(57)【要約】本発明は、体液サンプル中に含まれる少なくとも１の炎症の指標の迅速な検出方法に関する。上記方法は、個体における感染性の及び／又は炎症性の症状を迅速に診断するのに使用されることができる。上記方法は、好ましくはサイトカインである複数の感染及び／又は炎症応答因子を検出し、そしてそのような因子のプロフィールを完成することを含む。上記プロフィールは診断される症状のさらなる指標となるものである。特別には本発明は、迅速な検出のためのディップスティック又は同様の装置に関する。
2004511802.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中に存在する、少なくとも１の所定の炎症の指標を直接検出するためのキットであって、以下の：
ｉ）固相支持体、
ｉｉ）固相支持体に結合する複数の第１ターゲティング種であって、上記固相支持体に接触されるサンプル中に前記少なくとも１の所定の炎症の指標が存在する場合に、直接的に少なくとも１の所定の炎症の指標を検出することができる前記ターゲティング種、そして
ｉｉｉ）以下のｉｖ）に結合するポリマー担体分子を含む接合体、
ｉｖ）少なくとも１の第１及び／又は第２ターゲティング種であって、固相支持体に接触されるサンプル中に前記少なくとも１の所定の炎症の指標が存在する場合に、直接的に前記少なくとも１の所定の炎症の指標を検出することができる前記ターゲティング種、そして、
ｖ）少なくとも１のラベリング種、
を含む前記キット。
【請求項２】
上記炎症の指標がサンプル１ミリリッター（１０−３リッター）あたり約１００ナノグラム（１００×１０−９グラム）未満の量で存在する、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
請求項１に記載のキットであって、この中で上記接合体が以下の：
ｉ）少なくとも１である、複数の反応性の官能基を含むポリマー担体分子、
ｉｉ）少なくとも１の反応性の官能基に結合した少なくとも１の連結部分、
ｉｉｉ）各分子種が、試薬に結合した少なくとも１の連結部分との反応性のある、少なくとも１の官能基を含む、ターゲティング種及びラベリング種から成る分子種群から選ばれる少なくとも１の分子種、
ｉｖ）上記試薬中で上記接合体が、連結部分を介してそこへ共有結合により結合する少なくとも１の分子種を含む、
を含む前記キット。
【請求項４】
ポリマー担体分子が反応性の官能基をポリマー担体１ｇあたり約５〜約５，０００μｍｏｌ の量で含む、請求項２に記載のキット。
【請求項５】
少なくとも１の所定の炎症の指標がサイトカインである、先の請求項１〜４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６】
少なくとも１の所定の炎症の指標が少なくとも２のサイトカインである請求項５に記載のキット。
【請求項７】
前記キットがサイトカインのプロフィールを検出することのできる、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
上記所定の炎症の指標が好ましくはＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａであるＩＬ−１システムからのアゴニスト、ＩＬ−１αに対する自己抗体、ｓＩＬ１−ＲＩ及びｓＩＬ−ＲＩＩ、から成る群から選ばれる請求項５〜７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項９】
上記所定の炎症の指標が好ましくはｓＴＮＦＲｐ５５及びｐ７５である、ＴＮＦαシステムからのアゴニストから成る群から選ばれる請求項５〜７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１０】
上記所定の炎症の指標がＩＬ−６及びＩＬ−６に対する自己抗体から成る群から選ばれる、請求項５〜７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１】
上記所定の炎症の指標がＩＬ−１２、ｓＩＬ−４Ｒ、ＴＮＦβ（ＬＴ）、ＩＮＦγ、ＩＬ−４及びＩＬ−１０から成る群から選ばれる、請求項５〜７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１２】
上記所定の炎症の指標がＩＬ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８、ｓＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−１８、ＩＦＮα、及び好酸球カチオン性タンパクから成る群から選ばれる、請求項５〜７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１３】
少なくとも１の上記所定の炎症の指標が自己抗体である、先の請求項１〜１２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１４】
少なくとも１の所定の炎症の指標が少なくとも２の自己抗体である、請求項５に記載のキット。
【請求項１５】
前記キットが自己抗体のプロフィールを検出することのできる、請求項６に記載のキット。
【請求項１６】
前記キットがサイトカインと自己抗体の組み合わせを検出することができる、先の請求項１〜１５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１７】
前記キットが少なくとも２のサイトカイン及び少なくとも１の自己抗体の組み合わせを検出することのできる、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記キットが少なくとも４のサイトカイン及び少なくとも１の自己抗体の組み合わせを検出することのできる、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記キットが少なくとも１のサイトカイン及び少なくとも２の自己抗体の組み合わせを検出することのできる、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記炎症の指標がＰｒＰ−Ｓｃである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２１】
先の請求項１〜２０のいずれか１項に記載のキットであって、上記ターゲティング種が、抗原；ハプテン；モノクローナル及びポリクローナル抗体；遺伝子プローブ；天然及び合成のオリゴー及びポリヌクレオチド；天然及び合成のモノ−、オリゴ−、及びポリサッカライド；レクチン；アビジン及びストレプトアビジン；ビオチン；成長因子；ホルモン；レセプター分子；プロテインＡ及びプロテインＧから成る種群から選ばれる前記キット。
【請求項２２】
上記ターゲティング種がモノクローナル及びポリクローナル抗体から選ばれる、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
先の請求項１〜２２のいずれか１項に記載のキットであって、上記ラベリング種が、タンパク；酵素；毒素；薬剤；染料；蛍光性の、ルミネッセントの、リン光性の及び他の発光物質；金属キレート物質；放射性同位体でラベルされた物質；及び重原子でラベルされた物質から成る種群から選ばれる、前記キット。
【請求項２４】
先の請求項１〜２３のいずれか１項に記載のキットであって、上記ラベリング種が、フェリチン、フィコエリトリン、フィコシアニン、フィコビリン、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、イミノ２酢酸、エチレンジアミン４酢酸、ジエチレントリアミン５酢酸、及びデスフェリオキサミンＢから成る種群から選ばれる、前記キット。
【請求項２５】
上記第１及び第２ターゲティング種が同一である、先の請求項１〜２４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２６】
上記第１及び第２ターゲティング種が同一でない、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載のキットであって、上記ポリマー担体が、天然及び合成ポリサッカライド；ホモポリアミノ酸；天然及び合成のポリペプチド及びタンパク；並びに求核性の官能基を有する合成ポリマーから成るポリマー群から選ばれる、前記キット。
【請求項２８】
上記ポリマー担体が、ポリビニルアルコール、ポリアリルアルコール、ポリエチレングリコール及び置換ポリアクリレートから成るポリマー群から選ばれる、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２９】
上記ポリマー担体が、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、スターチ、ヒドロキシエチル−スターチ、ヒドロキシプロピル−スターチ、グリコーゲン、アガロース誘導体、セルロース誘導体及び天然ゴムから成る群から選ばれる、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３０】
上記ポリマー担体がデキストランである、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
上記ポリマー担体がヒドロキシエチル−セルロース及びヒドロキシプロピル−セルロースから成る群から選ばれる、請求項２９に記載のキット。
【請求項３２】
前記キットがディップスティックである、先の請求項１〜３１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３３】
前記キットがマイクロシステムに適合した、先の請求項１〜３２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３４】
少なくとも１の所定の炎症の指標を検出するための方法であって、以下のステップ：
ｉ）以下の：
ａ）固相支持体、
ｂ）上記固相支持体に結合した複数の第１ターゲティング種であって、ここで、前記炎症の指標が固相支持体と接触されるサンプル中に存在する場合、前記炎症の指標を直接検出できる前記ターゲティング種、及び
ｃ）接合体であって、以下の：ｉ）少なくとも１の第１及び／又は第２ターゲティング種であって、前記炎症の指標が上記固相支持体と接触されるサンプル中に存在する場合、前記炎症の指標を直接検出できる前記ターゲティング種、及びｉｉ）少なくとも１のラベリング種、に結合するポリマー担体を含む前記接合体、を含む前記キットと前記サンプルを接触させるステップ、及び
ｉｉ）上記所定の炎症の指標をターゲティングすることのできるターゲティング種を検出するステップ、
を含み、ここで上記ターゲティング種の検出が上記サンプル中の上記所定の炎症の指標の存在を示す、前記方法。
【請求項３５】
上記サンプルが体液サンプルである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
さらに、サンプル中に存在する所定の炎症の指標を検出する手段を含む、請求項３４又は３５に記載の方法であって、以下のステップ：
ｉ）上記サンプルを請求項１〜３４のいずれか１項に記載のキットと接触させること、及び
ｉｉ）上記所定の炎症の指標をターゲティングすることのできるターゲティング種を検出すること、
を含み、ここで、上記ターゲティング種の検出が上記サンプル中の炎症の指標の存在を示す、前記方法。
【請求項３７】
上記炎症の指標が上記サンプル中に１ミリリッター（１０−３リッター）あたり約１００ナノグラム（１００×１０−９グラム）未満の量で存在する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の方法であって、ここで上記ポリマー担体分子が以下の：
ｉ）少なくとも１である複数の反応性の官能基、
ｉｉ）少なくとも１の反応性の官能基に結合した少なくとも１の連結部分、及び
ｉｉｉ）ターゲティング種及びラベリング種から成る分子種群から選ばれる、少なくとも１の分子種であって、ここで各分子種が、試薬に結合した少なくとも１の連結部分との反応性を有し、そしてここで上記接合体が連結部分を介してそこへ共有結合により結合する少なくとも１の分子種を含む、
を含む、前記方法。
【請求項３９】
請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の方法であって、上記ターゲティング種が抗原；ハプテン；モノクローナル及びポリクローナル抗体；遺伝子プローブ；天然及び合成のオリゴ−及びポリヌクレオチド；天然及び合成のモノ−、オリゴ−、及びポリサッカライド；レクチン；アビジン及びストレプトアビジン；ビオチン；成長因子；ホルモン；レセプター分子；プロテインＡ及びプロテインＧから成る種群から選ばれる、前記方法。
【請求項４０】
請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の方法であって、上記ラベリング種がタンパク；酵素；毒素；薬剤；染料；蛍光性の、ルミネッセントの、リン光性の、及び他の発光物質；金属キレート物質；放射性同位体でラベルされた物質；及び重原子でラベルされた物質から成る種群から選ばれる、前記方法。
【請求項４１】
請求項３４〜４０のいずれか１項に記載の方法であって、上記ラベリング種がフェリチン、フィコエリトリン、フィコシアニン、フィコビリン、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、イミノ２酢酸、エチレンジアミン４酢酸、ジエチレントリアミン５酢酸、及びデスフェロキサミンＢから成る種群から選ばれる、前記方法。
【請求項４２】
請求項３４〜４１のいずれか１項に記載の方法であって、上記ポリマー担体が天然及び合成のポリサッカライド；ホモポリアミノ酸；天然及び合成のポリペプチド及びタンパク；及び求核性の官能基を有する合成ポリマーから成るポリマー群から選ばれる、前記方法。
【請求項４３】
請求項３４〜４２のいずれか１項に記載の方法であって、上記ポリマー担体が、ポリビニルアルコール、ポリアリルアルコール、ポリエチレングリコール及び置換ポリアクリレートから成るポリマー群から選ばれる、前記方法。
【請求項４４】
請求項３４〜４３のいずれか１項に記載の方法であって、上記ポリマー担体がデキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、スターチ、ヒドロキシエチル−スターチ、ヒドロキシプロピル−スターチ、グリコーゲン、アガロース誘導体、セルロース誘導体及び天然ゴムから成る群から選ばれる、前記方法。
【請求項４５】
上記ポリマー担体がデキストランである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
上記ポリマー担体が、ヒドロキシエチル−セルロース及びヒドロキシプロピル−セルロースから成る群から選ばれる、請求項３４〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
請求項３４〜４６のいずれか１項に記載の方法であって、上記所定の炎症の指標が好ましくはＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａである、ＩＬ−１システムからのアゴニスト、ＩＬ−１αに対する自己抗体、ｓＩＬ１−ＲＩ及びｓＩＬ１−ＲＩＩから成る群から選ばれる、前記方法。
【請求項４８】
請求項３４〜４７のいずれか１項に記載の方法であって、上記所定の炎症の指標が、好ましくはｓＴＮＦＲｐ５５及びｐ７５である、ＴＮＦαシステムからのアゴニストから成る群から選ばれる、前記方法。
【請求項４９】
上記所定の炎症の指標がＩＬ−６及びＩＬ−６に対する自己抗体から成る群から選ばれる、請求項３４〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
上記所定の炎症の指標がＩＬ−１２、ｓＩＬ−４Ｒ、ＴＮＦβ（ＬＴ）、ＩＮＦγ、ＩＬ−４及びＩＬ−１０から成る群から選ばれる、請求項３４〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
上記所定の炎症の指標が、ＩＬ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８、ｓＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−１８、ＩＦＮα及び好酸球カチオン性タンパクから成る群から選ばれる、請求項３４〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
上記所定の炎症の指標が自己抗体である、請求項３４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
炎症の指標のプロフィールが得られる、請求項３４〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
個体における感染性の及び／又は炎症の症状を診断するための方法であって、以下のステップ：
ｖ）請求項３４〜５３のいずれか１項に従って、体液サンプル中に存在する所定の炎症の指標を検出すること、及び
ｖｉ）前記感染性の及び／又は炎症の症状を診断すること、
を含む前記方法。
【請求項５５】
個体における感染性の及び／又は炎症の症状を診断するための方法であって、以下のステップ：
ｉ）請求項３６に従って、体液サンプル中に存在する所定の炎症の指標を検出すること、
ｉｉ）請求項３４〜５３のいずれか１項に従って体液サンプル中に存在する、所定の炎症の指標を検出すること、及び
ｉｉｉ）前記感染性の症状を診断すること、
を含む前記方法。
【請求項５６】
個体における感染性の及び／又は炎症の症状を治療するための方法であって、以下のステップ：
ｉｉｉ）請求項５５に記載のいずれか１の方法に従って診断を実行すること、及び
ｉｖ）上記診断に基づいて上記感染性の症状を治療すること、
を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、体液サンプル中に含まれる少なくとも１の炎症の指標の迅速な検出方法に関する。上記方法は個体における感染性の及び／又は炎症性の症状の迅速な診断のために用いられる。
【０００２】
上記方法は、好ましくはサイトカインである、複数の感染の及び／又は炎症応答因子を検出すること、及びそのような物質のプロフィールを完成する、さらなるステップを含む。上記プロフィールは診断される症状のさらなる指標である。
【０００３】
上記方法は、好ましくは自己抗体である、少なくとも１の免疫システム因子のような少なくとも１の炎症応答因子を検出するさらなるステップ、そして場合によりそのような因子のプロフィールを完成することをさらに含む。上記因子は、診断される症状の唯一の又は最初の指標であることができ、又は診断される症状のさらなる指標として寄与することができる。
【０００４】
本発明による方法は、
ｉ）サイトカインを含む感染性の因子及び／又は感染及び／又は炎症応答因子を潜在的に含む体液サンプルを
ｉｉ）好ましくは定量的に検出することができる、所定の感染性の因子及び／又は所定の炎症応答因子を特異的に認識することのできるターゲティング種、と接触させることにより実行される。接触は基本的に体液サンプルの前処理なしに行なわれることが好ましい。
【０００５】
ターゲティング種は、感染性の因子及び感染応答因子のうちの１又は両方と接触できるものが好ましい。ターゲティング種は、ターゲティング種と感染性の因子及び感染応答因子のどちらか一方又は両方との複合体が例えば側方流デバイスの固相試験エリアと接触した場合に検出可能な可視ラベルを含むこともできる。
【０００６】
発明の背景
米国特許第５，５８７，２８５号は、高感度の抗−ＨＩＶ抗体検出アッセイについて記載する。上記アッセイは、抗−ＨＩＶ抗体に免疫反応的に結合する非変性ＨＩＶ抗原決定基を用いることによって、生物学的サンプル中の抗−ＨＩＶ抗体の存在を検出する。非変性ＨＩＶ抗原決定基は、血清サンプル中の抗−ＨＩＶ抗体を、非変性ＨＩＶ抗原に対するＨＩＶ抗体の存在の血清陰性をテストすることにより検出する手段を提供した。
【０００７】
米国特許第５，０９３，２３０号は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＹＬＶ−Ｉ、及びＨＴＬＶ−ＩＩから成る群から選ばれたレトロウイルスに対するＩｇＭ抗体の検出方法に関する。上記方法は７０分以内に実施され、以下のステップ：
ｉ）ゲル電気泳動により分離されたウイルスライセートから得られた、ブロットされ、分離されたレトロウイルス抗原タンパクを含むニトロセルロース紙と、テストサンプルを接触させ、そしてニトロセルロース紙とテストサンプルがサンプル中の抗体とニトロセルロース紙上のタンパクとの結合を可能とするような所定の条件下で、インキュベートすること、
ｉｉ）インキュベートされたステップｉ）のニトロセルロース紙と、前記抗体と反応性のある抗−ＩｇＭ抗血清であって酵素と結合したものを接触させること、そして抗血清が前記抗体に結合できるようにインキュベートすること、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）のインキュベートされたニトロセルロース紙をステップｉｉ）の酵素に特異的な酵素基質と接触させること、及び発色するようにインキュベートすること、
ｉｖ）ステップｉｉｉ）の発色反応を停止し；そして
ｖ）ウイルスライセートに対する抗体の存在の指標として発色量を評価すること、
を含む。
【０００８】
複数のサイトカインが従来技術により検出されている。米国特許第５，５８７，２９４号は、血液中の内因性のサイトカインを測定する方法に関する。サイトカインはサイトカインを結合する物質の存在下で測定されるため、慣用方法では不正確な結果となる。上記発明はまた、唾液及び鼻からの分泌液のような生物学的液体中のサイトカインの非観血的な測定に関する。１の実施態様において、上記発明はヒトにおけるサイトカイン療法のモニタリング方法に関し、ここでサイトカインは、ＩＬ−１ではないという条件で、担体分子を結合する。上記方法は以下のステップ：
ｉ）潜在的にサイトカインを含むヒト体液サンプルを得ること、
ｉｉ）ステップｉ）からのサンプルを以下の：
ａ）実質的にすべてのサイトカインに特異的に結合することのできる抗体、ここで抗体は固相支持体上に固定化されている、及び
ｂ）ラベルされたサイトカインの結合エピトープ、ここで抗体結合について上記ラベルされた結合エピトープがサイトカインと競合する、
と併合してアッセイ混合物を形成すること、
ｉｉｉ）固定化された抗体が、特異的にサイトカイン又はラベルされた結合エピトープと結合できるように、アッセイ混合物をインキュベートすること、
ｉｖ）結合していない、ラベルされた結合エピトープを固相支持体から洗浄すること、
ｖ）固相支持体上の結合したラベルを検出すること、
ｖｉ）サンプル中のサイトカインの量を決定すること、
を含む。さらなるステップにおいて、決定されたサイトカインの量と、先の体液サンプル中においてサイトカインが決定されたサンプル中のサイトカイン量とを比較する。好ましいサイトカインはインターロイキン−２、インターロイキン−６、インターフェロン−α、インターフェロンγ及び腫瘍壊死因子−αである。
【０００９】
発明の要約
最初の側面において、サンプル中に１００ナノグラム（１００×１０−９グラム）／ミリリッター（１０−３リッター）未満の量で存在する、少なくとも１の所定の炎症の指標を検出する方法が提供される。上記方法は以下のステップ：
ｉ）サンプルを、キットであって以下の：
ａ）固相支持体、
ｂ）固相支持体に結合する複数の第１ターゲティング種であって、固相支持体に接触されるサンプル中に、上記所定の炎症の指標が存在する場合に、直接上記指標を検出することができる上記ターゲティング種、そして
ｃ）接合体であって、以下の：
ｉ）少なくとも１の第１及び／又は第２ターゲティング種であって、固相支持体に接触されるサンプル中に、前記所定の炎症の指標が存在する場合に、直接前記指標を検出することができる前記ターゲティング種、及びｉｉ）少なくとも１のラベリング種
に結合するポリマー担体分子を含む前記接合体、
を含む前記キットに接触させるステップ、及び
ｉｉ）所定の炎症の指標をターゲティングすることのできるターゲティング種を検出するステップ、
を含み、ここで、ターゲティング種の検出が、上記サンプル中の上記所定の炎症の指標の存在の指標となる。
【００１０】
炎症の指標又は炎症性物質という用語は、例えばサイトカイン及び自己抗体のような指標である、炎症性の及び／又は免疫システムの活性の指標を意味する。
【００１１】
さらなる側面においては、個体における感染性の症状を診断する方法であって、以下のステップ：
ｉ）体液サンプル中に存在する、所定の炎症の指標を本発明による方法に従って検出すること、及び
ｉｉ）前記感染性の症状を診断すること、
を含む前記方法が提供される。
【００１２】
さらなる側面においては、個体における炎症性の症状を診断する方法であって、以下のステップ：
ｉｉｉ）体液サンプル中に存在する少なくとも１の所定の炎症の指標を本発明の方法に従って検出すること、そして
ｉｖ）前記炎症性の症状を診断すること、
を含む前記方法が提供される。
【００１３】
なお別の側面においては、個体における感染性及び／又は炎症性の症状を治療する方法であって以下のステップ：
ｉ）本発明のいずれかの方法に従って診断を実行すること、そして
ｉｉ）上記診断に基づいて上記症状を治療すること、
を含む前記方法が提供される。
【００１４】
本発明のなおさらなる側面は、本発明によるキットであって、以下の：
ｉ）所定の炎症の指標を検出する方法、及び
ｉｉ）個体における感染性及び／又は炎症性の症状を診断する方法及び／又は個体における感染性及び／又は炎症性の症状を治療する方法
の中で用いられる前記キットに関する。
図面の簡単な説明
図１は、本発明によって検出できる選ばれた自己抗体の図解である。
【００１５】
発明の詳細な説明
１の好ましい実施態様において、本発明は、サンプル中に存在する、所定の炎症の指標を直接検出するキットを提供し、前記キットは、以下の：
ｉ）固相支持体、
ｉｉ）固相支持体に結合する複数の第１ターゲティング種であって、固相支持体に接触されるサンプル中に、上記所定の炎症の指標が存在する場合に、直接上記指標を検出することができる上記ターゲティング種、そして
ｉｉｉ）接合体であって、少なくとも以下の：
ａ）１の第１及び／又は第２ターゲティング種であって、固相支持体に接触されるサンプル中に、上記所定の炎症の指標が存在する場合に、直接上記指標を検出することができる上記ターゲティング種、及び
ｂ）少なくとも１のラベリング種、
に結合するポリマー担体分子を含む前記接合体であって、ここで上記ポリマー担体分子が、複数の少なくとも１の反応性のある官能基、少なくとも１の反応性のある官能基に結合した少なくとも１の連結部分、及びターゲティング種及びラベリング種から成る分子種群から選ばれた少なくとも１の分子種を含み、ここで各分子種が、上記試薬に結合した少なくとも１の連結部分と反応性のある、少なくとも１の官能基を含み、そしてここで、上記接合体が、連結部分を介してそこへ共有結合により結合する、少なくとも１の分子種を含む。
【００１６】
好ましい実施態様において、上記キットはサンプル中に１ミリリッター（１０−３リッター）あたり約１００ナノグラム（１００×１０−９グラム）未満の量で存在する炎症の指標の検出に好適である。
【００１７】
上記ポリマー担体分子は、好ましくはポリマー担体１ｇあたり約５〜約５０００μｍｏｌ の量の反応性の官能基を含む。
【００１８】
他の実施例においては、ポリマー担体分子は例えば本発明による１のデキストラン鎖であって４００未満のラベリング種、好ましくは可視的に検出できるターゲティング種又は蛍光性に検出できるラベリング種の形態で、例えば３８０未満のラベリング種、例えば３６０未満のラベリング種、例えば３４０未満のラベリング種、例えば３２０未満のラベリング種、例えば３００未満のラベリング種、例えば２８０未満のラベリング種、例えば２６０未満のラベリング種、例えば２４０未満のラベリング種、例えば２２０未満のラベリング種、例えば２００未満のラベリング種、例えば１８０未満のラベリング種、例えば１６０未満のラベリング種、例えば１４０未満のラベリング種、例えば１２０未満のラベリング種、例えば１００未満のラベリング種、例えば８０未満のラベリング種、例えば７０未満のラベリング種、例えば６０未満のラベリング種、例えば５０未満のラベリング種、例えば４０未満のラベリング種、例えば３０未満のラベリング種、例えば２５未満のラベリング種、例えば２０未満のラベリング種、例えば１５未満のラベリング種、例えば１２未満のラベリング種、例えば１０未満のラベリング種、例えば８未満のラベリング種、例えば４未満のラベリング種、例えば３未満のラベリング種、例えば２未満のラベリング種を含む。
【００１９】
１のデキストラン鎖ポリマーの分子量は好ましくは約５００，０００Ｄａであるが、分子量約１００，０００〜約９００，０００Ｄａのものもまた使用可能である。
【００２０】
他の連結部分もまた、以下において詳細に記載されている通りに用いることができるが、１の実施態様における各デキストラン鎖は、好ましくはジビニルスルホンにより２０〜２２％が活性化した、約２，７００のグルコース単位を含む。
【００２１】
１の実施態様においては、ターゲティング種及びラベリング種と反応するデキストラン鎖あたりの約６００の連結部分のうち約半分が好ましくは、しかし限定されないが、ジビニルスルホ基であり、そしてこれはデキストラン鎖あたりのラベリング鎖は約４００未満であるという数字を提供する。しかし、６００の連結部分のうちの約半分以上がラベリング種とよく反応することができ、したがってラベリング種の数は約４００よりも高い。
【００２２】
本発明による１のポリマー担体分子中のラベリング種とターゲティング種の数は本発明に従って検出可能な炎症の指標の最小量に影響を及ぼす。１の実施態様において、検出できる細胞の最小量はサンプル検体１ミリリッターあたり１００ナノグラムより少なく、例えば１ミリリッターあたり９５ナノグラム未満、例えば１ミリリッターあたり９０ナノグラム未満、例えば１ミリリッターあたり８５ナノグラム未満、例えば１ミリリッターあたり８０ナノグラム未満、例えば１ミリリッターあたり７５ナノグラム未満、例えば１ミリリッターあたり７０ナノグラム未満、例えば１ミリリッターあたり６５ナノグラム未満、例えば１ミリリッターあたり６０ナノグラム未満、例えば１ミリリッターあたり５５ナノグラム未満、例えば１ミリリッターあたり５０ナノグラム未満、例えば１ミリリッターあたり４５ナノグラム未満、例えば１ミリリッターあたり４０ナノグラム未満、例えば１ミリリッターあたり３５ナノグラム未満、例えば１ミリリッターあたり３０ナノグラム未満、例えば１ミリリッターあたり２５ナノグラム未満、例えば１ミリリッターあたり２０ナノグラム未満、例えば１ミリリッターあたり１５ナノグラム未満、例えば１ミリリッターあたり１０ナノグラム未満、例えば１ミリリッターあたり５ナノグラム未満、例えば１ミリリッターあたり１ナノグラム未満、例えば１ミリリッターあたり０．５ナノグラム未満、例えば１ミリリッターあたり０．１ナノグラム未満、例えば１ミリリッターあたり０．０５ナノグラム未満、例えば１ミリリッターあたり０．０１ナノグラム未満、例えば１ミリリッターあたり０．００５ナノグラム未満、例えば検体１ミリリッターあたり０．００１ナノグラム未満である。
【００２３】
例えば体液サンプルのようなサンプル中に存在する、サイトカイン及び／又は自己抗体を含む炎症の指標は、好ましくは本発明の一方法による陽性の診断結果として、約２０分未満の時間で検出され、そして記録され、例えば１５分未満、例えば１０分未満、例えば８分未満、例えば７分未満、例えば６分未満、例えば５分未満、例えば４分未満、例えば３分未満、例えば２分未満、例えば１分未満、例えば４５秒未満、例えば３０秒未満、例えば１５秒未満で検出され、そして記録される。
【００２４】
上記テストが上で特定された細胞量を所定の時間内で検出することが可能な場合、本発明のための好ましい統計的な質のパラメータについて以下のように概要を述べることができる。
【００２５】
感受性：少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、
特異性：少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、
陽性の予測値：少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、
陰性の予測値：少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９９．５％。
【００２６】
上記陽性の及び陰性の予測値はテストされる母集団における疾患の羅患率と密接に関係している。このような状況においては、統計学的な計算は、テストを使用するのに現実的な母集団のタイプに基づくことが好ましい。したがって、統計学的な計算は上記疾患を有することがわかっている母集団に基づくだけでなく、上記疾患に対して陰性であることが判明するかも知れない個体にも基づく。本発明によるキットの有効性及び感受性次第で、上記キットはテストの対象となっている症状の羅患率が１００％未満、例えば９０％未満、例えば８０％未満の母集団のテストに特に好適であり、さらに好ましくは７０％未満、なおさらに好ましくは６０％未満、例えば約５０％未満の母集団のテストに好ましい。
【００２７】
本発明は他の実施態様において、検体中の炎症の指標の検出方法を提供し、ここで場合により、望ましくない成分を除去する処理がされる、前記検体を、拡張された固相であって、そこへ好ましくは炎症の指標に対する抗体であるターゲティング種を接合させたものと接触させる。接触結果は抗体の場合、ターゲットとなる炎症の指標に特徴的な抗原と免疫複合体を形成することに用いられる。
【００２８】
拡張された固相を検体と分離する；前記分離した拡張された固相を、本発明によるポリマー担体分子であってそこへ所定の抗体のようなターゲティング種を接合させたものを含む可動性の固相と接触させる。上記抗体は結果的に本発明による前記ポリマー担体分子の前記免疫複合体に結合する；続いて、拡張された固相を前記可動性の固相から分離する；そして前記拡張された固相に結合した本発明によるポリマー担体分子の存在を検出し、これによって前記検体中の炎症の指標の存在を検出又は判定する。
【００２９】
本発明はまた、炎症の指標の検出キットであって個々の構成物として以下の：
（ａ）拡張された固相であって、そこへ好ましくは、検出される炎症の指標に特有の抗原と免疫複合体を形成することのできる抗体である、ターゲティング種を接合させたもの；及び
（ｂ）前記ターゲティング種又は好ましくは検出される炎症の指標に特有の抗体である、別のターゲティング種を接合させた、本発明によるポリマー担体分子の分散から成る可動性の固相、
を含む前記キットを提供する。
【００３０】
検出されるタイプの炎症の指標を含む検体を、１の実施態様において、拡張された固相の構成物であって、少なくとも１の位置において検出される炎症の指標の抗原と複合体を形成するターゲティング種でコートされたものに露出する。
【００３１】
１の実施態様においては、拡張された固相は、拡張された固相から検体を洗い出すような方法で検体から分離し、そして分離した拡張された固相をその後、可動性の固相であって、好ましくは抗体である、同一又は異なるターゲティング種を含む、本発明による分散されたポリマー担体分子であるものと接触させる。仮に、検出される炎症の指標（“ターゲット”炎症の指標）の抗原の免疫複合体が拡張された固相上で形成された場合、本発明によるポリマー担体分子がそのような複合体に結合するであろう。
【００３２】
非結合の、本発明によるポリマー担体分子である可動性の固相を、その後洗浄のような方法で除去し、そして拡張された固相を、拡張された固相に結合した本発明によるポリマー担体分子の存在を判定するために、検査する。これらは、いくつかの場合において可視的に検出することができ、例えば本発明によるポリマー担体分子が最初に染色又は着色される場合である。顕微鏡による検査を採用することもできる。本発明によるポリマー担体分子にトレーサーやラベルを使用することは、ここで以下においてさらに詳述する他の検出方法の使用を可能にする。
【００３３】
この手段によって、結合した本発明によるポリマー担体分子の存否がウイルスを含むターゲットである炎症の指標の存否の検出を可能とし、結合した本発明によるポリマー担体分子の量の評価が、検体中の炎症の指標の量の決定を、例えばスタンダードの結果と既知のサンプルのアッセイを比較することにより可能とする。
【００３４】
本発明において用いられる拡張された固相は、多様な形態及び構造で採用されることができる。上記固相は、好ましくは抗体であるターゲティング種が結合又は会合することができる部位を有し、検体と本発明による方法において用いられる他の物質との接触を可能とする。ここで、以下に詳述するように、好ましい検体は体液サンプルである。
【００３５】
拡張された固相は、検体及び他の試薬と容易に接触する、単純な操作を可能とする形態が最良である。この目的のために、拡張された固相は少なくともディップスティックの一部、シリンジ、チューブ又はコンテナの形をとることができる。
【００３６】
検体及び他の試薬はシリンジに吸いとって、駆出することができ、チューブを通じて流動させ、或いはテストチューブの形をしたコンテナのようなコンテナに蓄積することができる。そのような装置内で、拡張された固相は上記装置の全体又は一部を形成することができ、シリンジ、チューブ又はコンテナの場合、拡張された固相で形成された部分は、少なくとも検体及び試薬との接触を可能とする装置の内部において露出される。好ましくは抗体である、ターゲティング種は、好ましくは拡張された固相の一部分において濃縮され、検体に露出される。
【００３７】
もう一つの好ましい形態の拡張された固相はディップスティックである。そのようなディップスティック内では、拡張された固相は少なくとも１の末端に含まれ、好ましくは抗体である、拡張された固相に接合したターゲティング種がディップスティックの末端において濃縮されることがさらに望ましい。しかしながら、拡張された固相は完全なディップスティックを含み、１の末端又は１より多い部位において濃縮された、好ましくは抗体である、ターゲティング種を含む。
【００３８】
ディップスティックは拡張された固相から完全に形成することができ、その１の末端において、好ましくは抗体である、ターゲティング種のコーティングを接合している。他の実施態様においては、ディップスティックは、その一端が本体の一部分に付着した拡張された固相を有する。好ましくは抗体である、ターゲティング種のコーティングを拡張された固相に接合させる。さらに他の実施態様においては拡張された固相は検体を置くことのできる管状のコンテナを完全に形成する。好ましくは抗体である、ターゲティング種のコーティングを、コンテナの底部近くに置き、１以上の位置において濃縮する。
【００３９】
拡張された固相は、好ましくは抗体である、目的のターゲティング種がそこへ効果的に結合されうる材料で構成される。抗体タンパクとの共有結合のために、固相の材料は、水溶性のカルボジイミドを接合試薬として用い、表面にカルボキシル基を含むように選択されることができる。好ましい材料は、アクリル樹脂であり、これは、好ましくは抗体である、目的とするターゲティング種を接合によって結合することを可能とするカルボキシル化された表面を有する。表面にアミノ基を有する材料については、反応性のカルボキシル中間体が無水コハク酸との反応により調製できる。多様な無機支持体、典型的にはガラス、もまた好ましくは抗体である、ターゲティング種との共有結合性のカップリングのために調製することができる。例えば“Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ａ Ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ Ｔｅｘｔｂｏｏｋｓ ａｎｄ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ，”Ｖｏｌ． １， Ｃｈａｐｔｅｒ １， １９７５に言及があり、その開示がここに参考文献として含まれている。
【００４０】
好ましくは抗体であるターゲティング種を結合できる拡張された固相材料は、アッセイステップに重大な干渉をしない材料から選択する。
【００４１】
組織検体中の非特異的な凝集剤であってその一部がイムノグロブリンと結合しているものの存在は、本発明による可動性のポリマー担体分子が拡張された固相に、特異的な抗原のない条件においても結合するという誤った結果をもたらしうる。アッセイ中にくり返し洗浄することは非特異的結合を減らすであろうが、しかし、非特異的な凝集剤の除去はそのような望ましくない結合を防ぐのに必要である。単純なポリスチレンラテックスの表面は、例えば、ＩｇＧでコートされた表面がより高い親和性を提供する一方、受動的に凝集剤のいくつかを除去することができる。
【００４２】
以下の記述においては、便宜のために、拡張された固相は、他の形態がここで上で説明されたように使用できるものであるにもかかわらず、好ましいディップスティックを指す。
【００４３】
上記炎症の指標に対して作製されたモノクローナル抗体は、不変のそして複製可能な結合をすることができる。特異的な抗体が適切に供給された場合、本直接アッセイは、ラジオイムノアッセイで実行する競合免疫結合アッセイとは対照的に、信頼性のあるそして非常に迅速な方法であることができる、それは、競合結合アッセイにおいては必要とされる運動力学的平衡のためのインキュベーション時間がここでは不要だからである。
【００４４】
本発明による方法によれば、抗血清の通常のＩｇ分画からの又はモノクローナル抗体からの抗ウイルス抗体ターゲティング種をそれぞれ、可動性の固相と同様に固相ディップスティック、又は本発明によるいわゆる単分散のポリマー担体分子に接合させる。
【００４５】
本発明による可動性のポリマー担体分子の機能は形成された免疫複合体の検出である一方、ディップスティックの機能は抗原を取り扱い、そして遊離の抗原から結合した抗原を分離することである。抗体タンパクと多様な固相材料とのカップリング技術はよく進歩している（例として上で示されたＷ．Ｊ．Ｄｒｅｙｅｒ、米国特許第３，８５３，９８７号を参照のこと）。
【００４６】
上述の本発明による方法の１の実施態様において、得られた免疫複合体は多層の“サンドイッチ”であり以下の：ディップスティック＋好ましくは抗体であるターゲティング種＋ウイルス抗原＋好ましくは抗体であるターゲティング種＋ラベリング種を含むポリマー担体分子を含む。
【００４７】
しかしながら、共有結合に必要とされる抗体の量は、塩化ビニルのようなプラスチックへの受動的吸着のそれの１０００分の１以下であり、好ましくは抗体である、高度に特異的なターゲティング種をそのような量で使用することは経済面から禁止的なものである。
【００４８】
好ましくは抗体であるターゲティング種の特異性と同様の共有結合の強度を保持する代替の結合方法は、ターゲティング種と固相を第１抗体、ターゲティング抗体のＦｃ部位に対する抗種抗体、で架橋することである。そのようなＦｃ部位は、例えば“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（１９８１）， Ｔｈｅ Ｕｐｊｏｈｎ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｋａｌａｍａｚｏｏ， Ｍｉｃｈ 中に例解されている。
【００４９】
すなわち、高価でない第１抗体は最初に固相に共有結合で結合することができ、結合した第１抗体が炎症の指標の抗原に関しては不変のターゲティング抗体の機能的エピトープと離れてターゲティング抗体の種特異的なＦｃ部位を引きつける。そのような第１抗種抗体によって架橋されることにより、本発明のイムノアッセイは種の検出の場合にも以下のカップリング“サンドイッチ”を生じさせる：
ディップスティック＋抗種抗体＋ターゲティング抗体＋ウイルス抗原＋ターゲティング抗体＋抗種抗体＋ラベリング種を含むポリマー担体分子。
【００５０】
本発明による直接結合アッセイにおいては、本発明によるポリマー担体分子と好ましくは抗体であるターゲティング種の間のカップリングと同様に、ディップスティックと好ましくは抗体であるターゲティング種の間のカップリングが前もって調製され、そして上述の直接結合アッセイに先立つ前処理のために体液検体中の非特異的凝集要素が除去又は非活性化される。
【００５１】
本発明の１の実施態様によるアッセイ手順はしたがって以下のステップ：
（１）場合により前処理された体液サンプルの形態の検体にディップスティックを挿入する。
（２）ディップスティックとサンプルをインキュベートする。
（３）ディップスティックを洗浄する。
（４）ポリマー担体分子が前もって検体に加えられていない限り、好ましくは抗体である、少なくとも１のターゲティング種、及び少なくとも１のラベリング種を含むポリマー担体分子の分散中に、ディップスティックを挿入する。
（５）場合により（４）に従って得られた調製物を洗浄する。
（６）ターゲティング種又はラベリング種のいずれかを検出することにより、ディップスティック上の本発明によるポリマー担体分子を検出する。
に単純化される。
【００５２】
最少量の湿式化学を用いるために、ディップスティック上に結合した本発明によるポリマー担体分子の本検出は免疫化学とは独立に行う。好ましくは抗体であるターゲティング種をディップスティックの一端において濃縮することにより、結合した本発明によるポリマー担体分子が１の部位において濃縮され、これが検出を単純化する。
【００５３】
本発明によるポリマー担体分子は直接視覚観察のための染料又は蛍光性の化合物を含むことができ、またＸ−線蛍光又は電磁シグナルを発するようにその中に金属原子又は酸化鉄を混入又は包括することができる。酵素的増幅法もまた本発明によるポリマー担体分子中にデザインされることができる。
【００５４】
１の実施態様において、本方法は動的平衡に冗長なインキュベーションを必要とする競合結合アッセイのかわりに直接結合アッセイを採用する。当然、開示された方法は競合タンパク結合アッセイにおいても同様に採用することができる。免疫分析物の抗体及び抗原の役割は交換することも可能であるが、それでも、固定化された固相をシグナル増幅に用いることには変わりがない。抗体又は多様な抗原分子の固相物質への結合は、共有結合カップリング同様に受動的吸着においても周知である。
【００５５】
本発明によるイムノアッセイにおいて、炎症の指標に特有の抗原は、場合により高度に多様であり、可動性及び固定化された固相を連結する架橋として用いられる。この連結は明らかに、複数の抗体結合部位を有する多様な他の抗原によっても行なわれる。１より多いモノクローナル抗体を特異的に連結することのできない反復した結合部位を持たない一定の抗原の場合は、代わりに多価の抗体を用いることができる。
【００５６】
本発明の方法はまた、抗体、抗原及び１又はそれ以上のターゲティング種を含む同一又は異なるポリマー担体分子を含む対応する結合パートナーの特別なペアによって各分析物が代表される、単一の手順によって、いくつかの分析物をアッセイするようにデザインすることもできる。
【００５７】
異なるタイプの炎症の指標の検出は、本発明に従って、好ましくは抗体である複数の異なるターゲティング種、対応する異なる炎症の指標の抗原と複合体を形成することのできるタンパクを、それぞれ拡張された固相に及び可動性の固相に接合させることによって行なうことができる。上記アッセイに続いて、結合したミクロスフィアが可視的に観察され、又は他の方法で検出されることは検体中に１又はそれ以上の異なる炎症の指標が存在することを示し、仮に陽性の場合、このアッセイに続いて、同時にテストされた、異なる個々の炎症の指標のアッセイを行うことができる。
【００５８】
他の実施態様においては、異なる炎症の指標を両方同時にそして個々に検出することができる。そのようなテストのためには、異なるタイプの複数の炎症の指標の抗原に対応する抗体であることが好ましい、異なるターゲティング種を、同様に異なる金属原子でラベルしたミクロスフィアと接合させる。
【００５９】
１より多いタイプの、異なってラベルされたミクロスフィアが、本発明のアッセイにおいて拡張した固相に結合した場合、それらは別々に及び同時に検出することができる。この方法により、検体中の対応する個々のタイプの炎症の指標が同時に及び別々に検出される。これは、サイトカインのプロフィール又は自己抗体のプロフィールのような、炎症の指標のプロフィールを決定するのに特に広く用いられている。
【００６０】
本発明のアッセイ方法に有用な個々の構成物として、上述のように調製した好ましくは抗体であるターゲティング種と接合する拡張した固相及び分散したミクロスフィアを、そのような構成物を含む炎症の指標の検出キットの形態で提供することができる。好ましくは抗体であるターゲティング種、コーティングに関して、そしてしたがって検出される炎症の指標に関して異なる、異なるキットを提供することができる。
【００６１】
そのようなキットは個々の構成物としてさらに、アッセイに先立って検体から非特異的な凝集剤を除去するためのラテックス固相を含むことができる。この目的のための好ましいラテックスはガンマイムノグロブリンでコートされたポリスチレンである。
【００６２】
本発明のキットの構成物である拡張した固相及び可動性の固相は、上述の抗種抗体に結合した、好ましくは抗体であるターゲティング種とともに提供されることができる。また、上述のように、構成物であるミクロスフィアをラベルすることができ、拡張した固相は、開示したように少なくとも１の部位において、好ましくは抗体であるターゲティング種でコートされた、ディップスティック、シリンジ、チューブ又はコンテナの一部又は全体の形態をとることができる。
【００６３】
さらに、構成物である拡張した固相を、好ましくは抗体であって異なるタイプの炎症の指標の対応する抗原と複合体を形成することができる、複数の異なるターゲティング種とともに提供することができる。そのように提供した場合、構成物である個々の可動性の固相、好ましくは抗体であって、その各々のポリマー担体分子に接合したターゲティング種を同数、又は異なるタイプのポリマー担体分子の混合物が提供できる場合には、好ましくは抗体である異なるターゲティング種がそこへ接合した各タイプを同数有するように提供することができる；又はさらなる変法においては、構成物である可動性の固相は、分離したバッチのポリマー担体分子の形態で提供されることができ、各バッチは、そこへ前記の数の好ましくは抗体である異なるターゲティング種が接合している。
【００６４】
ここで上述のようにターゲティング種とラベリング種を含むポリマー担体分子を用いることが好ましいにもかかわらず、本発明は、ターゲティング種と、場合によりラベリング種をも含むミクロスフィアを含む球状粒子を用いることによっても実行することができる。そのようなミクロスフィアは特に本発明によるキットを含むマイクロシステムとともに用いることができる。
【００６５】
本発明によるキットはまたＰＣＴ出願公開第ＷＯ９８／１０２６７号に記載されたマイクロフローシステムのようなマイクロシステムに適用することができ、そのような１のシステムはＴｏｒｓａｎａ Ｂｉｏ−ｓｅｎｓｏｒ Ａ／Ｓ Ｄｅｎｍａｒｋにより販売されている。
【００６６】
マイクロフローシステムの技術の背景にある原理は、少なくとも２のガイディング流（ｇｕｉｄｉｎｇ ｓｔｒｅａｍ）の流速を制御することにより、サンプル流（ｓａｍｐｌｅ ｓｔｒｅａｍ ）が正確にターゲット表面に位置することができることである。
【００６７】
ガイディング流及びサンプル流の間の流速比を制御することにより、サンプル流を数ｍｍの幅に集中することができる。サンプル流は上記分子を上記表面と相互作用するように運搬する。
【００６８】
上記システムの固定されたレーンはｙ−次元において未知のサンプルを含む液体流と相互作用する。
【００６９】
反応が起こることのできる、数多くの独特の交差ポイントが作られる。
【００７０】
非常に狭い液体流においては乱流が起きないことにより、サンプル流の焦点を摂動させる唯一の現象は拡散である。事実上は、上記科学技術は、平面表面上での液体流の正確な位置付けを許容する。このやり方によって物質を数ｍｍの正確さで位置することが可能である。
【００７１】
微小流体システムは、物質（ＤＮＡ、タンパク、細胞）を運搬する液体の非常に狭い流れを制御することでチップ表面と相互作用することを可能とする。
【００７２】
マイクロフローシステムは、反応物の流れ、この前後関係においてはポリマー担体を含む接合体の流れである、を固定化し、そして続いて化学反応が起こり、そして検出される、織り合わされた数多くの交差ポイントを作り出す１又はいくつかのサンプルのテストを可能とする。仮にサンプルそして反応物の添加、固定化の選択、そして検出化学、そして配列レイアウトに関して柔軟性があれば、完全な手順は閉じた流体システム中で実行される。
【００７３】
特別には、炎症の指標のプロフィールを提供するように、複数の炎症の指標をテストするためのキットを使用した場合、本発明は好適にマイクロシステムにおける上記キットの使用を含む。
【００７４】
マイクロシステムに加えて、本発明によるキットは例えば側方流デバイスのような慣用のマイクロシステムの一部を形成することもできる。そのような装置の例を以下に列挙する。
【００７５】
米国特許第５，６１０，０７７（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）は、特異的結合アッセイを実施する方法を開示する。したがって、特異的結合アッセイを実行するための本発明による方法であって以下のステップ：（ａ）炎症の指標を含むアッセイされるサンプルを（ｂ）テストされる炎症の指標の特異的結合のパートナーであって、本発明によるポリマー担体分子であって固相支持体に固定化されたもの、及び（ｃ）テストされる炎症の指標の特異的結合のパートナーであって、本発明によるポリマー担体分子であって検出可能なマーカーと接合されたものと反応させる、を含む上記方法を提供し、これによっていかなる量であってもテストされる炎症の指標が存在すれば、これと試薬（ｂ）及び（ｃ）を反応させることによりサンドイッチ複合体を形成し、そしてテストされる炎症の指標を介してマーカーを支持体に固定化することにより、サンプル中に存在する、テストされる炎症の指標の量の指標としてマーカーを検出又はアッセイし、改良点としては、サンプル（ａ）との反応に試薬（ｂ）及び（ｃ）を一緒に使用し、テストされる炎症の指標及び試薬（ｂ）と（ｃ）との結合反応の間の競争的干渉を避けるために試薬（ｂ）その後（ｃ）というように使用すること、狭く、異なり、そして非干渉性の特異性を有するモノクローナル抗体、特異的結合反応がその中でおこる水性の液体を入れたウェル又はカップの容積の大部分を占める置換体の表面に固定化した結合試薬（ｂ）を含む。
【００７６】
抗体に求められる狭い特異性は、テストされる炎症の指標へ特異的に結合する能力であって、しかしテストされる炎症の指標と他の特異的結合パートナーとの結合反応を阻害しないものである。抗体及び固相に結合する酵素又は他のマーカー、及び／又は抗体（もしあれば）との間の接合体は、目的とするアッセイ反応が接合体及び免疫吸着剤とアッセイされるサンプル中に存在するいかなる量のテストされる炎症の指標との反応も接合体と免疫吸着剤との競争によって妨害されないことが確実なように十分に狭い特異性を有するモノクローナル抗体又は他の抗体を含むことができる。十分に狭い特異性を有する抗体は、テストされる物質の分散した化学的又は物理的分子断片に対して作成した抗血清の（ポリクローナル）イムノグロブリンからも得ることができ、例えば、テストされるイムノグロブリンのＦｃ断片（又はより小さなペプチド断片）に対する抗体、又はテストされるタンパク抗原のサブユニット又はペプチドに対する抗体である。各場合における目的は、例えば“サンドイッチ”又は“抗グロブリン”テストの立体配置をとるイムノアッセイを実行するのに特別に起こりうる干渉から実質的に自由であることを保証することである。
【００７７】
“サンドイッチ”テスト立体配置においては、テストされる抗原は、固相表面に結合した第１抗体に特異的に吸着されることができ、酵素又は他の（例えば蛍光又は放射性の）マーカーを有する第２抗体は特異的にテストされる放射測定又は蛍光測定或いは吸着した抗原に結合する。そのように特異的に結合したマーカーは、酵素マーカーを基質に露出し、その後生成物を測定することのような、例えば直接測定によるテストされる抗原の測定又は決定に用いられる。したがって、好ましいサンドイッチテストにおいては、使用される２の抗体は、テストされる同じ抗原に関して異なる、非干渉性の特異性を有することができる。
【００７８】
時には“サンドイッチ”テスト立体配置とも称される、“抗グロブリン”テスト立体配置においては、位置が類似している：テストされる物質はそれ自体がイムノグロブリンであり；固相表面に結合した物質はその対応する抗原又はハプテンであり；マーカーを運搬する物質は種及びテストされる抗体のイムノグロブリンタイプに対応する抗グロブリンである。好ましい抗グロブリンテストにおいては、抗グロブリンは、その対応するグロブリンが不溶化された抗原に、引き続いて吸着することを干渉しないのに十分な狭い特異性を有することができる。
【００７９】
無修飾抗原に対して作成された通常の抗血清からの抗体（ポリクローナル抗体）がサンドイッチ又は抗グロブリンテストにおいて使用された場合、もしすべての成分が単一のステップで混合されると、２の特異的な吸着反応間で干渉がおこるかも知れないという非常に可能性の高い危険がある。ここで記載された装置を用いて、本発明にしたがってそのようなテストが実行された場合、そのような干渉は、上記の狭い特異性を有する抗体を用いること又はそうでなければ仮に他の（マーカーに接合された）試薬の結合が続く固相への吸着を妨げる危険のある場合、他の（マーカーに接合した）結合試薬へのテスト物質の露出の前にテスト物質を固相表面に確実に結合させることにより、防ぐことができる。
【００８０】
好適なアッセイ特性、抗体特性、そして接合した試薬（ｃ）のゆっくりと遊離する形態の特別な場合について以下、例を挙げて記述する。
【００８１】
そのような特異的結合アッセイの実施においては、その容積の大部分を置換体によって占められるウェル又はカップに成分（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む反応液が入っている場合、反応動力学において価値のある進歩が得られる。（英国特許明細書第１，４１４，４７９号及び同第１，４８５，７２９号に記載の通り、桿状又は球状の形態の挿入物の使用は、他の種類のイムノアッセイとの関係において知られている。）
【００８２】
置換体は、例えば実質的にカップ又はウェルの形状に相補的又はわずかに小さく、したがって特異的結合試薬のうちの１を含む液相はほぼ、置換体とカップ又はウェルの間の空間を占める殻の形状をしている。置換体は緩く適合することができ、ぴったりと乗せられるものではなく、つまりカップ又はウェルに対して可動的である、したがって置換体とウェルの間の相対的な動きによってそれらの間にある液体が撹拌され、揺り動かされることができる。
【００８３】
例として、丸いウェルはウェルの直径よりもわずかに小さい外径を有する丸い置換体をその中に入れることができる。置換体の存在はウェル中の液体のために使用できる空間を、ウェル中の同様の液体レベル、例えばその通常の操作レベル又は最大容量まで満たした場合、に基づいて例えば２〜１０倍、例えば３〜８倍に減らすことができる。例として、通常のアッセイ中に３００マイクロリッターの液体をその中に満たすように設計されたマイクロタイターウェルは、３０〜１５０マイクロリッターの液体スペース、例えば５０〜１００マイクロリッター、を残す置換体とともに用いることができる。
【００８４】
ここで記載された、置換体とともにウェル又はカップを使用することは、アッセイ反応ステップの効率を上昇させることができ、なぜなら、第一にはこれにより既定のサイズのマイクロタイターウェル中で遭遇する通常の状態に比較して、より濃縮された試薬を試薬の重さの増加又はマイクロタイターウェルのサイズの減少を伴わずに使用することができ；そして第二にはこれが既定の液体試薬の容量と反応することのできる感作された表面部位を増加させ、したがって感作された表面上の特異的な試薬の密度を上げる必要性又はクラウディングの問題に遭遇することなく、比較的速い吸着反応速度論を達成することができるからである。
【００８５】
置換体のセットは好ましくは本発明の一定の実施態様中に、例えば標準的な８×１２ウェルのプレートのようなマイクロタイタープレート上に適合することのできるふたの不可欠な部分として、存在することができる。上記セットはプレートとすべてのウェル又はそのサブセット、例えば列、に適合するよう十分に大きくすることができる。置換体の容積及びウェルに分注される液体の容量は上述のやり方でウェルに対して相対的に選ぶことができ、好ましくはテストされる液体が実質的に主要な部分そして好ましくはウェルの内部表面全体に接触するように選ぶことができる。
【００８６】
アッセイされる炎症の指標の固定化された特異的結合パートナー（試薬（ｂ））はアッセイ反応が行われるウェル又はカップの壁に固定化することができる。代わりに、独立して使用における有益性及び便宜性を提供することのできる本発明の特徴により、例えば液体アッセイ試薬中へ浸すスティック、ペグ又はスタッドの形態をした液体置換体は免疫吸着性の表面を有することができる。これは、１の試薬から次の試薬へ渡される必要のあるアッセイ物質の部分、そして関連した操作を、感作された表面が中空のウェルの一部である場合に比べて、より取り扱いの容易なものとする。そのような液体置換体の代替的な形態は、毛の束又は好適な物質のリーフ、或いはこれに相当する大きな表面を有する物体である。さらなる代替的な形態はスタッド又はペグであって相対的に中空であって表面に突出した部分、例えば環状の溝のような、うね及び溝、を有するものである。そのようなアレンジメントは耐久性、増加した感作された表面、そしてより良い反応性をもたらす。
【００８７】
本発明の関連する実施態様によるテスト装置はしたがって１又はそれを越えるそのような形態の感作された液体−置換体のセットであって共通の操作バー、連結部又はふたに連結され、アッセイ中で使用される残りの物質を入れた相補的なウェルのセットと組み合わせて用いられるものを含むことができる。上記セットのいくつかの置換体は、１又は複数の異なるアッセイタイプを同時に実行できるように、同一又は異なる感受性を有することができる。仮に必要であれば、置換体は移動可能そして交換可能に操作バー、連結部又はふたに載せることができ、したがって目的とするパターンに従って、数多くのテストを実行するために目的とする特性を有するセットを、共通のストックから随意に作ることができる。
【００８８】
そのようなアレンジメントの１の有利性は、ウェルに一定分量の試薬を入れることの結果としての濃度の不安定な状態を回避しつつ、多数の置換体を、同じ液体試薬中で感作できることである。
【００８９】
この実施態様において、置換体は、共有結合又は吸着によって免疫吸着剤を調製するのに好適ないかなる物質で作ることもできる：例えばポリスチレン、ナイロン又はセルロースアセテートである。（置換体表面よりもむしろウェル表面の感作をすべき場合、置換体表面の性質はそれが不活性である限り、関係がない。）抗体、抗原などの置換体への結合はそれ自体既知の結合方法により実行することができ、例えばナイロン表面の部分的酸加水分解、露出したアミン表面のグルタルアルデヒドへの置換、及び結合する物質のカップリング、例えば抗体又は抗原の固定化されたアルデヒド基へのカップリングである。広く多様な好適な方法の中から例として、Ｉｎｍａｎ ＆ Ｈｏｒｎｂｙ （１９７２） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ， １２９， ２５５ ； Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ｈｏｒｎｂｙ ＆ Ｍｏｒｒｉｓ （１９７５） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ３８４， ３０７ ； Ｍａｔｔｉａｓｓｏｎ ＆ Ｎｉｌｓｓｏｎ （１９７７） Ｆ．Ｅ．Ｂ．Ｓ． Ｌｅｔｔｅｒｓ ７８， ２５１；及び英国特許明細書第１，４７０，９５５号及び同第１，４８５，１２２号を挙げる。
【００９０】
本発明はまた、特異的タンパク結合アッセイを実行するためのテスト物質のキットであって、以下の：
（ｉ）固相支持体に載せられた、本発明によるポリマー担体分子を含むテストされる炎症の指標の特異的な結合パートナーであって固定化されたもの、そして
（ｉｉ）本発明によるポリマー担体分子を含む、テストされる炎症の指標のマーカーが接合した特異的結合パートナーであってゆっくりと遊離される、又は試薬（ｉ）及び（ｉｉ）中の特異的結合パートナーが特異性の狭い抗体を含むために試薬（ｉ）及び（ｉｉ）がテストされる炎症の指標との結合反応において相互に干渉しないという条件下でいかなる形態でもよい、固定化された試薬（ｉ）と接触する反応液体に加えることのできる、前記パートナー、
を含む前記キットを提供することも可能であると考えられる。場合により上記キットはまたアッセイ中に固定化されたマーカーの量を後に推定するための物質を含むこともできる。
【００９１】
上記の通り、試薬（ｉ）は反応ウェルの置換体上又は反応ウェルの壁上のいずれに固定化することもできる。ゆっくりと遊離する形態の試薬（ｉｉ）も、上記の通り、例えば置換体又はウェルの壁のいずれかの相補的な表面上のショ糖又は同等の薄膜であることができる。特異性の狭い抗体は、例えば既に記載した方法でモノクローナル抗体から選択することができる。
【００９２】
米国特許第５，５０１，９４９（Ｍｕｒｅｘ ）号は、溶液中の分析物の検出方法及び定量の方法に関する。したがって、本発明は一の実施例において、１の方法であって以下のステップ：
（ａ）分析物を含んでいる最初の複合体、分析物に特異的な結合要素及び不溶性の粒子を含む懸濁液を形成するように、上記結合要素が結合した本発明による不溶性の粒子又はポリマー担体分子と溶液を接触させること；
（ｂ）半浸透膜であって、本発明による不溶性の粒子又はポリマー担体分子に相対的に容積のすき間を有し、本発明による不溶性の粒子又はポリマー担体分子が上記半浸透膜の厚みの全体に保持されるような厚みを有する前記半浸透膜の少なくとも１の部分に上記懸濁液を加え、上記粒子又はポリマー担体分子を保持している半浸透膜の部分がアッセイゾーンであること；
（ｃ）アッセイゾーンを有する半浸透膜を、好ましくは本発明による粒子又はポリマー担体分子に含まれその部分を形成する、ラベリング成分と接触させること、ここで、上記粒子又はポリマー担体分子はラベリング成分を含む第１複合体を含む第２複合体を形成するように特異的に第１複合体に結合することができ、第１複合体と結合しない上記ラベリング成分が上記半浸透膜のアッセイゾーンを通過することが可能であること；そして
（ｄ）第２複合体のラベリング成分により生成したシグナルを分析物の存在又は溶液中に存在する分析物の量の指標として測定すること、
を含む前記方法に関する。
【００９３】
米国特許第５，１５５，０２１号（ＥＡＳＴＭＡＮ ＫＯＤＡＫ ）は、単純ヘルペスウイルスの判定に有用な診断キットを開示する。したがって、本発明は１の実施態様において診断キットであって以下の：
ｉ）化学的又は生物学的物質から実質的にフリーであり、平均直径が約０．０１〜約１０マイクロメーターであるポリマー担体分子であって、粒子の表面積が約０．１〜約６００ｍ２／ｇ であり、粒子が炎症の指標の抗原をそこへ直接結合できるものである前記ポリマー担体分子；
ｉｉ）平均孔径サイズが約０．１〜約２０μｍである微小孔膜を含むディスポーザブルのテスト装置、そして
ｉｉｉ）本発明による炎症の指標に結合する抗体、
を含む前記キットに関する。
【００９４】
上記抗体は酵素でラベルされることができ、又はラベルされないこともできる、その場合には上記キットは前記炎症の指標に結合するラベルされた抗体をさらに含む。テスト装置は３のテストウェルを含み、各ウェルはポリアミドから調製した微小孔膜がその中にはめ込まれている。ポリマー粒子が前記テスト装置の微小孔膜上に−、粒子は水性の懸濁液中で添加される。微小孔膜は好適などの膜でもよく、例えば以下の商業的に入手可能なパッドから選ばれる。
Ｗｈａｔｍａｎ　ＧＦ／Ｄ
Ｗｈａｔｍａｎ　Ｆ１４７−１１
Ｗｈａｔｍａｎ　ＧＦ／ＡＶＡ
Ｗｈａｔｍａｎ　１４７−０２
Ｗｈａｔｍａｎ　ＧＦ／ＤＦＡ
Ｗｈａｔｍａｎ　Ｆ１４７−０９
Ｗｈａｔｍａｎ　Ｆ０７５−１７＊
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｒａｐｉｄ　Ｑ２４＊
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｒａｐｉｄ　Ｑ２７
Ａｈｌｓｔｒｏｍ　Ａ１４２
【００９５】
さらには、水性の懸濁液から液体を吸収するために吸収パッドを提供することができる。吸収パッドの例は、
Ｗｈａｔｍａｎ　Ｄ２８
Ｗｈａｔｍａｎ　１．５ＷＦ＊
Ｗｈａｔｍａｎ　３ＭＭ　ＣＨＲ
【００９６】
本発明に係るアッセイ装置及び診断方法のさらなる実施例は以下の：
アッセイ装置であって好ましくは以下の：
ｉ）感染及び／又は炎症の指標を含む体液サンプルを適用するゾーンであって、前記ゾーンが前記指標を結合することのできる少なくとも１の移動可能なレポーター種を含み、液体中の前記適用ゾーンが以下の：
ｉｉ）前記指標に結合した少なくとも１の前記レポーター種の存在、量又は濃度を検出するためのゾーンであって、前記ゾーンがさらに前記体液サンプル中に含まれる前記指標の少なくとも実質的な量を前記検出ゾーンに固定化するための結合種を含み、
に接触しており、そして場合により、
ｉｉｉ）少なくとも前記体液サンプルの一部を前記適用ゾーンから前記検出ゾーンに運ぶことを確認するための陽性コントロールを生成する陽性コントロールゾーン、
を含む前記アッセイ装置を含むがそれに限定されない。
【００９７】
サンプル適用ゾーンに含まれる少なくとも１のレポーター種は好ましくは、抗体であって少なくとも１のタグ、連結部又はマーカーであって、少なくとも前記マーカーの存在を検出することを可能とし、そして好ましくは前記指標に結合した前記抗体及び／又は前記レポーター種を定量的に検出することをも可能とする前記タグ、連結部又はマーカーを含む。
【００９８】
検出ゾーンの結合種は好ましくは抗体でもあるが、しかしこの抗体はどのタグ、ラベル又はマーカーも含むことができない。したがって、体液サンプル中に存在するマーカーの量を正確に反映する、定量的に検出可能なレポーター種の量を検出ゾーンに固定することが可能である。上記の用いられる少なくとも１のタグ、ラベル又はマーカーは、好ましくは例えば電磁放射線又は可視色の発生、及び例えば放射された電磁放射線の定量の両方の可視的な検出を可能とする。
【００９９】
移動可能なレポーター種は、例えば側方流デバイスに適用された場合、例えば固体の又は半固体の表面上を移動することのできるレポーター種を含むと理解されるべきである。
【０１００】
本発明のこの側面の１の実施態様においては、体液サンプル中に存在する感染及び／又は炎症の指標を検出するためのアッセイ装置が提供され、前記装置は以下の：
ｉ）体液サンプル適用のための開口部とテスト結果の観察のための開口部を有する中空のケーシング、
ｉｉ）前記サンプル適用のための開口部へ適用された前記体液サンプルを受けるための前記中空ケーシング中の、吸湿性の体液サンプルの受け入れ部分、
ｉｉｉ）前記ケーシング中の、ニトロセルロースのような乾性の多孔質担体を含み、前記吸湿性の体液サンプルの受け入れ部分から、前記テスト結果の観察のための開口部までそしてそれを越えて伸びるテスト条片であって、前記乾性の多孔質担体が前記観察のための開口部を通して観察可能なテスト結果ゾーンを有するもの、
ｉｖ）少なくとも１の前記吸湿性の体液サンプルの受け入れ部分及び前記テスト条片であって、前記テスト結果ゾーンの上流に前記指標と特異的に結合して第１複合体を形成することのできる検出可能なレポーター種を含むもの、
ｖ）染料ゾル、金属ゾル又は着色ラテックス微粒子のような少なくとも１の微粒子ラベル、及び場合により少なくとも１の蛍光性に検出可能なラベルであって、前記ラベルが前記体液サンプルによって可動性の形態に変えられる、を含む前記レポーター種、
ここで、前記テスト条片内の前記ラベルの可動性が、前記テスト結果ゾーンより上流の前記テスト条片の少なくとも１の部分をポリサッカライドを含む物質でコーティングすること、又は前記テストゾーンより上流の前記テスト条片の部分上で前記ラベルを前記テスト条片及び前記ラベル間の相互作用を減少させるのに効果的な量のポリサッカライドを含む物質の存在下で乾燥すること、のいずれかによって促進される。
ここで、前記乾性の多孔質担体は、前記テスト結果ゾーン中に前記第１複合体を結合するための手段を含み、前記結合手段は、前記テスト結果ゾーンに固定化された特異的な結合手段を含んでいる、
ここで、前記体液サンプルの前記吸湿性のサンプル受け入れ部分から前記乾性の多孔質担体中への、及びこれを通過する転位は、毛細管現象により、前記第１複合体を、前記第１複合体が前記結合手段によって第２複合体を形成する場である、前記テスト結果ゾーンの前記乾性の多孔質担体へ運搬する、そして
ｖｉ）前記テスト結果の観察のための開口部から観察可能な前記第２複合体の存在、量又は濃度を決定すること、を含む。
【０１０１】
他の実施態様においては、体液サンプル中の感染の及び／又は炎症の指標を検出するためのアッセイ装置が提供され、前記装置は、固相支持体上に少なくとも１の検出可能なレポーター種を含む固相支持体、少なくとも１の前記検出可能なレポーター種であって前記マーカーと結合可能なもの、可視的な微粒子の染料物質及び場合により蛍光性に検出可能なマーカーをも含むリポソーム又はマイクロカプセルをさらに含む前記レポーター種を含む。
【０１０２】
さらに他の実施態様においては、アッセイ装置であって、以下の：
ｉ）サンプル適用エリアであって、そこへ沈着した前記指標を結合することのできる抗体を含むレポーター種の所定の量を含む前記サンプル適用エリアであり、前記エリアが、
ｉｉ）反応ゾーンであって、前記指標を結合できる抗体を含む動員可能なレポーター種を含んでおり、前記レポーター種が少なくとも１の可視的に検出可能な微粒子及び／又は少なくとも１の蛍光性に検出可能な微粒子を含む、そして
ｉｉｉ）前記指標を結合可能な抗体を含む、レポーター種を含む検出ゾーン、
を含む前記アッセイ装置を提供し、
ここで、前記指標を含む前記体液サンプルが前記サンプル適用エリアに適用された場合、閾値の量の指標が前記抗体に結合し、これによって、反応ゾーンに存在する抗体に結合することが防止され、そして
ここで、前記体液サンプル中の結合せずに残っている指標がサンプル適用エリアから前記反応ゾーンを通って、通過し、前記反応ゾーンにおいては、上記指標は、前記動員可能なレポーター種であって以下の：
ｉ）前記指標を結合可能な抗体、そして
ｉｉ）少なくとも１の可視的に検出可能な微粒子及び／又は少なくとも１の蛍光性の検出可能な微粒子、を含み、そして
ここで、動員可能なレポーター種に結合した指標を検出ゾーンに接触させ、ここにおいて前記指標を結合可能な前記抗体を含む前記レポーター種に上記指標が結合し、
ここで前記指標の前記結合が、結果として、前記動員可能なレポーター種であってさらに以下の：
ｉ）前記指標を結合可能な抗体、そして
ｉｉ）少なくとも１の可視的に検出可能な粒子及び／又は少なくとも１の蛍光性に検出可能な粒子、
を含む前記レポーター種を固定化することとなる。
【０１０３】
本発明は、ターゲティング種、ラベリング種、そしてさらに一般的には分子種を採用する。本発明の前後関係において、“分子種”の用語は例えば：ラベル又はマーカー（例えば酵素、或いは蛍光性又はルミネッセントの種）として働く分子又はイオン性の種；又はターゲティング種として働く分子、すなわち１又はそれより多いターゲット分子、部分、レセプター又はエピトープに選択的又は特異的に結合できる分子（そのようなターゲティング種の例はハプテン又はハプテン接合体、抗原、抗体、ヌクレオチド配列及びホルモンである）を意味するように用いられる。１の特別な実施態様において、本発明はポリクローナル及びモノクローナル抗体を含む第１ターゲティング種及び第２ターゲティング種であって、それぞれ、ｉ）同一又は非同一であり、そしてｉｉ）同一又は異なる抗原決定基のエピトープであって本発明による炎症の指標に特徴的なものであることができる、前記第１及び第２ターゲティング種のどちらか一方又は両方に同時又は続けて使用することに関する。
【０１０４】
本発明による分子種は数多くの異なるタイプの物質の中に見い出され、その例は：フェリチン、フィコエリトリン、フィコシアニン又はフィコビリンのようなタンパク；西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホルファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ又はウレアーゼのような酵素；毒素；薬剤；染料；蛍光性の、ルミネッセントの、リン光性の又は他の発光物質；イミノ２酢酸、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ）又はデスフェロキサミンＢのような金属キレート物質；放射性同位体でラベルされた物質：又は重原子でラベルされた物質である。
【０１０５】
本発明による接合体中で多くの分子種がラベリング種として働くことができるであろう。ラベリング種の追加的な例をここで、直ちに以下に例記する。
ｉ）蛍光性の物質であって、例えばフルオレセイン（好適には、フルオレセインイソチオシアネート、ＦＩＴＣとして）、フルオレセイナミン、１−ナフトール、２−ナフトール、エオシン、エリスロシン、モリン、Ｏ−フェニレンジアミン、ローダミン及び８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸から選ばれる前記物質。
ｉｉ）適切な放射性同位体は、例えば水素（すなわちトリチウム、 ３Ｈ）、炭素（例えば１４Ｃ）、リン（例えば３２Ｐ）、イオウ（例えば３５Ｓ）、ヨウ素（例えば １３１Ｉ）、ビスマス（例えば ２１２Ｂｉ）、イットリウム（例えば９０Ｙ）、テクネチウム（例えば９９Ｔｃ）、パラジウム（例えば １０９Ｐｄのような）及びサマリウム（例えば １５３Ｓｍ）の放射性同位体中から選ぶことができる。
ｉｉｉ）適切な重原子は例えば、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｇａ、Ｉｎ、Ａｇ、Ａｕ、Ｈｇ、Ｉ、Ｂｉ、Ｙ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｅｕ及びＧｄの中から選ぶことができる。金（Ａｕ）は銀（Ａｇ）と組み合わせて促進剤として使用することができ、Ａｕは多くの場合、特別に有用な重原子である。
【０１０６】
分子種は、生物学的起源である物質に相補的な分子又は相補的な構造的領域と選択的に結合し、又は選択的に反応することができるターゲティング種の形態をとることもできる。適切なターゲティング種の例は、例えば：抗原；ハプテン；モノクローナル又はポリクローナル抗体；遺伝子プローブ；天然又は合成のオリゴ−又はポリヌクレオチド；一定の天然又は合成のモノ−、オリゴ−又はポリサッカライド；レクチン；アビジン又はストレプトアビジン；ビオチン；成長因子；ホルモン；レセプター分子；或いはプロテインＡ又はプロテインＧである。適切な抗体の例として、ここに挙げた実用例について言及する。適切なホルモンはステロイドホルモン（例えばエストロゲン、プロゲステロン又はコルチゾン）、アミノ酸ホルモン（例えばチロキシン）並びにペプチド及びタンパクホルモン（例えばバソプレシン、ボンベシン、ガストリン又はインシュリン）から選ぶことができる。
【０１０７】
本発明は、１の実施態様において所定の炎症の指標の検出のための標準的な免疫組織化学的又は細胞化学的検出方法、又はそのような方法の好適な変法を採用する。したがって、本発明は所定の炎症の指標の形態をとる、ターゲット抗原決定基と排他的に反応することのできる特異的な、いわゆる１次抗体と抗原決定基の免疫化学的反応により仲介された抗原決定基の認識に帰着するいかなるアッセイをも採用することができる。
【０１０８】
１次抗体は好ましくは検出可能なシグナルを直接的又は間接的に生成することのできる適切なラベルで標識される。上記ラベルは好ましくは酵素、同位元素、蛍光性の群又は金のような重金属である。
【０１０９】
他の実施態様においては、本発明は１次抗体と反応することのできる、特異的ないわゆる２次抗体との免疫化学的反応による１次抗体の検出を採用する。この場合、２次抗体は好ましくは酵素、同位元素、蛍光性の群又は金のような重金属のような適切なラベルで標識される。
【０１１０】
また別の実施態様においては、本発明はいわゆるリンカー抗体を所定の炎症の指標の検出手段として採用する。この実施態様は所定の炎症の指標の形態のターゲット抗原決定基と１次抗体との間の免疫化学的反応がもう１つの免疫化学的反応であって、１次抗体及び他の抗体であって免疫化学的反応を通じて、又は共有結合のカップリングその他同様の反応を通じて、酵素が結合するものの両方を同時に反応することのできる、特異的なリンカー抗体を含むものによって仲介されることを開発した。
【０１１１】
本発明によるまた別の実施態様においては、所定の炎症の指標の形態のターゲット抗原決定基と１次抗体の間の反応、又はその代わりに、１次抗体と２次抗体の間の反応を抗原及び抗体以外の相補的な分子の対の結合の方法で検出する。例えばビオチンとストレプトアビジンのような相補的な対が望ましい。この実施態様において、相補的な対のうちの１のメンバーが１次又は２次抗体に付着し、相補的な対のもう一方のメンバーは例えば酵素、放射性同位体、蛍光性の群又は金のような重金属のような好適なラベルと接触する。
【０１１２】
検出される所定の炎症の指標を潜在的に含むサンプルは好ましくは前記炎症の指標を検出することのできるラベルされた又はラベルされていない１次抗体を含むポリマー担体分子と接触させる。上記抗体は、上記サンプル中に含まれる所定の炎症の指標に免疫化学的に結合することとなる。上記炎症の指標はその後、前記炎症の指標を検出することのできる同一の又は別の、ラベルされた又はラベルされていない１次抗体を含む固相支持体に結合する。側方流デバイスを用いた場合、所定の炎症の指標に結合したラベルされた抗体を検出システムの選択に依存した好適な試薬と反応させることによって検出する。
【０１１３】
検出され、そして場合により定量もされる所定の炎症の指標を含むサンプルを本発明の１の実施態様において少なくとも１の以下に記載した検出反応に供する。検出反応の選択は、使用することを決定したラベリング種によるのと同様に問題のターゲティング種によって影響される。
【０１１４】
ラベリング種として酵素ラベルを用いた場合、上述の固相支持体に結合した炎症の指標を基質、好ましくは発色性の試薬、で処理する。上記酵素は基質と反応し、これが今度は、色のついた不溶性の沈着物を酵素のある場所の上またはその周囲に形成する。発色反応の形成はサンプル中の炎症の指標の存在の陽性の指標である。
【０１１５】
金のような重金属を用いた場合、サンプルを好ましくは、例えば銀又は類似の対照的指標を含む試薬の形態のいわゆるエンハンサーで処理する。銀金属は好ましくは、黒色の沈着物として金のある場所の上又はその周囲に沈澱する。蛍光性のラベルを用いた場合、発色試薬は通常は必要でない。
【０１１６】
その後にいくつかのサンプル構成成分が好ましくは好適な染料と反応して着色し、その結果、問題のラベリング種によって生じた色に対して望ましい対照をなすこととなる、少なくとも１の洗浄ステップを導入することは望ましいと言える。任意の最後の洗浄ステップの後、検体を、好ましくは検査のために耐久性の記録を保証するために透明の試薬でコートする。
【０１１７】
問題のラベリング種の検出は、好ましくは所定の炎症の指標の形態のターゲット抗原決定基の所在及びその量の双方の指標となる。検出は、可視的検査、酵素ラベルの場合には光学顕微鏡による検査、重金属ラベルの場合には光学又は電子顕微鏡による検査、蛍光性のラベルの場合には好適な波長の光照射を用いた蛍光顕微鏡による検査、そして同位元素ラベルの場合にはオートラジオグラフィーにより実施することができる。炎症の指標の存在−そして好ましくは上記指標の量も−の検出は、サンプルの可視的検査によることが好ましい。
【０１１８】
特に好ましい実施態様においては、可視的検出は、それより上では１の色が所定の最小量（限界点）より多い炎症の指標の存在を示し、それより下では別の色が、限界点により示された量よりも少ない量の炎症の指標の存在を示す、限界点に基づく。蛍光性のマーカーを使用する場合、検出される炎症の指標は、検出ユニットにより測定される蛍光と直接的に相関しうる。
【０１１９】
最初に抗原、ハプテン又は抗体の形態のターゲティング種による検出、そして続いて
−抗原又はハプテンが決定されるものである場合には−問題の抗原又はハプテンに特異的な抗体、又は
−抗体が決定されるものである場合には−問題の抗体に特異的な抗体
のいずれか一方と共有結合により共役又は接合するように連結した酵素という手段で、炎症の指標を直接検出する酵素免疫反応測定法（ＥＬＩＳＡ）が特に、本発明による所定の炎症の指標の検出に好ましい。
【０１２０】
好ましい実施態様において、検出される所定の炎症の指標を固相支持体のような適切な材料の表面に、例えば非共有結合の吸着により結合したいわゆる“捕捉”抗体と上記細胞を免疫化学的に接触させることによって結合又は固定化する。そのような固相支持体の材料の例はニトロセルロース又はポリスチレンのようなポリマーであり、場合によりスティック、テスト条片、ビーズ又はマイクロタイタートレイの形態である。
【０１２１】
商業的に入手可能なニトロセルロース膜は例えば：
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ ＨＦ０７５０４
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ ＨＦ０９００４
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ ＨＦ１２００４
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ ＨＦ１３５０４
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ ＨＦ１８００４
Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｕｎｉｓａｒｔ ＣＮ ４０
Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｕｎｉｓａｒｔ ＣＮ ９０
Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｕｎｉｓａｒｔ ＣＮ ２００＊
【０１２２】
好適な酵素と結合した特異的な抗体を、固定化した炎症の指標に結合させ、直接検出する。結合した特異的抗体の量、すなわち固定化された指標と相関しうるパラメーター、を結合した酵素のための基質として作用しうる物質を添加することにより決定する。基質の酵素的触媒作用により、例えば特徴的な色又は電磁放射源のような検出可能なシグナルが発生する。放射された放射線は、検出される所定の炎症の指標の量に相関−そして好ましくは比例−する。このタイプのアッセイに使用するための好ましい酵素の例は、例えば西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホルファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ及びウレアーゼのようなペルオキシダーゼである。
【０１２３】
ＥＬＩＳＡに類似するタイプの免疫組織化学的アッセイであるが他の検出手段を採用するものも、本発明による炎症の指標を直接検出するのに好適である。そのようなアッセイは、典型的には蛍光性の及びルミネッセントのラベリング種が共有結合で結合した特異的な抗体の使用に基づいている。いわゆる“時間分解された蛍光”アッセイは特別に好ましく、一定の他のランタニド種又はランタニドキレーターも採用することができるにもかかわらず、典型的にはユーロピウムイオンラベル又はユーロピウムキレーターを採用する。多くの伝統的な蛍光性のラベリング種とは対照的にランタニドキレーターの蛍光存続時間は一般的には１００〜１０００マイクロ秒の範囲内である。比較すると、フルオレッセインの蛍光存続時間はたった約１００ナノ秒又はそれより短い。パルス光源及び時間ゲート（ｔｉｍｅ−ｇａｔｅｄ）蛍光光度計を用いることによって、ランタニドキレート化合物を各励起後約２００〜６００マイクロ秒の時間ウィンドウ（ｔｉｍｅ−ｗｉｎｄｏｗ ）で測定することができる。この技術の主要な利点は、分析サンプル又は測定システム中に存在する他の物質の、より存続時間の短い蛍光から発生するバックグラウンドシグナルを減少させることである。
【０１２４】
免疫化学的検出技術を採用した本発明において開発されることのできる追加のアッセイは、例えば“ドットブロット”法及び“ウェスタンブロット”法のような“イムノブロッティング”法に属する。ウェスタンブロット法においては、これは、抗原ポリペプチド又はタンパクの分析及び同定に典型的に採用されているものであるが、対象である所定の炎症の指標を好ましくは、固相支持体或いは一枚のニトロセルロース又は炎症の指標が結合しうる化学的に処理された紙のような膜に移行又は固定する。結合はたとえば支持体に結合した抗原のようなターゲティング種によって仲介されうる。特異的な抗体の形態の適切なターゲティング種を、最初に加え、後に続いて第１抗体に対するラベルされた第２抗体を加える。ラベルは好ましくは放射性同位体、蛍光染料、酵素或いは金又はそのコロイドのような重金属である。炎症の指標の存在及び位置はここにおける上述のような適切な方法で検出する。
【０１２５】
ここで用いられる“連結部分”とは、分子種とポリマー担体分子を結合させることによって接合体を形成することのできるいかなる化学種をも意味する。ポリマー担体分子上のジビニルスルホンの誘導体である、共有結合で結合した反応性のある部分の確立、及び一方ではそのような部分の、またもう一方ではここで定義された分子種間の共有結合の確立は、本発明の１の実施態様に関して特別に好ましいものである。
【０１２６】
連結部分、又は反応性のある官能基の追加の例は、反応性の化合物群として例えば４−フルオロ−３−ニトロフェニルアジド、ベンゾイルアジド及びｐ−メチルベンゾイルアシドのようなアシルアジド、エチルアジドホルメート、フェニルアジドホルメートのようなアジドホルメート、ジフェニルホスホリルアジド及びジエチルホスホリルアジドのようなホスホリルアジド、ジアゾアセトフェノン及び１−トリフルオロメチル−１−ジアゾ−２−ペンタノンのようなジアゾ化合物、ｔ−ブチルジアゾアセテート及びフェニルジアゾアセテートのようなジアゾアセテート、ｔ−ブチルアルファジアゾアセトアセテートのようなベータ−ケト−アルファジアゾアセテート、アゾビスイソブチロニトリルのような脂肪族アゾ化合物、３−トリフルオロメチル−３−フェニルジアジリンのようなジアジリン、ケテン及びジフェニルケテンのようなケテン（−ＣＨ＝Ｃ＝Ｏ）、ベンゾフェノン及びアセトフェノンのような光活性化可能なケトン、ジ−ｔ−ブチルペルオキシド、及びジシクロヘキシペルオキシドのようなペルオキシ化合物、ジベンゾイルペルオキシド及びジアセチルペルオキシドのようなジアシルペルオキシド並びにエチルペルオキシベンゾエートのようなペルオキシエステルを含む化学種である。
【０１２７】
反応性の官能基であるビニル基の場合、例えばジビニルスルホンのような化学種の中のビニル基の反応性が、ポリマー担体、すなわち例えばジビニルスルホンのビニル基が共有結合を形成するようにそれと反応する群、の反応性の機能として一般的に要求するのは求核付加機能である。
【０１２８】
そして、好適なポリマー担体は例えば、ポリマー担体であって、以下のような官能基：
ｉ）Ｏ− （例えばポリペプチド又はタンパクのチロシン残基中の脱プロトン化された芳香性のヒドロキシ基のような脱プロトン化されたフェノール性のヒドロキシ基）、
ｉｉ）Ｓ− （例えばポリペプチド又はタンパクのシステイン残基中の脱プロトン化されたチオール基のような、芳香族の環又は脂肪族群上の脱プロトン化されたチオール基）、
ｉｉｉ）ＯＨ（例えばオリゴ−又はポリサッカライド中のグルコース又は他のモノサッカライド環のような糖の環上の脂肪族のヒドロキシ基；又はポリエチレングリコールのようなポリオール中のアルコール性のヒドロキシ基；或いはセリン又はトレオニン残基のようなポリペプチド又はタンパクの一定のアミノ酸残基）、
ｉｖ）ＳＨ（例えばポリペプチド又はタンパク中のシステイン残基中のチオール基）、１次アミノ基（例えばポリペプチド又はタンパク中のオルニチン残基又はリジン残基中；又はキトサンのような一定のポリサッカライド又はその誘導体中のアミノ−置換された糖の環中）又は２次アミノ基（例えばポリペプチド又はタンパク中のヒスチジン残基中）
を有する前記ポリマー担体である。
【０１２９】
したがって、本発明の前後関係における分子種上の問題の官能基は通常は上述のタイプのうちの１の求核付加機能のような求核付加機能でもあるだろう。
【０１３０】
本発明は１の実施態様において、１又はそれを越える分子種がそれぞれ、連結基（ｌｉｎｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）の形態の部分を介して共有結合で結合するポリマー担体分子を含む接合体を含むキットに関する。
【０１３１】
１のタイプの好ましい連結基はジビニルスルホンに由来する。この場合、連結基のポリマー担体分子への結合は、ジビニルスルホン分子の２のビニル基の１と担体分子上の反応性の機能性との間に形成された共有結合により生成し、分子種の連結基への結合は、ジビニルスルホン分子に由来する他のビニル基と分子種上の官能基との間の共有結合を介する。
【０１３２】
本発明による後者のタイプの特に興味深い接合体においては、ポリマー担子分子は、そこへ共有結合で結合した１又はそれを越えるジビニルスルホン由来の部分をさらに有し、各部分は、ジビニルスルホン分子の２のビニル基の１とポリマー担体分子上の反応性の機能性との間に形成された共有結合を介して結合し、そのような部分の少なくとも１は、その結合状況において、残りのフリーのビニル基を有し、フリーのビニル基に対して反応性のある官能基を有するさらなる分子種と反応可能である。
【０１３３】
本発明による接合体に結合した分子種は例えば約２０００又はそれより小さい分子量を有する分子種と約２０００又はそれより大きな分子量を有する分子種とに分割することができる。前者の場合、接合体のポリマー担体分子は共有結合でそこへ結合した１〜約１０，０００の分子種を有することができ、例えば約１０〜約１０００の分子種、例えば約２０〜約５００の分子種が共有結合でそこへ結合する。後者の場合、すなわち２，０００又はそれより大きい分子量の分子種については、接合体のポリマー担体分子は共有結合でそこへ結合した１〜約１０００の分子種を有することができ、例えば１〜約５００の分子種、例えば１〜約１００、２〜約５０、約１０〜約５０の分子種がそこへ共有結合で結合する。
【０１３４】
本発明による“ポリマー担体分子”は、分子種を結合することができ、又は分子種を結合する目的での修飾の可能な、いかなるポリマーでもある。ポリマー担体分子及び本発明によるそのようなポリマー担体分子を含む接合体又は、以下の：
ｉ）その誘導体同様に天然及び合成のポリサッカライドであって、例えばデキストラン及びデキストラン誘導体；スターチ及びスターチ誘導体、セルロース誘導体、アラビアゴム及びアルギン酸塩のような一定の天然ゴム及びその誘導体と同様にアミロース並びにペクチン；
ｉｉ）ポリリジン、ポリヒスチジン又はポリオルニチンのような好適な反応性の機能性を有するホモポリ（アミノ酸）；
ｉｉｉ）ウシアルブミン及び他の哺乳動物のアルブミンのような、天然及び合成のポリペプチド及びタンパク；そして
ｉｖ）ポリビニルアルコール、ポリアリルアルコール、ポリエチレングリコール及び置換ポリアクリレートのような、求核付加性の官能基を有する合成ポリマー、
を含む広く多様なポリマーから選ぶことができる。
【０１３５】
本発明の目的のための好ましいポリマー担体分子の１の群はポリサッカライド及びその誘導体であって、例えば：デキストラン、カルボキシ−メチル−デキストラン、ヒドロキシエチル−及びヒドロキシプロピル−スターチ、グリコーゲン、アガロース誘導体、及びヒドロキシエチル及びヒドロキシプロピル−セルロースである。
【０１３６】
デキストランは、本発明との関係において特に好適なポリマーであることが判明しており、そしてデキストランは現在最も好ましいポリマーの１の群の代表である。
【０１３７】
本発明による接合体は、好ましくは実効電荷を有さない、なぜなら正又は負の実効電荷の存在は、中でも、関心事である物質及び／又は材料以外の物質及び／又は材料の接合体への望ましくない非特異的結合につながるからである。電荷のある分子種が導入されない限り、多くの場合においてポリマー担体分子自体が実効電荷を持たないということを保証することによって、この条件は単純に満たされるであろう。本発明のさらなる実施態様においては、本発明の試薬中のポリマー担体分子又は接合体は、その遊離の状態において実質的に直線的であり、約４〜約１０の範囲のｐＨにおいて実質的に荷電していない。このｐＨ間隔は、広く大多数の免疫化学的方法、ハイブリダイゼーション方法、及び特に、本発明の接合体の他の適用に実際的な関連のあるものである。多様なポリマーの中で、この基準に適合するのは、例として数多くのポリサッカライド及びポリサッカライド誘導体、例えばデキストラン及びヒドロキシエチル−及びヒドロキシプロピルセルロースである。
【０１３８】
本発明の試薬又は接合体の使用のいかんによって、本発明の接合体は、分子量がやや小さいものから非常に大きいものまでの範囲にあるポリマー担体分子に基づくことができる。本発明のさらなる実施態様において、上記ポリマー担体分子は約１，０００〜約４０，０００，０００の範囲の分子量ピークを有することができる。
【０１３９】
重要な関心事である分子量ピークは約１，０００〜約８０，０００の範囲、及び約８０，０００〜約２，０００，０００の範囲にある。特別な関心事である分子量ピーク、特にポリマー担体がデキストランである場合は約５００，０００の分子量ピークである。
【０１４０】
ここで採用される“分子量ピーク”（“平均分子量ピーク”とも表される）という用語は、最も量的に多い分子量、すなわちポリマーの特定のサンプル又はバッチ中でもっとも多数の分子が有する分子量（分子量の分布の中で）を表す。（特に、最も大きな分子量についての）非常に狭い分子量分布のポリマー分画を得ること又は調製することの困難性のために、このやり方で数多くのタイプのポリマーを特徴づけることはかなり正常なことである。本発明の前後関係において関心事である数多くの商業的に入手可能なポリマーの場合、製造者又は配給者は、特別なタイプの試薬または接合体を調製するのに好適なポリマー分画を選ぶ基礎を提供する、信頼性のある（例えば、ゲル浸透クロマトグラフィーにより決定された）分子量ピークデータを提供することができるだろう。
【０１４１】
ここで引用した分子量ピークは、問題の遊離のポリマーの分子量ピークを示し、例えば２又はそれを越えるポリマーが、例えば本発明に従って本発明の試薬又は接合体を調製する過程でジビニルスルホンと反応することによって、クロスリンクする結果として可能なクロスリンクしたポリマーユニットを考慮するものではない；そのようなクロスリンクしたユニットは、概してそれらがそこから生成した個々の遊離のポリマー分子よりも大きな分子量を有するであろう。
【０１４２】
本発明による接合体は、ポリマーの分子量ピーク及び遊離の反応性のビニル基の含量に関して、非常に広範囲の要求に適合するように調製されることができる。本発明のさらなる側面は、約５００，０００又は約２，０００，０００の分子量ピークを有するポリマー担体分子、又は以下のいずれかの範囲内の分子量ピークを有するポリマー担体分子を含む接合体に関する；約１０００〜約２０，０００；約２０，０００〜約８０，０００；約８０，０００〜約５００，０００；約５００，０００〜約５，０００，０００；及び約５，０００，０００〜約４０，０００，０００；
【０１４３】
ポリマー担体分子は、以下のサブ範囲（ポリマー担体１ｇあたりのビニル基のμｍｏｌ であらわされる）におけるように、好ましくは遊離の反応性のビニル基をポリマー担体１ｇあたり約１〜約５，０００μｍｏｌ のビニル基を含有する：約１〜約５０；約５０〜約３００；約３００〜約１，０００；及び約１，０００〜約５，０００。
【０１４４】
本発明のさらなる実施態様においては、接合体を含むキットであって、上記接合体がポリマー担体であって以下の：
ｉ）分子量ピークが約５００，０００又は約２，０００，０００、又は以下のいずれかの範囲内：約１，０００〜約２０，０００；約２０，０００〜約８０，０００；約８０，０００〜約５００，０００；約５００，０００〜約５，０００，０００；又は約５，０００，０００〜約４０，０００，０００；に分子量ピークを有し、そして、
ｉｉ）分子種の総含量、そして、適切には、ａ）分子種約１〜約５，０００μｍｏｌ の範囲内のビニル基、そして、適切には、ｂ）ポリマー担体１ｇあたりのビニル基をμｍｏｌ で以下のいずれかのサブ範囲内（ポリマー担体１ｇあたりの分子種のμｍｏｌ に加えて、適切にはビニル基のμｍｏｌ であらわされる）：約１〜約５０；約５０〜約３００；約３００〜約１，０００；又は約１，０００〜約５，０００、
を有するものを含むものが提供される。
【０１４５】
本発明によるサンプルは好適には結膜液、鼻からの分泌液、咽頭からの分泌液、痰、洗口液、気管支洗浄液、頚管及び膣分泌液、尿、血液、大便、滑液、脳脊髄液、腹水、小胞、外傷浸出液及び、例えば潰瘍又は結膜からのスワブ（ｓｗａｂ）である。
【０１４６】
本発明による、炎症のメディエーターを含む炎症の指標は、以下の：
例えばＩＬ−１システムのような炎症性のシステムに属するサイトカインを含むサイトカイン及び自己抗体、；
ＩＬ−１α及びＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、並びにＩＬ−１α、ｓＩＬ１−ＲＩ及びｓＩＬ１−ＲＩＩに対する自己抗体を含むＴＮＦαシステム、；
ｓＴＮＦＲｐ５５及びｐ７５を含むがこれに限定されないＴＮＦαアンタゴニスト、並びにＩＬ−６そしてＩＬ−６に対する自己抗体、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスに関係したメディエーターのような免疫調節システムに属するサイトカイン：ＩＬ−１２、ｓＩＬ−４Ｒ、Ｔｈ１サイトカイン：ＴＮＦβ（ＬＴ）、ＩＮＦγ、Ｔｈ２サイトカイン：ＩＬ−４、ＩＬ−１０、そして例えばＩＬ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８、ｓＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−１８、ＩＦＮα及び好酸性のカチオン性のタンパク、
から成る群から選ばれるが、しかしこれらに限定されない。
【０１４７】
以下に列記したサイトカインは本発明による１の好ましい炎症の指標の群をあらわす。
【表１】
2004511802.tif 000003
【表２】
2004511802.tif 000004
【表３】
2004511802.tif 000005
【表４】
2004511802.tif 000006
【表５】
2004511802.tif 000007
【表６】
2004511802.tif 000008
2004511802.tif 000009
【０１４８】
特別には本発明はサイトカインαのプロフィール、すなわち例えば少なくとも４のサイトカインであるような少なくとも２のサイトカインの測定、それによって各サイトカインの存在及び相対的濃度が疾病又は疾病の予後の表示となることのできる前記サイトカインのプロフィールを提供するために用いられることができる。
【０１４９】
さらには、上記炎症の指標は、自己抗体のような免疫システムの指標を含むことができる。本発明によって、免疫疾患に関連した自己抗体又は免疫疾患に関連した症状を検出し、定量することができる。
【０１５０】
好ましい実施態様において、上記自己抗体は、診断される疾患に関連して以下に示した自己抗体から選ばれるが、しかしこれらに限定されない。
【表７】
2004511802.tif 000010
【表８】
2004511802.tif 000011
【表９】
2004511802.tif 000012
【０１５１】
自己抗体の検出は自己免疫疾患のような免疫システムに関連した症状の診断又は自己免疫疾患を患う危険性の指標に用いることができる。選ばれた自己抗体と疾患との間の相関関係は先の表に図解する形態で列挙されている。上記リストは、上記発明を一定の自己抗体及び疾患に限定するものであると考えるべきではない。
【０１５２】
本発明の１の実施態様において、上記炎症の指標はプリオンのような炎症性のタンパク粒子である。プリオンという用語はＰｒＰ−Ｓｃタンパクを含む。ＰｒＰ−Ｓｃタンパクは、正常の哺乳動物のシアロ糖タンパク質ＰｒＰ−Ｃの翻訳後の修飾から結果として生じた不溶性のプロテアーゼ耐性の糖タンパクである。ＰｒＰ−Ｓｃ及びＰｒＰ−Ｃの両者ともＰｒＰ遺伝子によりコードされる。
【０１５３】
本発明の範囲内にある炎症性のタンパク粒子は、通常、伝染性海綿状脳症（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｉｅｓ （ＴＳＥｓ））と命名される、致命的な神経変性異常の異種性の群の指標となることができる。ＴＳＥｓは、ＰｒＰ−Ｃタンパクの感染性の形態であるプリオンタンパクの、感染した個体の中枢神経系における沈着に特徴づけられる。
【０１５４】
本発明の目的の範囲内で伝染性海綿状脳症は、ヒツジ及びヤギにおけるスクレイピー、ウシにおけるウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、ミュールジカ及びヘラジカにおける慢性の萎縮病（ＣＷＤ）、ミンクにおける伝染性ミンク脳症（ＴＭＥ）、ネコにおけるネコ海綿状脳症（ＦＳＥ）、ヒトにおけるクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ヒトにおけるゲルストマン−ストラウスラー−シャインカー症候群（Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＧＳＳ））、ヒトにおける致死的な家族性インソムニア（ＦＦＩ）又はヒトにおけるクールー病を含むが、これらには限定されない。
【０１５５】
伝染性の海綿状脳症の検出は、ヒト、ウシ、ミンク、ネコ、ヤギ、ミュールジカ、ヘラジカ及びヒツジを含む多様な動物から得られたサンプルについて行うことができる。そのようなサンプルは脳又は中枢神経系からのサンプル或いは体液サンプルのような組織サンプルであることができる。
【０１５６】
多様な種のＰｒＰ−Ｓｃを特異的に認識するモノクローナル抗体は、当業者において知られている。例として米国特許第６１６５７８４号は、ヒツジ、ウシ、ミュールジカ、及びヘラジカからのＰｒＰ−Ｓｃタンパク上の保存されたエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体について記載する。
【０１５７】
さらには、本発明による上記キットは、関連するサイトカインと組み合わせて自己抗体を検出するのに好適であることができる。
【０１５８】
したがって、本発明によって、炎症の指標を定性的にかつ定量的に検出すること、そして広く多様な疾患及び症状を迅速に診断する手段として炎症の指標のプロフィールを提供することが可能である。
【０１５９】
本発明による診断方法は、１の実施態様において、炎症の指標を検出することにより得られた定性的かつ定量的なデータの使用を含む。そのようなデータ及び方法は以下の：放線菌症、アデノウイルス感染症、アントラックス（Ａｎｔｒａｘ）、細菌性の赤痢、ボツリヌス中毒、例えばブルセラ・メリテンシス（Ｂ． ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、及びブルセラ・シュイス（Ｂ． ｓｕｉｓ）によりひき起こされるブルセラ症（バング病）、カンジダ症、蜂窩織炎、軟性下疳、コレラ、コクシジウム症、急性無熱性結膜炎、嚢子、皮膚糸状菌症、細菌性心内膜炎、喉頭蓋炎、丹毒、類丹毒、胃腸炎、陰部ほう疹、Ｇｒａｎｄｕｌａｅ淋疾、ウイルス性肝炎、ヒストプラズマ症、膿痂疹、マラリア、単核球症、インフルエンザ、在郷軍人病、レプトスピラ症、ライム病、類鼻疽、髄膜炎、ノカルジア・アステロイデスノカルジア症、非淋菌性の尿道炎、ピンタ、肺炎球菌性肺疾患、灰白髄炎、原発性肺感染症、偽膜性全腸炎、抗体物質に関連した産褥セプシス、狂犬病、回帰熱リューマチ熱、ロッキー山脈斑点熱（Ｒｏｃｋｙ Ｍｏｕｎｔａｉｎ ｓｐｏｔｔｅｄ−ｆｅｖｅｒ）、風疹、はしか、ブドウ球菌性熱傷様症候群、連鎖球菌性咽頭炎（ｓｔｒｅｐ ｔｈｒｏａｔ）、梅毒、破傷風、毒物ショック症候群、トキソプラズマ症、結核、野兎病、腸チフス熱、チフス、膣炎、水痘、いぼ、百日咳、フランベシア（イチゴ腫）及び黄熱病
から成る群から選ばれた感染性の症状、しかしこれらには限られない、を患う個体を迅速に診断及び／又は同定する手段として、炎症の指標のプロフィールを提供する。
【０１６０】
また、上記診断方法は、免疫疾患、自己免疫疾患及び他の炎症性の疾患及び症候群から成る群から選ばれた症状を患う個体を同定することができるかも知れない、例として先の表を見ること。
【０１６１】
実施例１
サンプル中のサイトカインを検出するためのディップスティック
機能的側方流アッセイにおける赤いスポットのように鮮明に可視的に検出できるシグナルの出現によって上記サイトカインを鮮明に検出することができる、サンプル中のサイトカインの検出のためのディップスティックが開発された。
テストされる抗原は、商業的に入手可能なサイトカインである（ＩＮＦｘ）。
【０１６２】
いわゆる捕捉抗体である、ＩＮＦｘに対して作成されたターゲティング種としてのモノクローナル抗体であってディップスティック上の固相表面に結合したものを用いた。
【０１６３】
レポーター種は、約５００，０００Ｄａであり、そこへ反応性のジビニルスルホン基が共有結合で結合したポリデキストランのポリマー担体分子をさらに含むものであった。さらに、上記レポーター種はまた、ジビニルスルホン基を介して結合したローダミンラベル分子を含んでいた。
【０１６４】
レポーター種のテストのために図１に概略をあらわした原理にしたがって、２層側方流テストを採用した。図１は、サンプル中のＩＮＦｘ細胞の検出テストのためのアッセイに用いられる模式的なディップスティックをあらわす。上記ディップスティックはレポーター種を含むサンプルのためのアプリケーションゾーンを含む。接合体という用語はレポーター種を意味する。さらに、上記ディップスティックは、捕捉抗体がそこへ結合する１のゾーン及びコントロール抗体がそこへ結合する第２のゾーンを含む。上記ディップスティックはニトロセルロース（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｕｎｉｓａｒｔ ＣＮ ２００）及びＷｈａｔｍａｎ ＦＯ ７５−１７又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｒａｐｉｄ Ｑ２４ の微小孔膜、及び吸収パッド（Ｗｈａｔｍａｎ １， ５ ＮＦ）で作成される。
【０１６５】
レポーター種に含まれるターゲティング抗体に対して特異的な２次抗体を捕捉抗体として用いた。この側方テストでは、陽性の赤いスポットであって以下の：
１）ターゲティング抗体がポリデキストラン担体に結合した；
２）ポリデキストラン担体が良好な流動特性を有する、
を示した前記スポットが現れた。さらに、バックグラウンド／非特異的結合をおこすものはなかった。
【０１６６】
テストが陽性の場合、視覚的に可視の赤いスポットが現すように上記テストを開発した。このスポットはレポーター種に結合したローダミンの蓄積により生成した。テストにおける陽性の結果はサンプルがＩＮＦｘを含んでいることと定義する。視覚的に色の変化のない（赤いスポットの現れない）陰性の結果は、実質的にＩＮＦｘを用いない場合に得られた。
【０１６７】
上記テストは１−ステップテストであり、ここでサンプルをディップスティックに直接的に適用し、その後テスト結果が現れた。上記テストを１−ステップテストとして実施した場合、初めてフローテスト上に現れる色の反応はわずか１〜３分後である。テストは約５分後に終了する。
【０１６８】
尿中の抗原とは独立にレポーター種に結合するコントロール抗体もまた、コントロールゾーン内のディップスティックの固相表面に結合させた。テストが正確に実施されていたか否かの指標として、テスト中で陰性の尿又は陽性の尿のいずれが用いられたかにかかわらず、赤いスポットが毎日現れた。このコントロールスポットの赤い色もまた、レポーター種に結合したローダミンの蓄積により生成したものである。
【０１６９】
さらには、赤いスポットのかわりに膜を横切る赤にテストラインが現れるようにディップスティックが開発され、テスト結果及びコントロールを観察するためのものである（図２）。色の強さは、テストスポットに比較してテストラインにおいて増加していることがしばしば観察される。
【０１７０】
実施例２
競合的ディップスティック
本実施例において、陰性のシグナルが色の変化として示されるにもかかわらず陽性のシグナルが色の変化のないものとして示される、実施例１に記載されたディップスティックと同様のディップスティックを競合的ディップスティックとして作製した。
【０１７１】
レポーター種の量は陰性のサンプルにのみ現れた赤いスポット（ローダミンの可視的な蓄積）のような方法で滴定した。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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