(57)【要約】本発明は、樹脂状細胞(Dendritic cell)を利用して癌を治療するために提案された樹脂状細胞を利用した癌免疫治療剤に関するものであり、具体的には、１）樹脂状細胞を放射線が照射された腫瘍内に注入する癌免疫治療方法と、２）腫瘍抗原を電気穿孔(electroporation)、細胞融合(cell Fusion)、または、パルシング(Pulsing)でローディング(loading)を行った樹脂状細胞を癌患者に注射して癌免疫治療剤として使う組成物に関するものである。
2006509002.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌組織を確保している癌患者を対象として癌組織の死滅破砕物を未成熟樹脂状細胞に電気穿孔(Electroporation)により搭載して癌を治療するために製造された樹脂状細胞を含む製造物及びこの製造物を含む樹脂状細胞を利用した癌免疫治療剤。
【請求項２】
未成熟樹脂状細胞を濃縮して癌組織が確保されなかった癌患者を対象として放射線が照射されて細胞死滅(Apoptosis)が成り立つ癌病変(Intra-lesion)に直接投与して癌治療を目的に作られた製造物及びこの製造物を含む樹脂状細胞を利用した癌免疫治療剤。
【請求項３】
Pulseを実施して癌細胞が搭載された樹脂状細胞と電気穿孔による方法で癌細胞が搭載された樹脂状細胞を併用する目的で製造された製造物及びこの製造物を含む樹脂状細胞を利用した癌免疫治療剤。
【請求項４】
電気穿孔による方法で癌細胞が搭載された樹脂状細胞にPulseを実施して追加に癌細胞が搭載されるように製造された樹脂状細胞の製造物及びこの製造物を含む樹脂状細胞を利用した癌免疫治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、樹脂状細胞を利用した癌免疫治療剤に関するものであって、total  cell lysatesを抗原とする既存の樹脂状細胞癌免疫治療を原理として放射線が照射された腫瘍内に樹脂状細胞を注入する方法と抗原を樹脂状細胞に電気穿孔(electroporation)によりローディング (loading)して患者に投与する方法など、新しい方式の樹脂状細胞癌免疫治療法である樹脂状細胞を利用した癌免疫治療剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近には、癌による死亡の根本的な解決が困難な理由は、古典的な癌治療法の副作用と微細転移癌細胞とそれらの遺伝的な不安定(genetic  instability)による耐性獲得に起因する。従って、再発性癌に対してはこれという治療法がないと言っても過言ではない。
【０００３】
従って、免疫監視体系に根幹をなす抗腫瘍ワクチンの開発が台頭している。現在まで合成ペプチッドワクチン、遺伝子ワクチン、熱衝撃蛋白質ワクチンなど多様な方案が考案されたが、樹脂状細胞を利用した方法が一番效果的なものであると言われている。樹脂状細胞は生体内の一番力強くて重要な抗原提示細胞である関係で、抗腫瘍ワクチンだけでなく免疫反応が関与する大部分の疾患でその応用価値が非常に高い。
【０００４】
しかし、未だに樹脂状細胞を利用した免疫治療法の標準化は成り立つことなく、各研究機関別にその效果を極大化して調節を容易にするためのさまざまな方法を掘り出している。免疫体系が腫瘍を認知して攻撃する能力があることはよく知られている。体液性及び細胞性免疫両方とも腫瘍の溶解に関与するが、大部分の場合に腫瘍抗原の特異的認知を通する腫瘍の退縮(regression)は細胞免疫が関与する。特に、CD８+ cytotoxic T lymphocyte (CTL)が腫瘍細胞を認知して死滅できるということが色々なモデルで証明された((1)  Boon,T., J.C. Cerottini,B. Van den Eynde、P. van der Bruggen、and A. Van Pel. 1994. Tumor antigens  recognized by T lymphocytes. Annu Rev Immunol 12:337. (2)  Celluzzi, C.M., J.I.Mayordomo, W.J. Storkus, M.T. Lotze, and L.D. Falo, Jr. 1996. Peptide-pulsed  dendritic cells induce antigen-specific CTL-mediated protective tumor  immunity. J Exp Med 183, 1:283. (3)  Feltkamp, M.C., H.L. Smits, M.P. Vierboom,  R.P. Minnaar, B.M. de Jongh, J.W. Drijfhout, J. ter Schegget, C.J. Melief,  and W.M. Kast. 1993. Vaccination with cytotoxic T lymphocyte epitope-containing peptide protects against a tumor induced by human papillomavirus type 16- transformed cells. Eur J Immunol 23, 9:2242.3)。樹脂状細胞(dendritic  cell)は、免疫反応を誘発させることができる唯一の抗原提示細胞(antigen-presenting cell)であって、癌と感染疾患の抗原特異免疫治療に手広く使われて来た(Banchereau, J., F. Briere, C. Caux, J. Davoust, S. Lebecque,Y.J. Liu,B. Pulendran, and K. Palucka.  2000. Immunobiology of dendri-tic cells. Annu  Rev Immunol 18:767)。T細胞が腫瘍の特異的な方式で腫瘍細胞を認知して死滅させることができるように樹脂状細胞が初期化できる能力は多くの動物モデルで報告されたことがある。また、樹脂状細胞を基盤にした免疫(immunization)は免疫学的なmemoryを誘発して今後の腫瘍発生も阻むことができるようにする。
【０００５】
樹脂状細胞は全体循環白血球のただ約０．３％を占めるだけであるが、大食細胞とは区別される表現型を有する異質的な集団で構成されている。樹脂状細胞は、比較的弱い抗原提示能力を有するB細胞や大食細胞とは異に、力強い抗原提示細胞という点で差別化する。樹脂状細胞は多様なlineagesから来由されたと知られているが、通常、樹脂状細胞は、IL-4とGM−CSFで刺激された単核球や単核球前駆体（CD３４+ cell）から来由されてvaccine protocolに使われる。未成熟した樹脂状細胞は效果的にアポトシス(apoptotic)または怪死(necrotic)細胞、細菌、そして、特定抗原や水溶性蛋白質で效果的に抗原epitopeを抽出する。Apoptotic body捕獲、macropinocytosis、そして、mannose receptorやCD３２、または、CD６４受容体を通じるendocytosisなどのさまざまな起電で樹脂状細胞内に入って来た抗原は一連の過程を経って主組織複合体(MHC)とcomplexを形成することになる。
【０００６】
捕獲された抗原は、MHC class II区画に運びされ処理されてpeptide-MHC複合体に提示されてCD４+ T cell反応を誘導する。さらには、最近、樹脂状細胞が外部から流入された抗原に対してproteasome及びTAP依存性起電よって MHC I分子を通じて提示する能力があることが証明された。従って、樹脂状細胞は外部抗原に対して特別な処理過程を通じてT細胞及びB細胞全てを刺激することができる。このような樹脂状細胞の特性のため、現在、癌免疫治療にたくさん活用している。
【０００７】
樹脂状細胞の癌免疫治療臨床試験際、一番よく使われる抗原はepitope  peptideである。しかし、peptide抗原は、患者の癌腫でこの抗原が提示されているのか確認されなければならないし、抗原性peptideが複合体を形成することができる特定のHLA typeを有する患者にだけ使用が可能である。そして、アメリカやヨーロッパでも同定された抗原peptideが多くなくて、韓国ではまだ確認された腫瘍抗原を全然確保していることができず、特に、本研究で対象にしようとする消化器癌及び呼吸器癌の抗原は、全世界的にもほとんど明かされたところがない。また腫瘍抗原を救命する作業は大変多い時間を要する。従って、韓国で今すぐpeptide抗原を樹脂状細胞の癌免疫治療に利用することは不可能な実情である。
【０００８】
このような問題点を避けるために未確認TAA(total cell lysates、apoptotic/necrotic cells、total mRNA、tumor cells fused with DCなど)を抗原として使おうとする試みがたくさんあるが、未確認TAAを樹脂状細胞に搭載(loading)する方法らも欠点がある。Total cell lysatesは、主に、CD４+ helper T細胞を主に刺激させて、mRNAは腫瘍組職または細胞から直接分離しなければならない不便があり、apoptotic cellは腫瘍組職から癌細胞を分離・増殖させてapoptosisを起こした後、樹脂状細胞のように培養しなければならないという欠点があり、癌細胞と樹脂状細胞との融合は、腫瘍組職からの癌細胞分離増殖が要求される。本研究室では保健福祉部と韓国科学財団の支援で、このような欠点を補完しようと研究したところ、放射線が照射された腫瘍内に樹脂状細胞を注入する方法(Intra-lesional  method)と抗原を樹脂状細胞に電気穿孔(electroporation)により搭載(loading)する方法など、新しい方式の樹脂状細胞の癌免疫治療法を開発した。
【０００９】
保健福祉部と国立癌センターが発表した‘２０００年癌登録事業調査結果’によると、全体の癌発生件数の中、後進国型である胃癌、子宮頸部癌の割合はますます低くなる一方、先進国型である大膓癌、乳房癌、肺癌などは割合が高くなることと明かされた。一方、２０００年の一年の間登録された全体の癌発生件数は８万３、８４６件で１９９９年対比１.９％増加したと言う。これら癌の中、消化器癌の分布は断然首位を走っている。即ち、男の場合、胃癌、肝臓癌、大膓癌が各々２４.５％、１６.３％、１０.２％で癌発生の半分以上を占めていて、女の場合にも胃癌及び大膓癌の発生が１５.８％、１０.５％に増加している。一方、呼吸器癌の中で肺癌は韓国でも最近になって発病頻度が格段に増加して全体癌の中から胃癌の次に２位(１１.５％)であり、癌死亡率において首位を占めているほどである。
【００１０】
診断技術の発達による癌早期検診と予防意識の拡散及び手術、放射線治療及び坑癌化学療法の発展にもかかわらず癌発生率と癌による死亡率が減っていないという事実は既存の癌治療法の改善、または、新しい治療法の導入が切実であることを意味する。古典的な癌治療法である外科的切除、または、放射線治療の場合、遠隔微細転移病変が残っていることもあり、坑癌治療も骨髓の破壊による造血機能の抑制による副作用及び腫瘍細胞の抗癌剤耐性発現になる場合、治療に效果的でない。従って、治療耐性及び副作用を最小化しながらminimal residual lesionを根絶することができる方案は癌再発を防止して癌による死亡率を画期的に減少させることができる。このような点で免疫治療法、特に、樹脂状細胞を利用した免疫治療法は一番效果的な抗腫瘍ワクチンとしての可能性を提示している。
【００１１】
ここで、本研究を通して樹脂状細胞の癌免疫治療を国内に取り入れようとするだけでなく、本研究者たちが開発した新しい方法らで患者に適用して患者を治療しようとする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ここで、本発明は樹脂状細胞(Dendritic cell)を利用して癌免疫治療剤で使用して、医薬品で開発して癌患者に適用し治療しようとすることを目的にしている。
【００１３】
即ち、放射線が照射された腫瘍内に樹脂状細胞を注入する方法と抗原を樹脂状細胞に電気穿孔(electroporation)により搭載(loading)して患者に投与する方法など、新しい方式の樹脂状細胞癌免疫治療法を開発した。前者の方法は放射線照射によってapoptosis(細胞自然死)が誘発した腫瘍組職の内部に正確に樹脂状細砲を直接注入するので效果を現わして腫瘍組職を分離しなければならない不便がなく、後者の方法は蛋白質抗原を細胞質内に直接流入させることができるので癌細胞を殺すのに直接関与するCD８+ cytotoxic T cellをさらに多く刺激させることができる。本特許は、total cell lysatesを抗原院とする既存の樹脂状細胞の癌免疫治療を原理として上の技術を取り入れて医薬品化しようとすることにその目的がある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の構成）
本研究者が実施した実験の結果で樹脂状細胞を利用した細胞毒性実験で放射線が照射された腫瘍の内部に正確に未成熟樹脂状細胞を注射することにより形成された成熟樹脂状細胞が免疫を刺激して免疫刺激による免疫力が腫瘍細胞に対する效能実験の結果で細胞毒性が増加することが観察され、また、腫瘍抗原を成熟した樹脂状細胞に投与する場合にもイントルキン-２のはっきりした増加を見せた。また、固形腫瘍を対象として実施した実験結果でも明らかな效果を見せている。
【実施例】
【００１５】
(実施の形態)
以下、本発明の実際の実験例を詳しく説明する。
【００１６】
以下の実験例では癌免疫治療剤としての樹脂状細胞(Dendritic cell)を利用した実験を例示したものである。実験の結果で固形癌に対する抗腫瘍效果とイントルキン-２が増加する結果を見せている。
[実施の形態１]
MCA１０２ fibrosarcoma細胞をsyngeneic C５７BL/６mouseの右側大腿部の皮下に注射して腫瘍の直径が８mm位になるまで育て、腫瘍がある大腿部をLinac放射線照射機(Semens mevatron６７)の放射線の照射領域に置いて、１５Gyの放射線量を照射した後、腫瘍内に同種樹脂状細胞を注射する。この過程を毎週１回ずつ３回繰り返した後、１週後腫瘍がない対照群、腫瘍のみある群、放射線照射をしない腫瘍内に同種樹脂状細胞を注入した群、腫瘍に放射線の照射をした群、放射線照射をした後同種樹脂状細胞を注射した群などのmouseからsplenocyteを分離して腫瘍細胞に対するcytotoxicityを測定した。一定量の腫瘍細胞に対してSplenocytesを５倍１０倍２０倍の割合で処理した後の相対的な細胞毒性を観察した。
【００１７】
その結果、腫瘍のみある群では腫瘍がない対照群と同様にcytotoxicityを現わさなく、放射線照射をしない腫瘍内に同種樹脂状細胞を注入した群と腫瘍に放射線照射をした群では少しのcytotoxicityが見えた。しかし、放射線照射をした後、同種樹脂状細胞を注射した群では、他の群とは異に著しいcytotoxicityを見せた。従って、放射線が照射された腫瘍内に樹脂状細胞を注射することにより抗腫瘍免疫能を増加させることができることと見える。(図３参照)
そして、腫瘍に放射線照射をした群、放射線照射をした後、同種樹脂状細胞を注射した群などにおいて、反対側背に形成された腫瘍治療效果を観察した際、右側大腿部の腫瘍に放射線のみ照射した場合には治療效果が観察されなかったが、右側大腿部の腫瘍に放射線を照射した後、樹脂状細胞を注入した場合には肉眼的観察結果として著しい治療效果を観察することができた(図１参照)。固形癌を濃度別で投与した後、育っている固形癌の大きさを対照した(青色)。試験群には固形癌を作った後、放射線を処理して未成熟樹脂状細胞を投与し、成長が抑制された腫瘍の大きさを比較測定した(赤色)。結果的に、效果が確かで６週後に最大濃度の腫瘍細胞を投与した試験群１匹を除いて、皆治療され、固形癌が観察されなく腫瘍が残っている１匹も平均２５０mm2以上の大きさが５０mm2以下に格段に減っている結果を見せている(図２参照)。
[実施の形態２]
OVA(４mg/ml)を電気穿孔(electroporation)させてOVAを洗滌した後、１６時間培養した群(E)、OVA(４mg/ml)を１６時間の間pulseさせた群(P)、OVAを電気穿孔(electroporation)させた直後OVAを１６時間の間追加にpulseさせた群(E + P)の樹脂状細胞を利用してRF３３.７０(MHC class I)またはDO.１１.１０(MHC class II)細胞でIL-２を測定した結果、E群がP群より效果的にOVAをMHC class Iで提示することが分り、E + P群はE群より多くOVAをMHC class Iで提示することが分かり(Fig.１A)、予想の通り、P群がE群よりOVAをMHC class IIでより多く提示したし、E + P群はP群よりOVAをMHC class IIでより多く提示することが分かった(Fig.１B)。この結果で見ると、抗原を樹脂状細胞に電気穿孔(electroporation)させることにより抗原をMHC class Iで效果的に提示できるだけではなく、MHC class IIでも抗原をより多く提示することと考えられる。従って、電気穿孔(electroporation)は免疫能を效果的に増加させることができる方法と予想される。
【００１８】
【表１】
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Fig １. MHC class I (A) and II (B) presentation of OVA by dendritic cells after electroporation (E)、pulse (P) and combination of   both (E + P)。
[実施の形態３]
電気穿孔(electroporation)でOVAを同種樹脂状細胞にpulseさせた際、EG７細胞(EL４cells transfected with an OVA cDNA)に対するsplenocyteのcytotoxicityの照射では電気穿孔(electroporation)が效果的にOVAをMHC  Class Iでpresentationさせたら、OVA-electroporated DCでC５７BL/６mouseを減作させた際、OVA-pulsed DCで感作させた時よりも效率のよく特異的免疫能を起こすかを確認するためにOVAを電気穿孔(electroporation)させてOVAを洗滌した後１６時間培養した群(E)、OVAを１６時間の間pulseさせた群(P)、OVAを電気穿孔(electroporation)させた直後OVAを１６時間の間追加にpulseさせた群(E + P)の樹脂状細胞(１x１０６細胞)で毎週１回ずつ合計３回C５７BL/６mouseの右側脇腹の皮下に注射した後、１週後にsplenocyteを分離しEG７細胞(EL４ cells  transfected with an OVA cDNA)に対する細胞毒性を観察した。その結果、E群がP群より細胞毒性がより強く、E+P群の細胞毒性はE群よりも強く現れた(Fig.２A)。そして、同じ実験をEL４細胞に対して行った時、すべての群で細胞毒性が観察されなかった(Fig.２B)。この結果はEG７細胞に対する細胞毒性がOVAに特異的であることを現わして、電気穿孔(electroporation)がMHC class Iを通じる抗原提示を増加させて免疫能を效果的に増加させることができることを見せた。
【００１９】
【表２】
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Fig.２. Induction of OVA-specific cytotoxic activity by dendritic  cells、into which OVA was loaded by electroporation(E)、pulse (P) and combination of both (E + P)。
【００２０】
そして、上記のような方法でマウスに処置した後、１週後に左側背にEG７及びEL４細胞を植えた後、腫瘍発生抑制效果を観察した。その結果、E群とP群は似ている程度の腫瘍発生抑制效果を見せ、E+P群では腫瘍発生抑制效果が非常に高く現われた(Fig.３)。そして、同じ実験をEL４細胞に対して実行した時、すべての群で腫瘍発生抑制效果が観察されなかった。
【００２１】
【表３】
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Fig. ３. OVA-specific preventive antitumor immunity induced by  immunization with DCs、into which OVA was loaded by electroporation (E)、pulse (P) or both (E + P)。
（発明の效果）
前記した構成の本発明によると、樹脂状細胞を利用した癌免疫治療剤は癌治療に效果的であることを見せている。本研究で新たに開発した樹脂状細胞の癌免疫治療法を利用して、ほとんどすべての固形癌治療に適用(抗原を樹脂状細胞に電気穿孔(electroporation)で搭載(loading)する方法)できるだけでなく癌組織を確保していない患者にも放射線が照射された腫瘍内に未成熟樹脂状細胞を癌組織病変(Intra-lesion)に正確に入れて治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、腫瘍に放射線照射をした群(IR), 腫瘍に放射線照射をした後、同種樹脂状細胞を注射した群(IR+DCs)において反対側の背に形成された腫瘍治療效果を観察した際、右側大腿部の腫瘍に放射線のみ照射した場合には治療效果が観察されなかったが、右側大腿部の腫瘍に放射線を照射した後、左側背から樹脂状細胞を注入した場合には著しい治療效果を観察することができた。(IR群は放射線照射のみを実施した群であり、IR+DCsは放射線の照射後、反対側に樹枝状細胞を投与した群であって、IR群では明らかな效果がない結果で、IR+DCs後、右側大腿部の腫瘍の著しい減少で治療效果があることを見せる。Induction of the therapeutic anti-tumor immunity against distant tumor by intratumoral injection of dendritic cells into the irradiated tumor. Photographs (B) were taken １week after last immunization。)
【図２】図２は、固形癌を濃度別で投与した後、大きくなっている固形癌の大きさを対照した(青色)。試験群には固形癌を作った後、放射線を処理して未成熟樹脂状細胞を投与し、成長が抑制された腫瘍の大きさを比較測定した(赤色)。結果で效果が確かで６週後に最大濃度の腫瘍細胞を投与した試験群１匹を除いて皆治療されて固形癌が観察されなく、腫瘍が残っている１匹も平均２５０mm2以上の大きさが５０mm2以下に格段に減っている結果を見せている。
【図３】図３は腫瘍のない群(Tm(-)、腫瘍対照群(Tm(+))、樹脂状細胞処理群(DCs)、放射線の照射群(IR)、放射線照射後に樹脂状細胞処理群に試験群(IR+DCs)を分けて実験を行った結果、IR+DCs群で一番效果的な細胞毒性を見せて癌免疫治療能力が高いということが分る。5:1、10:1、20:1はSplenocytes : Tumor cellsの比率を現わす。Enhancement of antitumor immunity by intralesional injection of dendritic cells (DC) into irradiated (IR) tumor。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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2006509002.tif 000010