(57)【要約】本発明は、所定の化合物をインビボ、エキソビボおよびインビトロにおいて細胞内送達するためのデバイスとして有用な膜透過性ペプチドを目的とするものである。さらに特定すれば、本発明は、所定の化合物を細胞に送達させるためのタンパク質担体として使用できる膜透過性ペプチドの同定、ならびに膜透過性ペプチドに結合した所定の化合物を細胞に送達させる方法に関する。
2004512275.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の化合物に結合した膜透過性ペプチドからなる所定の化合物を細胞内に送達するための融合タンパク質。
【請求項２】
膜透過性ペプチドは、核局在化配列ペプチドに由来するか、哺乳動物もしくは酵母タンパク質の核局在化配列と重複するか、または配列−（Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ）ｎ−（式中、ｎは１〜７の整数であり、それぞれの場合Ｘは独立にアルギニン、ヒスチジンもしくはリジンからなる群より選択される）からなる請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項３】
核局在化配列は核タンパク質または転写因子に由来する請求項２記載の融合タンパク質。
【請求項４】
転写因子はＰｅｒｉｏｄタンパク質である請求項３記載の融合タンパク質。
【請求項５】
Ｐｅｒｉｏｄタンパク質はヒトＰｅｒｉｏｄタンパク質である請求項４記載の融合タンパク質。
【請求項６】
哺乳動物Ｐｅｒｉｏｄタンパク質はヒトＰｅｒｉｏｄ１タンパク質である請求項５記載の融合タンパク質。
【請求項７】
膜透過性ペプチドは配列−（Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ）ｎ−（式中、ｎは１〜７の整数であり、それぞれの場合Ｘは独立にアルギニン、ヒスチジンもしくはリジンからなる群より選択される）からなる、請求項２記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ｎは１〜４の整数である請求項７記載の融合タンパク質。
【請求項９】
ｎは１〜２の整数である請求項８記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
所定の化合物はペプチド、タンパク質、化学物質、核酸またはそれらの任意の修飾された形態である請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１記載の融合タンパク質を細胞と接触させることからなる、所定の化合物を細胞内に送達する方法。
【請求項１２】
請求項１記載の融合タンパク質を培養細胞と接触させることからなる、所定の化合物をインビトロで細胞内に送達する方法。
【請求項１３】
請求項１記載の融合タンパク質を細胞と接触させ、この細胞を患者生体内の細胞に導入することからなる、所定の化合物をエキソビボで細胞内に送達する方法。
【請求項１４】
請求項１記載の融合タンパク質を患者に投与することからなる、所定の化合物をインビボで細胞内に送達する方法。
【請求項１５】
配列−（Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ）ｎ−（式中、ｎは１〜７の整数であり、Ｘはそれぞれ独立にアルギニン、ヒスチジンまたはリジンからなる群より選択される）と検出可能なタンパク質からなる複合ペプチドを作成し、その複合ペプチドを細胞に外因的に加え、その複合ペプチドが細胞の細胞質および／または核に局在するか否かを決定することからなる、配列−（Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ）ｎ−（式中、ｎは１〜７の整数であり、Ｘはそれぞれ独立にアルギニン、ヒスチジンまたはリジンからなる群より選択される）からなる膜透過性ペプチドを同定する方法。
【請求項１６】
核局在化配列の部分またはすべてと検出可能なタンパク質からなる複合ペプチドを作成し、その複合ペプチドを細胞に外因的に加え、その複合ペプチドが細胞の細胞質および／または核に局在するか否かを決定することからなる、哺乳動物または酵母タンパク質の核局在化配列に由来またはそれと重複する配列からなる膜透過性ペプチドを同定する方法。
【請求項１７】
請求項１記載の融合タンパク質を細胞に投与することからなり、ここで、膜透過性ペプチドは配列−（Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ）ｎ−（式中、ｎは１〜７の整数であり、Ｘはそれぞれ独立にアルギニン、ヒスチジンまたはリジンからなる群より選択される）からなる、所定の化合物を細胞内に送達する方法。
【請求項１８】
融合タンパク質が配列−（Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ）ｎ−（式中、ｎは１〜７の整数であり、Ｘはそれぞれ独立にアルギニン、ヒスチジンまたはリジンからなる群より選択される）からなる膜透過性ペプチドと所定の化合物とからなる、所定の化合物を細胞内に送達するための融合タンパク質。
【請求項１９】
所定の化合物は、膜透過性ペプチドに直接化学的にまたはリンカーにより結合させたものである請求項１８記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
リンカーはアミノ酸リンカーまたはポリペプチドリンカーである請求項１９記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
膜透過性タンパク質は組換え技術、化学合成または前駆体タンパク質の分解により産生されたものである請求項１８記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【関連出願】
本出願は２０００年８月２５日の出願に係る米国特許仮出願６０／２２７，６４７号および２００１年２月７日の出願に係る英国特許出願０１０３１１０．３号の利益を享受する。
【０００２】
【技術分野】
本発明は、所定の化合物をインビトロ、エキソビボおよびインビボにおいて細胞に細胞内送達するためのインビトロ、エキソビボおよびインビボ送達デバイスとして有用な膜透過性ペプチド、それらからなる組成物およびそれらを使用する方法に関する。本発明はまたさらに、所定の化合物をインビトロ、エキソビボおよびインビボにおいて細胞に細胞内送達するための送達デバイスとして有用な膜透過性ペプチドの同定に関する。
【０００３】
【背景技術】
生物学的な膜を通過しての小分子、オリゴヌクレオチドおよびタンパク質の送達は、治療および確認規範のチャレンジが直面する大きな課題である。最近ではアンテナペディア、ＴＡＴ−ＨＩＶおよびＶＰ２２に由来する形質導入ペプチドが生物学的膜を透過し、カーゴビークルとして働いて、特異的な細胞下コンパートメント（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）に標的化されることが確立されている。本発明者らは形質導入ペプチドとして機能するヒトＰｅｒｉｏｄ １（ｈＰＥＲ１）概日周期タンパク質の核局在配列（ＮＬＳ）の同定をここに示す。さらに重要な点は、データベースの探索を用いて、本発明者らは他のタンパク質のＮＬＳ内に包埋されている知られていない付加的な形質導入ペプチドを明らかにし、遺伝子によりコードされた形質導入ペプチドの数を３から１４に拡大したことである。本発明者らのデータによれば、形質導入ペプチドはＮＬＳ内に見出され、普遍的かつ多様性であり、ゲノムを通じて広く分布することが示唆されている。ある種の細胞外および細胞内タンパク質は細胞内の特異的なオルガネラに標的化され、膜を内外に横切り、または細胞から分泌されることは十分に確立されている。細胞内タンパク質の標的化を生じる生物学的機構はその特徴を持続し続けるが、局在の一つの機構は所定のタンパク質内に含まれる特異的リーダー配列またはタンパク質内配列によって生じることが十分認識される。細胞内の選ばれたオルガネラ内におけるタンパク質の局在は特異的な標的化配列によって補助される。多数の核局在配列（ＮＬＳ）が、タンパク質の輸送、または他の場合には、細胞質から核膜内部への通過を可能にするものとしてタンパク質内に同定されている。
【０００４】
標的化配列、およびさもなければ他の場合には非標的化配列を含む融合タンパク質は、選択された標的化配列に依存して選択される細胞オルガネラ中に局在する。たとえば、Ｆｅｒｕｌｌｏ ＪＭ ＆ Ｐａｇｅｔ Ｅ：フランス特許２７９６９５には、酵素をサイトゾル以外の細胞内コンパートメントたとえば小胞対向性のシグナル配列に融合したヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）の選択的コンパートメンタリゼーションが開示されている。同様に、ＷＯ ０１４７９５０（Ｗｅｈｒｌｅ−Ｈａｌｌｅｒ， Ｂｅｒｎｈａｒｄ Ｍ： Ｉｍｈｏｆ， Ｂｅａｔ Ａ）には基底外側に対する標的化および細胞表面に繋留された成長因子の細胞表面に対する長期間暴露に関与する新しい決定基が同定されている。シグナルは、アミノ酸配列Ｘ１ｈ２Ｘ３ｈ４Ｌｐ５ｐ６（式中、Ｘ１は極性アミノ酸残基またはアラニンを表し、ｈ２は任意の疎水性アミノ酸残基を表し、Ｘ３は任意のアミノ酸残基を表し、ｈ４はロイシンおよびイソロイシンを除く任意の疎水性アミノ酸残基を表し、Ｌはロイシン残基を表し、ｐ５は任意の極性アミノ酸残基を表し、ｐ６は任意の極性アミノ酸残基を表す）から構成されるモノロイシン依存性基底外側ソーティングシグナルである。Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ａ．Ｅ．ら， Ｐｌａｎｔ Ｊ． （２００１）， ２５ （６）， ６４１−６４９にはキャロット伸長遺伝子からのシグナルペプチドを含む酵素アスペルギルスフィターゼの操作が記載されている。得られた融合タンパク質は、隣接する土壌に細胞外酵素として分泌された場合にのみ有効であって、トランスジェニック系列における根の総フィターゼ活性は２０倍に上昇し、以後のリン栄養は、植物の成長およびリン含量が無機リンを供給された対照植物と同等に改善された。ＷＯ ０１３２８９４（Ｌｏｋ， Ｓ．）には、組換えタンパク質をトランスフェクト細胞の表面に繋留させる目的でのＩＩ型細胞表面タンパク質シグナル繋留ドメイン配列の使用が開示されている。ＩＩ型細胞表面タンパク質の特徴的性質は、それらが単一の疎水性膜貫通ドメインによって細胞膜内に保持され、それらのＣ−末端は細胞の外側に向けられていることである。
【０００５】
さらに最近になって、能動的な輸送機構もしくは「ポア」を必要とせずに細胞膜を通過できる数種のタンパク質が同定された。アンテナペディア、ＴＡＴおよびＶＰ２２に由来する膜透過性ペプチド（ＭＰＰ， タンパク質形質導入ドメイン、「ＰＴＤ」としても知られる）が生物学的膜を貫通し、特異的な細胞下コンパートメントを標的化できることが最近分かった。以前に開示されたこれらのタンパク質には哺乳動物タンパク質に由来するものはない。本発明の目的は哺乳動物または酵母タンパク質の核局在化配列（ＮＬＳ）に由来するポリペプチドまたはＮＬＳと重複するポリペプチドがＭＰＰとして作用可能であることの発見、および大きなタンパク質たとえば生物学的に活性なタンパク質または他の有機化合物と結合していても、細胞膜を透過することができる特異的ポリペプチド配列の同定に向けられている。
【０００６】
核輸送は、遺伝子の発現および細胞分裂、ならびにウイルスの複製、腫瘍形成および腫瘍細胞の増殖を含む多くの生物学的過程に必須である。核輸送の機構は最近その特徴の詳細が明らかにされたばかりで、多数の別個の工程を含むことが示されている。核内への輸送が予定されるタンパク質は、それらのアミノ酸配列内に核局在化配列（「ＮＬＳ」）と呼ばれる短いアミノ酸のストレッチを含有する。これらの配列はそのアミノ酸配列内の任意場所に存在して、通常４〜約８個のアミノ酸からなる。これらの配列は、一般に本質は塩基性（すなわち、陽性に荷電している）が、コンセンサス配列は同定されていない。すなわち、これらの広範囲の配列が特定のタンパク質に特異的であるように思われる。
【０００７】
細胞内においては、これらのＮＬＳは補助的タンパク質によって、またはＮＬＳ含有タンパク質内のコンフォーメーション変化によってマスクされていても、マスクされていなくてもよい。ＮＬＳはタンパク質のコア中に埋没しており、タンパク質の表面に露出されないのでマスクされているであろう。ＮＬＳのマスクをはずすことおよび細胞質タンパク質の核トランスロケーションは、リン酸化、脱リン酸化、蛋白分解消化、阻害サブユニットのサブユニット会合もしくは解離等により誘発される。したがって、ＮＬＳのマスキングおよびアンマスキングは、これらの細胞質タンパク質の核への輸送を調節する機構を提供する。たとえば、転写因子ＮＦ−ＡＴは、細胞内カルシウムの存在下にＮＦ−ＡＴの核へのトランスロケートを可能にする核局在化配列を含有するが、カルシウムの不存在下にはＮＦ−ＡＴポリペプチド内の他のドメインとの分子内会合の形成によりシールドされる。
【０００８】
Ｌｅｅ Ｈ．Ｃ． ＆ Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ Ｈ．Ｄ．（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （２００１）， ９８ （６）， ３４７１−３４７６）は分泌前タンパク質たとえばマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）および、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）によるシャペロン分子ＳｅｃＢによって大腸菌内膜に標的化される、膜内在性タンパク質の標的化とは異なる外膜タンパク質Ａ（ＯｍｐＡ）の関与する機構を検討した。その著者らはＭＢＰまたはＯｍｐＡシグナルペプチドをＡｃｒＢの最初の膜貫通セグメントで置換すると、輸送に対するＳｅｃＢへの依存性は消失し、両タンパク質はＳＲＰ標的化経路に経路変更されることを見出した。
【０００９】
一部のタンパク質は細胞質局在化配列（ＣＬＳ）または核エキスポート配列を含有し、これがタンパク質の細胞質中における優先的な残留を保証する。たとえば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＭＨら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （２００１）， ２７６ （２８）， ２６３２４−２６３３１は、ユビキチン−タンパク質リガーゼ （Ｅ３）， ｈＲＰＦ１／Ｎｅｄｄ４， すなわち基質認識および基質特異性に関与するユビキタン−プロテアーゼ経路の成分は核に進入できるが、ｈＲＰＦ１／Ｎｅｄｄ４における機能性Ｒｅｖ−様核エキスポート配列の存在下では優先的な細胞質局在化を確実にすることを示している。多くの膜タンパク質の細胞質ドメインは形質膜からのそれらのエンドサイトーシスを仲介するソーティングシグナルを含有する。
【００１０】
Ｈｅｉｎｅｍａｎ Ｔ．Ｃ． ＆ Ｈａｌｌ ＳＶ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （２００１）， ２８５ （１）， ４２−４９）はＶＺＶ ｇＢの細胞質ドメイン内の３種のコンセンサス内在化モチーフを検討し、ＶＺＶ ｇＢの内在化およびそれに続くゴルジへの局在はその細胞質ドメイン内の２つのチロシンベース配列モチーフにより仲介されることを決定した。哺乳動物細胞および酵母細胞においては、膜貫通タンパク質の細胞質テールにおけるアミノ酸モチーフが、小胞体（ＥＲ）からの迅速なエキスポートによる局在を仲介することによって初期分泌経路におけるタンパク質の標的化に顕著な役割を果たしている（Ｈｏｐｐｅ ＨＣ ＆ Ｊｏｉｎｅｒ ＫＡ， Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． （２０００）， ２ （６）， ５６９−５７８）。
【００１１】
哺乳動物のエンドペプチダーゼのフューリンは定常状態においてはトランス−ゴルジネットワーク（ＴＧＮ）に著明に局在する。このコンパートメントに対するフューリンの局在はタンパク質がＴＧＮと形質膜の間で環形成を受ける動的過程の結果であると思われる。ＴＧＮの局在と形質膜からの内在化の両者はフューリンの形質膜ドメイン内に含まれる標的化情報によって仲介される。Ｖｏｏｒｈｅｅｓ Ｐら， ＥＭＢＯ Ｊ． （１９５５）， １４ （２０）， ４９６１−７５には、フユーリンの定常状態における局在および交換に寄与する細胞質決定基に少なくとも２種があることが報告されている。第一の決定基は主として内在化シグナルとして機能する標準的なチロシンベースのモチーフ、ＹＫＧＬ（残基７５８−７６１）に相当する。第二の決定基は、酸性残基（ＥおよびＤ）の大きなクラスターを含み、チロシンベースまたはジロイシンベースのモチーフを欠く強力な疎水性配列（残基７６６−７８３）から構成される。この第二の決定基はＴＧＮへの局在性の付与と同時に形質膜からの内在化を仲介することができる。
【００１２】
トランス−ゴルジネットワーク（ＴＧＮ）はタンパク質のソーティング／ターゲッティングに中心的な役割を果たし、配列ＳＸＹＱＲＬはそれ自体有意なＴＧＮ局在性を付与することができる。Ｗｏｎｇ， Ｓ．Ｈ． ＆ Ｈｏｎｇ， Ｗ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９９３）． ２６８ （３０）， ２２８５３−６２には、ＴＧＮ３８の３２−残基配列の詳細な突然変異誘発源としてＴＧＮに封じ込まれた内在性膜タンパク質が報告され、ＴＧＮの局在にはそれぞれ位置２３、２５および２８におけるＳｅｒ、ＴｙｒおよびＬｅｕが必須であることが決定された。ＴＧＮ３８の細胞質３２−残基配列がグリコフォリンＡ（表面タンパク質）の外部および膜貫通ドメインに融合している場合、生じるキメラタンパク質はＴＧＮに局在した。
【００１３】
ある種のタンパク質が特異的なオルガネラ内でのみ活性であるか、またはそれらの局在に応じて別異に機能できることは十分に認識されている。たとえば適当な細胞下局在はＮＦ−κＢ機能の調節にきわめて重要である。Ｈｕａｎｇ， Ｔ．Ｔ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （２０００）， ９７（３）， １０１４−１０１９には、潜在的ＮＦ−κＢ複合体がプレインダクション状態において核を出入させることができることを示し、不活性複合体の細胞質局在に要求されるＩκＢαの残基４５−５４中の、以前には特性が明らかにされていなかった核エキスポート配列が決定されている。ＮＦ−κＢ／ＩκＢα複合体は、核局在シグナル依存性インポートおよびＣＲＭ１−依存性核エキスポートによって細胞質と核の間を折り返し輸送され、核インポートを越える支配的な核エキスポートが不活性複合体の細胞質局在に大きく寄与し、細胞外シグナルによる効果的なＮＦ−κＢ活性化が達成されるものと思われる。
【００１４】
古典的核局在化配列含有タンパク質の核インポートには、核膜孔複合体（ＮＰＣ）の細胞質表面におけるインポート複合体のアッセンブリーが関与し、ついでこの複合体のＮＰＣの貫通移動および核内部へのインポート基質の放出が起こる。Ｒａｎとの組み合わせで、他の２つの溶解因子が核への古典的または基本的なＮＬＳを含有するタンパク質の核へのインポートを仲介するために絶対的に要求される。第一のものはカリオフェリン／インポーティンα（Ｋａｐ α）であり、これは古典的ＮＬＳとを結合し、ついでカリオフェリン／インポーティンβ１（Ｋａｐ β１）と複合体を形成する（Ａｄａｍ， Ｓ．Ａ． ＆ Ｇｅｒａｃｅ， Ｌ．， （１９９１） Ｃｅｌｌ ６６， ８３７−８４７； Ｇｏｅｒｌｉｃｈ， Ｄ．ら （１９９４） Ｃｅｌｌ ７９， ７６７−７７８； Ｍｏｒｏｉａｎｕ， Ｊ．ら （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９２， ２００８−２０１１； Ｒａｄｕ， Ａ．ら （１９９５）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ　９２， １７６９−１７７３； Ｇｏｅｒｌｉｃｈ， Ｄ．ら （１９９５） Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ５， ３８３−３９２； Ｃｈｉ， Ｎ．Ｃ．ら， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １３０， ２６５−２７４）。Ｋａｐ β１は核膜孔複合体（ＮＰＣ）タンパク質と相互作用し、これらの相互作用を介してＮＰＣを通過するインポート複合体の移動が仲介されるものと思われる（Ｒｅｘａｃｈ， Ｍ． ＆ Ｂｌｏｂｅｌ， Ｇ． （１９５５） Ｃｅｌｌ ８３， ６８３−６９２； Ｒａｄｕ， Ａ．， Ｂｌｏｂｅｌ， Ｇ． ＆ Ｍｏｏｒｅ， Ｍ．Ｓ． （１９５５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９２， １７６９−１７７３； Ｉｏｖｉｎｅ， Ｍ．Ｋ．， Ｗａｔｋｉｎｓ， Ｊ．Ｌ． ＆ Ｗｅｎｔｅ， Ｓ．Ｒ． （１９９５） Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １３１， １６９９−１７１３； Ｒａｄｕ， Ａ．， Ｍｏｏｒｅ， Ｍ．Ｓ． ＆ Ｂｌｏｂｅｌ， Ｇ． （１９５５） Ｃｅｌｌ ８１， ２１５−２２２）。他のタンパク質、ｐ１０／ＮＴＦ２も核インポートに関連しているが、その機能はＲａｎを核内に取り込むのみで、入ったインポート複合体をついで分解する必要がある（Ｍｏｏｒｅ， Ｍ．Ｓ． ＆ Ｂｌｏｂｅｌ， Ｇ．， （１９９４） Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１， １０２１２−１０２１６； Ｐａｓｃｈａｌ， Ｂ．Ｍ． ＆ Ｇｅｒａｃｅ， Ｌ．， （１９９５） Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２９， ９２５−９３７； Ｒｉｂｂｅｃｋ， Ｋ．， Ｌｉｐｏｗｓｋｙ， Ｇ．， Ｋｅｎｔ， Ｈ．Ｍ．， Ｓｔｅｗａｒｔ， Ｍ． ＆ Ｇｏｅｒｌｉｃｈ， Ｄ．， （１９９８） ＥＭＢＯ Ｊ． １７， ６５８７−６５９８； Ｓｍｉｔｈ， Ａ．， Ｂｒｏｗｎａｗｅｌｌ， Ａ． ＆ Ｍａｃａｒａ， Ｉ．Ｇ．， （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ８， １４０３−１４０６）。
【００１５】
酵母（ＳＰＲ１またはＫａｐ ６０）には唯１個のＫａｐαホモローグが存在するが、脊椎動物細胞は、古典的ＮＬＳを結合可能であり、配列ホモロジーを有する多くのタンパク質を含有する（Ｎａｃｈｕｒｙ， Ｍ．Ｖ．， Ｒｙｄｅｒ， Ｕ．Ｗ．， Ｌａｍｏｎｄ， Ａ．Ｉ， ＆ Ｗｅｉｓ， Ｋ． （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５， ５８２−５８７およびそこに引用された文献参照）。これらのタンパク質には様々な名称が与えられているが、３つの主要なファミリーに分類することができる。Ｋａｐα１ファミリーはヒトタンパク質ＮＰＩ−１／インポーティンα１／カリオフェリンα１／Ｒｃｈ２／ｈＳＲＰ１およびマウスＳ２タンパク質に加えて第二の関連タンパク質、インポーティンα６を含有する（Ｍｏｒｏｉａｎｕ， Ｊ．ら （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２， ２００８−２０１１； Ｃｏｒｔｅｓ， Ｐ．ら （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１， ７６３３−７６３７； Ｏ’Ｎｅｉｌｌ， Ｒ．Ｅ．ら （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０， ２２７０１−２２７０４； Ｋｏｈｌｅｒ， Ｍ．ら （１９９７） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４１７， １０４−１０８； Ｔｓｕｊｉ， Ｌ．ら （１９９７） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４１６， ３０−３４）。第二のファミリー、Ｋａｐα２には、ヒトＲｃｈ１／ｈＳＲＰ１／インポーティンα２／カリオフェリンα２およびマウスタンパク質のペンジュリン／ＰＴＡＣ５８が含有される（Ｇｏｅｒｌｉｃｈ， Ｄ．， Ｐｒｅｈｎ， Ｓ．， Ｌａｓｋｅｙ， Ｒ．Ａ． ＆ Ｈａｒｔｍａｎｎ， Ｅ． （１９９４） Ｃｅｌｌ ７９， ７６７−７７８； Ｃｕｏｍｏ， Ｃ．Ａ．， Ｋｉｒｃｈ， Ｓ．Ａ．， Ｇｙｕｒｉｓ， Ｊ．， Ｂｒｅｎｔ， Ｒ． ＆ Ｏｅｔｔｉｎｇｅｒ， Ｍ．Ａ． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１， ６１５６−６１６０； Ｋｕｓｓｅｌ， Ｐ． ＆ Ｆｒａｓｃｈ， Ｍ． （１９９５） Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２４８， ３５１−３６３； Ｉｍａｍｏｔｏ， Ｎ．， Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ， Ｔ．， Ｔａｋａｏ， Ｔ．， Ｔａｃｈｉｂａｎａ， Ｔ．， Ｋｏｓｅ， Ｓ．， Ｍａｔｓｕｕｂａｅ， Ｍ．， Ｓｅｋｉｍｏｔｏ， Ｔ．， Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉ， Ｙ． ＆ Ｙｏｎｅｄａ， Ｙ． （１９９５） ＥＭＢＯ Ｊ． １４， ３６１７−３６２６； Ｋ．， Ｍａｔｔａｊ， Ｉ．Ｗ． ＆ Ｌａｍｏｎｄ， Ａ．Ｉ． （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８， １０４９−５３）。第三のファミリー、Ｋａｐα３は、２種のヒトタンパク質、ＱＩＰ１／インポーティンα３およびＫＰＮＡ３／ｈＳＰＲ１γ／ｈＳＲＰ４、ならびにマウスタンパク質Ｑ１およびＱ２から構成される（Ｎａｃｈｕｒｙ， Ｍ．Ｖ．ら （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５， ５８２−５８７； Ｋｏｈｌｅｒ， Ｍ．ら（１９９７） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４１７， １０４−１０８； Ｔｓｕｊｉ， Ｌ．ら （１９９７） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４１６， ３０−３４； Ｔａｋｅｄａ， Ｓ．ら （１９９７） Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ． Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ． ７６， ８７−９３； Ｓｅｋｉ Ｔら （１９９７） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２３４， ４８−５３； Ｍｉｙａｍｏｔｏ， Ｙ．ら （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２， ２６３７５−２６３８１）。これらのクラスのそれぞれは互いにおよび酵素ＳＲＰ１と約５０％のホモロジーを有し、これらの哺乳動物タンパク質のそれぞれは１またはそれ以上の古典的ＮＬＳ−含有タンパク質のインポートを仲介できることが示されている（Ｎａｃｈｕｒｙ， Ｍ．Ｖ．ら （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５， ５８２−５８７； Ｓｅｋｉｍｏｔｏ， Ｔ． ら （１９９７） ＥＭＢＯ Ｊ． １６， ７０６７−７０７７； Ｎａｄｌｅｒ， Ｓ．Ｇ．ら （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２， ４３１０−４３１５； Ｐｒｉｅｖｅ， Ｍ．Ｇ．ら （１９９８） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １８， ４８１９−４８３２）。
【００１６】
Ｓｔａｔ−１のインポートはＫａｐα１／ＮＰＩ−１によって仲介されるが、Ｋａｐα２／Ｒｃｈ１によっては仲介されない。しかしながら、活性化Ｓｔａｔ−１はＮＬＳ結合Ａｒｍａｄｉｌｌｏリピートから離れたＫａｐα１のＣＯＯＨ−末端領域に結合するものと思われる。ＲＣＣ１に対し観察される、異なるＫａｐαの結合の差は単にＲＣＣ１上のＮＬＳによるものであり、したがって多分、Ｋａｐα３のＮＬＳ結合領域によるものと思われる（Ｓｅｋｉｍｏｔｏ， Ｔ．ら（１９９７） ＥＭＢＯ Ｊ． １６， ７０６７−７０７７）。Ｋａｍｅｉ， Ｙ．ら （１９９９） Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． ４７， ３６３−３７３は、マウスにおいて、Ｋａｐα３ホモローグは多くの組織で発現されることを示し、Ｋａｐα３が「限られた数のユニークなカリオフィリックなタンパク質たとえばヘリカーゼＱ１」のインポートにある役割を果たしていることを理論化した。Ｔａｌｃｏｔｔ， Ｂ． ＆ Ｍｏｏｒｅ， Ｍ．Ｓ． （２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５ （１４） １００９９−１０１０４によって提供された結果はＲＣＣ１がＫａｐα３をそれらの核インポートに用いるタンパク質のグループに含まれることを示唆するものである。
【００１７】
米国特許６，１９１，２６９号には、核局在化配列（ＮＬＳ）の特徴を有し、プロピースの核局在を仲介ができる（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら， （１９９７）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９４： ５０８−１３）Ｎ−末端ＩＬ−αプロピースＴ７６−ＮＧＫＶＬＫＫＲＲＬのｃＤＮＡ配列内に含まれる核局在配列の存在が教示されている。Ｎ−末端ＩＬ−αプロピースをコードするｃＤＮＡの培養糸球体間質細胞への導入は核の蓄積を生じた（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら， 前出）。
【００１８】
米国特許５，８７７，２８２号は、アンテナペディア　ホメオドメインシグナル配列ペプチドはアミノ酸配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫであり、線維芽細胞成長因子シグナル配列ペプチドはＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡであり、ＨＩＶ Ｔａｔシグナル配列ペプチドはアミノ酸配列ＣＦＩＴＫＡＬＧＩＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＳＱＴＨであることを教示している。
【００１９】
Ｓｃｈｗａｒｔｚｅ， Ｓ．Ｒ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５： １５６９−１５７２ （１９９９） は， ＴＡＴ融合タンパク質として組織にｉｐ注射したレポータータンパク質， １１６ ｋＤ β−ガラクトシダーゼが脳血管関門を通過して送達されることを報告している。Ｓｃｈｗａｒｔｚｅは、ＨＩＶ ｔａｔタンパク質に由来する１１アミノ酸タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）をＮ−末端フルオレセインイソチオシアナート （ＦＩＴＣ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙモチーフとともに使用した。この著者らはＴＡＴ ＰＴＤに化学的に架橋されたβ−Ｇａｌを形質導入する初期の試みが、限られた数の組織において、散在性の弱いβ−Ｇａｌ活性を生じたことを報告している。彼らは、改善された形質導入は、用いられたインフレーム融合と精製戦略によるものと推論している。
【００２０】
ＩＦＮγの核局在化は多重塩基性ＮＬＳによってそのＣ末端において仲介され、細胞外および細胞内両者におけるＩＦＮγの生物学的活性の完全な発現が要求される（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ， Ｐｒｅｍ Ｓ．ら， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． （２０００）， １１３ （１５）， ２７７１−２７８１）。このＮＬＳは、ＩＦＮγによって活性化される転写因子、ＳＴＡＴ１αの核トランスロケーションに内在性の細胞内の役割を果たしていると考えられる。なぜならば、ＮＬＳを含むＣ−末端領域（９５−１３３）に対する抗体によるＩＦＮγの処理はＳＴＡＴ１α核トランスロケーションの誘導を遮断するが、これらの抗体ＩＦＮα処理細胞におけるＳＴＡＴ１αの核トランスロケーションには何らの作用も示さないからである。Ｃ−末端ＮＬＳ領域を欠くヒトＩＦＮγの欠失突然変異体、ＩＦＮγ（１−１２３）は生物学的に不活性であるが、細胞上のＩＦＮγ受容体複合体に、野生型タンパク質の場合と類似のＫｄにおいてなお結合することができる。ＮＬＳの欠失はＩＦＮγ受容体複合体に結合したのちのＩＦＮγの生物学的活性に要求されるＳＴＡＴ１α核トランスロケーションを開始させるＩＦＮγの能力を、特異的に消失させる。ＮＬＳモチーフを含むマウスＩＦＮγのＣ−末端ペプチド、ＩＦＮγ（９５−１３３） は、マウスマクロファージ細胞系によって細胞内に取り込まれた場合に、ＳＴＡＴ１αの核トランスロケーションを誘導した。ＮＬＳモチーフの欠失では、この細胞内ペプチドの核トランスロケーション能力が特異的に阻害される。ＩＦＮγで活性化された細胞では、ＩＦＮγはＳＴＡＴ１αおよびインポーティン−αアナログ、Ｎｐｉ−１を含む複合体の部分として見出され、これはＳＴＡＴ１αの核インポートを仲介する。ＳＴＡＴ１αのチロシンリン酸化、複合体ＩＦＮγ／Ｎｐｉ−１／ＳＴＡＴ１α複合体の形成およびそれに続くＳＴＡＴ１αの核トランスロケーションはすべてＩＦＮγ ＮＬＳの存在に依存した。
【００２１】
多重塩基性配列、１２６ＲＫＲＫＲＳＲ１３２を含有するＩＦＮ−γのアミノ酸９５−１３２を表すペプチドはＡＴＰおよびＧＴＰの両者を要求するエネルギー依存性様式で自己蛍光タンパク質、ＡＰＣの核取り込みを特異化する。上述の多重塩基性配列を欠失させた場合は、核インポートは消失した（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ Ｐら （１９９９）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４ （１）， ４０３−４０７）。ＳＶ４０の大Ｔ−抗原のプロト型多重塩基性ＮＬＳ配列を含むペプチドもまた、ＩＦＮγ（９５−１３２） によって仲介される核インポートを阻害することが可能であり、これはＩＦＮγ中のＮＬＳがＳＶ４０ Ｔ−ＮＬＳによって利用されるＲａｎ／インポーティン経路の成分を介して機能することを示唆している。無傷のＩＦＮγがＡＰＣにカップリングした場合にもその核インポートを仲介することが可能であり、この核インポートはペプチドＩＦＮγ（９５−１３２）およびＳＶ４０ Ｔ−ＮＬＳペプチドによって遮断され、無傷のＩＦＮγもＲａｎ／インポーティン経路を介して核内に輸送されることを示唆している。
【００２２】
核タンパク質は、核膜孔複合体（ＮＰＣ）と呼ばれる核エンベロープに広がる水性チャンネルを通ってインポートされる。約２０〜４０Ｄａ未満のイオンおよび分子は核膜孔複合体を通過して受動的に拡散することができるが、より大きいタンパク質はエネルギーおよびシグナル依存性の飽和経路によって輸送される。核タンパク質のインポートを特定するシグナル（ＮＬＳ）１は通常、塩基性アミノ酸残基に富んだ短いアミノ酸のストレッチであるが、最近では他のクラスのＮＬＳも報告されている。塩基性アミノ酸型のＮＬＳを含有するタンパク質のインポートにおける開始工程はＮＬＳ含有タンパク質が受容体（ＮＬＳ受容体、インポーティンαおよびカリオフェリンと様々に呼ばれる）に結合している細胞質で起こる（１３）。基質−受容体複合体はついで、核膜孔複合体の細胞質表面と会合し、これに細胞質型因子が関与して、核膜孔複合体中の開口チャンネルを通って核内に輸送される。ＮＬＳ−仲介核インポートのインビボ現象は、細胞質抽出物およびＡＴＰを補充されたジギトニン透過性細胞を用いたインビトロ系において再現することができる。このインビトロアッセイにおける輸送は、インビボインポートを遮断する同一の阻害剤で遮断され、迅速かつ容易に定量される。
【００２３】
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）−１のＮ−末端におけるＮＬＳ、配列ＮＹＫＫＰＫＬ、酸性ＦＧＦのプレカーサーは、核トランスロケーションシグナルとしてのその機能によるＦＧＦ−１の長期活性化または膜貫通受容体キナーゼの結合および活性化の維持に必要な構造の安定化におけるその役割に影響することが提案されている（Ｌｕｏ， Ｙ．ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９９６） ２７１ （４３）， ２６８７６−２６８８３）。たとえば、至適活性における外因性ヘパリン依存性の著しい増大とともに、ＦＧＦ−１の残基ＮＹＫＫＰＫＬの逐次欠失は熱安定性、プロテアーゼに対する抵抗性、マイトジェン活性および膜貫通受容体に対する親和性を漸進的に消失させる。最大の変化はリジン−ロイシン残基を通じての全配列の欠失から生じた。十分高濃度のヘパリンの存在下には欠失突然変異体は野生型ＦＧＦ−１に等しいマイトジェン活性を示した。
【００２４】
ＦＧＦ−１はＮＴＳを含有するが、核トランスロケーションには外因性の、内因性ではない経路が必要とされる。ＦＧＦ−１のＮＴＳ、ＮＹＫＫＰＫＬはトランスフェクトされたＮＩＨ ３Ｔ３細胞の核に細菌性β−ガラクトシダーゼ（βｇａｌ）遺伝子の発現を指図することができるが、このＮＴＳはＦＧＦ−１それ自体またはＦＧＦ−１−βｇａｌ融合タンパク質のいずれも核へ標的化することはできず、ＦＧＦ−１には、内因的に発現されたＦＧＦ−１の核へのトランスロケーションを妨げる付加的配列が包含されることを示唆している（Ｚｈａｎ， Ｘ．ら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． （１９９２） １８８ （３）， ９８２−９１）。
【００２５】
インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）は、シグナル伝達にＪａｋ−Ｓｔａｔ経路を使用するタンパク質であって、サイトカインで細胞外処理した細胞においては核に急速にトランスロケートする。ＮＬＳはヒトおよびマウスＩＦＮ−γのＣ−末端に同定され、特性が明らかにされている。Ｌａｒｋｉｎ Ｊら， Ｊ． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ． （２００１） ２１ （６）， ３４１−３４８は、ヒトＩＦＮ−γ（Ｈｕ ＩＦＮ−γ）が上流部位に第二のＮＬＳを含有することを報告している。ＨｕＩＦＮ−γのアミノ酸１２２−１３２を表すマウスＩＦＮ−γ中に同定されたＮＬＳ配列と同族の一次配列は自己蛍光タンパク質アロフィコシアニン（ＡＰＣ）の核インポートをエネルギー依存的様式で仲介することができた。Ｈｕ ＩＦＮ−γのアミノ酸７８−９２を表す第二の配列もＡＰＣの核インポートをエネルギー依存的様式で仲介することができたが、その程度は著しく低かった。ＡＰＣに複合した両配列の核インポートは複合していないＨｕＩＦＮ−γ（１２２−１３２）との競合によって強力に遮断された。配列ＨｕＩＦＮ−γ（７８−８２）による競合は、ＡＰＣ−複合ＨｕＩＦＮ−γ（７８−９２）のインポートを効果的に遮断したが、同じ濃度でもＡＰＣ−複合ＨｕＩＦＮ−γ（１２２−１３２）の核インポートは阻害することができず、ＨｕＩＦＮ−γ（７８−９２）はＨｕＩＦＮ−γ（１２２−１３２）よりＮＬＳとしての効率が低いことを示唆している。これはＮＬＳの１２２−１３２における下流を欠くＨｕＩＦＮ−γの抗ウイルス活性の＞９０％喪失に一致する。ＡＰＣ複合ＨｕＩＦＮ−γ（１２２−１３２）の核インポートはＳＶ４０ Ｔ ＮＬＳのプロトタイプ多重塩基性ＮＬＳを含むペプチドにより阻害され、これは両場合において同じＲａｎ／インポーティン細胞性機構が使用されていることを示唆する。
【００２６】
核局在化の機構としては、ＮＬＳモチーフの強力な保存があるものと思われる。ＤＮＡ結合タンパク質を核内に封入する場合には、存在するＤＮＡ結合機構の部分が進化に用いられたように思われる。Ｃｏｋｏｌ， Ｍ．ら（ＥＭＢＯ Ｒｅｐ． （２０００）， １（５）， ４１１−４１５）は真核タンパク質の１７％以上が核にインポートされるものと推定して、文献から実験的に確証されたＮＬＳの９１のセットを分析後、このセットを「インシリコ突然変異」によって繰り返した２１４のセットの可能性のあるＮＬＳに拡大した。この最終セットは、すべての既知核タンパク質の４３％にマッチし、非核タンパク質はなかった。ＣｏｋｅｌらＮＬＳおよびＤＮＡ結合領域両者が知られているタンパク質の９０％についてＮＬＳとＤＮＡ結合領域の間に重複を見出したが、２１４のＮＬＳモチーフ中５６のみがＤＮＡ結合領域に重複した。これらの５６のＮＬＳによって、ヒト、ハエ、蠕虫および酵母における約８００種の部分的ＤＮＡ結合領域が新たに予測された。
【００２７】
さらに最近になって、ＮＬＳシグナルペプチドはＤＮＡの構造変化を誘導できることが報告されている。Ｌｕｐｉｎｕｓ ｌｕｔｅｕｓからの植物酵素であるグルタミニル−ｔＲＮＡシンテターゼＧｌｎＲＳはＮ−末端にリジンに富んだポリペプチド、ＫＰＫＫＫＫＥＫとしてＮＬＳを含有する（Ｋｒｚｙｚａｎｉｋ， Ａ．ら， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐ． （２０００）， ２７ （１）， ５１−５４）。ルピンＧｌｎＲＳのＮＬＳ配列に由来する２つの合成ペプチド（２０および８アミノ酸長）はＤＮＡと相互作用する。さらに、短い８アミノ酸のペプチドは、Ｂ型からＺ型へのＤＮＡのコンフォーメーション変化を引き起こす。この観察はＧｌｎＲＳのリーダー配列中におけるＮＬＳポリペプチドの存在がタンパク質の輸送のみならず、遺伝子発現の調節に必要なことを明らかに示唆している。これは、ＤＮＡの構造変化におけるＮＬＳシグナルペプチドの役割を最初に示唆した報告である。
【００２８】
通常、種の中のＮＬＳ配列には強力な保存が認められる。たとえば、ＴＧＦ−βシグナル伝達に関与する主要なＳｍａｄタンパク質であるＳｍａｄ ３タンパク質のＮＬＳはＮ−末端領域に塩基性モチーフ、Ｌｙｓ４０−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ４４を有し、これは、経路特異的なすべてのＳｍａｄタンパク質中で保存され、そのリガンドに対する応答においてＳｍａｄの核インポートを必要とする。Ｓｍａｄタンパク質はトランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）および関連サイトカインの細胞内メディエーターである。Ｘｉａｏ， Ｚ．ら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （２０００）， ２７５ （３１）， ２３４２５−２３４２８）は核局在化においてＮＬＳが果たす役割を同定した。この著者らは単離Ｓｍａｄ ３ ＭＨ１ドメインがインポーティンβへの有意に特異的な結合を示し、これはＮＬＳにおける突然変異により減弱または消失すことを証明した。完全長のＳｍａｄ３はインポーティンβに弱いが特異的な結合を示し、これはＩ型ＴＧＦ−β受容体によるリン酸化後に増強される。これに反し、インポーティンαとＳｍａｄ３またはそのＭＨ１ドメインの間には相互作用は観察されず、Ｓｍａｄタンパク質の核トランスロケーションはインポーティンβへの直接結合によることが示される。この著者らは、経路特異的なＳｍａｄすべてのタンパク質（Ｓｍａｄ １、２、３、５、８および９）の活性化が保存されたＮＬＳモチーフを露出させ、ついで直接インポーティンβに結合し、核のトランスロケーションを誘導すると結論した。
【００２９】
すべて細胞において、細胞の脂質二重層細胞膜は荷電分子通過の選択的障害として作用し、それとともに疎水性巨大分子の内在化は古典的輸送経路により達成される（Ｈａｗｉｇｅｒ， Ｊ．， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ３， ８９−９４， １９９９； Ｓｃｈｗａｒｚｅ， Ｓ．Ｒ．ら， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １０， ２９０−２９５， ２０００）。これらの古典的内在化機構には、受容体仲介エンドサイトーシスまたはトランスポート依存性取り込みが関与する（Ｃｌｅｖｅｓ， Ａ．Ｅ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ７， Ｒ３１８−Ｒ３２０ （１９９７））。これに反し、古典的インポートおよび／またはエキスポートシグナルを欠く分子数の増加が見出された（Ｃｌｅｖｅｓ， Ａ．Ｅ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ７， Ｒ３１８−Ｒ３２０ （１９９７））。これらの分子は、慣用的ではなくその機構はほとんど分かっていないプロセスを用いて直接、細胞質または核コンパートメントにアクセスすることができる。これらの新規な機構は、一般的に「非古典的」と呼ばれ、使用される輸送経路は非定型的である。後者に関連する例はＨＩＶ−１ ＴＡＴ（Ｆｒａｎｋｅｌ， Ａ．Ｄ． ＆ Ｐａｂｏ， Ｃ．Ｏ．， Ｃｅｌｌ， ５５， １１８９−１１９３ （１９８８））、ヘルペスウイルスＶＰ２２（Ｅｌｌｉｏｔｔ， Ｇ． ＆ Ｏ’Ｈａｒｅ， Ｐ．， Ｃｅｌｌ， ８８， ２２３−２３３ （１９９７））およびアンテナペディア， Ａｎｔｐ（Ｄｅｒｏｓｓｉ， Ｄ．ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９， １０４４４−１０４５０ （１９９４））の遺伝子コードタンパク質中に見出される。ＨＩＶ−Ｉ ＴＡＴ（Ｈｅｌｌａｎｄ， Ｄ．Ｅ．ら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６５， ４５４７−４５４９ （１９９１））およびＶＰ２２（Ｐｏｍｅｒａｎｚ， Ｌ．Ｅ． ＆ Ｂｌａｈｏ， Ｊ．Ａ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３， ６７６９− ６７８１ （１９９９））の完全長タンパク質が迅速に細胞膜内外にトランスロケートされることは現在では十分確立されている。実際別個のペプチド領域が、単独でまたはキメラカーゴペプチドとの組み合わせおよびタンパク質を細胞コンパートメント内にトランスロケートすることができるこれらのタンパク質両者内に同定されている（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ， Ｍ．ら， Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ． ３， ９９−１０３ （２０００）， Ｄｅｒｏｓｓｉ， Ｄ．ら Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ８， ８４−８７（１９９８）， Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ， Ａ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １２， ４００−４０６ （２０００）， Ｓｔｅｖｅｎ， Ｒ． Ｓｃｎｗａｒｚｅ， Ｓ．Ｒ．ら， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０， ２９０−２９５ （２０００））。これに反して、完全長Ａｎｔｐタンパク質が生物学的膜を横断することは示されなかったが、そのコード領域内に由来する１６アミノ酸の合成ペプチドは強力な膜透過性能力を有する（Ｄｅｒｏｓｓｉ， Ｄ．ら， Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ８， ８４−８７ （１９９８））。これらの核によって使用される非定型的輸送の受け入れられた概要は「伝達」（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）と呼ばれたが（Ｓｃｈｗａｒ���ｅ， Ｓ．Ｒ．ら， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０， ２９０−２９５ （２０００））、現在は受容体およびエネルギー依存性ですべての細胞型においてＣ４で生じる著しく迅速な膜透過性経路として定義されている（Ｓｃｈｗａｒｚ， Ｓ．Ｒ． ＆ Ｄｏｗｄｙ， Ｓ．Ｆ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ． ２１， ４５−４８ （２０００））。所定のことに、これらの３つのタンパク質はすべて転写調節に関与する核タンパク質であり、それぞれの形質導入ペプチドはアルギニンおよびリジンに富んだアミノ酸のストリングである（Ｓｃｈｗａｒｚ， Ｓ．Ｒ． ＆ Ｄｏｗｄｙ， Ｓ．Ｆ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ． ２１， ４５−４８ （２０００））。しかしながらこれらの類似性とは無関係に、これらの形質導入ペプチドは多くの異なる特性たとえばアミノ酸配列、配列の長さ、細胞性局在、および膜透過の活性を有する。すなわち、それぞれの形質導入配列は細胞および組織を透過することができるが、それらが同じ非定型的輸送機構を使用しているか否かはまだ確立されていない。
【００３０】
最後に、米国特許６，０２２，９５０号は、動物の細胞に上記ハイブリドタンパク質を結合させるのに有効な細胞結合ポリペプチドリガンドの結合ドメイン部分のハイブリド分子、細胞のサイトゾールへ細胞質膜を横切って、上記第三の部分をトランスロケートする天然に存在するタンパク質のトランスロケーションドメイン、および細胞に導入される化学物質の使用が教示されている。しかしながらその特許はトキシンのトランスロケーションドメインを教示するものである。トランスロケーションドメインを有することが知られている天然に存在するタンパク質には、ジフテリアトキシンおよびシュウドモナスエキソトキシンＡが包含され、また他のトキシンおよび非トキシン分子が同様に包含される。ジフテリアトキシンおよびシュウドモナスエキソトキシンＡのトランスロケーションドメインは十分特徴づけられていて（たとえば、Ｈｏｃｈら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２： １６９２−１６９６， １９８５； Ｃｏｌｏｍｂａｔｔｉら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６１： ３０３０−３０３５， １９８６ およびＤｅｌｅｅｒｓら， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． １６０： ８２−８６， １９８３参照）、ならびに他の分子におけるこのようなドメインの存在および位置がＨｗａｎｇら， Ｃｅｌｌ ４８： １２９−１３６， １９８７およびＧｒａｙら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１： ２６４５−２６４９， １９８４に採用された方法を用いて決定することができる。
【００３１】
細胞性局在の制御機構、細胞内輸送の調節に関与するタンパク質、細胞質膜および核エンベロープについての様々な性質および制御機構を教示するかなり大量の文献があることを考慮すれば、哺乳動物タンパク質に由来するポリペプチドが非古典的機構を使用する細胞質膜を通じて形質導入され、それによって所定の化合物のインビトロ、エキソビボおよびインビボにおける送達デバイスとして役立つ膜透過性ペプチドとして有用であることは予期されなかった。また所定の化合物の細胞内送達のための非タンパク質由来の方法、たとえば、エレクトロポレーション、リポソームによる膜融合、ＤＮＡコーティングマイクロプロジェクタイルによる高速ボンバードメント、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈物とのインキュベーション、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、修飾ウイルス核酸によるインフェクション、および単一細胞、通常は卵子による直接マイクロインジェクション等を教示するかなりの論文がある。これらの方法は比較的非効率的で、送達された所定の化合物を含む細胞は比較的低率にしか得られず、大部分の方法は明らかに現実的なインビボ送達が可能なものではない。多くの方法は細胞に対して毒性があり、比較的高率にアポトーシスを生じる。したがって、所定の化合物の簡単な、より効率的な細胞への送達方法には大きい必要性がある。
【００３２】
【発明の開示】
本発明は所定の化合物のインビトロ、エキソビボおよびインビボ送達のための担体として有用な、哺乳動物および酵母由来のポリペプチドに関する。本発明はまた、それらを含有する組成物、ならびに、所定の化合物を、インビトロ、エキソビボおよびインビボにおいて送達する方法を提供する。
【００３３】
添付の図面において：
図１．（Ａ）ＰＡＳの位置、細胞質の局在、および核局在配列（ＮＬＳ、ただし図中には核局在ドメイン（ＮＬＤ） として示した）を示すｈＰＥＲ１融合構築体の模式図。融合構築体の名称および位置は左側に示す。数はｈＰＥＲ１タンパク質の最初および最後のアミノ酸残基である。各融合タンパク質の主要な蓄積部位は右側にまとめる。（ｎ）核、（ｎｏ）核小体、（ｃ）細胞質、（ｄｉｆｆ）散在性。すべての構築体はＮ−末端にＥＹＦＰをタグした。ヒトおよびマウスＰＥＲ１−ＮＬＳのアラインメントは最下部に示す。
【００３４】
図１．（Ｂ）上記図１Ａに記載のｈＰＥＲ１融合タンパク質の生存細胞における細胞性局在。ＣＨＯ細胞は各パネルの最上部に指示した融合構築体によって一過性にトランスフェクトし、ＥＹＦＰレポーター（緑）細胞下の局在をトランスフェクト１０時間後に蛍光顕微鏡により可視化した。対照としてはＥＹＦＰベクター単独を用いた（５． ＥＹＦＰベクター参照）。
【００３５】
図２．（Ａ）ＣＨＯ細胞における膜透過性アッセイ。Ｎ−末端をビオチン化した合成ペプチド、ｈＰＥＲ１−ＰＴＤ、Ｆｌａｇ−ｈＰＥＲ１−ＰＴＤ、Ｆｌａｇ−ＴＡＴ−ＰＴＤ（陽性対照）およびＦｌａｇ−Ｆｌａｇ（陰性対照）を、培養液中の生存ＣＨＯ細胞における細胞膜の透過能力についてアッセイした。内在化したペプチドの細胞下局在はストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ ５９４（赤）または抗−ｆｌａｇ ｍＡｂ（緑）のいずれかによる二色染色法を用いて決定した。第三のカラムはオーバーレイ（黄色）である。さらに細胞内および核内局在を確認するためには共焦点顕微鏡を用いた。共焦点造影の単一セクションを示す。
【００３６】
図２．（Ｂ）ビオチン化ペプチド， ｈＰＥＲ１−ＮＬＤ（ｈＰＥＲ１−ＰＴＤとしても知られる）の標的核を、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ ５９４蛍光（緑）を用いてＴＡＴ−ＰＴＤおよび Ｆｌａｇ−Ｆｌａｇ（陰性対照）と比較した。核の染色には５ｎｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８（青、中央のカラム）を用いた。第三カラムは共焦点造影のオーバーレイである。
【００３７】
図３．ｈＰＥＲ１−ＰＤＴのアラニン走査。ビオチン化ｈＰＥＲ１−ＮＰＤは指示した位置をアラニンの単一アミノ酸残基置換により合成し、ＣＨＯ細胞における膜透過をアッセイした。細胞はペプチド濃度１０μＭ， ３７℃において１０分間インキュベートしたのち、洗浄、固定し、透過性にして、標識ストレプトアビジン Ａｌｅｘａ−５９４（赤， ２μｇ／ｍＬ）によりＲＴで１５分間検出した。対照ペプチドはｈＰＥＲ１ Ｎ−末端アミノ酸残基４８６−５００とした。
【００３８】
図４．セロトニン５ＨＴ２Ａ受容体のｈＰＥＲ−ＭＰＰ融合ペプチドによる活性化。
（Ａ）ｈＰＥＲ１−ＭＰＰおよびＴＡＴ−ＰＴＤペプチドは単独で、または第一の細胞内ループＩ１（ＳＬＥＫＫＬＱＮＡＴＮ）もしくは５ＨＴ２Ａ受容体、遺伝子アクセス番号 Ｍ８６８４１）由来のＣ−末端膜貫通７ドメインＴＭ７（ＫＴＹＲＳＡＦＳＲＹＩＱＹＫＥＮＫＫＰＬＱＬＩ）のいずれかと融合させて合成した。受容体の活性は標準ＦＬＩＰＲ分析を用いて、外因性および内因性Ｃａ＋２レベルをアッセイした。ペプチドの名称は次の通りである：Ｔ（ＴＡＴ−ＰＴＤ）、Ｐ（ｈＰＥＲ１−ＭＰＰ）、Ｉ１（細胞内ループ １）、Ｔ−Ｉ１（ＴＡＴ−ＰＴＤ−ＩＩ）、Ｐ−Ｉ１（ｈＰＥＲ１−ＭＰＰ−ＩＩ）、ＴＭ７ （Ｃ−末端ドメイン）、ＴＴＭ７ （ＴＡＴ−ＰＴＤ−ＴＭ７）、ＰＴＭ７ （ｈＰＥＲ１−ＭＰＰ−ＴＭ７）、およびＳ （セロトニン）。
【００３９】
図４．（Ｂ）ＰＴＭ７（黒丸）およびＴＴＭ７（黒菱形）ペプチドの用量反応。セロトニン（対照、白三角）は１０μＭの最大受容体刺激濃度で使用した。
【００４０】
図５．更なるＰＴＤの同定。ＰＴＤの候補配列は、キーワードとして「転写因子」と注釈された遺伝子バンク中のタンパク質コード領域から翻訳されたペプチド配列で、ＳｗｉｓｓＰｒｏ， ＰＲＦ， ＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｆｏ Ｒｅｓｏｕｒｃｅを含む複合バイオインフォーマティクス法を用いて探索した。本発明者らは最初、すべて既知または候補のＮＬＳについて探索した。第二に、本発明者らは変性パターンの発生 ［Ｒ／Ｈ／Ｋ］−［Ｒ／Ｈ／Ｋ］−［Ｒ／Ｈ／Ｋ］−［Ｒ／Ｈ／Ｋ］を探索するためＰＨＩ−ＢＬＡＳＴ（Ｐａｔｔｅｒｎ−Ｈｉｔ Ｉｎｉｔｉａｔｅ ＢＬＡＳＴ）、（Ｘ）ｎ（式中、ｎは４またはそれ以上の整数であり、Ｘは常に独立にアルギニン、ヒスチジンまたはリジンから選択される）を採用した。７３７４の候補ＰＴＤ配列が見出された。２つの探索から、本発明者らは（Ａ）これらの配列に対するビオチン化ペプチドを合成し、または（Ｂ）ＧＦＰとのインフレーム融合タンパク質を創製し、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。１２のペプチド中の９は形質導入され、すべての配列がトランスフェクトされた細胞中の核に局在することが見出された。ｈＰＥＲ１−ＰＴＤ、ｈＰＥＲ３−ＰＴＤおよびＴＡＴ−ＰＴＤペプチドを陽性対照として使用した。６つの陽性配列と２つの陰性配列が見られる。数は母体タンパク質配列内のアミノ酸残基数、およびこれらのタンパク質についての遺伝子バンク受入番号を以下に指示するように表す。すなわち （Ｍ２４８９９， ヒト甲状腺ホルモンα−１；Ｌ１２６９９， ヒトＨｏｍｅｏｂｏｘタンパク質Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ １ ＨＭＥ１；Ｘ１６４１６， ヒトプロト癌遺伝子チロシンプロテインキナーゼＡＢＬ１；Ｑ０２５７５ ヒトＨＥＮ１／ＮＳＬＣ１；Ｑ０２５７７， ヒトＨＥＮ２／ＮＳＬＣ２；ＡＡＡ７４５６１， ラットＨＮＦ３；ＣＡＢ６５８８７， ショウジョウバエｃＡＭＰ依存性転写因子）。３つの陰性ペプチドは（Ｖ０１５１２， ｃ−Ｆｏｓ；ＡＡＤ５３１８４， ヒト ｃｙｃｌｉｎ Ｌ ａｎｉａ−６ａ；ＣＡＢ６６９１４， Ａｒａｂｉｎｄｏｐｓｉｓ β−ｚｉｐ転写因子）である。
【００４１】
図６．ｈＰＥＲ−ＰＴＤはβ−ガラクトシダーゼを細胞内に運搬する：ＨＩＶ ＴＡＴ形質導入ペプチドの少なくとも一つの特徴は細胞および組織にタンパク質を運搬するその能力である。したがって、本発明者らはｈＰＥＲ１形質導入ペプチドがβ−ガラクトシダーゼを細胞内に運搬できるか否かを決定すること追求した。この実験を実施するためには、本発明者らはＦｒａｎｋｅｌら（１９８９， （１９）： ７３９７−４０１）によるプロトコールに従い、ｈＰＥＲ１−ＰＴＤまたはｈＰＥＲ−ＰＴＤ Ｒ７Ａを完全長のβ−ガラクトシダーゼに化学的に連結し、これらの接合体またはβ−ガラクトシダーゼ単独がＣＨＯ細胞に形質導入する能力をアッセイした。図６左側に示すように、ｈＰＥＲ−ＰＴＤβ−ガラクトシダーゼの融合は、Ｘ−ｇａｌの添加後の細胞に青色によって指示されるようにβ−ガラクトシダーゼについて陽性の酵素活性を示した。しかしながら、ｈＰＥＲ−ＭＰＰ Ｒ７Ａβ−ガラクトシダーゼ（中央）もβ−ガラクトシダーゼタンパク質単独（右側）もＸ−ｇａｌ添加後に青色の染色反応を示さないように、細胞内に入ることはできなかった。これらのデータはＴＡＴペプチドのようなｈＰＥＲ１−ＰＴＤは細胞の中に多量のタンパク質（１２０ｋＤ）を運搬することができるということを示している。
【００４２】
【発明の詳述】
本発明はヒトＰｅｒｉｏｄ１（ｈＰＥＲ１）タンパク質が、現在ではＭＰＰとしても同定され、所定の化合物の細胞内送達のためのデバイスとして有用なＮＬＳを含むことの発見に基づくものである。ｈＰＥＲ１は概日リズムの調節に関与し、ｈＰＥＲ１が隣接する細胞に局在する能力は概日リズムを調節するその全体的生物学的機能にきわめて重要である。ｈＰＥＲ１内に同定されたＮＬＳは、以前に同定されたＮＬＳ配列内にフィットせず、その同定は、ＭＰＰとしても機能する他のＮＬＳ配列の探索のためのアルゴリズムの同定を生じる。
【００４３】
Ｐｅｒｉｏｄ１（ｈＰＥＲ１）は、転写調節に関与する核タンパク質である。それは生物時計の「ギア」における必須の成分であり（Ｂｒｏｗｎ ＳＡ ＆ Ｓｃｈｉｂｌｅｒ Ｕ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ９， ５８８−５９４ （１９９９）， Ｄｕｎｌａｐ ＪＣ， Ｃｅｌｌ ９６， ２７１−２９０ （１９９９））、マウスでの研究によりＰＥＲ１の核への移入がＣＬＯＣＫ／ＢＭＡＬ転写複合体のダウンレキュレーションに必須であることを示した（Ｇｅｋａｋｉｓ Ｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０， １５６４−１５６９ （１９９８）， Ｙａｇｉｔａ Ｋら， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １４， １３５３−１３６３ （２０００）， Ｌｏｗｒｅｙ ＰＬら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８， ４８３−４９２ （２０００））。しかしながら、今日までヒトＰＥＲ１の機能性ＮＬＳは明らかにされていなかった。本発明者らは、ｈＰＥＲ１内にＮＬＳを同定し、１６アミノ酸および１３アミノ酸配列（図３．ＨＰＥＲ１−ＮＬＳペプチド参照）が強力な膜透過能力を有することを証明した。この研究ではさらに同じく核タンパク質に由来する４つのＭＰＰの同定がなされた。
【００４４】
ＰＥＲ１は概日時計における中心成分であり、その核への移入は毎日の振動の調節に重要な役割を果たしている（Ｊｉｎ， Ｘ．ら， Ｃｅｌｌ ９６， ５７−６８ （１９９９）；Ｓａｎｇｏｒａｍ， Ａ．Ｍ．ら， Ｎｅｕｒｏｎ ２１， １１０１−１３， （１９９８））。欠失および融合タンパク質分析を用いて、本発明者らはｈＰＥＲ１の核局在に必要かつ十分なＮＬＳを同定した。ｈＰＥＲ１のＮＬＳが古典的な核局在コンセンサスモチーフに一致せず、したがって、標準的なＮＬＳ探索操作を使用しては同定されなかったので、この機能分析が必要であった。本発明者らは、レポータータンパク質およびタグされたｈＰＥＲ１フラグメント（Ｐ１−Ｆ２〜Ｐ１−Ｆ７）の核局在をトランスフェクト細胞に導入するためには、ｈＰＥＲ１−ＮＬＳの単一コピーで十分であることを示す。ＨＰＥＲ１−ＮＬＳ は、ｈＰＥＲ１のアミノ酸（８３０〜８４５）の間に位置し、利用可能なデータベース中の他のＰＥＲまたは他の核タンパク質には見出されない、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンに富んだ１３個のアミノ酸のストリング（表１参照）内に包埋されている。したがって、ＰＥＲ２およびＰＥＲ３は核タンパク質ではあるが（Ｊｉｎ， Ｘ．ら， Ｃｅｌｌ ９６， ５７−６８ （１９９９））、それらは、それらの核インポートのために別の配列および／または機構を使用することが明らかである。
【００４５】
塩基性残基に富む核タンパク質の限られた数のペプチドフラグメントは、受容体なしでの、エネルギー依存性様式で細胞膜内に透過することが示されている。このような３種のタンパク質からの配列、ＴＡＴ、ＡｎｔｐおよびＶＰ２２は細胞および組織内に未確定の機構により透過し、融合分子を運搬する能力をもつことが証明されている。たとえば、Ｆｒａｎｋｅｌらに発行された米国特許５，８０４，６０４、５，７４７，６４１、５，６７４，９８０、５，６７０，６１７および５，６５２，１２２号参照。これにはカーゴ分子の細胞内送達のための、９アミノ酸のＨＩＶ ＴＡＴ由来のポリペプチド（Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ）の使用が教示されている。
【００４６】
ｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ１−ＮＬＳおよび他のＭＰＰ間の類似性は、本発明者らにｈＰＥＲ１−ＭＰＰが膜透過能力を有するか否かの検討を急がせることになった。ここに示す免疫組織化学的および細胞学的データはｈＰＥＲ１−ＭＰＰが様々な細胞型においてＭＰＰとして機能することを指示している。ＨＰＥＲ１−ＭＰＰは核細胞質ならびに核小体において強力なフォーカル染色を示し、ｈＰＥＲ１−ＭＰＰの核下におけるアドレスは、核内に分散し、核に濃縮されていないｈＰＥＲ１（Ｐ１−ＦＬ）タンパク質とは異なることを示唆する。ｈＰＥＲ１−ＭＰＰの核透過は、負に荷電した残基の添加または細胞の４％ＰＦＡによる前固定ではその配列が逆転する条件下（逆ｈＰＥＲ１−ＭＰＰ）にも遮断されず（未公表の観察）、後者は透過が受容体および膜依存性であるとの考え方を支持する。これらの結果は、遅い、温度、エネルギーおよび受容体依存性機構を使用して細胞膜に結合し、それを横切る、シグナルペプチド配列由来と記載されている他のペプチドクラス（Ｈａｗｉｇｅｒ， Ｊ．， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９， １８９−９４ （１９９７））、ＤＮＡ抗体（Ｄｅｎｇ， Ｓ．Ｘ．ら， Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２， ４１５−４２３ （２０００））、および他のタンパク質ドメイン（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ， Ｍ．ら， Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ． ３， ９９−１０３ （２０００））とは対照的である。
【００４７】
他のＭＰＰの同定は、膜ペプチド透過に必要な機構および構造的要求の理解の欠如により限られていた。特異的なペプチド構造および／または電荷が膜透過に重要と思われることはアラニン走査実験で証明され、アルギニン７における単一アミノ酸の変化がＭＰＰの可能性に重要であるように思われる。野生型ｈＰＥＲ１−ＭＰＰを生存細胞または前固定および透過化細胞中、修飾Ｐ１−Ｒ７Ａと比較すると（データは示していない）、Ｐ１−Ｒ７Ａのみが透過性を欠いたが、核標的化において細胞をいったん透過性にすれば透過性を示す。この所見はアルギニン７が構造に基づく透過に主要な役割を有し、したがって将来の構造−機能の研究に有用なモデルを提供する。ＴＡＴペプチドに対する構造決定基は報告されていないが、Ａｎｔｐの場合２つのトリプトファン残基を２つのフェニルアラニンで置換すると透過性は消失する（Ｌｅ Ｒｏｕｘ Ｉら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ９０， ９１２０−９１２４ （１９９３））。ｈＰＥＲ１−ＭＰＰはトリプトファン残基を含有しないので、これら２つのペプチドの間の膜透過は異なる機構により起こるものと思われる。
【００４８】
完全長のＨＩＶ ＴＡＴおよびＶＰ２２は、いずれも古典的分泌シグナル配列を欠き、したがって非古典的機構によってエキスポートされるもので、また非古典的様式で細胞内に「形質導入」によるインポートされうるものである（Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ， Ａ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １２， ４００−４０６ （２０００））。したがって多分、ｈＰＥＲ１が概日時計情報を、隣接するＳＣＮニューロンまたは概日アウトプット経路に完全長ＴＡＴおよびＶＰ２２タンパク質の場合と同様な「形質導入」機構によって配布すると推測することは興味がある。しかしながら単にタンパク質の本体内に膜透過性配列を有することでは、完全長Ａｎｔｐタンパク質が細胞からのエキスポートも、また細胞内へのインポートもされないように、膜透過能力は必ずしも付与されない。すなわち、Ａｎｔｐペプチドの細胞内への非古典的透過が生理学的な関連をもつとは考え難く、Ａｎｔｐ同様、完全長ｈＰＥＲ１が細胞膜透過タンパク質であることを示唆する証拠もない。しかしながら、これらの所見は、本発明者に他のＭＰＰ含有タンパク質を探索する元気を与えることになった。タンパク質データベースを核タンパク質内に塩基性残基のストリングを同定するために設計されたアルゴリズムで探索することによって、本発明者らは、膜透過性ペプチドの可能性がある何百もの領域を明らかにし、幾つかの種から４つの付加的ＭＰＰを見出したのである（図５参照）。これらのおよび付加的なデータベースの採掘探索により、ＭＰＰ様の配列が共通であり、広い様々なタンパク質中に存在することが示唆される。しかしながら、レポーター配列に融合した場合、常に核の局在を付与するとは限らない多くのＮＬＳ候補と同様に（Ｍｏｒｏｉａｎｕ， Ｊ．， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３２−３３， ７６−８３ （１９９９））、ＭＰＰの可能性は実験により機能的に決定しなければならない。形質導入または非形質導入いずれのタンパク質もＭＰＰ領域をコードできることは明らかであるように思われるが、ＭＰＰ様配列を含有するタンパク質が正常な生理学的過程を活性化し、急速に細胞ドメイン内に細胞内局在するためにこれらのドメインを使用するかどうかという所定の問題が残る。形質導入現象に伴う効率は、とくに細胞内情報の急速な送達が重要な場合に細胞の同調、発生および分化の規範の場合と同様に重要である。
【００４９】
ＭＰＰが細胞内コンパートメントに分子を運搬する能力は十分に確かめられつつある（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ， Ｍ．ら， Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ． ３， ９９−１０３ （２０００）；Ｄｅｒｏｓｓｉ， Ｄ．ら， Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ８， ８４−８７ （１９８８））。他のＭＰＰと同様に、ｈＰＥＲ１−ＭＰＰおよびここに同定された他のＭＰＰは所定の化合物たとえば大きな分子、すなわちペプチド、タンパク質、脂質、ポリサッカライド、他の有機分子を迅速かつ効率的に細胞内に送達することができる。ここに示すデータは、セロトニンおよび／またはアドレナリン７ＴＭ作動性受容体由来のペプチドと融合したｈＰＥＲ１−ＭＰＰがリガンド活性化受容体の作用を模倣することを示し、ｈＰＥＲ１−ＭＰＰが所定の化合物を細胞内コンパートメントに局在させることを確認し、生理学的に関連するシグナリングが所定の化合物に連結したＭＰＰによって開始できるとの考え方を支持する。ここに記載の方法を用い、本発明は標的に連結したＭＰＰを使用する標的の有効性および／または特異的な酵素もしくは酵素に連結したＭＰＰの使用を、酵素機能不全の結果または経路内における改変、補正もしくは補償方法としての治療戦略に拡大することができる。さらに、特異的受容体に連結したＭＰＰを用いる治療戦略は、機能不全受容体または正常もしくは異常受容体の発現の改変、補正または補償方法として使用することができる。
【００５０】
ここに提供された結果を考え合わせると、哺乳動物タンパク質、さらに特定すればヒト核タンパク質によってコードされたＭＰＰはその細胞透過が膜依存性であり、おそらくペプチド構造に依存することを示している。ｈＰＥＲ１−ＭＰＰは特異的な細胞下部位に標的化されるが、他の巨大分子を細胞内標的に効率的に送達する可能性がある。
【００５１】
さらに重要な点は、本発明はまたＮＬＳドメインに基づく新規なＭＰＰマッピングの最初の例を提供し、多くのＭＰＰ様の領域が、広く多様なタンパク質を含むことを示唆している。ここに提供されたデータはＭＰＰがＮＬＳの部分に基づくかもしくはＮＬＳの部分と重複するか、または新規なペプチドであることを示している。
【００５２】
ＮＬＳ配列を同定する方法は本技術分野では周知であり、ネイティブなタンパク質が核内に移行する能力の付与として以前に同定されたＮＬＳを包含するか、または以前に同定されたＮＬＳとの実質的な配列ホモロジーに基づいている。また、ＮＬＳは配列欠失実験によって同定されてもよい。たとえば、Ｌｕｏ， Ｊ．Ｃ．， Ｓｈｉｂｕｙａ， Ｍ．， Ａ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｏｆ ｂｉｐａｒｔｉｔｅ−ｔｙｐｅ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｐｏｘｉａ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒｓ （１α， ２α ａｎｄ ３α）， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００１ Ｍａｒ ２２； ２０ （１２）： １４３５−４４またはＨｏｄｅｌ， Ｍ．Ｒ．， Ｃｏｒｂｅｔｔ， Ａ．Ｈ．， Ｈｏｄｅｌ， Ａ．Ｅ．， Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００１ Ｊａｎ １２； ２７６ （２）： １３１７−２５ 参照）。
【００５３】
本発明の好ましい膜透過ペプチド（ＭＰＰ， ペプチド形質導入ドメインまたは「ＰＴＤ」としても知られる）は小さなポリペプチドであり、哺乳動物または酵母タンパク質のＮＬＳに由来するか、またはそのＮＬＳと重複してもよい。好ましい哺乳動物タンパク質は、ヒト、霊長類、マウスまたはラットである種のタンパク質である。一般にＮＬＳが由来するタンパク質と処置される細胞は同じ種のものであることが好ましい。ヒトの細胞を処置する場合には、とくにヒト種の細胞の使用が好ましい。ＮＬＳは広範なクラスの酵素内に見出され、核タンパク質、転写因子、サイトカインおよびキナーゼに限定されるものではない。好ましいＭＰＰは核タンパク質または転写因子に由来するものである。また本発明のＭＰＰは配列−（Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ）ｎ−（式中、ｎは１〜７の整数であり、Ｘはそれぞれ独立にアルギニン、ヒスチジンまたはリジンからなる群より選択される）からなる小さなペプチドである。小さなＭＰＰを使用するのが好ましく、したがってｎは１〜５の整数であることが好ましく、１〜３の整数であることがさらに好ましい。適当なＭＰＰが選択された実施態様を表１および実施例５に示す。
【００５４】
ＭＰＰおよび／または所定の化合物は別個に、たとえば化学合成経路によって化学的に合成し、市販されている試薬が利用できる。別法として、ＭＰＰおよび／または所定の化合物がポリペプチドである場合には、組換え技術によって合成し、既知の方法によって精製してもよい。宿主細胞、クローニングベクター、プロモーターおよびオリゴヌクレオチドリンカーは周知であり、市販品を利用することができる。組換え技術を使用する方法論および精製方法も周知である（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ４ Ｖｏｌｓ． Ｗｉｌｅｙ参照）。一般に、組換え技術は大規模な製造に適していて、大量生産が経済的である。また、ＭＰＰは特異的なプロテアーゼによる前駆体の分解によっても得ることができる。
【００５５】
所定の化合物は、ＭＰＰのＮ−末端またはＣ−末端に化学的架橋を介してＭＰＰに結合または連結させて、ＭＰＰと所定の化合物とを、たとえばジスルフィドまたはエステル結合させた複合（また融合ともいう）体とされる。別の実施態様において興味ある化合物がペプチドである場合は、ＭＰＰの融合配列と所定の化合物をコードするベクターを、そのベクターの発現を可能にする条件下に、ペプチドを宿主細胞により組換え技術で合成してＭＰＰと所定の化合物の融合体とされる。
【００５６】
他の実施態様においては、ＭＰＰと所定の化合物は化学リンカーを介して結合または連結させてもよい。化学リンカーは本技術分野において周知であり、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＭＢＳ）、Ｎ−エチルオキシカルボニル−２−エチルオキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、Ｎ−イソブチルオキシ−カルボニル−２−イソブチルオキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＩＩＤＱ）が包含されるがそれらに限定されるものではない。好ましいリンカーはまた、単量体化合物たとえば単一アミノ酸とくに好ましくは側鎖の小さいアミノ酸、または小さなポリペプチドもしくは数個のアミノ酸のポリマー化合物である。好ましいポリペプチドリンカーは１５個のアミノ酸またはそれ未満、さらに好ましくは１０個のアミノ酸またはそれ未満である。さらに好ましいポリペプチドリンカーは５個またはそれ未満のアミノ酸である。別の実施態様においては、リンカーは小さなポリペプチド鎖をコードする核酸、好ましくは１５個のアミノ酸またはそれ未満をコードする核酸である。さらに好ましいリンカーは１０個のアミノ酸またはそれ未満の小さなポリペプチド鎖をコードする核酸である。なおさらに好ましいリンカーは５個またはそれ未満のアミノ酸の小さなポリペプチド鎖、たとえばＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−ＬｅｕまたはＧｌｙ等をコードする核酸である。
【００５７】
組換え技術は上述のように、融合ＭＰＰ、リンカーおよび所定の化合物の発現に使用することが可能であり、本技術分野において周知である。
【００５８】
他の実施態様においては、リンカーは切断可能なリンカーとすることが可能であり、選択された組織または細胞に送達されたならば、ＭＰＰと所定の化合物の切断が起こる。このような実施態様においては、細胞または組織は、切断可能なリンカーを切断することができる内因性（天然に存在する酵素または組換え操作によって発現する酵素）、または外因性（たとえば、注射、吸収等）酵素である。切断に適当な酵素の使用には、たとえばＫＥＸ２プロテアーゼ認識部位（Ｌｙｓ， Ａｒｇ）を、グルコアミラーゼと所望のポリペプチドの間に挿入して、ネイティブなアスペルギルスＫＥＸ２様プロテアーゼの活性の結果として融合タンパク質から所望のポリペプチドのインビボ放出を可能にする例が包含される（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓら， １９９１； Ｂｒｏｅｋｈｕｉｊｓｅｎら， １９９３； Ｗａｒｄら， １９９５）。切断可能なリンカーペプチドの他の例には認識配列Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓからなり、その融合タンパク質はエンテロキナーゼで切断することができる。
【００５９】
別法として、リンカーは生物分解性とすることも可能であり、所定の化合物はＭＰＰと所定の化合物の融合体から、加水分解および／または細胞内部における酵素的切断によって脱着される。たとえば、腫瘍は特異的なプロテアーゼを発現することが多く、細胞毒素物質のプロドラッグの送達に使用される。リンカーはライソソームプロテアーゼたとえばカテプシンＢ、ＣまたはＤに対し選択的でありうる。プロドラッグの送達と引き続くそれらの活性化は良く知られたところで、このようなアプローチは早過ぎるリンカーの血中での加水分解により有意に低い全身毒性をもたらし、結果として大量の所定の化合物、すなわちドラッグまたは細胞毒性物質が腫瘍部位に送達される。たとえば、Ｈｉｇｕｃｈｉ， Ｔ． ＆ Ｓｔｅｌｌａ， Ｖ．によりプロドラッグについての完全な考察が提供されている（Ｐｒｏ−ｄｒｕｇ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ａ．Ｃ．Ｓ． Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ のＶｏｌ． １４， １９７５参照）。容易に切断可能な基の例にはアセチル、トリメチルアセチル、ブタノイル、メチルスクシノイル、ｔ−ブチルスクシノイル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、ベンゾイル、３−アミノシクロヘキシリデニル等が包含される。
【００６０】
所定の化合物は任意の有機分子であり、小有機分子、ペプチド、リポタンパク質および他の修飾タンパク質、ポリサッカライド、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドならびに医薬的、予防的、診断的および／または研究的に興味があると考えられる任意の他の化合物が包含される。所定の化合物は医薬的に既知の性質を有する小さい有機分子であってよく、したがって本発明は患者を所定の化合物で処置する方法として使用することができる。また、所定の化合物は機能未知の新規なタンパク質であってもよく、したがって本発明は所定の化合物の機能を同定する方法として使用することができる。他の実施態様においては、所定の化合物はアンチセンス分子であり、したがって本発明は転写を変化させる方法として使用することができる。さらに他の実施態様においては、所定の化合物はプロドラッグであり、たとえば不活性型であるが細胞内で活性化することができる。他の実施態様においては所定の化合物は細胞毒性物質であり、したがって本発明は細胞毒性物質を細胞に送達する方法として使用することができる。所定の化合物にはまた、複合ＭＭＰを発生させるのに有用であり、新しいＭＭＰの同定のためのタンパク質を検出できる検出可能なタンパク質が包含される。検出可能なタンパク質には、ＧＦＰ、β−ガラクトシダーゼ、放射標識タンパク質およびビオチン化タンパク質、細胞に検出可能な表現型を付与できるタンパク質が包含される。
【００６１】
本発明は、所定の化合物をインビトロ、エキソビボまたはインビボにおいて細胞内に送達するために使用できる。たとえば送達は、インビトロにおいては、複合したＭＰＰと所定の化合物を細胞に細胞外添加することによって行われる。送達は、エキソビボにおいては、複合したＭＰＰと所定の化合物を、患者から取り出した培養サンプルたとえば血液、組織または骨髄に細胞外または外因的に添加し、この処置されたサンプルを患者に戻すことによって行われる。インビボにおいては、送達は複合したＭＰＰと所定の化合物を患者への経皮的投与、吸入、または注射によって行われる。
【００６２】
本発明においては任意の型の細胞が使用できる。細胞は哺乳動物、細菌、ウイルスまたは酵母の起源とすることができる。細胞は腫瘍のスクリーニングに一般的に使用される培養細胞とすることができる。培養細胞の例にはＣＨＯ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨｅＬａ およびＮＩＨ３Ｔ３が包含される。細胞はＭＰＰ複合体によるエキソビボ処置に適当な患者からの培養細胞で、患者に再導入される細胞とすることができる。細胞は処置される患者と同じ患者またはそれ以外の患者からの細胞であっても良い。
【００６３】
ＭＰＰと所定の化合物との複合体からなる本発明の組成物は治療、予防、診断または研究の目的で使用される。組成物にはさらに、アジュバント、安定剤等、組成物の取り扱い、安定性および保存性を改良する添加物からなる。
【００６４】
新規なＭＰＰを同定する方法も本発明の一部である。膜透過性ペプチドを同定するための一方法は、配列−（Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ）ｎ−（式中、ｎは１〜７の整数であり、Ｘはそれぞれ独立にアルギニン、ヒスチジンまたはリジンからなる群より選択される）および検出可能なタンパク質たとえばＧＦＰ、β−ガラクトシダーゼ等からなるペプチド接合体を作り出し、このペプチド接合体を細胞に添加し、ペプチド接合体が細胞質および／または細胞核内に局在するか否かを決定する。膜透過性ペプチドを同定する他の方法では、哺乳動物または酵母タンパク質の核局在配列に由来するか、またはそれと重複するペプチドと、検出可能なタンパク質たとえばＧＦＰ、β−ガラクトシダーゼ等からなるペプチド接合体を作り出し、ペプチド接合体を細胞に添加し、ペプチド接合体が細胞質および／または細胞核内に局在するか否かを決定する。
【００６５】
アミノ酸に対しては次の略号を使用する。
ＡはＡｌａまたはアラニンを示す。
ＣはＣｙｓまたはシステインを示す。
ＤはＡｓｐまたはアスパラギン酸を示す。
ＥはＧｌｕまたはグルタミン酸を示す。
ＦはＰｈｅまたはフェニルアラニンを示す。
ＧはＧｌｙまたはグリシンを示す。
ＨはＨｉｓまたはヒスチジンを示す。
ＩはＩｌｅまたはイソロイシンを示す。
ＫはＬｙｓまたはリジンを示す。
ＬはＬｅｕまたはロイシンを示す。
ＭはＭｅｔまたはメチオニンを示す。
ＮはＡｓｎまたはアスパラギンを示す。
ＰはＰｒｏまたはプロリンを示す。
ＱはＧｌｎまたはグルタミンを示す。
ＲはＡｒｇまたはアルギニンを示す。
ＳはＳｅｒまたはセリンを示す。
ＴはＴｈｒまたはスレオニンを示す。
ＶはＶａｌまたはバリンを示す。
ＷはＴｒｐまたはトリプトファンを示す。
ＹはＴｙｒまたはチロシンを示す。
タンパク質は左側にＮ−末端がくるように記載する。
【００６６】
以下の略号を使用する。
「ｖ／ｖ」：容量対容量
「ＥＹＦＰ」：配列Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏのペプチドフラグメント
「ＯＲＦ」：オープンリーディングフレーム
「ＰＣＲ」：ポリメラーゼ連鎖反応
「ＣＨＯ」：チャイニーズハムスター卵巣細胞
「ＨＥＫ２９３Ｔ」：ヒト胚腎臓細胞
「ＨｅＬａ」：上皮腺癌細胞
「ＮＩＨ３Ｔ３」：スイスマウス胚線維芽細胞
「ＤＭＳＯ」：ジメチルスルホキシド
「ＦＣＳ」：ウシ胎児血清
「ＤＭＥＭ」：ダルベッコの改良イーグル培地
「ＰＢＳ」：リン酸緩衝食塩溶液
「ＢＳＡ」：ウシ血清アルブミン
「Ｃ−末端」：カルボキシ末端
「Ｎ−末端」：アミノ末端
「ＰＴＤ」：ペプチド形質導入ドメイン
「ＧＰＣＲ」：Ｇ蛋白共役受容体
「ＴＭ」：ＧＰＣＲの膜貫通ドメイン
「Ｔ」：ＧＰＣＲの細胞内ループ
「５ＨＴ２Ａ」：セロトニン受容体２Ａ
「ｍＡｂ」：モノクローナル抗体
【００６７】
【実施例】
実施例１　ｈＰｅｒ１内のＮＬＳの同定
プラスミドの構築
ここに記載するすべてのｈＰｅｒ１フラグメントは、ＥＹＦＰへのインフレームＣ−末端融合体としてクローン化する。ＥＹＦＰ−ｈＰｅｒ１ ＯＲＦ、Ｐ１−ＮおよびＰ１−ＮＸ（図１Ａ）はＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ消化フラグメントをＥＹＦＰ−Ｃ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入して作り出される。他のフラグメントは完全長ｈＰｅｒ１ｃＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ＥＹＦＰ−Ｃ１ベクターにサブクローニングした。各フラグメントの最初および最後の残基は図１Ａに示す。すべての構築体は自動ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００６８】
細胞培養およびＤＮＡトランスフェクション
ＣＨＯ、ＨｅＬａおよび２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、５０単位／ｍＬのペニシリン、５０μｇのストレプトマイシンおよび４ｍＭのＬ−グルタミン酸を補充したダルベッコの改良イーグル培地（以下、完全ＤＭＥＭと呼ぶ）中に３７℃、５％ＣＯ２で維持する。細胞のトランスフェクションは２−ウエルのＬａｂ−Ｔｅｋカバーグラス（Ｎｕｎｃ Ｉｎｃ．）中でＬＩＰＯＦＥＣＴ−ＡＭＩＮＥＴＭ（登録商標）試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて製造業者の説明書に従って行った。
【００６９】
ペプチドおよびペプチドの内在化
ペプチドは商業ベースの業者（Ｂｉｏ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）によって合成された。ペプチドの内在化には、細胞を２−ウエルＬａｂ−Ｔｅｋカバーグラス中２×１０５細胞／ウエルの濃度に取り一夜培養する。ペプチドをＰＢＳで指示された濃度に希釈したＤＭＳＯ中に溶解する。単層の細胞を適当なペプチド／ＰＢＳ溶液と１μＭの標準濃度において、とくにほかに指示がなければ室温（ＲＴ）で１０分間インキュベートする。４℃の実験では、プロトコールはすべてのインキュベーションを４℃で固定操作が終了するまで実施した以外はすべて同一とした。
【００７０】
免疫蛍光および顕微鏡検査
ＥＹＦＰ融合タンパク質の発現および細胞下局在の直接検出には、トランスフェクトされた細胞を直接固定しないで、またはＰＢＳ中４％（ｖ／ｖ）のホルムアルデヒドにより４℃で２０分間固定し、ついで洗浄したのちに直接検査した。ビオチン化ペプチドの間接的な免疫検出には、固定した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により４℃で２０分間浸透させたのち、ＰＢＳ中２％ＢＳＡで室温においてブロックした。ついで細胞をＰＢＳで洗浄し、０．２％ Ｔｗｅｅｎ ２０に１：４００で希釈し、ＰＢＳ中室温で１時間、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（登録商標， Ｓｉｇｍａ）またはＡｌｅｘ ４９９（分子プローブ）とインキュベートした。２×５分間ＰＢＳで、ついで１回ＰＢＳ中０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により室温で２０分間洗浄した。一部の実験では、核をＰＢＳ中５０ｎｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８ （Ｓｉｇｍａ） または３μｇ／ｍＬのプロピジウムヨウ化物で染色した。蛍光の細胞下局在をＯｌｙｍｐｕｓ顕微鏡上で分析した。共焦点像はＺｅｉｓｓ共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ ｐｈｏｉｂｏｓ １０００）で撮影した。
【００７１】
ＰＥＲ１の核内移入がその重要な機能であることは周知であるが、標準的なプロフィル走査プログラムを用いたのではＮＬＳ候補は同定されなかった（Ｓｈｅａｒｍａｎ， Ｌ．Ｐ．ら， Ｎｅｕｔｒｏｎ １９， １２６１−１２６９ （１９９７）， Ｙａｇｉｔａ， Ｋ．ら， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １４， １３５３−１３６３ （２０００））。ｈＰＥＲ１のＮＬＳを実験的に決定するためには、３つの完全長ｈＰＥＲ１（Ｐ１−ＦＬ）を構築し、Ｐ１−Ｎ、Ｐ１−ＮＭおよびＰ１−Ｃと命名した（図１Ａ）。ついでこれらの構築体がＣＨＯ中の核に局在する能力を分析した。生存細胞中のｈＰＥＲ１の検出を促進するためにはＥＹＥＰタグを使用したが、Ｎ−末端Ｆｌａｇタグで作成されたｈＰＥＲ１構築体は同一の細胞学的分布パターン提供するのでｈＰＥＲ１融合タンパク質の局在には見かけ上寄与しなかった（データは示していない）。一過性のトランスフェクション後、Ｐ１−ＦＬおよびＰ１−ＮＭタンパク質の両者は、トランスフェクトした細胞の核にトランスフェクション後１０時間までに発現したが、Ｐ１−ＮおよびＰ１−Ｃは細胞質中のみに蓄積した（図１Ｂ）。ＥＹＦＰベクターの対照は核および細胞質の両者に分散した。これらの結果はｈＰＥＲ１中の機能性ＮＬＳが本発明者らにより領域Ｍと名づけられたＰ１−ＮおよびＰ１−Ｃの間に局在することを示すものである。
【００７２】
さらにＮＬＳを領域Ｍ（アミノ酸４８１−８９０）に局在化させるため、一連の８つの欠失構築体、Ｐ１−Ｆ１〜Ｐ１−Ｆ８を作り出し、各突然変異体の細胞下分布を、図１ＡおよびＢに示すようにしてアッセイした。領域Ｍのアミノ酸５８１（Ｐ１−Ｆ２）から位置８２１（Ｐ１−Ｆ７）までの順次欠失によって核の局在化を生じた。更なるアミノ酸８２１から８４１（Ｐ１−Ｆ８）までの欠失は、トランスフェクトされた細胞内にＥＹＦＰベクターの対照の場合と類似の局在化パターンを有する分散性の蛍光パターンを生じた。これらのデータはＮＬＳがアミノ酸８２１と８９０の間に存在し、Ｍ領域のＣ−末端に位置することを示している。この観察はｈＰＥＲ１アミノ酸８３０−８４５を含有する付加的なＥＹＦＰ融合タンパク質Ｐ１−ＮＬＳの構築によって確認された。この領域はＮＬＳとして機能すると思われる塩基性残基のストリングを含有する（Ｗｅｉｓ， Ｋ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２３， １８５−１８９ （１９９８）， Ｔｒｕａｎｔ， Ｒ． ＆ Ｃｕｌｌｅｎ， Ｂ．Ｒ．， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９， １２１０−１２１７ （１９９９））。予想通り、Ｐ１−ＮＬＳはトランスフェクトされた細胞の１００％に核局在を示した（図１Ｂ）。付加的な融合構築体における他のＰＥＲ１領域では核の局在化は起こらなかった（データは示していない）。したがって本発明者らはｈＰＥＲ１のＮＬＳ（ｈＰＥＲ１−ＮＬＳ）はアミノ酸８３０−８４５内に局在すると結論した。興味深いことには構築体Ｐ１−Ｆ１はそれがＮＬＳを含有するかどうかとは無関係に、密に細胞質への局在パターンを示し、この領域も細胞質局在ドメインを含んでまだ同定されていないという公表所見を支持している（Ｖｉｅｌｈａｖｅｒ， Ｅ．ら， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２０， ４８８８−４８９９ （２０００））。配列のアラインメントは、ｈＰＥＲ１−ＮＬＳはヒトおよびマウスＰＥＲ１タンパク質の間で保存されていることを示すが（図１Ａ）、他のＮＬＳ候補または他のヒト、マウスもしくはショウジョウバエのＰＥＲでは保存されていなかった。本発明者らの研究の完了後に、Ｖｉｅｌｈａｖｅｒら （２０００） は本発明者らが同定した１６アミノ酸配列を含有するさらに長いマウスＰＥＲ１−ＮＬＳを同定し（Ｖｉｅｌｈａｖｅｒ， Ｅ．ら， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２０， ４８８８−４８９９ （２０００））、すなわち本発明者らの発見を支持している。
【００７３】
実施例２　ｈＰＥＲ１−ＮＬＳはＭＰＰをコードする
３つの同定された遺伝子によりコードされたＭＰＰ（ＴＡＴ， ＡｎｔｐおよびＶＰ２２）に共通な２つの特徴は、それらが核タンパク質に由来すること、およびそれらが塩基性アミノ酸残基から構成されることである（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ， Ｍ．ら， Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ． ３， ９９−１０３ （２０００））。ｈＰＥＲ１も、そのＮＬＳが塩基性アミノ酸に富んでいる核タンパク質である（ＳＲＲＨＨＣＲＳＫＡＫＲＳＲＨＨ， 図１参照）。これらの類似性が、本発明者らをｈＰＥＲ−ＮＬＳもＭＰＰとして機能するか否かの決定に導くことになった。この仮説を試験するため、本発明者らは数種のＮ−末端ビオチン化ペプチド；ｈＰＥＲ１−ＭＰＰ、Ｆｌａｇに標的化したｈＰＥＲ１−ＭＰＰ、Ｆｌａｇに標的化したＴＡＴ−ＰＴＤ、Ｆｌａｇ−Ｆｌａｇ単独を合成した（下記表１参照）。
【００７４】
【表１】
2004512275.tif 000003
【００７５】
ペプチドはそれらの細胞膜を透過する能力についてアッセイした。細胞内の局在を、ストレプトアビジンで標識したＡＬＥＸＡ試薬による直接染色または抗−Ｆｌａｇ ｍＡｂによる間接染色、ついで標識した二次抗体の添加によりアッセイした。培養細胞に１０μＭのｈＰＥＲ１−ＭＰＰ、Ｆｌａｇ−ｈＰＥＲ１−ＭＰＰおよびＦｌａｇ ＴＡＴ−ＰＴＤペプチドを添加した場合、１００％の細胞に迅速な透過が見出された（図２Ａおよび図５）。いずれの検出法によっても、ｈＰＥＲ１−ＭＰＰ、Ｆｌａｇ−タグ ｈＰＥＲ１−ＭＰＰおよびＦｌａｇタグＴＡＴ−ＰＴＤは細胞質全体に分散性に分布しているのが観察されたが、核および核小体内に分離した焦点のようにみえる細胞下ドメイン内に濃縮されていた。これに反して、ビオチン化陰性対照ペプチド、Ｆｌａｇ−ＦｌａｇおよびｈＰＥＲ１領域に由来するいくつかの他のペプチドは、背景の染色とほとんど識別不可能であり、高濃度でも、核または核小体は染色されなかった（データは示していない）。共焦点顕微鏡検査を用いてＦｌａｇ−タグｈＰＥＲ１−ＭＰＰの細胞内および核内染色、および陰性対照ペプチドは内在化されないことを確認した（図２Ａ）。
【００７６】
ｈＰＥＲ１−ＭＰＰは細胞膜を迅速に透過し、ＴＡＴ−ＰＴＤペプチドと類似の効率で核領域内に局在した（図２Ｂ）。同一の結果がＣＨＯ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３およびラットの一次表層ニューロンを用いて得られ（データは示していない）、細胞型依存性の透過を示した。
【００７７】
ｈＰＥＲ１−ＭＰＰの内在化は迅速に（５分以内に）、４℃および３７℃においてもまた細胞膜を固定したのちにも、同じ効力で起こる（データは示していない）。すなわち、ｈＰＥＲ１のアミノ酸配列８３０−８４５は融合タンパク質における核／核小体局在シグナルタンパク質として、ならびにＭＰＰとして機能し、膜透過は旧来の受容体−仲介エンドサイトーシス機構に依存しない。
【００７８】
実施例３　アルギニン７はｈＰＥＲ１−ＭＰＰ活性に必須である
今日まで、ＭＰＰが細胞膜を横切る機構ならびに基本構造は明らかにされていなかった。したがって本発明者らは、膜透過の可能性に必須の性質を維持するために重要な鍵となる残基がｈＰＥＲ１−ＭＰＰ内にあるか否かを探索することとした。本発明者らは、ｈＰＥＲ１−ＭＰＰ中の各アミノ酸を別個にアラニンに置換し（表２）、これらの突然変異ペプチドが、野生型ｈＰＥＲ１−ＭＰＰに比較して、生存細胞を透過する能力についてアッセイした。
【００７９】
【表２】
2004512275.tif 000004
【００８０】
図３に示すように、大部分の単一アラニン置換は野生型ペプチドに比べて、膜透過能にほとんど影響を示さない。しかしながら、アルギニン７をアラニンに変えると（Ｒ７Ａ）、検出可能な細胞学的シグナルは、陰性対照ペプチドで観察される程度まで低下した。すなわち、アルギニン７のアラニンへの突然変異はｈＰＥＲ１−ＭＰＰの膜透過性を有意に低下させた。アルギニン７をグルタミン酸に変えたのちにも（Ｒ７Ｅ）同じことが観察された（データは示していない）。さらに、ｈＰＥＲ１−ＭＰＰからＮ−末端セリンおよび２個のＣ−末端ヒスチジンを同時に欠失させると（ｈＰＥＲ１−ＭＰＰ１３）、ペプチドの陽性膜透過の可能性に対してはほとんど全体的に作用を示さなかった（図３）。
【００８１】
アルギニン７残基はｈＰＥＲ１−ＭＰＰの細胞透過能に重要な役割を果たしている。したがって、本発明者らはＲ７Ａ突然変異が融合タンパク質Ｐ１−ＮＬＳの核局在に影響するかどうかを決定することを探索した。融合タンパク質、Ｐ１−Ｒ７Ａ（アルギニン７がアラニンに突然変異）でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞は、野生型Ｐ１−ＮＬＳに類似の強力な核染色を示した（データは示していない）。Ｐ１−Ｒ７Ａ突然変異融合タンパク質においては、核局在は正常のようにみえるが、核小体への細胞下での標的化は破壊されている（データは示していない）。これらのデータは、膜透過性および核小体への標的化が単一のＲ７アミノ酸残基によって影響されることを示し、またｈＰＥＲ１−ＮＬＳの核転座は別個の異なる決定基を有することを示す。
【００８２】
実施例４　ｈＨＰＥＲ１−ＭＰＰによる機能性分子の送達
ＭＰＰの特徴の一つはタンパク質およびペプチドを細胞内に運搬する能力である。本発明者らは、Ｆａｗｅｌｌら １９９４（Ｆａｗｅｌｌ， Ｓ．ら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１， ６６４−６６８ （１９９４））に記載されたように、ｈＰＥＲ１−ＭＰＰのβ−ガラクトシダーゼへのカップリングおよび培養液中の細胞への融合タンパク質の送達に成功した。しかしながら、ＭＰＰの機能的有用性をさらに拡大するため、本発明者らはｈＰＥＲ１−ＭＰＰを生理学的に関連する生物学的に活性なペプチドとの融合体について試験した。Ｗｅｓｓおよび共同研究者（１９９３）らはＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーの保存された膜貫通セグメント７（ＴＭ７）の機能的役割を提示している。ＴＭ７とともに、第三の細胞内ループ（Ｉ３）がＧＰＣＲカルシウムシグナリングにおいて重要な役割を果たしている（Ｗｅｓｓ， Ｊ．Ｍ．ら， ＥＭＢＯ Ｊ． １２， ３３１−３３８ （１９９３））が、細胞内ループ１および２（Ｉ１およびＩ２）は重要でなないように思われる。セロトニン受容体、５ＨＴ２Ａを用いて、本発明者らはｈＰＥＲ１−ＭＰＰおよびＴＡＴ−ＰＴＤのＩ１およびＴＭ７ドメインから設計されたペプチドとの融合での受容体を活性化する能力について実験的に試験した。ビオチン化ペプチドｈＰＥＲ１−ＭＰＰ ＴＭ７、ＴＡＴ−ＰＴＤ ＴＭ７、ｈＰＥＲ１−ＭＰＰ Ｉ１、ＴＡＴ−ＰＴＤ Ｉ１、ｈＰＥＲ−ＭＰＰ、ＴＡＴ−ＰＴＤ、ＴＭ７またはＩ１を１０μＭの濃度で、５ＨＴ２Ａ受容体ＣＨＯ安定細胞系とインキュベートした、ペプチドの膜透過をストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ ５９４を用いて上述のようにアッセイした。図４Ａに示すように、受容体シグナリングは、カルシウム応答のレベルで測定して、外因性セロトニン、ｈＰＥＲ１−ＭＰＰ ＴＭ７およびＴＡＴ−ＰＴＤ ＴＭ７の添加により活性化された。しかしながら、ＴＭ７単独または他のいずれのペプチドもカルシウム応答を発生できなかった。さらに、ｈＰＥＲ１−ＭＰＰ ＴＭ７およびＴＡＴ−ＰＴＤ ＴＭ７による受容体の活性化はペプチドの濃度に依存する（図４Ｂ）。活性化ペプチド、ＴＭ７、ｈＰＥＲ１−ＭＰＰまたはＴＡＴ−ＰＴＤとの融合体の添加濃度を増大させると、用量依存的様式でカルシウム応答を生じる。ＴＡＴ−ＰＴＤ ＴＭ７は ｈＰＥＲ１−ＭＰＰ ＴＭ７よりも強力な５ＨＴ２Ａ受容体のアクティベーターであるように思われる。この結果の簡単な説明は、ＴＡＴ−ＰＴＤ ＴＭ７が細胞質に ｈＰＥＲ１−ＭＰＰ ＴＭ７より多く局在している、またはｈＰＥＲ１−ＭＰＰ ＴＭ７より大きな細胞透過能力を有するものであるが、本発明者らはそのようなことは観察しなかった。本研究室において、また ｈＰＥＲ１−ＭＰＰ をβ−アドレナリン性活性化ペプチドと融合させて使用して同様の結果を得た（データは公表していない）。これらのデータは ｈＰＥＲ１−ＭＰＰが細胞膜を透過することを支持するのみでなく、それはタンパク質を細胞内コンパートメントに運搬し、生物学的なシグナル伝達現象を開始することを示すものである。
【００８３】
実施例５　他の遺伝子コードされたＭＰＰの同定
ｈＰＥＲ１は転写調節に関与することを計画した核タンパク質であり、またこれまで天然に存在するタンパク質に由来するすべてのＰＴＤは転写因子である（ＴＡＴ， ＡｎｔｐおよびＶＰ２２）ことから、本発明者らは、ゲノム内に他のＰＴＤ配列が存在するか否かを探索した。この目的では、本発明者らは２つのアプローチを使用した。最初に本発明者らは、すべて既知のおよび可能性のあるＮＬＳについてＮＣＢＩの非重複タンパク質データベースを探索した（表１， １０−１７）。本発明者らはＮＬＳアミノ酸配列に相当するペプチドを合成し、ペプチド形質導入についてアッセイした。表１および図５に示すように、合成した７つのペプチドの６つは、ｈＰＥＲ１−ＰＴＤおよびＴＡＴ−ＰＴＤと類似の膜透過特性を示した。これらのタンパク質は、甲状腺ホルモン受容体α−１、ホメオボックスタンパク質ＨＭＥ１およびプロト癌遺伝子タンパク質ＡＢＬ−１のヒトタンパク質に包含された。さらに（表１および図５）本発明者らは、これらのペプチド配列とＧＦＰの間にインフレームな融合タンパク質を創製し、ついでＣＨＯまたはＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした場合、すべての配列は融合タンパク質に核局在性を付与した。
【００８４】
本発明者らのＰＴＤを同定する第二のアプローチは、ＮＣＢＩの非重複タンパク質データベースコレクションを変性アルゴリズムによる探索を包含した（図５の脚注参照）。これらの探索パラメーターを用いて、本発明者らは５３３，２９１の配列を見出し、アルゴリズムの条件は１２９，１６９回（２４％）満足された。本発明者らの探索を「転写因子、サイトカインまたはチロシンキナーゼ」のいずれかを包含するように限定すると、８２８０の転写因子タンパク質配列が同定され、そのアルゴリズムパターンは７３７４回（８９％）生じ、２３３３のサイトカインタンパク質配列内にはそのパターンは４５０回（１９％）生じ、２５１３のチロシンキナーゼタンパク質内ではそのパターンは８４３回（３６％）生じた。アルゴリズムは核タンパク質内で最も頻繁に起こるので本発明者らは６つの「転写因子」配列についてＰＴＤと推定されるペプチドを合成して、細胞内に透過するそれらの能力をアッセイした。表１の結果１８−２３行および図３Ａに示すように、試験した６ペプチドの４つがｈＰＥＲ１−ＰＴＤおよびＴＡＴ−ＰＴＤに類似の膜透過性を示した。これらのタンパク質には２種のヒトタンパク質、ＨＥＮ１／ＮＳＬＣ−１およびＨＥＮ２／ＮＳＬＣ−２が含まれ、ニューロンの分化および発達に関与すると報告されている（Ｕｉｔｔｅｎｂｏｇａａｄ， Ｍ．， Ｐｅａｖｙ， Ｄ．Ｒ． ＆ Ｃｈｉａｒａｍｅｌｌｏ， Ａ．， １９９９）。ｂＨＬＨ遺伝子ＮＳＣＬ１の発現は小脳顆粒細胞の成長および分化の役割が示唆されている（Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｒｅｓ． ５７： ７７０−７８１； Ｌｉｐｋｏｗｉｔｚ， Ｓ．ら， １９９２）。ヒトＮＳＣＬ−１およびＮＳＣＬ−２遺伝子の比較構造特性。２つの塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス遺伝子は発達中の神経系（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７： ２１０６５−２１０７１）、ラットＨＮＦ−３（１７）およびショウジョウバエｃＡＭＰ依存性転写因子（１８）で発現した。さらに、本発明者らこれらのペプチドとこれらのペプチドとＧＦＰの間にインフレームな融合タンパク質を創製し、ついでＣＨＯまたはＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした場合、すべての配列は融合タンパク質に核局在性を付与した。これらの結果はＰＴＤ配列がＮＬＳ内にまたはそれと重複して見出されることを示している。しかしながら、すべてのＮＬＳは、ＳＶ４０、ｈＰＥＲ２、Ｃ−ＦＯＳ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｌ ａｎｉａ−６およびβＺｉｐ転写因子ＮＬＳにおいて明らかなようにＰＴＤではない（表１）。これらの結果はまたＰＴＤ配列がゲノムを通じて広く、とくに核タンパク質において使用されていることを示唆するものである。
【００８５】
実施例６　β−ガラクトシダーゼを有するｈＰＥＲ−ＰＴＤ
ＨＩＶ ＴＡＴ形質導入ペプチドの少なくとも一つの特徴は細胞または組織にタンパク質を運搬するその能力である。したがって、本発明者らは、ｈＰＥＲ１形質導入ペプチドがβ−ガラクトシダーゼを細胞内に運搬できるか否かを探索した。この実験を行うためには、本発明者らはＦｒａｎｋｅｌら（ＰＮＡＳ １９８９ （１９）： ７３９７−４０１）のプロトコールに従い、ｈＰＥＲ１−ＰＴＤまたはｈＰＥＲ−ＰＴＤ Ｒ７Ａ（Ａｒｇ７をＡｌａで置換）を完全長β−ガラクトシダーゼに化学的に連結し、これらの接合体およびβ−ガラクトシダーゼタンパク質単独をＣＨＯ細胞に形質導入する能力をアッセイした。図６のパネル１に示すように、ｈＰＥＲ−ＰＴＤとβ−ガラクトシダーゼの融合体とインキュベートした細胞はＸ−ｇａｌの添加後青色の着色によって示されるように、β−ガラクトシダーゼに対し陽性の酵素活性を示した。しかしながら、ｈＰＥＲ−ＭＰＰ Ｒ７Ａβ−ガラクトシダーゼもβ−ガラクトシダーゼタンパク質単独も、Ｘ−ｇａｌの添加後に青色に染色される反応性により示されないように、細胞を入れることができなかった（パネル２および３）。これらのデータは、ＴＡＴペプチドと同様、ｈＰＥＲ１−ＰＴＤは大きな（１２０ｋＤ）タンパク質を細胞内に運搬できることを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
ＰＡＳの位置、細胞質の局在、および核局在配列（ＮＬＳ， ただし図中には核局在ドメイン（ＮＬＤ）として示した） を示すｈＰＥＲ１融合構築体の模式図。融合構築体の名称および位置は左側に示す。数はｈＰＥＲ１タンパク質の最初および最後のアミノ酸残基である。各融合タンパク質の主要な蓄積部位は右側にまとめる。（ｎ）核、（ｎｏ）核小体、（ｃ）細胞質、（ｄｉｆｆ）散在性。すべての構築体はＮ−末端にＥＹＦＰをタグした。ヒトおよびマウスＰＥＲ１−ＮＬＳのアラインメントは最下部に示す。
【図１Ｂ】
図１Ａに記載のｈＰＥＲ１融合タンパク質の生存細胞における細胞性局在。ＣＨＯ細胞は各パネルの最上部に示した融合構築体によって一過性にトランスフェクトし、ＥＹＦＰレポーター（緑）細胞下局在をトランスフェクト１０時間後に蛍光顕微鏡法により可視化した。対照としてはＥＹＦＰベクター単独を用いた（５． ＥＹＦＰベクター参照）。
【図２Ａ】
ＣＨＯ細胞における膜透過性アッセイ。Ｎ−末端をビオチン化した合成ペプチド、ｈＰＥＲ１−ＰＴＤ、Ｆｌａｇ−ｈＰＥＲ−ＰＥＤ、Ｆｌａｇ−ＴＡＴ−ＰＴＤ（陽性対照）およびＦｌａｇ−Ｆｌａｇ（陰性対照）を、培養液中の生存ＣＨＯ細胞における細胞膜の透過能についてアッセイした。内在化したペプチドの細胞下局在はストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ ５９４（赤）または抗−ｆｌａｇ ｍＡｂ（緑）のいずれかによる二色染色法を用いて決定した。第三のカラムはオーバーレイ（黄色）である。さらに、細胞内および核内局在を確認するためには共焦点顕微鏡を用いた。共焦点造影の単一セクションを示す。
【図２Ｂ】
ビオチン化ペプチド， ｈＰＥＲ１−ＮＬＤ（ｈＰＥＲ１−ＰＴＤとしても知られる）の核標的化を、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ ５９４蛍光（緑）を用いてＴＡＴ−ＰＴＤおよび Ｆｌａｇ−Ｆｌａｇ（陰性対照）と比較した。核の染色には５ｎｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８（青、中央のカラム）を用いた。第三カラムは共焦点造影のオーバーレイである。
【図３】
ｈＰＥＲ１−ＰＤＴのアラニン走査。ビオチン化ｈＰＥＲ１−ＮＰＤは指示した位置をアラニンの単一アミノ酸残基置換により合成し、ＣＨＯ細胞における膜透過をアッセイした。細胞はペプチド濃度１０μＭ， ３７℃において１０分間インキュベートしたのち、洗浄、固定し、透過性にして、標識ストレプトアビジン Ａｌｅｘａ−５９４（赤， ２μｇ／ｍＬ）によりＲＴで１５分間検出した。対照ペプチドはｈＰＥＲ１ Ｎ−末端アミノ酸残基４８６−５００とした。
【図４Ａ】
セロトニン５ＨＴ２Ａ受容体とｈＰＥＲ１−ＭＰＰ融合ペプチドによる活性化のｈＰＥＲ１−ＭＰＰおよびＴＡＴ−ＰＴＤペプチドは単独でまたは第一の細胞内ループＩ１（ＳＬＥＫＫＬＱＮＡＴＮ）もしくは５ＨＴ２Ａ受容体、遺伝子アクセス番号 Ｍ８６８４１）由来のＣ−末端膜貫通７ドメインＴＭ７（ＫＴＹＲＳＡＦＳＲＹＩＱＹＫＥＮＫＫＰＬＱＬＩ）のいずれかと融合させて合成した。受容体の活性は標準ＦＬＩＰＲ分析を用いて、外因性および内因性Ｃａ＋２レベルをアッセイした。ペプチドの名称は次の通りである：Ｔ（ＴＡＴ−ＰＴＤ）、Ｐ（ｈＰＥＲ−ＭＰＰ）、Ｉ１（細胞内ループ１）、Ｔ−Ｉ１（ＴＡＴ−ＰＴＤ−ＩＩ）、Ｐ−Ｉ１（ｈＰＥＲ１−ＭＰＰ−Ｉ１）、ＴＭ７ （Ｃ−末端ドメイン）、ＴＴＭ７ （ＴＡＴ−ＰＴＤ−ＴＭ７）、ＰＴＭ７（ｈＰＥＲ１−ＭＰＰ−ＴＭ７）およびＳ （セロトニン）。
【図４Ｂ】
ＰＴＭ７（黒丸）およびＴＴＭ７（黒菱形）ペプチドの用量反応。セロトニン（対照、白三角）は１０μＭの最大受容体刺激濃度で使用した。
【図５Ａ】
付加的ＰＴＤの同定。ＰＴＤの候補配列は、キーワードとして「転写因子」と注釈された遺伝子バンク中のタンパク質コード領域から翻訳されたペプチド配列で、ＳｗｉｓｓＰｒｏ， ＰＲＦ， ＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｆｏ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ， ＰＤＢを含む複合バイオインフォーマティクス法を用いて探索した。本発明者らは最初はすべて既知または候補ＮＬＳについて探索した。第二に本発明者らは変性パターンの発生 ［Ｒ／Ｈ／Ｋ］−［Ｒ／Ｈ／Ｋ］−［Ｒ／Ｈ／Ｋ］−［Ｒ／Ｈ／Ｋ］を探索するためＰＨＩ−ＢＬＡＳＴ（Ｐａｔｔｅｒｎ−Ｈｉｔ Ｉｎｉｔｉａｔｅ ＢＬＡＳＴ）、（Ｘ）ｎ（式中、ｎは４またはそれ以上の整数であり、Ｘは常に独立にアルギニン、ヒスチジンまたはリジンから選択される）を採用した。７３７４の候補ＰＴＤ配列が見出された。２つの探索から本発明者らは（Ａ）これらの配列に対するビオチン化ペプチドを合成し、または（Ｂ）ＧＦＰとのインフレーム融合タンパク質を創製し、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。１２のペプチド中の９つは形質導入され、すべての配列がトランスフェクトされた細胞中の核に局在することが見出された。ｈＰＥＲ１−ＰＴＤ、ｈＰＥＲ３−ＰＴＤおよびＴＡＴ−ＰＴＤペプチドを陽性対照として使用した。６つの陽性配列と２つの陰性配列が示された。数は母体タンパク質配列内のアミノ酸残基数、およびこれらのタンパク質についての遺伝子バンク受入番号を以下に示すように表す。すなわち （Ｍ２４８９９， ヒト甲状腺ホルモンα−１；Ｌ１２６９９， ヒトＨｏｍｅｏｂｏｘタンパク質Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ １ ＨＥＭＥ１；Ｘ１６４１６， ヒトプロト癌遺伝子チロシンプロテインキナーゼＡＢＬ１；Ｑ０２５７５ ヒトＨＥＮ１／ＮＳＬＣ１；Ｑ０２５７７， ヒトＨＥＮ２／ＮＳＬＣ２；ＡＡＡ７４５６１， ラットＨＮＦ３；ＣＡＢ６５８８７， ショウジョウバエｃＡＭＰ依存性転写因子）。３つの陰性ペプチドは（Ｖ０１５１２， ｃ−Ｆｏｓ；ＡＡＤ５３１８４， ヒト ｃｙｃｌｉｎ Ｌ ａｎｉａ−６ａ；ＣＡＢ６６９１４， Ａｒａｂｉｎｄｏｐｓｉｓ β−ｚｉｐ転写因子）である。
【図５Ｂ】
図５Ａの続きである。
【図６】
ｈＰＥＲ−ＰＴＤはβ−ガラクトシダーゼを細胞内に運搬する。ＨＩＶ ＴＡＴ形質導入ペプチドの少なくとも一つの特徴は細胞および組織にタンパク質を運搬するその能力である。したがって、本発明者らはｈＰＥＲ１形質導入ペプチドがβ−ガラクトシダーゼを細胞内に運搬できるか否かを決定すること追求した。この実験を実施するためには本発明者らはＦｒａｎｋｅｌら（１９８９， （１９）： ７３９７−４０１）によるプロトコールに従い、ｈＰＥＲ１−ＰＴＤまたはｈＰＥＲ−ＰＴＤ Ｒ７Ａを完全長のβ−ガラクトシダーゼに化学的に連結し、これらの接合体またはβ−ガラクトシダーゼ単独がＣＨＯ細胞に形質導入する能力をアッセイした。図６の左側に示すように、ｈＰＥＲ−ＰＴＤβ−ガラクトシダーゼの融合は、Ｘ−ｇａｌの添加後の細胞に青色によって示されるようにβ−ガラクトシダーゼについて陽性の酵素活性を示した。しかしながら、ｈＰＥＲ−ＭＰＰ Ｒ７Ａβ−ガラクトシダーゼ（中央）のみならずβ−ガラクトシダーゼタンパク質単独（右側）でもＸ−ｇａｌ添加後に青色の染色反応を示さないように、細胞内に入ることはできなかった。
【図１Ａ】
2004512275.tif 000005
【図１Ｂ】
2004512275.tif 000006
【図２Ａ】
2004512275.tif 000007
【図２Ｂ】
2004512275.tif 000008
【図３】
2004512275.tif 000009
【図４Ａ】
2004512275.tif 000010
【図４Ｂ】
2004512275.tif 000011
【図５Ａ】
2004512275.tif 000012
【図５Ｂ】
2004512275.tif 000013
【図６】
2004512275.tif 000014
【国際公開パンフレット】
2004512275.tif 000015
2004512275.tif 000016
2004512275.tif 000017
2004512275.tif 000018
2004512275.tif 000019
2004512275.tif 000020
2004512275.tif 000021
2004512275.tif 000022
2004512275.tif 000023
2004512275.tif 000024
2004512275.tif 000025
2004512275.tif 000026
2004512275.tif 000027
2004512275.tif 000028
2004512275.tif 000029
2004512275.tif 000030
2004512275.tif 000031
2004512275.tif 000032
2004512275.tif 000033
2004512275.tif 000034
2004512275.tif 000035
2004512275.tif 000036
2004512275.tif 000037
2004512275.tif 000038
2004512275.tif 000039
2004512275.tif 000040
2004512275.tif 000041
2004512275.tif 000042
2004512275.tif 000043
2004512275.tif 000044
2004512275.tif 000045
2004512275.tif 000046
2004512275.tif 000047
2004512275.tif 000048
2004512275.tif 000049
2004512275.tif 000050
2004512275.tif 000051
2004512275.tif 000052
2004512275.tif 000053
2004512275.tif 000054
2004512275.tif 000055
2004512275.tif 000056
2004512275.tif 000057
2004512275.tif 000058
2004512275.tif 000059
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004512275.tif 000060
2004512275.tif 000061
【国際調査報告】
2004512275.tif 000062
2004512275.tif 000063
2004512275.tif 000064
2004512275.tif 000065
2004512275.tif 000066