(57)【要約】本発明は、ＰＮＡ誘導体に関し、該誘導体は、ＰＮＡ主鎖のＣ末端またはＣ末端およびＮ末端に１以上のホスホリル基を有し、該ホスホリル基は必要に応じて１以上のマーカー基、または架橋のための基、または細胞内吸収を高める基、またはＰＮＡ誘導体の核酸に対する結合親和性を高める基を有する。さらに本発明は、上記ＰＮＡ誘導体の製造方法、および薬剤または診断薬としてのそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＮＡ主鎖のＣ末端またはＣ末端およびＮ末端に１または２以上のホスホリル基を有するＰＮＡ誘導体であって、オキソホスホリル基に加えて、チオホスホリル基およびイミノホスホリル基を含み、少なくとも１つのホスホリル基が１または２以上の脱プロトン可能な基、好ましくはヒドロキシル基またはメルカプト基を有し、該ホスホリル基が、酸素−リン結合、硫黄−リン結合または窒素−リン結合を介して、直接またはスペーサーを介してＰＮＡ主鎖に連結したＰＮＡ誘導体。
【請求項２】
スペーサーが、例えばアルカノイルアミド、ポリ（アルコキシ）カルボキシアミドまたはアミノ酸であってよく、少なくとも１つのホスホリル基が、ｐＨ４．５〜１４、好ましくは６．５〜１２、特に好ましくは６．５〜９の範囲で脱プロトン化できる１または２以上のヒドロキシル基またはメルカプト基を有し、さらに、該ホスホリル基が、例えば、ホスフェート、ホスホネート、チオホスフェート、ホスホアミデートまたは置換ホスホリル基であり、ここで置換ホスホリル基は、必要に応じて、１または２以上の標識基、または架橋のための基、または細胞内吸収を促進する基、またはＰＮＡ誘導体の核酸への結合親和性を高める基を有する、請求項１に記載のＰＮＡ誘導体。
【請求項３】
式Ｉ
【化１】
2004501211.tif 000045
で示されるＰＮＡ誘導体および前記式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体の生理学的に許容される塩であって、式中、
ｑは、０または１であり、
Ｄ’は、ヒドロキシル、メルカプト、アミノ、アルキルアミノまたはアシルアミノであり、
Ｖは、それぞれ独立して、酸素、硫黄、ＮＲ１であり、
Ｖ’は、それぞれ独立して、酸素、硫黄、ＮＲ１、Ｕ−（ＣＲ３Ｒ４）ｕ’−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ基またはＵ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｕ’−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ基であり、
Ｕは、それぞれ独立して、酸素、硫黄またはＮＨであり、
ｕ’は、それぞれ独立して、１〜１０、好ましくは１〜４、特に好ましくは１であり、
ＷおよびＷ’は、それぞれ独立して、酸素、硫黄またはＮＲ１であり、
ＹおよびＹ’は、それぞれ独立して、ヒドロキシル、メルカプト、オキシアニオン、チオエートまたはＮＲ１Ｒ２であり、
ＸおよびＸ’は、それぞれ独立して、Ｕ−（Ｃ２〜Ｃ２２−アルカンジイル）−Ｕ基またはＵ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｕ’基であり、
または、標識基もしくは架橋のための基、または細胞内吸収を促進する基、またはＰＮＡ誘導体の核酸への結合親和性を高める基、例えば、二官能価のフルオレセイン、ローダミン、ＴＡＭＲＡ、ビオチン、ピレン、ジニトロフェニル基、コレステリル基、アクリジン、アダマンチル基、ビタミンＥ、シアニン色素、Ｄａｂｃｙｌ、ＥＤＡＮＳ、レキシトロプシン、ソラレン基、ＢＯＤＩＰＹ、ＲＯＸ基、Ｒ６Ｇ基またはジゴキシゲニン基であり、
ＺおよびＺ’は、それぞれ独立して、ヒドロキシル、メルカプト、オキシアニオン、チオエートまたはＮＲ１Ｒ２、Ｃ１〜Ｃ２２アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アリールアルキル、Ｃ１〜Ｃ２２アルキル−Ｕ、Ｃ１〜Ｃ８アリールアルキル−Ｕ、ヒドロキシ−Ｃ１〜Ｃ１８−Ｕ、アミノアルキル−Ｕ、メルカプトアルキル−Ｕであり、
または、式Ｒ７（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｍで示される基であり、式中、Ｒ７はヒドロキシル、アミノまたはＣ１〜Ｃ２２アルコキシであり、ｍは１〜１００、好ましくは２〜１０であり、
または、標識基もしくは架橋のための基、または細胞内吸収を促進する基、またはＰＮＡ誘導体の核酸への結合親和性を高める基、例えば、一官能価または二官能価のフルオレセイン、ローダミン、ＴＡＭＲＡ、ビオチン、ピレン、ジニトロフェニル基、コレステリル基、アクリジン、アダマンチル基、ビタミンＥ、シアニン色素、Ｄａｂｃｙｌ、ＥＤＡＮＳ、レキシトロプシン、ソラレン基、ＢＯＤＩＰＹ、ＲＯＸ基、Ｒ６Ｇ基またはジゴキシゲニン基であり、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素を含む基またはＣ１〜Ｃ６アルキル、好ましくは水素であり、
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素を含む基もしくはＣ１〜Ｃ６アルキル、またはアミノ酸側鎖の基、好ましくは水素であり、Ｖ’における隣接したＲ３基およびＲ４基はまたＣ５〜Ｃ８シクロアルキル環を形成することができ、
ｎは、０〜１０、好ましくは０〜３であり、
ｍは、０〜１０、好ましくは０〜３であり、
さらに、｛ＰＯＬＹ｝は、式ＩＩ
【化２】
2004501211.tif 000046
で示され、
ここで｛ＢＬＯＣＫ｝は、それぞれ独立して、式ＩＩＩＡ、
【化３】
2004501211.tif 000047
または式ＩＩＩＢ、
【化４】
2004501211.tif 000048
または、式ＩＶＡ〜ＩＶＧ、
【化５】
2004501211.tif 000049
から選択される基であり、
式中、それぞれの構築ブロック｛ＢＬＯＣＫ｝は異なってよく、
さらに、
ｚ’’は、０〜１００、好ましくは１〜２０、特に好ましくは４〜１５であり、
Ｇは、（ＣＲ５Ｒ６）ｕ’基、Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＲ１Ｒ２）ｔ’基、またはＣ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｕ’−ＣＨ２ＣＨ２基から選択され、ここでｔ’は２〜１０、好ましくは６であり、
Ａは、それぞれ独立して、（ＣＲ１Ｒ２）ｓ基であり、ここでｓは１〜３、好ましくは１であり、
Ｂは、それぞれ独立して、ヘテロ芳香族の特徴を有し得る芳香族基、または水素、またはヒドロキシル、またはＣ１〜Ｃ１８アルキルのいずれかであり、
または、天然に存在しかつヌクレオチド化学で慣用の核酸塩基、または天然に存在しない核酸塩基、またはそれらのプロドラッグ型であり、
Ｄは、それぞれ独立して、（ＣＲ３Ｒ４）ｔ基であり、ここでｔは２〜１０、好ましくは２〜４、特に好ましくは２であり、
Ｅは、それぞれ独立して、（ＣＲ５Ｒ６）ｕ’基であり、ここで隣接したＲ５基およびＲ６基はまた、Ｃ５〜Ｃ８シクロアルキル環またはスピロ化合物を形成することができ、
Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、水素を含む基、またはＣ１〜Ｃ６アルキル、またはアミノ酸側鎖の基、好ましくは水素であり、
さらに、ｕ’、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は上記と同じ意味であり、
ただし、少なくとも１つのＹ基、Ｙ’基、Ｚ基またはＺ’基は、ヒドロキシル、メルカプト、オキシアニオンまたはチオエートであり、少なくとも１つのＢ基は核酸塩基である、
前記ＰＮＡ誘導体およびその塩。
【請求項４】
ｐＨ４．５〜１４、好ましくは６．５〜１２、特に好ましくは６．５〜９の範囲で、式Ｉにおける少なくとも１つのＹ基、Ｙ’基、Ｚ基またはＺ’基がオキシアニオンまたはチオエートである、請求項３に記載のＰＮＡ誘導体。
【請求項５】
ｎおよびｍがそれぞれ独立して０である、請求項３または４に記載のＰＮＡ誘導体。
【請求項６】
ｑが１である、請求項３〜５のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体。
【請求項７】
ＷおよびＷ’がオキソである、請求項３〜６のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体。
【請求項８】
ＹおよびＹ’がヒドロキシルまたはオキシアニオンである、請求項３〜７のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体。
【請求項９】
ＶおよびＶ’がオキシである、請求項３〜８のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体。
【請求項１０】
ＸおよびＸ’が、それぞれ独立して、Ｕ−（Ｃ２〜Ｃ２２−アルカンジイル）−Ｕ基、好ましくは、Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ２２−アルカンジイル）−Ｏ基、特に好ましくは、Ｏ−（ＣＨ２）２−６Ｏ基であり、または、Ｕ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｕ’基、好ましくはＯ（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｕ’基であり、ここでｕ’は好ましくは１〜６である、請求項３〜９のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体。
【請求項１１】
Ｘ、Ｘ’、ＺおよびＺ’が、それぞれ独立して、フルオレセイン、ローダミン、ＴＡＭＲＡまたはシアニン色素、ビオチン、Ｄａｂｃｙｌ、ソラレン、アクリジン、ＤＮＰ、コレステロールまたはビタミンＥ、Ｄａｂｃｙｌ、ＥＤＡＮＳ、レキシトロプシン、ソラレン、ＢＯＤＩＰＹ、ＲＯＸ、Ｒ６Ｇまたはジゴキシゲニンから選択される、請求項３〜１０のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体。
【請求項１２】
Ｘ、Ｘ’、ＺおよびＺ’が、それぞれ独立して、モノホスフェート基、ビオチン誘導体およびフルオレセイン誘導体から選択される、請求項３〜１１のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体。
【請求項１３】
Ｚが蛍光標識であり、Ｚ’が消光剤である、請求項３〜１１のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体。
【請求項１４】
Ｚが消光剤であり、Ｚ’が蛍光標識である、請求項３〜１１のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体。
【請求項１５】
ＺおよびＺ’が、それぞれ独立して、Ｃ１〜Ｃ２２アルキル基、またはＣ１〜Ｃ２２−Ｕ基、好ましくはＣ１〜Ｃ２２アルコキシ基、特に好ましくはＣ１６アルコキシであり、
または、ヒドロキシ−Ｃ１〜Ｃ１８−Ｕ、好ましくはヒドロキシ−Ｃ１〜Ｃ１８−Ｏ、特に好ましくはＨＯ−（ＣＨ２）３−１２Ｏであり、
または、アミノアルキル−Ｕ基、好ましくはアミノアルコキシ基、特に好ましくは６−アミノヘキソキシまたは５−アミノペントキシであり、
または、式Ｒ７−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｍで示される基であり、式中、Ｒ７は好ましくはＯＨまたはＮＨ２であり、ｍは１〜６であり、特に好ましくは、ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）２、ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）６およびＨ２Ｎ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）２、またはメルカプトアルキル−Ｖ基、好ましくはメルカプトアルコキシ基、特に好ましくは６−メルカプトヘキシルオキシである、請求項３〜１１のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体。
【請求項１６】
ｑが０である、請求項３〜５のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体。
【請求項１７】
Ｄ’がアシルアミノ、好ましくはアセチルアミノである、請求項１６に記載のＰＮＡ誘導体。
【請求項１８】
Ｄが（ＣＨ２）ｔ、好ましくは（ＣＨ２）２である、請求項３〜１７のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体。
【請求項１９】
Ａ、ＥおよびＧがＣＨ２である、請求項３〜１８のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体。
【請求項２０】
Ｂがアデニン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、チミンおよびウラシルであり、または、プリン、２，６−ジアミノプリン、Ｎ４Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ６Ｎ６−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−（Ｃ３〜Ｃ６）−アルキニルウラシル、５−（Ｃ３〜Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−（１−プロパルギルアミノ）ウラシル、５−（１−プロパルギルアミノ）シトシン、フェノキサジン、９−アミノエトキシフェノキサジン、５−フルオロウラシルもしくはシュードイソシトシン、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−アミノウラシル、シュードウラシル、ジヒドロウラシル、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルウラシル、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルシトシン、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルケニルシトシン、５−フルオロシトシン、５−クロロウラシル、５−クロロシトシン、５−ブロモウラシル、５−ブロモシトシン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、８−アザプリンもしくは７−デアザ−７−置換プリンである、請求項３〜１９のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体。
【請求項２１】
塩基配列が、がん抑制遺伝子、がん遺伝子もしくはテロメラーゼの部分またはそれらの転写産物に対するものである、請求項３〜２０のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体。
【請求項２２】
ＰＮＡ部分の塩基配列が、ＨＡ−ｒａｓ  ｍＲＮＡの翻訳開始部位に対するものである、請求項２１に記載のＰＮＡ誘導体。
【請求項２３】
医薬として使用される、請求項１〜１２または１５〜２２のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体。
【請求項２４】
腫瘍の治療のための医薬を製造するための、請求項１〜１２または１５〜２２のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体の使用。
【請求項２５】
診断薬として使用するための、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体。
【請求項２６】
微生物および／またはウイルスを検出するための、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体の使用。
【請求項２７】
核酸を検出および／または定量するための、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体の使用。
【請求項２８】
ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションまたは蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション用の検出試薬としての、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体の使用。
【請求項２９】
アンチセンス剤、アンチ遺伝子剤、おとり剤またはキメラプラスト剤としての、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体の使用。
【請求項３０】
分子ビーコンとしての、請求項１３または１４に記載のＰＮＡ誘導の使用。
【請求項３１】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体を含む、検出試薬。
【請求項３２】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体を含む、ＰＮＡチップ。
【請求項３３】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体を含む、バイオセンサー。
【請求項３４】
請求項１〜１２または１５〜２２のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体、必要に応じて、他の生理学的に許容される添加剤および／または賦形剤を含む、医薬。
【請求項３５】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体を含む、アンチセンス剤、アンチ遺伝子剤、おとり剤またはキメラプラスト剤。
【請求項３６】
ａ）アミド核酸のＣ末端を、固相に結合したリン酸化試薬に連結させること、または、Ｃ末端がリン酸化されたアミド核酸を固体支持体に結合させること、
ｂ）ＰＮＡオリゴマーの主鎖を、アミド核酸単量体とカップリングすることによって連続的に延長させること、
ｃ）必要であれば、Ｎ末端をリン酸化試薬と反応させること、
を含む、式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体の調製方法。
【請求項３７】
ＰＮＡが、ｔ−ブチロキシカルボニル（ＢＯＣ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはモノメトキシトリチル（Ｍｍｔ）保護基を用いて調製される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ＰＮＡが固相支持体を用いて調製される、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
固相支持体として、ＣＰＧ、テンタゲルまたはアミノメチルポリスチレンを用いる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ａ）請求項１〜１２または１５〜２２のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体を調製すること、および
ｂ）さらに、必要に応じて、薬理学的に許容される添加剤および／または賦形剤を該誘導体に加えること、
を含む、医薬の製造方法。
【請求項４１】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体を初めに調製し、次に固相支持体に固定するか、または、ＰＮＡ誘導体を支持体上に直接調製するかのいずれかである、ＰＮＡチップの製造方法。
【請求項４２】
リン基の酸性の特徴を利用して、クロマトグラフィーまたは電気泳動によってＰＮＡを精製することをさらに含む、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体の調製方法。
【請求項４３】
ＰＮＡ誘導体を、塩基性固定相および酸または塩を含む溶離液の濃度勾配を用いたクロマトグラフィーによって精製することを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
固定相は、陰イオン交換体または混合モード相である、請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、改良された特性を有する、カルボキシル末端をリン酸化した、および、カルボキシ／アミノ末端をリン酸化したリン酸化ポリアミド核酸（ＰＮＡ）誘導体、その使用、および薬剤、ならびにその調製方法に関する。
ポリアミド核酸は、ペプチド核酸（ＰＭＡ）とも称され、天然オリゴヌクレオチドより高い親和性で相補標的配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に結合し、さらに、天然ＤＮＡに比べて、血清中で非常に安定であるという利点を有する。ＰＮＡは、当初、全ての糖−リン酸主鎖がＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位で置換された非天然核酸類似体として説明された（Ｍ． Ｅｇｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４， １４９７−１５００； ＷＯ ９２／２０７０２； Ｍ． Ｅｇｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ （１９９３） ３６５， ５６６−５６８； Ｐ． Ｎｉｅｌｓｅｎ， （１９９４） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ５， ３−７； Ｅ． Ｕｈｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３７， ２７９６−２８２３）。用いられた塩基は、天然に存在する核酸塩基やヌクレオチド化学で慣用のもの、または天然に存在しない核酸、もしくはそれらのプロドラッグ型、すなわち体内で生体内変化により遊離塩基へのみ転換する前駆物質である。これに加えて、ＰＮＡは、主鎖の全ての位置に塩基残基を有するわけではないこと（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ ８２， ２１５１）、アミノエチルグリシンがより複雑な単位で置換されていること（Ｕｈｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． ３７， ２７９６； Ｆａｌｋｉｅｗｉｃｚ （１９９９） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｐｏｌ．， ４６， ５０９−５２９）が説明されている。
【０００２】
ＰＮＡ主鎖が実効電荷を全く持たないということは、この種の物質の重要な特徴であり、遠大な重要性を有する。ＰＮＡが、ワトソン−クリック塩基対の規則に従って低い塩濃度でも相補ＤＮＡまたはＲＮＡに結合するのは（例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ； Ｐｅｔｅｒ Ｅ． Ｎｉｅｌｓｅｎ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｅｇｈｏｌｍ （Ｅｄｉｔ．） Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９９， ３）、ＰＮＡの中性特徴と、それに関連する電荷反発の減少のためである。この理由のために、ＰＮＡは、天然オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体が別の方法で用いられるような多数の用途に大概用いることができる。さらにこれに加えて、独特な結合特性により、天然オリゴヌクレオチドでは不可能な多くの用途をも確実にする（例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ； Ｐｅｔｅｒ Ｅ． Ｎｉｅｌｓｅｎ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｅｇｈｏｌｍ （Ｅｄｉｔ．） Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９９を参照）。例えば、ＰＮＡを用いると、二本鎖ＤＮＡの鎖の逆位が観察された。
【０００３】
ＰＮＡに関する用途の典型的な例としては、配列特異的な方法によって細胞のＤＮＡまたはＲＮＡに結合することにより遺伝子発現を阻害するのにＰＮＡを使用することがあげられる。「アンチセンス剤」は、ワトソン−クリック塩基対の方法で相補ｍＲＮＡに結合し、その相当するタンパク質への翻訳を阻害するような、短い、単鎖の核酸誘導体である（Ｕｈｌｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｅｙｍａｎ（１９９０） Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９０， ５４３； Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １４８９， １５９）。「アンチ遺伝子剤」は、フーグスティーン型塩基対を介してＤＮＡ二重らせんの主溝に結合し、三重らせんを形成し、遺伝子転写を配列特異的な方法によって阻害する（Ｐｒａｓｅｕｔｈ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １４８９， １８１）。また遺伝子発現は、転写因子を結合させるための領域に類似した、いわゆるおとりオリゴマーによって特異的に阻害できる。おとり剤で処理することによって、特定の転写因子を配列特異的な方法で捕獲し、それによる転写の活性化を阻害することができる（Ｍｉｓｃｈｉａｔｉ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４， ３３１１４）。細胞内で作用するオリゴヌクレオチドの他の群、すなわちキメラプラストは、特異的な遺伝子の校正に用いられる（Ｃｏｌｅ−Ｓｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３， １３８９−１３８９）。
【０００４】
従って、ＰＮＡは、医薬および／または診断薬として用いることができ、または、医薬および／または診断薬を製造するために用いることができる。
例えば、ＰＮＡは、ビオチン、フルオレセインまたは他の標識で標識した後、診断目的で用いることができ、さらに、分子生物学において特異的なハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。これまで、標識基の導入に関する４種の方法が文献で説明されている（Ｏｅｒｕｍ ｅｔ ａｌ． （１９９９）、ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐａｇｅｓ ８１−８６； Ｌｏｈｓｅ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ８， ５０３）。第一の方法は、遊離の（脱保護された）ＰＮＡを溶液中で合成した後に標識することに基づく。この方法で、ＰＮＡのアミノ末端は活性化カルボン酸またはイソチオシアネートと反応する。しかしながら、追加のリシン残基がしばしばＰＮＡに導入され、これら残基はその後フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）と反応する。
【０００５】
第二の方法では、保護されたＰＮＡは、まだ固相上にある間に、そのアミノ末端が活性化カルボン酸誘導体またはイソチオシアネートで修飾される。この方法は、標識基が、ＰＮＡの除タンパク中および支持体からの分離中における状況下でも安定である場合にのみ適切である。両方の方法で好ましく用いられる反応試薬は、イソチオシアネート（Ｐ． Ｗｉｔｔｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３７５， ２７）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）のような活性化カルボン酸（Ｏｅｒｕｍ ｅｔ ａｌ．， １９９９）である。ＮＨＳ誘導体を用いる反応の不利益は、しばしば不十分な収量にしか到達しないことである。この理由として、これはＰＮＡと標識基との間のリンカーまたはスペーサーとしての８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸がしばしば凝集することがある（Ｏｅｒｕｍ ｅｔ ａｌ． １９９９）。両方の結合はアミド結合またはチオウレア結合を介して形成されるが、それ自体を不溶性にしてしまうことがある。別な方法では、カルボン酸を、ペプチド化学において慣用のもの、例えばＨＢＴＵ、ＴＢＴＵまたはＨＡＴＵのような活性化剤を用いて反応させる。
【０００６】
【化６】
2004501211.tif 000002
【０００７】
第三の方法で、固相上でのＰＮＡ合成中にフルオレセイン複合単量体を用い、アミド結合を介してフルオレセイン標識を形成し（Ｌｏｈｓｅ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ８， ５０３）、ふたたび比較的溶解しにくい融合体にする。
【０００８】
第四の方法は、ＰＮＡペプチド複合体を用い、そのペプチド部分はプロテインキナーゼの基質になる（Ｋｏｃｈ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３６， ６９３３）。従って、この方法では、修飾されるのはＰＮＡ部分ではなく、むしろペプチド部分のセリン残基が酵素的にリン酸化される。従って、この方法を用いる場合、ＰＮＡペプチド複合体のペプチド部分に、例えばフルオレセインまたはビオチンのいずれでもなく放射性ホスフェートのみを導入することができる。
【０００９】
【化７】
2004501211.tif 000003
【００１０】
ＰＮＡは水溶液中で凝集する傾向があり、すなわち生理的条件下でも同様であることが知られている。従って、ＰＮＡは、水性緩衝液中での可溶性が不十分であり、そのため相補配列へのハイブリダイゼーションに利用できない。その上、ＰＮＡは、オリゴマーを精製するのに用いられるＳｅｐｈａｄｅｘ：登録商標（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）、Ｂｏｎｄ Ｅｌｕｔ：登録商標（Ｖａｒｉａｎ製）などの様々な材料または様々なＨＰＬＣクロマトグラフ材料に高い親和性を有し、これは、ＰＮＡがしばしば不十分な収率でしか分離されないことを意味する。従って、ＰＮＡとリシンまたは他の正電荷を有するアミノ酸とを（Ｃ末端を介して）融合する必要がある（Ｅｇｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ （１９９２） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１４， １８９５）。グアニンの多いＰＮＡ配列は、非常に独特な凝集傾向を有し、そのため、このようなＰＮＡを用いないことが勧められる（“Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ＰＮＡ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ” ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （１９９９） ｐａｇｅｓ ２５３−２５５を参照）。例えば、比較的長いフルオレセイン標識ＰＮＡオリゴマーは特に溶解しにくく、有機溶媒の添加や５０℃への加熱が推奨される。
【００１１】
可溶性が不十分な親油性ＰＮＡ誘導体を精製することは特に難しい。ＰＮＡ凝集による数種のピークが、ＨＰＬＣでしばしば検出される。ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）ゲル電気泳動技術は、核酸を精製し分離するのに頻繁に用いられるが、これらＰＮＡ誘導体には用いることができない。
【００１２】
上述のＰＮＡを得る方法では、標識基は常にアミド結合またはチオアミド結合を形成することによって導入され、比較的溶解しにくいＰＮＡ誘導体が形成される。特に、フルオレセインのような親油性残基が導入された場合、可溶性が不十分なＰＮＡ誘導体が形成される。ＰＮＡの２つの末端にマーカーを挿入することは、技術的にさらにより難しく、一般的に溶解性がより不十分になる。加えて、ＰＮＡのアミノ末端およびカルボキシル末端を同時に誘導する、特に固相合成方法を用いた有効な方法は説明されていない。その上、標識化反応がしばしば不十分な収率で進行するため、達成すべき目的は、高収率での調製が可能であり、改善された溶解性、改善された結合反応およびより優れた細胞吸収などの有利な特性を示し、さらに加えて、ＰＮＡオリゴマーを精製するための効率的な方法を使用できる、利用可能な新しいＰＮＡ誘導体を製造するにすることにある。本発明によれば、この目的は、ＰＮＡ主鎖のＣ末端またはＣ末端およびＮ末端に１以上のホスホリル基を有する、利用可能なＰＮＡ誘導体を製造することによって達成され、該ＰＮＡ誘導体は、オキソホスホリル基に加えてチオホスホリル基およびイミノホスホリル基も含み、少なくとも１つのホスホリル基が１以上の脱プロトン化できる基、好ましくはヒドロキシル基またはメルカプト基を有する。ホスホリル基は、それぞれ直接的またはスペーサーを介して、酸素−リン結合、硫黄−リン結合または窒素−リン結合を介してＰＮＡ主鎖に結合し、該スペーサーは、例えばアルカノイルアミド、ポリ（アルコキシ）カルボキシアミドまたはアミノ酸であることが可能である。ホスホリル基の例としては、ホスフェート基、ホスホネート基、チオホスフェート基、ホスホアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄａｔｅ）基および置換ホスホリル基があり、置換ホスホリル基は、必要に応じて、１以上の標識基、または架橋のための基、または細胞内吸収を促進する基、またはＰＮＡ誘導体の核酸への結合親和性を高める基を有する。
【００１３】
この点について、標識基（標識）は、ＰＮＡ誘導体の化学的または生物学的活性を質的または量的に評価できる基であることとし、例えばビオチンまたはフルオレセインである。架橋は、空間的に隣接した官能基間での分子内または分子間の結合を形成するものとする。架橋のための基の例としては、ソラレン基がある。
【００１４】
本発明は、好ましくは、式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体および前記式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体の生理学的に許容される塩に関する。
【化８】
2004501211.tif 000004
　式中、
ｑは、０または１であり、
Ｄ’は、ヒドロキシル、メルカプト、アミノ、アルキルアミノまたはアシルアミノ、好ましくはアセチルアミノであり、
Ｖは、それぞれ独立して、酸素、硫黄、ＮＲ１であり、
Ｖ’は、それぞれ独立して、酸素、硫黄、ＮＲ１、Ｕ−（ＣＲ３Ｒ４）ｕ’−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ基またはＵ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｕ’−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ基であり、
Ｕは、それぞれ独立して、酸素、硫黄またはＮＨであり、
ｕ’は、それぞれ独立して、１〜１０、好ましくは１〜４、特に好ましくは１であり、
ＷおよびＷ’は、それぞれ独立して、酸素、硫黄、ＮＲ１であり、
ＹおよびＹ’は、それぞれ独立して、ヒドロキシル、メルカプト、オキシアニオン、チオエートまたはＮＲ１Ｒ２であり、
【００１５】
ＸおよびＸ’は、それぞれ独立して、Ｕ−（Ｃ２〜Ｃ２２−アルカンジイル）−Ｕ基またはＵ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｕ’基であり、
または、標識基もしくは架橋のための基、または細胞内吸収を促進する基、またはＰＮＡ誘導体の核酸への結合親和性を高める基であり、例えば、二官能価のフルオレセイン、ローダミン、ＴＡＭＲＡ、ビオチン、ピレン、ジニトロフェニル基、コレステリル基、アクリジン、アダマンチル基、ビタミンＥ、シアニン色素、Ｄａｂｃｙｌ、ＥＤＡＮＳ、レキシトロプシン、ソラレン基、ＢＯＤＩＰＹ基、ＲＯＸ基、Ｒ６Ｇ基またはジゴキシゲニン基であり、
【００１６】
ＺおよびＺ’は、それぞれ独立して、ヒドロキシル、メルカプト、オキシアニオン、チオエートまたはＮＲ１Ｒ２、Ｃ１〜Ｃ２２アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アリールアルキル、Ｃ１〜Ｃ２２アルキル−Ｕ、Ｃ１〜Ｃ８アリールアルキル−Ｕ、ヒドロキシ−Ｃ１〜Ｃ１８−Ｕ、アミノアルキル−Ｕまたはメルカプトアルキル−Ｕであり、
または、式Ｒ７（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｍで示される基であり、式中、Ｒ７はヒドロキシル、アミノまたはＣ１〜Ｃ２２アルコキシであり、ｍは１〜１００、好ましくは２〜１０であり、
または、標識基もしくは架橋のための基、または細胞内吸収を促進する基、またはＰＮＡ誘導体の核酸への結合親和性を高める基であり、例えば、一官能価または二官能価のフルオレセイン、ローダミン、ＴＡＭＲＡ、ビオチン、ピレン、ジニトロフェニル基、コレステリル基、アクリジン、アダマンチル基、ビタミンＥ、シアニン色素、Ｄａｂｃｙｌ、ＥＤＡＮＳ、レキシトロプシン、ソラレン基、ＢＯＤＩＰＹ、ＲＯＸ基、Ｒ６Ｇ基またはジゴキシゲニン基であり、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素を含む基またはＣ１〜Ｃ６アルキル、好ましくは水素であり、
【００１７】
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素を含む基もしくはＣ１〜Ｃ６アルキル、またはアミノ酸側鎖の基、好ましくは水素であり、Ｖ’における隣接したＲ３基およびＲ４基はまたＣ５〜Ｃ８シクロアルキル環を形成することができ、
ｎは、０〜１０、好ましくは０〜３であり、
ｍは、０〜１０、好ましくは０〜３であり、
ただし、少なくとも１つのＹ基、Ｙ’基またはＺ基、Ｚ’基は、ヒドロキシル、メルカプト、オキシアニオンまたはチオエートである。
【００１８】
｛ＰＯＬＹ｝基は、式ＩＩで示される。
【化９】
2004501211.tif 000005
　ここで｛ＢＬＯＣＫ｝は、それぞれ独立して、式ＩＩＩＡ、
【化１０】
2004501211.tif 000006
【００１９】
または式ＩＩＩＢ（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ ８２， ２１５１）
【化１１】
2004501211.tif 000007
または、式ＩＶＡ〜ＩＶＧ（Ｕｈｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． ３７， ２７９６； Ｆａｌｋｉｅｗｉｃｚ （１９９９） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｐｏｌ．， ４６， ５０９−５２９）
【化１２】
2004501211.tif 000008
から選択される基であり、式中、それぞれの｛ＢＬＯＣＫ｝構築ブロックは異なってよく、
【００２０】
さらに、
Ｚ’’は、０〜１００、好ましくは１〜２０、特に好ましくは４〜１５であり、  Ｇは、（ＣＲ５Ｒ６）ｕ’基、Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＲ１Ｒ２）ｔ’基、またはＣ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｕ’−ＣＨ２ＣＨ２基から選択され、ここでｕ’は前述した意味であり、ｔ’は２〜１０、好ましくは６であり、
Ａは、それぞれ独立して、（ＣＲ１Ｒ２）ｓ基であり、ここでｓは１〜３、好ましくは１であり、
Ｂは、それぞれ独立して、ヘテロ芳香族の特徴を有し得る芳香族基、または水素、またはヒドロキシル、またはＣ１〜Ｃ１８アルキルのいずれかであり、
または、天然に存在しかつヌクレオチド化学で慣用の核酸塩基、または天然に存在しない核酸塩基、またはそれらのプロドラッグ型であり、ただし少なくとも１つのＢ基は核酸塩基であり、
Ｄは、それぞれ独立して、（ＣＲ３Ｒ４）ｔ基であり、ここでｔは２〜１０、好ましくは２〜４、特に好ましくは２であり、
Ｅは、それぞれ独立して、（ＣＲ５Ｒ６）ｕ’基であり、ここで隣接したＲ５基およびＲ６基はまた、Ｃ５〜Ｃ８シクロアルキル環またはスピロ化合物を形成することができ、
Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、水素を含む基、またはＣ１〜Ｃ６アルキル、またはアミノ酸側鎖の基、好ましくは水素であり、
さらに、ｕ’、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は上記と同じ意味である。
【００２１】
生理学的に許容される塩は、特に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８５） Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， ＵＳＡ， ｐａｇｅ １４１８で説明される。好ましくは、アンモニウム塩、トリアルキルアンモニウム塩、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩やカリウム塩）およびアルカリ土類金属塩（例えばマグネシウム塩やカルシウム塩）である。特に好ましくはナトリウム塩である。
【００２２】
見出された驚くべき正電荷の効果は、例えばホスフェートなどのようなホスホリル基を親油性誘導体（例えばヘキサデシルホスホジエステルのような）に導入することにより、相補ＤＮＡまたはＲＮＡへのＰＮＡの親和性が高められることであった。この効果は予想外であり、なぜならＰＮＡの相補ＤＮＡまたはＲＮＡへの強い結合は、ＰＮＡの中性特徴と、それに関連する電荷反発の減少によるものだからである（例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ； Ｐｅｔｅｒ Ｅ． Ｎｉｅｌｓｅｎ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｅｇｈｏｌｍ （Ｅｄｉｔ．） Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９９， ３）。
【００２３】
ビオチンは、ホスホリル基を介して特に効率的に導入された。ハイブリダイゼーションプローブとして用いる場合、式Ｉで示されるビオチン化ＰＮＡ（Ｘ、Ｘ’、Ｚおよび／またはＺ’がビオチン基）は、相当するビオチン化ＤＮＡプローブより、優れた結合特性を示し、かつ、誤りの非特異的なバックグラウンドエフェクトが少なかった。
また、電荷を持たないＰＮＡとは異なり、本発明に係る式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体は、電場に移動することができ、それにより該ＰＮＡ誘導体をミクロレベルで位置確認し（ｍｉｃｒｏｌｏｃａｔｅ）、固定化相補核酸誘導体上にそれらを濃縮することができる。ポリ陰イオン系オリゴヌクレオチドの場合、電場を用いた本方法は、塩基のミスマッチの迅速な決定としてすでに説明されている（Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４， １１１９）。
【００２４】
本発明に係るＤＮＡ誘導体のホスホリル基のヒドロキシ置換基またはメルカプト置換基を、ｐＨ４．５〜１４、好ましくは６．５〜１２、特に好ましくは６．５〜９の範囲で脱プロトン化することができる。ホスホリル基のイオン化特性を、式Ｉで示される化合物の精製に有利に用いることができる。一方で、式Ｉで示される化合物は、電気泳動、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製することができる。一方で、陰イオン交換体を用いて該化合物を精製することもできる。この場合、所望の生産物は、塩濃度勾配、例えば塩化ナトリウム濃度勾配、またはｐＨ勾配を用いて溶出させることが好ましい。本発明に係る式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体は、陰イオン交換体を用いて特に簡単かつ効率的に精製できる。電荷を有する生産物はカラムに吸着するが、電荷を持たない副産物は陰イオン交換体に吸着しないことが見出された。水で洗浄した後、酢酸または塩化ナトリウム溶液を用いて、所望の生産物を純粋な形態で分離することができた。用いられた陰イオン交換体は、好ましくは強陰イオン交換体または混合モード相であり、例えばＯａｓｉｓ ＭＡＸ：登録商標（Ｗａｔｅｒｓ ＧｍｂＨ， Ｅｓｃｈｂｏｒｎ）である。
【００２５】
さらに、本発明に係る式Ｉで示される化合物は、ホスホリル基を有さない相当ＰＮＡオリゴマーに比べて、概して水性媒体により容易に溶解するということが見出された。フルオレセイン誘導体またはヘキサデシル誘導体のような親油性誘導体の場合、水性媒体への可溶性が大きく改善されるため、このような特徴が特に著しく明白である。
本発明は、特に、ＡおよびＥがＣＨ２であるＰＮＡ誘導体に関する。さらに本発明は、特にＤ置換基が（ＣＨ２）２であるＰＮＡ誘導体に関する。また好ましくは、ＷおよびＷ’がオキソである式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体、さらに、ＹおよびＹ’がヒドロキシルまたはオキシアニオンである前記ＰＮＡ誘導体、および、ＶおよびＶ’がオキシである前記ＰＮＡ誘導体である。
【００２６】
天然の塩基の例としては、アデニン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、チミンおよびウラシルがある。非天然の塩基の例としては、プリン、２，６−ジアミノプリン、Ｎ４Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ６Ｎ６−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−（Ｃ３〜Ｃ６）−アルキニルウラシル、５−（Ｃ３〜Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−（１−プロパルギルアミノ）ウラシル、５−（１−プロパルギルアミノ）シトシン、フェノキサジン、９−アミノエトキシフェノキサジン、５−フルオロウラシルまたはシュードイソシトシン、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−アミノウラシル、シュードウラシル、ジヒドロウラシル、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルウラシル、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルシトシン、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルケニルシトシン、５−フルオロシトシン、５−クロロウラシル、５−クロロシトシン、５−ブロモウラシル、５−ブロモシトシン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、８−アザプリン、および７−デアザ−７−置換プリンがある。
【００２７】
Ｃ末端のみにホスホリル基を有するＰＮＡ誘導体（ｑが０である）の場合、Ｎ末端はペプチド配列を連結させることができる。適切なペプチド配列は、好ましくは、ＰＮＡの器官分布または細胞内局在を最適化した配列、例えばトランスポータン（ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）、インスリン様成長因子、核局在化シグナルまたは他のキャリアー配列である（Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １５９−１６６）。またペプチドも、親和性タグとして用いることができ、例えば（Ｈｉｓ）６鎖である。
【００２８】
本発明は、Ｘ基、Ｘ’基、Ｚ基およびＺ’基を広範囲に変化させることができ（例えば、図１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａおよび３ｂがある）、それによって、ＰＮＡに様々な特異的な機能特徴を導入することを可能にする。
【００２９】
ＺまたはＺ’の好ましい実施形態は、Ｃ１〜Ｃ２２アルキル基である。また、Ｃ１〜Ｃ２２アルコキシ基、特にＣ１６アルコキシ基も好ましい。他の好ましい基は、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ１８アルコキシ）基、特にＨＯ（ＣＨ２）３−１２Ｏである。また、アミノアルコキシ基、特に６−アミノヘキソキシ基や５−アミノペントキシ基も好ましい。また、式Ｒ７（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｍで示される基も好ましく、式中、Ｒ７はヒドロキシル、アミノまたはＣ１〜Ｃ２２アルコキシ、好ましくはヒドロキシルであり、ｍは０〜１００、好ましくは２〜１０である。特に、ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）２、ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）６およびＨ２Ｎ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）２が好ましい。ＺまたはＺ’の他の好ましい例としては、メルカプトアルコキシ基、特に６−メルカプトヘキシルオキシ基がある。
【００３０】
他の好ましい実施形態において、ＺまたはＺ’は、フルオレセイン、ローダミン、ＴＡＭＲＡまたはシアニン色素のような蛍光性の基を含む。好ましい蛍光性の基を、図１ａ〜３ｂに示す。また、Ｚがビオチンであることも特により好ましい。Ｚに関する他の好ましい基としては、Ｄａｂｃｙｌ、ソラレン基、アクリジン、ＤＮＰおよびコレステロール（図１ｂおよび図２ｂ）、ＢＯＤＩＰＹ基、ＲＯＸ基またはＲ６Ｇ基（Ｓｕ−Ｃｈｕｎ Ｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５５， ３２−３８）ならびにジゴキシゲニン（Ｔａｒｒａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｏｌｏｇｙ （１９９９） Ｖｏｌ． ３１３， ２５７−２６８）がある。
【００３１】
これに加えて、ＺまたはＺ’は、一官能価または二官能価のフルオレセイン、ローダミン、ＴＡＭＲＡ、ビオチン、ピレン、ジニトロフェニル基、コレステリル基、アクリジン、アダマンチル基、ビタミンＥ、シアニン色素、Ｄａｂｃｙｌ、ＥＤＡＮＳ、レキシトロプシン、またはソラレン基であり得る。一官能価の末端の基は、図１ａ、図１ｂ、図２ａおよび図３ａで示される例によって記載され、一方、二官能価の結合基は図２ｂおよび図３ｂに記載される。他の好ましい実施形態において、ｎおよび／またはｍは、それぞれ独立して、０であり、すなわちいずれの場合もＰＮＡ部分はＮ末端上および／またはＣ末端上にホスホリル基を１つだけ有する。
【００３２】
ＸまたはＸ’の好ましい例は、Ｕ−（Ｃ２〜Ｃ２２アルカンジイル）−Ｕ、特にＯ−（Ｃ２〜Ｃ２２−アルカンジイル）−Ｏであり、特に好ましくはＯ−（ＣＨ２）２−６−Ｏである。ＸまたはＸ’の他の好ましい実施形態は、式Ｕ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｕ’で示される基であり、式中、ｕ’は１〜１０、好ましくは１〜６であり、Ｕは好ましくはオキシである。さらに好ましい例において、ＸまたはＸ’は、フルオレセイン、ローダミン、ＴＡＭＲＡまたはシアニン色素（例えばＣｙ３：登録商標（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ））のような蛍光性の基を含む。好ましい二官能価の基を、図２ａおよび図３ａに示す。また、ＸまたはＸ’がビオチンであることが特により好ましい。好ましい他の基としては、Ｄａｂｃｙｌ、ソラレン基、アクリジン、ＤＮＰ、コレステロール、ＢＯＤＩＰＹ、レキシトロプシン、ジゴキシゲニン、ＲＯＸ基およびＲ６Ｇ基がある。
【００３３】
式Ｉ中のＸ、Ｘ’、ＺおよびＺ’に関する基を異ならせることにより、異なる機能を実現することができる。フルオレセイン基は、ＤＮＡ配列決定やシグナル増幅において、または、ＰＮＡの細胞吸収を測定するマーカーとして、広範な用途を有する。シアニン色素基（Ｃｙ３：登録商標およびＣｙ５：登録商標）により、フルオレセインそのものよりも実質的により強くかつより長期持続する蛍光シグナルを得る。ソラレン基は、相補核酸との架橋のために用いられる。アクリジン基は、有効な挿入剤であり、それによって、ＰＮＡの結合親和性を増大させることができる。またビオチン、アクリジンおよびソラレン誘導体も、アンチセンス実験用に用いることができる。加えて、ヘキサデシルオキシおよびコレステロール誘導体は、ＰＮＡが膜を通過する能力を高めるのに用いることができる。式Ｉで示されるＤＮＰで標識した化合物は、抗ＤＮＰ抗体を用いて検出することができる。アミノアルコキシ基は、他の基上にカップリングするのに用いることができ、例えばレキシトロプシンである（実施例１７；ＰＮＡ−１６を参照）。同様の方法において、メルカプトアルコキシ基もまたさらなる誘導のために用いることができる。
【００３４】
さらに本発明は、式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体の医薬としての使用に関する。これら医薬は、特定の遺伝子を発現または過剰発現することによって伴われる病気を予防および／または治療するのに用いることができる。さらに本発明は、ＰＮＡ誘導体の診断薬としての使用に関する。これら診断薬は、上述の病気を初期段階で診断するのに用いることができる。医薬または診断薬として用いる場合、式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体は、それらの配列に依存する、アンチセンス剤、アンチ遺伝子剤、おとり（ｄｅｃｏｙ）剤およびキメラプラスト剤として用いることができる。
【００３５】
本発明に係るＰＮＡ誘導体は、特に、特定の遺伝子が原因であるかまたはその過剰発現の結果として関与するような病気を治療するための医薬を製造するために用いられる。
これらの医薬は、例えば、ＣＭＶ、ＨＩＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、インフルエンザ、ＶＳＶ、Ｂ型肝炎ウイルスまたはパピローマウイルスのようなウイルスによって引き起こされる病気を治療するために、対応するウイルスの配列を標的にして用いられる。
【００３６】
これら標的に対して活性な本発明に係るアンチセンスＰＮＡ誘導体は、例えば以下の塩基配列を有する。
ａ）ＣＭＶに対して、例えば、
2004501211.tif 000009
ｂ）ＨＩＶに対して、例えば、
2004501211.tif 000010
ｃ）ＨＳＶ−１に対して、例えば、
2004501211.tif 000011
である。
【００３７】
またこのような医薬は、例えばがんを治療するのにも好適である。これに関連して、好ましくは、発がんまたはがんの成長に関与する標的に対して設定された配列を用いることができ、特にテロメラーゼを阻害する（Ｅ． Ｍａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７， １１５２）。この性質を有する追加の標的は、
１）ｃ−ｍｙｃ、Ｎ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｆｏｓ／ｊｕｎ、ＰＣＮＡ、ｐ１２０のような、核内がん遺伝子産物、
２）ＥＪ−ｒａｓ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ｒｒｇ、ｂｃｌ−２、ｃｄｃ−２、ｃ−ｒａｆ−１、ｃ−ｍｏｓ、ｃ−ｓｒｃ、ｃ−ａｂｌ、ｃ−ｅｔｓのような、細胞質／膜関連がん遺伝子産物、
３）ＥＧＦ受容体、Ｈｅｒ−２、ｃ−ｅｒｂＡ、ＶＥＧＦ受容体（ＫＤＲ−１）、レチノイド受容体、プロテインキナーゼ調節サブユニット、ｃ−ｆｍｓ、Ｔｉｅ−２、ｃ−ｒａｆ−１キナーゼ、ＰＫＣ−α、およびプロテインキナーゼＡ（Ｒ１α）のような細胞受容体、
４）ＣＳＦ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ミエロブラスチンおよびフィブロネクチンのような、サイトカイン、成長因子および細胞外マトリックス
がある。
【００３８】
このような標的に対して活性なアンチセンスＰＮＡ誘導体は、例えば、以下の塩基配列を有する。
ａ）ｃ−Ｈａ−ｒａｓに対して、例えば、
2004501211.tif 000012
ｂ）ｂＦＧＦに対して、例えば、
2004501211.tif 000013
ｃ）ｃ−ｍｙｃに対して、例えば、
2004501211.tif 000014
ｄ）ｃ−ｍｙｂに対して、例えば、
2004501211.tif 000015
【００３９】
ｅ）ｃ−ｆｏｓに対して、例えば、
2004501211.tif 000016
ｆ）ｐ１２０に対して、例えば、
2004501211.tif 000017
ｇ）ＥＧＦ受容体に対して、例えば、
2004501211.tif 000018
ｈ）ｐ５３腫瘍サプレッサーに対して、例えば、
2004501211.tif 000019
ｉ）ｂｃｌ−２に対して、例えば、
2004501211.tif 000020
【００４０】
ｋ）ＶＥＧＦに対して、例えば、
2004501211.tif 000021
【００４１】
ｌ）ｃ−ｒａｆキナーゼに対して、例えば、
2004501211.tif 000022
ｍ）ＰＫＣ−αに対して、例えば、
2004501211.tif 000023
ｎ）プロテインキナーゼＡに対して、例えば、
2004501211.tif 000024
である。
【００４２】
さらに、式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体を含む医薬は、例えば、インテグリンや細胞−細胞接着受容体によって、例えばＶＬＡ−４、ＶＬＡ−２、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭまたはＥＬＡＭなどよってもたらされる病気を治療するのに適している。
【００４３】
このような標的に対して活性なアンチセンスＰＮＡ誘導体は、例えば、以下の塩基配列を有する。
ａ）ＶＬＡ−４に対して、例えば、
2004501211.tif 000025
ｂ）ＩＣＡＭ−１に対して、例えば、
2004501211.tif 000026
ｃ）ＥＬＡＭ−１に対して、例えば、
2004501211.tif 000027
ｄ）インテグリンα（Ｖ）に対して、例えば、
2004501211.tif 000028
である。
【００４４】
また式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体を含む医薬は、例えば再狭窄を防ぐのにも適している。これに関連して、増殖または遊走に関与する標的に対して設定されたＰＮＡ配列を用いることができる。このような標的の例は、
１）ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｆｏｓ／ｊｕｎ、サイクリンおよびｃｄｃ２キナーゼのような、核トランスアクチベータータンパク質およびサイクリン、
２）ＰＤＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦおよびＴＧＦ−βのようなマイトジェンまたは成長因子、
３）ｂＦＧＦ受容体、ＥＧＦ受容体およびＰＤＧＦ受容体のような、細胞受容体がある。
【００４５】
このような標的に対して活性であるアンチセンスＰＮＡ誘導体は、例えば、以下の塩基配列を有する。
ａ）ｃ−ｍｙｂに対して、例えば、
2004501211.tif 000029
ｂ）ｃ−ｍｙｃに対して、例えば、
2004501211.tif 000030
ｃ）ｃｄｃ２キナーゼに対して、例えば、
2004501211.tif 000031
ｄ）ＰＣＮＡ（ラットの増殖性細胞核抗原）に対して、例えば、
2004501211.tif 000032
である。
【００４６】
ＰＮＡ誘導体は、例えば白皮症や乾癬のような、白斑および他の色素脱失の病気もしくは色素脱失障害（例えば、皮膚、髪および目の）の治療、または、喘息の治療に、アデノシンＡ１受容体、アデノシンＡ３受容体もしくはブラジキニン受容体の発現、またはＩＬ−１３の発現を、適切なアンチセンス剤を用いて阻害することによって同様に用いられる。このような塩基配列の例は、
2004501211.tif 000033
である。
【００４７】
式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体を含む医薬は、例えば、医薬製剤の形態で用いることができ、該製剤は、例えば錠剤、被覆錠剤、ハードまたはソフトゼラチンカプセル、溶液、乳濁液または懸濁液の形態で経口投与することができる。また該製剤は、例えば座薬の形態で直腸内に投与することもでき、また、例えば注射用溶液の形態で非経口投与することもできる。医薬製剤を製造するために、これらの化合物は、治療上不活性な有機または無機の賦形剤中に加工され得る。錠剤、被覆錠剤およびハードゼラチンカプセル用のこのような賦形剤の例としては、ラクトース、コーンスターチまたはその誘導体、獣脂およびステアリン酸またはその塩がある。溶液を調製するのに適した賦形剤としては、水、ポリオール、スクロース、転化糖およびグルコースがある。注射溶液用の賦形剤に適した賦形剤としては、水、アルコール、ポリオール、グリセロールおよび植物油がある。座薬に適した賦形剤としては、植物油や水素化油、ワックス、脂肪および半液体のポリオールがある。また医薬製剤は、保存剤、溶媒、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、染料、着香料、浸透圧を変えるための塩、緩衝液、被覆剤、抗酸化剤、さらに必要に応じて、他の治療上活性な化合物を含ませることができる。
【００４８】
好ましい投与形態は、例えばカテーテルを用いることによる、または吸入、注射もしくは注入による、表面への適用、局所適用および経口投与である。注射に関して、式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体は溶液、好ましくは、ハンクス液やリンガー液のような、生理学的に許容される緩衝液に配合される。しかしながら、オリゴヌクレオチドを固形状のものに配合し、使用前に溶解または懸濁してもよい。計画的な投与で好ましい用量は、一日あたり、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００４９】
さらに本発明は、式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体および／またはその生理学的に許容される塩、加えて、製薬上問題のない賦形剤および／または添加剤を含む医薬製剤に関する。式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体および／またはその生理学的に許容される塩は、動物、好ましくは哺乳類、特にヒトに、医薬として投与することができ、ここで該医薬は、局所、経皮、非経口、腸内での使用が可能であり、通常の製薬上問題のない賦形剤および／または添加剤と共に少なくとも１種のＰＮＡ誘導体の有効量を活性成分として含む、それぞれの混合物または医薬製剤の形態である。該製剤は、通常、治療的に活性な化合物を、約０．１〜９０重量％含む。局所適用は、例えば軟膏、ローションまたはチンキ剤、乳濁液または懸濁液の形態で、皮膚病を治療することが好ましい。
【００５０】
該医薬製剤は、それ自体は既知の方法で製造され（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ． Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ．）、製薬上不活性な無機および／または有機賦形剤を用いる。丸剤、錠剤、被覆錠剤およびハードゼラチンカプセルを製造するには、例えば、ラクトース、コーンスターチおよび／またはその誘導体、獣脂、ステアリン酸および／またはその塩などを用いることができる。ソフトゼラチンカプセルおよび／または座薬用の賦形剤の例としては、脂肪、ワックス、半固体および液体のポリオール、天然油および／または水素化油などがある。溶液および／またはシロップを製造するのに適した賦形剤の例としては、例えば、水、スクロース、転化糖、グルコース、ポリオールなどがある。注射用溶液を製造するのに適した賦形剤としては、水、アルコール、グリセロール、ポリオール、植物油などがある。マイクロカプセル、インプラントおよび／またはロッドに適した賦形剤としては、グリコール酸や乳酸からなるコポリマーがある。当業者周知のリポゾーム製剤（Ｎ． Ｗｅｉｎｅｒ， Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐ Ｉｎｄ Ｐｈａｒｍ １５ （１９８９） １５２３； “Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｄｅｒｍａｔｉｃｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ １９９２）、例えば、ＨＶＪリポゾーム（Ｈａｙａｓｈｉ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３ （１９９６） ８７８）も適している。また皮膚への適用も、例えば、イオン泳動方法を用いて、および／またはエレクトロポレーションを用いてなされ得る。
【００５１】
活性化合物や賦形剤に加えて、医薬製剤は、添加剤、例えば、充填剤、増量剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、湿潤剤、安定剤、乳化剤、保存剤、甘味料、染料、着香料または芳香剤、増粘剤、希釈剤および緩衝物質、さらに、溶媒および／または可溶化剤および／または徐放性効果を達成するための物質、またさらに、浸透圧を変えるための塩、被覆剤および／または抗酸化剤を含んでよい。また該製剤は、２以上の異なる式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体および／またはその生理学的に許容される塩を含んでもよく、さらに、式Ｉで示される少なくとも１種のＰＮＡ誘導体に加えて、１以上の異なる治療的に活性な物質を含んでもよい。その用量は、広範囲に変動させることができ、各個人の場合における個人の状況にあわせて調節することができる。
【００５２】
さらに本発明は、式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体の、診断薬としての使用、特にＤＮＡ診断における補助としての使用、および分子生物学における使用に関する（例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ； Ｐｅｔｅｒ Ｅ． Ｎｉｅｌｓｅｎ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｅｇｈｏｌｍ （Ｅｄｉｔ．） Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９９を参照）。ＤＮＡ診断では、遺伝子プローブは、ＤＮＡプローブまたはハイブリダイゼーションプローブとも称されるが、特定の遺伝子の配列特異的検出において重要な役割を持つ。一般的に、遺伝子プローブは、認識配列および１以上の適切な標識基（標識）を含む。分析サンプル中の標的配列が相補遺伝子プローブとハイブリダイズすることによって同定されるような特異性は、認識配列およびその化学構造によって決定される。またこの技術はＰＮＡにも適用できる。天然構造を有するオリゴヌクレオチドと比べて、ＰＮＡは、標的配列に対するより高い親和性や、塩基を認識するより高い能力を有するという利点がある。
【００５３】
従って、式Ｉで示される化合物の使用は、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションや蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）にも関する。またｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションは、例えば、微生物やウイルスを検出するのにも用いることができる（Ｊｕｓｔ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒ． Ｍｅｔｈｏｄ． ７３， １６３−１７４）。本発明の化合物の他の用途は、核酸の検出および定量に関する。これに関して、その使用はアレイ技術で構成されることが好ましく（Ｓｔｒｏｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． （２０００） １２２， １２０５−１２０９； Ｎｉｅｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． （１９９９） １１１， ３０３９−３０４３； Ｐｉｒｒｕｎｇ （１９９７） Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９７， ４７３−４８８）、これは高いサンプルのスループットおよび高感度を提供する。この場合、ＰＮＡプローブは、適切な支持体またはＰＮＡチップ上に固定される。これを達成するために、ＰＮＡを実施例で説明されたように合成し、続いて支持体またはＰＮＡチップ上に固定することができる。あるいは、ＰＮＡを支持体上に直接調製してもよい。他の用途としては、核酸を検出するためのバイオセンサーとしての式Ｉで示される化合物の使用がある（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ （１９９６） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１８， ７６６７）。ヒスチジル−ＰＮＡのような、親和性標識を有する式Ｉで示されるＰＮＡの使用としては、核酸を精製する他の用途がある（Ｏｅｒｕｍ ｅｔ ａｌ． （１９９９）， ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）。
【００５４】
アミノ末端およびカルボキシル末端における２種のホスホリル基は、異なる機能を実現し得る。例えば、細胞吸収を高めるためにアミノ末端を親油的に置換することができ、改良された細胞吸収を検出するためにフルオレセイン残基をカルボキシル末端に設置する（実施例７のＰＮＡ−６を参照）。
また二様に誘導された式Ｉで示される化合物は、いわゆる「分子ビーコン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ）」として用いるのに適しており（Ｌｉ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍｉｅ １１２， １０９１−１０９４）、これは相補核酸への結合に関する蛍光シグナルのみを放出する。これらビーコンにおいて、ＰＮＡの１つの末端、例えばアミノ末端は、蛍光標識が与えられ、それに対して他方の末端、例えばカルボキシル末端は、消光剤が与えられる。その反対の場合、すなわちＮ末端が消光剤を有し、Ｃ末端が蛍光標識を有する場合も可能である。この場合、二様に標識されたＰＮＡ誘導体が相補核酸に結合しない限り、蛍光シグナルは抑制される。蛍光残基（例えばＥＤＡＮＳ）と消光剤（例えばＤａｂｃｙｌ）とが空間的に互いに離れた状態になり、蛍光シグナルが放出されるのは、結合に関してのみである（Ｓｏｋｏｌ ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９５， １１５３８）。
【００５５】
ＰＮＡ主鎖は、文献で説明された方法を用いて合成され、例えば、ｔｅｒｔ−ブチロキシカルボニル（ＢＯＣ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはモノメトキシトリチル（Ｍｍｔ）保護基による方法を用いる（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ； Ｐｅｔｅｒ Ｅ． Ｎｉｅｌｓｅｎ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｅｇｈｏｌｍ （Ｅｄｉｔ．） Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９９）。好ましくは、アミノエチルグリシンのアミノ官能基を一時的に保護するためのＭｍｔ保護基を用いることや、ヘテロ環式の核酸塩基上に塩基不安定性の保護基を用いることである（Ｄ． Ｗｉｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５１， １２０６９； Ｂｒｅｉｐｏｈｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５３， １４６７１−１４６８６）。単量体の構築ブロック（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋｓ）の例としては、式Ｖ〜ＶＤで示される化合物があり、Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、ｕ’およびＶ’は上記の意味である。ＰＧは、ベンゾイル基、アニソイル基、イソブチロイル基、アセチル基またはｔｅｒｔ−ブチルベンゾイル基のようなアミノ保護基である（Ｂｒｅｉｐｏｈｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５３， １４６７１−１４６８６）。ＴＲは、ジメトキシトリチル（Ｄｍｔ）（Ｖ’はＯおよびＳである）またはＭｍｔ（Ｖ’はＮＨである）のような、酸不安定性の保護基（ａｃｉｄ−ｌａｂｉｌｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）である。
【００５６】
【化１３】
2004501211.tif 000034
【００５７】
ＰＮＡ主鎖を構築した後、Ｎ末端の遊離アミノ官能基は、適切なリン酸化試薬と直接反応させることができ、例えば相当するホスホアミダイト（式ＩにおいてＶ’はＮＲ１である）を得る。
【００５８】
ホスホリル基は、ヌクレオチド化学で用いられる慣用の試薬を用いて導入されることができる。式Ｉで示される化合物を調製するのに用いることができる多数のリン酸化試薬がある。試薬の選択は図４ａ〜図４ｄに示されるが、本発明はこれら特定の誘導体に限定されない。適切に修飾された支持体、特に固相合成用のＣＰＧ支持体は、カルボキシル末端修飾に用いられる。このような支持体の例は図６に記載される。
【００５９】
用いられるリン酸化試薬としては、ヌクレオチド化学において慣用の試薬を用いることができ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓｔｅｒｌｉｎｇ， ＶＡ ２０１６４， Ｕ．Ｓ．Ａ．；図４ａ〜図４ｄ）、これらは例えばホスホアミダイト方法、Ｈ−ホスホネート方法またはホスホトリエステル方法に従って反応する（Ｅ． Ｓｏｎｖｅａｕｘ （１９８６） Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １４， ２７４； Ｓ． Ｌ． Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｒ． Ｐ． Ｉｙｅｒ （１９９３） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９， １９２５； Ｅ． Ｕｈｌｍａｎｎ ａｎｄ Ａ． Ｐｅｙｍａｎ （１９９０） Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９０， ５４３）。可能な修飾の広範な多様性は、多数の既知のリン酸化試薬および適切に誘導された支持体、特に多孔質ガラス（ＣＰＧ）支持体によって決定される。また、テンタゲル（Ｔｅｎｔａ Ｇｅｌ）：登録商標（Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ＧｍｂＨ， Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ）およびアミノメチルポリスチレンも固体支持体として好ましく用いられる。
【００６０】
また原則的に、ヌクレオチド化学において既知の試薬全てはホスホリル官能基の導入に適しており、特に適したものは、式ＶＩＡ、ＶＩＢ、ＶＩＣおよびＶＩＤで示される以下の試薬である。
【化１４】
2004501211.tif 000035
　式中、Ｋはハロゲン、好ましくはＣｌ、トリアゾリル、イミダゾリルまたはジアルキルアミノであり、Ｗは上述の意味かまたはＷ’の意味であり、Ｚは上述の意味か、またはＸ、Ｘ’またはＺ’の意味であり、反応性基は適切に保護される。
【００６１】
例えば、フルオレセイン−ホスホアミダイト３（図４ａ）のヒドロキシル基は、ピバル酸でエステル化することによって保護される。
式ＶＩで示される化合物は、このような試薬の例としてのみ認識され、これらは、必要に応じて、塩基、酸または縮合剤のような他の補助剤をさらに存在させて反応する。特に好ましくは、式ＶＩＡで示される試薬であり、これはホスホアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法に従って反応する（Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｉｙｅｒ， １９９３）。これらの試薬は、リン（ＩＩＩ）化合物として反応させ、続いて酸化させる。例えば、酸化がヨウ素／水／ピリジンまたはｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドを用いてなされる場合、その結果、ホスホリル誘導体（ＷはＯである）が得られる。一方で、酸化が硫黄原子またはＢｅａｕｃａｇｅ試薬を用いてなされる場合、その結果、相当するチオホスホリル化合物（ＷはＳである）が得られる。
【００６２】
試薬（図４ａ〜４ｄ）は、「二官能価試薬」としても見出され、初めに保護される第二の基を有するため数回反応させることができる。ホスホアミダイト４、６および８〜１３は、このような二官能価試薬の例である。これに関連して、試薬の複数の融合か、または異なる試薬との継続的な反応が問題となり得る。従って、例えば、フルオレセイン−ホスホアミダイト３は、１回だけ反応させることができる。これに対して、フルオレセイン−ホスホアミダイト４はＤｍｔ基で保護されたヒドロキシル基を有し、これはＤｍｔ基を除去した後にリン酸化剤と再び反応することができる。この方法では、１種の同じ基かまたは異なる基を数回導入することができる。ＰＮＡ−６は、カルボキシル末端における複数の融合、および、アミノ末端における追加の修飾の例である。まずフルオレセインおよびアミノリンカーを、カルボキシル末端に連続して合成する。ＰＮＡ部分を合成した後、ヒドロキシエチルグリシン−ｔ構築ブロックを最後のサイクルでカップリングし、この構築ブロックを、Ｃ１６−リン酸化試薬７と反応させる。ＰＮＡ−１およびＰＮＡ−２は、カルボキシル末端のみがホスホリル基で修飾された式Ｉで示される化合物（ｑは０である）である。この種の物質は、同様に新規であり、本発明の主題の一部である。図５ａおよび５ｂは、式Ｉで示される化合物のＮ末端修飾に関するいくつかの化合物型の例を示す。化合物型Ａは、ＰＮＡの末端ヒドロキシル基をリン酸化試薬１と反応させることによって得られる。化合物型Ｂは、ＰＮＡの末端アミノ基をビオチン−ホスホアミダイト５と反応させることによって得られる。化合物型Ｃは、末端ヒドロキシル基を有するＰＮＡをスペーサー１８ホスホアミダイト９、アミノ変性剤−５ホスホアミダイト１２およびレキシトロプシンと連続的に反応させることによって得られる。化合物型Ｄは、末端ヒドロキシル基を有するＰＮＡを、スペーサー−９ホスホアミダイト８およびシアニン−３ホスホアミダイト１０と連続的に反応させることによって得られる。化合物型Ｅは、末端ヒドロキシル基を有するＰＮＡを、二官能価フルオレセイン−ホスホアミダイト４、スペーサー−９ホスホアミダイト８、およびＣ１６−リン酸化試薬７と連続的に反応させることによって得られる。酸化や保護基の除去のような実行すべき追加の処置は、実施例で説明される。
【００６３】
式ＶＤで示されるホスホアミダイトを用いて得られたＰＮＡのカルボキシル末端修飾の例は、図７で説明される。この場合、出発原料は、ビスヒドロキシエチルスルホン支持体１（図６）であり、該支持体を、３％トリクロロ酢酸でＤｍｔ基を除去した後、触媒としてテトラゾールを用いて、式ＶＤで示されるホスホアミダイトと反応させる。ヨウ素溶液で酸化した後、アミノ末端のＭｍｔ基を３％トリクロロ酢酸で除去し、次にＰＮＡ部分を、文献で既知の方法、例えば以下で説明されるＭｍｔ方法を用いて合成する。カルボキシル末端修飾のための代替法は、ＣＰＧ支持体を用いる方法であり、該支持体は、導入される基に従って修飾され、結果的に例えば蛍光基を含む（図８）。この方法は、ヘキサデシルホスフェート基でアミノ末端が修飾され、かつフルオレセインホスフェートでカルボキシル末端が修飾されるＰＮＡ誘導体の例を用いて説明される。フルオレセイン支持体３（図６）は、まず第一にトリクロロ酢酸で脱トリチル化され、次に、テトラゾールを用いて、アミノ変性剤Ｃ６ホスホアミダイト１３（図４ｄ）で縮合する。ヨウ素溶液で酸化し、Ｍｍｔ基を除去した後、ＰＮＡ部分を通常の方法で合成することができる。最後のサイクルで、ヒドロキシエチルグリシンを基礎としたＰＮＡ構築ブロック（式ＶＡ、ｕ’は２であり、Ｖ’は酸素である）をカップリングし、この構築ブロックを、Ｃ１６リン酸化試薬７を用いてＤｍｔ保護基を除去した後、図９で示すように反応させる。全ての保護基を除去し、ＣＰＧ支持体から分離した後、二様に修飾されたＰＮＡ誘導体を得る。
【００６４】
【実施例】
以下の化合物の調製は、実施例によって説明される。
ＰＮＡ−１：
【化１５】
2004501211.tif 000036
　ＰＮＡ−２：
【化１６】
2004501211.tif 000037
　ＰＮＡ−３：
【化１７】
2004501211.tif 000038
【００６５】
ＰＮＡ−４：
【化１８】
2004501211.tif 000039
　ＰＮＡ−５：
【化１９】
2004501211.tif 000040
【００６６】
ＰＮＡ−６：
【化２０】
2004501211.tif 000041
　ＰＮＡ−７：
【化２１】
2004501211.tif 000042
【００６７】
ここで、１３塩基の配列は、それぞれの場合において配列番号５３に記載されており、ｚ’’はそれぞれの場合において１０である。
2004501211.tif 000043
【００６８】
実施例１：
ＰＮＡ鎖の合成
以下の試薬をＰＮＡ部分の調製に用いた。
１．ホスホアミダイト試薬（０．１Ｍ、アセトニトリル（ＡＣＮ）中）
２．Ｍｍｔ−ＰＮＡ単量体および／またはＤｍｔ−ｏｅｇ−ＰＮＡ単量体（０．２Ｍ、ＤＭＦ：ＡＣＮ（１：１；ｖ：ｖ）中）
３．無水ＡＣＮ（水は３０ｐｐｍ以下）
４．トリクロロ酢酸（３％）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中
５．無水酢酸、２，６−ルチジン、ＴＨＦ中（１：１：８；ｖ：ｖ：ｖ）；（Ｃａｐ Ａ）
６．Ｎ−メチルイミダゾール（１６％）、ＴＨＦ中；（Ｃａｐ Ｂ）
７．ヨウ素溶液（０．０５Ｍ）、ＴＨＦ、水、ピリジン（７：２：１；ｖ：ｖ：ｖ）中
８．洗浄溶液（ＴＨＦ、水、ピリジン（７：２：１；ｖ：ｖ：ｖ））
９．テトラゾール（０．３Ｍ）、ＡＣＮ中
１０．ＨＢＴＵ；０．２Ｍ、ＤＭＦ：ＡＣＮ（１：１；ｖ：ｖ）中
１１．ＤＩＰＥＡ；０．２Ｍ、ＤＭＦ：ＡＣＮ（１：１；ｖ：ｖ）中
１２．ＤＭＦ（＞９９．５％）
１３．固相支持体：Ｍｍｔ−アミノヘキサ−１−イルヘミスクシネートを装填したアミノプロピル−ＣＰＧ（５５０Å）（ＰＮＡ−ヘキシルアミド用）
Ｍｍｔ／アシルで保護された、または、Ｄｍｔ／アシルで保護されたｏｅｇ単量体は、すでに説明されている（Ｂｒｅｉｐｏｈｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５３， １４６７１−１４６８６）。アミノプロピル−ＣＰＧへのＭｍｔ−アミノヘキサ−１−イルヘミスクシネートの装填も同様にすでに説明されている（Ｗｉｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５１， １２０６９−１２０８２）。誘導されたＣＰＧ支持体は、商業的に利用可能である（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓｔｅｒｌｉｎｇ， ＶＡ ２０１６４， Ｕ．Ｓ．Ａ．）。ＰＮＡの合成は、だいたい２〜５μｍｏｌのスケールで行われた。
【００６９】
以下のサイクルをＰＮＡ合成に用いた。
１．ＡＣＮで洗浄する段階
２．ＴＣＡ３％のＤＣＭ溶液で１１０秒処理することによってＭｍｔ基またはＤｍｔ基を脱保護すること
３．ＤＭＦ／ＡＣＮ（１：１）で洗浄する段階
４．ＤＭＦ／ＡＣＮ（１：１）中でＤＩＰＥＡで中和すること
５．ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ／ＰＮＡ単量体（１：１：１の割合で、総体積は４５０μｌ）を固相に充填して予め活性化し（１５分）、カップリングする（４５分）ことによって、単量体の構築ブロック上にカップリングすること
６．ＡＣＮで洗浄する段階
７．無水酢酸／Ｎ−メチルイミダゾールでキャッピングすること
８．ＡＣＮで洗浄する段階
９．新たなサイクル
【００７０】
実施例２：
アセチル−ｔａｔ ｔｃｃ ｇｔｃ ａｔ−アミノヘキシル−ｐ（ＰＮＡ−１）の合成
まず初めに、Ｄｍｔ保護基を、３％トリクロロ酢酸で処理することによって、ビスヒドロキシエチルスルホニル支持体１（１μｍｏｌ、図６）から除去する。次に、遊離のヒドロキシル官能基を、触媒としてテトラゾールを用いて、アミノ変性剤Ｃ６ホスホアミダイト１３（図４ｄ）と反応させる。この反応は、過剰のリン酸化試薬１３（約２５倍）（アセトニトリル／テトラヒドロフラン（１：１；ｖ：ｖ）中の０．３Ｍ溶液として）、および、テトラゾール（約５０倍；アセトニトリル中、０．５Ｍ）が用いられる。縮合が起こった後、ヨウ素溶液（０．０５Ｍ、テトラヒドロフラン／水、ピリジン（７：２：１；ｖ：ｖ：ｖ）中）を用いて酸化する。その後、ＰＮＡ部分を実施例１で説明したような固相合成によって調製する。最後のサイクルで、遊離のアミノ官能基を、キャッピング試薬で処理することによってアセチル化する。これは、濃アンモニアで脱保護する間にＰＮＡのアミノ末端が分解されることを防ぐ。最後に、濃アンモニアで、５０℃で一晩処理することによって、ＰＮＡを支持体から分離し、保護基を同時に除去する。１０３ＯＤ（２６０）の所望の粗生成物が得られ、この粗生成物を予備的なポリアクリルアミド（ＰＡＡ）ゲル電気泳動によって精製する。所望の生成物のバンドを、０．２Ｍトリエチル重炭酸アンモニウム緩衝液で溶離し、Ｂｏｎｄ−Ｅｌｕｔｅ Ｃ１８カラム（１ｇ）に通して脱塩する。２３．３ＯＤのものが得られる。その生成物を、陰イオンマススペクトロメトリーで分析し、それにより計算量を確認した（計算値 ３１６６．２； 実測値 ３１６６．８）。
【００７１】
実施例３：
アセチル−ｔａｔ ｔｃｃ ｇｔｃ ａｔ（ｅｏ）−ｐ（ＰＮＡ−２）の合成
実施例２で説明されたのと類似の方法で調製が行われ、１μｍｏｌが合成される。Ｄｍｔ保護基を支持体１（図６）から除去した後、遊離のヒドロキシル官能基を、触媒としてテトラゾールを用いて、式ＶＤで示されるホスホアミダイトと反応させる。この反応は、過剰のホスホアミダイト（約２０倍）（アセトニトリル／テトラヒドロフラン（１：１；ｖ：ｖ）中の０．１Ｍ溶液として）、および、テトラゾール（約５０倍；アセトニトリル中、０．５Ｍ）が用いられる。縮合が起こった後、ヨウ素溶液（０．０５Ｍ、テトラヒドロフラン／水、ピリジン（７：２：１；ｖ：ｖ：ｖ）中）を用いて酸化する。濃アンモニアで分離した後、５０ＯＤの粗生成物が得られる。この粗生成物の４５ＯＤの部分を１５％ＰＡＡゲルを用いた電気泳動によって精製する。分子量３０５２．９（計算値 ３０５２．９）を有する１３．２ＯＤの生産物が得られる。
【００７２】
実施例４：
アミノヘキシル−ｐ−ｔ（ｏｅｇ）ａｔ ｔｃｃ ｇｔｃ ａｔ−アミノヘキシル−ｐ（ＰＮＡ−３）の合成
実施例２で説明されたのと類似の方法で調製が行われ、１μｍｏｌが合成される。しかしながら、カルボキシル末端およびＰＮＡ部分を合成した後、核酸塩基としてチアミンを有するヒドロキシエチルグリシンを基礎とした構築ブロック（ｏｅｇＴ）を最後のサイクルでカップリングする。Ｄｍｔ基を除去した後、遊離のヒドロキシル官能基を、触媒としてテトラゾールを用いて、アミノ変性剤Ｃ６ホスホアミダイト１３（図４ｄ）にカップリングさせ、続いて、ヨウ素溶液で酸化する。濃アンモニアで、５０℃で処理することによって、このオリゴマーを支持体から分離し、全ての塩基不安定性の保護基を同時に除去する。次に、末端Ｍｍｔ保護基を８０％酢酸で処理することによって除去する。１３０ＯＤの粗生成物が得られ、この群の生成物をゲル電気泳動で精製する。分子量３３０３．８（計算値 ３３０５．０）を有する２２．５ＯＤの生産物が得られる。
【００７３】
実施例５：
ビオチン−ｐ−ｔ（ｏｅｇ）ａｔ ｔｃｃ ｇｔｃ ａｔ−アミノヘキシル−ｐ（ＰＮＡ−４）の合成
実施例２で説明されたのと類似の方法で調製が行われ、０．５μｍｏｌが合成される。しかしながら、カルボキシル末端およびＰＮＡ部分を合成した後、核酸塩基としてチアミンを有するヒドロキシエチルグリシンを基礎とした構築ブロック（ｏｅｇＴ）を最後のサイクルでカップリングする。Ｄｍｔ基を除去した後、遊離のヒドロキシル官能基を、触媒としてテトラゾールを用いて、ビオチンホスホアミダイト５（図４ｂ）にカップリングさせ、続いて、ヨウ素溶液で酸化し、トリクロロ酢酸で脱トリチル化する。濃アンモニアで、５０℃で処理することによって、このオリゴマーを支持体から分離し、全ての保護基を同時に除去する。３７ＯＤの粗生成物が得られ、この生成物群をゲル電気泳動で精製する。２２．５ＯＤの生産物が得られる。
【００７４】
実施例６：
ｐ−ｔ（ｏｅｇ）ａｔ ｔｃｃ ｇｔｃ ａｔ−アミノヘキシル−ｐ−フルオレセイン（ＰＮＡ−５）の合成
実施例２と同様にして、フルオレセイン支持体３（図６ａおよび８）から反応を進め、合成する。Ｄｍｔ保護基を、３％トリクロロ酢酸で処理することによってフルオレセイン支持体３から除去する。次に、遊離のヒドロキシル官能基を、触媒としてテトラゾールを用いて、アミノ変性剤Ｃ６ホスホアミダイト１３（図４ｄ）と反応させる。縮合が起こった後、ヨウ素溶液（０．０５Ｍ、テトラヒドロフラン／水、ピリジン（７：２：１；ｖ：ｖ：ｖ）中）を用いて酸化する。その後、ＰＮＡ部分を実施例１で説明したような固相合成によって調製する。最後のサイクルで、核酸塩基としてチアミンを有するヒドロキシエチルグリシンを基礎とする構築ブロック（（ｔ）ｏｅｇ）をカップリングする。Ｄｍｔ基を除去した後、遊離のヒドロキシル官能基を、触媒としてテトラゾールを用いて、リン酸化試薬１（図ａ）にカップリングし、続いてヨウ素溶液で酸化する。最後に、濃アンモニアで、５０℃で、一晩処理することによって、ＰＮＡを支持体から分離し、保護基を同時に除去する。６１ＯＤ（２６０）の粗生成物が得られ、この粗生成物を予備的なポリアクリルアミド（ＰＡＡ）ゲル電気泳動によって精製する。所望の生成物のバンドを、０．２Ｍトリエチル重炭酸アンモニウム緩衝液で溶離し、Ｂｏｎｄ−Ｅｌｕｔ Ｃ１８カラム（１ｇ）に通して脱塩する。５．６ＯＤのものが得られる。その生成物を、陰イオンマススペクトロメトリーで分析し、計算量を示した（計算値 ３７０９．５； 実測値 ３７０６．３）。
【００７５】
実施例７：
Ｃ１６−ｐ−ｔ（ｏｅｇ）ａｔ ｔｃｃ ｇｔｃ ａｔ−アミノヘキシル−ｐ−フルオレセイン（ＰＮＡ−６）の合成
実施例６と同様にして、１μｍｏｌのフルオレセイン支持体３（図６ａおよび８）から反応を進め、合成を行う。最後のサイクルで、核酸塩基としてチアミンを有するヒドロキシエチルグリシンを基礎とする構築ブロック（（ｔ）ｏｅｇ）をカップリングした。しかしながら、Ｄｍｔ基を除去した後、遊離のヒドロキシル官能基を、触媒としてテトラゾールを用いて、Ｃ１６リン酸化試薬７（図４ｃ）にカップリングし、続いてヨウ素溶液で酸化する。最後に、濃アンモニアで、５０℃で、一晩処理することによって、ＰＮＡを支持体から分離し、保護基を同時に除去する。６１ＯＤ（２６０）の所望の粗生成物が得られ、この粗生成物を予備的なポリアクリルアミド（ＰＡＡ）ゲル電気泳動によって精製する。所望の生成物のバンドを、０．２Ｍトリエチル重炭酸アンモニウム緩衝液で溶離し、Ｂｏｎｄ−Ｅｌｕｔ Ｃ１８カラム（１ｇ）に通して脱塩する。４．６ＯＤのものが得られる。その生成物を、陰イオンマススペクトロメトリーで分析し、計算量を示した（計算値 ３９３４； 実測値 ３９３１）。
【００７６】
実施例８：
融解温度の測定
融解温度は、ＨＰ８４５２Ａダイオード−アレイスペクトロフォトメーター、ＨＰ８９０９０ＡペルティエエレメントおよびＨＰ温度コントロールソフトウェアＲｅｖ．Ｂ５．１（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ製）を用いて測定された。測定は、０．５℃／分の段階で、緩衝液として１４０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの二水素リン酸ナトリウム、０．１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）中で行われた。オリゴマーの濃度は、１ｍｌ当たり０．５〜１ＯＤ２６０である。
驚いたことに、２または３の負電荷を有する、二様にホスホリルで修飾されたＰＮＡ−５およびＰＮＡ−６誘導体は、相補ＤＮＡおよびＲＮＡに対して、電荷を持たないＰＮＡ（対照物質）と同等に優れた、またはより優れた結合の度合いを示した。
【００７７】
【表１】
2004501211.tif 000044
【００７８】
実施例９：
蛍光標識化後の細胞吸収の測定
ＣＯＳ細胞を、５ｃｍのペトリ皿を用いて、１０％ＦＣＳを追加したダルベッコのＭＥＭ培地中でコンフルエントになるまで培養する。細胞を、血清を含まないＤＭＥＭで２回洗浄する。ペトリ皿中央の約１ｃｍ２の領域を、滅菌針を用いて掻き取る。調査するＰＮＡ溶液（１０μＭ）をこの領域に適用する。この皿を３７℃、ＣＯ２雰囲気下でインキュベートする。２、４および１６時間後、細胞を、蛍光顕微鏡検査法によって調べる。この際、細胞を、血清を含まないＤＭＥＭで４回洗浄し、カバーガラスで覆い、蛍光顕微鏡または位相差顕微鏡によって観察する。ＰＮＡ−５およびＰＮＡ−６は、蛍光顕微鏡で観察された。
これに関連して、ヘキサデシル−ＰＮＡ誘導体（ＰＮＡ−６）は、ヘキサデシル基を有さないＰＮＡより効率的に細胞に吸収されることが見出された。
【００７９】
実施例１０：
ＰＮＡ−６を用いた細胞増殖の阻害
ＰＮＡ−６の配列は、Ｈａ−ｒａｓ ｍＲＮＡの翻訳開始部位に対して設定される。ＲＥＨ細胞（ヒトプレＢ白血病細胞、ＤＳＭ ＡＣＣ２２）またはＡ５４９腫瘍細胞を、３７℃、５％ＣＯ２下で、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ， Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を含むＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）中で培養した。分析するための細胞濃度は、約１×１０６個／ｍｌであった。２４ウェルのプレート中で、ＰＮＡ−６（１０μＭ）を細胞と一緒にインキュベートした。３７℃、５％ＣＯ２下で９６時間インキュベートした後、細胞濃度を測定した。細胞濃度の平均値を、与えられたＰＮＡ濃度あたりそれぞれ３つのウェルで測定した。ＰＮＡ−１３が、ＲＥＨ細胞の増殖を阻害することが見出された。インキュベート４日間の超過後、ＰＮＡ−６は、相当するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドよりも、さらに強い阻害を示した。
【００８０】
実施例１１：
アミノヘキシル−ｐ−スペーサー１８−ｐ−ｔ（ｏｅｇ）ａｔ  ｔｃｃ ｇｔｃ ａｔ−アミノヘキシル−ｐ（ＰＮＡ−７）の合成
実施例２で説明されたのと類似の方法で調製が行われ、１μｍｏｌが合成される。しかしながら、カルボキシル末端およびＰＮＡ部分を合成した後、核酸塩基としてチミンを有するヒドロキシエチルグリシンを基礎とした構築ブロック（ｏｅｇＴ）を最後のサイクルでカップリングする。Ｄｍｔ基を除去した後、遊離のヒドロキシル官能基を、触媒としてテトラゾールを用いて、スペーサー１８ホスホアミダイト（図４ｃ）にカップリングさせ、脱トリチル化した後もう１回、アミノ変性剤Ｃ６ホスホアミダイト１３（図４ｄ）にカップリングさせ、続いて、ヨウ素溶液で酸化する。濃アンモニアで、５０℃で処理することによって、このオリゴマーを支持体から分離し、全ての塩基不安定性の保護基を同時に除去する。次に、末端Ｍｍｔ保護基を８０％酢酸で処理することによって除去する。５７ＯＤの粗生成物が得られ、この生成物をゲル電気泳動で精製する。マススペクトラムで予想分子量３６４７．５（計算値 ３６４８．５）を示す７．４ＯＤの生産物が得られる。
【００８１】
略語のリスト
ＡＣＮ        アセトニトリル
ＢＯＣ        ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
Ｃ，ｃ　　　　シュードイソシトシン
ＣＯＳ　　　　ＣＶ１オリジンＳＶ４０
ＣＰＧ　　　　多孔質ガラス
ＤＣＭ　　　　ジクロロメタン
ＤＩＰＥＡ　　ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＥＭ　　　ダルベッコＭＥＭ培地
ＤＭＦ　　　　ジメチルホルムアミド
Ｄｍｔ　　　　ジメトキシトリチル
ＤＮＡ　　　　デオキシリボ核酸
ＤＮＰ　　　　ジニトロアリール
ＦＩＴＣ　　　フルオレセインイソチオシアネート
Ｆｍｏｃ　　　フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＡＴＵ　　　Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−
テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＢＴＵ      Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラ
メチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ｈｅｘ        −ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＯＨ
ＭＥＭ        改変イーグル最小培地
Ｍｍｔ        モノメトキシトリチル
ＯＤ          光学濃度
ｏｅｇ        Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）グリシン
ＰＡＡ        ポリアクリルアミド
ＰＧ          保護基
ＰＮＡ        ポリアミド核酸
ＲＮＡ        リボ核酸
ＴＢＴＵ      Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラ
メチルウロニウムテトラフルオロボレート
ＴＣＡ        トリクロロ酢酸
ＴＨＦ        テトラヒドロフラン
ＴＲ          酸不安定性の保護基
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】
末端Ｚ基およびＺ’基の例を示す。
【図１ｂ】
末端Ｚ基およびＺ’基の例を示す。
【図２ａ】
Ｘ基およびＸ’基をもたらす例を示す。
【図２ｂ】
末端Ｚ基およびＺ’基の例を示す。
【図３ａ】
Ｘ基およびＸ’基をもたらす例を示す。
【図３ｂ】
末端Ｚ基およびＺ’基の例を示す。
【図４ａ】
リン酸化試薬の例を示す。
【図４ｂ】
リン酸化試薬の例を示す。
【図４ｃ】
リン酸化試薬の例を示す。
【図４ｄ】
リン酸化試薬の例を示す。
【図５ａ】
単一（Ａ、Ｂ）および複数（Ｃ〜Ｅ）のＮ末端におけるＰＮＡの誘導の例を示す。
【図５ｂ】
単一（Ａ、Ｂ）および複数（Ｃ〜Ｅ）のＮ末端におけるＰＮＡの誘導の例を示す。
【図６】
固相合成に関して支持体に結合した試薬の例を示す。
【図７】
Ｃ末端とＮ末端とが修飾されたＰＮＡの合成の例を示す。
【図８】
Ｃ末端とＮ末端とが修飾されたＰＮＡの合成の例を示す。
【図９】
Ｃ末端とＮ末端とが修飾されたＰＮＡの合成の例を示す。
【図１ａ】
2004501211.tif 000050
【図１ｂ】
2004501211.tif 000051
【図２ａ】
2004501211.tif 000052
【図２ｂ】
2004501211.tif 000053
【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004501211.tif 000159
【国際調査報告】
2004501211.tif 000160
2004501211.tif 000161
2004501211.tif 000162
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