(57)【要約】塩基付加を用いて未知のヌクレオチド配列を同定する方法において、塩基の配列を鋳型から得て、配列中の塩基を未知塩基として確認し、“未知”インジケーターを配列中に含み、そして未知塩基インジケーターを含有する出力配列を作製する。レポーターの評価およびそれに従って塩基を帰属することにより塩基の配列を鋳型から得る。レポーターが塩基決定の先行するサイクルからであるかどうかを決定し、そして、もしレポーターが塩基決定の先行するサイクルからであれば、この塩基帰属は廃棄される。
2004501669.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基付加を用いる未知のヌクレオチド配列を同定する方法であって：
鋳型から塩基の配列を得る；
配列中の塩基を未知塩基として確認しかつ配列中に‘未知’インジケーターを含む；そして
未知塩基のインジケーターを含む出力配列を与える
ステップを含む方法。
【請求項２】
連続した未知塩基の数を計数し、そして連続した未知塩基の数が予め決めた閾値を超えるときに指示を与えることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
予め決めた閾値を超えるときに、先行する塩基を組込みミスしたとしてマークする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
出力配列および参照配列の間に配列アラインメントのステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
出力配列および参照配列の間に配列アラインメントのステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
配列をレポーターの評価により決定し、そしてこのレポーターが塩基決定の先行するサイクルからであるかどうかを決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
未知のヌクレオチド配列を同定する方法であって：
レポーターの評価により鋳型から塩基の配列を得てそしてそれに従って塩基を帰属する；
このレポーターが塩基決定の先行するサイクルからであるかどうかを決定し；もしこのレポーターが塩基決定の先行するサイクルからであれば、塩基帰属を廃棄し；そして
出力配列を与える
ステップを含む方法。
【請求項８】
塩基付加を用いる未知のヌクレオチド配列を同定するための装置であって：
鋳型から塩基の配列を得るための手段；
配列中の塩基を未知塩基として確認しかつ配列中に‘未知’インジケーターを含むための手段；そして
未知塩基のインジケーターを含む出力配列を与えるための手段
を含む装置。
【請求項９】
塩基付加を用いる未知のヌクレオチド配列を同定するための装置であって：
レポーターの評価により鋳型から塩基の配列を得てそしてそれに従って塩基を帰属するための手段；
このレポーターが塩基決定の先行するサイクルからであるかどうかを決定し、そしてもしこのレポーターが塩基決定の先行するサイクルからであれば、塩基帰属は廃棄されるための手段；そして
出力配列を与えるための手段
を含む装置。
【請求項１０】
塩基伸長を用いる未知のヌクレオチド配列を同定するためのコンピュータプログラム製品であって、コンピュータにロードしたときに、以下の：
鋳型から塩基の配列を得る；
配列中の塩基を未知塩基として確認しかつ配列中に‘未知’インジケーターを含む；そして
未知塩基のインジケーターを含む出力配列を与える
ステップを実施するようにコンピュータを制御するだろうコンピュータプログラム製品。
【請求項１１】
コンピュータプログラムであって、該プログラムをコンピュータ上でランするとき、請求項１〜７のいずれか１項の全てのステップを実施するためのプログラムコード手段
を含むコンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、個別の分子のシークエンシングの間にエラー訂正を可能にする、シークエンシング方法および装置に関する。
【０００２】
（背景技術）
Ｓａｎｇｅｒ， Ｆ．， Ｓ． Ｎｉｃｋｌｅｎ， ａｎｄ Ａ． Ｃｏｕｌｓｏｎ （Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， １９７７． ７４（１２）； ｐ． ５４６３−７）により本質的に記載されているように、シークエンシングは鎖終結およびゲル分離の方法により日常的に実施される。この方法は、配列中のそれぞれの塩基における終結を表すＤＮＡ断片の混合集団の作製に依存する。それから、これらの断片の電気泳動分離により配列を決定する。
【０００３】
シークエンシングのスループットを増加させる最近の努力は、電気泳動分離ステップを除外する代替法の開発をもたらしている。数多くのこれらの方法は塩基伸長（即ち塩基付加）を利用しそして例えばＷＯ  ９３／２１３４０、ＵＳ  ５，３０２，５０９およびＵＳ  ５，５４７，８３９に記載されている。これらの方法においては、シークエンシング用の試薬を作用させる前に鋳型もしくはプライマーを固体表面上に固定化する。固定化した分子をヌクレオチド類似体の存在下でインキュベートするが、これらは、その位置で水酸基を可逆的に保護する、糖残渣の３’炭素において修飾を有する。このような修飾したヌクレオチドのポリメラーゼによる組込みは、塩基伸長のそれぞれのサイクル間には唯一個のヌクレオチドが付加されることを保証する。それから、付加した塩基は、３’保護基中に組込んでいる標識によって検出される。検出に引き続いて、典型的には光化学的手段によって、保護基を除去して（即ち“切断して”）、次のサイクル間で塩基付加に利用できる遊離水酸基を露出させる。
【０００４】
一般的に、非−分離に基づくアプローチは、与えられた標的からコンセンサス配列を作成すべきそれぞれの標的配列に対する多数の鋳型分子の存在に依存する。かくして、例えば、核酸の離散的スポットを尋問することにより、塩基伸長反応を多重鋳型に応用し得るが、それぞれは、空間的にアドレス可能なアレイに固定化された、多重度の分子を含む。
【０００５】
しかしながら、ターミネーターの組込み／切断の反応、もしくは塩基切除はエラーを起こしやすい。例えば、上述のように、塩基伸長ストラテジーはヌクレオチド類似体を一般的に利用しているが、これらは、レポーター分子、通常蛍光体、の機能を糖部分上の３’位を占めるターミネーターのそれと結合させる。この基とその位置のかさ高い性質は、これらの化合物をポリメラーゼに対して高度に非効果的な基質にさせる。加えて、次の付加を可能にするためのターミネーター基の切断はまた非効率性を招きやすい。それぞれの標的に対して数千の、もしくは好ましくは数百万の、分子の存在下では、５％以下の少なめのエラーでさえも、少数のサイクル内において、それぞれの分子を表す多重度の鎖の間で、同調性の累積的な損失をもたらす。かくして、それぞれのサイクルのシークエンシングごとに、バックグランドノイズが累進的に増加して、それぞれの付加ごとでシグナルの必然的な劣化になる。これは、入手し得る配列データを持つ塩基数は、特定のシグナルがバックグランドから区別できなくなる前に、限られることを意味する。
【０００６】
単一分子検出の方法における最近の進歩は（例えば、Ｔｒａｂｅｓｉｎｇｅｒ， Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．，１９９９． ７１（１）； ｐ． ２７９−８３およびＷＯ  ００／０６７７０に記載されている）、シークエンシングストラテジーを単一の分子へ応用することを可能にする。しかしながら、シークエンシングは、分子のクローン集団に応用すると、他の分子が未修飾のままでいる間に幾らかな分子が反応を受けることになる、確率的プロセスである。かくして、従来のシークエンシング方法においては、組込みミスのようなエラーは、存在する多数の分子がコンセンサスシグナルを得ることを保証するので、普通には重大な意義をもたない。これらの反応を単一分子に応用するときには、結果は効率的に量子化される。
【０００７】
そのような単一分子シークエンシング方法は塩基切除に基づいていて、例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ， Ｇ． ａｎｄ Ｌ． Ｈｏｆｆｍａｎ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９９７． ｖｏｌ． １５； ｐ． ８０３−８０４およびＵＳ  ５，６７４，７４３に記載されている。このストラテジーでは、各塩基が適当なレポーターで標識化されるように単一の鋳型分子を作製する。この鋳型分子をエキソヌクレアーゼで消化しそして切除した塩基をモニターして同定する。これらの方法は、ラムダエキソヌクレアーゼのような高度処理性の酵素を使用するので、長さが数キロ塩基の大きい鋳型を分析する潜在性がある。しかしながら、それぞれの鋳型分子から切除した塩基をリアルタイムで連続的にモニターすることは、並行して分析できる分子の数を制限する。加えて、切除した塩基を生来の光学的もしくは化学的性質に基づいて検出できるように各塩基を適当なレポーターで標識化する場合には、鋳型を作成することが困難となる。
【０００８】
塩基切除に基づく方法（ＢＡＳＳのような）はまた単一分子アプローチに適応されている。
しかしながら、これらの技法はエラーを起こしやすい。特に、修飾したヌクレオチドの組込みは、例えば、修飾したヌクレオチドとのポリメラーゼ作用の減少した効率の結果として、失敗し得る。レポーター分子が蛍光性分子である場合には、蛍光体が無くなったり、損傷されたり、漂白されたり、もしくは切除されなかったりするために、エラーが蛍光の失敗によってまた起こり得る。単一分子レベルでは、これらのような失敗は適切な配列を得る際に失敗をもたらす。
【０００９】
本発明の一つの目的は、エラーの検出を可能にするシークエンシング方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、個別の分子の行き先をシークエンシング反応によりモニターすることによって、分析およびエラーの防止、もしくは訂正、を可能にすることである。
【００１０】
（発明の概要）
種々の態様におけるこの発明は上記の個別な請求項で規定されるが、それらについての参照をこれから行わねばならない。有利な特色は付随する請求項に示されている。
【００１１】
簡潔に言えば、ヌクレオチド配列を分析する方法の形態を取るこの発明の一つの好ましい実施態様において、塩基の配列を鋳型から取得し、そして配列中の塩基を未知塩基として確認する。‘未知’インジケーターは未知塩基に相当する位置において配列中に含まれ、そして未知塩基インジケーターを含む出力配列が作製される。この好ましい実施態様において、レポーターの評価およびそれに従って塩基を帰属することにより塩基の配列を鋳型から得る。レポーターが塩基決定の先行するサイクルからであるかどうかを決定し、そして、もしレポーターが塩基決定の先行するサイクルからであれば、この塩基帰属は廃棄される。
分析すべきヌクレオチド配列はＲＮＡもしくはＤＮＡ配列であってもよい。
【００１２】
（図面の簡単な説明）
ここで、付随する図面を参照して実施例によりこの発明を詳細に説明するが、そこで図１は、核酸分子のような生物分子の配列を決定するための反応の間に得られるデータを解析する方法を図示しかつこの発明の好ましい実施態様を形成する工程図である。
【００１３】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
図１は、鋳型から配列情報を得る方法を例示する流れ図を示す。この方法は、（ａ）先行するサイクルから持ち越される塩基を確認しそして（ｂ）塩基の標識失敗もしくは組込みミスから起こり得る休止分子を検出することによりエラーを追及する。このデータ解析法は、以下のように実施する標準的なシークエンシング反応を使用する。第一に、配列データを必要とする核酸分子、鋳型、を顕微鏡のスライドのような固体表面に結合させる。スライドを、例えば蛍光顕微鏡スキャナーにより観察するときにその位置を決定できるように、鋳型を標識化することができる。鋳型の配列における最初の塩基もしくはヌクレオチド、即ちＡ、Ｃ、ＧもしくはＴ、を蛍光的に標識化した塩基もしくは塩基を表す標識を付加する化学反応により検索する。これは、Ａ、Ｃ、ＧもしくはＴのいずれか一つであるか、または四つの異なる区別可能な標識で標識化されたそれら四個全部であり得る。鋳型中の第一の塩基は既知の様式で相補的な塩基に結合するであろう；即ち、ＡはＴと結合し、そしてＣはＧと結合し、かつ逆の場合も同様である。鋳型をポリメラーゼ酵素で伸長するかもしくは標識化したオリゴヌクレオチドをリガーゼで連結することにより、塩基組込みを引き起こすことができる。標識化した塩基の組込みを検出し、そしてその同一性を決定する。それから、その塩基から標識を除去する。それから、このシリーズのステップを鋳型中の次に続く塩基に対して繰り返す。
【００１４】
塩基の付加／組込みを伴う適切な標準的シークエンシング反応としては、ＷＯ  ９３／２１３４０、ＵＳ  ５，３０２，５０９およびＵＳ  ５，５４７，８３９に記載されているような塩基伸長反応ならびにＵＳ  ５，７６３，１７５、ＵＳ  ５，５９９，６７５、ＵＳ  ５，８５６，０９３およびＵＳ  ５，７１５，３３０に記載されているような技法が挙げられるが、そこでは連続するラウンドのシークエンシングは、引き続く塩基の組込みに先立って鋳型の塩基切除を伴う。
【００１５】
このシークエンシング反応を実施するときには、エラーが起こり得る。例えば、（ｉ）塩基が間違って組込まれ得る、即ち組込みミスされる、または（ｉｉ）次のサイクルを実施する前に一つのサイクルから標識を除去することに失敗し得る、または（ｉｉｉ）どれか一つのサイクルにおいて塩基の組込みが失敗し得ることである。説明されるこの発明の好ましい実施態様において、シークエンス反応からのデータは、これらのエラーの影響を減少し得るような方式で導入される。
【００１６】
固相上への分子の析出および固定の方法は技術上周知である。核酸を付着させる方法は、例えば、Ｓｃｈｅｎａ （ｅｄ．）， ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ： Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９９） ＩＳＢＮ： ０１９９６３７７６８に総説がある。典型的には、固相はガラスであろうが、非晶性もしくは結晶性シリコンまたはプラスチックのような他の材料を用いることができる。
【００１７】
複数の分子を規則正しいアレイで固相に付着させ得るが、さらに好ましくは、それらをランダム様式で付着させる。分子のランダム付着は、好ましくは、配列情報の光学的分解能に適した密度で分布させると、いかなる数の分子も含み得る。
【００１８】
適切なレポーター部分は種々の既知な報告システムのいずれか一つであってもよい。それは、組込まれたヌクレオシド類似体が容易に検出されるようになる放射性同位元素、例えば、ホスフェートもしくはチオホスフェートまたはＨ−ホスホネート基に組み込まれた３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、もしくは他には３Ｈもしくは１４Ｃまたはヨウ素同位元素であってもよい。それは、質量分析法もしくはＮＭＲにより検出可能な同位体であってもよい。それは、シグナル部分、例えば酵素、ハプテン、蛍光体、化学体、化学発光基、ラマン標識もしくは電気化学的標識、もしくは質量分析法による検出に適応するシグナル化合物であってもよい。
【００１９】
それぞれのシークエンシングステップは、個別の鋳型へのレポーター分子の取り付けをもたらすであろうし、かつ組込まれたレポーター部分の検出は塩基の同一性を帰属させることを可能にするであろう。蛍光性のレポーターの場合には、それから、例えば、蛍光顕微鏡法（例えばＰＭＴもしくはＣＣＤを用いて）によりこれらの分子が同定され、そしてレポーターの蛍光性質が、シークエンシング反応で組込まれた塩基への同一性の帰属を可能にするであろう。
【００２０】
一連のラウンドのシークエンシングサイクルからのデータを収集するためには鋳型の位置を特定しなければならない。これは最初のサイクルのシークエンシングで並行して達成し得るが、この場合、最初の塩基中のレポーター分子が鋳型の位置を確認するかまたは鋳型および／もしくはプライマー自体が、シークエンシングサイクリング反応に先立って固相上の位置を検出し得るように、レポーター部分で標識化されていてもよい。それぞれの鋳型分子の位置を知ることにより、シークエンシングのサイクル間に続いて起こる全てのイベントに引き続いてそれぞれの分子の状態をモニターすることが可能になる。付加の引き続く失敗は、例えば、鋳型を含むと知られた位置における蛍光の欠如により、それ自身を顕在化する。刺激の欠如、もしくは化学的損傷のどちらかによるレポーターの失敗はまた、一旦鋳型の位置が決定されていると、決定されることができる。これらの失敗した反応を追跡し、レポーターの失敗によるポテンシャルギャップとして最終配列において処理することができる。もしこれらの分子が引き続くサイクルで関与を再開するならば、これもまた追跡して意味のある配列を得ることができる。単一の塩基ギャップの個別のポイントが確認され得てかつ、複数の同一配列が固体表面上に並べられているならば、シークエンシングアレイ中における鋳型の他のコピーの配列のような参照鎖との比較によりコンセンサス配列を構築することができる。他に、既知の配列であり得る参照鎖との比較により単一の塩基ギャップを確認し得る（例えば、この技法を突然変異の検出に応用する際に）。
【００２１】
かくして、エラー、特に単一分子のシークエンシングに関連するエラーをこのシステムにおいて訂正することが可能であると我々は認識している。訂正の必要なエラーは、レポーターの切断および次のサイクル前の除去の失敗、組込みの失敗、レポーターへの損傷（例えば、蛍光体への損傷）ならびに組込みミスである。
【００２２】
一旦位置を特定すると、位置を特定した分子に対する全てのシークエンシングサイクルの結果は測定可能であろう。二つのセットのヌクレオチド類似体を用いることにより、先行するサイクルから持ち越されているレポーターの確認が可能になる。それ故に、先行するサイクルからのレポーターの再現を確認してモニターすることができる。
【００２３】
鋳型分子の位置を知ることにより、伸長していないように見える鋳型の確認がまた可能になる。上で議論したように、レポーター分子を観察する失敗は組込みの欠如に起因し得るが、レポーター部分への損傷にも起因し得る。しかしながら、損傷した分子の存在は、分解生成物および副反応の生成物を確認して除去することができる修飾ヌクレオチド合成の間での精製プロセスにより効果的に最小化することができるので、蛍光の不在は、それ故に、修飾したヌクレオチドを組込む失敗の結果である可能性が高い。
【００２４】
もし、いずれかのサイクルのシークエンシングの後で、鋳型分子がいずれのレポーターとも関連しなければ、したがってこのポイントにおいて配列をマークして“休止”と表示する。次のラウンドのシークエンシングにおいて、それから鋳型分子をレポーターと関連させ得る、即ち、“休止”分子は伸長を再開して配列データが得られるようにする。しかしながら、鋳型分子は一つ以上のサイクルに対する関連を欠き続けるであろうし、そして配列はそれぞれのサイクルに対して休止としてマークされるであろう。
【００２５】
シークエンシングの間に作製される位置マーカーは、参照配列と共に作製される配列と比較するかもしくは当業者に既知のアラインメントアルゴリズムの一つを用いてシークエンシング手順間に作製される他の配列と比較するとき、アラインメント中のギャップを解釈するのに有用であろう。
【００２６】
使用した適切なポリメラーゼおよびリガーゼの生来の性質を知ると、組込みミスの位置を予想することが可能である。例えば、ミスマッチした末端塩基を含むプライマー配列は、マッチした配列より１０２〜１０６−倍低い伸長効率を持って、ポリメラーゼに対してより劣った鋳型であることは当業者に既知である（Ｈｕａｎｇ， Ｍ．， Ｎ． Ａｒｎｈｅｉｍ， ａｎｄ Ｍ． Ｇｏｏｄｍａｎ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， １９９２． ２０（１７）： ｐ． ４５６７−７３； Ｔｉｎｄａｌｌ ＫＲ， Ｋ． Ｔ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９８８． ２７（１６）： ｐ． ６００８−１３； Ｅｓｔｅｂａｎ， Ｊ．， Ｍ． Ｓａｌａｓ， ａｎｄ Ｌ． Ｂｌａｎｃｏ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， １９９３． ２６８（４）： ｐ． ２７１９−２６を参照）。数回のサイクル間にもしくはシークエンシングプロトコールの最後まで休止のままである分子は、それ故に、末端ミスマッチを含む公算がはるかに高い。そのような休止を受ける鋳型は、それ故に、ミスマッチによる潜在的終結として最後の塩基呼出し位置において標識化される。それから、配列が決定された断片の同定は、参照配列もしくは同一の試料からの他の配列が決定された鋳型へのアラインメントにより達成される。マークした位置で起こるミスマッチは、真の配列を表すことよりむしろ組込みミスの結果である可能性がより高いために、それに従って解釈され得る。
【００２７】
そのために鋳型分子が休止するサイクルの数は、組込まれたレポーターの欠如の連続的検出により計数することができる。偶然に起因する連続的休止の公算に対する閾値を配列データの解析の間にセットすることができる。それ以上ではミスマッチに起因すると分類され得る連続的休止の閾値は、ポリメラーゼ依存性塩基伸長かもしくは配列依存性連結反応のどちらかによる標識化の効率に依存する。例えば、偶然に起因する連続的休止の公算に対する閾値が１×１０−６％にセットされるならば、休止がミスマッチとして計数される前に、標識化の異なる効率を考慮して、下記の数の休止を計数する。
【００２８】
【表１】
2004501669.tif 000003
【００２９】
比較的大きい確実性をもって、閾値を適当に増加させてもよい。必要な確実性の程度はシークエンシングの応用の許容度に依存するであろう；目的が配列の差を正確に決定するよりむしろ鋳型の断片を単に確認するだけならば、あまり厳格でないカットオフを許容できる。標識組込みのより低い効率の影響はまたシークエンシングの冗長度の程度により相殺することができる。この例における、組込みミスの確率は統計的に処理される。
【００３０】
主として蛍光により、単一分子を映像化して位置を特定することは当業者に既知である（Ｔｒａｂｅｓｉｎｇｅｒ， Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．， １９９９． ７１（１）： ｐ． ２７９−８３； Ｈａｒｍｓ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ．， １９９９． １７７： ｐ． ２８６４−２８７０； Ｄｅｓｃｈｒｙｖｅｒ， Ｆ．， Ｐｕｒｅ ＆ Ａｐｐｌ． Ｃｈｅｍ， １９９８． ７０： ２１４７−２１５６； Ｂａｒｔｋｏ， Ａ． ａｎｄ Ｒ． Ｄｉｃｋｓｏｎ， Ｊ Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ Ｂ， １９９９． １０３： ｐ． １１２３７−１１２４１を参照）。位置および標識のタイプに関する情報を含むデータファイルは、それ故に、容易に作成される。この発明の一つの実施態様において、配列データの解析は、シークエンシング手順の最後でそして全てのシークエンシングデータを得た後で実施される。一つもしくはそれ以上のファイルの中で、このデータを解析して、鋳型の位置を決定しかつこれらの位置に取り付けたいかなるレポーターも同定し得る。それから、そのようなデータを第二の解析に付して、全ての位置を確定した鋳型に対する配列を構築する。
【００３１】
好ましくは、シークエンシング反応のサイクルおよびデータ解析を並行して実施する。この例では、それぞれのサイクルから作製されたデータを解析して、レポーター分子の位置を確定して、それからこれらの位置を鋳型の位置と相関させる。それから、それぞれの位置を確定した鋳型に対する配列をそれぞれの連続したサイクルで構築する。
【００３２】
この発明を具体化するこの好ましい手順をこれから図１を参照して説明する。  図１に図示するシステムにおいて、配列が決定されるべき分子は技術的に記載されているような標準手順により固相上に固定されている。（Ｓｃｈｅｎａ （ｅｄ．）， ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ： Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９９） ＩＳＢＮ： ０１９９６３７７６８に総説がある）。顕微鏡のスライドのような固体表面に結合させた鋳型を標識化し、それでスライドを、例えば蛍光顕微鏡スキャナーにより観察するときに、その位置を決定することができる。ステップ１０において、適切な鋳型の位置が先ず確定される。
【００３３】
今やステップ１２で実施するのは、ポリメラーゼ酵素で鋳型を伸長することにより、もしくは標識化したオリゴヌクレオチドをリガーゼで連結することにより引き起される塩基組込みを伴うシークエンシング反応である。
【００３４】
上述のように、シークエンシングステップは、鋳型の配列中で最初の塩基へのレポーター分子の取り付けをもたらすであろうし、そしてステップ１４では、組込まれるレポーター部分の検出により帰属すべき塩基の同一性を可能にする。次のステップ、ステップ１６は塩基および鋳型の位置を相関させる；最初のサイクルではこれはささいなステップである。それから、鋳型分子がレポーターと関連しているかどうかを決定する。即ち、ステップ１８において、対象とする鋳型がレポーターを持つかどうかをテストする。もしもシークエンシング手順の後で鋳型がレポーターと関連するならば、ステップ２０に手順を移動する。ここで、レポーターが先行するサイクルから来るかどうかを決定するテストを行う。そうでなければ、それからレポーターを確認して、そしてステップ２２で新しい塩基を帰属する。かくして、塩基は正確に同定されて、全てよしとなる。
【００３５】
それから、手順をステップ２４へ移動し、ここではもはや鋳型はないかどうかについてテストする。もしあれば、手順をステップ１８から繰り返す。
もしもステップ２０で塩基に関連するレポーターが先行するサイクルからであると決定されるならば、ステップ２６では何も塩基を帰属しないで、そして手順はステップ２４へおよび、もしあれば次の鋳型へ、直行する。
【００３６】
もしステップ１８で鋳型はレポーターを持たないと見出されるならば、ステップ５０でミスマッチフラグが立っているかどうかについてチェックをする。連続した休止の数が、ステップ３０で行うテストに従って、予め決めた極大値を越えるときには、ミスマッチフラグが活性化される。ミスマッチフラグが立っていなければ、手順をステップ２８へ移動し、休止Ｐを配列中に挿入する。また、起こっている連続休止の数をモニターする、休止カウンターを１個だけ追加する。テストをステップ３０で行って、連続した休止の数が予め決めた閾値または極大値を越えるかどうかを決定する。もし越えていなければ、手順をステップ２４へ移動し、休止を配列中に残す。もし連続した休止の数が予め決めた極大値を越えるならば、先行する塩基をミスマッチしたとして得点し、ステップ３２でミスマッチフラグを活性化して、そして手順をステップ２４へ進める。
【００３７】
休止インジケーターは、未知塩基の表示を与える機能として働く。これは塩基Ａ、Ｃ、ＧおよびＴのいずれか一つであると証明するか、もしくは事実全く塩基でないと証明するかもしれない。未知塩基の可能性を与えることにより、その鋳型についての情報は完全には廃棄されない。むしろ、下記の実施例で説明するように、例えば参照配列と参照して、それをなお使用する。
【００３８】
もしステップ２０でレポーターが先行するサイクルからであると決定されるならば、ステップ５２でミスマッチフラグが立っているかどうかについてチェックをする。もしミスマッチフラグが立っていなければ、手順をステップ２２へ移動し、塩基を帰属する。それから、手順をステップ２４へ移動し、処理すべきもう一つの鋳型があるかどうかを決定する。
【００３９】
もしミスマッチフラグが立っているならば、ステップ５４で、先に帰属した塩基は、ミスマッチした一つを除く全ての他の塩基を表すＩＵＢコードと取り替えられる。これは、もしも先行する塩基が“Ｃ”と表示されたが今やミスマッチしたと知られるならば、この塩基はＡ、ＧもしくはＴのいずれかであることが明らかであるからである。
【００４０】
さらに鋳型がないときには、ステップ２４におけるテストは結果ＮＯとなり、そして手順をステップ３４へ移動して、そこで完成すべきサイクルがまだあるかどうか、即ち、その分子に対する塩基がまだあるかどうかを決定する。もしあれば、手順を次のサイクルのためのデータ、ステップ３６、へ移動し、その後で処理を再びステップ１６から進めて塩基および鋳型の位置を相関させる。
最終的には、ステップ３４におけるテストは結果ＮＯとなるであろうが、それでステップ３８においてこの手順の終了となる。
【００４１】
次に続く処理は、図１のシステムにより作成したような配列に応用されるもので、例えば、この方法で見出された配列を参照配列と比較することである。この実施例を以下に説明する。
化学反応を伴うステップ１０〜１４に引き続く、図１に示すステップをパソコン（ＰＣ）のようなデジタルコンピュータ上に構築する。二つの実施例を、この明細書につけた付録での擬似コードを経由してさらに詳細に示す。最初の擬似コードは、ヌクレオチドが全ての四つの塩基、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ、の混合物により検索されることを仮定し、そして第二の擬似コードは、四つの塩基を別々に順次用いるときに使用する。
【００４２】
本発明は多くの応用を有するが、その幾らかをここに示す。例えば、この方法を用いてＤＮＡおよびＲＮＡのゲノムの配列を決定することができる。さらに、領域もしくは全体のゲノムにおける、領域もしくは全体のゲノムのｍＲＮＡ表現における、または一つもしくはそれ以上の塩基の置換、欠失もしくは挿入から生じる、ゲノムの人工的に作製した表現（例えば、ゲノム領域のＰＣＲ生成物）における、配列変異を同定することができる。
【００４３】
本発明は、ハプロタイピング（個体における染色体対間の配列差を決定する）にもまた定量的なｍＲＮＡ発現分析にも、例えば異なる細胞タイプ（組織）もしくは異なって処理した細胞から誘導した試料間でｍＲＮＡ発現のレベルを比較するのに、応用される。この技法はまた、病原体の検出および同定に使用するために、病原体ゲノムから誘導された配列を同定するのに応用し得る。
【００４４】
ここに示す実施例は、決定された配列におけるエラーを減少させるようにこのシステムにより特定の配列を取り扱う方式に与えられる。
【００４５】
実施例１
シークエンシング反応から次の配列が得られるが：
【化１】
2004501669.tif 000004
式中、１は一個のＴが組込まれていることを示す（そして２＝Ｃ、３＝Ａ、４＝Ｇ）。
サイクルの閾値数のため一層の伸長の失敗は、配列にマークをつけて塩基が休止の閾値数に先立って組込みミスされていることを示すことをもたらす。ここで、１（一つ）は一個のＴが、予め決定された閾値レベル以上の数の休止に先立って、組込まれていることを示し、かくして組込みミスされている可能性がある。それ故に、配列は多分廃棄される。図１に関しては、ＹＥＳがステップ３０において出力されるまで、予め決められた数のステップに対して手順をパス２８と３０に進め、そして先行する塩基をステップ３２でミスマッチしたとしてマークする。１の代わりに他の塩基に対して、２，３もしくは４を用いるが、２はＣを示し、３はＡを示し、そして４はＧを示す。
【００４６】
実施例２
シークエンシング反応から次の配列が得られる。一番目は新しく決定された配列であり、二番目は参照配列である：
【化２】
2004501669.tif 000005
サイクルの閾値数より長い休止は、組込みミスとしてＴの代わりに一つの１をマークする。この場合においては、シークエンシングを閾値数の配列の後で再開している。得られた配列を参照配列と比較するとき、配列アラインメントは休止した位置においてＴ．１アラインメントを表示する。それ故に、それは参照配列との現実の塩基差として差引くことができる。この配列アラインメントは図１に図示した処理に追加的な段階を表す。
【００４７】
実施例３
シークエンシングの間に休止に遭遇すると、その位置をＰとしてマークする。もし以下の新しい及び参照配列が得られると：
【化３】
2004501669.tif 000006
Ｐでマークした位置におけるギャップの存在もしくは不存在下における参照配列との配列アラインメントは、それが休止であることを明らかにする。それ故に、全ての配列は隣接してかつ有用である。ここでも配列アラインメントは図１に図示した処理に追加的な段階を表す。
【００４８】
実施例４
シークエンシング反応から次の配列が得られる：
【化４】
2004501669.tif 000007
Ｐでマークした位置は失敗したレポーターを持つ塩基の組込みである。マークした位置におけるギャップの存在もしくは不存在下における参照配列との配列アラインメントは、これが配列中のギャップであることを明らかにする。取り出した配列は有用のままである。この例において、Ｐを‘Ｎ’で置換して配列中のギャップを意味することもできる。ここでも配列アラインメントは図１に図示した処理に追加的な段階を表す。
【００４９】
付録
第一擬似コード
シークエンシング反応完了後の配列集合のための擬似コードの例
2004501669.tif 000008
【００５０】
第二擬似コード
一連の単一塩基シークエンシングのための擬似コード
2004501669.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、核酸分子のような生物分子の配列を決定するための反応の間に得られるデータを解析する方法を図示しかつこの発明の好ましい実施態様を形成する工程図である。
【図１】
2004501669.tif 000010
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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