(57)【要約】本発明は、C型肝炎ウイルス（HCV）cDNAを基にした培養システムに関するもので、このシステムは細胞培養中での感染性HCVの合成、およびウイルスの細胞間伝播を可能にする。本発明はまた、肝細胞中でのHCV感染のレベルを測定する方法にも関連する。また、HCV活性のモジュレーターを同定する方法、およびHCV活性をモジュレートする方法も提示する。本発明は、ウイルスゲノムの遺伝学的解析、および新規抗ウイルス戦略の開発の両方に対して信頼性のあるシステムを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養から細胞培養培地を調製する工程を含む、C型肝炎ウイルス（HCV）を作製するための培養システムであって、該細胞培養は、細胞にトランスフェクションを行うのに適した条件の下で、HCVをコードする核酸配列およびRNAポリメラーゼをコードする核酸配列を肝細胞にトランスフェクトして製造され、トランスフェクション後の該細胞培養培地はHCVを含有する、培養システム。
【請求項２】
細胞培養培地をトランスフェクトされていない肝細胞へ暴露する工程をさらに含み、暴露後にトランスフェクトされていない肝細胞からHCVが分泌される、請求項1記載の培養システム。
【請求項３】
トランスフェクトされていない肝細胞を、トランスフェクトされた細胞と共培養する、請求項2記載の培養システム。
【請求項４】
細胞培養培地を分離する工程をさらに含む、請求項1または2記載の培養システム。
【請求項５】
HCVをコードする核酸配列およびRNAポリメラーゼをコードする核酸配列が単一のプラスミド中にある、請求項1記載の培養システム。
【請求項６】
HCVをコードする核酸配列が第一のプラスミドに含まれ、RNAポリメラーゼをコードする核酸配列が第二のプラスミド中にある、請求項1記載の培養システム。
【請求項７】
肝細胞にNS3およびNS5Bをコードする核酸配列をトランスフェクトする工程をさらに含む、請求項1記載の培養システム。
【請求項８】
HCVをコードする核酸配列、RNAポリメラーゼをコードする核酸配列、ならびにNS3およびNS5Bをコードする核酸配列が単一のプラスミド中にある、請求項7記載の培養システム。
【請求項９】
HCVをコードする核酸配列、RNAポリメラーゼをコードする核酸配列、ならびにNS3およびNS5Bをコードする核酸配列が一つより多いプラスミドに含まれる、請求項7記載の培養システム。
【請求項１０】
肝細胞がヒト組織に由来する、請求項1または2記載の培養システム。
【請求項１１】
肝細胞が肝細胞癌細胞である、請求項10記載の培養システム。
【請求項１２】
細胞がHuh-7、HepG2、C3A、またはPLCである、請求項11記載の培養システム。
【請求項１３】
HCVがタイプ1a HCVまたはタイプ1b HCVである、請求項1記載の培養システム。
【請求項１４】
RNAポリメラーゼがT7 RNAポリメラーゼである、請求項1記載の培養システム。
【請求項１５】
HCVをコードする核酸配列がRNAポリメラーゼにより活性化されるプロモーターを含む、請求項1記載の培養システム。
【請求項１６】
プロモーターがT7、SP6、またはQBである、請求項15記載の培養システム。
【請求項１７】
培養システム中の細胞の細胞表面に発現するHCV特異的タンパク質の量を測定する工程を含む、請求項1記載の培養システムにおいてHCVに感染した肝細胞の感染レベルを測定する方法。
【請求項１８】
HCV特異的タンパク質がコア、E1、E2、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、またはNS5Bである、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
以下の工程を含む、HCVの吸着、貫入、被包、放出、複製、翻訳、またはタンパク質プロセシングのモジュレーターを同定する方法：
a) 試験化合物を請求項1記載の培養システムに接触させる工程；および
b)試験化合物を接触させない時の培養システムと比較した場合に、HCVの吸着、貫入、被包、放出、複製、翻訳、またはタンパク質プロセシングにおける亢進または低下により、試験化合物をモジュレーターであると同定する、亢進または低下を検出する工程。
【請求項２０】
低下が検出され、モジュレーターがHCVの吸着、貫入、被包、放出、複製、翻訳、またはタンパク質プロセシングの阻害剤である、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
亢進が検出され、モジュレーターがHCVの吸着、貫入、被包、放出、複製、翻訳、またはタンパク質プロセシングの活性化剤である、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
HCVの吸着、貫入、被包、放出、複製、翻訳、またはタンパク質プロセシングにおける亢進または低下の検出を、培養システム中の細胞の細胞表面上のHCV特異的タンパク質の発現レベルを測定することによって行う、請求項19記載の方法。
【請求項２３】
HCV特異的タンパク質がコア、E1、E2、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、またはNS5Bである、請求項20記載の方法。
【請求項２４】
請求項19記載の方法によって同定されるモジュレーター。
【請求項２５】
HCVを含有するサンプルを請求項24記載のモジュレーターと接触させる工程を含む、HCVの吸着、貫入、被包、放出、複製、翻訳、またはタンパク質プロセシングをモジュレートする方法。
【請求項２６】
請求項1記載の培養システムのHCVに感染したトランスフェクトされた肝細胞を含むキット。
【請求項２７】
請求項19記載の方法により同定されたモジュレーターおよび薬学的に許容されるキャリアーを含む薬学的組成物。
【請求項２８】
モジュレーターがタンパク質である、請求項27記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
モジュレーターが核酸分子である、請求項27記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
モジュレーターがペプチド、擬似ペプチド、または他の低分子である、請求項27記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
請求項19記載の方法により同定されたモジュレーターの投与を含む、HCV感染組織またはウイルス関連組織線維症を診断、モジュレート、または治療する方法。
【請求項３２】
モジュレーターがタンパク質である、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
モジュレーターが核酸分子である、請求項31記載の方法。
【請求項３４】
モジュレーターがペプチド、擬似ペプチド、または他の低分子である、請求項31記載の方法。
【請求項３５】
細胞培養から細胞培養培地を調製する工程を含む、C型肝炎ウイルス（HCV）を作製するための方法であって、該細胞培養は、細胞にトランスフェクションを行うのに適した条件の下で、HCVをコードする核酸配列およびRNAポリメラーゼをコードする核酸配列を肝細胞にトランスフェクトして製造され、トランスフェクション後の該細胞培養培地はHCVを含有する、C型肝炎ウイルス（HCV）を作製するための方法。
【請求項３６】
細胞培養培地をトランスフェクトされていない肝細胞へ暴露する工程をさらに含み、暴露後にトランスフェクトされていない肝細胞からHCV が分泌される、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
トランスフェクトされていない肝細胞を、トランスフェクトされた細胞と共培養する、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
細胞培養培地を分離する工程をさらに含む、請求項35または36記載の方法。
【請求項３９】
HCVをコードする核酸配列およびRNAポリメラーゼをコードする核酸配列が単一のプラスミド中にある、請求項35記載の方法。
【請求項４０】
HCVをコードする核酸配列が第一のプラスミドに含まれ、RNAポリメラーゼをコードする核酸配列が第二のプラスミド中にある、請求項35記載の方法。
【請求項４１】
NS3およびNS5Bをコードする核酸配列を肝細胞へトランスフェクトする工程をさらに含む、請求項35記載の方法。
【請求項４２】
HCVをコードする核酸配列、RNAポリメラーゼをコードする核酸配列、ならびにNS3およびNS5Bをコードする核酸配列が単一のプラスミド中にある、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
HCVをコードする核酸配列、RNAポリメラーゼをコードする核酸配列、ならびにNS3およびNS5Bをコードする核酸配列が一つより多いプラスミドに含まれる、請求項41記載の方法。
【請求項４４】
肝細胞がヒト組織に由来する、請求項35または36記載の方法。
【請求項４５】
肝細胞が肝細胞癌細胞である、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
細胞がHuh-7、HepG2、C3A、またはPLCである、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
HCVがタイプ1a HCVまたはタイプ1b HCVである、請求項35記載の方法。
【請求項４８】
RNAポリメラーゼがT7 RNAポリメラーゼである、請求項35記載の方法。
【請求項４９】
HCVをコードする核酸配列がRNAポリメラーゼにより活性化されるプロモーターを含む、請求項35記載の方法。
【請求項５０】
プロモーターがT7、SP6、またはQBである、請求項49記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般的にはウイルス学の分野、さらに具体的には組織培養システムにおけるC型肝炎ウイルス（HCV）の作製に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
C型肝炎ウイルス（HCV）は、感染個体中、高い割合で慢性感染を成立させ、肝硬変および肝細胞癌を含む進行性肝疾患に関連する。インターフェロンアルファおよびリバビリン（ribavarin）などの抗ウイルス薬がHCV感染をコントロールする効果は、これまでのところ限定的なものである。その結果、米国ではHCV感染が肝移植の主因になっている。HCVはエンベロープを有するウイルスで、プラス極性の一本鎖RNAゲノム（約9500塩基）を含み、チンパンジーの肝臓に直接接種した場合に感染性である。ウイルスRNAの5’非翻訳領域には、単一のオープンリーディングフレームを大きなポリタンパク質に翻訳するために使われる、内部リボゾーム進入部位（IRES）が含まれる。ウイルスの構造タンパク質および非構造タンパク質は、前駆体のタンパク質分解過程により生じる。HCVは、適当で信頼性のある組織培養システムが無いために、研究することが難しいウイルスである。最近行われたウイルス構造タンパク質を欠損したHCVレプリコンの樹立は、組織培養細胞中でウイルス遺伝子発現および複製の実験が可能になったという点で、大きな進歩である。しかしながら、レプリコンに基づいたシステムでは、ウイルス構造タンパク質が欠損しているため感染性ウイルスが産生されず、従って、ウイルスの細胞間伝播は起こらない。さらに、個々の変異の研究には永続的な細胞株を作ることが不可欠なため、ウイルスゲノムの遺伝学的解析が妨げられている。
【０００３】
HCVポリタンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端までに、コアタンパク質（C）、エンベロープタンパク質（E1およびE2）、ならびに非構造タンパク質（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、およびNS5B）を含む。Cはコアヌクレオカプシドタンパク質をコードし、E1およびE2はウイルスを被うエンベロープタンパク質であり、NS2、NS3、およびNS4AはHCVポリタンパク質のタンパク質分解過程に関与し、NS5BはRNAポリメラーゼおよびRNAヘリカーゼ活性を有する。NS4AとNS5Bの機能は不明である。
【０００４】
HCVのRNAゲノムは最近クローニングされたが、HCV作製のための確かな組織培養システムの必要性は依然として残されている。ポリオウイルスなどのRNAウイルスは、様式化された方法を用いて、つまりはRNAを細胞にトランスフェクトすることにより細胞中で産生される。ポリオウイルスなどのRNAウイルス由来のウイルスcDNAを細胞にトランスフェクトする方法によりウイルスを産生させることは、これまで成功していない。RNAウイルスであるHCVも、RNAを用いたトランスフェクションにより容易に産生されるだろうと予想されていたが、そのような方法はHCVには適当でないということが明らかとなった。さらに、ウイルスcDNAを用いて細胞にトランスフェクトすることも、HCV産生を成功させる方法ではないと予想されていた。しかしながら、本発明ではHCVをコードする遺伝子を肝細胞にトランスフェクトすることで感染性HCVを合成させ、それから非感染細胞をそのHCVにさらすことでさらなるHCVを形成させる方法を提示する。この合成方法に成功したことが確認された。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
本発明は、組織培養システム中で感染性C型肝炎ウイルス（HCV）を作製する方法という将来性のある発見に基づく。細胞培養中で、感染性HCVを合成することができる一過性の、HCV cDNAを基にした発現システムについて、本明細書に記載する。本システムはウイルスの細胞間伝播を支える。本システムの確実性は、HCVの複製欠損型および複製可能型変異体の遺伝学的解析により実施例中に示されている。本発明は、ウイルスゲノムの遺伝学的解析のみならず、新規抗ウイルス戦略の開発にも信頼性があるシステムを提供する。
【０００６】
一つの観点においては、本発明はHCVを作製するための培養システムに向けられる。細胞培養培地は、細胞にトランスフェクションを行うのに適した条件の下で、HCVをコードする核酸配列およびRNAポリメラーゼをコードする核酸配列を肝細胞にトランスフェクトすることで作った細胞培養から調製され、トランスフェクション後の該細胞培養培地はHCVを含有する。
【０００７】
本発明の別の観点は、上記のように培養システム中の細胞の細胞表面に発現するHCV特異的タンパク質の量を測定することにより、培養システム中でHCVに感染した肝細胞の感染レベルを測定する方法に向けられる。
【０００８】
さらに本発明の別の観点は、吸着、貫入、被包、放出、複製、翻訳、またはタンパク質プロセシングなどのHCV活性のモジュレーターを同定する方法に向けられる。モジュレーターは、試験化合物を上記の培養システム中に接触させ、吸着、貫入、被包、放出、複製、翻訳、またはタンパク質プロセシングなどのHCV活性の亢進または低下を検出することで同定される。試験化合物を接触させない場合の培養システムと比較して、HCV活性の亢進または低下が認められた場合に、試験化合物はモジュレーターであると同定される。
【０００９】
関連する観点において、本発明はまた、吸着、貫入、被包、放出、複製、翻訳、またはタンパク質プロセシングなどのHCV活性をモジュレートする方法も含む。その方法は、HCVを含むサンプルに、上記の同定方法を用いて選択される、吸着、貫入、被包、放出、複製、翻訳、またはタンパク質プロセシングなどのHCV活性のモジュレーターを接触させるというやり方である。
【００１０】
別の観点において、本発明は上記のように同定されたモジュレーターに向けられる。
【００１１】
別の観点において、本発明は上記のモジュレーターを投与することにより、HCV感染組織またはウイルス関連組織線維症を診断、モジュレート、または治療する方法を含む。
【００１２】
別の観点において、本発明は、上記の細胞を含む、吸着、貫入、被包、放出、複製、翻訳、またはタンパク質プロセシングなどのHCV活性のモジュレーターを分析するキットに向けられる。別の態様として、そのキットは使用説明書を含む。
【００１３】
また別の観点において、本発明は上記のように同定されたモジュレーターおよび薬学的に許容されるキャリアーを含む薬学的組成物に向けられる。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、C型肝炎ウイルス（HCV）を作製するための組織培養システムおよび作製したHCVの使用方法に関連する。
【００１５】
定義
「C型肝炎ウイルス」および「HCV」という用語は、その開示が参照として本明細書に組み入れられる、国際公開公報第89/046699号；欧州特許公報第318,216号；および米国特許第5,350,671号でプロトタイプ分離株が確認されている、BB-NANBHの主要病原因子であるウイルス種のことを指す。本明細書で用いられる「HCV」は、C型肝炎を引き起こすことができる病原株、および弱毒株またはそれに由来する欠損妨害粒子を含む。HCVゲノムはRNAを含む。RNAを含むウイルスは、比較的高い率で自発的変異を起こすことが知られており、取り込まれたヌクレオチドあたり約10-3から10-4であると報告されている（Fields & Knipe, 「Fundamental Virology」(1986, Raven Press, NY)）。遺伝子型の異質性と流動性はRNAウイルス固有の特徴であるので、HCV種の中には病原性または非病原性などの多様な株/分離株が存在することになろう。
【００１６】
本明細書で用いられる「核酸」または「核酸配列」という語句は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはこれらのいかなる断片、一本鎖もしくは二本鎖のこともあり、またセンス鎖もしくはアンチセンス鎖のこともあるゲノムもしくは合成由来のDNAもしくはRNA、ペプチド核酸（PNA）、または自然もしくは合成由来の任意のDNA様もしくはRNA様物質のことを指す。
【００１７】
特定のポリペプチドまたはタンパク質「のコード配列」、「をコードしているヌクレオチド配列」、または「をコードしている遺伝子」とは、適当な調節配列のコントロール下に置かれた場合にポリペプチドまたはタンパク質に転写および翻訳される核酸配列のことである。
【００１８】
本明細書で使用される、指定された配列「から由来する」ポリヌクレオチドとは、指定されたヌクレオチド配列の領域に対応する、少なくとも約6ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約8ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも約10〜12ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも約15〜20ヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。「対応する」とは、指定された配列と相同または相補的であることを意味する。好ましくは、ポリヌクレオチドが由来する領域の配列は、HCVゲノムに独特の配列と相同または相補的である。配列がHCVゲノムに独特であるかないかは、当業者に周知の技術により決定できる。例えば、配列が非感染宿主、あるいは他の生物に存在するものなのかを決定するために、その配列を例えばGenebankのようなデータバンクにある配列と比較することができる。その配列はまた、例えばHAV、HBV、およびHDVといった肝炎を起こすことが知られているウイルスや、フラビウイルス科の仲間を含む、他のウイルス因子の既知の配列と比較することもできる。その由来する配列が他の配列と対応するか対応しないかも、適切なストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションを行うことで決定することができる。核酸配列の相補性を決定するハイブリダイゼーション技術は、当技術分野において周知である。例えば、Maniatisら(1982)も参照されたい。さらに、ハイブリダイゼーションによって生じた二本鎖ポリヌクレオチドの不適正塩基対は、例えば、二本鎖ポリヌクレオチドの一本鎖領域を特異的に消化するS1などのヌクレアーゼを使った消化を含む周知の技術で決定することができる。典型的なDNA配列が「由来する」可能性がある領域には、例えば、特定のエピトープをコードする領域、ならびに非転写および/または非翻訳領域が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００１９】
由来するポリヌクレオチドは、示されたヌクレオチド配列から必ずしも物理的に由来するものではなく、例えば、化学合成、DNA複製、逆転写、または転写を含む様々な方法で作製しうる。さらに、指定された配列のものに対応する領域の組み合わせは、使用目的に合うように当技術分野において周知の方法で変更しうる。
【００２０】
同様に、指示された核酸配列から「由来する」または「作製される」ポリペプチドまたはアミノ酸配列とは、その配列がコードするポリペプチドのものと同一のアミノ酸配列を持つポリペプチド、またはその一部分を指し、該一部分は、少なくとも3〜5アミノ酸、より好ましくは少なくとも8〜10アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも11〜15アミノ酸からなり、またはその配列中にコードされるポリペプチドと免疫学的に同一のものであると証明できるものである。この用語は、指定された核酸配列から発現させたポリペプチドも含む。
【００２１】
組換え型または由来するポリペプチドは、必ずしも指定された核酸配列またはHCVゲノムから翻訳される必要はなく、例えば化学合成、もしくは組換え型発現システムでの発現、もしくは変異HCVを含むHCVからの分離を含む様々な方法で作製しうる。組換え型または由来するポリペプチドは、その配列中に一つまたはそれ以上のアミノ酸のアナログまたは天然ではないアミノ酸を含有しうる。アミノ酸のアナログを配列中に挿入する方法は、当技術分野において周知である。それはまた、当業者に周知の一つまたはそれ以上のラベルを含む場合もある。
【００２２】
本明細書で用いられる「組換え型ポリヌクレオチド」という用語は、その由来または操作により、（1）本来関連するポリヌクレオチドの全部または一部と関連していない、（2）本来結合する以外のポリヌクレオチドと結合する、あるいは（3）自然には存在しない、ゲノム、cDNA、半合成、または合成由来のポリヌクレオチドを意味する。
【００２３】
本明細書で用いられる「アミノ酸」または「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質配列、またはそれらの任意の断片、一部分、もしくはサブユニット、および自然発生もしくは合成の分子を指す。
【００２４】
本明細書で用いられる「ポリペプチド」、「ペプチド」、「ポリタンパク質」、または「タンパク質」という用語は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、すなわちペプチド同配体によってお互いに結合されたアミノ酸を指し、遺伝子がコードする20アミノ酸以外の修飾アミノ酸を含む場合もある。ポリペプチドは、翻訳後プロセシングのような自然のプロセス、または当技術分野において周知の化学修飾技術のどちらかにより修飾されうる。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノまたはカルボキシ末端を含むポリペプチドのどの部分においても起こりうる。所与のポリペプチドの中の幾つかの部位に同じ型の修飾が同程度または様々に異なる程度に存在することが認識されよう。所与のポリペプチドに多様な修飾が起こっている場合もある。修飾には、アセチル化、アシル化、ADPリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、クロスリンクによる環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有クロスリンクの形成、システインの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、ガンマ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、パーギル化（pergylation）、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（selenoylation）、硫酸化、およびアルギニル化（arginylation）のようなタンパク質へのトランスファーRNA介在性アミノ酸付加が含まれる（Creighton, T.E., Proteins - Structure and Molecular Properties 2nd Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp. 1-12 (1983)を参照されたい）。
【００２５】
本明細書で用いられている「分離された」という用語は、物質がその本来の環境（例えば、それが自然に存在するものであれば、自然環境）から取り除かれることを意味する。例えば、生きた動物の中にある、自然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは分離されてはいないが、自然界のある種またはすべての共存する物質から離された、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは分離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部になる場合があり、および/もしくはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドが組成物の一部になる場合もあるが、そのようなベクターまたは組成物は自然環境の一部ではないので、それらは依然として分離されている。
【００２６】
本明細書で用いられている「組換え型」という用語は、核酸がその自然環境においては隣接しない「バックボーン」核酸に隣接していることを意味する。さらに、核酸が「豊富にされる」とは、核酸バックボーン分子集団の中に核酸挿入物の数が5％以上あることを意味する。本発明によるバックボーン分子には、発現ベクターなどの核酸、自己複製核酸、ウイルス、インテグレートされた核酸、および興味の核酸挿入物を維持もしくは操作するために用いられるその他のベクターまたは核酸が含まれる。典型的には、豊富にされた核酸とは組換え型バックボーン分子集団の中に核酸挿入物の数が15％以上あることを意味する。より典型的には、豊富にされた核酸とは組換え型バックボーン分子集団の中に核酸挿入物の数が50％以上あることを意味する。一つの態様では、豊富にされた核酸とは組換え型バックボーン分子集団の中に核酸挿入物の数が90％以上あることを意味する。
【００２７】
「組換え型」ポリペプチドまたはタンパク質は、組換えDNA技術を用いて産生した、すなわち、所望のポリペプチドまたはタンパク質をコードする外因性DNA構築物でトランスフォームした細胞から作られる、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。「合成」ポリペプチドまたはタンパク質とは、化学合成により調製されたものである。固相化化学ペプチド合成法を本発明のポリペプチドまたは断片の合成に使用することもある。そのような方法は、1960年代初頭より当技術分野において周知であり（Merrifield, R.B., J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154, 1963）(Stewart, J.M. and Young, J.D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, III., pp. 11-12も参照されたい)、最近は市販の実験用ペプチドデザインおよび合成キットに用いられている（Cambridge Research Biochemicals）。そのような市販の実験用キットは、一般的にH.M. Geysenら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:3998 (1984)の教えを用いており、すべてが単一のプレートに繋がっている「ロッド」あるいは「ピン」の多数のチップの上に合成ペプチドを供給する。そのようなシステムが使用されるとき、ロッドまたはピンのプレートは逆さまにされ、ロッドまたはピンのチップに適切なアミノ酸を付着もしくは固定させるための溶液を含んだ、第二のプレートの対応するウェルまたはレザバー（reservoir）に挿入される。このような処理過程、すなわち転倒とロッドおよびピンのチップの適切な溶液への挿入を繰り返すことにより、アミノ酸が望みのペプチドに組み込まれる。さらに、多数のFMOCペプチド合成システムが入手可能である。例えば、ポリペプチドまたは断片の組み立ては、Applied Biosystems, Inc. Model 431A自動化ペプチド合成機を用いた固相支持体上で実行可能である。そのような装置は、直接合成するか、あるいは他の周知の方法を用いて結合することが可能な一連の断片を合成することにより、本発明のペプチドの迅速なアクセスを提供する。
【００２８】
本明細書で用いられている「プロモーター配列」とは、RNAポリメラーゼが結合し転写を開始する、コーディング配列の5’端にあるDNA上の部位である。プロモーター配列は、プロモーター部位で転写を開始させるRNAポリメラーゼがコーディング配列をmRNAに転写しようとする場合に、コーディング配列へ「操作可能な形で繋げられる」。エンハンサーのようなその他の調節エレメントも本発明において有用であることが想像される。
【００２９】
本明細書で用いられている「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの長さに関わらず、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの重合体を指す。この用語が示すのは、分子の一次構造だけである。したがってこの用語は、二本鎖および一本鎖DNA、ならびにRNAを含む。またそれは、例えば、当技術分野において周知のラベル、メチル化、「キャップ」、自然に存在するヌクレオチドとアナログとの一つ以上の置換、例えば電荷によらない結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）および電荷による結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジンなどを含む）のようなペンダント部分を含んだもの、干渉物質を持つもの（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤を含むもの（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）、アルキル化剤を含むもの、修飾された結合を持つもの（例えば、アルファアノマー核酸など）、ならびにポリヌクレオチドの非修飾型などとのヌクレオチド間修飾などの周知の型の修飾も含む。
【００３０】
「精製されたウイルスポリヌクレオチド」という用語は、本質的に遊離した、すなわちウイルスポリヌクレオチドが自然状態で連携しているポリペプチドを約50％未満、好ましくは約70％未満、そしてさらに好ましくは約90％未満しか含まないHCVゲノムまたはその断片を指す。ウイルス粒子からウイルスポリヌクレオチドを精製する技術は、当技術分野において周知であり、例えば、カオトロピック剤（chaotropic agent）による粒子の破壊、イオン交換クロマトグラフィーによるポリヌクレオチドとポリペプチドの示差的抽出および分離、アフィニティークロマトグラフィー、ならびに密度にしたがった沈降が含まれる。
【００３１】
「精製されたウイルスポリペプチド」という用語は、本質的に遊離した、すなわちウイルスポリペプチドが自然状態で連携している細胞成分を約50％未満、好ましくは約70％未満、そしてさらに好ましくは約90％未満しか含まないHCVポリペプチドまたはその断片を指す。ウイルスポリペプチドを精製する技術は、当技術分野において周知である。
【００３２】
本明細書で用いられている「培養」、「培養された」、または「培養している」という用語は、調製された培地中のインビトロにおける細胞の増殖を指す。本明細書で用いられている「培養システム」とは、ウイルス粒子を作製する細胞を含む細胞培養である。特に、本発明の培養システムはHCVを作製する培養細胞を含む。
【００３３】
「組換え型宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養」、および微生物または単細胞で実在するものとして培養されるさらに高度な真核細胞株を意味するその他の同様な用語は、組換え型ベクターまたは他のトランスファーDNAの受容者として使われうる、または使われてきた細胞を指し、トランスフェクトされた本来の細胞の子孫を含む。単一の親細胞の子孫が、自然、偶然、または意図した変異のために、形態、またはゲノムもしくは全体のDNA相補性という点で必ずしも完全に本来の親のものと同一ではない場合があるということが理解される。
【００３４】
「レプリコン」とは、例えば、プラスミド、染色体、ウイルス、コスミドなどの、細胞内でポリヌクレオチド複製の自律性単位としてふるまう、換言すれば、自分自身による制御の下で複製できる、あらゆる遺伝因子である。
【００３５】
「ベクター」とは、付加されたセグメントが複製および/または発現を起こすように、別のポリヌクレオチドセグメントが付加されたレプリコンである。
【００３６】
「制御配列」とは、それに繋がったコーディング配列の発現をもたらすために必要なポリヌクレオチド配列を指す。そのような制御配列の性質は、宿主生物によって異なり、原核生物では、そのような制御配列は一般的にプロモーター、リボゾーム結合部位、およびターミネーターを含み、真核生物では、そのような制御配列は一般的にプロモーター、ターミネーター、および場合によってはエンハンサーを含む。「制御配列」という用語は、その存在が発現に必要なすべての構成成分を最少限含むことを意味し、また例えばリーダー配列のようにその存在が有利である付加的構成成分を含む場合もある。
【００３７】
「オープンリーディングフレーム（ORF）」とは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の領域であり、この領域がコーディング配列の一部に相当する場合もあり、また全コーディング配列に相当する場合もある。
【００３８】
「コーディング配列」とは、適切な調節配列の制御下におかれたときに、mRNAに転写および/またはポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コーディング配列の境界は、5’-端の翻訳開始コドンと3’-端の翻訳終止コドンによって決定される。コーディング配列には、mRNA、cDNA、組換え型ポリヌクレオチド配列を含むことができるが、それに限定されるものではない。
【００３９】
「免疫学的に同定できる」とは、指定されたポリペプチド、通常はHCVタンパク質、にも存在するエピトープまたはポリペプチドが存在することを意味する。免疫学的同一性は、抗体結合および/または結合の競合により決定され得、これらの技術は当業者に周知である。
【００４０】
本明細書で用いられる「エピトープ」は、ポリペプチドの抗原決定基を指す。エピトープは、そのエピトープに独特の空間構造に3アミノ酸を含むことができうる。一般的に、エピトープは少なくとも5つのそのようなアミノ酸からなり、さらに通常は、少なくともそのような8〜10アミノ酸からなる。アミノ酸の空間構造を決定する方法は、当技術分野において周知であり、例えば、X線結晶構造解析および二次元核磁気共鳴が含まれる。
【００４１】
ポリペプチド内に含まれる特異的エピトープを抗体が認識するために抗体と結合する場合に、ポリペプチドは抗体と「免疫学的に反応性である」という。免疫学的反応性は、抗体結合により、さらに特には抗体結合のキネティクスにより、および/または、抗体が認識するエピトープを含む既知のポリペプチドを競合物質として用いた結合の競合により決定されうる。ポリペプチドが抗体に免疫学的に反応性であるかどうかを決定する技術は、当技術分野において周知である。
【００４２】
本明細書で用いられる「トランスフェクション」という用語は、培養中の細胞による外来DNAの取り込みを指す。
【００４３】
本明細書で用いられる「免疫原性ポリペプチド」という用語は、アジュバントの存在下または非存在下で、単独もしくはキャリアーと結合して、細胞性および/または液性免疫反応を惹起するポリペプチドのことをいう。
【００４４】
本明細書で用いられる「トランスフォーメーション」とは、例えば、直接取り込み、形質導入、f-交配、または電気穿孔法など、挿入に用いた方法に関わらず、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの挿入を指す。外因性ポリヌクレオチドは、例えばプラスミドのようなインテグレートされていないベクターとして維持されうるし、また別に、宿主ゲノムにインテグレートされうる。
【００４５】
本明細書で用いられる「治療」とは、予防および/または療法を指す。
【００４６】
本明細書で用いられる「個体」とは、脊椎動物、特に哺乳類の仲間をさし、家畜、スポーツ動物、およびヒトを含む霊長類を含むがこれに限定されない。
【００４７】
本明細書で用いられる核酸の「センス鎖」は、mRNAのものと配列相同性を有する配列を含む。「アンチセンス鎖」は、「センス鎖」のものと相補的な配列を含む。
【００４８】
本明細書で用いられるウイルスの「プラス鎖ゲノム」とは、RNAまたはDNAに関わらずゲノムが一本鎖で、ウイルスのポリペプチドをコードするものである。プラス鎖RNAウイルスの例には、トガウイルス科、コロナウイルス科、レトロウイルス科、ピコルナウイルス科、およびカリシウイルス科が含まれる。以前はトガウイルス科として分類されていたフラビウイルス科も含まれる。Fields & Knipe (1986)を参照されたい。
【００４９】
本明細書で用いられる「精製HCV」とは、ウイルスが通常連携する細胞構成成分、および感染組織に存在していた可能性がある他の型のウイルスから分離されたHCV調製物を指す。ウイルスを分離する技術は当業者にとって周知であり、例えば、遠心分離およびアフィニティークロマトグラフィーを含む。
【００５０】
本明細書で用いられる「HCV粒子」という用語は、完全ウイルス粒子とともに、ウイルス粒子形成の途中段階にある粒子をも含む。HCV粒子は、通常HCV核酸と連携する一つ以上のHCVタンパク質を持つ。
【００５１】
本明細書で用いられる「プローブ」という用語は、プローブ中の少なくとも一つの配列が標的領域中の配列と相補的であるために、標的領域の配列とハイブリッド構造を形成するポリヌクレオチドを指す。
【００５２】
本明細書で用いられる「標的領域」という用語は、増幅および/または検出されるべき核酸の領域を指す。
【００５３】
本明細書で用いられる、HCV RNAを含む「ウイルスRNA」という用語は、ウイルスゲノム、その断片、その転写産物、およびそれから由来する変異配列からのRNAを指す。
【００５４】
本明細書で用いられる「生物学的サンプル」は、個体から分離された組織または体液のサンプルを指し、例えば、血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚の外部切片、呼吸気道、腸管、および尿生殖器管、涙、唾液、母乳、血液細胞、腫瘍、臓器、ならびにインビトロ細胞培養構成成分のサンプル（細胞培養培地中での細胞増殖の結果で出来た条件培地、ウイルス感染が推測される細胞、組換え型細胞、および細胞成分を含むが、これらに限定されるものではない）をも含むが、これらに限定されるものではない。
【００５５】
本明細書で用いられる「プラスミド」とは、自己複製する、環状の二本鎖DNA分子のことである。プラスミドはしばしば、制限酵素で切断され、外来DNAが挿入され、プラスミドは細胞内へ運び込まれる。「プラスミド」は、先に書かれる小文字の「p」と、ならびに/またはそれに続く大文字および/もしくは番号で名付けられる。本明細書における開始プラスミドは、市販のもの、無制限の原則で公共的に入手可能なもの、または入手可能なプラスミドから公表された手順に従って作製可能なもののいずれかである。さらに、本明細書に記載されるものと同等のプラスミドは、当技術分野において周知であり、当業者にとって明白なものになろう。
【００５６】
DNAの「消化」とは、DNAのある特定の配列のみに作用する、制限酵素を用いたDNAの酵素触媒による切断を意味する。本明細書で用いられる様々な制限酵素は市販のものであり、それらの反応条件、共因子、およびその他の要件は、当業者にとって周知のものとして用いられる。解析目的としては、典型的には1マイクログラムのプラスミドまたはDNA断片を、約20マイクロリットルのバッファー溶液中で約2単位の酵素とともに用いる。プラスミド構築のためにDNA断片を分離することを目的とする場合は、典型的には5から50マイクログラムのDNAをさらに大きい容積中で20から250単位の酵素で消化する。特別の制限酵素に対する適切なバッファーおよび基質量は、製造者によって明記される。通常用いられるインキュベーション時間は37℃で約1時間であるが、供給元の説明書にしたがって変わりうる。消化後はゲル電気泳動を行い、目的の断片を分離しうる。
【００５７】
「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成も可能な、一本鎖ポリデオキシヌクレオチドあるいは二本の相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖を指す。そのような合成オリゴヌクレオチドは、5’端にリン酸基を持たないので、キナーゼの存在下でATPを用いてリン酸基を付加しない限り、別のオリゴヌクレオチドと繋げることが出来ない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化を受けていない断片と繋げられる。
【００５８】
二つの核酸またはポリペプチドという関係において「実質的に同一」という語句は、周知の配列比較アルゴリズムの一つを用いて計測されるか、または眼での精査により最大一致するように比較および整列させた場合に、少なくとも60％、70％、80％、およびある面では90〜95％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一である、二つ以上の配列を指す。典型的には、実質的同一性は少なくとも約100残基の領域にわたって存在し、最もよくある場合には、配列は少なくとも約150〜200残基にわたって実質的に同一である。いくつかの態様においては、配列がコーディング領域の全長にわたって実質的に同一となる。
【００５９】
さらに「実質的に同一」なアミノ酸配列とは、特にアミノ酸置換がその分子の活性部位でない場所で起こり、ポリペプチドがその機能的特性を本質的に維持しているという条件で、一つ以上の保存的もしくは非保存的アミノ酸置換、欠失、または挿入によって参照配列と異なった配列である。保存的アミノ酸置換は、例えば、一つのアミノ酸を同じ分類の別のアミノ酸に置換することである（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、もしくはメチオニンなどの疎水性アミノ酸の別のアミノ酸への置換、またはアルギニンからリジンへの置換、グルタミン酸からアスパラギン酸への置換、もしくはグルタミンからアスパラギンへの置換のような極性アミノ酸から別のものへの置換）。
【００６０】
本明細書で用いられる「断片」とは、少なくとも二つの異なる構造で存在可能な、自然に存在するタンパク質の一部である。断片は自然に存在するタンパク質と同じ、または実質的に同じアミノ酸配列を持つことが出来る。「実質的に同じ」とは、アミノ酸配列が全部ではないが大部分が同じであり、それが関連する配列の機能的活性を少なくとも一つ保持していることを意味する。一般的に、少なくとも約85％同一である場合に、二つのアミノ酸配列は「実質的に同じ」、または「実質的に相同」である。自然に存在するタンパク質と3次元構造が異なる断片も含まれる。この例としては、切断によって有意に高い活性を持った成熟酵素へと変化できる、低活性のプロタンパク質のような「プロフォーム」分子がある。
【００６１】
「ハイブリダイゼーション」は、塩基が組になることを通じて、核酸鎖を相補鎖と結合させる過程を指す。ハイブリダイゼーション反応は感度がよく、選択性を高くできるので、サンプル内に低濃度で存在するような場合でも、興味のある特定の配列を同定することができる。ストリンジェントな条件は、例えば、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション溶液中の塩もしくはホルムアミド濃度、またはハイブリダイゼーション温度によって適宜決定でき、当技術分野において周知である。特に、ストリンジェンシーは、塩濃度を下げること、ホルムアミド濃度を上げること、またはハイブリダイゼーション温度を上げることによって上げることができる。
【００６２】
例えば、高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションは、約50％ホルムアミド中、約37℃から42℃で行われよう。ストリンジェンシーを下げた条件下でのハイブリダイゼーションは、約35％から25％のホルムアミド中、約30℃から35℃で行われよう。特に、高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションは、50％ホルムアミド、5X SSPE、0.3％SDS、200n/mlの剪断および変性されたサケ精子DNA中、42℃で行われよう。ストリンジェンシーを下げた条件下でのハイブリダイゼーションは、上記のように行われうるが、35％ホルムアミド中、温度を35℃に下げた条件で行われよう。ストリンジェンシーの特定のレベルに対応する温度の範囲は、興味の核酸のプリン/ピリミジン比を計算し、それに従って温度を調節することによりさらに狭めることができる。上記の範囲および条件の変動は、当技術分野において周知である。
【００６３】
「バリアント」という用語は、（それぞれ）一つ以上の塩基対、コドン、イントロン、エクソン、またはアミノ酸残基を改変されたが、NS3の生物学的活性を依然として維持している、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。バリアントは、例えば、入れ替え（shuffling）、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、アッセンブリーPCR、性的PCR突然変異誘発、インビボ突然変異誘発、カセット式突然変異誘発、循環（recursive）アンサンブル突然変異誘発、指数的アンサンブル突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、およびそれらの様々な組み合わせを含む多数の手段で作ることができる。
【００６４】
説明
細胞培養中で感染性HCVを合成することができる一過性の、HCV cDNAを基にした発現システムについて記載する。本システムはウイルスの細胞間伝播を支える。本システムの確実性は、HCVの複製欠損型および複製可能型変異体の遺伝学的解析により実施例中に示されている。トランスフェクション由来培養上清を三回連続継代した後の培養培地から分離されたウイルスは、未処理Huh-7細胞に感染し、ウイルスがコードするタンパク質ならびにウイルスのプラス鎖およびマイナス鎖RNAを合成する。イムノゴールド電子顕微鏡により、40〜60 nmの大きさのHCV粒子が細胞内（細胞質）で合成されていること、および細胞が著しい損傷を受けていることが明らかにされる。この研究は、ウイルスゲノムの遺伝学的解析のみならず、新規抗ウイルス戦略の開発にも信頼性のあるシステムを提供する。
【００６５】
一つの観点においては、本発明はHCVを作製するための培養システムに向けられる。細胞培養培地は、細胞培養から調製される。細胞培養は、細胞にトランスフェクションを行うのに適した条件の下で、HCVをコードする核酸およびRNAポリメラーゼをコードする核酸配列を肝細胞にトランスフェクトすることで調製され、トランスフェクション後に細胞培養培地はHCVを含有する。一つの態様においては、細胞培養培地はトランスフェクトされていない肝細胞へさらに暴露され、トランスフェクトされていない肝細胞からHCVが分泌される。HCVに感染した多数の細胞を得るためにこの過程を複数回繰り返してもよい。別の態様においては、トランスフェクトされていない肝細胞はトランスフェクトされた細胞と共培養される。また別の態様においては、培養システムは細胞培養培地の分離をさらに含む。また別の態様においては、培養システムはNS3およびNS5B をコードする核酸配列を細胞にトランスフェクトすることをさらに含む。一つの態様においては、肝細胞は肝細胞癌細胞、および別の態様においては、Huh-7などのヒト肝細胞癌細胞である。表1に示されているように、Huh-7などの肝細胞癌細胞におけるHCVの発現レベルは、ヒト子宮頸癌細胞株（HeLa）などの他の細胞より高い。肝細胞癌細胞は、例えば、HepG2、C3A、またはPLCでもよい。細胞はB細胞でもよい。本発明のトランスフェクトされた細胞およびトランスフェクトされていない細胞は、二つの異なる細胞のタイプでもよい。少なくとも6つのHVC遺伝子型と50よりも多いサブタイプが存在する。本発明で用いられるHCVのタイプは、1a、1b、1c、2a、2b、2c、2i、3a、3b、3c、4a、4b、4c、4d、4e、4f、4g、4h、5a、および6aを含みうるが、これらに限定されるものではない。一つの態様においては、HCVはタイプ1a HCVである。さらなる観点においては、本発明は共トランスフェクションを受けた細胞によるものとともに、この方法で産生されたHCVに向けられる。
【００６６】
別の態様においては、細胞培養はHCVをコードする核酸およびRNAポリメラーゼをコードする核酸を単一のプラスミドへトランスフェクトすることよって作られる。好ましい態様においては、HCVをコードする核酸およびRNAポリメラーゼをコードする核酸は二つの別のプラスミドへトランスフェクトされる。培養システムが、細胞にNS3およびNS5Bをコードする核酸配列をトランスフェクトすることをさらに含む場合には、HCVをコードする核酸、RNAポリメラーゼをコードする核酸、ならびにNS3およびNS5Bをコードする核酸配列は、単一のプラスミドへトランスフェクトされてもよいし、三つの別のプラスミドまでの複数のプラスミドへトランスフェクトされてもよい。
【００６７】
RNAポリメラーゼ遺伝子に対応するHCV DNAプラスミド上のいかなるプロモーターも、本発明の方法に使用することことができる。一つの態様においては、プロモーターはT7プロモーターで、RNAポリメラーゼはCMVプロモーターに制御されるT7 RNAポリメラーゼである。PL、tac、trp、trc、T3、T7、β-ガラクトシダーゼ、lacZ、SP6、SV40、QB、またはCMVプロモーターなどの、転写を調節する適切な核酸ならいかなるものでも、対応するRNAポリメラーゼをコードする任意のRNAポリメラーゼ遺伝子とともにプロモーターとして利用できる。したがって本発明のポリメラーゼには、プロモーターPL、tac、trp、trc、T3、T7、β-ガラクトシダーゼ、lacZ、SP6、SV40、QB、およびCMVに関連するポリメラーゼを含むが、これらに限定されるものではない。一つの態様においては、プロモーターはSP6であり、RNAポリメラーゼはSP6 RNAポリメラーゼである。別の態様においては、プロモーターはQBであり、RNAポリメラーゼはQB RNAポリメラーゼである。
【００６８】
本発明のT7 RNAポリメラーゼは細胞質に存在し、HCV RNAを作るためにT7プロモーターに続くHCV cDNAの転写を行う。ウイルスRNAはそれから翻訳され、ウイルス構造タンパク質（コア、E1、E2、およびp7）および非構造タンパク質（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、およびNS5B）を産生する。その後RNA依存性RNAポリメラーゼ（NS5B）によって指揮されるウイルスRNAの複製が起こるであろう。子孫ウイルス粒子が作られ、培養培地中に分泌される場合には、これらのウイルス粒子は別の細胞に感染する可能性があり、ウイルスが伝播する結果となる。ウイルスタンパク質の合成をモニターする方法は、実施例中に例示されており、蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）およびイムノゴールド電子顕微鏡を含むが、これらに限定されるものではない。
【００６９】
トランスフェクション後早い時期のFACS解析では、HCVプラスミドを最初にトランスフェクトされた細胞上でE1/E2の表面発現を検出する可能性が高い。しかし、トランスフェクトされた細胞から放出される新しく作られたウイルスが周囲の細胞に感染することにより、これらの周囲細胞上でもE1/E2が表面発現されてくる。したがってE1/E2陽性細胞の数は、トランスフェクションからの時間とともに増加するはずである。
【００７０】
四回継代されたウイルス調製物を感染させたHuh-7細胞を用いて、その細胞をヒト抗E1および抗E2抗体（細胞内染色）、ならびに10 nmの金粒子と結合した二次抗体（抗ヒトIgG）で染色して行った、イムノゴールド電子顕微鏡によるインビトロで合成されたHCVタイプ1a粒子の可視化により、ウイルス粒子が感染細胞中で合成されていることが示された。
【００７１】
HCVをトランスフェクトした細胞から回収した上清（培地）中のプラスおよびマイナス鎖HCV RNAの検出をRT-PCRを用いて行った。GFP；GFPおよびHCV；GFP、HCV、およびT7ポリメラーゼ（パネル上）をそれぞれトランスフェクトした細胞間で比較を行った。HCVプラスT7ポリメラーゼをトランスフェクトした細胞から回収した上清を感染させたものにおいて、HCVマイナス鎖の合成が認められた。マイナス鎖の検出はウイルスRNAの複製を示す。プラスおよびマイナス鎖HCV RNA合成に対する定量的RT-PCRの結果、細胞一個当たり400コピーのプラス鎖および45コピーのマイナス鎖がウイルス感染細胞中で合成されていることが示された。
【００７２】
本発明の別の観点は、上記のように培養システム中の細胞の細胞表面に発現するHCV特異的タンパク質の量を測ることにより、培養システム中でHCVに感染した肝細胞の感染レベルを測定する方法に向けられる。HCVは、C、E1、E2、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、およびNS5Bのタンパク質からなる。培養システム中の細胞の細胞表面に発現するHCV特異的タンパク質は、E1、E2、NS5A、またはNS3タンパク質である可能性がある。
【００７３】
本発明の別の観点は、吸着、貫入、被包、放出、複製、翻訳、またはタンパク質プロセシングなどのHCV活性のモジュレーターを同定する方法に向けられる。モジュレーターは、試験化合物を上記の培養システム中に接触させ、吸着、貫入、被包、放出、複製、翻訳、またはタンパク質プロセシングなどのHCV活性の亢進または低下を検出することで同定される。試験化合物を接触させない場合の培養システムと比較して、HCV活性の亢進または低下が認められた場合に、試験化合物はモジュレーターであると同定される。低下が検出された場合には、そのモジュレーターはHCVの吸着、貫入、被包、放出、複製、翻訳、またはタンパク質プロセシングの阻害剤である。亢進が検出された場合には、そのモジュレーターはHCVの吸着、貫入、被包、放出、複製、翻訳、またはタンパク質プロセシングの活性化剤である。一つの態様においては、培養システム中のHCVに感染した細胞の細胞表面に発現されたHCV特異的タンパク質を測ることにより、そのような活性は測定される。そのようなタンパク質には、E1、E2、NS5A、またはNS2タンパク質が含まれうる。一つの態様においては、モジュレーターはタンパク質である。別の態様においては、モジュレーターは核酸分子である。また別の態様においては、モジュレーターはペプチド、擬似ペプチド、または他の低分子である。
【００７４】
関連する観点において、本発明はまた、吸着、貫入、被包、放出、複製、翻訳、またはタンパク質プロセシングなどのHCV活性をモジュレートする方法も含む。その方法は、HCVを含むサンプルに、上記の同定方法を用いて選択される、吸着、貫入、被包、放出、複製、翻訳、またはタンパク質プロセシングなどのHCV活性のモジュレーターを接触させるというやり方である。一つの態様においては、モジュレーターはタンパク質である。別の態様においては、モジュレーターは核酸分子である。また別の態様においては、モジュレーターはペプチド、擬似ペプチド、または他の低分子である。そのようなサンプルは、HCVを含有するいかなる溶液をも含む。
【００７５】
また別の観点において、本発明は上記のように同定されたモジュレーターおよび薬学的に許容されるキャリアーを含む薬学的組成物に向けられる。一つの態様においては、モジュレーターはタンパク質である。別の態様においては、モジュレーターは核酸分子である。また別の態様においては、モジュレーターはペプチド、擬似ペプチド、または他の低分子である。
【００７６】
さらに、本発明は上記のモジュレーターを投与することにより、HCV感染組織またはウイルス関連組織線維症を診断、モジュレート、または治療する方法を含む。一つの態様においては、モジュレーターはタンパク質である。別の態様においては、モジュレーターは核酸分子である。また別の態様においては、モジュレーターはペプチド、擬似ペプチド、または他の低分子である。
【００７７】
別の観点において、本発明は、上記の細胞を含む、吸着、貫入、被包、放出、複製、翻訳、またはタンパク質プロセシングなどのHCV活性のモジュレーターを分析するキットに向けられる。好ましい態様においては、そのキットは分析を行うための使用説明書を含み、その説明書はパッケージの差し込み、パッケージ、またはキットに含まれるラベルに印刷されていてもよい。その印刷は、キットに含まれる容器上に入れることもでき、サンプルと試薬容量の印を試験容器中に記すことが可能である。正確な使用説明は、検出される物質および/または用いられる検出方法によって異なるであろうが、使用説明書には以下のものが一つ以上含まれうる。キット内容物の希釈および/またはサンプルの調製についての説明、それぞれのアッセイに用いられる物質の容量または濃度に関する指示、アッセイに加えるサンプルの容量、反応物をラベルするための指示、内容物の測量、好ましい温度条件、ならびに内容物を添加および混合するタイミングに関する指示、ならびに試験結果を較正するスタンダードの使用に関する説明。
【００７８】
以下の実施例は、本発明を例証するためのものであり、本発明を限定するためのものではない。
【００７９】
実施例
実施例1:
組織培養システムにおけるインビトロでの感染性C型肝炎ウイルスの合成
感染性C型肝炎ウイルス（HCV）合成のための、cDNAを基にした信頼性の高い組織培養アッセイを開発した。
【００８０】
クローン化された野生型 HCV(1a)cDNAを特定の条件下でヒト肝細胞癌細胞（Huh-7）にトランスフェクトすることにより、ウイルス糖タンパクE1およびE2が細胞表面に発現するという結果が得られた。ウイルス構造タンパク質および非構造タンパク質（NS5AおよびNS3）の両者の発現は、トランスフェクションの三週間後まで上昇した。細胞培養から分離した上清（培地）は、新しいHuh-7細胞と混合した場合に、感染性を有していた。培養上清の感染性は、デオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼ処理に抵抗性であった。ウイルス力価は四回の継代の後に著しく上昇し、継代したウイルスに感染した細胞は、ウイルスタンパク質ならびにプラス鎖およびマイナス鎖RNAの合成を示した。変異HCV cDNAクローンをトランスフェクトされたHuh-7細胞からは、感染性ウイルスは回収されなかった。HCV-IRES介在性の翻訳を阻害する二つの阻害剤は、感染性ウイルスの合成を効果的に阻害した。密度勾配遠心分離および初期の電子顕微鏡の両方法により、完全なウイルス粒子がこのシステムにおいて作られていることが示された。
【００８１】
実施例2:
Huh-7細胞におけるC型肝炎ウイルスの複製
細胞培養
ヒト肝細胞癌Huh-7細胞は、10%牛胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびL-グルタミンを含む1640 RPMI培地で培養した。
【００８２】
プラスミドDNA試薬
C型肝炎ウイルス（HCV）のcDNAクローン、pCV-H77Cは、NIH, Bethesda, MDのJens Bukh博士およびRobert Purcell博士より親切にも供与された。この構築物におけるHCVゲノムの転写は、バクテリオファージのT7プロモーターで制御されている。T7 RNA依存性RNAポリメラーゼ遺伝子ならびに真核生物の転写開始および終始シグナルを含むプラスミドDNA、AR3126およびAR3132は、Brookhaven National Laboratory, Upton, NYのF. William Studier博士より親切にも供与された。renilla reniformisのグリーン蛍光タンパク質をコードするEGFP-N1プラスミドDNAは、Promega Biotec, Madison, WIから購入した。
【００８３】
Huh-7細胞のトランスフェクション
トランスフェクションは、適切なプラスミドDNAを用い、BIGCO.BRL Life TechnologiesのSuperfect試薬を使用して行った。T-75組織培養フラスコに入れられた10x106個の細胞を、プラスミドDNAをそれぞれ15マイクログラム含むSuperfectで処理した。
【００８４】
上清からのウイルスの回収とHuh-7細胞の処置
上清は、規定の時間にトランスフェクトした細胞から回収し、-70℃で保存した。上清に含まれるHCV粒子を感染させるために、これらの回収した上清を用いてHuh-7細胞を処理した。
【００８５】
HCVエンベロープの発現のためのフローサイトメトリー
Kokaらにより以前に報告されているものと同様の手順を用いて、トランスフェクトまたは上清処理されたHuh-7細胞を抗E1またはE2抗体で染色した。PEを結合したヤギ抗マウスIgG1抗体を、一次抗体に対するラベルに用いた。フローサイトメトリー解析は、Becton-DickinsonのFACSCANで行った。
【００８６】
RNAの分離とHCV RNAのRT-PCR
RNAの分離は、Qiagenキットを用いて製造者により供給されたプロトコールに従い行った。分離したRNAは、HCVプラス鎖RNAの5’端の530 bpのDNA断片、およびウイルスマイナス鎖の3’端の480 bp断片を作り出す、20量体のダイレクトおよびリバースプライマーを用いて増幅した。
【００８７】
HCV非構造タンパク質を検出する細胞内フローサイトメトリー
ワンステップ細胞透過処理および抗体染色キット（one step cell permeabilization and antibody staining kit）はBD-Pharmingenより購入し、製造者により供給されたプロトコールに従って使用した。
【００８８】
実施例3:
トランスフェクション
HCV cDNAを基にした組織培養システムを開発するために、感染性HCVタイプ1aのcDNA（pCV-H77C (M. Yanagiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 8738 (1997).)）を、T7プロモーターによる制御下で、SV-40プロモーターで制御されるT7 RNAポリメラーゼ遺伝子（AR3126 (B. M. Benton, W. K. Eng, J. J. Dunn, F. W. Studier, R. Sternglanz, P. A. Fisher. Molecular Cell Biol. 10, 353 (1990))と共トランスフェクトした。後者の構築物は核局在化シグナルを欠失している。
【００８９】
T-75組織培養フラスコ中で60〜70％コンフルエントのHuh-7細胞（1x107）にプラスミドDNAをトランスフェクト/共トランスフェクトした。実験によっては、6穴プレートでトランスフェクションを行った（1穴当たり3x106個とプラスミドそれぞれ2マイクログラム）。プラスミドそれぞれ10マイクログラムを0.45ミリリットルの無血清RPMIに添加し、180 マイクロリットルのQuiagen製superfectトランスフェクション試薬と混合した。その混合物を室温で10分間インキュベートし、その後3ミリリットルの10％牛胎児血清入りRPMIを加えた。それから混合物をHuh-7細胞上に重層し、37℃で6時間インキュベートした。適当な抗体でラベルするか、またはRNAを分離するために細胞を回収するまでは、細胞培養培地を定期的に交換した。
【００９０】
実施例4:
ウイルスタンパク質合成
細胞質で作られたT7 RNAポリメラーゼは、T7プロモーターの下流のHCV cDNAを転写し、大量のHCV RNAを作製すると仮定されている。ウイルスRNAはその後翻訳され、ウイルス構造タンパク質（コア、E1、E2、およびp7）および非構造タンパク質（NS2、NS3、NS4AおよびB、NS5AおよびB）を産生するであろう。次に、RNA依存性RNAポリメラーゼ（NS5B）により制御されるウイルスRNAの複製がおそらく起こるであろう。子孫ウイルス粒子が作られ、組織培養培地中に分泌された場合には、これらの新しく作られたウイルス粒子は周囲の細胞に感染し、ウイルスの細胞間伝播が起こる結果となるであろう。
【００９１】
ウイルスタンパク質の合成は、蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）を用いてウイルスエンベロープタンパク質E1およびE2の細胞表面発現を計測することでモニターした。HCV E1およびE2の細胞表面発現は、以前に報告されている手順に従いフローサイトメトリーを用いて確認した（P. Koka, B.D. Jamieson, D.G. Brooks, J.A. Zack J. Virol. 73, 9089 (1999)。抗E1および抗E2抗体（Lot No. C569617）は、Austral Biologicals, San Ramon, CAから購入した。アイソタイプ抗体（ヒトIgG）を対照として用いた。対照細胞のバックグラウンド染色を除くために、抗体価を400倍にまで希釈した。フィコエリスリン（PE）でラベルしたマウス抗E1/E2抗体を2次抗体として用いて4℃で30分反応させ、細胞ペレットは抗体でラベルする前後に、3000 rpmで3分間遠心してPBSで洗浄した。
【００９２】
トランスフェクション後のFACS解析により、pCVH77CおよびAR3126プラスミドにより最初にトランスフェクトされた細胞におけるE1/E2の表面発現、およびトランスフェクトされた細胞から放出された新しく作られたウイルスの感染を受けた周辺細胞におけるE1/E2の表面発現の両者が検出される。したがって、E1/E2陽性細胞の数はトランスフェクション後の時間の経過とともに増加することが期待される。対照抗体を用いた場合に陽性細胞が1％であることと比較して、pCVH77CおよびAR3126プラスミドの共トランスフェクション後10日目において、Huh-7細胞の25％がE1/E2陽性となった（図1A）。トランスフェクションでT7プラスミドを省略すると、E1/E2の表面発現の著しい低下という結果となった（3〜4%）。E1/E2発現がウイルスタンパク質合成に依存していることは、ORF中に終止コドンを導入されたH77Cプラスミド変異体がE1/E2発現を誘導できないことにより確認された（図1A）。また、既知のHCV IRES阻害剤（IRNAまたは阻害剤RNAと呼ばれる；S. Dasら、J. Virol. 72:5638 (1998).）をコードするプラスミドを細胞へ共トランスフェクトすることにより、E1/E2の表面発現は完全に阻害された。トランスフェクション効率を評価するために、すべてのトランスフェクション反応にはグリーン蛍光タンパク質（EGFP）をコードする対照プラスミドが含まれている。共トランスフェクション後のE1/E2表面発現のタイムコースにより、一週間後の8〜12%、二週間後の25〜34%、および最終的に三週間後には34〜46%というように、E1/E2陽性細胞が徐々に増加することが示された（図1B）。E1とE2の発現の間に認められた差異は、おそらく本アッセイで使用した抗原特異的抗体の感度の違いによるものであろう。インターフェロンアルファおよびガンマの両者は、E1/E2発現をほんのわずかだけ阻害した。タイプ1aウイルスはインターフェロンの効果に広く抵抗性なので、この結果は期待されていたものである。
【００９３】
実施例5：
インビトロタンパク質合成
感染性子孫ウイルス粒子が培地中に放出されているかどうかを確認するために、H77CおよびAR3126プラスミドの共トランスフェクションを受けた細胞から細胞培養培地を分離し、それからデオキシリボヌクレアーゼとリボヌクレアーゼの混合物で消化をするか、またはバッファーのみで処理した。バッファー処理された培養上清の感染を受けた細胞が、89%の細胞でE2の表面発現を示していた一方で、デオキシリボヌクレアーゼ/リボヌクレアーゼ処理上清に感染後の細胞では82%がE2陽性であった。対照実験により、ヌクレアーゼ消化に用いられた条件下で、対照DNAおよびRNAサンプルの完全な分解が示された。これらの結果により、デオキシリボヌクレアーゼとリボヌクレアーゼ耐性ウイルス粒子がトランスフェクトされた細胞から分泌されていることが示された。
【００９４】
上清感染細胞のウイルス複製は、プラス鎖およびマイナス鎖ウイルスRNAを検出する適切なプライマーを用いた逆転写-ポリメラーゼチェーンリアクション（RT-PCR）で調べた。これらの上清をHuh-7細胞に感染させる前に、ウイルス力価が1500〜4000コピー/mlの上清（5 ml）それぞれを、10マイクログラムのDNAまたはRNAを完全に消化するの十分な条件である、1マイクロリットルのデオキシリボヌクレアーゼフリー膵臓リボヌクレアーゼ（Danes-free pancreatic Raze, Roche）および5マイクロリットルのRQ1リボヌクレアーゼフリーデオキシリボヌクレアーゼ（Promega）による、37℃、15分間の処理を行った。スタンダードとして、プラスミドをそれぞれXbaIまたはNdeIで切断することにより、pCVH77Cクローンからインビトロで転写したプラス鎖およびマイナス鎖RNAを作製した。560塩基対（bp）のプラス鎖RNAの5’端およびマイナス鎖RNAの5’端を検出して430 bpの増幅産物を生成するオリゴヌクレオチドプライマーペアーを用いて、RT-PCR解析を行った。RT反応には、プラス鎖に相補的なプライマー、
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を用いた。サンプルはその後、上記のリボヌクレアーゼで処理した。560bp産物は、
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と
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のプライマーペアーを用いて増幅した。430bp産物は、マイナス鎖に相補的なプライマー、
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を用いたRTとリボヌクレアーゼによる消化の後に、
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と
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のプライマーペアーを用いて増幅した。PCRによる増幅反応は、94℃で変性、60℃でハイブリダイゼーション、および72℃で伸長をそれぞれ1分ずつ行う反応を40サイクル行った。β-アクチンRNAを内部対照として用い、Promega Corp., Madison, WIから購入したプライマーペアーを用いて285bpの増幅産物を生成した。26量体のダイレクトプライマー
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および26量体のリバースプライマー
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を使用した。この増幅反応は、94℃で2分、（変性を94℃で30秒、ハイブリダイゼーションを65℃で1分、および伸長を68℃で2分）のサイクルを40サイクルという、製造者の説明に従って行った。
【００９５】
pCVH77CおよびpEGFP-N1またはpCVH77C、pEGFP-N1、およびAR3126をトランスフェクトした細胞から回収した細胞培養培地（5ml、1ml当たり約1500コピー）を、実施例5に記載されているようにデオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼで処理し、それから未処理Huh-7細胞への感染に用いた。8日後にトータル細胞RNAを分離し、560bpのプラス鎖および430bpのマイナス鎖PCR産物を検出する定性的RT-PCR解析にかけた。線状化したpCVH77Cからの転写により作製したインビトロで転写したプラス鎖およびマイナス鎖RNAを同じプライマーのセットを用いて増幅した。pCVH77Cをトランスフェクトした細胞から回収した上清を感染させた細胞においては、560bpの長さのHCVプラス鎖PCR産物だけが検出された。しかしながら、pCVH77CおよびAR3126を共トランスフェクトした細胞から回収した培養培地を感染させた細胞においては、560bpの長さのプラス鎖および430bpの長さのマイナス鎖PCR産物の両方が検出され、マイナス鎖RNA産生がRNA複製の間に認められることと一致する所見であった。pCVH77CおよびAR3126を共トランスフェクトした細胞から回収した培地においては、マイナス鎖PCR産物は検出されなかった。これらの結果は、pCVH77CおよびAR3126プラスミドをトランスフェクトした細胞から回収した上清が、培養中において未処理Huh-7細胞に感染可能なウイルス粒子を含んでいることを示す。これらの結果はまた、pCVH77Cプラスミドのみをトランスフェクトした細胞において、少量のウイルス粒子が産生されていることも示す。しかしながら、この調製物を未処理細胞に感染させた場合には、投与したプラス鎖RNAは検出されたが、マイナス鎖RNA合成により測定されたように活動的な複製は観察されなかった。リポフェクションではなく電気穿孔法を用いてプラスミドを細胞に導入した場合にも、同一ではないまでも、同様な結果が得られた。
【００９６】
実施例6：
変異体構築物におけるウイルス複製
チンパンジーで非感染性であること（M. Yanagi ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 2291 (1999).）、またはレプリコンを基にしたアッセイにおいてRNA複製が欠損していること（V. Lohmanら、Science 285, 110 (1999); K.J. Blight, A.A. Kolykholv, C.M. Rice. Science 290, 1972 (2000).）が以前に示されている変異体構築物を本実施例に用いた。三つの（タイプ1a）3’ UTR X領域欠失変異体（-98X, X-52, -42X）は、チンパンジーに非感染性であることが以前に見出されている一方で、可変領域欠失変異体（V-24）はチンパンジーに感染性であり、病気を引き起こす（M. Yanagi ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 2291 (1999).）。GDDモチーフがタイプ1bのバックグラウンドにおいてAAGに変えられているNS5B変異体は、レプリコンを基にしたアッセイにおいてRNA複製が完全に欠損していることが示されている（V. Lohmanら、Science 285, 110 (1999); K.J. Blight, A.A. Kolykholv, C.M. Rice. Science 290, 1972 (2000).）。五つの変異体構築物のすべてが、DNA構築物を最初にトランスフェクトしている間に、同様なレベルのE1の表面発現を示しており、トランスフェクトされた細胞においてT7 RNAポリメラーゼによる転写に引き続きウイルスタンパク質が合成されていることが示される。野生型および変異体プラスミドによる最初のトランスフェクション後のHCV E1の細胞表面発現は以下の通りであった：pCVH77C, (35%); GDD変異体 (22%); -98x (29%); -42x (39%); X-52 (30%)およびVR-24 (38%)。
【００９７】
野生型および変異体pCVH77Cをトランスフェクトされた細胞から回収した上清を感染させた細胞から分離したトータルRNAをRT-PCRで解析した。野生型pCVH77C、NS5B GDD変異体（GDD→AAG）、3’-UTR X領域欠失変異体 -98X、-42X、およびX-52、ならびに可変領域欠失変異体VR-24をHuh-7細胞にトランスフェクトした（M. Yanagi ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96,2291 (1999).）。すべてのトランスフェクション反応にはAR3126プラスミドが含まれている。トランスフェクトされた細胞から回収した組織培養培地（5 ml）を用いて、未処理Huh-7細胞に八日間感染させた。感染細胞から回収したトータルRNAに対して、上記のとおり560bpのプラス鎖および430bpのマイナス鎖RNAの存在をRT-PCRで解析した。ウイルスマイナス鎖RNAの検出にはプラス鎖RNAの検出より約10倍多いRNAを用いた。野生型および変異体DNAをトランスフェクトされた細胞から回収した組織培養培地に未処理細胞を感染させた場合、野生型およびVR-24のトランスフェクション由来の培養培地に感染した細胞において、E1/E2表面発現が検出された。-98X、X-52、-42X、およびGDD変異体は、ほとんどバックグラウンドレベルのE1/E2発現しか示さなかった。トータル細胞RNAのRT-PCR解析により、野生型およびVR-24感染細胞からはウイルスプラス鎖およびマイナス鎖特異的PCR産物両者の合成が示されたが、一方で-98X、X-52、-42X、およびGDD変異体感染細胞からはプラス鎖およびマイナス鎖RNAが検出されなかった。PCR解析でのこれらのRNA調製物においては、ウイルスDNAの汚染は認められなかった。感染細胞から分離したトータルDNAの中にインテグレートされたウイルスDNAが存在する証拠も認められなかった。
【００９８】
実施例7：
汚染の除去
デオキシリボヌクレアーゼ/リボヌクレアーゼ処理培養上清がウイルスcDNAまたはRNAに汚染されている可能性を除外するために、感染性HCV粒子と見られるものを含んでいる培養上清を、Huh-7細胞において三回連続して継代した。それぞれの継代の際には培地中に分泌されたウイルス粒子のみを細胞への感染に使用し、最終継代から回収した力価が約3〜5 x 104 RNA コピー/mlの培養培地を0、3、7、および10日間のHuh-7細胞への感染に用いた。
【００９９】
継代したウイルスを感染させた細胞から回収したトータル細胞RNAのRT-PCRを行った。実施例5に示される実験から回収したデオキシリボヌクレアーゼ/リボヌクレアーゼ処理組織培養培地をHuh-7細胞で三回継代した。最終継代から回収した、おおよその力価が40,000ゲノム相当/mlの培養上清（5 ml）を1x107のHuh-7細胞への感染に用いた。継代したウイルスを0、3、7、10および20日間感染させたHuh-7細胞から分離したトータルRNAを、RT-PCRによりウイルスのプラス鎖およびマイナス鎖RNAをモニターするために用いた。約106および107個の細胞から分離したRNAを、プラス鎖およびマイナス鎖RNAそれぞれを検出するために用いた。ウイルスのプラス鎖およびマイナス鎖RNA両者とも、感染から三日後に検出され、RNA合成は20日後まで徐々に増加した。インビトロで転写されたプラス鎖およびマイナス鎖RNAの既知の量から増幅したDNAを用いて直線のスタンダードカーブを作ることにより、RT-PCRのデータを定量化した。ベータ-アクチンの定量に対しては、示されている既知の数の細胞から抽出したRNAのRT-PCRにより、増幅DNAを作り出した。これらの結果から、細胞一つ当たりのプラス鎖およびマイナス鎖RNA分子の数は、それぞれ350および25であると概算された。定量的RT-PCRにより、所与の時間における細胞あたりのプラス鎖とマイナス鎖RNAの比は約15:1であることが明らかになった。予備的結果は、継代したウイルスに感染した細胞においてアクチノマイシンD抵抗性ウイルスRNAが合成されていることを示している。
【０１００】
平行して行った実験では、同じウイルス調製物を用いてHuh-7細胞を7および14日間感染させ、HCV非構造タンパク質特異的抗体による細胞内染色を行った。フローサイトメトリー解析により、培養中の細胞のほとんど70％においてNS3、NS4、およびNS5の存在が明らかになり、70％近くの細胞が継代ウイルスに感染していることが暗示された（図2）。これらの結果は、タイプ1b HCVプラスミドをトランスフェクトされた細胞から感染性HCVがうまく作製および継代されていることにより確認されている。
【０１０１】
実施例8：
感染性ウイルス粒子の可視化
感染性ウイルス粒子が電子顕微鏡で可視化できるかどうかを確認するために、抗E1および抗E2抗体を認識する金粒子（10 nm）に結合したヤギ抗マウス抗体を用いて、擬似感染およびウイルス感染した単層細胞（10日）を染色した。細胞を6穴プレート（Costar）中の0.45マイクロメートルTranswell膜上で培養し、図1に記載した最初の対照（トランスフェクション試薬のみ）またはプラスミドDNA（AR3126+pCVH77C）をトランスフェクトされた細胞由来の連続継代された上清に感染させた。感染から10日後に、3％パラホルムアルデヒドおよび1％グルタールアルデヒドを含むPBSを用いて4℃で一晩細胞を固定した。固定した細胞はそれからPBSで洗浄し、PBSに混ぜた20％正常ヤギ血清（NGS）でインキュベートしてブロッキングを行った。それから図1に記載されているマウス抗E1/E2一次抗体（あるいはアイソタイプ対照）で細胞を染色したが、この反応は2％NGS存在下において4℃で一晩行った。細胞をPBSで洗浄し、10 nmの金粒子に結合したヤギ抗マウス抗体（Ted Pella, Inc., Redding, CA）からなる二次抗体で一晩、2％NGS存在下でインキュベートした。それから細胞を1％四酸化オスミウム入りPBSで後固定し、エタノールで脱水してEpon中に包埋した。厚さ約70 nmの切片を作製し、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色を行い、JEOL-100CX電子顕微鏡（JEOL Ltd., Tokyo, Japan）を用いて透過型電子顕微鏡による検査をした。
【０１０２】
単層の薄切片の電子顕微鏡像により、擬似感染した細胞と比較して、核およびその他の細胞内小器官の損傷を含む、感染細胞の著しい損傷が示された。大きさが約40〜60 nmの金粒子の塊が、膜構造の中および周囲に観察された。非感染細胞では金粒子は検出されなかった。より高倍率での金粒子塊のさらに詳細な解析により、構築の様々な段階のウイルス粒子と一致する像が示された。検出されたウイルス粒子のあるものは、小胞体または小胞体/ゴルジを思わせる膜構造と見られるものから出芽する過程のものであり、一方ですでに細胞質内へ放出されたように思われるものも存在した。ウイルスエンベロープが明確に可視化できる粒子も存在した。継代したウイルスを密度勾配解析して得られた最初の結果は、電子顕微鏡で観察されたウイルスのおおよその大きさと一致することが確認された。
【０１０３】
本明細書で用いられたタイプ1a H77Cプラスミドは、HCV配列と隣接する5’および3’端にT7プロモーターを2つ含んでいることは注目される点である。したがって、pCVH77CおよびAR3126を最初にトランスフェクトされた細胞においては、プラス鎖およびマイナス鎖の両RNAが作られていると思われる。5’および3’プロモーターを両方含むプラスミドをトランスフェクトされた細胞のみが感染性ウイルス粒子を分泌しており、pCVH77Cから3’端T7プロモーターを欠失させることにより、これらの細胞ではプラス鎖RNAが大量に合成されているのも関わらず、非感染性になった。一つ以上のウイルスタンパク質の大量合成が、毒性または細胞損傷のために、ウイルス複製にとって有害でありうるので、プラス鎖およびマイナス鎖両RNAの存在が感染性ウイルスの産生に重要であると信じられている（M. M.C. Lai, C.F. Ware. Curr. Topics in Micro and Immunology. 242:117-134 (2000); D. Moradpour, P. Kary, C.M. Rice, H.E. Blum. Hepatology 28:1920201.(1998).）。プラス鎖RNAのみが合成されるpCVH77Cをトランスフェクトされた細胞は、感染性ウイルスを産生しないという最近の発見は、この考えと一致している（D. Moradpour, P. Kary, C.M. Rice, H.E. Blum. Hepatology 28:1920201.(1998).）。マイナス鎖RNAはタンパク質合成を弱め、それによって少量のタンパク質がより長期間にわたって合成され、ウイルス複製および新しいウイルスの培地への放出を容易にしているのかもしれない。または、インビトロで産生された二本鎖RNAが、HCVの成長の遅延および支持を伝導する可能性があるIFN-経路を活性化するのかもしれない。
【０１０４】
【表１】
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HeLa細胞と比較したHuh-7細胞におけるHCV E1およびE2の細胞表面発現。FACS解析の5日前に、HCVクローンおよびT7ポリメラーゼを細胞にトランスフェクトした。結果は、HeLa細胞ではなく、ヒト肝細胞がE1およびE2の発現を支持することを示している。
【０１０５】
【表２】
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HCV cDNAおよびT7 RNAポリメラーゼ遺伝子をトランスフェクトされた細胞から回収した培地を用いて、デオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼ混合物で処理前（未処理）および処理後に新しいHuh-7細胞に感染させた。結果は、新しい細胞への細胞除去培地の感染がキャプシド形成したウイルスによるものであり、HCV DNAまたはRNAの汚染によるものではないことを示している。
【０１０６】
本発明には上記実施例を参照として記載しているが、本発明の真意および視野の範囲内で変更および変動が包含されているものと理解されよう。したがって、本発明は特許請求の範囲によってのみ制限される。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】フローサイトメトリー（FACS）によるHCVエンベロープタンパク質E1およびE2の表面発現。（A）pEGFP-N1およびpCVH77C (野生型)（パネル左）、pEGFP-N1、pCVH77C、およびAR333126（T7-プラスミド）（パネル中央）、ならびにpEGFP-N1、終止コドン変異体pSC1、およびAR3126（パネル右）を1X107個のHuh-7細胞に共トランスフェクションした後に、E1/E2の表面発現を確認した。トランスフェクションしていない細胞、およびpEGFP-N1をトランスフェクトした細胞のFACS解析は、AR3126を欠いたものと同様なので示していない。（B）トランスフェクションから1、2、および3週間後のE1およびE2の細胞表面発現。トランスフェクションしていない細胞、およびpEGFP-N1をトランスフェクトした細胞を抗E2抗体でラベルしたもののフロープロフィールは、抗E1抗体でラベルしたものと同様であり、従って示していない。
【図２】HCVの非構造タンパク質の発現を細胞内フローサイトメトリー解析したものを示す。感染Huh-7細胞の透過処理および染色は、標準プロトコールと製造業者（BD Pharmingen, San Diego, CA）から供給されたキットを用いて行った。一次抗体の抗NS3、NS4、およびNS5抗体は、Austral Biologicalsより購入した。二次抗体のヤギPEラベル抗マウス抗体は、図1でラベルに用いたものと同じである。
【図３】パラホルムアルデヒドを用いたHCVのショ糖密度勾配を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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