(57)【要約】本発明は、モノポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ２ａの位置異性体、その単離方法、及び病気の処置、特にウイルス疾患の処置のための薬剤の製造におけるその使用方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌｙｓ（３１）においてポリエチレングリコール化されたインターフェロンアルファ２ａ（ＰＥＧ−Ｌｙｓ（３１））、Ｌｙｓ（４９）においてポリエチレングリコール化されたインターフェロンアルファ２ａ（ＰＥＧ−Ｌｙｓ（４９））、Ｌｙｓ（７０）においてポリエチレングリコール化されたインターフェロンアルファ２ａ（ＰＥＧ−Ｌｙｓ（７０））、Ｌｙｓ（８３）においてポリエチレングリコール化されたインターフェロンアルファ２ａ（ＰＥＧ−Ｌｙｓ（８３））、Ｌｙｓ（１１２）においてポリエチレングリコール化されたインターフェロンアルファ２ａ（ＰＥＧ−Ｌｙｓ（１１２））、Ｌｙｓ（１２１）においてポリエチレングリコール化されたインターフェロンアルファ２ａ（ＰＥＧ−Ｌｙｓ（１２１））、Ｌｙｓ（１３１）においてポリエチレングリコール化されたインターフェロンアルファ２ａ（ＰＥＧ−Ｌｙｓ（１３１））、Ｌｙｓ（１３４）においてポリエチレングリコール化されたインターフェロンアルファ２ａ（ＰＥＧ−Ｌｙｓ（１３４））及びＬｙｓ（１６４）においてポリエチレングリコール化されたインターフェロンアルファ２ａ（ＰＥＧ−Ｌｙｓ（１６４））の群から選択されるポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ２ａの位置異性体。
【請求項２】
ＰＥＧ−Ｌｙｓ（３１）、ＰＥＧ−Ｌｙｓ（１３４）から選択される、請求項１に記載のポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ２ａの位置異性体。
【請求項３】
前記ポリエチレングリコール化インターフェロン中のポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ部分）の平均分子量が、約２６，０００ダルトン〜約６６，０００ダルトンであり、特に約４０，０００ダルトンであることを特徴とする、請求項１又は２に記載のポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ２ａの位置異性体。
【請求項４】
前記ポリエチレングリコール化インターフェロンを、
ａ）弱カチオン交換マトリクスを有する分取液体クロマトグラフィーカラム上でその位置異性体に分離し、
ｂ）前記分画を、強カチオン交換マトリクスを有する分取カラム上でさらに分離及び精製することを特徴とする、ポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ２ａの位置異性体の単離方法。
【請求項５】
約ｐＨ３．８〜ｐＨ８．０までの増加していく酢酸ナトリウム濃度の直線的ｐＨ勾配をかけることによって前記クロマトグラフィー工程ａ）を行うことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
開始ｐＨ４．２〜約４．６から出発して約ｐＨ６．４〜約６．８の最終ｐＨとなる酢酸ナトリウム緩衝液（Ａ）からリン酸カリウム緩衝液（Ｂ）への直線的勾配を用いて前記クロマトグラフィー工程ｂ）を行い、該緩衝液溶液は１２％までのエタノール及び１．５％までのジエチレングリコールをさらに含有することを特徴とする、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
クロマトグラフィー工程を、約２７〜約３５℃の温度、好ましくは約３０〜３２℃の温度で行うことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ２ａの位置異性体及び治療上不活性な担体を含有する医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ２ａの位置異性体及び治療上不活性な担体を含有する、腫瘍性疾患又は感染症などの免疫調節障害の治療又は予防用の医薬組成物。
【請求項１０】
病気の治療又は予防に使用するための薬剤を製造するための請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ２ａの位置異性体の使用。
【請求項１１】
ウイルス疾患の処置に使用するための薬剤を製造するための請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ２ａの位置異性体。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ２ａの位置異性体を投与する工程を含む、免疫調節疾患の治療又は予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ２ａの位置異性体、その単離方法、及び病気の処置、特にウイルス疾患の処置のための薬剤の製造におけるその使用に関する。
【０００２】
インターフェロンアルファ−２ａは慢性Ｃ型肝炎の処置に重要な役割を果たすが、インビボでの半減期が短いことによりその効力は限られる。半減期及び効力を改善するために、インターフェロンアルファ−２ａをポリエチレングリコール部分と共役させた。ポリエチレングリコール化によって、タンパク質の物理化学的及び生物学的性質が変化する。１つの効果は、タンパク質分解による分解及び腎クリアランスの減少である。これにより、血中のポリエチレングリコール化タンパク質の半減期が増加する。別の効果は、タンパク質のＰＥＧ部分のサイズに依存して、体内での分布が変化することである。４０ｋＤａの分枝状ポリエチレン部分などの大きなポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ部分）によってポリエチレングリコール化されたインターフェロンアルファ２ａ：
【０００３】
【化１】
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（式中、Ｒ及びＲ’は、独立して、低級アルキルであり；ｎ及びｎ’は、合計６００〜１５００の整数であり；該共役体中のポリエチレングリコール単位の平均分子量は、約２６，０００ダルトン〜約６６，０００ダルトンである）は、改善された生物活性を有し、持続性の吸収及び腎クリアランスの減少を示し、１週間に１度の投与計画全体を通じて強い抗ウイルス圧を結果的に生ずる（Perry M. C., et al. Drugs, 2001, 15, 2263-2288 and Lamb M. W., et al. The Annals of Pharmacotherpy. 2002, 36, 933-938を参照のこと）。
【０００４】
インターフェロンアルファ−２ａのポリエチレングリコール化方法は、欧州特許出願第８０９９９６号に記載されている。このポリエチレングリコール化は、次式のＰＥＧ２−ＮＨＳ：
【０００５】
【化２】
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【０００６】
と、例えばリシンの第１級アミノ基とを反応させることによって、あるいはインターフェロンアルファのＮ末端に反応させることにより行うので、１つ以上のＰＥＧ部分が結合し、ポリエチレングリコール化されていないインターフェロン、モノポリエチレングリコール化インターフェロン、及び多ポリエチレングリコール化インターフェロンの混合物を形成することができる。モノポリエチレングリコール化インターフェロンアルファは、当業者に既知である方法によって混合物から単離することができる。さらに、インターフェロンアルファ−２ａ分子は、ポリエチレングリコール化用の１２個の部位（１１個のリシン及びＮ末端）を提示するゆえ、位置異性体の混合物である。これらの可能な１２個の異性体から９個を単離して特性付けし、これらの各々は、分枝状ポリエチレングリコール鎖へ特定のリシンにおいて共役されており、すなわち、Ｌｙｓ（３１）においてポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ２ａを形成し［ＰＥＧ−Ｌｙｓ（３１）と称する］、Ｌｙｓ（４９）においてポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ２ａを形成し［ＰＥＧ−Ｌｙｓ（４９）と称する］、Ｌｙｓ（７０）においてポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ２ａを形成し［ＰＥＧ−Ｌｙｓ（７０）と称する］、Ｌｙｓ（８３）においてポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ２ａを形成し［ＰＥＧ−Ｌｙｓ（８３）と称する］、Ｌｙｓ（１１２）においてポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ２ａを形成し［ＰＥＧ−Ｌｙｓ（１１２）と称する］、Ｌｙｓ（１２１）においてポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ２ａを形成し［ＰＥＧ−Ｌｙｓ（１２１）と称する］、Ｌｙｓ（１３１）においてポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ２ａを形成し［ＰＥＧ−Ｌｙｓ（１３１）と称する］、Ｌｙｓ（１３４）においてポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ２ａを形成し［ＰＥＧ−Ｌｙｓ（１３４）と称する］、Ｌｙｓ（１６４）においてポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ２ａを形成する［ＰＥＧ−Ｌｙｓ（１６４）と称する］。
【０００７】
ＰＥＧ−Ｌｙｓ（３１）及びＰＥＧ−Ｌｙｓ（１３４）は抗ウイルスアッセイにおいて混合物よりも高い活性を有し、ＰＥＧ−Ｌｙｓ（１６４）の活性は混合物と同等であったのに対し、ＰＥＧ−Ｌｙｓ（４９）、ＰＥＧ−Ｌｙｓ（７０）、ＰＥＧ−Ｌｙｓ（８３）、ＰＥＧ−Ｌｙｓ（１１２）、ＰＥＧ−Ｌｙｓ（１２１）及びＰＥＧ−Ｌｙｓ（１３１）の活性は低かったことが見出されている。
【０００８】
したがって、本発明は、新規なポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ２ａの位置異性体、すなわち、ＰＥＧ−Ｌｙｓ（３１）、ＰＥＧ−Ｌｙｓ（４９）、ＰＥＧ−Ｌｙｓ（７０）、ＰＥＧ−Ｌｙｓ（８３）、ＰＥＧ−Ｌｙｓ（１１２）、ＰＥＧ−Ｌｙｓ（１２１）、ＰＥＧ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（１３１）、ＰＥＧ−Ｌｙｓ（１３４）及びＰＥＧ−Ｌｙｓ（１６４）に関し、ポリエチレングリコール化インターフェロン中のポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ部分）の平均分子量が約２６，０００ダルトン〜約６６，０００ダルトン、特に約４００００ダルトンであることを特徴とする。
【０００９】
局所的な荷電の相違に基づくポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ２ａの位置異性体のクロマトグラフィー分離方法を開発した。この方法は、イオン交換クロマトグラフィーによる２工程の分離からなる。
【００１０】
したがって、さらなる実施態様において、本発明は、ａ）弱カチオン交換マトリクスを有する分取液体クロマトグラフィーカラム上での位置異性体の分離、及びｂ）第１工程から得た分画の強カチオン交換マトリクスを有する分取カラム上、好ましくはＨＰＬＣカラム上でのさらなる分離及び精製からなるポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ２ａの位置異性体の単離方法に関する。
【００１１】
弱カチオン交換マトリクス上での分離工程ａ）は、約ｐＨ３．８〜ｐＨ８．０の直線的ｐＨ勾配をかけることにより行った。
【００１２】
分離工程ｂ）は、開始ｐＨ４．２〜約４．６、好ましくは約ｐＨ４．４から出発して約ｐＨ６．４〜約６．８、好ましくはｐＨ６．６の最終ｐＨとなる酢酸ナトリウム緩衝液（Ａ）からリン酸カリウム緩衝液（Ｂ）（該緩衝液溶液はさらに、１２％までのエタノール及び１．５％までのジエチレングリコール、好ましくは１０％エタノール及び１％ジエチレングリコールを含有する）への直線的ｐＨ勾配を用いて行った。
【００１３】
異性体の溶出は、緩衝溶液の初濃度により影響され得る。緩衝溶液の濃度は、約３ｍＭ〜約１５ｍＭ、好ましくは約３〜７ｍＭ、理想的には３．４ｍＭ〜６．８ｍＭの酢酸ナトリウムである。
【００１４】
分離工程ｂ）は、室温又は約２７〜約３５℃の範囲の温度、好ましくは約３０〜３２℃の温度で行う。
【００１５】
この方法は、インターフェロンアルファ２ａのポリエチレングリコール化反応で得られる位置異性体組成物の分析のために分析的に用いることもできる。
【００１６】
得られたタンパク質試料を回収し、質量分析ペプチドマッピング、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）ペプチドマッピング、未消化タンパク質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトル、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの種々のタンパク質化学方法によって分析し、同定した（実施例２〜６を参照のこと）。
【００１７】
まず、各異性体の分子量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光法によって決定し、ＩＥＣクロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー）後にポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ２ａ分子が依然として完全な状態であることを裏づけ、かつ、モノポリエチレングリコール化を確認した。各ＩＥＣピークをさらなる修正を加えることなく測定した。すべての分子のスペクトルは、６３ｋＤａで最大である予測されたブロードなＭ＋ピーク、３２ｋＤａで対応するＭ２＋ピーク、２１ｋＤａで対応するＭ３＋ピークを示している（図５）。
【００１８】
次に、エンド−Ｌｙｓ−Ｃプロテアーゼを用いて各異性体をタンパク分解により消化し、得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦペプチドマップをポリエチレングリコール化−インターフェロンアルファ２ａ標準品から得られたものと比較した。
【００１９】
スペクトルの解釈及び位置異性体の構造的な同定は、以下の考慮に基づく。
【００２０】
１．異性体のジポリエチレングリコール化は、分子全体の分子量を決定するゆえ、除外することができる（上記を参照のこと）。
【００２１】
２．ポリエチレングリコール化ポリマー基が結合した特定の異性体の単一のリシンは、エンド−Ｌｙｓ−Ｃプロテアーゼ（２）にリシンとして認識されず（New England Journal of Medicine 2000, 343, 1666-1172）、したがって、ポリペプチド鎖はその特定の位置では切断されない。
【００２２】
３．したがって、特定の異性体のペプチドマップは、その単一のポリエチレングリコール化リシンに関係するペプチド（しかもそれらのペプチドのみ）を欠いているということが予測される。
【００２３】
４．ポリエチレングリコール化されていないペプチドを非常に正確に検出するために選択される質量範囲は８５０Ｄａ〜６０００Ｄａの範囲であるので、ＰＥＧ残基が結合したペプチドの質量ピークがＭＡＬＤＩ−ＴＯＦペプチドマップ中に検出されることは予測されない。ＰＥＧ部分自体は、４００００Ｄａの分子量を既に有している。しかしながら、同じ消化及びトランス−３−インドールアクリル酸（ＩＡＡ）をマトリクスとして用いて、ポリエチレングリコール化されたペプチドも検出された。Ｌｙｓ−Ｃ消化された各異性体に対して、４６〜４７ｋＤａでブロードなピークが観察され、モノポリエチレングリコール化ペプチドの存在が確認された。ＰＥＧ残基によって生じたブロードな質量分布のため、結合したペプチドをこれらの実験で直接同定することができなかった（データは示していない）。
【００２４】
得られたペプチドマップを図６に示す。標準と比較して消失したピークが矢印によって示されている。
【００２５】
インターフェロンアルファ−２ａ及びポリエチレングリコール化−ＩＦＮアルファ−２ａの２つの参照のスペクトルに関して有意な相違は見られない。ポリエチレングリコール化−インターフェロンアルファ２ａが異なるポリエチレングリコール化異性体の混合物であるとの事実ゆえに、インターフェロンに対して検出されるすべてのペプチドピークは、ポリエチレングリコール化−インターフェロンアルファ２ａに対しても検出される。
【００２６】
ＩＥＣ分画１から得られるエンド−Ｌｙｓ−Ｃ消化タンパク質のスペクトルにおいて、アミノ酸２４〜３１及び３２〜４９を含有するペプチドが８５０及び６，０００Ｄａの間の領域で消失し、その他のピークはすべて存在している。したがって、ＰＥＧ残基はＬｙｓ３１に結合しているはずである。
【００２７】
他の分画を同じようにして同定した。各々の場合において、標準品スペクトルと比較して、ポリエチレングリコール化ペプチドは消失している。分画３及び４ａではペプチドピークが１つだけ消失し、第２のペプチド１３２〜１３３では質量が小さすぎて規定の質量枠内では検出できない。分画４ａだけがこの方法によって同定できず、結論を出すことはできなかった。
【００２８】
異性体４ａを同定するため、ＲＰ−ＨＰＬＣ／ＵＶ検出を伴うエンド−Ｌｙｓ−Ｃペプチドマッピング方法を開発した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳペプチドマッピングに対して記載した通りに、タンパク質をエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃで消化した。水／アセトニトリル／ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）勾配によってペプチドを分離した。
【００２９】
ポリエチレングリコール化−インターフェロンアルファ２ａ標準品では、１３個のピークが観察された。分画はすべて手で回収され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって同定された。
【００３０】
ＩＥＣ分画４ａのポリエチレングリコール化部位の帰属を、試料のクロマトグラムを標準物質について得られたものと比較することによって再度行った。１３４〜１６４及び１３４〜１６５の２つのペプチドを含有するピークが、試料のクロマトグラムにおいて明らかに消失しており、したがって、ＩＥＣ分画４ａをＬｙｓ１６４においてＰＥＧを含有する異性体に帰属することができた。ポリエチレングリコール化−インターフェロンアルファ２ａ標準品（４６μｇ／ｍＬ）のクロマトグラム及び分画４ａの１つを図７に示す。
【００３１】
単離されかつ特性付けされた９個のポリエチレングリコール化−インターフェロンアルファ２ａ位置異性体のグラフ表示を図９に示す。
【００３２】
単離された異性体のインビトロ抗ウイルス活性を水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）による感染に対するマディン−ダービーウシ腎（ＭＤＢＫ）細胞への保護効果によって分析し、J. Virol. 1981, 37, 755-758に記載される手順に従ってポリエチレングリコール化−インターフェロンアルファ２ａ標準と比較した。
【００３３】
したがって、本発明のさらなる実施態様は、抗増殖、抗ウイルス、及び免疫調節用途のための薬剤を調製するためのポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ２ａ分子の位置異性体の使用、具体的にはＬｙｓ（３１）、Ｌｙｓ（４９）、Ｌｙｓ（７０）、Ｌｙｓ（８３）、Ｌｙｓ（１１２）、Ｌｙｓ（１２１）、Ｌｙｓ（１３１）、Ｌｙｓ（１３４）及びＬｙｓ（１６４）においてポリエチレングリコール化されたインターフェロンアルファ２ａの位置異性体の使用である。そのような薬剤を調製するためのＬｙｓ（３１）、Ｌｙｓ（１３４）及びＬｙｓ（１６４）においてポリエチレングリコール化されたインターフェロンアルファ２ａの使用が特に好ましい。位置異性体はさらに、ウイルス疾患の治療、特にＣ型肝炎の治療のための薬剤の調製に用いることができる。
【００３４】
本発明は、式Ｉの化合物又はその塩をベースとする医薬組成物及びその製造方法も含む。
【００３５】
病気の抑制又は予防に用いられる本発明の医薬組成物は、ポリエチレングリコール化ＩＦＮアルファ２ａの位置異性体、具体的にはＰＥＧ−Ｌｙｓ（３１）、ＰＥＧ−Ｌｙｓ（１３４）、又はＰＥＧ−（１６４）の位置異性体、より具体的にはＰＥＧ−Ｌｙｓ（３１）、ＰＥＧ−Ｌｙｓ（１３４）の位置異性体、及び治療上不活性、非毒性で、かつ治療上許容できる担体物質を含有する。用いる医薬組成物は、治療する障害、個々の患者の状態、ポリエチレングリコール化ＩＦＮアルファ２ａの位置異性体の送達部位、投与方法、及び当業者に既知である他の要因を考慮した良好な医療行為に合致する形で製剤化し、投与することができる。
【００３６】
以下に、ポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ２ａの位置異性体の単離及び特性付けにおいて用いる方法及び材料を詳細に記載する。
【００３７】
異性体の単離に用いたポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ２ａ（ＰＥＧ−ＩＦＮアルファ２ａ）は、欧州特許出願第８０９９９６号及びBioconjugate Chem. 2001, 12, 195-202に記載されている通り、リシンε−アミノ基をインターフェロン分子表面で分子量４０，０００Ｄａの活性化分枝状ポリエチレングリコール部分と共役させることにより、ホフマン−ラ  ロッシュ社（Hoffmann-La Roche Inc）で製造されたものである。
【００３８】
各精製工程からの位置異性体の分離の際の試料の純度を、分析用強カチオン交換カラム（東ソー・バイオセップ社（TOSOH-BIOSEP）、ＳＰ−５ＰＷ、粒子サイズ１０μｍ、直径７．５ｍｍ、長さ７．５ｃｍ）を用いて調べた。カラムを、ｐＨ４．４に調整した、３．４ｍＭ酢酸ナトリウム、１０％エタノール及び１％ジエチレングリコール（緩衝液Ａ）で予め平衡化した。ＰＥＧ−ＩＦＮ試料をロードした後、カラムを緩衝液Ａで洗浄し、続いてｐＨ６．６に調整した、１０ｍＭ二塩基性リン酸カリウム、１０％エタノール及び１％ジエチレングリコール（緩衝液Ｂ）への上昇していく直線的勾配とした。流量は１．０ｍＬ／分とし、検出は２１８ｎｍで行った。結果を図１に示す。
【００３９】
上記の方法と同様、インターフェロンアルファ２ａのポリエチレングリコール化反応で得られた位置異性体の組成物の分析のために以下の分析方法を見出した。
【００４０】
当業者に既知の方法によって反応混合物からモノポリエチレングリコール化インターフェロンアルファを分離した後、例えば東ソー・バイオサイエンス社（TosoH Bioscience）から得た２．５μｍの粒子サイズを有する非多孔性ＳＰ−ＮＰＲ相などの強カチオン交換マトリクスを充填したカラム上で分析用液体ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）法によって位置異性体を分離する。移動相は、緩衝液Ａ（１０％ｖ／ｖエタノール；１％ｖ／ｖジエチレングリコール；２．３ｍＭ酢酸ナトリウム、及び５．２ｍＭ酢酸、精製水中；ｐＨ調整なし）、及び緩衝液Ｂ（１０％ｖ／ｖエタノール；１％ｖ／ｖジエチレングリコール；１６．４ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４；及び４．４ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、精製水中；ｐＨ調整なし）からなり、結果を図８に示す。
【００４１】
以下の実施例によって本発明をさらに例示する。
【００４２】
実施例１Ａ
位置異性体の分離
ＰＥＧ−インターフェロンアルファ２ａのモノポリエチレングリコール化異性体を調製するため、２工程の単離及び精製スキームを用いた。
【００４３】
ａ）第１工程は、弱カチオン交換マトリクスを有する分取低圧液体クロマトグラフィーカラム上での位置異性体の分離であった（東ソー・バイオセップ社、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＣＭ−６５０Ｓ、例えば、樹脂バッチ番号８２Ａ、カラム直径１６ｍｍ、長さ１２０ｃｍ）。０．７ｍＬ／分の流量で、増加していく酢酸ナトリウム濃度の直線的ｐＨ勾配（２５ｍＭ（ｐＨ４．０）から７５ｍＭ（ｐＨ７．８）まで上げる）をかけた。検出は２８０ｎｍで行った。このクロマトグラフィーの工程では、１、２、５、６の種、並びに３、４、４ａ、７、及び８の混合物を回収することができた（表１を参照のこと）。
【００４４】
ｂ）第２調製工程において、分画をさらに分離し、精製した。上記の分析用強カチオン交換カラム（１２３ｍＥｑ／ｍｌのイオン交換能を有する樹脂バッチ番号８２Ａ）と同じマトリクスを有しているがより大きい寸法（内径３０ｍｍ及び長さ７０ｍｍ）を有する分取カラム、さらに、より大きい流量、及び延長した実施時間を用いた。分析方法に関して、カラムを、ｐＨ４．４に調整した、３．４ｍＭ酢酸ナトリウム、１０％エタノール及び１％ジエチレングリコール（緩衝液Ａ）で予め平衡化した。ＰＥＧ−ＩＦＮ試料をロードした後、カラムを緩衝液Ａで洗浄し、続いてｐＨ６．６に調整した、１０ｍＭ二塩基性リン酸カリウム、１０％エタノール及び１％ジエチレングリコール（緩衝液Ｂ）への上昇していく直線的勾配とした。流量は１．０ｍＬ／分とし、検出は２１８ｎｍで行った。
【００４５】
ＰＥＧ−ＩＦＮアルファ２ａ異性体のタンパク質濃度を、ＰＥＧ−ＩＦＮアルファ２ａのタンパク質部分の２８０ｎｍの吸収に基づいて分光測光法によって決定した。
【００４６】
ＰＥＧ−ＩＦＮアルファ２ａ  １８０μｇの分析用溶出プロフィールを図１に示す。この方法の結果は８つのピークへの分離であり、２つのピークはベースライン分離であり、６つは部分的な分離である。クロマトグラムの終点に向かってベースライン吸収が減少していることは、より大きな保持時間において溶出されるＩＦＮアルファ２ａのモノポリエチレングリコール化種が他にはなかったことを示唆している。
【００４７】
さらに、ＩＥＣ−クロマトグラムを注意深く見ると、検出限界に近いさらなるピークがピーク２及び３の間に見られ、ＰＥＧ−ＩＦＮアルファ２ａ混合物の特異的活性の一因にもなっているはずであるさらなる位置異性体の存在を示している。インターフェロンアルファ−２ａ分子はポリエチレングリコール化用の１２個の部位（１１個のリシン及びＮ末端）を提示するので、さらなる種が予想された。しかしながら、これらの種の存在度が低いことを考えると、それらは単離及び特性付けされなかった。
【００４８】
ＩＥＣ最適化実施から得られた異性体試料を、単離直後（ｔ＝０）及び５℃で２週間貯蔵した後に調べた（データは示してない）。タンパク質含有量に関して分光法により決定したところ、ＩＥＣピークに由来するタンパク質について有意な相違は観察されず、モノポリエチレングリコール化部位で検出される変化、オリゴ−ＰＥＧ−ＩＦＮアルファ２ａの含有量、凝集物の量、及び生物アッセイ活性についても有意な相違は観察されなかった。ＩＥＣ方法によって決定された個々の異性体の相対的な存在度及び抗ウイルスアッセイで決定された特異的活性を考慮すれば、単離に用いられたＰＥＧ−ＩＦＮアルファ２ａ混合物の特異的生物活はほぼ全て回復している（約９３％）。
【００４９】
ＩＥＣ分画中の他の位置異性体との混在性に関して、分析用ＩＥ−ＨＰＬＣを用いて個々の異性体の純度を調べた。ピーク２、３、４、４ａ、５、及び７は、９８％を超える純度を有し、ピーク１及び８は、９３％の純度を有し、ピーク６は、８８％の純度を有していた。
【００５０】
表１：異性体及び標準品のＬｙｓ−Ｃ消化スペクトルの比較により同定されたＰＥＧ−ペプチド
分離されたＰＥＧ−ＩＦＮ種中の同定されたＰＥＧ部位
【００５１】
【表１】
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【００５２】
実施例２〜６に記載した方法により、分画を特性付けした。
【００５３】
実施例１Ｂ
モノポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ２ａの位置異性体の分析用分離
ＨＰＬＣ装置：  ＨＰ１１００
カラム：        ＳＰ−ＮＰＲ、東ソー・バイオサイエンス社、粒子サイズ２．５μｍ、非多孔性、注文番号：１３０７６
注入：          モノポリエチレングリコール化ＩＦＮ５〜１０μｇ
移動相：        緩衝液Ａ：
１０％ｖ／ｖ  エタノール
１％ｖ／ｖ    ジエチレングリコール
２．３ｍＭ    酢酸ナトリウム
５．２ｍＭ    酢酸、精製水中、ｐＨ調整なし
緩衝液Ｂ：
１０％ｖ／ｖ  エタノール
１％ｖ／ｖ    ジエチレングリコール
１６．４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４
４．４ｍＭ    Ｋ２ＨＰＯ４、精製水中、ｐＨ調整なし
勾配：          ０分間        ４０％Ｂ
２分間        ４０％Ｂ
２．１分間    ４８％Ｂ
２５分間      ６８％Ｂ
２７分間      ７５％Ｂ
３０分間      ７５％Ｂ
３４分間      ４０％Ｂ
４０分間      ４０％Ｂ
フロー：        １．０ｍｌ／分
カラム温度：    ２５℃
検出：          ２１８ｎｍ
典型的なクロマトグラムを図８に示す。
【００５４】
実施例２
質量分析ペプチドマッピングによる分画の分析
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ装置（遅延抽出を有するパーセプティブ・バイオシステム社（PerSeptive Biosystems）Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＳＴＲ）上で質量スペクトルを記録した。各ＩＥＣ分画（イオン交換クロマトグラフィー）を透析により脱塩し、０．０２Ｍ  １，４−ジチオ−ＤＬ−トレイトール（ＤＴＴ）で還元し、０．２Ｍ  ４−ビニルピリジンでアルキル化した。次いで、０．２５Ｍ  トリス（トリス（ヒドロキシメチル）−アミノエタン）中、ｐＨ８．５において、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（ワコー・バイオケミカルズ社（Wako Biochemicals））により、１：３０の酵素とタンパク質との適当な比でタンパク質を消化した。反応は３７℃で一晩行った。
【００５５】
アセトン／イソプロパノール４０／６０（ｖ／ｖ）中の２０ｍｇ／ｍｌのα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸及び１２ｍｇ／ｍｌのニトロセルロースの溶液をマトリクスとして用いた（厚層塗布）。まず、マトリクス０．５μＬをターゲット上に置いて、乾燥させた。次いで、試料１．０μＬを加えた。加速電圧２０．０００Ｖ及び格子電圧９５％による直線的陽イオン化モード（linear positive ionisation mode）でスペクトルを得た。各スペクトルについて、スポット全部を覆う少なくとも１９０のレーザーショットを累積した。Ｄｅｓ−Ａｒｇ１−ブラジキニン及びウシインスリンを内部校正に用いた。
【００５６】
実施例３
高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）ペプチドマッピング
ペプチドを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）ペプチドマッピングによって特性付けした。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳペプチドマッピングに対して記載した通りに、ＩＥＣ分画を還元し、アルキル化し、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃで消化した。Ｖｙｄａｃ  ＲＰ−Ｃ１８分析用カラム（５μｍ、２．１×２５０ｍｍ）及び同じ充填材を有するプレカラムを備えるウォーター・アライアンス社（Water Alliance）ＨＰＬＣシステム上で、消化された異性体の分析を行った。水中での１％〜９５％のアセトニトリル勾配を用い、０．２ｍＬ／分の流量で１０５分間溶出を行った。溶媒は両方とも０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡを含有した。各々消化試料１００μＬを注入し、２１５ｎｍでモニタリングした。
【００５７】
実施例４
未消化タンパク質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトル
アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸７０／３０（ｖ／ｖ）中のトランス−３−インドールアクリル酸の１８ｍｇ／ｍｌの溶液を同じ体積の試料溶液と予め混合した。次いで、混合物１．０μＬをターゲット表面に塗布した。典型的には、１５０〜２００のレーザーショットを直線的陽イオン化モードで平均化した。加速電圧を２５．０００Ｖに設定し、格子電圧を９０％に設定した。ウシアルブミンＭ＋及びＭ２＋を外部較正に用いた。
【００５８】
実施例５
ＳＥ−ＨＰＬＣ（サイズ排除ＨＰＬＣ）
トーソーハス社（TosoHaas）ＴＳＫゲルＧ４０００ＳＷＸＬカラム（７．８×３００ｍｍ）を備えているウォーター・アライアンス社２６９０ＨＰＬＣシステムを用いて、ＳＥ−ＨＰＬＣを行った。０．０２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）ジエチレングリコール及び１０％（ｖ／ｖ）エタノール（ｐＨ６．８）を含有する移動相を用いて０．４ｍＬ／分の流量でタンパク質を溶出し、２１０ｎｍで検出した。注入量は各異性体２０μｇとした。
【００５９】
サイズ排除ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、異なるＩＥＣ分画中のオリゴ−ＰＥＧ−ＩＦＮアルファ２ａ体及び凝集物の量を決定した。標準物質は、凝集物を２．３％及びオリゴマーを２．２％含有する（図４）。
【００６０】
ピーク１、４、４ａ、５、６、及び８は０．７％未満のオリゴポリエチレングリコール化ＩＦＮアルファ２ａ体を含有するのに対し、ピーク２、３、及び７において、オリゴポリエチレングリコール化ＩＦＮアルファ２ａ体のパーセンテージは検出限界を下回る（０．２％未満）。凝集物の場合には、異なる傾向が見られた。すべてのピークで、凝集物の量は０．９％を下回っている。
【００６１】
実施例６
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
１６％のトリス−グリシンゲル（１．５ｍｍ、１０ウェル）を用いて、非還元条件及び還元条件下の双方でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。２．５〜２００ｋＤａの質量範囲を有するノベックス・マーク社（Novex Mark）の１２個の分子量マーカーを校正に用い、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を感度標準（２ｎｇ）として用いた。試料すべて約１μｇ及び標準０．５μｇをゲルに塗布した。実施条件は１２５Ｖ及び６Ｗで１２０分間とした。タンパク質を固定し、ノベックス社から得た銀染色キットであるシルバーＸプレス（SilverXpress）で染色した。
【００６２】
ＩＥＣ分画１〜８について非還元条件下で記録されたゲルは、ＰＥＧ−ＩＦＮアルファ２ａ標準品のパターンに匹敵したパターンを示している（図２）。
【００６３】
還元条件下において、ゲルは、標準と比較して、約９０ｋＤａにおける小さなバンドの強度の増加を示す。６及び１０ｋＤａの間には、タンパク質フラグメントがピーク６、７、及び８について現われている（図３）。両バンドは一緒に、約１％の切り取られた材料（clipped material）に対応する。異性体１、５、６、７、８のレーンでは、標準にも存在する１００ｋＤａを超えるさらなるバンドが見られる。これらはオリゴマーに帰属させることができる。したがって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってＳＥ−ＨＰＬＣ分析結果が確認される。
【００６４】
総合的には、ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験により、ＩＥＣ分画の純度はＰＥＧ−ＩＦＮアルファ２ａ標準品に匹敵するとみなすことができることが示される。
【００６５】
９つのＩＥＣ−分画から得られるＰＥＧ−ＩＦＮアルファ２ａ種の構造を、先に言及した戦略を用いて、上記の方法の結果に基づき同定した。
【００６６】
実施例７
抗ウイルス活性
抗ウイルス活性を水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）による感染に対するマディン−ダービーウシ腎（ＭＤＢＫ）細胞への保護効果によって評価し、ＰＥＧ−ＩＦＮアルファ２ａ標準と比較した。試料及び標準品を１０％ウシ胎児血清を含有するイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）に希釈して、１０ｎｇ／ｍＬの最終濃度とした（アッセイ出発濃度）。各試料を四つ組でアッセイした。
【００６７】
水疱性口内炎ウイルスを持つマディン−ダービーウシ腎細胞（ＭＤＢＫ）の抗ウイルス保護を、Virol. 1981, 37, 755-758に記載される方法に従って試験した。表２に示す通り、異性体はすべて、抗ウイルスアッセイでの活性を誘導した。活性は１０６１及び３３９Ｕ／μｇの間の範囲となり、位置異性体中のタンパク質の特異的活性における相違が有意であることを示している。これまでに生じた専門知識及び結果によって、位置異性体及びＩＦＮアルファ受容体の間の該構造機能相関を確立するためにさらなる調査を開始することが可能となる。
【００６８】
表２：ＰＥＧ−ＩＦＮアルファ２ａ及び個々のＰＥＧ−ＩＦＮアルファ２ａ異性体のインビトロ抗ウイルス活性
水疱性口内炎ウイルスにより感染されたＭＤＢＫ細胞での抗ウイルス活性を決定した。結果は、独立して行った３回のアッセイの平均を示している。
【００６９】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００７０】
以下の図によって結果をさらに図示する。
【図１】図１：ＰＥＧ−ＩＦＮアルファ２ａ  １８０μｇの分析用ＩＥＣ−ＨＰＬＣ。分析用強カチオン交換カラムを用いて、各精製工程から分離された位置異性体（東ソー・バイオセップ社、ＳＰ−５ＰＷ、粒子サイズ１０μｍ、直径７．５ｍｍ、長さ７．５ｃｍ）の純度を調べた。
【図２】図２：トリス−グリシン（１６％）を用いたＡ／Ｂ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。試料を非還元条件下で電気泳動した。ゲルをタンパク質に対して銀染色で染色した。レーン：Ｍ、分子量マーカータンパク質／２、ピーク１／３、ピーク２／４、ピーク３／５、ピーク４／６、ピーク４ａ／７、ピーク５／８、ピーク６／９、ピーク７／１０、ピーク８／１１、１×ＰＥＧ−ＩＦＮ標準／１２、１．５×ＰＥＧ−ＩＦＮ標準／Ｃ１、ＩＦＮ標準。
【図３】図３：Ａ／Ｂ：トリス−グリシン（１６％）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。試料を還元条件下で電気泳動した。ゲルをタンパク質について銀染色で染色した。レーン：Ｍ、分子量マーカータンパク質／２、ピーク１／３、ピーク２／４、ピーク３／５、ピーク４／６、ピーク４ａ／７、ピーク５／８、ピーク６／９、ピーク７／１０、ピーク８／１１、１×ＰＥＧ−ＩＦＮ標準／１２、１．５×ＰＥＧ−ＩＦＮ標準／Ｃ１、ＩＦＮ標準。
【図４】図４：サイズ排除（ＳＥ−）ＨＰＬＣを用いて、異なるＩＥＣ分画中のオリゴＰＥＧ−ＩＦＮ体及び凝集物の量を決定する。ＳＥ−ＨＰＬＣをトーソーハス社ＴＳＫゲルＧ４０００ＳＷＸＬカラム（７．８×３００ｍｍ）により行った。
【図５】図５：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光法を用いて各異性体の分子量を決定して、ＩＥＣクロマトグラフィー後にＰＥＧ−ＩＦＮ分子が依然として完全な状態であることを裏づけ、かつ、モノポリエチレングリコール化を確認した。
【図６】図６：ＰＥＧ−ＩＦＮ標準品及びピーク１、２、３、４、４ａ、５、６、７、８のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ Ｌｙｓ−Ｃペプチドマップ。標準と比較して消失しているピークを矢印によって示す。
【図７】図７：ＰＥＧ−ＩＦＮ標準及びピーク４ａのＬｙｓ−Ｃ消化のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム。
【図８】図８：実施例１Ｂに記載したＳＰ−ＮＰＲ（東ソー・バイオサイエンス社、粒子サイズ２．５μｍ、非多孔性）が充填されたカラム上でのＰＥＧ−ＩＦＮアルファ２ａ位置異性体混合物５〜１０μｇの分析用ＨＰＬＣ。
【図９】図９：ポリエチレングリコール化部位を示すインターフェロンアルファ−２ａのリボン構造。これは、ＮＭＲ分光法で決定したヒトインターフェロンアルファ−２ａの高分解能構造である（J. Mol. Biol. 1997, 274, 661-675を参照のこと）。ポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ−２ａのポリエチレングリコール化部位を赤色にし、残基タイプ及び残基数で標識する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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