(57)【要約】ここに我々は、我々がＤ−Ｇと呼ぶ新規のセリンプロテアーゼをコードするｃＤＮＡの分子同定を記載する。推論されるアミノ酸配列、および他の特性が良く解明されたセリンプロテアーゼとの整列は、これがＳ１セリンプロテアーゼファミリーのメンバーであることを明確に示す。我々は、プロテアーゼＤ−Ｇ  ｍＲＮＡが表皮、繊維芽細胞、ケラチノサイト、結腸、小腸、胃、肺、腎、骨髄、リンパ節、胸腺、卵巣、前立腺、子宮および脊髄を含む身体各部の数々の組織内で広範に発現されることを発見した。重要なことは、このプロテアーゼはＮＨ２ 末端近くの推定貫通膜であるアミノ酸の疎水性部分を含む。従って、このセリンプロテアーゼは、タイプＩＩ内在性タンパク質として合成されると考えられる。我々は、異種セリンプロテアーゼ触媒ドメインの包括的活性化を許容するように設計されたチモーゲン活性化構築物内に、触媒ドメインをコードするプロテアーゼＤ−Ｇ  ｃＤＮＡの部分を挿入することにより、この新規のヒトプロテアーゼの可溶性形を発現した。この結果は、アミド分解基質のサブセットに対する活性を有するプロテアーゼＤ−Ｇの活性調製物である。この酵素活性プロテアーゼＤ−Ｇ調製物は、生物学的基質の同定のためのさらなる生化学的分析を受けならびに特異性阻害剤である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼＤ−Ｇタンパク質をコードする単離および精製された核酸分子であって、
（ａ）配列番号２によりコードされるアミノ酸１から４３５までを含んでなるポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子、
（ｂ）配列番号９によりコードされるアミノ酸１から２９２までを含んでなるポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子、
（ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）または（ｂ）のいずれか一方に相補的である核酸分子、
（ｄ）ポリヌクレオチド（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のいずれか１つの少なくとも１５個の連続塩基を含んでなる核酸分子、および
（ｅ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチド分子のいずれか一方にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする核酸分子
よりなる群より選ばれるメンバーを含んでなる該核酸分子。
【請求項２】
ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１記載の核酸分子。
【請求項４】
（配列番号１）、（配列番号８）およびそれらの機能性誘導体よりなる群より選ばれるヌクレオチド配列を有する、請求項１記載の単離および精製された核酸分子。
【請求項５】
該核酸分子がゲノムＤＮＡである、請求項１記載の単離および精製された核酸分子。
【請求項６】
該ベクターがタンパク質分解活性プロテアーゼＤ−Ｇタンパク質およびその機能性誘導体をコードする核酸配列を含む、組換え宿主内でのプロテアーゼＤ−Ｇタンパク質の発現のための発現ベクター。
【請求項７】
発現ベクターが、（配列番号１）、（配列番号８）、およびそれらの機能性誘導体よりなる群より選ばれるヌクレオチド配列を有する、プロテアーゼＤ−Ｇタンパク質をコードする核酸分子を含む、請求項６記載の発現ベクター。
【請求項８】
発現ベクターがプロテアーゼＤ−Ｇタンパク質をコードするゲノムＤＮＡを含む、請求項６記載の発現ベクター。
【請求項９】
請求項６記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項１０】
該核酸分子が、（配列番号１）、（配列番号８）、およびそれらの機能性誘導体よりなる群より選ばれるヌクレオチド配列を有する、請求項９記載の組換え宿主細胞。
【請求項１１】
クローン化された核酸分子がゲノムＤＮＡである、請求項９記載の組換え宿主細胞。
【請求項１２】
プロテアーゼＤ−Ｇタンパク質分解活性を有する本質的に純粋の形であるタンパク質。
【請求項１３】
（配列番号２）、（配列番号９）およびそれらの機能性誘導体よりなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する、請求項１２記載のタンパク質。
【請求項１４】
プロテアーゼＤ−Ｇタンパク質と免疫学的に反応性の単一特異性抗体。
【請求項１５】
（ａ）請求項６記載の発現ベクターを適当な宿主細胞内に転移し、そして
（ｂ）該発現ベクターからプロテアーゼＤ−Ｇタンパク質の発現を許容する条件下で工程（ａ）の宿主細胞を培養する
ことを含んでなる、組換え宿主細胞内でのプロテアーゼＤ−Ｇタンパク質の発現のための方法。
【請求項１６】
ａ）試験化合物、タンパク質分解活性プロテアーゼＤ−Ｇタンパク質、および標識基質を、標識基質へのタンパク質分解活性の結果として検出可能な生成物を生成するために十分な時間インキュベーションし、そして
ｂ）試験化合物の不在における標識基質へのプロテアーゼＤ−Ｇタンパク質分解活性と比較して、標識基質へのプロテアーゼＤ−Ｇタンパク質分解活性の試験化合物モジュレーションの結果としての生成物の量の変化を測定する
工程を含んでなる、タンパク質分解活性の試験化合物モジュレーションを検出するための方法。
【請求項１７】
標識基質が、放射能標識原子、少なくとも１種の蛍光分子、および比色分子よりなる群より選ばれる検出可能な標識を含んでなる、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
基質が２種の蛍光分子で標識され、そして検出可能な分子が蛍光共鳴エネルギー転移により検出される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
該化合物がプロテアーゼＤ−Ｇタンパク質分解活性のモジュレーターである、請求項１６記載の方法において活性の化合物。
【請求項２０】
該化合物がプロテアーゼＤ−Ｇタンパク質分解活性のアゴニストまたはアンタゴニストである、請求項１６記載の方法において活性の化合物。
【請求項２１】
該化合物がプロテアーゼＤ−Ｇの発現のモジュレーターである、請求項１６記載の方法において活性の化合物。
【請求項２２】
該化合物がプロテアーゼＤ−Ｇタンパク質分解活性のモジュレーターである、請求項１６記載の方法において活性の化合物を含んでなる薬剤組成物。
【請求項２３】
請求項１６記載の方法において活性のプロテアーゼＤ−Ｇをモジュレーションする化合物の投与を含んでなる、プロテアーゼＤ−Ｇにより媒介されるような症状の治療が必要な患者を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願への言及］
本出願は、２０００年６月３０日付け出願の米国特許仮出願番号第０９／６０７，７４５号の利益を主張する。
【０００２】
［発明の背景］
トリプシン／キモトリプシン様（Ｓ１）セリンプロテアーゼファミリーのメンバーは、不活性チモーゲン前駆体のタンパク質分解活性化を介する消化過程および調節増幅カスケードを含む種々様々の生理学的過程において鍵となる役割を有する。多数の例において、これらのカスケード中のプロテアーゼ基質は、それら自身が「下流」セリンプロテアーゼの不活性形、すなわちチモーゲンである。セリンプロテアーゼ媒介調節の周知の例には、血液凝固（Ｄａｖｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１）． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０３６３−７０）、キニン形成（Ｐｒｏｕｄ ａｎｄ Ｋａｐｌａｎ （１９８８）． Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６：４９−８３）および相補系（Ｒｅｉｄ ａｎｄ Ｐｏｒｔｅｒ （１９８１）． Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５０：４３３−４６４） が含まれる。それらのタンパク質分解経路は以前より知られているが、新規のセリンプロテアーゼ遺伝子およびそれらの生成物の発見は、これらの存在するカスケード内の調節の我々の理解を向上し、そして完全に新規のプロテアーゼネットワークの解明に導くであろう。
【０００３】
プロテアーゼは、クリーニング用界面活性剤、食品加工、織物加工および皮膚手入れ製品を含む種々の商業的目的のために非天然環境で使用される。クリーニング用界面活性剤では、プロテアーゼは、有機性で溶解度が低い化合物を分解して界面活性剤および水中にさらに容易に溶解できるさらに可溶性の形とするために用いられる。この能力において、プロテアーゼは「ストレイン除去剤」として作用する。食品加工の例には、食肉の柔軟化およびチーズ製造が含まれる。プロテアーゼは例えば織物収縮を防ぐために羊毛を処理するための織物加工に使用される。プロテアーゼは、落屑速度の不均衡により蓄積する皮膚表面上の乾燥表皮を除去するために皮膚手入れ製品内に含まれることがある。一部のこれらの用途に使用される通常のプロテアーゼは、それらの酵素の工業的製造のために容易に培養できる原核または真核細胞から誘導され、例えば使用される通常の種は米国特許（ＵＳ）第５，２１７，８７８号に記載のバチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属である。あるいは、米国特許（ＵＳ）第５，２７８，０６２号は、クリーニング用界面活性剤組成物に使用するための真菌トリチラキウム・アルブム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ ａｌｂｕｍ）より単離されたセリンプロテアーゼを記載している。不幸にも、ある種のプロテアーゼの使用は、敏感な個体内にアレルギー反応を起こすそれらの可能性によりまたは非天然環境で使用された場合に低下する効率により制限される。ヒト以外の起源より誘導されたプロテアーゼタンパク質は、敏感な個体内に免疫反応を誘導する可能性が高いことが予想される。これらの制限のために、敏感な個体に対して免疫原性が低いかおよび／または非天然環境で効率的なタンパク質分解活性を提供する別のプロテアーゼへの要求がある。組換え技術の出現は、工業的製造に適する宿主内でのあらゆる種のタンパク質の発現を許容する。
【０００４】
本明細書中で、我々はＤ−Ｇと呼ばれる小腸より単離された新規のセリンプロテアーゼを記載する。推論（ｄｅｄｕｃｅ）されるアミノ酸配列は４３５アミノ酸のポリペプチドをコードする。興味あることに、配列はＮＨ２ 末端に近い推定貫通膜（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ） であるアミノ酸の疎水性部分を含む。従って、このセリンプロテアーゼは、タイプＩＩ内在性膜タンパク質として合成されると考えられる。他の良く特性が分かっているセリンプロテアーゼとの整列は、これが、分子のＣ−末端部分内に存在する触媒性三つ組を有するＳ１セリンプロテアーゼファミリーのメンバーであることを明確に示す。プロテアーゼＤ−Ｇ推論アミノ酸配列は、タイプＩＩ内在性膜プロテアーゼでもあるクローニングされたセリンプロテアーゼＴＭＰＲＳＳ２（Ｐａｏｌｏｎｉ−Ｇｉａｃｏｂｉｎｏ ｅｔ ａｌ． （１９９７）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４４：３０９−３２０）およびヘプシン（Ｌｅｙｔｕｓ ｅｔ ａｌ． （１９８８）． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：１０６７−７４） に最も類似している。我々は、プロテアーゼＤ−Ｇ  ｍＲＮＡが、表皮、繊維芽細胞、ケラチノサイト、結腸、小腸、胃、肺、腎臓、骨髄、リンパ節、胸腺、卵巣、前立腺、子宮および脊髄を含む身体各部の種々の組織内に広範に発現されることを見いだした。この酵素の改変された発現または調節は、これらの組織内の多数の病理学的状態のいずれかの原因であるらしい。
【０００５】
さらに、正常な生理学的条件下でプロテアーゼＤ−Ｇ  ｍＲＮＡのが発現されず、そしてこのために検出されないが、しかし病理学的状態でこれが著しく上昇しているアップレギュレーションは、ある種の疾患状態の開始または再燃病勢悪化をもたらす可能性がある。我々は、触媒ドメインをコードするプロテアーゼＤ−Ｇ  ｃＤＮＡの部分を、異種セリンプロテアーゼ触媒ドメインの包括的活性化を許容するように設計されたチモーゲン活性化構築物内に挿入してこの新規のヒトプロテアーゼの可溶性形を発現した。その結果は、アミド分解性基質のサブセットに対して活性を有するプロテアーゼＤ−Ｇの活性調製物である。精製した酵素的に活性のプロテアーゼＤ−Ｇの単離は、例えば酵素の化学的モジュレーターを発見するためまたは商業製品内の添加剤としてのタンパク質の直接使用を可能とする。プロテアーゼＤ−Ｇはヒト宿主から誘導されるので、敏感な個体内でアレルギー反応を誘導する可能性は低く、従って、プロテアーゼＤ−Ｇはクリーニング用界面活性剤および皮膚手入れ製品のための組成物の処方にも有用であろう。
【０００６】
［発明の要旨］
プロテアーゼｄ−ｇをコードするＤＮＡ分子をクローニングしそして特性を検討するとこれは新規のセリンプロテアーゼを表している。組換え発現系を用いて、プロテアーゼをコードする機能性ＤＮＡ分子を単離した。アミノ酸およびヌクレオチド配列としてのこれらのタンパク質の生物学的および構造的性質を開示する。組換えＤＮＡ分子、およびその部分は、ＤＮＡ分子の同族体の単離、ＤＮＡ分子のゲノム等価物の同定および単離、およびＤＮＡ分子の変異形の同定、検出または単離のために有用である。組換えタンパク質は、機能性プロテアーゼｄ−ｇのモジュレーターを同定するために有用である。本明細書中で開示するアッセイ中で同定されたモジュレーターは、ガン、皮膚障害、神経障害的疼痛、炎症、または凝固体質／血栓症のための治療剤として有用であろう。
【０００７】
［詳細な説明］
定義：
本明細書中に使用される場合の用語「タンパク質ドメイン」は、タンパク質の残部から独立してもよい特定の三次元構造を有してもよいタンパク質の領域を呼ぶ。この構造は、酵素活性、他の分子のための認識モチーフの創成を含むタンパク質内のドメインの機能と関連する特定の活性を維持するか、または特定の環境内に存在するためにタンパク質に必要な構造成分を提供してもよい。タンパク質ドメインは、通常、タンパク質ファミリー内および同様の機能を行うタンパク質スーパーファミリー内の双方において、タンパク質の進化的に保存される領域である。本明細書中に使用される場合の用語「タンパク質スーパーファミリー」は、その進化的関係が完全には確立されていなくても、または受容された系統発生的標準により遠くてもよいが、しかし類似した三次元構造を示すかまたは重要なアミノ酸の独特の同一性を示すタンパク質を呼ぶ。本明細書中に使用される場合の用語「タンパク質ファミリー」は、その進化的関係が受容された系統発生的標準により確立されているタンパク質を呼ぶ。
【０００８】
本明細書中に使用される場合の用語「融合タンパク質」は、ドメインまたはリンカー領域の組み合わせた機能を得る目的のために複数のタンパク質ドメインまたはリンカーを組み合わせた結果であるタンパク質構築物を呼ぶ。これは、所望の融合タンパク質をコードする新規のポリヌクレオチド配列を生成するためのかかるドメインをコードするヌクレオチド配列の分子クローニングにより達成されてもよい。あるいは、融合タンパク質の創成は、２種のタンパク質を化学的に結合して達成されてもよい。
【０００９】
本明細書中に使用される場合の用語「リンカー領域」または「リンカードメイン」または類似のかかる記述用語は、クローニングベクターまたは融合タンパク質の構築に使用されるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を呼ぶ。リンカー領域の機能は、ヌクレオチド配列内へのクローニング部位の導入、２個のタンパク質ドメインの間のフレキシブル成分またはスペース創成領域の送入、または特定の分子相互作用のためのアフィニティータグの創成を含むことができる。リンカー領域は、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列構築の間に行われる選択よりもたらされた融合タンパク質内に導入されてもよい。
【００１０】
本明細書中に使用される場合の用語「クローニング部位」または「ポリクローニング部位」は、１種またはそれ以上の利用可能な制限エンドヌクレアーゼ共通切断配列を有するヌクレオチド配列の領域を呼ぶ。これらのヌクレオチド配列は、新規の融合タンパク質を創成するためのＤＮＡベクター内への導入、または特異性部位指定変異を導入するための種々の目的のために使用されてもよいがこれらに限定はされない。クローニング部位が、サイレント変異、保存変異、または所望の制限酵素共通配列を含むリンカー領域の導入により所望の位置で操作できることは当該技術分野の熟練者には周知である。クローニング部位の正確な位置がヌクレオチド配列内のいかなる位置内へも操作できることは当該技術分野の熟練者には周知である。
【００１１】
本明細書中に使用される場合の用語「タグ」は、アミノ酸配列をコードするか、タグを含むタンパク質の単離、精製または検出を促進するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を呼ぶ。かかるタグの広範な種類は当該技術分野の熟練者には既知であり、そして本発明に使用するために適する。適当なタグは、ＨＡペプチド、ポリヒスチジンペプチド、ビオチン／アビジン、およびその他の抗体エピトープ結合部位を含み、これらに限定はされない。
プロテアーゼＤ−Ｇ核酸の単離
本発明は、小腸の細胞から単離されたヒトセリンプロテアーゼＤ−ＧをコードするＤＮＡに関する。本明細書中に使用されるプロテアーゼＤ−Ｇは、プロテアーゼとして特異的に機能できるタンパク質を呼ぶ。
【００１２】
プロテアーゼＤ−Ｇの完全なアミノ酸配列は、従来まで知られず、また既知のプロテアーゼＤ−Ｇをコードする完全なヌクレオチド配列でもなかった。細胞および細胞タイプの広範な種類が記載するプロテアーゼＤ−Ｇ  ｍＲＮＡを含むことは予測されている。プロテアーゼＤ−Ｇを生成できる組織は、我々が感度が高いポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）媒介ｍＲＮＡ検出方法により決定したように、表皮、繊維芽細胞、ケラチノサイト、結腸、小腸、胃、肺、腎臓、骨髄、リンパ節、胸腺、卵巣、前立腺、子宮および脊髄を含みこれらに限定はされない。
【００１３】
その他の細胞および細胞系統も単離されたプロテアーゼＤ−Ｇ  ｃＤＮＡを単離するための使用に適するであろう。適当な細胞の選択は、本明細書中に記載する細胞抽出液中または全細胞アッセイ中でプロテアーゼＤ−Ｇ活性のスクリーニングにより行ってもよい。これらのアッセイのいずれかでプロテアーゼＤ−Ｇ活性を有する細胞は、プロテアーゼＤ−Ｇ  ＤＮＡまたはｍＲＮＡの単離のために適するであろう。
【００１４】
当該技術分野で既知の各種の方法のいずれもプロテアーゼＤ−ＧＤＮＡを分子的にクローニングするために使用してもよい。これらの方法には、適当な発現ベクター系内でプロテアーゼＤ−Ｇを含むｃＤＮＡライブラリーの構築の後のプロテアーゼＤ−Ｇ遺伝子の直接機能的発現が含まれるが、これらに限定はされない。他の方法は、プロテアーゼＤ−Ｇサブユニットのアミノ酸配列から設計された標識オリゴヌクレオチドプローブを用いてバクテリオファージまたはプラスミドシャトルベクター内で構築されたプロテアーゼＤ−Ｇを含むｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングことである。別の方法は、プロテアーゼＤ−Ｇタンパク質をコードする部分ｃＤＮＡを用いてバクテリオファージまたはプラスミドシャトルベクター内で構築されたプロテアーゼＤ−Ｇ含有ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングことより成る。この部分ｃＤＮＡは、精製されたプロテアーゼＤ−Ｇタンパク質のアミノ酸配列からの変性オリゴヌクレオチドプライマーの設計を介するプロテアーゼＤ−Ｇ  ＤＮＡフラグメントの特異性ＰＣＲ増幅により得られる。
【００１５】
別の方法は、プロテアーゼＤ−Ｇ生成細胞よりＲＮＡを単離しそして生体外または生体内翻訳系を介してＲＮＡをタンパク質内に翻訳することである。ペプチドタンパク質へのＲＮＡの翻訳は、例えば抗プロテアーゼＤ−Ｇ抗体との免疫学的反応性によりまたはプロテアーゼＤ−Ｇタンパク質の生物学的活性により特定できるプロテアーゼＤ−Ｇタンパク質の少なくとも一部分の生成をもたらす。この方法では、プロテアーゼＤ−Ｇ生成細胞から単離されたＲＮＡのプールは、プロテアーゼＤ−Ｇタンパク質の少なくとも一部分をコードするＲＮＡの存在を分析できる。ＲＮＡプールのさらなる分別は、非−プロテアーゼＤ−Ｇ  ＲＮＡからプロテアーゼＤ−Ｇ  ＲＮＡを精製するために行うことができる。この方法で生成されたペプチドまたはタンパク質は、一方ではプロテアーゼＤ−Ｇ  ｃＤＮＡの生成のためのプライマーを提供するために使用されるアミノ酸配列を提供するために分析してもよく、または翻訳に用いられたＲＮＡはプロテアーゼＤ−Ｇをコードするヌクレオチド配列を提供するために分析しそしてプロテアーゼＤ−Ｇ  ｃＤＮＡのこの生成のためのプローブを作製できる。この方法は当該技術分野では既知であり、例えばＭａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．， Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ，，「分子クローニング、実験マニュアル」（”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ． １９８９）中に見いだすことができる。
【００１６】
他のタイプのライブラリー、ならびに他の細胞または細胞タイプより構築されたライブラリーがプロテアーゼＤ−ＧをコードするＤＮＡを単離するために有用であることは当該技術分野の熟練者には容易に認められる。他のタイプのライブラリーには、他の細胞より、プロテアーゼＤ−Ｇ以外の生物体より誘導されたｃＤＮＡライブラリー、およびＹＡＣ（酵母人工染色体）およびコスミドライブラリーを含むゲノムＤＮＡライブラリーが含まれ、これらに限定はされない。
【００１７】
適当なｃＤＮＡライブラリーは、プロテアーゼＤ−Ｇ活性を有する細胞または細胞系統より調製してもよいことは、当該技術分野の熟練者には容易に認められる。プロテアーゼＤ−Ｇ  ｃＤＮＡを単離するためにｃＤＮＡライブラリーの調製への使用のための細胞または細胞系統の選択は、プロテアーゼＤ−Ｇ関連生物学的活性の測定またはリガンド結合アッセイを用いて細胞関連プロテアーゼＤ−Ｇ活性を最初に測定して行ってもよい。
【００１８】
ｃＤＮＡライブラリーの調製は、当該技術分野で周知の標準技術により行うことができる。周知のｃＤＮＡライブラリー調製技術は、例えばＭａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．， Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ，，「分子クローニング、実験マニュアル」（”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ． １９８９）中に見出すことができる。
【００１９】
プロテアーゼＤ−ＧをコードするＤＮＡは、適当なゲノムＤＮＡライブラリーより単離してもよいことも当該技術分野の熟練者には容易に認められる。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は、当該技術分野で周知の標準技術により行うことができる。周知のＤＮＡライブラリー構築技術は、Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．， Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ，，「分子クローニング、実験マニュアル」（”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ． １９８９）中に見出すことができる。
【００２０】
上記の方法によりプロテアーゼＤ−Ｇ遺伝子をクローニングするために、プロテアーゼＤ−Ｇのアミノ酸配列が必要であろう。これを達成するために、プロテアーゼＤ−Ｇタンパク質を精製しそして自動化配列決定装置により部分アミノ酸配列を決定してもよい。完全にアミノ酸配列を決定する必要はなく、むしろタンパク質からの６〜８個のアミノ酸の２領域の線型配列が部分プロテアーゼＤ−Ｇ  ＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅のためのプライマーの生成のために決定される。適当なアミノ酸配列が特定されると、これらをコードできるＤＮＡ配列を合成する。遺伝子コードは縮退しているので、特定のアミノ酸をコードするための１個を越えるコドンを使用してもよく、従って、アミノ酸配列は類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかの一組によりコードされることができる。組の一つのメンバーのみがプロテアーゼＤ−Ｇ配列に同一性するであろうが、しかしミスマッチを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でもプロテアーゼＤ−Ｇ  ＤＮＡにハイブリダイゼーションできる。ミスマッチＤＮＡオリゴヌクレオチドは、それでもプロテアーゼＤ−Ｇ  ＤＮＡに十分ハイブリダイゼーションし、ＤＮＡをコードするプロテアーゼＤ−Ｇの同定および単離を可能とする。これらの方法により単離されたＤＮＡは、種々の細胞タイプ、無脊椎動物、脊椎動物起源よりのＤＮＡライブラリーをスクリーニングするため、および同種遺伝子を単離するために使用できる。
【００２１】
精製された生物学的に活性のプロテアーゼＤ−Ｇは、種々の物理的形を有してもよい。プロテアーゼＤ−Ｇは、全長の初期もしくは未処理ポリペプチドとしてまたは部分的に処理されたポリペプチドもしくは処理ポリペプチドの組み合わせとして存在してもよい。全長初期プロテアーゼＤ−Ｇポリペプチドは、全長初期ポリペプチドのフラグメントの形成をもたらす特異性タンパク質分解切断事象により翻訳後変性されてもよい。フラグメント、またはフラグメントの物理的会合は、プロテアーゼＤ−Ｇと関連する全生物学的活性を有してもよいが、しかしプロテアーゼＤ−Ｇ活性の程度は、個別のプロテアーゼＤ−Ｇフラグメントと物理的に会合したプロテアーゼＤ−Ｇポリペプチドフラグメントの間で変動してもよい。
【００２２】
遺伝子コードは縮退しているので、特定のアミノ酸をコードするために１個を越えるコドンを使用してもよく、従って、アミノ酸配列は類似ＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかの一組によりコードされることができる。組の一個のメンバーのみがプロテアーゼＤ−Ｇ配列に同一性するがしかし適当な条件下でミスマッチを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でもプロテアーゼＤ−Ｇ  ＤＮＡにハイブリダイゼーションできるであろう。別の条件下で、ミスマッチがあるＤＮＡオリゴヌクレオチドはそれでもプロテアーゼＤ−Ｇ  ＤＮＡにハイブリダイゼーションして、ＤＮＡをコードするプロテアーゼＤ−Ｇの同定および単離を可能とすることができる。
【００２３】
特定の生物体からのプロテアーゼＤ−ＧをコードするＤＮＡは、他の生物体からのプロテアーゼＤ−Ｇの同族体を単離および精製するために使用してもよい。これを達成するために、最初のプロテアーゼＤ−Ｇ  ＤＮＡを適当なハイブリダイゼーション条件下でプロテアーゼＤ−Ｇの同族体をコードするＤＮＡを含む試料と混合してもよい。ハイブリダイゼーションしたＤＮＡ複合体を単離しそして同族体ＤＮＡをコードするＤＮＡをこれから精製してもよい。
機能性誘導体／変異体
特定のアミノ酸をコードする種々のコドンにかなりの量の重複があることが知られている。従って、本発明は最終的には同一性するアミノ酸の翻訳をコードする別のコドンを含むこれらのＤＮＡ配列も指向する。この指定の目的のために、１種またはそれ以上の置換コドンを有する配列を縮退変異と定義する。発現されたタンパク質の最終的物理的性質を本質的には改変しないＤＮＡ配列または翻訳されたタンパク質のいずれかの中の変異も本発明の範囲内に含まれる。例えば、脂肪族アミノ酸のアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンの置換、ヒドロキシ残基のセリンとトレオニンとの交換、酸性残基のアスパラギン酸とグルタミン酸との交換、アミド残基のアスパラギンとグルタミンとの間の置換、塩基性残基のリシンとアルギニンとの交換および芳香族残基のフェニルアラニン、チロシンとの間の変異体（Ｖａｒｉａｎｔ） は、ポリペプチドの機能性に変化を起こさないであろう。かかる置換は周知でありそして、例えば「遺伝子の分子生物学」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ， ４ｔｈ．Ｅｄ． Ｂｅｎｇａｍｉｎ Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ． Ｃｏ． ｂｙ Ｗａｔｓｏｎ ｅｔａｌ．）に記載されている。
【００２４】
ペプチドをコードするＤＮＡ配列が天然に存在するペプチドのものとは異なる性質を有するペプチドをコードするように改変されてもよいことは既知である。ＤＮＡ配列の改変の方法は、部位特異的変異誘発、キメラ置換、および遺伝子融合を含むが、しかしこれらに限定はれない。部位特異的変異誘発は、サイレント変異、保存変異、または非保存変異をもたらすであろう１個またはそれ以上のＤＮＡ残基の交換のために使用される。キメラ遺伝子は、プロテアーゼＤ−Ｇ遺伝子内に類似のドメインを置換するために類似または異なる遺伝子のドメインを交換して作製される。同様に、融合遺伝子は、遺伝子の同定および単離を容易にするために例えばアフィニティータグなどのドメインをプロテアーゼＤ−Ｇ遺伝子に付加して作製されてもよい。融合遺伝子は、例えばタンパク質の正常な輸送の方向を変えるために膜貫通ドメインを除去するかもしくは標的配列を付加し、またはプロテアーゼＤ−Ｇ遺伝子に新しい翻訳後修飾配列を付加して、タンパク質の可溶性型を創成するためにプロテアーゼＤ−Ｇ遺伝子の領域を置換するために作製される。改変された性質の例には、基質のための酵素またはリガンドのための受容体のアフィニティーを変化させることを含むが、これに限定はされない。ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のすべてのかかる変化は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の当初の機能が本明細書中に記載のように維持される限り、本発明の有用な変異体として期待される。
【００２５】
当該技術分野では既知のように同一性および類似は、配列の比較により決定される２種またはそれ以上のポリペプチド配列または２種またはそれ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当該技術分野では、同一性は、該当する場合に、かかる配列の鎖の間のマッチにより決定されるようなポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の間の配列関連の程度も意味する。同一性および類似の双方共に、容易に算出できる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， Ａ．Ｍ．， ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８； Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．Ｗ．， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９８； Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ Ｉ， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ．Ｍ．， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｈ．Ｇ．， ｅｄｓ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， １９９４； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７；  およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ． ｅｄｓ．， Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１） 。２個のポリヌクレオチドまたは２個のポリペプチド配列の間の同一性および類似を測定するための多数の方法があるけれども、この両方の用語は熟練者には周知である（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ． ｅｄｓ．， Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ， Ｈ．， ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｄ．， （１９８８） ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．， ４８， １０７３）。配列間の同一性または類似を決定するために一般的に使用される方法には、Ｃａｒｉｌｌｏ， Ｈ．， ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｄ．， （１９８８） ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．， ４８， １０７３ に開示された方法が含まれるが、それに限定はされない。同一性を決定するための好ましい方法は、試験する配列間に最大のマッチを与えるように設計される。同一性および類似を決定するための方法は、コンピュータープログラムにコード化されている。２個の配列の間の同一性および類似を決定するための好ましいコンピュータープログラム方法には、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， （１９８４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）， ３８７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ２１５， ４０３） が含まれるが、これらに限定はされない。
【００２６】
ポリヌクレオチドは、一般に、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであってもよいあらゆるポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを呼ぶ。従って、例えば、本明細書中で使用されるポリヌクレオチド、なかでも、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域または一本鎖、二本鎖および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖または二本鎖ＲＮＡ、一本鎖および二本鎖領域混合物であるＲＮＡ、一本鎖、またはさらに典型的には、二本鎖、または三本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含んでなるハイブリッド分子を呼ぶ。さらに、本明細書中に使用される場合のポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両者を含んでなる三本鎖領域を呼ぶ。かかる領域内の鎖は、同じ分子由来でも異なる分子由来でもよい。領域は１個またはそれ以上の分子の全体を含んでもよいが、しかしさらに典型的には分子の一部の領域のみを包含する。
【００２７】
三本らせん領域の分子の一つは、しばしばオリゴヌクレオチドである。本明細書中に使用される場合に、ポリヌクレオチドという用語は、１個またはそれ以上の修飾された塩基を含む上記のＤＮＡまたはＲＮＡを含む。従って、安定性のためまたはその他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書中で意図される用語としての場合に「ポリヌクレオチド」である。さらに、例えば２例を挙げると、通常ではない塩基、例えばイノシン、または修飾された塩基、例えばトリチル化塩基を含んでなるＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書中で使用される用語としてのポリヌクレオチドである。多種の修飾が当該技術分野の熟練者に既知の多数の有用な目的に役立つＤＮＡおよびＲＮＡになされることが認められるであろう。本明細書中に使用されるポリヌクレオチドという用語は、かかる化学的、酵素的または代謝的に修飾されたポリヌクレオチドの形、ならびにウイルスおよびなかでも単純および複合細胞を含む細胞のＤＮＡおよびＲＮＡ特性の化学的の形を包含する。ポリヌクレオチドはしばしばオリゴヌクレオチドとも呼ばれる短いポリヌクレオチドも包含する。
【００２８】
本明細書中で使用されるポリペプチドという用語は、当該分野で周知でありそして教科書およびその他の出版物に記載されているポリペプチドの基本的化学構造を呼ぶ。この範囲内で、この用語は、ペプチド結合により互いに線型鎖に結合した２個またはそれ以上のアミノ酸を含んでなるあらゆるペプチドまたはタンパク質を呼ぶように本明細書中では使用される。本明細書中に使用される場合に、この用語は、当該分野では例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも一般に呼ばれる短い鎖、および種々の形があり、当該分野では一般にタンパク質と呼ばれるさらに長い鎖の双方を呼ぶ。ポリペプチドは２０種の天然に存在するアミノ酸と一般に呼ばれる２０種のアミノ酸の他のアミノ酸をしばしば含み、そして末端アミノ酸を含む多数のアミノ酸は、天然の過程、例えばプロセシングおよびその他の翻訳後修飾により、また当該技術分野では周知の化学的修飾技術のいずれかにより、与えられたポリペプチド内で修飾されていてもよいことが認められる。ポリペプチド中に天然で起きる一般的な修飾であっても、包括的にここに列記するには多すぎるが、しかし、これらは基本的教科書そしてさらに詳細には論文中、ならびに当該技術分野の熟練者には周知の長大な研究論文中に詳しく記載されている。
【００２９】
現在のポリペプチド中に存在していてもよい既知修飾中で、少数を例示的に挙げると、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合付加、ヘム領域の共有結合付加、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合付加、脂質または脂質誘導体の共有結合付加、ホスホチジルイニシトールの共有結合付加、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋形成、シスチンの形成、ピログルタマートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、ホスホリル化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファー−ＲＮＡ媒介付加例えばアルギニル化、およびユビキチン化である。かかる修飾は、当該技術分野の熟練者には周知でありそして科学文献中に詳細に記載されている。特に一般的な修飾である例えばグリコシル化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化は、最も基本的な教科書、例えば「タンパク質−構造および分子の性質」（ＰＲＯＴＥＩＮ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８３））に記載されている。多数の詳細な総説がこの主題に関して利用でき、例えば、Ｗｏｌｄ， Ｆ．， Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ： Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ， １−１２ ページ、ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ， Ｂ．Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３）； Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２， ６２６−６４６、およびＲａｔｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ”， （１９９２） Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６６３，４８−６２ により提供されるものである。
【００３０】
周知のようにそして上記のように、ポリペプチドは必ずしも常に完全には線型でないことが認められている。例えば、ポリペプチドは、一般に天然のプロセシング事象および天然には起きない人的操作によりもたらされる事象を含む翻訳後事象の結果としてのものである。環状、分枝状および分枝環状ポリペプチドが非翻訳天然過程によりそして完全に合成法によっても合成されてもよい。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含むポリペプチド中のあらゆる位置で起こることができる。実際、共有結合修飾によるポリペプチド中のアミノもしくはカルボキシル基または双方の遮断は、天然に存在および合成ポリペプチド中に一般的でありそしてかかる修飾は本発明のポリペプチド中に存在してもよい。例えば、タンパク質分解プロセシング前に大腸菌またはその他の細胞内に生成するポリペプチドのアミノ末端残基は、ほとんど常にＮ−ホルミルメチオニンである。
【００３１】
ペプチドの翻訳後修飾の間に、ＮＨ２ 末端のメチオニン残基が欠失されてもよい。従って、本発明は、本発明のタンパク質のメチオニン含有およびメチオニン欠失アミノ末端変異体の双方の使用を意図する。ポリペプチド内に起きる修飾は、しばしばその作製の方法の関数であろう。例えば、宿主内にクローニングされた遺伝子を発現して作製されるポリペプチドにおいて、修飾の性質およびその範囲は大部分が宿主細胞翻訳後修飾能力およびポリペプチドアミノ酸配列内に存在する修飾シグナルにより決定されるであろう。例えば、周知のように、グリコシル化は例えば大腸菌のような細菌宿主中にしばしばは起きない。従って、グリコシル化を望む場合には、ポリペプチドはグリコシル化宿主、一般的には真核細胞内に発現されるべきである。昆虫細胞はしばしば哺乳動物細胞と同様の翻訳後グリコシル化を行いそして、この理由から、昆虫細胞発現系はなかでもグリコシル化の本来のパターンを有する哺乳動物タンパク質を効率的に発現するために開発される。同様の考慮は他の修飾にも適用される。修飾の同じ形式が与えられたポリペプチド内の数個の部位で同様または異なる程度で存在してもよいことが認められる。また、与えられたポリペプチドは、修飾の多数の形式を含んでもよい。一般に、本明細書中に使用される場合には、ポリペプチドという用語は、すべてのかかる修飾、特には宿主細胞内にポリヌクレオチドを発現することにより組換え的に合成されるポリペプチド中に存在するものを包含する。
【００３２】
本明細書中に使用される用語としてのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、それぞれ基準のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。ポリヌクレオチドの変異体は、天然に存在する変異体、例えば天然に存在する対立遺伝子変異体であってもよく、またはこれは天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。（１）他の基準ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なるポリヌクレオチド。一般に、基準および変異体のヌクレオチド配列が全体的に類似しそして、多くの領域内で同一性するように相違が限定される。以下に記載するように、変異体のヌクレオチド配列内の変化は、サイレントであってもよい。すなわち、これらはポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸を改変しなくてもよい。改変がこの形式の変異体のサイレント変化に限定される場合には、変異体は基準と同様のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。同様に以下に記載するように、変異体のヌクレオチド配列における変化は、基準ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を改変してもよい。かかるヌクレオチド変化は、以上に考察したように基準配列によりコードされるポリペプチド中でアミノ酸置換、付加、欠失、融合および末端切除をもたらしてもよい。（２）他の基準ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なるポリペプチド。
【００３３】
一般に、相違は、基準と変異体の配列が全体的に類似でありそして多くの領域内で同一性するように限定される。変異体および基準ポリペプチドは、アミノ酸配列中で１個またはそれ以上の置換、付加、欠失、融合および末端切除により異なってもよく、それらはあらゆる組み合わせで存在してもよい。本明細書中に使用される場合に、プロテアーゼＤ−Ｇの「機能性誘導体」とは、プロテアーゼＤ−Ｇの生物学的活性に本質的に類似する生物学的活性（機能的または構造的のいずれか）を有する化合物である。
【００３４】
「機能性誘導体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）」の用語は、「フラグメント」、「変異体」、「縮退変異体」、「類似体」および「同族体」またはプロテアーゼＤ−Ｇの「化学誘導体」を含むことを意図する。ポリペプチドの有用な化学誘導体は、当該技術分野では周知でありそして例えば二次化学部分を有するポリペプチド内に含まれる反応性有機部位の共有結合修飾を含む。周知の架橋剤は、アフィニティータグ、例えばビオチン、蛍光染料を導入するため、または固相表面にポリペプチドを結合するために（例えばアフィニティーレジンを創成するために）、アミノ、カルボキシル、またはアルデヒド残基に反応させるために有用である。
【００３５】
「フラグメント」という用語は、プロテアーゼＤ−Ｇのあらゆるポリペプチドサブセットを呼ぶと意図する。双方の分子が本質的に類似した構造を有する場合または双方の分子が類似した生物学的活性を有する場合に分子はプロテアーゼＤ−Ｇに「本質的に類似」である。従って、２個の分子が本質的に類似した活性を有する場合に、分子の一方の構造が他方に見いだされない場合でもまたは２個のアミノ酸配列が同一性していない場合でも、これらは、変異体と考えられる。
【００３６】
「類似体」の用語は、全プロテアーゼＤ−Ｇ分子またはそのフラグメントのいずれかに対して機能的に本質的に類似した分子を呼ぶ。これに関して特に好ましいのは、配列番号１の変異体、類似体、誘導体およびフラグメントをコードするポリヌクレオチドおよびその中で数個、２、３個、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１または０個のアミノ酸残基がいずれかの組み合わせで置換、欠失または付加されている、配列番号２のポリペプチドのアミノ酸配列を有する変異体、類似体、誘導体およびフラグメントである。それらの中で特に好ましいは、配列番号１の遺伝子の性質および活性を改変しないサイレント置換、付加および欠失である。これに関して特に好ましいのは、保存性置換でもある。最高に好ましいのは、置換がなくて配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００３７】
本発明のさらなる好ましい態様は、配列番号２中に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、その全長にわたって少なくとも７０％同一性するポリヌクレオチド、およびかかるポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドである。あるいは、高度に好ましいのは、少なくとも８０％同一性する領域を含んでなるポリヌクレオチドでありさらに高度に好ましいのは、少なくとも９０％同一性する領域を含んでなるポリヌクレオチドであり、そしてこれらの好ましいポリヌクレオチドの中で少なくとも９５％同一性するものが特に好ましい。さらに、少なくとも９５％同一性するものの中で少なくとも９７％同一性を有するものが高度に好ましく、そしてそれらの中で少なくとも９８％、そして少なくとも９９％が特に高度に好ましく、少なくとも９９％が最も好ましい。好ましい態様中で本明細書中に記載のポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドは、配列番号２の推論されたアミノ酸配列により特性付けられるポリペプチドとして本質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコードする。さらに、この観点で好ましい態様は、配列番号１のＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドとして本質的に同様の生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。本発明は、さらに、本明細書中の上記の配列にハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドに関する。これに関して、本発明は、特に本明細書中の上記のポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドに関する。本明細書中に使用される場合に、「ストリンジェント条件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、そして好ましくは少なくとも９７％の同一性が存在する場合にのみハイブリダイゼーションが起きることを意味する。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドアッセイに関して本明細書中に追加して考察するように、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１の配列をコードする全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するためおよび配列番号１に高度の配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために、ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのためのハイブリダイゼーションプローブとして使用してもよい。かかるプローブは、一般に少なくとも１５個の塩基を含んでなる。好ましくは、かかるプローブは少なくとも３０個の塩基を有しそして少なくとも５０個の塩基を有してもよい。特に好ましいプローブは少なくとも３０個の塩基を有しそして５０個またはそれ以下の塩基を有する。例えば、本発明の遺伝子のコード領域は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するために既知のＤＮＡ配列を用いるスクリーニングにより単離されてもよい。本発明の遺伝子のものに相補的な配列を有する標識されたオリゴヌクレオチドは、次いで、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングして、ライブラリーのどのメンバーにプローブがハイブリダイゼーションするかを決定するために使用される。
【００３９】
本発明のポリペプチドは、配列番号２のポリペプチド（特に成熟ポリペプチド）ならびに配列番号２のポリペプチドに少なくとも７０％同一性、好ましくは配列番号２のポリペプチドに少なくとも８０％同一性、さらに好ましくは配列番号２のポリペプチドに少なくとも９０％類似（さらに好ましくは少なくとも９０％同一性）、そしてそれ以上に好ましくは配列番号２のポリペプチドに少なくとも９５％類似（さらに好ましくは少なくとも９７％同一性）を有するポリペプチドを含み、そして一般に少なくとも３０個のアミノ酸およびさらに好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を含むポリペプチドのかかる部分であるかかるポリペプチドの部分も含む。本発明のポリペプチドフラグメントの代表的な例には、例えば配列番号２の末端切除ポリペプチドが含まれる。末端切除ポリペプチドには、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはそれらの変異体もしくは誘導体が含まれるが、しかし、アミノ末端を含む残基の連続シリーズ（すなわち、連続領域、部分またはポーション）、もしくはカルボキシル末端を含む残基の連続シリーズの欠失または、二重末端切除変異体として、一方はアミノ酸末端を含み他方はカルボキシル末端を含む残基の２個の連続シリーズの欠失を除く。本発明のこの局面で好ましいのは、配列番号２の配列により特性付けられるポリペプチドの構造的または機能的属性により特性付けられるフラグメントである。
【００４０】
この観点において本発明の好ましい態様には、アルファらせんおよびアルファらせん形成領域、ベータ−シートおよびベータ−シート形成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、アルファ両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、フレキシブル領域、表面形成領域、基質結合領域、本発明のポリペプチドの高抗原性インデックス領域、およびかかるフラグメントの組み合わせを含んでなるフラグメントが含まれる。好ましい領域は、本発明のポリペプチドの活性を媒介するものである。この観点から最も好ましいのは、本発明の応答レギュラーターポリペプチドの化学的、生物学的またはその他の活性を有するフラグメントであり、これらには同様の活性もしくは改善された活性を有するか、または低下した望ましくない活性を有するものが含まれる。
プロテアーゼＤ−Ｇの組換え発現
本明細書中に記載の方法を介して得られたクローニングされたプロテアーゼＤ−Ｇ  ＤＮＡは、適合するプロモーターおよびその他の適当な転写調節要素を含む発現ベクター内に分子クローニングすることにより組換え的に発現され、そして組換えプロテアーゼＤ−Ｇタンパク質を生成するために原核または真核宿主細胞内に転移されてもよい。かかる操作の技術は、上記のＭａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ． 中に詳細に記載されそして当該技術分野では周知である。
【００４１】
発現ベクターは、遺伝子のクローニングされたコピーの転写および適当な宿主内のそれらのｍＲＮＡの翻訳のために必要なＤＮＡ配列として本明細書中で定義される。かかるベクターは、種々の宿主、例えば大腸菌を含む細菌、藍藻植物、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞を含む真菌細胞、および動物細胞内に真核遺伝子を発現するために使用できる。
【００４２】
特異的に設計されたベクターは、宿主、例えば細菌−酵母または細菌−動物細胞または細菌−真菌細胞または細菌−脊椎動物間のＤＮＡのシャトリングを可能とする。適切に構築された発現ベクターは、宿主細胞内の自律的複製のための複製起点、選択可能マーカー、有用な制限酵素部位の限定された数、高いコピー数のための潜在能力、および活性プロモーターを含まなければならない。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼにＤＮＡを結合しそしてＲＮＡ合成を開始することを指示するＤＮＡ配列として定義される。強力なプロモーターは、ｍＲＮＡに高い頻度で開始させるものである。発現ベクターは、クローニングベクター、修飾クローニングベクター、特異的に設計されたプラスミドまたはウイルスを含んでもよいがこれらに限定はされない。
【００４３】
種々の哺乳動物発現ベクターを組換えプロテアーゼＤ−Ｇを哺乳動物内に発現するために使用してもよい。組換えプロテアーゼＤ−Ｇ発現のために適するであろう商業的に入手できる哺乳動物発現ベクターには、ｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３） 、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０） 、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４） 、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９） 、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８） 、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６） 、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０） 、およびＩＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５） が含まれるがこれらに限定はされない。種々の細菌発現ベクターを細菌細胞内で組換えプロテアーゼＤ−Ｇを発現するために使用してもよい。組換えプロテアーゼＤ−Ｇ発現のために適するであろう商業的に入手できる細菌発現ベクターには、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ） およびｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）が含まれるがこれらに限定はされない。
【００４４】
種々の真菌細胞発現ベクターを真菌細胞、例えば酵母内で組換えプロテアーゼＤ−Ｇを発現するために使用してもよい。組換えプロテアーゼＤ−Ｇ発現のために適するであろう商業的に入手できる真菌細胞発現ベクターには、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＰｉｃｈｉａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれるがこれらに限定はされない。
【００４５】
種々の昆虫細胞発現ベクターを昆虫細胞内で組換えプロテアーゼＤ−Ｇを発現するために使用してもよい。プロテアーゼＤ−Ｇの組換え発現のために適するであろう商業的に入手できる昆虫細胞発現ベクターには、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれるがこれらに限定はされない。
【００４６】
プロテアーゼＤ−ＧをコードするＤＮＡは、組換え宿主細胞内の発現のために発現ベクター内にクローニングされてもよい。組換え宿主細胞は、大腸菌などの細菌、酵母などの真菌細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サルおよびネズミ起源の細胞系統を含むがこれらに限定はされない哺乳動物細胞、およびショウジョウバエおよびカイコ誘導細胞系統を含むがこれらに限定はされない昆虫細胞を含むがこれらに限定はされない、原核または真核性であってもよい。
【００４７】
適当でありそして商業的に入手できる哺乳動物種より誘導される細胞系統には、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ９２）、ＨＩＮ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １７１）、Ｌ−細胞、およびＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３）が含まれこれらに限定はされない。
【００４８】
発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポフェクション、およびエレクトロポレーションを含むがこれらに限定はされない多数の技術のいずれか一つを介して宿主細胞内に導入されてもよい。発現ベクターを含む細胞はクローン的に繁殖しそしてこれらがプロテアーゼＤ−Ｇタンパク質を生成するかどうかを決定するために個別に分析される。プロテアーゼＤ−Ｇ発現宿主細胞クローンの同定は、抗−プロテアーゼＤ−Ｇ抗体との免疫学的反応性、および宿主細胞関連プロテアーゼＤ−Ｇ活性の存在を含むがこれらに限定はされない種々の技術により行ってもよい。
【００４９】
プロテアーゼＤ−Ｇ  ＤＮＡの発現は、生体外生成された合成ｍＲＮＡを用いて行ってもよい。合成ｍＲＮＡまたはプロテアーゼＤ−Ｇ生成細胞より分離されたｍＲＮＡは、大豆胚抽出液および網赤血球抽出液を含むがこれらに限定はされない種々の細胞を含まない系内で効率的に翻訳され、なたびにカエル卵母細胞内へのマイクロインジェクションを含むがこれらに限定はされない細胞に基づく系内に効率的に翻訳されることができ、ここでカエル卵母細胞内へのマイクロインジェクションが一般的に好まれる。
【００５０】
プロテアーゼＤ−Ｇ活性および／またはプロテアーゼＤ−Ｇタンパク質の最適レベルを生成するプロテアーゼＤ−Ｇ  ＤＮＡ配列を決定するために、下記を含むがこれらに限定はされないプロテアーゼＤ−Ｇ  ＤＮＡ分子を構築できる：塩基〔２７７〕付近から塩基〔１５８１〕付近までの〔約４８ｋＤａ〕タンパク質をコードするプロテアーゼＤ−Ｇ  ｃＤＮＡの全長オープンリーディングフレーム（これらの数字は、最初のメチオニンの最初のヌクレオチドおよび最初の終止コドンの前の最後のヌクレオチドに相当する）およびプロテアーゼＤ−Ｇタンパク質をコードするｃＤＮＡの部分を含む数種の構築物。すべての構築物は、プロテアーゼＤ−Ｇ  ｃＤＮＡの５’または３’非翻訳領域を全く含まないか、すべてまたは一部分を含むように設計できる。プロテアーゼＤ−Ｇ活性およびタンパク質発現のレベルは、適当な宿主細胞内へのこれらの構築物の単独および組み合わせの双方の導入の後に決定できる。一過性アッセイにおいて最適発現を生成するプロテアーゼＤ−Ｇ  ＤＮＡカセットの決定の後に、哺乳動物細胞、バキュロウイルス感染昆虫細胞、大腸菌、および酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含むがこれらに限定はされない宿主細胞内の発現のために、このプロテアーゼＤ−Ｇ
ＤＮＡ構築物を種々の発現ベクターに転移する。
プロテアーゼＤ−Ｇのためのアッセイ方法
宿主細胞トランスフェクタントおよびマイクロインジェクションした卵母細胞は、下記の方法により機能性プロテアーゼＤ−Ｇ活性のレベルおよび全プロテアーゼＤ−Ｇタンパク質のレベルの双方をアッセイするために用いてもよい。組換え宿主細胞の場合に、これは触媒ドメインをコードする１個またはそれ以上のフラグメントをコードするプロテアーゼＤ−Ｇ  ＤＮＡを含む１個または可能ならば２個またはそれ以上のプラスミドの同時トランスフェクションを含む。卵母細胞の場合に、これはプロテアーゼＤ−Ｇタンパク質のための合成ＲＮＡの同時注入を含む。発現させるために適当な時間が経過した後、細胞タンパク質を例えば３５Ｓメチオニンを用いて２４時間で代謝的に標識し、その後、細胞溶解物および細胞培地上清を採取しそしてプロテアーゼＤ−Ｇタンパク質に対抗して指向するポリクロナール抗体を用いて免疫沈降する。
【００５１】
宿主細胞内のプロテアーゼＤ−Ｇタンパク質のレベルは、免疫アフィニティーおよび／またはタンパク質分解／アミド分解アッセイ技術により定量される。プロテアーゼＤ−Ｇを発現する細胞は、タンパク質分解／アミド分解活性の量を測定して発現されたプロテアーゼＤ−Ｇ分子の数をアッセイできる。プロテアーゼＤ−Ｇ特異性アフィニティービーズまたはプロテアーゼＤ−Ｇ特異性抗体を、例えば３５Ｓメチオニン標識または非標識プロテアーゼＤ−Ｇタンパク質を単離するために使用する。標識プロテアーゼＤ−Ｇタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析される。非標識プロテアーゼＤ−Ｇタンパク質はウエスタンブロティング、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡアッセイによりプロテアーゼＤ−Ｇ特異性抗体を用いて検出される。
細胞に基づくアッセイ
本発明は、プロテアーゼＤ−Ｇの化合物修飾を検出するための全細胞法を提供する。この方法は、工程
１）化合物、と機能性プロテアーゼＤ−Ｇとを接触させ、または機能性プロテアーゼＤ−Ｇを精製し、そして
２）化合物による応答またはプロテアーゼＤ−Ｇ活性の細胞内の変化を測定する、
を含んでなる。
【００５２】
化合物とのプロテアーゼＤ−Ｇ相互作用のために必要な時間の長さは、例えば既知プロテアーゼＤ−Ｇモジュレーターを用いる経過時間実験を行いそして時間の関数として細胞／活性変化を測定することにより実験的に決定される。
【００５３】
「細胞」の用語は、少なくとも１個の細胞、しかし検出方法の感度に適する複数個の細胞を含んで呼ぶ。本発明に適する細胞は、細菌、酵母、または真核性であってもよい。
【００５４】
機能性プロテアーゼＤ−Ｇの化合物モジュレーションを決定するためのアッセイ方法は、慣用の実験フォーマットでありまたは高処理量に適合させることができる。「高処理量」の用語は、多重試料を同時に容易に分析できるアッセイ設計、およびロボット操作のための可能性を呼ぶ。高処理量アッセイの別の望ましい特徴は、所望の分析を達成するための試薬使用量の低減、または操作の数の最小化に関して最適化されたアッセイ設計である。アッセイフォーマットの例には、９６−ウエルまたは３８４−ウエルプレート、浮揚液滴、および液体処理実験に用いられる「ラブオンアチップ（ｌａｂ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ） 」マイクロチャンネルチップが含まれる。プラスチック型および液体取り扱い器具の小型化が進歩し、または本発明の設計を用いてさらに多数の試料を処理できる改善されたアッセイ器具が設計されることは当該技術分野の熟練者には周知である。
【００５５】
本発明の方法に適する細胞変化は、プロテアーゼＤ−Ｇの機能もしくは量の変化を直接測定するか、または例えば転写における二次メッセンジャー濃度または変化を測定することによりまたはプロテアーゼＤ−Ｇにより転写的に影響される遺伝子のタンパク質レベルの変化によるプロテアーゼＤ−Ｇ機能の下流効果を測定することにより、または細胞内の表現型変化を測定することによるものを含んでなる。好ましい測定手段には、プロテアーゼＤ−Ｇタンパク質の量の変化、プロテアーゼＤ−Ｇの機能活性の変化、ｍＲＮＡの量の変化、細胞内タンパク質の変化、細胞表面タンパク質、または分泌されるタンパク質の変化、またはＣａ＋２、ｃＡＭＰたはＧＴＰ濃度の変化が含まれる。プロテアーゼＤ−Ｇの量または機能活性の変化を本明細書中有に記載する。ｍＲＮＡのレベルの変化は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりまたはディファレンシャル遺伝子発現により検出される。免疫アフィニティー、リガンドアフィニティー、または酵素測定は、宿主細胞内のタンパク質のレベルの変化を定量化する。タンパク質特異性アフィニティービーズまたは特異性抗体は、例えば３５Ｓメチオニン標識または非標識タンパク質を単離するために使用される。標識タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定される、非標識タンパク質は、ウエスタンブロティング、蛍光細胞分別による細胞表面検出、細胞イメージ分析、特異性抗体を用いるＥＬＩＳＡまたはＲＩＡにより検出される。タンパク質が酵素の場合には、タンパク質の誘導は、蛍光発光または比色基質の切断により測定される。
【００５６】
細胞表面タンパク質に好ましい検出手段は、フローサイトメトリーまたは統計的細胞イメージングを含む。双方の技術において、関係するタンパク質は細胞表面に局在化され、特異性蛍光プローブにより標識され、そして細胞蛍光の程度により検出される。フローサイトメトリーでは、細胞は溶液中で分析され、一方細胞イメージング技術では、細胞の視野を相対蛍光に関して比較する。酵素、例えばアルカリホスファターゼまたはプロテアーゼである分泌されたタンパク質のための好ましい分析手段は、蛍光または比色酵素アッセイであろう。
【００５７】
アルカリホスファターゼのための蛍光／発光／比色基質は商業的に入手できそしてかかるアッセイは高処理量のマルチウエルプレートスクリーンフォーマットに容易に適合される。蛍光エネルギートランスファービーズアッセイは、プロテアーゼアッセイに使用される。蛍光体およびクエンチャー分子をプロテアーゼのペプチド基質の両端内に組み込む。特異性基質が切断すると、蛍光体とクンチャーとの分離が蛍光を検出可能とする。分泌されたタンパク質が放射能法により測定できた場合に、シンチレーションプロキシミティー技術が使用できた。関係するタンパク質の基質は、蛍光物質を含む個体支持体上に被覆または組み込むかのいずれかにより固定される。酵素反応により固体相の近くにもたらされた放射性分子は、蛍光物質を励起させそして可視光を射出させる。可視光の射出は、リガンド／標的相互作用の検出成功の基礎を形成し、そして適当な測定器具により測定される。シンチレーションプロキシミティーアッセイの例は、１９８６年２月４日付け発行の米国特許（ＵＳ）第４，５６８，６４９号に記載されている。これらの形式のアッセイのための物質は、フラッシュプレート（ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ）ＴＭの商標名でデュポン（Ｄｕｐｏｎｔ）ＮＥＮＴＭ（Ｂｏｓｔｏｎ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ） より商業的に入手可能である。
【００５８】
内在性遺伝子が表現型細胞構造変化をもたらす場合の好ましい検出手段は、細胞形態または細胞内表現型変化の統計的イメージ分析である。限定の意味ではないが、例えば、表面に対して平のままであることに対して丸くなるように細胞は形態を変化するらしく、または増殖面に独立性となり従って腫瘍細胞生物学の分野では周知の形質転換細胞表現型に類似し、または細胞は新しい所生成物を生成するであろう。細胞内で起きてもよい表現型変化には、細胞骨格変化、新しい遺伝子転写に応答する小胞体／ゴルジ複合体の改変、または新しい小胞の生成が含まれる。
【００５９】
内在性遺伝子が可溶性細胞内タンパク質をコードする場合に、内在性遺伝子の変化は細胞溶解物内に含まれる特定のタンパク質の変化により測定してもよい。可溶性タンパク質は、本明細書中に記載の方法により測定してもよい。
【００６０】
本発明は、プロテアーゼＤ−ＧをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現をモジュレーションする化合物のスクリーニングのための方法ならびに生体内のプロテアーゼＤ−Ｇタンパク質の機能も指向する。化合物は、プロテアーゼＤ−ＧをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現、またはプロテアーゼＤ−Ｇタンパク質の機能の増加もしくは減少によりモジュレーションされてもよい。プロテアーゼＤ−ＧをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現またはプロテアーゼＤ−Ｇタンパク質の機能をモジュレーションする化合物を種々のアッセイにより検出してもよい。そのアッセイは、発現または機能に変化があったかどうかを決定するための単純な「正／否」アッセイであってもよい。アッセイは、試験試料の発現または機能を標準試料内の発現または機能のレベルと比較して定量化してもよい。本プロセスで同定されたモジュレーターは、治療剤、およびプロテアーゼＤ−Ｇとして有用である。
プロテアーゼＤ−Ｇタンパク質の精製
組換え宿主細胞内のプロテアーゼＤ−Ｇの発現の後、プロテアーゼＤ−Ｇタンパク質を精製されたプロテアーゼＤ−Ｇを活性形で得るために回収してもよい。数種のプロテアーゼＤ−Ｇ精製方法が利用可能であり、そして使用に適する（精製スキームの基礎となるであろう類似タンパク質の精製のための文献追加）。天然起源よりのプロテアーゼＤ−Ｇの精製のために以上に記載したように、組換えプロテアーゼＤ−Ｇは、細胞溶解液および抽出液より、または条件調整した培養媒体より、塩分別、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト吸着クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、および抗体／リガンドアフィニティークロマトグラフィーの種々の組み合わせ、または個別の適用により精製してもよい。
【００６１】
組換えプロテアーゼＤ−Ｇは、全長初期プロテアーゼＤ−Ｇに特異性のモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、プロテアーゼＤ−ＧもしくはプロテアーゼＤ−Ｇサブユニットのポリペプチドフラグメントを用いて作製した免疫アフィニティーカラムを用いて他の細胞タンパク質から分離できる。次いで、アフィニティーレジンを適当な緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．３）中で平衡させ、そしてプロテアーゼＤ−ＧまたはプロテアーゼＤ−Ｇサブユニットを含む細胞培養上清または細胞抽出液をゆっくりとカラムに通す。次いでカラムを緩衝液を用いて光学密度（Ａ２８０ ）が背景値に下がるまで洗浄し、次いで緩衝条件を、例えば０．２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）などの緩衝液を用いてｐＨを低下させて変化してタンパク質を溶離する。次いで精製されたプロテアーゼＤ−Ｇタンパク質を次いで適当な緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水に対して透析する。
タンパク質基づくアッセイ
本発明は、プロテアーゼＤ−Ｇタンパク質活性の化合物モジュレーションを検出するための生体外タンパク質アッセイ法を提供する。この方法は、工程
１）化合物、および機能性プロテアーゼＤ−Ｇタンパク質を接触させ、そして
２）化合物によるプロテアーゼＤ−Ｇ機能の変化を測定する
を含んでなる。
化合物との細胞接触のために必要な時間の長さは、例えば既知プロテアーゼＤ−Ｇモジュレーターを用いる時間経過実験を実行しそして時間の関数として変化を測定することにより実験的に決定される。
本セクションはプロテアーゼアッセイを記述する
プロテアーゼＤ−Ｇタンパク質分解活性をモジュレーションする化合物を検出するための方法は、推定モジュレーティング化合物、機能性プロテアーゼＤ−Ｇタンパク質、および適当な標識基質を組み合わせ、そして時間の関数としてまたは所定時間経過後のいずれかにおける基質の量の変化によりプロテアーゼに対する化合物の効果を測定することを含んでなる。標識基質には、放射能標識（Ｃｏｏｌｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６１：４１７０−６）、蛍光定量法（Ｌｏｎｇｅｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）． Ｊ． Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ． ６０：７２−３，７８； Ｔｗｉｎｉｎｇ （１９８４）． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １４３：３０−４）または比色法（Ｂｕｒｏｋｅｒ−Ｋｉｌｇｏｒｅ ａｎｄ Ｗａｎｇ （１９９３）． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０８：３７８−９２）である基質が含まれ、これらに限定はされない。本発明への使用に適する放射性同位元素には、当該技術分野では周知のもの、具体的には １２５Ｉ、 １３１Ｉ、 ３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、３２Ｐ、および３３Ｐが含まれる。放射性同位元素は、慣用の手段、例えばチロシン残基のヨウ素化、セリンまたはトレオニン残基のリン酸化、または放射性アミノ酸前駆体を用いるトリチウム、炭素または硫黄の組込はポリペプチド内に導入される。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に続く酵素電気泳動法（Ｗａｌｄｓｔｒｏｅｍ ａｎｄ Ｓｍｙｔｈ （１９７３）．Ｓｃｉ． Ｔｏｏｌｓ ２０：１７−２１） 、ならびに蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）に基づく方法（Ｎｇ ａｎｄ Ａｕｌｄ （１９８９）． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８３：５０−６） も、プロテアーゼＤ−Ｇタンパク質分解活性をモジュレーションする化合物を検出するために使用される方法である。アゴニストである化合物は、基質分解速度を上昇しそして時間の関数として残留基質がより減少する。アンタゴニストである化合物は、基質分解速度を低下しそして時間の関数として残留基質がより増加する。
【００６２】
本発明の方法に有用な好ましいアッセイフォーマットは、プロテアーゼＤ−Ｇ切断部位をコードするペプチド配列により分離されたクエンチャーまたはアクセプターのいずれかを有する蛍光ドナーを含むペプチド基質を用いる、ＦＲＥＴに基づく方法である。蛍光ドナーは、エネルギーを吸収しそして他の化合物にエネルギーの一部分を転移できる蛍光発光性化合物である。本発明に使用するために適する蛍光ドナーの例には、クマリン、キサンテン染料例えばフルオレセイン、ロドール、およびローダミン、レゾルフィン、シアニン染料ビメーン（ｂｉｍａｎｅｓ）、アクリジン、イソインドール、ダンシル染料、アミノフタル酸ヒドラジド例えばルミノールおよびイソルミノール誘導体、アミノフタルイミド、アミノナフタールイミド、アミノベンゾフラン、アミノキノリン、ジカノ（ｄｉｃａｎｏ）ヒドロキノン、およびユーロピウムおよびテルビウム複合体および関連化合物が含まれ、これらに限定はされない。クエンチャーは、ドナーに適切に近接して位置する場合に蛍光ドナーからの射出を低下する化合物であり、一般に蛍光の形でエネルギーを再射出しない。かかる部分の例には、インジゴ、ベンゾキノン、アントラキノン、アゾ化合物、ニトロ化合物、インドアニリン、およびジ−およびトリフェニルメタンが含まれる。ドナー／クエンチャー対を用いるＦＲＥＴ法は、ペプチド基質に対するプロテアーゼＤ−Ｇ酵素活性の関数として蛍光ドナーからの増加した射出を測定する。従って、プロテアーゼＤ−Ｇに拮抗する試験化合物は、ＦＲＥＴペプチド単独よりは低い（基底）蛍光と酵素活性プロテアーゼＤ−Ｇの活性により消化されたＦＲＥＴペプチド単独からの低い蛍光および酵素活性プロテアーゼＤ−Ｇにほり消化されたＦＲＥＴｐＨペプチドからの高い蛍光との２種の対立試料間の射出シグナルを生成する。
【００６３】
アクセプターは、蛍光ドナーからエネルギーを吸収しそしてエネルギーの一部分を蛍光として再射出する蛍光分子である。アクセプターは、プロテアーゼＤ−Ｇタンパク質分解効力を測定するための別の機序を可能とするクエンチャーの特殊な形である。ドナー／アクセプター対を利用する方法は、ペプチド基質に対するプロテアーゼＤ−Ｇ酵素活性の関数としてのアクセプター射出の低下を測定する。従って、プロテアーゼＤ−Ｇに拮抗する試験化合物は、ＦＲＥＴペプチド単独からの高い方の基底蛍光および酵素活性プロテアーゼＤ−Ｇの活性により消化されたＦＲＥＴペプチドからの低い方の蛍光の２種の対照試料間の射出シグナルを生成する。本発明の方法に有用なアクセプターの例には、クマリン、フルオレセイン、ロドール、ローダミン、レゾルフィン、シアニン、ジフルオロボラジアジンダセンおよびフタルシアニンが含まれるが、これらに減退はされない。
プロテアーゼＤ−Ｇに結合する抗体の生成および使用
プロテアーゼＤ−Ｇに対する単一特異性抗体は、プロテアーゼＤ−Ｇに対して反応性の抗体を含む哺乳動物抗血清より精製されるかまたは最初にコーラーとミルステイン（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７ （１９７５））により記載された技術を用いてプロテアーゼＤ−Ｇと反応性のモノクローナル抗体として調製されるる。免疫学的技術は当該技術分野では周知でありそして例えば「抗体：実験マニュアル」（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ 発行， ＩＳＢＮ ０８７９６９３１４２）に記載されている。本明細書中に使用される単一特異性抗体とは、プロテアーゼＤ−Ｇに対して均一結合（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｂｉｎｄｉｎｇ） 特性を有する単一抗体種または多重抗体種として定義される。本明細書中に使用される均一結合とは、特異性の抗原またはエピトープ、例えば上記のプロテアーゼＤ−Ｇに関連するものに結合する抗体種の能力を呼ぶ。プロテアーゼＤ−Ｇ特異性抗体は、適当な濃度のプロテアーゼＤ−Ｇを免疫アジュバントを用いるかまたは用いないで動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ラビット、ヤギ、ウマなど、好ましくはラビットを免疫化して得られる。
【００６４】
最初の免疫化の前に未免疫血清を採取する。それぞれの動物は、受容できる免疫アジュバントと関連させたプロテアーゼＤ−Ｇの約０．００１ｍｇ〜約１０００ｍｇを受ける。かかる受容できる免疫アジュバントには、フロイントの完全、フロイントの不完全、ミョウバン沈降物、コリネバクテリウム・パヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｖｕｍ） およびｔＲＮＡを含む油中水エマルションが含まれるが、これらに限定はされない。最初の免疫化は、皮下（ＳＣ）、腹膜腔内（ＩＰ）または双方のいずれかの多重部位における好ましくはフロイントの完全アジュバント中のプロテアーゼＤ−Ｇより成る。それぞれの動物を、抗体力価を測定するために、定期的、好ましくは毎週採血される。動物は、最初の免疫化の後にブースター注入をうけても受けなくてもよい。ブースター注入を受けたこれらの動物は、同じ経路でフロイントの不完全アジュバント中の等量の抗原を一般に与えられる。ブースター注入は、最高力価が得られるまで約３週間の間隔で与えられる。それぞれのブースター免疫化の約７日毎または単回免疫化の約１週間後に、動物から採血し、血清を採取し、そして試料を約−２０℃で保管する。
【００６５】
プロテアーゼＤ−Ｇと反応性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を近交マウス、好ましくはＢａｂｌ／ｃをプロテアーゼＤ−Ｇを用いて免疫化して調製する。マウスをＩＰまたはＳＣ経路により、上記の受容できるアジュバントの等量内に混合した約０．１ｍｌの緩衝液または生理食塩水中の約０．００１ｍｇ〜約１．０ｍｇ、好ましくは約０．１ｍｇのプロテアーゼＤ−Ｇを用いて免疫化する。フロイントのアジュバントが好ましく、ここでフロイントの完全アジュバントを最初の免疫化に使用しそしてフロイントの不完全アジュバントをその後に使用する。マウスは最初の免疫化を０日目に受けそして約２〜約３０週間安息させる。免疫化したマウスは、静脈内（ＩＶ）経路によるリン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液中のプロテアーゼＤ−Ｇ約０．００１〜約１．０ｍｇの１回またはそれ以上のブースター免疫化を与えられる。抗体陽性マウスからのリンパ球、好ましくは脾臓リンパ球を当該技術分野では既知の標準方法により免疫化マウスより脾臓を取り出して入手する。脾臓リンパ球と適当な融合相手、好ましくは骨髄腫細胞とを安定なハイブリドーマの形成を許容する条件下で混合してハイブリドーマ細胞を生成する。融合相手には、マウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ−１９４およびＳｐ２／０が含まれてもよく、ここでＳｐ２／０が一般に好ましく、これらに限定はされない。抗体生成細胞および骨髄腫細胞は、分子量約１０００のポリエチレングリコール中、約３０％〜約５０％の濃度で融合させる。
【００６６】
融合したハイブリドーマ細胞を、当該技術分野では既知の方法により、ヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリンを補足したダルベッコの変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養して選別する。上清液を約１４、１８、および２１日目に培養陽性ウエルより採取しそして抗原としてプロテアーゼＤ−Ｇを用いて固相免疫ラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）のような免疫アッセイにより抗体生成に関してスクリーニングする。培養液もオクタロニー沈降アッセイにより試験してｍＡｂのアイソタイプを決定する。抗体陽性ウエルからのハイブリドーマ細胞をマックファーソン（Ｍａｃ Ｐｈｅｒｓｏｎ， Ｓｏｆｔ Ａｇａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ 中， Ｋｒｕｓｅ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｓｏｎ編集， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９７３） のソフトアガー法などの技術によりまたは限定希釈の技術によりクローニングする。
【００６７】
モノクローナル抗体を生体内で、プライミングの少なくとも約４日目に約１ｘ１０６ 〜６ｘ１０６ ハイブリドーマ細胞を用いて、マウス当たり約０．５ｍｌでプリスタンプライムしたＢａｌｂ／ｃマウスの注入により生成する。腹水を細胞転移の約８〜１２日後に採取しそしてモノクローナル抗体を当該技術分野では既知の技術により精製する。
【００６８】
抗プロテアーゼＤ−Ｇ  ｍＡｂの生体外生成は、当該技術分野では周知の組織培養媒体中でハイブリドーマを増殖して行う。高密度生体外細胞培養は、当該技術分野では周知の中空繊維培養技術、空気リフト反応器、回転びん、または回転フラスコ培養技術を用いて、大量の抗プロテアーゼＤ−Ｇ  ｍＡｂを生成するように行ってもよい。ｍＡｂは当該技術分野では公知の技術により精製される。
【００６９】
腹水またはハイブリドーマ培養液の抗体力価は、沈降法、受動凝集法、酵素結合免疫吸着抗体（ＥＬＩＳＡ）技術および放射能免疫アッセイ（ＲＩＡ）技術を含むが、これらに限定はされない種々の血清学的または免疫学的アッセイにより決定される。体液または身体組織および細胞抽出液中のプロテアーゼＤ−Ｇの存在を検出するために同様のアッセイが使用される。
【００７０】
単一特異性抗体を生成するための上記の方法は、プロテアーゼＤ−Ｇポリペプチドフラグメント、または全長初期プロテアーゼＤ−Ｇポリペプチド、または個別のプロテアーゼＤ−Ｇサブユニットに特異性の抗体を生成するために使用してもよいことは当該技術分野の熟練者には直ちに理解できる。具体的には、唯一のプロテアーゼＤ−Ｇサブユニットまたは機能性プロテアーゼＤ−Ｇタンパク質全体に特異性である単一特異性抗体が生成されるであろうことは当該技術分野の熟練者には直ちに理解できる。プロテアーゼＤ−Ｇタンパク質の正常な機能を阻害する単一特異性抗体が生成されるであろうことも当該技術分野の熟練者には明らかである。
【００７１】
プロテアーゼＤ−Ｇ抗体アフィニティーカラムは、抗体がゲルビーズ支持体と共有結合を形成するようにゲル支持体に抗体を加えて作製される。好ましい共有結合は、抗体上に含まれるアミン、アルデヒドまたはスルフヒドリル残基を介して作製される。抗体上にアルデヒドまたは遊離スルフヒドリル基を生成するための方法は当該技術分野では周知である。アミン基は、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応性である。
【００７２】
タンパク質分解活性の異常な発現または調節は、多数の病理生理学的状態をもたらすことができる。例えば、遺伝的障害からもたらされる数種の出血異常は、多数の活性セリンプロテアーゼ凝集因子のいずれか１個の欠失により起きることが知られている。多数のガン細胞および腫瘍はプロテアーゼを過剰発現し、その数種はセリンプロテアーゼと同定されている。これらの酵素は、腫瘍増殖および／または転移を促進すると考えられている。同様に、皮膚内で同定されたセリンプロテアーゼは、組織再造形および落屑に関係すると考えられる。免疫系の多数の細胞は、炎症症状の間に機能するらしいセリンプロテアーゼを生成および分泌する。一般に、これらのセリンプロテアーゼは細胞外マトリックス分解によりまたは活性増殖レギュレーターまたは化学誘引物質へのプロ−ホルモン前駆体の特異性活性化により作用すると考えられる。従って、セリンプロテアーゼ活性のモジュレーターが種々の病理生理学的症状の重大な効果をどうして有することができたかは容易に想像できる。
プロテアーゼＤ−Ｇ特異性試薬を含むキット組成物
プロテアーゼＤ−Ｇ  ＤＮＡもしくはＲＮＡ、プロテアーゼＤ−Ｇへの抗体、またはプロテアーゼＤ−Ｇタンパク質を含むキットを調製してもよい。かかるキットは、プロテアーゼＤ−Ｇ  ＤＮＡに加水分解するＤＮＡを検出するため、または試料中のプロテアーゼＤ−Ｇタンパク質またはペプチドフラグメントの存在を検出するために使用される。かかる特性化は、法医学分析、診断用途、および疫学的研究を含むがこれらに限定はされない種々の目的に有用である。
【００７３】
本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組換えタンパク質および抗体は、プロテアーゼＤ−Ｇ  ＤＮＡ、プロテアーゼＤ−Ｇ  ＲＮＡまたはプロテアーゼＤ−Ｇタンパク質のレベルのスクリーニングおよび測定に使用してもよい。組換えタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子および抗体は、プロテアーゼＤ−Ｇの検出および形式決定に適するキットの処方に役立つ。かかるキットは、少なくとも１個の容器内に密封して保持するために適する区画化キャリヤーを含んでなる。キャリヤーは、さらに試薬、例えば組換えプロテアーゼＤ−Ｇタンパク質またはプロテアーゼＤ−Ｇの検出に適する抗プロテアーゼＤ−Ｇ抗体を含んでなる。キャリヤーは、例えば標識抗原または酵素基質などの検出のための手段を含んでもよい。
遺伝子治療
ＤＮＡ配列をコードするプロテアーゼＤ−Ｇに相補的なヌクレオチド配列はアンチセンス治療のために合成できる。これらのアンチセンス分子は、ＤＮＡ、ＤＮＡの安定な誘導体、例えばホスホロチオエートまたはメチルホスホナート、ＲＮＡ、ＲＮＡの安定な誘導体、例えば２’−Ｏ−アルキルＲＮＡ、またはその他のプロテアーゼＤ−Ｇアンチセンスオリゴヌクレオチド模擬体であってもよい。プロテアーゼＤ−Ｇアンチセンス分子は、マイクロインジェクション、リポソームカプセル化によりまたはアンチセンス配列を内包するベクターからの発現により細胞内に導入されてもよい。プロテアーゼＤ−Ｇアンチセンス治療は、プロテアーゼＤ−Ｇ活性を低下すると有益である疾患の治療のために特に有用であろう。
【００７４】
プロテアーゼＤ−Ｇ遺伝子治療は、プロテアーゼＤ−Ｇを標的生物体の細胞内に導入するために使用してもよい。プロテアーゼＤ−Ｇ遺伝子は、プロテアーゼＤ−Ｇ  ＤＮＡの転移を媒介するウイルスベクター内に、レシピエント細胞の注入により連結できる。適当なウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスなどが含まれる。あるいは、プロテアーゼＤ−Ｇ  ＤＮＡは、リガンド−ＤＮＡ結合体またはアデノウイルス−リガンド結合体を用いるレセプター媒介標的ＤＮＡ転移、リポフェクション膜融合または直接マイクロインジェクションを含む非ウイルス技術により、遺伝子治療のための細胞内に転移できる。それらの操作およびそれらの変形は、生体外ならびに生体内プロテアーゼＤ−Ｇ遺伝子治療に適する。プロテアーゼＤ−Ｇ遺伝子治療は、プロテアーゼＤ−Ｇ活性を上昇させることが有益な疾患の治療のために特に有用であろう。プロテアーゼＤ−Ｇ遺伝子を用いるために適する遺伝子治療の分子的方法のためのプロトコールは、「遺伝子治療プロトコール」（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｐａｕｌ Ｄ． Ｒｏｂｂｉｎｓ編集， Ｈｕｍａｎ ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔａｗａ， ＮＪ， １９９６）に記載されている。
薬剤組成物
プロテアーゼＤ−Ｇ  ＤＮＡ、プロテアーゼＤ−Ｇ  ＲＮＡ、またはプロテアーゼＤ−Ｇタンパク質、またはプロテアーゼＤ−Ｇレセプター活性のモジュレーターを含んでなる製剤学的に有用な組成物は、製剤学的に許容できるキャリヤーを混合するなどの既知の方法に従って処方してもよい。かかるキャリヤーおよび処方の方法の例は、「レミントンの薬剤科学」（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）中に見いだされる。効果的な投与のために適する製剤学的に許容できる組成物を形成するために、かかる組成物は、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはモジュレーターの有効量を含む。
【００７５】
本発明の治療用または診断用組成物は、プロテアーゼＤ−Ｇ関連活性のモジュレーションが指示された障害の治療または診断のために十分な量で個体に投与される。有効量は、様々な因子、例えば個体の状態、体重、性別および年齢などに従って変化してもよい。その他の因子には、投与の方法が含まれる。薬剤組成物は、個体に対して様々の経路、例えば皮下、局所、経口および筋肉内により投与されてもよい。
【００７６】
「化学誘導体」という用語は、通常は基礎分子の一部分ではない追加の化学部分を含む分子を記述する。かかる部分は、基礎分子の溶解度、半減期、吸着等を改善してもよい。あるいは、この部分は基礎分子の望ましくない副作用を減少しまたは基礎分子の毒性を低下してもよい。かかる部分の例は、「レミントンの薬剤科学」などの種々の教科書中に記載されている。
【００７７】
本明細書中に開示する方法に従って同定された化合物は、プロテアーゼＤ−Ｇレセプターまたはその活性の最適な阻害を得て他方ではあらゆる潜在的な毒性を最小化するための日常的な試験により定義される適当な用量のみで使用してもよい。さらに、他の薬剤の同時投与または連続投与も望ましいであろう。
【００７８】
本発明は、本発明の治療の新規方法に使用するために適する局所、経口、全身および非経口薬剤処方を提供するという目的も有する。プロテアーゼＤ−Ｇのモジュレーションに使用するための活性成分としての本発明に従って同定された化合物またはモジュレーターを含む組成物は、投与のための慣用のビヒクル内の広範な治療投与形で投与することができる。例えば、化合物またはモジュレーターは、錠剤、カプセル剤（いずれも持効性および徐放性処方を含む）、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、液剤、シロップ剤および乳剤としての経口投与形、または注射により投与できる。同様に、これらは、静脈内（ボーラスおよび輸液の双方）、腹腔内、皮下、吸蔵を含むかまたは含まない局所、または筋肉内形で投与してもよく、すべての使用形は薬剤技術分野の通常の熟練者には周知である。所望の化合物の効果的ではあるが非毒性量をプロテアーゼＤ−Ｇモジュレーティング剤として使用できる。
【００７９】
製品の日用量は、患者あたり、１日あたりに、０．０１〜１，０００ｍｇの広範囲に変化してもよい。経口投与のために、組成物は、好ましくは、治療される患者への用量の病状適合のための活性成分の０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、および５０．０ｍｇを含む割れ目付または割れ目なしの錠剤の形で提供される。薬剤の有効量は、通常、１日あたり、体重ｋｇあたりに約０．０００１ｍｇ〜約１００ｍｇの用量レベルで提供される。この範囲は、さらに具体的には、１日あたり体重ｋｇあたりに約０．００１ｍｇ〜約１０ｍｇである。プロテアーゼＤ−Ｇレセプターモジュレーターの用量は、所望の効果を達成するために組み合わされる場合には調整される。他方、これらの種々の薬剤の用量は、いずれかの薬剤を単独で使用した場合に予想されるよりも病状が緩和するような相乗効果を達成するために独立して最適化および組み合わされてもよい。
【００８０】
好ましくは、本発明の化合物またはモジュレーターは、単回の日用量で投与しても、または全日用量を毎日２回、３回、または４回に分割して投与してもよい。さらに、本発明の化合物またはモジュレーターは、適当な鼻内ビヒクルの使用を介する鼻内形で、または経皮経路を介して、当該分野の通常の技術者には周知の経皮貼付剤の形を用いて投与できる。経皮投与系の形で投与されるために、当然ながら、用量の投与は、用量レジメンの全体にわたって中断するよりは連続的である。
【００８１】
活性薬剤が別々の投与処方にある場合に１種を越える活性剤を用いる組み合わせ治療のために、活性薬剤は同時に投与でき、または分離して交互の時期にそれぞれ投与できる。
【００８２】
本発明の化合物またはモジュレーターを用いる用量レジメンは、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別および医学的状態；治療すべき病状の重症度；投与の経路；患者の腎臓および肝臓機能；および使用されるこれら特定の化合物を含む種々の因子に従って選択される。通常の技術の医師または獣医師は、病状の進行を防止、対抗または捕そくするために必要な薬剤の有効量を容易に決定しそして処方できる。毒性なく効力を発生する範囲内の薬剤の濃度を達成するための最適の精密性は、標的部位への薬剤利用性の速度論に基づくレジメンを必要とする。これには、薬剤の分布、平衡、および排出の考慮が含まれる。
【００８３】
本発明の方法において、本明細書中に詳細に記載した化合物またはモジュレーターは活性成分を形成することができ、そして典型的には、投与の意図する形態、すなわち経口錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤などに関して適切に選択され、そして慣用の製薬慣行と合致する適当な薬剤増量剤、賦形剤またはキャリヤー（集合的に本明細書中では「キャリヤー」物質と呼ぶ）と混合して投与できる。
【００８４】
例えば、錠剤またはカプセル剤の形での経口投与のために、活性薬剤成分は、経口、非毒性の製剤学的に許容できる不活性キャリヤー、例えばエタノール、グリセロール、水などと混合できる。さらに、望ましいかまたは必要な場合に、適当な結合剤、滑剤、崩壊剤および着色剤も混合物中に組み込むことができる。適当な結合剤には、デンプン、ゼラチン、天然糖類例えばグルコースまたはベータ−ラクトース、コーン甘味料、天然および合成ガム類、例えばアラビアゴム、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックスなどが含まれ、これらに限定はされない。これらの投与形内に使用される滑剤には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが含まれ、これらに限定はされない。崩壊剤には、デンプン、メチルセルロース、アガー、ベントナイト、キサンタンガムなどが含まれ、これらに限定はされない。
【００８５】
液状剤のために、活性薬剤成分は、適当な風味を有する懸濁剤または分散剤、例えば合成および天然ゴム、例えばトラガカント、アラビアゴム、メチル−セルロースなどと混合できる。使用してもよいその他の分散剤には、グリセリンなどが含まれる。非経口投与のためには、滅菌懸濁剤および液剤が望ましい。一般に適当な保存剤を含む等張性製剤は、静脈内投与が望ましい場合に使用される。
【００８６】
活性薬剤成分を含む局所製剤は、当該技術分野に周知の種々のキャリヤー物質、例えばアルコール、ホンアロエゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡおよびＥ油、鉱油、ＰＰＧ２ミリスチルプロピオナートなどと混合して、例えばアルコール性溶液、局所清浄剤、洗顔クリーム、皮膚ゲル、スキンローション、および乳状またはゲル状処方のシャンプーを形成することができる。
【００８７】
本発明の化合物またはモジュレーターは、リポソーム投与系、例えば小型単層ベシクル、大型単層ベシクルおよび多層ベシクルの形で投与されることができる。リポソームは、各種のリン脂質、例えばコレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンから形成できる。
【００８８】
本発明の化合物は、化合物分子が結合する個別のキャリヤーとしてモノクローナル抗体の使用により投与してもよい。本発明の化合物またはモジュレーターは、標的可能な薬剤キャリヤーとして可溶性ポリマーと結合することもできる。かかるポリマーは、ポリビニル−ピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメチルアクリル−アミドフェノール、ポリヒドロキシ−エチルアスパルトアミドフェノール、またはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリシンを含むことができる。さらに、本発明の化合物またはモジュレーターは、薬剤の制御された放出を達成するために有用なある種の生分解性ポリマー、例えばポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクタム、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロ−ピラン、ポリシアノアクリレートおよび架橋または両親媒性のヒドロゲルのブロックコポリマーと結合させてもよい。
【００８９】
経口投与のために、化合物またはモジュレーターは、カプセル剤、錠剤、またはボーラス形で投与してもよくあるいは動物飼料中に混合できる。カプセル剤、錠剤、およびボーラスは、適当なキャリヤービヒクル、例えばデンプン、タルク、ステアリン酸マグネシウム、またはリン酸二カルシウムと組み合わせた活性成分を含んでなる。これらの単位投与形は、増量剤、充填剤、崩壊剤、および／または結合剤を含む適当に微粉化した不活性成分と活性成分とを緊密に混合して均質な混合物が得られるようにして調製される。不活性成分は、化合物またはモジュレーターと反応せずそして治療される動物に対して非毒性であるものである。適当な不活性成分には、デンプン、ラクトース、タルク、ステアリン酸マグネシウム、植物性ゴムおよび油などが含まれる。これらの処方は、治療される動物種の大きさおよびタイプおよび感染のタイプおよび重症度などの種々の因子に応じて活性および不活性成分の広範に変化する量を含んでもよい。活性成分は、化合物を飼料と単に混合してまたは飼料の表面に化合物を添加して、飼料の添加剤として投与してもよい。あるいは、活性成分は、不活性キャリヤーと混合してもよく、そして得られた組成物を飼料と混合するかまたは直接動物に与えてもよい。適当な不活性キャリヤーには、コーンミール、サイトラスミール、発酵残さ、ダイズ粉、乾燥穀粒などが含まれる。活性成分は、粉砕、攪拌、磨砕、または振とうにより、最終組成物が活性成分０．００１〜５重量％を含むように緊密に混合される。
【００９０】
あるいは、化合物またはモジュレーターは、不活性液体キャリヤー中に溶解した活性成分より成る処方の注入を介して非経口的に投与してもよい。注入は、筋肉内、管腔内、気管内、または皮下のいずれかであってもよい。注入組成物は、適当な不活性液状キャリヤーと混合した活性成分より成る。受容できる液状キャリヤーには、植物油、例えばラッカセイ油、綿実油、ゴマ油などならびに有機溶剤、例えばソルケタール（ｓｏｌｋｅｔａｌ）、グリセロールホルマルなどが含まれる。別の方法として、水性非経口処方を使用してもよい。植物油が好ましい液状キャリヤーである。この処方は、活性成分を液状キャリヤー中に、最終処方剤が活性成分の０．００５〜１０重量％を含むように溶解または懸濁して調製される。
【００９１】
化合物またはモジュレーターの局所適用は、水性溶液または懸濁液として本化合物またはモジュレーターを含む液状水剤またはシャンプーの使用を介して可能である。これらの処方剤は、一般にベントナイトなどの懸濁剤を含みそして通常消泡剤も含む。活性成分０．００５〜１０重量％を含む処方剤が受容できる。好ましい処方剤は、本化合物またはモジュレーター０．０１〜５重量％を含むものである。
【００９２】
下記の実施例は、本発明を説明するがしかしそれを限定するものではない。
実施例１
プラスミド操作
すべての生物学的方法は、従来の記載のものに従った（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）． １−１６２６） 。オリゴヌクレオチドは、Ｒａｎｓｏｍ Ｈｉｌｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｒａｎｓｏｍ Ｈｉｌｌ，ＣＡ） よりそしてすべての制限エンドヌクレアーゼおよびその他のＤＮＡ変性酵素は、特に記載しない限りＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）より購入した。プロテアーゼＤ−Ｇ発現構築物は、下記のようにバキュロウイルス発現ベクターｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ， ＭＤ） 内で作製した。すべての構築操作は、Ａｌｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７ 蛍光配列決定装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ） を用いてターミネーターサイクル配列決定により確認した。
プロテアーゼＤ−Ｇ  ｃＤＮＡの取得
プロテアーゼＤ−ＧｃＤＮＡを含む組換えファージをヒト小腸ライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ） より単離した。挿入物を配列解析にかけそしてＳ１セリンプロテアーゼに相同性を有するＴＡＡ終止コドンを含まない１３０５ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含むことを見いだした（配列番号１）。重要なことは、オープンリーディングフレームが位置１５７におけるインフレームＴＧＡ終止コドンにより先行されているので、これが真正であるらしいことである。既知配列（ＡＡＴＡＡＡ）と良く同一性する推定ポリアデニル化配列（ＡＴＴＡＡＡ）もポリＡ部分の直前の上流に同定されたので、このクローンも全３’非翻訳を含むらしい。推論されたオープンリーディングフレームは４３５アミノ酸のプレプロ−Ｄ−Ｇ−タンパク質をコードし（配列番号１）、これは約４８−Ｋｄの推定分子量（Ｍｒ ）を有し、そして他のセリンプロテアーゼに高度に相同性である。プロテアーゼＤ−Ｇアミノ酸配列のさらなる配列分析は、アミノ末端近くの膜貫通セグメント（配列番号２中の残基３１−５２）を予測し、この新規のｃＤＮＡがタイプＩＩ膜貫通セリンプロテアーゼをコードすることを示唆する。プロテアーゼＤ−Ｇ  ｃＤＮＡを用いるジーンバンク（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）データベースの相同性サーチは、これが新規のｃＤＮＡでありそしてクローニングされたセリンプロテアーゼＴＭＰＲＳＳ２（Ｐａｏｌｉｎｉ−Ｇｉａｃｏｂｉｎｏ ｅｔ ａｌ． （１９９７）． Ｇｅｎｏｍｔｉｃｓ ４４：３０９−３２０） およびヘプシン（Ｌｅｙｔｕｓ ｅｔ ａｌ．（１９８８）． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：１０６７−７４）に最も近い類似性を有し、これらもタイプＩＩ内在性膜タンパク質である。
【００９３】
チモーゲン活性化配列は、他のＳ１セリンプロテアーゼのものと著しく類似しそして２３３アミノ酸の成熟タンパク質を予言する。プロテアーゼＤ−Ｇの触媒性三つ組Ｈ、ＤおよびＳは、それぞれ位置２４３、３３９および３８５に位置する（第一番としてプレプロＤ−Ｇ配列のメチオニンイニシエーターを使用）。Ｓ１セリンプロテアーゼファミリーの他のメンバーとの推論プロテアーゼＤ−Ｇアミノ酸配列の系統発生樹は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラム（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ（１９８９）． Ｃｏｍｐｕｔ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ． ５：１５１−３）により作製され、ＭｅｇＡｌｉｇｎ３．１．７プログラム（ＤＹＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用いて決定され図２に示す。
実施例２
プロテアーゼＤ−Ｇ  ｍＲＮＡの組織分布
我々は、プロテアーゼＤ−Ｇ  ｍＲＮＡの組織分布を同定するために感受性が高いＰＣＲプロファイリング技術を利用した。この適用のために、数種のヒトｃＤＮＡライブラリー（ＣＨＲＦ−２８８巨核球細胞系統を除きすべてＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ） より）および我々がＺＡＰ発現ｃＤＮＡ系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を用いて構築したヒトゲル濾過血小板ライブラリーを用いた。プロファイリング分析のためのＰＣＲプライマーは下記であった。
【００９４】
配列番号３：５’−ＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＴＴＴＣＴＴＧＧ−３’
配列番号４：５’−ＴＣＴＴＧＣＴＣＴＡＧＴＡＧＧＣＴＴＧＧ−３’
要約すると、５０μｌＰＣＲ反応は試験したそれぞれのｃＤＮＡライブラリーより希釈したファージストック（約１０８ 〜１０１０ｐｆｕ／ｍｌ）の１μｌを用いた。反応は、最初９４℃で５分間変性し、そして９４℃で２０秒間、５６℃で２０秒間、次いで７２℃で３０秒間の３５サイクル、次いで最後の７２℃の延伸を１０分間行った。配列
配列番号５：５’−ＴＴＧＧＴＧＣＴＣＣＣＡＧＣＡＴＣＣＣＡＧＧＧＡＧＡＧＡＣＡＣＡＧＣＣＣＡＣＴＧ−３’のネストしたプライマープローブをガンマ３２Ｐ−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ， ＭＤ） を用いて放射能標識しそして組み込まれなかった標識を除去し、次いでＱＩＡｑｕｉｃｋヌクレオチド除去カラム（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）を用いる反応を行った。３２Ｐ末端標識したネストしたプライマープローブ（１Ｘ１０５ ｃｐｍ）をＰＣＲ反応の後のそれぞれの試料１０μｌと混合した。ＰＣＲ生成物−プローブ混合物を９４、５分間で変性、６０℃で１５分間ハイブリダイゼーションしそして４℃に冷却した。アニーリングした試料（１０μｌ）を６％トリス−ボレート−ＥＤＴＡ非変性ポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖａｅｎ）中で電気泳動し、乾燥しそしてオートラジオグラフィーに暴露した。ベータ−アクチンＰＣＲプライマーおよび標識したネストしたプライマープローブを用いて図３中に用いたｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲプロフィールは、試験したすべての試料中でベータ−アクチンＰＣＲ生成物を生成した。
【００９５】
図３から分かるように、Ｄ−Ｇ  ｍＲＮＡの分布は、特定の組織および細胞タイプに高度に制限される。プロテアーゼＤ−Ｇ転写物を発現する組織の種類は、表皮、繊維芽細胞、ケラチノサイト、結腸、小腸、胃、肺、腎、骨髄、リンパ節、胸腺、卵巣、前立腺、子宮および脊髄である。特に重要なことは、通常では多数のセリン遺伝子が発現されることが見いだされる組織である膵臓または肝臓中にＤ−ＧプロテアーゼｍＲＮＡが発現されないことである。
実施例３
活性プロテアーゼＤ−Ｇの発現のための構築物生成
Ｓ１プロテアーゼファミリーのメンバーは不活性チモーゲン前駆体として最もしばしば合成され、そしてタンパク質分解活性となるためには限定されたタンパク質分解を必要とするので、我々は異種セリンプロテアーゼｃＤＮＡの遺伝子活性化を発現しそして許容するチモーゲン活性化構築物を開発した。この構築物は、それぞれ分泌および抗体検出（ＰＦ）の目的で以前に記載（Ｉｓｈｉｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：９７８０−６） のようにＭｏＡｂ  Ｍ２抗体ＦＬＡＧエピトープとインフレームで融合したウシプレプロラクチンシグナル配列を特徴とする。重要なことは、この構築物は、インフレームおよびシグナル配列より下流に融合したヒトトリプシノーゲンＩからのエンテロキナーゼ切断部位（ＥＫ）も含むことである。Ｃ−末端において、終止コドンの前にそれぞれのニッケルレジン上のアフィニティー精製のための６個のヒスチジンコドンをコードする追加の配列がある（６ＸＨＩＳ）。アフィニティータグ配列の直接の上流および上記のＰＦＥＫプレプロ配列の下流にある独自のＸｂａＩ制限酵素部位は、異種セリンプロテアーゼｃＤＮＡの触媒ドメインのインフレーム挿入の点である（図４）。上記のチモーゲン活性化ベクターは、ＰＦＥＫ−６ＸＨＩＳ−ＴＡＧ  ＦＢを生成するための変性ｐＦａｓｔＢａｃ１トランスプレースメント（ｔｒａｎｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）プラスミド内にクローニングされた。
【００９６】
全長プロテアーゼＤ−Ｇ  ｃＤＮＡの精製されたプラスミドＤＮＡを、製造者の推奨に従ってネーチブＰｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を用いる１００μｌ調製用ＰＣＲ反応中の鋳型として使用した。使用したプライマー、配列番号６：Ｄ−Ｇ  Ｘｂａ−Ｕ  ５’ＡＴＧＣＴＣＴＡＧＡＴＧＴＧＧＡＴＴＣＴＴＧＧＣＣＴＴＧＧＣ−３’、配列番号７：Ｄ−Ｇ  Ｘｂａ−Ｌ  ５’ＧＡＴＧＴＣＴＡＧＡＣＡＧＣＴＣＡＧＣＣＴＴＣＣＡＧＡＣＡＴＴＧ−３’はＸｂａ−Ｉ切断可能末端を含み、そしてプロテアーゼＤ−Ｇの触媒ドメインに近接しそしてプロテアーゼＤ−Ｇ  Ｘｂａ−Ｉ触媒カセットを生成するように設計された。調製用ＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２．０分間の１８サイクルで行った。
【００９７】
調製用ＰＣＲ生成物をフェノール／ＣＨＣｌ３ （１：１）で抽出１回、ＣＨＣｌ３ 抽出し、次いでグリコーゲン（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）およびキャリヤーを用いてＥｔＯＨ沈降した。沈降したペレットを７０％ＥｔＯＨを用いてリンスし、減圧下で乾燥し、そして８０μｌＨ２ Ｏ、１０μｌ  １０制限緩衝液第２番および１μｌ  １００ｘＢＳＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）中に再懸濁した。生成物を２００単位のＸｂａＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）を用いて３７℃で３時間消化した。ＸｂａＩ消化生成物をフェノール／ＣＨＣｌ３ （１：１）で抽出１回、ＣＨＣｌ３ 抽出、ＥｔＯＨ沈降、７０％ＥｔＯＨを用いてリンスし、そして減圧下で乾燥した。混入している鋳型プラスミドＤＮＡから精製するために、生成物をＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭ  トリス−アセテート、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．３）中の１．０％低融点温度アガロース（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ， ＭＤ） ゲルを通して電気泳動しそしてゲルから切除した。次いで、切除生成物の試料を上記のＸｂａＩ消化、脱リン酸化およびゲル精製、チモーゲン活性化ベクターを用いるゲル内結合に使用した。構築物ＰＦＥＫ−プロテアーゼＤ−Ｇ−６ＸＨＩＳ−ＴＡＧ６４を生成するために正しい方向に挿入したＤ−Ｇ  Ｘｂａカセットを含むクローンを配列分析により確認して、ＮＨ２ −末端ＰＦＥＫプレプロ配列およびＣ−末端６ＸＨＩＳアフィニティータグに関して適切な翻訳レジスタが維持されていることを確認した。
実施例４
組換えプロテアーゼＤ−Ｇの発現
ＰＦＥＫ−プロテアーゼＤ−Ｇ−６ＸＨＩＳ構築物を含む組換えバクミド（ｂａｃｍｉｄ）を、製造者の推奨に従って、細菌形質転換、選択、増殖、精製およびＰＣＲ確認により調製した。培養したＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７１１）を精製バクミドＤＮＡを用いてトランスフェクションしそして数日後に、組換えＰＦＥＫ−プロテアーゼＤ−Ｇ−６ＸＨＩＳバキュロウイルスを含む条件調整媒体をウイルスストック増幅のために採取した。２Ｘ１０６ ／ｍｌの密度でＳｆ９００ＩＩ  ＳＦＭ中で増殖したＳｆ９細胞を２７℃で８０時間、２の感染倍数により感染し、そして媒体を採取しそしてＰＦＥＫ−プロテアーゼＤ−Ｇ−６ＸＨＩＳの精製のために濃縮した。
実施例５
組換えプロテアーゼＤ−Ｇの精製および活性化
ＰＦＥＫ−Ｄ−Ｇ−６ＸＨＩＳを発現するバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞からの培養上清を濃縮しそしてＣｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｐｌｕｓ−８０ Ｂｉｏｍａｘ−８濃縮装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ， ＭＡ）を用いて４℃で脱塩した。Ｎｉ−ＮＴＡ（チモーゲン１００μｇあたりに５０％スラリー１５０μｌ）（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）を濃縮試料５ｍｌに加えそして４℃で６０分間振とうして混合した。チモーゲン結合レジンを洗浄緩衝液〔１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、および１５ｍＭイミダゾール〕を用いて３回洗浄し、次いでｄｓＨ２ Ｏ１．５ｍｌを用いて洗浄した。チモーゲン切断は、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および２．０ｍＭ  ＣａＣｌ２ を含む緩衝液中で軽く振とうして一晩室温で少量のチモーゲン結合Ｎｉ−ＮＴＡビーズにエンテロキナーゼ（チモーゲン５０μｇあたりに１０Ｕ）（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ； またはＳｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ） を加えて行った。次いでレジンを洗浄緩衝液１．５ｍｌを用いて２回洗浄した。活性化したプロテアーゼＤ−Ｇ−６ＸＨＩＳを溶離緩衝液〔２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および２５０ｍＭイミダゾール〕を用いて溶離した。溶離したタンパク質濃縮物をマイクロ（Ｍｉｃｒｏ） ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）により、標準としてウシ血清アルブミンを用いて決定した。
組換えプロテアーゼＤ−Ｇの電気泳動およびウエスタンブロッティング検出
還元剤ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の存在下で変性した精製ＰＦＥＫ−プロテアーゼＤ−Ｇ−６ＸＨＩＳチモーゲンまたは活性化プロテアーゼＤ−Ｇ−６ＸＨＩＳの試料を、クーマシーブリリアントブルーを用いて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂｉｏ Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）により分析した。ウエスタンブロッティングのために、ゲルをハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）ＥＣＬ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ） にエレクトロトランスファーした。感染Ｓｆ９細胞より発現したＦＬＡＧタグを付したＰＦＥＫ−プロテアーゼＤ−Ｇ−６ＸＨＩＳチモーゲンを抗フラッグ（Ｆｌａｇ）Ｍ２抗体（Ｂａｂｃｏ， Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， ＣＡ） を用いて検出した。二次抗体は、ヤギ−抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ホースラディシュペルオキシダーゼ−結合Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）でありそしてＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ） により検出した。
実施例６
活性化組換えプロテアーゼＤ−Ｇの色素原アッセイ
活性化セリンプロテアーゼのアミド分解活性は商業的に入手できる合成基質（Ｂａｃｈｅｍ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｉｎｃ．， Ｔｏｒｒａｎｃｅ， ＰＡ）； Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｉｎｃ．， Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ， ＣＴ； Ｋａｂｉ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｈｅｐａｒ Ｉｎｃ．， Ｆｒａｎｋｌｉｎ， ＯＨ）よりのパラ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）の放出により測定する。アッセイ混合物は５００μＭおよび１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、および２５ｍＭイミダゾール中に色素原基質を含む。ｐＮＡの放出は、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， ＣＡ） 上で４０５ｎｍ吸収フィルターを用いて３７℃で１２０分間測定する。最初の反応速度（Ｖｍａｘ、ｍＯＤ／分）は、ソフトマックス（Ｓｏｆｔｍａｘ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， ＣＡ）を用いて時間に対する吸光のプロットより測定した。種々の基質に対する活性化プロテアーゼＤ−Ｇ−６ＸＨＩＳの比活性（生成ｐＮＡｎモル／分／μｇタンパク質）を表１に示す。精製した非活性化ＰＦＥＫ−プロテアーゼＤ−Ｇ−６ＸＨＩＳチモーゲンを用いて、測定できる色素原アミド分解活性は検出されなかった。
【００９８】
【表１】
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【００９９】
本発明のセリンプロテアーゼをモジュレーションする化合物は、加速に関して、またはさらに一般的にはタンパク質分解活性の阻害に関してスクリーニングすることにより同定される。本件の場合に、色素原活性は吸光の増加により測定されるけれども、蛍光原アッセイまたはその他の方法、例えば上記のようなタンパク質分解活性を測定するためのＦＲＥＴが使用できる。化合物を適当な溶剤、例えばＤＭＦ、ＤＭＳＯ、メタノール中に溶かし、そして通常は１００μＭを越えない濃度範囲に水中で薄め、そしてプロテアーゼの１０００倍濃度の濃度で（これに限定はされない）典型的には試験する。次いで化合物をタンパク質ストック溶液と混合し、次いで反応混合物に加える。あるいは、タンパク質および化合物溶液を反応混合物に独立して加え、ここで化合物はプロテアーゼＤ−Ｇタンパク質の添加の前、またはその直後のいずれかで加える。
【０１００】
これらの研究の間に、本明細書中に記載の配列と類似するがしかし区別されるジーンバンク（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）提出物が同定された（ジーンバンクアクセッション番号ＳＦ２１６３１２）。プロテアーゼＤ−Ｇ  ｃＤＮＡとＡＦ２１６３１２配列との間の相違の正確な意義はこの時点で完全には理解されていないが、これはイニシエーターＡＴＧ近くの異なるスプライシングの結果であり、これにより別個の配列が生成しその結果別個のタンパク質が生成するらしい。下記は、本明細書中に記載するプロテアーゼＤ−Ｇ  ｃＤＮＡの核酸（配列番号１）を大文字で上部に、そして下部に小文字で示したＡＦ２１６３１２配列の間のＧＡＰ整列である。
【０１０１】
ジーンバンクの説明情報は下記である。
【０１０２】
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【０１０３】
【表２】
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【０１０４】
【表３】
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【０１０５】
【表４】
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【０１０６】
【表５】
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下記は、推論される貫通膜ドメインの小文字で記した本明細書中に記載のプロテアーゼＤ−Ｇ  ｃＤＮＡ（配列番号２）のアミノ酸配列とＡＦ２１６３１２配列によりコードされるものの間のＧＡＰ整列である。
【０１０７】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
新規プロテアーゼＤ−Ｇ  ｃＤＮＡのヌクレオチド（配列番号１）を示す。
【図１Ｂ】
新規プロテアーゼＤ−Ｇ  ｃＤＮＡのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。推定ヌクレオチドポリアデニル化配列ならびに予測されたチモーゲン活性化切断部位に続く最初のアミノ酸４個に下線を付す。予測された疎水性膜貫通ドメインのアミノ酸を囲む。
【図２】
他のＳ１セリンプロテアーゼと関連させたプロテアーゼＤ−Ｇアミノ酸配列の系統樹を示す。
【図３】
ＰＣＲに基づく組織分布は、プロテアーゼＤ−Ｇ  ｍＲＮＡが制限されていることを示す。ゲルのオートラジオグラムをＤ−Ｇ特異性ＰＣＲ生成物の位置で示し、これは遊離プローブ（Ｆ．Ｐ．）よりの電気泳動から識別された標識しネストしたプローブのハイブリダイゼーションにより検出された。分析した組織および細胞系統のｃＤＮＡライブラリーは図示の通りである。
【図４Ａ、４Ｂ】
チモーゲン活性化構築物内のプロテアーゼＤ−Ｇ触媒ドメインのヌクレオチド（配列番号８）およびアミノ酸（配列番号９）配列を示す。
【図５】
精製した組換えプロテアーゼＰＦＥＫプロテアーゼＤ−Ｇ−６ＸＨＩＳのポリアクリルアミドゲルおよびウエスタンブロット分析。クーマシーブリリアントブルーを用いて染色した新規セリンプロテアーゼＰＦＥＫ−プロテアーゼＤ−Ｇ−６ＸＨＩＳの試料を含むポリアクリルアミドゲルを示す（レーン２および３）。相対分子質量は、タンパク質標準の位置により示す（レーン１）。示されたレーンでは、精製チモーゲンは未処理（−）またはエンテロキナーゼ（ＥＫ）を用いて消化（＋）し、ＥＫはレーン１のチモーゲンを切断および活性化してレーン２に示す高い移動性の活性形とするために使用された。レーン４および５は、抗−ＦＬＡＧ  ＭｏＡｂＭ２と用いてプローブした相当するゲルレーン１および２のウエスタンブロットを示す。これは、処理および活性化されたプロテアーゼを生成する発現および精製されたチモーゲンの定量的な切断を証明する。ＦＬＡＧエピトープは、配列毎にＥＫの直ちに上流に位置するので、ＥＫを用いる切断は、ポリアクリルアミドゲル中に保持されるためには小さすぎるＦＬＡＧ含有ポリペプチドを生成し、従って＋ＥＫレーン中では検出されない。
【図６】
活性化構築物より発現、精製および活性化された組換えプロテアーゼＤ−Ｇ−６ＸＨＩＳの機能性アミド分解活性を図示の色素原基質を用いて決定した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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