(57)【要約】ヒトの間葉間質細胞は、それぞれ乏突起膠細胞および神経細胞に分化するように誘導されうる。したがってこれらの細胞型に関しては、パーキンソン病、アルツハイマー病、卒中、および頭部外傷のような神経細胞の喪失によって、または、テイ−サックス病、Ｇ１ガングリオシドーシス、異染性白質ジストロフィー、および多発性硬化症のようなガングリオシドの蓄積もしくは脱ミエリン化における機能不全によって特徴づけられる中枢神経系の病状を治療する状況において、インビトロもしくはインビボのいずれかにおいてＭＳＣが治療的供給源となることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
損傷を受けたミエリンまたは神経学的な変性によって特徴づけられる病状を治療するための方法であって、以下の段階を含む方法：
（ｉ）間葉間質細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ）およびそれに対する生理学的適合性の担体から本質的になる組成物をインビトロで提供する段階；（ｉｉ）該間葉間質細胞が、神経細胞（ｎｅｕｒｏｎ）および乏突起膠細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）より選択される種類の分化細胞に分化するような条件に該組成物を曝露する段階；ならびに（ｉｉｉ）該分化細胞が、該病状に罹患した患者における該神経学的変性または損傷を受けたミエリンについて補償することを可能にする段階。
【請求項２】
段階（ｉｉ）が、組成物を患者の神経系に導入する段階を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
段階（ｉｉ）がインビトロで実行され、かつ段階（ｉｉｉ）が、分化細胞が損傷を受けたミエリンまたは神経学的な変性について補償するように、患者の神経系に分化細胞を導入する段階を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
分化細胞を調製するための方法であり、以下の段階を含む方法：
（ｉ）間葉間質細胞およびそれに対する生理学的適合性の担体から本質的になる組成物を提供する段階；ならびに（ｉｉ）該間葉間質細胞が神経細胞または乏突起膠細胞にインビトロで分化するような条件に該組成物を曝露する段階。
【請求項５】
不死化した間葉間質細胞およびそれに対する生理学的適合性の担体から本質的になる組成物。
【請求項６】
不死化した間葉間質細胞、一つまたは複数の外因性遺伝子、およびそれらに対する生理学的適合性の担体から本質的になる組成物。
【請求項７】
外因性遺伝子がｈＴＥＲＴである、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
損傷を受けたミエリンによって特徴づけられる病状を治療するための方法であって、以下の段階を含む方法：
（ｉ）間葉間質細胞およびそれに対する生理学的適合性の担体から本質的になる組成物をインビトロで提供する段階；（ｉｉ）神経芽細胞腫適合（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）培地を含む培地において該細胞を培養する段階であって、乏突起膠細胞に分化できる乏突起膠細胞の前駆細胞を提供する段階；および（ｉｉｉ）該分化細胞が、該病状に罹患した患者における該損傷を受けたミエリンについて補償することを可能にする段階。
【請求項９】
神経芽細胞腫適合培地がＢ１０４適合培地である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
段階（ｉｉｉ）が、分化細胞が損傷を受けたミエリンについて補償するように、患者の神経系に乏突起膠細胞の前駆細胞を導入する段階を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
間葉間質細胞を乏突起膠細胞の前駆細胞に分化させる方法であって、以下の段階を含む方法：
（ｉ）該間葉間質細胞およびそれに対する生理学的適合性の担体から本質的になる組成物をインビトロで提供する段階；ならびに（ｉｉ）神経芽細胞腫適合培地を含む培地において該細胞を培養する段階であって、乏突起膠細胞に分化できる乏突起膠細胞の前駆細胞を提供する段階を含む方法。
【請求項１２】
神経芽細胞腫適合培地がＢ１０４適合培地である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
間葉間質細胞を乏突起膠細胞に分化させる方法であって、以下の段階を含む方法：
（ｉ）請求項１２記載の方法を行う段階；および（ｉｉ）該乏突起膠細胞の前駆細胞の少なくとも一部が乏突起膠細胞に分化するような条件に、該乏突起膠細胞の前駆細胞を曝露する段階を含む方法。
【請求項１４】
段階（ｉｉ）が、Ｂ１０４適合培地から乏突起膠細胞の前駆細胞を単離する段階を含む、請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、神経細胞および乏突起膠細胞の機能不全または喪失にそれぞれ関係する中枢神経系（ＣＮＳ）の病状を軽減するために、別個の種類の細胞を調製し利用することに関する。
【０００２】
２．関連技術の説明
哺乳動物のＣＮＳの二成分である乏突起膠細胞および神経細胞は有糸分裂を容易に行わず、したがって疾患や外傷によって引き起こされたそれらの喪失に対してインビボでは置換されない。例えばパーキンソン病には、ドーパミンを産生する脳の一部における神経細胞の喪失が関与する。ドーパミンレベルは結果として低下し、筋肉の震せん、筋肉および関節の硬直、ならびに全体的な協調性の欠如の発生となって現れる。別の神経崩壊性の疾患である多発性硬化症（ＭＳ）は、出生後の早期の成長段階で、乏突起膠細胞によって構成されるミエリンの軸策鞘が脱落することに特徴づけられる。この脱ミエリン化により、軸策に沿ったシグナル伝達が妨害され、視力障害、協調性の喪失、および記憶喪失までも引き起こされる。
【０００３】
このような疾患の痛烈な効果は、ＣＮＳの神経細胞および乏突起膠細胞を含む支持細胞に細胞をインビトロで分化させるのに適応できる細胞系および培養条件に関する研究の動機となってきた。例えば、ラットのＯ−２Ａ細胞である乏突起膠細胞の前駆体が増殖培地からマイトジェンを除去することによって、成熟乏突起膠細胞への分化を促しうることが調べられている。バレス（Ｂａｒｒｅｓ）ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２０： １０９７（１９９４）。また、疎水性の細胞表面受容体に対する甲状腺ホルモン、糖質コルチコイドおよびレチノール酸などのリガンドが存在するのであれば、マイトジェンが存在する血清非含有培地で培養された場合には、ラットのＯ−２Ａ細胞が成熟乏突起膠細胞に分化すると考えられる。同上。ヒトの奇形癌腫細胞系は「ＮＴ２」と称され、インビトロでの操作を行う複雑な管理下の手段によって６週間から１０週間の期間の間に有糸分裂後のＣＮＳ神経細胞に分化できる。ユンキン（Ｙｏｕｎｋｉｎ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ２１７４ （１９９３）。
【０００４】
多能性神経幹細胞は神経細胞を得るための別の可能なルートである。したがって米国特許第５，８５１，８３２号は、神経細胞系統に分化できる能力があると言われる、前頭の側脳室の裏にある上衣下の領域から得られた構成的増殖細胞の亜集団を開示している。乏突起膠細胞または神経細胞に分化する能力があるものの、神経幹細胞を可能性を秘めている治療的利用に十分なほどの量で得ることは困難である。奇形癌腫誘導性のＮＴ２系のような既知の細胞系が関わるこの事実および欠点は、乏突起膠細胞または神経細胞のレベルの減少によって特徴づけられる疾患を治療するために利用できる治療方法がほとんどないことを意味している。
【０００５】
発明の概要
したがって本発明の目的は、神経幹細胞およびありきたりの細胞系とは無関係のそれぞれ分化した乏突起膠細胞および神経細胞に対する供給源を提供することにある。
【０００６】
本発明の別の目的は、神経細胞および／または乏突起膠細胞の喪失によって特徴づけられた、ＣＮＳに影響する病状に対して実行可能な治療的アプローチを提供することにある。
【０００７】
これらおよびその他の目的を達成する場合において、本発明の一局面によると、損傷を受けたミエリンまたは神経学的な変性によって特徴づけられる病状を治療するための方法であって、以下の段階を含む方法が提供される：（Ａ）（ｉ）間葉間質細胞、即ち「ＭＳＣ」および（ｉｉ）それに対する生理学的適合性の担体から本質的になる組成物をインビトロで提供する段階；（Ｂ）ＭＳＣが神経細胞および／または乏突起膠細胞に分化するような条件に、前記組成物を曝露する段階；並びにその後（Ｃ）前記分化細胞が、問題となっている病状に罹患した患者における神経学的変性または損傷を受けたミエリンについて補償することを可能にする段階。好ましい態様ではこの組成物は、患者の神経系に導入される。
【０００８】
本発明の別の局面によると分化細胞は、ＭＳＣが神経細胞および／または乏突起膠細胞にインビトロで分化するような条件に、上記に記載したようにＭＳＣ含有組成物を曝露することによって調製される。
【０００９】
関連する特質において本発明は、不死化した間葉間質細胞と生理学的に悪影響を及ぼさない担体から本質的になる組成物をさらに提供する。また本発明は、不死化した間葉間質細胞、一つまたは複数の外因性遺伝子、および生理学的適合性の担体から本質的になる組成物を包含する。
【００１０】
好ましい態様の詳細な説明
間葉間質細胞、即ち非造血細胞の幹細胞様前駆体がそれぞれ乏突起膠細胞および神経細胞に分化できることが判明している。本発明以前には、ＭＳＣが乏突起膠細胞または神経細胞に分化できるという指摘はなかった。骨髄から単離された少なくとも一つのサブセットの細胞が、星状膠細胞、別のＣＮＳ細胞型の進化経路を追随できることが示唆された。アジジ（Ａｚｉｚｉ）らの、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５： ３９０８ （１９９９）参照。しかしこれまでは、ＭＳＣが乏突起膠細胞または神経細胞組織に至る系統に沿って分化できることを予測する根拠はなかった。
【００１１】
本発明者らによって発見されたこの驚くべき能力により、ＭＳＣおよびＭＳＣ分化細胞は、本発明にしたがって（Ａ）パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、および卒中のような神経細胞喪失に特徴付けられるＣＮＳの病状、ならびに（Ｂ）テイ−サックス病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、アデノ白質ジストロフィー、クラッベ病、異染性白質ジストロフィーおよび多発性硬化症のような乏突起膠細胞の喪失が関与する代謝性の脂質貯蔵性疾患を治療するための治療供給源となる。同じ特徴によって本発明はまた、頭部の傷害または他の外傷によってもたらされた神経細胞の喪失を軽減するためのＭＳＣおよびＭＳＣ分化細胞の利用法も提供する。
【００１２】
これらのために本発明はその局面の一つにおいて、乏突起膠細胞および神経細胞のいずれかを必要としている患者に、治療上有効量のＭＳＣまたはＭＳＣ分化細胞を投与する段階を企画している。これに関連して「ＭＳＣ分化細胞」とは、未成熟なおよび成熟した、乏突起膠細胞および神経細胞の両方をそれぞれ含むＭＳＣから分化した何らかの細胞を指す。「治療上有効な」とは、治療を受けている患者のＣＮＳ疾患の有害な作用を減少させる（「軽減する」）ＭＳＣまたはＭＳＣ分化細胞の量を意味する。
【００１３】
下記により詳細に記載したように、局所麻酔して採取することのできる骨髄の吸引物からＭＳＣを単離することは比較的容易である。またそれらを培養して拡張し、外因性ＤＮＡを用いてトランスフェクトすることも、プロコップ（Ｐｒｏｃｋｏｐ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６： ７１ （１９９７）に報告されているように比較的容易である。インサイチューでの移動性と多能性といった幹細胞様の質と併せてこれらの利点があるため、例えば脳の癌のようなＣＮＳ疾患を治療する状況で治療用ＤＮＡを供給するためのビヒクルとして使用できるＭＳＣが本発明によって推奨された。
【００１４】
ＭＳＣ自体は本発明によって治療用に投与できるが、多くの例ではＣＮＳ疾患に罹患した患者にＭＳＣ分化細胞を投与するほうがより実用的であると考えられる。このためＭＳＣは、経験的に決定された適切な培養条件下で、神経細胞の分化または乏突起膠細胞の分化に影響を与えることがわかっている種々の栄養因子を添加および除去してインビボでの生理的条件を擬態させることによってそれぞれ乏突起膠細胞および神経細胞に分化できる。
【００１５】
骨髄からのＭＳＣの単離
本発明の目的のためのＭＳＣは、例えばアジジ（Ａｚｉｚｉ）ら（１９９９）の同上文献に開示された既知の方法論によって入手できる。このため骨髄を、本発明によって治療されるべき患者となりうるドナーの腸骨稜から吸引することができる。骨髄のドナーは肝炎およびＨＩＶについてスクリーニングすべきである。続いてＭＳＣを、アジジ（Ａｚｉｚｉ）ら（１９９９）の同上文献によって例示されている従来の技術によって骨髄から単離する。
【００１６】
このアプローチにより、骨髄の吸引物を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を用いて希釈し、遠心分離する。その後で上清と界面を混合し、再び希釈してから遠心分離を行う。続いて核のある細胞を望ましい濃度のＦＢＳで懸濁し、適切な密度で培養皿にプレーティングする。細胞を約３日間インキュベートし、続いて非付着性の細胞を培地を置換することによって取り除く。培養物がコンフルエントに達してから細胞をトリプシン処理して取り上げる。希釈段階と再プレーティング段階を、第２代目の継代開始の際、血小板誘導性の成長因子αα（ＰＤＧＦ−ＡＡ；ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を添加し、３代から５代の継代を繰り返すことができる。
【００１７】
神経細胞前駆細胞のインビトロでの増殖および分化
ＭＳＣは、増殖と分化を高める基質上で増殖させねばならない。そのような適当な基質はゴットリーブ（Ｇｏｔｔｌｉｅｂ）らのＣＵＬＴＵＲＩＮＧ ＮＥＲＶＥ ＣＥＬＬＳ、２０２−０６ （ＭＩＴ Ｐｒｅｓｓ、１９９８）の方法論によって得られるのであるが、彼らは組織培養フラスコの底部を０．１％のゼラチンで被覆し、神経細胞の前駆細胞を増殖させ分化させることに導く表面を入手した。ゴットリーブ（Ｇｏｔｔｌｉｅｂ）らはまた、ＭＳＣの増殖に影響を与えるのに適した培養培地も開示しており、ピルビン酸塩、およびＦＢＳを含まないグルタミン、仔ウシ血清、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、β−メルカプトエタノール、並びに蒸留水にさまざまな濃度の５’−ヌクレオシドを含むヌクレオシドストックを加えたダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）である。
【００１８】
ゴットリーブ（Ｇｏｔｔｌｉｅｂ）の方法論は、胚幹細胞（ＥＳ）が神経細胞に分化する前に胚幹細胞を増殖させるために用いられ、それはＭＳＣの増殖／分化を刺激する目的に容易に適用される。同様に神経細胞の前駆細胞の増殖を誘導するための他の方法を、本発明によるインビトロでのＭＳＣの増殖に影響を与えるように適合させることが可能である。例えばブルストル（Ｂｒｕｓｔｌｅ）らのＮａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６： １０４０ （１９９８）はこの目的にふさわしい増殖培地を開示しており、それはＤＭＥＭ、グルコース、グルタミン、炭酸水素ナトリウム、インシュリン、ヒトアポ−トランスフェリン、プロゲステロン、プトレッシン、亜セレン酸ナトリウム、ペニシリン／ストレプトマイシン、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ２）、および上皮成長因子（ＥＧＦ）を含む。
【００１９】
ＬＩＦおよびβ−メルカプトエタノールはどちらも培養物中のＭＳＣの自然な分化を抑制する点で重要であるため、ＭＳＣを増殖させる際にはＬＩＦとβ−メルカプトエタノールのレベルをモニターすべきである。また、培養物の密度をモニターすること、また確立された限度内のレベル、即ち６０％〜７０％のコンフルエントを維持することも重要である。
【００２０】
ＭＳＣの継代は簡単な手順である。骨髄を最初にプレーティングした後、ＭＳＣを、アジジ（Ａｚｉｚｉ）ら（１９９９）の同上文献に開示されたように、付着性に差異があることを利用して造血細胞から精製する。引き続くＭＳＣの継代は標準的なトリプシンプロトコールの手段、例えばハンクの塩（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ Ｎｏ． １５０５０）に０．２５％のトリプシンをＥＤＴＡとともに入れた手段によって行われる。ＭＳＣをプレーティングした後のほぼ２日目には培養物は全体で約３×１０６個の細胞を持っているはずであり、その後で細胞は、ほとんどコンフルエントになっているフラスコの細胞の例えば１０分の１が新しい基質に植えられるように継代することができる。
【００２１】
ＭＳＣを神経細胞の形態に分化させるために、ＭＳＣの増殖を刺激する任意の成長因子が培養物から通常は抜き取られ、そして細胞の分化を刺激する神経成長因子（ＮＧＦ）およびレチノール酸（ＲＡ）のような物質が添加される。分化を誘導するための代表的な培養条件はロネット（Ｒｏｎｎｅｔ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８： ６０３ （１９９０）、およびプレジャー（Ｐｌｅａｓｕｒｅ）ら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２： １８０２ （１９９２）によって開示されており、彼らは１−イソブチル−３−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、ジブチリルアデノシン３’，５’−モノホスフェート（ｃＡＭＰ）、および神経成長因子（ＮＧＦ）を添加し、続いて２日から４日後に細胞培養物にＲＡを導入した。ＲＡ処理を行った後細胞を低密度で再プレーティングすることができる。約２日以上の期間が経過した後、同濃度のＲＡを用いて培地を置換した。この段階ではＮＧＦは、神経の分化に影響を与える適当な成長因子を残している。さらにＮＧＦはまた、リチャード（Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ）およびファリナス（Ｆａｒｉｎａｓ）がＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＡＮＤ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＡＰＰＲＯＡＣＨＥＳ ＩＮＴＯ ＮＥＵＲＡＬ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ２２０−２６３（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ． １９９７）によって報告したように成熟神経細胞の生存を促進する点での役割も果たしており、したがって利用可能である。
【００２２】
細胞を置換する場合、それらが増殖している基質からそれらを単離すべきである。この目的への一アプローチは、培養フラスコを揺すってフラスコから細胞を無理やり移動させることを伴い、これにより細胞が浮く。その後で浮遊する細胞を培地で洗浄し、そして再プレーティングする。この際の細胞培養に適した基質はＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＡ、ＵＳＡの製品）であり、基底膜マトリックスには成長因子のほかに、コラーゲンＩＶ、ラミニン、エンタクチン、およびなかでもヘパラン サルフェート プロテオグリカン（ペルレカン）（ｐｅｒｌｅｃａｎ）が含まれる。次に細胞を、ＦＢＳとペニシリン／ストレプトマイシンを含み、約１μｌのシトシンアラビノシド、およびそれぞれ１０μｌのフルオロデオキシウリジンとウリジンを補充したＤＭＥＭ高グルコース（ＨＧ）に植えることができる。
【００２３】
神経細胞系統に沿った分化に影響を与えるさらに別のアプローチは、ＭＳＣを条件培地（ＣＭ）に導入することを伴う。例えばヘンダーソン（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ）らのＰｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８： ２６２５ （１９８１）には、ニワトリの胚抽出物を含む適当なＣＭが開示されている。ヘンダーソン（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ）らによって開示された方法論に従うと、培養段階は基質に細胞をプレーティングするこから始まるのであるが、基質はゼラチンでコーティングされたプラスチック皿であってもよい。培養内地は、三成分最小必須培地、一成分培地１９９、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の熱不活性化ウシ血清、１％のニワトリ胚抽出物、２ｍＭのグルタミン、１００ユニット／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含む。アラビノシトシンの量は、当業者には明らかとなる時間が経過した後、分割中の細胞を殺せるように添加されうる。１日から４日後、培地を除去し、細胞を最小必須培地（２ｍＭのグルタミン、１００ユニット／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むイーグル）で二度洗浄する。続いて細胞を新しい（「非適合」）最小必須培地に載せる。１日から４日以上の培養を行った後、培地、ここでは「適合」培地を除去し、保存してから新しい、非適合培地によって置換するが、それはまた約４日間で適合する。適合培地は数週間、４℃でその活性を保持したまま保存できる。
【００２４】
神経細胞系統に沿ったＭＳＣ分化を誘導するために、ＬＩＦおよびβ−メルカプトエタノールを存在させるべきではない。分化する状況ではしたがって、ＬＩＦおよびβ−メルカプトエタノールを両方とも存在させない前述した培地のどれかにおいて、ＭＳＣを培養することが好ましい。
【００２５】
本発明に従ってインビトロでの培養物が４０％から６０％の神経細胞を含む時点まで分化段階が達した場合に、見かけの密度レベル１００％までさらに「精製」することは、例えばＮＴ２細胞を精製するのに採用された戦略を用いて可能である。クレップナー（Ｋｌｅｐｐｎｅｒ）らのＪ． Ｃｏｍｐ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ３５７： ６１８−６３２ （１９９５）は、適当な「精製」段階を記載している。この段階は、トリプシンを用いて神経細胞細胞を無理に移動させることを伴い、その後で細胞を再プレーティングしてからそれらに、５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴの製品）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（ＪＲＨ）（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳの製品）、および有糸分裂阻害剤とともにＤＭＥＭ−ＨＧを含む、適合培地の１：１希釈物を二度与える。適当な有糸分裂阻害剤は、１μＭのウリジン、１μＭの５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（ＦＵＤＲ）、および０．１ＭのＡｒａＣ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯの製品）を含む。この培養段階を行った約１週間後、細胞培養物は、約９９％の純粋な有糸分裂後の神経細胞を含んでいるはずである。
【００２６】
細胞発生のモニタリング
培養培地における栄養因子の濃度を変化させ、それによって目的の系統をＭＳＣに分化させるのに好ましいようにするための計画は、上記に記載したように所定のプロトコールの経過で起こる細胞発生をモニターすることによって経験的に決定されうる。特定の細胞の発生段階と同様に、生きている細胞の濃度は同じく従来の手法によって決定できる。例えば成熟神経細胞の表現形があることは、細胞が軸策および樹状突起を含む高度に分極した神経細胞形態を含んでいた場合に明らかとなる。さらに細胞を、ニューロフィラメントサブユニット、タウタンパク質、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２）、および神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）のような神経細胞特異性遺伝子産物を産生する効力によって培養物中で同定できる。
【００２７】
このように、神経細胞遺伝子の産物に結合するか、さもなければヒト神経細胞自体を同定する抗体に細胞を接触させること、続いて選択された培養条件下でマーカーに結合する細胞濃度を確かめることが日常的に行われる実験である。この方式で、ＭＳＣの神経細胞への分化を促進できる最適の培養条件を決定できる。この目的のための適当な抗体の例は、ＭＯＣＨ−１、Ｍ１２、Ｔ１４、ＲＭＯ９３、ＲＭＯ２４、ＲＭＯ２１７、およびＲＭＯ３０１である。クレップナー（Ｋｌｅｐｐｎｅｒ）ら（１９９５）の同上文献、およびミヤゾノ（Ｍｉｙａｚｏｎｏ）ら、Ｊ． Ｃｏｍｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． ３５７： ８１８ （１９９５）には、ヒトの神経細胞を同定するためにこれらの抗体を使用することが記載されている。例えばＭＯＣＨ−１は、神経細胞を識別できるポリペプチドのＮ−ＣＡＭにあるヒト特異的エピトープを結合できる。ブルメンドルフ（Ｂｒｕｍｍｅｎｄｏｒｆ）らのＣｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ６： ５８４ （１９９６）は、Ｎ−ＣＡＭが発見されたために神経接着タンパク質および認識タンパク質を含む１００以上のＩｇドメインが同定されたことを報告している。Ｎ−ＣＡＭと同様に、これらのタンパク質はこの状況において神経細胞特異的マーカーとして機能できる。
【００２８】
本発明はまた、より特異的マーカーが必要とされるのであればそのマーカーの利用法も包含する。パーキンソン病はドーパミン作動性神経細胞に悪い影響を与えるため、例えばチロシンヒドロキシラーゼおよびドーパミンβ−ヒドロキシラーゼのようなドーパミン作動性神経細胞に特異的なマーカーは、本発明によって培養物中で産生されたドーパミン作動性神経細胞を検出する際に都合がよい。同様にコリンアセチルトランスフェラーゼはアルツハイマー病に罹患した患者に影響を与えるコリン作動性神経細胞に対するマーカーであり、またトリプトファンヒドロキシラーゼはセロトニン作動性神経細胞に対するマーカーである。
【００２９】
インビトロでの乏突起膠細胞前駆細胞の増殖および分化
培養培地と栄養因子を適切に組み合わせた場合、ＭＳＣはまた、インビトロで乏突起膠細胞に分化するように本発明によって刺激できる。上述したように本質的に分化の進行をモニターすることが可能で、それによって分化段階を容易にする栄養因子を添加したり、取り除いたり、および／または濃度を変えたりして適当な計画を立てることができる。
【００３０】
ＭＳＣを前述したように骨髄から単離し、望ましい培養密度にまで増殖させた後で細胞を、例えばバレス（Ｂａｒｒｅｓ）ら（１９９４）の同上文献によって記載されているように乏突起膠細胞の増殖および分化に適した条件で、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）でコーティングされた組織培養上に、血清非含有培地に入れてプレーティングすることができる。こうして培養物は、ＤＭＥＭ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、セレン、プトレッシン、チロキシン、トリヨードチロニン、トランスフェリン、プロゲステロン、亜セレン化ナトリウムおよび適当な栄養因子を含むことができる。ウシ血清培地は純度が高く、結晶レベルの品質のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ａ４１６１）を用いて調製することによって、残存する因子が含まれるのを避けるべきである。またピルベート（１ｍＭ）の助けが存在すると、細胞培養の早期の段階でのＭＳＣが支持される。温度を３０℃〜４０℃の範囲に維持する必要がある。
【００３１】
二つの群の栄養因子、即ちサイトカインと成長因子は、ＭＳＣの乏突起膠細胞への増殖と分化に特に関連する。この状況で用いられる成長因子の例は、ＰＤＧＦ−αおよびＰＤＧＦ−ααを含む血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、塩基性繊維芽細胞由来成長因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦ−α）、インシュリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ３）、および甲状腺ホルモンである。バレス（Ｂａｒｒｅｓ）らのＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１８： ２８３ （１９９３）、ｌｏｃ． ｃｉｔ． １２０： １０９７ （１９９４）、およびＧｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ７１： （１９９６）、ゴクハン（Ｇｏｋｈａｎ）らの１６Ａ ＣＯＭＰＡＮＩＯＮ ＴＯ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ ３４５−５８ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９８）参照。サイトカインは例えば、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、インターロイキン６、インターロイキン１１およびインターロイキン１２（ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２）、並びにコロニー刺激因子（ＣＳＦ）の中から選択することができる。同上文献。
【００３２】
マイトジェンである成長因子は細胞の増殖を促進するが、分化は誘導しない。ｂＦＧＦは乏突起膠細胞およびその子孫のためのマイトジェンであり、系統の進行（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）を調節する。ＮＴ−３およびＰＤＧＦも、乏突起膠細胞系統に関わってゆく細胞に対する強力なマイトジェンである。ＰＤＧＦに対する乏突起膠細胞の増殖性の反応は、Ｐｒｏ−ＯＬ段階では保持されているが（下記の表参照）、ＰＤＧＦ−α受容体の下方制御前のＰｒｅ ＧａｌＣ段階で失われる。ＩＧＦ−１は、Ｐｒｏ−ＯＬの分化および可能ならば増殖の増強によって、培養物における乏突起膠細胞の産生を促進して増加させる。したがって、ＩＧＦ−１を少なくともＰｒｏ−ＯＬ段階で始まる培養物に導入することが有効であると考えられる。
【００３３】
甲状腺ホルモンが存在するとミエリンになるまでの早期の段階から乏突起膠細胞系統の分化に影響するため、ホルモンは乏突起膠細胞の発生に重要な役割を果たしていると考えられる。バレス（Ｂａｒｒｅｓ）ら（１９９４）の同上文献。甲状腺ホルモンは、マイトジェンの存在下で前駆細胞が乏突起膠細胞に分化するのを可能にすると考えられる。しかしマイトジェンが存在しない場合は、分化を誘導する必要はない。同上。
【００３４】
本発明の一態様では、ｂＦＧＦおよび／またはＰＤＧＦ−ααのような成長因子を用いて分化していない細胞を予め処理し、その後因子の除去とサイトカインの添加が連続して行われることが有用である。サイトカインは本明細書に記載されたものの組み合わせであってもよい。乏突起膠細胞の分化が起きている間は培養温度をモニターし、当業者にとって明らかになりうる確立された範囲内の温度に維持することが重要である。
【００３５】
マウスの胎児から得られる海馬と大脳の子孫が関与する実験に基づいて、ゴクハン（Ｇｏｋｈａｎ）ら（１９９８）の同上文献は、別個の因子からなる５個のサブクラスから得られるサイトカインが、乏突起膠細胞系統種を進化させる系統への傾倒と細胞の成熟をプログラムするために用いられると考えられることを報告した。さらに具体的には、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ−αα、ＩＧＦ−１、ＮＴ３、およびＣＮＴＦ／ＩＬ−６のサブクラスのメンバーの組み合わせが解明された。さらに、たとえばＣＮＴＦ、ＬＩＦ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、およびＧ−ＣＳＦなどのｇｐ−１３０関連リガンドにより、複数の系列の移行における様々な細胞活性を示す能力が示された。このようにゴクハン（Ｇｏｋｈａｎ）らは、ＭＳＣの乏突起膠細胞への分化を誘導するのに必須である栄養因子を適当に組み合わせるための眼識を提供した。
【００３６】
さらにバレス（Ｂａｒｒｅｓ）ら（１９９３）の同上文献は、インビトロで乏突起膠細胞が長期間生存するのを促進する３つのクラスの栄養因子、即ち（１）ＩＧＦ、（２）ニューロトロフィン、特にＮＴ−３、ならびに（３）ＣＮＴＦ、ＬＩＦおよびＩＬ−６の重要性を報告した。代（３）群の分子は同種のサイトカインのファミリーに属する。ＣＮＴＦは、インビボで乏突起膠細胞の生存を促進する別の生存（ｓｕｒｖｉｖａｌ）因子である。即ちそれは、星状膠細胞特異性タンパク質ＧＦＡＰを発現させるために培養物中に乏突起膠細胞前駆体を誘導するとともに、それはまた、インビトロ精製乏突起膠細胞に対する生存因子でもある。ＬＦおよびＩＬ−６は両方とも、精製された乏突起膠細胞の生存を促進する。バレス（Ｂａｒｒｅｓ）ら（１９９３）によって開示されているように、インビトロでは、プラトーに達した濃度のＬＩＦまたはＩＬ−６によって、精製された乏突起膠細胞の約５０％の生存が促進された。
【００３７】
ルイス（Ｌｏｕｉｓ）らのＪ． Ｎｅｕｒｏｓｉｃ． Ｒｅｓ． ３１： １９３−２０４ （１９９２）によって開示されたＢ１０４ ＣＭのような神経芽細胞腫ＣＭは、本発明によってＭＳＣを乏突起膠細胞に分化させるのに適した別の種類の培地である。このために前述したようにＭＳＣを骨髄から単離し、適当な基質上で望ましい培養密度にまで増殖させてからそこから分離した。この単離されたＭＳＣを上述したように、約１０μｇ／ｍｌのポリ−Ｄ−リジンでコーティングされた組織培養皿またはガラス製のカバーグラス片（Ｂｅｌｌｃｏ Ｇｌａｓｓ）などの基板上に移すことができる。基板はさらに、１．５Ｍのホウ酸塩でコーティングされていてもよい。
【００３８】
ＭＳＣを、ペニシリンおよびストレプトマイシンの混合物に入れた２ｍＭのグルタミンとともに、ＤＭＥＭに入れた約１０％のウシ胎児血清を含む培地にある基板上にプレーティングすることができる。好ましくは細胞を、１／２コンフルエントと完全なコンフルエントの間の密度、例えば約５，０００個の細胞／ｃｍ２になるようプレーティングする。細胞をプレーティングした後、乏突起膠細胞前駆体への分化を誘導するＢ１０４ ＣＭのような培地を添加する前に、それらの細胞がその基質表面に接着できるようにすることが好ましい。この接着段階は、ＭＳＣをプレーティングした後の通常約２４時間で自然に起こると考えられる。
【００３９】
充分な濃度の細胞が基質に接着したら細胞を最小必須培地で洗浄し、選択した神経芽細胞腫適合培地で培養する。この目的でＢ１０４ ＣＭ培地を作製するために、Ｂ１０４ ＣＭ培地のような神経芽細胞腫の細胞の培養物を、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｈｏｇａｎ、ＵＴの製品、またはＳｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯの製品）、２ｍＭのグルタミン、および１００μｇ／ｍｌのペニシリンを補充したＤＭＥＭ中で増殖させる。培養物がコンフルエントの約２分の１から完全なコンフルエントまでの濃度に達してからそれを例えばハンクの塩溶液（Ｈａｎｋ’ｓ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で二度洗浄し、そしてボッテンスタイン（Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎ）らのＥｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． １３５： １８３ （１９８０）に記載されたように、２ｍＭのグルタミン、１００μｇ／ｍｌのペニシリン、およびＮ１サプリメントを組み合わせた血清非含有ＤＭＥＭ中でインキュベートする。Ｎ１サプリメントは、５０μｇ／ｍｌのトランスフェリン、５μｇ／ｍｌのインシュリン、１００ｍＭのプトレッシン、２０ｎＭのプロゲステロン、および３０ｎＭのセレンを含む。約３日または４日の培養を行った後、培地を取り出し、濾過してから必要とされるまで−２０℃で保存する。培地を一週間以内に用いることが好ましい。
【００４０】
ＭＳＣの乏突起膠細胞前駆体への分化を誘導するために、記載されたように単離およびプレーティングされたＭＳＣを、その容積の約３０％のＢ１０４ ＣＭ培地を含むＮ１培地中で培養する。（Ｎ１培地は、５μｇ／ｍＬのトランスフェリン、１６．１μｇ／ｍＬのプトレッシン、６．３ｎｇ／ｍＬのプロゲステロン、３．３ｎｇ／ｍＬのセレン、１０ｎｇ／ｍＬのビオチン、２ｍＭのグルタミン、および５μｇ／ｍＬのインシュリンを含むＤＥＭＥを含む。）　得られた「Ｂ１０４／Ｎ１」培地は凍結したストックから、好ましくは１週間以上は保存されていないストックから調整できる。この段階での細胞培養物は、乏突起膠細胞前駆細胞に分化した、またはさもなくば似ている、任意の細胞を検出するためにモニターするべきである。
【００４１】
ＭＳＣの乏突起膠細胞前駆細胞への細胞分化は約６時間から１２時間の素早さで起こり、Ｂ１０４／Ｎ１培地で細胞を培養した約２４時間後までに容易に起こると考えられる。乏突起膠細胞の前駆細胞は、前駆細胞型に小さなプロセスが存在すること、同様にそれが相対的に小さい大きさであって丸い形状になっていることで他の細胞型と識別できる。一方ＭＳＣは通常、乏突起膠細胞前駆細胞に比べてかなり扁平で長い。また乏突起膠細胞前駆細胞を、従来の免疫組織化学的手法を用いて培養物に含まれる他の細胞と識別できる。このプロセスを実行するのに適した抗体には、下記の表に列挙したようなＡ２Ｂ５およびＧＤ３が含まれる。Ｂ１０４適合培地はまた、ＭＳＣから分化した乏突起膠細胞前駆細胞の急速な増殖も誘導する。したがって、一部のＭＳＣが乏突起膠細胞前駆体に分化した後でもＢ１０４ ＣＭが存在し続けていると、より高濃度の乏突起膠細胞前駆体を得ることができる。
【００４２】
乏突起膠細胞前駆細胞が１００％の培養集団を含んでいない場合には、培養物に含まれる乏突起膠細胞前駆細胞の純度を高めるために、培養物を、例えばグリンスパン（Ｇｒｉｎｓｐａｎ）ら、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ４３： １−１７ （２０００）に記載されているような従来の免疫パニング法（ｉｍｍｕｎｏｐａｎｎｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）に供することができる。この免疫パニング精製方法は、カルシウムまたはマグネシウムを含まないハンクス溶液中でトリプシン処理または粉砕処理を行い、続いてペレット化、計数、および培養培地への細胞の再懸濁を行うことで培養物から細胞を取り出す段階を包含する。この培地は例えば、１０μｇ／ｍｌのインシュリン、３０ｍＭの亜セレン化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｓｅｌｅｎｉｔｅ）、１０μｇ／ｍｌのヒトトランスフェリン、１０−１１のトリヨードチロニン、０．０５μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、５０倍に濃縮された最小必須アミノ酸１０μｇ／ｍｌの１０倍濃縮されたＭＥＭビタミン類、ならびにペニシリンおよびストレプトマイシン（１％ｖｏｌ／ｖｏｌ）を入れたＨａｍ’ｓ Ｆ１２を含む。
【００４３】
この細胞は、例えば非組織培養用のプラスチック製ペトリ皿であってもよい一つまたは複数の予めコーティングされた免疫パニング用皿に移されるまで懸濁液に入れたままにしてもよい。この免疫パニング用皿は、懸濁液に含まれる他の細胞から乏突起膠細胞前駆細胞を分離するのに有用な基質でコーティングされている。したがって免疫パニング用皿に細胞を植える前に、懸濁液に含まれる細胞型に対する親和性をその少なくとも一個が持っているような一つまたは複数の抗体で、皿をコーティングする。
【００４４】
一態様においては免疫パニング用皿をまず、二次抗体、即ち一次抗体に対して親和性を持つ抗体で被覆する。この状況での「一次抗体」とは、免疫パニング用皿に植えられる細胞の懸濁液に含まれる少なくとも一つの細胞型に対する親和性を持つ抗体である。選択された二次抗体は、用いた一次抗体によって異なると考えられる。例えば、一次抗体が「Ｒａｎ−２」である場合の二次抗体はＩｇＧでありうるし、また一次抗体が「Ａ２Ｂ５」もしくは「０４」である場合はＩｇＭでありうる。二次抗体が免疫パニング用皿にコーティングされた後で二次抗体を約６時間〜１８時間、４℃でインキュベートすることによって、充分な量の抗体を免疫パニング用皿に接着させることができる。その後皿を約１回から５回、例えば滅菌性のＰＢＳで洗浄することにより、プレートが乾燥しないように注意を払って非接着性の二次抗体を除去することができる。
【００４５】
その後で一次抗体を免疫パニング用皿に添加することができ、皿を約１時間、例えば約２５℃でインキュベートすることができる。非接着性の抗体は、免疫パニング用皿を約１回〜５回、好ましくは２回、滅菌性ＰＢＳを用いて、例えばプレートを乾燥させないように注意を払って洗浄することによって除去できる。このために洗浄溶液を、最後の洗浄をした後で免疫パニング用皿に残ったままにしておくことができる。
【００４６】
一次抗体を免疫パニング用皿に被覆してから、培地、即ち例えば上述したとおりのサプリメントを補充したＨａｍ’ｓ Ｆ１２を含む約８ｍｌの培地に入れた細胞が一皿あたり約２，０００，０００個〜４，０００，０００個、好ましくは２，５００，０００個〜３，０００，０００個の密度となるように、細胞を皿に植えることができる。皿内の組成物を、一次抗体が細胞に結合するのに充分な時間、約２５℃でインキュベートすることができる。インキュベート時間は、約１５分間から２時間、好ましくは約３０分間であってよい。
【００４７】
この皿の一次抗体は乏突起膠細胞前駆体に対する親和性を持っていないものであってもよいが、その代わり懸濁液に含まれる別の細胞型に対する親和性を持っている。例えば一次抗体は、ラットの星状膠細胞または星状膠細胞の前駆体に結合し、おそらくヒトの星状膠細胞にも結合できるＲａｎ−２であってもよい。したがってこのような抗体は、「望ましくない」細胞および／または他の混入物に結合すると考えられる。よって、一次抗体と複合体を形成しない細胞に乏突起膠細胞前駆体が含まれると考えられる。非接着性細胞（即ち一次抗体に結合しない細胞）を従来の手法によって皿から取り出すことができ、別の免疫パニング用皿に移すことができる。
【００４８】
非接着性細胞が移された新しい免疫パニング用皿は同様に、乏突起膠細胞前駆細胞に結合しないが、その代わりに懸濁液中に存在する可能性のある他の細胞に結合する一次抗体を含むと考えられる。例えば一次抗体はここでもＲａｎ−２であってもよいし、または乏突起膠細胞前駆体ではない一つまたは複数の細胞型を認識する別の抗体であってもよい。非乏突起膠細胞前駆細胞が乏突起膠細胞前駆細胞よりもＲａｎ−２に対して親和性が高いため、Ｒａｎ−２はこれに関して適当な抗体である。前述したように一次抗体と複合体を形成しない細胞には乏突起膠細胞前駆体が含まれ、それは簡単な技術によって皿から取り出されうり、別の免疫パニング用皿に植えられる。本発明は、乏突起膠細胞前駆細胞には結合しないが、その代わり懸濁液に存在する可能性のある他の望ましくない細胞および／または混入物に結合する一次抗体を含む免疫パニング用皿上で、細胞を一回、二回、またはそれ以上継代することを提供する。
【００４９】
細胞が移された免疫パニング用皿も、乏突起膠細胞前駆細胞に特異的か、または乏突起膠細胞前駆細胞に対して別のように親和性を持つ一次抗体を含むと考えられる。例えば一次抗体は、ロイ（Ｒｏｙ）ら、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １９： ９９８６−１００３ （１９９９）に開示されているように、Ａ２Ｂ５または０４、即ちヒト前駆体も認識するラットの乏突起膠細胞前駆体に対する抗体であってもよい。細胞と抗体からなる組成物をインキュベートさせると、一次抗体が乏突起膠細胞前駆細胞に結合すると考えられる。培養培地などの非接着性材料は皿を洗浄して除去されうる。残っている乏突起膠細胞前駆細胞を、トリプシン−バーシン（ｖｅｒｓｉｎｅ）溶液を用いて一次抗体から分離できる。続いて結合しなかった乏突起膠細胞前駆体を、上述したように、Ｎ１／Ｂ１０４培地を含む培地中の新しいペトリ皿に植えることができる。
【００５０】
Ｂ１０４ ＣＭが乏突起膠細胞前駆体がさらに分化するのを阻害しうる成長因子を含んでいるため、乏突起膠細胞前駆細胞が成熟乏突起膠細胞に分化する段階には、Ｂ１０４ ＣＭを別の培地と置換する段階が通常は含まれる。したがって上述した乏突起膠細胞前駆体をＢ１０４／Ｎ１培地から単離でき、例えばトランスフェリン、プトレッシン、プロゲステロン、セレン、ビオチン、グルタミン、インシュリン、Ｔ４、およびグルコースの混合物を含む５０％ＤＭＥＭおよび５０％Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２を含んでいる培地（「ＤＭＥＭ／Ｆ１２分化用培地」）で増殖させることができる。特に、この混合物は、５０μｇ／ｍＬのトランスフェリン、５ｍｇ／ｍＬのプトレッシン、３ｎｇ／ｍＬのプロゲステロン、２．６ｎｇ／ｍＬのセレン、１０ｎｇ／ｍＬのビオチン、２ｍＭのグルタミン、１２．５μｇ／ｍＬのインシュリン、０．４μｇ／ｍＬのＴ４、および０．３％のグルコースを含むことができる。乏突起膠細胞前駆体を成熟乏突起膠細胞に分化させるのに適した別の培地は、上述したように栄養因子ＣＮＴＦおよびＮＴ−３を含む。このためにＣＮＴＦおよびＮＴ−３を、それぞれ２ｎｇ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌでＤＭＥＭ／Ｆ１２分化用培地に添加することができる。
【００５１】
星状膠細胞のＣＭは本発明の細胞を乏突起膠細胞に分化させるためのさらに別の適当な培地である。ゴットリーブ（Ｇｏｔｔｌｉｅｂ）らのＣＵＬＴＵＲＩＮＧ ＮＥＲＶＥ ＣＥＬＬＳ ５１７−５３０ （ＭＩＴ Ｐｒｅｓｓ、１９９８）はこの培地の調整法を開示しており、それは、星状膠細胞の培養物をＤＭＥＭ−ＢＳ中で４８時間増殖させる段階、培地を収集する段階、続いて培地を新しいＤＭＥＭ−ＢＳと置換してさらに４８時間増殖させる段階からなる。約５００ｍｌのＤＭＥＭ−ＢＳの適当な混合物は次の成分を含んでいる：２５μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ ｎｏ． １５７５０−０１１）を加えた４６９ｍｌのＤ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｎｏ．１１９９５−０６５）；１０ｍｌの調製インシュリン；５ｍｌの調製トランスフェリン；５ｍｌのグルタミン；および１１ｍｌの「サプリメント混合物」。サプリメント混合物は４４４ｍｌの容量で作製されうる。第１段階は、２００ｍｌのＰＢＳ＋０．７２ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）パス（ｐａｔｈ）−ｏ−サイト（ｃｙｔｅ）４（ＩＣＮ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、２００ｍｌのＨ２Ｏ＋３２２ｍｇのプトレッシン（Ｓｉｇｍａ ｎｏ． Ｐ−７５０５）、２０ｍｌのエタノール（ＥｔＯＨ）＋８．０ｍｇのチロキシン（Ｔ４、Ｓｉｇｍａ ｎｏ．Ｔ−２５０１）、および２０ｍｌのＥｔＯＨ＋６．７４ｍｇのトリヨードチロニン（Ｔ３、Ｓｉｇｍａ ｎｏ．Ｔ−２７５２）を組み合わせることである。甲状腺ホルモン非含有培地が必要な場合には、Ｔ３およびＴ４を対応する量のＥｔＯＨと置換することができる。次に、２０ｍｌのＥｔＯＨ＋１２．４６ｍｇのプロゲステロン（Ｓｉｇｍａ Ｎｏ．Ｐ−０１３０）、および２０ｍｌのＨ２Ｏ＋７．７４ｍｇのセレン（Ｓｉｇｍａ Ｎｏ．Ｓ−１３８２）からそれぞれ２ｍｌずつ加える。次にこの混合物全体を０．２２μｍのフィルターを通過させて濾過し、１１ｍｌのアリコートに分離してから−２０℃で保存することができる。上述した調製トランスフェリンは、二度蒸留した水に１０ｍｇ／ｍｌのトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ Ｎｏ．Ｔ−２２５２）を混合し、続いて濾過段階を行うことによって得られる。２００ｍｇのインシュリン（Ｓｉｇｍａ Ｎｏ．Ｉ−５５００）を１００ｍＬのＨ２Ｏ中で前もって希釈し、その後インシュリンが溶解するまでＨＣｌ（１Ｎ／約、１０ｍｌ）を添加することによって、調製インシュリンを作製する。０．２２μｍのフィルターを通過させて混合液を濾過した後、最終容量が４００ｍｌになるまで滅菌水を加える。
【００５２】
細胞発生のモニタリング
前述したように、栄養因子を添加したり、取り除いたりおよび／または濃度を変えたりする必要性は、特定のプロトコールで細胞が発生するのをモニターすることによって経験的に決定できる。この状況では、特定の細胞の発生段階はもちろん、生きている細胞の濃度もこの技術分野で既知の方法によって測定できる。
【００５３】
例えばインビトロの生存細胞の濃度は、バレス（Ｂａｒｒｅｓ）ら（１９９３）の同上文献に記載されているようなＭＴＴ生存アッセイ法によってモニターできる。この段階によって３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ、Ｓｉｇｍａの製品）を、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルター（０．２２μｍ）を通過させることによって滅菌したＰＢＳに溶解する。このストック溶液を３７℃で約１時間かけて培養物に添加する。活性なミトコンドリアを持つ生存細胞はテトラゾリウム環を開裂することによって、可視性のダークブルー ホルマザン反応生成物を形成できる。可視化細胞の割合は、明視野相（ｐｈａｓｅ）の顕微鏡によって計数できる。
【００５４】
さらに、発生段階が異なると異なる濃度の栄養因子が必要であると考えられ、同様にそのプロトコールに他の変化も必要となると考えられるため、特定の培養条件で乏突起膠細胞前駆細胞の発生段階を決定することが有用である。特定の乏突起膠細胞前駆体段階に対して特異的な既知のマーカーのうちのどれかが、例えば既知の免疫組織化学的方法によってインビトロでの細胞分化を追跡する際に使用できると考えられる。
【００５５】
このようにＭＳＣおよび／またはＭＳＣ分化細胞は、さまざまな量の栄養因子によって特徴づけられる別個の培養条件下でガラス製のカバーグラス上で培養できる。上述した経験的な計画によって細胞を培養した後で細胞を固定化し、続いて乏突起膠細胞の発生段階に対応する特定のマーカーの存在を検出するために抗血清を用いて処理する。このように得られた情報は、成熟乏突起膠細胞にＭＳＣ分化するのに最適な培養条件を決定する際の助けとなる。
【００５６】
フェイファー（Ｐｆｅｉｆｆｅｒ）らのＴｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３： １９１ （１９９３）は、乏突起膠細胞の既知の発生段階を同定するために用いることのできる種々の段階特異的マーカーを開示している。これらの発生段階、およびそれぞれの段階を同定するマーカーが以下の表に示されている。
2004511266.tif 000002
【００５７】
さらに具体的には、この表は、これらの異なる段階における段階特異的マーカーとカップリングした既知の段階の乏突起膠細胞発生を列挙していて、いくつかのマーカーを同定する抗体が括弧内に示されている。最も早期の段階は、細胞が増殖し一極性になっている場合のＰｒｅ−ＧＤ３（Ｐｒｅ−Ｏ−２Ａ）であって、胚の神経細胞接着分子を発現する。この段階の細胞は、増殖性で遊走性の、双極ＧＤ−３（Ｏ−２Ａ）細胞に分化する。Ｏ−２Ａ前駆細胞は、モノクローナル抗体（Ｍａｂｓ）ＧＤ３およびＡ２Ｂ５によって認識されるガングリオシドを発現する。プロ−オリゴデンドロブラスト（Ｐｒｏ−ＯＬ）段階は、次に乏突起膠細胞の発生系統になり、二つのＭａｂ、Ｏ４およびＡＯＯ７と反応することによって同定できる多極性で後遊走性の増殖性細胞に特徴があって、硫酸塩化した表面抗原のＰＯＡを認識する。次の一過性のＰｒｅ−ＧａｌＣ発生段階は、Ｍａｂ Ｒとは反応するが、抗ＧａｌＣ Ｍａｂ Ｏ１とは反応しないという前駆細胞の能力によって同定される。未成熟なＯＬ段階の開始は、ＧａｌＣおよびスルファチドの合成と細胞表面への輸送によって、同様に２’−３’−環状ヌクレオチド３’−ホスホヒドロラーゼ（ＣＮＰ）の合成によって同定される。成熟乏突起膠細胞は、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、およびミエリン／乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）のようなマーカーの調節性の発現とともに発生した。したがってこれらの段階特異的マーカーは、それぞれの乏突起膠細胞発生段階における最適の培養条件を推定するための強力なツールを提供する。
【００５８】
ＭＳＣの不死化
本発明はまた、不死化したＭＳＣの細胞系を作製し、それによって細胞の活力とＭＳＣの供給量を増加させることも包含する。ある条件で不死化されたＭＳＣは、本明細書に開示された細胞系に分化する能力を有する同種のヒト細胞を無限的で更新可能に供給できるようにし、インビトロで細胞の収率を最大にする。
【００５９】
まず細胞を、増殖を実質的に阻害しない表面にプレーティングする。ＭＳＣは、増殖促進性タンパク質の産生および／または活性が外部因子によって調節可能になるように、増殖促進遺伝子、即ち適当な条件下でトランスフェクトした細胞の増殖を促進するタンパク質をコードする遺伝子を含む適当なベクターを用いてプレーティングした細胞をトランスフェクトまたは感染することによって、条件付けして不死化できる。一態様では増殖促進遺伝子は、ｍｙｃ遺伝子、ＳＶ４０ラージＴ抗原遺伝子、および突然変異ｐ５３遺伝子（国際公開公報第９８／１００５８号参照）のような癌遺伝子である。別の態様では、ミエルソン（Ｍｙｅｒｓｏｎ）らのＣｅｌｌ ９０： （１９９７）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号第ＡＦＯ １８１６７号参照）によって報告されているように、テロメラーゼ遺伝子（ｈＴＥＲＴ）の２ｋＤの触媒性フラグメントは調節性のプロモーターの調節下におかれている。また、ランゲ（Ｌａｎｇｅ）らのＳｃｉｅｎｃｅ ２８３（５４０４）： ９４７−９ （１９９９）も参照。
【００６０】
外因性遺伝子を用いるＭＳＣのトランスフェクションは、さまざまな従来の方法、即ち限定するわけでないが、レトロウイルスまたはアデノウイルスの感染、エレクトロポレーション法、およびリン酸カルシウム法−外因性遺伝子のＤＮＡの取り込み促進法を含む方法によって達成できる。ＭＳＣをトランスフェクトした後、本明細書に記載した培養条件を整えることによって、それらを維持し、かつ乏突起膠細胞および神経細胞にそれぞれ分化させることが可能である。
【００６１】
したがって本発明は、ｈＴＥＲＴをコードする能力を有するＤＮＡ分子を含むベクター（例えば、レトロウイルス構築物）をＭＳＣに供給する段階を企図している。本発明はまた、毒素の選択性に対して適合するタンパク質をコードする遺伝子（例えばｎｅｏ耐性またはハイグロマイシン耐性の遺伝子）をＭＳＣに供給する段階も提供する。この毒性選択性遺伝子を従来技術によって使用することによって、毒性選択遺伝子、およびこうして不死化された遺伝子をゲノムに統合したＭＳＣを単離することが可能になる。例えば、毒性薬剤である例えばハイグロマイシンによって殺されない形質導入されたＭＳＣは、ポリクローナル細胞増殖巣（ｆｏｃｕｓ）を形成する。形質導入したＭＳＣの別の特徴的な指標は、不死化遺伝子を発現しないＭＳＣに比べて、急速に増殖することである。一旦単離されると、感染細胞集団には、ｈＴＥＲＴのような不死化遺伝子を発現しないＭＳＣが、存在するとしてもほんの少ししか含まれていないことが好ましい。一旦不死化されると、本明細書に開示された方法論によって、ＭＳＣは乏突起膠細胞または神経細胞系統のいずれかに分化されうる。
【００６２】
本発明はまた、ｈ−ｔｅｒｔとともに一つまたは複数の別の外因性ＤＮＡ分子を用いてＭＳＣを感染させる段階も提供する。例えばヒトＭＳＣを不死化するには、癌遺伝子（例えばＨ−ｒａｓ、Ｔ抗原、またはｍｙｃ）を活性化することが必要であると考えられ、かつ、腫瘍抑制遺伝子（例えばｐ５３）のような、増殖を阻害する一つまたは複数のタンパク質を抑制することも必要であると考えられる。
【００６３】
さらに本発明は、他の種類の外因性遺伝子を用いるＭＳＣのトランスフェクション、または感染も企図している。例えば下記に記載したような遺伝子治療の状況では、不死化されたＭＳＣを、例えば必要とされる神経伝達物質をコードする外因性ＤＮＡ分子を用いてトランスフェクトできる。
【００６４】
ＣＮＳ疾患の患者の治療
本発明により、ＣＮＳ疾患を有する患者の治療段階は、疾患のあるＣＮＳの領域を含むＣＮＳへ、ＭＳＣまたはＭＳＣ分化細胞を脳内移植する段階を含むことができる。ＭＳＣ分化細胞には例えば、Ｂ１０４ ＣＭを含む培地中でＭＣＳを培養することによって分化された乏突起膠細胞前駆体が挙げられる。本発明の細胞を、脳内室領域、実質組織（盲注射として、または定位注射により特定部位へ、のいずれかとして）、およびクモ膜下または軟膜下の空間などの多くの部位に注射できる。注射の特定の部位は、皮質の灰白室、白室、基底核、および脊髄の部分であることができる。原理的には、本明細書に記載されたようなＣＮＳ疾患による影響を受けている任意の動物は、本明細書に記載された一つまたは複数の方法論によってそのように治療されうる。
【００６５】
移植についての従来の技術は、例えばＮＥＵＲＡＬ ＧＲＡＦＴＩＮＧ ＩＮ ＴＨＥ ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ ＣＮＳ、ブルヨクランド（Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ）およびステネビ（Ｓｔｅｎｅｖｉ）編 （１９８５）に記載されており、文献の内容は参照として本明細書に組み入れられる。段階は実質組織の移植を含んでおり、それは宿主の脳組織に本発明の細胞を注射することによって達成される。しかしながら本発明の細胞を移植することで、多くのＣＮＳ領域に影響を与えることが可能になる。
【００６６】
本発明によると、患者の脳の選択的領域への細胞の投与は、穴を開ける段階、そしてミクロシリンジのニードルの挿入が可能になるように硬膜を補強する段階によってなされると考えられる。または、その細胞は、脊髄領域にクモ膜下腔より注射することができる。本発明の細胞調整物は、脳または脊髄の任意の予め決められた部位への細胞の移植を可能にする。別個の解剖学的領域から得られる細胞の混合物と同様に、同一の細胞懸濁液を用いて数カ所の部位で同時に多重移植を作用させることも可能である。
【００６７】
本発明による患者の治療はＭＳＣの移動能力を利用することが可能であり、それらを用いてペプチド、タンパク質またはその他の物質を、それらの物質に関連する機能不全または欠陥によって影響されるＣＮＳの領域へと提供できる。このため本発明の細胞（成熟神経細胞に分化したＭＳＣを含む）は、ＣＮＳ疾患に罹患した患者が欠いている産物をコードする外因性ＤＮＡを含んでいてもよい。例えばＤＮＡは、アセチルコリンもしくはＧＡＢＡのような伝達物質、または例えば伝達物質に対する受容体をコードしうる。患者がグルタミン酸誘導性の障害に罹患した場合には、グルタミン酸誘導性の細胞毒性を減少させることの可能なグルタミン酸輸送タンパク質についてコードしている遺伝子を患者に導入することが望ましいと考えられる。ドーパミン、アドレナリン、ノルアドレナリン、エピネフリン、ノルエピネフリンおよびセロトニンのような他の伝達物質は、合成されるためには別個の遺伝子によってコードされる多数の酵素が必要である。
【００６８】
さらなるアプローチでは、成長因子またはサイトカインをコードするＤＮＡがＭＳＣにトランスフェクトされることができ、その後、その病因または合成が遺伝子発現産物における欠陥または機能不全と関連するような、ＣＮＳ疾患に罹患した患者に投与される。このため本発明は、例えば、発現の際の、ＮＧＦ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ＩＧＦ−１またはＣＮＴＦを産生する遺伝子の使用を企図している。さらに、選択される遺伝子は、ＬＩＦをコードしていてもよいし、または例えばリチャード（Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ）およびファリナス（Ｆａｒｉｎａｓ）（１９９７）の同上文献によって開示されている、細胞の生存もしくは分化を促進する任意の他のサイトカインをコードしていてもよい。
【００６９】
本発明にかかる治療法は、皮質または基底核に好ましくは定位で細胞を注射することによって効果を発現させることができる。その後でＭＳＣによって分泌される要求されたリガンドの拡散および取り込みは、患者の神経細胞が例えば遺伝子産物の産生に欠陥を与えている場合に起こる疾患の症状を緩和する点で有効でありうる。こうして神経成長因子（ＮＧＦ）のような神経栄養因子を分泌するように遺伝子的に修飾されたＭＳＣを、処理をしなかったなら死んでしまった可能性のあるコリン作動性神経細胞の変性を抑制するために用いることができる。また、パーキンソン病のようなドーパミン神経の喪失によって特徴づけられる疾患に罹患した患者に移植されるべきＭＳＣを、Ｌ−ＤＯＰＡ、即ちドーパミンの前駆体をコードする外因性ＤＮＡを含むように修飾することができる。
【００７０】
本発明によると他のＣＮＳ疾患、即ちアルツハイマー病、ガングリオシド貯蔵性疾患、卒中によるＣＮＳの損傷、および脊髄損傷を含む疾患も同様に治療できる。例えばアルツハイマー病は、基底前脳のコリン作動性神経細胞の変性に特徴がある。これらの神経細胞のための神経伝達物質はアセチルコリンであって、それは神経細胞の生存のために必須である。これらの神経細胞の生存を促進できる因子に対する外因性遺伝子を含むＭＳＣの移植を、本発明によって記載したとおりに達成できる。
【００７１】
別の態様では、本発明の細胞は、患者の免疫応答を下方制御する能力を有する遺伝子を用いてトランスフェクトされ、続いて本明細書に記載された方法の一つによって患者に投与されうる。この種類の治療は、多発性硬化症のような炎症性の疾患を治療するためにも役立つ。この態様に係る好ましい遺伝子は、ＩＬ−４またはＩＬ−１０のような抗炎症性サイトカインをコードする遺伝子である。またこの遺伝子は、プロ炎症性サイトカインの阻害剤であってもよい。インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）は炎症性疾患を治療するためのさらに別の候補である。例えばカデミ（Ｋｈａｄｅｍｉ）らのＪ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ． １０３： ２０２ （２０００）は、ＩＦＮ−βが抗炎症性のサイトカイン（例えばＩＬ−４およびＩＬ−１０）を刺激し、かつインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）のようなプロ炎症性サイトカインを阻害する能力があると報告している。
【００７２】
以下の実施例は本発明の制限でなく、例示を意図している。それらは用いられる可能性のあるものの典型であるが、当業者に既知の他の方法も用いられうる。
【００７３】
実施例１．骨髄由来のラット間葉間質細胞（ＭＳＣ）の調製／単離
ラットのＭＳＣを単離するために、生後８週目〜１２週目のラットから頸骨および大腿骨を切り出した。この骨の端部を切断して、針とシリンジを用いて５ｍｌのＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）により、髄液を除いた。１００×１０６個〜２００×１０６個の完全骨髄細胞を、ＤＭＥＭ／１０％のＦＢＳに入れた１７５ｃｍ２組織培養フラスコにプレーティングした。２４時間後、非接着細胞を培地を置換することによって除去した。培地は、細胞がコンフルエントに達するまで成長するように、２日〜３日毎に取り替えた。細胞を、４分の３が、０．２５％のトリプシンおよび１ｍＭのＥＤＴＡとともにインキュベートして取り出した。
【００７４】
実施例２．骨髄由来のヒトＭＳＣの調製／単離
ヒトＭＳＣは、正常な男性と女性のボランティアの腸骨稜（ｉｌｉａｃ ｃｒｅｓｔ）から採取した吸引物より増殖させた。吸引物をα−ＭＥＭ／１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を用いて１：１に希釈し、１，０００×Ｇで３０分間、密度勾配遠心分離を行った（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ； １．０７７ｇ／ｍｌ； Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。上清と境界部を混合し、約４０ｍｌまでα−ＭＥＭ／１０％のＦＢＳを用いて希釈してから遠心分離を行った。核のある細胞をα−ＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で１×１０７／ｍｌの濃度で懸濁し、２５ｃｍ２の培養皿に３×１０６／ｃｍ２でプレーティングした。細胞を３日間インキュベートし、培地を取り替えることによって非接着細胞を除去する。培養物がコンフルエントに達してから細胞を、０．２５％のトリプシンおよび１ｍＭのＥＤＴＡとともに３７℃で３分間から４分間インキュベートすることによって取り上げた。細胞を１：２または１：３に希釈し、その後置換した。方法を３回から５回の継代（ｐａｓｓａｇｅ）で繰り返した。２回目の継代の開始時には、５ｎｇ／ｍｌの血小板由来の成長因子αα（ＰＤＧＦ−ＡＡ；ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）が培地に加えられた。
【００７５】
実施例３．免疫拒絶しない新生ラットにヒトＭＳＣを投与した
ヒトＭＳＣは、細菌性ＬａｃＺおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するウイルスに感染させた。フラックス（Ｆｌａｘ）らのＮａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、１６： １０３３ （１９９８）は、この様式で細胞を感染するための方法を開示している。約５０，０００個のヒトＭＳＣを新生ラットの側脳室に注射し、その後フラックス（Ｆｌａｘ）らの （１９９８）、同上文献に開示されたような方法論を行った。ラットをさまざまな間隔において殺し、脳の断片をβ−ガラクトシダーゼ活性（ＬａｃＺ遺伝子の産物）について染色した。多くの細胞がラットの神経系に統合されており、青色に染色された（β−ガラクトシダーゼ活性の産物）。さらに免疫拒絶の明らかなサインはなかった。したがって移植は、若い動物では免疫拒絶と直接的には関連せず効果を示した。
【００７６】
実施例４．ヒトＭＳＣは、ミエリン欠損ラットに投与されると、乏突起膠細胞に分化する能力を発現した
ミエリン欠損（ＭＤ）ラットはプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）遺伝子に遺伝的欠陥を持っていて、結果的にＣＮＳにおいてミエリンを形成する能力がない。その結果これらの動物は生後三週で死ぬ。５０，０００個台の細胞をこの技術分野で周知の方法を用いて新生ラットの脳側室に注射することにより、ＭＳＣが乏突起膠細胞に分化できるかどうかが試験される。
【００７７】
移植後一週目か二週目に、移植したラット（ＤＮＡのテールクリップ（ｔａｉｌ ｃｌｉｐ）分析によって試験した）と正常のラットの両方を殺し、それらの脳を光学顕微鏡によって調べた。Ｌｕｘｏｌ耐性青色染色法を用いると、いくつかのミエリンがＭＤラットに存在していることが明らかであった。また、間接的免疫蛍光分析法はＰＬＰの発現を表したが、それは注射したＭＳＣおよび宿主細胞には通常は存在していない（ＰＬＰ遺伝子の突然変異による）。これらの細胞がヒトＰＬＰを発現するという知見は、ヒトＭＳＣが乏突起膠細胞に分化するという概念と一致している。
【００７８】
実施例５．ヒトＭＳＣは新生ラットに投与されると神経細胞に分化する能力を示す
実施例４と同様に、ヒトＭＳＣを、細菌のＬａｃＺおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するウイルスを用いて感染させた。約５０，０００個のヒトＭＳＣを新生ラットの側脳室に注射した。動物を殺し、脳を検査したところ、β−ガラクトシダーゼを発現する細胞が存在していて、かつ神経組織を持つ細胞が存在することが明らかとなった。免疫ペルオキシダーゼ研究法を組織断片について行うことによって、これらの細胞がヒト神経細胞であることを確認できた。この目的に対して選択された抗体は、ヒト神経細胞にあるエピトープを認識するモノクローナル抗体、ＭＯＣ１であった。ＭＯＣ１を用いて染色した後に断片を調べるとＭＯＣ１陽性の数個の細胞が認められ、このことはヒトＭＳＣが起源であるヒト神経細胞がラットの脳に存在していたことを示している。
【００７９】
実施例５．ラットＭＳＣは、ｈＴＥＲＴを用いたレトロウイルス感染により不死化された
継代２代目のＭＳＣ（Ｏｃｉｒｕｓ）を５０％コンフルエントでプレーティングし、レトロウイルスｐＢＡＢＥハイグロマイシンｈＴＥＲＴ（ＰＡ３１７タンパク質エンベロープにパッケージングされている）を用いて３７℃の加湿したインキュベーター中で６時間感染させた。感染後、細胞を３回リン酸緩衝生理食塩水を用いて洗浄し、培養培地に配置した（１０％のウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）および２ｍＭのＬ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を添加したαＭＥＭ）。４日後選抜用薬剤であるハイグロマイシンを培養培地に５０マイクログラム／ｍＬの濃度で添加した。数週間後ポリクローナルコロニーを単離し、拡張してからｈＴＥＲＴ転写産物をＲＴ−ＰＣＲによって分析した。これらの細胞巣に含まれる細胞の集団は形態学的に均一で、ＭＳＣに対する分化の欠陥経路である脂肪物質（ａｄｉｐｏｃｔｅ）を形成する可能性があった。ＲＴ−ＰＣＲデータによって、これらの急速に増殖するラットのＭＳＣにおいて、ｈＴＥＲＴのメッセージレベルが増加することが確認される。このデータは、不死化したＭＳＣ分化がさまざまな系統に分化する能力を有することを強く示唆している。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年5月31日(2002.5.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
損傷を受けたミエリンまたは神経学的な変性によって特徴づけられる病状を治療するための方法であって、以下の段階を含む方法：
（ｉ）間葉間質細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ）およびそれに対する生理学的適合性の担体から本質的になる組成物をインビトロで提供する段階；（ｉｉ）該間葉間質細胞が、神経細胞（ｎｅｕｒｏｎ）および乏突起膠細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）より選択される種類の分化細胞に分化するような条件に該組成物を曝露する段階；ならびに（ｉｉｉ）該分化細胞が、該病状に罹患した患者における該神経学的変性または損傷を受けたミエリンについて補償することを可能にする段階。
【請求項２】
段階（ｉｉ）が、組成物を患者の神経系に導入する段階を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
段階（ｉｉ）がインビトロで実行され、かつ段階（ｉｉｉ）が、分化細胞が損傷を受けたミエリンまたは神経学的な変性について補償するように、患者の神経系に分化細胞を導入する段階を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
分化細胞を調製するための方法であり、以下の段階を含む方法：
（ｉ）間葉間質細胞およびそれに対する生理学的適合性の担体から本質的になる組成物を提供する段階；ならびに（ｉｉ）該間葉間質細胞が神経細胞または乏突起膠細胞にインビトロで分化するような条件に該組成物を曝露する段階。
【請求項５】
不死化した間葉間質細胞およびそれに対する生理学的適合性の担体から本質的になる組成物。
【請求項６】
不死化した間葉間質細胞、一つまたは複数の外因性遺伝子、およびそれらに対する生理学的適合性の担体から本質的になる組成物。
【請求項７】
外因性遺伝子がｈＴＥＲＴである、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
損傷を受けたミエリンによって特徴づけられる病状を治療するための方法であって、以下の段階を含む方法：
（ｉ）間葉間質細胞およびそれに対する生理学的適合性の担体から本質的になる組成物をインビトロで提供する段階；（ｉｉ）神経芽細胞腫適合（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）培地を含む培地において該細胞を培養する段階であって、乏突起膠細胞に分化できる乏突起膠細胞の前駆細胞を提供する段階；および（ｉｉｉ）該分化細胞が、該病状に罹患した患者における該損傷を受けたミエリンについて補償することを可能にする段階。
【請求項９】
神経芽細胞腫適合培地がＢ１０４適合培地である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
段階（ｉｉｉ）が、分化細胞が損傷を受けたミエリンについて補償するように、患者の神経系に乏突起膠細胞の前駆細胞を導入する段階を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
間葉間質細胞を乏突起膠細胞の前駆細胞に分化させる方法であって、以下の段階を含む方法：
（ｉ）該間葉間質細胞およびそれに対する生理学的適合性の担体から本質的になる組成物をインビトロで提供する段階；ならびに（ｉｉ）神経芽細胞腫適合培地を含む培地において該細胞を培養する段階であって、乏突起膠細胞に分化できる乏突起膠細胞の前駆細胞を提供する段階を含む方法。
【請求項１２】
神経芽細胞腫適合培地がＢ１０４適合培地である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
間葉間質細胞を乏突起膠細胞に分化させる方法であって、以下の段階を含む方法：
（ｉ）請求項１２記載の方法を行う段階；および（ｉｉ）該乏突起膠細胞の前駆細胞の少なくとも一部が乏突起膠細胞に分化するような条件に、該乏突起膠細胞の前駆細胞を曝露する段階を含む方法。
【請求項１４】
段階（ｉｉ）が、Ｂ１０４適合培地から乏突起膠細胞の前駆細胞を単離する段階を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
病状が、代謝性の脂質貯蔵性疾患、ＧＭ１ガングリオシドーシス、アデノ白質ジストロフィー、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー及び多発性硬化症からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
分化細胞を調製する方法であり、以下の段階を含む方法：
（ｉ）間葉間質細胞およびそれに対する生理学的適合性の担体から本質的になる組成物を提供する段階；ならびに（ｉｉ）該間葉間質細胞がインビトロで乏突起膠細胞に分化するような条件に該組成物を曝露する段階。
【請求項１７】
病状が、代謝性の脂質貯蔵性疾患、ＧＭ１ガングリオシドーシス、アデノ白質ジストロフィー、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー及び多発性硬化症からなる群より選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１８】
不死化した間葉間質細胞、一つまたは複数の増殖促進遺伝子及びそれらに対する生理学的適合性の担体から本質的になる組成物。
【請求項１９】
間葉間質細胞が、神経細胞及び乏突起膠細胞より選択される種類の分化細胞に分化する、損傷を受けたミエリンまたは神経学的な変性に特徴付けられる病状の治療における使用のための、間葉間質細胞およびそれに対する生理学的適合性の担体から本質的になるインビトロ組成物。
【請求項２０】
間葉間質細胞がインビトロ分化間葉間質細胞である、請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】
間葉間質細胞が神経細胞及び乏突起膠細胞より選択される種類の分化細胞に分化する、神経学的な変性または損傷を受けたミエリンについて補償するように患者に投与するための、医薬品を調製するための間葉間質細胞及びそれに対する生理学的適合性の担体の使用。
【請求項２２】
間葉間質細胞が分化間葉間質細胞である、請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
間葉間質細胞が神経芽細胞腫適合培地を含む培地中で培養され、かつ培養段階が、乏突起膠細胞に分化する能力のある乏突起膠細胞前駆細胞を提供する、損傷を受けたミエリンに特徴付けられる病状の治療における使用のための、間葉間質細胞およびそれに対する生理学的適合性の担体から本質的になるインビトロ組成物。
【請求項２４】
間葉間質細胞が神経芽細胞腫適合培地を含む培地中で培養され、かつ培養段階が、乏突起膠細胞に分化する能力のある乏突起膠細胞前駆細胞を提供する、損傷を受けたミエリンについて補償するように患者に投与するための医薬品を調製するための、間葉間質細胞及びそれに対する生理学的適合性の担体の使用。
【国際調査報告】
2004511266.tif 000029
2004511266.tif 000030
2004511266.tif 000031