(57)【要約】ＶＥＧＦの一部である、式：ＱＫＲＫＲＫＫＳＲＹＫＳＷＳＶＰで示されるアミノ酸配列の一部または全体を有し、血管形成阻害能を有するペプチド。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
ＱＫＲＫＲＫＫＳＲＹＫＳＷＳＶＰ
（式中、任意のＹ残基は少なくともアイソスター、その同族体、またはそのフラグメント置換されていてもよい）
で示されるアミノ酸配列を有し、血管形成を阻害するペプチド。
【請求項２】
３〜８個のアミノ酸を有する請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
Ｒおよび／またはＫ残基を有する請求項１または２記載のペプチド。
【請求項４】
ＲＫＲＫＫＳＲの全部または一部を含む請求３に記載のペプチド。
【請求項５】
環状形である、請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド。
【請求項６】
治療使用のためのものである、請求項１〜５のいずれかに記載のペプチド。
【請求項７】
血管形成阻害薬の製造のための、請求項１〜６のいずれかに記載のペプチドの使用。
【請求項８】
癌治療用医薬の製造のための、請求項１〜６のいずれかに記載のペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）のフラグメントであって、治療において有益と予測される活性を有するペプチドに関する。
【０００２】
（背景技術）
ＶＥＧＦは胚形成における血管系の形成に必須であり、種々の疾患状態における血管形成に主要な役割を果たしている。ＶＥＧＦの発現は、多様な細胞型で低酸素と数種のサイトカインによってアップレギュレートされ、内皮細胞の分化、増殖、遊走（マイグレーション）及び生存、血管透過性の増大、単球の遊走、血管拡張因子ＮＯとプロスタサイクリンの内皮生産の増大等を含む、多数のインビボ及びインビトロでの生物学的な活性を誘発する。ＶＥＧＦ誘発性のＮＯとプロスタサイクリンの生産は、次いで、透過性の増大、内膜血管平滑筋細胞過形成と血栓症の防止等の、ＶＥＧＦの血管形成およびＶＥＧＦの幾つかの血管保護作用に関係する。
【０００３】
ヒトＶＥＧＦはｍＲＮＡの選択的スプライシングにより産生される１２１、１４５、１６５、１８９、および２０６アミノ酸の、多数のアイソフォームとして存在し、これらのうちＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５およびＶＥＧＦ１６５は分泌型であり生物学的に活性形であることが知られている。ＶＥＧＦのための２つの異なるタンパク質チロシンキナーゼ・レセプター（Ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ１）およびＫＤＲ／Ｆｌｋ １（ＶＥＧＦＲ２））が同定された。ＫＤＲ／ｆｌｋ−１は、主に内皮細胞内でのＶＥＧＦの分裂促進効果とインビボでの血管形成を媒介するレセプターであると思われるが、内皮細胞におけるＦｌｔ−１の機能は知られていない。非チロシンキナーゼ膜貫通タンパク質、ニューロピリン−１（ＮＰ−１））は、ＶＥＧＦ１６５に特異的に結合し、ＶＥＧＦ１６５のＶＥＧＦＲ２との結合を高める、ＶＥＧＦのための追加のレセプターであることが確認された。ＶＥＧＦの生物学的効果の調停におけるＮＰ−１の役割は、依然として大部分が未知である。
【０００４】
（発明の開示）
驚くべきことに、ＶＥＧＦのフラグメントが抗−血管形成性であることが分かった。それらは、ＶＥＧＦ拮抗作用（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有する可能性がある。
本発明によれば、ペプチドは式：
ＱＫＲＫＲＫＫＳＲＹＫＳＷＳＶＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）
（式中、任意のＹ残基は少なくともアイソスター（ｉｓｏｓｔｅｒｅ， 同配体）、またはそのフラグメント、誘導体または同族体で置換されていてもよい）
で示されるアミノ酸配列を有し、そのようなペプチドは血管形成を阻害する。
【０００５】
この配列は、ＶＥＧＦ内の、１２５−１４０アミノ酸に対応する。本発明はまた該配列の変異体を含み、該変異体において、新規な活性（すなわち血管形成の阻止）が予想外の構造上の変動なしに保持されている。このように、所定の配列は、ペプチドを比較的安定化させるアイソステアまたは同族体による置換または誘導体化を含む可能性がある。
【０００６】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明のペプチドは、既知の方法によって合成することができる。その例を、以下に示す。これらは既知の方法で処方し、使用することができる。ペプチドが抗−血管形成活性を伴うということは、それらが腫瘍の治療に使用し得ることを意味する。
【０００７】
アミノ酸配列の重要な特色は、ＫおよびＲのような塩基性残基の存在と配置であるかもしれない。本発明のペプチドは、好ましくは、１個の、または例えば非塩基性残基によって隔てられた２個以上のＫＫ、ＫＲまたはＲＫ配列を含む。
【０００８】
本発明の代表的なペプチドは、少なくとも４個のアミノ酸を有する。最高６個か８個のアミノ酸を有してもよいが、できるだけ短いことが好ましい。
【０００９】
本発明のペプチドは、例えば端と端で、または２個のＣｙｓ残基の置換／導入により、環化されていてもよい。環化手順は既知である（例えば、Ｔａｍら、ＪＡＣＳ １１３：６６５７−６２（１９９１））。他の環化法（例えば、ミツノブ法またはオレフィンメタセシス環化法）も使用可能である。環状ペプチドは、強化された特性を示す可能性がある。
【００１０】
上で指摘したように、本発明のペプチドは特定の配列の修飾を含む。そのような修飾は、当業者に周知である。アイソスター置換は、Ｃｙｓの代わりにＡｂ（これはペプチドの環化のために偶数のＣｙｓ残基を保持しなければならない場合に望ましいかもしれない）、Ｔｙｒの代わりにＰｈｅ、あるいは種々のアルキル／アリール置換分の置換、などを含む。より大きな蛋白質分解、および他の修飾に対する抵抗性を有するペプチドを生産するための、アミノ酸残基における置換分の変動、Ｃ原子からＮ原子、は既知であり本発明の範囲内に包含される。
【００１１】
本発明のペプチドの抗血管形成特性は、後述する方法で測定することができる。活性のレベルは、少なくとも、最初のテストの対象である２つの線状ドデカペプチド（すなわち、ＱＫＲＫＲＫＫＳＲＹＫＳ（Ｖ１２５−１３６； ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）およびＲＫＫＳＲＹＫＳＷＳＶＰ（Ｖ１２９−１４０； ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）と同程度の高さであることが好ましい。本発明の更なる例は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ４〜２１である。図２をも参照。
【００１２】
本発明のペプチドの活性は、血管形成が病理学的に有意な役割を果たす可能性のある疾患の治療に役立ち得ることを意味する。これらには、糖尿病性網膜症のような眼の血管形成疾患、またはＡＲＤＳ（加齢性黄斑変性）のような血管形成が関与している可能性の有る他の疾患が含まれる。血管形成が有意な役割を果たしている可能性がある他の疾患として、腫瘍増殖または子宮内膜症、および乾癬のような皮膚の病気がある。ペプチドは、また、カポジ肉腫（エイズ患者で発症）を含む特殊な癌、皮膚と眼の悪性黒色腫、卵巣、乳、肺、膵、前立腺、結腸および類表皮癌等の固形の悪性腫瘍の治療に役立つ可能性がある。それらはまた、血管の構成要素による炎症性状態としての関節リウマチの治療に使用しうる。
【００１３】
治療に使用するために、本発明のペプチドは、製剤化して投与することができ、また当業者既知の成分を用いることができる。ペプチドの適切な投与量は、対象の状態、化合物の有効性、投与経路および同様の因子等の典型的な必要条件を考慮して、当業者が選択することができる。
以下の実施例により本発明を説明する。
【００１４】
略語
ＭＢＨＡ（メチルベンズヒドラミン）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシ−カルボニル）、Ａｌａ（アラニン）、Ａｒｇ（アルギニン）、Ａｓｎ（アスパラギン）、Ａｓｐ（アスパラギン酸）、Ａｂｕ（アミノ酪酸）、Ｃｙｓ（システイン）、Ｇｌｎ（グルタミン）、Ｇｌｕ（グルタミン酸）、Ｇｌｙ（グリシン）、Ｈｉｓ（ヒスチジン）、Ｉｌｅ（イソロイシン）、Ｌｅｕ（ロイシン）、Ｌｙｓ（リジン）、Ｍｅｔ（メチオニン）、Ｐｈｅ（フェニルアラニン）、Ｐｒｏ（プロリン）、Ｓｅｒ（セリン）、Ｔｈｒ（スレオニン）、Ｔｒｐ（トリプトファン）、Ｔｙｒ（チロシン）、Ｖａｌ（バリン）、Ｐｂｆ（２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル）、Ｐｍｃ（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）、Ｔｒｔ（トリチル）、ｔＢｕ（ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｂｏｃ（ブトキシカルボニル）、Ｐｙｂｏｐ（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリスピロリジノホスホニウム　ヘキサフルオロホスフェート）、ＮＭＭ（Ｎ−メチルモルホリン）、ＤＣＭ（ジクロロメタン）、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）、ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィ質量分析）、ＡＡＡ（アミノ酸分析）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）、ＴＢＭＥ（ｔ−ブチル メチル エステル）。
【００１５】
ペプチド合成
全ペプチドを、固相法を用い、自動ＡＭＳ ４２２ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで合成した。Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂（負荷量、０．５９および０．６８ｍｍｏｌ／ｇ）と環化される誘導体のＣｙｓ側鎖の直角保護（Ａｃｍ、ｔ−ブチル）を用いるＮ−Ｆｍｏｃ法を適用した。例えば、ＱＫＲＫＲＫＫＳＲＹＫＳ（Ｖ１２５−１３６）とＲＫＫＳＲＹＫＳＷＳＶＰ（Ｖ１２９−１４０）を２５μモル規模で合成し、３０分の基本的なカップリング時間で一度に連結した。樹脂とアミノ酸誘導体、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ Ｈ２Ｏ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ／Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ Ｈ２Ｏ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ ＵＫ Ｌｔｄ．（ノッティンガム、英国）またはＡｌｅｘｉｓ（ノッティンガム、英国）から購入した。
【００１６】
カップリング試薬としてＰｙｂｏｐ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）とＮＭＭ（Ｒａｔｈｂｕｒｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ウォーカーバーン、スコットランド）を用い、活性エステル法で、各アミノ酸をＣ−末端からＮ末端方向に伸びるペプチド鎖に順次連結した。ＤＭＦ（Ｒａｔｈｂｕｒｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）中２０％ピペリジン処理によりＮ−Ｆｍｏｃ保護基を除去した後、ＤＭＦおよびＤＣＭにより順次洗浄した。自動アセチル化は、各ペプチドを合成した後、４倍過剰量の酢酸（０．７モル、Ｒａｔｈｂｕｒｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用い、 Ｒｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ−ＭＢＨＡ樹脂の置換に基づいて実施した。カップリング試薬、Ｐｙｂｏｐ、ＮＭＭと全てのアミノ酸誘導体（アミノ酸Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨとＦｍｏｃ Ｐｈｅ−ＯＨを除く）を、ＤＭＦ（０．７Ｍ、Ｒｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ−ＭＢＨＡ樹脂上の置換に基づいて、４倍過剰）に溶解した。これらの保護されたアミノ酸誘導体をＮ−メチルピロリドンに溶解した。使用した全溶媒は、ＨＰＬＣグレードの品質であった。
【００１７】
ペプチドを、５％チオアニソール、２．５％水および発生する反応性カチオンのスカベンジャーとして２．５％エタンジチオールの存在下、室温で３時間、９０％ＴＦＡを使用して同時脱保護することにより樹脂から開裂した。開裂混合物をろ過し氷冷ＴＢＭＥ中で析出させた。残る樹脂を、開裂試薬で一度洗浄し、ろ過して、先に得た画分と合した。沈降物を、遠心して集め、氷冷ＴＢＭＥで３回洗浄し、室温で一晩乾燥させた。粗製ペプチドを、１５％の水性酢酸に溶解し、２日間凍結乾燥した（−４０℃、６ ｍｂａｒ）。
【００１８】
精製と特性化
粗製ペプチドは、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ＨＰＬＣ装置（モデル１１００）を備えたＱｕａｔｔｒｏ ＬＣＭａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）により、分析的逆相カラム（カラム：Ａｌｌｔｅｃｈ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＰＥＰ逆相カラム、１０ｎｍ、Ｃ８、５μ（２５０ｘ ４．６ｍｍ）、０−５０％アセトニトリル、２０分間）を用いる分析的ＬＣ−ＭＳによって分析した。分離物を、流速１ｍＬ／分で、波長２１５ｎｍにおけるアミド結合の吸光度を測定してモニターした。粗製ペプチドを、２１５ｎｍでモニターし流速２０ｍＬ／分で溶出する、調製用逆相ＨＰＬＣ（Ｇｉｌｓｏｎ）によって精製した。粗製ペプチドのＬＣ−ＭＳ分析に関して記載したものと同一の移動相を用いた。粗製ペプチドを、Ａｌｌｔｅｃｈ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＰＥＰ逆相カラム、１０ｎｍ、Ｃ８、８μ（２５０ｘ ２２ｍｍ）を使用して精製した。０−５０％アセトニトリルにより、２０分で溶離した。同族体は、高速液体クロマトグラフィ（ＬＣ−ＭＳ）を使用した場合、純度９５％より高く、予想されるアミノ酸配列決定を示した。
【００１９】
さまざまな異なるグラディエントを、２１５ｎｍでモニターして行うペプチドの溶離に用いた。有機相、アセトニトリル、水相は、両方とも０．１％ＴＦＡおよび３％１−プロパノールを含む。グラディエントと流速を、以下に記載する。パーセンテージは、有機相の比率を示す。０−５０％、２０分、流速１ｍＬ／分。
【００２０】
ＶＥＧＦで刺激されたＰＧ１２生産のペプチドによる阻害
１２−ウエルプレート中で、コンフルエントなＨＵＶＥＣを、記載の濃度のペプチドＶ−１２５−１３６およびＶ１２９−１４０と一緒に、３０分間予備インキュベートした後、さらなる添加なしにさらに３０分間インキュベートするか、ＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）に１時間曝露した。若干の細胞を、ペプチドなしで、２５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦの非存在下（Ｃ、対照）または存在下で培養した。上清を集め、６−ケト−プロスタグランジンＦｌαをエンザイムイムノアッセイで測定した。結果を図１に示す。図中、バーはデュープリケートの決定から得た、６−ケト−プロスタグランジンＦｌαの、非刺激対照のレベル（１００％）に対する平均％±ＳＥＭを表す。同様の結果が、２つの独立実験で得られた。
【００２１】
１２５Ｉ−ＶＥＧＦ１６５結合実験
２４穴プレート中のコンフルエントなＨＵＶＥＣｓを、ＰＢＳで２回洗浄し、結合培地（ＤＭＥＭ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３、０．１％ＢＳＡ含有）で種々の濃度に希釈したペプチドと一緒に、０．０３ｎＭまたは０．１ｎＭ １２５Ｉ−ＶＥＧＦ１６５（１２００−１８００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ、アマシャム）の存在下、４℃でインキュベートした。４℃で２時間インキュベートし、細胞を冷ＰＢＳで４回洗浄した後、０．２５Ｍ ＮａＯＨ、０．５％ＳＤＳで溶解し、溶菌液に結合した放射活性を測定した。非特異的な結合を、１００倍過剰の非標識ＶＥＧＦの存在下で測定した。特異的な結合は、全結合から非特異的結合を差し引くことにより算出した。全結合実験は、トリプリケート（三通り）で行った。
【００２２】
１２−ｍｅｒ（１２アミノ酸長）のＶ１２５−１３６の端を切除した一連の誘導体を試験した。結果は、１０−ｍｅｒ ＲＫＲＫＫＳＲＹＫＳと９−ｍｅｒ ＱＫＲＫＲＫＫＳＲが１２−ｍｅｒと同様の活性を持つことを示している（図２）。これはＮ−末端とＣ末端の切り詰めが活性に影響を及ぼす可能性がないこと、および生物活性に必要な最小限の配列が７−ｍｅｒ ＲＫＲＫＫＳＲであることを示唆している。
【００２３】
インビトロ血管形成アッセイ
ヒト線維芽細胞との共培養中でのヒト内皮細胞由来の細管形成（ＴＣＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）に基づくインビトロ血管形成アッセイを用いて、選択したペプチドの血管形成における効果を調べた。実験の最初に、ペプチドをＶＥＧＦおよび他の因子と一緒に加え、各培地を第４、７および９日目に交換した。第１１日目に培養物を室温で３０分間、７０％エタノールで固定化した後、内皮細胞接着分子ＣＤ３１のための免疫染色に供した。固定化細胞を、一次抗体（マウス抗ヒトＣＤ３１）と一緒に３７℃で１時間培養し、ブロッキングバッファー（遮断緩衝液）（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）で、３回洗浄した後、３７℃で１時間、二次抗体（アルカリホスファターゼ結合抗ヤギマウスＩｇＧ）と一緒にインキューベートした。蒸留水で３回洗浄した後最後に細胞を基質溶液と一緒に３７℃で１０分間インキュベートした。免疫染色により観察し、対物レンズ（ｘ４）を備えたツァイス（Ｚｅｉｓｓ）倒立顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ ＣＦＬ２５）を使用して撮影した。各実験対照ウエルには、ＶＥＧＦ単独、ＶＥＧＦ＋２０μＭスラミン（既知のＶＥＧＦ−誘発血管形成阻害剤）、非添加を含む。幾つかの結果を図３に示す。Ａ、特異的イムノアッセイによって測定した、１１日間で非処理対照から放出されたＶＥＧＦ；Ｂ、非処理対照；Ｃ、ＶＥＧＦ；Ｄ、ペプチド１２１−１３２；Ｅ、ペプチド１２１−１３２存在下ＶＥＧＦ；Ｆ、ペプチド１２５−１３６；Ｇ、ペプチド１２５−１３６存在下ＶＥＧＦ。
【００２４】
アッセイのさらなる結果は図４に示されている。これらの結果は７−ｍｅｒ　ＲＫＲＫＫＳＲ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２１）に関し、それが１２−ｍｅｒと同様の有効性で血管形成を阻害することを示している。
【図１】
2004512342.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
2004512342.tif 000026
2004512342.tif 000027
2004512342.tif 000028