(57)【要約】経済的及び便宜的な方法は、電子供与体の再利用のために、電子供与体と酵素／基板システムとの組合せの中で、アミノ酸デアミナーゼを使用して、対応するα−アミノカルボン酸又はそれらの塩を酸化させて、さらに、Ｄ−又はＬ−乳酸塩脱水素酵素を使用して、製造された、対応するα−ケトカルボン酸又は塩を還元させることからなる、対掌体の高精度での精製でα−ヒドロキシカルボン酸又はそれらの塩類の調整を示している。生成されるα−ヒドロキシカルボン酸、水和物及びそれらの塩類は、キラルな化合物、特に調合薬の調整での価値のあるコンポーネント及び中間体である。この発明も、α−ヒドロキシカルボン酸、水和物及びそれらの塩類の製造でのα−アミノカルボン酸、水和物及びそれらの塩類、並びに、組合せる酵素システムの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アミノ酸デアミナーゼ又は酸化酵素を使用して、α−アミノカルボン酸、水和物又はそれらの塩を酸化することからなり；
そして、続いて、脱水素酵素を使用して、それらの生成物を還元する、キラルのα−ヒドロキシカルボン酸、水和物又はそれらの塩の製造方法。
【請求項２】
基板濃度は、約１ｍＭから５Ｍまでの間の範囲にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記脱水素酵素は、Ｌ−乳酸塩脱水素酵素（ＥＣ＃　１．１．１．２８）又はＤ−乳酸塩脱水素酵素（ＥＣ＃　１．１．１．２７）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記脱水素酵素は、牛の心臓、ウサギの筋肉、豚の心臓、豚の筋肉、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（スタフィロココカス　エピデルミディス）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ（レウコノストック　メセンテロイデス）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉ（ラクトバシルルス　レイカマンニイ）及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（バシルルス　ステアロサーモフィルス）からなる群から選択される由来のＬ−又はＤ−乳酸塩脱水素酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｌ−アミノ酸デアミナーゼ又は酸化酵素の由来は、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｙｘｏｆａｃｉｅｎｓ（プロテウス　ミクソファシエンツ）、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｒｅｔｔｇｅｒｉ（プロテウス　レットトゲリ）、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｃｅｌｌｕｌａｎｓ ＡＭ８（セルルロモナス　セルルランス　ＡＭ８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｒｏｔａｒｕｍ ２Ｐｆａ（バシルルス　カロタルム　２Ｐｆａ）、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ（プロテウス　ブルガリス）、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ（プロテウス　ミラビリス）、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ（モルガネルラ　モルガニイ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｐ−５０１（シュードモナス　ｓｐ． Ｐ−５０１）、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｐ． ＰＣＭ １２９８（プロビデンシア　ｓｐ． ＰＣＭ １２９８）、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｔｓ（プロビデンシア　アルカリファシエンツ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（コリネバクテリウム）、Ｃａｌｌｏｓｅｌａｓｍａ ｒｈｏｄｏｓｔｏｍａ（カルロセラスマ　ロードストマ）、Ｃｒｏｔａｌｕｓ ｔｅｒｒｉｆｉｃｕｓ ｔｅｒｒｉｆｉｃｕｓ（クロタルス　テルリフィクス　テルリフィクス）、Ｃｒｏｔａｌｕｓ ａｄａｍａｎｔｅｕｓ（クロタルス　アダマンテウス）、Ｃｒｏｔａｌｕｓ ａｔｒｏｘ（クロタルス　アトロックス）、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ（アグキストロドン　ピスシボルス　ピスシボルス）、Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ ｍｕｃｒｏｓｑｕａｍａｎｔｕｓ（トリメレスルス　ムクロスクアマンツス）、Ｏｐｈｉｏｐｈａｇｕｓ ｈａｎｎａｈ（オピオファグス　ハンナフ）、Ｎａｊａ ｎａｊａ ｋａｏｕｔｈｉａ（ナジャ　ナジャ　カオウシア）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ＰＣＣ ７９４２（シネチョココクス　ＰＣＣ ７９４２）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ＰＣＣ ６３０１（シネチョココクス　ＰＣＣ ６３０１）、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ（アナシスチス　ニズランス）、Ａｍｐｈｉｏｒａ ｃｒａｓｓｉｓｓｉｍａ（アンフィオラ　クラスシスシマ）、Ｇｙｍｎｏｇｏｎｇｒｕｓ ｆｌａｂｅｌｌｉｆｏｒｍｉｓ（ジンノゴングルス　フラベルリフォーミス）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ（クラミドモナス　レインハルドチイ）、Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ（プレウロクリシス）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ネイスセリア　メニンジチディス）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ Ｙ２４４−２（トリコデルマ　ビリデ　Ｙ２４４−２）及びＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ（ネウロスポラ　クラスサ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｌ−アミノ酸デアミナーゼ又は酸化酵素の由来は、大腸菌であり、当該大腸菌は、Ｌ−アミノ酸デアミナーゼのために遺伝子でクローンされている、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記キラルのα−ヒドロキシカルボン酸塩は、ナトリウム又はカリウムの塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記キラルのα−ヒドロキシカルボン酸は、置換された又は置換されていない（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−２−ヒドロキシアルカン酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記キラルのα−ヒドロキシカルボン酸は、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−２−ヒドロキシブタン酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−２−ヒドロキシペンタン酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−２−ヒドロキシヘキサン酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−メチルペンタン酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−２−ヒドロキシ−４−ペンタン酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−２，３−ジヒドロキシプロパン酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−２，４−ジヒドロキシプロパン酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−３−クロロ−２−ヒドロキシプロパン酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−メルカプトプロパン酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−２−ヒドロキシ−４−チオメチルブタン酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−フェニル酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−ｐ−ヒドロキシフェニル酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−２−ヒドロキシ−４−フェニルブタン酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−インドリルプロパン酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−３−メチル−２−ヒドロキシブタン酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−４−メチル−２−ヒドロキシペンタン酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−４，４−ジメチル−２−ヒドロキシペンタン酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−３−ヒドロキシ−２−ヒドロキシプロピオン酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−２−ヒドロキシ−４−フェニルブタン酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−３−（２−ピリジル）−２−ヒドロキシプロピオン酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−３−（３−ピリジル）−２−ヒドロキシプロピオン酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−３−（４−ピリジル）−２−ヒドロキシプロピオン酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−３−（１−ナフチル）−２−ヒドロキシプロピオン酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−３−（２−ナフチル）−２−ヒドロキシプロピオン酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−ｐ−ヒドロキシフェニル−２−ヒドロキシプロピオン酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−ｐ−Ｆ−フェニル−２−ヒドロキシプロピオン酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−α−ヒドロキシグルタン酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−２−ヒドロキシアジピン酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−２−ヒドロキシ−５−ウレイドバレン酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−２−ヒドロキシ−６−ウレイドノヘキサン酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−メルカプト−２−ヒドロキシプロピオン酸、（２Ｒ）−又は（２Ｓ）−インドール−２−ヒドロキシプロピオン酸及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
下記構造式を有するα−アミノカルボン酸塩、水和物又はそれらの塩は、
【化１】
2004511249.tif 000008
ここで、Ｒ１は、水素、又は、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、ホスホニル、スルホニル、チオアセチル、チオプロピオニル、フェニル、Ｃ１−Ｃ６のシクロアルキル、チエニル、ヒドロキシル、ナフチル、ピリジニル、アミノ、アミノアルキルチオ、カルボキシアルキルチオ、カルボキシアミノアルキルチオ、グアニジノ、ニトログアニジノ、ウレイド、アミノオキシ、グアニジノオキシ、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ３のアルコキシ、ベンジルオキシ、３−（２，３−ベンゾピロール）、３−（５−ヒドロキシ−２，３−ベンゾピロール）、３−（５−フルオロ−２，３−ベンゾピロール）、３−（ベンゾチオフェン）、メチルイミダジル、アミド、３−アントラニロイル、Ｎ−（３−ヒドロキシ−４−ピリドン）、リボシルアデノシンアルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４のアルキルチオ、ベンジルチオ、ｐ−メトオキシベンジルチオ、フェニルチオ、カルバンチオイル、システエインジスルフィデ、アルキルセレノ、アルキルスルホン、アルキルスルホキシデ、アルキルスルホキシミル、ビニル、アリール、プロパルギルからなる群から選択された１以上の置換基で置換された直鎖状又は分技状Ｃ１−Ｃ９のアルキルであり、かつ、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、独立して、水素、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノ、メチル、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ３のアルコキシ、ベンゾロキシ、ホスホニル及びベンゾイルからなる群から選択されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
９５％以上の対掌体の精製で、前記キラルのα−ヒドロキシカルボン酸塩の調整を含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
還元工程は、電子供与体を再利用するための電子供与体と酵素／基板システムとを組合せて達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記電子供与体は、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドであり、電子供与体を再利用するための前記酵素／基板システムが、蟻酸エステル脱水素酵素／蟻酸エステルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
バッチ方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
連続的方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
酸化工程は、全体のセルで実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
反応容器又は発酵用容器の中で下記のように実行される、請求項１に記載の方法。
ａ）酸素散布を有し；
ｂ）Ｌ−アミノ酸デアミナーゼ（酸化する酵素）及びα−アミノカルボン酸のために遺伝子でクローンされた大腸菌の溶液からなる反応混合物を含み；
ｃ）蟻酸エステルイオン（共同基板）、メルカプトエタノール、ジチオトレイトール（酸化防止剤）、トリス−ＣＩ（バッファー）、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（電子供与体）、Ｄ−乳酸塩脱水素酵素（還元する酵素）、及び、蟻酸エステル脱水素酵素（電子供与体の再生／再利用のための酵素／基板システム）の水溶液を与え；
ｄ）形成された化合物は、イオン交換又は溶解力のある抽出によって分離される。
【請求項１８】
α−ヒドロキシカルボン酸、水和物及びそれらの塩類の製造のための組合せる酵素システムのための基板としてα−アミノカルボン酸、水和物及びそれらの塩類の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、α−アミノカルボン酸からα−ヒドロキシ中心の対掌体の高い精度の精製でα−ヒドロキシルボン酸のＲ−又はＳ−の異性体の一方を合成する、経済的、便宜的、用途の広い方法に関する。アミノ酸デアミナーゼ（ＡＡＤ、さらに、アミノ酸酸化酵素、ＡＡＯとして参照される）、乳酸塩脱水素酵素（ＬＤＨ）、電子供与体、及び、電子供与体を再利用するための酵素／基板システムの組合せる酵素システムによって変換は触媒される。本発明は、さらに、α−アミノカルボン酸、水和物及びそれらの塩類、並びに、α−ヒドロキシカルボン酸、水和物及びそれらの塩類の製造で組合せる酵素システムの使用に関する。
【０００２】
（発明と先行技術との背景）
キラルのα−ヒドロキシ（さらに、２−ヒドロキシとして時々参照される）カルボキシエステル、酸及びそれらの塩類が、有用なキラルの化合物の種類、特に調合薬にしばしば変換される、用途の広い合成中間体であるので、キラルのα−ヒドロキシ（さらに、２−ヒドロキシとして時々参照される）カルボキシエステル、酸及びそれらの塩類の合成は、相当に重要である。α−ヒドロキシカルボキシエステル、酸、それらの塩類のキラルは、α位置、例えば、エポキシド、アルキルエステル、ヒドラジニルエステル、α−Ｎ−アルコキシアミノエステル、α−アミノエステルでの立体化学の保持によって、又は、α位置に求核性の置換を含む反応で，例えば、適切な求核分子と対応するα−トリフレートエステルの反応で立体化学の変換によって、他のキラルの機能性を得られるかもしれない。
【０００３】
分子中に付加的なキラル支持の官能基を所有する、キラルのα−ヒドロキシカルボキシエステル、酸、水和物及びそれらの塩類の有効性は、付加的なキラルの中心を含んでいる化合物の合成のためにさらに可能性を提示する。α位置での水酸基がキラル支持の官能基の立体化学な変換を促進して、内部制御要素を提供する、多数の例がある。例えば、β−γ−不飽和化合物のエポキシ化は、シャープレスタイプの中間体にアクセスを与え、β−γ−不飽和化合物の脱水は、炭水化物合成で有効性を持っている多価アルコールを製造し、及び、４−オキソ化合物のジアステレオ選択的な還元は、条件の選択に依存して、ｓｙｎ−又はａｎｔｉ−１，３−ジオールの一方を提供する。α−ヒドロキシカルボキシエステル、酸、水和物及びそれらの塩類が、価値のある合成実体であるので、多くの努力が、キラルの形成の調整のための方法の開発及び従来の化学薬品と下記に示される最近の酵素の方法との両方の例に消費された。
【０００４】
重要な変換が、比較的反応しなく、立体化学に敏感な中心で非常に極性の化合物で水に敏感な試薬及び低温の使用を一般に含んでいるので、α−アミノカルボン酸又はそれらの塩類からα−ヒドロキシカルボン酸又はそれらの塩類を直接製造する従来の化学的方法の例は、ほとんどない。ニトロ化及び加水分解によるＤ−アミノカルボン酸の脱アミノ反応（ＷｉｎｉｔｚＭ．， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９５６， ７８， ２４２３）は、Ｌ−形状のα−ヒドロキシカルボン酸へのアクセスを提供することができるが、制限のある有効性の高価な出発材料の使用を要求する。出発材料（ｋｕｎｚ Ｈ．， ｅｔ ａｌ． Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ． １９８７， ２８， １８７３）としてより容易に利用可能及び安価なＬ−アミノカルボン酸の使用は、数工程（数週間の反応時間）を要求し、多数の副生成物を形成する可能性があり、Ｄ−ヒドロキシカルボン酸誘導体だけの適度な生成だけになる。
【０００５】
α―ケトカルボン酸又はエステルからα−ヒドロキシカルボン酸を合成する方法の多くの例がある、しかしながら、特に出発材料が非対称の中心を欠くので、これらの方法もそれらの一般的な有効性で制限されている、さらに、比較的高価及び制限のある有効性である。エノン還元を例外として、生成物のキラルは、いくつかの合成の工程を要求するキラルの補助物（基板コントロール）の化学量論の使用又は大容量及び高価なキラルの還元剤（試薬コントロール）のいずれかから発生する。例えば、キラルの９−ボラビシクロ［３．３．１］ノナン（９−ＢＢＮ）誘導体（Ｂｒｏｗｎ Ｈ． Ｃ． ｅｔ． ａｌ． Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． １９８６ ５１， ３３９６）を使用するα−ケトエステルの非対称の還元は、化学量論の多量のこれらの複雑な還元剤を必要とする。オキサゾリドンオキシダントを有するキラルのオキサゾリドンエノレートのヒドロキシル化（Ｅｖａｎｓ， Ｄ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．， １９８５， １０２， ４３４６）は、α−ヒドロキシイミド中間体のクロマトグラフィーの溶液が付加的なソルボリシス工程に先立って試みられることを必要とし、妨害されたα−ケトカルボン酸が使用される場合、低収率となる。キラルのα―アルコキシカルバニオンのカルボキシル化（Ｃｈａｎ Ｃ． Ｍ． ｅｔ． ａｌ． Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ． １９９０， ３１， １９８５）は、化学量論の量の高価な還元剤（Ｒ）−又は（Ｓ）−ＢＩＮＡＬ−Ｈを要求し、金属交換反応段階の後に危険な錫残留物の処分を必要とする。上記の方法とは対照的に、エノンのエナンチオ選択の還元は、触媒量だけのキラルのオキサザボロリジンを使用して、達成することができる、（Ｃｏｎｅｙ． Ｇ． Ｊ． ｅｔ． ａｌ． Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ．， １９９０， ３１， ６１１）、しかしながら、４つの化学変換の配列は、明白なコスト及び含有物の生成で、α−ヒドロキシエステルに変換するために、最初に形成されたキラルのアルコールを必要とする。
【０００６】
キラルのα−ヒドロキシカルボン酸を製造する酵素の方法は、さらに、前駆体としてケトンのカルボキシエステル又は酸に依存する。また、精製された又は分離された還元酵素によって触媒作用が及ぼされる（例えば、 Ｇｈｉｓａｌｂａ， Ｏ． ｅｔ．ａｌ． Ｕ． Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，０９８，８４１； Ｗａｎｄｒｅｙ， Ｃ． ｅｔ． ａｌ． Ｕ． Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４，３２６，０３１； 及び　Ｃａｓｅｙ， Ｇ． ｅｔ ａｌ． Ｕ． Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，６８６，２７５）。出発原料としてα−アミノカルボン酸又はそれらの塩類を利用する、公表された方法はない。これらは酵素還元方法は、一般的に電子供与体、典型的に還元されたピリジン・ヌクレオチド又はフラビン・ヌクレオチド、及び、その再生の効率的なシステムの付加、つまり、別の酵素の付加及びその基板の付加を要求する。エノン還元で、これらの方法が、さらに、触媒量だけのキラルの還元剤（これらの場合、酵素及びその共同因子）を要求する長所を持ち、キラル支持の基板からキラルのα−ヒドロキシカルボン酸を製造する可能性がある。
【０００７】
これらの生体触媒の方法が、実際的であるならば、それらは他の方法に関して有効なコストであるに違いなく、得られる生成物は高い異性体の精製及び化学的生成で製造されるに違いない。これらの要因は、一般に、酵素システムの耐久性、特異性及び基板回転変換の割合の機能である。その使用される酵素の由来は、これらの酵素の反応の特性及び効能に重要である。それらが異なる由来、例えば、異なる微生物から分離されたならば、同じ型の酵素さえ、反応特異性、基板特異性、立体特異性のような構造の要因と、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ（ミカエリス−メンテン）の定数（ＫＭ）及び禁止定数（Ｋ１）のような運動の要因との両方によって異なる。例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｎｆｕｓｕｓ（ラクトバシルルス　コンフスス） からのＤ−乳酸塩脱水素酵素は、α−ケトバレン酸塩、α−ケトカプリン酸塩及びα−ケト−β−メチルバレン酸塩を還元するだけでなく、ピルビン酸塩、α−ケトブチル酸塩及びフェニルピルビン酸塩を変換するが、一方、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（Ｓ． ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）からのＤ−乳酸塩脱水素酵素が、α−ケト−β−メチルバレン酸塩又は２−オキソアジピン酸塩だけでなく、ピルビン酸塩、フェニルピルビン酸塩及びα−ケトブチル酸塩を変換する。個々の酵素／基板システムの態様は、各場合に関してテストされ、いくつか参照されるけれど、一般化によって予想することができず、その結論を指摘することができない（例えば、ヨーロッパ　特許 ０ ０２４ ５４７）。これらの酵素の変換の文献の中で報告された多数の記述（それらのうちのいくらかは下記に引用される）があるが、それらは低い収率に慣習的に帰着した。また、それらの一般的な有効性は下記に実証される。
【０００８】
（Ｒ）−オキシニトリラーゼは、（Ｒ）−α−ヒドロキシカルボン酸にアクセスを与えるために、後に加水分解される、キラルのシアノヒドリンの合成に触媒作用を及ぼす（Ｚｅｉｇｌａｒ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉ １９０， ５７５）。シアン化水素の高い有毒の水なしの調整は、Ｒ−異性体だけの７４％の収率として低く種々のエナンチオ選択性を与える酵素の反応のために必要になる。その（Ｓ）−オキシニトリラーゼの使用は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． ２００， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｅｒｌｉｎ（１９９９）， １９３−２２６のトピックに一般に記述される。
【０００９】
酵素の運動の溶液の例は、キラルのα−ヒドロキシエステル（Ｋａｌａｒｉｔｉｓ Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． １９９０， ５５， ８１２）を与えるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（シュードモナス　フルオレスセンス）リパーゼによって触媒作用を及ぼされたもの、並びに、キラルのα−ヒドロキシ酸を与えるグリコレート酸化酵素及びＤ−乳酸塩脱水素酵素（Ａｄａｍ Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ １９９８， ９， ３５１）によって触媒作用が及ぼされたものを含んでいる。特別の対掌体の収率が、非相称の基板の溶液の中で、最大５０％まで制限されているので、これらの方法は、本質的に欠陥がある。実際上、高い光学の精製を達成するためにパーセント変換を注意深くコントロールしなければならないので、収率はさらに引き下げられる。
【００１０】
多くの研究者は、哺乳類組織（例えば、ウサギの筋肉及び豚と牛の心臓、Ｋｉｍ， Ｍ．−Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９８８， １１０， ２９５９）並びにバクテリア（例えば、Ｂａｃｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ， Ｌｕｙｔｅｎ， Ｍ． Ａ． ｅｔ． ａｌ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９８９， １１１， ６８００）から得られたそれらを含む様々な由来から分離されたＳ−乳酸塩脱水素酵素（Ｓ−ＬＤＨ又はＬ−ＬＤＨ）によって触媒作用が及ぼされたα−オキソカルボン酸の還元を調査した。多数のα−オキソカルボン酸は、ＮＡＤＨ酸化のコースに続くことにより決定されるようなＳ−ＬＤＨに対する測定可能な活動を示すとして文献に記述されたが、ある場合のみ、調整の規模の実験は、完全に特徴づけられた生成物のα−ヒドロキシカルボン酸、及び、確立された還元のエナンチオ選択性で実行された。基板として調査された化合物は、さらに、α−オキソカルボン酸脱水素酵素を有する還元の可能な有用な境界を予想する傾向がある。これらの反応の一般的な有効性は、したがって、解釈に従う。完全に特徴づけられた時、これらの方法の大部分は、よい化学的な収率及び高い光学的な精製で、（Ｓ）−α−ヒドロキシカルボン酸を提供する。しかしながら、いくつかの基板の反応性は制限されて、１，６−ビスホスフェート（ＦＢＰ）のようなアロステリック活性剤の使用を必要としてもよく、完成に移るために１週以上かかる。これは、１−３日の典型的な反応時間に相当する。
【００１１】
（Ｒ）配置を有するα−ヒドロキシカルボン酸を得るために、触媒作用がＲ−ＬＤＨ又はＤ−ＬＤＨによって及ぼされたα−オキソカルボン酸の還元も研究された。この酵素は、大規模に分離することができる（Ｈｕｍｍｅｌ， Ｗ． ｅｔ． ａｌ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９８３， １８， ７５）。最近の研究は、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ（ＬＭ−Ｒ−ＬＤＨ）とＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＳＥ−Ｒ−ＬＤＨ）からのＲ−ＬＤＨに注目した（Ｓｉｍｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９８９， ２２， １６９ 及び Ｋｉｍ Ｍ． Ｊ． ｅｔ． ａｌ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ． １９９１， ３２６）。α−オキソカルボン酸基板の制限のある数だけが、測定可能な活動を示すと示された。また、調整の規模で還元された。
【００１２】
精製された還元酵素又は分離された還元酵素を使用するとき、以前に言及されたように、補酵素の酵素の再生用の効率的なシステム、つまり、別の酵素及びその基板が要求される。これらの反応については、触媒量のＮＡＤＨが、別の酵素、通常、蟻酸エステル脱水素酵素（ＦＤＨ）（二酸化炭素への蟻酸エステルイオンの酸化でのＮＡＤ＋を利用する）を要求して、典型的には再生するシステムと共に使用される（Ｓｈａｋｅｄ Ｚ． ｅｔ． ａｌ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９８０， １０２， ７１０５）。ヤマザキとマエダは、ＮＡＤＨ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ（ステレプトココクス　ファエカリス）からのベンゾイル蟻酸エステル脱水素酵素の援助でベンゾイル蟻酸からのＲ−（−）−マンデル酸の合成のためのバッチ及び連続的な方法（Ａｇｒｉｃｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９８６， ５０， ２６２１ 及び ３２１３）を説明する。ヨーロッパ特許 ０ ０２４ ５４７は、さらに、酵素薄膜リアクター中で、対応するα−ヒドロキシカルボン酸の中への水可溶α−ケトカルボン酸の連続的な酵素変換の方法ついて記述する。その変換は、分子量がポリエチレングリコールに結合することにより増加させられたＮＡＤ（Ｈ）が存在する状態で、並びに、蟻酸エステル脱水素酵素及び蟻酸エステルによる同時のＮＡＤＨ再生を有する乳酸塩脱水素酵素が存在する状態で行なわれる。
【００１３】
前駆体としてα−ケトカルボン酸を使用して、さらに、還元に制限されるが、立体特異性の微生物学の変換によるキラルのヒドロキシカルボン酸の製造も利用された。一方の完全な微生物、例えば、菌類（例えば、Ｍｕｃｏｒ（ムコア）， Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ（ゲオトリチュム）， Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（サクカロミケス）， Ｃａｎｄｉｄａ（カンジダ））又はバクテリア（例えば、Ｐｒｏｔｅｕｓ（プロテウス）， Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（シュードモナス））又はそれらの抜粋は、生体触媒として使用された。これらの場合の基板の還元も、基板に特有の脱水素酵素によって達成される。電子共与体も、このプロセスのために必要になり、例えば、炭水化物（例えば、グルコース）、蟻酸エステル、エタノール、水素又は電気化学のセルの陰極であるが、一般に補酵素、例えば、還元されたニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）及び還元されたニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド・リン酸（ＮＡＰＤＨ）のようなピリジン・ヌクレオチドによって、又は、還元されたフラビン・モノヌクレオチド（ＦＭＮＨ）及び還元されたフラビン・アデニン・ジヌクレオチド（ＦＡＤＨ）のような還元されたフラビン・ヌクレオチドによって提供される。還元された補酵素は、自然又は合成媒介（例えば、フェルドキシン、ビオロゲン）によって、競合する電子受容体が形成される一連の酵素触媒作用が及ぼされた工程で、又は、電子移動によって製造されて、通常、順番にある。しかしながら、媒介から電子を直接受理することができるいくつかの還元酵素が知られている。しかしながら、これらのシステムの全ては、まだ、出発原料のα−ケトカルボン酸のコスト及び有効性によって制限されている。
【００１４】
出発原料のα−ケトカルボン酸のコスト及び化学的有効性が禁じることができるので、α−ケトカルボキシ酸の製造用の有望な方法は、対応するケトカルボン酸（Ｍａｓｓａｄ， Ｇ． ｅｔ． ａｌ． Ｊ． ｏｆ Ｂａｃｔ．， １９９５， １７７， Ｎｏ． ２０，５８７８）及び逆（Ｐａｎｔａｌｅｏｎｅ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ： Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ， ２００１， １１： ７９５； Ｇａｌｋｉｎ， Ａｎｄｒｅｙ， ｅｔ ａｌ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １９９７， ６３， Ｎｏ． １２，４６５１）への容易に利用可能及び安価なＬ−アミノカルボン酸を変換するアミノ酸デアミナーゼ又は酸化酵素（例えば、Ｌ−アミノ酸： 酸素オキシドリダクターゼ； ＥＣ １．４．３．２）の利用である。アミノ酸酸化酵素は、典型的にはそれらは営利上利用可能ではないが、由来（表１で示されるように）の数で研究され、分離された。
【００１５】
【表１】
2004511249.tif 000002
【００１６】
【表２】
2004511249.tif 000003
【００１７】
【表３】
2004511249.tif 000004
【００１８】
【表４】
2004511249.tif 000005
アミノ酸デアミナーゼの活動は、したがって、抜粋又は全体のセルでほとんど研究された。乳酸塩脱水素酵素で、化合物の制限のある数だけが、様々な由来からのアミノ酸デアミナーゼの基板として測定可能な活動を持っていることが実証された、また、それらは、アミノ酸デアミナーゼ（例えば、当然、生成するα−アミノカルボン酸だけが、文献に記述された）を有する酸化の可能な境界を予想する傾向がある。生成物のケトカルボン酸はめったに完全に特徴づけられない、代わりに、有色の鉄コンプレックスの構成の観察によりコース又は反応に続くことにより通常推論される。反応は基板の類似及び特異性に関して広く可変であり、例えば、バクテリアで見つかった型のアミノ酸酸化酵素の類似及び特異性は、動物セル及び蛇毒で見つけられた型のフラビン・アミノ酸酸化酵素と異なる。さらに、それらは、調整の規模でまだ実行されていない。さらに、これらの反応の成功はしたがって、解釈に従う。
【００１９】
これらの酵素システムが、各酵素の基板の特異性は充分に広かった、及び、方法が実際的に役に立つのに各酵素の回転率が充分に大きかったことが組合せれるならば、原料として、安価及び容易に利用可能なＬ−α−アミノカルボン酸又はそれらの塩類を使用して、ホモキラルのα−ヒドロキシカルボン酸の直接の構成が実行される。上述したように、α−ヒドロキシカルボン酸又はそれらの塩類の酵素の製造に関係のある先行技術の基板として、Ｌ−α−アミノカルボン酸及びそれらの塩類は、記述されなかった、それに応じて、そのような酵素の生体内変化中の適応性及び振る舞いに関して調査されていなかった。
【００２０】
本発明は、共同因子としてＮＡＤＨとアミノ酸デアミナーゼ及びＬ−乳酸塩脱水素酵素又はＤ−乳酸塩脱水素酵素の組合せる酵素システムを使用して、α−アミノカルボン酸、水酸化物、及び、それらの塩類のエナンチオ選択性の酵素の酸化並びに還元によって、エナンチオメリカリィな純粋なＤ−及びＬ−α−ヒドロキシカルボン酸、水酸化物、及び、それらの塩類の生成の効率的な方法を示す。３つめの酵素システムは、共同因子を再生成するために蟻酸エステル脱水素酵素でギ酸の酸化を利用する。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本発明の１つの態様は、キラルのα−ヒドロキシカルボン酸又はそれらの塩類の生成の原料として、安価及び容易に利用可能なα−アミノカルボン酸又はそれらの塩類の使用を考慮に入れる方法を提供する。方法は、アミノカルボン酸、水酸化物及びそれらの塩類が、Ｌ−アミノ酸デアミナーゼを有する、対応するα−ケトカルボン酸又はそれらの塩類に脱アミノされ、続いて、共同因子／電子供与体として牛の心臓、ウサギの筋肉、豚の心臓又は豚の筋肉からのＬ−乳酸塩脱水素酵素又はＮＡＤ（Ｈ）を有するＳｐａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ， Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ， Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉ， 又はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのＤ−乳酸塩脱水素酵素のいずれかを使用する、目的のα−ヒドロキシカルボン酸又はそれらの塩類に還元されることに特徴づけられる。酵素の共同因子／電子供与体を再生成するために、３つめの酵素システムは、蟻酸エステル脱水素酵素でギ酸の酸化を利用する。両方のバッチ又は連続的な反応方法が、可能である。
【００２２】
本発明の別の態様は、α−ヒドロキシカルボン酸、水酸化物及びそれらの塩類の製造での、α−アミノカルボン酸、水酸化物及びそれらの塩類、並びに、組合せる酵素システムの使用に関する。
【００２３】
また、本発明の別の態様は、α−アミノカルボン酸、水酸化物及びそれらの塩類からα−ヒドロキシカルボン酸、水酸化物及びそれらの塩類を生成する方法の使用に関する。
【００２４】
（発明の好ましい具体例の詳細な説明）
本発明は、Ｌ−及びＤ−α−ヒドロキシカルボン酸又はそれらの塩類の両方の生成の原料として、安価及び容易に利用可能なＬ−α−アミノカルボン酸又はそれらの塩類の使用を考慮に入れる方法を提供する。基板のアミノカルボン酸、水酸化物及びそれらの塩類が、電子供与体の存在下で、酵素Ｌ−アミノ酸デアミナーゼを有する、対応するα−ケトカルボン酸又はそれらの塩類に脱アミノされ、得られた生成物が、Ｌ−乳酸塩脱水素酵素又はＤ−乳酸塩脱水素酵素のいずれかを使用して、続いて目的のα−ヒドロキシカルボン酸又はそれらの塩類に還元される。酵素の電子供与体／共同因子を再生成するために、３つめの酵素／基板システムは、蟻酸エステル脱水素酵素でギ酸の酸化を利用する。この発明の方法は、α−アミノカルボン酸、水酸化物及びそれらの塩類が高い収率で対応するα−ヒドロキシカルボン酸、水酸化物及びそれらの塩類へ変換されることを可能とする、したがって、α−ヒドロキシカルボン酸及びそれらの塩類の製造の有用なコスト有効な方法である。
【００２５】
α−ケトカルボン酸、水酸化物及びそれらの塩類へのα−アミノカルボン酸、水酸化物及び塩類の変換を処理することができる限り、様々なアミノ酸酸化酵素は使用することができる。発明の方法で使用可能な酵素の例は、表１で示され、Ｌ−アミノ酸デアミナーゼ（例えば、Ｌ−アミノ酸酸化酵素）、フェニルアラニン酸化酵素、フェニルアラニン脱水素酵素及びそれらの組合わせを含んでいる。大腸菌の中でクローンされたＬ−アミノ酸デアミナーゼの使用が好まれる。他の由来、例えば、豚の腎臓、蛇毒、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ， Ｐｒｏｔｅｕｓ ｒｅｔｔｇｅｒｉ， Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ， Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉからのＬ−アミノ酸デアミナーゼは、使用することができる。しかし、Ｌ−ＡＡＤ遺伝子の多重コピークローンを運ぶ大腸菌は、はるかに高い特定活動という長所を有する。
【００２６】
α−ヒドロキシカルボン酸、水酸化物及びそれらの塩類へのα−ケトカルボン酸、水酸化物及び塩類の変換を処理することができる限り、様々なα−ケト酸脱水素酵素は使用することができる。発明の方法で使用可能な還元酵素の例は、Ｌ−又はＤ−乳酸塩脱水素酵素、Ｌ−又はＤ−マンダ酸塩脱水素酵素、Ｌ−又はＤ−ヒドロキシイソカプロ酸塩脱水素酵素、Ｌ−又はＤ−ベンゾイル蟻酸塩脱水素酵素）及びそれらの組合わせを含んでいる。Ｌ−乳酸塩脱水素酵素及びＤ−乳酸塩脱水素酵素の一方の使用が好まれる。他の由来、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからの乳酸塩脱水素酵素が使用される、しかし、他の微生物からの乳酸塩脱水素酵素と比較して、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ， Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｏｎｔｅｒｏｉｄｅｓ， 又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉ からのＤ−ＬＤＨ及び牛の心臓からのＬ−ＬＤＨは、使用される基板、広い基板特異性及び得られる生成物に関して、高い特定の活動（ユニット／ｍｇの変換された基板又はｍｉｎ／ｍｇの蛋白質で形成されたμｍｏｌの生成物）　によって識別される、また、得られる生成物は、高い程度に対掌体で精製されている。この記述の情況で、表現’’高い程度の対掌体の精製’’は、問題の対掌体が、別の対掌体との混合物で少なくとも９５％（ｅｅ）の対掌体の超過で存在する、好ましくは９８％（ｅｅ）を越えることを意味する。α−ケト酸脱水素酵素としてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ， Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｏｎｔｅｒｏｉｄｅｓ， 又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉからのＤ−ＬＤＨ及び基板としてα−オキソカルボン酸の使用は、さらに、生成物の高い収率にし、生成物のＤ−α−ヒドロキシカルボン酸の高い収率にする。したがって、その使用は、酵素の変換が大規模で行なわれる場合、大きな重要性及び相当な経済的利点である方法の全面的な費用を引き下げる。これらの理由のため、酵素のためのこれらの由来が好ましい。基板が最初にＬ−アミノ酸酸化酵素で酸化され、得られる生成物が牛の心臓からの酵素Ｌ−乳酸塩脱水素酵素で還元されるアナログの方法で、Ｌ−α−ヒドロキシカルボン酸、水酸化物及びそれらの塩類の調整での同じ利点が観察される。
【００２７】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ， Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ， 又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉからのＤ−乳酸塩脱水素酵素又は牛の心臓からのＬ−乳酸塩脱水素酵素のために使用された電子共与体は、ＮＡＤにＤ−又はＬ−ＬＤＨによって酸化された、還元された形（ＮＡＤＨ）で、好ましくは補酵素ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドである。補酵素の再生のために、ＮＡＤＨを再利用する酵素及び基板からなる酵素／基板システム、例えば、蟻酸エステル脱水素酵素（ＦＤＨ）／蟻酸エステルシステム；アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）／エタノール、イソプロピルアルコール、シクロヘキサノールシステム；グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）／グルコースシステム；又は、同様なシステムは使用される。製造でのように、これらのシステムは、ＣＯ２／Ｈ−ＣＯ３−とアセトアルデヒドをそれぞれ生成する。蟻酸、例えば、アルカリ金属蟻酸エステル、例えば、カリウム又はナトリウム蟻酸エステルの塩が、蟻酸エステル由来として使用される蟻酸エステル脱水素酵素／蟻酸エステル（ＦＤＨ）システムが好ましい。本発明の方法を行なうための適切な蟻酸エステル脱水素酵素は、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ （カンジダ　ボイジニイ）又はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｘａｌａｃｔｉｃｕｓ（シュードモナス　オキサラクチクス）から分離することができる。脱水素酵素は、蟻酸エステル脱水素酵素及びα−ケト酸脱水素酵素の活動の比率が１：１と１：１００の間にある量に適切に加えられる。
【００２８】
広範囲のアミノカルボン酸又はそれらの塩類は、酵素変換（Ｌ−又はＤ−ＬＤＨ）のために使用された条件の選択に依存するＬ−又はＤ−ヒドロキシカルボン酸又はそれらの塩の一方に、容易に変換されてもよい。発明の好ましい化合物は、下記構造式を有するα−アミノカルボン酸塩、水和物又はそれらの塩である。
【００２９】
【化２】
2004511249.tif 000006
ここで、Ｒ１は、水素、又は、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、ホスホニル、スルホニル、チオアセチル、チオプロピオニル、フェニル、Ｃ１−Ｃ６のシクロアルキル、チエニル、ヒドロキシル、ナフチル、ピリジニル、アミノ、アミノアルキルチオ、カルボキシアルキルチオ、カルボキシアミノアルキルチオ、グアニジノ、ニトログアニジノ、ウレイド、アミノオキシ、グアニジノオキシ、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ３のアルコキシ、ベンジルオキシ、３−（２，３−ベンゾピロール）、３−（５−ヒドロキシ−２，３−ベンゾピロール）、３−（５−フルオロ−２，３−ベンゾピロール）、３−（ベンゾチオフェン）、メチルイミダジル、アミド、３−アントラニロイル、Ｎ−（３−ヒドロキシ−４−ピリドン）、リボシルアデノシンアルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４のアルキルチオ、ベンジルチオ、ｐ−メトオキシベンジルチオ、フェニルチオ、カルバンチオイル、システエインジスルフィデ、アルキルセレノ、アルキルスルホン、アルキルスルホキシデ、アルキルスルホキシミル、ビニル、アリール、プロパルギルからなる群から選択された１以上の置換基で置換された直鎖状又は分技状Ｃ１−Ｃ９のアルキルであり、かつ、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、独立して、水素、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノ、メチル、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ３のアルコキシ、ベンゾロキシ、ホスホニル及びベンゾイルからなる群から選択されるものである。
【００３０】
この発明の使用を通じて、例えば、Ｌ−フェニルアラニンは、Ｌ−又はＤ−フェニルラクト酸に変換され、Ｌ−２−アミノ−４−メチルバレリン酸は、Ｌ−又はＤ−２−ヒドロキシ−４−メチルバレリン酸に変換され、Ｌ−２−アミノ−３−メチルバレリン酸は、Ｌ−又はＤ−２−ヒドロキシ−３−メチルバレリン酸に変換され、Ｌ−２−アミノ−３−メチルブチル酸は、Ｌ−又はＤ−２−ヒドロキシ−３−メチルブチル酸に変換され、Ｌ−２−アミノバレリン酸は、Ｌ−又はＤ−２−ヒドロキシバレリン酸に変換され、Ｌ−２−アミノブタン酸は、Ｌ−又はＤ−２−ヒドロキシブタン酸に変換され、Ｌ−ノルバリンは、Ｌ−又はＤ−２−ヒドロキシペンタン酸に変換され、Ｌ−ノルレウシンは、Ｌ−又はＤ−２−ヒドロキシヘキサン酸に変換され、Ｌ−バリンは、Ｌ−又はＤ−３−メチル−２−ヒドロキシブタン酸に変換され、Ｌ−ロイシンは、Ｌ−又はＤ−４−メチル−２−ヒドロキシペンタン酸に変換され、Ｌ−ｔ−ブチルアラニンは、Ｌ−又はＤ−４，４−ジメチル−２−ヒドロキシペンタン酸に変換され、Ｌ−セリンは、Ｌ−又はＤ−３−ヒドロキシ−２−ヒドロキシプロピオン酸に変換され、Ｌ−ホモフェニルアラニンは、Ｌ−又はＤ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブタン酸に変換され、Ｌ−１−ナフチルアラニンは、Ｌ−又はＤ−３−（１−ナフチル）−２−ヒドロキシプロピオン酸に変換され、Ｌ−２−ナフチルアラニンは、Ｌ−又はＤ−３−（２−ナフチル）−２−ヒドロキシプロピオン酸に変換され、Ｌ−チロシンは、Ｌ−又はＤ−ｐ−ヒドロキシフェニル−２−ヒドロキシプロピオン酸に変換され、Ｌ−ｐ−Ｆ−フェニルアラニンは、Ｌ−又はＤ−ｐ−Ｆ−フェニル−２−ヒドロキシプロピオン酸に変換され、Ｌ−グルタミン酸は、Ｌ−又はＤ−α−ヒドロキシグルタン酸に変換され、Ｌ−２−アミノアジピン酸は、Ｌ−又はＤ−２−ヒドロキシアジピン酸に変換され、Ｌ−シトルリンは、Ｌ−又はＤ−２−ヒドロキシ−５−ウレイドバレリン酸に変換され、Ｌ−ホモシトルリンは、Ｌ−又はＤ−２−ヒドロキシ−６−ウレイドノヘキサン酸に変換され、Ｌ−システインは、Ｌ−又はＤ−メルカプト−２−ヒドロキシプロピオン酸に変換され、Ｌ−トリプトファンは、Ｌ−又はＤ−インドール−３−（２−ヒドロキシ）プロピオン酸に変換された。適切に、反応するα−アミノカルボン酸、例えば、フェニルアラニンは、それらの塩類、例えば、フェニルアラニン塩酸塩、又は、同種のものの形をして使用される。
【００３１】
多数の型の反応容器は、発酵用容器、攪拌されたリアクター、固定ベッド・リアクター、流体にされたベッド・リアクター又は薄膜リアクター（Ｈａｒｔｍｅｉｅｒ参照、’’Ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｉｅｒｔｅ Ｂｉｏｋａｔａｌｙｓａｔｏｒｅｎ’’、Ｂｅｒｌｉｎ １９８６の要約）のように使用することができる。空気散布は、基板としてＯ２の中で供給する反応容器に付けられる。バッチ方法で、発酵用容器は、基板のα−アミノカルボン酸の水溶液、例えば、好ましくはカリウム又はナトリウム塩の形態をして供給される。しかしながら、基板の濃度は、最大可能な濃度の５０〜１００％までになるべきであり、それは、２０００ｍｍｏｌ／ｌを超えなければよく、好ましくは２０〜１０００ｍｍｏｌ／ｌであり、特に好ましくは約１００−５００ｍＭである。これは、デアミナーゼ酵素及びα−ケト酸脱水素酵素の活動の比率が１：０．１〜１：１００までである量で有利に使用されるＰ． ｍｙｘｏｆａｃｉｅｎｓからのアミノ酸デアミナーゼでＯ２下で攪拌される間に培養される。その後、発酵用容器に、０．０１〜１０ｍＭ、好ましくは約０．１ｍＭの濃度で補酵素ＮＡＤ（Ｈ）、それぞれ望ましくて、１００〜１２００ｍＭ、好ましくは約３００ｍＭの濃度で、ＮＡＤＨを再利用する補酵素、例えば、アルコール脱水素酵素、蟻酸エステル脱水素酵素、及び、エタノール又は蟻酸エステルの水溶液が、変換が完了するまで、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ， Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ， 又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉからのＤ−乳酸塩脱水素酵素、又は、牛の心臓からＬ−乳酸塩脱水素酵素と供給される。酵素は、ＮＡＤＨを再利用する酵素及び基板に特有の脱水素酵素の活動の比率が１：０．１〜１：１０までである量で有利に使われる。分子量を増加させるためにポリエチレングリコールに結合されたＮＡＤの使用はされてもよいが、要求された補酵素は、０．０１〜１０ｍＭ、好ましくは約０．１ｍＭの濃度で、分子量が増加させられていないＮＡＤの形、例えば、在来のＮＡＤ（Ｈ）をして使用される。蟻酸エステルイオン又はエタノールの濃度は、蟻酸エステルのために１００〜６０００ｍｍｏｌ／ｌであり、好ましくは３００〜２０００ ｍｍｏｌ／ｌである。酵素反応には慣習的として、反応混合物は、ｐＨ６〜９、たとえば、ｐＨ７．５である。反応温度は、２０℃〜４０℃であり、好ましくは室温付近である。酵素の酸化を防ぎ、かつ、ＣＯ２から運転を助けるために、反応は、Ｎ２で行われる。生成物は、酸、例えば、塩酸のような鉱物の酸及び同種のものの付加によって反応混合物から結晶化される。発明の好ましい方法は、上述されるように、発酵用容器のようなバイオリアクターの中で酵素の変換が以下のように行なわれることです。ａ）蟻酸エステル脱水素酵素又はアルコール脱水素酵素の溶液からなる反応混合物を含んでいる、好ましくは蟻酸エステル脱水素酵素は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ， Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ， 又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉからのＤ−乳酸塩脱水素酵素又は牛の心臓からのＬ−乳酸塩脱水素酵素、及び、例えば、０．０１〜１ｍＭ、好ましくは約１ｍＭの濃度でニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤ（Ｈ））である。ｂ）基板のα−アミノカルボン酸水溶液が供給される。基板のアミノカルボン酸水溶液は、例えば、塩酸塩又はナトリウム塩の形で、５００ｍＭまでの濃度で、例えば、２０〜５００ｍＭ、好ましくは５０〜２００ｍＭの濃度で、及び、蟻酸エステル、例えば、カリウム又はナトリウム蟻酸エステル、又は、それぞれエタノール、１００〜１２００ｍＭ、好ましくは約３００ｍＭの濃度である。ｃ）形成された化合物がイオン交換又は溶解力のある抽出によって分離される。その方法は、含むことができ、本質的になることができ、又は、上述された工程からなることができ、また、使用された材料を含むことができ、本質的になることができ、又は、それらの状態からなることができる。
【００３２】
現在の基板で決定される酵素活動の結果は、特に、時間、収率、対掌体の精製及びコスト有効性に関して化学の変換の成功を危ぶませると予想される基板の７０／１００％の予想外に高い変換として調整の規模の酵素の使用で有望である。生成物の構成は、酸化した共同因子ＮＡＤ＋と比較して、還元された共同因子ＮＡＤＨの３４０ｎｍに、強い吸光度を有すること、及び、ＮＡＤＨの濃度と吸光度の減少により測定することができる。ＮＡＤＨの濃度に正比例する吸光度の減少は、酵素の反応の比率を評価するために使用されてもよい。他の酵素活動の存在が、ＮＡＤＨの活動の酸化に結びついてもよく、技術は、酵素の精製を含むいくつかの要因だけに制限されてもよく、予期された生成物の構成に相互に関連する。
【００３３】
形成されたα−ヒドロキシカルボン酸は、既知のやり方のろ過から得るられる／分離される。例えば、異なる酸性の強さを最大限に利用する基礎的なイオン交換器による手段によって、反応しないα−アミノカルボン酸及びα−ケトカルボン酸からα−ヒドロキシカルボン酸を分けることによって、行うことができる。塩類の異なる可溶性、特に、カルシウム塩は、多くの場合に、再結晶によって分離を可能にする。与えられた場合では、適切な溶剤を有する抽出による分離のために極性の差に近づくことができる。
【００３４】
α−ヒドロキシカルボン酸、水酸化物及びそれらの塩類の特性及び還元されたそれぞれのものの立体化学は、α−ヒドロキシカルボン酸のエステル化によって調整された（＋）−ＭＰＴＡ Ｍｏｓｈｅｒ誘導体のＮＭＲ及び毛管ＧＣの分析によって決定され、（＋）−ＭＴＰＡ−Ｃｌとのアシル化によって続け（Ｄａｌｅ， Ｊ． Ａ．， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， （１９６９）， ３４， ２５４３）、また、ラセミ化合物の標準と比較する。交互に、キラルで、逆層の高機能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分析によって、α−ヒドロキシカルボン酸、水酸化物及びそれらの塩類の特性及び還元されたそれぞれのものの立体化学を決定することができる。これらはα−ヒドロキシカルボン酸誘導体のキラルの分析用の標準の文献のプロトコルであり、また、小さなジアステレオ異性体の０．５％未満を検知するように充分に敏感である。エナンチオメリカリィの純粋なキラルのヒドロキシカルボン酸、水酸化物及びそれらの塩類は、調整での、抑制剤、調合薬、治療の代理剤として、また、前駆体／中間体として価値がある。
【００３５】
次の例において、発明の方法は、Ｄ−フェニル乳酸へのＬ−フェニルアラニンの変換、Ｄ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸へのＬ−ロイシンの変換、及び、Ｄ−２−ヒドロキシペンタン酸へのＬ−ノルバリンの変換に関してより詳細に説明される。次の例は、例の制限に限定されず、本発明を例証するように意図される。もし他の方法で示していなければ、全部分及びパーセンテージが重量による。これらの酵素は、蛋白質フレームワークの周囲にアミノ酸配列の小さな変化を展示することができるが、α−オキソカルボン酸／α−ヒドロキシカルボン酸相互変換の触媒作用の原因である活性部位中の、及び、その活性部位のまわりのそれらの残留物は、通常保存される。与えられたα―オキソカルボン酸、与えられた酵素活動は、ＵＶ分光学によって検知され、Ｋｍ及び触媒現象の回転置換、ｋｃａｔで特徴づけられてもよい。
【００３６】
実施例１
Ｌ−アミノ酸酸化酵素遺伝子の分離及び操作
Ｐ．ｍｙｘｏｆａｃｉｅｎｓからのアミノ酸デアミナーゼ遺伝子は、公表されたＰ、ｍｉｒａｂｉｌｉｓ ＤＮＡ 配列に設計されたプライマー（表２参照）を使用して、全体のセルＰＣＲによって分離された。連結反応は、Ｐａｎｖｅｒａ（パンベラ）（Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）からのタカラバイオケミカルＤＮＡ連結反応キットを使用して実行された。ＰＣＲは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（パーキン　エルマー）からのＴａｑ又はＵｌｔｍａ ＤＮＡ重合酵素を備えたＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９６００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（パーキン　エルマー ９６００ サーマル　サイクラー）で標準条件を使用して、実行された（Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ）。オリゴヌクレオチドは、応用のバイオケミカル ３００ Ｂ ＤＮＡシンセサイザーを使用して調整された。
【００３７】
【表５】
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実施例２
Ｌ−アミノ酸酸化酵素のためのスクリーニング研究
酸素消費は、次亜硫酸塩で０点調整されたＨａｎｓａｔｅｃｈ（ハンサテック）装置（Ｎｏｒｗａｌｋ， Ｅｎｇｌａｎｄ）からのオキシグラフシステムの中でクラークタイプＯ２電極を使用して測定された。アミノ酸基板（１０．０ｍＭ）は、酵素を加えるに先立って、合計９９０μｌで、２分間、３０℃で、５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー、ｐＨ ７．５の中で培養された。反応は、１０μｌの酵素（１０４ｍｇの蛋白質）を加えることにより始められ、また、さらに３分間、Ｏ２消費が測定された。Ｌ−フェニルアラニンは、参照基板として使用された。また、線形の割合は決定され、１００％に設定された。バッファーのみのブランクの割合が引かれた後、他のすべてのアミノ酸は、Ｌ−フェニルアラニンと比較された。
【００３８】
実施例３
乳酸塩脱水素酵素のためのスクリーニング研究
乳酸塩脱水素酵素は、分子装置からのＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ２５０ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（スペクトラマクス ２５０ マイクロプレート）リーダで２５℃で多くのケト酸基板上でスクリーニングされた（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）。反応は、１００ｍＭのリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０で、３０ｍＭのケト酸＋０．６ｍＭのＮＡＤＨへ１０μｌの薄められた酵素を加え、また、３４０ｎｍでＮＡＤＨの酸化をモニタリングすることによって実行された。ピルビン酸塩は、参照基板として使用された。また、酵素の活動は決定され、１００％に設定された。他のすべてのケト酸は、バッファーのみのブランク上の背景活動に合わせて調節した後にピルビン酸塩と比較された。
【００３９】
実施例４
Ｌ−アミノ酸デアミナーゼ（Ｌ−ＡＡＤ）の存在下でＤ−フェニル乳酸（Ｄ−ＰＬＡ）の製造
デアミナーゼ反応は、Ｌ−フェニルアラニン（１００ｍｍｏｌ）を含んでいる、５００ｍｌに脱イオン化された水に大腸菌（Ｌ−アミノ酸デアミナーゼ用の遺伝子の多重コピークローンを運んでいた）を１００ｇ（ウェトセルペレット）加えることにより、全体のセル生体内変化によって行なわれた。反応は、１ｖ．ｖ．ｍの比率でシステムの中に放射された酸素で３２℃でｐＨ７．５−８で２リットルの密閉された発酵用容器で急速に混合された。脱アミノ反応は、溶解された酸素が、酸素フローが閉じられたポイント（〜１時間）が上昇を開始するまで、継続する。脱水素反応反応は、ナトリウム蟻酸エステル（１００ ｍｍｏｌ）、メルカプトエタノール（１ ｍｍｏｌ）、ジチオトレイトール（１ ｍｍｏｌ）、トリス−ＣＩ（２５ ｍｍｏｌ）、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（１ ｍｍｏｌ）、Ｓ． ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（３８００ユニット）からのＤ−乳酸塩脱水素酵素及びＣ． ｂｏｉｄｉｎｉｉ（３８０ユニット）からの蟻酸エステル脱水素酵素を含んでいる溶液を５００ｍｌ加えることにより開始された。反応は、０．０５ｖ．ｖ．ｍで放射された窒素で室温で行なわれた。また、ｐＨは、１Ｎ　ＨＣｌで７．５に維持された。３２時間後、Ｄ−ＰＬＡの滴定濃度は、９．２４ｇ／Ｌであり、総計は、Ｌ−フェニルアラニンから５８．１％で産出された。
【００４０】
実施例５
Ｌ−ＡＡＤセルの除去後のＤ−フェニル乳酸（Ｄ−ＰＬＡ）の製造
デアミナーゼ反応は、Ｌ−フェニルアラニン（１００ｍｍｏｌ）を含んでいる、５００ｍｌに脱イオン化された水に大腸菌（Ｌ−アミノ酸デアミナーゼ用の遺伝子の多重コピークローンを運んでいた）を１００ｇ（ウェトセルペレット）加えることにより、全体のセル生体内変化によって行なわれた。反応は、１ｖ．ｖ．ｍの比率でシステムの中に放射された酸素で３２℃でｐＨ７．５−８で２リットルの密閉された発酵用容器で急速に混合された。脱アミノ反応は、溶解された酸素が、酸素フローが閉じられたポイント（〜１時間）が上昇を開始するまで、継続する。Ｌ−ＡＡＤセルは、２０分間、８０００ｘ Ｇで遠心分離によって除去され、上澄み液は、２リットルの発酵用容器へ注がれ、約２２℃に調節された。脱水素反応反応は、ナトリウム蟻酸エステル（１００ ｍｍｏｌ）、メルカプトエタノール（１ ｍｍｏｌ）、ジチオトレイトール（１ ｍｍｏｌ）、トリス−ＣＩ（２５ ｍｍｏｌ）、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（１ ｍｍｏｌ）、Ｓ． ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（３８００ユニット）からのＤ−乳酸塩脱水素酵素及びＣ． ｂｏｉｄｉｎｉｉ（３８０ユニット）からの蟻酸エステル脱水素酵素を含んでいる溶液を５００ｍｌ加えることにより開始された。反応は、０．０５ｖ．ｖ．ｍで放射された窒素で室温で行なわれた。また、ｐＨは、１Ｎ　ＨＣｌで７．５に維持された。３１．７５時間後、Ｄ−ＰＬＡの滴定濃度は、１３．５９ｇ／Ｌであり、総計は、Ｌ−フェニルアラニンから８８．９％で産出された。
【００４１】
実施例６
Ｄ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸の製造
デアミナーゼ反応は、Ｌ−ロイシン（１００ｍｍｏｌ）を含んでいる、５００ｍｌに脱イオン化された水に大腸菌（Ｌ−アミノ酸デアミナーゼ用の遺伝子をクローンされた）を１００ｇ（ウェトセルペレット）加えることにより、全体のセル生体内変化によって行なわれた。反応は、１ｖ．ｖ．ｍの比率でシステムの中に放射された酸素で３２℃でｐＨ７．５−８で２リットルの密閉された発酵用容器で急速に混合された。脱アミノ反応は、溶解された酸素が、酸素フローが閉じられたポイント（〜１．５時間）が上昇を開始するまで、継続する。Ｌ−ＡＡＤセルは、２０分間、８０００ｘ Ｇで遠心分離によって除去され、上澄み液は、２リットルの発酵用容器へ注がれ、〜２２℃に調節された。脱水素反応反応は、ナトリウム蟻酸エステル（１００ ｍｍｏｌ）、メルカプトエタノール（１ ｍｍｏｌ）、ジチオトレイトール（１ ｍｍｏｌ）、トリス−ＣＩ（２５ ｍｍｏｌ）、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（１ ｍｍｏｌ）、Ｓ． ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（３８００ユニット）からのＤ−乳酸塩脱水素酵素及びＣ． ｂｏｉｄｉｎｉｉ（３８０ユニット）からの蟻酸エステル脱水素酵素を含んでいる溶液を５００ｍｌ加えることにより開始された。反応は、０．０５ｖ．ｖ．ｍで放射された窒素で室温で行なわれた。また、ｐＨは、１Ｎ　ＨＣｌで７．５に維持された。４４時間後、１００ｍｌの酸が加えられ、Ｄ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸の滴定濃度は、７．２ｇ／Ｌであり、総計は、Ｌ−ロイシンから６０．０％で産出された。
【００４２】
実施例７
Ｌ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸の製造
デアミナーゼ反応は、Ｌ−ロイシン（１００ｍｍｏｌ）を含んでいる、５００ｍｌに脱イオン化された水に大腸菌（Ｌ−アミノ酸デアミナーゼ用の遺伝子をクローンされた）を１００ｇ（ウェトセルペレット）加えることにより、全体のセル生体内変化によって行なわれた。反応は、１ｖ．ｖ．ｍの比率でシステムの中に放射された酸素で３２℃でｐＨ７．５−８で２リットルの密閉された発酵用容器で急速に混合された。脱アミノ反応は、溶解された酸素が、酸素フローが閉じられたポイント（〜１．５時間）が上昇を開始するまで、継続する。Ｌ−ＡＡＤセルは、２０分間、８０００ｘ Ｇで遠心分離によって除去され、上澄み液は、２リットルの発酵用容器へ注がれ、〜２２℃に調節された。脱水素反応反応は、ナトリウム蟻酸エステル（１００ ｍｍｏｌ）、メルカプトエタノール（１ ｍｍｏｌ）、ジチオトレイトール（１ ｍｍｏｌ）、トリス−ＣＩ（２５ ｍｍｏｌ）、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（１ ｍｍｏｌ）、ウサギの筋肉（３８００ユニット）からのＬ−乳酸塩脱水素酵素及びＣ． ｂｏｉｄｉｎｉｉ（３８０ユニット）からの蟻酸エステル脱水素酵素を含んでいる溶液を５００ｍｌ加えることにより開始された。反応は、０．０５ｖ．ｖ．ｍで放射された窒素で室温で行なわれた。また、ｐＨは、１Ｎ　ＨＣｌで７．５に維持された。４４時間後、８ｍｌの酸が加えられ、Ｌ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸の滴定濃度は、１．４ｇ／Ｌであり、総計は、Ｌ−ロイシンから１０．６％で産出された。
【００４３】
実施例８
Ｄ−２−ヒドロキシペンタン酸の製造
デアミナーゼ反応は、Ｌ−ノルバリン（１００ｍｍｏｌ）を含んでいる、５００ｍｌに脱イオン化された水に大腸菌（Ｌ−アミノ酸デアミナーゼ用の遺伝子をクローンされた）を１００ｇ（ウェトセルペレット）加えることにより、全体のセル生体内変化によって行なわれた。反応は、１ｖ．ｖ．ｍの比率でシステムの中に放射された酸素で３２℃でｐＨ７．５−８で２リットルの密閉された発酵用容器で急速に混合された。脱アミノ反応は、溶解された酸素が、酸素フローが閉じられたポイント（３時間）が上昇を開始するまで、継続する。Ｌ−ＡＡＤセルは、２０分間、８０００ｘ Ｇで遠心分離によって除去され、上澄み液は、２リットルの発酵用容器へ注がれ、〜２２℃に調節された。脱水素反応反応は、ナトリウム蟻酸エステル（１００ ｍｍｏｌ）、メルカプトエタノール（１ ｍｍｏｌ）、ジチオトレイトール（１ ｍｍｏｌ）、トリス−ＣＩ（２５ ｍｍｏｌ）、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（１ ｍｍｏｌ）、Ｓ． ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（３８００ユニット）からのＤ−乳酸塩脱水素酵素及びＣ． ｂｏｉｄｉｎｉｉ（３８０ユニット）からの蟻酸エステル脱水素酵素を含んでいる溶液を５００ｍｌ加えることにより開始された。反応は、０．０５ｖ．ｖ．ｍで放射された窒素で室温で行なわれた。また、ｐＨは、１Ｎ　ＨＣｌで７．５に維持された。４４時間後、８９ｍｌの酸が加えられ、Ｄ−２−ヒドロキシペンタン酸の滴定濃度は、７．９６ｇ／Ｌであり、総計は、Ｌ−ノルバリンから７３．４％で産出された。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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