(57)【要約】ヒトまたはヒト以外の動物において脳血管疾患を治療する方法が開示されている。本方法は、ヒトまたはヒト以外の動物において脳血流を増加させるか、その減少を防止するのに十分なほど２０−ＨＥＴＥ合成酵素活性を低下させることを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたはヒト以外の動物において脳血管疾患を治療する方法であって、前記動物において脳血流を増加させるか、又はその減少を防止するのに十分なほど前記動物において２０−ＨＥＴＥ合成酵素活性を低下させる工程を含む方法。
【請求項２】
前記脳血管疾患が、閉塞性脳卒中、出血性脳卒中、偏頭痛、脳血管痙攣、感染症、外傷性頭部および脳損傷によって生じた症状、および、血流の低下に随伴する慢性神経疾患から選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
血流の低下に随伴する前記慢性神経疾患が、アルツハイマー病、痴呆、パーキンソン病、およびハンチントン病から選択される、請求項２の方法。
【請求項４】
２０−ＨＥＴＥ合成酵素活性の低下を、２０−ＨＥＴＥ合成酵素阻害物質を前記動物に投与することによって行なう、請求項１の方法。
【請求項５】
前記２０−ＨＥＴＥ合成酵素阻害物質が、ＨＥＴ００１６、１７−ＯＤＹＡ、ジブロモドデセニルメチルスルフィミド（ｄｉｂｒｏｍｏｄｏｄｅｃｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｉｍｉｄｅ）、１−アミノベンゾトリアゾール、およびミコナゾールから選択される、請求項４の方法。
【請求項６】
前記２０−ＨＥＴＥ合成酵素阻害物質が、２０−ＨＥＴＥ合成酵素に対する抗体である、請求項４の方法。
【請求項７】
前記２０−ＨＥＴＥ合成酵素阻害物質がＨＥＴ００１６である、請求項４の方法。
【請求項８】
ＨＥＴ００１６の投与量が、ＨＥＴ００１６の血中濃度が約１ｎＭから約１，０００ｎＭまでとなるのに十分である、請求項７の方法。
【請求項９】
ＨＥＴ００１６の投与量が、ＨＥＴ００１６の血中濃度が約２ｎＭから約２５ｎＭまでとなるのに十分である、請求項７の方法。
【請求項１０】
ＨＥＴ００１６を静脈内投与する、請求項７の方法。
【請求項１１】
ＨＥＴ００１６の投与量が、体重１ｋｇ当たり約０．００３ｍｇから体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇまでである、請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記２０−ＨＥＴＥ合成酵素阻害物質がＣＹＰ４Ａ阻害物質である、請求項４の方法。
【請求項１３】
前記２０−ＨＥＴＥ合成酵素阻害物質がＣＹＰ４Ｆ阻害物質である、請求項４の方法。
【請求項１４】
前記２０−ＨＥＴＥ合成酵素阻害物質を経口投与する、請求項４の方法。
【請求項１５】
前記２０−ＨＥＴＥ合成酵素阻害物質を静脈内投与する、請求項４の方法。
【請求項１６】
前記２０−ＨＥＴＥ合成酵素阻害物質を皮下投与する、請求項４の方法。
【請求項１７】
前記２０−ＨＥＴＥ合成酵素阻害物質を、硬膜下注射または脳室内注射によって、くも膜下腔内からＣＳＦに投与する、請求項４の方法。
【請求項１８】
前記脳血管疾患が、くも膜下出血後の脳血管痙攣である、請求項１の方法。
【請求項１９】
２０−ＨＥＴＥ合成酵素活性の低下を、ＨＥＴ００１６を前記動物に投与することによって行なう、請求項１８の方法。
【請求項２０】
ＨＥＴ００１６を静脈内投与する、請求項１９の方法。
【請求項２１】
ＨＥＴ００１６の投与量が、体重１ｋｇ当たり約０．００３ｍｇから約１０ｍｇまでである、請求項２０の方法。
【請求項２２】
２０−ＨＥＴＥ合成酵素活性の低下を、１７−ＯＤＹＡを前記動物に投与することによって行なう、請求項１８の方法。
【請求項２３】
１７−ＯＤＹＡを脳脊髄液に投与する、請求項２２の方法。
【請求項２４】
１７−ＯＤＹＡの投与量が、脳脊髄液における最終濃度を約１μＭから約１０μＭまでとするのに十分である、請求項２３の方法。
【請求項２５】
２０−ＨＥＴＥ合成酵素活性の低下を、ＤＤＭＳを前記動物に投与することによって行なう、請求項１８の方法。
【請求項２６】
ＤＤＭＳの投与量が、脳脊髄液における最終濃度を約１０μＭとするのに十分である、請求項２５の方法。
【請求項２７】
２０−ＨＥＴＥ合成酵素活性の低下を、２０−ＨＥＴＥ合成酵素の濃度を低下させることによって行なう、請求項１の方法。
【請求項２８】
２０−ＨＥＴＥ合成酵素活性の低下を、アンチセンスオリゴヌクレオチドを前記動物に投与することによって行なう、請求項１の方法。
【請求項２９】
前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡである、請求項２８の方法。
【請求項３０】
前記ＤＮＡが配列番号１と同じ塩基配列を有する、請求項２９の方法。
【請求項３１】
前記ＤＮＡが配列番号３と同じ塩基配列を有する、請求項２９の方法。
【請求項３２】
前記オリゴヌクレオチドがＲＮＡである、請求項２８の方法。
【請求項３３】
前記ＲＮＡが配列番号２と同じ塩基配列を有する、請求項３２の方法。
【請求項３４】
前記ＲＮＡが配列番号４と同じ塩基配列を有する、請求項３２の方法。
【請求項３５】
前記オリゴヌクレオチドを静脈内投与する、請求項２８の方法。
【請求項３４】
前記オリゴヌクレオチドを前記動物の脳脊髄液内に投与する、請求項２８の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０００年１１月３日に出願された米国仮出願第６０／２４５，６３８号の利益を主張するものである。
【０００２】
（連邦政府により援助を受けた研究または開発に関する記述）
本発明は、次の機関により授与された、米国政府の支援によって行われたものである。ＮＩＨ助成番号ＨＬ−５９９９６およびＨＬ−３６２７９。米国は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
（発明の背景）
脳血流の低下は、軽度の頭痛から重篤な脳損傷および死に至るまで各種疾患の原因となりうる。脳血流の低下をもたらしうる状況は数多くある。そのような状況の例として、出血性脳卒中、脳傷害、閉塞性脳卒中、脳血管痙攣、および低血圧などが挙げられる。
【０００４】
くも膜下出血（ＳＡＨ）が全脳卒中の５〜１０％を占めている。その発生率は、毎年人口１００，０００人当たり２〜２０件で、致死率は２０〜６０％である。Ｉｎｇａｌｌ， Ｔ．ら、Ｓｔｒｏｋｅ ３１： １０５４−１０６１ （２０００年）； Ｓｔｒｏｋｅ ３１： １８４３−１８５０ （２０００年）。ＳＡＨは、通常、脳動脈瘤の破裂または頭蓋骨損傷の後に起こり、くも膜下の出血および血栓形成に至る。出血すると、血管作用性物質を血液から放出して脳血管緊張を高めるとともに、脳脊髄液圧が上昇して有効灌流圧を低下させるために脳血流量は当初減少する。ＳＡＨに引き続いて起こる傷害の初期には高い死亡率が伴う（３０〜５０％）。遅発して脳血管痙攣（ＣＶＳ）が発症する（ラットでは２、３日後、人間では５〜７日後）。この遅発性ＣＶＳに随伴する死亡率は極端に高く７０％近い。Ｗｅｉｒ， Ｂ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． ９：３７５−３９０ （１９９５年）。血液から放出され、ＳＡＨ後の初期に脳血流を減少させる因子についてはほとんど知られていない。遅発性ＣＶＳをもたらすものについてはさらに知られていない。これまでの研究によって、ＳＡＨの後遅発して起こるＣＶＳは、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化、Ｋ＋チャンネル活性の低下、および血管平滑筋（ＶＳＭ）細胞の脱分極を伴うことが示されている。脳のＶＳＭ細胞の脱分極によってカルシウム流入が増加し、それが、エンドセリン（ＥＴ）、トロンボキサン、セロトニン、およびその他、凝血によって産生される血管収縮物質に対する血管収縮反応を可能にし、また、一酸化窒素（ＮＯ）など、内生的に生成される血管拡張物質に対する脳血管の応答性を減少させる。ＮＯに対する反応の低下は、赤血球溶血後に遊離したヘモグロビンにＮＯが結合するためであるか、Ｅｄｗａｒｄｓ， Ｄ．Ｈ．ら、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． ７６：８３０−８３７ （１９９２年）、またはヘモグロビンの酸化によって生成されるスーパーオキシドによってＮＯの分解が促進されるためであると考えられている。Ｍｉｓｒａ， Ｈ．Ｐ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４７：６９６０−６９６２ （１９７２年）； Ｗｉｎｔｅｒｂｏｕｒｎ ＣＣら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １５５： ４９３−５０２ （１９７６年）。さらに、ＮＯの二次メッセンジャーの一つであるグアニリルシクラーゼの活性が、ＳＡＨの後に低下するという証拠がある。Ｆａｒａｃｉ， Ｆ．Ｍ．とＳｏｂｅｙ， Ｇ．Ｃ．， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ８２１：３６８−３７３ （１９９９年）； Ｓｅｈｂａ， Ｆ．Ａ．ら、Ｓｔｒｏｋｅ ３０：１９５５−１９６１（１９９９年）。
【０００５】
別の研究によって、ＳＡＨの後にＣＶＳをもたらす血管収縮経路のアップレギュレーションの役割が調べられた。ＳＡＨの後にＥＴ値は上昇する。ラットにおいてＳＡＨを誘発した２時間後に観察される脳血流の最初の低下は、ＥＴ合成阻害剤およびＥＴレセプター遮断剤によって緩和する。Ｃｌｏｚｅｌ， Ｍ．とＷａｔａｎａｂｅ， Ｈ．， Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ５２：８２５−８３４ （１９９３年）。また、ＳＡＨの後には、脂肪酸の代謝回転が促進され、アラキドン酸（ＡＡ）の血管収縮物質代謝物の生成が増加することも観察された。Ｊｕｖｅｌａ Ｓ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． ９２：３９０−４００ （２０００年）； Ｓｅｉｆｅｒｔ， Ｖ．ら、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． ８２：５５−６２ （１９９５年）。最近の研究では、２０−ヒドロキシエイコサテトラエン酸（２０−ＨＥＴＥ）が、脳循環において産生されるＡＡの代謝物であることが示されている。しかし、ＳＡＨ後のＣＶＳの発病における２０−ＨＥＴＥの役割は不明である。２０−ＨＥＴＥは、大脳動脈中のＶＳＭ細胞において発現される、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）４Ａファミリーの酵素によって産生される。Ｈａｒｄｅｒ， Ｄ．Ｒ．ら、Ａｍ． Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ２６６：Ｈ２０９８−Ｈ２１０７ （１９９４年）； Ｇｅｂｒｅｍｅｎｄｉｎ， Ｄ．ら、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ８７：６０−６５， ２０００年。２０−ＨＥＴＥを生成するＣＹＰ４Ａファミリーのメンバーは、ラットのＣＹＰ４Ａ１、２、３、および８、マウスのＣＹＰ４Ａ１０、１２および１４、ならびにヒトのＣＹＰ４Ａ１１などである。ＣＹＰ４Ｆファミリーの酵素も２０−ＨＥＴＥ産生に関与する。２０−ＨＥＴＥを生成するＣＹＰ４Ｆファミリーのメンバーは、ラットのＣＹＰ４Ｆ１、４、５および６、ならびにヒトのＣＹＰ４Ｆ２および３などである。ＣＹＰ４Ｆ２をＡＡとインキュベートすると２０−ＨＥＴＥを産生することが明らかになっている。Ｐｏｗｅｌｌ， Ｐ．Ｋ．ら、Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒａｐ． ２８５：１３２７−１３３６， １９９８年。ＣＹＰ４Ｆ３は、２０−ＨＥＴＥを産生する多形核白血球において発現していることが分かっている。Ｂｅｄｎａｒ， Ｍ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ６０：４４７−４５５， ２０００年； Ｒｏｓｏｌｏｗｓｋｙ， Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． １３００：１４３−１５０， １９９６年。
【０００６】
２０−ＨＥＴＥは、大脳動脈の強力な血管収縮物質である（ＥＣ５０＜１０ｎＭ）。２０−ＨＥＴＥは、大きな伝導ＫＣａチャンネルを阻害することによって、ＰＫＣを活性化し、ＶＳＭ細胞を脱分極させる。また、２０−ＨＥＴＥは、脳脈管構造内のＬ型Ｃａ２＋チャンネルを経由するＣａ２＋流入も増加させ、Ｈａｒｄｅｒ， Ｄ．Ｒ．ら、Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ２６６：Ｈ２０９８−Ｈ２１０７ （１９９４年）； Ｇｅｂｒｅｍｅｄｈｉｎ， Ｄ．ら、Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ （Ｌｏｎｄ）． ５０７（Ｐｔ３）： ７７１−７８１ （１９９８年）、また、ラットにおける脳血流の自己調節の基礎をなす機序において重要な役割を演じている。Ａｌｏｎｓｏ−Ｇａｌｉｃｉａ， Ｍ．ら、Ｓｔｒｏｋｅ ３０：２７２７−２７３４ （１９９９年）； Ｇｅｂｒｅｍｅｄｈｉｎ， Ｄ．ら、Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ８７：６０−６５ （２０００年）。血管収縮ペプチド様アンギオテンシンＩＩおよびＥＴは２０−ＨＥＴＥの生成を促進する。Ｏｙｅｋａｎ， Ａ．ら、Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２７３：Ｒ２９３−Ｒ３００ （１９９７年）； Ｃｒｏｆｔ， Ｋ．Ｄ．ら、Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７９：Ｆ５４４−Ｆ５５１ （２０００年）。血管拡張物質であるＮＯは２０−ＨＥＴＥの生成を阻害する。Ａｌｏｎｓｏ−Ｇａｌｉｃｉａ， Ｍ．ら、Ｓｔｒｏｋｅ ３０：２７２７−２７３４ （１９９９年）。活性化多形核白血球（ＰＭＮ）および大脳動脈は、盛んに２０−ＨＥＴＥを産生する。Ｈａｒｄｅｒ， Ｄ．Ｒ．ら、Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ２６６：Ｈ２０９８−Ｈ２１０７ （１９９４年）； Ｇｅｂｒｅｍｅｄｈｉｎ， Ｄ．ら、Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ （Ｌｏｎｄ）． ５０７（Ｐｔ３）： ７７１−７８１ （１９９８年）、Ａｌｏｎｓｏ−Ｇａｌｉｃｉａ， Ｍ．ら、Ｓｔｒｏｋｅ ３０：２７２７−２７３４ （１９９９年）； Ｇｅｂｒｅｍｅｄｈｉｎ， Ｄ．ら、Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ８７：６０−６５ （２０００年）、Ｂｅｄｎａｒ， Ｍ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ６０：４４７−４５５， ２０００年； Ｒｏｓｏｌｏｗｓｋｙ， Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． １３００：１４３−１５０， １９９６年； Ｌａｎｇｅ， Ａ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２７３４５−２７３５２ （１９９７年）。しかしながら、２０−ＨＥＴＥ合成酵素阻害物質で動物を処置すれば、ＳＡＨ（出血性脳卒中）に伴う脳血流の初期低下または遅延性ＣＶＳおよび脳虚血を防止できるのか否かは不明である。さらに、２０−ＨＥＴＥの生成を阻害するために現在使用可能な薬剤には、治療薬としての可能性を大きく制約する重大な限界がある。例えば、１７−ＯＤＹＡは２０−ＨＥＴＥの合成を阻害するが、ＥＥＴ類の生成の遮断にも同じように有効であるため特異的な阻害剤とはいえない。Ｚｏｕ， Ａ．Ｐ．ら、Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒａｐ． ２６８： ４７４−４８１， １９９４年。ＥＥＴは、脳で生成される強力な血管拡張物質である。ＥＥＴ��の合成を遮断すると、２０−ＨＥＴＥの生成を遮断したことに伴う有利な効果と拮抗することになるかもしれない。Ａｌｋａｙｅｄ， Ｎ．Ｊ．ら、Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ２７１：Ｈ１５４１−Ｈ１５４６， １９９６年； Ｇｅｂｒｅｍｅｎｄｈｉｎ， Ｄ．ら、Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ２６３： Ｈ５１９−Ｈ５２５， １９９２年。１７−オクタデシン酸（１７−ＯＤＹＡ）も血漿タンパク質に結合するため、全身投与されても血液脳関門を通過しない。ＤＤＭＳは、２０−ＨＥＴＥの生成のより特異的な阻害物質である。Ａｌｏｎｓｏ−Ｇａｌｉｃｉａ， Ｍ．ら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ２９：３２０−３２５， １９９７年； Ｗａｎｇ， Ｍ．Ｈ．ら、Ｊ． Ｐｈａｒｍａ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒａｐ ２８４： ９６６−９７３， １９９８年。しかし、これも血漿タンパク質に結合して、全身投与されても血液脳関門を通過しない。
【０００７】
これまでの研究で、ＤＤＭＳの脳室内注射が脳血流に与える影響が調べられてきた。ＤＤＭＳは脳血流の基線に影響を与えない。しかし、脳血流の自己調節、すなわち、脳血流の上昇に伴う脳血管収縮を遮断する。Ｇｅｂｒｅｍｅｎｄｉｎ， Ｄ．ら、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ８７： ６０−６５， ２０００年。また、ＤＤＭＳも、ＮＯドナーであるＤＥＡ　ＮＯＮＯａｔｅによって生じる脳血流の増加を防止することが報告されている。Ａｌｏｎｓｏ−Ｇａｌｉｃｉａ， Ｍ．ら、Ｓｔｒｏｋｅ ３０：２７２７−２７３４， １９９９年。しかしながら、ＤＤＭＳまたは１７−ＯＤＹＡが、ＳＡＨないし脳卒中、およびこれ以外の脳血管疾患に付随する脳血流の低下を防止または逆転させるのに有利な作用を発揮するか否かに関して利用できるインビボ情報は存在しない。
【０００８】
（発明の簡単な要約）
一つの実施態様において、本発明は、脳血流を増加させるか、または、さまざまな病態に付随する脳血管流の低下を防止するのに十分なほど、ヒトまたはヒト以外の動物における２０−ＨＥＴＥ合成酵素活性を低下させることによって、ヒトまたはヒト以外の動物における脳血管疾患を治療する方法である。「脳血管疾患」という語は、脳血流の減少によって引き起こされる症状を意味する。
【０００９】
２０−ＨＥＴＥ合成酵素阻害物質を用いて、２０−ＨＥＴＥ合成酵素活性の低下を達成することができる。本発明の目的にとって、２０−ＨＥＴＥ合成酵素の阻害物質は、化学化合物または２０−ＨＥＴＥ合成酵素に対する抗体でもよい。２０−ＨＥＴＥを産生するＣＹＰ４Ａ酵素またはＣＹＰ４Ｆ酵素をコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドで動物を処置するなどして、２０−ＨＥＴＥ合成酵素量を低下させることによっても、２０−ＨＥＴＥ合成酵素活性の低下を達成することができる。
【００１０】
（発明の詳細な説明）
一般的に、本発明は、脳血流を増加させるか、または、さまざまな病態に伴う脳血流の低下を防止できるよう、２０−ＨＥＴＥ合成酵素活性を低下させることによって、脳血管疾患を治療する方法を提供する。「脳血管疾患」という語は、脳血流の低下によって引き起こされる症状を意味する。「２０−ＨＥＴＥ合成酵素」という語は、ＣＹＰ４ＡファミリーおよびＣＹＰ４Ｆファミリーの酵素を含む。ＣＹＰ４Ａ１１およびＣＹＰ４Ｆ２以外に、ヒト酵素ＣＹＰ４Ｆ３も２０−ＨＥＴＥを産生することが最近になって示された。Ｃｈｒｉｓｍａｓ Ｐ．ら、「選択的スプライシングが、基質特異性を切り換えることによってＣＹＰ４Ｆ３の機能を決定する（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＹＰ４Ｆ３ ｂｙ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （２００１年）。「処置」または「治療」という語は、病気の発症を防止すること、発病時における病気の重篤度を低下させること、発病後に病気の重篤度を低下させること、または、病気の症状を消失させることを意味する。
【００１１】
２０−ＨＥＴＥは血管収縮物質である。後述する実施例において、２０−ＨＥＴＥ合成酵素阻害物質で動物を処置すると、該動物における２０−ＨＥＴＥ濃度が低下し、脳血管疾患に罹患した動物において脳血流が改善されることが明らかになっている。２０−ＨＥＴＥ合成酵素阻害物質の脳血管疾患に対する治療効果は、最初に出血性脳卒中モデルＳＡＨで調べられた。このモデルでは、ＳＡＨの誘発は２０−ＨＥＴＥ濃度で増加を引き起こした。ＳＡＨまたは脳内出血の後に２０−ＨＥＴＥ濃度が上昇するのは、凝固反応過程で白血球が活性化され、大脳動脈壁の中で２０−ＨＥＴＥの産生が促進されることが原因である可能性が高い。また、２０−ＨＥＴＥ濃度は、ＳＡＨの後に出血部位に白血球が移動すること、閉塞性脳卒中の後に起こる脳の虚血性外傷、または、脳の炎症もしくは外傷性損傷によっても上昇することがある。２０−ＨＥＴＥ合成酵素阻害物質であるＨＥＴ００１６（構造については図１；Ｍｉｙａｔａ， Ｎ．ら、Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １３３： ３２５−３２９， ２００１年；ＨＥＴ００１６を合成する方法は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＪＰ００／０７６９４号、国際公開公報第０１／３２１６４号パンフレットに開示されている）および１７−ＯＤＹＡ（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）にあるシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ．）より購入した）は、ＳＡＨ後のＣＳＦにおいて２０−ＨＥＴＥの濃度を効果的に低下させることが明らかになった。ラットをＨＥＴ００１６または１７−ＯＤＹＡで前処理したところ、ＳＡＨ後の脳血流の低下が防止された。また、ＨＥＴ００１６は、ＳＡＨが既に開始して、脳血流および血管緊張に対する上昇した２０−ＨＥＴＥ濃度の有害作用が既に明らかになった後に、脳血流の低下を逆転させることが発見された。脳血管疾患に対する２０−ＨＥＴＥ合成酵素阻害物質の薬効を、閉塞性脳卒中モデルを用いてさらに調査した。このモデルでは、中大脳動脈を一時的に閉塞させて閉塞性脳卒中を起こさせた。２０−ＨＥＴＥ合成酵素阻害物質ＨＥＴ００１６によってラットを前処理すると、中大脳動脈閉塞後の梗塞量が有意に減少することが示された。この場合、２０−ＨＥＴＥの由来源は、おそらく虚血性梗塞領域の中に浸潤したＰＭＮであろう。
【００１２】
２０−ＨＥＴＥ合成酵素阻害物質で治療できる脳血管疾患は、上記の例に限定されない。活性化白血球と大脳動脈は両方ともひたすら２０−ＨＥＴＥを産生する。２０−ＨＥＴＥ合成酵素阻害物質を用いて、脳血流の減少によって生じた症状を治療することができると期待されている。出血性脳卒中および閉塞性脳卒中の他に、これらの症状には、偏頭痛、ＣＶＳ、感染症、外傷性頭部および脳損傷によって生じた症状、および、脳灌流を改善することによってその症状を緩和することができる、アルツハイマー病、痴呆、パーキンソン病、ならびにハンチントン病のような、血流の低下に随伴する慢性神経疾患があるが、これらに制限されない。
【００１３】
後述する実施例において、ＨＥＴ００１６は、２０−ＨＥＴＥ合成酵素を８０％以上阻害した濃度で使用するときには、ＥＥＴの合成、またはその他試験されたＣＹＰ酵素の合成をほとんど阻害しないことが観察されたという点で、非常に特異的な２０−ＨＥＴＥ合成酵素阻害物質であることが明らかにされている。他の研究者が、ＤＤＭＳも、２０−ＨＥＴＥを産生する酵素のかなり特異的な阻害物質であることを明らかにしている。１７−ＯＤＹＡ、１−ＡＢＴ（ミズーリ州セントルイスにあるシグマケミカル社より入手可能）、およびミコナゾール（ミズーリ州セントルイスにあるシグマケミカル社より入手可能）など、別の２０−ＨＥＴＥ合成酵素阻害物質は、２０−ＨＥＴＥ合成を阻害するだけでなく、少なくとも、ＥＥＴ類の合成を阻害するか、２０−ＨＥＴＥ合成酵素を阻害する一方で、それ以外にＣＹＰ酵素も有意に阻害するという点で遙かに特異性が低い。何れかの２０−ＨＥＴＥ合成酵素阻害物質を用いて脳血管疾患を治療することができる。しかし、ＨＥＴ００１６のように高い特異性を有する阻害物質の方が、副作用がより少ない可能性が高いのでより有益である可能性が高い。
【００１４】
後述する実施例において示すように、ＨＥＴ００１６は、ラットの腎臓ミクロソームにおいて、また、イヌのＰＭＮにおいて用量依存的に２０−ＨＥＴＥ生成を阻害し、ラットの２０−ＨＥＴＥ合成酵素を阻害するＨＥＴ００１６のＩＣ５０は約１０ｎＭから約２５ｎＭである。ＨＥＴ００１６は、ヒトの腎臓ミクロソームにおいて、用量依存的に、８．９ｎＭというＩＣ５０で２０−ＨＥＴＥの合成を阻害した。組換えＣＹＰ４Ａ１１、４Ｆ２、および４Ｆ３アイソフォームを用いて調べたところ、ＨＥＴ００１６は、５０ｎＭから１００ｎＭというＩＣ５０で用量依存的に２０−ＨＥＴＥの合成を阻害した。２０−ＨＥＴＥ合成酵素の阻害について調べたＨＥＴ００１６の最低投与量は１．５ｎＭであり、この濃度ではラットの２０−ＨＥＴＥ合成酵素が約２０％阻害された。一般的に、約１ｎＭから約１，０００ｎＭのＨＥＴ００１６血漿中濃度が、脳血管疾患を治療するのに効果的であると予想されている。本明細書および請求の範囲において、投与量とともに使用されている「約」という語は、投与量が、その投与量の一般的な機能性を保持する僅かな変動もカバーすることを意味する。ＨＥＴ００１６を体重１ｋｇ当たり１０ｍｇの投与量で静脈注射すると、１時間後のＨＥＴ００１６血漿中濃度は２．８μＭになった。体重１ｋｇ当たり約０．０３ｍｇから体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇを静脈注射すると、ＨＥＴ００１６の血漿中濃度が約１．０ｎＭから約２．８μＭの範囲になるため、脳血管疾患を治療するのに有効であろうと期待されている。
【００１５】
静脈注射以外に、ＨＥＴ００１６は、経口および皮下から投与することができる。ＨＥＴ００１６を静脈内に投与した後述する実施例に記載されている、血漿中のＨＥＴ００１６濃度を測定する同一の方法を用いて、ＨＥＴ００１６を経口または皮下から投与したときに血漿中濃度が約１ｎＭから約１，０００ｎＭに到達するのに必要な投与量を簡単に決定することができる。さらに、出血性脳卒中の場合には、ＨＥＴ００１６を直接出血部位に注射して脳血管疾患を治療することも可能である。例えば、ＳＡＨの場合、大槽、または硬膜下に設置されたカニューレを経由してＨＥＴ００１６をＣＳＦの中に直接注入してＣＶＳを治療することができる。ＨＥＴ００１６をＣＳＦに直接注入するのは、ＣＳＦを排出させて、上昇した脳脊髄液圧を低下させるために頭蓋骨の中にしばしばシャントが設置されているため、頭部外傷の後には好適な投与経路かもしれない。ＨＥＴ００１６を直接出血部位に注射するとき、脳血管疾患を効果的に治療するのに必要なＨＥＴ００１６の投与量も、１７−ＯＤＹＡについて後述する方法を用いて同様に決定することができる。ＣＳＦの容量は、ヒトでは約１０ｍｌ、ラットでは約０．３ｍｌである。すなわち、ヒトでは、脳血管疾患を治療するためにラットにおけるよりも約３０倍多くＨＥＴ００１６が必要である。
【００１６】
２０−ＨＥＴＥ生成を阻害するためのＩＣ５０は、１７−ＯＤＹＡでは１μＭ、ＤＤＭＳでは３μＭである。Ｚｏｕ， Ａ．Ｐ．ら、Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒａｐ． ２６８： ４７４−４８１， １９９４年；Ａｌｏｎｓｏ−Ｇａｌｉｃｉａ， Ｍ．ら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ２９：３２０−３２５， １９９７年。１７−ＯＤＹＡおよびＤＤＭＳは血液脳関門を通過することができないため、これらの薬剤は、ＣＳＦに直接導入する必要がある。１．５ナノモルの１７−ＯＤＹＡをラットの大槽に注射すると、ＳＡＨ後の脳血流の低下を完全に阻害した。ラットではＣＳＦの量が０．３ｍｌと仮定すると、１．５ナノモルの１７−ＯＤＹＡをＣＳＦに注射すれば、ＣＳＦにおいて１０μＭという１７−ＯＤＹＡの最終濃度が得られるはずである。
【００１７】
脳血管疾患を治療するために、ＨＥＴ００１６、１７−ＯＤＹＡ、およびＤＤＭＳ以外の２０−ＨＥＴＥ合成酵素阻害物質を用いようとする場合、ＨＥＴ００１６について上記に記載した方法を用いて、ＩＣ５０値、およびさまざまな投与経路の後に有効な阻害濃度となるのに必要とされる投与量を容易に決定することができる。
【００１８】
上記の２０−ＨＥＴＥ合成酵素阻害物質の他に、２０−ＨＥＴＥ合成酵素に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体も、本発明の目的のために酵素阻害物質として用いることができる。一般的に、抗体は、動物の体内に投与されると、標的タンパク質の機能を遮断できることが示されている。Ｄａｈｌｙ， Ａ．Ｊ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ．， ２０００年， １４：Ａ１３３； Ｄａｈｌｙ， Ａ．Ｊ．， Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ， ２０００年， １１：３３２Ａ。すなわち、本発明で定義された脳血管疾患を治療するために、２０−ＨＥＴＥ合成酵素に対する抗体を用いることができる。例えば、約０．０１ｍｇから約１００ｍｇ、好ましくは約０．１ｍｇから約１０ｍｇ、最も好ましくは約０．２ｍｇから約１．０ｍｇのヒト化ＣＹＰ４Ａ抗体またはＣＹＰ４Ｆ抗体を筋肉内注射によって投与して、大脳血管による２０−ＨＥＴＥの過剰生産に伴うＣＶＳを阻止することができる。これらの抗体の人間における半減期は２〜３週間ほどである。また、抗体をＣＳＦの中に直接投与して、ＣＳＦ中の血液成分に関係した２０−ＨＥＴＥの生産（ＳＡＨ）、または、脳の局所的炎症に関連した症状（感染症、虚血など）を阻止することができる。ＣＹＰ４ＡファミリーおよびＣＹＰ４Ｆファミリーの既知のメンバーすべてのＤＮＡ配列およびタンパク質アミノ酸配列は公開されており、当業者にとって利用可能である。当業者は、酵素に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の作製法を知っている。例えば、ＣＹＰ４Ａ１およびＣＹＰ４Ａ１０に対する抗体が作成されており、これらの抗体は、ＣＹＰ４Ａ１およびＣＹＰ４Ａ１０の酵素活性を阻害することが分かっている。Ａｍｅｔ， Ｙ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １９９７年， ５４（８）：ｐ．９４７−９５２； Ａｍｅｔ， Ｙ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １９９７年， ５３（６）： ｐ．７６５−７７１； Ａｍｅｔ， Ｙ．ら、Ａｌｃｏｈｏｌ Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｒｅｓ． １９９８年， ２２（２）：４５５−４６２。また、抗２０−ＨＥＴＥ合成酵素抗体のいくつかは購入することも可能である。例えば、抗ＣＹＰ４Ａ１は、ジェンテスト社（Ｇｅｎｔｅｓｔ　Ｃｏｒｐ．）（マサチューセッツ州ウォバーン（Ｗｏｂｕｒｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ））から購入することができる。
【００１９】
ここまで、我々は、酵素阻害物質を用いて２０−ＨＥＴＥ合成酵素の活性を低下させる方法を説明してきた。２０−ＨＥＴＥ合成酵素の活性を低下させる別の方法は、酵素濃度を低下させることである。これを行なうために多くの方法を利用することができる。例えば、酵素の分解速度を高めたり、酵素の合成を阻害することができる。酵素の合成は、転写レベルまたは翻訳レベルで阻害することができる。
【００２０】
酵素などのタンパク質の合成を阻止する一般的な方法の一つは、そのタンパク質のｍＲＮＡの配列の少なくとも一部に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いて翻訳を阻止することである。ＣＹＰ４ＡファミリーおよびＣＹＰ４Ｆファミリーの既知のメンバーすべてについてｃＤＮＡ配列が公開されており、当業者にとって利用可能である。当業者は、これらの酵素の合成を阻止するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの作製法と利用法を知っている。例えば、アンチセンス法を用いて、ラットの腎臓血管におけるＣＹＰ４Ａの発現をインビボで効果的に低下させ、また、血圧と血管緊張を低下させた。Ｗａｎｇ， Ｍ．Ｈ．ら、Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １９９９年， ２７６Ｌ Ｆ２４６−Ｆ２５３； Ｗａｎｇ， Ｍ．Ｈ．ら、Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ２００１年， ２８０： Ｒ２５５−Ｒ２６１。
【００２１】
本発明に係るアンチセンス法の例は、ＣＹＰ４Ａ１（ラット）、ＣＹＰ４Ａ２（ラット）、ＣＹＰ４Ａ１１（ヒト）、ＣＹＰ４Ｆ２（ヒト）、またはＣＹＰ４Ｆ３（ヒト）のメッセージの５’末端に対する２０〜２５塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、半減期とオリゴヌクレオチドの安定性を高めるために、その３’末端と５’末端の最後の３塩基対にホスホロチオエート誘導体を有するものを使用することである。有用な方法は、転写の５’側開始部位よりも２〜５塩基対長くなった配列を有するオリゴヌクレオチドをいくつか設計することである。ＣＹＰ４Ａ１に対する適当なアンチセンス配列は、例えば、ＤＮＡでは５’−ｃａｇｔｇｃａｇａｇａｃｇｃｔｃａｔｇｇｔ−３’（配列番号１）、ＲＮＡでは５’−ｃａｇｕｇｃａｇａｇａｃｇｃｕｃａｕｇｇｕ−３’（配列番号２）である。ＣＹＰ４Ａ２に対する適当なアンチセンス配列は、例えば、ＤＮＡでは５’−ｇｃｔａａａｔａｃａｇａｇａａａｃｃｃａｔｇｇｔ−３’（配列番号３）、ＲＮＡでは５’−ｇｃｕａａａｕａｃａｇａｇａａａｃｃｃａｕｇｇｕ−３’（配列番号４）である。
【００２２】
本発明で定義されている脳血管疾患を治療するために使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、病気を患う動物に静脈内から投与することができる。また、このオリゴヌクレオチドは、ＣＳＦに投与することもできる。アンチセンスオリゴヌクレオチド用の担体を用いることもできる。適当な担体の例は、カチオン性リポソームである。例えば、オリゴヌクレオチドは、１−αジオレイルファチジルセルタノールアミン（１−ａｌｐｈａ　ｄｉｏｌｅｙｌｐｈａｔｉｄｙｌｃｅｌｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）をジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ｄｉｍｅｔｈｌｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）を１ｍｌのクロロフォルムの中で５：２の割合で混合して調製したカチオン性リポソームと混合することができる。溶媒を蒸発させ、１０ｍｌの食塩水の中で超音波処理によって脂質を再懸濁する。カチオン性リポソームに懸濁したオリゴヌクレオチドは血液脳関門を通過するはずである。しかし、通過しない場合には、直接ＣＳＦの中に投与することができる。
【００２３】
本発明で用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与量は、約０．１μｇ／体重１ｋｇから約１００μｇ／体重１ｋｇ、約１μｇ／体重１ｋｇから約１０μｇ／体重１ｋｇ、または、約３μｇ／体重１ｋｇから約５μｇ／体重１ｋｇである。上記範囲内にないが、標的酵素の合成を阻止する投与量も本発明において使用することができる。
【００２４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用するための別の方法は、それをベクターに改造して、そのベクターが、２０−ＨＥＴＥを産生するＣＹＰ４Ａ酵素またはＣＹＰ４Ｆ酵素をコードするｍＲＮＡの翻訳を阻止するアンチセンスｃＲＮＡを産生できるようにすることである。
【００２５】
（実施例１）
ＳＡＨ後の血流の急激な低下の治療
材料と方法
動物。ハーラン・スプラーグ−ドーリー社（Ｈａｒｌａｎ　Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ　Ｉｎｃ．）（インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ））から購入したオスのスプラーグ−ドーリーラット（９〜１２週齢）に対して実験を行なった。ラットは、実験動物管理の認可に関する米国協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃａｒｅ）により認可されているウィスコンシン医科大学（Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）動物管理施設に収容された。動物に関するすべてのプロトコールは、ウィスコンシン医科大学の動物管理委員会による承認を受けた。
【００２６】
外科処理。ラットをケタミン（Ｋｅｔａｊｅｃｔ（登録商標）２０ｍｇ／ｋｇ筋注）およびチオブタバルビタールナトリウム（Ｉｎａｃｔｉｎ（登録商標）５０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）により麻酔した。カニューレを気管内に設置し、小型動物用換気装置（ペンシルバニア州アードモア（Ａｒｄｍｏｒｅ，ＰＡ）にあるＣＷＥ社（ＣＷＥ，Ｉｎｃ．ＳＡＲ−８３０））を用いて、Ｎ２中３０％Ｏ２により人工換気を行なった。薬剤を注入するために大腿静脈にカニューレを挿入し、ラットは、体液の消失を補うために３ｍｌ／分の速度で０．９％ＮａＣｌ溶液の静注による輸液を受けた。平均動脈圧（ＭＡＰ）および動脈血ガスを測定するため、大腿動脈にカニューレを挿入した。ＣＯ２分析装置（カリフォルニア州ウッドランドヒルズ（Ｗｏｏｄｌａｎｄ，Ｈｉｌｌｓ　ＣＡ）にあるキャプスター−１００　ＩＩＴＣ社（Ｃａｐｓｔａｒ−１００　ＩＩＴＣ））の読み取り値にしたがって換気量を調整することによって、二酸化炭素（ｐＣＯ２）の終末呼気分圧を３８　ｍＨｇに調節した。実験の開始時と終了時に血液試料を回収し、終末呼気（ｐＣＯ２）であることを確認するために血液ガス分析装置（ＡＢＬ　３００、デンマークのコペンハーゲン（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）にあるラジオメーター社（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ））を用いて解析した。必要に応じて更なる量のチオブタバルビタール（８ｍｇ／ｋｇ静注）を投与して麻酔状態を維持した。直腸体温を３７±１℃に維持した。
【００２７】
ＳＡＨの誘発および脳血流測定。ＳＡＨのモデルの後頭部法（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ　ｃｒａｎｉｏ−ｃｅｒｖｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ）の改変法を用いて、大槽の中に０．３ｍｌの自己動脈血を注射してＳＡＨを誘発した。Ｄｅｌｇａｄｏ ＴＪら、Ｓｔｒｏｋｅ （１９８５年） １６： ５９５−６０２； Ｓｏｌｏｍｏｎ ＲＡら、Ｓｔｒｏｋｅ （１９８５年） １６： ５８−６４。定位頭部固定装置の中にラットの頭部を置き、環椎後頭膜を、その上を覆っている頸部筋肉を中線で一気に切り離して露出させた。後頭骨と環椎を可視化した。立体顕微鏡を用いて、ＰＥ−１０に付属した３０ゲージの注射針を、環椎後頭膜を貫通させて大槽の中に挿入した。そして、０．３ｍｌの採血したばかりのヘパリン処理をしていない動脈血を、シリンジポンプを用いて３５μｌ／分の速度で大槽に注射した。これによって大規模なＳＡＨがすべてのラットで起きたことを剖検で確認した。血液が、小脳延髄結合部の後ろ側と、動脈基底部とウィリス輪の血管の周りを覆っているのが見られた。
【００２８】
レーザードップラー血流測定装置を用いて、薄い頭蓋骨部分を通して、脳血流（ＣＢＦ）を連続的に測定した。右頭頂葉皮質を覆う３×５ｍｍの骨領域を、手持ち式ドリルを用いて頭蓋骨の薄い半透明の層だけになるまで薄くした（薄い頭蓋骨部分）。ＰＦ　１０３レーザードップラー血流（ＬＤＦ）のプローブをこの頭骨部分に置き、ＰＦ−１０３レーザードップラー血流測定装置（スウェーデン、ストックホルム（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）にあるペリメド社（Ｐｅｒｉｍｅｄ））を用いてＣＢＦを監視した。
【００２９】
ＳＡＨの前にＨＥＴ００１６および１７−ＯＤＹＡを投与したときのｒＣＢＦに対する効果を調べるための実験プロトコール。外科処置後、さらに３０分間平衡化時間をおいてから、賦形剤またはＨＥＴ００１６（１０ｍｇ／ｋｇ）を静注により投与し、３０分間の対照時間の間ＣＢＦを測定した。別の動物には１７−ＯＤＹＡ（１．５ｎｍｏｌ）か賦形剤を５０μｌにして、マイクロマニピュレーターと３０ゲージ針を用いて大槽の中に直接投与した。ＳＡＨが開始する直前である、対照時間の最後の５分間にわたって記録されたＣＢＦを対照値として用いた。そして、大腿動脈から血液試料（０．３ｍｌ）を採集して、１０分間にわたって大槽の中に注入した。血液注射が完了してから１０、２０、３０、６０、９０、および１２０分後に２分間ＣＢＦを記録した。ＣＢＦのデータは、対照からの変化として百分率で表されている。
【００３０】
ＳＡＨが成立した後にＨＥＴ００１６を投与したときのｒＣＢＦに対する効果を調べるための実験プロトコール。０．３ｍｌの血液をラットの大槽に注射してＳＡＨを誘発した。３０分後に賦形剤またはＨＥＴ００１６（１ｍｇ／ｋｇ）を静注により投与した。血液を注射する前の最後の５分間の平均ＣＢＦを対照値として用い、ＳＡＨを誘発してから１０、３０、４０、７０、１００、および１６０分後に２分間ＣＢＦを記録した。ＣＢＦのデータは、対照からの変化として百分率で表されている。
【００３１】
ＣＳＦにおける２０−ＨＥＴＥの測定。各実験の最後に１ｍｌ注射器と３０ゲージの注射針を用いて、大槽からＣＳＦを採集した。また、大槽に血液の注射を受けていない、さらに別の偽処理されたラットからもＣＳＦを採集した。最近記載された新しい蛍光ＨＰＬＣアッセイ法を用いて、ＣＳＦにおける２０−ＨＥＴＥ濃度を測定した。Ｍａｉｅｒ ＫＧら、Ａｍ． Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， （２０００年） ２７９：Ｈ８６４−Ｈ８７１。簡単に言うと、５０ｎｇの内部標準２０−ヒドロキシエイコサ−６（Ｚ），１５（Ｚ）−ジエン酸（ＷＩＴ−００２）をＣＳＦ試料（５０μｌ）に加えた。この試料を１　ｍＬのエチル酢酸で抽出し、抽出物をアルゴン下で乾燥させ、脂質画分をＳｅｐ−Ｐａｋ（商標）Ｖａｃカラム（カタログ番号：ＷＡＴ０５４９５５、マサチューセッツ州ミルフォード（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）にあるウォーターズ社（Ｗａｔｅｒｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））で精製した。脂質画分を、３６．４ｍＭの２−（２，３−ナフタリミノ（ｎａｐｔｈａｌｉｍｉｎｏ））−エチルトリフルオロメタンスルホネートを含む２０μｌのアセトニトリルで標識した。反応を触媒させるためにＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１０μｌ）を加えた。試料を室温で３０分間反応させた。Ｓｅｐ−Ｐａｋ（商標）Ｖａｃカラムを用いて過剰な染料を除去し、試料をアルゴン下で乾燥させて、１００μｌのメタノールに懸濁し、４．６×２５０ｍｍのシンメトリーＣ１８カラム（マサチューセッツ州ミルフォードにあるウォーターズ社）と蛍光検出装置（モデル番号Ｌ−７４８０、イリノイ州ネーパービル（Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）にある日立社）を用いて、逆相ＨＰＬＣによって解析した。２０−ＨＥＴＥのピーク領域を内部標準のピークと比較して、試料中の２０−ＨＥＴＥの量を測定した。
【００３２】
２０−ＨＥＴＥ生成の選択的阻害物質としてのＨＥＴ００１６の特徴づけ。これらの実験によって、ＡＡを２０−ＨＥＴＥおよびＥＥＴ類に代謝するＣＹＰ酵素の豊富な由来源である腎臓ミクロソームにおけるＡＡの代謝に対するさまざまな濃度のＨＥＴ００１６の効果を調べた。ラットの腎皮質を、２５０ｍｍｏｌ／Ｌのショ糖、１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ、および１０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウムを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ　７．７）でホモジナイズした。ミクロソームは、既述されているように分画遠心法によって調製した。Ｍａ， Ｙ−Ｈら、Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｃａｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ． （１９９４年） ２６７： Ｒ５７９−Ｒ５８９。既述されているようにして、１ｍｌの０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ　７．４）と１ｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨの中で、腎皮質ミクロソーム（０．５ｍｇタンパク質）を［１４Ｃ］−ＡＡ（０．１μＣｉ／ｍｌ、４２μｍｏｌ／Ｌ、イリノイ州アーリントンハイツ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）にあるアマーシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ））とともに３７℃で３０分間インキュベートして、ＣＹＰ４Ａ酵素の活性を測定した。Ｍａ， Ｙ−Ｈら、Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｃａｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ． （１９９４年） ２６７： Ｒ５７９−Ｒ５８９。０．１ｍｏｌ／Ｌの蟻酸を用いてｐＨ　３．５まで酸性化させて反応を終結させ、エチル酢酸で抽出した。２５ｃｍ×２ｍｍ　ｉ．ｄ．（ペンシルバニア州ベルフォント（Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ）にあるスペルコ社（Ｓｕｐｅｌｃｏ　Ｉｎｃ．））のＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムと、アセトニトリル：水：酢酸（５０／５０／０．１）からアセトニトリル：酢酸（１００／０．１）までの範囲の直線的溶出勾配を用いて代謝物を４０分間にわたって分離した。放射能探傷装置（フロリダ州タンパ（Ｔａｍｐａ，ＦＬ）にあるラジオマティック・インスツルメント社（Ｒａｄｉｏｍａｔｉｃ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏ．）を用いて放射性生成物を測定した。
【００３３】
血漿および脳におけるＨＥＴ００１６濃度の測定。１０％レシチンに入れたＨＥＴ００１６（１０ｍｇ／ｋｇ）をラットに静脈注射した。１時間平衡化時間を置いた後、ラットをペントバルビツールで麻酔して、頸静脈から血液試料を採集した。そして、ラットを殺して脳を取り出し、重量を計り、ヒスコトロン（Ｐｈｙｓｃｏｔｒｏｎ）ホモジナイザー（千葉県にあるニチオン医科器械社）を用いて、３倍容の０．９％ＮａＣｌ溶液の中でホモジナイズした。選択的イオン測定を行なうＬＣ／ＭＳによって、血漿および脳ホモジネートの１００μｌ等量液におけるＨＥＴ００１６濃度を測定した。試料を１ｍｌのアセトニトリルと混合して遠心し、２０μｌの清澄な上清をＬＣ／ＭＳに注入した。この試料を、２００×４．６ｍｍのキャップセルパック（Ｃａｐｃｅｌｌｐａｋ）ＵＧ　１２０　ＯＤＳカラム（東京にある資生堂社）で分離し、アセトニトリル：水（７２／２８）で溶出した。各検体に特異的な生成物遷移の前駆体を検出するように変えられたサイエックス（Ｓｃｉｅｘ）ＡＰＩ３０００質量分析装置（カナダのオンタリオ州（Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）にあるパーキン・エルマー・サイエックス社（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｓｃｉｅｘ））を用いてピークを測定した。
【００３４】
薬剤および化学物質。化学物質はすべてＨＰＬＣ級のものであった。蛍光プローブ（２−（２，３−ナフタリミノ）−エチルトリフルオロメタンスルホネート）は、モレキュラー・プローブズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）（オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））から購入した。１７−ＯＤＹＡはシグマ社（ミズーリ州セントルイス）から購入した。ＨＥＴ００１６およびＷＩＴ−００２は、大正製薬株式会社（埼玉県）が合成した。
【００３５】
統計。数値は平均値±ＳＥＭで表示する。グループ内およびグループ間における平均値の差の有意性は、反復測定値について二元配置ＡＮＯＶＡ法、その後ダンカンの多重範囲検定法によって判定した。Ｐ値＜０．０５を有意と見なした。
【００３６】
結果
ＳＡＨの前にＨＥＴ００１６および１７−ＯＤＹＡを投与したときのｒＣＢＦに対する効果。２種類の化学的および力学的に異なる２０−ＨＥＴＥ生成阻害物質が、ＳＡＨ誘発後のｒＣＢＦの変化に与える影響を図２に示す。ラットは、ＨＥＴ００１６（１０ｍｇ／ｋｇ静注、ＳＡＨの３０分前、ｎ＝９）、１７−ＯＤＹＡ（１．５　ｎｍｏｌ、くも膜下、ｎ＝７）、または賦形剤（ｎ＝１５）で予め処理した。ＨＥＴ００１６の賦形剤（レシチン）または１７−ＯＤＹＡの賦形剤（生理食塩水中１：１，０００のエタノール）を与えられたラットの反応に有意な差異はなかった。そのため、これら２つのグループから得られたデータはまとめて図２に示す。賦形剤で処理されたラットでは、３００μｌの血液を大槽に注射すると、ｒＣＢＦの急激な低下が起きた。ＳＡＨ誘発後１０分間で平均３０％低下し、実験を続けた２時間中このレベルに止まった。２０−ＨＥＴＥおよびＥＥＴの生成に対する不可逆的阻害物質である１７−ＯＤＹＡ、または２０−ＨＥＴＥの新規の選択的阻害物質であるＨＥＴ００１６でラットを予め処理すると、ｒＣＢＦの低下が顕著に緩和された。どちらの薬剤も、１０分間後にｒＣＢＦの初期低下を約４０％有意に減少させ、ｒＣＢＦは、ＨＥＴ００１６で処理したラットではＳＡＨを誘発してから６０分以内に、また、１７−ＯＤＹＡで処理したラットではＳＡＨを誘発してから９０分以内に対照と有意差のない値にまで完全に回復した。
【００３７】
生理学的パラメータ。これらの実験におけるＭＡＰおよび終末呼気ｐＣＯ２データを比較したところ、実験期間中のいずれの時点でも、賦形剤、ＨＥＴ００１６、または１７−ＯＤＹＡを与えられたラットにおいて、終末呼気ｐＣＯ２データに有意な差はない。ＭＡＰは、３つのグループすべてで低下しがちであったが、実験期間中のいずれの時点でも、賦形剤、ＨＥＴ００１６、または１７−ＯＤＹＡを与えられたラットにおいて血圧には差異がない。
【００３８】
２０−ＨＥＴＥ合成に対するＨＥＴ００１６の効果。ラットの腎臓ミクロソームは、大脳動脈における２０−ＨＥＴＥ生成に関与するＣＹＰ４Ａ酵素と、ＥＥＴを産生するＣＹＰ２ＣおよびＣＹＰ２Ｊというファミリーの酵素を両方とも発現するため、これらの実験に使用された。ラット腎臓ミクロソームによるＡＡ代謝に対するＨＥＴ００１６の効果を図３に示す。４回のアッセイから得られた平均値±ＳＥＭが示されている。データは、タンパク質１ミリグラム当たり平均９６±３．９ｐｍｏｌｅ／分である２０−ＨＥＴＥの対照産生量に対する百分率として表されている。ＨＥＴ００１６は、１０〜１，０００　ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で容量依存的に２０−ＨＥＴＥの合成を阻害した。ＨＥＴ００１６は、１，０００　ｎｍｏｌ／Ｌという高濃度でも、腎臓ミクロソームによるＥＥＴ産生に対して有意な影響を及ぼさなかった。
【００３９】
血漿および脳におけるＨＥＴ００１６濃度の測定。１０ｍｇ／ｋｇのＨＥＴ００１６を静脈注射した１時間後にＨＥＴ００１６の濃度は、平均して、血漿では５７０±９０ｎｇ／ｍＬ（ｎ＝３，２．８μｍｏｌ／Ｌ）、脳では１，４８８±１０４ｎｇ／ｇ（ｎ＝３，７．２μｍｏｌ／Ｌ）であった。
【００４０】
ＣＳＦにおける２０−ＨＥＴＥ濃度の測定。偽処理された対照ラットのＣＳＦ、および、賦形剤、１７−ＯＤＹＡ、またはＨＥＴ００１６を与えられたラットにおけるＳＡＨの２時間後のＣＳＦにおける２０−ＨＥＴＥの濃度値を図４に示す。括弧内の数字は調べられた動物の頭数を示す。賦形剤を与えられたラットでは、ＳＡＨ後のＣＳＦにおける２０−ＨＥＴＥ濃度が、血液注射を受けなかった対照ラットで測定された濃度に較べて１０倍増加した。ＳＡＨを誘発する前に１７−ＯＤＹＡまたはＨＥＴ００１６を与えられたラットでは、ＣＳＦにおける２０−ＨＥＴＥ濃度が有意に低かった。ＣＳＦにおける２０−ＨＥＴＥ濃度の低下は、ＨＥＴ００１６で処理されたラットで見られるよりも、１７−ＯＤＹＡを与えられたラットの方が大きかった。
【００４１】
ＨＥＴ００１６が、ＳＡＨの誘発後に投与されたときに脳血流の低下を逆転させえる能力。０．３ｍｌの血液をラットの大槽に注射してＳＡＨを誘発した。図５に示すように、血液注射は、脳血流を一時的には６０％低下させ、その後も３０％の脳血流の低下が維持された。ＳＡＨを誘発してから３０分後にＨＥＴ００１６（１ｍｇ／ｋｇ体重、静注）でラットを処理したところ、脳血流は７０分後には対照値に戻った。これに対して、賦形剤処理したラットにおける脳血流は、１６０分間にわたる実験期間中低いままであった。図５に示したデータは、ＨＥＴ００１６が、脳血流の低下と、ＳＡＨ後に生じる脳損傷を治療および逆転させるための有効な治療剤であることを示している。
【００４２】
（実施例２）
一時的にＭＣＡ閉塞を起こしたラットにおける梗塞量に対するＨＥＴ００１６の効果
方法
成獣でオスのウィスターラット（２００〜２５０ｇ）をＯ２ガス中２％ハロタンで麻酔した。右外側頸動脈（ＥＣＡ）を注意深く解剖した。シリコンコードされた構造物（１８ｍｍの長さ）をＥＣＡの管腔から右内側頸動脈（ＩＣＡ）に挿入して右中大脳動脈（ＭＣＡ）の起点を閉塞させた。加温パッドで体温を３７℃に保った。手術後、麻酔を中断すると、虚血を起こした動物は上肢に重度の片側不全麻痺を示した。ＭＣＡ閉塞して１時間後に、糸を除去して虚血領域を再灌流させた。ラットは、再灌流の直後に賦形剤（３０％ヒドロキシプロピルベータ−シクロデキストリン）またはＨＥＴ００１６（０．０１、０．１および１ｍｇ／ｋｇ体重、静注）を与えられた。
【００４３】
梗塞量を測定するため、一時的ＭＣＡ閉塞後再灌流してから２４時間後にラットを殺した。脳を生理食塩水によって経心臓的に灌流し、頭蓋骨から取り出し、２−ｍｍの冠状切片に切り出した。切片を、３７℃で３０分間２％塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）に浸した。
【００４４】
数値はすべて平均値±ＳＥＭとして示されている。統計的解析には、ダネット多重範囲検定法を用いた。
【００４５】
結果
ＨＥＴ００１６を静脈内注射したところ、０．１および１ｍｇ／ｋｇという投与量で、ＭＣＡ閉塞を起こしたラットの梗塞量が有意に減少した（図６）。賦形剤グループ、０．１ｍｇ／ｋｇＨＥＴ００１６グループ、および１ｍｇ／ｋｇＨＥＴ００１６グループにおける梗塞量（％）は、２３．３±４．１％（ｎ＝１７）、１０．７±２．６％（ｎ＝１０、ｐ＜０．０５）、および９．７±２．１％（ｎ＝１７、ｐ＜０．０５）であった。
【００４６】
（実施例３）
２０−ＨＥＴＥ合成酵素阻害物質の２０−ＨＥＴＥ／ＥＥＴ選択性
方法
すべての処理は４℃で行なった。２０匹のオスＳＨＲラット（６週齢）から腎皮質を集めた。それらを溶解緩衝液（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，ｐＨ　７．４，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，１００μＭ　ｐ−（アミジノフェニル）メタンスルフォニルフルオリド、および２５０ｍＭショ糖）の中で念入りにホモジナイズし、１６，０００×ｇで１０分間遠心した。上清をさらに１６，０００×ｇで３０分間遠心した。可溶画分を集めて、２００，０００×ｇで３０分間遠心した。得られた沈殿物を５０ｍＭ　ＭＯＰＳ緩衝液に懸濁した。
【００４７】
ミクロソームを、ＨＥＴ００１６、１−ＡＢＴ、またはミコナゾールの存在下または不在下で［３Ｈ］−ＡＡ（１μＣｉ／ｍｌ）とともに５０ｍＭ　ＭＯＰＳ緩衝液の中でインキュベートした。この反応混合液にβ−ＮＡＤＰＨ（１ｍＭ）を加え、反応混合液を３７℃で１．５時間さらにインキュベートした。蟻酸とアセトニトリルを終濃度がそれぞれ１％および５０％になるように加えて反応を停止させた。この混合液の等量液をバイオ−シル（Ｂｉｏ−Ｓｉｌ）Ｃ１８ＨＬ９０−５Ｓカラム（１５０×４．６ｍｍ）に適用してから、以下に記載した通りの溶媒Ａ（１００％アセトニトリル）と溶媒Ｂ（０．１％酢酸）の勾配を用いて、０．７ｍｌ／分の流速で２０−ＨＥＴＥを溶出した。０〜１０分後、４８％のＡから６４．８％のＡ；１０〜２５分後、６４．８％のＡから７５％のＡ；２５〜２６分後、７５％のＡ。
【００４８】
結果
図７に示すように、ＨＥＴ００１６（ＭＷ＝２０６）は、用量依存的に２０−ＨＥＴＥ生成を強力に阻害した。本実験におけるＩＣ５０は平均して４ｎｇ／ｍｌで、２０ｎＭというモル濃度に相当する。しかし、ＨＥＴ００１６は、調べられた最高濃度（１，０００ｎｇ／ｍｌ、または５μＭ）でも、ラット腎臓ミクロソームにおいてＥＥＴ生成を阻害しなかった。１−ＡＢＴ（ＭＷ＝１３４）は、ＥＥＴおよび２０−ＨＥＴＥ両方の生成を用量依存的に低下させる非選択的阻害物質である。１−ＡＢＴのＩＣ５０は約２０μｇ／ｍｌすなわち１５０μＭである。ミコナゾール（ＭＷ＝４７９）は、約０．５μｇ／ｍｌすなわち１μＭのＩＣ５０を有する、ＥＥＴ生成の選択的阻害物質である。非常に高い濃度（１０〜２０μｇ／ｍｌ、２１〜４２μＭ）でのみ、ミコナゾールは２０−ＨＥＴＥの生成を阻害する。これらの結果は、これらＣＹＰ４５０阻害物質の中でＨＥＴ００１６が、ラット腎臓ミクロソームにおける２０−ＨＥＴＥの選択的ＣＹＰ４５０阻害物質であることを示唆している。それは、他の化合物よりも少なくとも１，０００倍は強力である。
【００４９】
（実施例４）
イヌ好中球における２０−ＨＥＴＥ産生活性
方法
２０−ＨＥＴＥの生成に関与するイヌ血液中の細胞型を判定するために実験を行なった。実験は、４頭のオスのビーグル犬を用いて行なった。イヌはペントバルビタール・ナトリウム（３０ｍｇ／ｋｇ，静注）で麻酔した。静脈血試料を採取し、直ちに、抗凝血剤として１：９容量のクエン酸三ナトリウム（３．８％）と混合した。好中球はパーコール勾配法を用いて、９８％純度になるまで調製した。２０ゲージ針を用いて、大槽からＣＳＦを採取した。血液を含まない清澄なＣＳＦのみを本実験に用いた。ＣＳＦを混合ガス（９５％Ｏ２、５％ＣＯ２）によって３０分間酸化した。酸化したＣＳＦに好中球を懸濁し、細胞数を２×１０６、６．３×１０６、および２×１０７になるよう調整した。全血（２０μｌ）、赤血球（２０μｌ）、または好中球を、１ｍＭ　ＮＡＤＰＨと［３Ｈ］−ＡＡを含む酸化ＣＳＦ（１８０μｌ）の中で、３７℃で２時間インキュベートした。この反応は、蟻酸を加えて停止させた。１００％アセトニトリル（２００μｌ）を反応緩衝液に加えて、ＨＰＬＣで分離するために最終濃度が５０％になるよう調整した。ＡＡの代謝物は、バイオ−シル（Ｂｉｏ−Ｓｉｌ）Ｃ１８ＨＬ９０−５Ｓカラム（１５０×４．６ｍｍ）上で、アセトニトリル：水：酢酸（４８／５２／０．１）からアセトニトリル：水：酢酸（７５／２５／０．１）という勾配溶出範囲を用いて、２６分間にわたり流速０．７ｍｌ／分で分離した。ラジオアクティブフロー検出器（レイテスト社（Ｒａｙｔｅｓｔ　ＧｍｂＨ）、ドイツ、シュトラウベンハルト（Ｓｔｒａｕｂｅｎｈａｒｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を用いて、生成された標識産物を測定した。
【００５０】
結果
本実験の結果、イヌ血液中の好中球が２０−ＨＥＴＥを産生することが明らかになった（図８）。我々は、ラット好中球を用いても同様のデータを得た。
【００５１】
（実施例５）
イヌ好中球における２０−ＨＥＴＥ産生活性に対するＨＥＴ００１６の効果
方法
我々は、さまざまな濃度のＨＥＴ００１６がイヌ好中球による２０−ＨＥＴＥ生成を阻害できるかを調べた。イヌ好中球（最終濃度２×１０７細胞）をイヌＣＳＦの中で、さまざまな濃度のＨＥＴ００１６（１０−１１、１０−１０、１０−９、１０−８、１０−７、および１０−６Ｍ）が存在または存在しない中、１ｍＭ　ＮＡＤＰＨ及び［３Ｈ］−ＡＡ存在下３７℃で２時間インキュベートした。反応は、蟻酸を加えて停止させた。アセトニトリルを反応緩衝液に加えて、ＨＰＬＣで分離するために最終濃度が５０％になるよう調整した。ＡＡの代謝物をバイオ−シル（Ｂｉｏ−Ｓｉｌ）Ｃ１８ＨＬ９０−５Ｓカラム（１５０×４．６ｍｍ）上で、アセトニトリル：水：酢酸（４８／５２／０．１）からアセトニトリル：水：酢酸（７５／２５／０．１）という勾配溶出範囲を用いて、２６分間にわたり流速０．７ｍｌ／分で分離した。ラジオアクティブフロー検出器ラモナ（ｒａｍｏｎａ）９３（レイテスト社（Ｒａｙｔｅｓｔ　ＧｍｂＨ）、ドイツ、シュトラウベンハルト（Ｓｔｒａｕｂｅｎｈａｒｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を用いて、標識さえた代謝物を測定した。
【００５２】
結果
ＨＥＴ００１６（１０−１１〜１０−６Ｍ）は、イヌ好中球による２０−ＨＥＴＥ生成を濃度依存的に阻害した（図９）。ＨＥＴ００１６のＩＣ５０は平均して１０．２±１．３ｎＭ（ｎ＝４）であった。
【００５３】
（実施例６）
ＳＡＨを患うイヌにおけるＣＳＦの２０−ＨＥＴＥ濃度の測定
方法
本研究ではオスのビーグル犬を用いた。慢性血管痙攣を確実に再現できるため、二重出血性イヌモデルを用いた。
【００５４】
第１日目に麻酔下で外科手術を行なった。２０ゲージの針を大槽に挿入してＳＡＨを誘発し、２から６ｍｌのＣＳＦを取り出した。新鮮な自己動脈血（５〜１０ｍｌ）を大槽に注射した。そして、脳底動脈の周囲の血液が重力によって固まりやすくなるよう、２０分間尻尾を引っ張り上げて身体を傾けさせた。そして、動物を覚醒させて、それぞれのケージに戻した。３日目に、イヌを麻酔して、０．５ｍｌ〜４ｍｌのＣＳＦを採取してから、第１日目について記載したようにして、５．５〜９ｍｌの新鮮な自己動脈血を大槽に注射した。そして、動物をそれぞれのケージに戻した。７日目に、同様の操作によって、ＣＳＦ試料（０．５〜２ｍｌ）を採取した。Ｍａｉｅｒ， Ｋ．Ｇ．ら、Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， （２０００年） ２７９：Ｈ８６３−Ｈ８７１によって記載されているようにＨＰＬＣ技術によって、ＣＳＦにおける２０−ＨＥＴＥ濃度を測定した。
【００５５】
結果
対照期間におけるＣＳＦの２０−ＨＥＴＥ濃度は２０．２±４．７ｎｇ／ｍｌ（ｎ＝５）であった。我々は、大槽への血液注射が、ＳＡＨを起こしたイヌのＣＳＦにおける２０−ＨＥＴＥ濃度を上昇させたことを発見した（図１０）。３日目および７日目におけるＣＳＦ中の２０−ＨＥＴＥ濃度は、８１．６±２９．６ｎｇ／ｍｌ（ｎ＝５）、および１４８．１±３６．６ｎｇ／ｍｌ（ｎ＝５）であった（図１０）。
【００５６】
（実施例７）
ヒト２０−ＨＥＴＥ合成酵素の阻害
方法
ＨＢＳＳ（ハンクスの平衡塩類溶液、カタログ番号：１４１７５、ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ））、５μＣｉ／ｍｌの３Ｈ−ＡＡ（アマシャム・ファルマシア・バイオテック社（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）、１ｍＭ　ＮＡＤＰＨ、およびヒト腎臓ミクロソーム（メリーランド州ローレル（Ｌａｕｒｅｌ，ＭＤ）にあるヒト細胞培養センター（Ｈｕｍａｎ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｅｎｔｅｒ））を含む反応混合液（０．０２〜０．４ｍｇのタンパク質）を３７℃で２時間インキュベートした。阻害実験では、ＨＥＴ００１６、１７−ＯＤＹＡ、または１−ＡＢＴを反応混合液に直接加えた。すべての反応は、１％蟻酸による酸性化によって停止させた。等量のアセトニトリルを加えて、最終濃度５０％のアセトニトリル混合液でＨＰＬＣ分析を行なった。反応混合液の分割量をバイオ−シル（Ｂｉｏ−Ｓｉｌ）Ｃ１８ＨＬ９０−５Ｓカラム（１５０×４．６ｍｍ　Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に適用して、以下のような溶媒Ａ（１００％アセトニトリル）および溶媒Ｂ（０．１％酢酸）の混合液の直線的勾配を用いて反応生成物を分離した。（ｉ）０〜１０分、４８から６４．８％の溶媒Ａ；（ｉｉ）１０〜２０分、６４．８から７５％の溶媒Ａ；（ｉｉｉ）２５〜２６分、７５％の溶媒Ａ；（ｉｖ）２６〜３１分、１００％の溶媒Ａ。３Ｈ−標識産物をラジオアクティブ検出器（レイテスト社、ラミナ（ｒａｍｉｎａ）９３）を用いて検出した。２０−ＨＥＴＥの保持時間は、我々の装置（ＨＰＬＣ、ギルソンシステム（Ｇｉｌｓｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ）、８０５（検圧モジュール）、８１１Ｃ（ダイナミックミキサー）、４０１Ｃ（希釈装置）、３０５（ポンプ）、３０６（ポンプ）、２３１ＸＬ（サンプル採取用注射器）、８３１（温度調節装置）、５０３（脱気装置））では約１６分であった。ＩＣ５０は、２０−ＨＥＴＥのピーク領域が対照の５０％になる、阻害物質の濃度と定義された。
【００５７】
結果
ＨＥＴ００１６（１０−１１〜１０−６Ｍ）、１７−ＯＤＹＡ（１０−９〜１０−４Ｍ）、および１−ＡＢＴ（１０−９〜１０−４Ｍ）は、ＡＡとインキュベートしたヒト腎臓ミクロソームによる２０−ＨＥＴＥ生成を濃度依存的に阻害した。ＨＥＴ００１６、１７−ＯＤＹＡ、および１−ＡＢＴのＩＣ５０は、それぞれ、８．９±２．７ｎＭ（ｎ＝６）、１．８±０．８μＭ（ｎ＝６）、および３８．５±１４．９μＭ（ｎ＝５）であった。
【００５８】
（実施例８）
ヒトにおける２０−ＨＥＴＥ生成に関与するＣＹＰアイソフォームのすべてである、ＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ４Ｆ２、およびＣＹＰ４Ｆ３に対するＨＥＴ００１６の効果
方法
ジェンテスト社（マサチューセッツ州ウォバーン）から購入した組換えＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ４Ｆ２、またはＣＹＰ４Ｆ３酵素３０ピコモルを、１ｍＭ　ＮＡＤＰＨを含む、１ｍｌの０．１　Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ　７．４）の中で［１４Ｃ］−ＡＡ（０．１　Ｃｉ、１．９　Ｍ）とともに３７℃で３０分インキュベートした。蟻酸によってｐＨ　３．５まで酸性化させて反応を停止させ、エチル酢酸で抽出した。代謝物を逆相ＨＰＬＣによって分離し、ラジオアクティブフロー検出器を用いて生成物を測定した。
【００５９】
結果
ＣＹＰ４Ｆ３で得られた典型的なクロマトグラムを図１１のパネルＡ（対照）およびＢ（１μＭのＨＥＴ００１６）に示す。ＣＹＰ４Ａ１１またはＣＹＰＦ２酵素を用いても同様の結果が得られた。３種類のアイソフォームすべてが、ＡＡとインキュベートすると２０−ＨＥＴＥを産生した。ＣＹＰ４Ｆ３アイソフォームが一番高い活性を持っており、その後にＣＹＰ４Ｆ２とＣＹＰ４Ａ１１が続いた。ＨＥＴ００１６は、３種類のアイソフォームすべてによる２０−ＨＥＴＥ生成を濃度依存的に阻害した（図１１、パネルＣ）。ＣＹＰ４Ａ１１のＩＣ５０は４２ｎＭであり、ＣＹＰ４Ｆ３およびＣＹＰ４Ｆ２アイソフォームについてはそれぞれ、平均して１００ｎＭおよび１２５ｎＭであった。
【００６０】
（実施例９）
薬剤代謝に関与する主要なヒト肝臓ＣＹＰ酵素、ＣＹＰ２Ｄ６、２Ｃ９、および３Ａ４の活性に対するＨＥＴ００１６、１７−ＯＤＹＡ、および１−ＡＢＴの効果。
方法
ＨＥＴ００１６、１７−ＯＤＹＡ、および１−ＡＢＴが、薬剤代謝に関与する普通のヒト肝臓チトクロームＰ４５０酵素（ＣＹＰ２Ｄ６、２Ｃ９、および３Ａ４）の触媒活性を阻害することができるかを調べた。１５人のヒトの肝臓から調製したミクロソームを日本農産工（Ｎｉｐｐｏｎ　Ｎｏｓａｎｋｏ）から購入した。この酵素／基質は、緩衝液、ヒト肝臓ミクロソーム、および以下の基質を含んでいた。（ＣＹＰ２Ｃ９：１４Ｃ−トルブタミド（４−メチルヒドロキシル化）、ＣＹＰ２Ｄ６：塩酸ブフラロール（ｂｕｆｕｒａｌｏｌ）（１’−ヒドロキシル化）、ＣＹＰ３Ａ４：１４Ｃ−テストステロン、およびＣＹＰ２Ｃ１９：１４Ｃ−（Ｓ）−メフェニトイン（４’−ヒドロキシル化）。上記混合液を、１−ＡＢＴ（１００μＭ）、１７−ＯＤＹＡ（１０μＭ）、またはさまざまな濃度のＨＥＴ００１６（１、１０、１００μＭ）とともに、またはこれらなしにインキュベートした。インキュベートした後、酸化された基質（代謝物）の生成率を、ＴＬＣまたはＨＰＬＣを用いて測定した。ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４、およびＣＹＰ２Ｃ１９に対する陽性対照はスルファフェナゾール、キニジン、ケトコナゾール、およびトラニルシプロミン（ｔｒａｎｙｌｃｙｐｒｏｍａｉｎｅ）であった。
【００６１】
ＣＯＸ活性に対するＨＥＴ００１６の効果。ＣＯＸ阻害物質スクリーニング測定キット（ミシガン州アナーバー（Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）にあるケイマン・ケミカル社（Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．））を用いて、ＣＯＸ活性に対するＨＥＴ００１６の効果を調べた。簡単に言うと、雄ヒツジの精嚢ＰＧＨ１合成酵素から精製した酵素を、ＨＥＴ００１６（１０−１０〜１０−４Ｍ）およびインドメタシン（１０−１０〜１０−４Ｍ）を含むか含まない１．０ｍｌのインキュベーション緩衝液（０．１　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ　８，５ｍＭ　ＥＤＴＡ，２ｍＭフェノール、および１μＭヘマチン）の中で１００μＭのＡＡとともにインキュベートした。反応混合液は、ＡＡを加える前に３７℃で２分間インキュベートし、加えた後２分間インキュベートした。すべての試料について反復して調べた。ＰＧＥ２の量は、トリス緩衝液で１００〜４００倍に希釈した後、ＥＩＡによって測定した。
【００６２】
結果
表１は、ヒトＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、およびＣＹＰ３Ａ４の活性に対するＨＥＴ００１６、１７−ＯＤＹＡ、および１−ＡＢＴの阻害効果を示している。対応する陽性対照は、ＣＹＰ２Ｃ９、２Ｄ６、および３Ａ４の代謝を約９０％、そしてＣＹＰ２Ｃ１９の活性を６５％阻害した。１００μＭの濃度の１−ＡＢＴは、これらＣＹＰアイソフォームの活性を４０〜８０％阻害した。１７−ＯＤＹＡは、ＣＹＰ４Ａの活性を実質的に阻害することができた１０μＭという濃度で、１−ＡＢＴよりも選択性が高く、ＣＹＰ２Ｃ９とＣＹＰ３Ａ４の活性を２０〜３０％低下させただけであった。同様に、２０−ＨＥＴＥの形成を阻害するのに必要とされる濃度よりも１００倍高い１μＭという濃度で、ＨＥＴ００１６は、ＣＹＰ２Ｃ９とＣＹＰ３Ａ４の活性を２７％低下させただけであった。より高い１０μＭおよび１００μＭという濃度では、ＨＥＴ００１６はＣＹＰアイソフォームの活性をより実質的に低下させた。しかし、１０μＭおよび１００μＭは、２０−ＨＥＴＥ生成を阻害するのに必要とされるＨＥＴ００１６の有効濃度を、それぞれ１，０００倍および１０，０００倍上回っている。
【００６３】
また、我々は、ＰＧＨ１合成酵素が触媒するＡＡからＰＧＥ２への変換を測定することによって、ＣＯＸ活性に対するＨＥＴ００１６の効果を調べた。ＨＥＴ００１６（１０−６Ｍ）はＣＯＸ活性を２０％阻害したが、インドメタシン（１０−６Ｍ）はＣＯＸ活性を９５％阻害した。
【００６４】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ’−（４−ブチル−２−メチルフェニル）−ホルムアミジン（ＨＥＴ００１６）の構造を表したものである。
【図２】
図２は、ＳＡＨを誘発する前にＨＥＴ００１６および１７−ＯＤＹＡを投与したときの、ＳＡＨ後の局所的脳血流（ｒＣＢＦ）に対するＨＥＴ００１６および１７−ＯＤＹＡの効果を示したものである。＊印は、対照と有意差があることを示す。‡印は、賦形剤処理群における対応値と有意差があることを示す。
【図３】
図３は、ラットの腎臓から調製したミクロソームにおける２０−ＨＥＴＥおよびＥＥＴの形成に対するＨＥＴ００１６の効果を示したものである。＊印は、対照と有意差があることを示す。２０−ＨＥＴＥに関するエラーバーは非常に短いため、データ点の内側に入っている。
【図４】
図４は、ＳＡＨの前後、および１７−ＯＤＹＡまたはＨＥＴ００１６によってラットを処理した前後の脳脊髄液（ＣＳＦ）中の２０−ＨＥＴＥ濃度を表したものである。＊印は、対照と有意差があることを示す。‡印は、賦形剤処理群と有意差があることを示す。
【図５】
図５は、ＳＡＨが開始して３０分後にＨＥＴ００１６を投与したときのｒＣＢＦに対するＨＥＴ００１６の効果を表したものである。
【図６】
図６は、ラットの中大脳動脈を一時的に閉塞させた後の梗塞量に対するＨＥＴ００１６の効果を表したものである。
【図７】
図７は、ラットの腎臓から調製したミクロソームにおける２０−ＨＥＴＥ合成およびＥＥＴ合成に対するＨＥＴ００１６、１−アミノベンゾトリアゾール（１−ＡＢＴ）、およびミコナゾールの効果を比較したものである。
【図８】
図８は、イヌＰＭＮが２０−ＨＥＴＥを産生できることを示したものである。
【図９】
図９は、イヌの好中球による２０−ＨＥＴＥ合成に対するＨＥＴ００１６の効果を表したものである。
【図１０】
図１０は、イヌのＣＳＦにおける２０−ＨＥＴＥの濃度に対するＳＡＨの効果を示している。
【図１１】
図１１は、ＨＥＴ００１６存在下（パネルＢ）または不在下（パネルＡ）でＣＹＰ４Ｆ３によって触媒された２０−ＨＥＴＥ生成のクロマトグラム、および、ＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ４Ｆ２、およびＣＹＰ４Ｆ３（パネルＣ）によって触媒された２０−ＨＥＴＥ生成に対するＨＥＴ００１６の効果を表している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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