(57)【要約】患者のＳＨＨシグナル伝達経路を阻害する治療によって起こりうる有害作用から前記患者を保護する方法であって、前記患者におけるテストステロンまたはその作用を抑制することを含む方法。患者における、癌などの増殖性疾患を治療する方法であって、ＳＨＨシグナル伝達経路を阻害すること、および前記患者におけるテストステロンまたはその作用を抑制することを含む方法。通常、ＳＨＨシグナル伝達経路は、シクロパミンまたはその誘導体を用いて阻害され、テストステロンは、ＧｎＲＨアンタゴニスト、ＧｎＲＨアゴニスト、アンドロゲンアンタゴニストまたは５α還元酵素阻害剤のいずれか１つまたは複数を用いて抑制される。
2006503055.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者におけるＳＨＨシグナル伝達経路の阻害を含む治療によって起こりうる有害作用から前記患者を保護する方法であって、前記患者におけるテストステロンまたはその作用を抑制することを含む方法。
【請求項２】
患者における、癌などの増殖性疾患を治療する方法であって、ＳＨＨシグナル伝達経路を阻害し、前記患者におけるテストステロンまたはその作用を抑制することを含む方法。
【請求項３】
前記ＳＨＨシグナル伝達経路が、前記患者へのシクロパミンまたはその誘導体の投与によって阻害される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
テストステロンが去勢レベルまで抑制される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
テストステロンまたはその作用が、ＧｎＲＨアンタゴニスト、ＧｎＲＨアゴニスト、アンドロゲンアンタゴニスト、または５α還元酵素阻害剤のいずれか１つまたは複数を前記患者に投与することによって抑制される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記患者が男性、好ましくは思春期後の男性である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記癌が、ＳＨＨシグナル伝達がその増殖および／または分化においてある役割を果たしている癌である、請求項２から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記癌が、基底細胞癌、髄芽腫、グリア芽腫または前立腺癌のいずれか１つである、請求項２から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
男性患者におけるＳＨＨシグナル伝達経路の阻害を含む治療によって起こりうる有害作用から前記男性患者を保護するための薬物の製造における、テストステロンまたはその作用を抑制する化合物の使用。
【請求項１０】
患者における、癌などの増殖性疾患を治療するための薬物の製造における、ＳＨＨシグナル伝達経路の阻害剤の使用であって、前記患者に、前記患者におけるテストステロンまたはその作用を抑制する化合物を投与する使用。
【請求項１１】
患者における、癌などの増殖性疾患を治療するための薬物の製造における、患者におけるテストステロンまたはその作用を抑制する化合物の使用であって、前記患者に、ＳＨＨシグナル伝達経路の阻害剤が投与される使用。
【請求項１２】
患者における、癌などの増殖性疾患を治療するための薬物の製造における、ＳＨＨシグナル伝達経路の阻害剤と、患者におけるテストステロンまたはその作用を抑制する化合物との組合せの使用。
【請求項１３】
前記ＳＨＨシグナル伝達経路の阻害剤がシクロパミンまたはその誘導体である、請求項９から１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
患者におけるテストステロンまたはその作用を抑制する前記化合物が、ＧｎＲＨアンタゴニスト、ＧｎＲＨアゴニスト、アンドロゲンアンタゴニスト、または５α還元酵素阻害剤のいずれか１つまたは複数である、請求項９から１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
前記患者が男性、好ましくは思春期後の男性である、請求項９から１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
前記癌が、ＳＨＨシグナル伝達がその増殖および／または分化においてある役割を果たしている癌である、請求項９から１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記癌が、基底細胞癌、グリア芽腫、髄芽腫、または前立腺癌のいずれか１つである、請求項１０から１６に記載の使用。
【請求項１８】
患者を治療するための治療システムであって、ＳＨＨシグナル伝達経路の阻害剤と、患者におけるテストステロンまたはその作用を抑制する化合物とを含むシステム。
【請求項１９】
ＳＨＨシグナル伝達経路の阻害剤と、患者におけるテストステロンまたはその作用を抑制する化合物とを含有する組成物。
【請求項２０】
医薬で使用するための、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
ＳＨＨシグナル伝達経路の阻害剤と、患者におけるテストステロンまたはその作用を抑制する化合物と、薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。
【請求項２２】
患者におけるＳＨＨシグナル伝達経路の阻害を含む治療によって起こりうる有害作用から、前記患者を保護する、本明細書に記載されたいずれかの新規方法。
【請求項２３】
患者における、癌などの増殖性疾患を治療する、本明細書に記載されたいずれかの新規方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、シクロパミンまたはその誘導体など、ＳＨＨシグナル伝達の阻害剤を使用した際に起こりうる望ましくない副作用を回避する方法に関する。本発明は、癌を治療する方法にも関する。
【０００２】
ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達経路は、多くの器官の発生中に、上皮間充織相互作用の調節を行う。ＳＨＨタンパク質は上皮細胞で合成され、多くの状況で、隣接した間葉系細胞で発現された、その受容体ＰＡＴＣＨＥＤ１（ＰＴＣ）を介して、パラクリン因子として作用する（ＢｉｔｇｏｏｄおよびＭｃＭａｈｏｎ、１９９５；Ｒｏｅｌｉｎｋら、１９９４；およびＳｔｏｎｅら、１９９６）。ＳＨＨシグナル伝達の破壊によって、器官形成における重要かつ多様な役割の証拠が提供された。Ｓｈｈノックアウトマウスは、単眼奇形、神経管欠損、および遠位肢構造の不在を含めた多様な発生障害を示す（Ｃｈｉａｎｇら、１９９６）。シクロパミン（Ｃｙ）を用いたＳＨＨシグナル伝達の阻害によって、神経管（Ｒｏｅｌｉｎｋら、１９９４）、胃腸管（Ｒａｍａｌｈｏ−Ｓａｎｔｏｓら、２０００；Ｓｕｋｅｇａｗａら、２０００）、および膵臓（ＫｉｍおよびＭｅｌｔｏｎ、１９９８）の発生、ならびに毛嚢形態形成（Ｃｈｉａｎｇら、１９９９）におけるＳＨＨシグナル伝達の役割がさらに明らかにされた。ＳＨＨシグナル伝達は、肺の分枝形態形成にも必要である（Ｂｅｌｌｕｓｃｉら、１９９７ａ；Ｐｅｐｉｃｅｌｌｉら、１９９８）。Ｓｈｈ転写産物発現は、尿生殖洞（ＵＧＳ）上皮でも報告されている（ＢｉｔｇｏｏｄおよびＭｃＭａｈｏｎ、１９９５）が、尿生殖洞で、ＳＨＨは外部生殖器の形成に必要であり（Ｈａｒａｇｕｃｈｉら、２００１；Ｐｅｒｒｉｔｏｎら、２００２）、さらに、前立腺の発生で重要な役割を果たしているかもしれない（Ｐｏｄｌａｓｅｋら、１９９９）。
【０００３】
前立腺器官形成は、上皮と間充織との間の相互的なシグナル伝達を必要とするアンドロゲン依存性過程であるが、これらの上皮間充織相互作用を制御する分子メディエーターに関しては、ほとんど知られていない。Ｓｈｈは尿生殖洞（ＵＧＳ）上皮で発現され、さらに、前立腺の成長におけるＳＨＨの重要性が、ＳＨＨを抗体で遮断することによって実証されている。すなわち、ＳＨＨの遮断によって、雄の宿主マウスに移植された雄ＵＧＳ組織における前立腺の成長が抑止されたのである（Ｐｏｄｌａｓｅｋら、１９９９）。また、Ｐｏｄｌａｓｅｋらは、男性では、Ｓｈｈ転写産物発現がアンドロゲンに応答してアップレギュレートされることも報告し、ＵＧＳにおけるアンドロゲン誘発性のＳｈｈ発現が前立腺の誘導に必要であると結論した。しかし、ＳＨＨシグナル伝達経路における、推定上の下流シグナル伝達エフェクターであるＢＭＰ４（ＢｉｔｇｏｏｄおよびＭｃＭａｈｏｎ、１９９５）は、アンドロゲン作用の如何にかかわらずＵＧＳ間充織で発現される（Ｌａｍｍら、２００１）。この不一致は、成長中の前立腺では、アンドロゲンによってＳｈｈが調節されないかもしれないという可能性を提起し、これを詳細に再検討するように発明者らにうながすものであった。発明者らは、前立腺器官形成におけるＳＨＨシグナル伝達の役割を、ＳｈｈおよびＰｔｃ転写産物発現の詳細な検査によって、さらに、インビトロで成長中の腹側前立腺（ＶＰ）でのＳＨＨシグナル伝達経路を混乱させることによって、検討した。これらの結果は、ＳｈｈおよびＰｔｃ転写産物発現がアンドロゲンに依存しないこと、そしてＳＨＨシグナル伝達がＶＰの成長に必要であることを示唆した。さらに発明者らは、ＶＰの成長中におけるＳＨＨシグナル伝達の阻害によって、上皮の成長、パターン形成、および分化が影響を受け、その結果、ヒト篩状前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）を想起させる前立腺上皮管が形成されることも実証した。
【０００４】
したがって、記載された研究は、患者の内科療法のためにＳＨＨシグナル伝達経路を阻害する化合物の使用において、アンドロゲンまたはそれらの影響を除去することが重要であることを始めて示唆するものである。
【０００５】
国際公開第９９／５２５３４号は、ヘッジホッグシグナル伝達経路の阻害剤としてのステロイド性アルカロイド誘導体の使用について記載している。米国特許第６２９１５１６Ｂ１号および国際公開第０１／２７１３５号は、ヘッジホッグ経路のレギュレーターについて記載し、国際公開第０２／３０４６２号はヘッジホッグアンタゴニストについて記載している。
【０００６】
本発明の第１の態様は、患者のＳＨＨシグナル伝達経路を阻害する治療によって起こりうる有害作用から前記患者を保護する方法であって、前記患者におけるテストステロンまたはその作用を抑制することを含む方法を提供する。
【０００７】
したがって、本発明は、患者におけるＳＨＨシグナル伝達経路の阻害によって患者に起こりうる有害な効果に対して、患者の前立腺を保護するための、患者でのテストステロンまたはその作用の抑制の使用を含む。
【０００８】
ＳＨＨシグナル伝達の阻害、例えば以下により詳細に記載する化合物を用いた阻害は、様々な病気および状態の治療で使用が推奨されている。例えば、国際公開第０２／３０４６２号（出典明示により本明細書に取り込まれる）は、そのような化合物の様々のものが（以下により詳細に論ずるように）、血管新生の抑制、および好ましくない細胞増殖の治療または阻止に有用であることを示し、ＳＨＨシグナル伝達の阻害が、眼内血管新生疾患、加齢性黄斑変性、糖尿病性網膜症、未熟網膜症、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクトレンズの過剰装用、アトピー性角膜炎、上輪部角膜炎、点状表層乾性角膜炎、シェーグレン症候群、酒さ性座瘡、フリクテン症、梅毒、ミコバクテリア感染症、脂質変性症、化学的火傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染症、帯状疱疹感染症、原虫感染症、カポジ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン周辺角膜変性症、辺縁性角膜溶解、リウマチ関節炎、全身性狼瘡、多発動脈炎、外傷、ヴェグナー類肉腫症、鞏膜炎、スティーブンジョンソン病、周辺部放射状角膜切除術、角膜移植拒絶、リウマチ関節炎、骨関節炎慢性炎症（例えば、潰瘍性大腸炎またはクローン病）、血管腫、遺伝性出血性毛細血管拡張症、および遺伝性出血性毛細管拡張症を含めた、血管新生に関連した疾患または状態の治療に有用であると記載している。
【０００９】
血管新生は、横紋筋肉腫、網膜胚種細胞腫、ユーイング肉腫、神経芽細胞腫、および骨肉腫などの固形腫瘍、ならびに、聴神経腫、神経繊維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫などの良性腫瘍を含めた、特定の癌および転移においても重要である。
【００１０】
乾せん、扁平上皮癌、および良性前立腺肥大（ＢＰＨ）を含めた、皮膚の増殖性疾患など、他の疾患も、ＳＨＨシグナル伝達の阻害剤によって治療されることが示唆されている。
【００１１】
疑念を避けるために、国際公開第０２／３０４６２号に記載された、ＳＨＨシグナル伝達の阻害剤で治療される疾患のすべてを、出典明示により本明細書に取り込まれる。同様に、米国特許６２９１５１６Ｂ１号、国際公開第０１／２７１３５号、または国際公開第９９／５２５３４号に記載された、ＳＨＨシグナル伝達の阻害剤で治療される疾患のすべても、出典明示により本明細書に取り込まれる。
【００１２】
テストステロンまたはその作用の抑制は、患者が、ＳＨＨシグナル伝達経路の阻害を含んだ癌治療を受ける際に使用される場合に、特に好ましい。
【００１３】
したがって、本発明の第２の態様は、患者における、癌などの増殖性疾患を治療する方法であって、ＳＨＨシグナル伝達経路を阻害すること、および前記患者におけるテストステロンまたはその作用を抑制することを含む方法を提供する。
【００１４】
ＳＨＨシグナル伝達経路は、ＳＨＨ、ＰＴＣ、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、Ｇｌｉ−１、Ｇｌｉ−２、およびＧｌｉ−３を含む。ＳＨＨは、ＰＴＣおよびＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄで構成されている受容体複合体のリガンドである。Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄは、シグナルを伝達をすると考えられており、ＳＨＨシグナル伝達経路の主要エレメントである。Ｇｌｉ−１、Ｇｌｉ−２、およびＧｌｉ−３は転写因子である。ＳＨＨシグナル伝達経路に関する詳細は、例えば、国際公開第０２／３０４６２号で見いだすことができる。
【００１５】
ＳＨＨシグナル伝達経路の阻害剤は、通常、増殖および／または分化に変化を引き起こすものである。典型的には、ＳＨＨシグナル伝達経路の阻害剤は、ＳＨＨシグナルに対する応答によるＰＴＣおよび／またはＢＭＰ−４（骨形成タンパク質４）の産生を阻害する。
【００１６】
ＳＨＨを阻害する化合物、またはＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄを阻害する化合物、またＰＴＣを変調する化合物、またはＧｌｉの機能を阻止する化合物が好ましい化合物である。
【００１７】
本発明の方法との関連においては、ＳＨＨシグナル伝達経路をいかなる適当な阻害剤で阻害してもよい。出典明示により本明細書に組み込まれている国際公開第９９／５２５３４号は、ＳＨＨが、生合成中にそのカルボキシル末端ドメインに媒介された自己切断反応を行い、これによって、既知のＳＨＨシグナル伝達活性すべてに必要な、脂質修飾されたアミノ末端断片が生成されることを記述している。ＳＨＨの自己プロセシングは、Ｎ末端ＳＨＨ断片のＣ末端に対する、共有結合によるコレステロールの結合を引き起こす。国際公開第９９／５２５３４号は、例えば、ヘッジホッグタンパク質のコレステロール修飾を中断させることによって、ＳＨＨシグナル伝達経路を阻害し、かつ／またはヘッジホッグタンパク質の生理活性を阻害する化合物を記載する。詳細には、ＳＨＨ、特に、このタンパク質のコレステロール修飾された形態によって生成されるパラクリンシグナルおよび／またはオートクリンシグナルを阻止するのに、ステロイド性アルカロイドおよびそれらのアナログを用いることができる。国際公開第９９／５２５３４号に、さらに詳細に記載されるように、バイケイソウ由来の化合物であるジェルビンは、細胞のそのようなシグナルと、これに付随する生物反応とを破壊する。
【００１８】
ジェルビンと、ＳＨＨシグナル伝達を阻害する他のステロイド性アルカロイドとが有する能力は、そのような分子がＰＴＣ媒介性または「ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ」媒介シグナル伝達経路と相互作用できることによるものかもしれない。これら阻害剤は、例えば、ＳＨＨ受容体であるＰＴＣの１つもしくは複数のステロール感受性ドメインと相互作用するか、または少なくとも、ＳＨＨが、その受容体、もしくは受容体に付随した他の分子、もしくはＳＨＨ媒介シグナル伝達に必要な他の分子と相互作用する能力を妨害するのかもしれない。これに加えて、またはこの代わりに、ＳＨＨシグナル伝達に対するジェルビンの作用は、コレステロールホメオスタシスを攪乱し、それがＳＨＨタンパク質のコレステロール媒介自己プロセシング、および／またはタンパク質の活性もしくは安定性に影響を与える結果かもしれない。したがって、ＰＴＣ活性におけるコレステロール依存性の側面を、同様に妨害する他のステロイド性小分子および非ステロイド性小分子も、ＳＨＨ媒介性シグナルを破壊するだろう。
【００１９】
「ヘッジホッグアンタゴニスト」、および国際公開第９９／５２５３４号の２８から３８頁に記載された例示的化合物は、ＳＨＨシグナル伝達経路を阻害する化合物として、出典明示により本明細書に特定して組み込んである。このＳＨＨシグナル伝達経路を阻害する化合物は、国際公開第９９／５２５３４号の式Ｉ、Ｉａ、ＩＩ、ＩＩａ、ＩＩＩ、ＩＩＩａ、ＩＶ、ＩＶａ、Ｖ、Ｖａ、ＶＩ、ＶＩａ、ＶＩＩおよびＶＩＩａで表される化合物の任意のものであることが好ましく、これらのすべてを、定義および置換基の優先度も含めて、出典明示により本明細書に取り込まれる。
【００２０】
これらの化合物のうち、少なくともいくつかは、ソラナム型またはベラトラム型アルカロイドの誘導体またはアナログであり、これらの化合物には、ジェルビン、シクロパミン、シクロポシン、ムキアミン（ｍｕｋｉａｍｉｎｅ）、ベラトラミン、ベルチチン、ジガシン、ソラニジン、およびカコニンの誘導体が含まれる。
【００２１】
出典明示により本明細書に組み込まれている国際公開第０２／３０４６２号は、ＳＨＨシグナル伝達経路の阻害剤について記載する。これらと、国際公開第０２／３０４６２号の３３から１１２頁に記載されている例示的化合物とを、ＳＨＨシグナル伝達経路を阻害する化合物として出典明示により本明細書に取り込まれる。このＳＨＨシグナル伝達経路を阻害する化合物は、国際公開第０２／３０４６２号の式Ｉ、Ｉａ、ＩＩ、ＩＩａ、ＩＩＩ、ＩＩＩａ、ＩＶ、ＩＶａ、Ｖ、Ｖａ、ＶＩ、ＶＩａ、ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＶＩＩＩａ、ＩＸ、ＩＸａ、Ｘ、Ｘａ、ＸＩ、ＸＩａ、ＸＩＩ、ＸＩＩａ、ＸＩＩＩ、ＸＩＩＩａ、ＸＩＶ、ＸＩＶａ、ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩ、ＸＶＩＩＩ、ＸＩＸ、ＸＸ、ＸＸＩ、ＸＸＩＩ、ＸＸＩＩＩ、ＸＸＩＶ、およびＸＸＶで表される化合物のうちの任意のものであることが好ましく、これらのすべてを、定義および置換基の優先度も含めて、出典明示により本明細書に取り込まれる。９３頁以降に記載されているアンタゴニストヘッジホッグ変異体、１０２頁以降に記載されている抗体アンタゴニスト、ならびに１０３頁以降に記載されているアンチセンス、リボザイム、および三本鎖オリゴヌクレオチドも出典明示により本明細書に取り込まれる。同様に、ＰＴＣ、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、Ｇｌｉ−１、Ｇｌｉ−２、またはＧｌｉ−３に対するものなど、ＳＨＨシグナル伝達経路のいかなる部分をも阻害する抗体アンタゴニスト、アンチセンス、リボザイム、および三本鎖オリゴヌクレオチドもまた有用でありうる。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下の通り、ＧｅｎＢａｎｋから取得できる。すなわち、アクッセッション番号Ｕ４３１４８（ヒトＰＴＣ）、Ｌ３８５１８（ヒトＳＨＨ）、Ｕ８４４０１（ヒトＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）、ＡＦ３１６５７３（ヒトＧｌｉ−１）、ＡＢ００７２９８（ヒトＧｌｉ−２）、およびＭ５７６０９（ヒトＧｌｉ−３）であり、これらすべてを出典明示により本明細書に取り込まれる。これらの配列は、当技術分野で周知なように、抗体、アンチセンス核酸、リボザイム、および三本鎖オリゴヌクレオチドの設計および製造に使用してもよい。
【００２２】
好ましいヘッジホッグアンタゴニストには、ＡＹ９９４４、トリパラノール、ジェルビン、シクロパミン、トマチジン（図９）、化合物Ａ（図１０）、および化合物Ｂ（図１１）が含まれる。
【００２３】
出典明示により本明細書に組み込まれている国際公開第０１／２７１３５号は、ＳＨＨシグナル伝達経路の阻害剤について記載する。
【００２４】
式Ｉ、Ｉａ、ＩＩ、ＩＩａ、ＩＩＩ、ＩＩＩａ、ＩＶ、ＩＶａ、Ｖ、Ｖａ、ＶＩ、ＶＩａ、ＶＩＩ、およびＶＩＩａの化合物を含めた、３２から４９頁に記載されている例示的化合物を、出典明示により特定して本明細書に取り込まれる。同様に、ＳＨＨシグナル伝達経路を阻害する限りにおいて、９８から１３３頁に記載されている化合物、特にシクロパミン誘導体およびジェルビン誘導体を、出典明示により本明細書に取り込まれる。
【００２５】
出典明示により本明細書に組み込まれている米国特許第６２９２５１６Ｂ１号は、ＳＨＨシグナル伝達経路の阻害剤について記載する。式Ｉ、Ｉａ、ＩＩ、ＩＩａ、ＩＩＩ、ＩＩＩａ、ＩＶ、ＩＶａ、Ｖ、Ｖａ、ＶＩ、ＶＩａ、ＶＩＩ、およびＶＩＩａの化合物を含めた、カラム２７から３５に記載されている化合物を、出典明示により特定して本明細書に取り込まれる。
【００２６】
ＳＡＮＴ−１、ＳＡＮＴ−２、ＳＡＮＴ−３、およびＳＡＮＴ−４と名付けられた化合物は、Ｃｈｅｎら（２００２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９、１４０７１〜１４０７６の図３Ａに記載されているように、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）アンタゴニストであり、したがって、ＳＨＨシグナル伝達経路の阻害剤である。これらの構造も、出典明示により本明細書に取り込まれる。
【００２７】
通常、ＳＨＨシグナル伝達経路は、患者への、シクロパミンまたはその誘導体の投与によって阻害される。
【００２８】
ＳＨＨシグナル伝達経路は、この経路の転写を妨害する薬剤で阻害してもよい。
【００２９】
したがって、この薬剤は、アンチセンス配列であってもよい。本発明における使用に供する薬剤であるアンチセンス配列は、ヌクレオチド配列にハイブリッド形成することができる。「アンチセンス配列」という用語には、長さが１０ヌクレオチドから３０ヌクレオチドの間にあるアンチセンスオリゴヌクレオチドなどのアンチセンスオリゴヌクレオチドと、それらより長い配列とが含まれる。当業者ならば、ＳＨＨ、ＰＴＣ、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、Ｇｌｉ−１、Ｇｌｉ−２、またはＧｌｉ−３をコードするヌクレオチド配列を参照にして、アンチセンス配列を設計することができる。
【００３０】
本明細書において、「ハイブリッド形成」という用語は、「核酸の１本鎖が塩基対合を介して相補鎖と結合する過程」と、さらにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術で行われるような増幅の過程とを含む。
【００３１】
本発明は、本明細書に提示する配列、または、いかなる誘導体、その断片もしくは誘導体に相補的な配列とハイブリッド形成できるヌクレオチド配列の使用も包含する。
【００３２】
「変異体」という用語は、本明細書に提示するヌクレオチド配列とハイブリッド形成できる配列に相補的な配列を包含する。
【００３３】
「変異体」という用語は、本明細書に提示するヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下（例えば５０℃、かつ０．２×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣの＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０｝）で、ハイブリッド形成できる配列に相補的な配列を包含することが好ましい。
【００３４】
「変異体」という用語は、本明細書に提示するヌクレオチド配列と、高ストリンジェントな条件下（例えば６０℃、かつ０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣの＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０｝）で、ハイブリッド形成できる配列に相補的な配列を包含することがより好ましい。
【００３５】
ＳＨＨシグナル伝達経路は、ＳＨＨ、ＰＴＣ、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、Ｇｌｉ−１、Ｇｌｉ−２、またはＧｌｉ−３のいずれか１つに結合する抗体で阻害してもよい。
【００３６】
本明細書において、「抗体」には、ポリクローナル抗体と、モノクローナル抗体と、キメラ抗体と、一本鎖抗体と、Ｆａｂ断片と、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生された断片とが含まれるが、これらに限定されるものではない。そのような断片には、標的物質に対する結合活性を保持する全抗体の断片である、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）断片およびＦ（ａｂ’）２断片、ならびに一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、融合タンパク質、および抗体の抗原結合部位を含んだ他の合成タンパク質が含まれる。さらに、抗体およびそれらの断片は、例えば米国特許第２３９４００Ａ号に記載されているような、ヒト化された抗体でもよい。診断および治療には、中和抗体、すなわち標的物質ポリペプチドの生物活性を阻害する抗体が特に好ましい。
【００３７】
抗体は、本発明の標的物質で免疫処置する技法、またはファージディスプレーライブラリーを使用する技法など、標準的な技法で生成することができる。
【００３８】
ポリクローナル抗体が望ましい場合には、選択された哺乳動物（例えばマウス、ラビット、ヤギ、ウマなど）を、本発明の同定された薬剤および／または物質から取得可能なエピトープを有する免疫原性ポリペプチドで免疫処置する。免疫応答を増強させるために、宿主種に応じて様々なアジュバントを用いることができる。そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムゲルなどのミネラルゲル、ならびにリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、およびジニトロフェノールなどの界面活性物質が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＢＣＧ（ウシ型弱毒結核菌ワクチン）およびコリネバクテリウムパルヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）は、潜在的に有用なヒトアジュバントであり、精製された標的物質ポリペプチドを、免疫障害を有する個体に、全身性防御反応を刺激する目的で投与する場合に利用することができる。
【００３９】
免疫処置された動物からの血清は、公知の操作手順に従って収集し、処理する。本発明の同定された薬剤および／または物質から取得可能なエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する血清が他の抗原に対する抗体を含有している場合には、免疫アフィニティークロマトグラフィーでポリクローナル抗体を精製することができる。ポリクローナル抗血清を生成する技法、および処理する技法は当技術分野で公知である。そのような抗体を生成することができるように、本発明は、免疫原として動物またはヒトで使用するために別のポリペプチドにハプテン化された、本発明のポリペプチドまたはその断片も提供する。
【００４０】
特定のエピトープに対するモノクローナル抗体は、当業者ならば容易に生成することができる。ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を生成する一般的な方法論が周知である。不死化された抗体産生培養細胞株は、細胞融合および、発癌性ＤＮＡによるＢリンパ球の直接的形質転換、またはエプスタインーバーウイルスによる形質移入などの他の技法でも生成することができる。眼窩（ｏｒｂｉｔ）エピトープに対して生成されたモノクローナル抗体のパネルは、様々な特性に関して、すなわち、イソタイプおよびエピトープの親和性に関して、スクリーニングすることができる。
【００４１】
モノクローナル抗体は、培養された継代細胞株による抗体分子産生を提供するいかなる技法を用いて調製してもよい。そのような技法には、ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７）で最初に記載されたハイブリドーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｓｂｏｒら（１９８３）、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２；Ｃｏｔｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８０：２０２６〜２０３０）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅら（１９８５）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ社、７７〜９６頁）が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、「キメラ抗体」産生用に開発された技法であって、マウス抗体遺伝子を、スプライシングによってヒト抗体遺伝子に連結して適当な抗原特異性および生物活性を有した分子を得る技法も用いることができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８１：６８５１〜６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（１９８４）、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４〜６０８；Ｔａｋｅｄａら（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２〜４５４）。別法として、一本鎖抗体産生用に記載された技法（米国特許第４９４６７７９号）を、標的物質に特異的な一本鎖抗体を生成するために適応させることができる。
【００４２】
抗体は、リンパ球集団内での生体内産生を誘導することによって、または、Ｏｒｌａｎｄｉら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８６：１９８９、３８３３〜３８３７）、ならびにＷｉｎｔｅｒ  ＧおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ（１９９１；Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３〜２９９）で開示されているように、組換え型免疫グロブリンライブラリー、もしくは高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって生成してもよい。
【００４３】
標的物質に特異的な結合部位を含有する抗体断片を生成することもできる。例えば、そのような断片には、Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦａｂ断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗体分子のペプシン消化によって生成でき、Ｆａｂ断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を減少させることによって生成できる。別法として、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ簡便な同定を可能にするために、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築してもよい（Ｈｕｓｅ  ＷＤら（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１２７５〜１２８１）。
【００４４】
「患者におけるテストステロンまたはその作用を抑制すること」には、テストステロンの内在レベルの低減（例えば産生を阻害することによる）と、テストステロンのジヒドロテストステロンへの転換の阻害（例えばテストステロン５α環元酵素の阻害による）と、アンドロゲン受容体の遮断（例えばアンドロゲンアンタゴニストの使用による）とが含まれる。このようにして、テストステロンシグナル伝達経路が遮断される。
【００４５】
例えば、ＡＲ特異的アンチセンス分子など、アンドロゲン受容体（ＡＲ）の産生を抑制する分子を用いて、テストステロンシグナル伝達経路を遮断することも可能かもしれない。
【００４６】
テストステロンまたはその作用を抑制できる薬剤は当技術分野で周知であり、これらは男性去勢化学薬品とみなすことができる。テストステロンは男性の去勢手術によって抑制してもよいが、これは、より好ましくない。
【００４７】
男性の化学的去勢および外科的去勢では、アンドロゲンのレベルが減少するが、低レベルのアンドロゲンが副腎によって産生され、残留していることがある。健常男性は、正常範囲である３．５〜１０．０ｎｇ／ｍｌのテストステロンレベルを有するが、これと比較して、テストステロンの去勢レベルは、通常、約２ｎｍｏｌ／ｌ（すなわち、０．５ｎｇ／ｍｌ）である。
【００４８】
テストステロンレベルは、去勢レベルにまで抑制されることが、特に好ましい。テストステロンのレベルまたはその作用は、ＧｎＲＨ（ＬＨＲＨ）アンタゴニスト、ＧｎＲＨ（ＬＨＲＨ）アゴニスト、テストステロン（アンドロゲン）アンタゴニスト、または５α還元酵素阻害剤のいずれか１つまたは複数を患者に投与することによって抑制することが好ましい。
【００４９】
ＧｎＲＨ（ＬＨＲＨ）アゴニストには、通常、４週間毎に静注／筋注３．７５ｍｇレベルで、または３カ月毎に静注１１．２５ｍｇレベルで投与されうるリユープロレリン（Ｗｙｅｔｈ社から販売されているプロスタップ（Ｐｒｏｓｔａｐ））；通常、８時間毎に静注０．５ｍｇレベルで、または１日６回、鼻腔内経路で０．２ｍｇ投与されるブセレリン（Ｓｈｉｒｅ社から販売されているスプレファクト）；通常、２８日間毎に３．６ｍｇの静注インプラントとして、または１２週間毎に１０．８ｍｇの静注インプラントとして投与されるゴセレリン（Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ社から販売されているゾラデックス）；通常、４週間毎に３ｍｇレベルで投与されるトリプトレリン（Ｉｐｓｅｎ社から販売されているデカペプチル）；ナファレリン（Ｓｅａｒｌｅ社から販売されているシナレル）；デスロレリン（Ｓｈｉｒｅ社によって販売されたソマガード（Ｓｏｍａｇａｒｄ））；およびヒストレリン／スプレリン（ｓｕｐｐｒｅｌｉｎ）（Ｏｒｔｈｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社／Ｓｈｉｒｅ社）が含まれる。
【００５０】
ＧｎＲＨアンタゴニストには、テベレリクス（アンタレリクス（ａｎｔａｒｅｌｉｘ）としても知られている）；アバレリクス（Ｐｒａｅｃｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社から販売されているプレナクシス）；通常、１日毎に静注０．２５〜０．３ｍｇレベルで投与されるセトロレリクス（ＡＳＴＡ  Ｍｅｄｉｃａ社によって販売されているセトロタイド）；および、通常１日毎に静注０．２５ｍｇレベルで投与されるガニレリックス（Ｏｒｇａｎｏｎ社から販売されているオルガルトラン）が含まれる。
【００５１】
テストステロン（アンドロゲン）アンタゴニストには、１日２回から３回、経口５０〜１００ｍｇレベルで投与される酢酸シプロテロン（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｈｅａｌｔｈ社から販売されているアンドロクール）などのシプロテロン；通常、１日あたり、経口５０〜１００ｍｇレベルで投与されるビカルタミド（Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ社から販売されているカロデックス（Ｃａｒｏｄｅｘ））；および、通常１日３回、経口２５０ｍｇレベルで投与されるフルタミド（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ社によって販売されているドロゲニル（Ｄｒｏｇｅｎｉｌ））が含まれる。
【００５２】
テストステロン５α還元酵素阻害剤には、ファイナステライド（ＭＳＤ社から販売されているプロスカー）が含まれ、これは通常、１日あたり、経口５ｍｇレベルで投与される。
【００５３】
疑念の避けるために述べると、ｓ．ｃ．は皮下；ｐ．ｏ．は経口；そして、ｉ．ｍ．は筋肉内である。
【００５４】
患者は男性であることが好ましい。
【００５５】
患者は思春期後の男性であることが特に好ましい。
【００５６】
本発明が癌の治療において用いられる際、この癌はいかなる癌であってもよいが、治療されるべき癌は、その癌でＳＨＨシグナル伝達経路が増殖および分化における役割を果たしている癌であることが好ましい。
【００５７】
その中でＳＨＨシグナル伝達経路の存在が示されている癌には、ヒト肺扁平上皮癌、腺癌、基底細胞癌、髄芽腫、髄膜腫、血管腫、横紋筋肉腫、グリア芽腫、肉腫、腎癌、甲状腺癌、骨肉腫、ならびに、乳房、腎臓、膀胱、輸尿管、前立腺、副腎、胃、および腸の腫瘍が含まれる。前立腺癌の治療も考慮されるが、好ましくない。
【００５８】
本発明の治療方法のすべてに関して、ＳＨＨシグナル伝達経路の阻害は、テストステロンまたはその作用を抑制する前、または後、または同時に行うことができる。したがって、ＳＨＨシグナル伝達経路の阻害剤は、患者にテストステロンまたはその作用を抑制する化合物が投与される前、または後、または同時に患者に投与することができる。テストステロンまたはその作用は、患者にＳＨＨシグナル伝達経路に対する阻害剤が投与される前に抑制されることが好ましい。
【００５９】
治療効果を得るためには、ＳＨＨシグナル伝達経路に対する阻害剤と、テストステロンまたはその作用を抑制する化合物との適当な用量（１回または複数回）を、患者に適切な間隔で投与する。
【００６０】
投与の用量およびタイミングも含めた治療計画は、患者に適切な量の治療用化合物が適切な時に投与されて、望ましい治療効果が得られるように、その患者用に調製することが便利な場合がある。適当な治療計画は、医師がその患者用に調製してもよい。通常、投与の用量およびタイミングは、治療用化合物がそれ単独で使用される場合と同じである。したがって、公知の化学的去勢療法を利用してもよく、ＳＨＨシグナル伝達経路に対する阻害剤に使用される治療上有効な量および治療計画は、治療される疾患または状態に依存するものである。
【００６１】
本発明での使用に供する前述の化合物（すなわち、ＳＨＨシグナル伝達経路に対する阻害剤、あるいはテストステロンまたはその作用を抑制する化合物）またはその製剤は、経口および非経口（例えば皮下または筋肉内）の注入を含めたいかなる在来法で投与してもよい。治療は、一定期間の間に、単回用量からなっても、複数回用量からなってもよい。
【００６２】
この製剤は、１日用量もしくは単位、１日の部分用量、またはこれらの適切な画分の有効成分を含有した単位用量であることが好ましい。
【００６３】
通常、本発明での使用に供する化合物は、薬学的に許容される剤形において、有効成分を含んだ製剤の形態で、場合によっては、非毒性の有機または無機の酸付加塩または塩基付加塩の形態で、経口投与されるか、または、いかなる非経口経路でも投与されるだろう。この組成物は、治療される障害および患者に応じて、また、投与経路に応じて、異なった用量で投与してもよい。
【００６４】
ヒト治療では、本発明での使用に供する化合物を単独で投与することもできるが、通常は、意図された投与経路および標準的な薬務を考慮して選択される適当な製剤賦形剤、希釈剤、もしくは担体との混合物として投与されるだろう。
【００６５】
例えば、本発明での使用に供する化合物は、風味料または着色料を含有することもある、錠剤、カプセル、腟坐薬、エリキシール、溶液、または懸濁液の形態で、即時放出、遅延放出、または徐放性の適用のために、経口投与、口腔投与、または舌下投与することができる。また、本発明の化合物は、海綿体内注射で投与してもよい。
【００６６】
そのような錠剤は、微晶性セルロース、乳糖、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、およびグリシンなどの賦形剤、デンプン（好ましくはトウモロコシデンプン、バレイショデンプン、またはタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメローセナトリウム、およびある種の複合ケイ酸塩などの崩壊剤、ならびに、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチン、およびアラビアゴムなどの造粒用結合剤を含有してもよい。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、グリセリルベヘネート、タルクなどの潤滑薬剤が含まれてもよい。
【００６７】
同様のタイプの固体組成物を、充填剤としてゼラチンカプセル中で利用してもよい。この点で好ましい賦形剤には、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖、または高分子量ポリエチレングリコールが含まれる。水性懸濁液および／またはエリキシール用には、本発明の化合物を様々な甘味料もしくは風味料と併せて、着色剤もしくは色素と併せて、乳化剤および／または懸濁剤と併せて、そして、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリンなどの希釈剤と併せて、さらには、これらの組合せと併せて用いてもよい。
【００６８】
本発明での使用に供する化合物は、非経口的に投与することができ、例えば静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、髄腔内投与、心室内投与、鼻腔内投与、頭蓋内投与、筋肉内投与、または皮下投与することができ、あるいは注入法を用いて投与してもよい。これらの化合物は、無菌水溶液の形態で用いるのが最善であり、この水溶液は、溶液を血液と等張にする他の物質、例えば、十分な塩またはグルコースを含有してもよい。この水溶液には、必要に応じて、適当な緩衝作用を与えるべきである（好ましくはｐＨ３から９に）。無菌条件下における適当な非経口製剤の調製は、当業者に周知である標準的な調剤法を用いて容易に達成される。
【００６９】
非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤と、緩衝液と、静菌薬と、製剤を対象である受容者の血液と等張にするための溶質とを含有しうる水性無菌注入液および非水性無菌注入液；ならびに、懸濁剤および増粘剤を含有しうる水性無菌懸濁液および非水性無菌懸濁液が含まれる。これらの製剤は、単位用量用または複数用量用の容器、例えば、密封されたアンプルおよびバイアルに入れて提供してもよく、さらに、使用直前に無菌液体担体、例えば注射用水を添加すればよいだけの凍結乾燥状態で保存してもよい。即時使用用の注入液および懸濁液は、上に記載した種類の無菌粉末薬、果粒剤、および錠剤から調製してもよい。
【００７０】
ヒト患者への経口投与用および非経口投与用には、本発明での使用に供する化合物の１日用量レベルは、単一用量または分割用量で投与された場合、通常、１成体あたり１から５０００ｍｇ（すなわち、約０．０１５から７５ｍｇ／ｋｇ）であるだろう。
【００７１】
したがって、例えば、本発明での使用に供する化合物の錠剤またはカプセルは、必要に応じて一度に１つまたは２つ以上投与されるよう、１ｍｇから１０００ｍｇの有効化合物を含有してもよい。いかなる場合にも、また、いかなる個々の患者対しても、その患者に最も適当であろう実際の用量は医師によって決定されるだろう。そして、その用量は、その特定の患者の年齢、体重、および反応に応じて異なるだろう。上記の用量は、平均的なケースの例である。当然ながら、個々の場合には、さらに高い用量範囲、またはさらに低い用量範囲が有益となる場合もありうるのであって、そのような用量範囲も、本発明の範囲に包含される。
【００７２】
本発明での使用に供する化合物は、鼻腔内投与または吸入による投与を行うことができ、好都合な送達形態では、適当な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ  １３４Ａ３）もしくは１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロエタン（ＨＦＡ  ２２７ＥＡ３）などのヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素、または他の適当なガスを使用して、加圧された容器、ポンプ、スプレーまたはネブライザーから、乾燥粉末吸入器またはエアゾールスプレープレゼンテーションの形態で送達される。加圧されたエアゾールを用いる場合、用量単位は、一定の量を計量して送達するバルブを提供することで決定してもよい。加圧された容器、ポンプ、スプレー、またはネブライザーは、例えば、溶剤としてエタノールおよび噴霧剤の混合物を使用して、有効化合物の溶液または懸濁液を含有してもよく、この溶剤は、潤滑剤、例えばトリオレイン酸ソルビタンをさらに含有してもよい。吸入器またはインサフレーターでの使用に供するカプセルおよびカートリッジ（例えば、ゼラチン製）は、本発明の化合物と、ラクトースおよびデンプンなどの適当な粉末薬ベースとの粉末混合物を含有するように製剤してもよい。
【００７３】
エアゾール剤または乾燥粉末製剤は、各計量投与すなわち「一服」が、患者への送達用に、本発明での使用に供する化合物を少なくとも１ｍｇ含有するように調製することが好ましい。エアゾールによる全体的な１日用量は患者によって異なり、また、これを単回用量で投与しても、または、より一般的に、１日を通した分割用量で投与してもよいことを理解されたい。
【００７４】
別法として、本発明での使用に供する化合物は、坐剤または腟坐剤の形態で投与することもでき、またはローション、溶液、クリーム、軟膏剤または散布剤の形態で局所的に適用してもよい。本発明での使用に供する化合物は、経皮的に、例えば、皮膚用パッチ剤の使用によって投与してもよい。本発明での使用に供する化合物は経眼投与してもよく、これは特に眼の疾患を治療するために行われる。
【００７５】
眼における使用では、本発明での使用に供する化合物を、ｐＨ調整された等張無菌食塩水中の微粉化物懸濁液として、また、好ましくはｐＨ調整された等張無菌食塩水溶液として、任意選択で塩化ベンザルコニウムなどの保存剤と併せて処方することができる。別法として、本発明での使用に供する化合物は、ワセリンなどの軟膏剤の中に処方してもよい。
【００７６】
局所的に皮膚に適用するためには、本発明での使用に供する化合物は、有効化合物を、例えば、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン化合物、乳化蝋、および水のうちの１つまたは複数との混合物中に懸濁または溶解して含有する適当な軟膏剤として処方することができる。別法として、本発明での使用に供する化合物は、例えば、鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、および水のうちの１つまたは複数との混合物中に懸濁または溶解して、適当なローションまたはクリームとして処方することができる。
【００７７】
口内における局所投与に適した製剤には、味のついた基礎の中、通常はスクロースとアラビアゴムまたはトラガントとの中に有効成分を含むトローチ；ゼラチン、グリセリン、スクロース、およびアラビアゴムなどの不活性な基礎の中に有効成分を含むパステル剤；および適当な液体担体中に有効成分を含むうがい薬が含まれる。
【００７８】
概してヒトでは、本発明の化合物の経口投与または局所投与が、最も好都合であり、したがって好ましい経路である。受容者が嚥下障害を患っているか、または経口投与後に薬物吸収の減失がある状況では、この薬物を、非経口投与、例えば、舌下投与または口腔投与してもよい。
【００７９】
本発明の第３の態様は、男性患者のＳＨＨシグナル伝達経路を阻害する治療によって起こりうる有害作用から、上記患者を保護する薬物の製造における、テストステロンまたはその作用を抑制する化合物の使用を提供する。
【００８０】
本発明の第４の態様は、患者における、癌などの増殖性疾患を治療するための薬物の製造における、ＳＨＨシグナル伝達経路に対する阻害剤の使用であって、上記患者に、上記患者のテストステロンまたはその作用を抑制する化合物が投与される使用を提供する。
【００８１】
本発明の５番目の態様は、患者における、癌などの増殖性疾患を治療するための薬物の製造における、患者におけるテストステロンまたはその作用を抑制する化合物の使用であって、上記患者に、ＳＨＨシグナル伝達経路に対する阻害剤が投与される使用を提供する。本発明の第３、第４、または第５の態様に関しては、投与の順序は、あまり重要ではないことがある。したがって、患者は、患者におけるテストステロンまたはその作用を抑制する化合物の投与の前に、ＳＨＨシグナル伝達経路に対する阻害剤を既に投与されていてもよく、または、患者におけるテストステロンまたはその作用を抑制する化合物の阻害剤と同時に、ＳＨＨシグナル伝達経路に対する阻害剤を投与されてもよく、または、患者におけるテストステロンまたはその作用を抑制する化合物の投与の後に、ＳＨＨシグナル伝達経路に対する阻害剤を投与されてもよい。しかし、テストステロンまたはその作用は、ＳＨＨシグナル伝達経路に対する阻害剤を投与する前に、患者で抑制されることが好ましい。
【００８２】
本発明の第６の態様は、患者における、癌などの増殖性疾患を治療するための薬物の製造における、ＳＨＨシグナル伝達経路に対する阻害剤と、患者におけるテストステロンまたはその作用を抑制する化合物との組合せの使用を提供する。
【００８３】
本発明の第７の態様は、患者における、癌などの増殖性疾患を治療するための治療システムであって、ＳＨＨシグナル伝達経路に対する阻害剤と、患者におけるテストステロンまたはその作用を抑制する化合物とを含むシステムを提供する。
【００８４】
本発明の第８の態様は、ＳＨＨシグナル伝達経路に対する阻害剤と、患者におけるテストステロンまたはその作用を抑制する化合物とを含む組成物を提供する。
【００８５】
本発明の第９の態様は、ＳＨＨシグナル伝達経路に対する阻害剤と、患者におけるテストステロンまたはその作用を抑制する化合物とを含む、医学で使用するための組成物を提供する。したがって、この組成物は、医学での使用用に、例えば薬物として包装され、提供される。この組成物は、人類医学で用いられても、獣医学で用いられてもよいが、好ましくは、人類医学で用いられる。
【００８６】
通常、この組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。したがって、ＳＨＨシグナル伝達経路に対する阻害剤と、患者におけるテストステロンまたはその作用を抑制する化合物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物（または、製剤とも呼ばれうる）は、本発明の実施において有用である。この（これらの）担体は、本発明の組成物と適合性があり、かつ、その受容者に有害でないという点において、「許容される」ものでなければならない。通常、担体は、無菌であって、かつ発熱因子を含まない水または食塩水であろう。したがって、本発明の第１０の態様は、ＳＨＨシグナル伝達経路に対する阻害剤と、患者においてテストステロンまたはその作用を抑制する化合物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。組成物（または製剤）のタイプについては、より詳細に上に記載した。
【００８７】
患者はヒトであることが好ましいが、患者は、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタなどの、いかなる哺乳動物であってもよく、これらには獣医学的適用がある。
【００８８】
獣医学的使用では、本発明での使用に供する化合物は、通常の獣医学の実施に従って適切に許容される製剤として投与され、特定の動物にとって最も適切であろう投与計画および投与経路は、獣医によって決定されるだろう。
【００８９】
本発明の第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、および第１０の態様に関して、本発明の第１の態様において好ましい化合物は、これらの態様でも好ましい。
【００９０】
これより、以下の実施例および図を参照して、本発明をさらに詳細に説明する。
【００９１】
（実施例１：ソニックヘッジホッグは前立腺の成長および上皮分化を調節する）
（概要）
ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）のシグナル伝達経路は、発生中および疾患中に、いくつかの組織の上皮と間充織との間のシグナル伝達を媒介する。前立腺の器官形成は、アンドロゲンシグナル伝達と上皮間葉間シグナル伝達との両方に依存するものであり、本発明者らはラット腹側前立腺（ＶＰ）の発生におけるＳＨＨシグナル伝達の役割を調べた。本発明者らのデータから、前立腺上皮におけるＶＰ成長、分岐、細胞分裂促進、および分化に、ＳＨＨシグナル伝達が重要であることが示唆される。本発明者らは、ＳｈｈおよびＰｔｃの発現が前立腺の成長および発生と相関すること、および、ＶＰにおけるＳｈｈおよびＰｔｃの発現がアンドロゲンによって調節されないことを実証した。ＳＨＨシグナル伝達を抗ＳＨＨ抗体を用いて、またはシクロパミンを用いて破壊したところ、どちらの処置もインビトロでＶＰの成長を阻害した。ＳＨＨシグナル伝達の阻害は、管先端数の増加、および管先端上皮におけるマイトジェネシスの減少を引き起こした。テストステロンの存在下では、ＳＨＨシグナル伝達の破壊は、前立腺上皮管の疎通を加速し、篩状前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）にいくらかの類似性を示す前立腺上皮管をもたらした。ｐ６３およびシトケラチン１４（ＣＫ１４）をマーカーとして用いて、上皮分化を検査したところ、遠位先端における上皮細胞の分化が早発的かつ異常であることが実証された。結論として、本発明者らは、ＳＨＨシグナル伝達が前立腺の成長に必要であること、および、ＳＨＨ経路からのシグナル伝達の非存在下では、アンドロゲン誘発性の成長によって、ＰＩＮを想起させる異常な上皮分化がもたらされることを実証した。
【００９２】
（材料および方法）
（ＲＮＡの単離）
全尿生殖路（ＵＧＴ）、ＶＰ、およびＵＲを、非近交系ウィスターラット、またはＳｈｈヌルマウス、または非近交系ＣＤ１バックグランドの同腹仔から顕微解剖により採取した（Ｃｈｉａｎｇら（１９９６）、Ｎａｔｕｒｅ  ３８３、４０７〜４１３）が、この際、膣栓観測日をｅ０．５とみなし、出産日をＰ０と指定した。全ＲＮＡは、記載されているように調製した（ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ、１９８７）。
【００９３】
（ＲＮアーゼプロテクションアッセイ）
ＳｈｈおよびＰｔｃリボプローブ用のＤＮＡテンプレートは、ＲＴ  ＰＣＲでＰ０  ＵＧＴ  ｃＤＮＡから合成し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳＩＩ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、米国）にサブクローニングした。ＰＣＲプライマーは、ＧｅｎＢａｎｋに公開されているｃＤＮＡ配列を用いて設計した（Ｓｈｈ：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ０１７２２１；プライマー：Ｌ−ＡＣＣＧＣＡＧＣＡＡＧＴＡＴＧＧＣＡ（配列番号１）、Ｒ−ＴＣＣＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＧＧＡＡＧ（配列番号２）；Ｐｔｃ：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０７９１６２；プライマーＬ−ＧＣＡＴＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴＧ（配列番号３）Ｒ−ＣＣＡＣＴＣＧＧＡＴＧＡＣＡＣＴＧＡＣＡ（配列番号４））。シクロフィリン（Ｃｐｈｎ）用および２８Ｓリボプローブ用のＤＮＡテンプレートは、Ａｍｂｉｏｎ社、米国から入手した。転写により３２Ｐ標識されたアンチセンスリボプローブを生成し、ＲＮアーゼプロテクションアッセイを、以前の詳細な記載にしたがって行った（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９７）。ＲＮアーゼで保護されたＳｈｈ産物、Ｐｔｃ産物、Ｃｐｈｎ産物、および２８Ｓリボプローブ産物は、それぞれ、２６９ヌクレオチド（ｎｔ）、３２２ｎｔ、１０３ｎｔ、および１５５ｎｔであった。Ｓｔｏｒｍホスファーイメジャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社、米国）を用いてゲルを映像化し、転写産物の存在量を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  Ｖ．１．２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社、米国）を用いて計算することで、バンド強度から決定した。転写産物の存在量は、Ｃｐｈｎまたは２８Ｓのどちらかを内部標準として正規化した（Ｃｐｈｎの発現は年齢と共にかなり減少することが見いだされたため、出生後試料では、２８Ｓを内部標準として用いた）。
【００９４】
（インサイツハイブリッド形成法）
インサイツハイブリッド形成法は、パラフィン包埋された７μｍ切片上で、以前に記載されたプロトコール（Ｆｒｏｈｍａｎら、１９９０；ＴｈｏｍｓｏｎおよびＣｕｎｈａ、１９９９）に若干の修正を加えた操作手順を用いて行った。３３Ｐ標識されたアンチセンスリボプローブおよびコントロールセンスリボプローブを、同じＳｈｈ  ＤＮＡテンプレートと、ＲＮアーゼプロテクションアッセイに関する方法とを用いて合成した。スライドをＧ．５エマルジョン（Ｉｌｆｏｒｄ社、英国）に浸漬し、製造元の指示書に従って発色させた。切片は、明視野／暗視野顕微鏡を用いて検査した。
【００９５】
（器官培養）
ＰＯウィスターラットＶＰの無血清器官培養は、以前の記載にしたがって行った（Ｓｕｇｉｍｕｒａら、１９９６）。培地は、１０−８Ｍのテストステロンおよび／あるいは、１μＭ、５μＭ、もしくは１０μＭのシクロパミン、または１００μｇ  ｍｌ−１の抗ＳＨＨ抗体（クローン５Ｅ１、アイオワ大学発生研究ハイブリドーマバンク（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ）、または０．２μｇ／ｍｌの組換え型ＳＨＨタンパク質（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、米国））で補完した。器官の二次元面積および周長は、ライブ捕捉した画像から、ＮＩＨ画像ソフトウェアを用いて測定した。
【００９６】
（組織学および免疫組織化学）
切片の組織学検査は、三重染色（Ｍａｓｓｏｎ、１９２９）によって、または、免疫組織化学染色の後で実施した。ジアミノベンズアミド（ＤＡＢ）検出によるＣＫ１４およびｐ６３免疫染色では、切片をｐＨ６．０、１０ｍＭのクエン酸で２分間加圧煮沸し、その後、以前に公表されたプロトコール（Ｔｈｏｍｓｏｎら、２００２）に従って実施した。ＣＫ１４抗体は１：１００に希釈し、抗ｐ６３抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）は、１：５００に希釈した。ＢｒｄＵおよび全サイトケラチンの共局在免疫組織化学検査は、抗ＢｒｄＵ抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、米国）の１：３００希釈と、抗全サイトケラチン抗体（Ｓｉｇｍａ社、英国）の１：２００希釈とを用いて、以前の記載（Ｔｈｏｍｓｏｎら、２００２）にしたがって実施した。ＢｒｄＵはＡｌｅｘｏｆｌｕｏｒ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、米国）を用いて検出し、全サイトケラチンはＣｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、英国）を用いて検出した。分裂指数は、全サイトケラチン陽性上皮細胞のうちＢｒｄＵにも陽性な細胞を計数することで計算した。
【００９７】
（結果）
（オスＵＧＴにおけるＳｈｈ  ｍＲＮＡの分布）
インサイツハイブリッド形成法によると、Ｓｈｈ転写産物は尿道上皮（ＵＲＥ）と、ＰＯオスＵＧＴにおける発生中腹側前立腺（ＶＰＥ）、背側前立腺（ＤＰＥ）、および背外側前立腺（ＤＬＰＥ）の上皮とに局在していた（図１）。Ｓｈｈ転写産物は、ＵＧＴ間質では観測されなかった。コントロールセンスリボプローブを用いた場合には、シグナルが観測されなかった（データは示されていない）。
【００９８】
Ｓｈｈ  ｍＲＮＡおよびＰｔｃ  ｍＲＮＡの経時発現パターンを、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）で検査した（図２）。ＳｈｈおよびＰｔｃ転写産物は、オスＵＧＴではｅ１８．５で最も豊富であった（図２Ａ）。転写産物レベルは、ｅ１９．５とｅ２１．５との間で低かったが、Ｐ０では上昇していた。ＶＰにおけるＳｈｈおよびＰｔｃ転写産物レベルは、Ｐ０では、ＵＧＴより高かったが、これは、これらの組織での上皮比率の変異によるものかもしれない。ＶＰにおけるＳｈｈおよびＰｔｃ転写産物の分析は、Ｐ０前には、器官原基が小さくてＵＲから切り離しにくく、ＶＰの顕微手術が困難であるため、実際的ではなかった。
【００９９】
出生後ＶＰでは、齢数の増大に従って、ＳｈｈおよびＰｔｃ転写産物レベルが減少した（図２Ｂ）。Ｓｈｈ  ｍＲＮＡおよびＰｔｃ  ｍＲＮＡは、ＰＯおよびＰ２で最も豊富であるが、Ｐ６までに、これらのレベルはＰ０より４倍低くなっていた。ＶＰの成長速度はＰ２０で迅速に低下するが、ＳｈｈおよびＰｔｃ転写産物は、Ｐ２０ではほとんど検出されず、成体には存在しなかった。
【０１００】
出生後オスラットにおけるＳｈｈおよびＰｔｃ転写産物レベルをＶＰとＵＲとの間で比較したところ、ＰＯからＰ２までは、ＶＰ中の転写産物がＵＲ中より豊富であったが、Ｐ４では、この状況が逆になっていた（図２Ｃ）。ＶＰとは異なり、ＵＲ中での発現はＰ２０の後まで維持され、これによりこれらの構造の発生経路が分離される。
【０１０１】
（ＶＰではＳｈｈ  ｍＲＮＡ発現がアンドロゲンで調節されない）
前立腺の発生がオスのみで起こり、マウスＵＧＳにおけるＳｈｈ  ｍＲＮＡのオス特異的なアップレギュレーションが報告されている（Ｐｏｄｌａｓｅｋら、１９９９）ため、ＳｈｈおよびＰｔｃ転写産物レベルを、オスラットＵＧＴとメスラットＵＧＴとの間で比較した（図３Ａ）。ＲＰＡ分析により、Ｓｈｈ  ｍＲＮＡおよびＰｔｃ  ｍＲＮＡの発現が、ｅ１７．５では、メスでオスより約２．５倍高く、ＰＯ、およびＰ６における転写産物レベルは、両性間で同等であったことを示した。Ｐ２０では、ＳｈｈおよびＰｔｃ転写産物の発現がオスで最小量となっているにもかかわらず、メスではまだ維持されていた。
【０１０２】
インビトロで成長中のＶＰおよびＵＲにおけるＳｈｈおよびＰｔｃ転写産物レベルを分析するために、ＲＰＡを行った。ＶＰを、テストステロン（Ｔ）の存在下または非存在下で６日間培養するか；または、Ｔで５日間、続いてＡＲアンタゴニスト酢酸シプロテロンで１日間処置した（図３Ｂ）。転写産物の存在量における有意差は、ＳｈｈまたはＰｔｃのいずれでも観測されなかった。同様に、ＶＰの短期培養（７時間または３日間）では、転写産物レベルの変化が観察されなかった（データは示されていない）。メスＵＧＴから顕微解剖され、Ｔの存在下または非存在下で３日間培養されたＵＲでの転写産物レベルを分析したところ、Ｐｔｃ転写産物レベルにおける顕著な変化は観測されなかったが、Ｓｈｈ転写産物で２．５倍のアップレギュレーションがあることが明らかになった（図３Ｃ）。
【０１０３】
（ＳＨＨシグナル伝達の阻害はＶＰの成長を低減する）
Ｐ０  ＶＰを、Ｔの存在下（＋）または非存在下（−）に、かつ１００ｍｌ−１抗ＳＨＨ抗体（５Ｅ１）の存在下（＋）または（−）非存在下に、５日間インビトロで成長させ（図４Ａ）、その後、これらの二次元面積を測定した（図４Ｂ）。５Ｅ１を培養に添加すると、ＶＰの成長が、−／＋Ｔの両方で（または、データは示されていないが、コントロールである非特異的なＩｇＧで）２０％抑制された。このデータは、ＳＨＨシグナル伝達が、ＶＰの成長における直接的役割を有する証拠を提供し、ＰＴＣ／ＳＭＯを介したシグナル伝達が、（ＶＰにおける）リガンドとしてＳＨＨに依存している可能性が大きいことを実証するものである。
【０１０４】
５Ｅ１抗体を多量に取得することが実際的でなかったため、ＶＰの成長におけるＳＨＨシグナル伝達のより大規模な検査は、ステロイド性アルカロイドであるシクロパミン（Ｃｙ）を用いて行った。Ｃｙは、ＰＴＣ／ＳＭＯを介したシグナル伝達を阻止する（Ｉｎｃａｒｄｏｎａら、１９９８）。Ｐ０  ＶＰを、−／＋Ｔ、および−／＋Ｃｙで６日間培養し（図５Ａ）、その後、それらの二次元面積を測定した（それぞれの４つの処置グループおよび２１回の独立した実験から得た総計１００個のＶＰ）（図５Ｂ）。用量反応性実験では、Ｃｙが成長阻害する最適濃度が１μＭであることが示された。Ｃｙは、０．１μＭを用いて行った培養では、まったく影響を示さないか、またはほとんど影響を示さず、一方、１０μＭのＣｙは毒性を示し、器官の早発的な死滅を伴う（データは示されていない）。ＣｙによるＳＨＨシグナル伝達の破壊は、ＶＰの成長を、Ｔの存在下および非存在下で有意に阻害した。−Ｔで培養された器官にＣｙを添加したところ、その結果、成長が１６％減退し（−Ｔ対−Ｔ＋Ｃｙ；スチューデントのｔ検定、Ｐ＝３．０ｅ−１４）、＋Ｔで培養されたＶＰでは、Ｃｙによって成長が２７％減退した（＋Ｔ対＋Ｔ＋Ｃｙ；スチューデントのｔ検定、Ｐ＝１．４ｅ−３４）。したがって、シクロパミンを用いた場合、ＳＨＨシグナル伝達の阻害によるＶＰ成長への影響は、Ｔの存在下でより大きなものであった。抗ＳＨＨ抗体５Ｅ１およびＣｙの両方が、ＶＰのＴ誘発性増殖を５０％減少させた。
【０１０５】
（ＳＨＨシグナル伝達および上皮発達）
本発明者らは、インビトロで成長したＶＰの前立腺上皮に対する、Ｃｙの影響を分析することを選択した。ＶＰ（それぞれの４つの処置グループおよび１６回の独立した実験から得た総計６０個のＶＰ）の辺縁部に位置する上皮芽先端を計数し、これと器官周長との比率を計算して、処置後における器官サイズの変化と関係づけた（図５Ｃ）。−Ｔで培養した器官へのＣｙの添加により、単位周長あたりの辺縁部上皮芽先端数の有意な増加が引き起こされた（単位周長あたりの平均上皮芽数は、−Ｔ＝６０．１６＋／−０．９７に対して−Ｔ＋Ｃｙ＝７４．４７＋／−１．０７；スチューデントのｔ検定、Ｐ＝１．３１ｅ−１７）。−Ｔ＋Ｃｙで観測された先端数の増大は、＋Ｔ単独で観測された増大（＋Ｔ＝７１．８０＋／−０．８３）と同程度であったが、ＴおよびＣｙの両方を培養に添加しても、先端数に対する相加効果はなかった（＋Ｔ＋Ｃｙ＝６９．８４＋／−１．１３）。ＴまたはＣｙによって誘導された上皮芽先端の数がこのインビトロ系での最大数にまで達して、このため相加効果が、このインビトロ系の限界により明らかにならなかった可能性もある。＋Ｔで培養された器官にＣｙを添加すると、＋Ｔ単独でのＶＰの培養と比較して、辺縁部上皮芽先端数がわずかに減少した。しかし、この減少は、統計的有意性の低いものであった（スチューデントのｔ検定、Ｐ＝０．０８）。辺縁部上皮芽先端数の増大は、Ｔの非存在下に抗ＳＨＨ抗体（５Ｅ１）と共に培養のＶＰでも観測され（−Ｔ＝６２．１３＋／−０．８２対−Ｔ＋５Ｅ１＝９３．０３＋／−１．０８）、＋Ｔで培養されたＶＰと、＋Ｔ＋５Ｅ１で培養されたＶＰとの間では、同程度の辺縁部上皮芽先端数が観測された（＋Ｔ＝７４．３２＋／−０．６９対＋Ｔ＋５Ｅ１＝７９．２１＋／−１．２８）。
【０１０６】
−／＋Ｔおよび−／＋Ｃｙで培養されたＶＰで、増殖中の上皮細胞を同定するために、そして、分裂指数を計算するために、ＢｒｄＵの取込みを用いた（図５Ｄ）。培養の６日目に、ＢｒｄＵをＶＰｓに添加し（４回の実験、それぞれの処置グループで９個の器官）、ＢｒｄＵの取込みを免疫組織化学法で可視化した。ＢｒｄＵの上皮への局在は、全サイトケラチンに対する免疫組織化学法で確認した（図５Ｄ、挿入図）。増殖中の細胞の割合は、この器官の辺縁部上皮芽先端（遠位）を撮した３つの画像と、尿道に最も近接した前立腺管（近位）の３つの画像とから、各処置グループにつき総計２７回の遠位および近位の計数を行って計算した。＋Ｃｙ、−Ｔで培養された器官と、＋Ｃｙ、＋Ｔで培養された器官との両方において、遠位での上皮先端における増殖の有意な減少が観測された（有糸核は、−Ｔ＝１８．９２％＋／−１．４８％対−Ｔ＋Ｃｙ＝１３．４８％＋／−０．９３％、スチューデントのｔ検定、Ｐ＝０．００２；＋Ｔ＝２３．２４％＋／−１．８６％対＋Ｔ＋Ｃｙ＝１６．２８％＋／−０．７４％、スチューデントのｔ検定、Ｐ＝０．０００５）。ＵＲに近位の前立腺管中では、増殖中の細胞の割合に、Ｃｙに反応した有意差が観測されなかった（データは示されていない）。Ｔによって、遠位での上皮芽先端の増殖は増強されるが、近位の前立腺管での増殖は抑制されることも実証した。本発明者らは、ＳＨＨシグナル伝達の阻害が、ＶＰにおける成長中の上皮芽先端で細胞増殖の速度を低下させると結論する。したがって、−Ｔ＋Ｃｙ処置グループで観測された遠位上皮芽先端数の増加は、上皮細胞増殖が増強されたことによるのではなく、分岐が増加したことによる可能性がより高い。
【０１０７】
（ＳＨＨシグナル伝達の阻害は前立腺上皮管の疎通および分化に影響を与える）
前立腺管は最初、固形の索として成長し、これが後に疎通を行って、管腔を含有する管となる。疎通は近位から遠位への方向で（すなわちＵＲから外側に）起こり、上皮細胞分化の結果でありうる（Ｈａｙｗａｒｄら、１９９６）。インビトロでの成長後では、通常、ＵＲに近位の管内には管腔が存在するであろう（図６Ｅ）が、遠位の上皮芽先端にはない可能性がある。すべての処置グループで、ＶＰにおける近位前立腺管内で管腔が観測されたが、＋Ｔ＋Ｃｙで培養されたＶＰは、遠位上皮芽先端でも管腔を示した（図６Ｇ、Ｈ。）また、＋Ｔ＋Ｃｙで培養されたＶＰでは、前立腺管の形態が正常ではないことも観測された。ラットの正常な前立腺管は、管腔分泌細胞と、その下の基底細胞とからなり、単一の管腔を形成する。＋Ｔ＋Ｃｙで培養されたＶＰの辺縁部前立腺管の構造は、さらに複雑であって、上皮架橋を伴い、この結果複数の管腔と、いくらか拡張した前立腺管とが現れる。この篩状の外観は、他の処置グループのＶＰでは限局的に存在するのみであった。
【０１０８】
成長中の上皮芽先端における未分化の前立腺上皮細胞は、サイトケラチン１４（ＣＫ１４）（Ｈａｙｗａｒｄら、１９９６）およびｐ６３（Ｐａｒｓｏｎｓら、２００１；Ｗａｎｇら、２０００）を一様に発現する。上皮細胞が分化するにしたがって、ＣＫ１４（Ｈａｙｗａｒｄら、１９９６）およびｐ６３（Ｐａｒｓｏｎｓら、２００１；Ｗａｎｇら、２０００）の発現は、基底細胞層に限定される。本発明者らは、−／＋Ｔおよび−／＋Ｃｙで、インビトロで成長しているＶＰにおけるＣＫ１４およびｐ６３の局在を調査した（図７）。
【０１０９】
ｐ６３の発現は、−Ｔ（図７Ａ）、−Ｔ＋Ｃｙ（図７Ｃ）、および＋Ｔ（図７Ｅ）で培養されたＶＰの遠位上皮芽先端の上皮細胞で高かった。これらのＶＰでは、遠位上皮芽先端の大部分が、未分化状態の特徴である均一なｐ６３染色を示したが、他のＶＰでは、基底膜に向うにしたがってｐ６３陽性細胞が増加していた。対照的に、＋Ｔ＋Ｃｙで培養されたＶＰでは、すべての遠位上皮芽先端で、ｐ６３の発現が基底細胞層に限局されていた（図７Ｇ）。ｐ６３の発現は、すべての処置グループのＶＰで、近位前立腺管における基底層の上皮細胞に局在していた。
【０１１０】
ＣＫ１４の発現はｐ６３に対する類似性を示したが、ｐ６３陽性細胞より少ない数の基底細胞がＣＫ１４陽性を示した。−Ｔで培養されたＶＰ（図７Ｂ）および−Ｔ＋Ｃｙで培養されたＶＰ（図７Ｄ）の遠位上皮芽先端の大部分がＣＫ１４を広範囲に発現し、これは、これらが未分化の上皮細胞であることと一致する。＋Ｔで培養されたＶＰでは、ＣＫ１４を均一に発現する遠位上皮芽先端と、特定の層の基底細胞がＣＫ１４を発現する遠位上皮芽先端との両方が観測された（図７Ｆ）。＋Ｔ＋Ｃｙで培養されたＶＰでは、遠位上皮芽先端（図７Ｈ）で、ＣＫ１４陽性細胞が非常に少なく、ｐ６３陽性細胞が相対的に多かったことと対照的である。ＣＫ１４の発現は、すべての処置グループのＶＰで、近位前立腺管における基底細胞層に限局されていた。
【０１１１】
様々な良性病変、前悪性病変、および悪性病変を有するヒト前立腺の針生検を抗ｐ６３抗体で染色して、本発明者らの培養ＶＰと比較した（図８）。正常なヒト前立腺管は、一層のｐ６３陽性基底細胞と、ｐ６３陰性の管腔細胞とを有し、単一の管腔を形成していた（図８Ａ）。良性上皮肥大では、抗ｐ６３染色によって基底細胞コンパートメントの拡張が明らかになった（図８Ｂ）。重度のＰＩＮの証跡を示すヒト前立腺管は、不連続な一層のｐ６３陽性基底細胞を有していた。前立腺管の管腔細胞は、篩状パターンの複雑な上皮架橋を形成し、これにより、複数の管腔と、拡張した前立腺管とを伴う外観を有した（図８Ｃ）。侵襲性腺癌では、ｐ６３陽性の基底細胞が存在しなかった（図８Ｄ）。＋Ｔ＋Ｃｙで成育されたＶＰの形態（図７Ｇ）と、重度なヒトＰＩＮの形態（図８Ｃ）との間で類似性が認められた。
【０１１２】
（ＨＨシグナル伝達は前立腺の誘導に必要ではない）
ｅ１７．５のＳｈｈヌルマウスからＵＧＴを顕微解剖で摘出し、検査した。ＳｈｈヌルマウスのＵＧＴは、それらの野生型同腹仔のＵＧＴより小さく（データは示されていない）、後腸が膀胱と隣接していた（図９Ａ）。変異体（図９Ｂ）でも、野生型のオスでも、この段階では前立腺が十分に発生していなかったので、Ｓｈｈヌルマウスと、それらの同腹仔との両方から体外移植されたＵＧＳを、インビトロで成育して、前立腺芽形成を誘導できるか判定した（ｎ＝３）。前立腺芽は３日後には存在し、５日後にはＳｈｈヌル体外移植片（図９Ｃ）と、同腹仔ＵＧＳ体外移植片（データは示されていない）の両方で拡大していた。ＲＴ−ＰＣＲによれば、ＶＰでは、インディアンヘッジホッグ（Ｉｈｈ）の発現がＳｈｈよりはるかに低いレベルであり（データは示されていない）、ＳｈｈヌルＵＧＴ体外移植片では、Ｉｈｈ（または、別のＨｈファミリーメンバー）のアップレギュレーションがＳＨＨの欠如を補償していた可能性もある。したがって、ｅ１６．５ラットのＵＧＳ体外移植片をインビトロで７日間、−／＋Ｔおよび−／＋１μＭ、５μＭ、または１０μＭシクロパミン（Ｃｙ）で成育させた（ｎ＝４）が、これは、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄを介したシグナル伝達を阻止し、したがってＨｈファミリーリガンドを介したシグナル伝達すべてを阻止するものである（Ｃｈｅｎら（２００２）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １６、２７４３〜２７４８；Ｉｎｃａｒｄｏｎａら（１９９８）、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２５、３５５３−３５６２）。−Ｔで成育された体外移植片では前立腺芽が観測されず（図９Ｄ）；＋Ｔで成育された体外移植片（図９Ｅ）と、＋Ｔ＋１μＭ  Ｃｙで成育された体外移植片（図９Ｆ）とでは、前立腺芽が同様のレベルで存在していた。また、＋Ｔ、＋５μＭ  Ｃｙで成育された体外移植片と、＋Ｔ、＋１０μＭ  Ｃｙで成育された体外移植片とでも、前立腺芽が存在していた（データは示されていない）が、これらの濃度のＣｙは毒性であり、早発的な器官の死滅を引き起こした。
【０１１３】
（ＶＰの成長および分岐に対する外来性ＳＨＨの影響）
インビトロで成育されているＶＰに、組換え型ＳＨＨを添加することの影響を検査した（図１０）。−／＋Ｔおよび−／＋組換え型ＳＨＨタンパク質で、３日間ＶＰを成長させた（ｎ＝６）。培養にＳＨＨを添加すると、その結果、−／＋Ｔの両方でＶＰ辺縁部周囲の間充織が拡張した（図１０Ａ）。培養されたＶＰの２Ｄ面積を測定した（ｎ＝６、各処置グループからの１４ＶＰ）ところ、ＳＨＨの添加によって、−／＋Ｔの両方で、ＶＰの全体的な成長に小さな減退が引き起こされたが、これらは統計的な有意性の低いものであった（−Ｔ対−Ｔ＋ＳＨＨの％面積＝１００＋／−３．５６対９０．１２−／＋５．２６、スチューデントのｔ検定、Ｐ＝０．０７；＋Ｔ対＋Ｔ＋ＳＨＨの％面積＝１２７．０５＋／−５．１２対１２３．０３＋／−６．７５、スチューデントのｔ検定、Ｐ＝０．３２）（図１０Ｂ）。
【０１１４】
培養されたＶＰからの辺縁部上皮芽先端を計数し、これと周長との比率を計算した（図１０Ｃ）。培養にＳＨＨを添加したことにより、−／＋Ｔの両方で、辺縁部上皮芽先端数が有意に減少したが、これはすなわち、ＣｙでＨＨシグナル伝達を阻害するのとは反対の効果を有するものである（１０００ピクセル周長あたりの平均上皮芽先端数は、−Ｔ対−Ｔ＋ＳＨＨ＝６８．６５＋／−２．６２対４８．０９＋／−３．３５、スチューデントのｔ検定Ｐ＝３．１３ｅ−５；＋Ｔ対＋Ｔ＋ＳＨＨ＝８３．９２＋／−２．２５対６８．３４＋／−２．５７、スチューデントのｔ検定Ｐ＝５．３７ｅ−５）
【０１１５】
ＢｒｄＵの添加後に、−／＋Ｔおよび−／＋ＳＨＨで培養されたＶＰにおける上皮細胞コンパートメントおよび間充織細胞コンパートメントの増殖指数を計算した（図１０Ｄ）。上皮標識指数は培養の３日目に計算し、間充織標識指数は培養の２日目に計算したが、これは間充織増殖に対する効果が、３日目と比較して２日目により顕著であることが、本発明者らのデータによって示されていたためである。−Ｔで成育されたＶＰでは、ＳＨＨによって上皮細胞増殖が３分の１減退した（−Ｔ対−Ｔ＋ＳＨＨの％増殖核＝２７．９５％＋／−１．１５％対１８．６２％＋／−２．０６％、スチューデントのｔ検定Ｐ＝１．８４ｅ−４）が、＋Ｔで成育されたＶＰでは６％のみの減退であり、これは統計的に有意ではなかった（＋Ｔ対＋Ｔ＋ＳＨＨの％増殖核＝３２．５４％＋／−１．６５％対３０．４６％＋／−１．７２％、スチューデントのｔ検定Ｐ＝０．１９）。間充織では、Ｔの存在下でも非存在下でも、ＳＨＨによって増殖が刺激された（−Ｔ対−Ｔ＋ＳＨＨの％増殖核＝１４．９６％＋／−０．８９％対１９．４５％＋／−１．１２％、スチューデントのｔ検定Ｐ＝０．００２；＋Ｔ対＋Ｔ＋ＳＨＨ％増殖核＝１７．８１％＋／−１．２２％対２０．４７％＋／−１．０７％、スチューデントのｔ検定Ｐ＝０．０５６）
【０１１６】
（考察）
本発明で、本発明者らはＳＨＨシグナル伝達が前立腺の成長、前立腺上皮の成長、および上皮分化を調節することを実証した。ＳＨＨシグナル伝達の阻害は、インビトロで培養されているＶＰの成長を遅延させ、マイトジェネシスを減弱させ、成長中の前立腺上皮における前立腺管先端数を増加させた。Ｔの存在下では、ＳＨＨシグナル伝達の阻害によって、前立腺上皮の異常な分化が引き起こされた。本発明者らは、ＳＨＨシグナル伝達が前立腺の上皮間充織相互作用の必須調節因子であると提案する。
【０１１７】
双方向的な上皮間充織相互作用が、発生中および疾患中に前立腺成長を方向付ける重要な役割を果たしている（ＣｕｎｈａおよびＣｈｕｎｇ、１９８１；Ｇａｏら、２００１；Ｏｌｕｍｉら、１９９９）。正常な発生条件下では、上皮成長がアンドロゲンで調節されたシグナル伝達を介して間充織から制御される（ＣｕｎｈａおよびＣｈｕｎｇ、１９８１）が、このための正確な機構は明らかではない。上皮成長のこのパラクリン制御は、正常成体の前立腺では維持されるが、前立腺癌では、アンドロゲンによる上皮の制御がオートクリンになっている（Ｇａｏら、２００１）。逆に、上皮からのパラクリンシグナル伝達は、前立腺発生中の間質分化を形づけ、正常な成体前立腺における間充織／間質の維持を行う（Ｃｕｎｈａら、１９９６；Ｈａｙｗａｒｄら、１９９８）。前立腺癌腫では、上皮細胞は間充織／間質の分化を誘導／維持できないようにみえるので、上皮からのパラクリンシグナル伝達が変化していると仮定されている（Ｃｕｎｈａら、１９９６。）
【０１１８】
現在までに、前立腺成長における上皮間充織相互作用を調節するものとして同定されたシグナル伝達経路は、前立腺特異的なものではない。ＳＨＨシグナル伝達経路は、多数の器官において発生中の上皮間充織相互作用を調節する。マウスＵＧＴでは、ＳｈｈがＵＧＳ上皮で発現され（ＢｉｔｇｏｏｄおよびＭｃＭａｈｏｎ、１９９５；Ｐｏｄｌａｓｅｋら、１９９９）、外部生殖器の形成に必須である（Ｈａｒａｇｕｃｈｉら、２００１；Ｐｅｒｒｉｔｏｎら、２００２）。また、抗体による封鎖でＳＨＨシグナル伝達を阻害すると、前立腺の分枝形態形成が抑止されることも実証されている（Ｐｏｄｌａｓｅｋら、１９９９）。
【０１１９】
オスラットＵＧＴにおけるＳｈｈの時間的および空間的発現パターンは、ＶＰの成長および発生におけるＳｈｈの役割を示唆するものであった。Ｓｈｈ転写産物はＰ０オスの尿道上皮と、発生中の前立腺葉の上皮芽とに局在し、以前に行われたＳｈｈ転写産物分布の研究と一致した（ＢｉｔｇｏｏｄおよびＭｃＭａｈｏｎ、１９９５；Ｐｏｄｌａｓｅｋら、１９９９）。ＲＰＡは、ＳｈｈおよびＰｔｃ転写産物がｅ１８．５で最も多いことを示し、腹側間葉パッド（ＶＭＰ）に向かった尿道上皮の可視的な成長と相関しているが、この尿道上皮の成長はＶＰの発生開始を定義するものである。ＳｈｈおよびＰｔｃ転写産物レベルはＰ０で再度上昇するが、これは新生児期に起こるＶＰの成長および分岐の活性化に付随するものである。オスＵＧＴにおけるＳｈｈおよびＰｔｃの時間的発現パターンは、Ｂｍｐ４の発現パターンを反映するものであることがわかった。Ｓｈｈの推定下流シグナル伝達エフェクターであるＢｍｐ４（ＢｉｔｇｏｏｄおよびＭｃＭａｈｏｎ、１９９５）は、前立腺における成長中の上皮芽を囲む間充織で発現される（Ｌａｍｍら、２００１）。ＳｈｈおよびＢｍｐ４の同時発現は、ＵＧＳを含めたいくつかの上皮間充織相互作用部位で実証されている（ＢｉｔｇｏｏｄとＭｃＭａｈｏｎ、１９９５）。出生後ＶＰでは、新生児期早期の成長および分枝で、高レベルのＳｈｈおよびＰｔｃ転写産物が観測された。これらのレベルはＰ６の後に低減し、このため、ＶＰの成長が成体期の静止状態まで大幅に遅くなるＰ２０（Ｓｕｇｉｍｕｒａら、１９８６）では転写産物はほとんど検出されなかった。ＶＰにおけるＳｈｈおよびＰｔｃの時間的発現パターンは、成長中の上皮芽を囲む間充織で発現されるＦｇｆ１０の発現パターンと相関する（ＴｈｏｍｓｏｎおよびＣｕｎｈａ、１９９９）。
【０１２０】
ＳｈｈおよびＰｔｃの転写産物レベルを、出生後オスのＶＰとＵＲとの間で比較した。成体期に近づくにつれてＶＰにおける転写産物レベルは低減したが、ＵＲの発現は、発生期を通して同程度のレベルに維持された。したがって、ＶＰの発生経路とＵＲの発生経路とは別々であることが判った。このデータは、ＳＨＨシグナル伝達がＶＰにおける成長および分岐に必要であることを示唆するものであり、本発明者らは、ＵＲで維持されていたＳＨＨシグナル伝達が、成体期にまで継続的されるＵＲの伸長か、または尿道腺の形成に必要なのかもしれないと提案する。本発明者らのデータは、出生後オスマウスＵＧＳで報告されている高レベルのＳｈｈ転写産物（Ｐｏｄｌａｓｅｋら、１９９９）が、ＵＲから生じているのかもしれないことも示唆する。
【０１２１】
オスＵＧＴとメスＵＧＴとの間の転写産物レベルを比較し、ｅ１７．５におけるＳｈｈ  ｍＲＮＡおよびＰｔｃ  ｍＲＮＡが、メスではオスより約２．５倍多いことを実証した。転写産物レベルはＰ０とＰ６とで同程度であったが、Ｐ２０では、オスＵＧＴより有意に多いＳｈｈおよびＰｔｃ転写産物がメスＵＧＴに存在していた。Ｐ２０のメスにおける転写産物レベルがオスと比べて上昇していたのは、本発明者らによるＵＧＴの定義の解剖学的な相違を反映するものかもしれない。本発明では、メスＵＧＴをＵＧＳ（すなわちＵＲ）のみと定義し、オスＵＧＴをＵＧＳプラス付随する前立腺葉およびＳＶと定義する。したがって、本発明におけるメスＵＧＴ  ＲＮＡ試料は、本発明におけるオスＵＧＴ由来のＲＮＡ試料より高い割合の尿道ＲＮＡを含有している。ＵＲはＳｈｈ  ｍＲＮＡおよびＰｔｃ  ｍＲＮＡの発現を少なくともＰ２０まで維持する（図２Ｃ）ので、メスＵＧＴ  ＲＮＡ試料で、ＳｈｈおよびＰｔｃ転写産物がより高レベルであるのは、尿道ＲＮＡの相対的な割合がより高いためであるかもしれない。本発明者らのデータは、Ｐｏｄｌａｓｅｋら（１９９９）のデータと矛盾することがわかった。Ｐｏｄｌａｓｅｋらは、ｅ１９マウスのオスＵＧＳにおけるＳｈｈ発現が、メスＵＧＳより７倍高いことを報告している（Ｐｏｄｌａｓｅｋら、１９９９）。Ｐｏｄｌａｓｅｋら（１９９９）の研究では、発生中の膣もＵＧＴと共に含まれているので、これによってメスＲＮＡ試料中のＳｈｈ転写産物の存在量が希釈されるが、このことによって、この不一致が説明できるかもしれない。
【０１２２】
ＶＰにおいてＳＨＨシグナル伝達がアンドロゲンによって調節されているかどうか判定するために、−／＋Ｔで６日間、または＋Ｔで５日間、続いてＡＲアンタゴニストである酢酸シプロテロンの存在下に１日間インビトロで培養されたＶＰの間でＳｈｈおよびＰｔｃの転写産物レベルを比較した。転写産物レベルの有意差は、このタイムコースでも、−／＋Ｔで７時間または３日間処置された器官の間（データは示されていない）でも観測されなかった。これは、Ｓｈｈ  ｍＲＮＡおよびＰｔｃ  ｍＲＮＡの発現がＶＰのアンドロゲンに依存しないであろうことを示した。以前の研究で本発明者らは、ＶＰの成長においてＦＧＦ１０もアンドロゲン作用に非依存的に作用することを示した（ＴｈｏｍｓｏｎおよびＣｕｎｈａ、１９９９）。これは、前立腺の発生がアンドロゲンに依存していることが知られているが、一部のシグナル伝達経路ではその機構が間接的であってもよいことを示唆している。最近、本発明者らは、アンドロゲンが平滑筋肉層の分化を制御するによって、前立腺誘導中の間充織上皮相互作用が調節されうることを示した（Ｔｈｏｍｓｏｎら、２００２）。
【０１２３】
Ｐｏｄｌａｓｅｋらは、３日間ジヒドロテストステロンで培養されたｅ１５オスマウスのＵＧＳ体外移植片で、Ｓｈｈ転写産物が５倍に増加することを報告した。これは、前立腺芽上皮ではアンドロゲン受容体（ＡＲ）の発現が出産まで現れない（Ｈａｙｗａｒｄら、１９９６）ので、ＵＧＳに特異的なことかもしれない。このことと一致して、本発明者らは、メスＵＧＴのＵＲにおいて、Ｔに応答してＳｈｈ転写産物が２．５倍にアップレギュレートされることを報告した。これは、Ｐｔｃのアップレギュレーションとは整合せず、この観測の機能的有意性に疑問がもたらされる。
【０１２４】
ＳｈｈヌルマウスはＵＧＳでＮｋｘ３．１を発現しないことが観測されている（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、２０００）。Ｎｋｘ３．１は、将来に前立腺上皮となる細胞における最も初期の既知マーカーであり、オスＵＧＳの、前立腺芽がＵＧＳから生じる領域に限って発現される（Ｂｈａｔｉａ−Ｇａｕｒら、１９９９）。Ｎｋｘ３．１ヌル変異体には前立腺が依然として存在するので、Ｎｋｘ３．１は前立腺の誘導に必要ではない（Ｂｈａｔｉａ−Ｇａｕｒら、１９９９；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、２０００）が、Ｎｋｘ３．１の発現は、発生中における上皮分化と、成体期における正常な前立腺機能とに必要である（Ｂｈａｔｉａ−Ｇａｕｒら、１９９９）。Ｎｋｘ３．１は、オスＵＧＳでのみ発現されるので、アンドロゲンによって調節されている可能性が高く、また、機能的なＡＲが上皮に現れる以前に発現が起こるので、アンドロゲンによるこの調節は、間充織によって媒介されている可能性が高い（Ｂｈａｔｉａ−Ｇａｕｒら、１９９９）。現在の文献は、アンドロゲンがオスでＳｈｈ発現をアップレギュレートし、これが次にＮｋｘ３．１発現を誘導することを示唆する（Ｐｏｄｌａｓｅｋら、１９９９）。本発明者らは、オスおよびメス両方のＵＧＳにＳｈｈ転写産物が存在すること、およびＳｈｈ発現にオス特異的なアップレギュレーションがないことを見いだしたので、Ｓｈｈは、オスＵＧＳにおけるＮｋｘ３．１発現の誘導因子ではなく、むしろ許容因子であると提案する。
【０１２５】
ＶＰ成長および発生におけるＳＨＨの直接的役割を、ＳＨＨシグナル伝達経路の阻害によって実証した。抗ＳＨＨ抗体を用いた場合と、Ｃｙを用いた場合との両方で、ＳＨＨシグナル伝達を阻止することによって、ＶＰ成長の減少がもたらされた。抗体による封鎖によって生じる成長の減退は、ＶＰの成長中および発生中、ＰＴＣ／ＳＭＯを介したシグナル伝達が、ＳＨＨにリガンドとして依存していることを確認した。ＲＴ−ＰＣＲによって、Ｄｈｈ転写産物ではなく、ＩｈｈがＶＰで観測されたがｌｈｈ転写産物レベルはＳｈｈのレベルよりはるかに低かった（データは示されていない）。ＳＨＨは、ＩＨＨより強力なペプチドであることが実証されており（Ｐａｔｈｉら、２００１）、本発明者らは、ＳＨＨがＶＰにおけるＰＴＣ／ＳＭＯを介したシグナル伝達の主要な調節因子であると提案する。本発明の結果は、ｅ１５マウスＵＧＳで、オス宿主の腎臓莢膜の下に移植された前立腺原基に抗ＳＨＨビーズを皮内移植することによって前立腺の成長および発生が抑止されることを示した実験（Ｐｏｄｌａｓｅｋら、１９９９）と一致するものである。
【０１２６】
ＳＨＨシグナル伝達の阻害によって、上皮細胞増殖が低減されているにもかかわらず、ＶＰ辺縁部の周りの上皮芽先端数は増加したが、これは、上皮芽先端数の増加が分岐の増大によるものであったことを示唆する。間充織を含まない肺の体外移植では、分岐に上皮細胞増殖の増大は必要ではないが、伸長するためには必要である（Ｎｏｇａｗａら、１９９８）。もし肺で上皮および間充織の両方に作用するＳＨＨのマイトジェン作用（Ｂｅｌｌｕｓｃｉら、１９９７ｂ）が前立腺でも効果をもたらすなら、ＳＨＨシグナル伝達はマイトジェネシスを促進して、分岐を阻害するように作用したかもしれず、その場合上皮芽先端の伸長を可能にしたであろう。前立腺管先端数および分枝点数の有意な増加は、Ｂｍｐ４ハプロインサフィシエントマウスのＶＰでも観測された（Ｌａｍｍら、２００１）。Ｂｍｐ４は、側部分岐を阻害し、それによって前立腺上皮管の伸長を可能にすると仮定されている（Ｌａｍｍら、２００１）。ＳｈｈおよびＢｍｐ４は、発生中に上皮間充織相互作用があるいくつかの部位で同時発現されることが判明しており（ＢｉｔｇｏｏｄおよびＭｃＭａｈｏｎ、１９９５）、ＳｈｈはＢｍｐ４の発現を変調できることが実証されている（Ｈａｒａｇｕｃｈｉら、２００１）。本発明者らは、前立腺で分岐形成を阻害する経路において、ＳｈｈがＢｍｐ４の上流で作用するかもしれないと提案する。
【０１２７】
上皮前立腺管は最初、固形の索として成長し、その後、この索が疎通を行う。疎通は前立の管の尿道端（近位）で始まり、管の遠位部分に向かって進行する（Ｈａｙｗａｒｄら、１９９６）。本発明者らは、疎通が＋Ｔ＋Ｃｙで培養されたＶＰの遠位先端でも起こったことを観測したが、一方、−Ｔ、−Ｔ＋Ｃｙ、および＋Ｔで培養されたＶＰでは、疎通が近位の管でのみ明らかであり、これは＋Ｔで培養したＶＰで最も進行していた。これは、Ｔの存在下ではＳＨＨシグナル伝達の阻害が疎通を加速すること、しかしＳＨＨシグナル伝達の破壊のみでは十分でなかったことを示唆する。本発明者らは、ＳＨＨシグナル伝達がインビボで前立腺上皮管の疎通を阻害し、したがって、疎通を促進するＴとは反対の役割を果たすと提案する（Ｈａｙｗａｒｄら、１９９６）。
【０１２８】
＋Ｔ＋Ｃｙで培養されたＶＰの遠位上皮芽先端の形態は、よく発達した篩状パターンと複数の管腔とを有する複雑なものであった。ヒトの病気では、この篩状パターンは、前立腺良性上皮肥大の重篤な形態と、浸潤癌の前駆体である高度のＰＩＮとで見ることができる。鑑別診断で用いられる特徴の１つには、前立腺肥大における正常な核の存在であり、これは、ＰＩＮにおける可視的な核小体を有する拡大して、可変的な核と対照をなす。しかし、後者の特徴は前立腺発生モデルでも見ることができ、本発明の実験すべてで一貫した特徴であった。管腔細胞の顕著な肥大における別の特徴は、それがしばしば対応する基底コンパートメントの拡張を伴うことであり（Ｅｐｓｔｅｉｎ、１９９２）、これはｐ６３免疫染色で明確に実証される（図８Ｂ）。他方では、ＰＩＮの病変部には、通常、単層の基底細胞があり、しばしば、これに大きなギャップが伴う（図８Ｃ）が、本発明における＋Ｔ＋Ｃｙで培養したＶＰと同様であった（図７）。最後に、前立腺良性上皮肥大は、通常前立腺管の拡張に至らず（図８Ｃ）、篩状ＰＩＮおよび本発明における＋Ｔ＋Ｃｙで培養されたＶＰ（図７Ｇ）とは異なる。これらの観測は、本発明における、＋Ｔ＋Ｃｙでインビロ成育されたＶＰの前立腺上皮がＰＩＮのもついくつかの特徴を再現したものであることを示唆する。
【０１２９】
前立腺管と上皮細胞分化の疎通との間には、明確な時間的空間的関係がある（Ｈａｙｗａｒｄら、１９９６）。未熟な前立腺管上皮細胞から、成熟した前立腺管に見いだされる管腔細胞および基底細胞への分化は、ＣＫ発現およびｐ６３発現の変化によって特徴づけられる（Ｈａｙｗａｒｄら、１９９６；Ｗａｎｇら、２０００）。未分化の前立腺上皮細胞は一様にＣＫ５、ＣＫ８、ＣＫ１４、ＣＫ１８、およびｐ６３を発現する。基底細胞は、ＣＫ５、ＣＫ１４、およびｐ６３の発現を維持し、ＣＫ８およびＣＫ１８の発現を喪失するが、管腔細胞は、ＣＫ８およびＣＫ１８の発現を維持し、ＣＫ５、ＣＫ１４、およびｐ６３発現を喪失する（Ｈａｙｗａｒｄら、１９９６；Ｗａｎｇら、２０００）。ｐ６３の免疫組織化学は、＋Ｔ＋Ｃｙで培養されたＶＰにおけるすべての遠位上皮芽先端の上皮細胞が分化していることを明らかにした。他の処置グループすべてのＶＰでは、未分化の上皮細胞か、または分化した基底細胞のいずれかを含有する遠位上皮芽先端が混在していた。これは、ＳＨＨシグナル伝達の阻害が、Ｔの存在下で上皮細胞分化を加速したことを示唆した。ＣＫ１４の発現パターンはｐ６３の発現パターンと同様であったが、＋Ｔ＋Ｃｙで培養されたＶＰの遠位上皮芽先端では、大部分の細胞がＣＫ１４を発現せず、発現した細胞はより基底部寄りで、分化を示すものであったことが異なっていた。ヒト前立腺は、ＣＫ１４陽性基底細胞の完全な層が存在していないことがよく認識されており、また、ケラチンサブタイプの発現に変異があることもよく記載されている（Ａｂｒａｈａｍｓら、２００２；Ｆｒｅｅｍａｎら、２００２）。ケラチンプロファイルにおけるこれらの変異の機能的有意性は未知である。それにもかかわらず、通常、ＰＩＮでは正常な前立腺より少ないＣＫ陽性細胞が見られ（ＢｏｓｔｗｉｃｋおよびＢｒａｗｅｒ、１９８７）、およびＰ．Ｈ．の個人的観測）、＋Ｔ＋Ｃｙで培養されたＶＰでＣＫ１４陽性細胞が相対的に少数であることは、再度、ＰＩＮを想起させるものである。基底細胞の完全な喪失は、前立腺腺癌に固有な特徴として既に久しく確立されている（Ｔｏｔｔｅｎら、１９５３）。これは、基底細胞の存在を実証することで浸潤性の疾患が除外されるので、異型（ただし良性）病変と前立腺腺癌との間の鑑別診断において診断病理学者が利用する重要な特色の１つである。基底層は、しばしば減衰していて標準的な形態学で同定することが困難であり、それ故、免疫細胞化学マーカーが有用である（ＷｏｊｎｏおよびＥｐｓｔｅｉｎ、１９９５）。本発明のデータは、ｐ６３がケラチンより一貫して発現されているかもしれず、そして、これに診断病理学上の価値があるであろうことを示唆する。
【０１３０】
本発明の結果は、ＳＨＨシグナル伝達がＶＰの成長におけるアンドロゲン作用に依存していない可能性が高いことを示した。しかし、ＳＨＨシグナル伝達の阻害がＴの存在下において遠位上皮芽先端の分化に与える影響は、Ｔの非存在下で与える影響とは異なっており、前立腺上皮分化の間に、ＳＨＨシグナル伝達とアンドロゲンとが共に関与していることが推論される。これは、Ｔの存在下では、ＶＰがＴの非存在下と比べてより高い成長率を示すことと関係あるかもしれない。本発明者らは、遠位上皮芽先端の上皮細胞が、Ｔの存在下でより急速に増殖することを示した（図５Ｄ）。したがって、ＳＨＨシグナル伝達を阻害した影響は、おそらく、より迅速に増殖している細胞にのみ影響を現すものである。ＶＰの近位前立腺管では分化に対する明白な影響が観測されなかったが、この近位前立腺管細胞は、培養６日後において遠位上皮芽先端の細胞よりはるかに遅い分裂を行う。本発明者らは、ＳＨＨシグナル伝達とアンドロゲンとの相互作用が、前立腺上皮分化の間はいかなるものもおそらく間接的かつ複雑である可能性が高いと提案し、現在の証拠に基づいて、いかなる機構によってこの相互作用が起こりうるかは提案し得ない。
【０１３１】
ＳＨＨシグナル伝達経路の不適切な活性化は、いくつかのタイプの腫瘍と関連づけられている（（Ｒｕｉｚ  ｉ  Ａｌｔａｂａら、２００２）に総説されている）。本発明のデータは、成長中におけるＳＨＨシグナル伝達経路の不活性化が疾患を想起させる損傷をもたらした点において新規である。ＳＨＨシグナル伝達経路は、前立腺疾患に関連づけられている他の遺伝子も制御しているかもしれない。本発明者らは、Ｓｈｈが前立腺上皮成長中におけるＮｋｘ３．１発現の許容因子であるかもしれないことを既に論じた。発生欠陥に加えて、Ｎｋｘ３．１変異体マウスは、本発明の＋Ｔ＋Ｃｙで培養されたＶＰと同様に、ＰＩＮを想起させる損傷を発達させる（Ｂｈａｔｉａ−Ｇａｕｒら、１９９９；Ｋｉｍら、２００２）。
【０１３２】
ＳＨＨシグナル伝達を破壊することによって、本発明者らは、ＳＨＨシグナル伝達が前立腺の成長に必要であること、そして分枝形態形成を阻害しうることを実証した。ＳＨＨシグナル伝達の阻害は、成長中の上皮細胞の早発的で異常な分化を導き、ヒト篩状ＰＩＮに似た損傷をもたらした。本発明は、成長中にＳＨＨシグナル伝達を破壊することによる発生への影響に関して新規の情報を提供し、正常な発生中に活性なシグナル伝達経路の不適切な調節が疾患過程に関与しうるという理論に証拠を与えるものである。
【０１３３】
（実施例２：基底細胞癌の治療）
基底細胞癌を患う男性患者に、テストステロンが去勢レベル（０．５ｎｇ／ｍｌ）に達するまで、リユープロレリンが投与（３．７５ｍｇを４週間毎に筋肉内投与）される。その後この患者には、基底細胞癌を寛解させる投与計画においてシクロパミンが投与される。
【０１３４】
（実施例３：グリア芽腫の治療）
グリア芽腫で来診した男性患者に、テストステロンの影響を抑制するために、フルタミドが投与（２５０ｍｇを１日３回経口投与）される。その後この患者には、グリア芽腫を寛解させる投与計画においてＳＨＨシグナル伝達経路に対する阻害剤が投与される。
【０１３５】
（参考文献）
Ａｂｒａｈａｍｓ，Ｎ．Ａ．、Ｏｒｍｓｂｙ，Ａ．Ｈ．およびＢｒａｉｎａｒｄ，Ｊ．（２００２）、「Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ  ５／６  ａｓ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  ｋｅｒａｔｉｎ  ９０３  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｎｉｇｎ  ｆｒｏｍ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌａｎｄｓ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｎｅｅｄｌｅ  ｂｉｏｐｓｉｅｓ」、Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ４１、３５〜４１。
【０１３６】
Ｂｅｌｌｕｓｃｉ，Ｓ．、Ｆｕｒｕｔａ，Ｙ．、Ｒｕｓｈ，Ｍ．Ｇ．、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．、Ｗｉｎｎｅｒ，Ｇ．およびＨｏｇａｎ，Ｂ．Ｌ．（１９９７ａ）、「Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｓｈｈ）ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｌｕｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４、５３〜６３。
【０１３７】
Ｂｅｌｌｕｓｃｉ，Ｓ．、Ｇｒｉｎｄｌｅｙ，Ｊ．、Ｅｍｏｔｏ，Ｈ．、Ｉｔｏｈ，Ｎ．ａｎｄ  Ｈｏｇａｎ，Ｂ．Ｌ．（１９９７ｂ）、「Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １０（ＦＧＦ  １０）ａｎｄ  ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｌｕｎｇ」、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４、４８６７〜７８。
【０１３８】
Ｂｈａｔｉａ−Ｇａｕｒ，Ｒ．、Ｄｏｎｊａｃｏｕｒ，Ａ．Ａ．、Ｓｃｉａｖｏｌｉｎｏ，Ｐ．Ｊ．、Ｋｉｍ，Ｍ．、Ｄｅｓａｉ、Ｎ．、Ｙｏｕｎｇ、Ｐ．、Ｎｏｒｔｏｎ，Ｃ．Ｒ．、Ｇｒｉｄｌｅｙ，Ｔ．、Ｃａｒｄｉｆｆ，Ｒ．Ｄ．、Ｃｕｎｈａ，Ｇ．Ｒ．ら（１９９９）、「Ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｎｋｘ３．１  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ」、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １３、９６６〜７７。
【０１３９】
Ｂｉｔｇｏｏｄ，Ｍ．Ｊ．およびＭｃＭａｈｏｎ，Ａ．Ｐ．（１９９５）、「Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ａｎｄ  Ｂｍｐ  ｇｅｎｅｓ  ａｒｅ  ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｔ  ｍａｎｙ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏ」、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １７２、１２６〜３８。
【０１４０】
Ｂｏｓｔｗｉｃｋ，Ｄ．Ｇ．およびＢｒａｗｅｒ，Ｍ．Ｋ．（１９８７）、「Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｉｎｔｒａ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ａｎｄ  ｅａｒｌｙ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ」、Ｃａｎｃｅｒ  ５９、７８８〜９４。
【０１４１】
Ｃｈｉａｎｇ，Ｃ．、Ｌｉｔｉｎｇｔｕｎｇ，Ｙ．、Ｌｅｅ，Ｅ．、Ｙｏｕｎｇ，Ｋ．Ｅ．、Ｃｏｒｄｅｎ，Ｊ．Ｌ．、Ｗｅｓｔｐｈａｌ，Ｈ．およびＢｅａｃｈｙ，Ｐ．Ａ．（１９９６）、「Ｃｙｃｌｏｐｉａ  ａｎｄ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ａｘｉａｌ  ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｎａｔｕｒｅ  ３８３、４０７〜１３。
【０１４２】
Ｃｈｉａｎｇ，Ｃ．、Ｓｗａｎ，Ｒ．Ｚ．、Ｇｒａｃｈｔｃｈｏｕｋ，Ｍ．、Ｂｏｌｉｎｇｅｒ，Ｍ．、Ｌｉｔｉｎｇｔｕｎｇ，Ｙ．、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｋ．、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｍ．Ｋ．、Ｇａｆｆｉｅｌｄ，Ｗ．、Ｗｅｓｔｐｈａｌ，Ｈ、Ｂｅａｃｈｙ，Ｐ．Ａ．ら（１９９９）、「Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２０５、１〜９。
【０１４３】
Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．およびＳａｃｃｈｉ，Ｎ．（１９８７）、「Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｃｉｄ  ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ」、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １６２、１５６〜９。
【０１４４】
Ｃｕｎｈａ，Ｇ．Ｒ．およびＣｈｕｎｇ，Ｌ．Ｗ．（１９８１）、「Ｓｔｒｏｍａｌ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ−Ｉ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ｕｒｏｔｈｅｌｉｕｍ  ｏｆ  ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ｆｅｍｉｎｉｚｅｄ（Ｔｆｍ／ｙ）ｍｉｃｅ」、Ｊ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １４、１３１７〜２４。
【０１４５】
Ｃｕｎｈａ，Ｇ．Ｒ．、Ｈａｙｗａｒｄ，Ｓ．Ｗ．、Ｄａｈｉｙａ，Ｒ．およびＦｏｓｔｅｒ，Ｂ．Ａ．（１９９６）、「Ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」、Ａｃｔａ  Ａｎａｔ  １５５、６３〜７２。
【０１４６】
Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｉ．（１９９２）、「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｉｎ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ：ｕｒｏｌｏｇｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｉｇａｋｕ−Ｓｈｏｉｎ。
【０１４７】
Ｆｒｅｅｍａｎ，Ａ．、Ｔｒｅｕｒｎｉｃｈｔ，Ｋ．、Ｍｕｎｓｏｎ，Ｐ．、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｋ．およびＰａｒｋｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｃ．（２００２）、「Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｕｓｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ」、Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ４０、４９２〜４。
【０１４８】
Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．、Ｂｏｙｌｅ，Ｍ．およびＭａｒｔｉｎ，Ｇ．Ｒ．（１９９０）、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  Ｈｏｘ−２．９  ｇｅｎｅ；  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｕｇｇｅｓｔｓ  ｔｈａｔ  ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｌｏｎｇ  ｔｈｅ  ａｎｔｅｒｉｏｒ−ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ａｘｉｓ  ｉｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｍｅｓｏｄｅｒｍ」、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１０、５８９〜６０７。
【０１４９】
Ｇａｏ，Ｊ．、Ａｒｎｏｌｄ，Ｊ．Ｔ．およびＩｓａａｃｓ，Ｊ．Ｔ．（２００１）、「Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａ  ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｔｏ  ａｎ  ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１、５０３８〜４４。
【０１５０】
Ｈａｒａｇｕｃｈｉ，Ｒ．、Ｍｏ，Ｒ．、Ｈｕｉ，Ｃ．、Ｍｏｔｏｙａｍａ，Ｊ．、Ｍａｋｉｎｏ，Ｓ．、Ｓｈｉｒｏｉｓｈｉ，Ｔ．、Ｇａｆｆｉｅｌｄ，Ｗ．およびＹａｍａｄａ，Ｇ．（２００１）、「Ｕｎｉｑｕｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｇｅｎｉｔａｌｉａ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２８、４２４１〜５０。
【０１５１】
Ｈａｙｗａｒｄ，Ｓ．Ｗ．、Ｂａｓｋｉｎ，Ｌ．Ｓ．、Ｈａｕｇｈｎｅｙ，Ｐ．Ｃ．、Ｃｕｎｈａ，Ａ．Ｒ．、Ｆｏｓｔｅｒ，Ｂ．Ａ．、Ｄａｈｉｙａ，Ｒ．、Ｐｒｉｎｓ，Ｇ．Ｓ．およびＣｕｎｈａ，Ｇ．Ｒ．（１９９６）、「Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｖｅｎｔｒａｌ  ｐｒｏｓｔａｔｅ，ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ａｎｄ  ｓｅｍｉｎａｌ  ｖｅｓｉｃｌｅ」、Ａｃｔａ  Ａｎａｔ  １５５、８１〜９３。
【０１５２】
Ｈａｙｗａｒｄ，Ｓ．Ｗ．、Ｈａｕｇｈｎｅｙ，Ｐ．Ｃ．、Ｒｏｓｅｎ，Ｍ．Ａ．、Ｇｒｅｕｌｉｃｈ，Ｋ．Ｍ．、Ｗｅｉｅｒ，Ｈ．Ｕ．、Ｄａｈｉｙａ，Ｒ．およびＣｕｎｈａ，Ｇ．Ｒ．（１９９８）、「Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｄｕｌｔ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ａｎｄ  ｒａｔ  ｕｒｏｇｅｎｉｔａｌ  ｓｉｎｕｓ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｅ  ｉｎ  ａ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ」、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ６３、１３１〜４０。
【０１５３】
Ｉｎｃａｒｄｏｎａ，Ｊ．Ｐ．、．Ｇａｆｆｉｅｌｄ，Ｗ．、Ｋａｐｕｒ，Ｒ．Ｐ．およびＲｏｅｌｉｎｋ，Ｈ．（１９９８）、「Ｔｈｅ  ｔｅｒａｔｏｇｅｎｉｃ  Ｖｅｒａｔｒｕｍ  ａｌｋａｌｏｉｄ  ｃｙｃｌｏｐａｍｉｎｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ」、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２５、３５５３〜６２。
【０１５４】
Ｋｉｍ，Ｍ．、Ｂｈａｔｉａ−Ｇａｕｒ，Ｒ．、Ｂａｎａｃｈ−Ｐｅｔｒｏｓｋｙ，Ｗ．、Ｄｅｓａｉ，Ｎ．、Ｗａｎｇ，Ｙ．、Ｈａｙｗａｒｄ，Ｓ．Ｗ．、Ｃｕｎｈａ，Ｇ．Ｒ．、Ｃａｒｄｉｆｆ，Ｒ．Ｄ．、Ｓｈｅｎ，Ｍ．Ｍ．およびＡｂａｔｅ−Ｓｈｅｎ，Ｃ．（２００２）、「Ｎｋｘ３．１  Ｍｕｔａｎｔ  Ｍｉｃｅ  Ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅ  Ｅａｒｌｙ  Ｓｔａｇｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２、２９９９〜３００４。
【０１５５】
Ｋｉｍ，Ｓ．Ｋ．およびＭｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ａ．（１９９８）、「Ｐａｎｃｒｅａｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｄ  ｂｙ  ｃｙｃｌｏｐａｍｉｎｅ，ａ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９５、１３０３６〜４１。
【０１５６】
Ｌａｍｍ，Ｍ．Ｌ．、Ｐｏｄｌａｓｅｋ，Ｃ．Ａ．、Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｄ．Ｈ．、Ｌｅｅ，Ｊ．、Ｃｌｅｍｅｎｓ，Ｊ．Ｑ．、Ｈｅｂｎｅｒ，Ｃ．Ｍ．およびＢｕｓｈｍａｎ，Ｗ．（２００１）、「Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４  ｒｅｓｔｒｉｃｔｓ  ｄｕｃｔａｌ  ｂｕｄｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｐｒｏｓｔａｔｅ」、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２３２、３０１〜１４。
【０１５７】
Ｍａｓｓｏｎ，Ｐ．（１９２９）、「Ｓｏｍｅ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｂｕｌｌ  Ｉｎｔ  Ａｓｓｏｃ  Ｍｅｄ  １２、７５。
【０１５８】
Ｎｏｇａｗａ，Ｈ，Ｍｏｒｉｔａ，Ｋ．およびＣａｒｄｏｓｏ，Ｗ．（１９９８）、「Ｂｕｄ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｐｒｅｃｅｄｅｓ  ｔｈｅ  Ａｐｐｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌｕｎｇ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ」、Ｄｅｖ  Ｄｙｎ  ２１３、２２８〜３５。
【０１５９】
Ｏｌｕｍｉ，Ａ．Ｆ．、Ｇｒｏｓｓｆｅｌｄ，Ｇ．Ｄ．、Ｈａｙｗａｒｄ，Ｓ．Ｗ．、Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｐ．Ｒ．、Ｔｌｓｔｙ，Ｔ．Ｄ．およびＣｕｎｈａ，Ｇ．Ｒ．（１９９９）、「Ｃａｒｃｉｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｄｉｒｅｃｔ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５９、５００２〜１１。
【０１６０】
Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｊ．Ｋ．、Ｇａｇｅ，Ｗ．Ｒ．、Ｎｅｌｓｏｎ，Ｗ．Ｇ．およびＤｅ  Ｍａｒｚｏ，Ａ．Ｍ．（２００１）、「ｐ６３  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｒａｒｅ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｕｒｏｌｏｇｙ  ５８、６１９〜２４。
【０１６１】
Ｐａｔｈｉ，Ｓ．、Ｐａｇａｎ−Ｗｅｓｔｐｈａｌ，Ｓ．、Ｂａｋｅｒ，Ｄ．Ｐ．、Ｇａｒｂｅｒ，Ｅ．Ａ．、Ｒａｙｈｏｒｎ，Ｐ．、Ｂｕｍｃｒｏｔ，Ｄ．Ａ．、Ｔａｂｉｎ，Ｃ．Ｊ．、Ｂｌａｋｅ  Ｐｅｐｉｎｓｋｙ，Ｒ．およびＷｉｌｌｉａｍｓ，Ｋ．Ｐ．（２００１）、「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  Ｓｏｎｉｃ，Ｉｎｄｉａｎ  ａｎｄ  Ｄｅｓｅｒｔ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ」、Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  １０６、１０７〜１７。
【０１６２】
Ｐｅｐｉｃｅｌｌｉ，Ｃ．Ｖ．、Ｌｅｗｉｓ，Ｐ．Ｍ．およびＭｃＭａｈｏｎ，Ａ．Ｐ．（１９９８）、「Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｌｕｎｇ」、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  ８、１０８３〜６。
【０１６３】
Ｐｅｒｒｉｔｏｎ，Ｃ．Ｌ．、Ｐｏｗｌｅｓ，Ｎ．、Ｃｈｉａｎｇ，Ｃ．、Ｍａｃｏｎｏｃｈｉｅ，Ｍ．Ｋ．およびＣｏｈｎ，Ｍ．Ｊ．（２００２）、「Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｕｒｅｔｈｒａｌ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  Ｅｘｔｅｒｎａｌ  Ｇｅｎｉｔａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２４７、２６〜４６。
【０１６４】
Ｐｏｄｌａｓｅｋ，Ｃ．Ａ．、Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｄ．Ｈ．、Ｃｌｅｍｅｎｓ，Ｊ．Ｑ．、Ｂａｋ，Ｐ．Ｍ．およびＢｕｓｈｍａｎ，Ｗ．（１９９９）、「Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｕｒｏｇｅｎｉｔａｌ  ｓｉｎｕｓ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ」、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２０９、２８〜３９。
【０１６５】
Ｒａｍａｌｈｏ−Ｓａｎｔｏｓ，Ｍ．、Ｍｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ａ．およびＭｃＭａｈｏｎ，Ａ．Ｐ．（２０００）、「Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７、２７６３〜７２。
【０１６６】
Ｒｏｅｌｉｎｋ，Ｈ．、Ａｕｇｓｂｕｒｇｅｒ，Ａ．、Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋ，Ｊ．、Ｋｏｒｚｈ，Ｖ．、Ｎｏｒｌｉｎ，Ｓ．、Ｒｕｉｚ  ｉ  Ａｌｔａｂａ，Ａ．、Ｔａｎａｂｅ，Ｙ．、Ｐｌａｃｚｅｋ，Ｍ．、Ｅｄｌｕｎｄ，Ｔ．、Ｊｅｓｓｅｌｌ，Ｔ．Ｍ．ら（１９９４）、「Ｆｌｏｏｒ  ｐｌａｔｅ  ａｎｄ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｖｈｈ−１，ａ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｏｆ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｎｏｔｏｃｈｏｒｄ」、Ｃｅｌｌ  ７６、７６１〜７５。
【０１６７】
Ｒｕｉｚ  ｉ  Ａｌｔａｂａ，Ａ．、Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｐ．およびＤａｈｍａｎｅ，Ｎ．（２００２）、「Ｇｌｉ  ａｎｄ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｔｕｍｏｕｒｓ，Ｅｍｂｒｙｏｓ  ａｎｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２、３６１〜７２。
【０１６８】
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ａ．、Ｂｒａｎｄ，Ｔ．、Ｚｗｅｉｇｅｒｄｔ，Ｒ．およびＡｒｎｏｌｄ，Ｈ．（２０００）、「Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｋｘ３．１  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍｉｎｏｒ  ｓａｌｉｖａｒｙ  ｇｌａｎｄｓ：  ｐａｒａｌｌｅｌｓ  ｔｏ  ｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｄｕｃｔ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ」、Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  ９５、１６３〜７４。
【０１６９】
Ｓｔｏｎｅ，Ｄ．Ｍ．、Ｈｙｎｅｓ，Ｍ．、Ａｒｍａｎｉｎｉ，Ｍ．、Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｔ．Ａ．、Ｇｕ，Ｑ．、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．Ｌ．、Ｓｃｏｔｔ，Ｍ．Ｐ．、Ｐｅｎｎｉｃａ，Ｄ．、Ｇｏｄｄａｒｄ，Ａ．、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｈ．ら（１９９６）、「Ｔｈｅ  ｔｕｍｏｕｒ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ  ｐａｔｃｈｅｄ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ」、Ｎａｔｕｒｅ  ３８４、１２９〜３４。
【０１７０】
Ｓｕｇｉｍｕｒａ，Ｙ．、Ｃｕｎｈａ，Ｇ．Ｒ．およびＤｏｎｊａｃｏｕｒ，Ａ．Ａ．（１９８６）、「Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｄｕｃｔａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ」、Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ３４、９６１〜７１。
【０１７１】
Ｓｕｇｉｍｕｒａ，Ｙ．、Ｆｏｓｔｅｒ，Ｂ．Ａ．、Ｈｏｍ，Ｙ．Ｋ．、Ｒｕｂｉｎ，Ｊ．Ｓ．、Ｆｉｎｃｈ，Ｐ．Ｗ．、Ａａｒｏｎｓｏｎ，Ｓ．Ａ．、Ｈａｙａｓｈｉ，Ｎ．、Ｋａｗａｍｕｒａ，Ｊ．およびＣｕｎｈａ，Ｇ．Ｒ．（１９９６）、「Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＫＧＦ）ｃａｎ  ｒｅｐｌａｃｅ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｕｃｔａｌ  ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｖｅｎｔｒａｌ  ｐｒｏｓｔａｔｅ」、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ４０、９４１〜５１。
【０１７２】
Ｓｕｋｅｇａｗａ，Ａ．、Ｎａｒｉｔａ，Ｔ．、Ｋａｍｅｄａ，Ｔ．、Ｓａｉｔｏｈ，Ｋ．、Ｎｏｈｎｏ，Ｔ．、Ｉｂａ，Ｈ．、Ｙａｓｕｇｉ，Ｓ．およびＦｕｋｕｄａ，Ｋ．（２０００）、「Ｔｈｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｇｕｔ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｅｎｄｏｄｅｒｍａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ」、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７、１９７１〜８０。
【０１７３】
Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ａ．Ａ．およびＣｕｎｈａ，Ｇ．Ｒ．（１９９９）、「Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｒｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ＦＧＦ１０」、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２６、３６９３〜７０１。
【０１７４】
Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ａ．Ａ．、Ｆｏｓｔｅｒ，Ｂ．Ａ．およびＣｕｎｈａ，Ｇ．Ｒ．（１９９７）、「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍＲＮＡ  ｌｅｖｅｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｓｅｍｉｎａｌ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ」、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４、２４３１〜９。
【０１７５】
Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ａ．Ａ．、Ｔｉｍｍｓ，Ｂ．Ｇ．、Ｂａｒｔｏｎ，Ｌ．、Ｃｕｎｈａ，Ｇ．Ｒ．およびＧｒａｃｅ，Ｏ．Ｃ．（２００２）、「Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ」、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２９、１９０５〜１２。
【０１７６】
Ｔｏｔｔｅｎ，Ｒ．Ｓ．、Ｈｅｉｎｅｍａｎ，Ｍ．Ｗ．、Ｈｕｄｓｏｎ，Ｐ．Ｂ．、Ｓｐｒｏｕｌ，Ｅ．Ｅ．およびＳｔｏｕｔ，Ａ．Ｐ．（１９５３）、「Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｌａｔｅｎｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ」、Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  ５５、１３１〜４１。
【０１７７】
Ｗａｎｇ，Ｙ．、Ｈａｙｗａｒｄ，Ｓ．Ｗ．、Ｃａｏ，Ｍ．、Ｔｈａｙｅｒ，Ｋ．Ａ．およびＣｕｎｈａ，Ｇ．Ｒ．（２０００）、「Ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ」、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ６８、２７０〜９。
【０１７８】
Ｗｏｊｎｏ，Ｋ．Ｊ．およびＥｐｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｉ．（１９９５）、「Ｔｈｅ  ｕｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉ−ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（３４  ｂｅｔａ  Ｅ１２）ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ２２８  ｃａｓｅｓ」、Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ  １９、２５１〜６０。
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１】インサイツハイブリッド形成法によるＳｈｈ転写産物分布の分析を示す図である。３３Ｐ標識されたアンチセンスリボプローブとおよびセンスコントロールリボプローブをパラフィン包埋したＰ０オスラットＵＧＴの７μｍ切片にハイブリッド形成させた。（Ａ）はＵＲ、ＶＰ、および精のう（ＳＶ）を示す明視野画像；（Ｂ）は発生中ＶＰの尿道上皮（ＵＲＥ）および芽上皮（ＶＰＥ）におけるＳｈｈ転写産物を示す（Ａ）の暗視野画像である。（Ｃ、Ｄ）は（Ａ、Ｂ）それぞれのより高倍率の画像を示す。（Ｄ）はＶＰＥで発現されたＳｈｈ転写産物を示す。（Ｅ）はＵＲ、ＶＰ、背側前立腺（ＤＰ）、および背外側前立腺（ＤＬＰ）を示す明視野画像；（Ｆ）はＵＲＥと、発生中のＤＰ、ＤＬＰ、およびＶＰ葉の芽上皮（ＤＰＥ、ＤＬＰＥ、およびＶＰＥ）とにおけるＳｈｈ転写産物を明らかにする（Ｅ）の暗視野画像である。（Ｇ、Ｈ）は、それぞれ（Ｅ、Ｆ）のより高倍率の画像を示す。スケールバーは５００μｍ。
【図２】ＲＮアーゼプロテクションアッセイによる、オスラットのＵＧＴ、ＶＰ、およびＵＲにおけるＳｈｈおよびＰｔｃ転写産物の分析を示す図である。ＲＮＡは、Ｓｈｈと、Ｐｔｃと、内部標準として、シクロフィリン（Ｃｐｈｎ）または２８Ｓのいずれかに対する３２Ｐ標識されたアンチセンスリボプローブとハイブリッド形成させた。転写産物レベルはＣｐｈｎまたは２８Ｓを用いて正規化した。オートラジオグラフの下の数字は、Ｐ０  ＵＧＴ（Ａ）またはＰ０  ＶＰ（Ｂ、Ｃ）との比較における、３回の独立な実験の平均として計算された％転写産物の存在量を示す。（Ａ）発生中のオスＵＧＴにおけるＳｈｈおよびＰｔｃの転写産物レベル。（Ｂ）出生後ＶＰにおけるＳｈｈおよびＰｔｃの転写産物レベル。（Ｃ）出生後ＶＰと出生後ＵＲとの間での、ＳｈｈおよびＰｔｃの転写産物レベルの比較。
【図３】オスＵＧＴとメスＵＧＴとの間、ならびに−／＋Ｔで培養されたＶＰおよびＵＲの間における、ＳｈｈおよびＰｔｃ転写産物レベルの比較を示す図である。オートラジオグラフの下の数字は、Ｐ０のオスＵＧＴ（Ａ）、または−Ｔ（Ｂ、Ｃ）との比較における、２回の実験の平均として計算された％転写産物の存在量を示す。（Ａ）オスＵＧＴとメスＵＧＴとの間における、ＳｈｈおよびＰｔｃ転写産物の存在量の比較。（Ｂ）培地補足なし（−Ｔ）で、１０−８Ｍのテストステロン（＋Ｔ）の存在下で、または１０−８Ｍのテストステロンで５日間、これに続いて１０−７  Ｍ酢酸シプロテロン（＋Ｔ＋ＣＡ）で１日間の処置において、インビトロで６日間育成されたＰ０  ＶＰの間におけるＳｈｈおよびＰｔｃ転写産物レベルの比較。（Ｃ）培地補足なし（−Ｔ）で、または１０−８Ｍのテストステロン（＋Ｔ）の存在下で、３日間培養されたＰ０メスＵＲの間におけるＳｈｈおよびＰｔｃ転写産物レベルの比較。
【図４】抗ＳＨＨ抗体でＳＨＨシグナル伝達を阻害することの、ＶＰ成長に対する影響を示す図である。Ｐ０  ＶＰを無血清培養で５日間、１０−８Ｍ  Ｔおよび／または１００μｇ・ｍｌ−１の抗ＳＨＨ抗体（５Ｅ１）の存在下または非存在下で成長させた。（Ａ）培養されたＶＰのホールマウント画像。スケールバーは１ｍｍ。（Ｂ）−Ｔとの比較における培養されたＶＰの平均二次元面積＋／−平均標準誤差を示すグラフ。
【図５】シクロパミンでＳＨＨシグナル伝達を阻害することの、インビトロでのＶＰ成長に対する影響を示す図である。Ｐ０ラットから得たＶＰを無血清培養で６日間、１０−８Ｍ  Ｔおよび／または１０−６Ｍ  Ｃｙの存在下または非存在下で成長させた。（Ａ）培養６日目におけるＶＰのホールマウント画像。スケールバーは１ｍｍ。（Ｂ）−Ｔとの比較における培養されたＶＰの平均二次元面積＋／−平均標準誤差を示すグラフ。（Ｃ）培養されたＶＰ辺縁部の周りにおける上皮芽先端の平均数を、器官周長との比率として計算して示すグラフ（１０００ピクセル周長あたりの平均上皮芽数＋／−平均標準誤差）。（Ｄ）上皮芽における増殖細胞の平均百分率＋／−平均標準誤差を示すグラフ。（挿入図−ＢｒｄＵの取込みは、免疫組織化学で可視化（緑色）され、全サイトケラチンに対する免疫組織化学で可視化（青色）された上皮に局在していた。核はヨウ化プロピジウムで対比染色（赤色）された。）
【図６】前立腺上皮管の組織像に対するシクロパミンの影響を示す図である。Ｔおよび／またはＣｙの存在下または非存在下で６日間培養されたＶＰの切片をＭａｓｓｏｎの三重染色法で染色した。（Ａ、Ｂ）−Ｔで育成された器官、（Ｃ、Ｄ）−Ｔ＋Ｃｙで育成された器官；Ｃｙの添加は、Ｔの非存在下で上皮先端の外観を変化させなかった。（Ｅ、Ｆ）＋Ｔで育成された器官；Ｔの添加は、前立腺管のＵＲに近位の領域で疎通を引き起こした（矢印）。（Ｇ、Ｈ）＋Ｔ＋Ｃｙで育成された器官；Ｃｙの添加は、Ｔの存在下で器官全体の前立腺疎通を引き起こし、辺縁部の周りの管に複数の管腔を有する外観をもたらした（矢印）。スケールバーは５０μｍ。
【図７】前立腺の上皮細胞分化に対するＣｙの効果を示す図である。ＴおよびＣｙの存在下または非存在下で６日間培養されたＶＰのパラフィン切片を、上皮分化を検査するために抗ｐ６３抗体（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）または抗サイトケラチン１４抗体（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）で染色した。（Ａ、Ｂ）培地補足なし（−Ｔ）で育てられたＶＰは、遠位上皮芽先端全体にわたってｐ６３染色（Ａ）およびサイトケラチン１４（ＣＫ１４）染色（Ｂ）を示した。−Ｔ＋Ｃｙで培養されたＶＰ（Ｃ、Ｄ）におけるｐ６３発現（Ｃ）およびＣＫ１４発現（Ｄ）は、−Ｔで培養されたＶＰ（Ａ、Ｂ）と同様であった。（Ｅ、Ｆ）＋Ｔで培養されたＶＰには、全体が染色された遠位上皮芽先端と、ｐ６３発現（Ｅ）およびＣＫ１４発現（Ｆ）が基底細胞層に限局されている遠位上皮芽先端とが混在して含有されていた。（Ｇ、Ｈ）＋Ｔ＋Ｃｙで成育されたＶＰでは、ｐ６３発現（Ｇ）およびＣＫ１４発現（Ｈ）が、すべての上皮芽先端で基底細胞層に限局されていた。ＣＫ１４発現（Ｈ）は＋Ｔ＋Ｃｙ  ＶＰでは有意に低減していた。スケールバーは５０μｍ。
【図８】ヒト前立腺疾患におけるｐ６３免疫染色を示す図である。ヒト前立腺針生検のパラフィン切片を、抗ｐ６３で染色して、基底上皮細胞を可視化した。（Ａ）正常（アスタリスク）またはわずかに肥大した管。基底層は小さな不連続を示すのみである。（Ｂ）良性前立腺上皮肥大における基底細胞層（矢）の拡張。（Ｃ）複数の管腔（アスタリスク）、局所的な基底細胞拡張、および局在性ギャップを有する良性前立腺篩状肥大。（Ｄ）前立腺管サイズの拡張と基底層における定常的なギャップとを伴うはるかに複雑な篩状パターンを有する重度のＰＩＮ。隣接した浸潤癌（矢印）はｐ６３陰性である。スケールバーは１００μｍ。
【図９】シクロパミン存在下にインビトロで育成されたＳｈｈヌルマウスおよびラットのＵＧＳにおける前立腺誘導を示す図である。（Ａ）尿生殖洞（ＵＧＳ）、膀胱（ＢＬ）、および後腸（ＨＧ）を示すｅ１７．５  Ｓｈｈヌルオスマウス全ＵＧＴ。インビトロで５日間育成する前（Ｂ）および後（Ｃ）のｅ１７．５  ＳｈｈヌルオスマウスＵＧＳ；矢印は前立腺芽を示す。培地補足なし（Ｄ）で、＋Ｔ（Ｅ）で、または＋Ｔ  ＋Ｃｙ（Ｆ）で、７日間インビトロ育成されたｅ１６．５オスラットＵＧＳ；矢印は前立腺芽を示す。スケールバーは１ｍｍを示す。
【図１０】インビトロ育成されたＶＰに対する、外来性組換え型ＳＨＨタンパク質の影響を示す図である。Ｐ０ラットから得たＶＰをインビトロで３日間、−／＋Ｔおよび−／＋組換え型ＳＨＨで成長させた。（Ａ）培養３日目におけるＶＰのホールマウント画像。スケールバーは１ｍｍ。（Ｂ）−Ｔとの比較における、培養されたＶＰの平均２Ｄ面積＋／−平均標準誤差を示すグラフ。（Ｃ）培養されたＶＰ辺縁部の周りにおける上皮芽の平均数を、器官周長との比率として計算して示すグラフ（１０００ピクセル周長あたりの平均上皮芽数＋／−平均標準誤差）。（Ｄ）遠位上皮芽（３日目）および周囲の間充織（２日目）における増殖細胞の平均百分率＋／−平均標準誤差を示すグラフ。
【図１１】ＡＹ９９４４、トリパラノール、ジェルビン、シクロパミン、トマチジン、およびコレステロールの構造を示す図である。
【図１２】国際公開第０２／３０４６２号に記載の化合物Ａの構造を示す図である。
【図１３】国際公開第０２／３０４６２号に記載の化合物Ｂの構造を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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