(57)【要約】本出願は、主要な14種のCYP450アイソフォームの特異的かつ同時の検出を可能にする新規なcDNAプローブのセット、およびそのプローブに特異的な新規なプライマーに関する。本発明はまた、それらから得られるトランスフェクションベクター、遺伝子改変細胞、および増幅産物を提供する。本発明は、特に、本発明のcDNAプローブまたは増幅産物を含む、DNAフィルターまたはDNAチップのような任意の固体表面を包含する。それによって提供される産物により、ある生成物の毒性または病原性を評価すること、およびインビボでの薬物の相互作用または有効性を予測することが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、およびその相補的配列からなる群より選択される、単離および精製されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号:15および配列番号:16、配列番号:17および配列番号:18、配列番号:19および配列番号:20、配列番号:21および配列番号:22、配列番号:23および配列番号:24、配列番号:25および配列番号:26、配列番号:27および配列番号:28、配列番号:29および配列番号:30、配列番号:31および配列番号:32、配列番号:33および配列番号:34、配列番号:35および配列番号:36、配列番号:37および配列番号:38、配列番号:39および配列番号:40、配列番号:41および配列番号:42、ならびにそれらのそれぞれの相補的オリゴヌクレオチドの組からなる群より選択されるプライマー対。
【請求項３】
ヒト、動物、植物、または原生生物起源のポリヌクレオチドのセットを、請求項2記載の少なくとも1つのプライマー対と共にポリメラーゼ連鎖反応に供することによって得ることができる増幅産物。
【請求項４】
請求項1記載のポリヌクレオチドを含むトランスフェクションベクター。
【請求項５】
請求項1記載のポリヌクレオチドまたは請求項4記載のトランスフェクションベクターを用いてトランスフェクトされた遺伝子改変細胞。
【請求項６】
請求項1記載のオリゴヌクレオチドが、細胞が増殖するように作製された場合に複製する、請求項5記載の遺伝子改変細胞。
【請求項７】
請求項1記載の少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、または請求項3記載の少なくとも1つの増幅産物、または請求項4記載の少なくとも1つのトランスフェクションベクター、または請求項5もしくは6に記載の少なくとも1つの遺伝子改変細胞を含む、固体表面。
【請求項８】
請求項7記載の固体表面であって、
配列番号:1またはその相補的配列、
配列番号:2またはその相補的配列、
配列番号:3またはその相補的配列、
配列番号:4またはその相補的配列、
配列番号:5またはその相補的配列、
配列番号:6またはその相補的配列、
配列番号:7またはその相補的配列、
配列番号:8またはその相補的配列、
配列番号:9またはその相補的配列、
配列番号:10またはその相補的配列、
配列番号:11またはその相補的配列、
配列番号:12またはその相補的配列、
配列番号:13またはその相補的配列、および
配列番号:14またはその相補的配列
を含む、固体表面。
【請求項９】
請求項7記載の固体表面であって、ヒトゲノムDNAを以下のプライマー対の各々と共にポリメラーゼ連鎖反応に供することによって得ることができる14の増幅産物を含む固体表面：
配列番号:15(またはその相補的配列)および配列番号:16(またはその相補的配列)、
配列番号:17(またはその相補的配列)および配列番号:18(またはその相補的配列)、
配列番号:19(またはその相補的配列)および配列番号:20(またはその相補的配列)、
配列番号:21(またはその相補的配列)および配列番号:22(またはその相補的配列)、
配列番号:23(またはその相補的配列)および配列番号:24(またはその相補的配列)、
配列番号:25(またはその相補的配列)および配列番号:26(またはその相補的配列)、
配列番号:27(またはその相補的配列)および配列番号:28(またはその相補的配列)、
配列番号:29(またはその相補的配列)および配列番号:30(またはその相補的配列)、
配列番号:31(またはその相補的配列)および配列番号:32(またはその相補的配列)、
配列番号:33(またはその相補的配列)および配列番号:34(またはその相補的配列)、
配列番号:35(またはその相補的配列)および配列番号:36(またはその相補的配列)、
配列番号:37(またはその相補的配列)および配列番号:38(またはその相補的配列)、
配列番号:39(またはその相補的配列)および配列番号:40(またはその相補的配列)、
配列番号:41(またはその相補的配列)および配列番号:42(またはその相補的配列)。
【請求項１０】
請求項7〜9のいずれか一項記載の固体表面であって、ナイロン(登録商標)メンブレンなどのDNAに適したフィルター、およびDNAチップなどのDNAアレイまたはマイクロアレイからなる群より選択される、固体表面。
【請求項１１】
CYP450のmRNAレベルを測定するためのキットであって、
請求項1記載のポリヌクレオチド、請求項2記載のプライマー対、請求項3記載の増幅産物、請求項4記載のトランスフェクションベクター、請求項5もしくは請求項6に記載の遺伝子改変細胞、または請求項7、請求項8、請求項9、もしくは請求項10に記載の固体表面からなる群より選択される、少なくとも1つの産物を含有し、
選択的に、検出標識および/またはバイオテクノロジーに適したバッファーをさらに含有する、キット。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドを含有する生物学的試料において、CYP 1A1、CYP 1A2、CYP 1B1、CYP 2A、CYP 2B6、CYP 2C8、CYP 2C18、CYP 2C9、CYP 2C19、CYP 2D6、CYP 2E1、CYP 3A4、CYP 3A5、およびCYP 3A7からなる群より選択される少なくとも1つのCYPアイソフォームを検出するための方法であって、
該試料の全DNAもしくは逆転写された全RNAと、請求項1記載の少なくとも1つのポリヌクレオチド、または請求項3記載の少なくとも1つの増幅産物、または請求項7〜9のいずれか一項記載の固体表面とのハイブリダイゼーションによるか、
または、該全DNAまたは逆転写された全RNA上で、請求項3記載の少なくとも1つのプライマー対を用いて行われる増幅によるか
のいずれかによって、該CYP450アイソフォームが検出される方法。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドを含有する生物学的試料において、CYP 1A1、CYP 1A2、CYP 1B1、CYP 2A、CYP 2B6、CYP 2C8、CYP 2C18、CYP 2C9、CYP 2C19、CYP 2D6、CYP 2E1、CYP 3A4、CYP 3A5、およびCYP 3A7を同時検出するための方法であって、該CYP450アイソフォームが、該試料の全DNAもしくは逆転写されたRNAと、請求項8〜9のいずれか一項記載の固定表面とのハイブリダイゼーションによって、または請求項2記載の配列番号:15-16〜41-42のプライマー対(もしくはそれらの相補的配列)を用いるDNAもしくはcDNA増幅によって検出される、方法。
【請求項１４】
CYP 1A1、CYP 1A2、CYP 1B1、CYP 2A、CYP 2B6、CYP 2C8、CYP 2C18、CYP 2C9、CYP 2C19、CYP 2D6、CYP 2E1、CYP 3A4、CYP 3A5、およびCYP 3A7からなる群より選択されるCYP450についての生物学的試料中に存在するmRNAレベルを測定するための方法であって、
該生物学的試料の全RNAが逆転写され、従って得られたcDNAが、請求項1記載の少なくとも1つのポリヌクレオチド、もしくは請求項3記載の少なくとも1つの増幅産物、もしくは請求項7〜9のいずれか一項記載の固体表面と、DNA/DNAハイブリダイゼーションに適切な条件下で接触、または請求項3記載の少なくとも1つのプライマー対とDNA増幅に適切な条件下で接触するように配置され、
このようにして得られたハイブリダイゼーションまたは増幅のシグナルの強度が測定され、
該CYP450 mRNAレベルがこの測定された強度に対応する、方法。
【請求項１５】
CYP 1A1、CYP 1A2、CYP 1B1、CYP 2A、CYP 2B6、CYP 2C8、CYP 2C18、CYP 2C9、CYP 2C19、CYP 2D6、CYP 2E1、CYP 3A4、CYP 3A5、およびCYP 3A7についての生物学的試料中に存在するmRNAレベルを同時測定するための方法であって、
該生物学的試料の全RNAが逆転写され、従って得られたcDNAが、請求項8〜9のいずれか一項記載の固体表面とDNAハイブリダイゼーションに適切な条件下で接触、または請求項2記載の配列番号:15-16〜41-42のプライマー対(もしくはそれらの相補的配列)とcDNA増幅に適切な条件下で、接触するように配置され、
このようにして得られたそれぞれのハイブリダイゼーションまたは増幅のシグナルが測定され、
該CYP450 mRNAレベルがこれらの測定されたハイブリダイゼーションまたは増幅シグナルにそれぞれ対応する、方法。
【請求項１６】
CYP 1A1、CYP 1A2、CYP 1B1、CYP 2A、CYP 2B6、CYP 2C8、CYP 2C18、CYP 2C9、CYP 2C19、CYP 2D6、CYP 2E1、CYP 3A4、CYP 3A5、およびCYP 3A7からなる群より選択される1つまたはいくつかのCYP450のmRNAレベルに対して化合物が有する影響を評価するための方法であって、
該化合物の存在下および同じ該化合物の非存在下でのこれらの単数もしくは複数のCYP450のmRNAレベルを、請求項14または15記載の方法によって測定し、
該化合物の影響を、このようにして測定された2つのmRNAレベルの比較によって評価する、方法。
【請求項１７】
薬物の候補化合物のセットの中から、より安全および/またはより効率的な薬物をスクリーニングするための方法であって、各薬物の候補化合物がCYP450のmRNAレベルに対して有する影響を考慮に入れており、該影響が請求項16記載の方法に従って評価される、方法。
【請求項１８】
生きている生物体における化合物の代謝を評価するための方法であって、該化合物がCYP450のmRNAレベルに対して有し得る影響を考慮に入れており、該評価が請求項16記載の方法に従ってなされる、方法。
【請求項１９】
CYP 1A1、CYP 1A2、CYP 1B1、CYP 2A、CYP 2B6、CYP 2C8、CYP 2C18、CYP 2C9、CYP 2C19、CYP 2D6、CYP 2E1、CYP 3A4、CYP 3A5、およびCYP 3A7からなる群より選択される少なくとも1つのCYP450アイソフォームを発現する生きている生物体に投与した場合に、化合物が有し得る効果を測定するため、またはこのようなCYP450アイソフォームの少なくとも1つを発現する生きている生物体への投与が意図される化合物間の相互作用を測定するための方法であって、
該化合物の各々が該少なくとも1つのCYP450アイソフォームのmRNAレベルに対して有する影響が、請求項16記載の方法によって評価され、
該生きている生物体における該化合物が有し得る効果(またはそれらが誘導し得る相互作用)が、それらのそれぞれの影響の比較によって評価される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、CYP450特異的なDNAプローブおよびプライマー、ならびにそれらの生物学的適用に関する。本発明はまた、該プローブおよびプライマーに由来する産物、すなわち、CYP450特異的DNAを有するトランスフェクションベクター、それらでトランスフェクトされた細胞、該プライマーを用いて入手可能な増幅産物、このようなCYP特異的cDNAプローブを含むDNAアレイ、およびこのような産物が使用される方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
CYP450(シトクロム450)は、小胞体の膜に局在している酵素のスーパーファミリーである。それらの主な機能は、NADPH、電子伝達体(NADPHシトクロムP450還元酵素)、および分子状酸素の存在下における酸素添加反応を触媒することである。異なるCYP450は、それらのアミノ酸配列の類似性が40％よりも高い場合に同じファミリーに属し(アラビア数字の記号によって表される)、それらのアミノ酸配列の類似性が55％よりも高い場合に、同じサブファミリーに属す(大文字の記号によって表される)。今日まで、ゼノバイオティクス代謝に関与するものとして3つのCYP450ファミリー(CYP 1ファミリー、CYP 2ファミリー、およびCYP 3ファミリー)が同定されている。CYP1ファミリーは、2つのサブファミリー：CYP 1Aサブファミリー(CYP 1A1およびCYP 1A2のアイソフォームを有する)およびCYP 1Bサブファミリー(CYP 1B1アイソフォームを有する)を含むことが知られている。CYP 2ファミリーは、5つのサブファミリー：CYP 2Aサブファミリー(CYP 2A6アイソフォーム、CYP 2A7アイソフォーム、CYP 2A13アイソフォームを有する)、CYP 2Bサブファミリー(CYP 2B6アイソフォームを有する)、CYP 2Cサブファミリー(CYP 2C8アイソフォーム、CYP 2C9アイソフォーム、CYP 2C18アイソフォーム、CYP 2C19アイソフォームを有する)、CYP 2Dサブファミリー(CYP 2D6アイソフォームを有する)、およびCYP 2Eサブファミリー(CYP 2E1アイソフォームを有する)、を含むことが知られている。ファミリー  3は、CYP 3A4アイソフォーム、CYP 3A5アイソフォーム、およびCYP3A7アイソフォームを有するCYP 3Aサブファミリーを含む。
【０００３】
いくつかのCYP450は内因性の基質(例えば、ステロイド、脂肪酸、プロスタグランジン)を代謝し、他のCYP450はゼノバイオティクス(すなわち、薬物、煙関連化合物(特に、タバコの煙関連化合物))、大気中の汚染物質、食物由来の化合物のような低分子量の分子を代謝する。従って、CYP450の発現パターンは、生物体の代謝能力またはその欠失を映す鏡である。
【０００４】
しかし、CYP450の発現は高度に可変性である(すなわち、組織可変性、生理病理学的可変性、遺伝的可変性、および環境的可変性が存在する)。なるほど、ほとんどすべてのヒトの組織はいくつかのCYP450アイソフォームを発現のに対して、大部分のアイソフォームは解毒のための主要な器官(すなわち、肝臓)に局在し、および環境との交換を有する組織(小腸、肺、腎臓、皮膚)にもまた局在している。CYP450は、肝実質細胞に主に局在するが、同じ組織のすべての細胞型がCYP450を発現するわけではなく、それらのそれぞれのCYP450の細胞組成は互いに異なる。いくつかのCYP450(例えば、CYP 1A2およびCYP 2C9)は主に肝臓に存在し、他のCYP450(例えば、CYP 1A1)はより肝臓外に存在する。さらに、生理学的な可変性が存在する(すなわち、いくつかの生理学的なパラメーター(例えば、年齢、栄養パターン、生理学的な条件)は、CYP450発現パターンに影響を有する)。例えば、CYP 3A7は、胎児の肝臓において強力に発現されるが、一方成人の肝臓においてはCYP3A7は低濃度でのみ発現される。栄養パターンのスタイル(例えば、アブラナ科の植物(例えばキャベツ)、グレープフルーツジュース、炭水化物が豊富な食物、または飢餓)もまた、CYP450発現パターンを変化させる。さらに、生理学的条件(例えば、糖尿病、肝炎、肝硬変)は、その生物体が代謝能力を減少するような方法で、CYP450発現パターンを変化させる。なおその上に、遺伝的な可変性もまた存在する。いくつかのCYP450は、それらの発現または触媒活性を変化し得る遺伝的多型性を有する。例えば、CYP 2D6多型(CYP 2D6は、デブリソキン、スパルテイン、およびデキストロメトルファンを代謝する)は、観察される異なる表現型(遅い代謝/速い代謝/極端に速い代謝)と直接的に関連していることが実証された。CYP450発現パターンはさらに、環境因子によって影響を受ける。すなわち、ゼノバイオティクス(例えば、煙(特にタバコの煙))、食物、薬物は、発現パターンを改変し、それによって、誘導されるか、抑制されるか、または阻害されるかのいずれかである代謝をもたらす。
【０００５】
酵素的誘導は、ゼノバイオティクスの除去を刺激する適応性の応答であって、それによってゼノバイオティクスに対して細胞を保護する。例えば、ベンズ［α］ピレンのような芳香族多環式炭化水素(タバコの煙中に含まれる)への暴露は、CYP 1A1およびCYP 1A2の組織濃度の増加を誘導する。リファンピシンまたはフェノバルビタールの投与は、ヒトにおけるCYP 3A4の発現を誘導する。CYP450の誘導は、主として転写活性に起因する。一方、安定なmRNA合成の減少を誘導する、サイトカイン(例えば、インターフェロン)のようなゼノバイオティクスへの暴露によっても特に、CYP450の抑制がまた起こり得る。CYP450阻害もまた、存在し得る：これは、(拮抗的または非拮抗的な)可逆的阻害または不可逆的阻害のいずれかに起因し得る。可逆的阻害は、阻害する基質がもはや投与されない場合に停止する(阻害する基質が活性部位に結合し、従って、別の基質がそこに結合することを妨害するか、または別の基質は別の阻害部位に結合する)。しかし、不可逆的阻害の場合には、阻害する基質(自殺基質とも呼ばれる)は、活性部位に結合し、ここでこの基質は反応物の代謝物に転換され、次にはCYP450に結合し、永続的にCYP450を阻害する。この後者の場合には、酵素活性は、新規なCYP450分子が合成される場合にのみ回復する。第一世代のマクロライド(例えば、トロレアンドマイシン、エリスロマイシン)、またはいくつかのステロイド(例えば、エチニルエストラジオール、ゲストデン(gestodene))は、ヘム基に結合する。他(例えば、クロラムフェニコール)は、酵素の触媒活性に必須であるアミノ酸に結合する。薬物でないゼノバイオティクスの中では、6’，7’ジヒドロキシベルガモッチン(dihydroxybergamottin)(グレープフルーツジュース中の主なフラノクマリン)は、触媒的な破壊によってCYP 3A4を阻害する。
【０００６】
従って、2つ以上の薬物の同時投与は、それらのそれぞれの薬物動力学、およびより詳細には、それらの代謝に有害な効果を有し得る。このような変化は、CYP450の誘導および/または抑制および/または阻害の、上述の機構が関与している。それゆえに、薬物の有効性または毒性は、その薬物が誘導するCYP450の発現パターンに密接に連係している。以下の表1は、いくつかの公知の薬物相互作用の例証を示す。
【０００７】
（表１）  薬物相互作用のいくつかの例
2004537989.tif 000002
NSAID：非ステロイド性抗炎症薬
【０００８】
第一の関心は、当然、いくつかの薬物が同時に投与された場合に有害な効果を回避することであるが、薬物の相互作用はまた、いくつかの場合において患者に対して有益であり得ることも留意されなければならない。例えば、抗プロテアーゼ剤であるサキナビルは、その低い生物学的利用能に起因して、インビボでは有効性が非常に低いが、グレープフルーツジュースまたはリトナビルの同時投与は、その生物学的利用能を顕著に増加させ、それによって薬物サキナビルの有効性を増加させる。非常に有用であるがまた非常に高価な免疫抑制剤であるシクロスポリンは、このような有益な相互作用の別の例である：確かに、ケトコナゾール(ketonazole)の同時投与はその生物学的利用能を2倍にし、それによって、実際の免疫抑制を達成するに必要な用量の60〜80％の減少をもたらすことが実証されてきた。
【０００９】
従って、CYP450発現パターンは、化合物がいかにして生物体または微生物によって代謝されるかの主要な指標であり、かつ、生成物の毒性または病原性を評価するため、および薬物の相互作用(有害か有益か)または薬物のインビボでの有効性を予測するための非常に価値のあるツールであることは明らかである。しかし、CYP450発現パターンが知られているのはほんのわずかの化合物についてだけである。このことは、全体的なCYP450発現パターンを評価するための適切な手段が今日まで欠けていたという事実に起因する。確かに、大部分の利用可能なツール(主として抗体)は、1つのアイソフォームを標的とするか、または他のツールは特異性を必要としないが、それらのいずれもがヒトの主要な14種のヒト肝臓CYP450アイソフォーム(すなわち、CYP 1A1、CYP 1A2、CYP 1B1、CYP 2A、CYP 2B6、CYP 2C8、CYP 2C18、CYP 2C9、CYP 2C19、CYP 2D6、CYP 2E1、CYP 3A4、CYP 3A5、およびCYP 3A7)の同時検出を可能にするものではなかった。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
本発明は、このような価値がありかつ有用なツールを提供する。本発明は、実際に、新規な50〜350塩基長のcDNAプローブのセットを提供し、このプローブは、14種の主要なCYP450アイソフォームの各々1つの特異的検出を全体で可能にする。
【００１１】
本発明のcDNAプローブのセットは、機能的な単一体である：これは、ヒト肝臓の該14種の主要なCYP450(すなわち、その発現がゼノバイオティクスによって変化され得る主要な14種のヒトCYP450)の全体のセットを同時かつ特異的に標的化することを可能にする。さらに、本発明のcDNAプローブはまた、ヒト肝実質細胞由来の全RNAとインキュベートした場合に、いかなる交差ハイブリダイゼーションをももたらさない(ノーザンブロットによって評価されるように)という共通の技術的特徴を共有し、本発明のcDNAプローブは、全体として捉えた場合に十分な特異性を共有し、かつ、このプローブを産業的な適用(すなわち、単一工程のCYP450の検出および転写の評価)のために高度に価値のあるツールとしているのは、この統一的な特徴である。出願人らが知る限り、このようなプローブセットが利用可能になったのは今回が初めてである。
【００１２】
本発明のあらゆるcDNAプローブは、ヒトゲノムDNAから単離および精製された。それらの各々は、特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって特異的に単離可能であるというさらなる利点を有する。本発明のcDNAプローブは、確かに、比較し得るTmおよび実際の特異性を有するプライマーが設計され得るような配列を有する。本発明のプライマーは、本発明のcDNAプローブを特異的に構成し、それによって、天然の供給源からのそれらの特異的増幅および単離を可能にする。従って、本発明はまた、工業的有用性を有する新規なプライマー対を提供する。
【００１３】
本発明はまた、本発明のcDNAプローブを含むトランスフェクションベクター、およびこのようなトランスフェクションベクターまたはこのようなcDNAプローブでトランスフェクトされた遺伝子改変細胞を提供する。このことは、特に、DNA複製を介して、該cDNAプローブを産生する細胞を提供する。本発明はまた、本発明のプライマーを用いて入手可能な増幅産物に関する。
【００１４】
本発明のcDNAプローブおよび増幅産物は、該CYP450のすべてまたはいくつかの同時かつ特異的検出を可能にするために、固体表面に有利に配置される。本発明は特に、DNA型フィルター(例えば、ナイロン(登録商標)メンブレン)のような固体表面およびDNAチップのようなアレイまたはマイクロアレイを含む。
【００１５】
このような特異的なCYP450産物の提供は、高い特異性、高度な迅速さ(14種のCYP450アイソフォームの同時検出)、およびインプットとしての生物学的試料に関する低い要求性で、CYP450の検出または転写の評価を可能にする。このような方法は本発明に含まれ、生成物の毒性または病原性を評価するため、および薬物のインビボでの相互作用または有効性を予測するために特に有用である。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、およびその相補的配列中に存在するcDNAプローブの群に関する。本発明は、この群のあらゆる単離および精製されたポリヌクレオチドを包含する。
【００１７】
配列番号:1は、CYP 1A1にハイブリダイズするDNA分子であり、
配列番号:2は、CYP 1A2にハイブリダイズするDNA分子であり、
配列番号:3は、CYP 1B1にハイブリダイズするDNA分子であり、
配列番号:4は、CYP 2AにハイブリダイズするDNA分子であり、
配列番号:5は、CYP 2B6にハイブリダイズするDNA分子であり、
配列番号:6は、CYP 2C8にハイブリダイズするDNA分子であり、
配列番号:7は、CYP 2C18にハイブリダイズするDNA分子であり、
配列番号:8は、CYP 2C9にハイブリダイズするDNA分子であり、
配列番号:9は、CYP 2C19にハイブリダイズするDNA分子であり、
配列番号:10は、CYP 2D6にハイブリダイズするDNA分子であり、
配列番号:11は、CYP 2E1にハイブリダイズするDNA分子であり、
配列番号:12は、CYP 3A4にハイブリダイズするDNA分子であり、
配列番号:13は、CYP 3A5にハイブリダイズするDNA分子であり、
配列番号:14は、CYP 3A7にハイブリダイズするDNA分子である。
【００１８】
前記群の各々の単離および精製されたポリヌクレオチドは50〜350塩基長であり、比較し得るTmおよび実際の特異性を有するプライマーが産生され得るような配列を有する。単離および精製されたポリヌクレオチドの全体の群はまた、機能的な単一体を有する。なぜなら、ヒト肝実質細胞由来の他のいかなる全体のRNA(非CYP450)の逆転写産物との交差ハイブリダイゼーションも伴わずに、これはすべてのそれらのそれぞれの標的(主要な14種のヒト肝臓CYP450)の同時かつ特異的検出および/または転写の評価を可能にするからである。従って、該群のすべての単離および精製されたポリヌクレオチドは、それらを全体として、主要な14種のヒト肝臓CYP450アイソフォームの同時かつ特異的な検出および/または転写の評価のための価値のあるツールとしている、構造的および機能的特徴を共有する。
【００１９】
さらなる特徴として、該群の各々のポリヌクレオチドは、この群の別のポリヌクレオチドとの交差ハイブリダイゼーションを伴うことなしに、またCYP450のコード領域との交差ハイブリダイゼーションを伴うことなしに、その標的にハイブリダイズする。さらに、該群の各々のポリヌクレオチドは、配列番号:9を除いて、別のCYP450アイソフォームにハイブリダイズすることなしに、その標的のCYP450アイソフォームにハイブリダイズする。その標的のCYP450アイソフォーム(すなわち、CYP 2C19)に加えて、配列番号:9は、別のCYP450アイソフォームの3'-NTRにもまたハイブリダイズし得る(しかし、配列番号:8は、CYP 2C19へのハイブリダイゼーションを伴わずにそのCYP 2C9標的にハイブリダイズする)。従って、配列番号:9および配列番号:8を用いる示差的検出は、CYP 2C19を完全に特異的に検出することが所望される場合に好ましく推奨される。
【００２０】
好ましいサブグループとして、本発明は、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11からなるサブグループ、およびその相補的配列(すなわち、CYP 1B1およびCYPファミリー2を標的化するポリヌクレオチド)を包含する。
【００２１】
本出願はまた、検出分子と物理的または化学的に関連する該ポリヌクレオチド(例えば、32Pのような放射性標識または蛍光標識)のいずれか1つを包含する。
【００２２】
本発明はまた、以下からなるプライマー対の群を提供する：
配列番号:15および配列番号:16、
配列番号:17および配列番号:18、
配列番号:19および配列番号:20、
配列番号:21および配列番号:22、
配列番号:23および配列番号:24、
配列番号:25および配列番号:26、
配列番号:27および配列番号:28、
配列番号:29および配列番号:30、
配列番号:31および配列番号:32、
配列番号:33および配列番号:34、
配列番号:35および配列番号:36、
配列番号:37および配列番号:38、
配列番号:39および配列番号:40、
配列番号:41および配列番号:42、ならびに
これらのそれぞれの相補的オリゴヌクレオチドの組み合わせ。
【００２３】
本出願は、この群からのあらゆる個々のプライマーおよびプライマー対を包含する。上述のように、各プライマーの対は比較し得るTmを有し、従って、これらは価値のあるPCRツールである(標準的なPCRまたはRT-PCR、ならびに定量的PCTまたはRT-PCR)。
【００２４】
ヒト肝実質細胞由来の全RNAと接触して配置した場合(逆転写した場合)、配列番号:15(またはその相補的配列)および配列番号:16(またはその相補的配列)のプライマー対は、配列番号:1を特異的に構成し、それによって、標準的なポリメラーゼ連鎖反応による配列番号:1の特異的増幅を可能にする。このようなPCRの例は以下の実施例において提示される。これは、必要な変更を加えて適用される：
配列番号:17(またはその相補的配列)および配列番号:18(またはその相補的配列)のプライマー対、ならびにポリヌクレオチド配列番号:2、
配列番号:19(またはその相補的配列)および配列番号:20(またはその相補的配列)のプライマー対、ならびにポリヌクレオチド配列番号:3、
配列番号:21(またはその相補的配列)および配列番号:22(またはその相補的配列)のプライマー対、ならびにポリヌクレオチド配列番号:4、
配列番号:23(またはその相補的配列)および配列番号:24(またはその相補的配列)のプライマー対、ならびにポリヌクレオチド配列番号:5、
配列番号:25(またはその相補的配列)および配列番号:26(またはその相補的配列)のプライマー対、ならびにポリヌクレオチド配列番号:6、
配列番号:27(またはその相補的配列)および配列番号:27(またはその相補的配列)のプライマー対、ならびにポリヌクレオチド配列番号:7、
配列番号:29(またはその相補的配列)および配列番号:30(またはその相補的配列)のプライマー対、ならびにポリヌクレオチド配列番号:8、
配列番号:31(またはその相補的配列)および配列番号:32(またはその相補的配列)のプライマー対、ならびにポリヌクレオチド配列番号:9、
配列番号:33(またはその相補的配列)および配列番号:34(またはその相補的配列)のプライマー対、ならびにポリヌクレオチド配列番号:10、
配列番号:35(またはその相補的配列)および配列番号:36(またはその相補的配列)のプライマー対、ならびにポリヌクレオチド配列番号:11、
配列番号:37(またはその相補的配列)および配列番号:38(またはその相補的配列)のプライマー対、ならびにポリヌクレオチド配列番号:12、
配列番号:39(またはその相補的配列)および配列番号:40(またはその相補的配列)のプライマー対、ならびにポリヌクレオチド配列番号:13、
配列番号:41(またはその相補的配列)および配列番号:42(またはその相補的配列)のプライマー対、ならびにポリヌクレオチド配列番号:14。
【００２５】
本発明のプライマー対を用いて、新規な増幅産物がポリメラーゼ連鎖反応によって産生された。出発物質は、CYP 1A1、CYP 1A2、CYP 1B1、CYP 2A、CYP 2B6、CYP 2C8、CYP 2C18、CYP 2C9、CYP 2C19、CYP 2D6、CYP 2E1、CYP 3A4、CYP 3A5、およびCYP 3A7からなる群より選択されるCYP450アイソフォームを含む任意の物質であり得る。このような出発物質の例には、ヒト、動物、植物、または原生生物起源の任意の物質が含まれる。好ましい出発物質には、特に、ヒト肝臓およびヒト肝実質細胞が含まれる。
【００２６】
該プライマー対がPCRプライマーとして使用される場合、当業者によって適切とみなされる任意のPCR条件が好都合である。標準的なPCR条件およびガイドラインは、例えば、Bruce A. White編「PCR protocols, Current Methods and Applications」において見出され得る。各々のプライマー対についての好ましい条件は、以下の実施例(すなわち、実施例1)において記載される。
【００２７】
それゆえに、本出願は、ヒト、動物、植物、または原生生物起源のポリヌクレオチドのセットを、本発明の少なくとも1つのプライマー対とともにポリメラーゼ連鎖反応に供することによって入手可能な任意の増幅産物を含む。
【００２８】
本発明のポリヌクレオチドを含むトランスフェクションベクターおよびそのようなポリヌクレオチドまたはトランスフェクションベクターでトランスフェクトされた遺伝子改変細胞もまた、産生された(以下に記載される実施例を参照されたい)。より詳細には、本発明は、プラスミド、コスミドのようなトランスフェクションベクターを提供し、このベクター上に本発明のポリヌクレオチドが挿入され、そして増殖している細胞中に挿入された場合に複製され得る。このようなトランスフェクションベクターおよび遺伝子改変細胞は本発明に含まれる。細胞が増殖するように作製された場合に、本発明のポリヌクレオチドが内部で複製され得る、遺伝子改変細胞は、このポリヌクレオチドを生成するための適切なツールである。なぜなら、複製されたポリヌクレオチドは、当該分野で標準的な手順(以下の実施例を参照されたい)に従って、当業者によって細胞から精製され得るからである。
【００２９】
関連する異なるCYP450アイソフォームの容易な検出および同定のために、本発明のポリヌクレオチド、増幅産物、トランスフェクションベクター、および遺伝子改変細胞は、それらを区別できるような様式で有利に配置される。固体表面は、該ポリヌクレオチドのためのそのような適切な手段の例である。マルチウェルのPCTまたはRT-PCRは、いくつかの該プライマー対が使用される場合のこのような適切な手段の例である。
【００３０】
それゆえに、本発明は、任意の固体表面(または担体)を包含する。この固体表面(または担体)は、少なくとも1つの本発明のポリヌクレオチド、または少なくとも1つの本発明の増幅産物、または少なくとも1つの本発明のトランスフェクションベクター、または少なくとも1つの本発明の遺伝子改変細胞を含む。本発明は、より詳細には、以下を含む任意の固体表面(または担体)を含み：
配列番号:1またはその相補的配列、
配列番号:2またはその相補的配列、
配列番号:3またはその相補的配列、
配列番号:4またはその相補的配列、
配列番号:5またはその相補的配列、
配列番号:6またはその相補的配列、
配列番号:7またはその相補的配列、
配列番号:8またはその相補的配列、
配列番号:9またはその相補的配列、
配列番号:10またはその相補的配列、
配列番号:11またはその相補的配列、
配列番号:12またはその相補的配列、
配列番号:13またはその相補的配列、および
配列番号:14またはその相補的配列、
また、（例えば、健康な個体から採集されたヒトリンパ球由来のDNAなどの）ヒトゲノムDNAを以下の各プライマー対を用いたポリメラーゼ連鎖反応に供することにより得られる14の増幅産物を含む任意の固体表面(または担体)を包含する：
配列番号:15(またはその相補的配列)および配列番号:16(またはその相補的配列)、
配列番号:17(またはその相補的配列)および配列番号:18(またはその相補的配列)、
配列番号:19(またはその相補的配列)および配列番号:20(またはその相補的配列)、
配列番号:21(またはその相補的配列)および配列番号:22(またはその相補的配列)、
配列番号:23(またはその相補的配列)および配列番号:24(またはその相補的配列)、
配列番号:25(またはその相補的配列)および配列番号:26(またはその相補的配列)、
配列番号:27(またはその相補的配列)および配列番号:28(またはその相補的配列)、
配列番号:29(またはその相補的配列)および配列番号:30(またはその相補的配列)、
配列番号:31(またはその相補的配列)および配列番号:32(またはその相補的配列)、
配列番号:33(またはその相補的配列)および配列番号:34(またはその相補的配列)、
配列番号:35(またはその相補的配列)および配列番号:36(またはその相補的配列)、
配列番号:37(またはその相補的配列)および配列番号:38(またはその相補的配列)、
配列番号:39(またはその相補的配列)および配列番号:40(またはその相補的配列)、
配列番号:41(またはその相補的配列)および配列番号:42(またはその相補的配列)。
【００３１】
適切な固体表面または担体の例には、ナイロン(登録商標)メンブレン(例えば、富士写真フイルム株式会社名義の欧州特許第1 098 004号「Fixation of nucleotide derivatives to solid carrier」を参照されたい)のような任意のDNAに適したフィルター、およびDNAチップのような任意のDNAアレイまたはマイクロアレイが挙げられる。DNAチップのようなDNAアレイまたはマイクロアレイは、任意の当該分野で標準的な手順に従って製造され得、この手順には、特に、以下に記載される手順および材料が含まれる：Gaschら、2000(Molecular Biology of the Cell、第II巻、4241〜4257頁)、Fodorら名義の米国特許第5,744,305号、Fodorら名義の米国特許第5,800,992号、Brownら名義の米国特許第5,807,522号、Khrapkuら名義の米国特許第5,552,270号、Conradら名義の米国特許第5,736,257号、Conradら名義の米国特許第5,847,019号、Hahnら名義の米国特許第6,174,683号、NGK Insulators, Ltd.名義の欧州特許第1 094 318号、Bio-Informatics Group, Inc.名義の国際公開公報第01/26799号。
【００３２】
本発明の生成物は、バイオテクノロジーキット(例えば、生物学における研究のためのキット、または薬物スクリーニングのためのキット、または病理学的な疾患の進化を決定するためのキット)に含まれ得る。これらは、特に、CYP450の発現パターン(CYP450のmRNAレベル)を決定するためのキットに含まれ得る。従って、本発明は、生物学的試料中のCYP450のmRNAレベルを決定するためのキットを包含し、このキットは、
本発明のポリヌクレオチド、本発明のプライマー対、本発明の増幅産物、本発明のトランスフェクションベクター、本発明の遺伝子改変細胞、本発明の固体表面、からなる群より選択される、少なくとも1種の産物を含み、
選択的に、検出標識、および/またはバイオテクノロジーに適したバッファー(例えば、リン酸バッファー)をさらに含む。
【００３３】
本発明の産物は、CYP450検出が含まれる任意の適用のために非常に価値のあるツールである。実際に、本発明のプローブおよびプライマーは、それとのハイブリダイゼーションによって、または、各々のその増幅によって、CYP450のDNA/cDNA/RNAの直接的な検出を可能にする。有利な特徴に従って、これらは、主要な14種のヒト肝臓のCYP450アイソフォームの同時検出を可能にし、この単回のプロセスは、さらに、生物学的材料のインプットが、先行技術の多段階の手順と比較して少なく要求される。
【００３４】
従って、本出願は、ポリヌクレオチドを含有する生物学的試料中で、CYP 1A1、CYP 1A2、CYP 1B1、CYP 2A、CYP 2B6、CYP 2C8、CYP 2C18、CYP 2C9、CYP 2C19、CYP 2D6、CYP 2E1、CYP 3A4、CYP 3A5、およびCYP 3A7からなる群から選択される少なくとも1種のCYP450アイソフォームの検出のための方法に関し、ここで、該CYP450アイソフォームは、該生物学的試料中でそのDNAまたはRNAの存在または非存在の検出によって検出される。このことは、以下のいずれかによって達成され得る：
該試料の全DNAまたは逆転写した全RNAの、本発明の少なくとも1種のポリヌクレオチド、または本発明の少なくとも1種の増幅産物、または本発明に従う固体表面とのハイブリダイゼーション、または
本発明の少なくとも1種のプライマー対を用いて、該全DNAまたは逆転写した全RNA上で実行される増幅。
【００３５】
当業者がハイブリダイゼーションまたはそれぞれの増幅に対して好都合であると判断する任意の条件が適切である。適切なハイブリダイゼーションまたはそれぞれの増幅の条件は当業者に公知であり、所望される場合、これらの条件は、各々の特定の場合について、慣用的な標準的な手順によって調整され得る。好ましい増幅およびハイブリダイゼーションの条件の例は、以下の実施例に示される。
【００３６】
有利には、本発明は、ポリヌクレオチドを含有する生物学的試料中で、CYP 1A1、CYP 1A2、CYP 1B1、CYP 2A、CYP 2B6、CYP 2C8、CYP 2C18、CYP 2C9、CYP 2C19、CYP 2D6、CYP 2E1、CYP 3A4、CYP 3A5、およびCYP 3A7の同時検出のための方法を提供し、ここで、該CYP450アイソフォームは、該生物学的試料中でそれらのそれぞれのDNAまたはRNAの存在または非存在の検出によって検出される。このことは、該試料の全DNAまたは逆転写した全RNAの、本発明の配列番号:1〜14のプローブのすべて(または、それらの相補的配列)とのハイブリダイゼーション、および好ましくは、本発明に従う固体表面とのハイブリダイゼーション(対応するCYP450の存在を意味する陽性のハイブリダイゼーションシグナル、その非存在を意味する陰性のハイブリダイゼーションシグナル)によって達成され得る。あるいは、この検出は、配列番号:15-16〜41-42のプライマー対(またはそれらの相補的配列)を用いるPCRまたはRT-PCRによる増幅(例えば、マルチウェルPCR/RT-PCR、好ましくはマルチウェル定量的PCR/RT-PCR)によって達成され得る(CYP450の存在を意味する実際の増幅、CYP450の非存在を意味する増幅産物がないこと)。適切なハイブリダイゼーションまたは増幅の条件は上記に示す通りである。
【００３７】
より詳細には、本発明は、CYP 1A1、CYP 1A2、CYP 1B1、CYP 2A、CYP 2B6、CYP 2C8、CYP 2C18、CYP 2C9、CYP 2C19、CYP 2D6、CYP 2E1、CYP 3A4、CYP 3A5、およびCYP 3A7からなる群より選択されるCYP450について、生物学的試料中に存在するmRNAレベルを測定するための方法に関し、ここで、
該生物学的試料の全RNAは逆転写され、このようにして得られたcDNAは、少なくとも1種の本発明のポリヌクレオチド、または少なくとも1種の本発明の増幅産物、または本発明のいずれか1つに従う固体表面とのDNA/DNAハイブリダイゼーションのために適切な条件下で、あるいは少なくとも1種の本発明のプライマー対を用いるDNA増殖のために適切な条件下で接触するように配置され、そして
このようにして得られたハイブリダイゼーションまたは増幅のシグナルの強度が測定され、
該CYP450のmRNAレベルはこの測定された強度に対応する。
【００３８】
さらに好都合な局面に従って、本発明は、CYP 1A1、CYP 1A2、CYP 1B1、CYP 2A、CYP 2B6、CYP 2C8、CYP 2C18、CYP 2C9、CYP 2C19、CYP 2D6、CYP 2E1、CYP 3A4、CYP 3A5、およびCYP 3A7について、生物学的試料中に存在するmRNAレベルを同時測定するための方法を提供し、ここで、
該生物学的試料の全RNAは逆転写され、このようにして得られたcDNAは、本発明の配列番号:1〜14のプローブ(またはそれらの相補的配列)すべてとのDNA/DNAハイブリダイゼーションのために適切な条件下で、および好ましくは本発明に従う固体表面とのDNA/DNAハイブリダイゼーションのために適切な条件下で接触するように配置され、そして
このようにして得られたそれぞれのハイブリダイゼーションシグナルが測定され、
該CYP450のmRNAレベルはこれらの測定されたハイブリダイゼーションシグナルにそれぞれ対応する。
【００３９】
または、該cDNAは、本発明のあらゆる1つのプライマー対、すなわち、配列番号:15-16〜41-42またはそれらの相補的配列を用いるDNA増幅(例えば、マルチウェルPCR/RT-PCR、好ましくはマルチウェル定量的PCR/RT-PCR)のために適切な条件下に配置され得る。このようにして得られたそれぞれの増幅シグナルは測定され、該CYP450のmRNAレベルは、それぞれ、測定されたこれらの増幅シグナルに対応する。
【００４０】
DNA/DNAハイブリダイゼーションまたはPCR/RT-PCRの適切な条件は、上記に示した通りである。
【００４１】
本出願はまた、CYP 1A1、CYP 1A2、CYP 1B1、CYP 2A、CYP 2B6、CYP 2C8、CYP 2C18、CYP 2C9、CYP 2C19、CYP 2D6、CYP 2E1、CYP 3A4、CYP 3A5、およびCYP 3A7からなる群より選択される1つまたはいくつかのCYP450  DNAについて、生物学的試料中に存在するmRNAレベルに、ある化合物が有する影響を評価するための任意の方法を包含し、ここで：
該化合物の存在下および非存在下でのこれらのCYP450のmRNAレベルは、本発明のmRNA測定のための方法によって測定され、そして
該化合物の影響は、このようにして測定された2つのmRNAレベルの比較によって評価される。
【００４２】
ある化合物が該1つまたはいくつかのCYP450のmRNAレベルに対して有する影響を評価するためのこの方法は、以下のような方法として有利に使用され得る：
薬物の候補化合物のセットの間で、各薬物の候補化合物がCYP450のmRNAレベルに対して有する影響を考慮に入れる、より安全および/もしくはより有効な薬物をスクリーニングするための方法として、ならびに/または
該化合物がCYP450のmRNAレベルに対して有し得る影響を考慮に入れる、生きている生物体中でのある化合物の代謝を評価するための方法として。
【００４３】
本発明はまた、CYP 1A1、CYP 1A2、CYP 1B1、CYP 2A、CYP 2B6、CYP 2C8、CYP 2C18、CYP 2C9、CYP 2C19、CYP 2D6、CYP 2E1、CYP 3A4、CYP 3A5、およびCYP 3A7からなる群より選択される少なくとも1つのCYP450アイソフォームを発現する生きている生物体に投与した場合に、ある化合物が有し得る効果を決定するための方法、またはこのようなCYP450アイソフォームの少なくとも1つを発現する生きている生物体への投与が意図される化合物間の相互作用を決定するための方法に関し、ここで：
化合物の各々が該少なくとも1つのCYP450アイソフォームのmRNAレベルに対して有する影響は、該化合物が該1種または数種のCYP450について生物学的試料中に存在するmRNAレベルに対して有する影響を評価するための該方法によって評価され、そして、
該生きている生物体中でその化合物が有し得る効果(またはそれらが誘導し得る相互作用)は、それらのそれぞれの影響の比較によって評価される。
【００４４】
本発明の方法を実施するために、ポリヌクレオチドを含有する任意の生物学的試料が適切である。好ましい生物学的試料は、特に、ヒト肝実質細胞由来の全逆転写RNAを含む。
【００４５】
本発明は、以下の実施例および添付の図面によって例証される。
【００４６】
実施例1:増幅およびクローニング
プライマーを用いるcDNAプローブの単離-予測されたサイズの単一バンドが得られる
標準的なPCR条件を使用して、配列番号:15-16〜41-42のプライマー対を用いて配列番号:1〜14のcDNAプローブを増幅した。dNTP、Taq Polymerase Cetus(登録商標)(Perkin Elmer)、および該各プライマーの最終濃度は、1.25mM、2.5IU、および0.4mMであった。増幅を、ヒトゲノムDNA(健康な個体から収集したヒトリンパ球由来のDNA)を用いて実行した。MgCl2含量、増幅温度、および予測フラグメントサイズを以下の図2に示す。
（表２）
2004537989.tif 000003
TD＝タッチダウンPCR(サイクルあたり、30秒ごとに0.5℃の減少)
すなわち：
2004537989.tif 000004
【００４７】
5μlの増幅産物を2％アガロースゲル上に負荷し、標準的な電気泳動に供した。UVによる可視化により、各増幅産物について1つのバンドのみが示され、各バンドは予測されたサイズであった。図3は、CYP 1A1、CYP 1A2、CYP 3A4、CYP 3A5、およびCYP 3A7を用いてこのようにして得られた結果を図示する。
【００４８】
cDNA精製、クローニング、および配列決定
PCRによって得られた相補的DNAを、余分なヌクレオチド、プライマー、酵素、および塩類を除去するために、QIAquickTMPCT purification kit(Qiagen(登録商標)、Courtaboeuf、フランス)を用いて精製した。次いで、このように精製したcDNAをEcoRIで消化した。
【００４９】
20μgのpUC19(Genbank X02415)を、20μlの水中でEcoRIによって消化し、20IUのアルカリホスファターゼ(Biolab(登録商標)Ozyme、St Quentin et Yvelines、フランス)によって、37℃で1時間、5'-脱リン酸化した。この反応を、5mM  EDTA(250mM、pH  8)の添加によって停止し、65℃で15分間加熱する。
【００５０】
挿入されるDNAおよび800IUのT4  DNAリガーゼ(Biolabs(登録商標))を、線状化しかつ脱リン酸化したベクターに添加する。インキュベーションを、16℃で少なくとも12時間実行する。このプラスミドは、好ましくは、挿入されるDNAと比較して低濃度である(例えば、モル濃度で1：5の比率)。
【００５１】
15μlのコンピテントE.coli XL1 Blueを、20μlのライゲーション産物と、42℃、1分間、熱ショックにより形質転換した。37℃一晩の培養後の、抗生物質を含むLB-寒天培養培地から、アンピシリン耐性コロニーを選択した。このように選択したコロニーを、定常的に振盪しながら、2mlのLBA培地中で37℃、一晩インキュベートした。
【００５２】
実際のDNAの挿入物は、DNA抽出(QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiagen(登録商標))によってチェックし、EcoRIによって消化し、次いで、2％アガロースゲル上に負荷する。次いで、陽性クローン(挿入物を含む)を、再度培養物に入れる。次いで、プラスミドDNAを、Maxiprep, Qiagen(登録商標)plasmid maxi kitで抽出し、そして配列決定する(AB Prism 310 genetic analyser, Perkin Elmer(登録商標))。配列決定は、pUCプラスミドにハイブリダイズし、クローニングサイトを形成するプライマーを用いて、蛍光色素標識したオリゴヌクレオチドを使用する改変サンガー法(Sanger F, Nickeln S およびCoulson AR、1992、DNA sequencing with chain-terminating inhibitors、Biotechnology 24: 104-108)に従って実行する。
【００５３】
このようにして得られた配列は、特許請求の範囲に記載された配列番号:1〜14に対応する。
【００５４】
実施例2:増幅したcDNAの特異性
増幅産物またはcDNAプローブのいずれかを含む固体表面の作製
ナイロン(登録商標)フィルター上に、以下のDNA配列のいずれかを負荷した：
上記の実施例1に記載した通りの50ngのプラスミドDNAの増幅、続いて精製およびUVの分光光度法的照射(Power Wave X2、Biotek instruments(登録商標)、St Quentin en Yvelines、フランス)によって得られた配列、
または、BamHIによる線状化(20μgのプラスミドDNAに対して20IU、37℃1時間)後に上記の実施例1において記載されたクローンから得られたプラスミドDNA(そこに挿入されたプローブを含む線状化プラスミドまたは空のpUCプラスミド50ng)。
【００５５】
増幅した配列ならびにプラスミドの配列を、EDTA(最終濃度10mM、65℃10分間)、次いで、NaOH(最終濃度0.1M、大気温度で30分間)によって変性させ、SSC6×バッファーによって中和し、その後ナイロン(登録商標)メンブレン(Biosupport(登録商標)、Pall、Portsmouth、UK)に付着させた。メンブレンへの結合を、UVに4分間さらすこと、および80℃で2時間の加熱によって達成した。
【００５６】
特異性アッセイ法
3つのタイプの特異性アッセイ法を実行した：
プローブ内特異性： Megaprime(登録商標)DNA Labelling System(Amersham Pharmacia Biotech、Elancourt、フランス)に従って、ランダムプライマーポリメリゼーションによって、各cDNAプローブ(配列番号:1〜14)を32Pで標識した。次いで、各放射性プローブを、上記のフィルターの1つとともにハイブリダイゼーションのためにインキュベートした(Amersham Rapid-Hybrid(登録商標)バッファー-ハイブリダイゼーションオーブンAppligene(登録商標)中で65℃、2時間)。次いで、フィルターを、SSC  2×、SDS  0.1％で、次いでSSC  0.5×、SDS  0.1％で、最後にSSC  0.1×、SDS  0.1％で(SSC  20×はpH＝7、3M  塩化ナトリウムおよび0.3M  クエン酸ナトリウムの組成を有し；SDS  10％は、熱水中に10g/100mlに希釈したドデシル硫酸ナトリウム塩からなる)、65℃、30分間洗浄する。次いで、このフィルターをホスホルイメージャーカセット(Storm(登録商標)、840)に暴露する。
ヒト肝実質細胞由来の全RNAについての特異性：同じプローブを、ヒト肝実質細胞由来の10μgの全RNAが負荷されているノーザンブロットにハイブリダイズさせた。
CYP450 cDNAの3'-NTRおよびコード領域についての特異性：14種のCYP450の全体のコード配列または全体の3’NTR領域を含むフィルターを、プローブフィルターについて上記に記載したものと同様に調製した。各プローブを、これらのフィルターとともにハイブリダイゼーションのためにインキュベートした。
【００５７】
結果:
配列番号:9のプローブ(すなわち、CYP 2C19プローブ)以外の各プローブは、その標的のみにハイブリダイズする：別のCYP450アイソフォームとの交差ハイブリダイゼーションは存在せず、トランスフェクションに使用した空のプラスミドとの交差ハイブリダイゼーションも存在せず(結果の図示については図6A〜6Eを参照されたい)、またヒト肝実質細胞由来のいかなる他のRNAとの交差ハイブリダイゼーションも存在しない(ノーザンブロットによって評価される通り)。
【００５８】
各プローブは、別のプローブとの交差ハイブリダイゼーションを起こすことなくその標的のcDNAとハイブリダイズする。しかし、ファミリー3についてのプローブは、標的でないファミリー3のCYP450の3'-NTRにハイブリダイズしないことは明らかであるものの、配列番号:9は(そのCYP 2C19標的に加えて)CYP 2C9の3'-NTR領域にハイブリダイズし得ることは除外できない。しかし、配列番号:8は、そのCYP 2C9標的にのみハイブリダイズする。
【００５９】
どのプローブもCYP450アイソフォームのコード領域とはハイブリダイズしない。
【００６０】
従って、配列番号:1〜14およびそれらの相補的配列は、ゼノバイオティクスによってその発現が変化する主要な14種のヒトCYP450アイソフォーム(ヒト肝臓アイソフォーム)に関する完全な特異性を有するcDNAプローブのセットを表す。
【００６１】
実施例3:メンブレンアッセイ法(CYP450発現の調節を誘導することが公知のゼノバイオティクスを用いる確認)
ヒト肝実質細胞培養および処理
抗生物質も殺真菌剤もなしで、ウェルあたり300，000細胞の比率で24ウェルプラーク中の培養から生じる健康な個体由来のヒト肝実質細胞を、以下の処理に供した。
【００６２】
（表３）
2004537989.tif 000005
3-CM対照：DMSO、最終濃度0.50％暴露、持続時間48時間。
培養培地はt＝24時間で置き換えた。ウェルあたりのDMSOの量は0.5％(最終濃度)を超えない。
【００６３】
RNAの単離:
細胞の溶解を引き起こすために600mlの溶液D(pH7；グアニジンチオシアネート4M；クエン酸ナトリウム25mM；サルコシル0.5％；および溶液D200mlあたり1.4mlのβ-メルカプトエタノール)を各ウェルに添加した。次いで、細胞溶解物を収集し、処理ごとに一緒にグループ化する。次いで、逐次的に以下を添加する：0.1容量の酢酸ナトリウム(2M、pH4)、1容量の水飽和フェノールおよび0.2容量のクロロホルム/イソアミルアルコール(49/1、v/v)。各段階において、懸濁液を勢いよくボルテックスし、次いで氷上で15〜20分間冷却させ、4000gで30分間、4℃で遠心分離する。等容量のイソプロパノールを、水相を除去した後に添加する。
【００６４】
次いで、RNAを沈殿させ(-20℃で1時間)、4000gで30分間、4℃で遠心分離する。上清を除去し、ペレットを2.7mlの溶液Dに再懸濁する。次いで、2.7mlのイソプロパノールをこの懸濁液に添加し、再度RNAを沈殿させ(-20℃で1時間)、そして遠心分離する。ペレットを5.4mlの70％エタノールで洗浄する。最後の遠心分離および上清の除去の後、ペレットを風乾し、DEPCを含む滅菌水中に再懸濁する(水中、DEPC  1/1000、次いで滅菌)。全RNA含量を、UV分光光度計で測定する。
【００６５】
全RNAの逆転写:
25μgの全RNAをオリゴ-dT(オリゴd(T)、および3’にAまたはGまたはCを有する3種のオリゴd(T)の等モル組成物、最終濃度0.4mM)と接触させて配置し、70℃で10分間加熱し、次いで、オリゴ-dTのポリA  RNAとのハイブリダイゼーションを可能にするために、氷上で5分間インキュベートした。次いで、4種のヌクレオチド(dATP、dGTP、dCTP、dTTP、各々について最終0.5mM)ならびに1.1U/mlのリボヌクレアーゼインヒビター、放射性標識したヌクレオチド(dATP*およびdTTP*；3000Ci/mmol、最終10μCi/ml-0.66μCi/ml)、MMLV-RT(最終6U/ml)、およびそのバッファー(最終1×)を添加した。全体の混合物を37℃で1時間インキュベートし、次いで、このようにして形成したcDNAを、2.5M  NaOHによって、37℃で10分間、変性させ、Hepesバッファー(1M-pH8)にて中和した。次いで、このようにして作製した標識したcDNAを精製した。逆転写の量をチェックするために、アリコートをアクリルアミドゲル上に負荷する。
【００６６】
並行して、メンブレンを、非特異的な部位にハイブリダイズするためにサケ精子DNA(10mg/ml、Sarmon testes DNAハイブリダイゼーション用、Sigma)を添加したプレハイブリダイゼーションバッファー(脱イオンホルムアミド50％、SDS 2.3％、サケ精子DNA0.2mg/ml、tRNA 0.1mg/ml、Denhardt 10×、SSEP 3×-SSPE 20×(pH 7.4)＝NaCl 3M＋NaH2PO4 0.2M＋EDTA 25mM-)とともに、42℃で24時間インキュベートする。
【００６７】
次いで、標識したcDNAをフィルターとハイブリダイズさせる(42℃で48時間)。対照の結果と処理結果とを比較するために、異なるハイブリダイゼーションを、液体シンチレーション分析機(TriCarb 2100 TR、Packard(登録商標)、Rungis、フランス)によって測定した1分間あたりの計数(約400，000cpm)に関して調整した。フィルターを、SDSを含まないSSC  2×バッファーで、42℃で30分間洗浄し、ホスホルイメージャーカセット中で一晩露光した。
【００６８】
比較の目的のために、10μgの全RNAを含むノーザンブロットを、各cDNAプローブと別々にハイブリダイゼーションのためにインキュベートした。定量実験を、18Sの量あたりのバンドの強度を測定することによって達成する(臭化エチジウムの着色によって評価する)。
【００６９】
結果:
本発明の固体表面(cDNAプローブの全体のセットを含むメンブレン)を用いて得られた結果は、プローブあたり1つのノーザンブロットを用いて得られた結果と同様である。これらの結果は、図4および図5に図示されており、ここではCYP 1A1、CYP 1A2、CYP 3A4について得られたノーザンブロット(図4に示す)は、本発明のメンブレンを用いて得られたスロットブロットと比較され得る(図5)。
【００７０】
本発明のアッセイ法の特定の場合において、3-メチルコラントレンはCYP 1A1の増加を誘導するが、また、CYP 1A2についてはより弱く増加を誘導することが観察できる。一方、これはCYP 3A4の減少を誘導する。フェノバルビタール処理およびリファンピシン処理は、CYP 3A4の強力な減少を誘導し、一方、CYPの14のサブファミリーならびにCYP 3A5および3A7に対しては変化が観察されなかった。ハイブリダイゼーションシグナルの定量は、本発明に従うスロットブロットと比較してノーザンブロットにおいて同じオーダーであった。
【００７１】
本発明のメンブレンは、好都合なことに、ノーザンブロット技術よりも少ない生物学的材料を必要とし、そしてこのことは、肝臓の生検および培養が実行される場合に非常に有用な特徴である。このことはまた、(14回のノーザンブロットの代わりに)1回のみのハイブリダイゼーションが十分な結果を与えるので、より時間がかからない。
【００７２】
本発明に係る方法の感度をさらに高めることが望ましいのであれば、DNAマイクロアレイを、上記のナイロン(登録商標)メンブレンの代わりに好都合に使用できる。
【００７３】
本明細書中で引用されたすべての刊行物、特許、特許出願は、各個々の刊行物、特許、特許出願が特異的にかつ個々に参照として取り込まれることが意図されるように、参照として本明細書に取り込まれる。前述の本発明は、理解を明確化するための例証および例示によって幾分詳細に記載したが、添付の特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の開示を鑑みて特定の変更および改変が本発明になされ得ることは当業者には容易に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図1は、配列番号:1〜14の配列(cDNAプローブ)を示す。
【図２】図2は、配列番号:15-16〜41-42の配列(配列番号:1〜14に特異的なプライマー対)を示す。
【図３】図3は、本発明のプライマーが推定サイズの単一な生成物を増幅することを示す、CYP 1A1、CYP 1A2、CYP 3A4、CYP 3A5、およびCYP 3A7を用いるアガロースゲルである。
【図４】図4は、ヒト肝実質細胞由来の全RT-RNAとのCYP 1A1、CYP 1A2、およびCYP 3A4のハイブリダイゼーション(参照として18S)について得られた代表的なノーザンブロットを示す(第1のレーン：対照、処理なし；第2のレーン：PB処理；第3のレーン：DMSO処理；第4のレーン：3-MC処理)。
【図５】図5は、ヒト肝実質細胞由来の全RT-RNA(第1のレーン：対照、処理なし；第2のレーン：PB処理；第3のレーン：DMSO処理；第4のレーン：3-MC処理)の、CYP 1A1(配列番号:1)、CYP 1A2(配列番号:2)、CYP 3A4(配列番号:12)、CYP 3A5(配列番号:13)、およびCYP 3A7(配列番号:14)に特異的なcDNAプローブを含む本発明のメンブレンとのハイブリダイゼーションによって得られた代表的なスロットブロットを示す。
【図６】図6A〜6Eは、本発明のプローブを、各14種のプラスミドDNAおよび空のプラスミド50ngを付着させたナイロン(登録商標)メンブレン(全部で14メンブレン)とハイブリダイズさせたときに得られた代表的な結果を図示する。各メンブレンの底部に見える名称は、どのプローブがこのメンブレンで使用されたかを示し、各々の図6の図のシートの上部左角には、挿入された各プラスミドDNA(挿入されたプローブの名称)および空のプラスミド(pUC)の位置が示されている。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年5月28日(2003.5.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、およびその相補的配列からなる群より選択される、単離および精製されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号:15および配列番号:16、配列番号:17および配列番号:18、配列番号:19および配列番号:20、配列番号:21および配列番号:22、配列番号:23および配列番号:24、配列番号:25および配列番号:26、配列番号:27および配列番号:28、配列番号:29および配列番号:30、配列番号:31および配列番号:32、配列番号:33および配列番号:34、配列番号:35および配列番号:36、配列番号:37および配列番号:38、配列番号:39および配列番号:40、配列番号:41および配列番号:42、ならびにそれらのそれぞれの相補的オリゴヌクレオチドの組からなる群より選択されるプライマー対。
【請求項３】
CYP 1A1、CYP 1A2、CYP 1B1、CYP 2A、CYP 2B6、CYP 2C8、CYP 2C18、CYP 2C9、CYP 2C19、CYP 2D6、CYP 2E1、CYP 3A4、CYP 3A5、およびCYP 3A7からなる群より選択されるCYP450特異的プローブの生産方法であって、ヒトゲノムDNAまたはヒト逆転写CYP450含有RNAが請求項2記載のプライマーを用いるPCRに供され、それにより生成された増幅産物が該CYP450特異的プローブに相当することを特徴とする、方法。
【請求項４】
ベクター挿入物が請求項1記載のポリヌクレオチドを含む、トランスフェクションベクター。
【請求項５】
請求項1記載のポリヌクレオチドまたは請求項4記載のトランスフェクションベクターを用いてトランスフェクトされた遺伝子改変細胞。
【請求項６】
請求項1記載のオリゴヌクレオチドが、細胞が増殖するように作製された場合に複製する、請求項5記載の遺伝子改変細胞。
【請求項７】
請求項1記載の少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、または請求項4記載の少なくとも1つのトランスフェクションベクター、または請求項5もしくは6に記載の少なくとも1つの遺伝子改変細胞を含む、固体表面。
【請求項８】
請求項7記載の固体表面であって、
配列番号:1またはその相補的配列、
配列番号:2またはその相補的配列、
配列番号:3またはその相補的配列、
配列番号:4またはその相補的配列、
配列番号:5またはその相補的配列、
配列番号:6またはその相補的配列、
配列番号:7またはその相補的配列、
配列番号:8またはその相補的配列、
配列番号:9またはその相補的配列、
配列番号:10またはその相補的配列、
配列番号:11またはその相補的配列、
配列番号:12またはその相補的配列、
配列番号:13またはその相補的配列、および
配列番号:14またはその相補的配列
を含む、固体表面。
【請求項９】
請求項7記載の固体表面であって、ヒトゲノムDNAを以下のプライマー対の各々と共にポリメラーゼ連鎖反応に供することによって得ることができる14の増幅産物を含む固体表面：
配列番号:15(またはその相補的配列)および配列番号:16(またはその相補的配列)、
配列番号:17(またはその相補的配列)および配列番号:18(またはその相補的配列)、
配列番号:19(またはその相補的配列)および配列番号:20(またはその相補的配列)、
配列番号:21(またはその相補的配列)および配列番号:22(またはその相補的配列)、
配列番号:23(またはその相補的配列)および配列番号:24(またはその相補的配列)、
配列番号:25(またはその相補的配列)および配列番号:26(またはその相補的配列)、
配列番号:27(またはその相補的配列)および配列番号:28(またはその相補的配列)、
配列番号:29(またはその相補的配列)および配列番号:30(またはその相補的配列)、
配列番号:31(またはその相補的配列)および配列番号:32(またはその相補的配列)、
配列番号:33(またはその相補的配列)および配列番号:34(またはその相補的配列)、
配列番号:35(またはその相補的配列)および配列番号:36(またはその相補的配列)、
配列番号:37(またはその相補的配列)および配列番号:38(またはその相補的配列)、
配列番号:39(またはその相補的配列)および配列番号:40(またはその相補的配列)、
配列番号:41(またはその相補的配列)および配列番号:42(またはその相補的配列)。
【請求項１０】
請求項7〜9のいずれか一項記載の固体表面であって、ナイロン(登録商標)メンブレンなどのDNAに適したフィルター、およびDNAチップなどのDNAアレイまたはマイクロアレイからなる群より選択される、固体表面。
【請求項１１】
CYP450のmRNAレベルを測定するためのキットであって、
請求項1記載のポリヌクレオチド、請求項2記載のプライマー対、請求項4記載のトランスフェクションベクター、請求項5もしくは請求項6に記載の遺伝子改変細胞、または請求項7、請求項8、請求項9、もしくは請求項10に記載の固体表面からなる群より選択される、少なくとも1つの産物を含有し、
選択的に、検出標識および/またはバイオテクノロジーに適したバッファーをさらに含有する、キット。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドを含有する生物学的試料において、CYP 1A1、CYP 1A2、CYP 1B1、CYP 2A、CYP 2B6、CYP 2C8、CYP 2C18、CYP 2C9、CYP 2C19、CYP 2D6、CYP 2E1、CYP 3A4、CYP 3A5、およびCYP 3A7からなる群より選択される少なくとも1つのCYPアイソフォームを検出するための方法であって、
該試料の全DNAもしくは逆転写された全RNAと、請求項1記載の少なくとも1つのポリヌクレオチド、または請求項3記載の少なくとも1つの増幅産物、または請求項7〜9のいずれか一項記載の固体表面とのハイブリダイゼーションによるか、
または、該全DNAまたは逆転写された全RNA上で、請求項2記載の少なくとも1つのプライマー対を用いて行われる増幅によるか
のいずれかによって、該CYP450アイソフォームが検出される方法。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドを含有する生物学的試料において、CYP 1A1、CYP 1A2、CYP 1B1、CYP 2A、CYP 2B6、CYP 2C8、CYP 2C18、CYP 2C9、CYP 2C19、CYP 2D6、CYP 2E1、CYP 3A4、CYP 3A5、およびCYP 3A7を同時検出するための方法であって、該CYP450アイソフォームが、該試料の全DNAもしくは逆転写されたRNAと、請求項8〜9のいずれか一項記載の固定表面とのハイブリダイゼーションによって、または請求項2記載の配列番号:15-16〜41-42のプライマー対(もしくはそれらの相補的配列)を用いるDNAもしくはcDNA増幅によって検出される、方法。
【請求項１４】
CYP 1A1、CYP 1A2、CYP 1B1、CYP 2A、CYP 2B6、CYP 2C8、CYP 2C18、CYP 2C9、CYP 2C19、CYP 2D6、CYP 2E1、CYP 3A4、CYP 3A5、およびCYP 3A7からなる群より選択されるCYP450についての生物学的試料中に存在するmRNAレベルを測定するための方法であって、
該生物学的試料の全RNAが逆転写され、従って得られたcDNAが、請求項1記載の少なくとも1つのポリヌクレオチド、もしくは請求項7〜9のいずれか一項記載の固体表面と、DNA/DNAハイブリダイゼーションに適切な条件下で接触、または請求項2記載の少なくとも1つのプライマー対とDNA増幅に適切な条件下で接触するように配置され、
このようにして得られたハイブリダイゼーションまたは増幅のシグナルの強度が測定され、
該CYP450 mRNAレベルがこの測定された強度に対応する、方法。
【請求項１５】
CYP 1A1、CYP 1A2、CYP 1B1、CYP 2A、CYP 2B6、CYP 2C8、CYP 2C18、CYP 2C9、CYP 2C19、CYP 2D6、CYP 2E1、CYP 3A4、CYP 3A5、およびCYP 3A7についての生物学的試料中に存在するmRNAレベルを同時測定するための方法であって、
該生物学的試料の全RNAが逆転写され、従って得られたcDNAが、請求項8〜9のいずれか一項記載の固体表面とDNAハイブリダイゼーションに適切な条件下で接触、または請求項2記載の配列番号:15-16〜41-42のプライマー対(もしくはそれらの相補的配列)とcDNA増幅に適切な条件下で、接触するように配置され、
このようにして得られたそれぞれのハイブリダイゼーションまたは増幅のシグナルが測定され、
該CYP450 mRNAレベルがこれらの測定されたハイブリダイゼーションまたは増幅シグナルにそれぞれ対応する、方法。
【請求項１６】
CYP 1A1、CYP 1A2、CYP 1B1、CYP 2A、CYP 2B6、CYP 2C8、CYP 2C18、CYP 2C9、CYP 2C19、CYP 2D6、CYP 2E1、CYP 3A4、CYP 3A5、およびCYP 3A7からなる群より選択される1つまたはいくつかのCYP450のmRNAレベルに対して化合物が有する影響を評価するための方法であって、
該化合物の存在下および同じ該化合物の非存在下でのこれらの単数もしくは複数のCYP450のmRNAレベルを、請求項14または15記載の方法によって測定し、
該化合物の影響を、このようにして測定された2つのmRNAレベルの比較によって評価する、方法。
【請求項１７】
薬物の候補化合物のセットの中から、より安全および/またはより効率的な薬物をスクリーニングするための方法であって、各薬物の候補化合物がCYP450のmRNAレベルに対して有する影響を考慮に入れており、該影響が請求項16記載の方法に従って評価される、方法。
【請求項１８】
生きている生物体における化合物の代謝を評価するための方法であって、該化合物がCYP450のmRNAレベルに対して有し得る影響を考慮に入れており、該評価が請求項16記載の方法に従ってなされる、方法。
【請求項１９】
CYP 1A1、CYP 1A2、CYP 1B1、CYP 2A、CYP 2B6、CYP 2C8、CYP 2C18、CYP 2C9、CYP 2C19、CYP 2D6、CYP 2E1、CYP 3A4、CYP 3A5、およびCYP 3A7からなる群より選択される少なくとも1つのCYP450アイソフォームを発現する生きている生物体に投与した場合に、化合物が有し得る効果を測定するため、またはこのようなCYP450アイソフォームの少なくとも1つを発現する生きている生物体への投与が意図される化合物間の相互作用を測定するための方法であって、
該化合物の各々が該少なくとも1つのCYP450アイソフォームのmRNAレベルに対して有する影響が、請求項16記載の方法によって評価され、
該生きている生物体における該化合物が有し得る効果(またはそれらが誘導し得る相互作用)が、それらのそれぞれの影響の比較によって評価される、方法。
【国際調査報告】
2004537989.tif 000066
2004537989.tif 000067
2004537989.tif 000068
2004537989.tif 000069