(57)【要約】新規のポリペプチドをコードする核酸配列が、本明細書中で開示される。これらの核酸配列によってコードされるポリペプチド、およびこのポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体、ならびにこれらのポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体のフラグメントの誘導体、改変体、変異体もまた、開示される。本発明はさらに、これらの新規なヒト核酸およびタンパク質のいずれか１つに関与する障害を診断、処置、および予防するための、治療方法、診断方法、および研究方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリペプチドであって、以下：
ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、および３４からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態；
ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、および３４からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態の改変体であって、ここで、該改変体が、該成熟形態のアミノ酸配列中と異なっているのは１５％以下のアミノ残基であるという条件で、該改変体中の１つ以上のアミノ酸残基が該成熟形態のアミノ酸配列と異なっている、改変体；
ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、および３４からなる群より選択されるアミノ酸配列；および
ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、および３４からなる群より選択されるアミノ酸配列の改変体であって、ここで、該改変体が該アミノ酸配列と異なっているのは１５％以下のアミノ酸残基であるという条件で、該改変体中の１つ以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列とは異なっている、改変体；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、および３４からなる群より選択されるアミノ酸配列の天然に存在する対立遺伝子改変体のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリペプチドであって、ここで、前記対立遺伝子改変体が配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、および３３からなる群より選択される核酸配列とは１つのヌクレオチドが異なる核酸配列の翻訳であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載のポリペプチドであって、前記改変体の前記アミノ酸配列が保存的アミノ酸置換を含む、ポリペプチド。
【請求項５】
単離された核酸分子であって、以下：
ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、および３４からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態；
ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、および３５からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態の改変体であって、ここで、該改変体が、該成熟形態のアミノ酸配列中と異なっているのは１５％以下のアミノ残基であるという条件で、該改変体中の１つ以上のアミノ酸残基が該成熟形態のアミノ酸配列と異なっている、改変体；
ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、および３４からなる群より選択されるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、および３４からなる群より選択されるアミノ酸配列の改変体であって、ここで、該改変体が該アミノ酸配列と異なっているのは１５％以下のアミノ酸残基であるという条件で、該改変体中の１つ以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列とは異なっている、改変体；
ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、および３４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドの改変体の少なくとも一部をコードする核酸フラグメントであって、ここで、該改変体が該アミノ酸配列と異なっているのは１５％以下のアミノ酸残基であるという条件で、該改変体中の１つ以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列とは異なっている、改変体；ならびに
ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）の相補体を含む核酸分子、からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が天然に存在する対立遺伝子核酸改変体のヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項７】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が天然に存在するポリペプチド改変体のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項８】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、および３３からなる群より選択される核酸配列とは１つのヌクレオチドが異なる、核酸分子。
【請求項９】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が以下：
ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、および３３からなる群より選択されるヌクレオチド配列；
ｂ）ヌクレオチド配列であって、ここで、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３からなる群より選択されるヌクレオチド配列中の１つ以上のヌクレオチドが異なっており、ただし、該ヌクレオチド配列と異なっているのは、該ヌクレオチドの２０％以下である、ヌクレオチド配列；
ｃ）（ａ）の核酸フラグメント；および
ｄ）（ｂ）の核酸フラグメント、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項１０】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３からなる群より選択されるヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、核酸分子。
【請求項１１】
請求項５に記載の核酸分子であって、以下：
（ａ）前記アミノ酸配列をコードするコード配列とは１つ以上のヌクレオチド配列が異なるコード配列を含む第１のヌクレオチド配列であって、ただし、該第１のヌクレオチド配列中のコード配列のヌクレオチドが該コード配列と異なっているのは２０％以下である、第１のヌクレオチド配列；
（ｂ）第１のポリヌクレオチドの相補体である単離された第２のポリヌクレオチド；および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸フラグメント、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１３】
前記核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１５】
請求項１に記載のポリペプチドに免疫特異的に結合する、抗体。
【請求項１６】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１８】
サンプル中の請求項１に記載のポリペプチドの存在または量を測定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該サンプルを提供する工程；
（ｂ）該サンプルを該ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体と接触する工程；および
（ｃ）該ポリペプチドに結合する抗体の存在または量を測定して、それによって該サンプル中のポリペプチドの存在または量を測定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
請求項５に記載の核酸分子のサンプル中における存在または量を測定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該サンプルを提供する工程；
（ｂ）該サンプルを該核酸分子に結合するプローブ接触させる工程；および
（ｃ）該核酸分子に結合する該プローブの存在または量を測定して、それによって該サンプル中の該核酸分子の存在または量を測定する工程
を包含する、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記核酸分子の存在または量が、細胞型または組織型についてのマーカーとして使用される、方法。
【請求項２１】
前記細胞型または組織型が癌性である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１に記載のポリペプチドに結合する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該ポリペプチドを該因子と接触させる工程；および
（ｂ）該因子が該ポリペプチドに結合するか否かを決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項２３】
前記因子が、細胞レセプターまたは下流エフェクターである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１のポリペプチドの発現または活性を調節する因子を同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該ポリペプチドを発現する細胞を提供する工程；
（ｂ）該因子と該細胞を接触させる工程；および
（ｃ）該因子が、該ポリペプチドの発現または活性を調節するか否かを決定する工程、
を包含し、それによって、該ペプチドの発現または活性における変化が、該ポリペプチドの発現または活性を調節する因子を示す、方法。
【請求項２５】
請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節するための方法であって、該方法は、請求項１に記載のポリペプチドを発現する細胞サンプルを、該ポリペプチドの活性を調節するのに十分な量で、該ポリペプチドに結合する化合物とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２６】
ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防する方法であって、該方法は、そのような処置または予防が所望される被験体に、該被験体における該ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防するに十分な量で、請求項１に記載のポリペプチドを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２７】
前記障害が、心筋症およびアテローム硬化症からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記障害が、細胞シグナルのプロセシングおよび代謝経路の調節に関連する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記被験体がヒトである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防する方法であって、該方法は、そのような処置または予防が所望される被験体に、該被験体における該ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防するに十分な量で、請求項５に記載の核酸を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３１】
前記障害が、心筋症およびアテローム硬化症からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記障害が、細胞シグナルのプロセシングおよび代謝経路の調節に関連する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記被験体がヒトである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防する方法であって、該方法は、そのような処置または予防が所望される被験体に、該被験体における該ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防するに十分な量で、請求項１５に記載の抗体を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３５】
前記障害が糖尿病である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記障害が、細胞シグナルのプロセシングおよび代謝経路の調節に関連する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記被験体がヒトである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項３９】
請求項５に記載の核酸分子および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項４０】
請求項１５に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項４１】
請求項３８に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
【請求項４２】
請求項３９に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
【請求項４３】
請求項４０に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
【請求項４４】
第１の哺乳動物被験体における請求項１に記載のポリペプチドの変化したレベルと関連する疾患の存在または該疾患に対する素因を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該第１の哺乳動物被験体由来のサンプル中の該ポリペプチドの発現レベルを測定する工程；および
（ｂ）工程（ａ）のサンプル中の該ポリペプチドの量を、該疾患を有さないことが既知であるかまたは該疾患にかかりにくいことが既知の、第２の哺乳動物被験体由来のコントロールサンプル中に存在する該ポリペプチドの量と比較する工程、
を包含し、ここで、該コントロールサンプルと比較した場合の該第１の被験体における該ポリペプチドの発現レベルにおける変化が、該疾患の存在または該疾患に対する素因を示す、方法。
【請求項４５】
前記素因が癌に対するものである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
第１の哺乳動物被験体における請求項５に記載の核酸分子の変化したレベルと関連する疾患の存在または該疾患に対する素因を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該第１の哺乳動物被験体由来のサンプル中の該核酸の量を測定する工程；および
（ｂ）工程（ａ）のサンプル中の該核酸の量を、該疾患を有さないことが既知であるかまたは該疾患にかかりにくいことが既知の、第２の哺乳動物被験体由来のコントロールサンプル中に存在する該核酸の量と比較する工程、
を包含し、ここで、該コントロールサンプルと比較した場合の該第１の被験体における該核酸のレベルにおける変化が、該疾患の存在または該疾患に対する素因を示す、方法。
【請求項４７】
前記素因が癌に対するものである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
哺乳動物において病理学的状態を処置する方法であって、該方法は、該病理状態を緩和するに十分な量でポリペプチドを該哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、該ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、および３４のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性なフラグメントと、少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドである、方法。
【請求項４９】
哺乳動物において病理学的状態を処置する方法であって、該方法は、該病理学的状態を緩和するに十分な量で請求項１５に記載の抗体を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、核酸およびそれによってコードされるポリペプチドに関する。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、一般的に、核酸およびそれによってコードされるポリペプチドに関する。より詳細には、本発明は、細胞質ポリペプチド、核ポリペプチド、膜結合ポリペプチド、および分泌ポリペプチドをコードする核酸、ならびにこれらの核酸およびポリペプチドを産生するためのベクター、宿主細胞、抗体および組換え方法に関する。
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は、新規なポリペプチドをコードする新規な核酸配列の発見に一部基づく。これらの新規の核酸およびポリペプチドは、本明細書中でＮＯＶＸ核酸、またはＮＯＶ１核酸、ＮＯＶ２核酸、ＮＯＶ３核酸、ＮＯＶ４核酸、ＮＯＶ５核酸、ＮＯＶ６核酸、ＮＯＶ７核酸、ＮＯＶ８核酸、およびＮＯＶ９核酸ならびにＮＯＶＸポリペプチド、またはＮＯＶ１ポリペプチド、ＮＯＶ２ポリペプチド、ＮＯＶ３ポリペプチド、ＮＯＶ４ポリペプチド、ＮＯＶ５ポリペプチド、ＮＯＶ６ポリペプチド、ＮＯＶ７ポリペプチド、ＮＯＶ８ポリペプチド、およびＮＯＶ９ポリペプチドとして参照される。これらの核酸およびポリペプチド、ならびにこれらの誘導体、ホモログ、アナログ、およびフラグメントは、これ以降、集合的に「ＮＯＶＸ」核酸配列または「ＮＯＶＸ」ポリペプチド配列として示される。
【０００４】
一つの局面において、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドをコードする単離されたＮＯＶＸ核酸分子を提供し、この核酸分子は、配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：）１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、および３３として開示される核酸配列と同一性を有する核酸配列を含む。幾つかの実施形態において、ＮＯＶＸ核酸分子は、ＮＯＶＸ核酸配列のタンパク質コード配列を含む核酸分子に相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。本発明はまた、ＮＯＶＸポリペプチドをコードする単離された核酸またはこれらのフラグメント、ホモログ、アナログもしくは誘導体を含む。例えば、これらの核酸は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、および３４のアミノ酸配列を含むポリペプチドに少なくとも８０％同一なポリペプチドをコードし得る。この核酸は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、および３３のいずれかの核酸配列を含む、例えば、ゲノムＤＮＡフラグメント、またはｃＤＮＡ分子であり得る。
【０００５】
また、オリゴヌクレオチド、例えば、ＮＯＶＸ核酸（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３）の少なくとも６個連続するヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド、またはそれらオリゴヌクレオチドの相補体が、本発明に含まれる。
【０００６】
また、実質的に精製されたＮＯＶＸポリペプチド（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、および３４）が、本発明に含まれる。特定の実施形態において、ＮＯＶＸポリペプチドは、ヒトＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列に実質的に同一なアミノ酸配列を含む。
【０００７】
本発明はまた、ＮＯＶＸポリペプチド、またはそれらのフラグメント、ホモログ、アナログもしくは誘導体と免疫選択的に結合する抗体を特徴とする。
【０００８】
別の局面において、本発明は、治療有効量または予防有効量の治療剤および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を含む。この治療剤は、例えば、ＮＯＶＸ核酸、ＮＯＶＸポリペプチド、またはＮＯＶＸポリペプチドに特異的な抗体であり得る。さらなる局面において、本発明は、１つ以上のキャリア、治療有効量または予防有効量のこの薬学的組成物を含む。
【０００９】
さらなる局面において、本発明は、このＤＮＡにコードされたＮＯＶＸポリペプチドの発現を可能にする条件下でＮＯＶＸ核酸を含む細胞を培養することによるポリペプチド産生方法を含む。次いで、所望の場合、ＮＯＶＸポリペプチドは回収され得る。
【００１０】
別の局面において、本発明は、サンプル中のＮＯＶＸポリペプチドの存在を検出する方法を含む。この方法において、サンプルをこのポリペプチドと選択的に結合するこの化合物と、このポリペプチドと化合物との間の複合体形成を可能にする条件下で接触させる。存在する場合、この複合体が検出され、これによって、サンプル中のＮＯＶＸポリペプチドが同定される。
【００１１】
本発明はまた、特定の細胞型または組織型を、これらのＮＯＶＸの発現に基づいて同定する方法を含む。
【００１２】
また、サンプル中のＮＯＶＸ核酸分子の存在を検出する方法も本発明に含まれる。この方法は、ＮＯＶＸ核酸プローブまたはＮＯＶＸ核酸プライマーをサンプル接触させること、およびこの核酸プローブまたは核酸プライマーがサンプル中のＮＯＶＸ核酸分子と結合しているか否かを検出することによって検出する。
【００１３】
さらなる局面において、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドを含む細胞サンプルと、ＮＯＶＸポリペプチドの活性を調節するのに十分な量の、ＮＯＶＸポリペプチドに結合する化合物とを接触させることによって上記のポリペプチドの活性を調節する方法を提供する。この化合物は、本明細書中でさらに記載されるように、例えば、低分子（例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質、または他の有機（炭素含有）分子もしくは無機分子）であり得る。
【００１４】
例えば、以下を含む障害または症候群の処置または予防のための医薬品の製造における治療剤の使用が、本発明の範囲に含まれる：糖尿病、肥満に関連する代謝障害、代謝症候群Ｘ、食欲不振、慢性疾患に関連するるいそう障害、代謝障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン障害、免疫障害、および造血障害、または細胞シグナルプロセシングおよび代謝経路調節に関連する他の障害。この治療剤は、例えば、ＮＯＶＸ核酸、ＮＯＶＸポリペプチド、またはＮＯＶＸ特異的抗体、またはこれらの生物学的に活性な誘導体もしくはフラグメントであり得る。
【００１５】
例えば、本発明の組成物は、以下に罹患した患者の処置についての効力を有する：発達疾患、ＭＨＣＩＩおよびＩＩＩの疾患（免疫疾患）、味覚および嗅覚の検知障害、バーキットリンパ腫、皮質神経性（ｃｏｒｔｉｃｏｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ）疾患、シグナル伝達経路障害、網膜疾患（光受容性に関連する疾患を含む）、細胞増殖速度障害、細胞形状障害、摂食障害；摂食の制限；過食に起因する潜在的肥満；飢餓に起因する潜在性障害（食欲不振）、非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ１）、細菌性感染、真菌性感染、原生動物性感染およびウイルス感染（特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に起因する感染）、疼痛、癌（新生物；腺癌；リンパ腫；前立腺癌；子宮癌を含むがこれらに限定されない）、食欲不振、過食症、ぜん息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう症、クローン病、多発性硬化症、オールブライト遺伝性骨形成異常症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、ぜん息、アレルギー、良性前立腺肥大、ならびに精神病性障害および神経性障害（不安、精神分裂病、躁鬱、せん妄、痴呆、重篤な精神遅滞を含む）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、低リン酸血症性くる病、常染色体優性（２）先端脳梁（Ａｃｒｏｃａｌｌｏｓａｌ）症候群およびジスキネジー（例えば、ハンティングトン病またはジル・ド・ラ・ツレット症候群）ならびに／または他の病状および障害など。
【００１６】
このポリペプチドは、本発明について特異的な抗体を産生するための免疫原、またはワクチンとして使用され得る。これらはまた、潜在的なアゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物をスクリーニングするために使用され得る。例えば、ＮＯＶＸをコードするｃＤＮＡは遺伝子治療において有用であり得、そしてこのＮＯＶＸは、これらを必要とする被験体に投与される場合に有用であり得る。非限定的な例として、本発明の組成物は、以下に罹患した患者の処置に効力を有する：細菌性感染、真菌性感染、原生動物性感染およびウイルス感染（特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に起因する感染）、疼痛、癌（新生物；腺癌；リンパ腫；前立腺癌；子宮癌を含むがこれらに限定されない）、食欲不振、過食症、ぜん息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう症、クローン病、多発性硬化症；およびオールブライト遺伝性骨形成異常症の処置、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、ぜん息、アレルギー、良性前立腺肥大、ならびに精神病性障害および神経性障害（不安、精神分裂病、躁鬱、せん妄、痴呆、重篤な精神遅滞を含む）、およびジスキネジー（例えば、ハンティングトン病またはジル・ド・ラ・ツレット症候群）ならびに／または他の病状および障害。
【００１７】
本発明は、例えば、以下の障害または症候群のモジュレーターについてのスクリーニング方法をさらに含む：糖尿病、肥満に関連する代謝障害、代謝症候群Ｘ、食欲不振、慢性疾患に関連するるいそう障害、代謝障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン障害、免疫障害、および造血障害、または細胞シグナル処理および代謝経路調節に関連する他の障害。この方法は、試験化合物とＮＯＶＸポリペプチドとを接触させること、およびこの試験化合物が上記のＮＯＶＸポリペプチドに結合するか否かを決定することを包含する。ＮＯＶＸポリペプチドに対する試験化合物の結合は、この試験化合物が活性または上述の障害または症候群に対する潜伏または素因のモジュレーターであることを示す。
【００１８】
以下の障害または症候群に対する増大した危険にさらされている試験動物に、試験化合物を投与することによる、活性のモジュレーター、または以下の障害もしくは症候群に対する潜伏もしくは素因のモジュレーターについてスクリーニング方法するもまた、本発明の範囲に含まれる：例えば、糖尿病、肥満に関連する代謝障害、代謝症候群Ｘ、食欲不振、慢性疾患に関連する他の障害、代謝障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン障害、免疫障害、および造血障害に関連するるいそう障害、または細胞シグナルプロセシングおよび代謝経路調節。この試験動物は、ＮＯＶＸ核酸によってコードされる組換えポリペプチドを発現する。次いで、ＮＯＶＸポリペプチドの発現または活性は、コントロール動物におけるこのタンパク質の発現または活性と同様に、試験動物において測定される。コントロール動物はＮＯＶＸポリペプチドを組換え的に発現しかつこの障害または症候群に対する危険が増大した状態ではない。次に、試験動物またはコントロール動物の両方におけるＮＯＶＸポリペプチドの発現を比較する。コントロール動物と比較した場合の、試験動物でのＮＯＶＸポリペプチドの活性の変化は、この試験化合物が、この障害または症候群の潜伏モジュレーターであることを示している。
【００１９】
さらに別の局面において、本発明は、被験体（例えば、ヒト被験体）における、ＮＯＶＸポリペプチド、ＮＯＶＸ核酸、または両方の変化したレベルに関連する疾患ついての素因の存在を決定する方法を含む。この方法は、被験体由来の試験サンプル中のＮＯＶＸポリペプチドの量を測定する工程、および試験サンプル中のこのポリペプチドの量を、コントロールサンプル中に存在するＮＯＶＸポリペプチドの量に対して比較する工程を含む。コントロールサンプルに比較した場合の試験サンプル中のＮＯＶＸポリペプチドのレベルの変化によって、被験体中の疾患の存在または疾患に対する素因の存在が示される。好ましくは、この素因としては、例えば、以下のもの挙げられる：糖尿病、肥満に関連する代謝障害、代謝症候群Ｘ、食欲不振、慢性疾患、代謝障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン障害、免疫障害、および造血障害に関連するるいそう障害。また、本発明の新規ポリペプチド発現レベルは、様々な癌についてスクリーニングする方法ならびに癌の段階を決定する方法に使用され得る。
【００２０】
さらなる局面において、本発明は、病的状態を緩和するかまたは予防するために十分な量で、ＮＯＶＸポリペプチド、ＮＯＶＸ核酸、またはＮＯＶＸ特異的抗体を被験体（例えば、ヒト被験体）に投与することによって、哺乳動物の障害に関連する病的状態を処置または予防する方法を含む。好ましい実施形態において、この障害は、例えば、以下のものを含む：糖尿病、肥満に関連する代謝障害、代謝症候群Ｘ、食欲不振、慢性疾患に関連するるいそう障害、代謝障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン障害、免疫障害、および造血障害。
【００２１】
さらに別の局面において、本発明は、当該分野で一般的に使用される多くの技術うちいずれか１つによって、本発明の、細胞レセプターおよび下流エフェクターを同定する方法に使用され得る。これらとして、以下が挙げられるこれらに限定されない：ツーハイブリッドシステム、親和性精製、抗体または他の特異的相互作用分子との共沈澱。
【００２２】
別段規定されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書中に記載の方法および材料に類似しているか、または等価である方法および物質は、本発明の実施または試験に使用され得るが、適切な方法および物質が以下に記載される。本明細書中で述べられた、全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、全体が参考として援用される。矛盾する場合、本明細書（定義を含む）が調整する。さらに、材料、方法、および実施例は、単に例示的なものであって、制限的であることを意図するものではない。
【００２３】
本発明の他の特徴および利点は、特許請求の範囲および以下の詳細な説明から明らかである。
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、新規なヌクレオチドおよびそれによってコードされるポリペプチドを提供する。新規な核酸配列およびそれらのポリペプチドが本発明に含まれる。それらの配列は、集合的に「ＮＯＶＸ核酸」または「ＮＯＶＸポリヌクレオチド」と呼ばれ、そして対応するコードされるポリペプチドは、「ＮＯＶＸポリペプチド」または「ＮＯＶＸタンパク質」と呼ばれる。他に示されない場合、「ＮＯＶＸ」は、本明細書中に開示された新規な配列のいずれかをいうことを意味する。表Ａは、ＮＯＶＸ核酸およびそれらがコードするポリペプチドの要約を提供する。
【００２５】
【表１】
2004512821.tif 000002
ＮＯＶＸ核酸およびそれらがコードするポリペプチドは、種々の用途および状況において有用である。本発明に従う様々なＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドは、先に記載されたタンパク質に対するドメインおよび配列の関連性の存在に従って、タンパク質ファミリーの新規なメンバーとして有用である。さらに、ＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドはまた、ＮＯＶＸポリペプチドが属するファミリーのメンバーであるタンパク質を同定するために使用され得る。
【００２６】
例えば、ＮＯＶ１は、セリン／スレオニンおよびチロシンの両方に対して二重特異性プロテインキナーゼ活性を提示するタンパク質であってかつ精巣で発現しているタンパク質である精巣特異的セリン／スレオニンプロテインキナーゼ（ＴＳＫ−１）ファミリーに相同である。従って、本発明に従ったこのＮＯＶ１核酸、ＮＯＶ１ポリペプチド、ＮＯＶ１抗体および関連する化合物は、例えば、精子形成、雄性生殖健康、受精能および／または他の病状／障害に関連する治療用途および診断用途において有用である。
【００２７】
また、ＮＯＶ２ａ、ＮＯＶ２ｂ、ＮＯＶ２ｃは、タンパク質のβサイモシンファミリーに相同である。従って、本発明に従ったＮＯＶ２核酸、ＮＯＶ２ポリペプチド、ＮＯＶ２抗体、および関連する化合物は、例えば、前立腺癌、アポトーシス、新脈管形成、および創傷治癒、神経変性疾患および神経精神病、免疫障害および自己免疫障害、加齢関連障害、および／または他の病状／障害に関連する治療用途および診断用途おいて有用である。
【００２８】
さらに、ＮＯＶ３ａおよびＮＯＶ３ｂは、特殊化した細胞−細胞接触部位の形成に重要であるコネキシン様タンパク質のファミリーに相同である。従って、ＮＯＶ３核酸およびＮＯＶ３ポリペプチド、ＮＯＶ３抗体および本発明に従った関連化合物は、例えば、Ｃｌｏｕｓｔｏｎ症候群および難聴、断節性掌蹠角皮症（ＰＰＫ）、Ｘ連鎖シャルコー−マリー−ツースニューロパシー、遺伝性末梢ニューロパシーおよび／または他の病状／障害に関連する治療用途および診断用途に有用である。
【００２９】
また、ＮＯＶ４ａ、ＮＯＶ４ｂ、ＮＯＶ４ｃ、ＮＯＶ４ｄは、重要な内皮細胞マイトジェンである肝癌由来増殖因子ファミリーのタンパク質に相同である。従って、本発明に従ったＮＯＶ４核酸およびＮＯＶ４ポリペプチド、ＮＯＶ４抗体および関連化合物は、例えば、副腎脳白質ジストロフィー、血友病、凝固能亢進（ｈｙｐｅｒｃｏｎｇｕｌａｔｉｏｎ）、免疫欠損、アルツハイマー病、発作、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性麻痺、てんかん、多発性硬化症、および／または他の病状／障害に関連する治療用途および診断用途に有用である。
【００３０】
さらに、ＮＯＶ５ａおよびＮＯＶ５ｂは、タンパク質のコルテキシン（ｃｏｒｔｅｘｉｎ）ファミリーに相同である。従って、本発明に従うＮＯＶ５核酸、ＮＯＶ５ポリペプチド、ＮＯＶＸ５抗体および関連化合物は、例えば、以下を含む種々の状態の処置において有用である：フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、アルツハイマー病、発作、結節硬化症、高カルシウム血症など。
【００３１】
また、ＮＯＶ６は、タンパク質のシアロアドヘシン（ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｎ）様ファミリーに相同である。従って、本発明に従うＮＯＶ６核酸、ＮＯＶ６ポリペプチド、ＮＯＶＸ６抗体および関連化合物は、例えば、細胞−細胞相互作用を含む様々な障害の治療用途および診断用途に有用である。
【００３２】
さらに、ＮＯＶ７は、タンパク質のトリオホスホプロテイン（Ｔｒｉｏ　Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ）ファミリーに相同である。従って、本発明に従うＮＯＶ７核酸、ＮＯＶ７ポリペプチド、ＮＯＶ７抗体および関連化合物は、例えば、欠陥のある細胞移動および足場非依存性増殖によって特徴づけられる障害の治療用途および診断用途に有用である。
【００３３】
尚さらに、ＮＯＶ８は、種々の機能に重要なＳｔｒａ６様タンパク質またはレチノイン酸応答性様タンパク質のファミリーに相同である。従って、本発明に従うＮＯＶ８核酸、ＮＯＶ８ポリペプチド、ＮＯＶ８抗体および関連化合物は、例えば、以下を含む障害の治療用途および診断用途に有用である：骨粗しょう症、高カルシウム血症、関節炎、強直性脊椎炎、脊柱側弯症、筋ジストロフィー、レッシュ−ナイハン症候群、重症筋無力症、生殖障害、受胎障害、発達障害、内分泌／成長障害、思春期発達における障害、外科手術／創傷治癒、および／または内分泌／成長障害。
【００３４】
最後に、ＮＯＶ９は、タンパク質の甲状腺調節遺伝子ファミリーに相同である。従って、本発明に従うＮＯＶ９核酸、ＮＯＶ９ポリペプチド、ＮＯＶ９抗体および関連化合物は、例えば、以下を含む様々な障害の治療用途および診断用途に有用である：甲状腺機能低下症および甲状腺機能亢進症、甲状腺の障害、および甲状腺関連癌。
【００３５】
ＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドはまた、ＮＯＶＸの活性または機能を阻害または増強する分子のスクリーニングに使用され得る。具体的には、本発明に従う核酸およびタンパク質は、例えば、神経発生、細胞分化、細胞増殖、造血、創傷治癒、および新脈管形成を調節または阻害する低分子同定のための標的として使用され得る。
【００３６】
本発明に従うＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドについてさらになる有用性を、本明細書中にて開示する。
【００３７】
（ＮＯＶ１）
本発明に従うＮＯＶ１配列（これはまた、３０２３５６６１＿ＥＸＴ１として参照される）は、精巣特異的セリン／スレオニンプロテインキナーゼ（ＴＳＫ−１）ファミリーのタンパク質に関連するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。表１Ａおよび表１Ｂによって、ＮＯＶ１核酸およびそれにコードされるポリペプチド配列をそれぞれ示す。１１４９ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ１核酸を表１Ａに示す。この開示されたＮＯＶ１にオープンリーディング（「ＯＲＦ」）は、ヌクレオチド１〜３にあるＡＴＧ開始コドンにて始まり、ヌクレオチド１１４７〜１１４９にあるＴＡＡコドンで終止することを同定した。表１Ａに示されるように、開始コドンおよび終止コドンは、太字である。
【００３８】
【表２】
2004512821.tif 000003
公開配列データベースの検索の際に、例えば、本発明で開示されたＮＯＶ１核酸配列は、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ＤＧＳ−Ｇ　ｍＲＮＡ（３’端、１８０６ｂｐ）（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＵＭＤＧＳＧ｜ａｃｃ：Ｌ７７５６４）の１つの領域に対して、３１４塩基のうち、同一（Ｅ値は４．７ｅ−３７）である２１９塩基（６９％）を有している。公開されたヌクレオチドデータベースとしては、ＧｅｎＢａｎｋデータベースおよび全てのＧｅｎｅＳｅｑ特許データベースが挙げられる。
【００３９】
本明細書中の全てのＢＬＡＳＴのアライメントにおいて、「Ｅ値（Ｅ−ｖａｌｕｅ）」および「期待（Ｅｘｐｅｃｔ）」値は、アライメントされた配列が、検索されたデータベース内で、ＢＬＡＳＴの問い合わせ配列に対して、偶然のみでこれらの類似性を達成し得た確率の数値表示である。例えば、ＮＯＶ１のＢＬＡＳＴ解析から検索された対象（「Ｓｂｊｃｔ」）、例えば、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ＤＧＳ−Ｇ　ｍＲＮＡが、偶然のみで問い合わせ配列であるＮＯＶ１配列に一致する確率は、４．７×１０−３７である。期待値（Ｅ）は、特定サイズのデータベースを検索した場合に、単に偶然によって見出すことを「期待」し得るヒット数を記述するパラメーターである。これは、２配列間のマッチに対して割り当てられるスコア（Ｓｃｏｒｅ）（Ｓ）に対して指数関数的に減少する。本質的には、Ｅ値は、２配列間のマッチについて存在するランダムなバックグラウンドノイズを記述する。
【００４０】
この期待値は、報告結果に対しての有意な閾値をつくるための簡便な方法として使用される。ＢＬＡＳＴ実行のために使用されるデフォルト値は、代表的には０．０００１に設定される。ＢＬＡＳＴ２．０において、この期待値はまた、マッチの有意性を報告するＰ値（確率）の代りに使用される。例えば、１つのヒットに対して割り当てられたＥ値が１であることによって、現在のサイズのデータベースにおいて、同様のスコアを伴う１つのマッチを偶然のみで見出しことが期待され得るという意味を解釈し得る。Ｅ値がゼロ（０）であることによって、同様のスコアを伴ういかなるマッチも偶然のみによっては見出すことが期待されないことが意味される。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／を参照のこと。必要に応じて、ＸまたはＮの文字列がＢＬＡＳＴ検索によって得られる。これは、人為的なヒットを避ける為に実施される、低複雑性（ｌｏｗ　ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ）配列に対する問い合わせ配列の自動フィルタリングの結果である。このフィルターは、見出したいかなる低複雑性配列を、ヌクレオチド配列においては文字「Ｎ」で置換（例えば、「ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ」）し、タンパク質においては文字「Ｘ」で置換（例えば、「ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ」）する。低複雑性領域によって、有意な位置と位置による（ｐｏｓｉｔｏｎ−ｂｙ−ｐｏｓｉｔｉｏｎ）のアライメントというよりはむしろ構成要素の偏りを反映する高スコアが生じる。ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　２６６：５５４−５７１、１９９６。
【００４１】
開示されたコードされるＮＯＶ１タンパク質は、３８２アミノ酸残基を有し、ＮＯＶ１タンパク質と呼ばれる。このＮＯＶ１タンパク質は、シグナルペプチド予測および細胞局在について分析された。ＳｉｇｎａｌＰおよびＰｓｏｒｔの結果によって、ＮＯＶ１はシグナルペプチドを有しておらず、そして核に局在するようであることが、確実性０．９８００で予測される。この開示されたＮＯＶ１ポリペプチド配列は、１文字アミノ酸コードを使用して表１Ｂに示される。
【００４２】
【表３】
2004512821.tif 000004
ＮＯＶ１配列を、目的のタンパク質ファミリーと類似性を有するタンパク質へと翻訳されるＤＮＡ配列に対して独自の配列ファイルデータベースを検索することによって最初に決定した。ＮＯＶ１を適切な類似性を有しているとして同定した。ＮＯＶ１を、新規の全長タンパク質ならびにＴＳＫ−１の新規のスプライス形態をコードする任意のオープンリーディングフレームを同定するためにさらに分析した。これは、さらになる独自のアセンブリ、公開され利用可能なＥＳＴ配列および公開ゲノム配列からの適切な配列を使用して、同定されたＮＯＶ１を伸長することによって実施した。ゲノムクローンＡＣ０１１４４８をＮＯＶ１に対する１００％同一性を有する領域を有するとして同定し、そして、この同一性によってこのクローンがＮＯＶ１についてのゲノム上の座の配列を含むことが導かれたので、ゲノムクローンＡＣ０１１４４８の分析のために選択した。
【００４３】
ゲノムクローンを、ＧｅｎｓｃａｎおよびＧｒａｉｌによって分析し、エキソンおよび推定コード配列／オープンリーディングフレームを同定した。このクローンをまた、ＴｂｌａｓｔＮ、ＢｌａｓｔＸおよび他のホモロジープログラムによって分析し、目的のもとのタンパク質／タンパク質ファミリーに対して類似性を有するタンパク質へと翻訳される領域を同定した。公開データベースおよび独自データベースの両方由来の発現された配列をまた、この遺伝子配列をさらに規定しそして完全にすることが可能な場合に加えた。次いで、明らかな不整合性にたいしては、ＤＮＡ配列を手動で修正し、これによって全長タンパク質をコードする配列を得た。
【００４４】
本発明で開示されたＴＳＫ−１（ＮＯＶ１）は、ゲノムＤＮＡ［ＧｅｎｂａｎｋＮＥＷからのＡＣ０１１４４８］に属する。このＧｅｎｂａｎｋＮｅｗのエントリの中に、この配列が第１９染色体由来であることを示す注釈がある。それゆえに、発明者らは、ＮＯＶ１の染色体上の座を第１９染色体として割り当てた。さらに、本発明で開示されたＴＳＫ−１（ＮＯＶ１）は精巣で発現される。
【００４５】
ＢＬＡＳＴＸ検索を、公開タンパク質データベースに対して実施した。開示されたＮＯＶ１タンパク質（配列番号２）は、ＴＳＫ−１様タンパク質と十分な同一性を有する。例えば、本発明のタンパク質の全長アミノ酸配列は、Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ由来の３６４アミノ酸残基のＴＳＫ−１タンパク質（ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ６１２４１；Ｅ＝３．４ｅ−６６）に対して、３６０アミノ酸残基のうち１４６アミノ酸残基（４０％）の同一なアミノ酸残基を有することが見出さられ、３６０残基のうち２０８残基（５７％）の類似のアミノ酸残基を有することが見出された。公開アミノ酸データベースとしては、ＧｅｎＢａｎｋデータベース、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＤＢ、およびＰＩＲが挙げられる。
【００４６】
ＮＯＶ１が、表１Ｃに列挙されたＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されたアミノ酸配列に対して相同性を有することがまた見出された。
【００４７】
【表４】
2004512821.tif 000005
これらの配列および他の配列の相同性を、表１Ｄにおいて示されたＣｌｕｓｔａｌＷ解析で図式的に示す。ＮＯＶ１タンパク質のＣｌｕｓｔａｌＷアライメントにおいて、ならびに本明細書中における全ての他のＣｌｕｓｔａｌＷ解析において、白抜きのアミノ酸配列残基は、保存された配列の領域（すなわち、構造特性および機能特性を保存するために必要とされ得る領域）を示すが、その一方、強調されていないアミノ酸配列はより低く保存されているおり、そしてこれらのアミノ酸配列は、タンパク質構造またはタンパク質機能を変更することなしに、より広い範囲で潜在的に変異され得る。
【００４８】
【表５】
2004512821.tif 000006
ＮＯＶ１、ならびに全ての他のＮＯＶＸタンパク質中で同定可能なドメインの存在を、ＰＲＯＳＩＴＥ、ＤＯＭＡＩＮ、Ｂｌｏｃｋｓ、Ｐｆａｍ、ＰｒｏＤｍａｉｎ、およびＰｒｉｎｔｓのようなソフトウェアアルゴリズムによって検索し、次いでＩｎｔｅｒｐｒｏのウェブサイト（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ）を使用しドメインマッチ（または番号）を組み合わせることによりＩｎｔｅｒｐｒｏ番号を決定することによって決定した。例えば、表１Ｅ〜表１Ｇにおいて開示されたＮＯＶ１に対するＤＯＭＡＩＮの結果は、Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｏｓｉｔｉｏｎ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＢＬＡＳＴ解析をするＣｏｎｓｅｒｖｅｄ　Ｄｏｍａｉｎ　Ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＤＤ）によって、収集された。このＢＬＡＳＴ解析ソフトウェアは、ＳｍａｒｔおよびＰｆａｍのコレクションに見出されたドメインをサンプリングする。表１Ｅ〜１Ｇおよび全ての連続するＤＯＭＡＩＮ配列アライメントについては、完全に保存された単一の残基を黒い網掛け（白抜き）で示し、そして「強い」半保存された残基をグレーの網掛けによって示す。保存されたアミノ酸の中で「強い」グループのうちいずれか１つとしては、アミノ酸の以下のグループが挙げられ得る：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷ。
【００４９】
表１Ｅ〜１Ｇは、ＮＯＶ１に対するＤＭＡＩＮ解析結果からのドメインの説明を列挙する。これによって、ＮＯＶ１配列は、このドメインを含むことが既知の他のタンパク質に類似の特性を有することが示される。
【００５０】
【表６】
2004512821.tif 000007
【００５１】
【表７】
2004512821.tif 000008
【００５２】
【表８】
2004512821.tif 000009
ＢＬＡＳＴ結果は、Ｐａｔｐデータベース（特許および特許出願において公開された配列を含む独自のデータベース）由来の配列を含む。Ｐａｔｐ結果は、表１Ｈにおいて列挙される結果を含む。
【００５３】
【表９】
2004512821.tif 000010
例えば、ｐａｔｐ：ＡＡＢ６５６８６（ＷＯ００／０７３４６９）、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ由来の２７３アミノ酸キナーゼに対するＢＬＡＳＴは、良好な同一性、Ｅ＝１．８ｅ−１４５を生じた。さらに、ｐａｔｐ：ＡＡＢ４２１６７、２１０ヒトＯＲＦＸポリペプチド配列（ＷＯ００／０５８４７３）に対するＢＬＡＳＴもまた、良好な同一性、Ｅ＝１．８ｅ−９０を生じた。
【００５４】
プロテインキナーゼは、細胞内シグナル伝達経路に関与する。それらは、セリン／スレオニンキナーゼおよびチロシンキナーゼに広く分類され、これはさらに、触媒ドメインにおける相同性に基づきファミリーおよびサブファミリーに分割され得る。
【００５５】
２つの研究が、精巣特異的セリン／スレオニンプロテインキナーゼファミリーのメンバーを単離および同定した。Ｂｉｅｌｋｅら（１９９４）は、プロテインキナーゼ触媒ドメイン中の２つの高度に保存されたモチーフに対応する縮重オリゴおよびＰＣＲに基づくクローニングストラテジーを用いて、プロテインキナーゼのＳｅｒ／Ｔｈｒ（セリン／スレオニン）ファミリーの新規メンバーをコードするｃＤＮＡフラグメントを単離した。発現分析は、このフラグメントが、精巣に特有の２つの転写物（１．６および１．４ｋｂ）を認識することを明らかにした。これらのフラグメントをプローブとして用いて、Ｂｉｅｌｋｅら（１９９４）は、マウス精巣ｃＤＮＡライブラリーから全長ｃＤＮＡをクローニングした。この配列は３６４アミノ酸のタンパク質をコードする１０９２ｂｐのオープンリーディングフレームを有する。Ｎ末端に局在するキナーゼ触媒ドメインは全て、他のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼにおいて見出される保存されたモチーフを有する。全長配列をプローブとして用いたノザンブロット分析は、１．６ｋｂの転写物に対応するクローニングされた遺伝子を明らかにし、このことは、少なくとも２つの精巣特異的な新規Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼの存在を示唆する。Ｂｉｅｌｋｅら（１９９４）はこの同定／記載された遺伝子について、精巣特異的キナーゼ−１（ＴＳＫ−１）という名称を提案した。ＧｅｎＥＭＢＬデータバンク検索は、ｒａｃプロテインキナーゼ−βをコードするヒト遺伝子およびＳＮＦ−１、ｎｉｍ−１、ＫＩＮ−１、およびＫＩＮ−２によりコードされる酵母Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼの群に対する高度な相同性を明らかにした。
【００５６】
より近年の研究において、Ｒｏｓｏｋら（１９９９）は、サブトラクティブＰＣＲクローニングストラテジーおよびセリン／スレオニンキナーゼの触媒ドメインにおける保存されたアミノ酸領域に基づく縮重プライマーを用いて、ヒト胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリーから新規の全長ｃＤＮＡを単離した。Ｒｏｓｏｋら（１９９９）は、このｃＤＮＡが、精巣特異的キナーゼ−１（ＴＥＳＫ１）のキナーゼドメインに対して６５％同一のキナーゼドメインを有する推定５５５アミノ酸タンパク質をコードすることから、このｃＤＮＡを精巣特異的キナーゼ−２（ＴＥＳＫ２）と命名した。ＴＥＳＫ２は、セリン／スレオニンおよびチロシンの両方に対する二重特異的プロテインキナーゼ活性を示し；また、ＬＩＭＫ１およびＬＩＭＫ２に対してそれぞれ４２％および３９％の同一性を示す。ノザンブロット分析は、主に精巣および前立腺において発現される、約３．０ｋｂの単一のＴＥＳＫ２　ｍＲＮＡ種を明らかにした。Ｒｏｓｏｋら（１９９９）はまた、このラットホモログが、円形精子細胞における生後発達の３０日後に精巣において最初に発現されることを見出した。この著者らは、ＴＥＳＫ２が精子形成において重要な役割を果たすことを示唆した。
【００５７】
本発明についての上記の規定された情報は、この新規ＴＳＫ−１様タンパク質（ＮＯＶ１）がＴＳＫ−１ファミリーのメンバーとして機能し得ることを示唆する。従って、ＮＯＶ１核酸およびタンパク質は、種々のＴＳＫ−１関連病理および／または障害に関係する潜在的な治療適用において有用である。例えば、ＴＳＫ−１様タンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり得、そしてＴＳＫ−１様タンパク質は、それを必要とする被験体に投与される場合に有用であり得る。ＮＯＶ１タンパク質またはそのフラグメントをコードする新規核酸はさらに、診断適用（これにより、核酸またはタンパク質の存在または量が評価される）において有用であり得る。これらの物質はさらに、治療または診断方法における使用のために、本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体を作製するのに有用である。
【００５８】
本発明のＮＯＶＸ核酸およびタンパク質は、以下に記載される種々の疾患および障害ならびに／または他の病理および障害に関係する潜在的な治療適用において有用である。例えば（しかしこれらに限定されない）、ＴＳＫ−１様タンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり得、そしてＴＳＫ−１様タンパク質は、それを必要とする被験体に投与される場合に有用であり得る。非限定的な例において、本発明の組成物は、精子形成、男性生殖の健康、受精能、および／またはその他の病理／障害に罹患した患者の処置に対する効果を有する。本発明のＴＳＫ−１様タンパク質をコードする新規核酸およびＴＳＫ−１様タンパク質またはそれらのフラグメントはさらに、診断適用（これにより、核酸またはタンパク質の存在または量が評価される）において有用であり得る。これらの物質はさらに、治療または診断方法における使用のために、本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体を作製するのに有用である。
【００５９】
さらに、ＮＯＶ１に対するタンパク質類似性情報、発現パターン、およびマップ配置は、ＮＯＶ１がＴＳＫ−１ファミリーの重要な構造的および／または生理学的機能の特徴を有し得ることを示唆する。従って、本発明の核酸およびタンパク質は、潜在的な診断適用および治療適用において、ならびに検索ツールとして有用である。本発明の組成物についての潜在的な治療用途として以下が挙げられるがこれらに限定されない：（ｉ）タンパク質治療剤、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療的、診断的、薬物標的／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）診断および／または予測マーカー（ｖ）遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子切除）、（ｖｉ）研究ツール、ならびに（ｖｉｉ）インビボおよびインビトロで組織再生（これらの組織全て、およびこれらの組織から構成される細胞型、ならびにこれらの組織由来の細胞型のための再生）。
【００６０】
これらの物質はさらに、治療方法または診断方法における使用のための新規ＮＯＶ１物質に免疫特異的に結合する抗体の作製において有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるような、疎水性チャートからの予測を使用して、当該分野で公知の方法に従って、作製され得る。開示されるＮＯＶ１タンパク質は、複数の親水性領域を有し、各々が免疫原として用いられ得る。１つの実施形態において、意図されるＮＯＶ１エピトープは、約１０〜３０アミノ酸由来である。別の実施形態において、ＮＯＶ１エピトープは、約３５〜７０アミノ酸由来である。さらなる実施形態において、ＮＯＶ１エピトープは、９０〜１１０、１２０〜１７０、１８０〜１９０、２１０〜２３０、２５０〜３３５、および３４０〜３６５アミノ酸由来である。これらの新規タンパク質は、種々のヒト障害の機能分析に関するアッセイシステムにおいて用いられ得、疾患の病因の理解および種々の障害のための新規薬物標的の開発において役立つ。
【００６１】
（ＮＯＶ２）
ＮＯＶ２は、以下に開示される３つの新規のβサイモシン様タンパク質を含む。開示されるタンパク質は、ＮＯＶ２ａ、ＮＯＶ２ｂ、およびＮＯＶ２ｃと命名された。
【００６２】
（ＮＯＶ２ａ）
新規核酸が、βサイモシンまたはホモログに関するＣｕｒａＧｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの配列ファイルを使用したＴｂｌａｓｔＮによって、およびＧｅｎＢａｎｋによって利用可能にされたＧｅｎｏｍｉｃ　Ｄａｉｌｙ　Ｆｉｌｅｓに対する実行によって、または個々のシーケンシングセンターからダウンロードされたファイルから、第９染色体上で同定された。この核酸配列を、既知のβサイモシンまたはホモログに対する相同性により、ゲノムファイルＧＢ　ＡＣＣＮＯ：ｂａ５１８ｋ１７から予測した。エキソンを相同性により予測し、そしてイントロン／エキソンの境界を標準的な遺伝的ルールを用いて決定した。エキソンをさらに選択し、そして複数のＢＬＡＳＴ（例えば、ｔＢｌａｓｔＮ、ＢｌａｓｔＸ、およびＢｌａｓｔＮ）検索、ならびにいくつかの場合、ＧｅｎｅＳｃａｎおよびＧｒａｉｌを用いた相同性決定により洗練した。公的なデータベースおよび独自のデータベースの両方から表現された配列を加えて（利用可能な場合）、遺伝子配列をさらに規定し完成させた。次いで、これらの配列を、明らかな不一致に関して手動で補正し、これによって、全長タンパク質をコードする配列を得た。特に、ｂａ５１８ｋ１７＿Ａ配列を準備する際に、ヌクレオチド１２１９０５をスプライシングしてヌクレオチド１２１７５８を得た。
【００６３】
新規βサイモシン様タンパク質をコードする１４７ヌクレオチドの新規核酸（ｂａ５１８ｋ１７＿Ａとも呼ばれる）を、表２Ａに示す。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド６〜８のＡＴＧ開始コドンで開始し、そしてヌクレオチド１３５〜１３７のＴＡＧコドンで終結する。開始コドンの上流および終止コドンの下流の推定の未翻訳領域は、表２Ａにおいて下線で示され、そして開始コドンおよび終止コドンは、太字で示される。
【００６４】
【表１０】
2004512821.tif 000011
公的な配列データベースの検索において、例えば、この核酸配列（ＮＯＶ２ａ）は、ヒトβサイモシンｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：Ｓ５４００５│ａｃｃ：Ｓ５４００５）に対して１５０塩基中１２６塩基（８４％）の同一性を有することを見出した（Ｅ＝７．０ｅ−１７）。公的なヌクレオチドデータベースは、全てのＧｅｎＢａｎｋデータベースおよびＧｅｎｅＳｅｑ特許データベースを含む。
【００６５】
配列番号３によりコードされる開示されたＮＯＶ２ａポリペプチド（配列番号４）は４３アミノ酸残基であり、そして表２Ｂにおいて１文字コードを用いて示される。ＮＯＶ２ａタンパク質を、シグナルペプチド予測および細胞内局在性について分析した。ＳｉｇｎａｌＰ、ＰｓｏｒｔおよびＨｙｄｒｏｐａｔｈｙは、ＮＯＶ２ａが推定シグナルペプチドを含まないようであり、そしてＮｏｖ２ａは、０．４５００の確実性で細胞質中に局在している可能性があると結論付けた。
【００６６】
【表１１】
2004512821.tif 000012
本発明のＮＯＶ２ａタンパク質の全長アミノ酸配列は、ラット由来の４４アミノ酸残基のサイモシンβ−１０タンパク質（ｐｔｎｒ：ＰＩＲ−ＩＤ：Ａ２７２６６；Ｅ＝７．２ｅ−０９）に対して、４４アミノ酸残基中３３アミノ酸残基（７５％）同一であり、４４残基のうち３４アミノ酸残基（７７％）陽性であることが見出された（表２Ｃ）。全体的な配列相同性は７９％のアミノ酸の相同性および７７％のアミノ酸の同一性である。さらに、このタンパク質は、アミノ酸２〜４１位にサイモシンタンパク質ドメイン（Ｉｎｔｅｒｐｒｏ＃ＩＰＲ００１１５２により規定されるような）を含む。公的なアミノ酸データベースとしては、ＧｅｎＢａｎｋデータベース、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＤＢ、およびＰＩＲが挙げられる。
【００６７】
【表１２】
2004512821.tif 000013
（ＮＯＶ２ｂ）
本発明において、上述の同定された標的配列（登録番号ｂａ５１８ｋ１７＿Ａ）をエキソン連結プロセスに供し、配列を確認した。ＰＣＲプライマーを、正方向プライマーとして利用可能な最も上流の配列および逆方向プライマーとして利用可能な最も下流の配列で始まるように設計した。各々の場合、固有であるかまたは高度に選択的であるかのいずれかである適切な配列に遭遇するまで（逆方向プライマーの場合、終止コドンに到達するまで）、各末端からコードの配列の方に内向きにウォーキングさせ、配列を試験した。次いで、このような適切な配列を、広範なｃＤＮＡライブラリーに基づくＰＣＲ増幅において、正方向プライマーおよび逆方向プライマーとして用いた。得られたアンプリコンをゲル精製し、クローニングし、そして高重複性になるまで配列決定して、以下に報告する配列（登録番号ｂａ５１８ｋ１７＿Ａと命名した）を提供した。
【００６８】
開示される１４７ヌクレオチドのＮＯＶ２ｂ（５１８ｋ１７＿Ａ１とも呼ばれる）を、表２Ｄに示す。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド６〜８のＡＴＧ開始コドンで開始し、そしてヌクレオチド１３５〜１３７のＴＧＡコドンで終結することが判明した。開始コドンの上流および終止コドンの下流の推定の未翻訳領域は、表２Ｄにおいて下線で示され、そして開始コドンおよび終止コドンは、太字で示される。
【００６９】
【表１３】
2004512821.tif 000014
配列番号５によりコードされる開示されるＮＯＶ２ｂポリペプチド（配列番号６）は４３アミノ酸残基であり、そして表２Ｅにおいて１文字コードを用いて示される。ＮＯＶ２ｂタンパク質を、シグナルペプチド予測および細胞内局在性について分析した。ＳｉｇｎａｌＰ、ＰｓｏｒｔおよびＨｙｄｒｏｐａｔｈｙは、ＮＯＶ２ｂが推定シグナルペプチド含まないようであり、０．４５００の確実性で細胞質中に局在している可能性があると結論付けた。ＮＯＶ２ｂは、４９７９．７ダルトンの分子量を有する。
【００７０】
【表１４】
2004512821.tif 000015
ＮＯＶ２ｂのアミノ酸配列は、表２Ｆに示されるように他のタンパク質に対して高い相同性を有した。
【００７１】
【表１５】
2004512821.tif 000016
ＮＯＶ２ｂについて見出された可能性のあるＳＮＰを表２Ｇに列挙する。
【００７２】
【表１６】
2004512821.tif 000017
（Ｎｏｖ２ｃ）
本発明において、上述の同定された標的配列（登録番号ｂａ５１８ｋ１７＿Ａ）をエキソン連結プロセスに供し、配列を確認した。ＰＣＲプライマーを、正方向プライマーとして利用可能な最も上流の配列および逆方向プライマーとして利用可能な最も下流の配列で始まるように設計した。各々の場合、固有であるかまたは高度に選択的であるかのいずれかである適切な配列に遭遇するまで（逆方向プライマーの場合、終止コドンに到達するまで）、各末端からコードの配列の方に内向きにウォーキングさせ、配列を試験した。次いで、このような適切な配列を、広範なｃＤＮＡライブラリーに基づくＰＣＲ増幅において、正方向プライマーおよび逆方向プライマーとして用いた。得られたアンプリコンをゲル精製し、クローニングし、そして高重複性になるまで配列決定して、以下に報告する配列（登録番号５１８ｋ１７＿Ａと命名した）を提供した。
【００７３】
開示される１４７ヌクレオチドのＮＯＶ２ｃ核酸（５１８ｋ１７＿Ａとも呼ばれる）を、表２Ｈに示す。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド６〜８のＡＴＧ開始コドンで開始し、そしてヌクレオチド１３５〜１３７のＴＡＧコドンで終結することが判明した。開始コドンの上流および終止コドンの下流の推定の未翻訳領域は、表２Ｈにおいて下線で示され、そして開始コドンおよび終止コドンは、太字で示される。
【００７４】
【表１７】
2004512821.tif 000018
配列番号７によりコードされる開示されるＮＯＶ２ｃポリペプチド（配列番号８）は４３アミノ酸残基であり、そして表２Ｉにおいて１文字コードを用いて示される。ＮＯＶ２ｃタンパク質を、シグナルペプチド予測および細胞内局在性について分析した。ＳｉｇｎａｌＰ、ＰｓｏｒｔおよびＨｙｄｒｏｐａｔｈｙは、ＮＯＶ２ｃが推定シグナルペプチドを含まないようであり、そして０．４５００の確実性で細胞質中に局在している可能性があると結論付けた。ＮＯＶ２ｃは、４９７９．７ダルトンの分子量を有する。
【００７５】
【表１８】
2004512821.tif 000019
ＮＯＶ２ｃのアミノ酸配列は、表２Ｊにおいて示されるように他のタンパク質に対して高い相同性を有した。
【００７６】
【表１９】
2004512821.tif 000020
ＮＯＶ２ａ、２ｂ、および２ｃは、表２Ｋにおいて列挙されるアラインメントにおいて示されるように互いに関連する。
【００７７】
【表２０】
2004512821.tif 000021
ＮＯＶ２ａは、表２Ｌにおいて列挙されるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるアミノ酸配列に対して相同性を有することがまた見出された。
【００７８】
【表２１】
2004512821.tif 000022
これらの配列の相同性を、表２Ｍにおいて示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図解により示す。
【００７９】
【表２２】
2004512821.tif 000023
他のＢＬＡＳＴ結果は、Ｐａｔｐデータベース（特許および特許出願において公開された配列を含む独自のデータベース）由来の配列を含む。Ｐａｔｐ結果は、表２Ｎにおいて列挙される結果を含む。
【００８０】
【表２３】
2004512821.tif 000024
例えば、ｐａｔｐ：ＡＡＲ９６９３２、４３アミノ酸合成性サイモシンβ１０タンパク質（ＷＯ９６／１１０１６）に対するＢＬＡＳＴは、良好な同一性、Ｅ＝４．９ｅ−８を生じた。さらに、ｐａｔｐ：ＡＡＹ８０２６７、サイモシンβ４ペプチドアイソフォーム（Ｔβ１０）（ＷＯ００／０６１９０）、４３アミノ酸ポリペプチドに対するＢＬＡＳＴもまた、良好な同一性、Ｅ＝４．９ｅ−８を生じた。
【００８１】
サイモシンβ−４（Ｔβ−４）は、インビボおよびインビトロでの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性の発現を誘導し、マクロファージの移動を阻害し、そして視床下部黄体形成ホルモン放出ホルモンの分泌を刺激する。Ｃｌａｕｓｓら（１９９１）は、このタンパク質が、Ｔ細胞の分化を誘導し、いくつかの易感染性動物（ｉｍｍｕｎｏ−ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ　ａｎｉｍａｌ）において一部効果的である部分的に精製されたウシ胸腺抽出物（サイモシン画分５）から最初に単離されたことを記載した。さらなる研究は、このヌクレオチドが分析された全ての組織および細胞株において遍在していることを実証した。このヌクレオチドは、脾臓、胸腺、肺、および腹膜マクロファージにおいて高濃度で見出される。Ｌｉら（１９９６）は、Ｔβ−４が、非筋肉細胞におけるアクチン重合および脱重合の動態の調節において重要な役割を有し得るアクチンモノマー隔離タンパク質（ａｃｔｉｎ　ｍｏｎｏｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）であることを記載した。その調節の役割は、Ｔβ−４の転写調節および組織特異的発現の多くの例と一致する。リンパ球は、多くの他の組織および細胞において見出される遍在性のＴβ−４転写と比較して、固有のＴβ−４転写を有する。別の研究において、Ｃｌａｕｓｓら（１９９１）は、ラットＴβ−４は、４４アミノ酸プロペプチドとして合成され、第１メチオニン残基の除去により４３アミノ酸ペプチドにプロセシングされることおよびシグナルペプチドを有さないことを記載した。比較研究によって、ヒトＴβ−４がラットＴβ−４に対して高度の相同性を有すること；そのコード領域は９ヌクレオチドのみ異なり、これらは全て静的な塩基変化であることが示された。
【００８２】
Ｇｏｎｄｏら（１９８７）は、急性リンパ性白血病患者の白血球から調製されたｃＤＮＡライブラリーの示差的なスクリーニングを用いて、Ｔβ−４をコードするｃＤＮＡを単離した。ノザンブロット分析を用いて、彼らは、種々の原発性骨髄およびリンパ悪性細胞株および造血細胞株における８３０ヌクレオチドのＴβ−４　ｍＲＮＡの発現について研究した。Ｇｏｎｄｏら（１９８７）は、Ｔβ−４遺伝子発現のパターンが早期の宿主防御機構に関与し得ることを示唆することを記載した。
【００８３】
他の研究において、Ｃｌａｕｓｓら（１９９１）は、ヒトインターフェロン誘導性遺伝子６−２６（Ｆｒｉｅｄｍａｎら、１９８４）のｃＤＮＡクローンを単離し、そしてその配列がヒトＴβ−４の配列と同一であることを示した。ヒトげっ歯類体細胞ハイブリッドのパネルの使用により、Ｃｌａｕｓｓら（１９９１）は、６〜２６のｃＤＮＡが、７つの遺伝子（第１、２、４、９、１１、２０、およびＸ染色体上に存在する多遺伝子ファミリーのメンバー）を認識することを示した。これらの遺伝子はそれぞれＴＭＳＬ１、ＴＭＳＬ２などと表される。別に、Ｌｉら（１９９６）は、単一のＴｍｓｂ４遺伝子がマウスにおいて存在し、そしてリンパ特異的転写物が、選択的下流スプライシング部位を有する遍在性のエキソン１を伸長することにより生じることを確立した。種間戻し交配マッピング（ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｂａｃｋｃｒｏｓｓ　ｍａｐｐｉｎｇ）により、彼らは、このマウス遺伝子（彼らはＰｔｍｂ４と表わしている）をマウスＸ染色体の、ＢｔｋおよびＧｊａに連結した遠位領域に位置決めした。従って、このヒト遺伝子は、ＢＴＫが位置するＸ染色体上のＸｑ２１．３〜ｑ２２の一般的な領域に存在することが予測され得る。体細胞ハイブリッドの分析により、ＬａｈｎおよびＰａｇｅ（１９９７）は、Ｔβ４またはＴＢ４Ｘ遺伝子をＸ染色体にマッピングした。彼らは、相同な遺伝子ＴＢ４ＹがＹ染色体上に存在することを記載した。
【００８４】
Ｂａｏら（１９９６）は、転移性前立腺癌細胞株において発現されるβサイモシンタンパク質ファミリーの新規メンバーを発見した。前立腺癌は、男性における最も一般的な形態の癌であり、男性老人間の癌による死亡の２番目の原因である。血清前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）試験の使用は、ヒト前立腺癌の早期の検出を可能にするが；早期の検出は、どの腫瘍が転移段階に進行し得るか決定する際の改善によっては達成されなかった。腫瘍転移のプロセスは、細胞外マトリクスの局所的な浸潤および破壊；血管、リンパ管、または他の輸送チャネルへの血管内侵入；循環中の生存性；血管から第２の部位への血管外浸出；および新たな場所での増殖が関連する多段階現象である。腫瘍細胞の運動性に対する要求は、転移プロセスの多くの構成要素に共通する。変化する転移可能性を示す十分に特徴付けられた一連の細胞株は、Ｄｕｎｎｉｎｇラット前立腺癌から生じた。Ｍｏｈｌｅｒら（１９８８）およびＰａｒｔｉｎら（１９８９）は、Ｄｕｎｎｉｎｇ細胞株における細胞移動と転移可能性との間の直接的な相関を示した。Ｄｕｎｎｉｎｇラット前立腺癌由来の乏しい運動性および高い運動性の転移細胞株における遺伝子発現の比較研究において、ディファレンシャルｍＲＮＡディスプレイを用いてＢａｏら（１９９６）は、アクチン結合分子のβサイモシンファミリーの新規メンバー（これをサイモシンβ−１５（Ｔβ−１５）と命名した）を発見し、これは、前立腺細胞における移動度を直接的に調節解除することが見出された。さらに、これは、進化した（ａｄｖａｎｃｅｄ）ヒト前立腺癌試料において発現されたが、正常なヒト前立腺または良性の前立腺過形成において発現されなかった。このことは、前立腺癌の進行についての新規マーカーとしてのその潜在的な用途を示唆する。Ｂａｏら（１９９６）はまた、Ｔβ−１５レベルが、Ｇｌｅａｓｏｎ腫瘍等級とポジティブに相関することを見出した。Ｃｏｆｆｅｙ（１９９６）は、Ｔβ−１５の陽性移動因子（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｍｏｔｉｌｉｔｙ　ｆａｃｔｏｒ）としてのアップレギュレーションおよび移動度サプレッサーＫＡＩ１のダウンレギュレーションが、転移についての「陰陽（ｙｉｎ　ａｎｄ　ｙａｎｇ）」を提供することを指し示し；従って、彼は、これらの経路は、治療のための新規標的を提供し得ることを推測した。
【００８５】
Ｔβ−４はまた、創傷治癒の加速に関連する。新脈管形成は、損傷後に生じる修復プロセスにおける必須工程である。本発明者らの研究において、本発明者らは、脈管形成性の胸腺ペプチドＴβ−４がラットの完全な厚さの創傷モデルにおいて創傷治癒を増強するか否かを調査した。Ｔβ−４の局所的または腹腔内添加は、４ｄで生理食塩水コントロールよりも再上皮形成を４２％増加させ、そして創傷後７ｄで６１％増加させた。処置した創傷はまた、７日間でコントロールよりも少なくとも１１％多く縮小した。増加したコラーゲン堆積および新脈管形成を、処置した創傷において観察した。本発明者らはまた、Ｔβ−４がＢｏｙｄｅｎチャンバーアッセイにおいてケラチノサイト移動を刺激することを見出した。４〜５時間後、移動は、１０ｐｇ程度の少ないＴβ−４をこのアッセイに添加した場合、培地のみを用いた移動よりも２〜３倍刺激された。これらの結果は、Ｔβ−４は臨床において有用であり得る複数の活性を有する強力な創傷治癒因子であることを示唆する。
【００８６】
本発明についての上記の規定された情報は、このβサイモシン様タンパク質が、「βサイモシンファミリー」のメンバーとして機能し得ることを示唆する。従って、本明細書中で同定される新規の核酸およびタンパク質は、以下に示す種々の病理および障害に関係する（しかしこれらに限定されない）潜在的な治療適用において有用であり得る。本発明についての潜在的な治療適用として以下が挙げられるがこれらに限定されない：タンパク質治療剤、低分子薬物標的、抗体標的（治療抗体、診断抗体、薬物標的／細胞傷害性抗体）、診断マーカーおよび／または予測マーカー、遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子除去）、検索ツール、本明細書で規定される組織および細胞型を構成する（しかしこれらに限定されない）全ての組織および細胞型のインビトロおよびインビボ組織再生。
【００８７】
本発明の核酸およびタンパク質は、以下を含むがこれらに限定されない癌に関連する潜在的な治療適用において有用である：前立腺癌、免疫学的障害および自己免疫障害（すなわち、甲状腺機能亢進）、新脈管形成および創傷治癒、アポトーシスの調節、神経変性障害および神経精神医学的障害、加齢関連障害、および他の病理学的障害（脾臓、胸腺、肺、および腹膜マクロファージ、ならびに／または他の病理および障害を含む）。例えば、βサイモシン様タンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり得、そしてβサイモシン様タンパク質は、それを必要とする被験体に投与される場合に有用であり得る。非限定的な例において、本発明の組成物は、以下を含むがこれらに限定されない癌に罹患した患者の処置に対する効果を有する：前立腺癌、免疫学的障害および自己免疫障害（すなわち、甲状腺機能亢進）、新脈管形成および創傷治癒、アポトーシスの調節、神経変性障害および神経精神医学的障害、加齢関連障害、および他の病理学的障害（脾臓、胸腺、肺、および腹膜マクロファージを含む）。本発明のβサイモシン様タンパク質をコードする新規核酸およびβサイモシン様タンパク質またはそれらのフラグメントはさらに、診断適用（これにより、核酸またはタンパク質の存在または量が評価される）において有用であり得る。これらの物質はさらに、治療または診断方法における使用のために、本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体を作製するのに有用である。
【００８８】
本発明のβサイモシン様タンパク質をコードする新規核酸またはそれらのフラグメントはさらに、診断適用（これにより、核酸またはタンパク質の存在または量が評価される）において有用であり得る。これらの物質はさらに、治療または診断方法における使用のために、本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体を作製するのに有用である。これらの抗体は、当該分野で公知の方法に従って（以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるような疎水性チャートからの予測を用いて）作製され得る。開示されるＮＯＶ２タンパク質は、複数の親水性領域を有し、各々が免疫原として用いられ得る。これらの新規タンパク質はまた、種々のヒト障害の機能分析のためのアッセイシステムにおいて有用であり得、疾患の病理の理解および種々の障害のための新規薬物標的の開発において役立つ。
【００８９】
（ＮＯＶ３）
ＭＯＶ３は、以下に開示される２つの新規のコネキシン様タンパク質を含む。開示されるタンパク質は、ＮＯＶ３ａおよびＮＯＶ３ｂと命名された。
【００９０】
（ＮＯＶ３ａ）
新規核酸が、コネキシンまたはホモログに関するＣｕｒａＧｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの配列ファイルを使用したＴｂｌａｓｔＮによって、およびＧｅｎＢａｎｋによって利用可能にされたＧｅｎｏｍｉｃ　Ｄａｉｌｙ　Ｆｉｌｅｓに対する実行によって、または個々のシーケンシングセンターからダウンロードされたファイルから、第６染色体上で同定された。この核酸配列を、既知のコネキシンまたはホモログに対する相同性により、ゲノムファイルシーケンシングセンター登録番号：ｂａ６３ｋ６＿Ａから予測した。エキソンを相同性により予測し、そしてイントロン／エキソンの境界を標準的な遺伝的ルールを用いて決定した。エキソンをさらに選択し、そして複数のＢＬＡＳＴ（例えば、ｔＢｌａｓｔＮ、ＢｌａｓｔＸ、およびＢｌａｓｔＮ）検索、ならびにいくつかの場合、ＧｅｎｅＳｃａｎおよびＧｒａｉｌを用いた相同性決定により洗練した。公的なデータベースおよび独自のデータベースの両方から表現された配列を加えて（利用可能な場合）、遺伝子配列をさらに規定し完成させた。次いで、このＤＮＡ配列を、明らかな不一致に関して手動で補正し、これによって、全長タンパク質をコードする配列を得た。
【００９１】
新規コネキシン様タンパク質をコードする１７５０ヌクレオチドの新規核酸（ＧＭ＿ｂａ６３ｋ６＿Ａとも呼ばれる）を、表３Ａに示す。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド５５〜５７のＡＴＧ開始コドンで開始し、そしてヌクレオチド１６８４〜１６８６のＴＡＧコドンで終結することが判明した。開始コドンの上流および終止コドンの下流の推定の未翻訳領域は、表３Ａにおいて下線で示され、そして開始コドンおよび終止コドンは、太字で示される。
【００９２】
【表２４】
2004512821.tif 000025
公的な配列データベースの検索において、例えば、開示されるＮＯＶ３ａ核酸配列は、Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓコネキシンｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＪ０１０７４１）に対して１５１４塩基中１２７４塩基（８４％）の同一性を有することを見出した（Ｅ＝４．７ｅ−２４５）。この核酸はまた、１３０８ｂｐヒトギャップ連結タンパク質α（ＧＪＡ３）遺伝子（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ０７５２９０│ａｃｃ：ＡＦ０７５２９０）に対して３３５塩基中２２６塩基（６７％）の同一性を有する（Ｅ＝３．１ｅ−３６）。公的なヌクレオチドデータベースは、全てのＧｅｎＢａｎｋデータベースおよびＧｅｎｅＳｅｑ特許データベースを含む。
【００９３】
配列番号９によりコードされる開示されるＮＯＶ３ａポリペプチド（配列番号１０）は５４３アミノ酸残基であり、そして表３Ｂにおいて１文字コードを用いて示される。ＮＯＶ３ａタンパク質を、シグナルペプチド予測および細胞内局在性について分析した。ＳｉｇｎａｌＰ、ＰｓｏｒｔおよびＨｙｄｒｏｐａｔｈｙ結果は、ＮＯＶ３ａがシグナルペプチドを有し（ＶＡＡ−ＥＤにおける４１位および４２位の開裂部位ｐｏｓが最も可能性が高い）、そしてＮＯＶ３ａは、０．６０００の確実性で細胞質中に局在している可能性があると予測した。
【００９４】
【表２５】
2004512821.tif 000026
ＢＬＡＳＴＸ検索を、公的なタンパク質データベースに対して実施した。本発明のタンパク質の全長アミノ酸配列は、Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ由来の５０５アミノ酸残基コネキシンタンパク質（ｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９ＷＵＳ４；Ｅ＝２．９ｅ−２１１）に対して４８５アミノ酸残基中３９３アミノ酸残基（８１％）の同一性、４８５残基のうち４２２アミノ酸残基（８７％）の陽性を有することが見出された。このタンパク質はまた、４３５残基のヒトギャップ連結タンパク質（コネキシン）（ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９Ｙ６Ｈ８；Ｅ＝２．８ｅ−７１）に対して２５８アミノ酸残基中１３８アミノ酸残基（５３％）の同一性、２５８残基のうち１８８アミノ酸残基（７２％）の陽性を有する。全体的な配列相同性（このタンパク質の全長配列を有するＧＡＰグローバルシーケンスアラインメントにより規定されるように）は、８４％のアミノ酸相同性および８１％のアミノ酸同一性である。さらに、このタンパク質は、１〜２３３位のアミノ酸において、コネキシン（ＩＰＲ０００５００）タンパク質ドメイン（Ｉｎｔｅｒｐｒｏにより規定されるような）を含む。
【００９５】
【表２６】
2004512821.tif 000027
（Ｎｏｖ３ｂ）
本発明において、以前に同定された標的配列（登録番号ＧＭｂａ６３ｋ６＿Ａ）をエキソン連結プロセスに供し、配列を確認した。ＰＣＲプライマーを、正方向プライマーとして利用可能な最も上流の配列および逆方向プライマーとして利用可能な最も下流の配列で始まるように設計した。各々の場合、固有であるかまたは高度に選択的であるかのいずれかである適切な配列に遭遇するまで（逆方向プライマーの場合、終止コドンに到達するまで）、各末端からコードの配列の方に内向きにウォーキングさせ、配列を試験した。このようなプライマーを、全長ｃＤＮＡ、このＤＮＡの一部（１つ以上のエキソン）または標的配列のタンパク質配列についてのインシリコでの予測に基づき、もしくは他の種由来の緊密に関連するヒト配列に対する予測されたエキソンの翻訳された相同性により設計した。次いでこれらのプライマーを、以下のヒトｃＤＮＡのプールに基づくＰＣＲ増幅において使用した：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全脳、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮。通常、得られたアンプリコンをゲル精製し、クローニングし、そして高重複性になるまで配列決定した。全てのクローンから得られた配列を、それ自体を用い、ＣｕｒａＧｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのデータベースにおける他のフラグメントおよび公開されたＥＳＴを用いて構築した。アセンブリの別の成分とのそれらの同一性の程度が、５０ｂｐにわたって少なくとも９５％である場合、フラグメントおよびＥＳＴは、このアセンブリの成分として含まれた。さらに、この配列トレースを手動で評価し、そして適切な場合は補正のために編集した。これらの手順は、登録番号ＣＧ５４７３４−０２と命名された、以下に報告する配列を提供する。
【００９６】
開示される１６４１ヌクレオチドのＮＯＶ３ｂ（ＣＧ５４７３４−０２とも呼ばれる）核酸を、表３Ｄに示す。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド５〜７のＡＴＧ開始コドンで開始し、そしてヌクレオチド１６３４〜１６３６のＴＡＡコドンで終結することが判明した。開始コドンの上流および終止コドンの下流の推定の未翻訳領域は、表３Ｄにおいて下線で示され、そして開始コドンおよび終止コドンは、太字で示される。
【００９７】
【表２７】
2004512821.tif 000028
公的な配列データベースの検索において、例えば、開示されたＮＯＶ３ｂ核酸配列が、Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓコネキシン５７ｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＪ０１０７４１．１）（Ｅ＝１．７ｅ−２３９）に、１４６７塩基のうちの１２３９塩基（８４％）の同一性を有することが見出された。公的なヌクレオチドデータベースとしては、ＧｅｎＢａｎｋデータベースおよびＧｅｎｅＳｅｑパテントデータベースが挙げられる。
【００９８】
配列番号１１によってコードされる、開示されたＮＯＶ３ｂポリペプチド（配列番号１２）は、５４３のアミノ酸残基であり、そして表３Ｅに１文字コードを使用して示される。ＮＯＶ３ｂタンパク質を、シグナルペプチドの予測および細胞の局在化について解析した。ＳｉｇｎａｌＰ、ＰｓｏｒｔおよびＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＶＡＡ−ＥＤの最も有望な切断部位である４１位および４２位を含むシグナルペプチドを有し、そしてＮＯＶ３ｂが、０．６０００の確実性で細胞質膜中に局在するらしいことを予測する。
【００９９】
【表２８】
2004512821.tif 000029
本発明のタンパク質の完全なアミノ酸配列が、Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ由来の５０５アミノ酸残基コネキシン５７タンパク質（ｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬＡＣＣ：Ｑ９ＷＵＳ４）（Ｅ＝１．１ｅ−２１１）に対して４８５アミノ酸残基のうちの３９２残基（８０％）の同一性、そして４８５アミノ酸残基のうち４２２アミノ酸残基（８７％）の類似性を有することが見出された。
【０１００】
ＮＯＶ３ｂについて見出される、可能性のあるＮＯＶ３ｂが、表３Ｆに列挙される。
【０１０１】
【表２９】
2004512821.tif 000030
ＮＯＶ３ａはまた、表３Ｇに列挙されたＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対して相同性を有することが見出された。
【０１０２】
【表３０】
2004512821.tif 000031
これらの配列の相同性は、表３Ｈに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ解析において図示される。
【０１０３】
【表３１】
2004512821.tif 000032
2004512821.tif 000033
上に示される相同性は、ＮＯＶ３ｂおよびＮＯＶ３ａが相同である範囲で、ＮＯＶ３ｂによって共有される。
【０１０４】
表３Ｉおよび３Ｊは、ＮＯＶ３ａに対するＤＯＭＡＩＮ解析の結果から、ドメインの説明を列挙する。これは、ＮＯＶ３ａ配列が、このドメインが含まれていることが公知の他のタンパク質に類似の性質を有することを示す。
【０１０５】
【表３２】
2004512821.tif 000034
【０１０６】
【表３３】
2004512821.tif 000035
コネキシンは、必須膜タンパク質のファミリーであり、オリゴマー化（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｓｅ）して、ギャップ結合でクラスター化される細胞間チャネルを形成する。これらのチャネルは、イオン、細胞内代謝物およびメッセンジャー分子（１〜２ｋＤの分子量を有する）が、１つの細胞の細胞質からその細胞に並んで隣接している細胞へ通過することを可能にする、特殊化した細胞と細胞の接触部位である。これらのチャネルは、ほとんど全ての脊椎動物細胞型で見出され、いくぶん類似したタンパク質が、植物種からクローニングされている。無脊椎動物は、異なる分子ファミリーである、イネキシン（これは、脊椎動物のコネキシンに類似の推定二次構造を共有するが、コネキシンに対して配列の同一性を有しない）を利用する。
【０１０７】
脊椎動物のギャップ結合チャネルは、多様な生物学的機能に関与すると考えられる。例えば、心臓において、脊椎動物のギャップ結合は、作用電位の迅速な細胞−細胞輸送を可能にし、心筋細胞の協調的収縮を確実にする。これらはまた、特殊化された「電気的（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ）」シナプスでの神経伝達に担う。非興奮性の組織（例えば、肝臓）において、細胞間の代謝的協調を可能にし得る。脳において、ギャップ結合は、神経膠細胞を広範に結合させる；このことは、細胞内Ｃａ２＋の波が神経組織全体に伝播することを可能にし、そして細胞外Ｋ＋濃度の局所的変化を空間的に緩衝化するこれらの能力に寄与し得る。
【０１０８】
コネキシンタンパク質のファミリーは、げっ歯類において、少なくとも１３の遺伝子によってコードされ、多くのホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）が、他の種からクローニングされている。コネキシンタンパク質のファミリーは、重複する組織発現パターンを示し、ほとんどの組織は、１より多くのコネキシン型を発現する。これらコネキシンの伝導性、異なる分子への透過性、リン酸化、およびコネキシンのゲート開閉（ｇａｔｉｎｇ）の電位依存性は、変化することが見出されている。可能な連絡の多様性は、ギャップ結合が、並んでいる細胞由来の異なるコネキシンアイソフォームの結合によって形成され得るという事実によって、さらに増加する。しかし、インビトロでの研究は、コネキシンの可能な組合せ全てが、活性なチャネルを生じるわけではないことを示した。
【０１０９】
ヒドロパシー（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）分析は、クローン化された全てのコネキシンが、共通の膜貫通（ＴＭ）トポロジーを共有することを予測する。各コネキシンは、２つの細胞外領域および３つの細胞質領域を有する４ＴＭドメインを含むと考えられる。このモデルは、これらのファミリーメンバーのうちの７つについてインビトロでの生化学的分析により確かめられた。Ｎ末端およびＣ末端の両方が、細胞質に面し、そして第３のＴＭドメインが両親媒性の性質を有していると考えられ、このことは、形成されたチャネルの整列に寄与することを示唆している。アイソフォーム間のアミノ酸配列の同一性は、約５０〜８０％であり、ＴＭドメインは十分に保存されている。両方の細胞外ループは、特徴的に保存されたシステイン残基を含み、このシステイン残基が、分子間ジスルフィド結合を形成するらしい。対照的に、単一の推定細胞内ループ（ＴＭドメイン２と３の間の）および細胞質のＣ末端は、これらのファミリーメンバー間で非常に可変性である。６つのコネキシンが、結合してヘミチャネル（ｈｅｍｉ−ｃｈａｎｎｅｌ）、またはコネキソンを形成すると考えられる。次に、２つのコネキソンが、（おそらくこれらコネキシンの細胞外ループを介して）相互作用して完全なギャップ結合チャネルを形成する。
【０１１０】
ギャップ結合は、接触している接着細胞の細胞質膜上に領域的に特殊化された構造であるとして、電子顕微鏡によって最初に特徴付けられた。これらの構造は、細胞と細胞のチャネルからなることが示された。コネキシンタンパク質は、異なる組織によって異なる富化されたギャップ結合画分から精製される。これらのコネキシンは、その分子量によって区別される。別の命名システムは、ヌクレオチドレベルおよびアミノ酸レベルでの配列類似性に従って、ギャップ結合タンパク質を２つのカテゴリー（αおよびβ）に分けている。例えば、ＣＸ４３は、α−１ギャップ結合タンパク質と命名されているが、ＣＸ３２およびＣＸ２６は、それぞれ、β−１ギャップ結合タンパク質およびβ−２ギャップ結合タンパク質と呼ばれている。この命名法は、ＣＸ３２およびＣＸ２６のいずれかがＣＸ４３に対して相同であるよりも、ＣＸ３２およびＣＸ２６は、お互いに対してより相同であることを強調する。
【０１１１】
Ｗｉｌｅｃｋｅら（１９９０）は、ヒト−マウス体細胞ハイブリッドのサザンブロッド分析にラットコネキシン遺伝子プローブを使用して、第１３染色体のＣＸ２６遺伝子をマッピングした。体細胞ハイブリッドにより、Ｈｓｉｅｈら（１９９１）は、ヒト第１３染色体およびマウスの第１４染色体にＧＪＢ２遺伝子を配置した。Ｈａｅｆｌｉｇｅｒら（１９９２）は、ＣＸ２６遺伝子およびＣＸ４６遺伝子のラットホモログが、第１４染色体上に強く連鎖していることを示した。同位体のインサイチュハイブリダイゼーションによって、Ｍｉｇｎｏｎら（１９９６）は、ＧＪＢ２を１３ｑ１１〜ｑ１２にマッピングし、そしてマウス第１４染色体への配置を確認した。
【０１１２】
種々の研究は、コネキシンファミリー由来の変化した遺伝子またはタンパク質の役割を調査するために実施された。Ｋｅｌｓｅｌｌら（１９９７）は、常染色体優性難聴を有する個体を含む家系図を研究し、そしてＣＸ２６遺伝子の変異（ｍｅｔ３４からｔｈｒへのアミノ酸置換を生じる１０１ＴのＣへの塩基転移）を同定した。成熟前停止コドンを生じるＣＸ２６の変異もまた、第３常染色体劣性非症候性感音難聴（３ａｕｔｏｓｏｍａｌ　ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ　ｎｏｎｓｙｎｄｒｏｍｉｃ　ｓｅｎｓｏｒｉｎｅｕｒａｌ　ｄｅａｆｎｅｓｓ）の家系図に見出され、一般的にＣＸ２６遺伝子が局在化している１３ｑ１１〜ｑ１２に遺伝的に連鎖している。ヒト蝸牛細胞のＣＸ２６についての免疫組織化学的染色は、高レベルでの発現を実証した。Ｋｅｌｌｙら（１９９８）は、常染色体優性非症候性難聴を有する個体において、Ｋｅｌｌｅｙら（１９９８）により同定された１０１ＴのＣへのミスセンス変異が、聴力消失を引き起こすのに十分ではないという証拠を示した。
【０１１３】
Ｃａｒｒａｓｑｕｉｌｌｏら（１９９７）は、５０よりも多い非症候性劣性難聴を有する個体を含む、単一のＩｓｒｅａｌｉ−Ａｒａｂ　ｖｉｌｌａｇｅにおいて相互に関係ある２つの血族家系の連鎖解析を実施した。遺伝的マッピングは、１３ｑ１１に局在する遺伝子が、これらの２つの家系と共に分離すること（ＤＦＮＢ１）を実証した。１３ｑ１１の１５ｃＭにわたる８つのマイクロサテライトマーカーを使用するハプロタイプ分析は、この拡大された家系における２つの異なる変異の分離を示唆し、影響された個体が、ハプロタイプまたは合成異型接合体のいずれかについて、ホモ接合体であることを示唆した。Ｃａｒｒａｓｑｕｉｌｌｏら（１９９７）は、ＣＸ２６遺伝子における２つの別個の変異（ＣＸ２６遺伝子におけるｔｒｐ７７のａｒｇへの変異および３５ｄｅｌＧ（この両方がコネキシン２６を不活化することが予測された））を同定した。１３ｑ１１の多型性を含むマーカー対立遺伝子の、変異から既知のマップ距離での組換えは、３〜５世代の変異齢（７５〜１２５年）を推定することを可能にする。この研究は、異系交配の大きな集団と比較して、高い割合の血族を有する小さな集団において、劣性変異が、非常に新しい起源を有し得、そして対立遺伝子の多様性を示し得ることを実証した。彼らは、３つの固有の変異を有するフルラー症候群および５つの別個の変異を有する異染性白質萎縮症（イスラエルのＤｒｕｚｅおよびＭｕｓｌｉｍ　Ａｒａｂ　ｖｉｌｌａｇｅの間で発見された）について観察される同じ現象を指摘した。これらの知見の観点において、著者らは、高度に同系交配された共同社会のホモ接合性マッピング研究は、この研究が変異の多様性の可能性を考慮しない限り、連鎖不均衡によるマッピング研究であり得る場合に、損われ得る可能性があることを論評した。
【０１１４】
Ｌｅｎｃｈら（１９９８）は、別個に生じる（散発的な）非症候性感音難聴の場合におけるＣＸ２６変異の役割を研究した。このような変異は、４３人の英国人患者のうちの４人で、そして２５人のベルギー人患者のうちの２人で同定された。従って、この疾患に散発的に罹患した小児を示すファミリーの約１０％は、決定的なメンデルの再発危険性を提供し得る。これは、このような小児をスクリーニングするために利用可能な最初の遺伝的テストと言われた。
【０１１５】
Ｋｅｌｌｅｙら（１９９８）は、常染色体劣性非症候性難聴と診断された少なくとも２人の罹患した小児を、それぞれ有する５８の多発性ファミリーを解析した。ＧＪＢ２の両方の対立遺伝子における変異は、５８のファミリーのうち２０のファミリーで観察された。３０ｄｅｌＧ対立遺伝子は、１１６の染色体のうちの３３の染色体（０．２８４の頻度）で生じた。この変異は、１９２のコントロール染色体のうちの２の染色体（０．０１＋／−０．００７の推定遺伝子頻度）で観察された。次に、３０ｄｅｌＧ対立遺伝子のホモ接合の頻度は、０．０００１（すなわち、１／１０，０００）で、推定された。全ての小児期聴覚障害の頻度が１／１，０００であること、およびその半分が遺伝性であることを考慮すると、特定の変異３０ｄｅｌＧが、小児期聴覚消失の１０％に、そして全ての小児期遺伝的聴覚消失の２０％の原因である。６つの新規な変異もまた、罹患した集団で観察された。
【０１１６】
より最近の研究において、Ｍｕｒｇｉａら（１９９９）は、非症候性感音聴覚障害を有する５３人の関係のない個体を研究し、そしてＣＸ２６の変異解析を実施した。変異が、５３％の場合において、常染色体劣性遺伝がありそうだと考えられる場合の３５．０％において、そして推定された散発性の場合の６０％において見出された。３つの新規な変異が見出された。聴覚欠損は、同じファミリー内でさえ、軽度な聴覚欠損から顕著な聴覚欠損まで変化した。顕著な聴覚欠損を有する患者のうち、３５．５％；重篤な聴覚障害のうち、２０％；そして中程度の聴覚障害のうち、３５．３％が、変異を有することが見出された。Ｒａｂｉｏｎｅｔら（２０００）は、イタリア人およびスペイン人の劣性難聴または散発性難聴を有する５７６のファミリー／関係のない患者のＧＪＢ２遺伝子を解析した。これらのうち、１９３は常染色体劣性であると言われ、そして他の３８３は、明らかに散発性と言われる。１，１５２の関係のないＧＪＢ染色体の３７％が、ＧＪＢ２変異を有した。全部で２３の異なる変異が、検出された。変異３５ｄｅｌＧは、最も一般的であり、ＧＪＢ２難聴対立遺伝子の８２％を占める。これは、イタリア人患者の対立遺伝子の８８％に相当し、そしてスペイン人の場合では５５％のみに相当した。Ｓｏｂｅら（２０００）は、イスラエルの７５人の難聴小児および成人におけるＧＪＢ２遺伝子の全てのコード領域を配列決定した。スクリーニングされた集団における発症年齢は、言語習得前および言語習得後の両方であり、中程度から顕著な範囲の難聴を有した。試験したすべて人のほぼ３９％が、ＧＪＢ２変異を保有し、その変異のほとんどが、３５ｄｅｌＧおよび１６７ｄｅｌＴであった。欠失および挿入の両方を含む新規な変異（５１ｄｅｌ２ｉｎｓＡ）が、ウズベキスタン人を起源とするファミリーにおいて同定された。全てのＧＪＢ２変異は、言語習得前聴覚消失に関連するが、重篤度は、中程度から顕著なものまでであり、聴覚障害の同胞間でさえ可変性を有する。３５ｄｅｌＧ変異と１６７ｄｅｌＴ変異を有する個体間で、聴力レベルにおける有意な差異は見出されなかった。
【０１１７】
上に規定にされた本発明の情報は、これらのコネキシン様タンパク質（ＮＯＶ３ａおよびＮＯＶ３ｂ）が、「コネキシンファミリー」のメンバーとして機能し得ることを示唆する。従って、本明細書中で同定された新規の核酸およびタンパク質は、以下に示される種々の病因および疾患に関連する（が、限定ではない）潜在的な治療的適用に有用であり得る。本発明の潜在的な治療的適用として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：タンパク質治療剤、低分子薬物標的、抗体標的（治療的、診断的、薬物標的化／細胞毒性抗体）、診断的および／もしくは予後診断的マーカー、遺伝子治療（遺伝子多様性／遺伝子切断）、検索ツール、本明細書中で規定されたものを含む（が、これらに限定されない）全ての組織型ならびに細胞型のインビボおよびインビトロでの組織再生。
【０１１８】
本明細書中の核酸およびタンパク質は、断節性掌蹠角皮症（ＰＰＫ）、Ｘ連鎖シャルコー−マリー−ツースニューロパシー、遺伝性末梢ニューロパシー、遺伝性非症候性感音難聴、フォーヴィンケル症候群（過角化によって特徴付けられる常染色体優性疾患）、手指および足指の収縮（ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｏｎ　ｆｉｎｇｅｒ　ａｎｄ　ｔｏｅｓ）、先天性難聴、ならびに他の病因および障害に関連した潜在的治療適用において有用である。例えば、コネキシン様タンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に有用であり得、そしてコネキシン様タンパク質は、このタンパク質が必要な被験体に投与される場合に有用であり得る。非限定的な例として、本発明の組成物は、クラウストン症候群（Ｃｌｏｕｓｔｏｎ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）および難聴、断節性掌蹠角皮症（ＰＰＫ）、Ｘ連鎖シャルコー−マリー−ツースニューロパシー、遺伝性末梢ニューロパシーに罹患する患者の治療に対して有効性を有する。コネキシン様タンパク質をコードする新規な核酸、および本発明のコネキシン様タンパク質、またはそのフラグメントは、診断的適用にさらに有用であり得、ここでこの核酸またはタンパク質の存在もしくはその量が、評価される。これらの材料は、治療的方法または診断的方法に使用するための本発明の新規な物質と免疫特異的に結合する抗体の作製にさらに有用である。
【０１１９】
本発明のコネキシン様タンパク質をコードする新規な核酸、またはそのフラグメントは、診断的適用にさらに有用であり得、ここでこの核酸またはこのタンパク質の存在もしくはその量が評価される。これらの材料は、治療的方法または診断的方法に使用するための本発明の新規な物質と免疫特異的に結合する抗体の作製にさらに有用である。これらの抗体は、疎水性チャートからの予測を使用する、当該分野で公知の方法に従って作製され得る（以下の節「抗ＮＯＶＸ抗体」に記載される）。開示されたＮＯＶ３タンパク質は、複数の親水性領域を有し、各親水性領域の各々が、免疫原として使用され得る。１つの実施形態において、意図されたＮＯＶ３エピトープは、約４０〜７０のアミノ酸である。別の実施形態において、ＮＯＶ３エピトープは、約８５〜１４５のアミノ酸である。さらなる実施形態において、ＮＯＶ３エピトープは、約１７５〜２００、２２５〜２７０、２８０〜４８０のアミノ酸、そして約５１０〜５３０のアミノ酸である。これらの新規のタンパク質は、種々のヒト障害の機能分析のためのアッセイ系で有用であり得、このことは、疾患の病因の理解および種々の障害に関する新規薬物標的の開発に役立つ。
【０１２０】
（ＮＯＶ４）
ＮＯＶ４は、４つの新規な肝細胞由来増殖因子様タンパク質（以下に開示する）を含む。開示されたこのタンパク質は、ＮＯＶ４ａ、ＮＯＶ４ｂ、ＮＯＶ４ｃおよびＮＯＶ４ｄと名づけられた。
【０１２１】
（ＮＯＶ４ａ）
新規な肝細胞由来増殖因子様タンパク質をコードする２０３１個のヌクレオチドを有する新規核酸（８５７３１８０８　ＥＸＴとも呼ばれる）は、図４Ａに示される。ヌクレオチド１〜３のＡＴＧ開始コドンで開始し、そしてヌクレオチド２０２９〜２０３１のＴＧＡコドンで停止するオープンリーディングフレームが、同定された。開始コドンおよび停止コドンは、図４Ａにおいて太字である。
【０１２２】
【表３４】
2004512821.tif 000036
公的な配列データベースの検索において、例えば、この核酸配列が、Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ肝細胞由来増殖因子様タンパク質ｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：Ｄ６３８５０）（Ｅ＝２．５ｅ−１７４）に、１７７５塩基のうちの１２６８塩基（７１％）の同一性を有することが見出された。これはまた、別個ではあるが、部分的に重複している同一遺伝子のフラグメントに３６４ｂｐにわたって７０％類似である。
【０１２３】
配列番号１３によってコードされる、ＮＯＶ４ａポリペプチド（配列番号１４）は、６７６のアミノ酸残基であり、そして表４Ｂに１文字アミノ酸コードを使用して示される。ＮＯＶ４ａタンパク質を、シグナルペプチドの予測および細胞の局在化について解析した。ＳｉｇｎａｌＰ、ＰｓｏｒｔおよびＨｙｄｒｏｐａｔｈｙのプロフィールは、ＮＯＶ４ａがシグナルペプチドを有さず、そして０．９８６６の確実性で核に局在するらしいことを示す。しかし、本明細書で予測されるタンパク質は、「肝細胞由来増殖因子様タンパク質ファミリー」に類似であり、このファミリーのいくつかのメンバーは、最終的に細胞外に存在し、そして増殖因子活性を示す。従って、ＮＯＶ４ａは、適切な細胞下の局在において利用可能であり、故に本明細書に記載される治療的使用に利用可能である。
【０１２４】
【表３５】
2004512821.tif 000037
肝細胞由来増殖因子様タンパク質（ＮＯＶ４ａ）を第１９染色体に対してマッピングし、そして少なくとも以下の組織で発現される：肺、血液、リンパ球、骨髄、結腸、脳、膵臓、下垂体、精巣、卵巣、前立腺、および子宮。
【０１２５】
ＮＯＶ４ａタンパク質の完全なアミノ酸配列が、Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ由来の６６９アミノ酸残基肝細胞由来増殖因子様タンパク質（ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ３５５４０；Ｅ＝１．３ｅ−２８４）（表４Ｃ）に対して６７６アミノ酸残基のうちの５８４残基（８１％）の同一性、そして６７６アミノ酸残基のうち６０１アミノ酸残基（８８％）の類似性を有することが見出された。
【０１２６】
【表３６】
2004512821.tif 000038
ＮＯＶ４ａならびに４ｂ、４ｃおよび４ｄ配列は、最初、肝細胞由来増殖因子様タンパク質に類似性を有するタンパク質に翻訳されるＤＮＡ配列に関する独自の配列ファイルデータベースを検索することによって同定された。ＮＯＶ４ａは、適切な類似性を有するように同定された。ＮＯＶ４ａは、新規タンパク質の全長およびこれらの遺伝子の新規なスプライス形態をコードする任意のオープンリーディングフレームをさらに同定するために分析された。このことは、さらなる独自の組立て、公的に利用可能なＥＳＴ配列および公的なゲノム配列からの適切な配列を使用して、同定されたＮＯＶ４ａを拡張することによって成された。ゲノムクローン（ＡＣ０１１４９８）ＨＴＧ　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ第１９染色体クローンＣＴＢ−５０Ｌ１７は、ＮＯＶ４ａに１００％の同一性を有する領域を含むと同定され、分析のために選択された。なぜなら、この同一性は、このクローンが、ＮＯＶ４ａについてのゲノム座位配列を含むことを意味するからである。
【０１２７】
ゲノムクローンは、エキソンおよび推定コード配列／オープンリーディングフレームを同定するためにＧｅｎｓｃａｎおよびＧｒａｉｌによって分析された。このクローンはまた、最初のタンパク質／目的のタンパク質ファミリーに対して類似性を有するタンパク質に翻訳される領域を同定するために、ＴｂｌａｓｔＮ、ＢｌａｓｔＸおよび他の相同性プログラムによって解析された。公的なデータベースおよび独自のデータベースの両方に由来の発現配列を、この遺伝子配列をさらに規定し、そして完全にするために利用可能である場合、付加した。次に、このＤＮＡ配列は、明らかな不一致について手動で補正され、これによって、完全長のタンパク質をコードする配列を得た。
【０１２８】
（ＮＯＶ４ｂ）
本発明において、上で同定された標的配列（登録番号８５７３１８０８　ＥＸＴ）は、配列を確かめるためにエキソン連結プロセスに供された。ＰＣＲプライマーは、前方向プライマーに利用可能なほとんどの上流配列、および逆方向プライマーに利用可能なほとんどの下流配列で開始することによって設計された。それぞれの場合において、独特であるか、または高度に選択的であるかのいずれかである適切な配列に、この配列が出会うまで、または逆方向プライマーの場合においては、停止コドンに達するまで、それぞれの末端からコード配列に向かって内向きに、この配列を検出した。次いで、このような適切な配列を、広範なｃＤＮＡ種を含むライブラリーに基づくＰＣＲ増幅において、前方向プライマーおよび逆方向プライマーとして使用した。生じたアンプリコンを、ゲル精製し、クローン化し、そして高度の重複性について配列決定して、以下に報告される配列を提供した（登録番号２１１４３４６３．０．４５と命名される）。
【０１２９】
２００４個の開示されたＮＯＶ４ｂ（２１１４３４６３．０．４５とも呼ばれる）核酸は、図４Ｄに示される。ヌクレオチド１〜３のＡＴＧ開始コドンで開始し、そしてヌクレオチド２００２〜２００４のＴＧＡコドンで停止するオープンリーディングフレームを同定した。開始コドンおよび停止コドンは、図４Ｄにおいて太字である。
【０１３０】
【表３７】
2004512821.tif 000039
配列番号１５によってコードされる、ＮＯＶ４ｂポリペプチド（配列番号１６）は、６７７のアミノ酸残基であり、そして表４Ｅに１文字アミノ酸コードを使用して示される。ＮＯＶ４ｂタンパク質を、シグナルペプチドの予測および細胞の局在化について解析した。ＳｉｇｎａｌＰ、ＰｓｏｒｔおよびＨｙｄｒｏｐａｔｈｙのプロフィールは、ＮＯＶ４ｂがシグナルペプチドを有さず、そして０．９８６７の確実性で核に局在するらしいことを示す。しかし、本明細書で予測されるタンパク質は、「肝細胞由来増殖因子様タンパク質ファミリー」に類似であり、このファミリーのいくつかのメンバーは、最終的に細胞外に存在し、そして増殖因子活性を示す。従って、ＮＯＶ４ｂは、適切な細胞下の局在において利用可能であり、故に本明細書に記載される治療的使用に利用可能である。ＮＯＶ４ｂは、７３８２７．３Ｄａの分子量を有する。
【０１３１】
【表３８】
2004512821.tif 000040
肝細胞由来増殖因子様タンパク質（ＮＯＶ４ｂ）は、少なくとも以下の組織で発現させる：肺、血液、リンパ球、骨髄、結腸、脳、膵臓、下垂体、精巣、卵巣、肝臓、前立腺、心臓、副腎、脾臓、甲状腺および子宮。
【０１３２】
ＮＯＶ４ｂのアミノ酸配列は、表４Ｆに示されるような他のタンパク質に対して高い相同性を有した。
【０１３３】
【表３９】
2004512821.tif 000041
（ＮＯＶ４ｃ）
２００４個のヌクレオチドを有する開示されたＮＯＶ４ｃ（２１１４３４６３　Ａ．０．４５　ＥＸＴとも呼ばれる）核酸は、図４Ｇに示される。ヌクレオチド１〜３のＡＴＧ開始コドンで開始し、そしてヌクレオチド２００２〜２００４のＴＧＡコドンで停止するオープンリーディングフレームを同定する。開始コドンおよび停止コドンは、図４Ｇにおいて太字である。
【０１３４】
【表４０】
2004512821.tif 000042
公的な配列データベースの検索において、例えば、この核酸配列（ＮＯＶ４ｃ）が、Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ　ｃＤＮＡコードＨＥＴ−Ｂ（これは、ＨＤＣＦ　ｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：Ｅ１４４０１ａｃｃ：Ｅ１４４０１）（Ｅ＝４．８ｅ−２５８）に、１９８５塩基のうちの１５７０塩基（７９％）の同一性を有することが見出された。
【０１３５】
配列番号１７によってコードされる、ＮＯＶ４ｃポリペプチド（配列番号１８）は、６６７のアミノ酸残基であり、そして表４Ｈに１文字アミノ酸コードを使用して示される。ＮＯＶ４ｃタンパク質を、シグナルペプチドの予測および細胞の局在化について解析した。ＳｉｇｎａｌＰ、ＰｓｏｒｔおよびＨｙｄｒｏｐａｔｈｙのプロフィールは、ＮＯＶ４ａがシグナルペプチドを有さず、そして核に局在するらしいことを示す。しかし、本明細書で予測されるタンパク質は、「肝細胞由来増殖因子様タンパク質ファミリー」に類似であり、このファミリーのいくつかのメンバーは、最終的に細胞外に存在し、そして増殖因子活性を示す。従って、ＮＯＶ４ｃは、適切な細胞下の局在において利用可能であり、故に本明細書に記載される治療的使用に利用可能である。
【０１３６】
【表４１】
2004512821.tif 000043
肝細胞由来増殖因子様タンパク質（ＮＯＶ４ｃ）は第１９染色体に対してマッピングし、そして少なくとも以下の組織で発現される：副腎、胎児脳、脾臓、甲状腺、ならびにさらに文献的供給源：精巣、卵巣および肝臓に由来する。
【０１３７】
ＮＯＶ４ｃタンパク質の完全なアミノ酸配列が、Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ由来の６６９アミノ酸残基肝細胞由来増殖因子様タンパク質（ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ３５５４０；Ｅ＝６．６ｅ−２８８）（表４Ｉ）に対して６６７アミノ酸残基のうちの５５２残基（８２％）の同一性、そして６６７アミノ酸残基のうち６０３アミノ酸残基（９０％）の類似性を有することが見出された。
【０１３８】
【表４２】
2004512821.tif 000044
（ＮＯＶ４ｄ）
２３０７個の開示されたＮＯＶ４ｄ（１１７４７７３３３　ＥＸＴとも呼ばれる）核酸は、図４Ｊに示される。ヌクレオチド７２〜７４のＡＴＧ開始コドンで開始し、そしてヌクレオチド２０８５〜２０８７のＴＧＡコドンで停止するオープンリーディングフレームが同定された。開始コドンから上流の推定非翻訳領域および停止コドンから下流の推定非翻訳領域は、図４Ｊで下線が付され、開始コドンおよび停止コドンは、太字である。
【０１３９】
【表４３】
2004512821.tif 000045
公的な配列データベースの検索において、例えば、この核酸配列（ＮＯＶ４ｄ）が、Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ肝細胞由来増殖因子様タンパク質ｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：Ｄ６３８５０）（Ｅ＝４．８ｅ−１６３）に、１３７８塩基のうちの１０５２塩基（７６％）の同一性を有することが見出された。
【０１４０】
配列番号１９によってコードされる、ＮＯＶ４ｄポリペプチド（配列番号２０）は、６７１のアミノ酸残基であり、そして表４Ｋに１文字アミノ酸コードを使用して示される。ＮＯＶ４ｄタンパク質を、シグナルペプチドの予測および細胞の局在化について解析した。ＳｉｇｎａｌＰ、ＰｓｏｒｔおよびＨｙｄｒｏｐａｔｈｙのプロフィールは、ＮＯＶ４ｄがシグナルペプチドを有さず、そして核に局在するらしいことを示す。しかし、本明細書で予測されるタンパク質は、「肝細胞由来増殖因子様タンパク質ファミリー」に類似であり、このファミリーのいくつかのメンバーは、最終的に細胞外に存在し、そして増殖因子活性を示す。従って、ＮＯＶ４ｄは、適切な細胞下の局在において利用可能であり、故に本明細書に記載される治療的使用に利用可能である。
【０１４１】
【表４４】
2004512821.tif 000046
ヘパトーム由来増殖因子様タンパク質（ＮＯＶ４ｄ）は、第１９染色体にマップされ、そして少なくとも以下の組織で発現される：脳、心臓、肺、肺カルチノイド、膵臓外分泌、乳房、奇形癌、卵巣腫瘍、前立腺、結腸、結腸癌腫、食道、包皮、生殖細胞、子宮、尿生殖管、甲状腺、血液、脾臓、扁桃、造血系およびリンパ系ならびに骨髄。
【０１４２】
ＮＯＶ４ｄタンパク質の全アミノ酸配列は、Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ由来の、６６９アミノ酸残基のヘパトーム由来増殖因子様タンパク質（ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ３５５４０；Ｅ＝２．７　ｅ−２８８）に対して、６７１アミノ酸残基のうち５６３残基（８２％）が同一であり、そして６７１アミノ酸残基のうち６０３残基（８９％）が類似することが見出された。
【０１４３】
ＮＯＶ４ｄのアミノ酸配列は、表４Ｌに示すように、他のタンパク質に対して高い相同性を有した。
【０１４４】
【表４５】
2004512821.tif 000047
ＮＯＶ４ａ、ＮＯＶ４ｂ、ＮＯＶ４ｃおよびＮＯＶ４ｄは、表４Ｍに列挙したアラインメントに示されるように、互いに関連する。
【０１４５】
【表４６】
2004512821.tif 000048
2004512821.tif 000049
ＮＯＶ４ａは、表４Ｎに列挙したＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対して相同性を有することもまた見出された。
【０１４６】
【表４７】
2004512821.tif 000050
これらの配列の相同性を、表４Ｏに示したＣｌｕｓｔａｌＷ分析において、図示する。
【０１４７】
【表４８】
2004512821.tif 000051
2004512821.tif 000052
表４Ｍに示したように、ＮＯＶ４ｂ、ＮＯＶ４ｃおよびＮＯＶ４ｄそれ自体がＮＯＶ４ａに対して相同である場合、上に示した相同性は、これらによって共有される。
【０１４８】
表４Ｐは、ＮＯＶ４ａに対するＤＯＭＡＩＮ分析の結果からのドメインの説明を列挙する。これは、ＮＯＶ４ａ配列が、このドメインを含むことが知られている他のタンパク質と類似の特性を有することを示す。
【０１４９】
【表４９】
2004512821.tif 000053
他のＢＬＡＳＴ結果は、Ｐａｔｐデータベース（これは、特許および特許公報において公開された配列を含む専有データベースである）からの配列を含む。Ｐｓｔｐ結果は、表４Ｑに列挙されるものを含む。
【０１５０】
【表５０】
2004512821.tif 000054
例えば、ｐａｔｐ：ＡＡＹ９９４２６（Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ由来の６７１アミノ酸のポリペプチド（ＷＯ００／０１２７０８））に対するＢＬＡＳＴは、良好な同一性（Ｅ＝０．０）を生成した。さらに、ｐａｔｐ：ＡＡＢ６６１７５（６７１アミノ酸の未同定タンパク質（ＷＯ００／７８９６１））に対するＢＬＡＳＴはまた、良好な同一性（Ｅ＝０．０）を生成した。
【０１５１】
ヘパトーム由来増殖因子（ＨＤＧＦ）は、ヒトヘパトームによって分泌される塩基性繊維芽細胞増殖因子様増殖因子であり、内皮細胞マイトジェンとして作用する（Ｋｌａｇｓｂｒｕｎら、１９８６）。これは、増殖している平滑筋細胞において発現され、そして脈管の発生およびアテローム硬化症に関与し得る（Ｅｖｅｒｅｔｔら、２０００）。ＨＤＧＦはまた、腎臓発生に関与している（Ｏｌｉｖｅｒら、１９９８）。
【０１５２】
多くのグループが、ＨＤＧＦの特定の機能の解明を試みてきた；なぜなら脈管増殖におけるその役割は、現在未知のままであるからである。Ｅｖｅｒｅｔｔら（２０００）は、ＨＤＧＦ　ｍＲＮＡが、平滑筋細胞（ＳＭＣ）、最も顕著には増殖しているＳＭＣにおいて発現されることを実証した。外因性ＤＨＧＦおよびＤＨＧＦの内因性の過剰発現は、ＳＭＣ数およびＤＮＡ合成の有意な増大を刺激した。さらに、ＨＤＧＦがヒトのアテローム硬化性頚動脈のＳＭＣにおいて、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）と同時局在することが示され、これは、ＨＤＧＦが、発生の間のＳＭＣの増殖、および脈管損傷に応答したＳＭＣの増殖の調節の補助をすることを示唆する。Ｃｉｌｌｅｙら（２０００）は、肺発生の研究の間に、気道結紮を有するインビトロのマウス胎仔肺モデルを使用する気管結紮によって増強される、差示的に発現する遺伝子として、ＨＤＧＦを同定した。この著者らは、気道圧迫または気管結紮によって増強される遺伝子が、繊維芽細胞に対して分裂促進的であり、細胞増殖に相関し、細胞の増殖および分化を調節し、そして遠位肺における増殖およびＩＩ型細胞分化において役割を果たし得ると結論付けた。Ｏｌｉｖｅｒら（１９９８）は、内皮マイトジェンアッセイおよび連続クロマトグラフィーを使用して、後腎発生の間充織細胞による内皮マイトジェンの潜在的な分泌の研究の間に、ＨＤＧＦを単離した。この著者らは、ＨＤＧＦが、発生の初期段階で腎原基に広範に分布するが、活性な形態形成部位では、いくつかの腎細管を除いてすぐに濃縮し、そして、成体の腎臓からは消失することを見出した。ＨＤＧＦは、ネフロン形態形成の部位および尿管芽の部位においては、最も豊富であったが、遠位管の小集団を除いて、成体腎臓において転写物は消失した。従って、この著者らは、ＨＤＧＦが、胚性腎臓に存在する内皮マイトジェンであり、そして、その発現が腎発生と同時であることを結論付けた。
【０１５３】
ＨＤＧＦと共に、アミノ末端領域（ハス（ｈａｔｈ）領域）においてＨＤＧＦに有意な相同性を有するタンパク質のファミリーが存在し、これらは、ＨＤＧＦ関連タンパク質（ＨＲＰ）と命名されている（Ｉｚｕｍｏｔｏら、１９９７）（Ｉｋｅｇａｍｅら、１９９９）。多様な組織発現を有するいくつかのファミリーメンバーが存在する。ＨＲＰ−１は、発生中の精巣の生殖細胞のみで発現し、そして精子形成に関与し得る。これらの知見は、精巣特異的なＨＲＰ−１遺伝子が、細胞の減数分裂の周辺の期において、重要な役割を果たし得ることを示唆する（Ｋｕｒｏｄａら、１９９９）。ＨＤＧＦ同様に、ＨＲＰ−２は、精巣および骨格筋で優勢に発現され、心臓、脳、肺、肝臓および腎臓において中程度のレベルで発現され、そして脾臓においては最低限に発現される。ＨＲＰ−１は、非常に酸性なタンパク質であり（２６％酸性）、そしてまた、推定ＮＬＳを有する。ＨＲＰ−２タンパク質は、混合電荷クラスターを保持する（Ｉｚｕｍｏｔｏら、１９９７）。ＨＲＰ−３　ｃＤＮＡは、２０３アミノ酸を含み、分泌のためのシグナルペプチドを有さない。ＨＲＰ−３は、推定の二連の核局在シグナル（ＮＬＳ）配列を有し、そして、結果として、核に移行することが公知である。ＨＲＰ−３遺伝子は、ＦＩＳＨ分析によって、第１５染色体、領域ｑ２５にマップされた。さらに、ＨＲＰ−３は、ヒトにおいて、精巣および脳において優勢に発現され、心臓において中程度に発現され、そして、卵巣、腎臓、脾臓および肝臓においては、より低いレベルで発現される（Ｉｋｅｇａｍｅら、１９９９）。
【０１５４】
本発明のための発現パターン、マップ位置およびタンパク質類似性情報は、これらのＮＯＶ４タンパク質が、ＨＤＧＦファミリーのメンバーとして機能し得ることを示唆する。従って、本発明の核酸およびタンパク質は、例えば、限定でなく、以下に記載されるような種々の病理／障害および／または他の病理／障害に関連する潜在的な治療的適用において有用である。本発明の潜在的な治療的用途は、例えば、限定でなく、以下である：タンパク質治療、低分子薬物標的、抗体標的（治療学的抗体、診断的抗体、薬物標識／細胞障害性抗体）、診断マーカーおよび／または予後マーカー、遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子切除）、研究ツール、ならびにインビトロおよびインビボにおける組織再生（これらの組織およびこれらの組織由来の細胞型を含む、これら全ての組織および細胞型についての再生）。
【０１５５】
本発明の核酸およびタンパク質は、以下に記載される種々の疾患および障害ならびに／または他の病理および障害に関連する潜在的な治療的適用において有用である。例えば、限定ではないが、ＨＤＧＦ様タンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり得、そしてＨＤＧＦ様タンパク質は、これを必要とする被験体に投与される場合に、有用であり得る。非限定的な例として、本発明の組成物は、以下を罹患した患者の処置のために効力を有する：副腎脳白質ジストロフィー、先天性副腎過形成、甲状腺機能亢進、炎症性腸疾患、憩室性疾患、血友病、凝固能亢進、特発性血小板減少性紫斑病、免疫欠損、移植片対宿主、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、アルツハイマー病、発作、結節硬化症、高カルシウム血症、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性小児麻痺、てんかん、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化症、毛細血管拡張性運動失調、白質萎縮症、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、神経防御、受胎能、肝硬変、移植。本発明のＨＤＧＦ様タンパク質をコードする新規核酸およびＨＤＧＦ様タンパク質またはこれらのフラグメントは、診断的適用においてさらに有用であり得、ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価されるべきである。これらの材料は、治療方法または診断方法における使用のために、本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の産生においてさらに有用である。
【０１５６】
本発明のＨＤＧＦ様タンパク質をコードする新規核酸およびＨＤＧＦ様タンパク質またはこれらのフラグメントは、診断的適用においてさらに有用であり得、ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価されるべきである。これらの材料は、治療方法または診断方法、ならびに他の疾患、障害および状態などにおける使用のために、本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の産生において、さらに有用である。これらの材料は、治療方法または診断方法における使用のために、本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の産生において、さらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるように、疎水性チャートからの予測を使用して、当該分野で公知の方法に従って産生され得る。
【０１５７】
例えば、開示されたＮＯＶ４タンパク質は、複数の疎水性領域を有し、その各々が免疫原として使用され得る。１つの実施形態において、意図されるＮＯＶ４エピトープは、約１０〜５０アミノ酸である。別の実施形態において、ＮＯＶ４エピトープは、約５５〜１２５アミノ酸である。さらなる実施形態において、ＮＯＶ４エピトープは、約１３０〜５００アミノ酸、そして５２０〜６８０アミノ酸である。これらの新規なタンパク質を、疾患の病理の理解および種々の障害のための新規薬物標的の開発を補助する、種々のヒト障害の機能的分析についてのアッセイシステムにおいて使用し得る。
【０１５８】
（ＮＯＶ５）
（ＮＯＶ５ａ）
本発明は、以下の新規コルテキシン（Ｃｏｒｔｅｘｉｎ）様タンパク質および、これをコードする核酸（２１６４７２４６＿ＥＸＴ）を記載する。これらの配列は、コルテキシン様タンパク質に対する類似性を有するタンパク質に翻訳されるＤＮＡ配列について、ＣｕｒａＧｅｎのＨｕｍａｎ　ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇデータベースを検索することによって最初に同定された。ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリ２１６４７２４６は、適切な類似性を有すると同定された。ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリ２１６４７２４６を、新規の全長タンパク質をコードする任意のオープンリーディングフレームおよびこれらの遺伝子の新規のスプライス形態を同定するために、さらに分析した。このＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリを、さらなるＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリ、公的に利用可能なＥＳＴ配列および公開ゲノム配列から取られた１以上の配列を使用して、伸長した。公開ＥＳＴおよびさらなるＣｕｒａＧｅｎ　ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリを、ＣｕｒａＴｏｏｌｓＴＭプログラムＳｅｑＥｘｔｅｎｄによって同定した。このようなフラグメントは、推定重複領域における同一性の程度が高い場合にのみ、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリ２１６４７２４６についてのＤＮＡ配列伸長に含まれた。同一性の程度は、例えば、約９０％以上、好ましくは約９５％以上、そしてさらにより好ましくは１００％に近いかまたは等しい。これらの包摂を、使用される場合、以下に記載する。
【０１５９】
以下のゲノムクローンは、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリ２１６４７２４６に対して１００％の同一性を有する領域を有するとして、同定された。これらは、分析のために選択された。なぜなら、この同一性は、これらのクローンがＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリ２１６４７２４６についてのゲノムの遺伝子座を同定することを示すからである。
【０１６０】
ゲノムクローンａｃｃ：ＡＣ０１０３３６、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ第１９染色体クローンＣＩＴＢ−Ｅ１＿３１９３Ｏ１３、ＷＯＲＫＩＮＧ　ＤＲＡＦＴ　ＳＥＱＵＥＮＣＥ、６４個の無秩序の断片−Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓを、ＧｅｎｓｃａおよびＧｒａｉｌによって分析して、エキソンおよび推定コード配列を同定した。このクローンをまた、ＴｂｌａｓｔＮ、ＢｌａｓｔＸおよび他のプログラムによって分析して、元のタンパク質または目的のタンパク質ファミリーに対する類似性を有するタンパク質に翻訳されるゲノム領域を同定した。
【０１６１】
これらの分析の結果を統合し、そして例えば、使用される元のフラグメントにおいて誤判定（ｍｉｓｃａｌｌ）された塩基から生じ得る明らかな不一致に関して手動で補正した。得られた配列は、本明細書中で開示される全長タンパク質をコードする。必要な場合、ｃＤＮＡ、ＥＳＴおよびゲノムクローンを同定および分析するためのプロセスを、全長配列を誘導するために反復した。本発明は、得られた全長ＤＮＡ配列、およびこれらがコードする全長タンパク質配列を記載する。
【０１６２】
新規コルテキシン様タンパク質をコードする、２４９ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ５ａ核酸（ＣｕｒａＧｅｎ　Ａｃｃ．Ｎｏ．２１６４７２４６＿ＥＸＴとも称される）を、表５Ａに示す。ＯＲＦは、ヌクレオチド１〜３においてＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド２４７〜２４９においてＴＧＡコドンで終結する。この開始コドンおよび終止コドンを、表５Ａにおいて太字で示す。
【０１６３】
【表５１】
2004512821.tif 000055
配列番号２１によってコードされるＮＯＶ５ａタンパク質は、８２アミノ酸残基を有し、そして表５Ｂにおいて一文字のコードを使用して表される。ＮＯＶ５ａについてのＰｓｏｒｔプロフィールは、この配列がシグナルペプチドを有し、そして０．７００の確実度で原形質膜に局在する可能性があり；また、微小体（ペルオキシソーム）（確実度０．２４６２）；小胞体（膜）（確実度０．２００）；およびミトコンドリア内膜（確実度０．１０００）に局在し得ることを予測する。ペプチドについての最も可能性の高い切断部位は、ＳｉｇｎａｌＰ結果に基づいて、アミノ酸４９と５０との間、すなわち、アミノ酸配列ＶＲＣ−ＶＲにおけるスラッシュである。
【０１６４】
開示されたコルテキシン様タンパク質は、第１９染色体にマップされる。さらに、この開示されたタンパク質は、少なくとも以下の組織で発現される：皮質（脳）、海馬（脳）、および神経系。
【０１６５】
【表５２】
2004512821.tif 000056
（ＮＯＶ５ｂ）
本発明において、以前に同定された標的配列（登録番号２１６４７２４６＿ＥＸＴ（ＮＯＶ５ａ））を、この配列を確認するためにエキソン連結プロセスに供した。ＰＣＲプライマーを、順方向プライマーについて利用可能な最も上流の配列で開始し、そして逆方向プライマーについて利用可能な最も下流の配列で開始することによって設計した。それぞれの場合において、独特であるかまたは高度に選択的であるかのいずれかである適切な配列に遭遇するまで、または逆方向プライマーの場合には、停止コドンに達するまで、それぞれの末端からコード配列に向かって内側にウォーキングしてこの配列を試験した。このようなプライマーを、標的配列の全長ｃＤＮＡ、ＤＮＡの一部（１つ以上のエキソン）またはタンパク質配列のインシリコ（ｉｎ　ｓｉｌｉｃｏ）予測に基づいて、あるいは密接に関連したヒト配列または他の種由来の配列に対する推定エキソンの翻訳相同性によって設計した。次いで、これらのプライマーを、ヒトｃＤＮＡの以下のプールに基づいて、ＰＣＲ増幅において使用した：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮。通常、得られたアンプリコンをゲル精製し、クローニングし、そして高い重複性まで配列決定した。全てのクローンから得られた配列を、互いに、ＣｕｒａＧｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのデータベースにおける他のフラグメントと、および公共のＥＳＴと構築した。構築の別の成分とのフラグメントおよびＥＳＴの同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％である場合には、これらのフラグメントおよびＥＳＴを、構築のための成分として含めた。さらに、配列の残りを手動で評価し、そして適切である場合には、補正のために編集した。これらの手順は、以下に報告する配列を提供し、これは、登録番号２１６４７２４６＿ｄａｌ（ＮＯＦ５ｂ）と称され、これは、以前に同定された配列（登録番号２１６４７２４６＿ＥＸＴ）に対して１００％相同である。
【０１６６】
本発明のＮＯＶ５ｂ配列は、本発明のＤＮＡ配列の全長および／または一部をカバーするｃＤＮＡフラグメントの実験室クローニングによって、ならびに／あるいは、公開ヒト配列データベースからの、本発明のＤＮＡ配列の全長および／または一部のインシリコ予測によって誘導された。
【０１６７】
この実験室クローニングを、以下に要約する方法の１以上を使用して実行した：
（エキソン連結）この配列をコードするｃＤＮＡを、以下のプライマー（ＡＴＧＡＧＣＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＣＧ（配列番号１０１）およびＴＣＡＣＡＣＣＡＡＣＧＣＧＴＡＧＴＣＧＡＡＣＴ（配列番号１０２））を使用して、ヒトｃＤＮＡの以下のプール（プール１−副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮）で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってクローニングした。
【０１６８】
プライマーを、本発明のＤＮＡ／タンパク質配列の全長またはその一部（１つ以上のエキソン）についてのインシリコ予測に基づいて、または密接に関連したヒト配列または他の種由来の配列に対する推定エキソンの翻訳相同性によって、設計した。通常、複数のクローンを配列決定してこの配列を誘導し、次いでこれを、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇプロセスと同様に構築した。さらに、配列の残りを、手動で評価し、そして適切な場合、補正のために編集した。
【０１６９】
（物理的クローン）エキソン連結によって誘導されたＰＣＲ産物を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｐＣＲ２．１ベクターにクローニングした。細菌クローン、２１０９０６：：２１６４７２４６．６９８３６１．Ｍ２２は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｐＣＲ２．１ベクター中にクローニングされた、全オープンリーディングフレームをカバーする挿入物を有する。改変体配列もまた、この適用に含まれる。改変体配列は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含み得る。いくつかの場合、ＳＮＰは、ｃＤＮＡに由来するＳＮＰを含むヌクレオチド配列であることを示すために、「ｃＳＮＰ」と称され得る。ＳＮＰは、いくつかの方法で生じ得る。例えば、ＳＮＰは、多型部位における、１つのヌクレオチドの別のヌクレオチドへの置換に起因し得る。このような置換は、塩基転移または塩基転換のいずれかであり得る。ＳＮＰはまた、参照対立遺伝子と比較して、ヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの挿入から生じ得る。この場合、多型部位は、１つの対立遺伝子が別の対立遺伝子の特定のヌクレオチドに関してギャップを有する部位である。遺伝子内で生じるＳＮＰは、この遺伝子によってコードされるアミノ酸のＳＮＰの位置での変更を生じ得る。しかし、遺伝子内のＳＮＰはまた、遺伝子コードの縮重の結果として、ＳＮＰを含むコドンが同じアミノ酸をコードする場合には、サイレントであり得る。遺伝子の領域の外側、または遺伝子のイントロンにおいて生じるＳＮＰは、タンパク質のいずれのアミノ酸配列にも変化を生じないが、その発現パターンの調節の変更を生じ得る（例えば、時間的発現、生理学的応答調節、細胞型発現調節、発現の強度、転写されたメッセンジャーの安定性における変更）。
【０１７０】
新規コルテキシン様遺伝子またはそのスプライス形態のうちの１つについてのＤＮＡ配列およびタンパク質配列は、単にエキソン連結によって得られ、そして本明細書でＮＯＶ５ｂとして報告される。
【０１７１】
以下の位置において、ヌクレオチド配列の１つ以上のコンセンサス位置（Ｃｏｎｓ．Ｐｏｓ．）が、ＳＮＰとして同定されている。「深さ（Ｄｅｐｔｈ）」は、ＳＮＰの領域をカバーするクローンの数を示す。推定対立遺伝子頻度（Ｐｕｔａｔｉｖｅ　Ａｌｌｅｌｅ　Ｆｒｅｑ．）は、ＳＮＰを含む全てのクローンの一部である。示される場合、ダッシュ（「−」）は、塩基が存在しないことを意味する。記号「＞」は、「に変更される」を意味する。
【０１７２】
【表５３】
2004512821.tif 000057
表５Ｃおよび５Ｄに示すように、開示されたＮＯＶ５ａおよびＮＯＶ５ｂの核酸配列およびアミノ酸配列は、１００％同一である。本明細書中で使用する場合、ＮＯＶ５に関する任意の言及は、ＮＯＶ５ａおよびＮＯＶ５ｂの両方を包含する。
【０１７３】
【表５４】
2004512821.tif 000058
【０１７４】
【表５５】
2004512821.tif 000059
ＮＯＶ５についての開示された核酸配列は、Ｒａｔｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓニューロン特異的コルテキシンｍＲＮＡ（ａｃｃ：Ｌ１５０１１）に対して、２４９塩基のうち２２９塩基（９１％）が同一であり、そして２４９塩基のうち２２９塩基（９１％）が陽性である塩基を有する（Ｅ＝４．２ｅ−４２）。
【０１７５】
さらに、本発明のタンパク質の全ＮＯＶ５アミノ酸配列は、８２アミノ酸残基のラットコルテキシン（ｇｉ｜７２９２２５｜ｓｐＰ４１２３７｜ＣＴＸＮ＿ＲＡＴ　ＣＯＲＴＥＸＩＮ；ｇｉ｜５４３３７６｜ｐｉｒ｝｝ＪＨ０８１４（ｃｏｒｔｅｘｉｎ−ｒａｔ））に対して、８２アミノ酸残基のうち４６残基（５６％）が同一であり、そして８２残基のうち４６残基（５６％）が陽性である残基を有することが見出された（Ｅ＝２ｅ−１５）。
【０１７６】
開示されたＮＯＶ５タンパク質は、コルテキシン様タンパク質に良好な同一性を有する。ＣｌｕｓｔａｌＷ分析に使用されるこの同一性情報を、表５Ｅに示す。
【表５６】
2004512821.tif 000060
この情報は、関連のタンパク質配列とＮＯＶ５を比較する、表５Ｆ（ＮＯＶ５は１行目に示される）に与えられるＣｌｕｓｔａｌＷ配列アラインメントにおいて、図示される。
【０１７７】
【表５７】
2004512821.tif 000061
本明細書で推定されたＮＯＶ５は、「コルテキシン様タンパク質ファミリー」に類似し、このファミリーのメンバーのいくつかは、最終的に、これらがその活性を示す、細胞表面に局在する。従って、これらの新規のコルテキシン様タンパク質は、適切な細胞成分の局在で利用可能であり、従って、本明細書中に記載される治療的使用のために接近可能である可能性がある。
【０１７８】
ラットの皮質富化ｍＲＮＡのｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列分析は、８２アミノ酸の新規の内在性膜タンパク質を同定する。コードされたタンパク質は、皮質に豊富に発現することを反映して、コルテキシンと命名されている。ラットコルテキシンおよびそのマウスホモログのアミノ酸配列は、ほぼ同一（９８％の類似性）であり、そして両方とも、各配列の中央に、保存された一回膜貫通領域を含む。ノーザンブロット分析は、コルテキシンｍＲＮＡが脳特異的で皮質に豊富であり、そして、胎仔脳で有意なレベルで存在し、出生後のげっ歯類の脳において最大に発現することを示す。インサイチュハイブリダイゼーション研究によって、主にげっ歯類小脳皮質のニューロンでコルテキシンｍＲＮＡが検出されるが、菱脳および白質領域の細胞では検出されない。コルテキシンの機能は、発生中および成体小脳皮質の両方のニューロンにおいて、特に重要であり得る。Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ　６１（２）：７５６−５９（１９９３）を参照のこと。
【０１７９】
Ｉ〜ＩＩ期の循環不全型（ｄｙｓｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ）エンセファロパシー（ＤＥ）の治療と組み合わせた、コルテキシン（小脳機能の新規のペプチド生物調節剤）の臨床試験を、７６人の患者で行った。彼らを、２群に分けた：標準的な治療の３１人の患者のコントロール群、および鼻電気泳動（ＮＥ）を介して送達されるアジュバントコルテキシンを用いる標準的な治療の４５人の患者の研究群。この効果を、臨床的症状、精神心理学的試験、コンピューター化ＥＥＧ、リハビリテーションの定量的パラメーターによって評価した。コルテキシンＮＥは、精神感情的（ｐｓｙｃｈｏｅｍｏｔｉｏｎａｌ）状態、神経学的状態、知能状態、知能−記憶（ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ−ｍｎｅｔｉｃ）、およびＣＮＳ機能に対するプラスの効果を生成した。アジュバントコルテキシンは、Ｉ期およびＩＩ期のＤＥにおけるリハビリテーションの効力を２２．７％喚起した。知能−記憶およびＣＮＳ機能の応答は、最も高かった。コルテキシンは、注意力、認知、記憶、思考、皮質神経エネルギープロセスを改善した。コルテキシンは、十分に許容され、そして副作用を有さない。コルテキシンは、Ｉ〜ＩＩ期のＤＥを有する患者の処置と組み合わせる選択薬物として推奨される。Ｋｌｉｎ　Ｍｅｄ．（Ｍｏｓｋ）７７（４）：４２−４５（１９９９）を参照のこと。
【０１８０】
コルテキシンおよびエピタラミン（ｅｐｉｔｈａｌａｍｉｎ）の、細胞増殖速度に対する効果を、脊髄神経節（ＤＲＧ）および皮質の器官組織培養物、ならびに１０〜１１日齢のニワトリ胚の皮質下構造において調査した。コントロールと比較して、２０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌの濃度のコルテキシンが活性であり、ＤＲＧにおけるより強力な神経突起増殖を誘導する。エピタラミンは、２０ｎｇ／ｍｌおよび２００ｎｇ／ｍｌの濃度で活性であった。コルテキシン（１００ｎｇ／ｍｌ）は、皮質組織培養物において活性であったが、皮質下構造の培養物においては神経突起増殖を阻害した。この培養物を発生させるた刺激は、２００ｎｇ／ｍｌのエピタラミンの使用の後で明らかであった。コルテキシンおよびエピタラミンの神経突起増殖刺激効果は、神経栄養因子とおそらく関連する。Ｔｓｉｔｏｌｏｇｉｉａ　３９（４）：５７１−７６（１９９７）を参照のこと。
【０１８１】
本発明についての発現パターン、マップ位置およびタンパク質類似性情報は、このコルテキシン様タンパク質がコルテキシン様タンパク質ファミリーのメンバーとして機能し得ることを示唆する。従って、本発明の核酸およびタンパク質は、例えば、限定ではなく、以下に記載するような種々の病理／障害および／または他の病理／障害に関連する潜在的な治療的適用において有用である。本発明についての潜在的な治療的使用は、例えば、限定ではなく、以下である：（ｉ）タンパク質治療、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療的抗体、診断的抗体、薬物標的化抗体／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）診断マーカーおよび／または予後マーカー、（ｖ）遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子切除）、（ｖｉ）研究ツール、ならびに（ｖｉｉ）インビトロおよびインビボでの組織再生（これらの組織およびこれらの組織から誘導された細胞型を含む、これら全ての組織および細胞型についての再生）。
【０１８２】
本発明の核酸およびタンパク質は、以下に記載される種々の疾患および障害ならびに／または他の症状および障害に関係する潜在的な治療適用において有用である。例えば、限定ではないが、コルテキシン様タンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり得、そしてコルテキシン様タンパク質は、それを必要とする被験体に投与する場合、有用であり得る。非限定的な例によって、本発明の組成物は、以下を患う患者の処置のための効力を有する：フォン・ヒッペル−リンダウ症候群（ＶＨＬ）、アルツハイマー病、発作、結節硬化、高カルシウム血症、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性小児麻痺、てんかん、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化症、毛細血管拡張性運動失調、白質萎縮症、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、記憶／知覚／注意障害および／または神経保護。本発明のコルテキシン様タンパク質をコードする新規の核酸およびコルテキシン様タンパク質またはそのフラグメントは、診断適用においてさらに有用であり得、ここで、核酸またはタンパク質の存在または量が、評価される。これらの物質は、治療方法または診断方法における使用のための、本発明の新規な物質に免疫特異的に結合する抗体の産生においてさらに有用である。
【０１８３】
本発明のコルテキシン様タンパク質をコードする新規の核酸およびコルテキシン様タンパク質またはそのフラグメントは、診断適用においてさらに有用であり得、ここで、核酸またはタンパク質の存在または量が、評価される。これらの物質は、治療方法または診断方法における使用のための、本発明の新規な物質に免疫特異的に結合する抗体の産生においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるように、疎水性チャートからの推測を使用して、当該分野で公知の方法に従って作製され得る。例えば、開示されるＮＯＶ５タンパク質は、複数の親水性領域を有し、これらの各々は免疫原として使用される。１つの実施形態において、意図されるＮＯＶ５エピトープは、約アミノ酸１２〜２８である。別の実施形態において、ＮＯＶ５エピトープは、約５８〜７７のアミノ酸である。これらの新規タンパク質はまた、種々のヒトの障害の機能分析のための強力なアッセイ系の開発において有用性を有し、これは、疾患の病理学の理解および種々の障害のための新規薬物標的の開発を補助する。
【０１８４】
（ＮＯＶ６）
本発明は、新規のＳＮ様タンパク質およびこれらのコードする核酸（２７９２６４５３＿ＥＸＴ１（ＮＯＶ６）と命名される）を記載する。これらの配列は、最初、ＤＮＡ配列のためのＣｕｒａＧｅｎのヒトＳｅｑＣａｌｌｉｎｇデータベース（これは、目的のタンパク質ファミリーに類似のタンパク質に翻訳する）を検索することによって同定された。ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリ２７９２６４５３＿ＥＸＴ１は、適切な類似性を有するとして同定された。ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリ２７９２６４５３＿ＥＸＴ１は、１つの成分を有する。ＣｕｒａＧｅｎのヒト発現配列アセンブリデータベース（トリミングされたアセンブリｓ３ａｑ：）の検索において；２７９２６４５３（６９９ヌクレオチド）は、この推定遺伝子配列に相同性を有するとして同定された（図３Ｂ）。ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリ２７９２６４５３＿ＥＸＴ１は、新規全長タンパク質およびこれらのＳＮの新規スプライス形態をコードするオープンリーディングフレームをさらに同定するために分析された。これは、適切なさらなるＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリ（公的に利用可能なＥＳＴ配列および／または公的なゲノム配列）を使用してＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリを伸長することによって行なった。公的なＥＳＴおよびさらなるＣｕｒａＧｅｎ　ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリは、ＣｕｒａＴｏｏｌｓＴＭ　ｐｒｏｇｒａｍ　ＳｅｑＥｘｔｅｎｄによって同定された。十分に相同な重複が、見出された場合のみ、これらは、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリ２７９２６４５３＿ＥＸＴ１についてのＤＮＡ配列伸長に含まれた。これらの包含は、以下に記載される。
【０１８５】
ゲノムクローンＡＬ１０９８０４は、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリ２７９２６４５３＿ＥＸＴ１に１００％相同な領域を有するとして同定され、分析ために選択された。この同一性は、このクローンが、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリ２７９２６４５３＿ＥＸＴ１についてのゲノム遺伝子座を提供することに関係する。
【０１８６】
ゲノムクローンは、エキソンおよび推定コード配列／オープンリーディングフレームを同定するために、ＧｅｎｓｃａｎおよびＧｒａｉｌによって分析された。このクローンはまた、目的の本来のタンパク質／タンパク質ファミリーに類似のタンパク質を翻訳する領域を同定するためにＴｂｌａｓｔＮ、ＢｌａｓｔＸおよび他の相同性プログラムによって分析された。
【０１８７】
これらの分析の結果は、組み込まれ、そして明らかな不一致について手動で訂正された。それによって全長タンパク質をコードする配列を得た。必要な場合、ｃＤＮＡ／ＥＳＴおよびゲノムクローンを同定および分析するプロセスは、全長配列を誘導するために反復された。本発明は、この全長ＤＮＡ配列およびそれがコードする全長タンパク質配列を記載する。各スプライス形態のためのこれらの核酸およびタンパク質配列は、本明細書中でＮＯＶ６（２７９２６４５３＿ＥＸＴ１）と称される。
【０１８８】
詳細には、ＣｕｒａＧｅｎのＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリ２７９２６４５３＿ＥＸＴ１は、１５４個のフラグメントから構成される（これは、６９９ｂｐコンティグにトリミングされる）。ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリ２７９２６４５３＿ＥＸＴ１は、骨髄、甲状腺、リンパ節、膵臓、胎盤、胎仔の肝臓、心臓、前立腺、脾臓、唾液腺、乳腺、視床、副腎および腎臓に見られる。ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリ２７９２６４５３＿ＥＸＴ１は、ＢＬＡＳＴＸを用いる検索によって、Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）タンパク質：ＳＩＡＬＯＡＤＨＥＳＩＮ　ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ（ＳＥＲ）（ＳＷＩＳＳＮＥＷ−ＡＣＣ：Ｑ６２２３０，１６９４ａａ）に最初に相同性を示した。ＢｌａｓｔＮを使用する、このＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリは、ヌクレオチドレベルにおいて、ＧｅｎＢａｎｋゲノム配列：ＧＥＮＢＡＮＫＮＥＷ−ＩＤ：ＨＳ１００９Ｅ２４｜ａｃｃ：ＡＬ１０９８０４　Ｈｏｍｏ　Ｓａｐｉｅｎｓ染色体２０クローン　ＲＰ５−１００９Ｅ２４，＊＊＊ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ　ＩＮ　ＰＲＯＧＲＥＳＳ＊＊＊，１０　ｕｎｏｒｄｅｒｅｄ　ｐｉｅｃｅｓ−Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ，１９５５８８ｂｐ．に相同であった。ＡＬ１０９８０４はＧｅｎＳｃａｎによってプロセスされ、そして推定コード領域は、ＢｌａｓｔＸ，ＢｌａｓｔＮおよびＴＢｌａｓｔＮを使用して分析され、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ　ＳＮに相同なエキソンを見出した。ゲノムクローンは、ＮＯＶ６に相同的に一致した。ＡＬ１０９８０４を使用して、２７９２６４５３＿ＥＸＴ１を伸長した。これは、ＧＢＮＥＷデータベースに対するＳＷＩＳＳＮＥＷ−ＡＣＣ：Ｑ６２２３０およびＣｕｒａｔｏｏｌ’ｓ　ＴｂｌａｓｔＮのタンパク質配列を使用することによって達成された。イントロン／エキソン結合は、手動の点検によって決定され、そして明白な不一致について訂正された。この配列のＢｌａｓｔＸは、訂正全長タンパク質２７９２６４５３＿ＥＸＴ１を示した。ゲノムクローンから使用されるこの塩基対（ｂｐ）領域は、以下である：１７９１２６−１７９１６１，１７９５３２−１７９９１２，１８０２１９−１８０５１０，１８２１６５−１８２４２８，１８２８０２−１８３０５３，１８４６０９−１８４９１１，１８６７９７−１８７０６６，１８８１２９−１８８４５５，１８８９１１−１８９１６９，１８９３６６−１８９６７０，１９１３３３−１９１５９６，１９１７２１−１９２０３２，１９２５５４−１９２８０６，１９３１２３−１９３３９２，１９３４８４−１９３７３５，１９４０５４−１９４３５８，１４０７０５−１４０７５７、これは明白な不一致について実質的に訂正された。
５１０３ヌクレオチドの開示される新規ＮＯＶ６核酸（登録番号２７９２６４５３＿ＥＸＴ１）を表６Ａに示した。オープンリーディングは、ヌクレオチド１〜３におけるＡＴＧ開始コドンから始まり、そしてヌクレオチド５１０１〜５１０３におけるＴＧＡコドンにおいて終了する。この開始コドンおよび停止コドンは、太文字である。
【０１８９】
【表５８】
2004512821.tif 000062
2004512821.tif 000063
配列番号２３によってコードされるＮＯＶ６タンパク質は、１７００アミノ酸残基を有し、そして表６Ｂ（配列番号２４）において１文字コードを使用して提示される。ＮＯＶ６ａについてのＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙプロフィールは、ＮＯＶ６がシグナルペプチドを有し、原形質膜に局在化するようである（０．４６００の確実度）ことを予測する。ＮＯＶ６はまた、小胞体（膜）（０．１０００の確実度）；小胞体（管腔）（０．１０００の確実度）；および外側（０．１０００の確実度）に局在化するようである。この推定タンパク質は、「ＳＮファミリー」に類似であり、これのいくつかの膜は、分泌され、そして膜局在は、形質膜において示され得る。従って、この新規のＳＮは、適切な細胞下局在において利用可能であるようであり、それ故、アクセス可能な治療的な使用は、本明細書中に記載される。おそらく、シグナルペプチド開裂部位は、配列ＧＱＡ−ＳＷ（表６Ｂのアミノ酸２０と２１の間）のスラッシュにおいて示される。
【０１９０】
【表５９】
2004512821.tif 000064
開示されるＮＯＶ６核酸配列は、ゲノムＤＮＡ［ＧｅｎｂａｎｋＮＥＷ由来の登録番号：ＡＬ１０９８０４］に属する。このＧｅｎｂａｎｋＮＥＷ入力内では、この配列は、染色体１由来であることを示すことに注目する。従って、おそらく開示されるＮＯＶ６核酸の染色体遺伝子座は染色体１である。
【０１９１】
ＮＯＶ６は、少なくとも以下の組織において発現する：骨髄、甲状腺、リンパ節、膵臓、胎盤、胎児肝臓、心臓、前立腺、唾液腺、乳腺、視床、副腎および腎臓。
【０１９２】
開示されるＮＯＶ６タンパク質（配列番号２４）は、シアロアドヘリンタンパク質との良好な同一性を有する。ＣｌｕｓｔａｌＷ分析において使用される同一性の情報は、表６Ｃにおいて示される。
【０１９３】
【表６０】
2004512821.tif 000065
2004512821.tif 000066
この情報は、ＮＯＶ６を関連タンパク質配列と比較するＣｌｕｓｔａｌＷ分析のように、表６Ｄに提供する複数配列整列にグラフで表す（ＮＯＶ６を１行目に示す）。
【０１９４】
【表６１】
2004512821.tif 000067
2004512821.tif 000068
2004512821.tif 000069
2004512821.tif 000070
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ＮＯＶ６において同定可能なドメインの存在が、ＰＲＯＳＩＴＥ、Ｂｌｏｃｋｓ、Ｐｆａｍ、ＰｒｏＤｏｍａｉｎ、Ｐｒｉｎｔｓのようなアルゴリズムを用いたサーチによって決定され、ついでＩｎｔｅｒｐｒｏウェブ（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／）を使用してドメインマッチ（または数）を組合せてＩｎｔｅｒｐｒｏ番号を決定した。
【０１９５】
ＮＯＶ６に対するＤＯＭＡＩＮの結果を、Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　Ｄｏｍａｉｎ　Ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＤＤ）からＲｖｅｒｓｅ　Ｐｏｓｉｔｉｏｎ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＢＬＡＳＴを用いて収集した。このＢＬＡＳＴサンプルドメインは、ＳｍａｒｔおよびＰｆａｍのコレクション中に見出された。この結果は、表６Ｅに統計値およびドメインの説明と共に列挙される。この結果は、このタンパク質が少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含むことを示す。これらの同定可能なドメインの存在は、表６Ｆにおいて示される。
【０１９６】
【表６２】
2004512821.tif 000073
【０１９７】
【表６３】
2004512821.tif 000074
2004512821.tif 000075
2004512821.tif 000076
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他のＢＬＡＳＴ結果は、Ｐａｔｐデータベース由来の配列を含み、このデータベースは、特許および特許公開において公開された配列を含む独特なデータベースである。Ｐａｔｐ結果は、表６Ｇにおいて列挙されるものを含む。
【０１９８】
【表６４】
2004512821.tif 000079
例えば、ｐａｔｐ：ＡＡＢ４１９０１、２３５アミノ酸ヒトＯＲＦＸポリペプチド配列（ＷＯ／００５８４７３）は、アミノ酸３からアミノ酸２３５の領域にわたって、良好な同一性（Ｅ＝８．１ｅ−１２３）を生成した。
【０１９９】
Ｃｒｏｃｋｅｒら（ＥＭＢＯ　Ｊ　１０（７）：１６６１〜６９（１９９１）；ＰＭＩＤ：２０５０１０６、ＵＩ：９１２６６８９３）は、レクチン様レセプターであるシアロ接着因子（もともとはヒツジ赤血球レセプター（「ＳＥＲ」）と名付けられた）（これは選択的にシアロ糖結合体を認識し、そして造血組織およびリンパ組織における間質性マクロファージの細胞相互作用に関係するようである）を発現するマウスにおける、マクロファージ亜集団を試験した。Ｃｒｏｃｋｅｒらはさらに、マウス脾臓から単離されたシアロ接着因子の精製およびリガンド特異性を記載した。精製されたシアロ接着因子（みかけの分子量１８５ｋｄの糖タンパク質）は、ヒツジまたはヒト赤血球を、シアル酸依存性の様式でナノモル濃度で凝集した。ローアングルシャドーイングおよび電子顕微鏡検査は、シアロ接着因子は、約９ｎｍの球状頭部領域および約３５ｎｍの伸長した尾部からなることを示した。
【０２００】
シアル酸についての特異性を研究するために、誘導体化されたヒト赤血球、糖タンパク質および糖脂質とシアロ接着因子との相互作用を試験した。シアロ接着因子は、シアロ糖タンパク質またはガングリオシドのいずれかにおいて、オリゴ糖配列Ｎｅｕ５Ａｃα２−−−−３Ｇａｌβ１−−−−３ＧａｌＮＡｃを特異的に認識する。これらの知見は、この構造を保有する特定のシアロ糖結合体が、間質性マクロファージと造血細胞およびリンパ球の亜集団との間の細胞相互作用に関連し得ることを意味する。
【０２０１】
シアロ接着因子の細胞外領域は、１７の免疫グロブリン様ドメインから構成され、このドメインのアミノ末端のうち２つは、ＣＤ２２、ミエリン関連糖タンパク質およびＣＤ３３のアミノ末端ドメインに、構造的および機能的に高度に関連する。これらのタンパク質（集合的にシアロ接着因子ファミリーとして公知である）は、シアル酸のタイプとおよびその端近くの糖に対する結合との両方について、明確な特異性を伴うシアル酸依存性結合を媒介し得る。
【０２０２】
さらに、Ｃｒｏｃｋｅｒら（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ　Ｊ　１４（５）：６０１〜０９（１９９７）は、シアロ接着因子に対する彼らの最近の研究をレビューし、そして、マクロファージ機能の範囲（正常な条件下ならびに炎症反応の間の両方）に、この分子がどのように寄与し得るかを示唆した。（また、Ｃｒｏｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ　Ｊ　１３（１９）：４４９０〜５０３（１９９４）を参照のこと。これは、マウスシアロ接着因子の分子クローンニングを報告し、そして、この分子が１７のＩｇ様ドメインを有する免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの新規なメンバーであることを示す。全長シアロ接着因子をコードするｃＤＮＡをトランスフェクトしたＣＯＳ細胞は、シアル酸依存性の様式でマウスの骨髄に結合した）。あるいは、スプライシングされたｃＤＮＡ（シアロ接着因子のＩｇ様ドメインの最初の３つまたは１６を含むシアロ接着因子の可溶性形態を予測する）は、ＣＯＳ細胞および精製されたそれぞれのタンパク質において発現された。プラスチック上に固定される場合、１６−ドメイン形態は、シアル酸依存性の様式で細胞に結合し、これは、シアロ接着因子は、分泌形態および膜結合形態の両方で機能し得ることを示唆した。
【０２０３】
データベースにおけるもっとも類似のタンパク質はＣＤ２２、ミエリン関連糖タンパク質、シュワン細胞ミエリンタンパク質およびＣＤ３３であった。シアロ接着因子のように、ＣＤ２２は、シアル酸依存性の細胞接着を媒介する。シアロ接着因子のＣＤ２２およびＩｇスーパーファミリーの関連するメンバーに対する配列類似性は、シアル酸結合タンパク質の新規なファミリーの存在が、細胞−細胞相互作用に関連することを示す。
【０２０４】
リンパ造血組織における間質性マクロファージは、他の造血細胞との非食作用性の相互作用に関連する、新規なマクロファージ制限原形質膜レセプターを発現する。ヒツジ赤血球およびマウス造血細胞上のシアリル化糖結合体についてレクチン様特異性を有する１つのこのようなレセプターは、免疫化学的に特徴付けられ、そしてシアロ接着因子と称される。マウス発達の間のシアロ接着因子の発現は、その調節および機能についてより知るために試験された。Ｍｏｒｒｉｓら、Ｄｅｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　２（１）：７〜１７（１９９２）、ＰＭＩＤ：１５２１０６５、ＵＩ：９２３９３３４８を参照のこと。免疫細胞化学、ロゼッティング（ｒｏｓｅｔｔｉｎｇ）、およびウェスタンブロット研究は、シアロ接着因子は、胎仔肝臓マクロファージにおいて、発生の第１８日目に最初に検出され、７日後、多くのＦ４／８０＋マクロファージが、赤芽球島中で見出される。脾臓および骨髄において、シアロ接着因子は、第１８日目と誕生との間、すなわち骨髄発達と平行して現れる。脾臓の辺縁部において強く標識されるマクロファージ（これは成体リンパ組織の特徴である）は、誕生後１〜４週間の間に、白色髄が増大するにつれて、徐々に表れた。第１４日目における胎仔肝臓マクロファージの単離によって、シアロ接着因子は赤芽球の結合に関与せず、この結合は別のカチオン性依存性レセプターによって媒介されるということを確認した。
【０２０５】
シアロ接着因子は、培養後に、成体マウス血清、すなわち誘導因子活性の既知の供給源において、胎仔肝臓マクロファージの単離によって発現され得たが、成体誘導マクロファージとは異なり、この誘導因子の存在に依存しなかった。胎仔血漿は、第１３日目において誘導活性を含むが、出生後２週間までは成体レベルに届かなかった。これらの研究は、シアロ接着因子が、赤芽球レセプターおよびＦ４／８０抗原と比較して調節が困難であること、胎仔赤血球生成を要求しないこと、そしてその間質性マクロファージに対するその誘導が、髄発達およびリンパ発達の開始まで遅れることを示す。シアロ接着因子は、リンパ造血系の個体発生の間の、マクロファージの成熟および機能を研究するためのマーカーを提供する。一般に、Ｍｏｒｒｉｓら、Ｄｅｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　２（１）：７〜１７（１９９２）ＰＭＩＤ：１５２１０６５、ＵＩ：９２３９３３４８を参照のこと。
【０２０６】
開示された本発明のＮＯＮ６タンパク質は、マウスＳＮに対して相同性を有する。このマウスＳＮは、上記のような特徴的な性質を有する。従って、この開示された本発明のＮＯＶ６タンパク質は、マウスＳＮに相同な特徴的な性質を有することが予測される。本発明についてこの発現パターン、マッピング位置およびタンパク質類似性の情報は、ＮＯＶ６が、ＳＮファミリーメンバーとして機能し得ることを示唆する。
【０２０７】
本発明の核酸およびタンパク質は、種々の疾患および障害ならびに／または他の病状および障害に関連する、潜在的な治療的適用において有用である。例えば、ＳＮ様タンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり得、そしてこのＳＮ様タンパク質は、それらを必要とする患者に投与される場合に有用であり得る。非限定的な例として、本発明の組成物は、以下に罹患する患者の処置に効力を有する：フォンヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、肝硬変、移植、血友病、凝固能亢進、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫障害、アレルギー、免疫欠損、移植、対宿主性移植片、糖尿病、腎動脈狭窄、間質性腎炎、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎疾患、全身性エリテマトーデス、尿細管性アシドーシス、ＩｇＡネフロパシー、高カルシウム血症、レッシュ−ナイハン症候群、アルツハイマー疾患、発作、結節硬化症、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性麻痺、てんかん、多発性硬化症、毛細血管拡張性運動失調、白質萎縮症、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、口内乾燥症、神経保護、糖尿病、自己免疫疾患、腎動脈狭窄、Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ　ｅｐｈｒｉｔｉｓ、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎疾患、全身性エリテマトーデス、尿細管性アシドーシス、副腎脳白質ジストロフィー、先天性副腎過形成、心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、先天性心欠陥、大動脈狭窄症、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠陥、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、強皮症、肥満症、移植、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、受精能、膵臓炎および／または他の疾患／病状。ＳＮ様タンパク質をコードする新規な核酸および本発明のＳＮ様タンパク質、またはそれらのフラグメントは、診断適用においてさらに有用であり得、ここで、核酸もしくはタンパク質の存在または量が評価されるべきである。これらの材料は、治療的用途または診断方法において使用するために本発明の新規な物質に免疫特異的に結合する抗体の産生において、さらに有用である。
【０２０８】
本発明の潜在的な治療的用途は、例えば、以下であるがこれらに限定されない：（ｉ）タンパク質治療剤、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療的抗体、診断的抗体、薬物標的化／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）診断マーカーおよび／または予後マーカー、（ｖ）遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子切除）、（ｖｉ）リサーチツール、ならびに（ｖｉｉ）インビトロおよびインビボにおける組織再生（これらの組織およびこれらの組織由来の細胞型を含む、全てのこれらの組織および細胞型についての再生）。本発明の核酸およびタンパク質は、下記の種々の疾患および障害ならびに／または他の病状および障害に関連する、潜在的な治療的適用において有用である。
【０２０９】
本発明の核酸およびタンパク質は、上記の種々の疾患および障害ならびに／または他の病状に関連する、潜在的な診断的および治療的用途において有用である。さらに、ポリペプチドは、本発明に特異的な抗体を産生するための免疫原として、およびワクチンとして使用され得る。このポリペプチドはまた、潜在的なアゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物をスクリーニングするために使用され得る。シアロ接着因子様タンパク質をコードする新規な核酸および本発明のシアロ接着因子様タンパク質、またはそれらのフラグメントは、診断適用においてされに有用であり得、ここで、核酸もしくはタンパク質の存在または量が評価されるべきである。
【０２１０】
これらの材料は、治療的方法または診断的方法において使用するための、新規なＮＯＶ６物質に免疫特異的に結合する抗体の産生において、さらに有用である。これらの抗体は、当業者に公知の方法に従って、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるような疎水性チャート由来の予測を使用して産生され得る。
【０２１１】
（ＮＯＶ７）
ＮＯＶ７は、Ｔｒｉｏに類似な配列を保有するゲノムＤＮＡ配列によってコードされる新規なタンパク質である。Ｔｒｉｏは、ヒトにおいて同定されるリンタンパク質（ＷＯ９７／３５９７９を参照のこと）であり、これは、複数のシグナル伝達経路の中心的オーガナイザーであり、ｃ−ｆｏｓのような癌遺伝子の活性化に関連し、そして細胞の形質転換を誘導することが示唆されている。Ｔｒｉｏは、いくつかの組織において発現することが見出された。
【０２１２】
Ｔｒｉｏは、それぞれ隣接プレクストリン（ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ）に相同性であり、そしてＳＨ３ドメインを有する２つのグアニンヌクレオチド変換因子ドメイン、隣接免疫グロブリン様ドメインを有するタンパク質セリン／スレオニン／キナーゼドメイン、ならびに複数スペクトリン様ドメインを有する複合タンパク質である。グアニンヌクレオチドは因子を変換し、これは、ＧＴＰのためにＧＤＰの変換を促進し、ＲｈｏファミリーＧＴＰアーゼを正に調節し、そして従って、多様な細胞プロセス（細胞運動および細胞増殖を含む）に関与する。Ｔｒｉｏのフラグメントの発現が、造血細胞移動および足場独立増殖（ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｇｒｏｗｔｈ）を誘導する証拠が存在する（Ｓｅｉｐｅｌら、Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉ　１１２（Ｐｔ１２）：１８２５〜３４（１９９９）を参照のこと）。
【０２１３】
これらの開示されたＮＯＶ７は、Ｔｒｉｏの選択的スプライシング形態である。この改変体は、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリ３３２７６６９において同定された。ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇは、差示的発現、およびサンプル中のｍＲＮＡ種を標準化する配列決定手順であり、そして米国第０９／４１７，３８６号（１９９９年１０月１３日出願）（これはその全体が参考として本明細書中で援用される）において開示される。ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリ３３２７６６９を伸長して、クローン１０５１８０７７８（ＮＯＶ７）を提供した。述べたように、ＮＯＶ７は、ＴＲＩＯの選択的スプライシング形態として見出された（登録番号Ｕ４２３９０）。
【０２１４】
開示されたＮＯＶ７核酸は、表７Ａにおいて示される。
【０２１５】
【表６５】
2004512821.tif 000080
配列番号２５によってコードされるＮＯＶ７タンパク質は、表７Ｂにおいて１文字コードを使用して表される（配列番号２６）。
【０２１６】
【表６６】
2004512821.tif 000081
Ｔｒｉｏ（ＡＦ０９１３９５）（配列番号１０３）を有するＮＯＶ７（配列番号２６）の比較は、表７Ｃにおいて提供される。
【０２１７】
【表６７】
2004512821.tif 000082
ＮＯＶ７を、組織発現プロフィールについて分析した。種々のクローンの定量的発現を、以下の実施例１に記載されるように、リアルタイム定量的ＰＣＲ（ＴＡＱＭＡＮ（登録商標））により、正常組織サンプルおよび腫瘍組織サンプルにおいて評価した。
【０２１８】
図１は、ＴａｑＭａｎ組織プロフィール結果を示す。同じ実験の２回の繰り返しを、灰色および黒の棒で示す。選択的スプライシング形態は、全ての主要な癌腫群（黒色腫、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、乳房癌、脳癌）由来の細胞株において過剰発現する。ほとんどの正常組織において、発現は存在しないか、または非常に低く発現する。
【０２１９】
図２は、外科的標本由来であった癌細胞の広い範囲において、複製ＴａｑＭａｎプロフィールを提供する。頻繁に、これらは、執刀者によって同時に得られる正常な隣接組織（ＮＡＴ）と並列される。図２は、結腸癌腫、肺癌腫、および腎臓癌腫において、Ｔｒｉｏ選択的スプライシング形態（ＮＯＶ７）は、隣接する正常組織と比較して、腫瘍において過剰発現することを示す。
【０２２０】
開示されたＮＯＶ７タンパク質（配列番号２６）は、Ｔｒｉｏリンタンパク質との同一性を有する。ＣｌｕｓｔａｌＷ分析を使用する同定情報は、表７Ｄにおいて表す。
【０２２１】
【表６８】
2004512821.tif 000083
この情報は、ＮＯＶ７を関連タンパク質配列と比較するＣｌｕｓｔａｌＷ分析のように、表７Ｅに提供する複数配列整列にグラフで表す（ＮＯＶ７を１行目に示す）。
【０２２２】
【表６９】
2004512821.tif 000084
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2004512821.tif 000089
2004512821.tif 000090
他のＢＬＡＳＴの結果は、Ｐａｔｐデータベース由来の配列を含み、これは、特許および特許広報に公開された配列を含む所有データベースである。Ｐａｔｐの結果は、表７Ｆに列挙された結果を含む。
【０２２３】
【表７０】
2004512821.tif 000091
例えば、ｐａｔｐ：ＡＡＷ２７２２７に対するＢＬＡＳＴ（２８６１アミノ酸のＴＲＩＯリンタンパク質（ＷＯ９７／３５９７９）は、良好な同一性を生じた（Ｅ＝９．８ｅ−１３））。
【０２２４】
本明細書において開示されるＮＯＶ７タンパク質およびＮＯＶ７核酸についての類似性の情報は、ＮＯＶ７が、Ｔｒｉｏを特徴付ける重要な構造的機能および／または病理学的機能を有し得ることを示唆する。従って、本発明の核酸およびタンパク質は、有力な診断適用および治療適用に有用であり、そして探索ツールとして有用である。これらは、特定の核酸もしくは選択的核酸または特定のタンパク質もしくは選択的タンパク質の診断マーカーおよび／もしくは予後判定マーカーとして役立つこと（ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価されるべきである）、ならびに以下のような有力な治療適用：（ｉ）タンパク質治療剤、（ｉｉ）低分子の薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療抗体、診断抗体、薬物標的化抗体／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療において有用な核酸（遺伝子送達／遺伝子除去）、ならびに（ｖ）インビトロおよびインビボにおける組織再生を促進する組成物、（ｖｉ）生物学的防御兵器、を含む。ＮＯＶ７をコードする新規核酸、および開示されたＮＯＶ７タンパク質、またはそれらのフラグメントは、診断適用にさらに有用であり得、ここで、この核酸またはタンパク質の存在および量が評価されるべきである。
【０２２５】
開示されたＮＯＶ７ポリペプチドは、ワクチンを産生するための免疫原として用いられ得る。ＮＯＶ様タンパク質をコードする新規核酸、および本発明のＮＯＶ様タンパク質、またはそれらのフラグメントは、診断適用においてさらに有用であり得、ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価されるべきである。これらの材料は、治療方法または診断方法における使用のための本発明の新規物質に対して免疫特異的に結合する抗体の産生にさらに有用である。例えば、開示されたＮＯＶ７タンパク質は、複数の親水性領域を有し、この親水性領域のそれぞれが免疫原として用いられ得る。これらの新規タンパク質はまた、機能分析のためのアッセイ系を開発するために用いられ得る。これらの抗体は、以下の節の「抗−ＮＯＶＸ抗体」において記載されるように、疎水性チャートからの予測を使用して、当該分野で公知の方法に従って産生され得る。
【０２２６】
（ＮＯＶ８）
本発明は、ｃＤＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡによってコードされる新規タンパク質およびそれに類似するタンパク質（すなわち、Ｓｔｒａ６に類似する配列を保有するタンパク質）を開示する。
【０２２７】
（ＮＯＶ８ａ）
本発明は、以下の新規Ｓｔｒａ６様タンパク質およびそれらをコードする核酸を記載する：３２７７７８９＿ＥＸＴ（ＮＯＶ８ａ）。これらの配列は、ＤＮＡ配列についてＣｕｒａＧｅｎのＨｕｍａｎ　ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇデータベースを検索することによって最初に同定された。この配列は、Ｓｔｒａ６様タンパク質に類似性を有するタンパク質に翻訳される。ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇは、示差的発現およびサンプル中のｍＲＮＡ種を規準化する配列決定手順であり、そして１９９９年１０月１３日に出願された米国出願番号第０９／４１７，３８６号に記載される（その全体が本明細書中において援用される）。ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリ３２７７７８９は、適切な類似性を有するものとして同定される。ＮＯＶ８ａをさらに解析し、新規全長タンパク質をコードする任意のオープンリーディングフレームおよびこれらの遺伝子の新規スプライス形態を同定した。ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリを、さらなるＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリ、公衆で利用可能なＥＳＴ配列および公共のゲノム配列から得られた１つ以上の配列を用いて伸展した。公共のＥＳＴおよびさらなるＣｕｒａＧｅｎ　ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリをＣｕｒａＴｏｏｌｓＴＭプログラムＳｅｑＥｘｔｅｎｄによって同定した。このようなフラグメントは、この推定重複領域における同一性の程度が高い場合にのみ、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリ３２７７７８９についてのＤＮＡ配列伸長に含まれた。同一性の程度は、例えば、約９０％以上、好ましくは、約９５％以上であり得、そしてさらにより好ましくは、ほぼ１００％かまたは１００％と同程度であり得る。これらの包括は、用いられる場合、以下に記載される。
【０２２８】
ゲノムクローン（ａｃｃ：ＡＣ０２３５４５　ＨＴＧ　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　１５　ｃｌｏｎｅ　ＲＰ１１−６６５Ｊ１６　ｍａｐ　１５，ＷＯＲＫＩＮＧ　ＤＲＡＦＴ　ＳＥＱＵＥＮＣＥ，２８　ｕｎｏｒｄｅｒｅｄ　ｐｉｅｃｅｓ−Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ）をＧｅｎｓｃａｎおよびＧｒａｉｌによって解析してエキソンおよび推定コード配列を同定した。このクローンをまた、ＴｂｌａｓｔＮ、ＢｌａｓｔＸおよび他のプログラムによって解析して、もとのタンパク質または目的のタンパク質ファミリーに類似性を有するタンパク質に翻訳されるゲノム領域を同定した。それは、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリ３２７７７８９に対して１００％の同一性を有する領域を有するものとして同定された。
【０２２９】
これらの分析の結果を統合し、例えば、用いられたもとのフラグメント中の読み違えられた（ｍｉｓｓｃａｌｌ）塩基から生じたかもしれない明らかな不一致について手動で補正した。得られたこれらの配列は、本明細書中に開示される全長タンパク質をコードする。必要な場合、ｃＤＮＡ、ＥＳＴおよびゲノムクローンを同定および解析するプロセスを繰り返して、この全長配列を導き出した。
【０２３０】
１９６２ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ８ａ核酸（３２７７７８９＿ＥＸＴとしても称される）を、表８Ａに示す。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１〜３でのＡＴＧ開始コドンで開始し、そしてヌクレオチド１９６０〜１９６２でのＴＧＡコドンで終わる。
【０２３１】
【表７１】
2004512821.tif 000092
配列番号２７によってコードされるＮＯＶ８ａタンパク質は、６５３アミノ酸残基を有し、そして表８Ｂにおいて１文字コードを用いて示される（配列番号２８）。ＮＯＶ８についてのＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙプロフィールによって、ＮＯＶ８がシグナルペプチドを有すること、そして０．６０００の確実度で原形質膜に局在する傾向にあることが予測される。それはまた、ゴルジ体（確実度＝０．４０００）；小胞体（膜）（確実度＝０．３０００）；および微小体（ペルオキシソーム）（確実度＝０．３０００）に局在する傾向にある。この開示されたＮＯＶ８ａタンパク質は、８位と９位との間で（すなわち、配列ＡＧＮ−ＱＴにおけるスラッシュで）おそらく切断されるシグナルペプチドを有することが予測される。
【０２３２】
【表７２】
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この開示されたＳｔｒａ６様タンパク質（ＮＯＶ８ａ）は、第１５染色体にマッピングする。さらに、公開されたＮＯＶ８ａタンパク質は、少なくとも以下の組織において発現される：精巣、骨、筋肉、および血液−器官関門。本明細書において開示されるタンパク質は、「Ｓｔｒａ６様タンパク質ファミリー」に類似し、このいくつかのメンバーは、結局、細胞表面に局在し、そこで、それらは活性を示す。従って、この新規Ｓｔｒａ６様タンパク質は、おそらく適切な細胞下の位置で利用可能であり、それ故、本明細書において記載される治療用途に利用しやすい。
【０２３３】
（ＮＯＶ８ｂ）
本発明において、既に同定された標的配列（登録番号３２７７７８９＿ＥｘｔまたはＣＧ５２２７６−０１（ＮＯＶ８ａ））をエキソン連結プロセスに供して、その配列を確証した。ＰＣＲプライマーを、順方向プライマーについて利用可能な最も上流の配列で開始するように設計し、逆方向プライマーについて利用可能な最も下流の配列で開始するように設計した。各場合において、独特であるかもしくは高度に選択性であるかのいずれかの適切な配列に遭遇するまで、または逆方向プライマーの場合、終止コドンに到達するまで、それぞれの末端からコード配列まで内向きに走査して、この配列を試験した。このようなプライマーを、全長ｃＤＮＡ、このＤＮＡの部分（１つ以上のエキソン）または標的配列のタンパク質配列についてインシリコ予測に基づいて、あるいは他の種由来の非常に関連したヒト配列に対する予測されたエキソンの翻訳されたホモロジーによって設計した。次いで、これらのプライマーを、ヒトｃＤＮＡの以下のプールに基づいてＰＣＲ増幅に用いた：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮。通常、得られたアンプリコンをゲル精製し、クローニングし、そして高度な重複性に対して配列決定をした。全てのクローンから得られた配列を、それら自体、ＣｕｒａＧｅｎ社のデータベースにおける他のフラグメント、および公共のＥＳＴを用いてアセンブリした。フラグメントおよびＥＳＴは、このアセンブリの別の成分とのこれらの同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％であった場合、アセンブリのための成分として含まれた。さらに、配列トレースを手動で評価し、適切な場合、補正のために変更した。これらの手順は、以下に報告される配列を提供し、これを、登録番号ＣＧ５２２７６−０３（ＮＯＶ８ｂ）と示す。ＮＯＶ８ｂは、スプライス改変形態であり、９個のさらなる内部アミノ酸および５９位でのＳ−＞Ｐの１個のアミノ酸の変更を有することで、既に同定された配列（ＮＯＶ８ａ）とは異なる。
【０２３４】
本発明の配列は、本発明のＤＮＡの全長および／もしくはその一部をカバーするｃＤＮＡフラグメントの研究室クローニングによって、ならびに／または公共のヒト配列データベース由来の本発明のＤＮＡ配列の全長および／もしくはその一部のインシリコ予測によって得られた。
【０２３５】
研究室クローニングを、以下に要約した方法の１つ以上を用いて実施した：
ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇＴＭ技術：ｃＤＮＡを、複数の組織型（健常状態および疾患状態、生理学的状態、ならびに異なるドナー由来の発生状態）を示す種々のヒトサンプルから得た。サンプルを、全組織、細胞株、初代細胞もしくは組織培養した初代細胞および細胞株として得た。細胞および細胞株を、遺伝子発現を調節する生物剤または化学剤（例えば、増殖因子、ケモカイン、ステロイド）で処理しておいてもよい。従って、得られたｃＤＮＡを、ＣｕｒａＧｅｎ独自のＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ技術を用いて配列決定した。配列トレースを手動で評価し、そして適切な場合、補正のために変更した。全てのサンプル由来のｃＤＮＡ配列を、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリのＣｕｒａＧｅｎのヒトＳｅｑＣａｌｌｉｎｇデータベースを作成するバイオインフォマティクスプログラムを用いてそれら自体および公共のＥＳＴとアセンブリした。各アセンブリは、１つ以上のヒトサンプル由来の１つ以上の重複ｃＤＮＡ配列を含む。このアセンブリの別の成分との同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％であった場合、フラグメントおよびＥＳＴをアセンブリのための成分として含んだ。各アセンブリは、遺伝子ならびに／またはその改変体（例えば、スプライス形態および／もしくは一塩基多型（ＳＮＰ）ならびにそれらの組み合わせ）を示し得る。
【０２３６】
エキソン連結：その配列についてコードするｃＤＮＡを、ヒトｃＤＮＡの以下のプール：プール１−副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮、における以下のプライマー：ＧＧＴＣＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＡＧＡＡＴ（配列番号６３）およびＴＴＴＴＣＴＣＡＧＧＡＣＣＡＡＧＴＴＴＡＴＴＧＣＡＧＧ（配列番号６４）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってクローニングした。
【０２３７】
プライマーを本発明のＤＮＡ／タンパク質配列の全長または一部（１つ以上のエキソン）についてのインシリコ予測に基づいてか、あるいは非常に関連したヒト配列または他の種由来の配列に対する予測されるエキソンの翻訳されたホモロジーによって設計した。通常、複数のクローンを配列決定して、次いで、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇプロセスに類似してアセンブリした配列を得た。さらに、配列トレースを手動で評価し、そして適切な場合、補正のために変更した。
【０２３８】
改変体配列もまた、本願に含まれる。改変体配列は、一塩基多型（ＳＮＰ）を含み得る。ＳＮＰを、いくつかの場合、ＳＮＰを含むヌクレオチド配列がｃＤＮＡとして起源することを示す「ｃＳＮＰ」として称し得る。ＳＮＰをいくつかの方法で生じ得る。例えば、ＳＮＰは、多型部位で１つのヌクレオチドを別のヌクレオチドに置換することに起因し得る。このような置換は、転位またはトランスバーションのいずれかであり得る。ＳＮＰはまた、参照対立遺伝子に関連して、ヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの挿入から生じ得る。この場合、多型部位は、１つの対立遺伝子が別の対立遺伝子中の特定のヌクレオチドに関するギャップを保有する部位である。遺伝子中に生じるＳＮＰは、ＳＮＰの位置でこの遺伝子によってコードされるアミノ酸の変更を生じる得る。しかし、ＳＮＰを含むコドンが遺伝子コードの重複性の結果として同じアミノ酸をコードする場合、遺伝子内ＳＮＰはまた、サイレントであり得る。遺伝子の領域の外側、または遺伝子内のイントロンに生じるＳＮＰは、タンパク質のいずれのアミノ酸配列にも変化を生じないが、遺伝子発現パターンの変更された調節（例えば、一時的な発現の変化、生理学的応答調節、細胞型発現調節、発現の強度、転写されたメッセージの安定性）を生じ得る。
【０２３９】
新規レチノイン酸応答性タンパク質様遺伝子または１つのそのスプライス形態についてのＤＮＡ配列およびタンパク質配列を、単にエキソン連結によって得、そしてＮＯＶ８ｂとして本明細書で報告する。
【０２４０】
２０１２ｂｐの開示されたＮＯＶ８ｂ核酸（配列番号２９）を表８Ｃに示す。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド２４〜２６で開始し、ヌクレオチド２０１０〜２０１２で終わることが同定された。オープンリーディングフレームの開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＧＡ）を太字で強調する。推定非翻訳領域は、存在する場合、下線が引かれている。
【０２４１】
【表７３】
2004512821.tif 000094
配列番号２９によってコードされるＮＯＶ８ｂタンパク質は、６６２アミノ酸残基を有し、そして表８Ｄ（配列番号３０）において１文字コードを使用して提示される。レチノイン酸応答性タンパク質様タンパク質についてのＳｉｇｎａｌＰ、ＰｓｏｒｔおよびＨｙｄｒｏｐａｔｈｙプロフィールは、この配列がシグナルペプチドを有し、そして０．６０００の確実度で原形質膜に局在化する傾向にあることを予測する。ＮＯＶ８ｂはまた、ゴルジ体（確実度＝０．４０００）；小胞体（膜）（確実度＝０．３０００）；および微小体（ペルオキシソーム）（確実度＝０．３０００）に局在する傾向にある。最初の８アミノ酸は、ＳｉｇｎａｌＰ結果に基づいたシグナルペプチドとして（すなわち、配列ＡＧＮ−ＱＴにおけるスラッシュの間で）切断される傾向がより高い。
【０２４２】
【表７４】
2004512821.tif 000095
本発明において開示されたＮＯＶ８ｂは、少なくとも以下において発現される：脳、子宮頸管、心臓、腎臓、リンパ節、リンパ組織、卵巣、下垂体、胎盤、網膜、側頭葉、甲状腺、子宮、全生物体。この情報は、本発明において含まれる配列の組織供給源（ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ供給源、公共のＥＳＴ供給源、文献の供給源、および／またはＲＡＣＥ供給源が挙げられるがこれらに限定されない）を決定することによって導かれた。
【０２４３】
（ＮＯＶ８ｃ）
登録番号ＣＧ５２２７６−０４（ＮＯＶ８ｃ）の配列は、ｃＤＮＡフラグメントの研究室クローニングによって、配列のインシリコ予測によって導き出された。全長のＤＮＡ配列、もしくはその配列の一部のいずれか、またはその両方をカバーするｃＤＮＡフラグメントをクローニングした。インシリコ予測は、Ｃｕｒａｇｅｎ所有配列データベースまたは公共のヒト配列データベースで利用可能な配列に基づき、そして全長ＤＮＡ配列、またはそのいくつかの部分のいずれかを提供した。
【０２４４】
エキソン連結：ＣＧ５２２７６−０４配列についてコードするｃＤＮＡを、プライマー：　５’ＧＴＣＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＡＧＡＡＴ　３’（配列番号６５）および５’ＴＴＴＴＣＴＣＡＧＧＡＣＣＡＡＧＴＴＴＡＴＴＧＣＡＧＧ　３’（配列番号６６）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってクローニングした。プライマーを本発明のｃＤＮＡ／タンパク質配列の全長またはいくつかの部分（１つ以上のエキソン）についてのインシリコ予測に基づいて設計した。これらのプライマーを用いて、以下の組織由来の発現されるヒト配列を含むプールからｃＤＮＡを増幅した：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、および子宮。
【０２４５】
複数のクローンを配列決定し、そしてこれらのフラグメントを一緒に（時折、公共のヒト配列を含む）、各アセンブリについてコンセンサス配列を生成するバイオインフォマティクスのプログラムを用いて、アセンブルした。各アセンブリは、ＣｕｒａＧｅｎ社のデータベースに含まれる。配列は、別の成分との同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％であった場合、アセンブリのための成分として含まれた。各アセンブリは、遺伝子またはその一部を示し、そして改変体（例えば、スプライス形態一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入、欠失および他の配列変化）における情報を含む。
【０２４６】
物理的クローン：エキソン連結によって得られたＰＣＲ産物（全オープンリーディングフレームをカバーする）を、クローン９０８１６：：３２７７７８９．６９８４８２．Ｃ４．を提供するＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｐＣＲ２．１ベクター中にクローニングした。
【０２４７】
改変体配列もまた、本願に含まれる。改変体配列は、一塩基多型（ＳＮＰ）を含み得る。ＳＮＰを、いくつかの場合、ＳＮＰを含むヌクレオチド配列がｃＤＮＡとして起源することを示す「ｃＳＮＰ」として称し得る。ＳＮＰをいくつかの方法で生じ得る。例えば、ＳＮＰは、多型部位で１つのヌクレオチドを別のヌクレオチドに置換するのに起因し得る。このような置換は、転位またはトランスバーションのいずれかであり得る。ＳＮＰはまた、参照対立遺伝子に関連して、ヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの挿入から生じ得る。この場合、多型部位は、１つの対立遺伝子が別の対立遺伝子中の特定のヌクレオチドに関するギャップを保有する部位である。遺伝子中に生じるＳＮＰは、ＳＮＰの位置でこの遺伝子によってコードされるアミノ酸の変更を生じる得る。ＳＮＰを含むコドンが遺伝子コードの重複性の結果として同じアミノ酸をコードする場合、遺伝子内ＳＮＰはまた、サイレントであり得る。遺伝子の領域の外側、または遺伝子内のイントロンに生じるＳＮＰは、タンパク質のアミノ酸配列に変化を生じないが、発現パターンの変更された調節を生じ得る。例としては、一時的な発現の変化、生理学的応答調節、細胞型発現調節、発現の強度、転写されたメッセージの安定性が挙げられる。
【０２４８】
新規レチノイン酸応答様遺伝子についてのＤＮＡ配列およびタンパク質配列を、エキソン連結によって得、そしてＮＯＶ８ｃ（ＣｕｒａＧｅｎ登録番号ＣＧ５２２７６−０４）として本明細書で報告する。
【０２４９】
２６２０ｂｐの開示されたＮＯＶ８ｃ核酸（配列番号３１）を表８Ｅに示す。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド２４〜２６で開始し、ヌクレオチド２０２５〜２０２７で終わることが同定された。オープンリーディングフレームの開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＧＡ）を太字で強調する。推定非翻訳領域は、存在する場合、下線が引かれている。
【０２５０】
【表７５】
2004512821.tif 000096
配列番号３１によってコードされるＮＯＶ８ｃタンパク質は、６６７アミノ酸残基を有し、そして表８Ｆ（配列番号３２）において１文字コードを用いて示される。レチノイン酸応答性タンパク質様タンパク質についてのＳｉｇｎａｌＰ、ＰｓｏｒｔおよびＨｙｄｒｏｐａｔｈｙプロフィールは、この配列が、シグナルペプチドを有し、そして０．６０００の確実度で原形質膜に局在する傾向にあることが予測される。ＮＯＶ８ｂまた、ゴルジ体（確実度＝０．４０００）；小胞体（膜）（確実度＝０．３０００）；および微小体（ペルオキシソーム）（確実度＝０．３０００）に局在する傾向にある。最初の８アミノ酸は、ＳｉｇｎａｌＰ結果に基づいたシグナルペプチドとして（すなわち、配列ＡＧＮ−ＱＴにおけるスラッシュの間で）切断される傾向がさらにある。
【０２５１】
【表７６】
2004512821.tif 000097
本発明において開示されたＮＯＶ８ｂは、少なくとも以下の組織に発現される：心臓、甲状腺、リンパ組織、リンパ節、脳、下垂体、側頭葉、子宮頸部、卵巣。発現情報は、ＮＯＶ８ｃの配列の派生物中に含まれる配列（ＣｕｒａＧｅｎ登録番号ＣＧ５２２７６＿０４）の組織供給源から導かれる。ＮＯＶ８ｃは、第１５染色体に対してマッピングする。
【０２５２】
本明細書中で使用される場合、ＮＯＶ８に対する任意の言及は、ＮＯＶ８ａ、ＮＯＶ８ｂ、およびＮＯＶ８ｃを包含する。ＮＯＶ８核酸配列の比較を、表８Ｇに示す。ＮＯＶ８アミノ酸配列の比較を、表８Ｈに示す。
【０２５３】
【表７７】
2004512821.tif 000098
2004512821.tif 000099
2004512821.tif 000100
【０２５４】
【表７８】
2004512821.tif 000101
2004512821.tif 000102
有意な結果を生じたＢＬＡＳＴ分析を、表８Ｉに列挙した。開示されたＮＯＶ８タンパク質は、多数のＳｔｒａ６様タンパク質およびレチノイン酸応答様タンパク質との良好な同一性を有する。
【０２５５】
【表７９】
2004512821.tif 000103
この情報は、ＮＯＶ８と関連するタンパク質配列とを比較するＣｌｕｓｔａｌＷ分析として、表８Ｊ（ＮＯＶ８ａがライン１に示され、ＮＯＶ８ｂがライン２に示され、そしてＮＯＶ８ｃがライン３に示される）に与えられる複数の配列整列において模式的に提供されている。
【０２５６】
（表８Ｊ．ＣｌｕｓｔａｌＷタンパク質についての情報）
【０２５７】
【表８０】
2004512821.tif 000104
2004512821.tif 000105
2004512821.tif 000106
2004512821.tif 000107
他のＢＬＡＳＴ結果は、Ｐａｔｐデータベースからの配列を含み、このＰａｔｐデータベースは、特許および特許出願において公開された配列を含む独自のデータベースである。Ｐａｔｐ結果は、表８Ｋに列挙されるものを含む。
【０２５８】
【表８１】
2004512821.tif 000108
例えば、ｐａｔｐ：ＡＡＢ５３２５６（１７８アミノ酸ヒト結腸癌抗原タンパク質　（ＷＯ／５５３５１））に対するＢＬＡＳＴは、良好な同一性を示した（Ｅ＝６．１ｅ−８３）。さらに、ｐａｔｐ：ＡＡＷ８８５５９（Ｈｏｍｏ　Ｓａｐｉｅｎｓ由来の遺伝子２６クローンＨＴＤＡＦ２８（ＷＯ９８／５４９６３）によってコードされる８８アミノ酸分泌タンパク質）に対するＢＬＡＳＴもまた、良好な同一性を示した（Ｅ＝１．５ｅ−４０）。
【０２５９】
レチン酸は、標的遺伝子の発現を調節することによって、発達、増殖および分化において重要な役割を果たす。新規なレチン酸誘導遺伝子であるＳｔｒａ６は、差し引きハイブリダイゼーションｃＤＮＡクローニング技術を使用して、Ｐ１９胎生期癌細胞において同定されている。Ｓｔｒａ６は、新しい型の非常に疎水性の膜タンパク質をコードし、これは、以前に特徴付けられた内在性膜タンパク質との類似性を示さない。Ｓｔｒａ６（これは、発生の間および成体において発現の特定のパターンを示す）は、血液−器官関門のレベルで強力に発現される。興味深いことには、精巣セルトーリ細胞において、Ｓｔｒａ６は、精子形成サイクル依存性発現を有し、これは、精巣において、ＲＡＲαヌル変異体の精巣において失われており、ここで、Ｓｔｒａ６は、全ての細管において発現される。このＳｔｒａ６タンパク質は、現在のところ同定されていない輸送機構の成分であり得る。一般的には、Ｍｅｃｈ　Ｄｅｖ　６３（２）：１７３−８６（１９９７）；ＰＭＩＤ：９２０３１４０，ＵＩ：９７３４６７２３を参照のこと。
【０２６０】
差示的差し引きハイブリダイゼーションクローニング技術を使用して、Ｓｔｒａ６は、近年、マウスＰ１９胎生期癌細胞における新規なレチン酸誘導遺伝子として同定されている。Ｓｔｒａ６の推定アミノ酸配列は、以前に特徴付けされたタンパク質との類似性を示さない。インサイチュハイブリダイゼーションによって明らかにされるように、マウス四肢発達の間に、Ｓｔｒａ６転写物の発現のパターンが報告されている。交尾後の日数（ｄｐｃ）８．５〜９．０の胚において、Ｓｔｒａ６は、肢芽成長の前に、外側板間葉において発現された。９．５ｄｐｃまでに、発現を、近位および背側前肢芽中胚葉に制限した。次の２日間の妊娠日にわたって、Ｓｔｒａ６発現は、最も遠位の領域または進行ゾーンを除いて、未分化の前肢芽および後肢芽の背側中胚葉に特異的であった。しかし、新規な近位腹側発現ドメインが、１１．０〜１１．５ｄｐｃまでに現れた。Ｓｔｒａ６はまた、側腹部中胚葉において発現されたままであった。１１．５〜１３．５ｄｐｃから、Ｓｔｒａ６発現が、軟骨形成芽体位を取り囲む表在性間葉に限定され、そして進行ゾーンの消失の際に四肢の遠位末端まで次第に延びた。軟骨膜および発達する筋肉に対するＳｔｒａ６発現の進行的制限は、１３．５〜１４．５ｄｐｃで見られた。軟骨内骨化の開始（１５．５〜１６．５ｄｐｃ）の際に、Ｓｔｒａ６発現が、高い代謝活性および増殖活性の細胞の反対側の軟骨膜の範囲（伸長ゾーン）に制限された。このことは、Ｓｔｒａ６が、最初は、背腹方向の四肢パターン形成において、そして後には、軟骨内骨化の制御において役割を果たし得ることを示唆する。一般的には、Ｄｅｖ　Ｇｅｎｅｔ　１９（１）：６６−７３（１９９６）；ＰＭＩＤ：８７９２６１０，ＵＩ：９６３８４７２６を参照のこと。
【０２６１】
Ｆ９胎生期癌細胞におけるレチン酸レセプター（ＲＡＲ）γの破壊は、いくつかの全てトランスのレチン酸（ＲＡ）誘導遺伝子の異常な分化および遺伝子の発現の減少した活性化に導く。ＲＡＲα−およびＲＡＲγ−Ｆ９ヌル細胞におけるいくつかのさらなるＲＡ応答性遺伝子の発現を、分析した。Ｃｄｘ１、Ｇａｐ４３、Ｓｔｒａ４、およびＳｔｒａ６のＲＡ誘導活性化が、ＲＡＲγ−ヌル細胞において特異的に損なわれ、このことは、各ＲＡＲが、標的遺伝子の別個のサブセットを調節し得るという考えを支持する。Ｆ９細胞分化におけるＲＡＲγの役割をさらに調べるために、ＲＡＲγ２を再発現するかまたはＲＡＲα１もしくはＲＡＲβ２のいずれかを過剰発現する「レスキュー」細胞株が、ＲＡＲγ−ヌル細胞において確立された。ＲＡＲγの再発現またはＲＡＲαの過剰発現は、標的遺伝子活性化および分化の可能性の両方を、回復した。対照的に、ＲＡＲβの過剰発現は、分化を不十分に回復したのみであるが、それは、標的遺伝子の活性化について、ＲＡＲγを置換し得る。一般的には、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９２（１７）：７８５４−５８（１９９５）；ＰＭＩＤ：７６４４５０３，ＵＩ：９５３７２３７７を参照のこと。
【０２６２】
発癌は、増殖、分化およびアポトーシスの正常な制御の不活性化または破壊に関係する（Ｈｕｒｓｔら、Ａｄｖ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ　Ｂｉｏｌ　４６２：４４９−６７（１９９９））。しかし、これらの制御は、遺伝子発現レベル、ｍＲＮＡ寿命の調節、転写、およびタンパク質のリサイクリングにおいて、強力で、重複し、そして連結されている。増殖、分化、およびアポトーシスの制御の中央系の１つは、レチノイドシグナル伝達である。このｈＲＡＲα核レセプターは、適切なレチノイドリガンドに結合される場合に、そのホモダイマーおよびｈＲＸＲαとのヘテロダイマーが、レチノイド応答性遺伝子の多くの転写を調節する点で、遺伝子転写の誘導に関して中心的位置を占める。これらは、他のシグナル伝達経路における遺伝子を含み、その結果、その全てが、複雑なネットワークを形成する。中心的な調節事象であるｈＲＡＲα遺伝子転写に関して、単純な、因果解釈は、レチノイド応答性遺伝子ネットワークを記述しないことが示された。
【０２６３】
膀胱腫瘍形成の異なる段階を表す、一連の培養された膀胱由来の細胞は、モデル系を形成した。これは、２つの不死化膀胱細胞株（ＨＵＣ−ＢＣおよびＨＵＣ−ＰＣ）、１つの扁平上皮細胞癌細胞株（ＳＣａＢＥＲ）、１つのパピローマ株（ＲＴ４）、および４つの転移性細胞癌（ＴＣＣ−Ｓｕｐ，５６３７，Ｔ２４，Ｊ８２）（種々の段階および程度）からなった。このセットの細胞は、膀胱癌の挙動の範囲をモデル化するために使用された。１０μＭの全てトランスのレチン酸（ａＴＲＡ）での処理の前（構成的）および後の相対的な遺伝子発現を、アンドロゲンおよびエストロゲンレセプター；レチノイド代謝および作用に関係する一連の遺伝子、ｈＲＡＲαおよびβ、ｈＲＸＲαおよびβＣＲＢＰ、ＣＲＡＢＰ　ＩおよびＩＩ；ならびにレチン酸、ＥＧＦＲ、サイトカインＭＫ、ＩＣＡＭ　Ｉおよびトランスグルタミナーゼに応答性であることが知られているシグナル伝達遺伝子について測定した。増殖の阻害についての表現型ならびにａＴＲＡおよび合成レチノイド４−ＨＰＲの両方に対するアポトーシス的な応答性についての表現型を決定した。ＴＲＡ感受性プロモーターを含むＣＡＴ含有プラスミドでのトランスフェクションを使用して、遺伝子発現のレチノール調節についての共通レチン酸応答性エレメント（ＲＡＲＥ）依存性経路が活性化か否かを決定した。選択された各遺伝子は、以前の研究から、メッセージおよびタンパク質の上方制御または下方制御のいずれかによって、特定の様式でａＴＲＡと反応することが知られている。単純な原因および効果によって容易に解釈可能ではない複雑なデータの組を観察した。
【０２６４】
すべての細胞株は、外因性ａＴＲＡでの処理によって変更されなかったｈＲＸＲαおよびβについて高いレベルでｍＲＮＡを発現したが、他の遺伝子の構成的および刺激的な応答は、細胞株の間で広範に変化した。例えば、ＣＲＡＢＰ　Ｉは、Ｊ８２、Ｔ２４、５６３７およびＲＴ４によって発現されなかったが、ＳＣａＢＥＲにおいて低レベル（これは変化しない）で発現され、そしてＨＵＣ−ＢＣ、ＴＣＣ−ＳｕｐおよびＨＵＣ−ＰＣにおいて、各々、減少、増加、または急激に減少する中程度のレベルで発現された。ｈＲＡＲαの発現（これは、多くのレチノイド感受性遺伝子の発現を支配する）は、すべての細胞株において中程度〜高いレベルで発現されたが、いくつかの場合において、それは、急激に上方制御されたか（ＴＣＣ−Ｓｕｐ、ＨＵＣ−ＰＣおよびＪ８２）、一定のままであったか（５６３７およびＨＵＣ−ＢＣ）、または下方制御された（ＳＣａＢＥＲ、Ｔ２４およびＲＴ４）。増幅の阻害についての表現型は、いずれの単一遺伝子の発現に対しても明確な関係を示さなかったが、ＴＲＡ（ＨＵＣ−ＢＣおよびＴＣＣ−Ｓｕｐ）によって阻害された細胞株は、４−ＨＰＲに対する感受性を示さず、そしてその逆もまたそうであった。１つの株（ＲＴ４）は、いずれのレチノイドに対しても非感受性であった。トランスフェクションは、ＲＴ４またはＨＵＣ−ＰＣでのＣＡＴレポーター遺伝子のレチノイド刺激トランスフェクションをほとんど示さなかった。約２倍の増強トランス活性化を、ＳＣａＢＥＲ、ＨＵＣ−ＢＣ、Ｊ８２およびＴ２４細胞で観察し、そして３〜８倍のトランス活性化を、５６３７、ＴＣＣ−Ｓｕｐ細胞で観察した。ＨＵＣ−ＢＣにおいて、ＧからＴへの点変異が、ｈＲＡＲα遺伝子の６０６位に見出された。この変異は、高度に保存されたドメインにおいて、アスパラギンをチロシンに置換する。
【０２６５】
これらのデータは、レチノイドシグナル伝達が、おそらく、膀胱発癌における不活性化の頻繁な標的であることを示す。ヒト膀胱癌およびＳＶ４０不死化尿路上皮性細胞株におけるレチノイドシグナル伝達経路の存在および機能性を試験した。（Ｗａｌｉｓｚｅｗｓｋｉら；Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　１４８（１−２）：５５−６５（１９９９）を参照のこと）。８つの細胞株のうちの２つのみが、全てトランスのレチン酸または１３−シス−レチン酸のいずれかの１０μＭによって増殖阻害された。レチノイド応答性エレメントの制御下でのＣＡＴ遺伝子のトランス活性化は、感受性細胞株および６つの耐性細胞株のうちの４つの両方におけるシグナル伝達経路の機能性を立証した。レチノイド応答性および誘導性遺伝子のパネルの相対的なＲＴ−ＰＣＲ分析は、多くの異常調節不全とともに、レチン酸処理に応答して、全ての遺伝子の発現レベルの変化を立証した。
【０２６６】
レチノイドシグナル伝達は、カップリングしていない遺伝子発現、増殖および分化による腫瘍形成間の不活性化についての標的であり得る。従って、レチノイドは、膀胱癌の処置についてよりも、化学防御について有効であるようである。レチノイドの増殖性効果を、ＭＣ−２６およびＬｏＶｏ結腸腺癌細胞株において試験した（Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｅｘｐ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ　２３３（２）：３２１−２９（１９９７）を参照のこと）。ＬｏＶｏ細胞株の増殖は、レチノイドである全てトランスのレチン酸（ａｔＲＡ）および９−シス−レチン酸（９−シス−ＲＡ）の存在下で変化しなかった。しかし、両方のレチノイドは、細胞増殖によって測定されるように、ＭＣ−２６細胞の増殖を刺激した。ａｔＲＡおよび９−シス−ＲＡは、ＭＣ−２６細胞増殖の増加において、等しい効力を有し、これは、増殖刺激が、１以上のレチン酸レセプター（ＲＡＲ）によって媒介されることを示唆する。ＲＡＲ（これは、この増殖刺激効果についての原因であり得る）を決定するために、ＲＡＲサブタイプ（これは、両方の細胞株に存在する）を、特徴付けした。ＲＡＲα、ＲＡＲβ、およびＲＡＲγについてのｍＲＮＡを、ＭＣ−２６細胞において検出した。ＭＣ−２６細胞に存在するＲＡＲのうちで、ＲＡＲαは、レチノイドの増殖刺激効果を媒介しない。なぜなら、そして選択的ＲＡＲαアンタゴニストは、ＭＣ−２６細胞増殖におけるレチノイド誘導増加を妨げることができなかったからである。ＲＡＲα、ＲＡＲβおよびＲＡＲγ　ｍＲＮＡはまた、ＬｏＶｏ細胞株において発現され；従って、ＬｏＶｏ細胞におけるレチノイドによる増殖刺激の欠如は、ＲＡＲの非存在には起因しないようである。
【０２６７】
これらの実験によって得られた結果は、レチノイドによって惹起された増殖応答が、結腸癌細胞の間で変化し得、そして応答における差異が、結腸癌細胞株において発現されるＲＡＲサブタイプによって単独で決定されなくてもよいことを実証する。
【０２６８】
レチン酸（ＲＡ）（これは、増殖および分化の十分に特徴付けられた調節因子である）は、小泡甲状線癌細胞株（ＦＴＣ−１３３、ＦＴＣ−２３８、およびＨＴＣ−ＴＳＨｒ）、ならびにＳＶ４０でトランスフェクトされた不死化甲状腺細胞株（ｏｒｉ３および７７５１）を部分的に再分化する（Ｓｃｈｍｕｔｚｌｅｒら、Ｅｘｐ　Ｃｌｉｎ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　１０４　補遺４：１６−１９（１９９６）を参照のこと）。これは、Ｉ型５’−脱ヨウ素酵素および他の分化マーカーの刺激によって示される。ＲＴ−ＰＣＲ、電気泳動移動度シフト、および［３Ｈ］−レチン酸結合アッセイによって実証されるように、甲状腺癌細胞株は、ＲＡレセプターｍＲＮＡならびに機能的リガンド−およびＤＮＡ−結合レセプタータンパク質（ＲＡ依存性シグナル伝達を媒介し得る）を発現する。また、これらの特性は、これらの甲状腺由来細胞株を、甲状腺癌のＲＡ再分化治療の効果を研究するための有用なインビトロモデルにする。
【０２６９】
化学療法剤である、レチン酸（ＲＡ）は、多くの腫瘍型の増殖および侵入を阻害する（Ｖｏら；Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　１８（１Ａ）：２１７−２４（１９９８）を参照のこと）。頭部および頚部の扁平上皮癌（ＳＣＣ）患者におけるＲＡ化学療法は、前悪性病変の再発を減少させ、そして前悪性病変の後退を誘導する。ＲＡの効果は、細胞質タンパク質および核タンパク質の両方によって媒介される。核において、リガンド依存的転写因子のファミリー、レチン酸レセプター（ＲＡＲ）およびレチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）は、ＲＡに対する標的遺伝子応答を調節する。細胞質において、細胞性レチン酸結合タンパク質ＩおよびＩＩ（ＣＲＡＢＰ）は、細胞内ＲＡ濃度、輸送、および代謝を調節する。ＣＲＡＢＰ発現における変化は、癌細胞の標的遺伝子応答および表現型に影響することが示されている。
【０２７０】
ＲＡ応答を媒介する際のこれらのタンパク質の役割を解明するために、アンチセンスＣＲＡＢＰ　ＩＩ構築物を発現するＳＣＣ２５細胞における標的遺伝子発現および悪性表現型を試験した。ＲＡ誘導ＣＲＡＢＰ　ＩＩ　ｍＲＮＡレベルは、転写上方制御によって、ＳＣＣ２５細胞において２倍である。アンチセンス構築物の発現は、検出可能ではないレベルにＣＲＡＢＰ　ＩＩ発現を減少させた。ＣＲＡＢＰ　ＩＩ発現の阻害は、ＲＡ応答性遺伝子の有意な下方制御を生じた。これらの減少は、ＲＡ応答性プロモーターからの減少した転写の結果であった。驚くべきことに、アンチセンスＣＲＡＢＰ構築物を発現するクローンは、増殖のＲＡ媒介阻害にあまり感受性でなかった。これらのクローンはまた、マトリックスメタロプロテイナーゼ活性の下方制御におそらく起因して、インビトロ侵襲性アッセイにおいてあまり侵襲性ではなかった。
【０２７１】
ＣＲＡＢＰ　ＩＩは、ＲＡ応答性遺伝子の転写に影響を与え、この遺伝子は、頭部および頚部ＳＣＣの増殖および侵襲を調節する。全てトランスのレチン酸（トランス−ＲＡ）および他のレチノイドは、レチノイドレセプター、ＲＡレセプター（ＲＡＲ）およびレチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）の２つの型を通して抗癌効果を発揮する（Ｗｕら；Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１７（１１）：６５９８−６０８（１９９７）を参照のこと）。以前の研究は、トランス−ＲＡおよび関連するレチノイドの増殖阻害効果が、特定のＲＡＲαおよびＲＡＲβのそれらの低いレベルに起因して、特定のエストロゲン非依存性乳癌細胞株において損なわれることを実証した。この研究において、本発明者らは、トランス−ＲＡ感受性およびトランス−ＲＡ耐性乳癌細胞株の両方における増殖阻害およびアポトーシスを誘導するそれらの能力についていくつかの合成レチノイドを評価した。特にＲＡＲ選択的レチノイドと組合せた、ＲＸＲ選択的レチノイドは、有意に、ＲＡＲβを誘導し得、そしてトランス−ＲＡ−耐性細胞、ＲＡＲα欠損ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖を阻害し、そしてこれらのアポトーシスを誘導し得るが、高いレベルのＲＡＲαを発現するトランスＲＡ感受性ＺＲ−７５−１に対して低い活性を有した。ゲル遅延アッセイおよび一過性トランスフェクションアッセイを使用して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するＲＸＲ選択的レチノイドの効果は、ＲＡＲβプロモーターにおけるＲＡ応答性エレメントに結合し、そしてＲＸＲ選択レチノイドに応答してＲＡＲβプロモーターを活性化するＲＸＲ−ｎｕｒ７７ヘテロダイマーによって、おそらく媒介された。対照的に、トランス−ＲＡ感受性のＲＡＲα発現細胞におけるＲＡＲ選択的レチノイドによる増殖阻害は、おそらく、ＲＡＲβプロモーターにまた結合しそしてＲＡＲβプロモーターを活性化するＲＸＲ−ＲＡＲαへテロダイマーによって生じた。ＲＡＲαを安定に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１クローンにおいて、ＲＸＲ選択的レチノイドによるＲＡＲβ誘導および増殖阻害の両方は抑制されたが、ＲＡＲ選択的レチノイドの効果は増加された。また、これらの結果は、ＲＸＲの活性化が、トランス−ＲＡ−耐性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞の増殖を阻害し得ることを実証し、そして低い細胞ＲＡＲαが、乳癌細胞におけるＲＸＲ媒介増殖阻害へのＲＡＲ媒介増殖阻害からのシグナル伝達スイッチを調節し得ることを示唆する。
【０２７２】
本明細書中に開示されるタンパク質類似性情報、発現パターン、およびレチン酸応答性タンパク質様タンパク質および核酸についてのマップ位置は、このレチン酸応答性タンパク質がレチン酸応答性タンパク質ファミリーの特徴である重要な構造的および／または生理学的機能を有し得ることを示唆する。従って、本発明の核酸およびタンパク質は、潜在的な診断適用および治療適用において有用であり、そして研究ツールとして有用である。これらは、特定のまたは選択的核酸またはタンパク質診断および／または予防マーカーとして機能すること（ここで、核酸またはタンパク質の存在または量が評価される）、ならびに以下のような潜在的な治療適用を含む：（ｉ）タンパク質治療剤、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療的、診断的、薬物標的化／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療に有用な核酸（遺伝子送達／遺伝子切除）、ならびに（ｖ）インビボおよびインビトロで組織再生を促進する組成物、（ｖｉ）生物学的防御武器。
【０２７３】
本発明の核酸およびタンパク質は、以下に記載される種々の疾患および障害、ならびに／または他の病状に関係する潜在的な診断適用および治療適用において有用である。例えば、本発明の組成物は、以下を被る患者の処置についての効力を有する：炎症、自己免疫疾患、老化、癌、心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、先天性心疾患、大動脈狭窄症、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠陥、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満症、移植、糖尿病、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、膵炎、肥満、子宮内膜症、受胎能、血友病、凝固亢進、特発性血小板減少性紫斑病、免疫不全、対宿主性移植片病、自己免疫疾患、腎動脈狭窄、間質性腎炎、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎疾患、全身性エリテマトーデス、尿細管性アシドーシス、ＩｇＡ腎症、高カルシウム血症、レッシュ−ナイハン、ならびに他の疾患、障害および状態。
【０２７４】
ＮＯＶ８タンパク質をコードする新規な核酸、本発明のＮＯＶ８タンパク質、またはそのフラグメントは、さらに、診断適用において有用であり得、ここで、核酸またはタンパク質の存在または量が、評価され得る。これらの物質は、治療または診断方法における用途のために、本発明の新規な物質に免疫特異的に結合する抗体の生成においてさらに有用である。
【０２７５】
ＮＯＶ８タンパク質をコードする新規な核酸、本発明のＮＯＶ８タンパク質、またはそのフラグメントは、さらに、診断適用において有用であり得、ここで、核酸またはタンパク質の存在または量が、評価され得る。これらの物質は、治療または診断方法における用途のために、新規なＮＯＶ８物質に免疫特異的に結合する抗体の生成においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるような、疎水性チャートからの予測を使用して、当該分野で公知の方法に従って、産生され得る。例えば、開示されるＮＯＶ８ａおよびＮＯＶ８ｂタンパク質は、複数の親水性領域を有し、これらの各々は、免疫原として使用され得る。例えば、親水性領域は、以下に見出される：約アミノ酸５〜約アミノ酸５０；約アミノ酸８０〜約アミノ酸１００；約アミノ酸１８０〜約アミノ酸１９０；約アミノ酸２１０〜約アミノ酸２８０；約アミノ酸３４５〜約アミノ酸３５０；約アミノ酸３９０〜約アミノ酸４１０；約アミノ酸４９０〜約アミノ酸５００；約アミノ酸５４０〜約アミノ酸５６０；および約アミノ酸５９５〜約アミノ酸６３０。これらの新規なタンパク質はまた、機能分析のためのアッセイ系を開発するために使用され得る。
【０２７６】
（ＮＯＶ９）
ＮＯＶ９は、ゲノムＤＮＡ配列によってコードされる新規なタンパク質およびそれに類似するタンパク質を含み、すなわち、甲状腺調節遺伝子によってコードされるタンパク質（ＴＲＧ様タンパク質）に対する配列類似性を有する新規なタンパク質を含む。
【０２７７】
新規な核酸は、ＧｅｎＢａｎｋによって入手可能なであるか、または個々の配列決定センターからダウンロードされたファイルからのＧｅｎｏｍｉｃ　Ｄａｉｌｙ　Ｆｉｌｅｓに対して実行されるようなＴＲＧまたはホモログについてのＣｕｒａＧｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの配列ファイルを使用してＴｂｌａｓｔＮによって、第１４染色体上に同定された。この核酸配列を、公知のＴＲＧまたはホモログに対する相同性によって、ゲノムファイルＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＬ０４９８７０から予測した。エキソンを、相同性によって予測し、そしてイントロン／エキソン境界を、標準的な遺伝子規則を使用して決定した。エキソンをさらに、複数のＢＬＡＳＴ（例えば、ｔＢｌａｓｔＮ、ＢｌａｓｔＸ、およびＢｌａｓｔＮ）検索、およびいくつかの場合においてＧｅｎｅＳｃａｎおよびＧｒａｉｌを使用する類似性決定によって、選択し、そして洗練した。公的なデータベースおよび独自のデータベースの両方からの発現された配列がまた、遺伝子配列をさらに規定しそして完全にするために利用可能である場合に、追加された。次いで、このＤＮＡ配列を、明らかな不一致について手動で修正し、それによって、全長タンパク質をコードするＳＣ１０８３４１９６７＿Ａ（ＮＯＶ９）と称される配列を得た。
【０２７８】
ＣｕｒａＧｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの独自のヒト発現配列アセンブリデータベースの検索において、アセンブリ１０８３４１９６７（５５２ヌクレオチド）を、この推定遺伝子配列に対する９５％より大きい相同性を有するとして同定した。ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇは、サンプル中のｍＲＮＡ種を規格化する差示的発現および配列決定手順であり、１９９９年１０月１３日に出願された、米国特許出願番号０９／４１７，３８６に開示される（これは、その全体が参考として援用される）。このデータベースは、９６より多い組織からの発現された配列（単離されたｍＲＮＡ由来のような）から構成される。このｍＲＮＡは、ｃＤＮＡに変換され、次いで配列決定される。これらの発現されたＤＮＡ配列は、次いで、データベースにプールされ、そして規定されたレベルの相同性を示すものを、共通のコンセンサス配列を有する単一のアセンブリに組み込まれる。これらのコンセンサス配列は、全てのメンバー成分の代表である。開示されたＮＯＶ９核酸は、ＣｕｒａＧｅｎアセンブリと９５％より大きい配列同一性を有するので、本発明の核酸は、発現された遺伝子配列を表す。このＤＮＡアセンブリは、１０の構成要素を有する。
【０２７９】
開示された新規なＮＯＶ９核酸は、１４７６ヌクレオチド長であり、そして表９Ａ（配列番号３３）に示される。ＯＲＦは、ヌクレオチド１〜３のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド１４７４〜１４７６のＴＡＡコドンで終了する。開始コドンおよび終止コドンは、表９Ａにおいて太文字になっている。
【０２８０】
【表８２】
2004512821.tif 000109
配列番号３３によってコードされる開示されたＮＯＶ９タンパク質は、４９１アミノ酸残基を有し、そして表９Ｂ（配列番号３４）に一文字表記を使用して、提供される。ＮＯＶ９についてのＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙプロフィールは、ＮＯＶ９が、シグナルペプチドを有し、そして０．４５５５の確実度で、糸粒体基質空間に局在化しているようであることを予測する。ＳＩＧＮＡＬＰ分析を使用して、本発明のタンパク質が、配列ＣＳＬＡＫＳＹＡ−ＳＩの残基４９と５０との間におそらく切断部位を有するシグナルペプチドを有することが予測される。
【０２８１】
ＮＯＶ９は、少なくとも以下の組織において発現されることが見出された：精巣、子宮、神経系、リンパ系、および筋肉。
【０２８２】
【表８３】
2004512821.tif 000110
開示されたＮＯＶ９タンパク質（配列番号３４）は、ＴＲＧファミリーのメンバーと良好な同一性を有する。ＣｌｕｓｔａｌＷ分析のために使用された同一性の情報を、表９Ｃに示す。
【０２８３】
【表８４】
2004512821.tif 000111
この情報は、ＮＯＶ９と関連するタンパク質配列とを比較するＣｌｕｓｔａｌＷ分析として、表９Ｄ（ＮＯＶ９がライン１に示される）に与えられる複数の配列整列において模式的に提供されている。
【０２８４】
（表９Ｄ．ＣｌｕｓｔａｌＷタンパク質についての情報）
【０２８５】
【表８５】
2004512821.tif 000112
2004512821.tif 000113
2004512821.tif 000114
2004512821.tif 000115
2004512821.tif 000116
他のＢＬＡＳＴ結果としては、Ｐａｔｐデータベース（これは、特許および特許刊行物中で公開された配列を含む特許データベースである）由来の配列が挙げられる。Ｐａｔｐ結果としては、表９Ｅに列挙されるものが挙げられる。
【０２８６】
【表８６】
2004512821.tif 000117
例えば、Ｐａｔｐ：ＡＡＢ６４３７８（Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ由来の７４７アミノ酸のヒト細胞内シグナル伝達分子（ＩＮＴＲＡ１０）（ＷＯ００／７７０４０））に対するＢＬＡＳＴは、良好な同一性（Ｅ＝１．２ｅ−２０８）を生成した。
【０２８７】
上記のように、開示されたＮＯＶ９タンパク質は、ヒト細胞内シグナル伝達分子と良好な同一性を示した。（ＷＯ００／７７０４０を参照のこと）。このような細胞内シグナル伝達分子は、細胞の増殖障害、自己免疫障害、炎症障害、神経障害、胃腸障害、生殖障害、および発生障害の診断、予防、および処置に有用であり得る。細胞内シグナル伝達分子の調節因子は、免疫抑制活性、細胞増殖抑制活性、神経保護活性、向精神性（ｎｏｏｔｒｏｐｉｃ）活性、抗動脈硬化活性、抗炎症活性、抗ＨＩＶ活性、神経弛緩活性、抗菌活性、抗真菌活性、抗ウイルス活性、抗寄生虫活性、抗蠕虫活性、および抗パーキンソン症候群活性を示す。異常な細胞内シグナル伝達分子の発現または活性に関連する障害としては、細胞増殖性障害（例えば、動脈硬化症および癌）；自己免疫障害または炎症障害（例えば、アディソン病およびＡＩＤＳ）；ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、寄生虫感染、原生動物感染、および蠕虫感染；胃腸障害（例えば、えん下障害および感応性腸症候群）；神経学的障害（例えば、癲癇およびパーキンソン病）；ならびにプリオン疾患（例えば、クロイツフェルト−ヤーコプ病）および精神障害（例えば、不安、精神分裂病およびツレット障害）が挙げられる。
【０２８８】
この遺伝子およびそのファミリーのメンバーの発現バターン、ならびにこれらの遺伝子のＴＲＧファミリーに対するその類似性は、これらがＴＲＧファミリーのタンパク質として機能し得ることを示唆する。従って、本明細書中に同定された新規核酸およびタンパク質は、以下に示される種々の病状および障害（これらに限定されない）に関与する潜在的な治療適用に有用であり得る。本発明に関する潜在的な治療適用としては、タンパク質治療、低分子薬物標的、抗体標的（治療抗体、診断抗体、薬物標的化／細胞傷害性抗体）、診断マーカーおよび／または予後マーカー、遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子除去）、研究ツール、本明細書中に規定されるもの（これらに限定されない）を構成する全ての組織および細胞型のインビボおよびインビトロにおける組織再生が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８９】
本発明の核酸およびタンパク質は、甲状腺機能低下症および甲状腺機能亢進症、甲状腺障害、甲状腺関連癌を含むがこれらに限定されない癌、ならびに／または他の病理および障害に関与する潜在的な治療適用に有用である。例えば、ＴＲＧ様タンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に有用であり得、そしてＴＲＧ様タンパク質は、それらを必要とする被験体に投与される場合に有用であり得る。非限定の例として、本発明の組成物は、甲状腺機能低下症および甲状腺機能亢進症、甲状腺障害、甲状腺関連癌を含むがこれに限定されない癌を患う患者の処置において効力を有する。本発明のＴＲＧ様タンパク質をコードする新規核酸および本発明のＴＲＧ様タンパク質、またはこれらのフラグメントはさらに、診断適用に有用であり得、ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価される。これらの材料はさらに、治療方法または診断方法における使用のために、本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の生成において有用である。
【０２９０】
これらの材料はさらに、治療方法または診断方法における使用のために、新規ＮＯＶ９物質に免疫特異的に結合する抗体の生成において有用である。これらの抗体は、疎水性チャートからの推定を用いて、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるように、当該分野で公知の方法に従って作製され得る。
【０２９１】
（ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチド）
本発明の１つの局面は、ＮＯＶＸポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分をコードする、単離された核酸分子に関する。また、ＮＯＶＸをコードする核酸（例えば、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用について十分な核酸フラグメント、ならびにＮＯＶＸ核酸分子の増幅および／または変異のためのＰＣＲプライマーとしての使用のためのフラグメントもまた、本発明に含まれる。本明細書中で使用される場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを使用して作成されるＤＮＡまたはＲＮＡのアナログ、ならびにそれらの誘導体、フラグメントおよびホモログを含むことを意図する。核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡを含む。
【０２９２】
ＮＯＶＸ核酸は、成熟ＮＯＶＸポリペプチドをコードし得る。本明細書中で使用される場合、本発明において開示されるポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態は、天然に存在するポリペプチドまたは前駆体形態またはプロプロテイン（ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）の生成物をいう。天然に存在するポリペプチド、前駆体形態またはプロプロテインとしては、非限定的な例として、対応する遺伝子によりコードされる全長遺伝子産物が挙げられる。あるいは、これらは、本明細書中に開示されるＯＲＦによりコードされるポリペプチド、前駆体またはプロプロテインとして規定され得る。生成物「成熟」形態は、また非限定的な例として、１以上の天然に存在するプロセシング工程（これらがこの遺伝子産物が生じる細胞または宿主細胞内で起こる場合）の結果として生じる。ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態に至るこのようなプロセシング工程の例としては、ＯＲＦの開始コドンによりコードされるＮ末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドもしくはリーダー配列のタンパク質分解切断が挙げられる。従って、残基１〜Ｎ（残基１がＮ末端メチオニンである場合）を有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態は、Ｎ末端メチオニンの除去後に残基２〜Ｎを有する。あるいは、残基１〜Ｎ（ここで、Ｎ末端シグナル配列（残基１〜Ｍ）が切断される）を有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態は、残りの残基Ｍ＋１〜残基Ｎの残基を有する。さらに、本明細書中で使用される場合、ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態は、タンパク質分解切断事象以外の、翻訳後修飾の工程から生じ得る。このようなさらなるプロセスとしては、非限定的な例として、グリコシル化、ミリストイル化またはリン酸化が挙げられる。一般に、成熟ポリペプチドまたはタンパク質は、これらのプロセスの１つのみまたはこれらのうちのいずれかの組み合わせの操作から生じ得る。
【０２９３】
用語「プローブ」とは、本明細書中で使用される場合、種々の長さの核酸配列をいい、好ましくは、特定の用途に依存して、少なくとも約１０ヌクレオチド（ｎｔ）、１００ｎｔ、または例えば、約６，０００ｎｔほどの大きさの間である。プローブは、同一、類似または相補的な核酸配列の検出において使用される。より長いプローブは、通常、天然供給源または組換え供給源から入手され、非常に特異的であり、そしてより長さの短いオリゴマープローブよりもはるかに遅くハイブリダイズする。プローブは、一本鎖または二本鎖であり得、そしてＰＣＲ、膜ベースのハイブリダイゼーション技術、またはＥＬＩＳＡ様の技術において特異性を有するように設計される。
【０２９４】
用語「単離された」核酸分子は、本明細書中で使用される場合、この核酸の天然の供給源中に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、「単離された」核酸は、この核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中でこの核酸に天然に隣接する配列（すなわち、この核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、種々の実施形態において、単離されたＮＯＶＸ核酸分子は、この核酸が由来する細胞／組織（例えば、脳、心臓、肝臓、脾臓など）のゲノムＤＮＡ中でこの核酸分子に天然で隣接する、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含み得る。さらに、「単離された」核酸分子、例えば、ｃＤＮＡ分子は、組換え技術により産生される場合、その他の細胞物質または培養培地を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合、化学物質前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に含まないものであり得る。
【０２９５】
本発明の核酸分子、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３のヌクレオチド配列または上記のヌクレオチド配列の相補体を有する核酸分子は、標準的な分子生物学的技法および本明細書で提供される配列情報を用いて単離され得る。ハイブリダイゼーションプローブとして、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３の核酸配列の全部または一部を使用して、ＮＯＶＸ分子は、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＹ　ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌら、（編）、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３に記載されるように）を用いて単離され得る。
【０２９６】
本発明の核酸は、標準的なＰＣＲ増幅技法に従って、テンプレートとしてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいはゲノムＤＮＡを用い、そして適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅され得る。このように増幅された核酸は、適切なベクター中にクローン化され、そしてＤＮＡ配列分析により特徴付けられ得る。さらに、ＮＯＶＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術、例えば、自動化ＤＮＡ合成機を用いることにより調製され得る。
【０２９７】
本明細書で用いられる場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、一連の連結されたヌクレオチド残基をいい、このオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応で用いられるに十分な数のヌクレオチド塩基を有する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム配列もしくはｃＤＮＡ配列に基づき得るか、またはそれから設計され得、そして特定の細胞もしくは組織において、同一、類似もしくは相補的ＤＮＡまたはＲＮＡを増幅し、確認し、もしくはその存在を示すために用いられる。オリゴヌクレオチドは、約１０ｎｔ、５０ｎｔ、または１００ｎｔの長さ、好ましくは約１５ｎｔ〜３０ｎｔの長さを有する核酸配列の部分を含む。本発明の１つの実施形態では、１００ｎｔより少ない長さの核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、さらに、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、および３３の少なくとも６個連続するヌクレオチド、またはその相補体を含む。オリゴヌクレオチドは、化学的に合成され得、そしてまたプローブとして用いられ得る。
【０２９８】
別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３に示されるヌクレオチド配列またはこのヌクレオチド配列の一部分（例えば、プローブまたはプライマーとして使用され得るフラグメント、あるいはＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードするフラグメント）の相補体である核酸分子を含む。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３に示されるヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３に示されるヌクレオチド配列に対しミスマッチがほとんどまたは全くなく水素結合し得、それによって安定な二本鎖を形成する、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３に示されるヌクレオチド配列に十分相補的な核酸分子である。
【０２９９】
本明細書で用いる場合、用語「相補的」は、核酸分子のヌクレオチド単位間のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成をいい、そして用語「結合」は、２つのポリペプチドまたは化合物または関連ポリペプチドまたは化合物あるいはこれらの組合せ間の物理的または化学的相互作用を意味する。結合は、イオン性、非イオン性、ファンデルワールス性、疎水性相互作用などを含む。物理的相互作用は直接的または間接的かのいずれかであり得る。間接的相互作用は、別のポリペプチドまたは化合物を介するか、またはそれらの効果に起因し得る。直接的結合は、別のポリペプチドもしくは化合物を介して、またはそれらの効果に起因して生じない、その他の実質的な化学的中間体がない相互作用をいう。
【０３００】
本明細書中に提供されるフラグメントは、少なくとも６個の（連続する）核酸配列または少なくとも４個の（連続する）アミノ酸配列（それぞれ、核酸の場合には、特異的なハイブリダイゼーションを可能にし、またはアミノ酸の場合には、エピトープの特異的な認識を可能にするに十分な長さ）として規定され、そして全長配列未満のせいぜいいくらかの部分である。フラグメントは、選択された核酸配列またはアミノ酸配列の任意の連続する部分に由来し得る。誘導体は、直接的にかまたは改変もしくは部分的置換によってかのいずれかでネイティブな化合物から形成される核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、ネイティブな化合物に類似する構造を有する（しかし、同一ではない）が、特定の成分または側鎖に関してそれとは異なる核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、合成物であり得るか、または進化的に異なる起源に由来し得、そして野生型と比較して、類似の代謝活性または反対の代謝活性を有し得る。ホモログは、異なる種由来の特定の遺伝子の核酸配列またはアミノ酸配列である。
【０３０１】
誘導体およびアナログは、以下に記載のように、誘導体またはアナログが、改変された核酸またはアミノ酸を含む場合、全長、または全長以外のものであり得る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体またはアナログは、種々の実施形態において、本発明の核酸もしくはタンパク質に、同一の大きさの核酸配列またはアミノ酸配列にわたって、または整列した配列に比較した場合（この整列は、当該分野で公知であるコンピューター相同性プログラムによって実施される）、少なくとも約７０％、８０％、または９５％の同一性（好ましい同一性は、８０〜９５％）で実質的に相同であるか、あるいはそのコードする核酸がストリンジェントの、中程度にストリンジェントの、または低いストリンジェントの条件下で上記のタンパク質をコードする配列の相補体にハイブリダイズし得る、領域を含む分子を包含するが、これらに限定されない。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３、および以下を参照のこと。
【０３０２】
「相同な核酸配列」もしくは「相同なアミノ酸配列」、またはその改変体とは、上記で考察したように、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルにおける相同性によって特徴付けられる配列をいう。相同なヌクレオチド配列は、ＮＯＶＸポリペプチドのアイソフォームをコードする配列をコードする。アイソフォームは、例えば、ＲＮＡの選択的スプライシングの結果として、同一の生物の異なる組織において発現され得る。あるいは、アイソフォームは、異なる遺伝子によってコードされ得る。本発明において、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の種（脊椎動物が挙げられるが、これに限定されず、従って、例えば、カエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよび他の生物が挙げられ得る）のＮＯＶＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。相同なヌクレオチド配列はまた、天然に生じる対立遺伝子改変体および本明細書に記載されるヌクレオチド配列の変異体が挙げられるが、これらに限定されない。しかし、相同ヌクレオチド配列は、ヒトＮＯＶＸタンパク質をコードする正確なヌクレオチド配列を含まない。相同核酸配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３の保存的アミノ酸置換（以下を参照のこと）をコードする核酸配列、およびＮＯＶＸ生物学的活性を保有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。ＮＯＶＸタンパク質の種々の生物学的活性は以下に記載されている。
【０３０３】
ＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸ核酸のオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）によりコードされる。ＯＲＦは、ポリペプチドに潜在的に翻訳され得るヌクレオチド配列に対応する。ＯＲＦを含む核酸のストレッチは、終止コドンによって途切れない。全タンパク質についてのコード配列を表すＯＲＦは、ＡＴＧ「開始」コドンで始まり、そして３つの「終止」コドン（すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）のうちの１つで終結する。本発明の目的について、ＯＲＦは、開始コドン、終止コドンまたはその両方を有するかまたは有さない、コード配列の任意の部分であり得る。ｂｏｎａ　ｆｉｄｅ細胞タンパク質のコードのための良好な候補としてみなされるＯＲＦについて、最小サイズの要求がしばしば、例えば、５０アミノ酸以上のタンパク質をコードするＤＮＡのストレッチを設定する。
【０３０４】
ヒトＮＯＶＸ遺伝子のクローニングから決定されたヌクレオチド配列は、他の細胞型（例えば、他の組織由来）におけるＮＯＶＸホモログ、ならびに他の脊椎動物由来のＮＯＶＸホモログを同定および／またはクローニングする際の使用のために設計されるプローブおよびプライマーの作製を可能にする。このプローブ／プライマーは、代表的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチドは、代表的には、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３の少なくとも約１２個、約２５個、約５０個、約１００個、約１５０個、約２００個、約２５０個、約３００個、約３５０個または約４００個の連続するセンス鎖ヌクレオチド配列；または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；あるいは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３の天然に存在する変異体に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
【０３０５】
ヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に基づくプローブは、同じまたは相同なタンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出するために使用され得る。種々の実施形態において、このプローブはさらに、プローブに付着した標識基を含み、例えば、この標識基は放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る。このようなプローブは、ＮＯＶＸタンパク質を誤って発現する細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として、例えば、被験体由来の細胞のサンプル中のＮＯＶＸをコードする核酸のレベルを測定すること（例えば、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡレベルを検出すること、またはゲノムＮＯＶＸ遺伝子が変異しているかもしくは欠失しているか否かを決定すること）によって使用され得る。
【０３０６】
「ＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」は、本発明のポリペプチドの活性に類似するが必ずしも同一ではない活性を示すポリペプチドをいい、用量依存性の有無に関わらず、特定の生物学的アッセイにおいて測定されるような成熟形態を含む。「ＮＯＶＸの生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントは、ＮＯＶＸの生物学的活性（ＮＯＶＸタンパク質の生物学的活性は、以下に記載される）を有するポリペプチドをコードする、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３の一部を単離し、ＮＯＶＸタンパク質のコードされた部分を発現させ（例えば、インビトロでの組換え発現によって）、そしてＮＯＶＸのコードされた部分の活性を評価することによって調製され得る。
【０３０７】
（ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドの改変体）
本発明はさらに、遺伝コードの縮重に起因して、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３に示されるヌクレオチド配列とは異なり、従って、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３に示されるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質と同じＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子を包含する。別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【０３０８】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３に示されるヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に加えて、このＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列における変化を導くＤＮＡ配列多型は、集団（例えば、ヒト集団）内に存在し得ることが、当業者によって認識される。ＮＯＶＸ遺伝子中のこのような遺伝的多型は、天然の対立遺伝子のバリエーションに起因して、集団内の個体間に存在し得る。本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＮＯＶＸタンパク質、好ましくは脊椎動物のＮＯＶＸタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子をいう。このような天然の対立遺伝子のバリエーションは、代表的には、ＮＯＶＸ遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％の変動を生じ得る。天然の対立遺伝子バリエーションの結果であり、そしてこのＮＯＶＸポリペプチドの機能的活性を変化させない、ＮＯＶＸポリペプチド内の任意および全てのこのようなヌクレオチドのバリエーションならびに得られるアミノ酸多型は、本発明の範囲内であることが意図される。
【０３０９】
さらに、他の種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードし、従って、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３のヒトヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子が、本発明の範囲内にあることが意図される。本発明のＮＯＶＸのｃＤＮＡの天然の対立遺伝子改変体およびホモログに対応する核酸分子は、本明細書中に開示されるヒトＮＯＶＸ核酸に対するその相同性に基づいて、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、標準的なハイブリダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡまたはその一部を用いて単離され得る。
【０３１０】
従って、別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも６ヌクレオチド長であり、そしてストリンジェント条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズする。別の実施形態では、この核酸は、少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、または２０００以上のヌクレオチド長である。なお別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、コード領域にハイブリダイズする。本明細書中で用いられる場合、用語「ストリンジェント条件下でハイブリダイズする」は、互いに少なくとも６０％相同なヌクレオチド配列が代表的に互いにハイブリダイズしたままである、ハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する条件を記載することを意図する。
【０３１１】
ホモログ（すなわち、ヒト以外の種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸）または他の関連配列（例えば、パラログ（ｐａｒａｌｏｇ））は、特定のヒト配列の全てまたは一部をプローブとし、核酸ハイブリダイゼーションおよびクローニングに関して当該分野で周知の方法を使用して、低い、中程度の、または高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションによって入手され得る。
【０３１２】
本明細書で用いられる場合、語句「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」は、その条件下で、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが、その標的配列にハイブリダイズするが、その他の配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる状況で異なる。より長い配列は、より短い配列より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで、特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。このＴｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下での）温度である。標的配列は一般に過剰で存在するので、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡状態で占有されている。代表的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオンより少なく、代表的には約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン（またはその他の塩）、そして温度が短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ）について少なくとも約３０℃、そしてより長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドについて少なくとも約６０℃であるような条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような、脱安定化剤の添加で達成され得る。
【０３１３】
ストリンジェント条件は、当業者に公知であり、そしてＡｕｓｕｂｅｌら（編），ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出され得る。好ましくは、この条件は、互いに少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％または約９９％相同な配列が、代表的には互いにハイブリダイズしたままであるような条件である。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０２％　ＰＶＰ、０．０２％　Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％　ＢＳＡ、および５００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中での６５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．０１％　ＢＳＡ中での５０℃での１回以上の洗浄である。ストリンジェント条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３の配列にハイブリダイズする、本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書中で使用される場合、「天然に存在する」核酸分子とは、天然に存在する（例えば、天然のタンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有する、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子をいう。
【０３１４】
第２の実施形態では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、もしくは３３、あるいはそれらのフラグメント、アナログまたは誘導体のヌクレオチド配列を含む核酸分子に、中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る核酸配列が提供される。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、５５℃での６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％　ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中でのハイブリダイゼーション、続いて１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ中での３７℃での１回以上の洗浄である。用いられ得る中程度のストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，ＮＹおよびＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ　ＴＲＡＮＳＦＥＲ　ＡＮＤ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照のこと。
【０３１５】
第３の実施形態では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、もしくは３３、あるいはそれらのフラグメント、アナログまたは誘導体のヌクレオチド配列を含む核酸分子に、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る核酸が提供される。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０２％　ＰＶＰ、０．０２％　Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％　ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（重量／容量）硫酸デキストラン中での４０℃でのハイブリダイゼーション、続いて２×ＳＳＣ、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．１％　ＳＤＳ中での５０℃での１回以上の洗浄である。用いられ得る低ストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である（例えば、種交差ハイブリダイゼーションについて用いられるように）。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，ＮＹならびにＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ　ＴＲＡＮＳＦＥＲ　ＡＮＤ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　７８：６７８９−６７９２を参照のこと。
【０３１６】
（保存的変異）
集団中に存在し得る、ＮＯＶＸ配列の天然に存在する対立遺伝子改変体に加えて、当業者は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３のヌクレオチド配列への変異によって変化が導入され得、それによって、このＮＯＶＸタンパク質の機能的能力を変更することなく、コードされるＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列に変化がもたらされることをさらに認識する。例えば、「非必須」アミノ酸残基にてアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４の配列において行われ得る。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を有意に変更することなく、このＮＯＶＸタンパク質の野生型配列から、変更され得る残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、このような生物学的活性に必要とされる。例えば、本発明のＮＯＶＸタンパク質の間で保存されているアミノ酸残基は、特に変更を受け入れ難いと予測される。保存的置換がなされ得るアミノ酸は、当該分野で周知である。
【０３１７】
本発明の別の局面は、活性に必須ではないアミノ酸残基における変化を含む、ＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなＮＯＶＸタンパク質は、アミノ酸配列が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３とは異なるが、生物学的活性をなお保持する。１つの実施形態では、単離された核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、このタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、および３４のアミノ酸配列に少なくとも約４５％の相同性であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、この核酸分子によってコードされるタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、および３４に対して少なくとも約６０％相同であり；より好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４に対して少なくとも約７０％相同であり；なおより好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４に対してして少なくとも約８０％相同であり；なおより好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４に対して少なくとも約９０％相同であり；そして最も好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４に対して少なくとも約９５％相同である。
【０３１８】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４のタンパク質に相同なＮＯＶＸタンパク質をコードする単離された核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３のヌクレオチド配列に１以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより作製され得、その結果、１以上のアミノ酸の置換、付加または欠失が、コードされるタンパク質に導入される。
【０３１９】
変異は、標準技術（例えば、部位指向型変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）によって配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３に導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、１以上の推定非必須アミノ酸残基にて作製される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される、アミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーとしては、以下が挙げられる：塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アルパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）。従って、ＮＯＶＸタンパク質中の推定された非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖のファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形態では、変異は、ＮＯＶＸコード配列の全てまたは一部に沿って（例えば、飽和変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって）ランダムに導入され得、そして得られる変異体は、ＮＯＶＸの生物学的活性についてスクリーニングされて、活性を維持する変異体を同定し得る。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３の変異誘発に続いて、コードされるタンパク質は、当該分野で公知の任意の組換え技術によって発現され得、そしてこのタンパク質の活性が決定され得る。
【０３２０】
アミノ酸ファミリーの関連性はまた、側鎖相互作用に基づいて決定され得る。置換されたアミノ酸は、完全に保存された「強い」残基または完全に保存された「弱い」残基であり得る。保存されたアミノ酸残基の「強い」群は、以下の群のいずれか１つであり得る：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷ（ここで、一文字のアミノ酸コードは、互いに置換され得るこれらのアミノ酸によりグループ化される）。同様に、保存された残基の「弱い」群は、以下のいずれかで１つ有り得る：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＶＬＩＭ、ＨＦＹ（ここで、各群内の文字は、一文字アミノ酸コードを表する）。
【０３２１】
１つの実施形態では、変異ＮＯＶＸタンパク質は、以下についてアッセイされ得る：（ｉ）他のＮＯＶＸタンパク質、他の細胞表面タンパク質、または生物学的に活性なそれらの部分と、タンパク質：タンパク質相互作用を形成する能力、（ｉｉ）変異ＮＯＶＸタンパク質とＮＯＶＸのリガンドとの間の複合体形成；（ｉｉｉ）変異ＮＯＶＸタンパク質が細胞内標的タンパク質またはその生物学的に活性な部分に結合する能力；（例えば、アビジンタンパク質）。
【０３２２】
なお別の実施形態において、変異体ＮＯＶＸタンパク質は、特定の生物学的機能を調節する能力（例えば、インスリン放出の調節）についてアッセイされ得る。
【０３２３】
（アンチセンス核酸）
本発明の別の局面は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１もしくは３３のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそのフラグメント、アナログもしくは誘導体にハイブリダイズし得るかまたは相補的である単離されたアンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的である（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるか、またはｍＲＮＡ配列に相補的である）ヌクレオチド配列を含む。特定の局面では、全ＮＯＶＸコード鎖の少なくとも約１０、２５、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチドに相補的、またはその一部分にのみ相補的な配列を含むアンチセンス核酸分子が提供される。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４のＮＯＶＸタンパク質のフラグメント、相補体、誘導体およびアナログをコードする核酸分子、または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３のＮＯＶＸ核酸配列に相補的なアンチセンス核酸がさらに提供される。
【０３２４】
１つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対するアンチセンスである。用語「コード領域」は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域をいう。別の実施形態では、このアンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対するアンチセンスである。用語「非コード領域」は、アミノ酸に翻訳されない、コード領域に隣接する５’および３’配列をいう（すなわち、５’および３’非翻訳領域ともいう）。
【０３２５】
本明細書に開示されるＮＯＶＸタンパク質をコードするコード鎖配列を考慮すれば、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対合の規則に従って設計され得る。このアンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡの全コード領域に相補的であり得るが、より好ましくは、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡのコードまたは非コード領域の一部分に対してのみアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡの翻訳開始部位を取り囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さが約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用いる化学的合成または酵素的連結反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増大するため、もしくはアンチセンスとセンス核酸との間に形成される二本鎖の物理的安定性を増大するために設計された種々の改変されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換されたヌクレオチドが用いられ得る）を用いて化学的に合成され得る。
【０３２６】
アンチセンス核酸を生成するために用いられ得る改変されたヌクレオチドの例は：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ヴィブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎ）、プソイドウラシル、ケオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含む。あるいは、このアンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向にサブクローン化された発現ベクターを用いて生物学的に産生され得る（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、以下のサブセクションでさらに記載されるように、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である）。
【０３２７】
本発明のアンチセンス核酸分子は、代表的には、それらがＮＯＶＸタンパク質をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、またはそれに結合するように被験体に投与されるか、またはインサイチュ（ｉｎ　ｓｉｔｕ）で生成され、それによって、例えば、転写および／または翻訳を阻害することによりタンパク質の発現を阻害する。このハイブリダイゼーションは、従来のヌクレオチド相補性により、安定な二本鎖を形成するか、または、例えば、ＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合、二重らせんの主溝における特異的相互作用を通じてであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与の経路の例は、組織部位における直接注入を含む。あるいは、アンチセンス核酸分子は、改変されて、選択された細胞を標的にし得、次いで全身的に投与され得る。例えば、全身投与のためには、アンチセンス分子は、それらが選択された細胞表面上に発現されたレセプターまたは抗原に特異的に結合するように（例えば、このアンチセンス核酸分子を、細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結することによって）改変され得る。このアンチセンス核酸分子はまた、本明細書に記載のベクターを用いて細胞に送達され得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ　ＩＩまたはｐｏｌ　ＩＩＩプロモーターの制御下に配置されるベクター構築物が好適である。
【０３２８】
なお別の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸分子は、αアノマー核酸分子である。αアノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、そこでは、通常のβユニットとは反対に、鎖は互いに平行に走る。Ｇａｕｌｔｉｅｒら、（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　Ｒｅｓ　１５：６６２５−６６４１を参照のこと。このアンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（例えば、Ｉｎｏｕｅら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１５：６１３１−６１４８、を参照のこと）、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（例えば、Ｉｎｏｕｅら、（１９８７）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０、を参照のこと）を含み得る。
【０３２９】
（リボザイムおよびＰＮＡ部分）
核酸の改変としては、非制限的な例として、改変塩基、および糖リン酸骨格が改変または誘導体化された核酸が挙げられる。これらの改変は、少なくとも一部は、改変された核酸の化学的安定性を増強するために実施され、その結果、それらは、例えば、被験体での治療的適用におけるアンチセンス結合核酸として使用され得る。
【０３３０】
１つの実施形態では、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それらに対してリボザイムが相補的領域を有する一本鎖核酸、例えばｍＲＮＡを切断し得るリボヌクレアーゼ活性を持つ触媒的ＲＮＡ分子である。従って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ　３３４：５８５−５９１に記載されている））は、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによってＮＯＶＸ　ｍＲＮＡの翻訳を阻害するために用いられ得る。ＮＯＶＸをコードする核酸に特異性を有するリボザイムは、本明細書に開示のＮＯＶＸ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３）に基づいて設計され得る。例えば、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ　Ｌ−１９　ＩＶＳ　ＲＮＡの誘導体を、活性部位のヌクレオチド配列が、ＮＯＶＸをコードするｍＲＮＡにおいて切断されるべきヌクレオチド配列に相補的であるように構築し得る。例えば、Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅｃｈら、米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。あるいは、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡはまた、ＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒的ＲＮＡを選択するために用いられ得る。例えば、Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６１：１４１１−１４１８を参照のこと。
【０３３１】
あるいは、ＮＯＶＸ遺伝子発現は、ＮＯＶＸ核酸の調節領域（例えば、ＮＯＶＸプロモーターおよび／またはＮＯＶＸエンハンサー）に相補的であるヌクレオチド配列を標的にし、標的細胞中のＮＯＶＸ遺伝子の転写を妨害する三重らせん構造を形成することによって阻害され得る。例えば、Ｈｅｌｅｎｅ（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓ．６：５６９−８４；Ｈｅｌｅｎｅら（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６；Ｍａｈｅｒ（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ　１４：８０７−１５を参照のこと。
【０３３２】
種々の実施形態では、ＮＯＶＸの核酸は、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格で改変され、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解性を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を改変してペプチド核酸を生成し得る。例えば、Ｈｙｒｕｐら（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ　４：５−２３を参照のこと。本明細書で用いる用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格がプソイドペプチド（ｐｓｅｕｄｏｐｅｐｔｉｄｅ）骨格で置換され、かつ４つの天然のヌクレオ塩基のみが保持されている、核酸模倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）をいう。ＰＮＡの中性の骨格は、低イオン強度条件下で、ＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐら（１９９６）上述；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９３：１４６７０−６７５に記載のような、標準的な固相ペプチド合成プロトコールを用いて実施され得る。
【０３３３】
ＮＯＶＸのＰＮＡは、治療適用および診断適用で用いられ得る。例えば、ＰＮＡは、例えば、転写または翻訳抑止（ａｒｒｅｓｔ）を誘導すること、または複製を阻害することにより、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンスまたはアンチ遺伝子剤（抗遺伝子座）として用いられ得る。ＮＯＶＸのＰＮＡはまた、例えば、遺伝子中の１塩基対変異の分析に（例えば、ＰＮＡ特異的ＰＣＲクランピングによる）；他の酵素、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼと組み合わせて用いる場合、人工の制限酵素として（Ｈｙｒｕｐら（１９６６）上述、を参考のこと）；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのプローブまたはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐら（１９６６）上述；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）上述、を参照のこと）用いられ得る。
【０３３４】
別の実施形態では、ＮＯＶＸのＰＮＡは、例えば、それらの安定性または細胞の取り込みを増大するために、ＰＮＡに親油性基またはその他の補助基を結合することによるか、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によるか、またはリポソームの使用もしくは当該分野で公知のその他の薬物送達の技術によって改変され得る。例えば、ＰＮＡとＤＮＡの有利な性質を組み合わせ得る、ＮＯＶＸのＰＮＡ−ＤＮＡキメラが生成され得る。このようなキメラは、ＰＮＡ部分の高い結合親和性および特異性を提供したままで、ＤＮＡ認識酵素、（例えば、ＲＮａｓｅ　ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）が、ＤＮＡ部分と相互作用することを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基スタッキング、ヌクレオ塩基間の結合の数、および配向の点から選択された適切な長さのリンカーを用いて連結され得る（Ｈｙｒｕｐら（１９９６）上述、を参照のこと）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、上記のＨｙｒｕｐら（１９６６）上述、およびＦｉｎｎら（１９９６）Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　２４：３３５７−３３６３に記載のように実施され得る。例えば、ＤＮＡ鎖を、標準的なホルホルアミダイトカップリング化学を用いて固体支持体上で合成し得、そして改変ヌクレオシドアナログ、例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイトを、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間に用い得る（例えば、Ｍａｇら（１９８９）Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ　１７：５９７３−５９８８、を参照のこと）。次いで、ＰＮＡモノマーを段階的様式でカップリングし、５’ＰＮＡセグメントと３’ＤＮＡセグメントをもつキメラ分子を生成する。例えば、Ｆｉｎｎら（１９９６）上述、を参照のこと。あるいは、キメラ分子は、５’ＤＮＡセグメントと３’ＰＮＡセグメントを用いて合成され得る。例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅｎら（１９７５）Ｂｉｏｏｒｇ　Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９−１１１２４を参照のこと。
【０３３５】
その他の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的にするため）、または細胞膜を横切る輸送を容易にする薬剤（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５２；ＰＣＴ公報番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）もしくは血液脳関門を横切る輸送を容易にする薬剤（例えば、ＰＣＴ公報番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）のような他の付属基を含み得る。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーショントリガー切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：９５８−９７６を参照のこと）またはインターカーレーティング剤（例えば、Ｚｏｎ、１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９を参照のこと）を用いて改変され得る。この目的のために、このオリゴヌクレオドは、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーショントリガー架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーショントリガー切断剤などの他の分子に結合体化され得る。
【０３３６】
（ＮＯＶＸポリペプチド）
本発明に従うポリペプチドは、その配列が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４に提供されるＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明はまた、その任意の残基が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４に示される対応する残基から変化し得るが、なおそのＮＯＶＸ活性および生理学的機能を維持するタンパク質、またはその機能的フラグメントをコードしたままである、変異体または改変体タンパク質を含む。
【０３３７】
一般に、ＮＯＶＸ様機能を保持するＮＯＶＸ改変体は、配列中の特定位置の残基が他のアミノ酸により置換され、そしてさらに、親タンパク質の２つの残基間にさらなる残基を挿入する可能性、および親配列から１つ以上の残基を欠失する可能性を含む。任意のアミノ酸置換、挿入または欠失が、本発明に包含される。好適な状況では、この置換は、上記で規定されるような保存的置換である。
【０３３８】
本発明の１つの局面は、単離されたＮＯＶＸタンパク質、およびその生物学的に活性な部分、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくは相同体に関する。抗ＮＯＶＸ抗体を惹起するための免疫原としての使用に適するポリペプチドフラグメントもまた提供される。１つの実施形態では、ネイティブＮＯＶＸタンパク質が、標準的なタンパク質精製技術を用いる適切な精製スキームにより、細胞または組織供給源から単離され得る。別の実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質は、組換えＤＮＡ技術により生産される。組換え発現の代替として、ＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を用いて化学的に合成され得る。
【０３３９】
「単離された」または「精製された」ポリペプチド、またはタンパク質、またはその生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質が由来する細胞または組織供給源からの細胞材料またはその他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、化学的に合成されたとき、化学的前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞材料を実質的に含まない」とは、ＮＯＶＸタンパク質が、単離されるかまたは組換えにより産生された細胞の細胞成分から分離されているこのタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態では、用語「細胞材料を実質的に含まない」は、非ＮＯＶＸタンパク質（本明細書ではまた「汚染タンパク質」と呼ばれる）が約３０％（乾燥重量による）より少ない、より好ましくは約２０％より少ない非ＮＯＶＸタンパク質、なおより好ましくは約１０％より少ない非ＮＯＶＸタンパク質、そして最も好ましくは約５％より少ない非ＮＯＶＸタンパク質を有する、ＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。このＮＯＶＸタンパク質または生物学的に活性なその部分が組換えにより産生されるとき、培養培地を実質的に含まないこともまた好適である。すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の容量の約２０％より少ないか、より好ましくは約１０％より少ないか、そして最も好ましくは約５％より少ない。
【０３４０】
用語「化学的前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まない」は、タンパク質の合成において含まれる化学的前駆体またはその他の化学物質からこのタンパク質が分離されているＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態では、用語「化学的前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まない」は、化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を約３０％（乾燥重量による）より少く、より好ましくは化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を約２０％より少なく、なおより好ましくは化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を約１０％より少なく、そして最も好ましくは化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を約５％より少なく有するＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。
【０３４１】
ＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、完全長のＮＯＶＸタンパク質より少ないアミノ酸配列を含み、そしてＮＯＶＸタンパク質の少なくとも１つの活性を示す、ＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３１、３２、または３４で示されるアミノ酸配列）に十分に相同的であるか、またはそれに由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。代表的には、生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも１つの活性をともなうドメインまたはモチーフを含む。ＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、１０、２５、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸の長さのポリペプチドであり得る。
【０３４２】
さらに、このタンパク質のその他の領域が欠失したその他の生物学的に活性な部分が、組換え技術により調製され、ネイティブなＮＯＶＸタンパク質の１つ以上の機能的活性について評価され得る。
【０３４３】
ある実施形態では、このＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４に示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、このＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４に実質的に相同であり、そして以下に詳細に記載されるように、天然の対立遺伝子変動または変異誘発に起因してアミノ酸配列がなお異なるが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４のタンパク質の機能的活性を保持する。従って、別の実施形態では、このＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４のアミノ酸配列に少なくとも約４５％相同であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４のＮＯＶＸタンパク質の機能的活性を保持するタンパク質である。
【０３４４】
（２つ以上の配列間の相同性の決定）
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の相同性のパーセントを決定するために、これらの配列を最適な比較の目的に整列させる（例えば、第２のアミノ酸または核酸配列との最適アラインメントのために第１のアミノ酸または核酸配列の配列中にギャップを導入し得る）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められるとき、この分子はその位置で相同である（すなわち、本明細書で用いるとき、アミノ酸または核酸「相同性」は、アミノ酸または核酸「同一性」と等価である）。
【０３４５】
核酸配列相同性は、２つの配列間の同一性の程度で決定され得る。この相同性は、ＧＣＧプログラムパッケージで提供されるＧＡＰソフトウェアのような当該分野で公知のコンピュータープログラムを用いて決定され得る。ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ　１９７０　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　４８：４４３−４５３を参照のこと。核酸配列比較のために以下の設定を用いてＧＣＧ　ＧＡＰソフトウェアを用い：５．０のＧＡＰ作成ペナルティーおよび０．３のＧＡＰ伸長ペナルティー、上記で言及した類似の核酸配列のコード領域は、好ましくは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３で示されたＤＮＡ配列のＣＤＳ（すなわちコードする）部分と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性の程度を示す。
【０３４６】
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、比較の特定の領域に亘って残基ごとについて同一である程度をいう。用語「配列同一性のパーセント」は、２つの比較の領域に亘り最適にアラインされた配列を比較すること、両方の配列において同一の核酸塩基（例えば、核酸の場合、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）がある位置の数を決定し、一致した位置の数を生成すること、比較領域中の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で一致した位置の数を除すること、およびこの結果に１００を乗じ配列同一性のパーセントを得ることにより算出される。本明細書で用いる用語「実質的に同一」は、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、ここで、このポリヌクレオチドは、比較領域に亘って参照配列と比較したとき、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性そしてしばしば９０〜９５％の配列同一性、より通常は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【０３４７】
（キメラおよび融合タンパク質）
本発明はまた、ＮＯＶＸキメラまたは融合タンパク質を提供する。本明細書で用いられるとき、ＮＯＶＸ「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非ＮＯＶＸポリペプチドと作動可能に連結されたＮＯＶＸポリペプチドを含む。「ＮＯＶＸポリペプチド」は、ＮＯＶＸタンパク質（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４）に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいい、その一方、「非ＮＯＶＸポリペプチド」は、このＮＯＶＸタンパク質に実質的に相同ではないタンパク質に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチド（例えば、ＮＯＶＸタンパク質とは異なり、しかも同一かまたは異なる生物に由来するタンパク質）をいう。ＮＯＶＸ融合タンパク質の中で、ＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸタンパク質のすべてか、またはその一部分に対応し得る。１つの実施形態では、ＮＯＶＸ融合タンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。別の実施形態では、ＮＯＶＸ融合タンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。なお別の実施形態では、ＮＯＶＸ融合タンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも３つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結される」は、ＮＯＶＸポリペプチドおよび非ＮＯＶＸポリペプチドが互いにインフレームで融合していることを示すことを意図する。非ＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【０３４８】
１つの実施形態では、この融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質であり、ここではＮＯＶＸ配列が、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合される。このような融合タンパク質は、組換えＮＯＶＸの精製を容易にし得る。
【０３４９】
別の実施形態では、この融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含むＮＯＶＸタンパク質である。特定の宿主では（例えば、哺乳動物宿主細胞）、ＮＯＶＸの発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用により増大され得る。
【０３５０】
なお別の実施形態では、この融合タンパク質は、ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質であり、ここではＮＯＶＸ配列が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合される。本発明のこのＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、薬学的組成物中に取り込まれ、そして被験体に投与されて、細胞の表面上でＮＯＶＸリガントとＮＯＶＸタンパク質との間の相互作用を阻害し、それによってインビボのＮＯＶＸ媒介シグナル伝達を抑制し得る。このＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を用い、ＮＯＶＸ同族リガンドの生体利用性に影響を与え得る。ＮＯＶＸリガンド／ＮＯＶＸ相互作用の阻害は、増殖障害および分化障害の両方の処置、および細胞生存を調節（例えば、促進または阻害）することに、治療的に有用であり得る。さらに、本発明のこのＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、被験体中で抗ＮＯＶＸ抗体を産生するための免疫原として用い得、ＮＯＶＸリガンドを精製し、そしてＮＯＶＸリガンドとのＮＯＶＸの相互作用を阻害する分子を同定するスクリーニングアッセイで用いられ得る。
【０３５１】
本発明のＮＯＶＸキメラまたは融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術により産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、従来の技術に従って、例えば、連結のための平滑末端または粘着（ｓｔａｇｇｅｒ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じて粘着（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）末端のフィルイン、所望しない連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を採用することにより、インフレームで一緒に連結する。別の実施形態では、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来技術により合成し得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、キメラ遺伝子配列を生成するために次いでアニールおよび再増幅され得る、２つの連続遺伝子フラグメント間の相補的オーバハングを生じるアンカープライマーを用いて実施し得る（例えば、Ａｕｓｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）。さらに、融合成分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をすでにコードした多くの発現ベクターが市販されている。ＮＯＶＸをコードする核酸は、この融合成分がＮＯＶＸタンパク質にインフレーム連結されるように、このような発現ベクター中にクローニングされ得る。
【０３５２】
（ＮＯＶＸアゴニストおよびアンタゴニスト）
本発明はまた、ＮＯＶＸアゴニスト（すなわち、模倣物）として、またはＮＯＶＸアンタゴニストとして機能するＮＯＶＸタンパク質の改変体に関する。ＮＯＶＸタンパク質の改変体、例えば、ＮＯＶＸタンパク質の離散した点変異または短縮型が、変異誘発により生成され得る。ＮＯＶＸタンパク質のアゴニストは、天然に存在する形態のＮＯＶＸタンパク質と実質的に同じ生物学的活性、またはその生物学的活性のサブセットを保持し得る。ＮＯＶＸタンパク質のアンタゴニストは、天然に存在する形態のＮＯＶＸタンパク質の１つ以上の活性を、例えば、ＮＯＶＸタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流または上流メンバーに競合的に結合することにより阻害し得る。従って、特異的生物学的効果が、限られた機能の改変体を用いた処理により惹起され得る。１つの実施形態では、このタンパク質の天然に存在する形態の生物学活性のサブセットを有する改変体を用いた被験体の処置は、ＮＯＶＸタンパク質の天然に存在する形態を用いた処置に対して被験体におけるより少ない副作用を有する。
【０３５３】
ＮＯＶＸアゴニスト（すなわち、模倣物）として、またはＮＯＶＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の改変体は、ＮＯＶＸタンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト活性のためのＮＯＶＸタンパク質の変異体、例えば短縮型変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより同定され得る。１つの実施形態では、ＮＯＶＸ改変体の多彩なライブラリーは、核酸レベルのコンビナトリアル変異誘発により生成され、そして多彩な遺伝子ライブラリーによりコードされる。ＮＯＶＸ改変体の多彩なライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、潜在的なＮＯＶＸ配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、あるいは、その中にＮＯＶＸ配列のセットを含む（例えば、ファージディスプレイのための）より大きな融合タンパク質のセットとして発現可能であるように、遺伝子配列に酵素的に連結することにより産生され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なＮＯＶＸ改変体のライブラリーを産生するために用いられ得る種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学的合成は、自動化ＤＮＡ合成機中で実施され得、次いでこの合成遺伝子は、適切な発現ベクター中に連結される。遺伝子の縮重セットの使用は、１つの混合物において、潜在的なＮＯＶＸ配列の所望のセットをコードする配列のすべての供給を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当該分野で周知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９８：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３）Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ　１１：４７７を参照のこと）。
【０３５４】
（ポリペプチドライブラリー）
さらに、ＮＯＶＸタンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーを用いて、ＮＯＶＸタンパク質の改変体のスクリーニングおよび引き続く選択のためのＮＯＶＸフラグメントの多彩な集団を生成し得る。１つの実施形態では、コード配列フラグメントのライブラリーは、ＮＯＶＸコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを、１分子あたり約１つのみのニックが生じる条件下、ヌクレアーゼで処理すること、二本鎖ＤＮＡを変性させること、異なるニック産物からのセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖を形成するためにこのＤＮＡを再生すること、Ｓ１ヌクレアーゼを用いた処理により再形成された二本鎖から一本鎖部分を除去すること、および得られるフラグメントライブラリーを発現ベクター中に連結することにより生成し得る。この方法により、ＮＯＶＸタンパク質の種々のサイズのＮ末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリーが派生し得る。
【０３５５】
点変異または短縮により作成されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、選択された性質を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための種々の技術が当該分野で公知である。このような技術を、ＮＯＶＸタンパク質のコンビナトリアル変異誘発により生成された遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、高スループット分析に適した最も広く用いられる技術は、代表的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター中にクローニングすること、得られるベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、およびこのコンビナトリアル遺伝子を、所望の活性の検出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下で発現することを含む。ライブラリー中の機能的変異体の頻度を増大する新規技術であるリクルーシブエンセブル（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ　ｅｎｓｅｍｂｌｅ）変異誘発（ＲＥＭ）を、スクリーニングアッセイと組み合わせて用い、ＮＯＶＸ改変体を同定し得る。例えば、ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　６：３２７−３３１を参照のこと。
【０３５６】
（抗ＮＯＶＸ抗体）
本発明は、本発明の任意のＮＯＶポリペプチドに免疫特異的に結合する、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２のような抗体または抗体フラグメントを包含する。
【０３５７】
単離されたＮＯＶＸタンパク質、またはその部分もしくはフラグメントは、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体調製のための標準的な技術を用いて、ＮＯＶＸに結合する抗体を生成するための免疫原として用いられ得る。全長のＮＯＶＸタンパク質が用いられ得るか、あるいは、本発明は、免疫原としての使用のためのＮＯＶＸの抗原性ペプチドフラグメントを提供する。ＮＯＶＸの抗原性ペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４で示されるアミノ酸配列の少なくとも４アミノ酸残基を含み、そしてこのペプチドに対して惹起された抗体がＮＯＶＸと特異的な免疫複合体を形成するように、ＮＯＶＸのエピトープを含む。好ましくは、この抗原性ペプチドは、少なくとも６、８、１０、１５、２０または３０のアミノ酸残基を含む。より長い抗原性ペプチドが、用途に依存して、そして当業者に周知の方法に従い、より短い抗原性ペプチドよりもしばしば好適である。
【０３５８】
本発明の特定の実施形態では、抗原性ペプチドに含まれる少なくとも１つのエピトープは、タンパク質の表面上に位置するＮＯＶＸの領域（例えば、親水性領域）である。抗体産生を標的にする手段として、親水性および疎水性の領域を示す疎水性親水性指標（ヒドロパシー）プロットを、例えば、フーリエ変換を伴うかまたは伴わない、Ｋｙｔｅ　ＤｏｏｌｉｔｔｌｅまたはＨｏｐｐ　Ｗｏｏｄｓ法を含む、当該分野で周知の任意の方法により生成し得る（例えば、それらの全体が本明細書に参考として援用される、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７８：３８２４−３８２８；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ　１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１４２を参照のこと）。
【０３５９】
本明細書で開示されるように、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、および３４のＮＯＶＸタンパク質配列、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログを、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の産生における免疫原として利用し得る。本明細書で用いる用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、ＮＯＶＸのような抗原に特異的に結合（免疫反応）する抗原結合部位を含む分子をいう。このような抗体は、制限されずに、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリーを含む。特定の実施形態では、ヒトＮＯＶＸタンパク質に対する抗体が開示される。当該分野で公知の種々の手順が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、および３４のＮＯＶＸタンパク質配列、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の産生のために用いられ得る。これらのタンパク質のいくつかを以下で論議する。
【０３６０】
ポリクローナル抗体の産生のために、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたはその他の哺乳動物）が、ネイティプタンパク質、またはその合成改変体、または前述の誘導体での注射により免疫され得る。適切な免疫原性調製物は、例えば、組換えにより発現されたＮＯＶＸタンパク質または化学的に合成されたＮＯＶＸポリペプチドを含有し得る。この調製物は、アジュバントをさらに含み得る。免疫学的応答を増大するために用いられる種々のアジュバントは、制限されずに、フロイントの完全および不完全アジュバント、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノールなど）、Ｂａｃｉｌｌｅ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−ＧｕｅｒｉｎおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍのようなヒトアジュバント、または類似の免疫刺激剤を含む。所望であれば、ＮＯＶＸに対して惹起された抗体分子は、哺乳動物（例えば、血液）から単離され、そしてさらに、ＩｇＧ画分を得るために、プロテインＡクロマトグラフィーのような、周知の技術により精製され得る。
【０３６１】
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、ＮＯＶＸの特定のエピトープと免疫反応し得る、１種類の抗原結合部位のみを含む抗体分子の集団をいう。従って、代表的には、モノクローナル抗体組成物は、それと免疫反応する特定のＮＯＶＸタンパク質に対し、単一の結合親和性を示す。特定のＮＯＶＸタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対して惹起されたモノクローナル抗体の調製には、継続的な細胞株培養による抗体分子の産生を提供する任意の技術が利用され得る。このような技術としては、限定はしないが、ハイブリドーマ技術（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５　Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５−４９７を参照のこと）；トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（例えば、Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３　Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ　４：７２を参照のこと）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（例えば、Ｃｏｌｅら、１９８５　ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　ＡＮＤ　ＣＡＮＣＥＲ　ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．７７−９６頁を参照のこと）が挙げられる。ヒトモノクローナル抗体を、本発明の実施において利用し得、そしてヒトハイブリドーマを用いることによるか（例えば、Ｃｏｔｅら、１９８３．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８０：２０２６−２０３０を参照のこと）、またはインビトロでヒトＢ細胞をエプスタイン−バーウイルスで形質転換することにより（例えば、Ｃｏｌｅら、１９８５　ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　ＡＮＤ　ＣＡＮＣＥＲ　ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．７７−９６頁を参照のこと）産生し得る。上記の引用の各々は、それらの全体が参考として本明細書に援用される。
【０３６２】
本発明によれば、技術は、ＮＯＶＸタンパク質に特異的な単鎖抗体の産生のために適合され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。さらに、方法は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築のために適合されて（例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６：１２７５−１２８１を参照のこと）、ＮＯＶＸタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ有効な同定を可能にし得る。非ヒト抗体は、当該分野で周知の技術により「ヒト化」され得る。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号を参照のこと。ＮＯＶＸタンパク質に対するイディオタイプを含む抗体フラグメントを、当該分野で公知の技術により産生し得るが、これには、限定することなく：（ｉ）抗体分子のペプシン消化により産生されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより産生されるＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）抗体分子のパパインおよび還元剤での処理により産生されるＦａｂフラグメント；ならびに（ｉｖ）Ｆｖフラグメントが含まれる。
【０３６３】
さらに、ヒトおよび非ヒト部分の両方を含むキメラ抗体およびヒト化モノクローナル抗体のような、組換え抗ＮＯＶＸ抗体（これらは、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製され得る）は、本発明の範囲内である。このようなキメラ抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術により生成され得る。この技術は例えば、以下に記載の方法を用いる：国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；欧州特許出願番号１８４，１８７号；欧州特許出願番号１７１，４９６；欧州特許出願番号１７３、４９４；ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ　８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号；米国特許第５，２２５，５３９号；欧州特許出願番号１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４０：１０４１〜１０４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：３４３９〜３４４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１〜３５２６；Ｓｕｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：２１４〜２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４７：９９９〜１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ　３１４：４４６〜４４９；Ｓｈａｗら（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．８０：１５５３〜１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９：１２０２〜１２０７；Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　４：２１４；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ　３２１：５５２〜５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：１５３４；ならびにＢｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３〜４０６０。上記引用の各々は、それらの全体において参考として本明細書中に援用される。
【０３６４】
１つの実施形態において、所望の特異性を保有する抗体のスクリーニングのための方法は、当該分野内で公知の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および他の免疫学的に媒介された技術を含むが、これに限定されない。特定の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質の特定のドメインに対して特異的である抗体の選抜は、このようなドメインを所有しているＮＯＶＸタンパク質のフラグメントに結合するハイブリドーマの生成により容易にされる。従って、ＮＯＶＸタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログ内の所望のドメインに対して特異的である抗体もまた、本明細書中に提供される。
【０３６５】
抗ＮＯＶＸ抗体は、ＮＯＶＸタンパク質の局在化および／または定量化に関する当該分野で公知の方法において用いられ得る（例えば、適切な生理学的サンプル内のＮＯＶＸタンパク質レベルの測定における使用、診断的方法における使用、タンパク質の画像化における使用などのために）。所定の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログの抗体（抗体由来の結合ドメインを含む）は、薬理学的に活性な化合物（本明細書中、以降において「治療剤」）として利用される。
【０３６６】
抗ＮＯＶＸ抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、標準的な技術（例えばアフィニティークロマトグラフィまたは免疫沈降）によって、ＮＯＶＸポリペプチドを単離するために用いられ得る。抗ＮＯＶＸ抗体は、細胞からの天然のＮＯＶＸポリペプチド、および宿主細胞において発現される組換え的に産生されたＮＯＶＸポリペプチドの精製を容易にし得る。さらに、抗ＮＯＶＸ抗体が、（例えば、細胞の溶解物または細胞上清中の）ＮＯＶＸタンパク質を検出するために用いられ、ＮＯＶＸタンパク質の発現の量およびパターンを評価し得る。抗ＮＯＶＸ抗体は、例えば、所定の治療レジメンの有効性を決定するために、臨床試験の手順の一部として組織におけるタンパク質レベルを診断的にモニターするために用いられ得る。検出は、抗体を検出可能物質に結合する（すなわち、物理的に結合する）ことにより容易になり得る。検出可能物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光材料、生物発光材料および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌａｍｉｎｅ）フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられる；発光材料の例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられる；そして、適切な放射性物質の例としては１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０３６７】
（ＮＯＶＸ組換え発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明の別の局面は、ＮＯＶＸタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログ、もしくはホモログをコードする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、これが連結された別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、これはさらなるＤＮＡセグメントが連結し得る環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。ベクターの別の型はウイルス性ベクターであり、ここでさらなるＤＮＡセグメントはこのウイルス性ゲノムに連結され得る。特定のベクターはこのベクターが導入される宿主細胞中で自発的に複製し得る。（例えば、細菌の複製起源を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入される際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、そしてこれによって宿主のゲノムと一緒に複製される。さらに、特定のベクターは、これが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で「発現ベクター」といわれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、交換可能に使用され得る。なぜなら、このプラスミドはベクターの中で最も一般的に使用される形態であるためである。しかし、本発明は、ウイルス性ベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような発現ベクターのこのような他の形態を含むことを意図し、これは等価な機能を果たす。
【０３６８】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸を、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態で含み、これはこの組換え発現ベクターが、発現のために使用される宿主細胞に基いて選択される１つ以上の調節配列を含むこと意味し、これは発現される核酸配列に作動可能に連結される。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結」は、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする（例えば、インビトロ転写／翻訳系においてか、またはこのベクターが宿主細胞に導入される場合には、宿主細胞において）ような様式で調節配列に連結されることを意味することを意図する。
【０３６９】
用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、ＧＥＮＥ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節配列としては、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指向する配列、および特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を指向する配列（例えば、組織特異的調節配列）が挙げられる。発現ベクターの設計が形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような因子に依存し得ることは当業者に理解される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、それにより、本明細書に記載されるような核酸によりコードされるタンパク質またはペプチド（融合タンパク質または融合ペプチドを含む）（例えば、ＮＯＶＸタンパク質、ＮＯＶＸタンパク質の変異形態、融合タンパク質など）を生成し得る。
【０３７０】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞における、ＮＯＶＸタンパク質の発現のために設計され得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、ＧＥＮＥ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）においてさらに考察される。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写および翻訳され得る。
【０３７１】
原核生物におけるタンパク質の発現は、最も頻繁には、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを有するＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉにおいて実行される。融合ベクターは、この融合ベクターにコードされるタンパク質に（通常、組換えタンパク質のアミノ末端に）、多数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、代表的には、以下の３つの目的のために役立つ：（ｉ）組換えタンパク質の発現を増加させること；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解度を増加させること；および（ｉｉｉ）親和性精製においてリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を補助すること。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解の切断部位が、融合部分の結合部に導入され、そして融合タンパク質の精製の後に、組換えタンパク質が組換えタンパク質の融合部分から分離されることを可能にする。このような酵素、およびその同族の認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを、それぞれ、標的の組換えタンパク質に融合するｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ　６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
【０３７２】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ　６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ　１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、ＧＥＮＥ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。
【０３７３】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大にするための１つのストラテジーは、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力が損なわれた宿主細菌中でこのタンパク質を発現させることである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ＧＥＮＥ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８を参照のこと。別のストラテジーは、各アミノ酸についての個々のコドンが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用されるように、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変更することである（例えば、Ｗａｄａら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８を参照のこと）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的なＤＮＡ合成技術によって実行され得る。
【０３７４】
別の実施形態において、ＮＯＶＸ発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、（１９８７）ＥＭＢＯ．Ｊ　６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ（１９８２）Ｃｅｌｌ　３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら（１９８７）Ｇｅｎｅ　５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ならびにｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【０３７５】
あるいは、ＮＯＶＸは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞中で発現され得る。培養された昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）中でタンパク質の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７０：３１−３９）が挙げられる。
【０３７６】
なお別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ　３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ　Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルスの調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０に由来する。原核生物細胞および真核生物細胞の両方のための他の適切な発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章および第１７章を参照のこと。
【０３７７】
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現する）中で優先的に核酸の発現を指向し得る。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ　４３：２３５−２７５）、特に、Ｔ細胞レセプタープロモーター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ　Ｊ．８：７２９−７３３）および免疫グロブリンのプロモーター（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ　３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ　３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０：９１２−９１６）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、ミルク乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発生的に調節されるプロモーターもまた含まれる（例えば、マウスホックス（ｍｕｒｉｎｅ　ｈｏｘ）プロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）。
【０３７８】
本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、そのＤＮＡ分子は、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を可能にする様式で調節配列に作動可能に連結される。種々の細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の連続的な発現を指向する、アンチセンス方向でクローニングされた核酸に作動可能に連結される調節配列が選択され得る。例えば、アンチセンスＲＮＡの構成的発現、組織特異的発現、または細胞型特異的発現を指向する、ウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサー、または調節配列が選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化されたウイルスの形態であり得、ここではアンチセンス核酸は、高効率調節領域の制御下で産生され、その活性は、ベクターが導入される細胞型によって決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の議論については、例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ＲＮＡ　ａｓ　ａ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｔｏｏｌ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１巻（１）１９８６を参照のこと。
【０３７９】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現べクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で、交換可能に使用される。このような用語は、特定の対象細胞をいうのみでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫をいうことが理解される。変異または環境的影響のいずれかに起因して、特定の改変は次の世代において起こり得るので、このような子孫は、実際、親の細胞と同一でないかもしれないが、なお、本明細書中で使用されるような用語の範囲内に含まれる。
【０３８０】
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）で発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０３８１】
ベクターＤＮＡは、従来的な形質転換技術またはトランスフェクション技術を介して原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来性の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための当該分野で認識される種々の技術をいうことを意図し、これらとしては、リン酸カルシウム共沈澱または塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが挙げられる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）および他の実験室マニュアルに見出され得る。
【０３８２】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションについては、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞のほんの一部のみが外来ＤＮＡをそのゲノムに組み込み得ることが知られている。これらの組込み物を同定および選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が、一般的には目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。種々の選択マーカーには、薬物に対する耐性を付与するもの（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキセート）が含まれる。選択マーカーをコードする核酸は、ＮＯＶＸをコードするベクターと同じベクター上で宿主細胞に導入され得るか、あるいは別々のベクター上で導入され得る。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定され得る（例えば、選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）。
【０３８３】
本発明の宿主細胞（例えば、培養中の原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞）は、ＮＯＶＸタンパク質を産生（すなわち、発現）するために使用され得る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して、ＮＯＶＸタンパク質を産生するための方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ＮＯＶＸタンパク質が産生されるような適切な培地中で、本発明の宿主細胞（ここに、ＮＯＶＸをコードする組換え発現ベクターが導入された）を培養する工程を包含する。別の実施形態において、この方法はさらに、培地または宿主細胞からＮＯＶＸを単離する工程を包含する。
【０３８４】
（トランスジェニックＮＯＶＸ動物）
本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。例えば、１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＮＯＶＸタンパク質コード配列が導入される、受精した卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、このような宿主細胞は、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用され得、ここで外因性のＮＯＶＸ配列は、それらのゲノムまたは相同組換え動物（ここで内因性のＮＯＶＸ配列が変更されている）に導入される。このような動物は、ＮＯＶＸの機能および／または活性を研究するため、ならびにＮＯＶＸの活性のモジュレーターを同定および／または評価するために有用である。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」とは、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは、ラットまたはマウスのような齧歯動物であり、ここでこれらの動物の１つ以上の細胞は、導入遺伝子を含む。トランスジェニック動物の他の例には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。導入遺伝子は、細胞のゲノムに組み込まれ（この細胞からトランスジェニック動物が発生する）、そして成熟動物のゲノムに残存する外因性のＤＮＡであり、これによって、このトランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織においてコード遺伝子産物の発現を指向させる。本明細書中で使用される場合、「相同組換え動物」とは、非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスであり、ここで、内因性ＮＯＶＸ遺伝子は、この内因性の遺伝子と、動物の発生の前に動物の細胞（例えば、動物の胚細胞）に導入された外因性ＤＮＡ分子との間の相同組換えによって、変更されている。
【０３８５】
本発明のトランスジェニック動物は、ＮＯＶＸをコードする核酸を、（例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって）受精した卵母細胞の雄性前核に導入すること、およびこの卵母細胞が偽妊娠雌性フォスター動物（ｆｏｓｔｅｒ　ａｎｉｍａｌ）中で発生することを可能にすることによって作製され得る。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３の、ヒトＮＯＶＸ　ＤＮＡ配列は、非ヒト動物のゲノムに導入遺伝子として導入され得る。あるいは、ヒトＮＯＶＸ遺伝子の非ヒトホモログ（例えば、マウスＮＯＶＸ遺伝子）は、ヒトＮＯＶＸ　ｃＤＮＡに対するハイブリダイゼーションに基づいて単離され得（上にさらに記載されている）、そして導入遺伝子として使用され得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた導入遺伝子中に含まれ、その導入遺伝子の発現の効率を増大させ得る。組織特異的調節配列（単数または複数）は、特定の細胞に対して、ＮＯＶＸタンパク質の発現を指向するために、ＮＯＶＸ導入遺伝子に作動可能に連結され得る。胚の操作およびマイクロインジェクションを介するトランスジェニック動物（特に、マウスのような動物）を作製するための方法は、当該分野で従来的になっており、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号；同第４，８７０，００９号；および同第４，８７３，１９１号；ならびにＨｏｇａｎ　１９８６、ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ　ＴＨＥ　ＭＯＵＳＥ　ＥＭＢＲＹＯ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。同様の方法は、他のトランスジェニック動物の作製のために使用される。トランスジェニック初代動物は、そのゲノムにおけるＮＯＶＸ導入遺伝子の存在および／またはその動物の組織または細胞中のＮＯＶＸ　ｍＲＮＡの発現に基づいて同定され得る。次いで、トランスジェニック初代動物は、導入遺伝子を有するさらなる動物を繁殖させるために使用され得る。さらに、ＮＯＶＸをコードする導入遺伝子を有するトランスジェニック動物は、さらに、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物に繁殖され得る。
【０３８６】
相同組換え動物を作製するために、欠失、付加、または置換が導入されて、それによってＮＯＶＸ遺伝子が変化（例えば、機能的に破壊）されている、ＮＯＶＸ遺伝子の少なくとも一部を含むベクターが調製される。ＮＯＶＸ遺伝子はヒト遺伝子（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３）であり得るが、より好ましくは、ヒトＮＯＶＸ遺伝子の非ヒトホモログである。例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、または３３のヒトＮＯＶＸ遺伝子のマウスホモログは、マウスゲノムにおいて内因性ＮＯＶＸ遺伝子を変更するのに適切な相同組換えベクターを構築するために使用され得る。１つの実施形態において、そのベクターは、相同組換えに際して、内因性ＮＯＶＸ遺伝子が、機能的に破壊される（すなわち、機能的タンパク質をもはやコードしない；「ノックアウト」ベクターともいわれる）ように設計される。
【０３８７】
あるいは、このベクターは、相同組換えに際して、内因性ＮＯＶＸ遺伝子が変異されるか、あるいは他の様式で変更されるが、なお機能性タンパク質をコードするように設計され得る（例えば、上流の調節領域を変更して、それによって内因性ＮＯＶＸタンパク質の発現を変更し得る）。相同組換えベクターにおいて、ＮＯＶＸ遺伝子が変更された部分は、その５’末端および３’末端でＮＯＶＸ遺伝子のさらなる核酸に隣接され、ベクターによって運ばれる外因性ＮＯＶＸ遺伝子と胚幹細胞中の内因性ＮＯＶＸ遺伝子との間で相同組換えが起こることを可能にする。さらなる隣接ＮＯＶＸ核酸は、内因性遺伝子との首尾よい相同組換えに十分な長さである。代表的に、数キロベースの（５’末端および３’末端の両方に）隣接するＤＮＡが、ベクターに含まれる。例えば、相同組換えベクターの記載について、Ｔｈｏｍａｓら（１９８７）Ｃｅｌｌ　５１：５０３を参照のこと。次いでこのベクターは、胚幹細胞株に導入され（例えば、エレクトロポレーションによって）、内因性ＮＯＶＸ遺伝子で相同組換えされたＮＯＶＸ遺伝子を導入された細胞が、選択される（例えば、Ｌｉら（１９９２）Ｃｅｌｌ　６９：９１５を参照のこと）。
【０３８８】
次いで、この選択された細胞を、動物（例えば、マウス）の胚盤胞へ注入して、凝集キメラを形成する。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ（１９８７）のＴＥＲＡＴＯＣＡＲＣＩＮＯＭＡＳ　ＡＮＤ　ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ　ＳＴＥＭ　ＣＥＬＬＳ：Ａ　ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　ＡＰＰＲＯＡＣＨ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ　１１３頁〜１５２頁を参照のこと。次いで、キメラ胚を、適切な偽妊娠雌性フォスター動物に移植し得、そしてこの胚を、一定期間置く。これらの胚芽細胞中に相同組換えＤＮＡを保有する子孫を使用して、動物を繁殖し得、ここで、この動物の全ての細胞は、導入遺伝子の生殖系列伝達によって相同組換えされたＤＮＡを含む。相同的組換えベクターおよび相同的組換え動物を構築するための方法が、さらに以下に記載される；Ｂｒａｄｌｅｙ（１９９１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：８２３−８２９；ＰＣＴ国際公開番号：ＷＯ９０／１１３５４；ＷＯ９１／０１１４０；ＷＯ９２／０９６８；およびＷＯ９３／０４１６９。
【０３８９】
別の実施形態において、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択された系を含む、非ヒトトランスジェニック動物が産生され得る。このような系の１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の記載については、例えば、Ｌａｋｓｏら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：６２３２−６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１：１３５１−１３５５を参照のこと）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が導入遺伝子の発現を調節するために使用される場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が、必要となる。このような動物は、例えば、２種のトランスジェニック動物（一方は選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む）を交配することによる、「二重の」トランスジェニック動物の構築によって提供され得る。
【０３９０】
本明細書中に記載される非ヒトトランスジェニック動物のクローンがまた、Ｗｉｌｍｕｔら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ　３８５：８１０−８１３に記載される方法に従って、産生され得る。簡単には、トランスジェニック動物からの細胞（例えば、体細胞）を、単離および誘導し、増殖サイクルを終了させ、そしてＧ０期に入らせ得る。次いで、静止細胞を、例えば、電気パルスの使用により、静止細胞が単離される同種動物から摘出された卵母細胞へ融合し得る。次いで、この再構成された卵母細胞を培養し、これにより、これは桑実胚または未分化胚芽細胞に発達し、次いで、偽妊娠雌性フォスター動物に移される。この雌性フォスター動物の産生子孫は、この細胞（例えば、体細胞）が単離される動物のクローンである。
【０３９１】
（薬学的組成物）
本発明のＮＯＶＸ核酸分子、ＮＯＶＸタンパク質、および抗ＮＯＶＸ抗体（これはまた、本明細書中で「活性化合物」と称される）、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、アナログ、およびホモログが、投与に適した薬学的組成物に組み込まれ得る。このような組成物は、代表的に、核酸分子、タンパク質または抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的な投与に適合した、任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤（ｄｅｌａｙｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）などを含むことが意図される。適切なキャリアは、当該分野における標準的な参考書である、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版（本明細書中で参考として援用される）に記載される。このようなキャリアまたは希釈剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油）もまた、使用され得る。薬学的に活性な物質に対する、このような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、この活性化合物と不適合である範囲を除いて、この組成物におけるそれらの使用が考慮される。補助活性化合物もまた、組成物へ組み込まれ得る。
【０３９２】
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与の経路と適合するように処方される。投与の経路の例には、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下）投与、経口（例えば、吸入）投与、経皮（局所的）投与、経粘膜（ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ）投与、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝液；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度の調節のための薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整され得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジあるいはガラスまたはプラスチックから作製される多用量のバイアル中に封入され得る。
【０３９３】
注入使用に適した薬学的組成物は、滅菌の水溶液（水溶性である場合）または水性分散液、および滅菌の注入可能な溶液または分散液の即座調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与について、適切なキャリアには、生理食塩水、静菌性水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ　ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌性でなければならず、そして容易な注入性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動的であるべきである。これは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存が利かなければならない。このキャリアは、例えば、以下を含む溶媒または分散液であり得る：水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）ならびにそれらの適切な混合物。適切な流動性が、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散剤の場合、要求される粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤（例えば、糖、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注入可能組成物の長期の吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチン）を組成物に含ませることによってもたらされ得る。
【０３９４】
滅菌注射可能液剤は、必要量のこの活性化合物（例えば、ＮＯＶＸタンパク質あるいは抗ＮＯＶＸ抗体）を、必要な場合、上記で列挙される成分の１つまたはその組み合わせと共に適切な溶媒中に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般的に、分散剤は、活性化合物を、基本（ｂａｓｉｃ）分散媒および上記で列挙される成分からの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中へ組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合において、調製方法は、減圧乾燥および凍結乾燥であり、これにより、既に滅菌濾過されたその溶液から、活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を得る。
【０３９５】
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤へ圧縮され得る。経口治療投与の目的のために、この活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得、そして錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、うがい薬（ｍｏｕｔｈｗａｓｈ）としての使用のために流体キャリアを使用して調製され得、ここで、この流体キャリア中のこの化合物は、経口的に適用され、そして素早く動かされ（ｓｗｉｓｈ）、そして吐き出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント材料が、この組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などが、任意の以下の成分または同様の性質を有する化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶セルロース、ガムトラガントまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸）、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチ；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ）；グライダント（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；あるいは香味剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバー）。
【０３９６】
吸入による投与について、この化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のような気体）を含む圧縮容器またはディスペンサー、あるいは噴霧器から、エアロゾルスプレーの形態で送達される。
【０３９７】
全身的投与はまた、経粘膜手段または経皮手段によりなされ得る。経粘膜投与または経皮投与について、浸透されるバリアに対して適切な浸透剤が、処方物に使用される。このような浸透剤は、一般的に、当該分野で公知であり、そして、例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、点鼻スプレーまたは坐剤の使用によって達成され得る。経皮投与については、この活性化合物は、当該分野で一般的に公知である軟膏剤、軟膏、ゲル、またはクリーム剤へ処方される。
【０３９８】
この化合物はまた、直腸送達のための坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤基剤を含む）または保持浣腸の形態で調製され得る。
【０３９９】
１つの実施形態において、この活性化合物は、身体からの迅速な排出に対してこの化合物を保護するキャリアを用いて調製され（例えば、徐放性処方物）、これには、移植片およびマイクロカプセル化された送達系が挙げられる。酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような、生分解性の生体適合性ポリマーが使用され得る。このような処方物の調製のための方法は、当該業者には明らかである。これらの材料はまた、Ａｌｚａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｎｏｖａ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能である。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染させた細胞に標的化されたリポソームを含む）がまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０４００】
投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態で、経口組成物または非経口組成物を処方することが、特に有益である。本明細書で使用される投薬単位形態は、処置される被験体のための単一の投薬量として適切な、物理的に別個の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアとともに、所望の治療的効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態についての仕様は、この活性化合物の固有の特性、および達成される特定の治療効果によって決定され、そしてこれらに直接依存する。
【０４０１】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（例えば、米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）、または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：３０５４−３０５７を参照のこと）によって被験体へ送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、受容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含有し得るか、または遺伝子送達ビヒクルが組み込まれた徐放性マトリックスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが、組換え細胞からインタクトで産生され得る場合（例えば、レトロウイルスベクター）、この薬学的調製物は、遺伝子送達系を生ずる１以上の細胞を含み得る。
【０４０２】
薬学的組成物は、投与のための使用説明書と一緒に、容器、包装、またはディスペンサーに含まれ得る。
【０４０３】
（スクリーニングおよび検出の方法）
本発明の単離された核酸分子は、以下にさらに記載されるように、（例えば、遺伝子治療適用における宿主細胞中の組換え発現ベクターを介して）ＮＯＶＸタンパク質を発現するため、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡ（例えば、生物学的サンプルにおいて）またはＮＯＶＸ遺伝子における遺伝子損傷を検出するため、ならびにＮＯＶＸ活性を調節するために使用され得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の活性または発現を調節する薬物または化合物をスクリーニングするため、ならびにＮＯＶＸタンパク質の不十分もしくは過剰な産生によって、あるいはＮＯＶＸ野生型タンパク質と比較して減少した活性もしくは異常な活性を有するＮＯＶＸタンパク質形態の産生によって特徴付けられる障害（例えば、糖尿病（インシュリン放出を調節する）、肥満（脂質を結合および輸送する）、肥満に関連する代謝障害、代謝性症候群Ｘ、ならびに食欲不振および慢性疾患に関連する消耗障害および種々の癌、および感染性疾患（抗微生物活性を保有する）および種々の異脂肪血症）を処置するために使用され得る。さらに、本発明の抗ＮＯＶＸ抗体が、ＮＯＶＸタンパク質を検出および単離するため、ならびにＮＯＶＸ活性を調節するために使用され得る。なおさらなる局面において、本発明は、ポジティブおよびネガティブな様式の両方で、食欲、栄養分の吸収、代謝物質の処分に影響するような方法で使用され得る。
【０４０４】
本発明は、さらに、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイによって同定される新規の薬剤、および上記のような処置のためのこれらの使用に関する。
【０４０５】
（スクリーニングアッセイ）
本発明は、調節因子、すなわち、ＮＯＶＸタンパク質に結合するか、あるいは例えば、ＮＯＶＸタンパク質発現またはＮＯＶＸタンパク質活性に対して刺激効果または阻害効果を有する、候補化合物または候補薬剤、あるいは試験化合物または試験薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または他の薬物）を同定するための方法（本明細書中において「スクリーニングアッセイ」とも称される）を提供する。本発明はまた、本明細書中で記載されるスクリーニングアッセイで同定される化合物を包含する。
【０４０６】
１実施形態において、本発明は、ＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチド、あるいはその生物学的に活性な部分の膜結合形態に結合するか、またはその膜結合形態の活性を調節する、候補化合物もしくは試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを使用して得られ得、これには、以下が挙げられる：生物学的ライブラリー；空間的に位置付け可能な並行固相もしくは溶液相ライブラリー；逆重畳を要する合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である（例えば、Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ　１２：１４５を参照のこと）。
【０４０７】
本明細書中で使用される場合、「低分子」とは、約５ｋＤ未満の分子量、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物をいうように意味される。低分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質または他の有機分子もしくは無機分子であり得る。化学的および／または生物学的混合物（例えば、真菌、細菌または藻類抽出物）のライブラリーは、当該分野で公知であり、そして本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングされ得る。
【０４０８】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば以下に見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３。
【０４０９】
化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１３：４１２〜４２１）、あるいはビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ　３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ　３６４：５５５〜５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ　米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ　米国特許第５，２３３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８〜６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１〜３１０；Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２３３，４０９号）において提示され得る。
【０４１０】
１つの実施形態において、アッセイは細胞ベースのアッセイであり、ここで、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質、またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上に発現する細胞が、試験化合物と接触され、そしてこの試験化合物が、ＮＯＶＸタンパク質に結合する能力が、決定される。例えば、細胞は、哺乳動物起源または酵母細胞であり得る。この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質に結合する能力の決定は、例えば、その試験化合物を放射性同位体または酵素的標識とカップリングさせて、その結果、この試験化合物のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に対する結合が、複合体におけるその標識化合物を検出することによって決定され得ることによって達成され得る。例えば、試験化合物は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで直接的または間接的のいずれかで標識され得、そしてその放射性同位体が、放射線放射の直接の計数により、またはシンチレーション計数により、検出され得る。あるいは、試験化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識され得、そしてこの酵素的標識が、適切な基質の生成物への転換を決定することにより、検出され得る。１つの実施形態において、このアッセイは、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質、またはその生物学的に活性な部分をその細胞表面上に発現する細胞を、ＮＯＶＸと結合する既知の化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物に試験化合物を接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、この試験化合物が、既知の化合物と比較して、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を決定する工程を包含する。
【０４１１】
別の実施形態において、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、これは、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上で発現する細胞を、試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物が、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物が、ＮＯＶＸまたはその生物学的に活性な部分の活性を調節する能力の決定は、例えば、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子に結合またはこの標的分子と相互作用する能力を決定することによって、達成され得る。本明細書中において使用する場合には、「標的分子」とは、ＮＯＶＸタンパク質が天然に結合または相互作用する分子であり、例えば、ＮＯＶＸ相互作用タンパク質を発現する細胞表面上の分子、第二の細胞の表面上の分子、細胞外環境中の分子、細胞膜の内面と会合する分子、または細胞質分子である。ＮＯＶＸ標的分子は、非ＮＯＶＸ分子あるいは本発明のＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドであり得る。１つの実施形態において、ＮＯＶＸ標的分子は、シグナル伝達経路の構成要素であり、これは、細胞膜を通って細胞内への細胞外シグナル（例えば、化合物が膜結合ＮＯＶＸ分子に結合することにより発生するシグナル）の伝達を促進する。その標的は、例えば、触媒活性を有する第二の細胞内タンパク質、または下流シグナル伝達分子のＮＯＶＸとの会合を容易にするタンパク質であり得る。
【０４１２】
ＮＯＶＸタンパク質がＮＯＶＸ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相互作用する能力の決定は、直接的結合を決定するための上記方法の１つにより、達成され得る。１つの実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質がＮＯＶＸ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相互作用する能力の決定は、その標的分子の活性を決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の活性は、その標的の細胞性セカンドメッセンジャー（すなわち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など）の誘導を検出すること、適切な基質への標的の触媒活性／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする核酸に作動可能に連結されたＮＯＶＸ応答性調節エレメントを含む）の誘導を検出すること、または細胞応答（例えば、細胞生存度、細胞分化、または細胞増殖）を検出することにより、決定され得る。
【０４１３】
なお別の実施形態において、本発明のアッセイは、無細胞アッセイであり、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物に接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物の、ＮＯＶＸタンパク質への結合は、上記のように、直接的または間接的にのいずれかで決定され得る。１つのこのような実施形態において、このアッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＮＯＶＸを結合する既知の化合物に接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物に接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、この試験化合物が、既知の化合物と比較して、ＮＯＶＸ、またはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を決定する工程を包含する。
【０４１４】
なお別の実施形態において、アッセイは、無細胞アッセイであり、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物がＮＯＶＸの活性を調節する能力の決定は、例えば、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子に結合する能力を、直接的結合の決定のための上記方法の１つによって決定することにより、達成され得る。代替の実施形態において、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質の活性を調節する能力の決定は、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子をさらに調節する能力を決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の適切な基質に対する触媒活性／酵素活性は、上記のように決定され得る。
【０４１５】
なお別の実施形態において、無細胞アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＮＯＶＸタンパク質を結合する既知の化合物に接触させてアッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子と優先的に結合するか、またはその標的分子の活性を優先的に調節する能力を決定する工程を包含する。
【０４１６】
本発明の無細胞アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質の、可溶性の形態または膜結合形態の両方の使用に受け入れられる。膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質を含む無細胞アッセイの場合には、ＮＯＶＸタンパク質の膜結合形態が溶液中に維持されるように、可溶化剤を利用することが所望され得る。このような可溶化剤の例には、非イオン性界面活性剤が挙げられ、例えば、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ（Ｉｓｏｔｒｉｄｅｃｙｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ　ｅｔｈｅｒ）ｎ、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンミニオール−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−１−ｐｒｏｐａｎｅ　ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳ）、または３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンミニオール−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａｎｅ　ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳＯ）である。
【０４１７】
本発明の上記アッセイ方法の１つより多い実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質またはその標的分子のいずれかを固定して、そのタンパク質の一方または両方の非複合形態からの複合形態の分離を容易にし、そしてそのアッセイの自動化に適合させることが、所望され得る。試験化合物の、ＮＯＶＸタンパク質への結合、または候補化合物の存在下および非存在下での、ＮＯＶＸタンパク質の標的分子との相互作用は、これらの反応物を収容するために適切な任意の容器内で、達成され得る。このような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。１実施形態において、そのタンパク質の一方または両方がマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質が、提供され得る。例えば、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質またはＧＳＴ標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され得、次いでこれらは、試験化合物と合わせられるか、あるいは試験化合物および未吸着標的タンパク質またはＮＯＶＸタンパク質のいずれかと合わせられ、そしてこの混合物が、複合体形成を誘導する条件下（例えば、塩およびｐＨに関して生理学的条件）でインキュベートされる。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、結合していないあらゆる成分を除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定し、例えば上記のように、複合体を直接的または間接的のいずれかで決定する。あるいは、複合体がマトリックスから解離され得、そしてＮＯＶＸタンパク質の結合レベルまたは活性レベルを、標準的な技術を使用して決定し得る。
【０４１８】
タンパク質をマトリックスに固定するための他の技術もまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質、またはその標的分子のいずれかが、ビオチンとストレプトアビジンとの結合体化を利用して、固定され得る。ビオチン化ＮＯＶＸタンパク質または標的分子は、当該分野において周知の技術を使用して、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製され得（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）、そしてストレプトアビジンでコーティングした９６ウェルのプレート（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定され得る。あるいは、ＮＯＶＸタンパク質または標的分子と反応性であるがＮＯＶＸタンパク質のその標的分子への結合を妨害しない抗体が、そのプレートのウェルに誘導体化され得、そして結合していない標的またはＮＯＶＸタンパク質が、抗体の結合体化によってウェル内に捕捉され得る。このような複合体を検出するための方法には、ＧＳＴ固定複合体に関しての上記で述べた方法に加えて、ＮＯＶＸタンパク質または標的分子と反応性の抗体を使用する、複合体の免疫検出、ならびにＮＯＶＸタンパク質または標的分子に会合する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが挙げられる。
【０４１９】
別の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質発現のモジュレーターは、細胞を候補化合物と接触させ、そして細胞中のＮＯＶＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を決定する方法において同定される。候補化合物の存在下でのＮＯＶＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、候補化合物の非存在下でのＮＯＶＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較される。次いで、候補化合物は、この比較に基づいて、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のモジュレーターとして同定され得る。例えば、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の非存在下より、その存在下における方が大きい（すなわち、統計的に有意に大きい）場合、この候補化合物は、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の刺激物質として同定される。あるいは、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の非存在下よりその存在下の方が少ない（統計的に有意に少ない）場合、この候補化合物は、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のインヒビターとして同定される。細胞中のＮＯＶＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するために本明細書中に記載の方法によって決定され得る。
【０４２０】
本発明のなお別の局面において、ＮＯＶＸタンパク質は、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおいて「餌（ｂａｉｔ）タンパク質」として使用されて（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ　７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら、１９９３　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら、１９９３　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら、１９９３　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ　ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）、ＮＯＶＸ（「ＮＯＶＸ結合タンパク質」または「ＮＯＶＸ−ｂｐ」）に結合するか、またはこれと相互作用し、そしてＮＯＶＸ活性を調節する他のタンパク質を同定し得る。このようなＮＯＶＸ結合タンパク質はまた、例えば、ＮＯＶＸ経路の上流または下流エレメントとしてＮＯＶＸタンパク質によるシグナル伝達に関与する可能性がある。
【０４２１】
ツーハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインからなる、大部分の転写因子のモジュール的性質に基づく。簡潔には、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。一方の構築物においては、ＮＯＶＸをコードする遺伝子が既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他方の構築物においては、ＤＮＡ配列のライブラリー由来の、未同定タンパク質（「餌食（ｐｒｅｙ）」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列が、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「餌」および「餌食」タンパク質がインビボで相互作用して、ＮＯＶＸ依存性複合体を形成し得る場合、この転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、非常に近くにある。近位にあることにより、転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写が可能となる。レポーター遺伝子の発現が検出され得、そして機能的転写因子を含む細胞コロニーが、単離され得、そしてＮＯＶＸと相互作用するタンパク質をコードするクローニングされた遺伝子を得るために使用され得る。
【０４２２】
本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイにより同定される新規な薬剤および本明細書中に記載されるような処置のためのこの薬剤の使用に関する。
【０４２３】
（検出アッセイ）
本明細書中で同定されるｃＤＮＡ配列の一部またはフラグメント（および対応する完全な遺伝子配列）は、ポリヌクレオチド試薬として多くの方法で使用され得る。例えば、限定でなく、これらの配列を使用して、（ｉ）染色体上にそれぞれの遺伝子をマッピングし得；従って、遺伝病と関連する遺伝子領域を位置決定し得る；（ｉｉ）微量の生物学的サンプルから個体を同定し得る（組織型決定）；そして（ｉｉｉ）生物学的サンプルの法医学的識別を助け得る。これらの適用のいくつかは、以下の節において記載される。
【０４２４】
（染色体マッピング）
一旦、遺伝子の配列（または配列の一部分）が単離されると、この配列を用いて染色体上に遺伝子の位置をマッピングし得る。このプロセスは、染色体マッピングとよばれる。従って、ＮＯＶＸ配列の一部またはフラグメント、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１または３３、またはそのフラグメントもしくは誘導体を用いて、それぞれ、ＮＯＶＸ遺伝子の位置を染色体上にマッピングし得る。ＮＯＶＸ配列を染色体にマッピングすることは、これらの配列と、疾患と関連する遺伝子とを相関付ける際の重要な第一歩である。
【０４２５】
簡潔には、ＮＯＶＸ遺伝子は、ＮＯＶＸ配列からＰＣＲプライマー（好ましくは、１５〜２５ｂｐの長さ）を調製することにより染色体にマッピングし得る。ＮＯＶＸ配列のコンピューター分析を用いて、ゲノムＤＮＡにおける１つを超えるエキソンにまたがらないプライマーを迅速に選択し得、従って、増幅プロセスを複雑にし得る。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用され得る。ＮＯＶＸ配列に対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅されたフラグメントを生じる。
【０４２６】
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳動物由来の体細胞（例えば、ヒトおよびマウス細胞）を融合することにより調製される。ヒトおよびマウス細胞のハイブリッドが増殖および分裂するにつれ、それらは、無作為な順序で徐々にヒト染色体を失うが、マウス染色体を維持する。マウス細胞は増殖できないがこれらは特定の酵素を欠くので、ヒト細胞は増殖できる培地を使用することにより、必要な酵素をコードする遺伝子を含む１つのヒト染色体が維持される。種々の培地を使用することによって、ハイブリッド細胞株のパネルが確立され得る。パネルにおける各細胞株は、単一のヒト染色体または少数のヒト染色体いずれかおよびマウス染色体の完全なセットを含み、これにより、個々の遺伝子を特定のヒト染色体にマッピングすることが容易に可能になる（例えば、Ｄ’Ｅｕｓｔａｃｈｉｏら（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２０：９１９−９２４を参照のこと）。ヒト染色体のフラグメントのみを含む体細胞ハイブリッドはまた、転座および欠失を伴うヒト染色体を使用することにより生成され得る。
【０４２７】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に特定の配列を割り当てるためには迅速な手順である。１つのサーマルサイクラーを用いて一日に３つ以上の配列が割り当てられ得る。ＮＯＶＸ配列を使用して、オリゴヌクレオチドプライマーを設計すると、下位位置決定（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、特定の染色体由来のフラグメントのパネルを用いて達成され得る。
【０４２８】
中期染色体スプレッドに対するＤＮＡ配列の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）をさらに使用して、一工程で正確な染色体位置を提供し得る。染色体スプレッドは、コルセミド（有糸分裂紡錘体を破壊する）のような化学物質により分裂が中期においてブロックされた細胞を使用して行われ得る。この染色体は、トリプシンで短時間処理され得、次いで、ギムザ染色され得る。薄いバンドおよび濃いバンドのパターンが各染色体で発生し、その結果、この染色体は、個々に同定され得る。ＦＩＳＨ技術は、５００または６００塩基ほどの短さのＤＮＡ配列を用いて使用され得る。しかし、１，０００塩基より大きなクローンは、簡単な検出に十分なシグナル強度で、独特の染色体位置に結合する可能性がより高い。好ましくは、１，０００塩基、そしてより好ましくは、２，０００塩基が妥当な時間量で良好な結果を得るために十分である。この技術の総説については、Ｖｅｒｍａら、ＨＵＭＡＮ　ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥＳ：Ａ　ＭＡＮＵＡＬ　ＯＦ　ＢＡＳＩＣ　ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８８）を参照のこと。
【０４２９】
染色体マッピングの試薬は、単一の染色体またはその染色体上の単一部位を印付けするために個々に使用され得るか、または試薬のパネルは複数部位および／または複数染色体を印付けするために使用され得る。遺伝子の非コード領域に対応する試薬は、実際に、マッピング目的のために好ましい。コード配列は、遺伝子ファミリー内に保存されており、従って、染色体マッピングの間に交叉ハイブリダイゼーションの機会が増大する可能性がより高い。
【０４３０】
一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、その配列の染色体上の物理的位置は、遺伝子マップデータと相関し得る。このようなデータは、例えば、ＭｃＫｕｓｉｃｋ，ＭＥＮＤＥＬＩＡＮ　ＩＮＨＥＲＩＴＡＮＣＥ　ＩＮ　ＭＡＮ（Ｊｏｈｎｓ　Ｈｏｐｋｉｎｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｗｅｌｃｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｌｉｂｒａｒｙを通じてオンラインで入手可能）において見いだされる。次いで、同じ染色体領域にマッピングされる遺伝子と疾患との間の関係は、例えば、Ｅｇｅｌａｎｄら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２５：７８３−７８７に記載される連鎖分析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）によって同定され得る。
【０４３１】
さらに、ＮＯＶＸ遺伝子と関連する疾患に罹患した個体と、この疾患に罹患していない個体との間のＤＮＡ配列における差異が決定され得る。罹患した個体のいくつかまたは全てにおいて変異が認められるが、非罹患個体のいずれにおいても認められない場合、この変異は特定の疾患の原因因子である可能性が高い。罹患個体と非罹患個体の比較は、一般に、染色体における構造的変化（例えば、染色体スプレッドから可視であるか、またはそのＤＮＡ配列に基づいたＰＣＲを用いて検出可能な欠失または転座）を最初に探す工程を包含する。最終的に、いくつかの個体に由来する遺伝子の完全な配列決定を行って、変異の存在を確認し、かつ多型に由来する変異を区別し得る。
【０４３２】
（組織型決定（ｔｉｓｓｕｅ　ｔｙｐｉｎｇ））
本発明のＮＯＶＸ配列はまた、わずかな生物学的サンプルから個体を同定するために使用され得る。この技術において、個体のゲノムＤＮＡは、１つ以上の制限酵素で消化され、そして同定のために独特のバンドを生成するためにサザンブロット上でプローブされる。本発明の配列は、ＲＦＬＰ（米国特許第５，２７２，０５７号に記載の「制限フラグメント長多型」）のためのさらなるＤＮＡマーカーとして有用である。
【０４３３】
さらに、本発明の配列を用いて、個体のゲノムの選択された部分について実際の塩基ごとにＤＮＡ配列を決定する代替的技術を提供し得る。従って、本明細書中に記載のＮＯＶＸ配列を用いて、配列の５’末端および３’末端から２つのＰＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これらのプライマーを使用して、個体のＤＮＡを増幅し得、引き続いて、配列決定し得る。
【０４３４】
このように調製された個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、各個体が、対立遺伝子差異に起因するこのようなＤＮＡ配列の独特のセットを有するので、唯一の個体同定を提供し得る。本発明の配列は、個体由来および組織由来の配列のこのような同定を得るために使用され得る。本発明のＮＯＶＸ配列は、ヒトゲノムの部分を独特に表す。対立遺伝子変異は、これらの配列のコード領域においてある程度生じ、そして非コード領域においてより大きな程度に生じる。個々のヒト間での対立遺伝子変異は、各５００塩基につき約１回の頻度で生じると見積もられる。対立遺伝子変異の多さは、制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）を含む単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）に起因する。
【０４３５】
本明細書中で記載の配列の各々は、ある程度、標準物質（これに対して個体由来のＤＮＡが同定の目的で比較され得る）として使用され得る。より多くの多型が非コード領域で生じるので、個体を区別するために、それほど多くの配列が必要であるわけではない。非コード配列は、おそらく１０〜１，０００プライマーのパネルを用いてポジティブな個体同定を不自由なく提供し得る。これらのプライマーは、各々が１００塩基の増幅された非コード配列を生じる。推定コード配列（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１または３３における配列）が使用される場合、ポジティブな個体同定に関するプライマーのより適切な数は、５００〜２，０００である。
【０４３６】
（予測医療）
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬物ゲノム（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）およびモニタリング臨床試験が、予後（予測）の目的に使用され、これによって個体を予防的に処置する、予測医療の分野に関する。従って、本発明の１つの局面は、ＮＯＶＸタンパク質および／または核酸の発現、ならびにＮＯＶＸの活性を、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織）に関して決定するための診断アッセイに関し、これによって、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連して、個体が疾患または障害に罹患しているか否か、あるいは障害を発症するリスクがあるかどうかを決定する。これらの障害としては、代謝障害、糖尿病、肥満症、感染症、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、ならびに種々の異常脂肪性浮腫（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａｓ）、肥満に関連する代謝障害、Ｘ代謝症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　Ｘ）、および慢性疾患と関連する消耗疾患、および種々の癌が挙げられる。本発明はまた、個体が、ＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または活性と関連した障害を発症するリスクがあるかどうかを決定するための予後的（または予測的）アッセイを提供する。例えば、ＮＯＶＸの遺伝子における変異が、生物学的サンプルにおいてアッセイされ得る。このようなアッセイは、予後的または予測的な目的に使用され得、これによってＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または生物学的活性によって特徴付けられるかまたは関連した障害の発病の前に個体を予防的に処置する。
【０４３７】
本発明の別の局面は、個体におけるＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現あるいは活性を決定するための方法を提供し、これによって、その個体についての適切な治療的または予防的薬剤（本明細書において「薬物ゲノム」とよばれる）を選択する。薬物ゲノムは、個体の遺伝型（例えば、特定の薬剤に対して応答する個体の能力を決定するために試験される個体の遺伝型）に基づいて個体の治療的または予防的処置のための薬剤（例えば、薬物）の選択を可能にする。
【０４３８】
本発明のなお別の局面は、臨床試験におけるＮＯＶＸの発現または活性に対する薬剤（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることに関する。
【０４３９】
これらおよび他の薬剤は、以下の節でさらに詳細に記載される。
【０４４０】
（診断アッセイ）
生物学的サンプルにおけるＮＯＶＸの存在または非存在を検出するための例示的な方法は、試験被験体から生物学的サンプルを得る工程、およびその生物学的サンプルをＮＯＶＸタンパク質またはＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出し得る化合物もしくは薬剤とを接触させ、その結果、ＮＯＶＸの存在が、その生物学的サンプルにおいて検出される工程を包含する。ＮＯＶＸのｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡを検出するための薬剤は、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る、標識された核酸プローブである。この核酸プローブは、例えば、全長のＮＯＶＸの核酸（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２５、２７、２９、３１もしくは３３の核酸またはそれらの一部）（例えば、少なくとも、１５、３０、５０、１００、２５０もしくは５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件下でＮＯＶＸのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするに十分である核酸）であり得る。本発明の診断アッセイにおける使用のための他の適切なプローブは本明細書において記載されている。
【０４４１】
ＮＯＶＸタンパク質を検出するための薬剤は、ＮＯＶＸタンパク質に結合し得る抗体であり、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナルであり得るか、またはより好ましくはモノクローナルであり得る。インタクトな抗体またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が使用され得る。用語「標識（された）」とは、プローブまたは抗体に関して、検出可能な物質をそのプローブもしくは抗体にカップリングさせる（すなわち、物理的に連結する）ことによってそのプローブまたは抗体を直接標識すること、ならびに、直接標識された別の試薬との反応性によってそのプローブもしくは抗体の間接的に標識することを包含することが意図される。間接的な標識の例としては、蛍光標識された二次抗体を用いた一次抗体の検出、および蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて検出され得るようにビオチンを用いたＤＮＡプローブの末端標識が挙げられる。用語「生物学的サンプル」とは、被験体から単離された組織、細胞および生物学的流体ならびに被験体に存在する組織、細胞および流体を含むことが意図される。すなわち、本発明の検出方法を用いて、ＮＯＶＸのｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを、生物学的サンプル中で、インビトロおよびインビボで検出し得る。例えば、ＮＯＶＸのｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。ＮＯＶＸタンパク質の検出のためのインビトロ技術としては、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光が挙げられる。ＮＯＶＸのゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、ＮＯＶＸタンパク質の検出のためのインビボ技術としては、標識された抗ＮＯＶＸ抗体を被験体に導入することが挙げられる。例えば、その抗体は、放射性マーカーを用いて標識され得る。被験体における放射性マーカーの存在および位置は、標準的な画像化技術によって検出され得る。
【０４４２】
１つの実施形態において、この生物学的サンプルは、その試験被験体からのタンパク質分子を含む。あるいは、その生物学的サンプルは、その試験被験体からのｍＲＮＡ分子またはその試験被験体からのゲノムＤＮＡ分子を含み得る。好ましい生物学的サンプルは、被験体から従来の手段によって単離された末梢血白血球サンプルである。
【０４４３】
別の実施形態において、本発明の方法はさらに、コントロール被験体からコントロール生物学的サンプルを得る工程、そのコントロールサンプルを、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡを検出し得る化合物もしくは薬剤と接触させ、その結果、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在がその生物学的サンプルにおいて検出される工程、およびそのコントロールサンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在と、その試験サンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在とを比較する工程を包含する。
【０４４４】
本発明はまた、生物学的サンプルにおけるＮＯＶＸの存在を検出するためのキットを包含する。例えば、このキットは、以下を備え得る：生物学的サンプルにおいてＮＯＶＸのタンパク質またはｍＲＮＡを検出し得る、標識された化合物もしくは薬剤；そのサンプルにおいてＮＯＶＸの量を決定するための手段；およびそのサンプルにおいて、ＮＯＶＸの量を標準と比較するための手段。この化合物または薬剤は、適切な容器内に包装され得る。このキットは、さらに、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸を検出するためにキットを用いるための指示書を備え得る。
【０４４５】
（予後アッセイ）
本明細書において記載された診断方法をさらに利用して、ＮＯＶＸ異常発現または異常活性に関連した疾患もしくは障害を有するか、またはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。例えば、本明細書に記載されるアッセイ（例えば、上述の診断アッセイまたは下記のアッセイ）を利用して、ＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または活性に関連する障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。あるいは、この予後アッセイを利用して、疾患または障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。従って、本発明は、ＮＯＶＸ異常発現または異常活性に関連する疾患もしくは障害を同定するための方法を提供する。ここで、試験サンプルは、被験体から得られ、そしてＮＯＶＸタンパク質または核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）が検出され、ここで、ＮＯＶＸタンパク質または核酸の存在は、ＮＯＶＸ異常発現または異常活性に関連する疾患または障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体についての診断指標である。本明細書において使用される場合「試験サンプル」とは、目的の被験体から得られた生物学的サンプルをいう。例えば、試験サンプルは、生物学的流体（例えば、血清）、細胞サンプル、または組織であり得る。
【０４４６】
さらに、本明細書に記載される予後アッセイを使用して、被験体に薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の薬物候補）を投与してＮＯＶＸ異常発現または異常活性に関連する疾患または障害を処置し得るか否かを、決定し得る。例えば、このような方法を使用して、被験体が障害のための薬剤で有効に処置され得るか否かを決定し得る。従って、本発明は、ＮＯＶＸ異常発現または異常活性に関連する障害についての薬剤を用いて、被験体が有効に処置され得るか否かを決定するための方法を提供する。ここで、試験サンプルが得られ、そしてＮＯＶＸタンパク質または核酸が検出される（例えば、ここで、ＮＯＶＸタンパク質または核酸の存在は、この薬剤が投与されてＮＯＶＸ異常発現または異常活性に関連する障害が処置され得る被験体についての、診断指標である）。
【０４４７】
本発明の方法はまた、ＮＯＶＸ遺伝子における遺伝的損傷を検出し、それによって、その損傷遺伝子を有する被験体が異常な細胞増殖および／または分化によって特徴付けられる障害についての危険性を有するか否かを決定するためにも使用され得る。種々の実施形態において、この方法は、その被験体からの細胞のサンプルにおいて、ＮＯＶＸタンパク質をコードする遺伝子の統合性に影響を与える少なくとも１つの変更によって特徴付けられる遺伝的損傷の存在または非存在、あるいはＮＯＶＸ遺伝子の誤発現を検出する工程を包含する。例えば、そのような遺伝的損傷は、以下の少なくとも１つの存在を確認することによって検出され得る：（ｉ）ＮＯＶＸ遺伝子からの１つ以上のヌクレオチドの欠失；（ｉｉ）ＮＯＶＸ遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの付加；（ｉｉｉ）ＮＯＶＸ遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの置換、（ｉｖ）ＮＯＶＸ遺伝子の染色体再配置；（ｖ）ＮＯＶＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルにおける変更、（ｖｉ）ＮＯＶＸ遺伝子の異常改変（例えば、ゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常改変）、（ｖｉｉ）ＮＯＶＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、（ｖｉｉｉ）ＮＯＶＸタンパク質の非野生型レベル、（ｉｘ）ＮＯＶＸ遺伝子の対立遺伝子の欠失、ならびに（ｘ）ＮＯＶＸタンパク質の不適切な翻訳後修飾。本明細書において記載されるように、当該分野において、ＮＯＶＸ遺伝子における損傷を検出するために使用され得る、多数の公知のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的サンプルは、従来手段によって被験体から単離された末梢血白血球サンプルである。しかし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプルが使用され得、これには、例えば、頬粘膜細胞が挙げられる。
【０４４８】
特定の実施形態において、損傷の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を参照のこと）（例えば、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ　ＰＣＲ）、あるいは、連結連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ　９１：３６０−３６４を参照のこと）におけるプローブ／プライマーの使用を包含する。後者は、ＮＯＶＸ遺伝子における点変異を検出するために特に有用であり得る）（Ａｂｒａｖａｙａら，１９９５　Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　２３：６７５−６８２を参照のこと）。この方法は、患者から細胞のサンプルを収集する工程、核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたはその両方）をそのサンプルの細胞から単離する工程、ＮＯＶＸ遺伝子に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーとその核酸サンプルとを、ＮＯＶＸ遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で接触させる工程、ならびに増幅産物の存在もしくは非存在を検出する工程、またはその増幅産物のサイズを検出する工程およびその長さをコントロールサンプルと比較する工程を包含し得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書中に記載される変異を検出するために使用される技術のいずれかとともに予備的増幅工程として使用されることが望ましくあり得ることが予想される。
【０４４９】
代替的な増幅方法としては、以下が挙げられる：当業者に周知な技術を用いた、その増幅された分子の検出の前の、自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：１８７４−１８７８を参照のこと）、転写増幅系（Ｋｗｏｈら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：１１７３−１１７７を参照のこと）、Ｑレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：１１９７を参照のこと）、または他の任意の核酸増幅方法。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に極少数で存在する場合に、そのような核酸分子の検出のために特に有用である。
【０４５０】
代替の実施形態において、サンプル細胞からのＮＯＶＸ遺伝子における変異は、制限酵素切断パターンにおける変更によって同定され得る。例えば、サンプルおよびコントロールのＤＮＡが単離され、増幅され（必要に応じて）、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて消化され、そしてフラグメント長の大きさがゲル電気泳動によって決定され、そして比較される。サンプルＤＮＡとコントロールＤＮＡとの間のフラグメント長の大きさにおける差異は、そのサンプルＤＮＡにおける変異を示す。さらに、配列特異的なリボザイムの使用（例えば、米国特許第５，４９３，５３１号を参照のこと）を使用して、リボザイム切断部位の発生または喪失によって特異的な変異の存在についてスコア付けし得る。
【０４５１】
他の実施形態において、ＮＯＶＸにおける遺伝子変異は、サンプル核酸およびコントロール核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイに対してハイブリダイズさせることによって同定され得る（例えば、Ｃｒｏｎｉｎら（１９９６）Ｈｕｍａｎ　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｌら（１９９６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：７５３−７５９を参照のこと）。例えば、ＮＯＶＸにおける遺伝子変異は、Ｃｒｏｎｉｎら（前出）に記載されるように光生成ＤＮＡプローブを含む二次元アレイにおいて同定され得る。手短には、プローブの第一ハイブリダイゼーションアレイを用いて、サンプルおよびコントロールにおける長いストレッチのＤＮＡにわたって走査し、連続的に重複するプローブの線形アレイを作成することによって、その配列間の塩基変化を同定し得る。この工程は、点変異の同定を可能にする。この工程に第二のハイブリダイゼーションアレイが続き、これは、検出される全ての改変体または変異体に相補的な、より小さな特化されたプローブアレイを用いることによる特定の変異の特徴付けを可能にする。各変異アレイは、一方が野生型遺伝子に対して相補的であり、そして他方が変異遺伝子に対して相補である並行プローブセットから構成される。
【０４５２】
なお別の実施形態において、当該分野で公知の種々の配列決定反応のいずれかを使用して、ＮＯＶＸ遺伝子を直接配列決定し得、そしてサンプルＮＯＶＸ配列と対応する野生型（コントロール）配列とを比較することによって、変異を検出し得る。配列決定反応の例としては、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ　７４：５６０またはＳａｎｇｅｒ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７４：５４６３によって開発された技術に基づくものが挙げられる。診断アッセイを実施する場合、種々の自動化配列決定手順のいずれかを利用し得ることもまた意図される（例えば、Ｎａｅｖｅら（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１９：４４８を参照のこと）。これらには、質量分析法による配列決定法（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ　９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら（１９９６）Ａｄｖ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎら（１９９３）Ａｐｐｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　３８．：１４７−１５９を参照のこと）が含まれる。
【０４５３】
ＮＯＶＸ遺伝子における変異を検出するための他の方法としては、切断剤からの保護を使用して、ＲＮＡ／ＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡのヘテロ二重鎖に基づくミスマッチ塩基を検出する方法が挙げられる（例えば、Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０：１２４２を参照のこと）。一般に、「ミスマッチ切断」の当該分野の技術は、野生型のＮＯＶＸ配列を含む（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織サンプルから得られた潜在的な変異体ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることによって形成されるヘテロ二重鎖を提供する工程によって始まる。この二本鎖の二重鎖を、二重鎖の一本鎖領域（例えば、そのコントロールとサンプルの鎖との間の塩基対ミスマッチに起因して存在するもの）を切断する薬剤を用いて処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を、ＲＮａｓｅを用いて処理し得、そしてＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、そのミスマッチ領域を酵素的に消化することに対して、Ｓ１ヌクレアーゼを用いて処理し得る。他の実施形態において、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡのいずれかの二重鎖を、ミスマッチ領域を消化するために、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム、およびピペリジンを用いて処理し得る。そのミスマッチ領域の消化後、次いで、得られた物質を変性ポリアクリルアミドゲル上で、大きさにより分離して、変異の部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａら（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　２１７：２８６−２９５を参照のこと。１つの実施形態において、コントロールのＤＮＡまたはＲＮＡは、検出のために標識され得る。
【０４５４】
なお別の実施形態において、ミスマッチ切断反応は、二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチ塩基対を認識する１つ以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を、細胞のサンプルから得られたＮＯＶＸ　ｃＤＮＡにおける点変異を検出およびマッピングするために規定された系において使用する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチでＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチでＴを切断する（Ｈｓｕら（１９９４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ　１５：１６５７〜１６６２）。例示的な実施形態に従って、ＮＯＶＸ配列（例えば、野生型ＮＯＶＸ配列）に基づくプローブは、試験細胞由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物にハイブリダイズされる。二重鎖は、ＤＮＡミスマッチ修復酵素を用いて処理され、そしてその切断産物（もしあれば）は、電気泳動プロトコルなどから検出され得る。例えば、米国特許第５，４５９，０３９号を参照のこと。
【０４５５】
他の実施形態において、電気泳動の移動度における変化は、ＮＯＶＸ遺伝子における変異を同定するために使用される。例えば、一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）は、変異体と野生型核酸との間の電気泳動の移動度における差異を検出するために使用され得る（Ｏｒｉｔａら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：８６：２７６６；Ｃｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５〜１４４；Ｈａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３〜７９を参照のこと）。サンプルおよびコントロールＮＯＶＸ核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントは、変性され、そして再生される。一本鎖核酸の二次構造は、配列に従って変化し、電気泳動の移動度において得られる変化は、１つの塩基変化の検出さえも可能にする。ＤＮＡフラグメントは、標識され得るか、または標識されたプローブを用いて検出され得る。アッセイの感度は、ＤＮＡよりもむしろ、二次構造が配列中の変化に対してより感受的であるＲＮＡを使用することによって増強され得る。１つの実施形態において、本発明の方法は、ヘテロ二重鎖分析を利用して、電気泳動の移動度における変化に基づいて二本鎖のヘテロ二重鎖分子を分離する。例えば、Ｋｅｅｎら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ　７：５を参照のこと。
【０４５６】
なお別の実施形態において、一定勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミドゲルにおける変異体または野生型フラグメントの移動は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使用してアッセイされる。例えば、Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ　３１３：４９５を参照のこと。ＤＧＧＥが分析の方法として使用される場合、ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲにより約４０ｂｐの高融点ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプを付加することによって、完全には変性されないことを確実するように改変される。さらなる実施形態において、温度勾配は、コントロールおよびサンプルＤＮＡの移動度における差異を同定するために、変性剤勾配の代わりに使用される。例えば、ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７）Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｃｈｅｍ　２６５：１２７５３を参照のこと。
【０４５７】
点変異を検出するための他の技術の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、既知の変異が中心的に配置されるように調製され得、次いで、完全なマッチが見出される場合にのみハイブリダイゼーションを許容する条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズされる。例えば、Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ　３２４：１６３）；Ｓａｉｋｉら（１９８９）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８６：６２３０を参照のこと。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ膜に付着され、そして標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズされる場合に、ＰＣＲ増幅された標的ＤＮＡまたは多くの異なる変異にハイブリダイズされる。
【０４５８】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術は、本発明と合わせて使用され得る。特異的増幅についてのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中心において（その結果、増幅は、差次的ハイブリダイゼーションに依存する）（例えば、Ｇｉｂｂｓら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１７：２４３７〜２４４８を参照のこと）か、あるいは適切な条件下でミスマッチが妨げられ得るかまたはポリメラーゼ伸長を減少し得る、１つのプライマーの３’の最末端で、目的の変異を保有し得る（例えば、Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ　１１：２３８を参照のこと）。さらに、切断に基づく検出を行うために、変異領域に新規な制限部位を導入することは、切断に基づく検出を行うために望ましくあり得る。例えば、Ｇａｓｐａｒｉｎｉら（１９９２）Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｂｅｓ　６：１を参照のこと。特定の実施形態において、増幅はまた、増幅用Ｔａｑリガーゼを使用して実施され得ることが予測される。例えば、Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８８：１８９を参照のこと。このような場合において、連結は、５’配列の３’末端に完全なマッチが存在する場合にのみ生じ、増幅の存在または非存在を探索することによって、特定の部位における既知の変異の存在を検出することを可能にする。
【０４５９】
本明細書中に記載される方法は、例えば、本明細書中に記載れる少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含む、予めパッケージングされた診断キットを利用することによって実施され得、これは、例えば、ＮＯＶＸ遺伝子を含む疾患または疾病の症状または家族病歴を示す患者を診断するための臨床的設定において簡便に使用され得る。
【０４６０】
さらに、ＮＯＶＸが発現される任意の細胞型または組織（好ましくは、末梢血白血球）は、本明細書中に記載される予後アッセイにおいて利用され得る。しかし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプル（例えば、頬粘膜細胞を含む）が、使用され得る。
【０４６１】
（薬理ゲノム学（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ））
ＮＯＶＸ活性（例えば、ＮＯＶＸ遺伝子発現）に対する刺激性または阻害性の影響を有する因子、すなわちモジュレーターは、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定されるように、以下の障害を（予防的または治療的に）処置するために個体に投与され得る：この障害としては、代謝障害、糖尿病、肥満症、感染症、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、造血障害、および種々の異常脂肪性浮腫（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａｓ）、肥満に関連する代謝障害、Ｘ代謝症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　Ｘ）、および慢性疾患と関連する消耗疾患、および種々の癌が挙げられる。このような処置と合わせて、個体の薬理ゲノム学（すなわち、個体の遺伝子型と外来化合物または薬物に対するその個体の応答との間の関係についての研究）が、考慮され得る。治療剤の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血中濃度との間の関係を変更することによって、重篤な毒性または治療の失敗を導き得る。従って、個体の薬理ゲノム学は、個体の遺伝子型の考慮に基づく予防的または治療的処置のために有効な薬剤（例えば、薬物）の選択を許容する。このような薬理ゲノム学は、さらに、適切な投薬量および治療剤レジメンを決定するために使用され得る。従って、ＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、あるいは個体におけるＮＯＶＸ遺伝子の変異含量が決定されて、それによって個体の治療的または予防的処置のために適切な薬剤を選択し得る。
【０４６２】
薬理ゲノム学は、罹患した人おける変更された薬物の性質および異常な作用に起因して、薬物に応答する臨床的に有意な遺伝性変更を扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ、１９９６、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，２３：９８３〜９８５およびＬｉｎｄｅｒ、１９９７、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ，４３：２５４〜２６６を参照のこと。一般に、２つの型の薬理ゲノム学状態が、区別され得る。薬物が身体に作用する方法を変更する１つの因子として伝達される遺伝的状態（変更された薬物作用）、または身体が薬物に作用する方法を変更する１つの因子として伝達される遺伝的状態（変更された薬物代謝）。これらの薬理ゲノム学状態は、稀な欠損としてか、または多型としてのいずれかで生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）欠損は、一般的な遺伝性酵素病であり、この主な臨床的合併症は、酸化剤薬物（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取およびソラマメの摂食後の溶血である。
【０４６３】
例示的な実施形態として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および持続期間の両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびシトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多型の発見は、幾人かの患者が予期される薬物効果を得ないか、または標準的かつ安全な用量の薬物を摂取した後に過大な薬物応答および深刻な毒性を示すことに関しての説明を提供した。これらの多型は、集団において２つの表現型（高い代謝能を持つ人（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ　ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＥＭ）および低い代謝能を持つ人（ｐｏｏｒ　ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＰＭ））で表現される。ＰＭの有病率は、異なる集団の間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型であり、そしていくらかの変異がＰＭにおいて同定されており、この全ては機能的ＣＹＰ２Ｄ６の非存在に至る。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低い代謝能を持つ人は、彼らが標準的な用量を受ける場合に、かなり頻繁に過大な薬物応答および副作用を経験する。代謝産物が活性な治療的部分である場合、そのＣＹＰ２Ｄ６形成代謝産物であるモルヒネによって媒介されるコデインの鎮痛効果について実証されるように、ＰＭは治療的応答を示さない。他の極端なものは、標準的な用量に応答しない、いわゆる超迅速な代謝能を持つ人である。最近、超迅速な代謝の基準となる分子は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に起因していることが同定されている。
【０４６４】
従って、ＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、あるいは個体におけるＮＯＶＸ遺伝子の変異内容を決定して、それによって、その個体の治療的または予防的処置のために適切な薬剤を選択し得る。さらに、薬理ゲノム学の研究を使用して、個体の薬物応答性の表現型の同定に対して薬物代謝酵素をコードする多型対立遺伝子の遺伝子型を適用し得る。この知見は、用量または薬物選択に適用される場合、有害な反応または治療の失敗を回避し得、従って、被験体をＮＯＶＸ調節因子（例えば、本明細書中に記載される例示的なスクリーニングアッセイの１つによって同定される調節因子）を用いて処置する場合に治療的または予防的効率を増強し得る。
【０４６５】
（臨床試験中の効果のモニタリング）
ＮＯＶＸ発現または活性（例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調節する能力）に対する薬剤（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることは、基本的な薬物スクリーニングおよび臨床試験に適用され得る。例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイによって決定される、ＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベルを増加するため、またはＮＯＶＸ活性をアップレギュレートする薬剤の効力は、減少したＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベル、またはダウンレギュレートしたＮＯＶＸ活性を示す被験体の臨床試験においてモニターされ得る。あるいは、スクリーニングアッセイによって決定される、ＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベルを減少、またはＮＯＶＸ活性をダウンレギュレートする薬剤の効力は、増加したＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベル、またはアップレギュレートしたＮＯＶＸ活性を示す被験体の臨床試験においてモニターされ得る。このような臨床試験において、ＮＯＶＸ発現または活性、および好ましくは、例えば、細胞増殖または免疫障害に関与するような他の遺伝子が、「リードアウト（読み出し）（ｒｅａｄ　ｏｕｔ）」、すなわち、特定の細胞の免疫応答性のマーカーとして使用され得る。
【０４６６】
例えば、ＮＯＶＸを含む遺伝子（これは、ＮＯＶＸ活性（例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイにおいて同定される）を調節する薬剤（例えば、化合物、薬物または低分子）を用いる処置によって、細胞内で調節される）が同定され得るが、これらに限定されない。従って、細胞性増殖障害に対する薬剤の効果を研究するために、例えば、臨床試験において、細胞が単離され得、そしてＲＮＡが調製され得、そしてＮＯＶＸおよびこの障害に関与する他の遺伝子の発現のレベルについて分析され得る。遺伝子発現のレベル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、本明細書中に記載されるように、ノーザンブロット分析もしくはＲＴ−ＰＣＲによるか、あるいは産生されるタンパク質の量を測定することによるか、本明細書中に記載されるような方法の１つによるか、あるいはＮＯＶＸまたは他の遺伝子の活性のレベルを測定することによって、定量され得る。この様式で、この遺伝子発現パターンは、この薬剤に対する細胞の生理学的応答の指標であるマーカーとして作用し得る。従って、この応答状態は、この薬剤を用いる個体の処置の前、および処置の間の種々の時点で、決定され得る。
【０４６７】
１つの実施形態において、本発明は、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチド模倣物、低分子、または本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される他の薬物候補物）を用いる、被験体の処置の効力をモニタリングするための方法を提供し、これは、以下の工程を包含する：（ｉ）薬剤の投与の前に、被験体から投与前サンプルを得る工程；（ｉｉ）この投与前サンプルにおいて、ＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出する工程；（ｉｉｉ）この被験体から１つ以上の投与後サンプルを得る工程；（ｉｖ）この投与後サンプルにおいて、ＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出する工程；（ｖ）この投与前サンプルにおけるＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを、この投与後サンプルにおけるＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルと比較する工程；ならびに（ｖｉ）従って、この被験体に対する薬剤の投与を変更する工程。例えば、この薬剤の増加した投与は、検出されるよりも高いレベルにＮＯＶＸ発現または活性を増加することが（すなわち、この薬剤の効力を増加すること）望ましくあり得る。あるいは、この薬剤の減少した投与は、検出されるよりも低いレベルにＮＯＶＸ発現または活性を減少することが（すなわち、この薬剤の効力を減少すること）望ましくあり得る。
【０４６８】
（処置方法）
本発明は、異常なＮＯＶＸ発現または活性に関連する障害の危険性のある（または感受性）か、またはこの障害を有する被験体を処置する予防的および治療的の両方の方法を提供する。このように関連する疾患または障害としては、例えば、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、先天性心欠損症、大動脈狭窄症、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損症、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満症、移植、副腎脳白質ジストロフィー、先天性副腎過形成、前立腺癌、新形成；腺癌、リンパ腫、子宮癌、受胎能、血友病、凝固能亢進、特発性血小板減少性紫斑病、免疫不全症、対宿主性移植片病、ＡＩＤＳ、気管支炎ぜん息、クローン病；多発性硬化症、オールブライト遺伝性骨形成異常症の処置、ならびに他の疾患、障害および状態など。
【０４６９】
これらの処置方法は、以下により詳細に記載される。
【０４７０】
（疾患および障害）
（その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）増加したレベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を拮抗する（すなわち、低減または阻害する）治療剤を用いて処置され得る。活性を拮抗する治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）上記ペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；（ｉｉ）上記ペプチドに対する抗体；（ｉｉｉ）上記ペプチドをコードする核酸；（ｉｖ）相同組換えによって上記ペプチドの内因性機能を「ノックアウトする」ために利用される、アンチセンス核酸および「機能不全性」である（すなわち、上記ペプチドに対するコード配列のコード配列内の異種挿入に起因する）核酸の投与、（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４：１２８８〜１２９２を参照のこと）；または（ｖ）上記ペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を変化させる、調節因子（すなわち、インヒビター、アゴニストおよびアンタゴニスト（本発明のさらなるペプチド模倣物または本発明のペプチドに対して特異的な抗体を含む））。
【０４７１】
（その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）減少したレベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を増加させる（すなわち、活性に対するアゴニストである）治療剤を用いて処置され得る。活性をアップレギュレートする治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：上記ペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；あるいはバイオアベイラビリティーを増加させるアゴニスト。
【０４７２】
増加したレベルまたは減少したレベルは、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することによって、容易に検出され得る。この定量は、患者の組織サンプルを（例えば、生検組織から）入手し、そしてそのサンプルを、その発現したペプチド（または上記ペプチドのｍＲＮＡ）のＲＮＡレベルまたはペプチドレベル、構造および／または活性をインビトロでアッセイすることによる。当該分野において周知の方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：イムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット分析、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動が後に続く免疫沈降、免疫細胞化学などによる）および／またはｍＲＮＡの発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼーションなど）。
【０４７３】
（予防的方法）
１つの局面において、本発明は、被験体において異常なＮＯＶＸ発現または活性と関連する疾患または状態を、ＮＯＶＸ発現または少なくとも１つのＮＯＶＸ活性を調節する薬剤をこの被験体に投与することによって予防するための方法を提供する。異常なＮＯＶＸ発現または活性によって引き起こされるかまたはこれらに起因する、疾患にかかる危険がある被験体は、例えば、本明細書中に記載の診断アッセイまたは予後アッセイのいずれか、またはそれらの組み合わせによって、同定され得る。予防薬剤の投与は、疾患または障害が予防されるか、あるいはその進行を遅らせられるように、このＮＯＶＸ異常の特徴である症状の発現の前に行い得る。このＮＯＶＸ異常の型に依存して、例えば、ＮＯＶＸアゴニスト薬剤またはＮＯＶＸアンタゴニスト薬剤が、その被験体を処置するために使用され得る。その適切な薬剤は、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイに基づいて決定され得る。本発明の予防方法は、以下の小節において、さらに議論される。
【０４７４】
（治療方法）
本発明の別の局面は、治療目的のためにＮＯＶＸ発現または活性を調節する方法に関する。本発明の調節方法は、細胞を、その細胞に関するＮＯＶＸタンパク質活性の活性のうちの１つ以上を調節する薬剤と接触させる工程を包含する。ＮＯＶＸタンパク質活性を調節する薬剤は、核酸またはタンパク質、ＮＯＶＸタンパク質の天然に存在する同族リガンド、ペプチド、ＮＯＶＸペプチド模倣物、または他の低分子のような、本明細書中に記載されるような薬剤であり得る。１つの実施形態において、この薬剤は、ＮＯＶＸタンパク質活性のうちの１つ以上を刺激する。このような刺激薬剤の例としては、活性なＮＯＶＸタンパク質、およびその細胞に導入されたＮＯＶＸをコードする核酸分子が挙げられる。別の実施形態において、この薬剤は、ＮＯＶＸタンパク質活性のうちの１つ以上を阻害する。このような阻害薬剤の例としては、アンチセンスＮＯＶＸ核酸分子、および抗ＮＯＶＸ抗体が挙げられる。これらの調節方法は、インビトロで（例えば、その薬剤とともにその細胞を培養することによって）、あるいはインビボで（例えば、被験体にその薬剤を投与することによって）実施され得る。このように、本発明は、ＮＯＶＸタンパク質または核酸分子の、異常な発現または異常な活性によって特徴付けられる、疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ＮＯＶＸ発現または活性を調節する（例えば、アップレギュレートまたはダウンレギュレートする）薬剤（例えば、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイによって同定される薬剤）あるいはそのような薬剤の組み合わせを投与する工程を包含する。別の実施形態において、この方法は、ＮＯＶＸタンパク質または核酸分子を、低減したかまたは異常な、ＮＯＶＸ発現または活性を補償するための治療として、投与する工程を包含する。
【０４７５】
ＮＯＶＸ活性の刺激は、ＮＯＶＸが異常にダウンレギュレートされている状況、および／またはＮＯＶＸ活性の増加が有益な効果を有するようである状況において、望ましい。このような状況の１つの例は、被験体が、異常な細胞増殖および／または細胞分化によって特徴付けられる障害（例えば、癌または免疫関連）を有する場合である。このような状況の別の例は、被験体が妊娠性疾患（例えば、プレクランプシア（ｐｒｅｃｌａｍｐｓｉａ））を有する場合である。
【０４７６】
（治療剤の生物学的効果の決定）
本発明の種々の実施形態において、適切なインビトロまたはインビボアッセイを行って、特定の治療剤の効果およびその投与が罹患組織の処置を示すか否かを決定する。
【０４７７】
種々の特定の実施形態において、インビトロアッセイが患者の障害に関与する代表的な細胞型で行われ、所定の治療剤がこの細胞型に対して所望の効果を発揮するか否かを決定し得る。治療において使用する化合物は、ヒト被験体において試験する前に適切な動物モデル系において試験され得る。これらの動物モデル系としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなど。同様に、インビボ試験については、当該分野で公知の任意の動物モデル系が、ヒト被験体に対する投与の前に使用され得る。
【０４７８】
（本発明の組成物の予防的用途および治療的用途）
本発明のＮＯＶＸ核酸およびタンパク質は、以下を含むが、これらに限定されない種々の障害に関連する強力な予防的適用および治療的適用に有用である：代謝障害、糖尿病、肥満症、感染症、食欲不振、癌関連癌、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、造血障害、および種々の異常脂肪性浮腫（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａｓ）、肥満に関連する代謝障害、Ｘ代謝症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　Ｘ）、および慢性疾患と関連する消耗疾患、および種々の癌。
【０４７９】
例のように、本発明のＮＯＶＸタンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に有用であり、そしてこのタンパク質は、遺伝子治療を必要とする被験体に投与される場合、有用であり得る。非制限的例示として、本発明の組成物は、以下の障害に罹患した患者の処置についての効力を有する：代謝障害、糖尿病、肥満症、感染症、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、造血障害、および種々の異常脂肪性浮腫（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａｓ）。
【０４８０】
本発明のＮＯＶＸタンパク質をコードする新規の核酸、およびＮＯＶＸタンパク質の両方、またはそれらのフラグメントは、診断適用に有用で有り得る。ここで、核酸またはタンパク質の存在または量が評価される。さらなる用途は、抗菌分子（すなわち、いくつかのペプチドは、抗菌特性を有することが見出されている）としての用途である。これらの材料は、治療的または診断的な方法における用途に関する本発明の新規の物質に免疫特異的に結合する抗体の生成においてさらに有用である。
【０４８１】
本発明は、以下の実施例においてさらに記載されるが、これは、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【０４８２】
（実施例１．種々の細胞および組織における定量的発現分析）
種々のクローンの定量的発現を、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＰＴＱ　ＰＣＲ；ＴＡＱＭＡＭ（登録商標）を使用する、種々の正常および病状の、誘導細胞、細胞株および組織由来のＲＮＡサンプルを含むマイクロタイタープレートを使用して評価した。ＲＴＱ　ＰＣＲを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００配列決定システムで実施した。サンプルの種々の収集物をプレート上で構築し、そしてパネル１（正常および癌供給源由来の、細胞および細胞株を含む）、パネル２（組織由来、特に、外科的サンプル由来、正常および癌供給源由来のサンプルを含む）、パネル３（広範な種々の癌供給源由来のサンプルを含む）およびパネル４（正常な細胞および炎症状態に関連する細胞由来の細胞および細胞株を含む）と呼ぶ。
【０４８３】
第１に、このＲＮＡサンプルを、βアクチンのような構成的に発現した遺伝子に正規化し、そしてＧＡＰＤＨ．ＲＮＡ（約５０ｎｇ総ＲＮＡまたは約１ｎｇポリＡ＋ＲＮＡ）を、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　Ｋｉｔ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ；カタログ番号Ｎ８０８−０２３４）および製造者のプロトコルに従ったランダムな６量体を使用してｃＤＮＡに変換した。反応を、２０μｌ中で実施し、そして３０分間４８℃でインキュベートした。次いで、ｃＤＮＡ（５μｌ）を、製造業者の指示に従って、βアクチンおよびＧＡＰＤＨ　ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３１０８８１Ｅおよび４３１０８８４Ｅの各々）およびＴＡＱＭＡＮ（登録商標）汎用ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３０４４４７）を使用するＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応のために、分離プレートに移した。反応を、以下のパラメータを使用して２５μｌ中で実施した：５０℃で２分；９５℃で１０分；９５℃で１５秒／６０℃で１分（４０サイクル）。結果を、ログスケールを使用するＣＴ値（所与のサンプルは、蛍光の閾値レベルを通過するサイクル）として記録し、所定のサンプル間のＲＮＡ濃度の差は、２のΔＣＴ乗として表される最も低いＣＴ値を有する。次いで、このＲＮＡの差の逆数をとり、そして１００で掛けることによって相対発現パーセントを得た。βアクチンおよびＧＡＰＤＨから得られた平均のＣＴ値を、ＲＮＡサンプルを正規化するために使用した。最も高いＣＴ値を発生するＲＮＡサンプルは、さらなる希釈を必要としないが、他の全てのサンプルは、β−アクチン／ＧＡＰＤＨの平均ＣＴ値に従うサンプルと比較して希釈した。
【０４８４】
正規化ＲＮＡ（５μｌ）を、ｃＤＮＡに転換し、製造者の指示に従って、Ｏｎｅ　Ｓｔｅｐ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；ｃａｔ．＃４３０９１６９）および遺伝子特異的プライマーを使用するＴＡＱＭＡＮ（登録商標）によって分析した。プローブおよびプライマーを、インプットとして標的配列を使用する、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ’ｓ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｐｐｌｅ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ’ｓ　Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ　Ｐｏｗｅｒ　ＰＣ用のヴァージョンＩ）または類似のアルゴリズムに従って、各アッセイに対して設定した。デフォルトの設定を、反応条件に対して使用し、そして以下のパラメータを、プライマーを選択する前に設定した：プライマーの濃度＝２５０ｎＭ、プライマーの融点（Ｔｍ）範囲＝５８℃〜６０℃、プライマーの最適Ｔｍ＝５９℃、プライマーの最大差＝２℃、プローブは、５’Ｇを有さず、プローブＴｍは、プライマーＴｍよりも１０℃高くなければならず、アンプリコンサイズ＝７５ｂｐ〜１００ｂｐ。選択されるプローブおよびプライマー（以下を参照のこと）は、Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）によって合成された。プローブを、未反応の色素を除去するために２回ＨＰＬＣ精製し、プローブの５’末端および３’末端へのレポーター色素およびクエンチャー色素のカップリングを立証するために、マススペクトルによって評価した。正方向プライマーおよび逆方向プライマーの最終濃度は、各々９００ｎＭであり、そしてプローブの濃度は、２００ｎＭであった。
【０４８５】
ＰＣＲ条件：各組織および各細胞株由来の正規化ＲＮＡを、９６ウエルＰＣＲプレート（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の各ウエルにスポットした。２つのプローブ（配列プローブで多重化された配列特異的プローブおよび別の遺伝子特異的プローブ）を含むＰＣＲカクテルを、ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　７７００の１×ＴａｑＭａｎＴＭＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ（ｄＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕ（１：１：１：２の比））、０．２５Ｕ／ｍｌ　ＡｍｐｌｉＴａｑ　ＧｏｌｄＴＭ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、および０．４Ｕ／μｌのＲＮａｓｅインヒビター、および０．２５Ｕ／μｌの逆転写酵素を含む）を用いて設定した。逆転写を、４８℃で３０分間実施し、次いで以下のＰＣＲ増幅サイクルを実施した：９５℃で１０分、次いで９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を４０サイクル。
【０４８６】
（パネル１）
パネル１についての結果において、以下の略語が使用される：
ｃａ．＝癌、
＊＝転移から樹立した、
ｍｅｔ＝転移、
ｓ　ｃｅｌｌ　ｖａｒ＝小細胞改変体、
ｎｏｎ−ｓ＝ｎｏｎ−ｓｍ＝非小、
ｓｑｕａｍ＝扁平上皮（ｓｑｕａｍｏｕｓ）、
ｐｌ．ｅｆｆ＝ｐｌ　ｅｆｆｕｓｉｏｎ＝胸水、
ｇｌｉｏ＝神経膠腫、
ａｓｔｒｏ＝神経膠星状細胞腫、および
ｎｅｕｒｏ＝神経芽細胞腫。
【０４８７】
（パネル２）
パネル２についてのプレートは、一般的に、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ　Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）またはＮａｔｉｏｎａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＮＤＲＩ）と密接に協同して作業する外科医によって作製されたヒト組織から単離されたＲＮＡまたはｃＤＮＡから構成される２個のコントロールウェルおよび９４個の試験サンプルを含む。これらの組織は、ヒト悪性腫瘍から導き、そして示される多くの悪性腫瘍組織が「一致した縁部（ｍａｔｃｈｅｄ　ｍａｒｇｉｎ）」を有する場合、腫瘍組織にすぐに隣接した非癌性組織から得た。これらは、正常な隣接組織と呼ばれ、以下の結果において「ＮＡＴ」と示される。腫瘍組織および「一致した縁部」は、２つの独立した病理学者（外科的病理学者および再びＮＤＲＩまたはＣＨＴＮの病理学者）によって評価される。この分析は、腫瘍区別等級の全体的組織病理学的評価を提供する。さらに、大部分のサンプルは、患者の臨床病期に関係する情報を提供するもとの外科医の病理学的報告を含む。これらの一致した縁部は、手術の区域の周り（すなわち、すぐ近位）の組織（正常な隣接組織のため、「ＮＡＴ」と示される）から採取される。さらに、ＲＮＡサンプルおよびｃＤＮＡサンプルを、高齢者または突然死の犠牲者（事故など）に行われた検死から導かれる種々のヒト組織から得た。これらの組織は、疾患を有さないことが確認されており、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）、Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、およびＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎのような種々の市販の供給源から購入した。
【０４８８】
全てのサンプル由来のＲＮＡの完全性を、２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡ染色強度比をガイドとして（２：１〜２．５：１　２８ｓ：１８ｓ）使用して、アガロースゲル電気泳動の視覚的評価、ならびに分解産物を示す低分子量ＲＮＡの非存在によって質について制御する。サンプルを、単一のエキソンの範囲にわたって増幅するように設計されたプローブおよびプライマーセットを使用して、逆転写酵素の非存在化で実行したＲＴＱ　ＰＣＲ反応によって、ゲノムＤＮＡ混入に対して制御する。
【０４８９】
（パネル４）
パネル４は、炎症状態と関連する種々のヒト細胞株または組織から単離されたＲＮＡ（パネル４ｒ）またはｃＤＮＡ（パネル４ｄ）から構成される９６ウェルプレート（２コントロール、９４試験サンプル）上のサンプルを含む。結腸および肺（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）ならびに胸腺および腎臓（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のようなコントロールの正常な組織由来の全ＲＮＡを使用した。肝硬変患者の肝臓組織および狼瘡患者の腎臓由来の全ＲＮＡを、ＢｉｏＣｈａｉｎ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｉｎｃ．、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）から得た。クローン病および潰瘍性大腸結腸炎を有すると診断された患者由来のＲＮＡ調製物のための腸組織を、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ）（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）から得た。
【０４９０】
神経膠星状細胞、肺繊維芽細胞、皮膚繊維芽細胞、冠状動脈平滑筋細胞、小気道上皮、気管支上皮、微小血管皮膚内皮細胞、微小血管肺内皮細胞、ヒト肺動脈内皮細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞を、すべて、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から購入し、そしてＣｌｏｎｅｔｉｃｓによってこれらの細胞型について供給された培地において増殖した。これらの初代細胞型を、示されたように、６および／または１２〜１４時間、種々のサイトカインまたはサイトカインの組み合わせを用いて活性化した。以下のサイトカインを使用した：約１〜５ｎｇ／ｍｌでＩＬ−１β、約５〜１０ｎｇ／ｍｌでＴＮＦα、約２０〜５０ｎｇ／ｍｌでＩＦＮγ、約５〜１０ｎｇ／ｍｌでＩＬ−４、約５〜１０ｎｇ／ｍｌでＩＬ−９、約５〜１０ｎｇ／ｍｌでＩＬ−１３。内皮細胞を、０．１％血清を有するＣｌｏｎｅｔｉｃｓからの基本培地における培養によって時々種々の時間の間、飢えさせた。
【０４９１】
単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌを使用して、ＣｕｒａＧｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの従業員の血液から調製した。ＬＡＫ細胞を、ＤＭＥＭ　５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、ならびにインターロイキン２での４〜６日間の培養によってこれらの細胞から調製した。次いで、細胞を６時間、１０〜２０ｎｇ／ｍｌ　ＰＭＡおよび１〜２μｇ／ｍｌイオノマイシン、５〜１０ｎｇ／ｍｌでＩＬ−１２、２０〜５０ｎｇ／ｍｌでＩＦＮγおよび５〜１０ｎｇ／ｍｌでＩＬ−１８とともに活性化した。いくつかの場合において、単核細胞を、ＤＭＥＭ５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中で、ＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）またはＰＷＭ（アメリカヤマゴボウマイトジェン）とともに、約５μｇ／ｍｌで４〜５日間、培養した。サンプルをＲＮＡ調製のために２４、４８および７２時間で採取した。ＭＬＲ（混合リンパ球反応）サンプルを、２人のドナーから血液を採取し、Ｆｉｃｏｌｌを使用して単核細胞を単離し、そして単離された単核細胞を１：１で、ＤＭＥＭ５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中の約２×１０６細胞／ｍｌ、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール（５．５×１０−５Ｍ）（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）の最終濃度で混合することによって得た。ＭＬＲを培養し、そしてサンプルをＲＮＡ調製物について１〜７日間の範囲の種々の時点で採取した。
【０４９２】
単核細胞を、製造業者の指示に従って、ＣＤ１４　Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｅａｄｓ、＋ｖｅ　ＶＳ選択カラムおよびＶａｒｉｏ　Ｍａｇｎｅｔを使用して単核細胞から単離した。単核細胞を、５〜７日間、ＤＭＥＭ　５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、５０ｎｇ／ｍｌＧＭＣＳＦおよび５ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ−４中での培養によって、樹状細胞に分化させた。マクロファージを、ＤＭＥＭ　５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）および１０％ＡＢ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｕｍまたは約５０ｎｇ／ｍｌでのＭＣＳＦ中で、５〜７日間、単球の培養によって調製した。単球、マクロファージ、および樹状細胞を、１００ｍｇ／ｍｌで、リポ多糖類（ＬＰＳ）とともに６および１２〜１４時間刺激した。樹状細胞をまた、６および１２〜１４時間、１０μｇ／ｍｌで、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で刺激した。
【０４９３】
ＣＤ４リンパ球、ＣＤ８リンパ球およびＮＫ細胞をまた、製造業者の指示に従って、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ５６　Ｍｉｌｔｅｎｙｉビーズ、ポジティブＶＳ選択カラムおよびＶａｒｉｏ　Ｍａｇｎｅｔを使用して単核細胞から単離した。ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯ　ＣＤ４リンパ球を、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１４およびＣＤ１９　Ｍｉｌｔｅｎｙｉビーズおよびポジティブ選択を使用して、ＣＤ８細胞、ＣＤ５６細胞、ＣＤ１４細胞およびＣＤ１９細胞の単核細胞を枯渇させることによって単離した。次いで、ＣＤ４５ＲＯビーズを使用して、ＣＤ４５ＲＯ　ＣＤ４リンパ球を単離した。残りの細胞は、ＣＤ４５ＲＡ　ＣＤ４リンパ球であった。ＣＤ４５ＲＡ　ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＯ　ＣＤ４およびＣＤ８リンパ球を、ＤＭＥＭ　５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中に配置し、そしてＰＢＳ中の０．５μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および３μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、ＡＴＣＣ）を用いて一晩コーティングした、Ｆａｌｃｏｎ　６ウェル組織培養プレート上に１０６細胞／ｍｌでプレートした。６および２４時間後、細胞をＲＮＡ調製のために収集した。長期の活性化ＣＤ８リンパ球を調製するために、本発明者らは、抗ＣＤ２８および抗ＣＤ３コーティングしたプレート上で、４日間、単離されたＣＤ８リンパ球を活性し、次いで、細胞を収集し、そしてこれらをＤＭＥＭ　５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）およびＩＬ−２中で増殖させた。次いで、増殖したＣＤ８細胞を、再び、４日間、プレート結合抗ＣＤ−３および抗ＣＤ２８と共に活性化し、先のように増殖させた。ＲＮＡを第２の活性化の６時間および２４時間後、ならびに第２の増殖培養の４日後に、単離した。単離したＮＫ細胞を、ＤＭＥＭ　５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）ならびにＩＬ−２中で、ＲＮＡが調製される４〜６日前に、培養した。
【０４９４】
Ｂ細胞を得るために、扁桃をＮＤＲＩから購入した。扁桃を、滅菌解剖はさみで切断し、次いで、篩に通した。次いで、扁桃細胞を遠心沈殿させ、そしてＤＭＥＭ　５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中で１０６細胞／ｍｌで再懸濁させた。細胞を活性化するために、本発明者らは、５μｇ／ｍｌのＰＷＭまたは約１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４を使用した。細胞を２４、４８および７２時間でＲＮＡ調製物について採取した。
【０４９５】
初代および二次ＴＨ１／Ｔｈ２およびＴｒ１細胞を調製するために、６ウェルのＦａｌｃｏｎプレートを一晩、１０μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および２μｇ／ｍｌＯＫＴ３（ＡＴＣＣ）でコーティングし、次いで、ＰＢＳで二回洗浄した。臍帯血ＣＤ４リンパ球（Ｐｏｉｅｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇｅｒｍａｎ　Ｔｏｗｎ、ＭＤ）を、ＤＭＥＭ　５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）およびＩＬ−２（４ｎｇ／ｍｌ）中に１０５〜１０６細胞／ｍｌで培養した。ＩＬ−１２（５ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＬ−４（１μｇ／ｍｌ）を使用して、Ｔｈ１に指向させ、一方、ＩＬ−４（５ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＦＮγ（１μｇ／ｍｌ）を使用して、Ｔｈ２に指向させ、そして５ｎｇ／ｍｌでＩＬ−１０を使用してＴｒ１に指向した。４〜５日後に、活性化Ｔｈ１リンパ球、Ｔｈ２リンパ球およびＴｒ１リンパ球を、ＤＭＥＭ中で１回洗浄し、そしてＤＭＥＭ　５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）およびＩＬ−２（１ｎｇ／ｍｌ）中で４〜７日間増殖させた。これに続いて、活性化Ｔｈ１リンパ球、Ｔｈ２リンパ球およびＴｒ１リンパ球を、上記の抗ＣＤ２８／ＯＫＴ３およびサイトカインを用いて５日間再刺激したが、アポトーシスを防ぐために、抗ＣＤ９５Ｌ（１μｇ／ｍｌ）の添加を伴った。４〜５日間後、Ｔｈ１リンパ球、Ｔｈ２リンパ球およびＴｒ１リンパ球を洗浄し、次いで、再び、ＩＬ−２を用いて４〜７日間、増殖させた。活性化Ｔｈ１リンパ球およびＴｈ２リンパ球を、３サイクルの最大についてこの方法で維持した。ＲＮＡを、プレート結合抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂでの第２および第３の活性化、ならびにインターロイキン２での第２および第３の増殖への４日間に続いて、６および２４時間後に、初代および二次のＴｈ１、Ｔｈ２およびＴｒ１から調製した。
【０４９６】
以下の白血球細胞株は、ＡＴＣＣから入手した：Ｒａｍｏｕｓ、ＥＯＬ−１、ＫＵ−８１２。ＥＯＬ細胞を、８日間の５×１０５細胞／ｍｌでの０．１ｍＭ　ｄｂｃＡＭＰ中での培養によってさらに分化させ、培地を３日毎に変え、そして細胞濃度を５×１０５細胞／ｍｌに調節した。これらの細胞の培養について、本発明者らは、５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）を添加した、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ（ＡＴＣＣによって推奨される）を使用した。ＲＮＡを、１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび１μｇ／ｍｌのイオノマイシンとともに６時間および１４時間の間、休止細胞または活性化細胞のいずれかから調製した。ケラチノサイト株ＣＣＤ１０６および気道上皮腫瘍株ＮＣＩ−Ｈ２９２もまた、ＡＴＣＣから得た。両方を、ＤＭＥＭ５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）において培養した。ＣＣＤ１１０６細胞を、約５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαおよび１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βとともに６時間および１４時間活性化し、一方、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を、以下のサイトカインとともに６時間および１４時間活性化した：５ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ−４、５ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ−９、５ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ−１３および２５ｎｇ／ｍｌ　ＩＦＮγ。
【０４９７】
これらの細胞株および血液細胞について、ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）を使用して、約１０７細胞／ｍｌを溶解することによって調製した。簡単に述べると、１／１０容積のブロモクロロプロパン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、ＲＮＡサンプルに添加し、ボルテックスし、そして１０分後に室温にし、チューブをＳｏｒｖａｌｌ　ＳＳ３４ローターで１４，０００ｒｐｍで遠心させた。水相を除去し、そして１５ｍｌ　Ｆａｌｃｏｎ　Ｔｕｂｅに置いた。等容積のイソプロパノールを加え、そして−２０℃に一晩置いた。沈殿したＲＮＡをＳｏｒｖａｌｌ　ＳＳ３４ローターで９，０００ｒｐｍで１５分間遠心させ、そして７０％エタノールで洗浄した。ペレットを３００μｌのＲＮＡｓｅを含まない水および３５μｌ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に再溶解させ、５μｌＤＴＴ、７μｌ　ＲＮＡｓｉｎおよび８μｌＤＮＡｓｅを加えた。チューブを３７℃で３０分間インキュベートして、混入するゲノムＤＮＡを除去し、フェノールクロロホルムで１回抽出し、そして１／１０容積の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２容積の１００％エタノールで再沈殿させた。ＲＮＡを遠心させ、ＲＮＡｓｅを含まない水中に置いた。ＲＮＡを−８０℃で保存した。
【０４９８】
各ＮＯＶＸについて使用されるＴａｑＭａｎプロトコルの要約を表Ｂに提供する。
【０４９９】
【表８７】
2004512821.tif 000118
（ＮＯＶ１）
ＮＯＶ１の発現を、表Ｃに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ３０７５を使用して評価する。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表Ｄ、Ｅ，およびＦに示す。
【０５００】
表Ｃ．プローブ名：Ａｇ３０７５
【０５０１】
【表８８】
2004512821.tif 000119
表Ｄ．パネル１．３Ｄ
【０５０２】
【表８９】
2004512821.tif 000120
2004512821.tif 000121
表Ｅ．パネル２Ｄ
【０５０３】
【表９０】
2004512821.tif 000122
2004512821.tif 000123
2004512821.tif 000124
表Ｆ．パネル４Ｄ
【０５０４】
【表９１】
2004512821.tif 000125
2004512821.tif 000126
2004512821.tif 000127
パネル１．３Ｄ要約：ＮＯＶ１は、精巣において高度に発現され、発現レベルは、他の組織におけるよりも少なくとも一桁少ない。従って、この遺伝子は、精巣についてのマーカーであり得、そして精子形成および受精能の調節または調節不全において重要な役割があり得る。他の正常な組織において、発現は、以下においてより低いレベルで検出される：胎児および成人脳；甲状腺、副腎、脳下垂体、胸腺、脾臓、リンパ節、小腸、胎児肝臓、乳腺、前立腺および臍帯。疾患状態において、最も高い発現は、胃癌のサンプルにおいて見られ、続いて、ＣＮＳ癌、黒色腫、肺癌、乳癌、膵臓癌、肝臓癌および卵巣癌において見られる。この分子に対して設計される治療剤は、不妊症または癌の処置において効果的であり得る。
【０５０５】
（パネル２Ｄ要約）：この遺伝子は、パネル２Ｄにおいて幅広い多くのサンプルにわたって発現される。特に、正常組織、ならびに卵巣癌、腎臓癌および肺癌に対して乳癌において過剰に発現されるようである。従って、ＮＯＶ１機能の阻害は、これらまたは潜在的に他の癌の型の治療において有用であり得る。
【０５０６】
（パネル４Ｄ要約）：ＮＯＶ１転写物は、大腸炎／炎症性腸疾患（ＩＢＤ）サンプルを例外として、処置に関係なく多くの組織において発現される。この転写物によってコードされるタンパク質を置き換えるために設計される治療剤は、炎症性腸疾患に起因する炎症を減少または除去し得る。
【０５０７】
（ＮＯＶ３Ａ）
ＮＯＶ３ａの発現を、表Ｇに記載される、プライマー−プローブセットＡｇ１２４７を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表Ｈに示す。
【０５０８】
表Ｇ．プローブ名：Ａｇ１２４７
【０５０９】
【表９２】
2004512821.tif 000128
表Ｈ．パネル４Ｄ
【０５１０】
【表９３】
2004512821.tif 000129
2004512821.tif 000130
2004512821.tif 000131
（パネル４Ｄ要約）：ＮＯＶ３ａ転写物の高い発現は、大腸炎１において見られる。この抗原によってコードされるタンパク質は、炎症プロセスにおいて重要であり得る。拮抗性の抗体または低分子治療剤は、ＩＢＤに起因する腸における炎症を減少または阻害し得る。
【０５１１】
（ＮＯＶ４ａ）
ＮＯＶ４ａの発現を、表Ｉ、ＪおよびＫに記載される、プライマー−プローブセットＡｇ１４９１、Ａｇ６７６およびＡｇ１４０３（同一配列）、Ａｇ７２１、およびＡｇ２８３５を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を、表Ｌ、Ｍ、ＮおよびＯに示す。
【０５１２】
表Ｉ．プローブ名：Ａｇ１４１９／Ａｇ６７６／Ａｇ１４０３
【０５１３】
【表９４】
2004512821.tif 000132
表Ｊ．プローブ名：Ａｇ７２１
【０５１４】
【表９５】
2004512821.tif 000133
表Ｋ．プローブ名：Ａｇ２８３５
【０５１５】
【表９６】
2004512821.tif 000134
表Ｌ．パネル１．２
【０５１６】
【表９７】
2004512821.tif 000135
2004512821.tif 000136
2004512821.tif 000137
表Ｍ．パネル１．３Ｄ
【０５１７】
【表９８】
2004512821.tif 000138
2004512821.tif 000139
2004512821.tif 000140
2004512821.tif 000141
表Ｎ．パネル２Ｄおよび３Ｄ
【０５１８】
【表９９】
2004512821.tif 000142
2004512821.tif 000143
2004512821.tif 000144
2004512821.tif 000145
2004512821.tif 000146
表Ｏ．パネル４Ｄおよび４．１Ｄ
【０５１９】
【表１００】
2004512821.tif 000147
2004512821.tif 000148
2004512821.tif 000149
2004512821.tif 000150
パネル１．２の要約：この３つのパネルは、３つのプローブ／プライマーセット（このうち２つは同一である）を用いて実験され、互いに完全に一致しない。しかし、３つ全ての実験によって見られるパターンは、ＮＯＶ４ａの発現が、骨格筋において高いことを示す。疾患組織の間で、一致した発現は、肺癌検体において見られる。この遺伝子の発現は、種々の他の組織においては低レベルである。
【０５２０】
パネル１．３Ｄの要約：ＮＯＶ４ａは、広範な組織および細胞型で発現される増殖因子ドメインを有するタンパク質をコードする。しかし、これは、海馬（レベルは、胎児骨格においてより高い）において、次いで精巣および卵巣において、その最も高い成体発現を示す。多くの増殖因子は、損傷（発作、頭部外傷、脊髄損傷の動物モデルにおいて）に応答して中枢神経系における代償性シナプス形成（ｓｙｎａｐｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）のプロセスにおいて有益であることが示されている。この遺伝子が、成体の脳においてその最も高い発現を示すという事実は、これが、神経保護効果／神経栄養性効果を有し得ることを示唆する。さらに、最も高い発現を有するその特定の領域（海馬）は、アルツハイマー病における、そしてより低い程度でパーキンソン病に対する、宣告された神経変性部位である。従って、この分子は、発作、頭部外傷および脊髄損傷に加えて、これらの疾患の処置におけるタンパク質治療剤として有用であり得る。さらに、この遺伝子は、成体の骨格筋と比較する場合に、胎児の骨格筋において最も高い発現を示し、これは、組織の再生における役割を潜在的に示す。これは、多くの場合において、胎児の組織は迅速に増殖および発達し、一方、成体の組織はホメオスタシスにあるためである。
【０５２１】
パネル２Ｄの要約：この遺伝子の発現は、パネル２Ｄにおける実質的に全てのサンプルにおいてであるようである。その隣接する縁と比較して、胃癌および結腸癌のサンプルにおいてこの遺伝子が過剰発現しているようであるという観察が、特に目的である。従って、この遺伝子の治療的標的化は、これらの疾患または他の疾患において有益であり得る。
【０５２２】
パネル３Ｄの要約：この遺伝子の発現は、扁平上皮癌および前立腺癌の少ないサンプルを除いて、ほとんど全ての組織および細胞株において見られる。これは肺癌において最も高く、次いでＣＮＳ癌、平滑筋肉腫および白血病およびリンパ腫においてより低いレベルである。
【０５２３】
パネル４Ｄおよび４．１Ｄの要約：この転写物は、Ａｇ７２１およびＡｇ２８３５によって探索される場合、処置に関係なく多くの組織および細胞型において広く発現される。
【０５２４】
（ＮＯＶ６）
ＮＯＶ６の発現を、表Ｐに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ２７４を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ操作の結果を、表ＱおよびＲに示す。
【０５２５】
（表Ｐ．プローブ名：Ａｇ２７４）
【０５２６】
【表１０１】
2004512821.tif 000151
（表Ｑ．パネル２Ｄおよび３Ｄ）
【０５２７】
【表１０２】
2004512821.tif 000152
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2004512821.tif 000157
（表Ｒ．パネル４Ｄ）
【０５２８】
【表１０３】
2004512821.tif 000158
2004512821.tif 000159
2004512821.tif 000160
パネル２Ｄの要約：パネル２ＤにおけるＮＯＶ６の発現は、このパネルにおける大部分のサンプルにおいて発現されることが明らかであるように、広範である。サンプルの正常な隣接組織と比較する場合に、腎細胞癌サンプルにおけるこの遺伝子の差次的発現が特に目的である。これらのデータは、この遺伝子が、腎臓癌における治療介入のための標的として有用性を有し得ることを示す。
【０５２９】
パネル３Ｄの要約：この遺伝子の発現は、ＰＭＡおよびイオノマイシンで１６時間刺激したＲａｍｏｓ細胞株において最も高く、次いで胃癌および膵管癌由来の細胞株においてより低く発現し、そして小細胞肺癌、髄芽細胞腫および骨髄性白血病においてなお低い。
【０５３０】
パネル４Ｄの要約：ＮＯＶ６の発現は、ＬＰＳ活性化単球および関連細胞型（マクロファージ）または単球由来の細胞型（樹状細胞）に限定される。この転写物によってコードされる推定シアロ接着因子（ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｎ）は、単球の血管外遊走を組織へと指向するための接着分子として、および細胞：細胞相互作用分子として利用され得る。この分子によってコードされるタンパク質から設計したタンパク質治療剤は、単球の血管外遊走をブロックし得る。抗体治療剤もまた、血管外遊走をブロックし得る。これらの治療剤は、ぜん息、乾癬、気腫、関節炎、および他の炎症性疾患に関連する炎症を低減または阻害し得る［参考文献：ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｅｒｇら，Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　２００１年３月１５日；１６６（６）：３６３７−４０　カッティングエッジ：ＣＤ４３は、マクロファージ接着レセプターシアロ接着因子（Ｓｉｇｌｅｃ−１）に対するＴ細胞カウンターレセプターとして機能する。シアロ接着因子（Ｓｉｇｌｅｃ−１）は、造血細胞（リンパ球を含む）との相互作用を媒介するマクロファージ制限シアル酸結合レセプターである。この研究において、本発明者らは、Ｔリンパ球上のシアロ接着因子のカウンターレセプターを同定する。いくつかの主要な糖タンパク質（８５、１３０、２４０ｋＤａ）を、マウスＴ細胞株（ＴＫ−１）由来のシアロ接着因子−Ｆｃ融合タンパク質によって沈殿した。これらの糖タンパク質へのシアロ接着因子の結合は、シアル酸依存性であり、そしてシアロ接着因子の膜遠位Ｉｇ様ドメインにおけるシアル酸結合部位の重要な残基（Ｒ９７Ａ）の変異によって無効にされる。この１３０ｋＤａおよび２４０ｋＤａのシアロ接着因子結合糖タンパク質を、それぞれシアロムチン（ｓｉａｌｏｍｕｃｉｎ）ＣＤ４３およびＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド１（ＣＤ１６２）として同定した。ＣＯＳ細胞において発現するＣＤ４３は、固定したシアロ接着因子への増大した結合を支持した。最後に、シアロ接着因子は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（枝のない（核１）および分枝の（核２）Ｏ：−連結グリカン（これは、通常、それぞれ休止Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞において見出される）を含む）において発現されるＣＤ４３の異なる糖形態（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）に結合した。これらの結果は、ＣＤ４３を、シアロ接着因子についてのＴ細胞カウンターレセプターとして同定し、そしてその抗接着性の役割に加えて、ＣＤ４３は、細胞−細胞相互作用を促進し得ることを示唆する］。
【０５３１】
（ＮＯＶ７）
ＮＯＶ７の発現を、表Ｓに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ５８２を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ操作の結果を、表Ｔ、Ｕ、およびＶに示す。
【０５３２】
（表Ｓ．プローブ名：Ａｇ５８２）
【０５３３】
【表１０４】
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（表Ｔ．パネル１．１）
【０５３４】
【表１０５】
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【０５３５】
【表１０６】
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パネル１．１要約：ＮＯＶ７は、脳、膀胱、心臓、下錐体および子宮において、中程度に高レベルで発現される。とりわけ、その発現は、胎児の骨格筋において高く、そして生体組織において非存在であるようである。従って、この遺伝子は、組織再生のための治療として使用され得る。さらに、この遺伝子は、肺癌、腎癌、卵巣癌、ＣＮＳ癌、黒色腫および乳癌において過剰発現され、正常組織におけるレベルは低い／検出不可能である。従って、このタンパク質を標的とする治療は、これらの種類の癌の効果的な治療剤であり得る。
【０５３６】
パネル２Ｄ要約：全体的に、この遺伝子の発現は、パネル２Ｄにわたって変動する発現を示す。しかし、これらは、肺癌、結腸癌および腎臓癌由来のサンプルにおいては、そのそれぞれの正常な隣接組織と比較した場合に、癌に関連する発現であるようである。このことは、パネル１．１における発現と一致する。従って、この遺伝子の標的化は、これらの疾患における治療用途を提供し得る。
【０５３７】
パネル４Ｄ要約：これら２つのパネルにおけるこれらの遺伝子の発現は、さほど再現性がなく、従って、はっきりしたまとめが引き出され得ない。
【０５３８】
（ＮＯＶ８ａ）
ＮＯＶ８ａの発現を、表Ｗに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ８５０を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲの実行の結果を、表Ｘに示す。
【０５３９】
【表１０７】
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パネル４．１Ｄ要約：ＮＯＶ８ａ転写物は、正常な腎臓および星状細胞において高度に発現されるが、大部分の他の組織においては発現されない。この転写物またはこの転写物がコードするタンパク質の発現は、正常な腎臓または星状細胞についてのマーカーとして機能し得る。
【０５４０】
（ＮＯＶ８ｃ）
ＮＯＶ８ｃの発現を、表Ｙに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ２１７を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲの実行の結果を、表ＺおよびＡＡに示す。
【０５４１】
【表１０８】
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パネル１要約：ＮＯＶ８ｃの発現は、胎盤において最高であり、それに続いて子宮、精巣および腎臓である。興味深いことに、成体腎臓における発現は、胎児腎臓におけるよりかなり高い。疾患組織のうちでも、強い発現は、胃癌において見られ、そしてより低いレベルで、肺癌、結腸癌、ＣＮＳ癌、卵巣癌および膵臓癌において見られる。このパターンは、この遺伝子が、これらの状態における治療標的であり得ることを示す。
【０５４２】
パネル４Ｄ要約：この転写物は、胸腺および星状細胞において高度に発現され、そしてより低レベルのこの転写物が、結腸および肺、ならびに皮膚の線維芽細胞（休止しているかまたはＩＬ−１で処置したかまたはＴＮＦで処置したかのいずれか）において見られる。この転写物の胸腺発現は、この転写物がＴ細胞発達において重要であり得ることを示唆する。レチン酸は、Ｔ細胞発達に対する影響を有することが見出された。この転写物によってコードされるタンパク質に対するアゴニスト治療またはアンタゴニスト治療が、器官移植の間の免疫調節のために、またはＴ細胞癌の処置として、使用され得る［参考文献：Ｙａｇｉ　Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１９９７年１１月１日；１８１（２）：１５３−６２．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｒｅｔｉｎｏｉｃ　ａｃｉｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｐａｔｈｗａｙ　ｏｆ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｉｎｔｈｅｔｈｙｍｕｓ．この研究は、レチン酸（ＲＡ）がＴ細胞分化に影響を与える能力を調査した。全てトランスのＲＡは、マウス胎仔胸腺器官培養物（ＦＴＯＣ）において、Ｔ細胞分化に対する顕著な影響を有した。ＦＴＯＣにおける１４日目のＣ５７ＢＬ／６胚に対する、ＦＴＯＣにおける全てトランスのＲＡの影響の時間経過は、Ｔ細胞発達の後期段階における、ＣＤ４単一陽性（ＳＰ）細胞の頻度の２倍の増加および高レベルのＣＤ３保有細胞（ＣＤ３高細胞）を明らかにした。早期段階においては、全てトランスのＲＡは、ＣＤ４　ＳＰ細胞の頻度の２倍の増加を誘導したが、ＣＤ３およびＴＣＲのアップレギュレーションを有意に抑制した。ＲＡレセプター（ＲＡＲ）サブタイプ特異的プローブを用いる逆転写ＰＣＲは、胸腺におけるＴ細胞発達の間にＲＡＲαは発現されるがＲＡＲβおよびＲＡＲγは発現されないこと、ならびにＲＡＲαの発現がＣＤ４／ＣＤ８の二重陽性（ＤＰ）細胞の発生を伴うことを示した。１６日目のＢＡＬＢ／ｃ胚のＦＴＯＣにおいて、Ｖβ３高細胞のレベルは、マウス乳房腫瘍ウイルス−６−コードスーパー抗原に応答して大いに低下した（ＣＤ３高細胞の１．４％）が、Ｖβ３保有細胞は、全てトランスのＲＡの存在下で低下から回復された（ＣＥ３高細胞の５．６％）。さらに、胸腺細胞欠失に対する全てトランスのＲＡの阻害効果は、この欠失がＦＴＯＣにおける低濃度のブドウ球菌エンテロトキシンＢによって誘導された場合に、観察された。一緒になって、これらのデータは、ＲＡが、恐らくＴ細胞分化のＤＰ段階におけるネガティブ選択のプロセスを阻害することによって、胸腺において成熟Ｔ細胞および自己反応性Ｔ細胞の頻度を増加させることを示唆する］。
【０５４３】
（ＮＯＶ９）
ＮＯＶ９の発現を、表ＢＢに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ１２４９を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲの実行の結果を、表ＣＣおよびＤＤに示す。
【０５４４】
【表１０９】
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パネル１．２要約：ＮＯＶ９の最も高い発現は、脂肪組織のサンプルにおいてであり、これは、ゲノムＤＮＡで汚染されていることが公知である。この遺伝子の発現の証拠を示す他の唯一のサンプルは、腹水として増殖した転移性卵巣癌細胞株由来であった。この型の腫瘍増殖（体腔における液体細胞懸濁物として）は、非常に独特である。この遺伝子の発現は、この型の増殖の前兆であり、従って、この遺伝子の治療的標的化は、腹水増殖に対する治療的利益を有し得る。
【０５４５】
パネル４Ｄ要約：実行２１０８は、良好な増幅プロットを示さず、従って、この分析に対して考慮されない。実行２１６１は、大腸炎１サンプルにおいて最も高い発現を示す。このことは恐らく、ゲノムＤＮＡ汚染に起因する。他のサンプルにおけるレベルは、検出可能なレベル未満である。
【０５４６】
（他の実施形態）
特定の実施形態が、本明細書中において詳細に記載されたが、このことは、説明のみの目的で例としてなされたものであり、そして添付の特許請求の範囲の範囲に関して限定することを意図されない。特に、種々の置換、代替および改変が、特許請求の範囲によって規定されるような本発明の意図および範囲から逸脱することなく、本発明に対してなされ得ることが、本発明者らによって意図される。核酸出発物質、目的のクローン、またはライブラリーの型の選択は、本明細書中に開示される実施形態の知識を有する当業者の慣用的な事項であると考えられる。他の局面、利点および改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内であるとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＮＯＶ７についてのＴａｑＭａｎ組織プロフィールの結果を示す。
【図２】
図２は、外科的な標本由来の広範な癌細胞におけるＮＯＶ７についての複製ＴａｑＭａｎプロフィールを示す。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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