(57)【要約】本発明は、樹状細胞の成熟を誘導するための、グラム陰性細菌、特に、肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）の膜画分の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
樹状細胞の成熟を誘導するための、グラム陰性細菌、好ましくは肺炎杆菌の少なくとも1種の膜画分の使用であって、該膜画分が、LPS（リポポリサッカライド）と関連する少なくとも一種の膜画分を含む使用。
【請求項２】
樹状細胞の成熟を誘導する薬剤を製造するための、グラム陰性細菌、好ましくは肺炎杆菌の少なくとも1種の膜画分の使用であって、該膜画分が、LPS（リポポリサッカライド）と関連する少なくとも一種の膜画分を含む使用。
【請求項３】
膜画分において、ガラクトース含量とタンパク質含量の和によって表されるプロテオグリカン価が、ガラクトースについては、1.2 g/l〜3.4 g/lの範囲、タンパク質については、7.5 g/l〜14.9 g/lの範囲であることを特徴とする、請求項1または2記載の使用。
【請求項４】
樹状細胞をインビトロで生成し、成熟させる、請求項1〜3のいずれか一項記載の使用。
【請求項５】
樹状細胞をインビトロで生成し、成熟させ、その後、成熟細胞をインビボに再注入する、請求項2〜4のいずれか一項記載の使用。
【請求項６】
薬剤を製造するために、少なくとも1種の生体物質をさらに使用する、請求項2〜5のいずれか一項記載の使用。
【請求項７】
生体物質が、細菌、ウイルス、酵母、寄生生物または真菌の抗原、腫瘍抗原、ならびに自己および／または非自己腫瘍細胞の溶解物から選択されたものであることを特徴とする、請求項6記載の使用。
【請求項８】
樹状細胞をエクスビボで、抗原および／またはサイトカインまたは成長因子をコードする遺伝子でトランスフェクトする、請求項2〜5のいずれか一項記載の使用。
【請求項９】
薬剤が、サイトカインまたは成長因子、好ましくはα-インターフェロン、γ−インターフェロン、TNFα、GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-6およびIL-18、またはHSPをさらに含む、請求項2〜8のいずれか一項記載の使用。
【請求項１０】
ウイルス、細菌もしくは真菌に起因する感染性疾患、または酵母もしくは寄生生物によって生じる感染性疾患の治療用薬剤もしくは予防用薬剤を製造するための、請求項1〜9のいずれか一項記載の使用。
【請求項１１】
HIV、肝炎ウイルス、およびパラインフルエンザウイルスから選択されるウイルスに対処するための薬剤を製造するための、請求項1〜9のいずれか一項記載の使用。
【請求項１２】
癌の治療用もしくは予防用薬剤を製造するに際しての、請求項1〜9のいずれか一項記載の使用。
【請求項１３】
骨髄腫、リンパ腫、白血病、腎臓の癌腫、脳の癌腫、前立腺の癌腫、直腸の癌腫、脾臓の癌腫、卵巣の癌腫、肺の癌腫、角質腫、ならびに癌腫から選択される癌の治療用薬剤または予防用薬剤を製造するための、請求項8または9記載の使用。
【請求項１４】
グラム陰性細菌、好ましくは肺炎杆菌の少なくとも1種の膜画分を含み、該膜画分が、LPS（リポポリサッカライド）と関連する少なくとも一種の膜画分を含む、樹状細胞を成熟させる装置。
【請求項１５】
膜画分において、ガラクトース含量とタンパク質含量の和によって表されるプロテオグリカン価が、ガラクトースについては、1.2 g/l〜3.4 g/lの範囲、タンパク質については、7.5 g/l〜14.9 g/lの範囲であることを特徴とする、請求項14記載の装置。
【請求項１６】
非自己抗原、または自己細胞の溶解物を得る手段をさらに含む、請求項14または15記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、樹状細胞の成熟を誘導し、特定の免疫応答を発現させるための、グラム陰性細菌、特に、肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）の膜画分の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞は、免疫応答を進行させ、特定のTリンパ球応答を開始させる際に、ある種の役割を果たす（Steinman RMら, Immuno Rev. (1997) 156, 25; Cella Mら, Curr. Opin. Immunol. (1997) 9, 10）。未成熟な樹状細胞は、非リンパ系組織に存在している。皮膚のレベルでは、樹状細胞は、腸以外の表皮のすべてに存在し、ランゲルハンス細胞と称されており、また、樹状細胞は、量こそ少ないものの、肺、肝臓、および腸などの器官にも存在している。これらの未成熟樹状細胞は、抗原を高い効率で捕捉し、消化する。インビボで、抗原による刺激または炎症誘発性分子による刺激を受けると、抗原を捕捉した樹状細胞は、二次リンパ器官へと移動する。この移動の間に、樹状細胞は、成熟という用語に包括されるような機能ならびに表現型の変化を生じる。この成熟は、樹状細胞表面での、Tリンパ球の活性化に関与する分子（たとえばCD40、CD54、CD58、CD86およびMHCクラスI/II）の増加；炎症誘発性サイトカイン（IL-6）およびケモカイン（たとえばTNFα、IL-8、MCP-1およびMIP-1a）の産生；ならびに抗原処理能力の喪失を特徴とする。ケモカインは、炎症細胞を動員し、免疫応答の開始を促進する。特に、IL-8、MCP-1およびMIP-1αは、炎症細胞ばかりでなく、ナイーブTリンパ球およびメモリーTリンパ球も誘引する。このように、樹状細胞は、ケモカインを分泌することによって、Tリンパ球と接触する機会を増大させている。炎症誘発性のサイトカインは、樹状細胞を直接活性化することによっても作用する。
【０００３】
これらの成熟樹状細胞は、Tリンパ球に対して抗原を提示し、特定のT応答を極めて効率的な様式で開始させ、その際には、樹状細胞上に、共刺激分子が大量に発現される。樹状細胞は、成熟とともに、抗原を捕捉して処理する能力を失う。リンパ系器官ののチモール依存性帯域では、移動してきた樹状細胞が強力な免疫刺激特性を獲得することによって循環ナイーブTリンパ球をきわめて効率的に活性化させる。
【０００４】
肺炎杆菌I145の膜画分は、細菌に起因する呼吸器感染症の発症や再発を防止する薬学的組成物に混合され、ヒトでは、20年にわたって使用されてきた。この点からすると、この製品は相当の非毒性期間を有するといえる。
【０００５】
仏国特許出願第9903154号には、FMKpまたはその主成分の一つであるP40と称される外膜タンパク質OmpAが、抗腫瘍免疫応答に関与するサイトカインであるTNF-αならびにIL-12の産生、特に単球による産生を誘導しうることが開示されている。
【０００６】
仏国特許出願第9903153号には、上記の膜画分FMKpと抗原を組み合わせたものが、サイトカイン応答をTh1/Th2プロファイルに再配向する能力を有するばかりでなく、この再配向が、上記膜画分の投与態様にかかわりなく生じることが開示されている。
【発明の開示】
【０００７】
本発明者らは、今回、グラム陰性細菌、好ましくは肺炎杆菌の膜画分が、ヒト樹状細胞の成熟を誘導することによって、特定のTリンパ球応答の発現を促すことを実証した。
【０００８】
したがって、本発明は、樹状細胞の成熟を誘導するための、グラム陰性細菌、好ましくは肺炎杆菌の少なくとも1種の膜画分の使用に関するものである。
【０００９】
本発明はまた、樹状細胞の成熟を誘導する薬剤を製造するための、グラム陰性細菌、好ましくは肺炎杆菌の少なくとも1種の膜画分の使用に関するものである。
【００１０】
細菌の膜画分という用語は、本発明では、上記細菌の培養物から得た任意の精製または部分精製膜画分または抽出物のことを意味するものであり、少なくとも、培養後に得られた細菌を溶菌する工程と、溶菌工程後に得られた全溶解物から上記細菌の膜含有画分を分離する工程、特に、遠心分離または濾過によって分離する工程の少なくとも一工程を含む製造方法によって製造される。したがって、本発明に即して言えば、膜画分は、少なくとも膜プロテオグリカンを含有する。また、本発明に即して言えば、膜画分は、少なくとも、当業者には公知のLPS（リポポリサッカライド）と組合わされた膜画分を含む画分であるとしても定義できる。
【００１１】
本発明に係る膜画分のプロテオグリカン価は、ガラクトース含量とタンパク質含量の和として表される。このプロテオグリカン価は、好ましくは、下記範囲：
ガラクトースについては、1.2 g/l〜3.4 g/l
タンパク質については、7.5 g/l〜14.9 g/l
とし、より好ましくは、下記範囲：
ガラクトースについては、1.8 g/l〜2.6 g/l
タンパク質については、9.3 g/l〜11.7 g/l
とする。
【００１２】
本発明の膜画分は、以下で説明する方法、または、他の任意の同等な方法、特に、仏国特許出願第9903154号および同第9903153号に記載された方法によって得ることができる。
【００１３】
これらの膜画分は、培地1ミリリットルあたり、0.1 μg〜100 μg、好ましくは1 μg〜50 μg、さらに好ましくは1 μg〜20 μgの濃度で使用することができる。
【００１４】
本発明の好ましい態様では、グラム陰性細菌は、クレブシエラ（Klebsiella）属の細菌、好ましくは、クレブシエラ・ニューモニエー（Klebsiella pneumoniae、肺炎杆菌）から選択される。
【００１５】
本発明の好ましい態様では、本発明の膜画分を使用して、インビトロでの樹状細胞の成熟を促すことができ、この成熟細胞は、その後、インビボに戻すことができる。
【００１６】
本発明のさらに好ましい態様では、この薬剤を使用して、まず、この薬剤を生体物質に接触させた後に、インビトロでの樹状細胞の生成および成熟を促すことができる。したがって、本発明は、薬剤を製造するための、本発明の膜画分、そしてさらに少なくとも1種の生体物質の使用に関するものである。この後者の生体物質は、たとえば、この生体物質に対する免疫応答を増大することができる。
【００１７】
この生体物質は、核酸、タンパク質、脂質、リポペプチド、またはポリサッカライドから選択することができる。
【００１８】
この生体物質は、さらに具体的には、ワクチン用抗原、ならびに／または細菌、ウイルス、酵母、寄生生物および真菌の抗原から選択することができる。
【００１９】
より好ましくは、この生体物質は、腫瘍抗原である。本発明では、腫瘍抗原は、腫瘍タンパク質もしくはペプチド、特にエピトープ、特に、CTLエピトープ（クラスI分子と相互作用し、CD8+ Tリンパ球に提示されるペプチド配列）、または、そのようなタンパク質、ペプチド、もしくはエピトープをコードする核酸であるとして定義される。腫瘍抗原として、以下のMAGE-2、MAGE-3、MUC-1、MUC-2、HER-2、GD2、癌胎児性抗原（CEA）、TAG-72、卵巣関連抗原OV-TL3 MOV18、TUAN、α−フェトタンパク質（AFP）、OFP、CA-125、CA-50、CA-19-9、腎腫瘍関連抗原G250、EGP-40（または、EpCAM）、S100（悪性黒色腫関連抗原）、p53、前立腺腫瘍関連抗原（たとえば、PSAならびにPSMA）、p21rasが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
生体物質は、自己および／または非自己腫瘍細胞の溶解物から選択することができる。本発明では、自己腫瘍細胞という用語は、本発明の組成物を受けとる被験体に由来する腫瘍細胞を意味するものである。非自己腫瘍細胞という用語は、本発明の組成物を投与しようとしている個体とは異なる個体由来の腫瘍細胞を意味するものである。非自己細胞を使用すれば、腫瘍細胞を採取できない癌患者であっても薬学的組成物を得て治療を行うことができる。また、非自己細胞を使用すれば、数多くの種類の癌に見いだされるような抗原を含み、したがって、患者の大半に使用することのできるような本発明の組成物の標準品を得ることも可能となる。
【００２１】
腫瘍細胞は、癌組織の除去、たとえば、バイオプシーまたは外科切除の後に得ることができる。得られた細胞は、そのまま溶解して使用しても、または培養してから溶解して使用してもよい。細胞溶解物は、本発明に即して言えば、細胞内および／または膜抗原の混合物、好ましくは、細胞内および膜抗原の混合物であるとして定義することができる。本発明の上記の自己および／または非自己腫瘍細胞の溶解物は、腫瘍細胞を、機械的、化学的、または酵素を用いて溶解することによって得ることができる。細胞を機械的に溶解する際には、具体的には、当業者にとっては公知の方法、具体的には、音波処理、超音波処理、または凍結／解凍がある。凍結／解凍を行うことが特に好ましく、凍結／解凍を数回繰り返すことが最も好ましい。細胞は、化学物質もしくは酵素、たとえば、ジギトニン、トリトンX-100、またはノニデット（Nonidet）P40を含有する細胞溶解用緩衝液を使用することによって溶解することもできる。溶解物を得るために、腫瘍細胞の細胞膜を破壊することのできる任意の方法を用いることができる。
【００２２】
樹状細胞は、これらの細胞溶解物または抗原を使用して、腫瘍抗原を発現するように改変される。したがって、上記薬剤は、樹状細胞と同時に投与することも可能であるし、または好ましくは、患者への再投与に先だって樹状細胞の成熟を促す目的で、インビトロで使用することもできる。
【００２３】
グラム陰性細菌の膜画分を抗原と同時に投与すると、樹状細胞による抗原の提示を増大させることができ、それによって治療の効率を上げることが可能となる。
【００２４】
抗原を提示し、免疫システムを刺激する効率が高いので、樹状細胞は、グラム陰性細菌の膜画分の存在下で、抗癌CTL応答（Nestle, F.O.ら、1998、Nat. Med., 4, 328-332）を誘導する際に使用することができる。すなわち、この「エクスビボ」と称される方法では、樹状細胞を、グラム陰性細菌の膜画分の存在下で、エクスビボにて目的の抗原（ペプチドまたは細胞溶解物）と接触させ、その後樹状細胞を患者に再移植する。樹状細胞を患者に再移植する前に、樹状細胞を洗浄して、樹状細胞を含む培地からグラム陰性細菌の膜画分を除去しておく工程を実施することもできる。
【００２５】
本発明の別の方法では、目的の抗原をコードする遺伝子、具体的には、上述したような細菌、ウイルス、酵母、寄生生物、真菌の抗原、もしくは腫瘍抗原、および／または後述するようなサイトカインもしくは成長因子をコードする遺伝子で、樹状細胞をエクスビボにてトランスフェクトし、このトランスフェクションの前および／または最中および／または後に、樹状細胞を、グラム陰性細菌の膜画分の存在下に置き、その後、トランスフェクトされた樹状細胞を再投与する（Gilboa E.ら, 1998, Cancer Immunol. Immunother., 46, 82-87）。樹状細胞を患者に再移植する前に、樹状細胞を洗浄して、樹状細胞を含む培地からグラム陰性細菌の膜画分を除去しておく工程を実施することもできる。こうした方法は、マウスおよびヒトで成功裡に使用されている（Hsu F.J.ら, 1996, Nat. Med., 2, 52-58）。
【００２６】
本発明の薬剤は、さらに、サイトカインまたは成長因子、具体的には、免疫応答の増強を可能とするα-インターフェロン、γ-インターフェロン、TNFα、GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-4、IL-6およびIL-18、HSP（熱ショックタンパク質）、例えばhsp70、hsp90、hsp96；ならびに／またはサイトカインまたは成長因子を放出するように遺伝的に改変された繊維芽細胞を含んでいてもよい。具体的には、イミューン・レスポンス・コーポレーション（Immune Response Corporation）から販売されているGM-CSF発現性線維芽細胞を挙げることができる。Tリンパ球の増殖を増大させる薬剤を製造するために、グラム陰性細菌の膜画分を、少なくとも1種の生体物質とともに、TNFαと組み合わせて使用することができる。
【００２７】
本発明の薬剤は、さらに、免疫応答を増強することのできるアジュバントを含んでいてもよく、アジュバントは、特に、以下の群から選択してもよい：Quil-A、ISCOM、CpG、Leif、CT（コレラ毒素）、またはLT（LTは易熱性エンテロトキシン）、ならびに解毒したCTもしくはLT、または細菌膜タンパク質、たとえば、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）のOMPC （Vellaら, Infect. Immun. 60, 1992, 4977-4983)、大腸菌（Escherichia coli）のTraT （Croftら, J. Immunol.,146, 1991, 793-798)、髄膜炎菌のProb （Fuscoら, J. Infect. Dis. 175, 1997, 364-372）、ならびに、好ましくはクレブシエラ属の細菌のOmPA、およびペプチドのサブユニット抗原に対してアジュバント活性を有するP40と称される主要な外膜タンパク質(国際公開公報第95/27787号および国際公開公報第96/14415号; Haeuwら, Eur. J. Biochem. 255, 1998, 446-454; Plotnicky-Gilquinら, J. Virol. 73. 1999, 5693-5645)。
【００２８】
本発明の薬剤は、薬学的に許容される溶媒を含有していてもよい。本発明に即して言えば、薬学的に許容される溶媒とは、本発明の化合物を投与する際に本発明の化合物を溶かす溶媒、好ましくは、ヒトに注射する際に用いる溶媒のことである。これは、水、水溶性塩類溶液、またはデキストロースおよび／もしくはグリセロールを主成分とする水性溶液から構成することができる。
【００２９】
本発明の薬剤は、また、薬剤の安定性および／または免疫原性を改善しうるような剤形として、すなわち、リポソーム、ビロソーム、ナノスフィア、マイクロスフィア、またはマイクロカプセルの剤形として担持させることもできる。薬剤、またはグラム陰性細菌の膜画分（生体物質）の組み合わせは、投与が容易な剤形、たとえば、軟膏、ローション、液剤の剤形、または粘着性組成物、すなわちプラスター、「パッチ」の剤形で提供することもできる。
【００３０】
本発明の薬剤は、特に、下記の治療に使用することができる。
- 微生物による感染症、特に、無効な特異的免疫応答が発現される慢性型感染症の治療（ウイルス、たとえば、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、肝炎ウイルス、特にA、B、CおよびD型肝炎ウイルス、ならびにパラインフルエンザウイルス、細菌、寄生生物、酵母）。
- 癌、特にHIVを保有する被験体、および／または骨髄腫、リンパ腫、白血病、黒色種、腎臓の癌腫、脳の癌腫、前立腺の癌腫、直腸の癌腫、脾臓の癌腫、卵巣の癌腫、肺の癌腫もしくは緩解期の癌腫などに罹患した被験者の治療。
【００３１】
上述したように、本発明は、特に、抗癌および抗感染症ワクチンを使用した細胞免疫治療に関するものであり、具体的には、インビトロで自己樹状細胞を生成し、その内部に腫瘍抗原を導入し、この樹状細胞を、必要に応じて洗浄工程を実施した後に再投与する治療に関するものである。樹状細胞を、インビトロで、グラム陰性細菌の膜画分と接触させると、樹状細胞の成熟を促進することによってワクチンの効果を高めることが可能となる。
【００３２】
したがって、本発明は、具体的には、上述の生体物質に対する免疫応答を増強する薬剤を製造するための、グラム陰性細菌の膜画分の使用、さらに具体的には、肺炎杆菌の膜画分に関する。この薬剤は、ウイルス（たとえば、HIV、肝炎ウイルス、およびパラインフルエンザウイルス）、細菌もしくは真菌に起因する感染性疾患、または酵母もしくは寄生生物によって生じる感染性疾患の治療もしくは予防のためのワクチンとすることができる。
【００３３】
本発明は、癌の治療用薬剤または予防用薬剤を製造するための、具体的には、骨髄腫、リンパ腫、白血病、腎臓の癌腫、脳の癌腫、前立腺の癌腫、直腸の癌腫、脾臓の癌腫、卵巣の癌腫もしくは肺の癌腫から選択される癌の治療用薬剤または予防用薬剤の製造、ならびに角質腫および癌腫から選択される癌の治療用薬剤または予防用薬剤の製造のために、グラム陰性細菌の膜画分を、少なくとも一種の生体物質とともに使用することにも関する。
【００３４】
黒色腫および角質腫のような皮膚癌では、癌細胞は、表皮に位置するランゲルハンス細胞と直接接触しており、本発明の使用を皮膚への適用によって実施すると、ランゲルハンス細胞に対して直接局所的に作用させることが可能となる。このように、本発明の薬剤は、皮膚に適用することができ、具体的には、皮膚、皮下、経皮もしくは内皮的経路を通じて、または粘膜を通じて適用することができ、その場合には、樹状細胞の成熟を介して全身的に、ランゲルハンス細胞の成熟を介して局所的に作用することになる。
【００３５】
上述したように、こうした癌の治療は、自己樹状細胞、特に腫瘍抗原を発現するように改変された自己樹状細胞を注入することによっても実施することができる。樹状細胞の成熟は、グラム陰性細菌の膜画分によって誘導されることになる。
【００３６】
本発明は、樹状細胞を成熟させるための装置、たとえば、キットにも関するものであり、この装置は、少なくともグラム陰性細菌の膜画分を含むものである。
【００３７】
このキットは、樹状細胞をインビトロで成熟させるのに適したものとすることができ、たとえば、研究施設で使用することができる。このキットは、また、未成熟樹状細胞のグラム陰性細菌の膜画分、および／または未成熟樹状細胞を単離するのに必要な手段、たとえば単核血球を精製するための手段を含むことができる。したがって、このキットは、たとえば、各種の培地、洗浄溶液、培養プレート、試薬、対照（たとえば抗体）、および樹状細胞を成熟させるための本発明の方法を実施するための説明書を含むことができる。
【００３８】
本発明のキットは、上述の治療法を実施するために適したものとすることもできる。このキットは、また、未成熟樹状細胞のグラム陰性細菌の膜画分、および／または未成熟樹状細胞を単離するのに必要な手段、たとえば単核血球を精製するための手段を含むことができる。したがって、このキットは、たとえば、各種の培地、洗浄溶液、培養プレート、試薬、対照（たとえば抗体）、および上述の治療法を実施するための説明書を含むことができる。このキットは、場合によっては、非自己抗原、または、自己細胞溶解物を得る手段を含むものであってもよい。
【００３９】
図面ならびに以下の実施例の説明文は、本発明を例示するためのものであって、本発明はこれらの図面や実施例によって限定されるものではない。これらの実施例は、グラム陰性細菌の膜画分が樹状細胞に及ぼす作用の例を示すものである。すなわち、グラム陰性細菌の膜画分は、ヒト未成熟樹状細胞の成熟を誘導し、樹状細胞に、有力な抗原刺激性ならびに抗原提示特性を付与するものである。
【００４０】
実施例では、添付の図1を参照することになるが、この図1には以下の事実が例示されている。
【００４１】
i）肺炎杆菌の膜画分は、CD83分子の発現を誘導し、CD86の発現とIL-8の産生を増大させる
表面分子についてのFACS分析の結果を、MFI（平均蛍光強度）として示す。この結果は、実験を3回行ったうちの代表的な1回についての結果である。CD83とCD86については、結果を、陽性細胞の比率（％）としても示している。IL-8についての測定結果は、ng/mlとして示し、この値は、4回の実験での平均±標準偏差である。
【００４２】
ii）肺炎杆菌の膜画分は、Tリンパ球の共刺激特性を増大させる（第4列のMLRを参照のこと）
未成熟な樹状細胞を、肺炎杆菌の膜画分またはLPSを用いて、24時間処理した。または上記処理を行わなかった。次に、これらの細胞を照射し、2人の別々の提供者から得た自己Tリンパ球とともに培養した。5日後に、Tリンパ球の増殖を測定した。結果を、1分あたりのカウント数（cps）で示す。この値は、5つの値の平均であり、実験を3回行ったうちの代表的な1回についての結果を示す。
【００４３】
実施例
実施例1：肺炎杆菌の膜画分の製造
+4℃で最低48時間解凍した後、1 kgの乾燥肺炎杆菌を、乾燥細胞が5%となるように懸濁した。DNaseを、5 mg/lとなるように加えた。その後、混合物を、マントンゴーリン（Manton Gaulin）を使用して30分間繰り返しすりつぶし、シャープルス（SHARPLES）で50 l/hにて清澄化し、酢酸でpHを4.2 + 0.1として30分間沈殿させた。ペレットを除去し（SHARPLES、25 l/h）、上清を中和し、逆浸透水で初期量の2倍に希釈した。PUFで、100 Ωcm〜800 Ωcmにて、一定流量にて透析し、得られた膜懸濁液（MS）を、乾燥細胞が11 l/kgとなるまで濃縮した。次に、MSを、+121℃で35分間オートクレーブにかけたところ、+4℃で6週間の保存が可能であった。
【００４４】
得られた膜画分の性質
定義としては、プロテオグリカン価は、ガラクトースの含量とタンパク質の含量の和と等しい。
- ガラクトース：平均で2.2 g/l、
- タンパク質：平均で10.5 g/l
【００４５】
実施例2：肺炎杆菌の膜画分はCD83の発現を増加させる
A．方法
A．1．未成熟ヒト樹状細胞のインビトロ生成
末梢血より単離した単球から、ヒト樹状細胞を生成した。血液を、抗凝固剤（たとえばヘパリンリチウム）の存在下で、白血球除去法によって採取した。単核細胞（MNC）を、健康な被験体より単離し、フィコール−ハイパック勾配（密度1.077）、（アマシャム・ファルマシア・バイオテック（Amersham Pharmacia Biotech）、スウェーデン、ウプサラ（Uppsala））で遠心することによって単離した。血球を、室温にて、1500 rpmにて30分間遠心した。フィコールと血漿の界面に局在していたMNCを回収し、RPMI 1640培地（ライフテクノロジース（Life technologies）、フランス、セルジー・ポントワーズ（Cergy Pontoise））の存在下で2回洗浄した。磁気細胞セパレータ（MACS (商標)、ミルテニイ・バイオテックス（Miltenyi Biotex）、ドイツ、ベルギッシュ・グラッドバッハ（Bergisch Gladbach）））を製造業者の指示にしたがって使用することによって、単球のポジティブ選択を行った。MNCを、抗ヒトCD14単核抗体を付着させた磁気ビーズとともに、4℃にて20分間培養した。洗浄後、細胞懸濁液とビーズをカラムに充填し、磁界を印加した。3回洗浄した後、カラムへの磁界の印加を停止し、単球を重力によって採取した。単球の純度を、細胞蛍光測定法（FACScan細胞蛍光測定法 （ベクトン・ディッキンソン（Becton Dickinson）、 ベルギー、エレンボジェム（Erembodegem））で、細胞の粒度（granulosity）をパラメータとすることによって評価した。純度は98％を超えた。次に、単球を、5 x 106個／mlの濃度にて、下記培地（以下では、完全培地と称する）中で培養した。すなわち、RPMI 1640培地に、10％ウシ胎児血清（56℃で30分間加熱）、2 mMのL-グルタミン、50 U/mlのペニシリン、50 μg/mlのストレプトマイシン（ライフテクノロジース）を加え、この培地を、6ウェルの培養プレート（ヌンク（Nunc）、デンマーク、ロスキレ（Roskilde））に、1ウェルあたり5 ml加えて培養を行った。細胞を、20 ng/mlの組換えヒトIL-4と20 ng/mlの組換えヒトGM-CSF（アール・アンド・ディーシステムス（R&D Systems）、英国、アビングドン（Abingdon））で活性化した。5日〜7日間の培養（37℃、5％CO2、高湿度雰囲気中）の後、細胞の表現型を、細胞蛍光測定法で判定した。すなわち、細胞懸濁液の一部分を採取した。この細胞を、FACS緩衝液（1%のウシ血清アルブミンと0.01%のアジ化ナトリウムを含有するpH 7.4の10 mMリン酸緩衝液）で洗浄し、円錐形状の底部を有する96ウェルの培養プレート（ヌンク）に、FACS緩衝液の容積50 mlあたり細胞2 x 105個の割合で分注した。各ウェルに、蛍光標識抗ヒトCD1a抗体（ベクトン・ディッキンソン）または非標識抗CD83抗体のいずれかを、蛍光標識抗マウス免疫グロブリン抗体（ベクトン・ディッキンソン）とともに加えた。4℃で20分間インキュベートした後、細胞を200 μlのFACS緩衝液で3回洗浄し、その後、200 μlの同じ緩衝液に再度懸濁した。CD1aの発現量対CD83の発現量は、FACSで分析し、評価した。CD1a分子を発現し（平均蛍光強度（MFI）＞100）、CD83分子は発現しないことを特徴とする未成熟な樹状細胞のみを使用した。
【００４６】
A．2．肺炎杆菌の膜画分によってヒト樹状細胞に誘導された示差マーカーの発現の、細胞蛍光測定法による分析
未成熟樹状細胞を回収し、洗浄し、平底の96ウェルの培養プレート（コスター（Coster）、米国、ケンブリッジ（Cambridge））を使用して、完全培地中にて、容積200 μlあたり105個の濃度で再度培養した。細胞を、最終培地1 mlあたり10 μg、20 μg、および50 μgの濃度の肺炎杆菌の膜画分で活性化した。刺激の24時間後に、CD83分子とCD86分子の発現量を、蛍光標識した特異的モノクローナル抗体（ベクトン・ディッキンソン）を使用し、細胞蛍光測定法で評価した。対照として用いたアイソタイプ抗体は、ベクトン・ディッキンソンより入手した。細胞を、FACS緩衝液で洗浄し、円錐形状の底部を有する96ウェルの培養プレートに、FACS緩衝液の容積50 μlあたり細胞2 x 105個の割合で分注した。抗体を、各ウェルに加えた。4℃で20分間インキュベートした後、細胞を200 μlのFACS緩衝液で3回洗浄し、その後、200 μlの同じ緩衝液に再度懸濁した。表面マーカーの発現についての分析を、FACSで評価した。
【００４７】
B．結果
図1に示した結果からもわかるように、肺炎杆菌の膜画分は、未成熟樹状細胞によるTリンパ球の活性化に関連した表面分子の発現を増大させる。
-  これまでにも示されていたとおり、未成熟樹状細胞の集団の大半は、CD83を発現しない。肺炎杆菌の膜画分は、共刺激分子の発現を誘導する。
-  肺炎杆菌の膜画分は、Tリンパ球の活性化に関連した他の分子、たとえば、CD86の発現も増大させる
【００４８】
実施例3：肺炎杆菌の膜画分は、樹状細胞によるIL-8の発現を誘導する
A．方法
未成熟ヒト樹状細胞を、実施例1に記載したようにして生成した。5日〜7日間の培養の後、細胞を、平底の96ウェルの培養プレートで、完全培地中にて、容積200 mlあたり105個の濃度で再度培養した。細胞を、培地1 mlあたり10 μgおよび50 μgの濃度の肺炎杆菌の膜画分で活性化し、24時間の培養の後、培養上清を、10,000 rpmで15分間4℃にて遠心し、市販のELISA型のアッセイキット（アール・アンド・ディーシステムス）を製造業者の指示どおりに使用して、IL-8を検定した。
【００４９】
B．結果
図1に示した結果からもわかるように、肺炎杆菌の膜画分は、IL-8の発現を誘導する。したがって、グラム陰性細菌の膜画分が、未成熟樹状細胞を活性化すると結論づけることができる。
【００５０】
実施例4：肺炎杆菌の膜画分は、樹状細胞の共刺激特性を増大させる
A．方法
A．1．混合リンパ球反応
未成熟ヒト樹状細胞を、実施例1に記載したようにして生成した。5日〜7日間の培養の後、細胞を、RPMI 1640培地で洗浄し、6ウェルの培養プレートで、完全培地中にて、細胞2 x 105個／ウェルの濃度で再度培養した（5 ml／ウェル）。細胞を、刺激しないか、または、LPS 1 mlあたり10 μg、50 μg、または10 ngの濃度の肺炎杆菌の膜画分の存在下で刺激した。24時間の培養の後、細胞を回収し、RPMI 1640培地で3回洗浄した。その後、細胞を、3000 radで照射した。末梢血から新たに単離したヒトリンパ球を、ヒツジ赤血球を用いてロゼット法で調製した。すなわち、単核細胞を、実施例1に記載したようにして、フィコール−ハイパック勾配で単離し、単核細胞を、完全培地に、200 x 106個/mlの濃度で再度懸濁し、50％ヒツジ赤血球（バイオメリュー（BioMerieux）、フランス、レトワール（l'Etoile））を含有する懸濁液1 mlと混合した。細胞を、4℃で一晩インキュベートした。穏やかに再懸濁した後、T細胞を、フィコール−ハイパック勾配上で遠心（1500 rpm、30分間、室温）することによって単離した。遠心管底部のT細胞／赤血球複合体を回収した。赤血球を、低浸透圧に二度つづけて暴露することによって溶血させた。得られた細胞の純度を、蛍光標識抗ヒトCD3抗体（ベクトン・ディッキンソン）を用いて、細胞蛍光測定法で評価した。純度は、95％を超えた。洗浄後、細胞を、2.5 x 105個／mlの濃度で完全培地に再度懸濁した。
【００５１】
活性化および照射を行った樹状細胞を、96ウェルの培養プレートで、細胞104個／200 μlの濃度にて、5 x 104個の自己リンパ球の存在下または非存在下で培養した。5日間培養した後、T細胞の増殖を、トリチウム化チミジン（3H-Thy）（アマシャム（Amersham）、英国、（Amersham）アマシャム）の取り込みを測定することによって評価した。すなわち、0.25 mCiの3H-Thyを、各培養ウェルに加えた。3H-Thyの取り込みを、液体シンチレーションカウンター（パッカード・インストラメンツ（Packard Instruments）、オーストラリア）で測定した。結果を、1分あたりのカウント数（cps）で示す。混合リンパ球反応を、2人の別々の健康な提供者から得たT細胞を用いて行った。
【００５２】
B．結果
図1に示した結果からもわかるように、肺炎杆菌の膜画分によって刺激された樹状細胞は、未刺激樹状細胞と比較して、Tリンパ球に対して共刺激のシグナルを提供する能力が高く、Tリンパ球の増殖をより強く誘導する。
【００５３】
実施例5：KpOmpAは、LPSと相乗的に作用して、樹状細胞の成熟を誘導する
FMKp（膜画分）に含まれる膜タンパク質としては、KpOmpAがあり、このKpOmpAが、ヒト樹状細胞の成熟を誘導する能力を有することは、すでに示されている（Jeanninら, 2000, Nat Immunol, 1(6), 502-509）。
【００５４】
しかし、タンパク質のレベルが1.2 g/l〜3.4 g/l、ガラクトースのレベルが7.5 g/l〜14.9 g/lのFMKpは、表1にも示されているように、タンパク質単独の場合より、樹状細胞の成熟を誘導する効果がはるかに高い。表1には、ヒト樹状細胞の成熟が、IL-12の産生によって客観的に示されている。
【００５５】
このように、FMKpは、タンパク質が0.1 μg/mlでは、134 pg/mlのIL-12を誘導するが、これらの全タンパク質の中で、KpOmpAは、少ない割合（約10％）を占めるのみである。
【００５６】
一方、たとえKpOmpAを高濃度（20 μg/ml）としても、KpOmpA単独では、30 pg/mlのIL-12の産生を誘導するのみである（値は、上掲のJeanninらから抽出）。
【００５７】
上述のようにして調製した10 x 106/mlの樹状細胞を、FMKpまたはKpOmpAの量を増大させながら刺激した。24時間後に、樹状細胞の成熟の指標となるIL-12を、上清中で、ELISA（アール・アンド・ディーシステムス）によって測定した。
【００５８】
（表１）KpOmpAまたはFMKpの存在下でのヒト樹状細胞の成熟
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【００５９】
特定の仮説に拘束されるものではないが、出願人は、FMKpがヒト樹状細胞の成熟を誘導する能力については、FMKpに含まれるKpOmpAとLPSの相乗効果なのではないかと考えている。
【００６０】
表2に示した結果は、この仮説を裏付けるものである。上述のようにして調製した10 x 106/mlの樹状細胞を、KpOmpA（10 μg/ml）の存在下または非存在下で、LPSの量を徐々に増大させながら刺激した。24時間後に、IL-8を、上清中で、ELISA（アール・アンド・ディーシステムス）によって測定した。下記の結果は、ng/mlで示してあり、実験を3回行ったうちの代表的な1回についての結果を示すものである。
【００６１】
（表２）KpOmpAの存在下または非存在下でLPSを用いたヒト樹状細胞の成熟
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【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図1には以下の事実が例示される。i）肺炎杆菌の膜画分は、CD83分子の発現を誘導し、CD86の発現とIL-8の産生を増大させる：表面分子についてのFACS分析の結果を、MFI（平均蛍光強度）として示す。この結果は、実験を3回行ったうちの代表的な1回についての結果である。CD83とCD86については、結果を、陽性細胞の比率（％）としても示している。IL-8についての測定結果は、ng/mlとして示し、この値は、4回の実験での平均±標準偏差である。ii）肺炎杆菌の膜画分は、Tリンパ球の共刺激特性を増大させる（第4列のMLRを参照のこと）：未成熟な樹状細胞を、肺炎杆菌の膜画分またはLPSを用いて、24時間処理した。または上記処理を行わなかった。次に、これらの細胞を照射し、2人の別々の提供者から得た自己Tリンパ球とともに培養した。5日後に、Tリンパ球の増殖を測定した。結果を、1分あたりのカウント数（cps）で示す。この値は、5つの値の平均であり、実験を3回行ったうちの代表的な1回についての結果を示す。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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