＰＲＯ７７１， ＰＲＯ７８８， ＰＲＯ７９１， ＰＲＯ８１９， ＰＲＯ８２７， ＰＲＯ８２８， ＰＲＯ８３６， ＰＲＯ８４６， ＰＲＯ８６５， ＰＲＯ１００５， ＰＲＯ１００６， ＰＲＯ１００７， ＰＲＯ１０２５， ＰＲＯ１０２９， ＰＲＯ１０５４， ＰＲＯ１０７１， ＰＲＯ１０７５， ＰＲＯ１０７９， ＰＲＯ１０８０， ＰＲＯ１１１４， ＰＲＯ１１３１， ＰＲＯ１１５５， ＰＲＯ１１６０， ＰＲＯ１１８４， ＰＲＯ１１８６， ＰＲＯ１１９０， ＰＲＯ１１９２， ＰＲＯ１１９５， ＰＲＯ１２４４， ＰＲＯ１２７２， ＰＲＯ１２７３， ＰＲＯ１２７４， ＰＲＯ１２７９， ＰＲＯ１２８３， ＰＲＯ１２８６， ＰＲＯ１３０６， ＰＲＯ１３０９， ＰＲＯ１３２５， ＰＲＯ１３２９， ＰＲＯ１３４７， ＰＲＯ１３５６， ＰＲＯ１３７６， ＰＲＯ１３８２， ＰＲＯ１４１１， ＰＲＯ１４１２， ＰＲＯ１４１９， ＰＲＯ１４７４， ＰＲＯ１４７７， ＰＲＯ１４８８， ＰＲＯ１５０８， ＰＲＯ１５５０， ＰＲＯ１５５６， ＰＲＯ１７６０， ＰＲＯ１７８２， ＰＲＯ１７８７， ＰＲＯ１８０１， ＰＲＯ１８６８， ＰＲＯ１８８７， ＰＲＯ１８９０， ＰＲＯ３４３８， ＰＲＯ３４４４， ＰＲＯ４３０２， ＰＲＯ４３２４， ＰＲＯ４３３３， ＰＲＯ４３４１， ＰＲＯ４３４２， ＰＲＯ４３５３， ＰＲＯ４３５４， ＰＲＯ４３５６， ＰＲＯ４３７１， ＰＲＯ４４０５， ＰＲＯ４４０８， ＰＲＯ４４２２， ＰＲＯ４４２５， ＰＲＯ４４９９， ＰＲＯ５７２３， ＰＲＯ５７２５， ＰＲＯ５７３７， ＰＲＯ５７７６， ＰＲＯ６００６， ＰＲＯ６０２９， ＰＲＯ６０７１， ＰＲＯ７４３６， ＰＲＯ９７７１， ＰＲＯ９８２１， ＰＲＯ９８７３， ＰＲＯ１０００８， ＰＲＯ１００９６， ＰＲＯ１９６７０， ＰＲＯ２００４０， ＰＲＯ２００４４， ＰＲＯ２１０５５， ＰＲＯ２１３８４又はＰＲＯ２８６３１ポリペプチド、そのアゴニスト又はそのアンタゴニストの投与を含んでなる哺乳動物における内皮細胞の増殖を調節（例えば、阻害又は刺激）する方法であって、前記哺乳動物において内皮細胞の増殖が調節される方法を提供する。
【００１９】
また他の実施態様では、本発明は、哺乳動物へのＰＲＯ１６２， ＰＲＯ１８１， ＰＲＯ１８２， ＰＲＯ１９５， ＰＲＯ２０４， ＰＲＯ２２１， ＰＲＯ２３０， ＰＲＯ２５６， ＰＲＯ２５８， ＰＲＯ５３３， ＰＲＯ６９７， ＰＲＯ７２５， ＰＲＯ７３８， ＰＲＯ８２６， ＰＲＯ８３６， ＰＲＯ８４０， ＰＲＯ８４６， ＰＲＯ８６５， ＰＲＯ９８２， ＰＲＯ１０２５， ＰＲＯ１０２９， ＰＲＯ１０７１， ＰＲＯ１０８０， ＰＲＯ１０８３， ＰＲＯ１１３４， ＰＲＯ１１６０， ＰＲＯ１１８２， ＰＲＯ１１８４， ＰＲＯ１１８６， ＰＲＯ１１９２， ＰＲＯ１２６５， ＰＲＯ１２７４， ＰＲＯ１２７９， ＰＲＯ１２８３， ＰＲＯ１３０６， ＰＲＯ１３０８， ＰＲＯ１３０９， ＰＲＯ１３２５， ＰＲＯ１３３７， ＰＲＯ１３３８， ＰＲＯ１３４３， ＰＲＯ１３７６， ＰＲＯ１３８７， ＰＲＯ１４１１， ＰＲＯ１４１２， ＰＲＯ１４１５， ＰＲＯ１４３４， ＰＲＯ１４７４， ＰＲＯ１４８８， ＰＲＯ１５５０， ＰＲＯ１５５６， ＰＲＯ１５６７， ＰＲＯ１６００， ＰＲＯ１７５４， ＰＲＯ１７５８， ＰＲＯ１７６０， ＰＲＯ１７８７， ＰＲＯ１８６５， ＰＲＯ１８６８， ＰＲＯ１９１７， ＰＲＯ１９２８， ＰＲＯ３４３８， ＰＲＯ３５６２， ＰＲＯ４３０２， ＰＲＯ４３３３， ＰＲＯ４３４５， ＰＲＯ４３５３， ＰＲＯ４３５４， ＰＲＯ４４０５， ＰＲＯ４４０８， ＰＲＯ４４３０， ＰＲＯ４５０３， ＰＲＯ５７２５， ＰＲＯ６７１４， ＰＲＯ９７７１， ＰＲＯ９８２０， ＰＲＯ９９４０， ＰＲＯ１００９６， ＰＲＯ２１０５５， ＰＲＯ２１１８４又はＰＲＯ２１３６６ポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニストの投与を含んでなる哺乳動物における平滑筋細胞の増殖を調節（例えば、阻害又は刺激）する方法であって、前記哺乳動物において平滑筋細胞の増殖が調節される方法を提供する。
また他の実施態様では、本発明は、哺乳動物へのＰＲＯ２１ポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニストの投与を含んでなる哺乳動物における心肥大を調節（例えば、誘導又は減少）する方法であって、前記哺乳動物において心肥大が刺激される方法を提供する。
また他の実施態様では、本発明は、哺乳動物へのＰＲＯ４３０２ポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニストの投与を含んでなる哺乳動物における内皮細胞のアポトーシスを調節（例えば、誘導又は減少）する方法であって、前記哺乳動物において心肥大が調節される方法を提供する。
さらに他の実施態様では、本発明は、哺乳動物へのＰＲＯ１３７６又はＰＲＯ１４４９ポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニストの治療的有効量を投与することを含んでなる哺乳動物における血管形成を調節（例えば、阻害又は刺激）する方法であって、前記血管形成が調節される方法を提供する。
さらに他の実施態様において、本発明は、ＰＲＯ１７８， ＰＲＯ１９５， ＰＲＯ２２８， ＰＲＯ３０１， ＰＲＯ３０２， ＰＲＯ５３２， ＰＲＯ７２４， ＰＲＯ７３０， ＰＲＯ７３４， ＰＲＯ７９３， ＰＲＯ８７１， ＰＲＯ９３８， ＰＲＯ１０１２， ＰＲＯ１１２０， ＰＲＯ１１３９， ＰＲＯ１１９８， ＰＲＯ１２８７， ＰＲＯ１３６１， ＰＲＯ１８６４， ＰＲＯ１８７３， ＰＲＯ２０１０， ＰＲＯ３５７９， ＰＲＯ４３１３， ＰＲＯ４５２７， ＰＲＯ４５３８， ＰＲＯ４５５３， ＰＲＯ４９９５， ＰＲＯ５７３０， ＰＲＯ６００８， ＰＲＯ７２２３， ＰＲＯ７２４８ ｏｒ ＰＲＯ７２６１ポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなる哺乳動物における内皮細胞管形成を調節（例えば、誘導又は減退）することにより血管形成を調節（例えば、誘導又は減退）する方法であって、前記哺乳動物における内皮細胞管形成が調節される方法を提供する。
本発明の他の実施態様において、本発明はＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸配列を提供する。
【００２０】
一態様では、単離された核酸分子は、（ａ）ここに開示する全長アミノ酸配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示するシグナルペプチド有又は無の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示する全長アミノ酸配列の特に同定された他の断片を持つＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して少なくとも約８０％， ８１％， ８２％， ８３％， ８４％， ８５％， ８６％， ８７％， ８８％， ８９％， ９０％， ９１％， ９２％， ９３％， ９４％， ９５％， ９６％， ９７％又は９８％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
他の態様では、単離された核酸分子は、（ａ）ここに開示する全長ＰＲＯポリペプチドｃＤＮＡコード化配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠くＰＲＯポリペプチドのコード化配列、ここに開示するシグナルペプチド有又は無の膜貫通ＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメインのコード化配列、又はここに開示する全長アミノ酸配列の特に同定された他の断片のコード化配列を持つＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して少なくとも約８０％， ８１％， ８２％， ８３％， ８４％， ８５％， ８６％， ８７％， ８８％， ８９％， ９０％， ９１％， ９２％， ９３％， ９４％， ９５％， ９６％， ９７％又は９８％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
さらなる態様では、本発明は（ａ）ここに開示するＡＴＣＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡの任意のものにコードされるのと同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８０％， ８１％， ８２％， ８３％， ８４％， ８５％， ８６％， ８７％， ８８％， ８９％， ９０％， ９１％， ９２％， ９３％， ９４％， ９５％， ９６％， ９７％又は９８％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。
本発明の他の態様は、膜貫通ドメインが欠失しているか又は膜貫通ドメインが不活性化されているＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又はそのようなコード化ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供し、そのようなポリペプチドの膜貫通ドメインはここに開示される。従って、ここに記載されるＰＲＯポリペプチドの可溶性細胞外ドメインが考慮される。
【００２１】
他の実施態様はＰＲＯポリペプチドコード化配列の断片、又はその相補鎖に向けられ、それらは、例えば、場合によっては抗−ＰＲＯ抗体に対する結合部位を含むポリペプチドをコードするＰＲＯポリペプチドのコード化断片のハイブリッド形成プローブとして、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとしての用途が見いだされる。このような核酸断片は、通常は少なくとも約２０， ３０， ４０， ５０， ６０， ７０， ８０， ９０， １００， １１０， １２０， １３０， １４０， １５０， １６０， １７０， １８０， １９０， ２００， ２５０， ３００， ３５０， ４００， ４５０， ５００， ６００， ７００又は８００ヌクレオチド長であり、あるいは、少なくとも約１０００ヌクレオチド長であって、ここで「約」という語の内容は参照する長さのプラス又はマイナス１０％のヌクレオチド配列長を指すことを意味する。ＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規な断片は、多くの周知の配列アラインメントプログラムの任意のものを用いてＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列と他の公知のヌクレオチド配列とを整列させ、いずれのＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列断片が新規であるかを決定することにより、定法で同定してもよいことを付言しておく。このようなＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列は全てここで考慮される。また、これらのヌクレオチド分子断片、好ましくは抗−ＰＲＯ抗体に対する結合部位を含むＰＲＯポリペプチド断片によってコードされるＰＲＯポリペプチド断片も考慮される。
【００２２】
他の実施態様では、本発明は、上記で特定された単離された核酸配列の任意のものにコードされる単離されたＰＲＯポリペプチドを提供する。
ある態様では、本発明は、ここに開示する全長アミノ酸配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示するシグナルペプチド有又は無の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示する全長アミノ酸配列の特に同定された他の断片を持つＰＲＯポリペプチドに対して少なくとも約８０％， ８１％， ８２％， ８３％， ８４％， ８５％， ８６％， ８７％， ８８％， ８９％， ９０％， ９１％， ９２％， ９３％， ９４％， ９５％， ９６％， ９７％又は９８％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたＰＲＯポリペプチドを提供する。
さらなる態様では、本発明は、ここに開示するＡＴＣＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡの任意のものにコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％， ８１％， ８２％， ８３％， ８４％， ８５％， ８６％， ８７％， ８８％， ８９％， ９０％， ９１％， ９２％， ９３％， ９４％， ９５％， ９６％， ９７％又は９８％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたＰＲＯポリペプチドを提供する。
特別な実施態様では、本発明は、Ｎ−末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを持たず、上記したようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる単離されたＰＲＯポリペプチドを提供する。それらを製造する方法もここに記載され、それらの方法は、適当なコード化核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞をＰＲＯポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、培養培地からＰＲＯポリペプチドを回収することを含む。
本発明の他の態様は、膜貫通ドメインの欠失した又は膜貫通ドメインが不活性化された、単離されたＰＲＯポリペプチドを提供する。それらを製造する方法もここに記載され、それらの方法は、適当なコード化核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞をＰＲＯポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培地からＰＲＯポリペプチドを回収することを含む。
さらに他の実施態様では、本発明は、ここで同定される天然ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストを提供する。特別な実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗−ＰＲＯ抗体又は小分子である。
さらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法に関し、それは、ＰＲＯポリペプチドを候補分子と接触させ、前記ＰＲＯポリペプチドによって媒介される生物学的活性をモニタリングすることを含む。好ましくは、ＰＲＯポリペプチドは天然ＰＲＯポリペプチドである。
【００２３】
またさらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯポリペプチド、又はここに記載するＰＲＯポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗−ＰＲＯ抗体を、担体と組み合わせて含有する物質の組成物に関する。場合によっては、担体は薬剤的に許容される担体である。
本発明の他の実施態様は、ＰＲＯポリペプチド、又は上記したようなそのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗−ＰＲＯ抗体の、ＰＲＯポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニスト又は抗−ＰＲＯ抗体に起因する状態の治療において有用な医薬の調製のための使用に向けられる。
本発明のさらなる実施態様では、本発明は、ここに記載するポリペプチドの任意のものをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。そのようなベクターの任意のものを含む宿主細胞も提供される。例として、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、又はバキュウロウイルス感染昆虫細胞であってよい。ここに記載する任意のポリペプチドの製造方法がさらに提供され、それは、宿主細胞を所望のポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培地から所望のポリペプチドを回収することを含む。
他の実施態様では、本発明は、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した、ここに記載する任意のポリペプチドを含んでなるキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例は、エピトープタグ配列又は免疫グロブリンのＦｃ領域に融合したここに記載の任意のポリペプチドを含む。
他の実施態様では、本発明は、上記又は下記のポリペプチドの任意のものに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片又は一本鎖抗体である。
さらに他の実施態様では、本発明は、ゲノム及びｃＤＮＡヌクレオチド配列又はアンチセンスプローブの単離に有用なオリゴヌクレオチドプローブを提供し、それらのプローブは上記又は下記のヌクレオチド配列の任意のものから誘導されうる。
【００２４】
５．発明の詳細な説明
５．１．定義
「心臓血管、内皮及び血管形成疾患」、「心臓血管、内皮及び血管形成機能不全」、「心臓血管、内皮又は血管形成疾患」及び「心臓血管、内皮又は血管形成機能不全」という用語は相互交換可能に使用され、並びに血管、例えば動脈、毛細管、静脈、及び／又はリンパ管それ自体の病気の、糖尿病などの血管に影響を与える全身疾患の一部を称する。これには、血管形成及び／又は心臓血管新生を刺激する徴候、及び血管形成及び／又は心臓血管新生を阻害する徴候が含まれている。このような疾患には、例えば動脈の病気、例えばアテローム性動脈硬化、高血圧、炎症性脈管炎、レーノー病及びレーノー現象、動脈瘤、及び動脈再狭窄；静脈及びリンパ管の疾患、例えば血栓静脈炎、リンパ管炎、及びリンパ浮腫；及び他の血管疾患、例えば末梢血管病、癌、例えば血管腫瘍、例えば血管腫（毛細管及び海綿状）、グロムス腫瘍、毛細管拡張症、細菌性血管腫症、血管内皮腫、血管肉腫、血管外皮細胞腫、カポジ肉腫、リンパ管腫、及びリンパ管肉腫、腫瘍血管形成、外傷、例えば傷、火傷、及び他に損傷を被った組織、移植固定、瘢痕化、虚血再潅流傷害、慢性関節リュウマチ、脳血管の病気、腎臓病、例えば急性腎不全、及び骨粗鬆症が含まれる。また、アンギナ、心筋梗塞、例えば急性心筋梗塞、心臓肥大、及び心不全、例えばＣＨＦも含まれる。
ここで使用される場合の「肥大」とは、腫瘍形成に関与しない正常な成長とは無関係に組織又は構造体の大きさが増加することとして定義される。器官又は組織の肥大は個々の細胞の大きさの増加（真性肥大）、又は組織を形成する細胞数の増加（過形成）、又はその両方のいずれかによる。ある種の器官、例えば心臓は誕生後、短い期間で分割能力を失う。従って、「心臓肥大」は心臓の大きさが増加するものとして定義され、成人においては、細胞分割が付随することのない、収縮性タンパク質の含有量とミオサイトの細胞サイズの増加により特徴付けられる。肥大を刺激する原因となるストレスの特徴（例えば、プレロードの増加、アフターロードの増加、心筋梗塞の場合と同様のミオサイトの損失、収縮性の一次低下）が、反応の性質の決定において重要な役割を担っていることは明らかである。心臓肥大の初期段階は、通常、ミオフィブリルとミトコンドリアのサイズの増加、並びにミトコンドリアと核の拡大により形態学的に特徴付けられる。この段階において、筋細胞は正常なものよりもより大きくなり、細胞組織はかなり保存される。心臓肥大の段階がさらに進行すると、特定のオルガネラ、例えばミトコンドリアの数及びサイズが優先的に増加し、新規の収縮エレメントは不規則な方法で、細胞の局在領域に添加される。長年にわたって肥大を被っている細胞は、隣接するミオフィブリルを置換し、正常なＺ膜レジストレーションの破壊を引き起こす、高度に分葉された膜を有する、かなり拡大した核を含む、細胞組織体におけるより明らかな分裂を示す。「心臓肥大」という用語は、根底にある心疾患に関係なく、心筋の種々の度合いの構造的ダメージにより特徴付けられる病状の進行における全ての段階を含むように使用される。この故に、その用語は、心臓肥大の進行における生理学的病状、例えば血圧の上昇、大動脈狭窄、又は心筋梗塞も含まれる。
【００２５】
「心不全」は、心臓が代謝中の組織の要求が必要とする速さで血液を送らない心機能の異常を指す。心不全は虚血、先天的、リュウマチ性又は特発的形態を含む、種々の因子が原因となり得る。
「うっ血性心不全」（ＣＨＦ）は、末梢組織まで酸素化された血液を送達させるために、十分な心拍出量（経時的に心臓により押し出される血液量）を供給することのできない心臓の進行性の病状である。 ＣＨＦが進行すると、構造的及び血行力学的ダメージが生じる。これらのダメージは色々と現れ、一つの特徴的徴候は心室肥大である。ＣＨＦは多くの心疾患の共通した終末結果である。
「心筋梗塞」は、しばしば多重冠動脈血栓症を伴う、冠動脈のアテローム性動脈硬化の結果であると一般的にされている。それは、心室壁の全厚みにわたって心筋壊死がある壁内梗塞、及び心室壁を通って心外膜に至る全ての経路に伸長することなく、壊死が内皮下層、心筋壁内、又はその両方にある副心内膜（非壁内）梗塞２つのタイプに分けることができる。心筋梗塞は、血行力学的影響の変化と心臓のダメージを受けた構造及び健康なゾーンにおける変化の両方に原因があることが知られている。よって、例えば心筋梗塞により心臓の最大流出量及び心臓鼓動容量が低減する。また、心筋梗塞に関連して、間隙に生じるＤＮＡ合成が刺激され、影響を受けていない心臓領域におけるコラーゲンの形成が増加する。
長期間にわたる高血圧において、心臓のストレス及び圧力が増加する結果、例えば全末梢耐性が増加して、心臓肥大は長期間「高血圧」を付随するようになる。慢性的に圧力が加わる結果、肥大した心室の特徴は、心拡張の実行が損なわれることである。Ｆｏｕａｄ等，  Ｊ． Ａｍ． Ｃｏｌｌ． Ｃａｒｄｉｏｌ．， ４：１５００−１５０６（１９８４）；Ｓｍｉｔｈ等，  Ｊ． Ａｍ． Ｃｏｌｌ． Ｃａｒｄｉｏｌ．， ５：８６９−８７４（１９８５）。長期間にわたる左心室の弛緩が、心収縮機能が正常又は通常であるにかかわらず、早期に本質的な高血圧にみられた。Ｈａｒｔｆｏｒｄ等，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ， ６： ３２９−３３８（１９８４）。しかし、血圧レベルと心臓肥大との間には近い並行性はない。ヒトにおいて、抗高血圧治療に応じて左心室機能の改善が報告されているが、利尿薬（ヒドロクロロチアジド）、β−ブロッカー（プレパノロール）、又はカルシウムチャンネルブロッカー（ジルチアゼム）で治療している患者は、心拡張機能が改善されることなく左心室肥大への逆戻りがみられる。Ｉｎｏｕｙｅ等， Ａｍ． Ｊ． Ｃａｒｄｉｏｌ．， ５３：１５８３−７（１９８４）。
【００２６】
心臓肥大に関連した他の複合的心疾患は「肥大性心筋症」である。この病状は形態学的、機能的及び臨床的特性が非常に多様であること（Ｍａｒｏｎ等， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３１６：７８０−７８９（１９８７）；Ｓｐｉｒｉｔｏ等，  Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３２０：７４９−７５５（１９８９）；Ｌｏｕｉｅ及びＥｄｗａｒｄｓ， ＰＲＯｇ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｄｉｓ．， ３６：２７５−３０８（１９９４）；Ｗｉｇｌｅ等， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ９２：１６８０−１６９２（１９９５））により特徴付けられる、その異種性は全年齢の患者を悩ますという点で強調される。Ｓｐｉｒｉｔｏ等， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３３６：７７５−７８５（１９９７）。また、肥大心筋症の原因となる要因は多様であり、ほとんど理解されていない。一般的に、サルコメアタンパク質をコードする遺伝子における変異が肥大性心筋症に関与している。近年のデータでは、β−ミオシン重鎖変異が、家族性肥大性心筋症の原因の約３０から４０パーセントであると計測されていることを示唆している。Ｗａｔｋｉｎｓ等， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３２６：１１０８−１１１４（１９９２）；Ｓｃｈｗａｒｔｚ等， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ９１：５３２−５４０（１９９５）；Ｍａｒｉａｎ及びＲｏｂｅｒｔｓ，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ９２：１３３６−１３４７（１９９５）；Ｔｈｉｅｒｆｅｌｄｅｒ等， Ｃｅｌｌ， ７７：７０１−７１２（１９９４）；Ｗａｔｋｉｎｓ等， Ｎａｔ． Ｇｅｎ．， １１：４３４−４３７（１９９５）。β−ミオシン重鎖の他にも、他の位置の遺伝子変異に、心臓トロポニンＴ、アルファトポミオシン、心臓ミオシン結合プロテインＣ、必須ミオシン軽鎖、及び調節性ミオシン軽鎖が含まれる。Ｍａｌｉｋ及びＷａｔｋｉｎｓ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃａｒｄｉｏｌ．， １２：２９５−３０２（１９９７）を参照されたい。
上弁「大動脈狭窄」は、上行大動脈が狭くなることにより特徴付けられる遺伝性血管疾患であるが、肺動脈を含む他の動脈もさらに影響をうけるおそれがある。未治療の大動脈狭窄では、心内圧力が増加し、結果として心臓肥大が生じ、最終的には心不全及び死に至る。この疾患の病因は十分には理解されていないが、中間平滑筋の過形及び肥大がことによってはこの疾患の顕著な特徴である。エラスチン遺伝子の分子変異体が大動脈狭窄の進行の病因に関与していることが、１９９７年７月２２日公開の米国特許第５，６５０，２８２号に報告されている。
「心臓弁逆流」は心臓弁の疾患の結果による心臓病の結果として生じる。リュウマチ熱のような種々の病気は、弁オリフィスの収縮又は引っ張りを引き起こすものであるが、他の病気は、心内膜炎、心内膜又は心房オリフィスの内側の膜の炎症、及び心臓の動きに関する。欠損、例えば弁狭窄又は弁の欠損近接により、心臓腔における血液の蓄積、又は弁を通過しての血液の逆流が生じる。弁狭窄又は不全を長期間治癒しないと、心臓肥大や心筋に関連したダメージを被る結果となり、最終的には弁の交換が必要となる。
これら全て、及び心臓肥大が付随するしないに関わらず他の心臓血管、内皮及び血管形成疾患の治療が本発明に含まれる。
【００２７】
「癌」、「癌性」及び「悪性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、黒色腫、肉腫、及び白血病を含む癌腫が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、例えば肝癌（ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）及び肝細胞腫（ｈｅｐａｔｏｍａ）、膀胱癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮体癌、唾液腺癌、腎細胞癌及びウィルムス腫瘍等の腎臓癌、基底細胞癌、黒色腫、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、及び様々な種類の頭部及び頸部の癌が含まれる。ここでの治療に好適な癌は乳癌、大腸癌、肺癌、黒色腫、卵巣癌及び上述に記した血管腫瘍に係るものである。
ここで用いられる「細胞毒性薬」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅ）、化学治療薬、及び細菌、真菌、植物又は動物起源の酵素活性毒素等の毒素、又はそれらの断片を含むことを意図する。
「化学治療薬」は、癌の治療に有用な化学化合物である。化学治療薬の例には、アルキル化剤、葉酸アンタゴニスト、核酸代謝の代謝拮抗物質、抗生物質、ピリミジン類似物、５−フルオロウラシル、シスプラチン、プリンヌクレオシド、アミン類、アミノ酸、トリアゾールヌクレオシド、又はコルチコステロイド類が含まれる。特定の例には、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、トキソテア、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン（米国特許第４，６７５，１８７号参照）、メルファラン及び関連するナイトロジェンマスタードを含む。また、タモキシフェン及びオナプリストン等の腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように機能するホルモン薬もこの定義に含まれる。
【００２８】
「成長阻害薬」は、ここで用いられる場合、インビトロ又はインビボで、細胞、例えばＷｎｔ−過剰発現癌細胞の成長を阻害する化合物又は組成物を称する。即ち、成長阻害薬は、Ｓ期における悪性細胞のパーセンテージをかなり低減させるものである。成長阻害薬の例は、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）阻止する薬剤、例えば、Ｇ１停止及びＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキソール、及びトポＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。Ｇ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル及びＡｒａ−Ｃである。さらなる情報は、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ及びＩｓｒａｅｌ，編集， Ｃｈａｐｔｅｒ １， Ｍｕｒａｋａｍｉらによる表題「Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ， ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ， ａｎｄ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｄｒｕｇｓ」（ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ： Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， １９９５）、特に１３頁に見出される。さらなる例には、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、酸性又は塩基性ＦＧＦ又は肝実質細胞成長因子（ＨＧＦ）の血管形成活性を阻害又は中和可能な抗体、組織因子の凝固活性を阻害又は中和可能な抗体、プロテインＣ又はプロテインＳ（１９９１年２月２１日に公開されたＷＯ９１／０１７５３を参照されたい）、又はＨＥＲ２レセプターに結合可能な抗体（ＷＯ８９／０６６９２）、例えば４Ｄ５抗体（及びそれらの機能的等価物）（例えばＷＯ９２／２２６５３）が含まれる。
「治療」とは、心臓血管、内皮及び血管形成疾患の病的状態の進行の防止又は改変を意図して行われる。治療の概念は最も広い意味に使用され、任意の段階の心臓血管、内皮及び血管形成疾患の防止（予防）、緩和、低減、及び治癒を特に含む。従って、「治療」は治癒的処置、及び予防的又は防止的手段の両方を称し、目的は肥大のような心臓血管、内皮及び血管形成疾患を防止し又は遅延させ（低減させ）又は改善することにある。治療が必要なものとは、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患に罹りやすいもの又は疾患が防止されているものを含む。疾患は、特発症、心栄養性（ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｃ）、又は筋栄養性の原因、又は虚血又は虚血発作、例えば心筋梗塞を含む、任意の原因の結果によるものである。
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式で薬剤を投与し、初期の治療効果、例えば抗肥大効果を長時間に渡って維持することを称する。
治療の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を称する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
一又は複数のさらなる治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
【００２９】
「心臓血管、内皮及び血管形成薬」なる用語は、一般的に、心臓血管、内皮及び血管形成疾患の治療に作用する任意の薬剤を称する。心臓血管剤の例は、血圧、心拍数、心収縮、及び内皮及び平滑筋の生物学を調節する血管ホメオスタシスを促進するもので、全因子は心臓血管病における役割を有している。これらの特定の例には、アンジオテンシン−ＩＩレセプターアンタゴニスト；エンドセリンレセプターアンタゴニスト、例えばＢＯＳＥＮＴＡＮＴＭ及びＭＯＸＯＮＯＤＩＮＴＭ；インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）；デス−アスパラタート−アンジオテンシンＩ；血栓溶解剤、例えばストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、ｔ−ＰＡ、及び半減期がより長く、非常に高いフィブリン特異性を有するように設計されたｔ−ＰＡ変異体、ＴＮＫ−ｔ−ＰＡ（Ｔ１０３Ｎ、Ｎ１１７Ｑ、ＫＨＲＲ（２９６−２９９）ＡＡＡＡｔ−ＰＡ変異体， Ｋｅｙｔ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１：３６７０−３６７４（１９９４））：強心薬又は昇圧薬、例えばジゴキシゲニン、及びβ−アドレナリン様レセプターブロック剤、例えばプロプラノロール、チモロール、タータロロール、カルテオロール、ナドロール、ベタキソロール、ペンブトロール、アセトブトロール、アテノロール、メトプロロール、及びカーベジルロール；アンジオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）インヒビター、例えばクイナピリル、カプトプリル、エナラプリル、ラミプリル、ベナゼプリル、フォシノプリル及びリシノプリル；ジウレティクス、例えばクロロチアザイド、ヒドロクロロチアザイド、ヒドロフルメタザイド、メチルクロチアザイド、ベンズチアザイド、ジクロロフェナミド、アセタゾラミド、及びインダパミド；及びカルシウムチャンネルブロッカー、例えばジルチアゼム、ニフェジピン、ベラパミル及びニカルジピンが含まれる。この種の好ましい一カテゴリーは、心臓肥大、又は心臓肥大の進行における生理学的状態、例えば血圧の上昇、大動脈狭窄又は心筋梗塞の治療に使用される治療薬である。
「血管形成薬」及び「内皮薬」は、血管形成及び／又は内皮細胞の成長、又は適切であるならば血管形成を促進する活性剤である。これには、傷の治癒を促進する因子、例えば成長ホルモン、インシュリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、ＶＥＧＦ、ＶＩＧＦ、ＰＤＧＦ、表皮成長因子（ＥＧＦ）、ＣＴＧＦ及びそのファミリーのメンバー、ＥＧＦ、及びＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βが含まれる。
「アンジオスタチック薬」は血管形成又は管形成を阻害、又は癌細胞の成長を阻害又は防止する活性剤である。例には、上述した血管形成剤の抗体又は他のアンタゴニスト、例えばＶＥＧＦに対する抗体が含まれる。さらに、細胞治療薬、例えば細胞毒性薬、化学治療薬、成長阻害薬、アポトーシス薬、及び癌を治療する他の薬剤、例えば抗−ＨＥＲ−２、抗−ＣＤ２０、及び生物活性及び有機化学薬が含まれる。
本発明における薬理学的意味で、活性剤、例えばＰＲＯポリペプチド、又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗−ＰＲＯ抗体の「治療的有効量」とは、哺乳動物の心臓血管、内皮及び血管形成疾患の治療に有効な量を称するものであり、経験的に決定することができる。
ここで使用される場合、活性剤、例えばＰＲＯポリペプチド、又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗−ＰＲＯ抗体の「有効量」とは記載した目的の実行に有効な量を称するものであり、このような量は、所望する効果に応じて経験的に決定することができる。
ここで用いられる用語「ＰＲＯポリペプチド」及び「ＰＲＯ」は、直後に数値符号がある場合に種々のポリペプチドを指し、完全な符号（例えば、ＰＲＯ／数字）は、ここに記載する特定のポリペプチド配列を意味する。「数字」という用語がここで使用される実際の数値符号として与えられる「ＰＲＯ／数字ポリペプチド」及び「ＰＲＯ／数字」という用語は、天然配列ポリペプチド及び変異体（ここで更に詳細に定義する）を含む。ここに記載されるＰＲＯポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、組換え又は合成方法によって調製してもよい。
【００３０】
「天然配列ＰＲＯポリペプチド」は、天然由来の対応するＰＲＯポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列ＰＲＯポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＰＲＯポリペプチド」という用語には、特に、特定のＰＲＯポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、自然に生じる変異形態（例えば、選択的にスプライシングされた形態）及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の種々の実施態様において、ここに開示される天然配列ＰＲＯポリペプチドは、添付の図面に示される全長アミノ酸配列を含む成熟又は全長天然配列ポリペプチドである。開始及び停止コドンは、図において太字及び下線で示した。しかし、添付の図面に開示したＰＲＯポリペプチドは、図面におけるアミノ酸位置１としてここに標記されるメチオニン残基で始まるように示されているが、図面におけるアミノ酸位置１の上流又は下流に位置する他のメチオニン残基をＰＲＯポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いることも考えられるし可能でもある。
ＰＲＯポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質ドメインを実質的に有しないＰＲＯポリペプチドの形態を意味する。通常、ＰＲＯポリペプチドＥＣＤは、それらの膜貫通及び／又は細胞質ドメインを１％未満、好ましくはそのようなドメインを０．５％未満しか持たない。本発明のＰＲＯポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、最初に同定されたドメインのいずれかの末端から約５アミノ酸を越えない可能性が高い。従って、ＰＲＯポリペプチド細胞外ドメインは、場合によっては、実施例又は明細書で同定されたように膜貫通ドメイン及び／又は細胞外ドメインの境界のいずれかの側から約５を越えないアミノ酸を含んでもよく、シグナルペプチドを伴う又は伴わないにかかわらず、それらのポリペプチド及びそれらをコードする核酸は、本発明で考慮される。
ここに開示する種々のＰＲＯポリペプチドの「シグナルペプチド」の適切な位置は、本明細書及び／又は添付の図面に示す。しかし、注記するように、シグナルペプチドのＣ−末端境界は変化しうるが、ここで最初に同定されたシグナルペプチドＣ−末端境界のいずれかの側で約５アミノ酸未満である可能性が最も高く、シグナルペプチドのＣ−末端境界は、そのような型のアミノ酸配列成分を同定するのに日常的に使用される基準に従って同定しうる（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ等， ＰＲＯｔ． Ｅｎｇ． １０： １−６ （１９９７）及びｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ等， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． １４： ４６８３−４６９０ （１９８６））。さらに、幾つかの場合には、分泌ポリペプチドからのシグナルペプチドの切断は完全に均一ではなく、一以上の分泌種をもたらすことも認められる。シグナルペプチドがここで同定されたシグナルペプチドのＣ−末端境界の何れかの側の約５アミノ酸未満内で切断されるこれらの成熟ポリペプチド、及びそれらをコードするポリヌクレオチドは、本発明で考慮される。
【００３１】
「ＰＲＯポリペプチド変異体」とは、上記又は下記に定義されるように、ここに開示される全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示されたような、シグナルペプチドを持つか持たないＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメイン又はここに開示された全長ＰＲＯポリペプチド配列の任意の他の断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する活性ＰＲＯポリペプチドを意味する。このようなＰＲＯポリペプチド変異体には、例えば、全長天然アミノ酸配列のＮ−又はＣ−末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたＰＲＯポリペプチドが含まれる。通常、ＰＲＯポリペプチド変異体は、ここに開示される全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示されたようなシグナルペプチドを持つか持たないＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメイン又はここに開示された全長ＰＲＯポリペプチド配列の任意の他の特に明確にされた断片と、少なくとも約８０％， ８１％， ８２％， ８３％， ８４％， ８５％， ８６％， ８７％， ８８％， ８９％， ９０％， ９１％， ９２％， ９３％， ９４％， ９５％， ９６％， ９７％又は９８％のアミノ酸配列同一性、そして、或いは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。通常は、ＰＲＯ変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０， ２０， ３０， ４０， ５０， ６０， ７０， ８０， ９０， １００， １５０又は２００アミノ酸長であり、或いは少なくとも約３００アミノ酸長であり、又はそれより長い。
【００３２】
ここに定義されるＰＲＯポリペプチド配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ＰＲＯ配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、以下に記載するように、ＡＬＩＧＮ−２プログラム用の完全なソースコードが表１に与えられている配列比較プログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、表１に示したソースコードは米国著作権事務所， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．， ２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２はジェネンテク社、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを通して公的に入手可能であり、また表１に与えたソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標） Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
ここでの目的のためには、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂに対しての、それとの、又はそれと対照しての％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂに対して、それと、又はそれと対照して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた％アミノ酸配列同一性の計算の例として、表２−３は、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の、「ＰＲＯ」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の計算方法を示す。
【００３３】
特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は上記のようにＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９−３４０２ （１９９７））を用いて決定してもよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．からダウンロードでき、また他の手段ではＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤから得られる。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、ｕｎｍａｓｋ＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ−値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２である。
アミノ酸配列比較にＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂに対しての、それとの、又はそれに対照しての％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂに対しての、それとの又はそれに対照しての或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
さらに、％アミノ酸配列同一性値は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２コンピュータプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６： ４６０−４８０ （１９９６））を用いて決定してもよい。殆どのＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。ここでの目的のために、％アミノ酸配列同一性値は、（ａ）天然ＰＲＯポリペプチドから誘導された配列を有する対象とするＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列と、対象とする比較アミノ酸配列（即ち、対象とするＰＲＯポリペプチドが比較されるＰＲＯポリペプチド変異体であってもよい配列）との間の、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２によって決定した一致する同一アミノ酸残基の数を、（ｂ）対象とするＰＲＯポリペプチドの残基の総数で除した商によって決定される。例えば、「アミノ酸配列Ｂに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を持つ又は持っているアミノ酸配列Ａを含んでなるポリペプチド」という表現では、アミノ酸配列Ａが対象とする比較アミノ酸配列であり、アミノ酸配列Ｂが対象とするＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００３４】
「ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチド」又は「ＰＲＯ変異体核酸配列」は、以下に定義するような活性なＰＲＯポリペプチドをコードする核酸分子を意味し、ここに開示する全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠く全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチド有又は無のＰＲＯポリペプチド細胞外ドメイン、又はここに開示する全長ＰＲＯポリペプチド配列の任意の他の断片をコードする核酸配列に対して少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する。通常は、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドは、ここに開示する全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠く全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチド有又は無のＰＲＯポリペプチド細胞外ドメイン、又はここに開示する全長ＰＲＯポリペプチド配列の他の断片をコードする核酸配列と少なくとも約８０％， ８１％， ８２％， ８３％， ８４％， ８５％， ８６％， ８７％， ８８％， ８９％， ９０％， ９１％， ９２％， ９３％， ９４％， ９５％， ９６％， ９７％， 又は９８％の核酸配列同一性、そして、或いは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有している。変異体は、天然のヌクレオチド配列を含まない。
通常は、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約３０， ６０， ９０， １２０， １５０， １８０， ２１０， ２４０， ２７０， ３００， ４５０又は６００ヌクレオチド長であり、或いは少なくとも約９００ヌクレオチド長、又はそれより長い。
【００３５】
ここに同定されたＰＲＯポリペプチドコード化核酸配列に対する「パーセント（％）核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ＰＲＯポリペプチドコード化配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％核酸配列同一性値は、以下に記載するように、ＡＬＩＧＮ−２プログラム用の完全なソースコードが表１に与えられている配列比較プログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、表１に示したソースコードは米国著作権事務所， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．， ２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２はジェネンテク社、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを通して公的に入手可能であり、またＦｉｇ２Ａ−Ｐに与えたソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
ここでの目的のためには、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄに対しての、それとの又はそれに対照しての％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄに対しての、それとの又はそれに対照しての或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた％核酸配列同一性の計算の例として、表４−５は、「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「ＰＲＯ−ＤＮＡ」と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示す。
特に断らない限りは、ここでの全ての％核酸配列同一性値は上記のようにＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％核酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９−３４０２ （１９９７））を用いて決定してもよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードでき、あるいはその他、国立医療研究所， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤから得られる。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、ｕｎｍａｓｋ＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ−値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２である。
【００３６】
配列比較にＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄに対しての、それとの、又はそれに対照しての％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄに対しての、それとの又はそれに対照しての或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
さらに、％核酸配列同一性値は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２コンピュータプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６： ４６０−４８０ （１９９６））を用いて決定してもよい。殆どのＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。ここでの目的のために、％核酸配列同一性値は、（ａ）天然配列ＰＲＯポリペプチドコード化核酸から誘導された配列を有する対象とするＰＲＯポリペプチドコード化配列の核酸配列と、対象とする比較核酸分子（即ち、対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子の配列が比較される変異体ポリヌクレオチドであってもよい配列）との間の、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２によって決定した一致する同一ヌクレオチドの数を、（ｂ）対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸のヌクレオチドの総数で除した商によって決定される。例えば、「核酸配列Ｂに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を持つ又は持っている核酸配列Ａを含んでなる単離された核酸分子」という表現では、核酸配列Ａが対象とする比較核酸配列であり、核酸配列Ｂが対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列である。
他の実施態様では、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドは、活性なＰＲＯポリペプチドをコードする核酸分子であり、好ましくは緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で、ここでの明細書及び添付の図中に示される全長ＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリッド形成できる。ＰＲＯ変異体ポリペプチドは、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。
【００３７】
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。好ましくは、単離されたポリペプチドは、自然に結合する全ての成分と結合していない。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、（１）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、（２）クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、ＰＲＯポリペプチドの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
ＰＲＯポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子、又は抗−ＰＲＯ抗体をコードする「単離された」核酸分子は、同定され、ＰＲＯ−コード化核酸の天然源、又は抗−ＰＲＯ−コード化核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、単離された核酸分子は、自然に結合する全ての汚染物質と結合していない。単離されたＰＲＯ−コード化核酸分子又は単離された抗−ＰＲＯ−コード化核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在するＰＲＯ−コード化核酸分子又は抗−ＰＲＯ−コード化核酸分子とは区別される。しかし、ＰＲＯポリペプチドをコードする単離された核酸分子、又は抗−ＰＲＯ抗体をコードする単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるＰＲＯポリペプチド又は抗−ＰＲＯ抗体を通常は発現する細胞に含まれるＰＲＯ−核酸分子、又は抗−ＰＲＯ−核酸分子を含む。
【００３８】
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのＰＲＯポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
ハイブリッド形成反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的ストランドがその融点より低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。ハイブリッド形成反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ａｕｓｕｂｅｌ等， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， （１９９５）を参照のこと。
ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリッド形成中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるもの；（３）４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃での５０％ホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定される。
「中程度の緊縮性条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリッド形成条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度の緊縮性条件は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１ｘＳＳＣ中３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
【００３９】
「エピトープタグ」なる修飾詞は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したＰＲＯポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するのに十分な数の残基を有しているが、その長さは融合するポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８から５０のアミノ酸残基（好ましくは約１０から約２０のアミノ酸残基）を有する。
ＰＲＯ変異体における「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生ＰＲＯポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＰＲＯタンパク質の形態を称する。
ここで開示されているスクリーニングアッセイにより同定可能なＰＲＯポリペプチドに拮抗する分子（例えば、有機又は無機小分子、ペプチド等）における「生物学的活性」とは、ここで同定されたＰＲＯポリペプチドに結合又は複合体化、又は他の細胞タンパク質とＰＲＯポリペプチドとの相互作用を干渉、又はＰＲＯポリペプチドの転写又は翻訳を阻害する分子の能力を称するときに使用される。特に好ましい生物学的活性には、血管に影響を及ぼす全身疾患、例えば真性糖尿病、並びに動脈、毛細管、静脈及び／又はリンパ管の病気、及び癌に作用する心臓肥大活性が含まれる。
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＰＲＯポリペプチドの一又は複数の生物学的活性、例えば適切であるならば、その分裂促進又は血管形成活性を阻止、阻害、又は中和する任意の分子を含む。ＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストは、ＰＲＯポリペプチドの細胞レセプターへの結合に干渉する、ＰＲＯポリペプチドにより活性化される細胞を無力化又は死亡させる、又はＰＲＯポリペプチドが細胞レセプターに結合した後に血管内皮細胞の活性化に干渉することにより作用する。ＰＲＯポリペプチドアンタゴニストによる仲介のこのような点の全ては、この発明の目的と等しいと考えられる。アンタゴニストは、分裂促進、血管形成、又はＰＲＯポリペプチドの他の生物学的活性を阻害し、よって、腫瘍、特に固形悪性腫瘍、慢性関節リュウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化、糖尿病、他の網膜症、水晶体後繊維増殖症、年齢関連性斑変性、新血管新生緑内障、血管腫、甲状腺過形成（グレイブス病を含む）、角膜及び他の組織の移植、及び慢性炎症を含む、所望しない過度の新血管新生により特徴付けられる病気又は疾患の治療に有用である。また、アンタゴニストは、所望しない過度の血管浸透性により特徴付けられる病気又は疾患、例えば脳腫瘍に関連した浮腫、悪性腫瘍に関連した腹水症、メーグス症候群、肺炎、ネフローゼ症候群、心外膜液（例えば心膜炎に関連したもの）、胸膜滲出の治療に有用である。同様に「アゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＰＲＯポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を含む。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然ＰＲＯポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機小分子等を含む。
「小分子」とは、ここでは約５００ダルトン以下の分子量を有するものと定義する。
ここで使用される場合の「ＰＲＯポリペプチドレセプター」なる用語は、ＰＲＯポリペプチドの細胞性レセプター、通常は血管内皮細胞に見出される細胞表面レセプター、並びにＰＲＯポリペプチドに結合する能力を保持しているそれらの変異体を称する。
【００４０】
「抗体」（ＡＢｓ）と「免疫グロブリン」（Ｉｇｓ）は同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すものであるが、免疫グロブリンは、抗体及び抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含むものである。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系により低レベルで、骨髄腫により増加したレベルで産生される。「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、限定するものではないが、特に無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷の抗体から形成された多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片も含む。
「天然抗体」及び「天然免疫グロブリン」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン（ＶＨ）を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、他端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を称する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つのＣＤＲにより連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲ領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲにより近接して結合せしめられ、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。Ｋａｂａｔ等， ＮＩＨ Ｐｕｂｌ． Ｎｏ．９１−３２４２， Ｖｏｌ．Ｉ， ６４７−６６９頁［１９９１］を参照のこと。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害活性への抗体の関与を示す。
【００４１】
「抗体断片」には、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域が含まれる。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片；ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）；直鎖状抗体（Ｚａｐａｔａ等， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ８（１０）：１０５７−１０６２［１９９５］）；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
抗体のパパイン消化により、各々が単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、その名称が容易に結晶化する能力を表す、残りの「Ｆｃ」断片が産生される。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、更に抗原を架橋させ得るＦ（ａｂ’）２断片が得られる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの３つのＣＤＲは相互に作用してＶＨ−ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（又は抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域（ＣＨ１）を有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を担持しているＦａｂ’に対するここでの命名である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生産された。抗体断片の他の化学結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには５つの主たるクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらのいくつかは更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分割される。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、σ、ε、γ及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び３次元構造はよく知られている。
【００４２】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対している。更に、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的には含む通常の（ポリクローナル）抗体と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されていないハイブリドーマ培養から合成される点で有利である。「モノクローナル」との修飾詞は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ等， Ｎａｔｕｒｅ ２５６， ４９５ （１９７５）により開示されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作ることができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）。また「モノクローナル抗体」は、例えばＣｌａｃｋｓｏｎ等， Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）、及びＭａｒｋｓほか， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来の抗体あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体あるいは他の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りそれら抗体の断片を特に含む（米国特許第４，８１６，５６７号； Ｍｏｒｒｉｓｏｎほか， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１：６８５１−６８５５［１９８４］）。
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはそれらの断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列）であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。大部分においてヒト化抗体はレシピエントのＣＤＲの残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖＦＲ領域残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練し、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる。更なる詳細は、Ｊｏｎｅｓ等， Ｎａｔｕｒｅ ３２１， ５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ等， Ｎａｔｕｒｅ ３３２， ３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２， ５９３−５９６（１９９２）を参照のこと。ヒト化抗体は、抗体の抗原結合領域が、関心のある抗原でマカクザルを免疫化することにより生産された抗体から由来するプリマタイズしたＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤＴＭ抗体を含む。
【００４３】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含有するもので、これらのドメインはポリペプチド単鎖に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合に対する所望の構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーをＶＨとＶＬドメインの間に更に含んでいる。ｓＦｖのレビューには、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｖｏｌ．１１３， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９４）ｐｐ．２６９−３１５を参照されたい。
「ダイアボディー」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を意味するもので、断片は軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）に含有する。同じ鎖上での二つのドメイン間の対合が許されないほど短いリンカーを使用することにより、ドメインが、他の鎖の相補的ドメインとの対合を強いられ、二つの抗原結合部位をつくりだす。ダイアボディーは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開９３／１１１６１号；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：６４４４−６４４８ （１９９３）に更に詳しく記載されている。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、（１）ローリ法（Ｌｏｗｒｙ ｍｅｔｈｏｄ）で測定した場合９５％を越える抗体、最も好ましくは９９重量％を越えるまで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、（３）クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに「特異的に結合する」、又は「特異的である」抗体は、他の如何なるポリペプチド又はポリペプチドエピトープと実質的に結合することなく特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに結合するものである。
「標識」なる語は、ここで用いられる場合、抗体に直接又は間接的に複合して「標識」抗体を生成する検出可能な化合物又は組成物を称する。標識は、それ自身検出可能でもよく（例えば、放射性標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。検出可能な標識として提供できる放射性核種は、例えば、Ｉ−１３１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８８、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｂｉ−２１２、及びＰｄ−１０９を含む。また、標識は毒素などの検出できない物質であってもよい。
【００４４】
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに含まれる固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス（例えば、孔制御ガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。或る種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ；その他では精製カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）とすることもできる。また、この用語は、米国特許第４，２７５，１４９号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物（ＰＲＯポリペプチド又はここに開示されているそれらの抗体など）の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３又はＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
以下に示すように、表１はＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムの安全なソースコードを与える。このソースコードは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステムでの使用のために日常的にコンパイルされ、ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムを与える。
さらに、表２−５は、ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムを用いた％アミノ酸配列同一性（表２−３）及び％核酸配列同一性（表４−５）を決定するために下記の方法を使用した仮説的例示を示す図であり、「ＰＲＯ」は対象とする仮説的ＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列を示し、「比較タンパク質」は対象とする「ＰＲＯ」ポリペプチドが比較されるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、「ＰＲＯ−ＤＮＡ」は対象とするＰＲＯ−コード化核酸配列を示し、「比較ＤＮＡ」は対象とする「ＰＲＯ−ＤＮＡ」核酸分子が比較される核酸分子のヌクレオチド配列を示し、「Ｘ」、「Ｙ」及び「Ｚ」は各々異なる仮説的アミノ酸残基を示し、「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」は各々異なる仮説的ヌクレオチドを示す。
【００４５】
2004516013.tif 000002
2004516013.tif 000003
2004516013.tif 000004
2004516013.tif 000005
2004516013.tif 000006
2004516013.tif 000007
【００４６】
2004516013.tif 000008
2004516013.tif 000009
2004516013.tif 000010
2004516013.tif 000011
2004516013.tif 000012
2004516013.tif 000013
【００４７】
2004516013.tif 000014
2004516013.tif 000015
2004516013.tif 000016
2004516013.tif 000017
2004516013.tif 000018
【００４８】
2004516013.tif 000019
【００４９】
５．２．本発明の組成物及び方法
５．２．１．ＰＲＯ変異体
ここに記載した全長天然配列ＰＲＯに加えて、ＰＲＯ変異体も調製できると考えられる。ＰＲＯ変異体は、ＰＲＯポリペプチドＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、及び／又は所望のＰＲＯポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がＰＲＯポリペプチドの翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
天然全長配列ＰＲＯ又はここに記載したＰＲＯポリペプチドの種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第５，３６４，９３４号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列ＰＲＯポリペプチドと比較した場合にＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列が変化するＰＲＯポリペプチドをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つのアミノ酸のＰＲＯポリペプチドの一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ＰＲＯポリペプチドの配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を全長又は成熟型天然配列によって示される活性について試験することにより決定される。
【００５０】
特別の実施態様では、関心のある保存的置換を、好ましい置換を先頭にして表６に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表６に例示的置換を示し又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より置換的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
2004516013.tif 000020
【００５１】
ＰＲＯポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の置換的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン， ｍｅｔ， ａｌａ， ｖａｌ， ｌｅｕ， ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：ｃｙｓ， ｓｅｒ， ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ， ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ， ｇｌｎ， ｈｉｓ， ｌｙｓ， ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：ｇｌｙ， ＰＲＯ； 及び
（６）芳香族：ｔｒｐ， ｔｙｒ， ｐｈｅ
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された（非保存）部位に導入されうる。
【００５２】
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等の当該技術において公知の技術を使用して作成することができる。部位指向性突然変異誘発［Ｃａｒｔｅｒ等， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １３： ４３３１ （１９８６）； Ｚｏｌｌｅｒ等， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １０： ６４８７ （１９８７）］、カセット突然変異誘発［Ｗｅｌｌｓ等， Ｇｅｎｅ， ３４： ３１５ （１９８５）］、制限選択突然変異誘発［Ｗｅｌｌｓ等， Ｐｈｉｌｏｓ． Ｔｒａｎｓ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ， ３１７： ４１５ （１９８６）］又は他の周知の技術が、ＰＲＯ変異体ＤＮＡを製造するために、クローン化されたＤＮＡに実施できる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４：１０８１−１０８５（１９８９）］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， （Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｎ．Ｙ．）； Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １５０： １ （１９７６）］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック（ｉｓｏｔｅｒｉｃ）アミノ酸を用いることができる。
【００５３】
５．２．２．ＰＲＯポリペプチドの修飾
ＰＲＯポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型は、ＰＲＯポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、ＰＲＯポリペプチドの選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばＰＲＯポリペプチドを水不溶性支持体マトリクスあるいは抗−ＰＲＯ抗体の精製方法及びその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）−ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化［Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ｐｐ．７９−８６ （１９８３）］、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【００５４】
本発明の範囲内に含まれるＰＲＯポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列ＰＲＯポリペプチドに見られる一又は複数の炭水化物部分の欠失（存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる）、及び／又は天然配列ＰＲＯポリペプチドに存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この成句は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び割合の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
ＰＲＯポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、一又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ＰＲＯポリペプチド（Ｏ−結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。ＰＲＯアミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
【００５５】
ＰＲＯポリペプチド上に糖鎖の数を増加させる他の方法は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、１９８７年９月１１日に発行されたＷＯ ８７／０５３３０、及びＡｐｌｉｎ及びＷｒｉｓｔｏｎ， ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ｐｐ． ２５９−３０６ （１９８１）に記載されている。
ＰＲＯポリペプチド上に存在する糖鎖部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ等， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ２５９：５２ （１９８７）により、及びＥｄｇｅ等， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １１８： １３１ （１９８１）により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ等， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １３８：３５０ （１９８７）に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
ＰＲＯポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ＰＲＯポリペプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号又は第４，１７９，３３７号に記載された方法での結合を含む。
【００５６】
また、本発明のＰＲＯは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＰＲＯポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
一実施態様では、このようなキメラ分子は、種々の組織への送達、及び、より特別には、例えば、ヒト免疫欠損ウィルスのＴＡＴタンパク質のタンパク質伝達ドメインを用いて、脳−血管関門を通過、のためにＰＲＯポリペプチドを標的とするタンパク質伝達ドメインとＰＲＯポリペプチドとの融合を含む（Ｓｃｈｗａｒｚｅ等， １９９９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１６５９−７２）。
他の実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとＰＲＯポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはＰＲＯポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなＰＲＯポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＰＲＯポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ ＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Ｆｉｅｌｄ等， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ８：２１５９−２１６５ （１９８８）］；ｃ−ｍｙｃタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Ｅｖａｎ等， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ５：３６１０−３６１６ （１９８５）］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体［Ｐａｂｏｒｓｋｙ等， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ３（６）：５４７−５５３ （１９９０）］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Ｈｏｐｐ等， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６：１２０４−１２１０ （１９８８）］；ＫＴ３エピトープペプチド［Ｍａｒｔｉｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５５：１９２−１９４ （１９９２）］；α−チューブリンエピトープペプチド［Ｓｋｉｎｎｅｒ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６６：１５１６３−１５１６６ （１９９１）］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：６３９３−６３９７ （１９９０）］を含む。
それに換わる実施態様では、キメラ分子はＰＲＯポリペプチドと免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に換えてＰＲＯポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第５，４２８，１３０号を参照のこと。
【００５７】
５．２．３．ＰＲＯポリペプチドの調製
本発明は、本出願においてＰＲＯポリペプチドと称される、新規に同定及び単離されたヌクレオチド配列コード化ポリペプチドを提供するものである。特に、ＰＲＯポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、以下の実施例にさらなる詳細が開示されているようにして、同定され単離される。分離発現環状部に生産されるタンパク質は、異なるＰＲＯ番号が付与されるが、ＵＮＱ番号は任意の付与されるＤＮＡ及びコード化タンパク質で唯一であり、変わることはないであろう。しかしながら、簡単にする目的で、本出願においては、ＰＲＯ ＤＮＡにコードされるタンパク質、さらなる天然相同体、及びＰＲＯポリペプチドの先の定義に含まれる変異体は、由来又は調製方法に無関係に、それぞれ「ＰＲＯ」と称される。
以下の説明は、主として、ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりＰＲＯポリペプチドを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＰＲＯポリペプチドを調製することができると考えられる。例えば、ＰＲＯポリペプチド配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい。Ｓｔｅｗａｒｔ等， Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ １９６９）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８５：２１４９−２１５４ （１９６３）参照。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ＰＲＯポリペプチドの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長ＰＲＯポリペプチドを生産してもよい。
【００５８】
５．２．３．１．ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡの単離
ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡは、ＰＲＯポリペプチドをコードするｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることができる。またＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子は、ゲノムライブラリから又はオリゴヌクレオチド合成により得ることもできる。
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはそれによりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ（ＰＲＯポリペプチドに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等）によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等， 上掲に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。所望のＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，上掲；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ等， ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９５）。
下記の実施例には、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリッド形成時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高度の厳密性を含むハイブリッド形成条件は、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等に与えられている。
このようなライブラリスクリーニング法において同定された配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は全長配列に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列同一性は、相同性を測定する種々のアルゴリズムを使用する、コンピュータソフトウエアプログラム、例えばＡＬＩＧＮ、ＤＮＡｓｔａｒ及びＩＮＨＥＲＩＴにより決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることにより得られる。
【００５９】
５．２．３．２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＰＲＯポリペプチド生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ編 （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９９１）及びＳａｍｂｒｏｏｋ等， 上掲に見出すことができる。
形質移入の方法、例えば、ＣａＰＯ４処理及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションは、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して一般に用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）による感染が、Ｓｈａｗ等， Ｇｅｎｅ， ２３： ３１５ （１９８３）及び１９８９年６月２９日公開の国際特許出願公開公報第ＷＯ８９／０５８５９号に記載されたように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Ｇｒａｈａｍ及びｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ５２： ４５６−４５７ （１９７８）のリン酸カルシウム沈降法が用いられる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母中への形質転換は、典型的には、Ｖａｎ ｓｏｌｉｎｇｅｎ等， Ｊ． Ｂａｃｔ．， １３０： ９４６ （１９７７）及びＨｓｉａｏ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ）， ７６：３８２９ （１９７９）の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることができる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Ｋｅｏｗｎ等， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １８５： ５２７−５３７ （１９９０）及び Ｍａｎｓｏｕｒ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３３６： ３４８−３５２ （１９８８）を参照のこと。
【００６０】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞を含む。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３，６３５）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ、エンテロバクター、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ） 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリスブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバシリリチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、１９８９年４月１２日発行のＤＤ ２６６，７１０に記載されたバシリリチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿筋及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生産発行のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、宿主に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５ （ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐ Ｔｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ ５５，２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５ （ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴ ｒｂｓ７ｉｌｖＧｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日発行の米国特許第４，９４６，７８３号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
【００６１】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＰＲＯポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセスプロンブ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｐｏｍｂｅ）（Ｂｅａｃｈ及びＮｕｒｓｅ， Ｎａｔｕｒｅ， ２９０： １４０ ［１９８１］； １９８５年５月２日発行のＥＰ １３９，３８３）；クルベロミセスホスツ（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｈｏｓｔｓ）（米国特許第４，９４３，５２９号； Ｆｌｅｅｒ等， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９： ９６８−９７５ （１９９１））、例えばケーラクチス（Ｋ． ｌａｃｔｉｓ）（ＭＷ９８−８Ｃ， ＣＢＳ６８３， ＣＢＳ４５７４； Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ等， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ７３７ ［１９８３］）、ケーフラギリス（Ｋ． ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ １２，４２４）、ケーブルガリクス（Ｋ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ １６，０４５）、ケーウィケラミイ（Ｋ． ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、ケーワルチイ（Ｋ． ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ ５６，５００）、ケードロソフィラルム（Ｋ． ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ ３６，９０６； Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ等， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ８： １３５ （１９９０））、ケーテモトレランス（Ｋ． ｔｈｅｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）及びケーマルキシアナス（Ｋ． ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ヤロウィア（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ ４０２，２２６）；ピッチャパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ １８３，０７０； Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ等， Ｊ． Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２８： ２６５−２７８ ［１９８８］）；カンジダ；トリコデルマレーシア（ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ ２４４，２３４）；アカパンカビ（Ｃａｓｅ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７６： ５２５９−５２６３ ［１９７９］）；シュワニオマイセス（ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス（ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）（１９９０年１０月３１日発行のＥＰ ３９４，５３８）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）（１９９１年１月１０日発行のＷＯ９１／００３５７）；及びコウジ菌、例えば偽巣性コウジ菌（Ｂａｌｌａｎｃｅ等， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １１２： ２８４−２８９ ［１９８３］； Ｔｉｌｂｕｒｎ等， Ｇｅｎｅ， ２６： ２０５−２２１ ［１９８３］； Ｙｅｌｔｏｎ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１： １４７０−１４７４ ［１９８４］）及びクロカビ（Ｋｅｌｌｙ及びＨｙｎｅｓ， ＥＭＢＯ Ｊ．， ４： ４７５−４７９ ［１９８５］）が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｉｃ）酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、及びロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏ���ｕｌａ）からなる属から選択されるメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、Ｃ． Ａｎｔｈｏｎｙ， Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ， ２６９ （１９８２）に記載されている。
グリコシル化ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 （ＣＯＳ−７， ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ等， Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．， ３６：５９ （１９７７））；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ， Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７：４２１６ （１９８０））；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４， Ｍａｔｈｅｒ， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．， ２３：２４３−２５１ （１９８０））；ヒト肺細胞 （Ｗ１３８， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）； ヒト肝細胞 （Ｈｅｐ Ｇ２， ＨＢ ８０６５）； 及びマウス乳房腫瘍細胞 （ＭＭＴ ０６０５６２， ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
【００６２】
５．２．３．３．複製可能なベクターの選択及び使用
ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）は、クローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、配列が分泌されるならば、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
ＰＲＯポリペプチドは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ−末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＰＲＯをコードするＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー（酵母菌属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びクルイベロマイシス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている）、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日発行のＥＰ３６２１７９）、又は１９９０年１１月１５日に公開されたＷＯ９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【００６３】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、（ａ）アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、（ｂ）栄養要求性欠陥を補い、又は（ｃ）例えばバシリに対する遺伝子コードＤ−アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
哺乳動物細胞に適切な選択可能マーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Ｕｒｌａｕｂ 等により， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７：４２１６ （１９８０）に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である。Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ等， Ｎａｔｕｒｅ， ２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎ等， Ｇｅｎｅ， ７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ等， Ｇｅｎｅ， １０：１５７（１９８０）。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４−１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Ｊｏｎｅｓ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ８５：１２ （１９７７）。
発現及びクローニングベクターは、通常、ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Ｃｈａｎｇ等， Ｎａｔｕｒｅ， ２７５：６１５ （１９７８）； Ｇｏｅｄｄｅｌ等， Ｎａｔｕｒｅ， ２８１：５４４ （１９７９）］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［Ｇｏｅｄｄｅｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ８：４０５７ （１９８０）； ＥＰ ３６，７７６］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［ｄｅＢｏｅｒ 等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８０：２１−２５ （１９８３）］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたＰＲＯをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を有する。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセラートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎ 等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５５：２０７３ （１９８０））又は他の糖分解酵素（Ｈｅｓｓ 等， Ｊ． Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．， ７：１４９ （１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １７：４９００（１９８７））、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモータはＥＰ ７３，６５７に更に記載されている。
【００６４】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからＰＲＯ核酸の転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス（１９８９年７月５日公開のＵＫ ２，２１１，５０４）、アデノウィルス（例えばアデノウィルス２）、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０（ＳＶ４０）のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
より高等の真核生物による所望のＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００−２７０塩基対）、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＰＲＯポリペプチドをコードする配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
また真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞）に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ＰＲＯをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのＰＲＯポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Ｇｅｔｈｉｎｇ等， Ｎａｔｕｒｅ， ２９３：６２０−６２５ （１９８１）； Ｍａｎｔｅｉ等， Ｎａｔｕｒｅ， ２８１：４０−４６ （１９７９）； ＥＰ １１７，０６０； 及びＥＰ １１７，０５８に記載されている。
【００６５】
５．２．３．４．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法（Ｔｈｏｍａｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５ （１９８０））、ドットブロット法（ＤＮＡ分析）、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ−タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＰＲＯポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
５．２．３．５．ＰＲＯポリペプチドの精製
ＰＲＯポリペプチドの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液（例えばトリトン−ＸＴＭ１００）又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ＰＲＯポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。ＰＲＯポリペプチドを、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ−７５を用いるゲル濾過；ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＰＲＯポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １８２ （１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８２）に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特定のＰＲＯの性質に依存する。
【００６６】
５．２．４．ＰＲＯポリペプチドの用途
５．２．４．１．心臓血管、内皮及び血管形成活性のアッセイ
種々のアッセイがここで記載されたポリペプチドの心臓血管、内皮及び血管形成活性をテストするために使用可能である。これらのアッセイは、以下の実施例中にて提供されるものも含む。
米国特許第５，７７３，４１４号に開示されているエンドセリンアンタゴニスト活性をテストするアッセイには、レセプターアッセイにおけるポリペプチドのヨード化エンドセリン−Ｉ結合を阻害する能力をテストするラット心室結合アッセイ、ウサギ腎動脈平滑筋細胞を使用し、放射能標識されたエンドセリン−Ｉの無傷細胞結合性をテストするエンドセリンレセプタ結合アッセイ、機能活性が第２のメッセッンジャーの細胞内レベルを測定することにより、Ｒａｔ−Ｉ細胞内で測定されるイノシトールホスファート蓄積アッセイ、雄のニュージーランドウサギの内皮を使用するインビトロ（単離された血管）の研究、及びＳＤラットを使用するインビボの研究において、添加化合物の、培養血管平滑筋内に放出されるエンドセリン刺激アラキドン酸を低減させる能力を測定するアラキドン酸放出アッセイが含まれる。
組織生成活性のアッセイには、限定するものではないが、ＷＯ９５／１６０３５（骨、軟骨、腱）、；ＷＯ９５／０５８４６（神経、ニューロン）、及びＷＯ９１／０７４９１（皮膚、内皮）に記載されているものが含まれる。
傷治癒活性のアッセイには、例えば、Ｅａｇｌｓｔｅｉｎ及びＭｅｒｔｚ，  Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ．， ７１：３８２−３８４（１９７８）の論文で改変されている、Ｗｉｎｔｅｒ， Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ， Ｍａｉｂａｃｈ， ＨＩ及びＲｏｖｅｅ， ＤＴ，編（Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ． Ｉｎｃ．， Ｃｈｉｃａｇｏ），ｐｐ７１−１１２に記載されているものが含まれる。
エンドセリンＢ１（ＥＴＢ１）レセプターポリペプチドに結合し、シグナル変換活性を調節するＰＲＯポリペプチドに関連したテスト用分子のスクリーニングアッセイは、米国特許第５，７７３，２２３号に記載されたようにして、エンドセリンＢ１レセプターポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転換した宿主細胞を提供し、テスト用候補薬に細胞を曝露し、エンドセリンＢ１レセプターシグナル変換活性を測定する。
心肥大アッセイにはいくつかある。インビトロアッセイには、成体ラット心臓ミオサイトの拡散の誘導が含まれる。このアッセイにおいて、心室ミオサイトは、Ｐｉｐｅｒら，「Ａｄｕｌｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｒａｔ ｈｅａｒｔ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ」，  Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｈｅａｒｔ ａｎｄ Ｖｅｓｓｅｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ｈ．Ｍ． Ｐｉｐｅｒ． ｅｄ（Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９０），ｐｐ．３６−６０により詳細に記載されている手順を改変したものに本質的に従って、単一の（雄のＳＤ）ラットから単離される。この手順により、成長心室ミオサイトの単離、及び桿体フェノタイプ細胞の長期間にわたる培養が可能になる。フェニレフリンとプロスタグランジンＦ２α（ＰＧＦ２α）は、これら成長細胞の転移反応を誘発することが示されている。種々の心肥大の潜在的インヒビターによる、ＰＧＦ２α又はＰＧＦ２α類似体（例えばフルプロステノール）及びフェニレフリンにより誘発されるミオサイト転移阻害が次にテストされる。
【００６７】
インビボアッセイの一例は、インビボにおけるフルプロステノールにより誘発される心肥大の阻害をテストすることである。この薬理学的モデルは、フルプロステノール（ＰＧＦ２αのアゴニスト類似体）の皮下注射によりラット（例えば、雄のＷｉｓｔａｒ又はＳＤ）に誘発された心肥大を阻害するＰＲＯポリペプチドの能力をテストするものである。心筋梗塞に誘発される病的な心肥大のあるラットにおいて、心筋内のＰＧＦ２αが検出可能なレベルまで慢性的に上昇していることが知られている。Ｌａｉら，  Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．），  ２７１：Ｈ２１９７−Ｈ２２０８（１９９６）。従って、インビボでの心筋成長におけるフルプロステノールの影響を阻害可能な因子は、心肥大の治療に有用である可能性がある。心肥大におけるＰＲＯポリペプチドの効力は、ＰＲＯポリペプチドを受容しないフルプロステノール処理されたラットに対する、心臓、心室及び左心室（体重により正規化）の重量を測定することにより決定される。
インビボアッセイの他の例は、圧力負荷心肥大アッセイである。インビボテストにおいて、テスト用動物の腹部大動脈の収縮による圧力負荷心肥大を誘発することは共通している。典型的なプロトコルにおいて、ラット（例えば雄のＷｉｓｔａｒ又はＳＤ）は麻酔処理され、各ラットの腹部大動脈を横隔膜の真下まで狭窄する。Ｂｅｚｎａｋ Ｍ．， Ｃａｎ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ３３：９８５−９４（１９５５）。 大動脈を外科的切開により曝露し、短い太針を管の隣におく。大動脈を針周囲に絹糸で結紮して収縮させ、すぐに除去し、針の直径まで大動脈の管腔を低減させる。このアプローチは、例えばＲｏｓｓｉら， Ａｍ． Ｈｅａｒｔ Ｊ．， １２４：７００−７０９（１９９２）及びＯ’Ｒｏｕｒｋｅ及びＲｅｉｂｅｌ，  Ｐ．Ｓ．Ｅ．Ｍ．Ｂ．， ２００：９５−１００（１９９２）に記載されている。
また他のインビボアッセイにおいて、心肥大、続いて実験的に誘発された心筋梗塞（ＭＩ）における効果を測定する。ラットにおいて、急性ＭＩを左冠動脈結紮にて誘発し、さらにこれを心電図試験で確認する。また動物の擬似操作グループを対照動物として用意する。初期のデータには、心肥大はＭＩを有するグループに存在することが示され、体重に対し心臓重量は１８％増加していることが明らかとなった。上掲のＬａｉ等。心肥大の候補ブロッカー、例えばＰＲＯポリペプチドでこれらの動物を治療し、テストした候補薬の治療可能性についての貴重な情報を提供する。ＳＤラットを使用する、心肥大の誘発におけるさらなるアッセイテストは米国特許第５，７７３，４１５号に開示されている。
【００６８】
癌において、腫瘍の病原及び進行におけるここで同定された遺伝子の役割をさらに理解し、天然ＰＲＯポリペプチドの抗体及び他のアンタゴニスト、例えば小分子アンタゴニストを含む治療用候補薬の効力をテストするために、種々のよく知られた動物モデルを使用することができる。このようなモデルのインビボの性質は、ヒト患者に前兆となる反応を特に起こさせるものである。腫瘍及び癌（乳癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌等）の動物モデルには、非組換え及び組換え（トランスジェニク）動物が含まれる。非組換え動物モデルには、例えば齧歯動物、例えばネズミモデルが含まれる。このようなモデルは標準的な技術、例えば皮下注射、尾静脈注射、脾臓移植、腹膜移植、腎嚢下移植、又はオルソピン（ｏｒｔｈｏｐｉｎ）移植、例えば結腸組織に移植された結腸癌細胞を使用し、同系のマウスに腫瘍細胞を移入することにより作成することができる。例えば、１９９７年９月１８日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／３３５５１を参照されたい。おそらくは癌遺伝子の研究に最も頻繁に使用される動物種は、免疫欠損マウス、特にヌードマウスである。胸腺刺激／形成不全を有するヌードマウスがヒト腫瘍異種移植片用の宿主として成功裡に作用するという知見はこの目的への広範な使用に導いた。常染色体劣性ｎｕ遺伝子は、例えばＡＳＷ、Ａ／Ｈｅ、ＡＫＲ、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｂ１０．ＬＰ、Ｃ１７、Ｃ３Ｈ、Ｃ５７ＢＬ、Ｃ５７、ＣＢＡ、ＤＢＡ、ＤＤＤ、Ｉ／ｓｔ、ＮＣ、ＮＦＲ、ＮＦＳ、ＮＦＳ／Ｎ、ＮＺＢ、ＮＺＣ、ＮＺＷ、Ｐ、ＲＩＩＩ及びＳＪＬを含む、非常に多数の明確に同族のヌードマウスに導入される。さらに、ヌードマウス以外に免疫学的欠損を受け継いだ広範囲の他の動物を育て、腫瘍異種移植片のレシピエントとして使用する。さらなる詳細は、Ｔｈｅ Ｎｕｄｅ Ｍｏｕｓｅ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｅ． Ｂｏｖｅｎ及びＢ． Ｗｉｎｏｇｒａｄ． ｅｄｓ．（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９１）を参照されたい。
このような動物に導入された細胞は周知の腫瘍／癌細胞、例えば上述にて列挙した任意の腫瘍細胞系、例えばＢ１０４−１細胞系（ｎｅｕ原腫瘍遺伝子で形質移入された安定ＮＩＨ−３Ｔ３細胞系）；Ｃａｃｏ−２（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３７）；又は中程度に分化したグレードＩＩヒト結腸腺癌細胞系、ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８）、又は腫瘍及び癌からのものを誘導可能である。腫瘍又は癌細胞のサンプルは凍結及び液体窒素での保管等を含む標準的な状態で使用され、外科手術により患者から得ることができる。Ｋａｒｍａｌｉら， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ． ４８：６８９−６９６（１９８３）。
【００６９】
腫瘍細胞は種々の手順によりヌードマウス等の動物に導入することができる。腫瘍の移植には、マウスの皮下（ｓ．ｃ．）空間が非常に適している。腫瘍は、固体ブロックとして、例えばトロカールの使用による針バイオプシー、又は細胞懸濁液を移植することもできる。固体ブロック又はトロカール移植用に適した大きさの腫瘍組織フラグメントが皮下空間に導入される。細胞懸濁液は一次腫瘍又は安定腫瘍細胞系から新鮮に調製され、皮下注射される。また、腫瘍細胞は皮下移植として注射することもできる。この位置において、移植片は真皮結合組織の下部と皮下組織との間に付与される。
乳癌の動物モデルは、Ｄｒｅｂｉｎら，  Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８３：９１２９−９１３３（１９８６）に記載されたようにして、例えばラット神経芽細胞（当初単離されたｎｅｕ癌遺伝子からのもの）、又はｎｅｕ−形質転換ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、ヌードマウスに移植することにより作成することができる。
同様に、結腸癌の動物モデルは、動物、例えばヌードマウスに結腸癌細胞を通過させ、これらの動物に腫瘍を出現せしめることにより作成することができる。ヌードマウスにおけるヒト結腸癌の同所移植モデルは、例えばＷａｎｇら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５４：４７２６−４７２８（１９９４）及びＴｏｏら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５５：６８１−６８４（１９９５）により記載されている。このモデルはＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ，Ｉｎｃ．，（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から販売されている、いわゆる「ＭＥＴＡＭＯＵＳＥＴＭ」に基づく。
動物内で生じた腫瘍は除去され、インビトロで培養することができる。ついで、インビトロ培養からの細胞を動物に継代させる。このような腫瘍はさらなるテスト又は薬剤スクリーニングの目的で役立ちうる。あるいは、継代により得られた腫瘍は単離可能で、継代前細胞及び一又は複数の継代段階の後に単離された細胞のＲＮＡは、関心のある遺伝子の差次的発現用に分析される。このような継代技術は、任意の周知の腫瘍又は癌細胞系で行うことができる。
例えば、Ｍｅｔｈ Ａ、ＣＭＳ４、ＣＭＳ５、ＣＭＳ２１及びＷＥＨＩ−１６４はＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（ＤｅＬｅｏら， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １４６：７２０（１９７７））の繊維肉腫を化学的に誘発し、種々の薬剤の抗腫瘍活性を研究する高度に制御されたモデル系を提供する。Ｐａｌｌａｄｉｎｏら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３８：４０２３−４０３２（１９８７）。簡単に言えば、腫瘍細胞は細胞培養におけるインビトロで増殖される。動物に注射をする前に細胞系を洗浄し、１０ｘ１０６から１０ｘ１０７細胞／ｍｌの細胞密度でバッファーに懸濁させる。ついで、動物に１０から１００μｌの細胞懸濁液を皮下注射すると、１から３週間で腫瘍が出現する。
さらに、最も詳細に研究されている試験用腫瘍の一つであるマウスのルイス肺（３ＬＬ）癌腫を研究用腫瘍モデルとして使用することができる。この腫瘍モデルの効力は、肺の小細胞癌腫（ＳＣＣＬ）と診断されたヒト患者における好ましい効果と相関している。この腫瘍は、病気になったマウス、又は培養されている細胞からの腫瘍フラグメントを注射することで、正常なマウスに導入することができる。Ｚｕｐｉら， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ４１：ｓｕｐｐｌ． ４． ３０（１９８０）。腫瘍が単一細胞の注射から出発して、感染した細胞がかなりの高割合で生存しているという証拠が示された。この腫瘍モデルについてのさらなる情報は、Ｚａｃｈａｒｓｋｉ， Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ， １６：３００−３２０（１９８６）を参照されたい。
【００７０】
移植腫瘍を有する動物モデルにおける試験化合物の効力を評価する方法の一つは、治療前又は後の腫瘍の大きさを測定することである。伝統的に、移植腫瘍の大きさは２又は３次元のスライドカリパスで測定される。２次元に限定する測定は腫瘍の大きさを正確に反映せず；よって通常は数学的公式を使用し、対応する量に転換する。しかし、腫瘍サイズの測定は非常に不正確である。候補薬の治療効果は治療誘発性の成長が遅れ、特定の成長が遅れた場合に、より良好であると記載することができる。腫瘍成長の記載における他の重要な変数は腫瘍量が２倍になる時間である。また、腫瘍成長の算出及び記載のためのコンピュータプログラム、例えばＲｙｇａａｒｄ及びＳｐａｎｇ−Ｔｈｏｍｓｅｎ， Ｐｒｏｃ． ６ｔｈ Ｉｎｔ． Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ Ｉｍｍｕｎｅ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ａｎｉｍａｌｓ． Ｗｕ及びＳｈｅｎｇ． ｅｄｓ．（Ｂａｓｅｌ． １９８９）， ｐ．３０１により報告されているプログラムを入手することができる。しかし、治療後の壊死及び炎症反応は、実際には少なくとも当初には腫瘍サイズの増加の結果となり得ることに留意されるべきである。よって、これらの変化は形態計測とフローサイトメトリー分析を組み合わせて、注意深く監視する必要がある。
さらに、組換え（トランスジェニック）動物モデルは、ここで同定されたＰＲＯ遺伝子のコード化部位を、関心のある動物のゲノムに導入し、トランスジェニック動物を作成するための標準的な技術を使用して加工することができる。トランスジェニック操作の標的として提供可能な動物には、限定するものではないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、及び非ヒト霊長類、例えばヒヒ、チンパンジー及びサルが含まれる。このような動物に導入遺伝子を導入するための、当該技術における周知の技術には、前核のミクロ注射（米国特許第４，８７３，１９１号）；胚へのレトロウイルス媒介性遺伝子移動（例えば、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２：６１４８−６１５（１９８５））；胚幹細胞における遺伝子を標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら， Ｃｅｌｌ， ５６：３１３−３２１（１９８９））；胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ３：１８０３−１８１４（１９８３））；及び精子媒介性遺伝子移動が含まれる。Ｌａｖｉｔｒａｎｏら， Ｃｅｌｌ， ５７：７１７−７３（１９８９）。レビューには、例えば米国特許第４，７３６，８６６号を参照されたい。
本発明の目的において、トランスジェニック動物にはそれらの細胞の一部のみに導入遺伝子を担持するもの（「モザイク動物」）が含まれる。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として、又は鎖状体で組み込むことができ、例えば、ヘッド対ヘッド又はヘッド対テイルのタンデムで組み込むことができる。また特定の細胞系への導入遺伝子の選択的導入は、例えばＬａｓｋｏら，  Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９：６２３２−６３６（１９９２）の技術に続いて可能である。トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は通常の技術により監視可能である。例えば、サザンブロット分析又はＰＣＲ増幅を導入遺伝子の統合を証明するために使用することができる。ついで、ｍＲＮＡの発現レベルはインシトゥーハイブリッド形成、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ又は免疫細胞化学等の技術を使用して分析することができる。動物は腫瘍又は癌進行の徴候のためにさらに試験される。
【００７１】
あるいは、動物の胚性細胞に導入されたＰＲＯポリペプチドをコードする変更ゲノムＤＮＡと、ＰＲＯポリペプチドをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ここで同定されるＰＲＯポリペプチドをコードする欠陥又は変更遺伝子を有する「ノックアウト」動物を構築することができる。例えば、特定のＰＲＯポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、該ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。特定のＰＲＯポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ（５’と３’末端の両方）を数キロベース含む。例えば、相同的組換えベクターについてはＴｈｏｍａｓ及びＣａｐｅｃｃｈｉ， Ｃｅｌｌ， ５１：５０３（１９８７）を参照のこと。ベクターは胚性幹細胞に（例えばエレクトロポレーションによって）導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞が選択される。例えば、Ｌｉ等， Ｃｅｌｌ， ６９：９１５（１９９２）参照。選択された細胞は次に動物（例えばマウス又はラット）の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ， Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｅ． Ｊ． Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， ｅｄ． （ＩＲＬ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９８７）， ｐｐ． １１３−１５２参照。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物をつくり出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ＰＲＯポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けられる。
ここで同定されたＰＲＯポリペプチドに特異的に結合する抗体、及び他の候補薬の効果は、自発的動物腫瘍の治療においてさらに試験することができる。この研究のための適切な標的はネコ口部扁平上皮細胞癌腫（ＳＣＣ）である。ネコ口部ＳＣＣは侵入性が高く、この悪性腫瘍はネコにおいて最も一般的な口部悪性腫瘍とされ、口部腫瘍の６０％以上がこの種において繰り返されると計測されている。それは遠くの部位にはめったに転移しないが、転移の発生率が低いのは、この腫瘍を有するネコの生存期間が短いことに反映されている。これらの腫瘍は、主としてネコの口腔の解剖学的構造により、通常外科手術により処理することができない。現在では、この腫瘍に対する効果的な治療はない。この研究に入る前に、各々のネコを完全な臨床実験用のバイオプシーとし、コンピュータＸ線断層撮影（ＣＴ）によりスキャンする。舌下口部扁平上皮細胞腫瘍であると診断されたネコはこの研究から除外する。舌はこのような腫瘍の結果として麻痺し、治療により腫瘍が死亡しても、動物は自分自身で食餌することができない。各々のネコを長期間繰り返し治療する。治療期間中、腫瘍の写真を毎日取り、続いて再チェックする。治療後、各ネコを他のＣＴスキャンにかける。ＣＴスキャンと胸部放射線写真を、その後８週間毎に評価する。データは、対照グループに対し、生存率、反応性及び毒性において異なっていると評価した。ポジティブ反応は、好ましくは生存の質の改善及び／又はライフスパンの増加を伴う腫瘍退行の証拠を必要とする。
さらに、イヌ、ネコ及びヒヒ他の自発的動物腫瘍、例えば線維肉腫、腺癌、リンパ腫、軟骨腫、又は平滑筋肉腫もテストすることができる。もちろん、イヌ及びネコの乳房腺癌は好ましいモデルであり、その外観及び性質はヒトのものと非常に似ている。しかし、このモデルの使用は動物におけるこの種の腫瘍の発生率により制限される。
また、当該技術で周知の他のインビトロ及びインビボ心臓血管、内皮及び血管形成試験もここで適切である。
【００７２】
５．２．４．２．組織分布
さらなる研究、例えば種々のヒト組織におけるｍＲＮＡ発現を測定することにより、ここで心臓血管、内皮及び血管形成アッセイの結果を証明することができる。
上述したように、種々の組織における遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法（Ｔｈｏｍａｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５ （１９８０））、ドットブロット法（ＤＮＡ分析）、又はインサイツハイブリッド形成法によって測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ−タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。
あるいは、種々の組織における遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＰＲＯポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＰＲＯＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外来性配列に対して調製され得る。抗体生産のための一般的な技術、及びインサイツ−ハイブリッド形成のための特定のプロトコルは以下に提供する。
【００７３】
５．２．４．３．抗体結合性の研究
心臓血管、内皮及び血管形成アッセイに使用される内皮細胞又は他の細胞におけるＰＲＯポリペプチドの効果を阻害する抗−ＰＲＯ抗体の能力を試験する、心臓血管、内皮及び血管形成研究の結果は、抗体結合性を研究することで証明することができる。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ抱合体抗体が含まれ、その調製は以下に記載する。
抗体結合性の研究は任意の周知のアッセイ方法、例えば競合結合アッセイ、直接及び間接サンドイッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイ等で行われうる。Ｚｏｌａ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９８７）ｐｐ． １４７−１５８ 。
競合結合アッセイは、有限量の抗体との結合における、試験用サンプルに対して競合する標識された標準体の能力による。試験用サンプル中の標的タンパク質の量は、抗体が結合する標準体の量に対して逆比例する。結合する標準体の量の測定を容易にするため、好ましくは抗体は競合の前後に不溶化され、抗体に結合する分析物及び標準体は、便宜上、結合しないで残存する標準体及び分析物から分離する。
サンドイッチアッセイでは、検出される互いに異なる免疫原部分、又はエピトープ、又はタンパク質に結合可能な２つの抗体が使用される。サンドイッチアッセイにおいて、分析されるテスト用サンプルは、固体支持体に固定化された第１の抗体に結合し、その後、第２の抗体が分析物に結合し、よって不溶性の３部位複合体が形成される。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照されたい。第２の抗体は検出可能な部分で、それ自身がラベルされてもよく（直接サンドイッチアッセイ）、又は検出可能な部分でラベルされた抗免疫グロブリン抗体を使用して測定してもよい（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、一方の種類のサンドイッチアッセイはＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合、検出可能な部分は酵素である。
免疫組織化学において、組織サンプルは新鮮なものであるか凍結されていてもよく、パラフィンに包埋されていてもよく、防腐剤、例えばホルマリンで固定されていてもよい。
【００７４】
５．２．４．４．細胞ベースの腫瘍アッセイ
心臓血管、内皮及び血管形成疾患、例えば腫瘍のための細胞ベースのアッセイ及び動物モデルは、ここで心臓血管、内皮及び血管形成アッセイの発見を立証し、さらに、ここで同定された遺伝子と所望しない心臓血管、内皮及び血管形成細胞成長の進行及び病因との関係を理解するために使用可能である。所望しない心臓血管、内皮及び血管形成細胞成長、例えば腫瘍の進行及び病因におけるここで同定された遺伝子産物の役割は、ＰＲＯポリペプチドにより刺激又は阻害されると同定された細胞又は細胞系を使用して試験することができる。このような細胞には、例えば以下の実施例に示すものが含まれる。
異なるアプローチにおいて、特定の心臓血管、内皮及び血管形成疾患に係る周知の細胞種の細胞を、ｃＤＮＡを用いて形質移入し、これらのｃＤＮＡが過度の成長を誘発するか、又は成長を阻害する能力を分析する。心臓血管、内皮及び血管形成疾患が癌である場合、適切な腫瘍細胞には、例えば安定腫瘍細胞系、例えばＢ１０４−１−１細胞系（ｎｅｕ原腫瘍遺伝子で形質移入された安定ＮＩＨ−３Ｔ３細胞系）及びｒａｓ−形質移入ＮＩＨ−３Ｔ３細胞が含まれ、これらは所望する遺伝子を形質移入することができ、腫瘍形成成長を監視することができる。ついで、このような形質移入細胞系を使用し、ポリ−又はモノクローナル抗体又は抗体組成物が、形質移入細胞の成長における細胞増殖抑制又は細胞毒性活性を働かせることによる、又は抗体−依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介することによる腫瘍形成細胞成長を阻害する能力をテストする。さらに、ここで同定された遺伝子のコード化配列で形質移入された細胞を、心臓血管、内皮及び血管形成疾患、例えば癌の治療用の候補薬を同定するのに使用することができる。
さらに、トランスジェニック動物の腫瘍から得られた初代培養（上述に記載）を細胞ベースのアッセイに使用することができるが、安定細胞系が好ましい。トランスジェニック動物から一定の細胞系を誘導するための技術は当該技術においてよく知られている。例えばＳｍａｌｌ等， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ５：６４２−６４８（１９８５）を参照されたい。
【００７５】
５．２．４．５．遺伝子治療
以下の記載は、それによって疾患の症状が寛解され得る方法及び組成物に関してのものである。ある種の疾患は、少なくとも一部において、過剰レベルの遺伝子産物、又は異常な又は過剰な活性を示す遺伝子産物の存在によってもたらされる。従って、そのような遺伝子産物のレベル及び／又は活性の低下がそのような疾患の症状の寛解を引き起こす。
あるいは、ある種の他の疾患は、少なくとも一部において、遺伝子発現のレベルの欠如又は低下、又は遺伝子産物活性レベルの低下によってもたらされる。従って、そのような遺伝子産物の遺伝子発現レベル及び／又は活性のレベルは、そのような疾患の症状の寛解をもたらす。
場合によっては、疾患状態における遺伝子の上方制御は、疾患状況に応答する遺伝子産物に関する防御的役割を反映する。そのような標的遺伝子の発現又は標的遺伝子産物の活性の促進は、それが発揮する防御的効果を補強することになろう。ある種の疾患状態は、そのような防御的遺伝子の異常に低いレベルの活性に起因する。また、このような場合、そのような遺伝子産物の遺伝子発現レベル及び／又は活性の増加は、そのような疾患症状の寛解をもたらすであろう。
ここに記載されるＰＲＯポリペプチド及びポリペプチジルアゴニスト及びアンタゴニストは、それらのペプチドを、しばしば遺伝子治療と呼ばれるインビボでの発現により本発明に従って用いてもよい。
核酸（場合によってはベクター内に含まれたもの）を患者の細胞に入れるために：インビボ及びエキソビボという２つの主要な方法がある。インビボ送達では、核酸は、通常はＰＲＯポリペプチドが必要とされている部位、すなわちＰＲＯポリペプチドの合成部位、もし知られているならばＰＲＯポリペプチドの生物学的活性が必要とされる部位（例えば傷）に、患者に直接注入される。エキソビボ処理では、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、修飾された細胞を患者に、直接、又は例えば患者に埋め込まれる多孔性膜にカプセル化して投与する（米国特許第４，８９２，５３８号及び第５，２８３，１８７号参照）。核酸を生細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。これらの技術は、核酸が培養された細胞にインビトロで移入されるか、又は対象とする宿主にインビボで移入されるかによる。哺乳動物細胞にインビトロで核酸を移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などを含む。形質導入は、複製欠陥、組換えウイルス（好ましくはレトロウイルス）粒子の細胞レセプターとの結合、次いで粒子に含まれる核酸の細胞への導入を含む。遺伝子のエキソビボ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスである。
【００７６】
現在インビボ核酸移入技術で好ましいのは、ウイルス又は非ウイルスベクター（アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ））、及び脂質ベースの系（遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ−Ｃｈｏｌである；例えば、Ｔｏｎｋｉｎｓｏｎ等， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ， １４（１）： ５４−６５ （１９９６） 参照）での形質移入を含む。遺伝子治療で使用するために最も好ましいベクターはウイルス、最も好ましくはアデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス、又はレトロウイルスである。レトロウイルスベクター等のウイルスベクターは、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサー又は位置決定因子、あるいは選択的スプライシング、核ＲＮＡ輸出、又はメッセンジャーの翻訳後修飾などの他の手段により遺伝子発現を制御する他の因子を含む。さらに、レトロウイルスベクター等のウイルスベクターは、ＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子の存在下で転写されたとき、それに作用可能に結合し、翻訳開始配列として機能する核酸分子を含む。このようなベクター作成物はまた、用いるウイルスに適したパッケージングシグナル、末端反復配列（ＬＴＲ）又はその一部、及びポジティブ及びネガティブストランドプライマー結合部位を含む（これらがウイルスベクターに既に存在しない場合）。さらに、これらのベクターは、典型的には、それらが配置される宿主細胞からＰＲＯポリペプチドを分泌させるシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は哺乳動物シグナル配列、最も好ましくはＰＲＯポリペプチドのための天然シグナル配列である。場合によっては、ベクター作成物は、ポリアデニル化並びに一又は複数の制限部位を指向するシグナル及び翻訳終結配列も含む。例として、このようなベクターは典型的には５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第二鎖ＤＮＡ合成の開始点、及び３’ＬＴＲ又はその一部を含む。非ウイルスの他のベクター、例えばカチオン性脂質、ポリリシン、及びデンドリマーを用いることもできる。
幾つかの状況では、核酸供給源を標的細胞にターゲティングする試薬、例えば細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体又は標的細胞、標的細胞上のレセプターのリガンドなどとともに提供するのが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質が、ターゲティング及び／又は取り込みの促進のために用いられ、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はそのフラグメント、サイクリングにおいて内部移行を受けるタンパク質の抗体、及び細胞内局在化をターゲティングし細胞内半減期を向上させるタンパク質である。レセプター媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Ｗｕ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６２：４４２９−４４３２ （１９８７）及びＷａｇｎｅｒ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７： ３４１０−３４１４ （１９９０）に記載されている。現在知られている遺伝子標識化及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５６：８０８−８１３ （１９９２）を参照のこと。また、ＷＯ９３／２５６７３及びそこに引用された参考文献も参照。
好適な遺伝子治療及びレトロウイルス粒子及び構造タンパク質の作成方法は、米国特許第５，６８１，７４６号に見出される。
【００７７】
５．２．４．６．診断法としての遺伝子の用途
また本発明は、診断法としてのＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子の用途に関する。ＰＲＯポリペプチド中の変異体は腫瘍の原因であるため、変異した形態のＰＲＯポリペプチドの検出は、心臓血管、内皮及び血管形成疾患、又は心臓血管、内皮及び血管形成疾患、例えば腫瘍への感受性の診断を可能にする。
ヒトＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子に変異体を担持する個人は、種々の技術でＤＮＡレベルが検出される。診断用の核酸は患者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織バイオプシー、及び検屍物質から得ることができる。ゲノムＤＮＡは、分析の前にＰＣＲを使用して酵素的に増幅させる（Ｓａｉｋｉら， Ｎａｔｕｒｅ， ３２４：１６３−１６６（１９８６））か、又は直接検出に使用することができる。ＲＮＡ又はｃＤＮＡは同じ目的のために使用することができる。例として、ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーを、ＰＲＯポリペプチド変異体の同定及び分析に使用することができる。例えば、欠失及び挿入は正常な遺伝子型と比較した増幅産物の大きさの変化により検出することができる。点変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）は、ＰＲＯポリペプチドをコードする放射能標識されたＲＮＡ、又はＰＲＯポリペプチドをコードする放射能標識されたアンチセンスＤＮＡ配列に対し、増幅ＤＮＡをハイブリッド形成させることにより同定することができる。完全な適合配列はＲＮアーゼＡ消化又は溶解温度の相違により非適合二重鎖と区別することができる。
ＤＮＡ配列の相違に基づく遺伝子テストは、変性剤を用いるか用いないで、ゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動移動性の変化を検出することにより達成される。小配列の欠失及び挿入は高解像度のゲル電気泳動により可視化することができる。異なる配列のＤＮＡフラグメントは、変性ホルムアミジン勾配ゲルにおいて区別され、異なるＤＮＡフラグメントの移動は、特定の溶解又は部分的な溶解温度により、ゲルの異なる位置で阻害される。例えば、Ｍｙｅｒｓら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３０：１２４２（１９８５）。
また、特定の位置における配列変化はヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばＲＮアーゼ及びＳＩ保護、又は化学的切断方法、例えばＣｏｔｔｏｎら，  Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５：４３９７−４４０１（１９８５）により明らかになる。
よって、特定のＤＮＡ配列の欠失はハイブリッド形成、ＲＮアーゼ保護、化学的切断、直接ＤＮＡ配列化、又は制限酵素、例えば制限フラグメント長のポリモルフィズム（ＲＦＬＰ）の使用、及びゲノムＤＮＡのサザンブロット等の方法により達成することができる。
【００７８】
５．２．４．７．ＰＲＯポリペプチドレベル検出のための用途
より便宜的なゲル電気泳動及びＤＮＡ配列化に加えて、変異はインサイツ分析で検出することもできる。
ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸の発現は、腫瘍形成に関連した血管の病気、又は新血管新生に連動している。ＰＲＯポリペプチドがシグナル配列を有している場合は、ｍＲＮＡは平滑筋細胞では少ないのに対して内皮細胞では高度に発現しており、このことはＰＲＯポリペプチドが血清中に存在していることを示している。従って、このＰＲＯポリペプチドのレベルの変化が腫瘍形成に関連した血管の病気、又は新血管新生であることを示しているために、抗−ＰＲＯポリペプチド抗体は、このような疾患の診断に使用することができる。
ＰＲＯポリペプチドに特異的な抗体を固体支持体上に取り付け、標識されたＰＲＯポリペプチド及び宿主から誘導されたサンプルを固体支持体に通過させる競合アッセイを使用することもでき、固体支持体に取り付けた検出されるレベルの量はサンプル中のＰＲＯポリペプチドの量と相関関係がある。
【００７９】
５．２．４．８．染色体マッピング
また、本発明の配列は染色体同定において重要である。配列は特異的に標的とされ、個人のヒト染色体の特定の位置にハイブリッド形成させることができる。さらに、染色体の特定の部位を同定するために、現在必要である。実際の配列データ（反復多形性）に基づいたいくつかの染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置のマーキングのために入手可能である。本発明の染色体のＤＮＡマッピングは、病気に関連した遺伝子を有する配列を相関させるために、重要な第１段階である。
簡単に言えば、配列はｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好ましくは１５−２５塩基対）を調製することにより、染色体にマッピングすることができる。３’−非翻訳領域のコンピュータ分析を使用すると、ゲノムＤＮＡの一エクソン以上のスパンではないプライマーが素早く選択され、よって増幅プロセスがより複雑になる。これらのプライマーを、次に、個々のヒト染色体を遺伝子を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみが、増幅断片を作成するであろう。
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に特定のＤＮＡを割り当てるための急速な手順である。同様のオリゴヌクレオチドプライマーを本発明で使用すると、サブ局部限定を、類似した方法で、大きなゲノムクローンのプール又は特定の染色体からの断片のパネルで達成することができる。同様に、その染色体へのマッピングに使用可能な他のマッピング方法には、インサイツハイブリッド形成、標識されたフローソート染色体を用いたプレスクリーニング、及び染色体特異性ｃＤＮＡライブラリを組み立てるためのハイブリッド形成によるプレ選択が含まれる。
中期染色体展開へのｃＤＮＡクローンの蛍光インサイツハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）を、正確な染色体位置を一工程で提供するために使用することができる。この技術は５００又は６００塩基と短いｃＤＮＡで使用することができるが；２０００塩基対を越える長さのクローンは、単純な検出に対して十分なシグナル強さを有する独特の染色体位置に結合する見込みが高い。ＦＩＳＨには、ＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子を誘導するクローンの使用が必要であり、長くなればなる程良好になる。例えば、２０００塩基対で良好であり、４０００塩基対でより好ましく、４０００を越えても、時間の合理的なパーセンテージの良好な結果を得るのには、おそらく必要ではない。この技術のレビューについては、Ｖｅｒｍａ等， Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ；ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． １９８８）を参照されたい。
一度、配列を厳密な染色体位置にマッピングすると、染色体上の配列の物理的位置は遺伝子地図データと相関可能である。このようなデータは、例えば、Ｖ． ＭｃＫｕｓｉｃｋ， Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ）に見出される。次に、同じ染色体領域にマッピングされる遺伝子と病気の関係を連鎖アッセイにより同定する（物理的に隣接する遺伝子の共同相続）。
次に、病気に罹患した又は病気に罹患しなかった個体間のｃＤＮＡ又はゲノム配列における差異を測定する必要がある。変異が病気に罹患し個体の数人又は全員に見出され、正常な個体では見出されない場合、変異は病気の原因であると思われる。
物理的マッピング及び遺伝子マッピング技術の現在の解像度によれば、病気に関連した染色体領域に厳密に位置するｃＤＮＡは、５０と５００潜在的原因遺伝子の間の一つである（このことは、１メガベースのマッピング解像度で、２０ｋｂ当たり１遺伝子であると仮定している）。
【００８０】
５．２．４．９．候補薬のスクリーニングアッセイ
本発明は、ＰＲＯポリペプチドに類似する（アゴニスト）又はＰＲＯポリペプチドの効果を阻害する（アンタゴニスト）ものを同定するための化合物のスクリーニング方法も包含する。アンタゴニスト候補薬のスクリーニングアッセイは、ここに同定した遺伝子にコードされるＰＲＯポリペプチドと結合又は複合体形成する化合物、又は他にコード化ポリペプチドと他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、それを特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに適用可能なアッセイを含む。
このアッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、及び細胞ベースのアッセイで、この分野で知られたものを含む種々の方式で実施される。
アンタゴニストについての全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定された核酸にコードされるＰＲＯポリペプチドと、これら２つの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通する。
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるＰＲＯポリペプチド又は候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばミクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をＰＲＯポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化されるＰＲＯポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、それを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
【００８１】
候補化合物が相互作用するがここに同定した遺伝子にコードされる特定のＰＲＯポリペプチドに結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、Ｃｈｅｖｒａｙ及びＮａｔｈａｎｓ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９， ５７８９−５７９３ （１９９１）に開示されているようにして、（Ｆｉｅｌｄｓ及び共同研究者等［Ｆｉｅｌｄｓ及びＳｏｎｇ， Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ） ３４０， ２４５−２４６ （１９８９）； Ｃｈｉｅｎ等， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８， ９５７８−９５８２ （１９９１））に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより監視することができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系（一般に「２−ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１−ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質−タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β−ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２−ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ（商品名））は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
ここで同定されたＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子と細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる：通常は反応混合物は、遺伝子産物と細胞外又は細胞内成分を、それら２つの生成物が相互作用及び結合する条件下及び時間で含むように調製される。候補化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。さらに、プラシーボを第３の反応混合物に添加してポジティブコントロールを提供してもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合（複合体形成）は上記のようにモニターされる。試験化合物を含有する反応混合物ではなく対照反応における複合体の形成は、試験化合物が試験化合物とその結合パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
【００８２】
ＰＲＯポリペプチドが同時有糸分裂促進物質ＣｏｎＡの存在下で内皮細胞の増殖を刺激する能力を有している場合、スクリーニング方法の一例では、この能力の利点が利用される。特に、増殖アッセイにおいて、ヒト臍帯静脈内皮細胞を得、９６−ウェル平底培養皿（Ｃｏｓｔａｒ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）で培養し、細胞の増殖を容易にするのに適切な反応混合物を補い、該混合物はＣｏｎ−Ａ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を含有している。Ｃｏｎ−Ａ及びスクリーニングされる化合物を添加し、３７℃でインキュベートした後、培養物を３−Ｈチミジンで標識し、ガラス繊維フィルター上に収集する（ｐｈＤ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ， ＭＡ）。３組の培養の平均３−Ｈチミジン取り込み（ｃｐｍ）を、液体シンチレーション計測器を使用して測定する（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ． Ｉｒｖｉｎｅ． ＣＡ）。有意な３−（Ｈ）チミジン混入率が内皮細胞の刺激において示された。
アンタゴニストを検定するために、上述したアッセイを行うが、このアッセイにおいて、ＰＲＯポリペプチドはスクリーニングされる化合物とともに添加してよく、ＰＲＯポリペプチド存在下での３−（Ｈ）チミジン導入を阻害する化合物の能力が、化合物がＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。あるいは、アンタゴニストは、ＰＲＯポリペプチド及び膜結合ＰＲＯポリペプチドレセプター又は組換えレセプターを持つ潜在的アンタゴニストを、競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させることにより検出してもよい。ＰＲＯポリペプチドは、放射活性等で標識でき、レセプターに結合したＰＲＯポリペプチド分子の数を潜在的アンタゴニストの有効性を決定するのに使用できる。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパンニング及びＦＡＣＳソートにより同定できる。Ｃｏｌｉｇａｎ等， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．， １（２）： Ｃｈａｐｔｅｒ ５ （１９９１）。好ましくは、発現クローニングが用いられ、ポリアデニル化ＲＮＡがＰＲＯポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリがプールに分配され、ＣＯＳ細胞又はＰＲＯポリペプチド反応性でない他の細胞の形質移入に使用される。スライドガラスで成長させた形質移入細胞を標識したＰＲＯポリペプチドに曝露する。ＰＲＯポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の包含を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフィ分析を施す。ポジティブプールを同定し、相互作用サブプール化及び再スクリーニング工程を用いてサブプールを調製して再形質移入し、結果的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生成する。
【００８３】
これに代わるレセプター同定のアプローチとして、標識したＰＲＯポリペプチドをレセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物に光親和性結合させることができる。架橋材料はＰＡＧＥに溶解させ、Ｘ線フィルムに曝露する。レセプターを含む標識複合体を励起し、ペプチド断片に分離し、タンパク質マイクロ配列決定を施すことができる。マイクロ配列から得たアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するｃＤＮＡライブラリをスクリーニングする分解性オリゴヌクレオチドプローブの組の設計に用いられる。
アンタゴニストの他の検定では、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、候補化合物の存在下で標識ＰＲＯポリペプチドとともにインキュベートする。次いで、この相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。
心臓血管、内皮及び血管形成疾患の治療に有用な組成物には、限定するものではないが、標的遺伝子産物の活性及び／又は発現を阻害する抗体、小有機及び無機分子、ペプチド、リンペプチド、アンチセンス及びリボザイム分子、トリプルへリックス分子が含まれる。
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとＰＲＯポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限られないが、ポリ−及びモノクローナル抗体及び抗体断片、単鎖抗体、抗−イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認識するが影響せず、それによりＰＲＯポリペプチドの作用を競合的に阻害するＰＲＯポリペプチドの変異形態であってもよい。
他の潜在的なＰＲＯポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ作成物であり、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリッド形成してタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、トリプルへリックス形成又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法はともに、ポリヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡへの結合に基づく。例えば、ここでの成熟ＰＲＯポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コード化部分は、約１０から４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計に使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計され（トリプルへリックス−Ｌｅｅ等， Ｎｕｃｌ， Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ６： ３０７３ （１９７９）； Ｃｏｏｎｅｙ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４１： ４５６ （１９８８）； Ｄｅｒｖａｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５１： １３６０ （１９９１）参照）、それによりＰＲＯポリペプチドの転写及び生成を防止する。ここで述べるように、ＲＮＡの一部と「相補的な」配列とは、ＲＮＡとハイブリダイズ可能な相補性を持ち、安定な二重鎖を形成することを意味し；従って、二重鎖アンチセンス核酸の場合、二重鎖ＤＮＡの一本鎖がテストされ、三重鎖へリックス形成がアッセイされる。ハイブリダイズする能力は相補度とアンチセンス核酸の長さに依存するであろう。一般に、ハイブリダイズする核酸が長ければ長い程、より多くのＲＮＡとの塩基ミスマッチを包含することとなり、さらに安定二重鎖（又は場合によっては三重鎖）を形成する。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融解温度を決定するための標準的な手法の使用により、可能な温度を評価することができる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリッド形成してｍＲＮＡ分子のＰＲＯポリペプチドへの翻訳を阻止する（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ， Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．， ５６： ５６０ （１９９１）； Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ： Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ， １９８８））。
【００８４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はそのキメラ混合物又は誘導体又は修飾された種類、一本鎖又は二本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格において、例えば、分子、ハイブリダイゼーションなどの安定性を改善するために修飾してもよい。オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、インビボにおいて、宿主細胞のレセプターを標的化するための）、又は細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ等， １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ ８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅ等， １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８４：６４８−６５２；ＰＣＴ公報、ＷＯ８８／０９８１０， １９８８年１２月１５日発行を参照のこと）又は血管−脳関門（例えば、ＰＣＴ公報、ＷＯ８９／１０１３４， １９８８年４月２５日発行を参照のこと）輸送を促進する薬剤、ハイブリダイゼーション−トリガー切断剤（例えば、Ｋｒｏｌ等， １９８８， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６を参照のこと）又はインターカレーティング剤（Ｚｏｎ， １９８８， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ５：５３９−５４９）などの付加的な他の集団を含んでもよい。このために、オリゴヌクレオチドは他の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション−トリガー架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション−トリガー切断剤、などと結合してもよい。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定はしないが、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（Ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（Ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６−ジアミノプリンを含む集団から選択される少なくとも一つの修飾された塩基部分を含んでもよい。
また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定はしないが、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、及びヘキソースを含む集団から選択される少なくとも一つの修飾された糖部分を含んでもよい。
さらに他の実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミドチオエート、ホスホラミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル及びホルムアセタール又はその類似体から成る集団から選択される少なくとも一つの修飾されたリン酸骨格を含む。
さらに他の実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは＿−アノメリックオリゴヌクレオチドである。＿−アノメリックオリゴヌクレオチドは、相補的なＲＮＡと特異的な二重鎖ハイブリッドを形成するが、通常の＿−ユニットとは反対に、鎖は互いに平行に並ぶ（Ｇａｕｔｉｅｒ等， １９８７， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． １５：６６２５−６６４１）。オリゴヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ等， １９８７， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５：６１３１−６１４８）、又はキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体である（Ｉｎｏｕｅ等， １９８７， Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔ． ２１５：３２７−３３０）。
本発明のオリゴヌクレオチドは当該技術分野において既知の標準的な方法、例えば、自動ＤＮＡ合成機（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， などから購入できるような）の使用により合成してもよい。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎ等の方法（１９８８， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：３２０９）によって合成されてもよく、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、調整された孔のガラスポリマー支持体などを用いて調製することができる（Ｓａｒｉｎ 等， １９８８， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：７４４８−７４５１）。
上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に輸送され、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡをインビボで発現させて、ＰＲＯポリペプチドの生産を阻害することもできる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の約−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【００８５】
アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、一般的に少なくとも約５塩基長、約１０塩基長、約１５塩基長、約２０塩基長、約２５塩基長、約３０塩基長、約３５塩基長、約４０塩基長、約４５塩基長、約５０塩基長、約５５塩基長、約６０塩基長、約６５塩基長、約７０塩基長、約７５塩基長、約８０塩基長、約８５塩基長、約９０塩基長、約９５塩基長、約１００塩基長、又はそれ以上である。
潜在的アンタゴニストは、ＰＲＯポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりＰＲＯポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチド有機又は無機化合物を含む。
更なる潜在的アンタゴニストはリボザイムであるが、これはＲＮＡの特異的な切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリッド形成、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Ｒｏｓｓｉ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４： ４６９−４７１ （１９９４）及びＰＣＴ公報、番号ＷＯ ９７／３３５５１（１９９７年９月１８日発行）を参照されたい。
特異的な認識部位でｍＲＮＡを切断するリボザイムは標的遺伝子ｍＲＮＡを破壊するために使用可能であるが、ハンマーヘッドリボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する隣接領域によって決定される位置でｍＲＮＡを切断する。唯一の条件は、標的ｍＲＮＡは以下の２塩基配列：５’−ＵＧ−３’を持つことである。ハンマーヘッドリボザイムの構築及び生産は当該技術分野においてよく知られており、その全体としてここに文献により取り込まれているＭｙｅｒｓ， １９９５， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （特に、８３３ページの図４を参照のこと）中、Ｈａｓｅｌｏｆｆ及びＧｅｒｌａｃｈ， １９８８， Ｎａｔｕｒｅ， ３３４：５８５−５９１中により詳細に記載されている。
好ましくはリボザイムは、切断認識部位が標的遺伝子ｍＲＮＡの５’末端近くに位置するように、即ち、効率を増大し、非機能的なｍＲＮＡ転写の細胞内蓄積を最小にするために加工される。
また、本発明のリボザイムは、テトラヒメナ  サーモフィラ（ＩＶＳ、又はＬ−１９ ＩＶＳＲＮＡとして知られる）中で天然に産生され、Ｔｈｏｍａｓ Ｃｅｃｈ及び共同研究者（Ｚａｕｇ等， １９８４， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２４：５７４−５７８；Ｚａｕｇ及びＣｅｃｈ， １９８６， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３１：４７０−４７５；Ｚａｕｇ等， １９８６， Ｎａｔｕｒｅ， ３２４：４２９−４３３；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｔｅｎｔｓ Ｉｎｃ．による、公開された国際特許出願番号ＷＯ８８／０４３００；Ｂｅｅｎ及びＣｅｃｈ， １９８６， Ｃｅｌｌ， ４７：２０７−２１６）により広範に記述されてきたＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（「Ｃｅｃｈ−タイプリボザイム」と後述される）も含む。Ｃｅｃｈ−タイプリボザイムは、標的ＲＮＡ配列とハイブリダイズした後、標的ＲＮＡの切断が生じる８塩基対の活性部位を持つ。本発明は標的遺伝子中に存在する８塩基対の活性配列を標的とするこれらＣｅｃｈ−タイプリボザイムを包含する。
アンチセンスのアプローチにおいて、リボザイムは、修飾されたオリゴヌクレオチド（例えば、改善された安定、標的化などのために）で構成され、インビボで標的遺伝子を発現する細胞へ送達される。送達の好ましい方法は、形質移入された細胞が、内在性の標的遺伝子メッセージを破壊し、翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを生産するように、強力で構成的なｐｏｌ ＩＩＩ又はｐｏｌ ＩＩプロモーターのコントロール下において、リボザイムをコードするＤＮＡコンストラクトを用いることを含む。アンチセンス分子とは異なり、リボザイムは酵素的であるため、低い細胞内濃度が効率化のために要求される。
転写阻害に用いられるトリプルヘリックス形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介するトリプルヘリックス形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、上掲のＰＣＴ公報、番号ＷＯ ９７／３３５５１を参照されたい。
これらの小分子は、上記で議論したスクリーニングアッセイの一又は複数の任意のものにより及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
【００８６】
５．２．４．１０．治療される心臓血管、内皮及び血管形成疾患のタイプ  ここで記載された心臓血管、内皮及び血管形成アッセイにおいて活性を有し、及び／又はそれらの遺伝子産物が心臓血管系に位置することが見出されているＰＲＯポリペプチド又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニストは、血管に影響を及ぼす全身疾患、例えば真性糖尿病を含む種々の心臓血管、内皮及び血管形成疾患において治療用途を有していると思われる。それらの治療有効性は、動脈、毛細管、静脈、及び／又はリンパ管の病気を含みうる。以下治療例には、筋肉消耗病治療、骨粗鬆症治療、移植周囲の細胞成長を刺激するための移植固定補助、よってその意図する部位への結合を容易にするもの、組織又は血清中のＩＧＦ安定性の増加、適切であるならば、ＩＧＦレセプターへの結合性の増加（ＩＧＦがヒト骨髄赤血球及び顆粒球原種細胞の成長を高めることが、インビトロで示されているため）が含まれる。
また、ＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、赤血球生成又は顆粒球生成を刺激し、傷の治癒及び組織の再生を刺激し、組織、例えば結合組織、皮膚、骨、軟骨、筋肉、肺又は腎臓の再成長に関連した治療に関連し、内皮細胞の移動を刺激又は阻害し、及び血管性平滑筋の増殖及び内皮細胞の生産を増やすために使用することができる。ＰＲＯポリペプチド又はアンタゴニストにより媒介される血管形成の増加は、虚血組織、心臓の側枝冠動脈、続いて冠動脈狭窄に有益である。アンタゴニストは、このようなポリペプチドの作用を阻害し、例えば、ＰＲＯポリペプチドがそのような生成を促進する場合、傷の治癒又は胚線維症の間に、過度の結合組織の生成を制限するために使用される。これには急性心筋梗塞及び心不全が含まれる。
さらに、本発明は原因にかかわらず、治療的有効量のＰＲＯポリペプチド、又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニストを投与することによる、心臓肥大の治療に関する。目的がヒト患者の治療である場合、ＰＲＯポリペプチドは、好ましくは組換えヒトＰＲＯポリペプチド（ｒｈＰＲＯポリペプチド）である。心臓肥大の治療は、心筋梗塞、高血圧、肥大性心筋症、及び心臓弁逆流を含む、多種多様な病状の結果における、その種々の段階の任意において行うことができる。治療は、根本にある心疾患にかかわらず、心筋の構造的ダメージを有するか又は有さない、心臓肥大の進行の全ての段階に広げることができる。
分子のアンタゴニストに対抗する場合、特定の指示に対し、分子それ自身又はそのアゴニストを使用するか否かの決定は、主として、分子が新血管新生、内皮細胞の発生、又は血管形成を促進する、又はこれらの病状を阻害するか否かに依存する。例えば、分子が血管形成を促進する場合は、そのアンタゴニストは血管形成の制限又は防止が所望されている疾患の治療に有用である。このような疾病の例には、血管腫瘍、例えば血管腫、腫瘍血管形成、網膜の新血管新生、糖尿病性網膜症又は時期尚早の幼児性網膜症又は黄斑変性及び増殖性硝子体網膜症に関連した脈絡膜、慢性関節リュウマチ、クローン病、アテローム性動脈硬化、卵巣過剰刺激、乾癬、新血管新生に関連した子宮内膜症、気球血管形成が続く再狭窄、瘢痕組織過剰生成、例えば外科手術の後に形成されるケロイドのようなもの、心筋梗塞の後の線維症、又は胚線維症に関連した線維症障害が含まれる。
しかし、分子が血管形成を阻害するならば、上述した病状の治療に直接使用されることが予期される。
【００８７】
他方、分子が血管形成を刺激する場合、指示に対し、それ自体を所望する血管形成、例えば末梢血管病、高血圧、血管炎、レーノー病及びレーノー現象、動脈瘤、及び動脈再狭窄、血栓静脈炎、リンパ管炎、リンパ浮腫、創傷治癒及び組織の修復、虚血再潅流傷害、アンギナ、心筋梗塞、例えば急性心筋梗塞、慢性心疾患、心不全、例えば鬱血性心不全、及び骨粗鬆症等に使用される。
しかし、分子が血管形成を阻害するならば、そのアゴニスト又はアンタゴニストは血管形成が所望される病状の治療に使用される。
特定の型の病気は以下に記載され、ここでのＰＲＯポリペプチド又はそのアンタゴニストは疾患の予防、又は治療のための治療標的として、又は標的とする血管放出剤に有用なものとして提供される。アテローム性動脈硬化は、体液の蓄積、平滑筋細胞の増殖、及び動脈壁内の繊維組織の形成により、動脈内の厚みが増した脈管内膜にプラークが蓄積することにより特徴付けられる病気である。病気は、任意の器官において大、中及び小動脈を襲う。内皮及び血管平滑筋細胞機能の変化は、これらのプラークの蓄積及び緩和を調節する、重要な役割を担っていることが知られている。
高血圧は全身性動脈、肺動脈、又は門脈系において血圧が上昇することにより特徴付けられる。上昇した血圧は、欠陥のある内皮機能及び／又は血管病に帰着するか、又はこれらに起因する。
血管炎には、巨大細胞動脈炎、タカヤス動脈炎、多発性動脈ｎｏｄｏｓａ（細小血管障害形態を含む）、カワサキ病、微小多発性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、種々の感染症関連の血管疾患（Ｈｅｎｏｃｈ−Ｓｃｈｏｎｌｅｉｎ ｐｒｕｐｕｒａを含む）が含まれる。変更内皮細胞機能はこれらの病気において重要であることが示されている。
レーノー病及びレーノー現象は、冷気にさらされた手足を通って、循環の間欠性異常欠陥により特徴付けられるものである。変更内皮細胞機能がこれらの病気において重要であることが示されている。
動脈瘤は、変更内皮細胞及び／又は血管平滑筋細胞に関連した動脈又は静脈樹状分の嚢状又は紡錘状拡張症である。
動脈再狭窄（動脈壁再狭窄）は、内皮及び血管平滑筋細胞の増殖及び機能の変更の結果によるもので、続いて血管形成を生じる。
血栓静脈炎及びリンパ管炎は静脈及びリンパ管の炎症性疾患であり、それぞれ内皮細胞機能の変更に帰着するか、及び／又は起因する。同様に、リンパ浮腫は内皮細胞機能からのリンパ管の欠陥に関連した病状である。
良性及び悪性血管腫瘍のファミリーは、血管系の細胞エレメントの異常な増殖及び成長により特徴付けられる。例えば、リンパ管腫は、先天的で、しばしば膀胱のリンパ系の良性腫瘍、通常新生児に生じるリンパの奇形である。膀胱腫瘍は隣接した組織内で成長する傾向にある。膀胱腫瘍は、通常、子宮頸部及び腋か領域に生じる。また、それらは四肢の軟組織でも生じる。主たる徴候は膨張であり、時折、網状に構造化されたリンパ及びリンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｓｔ）は結合組織に囲まれている。リンパ管腫は、胎性リンパ管又はそれらの欠失に不適当に結合することに起因すると仮定されている。結果は局所的にリンパドレナージを害している。Ｇｒｉｅｎｅｒ等， Ｌｙｍｐｈｏｌｏｇｙ， ４： １４０−１４４ （１９７１）。
【００８８】
ここでのＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの他の用途は、成長及び／又は転移可能な腫瘍の血管新生に関与する腫瘍血管形成にある。このプロセスは新しい血管の成長に依存する。新生物及び腫瘍血管形成に係る関連した病状の例には、乳癌腫、肺癌腫、胃癌腫、食道癌腫、結腸直腸癌腫、肝臓癌腫、卵巣癌腫、テコーマ、男性胚腫、子宮頸部癌腫、子宮内膜癌腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、繊維肉腫、絨毛癌、頭部及び首部の癌、鼻咽腔癌腫、喉頭癌腫、肝臓芽腫、カポジ肉腫、黒色腫、皮膚癌腫、血管腫、海面性血管腫、血管芽腫、膵臓癌腫、網膜癌腫、星状細胞腫、膠芽腫、シュワン細胞腫、乏突起膠細胞腫、髄芽腫、神経芽腫、横紋筋肉腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、尿路肉腫、甲状腺癌腫、ウィルムス腫瘍、腎細胞癌腫、前立腺癌腫、ｐｈａｋｏｍａｔｏｓｅｓに関連した異常な血管増殖、浮腫（例えば脳腫瘍に関連したもの）、及びＭｅｉｇｓ症候群が含まれる。
加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）は年輩者の集団における、ひどい視覚損失に至る原因である。ＡＭＤの滲出形態は脈絡膜新血管新生及び網膜色素内皮細胞剥離により特徴付けられる。脈絡膜新血管新生が予後の動的低下に関連しているため、ＰＲＯポリペプチド又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニストは、重度のＡＭＤを低減させるのに有用であることが予期される。
また、外傷の治癒、例えば傷の治癒及び組織の修復は、ここでのＰＲＯポリペプチド又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニストが目的とする用途である。新しい血管の形成及び緩和は、本質的に組織の治癒及び修復である。この範疇には、骨、軟骨、腱、靱帯、及び／又は神経組織の成長又は再生、並びに傷の治癒及び組織の再生及び交換、及び火傷、切断、及び潰瘍の治療が含まれる。骨が正常に形成されない環境で軟骨及び／又は骨の成長を誘発するＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、骨折及び軟骨のダメージ、又はヒト及び他の動物の欠損の治療に適用される。ＰＲＯポリペプチドまたはそのアゴニスト又はアンタゴニストを使用するこのような調製物は、骨折の低減及び人工関節の固定の改善において予防的に使用される。骨形成剤により誘発される新たな骨の形成は、先天的、外傷誘発性、又は腫瘍学的、切除誘発性頭蓋欠損の修復に寄与し、また美容形成外科においても有用である。
さらに、ＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、限定するものではないが、圧迫潰瘍、血管不全に関連した潰瘍、外科的又は外傷的な傷等を含む治癒していない傷を、より良好により早く閉塞させることを促進させるのに有用である。
またさらに、ＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、他の組織、例えば器官（例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚又は内皮を含む）、筋肉（平滑筋、骨格筋又は心筋）、及び血管（血管内皮を含む）組織の生成又は再生、又はこのような組織を含む細胞成長の促進活性を示し得る。所望の効果の一部は、線維性瘢痕化を阻害又は調節して、正常な組織を再生することである。
【００８９】
またここでのＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、全身的サイトカインダメージからの病状、及び種々の組織における傷の再灌流、肺又は肝臓線維症の治療、及び再生又は保護に有用である。また、ＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、先駆組織又は細胞からの上述した組織の分化を促進又は阻害、又は上述した組織の成長を阻害するのに有用である。
さらに、ＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは歯周病の治療及び他の歯修復プロセスに使用することができる。このような薬剤は骨形成細胞を誘引し、骨形成細胞の成長を刺激し、又は骨形成細胞の原種の分化を誘発する環境で提供される。ここでのＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、血管が、骨の回転及び成長の調節において重要な役割を担っているため、骨粗鬆症又は骨関節症の、例えば骨及び／又は軟骨修復を刺激、又は炎症プロセスにより媒介される組織破壊（コラゲナーセ活性、破骨細胞等）のプロセス又は炎症をブロックすることによる治療に有用である。
ここでＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストにあるとされる組織再生活性の他の範疇は、腱／靱帯形成である。組織が通常形成されない環境での腱／靱帯様組織又は他の組織形成を誘発するタンパク質は、ヒト及び他の動物の腱又は靱帯の裂け目、奇形、及びの腱又は靱帯の欠損の治癒に適用される。このような調製物は、腱又は靱帯組織へのダメージの予防、並びに腱又は靱帯の骨又は他の組織への固定の改善、及び腱又は靱帯組織の欠損の修復において予防的に使用される。ここでのＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの組成物により誘発される新しい腱／靱帯様組織形成は、先天的、外傷誘発性、又は他の由来による腱又は靱帯の他の欠損の修復に寄与し、また腱又は靱帯の取り付け又は修復のための美容形成外科においても有用である。ここでの組成物は、腱−又は靱帯−形成細胞を誘引、腱−又は靱帯−形成細胞の成長を刺激、腱−又は靱帯−形成細胞原種の分化を誘発、又はイクスビボでの回復インビボでの組織修復効果における腱／靱帯細胞又は原種の成長を誘発する環境で提供される。また、ここでの組成物は、腱炎、手根管症候群、及び他の腱又は靱帯欠損にも有用である。さらに組成物は、当該技術でよく知られている担体と同じ適切なマトリクス及び／又は金属イオン封鎖剤を含む。
【００９０】
ＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは神経細胞の増殖、及び神経及び脳組織の再生、すなわち神経細胞又は神経組織の変性、死亡又は外傷に関与する中枢及び末梢神経系の病気及び神経障害、並びに機械的又は外傷的疾患の治療に有用である。特に、ＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、末梢神経系の病気、例えば末梢神経損傷、末梢神経障害及び局所的神経障害、及び中枢神経系の病気、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティントン病、筋萎縮性側索硬化症、及びシャイ・ドレーガー症候群の治療に使用される。本発明で治療されるさらなる病状には、機械的又は外傷的疾患、例えば脊髄疾患、頭部外傷及び脳血管疾患、例えば脳卒中が含まれる。また、化学療法又は他の医学的療法の結果による末梢神経障害も、ＰＲＯポリペプチド又はそれに対するアゴニスト又はアンタゴニストを使用しての治療が可能である。
虚血−再潅流傷害は他の徴候である。内皮細胞機能不全は虚血−再潅流傷害が続いて生じる事象の後遺症の開始及び調節の両方において重要である。
慢性関節リュウマチはさらなる徴候である。血管成長及び脈管構造を通過する炎症細胞の標的は、関節炎のリュウマチ様及び血清ネガティブの形態の病因の重要な要因である。
また、ＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、病状の進行の防止、無症候性の患者の死を含む急死の回避のために、心臓肥大を有する患者に予防的に投与される。このような予防的治療は大きな左心室心臓肥大（成人においては最大壁厚が３５ｍｍ又はそれ以上、又は子供においてはそれに匹敵する値）のケース、又は心臓における血管腫の負荷が特に強くなった場合の例において、特に正当である。
さらにＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、肥大性心筋症と診断された患者のかなりの部分に発現する、心房細動の治療に有用である。
さらなる徴候には、アンギナ、心筋梗塞、例えば急性心筋梗塞、及び心不全、例えば鬱血性心不全が含まれる。さらなる、非新生物病状には乾癬、糖尿病、及び時期尚早の網膜症、水晶体後方繊維増殖症、新血管緑内障を含む他の増殖性網膜症、甲状腺過形成（グレーブス病を含む）、角膜及び他の組織の移植、慢性的炎症、肺炎、ネフローゼ症候群、子癇前症、腹水症、心膜滲出（例えば心膜炎に関連するもの）、及び胸膜滲出が含まれる。
上述した観点から、内皮細胞機能、増殖及び／又は形態を変更又はこれに衝撃を与えると示されている、ここで記載されたＰＲＯポリペプチド、又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、上述した多くの又は全ての疾患の原因及び病因において重要な役割を担っており、これらの疾患を標的とする血管関連剤、又はこれらのプロセスを増大又は阻害するための治療標的として提供可能であると思われる。
【００９１】
５．２．４．１１．投与プロトコール、スケジュール、用量及び製剤
ここに記載された分子及びそれらのアゴニスト及びアンタゴニストは、上述した種々の疾患及び病気の予防及び治療薬として薬剤的に有用である。
ＰＲＯポリペプチド又はアゴニスト又はアンタゴニストの治療用組成物は、適当な純度を持つ所望の分子を任意の薬剤的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｏｌ， Ａ．編， （１９８０））と、凍結乾燥した製剤又は水溶液の形態で混合することにより調製することができる。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、好ましくは用いられる投与量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸炎、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンザルコニウムクロライド；ベンゼトニウムクロライド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
このような担体の更なる例は、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩、又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、マグネシウムトリシリケート、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、及びポリエチレングリコールである。局所用の担体又はゲルベースの形態は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース又はメチルセルロース等の多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及びモクロウアルコールを含む。あらゆる投与について、従来のデポー形態が好適に用いられる。このような形態は、例えば、マイクロカプセル、ナノ−カプセル、リポソーム、硬膏剤、吸入形態、鼻スプレー、舌下状錠剤、及び徐放性製剤を含む。ＰＲＯポリペプチド又はアゴニスト又はアンタゴニストは、典型的にはそのような媒体中に約０．１ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌの濃度で処方される。
【００９２】
他の調製物は、形成された製品中に、ＰＲＯポリペプチド又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニストを導入して含有される。このような製品は内皮細胞の成長及び血管形成の調節に使用することができる。加えて、腫瘍侵入及び転移をこれらの製品で調節してよい。
インビボ投与に用いられるＰＲＯポリペプチド又はアゴニスト又はアンタゴニストは無菌でなければならない。これは、凍結乾燥及び再形成の前又は後の滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。ＰＲＯポリペプチドは通常は凍結乾燥形態又は全身投与される場合には溶液中に貯蔵される。凍結乾燥形態にある場合、ＰＲＯポリペプチド又はアゴニスト又はアンタゴニストは典型的には使用時の適当な希釈剤を含む他の成分と組み合わせて処方される。ＰＲＯポリペプチド又はアゴニスト又はアンタゴニストの液体製剤の例は、無菌の、透明な、無色の生鮮溶液で、皮下注射用の１回投与バイアルに充填されている。繰り返し使用に適切な防腐製薬組成物は、例えばポリペプチドの種類及び指示に主として依存し、
ａ）ＰＲＯポリペプチド又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニスト；
ｂ）溶液中のポリペプチド又は他の分子の安定性を最大にする範囲内のｐＨ、好ましくは約４−８のｐＨを維持可能なバッファー；
ｃ）主として、撹拌誘発性集合体に対しポリペプチド又は分子を安定化させる洗浄剤／界面活性剤；
ｄ）等張剤；
ｅ）フェノール、ベンジルアルコール及びベンゼトニウムハロゲン化物、例えば塩化物の群から選択される防腐剤；及び
ｆ）水；
を含有し得る。
使用される洗浄剤が非イオン性であるならば、それは、例えばポリソルベート（例えば、ＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥＴＭ（ＴＷＥＥＮＴＭ）２０、８０等）、ポロキサマー（例えば、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲＴＭ１８８等）であってよい。非イオン性界面活性剤を使用することにより、ポリペプチドの変性を引き起こすことなく、表面応力の剪断に調製物をさらすことができる。さらに、このような界面活性剤含有調製物は、エアゾール装置、例えば静脈投与、及びニードレスジェット注入ガンに使用されるものにおいて、使用され得る（例えば、ＥＰ２５７，９５６を参照されたい）。
等張剤は、ＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの液体組成物を確実に等浸透圧とするために存在し、多価糖アルコール、好ましくは３価又は高級糖アルコール、例えばグリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールが含まれる。これらの糖アルコールは、単独で、又は組合せて使用することもできる。また、塩化ナトリウム又は他の適切な塩を、溶液を等張にするために使用してもよい。
バッファーは、所望するｐＨに応じて、アセタート、シトラート、スクシナート又はホスファートバッファーであってよい。本発明の液状調製物の一種類のｐＨは、約４から８、好ましくはほぼ生理学的ｐＨの範囲に緩衝される。
防腐剤、フェノール、ベンジルアルコール及びベンゼトニウムハロゲン化物、例えば塩化物は、使用可能な周知の抗菌薬である。
【００９３】
治療用ＰＲＯポリペプチド組成物は、一般的に無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で穿孔可能なストッパーを具備するバイアルに配される。製剤は、好ましくは静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、又は筋肉内（ｉ．ｍ．）の繰り返し注射として、あるいは鼻内又は肺内送達に適したエアロゾル製剤として投与される（肺内送達については、例えばＥＰ ２５７，９５６参照）。
また、ＰＲＯポリペプチドは持続放出製剤の形態で投与することもできる。持続放出製剤の好適な例は、タンパク質を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、当該マトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、Ｌａｎｇｅｒ等， Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ．， １５： １６７−２７７ （１９８１）及びＬａｎｇｅｒ， Ｃｈｅｍ． Ｔｅｃｈ．， １２： ９８−１０５ （１９８２）に記載されたようなポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸及びガンマエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ等， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ， ２２： ５４７−５５６ （１９８３））、非分解性エチレン−酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ等， 上掲）、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬｕｐｒｏｎ ＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能な微小球）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸（ＥＰ １３３，９８８）を含む。
エチレン−酢酸ビニルや乳酸−グリコール酸等の重合体は１００日以上分子を放出できるが、特定のヒドロゲルはより短い時間タンパク質を放出する。カプセル化タンパク質は、長時間体内に残存すると、３７℃で水分に曝されることで、変性又は凝集し、生理活性の喪失や免疫原生の変化のおそれがある。かかる機構によって安定性を得るための合理的な処置が考えられる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合であることが分かったら、スルフヒドリル残基を変更し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分量を調整し、適当な添加物を使用し、特定の重合体マトリクス化合物を開発することで安定性を保証することができる。
ＰＲＯポリペプチドの持続放出組成物は、リポソーム的に包括されたＰＲＯポリペプチドを含む。ＰＲＯポリペプチドを含有するリポソームは、それ自体周知である方法、例えば、ＤＥ ３，２１８，１２１、Ｅｐｓｔｅｉｎ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２：３６８８−３６９２ （１９８５）、Ｈｗａｎｇ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７：４０３０−４０３４ （１９８０）、ＥＰ ５２，３２２、ＥＰ ３６，６７６、ＥＰ ８８，０４６、ＥＰ １４３，９４９、ＥＰ １４２，６４１、特願昭５８−１１８００８、米国特許第４，４８５，０４５号及び第４，５４４，５４５号、及びＥＰ １０２，３２４等による方法によって調製する。通常、リポソームは、脂質含有量が約３０モル％以上コレステロールであり、選択される割合が最適な治療法に対して調整された微小（約２００−８００オングストローム）な単ラメラ状のものである。
【００９４】
ＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの治療的有効量は、当然のことながら、治療（予防を含む）すべき病理学的状態、投与方法、治療に用いられる化合物の型、包含される任意の同時治療、患者の年齢、体重、一般的な医学的状態、医学的履歴などの要因によって変化し、それは担当する医師の技量の範囲内で良好に決定される。従って、治療者は、最大の治療効果が得られるように、投与量を滴定し投与経路を修正する必要がある。ＰＲＯポリペプチドが狭い範囲の宿主を有しているならば、ヒトの患者の治療には、ヒトＰＲＯポリペプチド、より好ましくは天然配列ヒトＰＲＯポリペプチドを含有する調製物であることが好ましい。臨床医は投与量が当該病状の治療において所望する効果が得られるまで、ＰＲＯポリペプチドを投与するであろう。例えば、目的がＣＨＦの治療である場合、この病状に関連した進行性心臓肥大を阻害する量とされる。この治療及び進行状況は、エコーカルジオグラフィーにより容易にモニターされる。同様に、肥大性心筋症の患者には、経験に基づいてＰＲＯポリペプチドを投与することができる。
上記の指針では、有効投与量は、一般的に約０．００１から約１．０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．０１−１．０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．０１−０．１ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
成人の高血圧の治療における非経口用途では、注射の形態で、体重１ｋｇ当たり約０．０１から５０ｍｇ、好ましくは約０．０５から２０ｍｇ、最も好ましくは１から２０ｍｇのＰＲＯポリペプチドを、静脈内注射により１日に１から３回投与するのが有利である。経口投与では、ＰＲＯポリペプチドをベースとする分子を、好ましくは体重１ｋｇ当たり約５ｍｇから１ｇ、好ましくは約１０から１００ｍｇ、１日に１から３回投与する。内毒素汚染物質、安全レベルの最小量、例えば０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満に保持すべきである。さらにヒト投与では、調製物は好ましくは滅菌され、発熱性であり、一般的に安全で、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ｓｔａｎｄａｒｄｓで要求されるようにして精製される。
組織再生に使用されるＰＲＯポリペプチドを含有する製薬組成物の用量計画は、ポリペプチドの作用を変える種々の要因、例えば、形成が望まれる組織（例えば骨）の重量、傷害部位、傷害を受けた組織の状態、創傷の大きさ、傷害を受けた組織のタイプ（例えば、骨）、患者の年齢、性別、食餌、感染症の重傷度、投与時間、及び他の臨床的要因を考慮して、担当する医師により決定されるであろう。用量は、再構成に使用されるマトリクスの種類、製薬組成物の他のタンパク質含有物により変わり得る。例えば、他の周知の成長因子、例えばＩＧＦ−Ｉを最終組成物に添加すると、さらに用量に影響を与える。進行状況は組織／骨の成長及び／又は修復を、例えばＸ線、組織形態測定（ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ）及びテトラサイクリン標識化により、定期的に評価することにより監視可能である。
【００９５】
ＰＲＯポリペプチド又はアンタゴニスト又はアゴニスト投与の経路は周知の方法に従い、例えば静脈内、筋肉内、脳内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、眼内、関節内、滑膜内、包膜内、経口、局所又は吸入経路による注射又は注入、あるいは以下に記載する持続放出系による。またＰＲＯポリペプチド又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニストは腫瘍内、腫瘍周辺、病巣内、又は病巣周辺経路で好適に投与され、局所的並びに全身に治療効果を発揮する。腹腔内経路は、例えば卵巣腫瘍の治療に特に有用であることが予期されている。
ペプチド又は小分子がアンタゴニスト又はアゴニストとして使用される場合、好ましくは、液体又は固体の形態で経口的又は非経口的に哺乳動物に投与される。
塩を形成し下記において有用な分子の薬理学的に許容可能な塩類の例には、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えばカルシウム塩、マグネシウム塩）、アンモニウム塩、有機塩基塩（例えばピリジン塩、トリエチルアミン塩）、無機酸塩（例えば塩酸、硫酸塩、硝酸塩）及び有機酸塩（例えば酢酸塩、シュウ酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩）が含まれる。
ここで記載され、骨、軟骨、腱、又は靱帯再生に有用な組成物における治療方法には、移植又は装置としての、局所的（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、全身的又は局部的（ｌｏｃａｌｌｙ）な組成物の投与が含まれる。投与した場合、有用な治療用組成物は、発熱物質を含有しない生理学的に許容可能な形態である。さらに組成物は、骨、軟骨又は組織のダメージ部位に送達される粘性のある形態で注射されるかカプセル化されることが望ましい。局所的投与は傷の治癒及び組織の修復に適している。好ましくは、骨及び／又は軟骨の形成のためには、組成物は、骨及び／又は軟骨のダメージ部位にタンパク質含有組成物を送達せしめ、好ましくは体内に再吸収可能な骨及び軟骨を発育する構造体を提供することのできるマトリクスを含む。このようなマトリクスは他の移植医療用途に使用される材料で作成される。
【００９６】
マトリクス材料の選択は、生物学的融和性、生物分解性能、機械的特性、美容的外観、及び界面活性に基づく。組成物の特定の用途は、適切な処方により定義される。組成物の潜在的マトリクスは生物分解性であり、化学的に定義される硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、及びポリ無水物であってよい。他の潜在的マトリクスは生物分解性で生物学的に明確に定義された、例えば骨又は真皮コラーゲンである。さらなるマトリクスは純粋タンパク質又は細胞外マトリクス成分からなる。他の潜在的マトリクスは、非生物分解性であり、化学的に定義された、例えば焼結ヒドロキシアパタイト、生体ガラス、アルミナート、又は他のセラミックスである。マトリクスは上述した任意の種類の材料、例えばポリ乳酸とヒドロキシアパタイト又はコラーゲンとリン酸三カルシウムの組合せからなるものであってもよい。生物セラミックは組成において、例えばカルシウム−アルミナート−ホスファートに変えてもよく、孔サイズ、粒子サイズ及び生物分解性能を変更するためのプロセスが施されていてもよい。
特定の一実施態様では、乳酸とグリコール酸が５０：５０（モル重量）のコポリマーであり、１５０から８００ミクロンの範囲の直径を有する多孔質粒子の形態である。いくつかの用途において、金属イオン封鎖剤、例えばカルボキシメチルセルロース、又は自己移植血塊を利用し、マトリクスからの分離から組成物を保護するのに有用である。
一好適なファミリーの金属イオン封鎖剤は、セルロース材料、例えばメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースを含むアルキルセルロース（ヒドロキシアルキルセルロースを含む）であり、好ましくはカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のカチオン塩である。他の好ましい金属イオン封鎖剤には、ヒアルロン酸、アルギニン酸ナトリウム、ポリ（エチレングリコール）、ポリオキシエチレンオキシド、カルボキシビニルポリマー、及びポリ（ビニルアルコール）が含まれる。ここで有用な金属イオン封鎖剤の量は、調製物の全量に基づき、０．５−２０重量％、好ましくは１−１０重量％であり、ポリマーマトリクスからのポリペプチド（又はそのアンタゴニスト）の脱着を防止し、組成物に適切な操作性を付与し、さらに原細胞のマトリクスへの浸透を防止し、よって、ポリペプチド（又はそのアンタゴニスト）に原細胞の骨形成活性を助長する機会を付与するのに必要な量である。
【００９７】
５．２．４．１２．組合せ治療
当問題となる疾患の防止又は治療におけるＰＲＯポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニストの効力は、同じ組成物又は別個の組成物において、これらの目的のために有効な他の薬剤と組合せるか、又は活性剤を連続して投与することにより改善される。
例えば、心肥大の治療のためには、ＰＲＯポリペプチド治療は、周知の心筋ミオサイト肥大因子のインヒビター、例えばフェニレフリン等のα−アドレナリンアゴニストのインヒビター；エンドセリン−１インヒビター、例えばＢＯＳＥＮＴＡＮＴＭ及びＭＯＸＯＮＯＤＩＮＴＭ；ＣＴ−１に対するインヒビター（米国特許第５，６７９，５４５号）；ＬＩＦに対するインヒビター；ＡＣＥインヒビター；デス−アスパラタート−アンジオテンシンＩインヒビター（米国特許第５，７７３，４１５号）及びアンジオテンシンＩＩインヒビターの投与を組合せることができる。
高血圧に関連した心臓肥大の治療のためには、ＰＲＯポリペプチドを、β−アドレナリン様レセプターブロック剤、例えばプロプラノロール、チモロール、タータロロール、カルテオロール、ナドロール、ベタキソロール、ペンブトロール、アセトブトロール、アテノロール、メトプロロール、又はカーベジロール；ＡＣＥインヒビター、例えばクイナプリル、カプトプリル、エナラプリル、ラミプリル、ベナゼプリル、フォシノプリル又はリシノプリル；ジウレティクス、例えばクロロチアザイド、ヒドロクロロチアザイド、ヒドロフルメタザイド、メチルクロチアザイド、ベンズチアザイド、ジクロロフェナミド、アセタゾラミド、又はインダパミド；及び／又はカルシウムチャンネルブロッカー、例えばジルチアゼム、ニフェジピン、ベラパミル又はニカルジピンと組合せて投与することができる。一般名によりここで同定された治療薬を含む遺伝子製薬用組成物は市販されており、用量、投与方法、副作用、禁忌等の製造者の使用説明書に従い投与される。例えば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｄａｔａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｏ．：Ｍｏｎｔｖａｌｅ， Ｎ．Ｊ．， １９９７）， ５１版を参照されたい。
【００９８】
心臓肥大の治療における組合せ治療用の好ましい候補薬は、β−アドレナリン様レセプターブロック剤（プロプラノロール、チモロール、タータロロール、カルテオロール、ナドロール、ベタキソロール、ペンブトロール、アセトブトロール、アテノロール、メトプロロール、又はカーベジロール）、ベラパミル、ジフェジピン、又はジルチアゼムである。高血圧を伴う肥大の治療には、カルシウムチャンネルブロッカー、例えばジルチアゼム、ニフェジピン、ベラパミル又はニカルジピン；β−アドレナリン様レセプターブロック剤；ジウレティクス、例えばクロロチアザイド、ヒドロクロロチアザイド、ヒドロフルメタザイド、メチルクロチアザイド、ベンズチアザイド、ジクロロフェナミド、アセタゾラミド、又はインダパミド；及び／又はＡＣＥインヒビター、例えばクイナプリル、カプトプリル、エナラプリル、ラミプリル、ベナゼプリル、フォシノプリル又はリシノプリルを使用する、抗高血圧治療薬の使用が必要である。
他の徴候のために、ＰＲＯポリペプチド又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニストは、当該問題における骨及び／又は軟骨欠損、傷又は組織の治療に有用な他の薬剤と組合せてもよい。このような薬剤には、種々の成長因子、例えばＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−α又はＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＦＧＦ、及びＣＴＧＦが含まれる。
加えて、癌の治療に使用されるＰＲＯポリペプチド又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニストは、上述にて同定したような細胞毒性薬、化学治療薬又は成長阻害薬と組合せられる。また癌の治療のために、ＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは適切に連続投与されるか、又は、放射活性物質の照射又は投与を含んでも含まなくても、放射線学的治療と組合せられる。
ＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニストと組合せて投与される治療薬の有効量は、医師又は獣医の裁量による。投与量とその調節は処理される病状に最大の治療効果が達成されるようになされる。例えば、高血圧の治療においては、これらの量は、理想的にはジウレティクス又はデジタルの使用、及び高血圧又は低血圧、腎損傷等を考慮に入れる。用量は、治療される特定の患者及び使用される治療薬の種類等の因子に依存する。典型的には、使用される量は、治療薬をＰＲＯポリペプチドと共に投与しない場合と同じ用量である。
【００９９】
５．２．４．１３．製造品
上述した疾患の診断又は治療に有用なＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストを含むキットのような製造品は、少なくとも１つの容器及びラベルを具備する。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジ及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような種々の物質から形成できる。容器は、状態の診断又は治療に有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で穿孔可能なストッパーを具備する静脈内バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の活性剤はＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストである。容器上又は添付されるラベルには、組成物が選択した状態の診断又は治療に使用されることが示されている。この製造品は、薬剤的に許容可能なバッファー、例えばリン酸緩衝塩水、リンガー液、及びデキストロース溶液を収容した第２の容器をさらに具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用説明書を備えた包装挿入物を含む、商業的及び使用者の立場から望ましい他の材料を具備してもよい。また、この製造品は、上述の他の活性剤を収容した第２又は第３の容器を具備してもよい。
【０１００】
５．２．５．抗体
本発明の多くの有用な候補薬のいくつかは、ここで同定された遺伝子の生成、又は遺伝子生成物を阻害、及び／又は遺伝子生成物の活性を低減する抗体及び抗体フラグメントである。
５．２．５．１．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、ＰＲＯポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート）が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【０１０１】
５．２．５．２．モノクローナル抗体
あるいは、抗−ＰＲＯ抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５ （１９７５）に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的には対象とするＰＲＯポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する。Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８６） ｐｐ． ５９−１０３。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒやバージニア州マナサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている。Ｋｏｚｂｏｒ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３３：３００１ （１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ等， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７） ｐｐ． ５１−６３。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＰＲＯポリペプチドに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）や酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばＭｕｎｓｏｎ及びＰｏｌｌａｒｄ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０７：２２０ （１９８０）によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【０１０２】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる。Ｇｏｄｉｎｇ， 上掲。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して）、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等， 上掲）、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られている。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、そのフラグメント、特にＦａｂフラグメントの生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
【０１０３】
５．２．５．３．ヒト及びヒト化抗体
抗−ＰＲＯ抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはそのフラグメント（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列）であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はＣＤＲの残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる。Ｊｏｎｅｓ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３２１：５２２−５２５ （１９８６）； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２：３２３−３２９ （１９８８）； 及びＰｒｅｓｔａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， ２：５９３−５９６ （１９９２）。
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒトを源にする一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）及び共同研究者（Ｊｏｎｅｓ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３２１：５２２−５２５ （１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２：３２３−３２７ （１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９：１５３４−１５３６ （１９８８））の方法に従って実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリを含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２７：３８１ （１９９１）；Ｍａｒｋｓ等， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２：５８１ （１９９１）。また、Ｃｏｌｅ等及びＢｏｅｒｎｅｒ等の方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる。Ｃｏｌｅ等， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ． ｐ．７７（１９８５）及びＢｏｅｒｎｅｒ等， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４７（１）：８６−９５（１９９１） 。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、及び次の科学文献：Ｍａｒｋｓ等， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０， ７７９−７８３ （１９９２）； Ｌｏｎｂｅｒｇ等， Ｎａｔｕｒｅ ３６８ ８５６−８５９ （１９９４）； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３６８， ８１２−８１３ （１９９４）； Ｆｉｓｈｗｉｌｄ等， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， ８４５−８５１ （１９９６）； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， ８２６ （１９９６）； Ｌｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚａｒ， Ｉｎｔｅｒｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３ ６５−９３ （１９９５）に記載されている。
【０１０４】
５．２．５．４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本ケースの場合において、結合特異性の一方はＰＲＯポリペプチドに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく。Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びＣｕｅｌｌｏ， Ｎａｔｕｒｅ， ３０５：５３７−５３９ （１９８３）。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が１９９３年５月１３日公開のＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ等， ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５−３６５６９（１９９１）に開示されている。
所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばＳｕｒｅｓｈ等， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
【０１０５】
５．２．５．５．ヘテロ抱合抗体
ヘテロ抱合抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため（米国特許第４，６７６，９８０号）及びＨＩＶ感染の治療のために（ＷＯ ９１／００３６０； ＷＯ ９２／２００３７３； ＥＰ ０３０８９）提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第４，６７６，９８０号に開示されているものが含まれる。
５．２．５．６．エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌治療における抗体の有効性を向上させるのが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させるようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上した内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有しうる。Ｃａｒｏｎ等， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７６： １１９１−１１９５ （１９９２）及びＳｈｏｐｅｓ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８： ２９１８−２９２２ （１９９２）参照。向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体はまた、Ｗｏｌｆｆ等， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３： ２５６０−２５６５ （１９９３）に記載されたような異種二官能性架橋を用いても調製しうる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ等， Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ３： ２１９−２３０ （１９８９）参照。
【０１０６】
５．２．５．７．免疫抱合体
本発明はまた、化学治療薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はそのフラグメント）などの細胞毒性薬、あるいは放射性同位体（即ち、放射性抱合）に抱合された抗体を含む免疫抱合体にも関する。
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬は上記した。用いることのできる酵素活性毒素及びそのフラグメントは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォーディ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）インヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）及びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）を含む。様々な放射性ヌクレオチドが放射性抱合抗体の生成に利用可能である。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅを含む。
抗体及び細胞毒性薬の抱合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣｌ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６−ジイソシアネート等）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８： １０９８ （１９８７）に記載されたように調製することができる。カーボン−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。ＷＯ ９４／１１０２６参照。
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」（ストレプトアビジン等）に抱合されてもよく、抗体−レセプター複合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細胞毒性薬（例えば、放射性ヌクレオチド等）に抱合された「リガンド」（アビジン等）を投与する。
５．２．５．８．免疫リポソーム
また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２： ３６８８ （１９８５）； Ｈｗａｎｇ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７： ４０３０ （１９８０）； 及び米国特許第４，４８５，０４５号及び第４，５４４，５４５号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ−誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズの孔のフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントは、Ｍａｒｔｉｎ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５７： ２８６−２８８ （１９８２）に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療薬（ドキソルビシン等）は、場合によってはリポソーム内に包含される。Ｇａｂｉｚｏｎ等， Ｊ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８１（１９） １４８４ （１９８９）参照。
【０１０７】
５．２．５．９．抗体の薬剤的組成物
ここで同定されるＰＲＯポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイで同定された他の分子は、上記及び下記に記した種々の疾患の治療のために、薬剤的組成物の形態で投与することができる。
ＰＲＯポリペプチドが細胞内であり、全抗体が阻害剤として用いられる場合、内在化抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも抗体、又は抗体フラグメントを細胞に導入するのに使用できる。抗体フラグメントが用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば、Ｍａｒａｓｃｏ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０， ７８８９−７８９３ （１９９３）参照。
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン、化学療法剤又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 上掲に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
持続放出製剤を調製してもよい。持続放出製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。持続放出性マトリクスの例は、ポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商品名）（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【０１０８】
５．２．５．１０．抗体を使用する治療方法
ＰＲＯポリペプチドに対する抗体を上述した種々の心臓血管、内皮及び血管形成病の治療に使用できることが予期されている。
抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトに、周知の方法、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入経路などにより投与される。抗体の静脈内投与が好ましい。
他の治療的養生法を例えば上述の本発明の抗体の投与と組み合わせてもよい。例えば、抗体で癌の治療をする場合は、このような抗体で治療される患者は放射線治療を受けてもよい。あるいは、又はそれに加えて、患者に化学治療薬を投与してもよい。このような化学治療薬の調製法及び用量スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、熟練した実務者により経験的に決定される。そのような化学治療に対する調製法及び用量スケジュールはまたＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｍ．Ｃ． Ｐｅｒｒｙ編， （Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， ＭＤ， １９９２）にも記載されている。化学治療薬は、抗体の投与に先立って、又は続いて投与してもよく、あるいはそれらと同時に投与してもよい。抗体は、タモキシフェン又はＥＶＩＳＴＡＴＭ等の抗エストロゲン化合物又はオナプリストンなどの抗プロゲステロン（ＥＰ ６１６８１２参照）の、それらの分子について知られた用量と組み合わせてもよい。
また、抗体を癌の治療に使用する場合、他の腫瘍関連抗原に対する抗体、例えば一又は複数のＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、又はＶＥＧＦレセプターに結合する抗体を投与することも好ましい。また、上述した薬剤も含む。抗体は適切に連続投与されるか、又は、放射活性物質の照射又は投与を含んでも含まなくても、放射線学的治療と組合せられる。あるいは、又はそれに加えて、ここで開示されており、同じか、又は二又はそれ以上の異なる抗原に対して結合する二又はそれ以上の抗体を、患者に同時投与してもよい。ときどきは、患者に一又は複数のサイトカインを投与することも有利である。好ましい実施態様では、ここの抗体は、成長阻害剤と同時投与される。例えば、まず成長阻害剤を投与し、続いて本発明の抗体を投与する。しかしながら、同時投与、又は本発明の抗癌剤を最初に投与することも考えられる。成長阻害剤についての適切な用量は現在用いられている量であるが、成長阻害剤とこの抗体との組み合わせ（相乗）効果により減少させ得る。
【０１０９】
一実施態様において、腫瘍の血管新生は、組合せ治療において攻撃される。抗−ＰＲＯポリペプチド抗体及び他の抗体（例えば抗−ＶＥＧＦ）は、例えば腫瘍又は転移病巣の壊死がみられるように決定された治療的有効量で、腫瘍を有する患者に投与される。この治療は、好ましい効果が観察されるか、又は腫瘍又は任意の転移病巣の痕跡がなくなるまで続けられる。ついで、ＴＮＦを、補助剤、例えばアルファ−、ベータ−又はガンマ−インターフェロン、抗−ＨＥＲ２抗体、ヘレグリン（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ）、抗ヘレグリン抗体、Ｄ−因子、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、又は腫瘍中の微細血管凝固促進剤、例えば抗−プロテインＣ抗体、抗−プロテインＳ抗体、又はＣ４ｂ結合プロテイン（１９９１年２月２１日公開のＷＯ９１／０１７５３）、又は熱又は放射線と組合わせて投与される。
補助剤はその有効性に応じて変わり、便宜的な方式でスクリーニングされるマトリクスにより、腫瘍における影響力と比較することが望ましい。抗−ＰＲＯポリペプチド抗体及びＴＮＦの投与は、所望する臨床効果が達成されるまで繰り返される。また、抗−ＰＲＯポリペプチド抗体は、ＴＮＦ、場合によっては補助剤と共に投与される。固形腫瘍が、四肢又は一般的な循環器からの単離が可能な他の位置で見出される例では、ここに記載される治療薬は単離された腫瘍又は器官に投与される。他の実施態様において、ＦＧＦ又はＰＤＧＦアンタゴニスト、例えば抗−ＦＧＦ又は抗−ＰＤＧＦ中和剤は、抗−ＰＲＯポリペプチド抗体と共に患者に投与される。抗−ＰＲＯポリペプチド抗体を用いた治療は、好ましくは傷の治癒又は所望する新血管新生の期間中は中止する。
心臓血管、内皮及び血管形成疾患の予防又は治療のための、ここでの抗体の適切な用量は、上記で定義したような治療される疾患の型、疾患の重篤さ及び経過、防止又は治療目的で薬剤が投与されるか否か、従前の治療、患者の臨床履歴及び抗体に対する反応、及び主治医の裁量による。抗体は、適切には患者に一回又は一連の治療に渡って適切に投与される。
例えば、疾患の型及び重篤さに応じて、約１μｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１−２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、例えば、１又はそれ以上の別々の投与あるいは連続注入のいずれにしても、患者に投与するための最初の候補用量である。典型的な１日又は週毎の用量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上であろう。数日以上に渡る繰り返し投与のためには、状態に応じて、疾患の徴候に所望の抑制が現れるまで治療が続けられる。しかしながら、他の用量計画が有用であることもある。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイ、例えばＸ線腫瘍イメージングによって容易に監視される。
【０１１０】
５．２．５．１１．抗体の製造品
また、抗体を収容する容器とラベルを含む製造品を提供する。このような製造品は上述しており、ここで活性剤は抗−ＰＲＯ抗体である。
５．２．５．１２．抗体を使用する腫瘍の診断及び予知
抗体が使用される徴候が癌である場合、或る種の腫瘍で過剰発現される成長レセプター等の細胞表面タンパク質は候補薬剤又は腫瘍（例えば、癌）治療の優れた標的であるが、ＰＲＯポリペプチドと同じタンパク質は腫瘍の診断及び予知におけるさらなる用途が見出されている。例えば、ＰＲＯポリペプチドに対して向けられる抗体は腫瘍の診断及び予知に使用することができる。
例えば、抗体断片を含む抗体は、ＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子を含む遺伝子の発現の定性的又は定量的検出に用いることができる。抗体は、好ましくは検出可能な、例えば蛍光標識を備え、結合は光学顕微鏡、フローサイトメトリー、フルオロメトリー、又はこの分野で知られた他の技術によって監視できる。このような結合アッセイは、実質的に上述のように実施される。
マーカー遺伝子産物に結合する抗体のインサイツ検出は、例えば、免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡によって実施できる。この目的のために、組織学的試料を患者から取り出し、好ましくは生物学的試料に抗体を被せることにより、標識抗体をそれに適用する。この手法はまた、試験される組織におけるマーカー遺伝子産物の分布も決定できるようにする。当業者には、インサイツ検出のために広範な組織学的方法が容易に利用できることは明らかであろう。
【０１１１】
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び文献の開示の全体を、出典明示によりここに取り込む。
６．実施例
実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、ＶＡである。特に記さない限り、本発明は上記及び以下の教科書に記載されたもののような組換えＤＮＡ技術の標準的な手法を用いた：上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等； Ａｕｓｕｂｅｌ等， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ．， １９８９）； Ｉｎｎｉｓ等， ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．； Ｎ．Ｙ．， １９９０）； Ｈａｒｌｏｗ等， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ １９８８）； Ｇａｉｔ， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９８４）； Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ， １９８７； Ｃｏｌｉｇａｎ等， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １９９１。
【０１１２】
６．１．実施例１：新規なポリペプチド及びそれをコードするｃＤＮＡを同定するための細胞外ドメイン相同性スクリーニング
Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ公的データベースからの約９５０の既知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列（もしあれば、分泌シグナル配列を含む）を、ＥＳＴデータベースの検索に使用した。ＥＳＴデータベースは、公的データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）及び企業のデータベース（例えば、ＬＩＦＥＳＥＱ（商品名）、Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を含む。検索は、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ−２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６： ４６０−４８０ （１９９６））を用いて、ＥＣＤタンパク質配列のＥＳＴ配列の６フレーム翻訳との比較として実施した。既知のタンパク質をコードせず、ＢＬＡＳＴスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「ｐｈｒａｐ」（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ， ＷＡ）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。
この細胞外ドメイン相同性スクリーニングを用いて、ｐｈｒａｐを用いて他の同定されたＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。さらに、得られたコンセンサスＤＮＡ配列を、しばしば（常にではない）ＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ−２及びｐｈｒａｐの繰り返しサイクルを用いて伸長し、コンセンサス配列を上で議論したＥＳＴ配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた。
上記のように得られたコンセンサス配列に基づいて、次いでオリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及びＰＲＯポリペプチドの全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして用いるために使用した。正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは一般的に２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００ ｂｐ長のＰＣＲ産物を与えるために設計される。プローブ配列は、典型的に４０−５５ｂｐ長である。幾つかの場合には、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂｐより大きいときに付加的なオリゴヌクレオチドが合成される。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、Ａｕｓｕｂｅｌ等， Ｃｕｒｒｅｎｔ ＰＲＯｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， のように、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。ポジティブライブラリを、次いで、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて対象とする遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
ｃＤＮＡクローンの単離に用いたｃＤＮＡライブラリは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動で適当にサイズ分類し、そして適切なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５３： １２７８−１２８０ （１９９１）参照）に、独特のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位において、所定の方向でクローニングした。
【０１１３】
６．２．実施例２：アミラーゼスクリーニングによるｃＤＮＡクローンの単離
６．２．１．オリゴｄＴプライムｃＤＮＡライブラリの調製
ｍＲＮＡを対象とするヒト組織から、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡからの試薬及びプロトコールを用いて単離した（Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ２）。このＲＮＡを、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ （Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ）からの試薬及びプロトコールを用いるベクターｐＲＫ５ＤにおけるオリゴｄＴプライムしたｃＤＮＡライブラリの生成に使用した。この方法において、二本鎖ｃＤＮＡは１０００ｂｐを越えるサイズ分類し、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ結合ｃＤＮＡをＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断ベクターにクローニングした。ｐＲＫ５Ｄを、ｓｐ６転写開始部位、それに続くＳｆｉＩ制限酵素部位、さらにＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ ｃＤＮＡクローニング部位を持つベクターにクローニングした。
６．２．２．ランダムプライムｃＤＮＡライブラリの調製
一次ｃＤＮＡクローンの５’末端を好ましく表現するために二次ｃＤＮＡライブラリを作成した。Ｓｐ６ＲＮＡを（上記の）一次ライブラリから生成し、このＲＮＡを、ベクターｐＳＳＴ−ＡＭＹ．０におけるＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （上で参照したＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ）からの試薬及びプロトコールを用いてランダムプライムしたｃＤＮＡライブラリの生成に使用した。この方法において、二本鎖ｃＤＮＡを５００−１０００ｂｐにサイズ分類し、平滑末端でＮｏｔＩアダプターに結合させ、ＳｆｉＩ部位で切断し、そしてＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ切断ベクターにクローニングした。ｐＳＳＴ−ＡＭＹ．０は、ｃＤＮＡクローニング部位の前に酵母アルコールデヒドロゲナーゼプロモータ、及びクローニング部位の後にマウスアミラーゼ配列（分泌シグナルを持たない成熟配列）に次いで酵母アルコールデヒドロゲナーゼ転写終結区を有するクローニングベクターである。即ち、アミラーゼ配列でフレームに融合するこのベクターにクローニングされたｃＤＮＡは、適当に形質移入された酵母コロニーからのアミラーゼの分泌を導くであろう。
【０１１４】
６．２．３．形質転換及び検出
上記２パラグラフに記載したライブラリからのＤＮＡを氷上で冷却し、それにエレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂ細菌（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２０ｍｌ）を添加した。細菌及びベクターの混合物は、次いで製造者に推奨されているように電気穿孔した。次いで、ＳＯＣ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１ｍｌ）を添加し、この混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。形質転換体は、次いでアンピシリンを含む２０標準１５０ｍｍＬＢプレートに蒔き、１６時間インキュベートした（３７℃）。ポジティブコロニーをプレートから拾い、細菌ペレットから標準的な方法、例えばＣｓＣｌ−勾配を用いてＤＮＡを単離した。精製ＤＮＡは、次いで以下の酵母プロトコールで用いた。
酵母方法は３つの範疇に分けられる：（１）酵母のプラスミド／ｃＤＮＡ結合ベクターでの形質転換；（２）アミラーゼを分泌する酵母クローンの検出及び単離；及び（３）酵母コロニーから直接的な挿入物のＰＣＲ増幅及び配列決定及びさらなる分析のためのＤＮＡの精製。
用いた酵母菌株はＨＤ５６−５Ａ（ＡＴＣＣ−９０７８５）であった。この株は以下の遺伝子型：ＭＡＴアルファ、ｕｒａ３−５２、ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１１２、ｈｉｓ３−１１、ｈｉｓ３−１５、ＭＡＬ＋、ＳＵＣ＋、ＧＡＬ＋を有する。好ましくは、不完全な翻訳後経路を持つ酵母変異体を用いることができる。このような変異体は、ｓｅｃ７１、ｓｅｃ７２、ｓｅｃ６２に転位不全対立遺伝子を持つが、切断されたｓｅｃ７１が最も好ましい。あるいは、これらの遺伝子の正常な操作を阻害するアンタゴニスト（アンチセンスヌクレオチド及び／又はリガンドを含む）、この翻訳後経路に含まれる他のタンパク質（例えば、ＳＥＣ６１ｐ、ＳＥＣ７２ｐ、ＳＥＣ６２ｐ、ＳＥＣ６３ｐ、ＴＤＪ１ｐ又はＳＳＡ１ｐ−４ｐ）又はこれらのタンパク質の複合体形成も、アミラーゼ発現酵母と組み合わせて好ましく用いられる。
形質転換は、Ｇｉｅｔｚ等， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ．， ２０： １４２５ （１９９２）に概略が記されたプロトコールに基づいて実施された。形質転換細胞は、次いで寒天からＹＥＰＤ複合培地ブロス（１００ｍｌ）に播種し、３０℃で終夜成長させた。ＹＥＰＤブロスは、Ｋａｉｓｅｒ等， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， ｐ． ２０７ （１９９４）に記載されているように調製した。終夜培地は、次いで新鮮なＹＥＰＤブロス（５００ｍｌ）中におよそ２ｘ１０６細胞／ｍｌ（約ＯＤ６００＝０．１）に希釈し、１ｘ１０７細胞／ｍｌ（約ＯＤ６００＝０．４−０．５）まで再成長させた。
【０１１５】
次いで細胞を回収し、５，０００ｒｐｍで５分間のＳｏｒｖａｌ ＧＳ３ ローターのＧＳ３ローターボトルに移し、上清を捨て、次いで無菌水に再懸濁することにより形質転換のために調製し、そして５０ｍｌのファルコン管内で、Ｂｅｃｋｍａｎ ＧＳ−６ＫＲ遠心機において３，５００ｒｐｍで再度遠心分離した。上清を捨て、細胞をＬｉＡｃ／ＴＥ（１０ｍｌ， １０ｍＭのトリス−ＨＣｌ， １ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ７．５， １００ｍＭのＬｉ２ＯＯＣＣＨ３）で続けて洗浄し、ＬｉＡｃ／ＴＥ（２．５ｍｌ）中に再懸濁させた。
形質転換は、マイクロチューブ内で、調製した細胞（１００μｌ）を新鮮な変性一本鎖サケ精子ＤＮＡ（Ｌｏｆｓｔｒａｎｄ Ｌａｂｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ， ＭＤ）及び形質転換ＤＮＡ（１μｇ． ｖｏｌ．＜１０μｌ）と混合することにより起こした。混合物はボルテックスにより簡単に混合し、次いで４０％ＰＥＧ／ＴＥ（６００μｌ， ４０％のポリエチレングリコール−４０００， １０ｍＭのトリス−ＨＣｌ， １ｍＭのＥＤＴＡ， １００ｍＭのＬｉ２ＯＯＣＣＨ３， ｐＨ ７．５）を添加した。この混合物を緩く撹拌し、３０℃で撹拌しながら３０分間インキュベートした。次いで細胞に４２℃で１５分間熱衝撃を与え、反応容器をミクロチューブ内で１２，０００ｒｐｍで５−１０秒間遠心分離し、デカント及びＴＥ（５００μｌ， １０ｍＭのトリス−ＨＣｌ， １ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ ７．５）への再懸濁に次いで遠心分離した。次いで、細胞をＴＥ（１ｍｌ）中に希釈し、アリコート（２００μｌ）を１５０ｍｍ成長プレート（ＶＷＲ）に予め調製した選択培地に拡げた。
あるいは、複数の少量反応ではなく、形質転換を１回の大規模反応で実施したが、試薬の量はしかるべくスケールアップした。
用いた選択培地は、Ｋａｉｓｅｒ等， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， ｐ． ２０８−２１０ （１９９４）に記載されているように調製したウラシルを欠く合成完全デキストロース寒天（ＳＣＤ−Ｕｒａ）であった。形質転換体は３０℃で２−３日成長させた。
アミラーゼを分泌するコロニーの検出は、選択成長培地における赤色デンプンの包含により実施した。Ｂｉｅｌｙ等， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １７２： １７６−１７９ （１９８８）に記載された方法に従って、デンプンを赤色染料（反応性 Ｒｅｄ−１２０， Ｓｉｇｍａ）に結合させた。結合したデンプンをＳＣＤ−Ｕｒａ寒天プレートに最終濃度０．１５％（ｗ／ｖ）で導入し、リン酸カリウムでｐＨ７．０に緩衝した（最終濃度５０−１００ｍＭ）。
ポジティブコロニーを拾って新鮮な選択培地（１５０ｍｍプレート）に画線し、良好に単離され同定可能な単一コロニーを得た。アミラーゼ分泌についてポジティブな良好に単離されたコロニーは、緩衝ＳＣＤ−Ｕｒａ寒天への赤色デンプンの直接導入により検出した。ポジティブコロニーは、デンプンを分解して、ポジティブコロニーの周囲に直接目視できる暈を形成する能力により決定した。
【０１１６】
６．２．４．ＰＣＲ増幅によるＤＮＡの単離
ポジティブコロニーが単離された場合、その一部を楊枝で拾い、９６ウェルプレートにおいて無菌水（３０μｌ）に希釈した。この時点で、ポジティブコロニーは凍結して次の分析のために保存するか、即座に増幅するかのいずれかである。細胞のアリコート（５μｌ）を、０．５μｌのＫｌｅｎｔａｑ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）； ４．０μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）； ２．５μｌのＫｅｎｔａｑバッファー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）； ０．２５μｌの正方向オリゴ１；０．２５μｌの逆方向オリゴ２；１２．５μｌの蒸留水を含有する２５μｌ容量におけるＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。正方向オリゴヌクレオチド１の配列は：
2004516013.tif 000021
（配列番号：３８２）であった。
逆方向オリゴヌクレオチド２の配列は：
2004516013.tif 000022
（配列番号：３８３）であった。
2004516013.tif 000023
下線を施した領域は、各々ＡＤＨプロモーター領域及びアミラーゼ領域にアニーリングされ、挿入物が存在しない場合はベクターｐＳＳＴ−ＡＭＹ．０からの３０７ｂｐ領域を増幅する。典型的には、これらのオリゴヌクレオチドの５’末端の最初の１８ヌクレオチドは、配列プライマーのアニーリング部位を含んでいた。即ち、空のベクターからのＰＣＲ反応の全生成物は３４３ｂｐであった。しかしながら、シグナル配列融合ｃＤＮＡは、かなり長いヌクレオチド配列をもたらした。
ＰＣＲに続いて、反応のアリコート（５μｌ）を、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記載されたように１％アガロースゲル中でトリス−ボレート−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝系を用いたアガロースゲル電気泳動により試験した。４００ｂｐより大きな単一で強いＰＣＲ産物をもたらすクローンを、９６ Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ 清浄化カラム（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）での精製の後にＤＮＡ配列によりさらに分析した。
【０１１７】
６．３．実施例３：シグナルアルゴリズム分析を用いたｃＤＮＡクローンの単離
種々のポリペプチド−コード化核酸配列は、ジェネンテク，インク（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ）によって開発された独自の配列発見アルゴリズムを、公的（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）及び／又は私的（ＬＩＦＥＳＥＱ（登録商標）， Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）データベースからのＥＳＴｓ並びに集団化及び構築されたＥＳＴ断片に適用することにより同定した。シグナル配列アルゴリズムは、考慮している配列又は配列断片の５’−末端の第１の、場合によっては第２のメチオニンコドン（ＡＴＧ）を取り囲むＤＮＡヌクレオチドの性質に基づく分泌シグナルスコアを計算する。第１のＡＴＧに続くヌクレオチドは、停止コドンを持たない少なくとも３５の不明瞭でないアミノ酸をコードしなければならない。第１のＡＴＧが必要なアミノ酸を有する場合、第２のものは試験しない。何れも要件を満たさない場合、候補配列にスコアをつけなかった。ＥＳＴ配列が真正のシグナル配列を含むか否かを決定するために、ＡＴＧコドンを取り囲むＤＮＡ及び対応するアミノ酸配列を、分泌シグナルに関連することが知られた７つのセンサー（評価パラメータ）の組を用いてスコアをつけた。このアルゴリズムの使用により、多くのポリペプチド−コード化核酸配列の同定がなされた。
【０１１８】
６．４．実施例４：ヒトＰＲＯポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンの単離
上述の実施例１から３に記載された技術を用いて、多数の全長ｃＤＮＡクローンがここで開示されたＰＲＯポリペプチドをコードするものとして同定された。そして、これらのｃＤＮＡは、下記の表７に示してあるように、ブダペスト条約の条項に従ってアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１０８０１ ユニバーシティ・ブルバード、マナッサス、バージニア  ２０１１０−２２０９米国（ＡＴＣＣ）へ寄託した。
【０１１９】
2004516013.tif 000024
2004516013.tif 000025
2004516013.tif 000026
2004516013.tif 000027
2004516013.tif 000028
2004516013.tif 000029
【０１２０】
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則（ブダペスト条約）の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則（特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む）に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
【０１２１】
６．５．実施例５：ＰＲＯ１８７３， ＰＲＯ７２２３， ＰＲＯ７２４８， ＰＲＯ７３０， ＰＲＯ５３２， ＰＲＯ７２６１， ＰＲＯ７３４， ＰＲＯ７７１， ＰＲＯ２０１０， ＰＲＯ５７２３， ＰＲＯ３４４４， ＰＲＯ９９４０， ＰＲＯ３５６２， ＰＲＯ１０００８， ＰＲＯ５７３０， ＰＲＯ６００８， ＰＲＯ４５２７， ＰＲＯ４５３８及びＰＲＯ４５５３
添付の図中に示されるＰＲＯ１８７３， ＰＲＯ７２２３， ＰＲＯ７２４８， ＰＲＯ７３０， ＰＲＯ５３２， ＰＲＯ７２６１， ＰＲＯ７３４， ＰＲＯ７７１， ＰＲＯ２０１０， ＰＲＯ５７２３， ＰＲＯ３４４４， ＰＲＯ９９４０， ＰＲＯ３５６２， ＰＲＯ１０００８， ＰＲＯ５７３０， ＰＲＯ６００８， ＰＲＯ４５２７， ＰＲＯ４５３８及びＰＲＯ４５５３ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子はＧｅｎＢａｎｋを通じて入手した。
【０１２２】
６．６．実施例６：ＰＲＯのハイブリッド形成プローブとしての使用
以下の方法は、ＰＲＯをコードするヌクレオチド配列のハイブリッド形成プローブとしての使用を記述する。全長又は成熟ＰＲＯ（添付の図中に示される）又はその断片のコード化配列を含むＤＮＡは、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリ又はヒト組織ゲノムライブラリの相同なＤＮＡ（ＰＲＯの天然発生変異体をコードするもの等）のスクリーニングのためのプローブとして用いられ得る。
ハイブリッド形成及びいずれかのライブラリＤＮＡを含むフィルターの洗浄は、以下の高緊縮性条件下で実施される。ＰＲＯポリペプチドをコードしている遺伝子から誘導された放射標識プローブのフィルターへのハイブリッド形成は、５０％ホルムアミド、５ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２ｘデンハード液、及び１０％デキストラン硫酸の溶液中で４２℃で２０時間実施した。フィルターの洗浄は、０．１ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ水溶液中で、４２℃で実施した。
全長天然配列をコードするＤＮＡと所望の同一性を持つＤＮＡは、次いでこの分野で知られた標準的技術を用いて同定できる。
【０１２３】
６．７．実施例７：大腸菌におけるＰＲＯの発現
この実施例は、大腸菌中における組み換え発現によるＰＲＯの非グリコシル化型の調製を例証する。
ＤＮＡ配列コード化は選択されたＰＣＲプライマーを利用して最初に増幅される。このプライマーは、選択された発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含まなければならない。様々な発現ベクターを使用することができる。適したベクターの例としては、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性に対する遺伝子を含むｐＢＲ３２２（大腸菌由来；Ｂｏｌｉｖａｒら， Ｇｅｎｅ， ２：９５ （１９７７）を参照のこと）がある。ベクターは制限酵素によって消化され、脱リン酸化される。次いで、ＰＣＲ増幅配列をベクターにライゲーションする。ベクターは好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ポリＨｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ポリＨｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ＰＲＯコード領域、ラムダ転写集結因子及びａｒｇＵ遺伝子をコードする配列を含む。
次いで、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， 上記に記載されている方法を用いて選択された大腸菌株を形質転換するために、このライゲーション混合物を利用した。形質転換体をＬＢプレート上でのその成長能力によって同定し、次いで抗生物質耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、それを制限分析及びＤＮＡ配列決定によって確認することができる。
選択されたクローンを、抗生物質が補填されたＬＢブロスのような液体培地で一晩かけて成長させることができる。この一晩の培養を、次により大きなスケールでの培養を播種するために使用してもよい。そして、細胞を所望の光学密度になるまで成長させ、その間に発現プロモーターが作用し始める。
更に数時間、細胞を培養した後に、遠心分離によって細胞を収集することが可能である。遠心分離によって得られた細胞ペレットは、当該分野で公知の様々な薬剤を使用して可溶化でき、次いで、この溶解したＰＲＯタンパク質を、タンパク質の堅固な結合を可能にする条件下において金属キレート化カラムを用いて精製すること可能である。
【０１２４】
以下の手法を用いて、ポリ−Ｈｉｓタグ形態でＰＲＯを大腸菌で発現させてもよい。ＰＲＯをコードするＤＮＡを、選択したＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。このプライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。次いで、ＰＣＲ増幅されたポリ−Ｈｉｓタグ配列を発現ベクターへ結合させ、これを株５２（Ｗ３１１０ ｆｕｈＡ（ｔｏｎＡ） ｌｏｎ ｇａｌＥ ｒｐｏＨｔｓ（ｈｔｐＲｔｓ） ｃｌｐＰ（ｌａｃＩｑ））に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用した。形質転換体を、最初に５０ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＢ中で、３０℃で振盪しながら３−５のＯ．Ｄ．６００に達するまで成長させた。ついで培養液をＣＲＡＰ培地（３．５７ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．７１ｇのクエン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、１．０７ｇのＫＣｌ、５．３６ｇのＤｉｆｃｏ酵母抽出物、５００ｍＬ水中の５．３６ｇのＳｈｅｆｆｉｅｌｄ ｈｙｃａｓｅ ＳＦ、並びに１１０ｍＭのＭＰＯＳ、ｐＨ７．３、０．５５％（ｗ／ｖ）のグルコース及び７ｍＭのＭｇＳＯ４の混合で調製）中にて５０−１００倍希釈し、３０℃で振盪によって約２０−３０時間成長させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより発現を確認するために試料を取り出し、細胞がペレットとなるようにバルク培地を遠心分離した。精製及びリフォールディング（再折りたたみ）まで、細胞ペレットを凍結させた。
０．５から１Ｌの発酵（６−１０ｇペレット）からの大腸菌ペーストを、７Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８バッファー中で１０容量（ｗ／ｖ）で再懸濁させた。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々０．１Ｍ及び０．０２Ｍとし、溶液を４℃で終夜撹拌した。この工程により、すべてのシステイン残基が亜硫酸によりブロックされた変性タンパク質が生じる。溶液をＢｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｉｆｕｇｅ中で４０，０００ｒｐｍで３０分間濃縮した。上清を金属キレートカラムバッファー（６Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４）の３−５容量で希釈し、透明にするために０．２２ミクロンフィルターを通して濾過する。透明抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた５ｍｌのＱｉａｇｅｎ Ｎｉ２＋−ＮＴＡ金属キレートカラムに負荷した。カラムを５０ｍＭのイミダゾール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｕｔｒｏｌ ｇｒａｄｅ）を含む添加バッファー、ｐＨ７．４で洗浄した。タンパク質を２５０ｍＭのイミダゾールを含有するバッファーで溶離した。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、４℃で保存した。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて２８０ｎｍにおけるその吸収により見積もった。
【０１２５】
試料を２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．６、０．３ＭのＮａＣｌ、２．５Ｍの尿素、５ｍＭのシステイン、２０ｍＭのグリシン及び１ｍＭのＥＤＴＡからなる新たに調製した再生バッファー中で徐々に希釈することによって、タンパク質を再生させた。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が５０〜１００マイクログラム／ｍｌとなるように選択した。リフォールディング溶液を４℃で１２−３６時間ゆっくり撹拌した。リフォールディング反応はＴＦＡを採取濃度０．４％（約３のｐＨ）で添加することにより停止させた。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を０．２２ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度２−１０％で添加した。再生したタンパク質を、Ｐｏｒｏｓ Ｒ１／Ｈ逆相カラムで、０．１％ＴＦＡの移動バッファーと１０〜８０％のアセトニトリル勾配での溶離を用いてクロマトグラフにかけた。Ａ２８０吸収を持つ画分のアリコートをＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、相同な再生タンパク質を含有する画分をプールした。一般的に、殆どの正しく再生したタンパク質種は、これらの種が最もコンパクトであり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。誤って再生したタンパク質を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。
所望の再生したＰＲＯポリペプチドを含有する画分をプールし、溶液に向けた窒素の弱い気流を用いてアセトニトリルを除去した。タンパク質を、透析又は調製バッファーで平衡化したＧ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、０．１４Ｍの塩化ナトリウム及び４％のマンニトールを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．８に調製した。
ここで開示された多くのＰＲＯポリペプチドは、上記の方法によって成功裏に発現した。
【０１２６】
６．８．実施例８：哺乳動物細胞におけるＰＲＯの発現
この実施例は、哺乳動物細胞での組換え発現による潜在的にグリコシル化形態のＰＲＯの調製を例示する。
発現ベクターとしてベクターｐＲＫ５（１９８９年３月１５日発行のＥＰ ３０７，２４７参照）を用いた。場合によっては、ＰＲＯＤＮＡを選択した制限酵素でｐＲＫ５に結合させ、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記載されたような結合方法を用いてＰＲＯ ＤＮＡの挿入を行う。得られたベクターは、ｐＲＫ５−ＰＲＯと呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５７３）は、子ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの媒質中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化した。約１０μｇのｐＲＫ５−ＰＲＯを約１μｇのＶＡ ＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ［Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａ等， Ｃｅｌｌ， ３１：５４３ （１９８２））］と混合し、５００μｌの１ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２２７ＭのＣａＣｌ２に溶解させた。この混合物に、滴状の、５００μｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａＰＯ４を添加し、２５℃で１０分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、２９３細胞に加えて３７℃で約４時間定着させた。培養培地を吸引し、２ｍｌのＰＢＳ中２０％グリセロールを３０秒間添加した。２９３細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約５日間インキュベートした。
形質移入の約２４時間後、培養培地を除去し、培養培地（のみ）又は２００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−メチオニンを含む培養培地で置換した。１２時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、ＰＲＯポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムに曝露した。形質転換した細胞を含む培地は、更なるインキュベーションを施し（無血清培地で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。
【０１２７】
これに換わる技術では、ＰＲＯを、Ｓｏｍｐａｒｙｒａｃ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １２：７５７５ （１９８１）に記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に一過的に導入してもよい。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、７００μｇのｐＲＫ５−ＰＲＯ ＤＮＡを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄した。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートした。細胞を２０％グリセロールで９０秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、５μｇ／ｍｌウシインシュリン及び０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入した。約４日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去した。次いで発現されたＰＲＯをコードする発現された遺伝子を含む試料を濃縮し、透析又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって濃縮及び精製した。
他の実施態様では、ＰＲＯをＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５−ＰＲＯは、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ−デキストランなどの公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（単独）又は３５Ｓ−メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。ＰＲＯポリペプチドの存在を同定した後、培養培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約６日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、発現されたＰＲＯポリペプチドを含む培地を濃縮して、選択した方法によって精製することができる。
また、エピトープタグ化ＰＲＯを、宿主ＣＨＯ細胞において発現させてもよい。ＰＲＯはｐＲＫ５ベクターからサブクローニングしてもよい。サブクローン挿入物はＰＣＲを行ってバキュロウイルス発現ベクター中にポリ−Ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグとインフレームで融合できる。ポリ−ＨｉｓタグＰＲＯ挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベクターで（上記のように）形質移入した。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたポリ−ＨｉｓタグＰＲＯを含む培地を次いで濃縮し、Ｎｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。
また、ＰＲＯはＣＨＯ細胞及び／又はＣＯＳ細胞中で一過的手法か、又はＣＨＯ細胞中では他の安定発現の手法によって発現させてもよい。
ＣＨＯ細胞における安定な発現は以下の方法を用いて実施された。タンパク質は、そのタンパク質の可溶化形態（例えば、細胞外ドメイン）のコード化配列がＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ２ドメイン及び／又はポリ−Ｈｉｓタグ形態を含む定常領域配列に融合したＩｇＧ作成物（イムノアドヘシン）として発現された。
ＰＣＲ増幅に続いて、対応するＤＮＡを、Ａｕｓｕｂｅｌ等， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｕｎｉｔ ３．１６， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ （１９９７）に記載されたような標準的技術を用いてＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングした。ＣＨＯ発現ベクターは、対象とするＤＮＡの５’及び３’に適合する制限部位を有し、ｃＤＮＡの便利なシャトル化ができるように作成される。ベクターは、Ｌｕｃａｓ等， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４： ９， １７７４−１７７９ （１９９６）に記載されたようにＣＨＯ細胞での発現を用い、対象とするｃＤＮＡ及びジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現の制御にＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲ発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。
所望のプラスミドＤＮＡの１２マイクログラムを、市販の形質移入試薬Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）， Ｄｏｓｐｅｒ（登録商標）及びＦｕｇｅｎｅ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して約一千万のＣＨＯ細胞に導入した。細胞は、上掲のＬｕｃａｓ等に記載されているように成長させた。約３ｘ１０７細胞を、下記のような更なる成長及び生産のためにアンプル中で凍結させた。
【０１２８】
プラスミドＤＮＡを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合した。内容物を１０ｍＬの媒質を含む遠心管にピペットして、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を吸引して細胞を１０ｍＬの選択培地（０．２μｍ濾過ＰＳ２０、５％の０．２μｍ透析濾過ウシ胎児血清を添加）中に懸濁させた。次いで細胞を９０ｍＬの選択培地を含む１００ｍｌスピナーに分けた。１−２日後、細胞を１５０ｍＬの選択培地を満たした２５０ｍＬスピナーに移し、３７℃でインキュベートした。さらに２−３日後、２５０ｍＬ、５００ｍＬ及び２０００ｍＬのスピナーを３ｘ１０５細胞／ｍＬで播種した。細胞培地を遠心分離により新鮮培地に交換し、生産培地に再懸濁させた。任意の適切なＣＨＯ培地を用いてもよいが、実際には１９９２年６月１６日に発行の米国特許第５，１２２，４６９号に記載された生産培地を使用した。３Ｌの生産スピナーを１．２ｘ１０６細胞／ｍＬで播種した。０日目に、細胞数とｐＨを測定した。１日目に、スピナーをサンプルし、濾過空気での散布を実施した。２日目に、スピナーをサンプルし、温度を３３℃に変え、５００ｇ／Ｌのグルコース及び０．６ｍＬの１０％消泡剤（例えば３５％ポリジメチルシロキサンエマルション、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６５ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｒａｄｅ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ）の３０ｍＬとした。生産を通して、ｐＨは７．２近傍に調節し維持した。１０日後、又は生存率が７０％を下回るまで、細胞培地を遠心分離で回収して０．２２μｍフィルターを通して濾過した。濾過物は、４℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに負荷した。
ポリ−Ｈｉｓタグ作成物について、タンパク質はＮｉ２＋−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。精製の前に、イミダゾールを条件培地に５ｍＭの濃度まで添加した。条件培地を、０．３ＭのＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ， ｐＨ７．４バッファーで平衡化した６ｍｌのＮｉ２＋−ＮＴＡカラムに４−５ｍｌ／分の流速で４℃においてポンプ供給した。負荷後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．１４ＭのＮａＣｌ及び４％のマンニトールを含む貯蔵バッファー中で２５ｍｌのＧ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵した。
イムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を以下のようにして条件培地から精製した。条件培地を、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー， ｐＨ６．８で平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に負荷した。負荷後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、１００ｍＭのクエン酸， ｐＨ３．５で溶離した。溶離したタンパク質は、１ｍｌの画分を２７５μｌの１Ｍトリスバッファー， ｐＨ９を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ−Ｈｉｓタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲルで試験し、エドマン（Ｅｄｍａｎ）分解によりＮ−末端アミノ酸配列決定した。
ここに開示されるＰＲＯポリペプチドの多くが上述のごとく成功裏に発現された。
【０１２９】
６．９．実施例９：酵母菌でのＰＲＯの発現
以下の方法は、酵母菌中でのＰＲＯの組換え発現を記載する。
第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＰＲＯの細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。ＰＲＯをコードするＤＮＡ及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＰＲＯの細胞内発現を指示する。分泌のために、ＰＲＯをコードするＤＮＡを選択したプラスミドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、天然ＰＲＯシグナルペプチド又は他の哺乳類シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、又は、例えば酵母菌アルファ因子分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）ＰＲＯの発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、１０％トリクロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えＰＲＯは、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。ＰＲＯを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
ここに開示されるＰＲＯポリペプチド多くが上述のごとく成功裏に発現された。
【０１３０】
６．１０．実施例１０：バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＰＲＯの発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中における組換え発現を記載する。
ＰＲＯをコードする配列は、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ポリ−Ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域など）を含む。ｐＶＬ１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、ＰＲＯ又はＰＲＯのコード化配列の所定部分（膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列、又は該タンパク質が細胞外のものならば成熟タンパク質をコードする配列など）が、５’及び３’領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５’プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生成物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）中にリポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから市販）を用いて同時形質移入することにより作成される。２８℃で４−５日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｅｙ等， Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｏｘｆｏｒｄ： Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９４）に記載されているように実施した。
次いで、発現されたポリ−ＨｉｓタグＰＲＯは、例えば、Ｎｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィーにより以下のように精製される。抽出物は、Ｒｕｐｅｒｔ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３６２：１７５−１７９ （１９９３）に記載されているように、ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製した。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（２５ｍｌのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２；０．１ｍＭのＥＤＴＡ；１０％のグリセロール；０．１％のＮＰ−４０；０．４ＭのＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭＮａＣｌ、１０％のグリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍希釈し、０．４５μｍフィルターで濾過した。Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎから市販）を５ｍｌの総容積で調製し、２５ｍｌの水で洗浄し、２５ｍｌの負荷バッファーで平衡させた。濾過した細胞抽出物は、毎分０．５ｍｌでカラムに負荷した。カラムを、分画回収が始まる点であるＡ２８０のベースラインまで負荷バッファーで洗浄した。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー（５０ｍＭのリン酸塩；３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄した。Ａ２８０のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で０から５００ｍＭのイミダゾール勾配で展開した。１ｍｌの分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Ｑｉａｇｅｎ）に複合したＮｉ２＋−ＮＴＡでのウェスタンブロットで分析した。溶離したＨｉｓ１０−タグＰＲＯを含む分画をプールし、負荷バッファーで透析した。
【０１３１】
あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ＰＲＯの精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
ＰＣＲ増幅に続いて、対応するコード化配列をバキュロウイルス発現ベクター（ＩｇＧ融合物に対するｐｂ．ＰＨ．ＩｇＧ及びポリ−Ｈｉｓタグに対するｐｂ．ＰＨ．Ｈｉｓ．ｃ）にサブクローニングし、そのベクター及びＢａｃｕｌｏｇｏｌｄ（登録商標）バキュロウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を１０５スポドプテラフルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）にリポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて同時形質移入した。ｐｂ．ＰＨ．ＩｇＧ及びｐｂ．ＰＨ．Ｈｉｓは、市販のバキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の修飾物であり、Ｈｉｓ又はＦｃタグ配列を含むように修飾されたポリリンカー領域を持つ。細胞を、１０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を添加したＨｉｎｋのＴＮＭ−ＦＨ培地で成長させた。細胞は、２８℃で５日間インキュベートした。上清を回収し、続いて１０％ＦＢＳを添加したＨｉｎｋのＴＮＭ−ＦＨ培地におけるＳｆ９細胞感染による約１０の感染効率（ＭＯＩ）での最初のウイルス増幅に用いた。細胞を２８℃で３日間インキュベートした。上清を回収し、バキュロウイルス発現ベクターにおける作成物の発現を、１ｍｌの上清の２５ｍＬのヒスチジンタグタンパク質用のＮｉ２＋−ＮＴＡビーズ（ＱＩＡＧＥＮ）又はＩｇＧタグタンパク質用のプロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）へのバッチ結合、次いでクマシーブルー染色により周知の濃度のタンパク質標準と比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により測定した。
第１の増幅ウイルス上清をＥＳＦ−９２１培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＬＬＣ）で成長させたＳｆ９細胞のスピナー培地（５００ｍｌ）の約０．１のＭＯＩでの感染に使用した。細胞は２８℃で３日間インキュベートした。上清を回収して濾過した。バッチ結合及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを、スピナー培地の発現が確認されるまで、必要に応じて繰り返した。
形質移入細胞からの条件培地（０．５〜３Ｌ）を、遠心分離により細胞を除去し０．２２ミクロンフィルターを通して濾過することにより回収した。ポリ−Ｈｉｓタグ作成物については、配列を含むタンパク質をＮｉ２＋−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。精製前に、イミダゾールを条件培地に５ｍＭの濃度まで添加した。条件培地を、０．３ＭのＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ， ｐＨ７．４バッファーで平衡化した６ｍｌのＮｉ２＋−ＮＴＡカラムに４−５ｍｌ／分の流速で４℃においてポンプ供給した。負荷後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．１４ＭのＮａＣｌ及び４％のマンニトールを含む貯蔵バッファー， ｐＨ６．８中で２５ｍｌのＧ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵した。
【０１３２】
タンパク質のイムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を以下のようにして条件培地から精製した。条件培地を、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー， ｐＨ６．８で平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に負荷した。負荷後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、１００ｍＭのクエン酸， ｐＨ３．５で溶離した。溶離したタンパク質は、１ｍｌの画分を２７５ｍＬの１Ｍトリスバッファー， ｐＨ９を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ−Ｈｉｓタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。タンパク質の均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＰＥＧ）電気泳動及びエドマン（Ｅｄｍａｎ）分解によるＮ−末端アミノ酸配列決定により評価できる。
あるいは、修飾バキュロウイルス法をｈｉｇｈ５細胞取り込みに使用してもよい。この方法では、所望の配列をコードするＤＮＡは、Ｐｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）等の適当な系で増幅されても、又はバキュロウイルス発現ベクターの含まれるエピトープタグの上流（５’−）に融合させてもよい。このようなエピトープタグは、ポリ−Ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域等）を含む。種々のプラスミドを用いることができ、ｐＩＥ１−１（Ｎｏｖａｇｅｎ）等の市販のプラスミドから誘導されたプラスミドを含む。ｐＩＥ１−１及びｐＩＥ１−２ベクターは、安定に形質転換された昆虫細胞（１）におけるバキュロウイルスｉｅ１プロモーターからの組換えタンパク質の構成的発現のために設計される。このプラスミドは複数のクローニング部位の方向においてのみ相違し、未感染昆虫細胞におけるｉｅ１媒介遺伝子発現に重要であることが知られた全てのプロモーター配列並びにｈｒ５エンハンサー成分を含む。ｐＩＥ１−１及びｐＩＥ１−２は翻訳開始部位を含み、融合タンパク質の製造に使用できる。簡単には、所望の配列又は配列の所望の部分（膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列など）を、５’及び３’領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅する。５’プライマーは隣接する（選択された）制限酵素部位を導入してもよい。生成物は、次いで、選択された制限酵素で消化して発現ベクターにサブクローニングされる。例えば、ｐＩＥｌ−１の誘導体はヒトＩｇＧ（ｐｂ．ＰＨ．ＩｇＧ）のＦｃ領域又は８ヒスチジン（ｐｂ．ＰＨ．Ｈｉｓ）タグ下流（３’−）を含むことができる。好ましくは、ベクター作成物は確認のために配列決定される。
【０１３３】
Ｈｉｇｈ−５細胞は、２７℃、ＣＯ２無し、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ無しの条件下で５０％の集密度まで成長させた。１５０ｍｍプレート各々について、配列を含む３０μｇのｐＩＥベースベクターを１ｍｌのＥｘ−細胞培地（媒質：Ｅｘ−細胞４０１＋１／１００のＬ−Ｇｌｕ ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃１４４０１−７８Ｐ（注：この媒質は光感受性））と混合し、別の管において、１００μｌのセルフェクチン（ＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ ＃１０３６２−０１０）（ボルテックスで混合））を１ｍｌのＥｘ−細胞培地と混合した。２つの溶液を混合し、室温で１５分間インキュベーションした。８ｍｌのＥｘ−細胞培地を２ｍｌのＤＮＡ／セルフェクチン混合物に添加し、Ｅｘ−細胞培地で１回洗浄したｈｉｇｈ−５細胞上に層形成させた。次いでプレートを暗中室温で１時間インキュベートした。次いでＤＮＡ／セルフェクチン混合物を吸引し、細胞をＥｘ−細胞で１回洗浄して過剰のセルフェクチンを除去した。３０ｍｌの新鮮なＥｘ−細胞培地を添加し、細胞を２８℃で３日間インキュベートした。上清を回収して、バキュロウイルス発現ベクターでの配列の発現を、１ｍｌの上清の２５ｍＬのヒスチジンタグタンパク質用のＮｉ２＋−ＮＴＡビーズ（ＱＩＡＧＥＮ）又はＩｇＧタグタンパク質用のプロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）へのバッチ結合、次いでクマシーブルー染色により周知の濃度のタンパク質標準と比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により測定した。
形質移入細胞からの条件培地（０．５〜３Ｌ）を、遠心分離により細胞を除去し０．２２ミクロンフィルターを通して濾過することにより回収した。ポリ−Ｈｉｓタグ作成物については、タンパク質作成物をＮｉ２＋−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。精製前に、イミダゾールを条件培地に５ｍＭの濃度まで添加した。条件培地を、０．３ＭのＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ， ｐＨ７．４バッファーで平衡化した６ｍｌのＮｉ２＋−ＮＴＡカラムに４−５ｍｌ／分の流速で４８℃においてポンプ供給した。負荷後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．１４ＭのＮａＣｌ及び４％のマンニトールを含む貯蔵バッファー， ｐＨ６．８中で２５ｍｌのＧ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵した。
タンパク質のイムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を以下のようにして条件培地から精製した。条件培地を、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー， ｐＨ６．８で平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に負荷した。負荷後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、１００ｍＭのクエン酸， ｐＨ３．５で溶離した。溶離したタンパク質は、１ｍｌの画分を２７５ｍｌの１Ｍトリスバッファー， ｐＨ９を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ−Ｈｉｓタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。配列の均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲル及びエドマン（Ｅｄｍａｎ）分解によるＮ−末端アミノ酸配列決定及び所望又は必要に応じて他の分析手法により評価できる。
ここに開示のＰＲＯポリペプチドの多くが、上記の方法により成功裏に発現された。
【０１３４】
６．１１．実施例１１：ＰＲＯに結合する抗体の調製
この実施例は、他の何れかのポリペプチド又はポリペプチドエピトープと実質的に結合することなく、ＰＲＯポリペプチド又はＰＲＯポリペプチド上のエピトープに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、上掲のＧｏｄｉｎｇに記載されている。用いられ得る免疫原は、精製ＰＲＯ、ＰＲＯを含む融合タンパク質、細胞表面に組換えＰＲＯをコードする遺伝子を発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に１−１００マイクログラムで注入したＰＲＯ免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｈａｍｉｌｔｏｎ， ＭＴ）に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで１０から１２日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫原で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗−ＰＲＯ抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
【０１３５】
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ」な動物に、ＰＲＯの静脈内注射の最後の注入をすることができる。３から４日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出した。次いで脾臓細胞を（３５％ポリエチレングリコールを用いて）、ＡＴＣＣから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択されたマウス骨髄腫細胞系に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。
ハイブリドーマ細胞は、ＰＲＯに対する反応性についてＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。所望のＰＲＯに対するモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
ポジティブハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗−ＰＲＯモノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【０１３６】
６．１２．実施例１２：特異的抗体を用いたＰＲＯポリペプチドの精製
天然又は組換えＰＲＯポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製できる。例えば、プロ−ＰＲＯポリペプチド、成熟ＰＲＯポリペプチド、又はプレ−ＰＲＯポリペプチドは、対象とするＰＲＯポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは抗ＰＲＯポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作成される。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロテインＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎ．Ｊ．）での精製のいずれかにより免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインＡでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、ＣｎＢｒ−活性化セファロース（商品名）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。
このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のＰＲＯポリペプチドを含有する細胞からの画分を調製することによるＰＲＯポリペプチドの精製において利用される。この調製物は、洗浄剤の添加又はこの分野で公知の方法により微分遠心分離を介して得られる全細胞又は細胞成分画分の可溶化により誘導される。あるいは、シグナル配列を含む可溶化ＰＲＯポリペプチドは、細胞が成長する培地中に有用な量で分泌される。
可溶化ＰＲＯポリペプチド含有調製物は、免疫親和性カラムを通され、カラムはＰＲＯポリペプチドの好ましい吸着をさせる条件下（例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度バッファー）で洗浄される。次いで、カラムは、抗体／ＰＲＯポリペプチド結合を分解する条件下（例えば、約２−３といった低ｐＨ、高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ）で溶離され、ＰＲＯポリペプチドが回収される。
【０１３７】
６．１３．実施例１３：薬物スクリーニング
本発明は、ＰＲＯポリペプチド又はその結合断片を種々の薬物スクリーニング技術において使用することによる化合物のスクリーニングにとって特に有用である。そのような試験に用いられるＰＲＯポリペプチド又は断片は、溶液中の自由状態でも、固体支持体に固定されても、細胞表面に担持されていても、或いは細胞内に位置していてもよい。薬剤スクリーニングの１つの方法では、ＰＲＯポリペプチド又は断片を発現する組換え核酸で安定に形質移入される真核生物又は原核生物宿主細胞を利用する。薬剤は、そのような形質移入細胞に対して、競合的結合アッセイによってスクリーニングされる。生存可能又は固定化形態のいずれかによって、このような細胞は標準的な結合アッセイで使用できる。例えば、ＰＲＯポリペプチド又は断片と試験される試薬の間での複合体の形成を測定してよい。あるいは、試験する試薬によって生ずるＰＲＯポリペプチドとその標的細胞又は標的レセプターとの間の複合体形成における減少を試験することもできる。
従って、本発明は、ＰＲＯポリペプチド関連疾患又は障害に影響を与えうる薬剤又は任意の他の試薬のスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、当該技術分野に周知の方法により、その試薬をＰＲＯポリペプチド又は断片に接触させ、（Ｉ）試薬とＰＲＯポリペプチド又は断片との間の複合体の存在について、又は（ｉｉ）ＰＲＯポリペプチド又は断片と細胞との間の複合体の存在について、検定することを含む。これらの競合結合アッセイでは、ＰＲＯポリペプチド又は断片が典型的には標識される。適切なインキュベーションの後、自由なＰＲＯポリペプチド又は断片を結合形態のものから分離し、自由又は未複合の標識の量が、特定の試薬がＰＲＯポリペプチドに結合する又はＰＲＯポリペプチド／細胞複合体を阻害する能力の尺度となる。
【０１３８】
薬剤スクリーニングのための他の技術は、ポリペプチドに対して適当な結合親和性を持つ化合物についての高スループットスクリーニングを提供し、１９８４年９月１３日に公開されたＷＯ８４／０３５６４に詳細に記載されている。簡単に述べれば、多数の異なる小型ペプチド試験化合物が、プラスチックピン等の固体支持体又は幾つかの他の表面上で合成される。ＰＲＯポリペプチドに適用すると、ペプチド試験化合物はＰＲＯポリペプチドと反応して洗浄される。結合したＰＲＯポリペプチドはこの分野で良く知られた方法により検出される。精製したＰＲＯポリペプチドは、上記の薬剤スクリーニング技術に使用するためにプレート上に直接被覆することもできる。さらに、非中和抗体は、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化するのに使用できる。
また、本発明は、ＰＲＯポリペプチドに結合可能な中和抗体がＰＲＯポリペプチド又はその断片について試験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイも考慮する。この方法において、抗体は、ＰＲＯポリペプチドで、１つ又は複数の抗原決定基を持つ任意のペプチドの存在を検出するのに使用できる。
【０１３９】
６．１４．実施例１４：合理的薬物設計
合理的薬物設計の目的は、対象とする生物学的活性ポリペプチド（即ち、ＰＲＯポリペプチド）又はそれらが相互作用する小分子、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの構造的類似物を製造することである。これらの例の任意のものが、ＰＲＯポリペプチドのより活性で安定な形態又はインビボでＰＲＯポリペプチドに機能を促進又は阻害する薬物の創作に使用できる（参考、Ｈｏｄｇｓｏｎ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９： １９−２１ （１９９１））。
【０１４０】
１つの方法において、ＰＲＯポリペプチド、又はＰＲＯポリペプチド−インヒビター複合体の三次元構造が、Ｘ線結晶学により、コンピュータモデル化により、最も典型的には２つの方法の組み合わせにより決定される。分子の構造を解明し活性部位を決定するためには、ＰＲＯポリペプチドの形状及び電荷の両方が確認されなければならない。数は少ないが、ＰＲＯポリペプチドの構造に関する有用な情報が相同タンパク質の構造に基づいたモデル化によって得られることもある。両方の場合において、関連する構造情報は、類似ＰＲＯポリペプチド様分子の設計又は効果的なインヒビターの同定に使用される。合理的な薬剤設計の有用な例は、Ｂｒａｘｔｏｎ及びＷｅｌｌｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３１： ７７９６−７８０１ （１９９２）に示されているような向上した活性又は安定性を持つ分子、又はＡｔｈａｕｄａら，Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １１３： ７４２−７４６ （１９９３）に示されているような天然ペプチドのインヒビター、アゴニスト、又はアンタゴニストとして作用する分子を含む。
【０１４１】
また、上記のような機能アッセイによって選択された標的特異的な抗体を単離しその結晶構造を解明することもできる。この方法は、原理的には、それに続く薬剤設計が基礎をおくことのできるファーマコア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）を生成する。機能的な薬理学的に活性な抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗ｉｄｓ）を生成することにより、タンパク質結晶学をバイパスすることができる。鏡像の鏡像として、抗ｉｄｓの結合部位は最初のレセプターの類似物であると予測できる。抗ｉｄは、次いで、化学的又は生物学的に製造したペプチドのバンクからペプチドを同定及び単離するのに使用できる。単離されたペプチドは、ファーマコアとして機能するであろう。
本発明によって、Ｘ線結晶学などの分析実験を実施するために十分な量のＰＲＯポリペプチドが入手可能である。さらに、ここに提供したＰＲＯポリペプチドアミノ酸配列の知識は、Ｘ線結晶学に代わる又はそれに加わるコンピュータモデル化技術で用いられるガイダンスを提供する。
【０１４２】
６．１５．実施例１５：内皮細胞増殖の刺激（アッセイ８）
このアッセイは、本発明のＰＲＯポリペプチドが副腎皮質毛細管内皮細胞（ＡＣＥ）成長を刺激する能力を示すか否かを測定するように設計されている。このアッセイにおいて陽性と試験されたポリペプチドは、例えば創傷治癒、及びこれに類似のものを含み、血管新生が有益である症状や疾患の治療的処置において有用であると期待される（これらＰＲＯポリペプチドのアゴニストがそうであるように）。このアッセイにおいて陽性と試験されたＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストは、癌性腫瘍の治療的処置に対して有用であると期待される。
ウシ副腎皮質毛細管内皮（ＡＣＥ）細胞（初代培養からのもの、最大１２−１４継代）を９６ウェルのプレートにおいて１００マイクロリットル当たり５００細胞／ウェルでプレーティングした。アッセイ媒体は、低グルコースＤＭＥＭ、１０％子ウシ血清、２ｍＭグルタミン、及び１ｘペニシリン／ストレプトマイシン／ファンギゾンを含む。対照ウェルは以下を含む：（１）ＡＣＥ細胞無添加；（２）ＡＣＥ細胞のみ；（３）ＡＣＥ細胞＋ＶＥＧＦ（５ ｎｇ／ｍｌ）；及び（４）ＡＣＥ細胞＋ＦＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）。次いで、対照及び試験試料（１００マイクロリットル容量）をウェルに添加した（各々、１％、０．１％及び０．０１％希釈）。細胞培地を３７℃／５％ＣＯ２で６−７日間インキュベートした。インキュべーションの後、ウェル中の培地を吸引して細胞をＰＢＳで１ｘ洗浄した。次いで、酸ホスファターゼ反応混合物（１００マイクロリットル、０．１Ｍ酢酸ナトリウム， ｐＨ５．５，０．１％  トリトンＸ−１００、１０ｍＭのリン酸ｐ−ニトロフェニル）を各ウェルに添加した。３７℃で２時間のインキュベーション後に、１０マイクロリットルの１ＮのＮａＯＨの添加により反応を停止させた。光学密度（ＯＤ）を４０５ｎｍでマイクロプレートリーダーで測定した。
ＰＲＯポリペプチドの活性は、（１）細胞のみのバックグラウンドに対する、及び（２）ＶＥＧＦによる最大刺激に対する（酸ホスファターゼ活性、ＯＤ４０５ｎｍで測定した）増殖増加の倍数として計算した。最大刺激についての活性参照としてＶＥＧＦ（３−１０ｎｇ／ｍｌ）及びＦＧＦ（１−５ｎｇ／ｍｌ）を使用した。アッセイの結果は、観察された刺激がバックグラウンドを越えて≧５０％である場合に「陽性」と考えた。ＶＥＧＦ（５ ｎｇ／ｍｌ）対照は１％希釈において１．２４倍の刺激を与え；ＦＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）対照は１％希釈において１．４６倍の刺激を与えた。
試験されたＰＲＯ２１がこのアッセイにおいてポジティブであった。
【０１４３】
６．１６．実施例１６：血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の刺激による内皮細胞成長の阻害（アッセイ９）
ＶＥＧＦに刺激された内皮細胞の増殖を阻害する種々のＰＲＯポリペプチドの能力を試験した。このアッセイにおいてポリペプチド試験がポジティブであると哺乳類の内皮細胞の成長の阻害に有用であり、このような効果は、例えば腫瘍成長の阻害等に有利である。
特に、ウシ副腎皮質性毛細管内皮（ＡＣＥ）細胞（一次培地から、最大１２−１４継代）を９６−ウェルのプレート１００マイクロリットルあたり５００細胞／ウェルで蒔いた。アッセイ用培地は、低グルコースＤＭＥＭ、１０％のウシ血清、２ｍＭのグルタミン、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン／フンギゾンを含有する。対照ウェルは次のものを含む：（１）ＡＣＥ細胞を添加しないもの；（２）ＡＣＥ細胞単独；（３）ＡＣＥ細胞プラス５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ；（４）ＡＣＥ細胞プラス３ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ；（５）ＡＣＥ細胞プラス３ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦプラス１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−ベータ；及び（６）ＡＣＥ細胞プラス３ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦプラス５ｎｇ／ｍｌのＬＩＦ。ついで、試験用試料であるポリ−ｈｉｓタグＰＲＯポリペプチド（１００マイクロリットル容量中）をウェル（それぞれ１％、０．１％及び０．０１％に希釈）に添加した。細胞を３７℃／５％のＣＯ２で６−７日インキュベートした。インキュベート後、ウェルの培地を吸引し、細胞を１ｘ ＰＢＳで洗浄した。酸ホスファターゼ反応混合物（１００マイクロリットル、０．１Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、０．１％のトリトンＸ−１００、１０ｍＭのｐ−ニトロフェニルホスフェート）を各ウェルに添加した。３７℃で２時間インキュベートした後、１０マイクロリットルの１ＮのＮａＯＨの添加で反応を停止した。光学密度（ＯＤ）をマイクロプレートリーダーで４０５ｎｍにおいて測定した。
ＰＲＯポリペプチドの活性を、刺激無しの細胞に対するＶＥＧＦ（３ｎｇ／ｍｌ）刺激増殖のパーセント阻害（ＯＤ４０５ｎｍにおける酸ホスファターゼ活性を測定することにより決定）として算出した。ＴＧＦ−βはＶＥＧＦ刺激ＡＣＥ細胞増殖を７０−９０％阻止するので、１ｎｇ／ｍｌで活性参照として使用した。結果は、ＰＲＯポリペプチドの癌治療、特に腫瘍新脈管形成の阻害における有用性を示している。数値（相対阻害度）は刺激なし細胞に対するＰＲＯポリペプチドによるＶＥＧＦ刺激増殖のパーセント阻害を算出し、ついで１ｎｇ／ｍｌ濃度でのＴＧＦ−βが、ＶＥＧＦ刺激細胞増殖を７０−９０％阻止することが知られていることで得られたパーセント阻害をパーセンテージに除することで決定される。結果は、ＰＲＯポリペプチドが内皮細胞成長のＶＥＧＦ刺激を３０％又はそれ以上（相対阻害度３０％又はそれ以上）を阻害したときにポジティブと考える。
試験されたＰＲＯ２４７， ＰＲＯ７２０及びＰＲＯ４３０２がこのアッセイにおいてポジティブであった。
【０１４４】
６．１７．実施例１７：ＬＩＦ＋ＥＴ−１によって誘導される心臓新生児肥大の刺激（アッセイ７５）
このアッセイは、本発明のＰＲＯポリペプチドがＬＩＦ及びエンドセリン−１（ＥＴ−１）によって誘導される新生児心臓肥大を刺激する能力を示すかどうか決定するためにデザインされる。本アッセイにおいてポジティブな反応を与える試験化合物は、心筋肥大の望ましくないレベルに特徴付けられ又は関連する心不全の疾病又は疾患の治療上の処置に対して有用である。
生後１日のＳＤラット由来の心筋細胞（７．５ ｘ １０４／ｍｌで１８０μｌ、血清＜０．１， 新しく単離されたもの）は、一日目にＤＭＥＭ／Ｆ１２＋４％ ＦＣＳで予めコートした９６ウェルプレートへ移される。その後、試験ＰＲＯポリペプチドサンプル又は成長培地のみ（ネガティブコントロール）が、２日目に２０μｌ用量でウェル中に直接添加される。その後、３日目にＬＩＦ＋ＥＴ−１がウェルに添加される。細胞はさらに培養２日後に染色され、その後、翌日に可視的にスコア化される。ＰＲＯポリペプチド処理筋細胞がゼロより大きなスコアを得た場合、アッセイにおいてポジティブとなる。ゼロのスコアは非応答細胞を示し、１又は２のスコアは増強（即ち、それらは、視覚的に非処理の筋細胞より概して大きく、又より数が多い）を示す。
ＰＲＯ２１ポリペプチドがこのアッセイにおいてポジティブであった。
６．１８．実施例１８：内皮細胞アポトーシスの検出（ＦＡＣＳ）（アッセイ９６）
本発明のＰＲＯポリペプチドの内皮細胞においてアポトーシスを誘導する能力は、ゼラチン化されたＴ−１７５フラスコ中、１０継代に満たないＨＵＶＥＣ細胞を用いて、ヒト静脈性臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ， Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）中にて試験された。本アッセイにおいてポジティブの試験ＰＲＯポリペプチドは、内皮細胞のアポトーシスが有益である状態を治療的に処置するために有用であると予想され、例えば、腫瘍の治療上の処置を含む。
１日目、細胞は継代し［ゼラチン化した６ ｃｍディッシュあたり４２０，０００細胞−（１１ ｘ １０３細胞／ｃｍ２ Ｆａｌｃｏｎ， Ｐｒｉｍａｒｉａ）］、血清を含む培地（ＣＳ−Ｃ， Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍ）中で一晩又は１６時間から２４時間成長させた。
２日目、細胞を５ ｍｌのＰＢＳで一回洗浄した；０ ％血清培地３ ｍｌをＶＥＧＦと共に添加した（１００ ｎｇ／ｍｌ）；及びＰＲＯの３０μｌ試験化合物（最終希釈１％）又は０％血清培地（ネガティブコントロール）が添加された。混合物は収集するまで４８時間インキュベートした。
その後、ＦＡＣＳ分析のために細胞を収集した。培地は吸引し、細胞は一回ＰＢＳで洗浄した。１ ｘ トリプシン、５ ｍｌをＴ−１７５フラスコ中の細胞に添加し、細胞がプレートから剥がれるまで（約５−１０分間）細胞を静置した。トリプシン処理は５ ｍｌの成長培地を添加することにより停止した。細胞は、４℃にて、５分間、１０００ ｒｐｍで遠心した。培地を吸引し、１０％血清を補充した培地（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍ）の１０ ｍｌ中に細胞を懸濁し、アネキシン−ＦＩＴＣ（Ｂｉｏ Ｖｉｓｏｎ）５μｌを添加され冷却されたチューブをＦＡＣＳにかけた。ポジティブな結果は、ＰＲＯポリペプチド処理サンプル中でネガティブコントロールと比較して増強されたアポトーシスとして決定された。
ＰＲＯ４３０２ポリペプチドがこのアッセイにおいてポジティブであった。
【０１４５】
６．１９．実施例１９：ＨＵＶＥＣ細胞におけるｃ−ｆｏｓの誘導（アッセイ１２３）
本アッセイは、ＰＲＯポリペプチドがＨＵＶＥＣ細胞においてｃ−ｆｏｓを誘導する能力を示すかどうかを決定するためにデザインされる。ポジティブとして試験されるＰＲＯポリペプチドは、血管形成が有益である状態又は疾患の治療的処置にとって有用であり、例えば、創傷治癒など（ＰＲＯポリペプチドのアゴニストがそうであるように）が含まれる。このアッセイでポジティブと試験されるＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストは癌性腫瘍の治療的処置に対して有用であることが期待される。
成長培地中（５０％ Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２ｗ／ｏ ＧＨＴ：低グルコース、及び５０％ ＤＭＥＭ グリシン無し：ＮａＨＣＯ３， １％ グルタミン， １０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ， １０％ＦＢＳ， １０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ）のヒト静脈性臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ， Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、細胞密度５ ｘ １０３細胞／ウェルで９６−ウェルマイクロタイタープレート上にプレートした。プレートの翌日（２日目）、細胞は、成長培地を除去し、無血清培地を置換することにより、２４時間飢餓状態にした。３日目、細胞を１００μｌ／ウェルの試験サンプルとコントロールで処理した（ポジティブコントロール＝成長培地；ネガティブコントロール＝Ｐｒｏｔｅｉｎ ３２バッファー＝１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ， １４０ ｍＭ ＮａＣｌ， ４％（ｗ／ｖ）マンニトール， ｐＨ６．８）。細胞の一プレートを３７℃、５％ＣＯ２下にて３０分間インキュベートした。他の細胞のプレートは、３７℃、５％ＣＯ２下にて６０分間インキュベートした。サンプルを除去し、ＲＮｅａｓｙ ９６ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを収集した。次いで、該ＲＮＡをｃ−ｆｏｓ， ｅｇｒ−１及びＧＡＰＤＨの誘導に関しＴａｑｍａｎを用いてアッセイした。
ネガティブコントロール（上述のＰｒｏｔｅｉｎ ３２／ＨＥＰＥＳ バッファー）値に対する増加倍率の活性の測定値は、ネガティブコントロールと比較した試験サンプル中のＧＡＰＤＨに対するｃ−ｆｏｓの増加倍率を計算することにより得られた。ＰＲＯポリペプチドが少なくともネガティブバッファーコントロールに対して２倍値を示す場合、結果はポジティブとした。
ＰＲＯ１３７６ポリペプチドはこのアッセイにおいてポジティブであった。
６．２０．実施例２０：正常ヒト腸骨動脈内皮細胞の増殖（アッセイ１３８）
本アッセイは、本発明のＰＲＯポリペプチドが、培養下においてヒト腸骨動脈内皮細胞の増殖を誘導する能力を示し、その結果、有用な成長又は阻害因子として機能するかどうかを決定するためにデザインされる。
０日目、ヒト腸骨動脈内皮細胞（最大１２−１４継代の細胞株由来）を９６−ウェルプレート中に１００マイクロリットルあたり１０００細胞／ウェルでプレートし、完全培地中で一晩インキュベートした［上皮細胞成長培地（ＥＧＭ， Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）、＋サプリメント：ヒト上皮成長因子（ｈＥＧＦ）、ウシ脳抽出液（ＢＢＥ）、ヒドロコルチゾン、ＧＡ−１０００、及びウシ胎児血清（ＦＢＳ， Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）］。１日目、完全培地は、基礎培地［ＥＧＭ＋１％ ＦＢＳ］と１％， ０．１％， ０．０１％でＰＲＯポリペプチドの添加により置換された。７日目、細胞増殖の評価は、Ｃｒｙｓｔａｌ ＶｉｏｌｅｔによるＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイによって実施された。結果はコントロールバッファー中で観察された細胞増殖の％で表される。
以下のＰＲＯポリペプチドがこのアッセイにおいて増殖を促進した：ＰＲＯ２１４， ＰＲＯ２５６， ＰＲＯ３６３， ＰＲＯ３６５， ＰＲＯ７９１， ＰＲＯ８３６， ＰＲＯ１０２５， ＰＲＯ１１８６， ＰＲＯ１１９２， ＰＲＯ１２７２， ＰＲＯ１３０６， ＰＲＯ１３２５， ＰＲＯ１３２９， ＰＲＯ１３７６， ＰＲＯ１４１１， ＰＲＯ１５０８， ＰＲＯ１７８７， ＰＲＯ１８６８， ＰＲＯ４３２４， ＰＲＯ４３３３， ＰＲＯ４４０８， ＰＲＯ４４９９， ＰＲＯ９８２１， ＰＲＯ９８７３， ＰＲＯ１０００８， ＰＲＯ１００９６， ＰＲＯ１９６７０， ＰＲＯ２００４０， ＰＲＯ２００４４ 及び ＰＲＯ２１３８４。
以下のＰＲＯポリペプチドがこのアッセイにおいて増殖を阻害した：ＰＲＯ２３８， ＰＲＯ１０２９， ＰＲＯ１２７４， ＰＲＯ１２７９， ＰＲＯ１４１９， ＰＲＯ１８９０， ＰＲＯ６００６ 及び ＰＲＯ２８６３１。
【０１４６】
６．２１．実施例２１：プールされたヒト臍静脈内皮細胞の増殖（アッセイ１３９）
本アッセイは、本発明のＰＲＯポリペプチドが、培養下においてプールされたヒト臍静脈内皮細胞の増殖を誘導する能力を示し、その結果、有用な成長又は阻害因子として機能するかどうかを決定するためにデザインされる。
０日目、プールされたヒト臍静脈内皮細胞（最大１２−１４継代の細胞株由来）を９６−ウェルプレート中に１００マイクロリットルあたり１０００細胞／ウェルでプレートし、完全培地中で一晩インキュベートした［上皮細胞成長培地（ＥＧＭ， Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）、＋サプリメント：ヒト上皮成長因子（ｈＥＧＦ）、ウシ脳抽出液（ＢＢＥ）、ヒドロコルチゾン、ＧＡ−１０００、及びウシ胎児血清（ＦＢＳ， Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）］。１日目、完全培地は、基礎培地［ＥＧＭ＋１％ ＦＢＳ］と１％， ０．１％， ０．０１％でＰＲＯポリペプチドの添加により置換された。７日目、細胞増殖の評価は、Ｃｒｙｓｔａｌ ＶｉｏｌｅｔによるＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイによって実施された。結果はコントロールバッファー中で観察された細胞成長の％で表される。
以下のＰＲＯポリペプチドがこのアッセイにおいて増殖を促進した：ＰＲＯ１８１， ＰＲＯ２０５， ＰＲＯ２２１， ＰＲＯ２３１， ＰＲＯ２３８， ＰＲＯ２４１， ＰＲＯ２４７， ＰＲＯ２５６， ＰＲＯ２５８， ＰＲＯ２６３， ＰＲＯ２６５， ＰＲＯ２９５， ＰＲＯ３２１， ＰＲＯ３２２， ＰＲＯ３３７， ＰＲＯ３６３， ＰＲＯ５３３， ＰＲＯ６９７， ＰＲＯ７２５， ＰＲＯ７７１， ＰＲＯ７８８， ＰＲＯ８１９， ＰＲＯ８２８， ＰＲＯ８４６， ＰＲＯ８６５， ＰＲＯ１００５， ＰＲＯ１００６， ＰＲＯ１０２５， ＰＲＯ１０５４， ＰＲＯ１０７１， ＰＲＯ１０７９， ＰＲＯ１０８０， ＰＲＯ１１１４， ＰＲＯ１１３１， ＰＲＯ１１５５， ＰＲＯ１１６０， ＰＲＯ１１９２， ＰＲＯ１２４４， ＰＲＯ１２７２， ＰＲＯ１２７３， ＰＲＯ１２７９， ＰＲＯ１２８３， ＰＲＯ１２８６， ＰＲＯ１３０６， ＰＲＯ１３０９， ＰＲＯ１３２５， ＰＲＯ１３２９， ＰＲＯ１３４７， ＰＲＯ１３５６， ＰＲＯ１３７６， ＰＲＯ１３８２， ＰＲＯ１４１２， ＰＲＯ１５５０， ＰＲＯ１５５６， ＰＲＯ１７６０， ＰＲＯ１７８７， ＰＲＯ１８０１， ＰＲＯ１８６８， ＰＲＯ１８８７， ＰＲＯ３４３８， ＰＲＯ３４４４， ＰＲＯ４３２４， ＰＲＯ４３４１， ＰＲＯ４３４２， ＰＲＯ４３５３， ＰＲＯ４３５４， ＰＲＯ４３５６， ＰＲＯ４３７１， ＰＲＯ４４２２， ＰＲＯ４４２５， ＰＲＯ５７２３， ＰＲＯ５７３７， ＰＲＯ６０２９， ＰＲＯ６０７１， ＰＲＯ１００９６ 及び ＰＲＯ２１０５５。
以下のＰＲＯポリペプチドがこのアッセイにおいて増殖を阻害した：ＰＲＯ２２９， ＰＲＯ４４４， ＰＲＯ８２７， ＰＲＯ１００７， ＰＲＯ１０７５， ＰＲＯ１１８４， ＰＲＯ１１９０， ＰＲＯ１１９５， ＰＲＯ１４１９， ＰＲＯ１４７４， ＰＲＯ１４７７， ＰＲＯ１４８８， ＰＲＯ１７８２， ＰＲＯ４３０２， ＰＲＯ４４０５， ＰＲＯ５７２５， ＰＲＯ５７７６， ＰＲＯ７４３６， ＰＲＯ９７７１， ＰＲＯ１０００８ 及び ＰＲＯ２１３８４。
【０１４７】
６．２２．実施例２２：ヒト冠動脈平滑筋細胞の増殖（アッセイ１４０）
本アッセイは、本発明のＰＲＯポリペプチドが、培養下においてヒト冠動脈平滑筋細胞の増殖を誘導する能力を示し、その結果、有用な成長又は阻害因子として機能するかどうかを決定するためにデザインされる。
０日目、ヒト冠動脈平滑筋細胞（最大１２−１４継代の細胞株由来）を９６−ウェルプレート中に１００マイクロリットルあたり１０００細胞／ウェルでプレートし、完全培地中で一晩インキュベートした［平滑筋成長培地（ＳｍＧＭ， Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）、＋サプリメント：インスリン、ヒト上皮成長因子（ｈＥＧＦ）、ヒト線維芽細胞成長因子（ｈＦＧＦ）、及びウシ胎児血清（ＦＢＳ， Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）］。１日目、完全培地は、基礎培地［ＳｍＧＭ＋１％ ＦＢＳ］と１％， ０．１％， ０．０１％でＰＲＯポリペプチドの添加により置換された。７日目、細胞増殖の評価は、Ｃｒｙｓｔａｌ ＶｉｏｌｅｔによるＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイによって実施された。結果はコントロールバッファー中で観察された細胞増殖の％で表される。
以下のＰＲＯポリペプチドがこのアッセイにおいて増殖を促進した：ＰＲＯ１６２， ＰＲＯ１８２， ＰＲＯ２０４， ＰＲＯ２２１， ＰＲＯ２３０， ＰＲＯ２５６， ＰＲＯ２５８， ＰＲＯ５３３， ＰＲＯ６９７， ＰＲＯ７２５， ＰＲＯ７３８， ＰＲＯ８２６， ＰＲＯ８３６， ＰＲＯ８４０， ＰＲＯ８４６， ＰＲＯ８６５， ＰＲＯ９８２， ＰＲＯ１０２５， ＰＲＯ１０２９， ＰＲＯ１０７１， ＰＲＯ１０８３， ＰＲＯ１１３４， ＰＲＯ１１６０， ＰＲＯ１１８２， ＰＲＯ１１８４， ＰＲＯ１１８６， ＰＲＯ１１９２， ＰＲＯ１２７４， ＰＲＯ１２７９， ＰＲＯ１２８３， ＰＲＯ１３０６， ＰＲＯ１３０８， ＰＲＯ１３２５， ＰＲＯ１３３７， ＰＲＯ１３３８， ＰＲＯ１３４３， ＰＲＯ１３７６， ＰＲＯ１３８７， ＰＲＯ１４１１， ＰＲＯ１４１２， ＰＲＯ１４１５， ＰＲＯ１４３４， ＰＲＯ１４７４， ＰＲＯ１５５０， ＰＲＯ１５５６， ＰＲＯ１５６７， ＰＲＯ１６００， ＰＲＯ１７５４， ＰＲＯ１７５８， ＰＲＯ１７６０， ＰＲＯ１７８７， ＰＲＯ１８６５， ＰＲＯ１８６８， ＰＲＯ１９１７， ＰＲＯ１９２８， ＰＲＯ３４３８， ＰＲＯ３５６２， ＰＲＯ４３３３， ＰＲＯ４３４５， ＰＲＯ４３５３， ＰＲＯ４３５４， ＰＲＯ４４０８， ＰＲＯ４４３０， ＰＲＯ４５０３， ＰＲＯ６７１４， ＰＲＯ９７７１， ＰＲＯ９８２０， ＰＲＯ９９４０， ＰＲＯ１００９６， ＰＲＯ２１０５５， ＰＲＯ２１１８４ 及び ＰＲＯ２１３６６。
以下のＰＲＯポリペプチドがこのアッセイにおいて増殖を阻害した：ＰＲＯ１８１， ＰＲＯ１９５， ＰＲＯ１０８０， ＰＲＯ１２６５， ＰＲＯ１３０９， ＰＲＯ１４８８， ＰＲＯ４３０２， ＰＲＯ４４０５ 及び ＰＲＯ５７２５。
【０１４８】
６．２３．実施例２３：成長因子で処理されたＨＵＶＥＣ細胞におけるＰＲＯポリペプチドの過剰発現を検出するためのマイクロアレイ解析
本アッセイは、本発明のＰＲＯポリペプチドがＨＵＶＥＣ細胞中での内皮細胞管形成を刺激することにより血管形成を誘導する能力を示すかどうか決定するためにデザインされる。
しばしば、数千もの遺伝子配列を含む核酸マイクロアレイは、様々な刺激（例えば、成長因子）に曝された組織中において、その正常組織、つまり刺激に曝されない組織と比較した場合、差次的に発現している遺伝子を同定するために有用である。核酸マイクロアレイを使用する場合、試験及びコントロール組織試料からの試験及びコントロールｍＲＮＡ試料が逆転写され、ｃＤＮＡプローブを生成するために標識される。次いで、このｃＤＮＡプローブは、固体支持体上に固定化された多くの核酸とハイブリダイズされる。このアレイは、アレイの各メンバーの配列と位置がわかるように構成されている。標識プローブとある特定のアレイのメンバーとのハイブリダイゼーションは、プローブが由来する試料がその遺伝子を発現していることを示す。試験（刺激に曝された組織）からのプローブのハイブリダイゼーションシグナルが、コントロール（正常組織、曝されていない組織）試料からのプローブのハイブリダイゼーションシグナルより大きい場合は、刺激に曝された組織において過剰発現している遺伝子又は複数遺伝子が同定される。この結果の意味するところは、刺激に曝された組織で過剰発現しているタンパク質が、刺激に曝された組織内における機能的変化（例えば、管形成など）に関与するということである。
核酸のハイブリダイゼーション及びマイクロアレイ技術の方法論は、当業者には良く知られている。本実施例では、ハイブリダイゼーション及びプローブ、スライドのための核酸の特別な調製、並びにハイブリダイゼーションの条件は、２０００年３月３１日に出願された米国仮出願一連番号 ６０／１９３，７６７にすべて詳述されており、ここにおいて文献として取り入れられている。
【０１４９】
本実施例において、コラーゲンゲル又はフィブリンゲルのどちらかにおいて成長するＨＵＶＥＣ細胞が、種々の成長因子の添加により管を形成するために誘導された。特に、コラーゲンゲルはすでに、Ｙａｎｇ等， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊ． Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， １９９９， １５５（３）：８８７−８９５及びＸｉｎ等， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊ． Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ２００１， １５８（３）：１１１１−１１２０中の記載に従い調製された。ＨＵＶＥＣ細胞のゲル化の後、Ｍ１９９を含み１ ％ ＦＢＳが添加された１ Ｘ 基礎培地、１ Ｘ ＩＴＳ、２ ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、２６．５ ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン及び１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシンが添加された。管形成は、ホルボルミリスチン酸アセテート（５０ ｎＭ）、血管内皮細胞成長因子（４０ ｎｇ／ｍｌ）及び塩基性線維芽細胞成長因子（４０ ｎｇ／ｍｌ）（”ＰＭＡ成長因子混合物”）、又は肝細胞成長因子（４０ ｎｇ／ｍｌ）及び血管内皮細胞成長因子（４０ ｎｇ／ｍｌ）（ＨＧＦ／ＶＥＧＦ混合物）のいずれかを指示された期間に含有させることにより誘導された。フィブリンゲルはＨｕｖｅｃ（４ ｘ １０５細胞／ｍｌ）を１％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）及びヒトフィブリノーゲン（２．５ ｍｇ／ｍｌ）を含むＭ１９９中に懸濁することにより調製された。その後、トロンビン（５０Ｕ／ｍｌ）は１パートトロンビン溶液：３０パートフィブリノーゲン懸濁液の割合でフィブリノーゲン懸濁液に添加された。その後、溶液は１０ ｃｍの組織培養プレート上に重層され（総体積：１５ ｍｌ／プレート）、次に３７℃で２０分間凝固させた。その後、組織培養液（ＰＭＡ（５０ ｎＭ）， ｂＦＧＦ（４０ ｎｇ／ｍｌ）及びＶＥＧＦ（４０ ｎｇ／ｍｌ）を含む１０ ｍｌのＢＭ）が添加され、細胞は、３７℃、５％ＣＯ２の空気中にて指示された期間培養した。
全ＲＮＡは、０， ４， ８， ２４， ４０及び５０時間インキュベートしたＨＵＶＥＣ細胞から、異なるマトリックス及び培地の組合わせ中で、ＴＲＩｚｏｌ抽出の後、ＲＮＡｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた第二の抽出を使用して抽出された。全ＲＮＡは後にマイクロアレイにハイブリダイズされたｃＲＮＡを調製するために使用された。
本実験では、ここに記載のＰＲＯポリペプチドコード化核酸配列から誘導された核酸プローブをマイクロアレイの作製に用い、上記のＨＵＶＥＣ細胞由来のＲＮＡをそれとのハイブリダイゼーションに用いた。二組による比較は、ベースラインとしてタイム０のチップを用いて行われた。３つの複製サンプルが各実験条件及び時間に対して分析された。それ故、各処理に対して３つのタイム０サンプル及び各継時点に３つの複製が存在した。従って、各タイム０に対する３対３の比較が各時点において行われた。これにより、各時点において９つの比較が行われた。３つのタイム０のどれと比較しても、各異なるマトリックス及び培地の組合わせにおける３つのタイム０ではない全ての複製物中で発現が増大した遺伝子のみがポジティブとされた。このストリンジェントなデータ分析方法は擬似ネガティブを許容しうるが、擬似ポジティブを最小にする。
ＰＲＯ１７８， ＰＲＯ１９５， ＰＲＯ２２８， ＰＲＯ３０１， ＰＲＯ３０２， ＰＲＯ５３２， ＰＲＯ７２４， ＰＲＯ７３０， ＰＲＯ７３４， ＰＲＯ７９３， ＰＲＯ８７１， ＰＲＯ９３８， ＰＲＯ１０１２， ＰＲＯ１１２０， ＰＲＯ１１３９， ＰＲＯ１１９８， ＰＲＯ１２８７， ＰＲＯ１３６１， ＰＲＯ１８６４， ＰＲＯ１８７３， ＰＲＯ２０１０， ＰＲＯ３５７９， ＰＲＯ４３１３， ＰＲＯ４５２７， ＰＲＯ４５３８， ＰＲＯ４５５３， ＰＲＯ４９９５， ＰＲＯ５７３０， ＰＲＯ６００８， ＰＲＯ７２２３， ＰＲＯ７２４８ 及び ＰＲＯ７２６１ポリペプチドがこのアッセイにおいてポジティブであった。
【０１５０】
６．２４．実施例２４：インサイツハイブリッド形成
インサイツハイブリッド形成は、細胞又は組織調製物内での核酸配列の検出及び局在化のための強力で多用途の技術である。それは、例えば、遺伝子発現部位の同定、転写物の組織分布の分析、ウイルス感染の同定と局在化、特定のｍＲＮＡ合成における変化の追跡及び染色体マッピングにおける補助に有用である。
インサイツハイブリッド形成は、Ｌｕ及びＧｉｌｌｅｔｔ， Ｃｅｌｌ Ｖｉｓｉｏｎ １： １６９−１７６ （１９９４）のプロトコールの最適化バージョンに従って、ＰＣＲ生成３３Ｐ−標識リボプローブを用いて実施される。簡単には、ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト組織を切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼＫ（２０ｇ／ｍｌ）で１５分間３７℃で脱タンパクし、さらに上掲のＬｕ及びＧｉｌｌｅｔｔに記載されたようにインサイツハイブリッド形成する。（３３−Ｐ）ＵＴＰ−標識アンチセンスリボプローブをＰＣＲ産物から生成し、５５℃で終夜ハイブリッド形成する。スライドをＫｏｄａｋ ＮＴＢ２ＴＭ核トラックエマルションに浸漬して４週間露出する。
６．２４．１．３３Ｐ−リボプローブ合成
６．０μｌ（１２５ｍＣｉ）の３３Ｐ−ＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢＦ １００２， ＳＡ＜２０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）をスピード真空乾燥させた。乾燥３３Ｐ−ＵＴＰを含む各管に以下の成分を添加した：
２．０μｌの５ｘ転写バッファー
１．０μｌのＤＴＴ（１００ｍＭ）
２．０μｌのＮＴＰ混合物（２．５ｍＭ： 各１０μｌの１０ｍＭ ＧＴＰ， ＣＴＰ及びＡＴＰ＋１０μｌのＨ２Ｏ）
１．０μｌのＵＴＰ（５０μＭ）
１．０μｌのＲＮＡｓｉｎ
１．０μｌのＤＮＡテンプレート（１μｇ）
１．０μｌのＨ２Ｏ
１．０μｌのＲＮＡポリメラーゼ（ＰＣＲ産物についてＴ３＝ＡＳ， Ｔ７＝Ｓ，通常）
チューブを３７℃で１時間インキュベートした。１．０μｌのＲＱ１ ＤＮａｓｅを添加し、次いで３７℃で１５分間インキュベートした。９０μｌのＴＥ（１０ｍＭトリスｐＨ７．６／１ｍＭのＥＤＴＡｐＨ８．０）を添加し、混合物をＤＥ８１紙にピペットした。残りの溶液をＭＩＣＲＯＣＯＮ−５０ＴＭ限外濾過ユニットに負荷し、プログラム１０を用いてスピンさせた（６分間）。濾過ユニットを第２の管に変換し、プログラム２を用いてスピンさせた（３分間）。最終回収スピンの後、１００μｌのＴＥを添加した。１μｌの最終生成物をＤＥ８１紙にピペットし６ｍｌのＢＩＯＦＬＵＯＲ ＩＩＴＭで数えた。
プローブをＴＢＥ／尿素ゲル上で泳動した。１−３μｌのプローブ又は５μｌのＲＮＡ ＭｒｋＩＩＩを３μｌの負荷バッファーに添加した。加熱ブロック上で９５℃に３分間加熱した後、ゲルを即座に氷上に置いた。ゲルのウェルをフラッシングし、試料を負荷し、１８０−２５０ボルトで４５分間泳動した。ゲルをプラスチックラップ（ＳＡＲＡＮＴＭ商標）でラップし、−７０℃冷凍機内で補強スクリーンを持つＸＡＲフィルムに１時間から終夜露出した。
【０１５１】
６．２４．２．３３Ｐ−ハイブリッド形成
６．２４．２．１．凍結切片の前処理
スライドを冷凍機から取り出し、アルミニウムトレイに配置して室温で１０分間解凍した。トレイを５５℃のインキュベータに５分間配置して凝結を減らした。スライドを蒸気フード内において氷上４％パラホルムアルデヒド中で５分間固定し、０．５ｘＳＳＣで５分間室温で洗浄した（２５ｍｌ ２０ｘＳＳＣ ＋ ９７５ｍｌ ＳＱ Ｈ２Ｏ）。０．５μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ中、３７℃で１０分間の脱タンパクの後（２５０ｍｌの予備加熱ＲＮａｓｅ無しＲＮａｓｅバッファー中の１０ｍｇ／ｍｌストック１２．５μｌ）、切片を０．５ｘＳＳＣで１０分間室温で洗浄した。切片を、７０％、９５％、及び１００％エタノール中、各２分間脱水した。
６．２４．２．２．パラフィン包埋切片の前処理
スライドを脱パラフィンし、ＳＱ Ｈ２Ｏ中に配置し、２ｘＳＳＣで室温において各々５分間２回リンスした。切片を２０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮａｓｅ無しＲＮａｓｅバッファー中１０ｍｇ／ｍｌを５００μｌ；３７℃、１５分間）−ヒト胚組織又は８ｘプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮａｓｅバッファー中１００μｌ、３７℃、３０分間）−ホルマリン組織で脱タンパクした。続く０．５ｘＳＳＣでのリンス及び脱水は上記のように実施した。
６．２４．２．３．プレハイブリッド化
スライドをＢｏｘバッファー（４ ｘ ＳＳＣ、５０％ホルムアミド）−飽和濾紙で列を作ったプラスチックボックスに並べた。組織を５０μｌのハイブリッド形成バッファー（３．７５ｇデキストラン硫酸＋６ｍｌＳＱ Ｈ２Ｏ）で被覆し、ボルテックスし、キャップを外して２分間マイクロ波で加熱した。氷上で冷却した後、１８．７５ｍｌのホルムアミド、３．７５ｍｌの２０ｘＳＳＣ及び９ｍｌのＳＱ Ｈ２Ｏを添加し、組織を良くボルテックスし、４２℃で１−４時間インキュベートした。
６．２４．２．４．ハイブリッド形成
スライド当たり１．０ｘ１０６ｃｐｍのプローブ及び１．０μｌのｔＲＮＡ（５０ｍｇ／ｍｌストック）を９５℃で３分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、スライド当たり４８μｌのハイブリッド形成バッファーを添加した。ボルテックスの後、５０μｌの３３Ｐ混合物をスライド上のプレハイブリッド５０μｌに添加した。スライドを５５℃で終夜インキュベートした。
６．２４．２．５．洗浄
洗浄は、２ｘ１０分間、２ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡで室温で実施し（４００ｍｌの２０ｘＳＳＣ＋１６ｍｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ、Ｖｆ＝４Ｌ）、次いでＲＮＡｓｅＡ処理を３７℃で３０分間行った（２５０ｍｌＲＮａｓｅバッファー中１０ｍｇ／ｍｌを５００μｌ＝２０μｇ／ｍｌ）。スライドを２ｘ１０分間、２ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡで室温において洗浄した。緊縮性洗浄条件は次の通り：５５℃で２時間、０．１ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡ（２０ｍｌの２０ｘＳＳＣ＋１６ｍｌのＥＤＴＡ、Ｖｆ＝４Ｌ）。
【０１５２】
６．２４．２．６．オリゴヌクレオチド
ここに開示したＤＮＡ配列の３つについてインサイツ分析を実施した。プローブを作成するのに使用したプライマー及び／又はこれらの分析に対して用いたプローブは次の通りである：
2004516013.tif 000030
【０１５３】
６．２４．２．７．結果
インサイツ分析が実施され、これらの解析結果が以下に示される：
６．２４．２．７．１．ＤＮＡ３３１００−１１５９（ＰＲＯ２２９）（スカベンジャー−Ｒ／ＣＤ６ホモログＴＮＦモチーフ）
特異的なポジティブシグナルがヒト胎児及び成人の単核貪食細胞（マクロファージ）、脾臓、肝臓、リンパ節及び胸腺中に観察された。他の全ての細胞はネガティブであった。
６．２４．２．７．２．ＤＮＡ３４４３１−１１７７（ＰＲＯ２６３）（ＣＤ４４）
特異的なポジティブシグナルがヒト胎児組織及び胎盤の単核細胞中に、強い発現を伴って副腎皮質の上皮細胞中に観察された。全ての成人組織はネガティブであった。
６．２４．２．７．３．ＤＮＡ３８２６８−１１８８（ＰＲＯ２９５）（インテグリン）
特異的なポジティブシグナルがヒト胎児神経節細胞、胎児神経細胞、成人副腎髄質、及び成人神経細胞中に観察された。他の全ての組織はネガティブであった。
６．２４．２．７．４．ＤＮＡ６４９０８−１１６３−１（ＰＲＯ１４４９）
特異的なポジティブシグナルが発生中の脈管構造（Ｅ７からＥ１１）、内皮細胞及び内皮細胞前駆体中に、ホールマウントのマウス胎児インサイツハイブリダイゼーションにおいて観察された（Ｆｉｇ３７５）。また、特異的な発現がＥ１２以後の血管及び表皮のサブセット中にも観察された。ＰＲＯ１４４９と約７８％のアミノ酸同一性を持つＰＲＯ１４４９のマウスオルソログがプローブとして使用された。
正常な成人組織中において、発現は低いレベルから全く確認されないものまであった。存在する場合、発現は血管に限定された（Ｆｉｇ３７６）。さらに、Ｆｉｇ３７６は、成人組織における最も高い発現は、脳の白質内の血管中に局部的に観察されたことを示す。また、限定はしないが、腫瘍の脈管構造を含む多くの炎症化及び疾患性組織の脈管構造中においても、上昇した発現が観察された。続くマウスＰＲＯ１４４９のオルソログのニワトリ胎児の眼中の脈絡膜層へのエレクトロポレーションの結果、新規血管形成がエレクトロポレーションされた眼（右上）中に観察されたが、同じ胎児由来のコントロール側（左上）、または、コントロールのｃＤＮＡでエレクトロポレーションが行われた胎児（右下）においては観察されなかった（Ｆｉｇ３７７）。
【０１５４】
６．２５．実施例２５：内皮細胞成長の塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）刺激性増殖の阻害
内皮細胞のｂＦＧＦ刺激性増殖を阻害する様々なＰＲＯポリペプチドの能力を試験した。このアッセイでポジティブと試験されるポリペプチドは、このような効果が有益である哺乳動物での内皮細胞成長を阻害するために、例えば腫瘍成長を阻害するために有用である。
具体的には、内皮細胞成長培地（ＥＧＭ， Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ， Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を細胞密度５ｘ１０３細胞／ウェル、体積１００μｌ／ウェルで９６穴マイクロタイタープレートに蒔いた。播種の翌日（２日目）に、成長培地を取り除き、飢餓培地（１％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンを補足したＭ１９９）と交換して２４時間細胞を飢餓させた。５日目、細胞を：（１）１０％のＦＢＳを含有するＭ１９９；（２）１％のＦＢＳを含有するＭ１９９；（３）１％のＦＢＳ及び２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含有するＭ１９９；（４）１％のＦＢＳ及び２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及びＰＲＯポリペプチド（５００ｎＭ）を含有するＭ１９９；（５）１％のＦＢＳ及び２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及びＰＲＯポリペプチド（５０ｎＭ）を含有するＭ１９９；又は（６）１％のＦＢＳ及び２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及びＰＲＯポリペプチド（５ｎＭ）を含有するＭ１９９の何れかで処理した。８日目、アラマーブルーアッセイにより細胞増殖の評価を行った。マイクロプレートリーダーを使って励起５３０及び発光５９０ｎｍで吸光度（ＯＤ）を測定した。
ＰＲＯポリペプチドの活性を、刺激なしの細胞に対するｂＦＧＦ刺激性増殖の阻害パーセントとして計測した。結果は癌治療、特に腫瘍血管形成の阻害でのＰＲＯポリペプチドの有用性を示すものである。数値（相対的な阻害）は、刺激のない細胞に対するＰＲＯポリペプチドによるｂＦＧＦ刺激性増殖の阻害パーセントを計算することにより決定した。結果は、ＰＲＯポリペプチドが３０％又はそれより高い内皮細胞成長のｂＦＥＧＦ刺激の阻害を示す場合にポジティブとみなす。
このアッセイにおいてＰＲＯ５７２５がポジティブと試験された。
【０１５５】
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【Ｆｉｇ１】Ｆｉｇ１は、天然配列ＰＲＯ１８１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１）を示し、配列番号：１は、ここで「ＤＮＡ２３３３０−１３９０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２】Ｆｉｇ２は、Ｆｉｇ１に示した配列番号：１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。
【Ｆｉｇ３】Ｆｉｇ３は、天然配列ＰＲＯ１７８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３）を示し、配列番号：３は、ここで「ＤＮＡ２３３３９−１１３０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ４】Ｆｉｇ４は、Ｆｉｇ３に示した配列番号：３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４）を示す。
【Ｆｉｇ５】Ｆｉｇ５は、天然配列ＰＲＯ４４４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５）を示し、配列番号：５は、ここで「ＤＮＡ２６８４６−１３９７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ６】Ｆｉｇ６は、Ｆｉｇ５に示した配列番号：５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６）を示す。
【Ｆｉｇ７】Ｆｉｇ７は、天然配列ＰＲＯ１９５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：７）を示し、配列番号：７は、ここで「ＤＮＡ２６８４７−１３９５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ８】Ｆｉｇ８は、Ｆｉｇ７に示した配列番号：７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：８）を示す。
【Ｆｉｇ９】Ｆｉｇ９は、天然配列ＰＲＯ１８２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：９）を示し、配列番号：９は、ここで「ＤＮＡ２７８６５−１０９１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１０】Ｆｉｇ１０は、Ｆｉｇ９に示した配列番号：９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１０）を示す。
【Ｆｉｇ１１】Ｆｉｇ１１は、天然配列ＰＲＯ２０５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１１）を示し、配列番号：１１は、ここで「ＤＮＡ３０８６８−１１５６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１２】Ｆｉｇ１２は、Ｆｉｇ１１に示した配列番号：１１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１２）を示す。
【Ｆｉｇ１３】Ｆｉｇ１３は、天然配列ＰＲＯ２０４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１３）を示し、配列番号：１３は、ここで「ＤＮＡ３０８７１−１１５７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１４】Ｆｉｇ１４は、Ｆｉｇ１３に示した配列番号：１３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１４）を示す。
【Ｆｉｇ１５】Ｆｉｇ１５は、天然配列ＰＲＯ１８７３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１５）を示し、配列番号：１５は、ここで「ＤＮＡ３０８８０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１６】Ｆｉｇ１６は、Ｆｉｇ１５に示した配列番号：１５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１６）を示す。
【Ｆｉｇ１７】Ｆｉｇ１７は、天然配列ＰＲＯ２１４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１７）を示し、配列番号：１７は、ここで「ＤＮＡ３２２８６−１１９１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１８】Ｆｉｇ１８は、Ｆｉｇ１７に示した配列番号：１７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１８）を示す。
【Ｆｉｇ１９】Ｆｉｇ１９は、天然配列ＰＲＯ２２１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１９）を示し、配列番号：１９は、ここで「ＤＮＡ３３０８９−１１３２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２０】Ｆｉｇ２０は、Ｆｉｇ１９に示した配列番号：１９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２０）を示す。
【Ｆｉｇ２１】Ｆｉｇ２１は、天然配列ＰＲＯ２２８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２１）を示し、配列番号：２１は、ここで「ＤＮＡ３３０９２−１２０２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２２】Ｆｉｇ２２は、Ｆｉｇ２１に示した配列番号：２１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２２）を示す。
【Ｆｉｇ２３】Ｆｉｇ２３は、天然配列ＰＲＯ２２９ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２３）を示し、配列番号：２３は、ここで「ＤＮＡ３３１００−１１５９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２４】Ｆｉｇ２４は、Ｆｉｇ２３に示した配列番号：２３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２４）を示す。
【Ｆｉｇ２５】Ｆｉｇ２５は、天然配列ＰＲＯ２３０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２５）を示し、配列番号：２５は、ここで「ＤＮＡ３３２２３−１１３６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２６】Ｆｉｇ２６は、Ｆｉｇ２５に示した配列番号：２５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２６）を示す。
【Ｆｉｇ２７】Ｆｉｇ２７は、天然配列ＰＲＯ７２２３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２７）を示し、配列番号：２７は、ここで「ＤＮＡ３４３８５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２８】Ｆｉｇ２８は、Ｆｉｇ２７に示した配列番号：２７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２８）を示す。
【Ｆｉｇ２９】Ｆｉｇ２９は、天然配列ＰＲＯ２４１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２９）を示し、配列番号：２９は、ここで「ＤＮＡ３４３９２−１１７０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３０】Ｆｉｇ３０は、Ｆｉｇ２９に示した配列番号：２９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３０）を示す。
【Ｆｉｇ３１】Ｆｉｇ３１は、天然配列ＰＲＯ２６３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３１）を示し、配列番号：３１は、ここで「ＤＮＡ３４４３１−１１７７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３２】Ｆｉｇ３２は、Ｆｉｇ３１に示した配列番号：３１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【Ｆｉｇ３３】Ｆｉｇ３３は、天然配列ＰＲＯ３２１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３３）を示し、配列番号：３３は、ここで「ＤＮＡ３４４３３−１３０８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３４】Ｆｉｇ３４は、Ｆｉｇ３３に示した配列番号：３３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３４）を示す。
【Ｆｉｇ３５】Ｆｉｇ３５は、天然配列ＰＲＯ２３１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３５）を示し、配列番号：３５は、ここで「ＤＮＡ３４４３４−１１３９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３６】Ｆｉｇ３６は、Ｆｉｇ３５に示した配列番号：３５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３６）を示す。
【Ｆｉｇ３７】Ｆｉｇ３７は、天然配列ＰＲＯ２３８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３７）を示し、配列番号：３７は、ここで「ＤＮＡ３５６００−１１６２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３８】Ｆｉｇ３８は、Ｆｉｇ３７に示した配列番号：３７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３８）を示す。
【Ｆｉｇ３９】Ｆｉｇ３９は、天然配列ＰＲＯ２４７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３９）を示し、配列番号：３９は、ここで「ＤＮＡ３５６７３−１２０１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ４０】Ｆｉｇ４０は、Ｆｉｇ３９に示した配列番号：３９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４０）を示す。
【Ｆｉｇ４１】Ｆｉｇ４１は、天然配列ＰＲＯ２５６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４１）を示し、配列番号：４１は、ここで「ＤＮＡ３５８８０−１１６０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ４２】Ｆｉｇ４２は、Ｆｉｇ４１に示した配列番号：４１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４２）を示す。
【Ｆｉｇ４３】Ｆｉｇ４３は、天然配列ＰＲＯ２５８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４３）を示し、配列番号：４３は、ここで「ＤＮＡ３５９１８−１１７４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ４４】Ｆｉｇ４４は、Ｆｉｇ４３に示した配列番号：４３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４４）を示す。
【Ｆｉｇ４５】Ｆｉｇ４５は、天然配列ＰＲＯ２６５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４５）を示し、配列番号：４５は、ここで「ＤＮＡ３６３５０−１１５８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ４６】Ｆｉｇ４６は、Ｆｉｇ４５に示した配列番号：４５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４６）を示す。
【Ｆｉｇ４７】Ｆｉｇ４７は、天然配列ＰＲＯ２１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４７）を示し、配列番号：４７は、ここで「ＤＮＡ３６６３８−１０５６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ４８】Ｆｉｇ４８は、Ｆｉｇ４７に示した配列番号：４７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４８）を示す。
【Ｆｉｇ４９】Ｆｉｇ４９は、天然配列ＰＲＯ２９５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４９）を示し、配列番号：４９は、ここで「ＤＮＡ３８２６８−１１８８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ５０】Ｆｉｇ５０は、Ｆｉｇ４９に示した配列番号：４９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５０）を示す。
【Ｆｉｇ５１】Ｆｉｇ５１は、天然配列ＰＲＯ３０２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５１）を示し、配列番号：５１は、ここで「ＤＮＡ４０３７０−１２１７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ５２】Ｆｉｇ５２は、Ｆｉｇ５１に示した配列番号：５１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５２）を示す。
【Ｆｉｇ５３】Ｆｉｇ５３は、天然配列ＰＲＯ３０１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５３）を示し、配列番号：５３は、ここで「ＤＮＡ４０６２８−１２１６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ５４】Ｆｉｇ５４は、Ｆｉｇ５３に示した配列番号：５３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５４）を示す。
【Ｆｉｇ５５】Ｆｉｇ５５は、天然配列ＰＲＯ３３７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５５）を示し、配列番号：５５は、ここで「ＤＮＡ４３３１６−１２３７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ５６】Ｆｉｇ５６は、Ｆｉｇ５５に示した配列番号：５５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５６）を示す。
【Ｆｉｇ５７】Ｆｉｇ５７は、天然配列ＰＲＯ７２４８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５７）を示し、配列番号：５７は、ここで「ＤＮＡ４４１９５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ５８】Ｆｉｇ５８は、Ｆｉｇ５７に示した配列番号：５７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５８）を示す。
【Ｆｉｇ５９】Ｆｉｇ５９は、天然配列ＰＲＯ８４６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５９）を示し、配列番号：５９は、ここで「ＤＮＡ４４１９６−１３５３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ６０】Ｆｉｇ６０は、Ｆｉｇ５９に示した配列番号：５９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６０）を示す。
【Ｆｉｇ６１】Ｆｉｇ６１は、天然配列ＰＲＯ１８６４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：６１）を示し、配列番号：６１は、ここで「ＤＮＡ４５４０９−２５１１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ６２】Ｆｉｇ６２は、Ｆｉｇ６１に示した配列番号：６１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６２）を示す。
【Ｆｉｇ６３】Ｆｉｇ６３は、天然配列ＰＲＯ３６３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：６３）を示し、配列番号：６３は、ここで「ＤＮＡ４５４１９−１２５２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ６４】Ｆｉｇ６４は、Ｆｉｇ６３に示した配列番号：６３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６４）を示す。
【Ｆｉｇ６５】Ｆｉｇ６５は、天然配列ＰＲＯ７３０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：６５）を示し、配列番号：６５は、ここで「ＤＮＡ４５６２４−１４００」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ６６】Ｆｉｇ６６は、Ｆｉｇ６５に示した配列番号：６５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６６）を示す。
【Ｆｉｇ６７】Ｆｉｇ６７は、天然配列ＰＲＯ３６５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：６７）を示し、配列番号：６７は、ここで「ＤＮＡ４６７７７−１２５３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ６８】Ｆｉｇ６８は、Ｆｉｇ６７に示した配列番号：６７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６８）を示す。
【Ｆｉｇ６９】Ｆｉｇ６９は、天然配列ＰＲＯ５３２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：６９）を示し、配列番号：６９は、ここで「ＤＮＡ４８３３５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ７０】Ｆｉｇ７０は、Ｆｉｇ６９に示した配列番号：６９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：７０）を示す。
【Ｆｉｇ７１】Ｆｉｇ７１は、天然配列ＰＲＯ３２２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：７１）を示し、配列番号：７１は、ここで「ＤＮＡ４８３３６−１３０９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ７２】Ｆｉｇ７２は、Ｆｉｇ７１に示した配列番号：７１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：７２）を示す。
【Ｆｉｇ７３】Ｆｉｇ７３は、天然配列ＰＲＯ１１２０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：７３）を示し、配列番号：７３は、ここで「ＤＮＡ４８６０６−１４７９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ７４】Ｆｉｇ７４は、Ｆｉｇ７３に示した配列番号：７３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：７４）を示す。
【Ｆｉｇ７５】Ｆｉｇ７５は、天然配列ＰＲＯ７２６１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：７５）を示し、配列番号：７５は、ここで「ＤＮＡ４９１４９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ７６】Ｆｉｇ７６は、Ｆｉｇ７５に示した配列番号：７５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：７６）を示す。
【Ｆｉｇ７７】Ｆｉｇ７７は、天然配列ＰＲＯ５３３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：７７）を示し、配列番号：７７は、ここで「ＤＮＡ４９４３５−１２１９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ７８】Ｆｉｇ７８は、Ｆｉｇ７７に示した配列番号：７７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：７８）を示す。
【Ｆｉｇ７９】Ｆｉｇ７９は、天然配列ＰＲＯ７２４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：７９）を示し、配列番号：７９は、ここで「ＤＮＡ４９６３１−１３２８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ８０】Ｆｉｇ８０は、Ｆｉｇ７９に示した配列番号：７９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：８０）を示す。
【Ｆｉｇ８１】Ｆｉｇ８１は、天然配列ＰＲＯ７３４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：８１）を示し、配列番号：８１は、ここで「ＤＮＡ４９８１７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ８２】Ｆｉｇ８２ａ−ｂは、Ｆｉｇ８１に示した配列番号：８１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：８２）を示す。
【Ｆｉｇ８３】Ｆｉｇ８３は、天然配列ＰＲＯ７７１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：８３）を示し、配列番号：８３は、ここで「ＤＮＡ４９８２９−１３４６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ８４】Ｆｉｇ８４は、Ｆｉｇ８３に示した配列番号：８３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：８４）を示す。
【Ｆｉｇ８５】Ｆｉｇ８５は、天然配列ＰＲＯ２０１０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：８５）を示し、配列番号：８５は、ここで「ＤＮＡ５０７９２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ８６】Ｆｉｇ８６は、Ｆｉｇ８５に示した配列番号：８５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：８６）を示す。
【Ｆｉｇ８７】Ｆｉｇ８７は、天然配列ＰＲＯ８７１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：８７）を示し、配列番号：８７は、ここで「ＤＮＡ５０９１９−１３６１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ８８】Ｆｉｇ８８は、Ｆｉｇ８７に示した配列番号：８７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：８８）を示す。
【Ｆｉｇ８９】Ｆｉｇ８９は、天然配列ＰＲＯ６９７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：８９）を示し、配列番号：８９は、ここで「ＤＮＡ５０９２０−１３２５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ９０】Ｆｉｇ９０は、Ｆｉｇ８９に示した配列番号：８９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：９０）を示す。
【Ｆｉｇ９１】Ｆｉｇ９１は、天然配列ＰＲＯ１０８３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：９１）を示し、配列番号：９１は、ここで「ＤＮＡ５０９２１−１４５８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ９２】Ｆｉｇ９２は、Ｆｉｇ９１に示した配列番号：９１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２２）を示す。
【Ｆｉｇ９３】Ｆｉｇ９３は、天然配列ＰＲＯ７２５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：９３）を示し、配列番号：９３は、ここで「ＤＮＡ５２７５８−１３９９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ９４】Ｆｉｇ９４は、Ｆｉｇ９３に示した配列番号：９３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：９４）を示す。
【Ｆｉｇ９５】Ｆｉｇ９５は、天然配列ＰＲＯ７２０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：９５）を示し、配列番号：９５は、ここで「ＤＮＡ５３５１７−１３６６−１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ９６】Ｆｉｇ９６は、Ｆｉｇ９５に示した配列番号：９５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：９６）を示す。
【Ｆｉｇ９７】Ｆｉｇ９７は、天然配列ＰＲＯ７３８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：９７）を示し、配列番号：９７は、ここで「ＤＮＡ５３９１５−１２５８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ９８】Ｆｉｇ９８は、Ｆｉｇ９７に示した配列番号：９７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：９８）を示す。
【Ｆｉｇ９９】Ｆｉｇ９９は、天然配列ＰＲＯ８６５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：９９）を示し、配列番号：９９は、ここで「ＤＮＡ５３９７４−１４０１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１００】Ｆｉｇ１００は、Ｆｉｇ９９に示した配列番号：９９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１００）を示す。
【Ｆｉｇ１０１】Ｆｉｇ１０１は、天然配列ＰＲＯ８４０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１０１）を示し、配列番号：１０１は、ここで「ＤＮＡ５３９８７−１４３８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１０２】Ｆｉｇ１０２は、Ｆｉｇ１０１に示した配列番号：１０１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１０２）を示す。
【Ｆｉｇ１０３】Ｆｉｇ１０３は、天然配列ＰＲＯ１０８０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１０３）を示し、配列番号：１０３は、ここで「ＤＮＡ５６０４７−１４５６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１０４】Ｆｉｇ１０４は、Ｆｉｇ１０３に示した配列番号：１０３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１０４）を示す。
【Ｆｉｇ１０５】Ｆｉｇ１０５は、天然配列ＰＲＯ１０７９ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１０５）を示し、配列番号：１０５は、ここで「ＤＮＡ５６０５０−１４５５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１０６】Ｆｉｇ１０６は、Ｆｉｇ１０５に示した配列番号：１０５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１０６）を示す。
【Ｆｉｇ１０７】Ｆｉｇ１０７は、天然配列ＰＲＯ７９３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１０７）を示し、配列番号：１０７は、ここで「ＤＮＡ５６１１０−１４３７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１０８】Ｆｉｇ１０８は、Ｆｉｇ１０７に示した配列番号：１０７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１０８）を示す。
【Ｆｉｇ１１９】Ｆｉｇ１０９は、天然配列ＰＲＯ７８８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１０９）を示し、配列番号：１０９は、ここで「ＤＮＡ５６４０５−１３５７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１１０】Ｆｉｇ１１０は、Ｆｉｇ１０９に示した配列番号：１０９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１１０）を示す。
【Ｆｉｇ１１１】Ｆｉｇ１１１は、天然配列ＰＲＯ９３８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１１１）を示し、配列番号：１１１は、ここで「ＤＮＡ５６４３３−１４０６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１１２】Ｆｉｇ１１２は、Ｆｉｇ１１１に示した配列番号：１１１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１１２）を示す。
【Ｆｉｇ１１３】Ｆｉｇ１１３は、天然配列ＰＲＯ１０１２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１１３）を示し、配列番号：１１３は、ここで「ＤＮＡ５６４３９−１３７６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１１４】Ｆｉｇ１１４は、Ｆｉｇ１１３に示した配列番号：１１３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１１４）を示す。
【Ｆｉｇ１１５】Ｆｉｇ１１５は、天然配列ＰＲＯ１４７７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１１５）を示し、配列番号：１１５は、ここで「ＤＮＡ５６５２９−１６４７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１１６】Ｆｉｇ１１６は、Ｆｉｇ１１５に示した配列番号：１１５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１１６）を示す。
【Ｆｉｇ１１７】Ｆｉｇ１１７は、天然配列ＰＲＯ１１３４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１１７）を示し、配列番号：１１７は、ここで「ＤＮＡ５６８６５−１４９１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１１８】Ｆｉｇ１１８は、Ｆｉｇ１１７に示した配列番号：１１７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１１８）を示す。
【Ｆｉｇ１１９】Ｆｉｇ１１９は、天然配列ＰＲＯ１６２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１１９）を示し、配列番号：１１９は、ここで「ＤＮＡ５６９６５−１３５６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１２０】Ｆｉｇ１２０は、Ｆｉｇ１１９に示した配列番号：１１９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１２０）を示す。
【Ｆｉｇ１２１】Ｆｉｇ１２１は、天然配列ＰＲＯ１１１４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１２１）を示し、配列番号：１２１は、ここで「ＤＮＡ５７０３３−１４３０−１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１２２】Ｆｉｇ１２２は、Ｆｉｇ１２１に示した配列番号：１２１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１２２）を示す。
【Ｆｉｇ１２３】Ｆｉｇ１２３は、天然配列ＰＲＯ８２８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１２３）を示し、配列番号：１２３は、ここで「ＤＮＡ５７０３７−１４４４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１２４】Ｆｉｇ１２４は、Ｆｉｇ１２３に示した配列番号：１２３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１２４）を示す。
【Ｆｉｇ１２５】Ｆｉｇ１２５は、天然配列ＰＲＯ８２７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１２５）を示し、配列番号：１２５は、ここで「ＤＮＡ５７０３９−１４０２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１２６】Ｆｉｇ１２６は、Ｆｉｇ１２５に示した配列番号：１２５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１２６）を示す。
【Ｆｉｇ１２７】Ｆｉｇ１２７は、天然配列ＰＲＯ１０７５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１２７）を示し、配列番号：１２７は、ここで「ＤＮＡ５７６８９−１３８５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１２８】Ｆｉｇ１２８は、Ｆｉｇ１２７に示した配列番号：１２７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１２８）を示す。
【Ｆｉｇ１２９】Ｆｉｇ１２９は、天然配列ＰＲＯ１００７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１２９）を示し、配列番号：１２９は、ここで「ＤＮＡ５７６９０−１３７４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１３０】Ｆｉｇ１３０は、Ｆｉｇ１２９に示した配列番号：１２９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１３０）を示す。
【Ｆｉｇ１３１】Ｆｉｇ１３１は、天然配列ＰＲＯ８２６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１３１）を示し、配列番号：１３１は、ここで「ＤＮＡ５７６９４−１３４１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１３２】Ｆｉｇ１３２は、Ｆｉｇ１３１に示した配列番号：１３１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１３２）を示す。
【Ｆｉｇ１３３】Ｆｉｇ１３３は、天然配列ＰＲＯ８１９ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１３３）を示し、配列番号：１３２は、ここで「ＤＮＡ５７６９５−１３４０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１３４】Ｆｉｇ１３４は、Ｆｉｇ１３３に示した配列番号：１３３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１３４）を示す。
【Ｆｉｇ１３５】Ｆｉｇ１３５は、天然配列ＰＲＯ１００６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１３５）を示し、配列番号：１３５は、ここで「ＤＮＡ５７６９９−１４１２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１３６】Ｆｉｇ１３６は、Ｆｉｇ１３５に示した配列番号：１３５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１３６）を示す。
【Ｆｉｇ１３７】Ｆｉｇ１３７は、天然配列ＰＲＯ９８２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１３７）を示し、配列番号：１３７は、ここで「ＤＮＡ５７７００−１４０８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１３８】Ｆｉｇ１３８は、Ｆｉｇ１３７に示した配列番号：１３７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１３８）を示す。
【Ｆｉｇ１３９】Ｆｉｇ１３９は、天然配列ＰＲＯ１００５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１３９）を示し、配列番号：１３９は、ここで「ＤＮＡ５７７０８−１４１１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１４０】Ｆｉｇ１４０は、Ｆｉｇ１３９に示した配列番号：１３９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１４０）を示す。
【Ｆｉｇ１４１】Ｆｉｇ１４１は、天然配列ＰＲＯ７９１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１４１）を示し、配列番号：１４１は、ここで「ＤＮＡ５７８３８−１３３７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１４２】Ｆｉｇ１４２は、Ｆｉｇ１４１に示した配列番号：１４１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１４２）を示す。
【Ｆｉｇ１４３】Ｆｉｇ１４３は、天然配列ＰＲＯ１０７１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１４３）を示し、配列番号：１４３は、ここで「ＤＮＡ５８８４７−１３８３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１４４】Ｆｉｇ１４４は、Ｆｉｇ１４３に示した配列番号：１４３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１４４）を示す。
【Ｆｉｇ１４５】Ｆｉｇ１４５は、天然配列ＰＲＯ１４１５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１４５）を示し、配列番号：１４５は、ここで「ＤＮＡ５８８５２−１６３７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１４６】Ｆｉｇ１４６は、Ｆｉｇ１４５に示した配列番号：１４５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１４６）を示す。
【Ｆｉｇ１４７】Ｆｉｇ１４７は、天然配列ＰＲＯ１０５４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１４７）を示し、配列番号：１４７は、ここで「ＤＮＡ５８８５３−１４２３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１４８】Ｆｉｇ１４８は、Ｆｉｇ１４７に示した配列番号：１４７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１４８）を示す。
【Ｆｉｇ１４９】Ｆｉｇ１４９は、天然配列ＰＲＯ１４１１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１４９）を示し、配列番号：１４９は、ここで「ＤＮＡ５９２１２−１６２７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１５０】Ｆｉｇ１５０は、Ｆｉｇ１４９に示した配列番号：１４９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１５０）を示す。
【Ｆｉｇ１５１】Ｆｉｇ１５１は、天然配列ＰＲＯ１１８４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１５１）を示し、配列番号：１５１は、ここで「ＤＮＡ５９２２０−１５１４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１５２】Ｆｉｇ１５２は、Ｆｉｇ１５１に示した配列番号：１５１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１５２）を示す。
【Ｆｉｇ１５３】Ｆｉｇ１５３は、天然配列ＰＲＯ１０２９ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１５３）を示し、配列番号：１５３は、ここで「ＤＮＡ５９４９３−１４２０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１５４】Ｆｉｇ１５４は、Ｆｉｇ１５３に示した配列番号：１５３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１５４）を示す。
【Ｆｉｇ１５５】Ｆｉｇ１５５は、天然配列ＰＲＯ１１３９ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１５５）を示し、配列番号：１５５は、ここで「ＤＮＡ５９４９７−１４９６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１５６】Ｆｉｇ１５６は、Ｆｉｇ１５５に示した配列番号：１５５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１５６）を示す。
【Ｆｉｇ１５７】Ｆｉｇ１５７は、天然配列ＰＲＯ１１９０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１５７）を示し、配列番号：１５７は、ここで「ＤＮＡ５９５８６−１５２０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１５８】Ｆｉｇ１５８は、Ｆｉｇ１５７に示した配列番号：１５７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１５８）を示す。
【Ｆｉｇ１５９】Ｆｉｇ１５９は、天然配列ＰＲＯ１３０９ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１５９）を示し、配列番号：１５９は、ここで「ＤＮＡ５９５８８−１５７１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１６０】Ｆｉｇ１６０は、Ｆｉｇ１５９に示した配列番号：１５９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１６０）を示す。
【Ｆｉｇ１６１】Ｆｉｇ１６１は、天然配列ＰＲＯ８３６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１６１）を示し、配列番号：１６１は、ここで「ＤＮＡ５９６２０−１４６３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１６２】Ｆｉｇ１６２は、Ｆｉｇ１６１に示した配列番号：１６１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１６２）を示す。
【Ｆｉｇ１６３】Ｆｉｇ１６３は、天然配列ＰＲＯ１０２５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１６３）を示し、配列番号：１６３は、ここで「ＤＮＡ５９６２２−１３３４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１６４】Ｆｉｇ１６４は、Ｆｉｇ１６３に示した配列番号：１６３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１６４）を示す。
【Ｆｉｇ１６５】Ｆｉｇ１６５は、天然配列ＰＲＯ１１３１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１６５）を示し、配列番号：１６５は、ここで「ＤＮＡ５９７７７−１４８０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１６６】Ｆｉｇ１６６は、Ｆｉｇ１６５に示した配列番号：１６５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１６６）を示す。
【Ｆｉｇ１６７】Ｆｉｇ１６７は、天然配列ＰＲＯ１１８２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１６７）を示し、配列番号：１６７は、ここで「ＤＮＡ５９８４８−１５１２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１６８】Ｆｉｇ１６８は、Ｆｉｇ１６７に示した配列番号：１６７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１６８）を示す。
【Ｆｉｇ１６９】Ｆｉｇ１６９は、天然配列ＰＲＯ１１５５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１６９）を示し、配列番号：１６９は、ここで「ＤＮＡ５９８４９−１５０４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１７０】Ｆｉｇ１７０は、Ｆｉｇ１６９に示した配列番号：１６９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１７０）を示す。
【Ｆｉｇ１７１】Ｆｉｇ１７１は、天然配列ＰＲＯ１１８６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１７１）を示し、配列番号：１７１は、ここで「ＤＮＡ６０６２１−１５１６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１７２】Ｆｉｇ１７２は、Ｆｉｇ１７１に示した配列番号：１７１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１７２）を示す。
【Ｆｉｇ１７３】Ｆｉｇ１７３は、天然配列ＰＲＯ１１９８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１７３）を示し、配列番号：１７３は、ここで「ＤＮＡ６０６２２−１５２５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１７４】Ｆｉｇ１７４は、Ｆｉｇ１７３に示した配列番号：１７３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１７４）を示す。
【Ｆｉｇ１７５】Ｆｉｇ１７５は、天然配列ＰＲＯ１２６５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１７５）を示し、配列番号：１７５は、ここで「ＤＮＡ６０７６４−１５３３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１７６】Ｆｉｇ１７６は、Ｆｉｇ１７５に示した配列番号：１７５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１７６）を示す。
【Ｆｉｇ１７７】Ｆｉｇ１７７は、天然配列ＰＲＯ１３６１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１７７）を示し、配列番号：１７７は、ここで「ＤＮＡ６０７８３−１６１１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１７８】Ｆｉｇ１７８は、Ｆｉｇ１７７に示した配列番号：１７７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１７８）を示す。
【Ｆｉｇ１７９】Ｆｉｇ１７９は、天然配列ＰＲＯ１２８７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１７９）を示し、配列番号：１７９は、ここで「ＤＮＡ６１７５５−１５５４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１８０】Ｆｉｇ１８０は、Ｆｉｇ１７９に示した配列番号：１７９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１８０）を示す。
【Ｆｉｇ１８１】Ｆｉｇ１８１は、天然配列ＰＲＯ１３０８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１８１）を示し、配列番号：１８１は、ここで「ＤＮＡ６２３０６−１５７０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１８２】Ｆｉｇ１８２は、Ｆｉｇ１８１に示した配列番号：１８１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１８２）を示す。
【Ｆｉｇ１８３】Ｆｉｇ１８３は、天然配列ＰＲＯ４３１３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１８３）を示し、配列番号：１８３は、ここで「ＤＮＡ６２３１２−２５５８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１８４】Ｆｉｇ１８４は、Ｆｉｇ１８３に示した配列番号：１８３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１８４）を示す。
【Ｆｉｇ１８５】Ｆｉｇ１８５は、天然配列ＰＲＯ１１９２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１８５）を示し、配列番号：１８５は、ここで「ＤＮＡ６２８１４−１５２１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１８６】Ｆｉｇ１８６は、Ｆｉｇ１８５に示した配列番号：１８５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１８６）を示す。
【Ｆｉｇ１８７】Ｆｉｇ１８７は、天然配列ＰＲＯ１１６０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１８７）を示し、配列番号：１８７は、ここで「ＤＮＡ６２８７２−１５０９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１８８】Ｆｉｇ１８８は、Ｆｉｇ１８７に示した配列番号：１８７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１８８）を示す。
【Ｆｉｇ１８９】Ｆｉｇ１８９は、天然配列ＰＲＯ１２４４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１８９）を示し、配列番号：１８９は、ここで「ＤＮＡ６４８８３−１５２６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１９０】Ｆｉｇ１９０は、Ｆｉｇ１８９に示した配列番号：１８９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１９０）を示す。
【Ｆｉｇ１９１】Ｆｉｇ１９１は、天然配列ＰＲＯ１３５６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１９１）を示し、配列番号：１９１は、ここで「ＤＮＡ６４８８６−１６０１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１９２】Ｆｉｇ１９２は、Ｆｉｇ１９１に示した配列番号：１９１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１９２）を示す。
【Ｆｉｇ１９３】Ｆｉｇ１９３は、天然配列ＰＲＯ１２７４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１９３）を示し、配列番号：１９３は、ここで「ＤＮＡ６４８８９−１５４１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１９４】Ｆｉｇ１９４は、Ｆｉｇ１９３に示した配列番号：１９３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１９４）を示す。
【Ｆｉｇ１９５】Ｆｉｇ１９５は、天然配列ＰＲＯ１２７２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１９５）を示し、配列番号：１９５は、ここで「ＤＮＡ６４８９６−１５３９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１９６】Ｆｉｇ１９６は、Ｆｉｇ１９５に示した配列番号：１９５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１９６）を示す。
【Ｆｉｇ１９７】Ｆｉｇ１９７は、天然配列ＰＲＯ１４１２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１９７）を示し、配列番号：１９７は、ここで「ＤＮＡ６４８９７−１６２８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ１９８】Ｆｉｇ１９８は、Ｆｉｇ１９７に示した配列番号：１９７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１９８）を示す。
【Ｆｉｇ１９９】Ｆｉｇ１９９は、天然配列ＰＲＯ１２８６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１９９）を示し、配列番号：１９９は、ここで「ＤＮＡ６４９０３−１５５３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２００】Ｆｉｇ２００は、Ｆｉｇ１９９に示した配列番号：１９９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２００）を示す。
【Ｆｉｇ２０１】Ｆｉｇ２０１は、天然配列ＰＲＯ１３４７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２０１）を示し、配列番号：２０１は、ここで「ＤＮＡ６４９５０−１５９０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２０２】Ｆｉｇ２０２は、Ｆｉｇ２０１に示した配列番号：２０１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２０２）を示す。
【Ｆｉｇ２０３】Ｆｉｇ２０３は、天然配列ＰＲＯ１２７３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２０３）を示し、配列番号：２０３は、ここで「ＤＮＡ６５４０２−１５４０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２０４】Ｆｉｇ２０４は、Ｆｉｇ２０３に示した配列番号：２０３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２０４）を示す。
【Ｆｉｇ２０５】Ｆｉｇ２０５は、天然配列ＰＲＯ１２８３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２０５）を示し、配列番号：２０５は、ここで「ＤＮＡ６５４０４−１５５１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２０６】Ｆｉｇ２０６は、Ｆｉｇ２０５に示した配列番号：２０５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２０６）を示す。
【Ｆｉｇ２０７】Ｆｉｇ２０７は、天然配列ＰＲＯ１２７９ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２０７）を示し、配列番号：２０７は、ここで「ＤＮＡ６５４０５−１５４７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２０８】Ｆｉｇ２０８は、Ｆｉｇ２０７に示した配列番号：２０７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２０８）を示す。
【Ｆｉｇ２０９】Ｆｉｇ２０９は、天然配列ＰＲＯ１３０６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２０９）を示し、配列番号：２０９は、ここで「ＤＮＡ６５４１０−１５６９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２１０】Ｆｉｇ２１０は、Ｆｉｇ２０９に示した配列番号：２０９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２１０）を示す。
【Ｆｉｇ２１１】Ｆｉｇ２１１は、天然配列ＰＲＯ１１９５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２１１）を示し、配列番号：２１１は、ここで「ＤＮＡ６５４１２−１５２３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２１２】Ｆｉｇ２１２は、Ｆｉｇ２１１に示した配列番号：２１１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２１２）を示す。
【Ｆｉｇ２１３】Ｆｉｇ２１３は、天然配列ＰＲＯ４９９５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２１３）を示し、配列番号：２１３は、ここで「ＤＮＡ６６３０７−２６６１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２１４】Ｆｉｇ２１４は、Ｆｉｇ２１３に示した配列番号：２１３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２１４）を示す。
【Ｆｉｇ２１５】Ｆｉｇ２１５は、天然配列ＰＲＯ１３８２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２１５）を示し、配列番号：２１５は、ここで「ＤＮＡ６６５２６−１６１６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２１６】Ｆｉｇ２１６は、Ｆｉｇ２１５に示した配列番号：２１５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２１６）を示す。
【Ｆｉｇ２１７】Ｆｉｇ２１７は、天然配列ＰＲＯ１３２５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２１７）を示し、配列番号：２１７は、ここで「ＤＮＡ６６６５９−１５９３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２１８】Ｆｉｇ２１８は、Ｆｉｇ２１７に示した配列番号：２１７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２１８）を示す。
【Ｆｉｇ２１９】Ｆｉｇ２１９は、天然配列ＰＲＯ１３２９ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２１９）を示し、配列番号：２１９は、ここで「ＤＮＡ６６６６０−１５８５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２２０】Ｆｉｇ２２０は、Ｆｉｇ２１９に示した配列番号：２１９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２２０）を示す。
【Ｆｉｇ２２１】Ｆｉｇ２２１は、天然配列ＰＲＯ１３３８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２２１）を示し、配列番号：２２１は、ここで「ＤＮＡ６６６６７−１５９６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２２２】Ｆｉｇ２２２は、Ｆｉｇ２２１に示した配列番号：２２１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２２２）を示す。
【Ｆｉｇ２２３】Ｆｉｇ２２３は、天然配列ＰＲ１３３７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２２３）を示し、配列番号：２２３は、ここで「ＤＮＡ６６６７２−１５８６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２２４】Ｆｉｇ２２４は、Ｆｉｇ２２３に示した配列番号：２２３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２２４）を示す。
【Ｆｉｇ２２５】Ｆｉｇ２２５は、天然配列ＰＲＯ１３４３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２２５）を示し、配列番号：２２５は、ここで「ＤＮＡ６６６７５−１５８７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２２６】Ｆｉｇ２２６は、Ｆｉｇ２２５に示した配列番号：２２５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２２６）を示す。
【Ｆｉｇ２２７】Ｆｉｇ２２７は、天然配列ＰＲＯ１３７６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２７）を示し、配列番号：２７は、ここで「ＤＮＡ６７３００−１６０５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２２８】Ｆｉｇ２２８は、Ｆｉｇ２２７に示した配列番号：２２７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２２８）を示す。
【Ｆｉｇ２２９】Ｆｉｇ２２９は、天然配列ＰＲＯ１４３４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２２９）を示し、配列番号：２２９は、ここで「ＤＮＡ６８８１８−２５３６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２３０】Ｆｉｇ２３０は、Ｆｉｇ２２９に示した配列番号：２２９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２３０）を示す。
【Ｆｉｇ２３１】Ｆｉｇ２３１は、天然配列ＰＲＯ３５７９ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２３１）を示し、配列番号：２３１は、ここで「ＤＮＡ６８８６２−２５４６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２３２】Ｆｉｇ２３２は、Ｆｉｇ２３１に示した配列番号：２３１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２３２）を示す。
【Ｆｉｇ２３３】Ｆｉｇ２３３は、天然配列ＰＲＯ１３８７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２３３）を示し、配列番号：２３３は、ここで「ＤＮＡ６８８７２−１６２０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２３４】Ｆｉｇ２３４は、Ｆｉｇ２３３に示した配列番号：２３３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２３４）を示す。
【Ｆｉｇ２３５】Ｆｉｇ２３５は、天然配列ＰＲＯ１４１９ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２３５）を示し、配列番号：２３５は、ここで「ＤＮＡ７１２９０−１６３０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２３６】Ｆｉｇ２３６は、Ｆｉｇ２３５に示した配列番号：２３５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２３６）を示す。
【Ｆｉｇ２３７】Ｆｉｇ２３７は、天然配列ＰＲＯ１４８８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２３７）を示し、配列番号：２３７は、ここで「ＤＮＡ７３７３６−１６５７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２３８】Ｆｉｇ２３８は、Ｆｉｇ２３７に示した配列番号：２３７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２３８）を示す。
【Ｆｉｇ２３９】Ｆｉｇ２３９は、天然配列ＰＲＯ１４７４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２３９）を示し、配列番号：２３９は、ここで「ＤＮＡ７３７３９−１６４５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２４０】Ｆｉｇ２４０は、Ｆｉｇ２３９に示した配列番号：２３９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２４０）を示す。
【Ｆｉｇ２４１】Ｆｉｇ２４１は、天然配列ＰＲＯ１５０８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２４１）を示し、配列番号：２４１は、ここで「ＤＮＡ７３７４２−１６６２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２４２】Ｆｉｇ２４２は、Ｆｉｇ２４１に示した配列番号：２４１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２４２）を示す。
【Ｆｉｇ２４３】Ｆｉｇ２４３は、天然配列ＰＲＯ１７５４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２４３）を示し、配列番号：２４３は、ここで「ＤＮＡ７６３８５−１６９２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２４４】Ｆｉｇ２４４は、Ｆｉｇ２４３に示した配列番号：２４３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２４４）を示す。
【Ｆｉｇ２４５】Ｆｉｇ２４５は、天然配列ＰＲＯ１５５０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２４５）を示し、配列番号：２４５は、ここで「ＤＮＡ７６３９３−１６６４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２４６】Ｆｉｇ２４６は、Ｆｉｇ２４５に示した配列番号：２４５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２４６）を示す。
【Ｆｉｇ２４７】Ｆｉｇ２４７は、天然配列ＰＲＯ１７５８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２４７）を示し、配列番号：２４７は、ここで「ＤＮＡ７６３９９−１７００」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２４８】Ｆｉｇ２４８は、Ｆｉｇ２４７に示した配列番号：２４７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２４８）を示す。
【Ｆｉｇ２４９】Ｆｉｇ２４９は、天然配列ＰＲＯ１９１７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２４９）を示し、配列番号：２４９は、ここで「ＤＮＡ７６４００−２５２８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２５０】Ｆｉｇ２５０は、Ｆｉｇ２４９に示した配列番号：２４９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２５０）を示す。
【Ｆｉｇ２５１】Ｆｉｇ２５１は、天然配列ＰＲＯ１７８７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２５１）を示し、配列番号：２５１は、ここで「ＤＮＡ７６５１０−２５０４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２５２】Ｆｉｇ２５２は、Ｆｉｇ２５１に示した配列番号：２５１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２５２）を示す。
【Ｆｉｇ２５３】Ｆｉｇ２５３は、天然配列ＰＲＯ１５５６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２５３）を示し、配列番号：２５３は、ここで「ＤＮＡ７６５２９−１６６６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２５４】Ｆｉｇ２５４は、Ｆｉｇ２５３に示した配列番号：２５３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２５４）を示す。
【Ｆｉｇ２５５】Ｆｉｇ２５５は、天然配列ＰＲＯ１７６０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２５５）を示し、配列番号：２５５は、ここで「ＤＮＡ７６５３２−１７０２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２５６】Ｆｉｇ２５６は、Ｆｉｇ２５５に示した配列番号：２５５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２５６）を示す。
【Ｆｉｇ２５７】Ｆｉｇ２５７は、天然配列ＰＲＯ１５６７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２５７）を示し、配列番号：２５７は、ここで「ＤＮＡ７６５４１−１６７５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２５８】Ｆｉｇ２５８は、Ｆｉｇ２５７に示した配列番号：２５７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２５８）を示す。
【Ｆｉｇ２５９】Ｆｉｇ２５９は、天然配列ＰＲＯ１６００ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２５９）を示し、配列番号：２５９は、ここで「ＤＮＡ７７５０３−１６８６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２６０】Ｆｉｇ２６０は、Ｆｉｇ２５９に示した配列番号：２５９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２６０）を示す。
【Ｆｉｇ２６１】Ｆｉｇ２６１は、天然配列ＰＲＯ１８６８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２６１）を示し、配列番号：２６１は、ここで「ＤＮＡ７７６２４−２５１５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２６２】Ｆｉｇ２６２は、Ｆｉｇ２６１に示した配列番号：２６１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２６２）を示す。
【Ｆｉｇ２６３】Ｆｉｇ２６３は、天然配列ＰＲＯ１８９０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２６３）を示し、配列番号：２６３は、ここで「ＤＮＡ７９２３０−２５２５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２６４】Ｆｉｇ２６４は、Ｆｉｇ２６３に示した配列番号：２６３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２６４）を示す。
【Ｆｉｇ２６５】Ｆｉｇ２６５は、天然配列ＰＲＯ１８８７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２６５）を示し、配列番号：２６５は、ここで「ＤＮＡ７９８６２−２５２２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２６６】Ｆｉｇ２６６は、Ｆｉｇ２６５に示した配列番号：２６５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２６６）を示す。
【Ｆｉｇ２６７】Ｆｉｇ２６７は、天然配列ＰＲＯ４３５３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２６７）を示し、配列番号：２６７は、ここで「ＤＮＡ８０１４５−２５９４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２６８】Ｆｉｇ２６８は、Ｆｉｇ２６７に示した配列番号：２６７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２６８）を示す。
【Ｆｉｇ２６９】Ｆｉｇ２６９は、天然配列ＰＲＯ１７８２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２６９）を示し、配列番号：２６９は、ここで「ＤＮＡ８０８９９−２５０１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２７０】Ｆｉｇ２７０は、Ｆｉｇ２６９に示した配列番号：２６９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２７０）を示す。
【Ｆｉｇ２７１】Ｆｉｇ２７１は、天然配列ＰＲＯ１９２８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２７１）を示し、配列番号：２７１は、ここで「ＤＮＡ８１７５４−２５３２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２７２】Ｆｉｇ２７２は、Ｆｉｇ２７１に示した配列番号：２７１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２７２）を示す。
【Ｆｉｇ２７３】Ｆｉｇ２７３は、天然配列ＰＲＯ１８６５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２７３）を示し、配列番号：２７３は、ここで「ＤＮＡ８１７５７−２５１２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２７４】Ｆｉｇ２７４は、Ｆｉｇ２７３に示した配列番号：２７３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２７４）を示す。
【Ｆｉｇ２７５】Ｆｉｇ２７５は、天然配列ＰＲＯ４３４１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２７５）を示し、配列番号：２７５は、ここで「ＤＮＡ８１７６１−２５８３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２７６】Ｆｉｇ２７６は、Ｆｉｇ２７５に示した配列番号：２７５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２７６）を示す。
【Ｆｉｇ２７７】Ｆｉｇ２７７は、天然配列ＰＲＯ６７１４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２７７）を示し、配列番号：２７７は、ここで「ＤＮＡ８２３５８−２７３８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２７８】Ｆｉｇ２７８は、Ｆｉｇ２７７に示した配列番号：２７７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２７８）を示す。
【Ｆｉｇ２７９】Ｆｉｇ２７９は、天然配列ＰＲＯ５７２３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２７９）を示し、配列番号：２７９は、ここで「ＤＮＡ８２３６１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２８０】Ｆｉｇ２８０は、Ｆｉｇ２７９に示した配列番号：２７９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２８０）を示す。
【Ｆｉｇ２８１】Ｆｉｇ２８１は、天然配列ＰＲＯ３４３８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２８１）を示し、配列番号：２８１は、ここで「ＤＮＡ８２３６４−２５３８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２８２】Ｆｉｇ２８２は、Ｆｉｇ２８１に示した配列番号：２８１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２８２）を示す。
【Ｆｉｇ２８３】Ｆｉｇ２８３は、天然配列ＰＲＯ６０７１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２８３）を示し、配列番号：２８３は、ここで「ＤＮＡ８２４０３−２９５９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２８４】Ｆｉｇ２８４は、Ｆｉｇ２８３に示した配列番号：２８３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２８４）を示す。
【Ｆｉｇ２８５】Ｆｉｇ２８５は、天然配列ＰＲＯ１８０１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２８５）を示し、配列番号：２８５は、ここで「ＤＮＡ８３５００−２５０６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２８６】Ｆｉｇ２８６は、Ｆｉｇ２８５に示した配列番号：２８５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２８６）を示す。
【Ｆｉｇ２８７】Ｆｉｇ２８７は、天然配列ＰＲＯ４３２４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２８７）を示し、配列番号：２８７は、ここで「ＤＮＡ８３５６０−２５６９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２８８】Ｆｉｇ２８８は、Ｆｉｇ２８７に示した配列番号：２８７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２８８）を示す。
【Ｆｉｇ２８９】Ｆｉｇ２８９は、天然配列ＰＲＯ４３３３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２８９）を示し、配列番号：２８９は、ここで「ＤＮＡ８４２１０−２５７６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２９０】Ｆｉｇ２９０は、Ｆｉｇ２８９に示した配列番号：２８９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２９０）を示す。
【Ｆｉｇ２９１】Ｆｉｇ２９１は、天然配列ＰＲＯ４４０５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２９１）を示し、配列番号：２９１は、ここで「ＤＮＡ８４９２０−２６１４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２９２】Ｆｉｇ２９２は、Ｆｉｇ２９１に示した配列番号：２９１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２９２）を示す。
【Ｆｉｇ２９３】Ｆｉｇ２９３は、天然配列ＰＲＯ４３５６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２９３）を示し、配列番号：２９３は、ここで「ＤＮＡ８６５７６−２５９５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２９４】Ｆｉｇ２９４は、Ｆｉｇ２９３に示した配列番号：２９３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２９４）を示す。
【Ｆｉｇ２９５】Ｆｉｇ２９５は、天然配列ＰＲＯ３４４４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２９５）を示し、配列番号：２９５は、ここで「ＤＮＡ８７９９７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２９６】Ｆｉｇ２９６は、Ｆｉｇ２９５に示した配列番号：２９５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２９６）を示す。
【Ｆｉｇ２９７】Ｆｉｇ２９７は、天然配列ＰＲＯ４３０２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２９７）を示し、配列番号：２９７は、ここで「ＤＮＡ９２２１８−２５５４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２９８】Ｆｉｇ２９８は、Ｆｉｇ２９７に示した配列番号：２９７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２９８）を示す。
【Ｆｉｇ２９９】Ｆｉｇ２９９は、天然配列ＰＲＯ４３７１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２９９）を示し、配列番号：２９９は、ここで「ＤＮＡ９２２３３−２５９９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３００】Ｆｉｇ３００は、Ｆｉｇ２９９に示した配列番号：２９９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３００）を示す。
【Ｆｉｇ３０１】Ｆｉｇ３０１は、天然配列ＰＲＯ４３５４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３０１）を示し、配列番号：３０１は、ここで「ＤＮＡ９２２５６−２５９６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３０２】Ｆｉｇ３０２は、Ｆｉｇ３０１に示した配列番号：３０１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３０２）を示す。
【Ｆｉｇ３０３】Ｆｉｇ３０３は、天然配列ＰＲＯ５７２５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３０３）を示し、配列番号：３０３は、ここで「ＤＮＡ９２２６５−２６６９」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３０４】Ｆｉｇ３０４は、Ｆｉｇ３０３に示した配列番号：３０３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３０４）を示す。
【Ｆｉｇ３０５】Ｆｉｇ３０５は、天然配列ＰＲＯ４４０８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３０５）を示し、配列番号：３０５は、ここで「ＤＮＡ９２２７４−２６１７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３０６】Ｆｉｇ３０６は、Ｆｉｇ３０５に示した配列番号：３０５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３０６）を示す。
【Ｆｉｇ３０７】Ｆｉｇ３０７は、天然配列ＰＲＯ９９４０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３０７）を示し、配列番号：３０７は、ここで「ＤＮＡ９２２８２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３０８】Ｆｉｇ３０８は、Ｆｉｇ３０７に示した配列番号：３０７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３０８）を示す。
【Ｆｉｇ３０９】Ｆｉｇ３０９は、天然配列ＰＲＯ５７３７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３０９）を示し、配列番号：３０９は、ここで「ＤＮＡ９２９２９−２５３４−１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３１０】Ｆｉｇ３１０は、Ｆｉｇ３０９に示した配列番号：３０９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３１０）を示す。
【Ｆｉｇ３１１】Ｆｉｇ３１１は、天然配列ＰＲＯ４４２５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３１１）を示し、配列番号：３１１は、ここで「ＤＮＡ９３０１１−２６３７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３１２】Ｆｉｇ３１２は、Ｆｉｇ３１１に示した配列番号：３１１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３１２）を示す。
【Ｆｉｇ３１３】Ｆｉｇ３１３は、天然配列ＰＲＯ４３４５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３１３）を示し、配列番号：３１３は、ここで「ＤＮＡ９４８５４−２５８６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３１４】Ｆｉｇ３１４は、Ｆｉｇ３１３に示した配列番号：３１３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３１４）を示す。
【Ｆｉｇ３１５】Ｆｉｇ３１５は、天然配列ＰＲＯ４３４２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３１５）を示し、配列番号：３１５は、ここで「ＤＮＡ９６７８７−２５３４−１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３１６】Ｆｉｇ３１６は、Ｆｉｇ３１５に示した配列番号：３１５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３１６）を示す。
【Ｆｉｇ３１７】Ｆｉｇ３１７は、天然配列ＰＲＯ３５６２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３１７）を示し、配列番号：３１７は、ここで「ＤＮＡ９６７９１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３１８】Ｆｉｇ３１８は、Ｆｉｇ３１７に示した配列番号：３１７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３１８）を示す。
【Ｆｉｇ３１９】Ｆｉｇ３１９は、天然配列ＰＲＯ４４２２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３１９）を示し、配列番号：３１９は、ここで「ＤＮＡ９６８６７−２６２０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３２０】Ｆｉｇ３２０は、Ｆｉｇ３１９に示した配列番号：３１９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３２０）を示す。
【Ｆｉｇ３２１】Ｆｉｇ３２１は、天然配列ＰＲＯ５７７６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３２１）を示し、配列番号：３２１は、ここで「ＤＮＡ９６８７２−２６７４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３２２】Ｆｉｇ３２２は、Ｆｉｇ３２１に示した配列番号：３２１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３２２）を示す。
【Ｆｉｇ３２３】Ｆｉｇ３２３は、天然配列ＰＲＯ４４３０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３２３）を示し、配列番号：３２３は、ここで「ＤＮＡ９６８７８−２６２６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３２４】Ｆｉｇ３２４は、Ｆｉｇ３２３に示した配列番号：３２３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３２４）を示す。
【Ｆｉｇ３２５】Ｆｉｇ３２５は、天然配列ＰＲＯ４４９９ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３２５）を示し、配列番号：３２５は、ここで「ＤＮＡ９６８８９−２６４１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３２６】Ｆｉｇ３２６は、Ｆｉｇ３２５に示した配列番号：３２５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３２６）を示す。
【Ｆｉｇ３２７】Ｆｉｇ３２７は、天然配列ＰＲＯ４５０３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３２７）を示し、配列番号：３２７は、ここで「ＤＮＡ１００３１２−２６４５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３２８】Ｆｉｇ３２８は、Ｆｉｇ３２７に示した配列番号：３２７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３２８）を示す。
【Ｆｉｇ３２９】Ｆｉｇ３２９は、天然配列ＰＲＯ１０００８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３２９）を示し、配列番号：３２９は、ここで「ＤＮＡ１０１９２１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３３０】Ｆｉｇ３３０は、Ｆｉｇ３２９に示した配列番号：３２９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３３０）を示す。
【Ｆｉｇ３３１】Ｆｉｇ３３１は、天然配列ＰＲＯ５７３０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３３１）を示し、配列番号：３３１は、ここで「ＤＮＡ１０１９２６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３３２】Ｆｉｇ３３２は、Ｆｉｇ３３１に示した配列番号：３３１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３３２）を示す。
【Ｆｉｇ３３３】Ｆｉｇ３３３は、天然配列ＰＲＯ６００８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３３３）を示し、配列番号：３３３は、ここで「ＤＮＡ１０２８４４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３３４】Ｆｉｇ３３４は、Ｆｉｇ３３３に示した配列番号：３３３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３３４）を示す。
【Ｆｉｇ３３５】Ｆｉｇ３３５は、天然配列ＰＲＯ４５２７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３３５）を示し、配列番号：３３５は、ここで「ＤＮＡ１０３１９７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３３６】Ｆｉｇ３３６は、Ｆｉｇ３３５に示した配列番号：３３５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３３６）を示す。
【Ｆｉｇ３３７】Ｆｉｇ３３７は、天然配列ＰＲＯ４５３８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３３７）を示し、配列番号：３３７は、ここで「ＤＮＡ１０３２０８」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３３８】Ｆｉｇ３３８は、Ｆｉｇ３３７に示した配列番号：３３７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３３８）を示す。
【Ｆｉｇ３３９】Ｆｉｇ３３９は、天然配列ＰＲＯ４５５３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３３９）を示し、配列番号：３３９は、ここで「ＤＮＡ１０３２２３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３４０】Ｆｉｇ３４０は、Ｆｉｇ３３９に示した配列番号：３３９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３４０）を示す。
【Ｆｉｇ３４１】Ｆｉｇ３４１は、天然配列ＰＲＯ６００６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３４１）を示し、配列番号：３４１は、ここで「ＤＮＡ１０５７８２−２６９３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３４２】Ｆｉｇ３４２は、Ｆｉｇ３４１に示した配列番号：３４１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３４２）を示す。
【Ｆｉｇ３４３】Ｆｉｇ３４３は、天然配列ＰＲＯ６０２９ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３４３）を示し、配列番号：３４３は、ここで「ＤＮＡ１０５８４９−２７０４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３４４】Ｆｉｇ３４４は、Ｆｉｇ３４３に示した配列番号：３４３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３４４）を示す。
【Ｆｉｇ３４５】Ｆｉｇ３４５は、天然配列ＰＲＯ９８２１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３４５）を示し、配列番号：３４５は、ここで「ＤＮＡ１０８７２５−２７６６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３４６】Ｆｉｇ３４６は、Ｆｉｇ３４５に示した配列番号：３４５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３４６）を示す。
【Ｆｉｇ３４７】Ｆｉｇ３４７は、天然配列ＰＲＯ９８２０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３４７）を示し、配列番号：３４７は、ここで「ＤＮＡ１０８７６９−２７６５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３４８】Ｆｉｇ３４８は、Ｆｉｇ３４７に示した配列番号：３４７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３４８）を示す。
【Ｆｉｇ３４９】Ｆｉｇ３４９は、天然配列ＰＲＯ９７７１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３４９）を示し、配列番号：３４９は、ここで「ＤＮＡ１１９４９８−２９６５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３５０】Ｆｉｇ３５０は、Ｆｉｇ３４９に示した配列番号：３４９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３５０）を示す。
【Ｆｉｇ３５１】Ｆｉｇ３５１は、天然配列ＰＲＯ７４３６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３５１）を示し、配列番号：３５１は、ここで「ＤＮＡ１１９５３５−２７５６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３５２】Ｆｉｇ３５２は、Ｆｉｇ３５１に示した配列番号：３５１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３５２）を示す。
【Ｆｉｇ３５３】Ｆｉｇ３５３は、天然配列ＰＲＯ１００９６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３５３）を示し、配列番号：３５３は、ここで「ＤＮＡ１２５１８５−２８０６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３５４】Ｆｉｇ３５４は、Ｆｉｇ３５３に示した配列番号：３５３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３５４）を示す。
【Ｆｉｇ３５５】Ｆｉｇ３５５は、天然配列ＰＲＯ１９６７０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３５５）を示し、配列番号：３５５は、ここで「ＤＮＡ１３１６３９−２８７４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３５６】Ｆｉｇ３５６は、Ｆｉｇ３５５に示した配列番号：３５５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３５６）を示す。
【Ｆｉｇ３５７】Ｆｉｇ３５７は、天然配列ＰＲＯ２００４４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３５７）を示し、配列番号：３５７は、ここで「ＤＮＡ１３９６２３−２８９３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３５８】Ｆｉｇ３５８は、Ｆｉｇ３５７に示した配列番号：３５７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３５８）を示す。
【Ｆｉｇ３５９】Ｆｉｇ３５９は、天然配列ＰＲＯ９８７３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３５９）を示し、配列番号：３５９は、ここで「ＤＮＡ１４３０７６−２７８７」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３６０】Ｆｉｇ３６０は、Ｆｉｇ３５９に示した配列番号：３５９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３６０）を示す。
【Ｆｉｇ３６１】Ｆｉｇ３６１は、天然配列ＰＲＯ２１３６６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３６１）を示し、配列番号：３６１は、ここで「ＤＮＡ１４３２７６−２９７５」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３６２】Ｆｉｇ３６２は、Ｆｉｇ３６１に示した配列番号：３６１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３６２）を示す。
【Ｆｉｇ３６３】Ｆｉｇ３６３は、天然配列ＰＲＯ２００４０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３６３）を示し、配列番号：３６３は、ここで「ＤＮＡ１６４６２５−２８９０」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３６４】Ｆｉｇ３６４は、Ｆｉｇ３６３に示した配列番号：３６３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３６４）を示す。
【Ｆｉｇ３６５】Ｆｉｇ３６５は、天然配列ＰＲＯ２１１８４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３６５）を示し、配列番号：３６５は、ここで「ＤＮＡ１６７６７８−２９６３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３６６】Ｆｉｇ３６６は、Ｆｉｇ３６５に示した配列番号：３６５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３６６）を示す。
【Ｆｉｇ３６７】Ｆｉｇ３６７は、天然配列ＰＲＯ２１０５５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３６７）を示し、配列番号：３６７は、ここで「ＤＮＡ１７００２１−２９２３」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３６８】Ｆｉｇ３６８は、Ｆｉｇ３６７に示した配列番号：３６７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３６８）を示す。
【Ｆｉｇ３６９】Ｆｉｇ３６９は、天然配列ＰＲＯ２８６３１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３６９）を示し、配列番号：３６９は、ここで「ＤＮＡ１７０２１２−３０００」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３７０】Ｆｉｇ３７０は、Ｆｉｇ３６９に示した配列番号：３６９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３７０）を示す。
【Ｆｉｇ３７１】Ｆｉｇ３７１は、天然配列ＰＲＯ２１３８４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３７１）を示し、配列番号：３７１は、ここで「ＤＮＡ１７７３１３−２９８２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３７２】Ｆｉｇ３７２は、Ｆｉｇ３７１に示した配列番号：３７１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３７２）を示す。
【Ｆｉｇ３７３】Ｆｉｇ３７３は、天然配列ＰＲＯ１４４９ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３７３）を示し、配列番号：３７３は、ここで「ＤＮＡ６４９０８−１１６３−１」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ３７４】Ｆｉｇ３７４は、Ｆｉｇ３７３に示した配列番号：３７３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３７４）を示す。
【Ｆｉｇ３７５】Ｆｉｇ３７５は、ＰＲＯ１４４９と約７８％のアミノ酸同一性を有するＰＲＯ１４４９のマウスオルソログを用いた、マウス胎児におけるインサイツハイブリダイゼーションのホールマウントによる結果を示す。結果から、ＰＲＯ１４４９オルソログは発生中の脈管構造中で発現されることが示される。さらに、切片は、内皮細胞及び内皮細胞の前駆細胞中での発現を示す。
【Ｆｉｇ３７６】Ｆｉｇ３７６は、ＰＲＯ１４４９と約７８％のアミノ酸同一性を持つＰＲＯ１４４９のオルソログが、多くの炎症化及び疾患性の組織の脈管構造中で発現されており、正常な成体の血管中では非常に低いか、又は欠損していることを示す。
【Ｆｉｇ３７７】Ｆｉｇ３７７は、ＰＲＯ１４４９と約７８％のアミノ酸同一性を持つＰＲＯ１４４９のオルソログが、ニワトリ胎児の眼中における異所性の血管を誘導することを示す。
【図２】
2004516013.tif 000031
【図４】
2004516013.tif 000032
【図６】
2004516013.tif 000033
【図８】
2004516013.tif 000034
【図１０】
2004516013.tif 000035
【図１２】
2004516013.tif 000036
【図１６】
2004516013.tif 000037
【図２０】
2004516013.tif 000038
【図２４】
2004516013.tif 000039
【図２６】
2004516013.tif 000040
【図２８】
2004516013.tif 000041
【図３０】
2004516013.tif 000042
【図３２】
2004516013.tif 000043
【図３４】
2004516013.tif 000044
【図３６】
2004516013.tif 000045
【図３８】
2004516013.tif 000046
【図４０】
2004516013.tif 000047
【図４２】
2004516013.tif 000048
【図４４】
2004516013.tif 000049
【図４６】
2004516013.tif 000050
【図５０】
2004516013.tif 000051
【図５２】
2004516013.tif 000052
【図５４】
2004516013.tif 000053
【図５８】
2004516013.tif 000054
【図６０】
2004516013.tif 000055
【図６２】
2004516013.tif 000056
【図６４】
2004516013.tif 000057
【図６６】
2004516013.tif 000058
【図６８】
2004516013.tif 000059
【図７０】
2004516013.tif 000060
【図７２】
2004516013.tif 000061
【図７４】
2004516013.tif 000062
【図７６】
2004516013.tif 000063
【図７８】
2004516013.tif 000064
【図８０】
2004516013.tif 000065
【図８２ａ】
2004516013.tif 000066
【図８２ｂ】
2004516013.tif 000067
【図８４】
2004516013.tif 000068
【図８６】
2004516013.tif 000069
【図８８】
2004516013.tif 000070
【図９０】
2004516013.tif 000071
【図９２】
2004516013.tif 000072
【図９４】
2004516013.tif 000073
【図９８】
2004516013.tif 000074
【図１００】
2004516013.tif 000075
【図１０２】
2004516013.tif 000076
【図１０４】
2004516013.tif 000077
【図１０８】
2004516013.tif 000078
【図１１０】
2004516013.tif 000079
【図１１２】
2004516013.tif 000080
【図１１４】
2004516013.tif 000081
【図１１６】
2004516013.tif 000082
【図１２０】
2004516013.tif 000083
【図１２２】
2004516013.tif 000084
【図１２６】
2004516013.tif 000085
【図１２８】
2004516013.tif 000086
【図１３８】
2004516013.tif 000087
【図１４０】
2004516013.tif 000088
【図１４２】
2004516013.tif 000089
【図１４４】
2004516013.tif 000090
【図１４６】
2004516013.tif 000091
【図１５０】
2004516013.tif 000092
【図１５８】
2004516013.tif 000093
【図１６２】
2004516013.tif 000094
【図１６４】
2004516013.tif 000095
【図１７０】
2004516013.tif 000096
【図１７２】
2004516013.tif 000097
【図１７６】
2004516013.tif 000098
【図１７８】
2004516013.tif 000099
【図１８２】
2004516013.tif 000100
【図１８４】
2004516013.tif 000101
【図１９０】
2004516013.tif 000102
【図１９２】
2004516013.tif 000103
【図１９４】
2004516013.tif 000104
【図１９６】
2004516013.tif 000105
【図１９８】
2004516013.tif 000106
【図２００】
2004516013.tif 000107
【図２０２】
2004516013.tif 000108
【図２０４】
2004516013.tif 000109
【図２０６】
2004516013.tif 000110
【図２０８】
2004516013.tif 000111
【図２１４】
2004516013.tif 000112
【図２１６】
2004516013.tif 000113
【図２１８】
2004516013.tif 000114
【図２２０】
2004516013.tif 000115
【図２２２】
2004516013.tif 000116
【図２２４】
2004516013.tif 000117
【図２２６】
2004516013.tif 000118
【図２２８】
2004516013.tif 000119
【図２３０】
2004516013.tif 000120
【図２３２】
2004516013.tif 000121
【図２３６】
2004516013.tif 000122
【図２３８】
2004516013.tif 000123
【図２４０】
2004516013.tif 000124
【図２４２】
2004516013.tif 000125
【図２４４】
2004516013.tif 000126
【図２４６】
2004516013.tif 000127
【図２４８】
2004516013.tif 000128
【図２５０】
2004516013.tif 000129
【図２５２】
2004516013.tif 000130
【図２５４】
2004516013.tif 000131
【図２５６】
2004516013.tif 000132
【図２５８】
2004516013.tif 000133
【図２６０】
2004516013.tif 000134
【図２６２】
2004516013.tif 000135
【図２６４】
2004516013.tif 000136
【図２６６】
2004516013.tif 000137
【図２６８】
2004516013.tif 000138
【図２７０】
2004516013.tif 000139
【図２７２】
2004516013.tif 000140
【図２７４】
2004516013.tif 000141
【図２７６】
2004516013.tif 000142
【図２７８】
2004516013.tif 000143
【図２８０】
2004516013.tif 000144
【図２８２】
2004516013.tif 000145
【図２８４】
2004516013.tif 000146
【図２８８】
2004516013.tif 000147
【図２９０】
2004516013.tif 000148
【図２９２】
2004516013.tif 000149
【図２９４】
2004516013.tif 000150
【図２９６】
2004516013.tif 000151
【図２９８】
2004516013.tif 000152
【図３００】
2004516013.tif 000153
【図３０２】
2004516013.tif 000154
【図３０４】
2004516013.tif 000155
【図３０６】
2004516013.tif 000156
【図３０８】
2004516013.tif 000157
【図３１０】
2004516013.tif 000158
【図３１２】
2004516013.tif 000159
【図３１４】
2004516013.tif 000160
【図３１６】
2004516013.tif 000161
【図３１８】
2004516013.tif 000162
【図３２０】
2004516013.tif 000163
【図３２２】
2004516013.tif 000164
【図３２４】
2004516013.tif 000165
【図３２６】
2004516013.tif 000166
【図３２８】
2004516013.tif 000167
【図３３０】
2004516013.tif 000168
【図３３２】
2004516013.tif 000169
【図３３４】
2004516013.tif 000170
【図３３６】
2004516013.tif 000171
【図３３８】
2004516013.tif 000172
【図３４０】
2004516013.tif 000173
【図３４２】
2004516013.tif 000174
【図３４４】
2004516013.tif 000175
【図３４６】
2004516013.tif 000176
【図３４８】
2004516013.tif 000177
【図３５０】
2004516013.tif 000178
【図３５２】
2004516013.tif 000179
【図３５４】
2004516013.tif 000180
【図３５６】
2004516013.tif 000181
【図３５８】
2004516013.tif 000182
【図３６０】
2004516013.tif 000183
【図３６２】
2004516013.tif 000184
【図３６４】
2004516013.tif 000185
【図３６６】
2004516013.tif 000186
【図３６８】
2004516013.tif 000187
【図３７０】
2004516013.tif 000188
【図３７２】
2004516013.tif 000189
【図３７５】
2004516013.tif 000190
【図３７６】
2004516013.tif 000191
【図３７７】
2004516013.tif 000192
【国際公開パンフレット】
2004516013.tif 000193
2004516013.tif 000194
2004516013.tif 000195
2004516013.tif 000196
2004516013.tif 000197
2004516013.tif 000198
2004516013.tif 000199
2004516013.tif 000200
2004516013.tif 000201
2004516013.tif 000202
2004516013.tif 000203
2004516013.tif 000204
2004516013.tif 000205
2004516013.tif 000206
2004516013.tif 000207
2004516013.tif 000208
2004516013.tif 000209
2004516013.tif 000210
2004516013.tif 000211
2004516013.tif 000212
2004516013.tif 000213
2004516013.tif 000214
2004516013.tif 000215
2004516013.tif 000216
2004516013.tif 000217
2004516013.tif 000218
2004516013.tif 000219
2004516013.tif 000220
2004516013.tif 000221
2004516013.tif 000222
2004516013.tif 000223
2004516013.tif 000224
2004516013.tif 000225
2004516013.tif 000226
2004516013.tif 000227
2004516013.tif 000228
2004516013.tif 000229
2004516013.tif 000230
2004516013.tif 000231
2004516013.tif 000232
2004516013.tif 000233
2004516013.tif 000234
2004516013.tif 000235
2004516013.tif 000236
2004516013.tif 000237
2004516013.tif 000238
2004516013.tif 000239
2004516013.tif 000240
2004516013.tif 000241
2004516013.tif 000242
2004516013.tif 000243
2004516013.tif 000244
2004516013.tif 000245
2004516013.tif 000246
2004516013.tif 000247
2004516013.tif 000248
2004516013.tif 000249
2004516013.tif 000250
2004516013.tif 000251
2004516013.tif 000252
2004516013.tif 000253
2004516013.tif 000254
2004516013.tif 000255
2004516013.tif 000256
2004516013.tif 000257
2004516013.tif 000258
2004516013.tif 000259
2004516013.tif 000260
2004516013.tif 000261
2004516013.tif 000262
2004516013.tif 000263
2004516013.tif 000264
2004516013.tif 000265
2004516013.tif 000266
2004516013.tif 000267
2004516013.tif 000268
2004516013.tif 000269
2004516013.tif 000270
2004516013.tif 000271
2004516013.tif 000272
2004516013.tif 000273
2004516013.tif 000274
2004516013.tif 000275
2004516013.tif 000276
2004516013.tif 000277
2004516013.tif 000278
2004516013.tif 000279
2004516013.tif 000280
2004516013.tif 000281
2004516013.tif 000282
2004516013.tif 000283
2004516013.tif 000284
2004516013.tif 000285
2004516013.tif 000286
2004516013.tif 000287
2004516013.tif 000288
2004516013.tif 000289
2004516013.tif 000290
2004516013.tif 000291
2004516013.tif 000292
2004516013.tif 000293
2004516013.tif 000294
2004516013.tif 000295
2004516013.tif 000296
2004516013.tif 000297
2004516013.tif 000298
2004516013.tif 000299
2004516013.tif 000300
2004516013.tif 000301
2004516013.tif 000302
2004516013.tif 000303
2004516013.tif 000304
2004516013.tif 000305
2004516013.tif 000306
2004516013.tif 000307
2004516013.tif 000308
2004516013.tif 000309
2004516013.tif 000310
2004516013.tif 000311
2004516013.tif 000312
2004516013.tif 000313
2004516013.tif 000314
2004516013.tif 000315
2004516013.tif 000316
2004516013.tif 000317
2004516013.tif 000318
2004516013.tif 000319
2004516013.tif 000320
2004516013.tif 000321
2004516013.tif 000322
2004516013.tif 000323
2004516013.tif 000324
2004516013.tif 000325
2004516013.tif 000326
2004516013.tif 000327
2004516013.tif 000328
2004516013.tif 000329
2004516013.tif 000330
2004516013.tif 000331
2004516013.tif 000332
2004516013.tif 000333
2004516013.tif 000334
2004516013.tif 000335
2004516013.tif 000336
2004516013.tif 000337
2004516013.tif 000338
2004516013.tif 000339
2004516013.tif 000340
2004516013.tif 000341
2004516013.tif 000342
2004516013.tif 000343
2004516013.tif 000344
2004516013.tif 000345
2004516013.tif 000346
2004516013.tif 000347
2004516013.tif 000348
2004516013.tif 000349
2004516013.tif 000350
2004516013.tif 000351
2004516013.tif 000352
2004516013.tif 000353
2004516013.tif 000354
2004516013.tif 000355
2004516013.tif 000356
2004516013.tif 000357
2004516013.tif 000358
2004516013.tif 000359
2004516013.tif 000360
2004516013.tif 000361
2004516013.tif 000362
2004516013.tif 000363
2004516013.tif 000364
2004516013.tif 000365
2004516013.tif 000366
2004516013.tif 000367
2004516013.tif 000368
2004516013.tif 000369
2004516013.tif 000370
2004516013.tif 000371
2004516013.tif 000372
2004516013.tif 000373
2004516013.tif 000374
2004516013.tif 000375
2004516013.tif 000376
2004516013.tif 000377
2004516013.tif 000378
2004516013.tif 000379
2004516013.tif 000380
2004516013.tif 000381
2004516013.tif 000382
2004516013.tif 000383
2004516013.tif 000384
2004516013.tif 000385
2004516013.tif 000386
2004516013.tif 000387
2004516013.tif 000388
2004516013.tif 000389
2004516013.tif 000390
2004516013.tif 000391
2004516013.tif 000392
2004516013.tif 000393
2004516013.tif 000394
2004516013.tif 000395
2004516013.tif 000396
2004516013.tif 000397
2004516013.tif 000398
2004516013.tif 000399
2004516013.tif 000400
2004516013.tif 000401
2004516013.tif 000402
2004516013.tif 000403
2004516013.tif 000404
2004516013.tif 000405
2004516013.tif 000406
2004516013.tif 000407
2004516013.tif 000408
2004516013.tif 000409
2004516013.tif 000410
2004516013.tif 000411
2004516013.tif 000412
2004516013.tif 000413
2004516013.tif 000414
2004516013.tif 000415
2004516013.tif 000416
2004516013.tif 000417
2004516013.tif 000418
2004516013.tif 000419
2004516013.tif 000420
2004516013.tif 000421
2004516013.tif 000422
2004516013.tif 000423
2004516013.tif 000424
2004516013.tif 000425
2004516013.tif 000426
2004516013.tif 000427
2004516013.tif 000428
2004516013.tif 000429
2004516013.tif 000430
2004516013.tif 000431
2004516013.tif 000432
2004516013.tif 000433
2004516013.tif 000434
2004516013.tif 000435
2004516013.tif 000436
2004516013.tif 000437
2004516013.tif 000438
2004516013.tif 000439
2004516013.tif 000440
2004516013.tif 000441
2004516013.tif 000442
2004516013.tif 000443
2004516013.tif 000444
2004516013.tif 000445
2004516013.tif 000446
2004516013.tif 000447
2004516013.tif 000448
2004516013.tif 000449
2004516013.tif 000450
2004516013.tif 000451
2004516013.tif 000452
2004516013.tif 000453
2004516013.tif 000454
2004516013.tif 000455
2004516013.tif 000456
2004516013.tif 000457
2004516013.tif 000458
2004516013.tif 000459
2004516013.tif 000460
2004516013.tif 000461
2004516013.tif 000462
2004516013.tif 000463
2004516013.tif 000464
2004516013.tif 000465
2004516013.tif 000466
2004516013.tif 000467
2004516013.tif 000468
2004516013.tif 000469
2004516013.tif 000470
2004516013.tif 000471
2004516013.tif 000472
2004516013.tif 000473
2004516013.tif 000474
2004516013.tif 000475
2004516013.tif 000476
2004516013.tif 000477
2004516013.tif 000478
2004516013.tif 000479
2004516013.tif 000480
2004516013.tif 000481
2004516013.tif 000482
2004516013.tif 000483
2004516013.tif 000484
2004516013.tif 000485
2004516013.tif 000486
2004516013.tif 000487
2004516013.tif 000488
2004516013.tif 000489
2004516013.tif 000490
2004516013.tif 000491
2004516013.tif 000492
2004516013.tif 000493
2004516013.tif 000494
2004516013.tif 000495
2004516013.tif 000496
2004516013.tif 000497
2004516013.tif 000498
2004516013.tif 000499
2004516013.tif 000500
2004516013.tif 000501
2004516013.tif 000502
2004516013.tif 000503
2004516013.tif 000504
2004516013.tif 000505
2004516013.tif 000506
2004516013.tif 000507
2004516013.tif 000508
2004516013.tif 000509
2004516013.tif 000510
2004516013.tif 000511
2004516013.tif 000512
2004516013.tif 000513
2004516013.tif 000514
2004516013.tif 000515
2004516013.tif 000516
2004516013.tif 000517
2004516013.tif 000518
2004516013.tif 000519
2004516013.tif 000520
2004516013.tif 000521
2004516013.tif 000522
2004516013.tif 000523
2004516013.tif 000524
2004516013.tif 000525
2004516013.tif 000526
2004516013.tif 000527
2004516013.tif 000528
2004516013.tif 000529
2004516013.tif 000530
2004516013.tif 000531
2004516013.tif 000532
2004516013.tif 000533
2004516013.tif 000534
2004516013.tif 000535
2004516013.tif 000536
2004516013.tif 000537
2004516013.tif 000538
2004516013.tif 000539
2004516013.tif 000540
2004516013.tif 000541
2004516013.tif 000542
2004516013.tif 000543
2004516013.tif 000544
2004516013.tif 000545
2004516013.tif 000546
2004516013.tif 000547
2004516013.tif 000548
2004516013.tif 000549
2004516013.tif 000550
2004516013.tif 000551
2004516013.tif 000552
2004516013.tif 000553
2004516013.tif 000554
2004516013.tif 000555
2004516013.tif 000556
2004516013.tif 000557
2004516013.tif 000558
2004516013.tif 000559
2004516013.tif 000560
2004516013.tif 000561
2004516013.tif 000562
2004516013.tif 000563
2004516013.tif 000564
2004516013.tif 000565
2004516013.tif 000566
2004516013.tif 000567
2004516013.tif 000568
2004516013.tif 000569
2004516013.tif 000570
2004516013.tif 000571
2004516013.tif 000572
2004516013.tif 000573
2004516013.tif 000574
2004516013.tif 000575
2004516013.tif 000576
2004516013.tif 000577
2004516013.tif 000578
2004516013.tif 000579
2004516013.tif 000580
2004516013.tif 000581
2004516013.tif 000582
2004516013.tif 000583
2004516013.tif 000584
2004516013.tif 000585
2004516013.tif 000586
2004516013.tif 000587
2004516013.tif 000588
2004516013.tif 000589
2004516013.tif 000590
2004516013.tif 000591
2004516013.tif 000592
2004516013.tif 000593
2004516013.tif 000594
2004516013.tif 000595
2004516013.tif 000596
2004516013.tif 000597
2004516013.tif 000598
2004516013.tif 000599
2004516013.tif 000600
2004516013.tif 000601
2004516013.tif 000602
2004516013.tif 000603
2004516013.tif 000604
2004516013.tif 000605
2004516013.tif 000606
2004516013.tif 000607
2004516013.tif 000608
2004516013.tif 000609
2004516013.tif 000610
2004516013.tif 000611
2004516013.tif 000612
2004516013.tif 000613
2004516013.tif 000614
2004516013.tif 000615
2004516013.tif 000616
2004516013.tif 000617
2004516013.tif 000618
2004516013.tif 000619
2004516013.tif 000620
2004516013.tif 000621
2004516013.tif 000622
2004516013.tif 000623
2004516013.tif 000624
2004516013.tif 000625
2004516013.tif 000626
2004516013.tif 000627
2004516013.tif 000628
2004516013.tif 000629
2004516013.tif 000630
2004516013.tif 000631
2004516013.tif 000632
2004516013.tif 000633
2004516013.tif 000634
2004516013.tif 000635
2004516013.tif 000636
2004516013.tif 000637
2004516013.tif 000638
2004516013.tif 000639
2004516013.tif 000640
2004516013.tif 000641
2004516013.tif 000642
2004516013.tif 000643
2004516013.tif 000644
2004516013.tif 000645
2004516013.tif 000646
2004516013.tif 000647
2004516013.tif 000648
2004516013.tif 000649
2004516013.tif 000650
2004516013.tif 000651
2004516013.tif 000652
2004516013.tif 000653
2004516013.tif 000654
2004516013.tif 000655
2004516013.tif 000656
2004516013.tif 000657
2004516013.tif 000658
2004516013.tif 000659
2004516013.tif 000660
2004516013.tif 000661
2004516013.tif 000662
2004516013.tif 000663
2004516013.tif 000664
2004516013.tif 000665
2004516013.tif 000666
2004516013.tif 000667
2004516013.tif 000668
2004516013.tif 000669
2004516013.tif 000670
2004516013.tif 000671
2004516013.tif 000672
2004516013.tif 000673
2004516013.tif 000674
2004516013.tif 000675
2004516013.tif 000676
2004516013.tif 000677
2004516013.tif 000678
2004516013.tif 000679
2004516013.tif 000680
2004516013.tif 000681
2004516013.tif 000682
2004516013.tif 000683
2004516013.tif 000684
2004516013.tif 000685
2004516013.tif 000686
2004516013.tif 000687
2004516013.tif 000688
2004516013.tif 000689
2004516013.tif 000690
2004516013.tif 000691
2004516013.tif 000692
2004516013.tif 000693
2004516013.tif 000694
2004516013.tif 000695
2004516013.tif 000696
2004516013.tif 000697
2004516013.tif 000698
2004516013.tif 000699
2004516013.tif 000700
2004516013.tif 000701
2004516013.tif 000702
2004516013.tif 000703
2004516013.tif 000704
2004516013.tif 000705
2004516013.tif 000706
2004516013.tif 000707
2004516013.tif 000708
2004516013.tif 000709
2004516013.tif 000710
2004516013.tif 000711
2004516013.tif 000712
2004516013.tif 000713
2004516013.tif 000714
2004516013.tif 000715
2004516013.tif 000716
2004516013.tif 000717
2004516013.tif 000718
2004516013.tif 000719
2004516013.tif 000720
2004516013.tif 000721
2004516013.tif 000722
2004516013.tif 000723
2004516013.tif 000724
2004516013.tif 000725
2004516013.tif 000726
2004516013.tif 000727
2004516013.tif 000728
2004516013.tif 000729
2004516013.tif 000730
2004516013.tif 000731
2004516013.tif 000732
2004516013.tif 000733
2004516013.tif 000734
2004516013.tif 000735
2004516013.tif 000736
2004516013.tif 000737
2004516013.tif 000738
2004516013.tif 000739
2004516013.tif 000740
2004516013.tif 000741
2004516013.tif 000742
2004516013.tif 000743
2004516013.tif 000744
2004516013.tif 000745
2004516013.tif 000746
2004516013.tif 000747
2004516013.tif 000748
2004516013.tif 000749
2004516013.tif 000750
2004516013.tif 000751
2004516013.tif 000752
2004516013.tif 000753
2004516013.tif 000754
2004516013.tif 000755
2004516013.tif 000756
2004516013.tif 000757
2004516013.tif 000758
2004516013.tif 000759
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004516013.tif 000760
2004516013.tif 000761
【国際調査報告】
2004516013.tif 000762
2004516013.tif 000763
2004516013.tif 000764
2004516013.tif 000765
2004516013.tif 000766
2004516013.tif 000767
2004516013.tif 000768
2004516013.tif 000769
2004516013.tif 000770
2004516013.tif 000771