(57)【要約】本発明は異常なタンパク質凝集に関連するアルツハイマー病や他の状態の治療又は緩和のための方法及び組成物に関する。本発明は、とりわけ、アルツハイマー病、パーキンソン病、及び白内障の免疫療法のための方法及び組成物に関する。一つの側面で、本発明は酸化的損傷及びチロシン架橋の形成と関連する特異的タンパク質の病的な凝集及び蓄積により特徴付けられる状態を予防し、治療し又は緩和する方法であって、一つ以上のチロシン架橋化合物、そして任意選択的に該化合物と錯体を形成している銅イオンを含むものの免疫化に有効な用量を用いて、このような治療を必要とする被験者を免疫化する工程を含む方法を提供する。または、チロシン架橋化合物に対する受動免疫を使用してもよい。予防用又は治療用の組成物及び診断方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある状態を予防、治療又は緩和する方法であって、この方法がそのような必要のある被験者を一つ以上のチロシン架橋化合物の免疫化有効用量を用いて免疫化する工程を含むものであり、該状態が酸化的損傷及びチロシン架橋の形成と関連する特異的タンパク質の病的凝集及び蓄積により特徴付けられるものである方法。
【請求項２】
該特異的タンパク質の病的な凝集形態がチロシン架橋部分を含むものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該チロシン架橋化合物が該特異的タンパク質の病的な凝集形態の免疫原性部分であるぺプチドであり、該ぺプチドが該架橋したチロシンの上流又は下流の残基と連結した架橋チロシン部分を含むものである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
該化合物中のチロシン架橋が銅イオンの存在下での酸化により得られうるものである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
該チロシン架橋化合物がジチロシン架橋化合物である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
該チロシン架橋化合物が銅イオンと錯体形成しているものである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
投与される各用量が僅か１μＭの銅しか含まないことを条件として、銅イオンのジチロシンに対する比が３：１に等しいかそれ未満である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
該化合物がそれ自体免疫原性である担体タンパク質に結合されているものである、請求項１記載の方法。
【請求項９】
該担体タンパク質が破傷風トキソイド、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、又はアルブミンから成る群より選択されるものである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該化合物がアジュバントと一緒に投与されるものである、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
該特異的タンパク質の免疫原性部分が免疫原性である最小部分である、請求項３記載の方法。
【請求項１２】
該状態がアルツハイマー病であり、該特異的タンパク質がＡβであり、そして該チロシン架橋化合物がヒトＡβ１−４０又はＡβ１−４２のアミノ酸配列中のチロシン１０の周りの配列に由来するチロシン架橋ぺプチドである、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
該チロシン架橋ぺプチドがジチロシンを含むものである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
チロシン架橋ぺプチドが銅イオンと錯体を形成しているものである、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
下記の追加的工程、即ち
病的に凝集している特異的タンパク質中のチロシン架橋の優勢な形態を同定する工程、及び
チロシン架橋の該優勢な形態の一つ以上を含むチロシン架橋化合物を一つ以上合成する工程、
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
ある状態を予防、治療又は緩和する方法であって、該状態が酸化的損傷と関連する特異的タンパク質の病的な凝集及び蓄積により特徴付けられるものであり、該特異的タンパク質の病的な凝集形態がチロシン架橋を含むものであり、該方法がある抗体又は抗体断片の有効量をこのような治療を必要とする被験者に投与する工程を含むものであり、
該抗体又は抗体断片がチロシン架橋化合物に対して形成されるものであり、
該化合物が該特異的タンパク質の病的に凝集した形態の免疫原性部分であり且つチロシン架橋を含むものであり、そして
該抗体及び抗体断片が該特異的タンパク質の病的に凝集した形態に特異的に結合できるものである方法。
【請求項１７】
該抗体がポリクローナル抗体である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
該抗体がヒト起源のものである、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
該抗体がモノクローナル抗体である、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
該抗体がヒト化されたものである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
該抗体又は抗体断片が該特異的タンパク質の病的に凝集した形態と特異的に反応し、且つ、該特異的タンパク質の非凝集形態とは明確には反応しないものである、請求項１６記載の方法。
【請求項２２】
該化合物中のチロシン架橋が銅イオンの存在下での酸化により得られうるものである、請求項１６記載の方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の方法において使用するための予防用又は治療用の組成物であって、薬学的に許容しうる担体と共にチロシン架橋化合物を含むものである組成物
【請求項２４】
該チロシン架橋化合物が銅イオンと錯体を形成しているものである、請求項２３記載の予防用又は治療用の組成物。
【請求項２５】
さらにアジュバントを含む、請求項２３記載の予防用又は治療用組成物。
【請求項２６】
請求項１６に記載の方法に使用するための予防用又は治療用組成物であって、該組成物が薬学的に許容しうる担体と共にチロシン架橋化合物に対して形成された抗体又は抗体断片を含むものであり、
該化合物が該特異的タンパク質の病的に凝集した形態の免疫原性部分であり且つチロシン架橋を含むものであり、そして
該抗体又は抗体断片が該特異的タンパク質の病的に凝集した形態に特異的に結合できるものである組成物。
【請求項２７】
酸化的損傷及びチロシン架橋の形成と関連する特異的タンパク質の病的凝集及び蓄積により特徴付けられる状態を診断する方法であって、該状態に罹患している疑いのある被験者から得た生体液の試料を、チロシン架橋を含む分子の存在について検定する工程を含む方法。
【請求項２８】
酸化的損傷及びチロシン架橋の形成と関連する特異的タンパク質の病的凝集及び蓄積により特徴付けられる状態を診断する方法であって、該状態に罹患している疑いのある被験者から得た生体液を、チロシン架橋を含む分子に対して生じた抗体の存在について検定する工程を含む方法。
【請求項２９】
該分子がジチロシンを含むものである、請求項２７又は請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
該生体液が血液、血漿、血清、脳脊髄液、尿、及び唾液からなる群より選択されるものである、請求項２７又は請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
該状態がアルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、運動ニューロン疾患、白内障、パーキンソン病、クロイツフェルト−ヤーコブ病、ハンティングトン病、レーヴィ小体の形成を伴う痴呆、多系統萎縮症、ハレルボーデン−シュパッツ病、及び瀰漫性レーヴィ小体病からなる群より選択されるものである、請求項１、請求項１６、請求項２７又は請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
該状態がアルツハイマー病又はパーキンソン病である、請求項１、請求項１６、請求項２７又は請求項２８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、アルツハイマー病及び異常なタンパク質の凝集に関連する他の状態の治療又は緩和のための方法及び組成物に関する。具体的には、本発明は、アルツハイマー病、パーキンソン病、及び白内障の免疫療法のための方法及び組成物に関する。
【０００２】
発明の背景
アルツハイマー病（ＡＤ）に特有のアミロイド病変は、体液中に見られ且つ通常可溶性タンパク質である３９〜４３個のアミノ酸からなるタンパク質であるアミロイドβ（Ａβ）（グレンナー＆ウォング、１９８４）から主に構成される。アミロイドの形成は該病の病因と結びついているため、Ａβの異化の阻害を招く神経化学的変化及び新皮質でのその蓄積を同定することはＡＤの病因に対する重要な手がかりとなるであろう。
【０００３】
ＡＤに関連する基本的な病理学、遺伝学的感受性及び生物学はより明瞭になりつつあるが、該疾病を予防又は治療するのに有効な薬物を開発するための合理的な化学的基礎及び構造的基礎は依然理解しにくい。ＡＤの遺伝学はＡβの代謝が上に示した該疾病の病因と深く関係していることを示す一方、ＡＤの治療のための薬物はこれまで「認識強化剤（ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ）」に重点的に取り組んできた。これらの薬剤は根本的な病気の過程に対処していない。これらの薬物はごく限られた成功しか得られていない。
【０００４】
ＡＤにおける狂った神経化学的環境の性質はアミロイドＡβの翻訳後修飾から一部推定され得る。生体系から抽出されたＡβは正常ではドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上を見掛け約４ ｋＤ のモノマーとして移動する（ショージら、１９９２）。しかながら、ＡＤに冒された死後脳の標本から抽出されたＡβは、ＳＤＳ、尿素及びギ酸に耐性のオリゴマーとしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ上を移動する（マスターズら，１９８５、ローエルら，１９９６、チェルニーら，１９９９）。
【０００５】
神経炎性局面及び血管アミロイドから抽出されたこれらのＳＤＳ耐性オリゴマーの、マトリックス支援レーザー脱着イオン化−質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）は、共有結合で架橋した二量体及び三量体のＡβ種の存在を示している（ローエルら，１９９６）。
【０００６】
合成のＡβ１−４０及びＡβ１−４２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上を見掛け単量体として正常に移動するが、インキュベーション時に見掛け上より高分子量の種を形成する（ブルディックら，１９９２）。この過程は酸化的な系への暴露により促進される（ディルクスら，１９９２、アトウッドら，１９９７）。
【０００７】
合成されたヒトＡβのチロシン残基はペルオキシダーゼで触媒される酸化系により架橋され得るので、チロシン架橋はインビボにおけるＡβオリゴマー形成の一機構として提唱されてきた（ガレアッチら，１９９９）。ヒトのＡβと違って、ラットのＡβはチロシン残基が欠如しているので（アトウッドら，１９９７）、それは金属で触媒される酸化的オリゴマー形成に耐性であり、これがおそらくこれらの動物におけるアミロイド沈着の希少性を説明している（ボーガンとピーターズ，１９８１）。
【０００８】
タンパク質のチロシン架橋は酸化的ストレスの敏感なマーカーである。共有結合の炭素−炭素架橋又は炭素−酸素架橋が一つのチロシン残基及び／又はジチロシン残基の間で形成され、幾つかの安定な蛍光性の反応生成物を生ずる（グロスとシザー，１９５９、アマドら，１９８４、ヤコブら，１９９６）。チロシンフリーラジカルの主な反応生成物は、強く蛍光を発するアミノ酸である ３，３’−ジチロシン（ＤＴ）、３， ３’， ３’−トリチロシン（ＴＴ）及びプルチェロシン（ｐｕｌｃｈｅｒｏｓｉｎｅ）（Ｐ）、並びに蛍光を発しないイソジチロシン（ｉｓｏ−ＤＴ）である（グロスとシザー，１９５９、アマドら，１９８４、ヤコブら，１９９６、ヘイネッケら，１９９３）。ＤＴ及び３−ニトロチロシンのレベルは、ＡＤ患者の脳の海馬及び新皮質の領域において正常な脳の同領域と比べて高く、ＡＤ患者の脳室の脳脊髄液でも高い（ヘンスレイら，１９９８）。
【０００９】
チロシン架橋は、パーキンソン病などの他の神経変性疾患及びα−シヌクレイン原繊維が沈着する他の状態においても重要でありうる。これらは、パーキンソン病自体、レーヴィ小体の形成を伴う痴呆、多系統萎縮症、ハレルボーデン−シュパッツ病、及び瀰漫性レーヴィ小体病を含む。硝化剤への組換えα−シヌクレインの暴露はチロシン残基のニトロ化及びチロシンの酸化を生じてＤＴを形成し、これはα−シヌクレインの架橋をもたらし安定な凝集体を形成する（サウザら，２０００）。同じ著者は、硝化シヌクレインに対して生じるモノクローナル抗体が種々のシヌクレイノパチーにおいてレーヴィ小体及びグリア細胞の封入体に特異的に結合することも見出した（デュダら，作成中、サウザら，２０００年で参照された）。
【００１０】
本発明者らは、ヒトのアミロイドに由来するＡβがチロシン架橋を含み且つジチロシン及びトリチロシンの両方の架橋種を含むことをここに見出した。これらの架橋は、例えば合成したヒトＡβをペルオキシダーゼ及びＨ２Ｏ２と又は銅イオンの存在下でＨ２Ｏ２とインキュベートすることによりインビトロで再現できる。これらの修飾物はプロテアーゼ耐性である、従って、本発明者らは、Ｈ２Ｏ２及びペルオキシダーゼ又は銅イオンとＡβとの異常な相互作用により惹起されるＡＤのチロシン架橋が神経毒Ａβオリゴマーの形成並びにＡβの沈着に寄与すると提唱する。故に、全長のＡβではなく、低分子量のチロシン架橋化合物に対する免疫化が、Ａβの完全体又はその大きな断片で免疫することにより別の方法で誘導されうるであろう自己免疫合併症を誘発する危険性無しに、ＡＤの治療又は予防に使用できる。免疫療法のための標的を該分子の異常な断片又は部分に限定することにより、異常な分子に対して積極的治療法を提供しながら、該分子の正常な機能への望ましくない妨害を最小限にすることが可能でありうる。能動免疫化又は受動的免疫化のいずれかが用いられうることが理解されよう。
【００１１】
チロシンを介したタンパク質の共有結合架橋を生じる酸化過程は、特定のタンパク質の病的な凝集及び蓄積により特徴づけられる他の障害にも関連している。従って、これらの状態も本発明の方法による予防又は治療の影響を受けやすいと考えられる。
【００１２】
幾つかの先行技術の刊行物が本明細書で引用されるが、この引用がこれらの文献のいずれもオーストラリア国又は他の何らかの国において一般的常識の一部を形成するということを承認するものではないことは明瞭に理解されるであろう。
【００１３】
発明の概要
第一の側面において、本発明はある状態を予防、治療又は緩和する方法であって、該状態が酸化的損傷及びチロシン架橋の形成に関連する特定のタンパク質の病的な凝集及び蓄積により特徴づけられるものであり、該方法が、ジチロシン、トリチロシン、テトラチロシン（プルチェロシンとしても知られる）、Ｏ−チロシン及びｍ−チロシンなどの酸化チロシンのオーソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅｓ）、ニトロチロシン、及びチロシン架橋を含むペプチド、及び任意選択的に該化合物と錯体形成した銅イオンも含むペプチドから成る群より選択される一つ以上の化合物の免疫に有効な用量を用いて、その必要性のある被験者を免疫化する工程を含むものである方法を提供する。これらの化合物は集合的に本明細書中で「チロシン架橋化合物」と呼ぶ。
【００１４】
当業者は、免疫に有効な用量の化合物がチロシン架橋化合物に結合できる抗体を誘発するものであることを認識するであろう。このような者は特定のチロシン架橋化合物が抗体を誘発する用量であることを認識するはずである。
【００１５】
好ましい一実施態様において、特定のタンパク質の病的な凝集形はチロシン架橋部分を含む。特に好ましい実施態様において、該チロシン架橋化合物は、特定のタンパク質の病的な凝集形の免疫原性の部分であるペプチドであり、該ペプチドは架橋チロシンの上流及び下流で残基と結合した架橋チロシン部分を含む。
【００１６】
好ましい実施態様において、該チロシン架橋化合物はジチロシン架橋化合物である。
【００１７】
投与される個々の用量が僅か１μＭの銅しか含まないという条件の下で、ジチロシンの１当量当たり３当量までの銅が使用されうる。
【００１８】
任意選択的に、免疫化に使用される該化合物は、破傷風トキソイド、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、又はアルブミンなどのそれ自体が免疫原である担体タンパク質に結合させる。また任意選択的に、該化合物は、ミョウバン、モノホスホリル脂質、ムラミルペプチド、ＱＳ２１などのＩＳＣＯＭ、その他のアジュバントとともに投与されうる。当業者は適切な担体及びアジュバントを十分に承知している。
【００１９】
チロシン架橋を含むペプチドが使用される場合、これは該状態に関連する特定のタンパク質の最小の部分且つ免疫原の部分であることが好ましい。該タンパク質は架橋チロシンの上流及び下流で残基に結合したジチロシン部分により構成される。該状態がアルツハイマー病である場合、チロシン架橋を含むペプチドはヒトのＡβ１−４０又はＡβ１−４２のアミノ酸配列におけるチロシン１０を囲む配列に由来することが好ましい。
【００２０】
本発明の全ての側面において、チロシン架橋を含むペプチドが使用される場合、該チロシン架橋は銅イオンの存在下における酸化により得られうるものであることが好ましい。
【００２１】
該ペプチドはジチロシンと錯体形成した銅イオンをも含むことがより好ましい。
【００２２】
免疫化は、皮下、筋肉内若しくは静脈への注射、粘膜表面への塗布、又は例えば軟膏での局部投与を含む任意の便宜的な経路により投与されうる。
【００２３】
投与される化合物の用量は、個々の化合物の性質、患者の体重、年齢及び健康の一般的状態、並びにアジュバントが使用されるか否かに応じて異なる。該用量は０．１μｇから２００ｍｇ、より好ましくは１ｍｇから５０ｍｇ、最も好ましくは１０ｍｇから２０ｍｇのＤＴの範囲にあることが予定される。単回の免疫化が施されうるが、複数回の免疫化、例えば１ヶ月から１２ヶ月の間、より好ましくは四ヶ月の間、一週間に一回、が投与されることが好ましい。ブースター系は６ヶ月から１２ヶ月後に施されうる。この免疫応答はＤＴ抗体を測定することにより監視され、ＥＬＩＳＡなどの任意の簡便な検定系が用いられうる。
【００２４】
任意選択的な実施態様において、該方法は、病的に凝集した特定のタンパク質におけるチロシン架橋の主形態を同定する追加の工程、並びにチロシン架橋の一つ以上の主形態を含む一つ以上のチロシン架橋化合物を合成する工程も含む。
【００２５】
本発明のこの側面の代替的形態において、該免疫化は受動的であってもよい。従って、本発明はある状態を予防、治療又は緩和する方法であって、該状態が酸化的損傷に関連する特定のタンパク質の病的な凝集及び蓄積により特徴づけられるものであり、特定のタンパク質の該病的に凝集した形態がチロシン架橋を含むものであり、該方法が有効量の抗体又は抗体断片をこのような治療の必要がある被験者に投与する工程を含むものであり、
該抗体又は抗体断片がチロシン架橋化合物に対して形成されるものであり、
該化合物が特定のタンパク質の病的に凝集した形態の免疫原部分であり且つチロシン架橋を含むものであり、
そしてこの抗体又は抗体断片が該特定タンパク質の病的に凝集した形態に特異的に結合できるものである
方法を提供する。
【００２６】
該抗体はポリクローナルであってもモノクローナルであってもよい。該抗体がポリクローナルである場合、これはヒト起源であることが好ましく、例えば健常個体から得たヒト血清のプールに由来しうる。または、チロシン架橋化合物に対して過免疫化された個体から得られる血清が用いられうる。過免疫化の計画は当分野で知られている。該抗体は任意の簡便な方法により血清から単離されうる。種々の適切な方法が当分野で知られている。該抗体がモノクローナルである場合、これはヒト化されていることが好ましい。Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２ 、Ｆｖ又はモノクローナルｓｃＦｖなどの抗体の抗原結合断片が本発明の範囲内であることは明瞭に理解されるであろう。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生産する方法及び精製する方法、並びにヒト化モノクローナル抗体又はｓｃＦｖ断片の組換え生産方法は当分野で周知である。例えば、ハルローとレーン（１９８８）、ＷＯ９０／０７８６１、及びＷＯ９２／０１０４７を参照せよ。ヒト化モノクローナル抗体はトランスジェニック哺乳動物でも生産されうる。例えばＷＯ９１／１０７４１及びＷＯ９３／１２２２７を参照せよ。
【００２７】
該抗体は該特定のタンパク質の病的に凝集した形態と特異的に反応しそして該タンパク質の非凝集形態とは明確には反応しないことが好ましい。
【００２８】
能動免疫化又は受動免疫化のいずれかの後、該患者を臨床的改善について監視する。この改善はわずか一週間以内に始まりうるが、６週目で観察されることがより多く、そして１２ヶ月もの間かかることもある。関連状態を患う患者の監視に用いられる標準的な臨床指標が用いられる。主治医は使用に最も適した試験を承知している。
【００２９】
該治療が予防的なものである場合、該患者は該状態の進行の兆候について監視される。該患者は遺伝連鎖の結果として例えば家族性のアルツハイマー病又はハンティングトン病の危険性がありうる。
【００３０】
従って、第二の側面において、本発明は本発明の方法で使用する予防用又は治療用の組成物を提供する。該組成物は、薬学的に許容しうる担体とともにチロシン架橋化合物を含み、任意選択的にアジュバント、及び／又は該化合物と錯体形成した銅イオンをさらに含む。
【００３１】
第二の側面の代替実施態様において、本発明は本発明の受動免疫化方法で使用するための予防用又は治療用の組成物を提供する。該組成物は、上で定義したチロシン架橋化合物に対する抗体、又は該チロシン架橋化合物に結合できるその断片を薬学的に許容しうる担体とともに含む。
【００３２】
第三の側面において、本発明は、酸化的損傷及びチロシン架橋の形成と関連する特定のタンパク質の病的な凝集及び蓄積により特徴づけられるある状態の診断方法を提供する。この方法は、ジチロシン、トリチロシン、テトラチロシン、Ｏ−チロシン及びｍ−チロシンなどの酸化されたチロシンのオーソログ、ニトロチロシン、及びチロシン架橋を含むペプチドから成る群より選択される化合物の存在について、該状態に罹患している疑いのある被験者から得られた体液の試料を検定する工程を含む。
【００３３】
一つの代替的側面において、該方法は、チロシン架橋化合物に対する抗体の存在について、該状態に罹患している疑いのある被験者から得られた体液を検定する工程を含む。
【００３４】
該体液は、血液、血漿、血清、脳脊髄液、尿、及び唾液から成る群より選択されることが好ましい。該化合物はジチロシンであることが好ましい。
【００３５】
該検定は任意の適切な手段により実施されうるが、チロシン架橋化合物に対する抗体を用いるＥＬＩＳＡ検定により実施するのが最も簡便である。このような検定は逆にチロシン架橋化合物に対する抗体を検出するために用いられうる。該抗体はモノクローナル抗体、又はモノクローナル抗体の混合物であることが好ましい。または、該検定は３２５ｎｍの励起波長及び３５０〜５００ｎｍの放射波長で蛍光を測定することにより実施されうる。
【００３６】
本発明の三側面全てにおいて、該状態は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、運動ニューロン疾患、白内障、パーキンソン病、クロイツフェルト−ヤーコブ病、ハンティングトン病、レーヴィ小体の形成を伴う痴呆、多系統萎縮症、ハレルボーデン−シュパッツ病、及び瀰漫性レーヴィ小体病、又は白内障から成る群より選択されることが好ましい。
【００３７】
該状態はアルツハイマー病又はパーキンソン病であることがより好ましい。
【００３８】
この明細書の目的のため、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語は「含むが限定しない」ことを意味し且つ「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という単語は対応する意味を有することが明瞭に理解されるであろう。
【００３９】
発明の詳細な説明
本発明は下記の非限定的な実施例及び図面のみを参照して詳細に記載する。
本明細書で用いられる略語は下記のとおりである。
ＡＤ　　　　　　　アルツハイマー病
ＤＴ　　　　　　　３， ３’−ジチロシン
ＴＴ　　　　　　　３， ３’， ３’−トリチロシン
Ｐ　　　　　　　　プルチェロシン
イソ−ＤＴ　　　　イソジチロシン
【００４０】
実験手法
試薬及びＡβペプチドの調製
オリゴマーＡβは前述したようにヒトのＡＤに冒された脳のアミロイド斑から抽出した（ローエルら、１９９６）。精製したアミロイドＡβをギ酸中で可溶化した後、使用直前に１００ｍＭの重炭酸アンモニウム（ｐＨ７．５）で５回交換しながら透析した。
【００４１】
ヒトのＡβ１−４０、Ａβ１−４２及びラットのＡβ１−４０を合成し、精製しそしてＨＰＬＣ分析、アミノ酸分析及びダブリュ・エム・ケック・ファンデーション・バイオテクノロジー・リソース・ラボラトリー（エール大学、ニューへーブン、コネチカット州）の質量分析により特性を決定した。確認のための研究はクオリティー・コントロール・バイオケミカルズ社（ホプキントン、マサチューセッツ州）により合成されたペプチドを用いて実施した。
【００４２】
個々のペプチドはＨＰＬＣによる単一のピークとして同定された。合成されたＡβペプチドは、二重に脱イオン化した水に０．５〜１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、３分間超音波破砕した後、１０，０００ｇで２０分間遠心分離し、その上清（Ａβストック）は実験の日に使用した。Ａβペプチドストックの濃度は ２１４ｎｍでの分光学的吸光度により又は前述したように（アトウッドら，１９９８）ミクロＢＣＡタンパク質検定（ピアース社、ロックフォード、イリノイ州）により測定した。
【００４３】
使用前に、全ての緩衝液及び金属イオンのストック溶液を ０．２２ μｍのフィルター（ゲルマン・サイエンスズ、アナーバー、ミシガン州）を通して濾過し粒状物質を取除いた。他の試薬は全て分析等級又はより純粋であった。ホースラディッシュペルオキシダーゼはシグマ化学社（セントルイス、ミズーリ州）から得た。
【００４４】
ジチロシン及びチロシンで架橋したＡβの調製及び蛍光分析
ＤＴ標準品はホウ酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ９．５）で可溶化されたＬ−チロシン（１ｍｇ／ｍＬ）をＨ２Ｏ２（５ｍＭ）及びホースラディッシュペルオキシダーゼ（７．５μｇ／ｍＬ）とともに３７℃で１日間インキュベートすることにより作製した（アマドら，１９８４）。
【００４５】
架橋したＡβはホウ酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ９．５）中でＡβ （５０μＭ）をＨ２Ｏ２（１ｍＭ）及びペルオキシダーゼ（７．５μｇ／ｍＬ）とともに３７℃で５日間インキュベートすることにより作製した。生理的に近い条件の下でこの反応を研究するための別個の実験においては、Ａβ１−４２をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で１０ｎＭまで希釈し１μＭのＨ２Ｏ２及びペルオキシダーゼ（７．５μｇ／ｍＬ）と３７℃で５日間インキュベートした。該インキュベーションの後、該試料を凍結乾燥し該ペプチドをウェスタンブロットにより検出され得る濃度範囲にもっていった（下記参照）。
【００４６】
反応生成物を高速相（ｆａｓｔ ｐｈａｓｅ）液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）により分離した。過剰のホウ酸塩はクロマトグラフィーの前に０℃の遠心分離によりまず試料から沈殿させた。次に、試料を０．２５％のＴＦＡの添加により酸性にし、残りの不溶性物質を濾過（０．２２μｍの孔サイズ）により取除いた。試料を３ｍＬのリソースＲＰＣカラム（ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）上にかけ、該カラムを０．１％のＴＦＡを含む水で洗浄した。結合種は０．１％のＴＦＡを含む０〜１００％直線勾配のアセトニトリルで４５分間以上１ｍＬ／分で溶出し、０．５ｍＬの画分として回収した。画分を乾燥させ、水でもどし、そして蛍光（励起３３０ｎｍ、放射４００ｎｍ）及びＵＶ吸光度（２８４ｎｍ）によりジチロシンについて検定した。ピークの画分は更に質量分析により特性決定し、ジチロシンを減衰係数（Ｅ３１５ｎｍ＝８３８０Ｍ−１ｃｍ−１、マレンシックら，１９９６）を用いて定量した。
【００４７】
溶液はヒタチＦ−４５００分光蛍光光度計を用いて蛍光化合物の存在について分析した。ＤＴ、ＴＴ及びＰは特徴的な放射スペクトル（λｅｘ３２５ｎｍ、λｅｍ３５０〜５００ｎｍ）を有し、これらはチロシン及びトリプトファンのスペクトル（これらの波長で蛍光を発しない）と全く異なっている。０〜５０μＭ間でジチロシン濃度が増加するにつれこの放射範囲で蛍光の直線的増大があった。
【００４８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析
ＳＤＳ耐性であるオリゴマーのヒトアミロイドに由来するＡβの試料を６ＮのＨＣｌを用いて１０５℃で４８時間真空中で加水分解した。この後、試料をハーバード大学の質量分析設備で液体クロマトグラフィーＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により分析した。
【００４９】
質量スペクトルは、Ｃ１８逆相カラム（２．１ｍｍｘ２５０ｍｍ）を取り付けたＨＰ１１００液体クロマトグラフと接続したＬＣＴ質量分析計（ミクロマス社、ビバリー、マサチューセッツ州）を用いて得られた。ＬＣ−ＭＳは緩衝液Ａ（水−０．１％のギ酸（ＦＡ））及び緩衝液Ｂ（アセトニトリル−０．１％のＦＡ）の勾配を用いて実施した。該勾配は２％のＢ（０〜２分）から１００％のＢ（２０〜２３分）までであった。
【００５０】
ウェスタンブロット分析
各反応の分取物（２ｎｇのペプチド）を１５μＬの試料緩衝液（４％のＳＤＳ、５％のβ−メルカプトエタノールを含む）中に回収し、９５℃まで加熱した（５分）。試料をＰＡＧＥ（トリシンゲル、１０〜２０％；ノベックス、サンディエゴ、カリフォルニア州）にかけ、ＰＶＤＦ膜（バイオラッド・ラボラトリーズ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）に移し、グルタルアルデヒド（１％、ｖ／ｖ）で固定し、牛乳（１０％、ｗ／ｖ）でブロッキングした後、抗Ａβモノクローナル抗体４Ｇ８（セネテック、メアリーランド・ハイツ、ミシガン州）を用いて４℃で一晩精査した。一つの実験において、モノクローナル抗体のＷＯ２（エピトープ：残基５〜８）、Ｇ２１１（エピトープ：残基３５〜４２）又はＧ２１０（エピトープ：残基３３〜４０）が使用された。次に、該ブロットを抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体（ピアース、ロックフォード、イリノイ州）と室温で２時間インキュベートし、ＥＣＬ試薬（アマーシャム、リトル・チャルフォント、英国）又はスーパーシグナル・ウルトラ（ピアース、ロックフォード、イリノイ州）で発色させた。化学発光シグナルはフルオロＳ画像分析システム（バイオラッド、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）を用いて捕捉し、電子画像はマルチアナリスト・ソフトウェア（バイオラッド、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）を用いて分析した。分子サイズマーカーはアマシャム社（アーリントン・ハイツ、イリノイ州）から入手した。
【００５１】
実施例１：ペルオキシダーゼで触媒されるＡβの重合はチロシン架橋の形成を伴う
本発明者らは最初に、ペルオキシダーゼで触媒される酸化状態がＡβの重合を促進し得るか否かを、Ｈ２Ｏ２及びペルオキシダーゼの存在下又は非存在下で１日間インキュベートしたヒトのＡβ１−４０、ヒトのＡβ１−４２、及びラットのＡβ１−４０（５０μＭ）の蛍光を測定することにより試験した。これらの試料の蛍光分析は、図１Ａで例示したようにＡβ１−４０及びＡβ１−４２を含む試料において蛍光の著しい増大を示した。これらの結果は、１．２５ ｍＭ の非常に高いペプチド濃度で達せられた合成のヒトＡβについて以前報告された結果（ガレアッチら、１９９９）に似ている。ヒト−配列のＡβペプチドの挙動と対照的に、図１Ａでも示されるように、Ｈ２Ｏ２及びペルオキシダーゼとのインキュベーションの後にラットＡβ１−４０の蛍光シグナルの増大は観察されなかった。このことは、ラットＡβはチロシンを欠如している（シヴァースら、１９８８）ので、該蛍光シグナルがＡβのチロシン酸化生成物に特異的であることを示唆した。
【００５２】
これらの反応がＡβの重合をもたらしたことを確認するため、上述したように処理されたＡβ１−４０及びＡβ１−４２をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけウェスタンブロットにより分析した。Ｈ２Ｏ２及びペルオキシダーゼとインキュベートしたヒトの合成のＡβ１−４０及びＡβ１−４２は両方とも、図１Ｂに示されるように未処理のＡβと比較して見かけ上ＳＤＳ耐性のポリマーの著しい増加を示した。ＡβがＨ２Ｏ２又はペルオキシダーゼのいずれか単独とインキュベートした場合、重合も蛍光の増大も観察されなかった。
【００５３】
実施例２：重合は生理的条件下で起きる。
Ｈ２Ｏ２／ペルオキシダーゼで誘導される合成Ａβの重合が生理的に近い条件下で起きるか否かを決定するため、本発明者らは ｐＨ７．４のＰＢＳ中で１０ｎＭのＡβ１−４２を１μＭのＨ２Ｏ２及びペルオキシダーゼ（７．５μｇ／ｍＬ）ともインキュベートした。本発明者らは、図１Ｃに示されるように該ペプチドのＳＤＳ耐性が再び誘導されることを観察した。しかしながら、図１Ｂで例示したように、より高い濃度の基質を用いることにより生じるオリゴマーより低い見掛け分子量のオリゴマーが生じた。これらの条件下での見掛けＡβポリマーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での移動は、二量体（８ｋＤ）、三量体（１３ｋＤ）、及び四量体（１７ｋＤ）の形成を示唆した。
【００５４】
図２Ａ及び図２Ｂにそれぞれ示すように、ＡＤに冒された死後の脳組織から精製されたＡβの蛍光分析は、チロシン架橋種に特徴的な分光蛍光のパターンを示した。この精製タンパク質は前述したようにＳＤＳ−ＰＡＧＥ上を見掛け上オリゴマーとして移動した（ローエルら，１９９６）。
【００５５】
実施例３：オリゴマーのチロシン架橋
見かけ上オリゴマーのヒトのアミロイドに由来するＡβがチロシン架橋されたことを確認するために、試料を加水分解した後、ＭＡＬＤＩＴＯＦ−ＭＳにより分析した。この分析は、図３Ａで例示するように、３６１ Ｄａ（ｍ／ｚ ３６１ 、Ｍ＋Ｈの代表値）に相当するピークを示したことにより、該試料中にＤＴ又はイソＤＴが存在することを確認した。５４０ Ｄａに相当するより小さなピークも検出され、ＴＴ又はＰの存在と一致していた。他の顕著なピークは ２４７ Ｄａ、２６３ Ｄａ、３０７ Ｄａ、３０９ Ｄａ及び５３８ Ｄａで検出され、これらはカルボニル化（アトウッド、１９９９）及び他のアミノ酸架橋など、Ａβのアミノ酸に他の修飾があったことを表している。
【００５６】
ヒトＡβの加水分解から得られるより大量の断片も４２３ Ｄａ及び４２５ Ｄａ（３：２の比）で検出され、ＤＴ又はイソＤＴへのＣｕの結合を示唆している（Ｃｕの質量＝６３　及び ６５ Ｄａ 、約２：１の天然同位元素の存在度）。
【００５７】
実施例４：ジチロシンによる銅の結合
４２３及び４２５でのピークがＣｕへのＤＴの結合によるものであり得るか否かを試験するために、本発明者らは分光分析によりＤＴとＣｕ２＋との相互作用を調べた。ジチロシン（５０μＭ）をリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）で可溶化し、吸光スペクトル（２００−１０００ｎｍ）をＳＰＥＣＴＲＡｍａｘプラス（モレキュラー・デバイシーズ）で測定した。谷（２８０ｎｍ）及びピーク（３１５ｎｍ）は明白であった。次にジチロシンを逓増濃度のＣｕＮＯ３（０−２００μＭ）又はＮａＣｌ（０−２００μＭ） とインキュベートし、２８０ｎｍ及び３１５ｎｍでの両吸光度の変化を観察した。
【００５８】
本発明者らは、ＤＴが逓増濃度のＣｕ２＋とインキュベートした際に ３１５ ｎｍ におけるその特徴的な吸光ピークが消失し新しい吸光ピークが ２８０ ｎｍに生じることを見出した。この分光学的変化は １：１〜２：１ （Ｃｕ：ＤＴ） の化学量論比で横這いに達した後 ３：１で飽和した。このことはＤＴがＣｕの３当量まで結合できることを示唆している。二塩化物の結合も同様なｐ＋２質量単位増分（Ｃｌの質量＝ ３５ Ｄａ及び３７ Ｄａ 、約３：１の天然同位元素の存在比）を生じるが、ＮａＣｌとともにインキュベートしたＤＴは分光学的吸光度の変化を誘導しなかった。これらの結果は図３Ｂに示す。
【００５９】
実施例５：Ａβのジチロシン化はその銅結合能を高める。
本発明者らは、ヒトの脳の可溶性画分に見出されたＡβの一部がジチロシン化により増強された銅結合性を示すと予測した。これが実際に事実であるか否かを試験するため、本発明者らはＡＤに冒された脳の可溶性抽出物の一部を銅で荷電したキレート・セファロースカラムに通した。凍結したＡＤ及び対照の脳（ＡＣ）から得られる大脳皮質の灰白質０．５ｇを３ｍｌの氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でホモジナイズした。試料を １７５０００ ｇで１時間遠心分離し、その上清をＡβ内容物の分析用に保持した。１０ｍＬの上清を１ｍｇ／ｍＬ の硫酸銅で荷電したキレート・セファロースカラムにかけた。未結合のタンパク質は ０．５Ｍ のＮａＣｌ（ｐＨ８）を含む０．０５Ｍの酢酸Ｎａ緩衝液を用いて洗い流した。結合物質を、ｐＨ５．５、３及び１の連続的段階を用いて酸性度が逓増する段階的勾配で溶出した後、５０ｍＭのＥＤＴＡで洗浄しカラムから取除いた。溶出物を、徹底的に透析し、２ｋＤａ のサイズ分画を用いて遊離の銅及び塩を除去し、凍結乾燥し、並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット及びＬＣ−ＭＳ分析にかけた。ＥＳＩ質量スペクトル（＋ｖｅイオン）はクアトロＩＩトリプルクォドラポール（マイクロマス）により得た。質量スペクトルは６５０から１６５０ｍ／ｚまでの８秒毎の連続モードで収集した。試料は５ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液に溶解してイオン源に注入した。スロットブロット分析はｐＨ３の溶出物においてＷＯ２の免疫反応性を示さず、更なる溶出がｐＨ１で実施された。このｐＨで強い免疫反応性が検出され、該透析試料は青色であった。
【００６０】
ウェスタンブロット分析は該ｐＨ１及びＥＤＴＡの画分中にＡβが存在することを示した。ｐＨ３は通常このようなカラムから大部分の銅結合タンパク質を溶出するのに十分であるので、これは銅への非常に高い親和性の結合を示唆している。これらの画分中の物質はオリゴマーのＡβに極めて富むことが示された。これらの結果は図４で例示される。
【００６１】
銀染色（図４Ａ）は実質的な金属親和性に基づく精製（レーン１対レーン２）を証明し、ウェスタンブロット分析は複数の単量体のＡβに相当するように見える免疫反応性のバンドを示した（図４Ｂ）。図５はＡＤ脳組織から得られる粗抽出物及びＩＭＡＣで精製した上清抽出物からのＬＣ（上）及びＭＳ（下）のトレースを示す。該ＩＭＡＣで精製した試料のＬＣ及びＭＳのスペクトルが実質的によりきれいであることは注目に値する。該ＩＭＡＣで精製した試料のＬＣ−ＭＳ分析は、銅の存在下又は非存在下における合成ペプチドのＬＣ−ＭＳ分析により確認されるように、２個の銅原子をもつＡβ１−４０を含むＡβ種に相当するシグナルを生じた。典型的な質量スペクトルでの際立ったピークのクラスターは質量が４５１５．１（Ａβ１−４２）及び４４５７．９（Ａβ１−４０＋２Ｃｕ）の親イオンと一致する質量／電荷比を示す。
【００６２】
この強く銅に結合するＡβ画分がＤＴを含むか否かを確認するために、本発明者らはＨ２Ｏ２及びホースラディッシュペルオキシダーゼを用いる工程により生成したＤＴに対して生じるモノクローナル抗体ＩＣ３を使用した（カトウら，（１９９８）、これは姫路工業大学、姫路、日本のカトウ・ヨウジ博士から贈与された）。本発明者らは、ウェスタンブロットで観察されるＡβのより高分子量のオリゴマーがＤＴの陽性染色と同一位置に局在化することを見出した。
【００６３】
Ａβを含有する画分はジチロシン部分の存在に特徴的な蛍光放射スペクトルをも示した。この放射はこの修飾により強化された銅の結合について予測される様式で銅の付加により消光した。
【００６４】
実施例６：ジチロシン化Ａβのさらなる特性決定
ＤＴに富むＡβを、更なる特性決定を行なうのに十分な量だけ、ヒトの脳の可溶性画分から単離する。これらの研究には、組織培養での毒性研究、アミノ酸配列決定、金属結合の研究、及びＤＴに富むＡβが増強された電気化学的活性（例えば過酸化水素形成の誘導及び銅の還元）を有するか否かを決定するための実験が含まれる。
【００６５】
実施例７：ジチロシンに対する免疫化の効果
本発明者らは野生型マウスにＤＴへの免疫応答を生じさせることを試みた。この実験において、該ＤＴは、実験手法で記載したように、ホウ酸緩衝液中でチロシンをＨ２Ｏ２と混合しそしてこの混合物をホースラディッシュペルオキシダーゼとインキュベートすることにより調製した。
【００６６】
ＤＴはグルタルアルデヒドを用い標準的なプロトコルに従って担体タンパク質のキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合させた。ＤＴ−ＫＬＨ、ＫＬＨ単独又は未処理のチロシンのそれぞれの乳濁液をフロイント完全アジュバント中で調製し、二匹の動物それぞれに １００ｍｇのＤＴ−ＫＬＨ又は未反応のチロシン若しくはＫＬＨ単独のいずれかを含む接種物を腹腔内に接種した。免疫前の血清はこの時点で採取した。最初の免疫血清は免疫化の１０日後に採取した。二回のブースター免疫化をその後２週間に１回の間隔でで実施した。血液試料は各接種時及び最終のブーストの一週間後に採取した。
【００６７】
ＥＬＩＳＡはＤＴに対する免疫応答を検定するために適合された。本発明者らは、ＤＴ−ＫＬＨ又は未反応のチロシンのいずれかで免疫化されたマウスのＤＴに対する免疫応答がＫＬＨ単独で免疫化されたマウスの応答よりも決して大きくないことを見出した。カトウ博士から得たＤＴのモノクローナル抗体ＩＣ３は、正の対照として使用され、この検定でＤＴに対する適度な陽性反応を生じた。
【００６８】
第二の実験において、二匹のウサギを上述した様式でＤＴ−ＫＬＨを免疫化した。これらの動物により生成された血清についてのＥＬＩＳＡの結果はＤＴに対する適度な免疫応答を証明した。
【００６９】
本発明者らは、死後の組織病理学によりアルツハイマー病と診断された四人のヒト患者から得られた個々の血清においてＤＴに対する内生抗体の存在を証明することも試みた。これらの血清のＤＴに対する免疫反応性はＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットにより観察されなかった。
【００７０】
さらなる実験反復において、本発明者らは、上述したＤＴ−ＫＬＨに対して生じたマウス又はウサギの抗血清がヒトの脳から抽出されたＡβの二量体及び高次オリゴマーのＤＴ部分を認識するか否かを調べた。驚くべきことに、血清はいずれもヒトの脳のＡβにおけるＤＴ部分に対する活性を実証しなかった。正の対照のＩＣ３抗体もこの検定で陰性であった。
【００７１】
実施例８：免疫原性及び抗体反応性に及ぼすジチロシン部分の生産方法の影響
本発明者らは、予期せぬ免疫応答の欠如がジチロシン部分の抗原性の弱さによるものであるかもしれないと推測した。
【００７２】
この仮説を検討するため、本発明者らは二つの異なる方法によりチロシンで架橋した合成のＡβ１−４０及びＡβ１−４２を調製した。第一の方法は、上記の実験手法に記載したように、ホウ酸緩衝液中で該Ａβペプチドをホースラディッシュペルオキシダーゼ及びＨ２Ｏ２とインキュベートする工程を含むものであった。
【００７３】
第二の方法では、２．５μＭのＡβ溶液を３０μＭのＣｕＣｌ２及び２００μＭのＨ２Ｏ２を含む二重に脱イオン化した水中で調製し室温で１日間から５日間インキュベートした。
【００７４】
架橋したＡβの各種試料をＰＡＧＥにかけ、そしてウェスタンブロッティングは該Ａβに特異的な抗体ＷＯ２又は正の対照である抗ＤＴ抗体ＩＣ３を用いて実施した。これらのブロットの結果は図６に提示する。
【００７５】
該ＩＣ３抗体はＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロットの両検定において架橋したＡβ中のＤＴを検出した。その上、ウェスタンブロットでは、該抗体は実施例７で調製されたＤＴ−ＫＬＨ中のジチロシンの存在を認識した。これらの結果から、Ａβ１−４２はＡβ１−４０より該ホウ酸塩又は銅の方法のいずれかによってより効率的に架橋されることは明白である。さらに、Ａβ１−４０は銅を含む方法で架橋される場合ＷＯ２に対する免疫反応性を失う。このことは該ペプチドが架橋後の抗体結合部位を遮蔽又は妨げるフリーラジカルによる損傷又は修飾に対してより影響され易いことによるものでありうる。
【００７６】
驚くべきことに、ジチロシンを介するＡβの架橋様式が該架橋を生成するために用いられる反応の種別に依存することがＩＣ３を用いた分染法からも明らかである。該ＩＣ３モノクローナル抗体はホウ酸の方法により形成されたＤＴを検出しなかったが、銅の方法により形成されたＤＴを検出した。
【００７７】
また意外にも、該ＩＣ３抗体はＡβ１−４２よりむしろＡβ１−４０中のＤＴ架橋を検出した。この様式は該抗Ａβ抗体のＷＯ２で観察されたものと反対である。
【００７８】
これらの結果は、ＤＴ架橋の誘導方法及び架橋されたポリペプチドの構造が抗体によるＤＴの認識において決定的な変数であることを証明している。この場合、ジチロシンで架橋されたＡβ１−４０への二つのアミノ酸残基の付加が抗ジチロシン抗体の結合能に劇的な減少をもたらした。この結果はインビボの状況に外挿され、抗原の選択が生理的に重要な免疫応答を誘発するのに決定的に重要であることを示唆している。
【００７９】
実施例９：抗体認識に及ぼすチロシン架橋形態の影響
ＤＴ接種物は免疫応答を誘発するためには大きな担体タンパク質と結合しなければならないことが予期された。さらに、生じる免疫応答の性質は適切な担体の選択にも部分的に依存するであろう。これを調べるため、本発明者らは種々のＤＴ種について二つの代替的担体、仔牛血清アルブミン（ＢＳＡ）及びキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）を選択した。
【００８０】
さらに、免疫認識における異なる形態のジチロシンの役割を調べるため、本発明者らは、ＤＴの多数のオリゴマー及び分枝形態を含む様々な形態のＤＴを含んだ粗混合物を調製した。この粗混合物のチロシン架橋は上述したホウ酸塩／Ｈ２Ｏ２／ペルオキシダーゼ方法を用いて作成した。得られたＤＴ混合物をチロシン分子の環上及び骨格上の様々な位置に結合をもつ分子を含んでいた。生じた構造の例は図７で説明される。
【００８１】
次に、該粗混合物を逆相ＨＰＬＣによりモノ−ジチロシン、ジチロシン、トリチロシン及びポリチロシンを主に含む画分に分けた。
【００８２】
オリゴマー構造の二つの重要な特徴は、それらが所望する抗原の多重コピーを提示して免疫原性を改良し該免疫応答を強化できること、並びにそれらが該チロシン残基間の化学結合の代替的形態の提示を許容できることである。
【００８３】
インビボでＡＤのＡβへの酸化的修飾を含むチロシン架橋の性質を調査するため、本発明者らはチロシンで架橋したＡβ断片をも調製した。同じ技法を用いて、本発明者らはジチロシンにより架橋された二つ以上のＡβ９−１６ペプチド鎖から成る分子を調製した（構造は示していない）。得られる架橋は様々なチロシン架橋の形態のラセミ混合物を表す可能性が最も高い。
【００８４】
上述した幾つかの新規な構造は抗ＤＴモノクローナルＩＣ３又はＤＴ−ＫＬＨで免疫化したウサギから得た免疫血清（実施例７に記載した）を用いてウェスタンブロットで特性決定された。これらの結果は図８に提示する。
【００８５】
その結果は、ＢＳＡに結合するＡβ９−１６の二量体が該ウサギ免疫血清と該モノクローナル抗体ＩＣ３の両方に免疫反応性があるが、Ａβ９−１６の三量体は免疫反応性がないことを証明した。
【００８６】
ＫＬＨの存在は、付加的なチロシン架橋抗原に結合するか否かにかかわらず該ブロット中で該ウサギ免疫血清により認識された。ポリチロシン−ＢＳＡ及びポリチロシン−ＫＬＨはＩＣ３により認識されたが、該ウサギ免疫血清はＫＬＨ単独とポリチロシン−ＫＬＨとを識別できなかった。
【００８７】
これらの結果から、図６に提示するデータから予測されるように、該ウサギの免疫化はジチロシンの一部の形態と反応性があるが他とは無い抗体を誘発したことは明白である。
【００８８】
実施例１０：トランスジェニック動物におけるＡβの沈着に及ぼすジチロシンの免疫化の効果
トランスジェニックマウスのモデルは、アルツハイマー病（ゲームスら，１９９５、シャオら，１９９６）、パーキンソン病（マスリアら，２０００）、家族性筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（ガーニーら，１９９４）、ハンティングトン病（レディーら，１９９８）、及びクロイツフェルト−ヤーコブ病（ＣＪＤ）（テリングら，１９９４）を含む幾つかの神経障害について利用できる。
【００８９】
本発明者らは、アルツハイマー病についてのトランスジェニックモデルの一つであるＡＰＰ２５７６ ｔｇマウス（シャオら，１９９６）も白内障の高い発症率を有することを見出した。これらの動物モデルは本発明の方法を試験するのに適している。
【００９０】
ＡＰＰ２５７６系統（シャオら，１９９６）のトランスジェニックマウスが用いられる。８月齢から９月齢の雌のマウスが選別され治療のための群に分けられる。
【００９１】
異なる形態のチロシン架橋を作成するためチロシンで架橋した抗原を種々の技法を用いて調製する。使用する抗原は下記のものを含む。
【００９２】
【表１】
2004501204.tif 000002
【００９３】
それぞれの免疫化はフロイント完全アジュバントに２５μｇの抗原を含み、総量０．５ｍＬで皮下的に投与される。
【００９４】
対照動物はチロシンで架橋した抗原なしに担体タンパク質を受けた。
【００９５】
血清の試料は１４日間隔で採取され、ブースター免疫化は２８日目に施される。血清試料は、例えばカトウらのＥＬＩＳＡ法を用いて抗ＤＴ抗体の存在について検定される。高い抗体力価は最終のブースター注射の約５週間後までに得られることが予測される。血液中のＡβのレベルも測定される。
【００９６】
一旦高い力価の抗体の存在が確認されれば、マウスを時間間隔で犠牲にし、該免疫化が脳のアミロイド形成を減少させるか否かを決定するためにそして最も効果的な免疫プロトコルを確認するためにそれらの脳を調べる。脳及び血清における可溶性及び不溶性のＡβのレベルは校正ウェスタンブロットを用いて測定する。該脳中のＡβ斑の負荷量は免疫組織化学的に調べる。
【００９７】
各群の他のマウスは標準的な方法に従ってモリス水迷路を用いて認知能力について８ヶ月までの期間にわたって試験される。該動物の一般的健康及び安泰感も、自発運動量、敏捷性及び一般的健康の兆候を含む特性の組合わせを主観的に評価する５点の整数尺度を用いて盲目化されたオペレータにより毎日測定される。
【００９８】
実施例１１：ジチロシンに対する抗体を用いた処理の効果
正常なマウスを実施例７に記載した一つ以上の免疫原を用いて当分野で周知の標準的手法により過剰免疫化する。該マウスを時間間隔で採血しそれらの血清を上述したように抗ＤＴについて検定する。高い力価の抗体が検出されると、血清を収穫し、該抗体成分を当分野で一般的に利用できる方法を用いて単離し及び／又は濃縮する。
【００９９】
これらの抗体を、数日又は数週間のコースにわたって単回投与又は反復投与のいずれかでＡＰＰ２５７６トランスジェニックマウスの静脈内注射し又はＣＳＦ内に直接注射する。
【０１００】
該トランスジェニックマウスを抗ジチロシン抗体で処理した後、時間間隔で犠牲にし、それらの脳を抗体処理が脳のアミロイド形成を減少させるか否かを決定するために調べる。
【０１０１】
実施例１２：チロシン架橋と関連する状態の診断
ＡＤに罹患していると確認された患者及び年齢の適合した対照から得られた血清及び脳脊髄液（ＣＳＦ）の試料を上述した蛍光分析を用いてチロシン架橋化合物の存在について検定する。一式の試料において、該試料中のチロシン架橋化合物をまず米国特許第５９７２６７４号に記載されているようにニトリロ三酢酸に結合した固体支持体の上に該試料を通すことにより濃縮する。
【０１０２】
同様な検定をＡＬＳ、パーキンソン病、及びＣＪＤに罹患している患者から得られた試料を用いて実施する。
【０１０３】
患者はチロシン架橋化合物に対する循環抗体も有することが可能である。そこで代替的検定においては、ＤＴに対するモノクローナル抗体（カトウら，１９９８）を使用するＥＬＩＳＡ検定を用いて血清又はＣＳＦのいずれかの中にあるこのような抗体を調べる。
【０１０４】
実施例１３：酸化的に修飾されたＡβ中に存在するジチロシンの形態の同定
酸化的に修飾されたＡβ中に存在するＤＴの優勢形態（単数又は複数）を同定するために、銅で触媒されたＡβオリゴマーの酵素消化断片を作製し、そして該断片を質量分析により分析する。この技法は最近プリオンタンパク質の銅で触媒された酸化的修飾の分析に適用された（レクエナ，ジェイ・アールら，２００１，ＰＮＡＳ ９８：７１７０−７１７５）。
【０１０５】
これにより、実施例１１に記載したように、受動免疫化に用いるのに適したモノクローナル抗体を誘発するのに効果的である可能性の最も高い抗原を同定できる。任意の特異性抗原に対して極めて特異的なモノクローナル抗体を作製する方法は当分野でよく知られている。一度該抗原が選択されると、抗原提示の最も有効な手段についての体系的分析が既知の方法を用いて実施される。
【０１０６】
考察
ＡＤのニューロン損傷は神経炎斑で固定化される不溶性のＡβよりむしろ可溶性のＡβに関連している（マックリーンら，１９９９）。本発明者らはここに、ＡＤに冒された脳から抽出された該神経毒Ａβオリゴマーがチロシン架橋（ＤＴ、イソＤＴ、ＴＴ及び／又はＰでありうる）を含むことを初めて明らかにした。これらの修飾はＡβをペルオキシダーゼ及びＨ２Ｏ２とインキュベートすることにより又は銅イオンの存在下でＡβを酸化することによりインビトロで模倣できた。これらの修飾は、Ａβの代謝を妨げるであろうし、ＡＤに見られる神経毒性に寄与しうるし、該病気の神経化学障害の徴候である。
【０１０７】
ＤＴ、Ｔ及びＰ間の炭素−炭素架橋の形成は不可逆的であると考えられ、ＤＴの架橋は６ＮのＨＣｌによる１１０℃で２４時間の加水分解切断及びプロテアーゼ消化に非常に耐性がある（スメイルら，１９９５）。病理学的には、タンパク質のＤＴ修飾の異化耐性はリポフスチン形成（カトウら，１９９８）及び蛍光性白内障（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｃａｔａｒａｃｔ） の形成におけるα−クリスタリンの架橋（キクガワら，１９９１）へのチロシンポリマーの寄与を説明し得るであろう。明らかに、Ａβのチロシン架橋はその異化を阻害すると予測されるであろう。そこでＡＤにおけるアミロイド斑沈着の進行に重要な段階となりうるであろう。
【０１０８】
チロシン架橋の形成はチロシン・ラジカルを含む分子が接触するようになることを必要とする。本発明者らの結果は、Ａβのチロシン残基がペルオキシダーゼ（単数又は複数）に接近可能でなければならないこと且つアミロイドのＡβサブユニット間のチロシン残基がある段階で並列しなければならないことを示唆している。
【０１０９】
Ｈ２Ｏ２はＤＴの形成に必要とされるので、ＡＤに由来する脳のＡβにおけるＤＴ修飾の検出はＨ２Ｏ２がＡＤの脳で増加していることを暗示する。提唱されたどの機構に拘束されることも望まないが、本発明者らは、脳実質におけるミクログリア細胞の貪食活性化（これはＡＤのアミロイド形成と密接に関連する（シェングら，１９９７））がペルオキシダーゼの活性及びＨ２Ｏ２に寄与しＡβのチロシン架橋を惹起すると考える。活性化されたラットのミクログリアはペルオキシダーゼのレベルを増加させることが観察され（リンデナウら，１９９８）、インビトロの実験は培養したラットのミクログリア及びヒトの食細胞の呼吸バーストの呼び水となり及び／又は引金を引くＡβの能力を証明した（ヴァン・ムイスヴィンケルら，１９９６）。活性化された食細胞はミエロペルオキシダーゼを放出し（ペンバーら，１９８３）、該呼吸バーストの間反応性酸素種を形成する。この応答は侵入する病原体又は腫瘍細胞を殺すように設計されている。しかしながら、この環境は周囲のタンパク質や脂質の酸化を促進することも示された（ビウンら，１９９９）。同様な微小環境は活性化されたミクログリアの周辺で生成しうる。インビトロにおいて、ミエロペルオキシダーゼ−Ｈ２Ｏ２系はＤＴ、ＴＴ、Ｐ及びイソＤＴなどのチロシン架橋種の合成を促進する（ヤコブら，１９９６）。
【０１１０】
こうして、Ａβの蓄積に応答したミクログリアの活性化はＡβのチロシン架橋を促進しその消滅を阻害し悪循環に陥りうる。この起こりうる悪循環に寄与して、ＤＴ形成のためのＨ２Ｏ２の身近な供給源がＡβ自体により形成されうる。何故なら、ＡβはＣｕ２＋又はＦｅ２＋の準化学量論的な量の減少を通じてＯ２と反応することによりＨ２Ｏ２を形成するからである（フアング，アトウッドら，１９９９、フアング，クアジュングコら，１９９９）。従って、Ａβがヒトのアミロイドから結合した銅とともに無傷で精製されたことは極めて意義深いことである（図３Ａ）。合成のＡβ１−４２は１０−１８モルの親和性でＣｕ２＋と結合し、銅はＡＤのアミロイドに豊富にあるため（ロヴェルら，１９９８）、本発明者らはＡβがインビボで銅と結合しているかも知れないと推測した。Ｃｕ２＋がＡβを沈降させ（アトウッドら，１９９８）、該ペプチドの毒性はＣｕ２＋により増強される（フアングら，１９９９）から、アミロイドに由来するＡβが銅を含むという発見はＡＤの病理生理学にも重要である。
【０１１１】
興味深いことに、ヒトのアミロイドに由来するＡβの酸加水分解の後にも質量分析の酸性条件下でも同様に、Ｃｕ２＋はＤＴに依然結合したままであった（図３Ａ）。この異常なＣｕ２＋への親和性は該ＤＴ修飾により形成されるＡβ上の二次的に生じた高親和性Ｃｕ２＋結合部位の結果でありうるであろう。この強化されたＣｕ２＋への親和性の結果として、ＤＴ修飾されたＡβの神経毒性又はその電気化学的活性は無修飾のＡβと比べて増大されうる。該ＤＴ修飾により惹起された二次的なＣｕ２＋の結合はアミロイドへのＡβの沈殿も強めうるであろう。これは、なぜ ｐＨ７．４ でのキレート剤による処理が死後のＡＤの脳組織から得られる単量体Ａβの放出よりも高い程度で二量体Ａβの放出を促進した（ウェスタンブロットにより検定）（チェルニーら， １９９９）かを説明する。増大したプロテアーゼ分解への耐性と二次的な金属結合との組合わせは、ＡＤの病理学に寄与するＡβのチロシン架橋のとりわけ悪性な結果でありうる。
【０１１２】
ＰＤＡＰＰトランスジェニックマウスは、ヒトのＡβ１−４２形態を過剰生産し、老化につれて広域の脳アミロイド斑の沈着、並びに行動及び認知の不足を示す（ゲームスら，１９９５、ＷＯ９６／４０８９６）。合成Ａβ１−４２による成熟したＰＤＡＰＰマウスの免疫化は結果としてアミロイド斑の数及び強度における著しい減少を生じさせる一方、この抗原で免疫化されたＰＤＡＰＰマウスはアミロイド斑を発症しない（シェンクら，１９９９及びＷＯ９９／２７９４４）。残るアミロイド斑のすぐ近くのスカベンジャーミクログリア細胞があり、そしてＡβ１−４２に対する抗体が血中に存在するという証拠があるので、Ａβ１−４２に対する免疫応答の誘導が成功したことは明らかであった。著者らは、Ａβによる免疫化がＡＤの予防又は治療に用いられ得るであろうことを示唆した。しかしながら、ヒトの受容者は免疫寛容のため自己タンパク質に対する明確な免疫応答にまで高めることができないのでＡＤの免疫治療は実現可能でありそうにないことが大いに考えられる。シェンクらにより得られた結果は、該脳が適切な刺激を与えられると他の方法で処置しにくいアミロイド沈着を吸収し除去する能力を有しうることを示唆している。しかしながら、有害な自己免疫応答の誘導及び／又は不適切で且つ斑を除去しない応答の誘導の可能性があるため、Ａβ自体による免疫化を用いることは望ましくない。本発明の非天然のジチロシン又はジチロシン含有化合物で免疫化することにより、この問題は回避できる。
【０１１３】
本発明が明確性及び理解のためにかなり詳細に記載され、一方、本明細書に開示された発明概念の範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された実施態様及び方法に対して種々の変更及び改変が為されうることは当業者には明らかであろう。
【０１１４】
本明細書で引用された引用文献は、下記の頁に列挙され、この引用文献により本明細書にインコーポレートされる。
【０１１５】
参照文献
１．　　アマド，アール．，アエスクバック，アール．，とネウコム，エイチ． 、（１９８４） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １０７， ３７７−８８．１３。
２．　　アトウッド， シー． エス．，フアング，エックス．，モイル，アール．ディー．，スカルパ，アール．シー．，バカッラ，エヌ．エム．イー．，ハートショーン，エム．エイ．，ゴールドステイン，エル．イー．，ロマノ，ディー．エム．，タンジ，アール．イー．，とブッシュ，エイ．アイ．、（１９９７） Ｓｏｃ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ａｂｓｔｒ． ２３， １８８３ 。
３．　　アトウッド， シー． エス．，モイル，アール．ディー．，フアング，エックス．，バカッラ，エヌ．エム．イー．，スカルパ，アール．シー．，ロマノ，ディー．エム．，ハートショーン，エム．エイ．，タンジ，アール．イー．，とブッシュ，エイ．アイ．、（１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３， １２８１７−１２８２６。
４．　　アトウッド， シー． エス．，スカルパ，アール．シー．，フアング，エックス．，ファッラグ，ワイ．ダブリュー．，モイル，アール．ディー．，クアジュングコ，エム．ピー．，タンジ，アール．イー．，とブッシュ，エイ．アイ．、（１９９９） Ｓｏｃ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ａｂｓｔｒ． ２４， ５４６。
５．　　アトウッド， シー． エス．，スカルパ，アール．シー．，フアング，エックス．，モイル，アール．ディー．，ジョーンズ，ダブリュー．ディー．，フェアリー，ディー．ピー．，タンジ，アール．イー．，とブッシュ，エイ．アイ．、（２０００） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７５， １２１９−１２３３。
【０１１６】
６．　　ブルディック，ディー．，ソレグハン，ビー．，クウォン，エム．，コスモスキー，ジェイ．，クナウアー，エム．，ヘンスチェン，エイ．，ヤテス，ジェイ．，コットマン，シー．，とグレイブ，シー．、（１９９２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７， ５４６−５５４。
７．　　ビウン，ジェイ．，ヘンダーソン，ジェイ．ピー．，ムエラー，ディー．エム．，とヘイネッケ，ジェイ．ダブリュー．、（１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８（８）， ２５９０−６００ 。
８．　　チェルニー，アール．エイ．，レッグ，ジェイ．ティー．，マクリーン，シー．エイ．，フェアリー，ディー．，フアング，エックス．，アトウッド，シー．エス．，ベイレウザー，ケイ．，タンジ，アール．イー．，マスターズ，シー．エル．，とブッシュ，エイ．アイ．、（１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４， ２３２２３−２３２２８。
９．　　ディルクス，ティー．，ディルクス，イー．，ハートマン，ティー．，マスターズ，シー．，とベイレウザー，ケイ．、（１９９２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７， １８２１０−１８２１７。
１０．　ガレアッチ，エル．，ロンチ，ピー．，フランセスチ，シー．，とギウンタ，エス．、（１９９９） Ａｍｙｌｏｉｄ ６（１）， ７−１３ 。
【０１１７】
１１．　グレンナー，ジー．ジー．，とウォング，シー．ダブリュー．、（１９８４） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １２０， ８８５−８９０ 。
１２．　グロス，エイ．ジェイ．，とシザー，アイ．ダブリュー．、（１９５９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２３４， １６１１−１６１４。
１３．　シャオ，ケイ．，チャップマン，ピー．，ニールセン，エス．，エックマン，シー．，ハリガヤ，ワイ．，ヨウンキン，エス．，ヤング，エフ．，コーール，ジー．、Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｅｍｏｒｙ ｄｅｆｉｃｉｔｓ， Ａβ ｅｌｅｖａｔｉｏｎ， ａｎｄ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｌａｑｕｅｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ． （１９９６） Ｓｃｉｅｎｃｅ； ２７４（５２８４）： ９９−１０２ 。
１４．　ヘイネッケ，ジェイ．ダブリュー．，リー，ダブリュー．，フランシス，ジー．エイ．，とゴールドテイン，ジェイ．エイ．、（１９９３） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９１（６）， ２８６６−７２ 。
１５．　ヘンスレイ，ケイ．，マイト，エム．エル．，ユー，ゼット．，サング，エイチ．，マーケスベリー，ダブリュー．アール．，とフロイド，アール．エイ．、（１９９８） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １８ ８１２６−８１３２ 。
【０１１８】
１６．　フアング，エックス．，クアジュングコ，エム．ピー．，アトウッド， シー． エス．，ハートショーン，エム．エイ．，ティンダル，ジェイ．，ハンソン，ジー．アール．，ストークス，ケイ．シー．，レオポルド，エム．，マルトハウプ，ジー．，ゴールドステイン，エル．イー．，スカルパ，アール．シー．，サウンダース，エイ．ジェイ．，リム，ジェイ．，モイル，アール．ディー．，グレイブ，シー．，ボウデン，イー．エフ．，マスターズ，シー．エル．，フェアリー，ディー．ピー．，タンジ，アール．イー．，とブッシュ，エイ．アイ．、（１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４， ３７１１１−６。
１７．　フアング，エックス．，アトウッド， シー． エス．，ハートショーン，エム．エイ．，マルトハウプ，ジー．，ゴールドステイン，エル．イー．，スカルパ，アール．シー．，クアジュングコ，エム．ピー．，グレイ，ディー．エヌ．，リム，ジェイ．，モイル，アール．ディー．，タンジ，アール．イー．，とブッシュ，エイ．アイ．、（１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８， ７６０９−７６１６ 。
１８．　ヤコブ，ジェイ．エス．，シストラ，ディー．ピー．，シュー，エフ．エフ．，ムザッファー，エス．，ムエラー，ディー．エム．，ハゼン，エス．エル．，とヘイネッケ，ジェイ．ダブリュー．、（１９９６） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１（３３）， １９９５０−６ 。
１９．　カトウ，ワイ．，マルヤマ，ダブリュー．，ナオイ，エム．，ハシズメ，ワイ．，とオオサワ，ティー．、（１９９８） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４３９（３）， ２３１−４ 。
２０．　キクガワ，ケイ．，カトウ，ティー．，ベップ，エム．，とハヤサカ，エイ．、（１９９１） Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １０９６（２）， １０８−１４ 。
【０１１９】
２１．　リンデナウ，ジェイ．，ノアック，エイチ．，アサヤマ，ケイ．，とウルフ，ジー．、（１９９８） Ｇｌｉａ ２４（２）， ２５２−６。
２２．　ロヴェル，エム．エイ．，ロバートソン，ジェイ．ディー．，ティースダール，ダブリュー．ジェイ．，カンプベル，ジェイ．エル．，とマーケスベリー，ダブリュー．アール．、（１９９８） Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ １５８（１）， ４７−５２． １５ 。
２３．　マレンシック，ディー．エイ．，スプラウズ，ジェイ．エフ．，スワンソン，シー．エイ．，とアンダーソン，エス．アール．、（１９９６） Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２４２（２）， ２０２−１３。
２４．　マスターズ，シー．エル．，マルトハウプ，ジー．，シムズ，ジー．，ポットギエサー，ジェイ．，マーティンズ，アール．エヌ．，とベイレウザー，ケイ．、（１９８５） Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ４， ２７５７−２７６３。
２５．　マックリーンら．、（１９９９）， ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． ４６， ８６０−８６６。
【０１２０】
２６．　ペンバー，エス．オー．，とキンケイド，ジェイ．エム．，ジュニア．、（１９８３） Ｂｌｏｏｄ ６１（６）， １１１６−２４． １４ 。
２７．　レクエナ，ジェイ．アール．，ら．、（２００１） ＰＮＡＳ ９８， ７１７０−７１７５ 。
２８．　ローエル，エイ．イー．，チャネイ，エム．オー．，クオ，ワイ．エム．，ウェブスター，エス．ディー．，スタイン，ダブリュー．ビー．，ハバーカンプ，エル．ジェイ．，ウッズ，エイ．エス．，コッター，アール．ジェイ．，ツオイ，ジェイ．エム．，クラッフト，ジー．エイ．，ボンエル，ビー．エス．，とエマールリング，エム．アール．、（１９９６） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１（３４）， ２０６３１−５ 。
２９．　セラ，エム．とアーロン，アール．、（１９６０） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ７５， ９１−１０２。
３０．　シェング，ジェイ．ジー．，マーク，アール．イー．，とグリフィン，ダブリュー．エス．、（１９９７） Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ （Ｂｅｒｌ） ９４（１）， １−５ 。
【０１２１】
３１．　シェンク，ディー．ら．、（１９９２） Ｎａｔｕｒｅ ４００， １７３−１７７。
３２．　シヴァース，ビー．ディー．，ヒルビッチ，シー．，マルトハウプ，ジー．，サルバウム，エム．，ベイレウザー，ケイ．，とシーブルグ，ピー．エイチ．、（１９８８） ＥＭＢＯ Ｊ． ７， １３６５−１３７０ 。
３３．　ショージ，エム．，ゴルデ，ティー．イー．，ガイソ，ジェイ．，チェウング，ティー．ティー．，エスタス，エス．，シャッファー，エル．エム．，カイ，エックス．ディー．，マッケイ，ディー．エム．，ティントナー，アール．，フランジオネ，ビー．，とヨウンキン，エス．ジー．、（１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８， １２６−１２９ 。
３４．　スメイル，イー．エイチ．，ブリザ，ピー．，パナゴス，エイ．，とベレンフェルド，エル．、（１９９５） Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６３（１０）， ４０７８−８３ 。
３５．　サウザ，ジェイ．エム．，ギアッソン，ビー．アイ．，チェン，キュー．，リー，ブイ．エム．ワイ．，とイスチロポウロス、（２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２９５， １８３４４−１８３４９ 。
【０１２２】
３６．　ヴァン　ムイスヴィンケル，エフ．エル．，ヴィールフイス，アール．，とエイケレンブーム，ピー．、（１９９６） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ６６， ２４６８−２４７６。
３７．　ボーガン，ディー．ダブリュー．，とピーターズ，エイ．、（１９８１） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ． Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． ４０， ４７２−４８７ 。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ヒトのＡβがペルオキシダーゼ触媒の酸化の後に蛍光及びＳＤＳ耐性を生じるが、ラットのＡβは生じないことを示す。ヒトのＡβ１−４０、ヒトのＡβ１−４２、又はラットのＡβ１−４０（５０μＭ）は、３７℃で１日間、５０ｍＭのホウ酸塩、ＰＨ９．５±Ｈ２Ｏ２（１ｍＭ）及びペルオキシダーゼ（７．５μｇ／ｍＬ）中でインキュベートした。
（Ａ）蛍光スペクトル（λｅｘ３２５、λｅｍ３５０〜５００）、
（Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での移動（４Ｇ８を用いるウェスタンブロットによる）、
（Ｃ）Ａβ１−４２（１０ｎＭ）を３７℃で５日間 ｐＨ７．４ のリン酸緩衝生理食塩水中でＨ２Ｏ２（１μＭ） 及びペルオキシダーゼ（７．５μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。その生成物（レーン２）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット（４Ｇ８）によりＨ２Ｏ２／ペルオキシダーゼ（レーン１）の非存在下で同条件の下にインキュベートされたペプチドと比較した。
【図２】図２は、ヒトのアミロイドに由来するＡβがチロシン架橋オリゴマーを含むことを示す。ヒトのアミロイドに由来するＡβ（２０μＭ）（ローエルら，１９９６）を、純粋なＤＴ標準（λｅｘ３２５、λｅｍ３５０〜５００）と比較して蛍光分光法（Ａ）及びウェスタンブロット（４Ｇ８）（Ｂ）により分析した。
【図３】図３は、ジチロシン及びトリチロシンの架橋がヒトのアミロイドに由来するＡβに存在し且つそれらが銅に結合していることを示す。
（Ａ）ヒトのアミロイドは精製し、加水分解しそしてクロマトグラフ分離後に質量スペクトルを決定した。異なるクロマトグラフ滞留時間（ＲＴ）で溶出する同一試料の分析を反映する二つの個々のスキャンが示される。
（Ｂ）逓増濃度のＣｕＳＯ４又はＮａＣｌの存在下における精製されたＤＴの２８０ｎｍ及び３１５ｎｍでの吸光度。
【図４】図４は、可溶性のヒトのＡβが高い親和性で銅に結合することを示す。
（Ａ）可溶性の粗抽出物（１）及び銅キレートセファロースカラムからのｐＨ１での溶出物（２）の銀染色。
（Ｂ）ＷＯ２、Ｇ２１１及びＧ２１０でプローブされたｐＨ１での溶出物のウェスタンブロット。
【図５】図５は、ヒトのＡβが銅に結合することを確認する、ＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
（Ａ）可溶性の粗抽出物及びＩＭＡＣ精製抽出物のＬＣ−ＭＳ分析。
（Ｂ）Ａβ１−４２及び二つの銅原子が結合したＡβ１−４０の質量スペクトル。
該ＩＭＡＣ及びＬＣ−ＭＳのデータは脳に由来するＡβが銅に結合できることを証明する。
【図６】図６は、架橋したＡβ１−４０及びＡβ１−４２中のジチロシンのウェスタンブロットでの検出を示す。
ジチロシン結合を形成させた二つの技法も比較する。
上側のウェスタンブロット（Ａ）は該ＷＯ２抗体を用いてＡβの存在を証明する。下側のブロット（Ｂ）はモノクローナル抗体ＩＣ３により認識されるジチロシン結合の存在を証明する。この抗体はホウ酸塩／Ｈ２Ｏ２／ホースラディッシュペルオキシダーゼを用いて調製されたジチロシンの形態に対して形成された。
【図７】図７は、潜在的な免疫原として生産されたチロシン架橋の形態の例を示す。これらの構造は、チロシン架橋を含み、且つ通常チロシン架橋ペプチドのチロシン架橋部分の両側に存在する付加的なアミノ酸残基の存在を模倣するためにアセチル化されたカルボキシ末端及びアミノ末端を有する。生じる免疫応答の強度を改良するためにジチロシン抗原の複数のコピーの提示が設計されている。
【図８】図８は、種々のチロシン架橋種におけるジチロシン結合のウェスタンブロットでの検出を示す。該ＤＴを含む種はＢＳＡに結合したジチロシン架橋Ａβ９−１６の二量体又は三量体並びにＢＳＡ又はＫＬＨの担体タンパク質のいずれかに結合した種々のポリＤＴ種を含む。上側のウェスタンブロット（Ａ）は、ホウ酸塩／Ｈ２Ｏ２／ペルオキシダーゼ技法を用いて調製され且つグルタルアルデヒドを用いてＫＬＨに結合させたＤＴに対して形成されたポリクローナルのウサギ抗血清に結合できる該試料の能力を証明している（実施例７で論じる）。下側のウェスタンブロット（Ｂ）は該モノクローナル抗体ＩＣ３により認識されるジチロシン結合の存在を証明する。この抗体はホウ酸塩／Ｈ２Ｏ２／ペルオキシダーゼ技法を用いても調製されたジチロシンの形態に対して形成させた。
【図１】
2004501204.tif 000003
【図２】
2004501204.tif 000004
【図３Ａ】
2004501204.tif 000005
【図３Ｂ】
2004501204.tif 000006
【図４】
2004501204.tif 000007
【図５】
2004501204.tif 000008
【図６】
2004501204.tif 000009
【図７Ａ】
2004501204.tif 000010
【図７Ｂ】
2004501204.tif 000011
【図７Ｃ】
2004501204.tif 000012
【図８】
2004501204.tif 000013
【国際公開パンフレット】
2004501204.tif 000014
2004501204.tif 000015
2004501204.tif 000016
2004501204.tif 000017
2004501204.tif 000018
2004501204.tif 000019
2004501204.tif 000020
2004501204.tif 000021
2004501204.tif 000022
2004501204.tif 000023
2004501204.tif 000024
2004501204.tif 000025
2004501204.tif 000026
2004501204.tif 000027
2004501204.tif 000028
2004501204.tif 000029
2004501204.tif 000030
2004501204.tif 000031
2004501204.tif 000032
2004501204.tif 000033
2004501204.tif 000034
2004501204.tif 000035
2004501204.tif 000036
2004501204.tif 000037
2004501204.tif 000038
2004501204.tif 000039
2004501204.tif 000040
2004501204.tif 000041
2004501204.tif 000042
2004501204.tif 000043
2004501204.tif 000044
2004501204.tif 000045
2004501204.tif 000046
2004501204.tif 000047
2004501204.tif 000048
2004501204.tif 000049
2004501204.tif 000050
2004501204.tif 000051
2004501204.tif 000052
2004501204.tif 000053
2004501204.tif 000054
2004501204.tif 000055
2004501204.tif 000056
2004501204.tif 000057
2004501204.tif 000058
2004501204.tif 000059
2004501204.tif 000060
2004501204.tif 000061
2004501204.tif 000062
2004501204.tif 000063
2004501204.tif 000064
2004501204.tif 000065
2004501204.tif 000066
2004501204.tif 000067
2004501204.tif 000068
2004501204.tif 000069
【手続補正書】
【提出日】平成13年12月20日(2001.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
本発明者らは、ＤＴが逓増濃度のＣｕ２＋とインキュベートした際に ３１５ ｎｍ におけるその特徴的な吸光ピークが消失し新しい吸光ピークが ２８０ ｎｍに生じることを見出した。この分光学的変化は １：１〜２：１ （Ｃｕ：ＤＴ） の化学量論比で横這いに達した後 ３：１で飽和した。このことはＤＴがＣｕの３当量まで結合できることを示唆している。二塩化物の結合も同様なｐ＋２質量単位増分（Ｃｌの質量＝ ３５ Ｄａ及び３７ Ｄａ 、約３：１の天然同位元素の存在比）を生じるが、ＮａＣｌとともにインキュベートしたＤＴは分光学的吸光度の変化を誘導しなかった。これらの結果は図３Ｃに示す。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ヒトのＡβがペルオキシダーゼ触媒の酸化の後に蛍光及びＳＤＳ耐性を生じるが、ラットのＡβは生じないことを示す。ヒトのＡβ１−４０、ヒトのＡβ１−４２、又はラットのＡβ１−４０（５０μＭ）は、３７℃で１日間、５０ｍＭのホウ酸塩、ＰＨ９．５±Ｈ２Ｏ２（１ｍＭ）及びペルオキシダーゼ（７．５μｇ／ｍＬ）中でインキュベートした。（Ａ）蛍光スペクトル（λｅｘ３２５、λｅｍ３５０〜５００）、
（Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での移動（４Ｇ８を用いるウェスタンブロットによる）、
（Ｃ）Ａβ１−４２（１０ｎＭ）を３７℃で５日間 ｐＨ７．４ のリン酸緩衝生理食塩水中でＨ２Ｏ２（１μＭ） 及びペルオキシダーゼ（７．５μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。その生成物（レーン２）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット（４Ｇ８）によりＨ２Ｏ２／ペルオキシダーゼ（レーン１）の非存在下で同条件の下にインキュベートされたペプチドと比較した。
【図２】図２は、ヒトのアミロイドに由来するＡβがチロシン架橋オリゴマーを含むことを示す。ヒトのアミロイドに由来するＡβ（２０μＭ）（ローエルら，１９９６）を、純粋なＤＴ標準（λｅｘ３２５、λｅｍ３５０〜５００）と比較して蛍光分光法（Ａ）及びウェスタンブロット（４Ｇ８）（Ｂ）により分析した。
【図３】図３は、ジチロシン及びトリチロシンの架橋がヒトのアミロイドに由来するＡβに存在し且つそれらが銅に結合していることを示す。
（Ａ）及び（Ｂ）　ヒトのアミロイドは精製し、加水分解しそしてクロマトグラフ分離後に質量スペクトルを決定した。異なるクロマトグラフ滞留時間（ＲＴ）で溶出する同一試料の分析を反映する二つの個々のスキャンが示される。
（Ｃ）　逓増濃度のＣｕＳＯ４又はＮａＣｌの存在下における精製されたＤＴの２８０ｎｍ及び３１５ｎｍでの吸光度。
【図４】図４は、可溶性のヒトのＡβが高い親和性で銅に結合することを示す。
（Ａ）可溶性の粗抽出物（１）及び銅キレートセファロースカラムからのｐＨ１での溶出物（２）の銀染色。
（Ｂ）ＷＯ２、Ｇ２１１及びＧ２１０でプローブされたｐＨ１での溶出物のウェスタンブロット。
【図５】図５は、ヒトのＡβが銅に結合することを確認する、ＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
粗可溶性抽出物（５Ａ）及びＩＭＡＣ精製可溶性抽出物（５Ｂ）のＬＣ−ＭＳ分析。
Ａβ１−４２の質量スペクトル（５Ｃ）及び（５Ｅ）並びに二つの銅原子が結合したＡβ１−４０の質量スペクトル（５Ｄ）及び（５Ｆ）。
該ＩＭＡＣ及びＬＣ−ＭＳのデータは脳に由来するＡβが銅に結合できることを証明する。
【図６】図６は、架橋したＡβ１−４０及びＡβ１−４２の中のジチロシンのウェスタンブロットでの検出を示す。
ジチロシン結合を形成させるための二つの技法も比較する。
上側のウェスタンブロット（Ａ）は該ＷＯ２抗体を用いてＡβの存在を証明する。下側のブロット（Ｂ）はモノクローナル抗体ＩＣ３により認識されるジチロシン結合の存在を証明する。この抗体はホウ酸塩／Ｈ２Ｏ２／ホースラディッシュペルオキシダーゼを用いて調製されたジチロシンの形態に対して形成された。
レーン１　Ａβ１−４０−ホウ酸架橋
レーン２　Ａβ１−４２−ホウ酸架橋
レーン３　Ａβ１−４０−銅架橋
レーン４　Ａβ１−４２−銅架橋
レーン５　Ａβ１−４０−未処理
レーン６　Ａβ１−４２−未処理
レーン７　ＫＬＨに結合したジチロシン
【図７】図７は、潜在的な免疫原として生産されたチロシン架橋の形態の例を示す。これらの構造は、チロシン架橋を含み、且つ通常チロシン架橋ペプチドのチロシン架橋部分の両側に存在する付加的なアミノ酸残基の存在を模倣するためにアセチル化されたカルボキシ末端及びアミノ末端を有する。生じる免疫応答の強度を改良するためにジチロシン抗原の複数のコピーの提示が設計されている。
７Ａ　チロシン
７Ｂ　ジチロシン
７Ｃ　Ａｔｅｅ
７Ｄ　ＤｉＡｔｅｅ（ジＡｔｅｅ）
７Ｅ　ＩｓｏＤｉＡｔｅｅ（イソジＡｔｅｅ）
７Ｆ　ＴｒｉＡｔｅｅ（トリＡｔｅｅ）
７Ｇ　ＴｅｔｒａＡｔｅｅ（テトラＡｔｅｅ）
７Ｈ　一つのイソ結合を持つトリＡｔｅｅの代替型
【図８】図８は、種々のチロシン架橋種におけるジチロシン結合のウェスタンブロットでの検出を示す。該ＤＴを含む種はＢＳＡに結合したジチロシン架橋Ａβ９−１６の二量体又は三量体並びにＢＳＡ又はＫＬＨの担体タンパク質のいずれかに結合した種々のポリＤＴ種を含む。上側のウェスタンブロット（Ａ）は、ホウ酸塩／Ｈ２Ｏ２／ペルオキシダーゼ技法を用いて調製され且つグルタルアルデヒドを用いてＫＬＨに結合させたＤＴに対して形成されたポリクローナルのウサギ抗血清に結合できる該試料の能力を証明している（実施例７で論じる）。下側のウェスタンブロット（Ｂ）は該モノクローナル抗体ＩＣ３により認識されるジチロシン結合の存在を証明する。この抗体はホウ酸塩／Ｈ２Ｏ２／ペルオキシダーゼ技法を用いても調製されたジチロシンの形態に対して形成させた。
レーン１　Ａｂｅｔａ ９−１６ ＤＴ二量体−ＢＳＡ
レーン２　Ａｂｅｔａ ９−１６ ＤＴ三量体−ＢＳＡ
レーン３　粗Ａｔｅｅ−ＢＳＡ
レーン４　ポリチロシン−ＢＳＡ
レーン５　ＢＳＡ
レーン６　Ａｂｅｔａ三量体−ＫＬＨ
レーン７　粗Ａｔｅｅ−ＫＬＨ
レーン８　ポリチロシン−ＫＬＨ
レーン９　ＫＬＨ
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ａ】
2004501204.tif 000070
【図１Ｂ】
2004501204.tif 000071
【図１Ｃ】
2004501204.tif 000072
【図２Ａ】
2004501204.tif 000073
【図２Ｂ】
2004501204.tif 000074
【図３Ａ】
2004501204.tif 000075
【図３Ｂ】
2004501204.tif 000076
【図３Ｃ】
2004501204.tif 000077
【図４】
2004501204.tif 000078
【図５Ａ】
2004501204.tif 000079
【図５Ｂ】
2004501204.tif 000080
【図５Ｃ】
2004501204.tif 000081
【図５Ｄ】
2004501204.tif 000082
【図５Ｅ】
2004501204.tif 000083
【図５Ｆ】
2004501204.tif 000084
【図６】
2004501204.tif 000085
【図７Ａ】
2004501204.tif 000086
【図７Ｂ】
2004501204.tif 000087
【図７Ｃ】
2004501204.tif 000088
【図７Ｄ】
2004501204.tif 000089
【図７Ｅ】
2004501204.tif 000090
【図７Ｆ】
2004501204.tif 000091
【図７Ｇ】
2004501204.tif 000092
【図７Ｈ】
2004501204.tif 000093
【図８】
2004501204.tif 000094
【手続補正書】
【提出日】平成14年6月24日(2002.6.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある状態を予防、治療又は緩和する方法であって、この方法がそのような必要のある被験者を一つ以上のチロシン架橋化合物の免疫化有効用量を用いて免疫化する工程を含むものであり、該状態が酸化的損傷及びチロシン架橋の形成と関連する特異的タンパク質の病的凝集及び蓄積により特徴付けられるものである方法。
【請求項２】
該特異的タンパク質の病的な凝集形態がチロシン架橋部分を含むものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該チロシン架橋化合物が該特異的タンパク質の病的な凝集形態の免疫原性部分であるぺプチドであり、該ぺプチドが該架橋したチロシンの上流又は下流の残基と連結した架橋チロシン部分を含むものである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
該化合物中のチロシン架橋が銅イオンの存在下での酸化により得られうるものである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
該チロシン架橋化合物がジチロシン架橋化合物である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
該チロシン架橋化合物が銅イオンと錯体形成しているものである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
投与される各用量が僅か１μＭの銅しか含まないことを条件として、銅イオンのジチロシンに対する比が３：１に等しいかそれ未満である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
該化合物がそれ自体免疫原性である担体タンパク質に結合されているものである、請求項１記載の方法。
【請求項９】
該担体タンパク質が破傷風トキソイド、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、又はアルブミンから成る群より選択されるものである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該化合物がアジュバントと一緒に投与されるものである、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
該特異的タンパク質の免疫原性部分が免疫原性である最小部分である、請求項３記載の方法。
【請求項１２】
該状態がアルツハイマー病であり、該特異的タンパク質がＡβであり、そして該チロシン架橋化合物がヒトＡβ１−４０又はＡβ１−４２のアミノ酸配列中のチロシン１０の周りの配列に由来するチロシン架橋ぺプチドである、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
該チロシン架橋ぺプチドがジチロシンを含むものである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
チロシン架橋ぺプチドが銅イオンと錯体を形成しているものである、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
下記の追加的工程、即ち
病的に凝集している特異的タンパク質中のチロシン架橋の優勢な形態を同定する工程、及び
チロシン架橋の該優勢な形態の一つ以上を含むチロシン架橋化合物を一つ以上合成する工程、
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
ある状態を予防、治療又は緩和する方法であって、該状態が酸化的損傷と関連する特異的タンパク質の病的な凝集及び蓄積により特徴付けられるものであり、該特異的タンパク質の病的な凝集形態がチロシン架橋を含むものであり、該方法がある抗体又は抗体断片の有効量をこのような治療を必要とする被験者に投与する工程を含むものであり、
該抗体又は抗体断片がチロシン架橋化合物に対して形成されるものであり、    該化合物が該特異的タンパク質の病的に凝集した形態の免疫原性部分であり且つチロシン架橋を含むものであり、そして
該抗体及び抗体断片が該特異的タンパク質の病的に凝集した形態に特異的に結合できるものである方法。
【請求項１７】
該抗体がポリクローナル抗体である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
該抗体がヒト起源のものである、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
該抗体がモノクローナル抗体である、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
該抗体がヒト化されたものである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
該抗体又は抗体断片が該特異的タンパク質の病的に凝集した形態と特異的に反応し、且つ、該特異的タンパク質の非凝集形態とは明確には反応しないものである、請求項１６記載の方法。
【請求項２２】
該化合物中のチロシン架橋が銅イオンの存在下での酸化により得られうるものである、請求項１６記載の方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の方法において使用するための予防用又は治療用の組成物であって、薬学的に許容しうる担体と共にチロシン架橋化合物を含むものである組成物
【請求項２４】
該チロシン架橋化合物が銅イオンと錯体を形成しているものである、請求項２３記載の予防用又は治療用の組成物。
【請求項２５】
さらにアジュバントを含む、請求項２３記載の予防用又は治療用組成物。
【請求項２６】
請求項１６に記載の方法に使用するための予防用又は治療用組成物であって、該組成物が薬学的に許容しうる担体と共にチロシン架橋化合物に対して形成された抗体又は抗体断片を含むものであり、
該化合物が該特異的タンパク質の病的に凝集した形態の免疫原性部分であり且つチロシン架橋を含むものであり、そして
該抗体又は抗体断片が該特異的タンパク質の病的に凝集した形態に特異的に結合できるものである組成物。
【請求項２７】
アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、運動ニューロン疾患、クロイツフェルト−ヤーコブ病、及びハンティングトン病からなる群より選択される状態を診断する方法であって、該状態に罹患している疑いのある被験者から得た生体液の試料を、チロシン架橋を含む分子の存在について検定する工程を含む方法。
【請求項２８】
アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、運動ニューロン疾患、クロイツフェルト−ヤーコブ病、及びハンティングトン病からなる群より選択される状態を診断する方法であって、該状態に罹患している疑いのある被験者から得た生体液の試料を、チロシン架橋を含む分子に対して生じた抗体の存在について検定する工程を含む方法。
【請求項２９】
該分子がジチロシンを含むものである、請求項２７又は請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
該生体液が血液、血漿、血清、脳脊髄液、尿、及び唾液からなる群より選択されるものである、請求項２７又は請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
該状態がアルツハイマー病である、請求項１、請求項１６、請求項２７又は請求項２８記載の方法。
【国際調査報告】
2004501204.tif 000095
2004501204.tif 000096
2004501204.tif 000097