(57)【要約】【課題】【解決手段】本明細書には、真菌の遺伝子発現を制御する方法、及びこの方法を実施するための試薬が開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
候補化合物が、真菌のインベイシン遺伝子プロモーターに作用可能に連結された遺伝子の発現を減少するかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）真菌のインベイシン遺伝子プロモーターに作用可能に連結された前記遺伝子を発現している真菌を準備する工程と；
（ｂ）前記真菌を候補化合物と接触させる工程と；
（ｃ）前記真菌を前記候補化合物と接触させた後に、前記遺伝子の発現を検出又は測定する工程と；
を備えた方法。
【請求項２】
前記真菌が、野生型株である請求項１の方法。
【請求項３】
前記野生型株が、サッカロミセス・セレビシアエ、カンジダ・アルビカンス、又はアスペルギルス・ニードランスである請求項２の方法。
【請求項４】
前記真菌が、変異株である請求項１の方法。
【請求項５】
前記真菌が、トランスジェニック真菌である請求項１の方法。
【請求項６】
前記遺伝子が、真菌のインベイシン遺伝子を含む請求項１の方法。
【請求項７】
前記真菌のインベイシン遺伝子が、ＦＬＯ１１又はＭＵＣ１である請求項６の方法。
【請求項８】
前記真菌のインベイシン遺伝子が、ＡＦＬ１， ＤＨＨ１， ＩＮＶ１， ＩＮＶ５， ＩＮＶ６， ＩＮＶ７， ＩＮＶ８， ＩＮＶ９， ＩＮＶ１０， ＩＮＶ１１， ＩＮＶ１２， ＩＮＶ１３， ＩＮＶ１４， ＩＮＶ１５， ＢＥＭ２， ＣＤＣ２５， ＨＯＧ１， ＩＲＡ１， ＭＣＭ１， ＭＧＡ１， ＰＥＴ９， ＰＨＤ２， ＰＨＯ２３， ＰＴＣ１， ＲＩＭ１５， ＳＦＬ１， ＳＲＢ１１， ＳＳＤ１， ＳＴＥ２１， ＳＴＰ２２， ＳＷＩ４， ＴＰＫ２， ＴＰＫ３， ＲＩＭ１， 又はＹＰＲ１である請求項１の方法。
【請求項９】
前記遺伝子が、レポーター遺伝子を含む請求項１の方法。
【請求項１０】
前記レポーター遺伝子が、ｌａｃＺ、ＵＲＡ３、又はＨＩＳ３である請求項９の方法。
【請求項１１】
前記真菌のインベイシン遺伝子プロモーターが、
ＦＬＯ１１， ＭＵＣ１， ＳＴＡ１， ＳＴＡ２， 又はＳＴＡ３遺伝子プロモーターである請求項１の方法。
【請求項１２】
前記真菌のインベイシン遺伝子プロモーターが、ＡＦＬ１， ＤＨＨ１， ＩＮＶ１， ＩＮＶ５， ＩＮＶ６， ＩＮＶ７， ＩＮＶ８， ＩＮＶ９， ＩＮＶ１０， ＩＮＶ１１， ＩＮＶ１２， ＩＮＶ１３， ＲＩＭ１， ＩＮＶ１４， ＩＮＶ１５， ＢＥＭ２， ＣＤＣ２５， ＨＯＧ１， ＩＲＡ１， ＭＣＭ１， ＭＧＡ１， ＰＥＴ９， ＰＨＤ２， ＰＨＯ２３， ＰＴＣ１， ＲＩＭ１５， ＳＦＬ１， ＳＲＢ１１， ＳＳＤ１， ＳＴＥ２１， ＳＴＰ２２， ＳＷＩ４， ＴＰＫ２， ＴＰＫ３， 又はＹＰＲ１遺伝子プロモーターである請求項１の方法。
【請求項１３】
前記真菌のインベイシン遺伝子プロモーターが、真菌のインベイシン遺伝子プロモーターの断片又は欠失である請求項１の方法。
【請求項１４】
前記断片が、基本プロモーターに融合されている請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記基本プロモーターが、ＰＧＫ１， ＡＤＨ１， ＧＡＬ１−１０， ｔｅｔ−Ｒ，　ＭＥＴ２５， ＣＹＣ１， 又はＣＵＰ１遺伝子である請求項１の方法。
【請求項１６】
前記遺伝子発現が、発現された遺伝子のタンパク質レベルをアッセイすることによって測定される方法。
【請求項１７】
前記遺伝子発現が、発現された遺伝子のＲＮＡレベルをアッセイすることによって測定される方法。
【請求項１８】
前記真菌のインベイシン遺伝子の発現の減少が、真菌の侵入を阻害する請求項６の方法。
【請求項１９】
前記真菌のインベイシン遺伝子の発現の減少が、酵母型から偽菌糸生育へのスイッチを阻害する方法。
【請求項２０】
前記候補化合物が、真菌の病原性を阻害又は減少させる請求項１の方法。
【請求項２１】
候補化合物が、真菌のインベイシン遺伝子プロモーターに作用可能に連結された遺伝子の発現を増加するかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）真菌のインベイシン遺伝子プロモーターに作用可能に連結された前記遺伝子を発現している真菌を準備する工程と；
（ｂ）前記真菌を候補化合物と接触させる工程と；
（ｃ）前記真菌を前記候補化合物と接触させた後に、前記遺伝子の発現を検出又は測定する工程と；
を備えた方法。
【請求項２２】
前記真菌が、野生型株である請求項２１の方法。
【請求項２３】
前記野生型株が、サッカロミセス・セレビシアエ、アスペルギルス・ニードランス、ペニシリウム・クリソジェナム、又はアクレモニウム・クリソジェナムである請求項２２の方法。
【請求項２４】
前記真菌が、変異株である請求項２１の方法。
【請求項２５】
前記真菌が、トランスジェニック真菌である請求項２１の方法。
【請求項２６】
前記遺伝子が、真菌のインベイシン遺伝子を含む請求項２１の方法。
【請求項２７】
前記真菌のインベイシン遺伝子が、ＦＬＯ１１又はＭＵＣ１である請求項２６の方法。
【請求項２８】
前記真菌のインベイシン遺伝子が、ＡＦＬ１， ＤＨＨ１， ＩＮＶ１， ＩＮＶ５， ＩＮＶ６， ＩＮＶ７， ＩＮＶ８， ＩＮＶ９， ＩＮＶ１０， ＩＮＶ１１， ＲＩＭ１， ＩＮＶ１２， ＩＮＶ１３， ＩＮＶ１４， ＩＮＶ１５， ＢＥＭ２， ＣＤＣ２５， ＨＯＧ１， ＩＲＡ１， ＭＣＭ１， ＭＧＡ１， ＰＥＴ９， ＰＨＤ２， ＰＨＯ２３， ＰＴＣ１， ＲＩＭ１５， ＳＦＬ１， ＳＲＢ１１， ＳＳＤ１， ＳＴＥ２１， ＳＴＰ２２， ＳＷＩ４， ＴＰＫ２， ＴＰＫ３，又はＹＰＲ１である請求項２６の方法。
【請求項２９】
前記遺伝子が、レポーター遺伝子を含む請求項２１の方法。
【請求項３０】
前記レポーター遺伝子が、ｌａｃＺ、ＵＲＡ３、又はＨＩＳ３である請求項２９の方法。
【請求項３１】
前記真菌のインベイシン遺伝子プロモーターが、
ＦＬＯ１１， ＭＵＣ１， ＳＴＡ１， ＳＴＡ２， 又はＳＴＡ３遺伝子プロモーターである請求項２１の方法。
【請求項３２】
前記真菌のインベイシン遺伝子プロモーターが、ＡＦＬ１， ＤＨＨ１， ＩＮＶ１， ＩＮＶ５， ＩＮＶ６， ＩＮＶ７， ＩＮＶ８， ＩＮＶ９， ＩＮＶ１０， ＩＮＶ１１， ＩＮＶ１２， ＩＮＶ１３，， ＩＮＶ１４， ＩＮＶ１５， ＢＥＭ２， ＣＤＣ２５， ＨＯＧ１， ＩＲＡ１， ＭＣＭ１， ＭＧＡ１， ＰＥＴ９， ＰＨＤ２， ＰＨＯ２３， ＰＴＣ１， ＲＩＭ１５， ＳＦＬ１， ＳＲＢ１１， ＳＳＤ１， ＳＴＥ２１， ＳＴＰ２２， ＳＷＩ４， ＴＰＫ２， ＴＰＫ３， ＲＩＭ１， ＴＰＫ３又はＹＰＲ１遺伝子プロモーターである請求項２１の方法。
【請求項３３】
前記真菌のインベイシン遺伝子プロモーターが、真菌のインベイシン遺伝子プロモーターの断片又は欠失である請求項２１の方法。
【請求項３４】
前記断片が、基本プロモーターに融合されている請求項３３の方法。
【請求項３５】
前記基本プロモーターが、ＰＧＫ１， ＡＤＨ１， ＧＡＬ１−１０， ｔｅｔ−Ｒ，　ＭＥＴ２５， ＣＹＣ１， 又はＣＵＰ１遺伝子である請求項３４の方法。
【請求項３６】
前記遺伝子発現が、発現された遺伝子のタンパク質レベルをアッセイすることによって測定される請求項２１の方法。
【請求項３７】
前記遺伝子発現が、発現された遺伝子のＲＮＡレベルをアッセイすることによって測定される請求項２１の方法。
【請求項３８】
前記候補化合物が、真菌の二次代謝産物の産生を増加させるかどうかを決定することをさらに備えた請求項２１の方法。
【請求項３９】
候補化合物が、真菌の侵入を阻害するかどうかを決定する方法であって、
（ａ）侵入に適した条件下で真菌と候補化合物を接触させる工程と；
（ｂ）前記候補化合物と接触させた後に、前記真菌による侵入を測定又は検出する工程と；
を備えた方法。
【請求項４０】
前記真菌が、カンジタ・アルビカンスである請求項３９の方法。
【請求項４１】
前記真菌が、サッカロミセス・セレビシアエである請求項３９の方法。
【請求項４２】
候補化合物が、真菌の侵入を促進するかどうかを決定する方法であって、
（ａ）侵入に適した条件下で真菌と候補化合物を接触させる工程と；
（ｂ）前記候補化合物と接触させた後に、前記真菌による侵入を測定又は検出する工程と；
を備えた方法。
【請求項４３】
前記真菌が、カンジタ・アルビカンスである請求項４２の方法。
【請求項４４】
前記真菌が、サッカロミセス・セレビシアエである請求項４２の方法。
【請求項４５】
前記真菌が、アスペルギルス・ニードランスである請求項４２の方法。
【請求項４６】
真菌の侵入促進遺伝子を同定する方法であって、
（ａ）真菌に、（１）真菌のインベイシン遺伝子プロモーターに作用可能に連結された第一の遺伝子、及び（２）第二の候補遺伝子又はその断片を発現させる工程と；
（ｂ）前記第一の遺伝子の発現をモニタリングする工程とを備え、前記発現の増加により、前記候補遺伝子を真菌の侵入促進遺伝子として同定する方法。
【請求項４７】
前記真菌が、野生型株である請求項４６の方法。
【請求項４８】
前記野生型株が、サッカロミセス・セレビシアエである請求項４７の方法。
【請求項４９】
前記真菌が、変異株である請求項４６の方法。
【請求項５０】
前記真菌が、トランスジェニック真菌である請求項４６の方法。
【請求項５１】
前記第一の遺伝子が、真菌のインベイシン遺伝子を含む請求項４６の方法。
【請求項５２】
前記真菌のインベイシン遺伝子が、ＦＬＯ１１又はＭＵＣ１である請求項５１の方法。
【請求項５３】
前記真菌のインベイシン遺伝子が、ＡＦＬ１， ＤＨＨ１， ＩＮＶ１， ＩＮＶ５， ＩＮＶ６， ＩＮＶ７， ＩＮＶ８， ＩＮＶ９， ＩＮＶ１０， ＩＮＶ１１， ＩＮＶ１２， ＩＮＶ１３， ＩＮＶ１４， ＩＮＶ１５， ＢＥＭ２， ＣＤＣ２５， ＨＯＧ１， ＩＲＡ１， ＲＩＭ１， ＭＣＭ１， ＭＧＡ１， ＰＥＴ９， ＰＨＤ２， ＰＨＯ２３， ＰＴＣ１， ＲＩＭ１５， ＳＦＬ１， ＳＲＢ１１， ＳＳＤ１， ＳＴＥ２１， ＳＴＰ２２， ＳＷＩ４， ＴＰＫ２， ＴＰＫ３，又はＹＰＲ１である請求項５１の方法。
【請求項５４】
前記第一の遺伝子が、レポーター遺伝子を含む請求項４６の方法。
【請求項５５】
前記レポーター遺伝子が、ｌａｃＺ、ＵＲＡ３、又はＨＩＳ３である請求項５４の方法。
【請求項５６】
前記真菌のインベイシン遺伝子プロモーターが、ＦＬＯ１１， ＭＵＣ１， ＳＴＡ１， ＳＴＡ２， 又はＳＴＡ３遺伝子プロモーターである請求項４６の方法。
【請求項５７】
前記真菌のインベイシン遺伝子プロモーターが、ＡＦＬ１， ＤＨＨ１， ＩＮＶ１， ＲＩＭ１， ＩＮＶ５， ＩＮＶ６， ＩＮＶ７， ＩＮＶ８， ＩＮＶ９， ＩＮＶ１０， ＩＮＶ１１， ＩＮＶ１２， ＩＮＶ１３， ＩＮＶ１４， ＩＮＶ１５， ＢＥＭ２， ＣＤＣ２５， ＨＯＧ１， ＩＲＡ１， ＭＣＭ１， ＭＧＡ１， ＰＥＴ９， ＰＨＤ２， ＰＨＯ２３， ＰＴＣ１， ＲＩＭ１５， ＳＦＬ１， ＳＲＢ１１， ＳＳＤ１， ＳＴＥ２１， ＳＴＰ２２， ＳＷＩ４， ＴＰＫ２， ＴＰＫ３， 又はＹＰＲ１遺伝子プロモーターである請求項４６の方法。
【請求項５８】
前記真菌のインベイシン遺伝子プロモーターが、ＦＬＯ１１， ＭＵＣ１， ＳＴＡ１， ＳＴＡ２， 又はＳＴＡ３遺伝子プロモーターの断片又は欠失である請求項４６の方法。
【請求項５９】
前記断片が、基本プロモーターに融合されている請求項５８の方法。
【請求項６０】
前記基本プロモーターが、ＰＧＫ１， ＡＤＨ１， ＧＡＬ１−１０， ｔｅｔ−Ｒ，　ＭＥＴ２５， ＣＹＣ１， 又はＣＵＰ１遺伝子である請求項５９の方法。
【請求項６１】
前記遺伝子発現が、発現された第一の遺伝子のタンパク質レベルをアッセイすることによって測定される請求項４６の方法。
【請求項６２】
前記遺伝子発現が、発現された第一の遺伝子のＲＮＡレベルをアッセイすることによって測定される請求項４６の方法。
【請求項６３】
前記真菌の侵入促進遺伝子が、インベイシン経路のメンバーを含む請求項４６の方法。
【請求項６４】
真菌の侵入阻害遺伝子を同定する方法であって、
（ａ）真菌に、（１）真菌のインベイシン遺伝子プロモーターに作用可能に連結された第一の遺伝子、及び（２）第二の候補遺伝子又はその断片を発現させる工程と；
（ｂ）前記第一の遺伝子の発現をモニタリングする工程とを備え、
前記発現の減少により、前記候補遺伝子を真菌の侵入阻害遺伝子として同定する方法。
【請求項６５】
前記真菌が、野生型株である請求項６４の方法。
【請求項６６】
前記野生型株が、サッカロミセス・セレビシアエである請求項６５の方法。
【請求項６７】
前記真菌が、変異株である請求項６４の方法。
【請求項６８】
前記真菌が、トランスジェニック真菌である請求項６４の方法。
【請求項６９】
前記第一の遺伝子が、真菌のインベイシン遺伝子を含む請求項６４の方法。
【請求項７０】
前記真菌のインベイシン遺伝子が、ＦＬＯ１１又はＭＵＣ１である請求項６９の方法。
【請求項７１】
前記真菌のインベイシン遺伝子が、ＡＦＬ１， ＤＨＨ１， ＩＮＶ１， ＩＮＶ５， ＩＮＶ６， ＩＮＶ７， ＩＮＶ８， ＩＮＶ９， ＩＮＶ１０， ＩＮＶ１１， ＩＮＶ１２， ＩＮＶ１３， ＩＮＶ１４， ＲＩＭ１， ＩＮＶ１５， ＢＥＭ２， ＣＤＣ２５， ＨＯＧ１， ＩＲＡ１， ＭＣＭ１， ＭＧＡ１， ＰＥＴ９， ＰＨＤ２， ＰＨＯ２３， ＰＴＣ１， ＲＩＭ１５， ＳＦＬ１， ＳＲＢ１１， ＳＳＤ１， ＳＴＥ２１， ＳＴＰ２２， ＳＷＩ４， ＴＰＫ２， ＴＰＫ３，又はＹＰＲ１である請求項６９の方法。
【請求項７２】
前記第一の遺伝子が、レポーター遺伝子を含む請求項６４の方法。
【請求項７３】
前記レポーター遺伝子が、ｌａｃＺ、ＵＲＡ３、又はＨＩＳ３である請求項７２の方法。
【請求項７４】
前記真菌のインベイシン遺伝子プロモーターが、ＦＬＯ１１， ＭＵＣ１， ＳＴＡ１， ＳＴＡ２， 又はＳＴＡ３遺伝子プロモーターである請求項６４の方法。
【請求項７５】
前記真菌のインベイシン遺伝子プロモーターが、ＡＦＬ１， ＤＨＨ１， ＩＮＶ１， ＲＩＭ１， ＩＮＶ５， ＩＮＶ６， ＩＮＶ７， ＩＮＶ８， ＩＮＶ９， ＩＮＶ１０， ＩＮＶ１１， ＩＮＶ１２， ＩＮＶ１３， ＩＮＶ１４， ＩＮＶ１５， ＢＥＭ２， ＣＤＣ２５， ＨＯＧ１， ＩＲＡ１， ＭＣＭ１， ＭＧＡ１， ＰＥＴ９， ＰＨＤ２， ＰＨＯ２３， ＰＴＣ１， ＲＩＭ１５， ＳＦＬ１， ＳＲＢ１１， ＳＳＤ１， ＳＴＥ２１， ＳＴＰ２２， ＳＷＩ４， ＴＰＫ２， ＴＰＫ３， 又はＹＰＲ１遺伝子プロモーターである請求項６４の方法。
【請求項７６】
前記真菌のインベイシン遺伝子プロモーターが、ＦＬＯ１１， ＭＵＣ１， ＳＴＡ１， ＳＴＡ２又はＳＴＡ３遺伝子プロモーターの断片又は欠失である請求項６４の方法。
【請求項７７】
前記断片が、基本プロモーターに融合されている請求項７６の方法。
【請求項７８】
前記基本プロモーターが、ＰＧＫ１， ＡＤＨ１， ＧＡＬ１−１０， ｔｅｔ−Ｒ，　ＭＥＴ２５， ＣＹＣ１又はＣＵＰ１遺伝子である請求項７７の方法。
【請求項７９】
前記遺伝子発現が、発現された第一の遺伝子のタンパク質レベルをアッセイすることによって測定される請求項６４の方法。
【請求項８０】
前記遺伝子発現が、発現された第一の遺伝子のＲＮＡレベルをアッセイすることによって測定される請求項６４の方法。
【請求項８１】
前記真菌の侵入阻害遺伝子が、インベイシン経路のメンバーを含む請求項６４の方法。
【請求項８２】
真菌細胞中での二次代謝産物の産生を増加させる方法であって、前記真菌細胞を真菌の侵入促進化合物と接触させる工程を備えた方法。
【請求項８３】
真菌細胞中での二次代謝産物の産生を増加させる方法であって、真菌の侵入阻害遺伝子の発現を減少させる工程を備えた方法。
【請求項８４】
前記真菌の侵入阻害遺伝子の前記減少した発現が、前記真菌の侵入阻害遺伝子の非活性化から生じる請求項８３の方法。
【請求項８５】
前記真菌の侵入阻害遺伝子が変異している請求項８３の方法。
【請求項８６】
前記真菌の侵入阻害遺伝子が、ＨＯＧ１， ＢＥＭ２， ＲＩＭ１５， ＳＦＬ１， ＩＲＡ１， ＳＳＤＩ， ＳＲＢ１１， ＳＷＩ４，又はＴＰＫ３を含む請求項８３の方法。
【請求項８７】
真菌の二次代謝産物の産生を増加させる方法であって、真菌の侵入促進遺伝子の発現を増加させる工程を含む方法。
【請求項８８】
前記真菌の侵入促進遺伝子が、ＡＦＬ１， ＤＨＨ１， ＩＮＶ７， ＩＮＶ８， ＳＴＥ２１， ＰＥＴ９， ＭＥＰ２， ＩＮＶ１， ＩＮＶ５， ＩＮＶ６， ＩＮＶ９， ＩＮＶ１０， ＩＮＶ１１， ＩＮＶ１２， ＩＮＶ１３， ＩＮＶ１４， ＩＮＶ１５， ＣＤＣ２５， ＭＣＭ１， ＭＧＡ１， ＰＨＤ２， ＰＨＯ２３， ＰＴＣ１， ＲＩＭ１， ＳＴＰ２２， ＴＰＫ２又はＹＲＰ１である請求項８７の方法。
【請求項８９】
前記真菌の侵入促進遺伝子の増加した発現が、構成的に発現され、又は過剰発現されている請求項８７の方法。
【請求項９０】
前記真菌の侵入促進遺伝子が変異している請求項８７の方法。
【請求項９１】
真菌の二次代謝産物の産生を増加させる方法であって、活性化された形態の侵入促進ポリペプチドをコードする遺伝子又はその断片を発現させる工程を備えた方法。
【請求項９２】
前記活性化された形態の前記侵入促進ポリペプチドが、侵入促進ポリペプチドと、前記侵入促進ポリペプチドの活性をさらに増大させる第二のポリペプチドとの融合を含む請求項９１の方法。
【請求項９３】
前記遺伝子が、変異を有する請求項９１の方法。
【請求項９４】
真菌細胞中での二次代謝産物の産生を増加させる方法であって、真菌の侵入阻害ポリペプチドの活性を減少させる工程を含む方法。
【請求項９５】
前記真菌の侵入阻害ポリペプチドが、変異を有する請求項９４の方法。
【請求項９６】
前記変異が、優性非活性ポリペプチドをコードする請求項９５の方法。
【請求項９７】
前記真菌の侵入阻害ポリペプチドが、Ｈｏｇ１， Ｂｅｍ２， Ｒｉｍ１５， Ｉｒａ１， Ｓｆｌ１， Ｓｓｄ１， Ｓｒｂ１１， Ｓｗｉ４，又はＴｐｋ３である請求項９４の方法。
【請求項９８】
真菌の二次代謝産物の産生を増加させる方法であって、真菌の侵入促進ポリペプチドの活性を増加させる工程を備えた方法。
【請求項９９】
前記真菌の侵入促進ポリペプチドが、変異を有する請求項９８の方法。
【請求項１００】
前記変異が、優性活性ポリペプチドをコードする請求項９９の方法。
【請求項１０１】
前記真菌の侵入促進ポリペプチドが、Ａｆｌ１， Ｄｈｈ１， Ｉｎｖ１， Ｉｎｖ５， Ｉｎｖ６， Ｉｎｖ９， Ｉｎｖ１０， Ｉｎｖ１１， Ｉｎｖ１２， Ｉｎｖ１３， Ｉｎｖ１４， Ｒｉｍ１， Ｉｎｖ１５， Ｃｄｃ２５， Ｉｎｖ７， Ｍｃｍ１， Ｍｇａ１， Ｐｈｄ２， Ｐｈｏ２３， Ｐｔｃ１， Ｉｎｖ８， Ｓｔｅ２， Ｐｅｔ９， Ｍｅｐ２， Ｓｔｐ２２， Ｔｐｋ２，又はＹｐｒ１である請求項９８の方法。
【請求項１０２】
真菌のインベイシン遺伝子を単離する方法であって、
（ａ）真菌のインベイシン遺伝子プロモーターが作用可能に連結された遺伝子を発現している真菌を準備する工程と；
（ｂ）前記真菌に変異を誘発させる工程と；
（ｃ）前記遺伝子の発現を測定し、前記遺伝子の発現の増加又は減少により、前記インベイシン遺伝子の変異を同定する工程と；
（ｄ）前記インベイシン遺伝子を単離するためのマーカーとして前記変異を使用する工程と；
を備えた方法。
【請求項１０３】
前記真菌が、野生型株である請求項１０２の方法。
【請求項１０４】
前記野生型株が、サッカロミセス・セレビシアエである請求項１０３の方法。
【請求項１０５】
前記真菌が、変異株である請求項１０２の方法。
【請求項１０６】
前記遺伝子が、真菌のインベイシン遺伝子を含む請求項１０２の方法。
【請求項１０７】
前記真菌のインベイシン遺伝子が、ＦＬＯ１１又はＭＵＣ１である請求項１０６の方法。
【請求項１０８】
前記真菌のインベイシン遺伝子が、 ＡＦＬ１， ＤＨＨ１， ＩＮＶ１， ＩＮＶ５， ＩＮＶ６， ＩＮＶ７， ＩＮＶ８， ＩＮＶ９， ＩＮＶ１０， ＩＮＶ１１， ＩＮＶ１２， ＩＮＶ１３， ＩＮＶ１４， ＩＮＶ１５， ＢＥＭ２， ＣＤＣ２５， ＨＯＧ１， ＩＲＡ１， ＭＣＭ１， ＭＧＡ１， ＰＥＴ９， ＰＨＤ２， ＰＨＯ２３， ＲＩＭ１， ＰＴＣ１， ＲＩＭ１５， ＳＦＬ１， ＳＲＢ１１， ＳＳＤ１， ＳＴＥ２１， ＳＴＰ２２， ＳＷＩ４， ＴＰＫ２， ＴＰＫ３又はＹＰＲ１である請求項１０６の方法。
【請求項１０９】
前記遺伝子が、レポーター遺伝子を含む請求項１０２の方法。
【請求項１１０】
前記レポーター遺伝子が、ｌａｃＺ、ＵＲＡ３、又はＨＩＳ３である請求項１０９の方法。
【請求項１１１】
前記真菌のインベイシン遺伝子プロモーターが、ＦＬＯ１１， ＭＵＣ１， ＳＴＡ１， ＳＴＡ２， 又はＳＴＡ３遺伝子プロモーターである請求項１０２の方法。
【請求項１１２】
前記真菌のインベイシン遺伝子プロモーターが、、ＡＦＬ１， ＤＨＨ１， ＩＮＶ１， ＩＮＶ５， ＩＮＶ６， ＩＮＶ７， ＩＮＶ８， ＩＮＶ９， ＩＮＶ１０， ＩＮＶ１１， ＩＮＶ１２， ＩＮＶ１３， ＩＮＶ１４， ＩＮＶ１５， ＢＥＭ２， ＣＤＣ２５， ＲＩＭ１， ＨＯＧ１， ＩＲＡ１， ＭＣＭ１， ＭＧＡ１， ＰＥＴ９， ＰＨＤ２， ＰＨＯ２３， ＰＴＣ１， ＲＩＭ１５， ＳＦＬ１， ＳＲＢ１１， ＳＳＤ１， ＳＴＥ２１， ＳＴＰ２２， ＳＷＩ４， ＴＰＫ２， ＴＰＫ３， 又はＹＰＲ１遺伝子プロモーターである請求項１０２の方法。
【請求項１１３】
前記真菌のインベイシン遺伝子プロモーターが、、ＦＬＯ１１， ＭＵＣ１， ＳＴＡ１， ＳＴＡ２， 又はＳＴＡ３遺伝子プロモーターの断片又は欠失である請求項１０２の方法。
【請求項１１４】
前記断片が、基本プロモーターに融合されている請求項１１３の方法。
【請求項１１５】
前記基本プロモーターが、ＰＧＫ１， ＡＤＨ１， ＧＡＬ１−１０， ｔｅｔ−Ｒ， ＭＥＴ２５， ＣＹＣ１， 又はＣＵＰ１遺伝子である請求項１１４の方法。
【請求項１１６】
前記遺伝子発現が、発現された遺伝子のタンパク質レベルをアッセイすることによって測定される請求項１０２の方法。
【請求項１１７】
前記遺伝子発現が、発現された遺伝子のＲＮＡレベルをアッセイすることによって測定される請求項１０２の方法。
【請求項１１８】
異種細胞を用いて、カンジダ・アルビカンスの遺伝子プロモーターからの発現を制御する遺伝子を同定する方法であって、
（ａ）カンジダ・アルビカンスの遺伝子プロモーターに作用可能に連結されたレポーター遺伝子を発現する異種細胞を準備する工程と；
（ｂ）前記異種細胞中の候補遺伝子を発現させる工程と；
（ｃ）前記レポーター遺伝子の前記発現を検出又は測定する工程と；
を備えた方法。
【請求項１１９】
前記異種細胞が、サッカロミセス・セレビシアエである請求項１１８の方法。
【請求項１２０】
増加した二次代謝産物産生を有するトランスジェニック真菌細胞を調製する方法であって、
（ａ）真菌細胞中にトランス遺伝子を導入する工程と；
（ｂ）タンパク質を産生するための前記トランス遺伝子を発現している細胞を選択する工程と；
を備え、前期トランス遺伝子が、ＡＦＬ１， ＤＨＨ１， ＩＮＶ７， ＩＮＶ８， ＳＴＥ２１， ＰＥＴ９， ＭＥＰ２， ＩＮＶ１， ＩＮＶ５， ＩＮＶ６， ＩＮＶ９， ＩＮＶ１０， ＩＮＶ１１， ＲＩＭ１， ＩＮＶ１２， ＩＮＶ１３， ＩＮＶ１４， ＩＮＶ１５， ＣＤＣ２５， ＭＣＭ１， ＭＧＡ１， ＰＨＤ２， ＰＨＯ２３， ＰＴＣ１， ＳＴＰ２２， ＴＰＫ２， ＹＰＲ１， ＩＩＯＧ１， ＢＥＭ２， ＲＩＭ１５， ＳＦＬ１， ＩＲＡ１， ＳＳＤ１， ＳＲＢ１１， ＳＷＩ４， ＴＰＫ３又はそれらの断片である方法。
【請求項１２１】
前記トランス遺伝子が、変異を有する請求項１２０の方法。
【請求項１２２】
前記変異が、優性活性変異である請求項１２１の方法。
【請求項１２３】
前記変異が、優性非活性変異である請求項１２１の方法。
【請求項１２４】
真菌中の二次代謝産物を増加させる方法であって、
（ａ）二次代謝産物の産生を可能とする条件で、培養物中の前記真菌を培養する工程と；
（ｂ）前記培養物に、真菌の侵入促進化合物を加える工程と；
（ｃ）前記培養物から前記代謝産物を単離する工程と；
を備えた方法。
【請求項１２５】
前記真菌が、変異を有する請求項１２４の方法。
【請求項１２６】
前記真菌が、野生型株である請求項１２４の方法。
【請求項１２７】
ＨＯＧ１遺伝子中に変異を有するトランスジェニック糸状菌であって、前記変異が、機能的Ｈｏｇ１タンパク質の活性を阻害するトランスジェニック糸状菌。
【請求項１２８】
請求項１２７のトランスジェニック糸状菌であって、前記真菌が、増加した二次代謝産物の産生を有するトランスジェニック糸状菌。
【請求項１２９】
ＳＷＩ４遺伝子中に変異を有するトランスジェニック糸状菌であって、前記変異が、機能的Ｓｗｉ４タンパク質の活性を阻害するトランスジェニック糸状菌。
【請求項１３０】
請求項１２９のトランスジェニック糸状菌であって、前記真菌が、増加した二次代謝産物の産生を有するトランスジェニック糸状菌。
【請求項１３１】
ＢＥＭ２遺伝子中に変異を有するトランスジェニック糸状菌であって、前記変異が、機能的Ｂｅｍ２タンパク質の活性を阻害するトランスジェニック糸状菌。
【請求項１３２】
請求項１３１のトランスジェニック糸状菌であって、前記真菌が、増加した二次代謝産物の産生を有するトランスジェニック糸状菌。
【請求項１３３】
ＳＲＢ１１遺伝子中に変異を有するトランスジェニック糸状菌であって、前記変異が、機能的Ｓｒｂ１１タンパク質の発現を阻害するトランスジェニック糸状菌。
【請求項１３４】
請求項１３３のトランスジェニック糸状菌であって、前記真菌が、増加した二次代謝産物の産生を有するトランスジェニック糸状菌。
【請求項１３５】
ＳＳＤ１遺伝子中に変異を有するトランスジェニック糸状菌であって、前記変異が、機能的Ｓｓｄ１タンパク質の発現を阻害するトランスジェニック糸状菌。
【請求項１３６】
請求項１３５のトランスジェニック糸状菌であって、前記真菌が、増加した二次代謝産物の産生を有するトランスジェニック糸状菌。
【請求項１３７】
ＴＰＫ３遺伝子中に変異を有するトランスジェニック糸状菌であって、前記変異が、機能的Ｔｐｋ３タンパク質の発現を阻害するトランスジェニック糸状菌。
【請求項１３８】
請求項１３７のトランスジェニック糸状菌であって、前記真菌が、増加した二次代謝産物の産生を有するトランスジェニック糸状菌。
【請求項１３９】
ＳＦＬ１遺伝子中に変異を有するトランスジェニック糸状菌であって、前記変異が、機能的Ｓｆｌ１タンパク質の発現を阻害するトランスジェニック糸状菌。
【請求項１４０】
請求項１３９のトランスジェニック糸状菌であって、前記真菌が、増加した二次代謝産物の産生を有するトランスジェニック糸状菌。
【請求項１４１】
ＩＲＡ１遺伝子中に変異を有するトランスジェニック糸状菌であって、前記変異が、機能的Ｉｒａ１タンパク質の発現を阻害するトランスジェニック糸状菌。
【請求項１４２】
請求項１４１のトランスジェニック糸状菌であって、前記真菌が、増加した二次代謝産物の産生を有するトランスジェニック糸状菌。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、真菌遺伝子発現の制御に関わる遺伝子を同定し、単離する方法に関する。本発明は、真菌のビルレンスファクターを同定するのに有用な方法にも関する。本発明は、さらに、真菌の病原を制御し、又は真菌の病原に必要とされる遺伝子の発現又は活性を増加又は減少させる因子を同定する方法に関する。本発明は、殺真菌剤又は静真菌剤としてのこのような因子の使用にも関する。
【０００２】
真菌は、ヒトに対して大きな重要性を有する大きく多様な生物群である。病原性の真菌は、とりわけ、その割合が急速に増加しつつある、疾病、化学療法、又は免疫抑制剤によって疾病が損なわれた集団において、ヒトの疾病の重要な原因である。様々な植物病原性真菌（例えば、焼枯れ（ｂｌｉｇｈｔｓ）、赤星病（ｒｕｓｔｓ）、かび（ｍｏｌｄ）、黒穂病（ｓｍｕｔ）、うどん粉病）は、莫大な穀物の損失及び鑑賞用植物への損害を引き起こす。植物の疾病は、多くの属、例えば：軟腐病（例えば、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、縮葉病（例えば、タフリナ（Ｔａｐｈｒｉｎａ）、うどんこ病（例えば、スファエロセカ（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ）、オモト赤星病（例えば、ファルビア（Ｆｕｌｖｉａ）、焼枯れ（例えば、アルターナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ））、いもち病（例えば、マグナポルス（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ））、黒腐病（例えば、ギニャルディア（Ｇｕｉｇｎａｒｄｉａ））、赤カビ病（例えば、ベンチュリア（Ｖｅｎｔｕｒｉａ））、萎ちょう（例えば、フサリウム）、赤星病（例えば、プッチニア（Ｐｕｃｃｉｎｉａ））、黒穂病（例えば、ウスティラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ））、及び潰瘍（例えば、リゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ））に属する無数の侵襲性の真菌病原体によって引き起こされる。さらに、真菌種は、抗生物質（例えば、ペニシリン、セファロスポリン、及びそれらの誘導体のようなβラクタム抗生物質）、抗高コレステロール血症剤（例えば、ロバスタチン及びコンパクチン）、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン）、及び抗真菌薬剤（例えば、ニューモカンディン（ｐｎｅｕｍｏｃａｎｄｉｎ）及びエチノカンディン（ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ））のような極めて多くの医学的に有用な製品の商業用製造源である。これらの薬物は、全て、真菌の二次代謝産物−真菌がそれらの微生物学的環境中の競合者に対して使用する小さな被分泌分子−である。最後に、真菌は、商業的に重要な酵素（例えば、セルラーゼ、プロテアーゼ、及びリパーゼ）並びにその他の産物（例えば、クエン酸、ジベレリン酸（ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｃ ａｃｉｄ）、天然色素、及び薬味（ｆｌａｖｏｒｉｎｇｓ））も産生する。
【０００３】
真菌が、それらの生育基質に侵入する詳細は、詳しくは理解されていない。しかしながら、真菌の侵入過程に関する二つの重要なテーマが、近年判明した。第一に、カンジダ種、アスペルギルス種、ムコール種、クモノスカビ種、フサリウム種、ペニシリウム・マルネファイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ）、ミクロスポラム種、及びトリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）種のような重要なヒトの真菌性病原体は、線状菌糸として宿主の組織から侵入する。カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）のビルレンスは、宿主組織の侵入に依存していることが示されている。すなわち、侵入性の生育に必要とされる幾つかの遺伝子の何れかが突然変異すると、全身感染のマウスモデルでビルレンスが相当減少する。植物の真菌性病原体であるウスティラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）の病原も侵入を要する。第二に、サッカロミセス・セレビシアエにおいて寒天の侵入を制御する遺伝子と病原性の酵母において侵入を制御する遺伝子には相関がある。サッカロミセス・セレビシアエは、遺伝学的研究に好適なので、真菌の侵入の遺伝学的性質を分子的に分析するのに利用できる。
【０００４】
侵入に必要とされるある種のサッカロミセス・セレビシアエの遺伝子の相同体は、他の真菌において、二次代謝産物及び分泌異化酵素の産生も調節する。例えば、サッカロミセス・セレビシアエのＩＮＶ遺伝子のアスペルギルス相同体中の突然変異を活性化すると、二次代謝産物であるペニシリンと、分泌アルカリフォスファターゼ産生の増加を引き起こす（Ｏｒｅｊａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １９９５， ９：１６６２）。
【０００５】
【発明の実施の形態】
ある側面では、本発明は、候補化合物が、真菌のインベイシン（ｉｎｖａｓｉｎ）遺伝子プロモーターに作用可能に連結された遺伝子の発現を減少するかどうかを決定するための方法に関する。該方法は、一般的には、（ａ）真菌のインベイシン遺伝子プロモーターに作用可能に連結された遺伝子を発現している真菌を準備する工程と；（ｂ）前記真菌を候補化合物と接触させる工程と；（ｃ）前記真菌を前記候補化合物に接触させた後に、前記遺伝子の発現を検出又は測定する工程とを備える。
【０００６】
好ましい態様では、真菌は、野生型株（例えば、サッカロミセス・セレビシアエ、カンジダ・アルビカンス、又はアスペルギルス・ニードランス）；変異株；又はトレンスジェニック真菌である。他の好ましい態様では、本発明の方法に使用される遺伝子は、真菌のインベイシン遺伝子である。真菌のインベイシン遺伝子には、例えば、ＡＦＬ１， ＤＨＨ１， ＩＮＶ１， ＩＮＶ５， ＩＮＶ６， ＩＮＶ７， ＩＮＶ８， ＩＮＶ９， ＩＮＶ１０， ＩＮＶ１１， ＩＮＶ１２， ＩＮＶ１３， ＩＮＶ１４， ＩＮＶ１５， ＢＥＭ２， ＣＤＣ２５， ＦＬＯ１１， ＩＲＡ１， ＭＣＭ１， ＭＧＡ１， ＭＵＣ１， ＰＥＴ９， ＰＨＤ２， ＰＨＯ２３， ＰＴＣ１， ＲＩＭ１５， ＳＦＬ１， ＳＲＢ１１， ＳＳＤ１， ＳＴＥ２１， ＳＴＰ２２， ＳＷＩ４， ＴＰＫ２， ＴＰＫ３， ＲＩＭ１， 又はＹＰＲ１が含まれるが、これらに限定されない。
【０００７】
他の好ましい態様では、本発明の方法に使用される遺伝子は、レポーター遺伝子である。本発明の方法に有用なレポーター遺伝子には、例えば、クロラムフェニコールトランスアセチラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、ルシフェラーゼ、ＵＲＡ３、又はＨＩＳ３が含まれるが、これらに限定されない。
【０００８】
好ましい態様では、本発明の方法に使用される真菌のインベイシン遺伝子プロモーターは、ＦＬＯ１１， ＭＵＣ１， ＳＴＡ１， ＳＴＡ２， 又はＳＴＡ３遺伝子プロモーターに由来する。他の好ましい態様では、真菌のインベイシン遺伝子プロモーターには、ＡＦＬ１， ＤＨＨ１， ＩＮＶ１， ＩＮＶ５， ＩＮＶ６， ＩＮＶ７， ＩＮＶ８， ＩＮＶ９， ＩＮＶ１０， ＩＮＶ１１， ＩＮＶ１２， ＩＮＶ１３， ＲＩＭ１， ＩＮＶ１４， ＩＮＶ１５， ＢＥＭ２， ＣＤＣ２５， ＨＯＧ１， ＩＲＡ１， ＭＣＭ１， ＭＧＡ１， ＰＥＴ９， ＰＨＤ２， ＰＨＯ２３， ＰＴＣ１， ＲＩＭ１５， ＳＦＬ１， ＳＲＢ１１， ＳＳＤ１， ＳＴＥ２１， ＳＴＰ２２， ＳＷＩ４， ＴＰＫ２， ＴＰＫ３， 又はＹＰＲ１遺伝子プロモーターに由来するプロモーター配列が含まれる。好ましくは、真菌のインベイシン遺伝子プロモーターは、真菌のインベイシン遺伝子プロモーターの断片又は欠失（例えば、ＦＬＯ１１遺伝子プロモーターの断片）であり；所望であれば、該断片は、基本プロモーター（ｂａｓａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）（例えば、ＰＧＫ１， ＡＤＨ１， ＧＡＬ１−１０， ｔｅｔ−Ｒ，　ＭＥＴ２５， ＣＹＣ１， 又はＣＵＰ１遺伝子からの基本プロモーター）に融合される。
【０００９】
典型的には、遺伝子（例えば、内在性ＦＬＯ１１、又はＦＬＯ１１遺伝子プロモーターの制御下で発現される組換えリポーター遺伝子、又はその断片）の発現は、発現される遺伝子のＲＮＡ又はタンパク質レベル又は両者をアッセイすることによって測定される。例えば、真菌のインベイシン遺伝子によって、又はレポーター遺伝子によって発現されるポリペプチドは、化合物が、産生されるべき測定可能なシグナルを生ぜしめるような条件下で、検出可能なシグナルを生ぜしめる。生じたシグナルの量を量的に決定するには、テストされている化合物が全く存在しない状態で、又は本明細書に記載されている他の任意の化合物に細胞を接触させたときに検出されたシグナルの量と生じたシグナルの量とを比較することを要する。この比較によって、発現された遺伝子によって生じた検出可能なシグナルの変化（例えば、ＲＮＡ又はタンパクレベルで）を引き起こすものとして化合物が同定され、これにより、真菌の侵入を阻害し得る化合物を同定することが可能となる。真菌インベイシン遺伝子の発現の減少は、一般的には、真菌の侵入の阻害によって、又は酵母型から偽菌糸体の生育への発達のスイッチの阻害、又は両者を伴う。
【００１０】
関連する側面では、本発明は、候補化合物が、真菌のインベイシン遺伝子プロモーターに作用可能に連結された遺伝子の発現を増加するかどうかを決定するための方法にも関する。該方法は、一般的には、（ａ）真菌のインベイシン遺伝子プロモーターに作用可能に連結された遺伝子を発現している真菌を準備する工程と；（ｂ）前記真菌を候補化合物と接触させる工程と；（ｃ）前記真菌を前記候補化合物に接触させた後に、前記遺伝子の発現を検出又は測定する工程とを備える。好ましい態様では、本発明は、さらに、候補化合物が、真菌の二次代謝産物の産生を増加するかどうかを決定することを備える。
【００１１】
別の側面では、本発明は、候補化合物が、真菌の侵入を阻害するかどうかを決定する方法に関する。該方法は、一般的には、（ａ）侵入に適した条件下で真菌と候補化合物を接触させる工程と、（ｂ）候補化合物と接触させた後に、真菌による侵入を測定又は検出する工程とを備える。好ましい態様では、真菌は、カンジタ・アルビカンス又はサッカロミセス・セレビシアエである。
【００１２】
別の側面では、本発明は、候補化合物が、真菌の侵入を促進するかどうかを決定する方法に関する。該方法は、一般的には、（ａ）侵入に適した条件下で真菌と候補化合物を接触させる工程と、（ｂ）候補化合物と接触させた後に、真菌による侵入を測定又は検出する工程とを備える。好ましい態様では、真菌は、カンジタ・アルビカンス又はサッカロミセス・セレビシアエ、又はアスペルギルス・ニードランスである。
【００１３】
さらに別の側面では、本発明は、真菌の侵入促進遺伝子を同定する方法に関する。該方法は、一般的に、（ａ）真菌に、（１）真菌のインベイシン遺伝子プロモーターに作用可能に連結された第一の遺伝子、及び（２）第二の候補遺伝子又はその断片を発現させる工程と；（ｂ）前記第一の遺伝子の発現をモニタリングする工程とを備え、前記第一の遺伝子の発現の増加により、前記第二の候補遺伝子が真菌の侵入促進遺伝子として同定される。好ましい態様では、真菌は、野生型株（例えば、サッカロミセス・セレビシアエ、アスペルギルス・ニードランス、ペニシリウム・クリソジェナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、又はアクレモニウム・クリソジェナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）；変異株；又はトレンスジェニック真菌である。他の好ましい態様では、本発明の方法に使用される遺伝子は、真菌のインベイシン遺伝子である。
【００１４】
好ましくは、第一の遺伝子は、真菌のインベイシン遺伝子を含む（例えば、ＦＬＯ１１又はＭＵＣ１）。さらに別の好ましい態様では、第一の遺伝子は、ＡＦＬ１， ＤＨＨ１， ＩＮＶ１， ＩＮＶ５， ＩＮＶ６， ＩＮＶ７， ＩＮＶ８， ＩＮＶ９， ＩＮＶ１０， ＩＮＶ１１， ＩＮＶ１２， ＩＮＶ１３， ＩＮＶ１４， ＩＮＶ１５， ＢＥＭ２， ＣＤＣ２５， ＨＯＧ１， ＩＲＡ１， ＲＩＭ１， ＭＣＭ１， ＭＧＡ１， ＰＥＴ９， ＰＨＤ２， ＰＨＯ２３， ＰＴＣ１， ＲＩＭ１５， ＳＦＬ１， ＳＲＢ１１， ＳＳＤ１， ＳＴＥ２１， ＳＴＰ２２， ＳＷＩ４， ＴＰＫ２， ＴＰＫ３，又はＹＰＲ１に由来する真菌のインベイシン遺伝子を含む；又は前記第一の遺伝子は、レポーター遺伝子（例えば、ｌａｃＺ、ＵＲＡ３、又はＨＩＳ３）を含む。
【００１５】
好ましい態様では、真菌のインベイシン遺伝子プロモーターは、ＦＬＯ１１， ＭＵＣ１， ＳＴＡ１， ＳＴＡ２， 又はＳＴＡ３遺伝子プロモーターに由来する。他の好ましい態様では、真菌のインベイシン遺伝子プロモーターは、ＡＦＬ１， ＤＨＨ１， ＩＮＶ１， ＲＩＭ１， ＩＮＶ５， ＩＮＶ６， ＩＮＶ７， ＩＮＶ８， ＩＮＶ９， ＩＮＶ１０， ＩＮＶ１１， ＩＮＶ１２， ＩＮＶ１３， ＲＩＭ１， ＩＮＶ１４， ＩＮＶ１５， ＢＥＭ２， ＣＤＣ２５， ＨＯＧ１， ＩＲＡ１， ＭＣＭ１， ＭＧＡ１， ＰＥＴ９， ＰＨＤ２， ＰＨＯ２３， ＰＴＣ１， ＲＩＭ１５， ＳＦＬ１， ＳＲＢ１１， ＳＳＤ１， ＳＴＥ２１， ＳＴＰ２２， ＳＷＩ４， ＴＰＫ２， ＴＰＫ３， 又はＹＰＲ１遺伝子プロモーターに由来し；又は上記真菌のインベイシン遺伝子プロモーターの断片若しくは欠失である。好ましくは、真菌のインベイシン遺伝子プロモーターの断片は、基本プロモーター （例えば、ＰＧＫ１， ＡＤＨ１， ＧＡＬ１−１０， ｔｅｔ−Ｒ， ＭＥＴ２５， ＣＹＣ１， 又はＣＵＰ１遺伝子の基本プロモーター）に融合される。
【００１６】
好ましくは、本発明の方法に利用される遺伝子の発現は、発現された第一の遺伝子のタンパク質レベルをアッセイすることによって、又は発現された第一の遺伝子のＲＮＡレベルをアッセイすることによって測定される。
【００１７】
関連した側面では、本発明は、真菌の侵入阻害遺伝子を同定する方法にも関する。該方法は、一般的に、真菌に、（１）真菌のインベイシン遺伝子プロモーターに作用可能に連結された第一の遺伝子、及び（２）第二の候補遺伝子又はその断片を発現させる工程と；（ｂ）前記第一の遺伝子の発現をモニタリングする工程とを備え、前記第一の遺伝子の発現の減少により、前記第二の候補遺伝子が真菌の侵入阻害遺伝子として同定される。
【００１８】
さらに別の側面では、本発明は、真菌細胞中での二次代謝産物の産生を増加させる方法に関する；該方法は、一般的に、真菌細胞を真菌の侵入促進化合物と接触させる工程と；二次代謝産物の増加した合成を促進する条件下で、細胞を培養する工程とを備える。
【００１９】
別の側面では、本発明は、真菌細胞中での二次代謝産物の産生を増加させる方法に関する；該方法は、一般的に、真菌の侵入阻害遺伝子の発現を減少させる工程を含む。好ましい態様では、真菌の侵入阻害遺伝子（例えば、ＨＯＧ１， ＢＥＭ２， ＲＩＭ１５， ＳＦＬ１， ＩＲＡ１， ＳＳＤＩ， ＳＲＢ１１， ＳＷＩ４，又はＴＰＫ３）の減少した発現は、真菌の侵入阻害遺伝子の不活化からもたらされる。別の好ましい態様では、二次代謝産物の増加した産生は、変異した真菌の侵入阻害遺伝子の発現からもたらされる。
【００２０】
さらに別の側面では、本発明は、真菌の二次代謝産物の産生を増加させる方法に関する。該方法は、一般的に、真菌の侵入促進遺伝子の発現を増加させる工程を含む。好ましい態様では、真菌の侵入促進遺伝子は、ＡＦＬ１， ＤＨＨ１， ＩＮＶ７， ＩＮＶ８， ＳＴＥ２１， ＰＥＴ９， ＭＥＰ２， ＩＮＶ１， ＩＮＶ５， ＩＮＶ６， ＩＮＶ９， ＩＮＶ１０， ＩＮＶ１１， ＩＮＶ１２， ＩＮＶ１３， ＩＮＶ１４， ＩＮＶ１５， ＣＤＣ２５， ＭＣＭ１， ＭＧＡ１， ＰＨＤ２， ＰＨＯ２３， ＰＴＣ１， ＲＩＭ１， ＳＴＰ２２， ＴＰＫ２又はＹＲＰ１である。別の好ましい態様では、真菌の侵入促進遺伝子の増加した発現は、真菌の侵入促進遺伝子を構成的に発現させることにより、又はこのような遺伝子を過剰発現させることにより達成される。さらに別の好ましい態様では、真菌の侵入促進遺伝子は、変異している。
【００２１】
別の側面では、本発明は、真菌の二次代謝産物の産生を増加させる方法に関する。該方法は、一般的には、活性化された形態の侵入促進ポリペプチドをコードする遺伝子又はその断片を発現させる工程を含む。好ましい態様では、活性化された形態の侵入促進ポリペプチドは、侵入促進ポリペプチドと、侵入促進ポリペプチドの活性をさらに増大させる第二のポリペプチドとの融合を含む。別の好ましい態様では、遺伝子は、変異を有する。
【００２２】
別の側面では、本発明は、真菌細胞中での二次代謝産物の産生を増加させる方法に関する。該方法は、一般的には、真菌の侵入阻害ポリペプチドの活性を減少させる工程を含む。好ましい態様では、真菌の侵入阻害ポリペプチドは、変異（例えば、優性非活性（ｄｏｍｉｎａｎｔ−ｉｎａｃｔｉｖｅ）ポリペプチド）を有する。別の好ましい態様では、真菌の侵入阻害ポリペプチドは、Ｈｏｇ１， Ｂｅｍ２， Ｒｉｍ１５， Ｉｒａ１， Ｓｆｌ１， Ｓｓｄ１， Ｓｒｂ１１， Ｓｗｉ４，又はＴｐｋ３である。
【００２３】
別の側面では、本発明は、真菌の二次代謝産物の産生を増加させる方法に関する。該方法は、一般的には、真菌の侵入促進ポリペプチドの活性を増加させる工程を含む。好ましい態様では、真菌の侵入促進ポリペプチドは、変異（例えば、優性活性ポリペプチド）を有する。別の好ましい態様では、真菌の侵入促進ポリペプチドは、Ａｆｌ１， Ｄｈｈ１， Ｉｎｖ１， Ｉｎｖ５， Ｉｎｖ６， Ｉｎｖ９， Ｉｎｖ１０， Ｉｎｖ１１， Ｉｎｖ１２， Ｉｎｖ１３， Ｉｎｖ１４， Ｒｉｍ１， Ｉｎｖ１５， Ｃｄｃ２５， Ｉｎｖ７， Ｍｃｍ１， Ｍｇａ１， Ｐｈｄ２， Ｐｈｏ２３， Ｐｔｃ１， Ｉｎｖ８， Ｓｔｅ２， Ｐｅｔ９， Ｍｅｐ２， Ｓｔｐ２２， Ｔｐｋ２，又はＹｐｒ１である。
【００２４】
別の側面では、本発明は真菌のインベイシン遺伝子を単離する方法に関する。本発明は、一般的には、（ａ）真菌のインベイシン遺伝子プロモーターが作用可能に連結された遺伝子を発現している真菌を準備する工程と；（ｂ）前記真菌に変異を誘発させる工程と、（ｃ）前記遺伝子の発現を測定し、前記遺伝子の発現の増加又は減少により、前記インベイシン遺伝子の変異を同定する工程と；（ｄ）前記インベイシン遺伝子を単離するためのマーカーとして前記変異を使用する工程とを備える。好ましい態様では、真菌は、野生型株（例えば、サッカロミセス・セレビシアエ）、又は変異株である。好ましい態様では、本方法に使用される遺伝子は、真菌のインベイシン遺伝子（例えば、ＦＬＯ１１， ＭＵＣ１， ＡＦＬ１， ＤＨＨ１， ＩＮＶ１， ＩＮＶ５， ＩＮＶ６， ＩＮＶ７， ＩＮＶ８， ＩＮＶ９， ＩＮＶ１０， ＩＮＶ１１， ＩＮＶ１２， ＩＮＶ１３， ＲＩＭ１， ＩＮＶ１４， ＩＮＶ１５， ＢＥＭ２， ＣＤＣ２５， ＨＯＧ１， ＩＲＡ１， ＭＣＭ１， ＭＧＡ１， ＰＥＴ９， ＰＨＤ２， ＰＨＯ２３， ＲＩＭ１， ＰＴＣ１， ＲＩＭ１５， ＳＦＬ１， ＳＲＢ１１， ＳＳＤ１， ＳＴＥ２１， ＳＴＰ２２， ＳＷＩ４， ＴＰＫ２， ＴＰＫ３， 又はＹＰＲ１）を含む。別の好ましい態様では、遺伝子は、レポーター遺伝子（例えば、ｌａｃＺ、ＵＲＡ３、又はＨＩＳ３）を含む。さらに別の好ましい態様では、真菌のインベイシン遺伝子プロモーターは、ＦＬＯ１１， ＭＵＣ１， ＳＴＡ１， ＳＴＡ２， 又はＳＴＡ３遺伝子プロモーターから得られる；又は、ＡＦＬ１， ＤＨＨ１， ＩＮＶ１， ＩＮＶ５， ＩＮＶ６， ＩＮＶ７， ＩＮＶ８， ＩＮＶ９， ＩＮＶ１０， ＩＮＶ１１， ＩＮＶ１２， ＩＮＶ１３， ＲＩＭ１， ＩＮＶ１４， ＩＮＶ１５， ＢＥＭ２， ＣＤＣ２５， ＲＩＭ１， ＨＯＧ１， ＩＲＡ１， ＭＣＭ１， ＭＧＡ１， ＰＥＴ９， ＰＨＤ２， ＰＨＯ２３， ＰＴＣ１， ＲＩＭ１５， ＳＦＬ１， ＳＲＢ１１， ＳＳＤ１， ＳＴＥ２１， ＳＴＰ２２， ＳＷＩ４， ＴＰＫ２， ＴＰＫ３， 又はＹＰＲ１遺伝子プロモーターから得られる。別の好ましい態様では、真菌のインベイシンプロモーターは、上記真菌のインベイシン遺伝子プロモーターの断片若しくは欠失である。好ましくは、真菌のインベイシン遺伝子プロモーターの断片は、基本プロモーター （例えば、ＰＧＫ１， ＡＤＨ１， ＧＡＬ１−１０， ｔｅｔ−Ｒ， ＭＥＴ２５， ＣＹＣ１， 又はＣＵＰ１遺伝子の基本プロモーター）に融合される。
【００２５】
別の側面では、本発明は、カンジダ・アルビカンスの遺伝子プロモーターからの発現を制御する遺伝子を同定するために、細胞（例えば、真菌細胞）を使用する方法に関する。該方法は、一般的には、（ａ）カンジダ・アルビカンスの遺伝子プロモーターに作用可能に連結されたレポーター遺伝子を発現する細胞を準備する工程と；（ｂ）前記細胞中の候補遺伝子を発現させる工程と；（ｃ）前記レポーター遺伝子の発現を検出又は測定する工程とを備える。好ましい態様では、真菌細胞は、サッカロミセス・セレビシアエである。
【００２６】
別の側面では、本発明は、増加した二次代謝産物産生を有するトランスジェニック真菌細胞を調製する方法に関する。該方法は、一般的には、（ａ）トランス遺伝子（例えば、真菌細胞中で発現するように配置されたＡＦＬ１， ＤＨＨ１， ＩＮＶ７， ＩＮＶ８， ＳＴＥ２１， ＰＥＴ９， ＭＥＰ２， ＩＮＶ１， ＩＮＶ５， ＩＮＶ６， ＩＮＶ９， ＩＮＶ１０， ＩＮＶ１１， ＲＩＭ１， ＩＮＶ１２， ＩＮＶ１３， ＩＮＶ１４， ＩＮＶ１５， ＣＤＣ２５， ＭＣＭ１， ＭＧＡ１， ＰＨＤ２， ＰＨＯ２３， ＰＴＣ１， ＳＴＰ２２， ＴＰＫ２， ＹＲＰ１のようなインベイシン遺伝子をコードするトランス遺伝子、又はその断片）を導入する工程と、（ｂ）前記トランス遺伝子を発現する細胞を選択する工程とを備える。好ましい態様では、トランス遺伝子は、変異（例えば、優性活性変異又は優性非活性変異）を有する。
【００２７】
別の側面では、本発明は、真菌中の二次代謝産物を増加させる方法に関する。該方法は、一般的には、（ａ）二次代謝産物の産生を可能とする条件で、培養物（ｃｕｌｔｕｒｅ）中の真菌を培養する工程と；（ｂ）前記培養物に、真菌の侵入促進化合物を加える工程と；（ｃ）前記培養物から代謝産物を単離する工程とを備える。好ましい態様では、真菌は、変異を有する。別の好ましい態様では、真菌は、野生型株である。
【００２８】
さらに別の側面では、本発明は、インベイシン遺伝子の活性を阻害する変異をインベイシン遺伝子中に含むトランスジェニック真菌（例えば、糸状菌（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ））に関する。好ましくは、本発明は、ＨＯＧ１， ＳＷＩ４， ＢＥＭ２， ＳＲＢ１１， ＳＳＤ１， ＴＰＫ３， ＳＦＬ１又はＩＲＡ１遺伝子、又は任意のこれらの組み合わせの中に変異を有するトランスジェニック糸状菌に関する。好ましくは、このような変異は、発現されたタンパク質（例えば、Ｈｏｇ１， Ｓｗｉ４， Ｂｅｍ２， Ｓｒｂ１１， Ｓｓｄ１， Ｔｐｋ３， Ｓｆｌ１， 又はＩｒａ１， 又は任意のそれらの組み合わせ）の活性を阻害する。別の好ましい態様では、トランスジェニック真菌は、増加した二次代謝産物の産生（例えば、増加した抗生物質の産生）を有する。
【００２９】
別の側面では、本発明は、実質的に、純粋なＩｎｖ９ポリペプチドに関する。好ましくは、Ｉｎｖ９ポリペプチドは、図６Ｂ（配列番号６）のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一である。好ましい態様では、Ｉｎｖ９ポリペプチドは、真菌（例えば、サッカロミセスのような酵母）から得られる。他の好ましい態様では、Ｉｎｖ９は、侵入促進活性を有する。
【００３０】
関連する側面では、本発明は、Ｉｎｖ９ポリペプチドをコードする単離された核酸（例えば、ＤＮＡ）に関する。好ましくは、このような単離された核酸配列は、図６Ａ（配列番号５）のＩＮＶ９遺伝子を含み、サッカロミセス・セレビシアエのＩＮＶ９変異を相補する。
【００３１】
別の側面では、本発明は、実質的に純粋なＲｉｍ１ポリペプチドに関する。好ましくは、Ｒｉｍ１ポリペプチドのジンクフィンガードメインは、図５Ａ（配列番号４）のアミノ酸配列のジンクフィンガーと少なくとも７５％同一であり、ポリペプチドのアミノ酸配列全長にわたっては、少なくとも２５％同一である。好ましい態様では、Ｒｉｍ１ポリペプチドは、真菌（例えば、サッカロッミセスのような酵母）から得られる。別の好ましい態様では、Ｒｉｍ１ポリペプチドは、侵入促進活性を有する。
【００３２】
関連する側面では、本発明は、Ｒｉｍ１ポリペプチドをコードする単離された核酸（例えば、ＤＮＡ）に関する。好ましくは、このような単離された核酸は、図５Ａ（配列番号３）のＲＩＭ１遺伝子を含み、本明細書に記載されているように、サッカロミセス・セレビシアエ中のＲＩＭ１変異を相補する。
【００３３】
関連する側面では、本発明は、さらに、細胞又はベクター（例えば、真菌発現ベクター）に関し、各々は、本発明の単離された核酸分子を含む。好ましい態様では、本発明は、真菌細胞（例えば、サッカロミセス・セレビシアエ）である。さらに別の好ましい態様では、単離された本発明の核酸分子は、核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現を媒介するプロモーターに作用可能に連結される。本発明は、さらに、本発明のベクターを含有する細胞（例えば、真菌細胞）に関する。
【００３４】
さらに別の側面では、本発明は、本発明の任意の上記核酸分子を含むトランスジェニック真菌に関する。前記核酸分子は、トランスジェニック真菌中で発現される。
【００３５】
関連する側面では、本発明は、Ｉｎｖ９又はＲｉｍ１ポリペプチドを産生する方法にも関する。該方法は、（ａ）細胞で発現するように配置された本発明の核酸分子で形質転換された細胞を提供する工程と；（ｂ）前記核酸分子を発現させる条件下で前記形質転換された細胞を培養する工程と；（ｃ）Ｉｎｖ９又はＲｉｍ１ポリペプチドを回収する工程とを備える。本発明は、さらに、本発明の単離された核酸分子のこのような発現によって産生された組換えＩｎｖ９又はＲｉｍ１ポリペプチド、及びこれらの各ポリペプチド又はその一部を特異的に認識し、結合する実質的に純粋な抗体に関する。
【００３６】
「真菌の侵入」とは、真菌が、基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を貫通し、掘り込む（ｄｉｇ）、接着（ａｄｈｅｒｅ）し、又は付着（ａｔｔａｃｈ）する過程を意味する。真菌による基質の侵入は、本明細書に記載されているような標準的方法に従って測定し得る。
【００３７】
「真菌インベイシン」遺伝子は、真菌による基質への侵入を促進又は阻害することができるポリペプチドをコードする遺伝子を意味する。この応答は、転写レベルで起こり得る。又は、これは、実際には、酵素又は構造的なものであり得る。真菌のインベイシン遺伝子は、本分野で公知の慣用法を組み合わせ、本明細書で開示された任意の配列を使用して任意の真菌種から同定、単離され得る。
【００３８】
「ポリペプチド」は、任意のアミノ酸の鎖を意味し、長さ又は翻訳後修飾（例えば、グリコシル化又はリン酸化）にかかわらない。
【００３９】
「レポーター遺伝子」は、その発現をアッセイし得る遺伝子を意味する。このような遺伝子には、βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ）、β−グルコシダーゼ、及びインベルターゼをコードする遺伝子、アミノ酸生合成遺伝子、例えば酵母のＬＥＵ２， ＨＩＳ３， ＬＹＳ２， ＴＲＰ１遺伝子、核酸生合成遺伝子、例えば酵母のＵＲＡ３およびＡＤＥ２遺伝子、哺乳類のクロラムフェニコールトランスアセチラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、又はそれに対する特異的な抗体を利用できる任意の表面抗原の遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。レポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）のような発光又は蛍光によって検出し得るタンパク質をコードし得る。レポーター遺伝子は、表現型マーカー、例えば、細胞の生育又は生存に必要とされるタンパク、又は細胞死を誘導する毒性タンパクを与える任意のタンパク質もコードし得、あるいは、レポーター遺伝子は、色の存在又は不存在をもたらす、カラーアッセイによって検出できるタンパク質をコードし得る。あるいは、レポーター遺伝子は、サプレッサーｔＲＮＡ（その発現は、アッセイ可能な表現型を与える）をコードし得る。本発明のレポーター遺伝子は、レポーター遺伝子機能に必要なエレメント（例えば、全てのプロモーターエレメント）を含む。
【００４０】
「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列（例えば、図５Ａ（配列番号４）に示されたアミノ酸配列）、又は核酸配列（図５Ａに示された核酸配列；配列番号３）と少なくとも２５％、好ましくは５０％、より好ましくは８０％、最も好ましくは９０％、さらには９５％の同一性を示すポリペプチド又は核酸を意味する。ポリペプチドの場合、比較配列の長さは、一般的には、少なくとも１６アミノ酸、好ましくは２０アミノ酸、より好ましくは少なくとも２５アミノ酸、最も好ましくは３５アミノ酸以上であろう。核酸の場合、一般的には、比較配列の長さは、少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも６０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも７５ヌクレオチド、最も好ましくは１１０ヌクレオチド以上である。
【００４１】
配列の同一性は、典型的には、配列分析ソフトウェア（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ， １７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ５３７０５， ＢＬＡＳＴ， ＢＥＡＵＴＹ， ｏｒ ＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸ ｐｒｏｇｒａｍｓ）を用いて測定される。このようなソフトウェアは、相同性の程度を様々な置換、欠失、及び／又は他の修飾に割り当てることによって、同一又は類似の配にとマッチさせる。典型的には、保存的な置換には、以下の群（グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン）内部での置換が含まれる。
【００４２】
「実質的に純粋なポリペプチド」は、自然の状態ではそれを伴う成分から分離されたポリペプチド（例えば、Ｉｎｖ９又はＲｉｍ１ポリペプチドのようなインベイシンポリペプチド）を意味する。典型的には、少なくとも６０重量％であり、自然の状態では付随するタンパク質及び天然に存在する有機分子がなければ、実質的に純粋である。好ましくは、調製物は、少なくとも７５重量％、より好ましくは、少なくとも９０重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％がインベイシンポリペプチドである。実質的に純粋なインベイシンポリペプチドは、例えば、天然の採取源（例えば、真菌細胞）から抽出することによって；インベイシンポリペプチドをコードする組換え核酸を発現することによって；該タンパク質を化学的に合成することによって取得し得る。純度は、任意の適切な方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、又はＨＰＬＣ分析によって測定できる。
【００４３】
「由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ）」とは、天然に存在する配列（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成又はそれらの組み合わせ）から単離されるか、又は天然に存在する配列を有することを意味する。
【００４４】
「単離されたＤＮＡ」とは、本発明のＤＮＡが由来する生物の天然に存在するゲノムで、遺伝子と相隣する遺伝子が除かれたＤＮＡを意味する。それ故、この用語には、例えば、ベクター、自己複製プラスミド、又はウイルス、；又は原核細胞若しくは真核細胞のゲノムＤＮＡに取り込まれた組換えＤＮＡ；又は他の配列から独立した別個の分子（例えば、ｃＤＮＡ、又はＰＣＲ若しくは制限エンドヌクレアーゼ消化によって作成されたゲノム若しくはｃＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡが含まれる。付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含まれる。
【００４５】
「トランスジェニック真菌細胞」とは、組換えＤＮＡ技術によって、インベイシンポリペプチドをコードする（本明細書で使用されているように）ＤＮＡ分子が導入された真菌細胞（又はその先祖）を意味する。
【００４６】
「発現するように配置」とは、ＤＮＡ分子が、該配列の転写及び翻訳を誘導する（すなわち、例えば、インベイシンポリペプチド、組換えタンパク質、又はＲＮＡ分子の産生を促進する）ＤＮＡ配列に隣接するように配置されていることを意味する。
【００４７】
「プロモーター配列」とは、転写を誘導するのに十分な任意の最小配列を意味する。本発明では、プロモーター依存性遺伝子の発現を調節するのに十分な遺伝死発現用のプロモーターエレメント、又は外部シグナル若しくは因子によって誘導可能なエレメントが含まれ、このようなエレメントは、ネイティブの遺伝子の５’又は３’領域に配置され、又はトランス遺伝子構築物中に工作され得る。
【００４８】
「作用可能に連結された」とは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク）が制御配列に結合したときに、遺伝子発現が可能となるように遺伝子及び制御配列が結合されていることを意味する。
【００４９】
「候補遺伝子」とは、細工（ａｒｔｉｆｉｃｅ）によって、細胞中に挿入され、細胞中で発現される任意のＤＮＡを意味する。候補遺伝子には、一部又は全体がトランススジェニック生物に異種（すなわち、外来）の遺伝子が含まれ得、生物の内在性遺伝子と相同な遺伝子を表し得る。
【００５０】
「トランス遺伝子」とは、細工によって細胞中に挿入され、その細胞から発達する生物のゲノムの一部となったＤＮＡを意味する。このようなトランス遺伝子には、一部又は全体がトランスジェニック生物に異種（すなわち、外来）の遺伝子が含まれ得、生物の内在性遺伝子と相同な遺伝子を表し得る。
【００５１】
「トランスジェニック」とは、細工によって細胞中に挿入され、その細胞から発達する生物のゲノムの一部となったＤＮＡ配列を含む任意の細胞を意味する。本明細書で使用する場合、トランスジェニック生物は、一般的には、トランスジェニック真菌細胞である。本発明のトランスジェニック真菌細胞は、一以上のインベイシン遺伝子を含有し得る。
【００５２】
「二次代謝産物の増加した産生」とは、対照真菌（例えば、非トランスジェニック真菌）の産生レベルより、本発明のトランスジェニック真菌中の二次代謝産物の産生レベルが多いことを意味する。好ましい態様では、本発明のトランスジェニック真菌中の二次代謝産物レベルは、対照真菌中のレベルより、少なくとも１０％多い（より好ましくは、３０％又は５０％）。二次代謝産物の産生レベルは、慣用法を用いて測定される。
【００５３】
「検出可能にラベルされた」とは、分子の存在をマークし同定するための任意の直接又は間接的な手段、例えば、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマー、遺伝子又はその断片、又はｃＤＮＡ分子若しくはその断片を意味する。分子を検出可能にラベルする方法は、本分野において周知であり、（例えば、３２Ｐ又は３５Ｓのようなアイソトープによる）放射能ラベル、及び非放射能ラベル（例えば、化学発光ラベル、例えばフルオレセインラベル）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５４】
「精製された抗体」とは、少なくとも６０重量％であり、天然の状態ではこれに随伴するタンパク質及び天然に存在する有機分子がない抗体を意味する。好ましくは、調製物は、少なくとも７５重量％、より好ましくは９０重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％が抗体、例えば、後天的耐性ポリペプチド特異的抗体（ａｃｑｕｉｒｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）である。精製されたインベイシン抗体（例えば、Ｉｎｖ９又はＲｉｍ１）は、例えば、組換えで作成した後天的耐性ポリペプチドを用いたアフィニティークロマトグラフィー及び標準的な手法によって取得し得る。
【００５５】
「特異的に結合する」とは、インベイシンポリペプチドを認識し、結合するが、天然にＩｎｖ９又はＲｉｍ１のようなインベイシンポリペプチドを含んだサンプル、例えば生物学的サンプル中に存在する他の分子を実質的に認識及び結合しない抗体を意味する。
【００５６】
「変異」とは、位置指定又はランダム変異誘発の何れかによる配列中の変化を意味する。変異した形態のタンパク質には、点変異及び挿入、欠失、又は転位（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）が包含される。変異体とは、変異を含有する生物である。
【００５７】
本発明は、真菌病原体中の遺伝子発現の制御における化合物の効力を区別し、評価するために使用される様々な標準的スクリーニング法に比べて、長く待ち望まれた利点を有する。例えば、該方法は、高情報量フォーマットでの遺伝的選別によって、真菌の侵入を特異的に活性化又は阻害するペプチド及び化合物を同定することが可能となる。これらの方法によれば、このような因子の作用様式を迅速に描出することも可能となる。さらに、これらの方法は、最初の当たり（ｈｉｔｓ ａｎｄ ｌｅａｄｓ）から、より効率的な化合物の発展を可能とする反復的な化合物の修飾及び再テストプロセスに向いている。
【００５８】
真菌の侵入を阻害する化合物は、真菌のビルレンスも阻止することが多いであろう。これらの化合物は、植物又は動物の真菌性疾病を治療するのに治療的価値を有し得る。真菌の侵入を促進する化合物は、商業的に重要な真菌の二次代謝産物の収率を増加させるのに有用であり得る。
【００５９】
本発明は、病原に重要な新規真菌遺伝子を単離するアプローチも提供する。これらの新規遺伝子及びそれらがコードするタンパク質は、さらなる化合物の標的を含む。
【００６０】
さらに、本発明は、真菌生物自体の遺伝的操作によって、商業的に重要な二次代謝産物の収率を増加させる手段を与える。これにより、これまでは不可能であった真菌産物の大規模生産が容易になる。さらに、それにより、真菌に接触させ、又は真菌中で発現されたときに、二次代謝産物の産生を活性化することができる「増強物質（ｐｏｔｅｎｔｉａｔｏｒｓ）」（すなわち、化合物及びペプチド）の容易な同定が可能となる。真菌の二次代謝産物の生産を増加し得ることには、少なくとも二つの重要な応用がある。第一に、二次代謝産物の生産の増加により、増加がなければ、実験室で検出できないレベルのこれらの化合物を作り出す真菌から、新規な抗微生物化合物を同定することが容易になるであろう。第二に、臨床的に、又は研究に有用である既存の二次代謝産物の産生を増加させることができるであろう。
【００６１】
本発明のその他の特徴及び利点は、以下の好適な態様の記載、及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００６２】
我々は、真菌の侵入及び偽菌糸体の生育を制御する相互に接続された一連のシグナル伝達カスケードを発見した。我々は、サッカロミセス・セレビシアエから、以前に特徴づけられた遺伝子の新しい役割、侵入及び偽菌糸体の生育を同定した（ＡＦＬ１， ＤＨＨ１， ＩＮＶ１， ＩＮＶ５， ＩＮＶ６， ＩＮＶ７， ＩＮＶ８， ＩＮＶ９， ＩＮＶ１０， ＩＮＶ１１， ＩＮＶ１２， ＩＮＶ１３， ＲＩＭ１， ＩＮＶ１４， ＩＮＶ１５， ＢＥＭ２， ＣＤＣ２５， ＨＯＧ１， ＩＲＡ１， ＭＣＭ１， ＭＧＡ１， ＰＥＴ９， ＰＨＤ２， ＰＨＯ２３， ＰＴＣ１， ＲＩＭ１５， ＳＦＬ１， ＳＲＢ１１， ＳＳＤ１， ＳＴＥ２１， ＳＴＰ２２， ＳＷＩ４， ＴＰＫ２， ＴＰＫ３， ＹＰＲ１）。遺伝学的及び生化学的分析によって、我々は、これらの遺伝子、及び侵入を制御することが知られた他の遺伝子を一連の並列的シグナル伝達カスケードに位置付けることができた。下表１は、サッカロミセス・セレビシアエの侵入及び／又は偽菌糸体の生育を制御する、我々が同定した遺伝子のリストである。これらの遺伝子は、サッカロミセスゲノムデータベースによって表記される対応する配列名で相互参照される。これらの遺伝子の配列及びそれらの転写制御エレメント候補もサッカロミセスゲノムデータベースでみることができる（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｓｅｓ／）。
【表１】
2004512001.tif 000002
【００６３】
我々は、これらのシグナル伝達カスケードの「樹形図（ｗｉｒｉｎｇ ｄｉａｇｒａｍ）」を構築し、これらの遺伝子の多くが、少なくとも、一部は、単一の遺伝子ＦＬＯ１１の制御を介して、真菌の侵入を直接制御することを示した。単一の標的に収束するシグナルの同定により、動物又は植物宿主の何れかで真菌の病原を阻害するのに有用な治療因子を評価し、同定するようにデザインされた改良スクリーニング法が容易となった。さらに、我々の発見は、様々な新規真菌ビルレンス因子を同定するのに有用なスクリーニング法の基礎を与える。さらに、このようなビルレンス因子の同定は、抗病原体として使用するための標的化された試薬の開発を促進する。さらに、改良されたスクリーニング法は、重要な真菌の二次代謝産物の産生を増加させる因子を同定するための基礎を与える。
【００６４】
以下の実験例は、説明を意図したものであり、特許請求の範囲に記載された発明の範囲を限定することを意図したものではない。
偽菌糸体の生育及び侵入に関与する遺伝子を単離するためのスクリーニング
以下、我々は、一連のシグナル伝達カスケードが、協働して作動し、偽菌糸体の生育、及び固体培地、サッカロミセス・セレビシアエ中への一倍体の掘り込みを制御するという実験的な証拠を記載する。
【００６５】
高グルコースと低窒素を含有する固体培地上で、サッカロミセス・セレビシアエの二倍体細胞は、侵入糸（ｉｎｖａｓｉｖｅ ｆｉｌａｍｅｎｔ）を形成する伸長した細胞の鎖からなる偽菌糸体を形成する（Ｇｉｍｅｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ １９９２， ６８：１０７７−１０９０）。リッチな培地上では、一倍体細胞は、「掘り込み（ｄｉｇｇｉｎｇ）」と称されている侵入性の生育を示すが、二倍体細胞は示さない（Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｆｉｎｋ， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １９９４， ８：２９７４−８５）。偽菌糸体の生育と一倍体の侵入性生育（ｉｎｖａｓｉｖｅ ｇｒｏｗｔｈ）の両者に行き着く栄養的なシグナルは、幾つかの経路を含んでいる。これらの動態に関与するサッカロミセス・セレビシアエの遺伝子を単離するために、我々は、偽菌糸体生育又は一倍体の侵入の何れかが欠損した変異体を求めて一連のスクリーニングを行った。これらのスクリーニングを以下に記載する。
スクリーニング１．偽菌糸体生育中の侵入を喪失した変異体の同定
酵母の突然変異導入とスクリーニングは、ＭｏｓｃｈとＦｉｎｋに記載されているように実施した（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９７， １４５：６７１−６８４）。簡潔に述べれば、低窒素ＳＬＡＤ寒天上で生育させたときに寒天に侵入できないトランスポゾンで誘導した変異体を探すための直接的な視覚的スクリーニングは、偽菌糸体生育が可能なＭＡＴａ／α一倍体株で行った。二次スクリーニングによって、長い細胞を作り、侵入以外の偽菌糸体生育の全側面が可能である変異体のサブセットを同定した。
スクリーニング２．掘り込み欠損変異体の同定
（Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｆｉｎｋ、上記）に記載されたプレート洗浄アッセイを用いて、一倍体の侵入性生育が欠損したサッカロミセス・セレビシアエの変異体を同定した。ＭｏｓｃｈとＦｉｎｋ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９７， １４５：６７１−８４， ａｎｄ Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １９９４ ８：１０８７−１０５）の記載に従って構築した、トランスポゾンで変異誘発した一倍体をＹＰＤ上に播種し、よく分離した単一コロニーを形成せしめた。３〜５日、３０℃で生育させた後、プレートをレプリカプレーティングして、マスタープレートの表面を水流で洗浄した。侵入欠損変異体のコロニーは、完全に（又はほとんど完全に）寒天から洗浄されたのに対して、野生型株の多くの細胞は、洗浄後も寒天中に残存していた。続いて、侵入欠損表現型を示すコロニーのレプリカから変異株を摘み取った。
スクリーニング３．高侵入性変異体の同定
トランスポゾンで変異誘発した一倍体をＹＰＤに播種し、上記スクリーニング２に記載したように生育させた。野生型コロニーよりも「粗く」見える表面形態を有するコロニーを選び出した−粗いコロニー表面は、高侵入性の指標である。続いて、二次試験により、野生型対照に比べて、洗浄後に、より多くの細胞が寒天中に残存している変異体を同定した。このような変異体は、高侵入性変異体として保有された。
スクリーニング４．ＩＮＶ経路に特異的に影響を与える変異の同定
該スクリーニングは、偽菌糸体の生育に必要とされる他の特徴付けられた遺伝子に影響を与える変異とは異なり、ｉｎｖ変異体は、野生型変異体に比べて、漂白剤カルコフラワー（ｃａｌｃｏｆｌｏｕｒ）に対してより耐性があるという我々の観察に基づいていた。さらに、全ての侵入欠損変異体に当てはまることであるが、ｉｎｖ一倍体は、ＹＰＤ寒天上で生育させたときに、野生型コロニーに比べて、より滑らかに見えるコロニー表面形態を示した。ＹＰＤ寒天上で生育させたときに、滑らかなコロニー形態を示すトランスポゾンで誘導したカルコフラワー耐性変異体の集合体も同定された。
【００６６】
トランスポゾン挿入によって誘導された全ての変異について、慣用法により、トランスポゾン挿入部位に隣接するゲノムｃＤＮＡを単離し、配列決定された。続いて、影響を受けた遺伝子を同定するために、隣接ＤＮＡのヌクレオチド配列をサッカロミセス・セレビシアエのゲノム配列と比較した。
スクリーニング５．侵入欠損変異体の高コピー抑制因子の同定
酵母ゲノムＤＮＡを含有するプラスミドのライブラリーを侵入欠損（Ｉｎｖ−）二倍体ｗｈｉ３株に形質転換した。これらのライブラリープラスミドは、
高コピー数で維持を促進する複製起点を含有していた（２μ起点）。選択培地（ＳＣ−ＵＲＡ）上に形質転換体を播種し、１〜２日間プレートをインキュベートした後、プレート洗浄アッセイを行った。Ｉｎｖ表現型を抑圧した高コピープラスミドは、合成培地中への一過性の侵入性生育を促進した。この生育は、プレート洗浄アッセイ後に、寒天中に残存した小さな窪みのコロニーとして同定された。ＭＣＭ１とＰＨＤ２を含む、幾つかの遺伝子が、ｗｈｉ３変異体のＩｎｖ−表現型の高コピー抑制因子として同定された。続いて、Ｐｈｄ２が欠失した、ｍｃｍ１部分的機能喪失変異体の分析によって、これらの遺伝子は、侵入とＦＬＯ１１発現を制御することが実証された。
【００６７】
上記スクリーニングから、我々は、偽菌糸体生育又はサッカロミセス・セレビシアエの一倍体の侵入を制御する６０の遺伝子を同定した。インベイシンと呼ばれる、これらの遺伝子は、さらに、少なくとも６つのシグナル伝達カスケードに分類されてきた。変異又は過剰発現後に生じた表現型に基づいて、これらの遺伝子は、さらに、「真菌侵入促進」又は「真菌侵入阻害」として分類することができる。例えば、ＡＦＬ１の完全な欠失を含有するサッカロミセス・セレビシアエ株は、野生型株が糸を形成し、又は侵入する条件下で、糸の形成、又は侵入がなく、通常は、偽菌糸体生育又は一倍体の掘り込み中に侵入を誘導する条件下で、侵入が観察されない。シグナル伝達カスケードの例は、以下に記載されている。
【００６８】
寒天の侵入に必要とされるこのシグナル伝達経路を含む１２のサッカロミセス・セレビシアエ遺伝子が、同定、クローニング、特性決定された。その活性が、タンパク分解によって制御される転写因子をコードするＪＮＶ８は、該経路の最も下流に位置するメンバーである。他の１２のメンバー（ＩＮＶ１， ＩＮＶ３， ＩＮＶ５， ＩＮＶ９， ＩＮＶ１０， ＩＮＶ１１， ＩＮＶ１２， ＩＮＶ１３， ＩＮＶ１４， ＩＮＶ１５， ＩＮＶ１６， 及びＳＴＰ２２）は、全て、Ｉｎｖ８のタンパク分解制御に必要とされる。図１に示されているように、これまでに調べられた他の全てのインベイシン遺伝子の変異と異なり、これらの遺伝子の変異は、Ｉｎｖ８のプロセッシングをブロックする。ＩＮＶメンバーの一つ、Ｉｎｖ１４は、カルパインファミリーの細胞質システインプロテアーゼである。このシグナル伝達経路が、真菌で保存されており、他の真菌で、二次代謝産物及び細胞外基質を分解し得る分泌酵素の産生を制御できることは驚くべきことであった。サッカロミセス・セレビシアエ遺伝子の相同体は、例えば、アスペルギルス・ニードランス（ここでは、一群の類似した遺伝子が、細胞外ｐＨに応答して多数の分泌異化酵素の転写を制御する）；ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（多数の分泌アルカリプロテアーゼの転写制御因子として）；ペニシリウム・クリソジェナムとアスペルギルス・ニガー（アスペルギルス・ニードランスに見出されたのと類似の役割を有する）に見出されている。アスペルギルス・ニードランスとペニシリウム・クリソジェナムでは、該経路は、直接ペニシリンの産生を制御する（ペニシリンの産生は、活性化された形態の転写因子によって制御される）。
【００６９】
これらのシグナル伝達カスケード他の更なるメンバーは、様々な標準的手法を通じて同定される。第一に、変異株の表現型のエンハンサーとサプレッサーは、当業者に公知の標準的な手法を用いて単離される（Ａｕｓｕｂｅｌ、上記）。第二に、経路のメンバーと相互作用するタンパク質は、酵母ツーハイブリッド法を用いて単離される（Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｓｏｎｇ， Ｎａｔｕｒｅ １９８９， ２４０：２４５−２４６； Ｃｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９１， ８８：９５７８−９５８２； Ｂｒｅｎｔ ａｎｄ Ｆｉｎｌｅｙ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． １９９７， ３１：６６３−７０４）。一つの例では、Ａキナーゼの触媒サブユニットＴｐｋ２と特異的に相互作用し、関連タンパク質Ｔｐｋ１及びＴｐｋ３とは相互作用しないタンパク質が同定され、偽菌糸体の発育に重要であることが示された。ＳＬＡＤ（低窒素培地）上で生育された二倍体ｔｐｋ２株は、偽菌糸体の発育が完全に欠損しているのに対して、ｔｐｋ３二倍体株は、線状化が非常に増大していた（図２Ｂ）。同様に、一倍体ｔｐｋ２変異体は、侵入性生育が欠損しており、ｔｐｋ３変異体は、高侵入性であった（図２Ａ）。ｔｐｋ１変異体は、一倍体と二倍体の何れとしても、野生型株から区別できなかった。ｔｐｋ２ ｔｐｋ３変異体は、ｔｐｋ２一重変異体と同じ表現型を有していたので、ｔｐｋ３変異体の強調された線状化と侵入表現型には、機能的なＴｐｋ２が必要であった。Ｔｐｋ２は、偽菌糸体の生育のみに必要とされるようなので、我々は、Ｔｐｋ２と特異的に相互作用するタンパク質を同定するために、ツーハイブリッドスクリーニングを使用した。そのままの状態のＴＰＫ２のオープンリーディングフレームをＧａｌ４ ＤＮＡ結合のコーディング配列に融合し、Ｇａｌ４転写活性ドメインのコーディング配列に融合した酵母ゲノム断片のライブラリーをスクリーニングするのに使用した。ａｄｅ−株のアデニン非依存性生育をもたらすＧＡＬ４−ＡＤＥ２レポーターの活性化を、Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン：Ｔｐｋ２融合体とＧａｌ４活性化ドメインに融合されたＴｐｋ２相互作用タンパク質との相互作用に対する予備的な証拠とした。次に、Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインに融合されたＴｐｋ１、Ｔｐｋ２、Ｔｐｋ３、又はＤｐｈ１を用いて、陽性クローンに対してツーハイブリッドアッセイを再びテストした。ジフタミド（ｄｉｐｈｔｈａｍｉｄｅ）の生合成に必要とされる遺伝子、ＤＰＨ１、ＰＫＡイソフォームに特異的ではない相互作用を制御するために使用した。
【００７０】
二つのクラスのタンパク質が、ツーハイブリッドアッセイでＴｐｋ２と相互作用した：第一のクラスは、無差別であり、Ｔｐｋ１、Ｔｐｋ２、及びＴｐｋ３と相互作用した：第二のクラスは、選択的であり、Ｔｐｋ２と優先的に相互作用した（図３）。三つの全ての触媒サブユニットと相互作用したタンパク質の一つは、以前Ｔｐｋ１、Ｔｐｋ２、及びＴｐｋ３に結合することが示された、ＰＫＡの負の制御サブユニットＢｃｙ１である。第二のクラスは、ヘリックス−ターン−ヘリックスＤＮＡ結合モチーフを含有する一群の５つの酵母タンパク質（Ｍｇａ１、ＳｆｌＩ、Ｈｓｆ１、Ｓｋｎ７、及びＨｍｓ２）に属する転写因子候補であるＳｆｌ１とＭｇａ１からなる。Ｓｋｎ７以外は全て、少なくとも一つのコンセンサスＰＫＡリン酸化部位（［Ｒ／Ｋ］［Ｒ／Ｋ］Ｘ［Ｓ／Ｔ］）を含有する：Ｓｆｌ１は五つ、Ｍｇａ１は二つ、Ｈｓｆ１は四つ、及びＨｍｓ２は一つ有する。
【００７１】
我々は、ＭＧＡ１とＳＦＬ１のオープンリーディングフレームを共に欠失させた。ｓｆｌ１変異体は、劇的な表現型を有していた：ｓｆｌ１の一倍体株は、非常に房状（ｆｌｏｃｃｕｌｅｎｔ）であり、高侵入性であったのに対して、ｓｆｌ１の欠失がホモ接合である二倍体は、非常に線状化が増強されていた（図４Ａ−４Ｂ）。我々は、ｔｐｋ２の偽菌糸体欠損が、Ｓｆｌ１機能の喪失によってブロックされるかどうかを見るために、ｓｆｌ１ ｔｐｋ２二重変異体を構築した。ｓｆｌ１ ｔｐｋ２二重変異体は、ｓｆｌ１一重変異体と同一の表現型を有しており、Ｓｆｌ１が、Ｔｐｋ２の下流で作用することが示唆された（図４Ａ−Ｂ）。我々は、ｍｇａ１ヌル変異変異体では、偽菌糸体欠損形成に劇的な欠損を検出することができなかった。
【００７２】
同様のツーハイブリッドスクリーニングは、本明細書に記載された任意のシグナル伝達カスケードのさらなるメンバーを同定するためにも使用することができる。次に、変異株又は過剰発現の構築のような当業者に公知の様々な手法を用いて、候補遺伝子を分析する。Ｉｎｖ８又はＳｆｌ１のような菌体シグナル伝達経路中の遺伝子の転写標的の同定は、細胞外基質の分解又は侵入に直接必要とされる遺伝子産物を同定するために使用される。例えば、Ｉｎｖ８転写標的の同定は、寒天への侵入に直接必要とされる遺伝子産物を同定するのに有用である。このような標的遺伝子の同定は、ＩＮＶ経路の優れたレポーターとなり、非プロセッシングｖｓタンパク分解されたＩｎｖ８タンパク質の相対活性を明らかにし、Ｉｎｖ８が、標的遺伝子を活性化し、抑制する機序を決定することを可能にする。あるいは、例えば、サッカロミセス・セレビシアエの表現型の相補性をスクリーニングすることによる、他の真菌中の相同体の同定は、抗生物質、抗高コレステロール血症剤、免疫抑制剤、又は抗真菌剤のような二次代謝産物の産生を調節する真菌の遺伝子産物を同定するために実施することができる。
【００７３】
本明細書に記載した研究に基づけば、新規抗真菌治療薬を発見し、開発すること；新規真菌二次代謝産物を同定し、商業化すること；現在入手できる真菌産物の収量を改善すること；および未知の真菌に挑戦するための手法と産物を開発することが可能となる。シグナル伝達機構は、真菌間で保存されているものと思われる。従って、本明細書に記載した発見に基づけば、これらの各シグナル伝達カスケードは、抗真菌薬及び／又は二次代謝産物の制御の標的となる。これらの中の何れかの遺伝子の変異した対立遺伝子を担持するサッカロミセス・セレビシアエ株は、アスペルギルス種、ペニシリウム種、アクレモニウム・クリソジェナム、ヤロウィア・リポリティカ、及びファフィア・ロドツィーマ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）のような重要な病原性真菌及び商業的に重要な真菌からの相同体を含む、真菌の相同体であって、変異した表現型を相補し、又は救出し得る相同体をスクリーニングするために使用できる。これらの株は、救出された生物が、増加した生育又は生存をし得るように、これらの生物は、本明細書に記載したセレクションをベースとするスクリーニングを用いて単離するように、遺伝的に修飾することができる。セレクションをベースとするスクリーニングは、高情報量を可能にし、このため、現在使用されているアプローチよりもさらに迅速に遺伝子を単離するアプローチを与える。さらに、変異した表現型を相補する遺伝子のスクリーニングは、機能的な特性を共有するが、ヌクレオチド又はアミノ酸レベルで高度の類似性を含有しない遺伝子の単離を可能とする。
インベイシン相同体の単離
任意の真菌細胞は、インベイシン相同体の分子クローニングの核酸源として用いることができる。インベイシン相同体（例えば、ＡＦＬ１， ＤＨＨ１， ＩＮＶ１， ＩＮＶ５， ＩＮＶ６， ＩＮＶ７， ＩＮＶ８， ＩＮＶ９， ＩＮＶ１０， ＩＮＶ１１， ＩＮＶ１２， ＩＮＶ１３， ＩＮＶ１４， ＩＮＶ１５， ＢＥＭ２， ＣＤＣ２５， ＨＯＧ１， ＩＲＡ１， ＭＣＭ１， ＭＧＡ１， ＰＥＴ９， ＰＨＤ２， ＰＨＯ２３， ＰＴＣ１， ＲＩＭ１， ＲＩＭ１５， ＳＦＬ１， ＳＲＢ１１， ＳＳＤ１， ＳＴＥ２１， ＳＴＰ２２， ＳＷＩ４， ＴＰＫ２， ＴＰＫ３， 又はＹＰＲ１）の単離には、真菌の侵入の促進又は阻害を伴う特性又は活性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の単離が含まれる。本明細書に記載されているインベイシン遺伝子及びポリペプチドの配列に基づき、当業者に周知の標準的な戦略と手法を用いて、様々な真菌（例えば、カンジダ、アスペルギルス、ペニシリウム、ムコール、モナスカス、トリコデルマ、フサリウム、トリポクラダム、アクレモニウム、クリプトコッカス、ウスティラゴ、マグネポルス（Ｍａｇｎｅｐｏｒｔｈｅ）、アクレモニウム、ヤロウィア、及びファフィア）から、さらなるインベイシン相同体の制御及びコーディング配列を単離することが可能となる。
【００７４】
ある例では、核酸ハイブリダイゼーションスクリーニングの慣用的スクリーニング法とともに、本明細書に記載された任意のインベイシン配列を使用してもよい。このようなハイブリダイゼーション手法とスクリーニング操作は、当業者に周知であり、例えば、「Ｂｅｎｔｏｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９７７， １９６：１８０； Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｈｏｇｎｅｓｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｕ．Ｓ．Ａ． １９７５， ７２：３９６１； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １９８７， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；及びＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ」に記載されている。ある例では、カンジダ・アルビカンスのＲＩＭ１ ｃＤＮＡ（本明細書に記載されている）の全部又は一部は、カンジダ・アルビカンスＲＩＭ１遺伝子と配列同一性を有する相同体を見出すために、組換え真菌ＤＮＡライブラリー（例えば、アスペルギルス・ニードランスから調製された組換え発現ライブラリー）をスクリーニングするためのプローブとして使用され得る。ハイブリダイジングしている配列は、以下に記載されている方法に従って、プラーク又はコロニーハイブリダイゼーションによって検出される。
【００７５】
あるいは、Ｒｉｍ１ポリペプチドのアミノ酸配列の全部又は一部を用いて、
Ｒｉｍ１ “ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ”オリゴヌクレオチドプローブ（すなわち、あるアミノ酸配列のための全ての可能なコーディング配列の混合物）を含むＲｉｍ１特異的オリゴヌクレオチドプローブを容易にデザインし得る。これらのオリゴヌクレオチドは、Ｒｉｍ１配列のＤＮＡストランド及び任意の適切な一部の配列に基づき得る。このようなプローブをデザインし、調製するための一般的な方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（上記）とＢｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ（上記）に記載されている。これらのオリゴヌクレオチドは、ＲＩＭ１相補配列にハイブリダイズし得るプローブとして、又は様々な増幅技術、たとえばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）クローニング戦略用のプライマーとしてのそれらの使用の何れかを通じて、ＲＩＭ１相同体の単離に有用である。所望であれば、様々なオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせを組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニング用に使用し得る。オリゴヌクレオチドは、本分野で公知の方法を用いて検出可能にラベルされ得、組換えＤＮＡライブラリーからのフィルターレプリカをプローブするために使用し得る。組換えＤＮＡライブラリーは、本分野で周知の方法、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（上記）に記載されているような方法に従って調製される。又は、それらは、市販の採取源から得られ得る。
【００７６】
該アプローチの一例では、７５％を超える同一性を有する相同なＲＩＭ１配列は、高ストリンジェンシー条件を用いて検出又は単離される。高ストリンジェンシー条件には、約４２℃、及び約５０％のホルムアミド、０．１ｍｇ／ｍＬの絞り取ったサケの精子ＤＮＡ、１％ ＳＤＳ、２×ＳＳＣ、１０％デキストランサルフェートでのハイブリダイゼーション、約６５℃、約２×ＳＳＣ、及び１％ ＳＤＳでの第一の洗浄後の約６５℃、及び約０．１×ＳＳＣでの第二の洗浄が含まれ得る。あるいは、高ストリンジェンシー条件には、約４２℃、及び約５０％のホルムアミド、０．１ｍｇ／ｍＬの絞り取ったサケの精子ＤＮＡ、０．５％ ＳＤＳ、５×ＳＳＰＥ、１×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）でのハイブリダイゼーション後の、室温、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳでの二度の洗浄、及び５５〜６０℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳでの二度の洗浄が含まれ得る。
【００７７】
別のアプローチでは、本明細書に記載されているカンジダ・アルビカンスのＲＩＭ１遺伝子と約２５％以上の配列同一性を有するＲＩＭ１相同体を検出するための低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件には、例えば、約４２℃、０．１ｍｇ／ｍＬの絞り取ったサケの精子ＤＮＡ、１％ ＳＤＳ、２×ＳＳＣ、及び１０％デキストランサルフェート（ホルムアミドなし）でのハイブリダイゼーション、及び約３７℃、６×ＳＳＣ、約１％ ＳＤＳでの洗浄が含まれる。あるいは、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、約４２℃、及び約４０％のホルムアミド、０．１ｍｇ／ｍＬの絞り取ったサケの精子ＤＮＡ、０．５％ ＳＤＳ、５×ＳＳＰＥ、１×デンハルトで、その後室温、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳでの二度の洗浄、及び室温、０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳでの二度の洗浄で実施し得る。これらのストリンジェンシーの条件は、例示である；他の適切な条件は、当業者によって決定し得る。
【００７８】
所望であれば、慣用法を用いて、ＲＩＭ１転写物の存在又は不存在を決定するために、任意の真菌（例えば、本明細書に記載されている真菌）から単離した全ＲＮＡ又はポリ（Ａ＋）ＲＮＡのＲＮＡゲルブロット分析を使用し得る。一例として、アスペルギルス・ニードランスＲＮＡのノーザンブロットは、標準的な方法に従って調製され、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、２．５×デンハルトの溶液、及び３００μｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡを含有するハイブリダイゼーション溶液中にて、３７℃で、ＲＩＭ１遺伝子断片を用いてプローブされる。一晩ハイブリダイゼーションを行った後、該ブロットを１０分間、各回１×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳを含有する溶液中において、３７℃で二度洗浄する。ブロットのオートラジオグラムは、真菌ＲＮＡサンプルにＲＩＭ１ハイブリダイジングＲＮＡが存在することを実証するために使用される。ハイブリダイズしているバンドは、この真菌が、Ｃ．アルビカンスＲＩＭ１相同体を発現していることの指標とされる。このハイブリダイズしている転写物の単離は、標準的なｃＤＮＡクローニング手法を用いて行われる。他の真菌の侵入は、類似の様式で評価され、クローニングし得る。
【００７９】
上述のように、インベイシンオリゴヌクレオチド（例えば、カンジダ・アルビカンスＲＩＭ１遺伝子から調製したオリゴヌクレオチド）は、例えば、ＰＣＲを用いた増幅クローニング戦略でのプライマーとしても使用し得る。ＰＣＲ法は、本分野において周知であり、例えば、「ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｅｒｌｉｃｈ， ｅｄ．， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， １９８９； ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９０； 及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（上記）」に記載されている。プライマーは、必要に応じて、例えば、（本明細書に記載されているような）増幅された断片の５’及び３’末端の適切な制限部位を含有せしめることによって、適切なベクターに増幅された産物がクローニングされるようにデザインされる。所望であれば、ＲＩＭ１配列は、ＰＣＲ「ＲＡＣＥ」手法、すなわち「Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ（例えば、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（上記）参照）」を用いて、単離し得る。この方法により、カンジダ・アルビカンスのＲＩＭ１配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマーは、３’及び５’方向に向けられ、重複するＰＣＲ断片を作成するために使用される。これらの重複する３’と５’末端ＲＡＣＥの産物は、元の完全長ｃＤＮＡを産生するために結合される。該方法は、Ｉｎｎｉｓら（上記）；及びＦｒｏｈｍａｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ ８５：８９９８， １９８８に記載されている。ＲＩＭ１相同配列を増幅するのに有用なオリゴヌクレオチドプライマーの例には、
2004512001.tif 000003
が含まれるが、これらに限定されない。
【００８０】
上記各配列において、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣである。
【００８１】
あるいは、任意の真菌ｃＤＮＡ又はｃＤＮＡ発現ライブラリーは、本明細書に記載された標準的方法に従って、インベイシン変異体（例えば、本明細書に記載されているＲＩＭ１及びＡＦＬ１変異体）の機能的な相補によってスクリーニングされ得る。
【００８２】
配列のインベイシンポリペプチドとの関連性の確認は、機能的相補性アッセイ、及び相同体及び発現された産物の配列比較を含む様々な慣用法によってなし得るが、これらに限定されない。さらに、遺伝子産物の活性は、本明細書に記載された手法の何れか、、例えば、そのコードされた産物の機能的又は免疫学的特性に従って、評価し得る。
【００８３】
一度インベイシン相同体が同定されれば、それは、標準的な方法にしたがってクローニングされ、標準的な方法に従って、真菌発現ベクターの構築に使用される。
相互作用するポリペプチド
インベイシンタンパク質配列の単離は、インベイシンタンパク質と作用するポリペプチドの同定も促進する。このようなポリペプチドをコードする配列は、任意の標準的なツーハイブリッドシステムによって単離される（例えば、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ １９８９， ２４０：２４５−２４６； Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９２， ２５７：６８０−６８２； Ｚｅｒｖｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ １９９３， ７２：２２３−２３２）。例えば、Ｔｐｋ２配列の全部又は一部は、（ＧＡＬ４又はＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインのような）ＤＮＡ結合ドメインに融合され得る。この誘導タンパク質が、それ自身、適切なＤＮＡ結合部位を有するレポーター遺伝子（例えば、ｌａｃＺ又はＬＥＵ２レポーター遺伝子）の発現を活性化しないことを確定した後に、該融合タンパク質を相互作用の標的として使用する。続いて、活性化ドメイン（例えば、酸性活性化ドメイン）に融合されたタンパク質と相互作用する候補を宿主細胞中でＴｐｋ２融合体と同時発現させ、それらがＴｐｋ２配列と接触し、レポーター遺伝子の発現を刺激する能力によって、相互作用するタンパク質を同定する。このスクリーニング法を用いて同定されたＴｐｋ２と相互作用するタンパク質は、後天的な耐性シグナル伝達経路に含まれるタンパク質のよい候補となる。該方法の例は、本明細書に記載されている（下記）。
サッカロミセス・セレビシアエの変異を相補する真菌の相同体の単離
サッカロミセス・セレビシアエ変異株の使用の一つは、サッカロミセスセレビシアエの変異を相補できる他の真菌の相同体をスクリーニングすることである。ここで、我々は、このようなアプローチの効果に対する証拠を与える。我々は、ＩＮＶ８のＣ．アルビカンスの相同体（ＲＩＭ１（図５Ａ；配列番号３）と表記される）を同定した。完全長のＲＩＭ１が、サッカロミセス・セレビシアエｉｎｖ８株中のプラスミドから発現されると、細胞は、まだｉｎｖ８表現型を示していた。しかしながら、ＲＩＭ１の相同体（サッカロミセス・セレビシアエのＩＮＶ８、ヤロウィワ・リポリティカのＲＩＭ１０１、及びアスペルギルス・ニードランスのｐａｃＣ）は、活性化のためにタンパク分解によるプロセッシングを必要とする。サッカロミセス・セレビシアエのプロテアーゼは、カンジダ・アルビカンスのＲｉｍ１（図５Ａ；配列番号４）を切除することができないようである。これを支持するように、プロテアーゼ切断部位の直前で末端切断されたＲＩＭ１遺伝子は、サッカロミセス・セレビシアエのｉｎｖ８表現型を相補することが見出された（図５Ｂ）。これによれば、Ｒｉｍ１プロテアーゼは、カンジダ・アルビカンス中に存在するようであり、該プロテアーゼは、ＩＮＶ１４の相同体と考えられるであろう。サッカロミセス・セレビシアエの侵入と他の真菌による二次代謝産物の産生との相関という我々の発見に基づけば、全てではないにしても、多くのサッカロミセス・セレビシアエＩＮＶ遺伝子が、様々な真菌に相同体を有するものと思われる。実際、ＩＮＶ５、ＩＮＶ９及びＩＮＶ４は、それぞれ、アスペルギスル・ニードランス遺伝子のｐａｌＡ、ｐａｌＦ、及びｐａｌＢの産物と高いアミノ酸類似性を有するタンパク質をコードすると予想される。我々は、ＩＮＶ９近傍のゲノム領域の公開された配列が、幾つかの誤りを含有していることを見出した。ＩＮＶ９の正しいＤＮＡ配列（配列番号５）と予想されるポリヌクレオチドの配列（配列番号６）は、図６Ａ−Ｂに示されている。ＩＮＶ５／ｐａｌＡ、ＩＮＶ９／ｐａｌＦ、及びＩＮＶ１４／ｐａｌＢは、それぞれの生物中でＩｎｖ８／ＰａｃＣを活性化させるのに必要とされる。このようにこれらの遺伝子は、構造的及び機能的に保存された遺伝子である。さらに、ＩＮＶ９の相同体、ＩＮＶ１１及びＩＮＶ１３は、部分的に配列決定されたカンジダ・アルビカンスの遺伝子のリストに見出される（ｈｔｔｐ：／／ａｌｃｅｓ．ｍｅｄ．ｕｍｎ．ｅｄｕ．）。真菌スキゾサッカロミセス・ポンベのＩＮＶ１の相同体（ＧＥＮＢＡＮＫ ｌｏｃｕｓ：ＳＰＢＣ３Ｂ９）、ＩＮＶ１３の相同体（ＧＥＮＢＡＮＫ ｌｏｃｕｓ： ＳＰＢＣ４Ｂ４）、及びＩＮＶ１５の相同体（ＧＥＮＢＡＮＫ ｌｏｃｕｓ： ＳＰＡＣＣ１Ｂ３）と同様に、真菌クルベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）のＩＮＶ１１の相同体（ＧＥＮＢＡＮＫ ｌｏｃｕｓ： ＫＬＡＪ９８４８）も部分的に配列決定されている。ＳＴＰ２２の相同体（ＧＥＮＢＡＮＫ ｌｏｃｕｓ； ＳＣＺ８６１０９）は、真菌サッカロミセス・カールスベルジェンエシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｅｓｉｓ）において同定されている。ＩＮＶ経路の１２���クローニングされた遺伝子のうち、六つ（ＩＮＶ５、ＩＮＶ８、及びＩＮＶ１２−１５）は、真菌界の外に、明白な構造的相同性を有している。病原性の真菌、カンジダ・アルビカンス、及び重要な二次代謝産物であるペニシリンを産生する真菌、アスペルギルス・ニードランスを含む様々な真菌にＩＮＶ相同体が存在することは、様々な真菌の病原および二次代謝産物の産生に影響を与えるために、これらの遺伝子及び／又はそれらの活性を操作することの潜在的な有用性を強調するものである。さらなる相同体は、サッカロミセス・セレビシアエの変異株中で真菌のｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーから遺伝子を発現させ、変異表現型が相補又は増強されている形質転換体を選択することによって単離することができる。
侵入におけるそれらの役割を決定するための他の真菌遺伝子の変異生成
任意の真菌種から、侵入に関与するサッカロミセス・セレビシアエ・遺伝子の任意の特異的な相同体を単離した後、我々は、病原又はその真菌による侵入における遺伝子の役割を決定することができる。侵入を活性化又は増加させる任意のこのような遺伝子は、ビルレンスも活性化又は増加させるであろう。これらの遺伝子の機能の欠失又は不活化は、その真菌株のビルレンスを減少させるであろう。以下の遺伝子欠失の例は、前節からのカンジダ・アルビカンスＲＩＭ１遺伝子を利用する。
【００８４】
我々は、カンジダ・アルビカンスＲＩＭ１遺伝子が、カンジダ・アルビカンス中での侵入性の菌糸の成長に必要であるかどうかをテストした。ホモ接合のｒｉｍ１／ｒｉｍ１欠失を作った。カンジダ・アルビカンスのｒｉｍ１／ｒｉｍ１変異体は、寒天上、３７℃、血清の存在下で侵入性の菌糸を形成しないのに対して、非変異カンジダアルビカンスは侵入性の菌糸を形成する（図７）。変異した株のビルレンスは、様々な動物モデルを用いて決定することができる。全身感染のモデルの一つを一例として記載する。正常な「野生型」株と比較したカンジダの変異株の相対的なビルレンス（感染性）をテストするために、変異及び正常カンジダ細胞を別々の健康なマウスの尾静脈の中に注射する。次に、２週間から１月の間、マウスを観察する。変異したカンジダによって死んだマウスと正常なカンジダによって死んだマウスとの相対数が、ビルレンス指標を与える（Ｌｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ １９９７， ９０： ９３９−９４９参照）。さらに、侵入を阻害し、又は減少する任意の真菌遺伝子も二次代謝産物の産生を阻害又は減少させる可能性がある。このような遺伝子のうちの何れかの機能を欠失又は崩壊すれば、二次代謝産物の産生が増大するであろう。形質転換及び相同的組換え手法を含む遺伝子工学的な方法が、多くの真菌で実施されている（Ｐｕｎｔ ａｎｄ ｖｑｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９９２， ２１６：４４７−４５７； Ｔｉｍｂｅｒｌａｋｅ ａｎｄ Ｍａｒｓｈａｌｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８９， ２４４： １３１３−１３１７； Ｆｉｎｃｈａｍ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ． １９８９， ５３： １４８−１７０）。現在、遺伝子欠失手法は、カンジダ・アルビカンス（Ｆｏｎｚｉ ａｎｄ Ｉｒｗｉｎ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９３， １３４：７１７−７２８）、ウスティラゴ・メイディス（Ｆｏｔｈｅｒｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｈｏｌｌｍａｎ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９８９， ９：４０５２−４０５５； Ｂｏｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． １９９５， ２４８：５４７−５５２）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｎｅｕｖｅｇｌｉｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ １９９８， ２１３： ３７−４６； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９９７， ４８：２３２−２３５； Ｃｏｒｄｅｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９９６， ４６：１４３−１４８）、アクレモニウム・クリソジェナム（Ｓｋａｔｒｕｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． １９８７， １２：３３７−３４８； Ｗａｌｚ ａｎｄ Ｋｕｃｋ， Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． １９９３， ２４； ４２１−４２７）、マグナポルセ・グリージー（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）（Ｓｗｅｉｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． １９９２， ２３２： １８３−１９０）；Ｋｅｒｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １９９８， １７： ３８３８−３８４９）、ヒストプラズマ・カプシュレイタム（Ｈｉｓｔｏｐｌｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）（Ｗｏｏｄｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １９９８， １８０：５１３５−５１４３）、及びア��ペルギルス種（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９８５， ５： １７１４−１７２１； ｄｅ Ｒｕｉｔｅｒ−Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． １９８９， １６： １５９−１６３； Ｇｏｕｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． １９９５， ２７： ５３６−５４０； ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｍｂｅｒｇｈ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． １９９６， ２５１： ５４２−５５０； Ｄ’Ｅｎｆｅｒｔ， Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． １９９６， ３０：７６−８２； Ｗｅｉｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． １９９８， ３３：３７８−３８５）を含む多くの真菌で実施されているが、これらに限定されない。
【００８５】
この遺伝子欠失手法は、最強の表現型を与える真菌の相同体及び侵入特異的な相同体の選別を可能とする。遺伝子破壊の幾つかは、非病原性真菌をもたらすであろう。これらの遺伝子及びコードされるタンパク質は、化合物で標的とするための優れた候補である。他の破壊は、高侵入性真菌をもたらすであろう。アスペルギルス種、ペニシリウム種、アクレモニウム・クリソジェナム、ヤロウィア・リポリティカ、及びファフィア・ロドツィーマのような真菌中に存在するこれらの遺伝子の変異は、βラクタム抗生物質及びそれらの誘導体又はスタチンのような抗高コレステロール血症剤等の商業的価値のある二次代謝産物の産生を増加せしめるはずである。
二次代謝産物の産生を増加するための系
真菌は、彼らの生存に好ましい環境を作り出すために二次代謝産物を分泌する。これらの代謝産物は、極めて多くの商業的用途を有することも示されている。我々は、二次代謝産物の産生と侵入の制御との間に相関を発見した。ペニシリン産生の制御に関与するアスペルギルス・ニードランスのｐａｃＣ遺伝子は、侵入に役割を有する相同体がサッカロミセス・セレビシアエとカンジダ・アルビカンスの両者に存在する。ペニシリン産生の制御に関与するアスペルギルス・ニードランスの遺伝子ｐａｌＡ、ｐａｌＤ、及びｐａｌＦも、侵入に必要とされる相同体がサッカロミセス・セレビシアエに存在する。さらに、上述のように、我々は、カンジダ・アルビカンスにｐａｃＣの相同体を同定し（ＲＩＭ１）、これも侵入に必要であることを示した。同様に、サッカロミセス・セレビシアエによる基質への侵入を誘導する栄養状態の多くも、アスペルギルス・ニードランスに増加したペニシリンの産生をもたらす。例えば、限られた量のアンモニアの存在下における生育は、サッカロミセス・セレビシアエにおける偽菌糸体の生育とアスペルギルス・ニードランスにおけるペニシリンの産生の両者に重要である（Ｇｉｍｅｎｏ ｅｔ ａｌ， 上記、及び、Ｂｒａｋｈａｇｅ． Ａ． Ａ．， Ｍｉｃｒｏ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． １９９８， ６２：５４７−５８５参照）。我々が、侵入及びＦＬＯ１１プロモーターからの発現（下記）を制御することを示した遺伝子の多くは、アスペルギルス種、ペニシリウム種、アクレモニウム・クリソジェナム、ヤロウィア・リポリティカ、及びファフィア・ロドツィーマのような真菌中で二次代謝産物の産生も制御するであろう。この知見は、その多くが、商業的に価値が高い、より多量のこれらの二次代謝産物を産生する真菌株を作り出すために使用することができる。
【００８６】
遺伝学的な操作で二次代謝産物の産生を増加させる方法の一例は、真菌の侵入阻害遺伝子ＨＯＧ１を利用することである。我々は、ＨＯＧ１が、サッカロミセス・セレビシアエにおける一倍体の侵入と偽菌糸体の生育の負の制御因子であることを示した。サッカロミセス・セレビシアエのＨＯＧ１を変異又は欠失させると、野生型株が侵入し得ない条件で、基質に侵入するトランスジェニック株が得られる。アスペルギルス種、ペニシリウム種、アクレモニウム・クリソジェナム、ヤロウィア・リポリティカ、及びファフィア・ロドツィーマのような真菌中のＨｏｇ１タンパク質の活性を減少させると、シグナル伝達経路の脱抑制を介して、二次代謝産物の産生の増加をもたらす。タンパク質活性を減少させるための様々な方法が存在する。一つの方法は、本明細書に記載したように、真菌に適用し得ることが知られている相同的組換え手法を用いて、ＨＯＧ１遺伝子全体又はその一部を欠失させることである。どうように、遺伝子の変異誘発は、減少したタンパク質活性ももたらし得る。別の方法は、直接又は間接に、ＨＯＧ１の発現又はＨｏｇ１の活性を阻害する遺伝子又は化合物を適用することであろう。これらの遺伝子及び化合物は、本明細書に記載されたスクリーニング手法を用いて単離することができる。ＨＯＧ１に関して記載した方法は、同様に、ＧＲＲ１， ＩＲＡ１， ＢＥＭ２， ＴＰＫ３， ＳＦＬ１， ＳＳＤ１， ＲＩＭ１５， ＣＤＣ５５， ＳＷＩ４及びＥＬＭ１を含む任意の真菌の抗侵入遺伝子に適用できるが、これらに限定されない。
【００８７】
産生を増加させるための第二の機構は、ＩＮＶ８の相同体又は他の任意の真菌侵入促進遺伝子のような真菌侵入促進遺伝子の活性を増加させることである。一つの方法は、構成的に活性なプロモーターからこのような遺伝子を発現させることである。アスペルギルス・ニードランスのｇｐｄＡ遺伝子、アクレモニウム・クリソジェナムのｉｐｎＳ遺伝子、又はペニシリウム・クリソジェナムｐｈｏＡ遺伝子の何れかから得たプロモーター配列からの遺伝子の発現を誘導する発現システムのような発現システムは、当業者に周知である（Ｓｋａｔｒｕｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． １９８７， １２：３３７−３４８； Ｋｏｌａｒ ｅｔ ａｌ， Ｇｅｎｅ １９８８， ６２：１２７−１３４； ｄｅ Ｒｕｉｔｅｒ−Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． １９８９， １６： １５９−１６３： Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ １９８８， １１４：２１１−２１６； Ｇｒａｅｓｓｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １９９７， ６３：７５３−７５６）。
【００８８】
真菌の侵入促進遺伝子の活性を増加させるための別の方法は、活性化変異の導入を介して、又は活性の増加をもたらす他の遺伝子への融合を作出することにより、遺伝的に真菌侵入遺伝子を変化させることである。融合タンパク質は、好ましくは、構成的に活性である。第三の方法は、コードされたタンパク質の活性が増加するように真菌の侵入遺伝子を変異させることである。例えば、サッカロミセス・セレビシアエのＩｎｖ８とその相同体ＰａｃＣは、転写活性特性にタンパク分解による切断を必要とする。我々は、この切断には、Ｉｎｖ８の核への局在化が必要なことを示した。Ｉｎｖ８を末端切断することができないと、Ｉｎｖ８の細胞質への蓄積をもたらす。これらのデータは、Ｉｎｖ８とその相同体の活性化が、タンパク質が核内に存在するその標的遺伝子に接近できるようになった結果であろうと示唆している。このように、プロテアーゼ切断部位のコーディング配列の上流へのストップコドンの導入によって引き起こされるＩｎｖ８又はＰａｃＣの末端切断は、構成的に活性な転写因子を作り出すであろう。別の方法は、直接又は間接に、ＩＮＶ８の発現又はＩｎｖ８の活性を増加させる化合物を適用することである。これらの化合物は、本明細書に記載したスクリーニング手法を用いて単離し得る。サッカロミセス・セレビシアエのＩＮＶ８は、ヤロウィア・リポリティカのＲＩＭ１０１、並びにアスペルギルス・ニードランス、アスペルギルス・ニガー及びペニシリウム・クリソジェナムのｐａｃＣと相同である。ｐａｃＣは、直接ペニシリンの産生を制御することが知られている。ペニシリンの産生は、活性化された形態の転写因子によって制御される。このように、記載した何れかの方法を用いてＰａｃＣ活性を増加させれば、ペニシリン産生の増加がもたらされるであろう。
ＦＬＯ１１プロモーターは、真菌侵入のレポーターである
細胞表面タンパク質Ｆｌｏ１１は、侵入性生育と線状生育（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｇｒｏｗｔｈ）に必要であることが報告されている（Ｌａｍｂｒｅｃｈｔｓ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｌｏ ａｎｄ Ｄｒａｎｇａｎｉｓ， １９９６； Ｌｏ ａｎｄ Ｄｒａｎｇａｎｉｓ， １９９８； Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｖａｒ． ｄｉａｔａｔｉｃｕｓでは、Ｆｌｏ１１は、Ｍｕｃ１と呼ばれている）。ＦＬＯ遺伝子は、細胞−細胞接着に必要とされるタンパク質をコードする（Ｔｅｕｎｉｓｓｅｎ ａｎｄ Ｓｔｅｅｎｓｍａ， １９９５）。四つのプロテインキナーゼ（Ｓｔｅ２０， Ｓｔｅ１１， Ｓｔｅ７及びＫｓｓ１）が関与するＭＡＰキナーゼ経路は、転写因子Ｓｔｅ１２／Ｔｅｃ１の活性を制御する。このシグナル伝達カスケードによって制御される遺伝子の一つがＦＬＯ１１である。
【００８９】
我々は、ＦＬＯ１１が、二倍体の線状生育及び一倍体の侵入を制御する他のシグナル伝達経路に対する下流の標的であることを発見した。これらの表現型を制御する一つの経路が、ＦＬＯ１１の発現も制御することは知られていたが、ＦＬＯ１１が、数個のシグナル伝達経路によるこのような複雑な制御の下にあると思われるのは驚くべきことであった。これらの発見を以下に概説する。
【００９０】
ＦＬＯ１１発現を制御する別のシグナル伝達カスケードの例は、ｃＡＭＰ／ＰＫＡ経路である。ＦＬＯ１１がｃＡＭＰ経路の標的であることを示唆する証拠は、以下のとおりである。ＭＡＰＫ経路とｃＡＭＰ／ＰＫＡ経路は共に、同一の活性化因子Ｒａｓ２により、線状化のために活性化されるので、線状生育に対するｃＡＭＰの別個の役割の分析には、Ｒａｓとは独立して、ＰＫＡの分岐を活性化する能力が必要とされる。この最終目標を達成するために、我々は、ＲＡＳ遺伝子（ＲＡＳ１とＲＡＳ２）と高親和性ｃＡＭＰホスホジエステラーゼＰＤＥ２を共に欠損する株（ｒａｓ１ ｒａｓ２ ｐｄｅ２）を構築した。Ｒａｓ１とＲａｓ２は、アデニレート・シクラーゼＣｙｒ１の活性化に必要とされ、ＰＤＥ２は、ｃＡＭＰの加水分解に必要とされるホスホジエステラーゼをコードしているので、ｒａｓ１ ｒａｓ２ ｐｄｅ２株は、ｃＡＭＰの合成と分解が損なわれている。Ｒａｓに誘導されたシグナルが、ＭＡＰＫカスケードに伝達できないので、このような株は、Ａキナーゼを誘導するための外来ｃＡＭＰに依存するはずであり、線状化に対するｃＡＭＰの効果は、Ｒａｓ／ＭＡＰＫシグナルに依存しないはずである。
【００９１】
ｒａｓ１ ｒａｓ２ ｐｄｅ２株（ＳＲ９５７）は、ＹＰＤ（酵母抽出物、ペプトン、デキストロース）上での生育にｃＡＭＰを必要とするが、ＳＣ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｏｍｐｌｅｔｅ）、ＳＬＡＤ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｏｗ ａｍｍｏｎｉａ ｄｅｒｔｒｏｓｅ）、及びＹＮＢ（ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ）培地上では、ｃＡＭＰがなくても生育し、低ｃＡＭＰレベルの指標であるグリコーゲンの高蓄積を示す。我々は、他者によって観察されているように（Ｎｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， １９８７）、ｃＡＭＰを添加しなくても、この三重変異体が生育できるのは、内部ｃＡＭＰを与えるのに十分な基礎シクラーゼ活性があるからと推測する。この見解を支持するように、我々は、我々のｒａｓ１ ｒａｓ２ ｐｄｅ２株の生育が、機能的シクラーゼ（ＣＹＲ１）遺伝子に依存することを観察した。
【００９２】
二倍体ｒａｓ１ ｒａｓ２ ｐｄｅ２株（ＳＲ９５９）は、ｃＡＭＰがなくてもＳＬＡＤ培地上で生育するが、偽菌糸体を形成しない。しかしながら、ｃＡＭＰを含有するＳＬＡＤ培地上では、該株は、非常に線状性である。さらに、ｃＡＭＰの添加は、線状化の誘導のみならず、基質の侵入をもたらす。ＣＡＭＰの存在下では、ｒａｓ１ ｒａｓ２ ｐｄｅ２株（ＳＲＳ５９）は、テストした全ての培地（ＹＰＤ， ＳＣ， ＳＬＡＤ）上で侵入性である。侵入性の生育は、ＹＰＤ上で一倍体株を用いると通常観察されるので、細胞の種類のシグナルと栄養学的なシグナルの両者が、細胞内の高いｃＡＭＰレベルによって回避され得る。
【００９３】
ＭＡＰＫ経路を活性化することによってｃＡＭＰが、線状化を誘導するかどうかを決定するために、我々は、線状化を誘導する濃度のｃＡＭＰを含有するＳＬＡＤプレート上で培養されたｒａｓ１ ｒａｓ２ ｐｄｅ２株におけるＫｓｓ１ ＭＡＰＫ経路特異的なレポーターＦＧ：：Ｔｙ１−ｌａｃＺ（Ｍｏｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，上記）の発現を測定した。ｒａｓ１ ｒａｓ２ ｐｄｅ２株（ＳＲ９５９）中のＦＧ：：Ｔｙ１−ｌａｃＺレポーターの発現レベルは、これらのｃＡＭＰレベルによって変化しなかった。さらに、ｃＡＭＰは、ｓｔｅ１２ ｒａｓ１ ｒａｓ２ ｐｄｅ２欠失株（ＳＲ１０８８）に線状化を誘導したので、ｃＡＭＰ／ＰＫＡ経路は、ＭＡＰＫ経路と並列的に作用していることを示している。
【００９４】
我々は、ｃＡＭＰによって、ｒａｓ１ ｒａｓ２ ｐｄｅ２株でＦＬＯ１１ ｍＲＮＡが誘導されるが、野生型バックグラウンドでは誘導されないことを実証した。ｃＡＭＰなしで三重変異株が生育するときには、ＦＬＯ１１転写物が検出できず、２ｍＭ ｃＡＭＰの存在下では強く誘導された。房状化（ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ）に必要とされ、Ｆｌｏ１１と２６％同一である別の細胞表面タンパク質Ｆｌｏ１をコードするＦＬＯ１の発現は、同一の条件下で１．４倍しか誘導されない。この結果は、ＦＬＯ１１の強力な誘導は、全ての房状化遺伝子の一般的な特徴ではないことを示している。ＦＬＯ１１のｃＡＭＰ誘導とｃＡＭＰの存在下で細胞が培養されるときに観察される形態的な変化との対応は、さらに、ＦＬＯ１１欠失の表現型によって支持される；ｆｌｏ１１ ｒａｓ１ ｒａｓ２ ｐｄｅ２株（ＳＲ１１２１）では、ｃＡＭＰは、侵入も線状化も誘導できない。これらのデータは、ＦＬＯ１１が、侵入性及び線状生育の誘導に必要とされるｃＡＭＰ依存性シグナル経路の中心的な標的であることを示唆している。
【００９５】
ＣＡＭＰの存在下での増強されたＦＬＯ１１転写は、細胞の形態的変化と相関する。２ｍＭのｃＡＭＰが存在する液体ＳＣで培養された細胞は、偽菌糸体様の細胞の鎖を示すのに対して、ｃＡＭＰが存在しない液体ＳＣで培養された細胞の多くは、単一の細胞であるか、又は単一の芽（ｂｕｄ）を有する細胞の何れかである。細胞−細胞接着に対するｃＡＭＰの効果は、細胞の伸長に対する環状ヌクレオチドの影響よりもずっと顕著である。
【００９６】
侵入性及び線状生育のレポーターとしてのＦＬＯ１１プロモーターの使用は、普遍的なようである。図９に示されているように、ＦＬＯ１１プロモーターは、侵入性及び偽菌糸体生育の良好なレポーターである。侵入又は偽菌糸体生育を減少させる変異体の場合、ａｆｌ１， ｓｔｅ１２， ｔｅｃ１， ｆｌｏ８， ｉｎｖ８， ｒａｓ２， ｔｐｋ２， ｐｈｄ１， ｐｈｄ２， ｉｎｖ６， ｉｎｖ７， ｗｈｉ３， ｄｈｈ１， ｍｅｐ２， ｐｔｃ１， ｍｃｍ１， ｉｎｖ１， ｉｎｖ１３及びｉｎｖ１４に対して、ＦＬＯ１１の発現と侵入／偽菌糸体生育には直接的な相関が存在した。さらに、侵入／偽菌糸体の生育の増加を示したｈｏｇ１、ｇｒｒ１、ｉｒａ１、ｔｐｋ３、及びｓｆｌ１変異体も、増加したＦＬＯ１１発現を示した。例えば、ＦＬＯ１１は、Ｔｐｋ２とＳｆｌ１の両者によって転写的に制御されている。ｔｐｋ２変異体のＦＬＯ１１発現は、１／１０に減少を示したのに対して、ｔｐｋ３変異体は、
３倍の上昇を有していた。ＦＬＯ１１ ｍＲＮＡのレベルは、ｔｐｋ２ ｔｐｋ３二重変異体でも１０倍減少していた。ＦＬＯ１１ ｍＲＮＡのレベルは、ｓｆｌ１変異体でも３倍増加し、ｓｆｌ１ ｔｐｋ２変異体で同じように増加した。ｓｆｌ１ ｔｐｋ３二重変異体のＦＬＯ１１ ｍＲＮＡレベルは、何れの一重変異体のレベルをも超えていた。
【００９７】
ＦＬＯ１１は、偽菌糸体生育と侵入の優れたレポーターであるのみならず、侵入及び偽菌糸体生育にも重要である。ｓｆｌ１ ｆｌｏ１１一倍体変異株は、リッチ培地上での侵入性生育ができず、ｓｆｌ１ ｆｌｏ１１ホモ接合二倍体変異体は、偽菌糸体の発育ができなかった。このように、ｆｌｏ１１機能喪失は、ｓｆｌ１機能喪失の高侵入性及び高線状表現型をブロックした。しかしながら、ｓｆｌ１ ｆｌｏ１１二重変異体の喪失は、ｆｌｏ１１一重変異体のそれに比べて顕著ではなく、ＦＬＯ１１が、偽菌糸体の発育と一倍体の侵入に関与する、唯一のＳｆｌ１の下流標的でないことを示唆している。
【００９８】
図１０に示された遺伝子を含む、シグナル伝達経路に位置する他の多くの遺伝子も、ＦＬＯ１１発現に必要とされるであろうと仮定するのが合理的である。これらの結果と侵入（そして、おそらくは、ＦＬＯ１１の発現）を制御する多数の更なる遺伝子の我々の近年の同定に基づいて、我々は、ＦＬＯ１１を制御する遺伝的な回路の樹形図を構築した（図１０）。表１に掲載されたこれらの遺伝子は全て、侵入及び／又は二形性の生育をブロックすることによって作用する新規抗真菌剤の候補標的である。
【００９９】
ＦＬＯ１１の制御された発現に、ＦＬＯ１１の該５’領域がどの程度必要であるかを決定するために、我々は、この非コーディング領域中に欠失を含有するプラスミドベースのＦＬＯ１１：：ｌａｃＺレポーター構築物の発現を調べた。ＦＬＯ１１の開始コドンから２８００塩基（ｂｐ−２８００）上流の領域に及ぶ１４の連続する２００ｂｐの欠失を構築した。ＢｇｌＩＩ部位を末端に含有するプライマーを使用し、ＹＥｐ３５５中にクローニングするＰＣＲにより、ＡＴＧの５’の３ｋｂ領域を増幅することによって、ＦＬＯ１１−ｌａｃＺレポータープラスミドを構築した（用いたプライマーの配列は、５’−ＣＧＣＡＣＡＣＴＡＴＧＣＡＡＡＧＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＴＣＣ−３’）（配列番号７）と５’−ＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＴＣ ＣＡＣＡＴＡＣＣＡＡＴＣＡＣＴＣＧ−３’）（配列番号８）。該レポーター中の各１４の欠失は、３ｋｂのＦＬＯ１１−プロモーター領域（ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてＹＥｐ３５５−ＦＬＯ１１：：ｌａｃＺからサブクローニングされた）を含有するＫＳ＋ブルースクリプトプラスミドを使用して、プライマー重複法によって構築された。変異誘発後、部分的に欠失されたｆｌｏ１１−ｎｎプロモーター配列をＹＥｐ３５５に再クローニングした。この目的で使用したプライマーは、
2004512001.tif 000004
得られた欠失シリーズのための１４のプラスミドを株１０５６０−２Ｂに形質転換した。βガラクトシダーゼの等価発現について、フィルターアッセイを用いて、少なくとも３つの独立したクローンをテストした。二倍体株は、１０５６０−２Ｂ ｆｌｏ１１−ｎｎ形質転換体と株１０５６０−５Ｂをそれぞれ交配することにより、添加成分としてロイシンのみを含有するＹＮＢ上で選択することによって作出した。
【０１００】
４００ｂｐの配列エレメントを含有する１４のプラスミドを１０５６０−２Ｂ、Ｌ５７９５、Ｌ５８１６、Ｌ６１４９、Ｌ６１５０、及びＳＲ９５７に形質転換した。βガラクトシダーゼの等価発現について、フィルターアッセイを使用して、少なくとも三つの独立したクローンをテストした。フィルターアッセイは、α−因子（５μＭ）の効果をテストするために使用した。
【０１０１】
ＦＬＯ１１プロモーターエレメントが多数存在し、これらのエレメントに影響を与える複数の条件があるために、実験のデザインには、いくつかの節約が必要であった。これらの各エレメントを含有する我々のプラスミドベースのレポーターからβガラクトシダーゼを測定することにより、迅速な株の構築とレポーター活性の再現性ある測定が可能となった。我々は、株がプラスミドを保持するように、分析を選択培地に限定した。我々のβガラクトシダーゼアッセイは、一般的に、二倍体株に対するより一倍体株に対してより高い活性を示す。リッチ培地の場合、この結果は、定常状態のｍＲＮＡレベルを測定することにより、ＦＬＯ１１の発現をモニターしたときに以前観察された結果と一致している。我々が、２４−２６時間後（ディオキシ生育後）に、又はＳＬＡＤ培地上で、ＦＬＯ１１：：ｌａｃＺを測定すると、一倍体細胞は１０倍、二倍体細胞は、５倍を超える誘導を示す。ＳＬＡＤ上での一倍体細胞に対するＦＬＯ１１：：ｌａｃＺのこの大きな誘導は、ＦＬＯ１１のｍＲＮＡを測定した実験では観察されなかった。この差は、ｍＲＮＡとタンパク質の安定性の差、又は培養をサンプリングした時間の差の何れかによるものであり得る。何れかの方法で測定したＦＬＯ１１の発現は、生育条件と生育期に極めて敏感である。
【０１０２】
総ＲＮＡは、熱い酸フェノールを用いて調製し、ノーザンブロットは、Ａｕｓｕｂｅｌら（上記）に記載されているように実施した。ＯＤ６００＝１．０になるまで、ｒａｓ１ ｒａｓ２ ｐｄｅ２を欠失した株をＳＣ＋１ｍＭ ｃＡＭＰの中でプレ培養した。ＳＣを用いて２度細胞を洗浄し、新鮮なＳＣ培地又はＳＣ培地＋２ｍＭ ｃＡＭＰ中に、ＯＤ６００＝０．３になるように希釈した。該細胞をＯＤ６００＝１．０になるまで、培養し、採集した。ホルムアルデヒドを含有するアガロースゲル上で、１０〜１５μｇのＲＮＡを分離した。ＦＬＯ１１ ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションについては、ＦＬＯ１１ ＯＲＦのｂｐ ３５０２−４０９３に対応するプローブを使用した。
【０１０３】
ＦＧ：：ＴｙＡ−ｌａｃＺのβガラクトシダーゼアッセイのための細胞を三日間ＳＬＡＤ−プレート上でインキュベートした；ＦＬＯ１１：：ｌａｃＺ発現研究のための細胞を、それぞれの液体培地中で培養し、Ｍｏｓｃｈら（上記）に従って定量した。
【０１０４】
２０時間生育した集密培養から、指数生育相にあるＦＬＯ１１：：ｌａｃＺ発現を定量するための細胞を新鮮な培地にＩ：２０で播種し、４〜６時間培養した。ディオキシシフト後に、ＦＬＯ１１：：ｌａｃＺ発現を定量するための細胞を２４〜２６時間生育させた。指数生育する培養に播種するために、同じ培養を使用した。ＳＬＡＤ培地でＦＬＯ１１：：ｌａｃＺ発現を定量するための細胞をＳＣ培地中で２０時間プレ生育させ、２％のグルコースで二度洗浄し、ＳＬＡＤ培地中に１；５で希釈し、４〜６時間生育させた。ｃＡＭＰにより誘導されたＦＬＯ１１プロモーターセグメントを検出するために、各プラスミドを保有する株ＳＲ９５７を、１ｍＭ ｃＡＭＰを含有する選択培地で一晩生育させ、ｃＡＭＰを全く含有しない培地に１０時間移して２ｍＭのｃＡＭＰを含有するか、又は全くｃＡＭＰを含有する二つの培養に分割し、採集前に四時間生育させた。
【０１０５】
一倍体と二倍体の株で、欠失の発現をアッセイした。ＦＬＯ１１の発現は、細胞の生育相とともに変動するので、我々は、ＳＣ上で指数生育している細胞、グルコースが枯渇するまでＳＣ上で生育された細胞（ポスト−ディオキシ）、及びＳＬＡＤ（グルコースが多く、窒素が少ない培地）上の細胞を調べた。
【０１０６】
各ＦＬＯ１１：：ｌａｃＺプロモーター欠失に対する酵素アッセイにより、多くの部位を有する異常に長いプロモーターが明らかとなる。もし、その欠失が、少なくとも三倍ｌａｃＺの発現を増加せしめれば、次のセクションでは、暫定的に、この部位を上流抑制部位（ＵＲＳ）と呼び、もし、その欠失が少なくとも３０％の発現減少をもたらせば、上流活性化部位（ＵＡＳ）と呼ぶ。
【０１０７】
各ｆｌｏ１１−ｌａｃＺプロモーター欠失の酵素アッセイによるシス−エレメントの分析によって、本来のＦＬＯ１１プロモーターが、非常に抑制されていることが明らかになる。該欠失には、その活性が生育状態、栄養条件、及び細胞の種類に依存する少なくとも九個のＵＲＳエレメントが明らかとなる。ＵＲＳエレメントの一つは、ｆｌｏ１１−１４（ｂｐ −２６００−２８００）によって規定され、シス−エレメントが、ＦＬＯ１１のコーディング領域の候補から少なくとも２８００塩基対離れたところに存在していることを示している。一般的に、一倍体株は、二倍体株より強い抑制を示す。
【０１０８】
抑制部位の活性を可視化するための明瞭な方法は、各々の条件に対するｌａｃＺ活性とＳＬＡＤ上で生育された一倍体のｌａｃＺ活性を比較することである。この比較により、ｆｌｏ１１−４，−５， −７， −８， −１２， −１３及びｆｌｏ１１−１４内のＵＲＳエレメントが明らかになる。これらサブセットのエレメントは、全ての培地上での抑制に対する鍵であるが、ＳＬＡＤ上で生育された一倍体における効果が最強である。一倍体特異的な効果は、欠失ｆｌｏ１１−４，−１０， −１１， −１２及びｆｌｏ１１−１３に対して見出される。明らかに、ｆｌｏ１１−４， −１１， −１２及びｆｌｏ１１−１３には、一倍体特異的なＦＬＯ１１の窒素抑制で機能する部位が存在する。
【０１０９】
一倍体と二倍体株には、その他の差異が存在し、最も顕著なのが、：１）ＳＣ上での二倍体で（指数生育）、ｆｌｏ１１−４は、２倍減少した発現レベルを有するのに対して、一倍体では、３３倍上昇した発現を有すること；２）ディオキシシフト後の二倍体では、ｆｌｏ１１−１１は、３倍減少したレベルを有しているのに対して、一倍体では、１２倍上昇した発現を有している。二倍体細胞では、ｆｌｏ１１−４、ｆｌｏ１１−１０、及びｆｌｏ１１−１１は、ＵＡＳエレメントとして作用する。ｆｌｏ１１−５は、一倍体と二倍体の両者において、強力に窒素制御された部位である。
【０１１０】
欠失分析は、ＦＬＯ１１の発現に必要とされる配列エレメントも明らかにした。テストした全ての条件下で、ｆｌｏ１１−６は、発現が劇的に減少し、ｆｌｏ１１−６（−１２００〜−１０００）中の欠失した配列は、強いＵＡＳを含有することを示唆している。さらに、ｆｌｏ１１−１、ｆｌｏ１１−２、及びｆｌｏ１１−３は、一貫して、野生型のＦＬＯ１１−ｌａｃＺレポーター構築物に比べて、より低い活性を示し、これらは、ＦＬＯ１１プロモーター中のＵＡＳエレメントとして同定されている。ｆｌｏ１１−１の発現が減少しているのは、この構築物からＴＡＴＡＡ領域が欠失している結果であろう。
【０１１１】
我々は、染色体のＦＬＯ１１遺伝子座に二つのｆｌｏ１１プロモーター変異を作成した。そのうちの一つｆｌｏ１１−１６では、我々は、実質的にプロモーター領域全体（−１５０〜−２９４７）を欠失させた。残りの一つでは、我々は、野生型プロモーター全体をｆｌｏ１１−６と置き換えた。ＦＬＯ１１プロモーターの染色体欠失は、塩基対−２９４７〜−１５０をＵＲＡ３と置きかえることによって行い（使用したプライマーの配列は：
2004512001.tif 000005
【０１１２】
染色体ＦＬＯ１１プロモーター領域にｆｌｏ１１−６を作成するために、形質転換により、ＵＲＡ３遺伝子をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したＫＳ＋ｆｌｏ１１−Ｄ６と置き換えて、５−ＦＯＡ上での選別により、塩基対−１０００〜−１２００（ＳＲ１１７４）の欠失を得た。
【０１１３】
ｆｌｏ１１−１６又はｆｌｏ１１−６の何れかを担持する株は、完全に一倍体侵入性生育を欠損しており、二倍体（例えば、ｆｌｏ１１−６／ｆｌｏ１１−６）のように、非常に減少した線状化を示す。一倍体の侵入欠損は、ＦＬＯ１１コーディング領域の欠失のそれと同程度に著しいものである。ｆｌｏ１１−６構築物が欠失したセグメントをＦＬＯ１１発現用の必須ＵＡＳとして同定したｆｌｏ１１−６を用いた結果は、ｌａｃＺプラスミド構築物からのデータに基づく我々の結論を支持している。
【０１１４】
ＦＬＯ１１プロモーターのＵＡＳエレメントを同定するための第二のアプローチでは、我々は、基礎転写ユニットに融合されたｌａｃＺレポーターの活性化をテストするために、約４００塩基対の１４個の各配列エレメントをデザインした（図１１）。ＵＡＳ配列エレメントを決定するために、２００ｂｐ重複する１４の各４００ｂｐエレメントをＰＣＲによって増幅し、ｐＬＧ６６９Ｚの中にクローニングした。このベクターは、ｌａｃＺ遺伝子に融合されたＣＹＣ１遺伝子のコドンを一つ含有し、この融合された遺伝子の前には、ＣＹＣ１の上流に横たわる１１００のヌクレオチドがある。プロモーター断片は、−６８３〜−２４９位にＸｈｏＩ制限部位を有する。ＸｈｏＩ断片を切り出し、ＦＬＯ１１プロモーターからの断片と置き換えた。該断片は、ＦＬＯ１１の開始コドンに対して、以下の位置に対応する：ＦＬＯ１１：−１〜−４２１（ＦＬＯ１１−２／１），−１８１〜−６１８（ＦＬＯ１１−３／２），−３８０〜−８１９（ＦＬＯ１１−４／３），−５８０〜−１０ｌ７（ＦＬＯ１１−５／４），−７７８〜−１２１９（ＦＬＯ１１−６／５），−９８０〜−１４２０（ＦＬＯ１１−７／６），−１１８１〜−１６１９（ＦＬＯ１１−８／７），−１３８０〜−１８１９（ＦＬＯ１１−９／８），−１５７２〜−２０１９（ＦＬＯ１１−１０／９），−１７８０〜−２２１９（ＦＬＯ１１−１１／１０），−１９８０〜−２４１９（ＦＬＯ１１−１２／１１），−２１８０〜−２６１９（ＦＬＯ１１−１３／１２），−２３８０〜−２８１９（ＦＬＯ１１−１４／１３），−２５８０〜−２９８３（ＦＬＯ１１−１５／１４）。クローニングの目的で、ＰＣＲプライマーの５’末端に制限部位（ＸｈｏＩ）を導入した。この目的で使用したプライマーは：
2004512001.tif 000006
であった。
【０１１５】
このレポーター構築物シリーズは、ｂｐ−２００〜−４００の間で重複するセグメントＦＬＯ１１−２／１とＦＬＯ１１−３／２、ｂｐ−１２００〜−１０００の間で重複するＦＬＯ１１−６／５とＦＬＯ１１−７／６、及びｂｐ−２０００〜−１８００の間で重複するＦＬＯ１１−１０／９とＦＬＯ１１−１１／１０にＵＡＳエレメント同定された。これらの配列エレメントは、基礎転写ユニットを含有するが、挿入をもたないレポータープラスミドと比較して、βガラクトシダーゼ活性に２倍を超える増加を示している。ＦＬＯ１１−２／１、ＦＬＯ１１−３／２、及びＦＬＯ１１−１１／１０の活性は、ポスト−ディオキシの細胞中で誘導される。２００倍にも及ぶ誘導をもたらす。これらの結果は、エレメントＦＬＯ１１−２、ＦＬＯ１１−３、及びＦＬＯ１１−１１が、生育の後期段階におけるＦＬＯ１１の発現に必要とされることを示唆した。欠失分析と合わせれば、これらのデータは、ＦＬＯ１１プロモーターには、少なくとも四つのＵＡＳエレメントが存在することを示唆していた。ＦＬＯ１１プロモーターは、サッカロミセス・セレビシアエ・バール・ディアスタティカスのＭＵＣ１， ＳＴＡ１， ＳＴＡ２及びＳＴＡ３遺伝子のプロモーター領域と非常に相同性を有している。
【０１１６】
上記のプロモーター分析のタイプは、二倍体の線状生育又は一倍体の侵入に欠損を有する同定された一連の変異株と組み合わせると、トランス−エレメント（ｔａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）及びそれらによって標的とされるＦＬＯ１１プロモーターの領域の同定が可能となる。ある例では、我々は、ＦＬＯ８、ＳＴＥ１２、ＴＥＣ１が欠失した株、又はＳＴＥ１２とＴＥＣ１の両者を欠失した株に、１４個の各４００ｂｐ配列エレメントを形質転換した。
【０１１７】
ＦＬＯ８の欠失は、指数（それぞれ、８倍と４倍の減少）、及びポスト−ディオキシ生育（両エレメントともに５倍の減少）の両者で、ＦＬＯ１１−６／５とＦＬＯ１１−７／６の発現を著しく減少せしめる。これらのエレメントは、高ｃＡＰＭレベルによっても誘導される。ＦＬＯ８機能は、ポスト−ディオキシ生育相におけるＦＬＯ１１−３／２とＦＬＯ１１−８／７の最大発現にも必要とされるが、指数生育においては必要とされず、この結果は、Ｆｌｏ８が、栄養条件に応じて異なって機能し得ることを示唆している。
【０１１８】
ＳＴＥ１２の欠失は、ポスト−ディオキシ細胞よりも、指数生育細胞で、より強い効果を有していた。Ｓｔｅ１２を欠く指数生育細胞では、ＦＬＯ１１−６／５、ＦＬＯ１１／１０／９、及びＦＬＯ１１−１１／１０セグメントは、少なくとも発現が３倍の減少を示した。ポスト−ディオキシ細胞では、ＦＬＯ１１−１０／９のみが、ＳＴＥ１２欠失株減少した発現を示した。
【０１１９】
ＴＥＣ１の欠失は、ＦＬＯ１１挿入レポーターシリーズの発現に対して顕著な影響を与えたが、この減少は、指数生育細胞のみで観察することができ、ＳＴＥ１２又はＦＬＯ８が欠失された株で観察されたものに比べて、顕著でなかった。この観察は、本来のＦＬＯ１１プロモーターのノーザン分析と一致しており、ＦＬＯ１１ ｍＲＮＡレベルは、ＳＴＥ１２（Ｌ５７９５）又はＦＬＯ８（Ｌ５８１６）が欠失した株での減少に比べて、ＴＥＣ１（Ｌ６１４９）が欠失した株ではより低い減少を示した。ＦＬＯ１１−６／５、ＦＬＯ１１−１０／９、及びＦＬＯ１１−１１／１２は、指数生育細胞では、ＴＥＣ１に依存していた。ｓｔｅ１２株中のＴＥＣ１の欠失は、一重変異株に比べて、ＦＬＯ１１−１０／９の発現に中程度の減少を示した。しかしながら、ＳＴＥ１２の欠失は、ＴＥＣ１の欠失に比べて、１０倍を超える強い効果をもたらしたので、この結果は、この部位におけるＳｔｅ１２のＴｅｃ１非依存性の役割を示唆し得る。
【０１２０】
我々の結果は、Ｆｌｏ８とＳｔｅ１２／Ｔｅｃ１が、大部分が重複していないＦＬＯ１１プロモーター中の複数の部位を介して作用することを示唆している。Ｆｌｏ８とＳｔｅ１２の最強の効果は、指数及びポストディオキシ細胞の何れにおいても、ＦＬＯ１１プロモーターの二つの異なる配列エレメントで観察された。Ｆｌｏ８は、ｆｌｏ１１−６（ｂｐ−１２００〜−１０００）で規定された配列エレメントに作用したのい対して、Ｓｔｅ１２は、ＦＬＯ１１−１０／９に対して作用した（ｂｐ−１８００〜１６００）。ＦＬＯ１１−１２／１１とＦＬＯ１１−１０／９は、Ｔｅｃ１とＳｔｅ１２の両者により標的とされた。異なる転写因子に対して空間的に離れた部位が存在することは、ＦＬＯ１１の転写に対して、複合的なコントロール（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）が行われていることを支持する強力な証左である。
【０１２１】
第二の例では、我々は、ＡＦＬ１の変異株におけるＦＬＯ１１プロモーターの断片からのｌａｃＺの発現を測定した。この変異株の二倍体は、野生型酵母が糸を形成する条件下で、糸を形成せず、あるいは侵入しない。我々は、あるエレメントＦＬＯ１１−１１／１０が、発現に関して、完全にＡＦＬ１に依存することを発見した。我々は、酵母細胞が、対数期生育から定常期生育に変化するにつれて、ＦＬＯ１１プロモーター断片１１／１０からの発現は、１５倍以上誘導されることも見出した。さらに、この定常期のＦＬＯ１１−１１／１０からの転写の誘導は、完全にＡＦＬ１に依存していた。
【０１２２】
上述のように、ＦＬＯ１１の発現は、偽菌糸体生育と一倍体の侵入に関与する多くの遺伝子に依存している。このため、ＦＬＯ１１プロモーターの分析を様々な変異株と組み合わせることにより、我々は、ＦＬＯ１１を制御するトランス−エレメント及び標的として機能する重要なプロモーターエレメントをマップすることができるだろう。サッカロミセス・セレビシアエ遺伝子の多くは、他の真菌に相同体を有しているので、この分析により、真菌の侵入を阻害し、又は二次代謝産物の産生を促進する化合物に対する標的の候補を同定することが可能となろう。
【０１２３】
変異株と組み合わせて、ＦＬＯ１１プロモーター断片及び欠失を用いる別の例では、ｃＡＭＰシグナルが、ＦＬＯ１１転写を活性化するプロモーター中の部位
を決定した。我々は、培地にｃＡＭＰを添加することによって内部ｃＡＭＰレベルを操作し得る株であるｒａｓ１ ｒａｓ２ ｐｄｅ２変異株（ＳＲ９５７）の中に４００ｂｐのレポーターシリーズを形質転換した。ＳＲ９５７に２ｍＭ ｃＡＭＰを添加すれば、ｃＡＭＰなしで生育したＳＲ９５７に比べて、ＦＬＯ１１−６／５が３倍誘導され、ＦＬＯ１１−７／６、ＦＬＯ１１−８／７、及びＦＬＯ１１−１０／９が２倍誘導された。これらの結果は、トランス−エレメントが、一より多いシス−エレメントを介して、ｃＡＭＰを介するシグナルを通じて、ＦＬＯ１１の発現をアップレギュレートされることを示唆している。ｃＡＭＰによって最も強く誘導されたセグメントは、重複するエレメントＦＬＯ１１−６／５とＦＬＯ１１−７／６（ｂｐ −１２００〜−１０００）によって規定され、同エレメントは、Ｆｌｏ８の標的となる。先に示したように、このエレメントは、侵入及び線状生育の誘導にも必要とされる。
【０１２４】
上述のように、ＦＬＯ１１転写物は、ＦＬＯ８遺伝子の欠失を含有する株（Ｌ５８１６、ｆｌｏ８−２）では検出されなかった。さらに、ｃＡＭＰによるＦＬＯ１１の誘導は、ＦＬＯ８の欠失を担持するｒａｓ１ ｒａｓ２ ｐｄｅ２変異株（ＳＲ１０８１）ではブロックされる。ｓｔｅ１２ ｒａｓ１ ｒａｓ２ ｐｄｅ２変異株（ＳＲ１０８８）は、ｆｌｏ８ ｒａｓ１ ｒａｓ２ ｐｄｅ２変異株（ＳＲ１０８１）のように、劇的に減少したＦＬＯ１１発現を有する。しかしながら、ＦＬＯ１１の転写は、ｓｔｅ１２ ｒａｓ１ ｒａｓ２ ｐｄｅ２株では、ｃＡＭＰによって誘導され得る。ｓｔｅ１２変異体では、ｃＡＭＰによってＦＬＯ１１が誘導されるが、ｆｌｏ８変異体では誘導されないことは、対応するこれらの株の表現型と整合する。すなわち、ｆｌｏ８ ｒａｓ１ ｒａｓ２ ｐｄｅ２株は、ｃＡＭＰの存在下において、ＳＬＡＤプレート上で糸を形成できないか、又はＹＰＤプレート上で寒天に侵入するのに対して、ｓｔｅ１２ ｒａｓ１ ｒａｓ２ ｐｄｅ２は、侵入性であり、且つ２ｍＭ ｃＡＭＰを含有するＹＰＤ又はＳＬＡＤプレート上で糸を形成することができる。このため、高ｃＡＭＰレベルは、ＦＬＯ１１の転写の活性化において、ＭＡＰＫカスケードの転写因子Ｓｔｅ１２要求性を回避できるが、Ｆｌｏ８要求性は回避できない。これらの実験は、幾つかのシグナル伝達カスケードが、ＦＬＯ１１のプロモーターに収束するモデルを支持する。
【０１２５】
それぞれ、ＦＬＯ８とＳＴＥ１２の過剰発現によるｓｔｅ１２とｆｌｏ８変異体の抑制パターンは、ＦＬＯ１１に対するそれらの共同コントロールのモデルを支持する。ｓｔｅ１２株（ＳＲ１０２１）におけるＦＬＯ８の過剰発現とｆｌｏ８株（ＳＲ１１３４）におけるＳＴＥ１２の過剰発現は、該変異体の偽菌糸体と侵入欠損を抑圧した。「抑圧された」株の偽菌糸体の形態は、野生型のそれとは同一でなかった。ＳＴＥ１２を過剰発現するｆｌｏ８株では、各偽菌糸体鎖の細胞は、野生型偽菌糸体の細胞に比べて、より伸長しているようにみえる。ＦＬＯ８を過剰発現するｓｔｅ１２株では、細胞が、野生型よりも長くない。しかしながら、それらは、より高密度の線状ネットワークを有している。このコロニーの形状は、ｃＡＭＰによって糸を形成するように誘導された株（ＳＲ９５９）と同様の形状である。
【０１２６】
過剰発現による抑圧のパターンは、ＦＬＯ１１の発現パターンに反映されていた。ＦＬＯ８の過剰発現は、ｓｔｅ１２変異体（ＳＲ１０２１）において、ＦＬＯ１１の発現を１０倍増加した。高レベルのＳｔｅ１２は、有毒なので、ＳＴＥ１２を過剰発現した逆の実験はより困難である。ＳＴＥ１２のレベルを制御するために、我々は、ガラクトースによって制御され得るＧＡＬ：：ＳＴＥ１２構築物を使用した。プラスミド上にＧＡＬ：：ＳＴＥ１２構築物を含有するｆｌｏ８株（ＳＲ１１３４）では、ＦＬＯ１１転写物のレベルは、対照プラスミド（ＳＲ１０９７）を形質転換した株と比較して、ＳＣグルコース培地上で３倍増加した。この増加は、おそらく、ＧＡＬプロモーターの不完全な抑制を表していた。ＳＣガラクトース培地中で四時間インキュベートすることによって、ＳＴＥ１２が誘導されれば、ＦＬＯ１１の発現は、１０倍増加した。
【０１２７】
高レベルの内部ｃＡＭＰが、ＦＬＯ１１の転写を刺激するかどうかを決定するために、我々は、それ以外は野生型である株のＩＲＡ１を欠失させた。Ｉｒａ１は、ＲｓＳ−ＧＴＰをＲａｓ−ＧＤＰに転換することによって、ＲａｓＧＴＰを非活性化させるＲａｓ−ＧＡＰである。Ｉｒａ１の機能が失われると、活性化されたＲａｓの割合が高くなり、このため、細胞内のｃＡＭＰレベルの上昇がもたらされる（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ， １９８９）。ｉｒａ１変異株（ＳＲ５９９）では、ＦＬＯ１１転写物は、強く誘導された。このＦＬＯ１１の誘導は、ＩＲＡ１機能を欠如した株の高侵入性表現型に反映されれいた。ｓｔｅ１２ ｉｒａ１変異体（ＳＲ１１３３）は、まだ高侵入性であり、少なくとも幾つかのｃＡＭＰシグナルが、ＭＡＰＫ経路とは独立していることを示している。しかしながら、ｆｌｏ１１ ｉｒａ１（ＳＲ１０７９）又はｆｌｏ８ ｉｒａ１（ＳＲ１１３２）株は、侵入できなかった。これらの結果は、高い内部及び外部ｃＡＭＰレベルによるＦＬＯ１１の誘導に、Ｆｌｏ８が必要とされるという解釈と合致する。ＦＬＯ８とＩＲＡ１を共に欠如する株（ＳＲ１１３２）は、ＦＬＯ１１転写物のレベルを劇的に減少していたのに対して、ｉｒａ１バックグラウンド（ＳＲ１１３３）中のＳＴＥ１２の欠失は、まだ野生型と同等のＦＬＯ１１転写物レベルを示していた。これらの結果は、ｉｒａ１ ｓｔｅ１２株の高侵入性表現型及びｉｒａ１ ｆｌｏ８株の非侵入性表現型と合致している。
【０１２８】
サッカロミセス・セレビシアエのＦＬＯ１１プロモーターの制御の分析によって、様々な真菌種における侵入の制御及び二次代謝産物の産生に関する価値ある情報が与えられ、そして与えられ続けるであろう。サッカロミセス・セレビシアエ又は他の真菌種の侵入又は二次代謝産物の産生に関わる他の遺伝子のプロモーターは、同様に、侵入と二次代謝産物の制御に関するさらに価値ある情報を与えるであろう。このようなプロモーターの例は、カンジダ・アルビカンスからのＥＣＥ１遺伝子プロモーターである。カンジダ・アルビカンスのＥＣＥ１遺伝子の発現は、非侵入性の酵母の生育から侵入性の菌糸の生育への転換中に、高度に誘導される。カンジダの侵入性生育の制御因子をクローニングするために、ＥＣＥ１プロモーターと大腸菌のｌａｃＺ遺伝子の融合体を構築した。具体的には、ＥＣＥ１の開始コドンの上流の７０６塩基とＥＣＥ１遺伝子の最初の１０コドンからなるＤＮＡ断片を作成するために、ＰＣＲプライマーをデザインした。酵母２μ／ＬＥＵ２シャトルベクター上に担持されたｌａｃＺとのインフレームな翻訳融合体を作り出すために、その断片をクローニングした。融合プラスミドは、ホモ接合のｌｅｕ２／ｌｅｕ２とｕｒａ３／ｕｒａ３であった二倍体サッカロミセス・セレビシアエ株を形質転換するために使用した。続いて、酵母２μ／ＵＲＡ３ベクター中にクローニングされたカンジダ・アルビカンスのゲノムＤＮＡ断片のライブラリーを用いて該株を形質転換した。得られた二重形質転換体は、補充アミノ酸を欠く選択培地上で回収され、プールされた後、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）と．００３％ ｗ／ｖＸＧＡＬを含有した最小培地上に、低密度で再プレーティングされた（２００−３００コロニー／プレート）。該プレートを一週間インキュベートし、クローニングされたカンジダの侵入制御因子は、ＥＣＥ１プロモーターを介したｌａｃＺの転写を活性化すると考えて、濃青色のコロニーを取り出した。２μ／ＵＲＡ３プラスミドは、青い形質転換体から単離し、再テストした後、クローニングしたＤＮＡの配列を決定した。同定された遺伝子の一つが、かんじだＡＦＬ１であった。サッカロミセス・セレビシアエ中でのカンジダＡＦＬ１遺伝子の発現は、通常であれば、基質に侵入しないリッチ培地条件下で、二倍体に対して、増大した侵入性の行動を付与した。カンジタＡＦＬ１遺伝子の相同体を標準的にデータベースで検索することにより、サッカロミセス・セレビシアエ相同体が明らかになった。ＡＦＬ１の完全な欠失を含有するサッカロミセス・セレビシアエ株は、野生型酵母が糸を形成し、又は侵入する条件下で、糸を形成せず、又は侵入しなかった。
【０１２９】
ＡＦＬ１は、サッカロミセス・セレビシアエＦＬＯ１１（上記）とカンジダＥＣＥ１の両者の発現を制御する。ＦＬＯ１１を制御する他のサッカロミセス・セレビシアエ遺伝子の相同体は、他の真菌においてそれ自体菌糸の生育又は侵入を制御する遺伝子プロモーターを制御するようである。下流の遺伝子は、当業者に公知の多くの手法によって決定できる。一つの例は、「ＤｅＲｉｓｉ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９７， ２７８：６８０」に記載されているようなマイクロアレー分析を使用することである。
【０１３０】
その機能をスクリーニングすることによって、カンジダの遺伝子をクローニングするために、カンジダＥＣＥ１遺伝子転写の誘導因子としてサッカロミセスを使用することは、侵入又は二次代謝産物の産生に関与する重要な真菌遺伝子を単離するための別のアプローチの例である。この実験で重要なカンジダの侵入制御因子をクローニングすることに成功すれば、その中でスクリーニングするための異種宿主としてサッカロミセスを使用することによって、潜在的に多様な種から転写の制御因子をクローニングできるという概念が証明される。この手法は、他の生物には利用できないが、サッカロミセスには利用できる洗練された分子遺伝学的なツールという利点を与える。これは、カンジダのような真菌に対してのみならず、潜在的には、哺乳動物種のような極めてかけ離れた種に対する示唆も有する。この方法は、非サッカロミセス種からの転写の制御因子の機能をより詳細に分析する上でも有用であり得る。異種宿主としてのサッカロミセスの使用は、カンジタ又は他の任意の生物の転写制御因子を単離するために、ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーを迅速にスクリーニングするための選択をベースとするスクリーニングと組み合わせることができる。
遺伝子と化合物用のスクリーニングアッセイ
上述のように、我々は、病原性に関与し、それ故、病原性真菌及び他の微生物病原体のビルレンスを減少させる化合物をスクリーニングするために、又は、あるいは、二次代謝産物の産生を増加させるために使用し得る多数の真菌の侵入促進及び侵入抑制因子を同定した。このようなスクリーニングアッセイを実施するためには、任意の数の方法を利用し得る。一つのアプローチによれば、候補化合物は、本明細書に記載された核酸配列の一つを発現する病原性真菌細胞の培地に様々な濃度で添加される。次に、例えば、核酸分子から調製された任意の適切な断片をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、標準的なノーザンブロット分析（Ａｕｓｕｂｅｌら、上記）により、遺伝子発現を測定する。候補化合物の存在下での遺伝子発現のレベルは、候補分子を欠いた対照培地中で測定されたレベルと比較される。侵入促進因子の発現の減少を促進する化合物は、本発明において有用であると考えられる；このような分子は、例えば、感染性生物の病原性と闘うための治療剤として使用し得る。侵入促進因子の発現の増加を促進する化合物は、本発明において有用であると考えられる；このような分子は、例えば、商業的に重要な二次代謝産物の産生を増加させる増強物質として使用し得る。
【０１３１】
所望であれば、候補化合物又は遺伝子の影響は、代わりに、タンパク質ポリペプチドレベルをアッセイすることによって測定し得る。インベイシンポリペプチドに特異的な抗体を用いたウェスタンブロッティング又は免疫沈降のような標準的な免疫学的手法を含む、好ましいタンパク質アッセイが多数存在する。例えば、免疫アッセイは、病原性生物中に存在する本発明のポリペプチドの少なくとも一つの発現を検出又はモニターするために使用し得る。このようなポリペプチドに結合し得るポリクローナル又はモノクローナル抗体（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ １９８８ｍ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓの記載に従って製造される）は、病原性ポリペプチドのレベルを測定するために、任意の標準的な免疫アッセイフォーマット（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、又はＲＩＡアッセイ）に使用し得る。別の例では、ポリペプチドレベルは、標準的なアッセイで、酵素活性を使用して決定し得る。例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）及びβガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子によってコードされる）の酵素活性の測定を可能とする標準的なキットを利用できる（例えば、Ｔｒｏｐｉｘ， Ｉｎｃ．， Ｂｅｄｆｏｒｄ Ｍａｓｓ．から入手できる、Ｇａｌａｃｔｏ−Ｐｌｕｓ ａｎｄ Ｇｕｓ ｌｉｇｈｔ ｓｙｓｔｅｍｓ）。タンパク質レベルは、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）、分光光度計、又は発光のような手法を用いても決定できる。インベイシン促進ポリペプチドの発現の減少を促進する化合物は、有用であると考えられる。このような分子も、例えば、感染性生物の病原性と闘うための治療剤として使用し得る。インベイシン促進ポリペプチドの活性の増加を促進する化合物も有用であると考えられる。このような分子は、例えば、商業的に重要な二次代謝産物の産生を増加させる増強物質としても使用し得る。
【０１３２】
これに代えて、又はこれに加えて、本発明のインベイシンポリペプチドに特異的に結合し、阻害する化合物を探索するために、候補化合物をスクリーニングしてもよい。このような化合物の効力は、インベイシンポリペプチドと相互作用する能力に依存する。このような相互作用は、任意の数の標準的な結合手法及び機能的なアッセイを用いて、容易にアッセイし得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌらに記載されたもの、上記）。例えば、候補化合物は、本発明のポリペプチドとの相互作用及び結合についてインビトロでテストし得、病原性をモジュレートする能力は、任意の標準的なアッセイ（例えば、本明細書に記載されたもの）によってアッセイし得る。
【０１３３】
ある例では、インベイシンポリペプチドに結合する候補化合物は、クロマトグラフィーをベースとする手法を用いて同定し得る。例えば、本発明の組換えポリペプチドは、該ポリペプチドを発現するように改変された細胞から標準的な手法（例えば、上記のもの）によって精製し得、カラム上に固相し得る。次に、候補化合物の溶液をカラムに通して、インベイシンポリペプチドに結合する能力に基づいて、インベイシンポリペプチドに特異的な化合物が同定され、カラムに固定化される。化合物を単離するためには、非特異的に結合した分子を除去するためにカラムを洗浄し、続いて、目的とする化合物をカラムから放出し、採取する。この方法（又は、他の任意の適切な方法）によって単離された化合物は、所望であれば、（例えば、高性能液体クロマトグラフィーにより）さらに精製してもよい。さらに、これらの候補化合物は、病原体のビルレンスを低下させる能力についてテストし得る（例えば、本明細書に記載したように）。このアプローチによって単離された化合物は、例えば、病原性の感染、疾病、又は双方の開始を治療し、または阻止するための治療剤としても使用し得る。１０ｍＭ以下の親和定数で病原性ポリペプチドに結合するものとして同定された化合物は、本発明において特に有用と考えられる。
【０１３４】
さらに別のアプローチでは、候補遺伝子及び化合物は、線状の侵入、菌糸体の生育、偽菌糸体の生育、又は一倍体の掘り込み中に、正又は負に制御されることが知られているプロモーターエレメントからの発現をモニターすることにより、真菌細胞のビルレンスを阻害する能力についてスクリーニングされる。これらの同じく選別をベースとするシステムは、ＦＬＯ１１プロモーター（ＰＦＬＯ１１）からの発現の増加をもたらす遺伝子又は化合物をスクリーニングするために、設計し得る。ある例では、ＰＦＬＯ１１は、発現が増加したときに、優れた生育を与える遺伝子に融合される。例えば、ｈｉｓ３変異体中に存在するときに、ＳＣ−ＨＩＳ上での生育を可能とするＰＦＬＯ１１−ＨＩＳ３融合体が作成された。該融合体は、化合物３−アミノトリアゾール（３−ＡＴ）によって、発現レベルを滴定できるというさらなる利点を有する。３−ＡＴは、十分な量で存在すれば、ＰＦＬＯ１１から発現されたＨｉｓ３を阻害し、この株をＳＣ−ＨＩＳ上で生育できなくするＨｉｓ３の拮抗阻害剤である。それ故、ＰＦＬＯ１１−ＨＩＳ３を含有する株の生育は、ＰＦＬＯ１１−ＨＩＳ３の発現が増加して３−ＡＴによるＨｉｓ３の拮抗阻害が克服されたときに播種されたＳＣ−ＨＩＳ＋３−ＡＴ上だけで起こる。転写因子Ｔｅｃ１の発現の増加は、このような株に３−ＡＴに対する耐性の増加を与える。異なる量の３−ＡＴを使用することによって、生育に必要なＰＦＬＯ１１−ＨＩＳ３の増加の程度をモジュレートすることができる。このような正の選別システムには、ＵＲＡ３， ＴＲＰ１， ＡＤＥ２， ＬＥＵ２を含む多くのマーカーを使用することができるが、これらに限定されない。当業者であれば、他の正の選別システムも該システムで機能することが理解できるであろう。
【０１３５】
別の例では、ＦＬＯ１１の発現をダウンレギュレートする遺伝子及び化合物を選別するために、劣った生育（その最極端な場合は−死滅）を与える遺伝子産物にＰＦＬＯ１１をリンクした遺伝子融合体を用いることができる。この場合、ＦＬＯ１１発現を減少及び／又は喪失させる任意の条件が、劣った生育を改善し、株を生育せしめるであろう。例えば、ＰＦＬＯ１１依存的にＳＣ−ＵＲＡ上での生育を可能とするＵＲＡ３オ−プンリーディングフレームへのＰＦＬＯ１１の融合体が作成された。ＵＲＡ３の発現は、５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ；５−ｆｌｕｏｒｏ−ｏｒｏｔｉｃ ａｃｉｄ）の存在下において、有毒なので、ＦＬＯ１１が発現していないことの選別は、ＰＦＬＯ１１ ＵＲＡ３融合体を担持する株のＳＣ＋５−ＦＯＡ上での生育をスクリーニングすることによって達成し得る。当業者であれば、、他の負の選別システムも該システムで機能することが理解できるであろう。
【０１３６】
上記システムは、ＦＬＯ１１の発現の有無の選別を可能にするが、同様の手法は、ＦＬＯ１１の発現の変化をスクリーニングするために使用し得る。定量できる有用なＰＦＬＯ１１のレポーター遺伝子融合体の他の例には、ｌａｃＺ及び緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）のような酵素又は蛍光レポーターが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３７】
ここに記載した選別及びスクリーニングシステムは、上述したもの以外に多くの潜在的な応用を有する。例えば、それらは、選別方法によって、ＦＬＯ１１を制御する多くの遺伝子の機能的相同体を同定するために使用できる。例えば、ｈｉｓ３が欠失され、且つＰＦＬＯ１１ＨＩＳ３融合体を担持する株でＦＬＯ１１の発現を喪失させる遺伝子の変異は、この株をヒスジチジン栄養要求体にする（ヒスチジンが欠損した培地中では生育できない）。しかしながら、このような株に（相補又は変異対立遺伝子の抑圧による）ＦＬＯ１１の発現を復活させる他の生物からのｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡクローンは、ヒスチジン欠損培地上での生育を選別することによって、直接選別することができる。同様に、サッカロミセス・セレビシアエ及び異種の生物からのＦＬＯ１１発現の新規制御因子は、同じ選別スキームを用いて同定し得る。
【０１３８】
菌糸体又は偽菌糸体の生育中に制御されることが知られているプロモーターを使用することの他の応用では、各シグナル伝達経路に必要とされるシス−エレメントをマッピングするために、欠失構築物を作成することができる。一例として、ＦＬＯ１１ ＯＲＦの上流の３ｋｂ領域から２００ｂｐずつのｎｅｓｔｅｄ欠失が作成される、ＦＬＯ１１プロモーターのスクリーニングと選別アッセイが、様々な野生型および変異バックグラウンド株におけるｌａｃＺ発現に対する影響について分析されている。別の例では、ＦＬＯ１１プロモーターの重複する４００ｂｐの断片が、ＣＹＣ１転写ユニットにクローニングされる（図１１）。共に、これらの例は、どのＤＮＡ領域が発現に必要とされるか（及びこれらの各領域がどの程度必要とされるか）を実証するであろう。さらに、ＦＬＯ１１プロモーターのような菌糸体生育又は偽菌糸体生育中に制御されるサブクローニングされたプロモーター片とのレポーター遺伝子融合体は、別個の経路をブロックする（又は活性化する）様々な変異体での発現について評価され得る。当業者であれば、本明細書に記載したものを含む、他のインベイシンからの制御エレメントは、Ａｕｓｕｂｅｌら（上記）に記載された標準的な手法と共に、本明細書に記載した方法を用いて、記載に従って単離し得ることが理解できるであろう。これらの方法には、制御又はプロモーター領域候補からのＤＮＡセグメントのレポーター遺伝子への融合、及び欠失分析が含まれる。さらに、任意のインベイシンプロモーターの経路特異性は、野生型及び変異宿主株の使用によって決定し得る。あるＤＮＡセグメントが、野生型株でレポーター発現を与えるが、特定の変異体で全く発現しないか、又は増加した発現を示せば、この配列は、変異体が規定する経路によるインベイシンの発現を媒介すると推測される。このアプローチを用いて、ＦＬＯ１１を制御する別個の経路をレポートする一群の遺伝子融合体を作成することができる。ＣＹＣ１， ＰＧＫ１， ＡＤＨ１， ＧＡＬ１−１０， ｔｅｔ−Ｒ， ＭＥＴ２５及びＣＵＰ１を含む様々な基本又は誘導性プロモーターエレメントをこの手法に適用することができるが、これらに限定されない。上記システムを用いて、任意の処置について、ＦＬＯ１１の発現に対する作用様式を割り付けることができる。経路特異的なレポーターに対する化学的又は遺伝学的処置の影響を評価すれば、どの経路が、この処置によって変化したかを決定することが可能となろう。例えば、一つは、ＳＴＥ経路を介したＦＬＯ１１の発現をレポートするレポーター（レポーター１）、もう一つは、ＦＬＯ１１のＩＮＶ経路を介した発現をレポートするレポーター（レポーター２）という二つの異なるレポーター融合体を考える。もし、完全長のＰＦＬＯ１１の発現を消失させる能力によって同定された化合物Ｘが、レポーター１に影響を与えるが、レポーター２には影響を与えないことが示されれば、化合物Ｘは、ＳＴＥ経路の活性に影響を与えることによって、ＦＬＯ１１発現をブロックすると推定される。同様に、経路特異的なＰＦＬＯ１１レポーター構築物及びあるシグナル成分の活性化された対立遺伝子を用いれば、ある経路のどこで、化合物が影響を与えているかについても詳細が明らかとなるであろう。例えば、変異体ＳＴＥ１１−４及びＳＴＥ１２の過剰発現は、共にＦＬＯ１１の発現を増加すると予測される。もし化合物Ｘが、ＳＴＥ１１−４によって媒介されるＦＬＯ１１の増加した発現をブロックするが、ＳＴＥ１２の過剰発現をブロックしなければ、化合物Ｘは、ＳＴＥ１２の前だが、ＳＴＥ１１において又はＳＴＥ１１以降でＳＴＥ経路を拮抗すると推定し得る。様々な欠失変異体でのレポーターの発現を評価すれば、ＦＬＯ１１の発現を活性化する化合物の効果を評価するための同様のアプローチが可能となろう。
【０１３９】
これらの実験で用いたレポーターは、正と負の選別及び様々なスクリーニング法を可能とするために、完全長のＦＬＯ１１プロモーターについて記載したのと同様の方法で、利用することができる。これは、ＦＬＯ１１の発現の経路特異的モジュレーター（異種の遺伝子、化合物、ペプチド等）の同定を可能とするであろう。このようなシステムは、他の生物からこれらの制御遺伝子の重要な相同体のモジュレーターを同定する上でも有用である。例えば、小さなＧタンパク質Ｒａｓは、多種類のヒト腫瘍で活性化され、抗腫瘍因子の候補としてＲＡＳの阻害剤を同定するのは興味深い。酵母（例えば、二つの酵母ＲＡＳ遺伝子が欠失され、ヒトＲＡＳを発現する酵母株）中のヒトＲＡＳの活性をレポートするＦＬＯ１１プロモーター断片融合体を入手すれば、酵母で、ヒトＲａｓのモジュレーターを選別し、及び／又はスクリーニングすることが可能となろう。
【０１４０】
スクリーニングの別の例は、リッチ（ＹＰＤ）培地上で生育させると、一倍体のサッカロミセス・セレビシアエ由来の酵母が、偽菌糸体を形成せずに、寒天に侵入するという観察に基づいている。この非線状の侵入行動は、「掘り込み」と名付けられ、この行動を検出するために使用されるアッセイは、「掘り込みアッセイ（ｄｉｇ ａｓｓａｙ）」と名付けられている（ＲｏｂｅｒｔｓとＦｉｎｋ（上記））。リッチ培地上での一倍体のサッカロミセス・セレビシアエの掘り込みをブロックする変異は、低窒素条件下で、二倍体サッカロミセス・セレビシアエの偽菌糸体の成長及びに寒天への侵入も阻害する。掘り込みを欠失した変異株は、「掘り込みマイナス」、又は「掘り込み−」と称される。偽菌糸体の侵入と掘り込みアッセイでの行動との相関は、このスクリーニングの不可欠な側面である。掘り込みアッセイは、偽菌糸体侵入アッセイに比べて、比較的実施が容易であり、一倍体細胞で起こるので、劣性変異に依存する遺伝的アプローチにより向いている。
【０１４１】
我々は、病原性真菌が、所定の基質中への増加した侵入又は接着を特徴とする類似の掘り込み行動を示し得ることを発見した。例えば、カンジダ・アルビカンスは、種々の適切な条件（例えば、ＹＰＤ、及びＳＰＩＤＥＲ）で、基質の非線状侵入を示す。この行動は、報告されたサッカロミセス・セレビシアエの掘り込み行動と似ている。サッカロミセス・セレビシアエと同じく、任意のカンジダ・アルビカンス変異株による非菌糸性の寒天への侵入は、線状誘導条件下（例えば、寒天＋血清）で、その株が糸を形成能力と相関する。このため、真菌の掘り込み表現型をブロックする化合物をスクリーニングすれば、糸の形成をブロックし、その結果、発症をブロックする化合物の同定が可能となろう。これらの化合物は、抗真菌剤又は静真菌剤として有用と考えられる。同様に、基質への侵入を増加させる化合物のスクリーニングは、二次代謝産物の産生又は収量も増加させ得る化合物の同定を可能とするであろう。
【０１４２】
掘り込みアッセイの例を以下に示す。ある化合物が、最低生育阻害濃度よりずっと低い濃度で、非変異サッカロミセス・セレビシアエ又はカンジダ・アルビカンスの非線状の寒天への侵入に影響を与えるかどうかを調べるために、リッチ培地（ＹＰＤ）及び抗真菌剤フルコナゾールの勾配を含有する寒天プレート上に、これらの真菌をスポッティングした。次に、至適生育温度で二日間、該プレートをインキュベートし、水で洗浄した。両真菌ともに、生育を阻害するのに必要とされる濃度より有意に低いフルコナゾール濃度で、寒天の侵入の阻害を示した（図１２）。このアッセイは、Ｕ．ｍａｙｄｉｓのような他の二形性真菌及びその他の真菌に対して行い得る。全てのケースで、侵入アッセイは、侵入を阻害する化合物、又は侵入を促進する化合物を単離するために使用し得る。各種の化合物は、本明細書に記載した価値ある用途を有するであろう。
【０１４３】
必要に応じて、上記アッセイの何れかで同定された侵入阻害化合物は、任意の標準的な動物モデルに、病原性感染の進行に対する保護を与えるのに有用であると確認され得る。ここに、一例を記載する。もし成功すれば、候補化合物は、抗病原体治療剤として使用し得る。侵入促進化合物は、二次代謝産物の産生を評価することによって確認し得る。もし成功すれば、候補化合物は、これらの又は他の二次代謝産物の産生又は収量を増加させるための増強物質として使用し得る。
テスト化合物と抽出物
一般的に、本分野で公知の方法に従って、天然の産物と合成（又は半合成）抽出物の両者の大規模なライブラリから、又は化学ライブラリーから化合物が同定される。薬物の発見と開発の分野の当業者であれば、テスト抽出物又は化合物の正確な採取源は、本発明のスクリーニング操作にとって決定的なものではないことが理解できよう。従って、本明細書に記載した方法を用いて、実質的に任意の数の化学的抽出物又は化合物をスクリーニングすることができる。このような抽出物又は化合物の例には、植物、真菌、原核細胞、又は動物をベースとする抽出物、醗酵ブロス、及び合成化合物、並びに既存の化合物の修飾物が含まれるが、これらに限定されない。糖質、脂質、ペプチド、及び核酸をベースとする化合物を含む任意の数（これらに限定されない）の化学物質のランダムな、又は指向的な合成（例えば、半合成又は全合成）をもたらすためにも、多くの方法を利用し得る。合成化合物ライブラリーは、Ｂｒａｎｄｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ （Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ， ＮＨ）、及びＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， ＷＩ）から商業的に購入し得る。あるいは、細菌、真菌、植物、及び動物の抽出物の形態である天然の化合物のライブラリーは、Ｂｉｏｔｉｃｓ（Ｓｕｓｓｅｘ， ＵＫ）、Ｘｅｎｏｖａ（Ｓｌｏｕｇｈ， ＵＫ）、Ｈａｒｂｏｒ Ｂｒａｎｃｈ Ｏｃｅａｎｇｒａｐｈｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｅ（Ｆｔ． Ｐｉｅｒｃｅ， ＦＬ）、及びＰｈａｒｍａＭａｒ， Ｕ．Ｓ．Ａ． （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）を含む多くの供給元から商業的に購入し得る。さらに、所望であれば、本分野で公知の方法に従って、例えば、標準的な抽出と分画法によって、天然の及び合成的に製造したライブラリーが作成される。さらに、所望であれば、任意のライブラリー又は化合物は、標準的な化学的、物理的、又は生化学的方法を用いて容易に修飾され得る。
【０１４４】
さらに、薬物の発見と開発の分野の当業者であれば、可能であればいつでも、脱複製（ｄｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（例えば、分類学的な脱複製、生物学的な脱複製、及び化学的な脱複製、または任意のそれらの組み合わせ）（すなわちレプリケートすなわち抗病原活性が既に知られた物質のリピートを除去すること）する方法を利用し得ることを容易に理解できるであろう。
【０１４５】
ある粗抽出物が、侵入促進、又は侵入抑制活性、又は結合活性を有することが見出されたら、観察された効果に必要とされる化学的成分を単離するために、ポジティブリード抽出物のさらなる分画が必要である。このように、抽出、分画、及び精製工程のゴールは、所望の活性を有する粗抽出物中の化学的な実体（ｅｎｔｉｔｙ）を慎重に特性決定し、同定することである。このような異種抽出物の分画及び精製法は、本分野において公知である。所望であれば、疾病の発症の治療、又は二次代謝産物の増加した産生に有用な因子であることが示された化合物は、本分野で公知の方法に従って、化学的に修飾される。
薬学的治療剤と植物保護剤
本発明は、病原体の病原性又はビルレンスを阻害し得る化合物（ペプチド、小分子阻害剤、及び模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）を含む）を同定するための簡便な手段を提供する。従って、本明細書に記載された方法を用いて、医学的又は農学的に価値を有することが発見された化学的実体は、薬物、植物保護剤の何れかとして、又は、例えば、論理的ドラッグデザインにより、既存の抗病原体化合物の構造的修飾に関する情報として有用である。このような方法は、細菌、ウイルス、真菌、アネライド、線虫、プラチヘルミンセス（Ｐｌａｔｙｈｅｌｍｉｎｔｈｅｓ）、及び原生動物を含む（これらに限定されない）様々な病原体に対して影響を有する化合物をスクリーニングするのに有用である。病原性真菌の例には、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス種、ムコール種、クモノスカビ種、フサリウム種、ペニシリウム・マルネファイ、ミクロスポラム種、クリプトコッカス・ネオファルマンス・ニューモシスチス・カリニ、及びトリコフィトン種が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４６】
治療的に使用する場合、本明細書に開示した方法を用いて同定された組成物又は因子（ａｇｅｎｔ）は、例えば、生理的食塩水のような薬学的に許容される緩衝液中に調合して、全身投与し得る。処置は、例えば、病原性ポリペプチドに伴う生物学的現象を崩壊、抑圧、減弱、又は中和するアンタゴニストで動物を処置することによって、直接達成され得る。好ましい投与ルートには、例えば、患者に継続的、持続的な薬物レベルを与える吸入、又は、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、、又は皮内注射が含まれる。ヒト患者又は他の動物の治療は、生理的に許容される担体中の治療的有効量の抗病原因子を用いて実施されるであろう。適切な担体及びそれらの調合は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｂｙ Ｅ．Ｗ． Ｍａｒｔｉｎ」に記載されている。投与すべき抗病原因子の量は、投与様式、年齢、及び患者の体重、疾病の種類、及び疾病の範囲に応じて変わる。一般的に、量は、他の微生物疾病の治療に使用される他の因子に使用される量の範囲内であろうが、ある場合には、化合物の特異性の増加故に、より少ない量が必要とされる。化合物は、微生物の生育を阻害する用量で投与される。例えば、全身投与の場合、化合物は、典型的には、０．１ｎｇ〜１０ｇ／ｋｇ体重の範囲で投与される。
【０１４７】
農業に使用する場合には、本明細書に開示した方法を用いて同定された組成物又は因子は、植物の葉にスプレー又は粉末として、又は灌漑システムに化学物質として適用される。典型的には、このような因子は、感染を防ぐために、病原体に先立って、植物の表面に投与されるべきである。それらの上に担持された、又は植栽部位の土壌中に存在する病原体を抑制することによって、植栽後に病原体に襲われるのを防ぐために、種、球根、根、塊茎、及び球茎も処理される。様々な微生物病原体を抑制するために、野菜、観葉植物、かん木、又は木を植える土壌を化学的消毒薬で処理してもよい。処理は、好ましくは、植栽の数日又は数週間前に行われる。化学物質は、例えば、トラクターのような機械ルート、又は手で蒔くかの何れかによって適用し得る。さらに、前記アッセイ方法を用いて同定した化学物質は、消毒剤として使用し得る。
【０１４８】
さらに、抗病原性因子は、潜在的な病原体による定着及び全身的植種（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｅｅｄｉｎｇ）を防ぐために、静脈内、泌尿、腹腔内、脳室、脊髄、及び外科的ドレナージカテーテルを含むカテーテル（これらに限定されない）を作るために使用される物に加えてもよい。同様に、抗病原性因子は、病原体による定着を防ぐことにより、さらに深刻な侵入性感染、又は病原体による全身的植種を阻止するために、様々な外科的プロテーゼを構成する物に、及び義歯に加えてもよい。
二次代謝産物産生の増加
本発明は、真菌の二次代謝産物の産生を活性化し得る化合物（ペプチド、小分子、及び模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）を含む）を同定するための簡便な手段を提供する。従って、本明細書に記載された方法を用いてこのような特性を有することが発見された化学的実体は、その産生が、完全に又は部分的に、真菌の醗酵に依存する現在市場に出ている薬学的組成物の収量を増加させるための手段として有用である。このような化合物によって、その収量が醗酵中に増加し得る市場に出ている二次代謝産物の例は、シクロスポリン、ペニシリン、セファロスポリン、麦角アルカロイド、ロバスタチン、メバスタチン、及びそれらの生合成中間体が含まれるが、これらに限定されない。さらに、このような化学的実体は、このような代謝物の醗酵ブロス中の濃度（これにより、化学又はバイオアッセイによる検出の可能性）を増加させることによって、医学的又は農学的な価値を有する新規二次代謝産物を同定する可能性を増加させるために使用することもできる。何れの例でも、増加した代謝物の収量は、前記実体に真菌を接触させ、及び／又は真菌内に前記実体の産生をもたらす遺伝子発現構築物で真菌を形質転換することによって達成できる。
【０１４９】
本発明は、正及び負の何れにも二次代謝産物の産生を制御する候補遺伝子を同定するための簡便な手段も与える。さらに、これらの遺伝子の活性化されたバージョン又はドミナントネガティブなバージョンを同定するための方法が記載されている。従って、このような遺伝子及びそれらの誘導体は、標準的な形質転換法によって、これらの遺伝子の改変された形態を産生真菌中に導入することにより、及びノックアウトの構築による適切な遺伝子機能の除去により、二次代謝産物の産生を増加させるための真菌の遺伝子工学を可能にする可能性を有する候補である。これらのような遺伝子工学的方法によって、醗酵中にその収量が増加され得る市場に出ている二次代謝産物の例には、シクロスポリン、ペニシリン、セファロスポリン、麦角アルカロイド、ロバスタチン、メバスタチン、及びその生合成中間体が含まれるが、これらに限定されない。
真菌二次代謝産物の産生及び検出法
βラクタム抗生物質、スタチン類、麦角アルカロイド、シクロスポリン、及び他の真菌代謝物の醗酵及び産生法は、Ｍａｓｕｒｅｋａｒ （Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９２， ２１：２４１−３０１）及びその参考文献に記載されている。二次代謝産物の検出は、各代謝物に特異的であり、当業者に周知である。醗酵ブロス中での化合物の産生と完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を評価するための一般的な方法には、抗微生物活性のバイオアッセイ、高性能液体クロマトグフィー（ＨＰＬＣ）分析、核磁気共鳴、薄相クロマトグラフィー、及び吸光分光法が含まれるが、これらに限定されない。醗酵ブロスからの代謝物の精製には、遠心又はろ過による真菌細胞又は菌糸の除去、（溶解度及び／又はその後の抽出効率を増加させるための）醗酵後のｐＨ及び／又は塩濃度の調整、及び適切な有機溶媒によるブロスの抽出が含まれ得る。
他の態様
一般的に、本発明には、本明細書の記載に従って単離し得る、又は相同性スクリーニングによって容易に単離される、又は本発明の核酸配列を用いたＰＣＲ増幅によって単離される任意の核酸配列が含まれる。本発明には、その病原活性（例えば、本明細書の記載に従ってアッセイされる）が失わなれないように修飾されているポリペプチドも含まれる。このような変化には、ある種の変異、欠失、挿入、又は翻訳後修飾が含まれ得、又は、さらに大きい融合タンパク質の一成分としての本発明の任意のポリペプチドの含有が含まれ得る。
【０１５０】
このため、他の態様では、本発明には、本発明のポリペプチドと実質的に同一である任意のタンパク質が含まれる。このような相同体には、実質的に純粋な天然に存在するポリペプチド及び対立遺伝子変種（ｖａｒｉａｎｔ）；天然の変異体；誘導された変異体；高ストリンジェンシー条件下で、あるいはより好ましくないが、低ストリンジェンシー条件下で（例えば、少なくとも４０ヌクレオチドの長さのプローブを用いて、２×ＳＳＣ、４０℃で洗浄）本発明の核酸配列の何れか一つにハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるタンパク質；及び本発明の抗血清によって特異的に結合されるタンパク質が含まれる。
【０１５１】
本発明には、さらに、本発明の任意の天然に存在するポリペプチドの類縁体が含まれる。類縁体は、本発明の天然のポリペプチドとは、アミノ酸配列、翻訳後修飾、又はその両者が異なり得る。本発明の類縁体は、一般的には、本発明の天然に存在するアミノ酸配列の全部又は一部と、少なくとも８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％、さらには９９％の同一性を示すであろう。配列比較の長さは、少なくとも１５アミノ酸残基、好ましくは２５アミノ酸残基、より好ましくは３５アミノ酸残基を超える。また、同一性の程度を決定するための模範的なアプローチでは、密接に関連した配列を示すｅ−３〜ｅ−１００の間の確率値で、ＢＬＡＳＴプログラムを使用し得る。修飾には、ポリペプチドのインビボ及びインビトロ化学的誘導化、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、又はグリコシル化が含まれる：このような修飾は、ポリペプチドの合成若しくはプロセッシング中に、又は単離された修飾酵素での処理後に起こり得る。類縁体は、改変により、本発明の天然に存在するポリペプチドと一次配列が異なっていてもよい。これらには、天然と誘導の両遺伝的変種が含まれる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．）， ＣＳＩＩ Ｐｒｅｓｓ， １９８９， 又はＡｕｓｕｂｅｌら、上記の記載に従って、例えば、放射線照射、若しくはエタンメチルサルフェートへの暴露によるランダムな変異誘発、又は部位特異的変異誘発によって生じる）。Ｌアミノ酸以外の残基、例えば、Ｄアミノ酸、又は天然に存在するアミノ酸若しくは合成アミノ酸、例えば、β又はγアミノ酸以外の残基を含有する環状ペプチド、分子、及び類縁体も含まれる。
【０１５２】
完全長のポリペプチドに加えて、本発明には、本発明のポリペプチドの任意の一つの断片も含まれる。本明細書で使用する「断片」という語は、少なくとも５つ、好ましくは少なくとも２０の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも３０の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも５０の連続したアミノ酸、最も好ましくは、少なくとも６０〜８０以上の連続したアミノ酸を意味する。本発明の断片は、当業者に公知の方法によって作成することができ、又は正常なタンパク質のプロセッシングから生じるかもしれない（例えば、生物学的活性に必要とされない生まれたばかりのポリペプチドからのアミノ酸の除去、又は選択的ｍＲＮＡスプライシング又は選択的タンパク質プロセッシング現象によるアミノ酸の除去）。
【０１５３】
本発明は、さらに、発症状態を診断するための組成物（例えば、ヌクレオチド配列プローブ）、及び方法を提供する。
【０１５４】
本明細書に挙げた全ての文献及び特許出願は、独立した各文献又は特許出願を具体的且つ個別的に参照文献として組み込むために示した場合と同様に、参照文献として本明細書に組み込まれる。
【０１５５】
他の態様も本発明の範囲に属する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
Ｉｎｖ８タンパク分解プロセッシングに対するＩＮＶ経路及びＳＴＥ経路の変異の効果を示すウェスタンブロットを示す図。
【図２】
野生型株及びＴＰＫ遺伝子に変異を有する株の一倍体侵入表現型を示す一連の写真（２Ａ）と、野生型株及びＴＰＫ遺伝子に変異を有する株の偽菌糸体表現型を示す一連の写真（２Ｂ）を示す図。
【図３】
Ｔｐｋ２のＭｇａ１及びＳｆｌ１に対する優先的な親和性を示している酵母ツーハイブリッド分析の結果を示した写真を示す図（テストした遺伝子産物は、縦軸及び横軸に示されている。酵母の生育は、それぞれの軸上に示された遺伝子の産物間の相互作用を示している）。
【図４】
一倍体侵入生育中に、ＦＬＯ１１がＳＦＬ１とＴＰＫ２の下流で作用することを示すエピスタシス分析の写真（４Ａ）と、偽菌糸体生育中に、ＦＬＯ１１がＳＦＬ１とＴＰＫ２の下流で作用することを示すエピスタシス分析の写真（４Ｂ）を示す図。
【図５】
カンジダＲＩＭ１遺伝子（配列番号３）のＤＮＡ配列と予想されるコードされたタンパク質（配列番号４）を示す図。
【図６】
カンジダＲＩＭ１遺伝子（配列番号３）のＤＮＡ配列と予想されるコードされたタンパク質（配列番号４）を示す図。
【図７】
カンジダＲＩＭ１遺伝子（配列番号３）のＤＮＡ配列と予想されるコードされたタンパク質（配列番号４）を示す図。
【図８】
カンジダＲＩＭ１遺伝子（配列番号３）のＤＮＡ配列と予想されるコードされたタンパク質（配列番号４）を示す図。
【図９】
カンジダＲＩＭ１遺伝子（配列番号３）のＤＮＡ配列と予想されるコードされたタンパク質（配列番号４）を示す図。
【図１０】
カンジダＲＩＭ１遺伝子（配列番号３）のＤＮＡ配列と予想されるコードされたタンパク質（配列番号４）を示す図。
【図１１】
カンジダＲＩＭ１遺伝子（配列番号３）のＤＮＡ配列と予想されるコードされたタンパク質（配列番号４）を示す図。
【図１２】
カンジダＲＩＭ１遺伝子（配列番号３）のＤＮＡ配列と予想されるコードされたタンパク質（配列番号４）を示す図。
【図１３】
カンジダＲＩＭ１遺伝子（配列番号３）のＤＮＡ配列と予想されるコードされたタンパク質（配列番号４）を示す図。
【図１４】
カンジダＲＩＭ１遺伝子（配列番号３）のＤＮＡ配列と予想されるコードされたタンパク質（配列番号４）を示す図。
【図１５】
カンジダＲＩＭ１遺伝子（配列番号３）のＤＮＡ配列と予想されるコードされたタンパク質（配列番号４）を示す図。
【図１６】
カンジダＲＩＭ１遺伝子（配列番号３）のＤＮＡ配列と予想されるコードされたタンパク質（配列番号４）を示す図。
【図１７】
カンジダＲＩＭ１によるサッカロミセスｉｎｖ８表現型の相補性を記載した図。
【図１８】
サッカロミセス・セレビシアエＩＮＶ９のＤＮＡ配列（配列番号５）を示す図。
【図１９】
サッカロミセス・セレビシアエＩＮＶ９のＤＮＡ配列（配列番号５）を示す図。
【図２０】
サッカロミセス・セレビシアエＩＮＶ９のＤＮＡ配列（配列番号５）を示す図。
【図２１】
サッカロミセス・セレビシアエＩｎｖ９の予想されるアミノ酸配列（配列番号６）を示す図。
【図２２】
カンジダｒｉｍ１／ｒｉｍ１変異体の血清応答の表現型分析の一連の写真を示す図。
【図２３】
Ｉｎｖ８の核への蓄積には、Ｉｎｖ８のプロセッシングが必要とされることを示した一連の写真を示す図。
【図２４】
様々な侵入欠損（ｆｌｏ８， ｓｔｅ１２， ｐｈｄ１， ｐｈｄ２， ａｆｌ１， ｒａｓ２， ｔｐｋ２， ｔｅｃ１， ｆｌｏ１１，及びｉｎｖ６）及び高侵入変異体（ｉｒａ１）中のＦＬＯ１１ ｍＲＮＡの定常状態レベルを示すノーザンブロットの写真を示す図（ブロットは、ＦＬＯ１１及びＡＣＴ１に対するプローブを用いてプローブした）。
【図２５】
侵入を制御する遺伝子及び経路を示す図（先の尖った矢印は、活性化を表し、末端が扁平な矢印は、抑制を示す）。
【図２６】
レポーター構築物を作成するために使用されたＦＬＯ１１プロモーター断片相対的な位置を示す図。
【図２７】
抗真菌化合物を同定するためのシステムとして寒天侵入スクリーンを利用できることを実証したグラジエントプレートアッセイの結果を示す図。
【図１】
2004512001.tif 000007
【図２】
2004512001.tif 000008
【図３】
2004512001.tif 000009
【図４】
2004512001.tif 000010
【図５】
2004512001.tif 000011
【図６】
2004512001.tif 000012
【図７】
2004512001.tif 000013
【図８】
2004512001.tif 000014
【図９】
2004512001.tif 000015
【図１０】
2004512001.tif 000016
【図１１】
2004512001.tif 000017
【図１２】
2004512001.tif 000018
【図１３】
2004512001.tif 000019
【図１４】
2004512001.tif 000020
【図１５】
2004512001.tif 000021
【図１６】
2004512001.tif 000022
【図１７】
2004512001.tif 000023
【図１８】
2004512001.tif 000024
【図１９】
2004512001.tif 000025
【図２０】
2004512001.tif 000026
【図２１】
2004512001.tif 000027
【図２２】
2004512001.tif 000028
【図２３】
2004512001.tif 000029
【図２４】
2004512001.tif 000030
【図２５】
2004512001.tif 000031
【図２６】
2004512001.tif 000032
【図２７】
2004512001.tif 000033
【国際公開パンフレット】
2004512001.tif 000034
2004512001.tif 000035
2004512001.tif 000036
2004512001.tif 000037
2004512001.tif 000038
2004512001.tif 000039
2004512001.tif 000040
2004512001.tif 000041
2004512001.tif 000042
2004512001.tif 000043
2004512001.tif 000044
2004512001.tif 000045
2004512001.tif 000046
2004512001.tif 000047
2004512001.tif 000048
2004512001.tif 000049
2004512001.tif 000050
2004512001.tif 000051
2004512001.tif 000052
2004512001.tif 000053
2004512001.tif 000054
2004512001.tif 000055
2004512001.tif 000056
2004512001.tif 000057
2004512001.tif 000058
2004512001.tif 000059
2004512001.tif 000060
2004512001.tif 000061
2004512001.tif 000062
2004512001.tif 000063
2004512001.tif 000064
2004512001.tif 000065
2004512001.tif 000066
2004512001.tif 000067
2004512001.tif 000068
2004512001.tif 000069
2004512001.tif 000070
2004512001.tif 000071
2004512001.tif 000072
2004512001.tif 000073
2004512001.tif 000074
2004512001.tif 000075
2004512001.tif 000076
2004512001.tif 000077
2004512001.tif 000078
2004512001.tif 000079
2004512001.tif 000080
2004512001.tif 000081
2004512001.tif 000082
2004512001.tif 000083
2004512001.tif 000084
2004512001.tif 000085
2004512001.tif 000086
2004512001.tif 000087
2004512001.tif 000088
2004512001.tif 000089
2004512001.tif 000090
2004512001.tif 000091
2004512001.tif 000092
2004512001.tif 000093
2004512001.tif 000094
2004512001.tif 000095
2004512001.tif 000096
2004512001.tif 000097
2004512001.tif 000098
2004512001.tif 000099
2004512001.tif 000100
2004512001.tif 000101
2004512001.tif 000102
2004512001.tif 000103
2004512001.tif 000104
2004512001.tif 000105
2004512001.tif 000106
2004512001.tif 000107
2004512001.tif 000108
2004512001.tif 000109
2004512001.tif 000110
2004512001.tif 000111
2004512001.tif 000112
2004512001.tif 000113
2004512001.tif 000114
2004512001.tif 000115
2004512001.tif 000116
2004512001.tif 000117
2004512001.tif 000118
2004512001.tif 000119
2004512001.tif 000120
2004512001.tif 000121
2004512001.tif 000122
2004512001.tif 000123
2004512001.tif 000124
2004512001.tif 000125
2004512001.tif 000126
2004512001.tif 000127
2004512001.tif 000128
2004512001.tif 000129
2004512001.tif 000130
2004512001.tif 000131
2004512001.tif 000132
2004512001.tif 000133
2004512001.tif 000134
2004512001.tif 000135
2004512001.tif 000136
2004512001.tif 000137
2004512001.tif 000138
2004512001.tif 000139
2004512001.tif 000140
2004512001.tif 000141
2004512001.tif 000142
2004512001.tif 000143
2004512001.tif 000144
2004512001.tif 000145
2004512001.tif 000146
2004512001.tif 000147
2004512001.tif 000148
2004512001.tif 000149
2004512001.tif 000150
2004512001.tif 000151
2004512001.tif 000152
2004512001.tif 000153
2004512001.tif 000154
2004512001.tif 000155
2004512001.tif 000156
2004512001.tif 000157
2004512001.tif 000158
2004512001.tif 000159
2004512001.tif 000160
2004512001.tif 000161
2004512001.tif 000162
2004512001.tif 000163
2004512001.tif 000164
2004512001.tif 000165
2004512001.tif 000166
2004512001.tif 000167
2004512001.tif 000168
【国際調査報告】
2004512001.tif 000169
2004512001.tif 000170
2004512001.tif 000171
2004512001.tif 000172