(57)【要約】哺乳動物オクルディンの第二の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列を有するペプチドおよびそのアナログを含有する雄性避妊薬が開示される。このペプチドは、精巣細胞を標的するキャリアに連結されてもよく、好ましくは、改変された卵胞刺激ホルモンに連結されてもよい。このような避妊薬を生成する方法、および使用の方法がまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物オクルディンの第二の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列を有するペプチドまたは前記ペプチドのアナログと、キャリアとを含んでなる雄性避妊薬であって、前記ペプチドまたはその前記アナログが、インビボにおいてセルトリ細胞間の密着結合を破壊する雄性避妊薬。
【請求項２】
精巣中におけるセルトリ細胞を特異的に標的するリガンドをさらに含み、ここで前記リガンドが前記ペプチドに連結される請求項１の避妊薬。
【請求項３】
前記ペプチドおよび前記リガンドが、ペプチド結合によって連結される請求項２の避妊薬。
【請求項４】
前記リガンドが、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含む請求項２の避妊薬。
【請求項５】
精巣内注入に適切な形態である請求項１の避妊薬。
【請求項６】
非経口的な投与に適切な形態である請求項１の避妊薬。
【請求項７】
雄性哺乳動物に対して、哺乳動物オクルディンの第二の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列を有するペプチドまたは前記ペプチドのアナログと、キャリアとを含んでなる組成物を投与するステップを含む避妊方法であって、ここで、前記ペプチドが、インビボにおいてセルトリ細胞間の密着結合を破壊する、避妊方法。
【請求項８】
前記雄性哺乳動物がヒトである請求項７の方法。
【請求項９】
雄性避妊薬を製造するための方法であって、
（ａ）哺乳動物オクルディンの第二の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列を有するペプチドまたは前記ペプチドのアナログを調製するステップであって、ここで前記ペプチドが、インビボにおいてセルトリ細胞間の密着結合を破壊するステップと、
（ｂ）前記ペプチドとキャリアとを組み合わせるステップと
を包含する、方法。
【請求項１０】
（１）精巣中でセルトリ細胞を特異的に標的するリガンドを調製するステップと、
（２）前記ペプチドおよび前記リガンドを連結するステップと
をさらに包含する請求項９の方法。
【請求項１１】
哺乳動物オクルディンの第二の細胞外ドメインのペプチドフラグメントであって、１つ以上の置換、付加、および／または欠失を含んでもよく、インビボにおいてセルトリ細胞間の密着結合を破壊するペプチドフラグメント。
【請求項１２】
ペプチド配列ＡＬＣＮＱＦＹＴＰＡＡＴを含む請求項１１のペプチドフラグメント。
【請求項１３】
前記フラグメントが、ペプチド配列ＧＳＱＩＹＴＩＣＳＱＦＹＴＰＧＧＴＧＬＹＶＤを含む請求項１１のペプチドフラグメント。
【請求項１４】
哺乳動物オクルディンの第二の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列を有するペプチドまたはそのアナログをコードするＤＮＡ分子であって、ここで前記ペプチドまたはアナログが、インビボにおいてセルトリ細胞間の密着結合を破壊する、ＤＮＡ分子。
【請求項１５】
その第一部分が、前記ペプチドをコードし、その第二部分が、精巣中においてセルトリ細胞を選択的に標的するリガンドをコードする請求項１４のＤＮＡ分子であって、ここで前記ＤＮＡ分子の発現が、前記ペプチドおよび前記リガンドを含有する融合タンパク質を生成する、ＤＮＡ分子。
【請求項１６】
前記第二部分が、精巣中においてセルトリ細胞を選択的に標的するのに十分な卵胞刺激ホルモンの結合ドメインの少なくとも一部をコードする請求項１５のＤＮＡ分子ＤＮＡ分子。
【請求項１７】
前記アナログが、哺乳動物オクルディンの第二の細胞外ドメインのフラグメントに相当するアミノ酸配列を有し、そして少なくとも１つのアミノ酸置換、付加、または欠失の観点から、前記フラグメントの天然の配列とは異なり得る、請求項１４のＤＮＡ分子。
【請求項１８】
請求項１４のＤＮＡ分子を含むベクター。
【請求項１９】
請求項１４のＤＮＡ分子によって形質転換された非ヒト宿主。
【請求項２０】
大腸菌である請求項１９の非ヒト宿主。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互作用］
本出願は、２００１年６月１９日出願、米国仮特許出願第６０／２９９，３１３号（その開示は、参照することにより本明細書に組み込まれる）の利益を請求する。
【０００２】
［政府の支援］
本明細書において記載された本発明は、アメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）の助成金番号Ｕ５４−ＨＤ−１３５４１−２０Ｓによって、その一部は支援された。従って、政府は、本発明において権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
雌性生殖系は、長年にわたって広範に研究されてきた。雌性避妊の多くの方法が開発されている。対照的に、雄性生殖系の生理機能は十分に解明されていない。結果として、現在、男性に利用可能な、避妊の選択肢はほとんどない。
【０００４】
過去数十年にわたって、新しい雄性避妊の開発は、視床下部−下垂体−精巣軸を操作して精子形成を破壊することにほとんど集中してきた（Ｐａｕｌｓｅｎら、１９９４を参照のこと）。テストステロン、または合成プロゲスチンのいずれかの高用量投与によって、下垂体ゴナドトロピン分泌（これが次に精子減少症または無精子症をもたらす）を阻害することができる（Ｆｒｉｃｋら、１９９７）。精子形成に対するこの阻害効果は可逆的であるが、ステロイドまたはポリペプチドホルモンの外因性投与は、ホルモンバランスを妨害する傾向であって、望ましくない副作用を誘導する。アンドロゲンレベルが影響される場合、他の第二次性徴が影響される。さらに、雄性の性ホルモンであるアンドロゲンは、ヒトの身体において多様な影響を有する。アンドロゲンが調整する生理学的なエンドポイントのいくつかはまだ公知ではなく、従って、潜在的な副作用は、数年後まで不明であるかもしれない。
【０００５】
精子形成を通じて、一連の分子的事象、生化学的事象、および細胞事象が生じる。これらの事象によって、減数分裂の間に、２つの連続的減数分裂を介して、単一の精原細胞から４つの精子細胞の生成がもたらされる（概説については、ｄｅ  Ｋｒｅｔｓｅｒ、およびＫｅｒｒ，１９８８；Ｂａｙｅｒｓら，１９９３を参照のこと）。他方では、発達中の生殖細胞はまた、基部から精上皮の傍管腔（ａｄｌｕｍｉｎａｌ）区画に対して徐々に位置を変えねばならない。その結果、完全に発達した精子細胞（精子）が、精子形成の間に管腔中に放出され得る。さらに、血液−精巣関門（ＢＴＢ）を構成するセルトリ細胞間の密着結合（ＴＪ）は、ＢＴＢを横断する前細糸期精母細胞の適時的な通過を可能にするために、周期的に破壊されて再アセンブリされなければならない。これによって、傍管腔区画に入って、その細胞の発達が続く。ＢＴＢおよび上皮を横切る発達中の生殖細胞のこの適時的な移動は、精子形成の完了に必須である。
【０００６】
血液−精巣関門を作成するセルトリ細胞間ＴＪは、この精巣において重要な役割を果たす。第一に、精上皮と、基部の薄膜との間のフェンスとして働き、分子の傍細胞輸送を制限する。第二に、全身循環から生殖細胞発達を隔離する血液−精巣障壁の主要な部分を構成して、精子形成のための好ましい環境を作成する（Ｄｙｍら、１９７０）。第三に、ＴＪは、細胞極性を生み出して維持する。ＺＯ−１（Ｂｙｅｒｓら、１９９１；Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒら、１９９７）、ｃｉｎｇｕｌｉｎ（Ｂｙｅｒｓら、１９９３）、オクルディン（Ｍｏｒｏｉら、１９９８）、およびクラウディン−１、−３、−５、−７、−８、および−１１（概説については、Ｆａｎｎｉｎｇら、１９９９；Ｔｓｕｋｉｔａ、およびＦｕｒｕｓｅ，２０００を参照のこと）のようないくつかのＴＪ関連タンパク質が精巣において見出された。これらのタンパク質のうちでも、細胞質タンパク質であるＺＯ−１のみが、精巣において広範に研究されている（Ｂｙｅｒｓら、１９９１；Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒら、１９９７；Ｃｈｕｎｇら、１９９９；Ｗｏｎｇら、２０００）。
【０００７】
オクルディンは、ＴＪ鎖に位置する６５ｋＤａの内在性膜タンパク質である（Ｆｕｒｕｓｅら、１９９３；Ｆｕｊｉｍｏｔｏら、１９９５；Ｓａｉｔｏｕら、１９９７）。オクルディンは、４つの膜貫通ドメイン、長いカルボキシ末端細胞質ドメイン、短いアミノ末端細胞質ドメイン、２つの細胞外ループ、および１つの細胞内ループから構成される。これらのドメインの中でも、第一の細胞外ドメインは、Ｔｙｒ、およびＧｌｙの含量に富む（約６０％）（Ａｎｄｏ−Ａｋａｔｓｕｋａら、１９９６）。これらの特徴は、哺乳動物種の間で十分に保存されている（Ａｎｄｏ−Ａｋａｔｓｕｋａら、１９９６）。
【０００８】
オクルディン発現の誘導は、経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）によって評価した場合、ＴＪがアセンブリされている時点で検出される。このことは、オクルディンがＴＪ形成に必要であることを実証する。ＺＯ−１およびオクルディンの両方の発現は、セルトリ細胞間ＴＪがアセンブリされている時点で誘導されるが、これは、オクルディンの細胞質ドメインが、１：１のモル比でＺＯ−１と会合しているという観察と一致する（Ｆｕｒｕｓｅら、１９９４）。これらの結果はまた、ＺＯ−１が、リンカーとして働いて、ＴＪの生合成の間に、オクルディンのような内在性膜ＴＪタンパク質、およびアクチンベースの細胞骨格を架橋するという考えと一致している（Ｆｕｒｕｓｅら、１９９４；Ｆａｎｎｉｎｇら、１９９８）。ＴＪアセンブリの間のオクルディン発現の適時的な誘導はさらに、リン酸化されたオクルディンのレベルの上昇が、ＴＪアセンブリの間に観察されたといういくつかの報告と一致している（Ｓａｋａｋｉｂａｒａら、１９９７；Ｗｏｎｇら、１９９７ｂ）。
【０００９】
異なる上皮系におけるオクルディンの機能的解析によって、オクルディンが、ＴＪのアセンブリにおいて重要な役割と果たすことが示された（概説については、Ｍａｔｔｅｒ、およびＢａｌｄａ，１９９９；Ｍｉｔｉｃ、およびＡｎｄｅｒｓｏｎ，１９９８；Ｔｓｕｋｉｔａ、およびＦｕｒｕｓｅ，１９９９を参照のこと。）。例えば、ＴＥＲの増大を、全長オクルディンｃＤＮＡを用いたトランスフェクション後、ＭＤＣＫ細胞において検出した（Ｂａｌｄａら、１９９６；ＭｃＣａｒｔｈｙら、１９９６）。しかし、オクルディンが欠損した胚性幹細胞は、ＴＪを保有する極性を有する上皮性細胞に分化され得るということがまた見出されている（Ｓａｉｔｏｕら、１９９８）。この結果によって、クラウディン（別のＴＪ内在性膜貫通タンパク質であって、その少なくとも１８の異なる種が見出されている）、または他のこれから同定されるであろうＴＪインテグラルタンパク質（これはまた、裏打ちする細胞質ＴＪタンパク質であるＺＯ−１と会合することができる）が、ＴＪアセンブリにおいてオクルディンの役割にとって代わり得ることが示唆される。他の研究によって、クラウディン−１、−３、−５、−８、および−１１が、精巣に存在することが示され、このことによって、上皮細胞は、他のＴＪタンパク質を利用してＴＪを構築することが示唆される（概説については、Ｍｉｔｉｃら、２０００を参照のこと）。
【００１０】
合成オクルディンペプチドの効果は、インビトロで検討されている。例えば、１つの研究では、オクルディンの第一の外部ループに相当する合成ペプチドを用いて、細胞間接着におけるオクルディンの役割を試験した。オクルディンをトランスフェクトされた線維芽細胞を、オクルディンの第一の外部ループに相当するペプチドとともにインキュベートした場合、オクルディン誘導性の細胞接着は、阻害された（Ｖａｎ  Ｉｔｌａｌｉｅ、およびＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９９７）。この観察によって、第一の外部ループは、細胞間接着の原因であるという推測が思い起こされる。別の研究では、ニワトリオクルディンの第一の外部ループに対して相同なペプチドをアフリカツメガエルＡ６細胞培養物に添加することによって、ＴＪの再封（ｒｅｓｅａｌｉｎｇ）が防止された。対照的に、第二の細胞外ドメインに相当する１０アミノ酸のペプチドは、影響を有さない（Ｌａｃａｚ  Ｖｉｅｒａら、１９９９）。しかし、Ｗｏｎｇ、およびＧｕｍｂｉｎｅｒ（１９９７）は、ニワトリオクルディンの第一の外部ループ全体に基づいて合成された４４アミノ酸のペプチドは、培養されたアフリカツメガエル腎臓上皮（Ａ６）細胞中でＴＪを破壊できなかったが、第二の外部ループ全体にまたがる４４アミノ酸のペプチドは、Ａ６細胞におけるＴＪアセンブリを摂動（ｐｅｒｔｕｒｂ）させることを実証した。
【発明の開示】
【００１１】
本発明の１つの態様は、哺乳動物オクルディンの第二の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列を有するペプチドまたはそのペプチドのアナログと、キャリアとを含んでなる雄性避妊薬に関する。このペプチドまたはそのアナログは、インビボにおいてセルトリ細胞間の密着結合を破壊する。いくつかの実施形態において、このアナログは、哺乳動物オクルディンの第二の細胞外ドメインのフラグメントに相当する。このフラグメントの配列は、１つ以上のアミノ酸置換、付加、および／または欠失の観点から、天然物の対応するフラグメントとは異なり得る。
【００１２】
避妊薬は、経口的に投与されてもよいし、または非経口的に（例えば、精巣内注射によって）投与されてもよい。いくつかの実施形態において、このペプチドは、精巣細胞を特異的に標的する、リガンドに連結される（これによって、結合体を形成する）。他の好ましい実施形態において、リガンドはペプチドであり、そしてペプチド結合を介してオクルディンペプチドに連結され、その結果オクルディンペプチドおよびリガンドは、融合タンパク質の形態で連結される。より好ましい実施形態において、このリガンドは、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の結合ドメインの少なくとも一部を含む。オクルディンペプチド、および融合タンパク質をコードする核酸、ならびにこれを含有する構築物（例えば、ベクターおよび宿主）もまた提供される。避妊を行う方法、およびヒトのような哺乳動物において避妊効果を達成するためにこのペプチドまたは核酸を用いる方法がさらに提供される。
【００１３】
正常な環境下で、セルトリ細胞間の密着結合によって形成された血液−精巣関門は、生殖細胞が発達して完全に機能的な精細胞に成熟することを可能にする、精上皮と呼ばれる防御環境を規定する。いかなる特定の理論の運用によっても拘束されないが、出願人らは、セルトリ細胞によって、そしてセルトリ細胞の間で形成された密着結合を破壊することによって、本発明のペプチドがまた、血液−精巣関門（ＢＴＢ）の破壊を生じ、これが精上皮への身体の免疫細胞の流入をもたらすと考えている。免疫細胞は、生殖細胞を身体に対して「外来性（ｆｏｒｅｉｇｎ）」であると認識して、生殖細胞を破壊する。結果として、精子細胞数は、不妊レベルまで減少させられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のペプチド（「オクルディンペプチド」とも呼ばれる）は、セルトリ細胞の間の密着結合を破壊する哺乳動物のオクルディンの第二の細胞外ループ、またはそのアナログに相当する。ヒトオクルディンの模式図は、図８に例示している。理解されるとおり、ヒトオクルディンペプチドは、第一および第二の細胞内ループ／ドメインを含む。種々の哺乳動物オクルディンの第二の細胞外ループを表す配列のアラインメントを表１に示す。このアラインメントは、哺乳動物のオクルディンが、このドメインにおいて実質的な相同性、または配列類似性を保有することを示す。
【００１５】
【表１】
2004531269.tif 000002
【００１６】
Ｍｉｔｉｃら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．６０：１２１〜１４２（１９９８）、ならびにＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ−１１２６１９（ラットオクルディン）、ＮＰ−０３２７８２（マウスオクルディン）、ＡＡＣ５０４５１（ヒトオクルディン）およびＡ４９４６７（ニワトリオクルディン）を参照のこと。さらに、ネズミカンガルーは、この領域において有意な相同性を示す。なお他の哺乳動物種のオクルディンにおける第二の細胞外ループが、第二の細胞外ループ、またはそのフラグメントにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いてゲノムライブラリーをプローブすることなどによる、標準的な技術に従って同定され得る。配列情報の解釈を容易にするため、表２は、アミノ酸の名称、ならびに３文字記号および１文字記号の両方を示している。
【００１７】
【表２】
2004531269.tif 000003
【００１８】
概して、オクルディンペプチドのアナログは、このアナログが、インビボにおいてセルトリ細胞の間の密着結合形成を破壊するという条件下であれば、全長バージョン（表１に示された配列の）、またはそのフラグメントであって、１つ以上の天然に存在するかまたは合成の（例えば、改変された）アミノ酸の置換、付加、および／または欠失を有してもよい。このアナログが、１つ以上のアミノ酸置換を含む場合には、保存的変化が好ましい。例えば、Ｓ、Ｑ、Ｇ、およびＴのような親水性アミノ酸は、Ｄ、Ｎ、またはＧのような別の親水性アミノ酸残基で置換されてもよい。同様に、Ｙのような疎水性アミノ酸残基は、別の疎水性残基、例えば、Ｒ、Ｉ、Ｋ、またはＬで置換されてもよい。疎水性置換は、所定のキャリアにおけるペプチドの可溶性の観点から有利であり得る。非保存的置換はまた、そのアナログが密着結合形成を破壊する能力を保持するという条件下であれば、許容される。
【００１９】
好ましいアナログは、第二の細胞外ループに相当するフラグメントである。概して、密着結合形成を破壊するフラグメントは、哺乳動物オクルディンの第二の細胞外ループに相当する、約１２個から全て（例えば、４３〜４５個）のアミノ酸残基（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または４５個のアミノ酸残基を有するペプチド）を含む。好ましいフラグメントは、細胞膜の最も外側、すなわち最外部であるフラグメントであり（図８を参照のこと）、そして密着結合のインターロックドメインの形成に関与するループの一部に相当する。表１に示されるラットオクルディン配列に対して再度言及すれば、好ましいアナログは、１２個のアミノ酸配列ＴＩＣＳＱＦＹＴＰＧＧＴ（アミノ酸残基２１４〜２２５に相当する）を含む。ヒトにおいては、相当する１２個のアミノ酸配列は、ＡＬＣＮＱＦＹＴＰＡＡＴ（これもアミノ酸残基２１４〜２５５に相当する）である。従って、この１２個のアミノ酸ペプチド自体に加えて、このペプチドを含有する他のアナログが、いずれかの末端の配列に隣接する１つ以上の天然に存在するアミノ酸残基を単に付加することによって、推定され得る。再度表１を参照すれば、この１２個のアミノ酸配列を含有する代表的なアナログとしては、以下が挙げられる。
ＮＨ2−ＴＩＣＳＱＦＹＴＰＧＧＴ−ＣＯＯＨ
ＮＨ2−ＹＴＩＣＳＱＦＹＴＰＧＧＴ−ＣＯＯＨ
ＮＨ2−ＴＩＣＳＱＦＹＴＰＧＧＴＧ−ＣＯＯＨ
ＮＨ2−ＹＴＩＣＳＱＦＹＴＰＧＧＴＧ−ＣＯＯＨ
ＮＨ2−ＩＹＴＩＣＳＱＦＹＴＰＧＧＴ−ＣＯＯＨ
ＮＨ2−ＴＩＣＳＱＦＹＴＰＧＧＴＧＬ−ＣＯＯＨ
ＮＨ2−ＩＹＴＩＣＳＱＦＹＴＰＧＧＴＧ−ＣＯＯＨ
ＮＨ2−ＹＴＩＣＳＱＦＹＴＰＧＧＴＧＬ−ＣＯＯＨ
ＮＨ2−ＱＩＹＴＩＣＳＱＦＹＴＰＧＧＴ−ＣＯＯＨ
ＮＨ2−ＱＩＹＴＩＣＳＱＦＹＴＰＧＧＴＧ−ＣＯＯＨ
ＮＨ2−ＹＴＩＣＳＱＦＹＴＰＧＧＴＧＬＹ−ＣＯＯＨ
ＮＨ2−ＹＴＩＣＳＱＦＹＴＰＧＧＴＧＬＹＶ−ＣＯＯＨ
ＮＨ2−ＹＴＩＣＳＱＦＹＴＰＧＧＴＧＬＹＶＤ−ＣＯＯＨ
ＮＨ2−ＩＹＴＩＣＳＱＦＹＴＰＧＧＴＧＬＹＶＤ−ＣＯＯＨ
ＮＨ2−ＱＩＹＴＩＣＳＱＦＹＴＰＧＧＴＧＬＹＶＤ−ＣＯＯＨ
ＮＨ2−ＳＱＩＹＴＩＣＳＱＦＹＴＰＧＧＴＧＬＹＶＤ−ＣＯＯＨ
ＮＨ2−ＴＩＣＳＱＦＹＴＰＧＧＴＧＬＹ−ＣＯＯＨ
ＮＨ2−ＴＩＣＳＱＦＹＴＰＧＧＴＧＬＹＶ−ＣＯＯＨ
ＮＨ2−ＴＩＣＳＱＦＹＴＰＧＧＴＧＬＹＶＤ−ＣＯＯＨ
ＮＨ2−ＧＳＱＩＹＴＩＣＳＱＦＹＴＰＧＧＴＧＬＹＶ−ＣＯＯＨ
ＮＨ2−ＧＳＱＩＹＴＩＣＳＱＦＹＴＰＧＧＴＧＬＹ−ＣＯＯＨ
ＮＨ2−ＧＳＱＩＹＴＩＣＳＱＦＹＴＰＧＧＴＧＬ−ＣＯＯＨ
ＮＨ2−ＧＳＱＩＹＴＩＣＳＱＦＹＴＰＧＧＴＧ−ＣＯＯＨ
【００２０】
付番の観点から記載された（例えば、（２１４〜２２５）と記される、ＴＩＣＳＧＦＹＴＰＧＧＴ）、この配列を含むいくつかの他のアナログとしては、アミノ酸残基（２１３〜２２５）、（２１２〜２２５）、（２１１〜２２５）、（２１０〜２２５）、（２０９〜２２５）、（２０８〜２２５）、（２０７〜２２５）、（２０６〜２２５）、（２０５〜２２５）、（２０４〜２２５）、（２０３〜２２５）、（２０２〜２２５）、（２０１〜２２５）、（２００〜２２５）、（１９９〜２２５）、（２１４〜２２６）、（２１４〜２２７）、（２１４〜２２８）、（２１４〜２２９）、（２１４〜２３０）、（２１４〜２３１）、（２１４〜２３２）、（２１４〜２３３）、（２１４〜２３４）、（２１４〜２３５）、（２１４〜２３６）、（２１４〜２３７）、（２１４〜２３８）、（２１４〜２３９）、（２１４〜２４０）、（２１４〜２４１）、（２１４〜２４２）、（２１４〜２４３）、（２１３〜２２６）、（２１２〜２２７）、（２１１〜２２８）、（２１０〜２２９）、および（２０９〜２３０）が挙げられる。同じスキームを用いて、ヒトを含む、他の哺乳動物オクルディン由来の適切なアナログの列挙は、容易に作成できる。
【００２１】
文献に記載された標準的な手順を用いて、精巣中で、他のアナログを試験して、それらが、セルトリ細胞間密着結合を破壊するか否かを決定することができる。Ｌｕｉ  ＷＹ、Ｌｅｅ  ＷＭ、およびＣｈｅｎｇ  ＣＹ（２００１）Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂ３  ｐｅｒｔｕｒｂｓ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒ−Ｓｅｒｔｏｌｉ  ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐｏｓｓｉｂｌｙ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｖｉａ  ｉｔｓ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｏｃｃｌｕｄｉｎ，ｚｏｎｕｌａ  ｏｃｃｌｕｄｉｎｓ−１、ａｎｄ  ｃｌａｕｄｉｎ−１１、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４２：１８６５−１８７７；Ｃｈｕｎｇ  ＮＰＹ、およびＣｈｅｎｇ  ＣＹ（２００１）Ｉｓ  ｃａｄｍｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｔｅｒ−Ｓｅｒｔｏｌｉ  ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ａ  ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｏｄｅｌ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｔｈｅ  ｅｖｅｎｔｓ  ｏｆ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｔｅｓｔｉｓ？、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４２：１８７８−１８８８；ならびにＧｒｉｍａ  Ｊ、Ｗｏｎｇ  ＣＳＣ、Ｚｈｕ  ＬＪ、Ｚｏｎｇ  ＳＤ、およびＣｈｅｎｇ  ＣＹ（１９９８）Ｔｅｓｔｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｂｙ  Ｓｅｒｔｏｌｉ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｒｔｏｌｉｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ  ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒ−Ｓｅｒｔｏｌｉ  ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２１０４０〜２１０５３を参照のこと。セルトリ細胞の単層懸濁物を調製する（例えば、ここでは、セルトリ細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングした二室性の装置上で、約１×１０6細胞／ｃｍ2の密度で培養させる）。次いで、電流（約２０ｕＡ）のパルスを、短時間（例えば、約２秒）、２つの電極の間（例えば、銀−塩化銀）のセルトリ細胞上皮を横断して加え、その抵抗を（例えば、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ電気抵抗システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ）を用いて）定量する。その抵抗に、そのフィルターの表面積（約０．６ｃｍ2）を掛けて、抵抗をオーム×ｃｍ2として得る。次いで、そのアナログを懸濁物に添加する。このアナログが、密着結合関門を摂動させる場合、セルトリ細胞上皮を横切る電気抵抗は、低下する（例えば、約１００オーム×ｃｍ2〜約４０〜８０オームｃｍ2、またはさらに下）。
【００２２】
本発明のペプチドおよびアナログは、固相ペプチド合成のような標準的技術に従って、または組み換え宿主（例えば、細胞）における、このペプチドをコードするＤＮＡの発現によるなどの遺伝子操作を介して調製されてもよい。公知の適切な宿主としては、細菌、酵母、真菌、哺乳動物、および植物細胞を挙げることができる。コドン優先度、調節性配列の選択、および宿主などのパラメーターは、公知の手順に従って最適化されてもよい。
【００２３】
本発明のペプチドは、雄性避妊薬として有用である。従って、任意の雄性哺乳動物、特にヒトに対する投与のために処方されてもよい。投与されるペプチドの量は、この雄の体重および全体的健康状態、ならびに投与の様式のようないくつかの要因に基づく。しかし、概して、投薬量は、約０．１〜１０ｍｇ／精巣の範囲である。この雄は通常、投与の時点から約２〜４週間内に生殖能力がなくなる。ペプチドの効果は、一時的である。この雄は、効果が切れて、受精能力が回復するまで、約６週間、生殖能力がないままである。これらの期間は、個人により変化する。
【００２４】
避妊薬の投与の適切な様式としては、経口投与、および非経口投与（皮下注射、または精巣内注射などによる）が挙げられる。さらに、精巣に対するペプチドの送達は、ペプチドと、リガンド、例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、またはその誘導体（精巣細胞に選択的に結合する、減退した（野生型タンパク質に比べて）、または好ましくはホルモン活性を完全に欠く）とのカップリングなどによって標的されてもよい。このリガンドは、現実には、ペプチドであってもペプチドでなくてもよい。従って、このリガンドは、化学的架橋の手段のような、標準的な技術および試薬に従って、オクルディンペプチドと結合されて、結合体を形成することができる。このリガンドがペプチドである実施形態では、オクルディンペプチド、およびリガンドは、融合タンパク質を生成するために、ペプチド結合を介して連結されてもよい。このリガンドは、精巣細胞、そして好ましくはセルトリ細胞中に、より豊富に、または排他的に存在するレセプターを標的するように選択される。従って、この結合体または融合タンパク質は、レセプターを少量発現するか、または全く発現しない細胞に比べて、このような細胞に優先的にまたは選択的に結合する。
【００２５】
ＦＳＨは、２つの非共有的に結合したαサブユニット、およびβサブユニットから構成されるヘテロ二量体糖タンパク質である（概説については、Ｐｉｅｒｃｅら、１９８１を参照のこと）。ＦＳＨは、βサブユニット（Ｌｉｎｄａｕ  Ｓｈｅｐａｒｄら、１９９４）のＣ末端領域におけるアミノ酸残基９３〜９９の内、ならびにαサブユニット（Ｚｅｎｇら、１９９５）のＨｉｓ９０およびＬｙｓ９１に存在する、ＦＳＨのレセプター結合部位を介して、セルトリ細胞上に存在するＦＳＨレセプターに結合する（概説については、Ｆｒｉｔｚら、１９７８を参照のこと）。ＦＳＨレセプターは、他の細胞型に存在するとは知られていない。αサブユニット上のアミノ酸残基Ａｓｎ５２、およびＡｓｎ７８、ならびにβサブユニット上のアミノ酸残基Ａｓｎ７、およびＡｓｎ２４は、ホルモン活性を付与する（概説については、Ｒｏｓｅら、２０００を参照のこと）。αサブユニットの２つのＡｓｎ残基の脱グリコシル化によって、バイオポテンシー（ｂｉｏｐｏｔｅｎｃｙ）が野生型の約４１％まで有意に低下するということが報告されている（Ｂｉｓｈｏｐら、１９９４）。従って、これらの４つの部位における部位特異的突然変異誘発によって、セルトリ細胞に対する結合親和性を維持しながら、ホルモン活性をほとんど有さないか、または無視できる（機能的に問題にならない）ホルモン活性しか有さないＦＳＨ分子が得られる。次いで、組み換えタンパク質（ペプチドに融合したＦＳＨ）、またはペプチドにＦＳＨが（例えば、化学的架橋剤によって）連結されている結合体を生成する目的で、このような変異したＦＳＨをコードする配列を、発現ベクターに挿入して、宿主（例えば、ＣＨＯ細胞）にトランスフェクトすることができる（Ｋｅｅｎｅら、１９８９；Ｖａｎ  Ｗｅｚｅｎｂｅｅｋら、１９９０）。この場合、皮下（例えば、筋肉内）投与が、特に適切である。他の適切なリガンドの選択、および必要な結合親和性を維持する（ただし、ここで他のネイティブな機能は効果的に排除される）ためのその改変は、細胞特異的な送達系の当業者の水準内である。
【００２６】
同様に、キャリアの選択は、投与の任意の所定の様式についてなされて、最適化されてもよく、薬学の当分野の水準内である。投与の任意の所定の様式のためにペプチドを処方するのに有用であり得る他の成分（例えば、アジュバント、希釈物、賦形剤、および／または安定化剤）の選択は、当分野で公知であり、そして工業における標準的手技に従って選択され得る（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０００））。
【００２７】
オクルディンペプチドはまた、送達のために、多数の正に荷電したリジン（Ｋ），およびアルギニン（Ｒ）残基を有する約１０〜１６残基の小ペプチドである、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）に結合されてもよい。好ましくは、このＰＴＤは、１〜５個のこのような残基を有するべきである。βグルコシダーゼ（約１２０ｋＤａ）と同じ程度大きい機能的タンパク質が、ＮＨ２−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲの配列を有するＴａｔ−ＰＴＤ（レトロウイルス由来のトランス活性化タンパク質のＴａｔ鎖）に結合体化される場合、腹腔内注射を介して細胞に対して細胞内送達することができるということが研究によって示されている（Ｓｃｈｗａｒｚｅら、１９９９；Ｓｃｈｗａｒｚｅ、およびＤｏｗｄｙ、２０００）。ＰＴＤとの結合体化は、精巣におけるセルトリ細胞へのオクルディンペプチドの送達を改善することによって、避妊薬の効率を増強することができる。
【００２８】
避妊はまた、適切な送達系を介して、オクルディンペプチド（または融合ペプチド）をコードする核酸を、雄に投与することによって達成することができる。例えば、アデノウイルス／レトロウイルス媒介性の遺伝子移入システムはまた、ペプチドを送達するために用いることができる。Ｂｌａｎｃｈａｒｄ、およびＢｏｅｋｅｌｈｅｉｄｅ、１９９７；Ｎａｇａｎｏら、２０００を参照のこと。例えば、βガラクトシダーゼのようなレポーター遺伝子に連結されたオクルディンペプチドに相当するペプチドをコードするＤＮＡ分子が、ヒトアデノウイルス血清型５のような複製欠陥ウイルス発現ベクターに挿入される（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、１９９０；Ｌｅｅら、１９９３；Ｂｌａｎｃｈａｒｄら、１９９７）。好ましい実施形態において、Ｅ１欠失、およびＥ３欠失の両方を含む、複製能をもたないヒトアデノウイルス血清型５であって、ここでオクルディンペプチドおよびレポーター遺伝子のコード配列が挿入されており、そしてアデノウイルスプロモーターによって駆動される、アデノウイルスが構築される。インビトロにおけるウイルスパッケージングを実施して、高い力価のウイルスストックを生成する。ウイルスストックの濃度は、プラーク形成単位アッセイを用いて、２９３ヒト胚性腎細胞を用いて定量される（Ｈｉｔｔら、１９９５）。次いで、このウイルスストックを、ＣａＣｌ2、およびＭｇＣｌ2を含有するＰＢＳを用いて、適切な濃度に希釈して、精巣内注射によって精巣に送達する。
【００２９】
本発明は、その好ましい特定の実施形態と併せて記載されているが、上記の説明、および以下の実施例は、本発明の範囲を例示することを意図しており、本発明の範囲を限定しないことが理解されるべきである。本発明の範囲内の他の態様、利点、および改変は、本発明が属する当分野の当業者に明白である。
【００３０】
以下の実施例は、ラットオクルディンの第二の細胞外ドメインに相当する２２アミノ酸のペプチドである本発明のペプチドを用いて実施された実験を記載する。セルトリ細胞上皮を横切る経上皮の電気的抗を測定することによって、インビトロでこのペプチドを、試験した。このペプチドは、セルトリ細胞の密着結合を可逆的に破壊した。このペプチドをまた、雄性ラットにおける精巣注射によってインビボで評価したところ、その結果によって、精上皮由来の生殖細胞の可逆的な枯渇、および血液−精巣関門の破壊が示された。
【実施例】
【００３１】
動物。成体（２５０〜３００ｇの体重を秤量する）、および２０日齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、ＭＡ）から入手した。全てのラットを、Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＬＡＲＣ）で飼育した。１つのケージあたり、２匹の成体ラットを飼育した。全ての動物を、制御された温度（２２℃）、および１２時間：１２時間の一定の明：暗サイクルのもとで、、標準的なラットの飼料および水に対して自由摂取できるようにした。これらの動物を、動物保護法（Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ａｃｔ）の適用可能部分、および保健社会福祉省（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）の刊行物のガイドライン：「Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ」に従って維持した。本出願に記載されるような動物の使用は、ロックフェラー大学の動物の取り扱いおよび使用の委員会（Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の以下のプロトコール番号：９７１１７，９５１２９Ｒ、および００１１１によって承認された。
【００３２】
セルトリ細胞培養物の調製。初代セルトリ細胞を、以前に記載されたように（Ｃｈｅｎｇら、１９８６）、２０日齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの精巣から単離した。低い細胞密度の培養のために、１００ｍｍのペトリ皿に５×１０4細胞／ｃｍ2で、セルトリ細胞をプレートした［約４．５×１０6細胞／１００ｍｍディッシュ／９ｍｌ  ハムのＦ１２栄養混合物／ダルベッコの改変イーグル培地（Ｆ１２／ＤＭＥＭ、１：１，ｖｏｌ／ｖｏｌ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）；Ｆ１２／ＤＭＥＭに、以下を補充した。１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１．２ｇ／Ｌ  炭酸水素ナトリウム、１０μｇ／ｍｌ  ウシインスリン、５μｇ／ｍｌ  ヒトトランスフェリン、２．５ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ、２０ｍｇ／Ｌ  ゲンタマイシン、および１０μｇ／ｍｌバシトラシン。低細胞密度で培養されたセルトリ細胞は、ＴＥＲ測定によってモニターした場合、セルトリ細胞間のＴＪのアセンブリなしに、単層の上皮を形成した（Ｇｒｉｍａら、１９９８）。しかし、接着結合（ａｄｈｅｒｅｎｓ  ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ）（ＡＪ）、およびギャップ結合（ＧＪ）の両方が形成された（Ｃｈｕｎｇら、１９９９）。高い細胞密度培養のために、以前に記載されたとおり（Ｇｒｉｍａら、１９９８）、０．６〜３×１０6細胞／ｃｍ2の密度で、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｅｌｆｏｒｄ、ＭＡ）でコーティングした（Ｆ１２／ＤＭＥＭを用いて１：７（ｖｏｌ／ｖｏｌ）に希釈した）２４ウェルディッシュ（有効な表面積、約１．８８ｃｍ2、１ウェルあたり２ｍｌのＦ１２／ＤＭＥＭを有する）の上にセルトリ細胞をプレートして、ＴＪ、ＡＪ、およびＧＪ（種々の基準によって評価した場合、インビボで見出されるセルトリ細胞を模倣する）の形成をさせた（Ｇｒｉｍａら、１９９２）。３５℃で、９５％空気、および５％ＣＯ2（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の湿潤雰囲気において、細胞培養物をインキュベートして、ＴＥＲ読み取りを２４時間後に記録して、１日目の培養として指定した。これらのセルトリ細胞培養物は、顕微鏡的に試験した場合、９５％より大きい純度を有することが示された（Ｗｏｎｇら、２０００；Ｇｒｉｍａら、１９９２；Ｇｒｉｍａら、２０００）。
【００３３】
半定量的ＲＴ−ＰＣＲによるオクルディンの定常状態ｍＲＮＡレベルの検出。本質的に、以前に記載されたとおり（Ｇｒｉｍａら、１９９８；Ｃｈｕｎｇら、１９９８ａ、ｂ；１９９９；Ｍｏｎｋ、およびＣｈｅｎｇ、１９９９）、半定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＲＮＡ  ＳＴＡＴ−６０（商標）（Ｔｅｌ  Ｔｅｓｔ「Ｂ」Ｉｎｃ．，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）によって特定の時点で、培養した細胞からＲＮＡを抽出した。最終反応容積２５μｌ中で、１μｇのオリゴ−ｄＴ15、およびＭＭＬＶ逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、総ＲＮＡの約３μｇを、ｃＤＮＡに逆転写した。種々のサンプル由来のオクルディンｍＲＮＡのレベルを定量して比較するために、オクルディンをＳ１６と同時増幅して、それによってオクルディンの相対的発現をＳ１６に対して正規化することができた。予備的な実験では、種々の濃度のテンプレートおよびプライマー対を用いて、ＰＣＲを実施した。そして２０〜２８の範囲の増幅サイクルにわたってＰＣＲ産物を試験して、標的遺伝子およびＳ１６の直線性を確認した。ほとんどの実験においては、３μｌのＲＴ産物と、以下とを合わせることによって、ＰＣＲを実施した。０．４μｇの各々のオクルディンプライマー（センスプライマー：５’−ＣＴＧＴＣＴＡＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴＣＧ−３’、ヌクレオチド７７０〜７８８、およびアンチセンスプライマー：５’−ＣＡＴＴＣＣＣＧＡＴＣＴＡＡＴＧＡＣＧＣ−３’、ヌクレオチド１０４４〜１０６３）（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号ＡＢ０１６４２５）、ラットリボソームＳ１６プライマーの各々８０ｎｇ（センスプライマー：５’−ＴＣＣＧＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＴＴＣＡＡＧＴＣＴＴ−３’、ヌクレオチド１５〜３８、およびアンチセンスプライマー：５’−ＧＣＣＡＡＡＣＴＴＣＴＴＧＧＡＴＴＣＧＣＡＧＣＧ−３’、ヌクレオチド３７６〜３９９）（Ｃｈａｎら、１９９０）、５μｌ  １０×ＰＣＲ緩衝液、３μｌのＭｇＣｌ2（２５ｍＭ）８μｌのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰの各々２００μＭ）、２．５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、および滅菌二回蒸留水（最終容積５０μｌに）。ＰＣＲについてのサイクルパラメーターは以下のとおりであった。９４℃で１分間の変性、６２℃で２分間のアニーリング、および７２℃で３分間の伸長を全部で２３サイクル、その後に７２℃で１５分の伸長を続けた。検出限界を強化するために、そして得られたオートラジオグラムの濃度測定スキャン後の半定量的解析のためのデータを得るために、［γ−32Ｐ］標識プライマーの存在下でＰＣＲを実施した。要するに、オクルディンおよびＳ１６のセンスプライマーを、Ｔ4ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて、［γ−32Ｐ］−ｄＡＴＰ（比活性、６０００  Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって、５’末端で標識した。［γ−32ｐ］−Ｓ１６（センスプライマー，−１０，０００  ｃｐｍ／ＰＣＲ  チューブ）：［γ−32Ｐ］−オクルディン（センスプライマー）の相対比は、標識されていない対応するセンスプライマーと同じであって、その結果、得られたオートラジオグラムは、臭化エチジウムで染色したゲルの複製である。ＰＣＲ産物の約１０μｌのアリコートを、泳動緩衝液として、０．５×ＴＢＥ（４５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ホウ酸塩，１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ８．０）を用いて、５％Ｔポリアクリルアミドゲル上で分離した。ＰＣＲ産物を臭化エチジウ染色によって可視化した。次いで、ゲルを乾燥させて、コダック（Ｋｏｄａｋ）Ｘ−ＯＭＡＴ  ＡＲフィルム（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を用いて、オートラジオグラフィーを実施した。得られたオートラジオグラムを、ＵｌｔｒｏＳｃａｎ  ＸＬ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて６００ｎｍで濃度測定的にスキャンして、Ｓ１６に対してデータを正規化して、半定量的データを得た。
【００３４】
２２アミノ酸のオクルディン合成ペプチドの合成、精製、および特徴づけ。ラットオクルディンの第二の細胞外ドメインに相当する２２個のアミノ酸のペプチド（ＮＨ2−ＧＳＱＩＹＴＩＣＳＱＦＹＴＰＧＧＴＧＬＹＶＤ−ＣＯＯＨ、アミノ酸残基２０９〜２３０）（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号ＡＢ０１６４２５）、および２２アミノ酸の筋小管（ｍｙｔｏｔｕｂｕｌａｒｉｎ）（ＮＨ2−ＴＫＶＮＥＲＹＥＬＣＤＴＹＰＡＬＬＡＶＰＡＮ−ＣＯＯＨ、残基１５６〜１７７）（Ｌｉら、２０００ａ）を、ＳｙｎＰｅｐ  Ｃｏｒｐ（Ｄｕｂｌｉｎ、ＣＡ）から入手した。これらのペプチド配列は、ＢＬＡＳＴ検索ソフトウェアを用いて、ＧｅｎＢａｎｋにおいて既存の入力に対して相同性を共有しない。しかし、ラットオクルディンについての配列の短いストレッチは、異なる種から単離されたオクルディンの間で９０％の相同性を共有した。合成ペプチドを精製するために、５００μｇの粗ペプチドを、溶媒Ａ（５％アセトニトリル、９５％水、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）トリフルオロ酢酸含有）中に溶解して、１ｍｌ／分の流速で、Ｖｙｄａｃ（商標）（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｇｒｏｕｐ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ、ＣＡ）Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（４．６×２５０ｍｍ内径）にロードした。次いで、オクルディンペプチドを他の混入物から分離して、記載のとおり（Ｌｉら、２０００；Ｍｏｎｋ  ＆  Ｃｈｅｎｇ、１９９９）、３０分間にわたって１５〜６５％の溶媒Ｂ（９５％アセトニトリル、５％水、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）トリフルオロ酢酸含有）の直線勾配を用いて溶出した。その溶出物を、２２０ｎｍでＵＶ吸収によってモニターして、各々０．５ｍｌの画分を回収した。オクルディンペプチドを含有する画分をプールして、凍結して、凍結乾燥した。その後、約５０ｐｍｏｌの精製したオクルディンペプチドを、ミクロシーケンシングして、以前に記載されたとおり同一性を確認した（Ｍｏｎｋ、およびＣｈｅｎｇ、１９９９；Ｃｈｅｎｇら、１９９８；ならびにＣｈｅｎｇら、１９８９）。平均反応収率は約９６％であった。
【００３５】
セルトリ細胞上皮を横切る経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）を測定することによる、セルトリ細胞間ＴＪ透過性関門の完全性の評価。セルトリ細胞間ＴＪのアセンブリに対するオクルディンペプチドの効果を評価するために、２０日齢のラット精巣から単離したセルトリ細胞を、１．２×１０6細胞／ｃｍ2に培養して、セルトリ細胞間ＴＪのアセンブリを可能にし、そしてセルトリ細胞上皮を横切る、ＴＪの完全性の定量的な指標であるＴＥＲを、以前に記載されたように定量した（Ｗｏｎｇら、２０００；Ｇｒｉｍａら、１９９８）。細胞を、先端のチャンバ中で、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（１：７）でコーティングしたＨＡフィルター上にプレートした（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）（２５，２８）。セルトリ細胞の凝集物の間に気泡が取り込まれないように細心の注意を払った。気泡は、セルトリ細胞上皮を横切る定常なＴＥＲを得るには主な障害である。なぜなら気泡は、隣接するセルトリ細胞の間に物理的な細孔を作成するからである。特定の時点でセルトリ細胞上皮を横切るＴＥＲは、記載されたとおり（Ｇｒｉｍａら、１９９８；Ｃｈｅｎｇ、およびＣｈｕｎｇ、２００１）、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ電気抵抗システムによって決定された。抵抗（オーム）に、二室性の装置の有効表面積（約０．６ｃｍ2）を掛けて、面積抵抗（オーム・ｃｍ2）を得た。次いで、セルトリ細胞をプレートしたチャンバの値から、バックグラウンド値（Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングした無細胞のチャンバ上で測定した）を差し引きすることによって、電気抵抗の正味の値を計算した。ＴＥＲ測定の間の温度誘導性の変動を最小化するために、セルトリ細胞上皮を横切るＴＥＲを記録する前に２０〜３０分間、培養物を室温で安定化させた。新鮮に単離したセルトリ細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティング装置上にプレートした（１日目）２４時間後に、二室性の装置の基部チャンバ（０．５ｍｌ  Ｆ１２／ＤＭＥＭ、０．０３％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＤＭＳＯ含有、ＤＭＳＯは倍地中のペプチドを可溶化するために用いた）、および先端チャンバ（０．５ｍｌ  Ｆ１２／ＤＭＥＭ、０．０３％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＤＭＳＯ含有）に、０．２〜４μＭの合成オクルディンペプチドを、入れた。培地が毎日交換される場合、ペプチドが、０．０３％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＤＭＳＯ含有Ｆ１２／ＤＭＥＭに含まれた。選択実験において、ペプチドなしのＦ１２／ＤＭＥＭ、および引き続く培地（これもペプチドを含まない）を用いた２回連続の洗浄によって、細胞をリンスすることによって、合成オクルディンペプチドを、セルトリ細胞上皮から除去した。コントロール実験は、（ｉ）単独で培養されたセルトリ細胞、（ｉｉ）ビヒクルのみ（０．０３％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＤＭＳＯを有する培地）を用いて培養されたセルトリ細胞、および（ｉｉｉ）４μＭの２２アミノ酸合成筋小管ペプチドの存在下で培養されたセルトリ細胞（上記のとおり）、を含んでいた。各時点で、三連の培養物を含んだ、そして異なるバッチのセルトリ細胞を用いて、各々の実験を、２〜３回繰り返した。本発明者らは、他の方法論よりも、ＴＥＲ測定値を定量すること、ならびにセルトリ細胞間ＴＪのアセンブリおよび維持を選択したが、これには、（ｉ）セ���トリ細胞上皮を横切る［3Ｈ］−インスリン、［125Ｉ］−ＢＳＡ、またはフルオレセインイソチオシアネート標識デキストランの拡散の制限、（ｉｉ）二室性装置の先端部チャンバおよび基部チャンバにおける培地の非平衡の維持、ならびに（ｉｉｉ）記載された（Ｇｒｉｍａら、１９９２；Ｇｒｉｍａら、２０００）ような、トランフフェリン、ｒＡＢＰ、テスチン、クルステリン、およびα２マクログロブリンのようなセルトリ細胞産物の分極した分泌。そして、この理由は以下である。第一に、これは、この分野における細胞生物学者によって広く受け入れられた技術である（Ｗｏｎｇら、１９９７；Ｂａｌｄａら、１９９６）、を含んでいた。第二に、これによって、セルトリ細胞間ＴＪのアセンブリおよび維持に対する定量的測定が得られる。第三に、そして最も重要なことに、ＴＥＲ測定によって得られた結果は、上記のような他の冗漫なアプローチ（例えば、［3Ｈ］−インスリンの制限拡散）と一致しており、そしてフルオレセインイソチオシアネート標識デキストラン（Ｔｅｃａｎ  ＧＥＮｉｏｓサイトフルオロメーターによってモニターした）を、ＴＥＲと平行して用いて、密着結合透過性関門を評価した。
【００３６】
オクルディンペプチドの精巣内注射、および精巣の組織学的分析。精子形成に対するオクルディンペプチドのインビボ効果を評価するため、以下のように、直接精巣内注射によって成体ラットの精巣にペプチドを投与した。０．９％の滅菌生理食塩水（ＵＶに５分間曝すことによって滅菌した）にペプチドを懸濁した。このペプチド懸濁物を使用前に滅菌するための短いＵＶ処理は、その構造を変更せず、そしてこのことは２つのアプローチによって確認されたことに注意のこと。第一にＵＶ処理したペプチドは、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、内径）（Ｃｈｅｎｇら、１９９８；Ｃｈｅｎｇら、１９８９）を用いる逆相ＨＰＬＣ上で、ＵＶ処理前のペプチドと比べて、同じ保持時間を保っていた。第二に、直接のタンパク質ミクロシーケンシングを、記載されたとおり（Ｍｒｕｋ、およびＣｈｅｎｇ、１９９０；Ｃｈｅｎｇら、１９９８；Ｃｈｅｎｇら、１９８９）実施した場合、ＵＶ処理したペプチドの一次配列は、変更されないままであった。２５０〜３００ｇの体重を秤量する成体ラットを、処置前にＭｅｔｏｆａｎｅ（登録商標）を用いて麻酔した。ラットには、３００μｌの０．９％滅菌生理食塩水、（ビヒクルコントロール）、処理なし（コントロール）、または１．５〜１０ｍｇのオクルディンペプチド（３００μｌの０．９％生理食塩水に懸濁した）のいずれかを精巣内に投与した。ペプチドまたはビヒクルを投与された動物の右の精巣、および同じ動物の左の精巣を処理して、コントロールとして用いた。本質的に以前に記載されたとおり、１部位あたり約１００μｌのサンプルを用いて３部位／精巣に、ペプチドまたはビヒクルを投与した（Ｇｒｉｍａら、１９９８；Ｅｎｇら、１９９４）。別のコントロール群において、オクルディンと配列相同性を有さない、公知のセルトリ細胞タンパク質である、ラット筋小管（ｒＭＴＭ）（Ｌｉら、２０００；Ｌｉら、２００１）に基づく、ＮＨ2−ＴＫＶＮＥＲＹＥＬＣＤＴＹＰＡＬＬＡＶＰＡＮ−ＣＯＯＨという合成された２２アミノ酸のペプチドをラットに注射した。各々の処理群において３匹のラットを用いた。そして特定の時点でラットをＣＯ2窒息によって屠殺した。精巣を直ちに除去して、１０％の中性の緩衝化ホルマリン中で固定した。精巣をパラフィン中に包埋して、段階的エタノール中で脱水させた。形態学的解析のために、５μｍの切片を切り取って、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＰＭ−３０露出制御装置（Ｅｘｐｏｓｕｒｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｕｎｉｔ）に接続された、オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ）ＢＸ４０顕微鏡（日本、東京（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ））を用いて、約５０の切片を、各々の精巣について異なる部位で試験した。
【００３７】
微小穿刺技術による血液−精巣関門（ＢＴＢ）のオクルディンペプチド誘導性破壊の評価
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の放射ヨウ素標識。
簡潔に言えば、５μｇのＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，ＲＩＡ等級、分子量６８ｋＤａ）を、記載どおり（Ｃｈｅｎｇら、１９８３）、１  ｍＣｉの［125Ｉ］−ヨウ化ナトリウム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、Ｉｏｄｏｇｅｎ（Ｆｒａｋｅｒら、１９７８）によって、放射ヨウ素標識した。
【００３８】
精細管液（ＳＴＦ）および精巣網液（ＲＴＦ）における［125Ｉ］−ＢＳＡの検出。上記のように、オクルディンまたは筋小管ペプチド／精巣のいずれかの１．５ｍｇの精巣内投与（右の精巣に対して３つの部位で投与された）（ここでは、同じ動物の左の精巣がコントロールとして用いられた）の後、２、４、６、および１２週。ラット（ペプチド処理の時点で、１時点あたり、体重約２５０グラム、ｎ＝４〜６のラット）を、体重１ｋｇあたり６０ｍｇのケタミンＨＣｌ（Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ  ＩＡ）を用いて麻酔した。微小穿刺を本質的に記載どおりに実施した（Ｔｕｒｎｅｒら、１９８４；Ｓｔａｈｌｅｒら、１９９１）。要するに、精巣を腹部切開によって露出し、外科用の絹の縫合糸を用いて輸出管を結紮した。次いで、精巣を陰嚢に戻して、７０％エタノールを用いて創傷を浄化して、外科的に閉鎖して、動物を覚醒させた。輸出管の結紮後２４時間で、ケタミンＨＣｌによってラットを麻酔し、両側腎摘出術を実施して［125Ｉ］−ＢＳＡの腎排泄を防ぎ、そして約６×１０6ｃｐｍの［125Ｉ］−ＢＳＡを、頸静脈を介してラットに注入した。注入の２時間後、精巣を取り出して、γカウンターにおける放射能決定のために、ＲＴＦ、およびＳＴＦを記載どおり（Ｔｕｒｎｅｒら、１９８４；Ｓｔａｈｌｅｒら、１９９１）回収した。オクルディンも筋小管ペプチド（コントロールとして働く）のいずれも投与されていない同じ動物由来の左の精巣、ならびにＳＴＦおよびＲＴＦの両方についても、放射能決定のために回収して、ＢＴＢの完全性を評価した。
【００３９】
統計学的解析。処理したサンプルと、その対応するコントロールとを比較するスチューデントのｔ検定によって、またはＧＢ−ＳＴＡＴ統計学的解析パッケージ（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ）（バージョン７．０、Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）を用いるＡＮＯＶＡによって、結果を統計学的有意性について解析した。ＡＮＯＶＡについて、チューキーの誠実有意差（ｈｏｎｅｓｔｌｙ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）（ＨＳＤ）検定を用いて、個々のサンプルの結果を、コントロール、および同じ群内の同じ処置に供されたサンプルに対して比較した。全ての培養実験において、細胞遺伝子発現を研究するために、またはセルトリ細胞間ＴＪ透過性関門を評価するためのＴＥＲ測定のために、各々の時点では複製培養物を備え、そして異なるバッチのセルトリ細胞を用いて、各々の実験を、２〜３回繰り返した。
【００４０】
セルトリ細胞によるオクルディンの発現は、インビトロにおけるセルトリ細胞間ＴＪ透過性関門のアセンブリと相関する。
Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングした二室性の装置上で、２×１０4〜３×１０6細胞／ｃｍ2にわたる種々の細胞密度で、セルトリ細胞を培養した場合、セルトリ細胞上皮を横切るＴＥＲの定常的な増大が注目された（図１）。セルトリ細胞間ＴＪのアセンブリは、セルトリ細胞上皮を横切る安定なＴＥＲによって明らかになるとおり、４日目までに終了した（図１）。これらの結果は、セルトリ細胞間ＴＪ透過性関門を評価するために用いた他の技術（例えば、セルトリ細胞上皮を横切る［3Ｈ］−インスリンの制限拡散、セルトリ細胞分泌産物（例えば、ｒＡＢＰ、トランスフェリン）の分極された分泌）、および試験と一致していた（Ｇｒｉｍａら、１９９２；Ｂｙｅｒｓら、１９８６；およびＪａｎｅｃｋｉら、１９８６）。ＴＥＲ測定によって、セルトリ細胞間ＴＪアセンブリに対する定量的なアセスメントが得られるので、放射性同位体の使用は必要がない；この方法は、高度に再現性であり、そして設定および維持することが比較的容易である。さらに、この方法は、この分野における細胞生物学者によって広く用いられている（Ｗｏｎｇら、１９９７；Ｂａｌｄａら、１９９６）。従って、この方法は他のアプローチよりも選ばれることになった。
【００４１】
Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングした二室性の装置上で種々の細胞密度で培養したセルトリ細胞は、ＴＪアセンブリの間の培養において経時的にＴＥＲプロフィールの同様のパターンを提示したが、セルトリ細胞間ＴＪの「密着性（ｔｉｇｈｔｎｅｓｓ）」は細胞密度と正に相関した。セルトリ細胞を３×１０6細胞／ｃｍ2で培養した場合、３つの異なる実験において４日後にＴＥＲの軽度の低下が存在した。これは、細胞の密集および死、代謝性廃棄物の蓄積、および不十分な栄養物流動の結果であり得る。形態学的研究によって、このような高密度で培養された細胞は、変性しているセルトリ細胞由来のＤＮＡ分解の増大を伴うことが示されている（Ｗｏｎｇら、２０００）。低い細胞密度（２×１０4細胞／ｃｍ2）では、おそらく、細胞数が不十分なせいで、ＴＪアセンブリを可能にする、近くの隣接する細胞がないことに起因して、測定可能なＴＪ透過性は検出されなかった（図１）。高い細胞密度（１．２×１０6細胞／ｃｍ2）では、セルトリ細胞間ＴＪがアセンブリされた時点で、２〜４．５日の間に（図２Ａ、Ｂ）、オクルディン定常状態ｍＲＮＡレベルの有意だが、一過性の増大が存在した（図１、対図２）。このことは、ＴＪアセンブリが、ＴＪの構築単位の１つであるオクルディンの新しい合成を必要とすることを例証する。５日後、定常状態のオクルディンｍＲＮＡは、１日目と同様の基礎レベルに戻った（図２Ａ、Ｂ）。オクルディン発現におけるこのような一過性の誘導は、２×１０4細胞／ｃｍ2という低細胞密度の培養中では検出されなかった（図２Ｃ、対図２Ａ、Ｂ）。これらの結果は、ＺＯ−１誘導（これもＴＪ関連タンパク質）と、セルトリ細胞間ＴＪアセンブリとの間の相関を示す以前の観察（Ｃｈｕｎｇら、１９９９；Ｗｏｎｇら、２０００）と一致した。
【００４２】
オクルディンの第二の外部ループのセグメントに相当する２２アミノ酸の合成ペプチドの使用による、インビトロでのセルトリ細胞間ＴＪ透過性関門の可逆的な混乱。
ラットオクルディンの第二の外部ループの最外部領域に相当する２２アミノ酸の合成ペプチド（表１の残基２０９〜２３０）を、セルトリ細胞間ＴＪのアセンブリに影響する能力について評価した。その合成後に、合成オクルディンペプチドを逆相ＨＰＬＣによって精製して（図３Ａ、Ｂ）、その密度を直接のタンパク質ミクロシーケンシングによって確認した。１．２×１０6細胞／ｃｍ2の密度での単離の２４時間後、セルトリ細胞上皮に対するオクルディンペプチドの添加によって、ＴＥＲの用量依存性の低下が誘導された（図４Ａ）。傍細胞透過性関門のこのペプチド誘導性の破壊は、培養物からのその除去後に反転することができた（図４Ｂ）。４μＭでオクルディンペプチドとインキュベートされたセルトリ細胞は、４〜５日目に未処理のコントロールと比べた場合、ＴＥＲの有意な低下（約５０％）を生じた。選択実験では、オクルディンペプチドを、Ｆ１２／ＤＭＥＭを用いて２回の連続した洗浄によって二室性の装置から５日目に除去した場合、セルトリ細胞間ＴＪ透過性関門は、再アセンブリされることができて、これによって３〜４日内にコントロールと識別不能なＴＥＲ読み取り値が得られる（図４Ｂ）。興味深いことに、オクルディンペプチドによって誘導された、破壊されたセルトリ細胞間ＴＪを再アセンブリするのに要する時間は、インビトロで新鮮に単離されたセルトリ細胞を用いるセルトリ細胞間ＴＪアセンブリの時間にほぼ等しかったが、これは、破壊されたＴＪを再封するのに、セルトリ細胞は、わずか９０分しか要さないように、［Ｃａ2+］枯渇誘導性ＴＪ漏出とは異なった（Ｇｒｉｍａら、１９９８）。セルトリ細胞間ＴＪ透過性関門を乱すことにおけるオクルディンペプチドの効果は、ペプチド除去後に可逆性であったので、オクルディンペプチドは、セルトリ細胞に対して毒性でないことが確認された。２２アミノ酸のｒＭＴＭペプチドを、４μＭで、オクルディンペプチドの代わりに用いた場合、セルトリ細胞間ＴＪ関門を乱すことに明確な効果はなかった（データ示さず）。選択実験における、トリパンブルー色素排除試験、対コントロール培養によって、オクルディンペプチド処理培養物において、細胞生存度を評価した場合、明確な相違は検出されなかった（データ示さず）。オクルディンの第二の細胞外ループから得られた他のポリペプチド（またはそのアナログ）は、前述の試験を実行することによって有効性について容易に評価することができる。
【００４３】
インビボにおける精子形成に対するオクルディンペプチドの可逆性の効果
ＨＰＬＣ精製後、オクルディンまたは筋小管ペプチドを０．９％滅菌生理食塩水に懸濁して、ＵＶのもとで５分間滅菌した。実験群における各々のラットは、対応する精製したペプチドの０．１５ｍｇまたは１．５ｍｇのいずれかを含有する３００μｌの生理食塩水の筋肉内注射を受けた。このペプチド懸濁液を、材料および方法に記載されるとおり、そして他のいずれかに詳細に記載されるとおり（Ｇｒｉｍａら、１９９２；Ｅｎｇら、１９９４）、３つの部位で（１部位あたり約１００ｍｌ）各々の精巣に分配した。精製されたオクルディンペプチドの精巣内注射は、処理なし、ビヒクル（０．９％滅菌生理食塩水）単独、または筋小管ペプチドを投与されたコントロールラットと比べた場合、２週間内に精巣重量の低下を生じた（図５）。精巣重量および精巣の大きさにおいて、オクルディンペプチド誘導性の低下があった（図５）が、精巣および精巣上体（副睾丸）の外観は正常のようであった。図６Ａ〜Ｃは、処理なし（図６Ａ）、ビヒクル単独の精巣内注射を受けた１４日後（図６Ｂ）、または生理食塩水の精巣内注射を受けた１４日後（図６Ｃ）のいずれかによる、コントロールのラットの精巣を示した。図６Ｄ〜Ｆは、精巣の別のコントロールセットであり、ここではラットは、処理後、１０日（図６Ｄ）、２３日（図６Ｅ）、および４０日（図６Ｆ）で、筋小管ペプチドの精巣内注射を受けた。処理された精巣の形態学的解析によって、さらに進行した生殖細胞（例えば、伸長した精細胞）が、オクルディンペプチド処理後、８日（図６Ｇ）〜１６日の間に上皮から枯渇し始めることが明らかになった。実質的に試験した全ての小管における上皮からの生殖細胞の大量の枯渇が、精巣内オクルディンペプチド注射後２７日までに注目された（図６Ｉ、および６Ｊ）。さらに、オクルディン処理した精巣の精細管は、有意に縮んでおり、ここでは、ビヒクルのみ、または筋小管ペプチドを投与されたコントロールのラットまたは精巣と比べた場合、２０〜３０％程度まで小管直径が減少していた（図６Ｉ、および６Ｊ、対６Ａ〜Ｃ）。生殖細胞は、オクルディンペプチド処理の２７日後に上皮において再増殖し始めた。４７日目までに、精母細胞は、試験した全ての小管で明確に認められるようになり（図６Ｋ）、精上皮の形態学は、オクルディンペプチド処理後６８日までにコントロールラットと識別不能となった（図６Ｌ）、このことは、精巣におけるオクルディンペプチド誘導性の障害からの完全な回復を示す（図６Ｌ）。４０日内に精巣がほとんど完全に回復したという事実（処理後、６８日目の図６Ｌ、対２７日目の図６Ｉ、Ｊ）によって、ほとんどの精母細胞は、オクルディンペプチド処理によって破壊されなかったことが示唆される。
【００４４】
血液−精巣関門（ＢＴＢ）に対するオクルディンペプチドの効果
ペプチド誘導性の生殖細胞損失が、ＢＴＢの破壊（これは、次に、図６に示されるように、宿主免疫系を誘導して、生殖細胞再吸収を生じる攻撃を開始する）に起因するか否かを決定するため、１つの精巣あたり３つの部位で、合成ペプチド（オクルディンまたは筋小管ペプチドのいずれか）の精巣内注射後に、ＢＴＢの完全性を評価した。この時、同じ動物（成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット、体重２７０〜３００グラム）の他の精巣をコントロールとして用いた（１時点あたりｎ＝４〜６のラット）。図７に示される結果によって、１．５ｍｇ／精巣でオクルディンペプチドの精巣内注射後のＢＴＢの破壊が明確に例証された。頸静脈を通じた［125Ｉ］−ＢＳＡの注入後の同じラットにおける未処理の精巣に比べて、処理後２〜６週間の間のオクルディンペプチド注射された精巣において、ＳＴＦ（図７Ａ）、およびＲＴＦ（図７Ｂ）における［125Ｉ］−ＢＳＡの蓄積があった。ＢＴＢに対するペプチド誘導性の障害は、可逆性であるようであった。なぜなら、図６に示されるものと同様の組織学的解析（データ示さず）によって試験した場合、精上皮の回復と一致して、処理後１２週まで、ＳＴＦおよびＲＴＦの両方において、［125Ｉ］−ＢＳＡの蓄積の劇的な低下があった（図７Ａ、Ｂ）からである。さらに、ペプチド処理ラットから回収したＳＴＦおよびＲＴＦにおける放射能のレベルは、オクルディンペプチドに曝されていないコントロールの精巣と識別不能になった（図７）。ＢＴＢに対するこのオクルディンペプチド誘導性の障害は、特異的であるらしい。なぜなら、筋小管ペプチド処理ラットにおけるＳＴＦまたはＲＴＦのいずれかにおいて検出された放射能は、ペプチド処理されていないコントロールラットと識別不能であったため、２２アミノ酸のラット筋小管ペプチドは、ＢＴＢの破壊を誘導することができなかったからである（図７Ａ、Ｂ）。
【００４５】
野生型ＦＳＨサブユニットおよび対応する変異体をコードするｃＤＮＡのＰＣＲによる調製
表３は、野生型の卵胞刺激ホルモン（「ＦＳＨ」）、ＦＳＨ−αの２つの変異体、およびＦＳＨ−βの１つの変異体のαサブユニット、およびβサブユニットをコードする全長ｃＤＮＡを示す。表４は、Ｓｏｒｒｅｎｔｉｎｏら、１９９８に記載されたようなバキュロウイルス系を用いて調製され得る、３つの組み換えＦＳＨ変異体を示す。これらのｃＤＮＡを得るために、ＰＣＲを用いる部位特異的突然変異誘発を、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、１９９１に記載されるように実施してもよい。要するに、オリゴ（ｄＴ）１５を用いるＲＴ反応のために、ラット下垂体から総ＲＮＡを単離した。これらのｃＤＮＡは、引き続くＰＣＲのためのテンプレートとして働く。記載されたとおり（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、１９９１；Ｓｏｒｒｅｎｔｉｎｏら、１９９８）、テンプレートとして、上記のＲＴ産物を用いて、ＰＣＲのために用いられる、変異した部位を含む適切なプライマー対を合成する。ＦＳＨの全体的なホルモン活性に寄与することが公知である（Ｒｏｓｅｒａ、２００１）、推定のグリコシル化部位を欠く組み換えＦＳＨタンパク質（表３および４を参照のこと）を、Ｎ末端から５６および８２におけるＡｓｎ（Ｎ）を、Ａｓｐ（Ｄ）に転換することによって調製した（表３、および表４の変異体１を参照のこと）。さらに、Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ（残基５０〜５２）、およびＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ（残基７５〜７７）を、それぞれＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、およびＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａを用いて置換することによって変異体を調製した（表３および表２の変異体４を参照のこと）。この目的は、推定のグリコシル化部位付近の部位における疎水性および高次構造を変更することである。第三の変異体は、推定グリコシル化部位における欠失を有するＦＳＨ−βのみから構成される（表３、および表２の変異体４を参照のこと）。次いで、表３および４に示される３つの異なるＦＳＨ−αサブユニット、および２つのＦＳＨ−βサブユニットをコードする、部位特異的突然変異誘発実験後の、ＰＣＲ産物を、直接ヌクレオチド配列分析のためにｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）においてサブクローニングして、所望の変異部位における配列を確認する。次いで、所望の変異された部位を含有するｃＤＮＡを、組み換えタンパク質産生のためにバキュロウイルス中へのトランスフェクションのために用いることができる、プラスミド、例えば、ｐＡｃＧｚｔに連結してもよい。
【００４６】
【表３】
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【００４７】
【表４】
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【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明は、医学、獣医学、および製薬産業、特に避妊薬の分野に関する。
【００４９】
本明細書において言及された全ての刊行物は、本発明が関与する当分野における当業者の水準を示す。これらの刊行物の全ては、各々の個々の刊行物が、詳細にかつ個々に、参考として本明細書に示される場合と同じ程度まで、参考として本明細書に組み込まれる。
【００５０】
特定の実施形態の前述の説明によって、本発明の一般的特質が完全に明らかになり、その結果、現在の知識を適用することによって、本発明の一般的特質から逸脱することなく、このような特定の実施形態を種々の適用に対して容易に改変、および／または適合させることが他者に可能である。従って、このような適合および改変は、開示された実施形態の等価な意味および範囲内に包含されることが意図される。さらに、本明細書における専門用語は、説明することを目的とするものであり、限定することを意図するものではない。
【００５１】
［引用文献］
【表５Ａ】
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【表５Ｂ】
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【表５Ｃ】
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【表５Ｄ】
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【表５Ｅ】
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【表５Ｆ】
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【表５Ｇ】
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【表５Ｈ】
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【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、インビトロにおけるセルトリ細胞間の密着結合（ＴＪ）透過性関門のアセンブリを例示するグラフである。
【図２】図２Ａ、および２Ｃは、ゲルであり、図２Ｂおよび２Ｄはグラフであり、これらは、インビトロにおけるセルトリ細胞間のＴＪのアセンブリの間の定常状態のオクルディンｍＲＮＡレベルの変化を示している。
【図３】図３ＡおよびＢは、クロマトグラムであり、これは、同一性確認のためのＨＰＬＣおよびミクロシーケンシング（微小配列決定）による、オクルディンペプチドの精製を示している。
【図４】図４ＡおよびＢは、インビトロにおけるセルトリ細胞間のＴＪ透過性関門上のラットオクルディンの第二の細胞外ループ（残基２０９〜２３０）に相当する２２アミノ酸のオクルディンペプチドの影響を示すグラフである。
【図５】図５は、オクルディンペプチドの精巣内注射後の、精巣重量の変化を例証するグラフである。
【図６】図６Ａ〜Ｌは、２２アミノ酸の合成オクルディンペプチドを、精巣内注射を介して成体ラットに対して投与した後の、抗精子形成効果の顕微鏡視野を示す写真である。
【図７】図７ＡおよびＢは、合成オクルディンまたは筋小管ペプチドの精巣内注射後の血液−精巣関門（ＢＴＢ）の可逆的な破壊を示すグラフである。
【図８】図８は、細胞膜に対するヒトオクルディンの配向の模式図である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
2004531269.tif 000074
2004531269.tif 000075
2004531269.tif 000076