(57)【要約】本発明は、筋特異的エンハンサーに作動可能に連結したＳＭＣ特異的プロモーターを含んでなるキメラ構築物に関する。本発明は、このようなキメラ構築物を含んでなり、治療遺伝子の発現を制御するための発現カセットも提供する。最後に、本発明は、上記発現カセットを含んでなる組み換えベクター、ウイルス粒子、真核宿主細胞、組成物、およびＳＭＣ中での特異的発現および治療または予防目的のためのそれらの使用、本発明のキメラ構築物、発現カセットまたはベクターをゲノムに組込んでなる、ヒトまたは動物生体、並びにヒト以外のトランスジェニック動物の治療方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１個の（ｉｉ）筋特異的エンハンサーに作動可能に連結した少なくとも１個の（ｉ）平滑筋（ＳＭＣ）特異的プロモーターを含んでなるキメラ構築物。
【請求項２】
上記ＳＭＣ特異的プロモーターが平滑筋α−アクチン、平滑筋ミオシン重鎖（ＳＭ−ＭＨＣ）、平滑筋カルポニン、デスミンおよびＳＭ２２α遺伝子のプロモーターからなる群から選択される、請求項１に記載のキメラ構築物。
【請求項３】
上記ＳＭＣ特異的プロモーターがマウスＳＭ２２α遺伝子に由来する、請求項２に記載のキメラ構築物。
【請求項４】
上記ＳＭＣ特異的プロモーターがマウスＳＭ２２αプロモーターの転写開始部位の上流の４４５ｂｐ断片（すなわち、配列番号：１、１〜４４５位）内に包含される、請求項３に記載のキメラ構築物。
【請求項５】
上記ＳＭＣ特異的プロモーターがヒトＳＭ２２α遺伝子に由来する、請求項２に記載のキメラ構築物。
【請求項６】
上記ＳＭＣ特異的プロモーターがヒトＳＭ２２αプロモーターの転写開始部位の上流の４４５ｂｐ断片（すなわち、配列番号：１４、１〜４４５位）内に包含される、請求項５に記載のキメラ構築物。
【請求項７】
上記筋特異的エンハンサーが
ａ） 哺乳類α−アクチン、特に心臓、骨格または平滑筋α−アクチン、
ｂ） 哺乳類トロポニン、特にトロポニンＣ、ＩまたはＴ、
ｃ） 哺乳類 ミオゲニン、
ｄ） 哺乳類ミオシン、
ｅ） 哺乳類クレアチンキナーゼ、特にヒトまたはマウスクレアチンキナーゼ、
ｈ） 哺乳類ＳＭ２０遺伝子産物、
ｉ） 哺乳類Ｔｉｍｐ４ （Ｔｉｓｓｕｅ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ４）、および
ｊ） 哺乳類カルポニン
をコードする遺伝子のエンハンサーからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のキメラ構築物。
【請求項８】
上記筋特異的エンハンサーがウサギミオシン重鎖コード遺伝子に由来する、請求項７に記載のキメラ構築物。
【請求項９】
上記筋特異的エンハンサーがウサギミオシン重鎖コード遺伝子の転写開始部位の上流約−１３３２〜約−１２２５位（すなわち、配列番号：２）に配置されている、請求項８に記載のキメラ構築物。
【請求項１０】
上記筋特異的エンハンサーがヒトクレアチンキナーゼ遺伝子の転写開始部位の上流約−９１９〜約−７１１位（すなわち、配列番号：３）に配置されている、請求項７に記載のキメラ構築物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のキメラ構築物の制御下に置かれた目的の遺伝子を含んでなり、ターゲット細胞でそれを発現させる、発現カセット。
【請求項１２】
上記目的の遺伝子がＳＭＣ上で増殖抑制活性を有するポリペプチドをコードする、請求項１１に記載の発現カセット。
【請求項１３】
上記ポリペプチドがＩＦＮβ、ＩＦＮγ、酸化窒素シンターゼｅＮＯＳ、Ｆａｓリガンド、ヘムオキシゲナーゼ、インターロイキン−１０、およびヘパリン結合ＶＥＧＦ、好ましくはそれぞれがヒト由来のもの、からなる群から選択される、請求項１２に記載の発現カセット。
【請求項１４】
上記発現カセットが１個以上のエキソンまたはそれらの部分をも含んでなる、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項１５】
＋１位〜約＋６５位まで伸張しているマウスＳＭ２２α遺伝子の第一の非コードエキソンの部分（すなわち、配列番号：１、４４６〜５１０位）または＋１〜約＋６３位まで伸張しているヒトＳＭ２２α遺伝子の第一の非コードエキソンの部分（すなわち、配列番号：１４、４４６〜５０８位）を含んでなる、請求項１４に記載の発現カセット。
【請求項１６】
請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の発現カセットを含んでなるベクター。
【請求項１７】
上記ベクターがヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、フォーミーウイルス、レンチウイルス、セムリキ森林ウイルス、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）、ポックスウイルス、レトロウイルスおよびアデノウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来するウイルスベクターである、請求項１６に記載のベクター。
【請求項１８】
上記ウイルスベクターが複製欠陥アデノウイルスベクターである、請求項１８に記載のベクター。
【請求項１９】
ターゲット細胞の目的の遺伝子をＳＭＣ特異的に発現させるウイルス粒子の製造方法であって、
ａ）　許容細胞系に請求項１７または１８に記載のウイルスベクターを導入し、
ｂ）　工程ａ）で得た許容細胞系を適当な時間適当な条件下で培養して、上記ウイルス粒子を産生させ、
ｃ）　細胞培養物から上記ウイルス粒子を回収し、
ｄ）　場合によっては、回収したウイルス粒子を精製する
工程を含んでなる、方法。
【請求項２０】
請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のベクターを含んでなる、または請求項１９に記載の方法によって得られる、ウイルス粒子。
【請求項２１】
請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の発現カセット、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のベクターを含んでなる、または請求項２０に記載のウイルス粒子に感染した、真核宿主細胞。
【請求項２２】
上記細胞が血管平滑筋である、請求項２１に記載の真核宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の発現カセット、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のベクター、請求項２０に記載のウイルス粒子、または請求項２１または２２に記載の真核宿主細胞、および場合によっては、薬学上許容可能なキャリヤーを含んでなる、医薬組成物。
【請求項２４】
遺伝子治療によるヒトまたは動物生体の疾患の治療または予防のための薬剤の製造のための、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の発現カセット、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のベクター、請求項２０に記載のウイルス粒子、または請求項２１または２２に記載の真核宿主細胞の使用。
【請求項２５】
循環器疾患の治療または予防のための薬剤の製造のための、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の発現カセット、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のベクター、請求項２０に記載のウイルス粒子、または請求項２１または２２に記載の真核宿主細胞の治療上有効量をヒトまたは動物生体に投与することを含んでなる、上記生体の治療方法。
【請求項２７】
ＳＭＣにおける目的の遺伝子の特異的発現のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のキメラ構築物、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の発現カセット、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のベクター、または請求項２０に記載のウイルス粒子の使用。
【請求項２８】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のキメラ構築物、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の発現カセット、または請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のベクターをゲノムに組込んでなる、非ヒトトランスジェニック動物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、筋特異的エンハンサーに操作可能に結合した平滑筋細胞（ＳＭＣ）特異的プロモーターを含んでなるキメラ構築物に関する。本発明は、このようなキメラ構築物を含んでなり、治療遺伝子の発現を制御するための発現カセットも提供する。最後に、本発明は、上記発現カセットを含んでなる組み換えベクター、ウイルス粒子、真核宿主細胞、医薬組成物、およびＳＭＣ中での特異的発現および治療または予防目的のためのそれらの使用、ゲノムに上記発現カセットを組込んだトランスジェニック動物に関する。本発明は、組織特異的遺伝子発現の分野に関し、培養細胞系における組み換えポリペプチドの産生、トランスジェニック動物モデルの構築、遺伝子調節の研究、および血管ターゲッティング技術の開発など多くの用途に用いられる。本発明は、遺伝子治療、特に循環器分野における遺伝子治療に関して極めて興味深いものである。
【０００２】
遺伝子治療は、遺伝子材料の細胞または生体への導入と定義することができる。遺伝子治療によるヒト疾患の治療の可能性は、数年間で理論的考察の段階から臨床的応用の段階へと変化してきた。ヒトに適用された最初のプロトコールは、アデニンデアミナーゼ（ＡＤＡ）をコードする遺伝子に影響を与える突然変異の結果としての遺伝的に免疫不全である患者について１９９０年９月にアメリカ合衆国で開始され、この最初の実験の相対的な成功により様々な遺伝的および後天的疾患についての技術開発が促進された。遺伝子治療に基づく有望な臨床試験が、現在進行中である（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏ．ｕｋ／ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ／ｃｌｉｎｉｃａｌ／に記載されている臨床試験を参照されたい）。
【０００３】
循環器疾患は、先進工業国の大半における死亡率の主な原因であるので、遺伝子治療の主要なターゲットである。平滑筋（ＳＭＣ）の表現型を増殖および調節する能力は、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、および喘息など多くの疾患の病因に関係してきた。例えば、動脈壁の損傷により、サイトカインおよびＳＭＣ移動および増殖を促進する他の生長調節分子の合成が誘発され、血管内膜の過形成が生じ（Ｒｏｓｓ， １９９３， Ｎａｔｕｒｅ ３６２， ８０１−８０９）、アテローム性動脈硬化症などの幾つかの循環器疾患の発症の一因となる。このような損傷に対する普通の臨床的に重要な設定は、閉塞した動脈をカテーテル上のバルーンで機械的に拡張して血流を回復するバルーン血管形成術である。しかしながら、症例の３０〜５０％では、反応性の細胞増殖応答により局部的に平滑筋が再増殖し、血液循環に欠陥を生じる（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｒｄｉｏｌ． ５３， ７１−８０）。再狭窄と呼ばれるこの工程は、通常の方法では治療し難いものであった。従って、ＳＭＣへの遺伝子導入により、これらの循環器疾患の病因の解明および遺伝子治療によるそれらの治療が保証される。
【０００４】
遺伝子治療の成功は、主として生体の細胞への治療遺伝子の効率的送達と遺伝情報の発現によって左右される。機能的遺伝子は、様々な手法によって細胞に導入して、上記遺伝子の宿主ゲノムへの組み込みにより宿主細胞の一過性発現または恒久的形質転換を生じることができる。裸の核酸（すなわち、プラスミドＤＮＡ）を用いて目的の遺伝子をターゲット細胞中に運ぶことができるが（Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７， １４６５−１４６８）、遺伝子治療プロトコールの大半はウイルスまたは合成ベクターを使用している。
【０００５】
ウイルスは、細胞膜を通って輸送を行い、リソソーム分解を免れてそれらのゲノムを核に送達するための多様で極めて複雑な機構を発現させており、従って、多くの遺伝子送達用途に用いられてきた。レトロウイルスおよびアデノウイルス由来のものが広汎に使用されているが（総説については、Ｃｒｙｓｔａｌ， １９９５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０， ４０４−４１０； Ｋｏｖｅｓｄｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ８， ５８３−５８９ ； Ｍｉｌｌｅｒ， １９９７， ヒト遺伝子Ｔｈｅｒ． ８， ８０３−８１５を参照されたい）、ポックスウイルス由来のベクターのような他のウイルスベクターはイン・ビボでの遺伝子導入の有望な候補として出てきている。
【０００６】
合成ベクターは、核酸（例えば、プラスミドＤＮＡ）と脂質またはポリマーとの特別な組合せであって、その細胞摂取を促進するものを表す。様々な脂質およびポリマーを基材としたベクターが、現在入手できる（総説については、例えば、Ｒｏｌｌａｎｄ， １９９８， Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １５， １４３−１９８を参照されたい）。ウイルスベクターより効率は劣るが、合成ベクターは大規模生産、安全性、低免疫原性およびクローニング能に関して潜在的な利点を示す。
【０００７】
しかしながら、本発明の遺伝子治療ベクターの宿主範囲が広汎にわたることが、それらの使用の主要な制限となる可能性がある。この特異性の欠如により、広汎に治療遺伝子が発現し、これが特に細胞傷害性遺伝子を導入するときには患者にとって有害となることがある。従って、遺伝子発現を標的設定した範囲の細胞に限定する手段が遺伝子治療に有用であろう。
【０００８】
数名の研究者らは、ターゲットの細胞表面ポリペプチドに特異的に結合するリガンドを結合させることによるベクター特異性の変更を提案している（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６， ９０７９−９０８３； ＷＯ９４／１０３２３号明細書）。例えば、Ｇｏｕｄ ｅｔ ａｌ． （１９８８， Ｖｉｒｏｌ． １６３， ２５１−２５４）はアンチ−トランスフェリン受容体抗体をレトロウイルスエンベロープタンパク質に連結させて、レトロウイルス粒子をトランスフェリン受容体を有するヒト細胞に送達した。しかしながら、結合およびインターナリゼーションは生じたが、感染および複製は起こらなかった。更に、この手法は複雑であり、特にベクターとその天然に存在する細胞受容体との間に存在する相互作用を排除する必要がある。
【０００９】
もう一つの代替法は、組織特異的転写調節要素を用いて遺伝子発現を所望な細胞個体数に限定することである。哺乳類細胞での遺伝子転写を完全且つ効率的に調節するには、２個の主要なＤＮＡ配列、すなわちプロモーターおよびエンハンサーが必要である。プロモーターは転写の開始部位（キャップ部位または＋１）のすぐ上流（５′）に位置し、開始部位から転写を正確且つ効率的に開始するのに必要である。大多数の真核プロモーターは、特異的なシス作用配列、例えば、（ｉ） キャップ部位に約３０塩基対５′を提供し、キャップ部位を決定して遺伝子転写を開始するのに必要なＴＡＴＡボックスと呼ばれるＡＴリッチ領域（Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈおよび Ｃｈａｍｂｏｎ， １９８１， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５０， ３４９−３８０）、および（ｉｉ） 転写開始効率を増加させ、プロモーターが適正なレベルで機能するのに必要な１個以上の上流プロモーター要素（ＵＰＥ）（ＧｅｎｅＶＩ， １９９７， Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）， ｐ ８１０−８４６， Ｂ． Ｌｅｗｉｎ監修， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）を包含する。これらのシス作用配列は遍在しており（任意の細胞の種類で見出される）または調節の役割を有する（特異的な時間にまたは特異的な組織で合成または活性化される）核転写因子によって認識され、結合される。
【００１０】
プロモーターの活性は、「エンハンサー」と呼ばれ、プロモーターからの転写速度を増加させることができる他の配列によっても調節される。エンハンサーの成分は、転写因子によって認識される幾つかのシス作用配列も含んでいるが、これらの配列は更に緊密に充填された配列に組織されるので、プロモーターの成分に似ている。これらのエンハンサーのシス作用配列は、遍在している（例えば、ウイルスエンハンサー）または調節の役割を有する（組織特異的または一時的に調節される転写因子のターゲット）核転写因子によっても認識され、結合される。エンハンサーは、プロモーターの上流または下流の数キロ塩基対（ｂｐ）までの距離に、いずれの配向でも配置することができる（ＧｅｎｅＶＩ， １９９７， Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）， ｐ ８１０−８４６， Ｂ． Ｌｅｗｉｎ監修， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）。
【００１１】
様々な組織において遺伝子を特異的且つ選択的に発現させる多数の組織特異的プロモーター／エンハンサーが、文献に記載されている（総説については、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６， １２３７−１２４５； Ｆｉｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１， １９−２４を参照されたい）。しかしながら、これまでに、数種類のＳＭＣ特異的プロモーター／エンハンサーしか同定されていない。例は、平滑筋α−アクチン（Ｆｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７， １１９９５−１２００３ ； Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２７０， ７６３１−７６４３）、平滑筋ミオシン重鎖（ＳＭ−ＭＨＣ）（Ｋａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２６９， ３０５３８−３０５４５）、デスミン（欧州特許出願第ＥＰ０　９９９　２７８号明細書； Ｍｅｒｉｃｓｋａｙ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ ９３ ｐ ７−１７， Ｄｅｓｍｏｕｌｉｅｒｅおよび Ｔｕｃｈｗｅｂｅｒ監修， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、およびＳＭ２２α遺伝子（Ｄｕｂａｎｄ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ５５， １−１１）のものに限定されている。
【００１２】
ＳＭ２２αプロモーターは、総ての平滑筋組織（内臓並びに血管ＳＭＣ）で機能する。転写開始部位のすぐ上流の４４５塩基対（ｂｐ）は、培養したＳＭＣ（Ｓｏｌｗａｙ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０， １３４６０−１３４６９； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １００， １００６−１０１８； 米国特許第６，０１５，７１１号明細書）で示されるように内臓および血管ＳＭＣでＳＭＣ系に限定されたやり方で、並びにイン・ビボでのトランスジェニックマウスで（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １３２， ８４９−８５９； Ｍｏｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２， ２４１５−２４２５）、および動脈内投与（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １００， １００６−１０１８）によって遺伝子発現をプログラムするのに十分である。更に、ＳＭ２２α遺伝子の更に上流領域は、動脈ＳＭＣ、更に具体的には、大動脈に限定された発現の特異性を示す他の転写調節したシス作用配列を含むことが示されており（ＷＯ９７／３５９７４号明細書）、ＳＭ２２α遺伝子の転写活性の複雑性を示している。
【００１３】
しかしながら、前に引用した転写要素がＳＭＣに限定されたやり方で適正に調節される場合には、それらは通常は弱く、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ； Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｃｅｌｌ ４１， ５２１−５３０）または他のウイルスのような「強い」プロモーター／エンハンサーで得られるものよりずっと低い発現レベル（１０〜２００分の１）を提供する。しかしながら、このようなウイルス転写要素は通常は非特異的であり、多くの種由来の多種多様な細胞型で活性である。
【００１４】
ＣＭＶまたは骨格筋特異的エンハンサーを骨格筋特異的プロモーターと結合させるキメラ構築物は、文献に記載されている（Ｂａｒｎｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９９８， ヒト遺伝子Ｔｈｅｒ． ９， ２５４５−２５５３）。幾つかの会合は（エンハンサーを欠いた構築物と比較して）培養した分化骨格筋細胞におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベル有意に増強させるが、強い発現は筋肉以外のＢＨＫ細胞でも観察され、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーを用いて得た発現レベルの１００％まで到達する。更に、イン・ビトロで強い増強を示す幾つかのキメラ構築物は、骨格筋に投与するときにはイン・ビボではこのような増加を再現しない。Ｂａｒｎｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．によって記載されているように、遺伝子発現を定義する臨床パラメーターは複雑であり、プロモーター配列並びに配列環境に関してエンハンサーの性質、数、配向および位置によって変化する。
【００１５】
ＣＭＶエンハンサーをＳＭ２２αプロモーターなどのＳＭＣ特異的プロモーターと会合させるキメラ構築物は、近年ＷＯ００／１８９０８号明細書に記載されている。様々な培養細胞系のトランスフェクション研究は、ＣＭＶエンハンサーが存在するときのＳＭＣにおける遺伝子発現の活性化を示している。しかしながら、キメラ構築物は非ＳＭＣでも強い誘導性を保持しており、コントロールとして用いた強力なＣＭＶプロモーター／エンハンサーを用いて得た発現レベルの２６％まで達する。非標的設定細胞におけるこのようなバックグラウンド発現は、特に細胞傷害性遺伝子の送達を考えるときには、ヒト遺伝子治療と両立しないことがある。
【００１６】
要するに、これらの研究は、ターゲット細胞、好ましくはＳＭＣに対する限定された特異性を保持したまま有意なレベルで遺伝子を発現させる適当なプロモーター／エンハンサーの組合せをデザインすることが困難であることを明らかにしている。
【００１７】
従って、当該技術分野では、ＳＭＣ、特に血管構造のＳＭＣにおいて遺伝子を高レベルおよび特異的に発現させる転写要素をデザインして、治療レベルのタンパク質発現を達成し、広汎な遺伝子発現に固有の潜在的な副作用を回避する必要がある。
【００１８】
この技術的問題は、特許請求の範囲に定義した態様を提供することによって解決される。
【００１９】
従って、本発明は、少なくとも１個の（ｉｉ）筋特異的エンハンサーに作動可能に連結した少なくとも１個の（ｉ）平滑筋（ＳＭＣ）特異的プロモーターを含んでなるキメラ構築物を提供する。
【００２０】
本明細書で用いられる「キメラ構築物」という用語は、種、遺伝子などにあてはまる各種起源の少なくとも２個の配列を含んでなる核酸構築物を表す。好ましくは、これらの２個の配列、すなわちＳＭＣ特異的プロモーターおよび筋特異的エンハンサーは互いに非相同性であり、すなわちそれらは異なる遺伝子または異なる種から生じ、更に好ましくは、それらは異なる遺伝子および異なる種から生じるという意味において非相同性である。本発明の範囲内では、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は互換的に用いられ、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態またはその類似体を定義している。「ポリヌクレオチド」としては、任意の可能な核酸、特に一本鎖または二本鎖、線状または環状、天然または合成であることができるＤＮＡが挙げられる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体のような修飾ヌクレオチドを含んでなることができる（米国特許第５，５２５，７１１号明細書、米国特許第４，７１１，９５５号明細書、またはＥＰＡ３０２　１７５号明細書を修飾の例として参照されたい）。このようなポリヌクレオチドは既成の核酸供給源（例えば、ゲノムｃＤＮＡ）から得ることができるが、合成的なもの（例えば、オリゴヌクレオチド合成によって製造される）であることもできる。ヌクレオチドの配列を非ヌクレオチド要素によって中断することができる。ポリヌクレオチドは、重合の後にらに修飾してもよい。
【００２１】
ＳＭＣ特異的プロモーターおよび筋特異的エンハンサーについて本出願明細書に引用されたヌクレオチド位置に、転写開始部位またはキャップ部位（位置＋１を表す）に対して負の番号を付ける。転写開始部位のすぐ上流の最初のヌクレオチドは、−１と番号を付ける。転写開始部位は、Ｓ１マッピングまたはプライマー伸張のような標準的手法によって決定することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９， 実験室便覧（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， コールドスプリングハーバー， ニューヨーク）。
【００２２】
「平滑筋細胞（ＳＭＣ）」という用語は、内臓および血管ＳＭＣ、更に具体的には動脈ＳＭＣなど任意の種類の平滑筋細胞を表し、大動脈、冠、乳房、大腿および頸動脈の並びに伏在静脈の血管内膜（ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ）および中間部（ｍｅｄｉａｌ）ＳＭＣが特に好ましい。
【００２３】
本明細書で用いられる「ＳＭＣ特異的プロモーター」は、平滑筋細胞に含まれる（複数の）転写因子および／またはＲＮＡポリメラーゼによって認識されることによって、隣接遺伝子の発現を促進する任意の核酸配列を意味する。「隣接遺伝子」という用語は、転写が上記プロモーターおよび／または本発明のキメラ構築物によって制御される遺伝子を表す。特に、「特異的」という用語は、本発明で用いられるプロモーターおよび／または本発明のキメラ構築物がＳＭＣでの遺伝子発現を指示するが非ＳＭＣでは全くまたは余り活性ではない（少なくとも５、好ましくは少なくとも１０のファクターの減少した活性）傾向を示すことを意味する。
【００２４】
本発明で用いられるＳＭＣ特異的プロモーターは、ＳＭＣにおいて低レベルであっても遺伝子発現を促進するのに必要な少なくとも総ての要素を包含する。このようなプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位を可能にし、且つ好ましくはキャップ部位の２５〜３５ｂｐに配置されたＴＡＴＡボックス（コンセンサス配列ＴＡＴＡＡＡＡ）またはＴＡＴＡボックス様要素（ＴＡＴＡボックス機能を有するＡＴリッチ配列）のようなキャップ部位で転写を開始するのに必要なシス作用配列を含むいわゆる「最小プロモーター」であることができる。ＴＡＴＡボックスの存在は配列分析によって決定することができ、また転写の開始部位はＳ１マッピングまたはプライマー伸張のような標準的手法によって決定することができる。最小ＳＭＣ特異的プロモーターは、通常は転写開始部位の（上流）２００塩基対（ｂｐ）の断片に含まれ、有利には１００塩基対（ｂｐ）の断片に含まれる。
【００２５】
第二の好ましい代替態様によれば、本発明のキメラ構築物は、ＳＭＣにおける最小プロモーターによって指示される遺伝子発現を実質的に増加させる追加のシス作用配列を含むＳＭＣ特異的プロモーターを用いる。このようなシス作用配列は、遍在しているかまたは調節の役割（一時的または組織特異的）を有する転写因子、特にＳＭＣに特異的な因子を結合させることができる。代表例としては、ＮＦ−１因子が結合したＣＡＡＴボックス（コンセンサスＧＧＣＣＡＡＴＣＴ）、ＳＰ１因子が結合したＧＣボックス（コンセンサス ＧＧＧＣＧＧ）、Ｏｃｔ因子が結合したオクタマーＡＴＴＴＧＣＡＴ、ＮＦ６Ｂが結合した６Ｂ（コンセンサスＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ）、ＡＴＦ因子が結合したＡＴＦ（コンセンサスＧＴＧＡＣＧＴ）、Ａｐ２、Ｓｐ１、Ｅｇｒ１、ＹＹ１、ＴＧＴ３−３、Ｅボックス（ＣＡＮＮＴＧ）、ＣａｒＧボックス（ＣＣ（Ａ／Ｔ）６ＧＧ）、および／またはＭＥＦ−２（ＹＴＡＷＡＡＡＴＡＲ）配列が挙げられるが、これらに限定されない。これらのシス作用配列は単独でまたは様々な組合せで用いることができ、相同性（本発明で用いられるＳＭＣ特異的プロモーターから単離）または非相同性（別のプロモーター領域から単離）であってもよい。これに関連して、数種類のＳＭＣ特異的プロモーターの異なる部分を融合させ、ＳＭＣでの遺伝子発現を最適にするのが有利であることがある。
【００２６】
この好ましい態様によれば、本発明のキメラ構築物で用いられるＳＭＣ特異的プロモーターは、転写開始部位の上流の４０００ｂｐの断片内、有利には２０００ｂｐの断片内、好ましくは１０００ｂｐの断片内、更に好ましくは５００ｂｐの断片内に含まれる。
【００２７】
更に、本発明のキメラ構築物で用いられるＳＭＣ特異的プロモーターは、隣接遺伝子に含まれていないときには、標的設定したＳＭＣで機能する転写開始部位を含んでなることがある。
【００２８】
好ましい態様によれば、本発明のキメラ構築物で用いられるＳＭＣ特異的プロモーターは、平滑筋α−アクチン（Ｆｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７， １１９９５−１２００３； Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２７０， ７６３１−７６４３）、平滑筋ミオシン重鎖（ＳＭ−ＭＨＣ）（Ｋａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２６９， ３０５３８−３０５４５）、平滑筋カルポニン（マウス遺伝子についてＭｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１， ７０９５−７１０３、ラット遺伝子についてＮｏｂｒｅｇａ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｍａｍｍ Ｇｅｎｏｍｅ １１， １１５−１１９、およびヒト遺伝子についてＫｉｔａｍｉ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ． Ｒｅｓ． ２２， １８７−１９３）、デスミン（欧州特許出願第ＥＰ　０　９９９　２７８号明細書；Ｍｅｒｉｃｓｋａｙ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ ９３， ｐ ７−１７， Ｄｅｓｍｏｕｌｉｅｒｅおよび Ｔｕｃｈｗｅｂｅｒ監修， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）およびＳＭ２２α遺伝子 （Ｄｕｂａｎｄ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ５５， １−１１）のプロモーターからなる群から選択される。ＳＭ２２αプロモーターを用いるのが好ましい。この好ましい態様の範囲内には、ＳＭＣ特異的発現を伝達することもできるこれらのプロモーターの５′欠失断片がある。
【００２９】
本発明のキメラ構築物は、任意の種、特にヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ由来のＳＭ２２αプロモーターを用いることができる。様々な種のＳＭ２２αプロモーターの配列は、文献または専門のデーターバンク（ヒト配列については受託番号ＡＨ００６１７２．１、マウス配列についてはＺ．６８６１８．１、およびラット配列についてはＺ４８６０７．１のＧｅｎｅｂａｎｋなど）から当業者が入手することができる。基本的なシス作用配列の位置は、公表されたデーターに基づいて決定することができる。
【００３０】
マウス遺伝子のＳＭ２２αプロモーター、特に転写開始部位の上流の４４５ｂｐ断片（すなわち、配列番号：１、１〜４４５位）内に含まれるマウスＳＭ２２αプロモーターの部分が、本発明に関して特に好ましい。このネズミＳＭ２２αプロモーターは、Ｍｏｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．に記載の方法で単離することができる（１９９６， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２，２４１５−２４２５）。ヒト遺伝子のＳＭ２２αプロモーター、特に約−４４５位まで伸張する部分（配列番号：１４の１〜４４５位）も、本発明に関して適当である。他の哺乳類形態のＳＭ２２αプロモーターは、通常の分子生物学の手法を用いてまたはＰＣＲによって適当なマトリックス（例えば、前に引用した文献記載の従来の技術によるプラスミド）から得ることができる。例えば、 ネズミ遺伝子の断片を用いて、相同配列をハイブリダイズさせる条件下で他の種の哺乳類から作製したゲノムライブラリーをプローブすることができる。適当なハイブリダイゼーション条件は、標準的マニュアル（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ， コールドスプリングハーバー， ニューヨーク）を参照して決定することができる。
【００３１】
本明細書で用いられる「筋」という用語は、（上記で定義した通りの）骨格、心および平滑筋など任意の種類の筋細胞を表そうとするものである。骨格および平滑筋が、本発明に関して好ましい。
【００３２】
本明細書で用いられる「筋特異的エンハンサー」は、（複数の）因子が直接または間接的に（すなわち、他の細胞因子との相互作用によって）結合することによって、本発明のキメラ構築物、特に標的設定したＳＭＣに含まれるＳＭＣ特異的プロモーターによって行われる遺伝子発現を増進するポリヌクレオチド配列を表す。このような増進は、例えばイン・ビトロ（例えば、培養ＳＭＣ中）またはイン・ビボ（例えば、トランスジェニック動物中でまたは動物モデルに直接投与することによって）でも、同一実験条件下で筋特異的エンハンサーの存在下または非存在下においてＳＭＣ特異的プロモーターの制御下でレポーター遺伝子の発現を比較することによって決定することができる。このような遺伝子発現分析の例は、本明細書の例３、４および６において提供されるが、当業者に周知の他の方法を本発明に関連して用いることもできる。
【００３３】
多種多様な異なる供給源由来の多数の筋特異的エンハンサーは当該技術分野で周知であり、クローニングしたポリヌクレオチド配列としてまたはの範囲内で（例えば、ＡＴＣＣのような寄託機関、または商業的および個人的供給源から）利用可能である。従って、好ましい態様では、筋特異的エンハンサーは
ａ） 哺乳類α−アクチン（Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０，７６３１−７６４３）、特に心臓、骨格または平滑筋α−アクチン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｄ００６１８）、
ｂ） 哺乳類トロポニン、特にトロポニンＣ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ３７９８４）、Ｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ９０７８０）またはＴ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＪ０１１７１２）、
ｃ） 哺乳類ミオゲニン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ６２１５５）、
ｄ） 哺乳類ミオシン。数種類のミオシンエンハンサーが、これまでにミオシン軽鎖およびミオシン重鎖遺伝子（例えば、Ｄｏｎｏｇｈｕｅ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２， １７７９−１７９０）のいずれに由来するものも同定されている。好ましいものは、ミオシン重鎖エンハンサーであり、更に好ましくはウサギのエンハンサーであり、遺伝子をコードするウサギミオシン重鎖の転写開始部位の上流約−１３３２〜約−１２２５位（配列番号：２）に配置されたエンハンサーが特に好ましい（Ｋａｌｌｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０，３０９４９−３０９５７）、
ｅ） 哺乳類クレアチンキナーゼ、特にヒト（Ｔｒａｓｋ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６３， １７１４２−１７１４９ ； Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＨ００３４６０）またはマウス（Ｊａｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８， ６２−７０）クレアチンキナーゼ。好ましい筋特異的エンハンサーは、好ましくはヒトクレアチンキナーゼ遺伝子の転写開始部位の上流の約−９１９〜約−７１１位に配置された配列（配列番号：３）を用いる、
ｆ） 哺乳類ＡＰＥＧ−１（大動脈で優先的に発現される遺伝子−１； Ｈｓｉｅｈ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４， １４３４４−１４３５１）、
ｇ） 哺乳類スムーセリン（ｓｍｏｏｔｈｅｌｉｎ）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＨ００７６９１）、
ｈ） 哺乳類ＳＭ２０遺伝子産物、特にヒト由来のもの（Ｗａｘ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７４， ７９７−８０８）、
ｉ） 哺乳類Ｔｉｍｐ４（メタロプロテイナーゼ組織インヒビター４（Ｔｉｓｓｕｅ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ４））、特にヒト由来のもの（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ７６４５６）、および
ｊ） 哺乳類カルポニンであって、ネズミカルポニン遺伝子の最初のイントロン内の約＋１３８〜＋１８７５位に配置された配列が特に好ましい（Ｍｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５， ９８１４−９８２２）、
をコードする遺伝子のエンハンサーの群から選択される。
【００３４】
「作動可能に連結」とは、核酸配列（ｉ）および（ｉｉ）の並置であって、筋特異的エンハンサーおよびＳＭＣ特異的プロモーターがそれらを所期の方法で機能させる関係にあるものを表す。筋特異的エンハンサーがＳＭＣ特異的プロモーターによって行われる遺伝子発現を増加させるときには、このエンハンサーはプロモーターに作動可能に連結している。作動可能に連結したエンハンサーは、プロモーターの上流、下流または遺伝子配列内のキメラ構築物に置くことができ、近い距離または数ｋｂまでの距離を介して隣接することができる。有利には、筋特異的エンハンサーは、ＳＭＣ特異的プロモーターの上流にプロモーターとエンハンサーを分離する距離が５００ｂｐ未満、好ましくは２００ｂｐ未満で、更に好ましくはプロモーターのすぐ上流に配置される。更に、筋特異的エンハンサーの配向は、ＳＭＣ特異的プロモーターによって付与される転写方向に対してセンス（５′→３′）またはアンチセンス（３′→５′）であることができる。本発明に関しては、キメラ構築物は、好ましくはＳＭＣ特異的プロモーターに対してアンチセンス配向で位置するクレアチンキナーゼエンハンサーまたはセンス配向で位置するミオシン重鎖エンハンサーを含んでなる。カルポニンエンハンサーは、好ましくはＳＭＣ特異的プロモーター の下流に（すなわち、イントロンとしてまたはイントロン内に）挿入されている。上記で定義した２種類以上の筋特異的エンハンサーを含むキメラ構築物も包含される。
【００３５】
本発明のキメラ構築物の作動可能性は、イン・ビトロで適当な培養細胞中でまたはイン・ビボで（トランスジェニック動物中または動物モデルに直接投与することによって）ＳＭＣにおいて遺伝子（例えば、細菌性酵素であるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたはｅＧＦＰなどをコードするレポーター遺伝子）を発現させる能力を測定することによって容易に決定することができる。　遺伝子発現は、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、ウェスタンブロット法、生物活性測定などの標準的方法によって決定することができる。
【００３６】
更に、本発明のキメラ構築物の遺伝子発現活性を、現在最も活性であることが知られているものの一つと考えられているが非特異的（遍在発現）であるＣＭＶのような強力なプロモーター／エンハンサーと比較することができる。本発明のキメラ構築物は、類似の実験条件下で、特にネズミＳＭＣ特異的プロモーター（例えば、キャップ部位に対して約−４４５〜約＋６５のネズミＳＭ２２αプロモーターの部分）を用いるときには、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーを用いて得たものの少なくとも１０％、有利には少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％であり、更に具体的には約２０〜３５％のＳＭＣにおけるレポーター遺伝子の発現レベルを提供する。発現レベルは、ヒトＳＭＣ特異的プロモーター（キャップ部位に対して約−４４５〜約＋６３のヒトＳＭ２２αプロモーターの部分）を補充したキメラ構築物を用いるときには、リファレンスＣＭＶプロモーター／エンハンサーを用いて得たものの少なくとも１５％、好ましくは２０〜２００％に達することができる。非ＳＭＣでは、本発明のキメラ構築物によって行われる遺伝子発現は低いか（ＣＭＶ構築物で用いたものの５％未満、有利には２％未満、好ましくは１％未満）、または検出されない。
【００３７】
キメラ構築物は、当該技術分野で周知の標準的な分子生物学の手法によって構築することができる。ＳＭＣ特異的プロモーターおよび筋特異的エンハンサーは、例えばＤＮＡライブラリーからのクローニングの手法または適当なプローブを用いる増幅法（ＰＣＲ）によって単離することができる。あるいは、それらは、当該技術分野で理由できる配列データーに基づいて化学合成によって製造することができる。プロモーターおよびエンハンサーを有する断片は、制限酵素およびリガーゼを用いて結合させ、本発明のキメラ構築物を生成させることができる。
【００３８】
本発明に関連して、プロモーターまたはエンハンサーはそれぞれ、または両方とも、それぞれの上記の活性が実質的に（本来の配列の活性の少なくとも８０％）保存されるという条件で、１または数個のヌクレオチドの欠失、付加および／または置換によって修飾することができる。このような修飾は、（ｉ）ＳＭＣ以外の細胞の種類で発現を制御する正のシス作用配列（ＳＭＣ特異性の改良）または（ｉｉ）発現レベルを減少させるシス作用配列（「サイレンサー」）を除去することを目的とすることができる。位置指定突然変異誘発を用いて、本来の配列を修飾することができる。
【００３９】
本発明は、本質的にＳＭＣ結合を制限したやり方で遺伝子発現を行うのに十分なヒトＳＭ２２αプロモーターの部分を含んでなるＳＭＣ特異的プロモーターにも関する（内臓および／または血管ＳＭＣ）。ＳＭＣの特異性は、上記のような培養細胞、トランスジェニック動物またはイン・ビボ投与を用いる方法などの任意の通常の手法によって明らかにすることができる。好ましくは、本発明のＳＭＣ特異的プロモーターは、配列番号：１４に記載の配列の総てまたは部分、更に好ましくは約ヌクレオチド１から約ヌクレオチド４４５まで（キャップ部位に対してヒトＳＭ２２α遺伝子の約−４４５〜−１位に相当する）伸張しているもの、またはそれらの任意の機能的に同等なもの（本来の配列に対して１個以上のヌクレオチドの付加、欠失および／または置換によって修飾され且つＳＭＣ特異性および／または発現レベルに関して本来の配列の活性の少なくとも８０％を保存している）を含んでなり、または好ましくはからなる。
【００４０】
本発明は、本発明によるキメラ構築物またはＳＭＣ特異的プロモーターによって制御される目的の遺伝子を含んでなり、ターゲット細胞で発現させる発現カセットも提供する。
【００４１】
「目的の遺伝子」という用語は、任意の起源のものであり、且つゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボチームまたはトランスファーＲＮＡのようなＲＮＡをコードする任意のＤＮＡから単離することができる核酸を表す。目的の遺伝子は、オリゴヌクレオチド（すなわち、１００ｂｐ未満の短いサイズの核酸）であることもできる。
【００４２】
好ましい態様では、本発明で用いられる目的の遺伝子は、治療上関心のある遺伝子産物をコードする。「治療上関心のある遺伝子産物」とは、患者、特に疾患または疾病状態のあるまたはこの疾患または状態から防御すべき患者に適当に投与するとき、治療または防御活性を有するものである。このような治療または防御活性は、上記疾患または上記状態の症状の経過に対する有益な効果に相関させることができる。治療を行う疾患または状態によって治療上関心のある適当な遺伝子産物をコードする遺伝子を選択することは、当業者の能力範囲内にある。一般的には、当業者の選択は以前に得られた結果基づくことがあり、過度の実験を行うことなく、特許請求の範囲に記載の発明を実施すること以外は、このような治療特性を得ることを合理的に期待することができる。
【００４３】
本発明に関連して、目的の遺伝子は、これを導入するターゲット細胞に対して相同性または非相同性であることができる。有利には、この遺伝子は、ポリペプチド、リボチームまたはアンチセンスＲＮＡをコードする。「ポリペプチド」という用語は、サイズがどのようなものであれ、ポリヌクレオチドの任意の翻訳産物と理解すべきであり、７個程度の残基（ペプチド）を有するポリペプチドを包含するが、更に典型的にはタンパク質を包含する。更に、これは、任意の起源（原核生物、下等または高等真核生物、植物、ウイルスなど）であることができる。これは、本来のポリペプチド、変異体、性質の対応部を持たないキメラポリペプチド、またはその断片であってもよい。有利には、本発明で用いられる目的の遺伝子は、動物またはヒト生体で１個以上の欠陥または不完全な細胞性タンパク質を相殺できるまたは体内から有害な細胞を限定しまたは除去するための毒性効果を介して作用する少なくとも１個のポリペプチドをコードする。適当なポリペプチドは、免疫付与性であり且つ体液性または細胞性応答または両方を刺激するための抗原として作用することもできる。
【００４４】
本発明の発現カセットで用いられる目的の遺伝子によってコードされるポリペプチドの例としては、
ｐ２１、ｐ１６、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）遺伝子、キナーゼインヒビター（好ましくは、サイクリン依存型）、ＧＡＸ、ＧＡＳ−１、ＧＡＳ−３、ＧＡＳ−６、Ｇａｄｄ４５、およびサイクリンＡ、ＢおよびＤのような細胞サイクルに関与するポリペプチド、
ｐ５３、Ｂａｓ、Ｂｃｌ２、ＢｃｌＸ、Ｂａｄ、およびそれらのアンタゴニストのようなアポトーシス誘導物質、
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ、特にＴＧＦαおよびβ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ、特にＦＧＦαおよびβ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ、特にＴＮＦαおよびβ）、ＣＣＮ（ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１、Ｎｏｖ、Ｅｌｍ−１、Ｃｏｐ−１、およびＷｉｓｐ−３など）、散乱因子／肝細胞増殖因子（ＳＨ／ＨＧＦ）、アンギオゲニン、アンギオポエチン（特に、１および２）、アンギオテンシン−２、サイトカイン（インターロイキン、特にＩＬ−２、ＩＬ−８；ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦのようなコロニー刺激因子）、プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）およびウロキナーゼ（ｕＰＡ）、のファミリーの一員などのアンギオゲニンポリペプチド、
抗体、毒素、イムノトキシン、腫瘍遺伝子発現産物を阻害するポリペプチド（例えば、ｒａｓ、ｍａｐキナーゼ、チロシンキナーゼ受容体、増殖因子）、Ｆａｓリガンド、自殺遺伝子産物などの細胞増殖を減少または阻害することができるポリペプチド、
細胞遺伝子の発現を調節または調整することができるポリペプチド、
凝固因子（ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸなど）、
Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭなどの免疫刺激ポリペプチド、
ウレアーゼ、レニン、トロンビン、メタロプロテイナーゼ、酸化窒素シンターゼｅＮＯＳまたはｉＮＯＳ、ＳＯＤ、カタラーゼ、ヘムオキシゲナーゼ、リポタンパク質リパーゼファミリーなどの酵素、
酸素ラジカルスカベンジャー、
α１−アンチトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビターＰＡＩ−１、メタロプロテイナーゼ１〜４の組織インヒビターのような酵素インヒビター、
ジストロフィン、
アンギオスタチン、エンドスタチン、血小板因子−４、ＩＬ−１２、ＩＦＮβまたはγのようなサイトカインなどの血管新生インヒビター、
ＤＮＡ結合ドメイン、リガンド結合ドメインおよび転写を活性化または阻害するドメインを含んでなる核受容体のような転写因子（例えば、エストロゲン、ステロイドおよびプロゲステロン受容体由来の融合産物）、
マーカー（β−ガラクトシダーゼ、ＣＡＴ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰなど）、および
臨床状態の治療または予防に有用であると当該技術分野で認められている任意のポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
目的の遺伝子が本来の配列に関して１個以上のヌクレオチドの付加、欠失および／または修飾を含むことがあることは、本発明の範囲内にある。
【００４６】
本発明に関連して、自殺遺伝子産物は、不活性物質（プロドラッグ）を細胞傷害性物質に転換することによって細胞死をもたらすことができる。ＨＳＶ−１のチミジンキナーゼをコードする遺伝子は、自殺遺伝子ファミリーのプロトタイプを構成し（Ｃａｒｕｓｏ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０， ７０２４−７０２８； Ｃｕｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６， １５５０−１５５２）、アシクロビールまたはガンシクロビールのようなヌクレオシド類似体（プロドラッグ）の、新たに形成されたＤＮＡ鎖に組込まれる毒性ヌクレオシドへの変換を触媒し、細胞分割を阻害する。多数の自殺遺伝子／プロドラッグの組合せが、現在利用可能である。更に具体的に記載することができるものは、シトシンデアミナーゼ（Ｅｒｂｓ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． ３１， １−６； ＷＯ９３／０１２８１号明細書； 欧州特許第４０２　１０８号明細書）およびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０４， ５１−５６； Ｋｅｒｎ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｇｅｎｅ ８８， １４９−１５７）をコードする細菌および真菌性遺伝子であって、プロドラッグ５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）と共に用いることができる。本発明は、ＷＯ９６／１６１８３号明細書およびＷＯ９９／５４４８１号明細書に記載されているような突然変異自殺遺伝子の使用も包含する。
【００４７】
もう一つの好ましい態様は、目的の遺伝子がＳＭＣに対する増殖抑制活性を有するポリペプチドをコードする発現カセットに関する。従って、もう一つの好ましい態様では、ポリペプチドは、ＩＦＮβ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ２５４６０）、ＩＦＮγ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ２９３８３）、酸化窒素シンターゼｅＮＯＳ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ９５２９６）、Ｆａｓリガンド（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ０８１３７）、ヘムオキシゲナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ０６９８５）、インターロイキン−１０（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ１６７２０）、およびヘパリン結合ＶＥＧＦ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ３２９７７）からなる群から選択され、好ましくはそれぞれはヒト起源のものである。
【００４８】
上記のように、目的の遺伝子は、特異的細胞ＲＮＡと結合と不活性化することができるアンチセンス配列およびリボチームをコードする遺伝子も包含し、好ましくは癌遺伝子およびプロト癌遺伝子（ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｒａｓ、ＫｃおよびＪＥ）のような選択されたポジティブ作用性増殖調節遺伝子を包含する。
【００４９】
本発明の発現カセットは、１個以上の目的の遺伝子を含んでなることができる。これに関して、自殺遺伝子産物とサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦなど）または免疫刺激ポリペプチド（Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭなど）をコードする遺伝子の組合せが本発明に関連して有利なことがある。別の目的の遺伝子は、本発明のキメラ構築物またはＳＭＣ特異的プロモーター（ポリシストロン性カセット）または独立プロモーターであって、少なくとも一方が同一または反対方向に配置されている上記に定義したキメラ構築物またはＳＭＣ特異的プロモーターであるものによって制御することができる。更に、それらは、同一ベクターまたは独立ベクターによって運ぶことができる。
【００５０】
本発明の発現構築物は、追加の機能的要素、例えばエキソン／イントロン配列、ターゲッティング配列、輸送配列、分泌シグナル配列、核局在化シグナル配列、ＩＲＥＳ、ポリＡ転写終結配列、トリパルタイトリーダー配列、複製または組み込みに関与する配列を含んでなることもできる。上記配列は文献に報告されており、当業者であれば容易に得ることができる。
【００５１】
好ましい態様では、本発明の発現カセットは、更に１個以上のエキソンまたはその部分、好ましくは非コードエキソン、および場合によっては１個以上のイントロンを含んでなる。このようなエキソンおよび／またはイントロン配列は、発現の安定化に有利であることがあり、例えば、ＳＭＣ特異的プロモーターが生じる遺伝子（例えば、ＳＭ２２α）または任意の他の起源（例えば、真核生物、ウイルス、合成）から得ることができる。当該技術分野の状態で記載されている多種多様なエキソン／イントロン配列は、本発明に関して適当である。それらは、好ましくは転写開始部位の後および目的の遺伝子の前に挿入される。
【００５２】
マウスＳＭ２２αプロモーターを含んでなるキメラ構築物の好ましい態様に関しては、適当なエキソン配列は、マウスＳＭ２２α遺伝子の＋１位から約＋６５位まで（すなわち、配列番号：１、４４６〜５１０位）またはヒトＳＭ２２α遺伝子の＋１位から約＋６３位まで（すなわち、配列番号：１４、４４６〜５０８位）伸張する第一の非コードエキソンの部分を含んでなる。
【００５３】
本発明の発現カセットは、（複数の）目的の遺伝子に操作可能に結合したポリアデニル化シグナルを含むこともある。ポリアデニル化配列は、転写を終結させるときには、転写を行う遺伝子に操作可能に結合する。これは、好ましくは目的の遺伝子の３′位（下流）に位置している。
【００５４】
本発明は、本発明による発現カセットを含んでなるベクターも提供する。熟練者であれば、広汎なベクターから適当なベクターを選択することができる。例えば、ベクターは、裸のＤＮＡ分子、例えば、プラスミドまたはウイルスベクターの形態の最終的に（複数の）合成ベクターと複合体形成または混合するものであることができる。「プラスミド」という用語は、所定の細胞で自律複製を行うことができる染色体外の環状ＤＮＡを表す。適当なプラスミドの範囲は、極めて大きい。好ましくは、プラスミドは、細菌中で増幅し、真核ターゲット細胞で発現するようにデザインされる。このようなプラスミドは、様々な製造業者から購入することができる。適当なプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ｐＵＣ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、およびｐＰｏｌｙ（Ｌａｔｈｅ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ５７ （１９８７）， １９３−２０１）が挙げられるが、これらに限定されない。これは、標準的な分子生物学の手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， コールドスプリングハーバー（１９８９）， ニューヨーク）によって得ることもできる。これは、選択遺伝子を含んでなり、トランスフェクション細胞（例えば、細胞栄養要求性の補足または抗生物質耐性による）安定化要素（例えば、ｃｅｒ配列； Ｓｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｓｈｅｒｒａｔ， Ｃｅｌｌ ３６ （１９８４）， １０９７−１１０３）または 組込み要素（例えば、ＬＴＲウイルス配列 およびトランスポゾン）を選択しまたは同定することもできる。
【００５５】
本発明のベクターの好ましい態様は、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、フォーミーウイルス、レンチウイルス、セムリキ森林ウイルス、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）、ポックスウイルス、アデノウイルス、およびレトロウイルスからなる群から選択されるウイルス由来のウイルスベクターに関する。このようなウイルス ベクターは、当該技術分野で周知である。「由来する」とは、ウイルスゲノムのコードまたは非コード部分に含まれる１または数個のヌクレオチドの欠失、付加、および／または置換などの１個以上の修飾を導入することによって本来のウイルスゲノムから遺伝子工学的に作製することを意味する。
【００５６】
本発明に特に適当なウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。アデノウイルスゲノムは、ウイルスサイクルを完成するのに必要な約３０個を上回る遺伝子を有する約３６ｋｂの線状の二本鎖ＤＮＡ分子からなる。初期遺伝子は、抗ウイルス宿主免疫応答を調節すると考えられるＥ３を除いてウイルス複製に本質的な４つの領域（Ｅ１〜Ｅ４）に分割される。Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムの転写の調節に関与するタンパク質をコードする。Ｅ２領域遺伝子（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現により、ウイルス複製に必要なポリペプチドが合成される（Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ， １９８６， 癌細胞（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ）（第４巻）： ＤＮＡ腫瘍ウイルス（ＤＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ）， Ｂｏｔｃｈａｎ ａｎｄ Ｇｌｏｄｚｉｃｋｅｒ Ｓｈａｒｐ監修， ｐｐ ３７−４７， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， コールドスプリングハーバー， ニューヨーク）Ｅ３領域によってコードされるタンパク質は、細胞傷害性Ｔ細胞および腫瘍壊死因子による細胞溶解を防止する（Ｗｏｌｄ ａｎｄ Ｇｏｏｄｉｎｇ， １９９１， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８４， １−８）。Ｅ４領域によってコードされるタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現、およびスプライシングおよび宿主細胞シャットオフ（Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ５６， ２５０−２５７）に関与する。後期遺伝子は、大半がウイルスキャプシドを構成する構造タンパク質をコードする。更に、アデノウイルスゲノムは、両端にシス作用性の５′および３′ＩＴＲ（逆方向末端反復配列）およびＤＮＡ複製に本質的なパッケージング配列を有する。ＩＴＲはＤＮＡ複製の起源を有し、キャプシド化領域がアデノウイルスＤＮＡの感染性粒子へのパッケージングに必要である。
【００５７】
一態様では、本発明のアデノウイルスベクターを条件付きで複製するようにし（ＣＲＡｄベクター）、Ｈｅｉｓｅ ａｎｄ Ｋｉｒｎに記載されているように特定の細胞（例えば、増殖細胞）で選択的に複製するようにする（２０００， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０５，８４７−８５１）。
【００５８】
もう一つの好ましい態様によれば、本発明のアデノウイルスベクターは、Ｅ１領域を構成する１個以上の遺伝子の全部または部分的欠失および／または突然変異により少なくともＥ１機能について複製欠陥を有する。有利には、Ｅ１欠失は、Ｇｅｎｅｂａｎｋデーターベースに受託番号Ｍ７３２６０で開示されているヒトアデノウイルス５型の配列を参照すればヌクレオチド（ｎｔ）４５８〜３３２８または４５８〜３５１０を包含する。
【００５９】
更に、ベクターのアデノウイルス主鎖ベクターは、追加の修飾（１個以上のウイルス遺伝子の欠失、挿入または突然変異）を含んでなることがある。Ｅ２修飾の一例は、遺伝子をコードするＤＢＰ（ＤＮＡ結合タンパク質）に局在した熱感受性突然変異によって明示される（Ｅｎｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９７２， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． １０， ３２８−３３９）。アデノウイルス配列は、Ｅ４領域の全部または一部を欠失することもできる。ＯＲＦ３および４またはＯＲＦ３および６／７が有利なことがある（例えば、欧州特許出願ＥＰ９７４　６６８号明細書； Ｃｈｒｉｓｔ ｅｔ ａｌ．， ２０００， ヒトＧｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １１， ４１５−４２７； Ｌｕｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３， ８３０８−８３１９）。非本質的Ｅ３領域内の追加の欠失はクローニング能を増加することができるが（総説については、例えばＹｅｈ ｅｔ ａｌ． ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ １１ （１９９７） ６１５−６２３を参照されたい）、ポリペプチド（例えば、ｇｐｌ９ｋ）をコードするＥ３配列の総てまたは一部を保持して、宿主免疫系（Ｇｏｏｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０， ５３−７１）または炎症反応（欧州特許ＥＰ００４４０２６７．３号明細書）を回避するのが有利であることがある。ＩＴＲおよびパッケージング配列を保持し、ウイルス抗原の残余合成を廃止することを目的とする実質的な遺伝子修飾を含む第二世代ベクターを考えて、形質導入した細胞における発現遺伝子の長期発現を改良することもできる（ＷＯ９４／２８１５２号明細書； Ｌｕｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ７２， ２０２２−２０３２）。
【００６０】
本発明の発現カセットは、シス作用配列を除きアデノウイルスゲノムの任意の位置に挿入することができる。好ましくは、これは、欠失領域（Ｅ１、Ｅ３および／またはＥ４）の代わりに、特に優先的には欠失したＥ１領域の代わりに挿入される。更に、発現カセットは、問題の領域の転写方向に対してセンスまたはアンチセンス配向で配置することができる。
【００６１】
本発明による使用に適合させることができるアデノウイルスは、任意のヒトまたは動物供給源、特にイヌ（例えば、ＣＡＶ−１またはＣＡＶ−２； それぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＣＡＶＩＧＥＮＯＭおよびＣＡＶ７７０８２）、トリ（Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＡＡＶＥＤＳＤＮＡ）、ウシ（例えば、ＢＡＶ３； Ｓｅｓｈｉｄｈａｒ Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２， １３９４−１４０２）、ネズミ（Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＡＤＲＭＵＳＭＡＶ１）、ヒツジ、ネコ、ブタまたはサルアデノウイルス、あるいはそれらの雑種から誘導することができる。任意の血清型を用いることができる。しかしながら、Ｃサブグループのヒトアデノウイルスが好ましく、特にアデノウイルス２（Ａｄ２）および５（Ａｄ５）が好ましい。一般的には、引用したウイルスはＡＴＣＣのようなコレクションで利用でき、それらの配列、構成および生物学を記載している多数の公表文献の主題となっており、熟練者であればそれらを応用することができる。
【００６２】
更に、アデノウイルス粒子または中空アデノウイルスキャプシドを用いて、米国特許第５，９２８，９４４号明細書に記載のウイルス依存性コインターナリゼーション法によって核酸（例えば、プラスミドベクター）を導入することもできる。この方法は、ポリカルベンまたは１以上の脂質層を含んでなる脂質小胞の存在下にて行うことができる。
【００６３】
レトロウイルスベクターも、適当である。レトロウイルスは、ウイルスによってコードされる逆転写酵素を用いて複製し、ウイルスＲＮＡゲノムを二本鎖ＤＮＡに複製し、これを感染細胞の染色体ＤＮＡに組込む組込みウイルスのクラスである。文献記載の多数のベクター、特にネズミ白血病ウイルス、特にＭｏｌｏｎｅｙ株（Ｇｉｌｂｏａ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ２４１， ２９）またはＦｒｉｅｎｄｓ ＦＢ２９株（ＷＯ９５／０１４４７号明細書）由来のものを本発明の枠内で用いることができる。一般的に、レトロウイルスベクターはウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖの全部または一部を欠失しており、５′および３′ＬＴＲおよびキャプシド化配列を保持している。これらの要素を修飾して、レトロウイルスベクターの発現レベルまたは安定性を増加させることができる。このような修飾としては、レトロウイルスキャプシド化配列のＶＬ３０のようなレトロトランスポゾンの一つによる置換が挙げられる（米国特許第５，７４７，３２３号明細書）。本発明の発現カセットは、キャプシド化配列の下流、好ましくはレトロウイルスゲノムに対して逆方向で挿入される。
【００６４】
ポックスウイルスは、それらの大きなＤＮＡゲノムおよびそれらの複製の細胞質部位によって上記ウイルスから識別される複雑なエンベロープ付きウイルスの群である。ポックスウイルス科の数種類のゲノムはマッピングされ、配列決定されている。これは、約２００種類のタンパク質（その中の約１００種類がウイルス組立に関与している）をコードする約２００ｋｂの二本鎖ＤＮＡである。本発明に関連して、ポックスウイルスベクターは、ポックスウイルス科の任意の一員、特にカナリヤポックス、鶏痘およびワクシニアウイルスから得ることができ、後者のものが好ましい。適当なワクシニアウイルスとしては、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株（Ｇｏｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｖｉｒｏｌ． １７９， ２４７−２６６ および５１７−５６３； Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｖｉｒｏｌ． １９６， ３８１−４０１）、Ｗｙｅｔｈ株、および改良Ａｎｋａｒａ（ＭＶＡ）株（Ａｎｔｏｉｎｅ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｖｉｒｏｌ． ２４４， ３６５−３９６）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明による発現カセットを含んでなるワクシニアウイルスを構築する一般的条件は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルスについては欧州特許第８３　２８６号明細書および欧州出願第２０６　９２０号明細書、およびＭＶＡウイルスについてはＭａｙｒ ｅｔ ａｌ．， １９７５， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ３， ６−１４ およびＳｕｔｔｅｒ ａｎｄ Ｍｏｓｓ， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９， １０８４７−１０８５１を参照されたい）。
【００６５】
本発明の発現カセットは、好ましくは非コード遺伝子間領域、または不活性化または欠失がウイルス増殖および複製を著しく損なわない任意の遺伝子のような非本質的座におけるポックスウイルスゲノム内に挿入される。チミジンキナーゼ遺伝子は、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルスでの挿入に特に適している（Ｈｒｕｂｙ ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０， ３４１１−３４１５； Ｗｅｉｒ ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ４６， ５３０−５３７）。ＭＶＡに関する限り、発現カセットの挿入は切除Ｉ〜ＶＩＩのいずれかで、好ましくは切除ＩＩまたはＩＩＩで（Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７２， １０３１−１０３８； Ｓｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｖａｃｃｉｎｅ １２，１０３２−１０４０）またはＤ４Ｒ座で行うことができる。鶏痘ウイルスについては、チミジンキナーゼ遺伝子内への挿入が考えられるが、発現カセットは非コード遺伝子間領域に導入するのが好ましい（例えば、欧州特許第３１４　５６９号明細書および米国特許第５，１８０，６７５号明細書を参照されたい）。欠陥機能がヘルパーウイルスを介してイン・トランスでまたは生産者細胞系での発現によって供給されるという条件では、本質的ウイルス座での挿入を考えることもできる。
【００６６】
有利な別態様によれば、本発明のベクターは、脂質および／またはポリマー （合成ベクター）に複合体形成することができる。好ましい脂質は、核酸に高親和性を有し且つ細胞膜と相互作用するカチオン性脂質である（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３３７ （１９８９） ３８７−３８８）。結果として、それらは、核酸を複合体形成することができ、従って、細胞にはいることができるコンパクトな粒子を生成することができる。適当な脂質としては、ＤＯＴＭＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４ （１９８７）， ７４１３−７４１７）、ＤＯＧＳまたはＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商品名）（Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６ （１９８９）， ６９８２−６９８６）、ＤＭＲＩＥまたはＤＯＲＩＥ（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ５ （１９９３）， ６７−７５）、ＤＣ−ＣＨＯＬ（Ｇａｏ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ， ＢＢＲＣ １７９ （１９９１）， ２８０−２８５）、ＤＯＴＡＰ（商品名）（ＭｃＬａｃｈｌａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ　２ （１９９５）， ６７４−６２２）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商品名）、およびグリセロ糖脂質化合物（欧州特許第９０１４６３号明細書およびＷＯ９８／３７９１６号明細書を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
適当なポリマーは、好ましくはポリアミドアミン（Ｈａｅｎｓｌｅｒ ａｎｄ Ｓｚｏｋａ， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ４ （１９９３）， ３７２−３７９）、樹枝状ポリマー（ＷＯ９５／２４２２１号明細書）、ポリエチレンイミンまたはポリプロピレンイミン（ＷＯ９６／０２６５５号明細書）、ポリリシン（ＵＳ−Ａ−５　５９５　８９７号明細書またはフランス国特許第２　７１９　３１６号明細書）、キトサン（米国特許第５，７４４，１６６号明細書）、またはＤＥＡＥデキストラン（Ｌｏｐａｔａ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １２ （１９８４） ５７０７−５７１７）のようなカチオン性である。
【００６８】
もう一つの態様では、本発明は、ターゲット細胞中で目的の遺伝子のＳＭＣ特異的に発現させるウイルス粒子の製造方法であって、
ａ）　本発明のウイルスベクターを許容細胞系に導入し、
ｂ）　工程ａ）で得た許容細胞系を適当な時間適当な条件下で培養して、上記ウイルス粒子を産生させ、
ｃ）　細胞培養物から上記ウイルス粒子を回収し、
ｄ）　場合によっては、回収したウイルス粒子を精製する
工程を含んでなる、方法に関する。
【００６９】
好ましい態様では、許容細胞系は、感染性ビリオンを産生するのに必要な総ての遺伝子産物をイン・トランスで提供する相補性細胞系である。
【００７０】
本発明は、本発明によるベクター、好ましくはウイルスベクターを含んでなる、またはこのようなウイルス粒子の製造方法によって得ることができるウイルス粒子も提供する。
【００７１】
アデノウイルス粒子は、相補性細胞系またはヘルパーウイルスであって、本発明のアデノウイルスベクターが欠陥を有するウイルス遺伝子をイン・トランスで供給するものを用いて、当該技術分野で任意の通常の手法によって調製し、増殖させることができる（例えば、Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｃｔ， １９９１， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ ７， Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ； Ｅ． Ｊ． Ｍｕｒｒａｙ監修， Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ， クリントン， ニュージャージー、またはＷＯ９６／１７０７０号明細書に記載の方法）。細胞系２９３（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， １９７７， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ３６， ５９−７２）およびＰＥＲＣ６（Ｆａｌｌａｕｘ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９， １９０９−１９１７）は、Ｅ１機能を補足するのに普通に用いられる。他の細胞系を作製して、二重に欠陥を有するベクターを補足した（Ｙｅｈ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０， ５５９−５６５； Ｋｒｏｕｇｌｉａｋ ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ， １９９５， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ６， １５７５−１５８６； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２， ７７５−７８３； Ｌｕｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２， ２０２２−２０３３； 欧州特許第９１９６２７号明細書およびＷＯ９７／０４１１９号明細書）。アデノウイルス粒子は培養上清から回収することができるが、リーシス後に細胞からも回収することができ、場合によっては標準的手法（例えば、ＷＯ９６／２７６７７号明細書、ＷＯ９８／００５２４号明細書、ＷＯ９８／２６０４８号明細書、およびＷＯ００／５０５７３号明細書に記載のクロマトグラフィー、超遠心）によって更に精製することができる。
【００７２】
レトロウイルス粒子は、ヘルパーウイルスの存在下でまたはレトロウイルスベクターが欠陥を有するレトロウイルス遺伝子（例えば、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ）をそのゲノム中に組込んで含む適当な相補性（パッケージング）細胞系で調製される。このような細胞系は、従来の技術に記載されている（Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｒｏｓｍａｎ， １９８９， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７， ９８０； Ｄａｎｏｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５， ６４６０； Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｖｉｒｏｌ． １６７， ４００）。ｅｎｖ遺伝子の産物は、ターゲット細胞の表面上に存在するウイルス受容体へのウイルス粒子の結合に関与しており、従って、レトロウイルス粒子の宿主範囲を決定する。本発明に関連して、ＰＡ３１７細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　９０７８）または両種指向性エンベロープタンパク質を含み、ヒトおよび他の種のターゲット細胞を感染させる２９３Ｅ１６（ＷＯ９７／３５９９６号明細書）のようなパッケージング細胞系を用いるのが有利である。レトロウイルス粒子は、好ましくは培養上清から回収され、場合によっては標準的手法（例えば、クロマトグラフィー、超遠心）によって更に精製することができる。
【００７３】
ポックスウイルス粒子は、当業者が入手することができる多数の文献に記載されている方法で調製される（Ｐｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３， ５４５−５６３；米国特許第４，７６９，３３０号明細書；米国特許第４，７７２，８４８号明細書；米国特許第４，６０３，１１２号明細書；米国特許第５，１００，５８７号明細書および米国特許第５，１７９，９９３号明細書）。開発された主な手法は、ｐｏｘＤＮＡ配列（所望な挿入部位を包含する）によって両側にフランクした本発明の発現カセットを含むドナープラスミドと野生型ポックスウイルスゲノムとの間の相同性組み換えを用いている。一般的に、ドナープラスミドは、Ｅ． ｃｏｌｉで構築され、増殖によって増幅され、通常の手続きによって単離される。次いで、これはポックスウイルスゲノムと共に適当な細胞培養物（例えば、ニワトリ胚繊維芽細胞）に導入され、相同組み換えによって本発明のポックスウイル粒子を産生する。それらは、培養上清またはリーシス工程（化学物質、凍結／融解、浸透圧衝撃、機械的衝撃、超音波処理など）後の培養細胞から回収することができ、必要ならば、連続的なプラーク精製処理によって野生型混入物質から単離し、当該技術分野の手法（クロマトグラフィー法、塩化セシウムまたはスクロースグラディエント上での超遠心）を用いて精製することができる。
【００７４】
本発明は、特定のターゲット細胞を優先的にターゲッティングする目的で修飾したベクターまたは粒子も包含する。（ポリマーおよび脂質と複合体形成したベクターのようなウイルスおよび非ウイルス性の）本発明の標的設定ベクター／粒子の特徴は、細胞および表面露出成分またはコラーゲンのような細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を認識し且つ結合することができるターゲッティング残基がその表面に存在することである（Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１， ９８３−９９３）。このようなターゲッティング残基としては、化学的接合体、脂質、糖脂質、ホルモン、糖、ポリマー（例えば、ＰＥＧ、ポリリシン、ＰＥＩなど）、ペプチド、ポリペプチド（例えば、ＷＯ９４／４０９５８号明細書に記載のＪＴＳ１）、オリゴヌクレオチド、ビタミン、抗原、レクチン、抗体、およびそれらの断片が挙げられるが、これらに限定されない。それらは、好ましくは細胞特異的マーカー、組織特異的マーカー、細胞受容体、ウイルス抗原、抗原性エピトープ、または腫瘍関連マーカーを認識し且つ結合することができる。
【００７５】
細胞型特異的ターゲッティングは、ウイルス表面タンパク質の修飾によって広汎な宿主範囲を有するウイルス由来のベクターを用いて行うことができる。例えば、アデノウイルスの感染の特異性は、許容細胞の表面にある細胞受容体への付着によって決定される。これに関して、アデノウイルスキャプシドの表面に存在する繊維およびペントンが、細胞付着に重要な役割を果たす（Ｄｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６４ （１９９０） ３６６１−３６７３）。従って、アデノウイルスの細胞ターゲッティングは、繊維および／またはペントンをコードするウイルス遺伝子の遺伝子修飾によって行い、ユニークな細胞表面受容体と特異的に相互作用できる修飾した繊維および／またはペントンを生成することができる。このような修飾の例は、文献に記載されている（例えば、Ｗｉｃｋａｍ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１， ８２２１−８２２９ ； Ａｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｖｉｒｏｌ． ２２７， ２３９−２４４； Ｍｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２， ６６０−６６８； ＷＯ９４／１０３２３号明細書）。例えば、アデノウイルス繊維をコードする配列中にＥＧＦをコードする配列を挿入することによって、ＥＧＦ受容体発現細胞をターゲッティングする。
【００７６】
他の細胞特異的なターゲッティングの方法は、抗体または抗体断片をレトロウイルスエンベロープタンパク質に接合（Ｍｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２６８， ６８６６−６８６９； Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６， ９０７９−９０８３； Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｖｉｌｅ， １９９５， ＦＡＳＥＢ Ｊ． ９， １９０−１９９， およびＷＯ９３／０９２２１号明細書）、および核酸結合ドメインとターゲッティング残基を有するポリペプチドの接合（ＷＯ９５／２８４９４号明細書）によって行われている。
【００７７】
本発明は、本発明による発現カセットまたはベクターを含んでなる、または本発明によるウイルス粒子によって感染した真核宿主細胞も提供する。本発明に関連して、「真核宿主細胞」という用語は、本発明で用いられるＳＭＣ特異的プロモーターおよび／または筋特異的エンハンサーに含まれるシス作用配列と相互作用できる１または数個の転写因子を含んでなる任意の細胞を表す。このような細胞は、ユニークな種類の細胞または異なる種類の細胞であってもよく、哺乳類由来の培養細胞系、一次細胞および増殖細胞を包含するが、ヒト由来のものが特に好ましい。好ましい真核宿主細胞としては、繊維芽細胞および筋細胞（例えば、心筋細胞、筋繊維芽細胞およびＳＭＣ、特に血管ＳＭＣが挙げられる。後者の中では、動脈ＳＭＣが特に好ましく、特に中間部および血管内膜ＳＭＣが好ましい。
【００７８】
本発明は、本発明による発現カセット、ベクター、ウイルス粒子または真核宿主細胞、および場合によっては、薬学上許容可能なキャリヤーを含んでなる医薬組成物も提供する。特別な場合には、この組成物は、２種類以上の発現カセット、ベクター、ウイルス粒子または真核宿主細胞であって、（ｉ）筋特異的エンハンサーおよび／または（ｉｉ）ＳＭＣ特異的プロモーターおよび／または（ｉｉｉ）治療遺伝子および／または（ｉｖ）ベクター主鎖の性質が異なることがあるものを含んでなることができる。
【００７９】
本発明による組成物は、全身、局所および局部化投与などの様々な投与用式のために通常の方法で製造することができる。全身投与には、注射、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、鞘内、心臓内（例えば、経心臓内（ｔｒａｎｓｅｎｄｏｃａｒｄｉａｌ）および心膜）、筋肉内、腫瘍内、肺内、気管内、冠動脈内または脳室内、および更に具体的には、血管内または動脈内注射が好ましい。投与は、単回投与または一定間隔を置いた１または数回の繰り返し投与で行うことができる。適当な投与経路および投薬量は、様々なパラメーター、例えば、治療を行う状態または疾患、疾患が進行した段階、予防または治療の必要性、および導入される治療遺伝子によって変化することができる。目安としては、ウイルス粒子を基剤とする組成物は、１０４〜１０１４ｉｕ（感染単位）の用量形態に処方することができ、有利には１０５〜１０１３ｉｕ、好ましくは１０６〜１０１２ｉｕに処方することができる。力価は、通常の手法によって決定することができる。ＤＮＡベクターの用量は、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇであり、更に具体的には、０．１〜２ｍｇ／ｋｇである。本発明の組成物は、例えば固形物（例えば、粉末、凍結乾燥形態）、液体（例えば、水溶液）などの様々な形態であることができる。
【００８０】
好ましい態様では、本発明の組成物は、薬学上許容可能なキャリヤーを含んでなり、ヒトまたは動物の治療法に用いられる。この特別な場合には、キャリヤーは、好ましくは薬学上適当な注射可能なキャリヤーまたは希釈剤であって、用いられる投薬量および濃度ではヒトまたは動物体に毒性を持たないものである（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第１６版 １９８０年， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏを参照）。これは、好ましくは等張性、低張性または弱高張性であり、スクロース溶液によって提供されるように比較的低いイオン強度を有する。更に、これは任意の関連溶媒、滅菌した発熱物質不含水、分散媒、コーティング物質、および同等なものを含んでなる水性または部分的に水性の液体キャリヤー、または希釈剤（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、乳化剤、可溶化剤、またはアジュバントを含むことができる。医薬製剤のｐＨは、ヒトまたは動物での使用に適当なように適当に調整し、緩衝する。注射可能な組成物用のキャリヤーまたは希釈剤の代表例としては、水、等張食塩溶液であって、好ましくは生理学的ｐＨで緩衝したもの（例えば、リン酸緩衝食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水、マンニトール、デキストロース、ヒト血清アルブミンなどのポリペプチドまたはタンパク質を含むまたは含まないグリセロール）が挙げられる。例えば、このような組成物は、１０ｍｇ／ｍｌのマンニトール、１ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ、２０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７．２、および１５０ｍＭのＮａＣｌを含んでなることができる。
【００８１】
更に、本発明の組成物は、脂質（例えば、カチオン性脂質、リポソーム、ＷＯ９８／４４１４３号明細書に記載の脂質）、ヌクレアーゼインヒビター、ヒドロゲル、ヒアルロニダーゼ（ＷＯ９８／５３８５３号明細書）、コラゲナーゼ、ポリマー、キレート化剤（欧州特許第８９０３６２号明細書）などの１個以上の安定化物質を含み、動物／ヒト体内での分解を保存し、および／またはベクターの宿主細胞へのトランスフェクション／感染を改良することができる。このような物質は、単独でまたは組み合わせて（例えば、カチオン性 および中性脂質）用いることができる。これは、ポリリシンとラクトース（Ｍｉｄｏｕｘ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ２１， ８７１−８７８）またはポロキサマー４０７（Ｐａｓｔｏｒｅ， １９９４， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９０， Ｉ−５１７）とのゲル複合体などの動脈細胞での遺伝子導入を促進する傾向のある物質を含んでなることもできる。アデノウイルスタンパク質はエンドソームを不安定化し、ＤＮＡの細胞中への摂取を増進することができることも示されている。アデノウイルスを脂質と複合体形成したＤＮＡベクターを含む溶液に混合すること、またはアデノウイルスに共有結合したポリリシンへのタンパク質架橋剤を用いるＤＮＡの結合は、組み換え遺伝子の摂取および発現を実質的に改良することができる（Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ６， ２４７−２５２）。
【００８２】
本発明の組成物は、特に、高血圧、アテローム発生、内膜過形成、血管形成術またはステント配置後の（再）狭窄、虚血、腫瘍性疾患（例えば、腫瘍および腫瘍転移）、良性腫瘍、結合組織疾患（例えば、慢性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症）、目の血管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶反応、血管新生緑内障）、循環器疾患、脳血管疾患、糖尿病関連疾患および免疫不全症（例えば、慢性炎症または自己免疫）など、これらに限定されない血管（好ましくは動脈）および／または循環器に関連した障害、症状または疾患の予防または治療を目的とするものである。
【００８３】
好ましい応用は、虚血性心疾患（急性または慢性）の予防または治療である。バルーン血管形成術は、閉塞した血管でバルーンを膨張させて、塞がった血管を開くことを伴う主要な治療法である。ステント配置を用いて、血流を回復させることも行われる。不運なことには、これらの治療法は、血管内壁を覆っている内皮細胞を傷つけ、ＳＭＣが再開通した血管に浸潤して二次的閉塞を引き起こすことが多い（再狭窄と呼ばれる過程）。ウイルス性の遺伝子治療を、この症例で応用して、バルーン血管形成術またはステント配置法によって生じた損傷にＳＭＣ増殖を阻害する産物をコードする治療遺伝子を送達することができる。
【００８４】
本発明は、本発明による発現カセット、ベクター、ウイルス粒子、または真核宿主細胞を用いる、遺伝子治療によるヒトまたは動物体の疾患の治療または予防のための薬剤の調製をも提供する。
【００８５】
本発明の範囲内では、「遺伝子治療」とは、任意の発現可能な配列を細胞に導入する方法と理解すべきである。従って、これは、潜在的に抗原性を有するエピトープを細胞に導入して、細胞性または体液性、または両方であることができる免疫応答を誘導することに関する免疫治療をも包含する。
【００８６】
好ましい態様では、このような使用は、循環器疾患の治療または予防を目的とする。このために、本発明の発現カセット、ベクターまたはウイルス粒子を、カテーテル、ステントなどのこの病理学に適合した特定の送達手段によってヒトまたは動物体にイン・ビボで送達することができる。例えば、本発明の発現カセット、 ベクターまたはウイルス粒子をコーティングしたバルーンカテーテルまたはステントを用いることができる（Ｒｉｅｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ４， ７４９−７５８； Ｆｅｌｄｍａｎ ａｎｄ Ｓｔｅｇ， １９９６， Ｍｅｄｅｃｉｎｅ／Ｓｃｉｅｎｃｅ １２， ４７−５５）。本発明に関する使用に適するカテーテルは、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ （ＡＣＳ）、Ｂｏｓｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＩＶＴ、Ｔａｒｇｅｔ ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓまたはＣｏｒｄｉｓのような商業的供給業者から入手可能であり、またはフランス国特許第００　０８７５１号明細書に記載されている。例えば、カテーテルを好都合に大腿動脈に導入し、腸骨動脈および腹部大動脈中を逆方向に冠動脈に通すことができる。これらの手法の詳細な説明は、文献に見出すことができる（例えば、Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ， Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｕｒｇｅｒｙ， 第３版（Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ １９８９））。本発明の発現カセット、ベクターまたはウイルス粒子を、外科手術後の動脈に直接送達することもできる。もう一つの代替法は、罹患した動脈に沿って治療薬を浸漬したグリッドフレームを導入する方法である（Ｆｅｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９５， ２６６２−２６７１）。
【００８７】
あるいは、本発明による発現カセット、ベクターまたはウイルス粒子を含むようにエクス・ビボで作製した真核宿主細胞を用いることもできる。このような要素の真核細胞への導入法は当業者に周知であり、微量のＤＮＡの細胞核への微量投与（Ｃａｐｅｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９８０， Ｃｅｌｌ ２２， ４７９−４８８）、ＣａＰＯ４を用いるトランスフェクション（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ， １９８７， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ７， ２７４５２７５２）、電気穿孔（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １５， １３１１−１３２６）、リポフェクション／リポソーム融合（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４， ７４１３−７４１７）、および粒子衝撃（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７， ９５６８−９５７２）が挙げられる。作製したＳＭＣの移植を、本発明に関して行うこともできる（Ｌｙｎｃｈ ｅｔ ａｌ， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９， １１３８−１１４２）。
【００８８】
本発明は、ヒトまたは動物体の治療方法であって、上記生体に治療上有効量の本発明による発現カセット、ベクター、ウイルス粒子または真核細胞を投与することを含んでなる方法にも関する。
【００８９】
「治療上有効量」とは、治療が所望な疾患または状態に普通に関連した１以上の症状の緩和に十分な容量である。予防的使用に関するときには、この用語は、疾患または状態の発症を予防または遅延させるのに十分な容量を意味する。
【００９０】
本発明の方法は、上記疾患または状態の予防目的および治療応用に用いることができる。本発明の方法は、本明細書に記載の方法と類似の方法を用いて再狭窄の発症を防止しまたは血管形成術またはステント配置手続きの後の再狭窄を後退させる上で特に有用である。本発明の方法は、多種多様な方法のいずれによって行うこともできるものと理解すべきである。有利には、本発明の発現カセット、ベクターまたは医薬組成物は、任意の通常の生理学的に許容可能な投与経路によって、例えば、動脈内注射によってまたは血管系への適当なカテーテルなどによってイン・ビボで直接投与することができる。あるいは、本発明の発現カセット、ベクターまたはウイルス粒子を細胞中に導入し、トランスフェクション／感染細胞をイン・ビトロで増殖させた後、それらを治療を行う患者に再導入することからなるエクス・ビボ法を採用することもできる。
【００９１】
トランスフェクション率を改良するために、患者はマクロファージ枯渇治療を行った後に本発明の組成物を投与することができる。このような手法は、文献に記載されている（例えば、Ｖａｎ Ｒｅｏｐｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７， ＴｉｂＴｅｃｈ， １５， １７８−１８４）。
【００９２】
本発明の方法で自殺遺伝子を発現する発現カセットを含んでなる医薬組成物を用いるときには、発現した自殺遺伝子産物に特異的なプロドラッグの薬学上許容可能な量を追加的に投与するのが有利であろう。２回の投与を同時にまたは連続的に行うことができるが、好ましくはプロドラッグは本発明の組成物の後に投与する。例えば、５０〜５００ｍｇ／ｋｇ／日のプロドラッグ用量を用いることができるが、２００ｍｇ／ｋｇ／日の用量が好ましい。プロドラッグは、標準的実施法に従って投与される。経口投与が好ましい。単回用量のプロドラッグ、または宿主生体またはターゲット細胞内に毒性代謝物を産生させるのに十分な時間反復される用量を投与することができる。上記のように、プロドラッグであるガンシクロビールまたはアシクロビールをＴＫ　ＨＳＶ−１遺伝子産物と組み合わせて、および５−ＦＣをシトシンデアミナーゼおよび／またはウラシルホスホトランスフェラーゼ遺伝子産物と組み合わせて用いることができる。
【００９３】
疾患または状態の予防または治療は、本発明の方法を単独でまたは所望ならば現在利用可能な方法（例えば、放射線、化学療法、および血管形成術のような外科手術）と組み合わせて用いて行うことができる。
【００９４】
本発明は、本発明によるキメラ構築物、ＳＭＣ特異的プロモーター、発現カセット、ベクターまたはウイルス粒子を用いる、ＳＭＣ、好ましくは動脈ＳＭＣ、特に中間部および／または血管内膜由来のＳＭＣでの特異的発現をも提供する。
【００９５】
本発明は、非ヒトトランスジェニック動物、特にトランスジェニックマウスであって、本発明による発現カセットまたはベクターをそのゲノムに組込んで含んでなるものも提供する。このような動物は、通常のトランスジェネシス（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ）法によって生成させることができ、且つ治療遺伝子の潜在的効果または活性、または本発明の発現カセットに含まれるＳＭＣ特異的プロモーターおよび／または筋特異的エンハンサーの調節を検討するためのモデルとして用いることができる。
【００９６】
本発明を例示的に説明してきたが、用いてきた用語は単語に性質が制限よりはむしろ説明を目的とするものであることを理解すべきである。明らかに、本発明の多くの修飾および変更が、上記教示の観点で可能である。従って、特許請求の範囲内では、本発明は、本明細書に具体的に記載されているものとは異なる方法で実施することができることを理解すべきである。
【００９７】
上記で引用した特許明細書、公表文献およびデーターベースの記載事項の総ての内容は、それらの個々の特許明細書、公表文献または記載事項が具体的且つ個別的に引用されるのと同程度にその開示の一部として本明細書に引用される。
【００９８】
下記の例により、本発明を説明する。
例
発現カセット
下記の様々な構築物に用いるアデノウイルスゲノム断片は、Ｃｈｒｏｂｏｃｚｅｋ ｅｔ ａｌ． （１９９２， Ｖｉｒｏｌ． １８６， ２８０−２８５）に開示されているＡｄ５ゲノムのヌクレオチド配列におけるそれらの位置に従って正確に得られる。
【００９９】
標準的クローニング法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， コールドスプリングハーバー， ニューヨーク）を用いて、下記の発現カセットを生成させた。
【０１００】
ＡｄＣＭＶｅＧＦＰを、ヒトＣＭＶ前初期エンハンサー／プロモーター （Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｃｅｌｌ ４１， ５２１−５３０）に続いてｅＧＦＰ配列をＥ１欠失領域に挿入することによって構築した（Ｃｏｒｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｇｅｎｅ １７３， ３３−３８）。
【０１０１】
ＡｄＳＭ２２ｅＧＦＰ、ＡｄＳＭ−ＭＨＣ／ＳＭ２２ｅＧＦＰ、ＡｄＣＫ／ＳＭ２２ｅＧＦＰは、ｐ４４５ｎｌｚから単離したＣＭＶプロモーターを５１０ｂｐのネズミＳＭ２２αプロモーター（転写開始部位に対して−４４５〜＋６５）で置換することによって得た（Ｍｏｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２，２４１５−２４２５）。次に、ネズミＳＭ２２αプロモーターを、ヒト筋肉クレアチンキナーゼエンハンサー（ＣＫｅｎｈ；−９１９〜−７１１）（配列番号：３； Ｔｒａｓｋ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３， １７１４２−１７１４９）またはウサギＳＭ−ミオシン重鎖エンハンサー（ＳＭ−ＭＨＣｅｎｈ−１３３２〜−１２２５；配列番号：２）（Ｋａｌｌｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０， ３０９４９−３０９５７）と組み合わせた。これらのエンハンサーをＰＣＲによって単離し、プロモーターのすぐ上流にクローニングした。ＰＣＲ増幅法は、当業者には知られている（例えば、ＰＣＲプロトコール−方法および応用の指針（ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ − Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）， １９９０， Ｉｎｎｉｓ， Ｇｅｌｆａｎｄ， Ｓｎｉｎｓｋｙ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ著， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。簡略に説明すれば、ＰＣＲ反応は、鋳型として１μｇのヒト（ＣＫｅｎｈ）またはウサギ（ＳＭ−ＭＨＣｅｎｈ）ゲノムＤＮＡ、５０ｐｍｏｌの下記の特異的プライマー：ＣＫｅｎｈフォワード５’−ＡＡＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＧＣＣＡＣＣＣＡＧＧＧＣＣＣＣＧＴＧ−３’（配列番号：４）、ＣＫｅｎｈリバース５’−ＴＴＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＣＧＣＣＧＧＧＡＡＡＧＧＡＧ−３’（配列番号：５）、ＳＭ−ＭＨＣｅｎｈフォワード５’−ＡＡＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＣＧＣＧＧＧＧＴＧＣＡＧＧＧＴＧＣ−３’（配列番号：６）、ＳＭ−ＭＨＣｅｎｈリバース５’−ＴＴＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＣＡＧＣＧ ＣＣＧＣＡＴＡＣＣＡ−３’（配列番号：７）、２５０μＭのｄＮＴＰ（Ｓｉｇｍａ，サン・ケンチン・ファラビェール，フランス）および２．５ＵのＴａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ， クルタベーフ， フランス）を用いて行った。増幅は、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間で５０サイクル行った。
【０１０２】
ＡｄＳＭ２２ＩＦＮγ、ＡｄＳＭ−ＭＨＣ／ＳＭ２２ＩＦＮγ、ＡｄＣＫ／ＳＭ２２ＩＦＮγは、ｅＧＦＰ配列をＲＴ−ＰＣＲによって単離したラットＩＦＮγ配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＡＦ０１０４６６）で置換することによって得た。簡単に説明すれば、総ＲＮＡは、ＴＲＩＺＯＬ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて製造業者（Ｓｉｇｍａ）の指示に従ってラット脾臓から抽出した。２μｇの総ＲＮＡを、ランダムプライマーｐ（ｄＮ）６（Ｒｏｃｈｅ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， メイラン， フランス）１００ｐｍｏｌの存在下で７０℃で１０分間変性した後、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）２００ＵおよびそれぞれのｄＮＴＰ０．１ｍＭの存在下にて、３７℃で９０分間２０μｌの最終容積で逆転写した。反応は、混合物を９５℃で５分間加熱することによって停止した。増幅は、上記と同様にして２種類の特異的プライマー（ＩＦＮγ フォワード： ５’−ＡＡＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧＡＴＧＡＧＴＧＣＴＡＣＡＣＧＣＣＧＣＧＴ３’（配列番号：８）、ＩＦＮγリバース ５’−ＴＴＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧＴＣＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＣＴＴＴＴＣＣ３’（配列番号：９）（Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＡＦ１０４６６）を用いて行った。
【０１０３】
ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）３′の長い末端反復プロモーターによって操作されるβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を含むＡｄＲＳＶＬａｃＺは、以前に報告された（Ｌｕｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２， ２０２２−２０３２）。ＡｄＳＭ２２ＬａｃＺは、ＲＳＶプロモーターを５１０ｂｐのＳＭ２２αプロモーターで置換することによって得た。
【０１０４】
ＡｄＡＰＥＧ−ｌｅｎｈ／ＳＭ２２ｅＧＦＰは、ヒトＡＰＥＧ−１遺伝子のエンハンサーをネズミＳＭ２２αプロモーターと組み合わせることによって得た。プライマー１（配列番号：１０； ５’ＴＣＧＡＧＣＴＴＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＣＡＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣ ３’）およびプライマー２（配列番号：１１； ５’ＣＡＧＣＴＧＡＧＧＣＣＣＣＧＣＡＣＴＧＡＧＣＣＡＧＣＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧ−ＧＡＡＧＣ３’）２５ｐｍｏｌを３０μｌの最終容積で混合した。温度を５分間で９５℃まで増加し、溶液をゆっくり室温に戻した。同時に、この操作をプライマー３（配列番号：１２， ５’ＡＧＴＧＣＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＣＴＧＧＧＴＣＡＧＣＧＡＧＴＧＡＧＴＧＧＧＧＣＴＧＧＣＣＡＧＧ−ＣＴＧＡＧ３’）および４（配列番号：１３； ５’ＴＣＧＡＣＴＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣＡＣ−ＴＣＡＣＴＣＧＣＴ ＧＡＣＣ ３’）について行った。次に、これらの対１／２および３／４を、同じプロトコールを用いてハイブリダイゼーションした。最終生成物は、５′末端に開いたＸｈｏＩ制限部位と３′末端に開いたＳａｌＩ部位を示す。それらを用いて、ユニークＳａｌＩ部位においてＳＭ２２αプロモーターに対してすぐ５′のＡＰＥＧ−１エンハンサーをクローニングした。
【０１０５】
ヒトＳＭ２２αプロモーターは、上記のように鋳型としてヒトゲノムＤＮＡおよび配列番号：１５（フォワード）および１６（リバース）に記載のプライマーを用いてＰＣＲによって単離した。ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＶによって消化された増幅断片を、ネズミプロモーターの代わりにＳａｌＩおよびＥｃｏＲＶによって制限されたＡｄＳＭ２２ｅＧＦＰでクローニングした。ＣＫおよびＭＨＣエンハンサーを、上記のようにヒトＳＭ２２αプロモーターに組み合わせた。
【０１０６】
エンハンサー配列を含むネズミカルポニン遺伝子のイントロンＩは、鋳型としてマウスゲノムＤＮＡおよび配列番号：１７（フォワード）および１８（リバース）に記載のプライマーを用いて、前に記載した実験条件下で行ったＰＣＲによって単離した。ネズミカルポニンエンハンサーを、ヒトＳＭ２２αプロモーターの下流（３′）に挿入して、目的のレポーターｅＧＦＰ遺伝子または治療遺伝子を発現させることができる。
【０１０７】
ウイルスの構築、産生および滴定
総てのウイルスベクターを、以前に報告されているように（Ｃｈａｒｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０， ４８０５−４８１０）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＪ５１８３（Ｈａｎａｈａｎ， １９８３， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １６６， ５５７−５８０）中で相同組み換えによって感染性プラスミドとして構築した。それらは、総てＥ１領域（ヌクレオチド４５９〜ヌクレオチド３３２７）およびＥ３領域（ヌクレオチド２８５９３〜ヌクレオチド３０４６９）において欠失を有した。筋特異的エンハンサーを有するまたは持たないプロモーター配列に続いてレポーターまたは治療遺伝子およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む発現カセットは、Ｅ１に位置した。幾つかのベクター（表１参照）は、プロモーターとコード領域との間に挿入されたキメライントロンを含んでいた。このイントロンは、ヒトβ−グロブリンイントロン１由来のスプライスドナーとｐＣＩプラスミド （Ｐｒｏｍｅｇａ， シャルボンニェール， フランス）から得たＩｇＧ介在配列由来のスプライス受容体とを組み合わせることによって生成した。アデノウイルス主鎖に対する発現カセットの２つの配向を評価した。アデノウイルスプラスミドを最初にＰａｃＩで消化して、アデノウイルスゲノムを放出した後、２９３相補性細胞系（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５７３）でトランスフェクションした。ウイルス増殖、精製、およびウイルスＤＮＡ結合タンパク質の間接免疫蛍光による感染単位（ｉｕ）の滴定は、以前に報告されている方法で行った（Ｌｕｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２， ２０２２−２０３２）。精製したウイルスは、ウイルス保管緩衝液（１Ｍスクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ＝８．５］、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％［容積／容積］Ｔｗｅｅｎ ８０）中に保管した。
【０１０８】
細胞および培養条件
一次ラット胸部大動脈ＳＭＣおよび一次ブタ冠動脈ＳＭＣを、ＳＭＣ細胞として用いた。ヒト肺上皮 Ａ５４９およびネズミ筋原細胞Ｃ２Ｃ１２細胞系を、非ＳＭＣコントロールとして用いた。ラット胸部大動脈ＳＭＣは、正常ラット（ラットＡｏ）およびバルーンカテーテルによる内皮除去（ｄｅｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）から１５日経過した損傷ラット（ｒａｔＩＴ１５）から以前に報告されている酵素消化によって単離した（Ｏｒｌａｎｄｉ ａｔ ａｌ．， １９９４， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ． １４， ９８２−９８９）。ブタ冠動脈ＳＭＣは、正常ブタ（ｐｉｇＣｏ）およびステント配置から１５または３０日経過した損傷動物から以前に報告されている酵素消化によって単離した（Ｃｈｒｉｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ８５， ９９−１０７）。Ａ５４９およびＣ２Ｃ１２細胞系は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ； ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５およびＣＲＬ−１７７２， マナサス， バージニア）から購入した。細胞は、感染中および後であって、それらを２％ＦＣＳ含有培地（Ｃ２Ｃ１２を１０％ＦＣＳ中に保持して融合を防止した）で増殖させたことを除き、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， セルジュ−ポントワーズ， フランス）中で培養した。ヒトＳＭ細胞 （Ｈｕ ＣｏおよびＨｕ Ａｏ）およびＨＵＶＥＣはＢｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ Ｉｎｃ（ウォーカーズビル， メリーランド２１７９３， アメリカ合衆国）から得て、製造業者の指示に従って培養する。
【０１０９】
イン・ビトロ実験
様々な細胞型のアデノウイルス感染の感染性を、ＡｄＣＭＶｅＧＦＰの様々な感染多重度（ＭＯＩ）を用いて決定した。２×１０５個の細胞／ウェル（Ｃ２Ｃ１２： 細胞数を５×１０４個にして融合を防止）をＤ０に６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ， Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， ポン・ドゥ・クレス， フランス）に播種し、Ｄ１で感染させ、Ｄ２で収穫した。それらを、４％ホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で５分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、２９３ｇで５分間遠心分離し、１ｍｌＰＢＳに再懸濁した。細胞の発現率を、フローサイトメトリー （ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ， Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって決定した。更に、ｅＧＦＰを用いるイン・ビトロ実験を、最適ＭＯＩ（例えば、有意な毒性のない感染細胞の比率を最高にするＭＯＩ）で行った。感染細胞１００％に相当するＭＯＩでも、ラット、ネズミおよびヒト細胞について、毒性効果は見られなかった（ラットＡｏ： ＭＯＩ３００；ラットＩＴ１５：ＭＯＩ１０；Ａ５４９：ＭＯＩ５０；およびＣ２Ｃ１２：ＭＯＩ１００）。ブタＳＭＣについては、細胞の５０％だけが感染したが、毒性はなかった（ブタＣｏ：ＭＯＩ２００；ブタＩＴ１５：ＭＯＩ５００）。
【０１１０】
ｅＧＦＰ発現の定量分析は、フローサイトメトリーによって行った。簡単に説明すれば、細胞を、Ｄ４で回収したことを除き上記と同様に感染させ、ｅＧＦＰを蓄積した。様々な調節配列の強度を、ＧＦＰ陽性細胞の百分率と平均蛍光値との積として計算した総蛍光係数（ＧＦＩ）を用いて測定した（Ｍａｓｓｉｅ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８， ５３−６４）。細胞増殖阻害実験については、Ｄ０に細胞を６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ， Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に３×１０４個の細胞／ウェルの密度で播種し、Ｄ１にＡｄＳＭ２２ＩＦＮγ、，ＡｄＳＭ−ＭＨＣ／ＳＭ２２ＩＦＮγ、ＡｄＣＭＶＩＦＮγに感染させた。培養物を１０％ＦＣＳ含有培地に保持し、細胞をＤ４に計数した。培地の試料をＤ３に回収し、ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＭラットＩＦＮγ， Ｒ ＆ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ， アビングドン， 英国）を用いて分泌されたラットＩＦＮγを定量した。
【０１１１】
イン・ビトロでのマウスへの遺伝子導入
９週齢の雌の免疫適格マウス（Ｃ５７ＢＬ／６， Ｉｆｆａ−Ｃｒｅｄｏ， ルアーブル， フランス）を用いて、ＳＭ−特異的発現カセットの発現パターンを検討した。Ｄ０で、アデノウイルスベクターを２×１０９ｉｕ／１００μｌ保管緩衝液の用量で静脈内投与し、臓器（肝臓、肺、脾臓および心臓）を取り出し、２％ホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中で固定した。ｅＧＦＰ発現を、蛍光顕微鏡によって評価した。
【０１１２】
イン・ビボでのラット頸動脈への遺伝子導入
成熟した雄のＷｉｓｔａｒラット（体重＞４００ｇ）を実験に用いた（Ｉｆｆａ−Ｃｒｅｄｏ）。麻酔は、ケタミン（Ｉｍａｌｇｅｎｅ， ＲｈｏｎｅＭｅｒｉｅｕｘ， リヨン， フランス）およびアセプロマジン（Ｖｅｔｒａｎｑｕｉｌ ０．５％， Ｓａｎｏｆｉ， Ｌｉｂｏｕｒｎｅ， フランス）をそれぞれ２３．１および３．８４ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与して行った。ヒトヘパリン（Ｃｈｏａｙ， Ｓａｎｏｆｉ Ｗｉｎｔｈｒｏｐ， Ｇｅｎｔｉｌｌｙ， フランス）２００Ｕ／ｋｇを静脈内投与して、動物の血液凝固を阻害した。左総頸動脈を外科手術により露出させ、左外頸動脈について動脈切開を行った。内皮除去（ｄｅｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、０．２ｍｌの空気を満たした２Ｆ Ｆｏｇａｒｔｙバルーンカテーテル（Ｂａｘｔｅｒ， Ｍａｕｒｅｐａｓ， フランス）を３回通すことによって行った。１ｃｍの長さの頸動脈の切片をマイクロサージャリークランプで単離し、２４ケージ度のカテーテルを動脈切開によって通した。切片を０．２ｍｌの０．９％ＮａＣｌで洗浄し、アデノウイルス溶液（２×１０９ｉｕ）を注入した。この溶液を頸動脈で５分間停止させ、その間に頸動脈切片は膨張したままであった。溶液を抜き取り、外頸動脈を結紮し、総および内頸動脈中に血流を回復させた。ラットを、異なる実験に従って様々な時点で塗擦した。致死量のペントバルビタールを投与し、心挿管の後、血管に１×ＰＢＳ溶液を灌流させ、２％または４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで正常血圧で灌流を固定した。次いで、頸動脈を摘出し、様々な組織学的分析のために処理した。
【０１１３】
組織学および免疫細胞化学分析
ＳＭ２２αの免疫組織化学染色は、４％ホルムアルデヒドで固定しパラフィン埋設した頸動脈の４μｍの厚みの切片について行った。切片からパラフィンを除去し、３％Ｈ２Ｏ２を含む蒸留水に１０分間浸漬した。次に、切片を、Ｅ−１Ｉ ＳＭ２２αマウスモノクローナル抗体（Ｄｒ． Ｓ． Ｓａｒｔｏｒｅより厚意により提供を受けた； Ｆａｇｇｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ． １９， １３９３−１４０４）を１：１００の希釈倍率で用いて、室温にて１時間インキュベーションした。二次抗体は、ビオチン化ヤギ抗マウス抗体であり、１：１００の希釈倍率で用いた。ＳＭ２２αの存在は、ストレプトアビジン−ビオチン複合体ペルオキシダーゼ法によって確かめた（ＬＳＡＢキット， Ｄａｋｏ， トラプス， フランス）。スライドを、ヘマトキシリンで対比染色した。β−ガラクトシダーゼ活性については、２％ホルムアルデヒドで固定した血管をＰＢＳで洗浄し、５ｍＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ６）、５ｍＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ６）、２ ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）中で３７℃にて２４時間インキュベーションした。次に、頸動脈をＰＢＳで洗浄し、５％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で４℃にて２４時間後固定し、脱水して、パラフィンに埋設した。５μｍ切片を、青色核染色について検討した。形態学的分析については、４％ホルムアルデヒドで固定した動脈をパラフィンに埋設した。５μｍ切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。中間部および血管内膜面積並びに細胞数を、画像分析によって評価した（Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ）。
【０１１４】
ウイルスＤＮＡ分析
総ＤＮＡを、以前に報告されている方法で臓器から抽出した（Ｌｕｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２， ２０２２−２０３２）。ＤＮＡ（１０μｇ）をＳａｌＩによって消化し、総ｅＧＦＰｃＤＮＡに相当する３２Ｐを標識した制限断片を用いてサザンブロット法によって分析した。ＤＮＡの性質および量は、導入の前にケージを臭化エチジウムで染色することによって観察した。
【０１１５】
統計分析
総ての結果は、平均値±ＳＥＭとして表した。統計学的評価のため、これらの結果をｔ−検定によって分析した。差は、Ｐ＜０．０５の値で統計学的に有意であると考えた。
【０１１６】
例１：アデノウイルスに関するネズミＳＭ２２αプロモーターの機能性および特異性
表１にまとめたように、４種類のアデノウイルス構築物を、ヒトアデノウイルス節制型５のＥ１欠失領域におけるＳＭ２２αプロモーターによってのみ発現するｅＧＦＰ発現カセットを挿入することによって生成した。アデノウイルスの内調節要素との相互作用を防止および／または検出するため、カセットを２つの配向のそれぞれでクローニングした。ｍＲＮＡを安定化させるイントロンの効果も試験した。
【０１１７】
【表１】
2004502426.tif 000002
【０１１８】
Ａ．ＳＭＣおよび非ＳＭＣ細胞系のアデノウイルスへの感染性
ラット大動脈およびブタ冠動脈由来のＳＭＣおよびＡ５４９コントロール細胞のアデノウイルスへの感染性を、１〜１０００の範囲のＭＯＩでＡｄ−ＣＭＶ／ｅＧＦＰを用いて感染させることによって決定した。非毒性ＭＯＩでは、５０％のブタ細胞しか感染しなかった。例えば、ＭＯＩ５００〜ＭＯＩ７００では、それぞれ５０±２％および５６±２％のブタＩＴ１５に感染した細胞の数には有意な変化は見られなかった。最適感染（ラット細胞について１００％、およびブタ細胞について５０％）に相当するＭＯＩはラット血管内膜細胞についての１０からブタＩＴ１５細胞についての５００まで変動したので、ＳＭＣ感染に大きな変動が見られた。
【０１１９】
感染性が異なることにより、細胞を４種類のアデノウイルスベクターに感染させ、ｅＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡によって評価した。マウスＳＭ２２αプロモーターによって発現される４種類の構築物を比較したとき、発現レベルは強度および特異性に関して有意差は見られなかった。実際に、発現は総てのＳＭＣで検出されたが、Ａ５４９では発現はほとんどまたは全く見られなかった。次に、ＡｄＳＭ２２ｅＧＦＰを選択して、更にイン・ビボ実験を行った。これは、アデノウイルス主鎖に対してセンス配向でＳＭ２２αプロモーターによって行われ且つイントロンを備えたｅＧＦＰ発現カセットを含んでいる。
【０１２０】
Ｂ．ＳＭ２２αプロモーター活性に対する細胞分化の効果
Ａ５４９、ラットＡｏおよびラットＩＴ１５に、５０％および１００％感染細胞に相当するＭＯＩでＡｄＳＭ２２ｅＧＦＰまたはコントロールＡｄ−ＣＭＶ／ｅＧＦＰを０日目に感染させた。次に、これらの細胞を、２％（分化状態）または１０％（増殖状態）ＦＣＳを含む培地で３日間培養し、ＳＭ２２αによって行われるｅＧＦＰ発現に対する細胞分化の効果を検討した。予想されたように、ｅＧＦＰ発現が強度は異なったがＡｄ−ＣＭＶ／ｅＧＦＰに感染した総ての細胞型で見られた。ＡｄＳＭ２２ｅＧＦＰに感染すると、非ＳＭ細胞系（Ａ５４９）はｅＧＦＰ蛍光を欠いた。一方、ラットＡｏでは、特に低血清条件で強い蛍光が見られたが、高濃度の血清を含む培地では減少した。ラットＩＴ１５では、蛍光は低血清条件にのみ見られた。これらのデーターは、ＳＭ２２αによって行われる発現がアデノウイルスベクターに関してＳＭＣ特異的のままであることを示している。高濃度の血清の存在下で蛍光がないかまたは減少することは、ＳＭＣにおいて、ＳＭ２２αプロモーターが少なくとも細胞分化状態に関して示差的に調節されることを示している。
【０１２１】
Ｃ．ＳＭ２２αプロモーター活性のイン・ビトロ定量
マウスＳＭ２２αプロモーターによって駆動されるｅＧＦＰ発現を、２種（ブタおよびラット）であって、正常（大動脈Ａｏおよび冠Ｃｏ）または再狭窄（ＩＴ１５）のＳＭＣ、および非ＳＭＣ（Ａ５４９）における強力なＣＭＶプロモーター／エンハンサーで得たｅＧＦＰ発現レベルと定量的に比較した。細胞を高密度で播種し、最適感染（ブタ５０％、ラット１００％）に相当するＭＯＩで翌日感染させた。ｅＧＦＰ発現のレベル（ｅＧＦＰを発現する細胞の画分およびその蛍光強度）を、３日後にフローサイトメトリーによって分析した。ＣＭＶおよびＳＭ２２αプロモーターの相対強度を総蛍光係数を用いて比較し、図１に示す。
【０１２２】
ＣＭＶによって行われる発現の総蛍光係数は、試験したそれぞれの細胞型で１００％で任意に設定した。ＳＭ２２αプロモーターに関しては、弱いｅＧＦＰ発現がＡ５４９細胞（ＣＭＶによる発現の２．０％）で見られた。総てのラットおよびブタＳＭＣでは、マウスＳＭ２２αプロモーターは、一層高いｅＧＦＰ発現を生じ、ラットＡｏでの５．７％、ブタＣｏでの６％、ラットＩＴ１５での８．８％からブタＩＴ１５での１５．３％までの範囲であった。
【０１２３】
Ｄ．ＭＯＩのＳＭ２２αによって行われる発現への影響
ＮＫκＢ因子の刺激により、ヒトＶＳＭＣ（Ｃｌｅｅｓｈａｍ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５， １７４−１８０）またはＨｅｐＧ２のような確立した細胞系（Ｌｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２， １８０−１９０）で示されるように、ウイルス荷重が細胞生理学およびプロモーター活性に影響を与えることがあることが示唆されている。従って、ＣＭＶプロモーターは多くの他のプロモーターと同様に、完全に活性なＮＦκＢの存在によって変化する。
【０１２４】
高ウイルス荷重の導入遺伝子発現に対する影響を決定するため、ラットＡｏ、ラットＩＴ１５、ブタＣｏおよびブタＩＴ１５を、最適感染を行うウイルス用量（ラットＩＴ１５ではそれぞれＭＯＩ１０、５０および１００、ラットＡｏではＭＯＩ３００および５００、ブタＣｏではＭＯＩ２００、３００および４００、およびブタＩＴ１５では５００、６００および７００）から開始する異なるＭＯＩで感染させた。
【０１２５】
ラットＡｏおよびブタＣｏでは、ウイルス用量を増加したところ（それぞれＭＯＩ３００〜５００およびＭＯＩ２００〜４００）、ＳＭ２２αプロモーター によって行われる発現は５倍に増加したが、ＣＭＶによって行われる発現は変化しないままであった。ラットＩＴ１５では、ｅＧＦＰ発現はＣＭＶおよびＳＭ２２αプロモーターのいずれでもウイルス用量と共に異なる比率であるが増加した。ウイルス濃度の１０倍の増加（ＭＯＩ１０から１００）により、ＳＭ２２αプロモーターを用いる蛍光では３倍の利得があり、ＣＭＶでは８倍になった。同様に、ブタＩＴ１５では、ｅＧＦＰをＳＭ２２αプロモーターよりはＣＭＶプロモーターによって制御するときに、蛍光は一層速やかに増加した。ＭＯＩを５００から７００へ増加しても、ＳＭ２２α関連発現には有意な変化はなく、このときＣＭＶプロモーターでは発現は２倍の強さであった。
【０１２６】
中間部細胞（ＡｏおよびＣｏ）と比較して血管内膜細胞（ＩＴ１５細胞）の増殖状態が高いことにより、ウイルスおよび細胞プロモーターの調節に影響すると思われる。これは、必要な転写因子の存在下での主要な差によることがある。従って、ＳＭ２２αとＣＭＶプロモーターの厳密な比較には、最適感染に相当するＭＯＩおよび重複感染が回避される条件下での分析が必要である。
【０１２７】
例２：ＳＭ２２αプロモーターイン・ビボ評価
Ａ．マウスにおけるＳＭ２２αプロモーター特異性の評価
静脈内または動脈内投与の後の血液循環におけるアデノウイルスベクターの散在は、特にそれらを潜在的に有害な治療遺伝子（例えば、細胞傷害性）を送達するのに用いるときには、重要な問題である。ＳＭ２２αによって駆動される発現が主要なアデノウイルスの天然のターゲット臓器（例えば、肝臓、肺、脾臓および心臓）の一つでは起こらないことを立証するため、ＳＭ２２αプロモーターを含む４種類のアデノウイルス構築物（表１参照）をＣ５７Ｂ１６免疫適格マウスに投与した。Ａｄ−ＣＭＶｅＧＦＰベクターおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌ注射を、それぞれ正および負のコントロールとして用いた。４匹のマウスにそれぞれの構築物２×１０９ｉｕを静脈内投与し、ｅＧＦＰ発現を様々な臓器の蛍光顕微鏡検査によって３日後に決定した。サザンブロット法分析を、アデノウイルス特異的プローブを用いて上記臓器から抽出したＤＮＡで行った。総てのマウスで同様なウイルスＤＮＡ量が認められ、正確な感染を示していた。
【０１２８】
Ａｄ−ＣＭＶ／ｅＧＦＰを投与した４匹のマウスは試験した総ての臓器で有意な蛍光を示したが、ＳＭ２２αプロモーターを含むビリオンを投与した動物は蛍光を全く示さず、マウスＳＭ２２αプロモーターの組織特異性が確かめられる。この特異性は発現カセット配向から独立しており、アデノウイルス配列はイン・ビボでプロモーター特異性を妨げないことを示していた。
【０１２９】
Ｂ．ラット頸動脈損傷モデルでのＳＭ２２αプロモーターの評価
アデノウイルスベクターの治療能を評価するため、ＲＳＶ（Ａｄ−ＲＳＶ／ＬａｃＺ）またはＳＭ２２α（Ａｄ−ＳＭ２２／ＬａｃＺ）プロモーターの制御下でＬａｃＺ細菌性遺伝子を含む２種類のアデノウイルスベクターを、例１に記載の通りに生成させ、ウイルス粒子にパッケージングした。頸動脈を損傷したラットモデルの頸動脈から単離した切片に２・１０９ｉｕを５分間点滴した。７日後、Ａｄ−ＲＳＶ／ＬａｃＺ およびＡｄ−ＳＭ２２／ＬａｃＺに感染した頸動脈を、β−ガラクトシダーゼについて染色した。
【０１３０】
これらのウイルスに感染した総ての検討した血管は、中間部に青色染色を示し、発生期の血管内膜には青色細胞はほとんど見られなかった。感染中間部細胞は、一般的に血管内膜構成によって取り囲まれている。これらの結果から、Ａｄ−ＳＭ２２／ＬａｃＺは病的条件においてもＳＭＣターゲット細胞に感染することができることが確かめられる。
【０１３１】
要するに、これらのデーターは、ＳＭ２２αプロモーターはアデノウイルスに関連してイン・ビトロおよびイン・ビボでレポーター遺伝子（ｅＧＦＰおよびβ−ガラクトシダーゼコード遺伝子）のＳＭＣ特異的発現を生じることを示している。中間部および血管内膜起源のラットおよびブタＳＭ細胞で試験したところ、このプロモーターは、強力なウイルスＣＭＶエンハンサー／プロモーターの６〜１５％の発現レベルを示した。
【０１３２】
例３：アデノウイルスに関連したキメラＳＭ２２αプロモーターの機能性および特異性
Ａ．キメラＳＭ２２αプロモーター活性のイン・ビトロ定量
ＳＭ２２αプロモーターをＣＫまたはＭＨＣエンハンサーと結合するキメラプロモーターの発現の強度および特異性を、最初にレポーター遺伝子としてのｅＧＦＰコード遺伝子を用いてイン・ビトロで試験した。総蛍光係数の分析は上記と同様に行い、構築物の特異性を評価し、次にそれらを正常（ラットＡｏ）、再狭窄（ラットＩＴ１５）ＳＭ細胞および非ＳＭ細胞（Ａ５４９）での強力なＣＭＶエンハンサー／プロモーターと比較した。比較を容易にするため、ＣＭＶによって行われる発現の総蛍光係数を、試験した総ての細胞型で任意に１００％に設定した。比較データーを、図２に示す。
【０１３３】
Ａ５４９での非特異的発現レベルは、いずれのキメラ構築物でもマウスＳＭ２２αプロモーターのみと比較して減少する（Ａ５４９では、それぞれ０．５％対２％）ＣＫエンハンサーの存在により、ラットＡｏおよびラットＩＴ１５ではｅＧＦＰ発現が約３倍だけ増加し、それぞれＣＭＶ関連発現の１５．８％および２１．３％となった。ＭＨＣエンハンサーを組込んだベクターは、いずれの型のＳＭＣでも一層高い発現レベルを生じ、ラットＡｏではＣＭＶ発現の１６．９％となり、ラットＩＴ１５では２３．５％となった。
【０１３４】
ＣＫエンハンサーが骨格筋に由来するため、キメラベクターをネズミ筋原細胞中でＣ２Ｃ１２細胞系を用いても試験した。意外なことには、ｅＧＦＰ蛍光の強度は試験した総ての構築物（ＳＭ２２αプロモーター単独またはＣＫまたはＭＨＣエンハンサーと組み合わせたもの）で同じであり、Ａ５４９細胞系で観察された強度と同じ範囲であった（ＣＭＶプロモーターの約１．７％）。コントロールとして、ＣＭＶエンハンサー／プロモーターによって行われるｅＧＦＰ発現が、高レベルで観察される。従って、ＣＫｅｎｈをマウスＳＭ２２αプロモーターと組み合わせてＳＭＣ特異性に有利になるようにすると、骨格特異性は失われる。これらのデーターから、ＭＨＣｅｎｈ／ＳＭ２２αおよびＣＫｅｎｈ／ＳＭ２２α キメラベクターのＳＭＣ特異性が立証される。
【０１３５】
Ｂ．キメラベクター関連発現に対する細胞分化の効果
ＳＭ２２αを単独でまたはＣＫまたはＭＥＣエンハンサーと組み合わせて含む構築物を、２または１０％ＦＣＳの存在下で培養したラットＡｏ中で試験し、発現に対する細胞増殖／分化の効果を測定した。総ての構築物を、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーのような高濃度の血清の存在下でダウンレギュレーションした。従って、筋特異的エンハンサーＣＫおよびＭＨＣをマウスＳＭ２２αプロモーターと結合するキメラ構築物は、分化マーカー（ＳＭ２２α、ＳＭ−ＭＨＣ、α−アクチン）の自然なレギュレーションに続き、分化した細胞で一層活性である。
【０１３６】
Ｃ．ラットＩＦＮγを発現するアデノウイルスベクターのイン・ビトロ評価
ＭＨＣエンハンサーに結合したＳＭ２２αプロモーターによって行われるラットＩＦＮγ遺伝子を発現するアデノウイルスベクターを、（それらの増殖を高めるため）１０％ＦＣＳを含む培地で培養したラットＩＴ１５細胞でＳＭＣ増殖を防止する能力について試験した。ラットＩＴ１５感染も、ＣＭＶｐｒｏ／アデノウイルスベクター（正のコントロール）およびＣＭＶｐｒｏ／ｅＧＦＰアデノウイルスベクター（負のコントロール）を用いて行った。図３に示される結果は、観戦後のＤ４における増殖阻害率として表される。
【０１３７】
これらのキメラプロモーターの制御下でＩＦＮγを発現するアデノウイルスを用いて得たラット細胞の増殖阻害は、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーを含むウイルスで生じたものと同じ範囲であるかまたは若干高い（５４％対５９％）。負のコントロール（ＣＭＶｐｒｏ／ｅＧＦＰ）で感染すると、感染していない細胞と比較して統計的には有意ではない弱い増殖阻害を生じた。
【０１３８】
感染細胞の上清を３日目に回収し、ＥＬＩＳＡによって試験し、ラットＩＦＮγ濃度を測定した。キメラＭＨＣｅｎｂ／ＳＭ２２αプロモーターで得たＩＦＮγ濃度を９ｎｇ／ｍｌと評価し、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーでは３１ｎｇ／ｍｌであった。
【０１３９】
例４：マウスでのキメラベクターのイン・ビボ評価
Ａ．マウスにおけるＳＭ２２αプロモーター特異性の評価
肝臓、肺、脾臓および心臓でのｅＧＦＰ発現は、例２に記載した通りにＣ５７Ｂ１６免疫適格マウスの尾静脈にＳＭ２２αを単独でまたはＣＫまたはＭＨＣエンハンサーと組み合わせて含むアデノウイルス２×１０９ｉｕ、Ａｄ−ＣＭＶ／ｅＧＦＰ（正のコントロール）またはＴｒｉｓ−ＨＣｌ（負のコントロール）を投与することによってチェックした。４匹の動物全部を、構築物に対して試験した。
【０１４０】
Ａｄ−ＣＭＶ／ｅＧＦＰを投与した４匹のマウスは、試験した総ての臓器で有意な蛍光を示したが、ＳＭ２２α含有ベクターを投与した総てのマウスは蛍光を全く示さなかった。
【０１４１】
ＳＭ２２αに結合したＣＫエンハンサーのキメラ構築物を含むアデノウイルスの非平滑筋で遺伝子発現を指示する能力も検討した。ＡｄＣＫｅｎｈ／ＳＭ２２ｅＧＦＰ ２×１０９ｉｕを、Ｃ５７Ｂ１６免疫適格マウスに筋肉内経路（前頸骨筋）で投与した。ＡｄＣＭＶｅＧＦＰを、正のコントロールとして用いた。ｅＧＦＰ発現によって誘導された蛍光を、筋肉切片の顕微鏡観察によって評価した。ＡｄＣＫｅｎｈ／ＳＭ２２ｅＧＦＰを投与したマウスは蛍光を示さなかったが、Ａｄ−ＣＭＶ／ｅＧＦＰを投与した総ての動物は骨格繊維の強い蛍光を示した。
【０１４２】
これらの結果により、本発明のキメラ構築物のＳＭＣに限定された特異性が確認される。
【０１４３】
Ｂ．ラット損傷モデルでのキメラプロモーター／エンハンサーの評価
ＭＨＣエンハンサーに結合したＳＭ２２αプロモーターによって行われるラットＩＦＮγの増殖抑制効果を、上記の例２で記載した通りにラット頸動脈バルーン損傷モデルで評価した。アデノウイルス２×１０９ｉｕを、ラットの損傷頸動脈に局所投与した。コントロールラットには、ＣＭＶｐｒｏ／ＩＦＮγ含有アデノウイルスを投与した。
【０１４４】
ＭＨＣｅｎｈ／ＳＭ２２αプロモーターまたはＣＭＶプロモーターによって行うと、ラットＩＦＮγはラット頸動脈モデルにおける血管内膜の肥厚化を部分的に阻害した。この阻害は、中間部面積が総ての群で同じままで、発現カセットを欠くコントロールアデノウイルスを注入したコントロールと比較して損傷が３５％になって１４日後に分析した。
【０１４５】
これらのデーターは、マウスＳＭ２２αプロモーターに結合した特異的なエンハンサー（ＭＨＣまたはＣＫ）を有するキメラ構築物により、イン・ビトロでのＣＭＶプロモーター／エンハンサー発現の２５％まで到達する有意な一層強い特異的発現を生じた。イン・ビボでは、発現は動脈ＳＭＣに限定され、肝臓、脾臓、肺、心臓および骨格筋には検出可能なシグナルは見られなかった。ラットＩＦＮを有するキメラベクターは、イン・ビトロでのラット大動脈およびＩＴ１５細胞の増殖を阻害するのに有効であった。更に、この増殖阻害は、ＣＭＶエンハンサー／プロモーターと同程度の強さであった。総合すると、これらのデーターは、本発明のキメラエンハンサー／プロモーター構築物が血管増殖疾患における治療遺伝子の特異的な発現に有用であることを示唆している。
【０１４６】
例５：アデノウイルスに関連してヒトＳＭ２２αプロモーターを供給した発現カセットの機能性および特異性
Ａ．キメラヒトＳＭ２２αプロモーター活性のイン・ビトロ定量
ヒトＳＭ２２αプロモーター、またはヒトＳＭ２２αプロモーターをＣＫまたはＭＨＣエンハンサーと結合したキメラプロモーターの発現の強度および特異性を、最初にイン・ビトロでｅＧＦＰコード遺伝子をレポーター遺伝子として用いて試験した。総蛍光係数の分析は上記と同様に行い、構築物の特異性を評価し、正常（ラットＡｏ、ブタＣｏ、ｈｕＡｏ、ｈｕＣｏ）、再狭窄（ブタＩＴ１５、ブタＩＴ３０）ＳＭ細胞および非ＳＭＨＵＶＥＣ細胞中で強いＣＭＶエンハンサー／プロモーターと比較した。比較を容易にするため、ＣＭＶによって行われる発現の総蛍光係数を、試験した総ての細胞型で任意に１００％に設定した。ラットおよびブタ細胞に関する比較データーを、図４に示す。
【０１４７】
ラットＡｏでのヒトＳＭ２２α（ｈＳＭ２２α）プロモーターによって行われる発現は強く、ＣＭＶ関連発現の約７１％に達した。この発現はＭＨＣエンハンサーまたはＣＫエンハンサーを添加することによってごくわずかであるが増加し、それぞれＣＭＶ関連発現の８０％および９７％となった。同様の結果がブタＣｏで見られ、ｅＧＦＰ発現をそれぞれｈＳＭ２２αプロモーター、ＳＭ−ＭＨＣ／ｈＳＭ２２αプロモーターおよびＣＫ／ｈＳＭ２２αプロモーターで行った時には、ＣＭＶ関連発現の１１０％、１１４％および１７０％となった。ブタＩＴ１５およびブタＩＴ３０では、ｈＳＭ２２αプロモーターによって行われる発現は、それぞれＣＭＶプロモーター／エンハンサーで得られるものの約５０％（ブタＩＴ１５）および７０％（ブタＩＴ３０）である。発現レベルは、ｈＳＭ２２αプロモーターをＭＨＣエンハンサーと関連させるときにはいずれの細胞でも同じ範囲のままであり、ＣＫエンハンサーと関連させると若干増加する。
【０１４８】
予想されるように、総てのｈＳＭ２２αプロモーター含有構築物を有する非ＳＭＨＵＶＥＣ細胞では、ｅＧＦＰ発現のバックグラウンドしか検出されなかった（ＣＭＶ関連発現の０．０５％未満）。
【０１４９】
ヒト細胞（ＨｕＡｏおよびＨｕＣｏ）では、３種類の ｈＳＭ２２α含有ベクターによって行われるｅＧＦＰ発現は、低レベルのものが得られたが、ＳＭＣ特異的として決定した（ＣＭＶ関連発現の約５％）。
【０１５０】
Ｂ．ｈＳＭ２２αプロモーター活性に対する細胞培養条件の影響
細胞培養条件がヒト細胞中でヒトＳＭ２２αプロモーター活性に影響を及ぼすことができるかどうかについての問題を検討した。従って、細胞集密性および血清濃度のこれらの細胞および引き続くｈＳＭ２２αプロモーター活性化に対する影響を評価した。ヒト冠細胞を、２％または１０％ＦＣＳ含有培地に６ウェル／プレートにウェル当たり５×１０４または２×１０５個の細胞で播種した。
【０１５１】
２×１０５個の細胞密度で感染して２％血清の存在下で培養したヒト冠細胞で、ｅＧＦＰ遺伝子をそれぞれｈＳＭ２２αプロモーター、ＭＨＣ／ｈＳＭ２２αプロモーターおよびＣＫ／ｈＳＭ２２αプロモーターの制御下に置いたとき、ｅＧＦＰ発現レベルをＣＭＶ関連発現の１．５％、２．５％、および４％として決定した。同様の結果は５×１０４の密度で感染したｈｕＣｏでも見られ、それぞれＣＭＶ関連発現の２％、５．５％および５．５％であった。ヒト冠細胞を１０％血清含有培地で培養したときには、一層高い発現レベル（２．５〜４のファクターだけ増加）が得られた。２×１０５の密度での細胞感染では、それぞれｈＳＭ２２α、ＭＨＣ／ｈＳＭ２２αおよびＣＫ／ｈＳＭ２２αプロモーターではｅＧＦＰの４％、６％および１１％となり、一方同じ構築物を用いて、感染を低細胞密度（５×１０４）で行ったときには、発現はそれぞれ７．５％、１７．５％および２２％に達した。
【０１５２】
要約すると、ｈＳＭ２２αプロモーター含有ベクターによって行われるｅＧＦＰ発現は、低細胞濃度（５×１０４）でのものより常に強かった。更に、血清画布くまれていると、３種類のｈＳＭ２２α含有プロモーターによって行われる発現が有意に増加した。その結果、ｈＳＭ２２αキメラプロモーターで得られる発現レベルは、ヒトＳＭ細胞を低集密性で感染させ且つ高血清濃度で培養したときには、ＣＭＶの約２０％に達した。
【０１５３】
例６：ヒトＳＭ２２αプロモーターイン・ビトロ評価
Ａ．マウスでのヒトＳＭ２２αプロモーター特異性の評価
ｈＳＭ２２αで行われる発現は主要なアデノウイルスの天然ターゲット臓器（例えば、肝臓、肺、脾臓および心臓）では見られないことを明らかにするために、ｈＳＭ２２αプロモーターを単独でまたはＭＨＣまたはＣＫエンハンサーと組み合わせて含むアデノウイルス構築物を、Ｃ５７Ｂ１／６免疫適格マウスに投与した。Ａｄ−ＣＭＶｅＧＦＰベクターおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌ注射を、それぞれ正および負のコントロールとして用いた。４匹のマウスにそれぞれの構築物２・１０９ｉｕを静脈内投与し、ｅＧＦＰ発現を、上記のように３日後に様々な臓器の蛍光顕微鏡での検討によって決定した。
【０１５４】
Ａｄ−ＣＭＶ／ｅＧＦＰを投与した４匹のマウスは試験した総ての臓器で有意な蛍光を示したが、ｈＳＭ２２αプロモーターを含むビリオンを投与した動物は蛍光を全く示さず、これによりヒトＳＭ２２αプロモーターのＳＭＣ特異性が確認される。
【０１５５】
Ｂ．ラット頸動脈損傷モデルでのＭＨＣ／ｈＳＭ２２αプロモーターの評価
イン・ビボでのＳＭＣでのＭＨＣ／ｈＳＭ２２α含有アデノウイルスベクターの能力を評価するため、ＣＭＶ（ＡｄＣＭＶｅＧＦＰ）またはＭＨＣ／ｈＳＭ２２α（ＡｄＭＨＣ／ｈＳＭ２２ｅＧＦＰ）プロモーターによって制御されているｅＧＦＰを含むベクターを生成させ、上記のようにウイルス粒子にパッケージングした。頸動脈損傷を誘発させたラットモデルの頸動脈から単離した切片に、２・１０９ｉｕを５分間点滴注入した。３日後、ＡｄＣＭＶｅＧＦＰおよびＡｄＭＨＣ／ｈＳＭ２２ｅＧＦＰに感染した頸動脈を回収し、ＰＢＳ／２％ホルムアルデヒド中で固定し、蛍光顕微鏡法によって分析した。ＡｄＣＭＶｅＧＦＰおよびＡｄＭＨＣ／ｈＳＭ２２ｅＧＦＰに感染した血管は、有意な蛍光を示した。これらの結果から、ＭＨＣ／ｈＳＭ２２αプロモーターはＳＭＣでｅＧＦＰ発現を行うことができるが、非ＳＭＣでは発現しないことが確かめられる。
【０１５６】
要するに、これらのデーターは、アデノウイルスに関連するｈＳＭ２２α含有プロモーターは、レポーター遺伝子をイン・ビトロおよびイン・ビボでＳＭＣ特異的発現することを示唆している。中間部および血管内膜起源に由来するラット、ブタおよびヒトＳＭ細胞で試験すると、これらのプロモーターは強力なウイルスＣＭＶエンハンサー／プロモーターの５〜１７０％の範囲の発現レベルを示した。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＳＭＣ（ラットＡｏ、ラットＩＴ１５、ブタＣｏおよびブタＩＴ１５）およびＡ ５４９細胞でのＳＭ２２αプロモーター強度。結果は、ＣＭＶ総蛍光係数の百分率として示される。それぞれの細胞型を、最適感染に相当するＭＯＩでＡｄＳＭ２２ｅＧＦＰまたはＡｄＣＭＶｅＧＦＰに暴露した。総蛍光係数は、Ｄ３でフローサイトメトリーによって決定した。
【図２】
ＳＭ対非ＳＭ細胞でのネズミＳＭ２２αプロモーターを含むベクターの比較。ＳＭ２２αプロモーターは、単独でまたはヒトクレアチンキナーゼエンハンサー（ＣＫ）またはウサギＳＭ−ミオシン重鎖エンハンサー（ＭＨＣ）と共に用いた。発現は、ラットＩＴ１５（黒棒線）、ラットＡｏ（灰色棒線）、およびＡ５４９（白棒線）で分析した。結果は、ＣＭＶ総蛍光係数の百分率として示す。それぞれの細胞型をＳＭ２２αプロモーター含有ベクターおよびＡｄＣＭＶｅＧＦＰに適当なＭＯＩで暴露した。総蛍光係数は、Ｄ３でフローサイトメトリーによって決定した。
【図３】
ラットＩＴ１５増殖に対するラットγＩＦＮの効果。細胞をＡｄＣＭＶＩＦＮ（ＡｄＳＭ−ＭＨＣｅｎｈ／ＳＭ２２ＩＦＮ）、またはＡｄＣＭＶｅＧＦＰ （コントロール）に暴露し、４日後に計数した。ＩＦＮの増殖抑制効果を、感染していない細胞に対して評価した。
【図４】
ＳＭ細胞でのヒトＳＭ２２αプロモーターを含むベクターの比較。ＳＭ２２αプロモーターは、単独でまたはヒトクレアチンキナーゼエンハンサー（ＣＫ）またはウサギＳＭ−ミオシン重鎖エンハンサー（ＭＨＣ）と共に用いた。発現は、ラットＡｏ（黒棒線）、ブタＣｏ（濃い灰色棒線）、ブタＩＴ１５（明るい灰色棒線）、およびブタＩＴ３０（白棒線）で分析した。結果は、ＣＭＶ総蛍光係数の百分率として示す。それぞれの細胞型をＳＭ２２αプロモーター含有ベクターおよびＡｄＣＭＶｅＧＦＰに適当なＭＯＩで暴露した。総蛍光係数は、Ｄ３でフローサイトメトリーによって決定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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