(57)【要約】本発明は、エストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットタンパク質の核酸配列およびタンパク質配列、ならびに、哺乳動物細胞におけるエストロゲンの作用を調整するために本配列を用いる方法、細胞におけるエストロゲンシグナル伝達の検出方法、およびエストロゲン受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用できる化合物の同定方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質が配列番号：１のアミノ酸配列を含む、エストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットタンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項２】
マウスに由来する、請求項１記載の核酸。
【請求項３】
配列番号：２または３に対して少なくとも約７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の核酸。
【請求項４】
配列番号：２または３のヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の核酸。
【請求項５】
請求項１記載の核酸を含む、発現カセット。
【請求項６】
請求項５記載の発現カセットを含む、単離された真核細胞。
【請求項７】
配列番号：１のアミノ酸配列を含む、単離されたエストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットタンパク質。
【請求項８】
マウスタンパク質である、請求項７記載のタンパク質。
【請求項９】
配列番号：４のアミノ酸配列を有するエストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットタンパク質とは結合しない、請求項７記載のエストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットタンパク質と選択的に結合する抗体。
【請求項１０】
哺乳動物細胞におけるエストロゲンシグナル伝達を調整する方法であって、以下の段階を含む方法：
エストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットタンパク質の発現または活性のレベルを調整する段階。
【請求項１１】
エストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットタンパク質の発現レベルが、ポリヌクレオチドを細胞に導入することによって調整され、それによって該ポリヌクレオチドの存在または発現が該エストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットタンパク質の該発現レベル調整する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドが完全長エストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットタンパク質をコードし、該ポリヌクレオチドの発現によって該エストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットタンパク質の発現レベルが高まる、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドがアンチセンス配列であり、該ポリヌクレオチドの存在または発現によってエストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットタンパク質の発現レベルが低下する、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
化合物を細胞に投与し、それによってエストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットの発現または活性のレベルが調整される、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
エストロゲンシグナル伝達がエストロゲン受容体αによって媒介される、請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
細胞が哺乳動物内に存在している、請求項１０記載の方法。
【請求項１７】
細胞が血管平滑筋細胞または血管内皮細胞である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
エストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットタンパク質の発現または活性のレベルが上昇し、それによって哺乳動物におけるアテローム硬化症、骨粗鬆症、アルツハイマー病またはパーキンソン病の発症が阻害される、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物細胞におけるエストロゲンシグナル伝達の存在を検出する方法であって、以下の段階を含む方法：
エストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットタンパク質をコードする核酸の発現を検出する段階。
【請求項２０】
核酸が請求項１記載の核酸である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
細胞におけるエストロゲンシグナル伝達の存在を、該細胞のエストロゲンに対する反応性を決定するために利用する、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
細胞におけるエストロゲンシグナル伝達の存在を、哺乳動物におけるエストロゲンシグナル伝達の組織特異的分布を決定するために利用する、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
細胞における核酸の発現が、エストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットタンパク質の発現または活性を検出することによって検出される、請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
タンパク質が請求項７記載のタンパク質である、請求項１９記載の方法。
【請求項２５】
細胞における核酸の発現が、該細胞におけるエストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットｍＲＮＡのレベルを検出することによって検出される、請求項１９記載の方法。
【請求項２６】
エストロゲンシグナル伝達がエストロゲン受容体αによって媒介される、請求項１９記載の方法。
【請求項２７】
細胞におけるエストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットのｍＲＮＡ、タンパク質またはタンパク質活性のレベルの上昇によって化合物がエストロゲン受容体アゴニストとして作用できることが示され、細胞におけるエストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットのｍＲＮＡ、タンパク質またはタンパク質活性のレベルの低下によって化合物がエストロゲン受容体アンタゴニストとして作用できることが示される、エストロゲン受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用できる化合物を同定する方法であって、以下の段階を含む方法：
（１）エストロゲン受容体を含む細胞を該化合物と接触させる段階；および
（２）該細胞に対する該化合物の機能的影響を決定する段階。
【請求項２８】
エストロゲン受容体がエストロゲン受容体αである、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
エストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットのｍＲＮＡが配列番号：１の配列を有する、またはエストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットタンパク質が配列番号：２もしくは３のアミノ酸配列を含む、請求項２７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０００年３月１０日に出願された米国特許仮出願第６０／１８８，４６０号の恩典を主張するものであり、この出願はすべての目的に関して参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
米国政府の援助を受けた研究および開発の下で行われた発明の権利に関する表明  該当せず。
【０００３】
発明の背景
卵巣の性ステロイドホルモンであるエストロゲンは、アテローム硬化症、骨粗鬆症、ならびにアルツハイマー病およびパーキンソン病を含む神経疾患の発症の阻害を含む、広範囲にわたる生物機能を有する。エストロゲンは乳癌および他の癌に関係する。エストロゲンおよびエストロゲンシグナル伝達は上記および他の疾患において重要であるが、エストロゲンの作用の分子的機構の多くは不明であり、エストロゲンシグナル伝達の調整を実現する手法はほとんど開発されていない。
【０００４】
エストロゲンは、ＥＲαおよびＥＲβという既知の二つの核内受容体と結合することにより、多くの遺伝子の発現を調節する。これらの２種類の受容体は別個の遺伝子によってコードされており、リガンド親和性および組織分布が異なる（例えばＫｕｉｐｅｒら、（１９９７） Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３８：８６３〜７０を参照）。エストロゲン受容体αの重要性は、ＥＲＫＯと呼ばれるノックアウトマウスの作製によって示されている。ＥＲＫＯマウスは雌雄ともに繁殖能力がなく、骨密度の低下、生殖組織の障害、癌遺伝子誘発性癌の確率の低下を含む、さまざまな表現型上の影響が認められる。例えばコース（Ｃｏｕｓｅ）ら（１９９９）Ｅｎｄｏｃｒ． Ｒｅｖ． ２０：３５８〜４１７；コラッハ（Ｋｏｒａｃｈ）（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１５２４〜７；ボッチンフソ（Ｂｏｃｃｈｉｎｆｕｓｏ）ら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９：１８６９〜７６を参照されたい。エストロゲン受容体βが欠失したマウスには繁殖能力があるが、雌には卵巣活動の低下が認められ、このため仔のサイズが小さい（Ｋｒｅｇｅら（１９９８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１５６７７〜１５６８２）。α受容体およびβ受容体をいずれも欠くマウスは繁殖能力がなく、一方の受容体のみがノックアウトされたものとは異なる卵巣表現型を呈する。（Ｃｏｕｓｅら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：２３２８〜２３３１）。
【０００５】
ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質）は、さまざまな細胞表面受容体から下流の細胞内エフェクター分子にシグナルを伝達するタンパク質のファミリーである。Ｇタンパク質はα、βおよびγサブユニットからなるヘテロ三量体タンパク質であり、このうち後者の２つは生理的条件下で強固に会合している。各サブユニットは別個の遺伝子によってコードされる。リガンドが受容体に結合すると、αサブユニットに結合したＧＤＰ分子がＧＴＰ分子と交換され、αサブユニットのβおよびγサブユニットからの解離が引き起こされる。多くの研究から、受容体の刺激によってＧタンパク質のＧＴＰ結合αサブユニットおよびβγ二量体への解離が促進し、その両方が細胞内エフェクターを独立に調節することが示されている。多くの研究により、βγ二量体がアデニリルシクラーゼ、ホスホリパーゼＣ、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ、受容体キナーゼ、Ｋ＋チャンネルおよびＣａ２＋チャンネルを調節することが示されている。また、βγ複合体がマイトジェン活性化プロテインキナーゼの刺激に関与することも明らかになっている。
【０００６】
したがって、当技術分野には、動物におけるエストロゲンシグナル伝達の解明および調整のための新たなアプローチに対する需要がある。本発明はこれおよびその他の需要に対処するものである。
【０００７】
発明の概要
本発明は、エストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２タンパク質（ｍＧγ１２）の新規な核酸配列、ならびにタンパク質配列の他に哺乳動物細胞におけるエストロゲンの作用を調整するための配列を用いる方法、細胞におけるエストロゲンシグナル伝達の検出方法、およびエストロゲン受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用できる化合物の同定方法も提供する。
【０００８】
一つの局面において、本発明はエストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２タンパク質をコードする単離された核酸を提供し、タンパク質は配列番号：１のアミノ酸配列を含む。ある態様において、核酸は、配列番号：２または３と少なくとも約７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。別の態様において、核酸は、配列番号：２または３のヌクレオチド配列を含む。さらに別の態様において、核酸は、配列番号：２または３のヌクレオチド配列を含む核酸と、中程度にストリンジェントな洗浄条件下でハイブリダイズする。別の態様において、核酸は、配列番号：２または３のヌクレオチド配列を含む核酸と、ストリンジェントな洗浄条件下でハイブリダイズする。いくつかの態様において、核酸はマウスに由来する。
【０００９】
別の局面において、本発明は、本核酸を含む発現カセットを提供する。本発明は、本発現カセットを含む単離された真核細胞をさらに提供する。
【００１０】
さらにもう１つの局面において、本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列を含むタンパク質である、単離されたエストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２タンパク質を提供する。１つの態様において、本タンパク質はマウスに由来する。
【００１１】
本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列を含むエストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２タンパク質と選択的に結合し、配列番号：４のアミノ酸配列を有するエストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットタンパク質とは結合しない抗体も提供する。
【００１２】
もう１つの局面において、本発明は、哺乳動物細胞におけるエストロゲンの作用を調整するための方法であって、配列番号：１のアミノ酸配列を有するエストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２タンパク質の発現または活性のレベルを調整することを含む方法を提供する。
【００１３】
一つの態様において、発現レベルはポリヌクレオチドを細胞内に導入することによって調節され、それによってポリヌクレオチドの存在または発現量は細胞内のエストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２タンパク質の発現量を調節する。別の態様において、ポリヌクレオチドは完全長エストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２タンパク質をコードし、ポリヌクレオチドの発現によって細胞におけるエストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２タンパク質の発現レベルが上昇する。別の態様において、ポリヌクレオチドはアンチセンス配列であり、ポリヌクレオチドの存在または発現によって細胞におけるエストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２タンパク質の発現レベルが低下する。さらに別の態様において、化合物を細胞に投与し、それによってエストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２タンパク質の発現または活性のレベルが調整される。別の態様において、エストロゲンの作用はエストロゲン受容体αに媒介される。
【００１４】
別の態様において、細胞は哺乳動物内に存在する。別の態様において、エストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２タンパク質の発現または活性のレベルが上昇し、それによって哺乳動物におけるアテローム硬化症または骨粗鬆症の発症が阻害される。
【００１５】
別の局面において、本発明は、細胞内でエストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２タンパク質をコードする核酸の発現を検出する段階を含む、哺乳動物細胞におけるエストロゲンシグナル伝達の存在を検出する方法を提供し、タンパク質は配列番号：１のアミノ酸配列を含む。
【００１６】
一つの態様において、哺乳動物におけるエストロゲンシグナル伝達の組織特異的分布を決定するために、エストロゲンシグナル伝達の存在を用いる。別の態様において、エストロゲンシグナル伝達はエストロゲン受容体αによって媒介される。別の態様において、細胞における核酸の発現を、コードされるエストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２タンパク質の細胞内での発現または活性を検出することによって検出する。さらに別の態様において、エストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２タンパク質ｍＲＮＡの細胞内でのレベルを検出することによって、細胞における核酸の発現を検出する。
【００１７】
最後に、本発明はまた、エストロゲン受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用できる化合物を同定する方法であって、以下の段階を含む方法を提供する：（１）エストロゲン受容体を含む細胞を化合物と接触させる段階；および（２）細胞に対する化合物の機能的影響を検出する段階。ここで、細胞におけるエストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２ ｍＲＮＡ、タンパク質またはタンパク質活性のレベルの上昇によって、化合物がエストロゲン受容体アゴニストとして作用できることが示され、かつ細胞におけるエストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２ ｍＲＮＡ、タンパク質またはタンパク質活性のレベルの低下によって、化合物がエストロゲン受容体アンタゴニストとして作用できることが示される。
【００１８】
１つの態様において、エストロゲン受容体はエストロゲン受容体αである。もう１つの態様において、ｍＲＮＡは配列番号：２または３に示した配列に対して少なくとも約７０％の同一性を有し、タンパク質は配列番号：１の配列を含む。
【００１９】
発明および好ましい態様の詳細な説明
Ｉ．序論
本発明は、エストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ１２サブユニットタンパク質（Ｇγ１２）に関する、および、特に新規マウスエストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ１２サブユニットタンパク質（ｍＧγ１２）に関する、核酸およびポリペプチドを提供する。ｍＧγ１２はエストロゲンによって劇的に上方制御され、これによりｍＧγ１２および一般にはＧγ１２タンパク質がエストロゲンのインビボ機能の分子媒介物質であることが示される。このため、Ｇγ１２の発現または活性を調整することによってエストロゲンの作用を細胞内で調整することができ、さらに、Ｇγ１２の発現または活性を検出することによってエストロゲンシグナル伝達の存在、レベルまたは組織分布を検出することも可能である。また、Ｇγ１２を、エストロゲン受容体のアゴニストおよびアンタゴニストなどの、組織特異的およびエストロゲン受容体特異的なリガンドを調べるためのマーカー遺伝子として用いることもできる。
【００２０】
Ｇγ１２配列を提供する。例えば配列番号：２および３として示した、マウスＧγ１２（ｍＧγ１２）ｃＤＮＡの二つの変種（ｖａｒｉａｎｔ）を提供する。これらのｃＤＮＡは、配列番号：１として示した別個のタンパク質をコードする。さらに、ヒトＧγ１２タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。
【００２１】
本明細書に記載のＧγ１２の調整物質（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）、組換え体、誘導体、変種または断片は、細胞におけるエストロゲンシグナル伝達の増強または抑制のために用いることができ、このため、多岐にわたるエストロゲン関連疾患の治療に有用な可能性がある。例えば骨粗鬆症、心血管疾患、アルツハイマー病またはパーキンソン病を非制限的に含む疾患を治療するために、エストロゲンシグナル伝達を増強することができる。または、乳癌または他の癌を治療するためにエストロゲンシグナル伝達を抑制することができる。
【００２２】
数多くの態様において、本発明は、Ｇγ１２核酸およびタンパク質の調整物質、例えば活性化物質、阻害物質、刺激物質、エンハンサーなどに関するスクリーニングの方法を提供する。このような調整物質は、さまざまな様式のうち任意の様式でＧγ１２活性に影響を及ぼすことができ、これは例えばＧγ１２の転写、翻訳、リン酸化、ＲＮＡもしくはタンパク質の安定性を調節すること、Ｇγ１２の異種タンパク質もしくは他の分子との結合を変化させること、またはＧγ１２タンパク質の活性に影響を及ぼすことによる。好ましい態様において、Ｇγ１２の活性またはレベルを上昇または低下させる調整物質を、上に挙げたエストロゲン関連疾患または症状のいずれかを治療するために用いる。
【００２３】
一つの態様において、単離されたＧγ１２ポリペプチドもしくはその断片と結合する、および／またはその活性を調整することが可能な化合物を同定するために、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）などを用いて、化合物のスクリーニングを行う。別の態様において、Ｇγ１２タンパク質を組換え法によって細胞内で発現させ、細胞におけるＧγ１２の存在または活性を検出することにより、Ｇγ１２の調整物質である可能性があるものをアッセイする。
【００２４】
数多くの態様において、Ｇγ１２ポリヌクレオチドまたはポリペプチドをインビボまたはエクスビボで細胞に導入し、それによって細胞内のＧγ１２活性を調整する。例えば完全長Ｇγ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞集団に導入し、それによって細胞内でのＧγ１２のレベルまたは活性を上昇させる。または、アンチセンス、リボザイムまたはドミナントネガティブをコードするヌクレオチドを細胞集団に導入し、それによって細胞内でのＧγ１２のレベルおよび／または活性を抑制することもできる。
【００２５】
本発明はまた、例えばエストロゲン受容体αなどのエストロゲンを介したシグナル伝達および転写の調査を可能にし、エストロゲン反応性細胞のインビトロまたはインビボでの特異的な同定を可能にする、Ｇγ１２核酸およびタンパク質の発現を検出する方法も提供する。Ｇγ１２ポリペプチドを、エストロゲン反応性細胞、特にエストロゲン受容体αを介してエストロゲンに反応する細胞を同定するのに有用なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を作製するために用いることもできる。Ｇγ１２の発現は、ｍＲＮＡの逆転写および増幅、全ＲＮＡまたはポリＡ＋ＲＮＡの単離、ノーザンブロット法、ドットブロット法、インサイチューハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護、Ｓ１消化、ＤＮＡマイクロチップアレイのプローブ検索、ウエスタンブロット法などの技法を用いて同定可能である。
【００２６】
Ｇγ１２核酸は機能的には、エストロゲンシグナル伝達によって強く上方制御されるＧＴＰ結合タンパク質ファミリーの新規メンバーをコードする。異なる種に由来する近縁のＧγ１２遺伝子は、配列番号：２もしくは３に対して、少なくとも約５０ヌクレオチド長、選択的には６５ヌクレオチド長もしくはそれ以上のヌクレオチド長の領域にわたって少なくとも約８０％のヌクレオチド配列の類似性もしくは同一性を有する、または、配列番号：１に対して、少なくとも約２５アミノ酸長、選択的には５０アミノ酸長から７０アミノ酸長のアミノ酸領域にわたって少なくとも約８０％のアミノ酸配列の類似性もしくは同一性を有するポリペプチドをコードする。好ましくは、Ｇγ１２ポリペプチドは約６５アミノ酸〜７５アミノ酸を含む。より好ましくは、Ｇγ１２ポリペプチドは約７２アミノ酸を含む。
【００２７】
本発明は、配列番号：１に示されたｍＧγ１２タンパク質の多型変種も提供する。
【００２８】
Ｇγ１２ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の特定領域を、Ｇγ１２遺伝子の多型変種、種間相同体および対立遺伝子を同定するために用いてもよい。この同定を、例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、または、ＰＣＲおよびシークエンシングにより、もしくは他のヌクレオチド配列との比較用のコンピュータシステム内の配列情報を用いることによって、インビトロで行うことができる。一般的には、Ｇγ１２タンパク質の多型変種および対立遺伝子の同定は、約２５アミノ酸またはそれ以上、例えば５０アミノ酸〜７０アミノ酸のアミノ酸配列を比較することによって行える。少なくとも約８０％またはそれ以上、選択的には８５％〜９５％またはそれ以上のアミノ酸同一性により、タンパク質が所与のＧγ１２タンパク質の多型変種、種間相同体または対立遺伝子であることが典型的に示される。配列の比較は、以下に考察する配列比較アルゴリズムのいずれかを用いて行うことができる。ｍＧγ１２ポリペプチドまたはその保存領域と特異的に結合する抗体を、対立遺伝子、種間相同体および多型変種の同定に用いることもできる。
【００２９】
本明細書に記載されたＧγ１２の多型変種、種間相同体および対立遺伝子を、例えば推定相同体のエストロゲンに対する発現または活性を検討することにより、確認する。一般的には、配列番号：１のアミノ酸配列を有するｍＧγ１２ポリペプチドを推定Ｇγ１２タンパク質との比較のための陽性対照として用いて、ｍＧγ１２遺伝子またはタンパク質の多型変種または対立遺伝子の同定を示す。
【００３０】
本発明のｍＧγ１２配列に関するヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の情報を、Ｇγ１２ポリペプチドのモデルをコンピュータシステム内に構築するために用いてもよい。続いてこれらのモデルを、Ｇγ１２タンパク質を活性化または阻害できる化合物の同定に用いる。このような化合物は、エストロゲンを介したシグナル伝達におけるＧγ１２遺伝子の役割を調べるため、および数多くのエストロゲン関連疾患または症状のうちいずれかを治療するために用いることができる。
【００３１】
本発明は、Ｇγ１２と相互作用する、および／またはそれを調整する、化合物または他の分子を同定するためのアッセイ法、好ましくはハイスループットアッセイ法も提供する。
【００３２】
本発明は、エストロゲンシグナル伝達と関連のある疾患または症状を治療する方法も提供する。例えばアテローム硬化症、骨粗鬆症、アルツハイマー病、パーキンソン病および乳癌を非制限的に含む疾患および症状を治療または予防するために、患者の細胞におけるＧγ１２の活性および／または発現を改変することができる。
【００３３】
本明細書に開示したポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用いるため、ならびに本明細書に開示した方法を実践するためのキットとして、一つもしくは複数のＧγ１２対立遺伝子が欠失した、または改変型のＧγ１２を含む、トランスジェニック動物および細胞も提供される。
【００３４】
ＩＩ．定義
本明細書で用いる場合、以下の用語は、別に明記する場合を除き、以下の意味を有する。
【００３５】
本明細書で用いる「Ｇγ１２」とは、配列番号：１のアミノ酸配列またはその任意の誘導体、相同体もしくは断片に対して、またはこのようなタンパク質、その誘導体、相同体もしくは断片をコードする任意の核酸に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、ＧＴＰ結合タンパク質γ１２サブユニットを指す。「ｍＧγ１２」とは、配列番号：１に示したマウスＧＴＰ結合タンパク質γ１２サブユニットまたはその任意の誘導体、相同体もしくは断片、またはこのようなタンパク質、その誘導体、相同体もしくは断片をコードする核酸を指す。Ｇγ１２タンパク質または誘導体は任意の真核細胞もしくは原核細胞を含む任意の細胞種で発現させることもでき、またはインビトロで合成することもできる。一般的には、Ｇγ１２核酸は、ＧＴＰ結合タンパク質βおよび／またはαサブユニットと結合する活性型ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットをコードする。Ｇγ１２の誘導体、相同体および断片を本発明に容易に用いうることは理解されると考えられる。このようなＧγ１２変種には、配列番号：１として示したポリペプチドなどの任意の１つもしくは複数のドメイン、または任意の１つもしくは複数のドメインの多数のコピー、または任意の数のドメインのお互い同士もしくは他のタンパク質もしくはタンパク質ドメインとの新規な組み合わせが含まれうる。
【００３６】
「ｍＧγ１２」という用語は、（１）配列番号：１に対して、約２５アミノ酸、選択的には５０〜１００アミノ酸の範囲にわたって約６０％のアミノ酸配列同一性、選択的には約７５、８０、８５、９０もしくは９５％のアミノ酸配列同一性を有する；（２）配列番号：１のアミノ酸配列およびその保存的に改変された変種を含む免疫原に対して産生された抗体と特異的に結合する；または（３）配列番号：２もしくは３の配列およびその保存的に改変された変種と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（少なくとも約１００ヌクレオチド、選択的には少なくとも約５００〜１０００ヌクレオチドのサイズで） ハイブリダイズする、多型変種、対立遺伝子、変異体および種間相同体のことも指す。
【００３７】
本明細書で用いる「生物試料」とは、一つまたは複数のＧγ１２タンパク質をコードする一つまたは複数のＧγ１２核酸を含む生物学的な組織または液体の試料を指す。このような試料には、哺乳動物から単離された組織、特に、例えば肝臓、胸腺、脾臓、腎臓、胎盤、肺、腎臓、膵臓、前立腺、精巣、卵巣、小腸、大腸などが非制限的に含まれる。組織検査用に採取した凍結切片などの組織切片も生物試料に含まれうる。生物試料は一般に、昆虫、原生動物、鳥類、魚類、爬虫類などの真核生物、好ましくは、例えばマウス、ラット、ウシ、イヌ、モルモットまたはウサギなどの哺乳動物から入手され、例えばチンパンジーまたはヒトなどの霊長類に由来してもよい。
【００３８】
「機能的影響を決定すること」とは、機能的、物理的および化学的影響などの、間接的または直接的にＧγ１２ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの影響下にあるパラメーターを調整する、例えば増加または減少させる化合物をアッセイすることを意味する。このような機能的影響は、当業者に知られた任意の手段、例えば分光学的特性（例えば蛍光、吸光度、屈折率）、流体力学的特性（例えば形状）、クロマトグラフィー特性もしくは溶解特性の変化、Ｇγ１２の遺伝子発現、もしくはＧγ１２活性の指標となる任意のマーカー遺伝子の遺伝子発現の変化などによって計測可能である。
【００３９】
Ｇγ１２遺伝子またはタンパク質の「阻害物質」、「活性化物質」および「調整物質」とは、Ｇγ１２に関するインビトロおよび／またはインビボアッセイ法を用いて同定された分子を阻害、活性化または調整する分子を指すために用いられる。阻害物質とは、例えばＧγ１２タンパク質と結合する、Ｇγ１２活性を部分的もしくは全体的にブロックする、Ｇγ１２の発現もしくは安定性を下方制御する、またはＧγ１２の異種分子、例えばＧＴＰ結合タンパク質のαサブユニットおよびβサブユニット、との結合を妨げる化合物である。活性化物質とは、例えばＧγ１２と結合する、Ｇγ１２活性を刺激する、Ｇγ１２の発現もしくは安定性を高める、または膜もしくは任意の他のタンパク質もしくは因子とＧγ１２との結合を促進する化合物である。調整物質には、遺伝子組換え型のＧγ１２タンパク質、例えばドミナントネガティブ型または活性化型のＧγ１２が含まれうる。阻害物質および活性化物質に関するこのようなアッセイ法については以下に述べるが、これには例えばＧγ１２タンパク質を細胞内で発現させること、調整性化合物と推定されるものを適用すること、および、続いてＧγ１２活性に対する機能的影響を決定することが含まれる。候補化合物の影響を検討するために、活性化物質、阻害物質または調整物質の可能性があるもので処理したＧγ１２ポリペプチドを含む試料またはアッセイ法を、阻害物質、活性化物質または調整物質で処理していない対照試料と比較する。対照試料（化合物で処理していないもの）に対しては、Ｇγ１２活性の相対値を１００％とする。Ｇγ１２ポリペプチドの阻害は、活性値が対照に対して約８０％、選択的には５０％または２５％〜０％となった場合に達成される。Ｇγ１２ポリペプチドの活性化は、活性値が対照に対して１１０％、選択的には１５０％、選択的には２００％〜５００％または１０００％〜３０００％高い場合に達成される。
【００４０】
「単離された」、「精製された」または「生物的に純粋」という用語は、その天然の状態に通常付随する成分を実質的または本質的に含まない材料を指す。純度および均一性は一般に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学の技法を用いて決定する。ある調製物に存在する主な分子種であるタンパク質は、実質的に精製されている。特に、単離されたＧγ１２核酸は、Ｇγ１２遺伝子に隣接してＧγ１２以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離されている。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に１本のバンドを生じることを表す。特に、これは核酸またはタンパク質の純度が少なくとも８５％、選択的には少なくとも９５％、選択的には少なくとも９９％であることを意味する。
【００４１】
「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、および一本鎖形態または二本鎖形態にあるその重合体を指す。この用語には、参照核酸と類似した結合特性を有し、参照ヌクレオチドと類似した様式で代謝される、合成型、天然型および非天然型の、既知のヌクレオチド類似体または改変された骨格残基または結合を含む核酸が含まれる。このような類似体の例には、ホスホロチオネート、ホスホロアミダイト、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が非制限的に含まれる。
【００４２】
別に指示する場合を除き、個々の核酸配列は、その保存的に改変された変種（例えば縮重コドン置換体）および相補配列、さらには黙示的に指示される配列も黙示的に含む。特に、縮重コドン置換体は、選択した一つまたは複数の（またはすべての）コドンの第３の位置を混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換した配列を作製することによって得られる（Ｂａｔｚｅｒら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａら（１９８５）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０：２６０５〜２６０８；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら（１９９４）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１〜９８）。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと互換的に用いられる。
【００４３】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基の重合体を指して本明細書内で互換的に用いられる。この用語は、一つまたは複数のアミノ酸残基が天然のアミノ酸に対応する人工的な模倣化学物質であるアミノ酸重合体、さらには天然のアミノ酸重合体および非天然型のアミノ酸重合体に対して適用される。
【００４４】
「アミノ酸」という用語は、天然型および合成型のアミノ酸のほか、天然のアミノ酸と類似した様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物も指す。天然のアミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるもののほか、後に改変されたアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸およびＯ−ホスホセリンなどもいう。アミノ酸類似体とは、天然のアミノ酸と同じ基本的な化学構造を持つ、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどと結合した炭素を有する化合物を指す。このような類似体は、改変されたＲ基（例えばノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有するが、天然のアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保っている。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を持つものの、天然のアミノ酸と類似した様式で機能する化合物を指す。
【００４５】
本明細書ではアミノ酸を、一般的に知られた三文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの生化学物質命名委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）が推奨している一文字記号のいずれかによって参照する。ヌクレオチドも同じく、一般的に認められた一文字記号によって参照する。
【００４６】
「保存的に改変された変種」とは、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。個々の核酸配列に関して、保存的に改変された変種とは、同一もしくは本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸を指し、または、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一な配列を指す。遺伝暗号の縮重性のため、任意のタンパク質は多数の機能的に同一な核酸によってコードされる。例えばコドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべてアラニンというアミノ酸をコードする。このため、コドンによってアラニンが指定されるあらゆる位置で、コードされるポリペプチドを変化させずに、そのコドンを対応する上記のコドンのいずれかに変化させることができる。このような核酸異形（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は「サイレント異形」であり、保存的に改変された異形の一種である。何らかのポリペプチドをコードする本明細書のあらゆる核酸配列は、その核酸のあらゆる可能なサイレント異形についても述べている。当業者は、核酸内の各コドン（通常はメチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常はトリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変して、機能的に同一な分子を作製しうることを認識すると考えられる。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各々のサイレント異形は、記載する各配列に黙示的に含まれる。
【００４７】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列中の単一のアミノ酸または少数のアミノ酸が改変、付加または除去される、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列に対する個々の置換物、欠失物または付加物が、改変によってアミノ酸が化学的に類似したアミノ酸に置換されるような「保存的に改変された変種」であることを認識すると考えられる。機能的に類似したアミノ酸が得られる保存的置換の表も当技術分野で周知である。このような保存的に改変された変種は、本発明の多型変種、種間相同体および対立遺伝子に加わるものであり、それらが除外されるわけではない。
【００４８】
以下の８つの群はそれぞれ、互いに対して保存的なアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（５）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ、「タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」（１９８４）を参照）。
【００４９】
ポリペプチド構造などの高分子構造はさまざまな構成物のレベルで記載可能である。このような構成物に関する一般的な考察については、例えばアルバート（Ａｌｂｅｒｔｓ）ら、「細胞の分子生物学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ）」（第３版、１９９４）、ならびにカンター（Ｃａｎｔｏｒ）およびシメール（Ｓｃｈｉｍｍｅｌ）、「生物物理化学第Ｉ部：生体高分子の高次構造（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｐａｒｔ Ｉ：Ｔｈｅ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」（１９８０）を参照されたい。「一次構造」とは、個々のペプチドのアミノ酸配列を指す。「二次構造」とは、局所的に並んだポリペプチド内部の三次元構造を指す。これらの構造は一般にドメインとして知られている。ドメインとはポリペプチドの密集単位を形成するポリペプチドの部分であり、一般に５０アミノ酸〜３５０アミノ酸長である。典型的なドメインは、β−シートおよびα−ヘリックスの連鎖などのより小規模な構成物から構成される。「三次構造」とは、ポリペプチド単量体の完全な三次元構造を指す。「四次構造」とは、独立した三次単位の非共有的な会合によって形成される三次元構造を指す。異方性の項はエネルギー項としても知られている。
【００５０】
「標識」または「検出可能部分」とは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段によって検出可能な組成物である。例えば有用な標識には、３２Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えばＥＬＩＳＡに一般に用いられるもの）、ビオチン、ジゴキシゲニンまたはハプテン、および、例えばペプチドへの放射標識の取り込みにより、またはペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために用いることで、検出可能となるタンパク質が含まれる。
【００５１】
「標識された核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」とは、プローブと結合した標識の存在を検出することによってプローブの存在を検出できるように、標識と、リンカーもしくは化学結合によって共有結合したもの、またはイオン結合、ファンデルワールス結合、静電結合もしくは水素結合によって非共有的に結合したものを指す。
【００５２】
本明細書で用いる「核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」とは、一つまたは複数のタイプの化学結合、通常は水素結合の形成による相補的な塩基対形成によって、相補配列を有する標的核酸と結合しうる核酸と定義される。本明細書で用いるプローブには、天然の塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）または改変塩基（７−デアザグアノシン、イノシンなど）が含まれうる。加えて、ハイブリダイゼーションを妨げない限り、プローブ中の塩基をホスホジエステル結合以外の結合によって連結させてもよい。このため、プローブは例えば構成要素の塩基をホスホジエステル結合ではなくペプチド結合によって連結したペプチド核酸でもよい。当業者は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに応じて、プローブが、プローブ配列と完全に相補的ではない標的配列とも結合しうることを理解すると考えられる。プローブは選択的には、放射性同位体、発色団、発光団（ｌｕｍｉｐｈｏｒｅ）、色素原で直接的に標識する、または後にストレプトアビジン複合体が結合するようにビオチンで間接的に標識する。プローブの有無をアッセイすることにより、選択した配列または部分配列の有無を検出することができる。
【００５３】
細胞、核酸、タンパク質またはベクターなどに言及して用いる場合、「組換え型の」という用語は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入または天然の核酸もしくはタンパク質の改変によって改変されたこと、または細胞がそのように改変された細胞に由来することを意味する。このため、例えば組換え細胞は、天然型（非組換え型）の細胞に認められない遺伝子を発現する、または、通常であれば異常発現される、低発現される、もしくは全く発現されないような天然遺伝子を発現する。
【００５４】
核酸の部分に言及して用いる場合、「異種」という用語は、核酸が、自然界ではお互いに同じ関係では認められない二つまたはそれ以上の部分配列を含むことを意味する。例えば核酸は一般に、例えば一つの供給源からのプロモーターおよび別の供給源からのコード領域というように、関連のない遺伝子に由来する二つまたはそれ以上の配列が新たな機能的核酸を生じるように配置された形で、組換え法によって産生される。同様に、異種タンパク質とは、タンパク質が、自然界ではお互いに同じ関係では認められない二つまたはそれ以上の部分配列を含むことを意味する（例えば融合タンパク質）。
【００５５】
「プロモーター」とは、核酸の転写を指令する一連の核酸調節配列と定義される。本明細書で用いるプロモーターには、転写開始部位の近くにある必須核酸配列、例えばＩＩ型ポリメラーゼプロモーターの場合のＴＡＴＡ配列など、が含まれる。選択的には、転写開始部位から数千塩基対もの距離を隔てて位置しうる遠位エンハンサーまたはリプレッサー配列もプロモーターに含まれる。「構成的」プロモーターとは、ほとんどの環境条件および発生条件下で活性のあるプロモーターである。「誘導性」プロモーターとは、環境的または発生的な調節の下で活性のあるプロモーターである。「機能的に結合した」という用語は、発現調節配列が第２の配列に対応する核酸の転写を指令するような、核酸発現調節配列（プロモーターまたは一連の転写因子結合部位など）と第２の核酸配列との間の機能的結合を指す。
【００５６】
「発現ベクター」とは、宿主細胞内での特定の核酸の転写を許容する一連の指定された核酸配列を有する、組換え法または合成によって作製された核酸構築物である。発現ベクターはプラスミド、ウイルスまたは核酸断片の部分であってもよい。発現ベクターは、プロモーターと機能的に結合した転写用の核酸を含むことが一般的である。
【００５７】
二つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における、「同一性」または「同一」率という用語は、一定の比較域にわたって、または以下の配列比較アルゴリズムの一つを用いて、もしくは手作業による整列化および肉眼検査によって指定された領域にわたって、最大の対応関係が得られるように比較および整列化を行った場合に、同じである、または同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチドが指定された比率である（すなわち、指定された領域にわたって６０％の同一性、選択的には６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性）、二つまたはそれ以上の配列または部分配列を指す。このような配列を「実質的に同一である」と言う。この定義は、被験配列の相補物も指す。選択的には、同一性は、少なくとも約５０アミノ酸長もしくはヌクレオチド長の領域にわたって、またはより好ましくは少なくとも約７５アミノ酸長〜１００アミノ酸長もしくはヌクレオチド長の領域にわたって存在する。
【００５８】
二つまたはそれ以上のポリペプチド配列の文脈において、「類似性」または「類似」率という用語は、一定の比較域にわたって、または以下の配列比較アルゴリズムの一つを用いて、もしくは手作業による整列化および肉眼検査によって指定された領域にわたって、最大の対応関係が得られるように比較および整列化を行った場合に、同じである、または上に定義した８種の保存的アミノ酸置換の定義に基づいて類似性のあるアミノ酸残基が指定された比率である（すなわち、指定された領域にわたって６０％、選択的には６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の類似性）、二つまたはそれ以上の配列または部分配列を指す。このような配列を「実質的に類似している」と言う。選択的には、この類似性は、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって、またはより好ましくは少なくとも約７５アミノ酸長〜１００アミノ酸長の領域にわたって存在する。
【００５９】
配列比較に関しては、一つの配列を、被験配列と比較するための参照配列とすることが一般的である。配列比較アルゴリズムを用いる場合には、被験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列の座標を指定して、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。デフォルトのプログラムパラメーターを用いることもでき、別のパラメーターを指定することもできる。その後、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する被験配列の配列一致率を配列比較アルゴリズムに計算させる。
【００６０】
本明細書で用いる「比較域（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｎｄｏｗ）」には、二つの配列の最適アラインメントを行った後に、ある配列を同じ数の連続した位置を持つ参照配列と比較しうるような、２０個〜６００個、通常は約５０個〜約２００個、より一般的には約１００個〜約１５０個からなる群より選択される数の連続した位置のいずれか一つの区域に対する言及が含まれる。比較のための配列の整列化の方法は当技術分野で周知である。比較のための配列の最適アラインメントは、スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）（１９７０）Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２ｃの局所的相同性アルゴリズムにより、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）（１９７０）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３の相同性整列化アルゴリズムにより、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）（１９８８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：２４４４の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ・インプリメンテーション（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）により、または手作業による整列化および肉眼検査によって行うことができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（１９９５年補遺）を参照されたい）。
【００６１】
有用なアルゴリズムの一例がＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは漸進的な対形式のアラインメントを用いて一群の関連配列から多数の配列アラインメントを作成し、関連性および配列一致率を示す。これはアラインメントを作成するために用いたクラスター化の関係を示す樹状図またはデンドログラムのプロットも行う。ＰＩＬＥＵＰはフェング（Ｆｅｎｇ）およびドリトル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）（１９８７）Ｊ． Ｍｃｉ． Ｅｖｏｌ． ３５：３５１〜３６０の漸進的整列化法を単純化したものを用いている。用いる方法はヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１〜１５３と類似している。このプログラムは、それぞれ最大長が５，０００ヌクレオチドまたは５，０００アミノ酸の配列を最大で３００個整列化することができる。最も類似した二つの配列の対形式の整列化から多数の整列化手順が始まり、整列化された二つの配列のクラスターが作成される。続いてこのクラスターを、次に最も関連性の高い配列、または整列化された配列のクラスターに対して整列化する。二つの配列クラスターは、個々の二つの配列の対形式の整列化を単純に拡張することによって整列化する。最終的な整列化は、一連の漸進的な対形式の整列化を行うことによって得られる。このプログラムは、配列を比較する領域に関して特定の配列およびそのアミノ酸またはヌクレオチド座標を指定することにより、ならびにプログラムパラメーターを指定することによって実行される。ＰＩＬＥＵＰを用いる場合には、以下のパラメーターを用いて参照配列を他の被験配列と比較して、配列一致率を決定する：デフォルトのギャップ加重（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）（３．００）、デフォルトのギャップ長加重（ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）（０．１０）および加重エンドギャップ（ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｅｎｄ ｇａｐ）。ＰＩＬＥＵＰはＧＣＧ配列解析ソフトウエアパッケージ、例えばバージョン７．０（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘら（１９８４）Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：３８７〜３９５）から入手可能である。
【００６２】
配列一致率および配列類似性の決定のために適したアルゴリズムの別の例が、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、それぞれアルツシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９７７）Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９〜３４０２およびアルツシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９０）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３〜４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウエアは米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎ１ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に公開されている。このアルゴリズムでは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列化した場合に何らかの正値の閾値スコアＴと一致する、またはそれを満たす、長さＷの短いワードを検索配列中に同定することにより、高スコアの配列ペア（ＨＳＰ）をまず同定する。Ｔは近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前記）。これらの初期の近隣ワードでのヒットは、それらを含む長いＨＳＰを見いだすための検索を開始する供給源となる。ワードの検索は、累積アラインメントスコアが増加する限り、各配列の両方向に対して延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合にはパラメーターＭ（一致する残基対に関する報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基に関するペナルティスコア；常に＜０）を用いて算出する。アミノ酸配列の場合には、累積スコアの算出にスコア行列を用いる。各方向へのワード検索の延長は以下の場合に停止する：累積アラインメントスコアが最大達成値に比べて量Ｘより低くなった場合：一つもしくは複数の負スコアの残基アラインメントの蓄積のために累積スコアがゼロまたはそれ未満になった場合；または配列のいずれかの端に達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターであるＷ、ＴおよびＸは整列化の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラムは（ヌクレオチド配列の場合）、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両ストランドの比較を用いる。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムはデフォルトとしてワード長３および期待値（Ｅ）１０、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照）のアラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両ストランドの比較を用いる。
【００６３】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、二つの配列の間の類似性に関する統計分析も行う（例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３〜５７８７を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって得られる類似性の指標の一つは最小合計確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、二つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の一致が偶然に起こる確率の指標となる。例えばある核酸は、被験核酸と参照核酸との比較による最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満の場合に、参照配列と類似しているとみなされる。
【００６４】
二つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるという指標は、以下に述べる通り、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に交差反応することである。したがって、例えば二つのペプチドが保存的置換のみの点で異なる場合、ポリペプチドは一般に第２のポリペプチドと実質的に同一である。二つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、以下に述べる通り、二つの分子またはその相補物がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。 二つの核酸配列が実質的に同一であるというさらに別の指標は、配列の増幅に同じプライマーを用いることができることである。
【００６５】
「選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」という語句は、ある分子の結合、二重鎖形成またはハイブリダイゼーションが、その配列が複合混合物（例えば全細胞またはライブラリーのＤＮＡまたはＲＮＡ）中に存在する場合に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特定のヌクレオチド配列のみに対して起こることを指す。
【００６６】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、一般には核酸の複合混合物において、プローブがその標的部分配列とハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしないと思われる条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、環境が異なれば異なると考えられる。配列が長いほど高い温度で特異的にハイブリダイズすると考えられる。核酸のハイブリダイゼーションに関する詳細な手引きは、ティッセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）、「生化学および分子生物学の技法−核酸プローブとのハイブリダイゼーション（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ）」における「ハイブリダイゼーションの原理および核酸アッセイ法の戦略の概要（Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ）」（１９９３）に記載がある。一般に、ストリンジェントな条件とは、規定のイオン強度および強度での特定の配列の融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的に対して相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度（規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度の下で）である（標的配列が過剰に存在するため、Ｔｍでは平衡状態でプローブの５０％が占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度がナトリウムイオン濃度で約１．０Ｍ未満、一般的にはナトリウムイオン（または他の塩の）濃度で約０．０１Ｍ〜１．０Ｍ、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．３であり、温度は短いプローブ（例えば１０ヌクレオチド〜５０ヌクレオチド）に関しては少なくとも約３０℃であって、（例えば５０ヌクレオチドを上回るもの）に関しては少なくとも約６０℃であると考えられる。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの脱安定剤の添加によっても得られる。選択的または特異的なハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルはバックグラウンド値の少なくとも２倍、選択的にはバックグラウンドでのハイブリダイゼーションの１０倍である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては以下のものが考えられる：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベートを行い、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベートを行い、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ、６５℃で洗浄する。このような洗浄を５分、１５分、３０分、６０分、１２０分またはそれ以上にわたって行うことができる。
【００６７】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸も、それらをコードするポリペプチドが実質的に同一であれば、やはり実質的に同一である。これは例えば遺伝暗号によって許容される最大のコドン縮重性を用いて生じた核酸のコピーの場合に起こる。このような場合には、核酸は一般に、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の例には、４０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、３７℃の緩衝液中でのハイブリダイゼーション、および１×ＳＳＣ、４５℃での洗浄が含まれる。このような洗浄は、５分、１５分、３０分、６０分、１２０分またはさらに多くの期間にわたって行いうる。陽性のハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも２倍である。代替的なハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を用いて同様に厳密な条件が得られることを、当業者は容易に認識すると考えられる。
【００６８】
「抗体」とは、抗原と特異的に結合してそれを認識する、免疫グロブリン遺伝子またはその断片に由来するフレームワーク領域を含むポリペプチドを指す。認識される免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμの定常領域遺伝子のほか、多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はκまたはλのどちらかとして分類される。重鎖はγ、μ、α、δまたはεとして分類され、これによってそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥという免疫グロブリンのクラスが定義される。
【００６９】
例示的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は四量体から構成される。各四量体は二つの同一なポリペプチド鎖の対から構成され、それぞれの対は一つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および一つの「重」鎖（約５０ｋＤａ〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端には、抗原認識の主な原因となる約１００アミノ酸〜１１０アミノ酸またはそれ以上のアミノ酸からなる可変領域がある。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語はそれぞれ、これらの軽鎖および重鎖を指す。
【００７０】
抗体は、たとえば完全な免疫グロブリン、または種々のペプチダーゼによる消化によって生じる特徴が解明された数多くの断片として存在する。すなわち、例えばペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド結合の下方で抗体を切断し、ジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１と連結した軽鎖であるＦａｂの二量体、Ｆ（ａｂ）’２を生じる。ヒンジ領域のジスルフィド結合を切断するためにＦ（ａｂ）’２を穏和な条件下で還元し、それによってＦ（ａｂ）’２二量体をＦａｂ’単量体に変換してもよい。Ｆａｂ’単量体は本質的にはヒンジ領域の一部を伴うＦａｂである（「基礎免疫学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（Ｐａｕｌ編、第３版、１９９３）を参照のこと）。さまざまな抗体断片が完全抗体の消化の見地から定義されているが、当業者は、このような断片を化学的または組換えＤＮＡ法を用いてデノボ合成しうることを理解すると考えられる。このため、本明細書で用いる抗体という用語には、抗体全体の改変によって生じる抗体断片、または組換えＤＮＡ法を用いてデノボ合成されたもの（例えば一本鎖Ｆｖ）またはファージディスプレイライブラリーを用いて同定されたもの（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２〜５５４を参照）も含まれる。
【００７１】
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の調製に関しては、当技術分野で知られた任意の技法を用いることができる（例えばＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７；Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２；Ｃｏｌｅら、ｐｐ．７７〜９６、「モノクローナル抗体および癌治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）」（１９８５）を参照のこと）。一本鎖抗体の産生のための技法（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明のポリペプチドに対する抗体を産生させるために応用しうる。また、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物などの他の生物を、ヒト化抗体を発現させるために用いてもよい。または、選択した抗原と特異的に結合する抗体およびヘテロメリックＦａｂ断片を同定するためにファージディスプレイ技術を用いることもできる（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２〜５５４；Ｍａｒｋｓら（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９〜７８３を参照）。
【００７２】
「キメラ抗体」とは、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、以下のような抗体分子をさす：異なるもしくは改変されたクラス、エフェクター機能および／もしくは種の定常領域、または新たな特性をキメラ抗体に付与する酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物などの全く異なる分子と結合するように、定常領域またはその一部が改変、置換または交換されている；または（ｂ）可変領域またはその一部が、異なるもしくは改変された抗原特異性を有する可変領域によって改変、置換または交換されている。
【００７３】
「抗Ｇγ１２」抗体とは、Ｇγ１２遺伝子、そのｃＤＮＡまたは部分配列によってコードされるポリペプチドと特異的に結合する抗体または抗体断片である。「抗ｍＧγ１２」抗体とは、ｍＧγ１２遺伝子、そのｃＤＮＡまたは部分配列によってコードされるポリペプチドと特異的に結合し、かつ、例えばヒトＧγ１２などの異なる種由来のＧγ１２遺伝子によってコードされるポリペプチドに結合しない抗体または抗体断片である。
【００７４】
「イムノアッセイ法」という用語は、抗原と特異的に結合する抗体を用いるアッセイ法である。イムノアッセイ法は、特定の抗体の特異的結合特性を、抗原の単離、ターゲティングおよび／または定量化のために用いることを特徴とする。
【００７５】
抗体と「特異的に（または選択的に）結合する」、または「特異的に（または選択的に）免疫反応性である」という語句は、タンパク質またはペプチドに言及する場合、タンパク質または他の生物材料の不均一集団内にそのタンパク質が存在することの決定因子となる結合反応を指す。すなわち、指定のイムノアッセイ条件下で、指定された抗体は特定のタンパク質とバックグラウンドの少なくとも２倍で結合し、試料中に存在する他のタンパク質とは意味のある量としては実質的に結合しない。このような条件下での抗体に対する特異的結合には、特定のタンパク質に対する特異性の点から選択された抗体が必要と思われる。例えば、関心対象のＧγ１２タンパク質（例えばｍＧγ１２）に対して特異的に免疫反応性であり、関心対象のＧγ１２タンパク質の多型変種および対立遺伝子を除く他のタンパク質（例えばヒトＧγ１２）に対して免疫反応性ではないポリクローナル抗体のみが得られるように、ラット、マウスまたはヒトなどの特定の種由来のＧγ１２ポリペプチドに対して産生されたポリクローナル抗体を選択することが可能である。この選択は、他の種のＧγ１２分子と交差反応する抗体を取り除くことによって実施しうる。特定の抗体に対して特異的に免疫反応性である抗体の選択には、種々の形式のイムノアッセイ法を用いることができる。例えばあるタンパク質に対して免疫反応性である抗体の選択には、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ法が日常的に用いられる（特異的な免疫反応性の決定に用いることができるイムノアッセイ法の形式および条件に関する説明については、例えばＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「抗体、実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（１９８８）を参照）。一般に、特異的または選択的な反応は、バックグラウンドシグナルもしくはノイズの少なくとも２倍、より一般的にはバックグラウンドの１０倍〜１００倍と考えられる。
【００７６】
「選択的に会合する」という語句は、核酸が、上記に定義した別の核酸と「選択的にハイブリダイズする」能力、または抗体が、上記に定義したタンパク質と「選択的に（または特異的に）結合する」能力を指す。
【００７７】
「宿主細胞」とは、発現ベクターを含み、発現ベクターの複製または発現を補助する細胞を指す。宿主細胞は、例えば大腸菌などの原核細胞でもよく、または例えば酵母細胞、昆虫細胞、両生類細胞、もしくはＣＨＯ、ＨｅＬａ、その他の哺乳動物細胞などの真核細胞、例えば培養細胞、外殖片およびインビボ細胞などでもよい。
【００７８】
ＩＩＩ．Ｇγ１２核酸の操作および検出
本発明の数多くの態様において、完全長Ｇγ１２タンパク質またはその任意の誘導体、変種、相同体もしくは断片を含む、Ｇγ１２ポリペプチドをコードする核酸が用いられると考えられる。このような核酸は、Ｇγ１２タンパク質の産生、診断アッセイ法、治療的応用、Ｇγ１２特異的プローブ、他の種由来のＧγ１２相同体を同定および／または単離するためのＧγ１２結合性および／または調整性の化合物に関するアッセイ法、ならびに他の用途を含む、数多くの用途のうち任意のものに有用である。本発明の異なる態様において、Ｇγ１２ポリペプチドをコードする核酸は、特に、例えばヒト、マウスなどを含む任意の哺乳動物に由来することができる
【００７９】
Ａ．一般的な組換えＤＮＡ法
本発明の数多くの応用には、組換え遺伝学の分野における日常的な技法を用いて行える、核酸配列のクローニング、合成、維持、変異誘発および他の操作が含まれる。本発明における一般的な使用方法を開示している基本的なテキストには、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（第２版、１９８９）；クリーグラー（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ）、「遺伝子の導入および発現：実験室マニュアル（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（１９９０）；および「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４）が含まれる。
【００８０】
核酸の場合、サイズはキロベース（ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）のいずれかによって表される。これらは、アガロースゲルまたはアクリルアミドゲルでの電気泳動、配列が決定された核酸、または公表されたＤＮＡ配列から得られる推定値である。タンパク質の場合、サイズはキロダルトン（ｋＤａ）またはアミノ酸残基数によって表される。タンパク質のサイズは、ゲル電気泳動、配列が決定されたタンパク質、導き出されたアミノ酸配列、または公表されたタンパク質配列から推定される。
【００８１】
市販されていないオリゴヌクレオチドは、ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）およびカルーセル（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ． ２２：１８５９〜１８６２によって最初に記載された固相ホスホロアミダイドトリエステル法に従って、ファンデバンター（Ｖａｎ Ｄｅｖａｎｔｅｒ）ら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １２：６１５９〜６１６８に記載された自動合成装置を用いて化学合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびレーニア（Ｒｅａｎｉｅｒ）（１９８３）Ｊ． Ｃｈｒｏｍ． ２５５：１３７〜１４９に記載された未変性アクリルアミドゲル電気泳動または陰イオン交換ＨＰＬＣによって行う。
【００８２】
クローニングされた遺伝子および合成オリゴヌクレオチドの配列は、例えばウォレス（Ｗａｌｌａｃｅ）ら（１９８１）Ｇｅｎｅ １６：２１〜２６による二本鎖鋳型のシークエンシング用の連鎖停止法などを用いたクローニングの後に確認することができる。
【００８３】
Ｂ．Ｇγ１２ヌクレオチド配列の単離および検出
本発明の数多くの態様において、Ｇγ１２核酸を単離し、組換え方法を用いてクローニングする。このような態様は、例えば、タンパク質発現用にまたはＧγ１２に由来する変種、誘導体、発現カセットもしくは他の配列の作製時に、Ｇγ１２ポリヌクレオチドを単離するため、異なる種におけるＧγ１２配列の単離または検出用に、患者における診断目的用に、Ｇγ１２遺伝子発現をモニターするため、例えば、Ｇγ１２における変異を検出するために用いられる。一つの態様において、本発明の核酸は、特に、例えばヒト、マウスなどを含む任意の哺乳動物に由来する。
【００８４】
しばしば、Ｇγ１２タンパク質および関連した核酸配列相同体をコードする核酸配列を、プローブとのハイブリダイゼーションによってｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡライブラリーからクローニングする、または、オリゴヌクレオチドプライマーを用いる増幅法を用いて単離する。例えばＧγ１２配列を、一般に、その配列を特異的Ｇγ１２遺伝子、例えば配列番号：２もしくは３から得ることができる核酸プローブとのハイブリダイゼーションにより、哺乳動物核酸（ゲノムまたはｃＤＮＡ）ライブラリーから単離し、または当技術分野で公知の標準的技法を用いて、特異的Ｇγ１２配列、例えば配列番号：２もしくは３記載の配列から設計できる特異的プライマーを用いて増幅する。Ｇγ１２のＲＮＡおよびｃＤＮＡを単離するのに適した生物材料には、例えば肝臓、胸腺、脾臓、腎臓、胎盤、腎臓、肺、膵臓、前立腺、精巣、卵巣、小腸、大腸などの非常に様々な組織が含まれる。
【００８５】
プライマーを用いる増幅技術を、ＤＮＡまたはＲＮＡからのＧγ１２配列の増幅および単離のために用いることもできる（例えばＤｉｅｆｆｅｎｆａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ、「ＰＣＲプライマー：実験室マニュアル（ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（１９９５））。プライマーは例えば完全長配列または１個〜数百個のヌクレオチドのプローブを増幅するために用いることができ、これを次に、完全長Ｇγ１２クローンに関する哺乳動物ライブラリーのスクリーニングに用いることができる。
【００８６】
Ｇγ１２ポリペプチドをコードする核酸を、抗体をプローブとして用いて、発現ライブラリーから単離することもできる。このようなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を、例えば、配列番号：１の配列またはその誘導体もしくは断片を用いて産生させることができる。さらに、配列番号：１に結合するが、例えば配列番号：４に結合しない抗体をさらに選択することにり、ｍＧγ１２に特異的な抗体を得ることができる。
【００８７】
Ｇγ１２遺伝子と実質的に同一である多型変種、対立遺伝子および種間相同体を、ライブラリーのスクリーニングにより、例えばｍＧγ１２核酸プローブおよびオリゴヌクレオチドを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で単離することができる。または、例えばｍＧγ１２相同体も認識して選択的に結合するｍＧγ１２ポリペプチドに対して作製した抗血清または精製抗体を用いて、発現された相同体を免疫学的に検出することにより、Ｇγ１２の多型変種、対立遺伝子および種間相同体のクローニングのために発現ライブラリーを用いることもできる。
【００８８】
より近縁性の低いＧγ１２相同体は、Ｇγ１２プローブを中程度にストリンジェントな条件下または低ストリンジェンシー条件下でゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーとハイブリダイズさせる段階を含む、よく知られた数多くの技法のうちいずれかを用いて同定可能である。また、近縁性の低い相同体を、縮重プライマーセット、すなわち、所定のアミノ酸配列をコードするすべての可能なコドンを組み込んだプライマーを、特に高度に保存的なアミノ酸連鎖に基づいて用いて、核酸ライブラリーから増幅することもできる。このようなプライマーは当業者に周知であり、縮重プライマーの設計に関しては、インターネット上などから数多くのプログラムを入手可能である。
【００８９】
ｃＤＮＡライブラリーを作製するためには、Ｇγ１２ ｍＲＮＡを豊富に含む供給源、例えば肝臓、胸腺、脾臓、腎臓、胎盤、肺、腎臓、膵臓、前立腺、精巣、卵巣、小腸、大腸などの非常に多様な組織から単離した細胞を選択する必要がある。その後、逆転写酵素を用いてｍＲＮＡをｃＤＮＡに変え、組換えベクター中に連結し、組換え宿主にトランスフェクトして増殖、スクリーニングおよびクローニングを行う。ｃＤＮＡライブラリーの作製およびスクリーニングのための方法はよく知られている（例えばＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎ（１９８３）Ｇｅｎｅ ２５：２６３〜２６９；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前記；Ａｕｓｕｂｅｌら、前記を参照）。
【００９０】
ゲノムライブラリーの場合には、ＤＮＡを組織または細胞から抽出し、機械的剪断または酵素消化のいずれかによって約１２ｋｂ〜２０ｋｂの断片を得る。続いて勾配遠心によって望ましくないサイズのものから断片を分離し、バクテリオファージλベクター中に構築する。これらのベクターおよびファージのパッケージングをインビトロで行う。組換えファージを、ベントン（Ｂｅｎｔｏｎ）およびデービス（Ｄａｖｉｓ）（１９７７）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８０〜１８２に記載されたプラークハイブリダイゼーションによって分析する。コロニーハイブリダイゼーションをグルンシュタイン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ）ら（１９７５）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７２：３９６１〜３９６５に概略して記載された通りに行う。
【００９１】
Ｇγ１２核酸およびその相同体を単離する別の方法では、合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用とＲＮＡまたはＤＮＡ鋳型の増幅とを組み合わせる（米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号；「ＰＣＲのプロトコール：方法および応用の手引き（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」（Ｉｎｎｉｓら編、１９９０）を参照）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）などの方法を用いて、ｍＲＮＡから、ｃＤＮＡから、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーからＧγ１２遺伝子の核酸配列を直接増幅することができる。縮重オリゴヌクレオチドを設計して、特定の配列（例えば配列番号：２または３に記載された配列）を用いてＧγ１２相同体（例えばｍＧγ１２相同体）を増幅できる。制限酵素部位をプライマーに組み入れることができる。ポリメラーゼ連鎖反応または他のインビトロ増幅法は、例えば発現させようとするタンパク質をコードする核酸配列のクローニングのため、生理的試料中のＧγ１２をコードするｍＲＮＡの存在の検出用のプローブとして用いるための核酸を作製するため、核酸配列の決定のため、または他の目的のためにも有用でありうる。ＰＣＲ反応によって増幅された遺伝子をアガロースゲルから精製し、適したベクター中にクローニングできる。
【００９２】
合成オリゴヌクレオチドは、プローブとしての使用またはタンパク質の発現を目的として組換えＧγ１２遺伝子を構築するために用いることができる。この方法は、遺伝子のセンス鎖および非センス鎖の双方を表す、通常長さ４０ｂｐ〜１２０ｂｐの一連の重複オリゴヌクレオチドを用いて行われる。その後、これらのＤＮＡ断片のアニーリング、連結およびクローニングを行う。または、Ｇγ１２核酸の特定の部分配列を増幅するための正確なプライマーを用いる増幅法を行うこともできる。続いてその特定の部分配列を発現ベクター中に連結する。
【００９３】
Ｇγ１２ポリペプチドをコードする核酸は一般に、複製および／または発現のために原核細胞または真核細胞への形質転換導入を行う前に、中間ベクター中にクローニングされる。これらの中間ベクターは原核生物ベクター、例えばプラスミドまたはシャトルベクターであることが一般的である。ベクター、細胞およびトランスフェクションの方法は当業者に周知であり、例えばアウスユーベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）らまたはサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、いずれも前記に記載されている。
【００９４】
選択的には、Ｇγ１２ポリペプチドまたはその断片を一つ以上の異種ポリペプチドとともに含むキメラタンパク質をコードする核酸を用いることが考えられる。適切な異種タンパク質は、それぞれが当技術分野で周知である、例えばルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびβ−ｇａｌを非制限的に含む。
【００９５】
いくつかの態様においては、例えば、Ｇγ１２ ＲＮＡレベルの測定または特定のＤＮＡ配列の検出のために、ハイブリダイゼーションに基づく方法を用いてＧγ１２ポリヌクレオチドが検出されると考えられる。例えばＧγ１２の遺伝子発現を、ノーザンブロット法、ｍＲＮＡの逆転写および増幅、ドットブロット法、インサイチューハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護、ＤＮＡマイクロチップアレイのプローブ検索などの、当技術分野で知られた技法によって分析することができる。一つの態様において、Ｇγ１２の相同体および多型変種の同定またはＧγ１２ ｍＲＮＡレベルの観測を目的として、高密度オリゴヌクレオチド分析技術（例えばＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標））を用いる。相同体が既知の疾患と関係している場合には、生物試料における疾患を検出する診断ツールとして、それらをＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）とともに用いることができる（例えばＧｕｎｔｈａｎｄら（１９９８）ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １４：８６９〜８７６；Ｋｏｚａｌら（１９９６）Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ２：７５３〜７５９；Ｍａｔｓｏｎら（１９９５）Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２４：１１０〜１０６；Ｌｏｃｋｈａｒｔら（１９９６）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４：１６７５〜１６８０；Ｇｉｎｇｅｒａｓら（１９９８）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ８：４３５〜４４８；Ｈａｃｉａら（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ２６：３８６５〜３８６６を参照されたい）。
【００９６】
哺乳動物におけるＧγ１２ ＤＮＡ配列、例えば特定の対立遺伝子を、サザンブロットハイブリダイゼーションを用いて、すなわち、ゲノムＤＮＡを単離し、単離されたＤＮＡの制限消化を行い、制限断片をアガロースゲルなどで電気泳動的に分離し、分離したＤＮＡを膜に移行させた上で、特異的な標識配列でプローブ検索することにより、検出することができる。サザンブロット法は当技術分野で周知であり、アウスユーベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）らおよびサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、共に上述、を含む数多くの参照に教示されている。
【００９７】
その他の態様において、例えば遺伝子発現の組織特異的または時間的なパターンを検出するために、インサイチューハイブリダイゼーションを用いてＧγ１２ポリヌクレオチドを検出する。インサイチューハイブリダイゼーションでは、細胞内でのハイブリダイゼーションが可能となり、同時にその後の解釈および分析のために細胞形態が保持されるように、標的核酸を細胞周囲から遊離させる。以下の論文に、インサイチューハイブリダイゼーションの技術に関する概要が示されている：シンガー（Ｓｉｎｇｅｒ）ら（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２３０〜２５０；ハーゼ（Ｈａａｓｅ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第ＶＩＩ巻、ｐｐ．１８９〜２２６（１９８４）；および「核酸ハイブリダイゼーション：実践的アプローチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」（Ｈａｍｅｓら編、１９８７）。
【００９８】
Ｃ．原核生物および真核生物における発現
しばしば、発現を得るため、すなわち、コードされるｍＲＮＡまたはタンパク質の産生のために、クローニングしたＧγ１２配列を原核細胞内または真核細胞内で発現させることが考えられる。例えば数多くの態様において、細胞におけるＧγ１２活性のレベルを調整するため、かつそれによって患者の細胞におけるエストロゲンシグナル伝達のレベルを調整するために、Ｇγ１２ポリヌクレオチドを細胞に導入する。Ｇγ１２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡなどの、クローニングした遺伝子または核酸の高レベルの発現を得るためには、一般的にはＧγ１２配列を、転写を指令する強力なプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、および、タンパク質をコードする核酸に関する、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含む発現ベクター中にサブクローニングする。適した細菌プロモーターは当技術分野で周知であり、例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らおよびアウスユーベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、共に上述、に記載されている。Ｇγ１２タンパク質の発現用の細菌発現系としては、例えば大腸菌、バチルス属細菌およびサルモネラ菌を用いることができる（Ｐａｌｖａら（１９８３）Ｇｅｎｅ ２２：２２９〜２３５；Ｍｏｓｂａｃｈら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ ３０２：５４３〜５４５）。このような発現系のためのキットが市販されている。哺乳動物細胞、酵母および昆虫細胞用の真核生物発現系は当技術分野で周知であり、市販もされている。一つの態様において、真核生物発現ベクターはアデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクターまたはレトロウイルスベクターである。
【００９９】
治療的応用のためには、ウイルスベクターによる感染、リポソームを用いる方法、微粒子射入（遺伝子銃）および裸ＤＮＡの注入を非制限的に含む多数の方法のうち任意のものを用いて、Ｇγ１２核酸をインビトロ、インビボまたはエクスビボで細胞に導入する。このような治療的に有用な核酸には、完全長Ｇγ１２のコード配列、Ｇγ１２断片、誘導体または変種のコード配列、Ｇγ１２アンチセンス配列およびＧγ１２リボザイムが非制限的に含まれる。このような配列はプロモーターと機能的に結合させることが一般的であるが、さまざまな応用においては、それ自体が直接、治療的に有効な核酸、例えばある種のアンチセンスまたはリボザイム分子を細胞に投与する。
【０１００】
異種核酸の発現を指令するために用いるプロモーターは、個々の用途に応じて決まる。プロモーターは選択的には、異種転写開始部位に対して、自然下の状況における転写開始部位との距離とほぼ同じ距離を隔てて位置する。しかし、当技術分野で知られている通り、この距離はプロモーター機能を損なわずにある程度変えることが可能である。
【０１０１】
発現ベクターは、プロモーターに加えて、転写単位、または、Ｇγ１２をコードする核酸の宿主細胞における発現のために必要なすべての追加的な要素を含む発現カセットを含むことが一般的である。このため、典型的な発現カセットは、Ｇγ１２ポリペプチドをコードする核酸配列と機能的に結合したプロモーター、および、転写物の効率的なポリアデニル化のために必要なシグナル、リボソーム結合部位ならびに翻訳終結部位を含む。Ｇγ１２ポリペプチドをコードする核酸配列を、コードされるタンパク質のトランスフェクト細胞による分泌を促進するための切断性シグナルペプチド配列と結合させてもよい。このようなシグナルペプチドには特に、組織プラスミノーゲン活性化物質、インスリンおよび神経成長因子、ならびにオオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）の幼若ホルモンエステラーゼに由来するシグナルペプチドが含まれる。カセットのその他の要素としては、エンハンサーのほか、ゲノムＤＮＡを構造遺伝子として用いる場合には機能的なスプライスドナー部位およびアクセプター部位を有するイントロンが含まれうる。
【０１０２】
発現カセットは、プロモーター配列に加えて、効率的な終結がなされるように、構造遺伝子の下流に転写終結領域も含む必要がある。終結領域をプロモーター配列と同じ遺伝子から入手してもよく、異なる遺伝子から入手してもよい。
【０１０３】
遺伝情報を細胞内に運ぶためにどのような発現ベクターを用いるかは特に重要ではない。真核細胞または原核細胞における発現に用いられる従来のベクターのうち任意のものを用いてよい。標準的な細菌発現ベクターには、ｐＢＲ３２２をベースとするプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄなどのプラスミド、ならびにＧＳＴおよびＬａｃＺなどの融合発現系が含まれる。好都合な分離方法が得られるように、ｃ−ｍｙｃ、ＨＡ−タグ、６−Ｈｉｓタグ、マルトース結合タンパク質、ＶＳＶ−Ｇタグ、抗ＤＹＫＤＤＤＤＫタグまたは任意のこの種のタグなどのエピトープタグ（これらは多数のものが当業者に周知である）を組換えタンパク質に付加することもできる。
【０１０４】
真核生物発現ベクターには、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタイン−バーウイルス由来のベクターなどの、真核生物ウイルス由来の調節配列を含む発現ベクターが一般に用いられる。真核生物ベクターのその他の例には、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、および、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞における発現に有効なことが示されている他のプロモーターの指令下でタンパク質の発現が可能となる任意の他のベクターが含まれる。
【０１０５】
発現系の中には、ネオマイシン、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼなどの、遺伝子増幅をもたらすマーカーを備えたものもある。または、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指令下にあるＧγ１２ポリペプチドをコードする配列を有する、昆虫細胞におけるバキュロウイルスベクターなどを用いる、遺伝子増幅を用いない高収率発現系も適している。
【０１０６】
発現ベクターに一般に含まれる要素には、大腸菌内で作用するレプリコン、組換えプラスミドを有する細菌の選択を可能とする抗生物質耐性をコードする遺伝子、および真核生物配列の挿入を可能とするプラスミドの非必須領域における一意的な制限部位も含まれる。どの抗生物質耐性遺伝子を選択するかは特に重要ではなく、当技術分野で知られた多くの耐性遺伝子の任意のものが適している。選択的には、真核細胞におけるＤＮＡの複製と干渉しないように、必要に応じて原核生物配列を選択する。
【０１０７】
標準的なトランスフェクション法を用いて、大量のＧγ１２タンパク質を発現する細菌、哺乳動物、酵母または昆虫の細胞系を作製し、続いて標準的な技法を用いてＧγ１２タンパク質を精製する（例えばＣｏｌｌｅｙら（１９８９）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：１７６１９〜１７６２２；「タンパク質精製の手引き（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｆｉｃａｔｉｏｎ）」、「酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」内、第１８２巻（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編、１９９０）を参照）。真核細胞および原核細胞の形質転換は標準的な技法に従って行う（例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ（１９７７）Ｊ． Ｂａｃｔ． １３２：３４９〜３５１；Ｃｌａｒｋ−ＣｕｒｔｉｓｓおよびＣｕｒｔｉｓｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：３４７〜３６２（Ｗｕら編、１９８３）を参照）。
【０１０８】
発現ベクターの導入には、外来性ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための周知の手法のうち任意のものを用いることができる。これには、スーパーフェクト（Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ）（Ｑｉａｇｅｎ）などの試薬、リポソーム、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、電気穿孔、微量注入、プラスミドベクター、ウイルスベクター、微粒子射入（遺伝子銃）、またはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成 ＤＮＡもしくは他の外来遺伝物質を宿主細胞に導入するためのよく知られた他の方法のうちの任意のものの使用が含まれる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、前記を参照）。唯一必要なのは、用いる具体的な遺伝子工学手順が、Ｇγ１２遺伝子を発現しうる宿主細胞に少なくとも一つの遺伝子をうまく導入できるという点のみである。
【０１０９】
発現ベクターを細胞に導入した後に、Ｇγ１２ポリペプチドの発現を促す条件下でトランスフェクト細胞を培養し、以下に明記する標準的な技法を用いて培養物からＧγ１２ポリペプチドを回収する。原核細胞または真核細胞の培養法は周知であり、例えばアウスユーベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、共に上述、およびフレッシュニー（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）編、「動物細胞の培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ）」、第３版（１９９３）、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎに教示されている。
【０１１０】
ＩＶ．Ｇγ１２ポリペプチドの精製
天然型および組換え型のＧγ１２ポリペプチドをいずれも、機能アッセイ法、結合アッセイ法、診断アッセイ法および他の用途に用いることができる。典型的には、組換え型のＧγ１２ポリペプチドが精製される。天然型Ｇγ１２ポリペプチドは、例えば肝臓、胸腺、脾臓、腎臓、胎盤、肺、腎臓、膵臓、前立腺、精巣、卵巣、小腸、大腸、もしくは他の組織などの哺乳動物組織、またはＧγ１２相同体の任意の他の供給源から精製される。組換えＧγ１２ポリペプチドは、任意の適した細菌または真核生物発現系、例えばＣＨＯ細胞または昆虫細胞から精製される。ここで、および本明細書全体を通して、本発明のいくつかの態様において、Ｇγ１２ポリペプチドはマウスＧγ１２ポリペプチド（ｍＧγ１２）である。
【０１１１】
硫酸アンモニウムなどの物質による選択的沈殿、カラムクロマトグラフィー、免疫精製法などを含む標準的な技法により、Ｇγ１２タンパク質を実質的に純粋になるまで精製することもできる（例えばＳｃｏｐｅｓ、「タンパク質精製：原理および実践（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」（１９８２）；米国特許第４，６７３，６４１号；Ａｕｓｕｂｅｌら、前記；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、共に前記を参照）。
【０１１２】
組換えＧγ１２ポリペプチドを精製する場合には数多くの方法を用いることができる。例えば分子接着特性が立証されているタンパク質をＧγ１２ポリペプチドと可逆的に融合させることができる。適切なリガンドを用いて、Ｇγ１２ポリペプチドを精製カラムに選択的に吸着させ、次にそれをカラムから比較的純粋な形で遊離させることができる。その後、酵素活性によって融合タンパク質を分離する。イムノアフィニティーカラムを用いてＧγ１２タンパク質を精製することも可能である。
【０１１３】
Ａ．組換え細胞からのＧγ１２タンパク質の精製
大量のＣＨＯ細胞または昆虫細胞などの形質転換を施した細菌細胞または真核細胞により、一般的にはプロモーター誘導後に、組換えタンパク質を発現させる；ただし、発現は構成的でもよい。ＩＰＴＧによるプロモーター誘導は、誘導性プロモーター系の一例である。当技術分野における標準的な手順に従って細胞を増殖させる。タンパク質の単離には新鮮細胞または凍結細胞を用いる。
【０１１４】
細菌内で発現させたタンパク質は不溶性凝集物（「封入体」）を形成することがある。Ｇγ１２封入体の精製にはいくつかのプロトコールが適している。例えば封入体の精製には一般に、例えば５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＡＴＰおよび１ｍＭ ＰＭＳＦを含む緩衝液中でのインキュベーションによる細菌細胞の破壊による、封入体の抽出、分離および／または精製が伴う。細胞懸濁液の可溶化は、フレンチプレスによる破砕を２〜３往復することにより、ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）（Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてホモジネート化することにより、または氷上での超音波処理によって行える。細菌を可溶化する代替的な方法は当業者には明らかである（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、およびＡｕｓｕｂｅｌら、共に前記を参照）。
【０１１５】
必要であれば、封入体を可溶化し、不要な不溶性物質を除去するために細胞溶解液を、典型的には遠心分離する。封入体を形成したタンパク質を、適合性のある緩衝液による希釈または透析によって再生させることもできる。適した溶媒には、尿素（約４Ｍ〜約８Ｍ）、ホルムアミド（少なくとも約８０％、容積／容積比）および塩酸グアニジン（約４Ｍ〜約８Ｍ）が含まれる。凝集体形成性タンパク質を可溶化しうるいくつかの溶媒、例えばＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）および７０％ギ酸は、タンパク質が非可逆的に変性し、免疫原性および／または活性がなくなる恐れがあるため、この手順に用いるには適していない。塩酸グアニジンおよび類似の薬剤は変性剤であるが、この変性は非可逆的ではなく、（例えば透析により）変性剤を除去または希釈すると再生が起こり、免疫学的および／または生物学的に活性のあるタンパク質が再構成される。当業者にはその他の適した緩衝液も知られている。Ｇγ１２ポリペプチドは、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース樹脂などの標準的な分離法によって他の細菌タンパク質から分離される。
【０１１６】
または、Ｇγ１２ポリペプチドを細菌の周辺質から精製することも可能である。細菌の可溶化を行った後に、Ｇγ１２タンパク質が細菌の周辺質に輸送された時点で、細菌の周辺質画分を低温浸透圧ショック、さらに当業者に公知の他の方法によって単離することができる。周辺質から組換えタンパク質を単離するためには、細菌細胞に遠心処理を行ってペレット化する。このペレットを２０％ショ糖を含む緩衝液中に再懸濁する。細胞を可溶化するためには、細菌を遠心分離し、氷冷した５ｍＭ ＭｇＳＯ４中にペレットを再懸濁して、氷浴中に約１０分間おく。この細胞懸濁液を遠心分離し、上清をデカントして回収する。上清中に存在する組換えタンパク質は、当業者に知られた標準的な分離法によって宿主タンパク質から分離することができる。
【０１１７】
Ｂ．Ｇγ１２ポリペプチドを精製するための標準的なタンパク質分離技術
１．溶解度分画（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）
特にタンパク質混合物が複合体である場合には、しばしば最初の段階として、最初に塩分画を行うことにより、不要な宿主細胞タンパク質（または細胞培養液に由来するタンパク質）の多くを関心対象の組換えタンパク質から分離できる。好ましい塩は硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水の量を効果的に減らすことによってタンパク質を沈殿させる。その後タンパク質は溶解性に基づいて沈殿する。タンパク質の疎水性が高いほど、より低い硫酸アンモニウム濃度で沈殿する可能性が高い。一般的なプロトコールでは、タンパク質溶液に硫酸アンモニウム飽和溶液を添加し、その結果、硫酸アンモニウム濃度が２０％〜３０％となるようにする。この濃度で最も疎水性の高いタンパク質が沈殿すると考えられる。次に沈殿物を廃棄し（関心対象のタンパク質が疎水性でない場合）、硫酸アンモニウムを上清に添加し、関心対象のタンパク質が沈殿することが公知の濃度にする。その後、沈殿物を緩衝液に溶解し、必要であれば過剰な塩を透析または透析濾過によって除去する。低温エタノール沈殿法などの、タンパク質の溶解性に依拠するその他の方法も当業者に知られており、複合タンパク質混合物の分画に用いることができる。
【０１１８】
２．サイズの差に基づく濾過
Ｇγ１２タンパク質の分子量を利用し、種々の孔径の膜（例えばＡｍｉｃｏｎ社またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社の膜）を通過させる限外濾過を用いて、それよりもサイズが大きいまたは小さいタンパク質から単離することができる。第１の段階として、分子量カットオフ値が関心対象のタンパク質の分子量よりも低い孔径の膜を通してタンパク質混合物の限外濾過を行う。その後、限外濾過後の保持物質に、分子量カットオフ値が関心対象のタンパク質の分子量よりも高い膜に対する限外濾過を行う。組換えタンパク質はこの膜を通過して濾液に入ると考えられる。その後、濾液を、以下に記載するクロマトグラフィーに供する。
【０１１９】
３．カラムクロマトグラフィー
Ｇγ１２タンパク質を、そのサイズ、正味の表面電荷、疎水性および異種分子に対する親和性に基づいて他のタンパク質から分離することもできる。さらに、タンパク質に対して産生された抗体をカラム基質に結合させて、タンパク質の免疫精製を行うこともできる。これらの方法はすべて当技術分野で周知である。クロマトグラフィー法を任意の規模で、しかもさまざまな製造者（例えばＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）による装置を用いて行えることは、当業者には明らかであると考えられる。
【０１２０】
Ｖ．Ｇγ１２ファミリーのメンバーに対する抗体
本発明の数多くの態様において、Ｇγ１２ポリペプチドと特異的に結合する抗体を用いることが想定される。このような抗体には、Ｇγ１２活性の調整、Ｇγ１２およびＧγ１２の変種、誘導体、断片などを検出するためのイムノアッセイ法を含む、数多くの用途がある。イムノアッセイ法を用いて、Ｇγ１２ポリペプチドを定性的または定量的に分析することができる。利用できる技術に関する一般的な概要は、ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）、「抗体：実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（１９８８）に記載されている。いくつかの態様において、本発明の抗体はｍＧγ１２に特異的に結合し、例えばヒトＧγ１２などの、異なる種由来のＧγ１２タンパク質に結合しない。
【０１２１】
Ａ．抗体の作製
Ｇγ１２ポリペプチドと特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の作製方法は当業者に知られている（例えばＣｏｌｉｇａｎ、「免疫学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（１９９１）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前記；Ｇｏｄｉｎｇ、「モノクローナル抗体：原理および実践（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」（第２版、１９８６）；ならびにＫｏｈｉｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７を参照）。このような技法には、ファージベクターまたは類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリーからの抗体の選択による抗体調製、さらにはウサギまたはマウスの免疫処置によるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製が含まれる（例えばＨｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１；Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６を参照）。
【０１２２】
Ｇγ１２を含むさまざまな免疫原を、Ｇγ１２ポリペプチドと特異的に反応する抗体の作製に用いることができる。例えば組換えＧγ１２タンパク質、特にｍＧγ１２タンパク質、またはその抗原性断片を、本明細書に記載した通りに単離する。組換えタンパク質を上記の通りに真核細胞または原核細胞で発現させ、上に一般的に述べた通りに精製することができる。組換えタンパク質は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の作製のために好ましい免疫原である。または、本明細書に開示した配列に由来し、担体タンパク質と結合させた合成ペプチドを免疫原として用いることもできる。天然のタンパク質を純粋または不純な状態で用いてもよい。その後、抗体を産生しうる動物内にその生成物を注入する。タンパク質を測定するためのイムノアッセイ法に後で用いるために、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のどちらかを作製できる。
【０１２３】
ポリクローナル抗体の作製方法は当業者に知られている。フロイントアジュバントなどの標準的なアジュバント、および標準的な免疫化プロトコールを用いて、近交系マウス（例えばＢＡＬＢ／Ｃマウス）またはウサギを、タンパク質により免疫化する。検査採血を行い、Ｇγ１２ポリペプチドに対する反応性力価を測定することにより、免疫原調製物に対する動物の免疫応答を観測する。免疫原に対して適切な高い力価を持つ抗体が得られた時点で、動物から血液を採取し、抗血清を調製する。必要に応じて、タンパク質に反応する抗体を濃縮するために抗血清をさらに分画することもできる（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前記を参照）。
【０１２４】
モノクローナル抗体は、当業者によく知られた種々の技法によって入手できる。簡潔に述べると、望ましい抗原による免疫化された動物から得た脾細胞を、一般的には骨髄腫細胞との融合によって不死化させる（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７６）Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：５１１〜５１９を参照）。代替的な不死化の方法には、エプスタイン−バーウイルス、癌遺伝子もしくはレトロウイルスによる形質転換、または当技術分野で周知の他の方法が含まれる。単一の不死化細胞から生じたクローンを抗原に対する望ましい特異性および親和性に関してスクリーニングし、このような細胞によって産生されるモノクローナル抗体の収量を、脊椎動物宿主の腹腔内に注射することを含む種々の技法によって高めることもできる。または、ヒューズ（Ｈｕｓｅ）ら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１に概要が示された一般的なプロトコールに従ってヒトＢ細胞由来のＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、モノクローナル抗体またはその結合性断片をコードするＤＮＡ配列を単離することもできる。
【０１２５】
モノクローナル抗体およびポリクローナル血清を回収し、イムノアッセイ法、例えば固体支持体上に固定した免疫原を用いる固相イムノアッセイ法において免疫原に対する滴定を行う。一般には、力価が１０４またはそれ以上であるポリクローナル抗血清を選択し、競合結合イムノアッセイ法を用いて、非Ｇγ１２タンパク質または他の生物由来の関連タンパク質との交差反応性を調べる。特異的なポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体は通常、少なくとも約０．１ｍＭ、より一般的には少なくとも約１μＭ、選択的には少なくとも約０．１μＭまたはそれ未満、かつ選択的には０．０１μＭまたはそれ未満のＫｄで結合すると考えられる。
【０１２６】
Ｇγ１２特異抗体を用いて、種々のイムノアッセイ法によって個々のＧγ１２タンパク質を検出することができる。免疫学的手順およびイムノアッセイ手順の概説については、「基礎免疫学および臨床免疫学（Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（ＳｔｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ編、第７版、１９９１）を参照されたい。さらに、本発明のイムノアッセイ法は、「酵素イムノアッセイ法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）」（Ｍａｇｇｉｏ編、１９８０）；ならびにハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）、前記に詳細に概説された複数の方式のうち任意の形式で行いうる。
【０１２７】
Ｂ．免疫学的結合アッセイ法
Ｇγ１２タンパク質は、よく知られた数多くの免疫学的結合アッセイ法のうち任意のものを用いて検出および／または定量化されうる（例えば米国特許第４，３６６，２４１号；第４，３７６，１１０号；第４，５１７，２８８号；および第４，８３７，１６８号を参照）。一般的なイムノアッセイ法の概説については、「細胞生物学の方法：細胞生物学における抗体（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第３７巻（Ａｓａｉ編、１９９３）；「基礎免疫学および臨床免疫学（Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（ＳｔｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ編、第７版、１９９１）を参照されたい。免疫学的結合アッセイ法（またはイムノアッセイ法）には一般に、選択したタンパク質または抗原（例えばｍＧγ１２タンパク質またはその抗原性部分配列）と特異的に結合する抗体を用いる。抗体（例えば抗ｍＧγ１２）を、当業者に周知の数多くの手段および上記の手段のうち任意のものを用いて作製できる。
【０１２８】
イムノアッセイ法には、抗体および抗原によって形成された複合体と特異的に結合し、それを標識する標識剤もしばしば用いられる。標識剤はそれ自体が抗体／抗原複合体を含む部分の一つであってもよい。すなわち、標識剤が標識Ｇγ１２ポリペプチド（例えば標識ｍＧγ１２ポリペプチド）または標識抗Ｇγ１２抗体（例えば標識抗ｍＧγ１２抗体）であってもよい。または、標識剤が、抗体／Ｇγ１２複合体と特異的に結合する二次抗体などの第３の部分であってもよい（二次抗体は、第１の抗体の由来となった種の抗体に対して特異的なことが一般的である）。免疫グロブリンの定常領域と特異的に結合しうる、プロテインＡまたはプロテインＧなどの他のタンパク質を標識剤としても用いてもよい。これらのタンパク質は、さまざまな種に由来する免疫グロブリン定常領域に対して強い非免疫原性反応性を示す（例えばＫｒｏｎｖａｌら（１９７３）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１１：１４０１〜１４０６；Ａｋｅｒｓｔｒｏｍら（１９８５）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３５：２５８９〜２５４２を参照）。別の分子、例えばストレプトアビジンが特異的に結合しうる、ビオチンなどの検出可能な部分によって標識剤を調整することができる。当業者にはさまざまな検出可能部分が周知である。
【０１２９】
アッセイ法全体を通じて、試薬の各々の組み合わせを用いた後には、インキュベーションおよび／または洗浄の段階が必要でありうる。インキュベーションの段階は、約５秒間〜数時間、選択的には約５分間から約２４時間の範囲でありうる。しかし、インキュベーション時間はアッセイ形式、抗原、溶液の容積、濃度などに依存すると考えられる。通常、アッセイ法は室温で行うが、１０℃〜４０℃といった範囲の温度にわたって行うことができる。
【０１３０】
１．非競合アッセイ形式
試料中のＧγ１２タンパク質を検出するためのイムノアッセイ法は競合的でも非競合的でもよい。非競合イムノアッセイ法は、抗原の量を直接測定するアッセイ法である。例えば一つの好ましい「サンドイッチ」アッセイ法では、抗Ｇγ１２抗体を、それを固定するための固体基質に対して直接結合させることができる。これらの固定された抗体は被験試料中に存在するＧγ１２タンパク質を捕捉することができる。このようにして結合したＧγ１２タンパク質に対して、次に、標識を有する第２のＧγ１２抗体などの標識剤を結合させる。または、第２の抗体には標識がなく、その代わりに、第２の抗体の由来となった種の抗体に対して特異的な第３の抗体をそれと結合させてもよい。第２または第３の抗体には一般に、検出可能な部分が得られるように、ストレプトアビジンなどの別の分子と特異的に結合するビオチンなどの検出可能な部分による調整を行う。
【０１３１】
２．競合アッセイ形式
競合アッセイ法では、試料中に存在する未知のＧγ１２タンパク質によって抗Ｇγ１２抗体から解離した（競合に敗れた）、添加された（外因性の）既知のＧγ１２タンパク質の量を測定することにより、試料中に存在するＧγ１２タンパク質の量を間接的に測定する。一つの競合アッセイ法では、既知の量のＧγ１２タンパク質を試料に添加し、続いて試料を、Ｇγ１２タンパク質と特異的に結合する抗体と接触させる。抗体と結合した外因性Ｇγ１２タンパク質の量は、試料中に存在するＧγ１２タンパク質の濃度と反比例する。一つの特に好ましい態様において、抗体を固体基質上に固定する。抗体と結合したＧγ１２タンパク質の量は、Ｇγ１２／抗体複合体中に存在するＧγ１２タンパク質の量を測定することにより、または、複合体を形成していない残ったタンパク質の量を測定することによって決定できる。標識したＧγ１２分子を用いることによってＧγ１２タンパク質の量を検出してもよい。
【０１３２】
もう一つの好ましい競合アッセイ法はハプテン阻害アッセイ法である。このアッセイ法では、既知のＧγ１２タンパク質を固体基質上に固定する。既知の量の抗Ｇγ１２抗体を試料に添加し、次にこの試料を固定されたＧγ１２と接触させる。固定された既知のＧγ１２タンパク質と結合した抗Ｇγ１２抗体の量は、試料中に存在するＧγ１２タンパク質の量と反比例する。この場合も、固定された抗体の量は、固定された抗体の割合または溶液中に残った抗体の割合のいずれかを検出することによって検出できる。検出は抗体が標識される場合には直接的でよく、上記の抗体と特異的に結合する標識部分を後に添加する場合には間接的でよい。
【０１３３】
３．交差反応性の決定
競合結合形式のイムノアッセイ法を、交差反応性の決定に用いることもできる。例えば配列番号：２または３の配列を有する核酸によって少なくとも一部がコードされるタンパク質を固体支持体に固定することができる。固定された抗原に対する抗血清の結合と競合するタンパク質（例えばｍＧγ１２タンパク質および相同体）をアッセイ法に添加する。添加されたタンパク質が、抗血清の固定されたタンパク質との結合と競合する能力を、配列番号：２または３の配列を有する核酸にコードされるｍＧγ１２ポリペプチドがそれ自体と競合する能力と比較する。上記のタンパク質に関する交差反応性の比率を、標準的な計算を用いて算出する。上記した添加されたタンパク質のそれぞれとの交差反応性が１０％未満であるような抗血清を選択してプールする。交差反応性のある抗体は、選択的には、例えば近縁性の低い相同体などの添加したタンパク質との免疫吸着により、プールした抗血清から除去される。
【０１３４】
免疫吸着してプールされた抗血清は次に、Ｇγ１２タンパク質の対立遺伝子または多型変種と思われる第２のタンパク質を、免疫原タンパク質（例えば、配列番号：２または３の配列を有する核酸にコードされるｍＧγ１２タンパク質）と比較するために、上記の競合結合イムノアッセイ法に用いられる。この比較を行うためには、二つのタンパク質を広範囲の濃度にわたって互いにアッセイし、抗血清と固定されたタンパク質との結合の５０％を抑制するのに必要な各タンパク質の量を決定する。結合の５０％を阻害するために必要な第２のタンパク質の量が、結合の５０％を抑制するために必要な関心対象の免疫原タンパク質（配列番号：２または３によってコードされるタンパク質）の量の１０倍未満であれば、第２のタンパク質はＧγ１２免疫原（例えばｍＧγ１２免疫原）に対して産生されたポリクローナル抗体と特異的に結合すると考えられる。
【０１３５】
特定の種に由来するＧγ１２タンパク質と特異的に結合するポリクローナル抗体は、交差反応性のある抗体をＧγ１２相同体を用いて取り除くことによって作製できる。例えばｍＧγ１２（配列番号：１）に特異的な抗体を、マウスＧγ１２と交差反応する抗体、例えば配列番号：４の配列を有するヒトＧγ１２またはラットＧγ１２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ０２２０９１）を取り除くことによって作製できる。類似した様式で、特定のＧＴＰ結合タンパク質γ−１２タンパク質に対して特異的な抗体を、多数のＧＴＰ結合タンパク質γ−１２遺伝子を有する生物から入手することが可能である。
【０１３６】
４．その他のアッセイ形式
ウエスタンブロット（イムノブロット）分析は、試料中のＧγ１２タンパク質の存在を検出および定量化するために用いる。この技法は一般に、試料のタンパク質を分子量に基づいてゲル電気泳動によって分離する段階、分離されたタンパク質を適した固体支持体（ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルターまたは誘導体化ナイロンフィルター）に移行させる段階、Ｇγ１２タンパク質と特異的に結合する抗体とともに試料をインキュベートする段階を含む。抗Ｇγ１２ポリペプチド抗体は、固体支持体上のＧγ１２ポリペプチドと特異的に結合する。これらの抗体を直接標識してもよく、または、抗Ｇγ１２抗体と特異的に結合する標識抗体（例えば標識したヒツジ抗マウス抗体）を用いて後に検出してもよい。
【０１３７】
その他のアッセイ形式には、特定の分子（例えば抗体）と結合し、封入された試薬またはマーカーを放出するように設計されたリポソームを用いるリポソームイムノアッセイ法（ＬＩＡ）が含まれる。その後、放出された化学物質を標準的な技法に従って検出する（Ｍｏｎｒｏｅら（１９８６）Ａｍｅｒ． Ｃｌｉｎ． Ｐｒｏｄ． Ｒｅｖ． ５：３４〜４１を参照）。
【０１３８】
５．非特異的結合の減少
当業者は、イムノアッセイ法における非特異的結合をできるだけ減らすのが往々にして望ましいことを理解すると考えられる。特に、固体基質上に固定された抗原または抗体をアッセイ法に用いる場合には、基質に対する非特異的結合の量をできるだけ減らすことが望ましい。このような非特異的結合を減らす手段は当業者には周知である。この技法には一般に、基質をタンパク質性組成物でコーティングすることが含まれる。特に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脱脂粉乳およびゼラチンなどのタンパク質組成物が広く用いられるが、脱脂粉乳が最も好ましい。
【０１３９】
６．標識
アッセイ法に用いる特定の標識または検出可能基は、アッセイ法に用いる抗体の特異的結合にそれが大きな妨げとならない限り、本発明の特に重要な面ではない。検出可能基は、検出可能な物理的または化学的特性を有する任意の物質でありうる。このような検出可能な標識はイムノアッセイ法の分野では十分に開発されており、通常、このような方法に有用なほとんどすべての標識を本発明に適用することができる。すなわち、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電子的、工学的または化学的な手段によって検出可能な任意の組成物である。本発明において有用な標識には、磁気ビーズ（例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標））、蛍光色素（例えばフルオレセイン、イソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ）、酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびその他、ＥＬＩＳＡに一般に用いられるもの）、およびコロイド金または着色ガラスまたはプラスチックビーズ（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）などの比色定量標識が含まれる。
【０１４０】
標識を、当技術分野で周知の方法に従って、アッセイ法の望ましい構成要素に直接的または間接的に結合させてもよい。以上に示した通り、非常にさまざまな標識を用いることができ、標識の選択は必要な感度、化合物との結合の容易さ、安定性の必要条件、用いることができる装置、および廃棄への対応に依存する。
【０１４１】
非放射性標識を、しばしば間接的な手段によって結合させる。一般的には、リガンド分子（例えばビオチン）を分子と共有結合させる。続いてリガンドを、内在的に検出可能であるか、検出可能な酵素、蛍光化合物または化学発光化合物などのシグナル系と共有結合した別の分子（例えばストレプトアビジン）と結合させる。リガンドおよびその標的は、Ｇγ１２タンパク質を認識する抗体、または抗Ｇγ１２を認識する二次抗体との任意の適した組み合わせで用いることができる。
【０１４２】
酵素または蛍光団との結合などにより、分子をシグナル生成化合物と直接結合させることもできる。標識として関心がもたれる酵素は主として加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、またはオキシダーゼ、特にペルオキシダーゼであると考えられる。蛍光化合物には、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが含まれる。化学発光化合物には、ルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えばルミノールが含まれる。用いることができるさまざまな標識系またはシグナル生成系の概説については、例えば米国特許第４，３９１，９０４号を参照されたい。
【０１４３】
標識の検出手段は当業者に周知である。すなわち、例えば標識が放射性標識であれば、検出のための手段には、シンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーの場合の写真フィルムが含まれる。標識が蛍光標識であれば、適切な波長の光で蛍光色素を励起させ、その結果生じた蛍光を検出することによってそれを検出できる。蛍光は、肉眼的に、写真フィルムにより、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子増倍管などの電子検出装置の使用によって検出できる。同様に、酵素標識を、酵素に対する適切な基質を提供し、その結果得られた反応生成物を検出することにより検出することができる。さらに、単純な比色定量標識は、標識に伴う色を単に観察することによって検出できる。すなわち、種々の試験紙アッセイ法において、結合した金はしばしば薄赤色に見え、一方、種々の結合ビーズはビーズの色に見える。
【０１４４】
いくつかのアッセイ形式は、標識成分の使用を必要としない。例えば凝集アッセイ法を用いて標識抗体の存在を検出することができる。この場合には、標的抗体を含む試料により、抗原をコーティングした粒子を凝集させる。この形式では、成分を標識する必要はなく、単純な肉眼検査によって標的抗体の存在を検出する。
【０１４５】
ＶＩ．細胞におけるＧγ１２活性の調整
Ａ．Ｇγ１２タンパク質の調整物質に関するアッセイ法
本発明の数多くの態様において、細胞におけるＧγ１２活性のレベルは、Ｇγ１２調整分子の多数の候補のうち任意のもの、例えばポリペプチド、抗体、アミノ酸、ヌクレオチド、脂質、炭水化物または任意の有機分子もしくは無機分子を、インビボまたはインビトロで細胞に投与することによって調整されると考えられる。このようなＧγ１２調整物質は、例えばアテローム硬化症、骨粗鬆症、アルツハイマー病、パーキンソン病および乳癌など、多くのエストロゲン関連疾患のいずれかの治療に特に有用である。
【０１４６】
Ｇγ１２を調整しうる分子を同定するためには、種々の化合物の細胞内のＧγ１２活性に対する影響を検出するアッセイ法を行うことが考えられる。このようなアッセイ法は、Ｇγ１２タンパク質と物理的または遺伝的に相互作用する化合物の同定を含むことができ、このため、化合物の間の物理的または遺伝的相互作用を検出するための多数の標準的な方法のうち任意のものに依拠しうる。このようなアッセイ法には、Ｇγ１２の発現、活性または他の特性、例えばそのリン酸化状態もしくは他のタンパク質との結合能などに影響を及ぼす化合物の同定も含まれうる。このようなアッセイ法には、インビトロまたはインビボの細胞におけるＧγ１２活性の検出も含まれうる。このような細胞系（ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ）アッセイ法は、Ｇγ１２を本来発現する細胞、または組換え発現によってＧγ１２を産生する培養細胞などの、任意の種類の細胞において行われうる。
【０１４７】
Ｂ．Ｇγ１２相互作用性化合物に関するアッセイ法
いくつかの態様において、Ｇγ１２タンパク質と物理的または遺伝的に相互作用する分子を同定するためのアッセイ法を行うことが考えられる。このような分子は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ヌクレオチド、炭水化物、脂質または任意の他の有機分子もしくは無機分子を含む、任意の種類の分子でありうる。このような分子は、Ｇγ１２タンパク質と通常相互作用して例えばエストロゲンシグナル伝達に作用する分子でもよく、または、細胞におけるＧγ１２タンパク質活性の調節に用いることができる、もしくはＧγ１２タンパク質との相互作用および／もしくはその調整が可能な分子のクラスを同定するためのリード化合物として用いることができる可能性がある合成分子もしくは他の分子でもよい。このようなアッセイ法は、アフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降、ツーハイブリッドスクリーニングもしくは他の結合アッセイ法などの物理的結合アッセイ法でもよく、または以下に述べる遺伝学的アッセイ法でもよい。
【０１４８】
本明細書に記載のインビボまたはインビトロでの結合アッセイ法および機能アッセイ法のいずれにおいても、任意のＧγ１２タンパク質またはＧγ１２タンパク質の誘導体、変形物、相同体もしくは断片を用いうる。好ましくは、Ｇγ１２タンパク質は配列番号：１に対して少なくとも約８０％の同一性を有する。または、Ｇγ１２タンパク質の断片を用いることもできる。このような断片は単独で用いることもでき、他のＧγ１２断片と併用することもでき、または異種タンパク質由来の配列と併用することもでき、例えば、断片を異種ポリペプチドと融合させ、それによってキメラポリペプチドを形成させることができる。
【０１４９】
Ｇγ１２タンパク質と相互作用する化合物を、Ｇγ１２タンパク質またはその断片と特異的に結合する能力に基づいて単離することができる。数多くの態様において、Ｇγ１２タンパク質またはタンパク質断片を固体支持体に付着させることが考えられる。一つの態様において、Ｇγ１２ポリペプチドを用いてアフィニティーカラムを作製し、物理的に相互作用する分子を同定する。クロマトグラフィー法を任意の規模で、しかもさまざまな製造者（例えばＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）による装置を用いて行えることは、当業者には明らかであると考えられる。さらに、Ｇγ１２タンパク質とインビボで相互作用する分子を、免疫共沈または他の方法、すなわち、細胞または細胞抽出物からのＧγ１２タンパク質を抗Ｇγ１２抗体を用いて免疫共沈させ、Ｇγ１２タンパク質とともに沈殿する化合物、例えばタンパク質を同定することによって同定することもできる。このような方法は当業者に周知であり、アウスユーベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）、いずれも前記において教示されている。
【０１５０】
Ｇγ１２ポリペプチドまたはその断片とインビボで相互作用するポリペプチドを同定するために、ツーハイブリッドスクリーニング系を用いることもできる（Ｆｉｅｌｄｓら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５〜２４６）。このようなスクリーニング系は、転写因子タンパク質の二つの離散的なモジュラー状ドメイン、例えばＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含み、これらは細胞内で二つの別々のポリペプチドとして産生され、そのそれぞれがさらに二つの結合性ポリペプチドを一つずつ含む。二つの結合性ポリペプチドが実際にインビボで相互作用すると、転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインが一緒になり、それによって細胞内で標的遺伝子の発現が起こる。標的遺伝子は一般に、容易に検出可能な遺伝子産物、例えば標準的な方法を用いて検出できるβ−ガラクトシダーゼ、ＧＦＰまたはルシフェラーゼをコードする。本発明において、Ｇγ１２ポリペプチドを転写因子の二つのドメインの一方に融合させ、潜在的なＧγ１２結合性ポリペプチド（例えばｃＤＮＡライブラリーによってコードされるもの）を他方のドメインと融合させる。このような方法は当業者に周知であり、例えばアウスユーベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、前記において教示されている。
【０１５１】
Ｃ．Ｇγ１２タンパク質活性に関するアッセイ法
Ｇγ１２遺伝子ならびにその対立遺伝子および多型変種は、ＧＴＰ結合タンパク質のγ−１２サブユニットをコードする。したがって、Ｇγ１２ポリペプチドの活性は、機能的、化学的および物理的な影響を決定するためのインビトロアッセイ法およびインビボアッセイ法を用いること、例えば、Ｇγ１２の活性を直接測定することによって評価しうる。Ｇγ１２の活性は、例えば、Ｇγ１２、γ／β複合体もしくはＧＴＰ結合タンパク質の活性を測定すること、例えば、下流エフェクター（例えば、アデニル酸シクラーゼ、Ｋ＋チャンネル、Ｃａ２＋チャンネル、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼｃ−β、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼなど）の発現もしくは活性を測定すること、Ｇγ１２の異種タンパク質（例えば、ＧＴＰ結合タンパク質のαまたはβサブユニット）もしくは他の分子との結合（例えば、放射性結合）を測定すること、Ｇγ１２タンパク質および／もしくはＲＮＡのレベルを測定すること、またはＧγ１２ポリペプチドの他の様相（例えば、リン酸化レベル、転写レベルなど）を測定することによって測定しうる。このようなアッセイ法は、Ｇγ１２タンパク質の活性化物質および阻害物質のいずれの試験にも用いうる。調整物質は、遺伝的に改変された型のＧγ１２タンパク質、例えば、ドミナントネガティブ型のＧγ１２、またはＧγ１２と相互作用するタンパク質の遺伝的改変物でもありうる。このような活性の調整物質は多くの診断的および治療的用途などに有用である。
【０１５２】
いくつかの態様において、アッセイ用のＧγ１２タンパク質とは、配列番号：１の配列を有する組換え型もしくは天然型のｍＧγ１２ポリペプチド、またはその保存的に改変された変種であると考えられる。または、アッセイ用のＧγ１２タンパク質は別の真核生物に由来し、配列番号：１とのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸部分配列を含むことが考えられる。一般に、アミノ酸配列同一性は少なくとも８０％、選択的には少なくとも８５％〜９５％、またはそれ以上であると考えられる。選択的には、アッセイ用のポリペプチドは、Ｇγ１２タンパク質の断片を含むと考えられる。ある種の態様において、Ｇγ１２タンパク質の断片を異種ポリペプチドと融合させ、それによってキメラポリペプチドを形成させる。このようなキメラポリペプチドは、例えばＧγ１２の調整物質を同定するためのアッセイ法にも有用である。
【０１５３】
調整の程度を調べるために、Ｇγ１２タンパク質の阻害物質または活性化物質の候補物質で処理した試料またはアッセイ法を、被験化合物で処理していない対照試料と比較する。対照試料（活性化物質または阻害物質で処理していないもの）のＧγ１２活性の相対値は１００とする。Ｇγ１２タンパク質の阻害は、Ｇγ１２活性の値が対照に対して約９０％、選択的には５０％、選択的には２５％〜０％である場合に達成される。Ｇγ１２タンパク質の活性化は、Ｇγ１２活性の値が対照に対して１１０％、選択的には１５０％、２００％〜５００％または１０００％〜２０００％である場合に達成される。
【０１５４】
ポリペプチドの機能に対する被験化合物の影響は、上記のパラメーターのいずれかを調べることによって測定可能である。本発明のポリペプチドに対する被験化合物の影響を調べるためには、Ｇγ１２活性に影響する任意の適切な生理的変化を利用しうる。機能面の結果を無傷の細胞または動物を用いて決定する場合には、例えば血管作用性分子の活性化または発現における変化により示されるような、例えばエストロゲンシグナル伝達および／または心血管系防御の変化などのさまざまな影響を測定することも可能である。
【０１５５】
Ｄ．エストロゲン受容体のアゴニストおよびアンタゴニストの同定
一つの好ましい態様において、例えばエストロゲン受容体αに媒介されるエストロゲンシグナル伝達に対する被験化合物の影響を評価するために、Ｇγ１２の転写レベルを測定する。関心対象のエストロゲン受容体を含む宿主細胞を、相互作用が起こるのに十分な時間にわたって被験化合物と接触させ、Ｇγ１２発現のレベルを測定する。このような相互作用が起こるための時間の長さは、時間経過を追い、転写レベルを時間の関数として測定することなどによって経験的に決定できる。
【０１５６】
このようなアッセイ法は、例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞または酵母細胞を含む任意の適した真核細胞を用いて、標準的な方法を用いて行うことができる。エストロゲン受容体、例えばエストロゲン受容体αを本来発現する細胞種、または例えばプロモーターと機能的に結合した、受容体をコードする異種ポリヌクレオチドを導入することによってエストロゲン受容体を発現するように誘導された細胞種を選択する。
【０１５７】
転写の量を、当業者に知られた任意の適した方法を用いて測定できる。例えば関心対象のタンパク質のｍＲＮＡ発現（例えばｍＧγ１２）を、ノーザンブロット法、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）または任意の標準的な方法を用いて、例えばＧγ１２ポリペプチドをコードする特異的ヌクレオチド配列（例えば配列番号：２または３）から設計したプローブまたはプライマーを用いて検出できる。または、Ｇγ１２活性を検出するためのイムノアッセイ法または他のアッセイ法を用いてポリペプチド産物のレベルを検出することによって、Ｇγ１２の発現を検出することもできる。このようなアッセイ法には、天然型のＧγ１２を用いることもでき、または、Ｇγ１２融合物、例えばＧγ１２転写物をクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＧＦＰもしくはアルカリホスファターゼをコードする配列などのレポーター配列と融合させたものを用いることもできる。または、これらのマーカー配列のいずれかをｍＧγ１２プロモーターと機能的に結合させることもできる（例えばＭｉｓｔｉｌｉおよびＳｐｅｃｔｏｒ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：９６１〜９６４を参照）。さらに、一般的にＧγ１２活性化の後で発現される任意のポリヌクレオチド、例えばアデニル酸シクラーゼ、Ｋ＋チャネル、Ｃａ２＋チャネル、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼｃ−β、またはホスファチジルイノシトール３−キナーゼを用いることができる。
【０１５８】
続いて、転写の量を、被験化合物の非存在下での同じ細胞における転写の量と比較する、またはそれを、関心対象のタンパク質を含まない実質的に同一な細胞における転写の量と比較できる。実質的に同一な細胞は、組換え細胞が調製された細胞と同じ細胞に由来しうるが、異種ＤＮＡの導入による改変を受けていない。転写の量に差があれば、被験化合物が何らかの様式で関心対象のタンパク質の活性を変化させたことを意味する。
【０１５９】
本明細書に記載の方法のいずれかによって検出した場合にＧγ１２発現量の増加を引き起こす化合物は、エストロゲン受容体アゴニストの候補であって、これは例えば骨粗鬆症、アテローム硬化症、アルツハイマー病またはパーキンソン病の阻害に有用な可能性があり、一方、Ｇγ１２発現量の低下を引き起こす化合物はエストロゲン受容体アンタゴニストの候補であり、これは例えば乳癌の阻害に有用な可能性がある。アゴニストまたはアンタゴニストの候補の特徴は、例えばそれらのエストロゲン受容体との相互作用を直接調べる段階、エストロゲン受容体を発現しない細胞におけるＧγ１２発現を変化させるそれらの能力を検討する段階、候補物のエストロゲン受容体特異性（すなわち、エストロゲン受容体αまたはβ）を検討する段階などを含む数多くの方法のうち任意のものによって、さらに調べることができる。
【０１６０】
好ましい態様において、被験化合物の存在下または非存在下におけるＧγ１２発現レベルの検出を、ハイスループットスクリーニングなどを用いて、多数の被験化合物に関して同時に行う。
【０１６１】
Ｅ．調整物質および結合性化合物
Ｇγ１２タンパク質の調整物質として検討される化合物は、タンパク質、糖、核酸もしくは脂質などの任意の低分子化合物または生物的実体でよい。または、調整物質は遺伝的に改変された型のＧγ１２遺伝子でもよい。一般に、被験化合物は低分子の化合物およびペプチドである。本質的にすべての化合物を、本発明のアッセイ法における調整物質または結合性化合物の候補として用いることができるが、水性溶液または有機溶液（特にＤＭＳＯをベースとするもの）中に溶解されうる化合物を用いることが最も多い。アッセイ法は、アッセイ法の段階を自動化し、任意の好都合な供給源から化合物をアッセイ法に提供し、一般にはそれを並行して稼働させることにより（例えば自動化アッセイ法でのマイクロタイタープレート上でのマイクロタイター形式による）、大規模化学ライブラリーをスクリーニングするように設計する。シグマ社（Ｓｉｇｍａ）（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、アルドリッチ社（Ａｌｄｒｉｃｈ）（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、シグマ−アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、フルカケミカ−バイオケミカアナリティカ社（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｋａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ Ａｎａｌｙｔｉｋａ）（Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）などを含む、化合物の供給元が数多く存在することが明らかであると考えられる。
【０１６２】
一つの好ましい態様において、ハイスループットのスクリーニング方法は、数多くの治療用化合物の候補（調整物質または結合性化合物の候補）を含むコンビナトリアル化学またはペプチドライブラリーを提供する段階を含む。その後、このような「コンビナトリアル化学ライブラリー」を、本明細書に記載の一つまたは複数のアッセイ法においてスクリーニングし、望ましい特徴的な活性を示すライブラリーのメンバー（特定の化学種またはサブクラス）を同定する。このようにして同定された化合物は、通常の「リード化合物」として役立ち、またはそれ自体を治療薬の候補もしくは実際の治療薬として用いることができる。
【０１６３】
コンビナトリアル化学ライブラリーは、試薬などの多数の「構成ブロック（ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋ）」を組み合わせることにより、化学合成または生物合成によって生じた多様な化合物からなる集成物である。例えばポリペプチドライブラリーなどの線状コンビナトリアル化学ライブラリーは、一群の構成ブロック（アミノ酸）を所定の化合物の長さ（すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数）に関して考えられるすべてのやり方で組み合わせることによって生成される。構成ブロックのこのようなコンビナトリアル混合により、何百万もの化合物を合成することができる。
【０１６４】
コンビナトリアル化学ライブラリーの調製およびスクリーニングは当業者に周知である。このようなコンビナトリアル化学ライブラリーには、ペプチドライブラリー（例えば米国特許第５，０１０，１７５号、Ｆｕｒｋａ（１９９１）Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｐｒｏｔ． Ｒｅｓ． ３７：４８７〜４９３およびＨｏｕｇｈｔｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４〜８８を参照）が非制限的に含まれる。多様な化学物質ライブラリーを作製するためにその他の化学的実体を用いることもできる。このような化学的実体には、これらに制限されないが、以下が含まれる：ぺプトイド（例えば国際公開公報第９１／１９７３５号）、コード化ペプチド（例えば国際公開公報第９３／２０２４２号）、ランダムバイオオリゴマー（例えば国際公開公報第９２／０００９１号）、ベンゾジアゼピン（例えば米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドなどのダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）（Ｈｏｂｂｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６９０９〜６９１３）、ビニル性ポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら（１９９２）Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１４：６５６８）、グルコース骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ）を有する非ペプチド性ペプチド模倣物（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎら（１９９２）Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１４：９２１７〜９２１８）、低分子化合物ライブラリーの類似の有機合成（Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１６：２６６１）、オリゴカルバメート（Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３）、および／またはペプチジルホスホネート（Ｃａｍｐｂｅｌｌら（１９９４）Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ５９：６５８）、核酸ライブラリー（Ａｕｓｕｂｅｌ、ＢｅｒｇｅｒおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、いずれも前記を参照）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば米国特許第５，５３９，０８３号を参照）、抗体ライブラリー（例えばＶａｕｇｈｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４（３）：３０９〜３１４およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７号を参照）、炭水化物ライブラリー（例えばＬｉａｎｇら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４：１５２０〜１５２２および米国特許第５，５９３，８５３号を参照）、有機低分子ライブラリー（例えばベンゾジアゼピン、Ｂａｕｍ Ｃ＆ＥＮ、Ｊａｎ １８、３３ページ（１９９３）を参照；イソプレノイド、米国特許第５，５６９，５８８号を参照；チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第５，５４９，９７４号を参照；ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号および米国特許第５，５１９，１３４号を参照；モルフォリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号を参照；ベンゾジアゼピン、米国特許第５，２８８，５１４号などを参照）。
【０１６５】
コンビナトリアルライブラリーの調製用の装置は市販されている（例えば３５７ ＭＰＳ、３９０ ＭＰＳ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍ Ｔｅｃｈ、Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ ＫＹ、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ、Ｒａｉｎｉｎ、Ｗｏｂｕｍ、ＭＡ、４３３Ａ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、９０５０ Ｐｌｕｓ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡを参照）。加えて、数多くのコンビナトリアルライブラリーそれ自体が市販されている（例えばＣｏｍＧｅｎｅｘ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．、Ｔｒｉｐｏｓ， Ｉｎｃ．、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、３Ｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ、Ｍａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤなど）。
【０１６６】
１．固体状および可溶性のハイスループットアッセイ法
一つの態様において、本発明は、Ｎ末端またはＣ末端ドメインなどの分子を単独で、または異種タンパク質と共有結合させてキメラ分子を作製した上で用いる、可溶性アッセイ法（ｓｏｌｕｂｌｅ ａｓｓａｙ）を提供する。別の態様において、本発明は、Ｇγ１２断片、Ｇγ１２キメラ分子、Ｇγ１２タンパク質、またはＧγ１２タンパク質を発現する細胞もしくは組織を固相基質上に付着させる、ハイスループット形式の、固体状（ｓｏｌｉｄ ｓｔａｔｅ）を用いるインビトロアッセイ法を提供する。
【０１６７】
本発明のハイスループットアッセイ法では、最大で数千もの異なる調整物質を１日でスクリーニングすることが可能である。特に、マイクロタイタープレートの各ウェルを、選択した調整物質の候補に対して別々のアッセイ法を実行するために用い、または、濃度もしくはインキュベーション時間の影響を観察しようとする場合には、単一の調整物質を試験するためにウェルを５個〜１０個ずつ用いることができる。このため、１枚の標準的なマイクロタイタープレートであれば、約１００種（例えば９６種）の調整物質をアッセイ可能である。１５３６穴のウェルプレートを用いれば、１枚のプレートで約１００種〜約１５００種の異なる化合物をアッセイすることができる。１日当たり数枚の異なるプレートをアッセイできれば、本発明の統合システムを用いて最大で約６，０００種〜２０，０００種の異なる化合物をアッセイ法でスクリーニングすることが可能である。より最近では、試薬操作のためのマイクロ流体（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ）アプローチが開発されている。
【０１６８】
関心対象の分子を、共有結合またはタグを介した結合などの非共有結合により、直接的または間接的に固体成分に結合させることができる。タグは種々の成分のうち任意のものでよい。一般的には、タグと結合する分子（タグ結合剤）を固体支持体に固定し、タグの付いた関心対象の分子を、タグおよびタグ結合剤の相互作用によって固体支持体に付着させる。
【０１６９】
文献中に詳細に記載された既知の分子相互作用に基づき、さまざまなタグおよびタグ結合剤のうち任意のものを用いることができる。例えばビオチン、プロテインＡまたはプロテインＧのようにタグが天然の結合剤を有する場合には、それを適切なタグ結合剤（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジン、免疫グロブリンのＦｃ領域など）との結合に用いることができる。ビオチンなどの天然の結合剤を備えた分子に対する抗体も広く入手可能であり、適切なタグ結合剤についても同様である；例えばシグマイムノケミカルズ（ＳＩＧＭＡ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）１９９８年カタログ（ＳＩＧＭＡ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）を参照されたい。
【０１７０】
同様に、任意のハプテン性化合物または抗原性化合物を適切な抗体と組み合わせて用いて、タグ／タグ結合剤の対を形成させることもできる。数千種もの特異抗体が市販されており、ほかにも多くの抗体が文献中に記載されている。例えば一つの一般的な構成においては、タグは第１の抗体であり、タグ結合剤は第１の抗体を認識する第２の抗体である。
【０１７１】
ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリールスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミドおよびポリアセテートなどの合成重合体も適切なタグまたはタグ結合剤を生じうる。その他の多くのタグ／タグ結合剤の対も本明細書に記載のアッセイ法に有用であり、これは本開示を参照することによって当業者には明らかになると考えられる。
【０１７２】
ペプチド、ポリエーテルなどの一般的なリンカーもタグとして有用であり、これには約５アミノ酸〜２００アミノ酸のポリｇｌｙ配列などのポリペプチド配列が含まれる。このような柔軟なリンカーは当業者に知られている。例えばポリ（エチレングリコール）リンカーはシェアウォーターポリマー社（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ， Ｉｎｃ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、Ａｌａｂａｍａ）から販売されている。選択的には、これらのリンカーはアミド結合、スルフヒドリル結合またはヘテロ官能性結合を有する。
【０１７３】
現在用いることができる種々の方法のうち任意のものを用いて、タグ結合剤を固体基質に固定する。一般的には、タグ結合剤の一部と反応する化学基を表面に固定させる化学試薬に、基質の全体または一部を曝露させることにより、固体基質に誘導体化または官能性付与を施す。例えば比較的長い連鎖部分を付着させるのに適した基には、アミン基、ヒドロキシル基、チオール基およびカルボキシル基が含まれると考えられる。ガラス表面などの種々の表面に官能性を付与するためには、アミノアルキルシランおよびヒドロキシアルキルシランを用いることができる。このような固相バイオポリマーアレイの構築は文献中に詳細に記載されている。例えばメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）（１９６３）Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５：２１４９〜２１５４（ペプチドなどの固相合成を記載）；ゲイセン（Ｇｅｙｓｅｎ）ら（１９８７）Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． Ｍｅｔｈ． １０２：２５９〜２７４（ピン上での固相成分の合成を記載）；フランク（Ｆｒａｎｋ）およびドーリング（Ｄｏｒｉｎｇ）（１９８８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４４：６０３１〜６０４０（セルロースディスク上での種々のペプチド配列の合成を記載）；フォドア（Ｆｏｄｏｒ）ら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：７６７〜７７７；シェルドン（Ｓｈｅｌｄｏｎ）ら（１９９３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｉｙ ３９（４）：７１８〜７１９；ならびにコザル（Ｋｏｚａｌ）ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（７）：７５３〜７５９（いずれも固体基質に固定したバイオポリマーのアレイを記載）を参照されたい。タグ結合剤を基質に固定する非化学的アプローチには、加熱、ＵＶ照射による架橋などの他の一般的な方法が含まれる。
【０１７４】
２．コンピュータに基づくアッセイ法
Ｇγ１２タンパク質活性を調整する化合物に関するさらにもう１つのアッセイ法は、アミノ酸配列にコードされた構造情報に基づいてＧγ１２タンパク質の三次元構造を作成するためにコンピュータシステムを用いる、コンピュータ支援による薬物設計である。入力したアミノ酸配列がコンピュータプログラム内にあらかじめ設定したアルゴリズムと直接かつ能動的に相互作用して、タンパク質の二次構造、三次構造および四次構造のモデルが生成される。続いて、結合能を有する構造領域を同定するためにタンパク質構造のモデルを検討する。次にこれらの領域を利用して、タンパク質と結合する化合物を同定する。
【０１７５】
タンパク質の三次元構造モデルは、少なくとも１０アミノ酸残基のタンパク質アミノ酸配列、またはそれに対応するＧγ１２ポリペプチドをコードする核酸配列をコンピュータシステムに入力することによって生成される。一つの態様において、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号：２または３およびそれらの保存的に改変された異形を含む。別の態様において、配列番号：１またはそれらの保存的に改変された異形を含むアミノ酸配列は、タンパク質の構造情報をコードする、タンパク質の一次配列または部分配列である。少なくとも１０残基のアミノ酸配列（または１０アミノ酸をコードするヌクレオチド配列）を、コンピュータのキーボード、さらには電子記憶媒体（例えば磁気ディスケット、テープ、カートリッジおよびチップ）、光メディア（例えばＣＤ ＲＯＭ）、インターネットのサイトから配付された情報、およびＲＡＭを非制限的に含む、コンピュータで読み取れる担体から、コンピュータシステムに入力する。続いて、当業者に公知のソフトウエアを用いて、アミノ酸配列とコンピュータシステムとの相互作用により、タンパク質の三次元構造モデルを生成する。
【０１７６】
アミノ酸配列は、関心対象のタンパク質の二次構造、三次構造および四次構造のを生成するために必要な情報をコードする一次構造である。ソフトウエアは、一次配列によってコードされた特定のパラメーターを調べて構造モデルを生成する。これらのパラメーターは「エネルギー項」と呼ばれ、これには主として、静電ポテンシャル、疎水性ポテンシャル、溶媒接触表面および水素結合が含まれる。二次エネルギー項にはファンデルワールスポテンシャルが含まれる。生体分子はエネルギー項の累積値が最小となるような構造をとる。このため、コンピュータプログラムは、一次構造またはアミノ酸配列によってコードされるこれらの項を用いて二次構造モデルを生成する。
【０１７７】
次に、二次構造によってコードされるタンパク質の三次構造が、二次構造のエネルギー項に基づいて生成される。ユーザーはこの時点で、タンパク質が膜結合型または可溶型のいずれであるか、体内でのその位置、およびその細胞内位置、例えば細胞質、表面または核などの追加変数を入力することができる。これらの変数が二次構造のエネルギー項とともに用いられて、三次構造のモデルが生成される。三次構造のモデル化に際して、コンピュータプログラムは二次構造の疎水性表面同士を一致させるとともに、二次構造の親水性表面同士を一致させる。
【０１７８】
ひとたび構造が生成されれば、調整物質の結合領域と考えられる部分がコンピュータシステムによって同定される。調整物質候補の三次元構造は、化合物のアミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列または化学式を上記の通りに入力することによって生成される。次に調整物質候補の三次元構造をＧγ１２タンパク質のものと比較して、タンパク質と結合する化合物を同定する。エネルギー項を用いてタンパク質と化合物との間の結合親和性を評価し、タンパク質と結合する確率が高い化合物を決定する。
【０１７９】
コンピュータシステムは、Ｇγ１２遺伝子の変異、多型変種、対立遺伝子および種間相同体のスクリーニングにも用いられる。このような変異は疾病症状または遺伝形質と関係している可能性がある。上記の通り、ジーンチップ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ）（商標）および関連技術も、変異、多型変種、対立遺伝子および種間相同体のスクリーニングに用いることができる。ひとたび変種が同定されれば、診断アッセイ法を用いて、このような変異遺伝子を持つ患者を同定することができる。変異型Ｇγ１２遺伝子（例えば変異型ｍＧγ１２遺伝子）の同定には、第１の核酸配列（配列番号：２または３の核酸配列）または第１のアミノ酸配列（配列番号：１のアミノ酸配列）およびそれらの保存的に改変された異形を入力する段階が含まれる。配列は上記のコンピュータシステムに入力する。続いて、第１の核酸またはアミノ酸配列を、第１の配列と実質的に同一な第２の核酸またはアミノ酸配列と比較する。第２の配列は上記の様式でコンピュータシステムに入力する。第１および第２の配列を比較すれば、配列間のヌクレオチドまたはアミノ酸の違いが同定される。このような配列は、種々のＧγ１２遺伝子における対立遺伝子の差異、ならびに疾病症状および遺伝形質と関連のある変異を表す。
【０１８０】
ＶＩＩ．疾患または症状を治療するためのＧγ１２活性／発現の調整
本発明の数多くの態様では、患者におけるＧγ１２の活性または発現を変化させるために、化合物、例えば核酸、ポリペプチドまたは他の分子を、インビボまたはエクスビボで患者に投与する。このような化合物は、配列番号：１に示したような完全長Ｇγ１２ポリペプチドをコードする核酸、またはその任意の誘導体、断片もしくは変種が、プロモーターと機能的に結合したものであってよい。適切な核酸にはアンチセンスまたはリボザイム配列などの阻害性配列も含まれ、これらを例えばプロモーターと機能的に結合した発現ベクター中にある形で送達することもでき、または直接送達することもできる。また、Ｇγ１２の発現を調整するポリペプチドをコードする任意の核酸も用いることができる。一般に、核酸を、任意のさまざまなベクターまたは方法、例えばレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクター、リポソーム配合物、裸ＤＮＡの注入などを用いて細胞に送達することができる。これらの方法はすべて当業者に周知である。
【０１８１】
Ｇγ１２活性を調整するためにタンパク質を患者に送達することもできる。好ましい態様においては、Ｇγ１２に特異的に結合するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を送達する。加えて、Ｇγ１２と相互作用する、および／またはその活性を調整するポリペプチド、例えば本明細書に記載のアッセイ法を用いて同定されるポリペプチド、または任意のドミナントネガティブ型のＧγ１２、またはＧγ１２相互作用性タンパク質、例えばＧＴＰ結合タンパク質のβサブユニットもしくはαサブユニットなどを用いることもできる。加えて、Ｇγ１２の発現に影響を及ぼすポリペプチドも用いることができる。
【０１８２】
さらに、Ｇγ１２と相互作用する、および／もしくはその活性を調整することが判明した、またはそのように設計された、任意の化合物も用いることができる。例えばＧγ１２と結合する、またはその活性を調整することが、本明細書に記載の方法を用いて判明した任意の化合物を用いることができる。
【０１８３】
上記の分子のうち任意のものを、Ｇγ１２の発現もしくは活性を上昇もしくは低下させるため、または他の様式でＧγ１２ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの特性および／もしくは挙動、例えば安定性、リン酸化、タンパク質活性、他のタンパク質との相互作用などに影響を及ぼすために用いることができる。このため、本発明の化合物は、卒中およびアテローム硬化症、骨粗鬆症、乳癌、アルツハイマー病、パーキンソン病などを非制限的に含む、例えば心血管疾患を非制限的に含む肺疾患および気管の疾患を非制限的に含む数多くの治療のうち任意のものに用いることができる。
【０１８４】
本発明の任意の分子の投与は、調整性化合物を導入し、治療しようとする組織に最終的に接触させるために通常用いられる任意の経路によって行うことができる。調整物質は、選択的には薬学的に許容される担体とともに、任意の適切な様式で投与される。このような調整物質の適切な投与方法を用いることができ、これらは当業者に周知であり、かつ特定の化合物の投与には複数の経路を用いることができるにもかかわらずある特定の経路によって別の経路よりも即時的かつより効果的な反応が得られることが多い。
【０１８５】
薬学的に許容される担体は、ある程度、投与する個々の組成物、さらには組成物の投与に用いる個々の方法によって決まる。したがって、本発明の薬学的組成物に適した様々な製剤が存在する（例えば「レミントン薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１７版、１９８５）を参照）。
【０１８６】
Ｇγ１２の調整物質は、単独で、または他の適切な成分と組み合わせて、吸入によって投与するためのエアロゾル製剤（すなわち、それらを「噴霧」することが可能である）の形にすることができる。エアロゾル配合物は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧した許容される噴霧剤中に入れることができる。
【０１８７】
投与のために適した製剤には、水性および非水性の溶液、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および製剤を等張化する溶質を含みうる等張滅菌溶液、ならびに懸濁化剤、溶解補助剤、濃稠化剤、安定剤および保存料を含みうる水性および非水性の滅菌懸濁液が含まれる。本発明の実践に際しては、組成物を例えば経口的、鼻腔内、局所的、静脈内、腹腔内、膀胱内または髄腔内に投与することができる。化合物の製剤は単位用量または複数回の用量がアンプルまたはバイアルなどの容器内に密封された形式で提供することができる。溶液および懸濁液は、以前に記載された種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。調整物質を調製済みの食品または薬剤の一部として投与することもできる。
【０１８８】
患者に投与する用量は、本発明の状況においては、一定期間にわたって対象において有益な反応を生じさせるのに十分である必要がある。用量は、用いる個々の調整物質の有効性および対象の症状、さらには治療の対象となる体重または表面積によって決まると考えられる。また、用量の程度は、個々の対象における特定の化合物またはベクターの投与に伴う何らかの有害な副作用の存在、性質および程度によっても決まると考えられる。
【０１８９】
投与する調整物質の有効量を決定する際に、医師が調整因子の循環血漿中レベル、調整物質の毒性および抗調整物質抗体の産生を評価してもよい。一般に、調整物質当量としての用量は、一般的な対象の場合、約１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【０１９０】
投与に関しては、本発明の調整物質を、調整物質のＬＤ−５０、および化合物の種々の濃度での副作用を対象の体重および全般的健康状態に当てはめることによって決定される速度で投与することができる。投与は単回投与または分割投与によって行うことができる。
【０１９１】
ＶＩＩＩ．トランスジェニック動物
トランスジェニック性およびキメラ性の非ヒト哺乳動物ならびにその作製方法を以下に説明する。哺乳動物はとりわけ、インビボでのＧγ１２の機能の検討に関して、例えばアテローム硬化症、骨粗鬆症、アルツハイマー病、パーキンソン病および乳癌の研究用、ならびにＧγ１２と関連した、例えば心血管の疾患および症状に対する潜在的治療法の開発用のモデルを作製するために有用である。
【０１９２】
Ｇγ１２に関する少なくとも１つの機能的な内因性対立遺伝子を欠失した細胞を含む、トランスジェニック性およびキメラ性の非ヒト哺乳動物を作製する。「キメラ動物」とは、関心対象の機能的Ｇγ１２遺伝子を欠失した一部の細胞、および不活性化された遺伝子を含まない他の細胞を含む。これに対して、「トランスジェニック動物」とは、Ｇγ１２遺伝子を不活性化または他の様式で変化させる特定の改変がすべてに組み入れられた細胞から構成される。トランスジェニック動物は一般的には必ず、変異型Ｇγ１２遺伝子を子孫に伝達することができるが、キメラ動物が変異を伝達する能力は、不活性化された遺伝子が動物の生殖細胞に存在するか否かに依存する。Ｇγ１２遺伝子を不活性化または別の様式で変化させる改変には、例えば１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失または置換が含まれうる。この改変は、遺伝子自体の転写、得られたｍＲＮＡの翻訳および／もしくは安定性を妨げることもでき、または遺伝子に不活性化型もしくは別の様式で変化したＧγ１２ポリペプチド、例えば結合特性またはキナーゼ活性が改変されたＧγ１２ポリペプチドをコードさせることもできる。
【０１９３】
主張される方法は、ほとんどの脊椎動物種のトランスジェニック動物およびキメラ動物を作製するために有用である。このような種には、マウスおよびラットなどの齧歯類を含む非ヒト哺乳動物、ウサギ、ヒツジおよびヤギなどのヒツジ類、ブタなどのブタ類、ならびにウシおよびバッファローなどのウシ類が非制限的に含まれる。トランスジェニック動物を入手するための方法は、例えばプーラー（Ｐｕｈｌｅｒ）， Ａ．編、「動物の遺伝子工学（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ）」、ＶＣＨ Ｐｕｂｌ．、１９９３；マーフィー（Ｍｕｒｐｈｙ）およびカーター（Ｃａｒｔｅｒ）編、「遺伝子導入の技法：原理およびプロトコール（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ． １８）（１９９３）；ならびにピンカート（Ｐｉｎｋｅｒｔ）編、「トランスジェニック動物の技術：実験室ハンドブック（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）に記載されている。
【０１９４】
好ましい態様においては、トランスジェニックマウスを、トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）ら（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６３：９７８〜８４；カナカライ（Ｋａｎａｋａｒａｊ）ら（１９９８）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８７：２０７３〜９；またはイェー（Ｙｅｈ）ら（１９９７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：７１５〜７２５に記載された通りに作製する。
【０１９５】
一般的には、改変されたｍＧγ１２遺伝子（例えば改変ｍＧγ１２遺伝子）を、相同組換えなどにより、着床前の胚から入手してインビトロで培養した胚性幹細胞（ＥＳ）に導入する（例えばフーパー（Ｈｏｏｐｅｒ）， ＭＬ、「胚性幹細胞：動物生殖系列への計画的変化の導入（Ｅｍｂｒｙｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｐｌａｎｎｅｄ Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｇｅｒｍｌｉｎｅ）」（Ｍｏｄｅｒｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ｖ． １）、Ｉｎｔ’ｌ． Ｐｕｂ． Ｄｉｓｔｒｉｂ．， Ｉｎｃ．（１９９３）；ブラッドレイ（Ｂｒａｄｌｅｙ）ら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３０９：２５５〜２５８を参照されたい）。その後に、形質転換がなされたＥＳ細胞をマウスなどの非ヒト動物由来の胚盤胞と組み合わせる。ＥＳ細胞は胚にコロニーを形成し、一部の胚はその結果得られるキメラ動物の生殖系列を形成する（イェーニッシュ（Ｊａｅｎｉｓｃｈ）（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１４６８〜１４７４を参照されたい）。または、生物体を再構成しうるＥＳ細胞または体細胞（「再増殖性体細胞細胞」）を、除核受精卵母細胞に移植するための核の材料として用いてトランスジェニック哺乳動物を作製することもできる（例えばウィルムット（Ｗｉｌｍｕｔ）ら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０〜８１３を参照されたい）。
【０１９６】
変異型Ｇγ１２遺伝子をゲノム中に有するトランスジェニック動物またはキメラ動物を入手するための他の方法は、受精した卵母細胞を、改変された、例えば不活性型のＧγ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターと接触させることである。マウスなどのいくつかの動物では、受精は一般にインビボで行い、受精卵を外科的に採取する。他の動物、特にウシ類では、卵子を生きた動物または屠殺動物から採取し、卵子をインビトロで受精させることが好ましい（国際公開公報第９１／０８２１６号を参照されたい）。インビトロ受精により、実質的に同期した細胞に改変を導入することが可能となる。
【０１９７】
受精した卵母細胞を一般には、約１６個〜１５０個の細胞を含む着床前の胚が得られるまでインビトロで培養する。１６個〜３２個の細胞期の胚は桑実胚として記載され、一方、３２個を上回る細胞を含む着床前の胚は胚盤胞と呼ばれる。これらの胚は典型的には６４個の細胞期の時点で胚盤胞腔の発生を示す。胚の細胞内に望ましいＧγ１２変異が存在することは、当業者に公知の方法、例えばサザンブロット法、ＰＣＲ、ＤＮＡシークエンシングまたは他の標準的な方法によって検出することができる。受精卵母細胞を着床前期まで培養するための方法は、例えばゴードン（Ｇｏｒｄｏｎ）ら（１９８４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １０１：４１４；ホーガン（Ｈｏｇａｎ）ら、「マウス胚の操作：実験マニュアル（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ． Ｎ．Ｙ．（１９８６）（マウス胚）；ハンマー（Ｈａｍｍｅｒ）ら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１５：６８０（ウサギ胚およびブタ胚）；ガンドルフィ（Ｇａｎｄｏｌｆｉ）ら（１９８７）Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｆｅｒｔ． ８１：２３〜２８；レクスロード（Ｒｅｘｒｏａｄ）ら（１９８８）Ｊ． Ａｎｉｍ． Ｓｃｉ． ６６：９４７〜９５３（ヒツジ胚）およびアイストーン（Ｅｙｅｓｔｏｎｅ）ら（１９８９）Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｆｅｒｔ． ８５：７１５〜７２０；カモス（Ｃａｍｏｕｓ）ら（１９８４）Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｆｅｒｔ． ７２：７７９〜７８５；およびハイマン（Ｈｅｙｍａｎ）ら（１９８７）Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ２７：５９６８（ウシ胚）に記載されている。着床前胚を移植前の一定期間にわたって凍結保存してもよい。
【０１９８】
着床前胚を適当な雌に移植することにより、導入遺伝子が組み込まれた時点の発生ステージに依存して、トランスジェニック動物またはキメラ動物が誕生する。キメラ哺乳動物同士を交配することによって真の生殖系列トランスジェニック動物を作製することができる。キメラマウスおよび生殖系列トランスジェニックマウスを販売元に発注することもできる（例えばＤｅｌｔａｇｅｎ、Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）。
【０１９９】
哺乳動物細胞または動物に変異を導入するための他の方法にはリコンビナーゼ系が含まれ、これは関心対象の遺伝子座の全体または一部を除去するために用いることができる。リコンビナーゼ系の例には、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘ系（例えばＧｕら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：１０３〜１０６；Ｔｅｒｒｙら（１９９７）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ． ６：３４９〜３５６を参照）およびＦＬＰ／ＦＲＴ部位特異的組み込み系（例えばＤｙｍｅｃｋｉ（１９９６）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：６１９１〜６１９６を参照）が含まれる。これらの系では一般に、特定のリコンビナーゼによって認識される部位を、除去しようとする遺伝子の部分に隣接する位置にあるゲノム中に導入する。続いて、リコンビナーゼを細胞に導入することによって組換えが触媒され、それによって組換え部位に隣接したポリヌクレオチド配列がゲノムから除去される。必要に応じて、例えばリコンビナーゼの発現を駆動する組織特異的プロモーターを用いることにより、特定の細胞種のみが関心対象のＧγ１２遺伝子を欠失している動物を入手することができる（例えばＴｓｉｅｎら（１９９６）Ｃｅｌｌ ８７：１３１７〜２６；Ｂｒｏｃａｒｄら（１９９６）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１０８８７〜１０８９０；Ｗａｎｇら（１９９６）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：３９３２〜６；Ｍｅｙｅｒｓら（１９９８）Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １８：１３６〜４１を参照されたい）。
【０２００】
細胞または動物においてＧγ１２遺伝子に変異が存在することは、サザンブロット法、ＰＣＲまたはＤＮＡシークエンシングなどの、本明細書に記載の任意の方法を用いて検出することができる（例えばＡｕｓｕｂｅｌら、前記を参照されたい）。
【０２０１】
ＩＸ．キット
Ｇγ１２遺伝子およびそれらの相同体は、たとえばアテローム硬化症、骨粗鬆症、乳癌、アルツハイマー病、パーキンソン病などの非常に多数のエストロゲン関連疾患のうち任意のものの治療のためのエストロゲン反応性細胞の同定を非制限的に含む、数多くの用途に有用なツールである。このため、Ｇγ１２核酸と特異的にハイブリダイズするＧγ１２プローブおよびプライマーなどのＧγ１２特異的試薬、ならびにＧγ１２タンパク質と特異的に結合する、またはその活性を調整するＧγ１２特異的試薬、例えば抗Ｇγ１２抗体または他の化合物を、本明細書に記載の用途を実践するためのキットとして提供することができる。
【０２０２】
Ｇγ１２ポリヌクレオチドに関するＤＮＡおよびＲＮＡが試料中に存在することに関する核酸アッセイ法には、サザン分析、ノーザン分析、ドットブロット法、ＲＮアーゼ保護、Ｓ１分析、ＰＣＲおよびＬＣＲなどの増幅法、ならびにインサイチューハイブリダイゼーションなどの、当業者に公知の数多くの技法が含まれる。インサイチューハイブリダイゼーションでは、例えば細胞内でのハイブリダイゼーションが可能となり、同時にその後の解釈および分析のために細胞形態が保持されるように、標的核酸を細胞周囲から遊離させる。以下の論文に、インサイチューハイブリダイゼーションの技術に関する概要が示されている：シンガー（Ｓｉｎｇｅｒ）ら（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２３０〜２５０；ハーゼ（Ｈａａｓｅ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第ＶＩＩ巻、ｐｐ．１８９〜２２６（１９８４）；および「核酸ハイブリダイゼーション：実践的アプローチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」（Ｈａｍｅｓら編、１９８７）。さらに、Ｇγ１２タンパク質を上記のさまざまなイムノアッセイ法を用いて検出することもできる。一般的には被験試料を陽性対照（例えば組換えＧγ１２タンパク質を発現する試料）および陰性対照の両方と比較する。
【０２０３】
本発明は、Ｇγ１２タンパク質または核酸の調整物質に関するスクリーニングのためのキットも提供する。このようなキットは、容易に入手しうる材料および試薬から調製可能である。例えばこのようなキットは以下の材料のうち１つまたは複数を含みうる：Ｇγ１２核酸またはタンパク質、反応管およびＧγ１２活性を検査するための説明書。選択的には、本発明のキットは生物活性のあるＧγ１２タンパク質を含む。キットの想定ユーザーおよびユーザーの個々の需要に応じて、さまざまなキットおよび成分を本発明に従って調製することができる。
【０２０４】
Ｘ．実施例
エストロゲンを投与した正常雄性マウスの肝臓の方が同じくエストロゲンを投与したエストロゲン受容体αノックアウト（ＥＲＫＯ）雄性マウスの肝臓よりも量が多いメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に相当する発現配列タグ（ＥＳＴ）を、サブトラクションクローニングによって入手した。上記のＥＳＴの１つに対応する完全長ｍＲＮＡ分子を表す相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンのＤＮＡ配列を入手した。
【０２０５】
変種１および変種２と命名した、ｃＤＮＡの２つの変種を入手し、これらのＤＮＡ配列をそれぞれ配列番号：２および３として示した。変種１および変種２の配列は、配列番号：３に示した変種２の配列のヌクレオチド８７〜１３９の間の５３ｂｐの領域が変種１に存在しないことを除いて同一である。 さらに、変種１の最初の５６ヌクレオチドと変種２の最初の３１ヌクレオチドも互いに異なる。
【０２０６】
変種１および変種２は、配列番号：１に示した７２アミノ酸の同じ予想されるタンパク質をコードする。このタンパク質は、配列番号：２に示した変種１の配列のヌクレオチド１４１および配列番号：３に示した変種２の配列のヌクレオチド１６９にあるＡＴＧコドン（ｍＲＮＡではＡＵＧ、アミノ酸メチオニンをコードする）に始まる。このＡＴＧコドンは上記の５３ｂｐエクソンの下流に位置するため、この７２アミノ酸のタンパク質をコードするＤＮＡ配列の全体は、２つの変種において同一である領域内に位置する。ＡＴＧ開始コドンは、コザック（Ｋｏｚａｋ）（１９８９）Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０８：２２９〜２４１により定義された翻訳開始用のコンセンサス配列に適合する配列の内部にある。ほとんどのｍＲＮＡの場合、翻訳はｍＲＮＡの５’末端にある第１のＡＵＧコドンから始まる。本明細書に報告したｃＤＮＡ配列の場合には、上記の７２アミノ酸のタンパク質が始まるＡＴＧコドンの上流に単一のＡＴＧコドンが存在する。このもう１つの上流ＡＴＧコドンはいずれの変種においても同じ配列状況下に位置し、翻訳開始用のコザック（Ｋｏｚａｋ）コンセンサス配列と一致する。しかし、いずれの変種とも、これらの上流ＡＴＧコドンの５または６コドンの後にはインフレームに停止コドンがある。このため、リボソームは第１のＡＵＧで転写を開始し、インフレームの停止コドンで終了した上で、その後もｍＲＮＡの下流に読み取りを続け、第２のＡＵＧコドンに到達した時点で翻訳を再開すると思われる。または、いくつかの遺伝子に関して示されているように、上流ＡＵＧコドンがイントロン内部に位置している可能性もあり、この場合にはｃＤＮＡは、このイントロンが内部で除去されていない、部分的にプロセシングがなされた転写物であると思われる。
【０２０７】
公開データベース（ＧｅｎＢａｎｋ、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ）の検索により、本明細書に報告したｃＤＮＡ配列が、ＧＴＰ結合タンパク質γサブユニットファミリーの遺伝子のメンバーと明らかな配列類似性があることが判明した。さらに、本明細書に報告したｃＤＮＡ配列によってコードされる予想される７２アミノ酸のタンパク質は、多くの種に由来するＧＴＰ結合タンパク質γサブユニットファミリーのメンバーと高度の配列類似性を示した。これらのタンパク質の数多くのアラインメントにより、本明細書に報告した予想される７２アミノ酸のタンパク質が、配列番号：４に示したヒトＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットと最も類似していることが示された（７２個のアミノ酸のうち７０個が同一）。本明細書に報告したｃＤＮＡ配列、およびそれによってコードされる予想される７２アミノ酸のタンパク質を、マウスＧＴＰ結合タンパク質γ１２サブユニット（ｍＧγ１２）と命名した。
【０２０８】
今日までに、少なくとも１１種の哺乳類Ｇタンパク質γサブユニットが同定されている。 これらのγサブユニットの配列はαおよびβサブユニットファミリーよりも多様性が大きく、このことは機能的多様性の程度がより大きいことを示唆する。ウシＧタンパク質γ１２に対する抗体を用いたウエスタンブロット法により、検討した１９種の組織のすべてでラットγ１２サブユニットの発現が示された（Ｍｏｒｉｓｈａｔａら（１９９５）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：２９４６９〜２９４７５）。このことは、γ１２サブユニットが他のＧタンパク質γサブユニットとは異なり、少なくともラットでは遍在性に発現されることを示唆する。培養ラット大動脈平滑筋細胞における主要なＧタンパク質γサブユニットはγ−１２であり、γ−５は少量に過ぎず、γ−２、−３または−７は検出不能であったことが示されている（Ｍｏｒｉｓｈａｔａら、前記）。さらに、γ−１２サブユニットはプロテインキナーゼＣによってＳｅｒ１またはＳｅｒ２にリン酸化を受けたが、このリン酸化は培養大動脈平滑筋細胞において、いずれもインビボで血管収縮物質であるアゴニスト、アンジオテンシンＩＩおよびバソプレッシンに反応して観察された。γ−１２サブユニットのリン酸化により、下流エフェクターを活性化するその能力が調整される可能性がある。ヤスダ（Ｙａｓｕｄａ）ら（（１９９８）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：２１９５８〜２１９６５）は、γ−１２サブユニットのリン酸化によってアデニル酸シクラーゼの活性化の効率が高まるが、ホスホリパーゼＣ−βを活性化する能力は影響されないことを示している。
【０２０９】
エストロゲンを投与した正常雄マウス、エストロゲンを投与したＥＲＫＯ雄マウス、および投与していない雄マウスの肝臓から調製したＲＮＡを用い、ｍＧγ１２ ｃＤＮＡ由来のハイブリダイゼーションプローブを用いてノーザンブロット分析を行った。この実験により、ｍＧγ１２ｍＲＮＡの発現には機能的なエストロゲン受容体αの存在が必要なことが示され、肝臓におけるｍＧγ１２遺伝子の転写がβ受容体ではなくα受容体を介してエストロゲンによって特異的に活性化されることが示された。これは、エストロゲン受容体のサブタイプに特異的な遺伝子発現の調整を初めて示したものである。
【０２１０】
いずれの型のエストロゲン受容体（αおよびβ）も、霊長類の冠動脈および培養大動脈平滑筋細胞において発現される（ＲｅｇｉｓｔｅｒおよびＡｄａｍｓ（１９９８）Ｊ． Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ、６４：１８７〜１９１）。このため、エストロゲンに対する血管平滑筋細胞の応答の１つがＧタンパク質γ−１２サブユニットのｍＲＮＡのアップレギュレーションであり、それによって細胞内でのＧタンパク質γ−１２タンパク質の増加が引き起こされることが考えられる。同じく機能的なエストロゲン受容体を有する血管内皮細胞でも類似の応答がみられる可能性がある。γ−１２サブユニットが（ラット）平滑筋細胞における主要なＧタンパク質γサブユニットであることを考慮すると、未確認ではあるが、γ−１２レベルのこの上昇はＧタンパク質共役シグナル伝達に対して何らかの影響を及ぼすと考えられる。Ｇタンパク質共役シグナル伝達の調整は、例えば、Ｇタンパク質共役受容体を介してシグナルを送る種々の血管作用分子の作用を調整することにより、エストロゲンの心保護作用に一定の役割を果たしている可能性がある。
【０２１１】
本明細書で説明した態様は例示のみを目的としており、当業者にはそれに鑑みてさまざまな修正または変更が想起されると考えられるが、これらは本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲に含まれるべきである。本明細書に引用したすべての刊行物、特許および特許出願は、その全体がすべての目的に関して参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】マウスＧγ１２タンパク質（ｍＧγ１２）のアミノ酸配列（配列番号：１）を提供する。
【図２Ａから図２Ｄ】マウスＧγ１２変種１をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２）を提供する。
【図３Ａから図３Ｄ】マウスＧγ１２変種２をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３）を提供する。
【図４】ヒトＧγ１２のアミノ酸配列（配列番号：４）を提供する。
【図５】Ｇγ１２のドメイン構造を示す。ドメイン構造は、翻訳されたアミノ酸配列を用いてＨＭＭにより分析した。
【図１】
2004501607.tif 000002
【図２Ａ】
2004501607.tif 000003
【図２Ｂ】
2004501607.tif 000004
【図２Ｃ】
2004501607.tif 000005
【図２Ｄ】
2004501607.tif 000006
【図３Ａ】
2004501607.tif 000007
【図３Ｂ】
2004501607.tif 000008
【図３Ｃ】
2004501607.tif 000009
【図３Ｄ】
2004501607.tif 000010
【図４】
2004501607.tif 000011
【図５】
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【国際公開パンフレット】
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2004501607.tif 000091
2004501607.tif 000092
2004501607.tif 000093
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004501607.tif 000094
【手続補正書】
【提出日】平成13年10月9日(2001.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
遺伝情報を細胞内に運ぶためにどのような発現ベクターを用いるかは特に重要ではない。真核細胞または原核細胞における発現に用いられる従来のベクターのうち任意のものを用いてよい。標準的な細菌発現ベクターには、ｐＢＲ３２２をベースとするプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄなどのプラスミド、ならびにＧＳＴおよびＬａｃＺなどの融合発現系が含まれる。好都合な分離方法が得られるように、ｃ−ｍｙｃ、ＨＡ−タグ、６−Ｈｉｓタグ、マルトース結合タンパク質、ＶＳＶ−Ｇタグ、抗ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号：３）タグまたは任意のこの種のタグなどのエピトープタグ（これらは多数のものが当業者に周知である）を組換えタンパク質に付加することもできる。




【手続補正書】
【提出日】平成14年5月23日(2002.5.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質が配列番号：１のアミノ酸配列を含む、エストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットタンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項２】
マウスに由来する、請求項１記載の核酸。
【請求項３】
配列番号：２または３に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の核酸。
【請求項４】
配列番号：２または３のヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の核酸。
【請求項５】
請求項１記載の核酸を含む、発現カセット。
【請求項６】
請求項５記載の発現カセットを含む、単離された真核細胞。
【請求項７】
配列番号：１のアミノ酸配列を含む、単離されたエストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットタンパク質。
【請求項８】
マウスタンパク質である、請求項７記載のタンパク質。
【請求項９】
配列番号：４のアミノ酸配列を有するエストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットタンパク質とは結合しない、請求項７記載のエストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットタンパク質と選択的に結合する抗体。
【請求項１０】
哺乳動物細胞におけるエストロゲンシグナル伝達を調整する方法であって、以下の段階を含む方法：
エストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットタンパク質の発現または活性のレベルを調整する段階。
【請求項１１】
エストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットタンパク質の発現レベルが、ポリヌクレオチドを細胞に導入することによって調整され、それによって該ポリヌクレオチドの存在または発現が該エストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットタンパク質の該発現レベル調整する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドが完全長エストロゲン調節性マウスＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットタンパク質をコードし、該ポリヌクレオチドの発現によって該エストロゲン調節性マウスＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットタンパク質の発現レベルが高まる、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドがアンチセンス配列であり、該ポリヌクレオチドの存在または発現によってエストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットタンパク質の発現レベルが低下する、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
化合物を細胞に投与し、それによってエストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットの発現または活性のレベルが調整される、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
エストロゲンシグナル伝達がエストロゲン受容体αによって媒介される、請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
細胞が哺乳動物内に存在している、請求項１０記載の方法。
【請求項１７】
細胞が血管平滑筋細胞または血管内皮細胞である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
エストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットタンパク質の発現または活性のレベルが上昇し、それによって哺乳動物におけるアテローム硬化症、骨粗鬆症、アルツハイマー病またはパーキンソン病の発症が阻害される、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物細胞におけるエストロゲンシグナル伝達の存在を検出する方法であって、以下の段階を含む方法：
エストロゲン調節性マウスＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットタンパク質をコードする核酸の発現を検出する段階。
【請求項２０】
核酸が請求項１記載の核酸である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
細胞におけるエストロゲンシグナル伝達の存在を、該細胞のエストロゲンに対する反応性を決定するために利用する、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
細胞におけるエストロゲンシグナル伝達の存在を、哺乳動物におけるエストロゲンシグナル伝達の組織特異的分布を決定するために利用する、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
細胞における核酸の発現が、エストロゲン調節性マウスＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットタンパク質の発現または活性を検出することによって検出される、請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
タンパク質が請求項７記載のタンパク質である、請求項１９記載の方法。
【請求項２５】
細胞における核酸の発現が、該細胞におけるエストロゲン調節性マウスＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットｍＲＮＡのレベルを検出することによって検出される、請求項１９記載の方法。
【請求項２６】
エストロゲンシグナル伝達がエストロゲン受容体αによって媒介される、請求項１９記載の方法。
【請求項２７】
細胞におけるエストロゲン調節性マウスＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットのｍＲＮＡ、タンパク質またはタンパク質活性のレベルの上昇によって化合物がエストロゲン受容体アゴニストとして作用できることが示され、細胞におけるエストロゲン調節性マウスＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットのｍＲＮＡ、タンパク質またはタンパク質活性のレベルの低下によって化合物がエストロゲン受容体アンタゴニストとして作用できることが示される、エストロゲン受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用できる化合物を同定する方法であって、以下の段階を含む方法：
（１）エストロゲン受容体を含む細胞を該化合物と接触させる段階；および
（２）該細胞に対する該化合物の機能的影響を決定する段階。
【請求項２８】
エストロゲン受容体がエストロゲン受容体αである、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
エストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットのｍＲＮＡが配列番号：１の配列を有する、またはエストロゲン調節性ＧＴＰ結合タンパク質γ−１２サブユニットタンパク質が配列番号：２もしくは３のアミノ酸配列を含む、請求項２７記載の方法。
【国際調査報告】
2004501607.tif 000095
2004501607.tif 000096
2004501607.tif 000097