(57)【要約】本発明は、ヒト胚性幹細胞由来のインスリン産生細胞を開示する。インスリン産生胚性細胞系の集団を生成、濃縮、選択、クローニング、及び単離する方法が開示される。これらの細胞のインスリン産生は、グルコース応答性又は調節可能であり得る。有利には、これらのインスリン産生細胞は、ｈＥＳＣの安定なトランスフェクタント由来の安定な細胞系であり得る。これらの細胞、細胞集団、又は細胞系の使用方法、特に細胞療法での使用方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト胚性幹細胞由来のインスリン産生細胞を含む細胞集団。
【請求項２】
ヒト胚性幹細胞由来のインスリン産生細胞を濃縮した請求項１に記載の細胞集団。
【請求項３】
前記濃縮が、ヒト胚性幹細胞をインスリン、トランスフェリン、及び亜セレン酸塩で処理することを含む請求項２に記載の細胞集団。
【請求項４】
ヒト胚性幹細胞由来の選択されたインスリン産生細胞を含む請求項１に記載の細胞集団。
【請求項５】
ヒト胚性幹細胞由来の単離されたインスリン産生細胞を含む請求項１に記載の細胞集団。
【請求項６】
ヒト胚性幹細胞由来のクローン化インスリン産生細胞を含む請求項１に記載の細胞集団。
【請求項７】
ヒト胚性幹細胞由来の調節可能なインスリン産生細胞を含む細胞集団。
【請求項８】
ヒト胚性幹細胞由来のグルコース応答性インスリン産生細胞を含む請求項７に記載の細胞集団。
【請求項９】
ヒト胚性幹細胞由来のグルコース応答性インスリン産生細胞が濃縮された請求項８に記載の細胞集団。
【請求項１０】
前記濃縮が、インスリン、トランスフェリン、及び亜セレン酸塩による処理を含む請求項９に記載の細胞集団。
【請求項１１】
ヒト胚性幹細胞由来の選択されたグルコース応答性インスリン産生細胞を含む請求項８に記載の細胞集団。
【請求項１２】
ヒト胚性幹細胞由来の単離されたグルコース応答性インスリン産生細胞を含む請求項８に記載の細胞集団。
【請求項１３】
ヒト胚性幹細胞由来のクローン化グルコース応答性インスリン産生細胞を含む請求項８に記載の細胞集団。
【請求項１４】
前記細胞が、インスリン、島グルコキナーゼ、Ｇｌｕｔ−２グルコース輸送担体、Ｇｌｕｔ−１グルコース輸送担体、インスリンプロモータ因子１／膵臓及び十二指腸ホメオボックス遺伝子１  ＩＰＦ１／ＰＤＸ１転写因子、Ｎｇｎ３転写因子のグループの少なくとも１種の遺伝子を発現する請求項８〜１３のいずれか一項に記載のグルコース応答性インスリン産生細胞。
【請求項１５】
ヒト胚性幹細胞由来の安定なインスリン産生細胞を含む細胞集団。
【請求項１６】
ヒト胚性幹細胞由来の安定なクローンインスリン産生細胞を含む請求項１５に記載の細胞集団。
【請求項１７】
ｈＴＥＲＴ過剰発現ヒト胚性幹細胞由来のインスリン産生細胞を含む請求項１５に記載の細胞集団。
【請求項１８】
インスリンプロモータを含む構築物で安定にトランスフェクトされたヒト胚性幹細胞由来のインスリン産生細胞を含む請求項１５に記載の細胞集団。
【請求項１９】
インスリンプロモータで安定にトランスフェクトされたヒト胚性幹細胞由来のクローンインスリン産生細胞を含む請求項１８に記載の細胞集団。
【請求項２０】
ヒトインスリンプロモータのＤＮＡコード配列を含むベクターで安定にトランスフェクトされた未分化ヒト幹細胞のクローン。
【請求項２１】
インスリンプロモータで安定にトランスフェクトされたヒト胚性幹細胞由来の膵臓ベータ島細胞の多能性前駆体を含む細胞集団。
【請求項２２】
ヒト胚性幹細胞由来の膵臓ベータ島細胞の前駆細胞を含む細胞集団。
【請求項２３】
レポータ遺伝子が、インスリンプロモータ配列の下流に融合されている請求項２０に記載の細胞クローン。
【請求項２４】
レポータ遺伝子の発現が、インスリンプロモータ遺伝子によって調節される請求項２０に記載の細胞クローン。
【請求項２５】
インスリン産生細胞を含む請求項２０に記載の細胞クローン。
【請求項２６】
幹細胞由来のインスリン産生細胞をイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で濃縮する方法であって、
（ｉ）血清代替物、非必須アミノ酸、メルカプトエタノール、グルタミン、線維芽細胞増殖因子から選択された補足剤を補った既知組成の無血清培地で未分化多能性幹細胞を培養する段階、
（ｉｉ）（ｉ）の付着細胞培養物を分散し、細菌用ペトリ皿の浮遊培養に移す段階、及び
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の細胞の培地に、インスリン、トランスフェリン、及び亜セレン酸ナトリウム（ＩＴＳ）、グルコース、ニコチンアミド、ケラチノサイト増殖因子、線維芽細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、上皮増殖因子、神経発育因子、アクチビン、βセルリンからなるグループから選択された補足剤を添加する段階、
を含む上記方法。
【請求項２７】
（ｉ）血清代替物、非必須アミノ酸、メルカプトエタノール、グルタミン、線維芽細胞増殖因子から選択された補足剤を補った既知組成の無血清培地中、供給細胞層上に未分化多能性幹細胞を培養する段階、
（ｉｉ）（ｉ）の付着細胞培養物を分散し、細菌用ペトリ皿の浮遊培養に移す段階、
（ｉｉｉ）線維芽細胞増殖因子を含まない（ｉ）の培地で４〜５の間、（ｉｉ）の細胞を培養する段階、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）で形成された胚様体を分散し、フィブロネクチンコート組織培養皿の無血清培地に移す段階、
（ｖ）（ｉｖ）の培地に、フィブロネクチン、トランスフェリン、及び亜セレン酸ナトリウム（ＩＴＳ）からなるグループから選択された補足剤を添加する段階、
（ｖｉ）（ｖ）の培地に、Ｂ２７補足剤（ＧＩＢＣＯ）、Ｎ２補足剤（ＧＩＢＣＯ）、ラミニン、線維芽細胞増殖因子からなるグループから選択された補足剤を添加する段階、及び
（ｖｉｉ）（ｖｉ）の培地を、Ｂ２７補足剤（ＧＩＢＣＯ）、Ｎ２補足剤（ＧＩＢＣＯ）、ラミニン、ニコチンアミドからなるグループから選択された補足剤を含む培地に置き換える段階、
を含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
細胞置換療法でのヒト胚性幹細胞由来インスリン産生細胞の使用。
【請求項２９】
前記細胞を、それを必要としている対象の膵臓に移植する請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記細胞を、それを必要としている対象の異所部位に移植する請求項２８に記載の使用。
【請求項３１】
ヒト胚性幹細胞由来インスリン産生細胞を用いて、それを必要としている患者を治療する方法であって、ヒト胚性幹細胞由来インスリン産生細胞を含む細胞集団を移植することを含む上記方法。
【請求項３２】
ヒト胚性幹細胞由来インスリン産生細胞を含む細胞集団を膵臓に移植することを含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ヒト胚性幹細胞由来インスリン産生細胞を含む細胞集団を異所部位に移植することを含む請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリン産生ヒト胚性幹細胞、インスリン産生ヒト胚性幹細胞集団の生成及び濃縮、インスリン産生ヒト胚性幹細胞又は安定細胞系の単離、並びにこれらの細胞の使用方法、特に細胞置換療法での使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｉ型糖尿病は一般に、結果として生じる絶対的インスリン欠乏、及び外因性インスリン治療への完全依存を伴う、ランゲルハンス島β細胞の自己免疫破壊に起因する。膵臓又は島同種移植片移植の提供片が相対的に不足しているため、β細胞置換療法の代替供給源の探求が促されてきた。
【０００３】
最近の研究は、Ｉ型糖尿病の眼、神経、及び腎合併症を低減するために、厳格な血糖コントロールが重要であることを強調している（Ｆｉｏｒｅｔｔｏ等、１９９８）。さらに、現在のところ膵臓及び島細胞置換が、唯一の治療アプローチであると考えられている。実際に、このアプローチは糖尿病性腎症を伴う患者において糸球体病変を好転することが最近示された（Ｓｈａｐｉｒｏ等、２０００）。このアプローチへの期待は、島同種移植片移植において糖質コルチコイドを含まない有害性の低い改善された治療プログラムの使用が報告されたことによって近年さらに高まっている（Ｓａｍｓｔｅｉｎ等、２００１）。しかしながら、提供片の不足が主要な障害であり、このアプローチが実用的な解決手段となるのを妨げている。したがって、異種移植片などの代替供給源の使用に注目が集まっているが、異種移植片は未特定の人畜共通性感染の潜在的リスクを含む、他の不利益を有する（Ｅｆｒａｔ、１９９８）。齧歯動物由来のβ細胞系が、細胞置換治療の無限の供給源を提供する可能性も示唆されている。生体異物源に内在する問題に加えて、そのような細胞系は、増殖中のインスリン生合成及び調節性分泌の低下を伴う表現型の不安定性を露呈することが示されている（Ｅｆｒａｔ、１９９９、Ｓｏｒｉａ等、２０００ａ、Ｃｈｅｕｎｇ等、２０００）。より最近に記載された他のアプローチには、グルコース感受性プロモータの制御下でインスリン遺伝子又はインスリン遺伝子アナログを発現させることによって、あるいはインスリンプロモータ因子１／膵臓及び十二指腸ホメオボックス遺伝子１（ＩＰＦ１／ＰＤＸ１）の異所性発現によって（Ｔｈｏｍｓｏｎ等、１９９８）、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子導入を用いて他の組織にβ細胞表現型を拡張することが含まれる（Ｌｅｅ等、２０００、Ｆｅｒｂｅｒ等、２０００）。
【０００４】
多能性ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ等、２０００、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ等、１９９８）、及び胚性生殖（ＥＧ）細胞（Ｓｏｒｉａ等、２０００ｂ）の確立は、特に最近のマウスＥＳからのグルコース感受性インスリン分泌細胞産生の成功の観点から（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ等、２００１）、Ｉ型糖尿病患者における細胞療法に新しい潜在的供給源を導入した。ｈＥＳ細胞は、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）供給細胞層上で増殖させるとき、均質な未分化コロニーとして増殖する（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ等、２０００）。以前に示されているように、これらのｈＥＳ細胞は、正常な核型を有し、テロメラーゼ及び胚性細胞表面マーカを発現する。ＭＥＦ供給細胞層からの除去は、ヌードマウスへの皮下注射後に形成される奇形腫から明らかなように、３種の胚性生殖層の派生物への分化に関連している（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ等、２０００）。インスリン発現ではないが、内胚葉マーカは、以前に行われたＥＧ細胞での異なる増殖条件及び分化マーカの総合的な調査において報告されている（Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ等、２０００）。分化ｈＥＳ細胞から抽出されたＲＮＡにＲＴ−ＰＣＲを適用し、インスリンを含む多様な分化細胞マーカを検出することが報告されている（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、１９８７）。
【０００５】
哺乳動物幹細胞に関して哺乳動物細胞の混合集団を濃縮する方法は、米国特許第６１４６８８８号に記載されている。この方法によれば、この哺乳動物細胞の混合集団は、哺乳動物幹細胞において優先的に抗生物質耐性遺伝子を発現するプロモータに操作的に結合した抗生物質耐性遺伝子を含む。したがって、哺乳動物細胞の混合集団は、抗生物質の存在下、哺乳動物幹細胞の優先的な生存に寄与する条件下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養される。
【０００６】
新規な胚性細胞集団を生成し、増殖因子の組合せを用いて胚性幹細胞を増殖し、そのような細胞系を不朽化する多様な方法は当分野で知られており、数ある中でもたとえば米国特許第５６９０９２６号、第５７５３５０６号、第６１１０７３９号、欧州特許出願第３８０６４６号に記載されている。
【０００７】
細胞の多能性を保持しながら、ヒト胚性幹細胞を長期間ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する方法、並びに前記細胞の精製調製物は米国特許第６２００８０６号に記載されている。この胚性幹細胞は、培養期間中及び１１ヶ月の連続培養後、３種すべての胚性生殖層由来のすべての組織に分化する能力も維持する。
【０００８】
幹細胞を含む細胞の増殖、付着、及び／又は分化を支持する表面を産生する方法は、米国特許第６２３２１２１号に記載されている。この方法は、少なくとも１種の生物活性増殖因子を含む細胞外マトリクスの細胞による分泌を促進する条件下で表面上に骨肉腫細胞を増殖させることを含み、細胞外マトリクス及び増殖因子は同時に産生され、細胞外マトリクスは前記表面に接着されている。
【０００９】
未分化胚性幹細胞から所望の構造の所望の生体組織を哺乳動物において再生する方法は、米国特許第６３２８７６５号に記載されている。
【００１０】
治療上有効量のヒト間葉幹細胞を投与することによって、ヒト対象を治療する方法は、米国特許第６３５５２３９号に記載されている。この特許による幹細胞は、組み込まれた当該遺伝物質を発現することができる。
【００１１】
インスリン産生細胞系が確立されたヒト幹細胞系から得られる可能性のあることは背景技術のいずれにも教示されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の一目的は、ヒト胚性幹細胞由来のインスリン産生細胞を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、ヒト胚性幹細胞由来のインスリン産生細胞を濃縮した細胞集団を提供することである。好ましくはヒト胚性幹細胞由来の選択されたインスリン産生細胞を含有する細胞集団、より好ましくは単離された細胞、もっとも好ましくはクローン化細胞系が、本発明の原理に従って提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の他の態様によれば、ｈＥＳ細胞由来のインスリン産生細胞、又はｈＥＳ細胞由来のインスリン産生細胞を含む細胞集団は調節可能である。好ましくは、それらはグルコース応答性、又はインスリン産生及び分泌に関してグルコース調節可能である。
【００１５】
本発明の他の態様によれば、ｈＥＳ細胞由来のインスリン産生細胞、又はｈＥＳ細胞由来のインスリン産生細胞を含む細胞集団は、長期間にわたって安定であり、好ましくは長命であり、すなわち増殖停止又は老化せず、より好ましくは安定な細胞系であり、もっとも好ましくはクローン細胞系であり、あるいは不朽化細胞系である。
【００１６】
本発明の他の態様によれば、ｈＥＳ細胞由来のインスリン産生細胞、又はｈＥＳ細胞由来のインスリン産生細胞を含む細胞集団は、これに限定されるものではないが、細胞置換療法を含む医療応用例に有用である。
【００１７】
本発明の原理により、多能性未分化ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞が系統特異分化の系として機能し得ることがここに開示される。付着及び浮遊培養条件においてｈＥＳ細胞を用いる本発明の好ましい実施形態において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化がインスリン産生β細胞の特性を有する細胞の生成を含むことが実証された。インスリンの免疫組織化学染色が、驚くほど高い割合の細胞で認められた。インスリンの培地への分泌は、分化依存的に認められ、他のβ細胞マーカの出現に関連した。これらの調査結果は、糖尿病における細胞置換療法の可能な供給源としてのヒトβ細胞又はその前駆体の派生及び／又は濃縮の潜在的基礎として、ｈＥＳ細胞系の有効性を示している。
【００１８】
本発明のより好ましい実施形態により、インスリンプロモータを用いてヒト胚性幹細胞を安定にトランスフェクトできることがここに開示される。以下に例示するとおり、これらの安定なトランスフェクタントは多能性を維持する。
【００１９】
本発明のもっとも好ましい一実施形態によれば、インスリンプロモータは、非限定的な例として緑色蛍光タンパク質などの蛍光マーカのような好都合なマーカに結合することができ、それによりトランスフェクタントの蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）による選択又は濃縮が可能になる。この安定なトランスフェクタントは、非限定的な例としてハイグロマイシンなどの抗生物質を用いて選択することができ、首尾よくクローン化できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
最近、ヒト及び成体マウスの膵幹細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで島細胞が首尾よく生成された（Ｒａｍｉｙａ等、２０００、Ａｍｉｔ等、２０００）。後者の研究において、Ｒａｍｉｙａ等は、非肥満型糖尿病マウスに移植後、これらの島細胞が糖尿病を好転できることを示した。しかしながら、このアプローチの重大な実用上の制限は、ヒト膵臓から培養できる細胞の数が限られていることである。したがって、ヒト胚性幹細胞は適当な潜在的代替物である。
【００２１】
本発明は、ヒト胚性幹細胞由来のインスリン産生細胞の生成、濃縮、選択、クローニング、及び使用に関する。本発明を、好ましい実施形態に関してここに詳しく記載する。
【００２２】
Ｉ．定義
本明細書では、「多能性胚性幹細胞」は、生殖細胞（精子及び卵子）を含む、胚又は成体に多数の分化細胞型を生じることのできる細胞を意味する。これは細胞系統においてもっとも分化していない細胞である。多能性胚性幹細胞は自己複製することもできる。この細胞型は、本明細書では「ＥＳ細胞」とも呼ばれる。しかしながら、幹細胞は操作上の用語である。ＥＳ細胞は供給細胞層で培養されるか、又はある種の細胞によって調整された培地で培養されたときにのみ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで幹細胞表現型を保持することが知られている。供給細胞層又は調整培地が存在しないとき、ＥＳ細胞は自然に多種多様な細胞型に分化し、これは胚形成中、及び成体動物において見出されるものに類似している。
【００２３】
本明細書では、「供給細胞層」は、多能性ＥＳ細胞を培養するために培養された細胞又は細胞系である。あるいは、供給細胞層は、始原生殖細胞、胚体外胚葉細胞又は生殖細胞が位置する、たとえば生殖腺などの器官又は組織に由来するか、又はそれらから提供され得る。したがって、所望の細胞が位置する組織又は器官の体細胞が適切な培養環境を提供するのに充分である場合、別の供給細胞層は必要でない。あるいは、この供給細胞層は、細胞外マトリクスと結合増殖因子とによって代用できる。
【００２４】
本明細書では、「補足剤」という用語は、「因子」という用語と同じ意味で用いられる。培地に添加される因子は、多能性ＥＳ細胞の形成に必須である。したがって、用いられる因子の量は、多能性ＥＳ細胞の最終結果によって決定される。しかしながら、この因子はさらに増殖を促進し、細胞の連続増殖を可能にする役割も果たす。したがって、因子は細胞の生存にも役立っていると考えられる。
【００２５】
本明細書では、「遺伝子改変細胞」という用語は、たとえば当該遺伝子のコード配列を含む発現ベクターなどのベクターによってトランスフェクトされた細胞に関し、前記細胞は前記遺伝子を発現することができる。特に本発明において、遺伝子改変細胞は、リボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）；細胞特異遺伝子プロモータ、たとえばβ細胞分化経路の非常に早い段階でβ細胞の前駆体において活性化するＰＤＸ−１；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；これに限定されるものではないが、たとえばネオマイシンなどの抗生物質を含む選択マーカ、又は蛍光マーカ、たとえば変異型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）；構成プロモータ、たとえばＰＧＫプロモータ又は他の哺乳動物プロモータから選択された少なくとも１つの遺伝子コード配列を含有する発現ベクターを用いてトランスフェクトされた胚性幹細胞である。この遺伝子改変ｈＥＳ細胞は、それらをインスリン産生細胞に分化させる条件下で培養することができる。
【００２６】
ＩＩ．本発明を実施するための好ましい様式
膵臓の胚発生は、増殖因子、上皮／間葉相互作用（Ｅｄｌｕｎｄ、１９９９）、及び最終的に多様な転写因子の発現を調節する細胞外マトリクス（Ａｐｅｌｑｖｉｓｔ等、１９９９、Ｋｉｍ等、２００１、Ｅｆｒａｔ、１９９７）を含むいくつかの別個であるが相互に作用する機構によってもたらされるものであることが当分野で知られている。しかしながら、腸内胚葉が膵臓組織に発達することを確約する事象のカスケードにおける最初のシグナルはまだ知られていない。
【００２７】
現在用いられるｈＥＳ細胞は、未分化状態で均質に見えるにもかかわらずクローン起源ではなく、各ｈＥＳ由来細胞系の分化をｉｎ  ｖｉｔｒｏで独立して調べるか、あるいは増殖因子に対する明確な分化応答を用いてクローンｈＥＳ細胞系を調べる必要性を示唆している（Ｋｌｕｇ等、１９９６）。
【００２８】
胚性幹細胞は、自然に分化する生得の特性を示す。本発明の未分化ｈＥＳ細胞の集団を濃縮し、その均質性を維持するために、これらの細胞の生得の自然分化は抑制されなければならない。胚性細胞の分化を抑制する方法には、以下に非限定的な例として記載するようなマウス線維芽細胞などの供給細胞層、又はある種の細胞によって調整した培地で未分化胚性細胞を培養することが含まれる。
【００２９】
ｈＥＳ細胞における分化の誘導、好ましくは特定の細胞系統に対して制御された誘導は、たとえば培地から分化抑制要素、たとえば供給細胞層を除去することによって主として達成される。結果として生じる分化を有効に制御するために、細胞は均質状態でなければならない。胚性幹細胞の増殖及び分化を支持できる任意の細胞培養培地を本発明に用いることができる。そのような細胞培養培地には、これに限定されるものではないが、Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉａ  Ｅａｇｌｅ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ培地、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ培地、ＭｃＣｏｙ’ｓ培地、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、Ｆ−１０  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅｓ、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ培地、ＲＰＭＩ培地、及びＭａｃｒｏｐｈａｇｅ−ＳＦＭ培地、又はそれらの組合せが含まれる。培地は、濃縮（たとえば１０倍）、又は非濃縮形態で供給でき、液体、粉末、又は凍結乾燥体として提供されることができる。培地は、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ  Ｍｄ．）、及びＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｍｏ．）などの多数の供給元から市販されている。
【００３０】
本発明の一態様によれば、インスリン産生細胞に対して制御されたｈＥＳ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化は、好ましくは、以下でノックアウト培地とも称する無血清条件下で行われる。好ましくは、ノックアウト培地には、血清代替物、非必須アミノ酸、２−メルカプトエタノール、グルタミンを補足する。もっとも好ましくは、ノックアウト培地には、さらにヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｈｒｂＦＧＦ）を補足する。
【００３１】
ＥＳ細胞を用いて、ＥＳ派生（より分化した）細胞を産生する因子をスクリーニングすることができる。より分化した細胞の存在を判定するための多くの標準的な手段が当分野でよく知られている。たとえば、ＲＴ−ＰＣＲは分化ｈＥＳ細胞から抽出されたＲＮＡに適用され、インスリンを含む多様な分化細胞マーカの検出を可能にしている（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、１９８７）。しかしながら、インスリンの培地への同化、インスリン産生細胞の割合を含む量的な側面は当分野で知られていない。そのような情報は、β細胞置換細胞療法の供給源として、ｈＥＳ細胞の使用を可能にするために不可欠である。
【００３２】
本発明は、さらにβ細胞の特徴を有するインスリン分泌細胞を産生する経路が、本明細書に記載の適切な条件下、培養ヒト胚性幹細胞の自然分化の過程で生じるのは珍しくないことを証明している。この観察結果は、細胞置換療法に用いる、自然発生β細胞又はその前駆体の濃縮に基づく実験的方策の必要条件である。本明細書に記載の細胞は、インスリンを産生、分泌し、２種の必須の遺伝子、Ｇｌｕｔ−２及び島特異グルコキナーゼ（ＧＫ）を発現するが、これらはβ細胞機能及びグルコース刺激インスリン分泌において重要な役割を果たすと考えられている（Ｍａｔｓｃｈｉｎｓｋｙ等、１９９８、Ｓｈｅｐｈｅｒｄ等、１９９９、Ａｌａｒｃｏｎ等、１９９８）。β細胞発生マーカ出現の時間的経過を含む、同定された他のマーカを考慮し、完全にプロセシングされたインスリンの分泌を考慮すると、インスリン染色細胞がβ細胞に関係せず、胚体外性又は他の起源である（Ｌｉｎｇ等、１９９６）という可能性は極めて低い。
【００３３】
有効な細胞置換療法の他の必要条件は、ヒト胚性幹細胞によるインスリン産生がグルコース応答性又は調節可能であることである。β細胞が均質又は濃縮状態でなく、他の細胞型の中に存在する限り、グルコースの作用を他の分泌促進物質の対抗的な作用から分離することはできない。さらに、均質細胞集団が存在しないとき、ＥＢの不均質性、及びタンパク質又はＤＮＡ含量などのパラメータに対するインスリン応答を正規化することの難しさから、異なる実験条件に基づく比較は容易に定量されない（Ｊｏｎｋｅｒｓ等、１９９９）
【００３４】
選択された細胞を単離及び増殖するために、不均質なＥＳ細胞集団から前駆細胞を選択する好ましい方策には、細胞特異プロモータを用いた多能性ＥＳ細胞のトランスフェクションが含まれる。好ましくは、細胞特異プロモータをさらに、抗生物質耐性クローンを選択できる抗生物質などの都合のよいマーカ、又は蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）によって所望の細胞を選択できる蛍光マーカに結合することができる。
【００３５】
本発明の好ましい一実施形態によれば、未分化ヒトＥＳ細胞は、β細胞発生の非常に早い段階でβ細胞前駆体において活性化する細胞特異遺伝子プロモータを用いてトランスフェクトされ、前記トランスフェクションは、ＥＳ細胞の多能性を損なわない。さらに、前記プロモータの制御下、選択マーカが添加され、トランスフェクト細胞は分化され、選択的インスリン産生細胞クローンが産生される。
【００３６】
グルコースに応答するインスリン分泌の微調整は、機能の異質性のため隣接するβ細胞間の相互認識を必要とし、単離されたβ細胞の機能は、クラスタ又は偽島に見出されるβ細胞とは異なることが示されている（Ｃｈａｒｏｌｌａｉｓ等、２０００、Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ等、２０００）。他の系において以前に報告されているように、高濃度のグルコースへの長期の曝露は、そのようなインスリン産生細胞の機能に影響を及ぼし、急激なグルコースの変化に対する応答性が低減される可能性のある（Ｊｏｎｋｅｒｓ等、１９９９）ことが考えられる。この高グルコース培地は、生存可能なｈＥＳの培養増殖の維持に必要であるが、このことは低濃度のグルコースを含有する培地でのインスリン産生能力を備えた細胞の増殖を可能にするプロトコルがグルコース応答性を付与又は回復する可能性を排除しない。いずれの場合においても、分化ｈＥＳ由来のβ細胞移植片を用いた糖尿病の治療のために、マウスＥＳ由来β細胞に関して実証されている（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ等、２００１）濃縮又は均質β細胞培養物獲得後の刺激−分泌連関を実証する必要がある。
【００３７】
本明細書に開示の様々な実験的アプローチの元でｈＥＳ細胞のＨ９系の分化を用いて、もっとも顕著なインスリン産生及び分泌を含むβ細胞の特徴を備えた豊富な細胞が確立されることが初めてここに開示される。ｈＥＳの安定なトランスフェクタントが得られたことが初めてここに開示される。これらのトランスフェクタントは多能性を維持し、選択、濃縮、クローン化することができる。これらの安定にトランスフェクトされたクローンを浮遊培養で増殖したとき、野生型ｈＥＳＣに外観の類似した、細胞集合体（胚様体）が生成された。
【００３８】
多量の未分化及び分化胚性幹細胞の濃縮及び増殖には、低い増殖能及び寿命の限定という不都合が起こることが考えられる。この制限を克服するために設計された条件及び方法は、細胞置換療法の利益を大いに高めることになる。このことは、より高い供給量のｈＥＳ細胞を提供する多能性未分化胚性幹細胞の「自己再生」の増加、及びより高い供給量の系統特異細胞、特にインスリン産生β細胞を提供する分化を伴う増殖の両方に当てはまる。分化及び未分化胚性幹細胞に増殖優位性を付与する可能性のある薬剤が、好ましくは本発明において用いられる。テロメア長及び完全性を維持し、それによって胚性幹細胞の増殖能を拡大するために、特にテロメラーゼを用いることができる。ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）の異所性過剰発現が分化パターンに悪影響を及ぼさない場合、テロメラーゼ陽性ＥＳ細胞の完全に分化された所望の系統を生じることができる。
【００３９】
さらなる特性決定と研究のためにインスリン分泌ｈＥＳ由来細胞系の集団を濃縮する方策に関して、マウスＥＳ細胞由来の心筋細胞を濃縮するために最初にＫｌｕｇ等が記載したアプローチを本出願にも潜在的に適合できることを本出願人等の結果は間違いなく示唆している（Ｋｌｕｇ等、１９９６）。簡潔に述べれば、Ｋｌｕｇのアプローチは、ＥＳ細胞の心筋細胞への分化の誘導、それに続く心筋ミオシンプロモータを用いたＥＳ細胞の安定なトランスフェクションに基づいている。この単純な遺伝子改変は、分化性ＥＳ細胞からの本質的に純粋な心筋細胞の培養の生成を可能にする。非限定的な１つの例として、β細胞の場合、下流の選択マーカに接合されたインスリンプロモータは、分化ヒトＥＳ細胞由来のこれらの細胞の適切な選択ツールとしての機能を果たすことができる。実際に、最近この方策はマウスＥＳ細胞由来のβ細胞の濃縮に拡大適用された（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ等、２００１）。本発明の観察結果は、非クローン多能性ｈＥＳ細胞の自然分化の条件下であっても、インスリン産生能を有する細胞を驚くほど高い発現量で含むＥＢが産生されることを示唆している。この研究において６０％を越えるＥＢが陽性染色細胞の散在小集団を含有し、これはマウスＥＳでは１％未満であるのに対し、ヒトＥＢの細胞集団の約１〜３％に相当する（Ｅｆｒａｔ、１９９８、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ等、２００１）。これは自然に起こったように見えるが、分化培地にはｂＦＧＦが補足されていることに留意されたい。近年、Ｈａｒｔ等（Ｈａｒｔ等、２０００）は、ＦＧＦシグナリングがβ細胞の成熟、最終分化、及び生後伸長に関与する可能性のあることを示した。組織工学による推定値は、このことがすでにＫｌｕｇ等（Ｋｌｕｇ等、１９９６）に記載の方策に基づく濃縮プロトコルの充分な基礎となることを示している。重要なことに、ＥＢの約６０％であるサブセットがインスリンを含有し、残部はインスリンを含有していないという観察結果は、その後の濃縮に用いる原材料として、もっとも高い割合でインスリン発現細胞を含むＥＢのサブセットを選択することから始めることが有用である可能性を示している。インスリンプロモータに駆動される必須のレポータマーカを安定に過剰発現するｈＥＳを用いることによって、このサブセットのＥＢを犠牲にすることなくこれらを選択することができる。本明細書で以下に例示するとおり、ＥＢ中の細胞混合集団においてβ細胞の出発総数を増加するための追加のプロトコルは、濃縮方策の収率を高めることができる。
【００４０】
その発現がたとえば本発明の細胞に増殖優位性を付与し、選択効率を高める可能性のある所望の遺伝子が細胞培養に導入される。エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、その遺伝子配列を含有するウイルス又はバクテリオファージベクターの感染、細胞融合、染色体介在遺伝子導入、マイクロセル介在遺伝子導入、リン酸カルシウム介在トランスフェクション、スフェロプラスト融合などを含む、細胞に外来遺伝子を導入するための多数の技法が当分野で知られている（たとえば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ等、１９９３、Ｃｏｈｅｎ等、１９９３、Ｃｌｉｎｅ、１９８５を参照のこと）。受容細胞に必要な発達及び生理的機能が妨げられないならば、これらの方法を本発明に従って用いることができる。その遺伝子がその細胞によって発現可能であり、好ましくはその細胞子孫においても遺伝性かつ発現可能であるために、この方法はさらにＥＳ細胞への安定な遺伝子の導入を提供するべきである。通常この導入法には、細胞に選択マーカを導入することが含まれる。次いで、この細胞を選択段階に供し、導入された遺伝子を取り込み、それを発現している細胞を単離する。
【００４１】
ＩＩＩ．薬理学
本発明のＥＳ細胞は、病的状態を治療する療法に用いる細胞を得るために用いることができる。胚性幹細胞由来のインスリン産生細胞を導入するか、あるいは多能性胚性幹細胞を得ることのできる対象は、好ましくは、これに限定されるものではないが、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどを含む動物であり、好ましくは哺乳動物であり、もっとも好ましくはヒトである。好ましくは、この胚性幹細胞はそれが投与される対象に由来し、すなわち移植片は自己由来である。たとえば、ヒトＥＳ細胞の派生物は、インスリン産生β細胞置換細胞療法の供給源として用いることができる。
【００４２】
本発明は、治療上有効量の細胞、好ましくは胚性幹細胞由来のインスリン産生細胞を含む薬剤（治療）組成物を対象に投与することによって治療する方法を提供する。治療上の使用が想定されるそのような細胞は、以下において「治療剤」又は「本発明の治療剤」と呼ぶ。好ましい態様において、治療剤は実質的に精製されている。対象は、好ましくは哺乳動物、もっとも好ましくはヒトである。
【００４３】
本発明の治療剤は、移植される細胞型及び移植部位に適切な、当分野で知られている任意の方法によって、疾病又は損傷の治療のために患者に投与することができる。この細胞は、当該器官に位置することができるならば、静脈内に移植することができる。特定の実施形態において、本発明の治療剤は、治療を必要としている領域に局所的に投与することが望ましい可能性がある。この投与は、これに限定されるものではないが、たとえば手術時局所注入、局所適用、たとえば注入、カテーテル、又はインプラントにより埋め込み部位で膵臓に直接移植することによって達成され、前記インプラントは、ポーラス、非ポーラス、又はゼラチン材料であり、シアラスチック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜などの膜、又はファイバーが含まれる。
【００４４】
本発明は、薬剤組成物を提供する。そのような組成物は、治療上有効量の治療剤、及び薬剤として許容される担体又は賦形剤を含む。そのような担体には、これに限定されるものではないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びそれらの組合せが含まれる。この担体及び組成物は無菌であり得る。配合は投与様式に適しているべきである。
【００４５】
この組成物は所望であれば、微量の湿潤剤、乳化剤、又はｐＨ緩衝剤をさらに含むことができる。組成物は、溶液、懸濁液、又はエマルジョンであることができる。
【００４６】
好ましい一実施形態において、この組成物は、好ましくはヒトの膵臓組織への静脈内投与又は異所性投与に適合させた薬剤組成物として常法に従って配合される。必要な場合には、この組成物は、可溶化剤、及び投与部位の痛みを緩和するためにリグノカインなどの局所麻酔剤をさらに含むことができる。
【００４７】
本明細書で細胞移植とも称する細胞置換療法のために変更できる代表的な方法は、Ｌｉｎｄｖａｌｌ等によって示されている（Ｌｉｎｄｖａｌｌ等、１９８９及び１９９０）。
【００４８】
特定の障害又は状態の治療に有効な本発明の治療組成物の量は、その障害又は状態の性質によって決まり、標準的な臨床技術によって決定することができる。さらに、最適な投与量範囲を特定する一助とするために、任意選択でｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いることができる。製剤に用いられる正確な用量は、さらに投与経路、及び疾病又は障害の重篤度によって決まり、医師の判断、及び各患者の状況によって決定されるべきである。
【００４９】
ＩＶ．本発明の利点
本明細書に開示のとおり、ｈＥＳ細胞の複雑な分化パターンは、プロインスリン及び／又はインスリン産生、インスリン放出、並びに他のβ細胞マーカの発現を含む、β細胞機能の多くの特性を有する細胞のサブセットを含む。この発見は、Ｉ型糖尿病における細胞置換の供給源としてのｈＥＳ細胞由来の細胞の濃縮に基づく方策に必要な前提条件である。さらに、そのような細胞を驚くほど高い割合で含むＥＢの数は、細胞置換療法におけるインスリン産生ヒト胚性幹細胞の使用の成功の可能性に関して好材料である。
【００５０】
結論として、本出願人等はここに初めて、細胞特異プロモータによって駆動されるレポータを遺伝子導入した、遺伝子導入多能性未分化ｈＥＳＣクローンを開示する。このアプローチは、インスリン産生細胞の分化の調査及びモニターに有用である。本発明は、細胞移植療法に有用なｈＥＳＣ由来のインスリン産生細胞の成功した単離及び濃縮を初めて提示する。
【００５１】
本発明は本明細書に特に示し記載したものによって制限されないことを、当分野の技術者は理解するであろう。本発明の範囲は添付の請求の範囲によって定義される。
【実施例１】
【００５２】
研究計画及び方法
ａ．組織培養
多量の初代マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）をＲｏｂｅｒｔｓｏｎ（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ等、１９９５）に記載のとおり調製し、液体窒素に保存した。各解凍後、細胞は３〜５継代のみ使用した。
【００５３】
ｈＥＳ  Ｈ９細胞を、３５Ｇｙでγ照射することによって有糸分裂不活性化したＭＥＦの供給細胞層上で培養増殖して未分化状態で維持し、ゼラチンコートした６ウェルプレートに培養した。細胞を、２０％血清代替物（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、１％非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、０．１ｍＭ２−メルカプトエタノール（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、１ｍＭグルタミン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ａｓｈｒａｔ、Ｉｓｒａｅｌ）、４ｎｇ／ｍｌヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｈｒｂＦＧＦ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）を補足したノックアウトＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で増殖させた。培養物を５％ＣＯ２、湿度９５％で増殖させ、０．１％のコラゲナーゼＩＶ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）で分散した後、４〜５日毎に定期的に継代した。
【００５４】
ｂ．ｈＥＳ細胞の分化の誘導
マウスＥＳに分化を誘導する方法を、本発明においてｈＥＳ分化の誘導に適用した（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ等、１９９５、Ｋｅｌｌｅｒ、１９９５）。簡潔に述べると、約１０7の未分化ｈＥＳ細胞を分散させ、１００ｍｍ細菌用ペトリ皿（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で浮遊培養したが、これによって初期の小集合体形成を特徴とする同調分化が誘導され、次いで胚様体（ＥＢ）の構造が得られる（Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ等、２０００）。別法として、ｈＥＳコロニーをコンフルエンスまで（約１０日）未継代のままにし、その後、供給細胞層を含まないゼラチンコート６ウェル組織培養プレートに再び培養した。細胞は、一連の細胞表現型に自然に分化した。分化に用いた増殖培地は、上述のとおりである。
【００５５】
ｃ．組織学的分析
ＥＢを指示された間隔で収集し、氷冷ＰＢＳで３回洗浄、１０％中性緩衝ホルマリンに一晩固定、段階的濃度（７０〜１００％）のアルコールで脱水、パラフィンに包埋した。一般的な組織形態学分析のために、５μｍの切片をヘマトキシリン／エオシンで染色した。
【００５６】
ｄ．免疫組織化学
脱パラフィンした５μｍの切片を、１次抗体のポリクローナルモルモット抗ブタインスリン１：１００希釈（Ｄａｋｏ）と共に室温で９０分間インキュベートし、次いでヤギ抗ウサギビオチン化２次抗体と共にインキュベートした。ストレプトアビジン／ペルオキシダーゼ複合体及び基質としてＡＥＣ（又はＤＡＢ）（Ｈｉｓｔｏｓｔａｉｎ−ＳＰキット、Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂ  Ｉｎｃ．ＣＡ）を用いて、検出を行った。対比染色はヘマトキシリンを用いて行った。非免疫血清を陰性コントロールとして用い、正常ヒト膵臓パラフィン切片を陽性コントロールとして用いた。
【００５７】
ｅ．形態計測研究
免疫組織化学によって陽性に染色している細胞の相対的割合を推定するために、以前に記載されているとおり形態計測を行った（Ｇｒｅｅｎ等、２０００）。
【００５８】
ｆ．インスリン検出アッセイ
付着細胞に関して、ＭＥＦ、未分化ｈＥＳ細胞、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで自然に分化した細胞を、２０日を超える期間６ウェルプレートで増殖させた。細胞を、２５ｍＭグルコースを含有する無血清培地で３回洗浄し、３ｍｌの無血清培地中で２時間インキュベートした。浮遊ＥＢに関して、５０ｍｍの細菌用ペトリ皿で実験を行った。プレート当たり６０から７０のＥＢを、５．５ｍＭ又は２５ｍＭのグルコースを含有する３ｍｌの無血清培地に曝露した。その後、調整培地を回収し、プロインスリン又はＣペプチドに交差反応性がなく、ヒトインスリンを検出する微粒子酵素免疫測定法ＭＥＩＡ（Ａｂｂｏｔｔ  ＡＸＳＹＭ（登録商標）システムインスリンキット、コードＢ２Ｄ０１０）を用いて、インスリンレベルを測定した。データは平均±標準誤差で表す。
【００５９】
ｇ．ＲＴ−ＰＣＲ
未分化ｈＥＳ細胞、及びＥＢとして、又は分化の様々な段階の高密度培養として増殖するｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化ｈＥＳ細胞から全ＲＮＡを単離した。
【００６０】
０．５μｍｏｌ／ｌのオリゴｄＴ(12-18)（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）及び４００μｍｏｌ／ｌのｄＮＴＰを含有する１倍転写バッファ中でＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、７μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡのアリコートを、ＩＰＦ１／ＰＤＸ１、ニューロゲニン３（Ｎｇｎ３）、オクタマー結合転写因子（Ｏｃｔ４）、Ｇｌｕｔ−１、及びＧｌｕｔ−２に対して１：５、又はインスリン、及び島特異グルコキナーゼ（ＧＫ）に対して１：２で希釈した。続いてＰＣＲ反応を以下のように行った。ｃＤＮＡ２．５μｌ（ＩＰＦ１／ＰＤＸ１、Ｎｇｎ３、Ｏｃｔ４の場合）又は５μｌ（その他の場合）、１倍ＰＣＲバッファ、ｄＮＴＰ４００μｍｏｌ／ｌ、各プライマペア１００ｎｇ、Ｔａｑポリメラーゼ１Ｕ。５分間の最初のホットスタート後、βアクチンは２８サイクル、Ｇｌｕｔ−１は３１サイクル、Ｇｌｕｔ−２は４０サイクル、グルコキナーゼは３８サイクル、インスリンは３６サイクル、Ｏｃｔ４は３７サイクル、ＩＰＦ１／ＰＤＸ１及びＮｇｎ３は３５サイクル増幅を続けた。熱変性段階は９４℃で１分間、アニーリングはそれぞれ５８、５２、５０、６７、６２、５５、５２、６０℃で１分間、伸長は７２℃で１分間、最終重合は１０分間行った。この増幅産物を１．５％アガロースゲルで分離した。それぞれのＰＣＲ反応は、直線条件下二重で行った。ヒトインスリン、ＩＰＦ１／ＰＤＸ１、Ｎｇｎ３、βアクチンの決定に用いたフォワード及びリバースプライマ配列は次のとおりである。それぞれｈＩｎｓ：５’−ＧＣＣ  ＴＴＴ  ＧＴＧ  ＡＡＣ  ＣＡＡ  ＣＡＣ  ＣＴＧ−３’、５’−ＧＴＴ  ＧＣＡ  ＧＴＡ  ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＣＴＧ−３’（２６１ｂｐフラグメント）、ＩＰＦ１：５’−ＣＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＧＡＡ  ＧＴＣ  ＴＡＣ  Ｃ−３’、５’−ＧＴＣ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＣＴＴ  ＴＴＴ  ＣＣＡ  Ｃ（２６２ｂｐフラグメント）、Ｎｇｎ３：５’−ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＧＴ  ＡＧＡ  ＡＡＧ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＧＣＣ  ＴＣ−３’、５’−ＡＣＧ  ＣＧＴ  ＧＡＡ  ＴＧＧ  ＧＡＴ  ＴＡＴ  ＧＧＧ  ＧＴＧ  ＧＴＧ−３’（９４８ｂｐフラグメント）、βアクチン５’−ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＧＧＧ  ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＴＡＧ  ＧＣＡ  Ｃ−３’、５’−ＣＣＧ  ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＣＡＡ  ＧＴＣ  ＣＡＧ  ＧＡＣ  ＧＧ−３’（５０８ｂｐフラグメント）である。Ｇｌｕｔ−１、Ｇｌｕｔ−２、ＧＫ、及びＯｃｔ４の決定に用いたプライマ配列は、以前に記載されたとおりであり（Ｓｅｉｎｏ等、１９９３、Ｋｏｒａｎｙｉ等、１９９２、ｖａｎ  Ｅｉｊｋ等、１９９９）、増幅フラグメントはそれぞれ３１０、３９８、３８０、３２０ｂｐであった。
【００６１】
ｈ．統計
結果は平均±標準誤差で表し、比較は対応のないスチューデントｔ検定を用いて行った。
【実施例２】
【００６２】
自然分化のヒトＥＳ細胞Ｈ９系由来インスリン産生細胞
本発明の好ましい一実施形態に従って、ｈＥＳ細胞のＨ９系を用いた。これらの細胞は、ＭＥＦの供給細胞層上で増殖させるとき、均質かつ未分化のコロニーとして増殖する。したがって、Ｈ９細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ自然分化を、ＭＥＦ供給細胞層から細胞を除去した後、２種の異なるモデル系を用いて調べた。ＭＥＦの不在下、組織培養プレート中付着条件で増殖した細胞は、ニューロン様、筋様、又は腺様構造を含む多数の形態を有する多面性パターンを示した（データは示していない）。対照的に、浮遊培養のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化は、離散ＥＢの形成を伴うより均一なパターンを生じた。細菌用ペトリ皿に移して１日後、細胞は付着できず、小さな集合体を形成した。この条件下で３日後、ＥＢは内細胞を囲む原始内胚葉層を有する単純構造を獲得し（図１Ａ〜Ｂ）、その後、大きさを増し続け、より嚢包性の構造を発達させた（４００〜７００μｍ）。これらはマウスＥＢに関して報告された形態に類似している（Ａｂｅ、１９９６）。続く研究は空間及び時間的パターンを求め、インスリン産生能を有するＥＢ浮遊培養の細胞の相対密度の推定値を得るために免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いて行った。ＥＢの全体的な組織形態を知るために、パラフィン包埋切片のヘマトキシリン及びエオシン染色を用いた。ＥＢの構築は、ＭＥＦから除去し浮遊培養に移して３日後には始まった。浮遊培養において日数の経過と共に、中空構造又は嚢胞の内側を覆う上皮又は内皮様細胞などの、より複雑な構造が明らかになった（図１Ｃ）。
【００６３】
ＥＢの発達をモニターするために、第１９日まで３日毎にＥＢを採集した。抗インスリン抗体を用いる免疫組織化学は、細胞が分化の第１４日にはインスリンを発現し、その数は第１９日まで漸進的に増加することを明らかにした（図２Ａ〜Ｆ）。インスリン発現細胞は、ＥＢ中に散在するか、あるいは小さいクラスタを形成することが見出された（図２Ａ〜Ｆ）。インスリンに対して陽性に染色されるＥＢの中で（６０〜７０％）、平均して１〜３％の細胞が最大密度で染色されていた。残りの３０〜４０％のＥＢは、インスリン染色に陰性であった。
【００６４】
自然に分化する付着ｈＥＳの混合集団に散在しているこれらのインスリン含有細胞の特性を明らかにするために、未分化ｈＥＳ（ｕｈＥＳ）、分化ｈＥＳ（ｄｈＥＳ）、及びＭＥＦ細胞において培地に同化したインスリンを酵素免疫法によって測定した。増殖培地は、ｈＥＳの生存に必須である２５ｍＭグルコース及び血清代替物を含有した。インスリンの分泌は、付着細胞（図３Ａ）及びＥＢ（図３Ｂ）の両方の培養条件で測定した。付着細胞では、未分化ｈＥＳ（５．６±０．６μＵ／ｍｌ、ｎ＝６）から採取された無血清培地で微量の免疫反応性インスリンが検出され、ｈＥＳを覆っていない供給細胞層からは検出されなかった（データは示していない）。しかしながら、分化の２２日後、及び３１日後に採取した無血清培地では、インスリン濃度はそれぞれ１２６．２±１７．７（ｎ＝１２）、及び３１５．９±４７μＵ／ｍｌ（ｎ＝７）であった（図３Ａ）。ｄｈＥＳ細胞のインスリン濃度は、ｕｈＥＳ細胞に比べて著しく高かった（Ｐ＜０．０００１）。ｄｈＥＳ細胞において、分化３１日後のインスリン分泌は、２２日後に比べて著しく高かった（Ｐ＝０．０００４）。同様に、図３Ｂに示したように、インスリン放出はｕｈＥＳに比べて２０〜２２日のＥＢで著しく高かった（各実験当たりＥＢ６０〜７０）（Ｐ＜０．０００１）。
【００６５】
異なるグルコース濃度に対するＥＢインスリン応答性を評価するために、ＥＢを含有する培養皿を５．５ｍＭ又は２５ｍＭのグルコースに２時間、急激に曝露した。培地グルコースの急激な変化は、２つのグループの同化インスリン濃度に著しい相違を誘出しなかった（それぞれ１５８±１６μＵ／ｍｌ、ｎ＝６と１４６．２±２２．１μＵ／ｍｌ、ｎ＝６、図３Ｂ）。
【実施例３】
【００６６】
Ｈ９ｈＥＳ細胞におけるβ細胞関連遺伝子の発現
前述の実施例からヒントを得て、本出願人等は、未分化及び分化ｈＥＳ細胞から抽出した全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を用いて、他のβ細胞関連遺伝子の発現を調べた。図４に示したように、インスリンｍＲＮＡは分化細胞で検出されたが、未分化ｈＥＳでは検出されなかった。同様に、島グルコキナーゼ（ＧＫ、図４Ａ）及びＧｌｕｔ−２（図４Ｂ）遺伝子も分化後に同定されたが、分化前には同定されなかった。ＥＢ又は高密度付着培養条件を用いても、同様の結果が得られた。これに対して、Ｇｌｕｔ−１アイソタイプ、構成グルコース輸送担体は、ｈＥＳのすべての形態、並びにヒト線維芽細胞に広く発現した（図４Ｂ）。３種の転写因子、Ｏｃｔ４、Ｎｇｎ３、ＩＰＦ１の発現を調べた（図４Ｃ）。予想どおり、多能性状態のマーカであるＯｃｔ４のｍＲＮＡ発現は（Ｙｅｏｍ等、１９９６、Ｎｉｗａ等、２０００）未分化ｈＥＳで検出されたが、分化から３週間の間に段階的に減少した（図４Ｃ）。本出願人等はさらに分化性ｈＥＳ細胞がＩＰＦ１／ＰＤＸ１及びＮｇｎ３転写因子を発現することを実証したが（図４Ｃ）、これらは共に膵細胞及び内分泌細胞の分化を調節することが示されている（Ｅｄｌｕｎｄ、１９９８、Ａｐｅｌｑｖｉｓｔ等、１９９９、Ｓｃｈｗｉｔｚｇｅｂｅｌ等、２０００、Ｈｅｒｒｅｒａ、２０００）。
【００６７】
βアクチンの発現は、β細胞関連遺伝子の発現と同様に、ＲＮＡロード及びブロットのレーン間相違の内部コントロールの役割を果たす。
【実施例４】
【００６８】
ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）過剰発現ｈＥＳ細胞由来のインスリン産生細胞
多能性ｈＥＳ細胞は多くの細胞型に分化できるので、多能性ｈＥＳ細胞及びその派生物は、細胞移植を含む医療応用例及び研究に用いることができる。本発明の主要な目的は、所望の前駆体の集団、又は完全に分化した細胞が得られるように、ｈＥＳ細胞の分化を調節することである。
【００６９】
本発明で用いた条件下で、驚くほど多数のインスリン産生β細胞が培養ｈＥＳの分化中に出現することを本出願人等はすでに証明した（実施例２を参照）。この観察結果は、組織工学及び糖尿病の治療における細胞置換療法に用いる自然発生β細胞又はその前駆体の濃縮に基づく実験的方策の必要条件である。
【００７０】
しかしながら、多量な分化細胞の濃縮及び増殖には、低い増殖能及び寿命の限定といった不都合が起こることが考えられる。この制限を克服するために、増殖優位性を付与する可能性のある薬剤（たとえば、テロメラーゼ）を用いることができる。テロメラーゼは特にテロメア長及び完全性を維持し、それによってその細胞の増殖能を拡大するために用いることができる。ｈＴＥＲＴの異所性過剰発現が分化パターンに悪影響を及ぼさない場合、完全に分化されたテロメラーゼ陽性細胞の所望の系統を生成することができる。
【００７１】
実験プロトコル：
ａ．未分化ｈＥＳ細胞におけるｈＴＥＲＴの異所性発現
ｈＴＥＲＴ過剰発現ｈＥＳ細胞は、インスリン産生細胞を生成するための選択及び濃縮に選ばれた条件と同じ条件下で分化することができる（培地中、インスリン＋トランスフェリン＋亜セレン酸ナトリウム（ＩＴＳ）、グルコース、ニコチンアミド、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、神経発育因子（ＮＧＦ）、アクチビン、βセルリンなどの因子の組合せ）。
【００７２】
本発明のもっとも好ましい実施形態によれば、ＩＴＳとして知られる因子、すなわちインスリン、トランスフェリン、及び亜セレン酸塩の組合せを用いて、インスリン産生細胞の収率を著しく高めることができる。好ましい塩の１つは亜セレン酸ナトリウムであるが、セレンを含有する他の塩も用いることができる。
【００７３】
本出願人等は、減衰したリボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）を含有する適切な（たとえば、バイシストロン性）発現ベクターを用いることによって、均質なインスリン産生細胞が生成できるような方法で細胞特異プロモータ−ネオマイシン耐性導入遺伝子を用いるヒトＥＳ細胞の遺伝子改変の方策を用いる。このベクターは、β細胞分化経路の非常に早い段階でβ細胞の前駆体において活性化する細胞特異遺伝子プロモータＰＤＸ−１によってｈＴＥＲＴコード配列が駆動されるように構築される。他のプロモータをＰＤＸ−１の代わりに用いることができる。ｈＴＥＲＴコード領域は、ＩＲＥＳ及びハイグロマイシン又は他の抗生物質耐性選択マーカと共に単一カセットに存在するように構築される。さらに、このベクターは、たとえばＰＧＫプロモータ又は他の哺乳動物プロモータを含む、構成プロモータの制御下ネオマイシン（又は他の抗生物質）選択マーカを有する。この構築物を未分化ｈＥＳ細胞にトランスフェクトし、ネオマイシン耐性クローンを選択する。次のステップにおいて、これらのクローンを分化させ、ハイグロマイシン耐性クローンを選択する。実質的には、選択マーカを発現するすべてのトランスフェクト細胞がテロメラーゼを発現するはずであり、この分化経路の非常に早い段階でＰＤＸ−１細胞特異プロモータを活性化する能力を有するインスリン産生細胞系統に分化する可能性が高い。
【００７４】
ｈＥＳ細胞の増殖培地のグルコース濃度が高いことにより、高グルコースがＰＤＸ−１プロモータに与える有害な影響を回避するために、これに限定されるものではないが、ニコチンアミド、Ｌ−リボース、Ｎ−アセチルシステイン、及び他の抗酸化薬を含む抗酸化試薬を培地に添加する。
【００７５】
ｂ．クローン選択の基準
得られたクローンは、以下のとおり、有利な特性及び／又は有害性の不在に関して検査する。
１．偽陽性クローンによる選択手順が進行するのを回避するために、ネオマイシン耐性遺伝子の発現に関してＲＴ−ＰＣＲを用いて未分化状態で検査する。
２．外因性ｈＴＥＲＴ又は他の増殖（寿命の延長）促進遺伝子の発現に関してノザンブロット分析又はＲＴ−ＰＣＲを用いて、テロメラーゼ活性に関してＴＲＡＰアッセイを用いて、テロメア長に関してＴＲＦアッセイを用いて、分化及びハイグロマイシン選択後に生じたクローンを検査する。これらは分化後、複数の時間間隔でモニターする。コントロールとして、同じプロセスを経た正常ｈＥＳを用いる。
３．β細胞分化及び成熟に関わる因子の発現プロファイルを、定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて検査する。以下の遺伝子の発現をモニターする。インスリン、ＰＤＸ−１、Ｎｋｘ６．１、Ｎｋｘ２．２、Ｇｌｕｔ−２、Ｐａｘ−６、ＢＥＴＡ２、Ｎｇｎ３、Ｉｓｌｅｔ−１、Ｐａｘ−４、Ｈｌｘｂ−９、ＧＫ、ネスチン、プロホルモン変換酵素（ＰＣ）１及び２、グルカゴン、ＧＡＤ６５である。発現のパターンをコントロール細胞と比較する。必要であれば、評価を容易にするために、発現プロファイル用のマイクロチップを用いる。
４．Ｇｌｕｔ−２、ＧＫ、ＰＣに関して、酵素アッセイを用いて特定酵素プロファイルを検査する。
５．前述のとおりｈＥＳから得られたインスリン産生細胞の品質管理を以下のパラメータを用いて行う。電子顕微鏡を用いる超微細構造の特性決定、インスリン分泌、インスリンプロセシング、電気生理学プロファイル、代謝プロファイル。
６．クローン中のβ細胞発生遺伝子発現プロファイルを、マイクロアレイチップを用いて正常細胞と比較する。
７．β細胞特異マーカに関して特定の抗体を用いて免疫組織化学又はウエスタンブロット分析を行う。
８．ヌードマウスに腫瘍を生じる能力、軟寒天における増殖能力（増殖巣形成）、及び正常細胞核型の存在を含む、当分野で知られている任意の基準に従って腫瘍形成性の不在を検査する。
【００７６】
ｃ．完全分化細胞系統へのｈＴＥＲＴの安定なトランスフェクション
完全に分化した細胞系統、たとえばインスリン産生β細胞の濃縮及び特徴決定に続いて、低い増殖能、寿命の限定といった不都合を克服するために、βアクチン遺伝子プロモータ又はＰＧＫ遺伝子プロモータなどの強力なプロモータによって駆動されるｈＴＥＲＴ遺伝子コード配列を、選択マーカを用いて安定にトランスフェクトする。これは島移植のドナーの必要性に取って代わる可能性のあるインスリン産生β細胞の増殖を促進するための方策である。最終クローン集団を、上述のすべての基準に関して検査する。同時に、このクローン集団を、上に概説したとおり、テロメラーゼ活性、テロメア長、寿命の延長、及び腫瘍形成性の不在に関して検査する。
【００７７】
ｄ．Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子と組み合わせた未分化ｈＥＳ細胞におけるｈＴＥＲＴ及び／又は増殖促進遺伝子の異所性発現
細胞療法用の多量のインスリン産生細胞を確立するために、最終的に分化した成熟β細胞の増殖能及び寿命の限定という問題をいずれ克服する必要がある。前述のとおり、この制限を克服するために、テロメラーゼ活性を利用してテロメア長及び完全性を維持し、それによって細胞の増殖能を拡大することができる。別法として、上に記載の方策と同様に、増殖促進遺伝子をｈＥＳ細胞に挿入することができる。簡潔に述べれば、ＰＤＸ−１プロモータの制御下、ＳＶ４０大型Ｔ抗原などの増殖促進遺伝子のコード領域を、それ自体もβアクチン遺伝子又はＰＧＫ遺伝子の構成プロモータの制御下ネオマイシン体制遺伝子を有するバイシストロン性ベクター中ハイグロマイシン選択マーカ及びＩＲＥＳと共に単一カセットに構築する。前駆細胞集団を、成熟β細胞への最終分化の誘導後、桁違いに拡大することができる。これらの成熟細胞を、上述の基準を用いて、８番目の基準、すなわち腫瘍形成性の不在に重点を置いて検査する。
【００７８】
細胞移植のために、腫瘍形成性を生じる可能性のあるＤＮＡ配列を、移植前に細胞から除去する。ｈＴＥＲＴ遺伝子は癌遺伝子ではないが、癌の８５〜９５％でその再活性化が起こる。さらに、ほとんどの増殖促進遺伝子が、細胞の悪性の特質を付与する能力を有している。
【００７９】
このため、本出願人等は、細胞特異的に標的配列の不活性化及び除去を限定するためにＣｒｅリコンビナーゼ−ｌｏｘＰ（Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ）を用いる。Ｃｒｅリコンビナーゼは、部位特異リコンビナーゼとして機能し、ｌｏｘＰ部位として知られる特定の３４ｂｐ配列間のＤＮＡ配列をスプライシングする。膵臓β細胞にのみ発現するインスリン遺伝子に独自の特性のために、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現のβ細胞特異インスリンプロモータを用いて、完全成熟β細胞の遺伝子を不活性化及び除去することができる。このプロトコルは、ＩＲＥＳ及びハイグロマイシン又は他の抗生物質選択マーカを伴う単一カセット中、上述のβ細胞前駆細胞特異プロモータＰＤＸ−１の制御下、ｈＴＥＲＴ又は増殖促進遺伝子コード配列で安定にトランスフェクトされたｈＥＳを用いる。ハイグロマイシン遺伝子の下流に独立して挿入されたｌａｃＺ遺伝子コード配列は、Ｃｒｅリコンビナーゼが活性化されていない限り、前駆細胞において未発現のままである。ｈＴＥＲＴ−ＩＲＥＳ−ハイグロマイシン配列をｌｏｘＰで挟むことにより（ｆｌｏｘ）、細胞内でのＣｒｅリコンビナーゼの発現に続いて、この配列の切り出しが可能となる。インスリンプロモータが活性化し、それによって完全に成熟したβ細胞でＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子が活性化すると、この配列は除去（ｆｌｏｘ  ｏｕｔ）され、ＰＤＸ−１プロモータの制御下、ｌａｃＺコード配列が発現される。ｌａｃＺ遺伝子の発現はＣｒｅリコンビナーゼの発現に依存するので、β細胞の標的遺伝子を切除し、ｌａｃＺ遺伝子の発現をもたらす最大の組換えに要する最適時間を求めるために、時間的経過の研究は必須である。
【００８０】
ｌａｃＺ酵素活性の測定は、加水分解され、細胞内に保持される蛍光基質を用いて行う。この系の利点は、ｌａｃＺが組換え効率を定量するレポータ遺伝子、及びｌａｃＺ発現レベルに基づく蛍光活性化細胞選別の選択マーカの両方としての機能を果たすことである。
【００８１】
このアプローチの変法は、ｌｏｘＰ部位の間にチミジンキナーゼ遺伝子が安定にトランスフェクトされた細胞でインスリンプロモータによって駆動されるＣｒｅリコンビナーゼを用いる。ガンシクロビルの添加によって細胞毒性が誘出され、ＴＫが特異的に除去（ｆｌｏｘ  ｏｕｔ）される（細胞特異プロモータがＣｒｅリコンビナーゼを駆動）細胞のみがガンシクロビル処理後も生存する。
【００８２】
本発明が属する分野の技術者は、前述のすべてのプロトコルを他の細胞特異プロモータに基づく系に一般化できることを理解するであろう。
【００８３】
ｅ．グルコース応答性
グルコース応答性に関して、本発明のプロトコルは、抗酸化剤を添加又は添加しない、様々なグルコース濃度の培地でのプレインキュベーションを利用する。長期培養に適切なインキュベーショングルコース濃度の指標として、ＥＭＳＡによるＰＤＸ−１結合をモニターする。
【００８４】
重要なことに、ＥＢの約６０％であるサブセットがインスリンを含有し、残部はインスリンを含有していないという観察結果は、その後の濃縮に用いる原材料として、もっとも高い割合でインスリン発現細胞を含むＥＢのサブセットを選択することから始めることが有用である可能性を示している。インスリンプロモータに駆動される必須のレポータマーカを安定に過剰発現するｈＥＳを用いることによって、このサブセットのＥＢを犠牲にすることなくこれらを選択することができる。
【００８５】
別法として、ＥＢ集団を９６ウェルプレートにウェル当たり１つのＥＢで接種し、培地へのインスリン分泌を測定することによって、インスリン応答性を実証する。
【実施例５】
【００８６】
インスリンプロモータ駆動変異型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）レポータ遺伝子で安定にトランスフェクトされたｈＥＳ細胞クローンの確立
ａ．ヒトインスリンプロモータを含有するプラスミドの構築（ｐＩｎｓ）
ヒトインスリン遺伝子の３２７ｂｐの５’フランキング領域及び３０ｂｐのエキソン１を含有するＤＮＡフラグメントを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅した。以下のオリゴデオキシヌクレオチオドをプライマとして用いた。
５’−ＧＣＧ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＧＧＴ  ＣＴＡ  ＡＴＧ  ＴＧＧ  ＡＡ−３’
５’−ＧＣＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＴＴＣ  ＴＧＡ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＴＣ−３’
【００８７】
新しい構築物のヒトインスリン調節フラグメントの配列を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）Ｂｉｇ  Ｄｙｅ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いる配列決定によって確認した。
【００８８】
このフラグメントを、ＳａｃＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位を用いて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＫＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローンした。ｐＩｎｓを含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐをＳａｃＩ及びＫｐｎＩによって消化し、得られたフラグメントをｐＥＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＭＣＳに正しい方向性で挿入した。このベクターはさらに構成ＳＶ４０プロモータによって駆動されるネオマイシン耐性遺伝子を有する。この特徴は、安定なトランスフェクションの実験の淘汰圧に関するさらなる研究において重要である。
【００８９】
ｐＥＧＦＰ−１バックボーンを、インスリンコアプロモータ駆動ハイグロマイシン耐性遺伝子がＥＧＦＰの上流に融合した第２の構築物に用いた。このレポータ遺伝子を用いる利点は、これがＥＧＦＰ陽性細胞を同定する能力を備えた薬剤耐性選択マーカの利便性を提供することである。
【００９０】
両発現ベクターにおけるインスリンプロモータの活性は、トランスフェクト細胞でＥＧＦＰ蛍光を示すハムスターインスリノーマ腫瘍細胞（ＨＩＴ）の一過性トランスフェクションを用いて試験した。
【００９１】
ｂ．安定なトランスフェクション
Ｈ９  ｈＥＳ細胞を６ウェルプレートで培養し、２４時間後、３μｇのプラスミドＤＮＡ及び６μｌの非リポソーム配合ＦｕＧＥＮＥ（商標）トランスフェクション試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いてトランスフェクトした。
【００９２】
陽性クローンを単離し、増殖培地中１００μｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で増殖し、ノザンブロット分析を用いてネオマイシン耐性遺伝子発現の特性を明らかにした。
【００９３】
ｃ．トランスフェクトクローンの奇形腫の発生
安定クローン由来の未分化細胞をヌードマウスの後肢に筋肉注射した（部位当たり細胞〜５×１０6）。７０〜９０日後、奇形腫を採取し、固定、パラフィンに包埋、５μｍの切片を調製した。組織形態分析のために、切片をヘマトキシリン／エオシンで染色した。免疫組織化学分析のために、脱パラフィン切片を、以前に記載のとおり、抗インスリン抗体と共にインキュベートした（Ａｓｓａｄｙ等、２００１）。
【００９４】
ｄ．インスリン陽性細胞集団の確立
インスリンプロモータ−ＥＧＦＰレポータで安定にトランスフェクトされた６つの陽性クローン、及びインスリンプロモータ−ＨｙｇＥＧＦＰレポータで安定にトランスフェクトされた１つのクローンを確立した。
【００９５】
野生型Ｈ９細胞と比べて、トランスフェクト未分化細胞は正常な形態を維持した。
【００９６】
浮遊培養で増殖したとき、すべての新しいクローンが細胞集合体（胚様体）を生成し、ヌードマウスへの注射後、胚生殖細胞の３種すべての原始細胞層の進化した派生物を形成した（図５Ａ〜Ｂ）。希少であるが明白なインスリン陽性細胞の小さなクラスタがＩＨＣによって認められ（図５Ｃ〜Ｄ）、これはｉｎ  ｖｉｖｏの血糖正常生理状態でこの特定の導入遺伝子を有する細胞に発生上の優位性が欠如していることを示している可能性がある。
【００９７】
ＥＧＦＰは未分化状態で陰性であり、分化条件下で増殖したとき、可視となった（図６）。培養ウェルにおいて、顕微鏡検査によって観察されたＥＧＦＰ蛍光と、測定されたインスリン分泌及び含量との間に相関性があったことに留意されたい。たとえば、ＩＢ３クローン（図６Ｂ、１０１５μＵ／ｍｌ）に比べて低い蛍光及び低いインスリン含量（図６Ａ、２８２μＵ／ｍｌ）を示したＩＩＢ６クローンは、ＩＢ３クローン（３６４．５μＵ／ｍｌ）に分泌されるものより少ないインスリンを分泌した（４３μＵ／ｍｌ）。形態学的には、多くの場合ＥＧＦＰ発現細胞は小さく、密度の高いクラスタとして増殖した。これらの細胞をＥＧＦＰ蛍光に基づく蛍光活性化選別を用いて分離したが、分子及び生理学上の特徴は現在調査されている。
【００９８】
ｅ．インスリン陽性細胞集団の濃縮
異なるプロトコルを比較する。１５日間、ＥＢとしてｈＥＳを増殖し、その後４〜５週間、増殖培地中ＩＴＳ  Ｘ１（Ｓｉｇｍａ又はＧＩＢＣＯ）及びＦＧＦ４ｎｇ／ｍｌを含むマトリゲルに接種することによって、ＩＢ３クローン中ＦＡＣＳ分析による評価で５％の濃縮が得られることが予備段階の結果示された（プロトコル１、図６Ｂ）。
【００９９】
次に、最近Ｌｕｍｅｌｓｋｙ等によって発表されたマウスＥＳ由来のβ様細胞を濃縮するための再現性段階的濃縮プロトコルの変更プロトコルを、ＥＧＦＰレポータ遺伝子を用いるトラッキング濃縮法と組み合わせて適応した（プロトコル２）。簡潔に述べると、このプロトコルは以下の段階で構成された。
ステージＩ：トランスフェクトされたクローンの多能性未分化細胞を、４〜５日間、以前に記載されているとおり（Ａｓｓａｄｙ等、２００１）、１０ｃｍ組織培養皿（Ｎｕｎｃ）でＭＥＦの供給細胞層上に増殖した。
ステージＩＩ：コラゲナーゼＩＶ型０．１％を用いて分散した後、細胞を４〜５日間、ｈｒｂＦＧＦを含まない同じ増殖培地の浮遊培養に移した。
ステージＩＩＩ：フィブロネクチン１μｇ／ｍｌ及びＩＴＳ×１を含有する無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、７〜１０日間、フィブロネクチンコート６ウェル組織培養皿で増殖した後、トリプシン／ＥＤＴＡＸ１（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）によって５分間ＥＢを分散した。
ステージＩＶ：Ｂ２７補足剤（ＧＩＢＣＯ）、Ｎ２補足剤（ＧＩＢＣＯ）、ラミニン１μｇ／ｍｌ、ＦＧＦ１０μｇ／ｍｌを含有する無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、７〜８日間、ラミニン／ポリオルニチン又はラミニン／ポリリシンコート皿で細胞を増殖した。
ステージＶ：培地を、７〜１０日間、ニコチンアミド１０μｇ／ｍｌ、Ｂ２７、Ｎ２、及びステージ４と同様にラミニンを含有する培地に置き換えた。
【０１００】
この濃縮プロトコルを８回繰り返し、増殖及び分化の再現性パターンが認められた。図７Ａ（第４日）に示したように、ステージＩＩＩの第４日及び第５日に最初の蛍光シグナルが認められ、細胞の付着層において、Ｌｕｍｅｌｓｋｙ報告の対応する段階では赤色の染色として示された陽性インスリン免疫蛍光を大いに連想させる形態で領域全体に散在して蛍光細胞群が観察される。ステージＩＶ又はＶの終わりまでに、容易に除去されるＥＧＦＰ発現細胞のクラスタが、神経様投射路に囲まれた（図７Ｂ、第２日）。
【０１０１】
分子及び生理学上の特徴は現在調査されている。
【０１０２】
結論として、細胞特異プロモータによって駆動されるレポータを遺伝子導入した遺伝子導入多能性未分化ｈＥＳ細胞クローンが生成された。このアプローチは、インスリン産生細胞の分化を調査、モニターし、その後、今後に見込まれる移植療法のインスリン産生細胞の濃縮集団を単離するために用いることができる。
【０１０３】
上述の特定の増殖条件又はその構成要素は、ｈＥＳ由来インスリン産生細胞の有利な増殖を促進するプロトコルの基礎となるものである。これらのプロトコルの多くの項目を本発明の本質的要素から逸脱することなく変更できることを、当分野の技術者は明確に理解するであろう。多くの可能な変形例はすべて、開示された本発明の範囲内のパラメータの最適化であると見なすことができる。本発明の範囲は添付の請求の範囲によって定義される。
【０１０４】
特定の実施形態に関する上述の説明は本発明の一般的な性質を完全に開示しているので、現在の知識を適用することによって、必要以上の実験なしに、包括的な概念から逸脱することなく、そのような特定の実施形態を変更しかつ／又は多様な応用例に適応させることができ、したがってそのような適応及び変更は、開示された実施形態の同等物の意味及び範囲内であることが理解されるべきであり、理解されることが意図される。本明細書で用いられた表現及び用語は説明のためであり、限定のためではないことが理解される。開示した種々の機能を実施するための方法、材料、及び段階は、本発明から逸脱することなく他の様々な形態を取ることができる。したがって、上述の明細書及び／又は添付の請求の範囲に見出すことのできる、機能上の説明に伴う「〜するための手段」及び「〜のための手段」という表現、又は方法段階のいずれの表現も、上述の明細書に開示された実施形態の厳密な同等物であるかどうかを問わず、どのような構造的、物理学的、化学的、又は電気的な要素又は構造であっても、又は現在又は今後存在する可能性があり、列挙した機能を実行するどのような方法段階であっても、それを定義し、網羅することを意図し、すなわち同一の機能を実施するための他の手段及び段階を用いることができ、かつそのような表現にはもっとも広い解釈が与えられることが意図される。
【０１０５】
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【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１Ａ】ＭＥＦからＥＳ細胞を除去して３日後、浮遊中、２０倍の胚体（ＥＢ）を示す図である。
【図１Ｂ】ＭＥＦからＥＳ細胞を除去して３日後、浮遊中、４０倍のＥＢを示す図である。
【図１Ｃ】ＭＥＦからＥＳ細胞を除去して１７日後、浮遊中、４０倍のＥＢを示す図である。
【図２Ａ】正常なヒト膵臓のコントロール組織におけるインスリン発現を示す図である。
【図２Ｂ】分化１９日後のＥＢにおけるインスリン発現を示す図である。
【図２Ｃ】分化１９日後のＥＢにおけるインスリン発現を示す図である。
【図２Ｄ】分化１９日後のＥＢにおけるインスリン発現を示す図である。
【図２Ｅ】分化１９日後のＥＢにおける染色の細胞質局在（インスリン発現）を示す図である。
【図２Ｆ】非免疫血清を用いた分化１９日後のＥＢを示す図である。
【図３】Ａ：ノックアウト培地で培養した未分化ｈＥＳ細胞（ｕｈＥＳ）、又は２２日間及び３１日間、高密度付着条件で分化させたｈＥＳ細胞（ｄｈＥＳ）によるインスリン分泌を示す図である。  Ｂ：種々のグルコース濃度で２０〜２２日間胚様体として培養、浮遊で増殖させたｈＥＳによるインスリン分泌を示す図である。
【図４Ａ】未分化ｈＥＳ（ｕｈＥＳ）、ＥＢ又は高密度付着細胞培養（ｄｈＥＳ）として増殖する分化ｈＥＳ、及び正常ヒト線維芽細胞（ＮＨＦ）の全ＲＮＡ中のβ細胞関連遺伝子、インスリン、及びＧＫの発現を示す図である。
【図４Ｂ】未分化ｈＥＳ（ｕｈＥＳ）、ＥＢ、高密度付着細胞培養（ｄｈＥＳ）、及び正常ヒト線維芽細胞（ＮＨＦ）の全ＲＮＡ中のＧｌｕｔ−２、及びＧｌｕｔ−１の発現を示す図である。
【図４Ｃ】未分化ｈＥＳ（ｕｈＥＳ）、ＥＢ、高密度付着細胞培養（ｄｈＥＳ）、及び正常ヒト線維芽細胞（ＮＨＦ）の全ＲＮＡ中のＯｃｔ４、Ｎｇｎ３、及びＩＰＦ１／ＰＤＸ１の発現を示す図である。
【図５Ａ】インスリンプロモータで安定にトランスフェクトされたクローンから生じたＥＢを示す図である。
【図５Ｂ】インスリンプロモータで安定にトランスフェクトされたクローンから生じたＥＢを示す図である。
【図５Ｃ】インスリンプロモータで安定にトランスフェクトされたクローンから生じたＥＢ中のインスリン陽性細胞を示す図である。
【図５Ｄ】インスリンプロモータで安定にトランスフェクトされたクローンから生じたＥＢ中のインスリン陽性細胞を示す図である。
【図６Ａ】ＩＩＢ６クローン中の分化後のＥＧＦＰ蛍光を示す図である。
【図６Ｂ】ＩＢ３クローン中の分化後のＥＧＦＰ蛍光を示す図である。
【図７】神経投射路に囲まれたＥＧＦＰ発現細胞を示す図である。
【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004531262.tif 000064
【国際調査報告】
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