(57)【要約】本発明は、増殖性障害の重篤度の軽減方法を提供する。１つの方法は、増殖性障害を有する個体に有効量のパリカルシトールを投与する工程と、癌が前立腺癌または頭頸部扁平上皮癌ではない場合、前記パリカルシトールにより細胞増殖が減少することとを含む。本発明によって提供される別の増殖性障害の重篤度を軽減する方法は、増殖性障害を有する個体に有効量のパリカルシトールおよび抗癌剤を投与する工程と、前記増殖性障害が前立腺癌または頭頸部扁平上皮癌ではない場合、前記パリカルシトールと前記抗癌剤との組み合わせにより細胞増殖が減少することとを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
増殖性障害の重篤度を軽減する方法であって、該増殖性障害を有する個体に有効量のパリカルシトールを投与する工程を包含し、ここで、該パリカルシトールは、該増殖性障害が前立腺癌でも頭頸部扁平上皮癌でもないという条件で、細胞増殖を軽減する、方法。
【請求項２】
前記増殖性障害が癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増殖性障害が骨髄異形成症候群である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記癌が白血病である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記白血病が急性骨髄性白血病である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記白血病が急性リンパ球性白血病である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記癌が多発性骨髄腫である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記癌が乳癌または結腸癌である、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
増殖性障害の重篤度を軽減する方法であって、該増殖性障害を有する個体に有効量のパリカルシトールおよび抗癌剤を投与する工程を包含し、ここで、該パリカルシトールと該抗癌剤との組み合わせは、該増殖性障害が前立腺癌でも頭頸部扁平上皮癌でもないという条件で、細胞増殖を軽減する、方法。
【請求項１０】
前記増殖性障害が癌である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記癌が、白血病、多発性骨髄腫、乳癌、および結腸癌から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記増殖性障害が骨髄異形成症候群である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗癌剤が、ダウノマイシン、三酸化ヒ素、アドリアマイシン、ＰＳ３４１、デキサメタゾン、タキソール、５−フルオロセラシル、およびメトトレキセートから選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗癌剤が三酸化ヒ素である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記増殖性障害が白血病である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記白血病が急性骨髄性白血病である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記白血病が急性リンパ球性白血病である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗癌剤がデキサメタゾンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記増殖性障害が多発性骨髄腫である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗癌剤がダウノマイシンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記増殖性障害が骨髄性白血病である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗癌剤がＰＳ３４１である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
前記増殖性障害が骨髄腫である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗癌剤がタキソールである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
前記増殖性障害が前立腺癌である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記増殖性障害が乳癌である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗癌剤がアドリアマイシンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２８】
前記増殖性障害が乳癌である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗癌剤が５−フルオロセラシルである、請求項１３に記載の方法。
【請求項３０】
前記増殖性障害が結腸癌である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗癌剤がメトトレキセートである、請求項１３に記載の方法。
【請求項３２】
前記増殖性障害が結腸癌である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
癌の再発を軽減する方法であって、癌が寛解した個体に有効量のパリカルシトールを投与する工程を包含し、該パリカルシトールは癌細胞の増殖を軽減する、方法。
【請求項３４】
前記個体が白血病から寛解している、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記白血病が急性骨髄性白血病である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記白血病が急性リンパ球性白血病である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記個体が多発性骨髄腫から寛解している、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記個体が乳癌または結腸癌から寛解している、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
癌の再発を軽減する方法であって、癌が寛解した個体に有効量のパリカルシトールおよび抗癌剤を投与する工程を包含し、該パリカルシトールと該抗癌剤との組み合わせが癌細胞の増殖を軽減する、方法。
【請求項４０】
前記個体が、白血病、多発性骨髄腫、乳癌、および結腸癌から選択される癌から寛解している、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗癌剤が、ダウノマイシン、三酸化ヒ素、アドリアマイシン、ＰＳ３４１、デキサメタゾン、タキソール、５−フルオロセラシル、およびメトトレキセートから選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗癌剤が三酸化ヒ素である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記個体が白血病から寛解している、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記白血病が急性骨髄性白血病である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記白血病が急性リンパ球性白血病である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記抗癌剤がデキサメタゾンである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記個体が多発性骨髄腫から寛解している、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記抗癌剤がダウノマイシンである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記個体が骨髄性白血病から寛解している、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗癌剤がＰＳ３４１である、請求項４１に記載の方法。
【請求項５１】
前記個体が骨髄腫から寛解している、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記抗癌剤がタキソールである、請求項４１に記載の方法。
【請求項５３】
前記個体が前立腺癌から寛解している、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記個体が乳癌から寛解している、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗癌剤がアドリアマイシンである、請求項４１に記載の方法。
【請求項５６】
前記個体が乳癌から寛解している、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記抗癌剤が５−フルオロセラシルである、請求項４１に記載の方法。
【請求項５８】
前記個体が結腸癌から寛解している、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記抗癌剤がメトトレキセートである、請求項４１に記載の方法。
【請求項６０】
前記個体が結腸癌から寛解している、請求項５９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、一般に、癌療法、より詳細には、化学療法薬としてのビタミンＤアナログであるパリカルシトールの使用に関する。
【０００２】
癌は、米国における主な死因の１つである。毎年、５０万人を超えるアメリカ人が癌で死亡し、１００万人以上が新規にこの疾患と診断されている。癌では、新生物細胞がその正常な成長調節機構を回避して制御不可能な様式で増殖し、悪性腫瘍を発症する。原発性腫瘍の治療が完全でないか疾患の実質的な進行前に開始されなかった場合、腫瘍細胞は第２の部位に転移し得る。したがって、悪性腫瘍の早期診断および有効な治療が生存に不可欠である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
現在の癌治療方法には、手術、放射線療法、および化学療法が含まれる。これらの各治療の主な問題点は、その癌細胞に対する特異性の欠如および多数の副作用である。例えば、正常組織に対するその毒性のために、安全に使用することができる放射線または化学療法薬の量はしばしば全ての新生物細胞の死滅には不適切である。これらは急速に増殖して他の部位に転移し得ることから、ほんの少しの残存新生物細胞でも致死的である。不運なことに、放射線および化学療法に関連する毒性は、これらの治療を受けた癌患者の生活の質を著しく低下させる好ましくない副作用（吐気および脱毛が含まれる）として出現する。明らかに、副作用の少ない癌治療手段が必要である。
【０００４】
したがって、有効な抗癌剤が必要である。本発明は、このニーズを満たし、さらなる関連する利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、増殖性障害の重篤度を軽減する方法に関する。１つの方法は、増殖性障害を有する個体に有効量のパリカルシトールを投与する工程と、前記パリカルシトールにより細胞増殖が減少することとを含む。本発明の１つの実施形態では、増殖性障害は、前立腺癌または頭頸部扁平上皮癌ではない癌である。別の実施形態では、増殖性障害は、骨髄異形成症候群である。本方法を使用して治療することができる癌の例には、急性骨髄性白血病および急性リンパ球性白血病などの白血病、多発性骨髄腫、乳癌、および結腸癌が含まれる。
【０００６】
本発明によって提供される別の増殖性障害の重篤度の軽減方法は、増殖性障害を有する個体に有効量のパリカルシトールおよび抗癌剤を投与する工程と、前記パリカルシトールと前記抗癌剤との組み合わせにより細胞増殖が減少することとを含む。本発明の１つの実施形態では、増殖性障害は癌である。特定の実施形態では、本方法を使用して、白血病、多発性骨髄腫、乳癌、または結腸癌を有する個体を治療する。本発明の別の実施形態では、増殖性障害は骨髄異形成症候群である。本方法で使用することができる抗癌剤の例には、ダウノマイシン、三酸化ヒ素、アドリアマイシン、ＰＳ３４１、デキサメタゾン、タキソール、５−フルオロセラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｃｅｒａｃｉｌ）、およびメトトレキセートが含まれる。１つの実施形態では、パリカルシトールと共に三酸化ヒ素を使用して、急性骨髄性白血病または急性リンパ球性白血病などの白血病を治療する。別の実施形態では、パリカルシトールと共にデキサメタゾンを使用して多発性骨髄腫を治療する。さらなる実施形態では、パリカルシトールと共にダウノマイシンを使用して骨髄性白血病を治療する。さらなる実施形態では、パリカルシトールと共にＰＳ３４１を使用して骨髄腫を治療する。さらなる実施形態では、パリカルシトールと共にタキソールを使用して前立腺癌または乳癌を治療する。さらに別の実施形態では、パリカルシトール共にアドリアマイシンを使用して、乳癌を治療する。１つの実施形態では、パリカルシトールと共に５−フルオロセラシルを使用して結腸癌を治療する。さらなる実施形態では、パリカルシトールと共にメトトレキセートを使用して結腸癌を治療する。
【０００７】
癌の再発の軽減方法が本発明によってさらに提供される。方法は、癌が寛解した個体に有効量のパリカルシトールを投与する工程と、前記パリカルシトールにより癌細胞の増殖が減少することとを含む。本発明の１つの実施形態では、治療を受ける個体は、急性骨髄性白血病または急性リンパ球性白血病などの白血病が寛解している。さらなる実施形態では、個体は、多発性骨髄腫、乳癌、または結腸癌が寛解している。
【０００８】
本発明は、別の癌再発の軽減方法を提供する。本方法は、癌が寛解した個体に有効量のパリカルシトールおよび抗癌剤を投与する工程と、前記パリカルシトールおよび前記抗癌剤の組み合わせにより癌細胞の増殖が減少することとを含む。本発明の実施形態では、治療すべき個体は、白血病、多発性骨髄腫、乳癌、および結腸癌から選択される癌が寛解している。本発明の実施形態では、抗癌剤は、ダウノマイシン、三酸化ヒ素、アドリアマイシン、ＰＳ３４１、デキサメタゾン、タキソール、５−フルオロセラシル、およびメトトレキセートから選択される。１つの実施形態では、パリカルシトールと共に三酸化ヒ素を使用して、急性骨髄性白血病または急性リンパ球性白血病などの白血病が寛解した個体を治療する。別の実施形態では、パリカルシトールと共にデキサメタゾンを使用して多発性骨髄腫が寛解した個体を治療する。別の実施形態では、パリカルシトールと共にダウノマイシンを使用して骨髄性白血病が寛解した個体を治療する。さらなる実施形態では、パリカルシトールと共にＰＳ３４１を使用して骨髄腫が寛解した個体を治療する。さらなる実施形態では、パリカルシトールと共にタキソールを使用して前立腺癌または乳癌が寛解した個体を治療する。さらに別の実施形態では、パリカルシトール共にアドリアマイシンを使用して、乳癌が寛解した個体を治療する。１つの実施形態では、パリカルシトールと共に５−フルオロセラシルを使用して結腸癌が寛解した個体を治療する。さらなる実施形態では、パリカルシトールと共にメトトレキセートを使用して結腸癌が寛解した個体を治療する。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
パリカルシトール（１９−ノル−１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）は、続発性上皮小体機能亢進症の臨床治療について現在食品医薬品局（ＦＤＡ）で承認されているビタミンＤ（１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）の合成アナログである。１，２５（ＯＨ）２Ｄ３を超えるパリカルシトールの利点は、パリカルシトールのカルシウム血症の可能性が低く、それにより１，２５（ＯＨ）２Ｄ３より副作用が少ないことである（Ｌｌａｃｈら、Ａｍ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．３２（Ｓｕｐｐｌ．）：Ｓ４８−５４（１９９８）；およびＭａｒｔｉｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．９：１４２７−１４３２（１９９８））。例えば、Ａｂｅら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２９：８３２−８３７（１９９１）；Ｚｈｏｕら、Ｂｌｏｏｄ  ７８：７５−８２（１９９１）；Ｊｕｎｇら、Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．１８：４５３−４６３（１９９４）；Ａｎｚａｎｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１６５３−１６５６（１９９４）；Ｐａｋｋａｌａら、Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．１９：６５−７２（１９９５）；Ｋｏｉｋｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５４５−  ４５５０（１９９７）；Ｋｕｂｏｔａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：３３７０−３３７５（１９９８）；Ｈｉｓａｔａｋｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：４０２３−４０２９（１９９９）；および  Ｈｉｓａｔａｋｅら、Ｂｌｏｏｄ  ９７：２４２７−２４３３（２００１）に記載のように、パリカルシトール以外の低カルシウム血症ビタミンＤアナログが合成されている。
【００１０】
インビトロでの前立腺癌細胞に対するパリカルシトールの抗増殖効果は、Ｃｈｅｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６：９０１−９０８（２０００）に記載されている。本明細書中に開示されるように、本発明者らは、パリカルシトールが異なる癌細胞型（例えば、白血病細胞、骨髄腫細胞、および結腸癌細胞）に対して抗増殖活性を有することを発見した。また、本明細書中に開示のように、本発明者らは、パリカルシトールが細胞周期の停止、分化およびアポトーシスの誘導、ならびにＣＯＸ−２レベルの減少に関連することを発見した。さらなる開示は、パリカルシトールと他の抗癌剤（三酸化ヒ素およびデキサメタゾンなど）との組み合わせが骨髄性白血病細胞および他の癌細胞型において抗増殖活性を有することである。
【００１１】
本明細書中に開示のように、種々のヒト癌細胞株（乳癌細胞株、肺癌細胞株、脳腫瘍細胞株、骨髄性白血病細胞株、リンパ腫細胞株、骨髄腫細胞株、結腸癌細胞株、および子宮癌細胞株が含まれる）に対するパリカルシトールの抗増殖効果をインビトロで評価した。第１のスクリーニングは、４日間のパリカルシトール曝露を伴う迅速なＭＴＴアッセイを使用した。ＭＴＴアッセイを使用したパリカルシトールに感受性を示す細胞株（骨髄性白血病細胞株（ＨＬ−６０、ＮＢ−４、ＴＨＰ−１）、骨髄腫細胞株（ＮＣＩ−Ｈ９２９）、および結腸癌細胞株（ＨＴ−２９、ＳＷ８３７）が含まれる）をさらに試験した。例えば、図１に示すように、より感度の高い軟寒天コロニーアッセイを使用して、インビトロでの骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０、ＮＢ−４、ＴＨＰ−１）、骨髄腫細胞（ＮＣＩ−Ｈ９２９）、および結腸癌細胞（ＨＴ−２９、ＳＷ８３７）に対するパリカルシトールのさらなる抗増殖研究を行った。クローン成長を５０％阻害するパリカルシトール濃度（ＥＤ５０）は以下であった：ＨＬ−６０では２．４×１０−９Ｍ、ＮＢ−４については３．４×１０−９Ｍ、ＴＨＰ−１については５．８×１０−９Ｍ、ＨＴ−２９については１．７×１０−８Ｍ、ＳＷ８３７については４．６×１０−８Ｍ、ＮＣＩ−Ｈ９２９については２．０×１０−１０Ｍ（図１を参照のこと）。
【００１２】
本明細書中にさらに開示のように、パリカルシトールは、インビトロで骨髄性白血病細胞の細胞周期状態に影響を与える。例えば、図２Ａに示すように、パリカルシトール（１０−７Ｍで７２時間）への曝露後のＨＬ−６０細胞の細胞周期分析は、Ｇ０／Ｇ１期（１６％増加）およびＧ２／Ｍ期（１７％増加）の細胞の蓄積およびそれに伴うＳ期（３３％減少）細胞比率の減少を示した。さらに、図２Ｂに示すように、Ｇ０／Ｇ１期およびＧ２／Ｍ期細胞の蓄積に関連するｐ２１ＷＡＦ１およびｐ２７ＫＩＰ１などのサイクリン依存性キナーゼインヒビター（ＣＤＫＩ）の発現は、パリカルシトールおよび１，２５（ＯＨ）２Ｄ３への曝露（１０−７Ｍで７２時間）によって増加した。パリカルシトールおよび１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の両方により、ＨＬ−６０細胞においてｐ２１ＷＡＦ１が約７倍、ｐ２７ＫＩＰ１が約６倍誘導された（図２Ｂを参照のこと）。
【００１３】
分化の誘導は、より積極的なアプローチを補足することができる毒性の低い癌治療として時折有用である。このアプローチは、完全な寛解を誘導することができる急性リンパ球性白血病治療のためのオールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）の使用で証明されている（Ｈｕａｎｇら、Ｂｌｏｏｄ  ７２：５６７−５７２（１９８８）；Ｃａｓｔａｉｇｎｅら、Ｂｌｏｏｄ  ７６：１７０４−１７０９（１９９０）；およびＷａｒｒｅｌｌら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｄ．３２４：１３８５−  １３９３（１９９１））。
【００１４】
本明細書中に開示のように、パリカルシトールは、インビトロで骨髄性白血病細胞の分化状態に影響を与える。例えば、パリカルシトールは、ＰＴＥＮ（活性化ＰＩ３キナーゼを標的し、抗増殖性分化促進（ｐｒｏ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）効果に関連するホスファターゼ）の発現を誘導した。図２Ｂに示すように、パリカルシトール（１０−７Ｍで７２時間）により、ＨＬ−６０細胞においてＰＴＥＮが約７倍、ＮＢ−４骨髄性白血病細胞において２５倍誘導された。さらに、細胞表面マーカーＣＤ１４発現の誘導によって測定したところ、パリカルシトールにより、ＨＬ−６０細胞の単球／マクロファージ様分化が誘導された。図２Ｃに示すように、パリカルシトール（１０−７Ｍで９６時間）により、ＨＬ−６０細胞の６５％がＣＤ１４を発現するように誘導され、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（１０−７Ｍで９６時間）により、ＨＬ−６０細胞の５４％で分化が誘導された。さらに、図２Ｄに示すように、形態学的実験により、パリカルシトール（１０−７Ｍで１２０時間）で処置したＨＬ−６０細胞の単球の分化が示された。円形または楕円形の核、隆起した核小体、および両染性細胞質を有するＨＬ−６０コントロール細胞は巨大である。しかし、パリカルシトールへの曝露後、楕円形、不規則、またはギザギザのある核および豊富な空胞化細胞質を有するＨＬ−６０細胞は単球様分化を示した（図２Ｄ）。
【００１５】
本明細書中に開示のように、パリカルシトールは、インビトロでヒト骨髄腫細胞に対する抗増殖効果を有する。例えば、パリカルシトールは、用量依存性様式でＮＣＩ−Ｈ９２９骨髄腫細胞に対する抗増殖活性を有していた。ＲＰＭＩ−８２２６およびＡＲＨ−７７骨髄腫細胞に対するパリカルシトールの効果は、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞に対する効果よりもいくらか低かった。図３Ａに示すように、パリカルシトール（１０−７Ｍで７２時間）により、Ｇ１／Ｇ０期の蓄積が７％増加し、且つＮＣＩ−Ｈ９２９細胞のアポトーシスサブＧ１集団が２１％増加する一方で、希釈剤コントロールで処置したこれらの細胞は４％のサブＧ１集団のみであった。また、図３Ａに示すように、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（１０−７Ｍで７２時間）により、Ｇ１／Ｇ０期の細胞が蓄積し（コントロールに対して７％増加）、サブＧ１細胞集団は１６％増加した。さらに、図３ＢのＴＵＮＥＬアッセイに示すように、パリカルシトール（１０−７Ｍで９６時間）のＮＣＩ−Ｈ９２９細胞の処置により、希釈剤コントロール細胞（４％）と比較してＮＣＩ−Ｈ９２９細胞（３１％）のアポトーシスが有意に増加した（ｐ＜０．０１）。同一のアッセイでは、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３処置により、２０％のアポトーシス細胞が得られた（図３Ｂを参照のこと）。また、同一の条件下で（１０−７Ｍで９６時間）、パリカルシトールおよび１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の両方によってｐ２７ＫＩＰ１発現が約３倍に増加したが（図３Ｃを参照のこと）、ｐ２１ＷＡＦ１レベルにはほとんど影響を与えなかった。さらに、図３Ｃに示すように、パリカルシトールおよび１，２５（ＯＨ）２Ｄ３での処置（１０−７Ｍで７２時間）により、抗アポトーシス遺伝子Ｂｃｌ−２のタンパク質レベルが約４０％減少するが、アポトーシス誘導タンパク質Ｂａｘレベルには影響を与えなかった。
【００１６】
本明細書中に開示のように、パリカルシトールは、インビトロおよびインビボで結腸癌細胞に対して抗増殖効果を有する。例えば、図４ＡのＭＴＴアッセイに示すように、ＨＴ−２９およびＳＷ８３７結腸癌細胞株は、パリカルシトール（１０−７Ｍで９６時間）での処置に感受性を示した。また、図４Ａに示すように、ＳＷ４８０およびＨＣＴ１１６結腸癌細胞株は、パリカルシトール（１０−７Ｍで９６時間）での処置にわずかに感受性を示すのみであるか耐性を示した。図４Ｂに示すように、ＨＴ−２９細胞において、ｐ２１ＷＡＦ１およびｐ２７ＫＩＰ１のタンパク質レベルは、パリカルシトール（１０−７Ｍで７２時間）への曝露後にそれぞれ約５倍および６倍に増加した。同時に、サイクリンＤ１およびｃ−ｍｙｃの発現は、パリカルシトールまたは１，２５（ＯＨ）２Ｄ３のいずれかとの培養後にそれぞれ約５０％および４０％減少した（図４Ｂを参照のこと）。
【００１７】
本明細書中に開示のように、インビボでのパリカルシトール処置により腫瘍のサイズおよび重量を減少させることができる。ヌードマウスにおけるＨＴ−２９ヒト結腸癌腫瘍成長に対するパリカルシトールのインビボ効果を評価した。１週間に３日パリカルシトールを腹腔内注射した。腫瘍体積を毎週測定し、５週間目に全てのマウスを安楽死させた。次いで、腫瘍を切除し、秤量した。図５Ａおよび５Ｂに示すように、パリカルシトールは、希釈剤コントロールマウスにおける成長と比較して結腸癌腫瘍の成長（ｐ＝０．０３）（図５Ａ）およびその平均腫瘍重量（ｐ＝０．０００４）（図５Ｂ）の両方を有意に抑制した。血清カルシウムレベルは、コントロールマウスで９．５±０．４ｍｇ／ｄｌであり、実験マウスで１０．２±０．７であった。コントロールマウスと実験マウスとの間で血清カルシウムレベルは有意に異ならず（ｐ＝０．１７）、各レベルは正常範囲内であった。
【００１８】
本明細書中にさらに開示のように、三酸化ヒ素と組み合わせた場合、パリカルシトールは、ＭＭＴおよびコロニーアッセイによって測定したところ、いずれかの薬物のみと比較して、骨髄性白血病細胞株（ＨＬ−６０およびＮＢ−４）に対して抗増殖効果の増強を示した。パリカルシトール（０．０１μＭ）のみでＨＬ−６０の単球分化が誘導される一方で、三酸化ヒ素（０．８μＭ）では分化にほとんど影響を与えず、組み合わせた場合、２つの薬物は、ＮＢＴアッセイで示すようなＨＬ−６０の単球分化およびＣＤ１４発現の誘導を顕著に増強した。薬物の組み合わせにより、いずれかの薬物のみでの処置と比較してＧ０／Ｇ１細胞周期停止においてより多くのＨＬ−６０細胞を蓄積し、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ＸＬを下方制御した。パリカルシトール（０．１μＭ）や三酸化ヒ素（０．６μＭ）ではＮＢ−４  ＡＰＬ細胞の分化を誘導しないが、組み合わせにより単球を分化させ、その後著しくアポトーシスを起こした。
【００１９】
パリカルシトールと三酸化ヒ素および他の抗癌剤との組み合わせによる細胞増殖の阻害を、本明細書中の実施例７に開示する。パリカルシトールとデキサメタゾンおよび他の抗癌剤との組み合わせによる骨髄腫細胞増殖の阻害を、本明細書中の実施例１１に開示する。
【００２０】
本明細書中に開示の結果に基づいて、本発明は、増殖性障害の重篤度の軽減方法を提供する。１つの方法は、増殖性障害を有する個体に有効量のパリカルシトールを投与する工程と、前記パリカルシトールにより細胞増殖が減少することとを含む。本発明の１つの実施形態では、増殖性障害は、前立腺癌または頭頸部扁平上皮癌ではないである。別の実施形態では、増殖性障害は、骨髄異形成症候群である。本方法を使用して治療することができる癌の例には、急性骨髄性白血病および急性リンパ球性白血病などの白血病、多発性骨髄腫、乳癌、および結腸癌が含まれる。
【００２１】
別の増殖性障害の重篤度の軽減方法は、増殖性障害を有する個体に有効量のパリカルシトールおよび抗癌剤を投与する工程と、前記パリカルシトールおよび前記抗癌剤の組み合わせにより細胞増殖が減少することとを含む。本発明の１つの実施形態では、増殖性障害は癌である。特定の実施形態では、処置すべき個体は、白血病、多発性骨髄腫、乳癌、または結腸癌を有する。本発明の別の実施形態では、増殖性障害は骨髄異形成症候群である。本方法で使用することができる抗癌剤の例には、ダウノマイシン、三酸化ヒ素、アドリアマイシン、ＰＳ３４１、デキサメタゾン、タキソール、５−フルオロセラシル、およびメトトレキセートが含まれる。１つの実施形態では、パリカルシトールと共に三酸化ヒ素を使用して、急性骨髄性白血病または急性リンパ球性白血病などの白血病を治療する。１つの実施形態では、パリカルシトールと共にデキサメタゾンを使用して多発性骨髄腫を治療する。別の実施形態では、パリカルシトールと共にダウノマイシンを使用して骨髄性白血病を治療する。さらなる実施形態では、パリカルシトールと共にＰＳ３４１を使用して骨髄腫を治療する。さらなる実施形態では、パリカルシトールと共にタキソールを使用して前立腺癌または乳癌を治療する。さらに別の実施形態では、パリカルシトール共にアドリアマイシンを使用して、乳癌を治療する。１つの実施形態では、パリカルシトールと共に５−フルオロセラシルを使用して結腸癌を治療する。さらなる実施形態では、パリカルシトールと共にメトトレキセートを使用して結腸癌を治療する。
【００２２】
上記のように、本発明は、増殖性障害の重傷度の軽減方法を提供する。本明細書中で使用される、用語「重傷度の軽減」は、増殖性障害の臨床症状、生理学的指標、または生体マーカーの停止または減少を意味する。臨床症状には、認知可能、外観上、または視覚可能な疾患の兆候が含まれる。生理学的指標には、身体のプロセスまたは機能に関連する物理的要因および化学的要因の有無の検出が含まれる。生体マーカーには、腫瘍マーカーなどの疾患マーカーの存在などの分子レベルで認められる疾患の兆候が含まれる。腫瘍マーカーは、通常癌の存在を示す体内物質である。腫瘍マーカーは、通常、一定の癌型に特異的であり、通常、血液または他の組織サンプル中に見出される。当業者は、特定の増殖性障害に関連する特異的臨床症状、生理学的指標、および生体マーカーを認識することができる。
【００２３】
本明細書中に開示のように、パリカルシトールまたはパリカルシトールおよび抗癌剤を使用して、増殖性障害を有する個体を治療することができる。増殖性障害には、望ましくないか異常に細胞が成長、生存、または増殖する疾患または異常な病態が含まれる。増殖性障害には、細胞が新生物を形成するように形質転換された癌などの疾患および正常な細胞の過剰成長に起因する疾患が含まれる。例えば、細胞増殖性疾患には、種々の線維性疾患など（強皮症、関節炎、アルコール肝硬変、ケロイド、および肥厚性瘢痕が含まれる）の結合組織の過剰成長に関連する疾患；アテローム性動脈硬化症などの血管増殖障害；良性腫瘍、ならびに自己免疫疾患を媒介する細胞の異常な増殖が含まれる。当業者は、特定の過剰増殖疾患の重篤度の適切な検出および評価方法を使用して個体の疾患の重篤度を評価することができる。
【００２４】
増殖性障害の上記カテゴリーの特定の言及により、当業者は、このような用語にはこれらの増殖性障害の全てのクラスおよび型が含まれることを理解している。本明細書中で使用される、用語「癌」は、異常な細胞の制御不可能な成長によって特徴づけられる疾患クラス（公知の全ての癌および新生物性病態（悪性、良性、軟組織、または充実性の腫瘍のいずれかとして特徴づけられる）が含まれる）を意味する。例として、公知の癌のリストを以下の表１に示す。
【００２５】
（表１）
ＨＥＭＡＴＯＰＯＲＥＴＩＣ  ＮＥＯＰＬＡＳＭＳ：血液新生物
Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  Ｎｅｏｐｌａｓｍｓ  ：リンパ系新生物
Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｎｅｏｐｌａｓｍｓ  ：骨髄性新生物
Ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｏｓｅｓ  ：組織球増加症
Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ／ｌｙｍｐｈｏｍａ  （ＡＬＬ）  ：前駆Ｂ細胞性リンパ芽球性白血病／リンパ腫
Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ／ｌｙｍｐｈｏｍａ  （ＡＬＬ）  ：前駆Ｔ細胞性リンパ芽球性白血病／リンパ腫
Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ／ｓｍａｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  （ＳＬＬ）  ：慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫
Ｌｙｍｐｈｏｐｌａｓｍａｃｙｔｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ：リンパ形質細胞性リンパ腫
Ｍａｎｔｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ：マントル細胞リンパ腫
Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ：濾胞性リンパ腫
Ｍａｒｇｉｎａｌ  ｚｏｎｅ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ：辺縁層リンパ腫
Ｈａｉｒｙ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ：有毛細胞白血病
Ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｍａ／ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌ  ｍｙｅｌｏｍａ  ：形質細胞腫／形質細胞性骨髄腫
Ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌａｒｇｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ：びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫
Ｂｕｒｋｉｔｔ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ：バーキットリンパ腫
Ｔ−ｃｅｌｌ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ：Ｔ細胞慢性リンパ球性白血病
Ｌａｒｇｅ  ｇｒａｎｕｌａｒ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ：大顆粒リンパ球性白血病
Ｍｙｃｏｓｉｓ  ｆｕｎｇｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｓｅｚａｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ：菌状息肉症およびセザリー症候群
Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ，  ｕｎｓｐｅｃｉｆｉｅｄ  ：末梢Ｔ細胞リンパ腫（非特定）
Ａｎｇｉｏｉｍｍｕｎｏｂｌａｓｔｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ：血管免疫芽球性Ｔ細胞性リンパ腫
Ａｎｇｉｏｃｅｎｔｒｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  （ＮＫ／Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）  ：血管中心性リンパ腫（ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫）
Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ：腸症型Ｔリンパ腫
Ａｄｕｌｔ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ／ｌｙｍｐｈｏｍａ  ：成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫
Ａｎａｐｌａｓｔｉｃ  ｌａｒｇｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ：未分化大細胞リンパ腫
Ｈｏｄｇｋｉｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  （ＨＤ）  ：ホジキン病（ＨＤ）
Ａｃｕｔｅ  ｍｙｃｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  （ＡＭＬ）  ：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）
Ｍｙｃｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ  ：骨髄異形成症候群
Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｍｙｃｌｏｆｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ：慢性骨髄増殖性障害
Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｍｙｃｌｏｇｅｎｏｕｓ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  （ＣＭＬ）  ：慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）
Ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ  Ｖｅｒａ  ：真性赤血球増加症
Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｓｉｓ  ：本態性血小板増多症
Ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｗｉｔｈ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｍｅｔａｐｌａｓｉａ  ：骨髄化生を伴う骨髄硬化症
Ｈｅｍａｎｇｉｏｍａ  ：血管腫
Ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｍａ  ：リンパ管腫
Ｇｌｏｍａｎｇｉｏｍａ  ：グロムス血管腫
Ｋａｐｏｓｉ  Ｓａｒｃｏｍａ  ：カポジ肉腫
Ｈｅｍａｎｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｍａ  ：血管内皮腫
Ａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ  ：血管肉腫
Ｈｅｍａｎｇｉｏｐｅｒｉｃｙｔｏｍａ：  血管外皮腫
ＨＥＡＤ  ＆  ＮＥＣＫ  ：頭頸部
Ｂａｓａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：基底細胞癌
Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：扁平上皮癌
Ｃｅｒｕｍｉｎｏｍａ  ：耳垢腺腫瘍
Ｏｓｔｅｏｍａ  ：骨腫
Ｎｏｎｃｈｒｏｍａｆｆｉｎ  Ｐａｒａｇａｎｇｌｉｏｍａ  ：非クロム親和性傍神経節腫
Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ｎｅｕｒｉｎｏｍａ  ：聴神経鞘腫
Ａｄｅｎｏｉｄ  Ｃｙｓｔｉｃ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：腺様嚢胞癌
Ｍｕｃｏｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：粘膜類表皮癌
Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｍｉｘｅｄ  Ｔｕｍｏｒｓ  ：悪性混合腫瘍
Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：腺癌
Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ：リンパ腫
Ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ  ：線維肉腫
Ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ  ：骨肉腫
Ｃｈｏｎｄｒｏｓａｒｃｏｍａ  ：軟骨肉腫
Ｍｅｌａｎｏｍａ  ：黒色腫
Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ：嗅覚神経芽腫
Ｉｓｏｌａｔｅｄ  Ｐｌａｓｍｏｃｙｔｏｍａ  ：孤立性形質細胞腫
Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｓ  ：内反乳頭腫
Ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：未分化癌
Ｍｕｃｏｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：粘膜類表皮癌
Ａｃｉｎｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：腺房細胞癌
Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｍｉｘｅｄ  Ｔｕｍｏｒ  ：悪性混合腫瘍
Ｏｔｈｅｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ：他の癌腫
Ａｍｅｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  ：エナメル上皮腫
Ｏｄｏｎｔｏｍａ  ：歯牙腫
ＴＨＹＭＵＳ  ：胸腺
Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｔｈｙｍｏｍａ  ：悪性胸腺腫
Ｔｙｐｅ  Ｉ  （Ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｔｈｙｍｏｍａ）  ：Ｉ型（浸襲性胸腺腫）
Ｔｙｐｅ  ＩＩ  （Ｔｈｙｍｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）  ：ＩＩ型（胸腺癌）
Ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：扁平上皮癌
Ｌｙｍｐｈ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｍａ  ：リンパ上皮腫
ＬＵＮＧ  ：肺
Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：扁平上皮癌
Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：腺癌
Ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ：気管支由来
Ａｃｉｎａｒ  ；  ｐａｐｉｌｌａｒｙ  ；  ｓｏｌｉｄ  ：腺房；乳頭；充実性
Ｂｒｏｎｃｈｉｏａｌｖｅｏｌａｒ  ：細気管支肺胞上皮
Ｓｍａｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：小細胞癌
Ｏａｔ  Ｃｅｌｌ  ：燕麦細胞
Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  Ｃｅｌｌ  ：中間細胞群
Ｌａｒｇｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：大細胞癌
Ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ；  ｇｉａｎｔ  ｃｅｌｌ  ；  ｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ  ：未分化；巨細胞；明細胞
Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ  ：悪性中皮腫
Ｓａｒｃｏｍｏｔｏｉｄ  Ｔｙｐｅ  ：類肉腫型
Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｔｙｐｅ  ：上皮型
ＧＡＳＴＲＯＩＮＴＥＳＴＩＮＡＬ  ＴＲＡＣＴ  ：胃腸管
Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：扁平上皮癌
Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：腺癌
Ｃａｒｃｉｎｏｉｄ  ：カルチノイド
Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  ：悪性黒色腫
Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：腺癌
Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：胃癌
Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ：胃リンパ腫
Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｕｍｏｒｓ  ：胃間質細胞腫瘍
Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ：リンパ腫
Ｋａｐｏｓｉ’ｓ  Ｓａｒｃｏｍａ  ：カポジ肉腫
Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｕｍｏｒｓ  ：腸間質細胞腫瘍
Ｃａｒｃｉｎｉｄｓ  ：カルチノイド
Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｍｅｓｅｔｈｅｌｉｏｍａ  ：悪性中皮腫
Ｎｏｎ−ｍｕｃｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：非粘液産生腺癌
ＬＩＶＥＲ  ＡＮＤ  ＴＨＥ  ＢＩＬＩＡＲＹ  ＴＲＡＣＴ  ：肝臓および胆道
Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：肝細胞癌
Ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：肝内胆管癌
Ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔｏｍａ  ：肝芽腫
Ａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ  ：血管肉腫
Ｆｉｂｒｏｌａｍｅｌｌｅｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：線維層板癌
Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇａｌｌｂｌａｄｄｅｒ  ：胆嚢癌
Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：腺癌
Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：扁平上皮癌
Ｐａｐｉｌｌａｒｙ，  ｐｏｏｒｌｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ：低分化乳頭腫
ＰＡＮＣＲＥＡＳ  ：膵臓
Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：腺癌
Ｃｙｓｔａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：嚢胞腺癌
Ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａ  ：インスリノーマ
Ｇａｓｔｒｉｎｏｍａ  ：ガストリノーマ
Ｇｌｕｃａｇｏｎａｍｏａ  ：グルカゴノーマ
ＫＩＤＮＥＹ  ：腎臓
Ｒｅｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：腎細胞癌
Ｎｅｐｈｒｏｂｌａｓｔｏｍａ（Ｗｉｌｍ’ｓ  Ｔｕｍｏｒ）  ：腎芽腫（ウィルムス腫瘍）
ＬＯＷＥＲ  ＵＲＩＮＡＲＹ  ＴＲＡＣＴ  ：下部尿路
Ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｔｕｍｏｒｓ  ：尿路上皮腫瘍
Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：扁平上皮癌
Ｍｉｘｅｄ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：混合癌
Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：腺癌
Ｓｍａｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：小細胞癌
Ｓａｒｃｏｍａ  ：肉腫
ＭＡＬＥ  ＧＥＮＩＴＡＬ  ＴＲＡＣＴ  ：男性生殖管
Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：扁平上皮癌
Ｓａｒｃｉｎｏｍａ  ：セミノーマ
Ｓｐｅｒｅｔｏｃｙｔｉｃ  Ｓａｒｃｉｎｏｍａ  ：精母細胞性セミノーマ
Ｅｍｂｙｏｎａｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：胎児性癌
Ｃｈｏｒｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：絨毛癌
Ｔｅｒａｔｏｍａ  ：奇形腫
Ｌｅｙｄｉｇ  Ｃｅｌｌ  Ｔｕｍｏｒ  ：ライディッヒ細胞腫
Ｓｅｒｔｏｌｉ  Ｃｅｌｌ  Ｔｕｍｏｒ  ：セルトリ細胞腫
Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ：リンパ腫
Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：腺癌
Ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：未分化前立腺癌
Ｄｕｃｔａｌ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：移行腺管癌
ＦＥＭＡＬＥ  ＧＥＮＩＴＡＬ  ＴＲＡＣＴ  ：女性生殖管
Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：扁平上皮癌
Ｂａｓａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：基底細胞癌
Ｍｅｌａｎｏｍａ  ：黒色腫
Ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ  ：線維肉腫
Ｉｎｔａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：上皮内癌
Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  Ｒｈａｂｄｏｍｙｓａｒｃｏｍａ  ：胎児性横紋筋肉腫腺癌
Ｌａｒｇｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：大細胞癌
Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｏｒ  Ｏａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：神経内分泌または燕麦細胞癌
Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：腺癌
Ａｄｅｎｏｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：腺扁平上皮癌
Ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：未分化癌
Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：癌腫
Ａｄｅｎｏａｃａｎｔｈｏｍａ  ：腺棘細胞癌
Ｓａｒｃｏｍａ  ：肉腫
Ｃａｒｃｉｎｏｓａｒｃｏｍａ  ：癌肉腫
Ｌｅｉｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ  ：平滑筋肉腫
Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｓａｒｃｏｍａ  ：子宮内膜間質肉腫
Ｓｅｒｏｕｓ  Ｃｙｓｔａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：漿液性嚢胞腺癌
Ｍｕｃｉｎｏｕｓ  Ｃｙｓｔａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：卵巣粘液性嚢胞腺癌
Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ  ：類内膜腫瘍
Ａｄｅｎｏｓａｒｃｏｍａ  ：腺肉腫
Ｃｅｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  （Ｂｒｅｎｎｅｒ  Ｔｕｍｏｒ）  ：セリオブラストーマ（ブレンネル腫瘍）
Ｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：明細胞癌
Ｕｎｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：分類不能癌
Ｇｒａｎｕｌｏｓａ−Ｔｈｅｃａ  Ｃｅｌｌ  Ｔｕｍｏｒ：顆粒膜−莢膜細胞腫瘍
Ｓｅｒｔｏｌｉ−Ｌｅｙｄｉｇ  Ｃｅｌｌ  Ｔｕｍｏｒ  ：セルトリ−ライディッヒ細胞腫
Ｄｉｓｇｅｒｍｉｎｏｍａ  ：未分化胚細胞腫
Ｔｅｒａｔｏｍａ  ：奇形腫
ＢＲＥＡＳＴ  ：乳房
Ｐｈｙｌｌｏｄｅｓ  Ｔｕｍｏｒ  ：葉状腫瘍
Ｓａｒｃｏｍａ  ：肉腫
Ｐａｇｅｔ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ：パジェット病
Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：癌腫
Ｉｎｓｉｔｕ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：上皮内癌
Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：浸潤癌
ＥＮＤＯＣＲＩＮＥ  ＳＹＳＴＥＭ  ：内分泌系
Ａｄｅｎｏｍａ  ：腺腫
Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：癌腫
Ｍｅｎｉｎｇｎｏｍａ  ：髄膜腫
Ｃｒａｍｉｏｐｈａｒｌｉｎｇｉｏｍａ  ：頭蓋咽頭腫
Ｐａｐｉｌｌａｒｙ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：乳頭状癌
Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：濾胞状癌
Ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：髄様癌
Ａｎｏｐｌａｓｔｉｃ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：退形成癌
Ａｄｅｎｏｍａ  ：腺腫
Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：癌腫
Ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ  ：褐色細胞腫
Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍｅ  ：神経芽腫
Ｐａｒａｇａｎｇｌｉｏｍａ  ：傍神経節腫
Ｐｉｎｅａｌ  ：松果体
Ｐｉｎｅｏｂｌａｓｔｏｍａ  ：松果体芽腫
Ｐｉｎｅｏｃｙｔｏｍａ  ：松果体細胞腫
ＳＫＩＮ  ：皮膚
Ｍｅｌａｎｏｍａ  ：黒色腫
Ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：扁平上皮癌
Ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：基底細胞癌
Ｍｅｒｋｅｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：メルケル細胞癌
Ｅｘｔｒａｍａｍａｒｙ  Ｐａｇｅｔ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ：乳房外パジェット病
Ｐａｇｅｔ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｉｐｐｌｅ  ：乳頭パジェット病
Ｋａｐｏｓｉ’ｓ  Ｓａｒｃｏｍａ  ：カポジ肉腫
Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ：皮膚Ｔ細胞リンパ腫
ＢＯＮＥＳ，  ＪＯＩＮＴＳ，  ＡＮＤ  ＳＯＦＴ  ＴＩＳＳＵＥ  ＴＵＭＯＲＳ  ：骨、関節、および軟組織腫瘍
Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｍｙｅｌｏｍａ  ：多発性骨髄腫
Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ：悪性リンパ腫
Ｃｈｏｎｄｒｏｓａｃｒｃｏｍａ  ：軟骨肉腫
Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｃｈｏｎｄｒｏｓａｒｃｏｍａ  ：間葉性軟骨肉腫
Ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ  ：骨肉腫
Ｅｗｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  （Ｅｗｉｎｇ  Ｓａｒｃｏｍａ）  ：ユーイング腫瘍（ユーイング肉腫）
Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｉａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｕｍｏｒ  ：悪性巨細胞腫
Ａｄａｍａｎｔｉｎｏｍａ  ：アダマンチノーマ
Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｆｉｂｒｏｕｓ  Ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｏｍａ  ：悪性線維性組織球腫
Ｄｅｓｍｏｐｌａｓｔｃ  Ｆｉｂｒｏｍａ  ：類腱線維腫
Ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ  ：線維肉腫
Ｃｈｏｒｄｏｍａ  ：脊索腫
Ｈｅｍａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｍａ  ：血管内皮腫
Ｍｅｍａｎｇｉｓｐｅｒｉｃｙｔｏｍａ  ：血管周囲細胞腫
Ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ  ：脂肪肉腫
Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｆｉｂｒｏｕｓ  Ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｏｍａ  ：悪性線維性組織球腫
Ｒｈａｂｄｏｍｙｓａｒｃｏｍｓ  ：横紋筋肉腫
Ｌｅｉｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ  ：平滑筋肉腫
Ａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ  ：血管肉腫
ＮＥＲＶＯＵＳ  ＳＹＳＴＥＭ  ：神経系
Ｓｃｈｗａｎｎｏｍａ  ：シュワン細胞腫
Ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｏｍａ  ：神経線維腫
Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｐｅｒｉｆｅｒａｌ  Ｎｅｒｖｅ  Ｓｈｅａｔｈ  Ｔｕｍｏｒ  ：悪性末梢神経鞘腫
Ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ  ：星状細胞腫
Ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  Ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ  ：線維性星状細胞腫
Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ  ：多形性グリア芽腫
Ｂｒａｉｎ  Ｓｔｅｍ  Ｇｌｉｏｍａ  ：脳幹部神経膠腫
Ｐｉｌｏｃｙｔｉｃ  Ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ  ：毛様性星状細胞腫
Ｐｌｅｏｍｏｒｐｈｉｃ  Ｘａｎｔｈｏｒｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ  ：多形性黄色星状膠細胞腫
Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍａ  ：希突起膠腫
Ｅｐｅｎｄｙｍｏｍａ  ：脳室上衣腫
Ｇａｎｇｌｉｏｃｙｔｏｍａ  ：神経節細胞腫
Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ：大脳神経芽細胞腫
Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｍａ  ：中心性神経細胞腫
Ｄｙｓｅｍｂｒｙｏｐｌａｓｔｉｃ  Ｎｅｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｔｕｍｏｒ  ：胚芽異形成性神経上皮腫瘍
Ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａ  ：髄芽腫
Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｍｅｎｉｎｇｉｏｍａ  ：悪性髄膜腫
Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｂｒａｉｎ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ：原発性脳リンパ腫
Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｂｒａｉｎ  Ｇｅｒｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｕｍｏｒ  ：原発性脳胚細胞腫瘍
ＥＹＥ  ：眼
Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：癌腫
Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：扁平上皮癌
Ｍｕｃｏｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ：粘膜類表皮癌
Ｍｅｌａｎｏｍａ  ：黒色腫
Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  ：網膜芽細胞腫
Ｇｌｉｏｍａ  ：神経膠腫
Ｍｅｎｉｎｇｉｏｍａ  ：髄膜腫
ＨＥＡＲＴ  ：心臓
Ｍｙｘｏｍａ  ：粘液腫
Ｆｉｂｒｏｍａ  ：線維腫
Ｌｉｐｏｍａ  ：脂肪腫
Ｐａｐｉｌｌａｒｙ  Ｆｉｂｒｏｅｌａｓｔｏｍａ  ：乳頭状線維芽腫
Ｒｈａｓｄｏｙｏｍａ  ：横紋筋腫
Ａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ  ：血管肉腫
Ｏｔｈｅｒ  Ｓａｒｃｏｍａ  ：他の肉腫
ＨＩＳＴＩＯＣＹＴＯＳＥＳ  ：組織球増加症
Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ  Ｃｅｌｌ  Ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｏｓｉｓ：ランゲルハンス細胞組織球増加症
。
【００２６】
本発明の増殖性障害の重篤度の軽減方法を使用して、種々の前癌性病態を治療することができる。本明細書中で使用される、用語「前癌性」は、同一の型の正常組織よりも癌が発症する可能性が高い異常を有する組織の前癌状態を意味する。組織の前癌性状態と正常状態との間の細胞学の組織学的異常および／または構造もしくは生化学的相違に基づいて、このような異常を特徴づけることができる。特定の相違は、前癌プロセスを受けた特定の腫瘍型に依存し、例えば、正常と比較した構造および／または機能の変化の程度に依存して、化生、形成異常、過形成、上皮内癌、および脈管形成などとして当該分野で記載されている。
【００２７】
１つの実施形態では、パリカルシトールまたはパリカルシトールおよび抗癌剤を使用して骨髄異形成症候群を有する個体を治療する。骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、骨髄機能障害に続発する１つまたは複数の末梢血球減少によって特徴づけられる障害群である。この症候群は、ｄｅ  ｎｏｖｏで発症するか、他の疾患のための化学療法および／または放射線療法を用いた治療後に二次的に発症し得る。骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、細胞形態学、病因学、および臨床所見の特徴にしたがって分類される。ＭＤＳの形態学的分類は、一般に、大部分が骨髄および血液中の骨髄芽球の比率、骨髄形成異常の型および程度、ならびに環状鉄芽球の比率に基づく（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ５１  （２）：１８９−９９（１９８２））。ＭＤＳの臨床的分類は、一般に、同定可能な病因学が存在するかどうかまたはＭＤＳが以前に治療されているかどうかに依存する。ＭＤＳの例には、不応性貧血（ＲＡ）、多系列異形成を伴う不応性血球減少（ＲＣＭＤ）、環状鉄芽球を伴う不応性貧血（ＲＡＲＳ）、過剰な芽球を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ）、分類不能骨髄異形成症候群（ＭＤＳ−Ｕ）、ｄｅｌ（５ｑ）に関連する骨髄異形成症候群、骨髄異形成症候群後に多系列異形成を伴うＡＭＬ、および骨髄異形成／骨髄増殖性疾患（ＭＤＳ／ＭＰＤ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
増殖性障害の重篤度の軽減方法を使用して癌を治療することができる。本発明の実施形態では、パリカルシトールまたはパリカルシトールおよび抗癌剤を使用して、白血病を有する個体を治療する。白血病は、血液形成組織の悪性新生物であり、白血球の異常な増殖によって特徴づけられる。白血病は、一般に、細胞成熟によって分類される。急性白血病は主に未熟な細胞（通常、芽球形態）からなり、慢性白血病は主により成熟した細胞からなる。
【００２９】
急性白血病は、リンパ芽球性白血病型（ＡＬＬ）および骨髄性白血病型（ＡＭＬ）に分類され、形態学的および細胞化学的外観（例えば、フランス−アメリカ−イギリス（ＦＡＢ）分類または免疫表現型）によってさらに分類することができる。フローサイトメトリーを使用した特異的Ｂ細胞およびＴ細胞ならびに骨髄−抗原モノクローナル抗体は、ＡＬＬとＡＭＬとの分類に有用である。慢性白血病は、リンパ球性（ＣＬＬ）または骨髄性（ＣＭＬ）と呼ぶ。骨髄異形成症候群は、進行性骨髄不全を示すが、ＡＭＬと明確に診断するには芽球の比率が不十分であり（３０％未満）、症例の４０〜６０％がＡＭＬに進行する。
【００３０】
急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）は、骨髄中の１つの細胞のＤＮＡの遺伝子損傷に起因する。この疾患は、正常な骨髄と置換された白血球が白血病性リンパ芽球であるので、しばしば急性リンパ芽球性白血病と呼ばれる。ＡＬＬの影響には、正常な血球として機能することができずに正常な骨髄細胞の産生を遮断し、血液中の赤血球（貧血）、血小板（血小板減少症）、および正常な白血球（特に好中球）を欠乏させる、「リンパ芽球」または「白血病性芽球」と呼ばれる細胞の制御不可能且つ過度の成長および蓄積が含まれる。
【００３１】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、骨髄中の発達細胞のＤＮＡへの遺伝子損傷に起因する。ＡＭＬの影響には、正常な血球として機能することができずに正常な骨髄細胞の産生を遮断し、血液中の赤血球（貧血）、血小板（血小板減少症）、および正常な白血球（特に好中球）を欠乏させる、「白血病性芽球」と呼ばれる細胞の制御不可能且つ過度の成長および蓄積が含まれる。
【００３２】
本発明の増殖性障害の重篤度の軽減方法または癌の再発の軽減方法を、種々の白血病（上記の特定の白血病が含まれる）に使用することができる。
【００３３】
本発明の実施形態では、パリカルシトールまたはパリカルシトールおよび抗癌剤を使用して、多発性骨髄腫を有する個体を治療する。多発性骨髄腫は、形質細胞の全身性悪性疾患である。一般に、骨髄腫は、癌性形質細胞によって産生された免疫グロブリンまたは軽鎖（κ型またはλ型）の型によって言及される。骨髄腫の種々の免疫グロブリン型の頻度は、免疫グロブリンの正常血清濃度に匹敵する。最も一般的な骨髄腫型はＩｇＧおよびＩｇＡである。ＩｇＧ骨髄腫は骨髄腫の全症例の約６０％〜７０％を占め、ＩｇＡ骨髄腫は約２０％を占める。ＩｇＤおよびＩｇＥ骨髄腫の症例はほとんど報告されていない。血液中の高レベルのＭタンパク質が骨髄腫疾患の特質であるが、骨髄腫患者の約１５％〜２０％は、免疫グロブリンの軽鎖部分しか含まない不完全な免疫グロブリンを産生する（軽鎖骨髄腫）。非分泌性骨髄腫と呼ばれる骨髄腫の稀な形態は、骨髄腫患者の約１％である。この疾患形態では、形質細胞はＭタンパク質または軽鎖を産生しない。本発明の増殖性障害の重篤度の軽減方法または癌の再発の軽減方法は、任意の骨髄腫型に適用される。
【００３４】
本発明の増殖性障害の重篤度の軽減方法または癌の再発の軽減方法は、有効量のパリカルシトールまたは有効量のパリカルシトールおよび抗癌剤を投与する工程を含む。本明細書中で使用される、用語「有効量」は、癌などの増殖性障害の重篤度の軽減に関して使用する場合、新生物の病態または病理学の範囲、量、または拡大速度を減少させるために必要な個体に投与するパリカルシトールまたはパリカルシトールおよび抗癌剤の量を意味する。癌再生の軽減に関して使用する場合、この用語は、癌の再発または癌の再発のリスクの減少に必要な個体に投与するパリカルシトールまたはパリカルシトールおよび抗癌剤の量を意味する。パリカルシトールおよび抗癌剤の有効量は、例えば、投与する抗癌剤の型および治療される病態ならびに個体の体重および生理学的状態および以前に受けた療法または併用療法に依存する。パリカルシトールまたはパリカルシトールおよび抗癌剤の特定の適用について有効量と考えられる量は、当業者に公知であるか、本明細書中に記載の技術およびガイダンスを使用して決定することができる。当業者は、患者の状態を一連の療法によってモニタリングすることができ、投与される化合物の量を個体の療法に対する応答にしたがって調整することができることを認識する。
【００３５】
本発明の増殖性障害の重篤度の軽減方法または癌の再発の軽減方法では、パリカルシトールまたはパリカルシトールと抗癌剤との組み合わせの投与により細胞増殖を軽減させる。本明細書中で使用される、用語「軽減する」は、細胞増殖に関して使用する場合、細胞増殖の範囲、量、または速度への影響を意味する。
【００３６】
本明細書中の実施例１〜５、７、および１１に開示するように、パリカルシトールまたはパリカルシトールと１つまたは複数の抗癌剤との組み合わせにより、癌細胞の増殖が軽減する。したがって、パリカルシトールまたはパリカルシトールと１つまたは複数の抗癌剤との組み合わせの投与を使用して癌細胞の増殖を軽減させ、癌が寛解した個体の癌の再発を軽減することができる。したがって、本発明は、癌の再発の軽減方法を提供する。本方法は、癌が寛解した個体に有効量のパリカルシトールを投与する工程と、前記パリカルシトールにより癌細胞の増殖が軽減することとを含む。本発明の１つの実施形態では、治療を受ける個体は、急性骨髄性白血病または急性リンパ球性白血病などの白血病が寛解している。さらなる実施形態では、個体は、多発性骨髄腫、乳癌、または結腸癌が寛解している。
【００３７】
本発明は、別の癌再発の軽減方法を提供する。本方法は、癌が寛解した個体に有効量のパリカルシトールおよび抗癌剤を投与する工程と、前記パリカルシトールおよび前記抗癌剤の組み合わせにより癌細胞の増殖が軽減することとを含む。本発明の実施形態では、治療すべき個体は、白血病、多発性骨髄腫、乳癌、および結腸癌から選択される癌が寛解している。本発明の実施形態では、抗癌剤は、ダウノマイシン、三酸化ヒ素、アドリアマイシン、ＰＳ３４１、デキサメタゾン、タキソール、５−フルオロセラシル、およびメトトレキセートから選択される。１つの実施形態では、パリカルシトールと共に三酸化ヒ素を使用して、急性骨髄性白血病または急性リンパ球性白血病などの白血病が寛解した個体を治療する。別の実施形態では、パリカルシトールと共にデキサメタゾンを使用して多発性骨髄腫が寛解した個体を治療する。別の実施形態では、パリカルシトールと共にダウノマイシンを使用して骨髄性白血病が寛解した個体を治療する。さらなる実施形態では、パリカルシトールと共にＰＳ３４１を使用して骨髄腫が寛解した個体を治療する。さらなる実施形態では、パリカルシトールと共にタキソールを使用して前立腺癌または乳癌が寛解した個体を治療する。さらに別の実施形態では、パリカルシトール共にアドリアマイシンを使用して、乳癌が寛解した個体を治療する。１つの実施形態では、パリカルシトールと共に５−フルオロセラシルを使用して結腸癌が寛解した個体を治療する。さらなる実施形態では、パリカルシトールと共にメトトレキセートを使用して結腸癌が寛解した個体を治療する。
【００３８】
癌の再発リスクを軽減させるために、本発明の方法にしたがって癌が寛解した個体を治療することができる。本明細書中で使用される、用語「再発」は、手術または癌細胞の化学的に誘導された除去もしくは崩壊などによって腫瘍または他の癌性病態を首尾よく治療した後の新生物または癌性細胞の成長を意味する。このような再発は、原発性癌に関する局所または離れた組織および器官への癌細胞の蔓延を含み得る。
【００３９】
増殖性障害の重篤度の軽減または癌の再発の軽減のための有効量は、治療計画に依存して、例えば、約１０μｇ／ｋｇ体重〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇであり得る。例えば、パリカルシトール、抗癌剤、もしくはその両方、またはパリカルシトール、抗癌剤、もしくはその両方を含む処方物を１日に１回から数回投与する場合、処方物を毎週、毎月、またはより低い頻度で投与する場合よりも低い用量が必要である。同様に、パリカルシトールまたはパリカルシトールおよび抗癌剤を徐放させる処方物により、単回ボーラス用量で投与した場合よりも少量のパリカルシトールまたはパリカルシトールおよび抗癌剤が連続的に放出される。例えば、パリカルシトールまたはパリカルシトールおよび抗癌剤を、約１〜５ｍｇ／ｋｇ／週で投与することができる。パリカルシトール投与を使用した研究は周知であり、市販のパリカルシトール調製物ＺＥＭＰＬＡＲ（商標）（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）に関するパリカルシトール投与のための投与計画の例は公開されている。例えば、ＺＥＭＰＬＡＲ（商標）の推奨初期用量は、透析時はいつでも１日おきよりも低い頻度にてボーラス用量で投与する場合、０．０４ｍｃｇ／ｋｇ〜０．１ｍｃｇ／ｋｇ（２．８〜７ｍｃｇ）である。０．２４ｍｃｇ／ｋｇ（１６．８ｍｃｇ）もの用量が安全に投与されている。
【００４０】
パリカルシトールまたはパリカルシトールおよび抗癌剤の処方物を、その抗増殖効果を長期間組み合わせるために投与を変化させて送達することもできる。例えば、パリカルシトールもしくは抗癌剤またはその組み合わせを単回ボーラス用量で投与し、その後パリカルシトール、抗癌剤、またはその組み合わせを複数回投与することができる。当業者は、特定の適用に有効な特定の投与計画を理解しているか、特定の増殖性障害の技術分野で公知の診断基準および臨床基準と共に本明細書中に記載の技術およびガイダンスを使用して決定することができる。
【００４１】
有効な治療に必要なパリカルシトールまたはパリカルシトールおよび抗癌剤の投薬量は、例えば、治療すべき病理学的状態、投与の経路および形態、個体の体重および病態ならびに以前に受けた療法または併用療法に依存する。当業者は、本方法の特定の適用の有効用量と見なされる適量を本明細書中に記載のガイダンスを使用して決定することができる。例えば、この量を、本明細書中に記載のインビトロまたはインビボアッセイから予想することができる。当業者は、患者の状態を一連の療法によってモニタリングすることができ、それによって薬剤の投与量を調整することができることを認識する。
【００４２】
本発明の増殖性障害の重篤度の軽減方法または癌の再発の軽減方法を、他の療法と組み合わせて実施することができる。例えば、本発明の方法を、手術、化学療法（サイトカインおよび成長因子の投与が含まれる）、照射、または当該分野で公知の他の方法などの従来の癌治療の前、その間、またはその後に実施することができる。
【００４３】
本発明の増殖性障害の重篤度の軽減方法は、Ｄｕｎｌａｐら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ８９：７４６−７５３（２００３）に記載の前立腺癌のための放射線療法または近接照射療法を伴うパリカルシトールの使用を含まず、Ｈｕａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｃｏ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：５０９（２００３）に記載の頭頸部扁平上皮癌の治療にシスプラチンとのパリカルシトールの併用を含まず、Ｃｈｅｎら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６（３）：９０１−８（２０００）に記載の前立腺癌細胞の治療のためのパリカルシトールの使用を含まない。
【００４４】
本明細書中の実施例７および１１に示すように、例えば、パリカルシトールと抗癌剤との組み合わせは協力様式で作用することができる。このような協力活性またはなおさらなる活性により、従来の療法によって生じた腫瘍塊が減少し、パリカルシトールまたはパリカルシトールと抗癌剤との組み合わせの有効性を増加させることができ、その逆も可能である。同時投与に適切な抗癌剤の非限定的な例は癌療法分野の当業者に周知であり、メクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、イフォスファミドなどのアルキル化剤；メトトレキセート、６−メルカプトプリン、５−フルオロウラシル、またはシタラビンなどの代謝拮抗物質；Ｒｉｔｕｘａｎ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、またはＭｅｂＴｈｅｒａなどの抗体；ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはエトポシドなどの植物アルカロイド；ドキソルビシン、ダウノマイシン、ブレオマイシン、またはマイトマイシンなどの抗生物質；カルムスチンまたはロムスチンなどのニトロソ尿素（ｎｉｔｏｒｏｓｕｒｅａ）；シスプラチンなどの無機イオン；インターフェロンなどの生物学的応答調節剤；アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒｉｇｉｎａｓｅ）などの酵素；またはタモキシフェンまたはフルタミドなどのホルモンが含まれる。抗癌剤の他の例には、アミノグルテチミド、アムサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、アザシチジン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、クロラムブシル、シスプラチン（シス−ＤＤＰ）、シクロホスファミド、塩酸シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、エリスロポエチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、エトポシド（Ｖ１６−２１３）、フロクスウリジン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルタミド、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、ヒドロキシ尿素（ヒドロキシカルバミド）、イフォスファミド、インターフェロンα、インターロイキン２、酢酸ロイプロリド（ＬＨＲＨ放出因子アナログ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、塩酸メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート（ＭＴＸ）、ミトグアゾン（メチル−ＧＡＧ、メチルグリオキサールビス−グアニルヒドラゾン、ＭＧＢＧ）、マイトマイシン、ミトタン（ｏ．ｐ’−ＤＤＤ）、塩酸ミトキサントロン、オクトレオチド、ペントスタチン、プリカマイシン、塩酸プロカルバジン、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、ストレプトゾシン、クエン酸タモキシフェン、テニポシド（ＶＭ−２６）、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、ヘルセプチン、およびＭａｂＴｈｅｒａが含まれる。これらおよび他の抗癌剤が当該分野で公知であり、例えば、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  １６ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓ．Ｌａｂｓ．，Ｒａｈｗａｙ  Ｎ．Ｊ．（１９９２）に記載の薬学的用途に適切な処方物が公知である。
【００４５】
本発明の増殖性疾患の重篤度の軽減方法または癌の再発の軽減方法では、パリカルシトールまたはパリカルシトールおよび抗癌剤を薬学的に許容可能なキャリアと共に処方することができる。適切な薬学的に許容可能なキャリアは当該分野で周知であり、例えば、生理学的食塩水、グリコール、グリセロール、オイル、または注射可能な有機エステルなどの水性または有機溶媒が含まれる。薬学的に許容可能なキャリアはまた、例えば、薬学的組成物を安定化するか溶解性を増加させるように作用する生理学的に許容可能な薬剤を含むことができる。このような生理学的に許容可能な薬剤は、例えば、グルコース、スクロース、またはデキストランなどの炭水化物；アスコルビン酸またはグルタチオンなどの抗酸化剤；キレート剤；低分子量ポリペプチド；または別の安定剤もしくは賦形剤であり得る。例えば、Ｍａｒｔｉｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１５ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，１９７５）に記載されるように、溶媒、安定剤、可溶化剤、および防腐剤を含む薬学的に許容可能なキャリアは当該分野で周知である。
【００４６】
再負荷可能な（ｒｅｃｈａｒｇｅａｂｌｅ）デバイスまたは生分解性デバイス（特に、濃度勾配または連続送達が望ましい）によって、インビボで適切に分布させることができる。薬物の制御放出のための種々の持続放出高分子デバイスが当該分野で公知であり、生分解性および非分解性ポリマーおよびヒドロゲルが含まれる。高分子デバイスの挿入によって、正確に投与し、全身吸収を減少させ、いくつかの場合、投与頻度の減少によって患者の服薬遵守をより改善することができる。当業者は、薬学的処方物の選択および化合物の適切な調製は意図する用途および投与様式に依存すると理解している。
【００４７】
パリカルシトールまたはパリカルシトールおよび抗癌剤の適切な投与経路には、経口、局所、舌下、眼内、皮内、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、脊髄内、脳内、および皮下経路が含まれるが、これらに限定されない。
【００４８】
パリカルシトールまたはパリカルシトールおよび抗癌剤を、末梢（錠剤、丸薬、カプセル、粉末、液体、懸濁液、または乳濁液などの任意の許容可能な形態での経口投与；エアゾールとして；座剤としての投与；静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または非経口注射；経皮拡散または電気泳動による投与；ドロップ、クリーム、ゲル、または軟膏などの任意の許容可能な形態での局所投与；およびミニポンプまたは他の埋め込み徐放デバイスもしくは処方物が含まれるがこれらに限定されない）に投与することができる。本発明の方法で持続放出処方物が有用であり得ると理解される。上で詳述するように、投与の頻度および持続時間は、一部が、所望の効果および有効成分の半減期に依存し、種々の投与経路が持続放出処方物の送達に有用であることがさらに理解される。
【００４９】
特定の過剰増殖疾患の動物モデルを使用して、パリカルシトールまたはパリカルシトールおよび抗癌剤の特定の投薬量の有効性、処方物、または投与経路を評価することができる。治療上の処置の効果を予想する種々の動物腫瘍モデルが当該分野で公知である。これらのモデルには、一般に、実験動物への異種腫瘍細胞の接種または移植および同時またはその後の治療薬の投与が含まれる。腫瘍成長または転移の範囲の測定によって治療有効性を決定する。治療有効性の指標として、臨床または生理学的指標の測定を、代替的または追加で評価することができる。動物腫瘍モデルの例を、例えば、Ｂｒｕｇｇｅら、Ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９１）に見出すことができる。
【００５０】
本発明の方法は、パリカルシトールの投与を含む。パリカルシトールを市販の調製物（ＺＥＭＰＬＡＲ；Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）として得ることができるか、合成によって調製することができる。パリカルシトールおよび類似の化合物の調製手順は、一般に、例えば、米国特許第５，９７６，７８４
号に記載されている。
【００５１】
本明細書中に開示されるように、パリカルシトール効果の媒介におけるビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）の役割を評価した。例えば、図４で使用した各結腸癌細胞株（ＨＴ−２９、ＳＷ８３７、ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６）を、ＶＤＲタンパク質の発現について評価した。図６Ａに示すように、これらの各細胞株は、ＶＤＲタンパク質を発現した。図４Ａに示すＭＴＴ抗増殖アッセイの結果と比較して、種々の細胞株によって発現したＶＤＲ量とパリカルシトールに対するその感受性との間に相関関係は認められなかった。
【００５２】
１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の異化の第１工程を担う酵素は、２５−ヒドロキシビタミンＤ３−２４−ヒドロキシラーゼ（２４−ヒドロキシラーゼ）である（Ｊｏｎｅｓら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７８：１１９３−１２３１（１９９８））。２４−ヒドロキシラーゼの転写誘導は、ＶＤＲのリガンド活性化および２４−ヒドロキシラーゼ遺伝子のプロモーターのビタミンＤ応答エレメントへの複合体の結合に依存する（Ｚｉｅｒｏｌｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９００−９０２（１９９４）およびＯｈｙａｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１０５４５−１０５５０（１９９４））。図６Ｂに示すように、パリカルシトール（１０−７Ｍ）は、ＨＴ−２９細胞への曝露から６時間以内に２４−ヒドロキシラーゼｍＲＮＡの発現を誘導した。本明細書中に開示のさらなる実験では、野生型（ＷＴ）マウスまたはＶＤＲノックアウト（ＫＯ）マウスの脾臓由来の単核細胞を単離し、パリカルシトール（１０−８Ｍ）と培養した。図６Ｃに示すように、１２時間以内に、パリカルシトールは、野生型マウス由来の細胞で２４−ヒドロキシラーゼｍＲＮＡの発現を誘導したが、ＶＤＲ  ＫＯマウスでは誘導しなかった。
【００５３】
本明細書中に開示のさらなる実験では、パリカルシトール（１０−８Ｍ）を、ＶＤＲノックアウトマウスおよび野生型マウス由来のマウス骨髄細胞の軟ゲル培養物に添加した。培養２週間後、コロニーを、マクロファージ、顆粒球、または顆粒球／マクロファージ混合コロニーのいずれかとして記録した（Ｏ’Ｋｅｌｌｙら、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９：１０９１−１０９９（２００２））。全コロニー数（平均）は、野生型マウスで８７（コントロール）および６６（パリカルシトール、１０−８Ｍ）、ＶＤＲノックアウトマウスで１１０（コントロール）および１２２（パリカルシトール、１０−８Ｍ）であった。図６Ｄに示すように、軟ゲル培養物へのパリカルシトールの添加によって野生型マウス由来の委任骨髄系幹細胞の分化が変化するが、ＶＤＲノックアウトマウスでは変化しなかった。野生型マウスにおける骨髄系幹細胞の試験では、パリカルシトールによってマクロファージコロニーの比率が有意に増加し（コントロールでは３２±４％、パリカルシトールでは６９±２％）、混合コロニー（コントロールでは４３±７％、パリカルシトールでは２５±５％）および顆粒球コロニー（コントロールでは２３±４％、パリカルシトールでは６±３％）の比率は減少した（図６Ｄを参照のこと）。ノックアウトマウスにおける骨髄系幹細胞の研究では、パリカルシトールは、マクロファージコロニー（コントロールでは３０±８％、パリカルシトールでは２５±５％）、混合コロニー（コントロールでは５６±１０％、パリカルシトールでは６１±８％）、または顆粒球コロニー（コントロールでは１３±３％、パリカルシトールでは１３±４％）のいずれの比率も変化しなかった（図６Ｄを参照のこと）。
【００５４】
本明細書中に開示されるように、ビタミンＤ２アナログであるパリカルシトールは、その細胞周期、分化、およびアポトーシスの調整によって骨髄性白血病、骨髄腫、および結腸癌の細胞株のクローン増殖をインビトロで阻害することができた。さらに、化合物は、ヌードマウス中で成長したＨＴ−２９ヒト結腸癌腫瘍のインビボ成長を阻害することができた。
【００５５】
腫瘍細胞に対するパリカルシトールの抗増殖効果は、対応するＣＤＫＩ発現の変化を伴う細胞周期の停止に関連した。以前の研究は、ビタミンＤ３アナログはＧ１／Ｇ０細胞周期を停止させることができ、これをｐ２１ＷＡＦ１およびｐ２７ＫＩＰ１によって媒介することができることを示した（Ｗａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：２６４−２６７（１９９６）；Ｍｕｎｋｅｒら、Ｂｌｏｏｄ  ８８：２２０１−２２０９（１９９６）および  Ｊｉａｎｇら、前出、１９９４）。パリカルシトールは、ＨＬ−６０白血病細胞のＧ１／Ｇ０およびＧ２／Ｍ細胞周期を停止させ、ＮＣＩ−Ｈ９２９骨髄腫細胞のＧ１／Ｇ０を停止させ、白血病、骨髄腫、および結腸癌細胞株におけるｐ２１ＷＡＦ１およびｐ２７ＫＩＰ１の発現を誘導した。これらの結果は、ＣＤＫＩが腫瘍細胞のＳ期への侵入能力の減少によってパリカルシトールおよび他のビタミンアナログの抗増殖効果で役割を果たすことができることを示す（Ｄｏｇｌｉｏｎｉら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７９：２４８−２５３（１９９６）およびＹａｎｇら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１０５２−１０５６（１９９５））。パリカルシトールを使用した本明細書中に開示のものと類似の１，２５（ＯＨ）２Ｄ３への曝露後のＨＬ−６０細胞におけるＧ２／Ｍチェックポイントにおける遮断も以前に報告されていた（Ｊｉａｎｇら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ９：３３９７−３４０６（１９９４））。以前の報告では、ビタミンＤ３によって媒介されるＧ２／Ｍの遅延は、ｐ３４（ｃｄｃ）レベルの減少に関連していた（Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７５：２２６−２３４（１９９９））。
【００５６】
本明細書中に開示されるように、パリカルシトールによっていくつかのの腫瘍抑制遺伝子（ＰＴＥＮおよびＥ−カドヘリンが含まれる）の発現が誘導された。ホスファターゼＰＴＥＮは、細胞死および増殖の阻害の両方に寄与し得るホスファチジルイノシトール３’−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔシグナル伝達経路を遮断することができる（Ｃａｎｔｌｅｙ  ａｎｄ  Ｎｅｅｌ，Ｐｒｏｘ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：４２４０−４２４５（１９９９）およびＤｉ  Ｃｒｉｓｔｏｆ  ａｎｏ  ａｎｄ  Ｐａｎｄｏｌｆｉ，Ｃｅｌｌ  １００：３８７−３９０（２０００））。ＰＴＥＮ遺伝子の変異は、種々のヒト癌で見出されている（Ｌｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：１９４３−１９４７（１９９７）；Ｔｅｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：５２２１−５２２５（１９９７）；Ｏｂａｔａら、Ｂｌｏｏｄ  ５８：２０９５−２０９７（１９９８）；Ｓａｋｉら、Ｂｌｏｏｄ  ９２：３４１０−３４１５（１９９８）；Ｖｌｉｅｔｓｔｒａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２７２０−２７２３（１９９８）；Ｄａｈｉａら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．８：１８５−１９３（１９９９）；およびＬｉｕら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．６３：１７０−１７５（２０００））。マウスにおけるＰＴＥＮの生殖系列欠失によって初期胚致死率が得られる一方で、遺伝子のヘテロ接合性生殖系列欠失は悪性新生物の発生率の増加に関連した。これらのデータは、ＰＴＥＮがＰＩ３キナーゼ経路の成長促進シグナルを減少させる腫瘍抑制遺伝子のように挙動することを示す（Ｄｉ  Ｃｒｉｓｔｏｆ  ａｎｏら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：３４８−３５５（１９９８）およびＳｕｚｕｋｉら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：１１６９−１１７８（１９９８））。１，２５（ＯＨ）２Ｄ３およびそのアナログの１つ（２１−（３−メチル−３−ヒドロキシ−ブチル）−１９−ノルＤ３）によりＨＬ−６０細胞におけるＰＴＥＮ発現レベルを増強することが以前に示されている（Ｈｉｓｔａｋｅら、Ｂｌｏｏｄ  ９７：２４２７−２４３３（２００１））。この研究は、パリカルシトールおよび１，２５（ＯＨ）２Ｄ３によりＨＬ−６０およびＮＢ−４骨髄性白血病細胞の両方においてＰＴＥＮ発現が誘導されることを示した。
【００５７】
パリカルシトールまたは他のビタミンＤ化合物は、ＰＴＥＮが欠失した細胞の成長を阻害することができる。以前に、骨髄芽球性白血病細胞株ＨＬ−６０におけるＭＭＡＣ１／ＰＴＥＮエクソン２〜５を含む遺伝子内欠失および急性単球性白血病細胞株Ｕ９３７中のエクソン５への４つのヌクレオチドの挿入が同定された（Ａｇｇｅｒｈｏｌｍら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ：６５：１０９−１１３（２０００））。これらの細胞は、ビタミンＤ化合物による末端分化を受けるように誘導される。さらに、ＰＴＥＮの変異は、前立腺癌細胞株に存在する（Ｌｉ，前出、１９９７）。１，２５（ＯＨ）２Ｄ３は、これらの前立腺癌細胞の成長を阻害して分化を誘導することができる（Ｓｋｏｗｒｏｎｓｋｉら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６：２０−２６（１９９５）；Ｄａｎｉｅｌｐｏｕｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：３４１３−３４２１（１９９４）；およびＣａｍｐｂｅｌｌら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６：４１３−４２５（１９９７））。また、研究は、いくつかの腫瘍細胞（子宮内膜癌、乳癌、結腸癌、および前立腺癌細胞株が含まれる）は、この遺伝子のプロモーター領域のメチル化に関連するＰＴＥＮの発現が低いことを示した（Ｌｉら、前出、１９９７；Ｇｕｎｔｉら、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９：２８３−２８７（２０００）；およびＴａｓｈｉｒｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：３９３５−３９４０（１９９７））。いくつかのビタミンＤアナログは、これらの細胞の成長を遅延させることが示されている。これらの細胞におけるパリカルシトールの抗増殖活性は、ＰＴＥＮ発現の増加およびＰＴＥＮ遺伝子の同時脱メチル化に関連し得る。
【００５８】
ＮＣＩ−Ｈ９２９骨髄腫細胞に関して、本明細書中に開示されるように、パリカルシトールによるアポトーシスは、Ｂａｘタンパク質レベルを変化させないＢｃｌ−２タンパク質発現の下方制御によって誘導された。以前の研究により、ビタミンＤ３アナログであるＥＢ１０８９は、アポトーシス、Ｂｃｌ−２発現の下方制御、およびカスパーゼ３活性の増加に関連するＮＣＩ−Ｈ９２９の増殖を阻害することができることが見出された（Ｐａｒｋら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈｅａｍａｔｏｌｏｇｙ  １０９：５７６−５８３（２０００））。さらに、ＥＢ１０８９は、これらの細胞のアポトーシス時にｐ３８キナーゼを活性化し、ｐ４４細胞外シグナル関連キナーゼ（ＥＲＫ）活性を抑制した。
【００５９】
疫学研究により、ＮＴＨＥの使用によって悪性疾患（結腸癌が含まれる）の発症リスクが減少することが示唆された（Ｆｏｓｓｌｉｅｎ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．３７：４３１−５０２（２０００）およびＧｕｐｔａ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  １：１１−２１（２００１））。ＮＴＨＥの主な標的は、アラキドン酸のプロスタグランジンへの変換を触媒する酵素のＣＯＸファミリーである（Ｓｅｉｂｅｒｔら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４００Ａ：１６７−１７０（１９９７））。ＣＯＸ−１イソ酵素は体内全体に普遍的に発現し、多くの生理学的活動（胃腸管粘膜の維持ならびに腎臓および血小板機能が含まれる）を担う（Ｓｉｅｂｅｒｔら、Ａｄｖ．Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｔｈｒｏｍｏｂｏｘａｎｅ  Ｌｅｕｋｏｔ．Ｒｅｓ．２３：１２５−１２７（１９９５）およびＳｍｉｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３３１３−１３３１８（１９９８））。対照的に、ＣＯＸ−２は、種々の炎症刺激（サイトカイン、成長因子、および発癌物質が含まれる）によって誘導可能であり、癌細胞および前癌細胞の成長促進に関連している（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：７９０８−７９１６（１９９９））。種々の悪性疾患においてＣＯＸ−２発現が上昇するので（ｖａ  Ｒｅｅｓ  ａｎｄ  Ｒｉｓｔｉｍａｋｉ，前出、２００１およびＲｉｓｔｉｍａｋｉら、前出、２００２）、これは癌の化学的予防のための妥当な標的である。選択的ＣＯＸ−２インヒビターは、げっ歯類モデルにおいて発癌を抑制し、ＣＯＸ−２の生殖系列の崩壊によってＡＰＣＤ７１６ノックアウトマウスのポリープ形成が阻害された（Ｏｓｈｉｍａら、Ｃｅｌｌ  ８７：８０３−８０９（１９９６））。さらに、選択的ＣＯＸ−２インヒビターによって家族性腺腫性ポリポーシス患者のポリープ負荷が減少した（Ｓｔｅｉｎｂａｃｈら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３４２：１９４６−１９５２（２０００））。ビタミンＤ３およびそのアナログで処置したＭｉｎマウス（ＡＰＣ−／−）は、全胃腸管上の全腫瘍負荷が減少した（Ｈｕｅｒｔａら、前出、２００２）。
【００６０】
本明細書中に開示されるように、パリカルシトールおよび１，２５（ＯＨ）２Ｄ３は、ＨＴ−２９およびＳＷ８３７結腸癌細胞においてＣＯＸ−２発現を抑制するがＣＯＸ−１発現を抑制せず、このビタミンＤアナログは選択的ＣＯＸ−２インヒビターとして作用することを示す。結腸癌細胞に対するビタミンＤ化合物のいくつかの抗増殖活性は、ＣＯＸ−２発現のその阻害に関連し得る。
【００６１】
パリカルシトールがビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）を介してその効果を媒介するかどうかに取り組むいくつかの実験を本明細書中に開示した。第１に、結腸癌細胞株におけるＶＤＲ発現レベルとパリカルシトールに対するその感受性との間に相関関係は認められなかった（図６Ａ）。ＶＤＲの全細胞レベルとビタミンＤ３アナログに対する応答性との間に相関関係はほとんどないことが以前に見出されている（Ｋｏｅｆｆｌｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ７０：１−１１（１９９０））。ビタミンＤ３化合物のいくつかの作用を、ＶＤＲと無関係に非ゲノム経路における作用によって媒介することができる（Ｎｏｒｍａｎら、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１：２３１−２４０（１９９２））。それにもかかわらず、本明細書中に開示されるように、パリカルシトールは、２５−ヒドロキシビタミンＤ３−２４−ヒドロキシラーゼ（活性化ＶＤＲの標的遺伝子）を誘導した。さらに、このアナログは、ＶＤＲ−／−マウスと比較してＶＤＲ＋／＋マウスに由来する場合にこれらの委任骨髄系幹細胞が最終的に分化する能力の比較によってＶＤＲが骨髄性造血幹細胞のマクロファージ分化を媒介する必要があることを本明細書中に示した。また、２５−ヒドロキシビタミンＤ３−２４−ヒドロキシラーゼ（活性化ＶＤＲの標的遺伝子）は、ＶＤＲ−／−マウス由来の細胞においてはパリカルシトールによって誘導されないが、ＶＤＲ＋／＋細胞においてはパリカルシトールによって誘導される。したがって、ＶＤＲは必要であり得るが、パリカルシトールが癌細胞に対する抗増殖効果を確実に有するのに十分ではない。
【００６２】
本明細書中に開示されるように、パリカルシトールおよび１，２５（ＯＨ）２Ｄ３は、類似の濃度にてインビトロで非常に類似した生物活性を有していた。しかし、ヒトでは、パリカルシトールは高カルシウム血症を引き起こす可能性が低いので、より高用量を投与し、アナログのより高いピーク血清濃度を達成することが可能であることが示されている。１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の典型的な用量は、４０〜６０ｐｇ／ｍｌのピーク血清レベルが達成される０．５〜１．０ｍｇ／１日おき（ＱＯＤ）である。パリカルシトールの典型的な用量は２．８〜７．５ｍｇ  ＱＯＤであり、１８５０ｐｇ／ｍｌのピーク血清レベルが達成される１６．８ｍｇまでが安全に投与された。さらに、両方の血清半減期は類似している。したがって、パリカルシトールを、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３と比較して毒性を示すこと無くより高い血清レベルが得られるより高い用量で投与することができる。
【００６３】
三酸化ヒ素と併用した場合、パリカルシトールは、ＭＴＴおよびコロニーアッセイによって測定したところ、いずれかの薬物のみと比較して、骨髄性白血病細胞株ＨＬ−６０およびＮＢ−４に対する抗増殖効果が著しく増強した。パリカルシトール（０．０１μＭ）のみでＨＬ−６０の単球分化を誘導する一方で、三酸化ヒ素（０．８μＭ）では分化に対する効果はほとんどなく、組み合わせた場合、ＮＢＴアッセイおよびＣＤ１４発現の誘導によって示されるように、２つの薬物によりＨＬ−６０の単球分化が著しく増強された。薬物の組み合わせにより、いずれかの薬物のみでの処置と比較して、Ｇ０／Ｇ１細胞周期停止においてより多数のＨＬ−６０細胞が蓄積され、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ＸＬが下方制御された。明らかに、パリカルシトール（０．１μＭ）や三酸化ヒ素（０．６μＭ）ではＮＢ−４  ＡＰＬ細胞の分化は誘導されないが、組み合わせにより単球が分化し、その後アポトーシスを示した。ＡＰＬ融合タンパク質の存在と組み合わせ治療の効果との間の関係を試験するために、ＰＭＬ−ＲＡＲαで安定にトランスフェクトしたＵ９３７細胞（ＰＲ９細胞）をパリカルシトールと共に培養した。パリカルシトールは、野生型Ｕ９３７およびベクタートランスフェクトＵ９３７において単球分化を誘導したが、ＲＰ９において分化が部分的に遮断された。三酸化ヒ素は、用量依存性様式で、ＲＰ９において元の融合タンパク質レベルを減少させ、パリカルシトールと三酸化ヒ素との組み合わせによってＰＭＬ−ＲＡＲαの三酸化ヒ素誘導性減少と同時にＰＲ９の分化を増強し、これらにより、三酸化ヒ素による前骨髄球性白血病細胞中の融合タンパク質の分解によって組み合わせ療法がＡＰＬ細胞の分化を誘導する能力が増強されることが示唆された。さらに、三酸化ヒ素によりミトコンドリア酵素２４−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ−２４）活性が減少し、ＨＬ−６０およびＮＢ−４細胞において活性型ビタミンＤ３代謝産物レベルがより高くなった。まとめると、パリカルシトールおよび三酸化ヒ素によりＡＰＬ細胞の成長が著しく減少して分化が誘導され、このことは、おそらく三酸化ヒ素によってＰＭＬ−ＲＡＲα融合タンパク質が減少し、ＣＹＰ２４によりパリカルシトール活性が増加することによって起こった。これらの両ＦＤＡ承認薬物の組み合わせを、ＡＴＲＡ耐性ＡＰＬ患者用と見なすべきである。
【００６４】
パリカルシトール処置培養物および１，２５（ＯＨ）２Ｄ３処置培養物において分化にも関連する細胞接着タンパク質Ｅ−カドヘリンが約６倍に増加した（図４Ｂを参照のこと）。Ｅ−カドヘリンは、上皮細胞の接着性および極性化表現型を維持する細胞間接着接合部の膜貫通リンカータンパク質である（Ｔａｋｅｉｃｈｉ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：６１９−６２７（１９９５）およびＧｕｍｂｉｎｅｒ，Ｃｅｌｌ  ８４：３４５−３５７（１９９６））。腺腫から侵入能力を獲得した癌腫への移行の間にＥ−カドヘリン発現が喪失する（Ｐｅｒｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：１９０−１９３（１９９８）およびＣｈｒｉｓｔｏｆｏｒｉ  ａｎｄ  Ｓｅｍｂ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２４：７３−７６（１９９９）。Ｅ−カドヘリンは腫瘍抑制遺伝子と見なされており、その喪失はしばしば不良な予後が予想される。Ｅ−カドヘリンは、ｂ−カテニンを細胞膜の適所に保持するｂ−カテニンのレギュレーターとしても公知である。Ｅ−カドヘリンの喪失により、ｂ−カテニンはｂ−カテニンのユビキチン化および分解の媒介を補助する細胞質ＡＰＣと相互作用することが可能である。結腸癌の発症時に頻繁に起こるＡＰＣ遺伝子の変異により、核内にｂ−カテニンが蓄積し、転写因子のＴＣＦファミリーのための同時刺激タンパク質として作用することができる。これらの転写因子の活性化により、多数の成長促進遺伝子（サイクリンＤ１およびｃ−ｍｙｃが含まれる）が刺激される（Ｐｏｌａｋｉｓ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１４：１８３７−１８５１（２０００）およびＨｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１５０９−１５１２（１９９８））。
【００６５】
最近の研究により、リガンド活性化ＶＤＲはＴＣＦ−４とｂ−カテニンへの結合を競合し、ｂ−カテニンを核から原形質膜のＥ−カドヘリン複合体に戻すように移行させてＴＣＦの転写調節活性を鈍化させることが示唆された（Ｐａｌｍｅｒら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５４：３６９−３８７（２００１））。本明細書中に開示されるように、パリカルシトールによりＥ−カドヘリンレベルが増加し、サイクリンＤ１およびｃ−ｍｙｃの発現が減少し、後者の２つはパリカルシトールと共に培養したＨＴ−２９中のＴＣＦ／ｂ−カテニン活性化の標的である。本明細書中に開示の結果は、パリカルシトールの抗癌効果がＥ−カドヘリン／ｂ−カテニン／ＴＣＦ経路の調整に関連することに一致する。興味深いことに、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３またはそのアナログで処置したＭｉｎマウス（ＡＰＣ−／−）はコントロールマウスと比較して全胃腸管上の全腫瘍負荷が減少することが示されている（Ｈｕｅｒｔａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：７４１−７４６（２００２））。
【００６６】
ＣＯＸ酵素は、アラキドン酸のプロスタグランジンへの変換を触媒する。最近、ＣＯＸ−２発現の上昇は、種々の悪性疾患（結腸癌が含まれる）に関連しており（ｖａｎ  Ｒｅｅｓ  ａｎｄ  Ｒｉｓｔｉｍａｋｉ，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．３６：８９７−９０３（２００１）およびＲｉｓｔｉｍａｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：６３２−６３５（２００２））、いくつかの癌（結腸癌が含まれる）の化学的予防のための標的となっている。図４Ｃに示すように、パリカルシトール（１０−７Ｍで７２時間）は、ＨＴ−２９およびＳＷ８３７結腸癌細胞において希釈剤処置コントロール細胞と比較してＣＯＸ−１発現に影響を与える事なくＣＯＸ−２発現を４０％減少させた。同一条件下で、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３はＣＯＸ−２レベルを５０％減少させた（図４Ｃを参照のこと）。
【００６７】
本発明の種々の実施形態の活性に実質的に影響を与えない修飾も本明細書中に記載の本発明の定義に含まれると理解される。したがって、以下の実施例は例示を意図し、本発明の制限を意図しない。
【実施例】
【００６８】
（実施例Ｉ）
（パリカルシトールによるコロニー形成の誘導）
本実施例は、パリカルシトールによる骨髄性白血病細胞株、結腸癌細胞株、および骨髄腫細胞株における軟寒天コロニー形成の阻害を示す。結果を図１に示す。
【００６９】
軟寒天コロニーアッセイを使用して、種々の癌細胞株に対するパリカルシトールおよび１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の効果を試験した。以前に記載のように（Ｋｕｂｏｔａら、前出、１９９８）、軟寒天コロニーアッセイのために、トリプシン処理して洗浄した細胞の単一細胞懸濁液を計数し、二層軟寒天系を使用して、４００ｍｌ／ウェルの体積にて全部で１×１０３細胞／ウェルを２４ウェルの平底プレートにプレートした。
【００７０】
本研究で使用した細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手し、その忠告にしたがって維持した。骨髄性白血病細胞株（ＨＬ−６０、ＮＢ−４、ＴＨＰ−１、Ｕ９３７）、リンパ腫細胞株（Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ、Ｊｕｒｋａｔ、Ｊｅｋｏ−１、ＪＵＤＨＬ）、および骨髄腫細胞株（ＲＰＭＩ−８２２６、ＡＲＨ−７７、ＮＣＩ−Ｈ９２９）を、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １６４０中で成長させた。乳癌細胞株（ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、脳腫瘍細胞株（Ｕ３４３、Ｕ１１８、Ｕ１３８、Ｕ３７３、Ｕ８７）、および結腸癌細胞株（ＨＴ−２９、ＳＷ８３７、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＨＣＴ１１６）を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中に維持した。子宮内膜癌細胞株ＡＮ−３を、１０％ＦＣＳを含むα最小基本培地（ａ−ＭＥＭ）中で維持した。
【００７１】
（実施例ＩＩ）
（細胞周期および分化に対するパリカルシトールの効果）
本実施例は、パリカルシトールが骨髄性白血病細胞の細胞周期および分化状態に影響を与えることを示す。
【００７２】
細胞周期分析のために、細胞を、１０−７Ｍの１，２５（ＯＨ）２Ｄ３、１０−７Ｍのパリカルシトール、または賦形剤コントロールに３日間または４日間曝露した。懸濁液中および接着した両方の全細胞を回収し、洗浄し、冷ＰＢＳに懸濁した。次いで、細胞を７５％冷却エタノール中で固定し、ヨウ化プロピジウムで染色した。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎのフローサイトメトリーにて細胞周期の状態を分析した。結果を図２Ａに示す。
【００７３】
ウェスタンブロット分析を使用して、細胞周期および分化に関与するタンパク質レベルを決定した。ウェスタンブロット分析のために、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１％ＮＰ４０、１００ｍｇ／ｍｌフェニルメチルスルホニルフルオリド、２ｍｇ／ｍｌアプロチニン、１ｍｇ／ｍｌペプスタチン、および１０ｍｇ／ｍｌｌｅｕｐｅｔｉｎ）中に懸濁し、氷上に３０分間置いた。４℃、１５，０００×ｇで１５分間の遠心分離後、懸濁液を回収した。Ｂｉｏ−Ｒａｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、タンパク質濃度を定量した。全溶解物（４０ｍｇ）を、４〜１５％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、ｉｍｍｏｂｉｌｏｎポリビニリデンｄｉｆｕｒｉｄｅメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）に移し、多数の抗体（ｐ２１ＷＡＦｌ，ｐ２７ＫＩＰｌ，ＰＴＥＮ、およびＧＡＰＤＨ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）で連続的に探索した。Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、ブロットを発色させた。結果を図２Ｂに示す。
【００７４】
ＨＬ−６０細胞上の細胞表面ＣＤ１４抗原を測定するために、以前に記載のように（Ｈｉｓａｔａｋｅら、前出、２００１）、前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ−６０を、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３またはパリカルシトール（１０−７Ｍ）のいずれかで４日間処置し、ＣＤ１４抗体（ＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を使用したフローサイトメトリーによってＣＤ１４発現について試験した。コントロールとしてマウスＩｇＧ１抗体（ＤＡＫＯ）を使用した。結果を図２Ｃに示す。
【００７５】
（実施例ＩＩＩ）
（細胞周期およびアポトーシスに対するパリカルシトールの効果）
本実施例は、パリカルシトールがＮＣＩ−Ｈ９２９細胞の細胞周期およびアポトーシス状態に影響を与えることを示す。
【００７６】
フローサイトメトリーによるＮＣＩ−Ｈ９２９細胞の細胞周期分析を行い、図３Ａに示す。ＨＣＩ−９２９細胞を、パリカルシトール（１０−７Ｍ）または１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（１０−７Ｍ）のいずれかと共に７２時間培養し、回収し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した。コントロール細胞を、賦形剤のみで処置した。
【００７７】
図３Ｂでは、パリカルシトール（１０−７Ｍ）または１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（１０−７Ｍ）のいずれかに９６時間曝露し、ＴＵＮＥＬアッセイによって分析したＮＣＩ−Ｈ９２９細胞株のアポトーシスの定量分析を示す。結果は、３つの独立した実験の平均±ＳＤを示す。単一細胞レベルでのプログラム細胞死の免疫組織化学的検出および定量のために、Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用したＤＮＡ鎖破壊の標識に基づいて、ＴＵＮＥＬアッセイを行った。Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）およびその後のフローサイトメトリー分析を使用した細胞膜中のアネキシンＶタンパク質の測定によって、初期アポトーシスも検出した。結果を図２Ｂに示す。
【００７８】
図３Ｃでは、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞をパリカルシトール（１０−７Ｍ）または１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（１０−７Ｍ）のいずれかで処置し、７２時間後に細胞溶解物を調製した。ウェスタンブロット分析のために細胞溶解物を使用し、ｐ２７ＫＩＰ１、Ｂｃｌ−２、およびＢａｘに対する抗体を使用して連続的に探索した。コントロール細胞を、賦形剤のみで処置した。タンパク質量を、ＧＡＰＤＨ量との比較によって正規化した。実施例２に記載のように、パリカルシトールまたは１，２５（ＯＨ）２Ｄ３で処置したＮＣＩ−Ｈ９２９細胞のウェスタンブロット分析を行った。Ｂｃｌ−２およびＢａｘ抗体を、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡから入手した。結果を図３Ｃに示す。
【００７９】
（実施例ＩＶ）
（結腸癌細胞に対するパリカルシトールの効果）
本実施例は、結腸癌細胞株ＨＴ−２９、ＳＷ８３７、ＳＥ４８０、およびＨＴ１１６に対するパリカルシトールの効果を示す。
【００８０】
ＨＴ−２９、ＳＷ８３７、ＳＥ４８０、およびＨＣＴ１１６結腸癌細胞を、パリカルシトール（１０−７Ｍ）、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（１０−７Ｍ）、または希釈剤（コントロール）のいずれかで９６時間処置した。ＭＴＴアッセイによって成長（コントロールに対する比率）を測定した。結果は、三組の皿を使用した３つの独立した実験の平均±ＳＤを示す。ＭＴＴアッセイのために、ＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ）を、ＰＢＳ（５ｍｇ／ｍｌ）を含む溶液中に入れ、これを使用して細胞の増殖または生存のいずれかを測定した。９６ウェルプレート中の培養培地中にて１０３細胞を９６時間インキュベートし、１０ｍｌのＭＴＴ溶液を添加した。４時間のインキュベート後、１００ｍｌの可溶化溶液（２０％ＳＤＳ）を添加し、溶液を３７℃で１６時間インキュベートした。このアッセイでは、代謝活性細胞によってＭＴＴを橙色のホルマザン色素に切断した。５４０ｎｍでの酵素結合免疫吸着アッセイリーダーを使用して、色素を直接定量した。
【００８１】
図４Ｂでは、ＨＴ−２９細胞を、パリカルシトール（１０−７Ｍ）または１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（１０−７Ｍ）に曝露した。培養７２時間後に細胞溶解物を調製し、ウェスタンブロットによって分析した。ウェスタンブロットを、ｐ２７ＫＩＰ１、ｐ２１ＷＡＦ１、サイクリンＤ１、ｃ−ｍｙｃ、およびＥ−カドヘリンの抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより入手した抗体）で連続的に探索した。コントロール細胞を、賦形剤のみで処置した。タンパク質量を、ＧＡＰＤＨ量との比較によって正規化した。
【００８２】
図４Ｃに示すように、ＨＴ−２９およびＳＷ８３７細胞を、パリカルシトール（１０−７Ｍ）または１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（１０−７Ｍ）のいずれかと７２時間培養した。細胞溶解物を調製し、ウェスタンブロットによって分析し、それを、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２に対する抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で連続的に探索した。コントロール細胞を、賦形剤のみで処置した。タンパク質量を、ＧＡＰＤＨ量との比較によって正規化した。
【００８３】
（実施例Ｖ）
（インビボでの結腸癌細胞に対するパリカルシトールの効果）
図５は、ヌードマウスにおける腫瘍として成長したＨＴ−２９結腸癌細胞の成長に対するパリカルシトールの効果を示す。ＨＴ−２９細胞を、ヌードマウスに  左右対称に皮下注射し、マウスあたり２つの腫瘍を形成させた。マウスを無作為にコントロール群と実験群に分けた。実験群において、パリカルシトール（１００ｎｇ／マウス）を、１週間に３日（月曜日、水曜日、金曜日）腹腔内に投与した。
【００８４】
図５Ａでは、腫瘍体積を毎週測定した。各群の１０個の腫瘍の平均体積±ＳＤを示す。実験群とコントロール群との間で、腫瘍体積は有意に異なった（ｐ＝０．０３）。図５Ｂでは、治療から４週間後に、各群から腫瘍を取り出し、秤量した。２つの群の間で腫瘍重量は有意に異なった（ｐ＝０．０００４）。
【００８５】
マウス研究のために、８週齢のＢＮＸｎｕ／ｎｕヌードマウスを、Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｎｇｕｅ  Ｄａｕｌｅｙ  Ｉｎｃ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入し、そのケアは、Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのガイドラインにしたがった。照射固形試料を使用した無病原体条件下でマウスを維持した。全部で１×１０６個のＨＴ−２９細胞を含む０．１ｍｌのＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を、各マウスの両側腹部に皮下注射して、マウスあたり２つの腫瘍を形成させた。マウスを無作為にコントロール群と実験群に分けた。ＰＣ−３細胞の注射日以降に処置を開始し、６週間継続した。コントロールマウス（５頭）に希釈剤のみを投与し、実験マウス（５頭）にパリカルシトールを投与した（１００ｎｇ／日、腹腔内、１週間に３日（月、水、金））。腫瘍サイズを毎週測定し、式：Ａ（長さ）×Ｂ（幅）×Ｃ（高さ）×０．５２３６によって計算した。４週間後、血清カルシウム測定のために採血した。研究終了時に全マウスを安楽死させ、組織学的分析のために腫瘍を１０％中性緩衝化ホルマリンで固定し、パラフィン中に包埋した。スチューデントｔ検定によってデータを分析した。
【００８６】
マウスの血清カルシウムレベルを測定するために、ｏ−クレゾールフタレイン（カルシウムと複合体化して紫色の複合体を形成する）を含むＳｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓカルシウム試薬（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）を使用した。有色複合体を、５７５ｎｍでの酵素結合免疫吸着アッセイリーダーを使用して直接定量した。
【００８７】
（実施例ＶＩ）
（パリカルシトールの作用におけるビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）の役割）
図６は、細胞株中のビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）の発現、パリカルシトールに応答した２４−ヒドロキシラーゼの発現、ならびに野生型およびＶＤＲノックアウトマウスから単離した細胞におけるパリカルシトールの効果を示す。図６Ａでは、ＨＴ−２９、ＳＷ８３７、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、およびＨＣＴ１１６結腸癌細胞の細胞溶解物を回収し、ウェスタンブロットによってＶＤＲ発現を測定した。タンパク質量を、ＧＡＰＤＨレベルとの比較によって正規化した。上記のようにウェスタンブロットを行った。
【００８８】
図６Ｂでは、ＨＴ−２９結腸癌細胞を、パリカルシトール（１０−７Ｍ）で０、６、１２、または２４時間処置し、ＲＮＡを回収した。２４ヒドロキシラーゼｍＲＮＡの発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ｍＲＮＡ量を、１８Ｓ  ＲＮＡとの比較によって正規化した。図６Ｃでは、野生型またはＶＤＲノックアウトマウスのいずれかの脾臓から抽出した単核細胞を、パリカルシトール（１０−８Ｍ）で１２時間または２４時間処置し、ＲＮＡを回収した。２４ヒドロキシラーゼｍＲＮＡの発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ｍＲＮＡ量を、１８Ｓ  ＲＮＡとの比較によって正規化した。ＰＣＲ分析のために、ＴＲＩｚｏｌｅ（Ｉｎｂｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）および逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によってＲＮＡ抽出および逆転写を行った。１μｇのＲＮＡから２０μｌのｃＤＮＡを調製した。２４−ヒドロキシラーゼおよび１８Ｓの特異的プライマーを使用したＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅した。サイクル数は、１８Ｓについては２５であり、２４−ヒドロキシラーゼについては３２であった。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで分離し、臭化エチジウムで染色し、撮影した。
【００８９】
図６Ｄでは、ＶＤＲノックアウト（ＶＤＲ−ＫＯ）および野生型（ＷＴ）マウス由来の単核骨髄細胞によるコロニー形成を示す。大腿骨髄栓（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｐｌｕｇ）から単核細胞を得て、パリカルシトール（１０−８Ｍ）または希釈剤のいずれかを含むメチルセルロース培地中で成長させた。培養１０日目にコロニーを計数した。全コロニー数（平均）は、野生型マウスで８７（コントロール）および６６（パリカルシトール１０−８Ｍ）であり、ＶＤＲ−ＫＯマウスで１１０（コントロール）および１２２（パリカルシトール１０−８Ｍ）であった。マクロファージ、顆粒球、および顆粒球／マクロファージの混合コロニーの比率を示す。各マウスあたり３組のウェルならびに全部で３つのＫＯマウスおよび３つのＷＴマウスを研究した。Ｇ、顆粒球コロニー；Ｇ／Ｍ、顆粒球／マクロファージ混合コロニー；Ｍ、マクロファージコロニー。
【００９０】
ＶＤＲ  ＫＯマウスおよびコロニー形成アッセイを以下のように行った。以前に記載のように（Ｏ’Ｋｅｌｌｙら、前出、２００２）、ＶＤＲ  ＫＯマウスを作製し、サザンブロット分析によって表現型を決定した。ＶＤＲ  ＫＯマウスを使用した実験のために、コントロールとして野生型（ＷＴ）同腹子を使用した。頸部脱臼によってマウスを屠殺した。２６ゲージニードルを使用して１０％ＦＣＳを含む（ａ−ＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）で単離大腿骨から骨髄を押し出す。単離脾臓に、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）＋１０％ＦＣＳを注射し、鉗子で破壊して細胞を放出させた。骨髄または脾臓由来の単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度遠心分離（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって分離した。以前に記載のように（１９）、再懸濁した単核骨髄細胞（２×１０４細胞／ｍｌ）および成長因子を、メチルセルロース培地Ｍ３２３４（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｃａｎａｄａ）に１：１０の比で添加して、１％メチルセルロース、３０％ＦＣＳ、１％ＢＳＡ、１０−４Ｍメルカプトエタノール、および２ｍＭ  Ｌ−グルタミンの最終濃度を得た。細胞を１ｍｌの体積の６ウェルプレートにプレートし、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下にて３７℃でインキュベートした。２週間後にコロニーを計数した。形態学によってコロニー型を確立し、正確な決定を確実にするために、各コロニーをプレートから取り出し、スライド上に遠心分離し、ライト−ギムザ色素を使用して染色し、光学顕微鏡によって試験した。
【００９１】
（実施例ＶＩＩ）
（パリカルシトールと三酸化ヒ素との組み合わせは細胞増殖を阻害する）
本実施例は、三酸化ヒ素と組み合わせたパリカルシトールがヒト骨髄性白血病細胞に対する顕著な抗増殖活性を有することを示す。
【００９２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの種々の癌細胞株型に対する他の臨床的に使用されている抗癌剤と組み合わせたビタミンＤ２アナログであるパリカルシトールの抗増殖効果を試験した。骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０、ＮＢ−４、Ｕ９３７）を処置するためにダウノルビシンおよび三酸化ヒ素と組み合わせ、多発性骨髄腫細胞（ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＲＰＭＩ８２２６、ＡＲＨ−７７）を処置するためにドキソルビシン（アドリアマイシン）、ビンクリスチン、またはデキサメタゾンと組み合わせ、前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ、ＰＣ−３、ＤＵ１４５）を処置するためにタキソールと組み合わせ、乳癌細胞（ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を処置するためにドキソルビシンまたはタキソールと組み合わせ、および結腸癌細胞（ＨＴ−２９）を処置するためにドキソルビシン、５−ＦＵ、またはＣＯＸ−２インヒビター（ＮＳ−３８４）と組み合わせたパリカルシトールを使用した。これらの組み合わせで癌細胞株を処置し、薬剤への４日間の相対的に短時間の曝露を使用した迅速なＭＴＴアッセイを使用して、第１のスクリーニングを行った（図７Ａ〜Ｋ）。種々の濃度の各薬物を使用し、表示濃度の場合における結果を示した。これらの組み合わせのうち、各薬物のみと比較してパリカルシトールと三酸化ヒ素との組み合わせが、骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０、ＮＢ−４）に対して顕著な抗増殖効果を有することが見出された。各薬物は両細胞株の細胞成長を用量依存的様式で抑制し、これら２つの薬物はこれらの細胞に対して協力効果を有していた。パリカルシトールとデキサメタゾンとの組み合わせも多発性骨髄腫細胞に対して有意な抗増殖効果を有していた（図７Ｂ）。これら２つの薬物は、両細胞株に対する協力的抗増殖効果も有していた。パリカルシトールと三酸化ヒ素との組み合わせ治療を使用して、骨髄性白血病細胞を処置した。コロニーアッセイによると、この組み合わせによって両細胞のコロニー成長が抑制された（図７Ｌ）。両細胞をパリカルシトール（ＨＬ−６０については０．０１μＭ、ＮＢ−４については０．１μＭ）および三酸化ヒ素（ＨＬ−６０については０．８μＭ、ＮＢ−４については０．６μＭ）で処置した場合のトリパンブルーアッセイによって計数された細胞数の経時時間アッセイも示す（図７ＭおよびＮ）。経時変化では、トリパンブルーアッセイによると最初の数日間は細胞死は顕著ではないが、３または４日後に細胞は特にＮＢ−４細胞で死滅し始めた。前立腺癌細胞株（ＬＮＣａｐ、ＰＣ−３、ＤＵ１４５）、乳癌細胞株（ＭＣＦ−７）、結腸癌細胞株（ＨＴ−２９）、子宮内膜癌細胞株（Ｉｓｈｉｋａｗａ、ＨＥＣ５９、ＨＥＣ１Ｂ）、および肺癌細胞株（ＮＣＩ−Ｈ１２５、ＮＣＩ−Ｈ５２０）をパリカルシトール（０．１μｍ）および三酸化ヒ素（１μｍ）で処置し、４日後にＭＴＴアッセイを行った。この組み合わせはまた、ＰＣ−３前立腺癌細胞に対するさらなる抗増殖効果を示した（図７Ｏ）。
【００９３】
本研究で使用した細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手し、その忠告にしたがって維持した。骨髄性白血病細胞株（ＨＬ−６０、ＮＢ−４、ＴＨＰ−１、Ｕ９３７）、リンパ腫細胞株（Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ、Ｊｕｒｋａｔ、Ｊｅｋｏ−１、ＪＵＤＨＬ）、骨髄腫細胞株（ＲＰＭＩ−８２２６、ＡＲＨ−７７、ＮＣＩ−Ｈ９２９）、卵巣癌細胞株、およびＰＣ−３前立腺細胞株を、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １６４０中で成長させた。乳癌細胞株（ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、結腸癌細胞株（ＨＴ−２９、ＳＷ８３７）、膵臓癌細胞株、および子宮内膜癌細胞を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中に維持した。パリカルシトールおよびＰＤ５８０４８以外の化合物は、Ｓｉｇｍａから入手した。ＰＲ９細胞におけるＰＭＬ−ＲＡＲの誘導のために、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＺｎＳＯ４を培養培地に添加した。
【００９４】
ＭＴＴアッセイのために、ＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ）を、ＰＢＳ（５ｍｇ／ｍｌ）を含む溶液中に入れ、これを使用して細胞の増殖を測定した。１０３個の細胞を９６ウェルプレート中に広げた後、いくつかの薬物を含む培養培地中で９６時間インキュベートし、１０μｌのＭＴＴ溶液を添加した。４時間のインキュベート後、１００μｌの可溶化溶液（２０％ＳＤＳ）を添加し、溶液を３７℃で１６時間インキュベートした。このアッセイでは、代謝活性細胞によってＭＴＴを橙色のホルマザン色素に切断した。５４０ｎｍでの酵素結合免疫吸着アッセイリーダーを使用して、色素を直接定量した。
【００９５】
（実施例ＶＩＩＩ）
（パリカルシトールと三酸化ヒ素との組み合わせは単球分化を増強してアポトーシスを増加させる）
本実施例は、三酸化ヒ素と組み合わせたパリカルシトールがＨＬ−６０およびＮＢ−４骨髄性白血病細胞の単球分化を顕著に増強し、その後アポトーシスを増加させることを示す。
【００９６】
ＨＬ−６０およびＮＢ−４の分化およびアポトーシスに対する三酸化ヒ素と組み合わせたパリカルシトールの効果を試験した。パリカルシトール（ＨＬ−６０については０．０１μＭ、ＮＢ−４については０．１μＭ）および三酸化ヒ素（ＨＬ−６０については０．８μＭ、ＮＢ−４については０．６μＭ）で３日間の処置後、ＣＤ１４（単球分化のマーカー）を、ＨＬ−６０細胞およびＮＢ−４細胞におけるフローサイトメトリーによって測定した。ＨＬ−６０細胞では、パリカルシトールのみで細胞表面ＣＤ１４が増加するが、三酸化ヒ素では増加しなかった。これらの薬物の組み合わせにより、パリカルシトールのみと比較してＣＤ１４発現が顕著に誘導された（図８Ａ）。パリカルシトールのみおよび三酸化ヒ素のみではいずれもＮＢ−４細胞のＣＤ１４発現は誘導されなかったが、パリカルシトールは、三酸化ヒ素と組み合わせた場合、この細胞株におけるＣＤ１４発現を誘導することは注目すべきである（図８Ａ）。パリカルシトールおよび／または三酸化ヒ素との処置後、ＨＬ−６０およびＮＢ−４細胞におけるＮＢＴ還元によっても単球分化を測定した（図８Ｂ）。ＨＬ−６０では、パリカルシトールによってＮＢＴ還元が増加し、三酸化ヒ素によってパリカルシトールの増加が増強された。ＮＢ−４細胞では、パリカルシトールは、三酸化ヒ素と組み合わせた場合、ＮＢ−４還元を増加させた。
【００９７】
パリカルシトールおよび三酸化ヒ素でのＨＬ−６０およびＮＢ−４の処置後、ＨＬ−６０細胞では５〜６日後、ＮＢ−４細胞では３〜４日後にトリパンブルーアッセイによって死細胞を検出した。これらの所見に基づいて、細胞周期分析およびＴＵＮＥＬアッセイにおけるサブＧ１集団の測定によってアポトーシス細胞を試験した。パリカルシトール（０．１μＭ）および／または三酸化ヒ素（０．６μＭ）で４日間のＮＢ−４細胞の処置後、三酸化ヒ素のみでサブＧ１集団における細胞によって示されるようにアポトーシスが誘導され（３３％）、コントロール細胞およびパリカルシトール処置細胞はそれぞれサブＧ１集団において４％および５％の細胞がアポトーシスを示した。２つの薬物の組み合わせによって、サブＧ１集団の細胞の９７％にアポトーシス細胞死が増加した（図８Ｃ）。パリカルシトール（ＨＬ−６０については０．０１μＭ、ＮＢ−４については０．１μＭ）および／または三酸化ヒ素（ＨＬ−６０については０．８μＭ、ＮＢ−４については０．６μＭ）での処置後、ＴＵＮＥＬアッセイによるアポトーシス細胞の比率も決定した。組み合わせにより、各薬物のみと比較してアポトーシスが増加した（図８Ｄ）。ＨＬ−６０では、サブＧ１集団中の細胞の比率の決定およびパリカルシトールおよび三酸化ヒ素での処置から６〜７日後のＴＵＮＥＬアッセイによってもアポトーシスを検出した。
【００９８】
細胞周期分析を以下のように行った：選択した化合物での５×１０４個の細胞の処置後、細胞を回収し、洗浄し、冷ＰＢＳに懸濁した。冷却７５％メタノール中で細胞を固定し、ヨウ化プロピジウムで染色した。標準的なプロトコールを使用したＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎのフローサイトメトリーにて細胞周期状態を分析した。
【００９９】
Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用したＤＮＡ鎖破壊の標識に基づいて、単一細胞レベルでのプログラム細胞死の免疫組織化学的検出および定量のためのＴＵＮＥＬアッセイを使用してアポトーシスを決定した。
【０１００】
ＣＤ１４抗体（ＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を使用したフローサイトメトリーによるＨＬ−６０細胞上の細胞表面ＣＤ１４抗原の測定を、以前に記載のように決定した（Ｈｉｓａｔａｋｅら、Ｂｌｏｏｄ  ９７：２４２７−２４３３（２００１））。
【０１０１】
（実施例ＩＸ）
（パリカルシトールと三酸化ヒ素との組み合わせにより骨髄性白血病細胞の遺伝子発現が変化する）
本実施例は、パリカルシトールおよび三酸化ヒ素によって骨髄性白血病細胞におけるいくつかの遺伝子発現が調整されることを示す。
【０１０２】
ＨＬ−６０細胞およびＮＢ−４細胞を使用して、パリカルシトールおよび三酸化ヒ素での処置に応答した遺伝子発現を試験した。酵素２５−ヒドロキシビタミンＤ３−２４−ヒドロキシラーゼは、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３異化の第１工程を触媒する。２４−ヒドロキシラーゼの発現を、転写的に調節し、ＶＤＲへのそのリガンド（１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）またはそのアナログの結合によって活性化する。次いで、ＶＤＲ−リガンド複合体（ＶＤＲ−ＲＸＲ）は、２４−ヒドロキシラーゼプロモーター中のビタミンＤ応答エレメントに結合してその転写を活性化する。ＨＬ−６０においてパリカルシトールおよび／または三酸化ヒ素によってＶＤＲおよびＲＸＲの発現は実質的に変化しないと判断された。
【０１０３】
初期ビタミンＤ標的遺伝子としての２４−ヒドロキシラーゼの発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって試験した。パリカルシトールのみでの処置（ＨＬ−６０については０．０１μＭ、ＮＢ−４については０．１μＭ）の２４時間後、２４−ヒドロキシラーゼのｍＲＮＡレベルが増加した（図９Ａ、図９Ｂ）。細胞をパリカルシトールおよび三酸化ヒ素で処置した場合（ＨＬ−６０については０．８μＭ、ＮＢ−４については０．６μＭ）、２４−ヒドロキシラーゼの転写レベルはパリカルシトールのみよりも遥かに高く、三酸化ヒ素がＶＤＲを介した転写活性化を増強したことを示す（図９Ａ、図９Ｂ）。
【０１０４】
Ｃ／ＥＢＰβの発現を、ウェスタンブロット分析によって試験した。ＨＬ−６０細胞では、パリカルシトールによってＣ／ＥＢＰβの発現が増加した。三酸化ヒ素のみでその発現レベルが増加し、両薬物の組み合わせによって各薬物のみよりもその発現が増加する。
【０１０５】
骨髄腫細胞においてビタミンＤによって誘導される分化に関与する遺伝子がいくつか存在する。ＨＬ−６０細胞では、１，２５（ＯＨ）Ｄ３によって活性化されたリン酸化Ｒｂ遺伝子は、分化時の細胞周期調節における鎮静期状態に関連し得る。したがって、３日間のパリカルシトールおよび／または三酸化ヒ素での処理後にＲｂ遺伝子のリン酸化を試験した。パリカルシトールおよび三酸化ヒ素での処置の際にＲｂのリン酸化が増加し、組み合わせによりその発現がより強力に増加することが示された。
【０１０６】
パリカルシトールと三酸化ヒ素との組み合わせによる分化の増強後、ＨＬ−６０およびＮＢ−４はアポトーシスを受けた（図９Ｂ）。ＨＬ−６０細胞では、抗アポトーシス遺伝子Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ＸＬの発現レベルは、パリカルシトール（０．０１μＭ）および三酸化ヒ素（０．８μＭ）での処理後に有意に減少するが、いずれかの薬物または両薬物によってアポトーシス促進遺伝子Ｂａｘの発現は変化しなかった。
【０１０７】
活性化ＥＲＫは、ＨＬ−６０細胞においてビタミンＤ３によって誘導された単球分化で重要な役割を果たすことが報告されている。したがって、リン酸化ＥＲＫの発現をウェスタンブロットによって試験した。パリカルシトール（０．０１μＭ）へのＨＬ−６０の曝露後に発現が増加し、三酸化ヒ素のみ（０．８μＭ）またはパリカルシトールとの組み合わせへの曝露後も増加することが認められた。発現レベルは各薬物への１日間の曝露後にピークとなった（図９Ｃ）。両薬物に応答したｐ−ＥＲＫ発現の増加が組み合わせ治療によって誘導される分化の増強に重要であるかどうかを決定するために、ＨＬ−６０細胞を強力な選択的ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼインヒビターであるＰＤ９８０５９で処置した。ＨＬ−６０細胞を、パリカルシトールおよび／または三酸化ヒ素と組み合わせたＰＤ９８０５９（２５μＭ）で処置し、フローサイトメトリーによってＣＤ１４発現（単球分化のマーカー）を測定した（図９Ｄ）。ＨＬ−６０細胞をＰＤ９８０５９の存在下でパリカルシトールおよび／または三酸化ヒ素と処置した場合、パリカルシトールによって誘導される分化が減少し、組み合わせ治療によって有意に増強されなかった。これは、単球分化はパリカルシトールによって誘導され、組み合わせによる分化の増強はＰＤ９８０５９によって遮断されることを示した。これらの結果は、ＨＬ−６０細胞を両薬物で処置した場合、ＥＲＫの活性化は三酸化ヒ素によるパリカルシトール誘導分化の増強に必要であることを示す。
【０１０８】
ウェスタンブロット分析を以下のように行った：細胞をＰＢＳで２回洗浄し、溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、１００μｇ／ｍＬフェニルメチルスルホニルフルオリド、２μｇ／ｍｌアプロチニン、１ｍｇ／μｌペプスタチン、および１０μｇ／ｍＬｌｅｕｐｅｔｉｎ）中に懸濁し、氷上に３０分間置いた。４℃、１５，０００×ｇで１５分間の遠心分離後、懸濁液を回収した。製造者の説明書にしたがったＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ色素試薬濃縮物（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）の使用によって、タンパク質濃度を定量した。全溶解物（４０μｇ）を、４〜１５％のゲルでのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ポリビニリデンｄｉｆｕｒｉｄｅメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）に移し、以下のタンパク質に対する抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）で連続的に探索した：ＶＤＲ、ＲＸＲ、ＣＥＢＰβ、Ｒｂ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂａｘ、ｐ−ＥＲＫ、ＲＡＲα、ＧＡＰＤＨ。Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、ブロットを発色させた。
【０１０９】
（実施例Ｘ）
（パリカルシトールと三酸化ヒ素との組み合わせは、ＰＭＬ−ＲＡＲαによって誘導された分化の阻害に打ち勝つ）
本実施例は、三酸化ヒ素と組み合わせたパリカルシトールがＰＭＬ−ＲＡＲα融合タンパク質によって誘導された分化の遮断に打ち勝つことを示す。
【０１１０】
ＮＢ−４前骨髄球性白血病細胞は、急性リンパ球性白血病の病理発生で重要な役割を果たすＰＭＬ−ＲＡＲ融合遺伝子を発現する。急性リンパ球性白血病の治療薬として使用される三酸化ヒ素は、この融合タンパク質を分解すると報告されている。以下に示すように、三酸化ヒ素は、三酸化ヒ素（０．６μＭ）での３日間の処置後にＰＭＬ−ＲＡＲのタンパク質レベルを減少させ、三酸化ヒ素（０．６μＭ）またはパリカルシトール（０．１μＭ）と組み合わせた三酸化ヒ素でＮＢ−４細胞を処置した場合、その発現を抗ＲＡＲα抗体を使用したウェスタンブロットによって検出することができなかった（図１０Ａ）。
【０１１１】
融合タンパク質の存在と組み合わせ治療の効果との間の関連を試験するために、Ｚｎ２＋誘導性マウスメタロチオネイン１プロモーターの調節下でＰＭＬ−ＲＡＲα  ｃＤＮＡを安定に組み込む操作Ｕ９３７単球性白血病細胞株（ＰＲ９）を使用した。コントロールとしてＭＴベクター（Ｂ４１）でトランスフェクトしたＵ９３７細胞も使用した。細胞表面マーカーであるＣＤ１４を、単球分化のマーカーとして使用した。野生型Ｕ９３７細胞をパリカルシトール（０．０１μＭ）および／または三酸化ヒ素（０．４μＭ）と培養した場合、パリカルシトールはＣＤ１４発現単球細胞を増加させ、組み合わせによりＣＤ１４発現細胞の増加が増強された。三酸化ヒ素のみではＣＤ１４発現を誘導しなかった（図１０Ｃ）。これは、Ｕ９３７細胞において三酸化ヒ素と組み合わせたパリカルシトールもパリカルシトール誘導単球分化を増強することを示した。組み合わせはＴＨＰ−１単球白血病細胞においてパリカルシトール誘導単球分化も増強した。
【０１１２】
ＰＭＬ−ＲＡＲα（ＰＲ９）を発現するＵ９３７細胞またはベクターコントロール（Ｂ４１）を、パリカルシトールおよび三酸化ヒ素で処置した。亜鉛を含み又は含めずにＢ４１細胞をパリカルシトールおよび／または三酸化ヒ素と培養した場合、または亜鉛を含めずにＰＲ９をパリカルシトールおよび／または三酸化ヒ素と培養した場合、結果は野生型Ｕ９３７細胞に類似していた（図１０Ｃ）。言い換えれば、これらのＵ９３７由来の細胞において、ＰＭＬ−ＲＡＲαを発現することなくパリカルシトールによって単球分化が誘導され、三酸化ヒ素と組み合わせたパリカルシトールによって単球分化が増強された（図１０Ｃ）。ウェスタンブロット分析によって示されるように、ＰＲ９細胞は亜鉛とともに培養した場合にＰＭＬ−ＲＡＲαを発現し、パリカルシトール（０．０１μＭ）によって誘導された分化は亜鉛を含めないＰＲ９と比較して部分的に遮断された。三酸化ヒ素を培地に添加した場合、用量依存性様式で亜鉛によって誘導されたＰＭＬ−ＲＡＲα（１２０ｋｂ）のタンパク質レベルが減少した。図１０Ｂに示すように、ＰＲ９細胞において、三酸化ヒ素濃度が０．４μＭを超える場合、タンパク質発現はほとんど検出することができなかった。パリカルシトールと三酸化ヒ素との組み合わせは、ＰＭＬ−ＲＡＲαの三酸化ヒ素誘導減少と並行してＰＲ９細胞の分化を増強した（図１０Ｃ）。
【０１１３】
ミトコンドリア酵素である１，２５（ＯＨ）２Ｄ３  ２４−ヒドロキシラーゼ（２４−ヒドロキシラーゼ）は、ビタミンＤの標的遺伝子である。この酵素の転写活性はパリカルシトールによって活性化され、三酸化ヒ素によって増強されることが示された（図１０Ａ）。この酵素は、活性分子である１，２５（ＯＨ）２Ｄ３を低活性代謝産物である２４，２５（ＯＨ）２Ｄ３に変換してビタミンＤの抗増殖効果を阻害する最初の工程を触媒する。
【０１１４】
三酸化ヒ素がビタミンＤに対する細胞応答を活性化させるミトコンドリア酵素である２４−ヒドロキシラーゼを不活化する可能性を試験した。２４−ヒドロキシラーゼ活性を、白血病細胞におけるＴＬＣ分析によるその代謝産物２４，２５（ＯＨ）２Ｄ３の測定によって試験した。ＨＬ−６０およびＮＢ−４骨髄性白血病細胞株を、パリカルシトール（ＨＬ−６０については０．０１μＭ、ＮＢ−４については０．１μＭ）および／または三酸化ヒ素（ＨＬ−６０については０．８μＭ、ＮＢ−４については０．６μＭ）で３日間処置した。コントロール細胞を、賦形剤のみで処置した。次いで、２４，２５（ＯＨ）２Ｄ３レベルを、ＴＬＣ分析によって測定した。ＨＬ−６０およびＮＢ−４細胞においてパリカルシトールのみによって２４，２５（ＯＨ）２Ｄ３レベルが増加し、三酸化ヒ素によってコントロール細胞と比較してそのレベルは減少した（図１１）。細胞をパリカルシトールおよび三酸化ヒ素で処置した場合、ＨＬ−６０におけるレベルの増加はパリカルシトールのみよりも遥かに小さく、ＮＢ−４細胞においてコントロールと比較して増加しなかった（図１１）。三酸化ヒ素による２４−ヒドロキシラーゼレベルの減少は、白血病細胞における三酸化ヒ素によるパリカルシトール活性の増加を説明することができる。
【０１１５】
（実施例ＸＩ）
（パリカルシトールとデキサメタゾンとの組み合わせは骨髄腫細胞増殖を阻害する）
本実施例は、デキサメタゾンと組み合わせたパリカルシトールがｉｎ  ｖｉｔｒｏで骨髄腫細胞に対して著しい抗増殖活性を有することを示す。
【０１１６】
パリカルシトールと三酸化ヒ素との組み合わせに加えて、ＭＴＴアッセイによってパリカルシトールとデキサメタゾンとの組み合わせが骨髄種細胞株であるＮＣＩ−Ｈ９２９およびＲＰＭＩ８２２６に対して強い抗増殖性を示すと判断された（図７Ｅ）。
【０１１７】
骨髄腫細胞株ＮＣＩ−Ｈ９２９を、パリカルシトール（０．０１μＭ）および／またはデキサメタゾン（０．０１μＭ）で３日間処置した。コントロール細胞を、賦形剤のみで処置した。フローサイトメトリーによって細胞周期分析を行った（図１１Ａ）。パリカルシトールのみまたは三酸化ヒ素のみでＮＣＩ−Ｈ９２９のＧ０／Ｇ１停止が誘導された。組み合わせにより、各薬物のみと比較してＧ０／Ｇ１蓄積がわずかに増加した。フローサイトメトリーによって、サブＧ１集団の比率を測定した（図１１Ｂ、左側）。パリカルシトールのみおよび三酸化ヒ素のみによってサブＧ１集団が増加した。組み合わせによってサブＧ１集団が明白に増加し、アポトーシスを示した。アポトーシス細胞の定量分析のために、３日後にＴＵＮＥＬアッセイも行った（図１１Ｂ、右側）。パリカルシトールのみおよび三酸化ヒ素のみによってアポトーシス細胞が増加した。ＴＵＮＥＬアッセイによれば、組み合わせによってアポトーシス細胞が明白に増加した。処置３日後に、細胞溶解物を回収し、Ｂｃｌ−２およびｐ２７ＫＩＰ１に対する抗体を使用したウェスタンブロッティングのために使用した。各薬物およびその組み合せによってＢｃｌ−２およびｐ２７ＫＩＰ１発現が下方制御されるが発現レベルは変化しないことが見出され、これらの遺伝子レベルでは組み合わせ活性の増強が説明されないことを示す（図１０Ｃ）。
【０１１８】
本願を通して種々の刊行物が範囲内で参照される。本発明に関連する技術をより完全に説明するために、これらの刊行物の開示全体が本願で参照として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】図１は、ヒト癌細胞株のクローン増殖に対するパリカルシトールの用量反応効果を示す。パリカルシトールまたは１，２５（ＯＨ）２Ｄ３のいずれかと共に培養した白血病細胞株（ＨＬ−６０、ＮＢ−４、ＴＨＰ−１）、結腸癌細胞株（ＨＴ−２９、ＳＷ８３７）および骨髄腫細胞株（ＮＣＩ−Ｈ９２９）についての用量反応クローン原性アッセイの結果を示す。１４日後にコロニーを計数した。結果は、三組の皿を使用した３つの独立した実験の平均±標準偏差（ＳＤ）を示す。
【図２−１】図２は、ＨＬ−６０白血病細胞株に対するパリカルシトールの効果を示す。（Ａ）フローサイトメトリーによるＨＬ−６０細胞の細胞周期分析。ＨＬ−６０細胞をパリカルシトール（１０−７Ｍ）と７２時間培養し、回収し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した。コントロール細胞を、賦形剤のみで処置した。結果は、３つの独立した実験の平均±ＳＤを示す。（Ｂ）ＨＬ−６０またはＮＢ−４細胞を、パリカルシトール（１０−７Ｍ）または１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（１０−７Ｍ）のいずれかで処置した。７２時間後に細胞溶解物を調製し、一連の抗体（ｐ２１ＷＡＦ１、ｐ２７ＫＩＰ１、ＰＴＥＮ）を使用したウェスタンブロットによって分析した。コントロール細胞を、賦形剤のみで処置した。タンパク質量を、ＧＡＰＤＨレベルとの比較によって正規化した。（Ｃ）ＨＬ−６０細胞を、パリカルシトール（１０−７Ｍ）または１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（１０−７Ｍ）のいずれかと９６時間培養し、フローサイトメトリーを使用してＣＤ１４発現について分析した。破線は、負のコントロール抗体を示し、黒い領域はＣＤ１４抗体を示す。ＣＤ１４陽性細胞は、Ｍ２で示す領域中に存在する。（Ｄ）ＨＬ−６０細胞をパリカルシトール（１０−７Ｍ）と１２０時間培養し、固定し、形態学的分析のためにライト−ギムザ色素で染色した。左のパネルはＨＬ−６０コントロール細胞（元の倍率は４００倍）を示し、右のパネルはパリカルシトールへの曝露後のＨＬ−６０細胞（元の倍率は４００倍）を示す。
【図２−２】図２は、ＨＬ−６０白血病細胞株に対するパリカルシトールの効果を示す。（Ａ）フローサイトメトリーによるＨＬ−６０細胞の細胞周期分析。ＨＬ−６０細胞をパリカルシトール（１０−７Ｍ）と７２時間培養し、回収し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した。コントロール細胞を、賦形剤のみで処置した。結果は、３つの独立した実験の平均±ＳＤを示す。（Ｂ）ＨＬ−６０またはＮＢ−４細胞を、パリカルシトール（１０−７Ｍ）または１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（１０−７Ｍ）のいずれかで処置した。７２時間後に細胞溶解物を調製し、一連の抗体（ｐ２１ＷＡＦ１、ｐ２７ＫＩＰ１、ＰＴＥＮ）を使用したウェスタンブロットによって分析した。コントロール細胞を、賦形剤のみで処置した。タンパク質量を、ＧＡＰＤＨレベルとの比較によって正規化した。（Ｃ）ＨＬ−６０細胞を、パリカルシトール（１０−７Ｍ）または１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（１０−７Ｍ）のいずれかと９６時間培養し、フローサイトメトリーを使用してＣＤ１４発現について分析した。破線は、負のコントロール抗体を示し、黒い領域はＣＤ１４抗体を示す。ＣＤ１４陽性細胞は、Ｍ２で示す領域中に存在する。（Ｄ）ＨＬ−６０細胞をパリカルシトール（１０−７Ｍ）と１２０時間培養し、固定し、形態学的分析のためにライト−ギムザ色素で染色した。左のパネルはＨＬ−６０コントロール細胞（元の倍率は４００倍）を示し、右のパネルはパリカルシトールへの曝露後のＨＬ−６０細胞（元の倍率は４００倍）を示す。
【図３】図３は、ＮＣＩ−Ｈ９２９骨髄腫細胞株に対するパリカルシトールの効果を示す。（Ａ）フローサイトメトリーによるＮＣＩ−Ｈ９２９細胞の細胞周期分析。ＨＣＩ−Ｈ９２９細胞をパリカルシトール（１０−７Ｍ）または１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（１０−７Ｍ）のいずれかと７２時間培養し、回収し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した。コントロール細胞を、賦形剤のみで処置した。（Ｂ）パリカルシトール（１０−７Ｍ）または１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（１０−７Ｍ）のいずれかに９６時間曝露し、ＴＵＮＥＬアッセイによって分析したＮＣＩ−Ｈ９２９細胞株のアポトーシスの定量分析。結果は、３つの独立した実験の平均±ＳＤを示す。（Ｃ）ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞を、パリカルシトール（１０−７Ｍ）または１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（１０−７Ｍ）のいずれかで処置し、７２時間後に細胞溶解物を調製した。ウェスタンブロット分析のために細胞溶解物を使用し、ｐ２７ＫＩＰ１、Ｂｃｌ−２、およびＢａｘに対する抗体で連続的に探索した。コントロール細胞を、賦形剤のみで処置した。タンパク質の量を、ＧＡＰＤＨ量との比較によって正規化した。
【図４】図４は、結腸癌細胞株に対するパリカルシトールの効果を示す。（Ａ）ＨＴ−２９、ＳＷ８３７、ＳＷ４８０、およびＨＣＴ１１６結腸癌細胞を、パリカルシトール（１０−７Ｍ）、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（１０−７Ｍ）、または希釈剤（コントロール）のいずれかで９６時間処置した。ＭＭＴアッセイによって成長（コントロールに対する比率）を測定した。結果は、三組の皿を使用した３つの独立した実験の平均±ＳＤを示す。（Ｂ）ＨＴ−２９細胞を、パリカルシトール（１０−７Ｍ）または１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（１０−７Ｍ）のいずれかに曝露した。培養の７２時間後に細胞溶解物を調製し、ウェスタンブロットによって分析した。ウェスタンブロットを、ｐ２７ＫＩＰ１、ｐ２１ＷＡＦ１、サイクリンＤ１、ｃ−ｍｙｃ、およびｅ−カドヘリンの抗体で連続的に探索した。コントロール細胞を、賦形剤のみで処置した。タンパク質量を、ＧＡＰＤＨ量との比較によって正規化した。（Ｃ）ＨＴ−２９およびＳＷ８３７細胞を、パリカルシトール（１０−７Ｍ）または１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（１０−７Ｍ）のいずれかと７２時間培養した。細胞溶解物を調製し、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２に対する抗体で連続的に探索するウェスタンブロットによって分析した。コントロール細胞を、賦形剤のみで処置した。タンパク質量を、ＧＡＰＤＨ量との比較によって正規化した。
【図５】図５は、ヌードマウスにおける腫瘍として成長したＨＴ−２９結腸癌細胞の成長に対するパリカルシトールの効果を示す。ＨＴ−２９細胞を、ヌードマウスに左右対称に皮下注射し、マウスあたり２つの腫瘍を形成させた。マウスを無作為にコントロール群と実験群に分けた。実験群において、パリカルシトール（１００ｎｇ／マウス）を、１週間に３日（月曜日、水曜日、金曜日）腹腔内に投与した。（Ａ）腫瘍体積を毎週測定した。各群の１０個の腫瘍の平均体積±ＳＤを示す。実験群とコントロール群との間で、腫瘍体積は有意に異なった（ｐ＝０．０３）。（Ｂ）治療から４週間後に、各群から腫瘍を取り出し、秤量した。２つの群の間で腫瘍重量は有意に異なった（ｐ＝０．０００４）。
【図６】図６は、細胞株中のビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）の発現、パリカルシトールに応答した２４−ヒドロキシラーゼの発現、ならびに野生型およびＶＤＲノックアウトマウスから単離した細胞におけるパリカルシトールの効果を示す。（Ａ）ＨＴ−２９、ＳＷ８３７、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、およびＨＣＴ１１６結腸癌細胞の細胞溶解物を回収し、ウェスタンブロットによってＶＤＲ発現を測定した。タンパク質量を、ＧＡＰＤＨレベルとの比較によって正規化した。（Ｂ）ＨＴ−２９結腸癌細胞を、パリカルシトール（１０−７Ｍ）で０、６、１２、または２４時間処置し、ＲＮＡを回収した。２４ヒドロキシラーゼｍＲＮＡの発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ｍＲＮＡ量を、１８Ｓ  ＲＮＡとの比較によって正規化した。（Ｃ）野生型またはＶＤＲノックアウトマウスのいずれかの脾臓から抽出した単核細胞を、パリカルシトール（１０−８Ｍ）で１２時間または２４時間処置し、ＲＮＡを回収した。２４ヒドロキシラーゼｍＲＮＡの発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ｍＲＮＡ量を、１８Ｓ  ＲＮＡとの比較によって正規化した。（Ｄ）ＶＤＲノックアウト（ＶＤＲ−ＫＯ）および野生型（ＷＴ）マウス由来の単核骨髄細胞によるコロニー形成。大腿骨髄栓（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｐｌｕｇ）から単核細胞を得て、パリカルシトール（１０−８Ｍ）または希釈剤のいずれかを含むメチルセルロース培養培地中で成長させた。培養１０日目にコロニーを計数した。全コロニー数（平均）は、野生型マウスで８７（コントロール）および６６（パリカルシトール１０−８Ｍ）であり、ＶＤＲ−ＫＯマウスで１１０（コントロール）および１２２（パリカルシトール１０−８Ｍ）であった。マクロファージ、顆粒球、および顆粒球／マクロファージの混合コロニーの比率を示す。各マウスあたり３組のウェルならびに全部で３つのＫＯマウスおよび３つのＷＴマウスを研究した。Ｇ、顆粒球コロニー；Ｇ／Ｍ、顆粒球／マクロファージ混合コロニー；Ｍ、マクロファージコロニー。
【図７−１】図７は、種々の癌細胞株型に対する他の抗癌剤と組み合わせたパリカルシトールの抗増殖効果を示す。癌細胞株（骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０、ＮＢ−４、Ｕ９３７）、骨髄腫細胞（ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＲＰＭＩ８２２８、ＡＲＨ−７７）、前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ、ＰＣ−３、ＤＵ１４５）、乳癌細胞（ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ２３１）、および結腸癌細胞（ＨＴ−２９）が含まれる）を、表示の用量のパリカルシトールおよび／または別の抗癌剤（（Ａ）ダウノマイシン、（Ｂ）三酸化ヒ素、（ＣおよびＧ）アドリアマイシン、（Ｄ）ＰＳ３４１、（Ｅ）デキサメタゾン、（ＦおよびＨ）タキソール、（Ｉ）５−フルオロセラシル（５ＦＵ）、（Ｊ）メトトレキセート（ＭＴＸ）、および（Ｋ）ＮＳ３９８（ＣＯＸ−２インヒビター）が含まれる）で処置し、４日後にＭＴＴアッセイを行った。コントロール細胞を、賦形剤のみで処置した。結果は、三組の皿を使用した３つの独立した実験の平均±ＳＤを示す。（Ｌ）ＨＬ−６０およびＮＢ−４骨髄性白血病細胞を、表示の用量のパリカルシトールおよび／または三酸化ヒ素で処置し、コロニーアッセイを行った。１４日後、コロニーを計数した。結果は、三組の皿を使用した３つの独立した実験の平均±ＳＤを示す。ＨＬ−６０（Ｍ）およびＮＢ−４（Ｎ）骨髄性白血病細胞株を、パリカルシトール（ＨＬ−６０については１０−８Ｍ、ＮＢ−４については１０−７Ｍ）および／または三酸化ヒ素（ＨＬ−６０については８×１０−８Ｍ、ＮＢ−４については６×１０−７Ｍ）で処置した。コントロール細胞を、賦形剤のみで処置した。細胞数を、トリパンブルーアッセイによって６日間毎日計数した。結果は、三組の皿を使用した３つの独立した実験の平均±ＳＤを示す。（Ｏ）前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰ、ＰＣ−３、ＤＵ１４５）、乳癌細胞株（ＭＣＦ−７）、結腸癌細胞株（ＨＴ−２９）、子宮内膜癌細胞株（Ｉｓｈｉｋａｗａ、ＨＥＣ５９、ＨＥＣ１Ｂ）、および肺癌細胞株（ＮＣＩ−Ｈ１２５、ＮＣＩ−Ｈ５２０）をパリカルシトール（０．１μｍ）および三酸化ヒ素（１μｍ）で処置した。４日後にＭＴＴアッセイを行った。
【図７−２】図７−２は、図７−１の続きである。
【図７−３】図７−３は、図７−２の続きである。
【図７−４】図７−４は、図７−３の続きである。
【図７−５】図７−５は、図７−４の続きである。
【図８−１】図８は、三酸化ヒ素と組み合わせたパリカルシトールによってＨＬ−６０およびＮＢ−４骨髄性白血病細胞の単球の分化が顕著に増強され、その後アポトーシスが増大することを示す。ＨＬ−６０およびＮＢ−４骨髄性白血病細胞株を、パリカルシトール（ＨＬ−６０については１０−８Ｍ、ＮＢ−４については１０−７Ｍ）および／または三酸化ヒ素（ＨＬ−６０については８×１０−８Ｍ、ＮＢ−４については６×１０−７Ｍ）で処置した。コントロール細胞を、賦形剤のみで処置した。（Ａ）３日後に、フローサイトメトリーによってＣＤ１４を測定した。結果は、三組の皿を使用した３つの独立した実験の平均±ＳＤを示す。（Ｂ）３日後、ＮＢＴ還元によって単球分化を測定した。結果は、三組の皿を使用した３つの独立した実験の平均±ＳＤを示す。（Ｃ）４日後、フローサイトメトリーによってＮＢ−４細胞の細胞周期分析を行った。サブＧ１集団における細胞の比率を示す。（Ｄ）４日後、ＴＵＮＥＬアッセイによってＮＢ−４細胞株のアポトーシス定量分析を行った。ＴＵＮＥＬ陽性細胞の比率を、３つの独立した実験の平均±ＳＤとして示す。
【図８−２】図８は、三酸化ヒ素と組み合わせたパリカルシトールによってＨＬ−６０およびＮＢ−４骨髄性白血病細胞の単球の分化が顕著に増強され、その後アポトーシスが増大することを示す。ＨＬ−６０およびＮＢ−４骨髄性白血病細胞株を、パリカルシトール（ＨＬ−６０については１０−８Ｍ、ＮＢ−４については１０−７Ｍ）および／または三酸化ヒ素（ＨＬ−６０については８×１０−８Ｍ、ＮＢ−４については６×１０−７Ｍ）で処置した。コントロール細胞を、賦形剤のみで処置した。（Ａ）３日後に、フローサイトメトリーによってＣＤ１４を測定した。結果は、三組の皿を使用した３つの独立した実験の平均±ＳＤを示す。（Ｂ）３日後、ＮＢＴ還元によって単球分化を測定した。結果は、三組の皿を使用した３つの独立した実験の平均±ＳＤを示す。（Ｃ）４日後、フローサイトメトリーによってＮＢ−４細胞の細胞周期分析を行った。サブＧ１集団における細胞の比率を示す。（Ｄ）４日後、ＴＵＮＥＬアッセイによってＮＢ−４細胞株のアポトーシス定量分析を行った。ＴＵＮＥＬ陽性細胞の比率を、３つの独立した実験の平均±ＳＤとして示す。
【図９】図９は、骨髄性白血病細胞におけるパリカルシトールおよび三酸化ヒ素による遺伝子発現の調整を示す。ＨＬ−６０およびＮＢ−４骨髄性白血病細胞株を、パリカルシトール（ＨＬ−６０については０．０１μＭ、ＮＢ−４については０．１μＭ）および／または三酸化ヒ素（ＨＬ−６０については０．８μＭ、ＮＢ−４については０．６μＭ）で処置した。コントロール細胞を、賦形剤のみで処置した。（Ａ）処置３日後、ｍＲＮＡを抽出し、２４−ヒドロキシラーゼ発現を、遺伝子の特異的プライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによって測定した。細胞溶解物も作製し、Ｃ／ＥＢＰβに対する抗体を使用して探索するウェスタンブロットのために使用した。（Ｂ）３日後にＨＬ−６０細胞の細胞溶解物を作製し、Ｂｃｌ−２、ＢｃｌＸＬ、およびＢａｘに対する抗体で連続的に探索するウェスタンブロットのために使用した。（Ｃ）１、２、または３日後にＨＬ−６０細胞の細胞溶解物を作製し、リン酸化ＥＲＫに対する抗体で連続的に探索するウェスタンブロットのために使用した。（Ｄ）２５ｎＭのＰＤ９８０５９を用いて又は用いないで１時間前処理した後、ＨＬ−６０細胞を、パリカルシトール（０．０１μＭ）および／または三酸化ヒ素（０．８μＭ）で２日間処置した。コントロール細胞を、賦形剤のみで処置した。フローサイトメトリーによってＣＤ１４発現を測定した。
【図１０】図１０は、三酸化ヒ素と組み合わせたパリカルシトールはＰＭＬ−ＲＡＲα融合タンパク質による分化の遮断を克服することを示す。（Ａ）ＮＢ−４骨髄性白血病細胞株を、パリカルシトール（０．１μＭ）および／または三酸化ヒ素（０．６μＭ）で３日間処置した。コントロール細胞を、賦形剤のみで処置した。細胞溶解物を調製し、融合タンパク質ＰＭＬ−ＲＡＲαを検出するためにＲＡＲαに対する抗体で連続的に探索するウェスタンブロットのために使用した。（Ｂ）Ｕ９３７細胞を、Ｚｎ２＋誘導性マウスメタロチオネイン１プロモーター（ＰＲ９）の調節下でコントロールＭＴベクター（Ｕ９３７−ＰＭＴ）またはＰＭＬ−ＲＡＲα  ｃＤＮＡのいずれかで安定にトランスフェクトした。細胞を、Ｚｎを使用し（＋）又は使用しないで（−）２日間処置した。表示用量のパリカルシトールおよび／または三酸化ヒ素を細胞に添加した。細胞溶解物を回収し、ＰＭＬ−ＲＡＲα融合タンパク質（１２０ｋｂ）を検出するためにＲＡＲαに対する抗体で探索するウェスタンブロットのために使用した。（Ｃ）Ｕ９３７−ＰＭＴおよびＰＲ９細胞を、示すようにＺｎを用いてか又は用いないでパリカルシトールおよび／または三酸化ヒ素で３日間処理し、フローサイトメトリーによってＣＤ１４発現を測定した。
【図１１】図１１は、三酸化ヒ素によって白血病細胞における２４−ヒドロキシラーゼ酵素活性が抑制されることを示す。ＨＬ−６０（Ａ）およびＮＢ−４（Ｂ）骨髄性白血病細胞株を、パリカルシトール（ＨＬ−６０については０．０１μＭ、ＮＢ−４については０．１μＭ）および／または三酸化ヒ素（ＨＬ−６０については０．８μＭ、ＮＢ−４については０．６μＭ）で３日間処置した。コントロール細胞を、賦形剤のみで処置した。ＨＰＬＣ分析によって、２４，２５（ＯＨ）２Ｄ３レベルを測定した。
【図１２】図１２は、デキサメタゾンと組み合わせたパリカルシトールによりインビトロでの骨髄腫細胞の増殖が非常に減少することを示す。骨髄腫細胞株ＮＣＩ−Ｈ９２９を、パリカルシトール（０．０１μＭ）および／またはデキサメタゾン（０．０１μＭ）のいずれかで３日間処置し、コントロール細胞を、賦形剤のみで処置した。（Ａ）フローサイトメトリーによって細胞周期分析を行った。（Ｂ）フローサイトメトリーによってサブＧ１集団の比率を測定した（左）。アポトーシス細胞の定量分析のために、ＴＵＮＥＬアッセイを行った（右）。（Ｄ）細胞溶解物を回収し、Ｂｃｌ−２およびｐ２７ＫＩＰ１に対する抗体で連続的に探索するウェスタンブロットのために使用した。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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