(57)【要約】本発明は、血管新生および／または腫瘍進行を抑制するために有用である抑制性ＰＡＳドメインタンパク質（ＩＰＡＳ）と呼ばれる哺乳動物ポリペプチドに関する。本発明はさらにまた、血管新生および／または腫瘍進行に関連する医学的状態を治療するための薬剤として有用な可能性がある化合物についてのスクリーニング法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記から選択される単離核酸分子：
（ａ）配列番号２で示されるヌクレオチド配列を備える核酸分子；
（ｂ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）に定義された核酸分子のポリペプチドコード領域に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができ、さらに生物学的に活性な哺乳動物ＩＰＡＳポリペプチドまたはそれの機能的に等価な改変形態をコードするヌクレオチド配列を備える核酸分子；および
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）に定義されたヌクレオチド配列への遺伝暗号の結果として縮重しており、さらに生物学的に活性な哺乳動物ＩＰＡＳポリペプチドまたはそれの機能的に等価な改変形態をコードする核酸配列を備える核酸分子。
【請求項２】
請求項１記載の核酸分子によってコードされる単離哺乳動物ＩＰＡＳポリペプチド。
【請求項３】
配列表における配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する請求項２記載の単離哺乳動物ＩＰＡＳポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に定義された核酸配列を備えるベクター。
【請求項５】
請求項１に定義された核酸配列を担持していてその発現を媒介できる複製型発現ベクター。
【請求項６】
請求項４または５記載のベクターを宿す培養宿主細胞。
【請求項７】
哺乳動物ＩＰＡＳポリペプチドを産生するためのプロセスであって、それにより前記ポリペプチドが産生する条件下で請求項６記載の宿主細胞を培養する工程と、前記ポリペプチドを回収する工程とを備えるプロセス。
【請求項８】
哺乳動物ＩＰＡＳ核酸分子の発現を活性化させるために有用な物質を同定するための、下記の工程を備える方法：
（ｉ）候補物質を請求項１記載の哺乳動物ＩＰＡＳヌクレオチド酸分子と接触させる工程；および
（ｉｉ）前記候補物質が前記哺乳動物ＩＰＡＳ核酸分子の発現を活性化させるかどうかを判定する工程。
【請求項９】
血管新生および／または腫瘍増殖を抑制するために有用な物質を同定するための、下記の工程を備える方法：
（ｉ）候補物質を請求項１記載の哺乳動物ＩＰＡＳヌクレオチド酸分子と接触させる工程；および
（ｉｉ）前記候補物質が前記哺乳動物ＩＰＡＳヌクレオチド配列の発現を活性化させるかどうかを判定する工程であって、前記活性化が血管新生および／または腫瘍増殖を抑制するために有用な物質の指標となる工程。
【請求項１０】
哺乳動物ＩＰＡＳポリペプチドの生物学的活性を刺激するために有用な物質を同定するための、下記の工程を備える方法：
（ｉ）候補物質を請求項２または３記載の哺乳動物ＩＰＡＳポリペプチドと接触させる工程；および
（ｉｉ）前記候補物質が前記ポリペプチドの生物学的活性を刺激するかどうかを判定する工程。
【請求項１１】
血管新生および／または腫瘍増殖を抑制するために有用な物質を同定するための、下記の工程を備える方法：
（ｉ）候補物質を請求項２または３記載の哺乳動物ＩＰＡＳポリペプチドと接触させる工程；および
（ｉｉ）前記候補物質が前記ポリペプチドの生物学的活性を刺激するかどうかを判定する工程であって、前記刺激が血管新生および／または腫瘍増殖に関連する医学的状態の治療のために有用な物質の指標となる工程。
【請求項１２】
血管新生性疾患または腫瘍増殖を治療するための薬剤の製造における請求項８〜１１のいずれか１項記載の方法によって同定された物質の使用。
【請求項１３】
請求項８〜１１のいずれか１項記載の方法によって同定された物質の有効量を対象者に投与することを備える血管新生性疾患または腫瘍増殖を治療するための方法。
【請求項１４】
前記血管新生性疾患が虚血性心血管性傷害、脳卒中または糖尿病性微小血管疾患に関連している請求項１２または１３記載の使用または方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、血管新生および／または腫瘍進行を抑制するために有用である抑制性ＰＡＳドメインタンパク質（ＩＰＡＳ）と呼ばれる哺乳動物ポリペプチドに関する。本発明はさらにまた、血管新生または腫瘍進行に関連する医学的状態を治療するための薬剤として有用な可能性がある化合物についてのスクリーニング法にも関する。
【０００２】
背景技術
酸素は脊椎動物細胞のミトコンドリアにおける最終電子受容体として極めて重要な生物学的役割を果たしている。これらの細胞は、進化の間に酸素レベルの変化を感知する方法を発達させ、さらにこのプロセス中に血管新生、赤血球生成および解糖を含む低酸素への適応性生理的応答に関係する遺伝子の発現を条件付きで変調させる能力を獲得してきた。これらの遺伝子には血管内皮細胞増殖因子、エリスロポエチン（赤血球産生促進因子）、数種の解糖系酵素および誘導性一酸化窒素合成酵素が含まれ、それらはすべてが低酸素応答領域（ｈｙｐｏｘｉａ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ；ＨＲＥ）を含んでいることが証明されている（例として、Ｇｕｉｌｌｅｍｉｎ　ａｎｄ　Ｋｒａｓｎｏｗ（１９９７）　Ｃｅｌｌ　８９，９−１２；Ｗｅｎｇｅｒ　ａｎｄ　Ｇａｓｓｍａｎｎ（１９９７）　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　３７８，６０９−６１６を参照）。低酸素条件下では、これらの応答領域は低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ−１α）およびＡｒｎｔから構成されるヘテロ二量体複合体によって認識される（ワン（Ｗａｎｇ）ら（１９９５）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９２，５５１０−５５１４；Ｇｒａｄｉｎら（１９９６）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１６，５２２１−５２３１を参照）。これらの転写因子はどちらも急速に増えつつあるベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス（ｂＨＬＨ）−ＰＡＳ（Ｐｅｒ，Ａｒｎｔ，Ｓｉｍ）タンパク質ファミリーに属している。
【０００３】
Ｉｄと称されるヘリックス・ループ・ヘリックスタンパク質ファミリー１８は、ｂＨＬＨ転写調節因子のアンタゴニストであると同定されている。ｂＨＬＨタンパク質は、典型的にはヘテロ二量体構造内の制御配列に結合し、分化関連（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ｌｉｎｋｅｄ）遺伝子発現を活性化させるように機能する。ヘテロ二量体は、通例はクラスＢ　ｂＨＬＨタンパク質と一緒にクラスＡ　ｂＨＬＨタンパク質を備える。Ｉｄタンパク質が過剰に存在する場合は、クラスＡ　ｂＨＬＨパートナーは典型的にはＩｄタンパク質によりヘテロ二量体化を通して滴定される。
【０００４】
ＨＩＦ−１αの調節障害もしくは過剰機能は腫瘍進行１５，１６，７および炎症性血管新生１７を含む様々な生理的状態を惹起する可能性がある。従って、ＨＩＦ−１αの負の調節因子として作用する化合物を同定する必要があるが、前記化合物は血管新生および腫瘍進行に関連する医学的状態に対して有用な可能性がある。
【０００５】
図面の説明
図１：　マウスＩＰＡＳ配列および発現。
（ａ）
マウスＩＰＡＳの推定アミノ酸配列。ベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス（ｂＨＬＨ）およびＰＡＳＡおよびＢのドメインを示した。
（ｂ）
ＩＰＡＳおよび低酸素誘導因子の構造的特徴の略図である。ｂＨＬＨおよびＰＡＳモチーフ内での各タンパク質のＩＰＡＳとの同一性率を示した。ｂＨＬＨ、ベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス；ＰＡＳ、Ｐｅｒ／Ａｒｎｔ／Ｓｉｍ；Ｎ−もしくはＣ−ＴＡＤ、Ｎ末端もしくはＣ末端転写活性化ドメイン。
（ｃ）
成熟マウス組織におけるＩＰＡＳ発現のノーザンブロット解析。種々の成熟マウス組織からのポリ（Ａ）＋　ＲＮＡ（４．５μｇ）を、３２Ｐ標識ＩＰＡＳ　ｃＤＮＡプローブを用いてハイブリダイズした。ＲＮＡマーカーの位置はｋｂ単位で右側に示した。
（ｄ）−（ｏ）
Ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析。成熟マウスの角膜（ｄ−ｇ）、網膜（ｈ−ｋ）、および小脳（ｌ−ｏ）の切片を、ｍＩＰＡＳ（ｄ，ｅ，ｈ，ｉ，ｌおよびｍ）またはｍＨＩＦ−１α（ｆ，ｇ，ｊ，ｋ，ｎおよびｏ）のアンチセンスＲＮＡプローブを用いてハイブリダイズした。明（ｄ，ｆ，ｈ，ｊ，ｌおよびｎ）および暗領域（ｅ，ｇ，ｉ，ｋ，ｍおよびｏ）を示した。Ｃ、角膜；Ｅｐ、上皮；Ｓ、固有質；ＬＥ、水晶体上皮；ＧＣ、顆粒細胞層；ＩＮＬ、内顆粒層；Ｒ＆Ｃ、桿状体および錐状体；Ｇ、顆粒層；Ｐ、プルキンエ細胞；Ｍ、分子層。
【０００６】
図２：　ＩＰＡＳは低酸素誘導因子の優勢な負の調節因子である。
（ａ）
ＩＰＡＳはＨＲＥ駆動レポーター遺伝子を転写活性化しない。大量のＩＰＡＳ発現ベクター（ＣＭＶ　ＩＰＡＳ）をＨＲＥ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子と一緒にＨｅＬａ細胞内へコトランスフェクトした。細胞を正常酸素（２１％　Ｏ２）もしくは低酸素（１％　Ｏ２）状態のどちらかで２４時間インキュベートし、細胞のルシフェラーゼ発現を測定した。
（ｂ）、（ｃ）
ＩＰＡＳは低酸素誘導因子媒介性遺伝子発現を抑制する。ＩＰＡＳ発現ベクター、ＨＲＥ−ルシフェラーゼレポーター、およびＨＩＦ−１α（ｂ）もしくはＨＬＦ（ｃ）発現ベクター（各々、ＣＭＶ　ＨＩＦ−１αもしくはＣＭＶ　ＨＬＦ）をＨｅＬａ細胞内に導入した。正常酸素（２１％　Ｏ２）もしくは低酸素（１％　　Ｏ２）状態での２４時間に渡るインキューベンション後、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果は、レポーター遺伝子単独でトランスフェクトした細胞のルシフェラーゼ活性と比較した誘導倍率として表示した。平均値±ＳＤ（標準偏差）を示した。
（ｄ）
ＩＰＡＳはＨＩＦ−１αおよびＨＬＦタンパク質レベルに影響を及ぼさない。ＨｅＬａ細胞をＦＬＡＧ−タグ付きＩＰＡＳ発現プラスミド（１．０μｇ／２１．５ｃｍ２　ｄｉｓｈ）でトランスフェクトし、６時間に渡り低酸素に暴露させた。全細胞抽出物（５０μｇ）を調製し、本質的にはＨＩＦ−１α（ノーバス［Ｎｏｖｕｓ］社製）、ＨＬＦ（ノーバス［Ｎｏｖｕｓ］社製）、およびＦＬＡＧエピトープ（シグマ［Ｓｉｇｍａ］社製）に対する抗体類を使用して、以前に報告されたように６、イムノブロット解析を受けさせた。
【０００７】
図３：　ＩＰＡＳは特異的に低酸素誘導ｍＲＮＡ発現を減弱させる。
（ａ）
低酸素誘導遺伝子発現はＩＰＡＳ過剰発現細胞中では損なわれている。野生型（Ｈｅｐａｌｃ１ｃ７）もしくはＩＰＡＳ−安定的トランスフェクトされた（Ｈｅｐａ　ＩＰＡＳ）マウス肝臓癌細胞系を正常酸素（Ｎ）もしくは低酸素（Ｈ）状態のどちらかで２４時間に渡って培養した。細胞からポリ（Ａ）＋ＲＮＡを単離し、放射標識マウスＩＰＡＳ、ＰＧＫ１、ＶＥＧＦおよび指標としてβ−アクチンｃＤＮＡプローブを用いてハイブリダイズした。
（ｂ）
転写レベルでのＩＰＡＳによる低酸素誘導遺伝子発現の抑制。ＨＲＥルシフェラーゼレポーターはＨＩＦ−１α発現ベクターとともに、もしくは、なしに、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７もしくはＨｅｐａＩＰＡＳ細胞内へトランスフェクトした。細胞は２１％もしくは１％のＯ２濃度のどちらかの条件下で培養し、ルシフェラーゼアッセイを受けさせた。レポーター遺伝子単独でトランスフェクトしたＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞のルシフェラーゼ含量をコントロールとして使用し、結果はコントロールと比較した誘導倍率として示した。
（ｃ）
ＩＰＡＳはＨＩＦ−１α／Ａｒｎｔ複合体のＨＲＥへの結合を抑制する。正常酸素もしくは低酸素のＨｅｐａ１ｃ１ｃ７およびＨｅｐａＩＰＡＳ細胞からの核抽出液を３２Ｐ標識ＨＲＥオリゴヌクレオチドプローブを使用するＥＭＳＡによって解析した。星印は核抽出液中の構成的な（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）ＨＲＥ結合活性の位置を示しており、矢印は低酸素誘導ＨＩＦ−１α／Ａｒｎｔ−ＤＮＡ複合体の位置を示している１２。非標識ＨＲＥ（Ｓ）もしくは非関連配列（ＮＳ）による競合アッセイおよび抗ＨＩＦ−１α抗体および抗Ａｒｎｔ抗体によるスーパーシフト形成を示した。
（ｄ）
ＩＰＡＳはドキシン誘導遺伝子発現に影響を及ぼさない。Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７およびＨｅｐａＩＰＡＳ細胞はＴＣＤＤ（１０ｎＭ）で、もしくは、なしで、２４時間かけて処理し、細胞からのポリ（Ａ）＋　ＲＮＡを３２Ｐ標識マウスＣＹＰ１Ａ１、ＩＰＡＳおよびβ−アクチンｃＤＮＡプローブを用いてハイブリダイズした。
（ｅ）
ＩＰＡＳはＴＣＤＤ媒介ＸＲＥレポーター遺伝子発現に影響を及ぼさない。Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７およびＨｅｐａＩＰＡＳ細胞をＸＲＥレポータープラスミドでトランスフェクトし、ＴＣＤＤ存在下もしくは不在下での２４時間のインキュベーション後に、ルシフェラーゼ活性をモニターした。結果は、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞のリガンドフリーコントロールと比較したルシフェラーゼ活性の誘導倍率として表示した。平均値±ＳＤ（標準偏差）を示した。
【０００８】
図４：　ＩＰＡＳは非機能的複合体を形成するためにＨＩＦ−１αを標的とする。
（ａ）
ＩＰＡＳはＨＩＦ−１αと物理的に相互作用する。Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳されたＧＳＴ−ＩＰＡＳもしくはＧＳＴを３５Ｓ標識ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳ＡｒｎｔもしくはＨＩＦ−１αと混合し、抗ＧＳＴ抗体を用いた免疫沈降反応を実施した。沈降物はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、その後オートラジオグラフィーにかけた。ローディングコントロールとして、１０％のインプットＡｒｎｔおよびＨＩＦ−１αが示された。
（ｂ）
ＨＩＦ−１αのＮ−末端構造はＩＰＡＳとのヘテロ二量体化のために不可欠である。３５Ｓ標識ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳ＩＰＡＳをＨＩＦ−１αの様々なフラグメントのＧＡＬ４−融合物と一緒にインキュベートし、抗ＧＡＬ４抗体もしくは免疫前コントロール血清のどちらかで免疫沈降させた。沈降した分画はＳＤＳ　ＰＡＧＥによって解析し、結果はオートラジオグラフィーによって入手した。インプットＩＰＡＳの１０％をコントロールとして示した。
（ｃ）、（ｄ）
ＩＰＡＳおよびＨＩＦ−１α間のｉｎ　ｖｉｖｏ相互作用。ＣＯＳ７細胞は、指標としての、ＧＡＬ４−駆動レポーター遺伝子と共に、ＧＡＬ４−ＨＩＦ−１α／１−３３０およびＶＰ１６−ＩＰＡＳ（ｃ）またはＧＡＬ４−ＩＰＡＳおよびＶＰ１６−Ａｒｎｔ（ｄ）に対する様々な量の発現ベクターでトランスフェクトされた。２４時間のインキュベーション後、細胞のルシフェラーゼ活性を測定した。結果は、レポーター遺伝子単独でトランスフェクトした細胞のルシフェラーゼ含量と比較した誘導倍率として表示した。
（ｅ）
ＩＰＡＳ／ＨＩＦ−１αへテロ二量体はＨＲＥへ結合できない。様々な組み合わせのｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳ＩＰＡＳ、ＨＩＦ−１α、およびＡｒｎｔ、または指標として非定型的（ｕｎｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ）網状赤血球ライセートを３２Ｐ標識ＨＲＥオリゴヌクレオチドプローブと混合し、タンパク質ＤＮＡ複合体形成をＥＭＳＡによってモニターした。結果はオートグラフィーによって可視化した。
【０００９】
図５：　角膜上皮細胞中の血管新生増殖因子の産生をサイレンシングすることにおけるＩＰＡＳの関与。
マウス角膜上皮細胞の初代培養をアンチセンスＩＰＡＳ発現プラスミドもしくは空ベクター（ベクター）のどちらかでトランスフェクトし、正常酸素（Ｎ、２１％　Ｏ２）または低酸素（Ｈ、１％　Ｏ２）条件下で２４時間インキュベートした。細胞から全ＲＮＡを抽出し、放射標識マウスＶＥＧＦｃＤＮＡプローブを使用したノーザンブロット解析を実施した。全ＲＮＡ形正常酸素および低酸素Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞はＶＥＧＦ誘導のための参照として供された。ローディングコントロールとして、１８ＳＲＮＡレベルが示されている。
【００１０】
発明の開示
本発明は、活性化ＨＩＦ−１αが例えばＩＰＡＳのような小さなタンパク質因子による負の調節にあい、非機能的へテロ二量体複合体を形成するモデルを提供する。このＨＩＦ−１αの調節様式は、角膜ＶＥＧＦ産生におけるＩＰＡＳの著しい負の作用によって証明されるように、ｉｎ　ｓｉｔｕにおける低酸素シグナル伝達の厳密な制御に寄与する可能性がある。他方、ＩＰＡＳの異所性発現は潜在的に低酸素誘導性ＶＥＧＦ発現を抑制してきたが、ＩＰＡＳの負の作用はこれまで試験したところでは低酸素シグナル伝達に対して選択的であった。このため、ＩＰＡＳが例えば虚血性心血管性傷害、脳卒中および糖尿病性微小血管疾患のような様々な血管新生性疾患のための治療薬デザインにおけるターゲットとして有用であると想定されている。
【００１１】
その結果、第１態様では、本発明は下記から選択される単離核酸分子を提供する：
（ａ）配列番号２で示されるヌクレオチド配列を備える核酸分子；
（ｂ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）に定義された核酸分子のポリペプチドコード領域に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができ、さらに生物学的に活性な哺乳動物ＩＰＡＳポリペプチドまたはそれの機能的に等価な改変形態をコードするヌクレオチド配列を備える核酸分子；および
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）で定義されたヌクレオチド配列に対する遺伝暗号の結果として縮重しており、さらに生物学的に活性な哺乳動物ＩＰＡＳポリペプチドまたはその機能的に等価な改変形態をコードする核酸配列を備える核酸分子。
【００１２】
本発明に従った核酸分子には、ｃＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲによって単離されたＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、およびそれらの組み合わせが含まれる。ゲノムＤＮＡは、当分野でよく知られている方法を使用してここに記載したＩＰＡＳ　ｃＤＮＡを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって入手できる。ＤＮＡから転写されたＲＮＡもまた本発明に含まれる。
【００１３】
用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、当分野における標準プロトコル（例、Ａｕｓｕｂｅｌら、下記参照）から知られており、例えば、フィルター結合ＤＮＡに対する、０．５Ｍ　ＮａＨＰＯ４、７％　ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ中での＋６５℃のハイブリダイゼーション、および０．１　ｘＳＳＣ／０．１％　ＳＤＳ中での＋６８℃の洗浄であると理解できよう。
【００１４】
本発明の好ましい形態では、前記核酸分子は配列表の配列番号２と同一であるヌクレオチド配列を有する。しかし、本発明に従った核酸分子は配列番号２で示される配列に厳密には限定されない。むしろ本発明は置換、小さな欠失、挿入もしくは逆位のような修飾を有し、さらにその上、本発明に従ったＩＰＡＳポリペプチドの生化学活性を実質的に有するタンパク質をコードする核酸分子を含んでいる。その結果として本発明に含まれるのは、そのヌクレオチド配列が配列表に配列番号２で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％相同である、好ましくは少なくとも９５％相同である核酸分子である。
【００１５】
さらに本発明にはそのヌクレオチド配列が遺伝暗号のために配列番号２で示されるヌクレオチド配列が縮重している核酸分子も含まれる。３種のヌクレオチドの連続分類である「コドン」は１個のアミノ酸をコードする。６４個のコドンが存在する可能性があるが、天然アミノ酸は２０個だけであるので、ほとんどのアミノ酸は１個より多いコドンによってコードされる。この遺伝暗号の自然の「縮重」もしくは「重複性」は当分野においてよく知られている。従って、本配列表に示されているヌクレオチド配列がＩＰＡＳポリペプチドをコードする配列の大きいが限定的な群内の１例に過ぎないことは理解されるであろう。
【００１６】
さらにまた別の態様では、本発明は上記で定義した核酸分子によってコードされる単離哺乳動物ＩＰＡＳポリペプチドを提供する。ある好ましい形態では、前記ポリペプチドは配列表に記載の配列番号３に従ったアミノ酸配列を有する。しかし、本発明に従ったポリペプチドは配列表に記載の配列番号３と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドに厳密には限定されない。むしろ本発明は、置換、小さな欠失、挿入もしくは逆位のような改変を有するポリペプチドを含んでおり、それらのポリペプチドはその上、本発明に従ったＩＰＡＳポリペプチドの生物学的活性を実質的に有している。その結果として本発明に含まれるのは、そのアミノ酸配列が配列表に配列番号３で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％相同である、好ましくは少なくとも９５％相同であるポリペプチドである。
【００１７】
さらにまた別の態様では、本発明は上記に定義した核酸配列を備えるベクターを提供する。用語「ベクター」は、宿主細胞による外来性ＤＮＡの複製および／または適切な発現のために宿主細胞へＤＮＡをトランスファーさせるために有用である外来性ＤＮＡの担体を意味する。前記ベクターは、本発明に従った核酸配列を有し、その発現を媒介できる複製型発現ベクターであってよい。本明細書の状況では、用語「複製型」はベクターが、それがその中に導入されている一定のタイプの宿主細胞中で複製できることを意味している。ベクターの例は、例えばバクテリオファージのようなウイルス、コスミド、プラスミドおよびその他の組換えベクターである。核酸分子は当分野においてよく知られている方法によってベクターゲノム内に挿入する。
【００１８】
さらにまた本発明に含まれるのは、本発明に従ったベクターを宿している培養された宿主細胞である。そのような宿主細胞は、原核細胞、単細胞性真核細胞または多細胞生物に由来する細胞である。従って宿主細胞は、例えばＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）のような細菌細胞；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｖｉｓｉｄａｅ（サッカロミセス・セレビシエ）もしくはＰｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ（ピキア・パストリス）のような酵母、または哺乳動物細胞であってよい。宿主細胞内へのベクターの導入を実行するために使用される方法は、組換えＤＮＡ法に習熟した当業者にはよく知られている標準方法である。本発明はさらにまた、それによって前記ポリペプチドが産生される条件下で前記宿主細胞を培養する工程、および前記ポリペプチドを回収する工程を備える、哺乳動物ＩＰＡＳポリペプチドを産生させるためのプロセスを含む。
【００１９】
さらにまた別の重要な態様では、本発明は哺乳動物ＩＰＡＳ核酸分子の発現を活性化させるために有用な物質を同定するための（スクリーニング）方法を提供する。前記方法は、下記の工程を備える：
（ｉ）候補物質を本発明に従った哺乳動物ＩＰＡＳヌクレオチド酸分子または哺乳動物ＩＰＡＳポリペプチドと接触させる工程；および
（ｉｉ）前記候補物質が前記哺乳動物ＩＰＡＳ核酸分子の発現を活性化させるかどうか、または前記ポリペプチドの生物学的活性を刺激するかどうかを判定する工程。
【００２０】
スクリーニングのためには、適切な宿主細胞を本発明に従ったＩＰＡＳ遺伝子の制御下でレポーター遺伝子を有するベクターを用いて形質転換させることができる。レポーター遺伝子の発現は、既知の活性を有する物質（即ち、標準物質）もしくは推定上の活性を有する物質（即ち、「被験物質」または「候補物質」）の存在下または不在下で測定できる。被験物質の存在下でのレポーター遺伝子の発現レベルにおける変化を標準物質によって達成される発現レベルと比較する。この方法で、活性物質を同定し、このアッセイにおけるそれらの相対的効力を測定する。
【００２１】
ここで使用する用語「レポーター遺伝子」は、単純で安価な方法または試薬を使用して同定できる、およびＩＰＡＳ配列へ操作可能に連結できる遺伝子産物をコードする遺伝子を意味する。例えばルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼまたは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子のようなレポーター遺伝子は、本発明に従ったスクリーニングアッセイにおける転写活性を測定するために使用できる（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（編集），Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　Ｖｏｌ．　１８５，　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｉｎｃ．（１９９０）；下記のＳａｍｂｒｏｏｋを参照）。
【００２２】
ここで使用する用語「物質」は、例えば単純もしくは複雑有機分子、ペプチド、タンパク質もしくはオリゴヌクレオチドのような生物学的または化学的化合物を意味する。本発明に従った方法で同定されるような物質は、例えば虚血性心血管疾患病変、脳卒中または糖尿病性微小血管疾患に関連する血管新生性疾患を含む血管新生および／または腫瘍増殖を抑制するための薬物の同定、開発および製造において有用である。
【００２３】
このため、本発明はさらにまた上記の方法によって同定される物質の有効量を対象者へ投与する工程を備える、血管新生性疾患または腫瘍増殖を治療するための方法を提供する。用語「治療」は、下記を含む哺乳動物における疾患のあらゆる治療を意味する：（ｉ）疾患を予防する、即ち疾患の臨床症状が発生しないことを惹起する工程；（ｉｉ）疾患を抑制する、即ち臨床症状の発生を停止させる工程；および／または（ｉｉｉ）疾患を軽減する、即ち臨床症状の退行を惹起する工程。用語「有効量」は、治療されている疾患の状態を治療するために十分な用量を意味する。これは患者、疾患および実施される治療に依存して変化するであろう。
【００２４】
実験的方法
本明細書の本文の全体を通して用語「標準プロトコル」および「標準手法」は、分子生物学的技術の状況において使用する場合には次のような通常の実験マニュアルで所見されるプロトコルおよび手法であると理解するべきである：Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における最新プロトコル），エフ，オースベル（Ｆ．　Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編集，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．　１９９４，またはサムブルック，ジェイ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．），フリッチュ，イー・エフ（Ｆｒｉｔｓｃｈ　Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス，ティ（Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．），　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ，　２ｎｄ　Ｅｄｏｓ．，（分子クローニング：実験マニュアル第２版），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＮＹ　１９８９。
【００２５】
プラスミド構築
ｐｃＤＮＡ３　ＩＰＡＳは、ｐＴ７Ｔ３Ｄ　ＩＰＡＳ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＡ０２８４１６）からのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩフラグメントをＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ消化ｐｃＤＮＡ３プラスミド（インビトロゲン［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］社製）内に挿入することによって作製した。ＰＣＭＶ　ＩＰＡＳもしくはｐＦＬＡＧ　ＩＰＡＳは、各々ｐＣＭＶ４もしくはｐＣＭＶ　ＦＬＡＧプラスミドの対応する部位においてｐｃＤＮＡ３　ＩＰＡＳからのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩまたはＢａｍＨＩ−ＸｂａＩフラグメントを含有していた６。ＨＲＥ−ルシフェラーゼ、ＸＲＥ−ルシフェラーゼおよびｐＣＭＶ　ＨＩＦ−１αについては他の場所で説明されている１２，２０。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ｍＨＬＦはＤｒ．　Ｙ．　Ｆｕｊｉｉ−Ｋｕｒｉｙａｍａからの寄贈品であり、ｐＣＭＶ　ｍＨＬＦを構築するために使用した。ｐＧＳＴ、ＧＳＴ融合タンパク質のｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳のためのプラスミド、を構築するために、ＧＳＴ　ｃＤＮＡおよびｐＧＥＸ−４Ｔ−３（アマーシャム・ファルマシア・バイオテック［Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ］社製）のマルチクローニング部位をＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩリンカーを用いてＰＣＲによって増幅させ、ｐＳＰ７２ベクター（プロメガ［Ｐｒｏｍｅｇａ］社製）のＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位内へサブクローニングした。ｐＧＳＴ　ＩＰＡＳは、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ消化ｐＧＳＴ内への、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩリンカーをもつＰＣＲクローン化ＩＰＡＳ　ｃＤＮＡの挿入によって作製した。ＧＡＬ４　ＨＩＦ−１α／１−８２６、１−３３０、１−６５２、５２６−８２６は以前に報告された通りであった６。ｐＣＭＸ　ＧＡＬ４−ＩＰＡＳまたはｐＣＭＸ　ＶＰ−１６　ＩＰＡＳ構築のためには、ｐｃＤＮＡ３　ＩＰＡＳのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩまたはＢａｍＨＩ−ＸｂａＩフラグメントを各々ｐＣＭＸ　ＧＡＬ４のＥｃｏＲＩ−ＮｈｅＩ部位またはｐＣＭＸ　ＶＰ１６のＢａｍＨＩ−ＮｈｅＩ部位内へ挿入した。ＰＣＭＸＶＰ１６−ＡｒｎｔはＤｒ．　Ｉ．　Ｐｏｎｇｒａｔｚからの寄贈品であった。アンチセンスＩＰＡＳ発現プラスミドを作製するためには、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩリンカーを含む全長ＩＰＡＳ　ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３プラスミドのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位へ逆方向で挿入した。
【００２６】
細胞培養およびトランスフェクション
Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７、ＨｅＬａおよびＣＯＳ７細胞はＡＴＣＣから入手した。Ｈｅｐａ　ＩＰＡＳ細胞は、ｐＥＦＩＲＥＳｐｕｒｏ　ＩＰＡＳでのＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞の安定トランスフェクションおよびピューロマイシン（５μｇ／ｍＬ）による選択によって樹立した。一過性トランスフェクションは２８ｃｍ２培養皿におけるリポフェクション法によって実施した。ルシフェラーゼアッセイでは、０．５μｇのレポータープラスミドおよび指標量の発現プラスミドをトランスフェクトした。細胞の低酸素もしくはＴＣＤＤ処理については以前に説明されている１２。
【００２７】
ノーザンブロット（Ｎｏｔｈｅｒｎ　Ｂｌｏｔ）およびＩｎ　Ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析
８週齢のＣ５７Ｂ１６マウスの様々な組織、またはＨｅｐａ１ｃ１ｃ７およびＨｅｐａ　ＩＰＡＳ細胞からポリ（Ａ）＋　ＲＮＡ（４．５μｇ）をグアニジウムチオシアネート法によって入手し、その後オリゴｄＴ−ビーズ精製（Ｄｙｎａｌ）を実施し、ｍＩＰＡＳ（ｎｔ６２３−８９７）、ｍＰＧＫ１（ｎｔ４２６−７７１）、ｍＶＥＧＦ３（ｎｔ２４−４６６）、ｍＣＹＰ１Ａ１（ｎｔ８７４−１１９９）およびβアクチン（ｎｔ９３０−１０７５）の３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブを使用するノーザンブロット法によって解析した。マウス角膜上皮初代培養またはＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞からの全ＲＮＡ（２０μｇ）を分離し、放射標識ｍＶＥＧＦ３　ｃＤＮＡ（ｎｔ２４−４６６）プローブを用いて探索した。３５Ｓ標識ｍＩＰＡＳもしくはｍＨＩＦ−１αアンチセンスＲＮＡプローブを使用した８週齢のＣ５７Ｂ１６マウスから作製した組織切片のｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは以前に報告された通りに実施した２１。
【００２８】
電気泳動移動度シフト解析（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　Ｍｏｂｉｌｉｔｙ　Ｓｈｉｆｔ　Ａｓｓａｙ）
正常酸素もしくは低酸素細胞のどちらかからの核抽出液を以前に報告された通りに調製した１２。１０μｇの核抽出液を、１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６０ｍＭ　ＫＣｌ、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、５％　グリセロール中で、０．１μｇの超音波処理した変性子ウシ胸腺ＤＮＡを含有する緩衝液中で３２Ｐ標識ＨＲＥオリゴヌクレオチドと一緒にインキュベートした。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳タンパク質（各５μＬ）の種々の組み合わせを１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ　ＫＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、３ｍＭ　ＭｇＣｌ２、４ｍＭスペルミジン、０．５ｍＭ　ＤＴＴ、１０％グリセロール、２０ｎｇ／μＬ　ｔＲＮＡ、１ｎｇ／μＬサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中でＨＲＥプローブと混合した。タンパク質ＤＮＡ複合体を０．５Ｘ　ＴＢＥ緩衝液（１×ＴＢＥ；８９ｍＭＴｒｉｓ、８９ｍＭホウ酸、５ｍＭ　ＥＤＴＡ）中で４％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。
【００２９】
Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ（試験管内）タンパク質相互作用アッセイ
ＧＳＴ融合ＩＰＡＳもしくはＨＩＦ−１αの様々なフラグメントのＧＡＬ４融合物を、ウサギ網状赤血球ライセート（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）中において３５Ｓ標識メチオニンの存在下または不在下のどちらかでの翻訳によって産生した。ＧＳＴ−ＩＰＡＳまたはＧＡＬ４−ＨＩＦ−１αのタンパク質濃度は取り込んだ３５Ｓ標識メチオニンに基づいて測定した。等量の３５Ｓ標識ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳Ａｒｎｔ、ＨＩＦ−１αもしくはＩＰＡＳを室温で１時間ＧＳＴ　ＩＰＡＳもしくはＧＡＬ４−ＨＩＦ−１αと一緒にインキュベートし、その後、抗ＧＳＴ抗体（アマーシャム・ファルマシア・バイオテック［Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ］社製）または抗ＧＡＬ４抗体（アップステート・バイオテクノロジー［Ｕｐｓｔａｔｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ］社製）抱合プロテインＡセファロース（アマーシャム・ファルマシア・バイオテック［Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ］社製）と一緒に室温でさらに１時間インキュベートした。短時間の遠心後、免疫共沈降したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。
【００３０】
マウス角膜上皮細胞の単離
６週齢のＣ５７Ｂ１６／Ｊ健常マウスを致死量のＣＯ２を用いて致死させた。眼を摘出し、角膜組織を実体顕微鏡下で１０％子ウシ血清を補給したＤＭＥ倍地中で解体した。角膜組織を無菌条件下で小切片に切開し、ＤＭＥＭを用いて２回洗浄した。組織塊をゼラチン被覆組織培養皿上に置き、３ｎｇ／ｍＬの濃度でヒト組換えＦＧＦ−βを補給した１０％子ウシ血清を含むＤＭＥＭ中でインキュベートした。８日間に渡り５％ＣＯ２中でインキュベートした後、ほぼコンフルエンスの状態へ増殖した角膜上皮細胞をトリプシン処理した。その後単一細胞懸濁液を２１．５ｃｍ２培養皿上に播種し、上記と同一条件下で細胞を増殖させた。
【００３１】
実施例
実施例１：　ＩＰＡＳ配列の同定
隠れマルコフモデル（Ｈｉｄｄｅｎ　Ｍａｒｋｏｖ　Ｍｏｄｅｌ）プロファイル３は、選択された数のｂＨＬＨ／ＰＡＳ因子のＰＡＳドメインに対応するヌクレオチド配列からＨＭＭＥＲ１，８，３ソフトウエア１９を使用して設計した。ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）のマウスＥＳＴデータベースをスクリーニングし、ｂＨＬＦ（ベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス）ＰＡＳモチーフを含有する４６０ｂｐのＥＳＴクローン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＡ０２８４１６；配列番号１）を同定した。
【００３２】
ＤＮＡ配列解析により、ＩＰＡＳ　ｃＤＮＡ（配列番号２）が３０７アミノ酸のポリペプチド（図１ａ：配列番号３）をコードする９２１ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含有することが判明した。推定されたポリペプチドをＩＰＡＳ（抑制性ＰＡＳドメインタンパク質）と名付けた。
【００３３】
このアミノ酸配列の既知のｂＨＬＨ　ＰＡＳ因子を用いたアライメント解析により、ＨＩＦ−１α４およびＨＬＦ５とのＮ末端ｂＨＬＨドメイン（各々７５％および７６％同一性；図１ｂ）での高度の類似性、およびＰＡＳ領域内（各々、ＰＡＳ　Ａドメインでは３４％および３６％、およびＰＡＳ　Ｂドメインでは４０％および３６％；図１ｂ）での少ない程度の類似性が証明された。特に、ＩＰＡＳには、２つの転写活性化ドメイン（ＮＴＡＤおよびＣＴＡＤ）が同定されているＨＩＦ−１αおよびＨＬＦのＣ末端領域に対応する配列が欠如している。
【００３４】
実施例２：　ＩＰＡＳ　ｍＲＮＡは主として眼中で発現する
種々のマウス組織に由来するポリ（Ａ）＋　ＲＮＡのノーザンブロット解析は、ＩＰＡＳ　ｍＲＮＡが主として眼中で発現し、小脳および大脳ではより低レベルで発現することを証明した。試験した他のマウス組織中では明白な発現は検出されず、これはＩＰＡＳ　ｍＲＮＡの極めて組織限定的発現パターンを示している（図１ｃ）。
【００３５】
実施例３：　ＩＰＡＳ発現は角膜の上皮細胞層で観察される
眼および小脳中のＩＰＡＳ遺伝子の空間的発現パターンを特徴付けるために、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施した。角膜の上皮細胞層中では強度のＩＰＡＳ発現が観察され（図１ｄおよび１ｅ）、網膜の神経節細胞層、内顆粒層、並びに杆状体および錐状体においてはより低強度で観察された（図１ｈおよび１ｉ）。ＨＩＦ−１α　ｍＲＮＡの発現は、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって角膜の上皮中で低いレベルで検出されたが（図１ｆおよび１ｇ）、これはこれらの細胞中ではＨＩＦ−１αに比較してＩＰＡＳが顕著に優勢に発現することを証明している。ＨＩＦ−１αはさらにまた網膜のＩＰＡＳ発現が観察されたのと同一層で発現した（図１ｊおよび１ｋ）。小脳では、ＩＰＡＳの発現はプルキンエ細胞層に限定されていたが（図１ｌおよび１ｍ）、他方ＨＩＦ−１αは全切片を通して局所的発現を示さなかった（図１ｊおよび１ｋ）。ＩＰＡＳおよびＨＩＦ−１α　ｍＲＮＡはどちらも、大脳の一定領域では非特異的バックグラウンドレベルを超える弱い拡散性シグナルとして観察された（データは示されていない）。
【００３６】
実施例４：　ＩＰＡＳの共発現はＨｅＬａ細胞中の低酸素誘導レポーター遺伝子発現を減少させる
ＩＰＡＳの低酸素誘導転写因子との構造的類似性およびマウス角膜中でのＩＰＡＳおよびＨＩＦ−１αの共局在に刺激されて、我々は低酸素に対する細胞応答性の転写調節におけるＩＰＡＳの役割を調査した。我々は一過性に発現したＩＰＡＳの不在下または存在下で低酸素応答配列（ＨＲＥ）駆動ルシフェラーゼレポーターを使用して、ＨｅＬａ細胞における一過性トランスフェクションアッセイを実施した。低酸素（１％　Ｏ２）条件下での細胞のインキュベーションはレポーター遺伝子の４．２倍の活性化を誘発したが、これは内因性の低酸素誘導因子の誘導性転写活性化機能を表していた（図２ａ）。ＩＰＡＳの共発現は、低酸素依存形式で高レベルのルシフェラーゼ発現を刺激したＨｅＬａ細胞における低酸素誘導レポーター遺伝子を減少させたが（各々図２ｂおよび図２ｃ）、これはＩＰＡＳが内因性の低酸素誘導因子の機能の優勢な負の調節因子として機能することを示している。ＩＰＡＳはＨＩＦ−１αおよびＨＬＦの低酸素誘導タンパク質安定化には何の影響も及ぼさなかったが（図２ｄ）、これはＨＩＦ−１αもしくはＨＬＦ機能の活性化における極めて重要な初期工程を表していることが以前に証明されている６，７，８。従って、ＩＰＡＳは低酸素誘導転写因子によって媒介されるシグナル伝達における下流段階をより多く抑制すると思われる。
【００３７】
実施例５：　ＩＰＡＳは低酸素誘導遺伝子発現のダウンレギュレーションを媒介する−ＩＰＡＳはＨＩＦ−１αとＨＲＥとの間の相互作用を損なわせる
低酸素性細胞中におけるＨＩＦ−媒介情報伝達経路の調節におけるＩＰＡＳの役割を詳細に調査するために、我々はマウス肝臓癌Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞の安定トランスフェクションによってＩＰＡＳを安定に過剰発現する細胞を産生した。安定にトランスフェクトされた細胞におけるＩＰＡＳ　ｍＲＮＡの発現をノーザンブロット解析により確認したが、親Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞は検出可能な内因性のＩＰＡＳ発現を示さなかった（図３ａ）。低酸素条件下で培養した野生型Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞は、どちらも様々な細胞系において低酸素条件下で誘導されることが証明されている９，１０ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ１）および血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）をコードするｍＲＮＡの顕著な発現増加を示した（図３ａ）。低酸素に応答して、Ｈｅｐａ　ＩＰＡＳ細胞はこれらの遺伝子の誘導レベルの低下を示した（ＰＧＫ１およびＶＥＧＦ活性化において各々４５％および４８％の低下；図３ａ）。低酸素誘導遺伝子発現のＩＰＡＳ媒介性ダウンレギュレーションは転写レベルであると思われたが、それは一過性にトランスフェクトされたＨＲＥ駆動レポーター遺伝子の低酸素による活性化が野生型細胞よりＨｅｐａ　ＩＰＡＳ細胞中における方が有意に低かったためである（図３ｂ）。レポーター遺伝子活性化はＨＩＦ−１αの一過性過剰発現後にＨｅｐａ　ＩＰＡＳ細胞中では抑制さえされたが、これはＩＰＡＳがＨＩＦ−１αとＨＲＥ間の生産的相互作用を損傷させることを示している。
【００３８】
実施例６：　ＩＰＡＳはＨＩＦ−１α／Ａｒｎｔ複合体のＤＮＡ結合活性を損なう
移動度シフト解析はＧｒａｄｉｎら１２によって報告された通りに実施した。実施例５で入手された結果を強力に支持して、ＨＩＦ−１α／Ａｒｎｔヘテロ二量体複合体によるＨＲＥ特異的ＤＮＡ結合活性は、野生型細胞からの対応する核抽出液より正常酸素もしくは低酸素Ｈｅｐａ　ＩＰＡＳ細胞のどちらかからの核抽出液における方が低かった（図３ｃ）。
【００３９】
実施例７：　ＩＰＡＳによる負の調節はＨＩＦ媒介情報伝達経路に特異的である　ＩＰＡＳによる負の調節がＨＩＦ媒介情報伝達経路に特異的であるかどうかを試験した。生体異物化学薬品に応答して遺伝子調節を媒介するアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）もまたｂＨＬＨ／ＰＡＳ転写因子ファミリーのメンバーであり、これは、ＨＩＦ−１αと二量化パートナー因子であるＡｒｎｔを共有している１１。野生型Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞を２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（ＴＣＤＤ）とともにインキュベートするとＡｈＲターゲット遺伝子シトクロームＰ−４５０１Ａ１（ＣＹＰ１Ａ１）のｍＲＮＡ発現を強度に誘導した。低酸素誘導遺伝子発現とは対照的に、ＣＹＰ１Ａ１　ｍＲＮＡのＴＣＤＤ誘導発現はＨｅｐａ　ＩＰＡＳ細胞中で撹乱させられず、野生型細胞中で観察されるのに類似する誘導応答を示した。（図３ｄ）これらのデータに一致して、リガンド刺激ＡｈＲ／Ａｒｎｔへテロ二量体複合体１２による生体異物応答配列（ＸＲＥ）駆動レポーター遺伝子の極めて類似するレベルの活性化が野生型およびＩＰＡＳ過剰発現Ｈｅｐａ細胞の両方で観察された（図３ｅ）。これらを総合すると、ＩＰＡＳは低酸素誘導遺伝子発現の優勢な負の調節因子として機能するために優先的にＨＩＦ−１αをターゲットとすると思われる。
【００４０】
実施例８：　ＩＰＡＳの抑制性作用はＨＩＦ−１αとの直接相互作用によって媒介される
ＩＰＡＳの抑制性作用がＨＩＦ−１αもしくはＡｒｎｔとの直接相互作用によって媒介されるのかどうかを試験した。放射標識ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳ＨＩＦ−１αもしくはＡｒｎｔをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＩＰＡＳ融合タンパク質と一緒にインキュベートし、抗ＧＳＴ抗体（アマーシャム・ファルマシア・バイオテック［Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ］社製）を使用して免疫沈降アッセイによって解析した。ＧＳＴ−ＩＰＡＳはＨＩＦ−１αとは共沈降したがＡｒｎｔとは共沈降しなかったので、これはＩＰＡＳとＨＩＦ−１α間の特異的物理的相互作用を証明している（図４ａ）。
【００４１】
実施例９：　ＨＩＦ−１αのＮ末端部はＩＰＡＳとの物理的相互作用を引き起こす
ＩＰＡＳとの相互作用に不可欠なＨＩＦ−１αのドメインを同定するために、我々はＧＡＬ４最小ＤＮＡ結合ドメインへ融合したＨＩＦ−１αの様々なフラグメント（参考文献１８のＫａｌｌｉｏらを参照）およびｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳によって生成した放射標識ＩＰＡＳをインキュベートし、抗ＧＡＬ−４抗体（アップステート・バイオテクノロジー［Ｕｐｓｔａｔｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ］社製）によってこの物質を免疫沈降させた。ＧＡＬ４−ＨＩＦ−１α／１−８２６（全長）、／１−３３０および／１−６５２は明白にＩＰＡＳを共沈降させたが、ＧＡＬ４−ＨＩＦ−１α／５２６−８２６およびＧＡＬ４　ＤＢＤはＩＰＡＳを共沈降させなかった。同時に、ｂＨＬＨ／ＰＡＳモチーフから主として構成されるＨＩＦ−１αのＮ末端構造がＩＰＡＳとの物理的会合を引き起こす（図４ｂ）。これらの観察を支持して、ＧＡＬ４−ＨＩＦ−１α／１−３３０およびＶＰ１６−ＩＰＡＳを使用した哺乳類細胞ツーハイブリッドアッセイは、細胞内におけるＩＰＡＳとＨＩＦ−１αＮ末端部の間の相互作用を示した（図４ｃ）。他方、プルダウン法（ｐｕｌｌ　ｄｏｗｎ　ａｓｓａｙ）からの結果に類似して、ＧＡＬ−４−ＩＰＡＳおよびＶＰ１６−Ａｒｎｔは相互作用を示すことができなかった（図４ｄ）。
【００４２】
実施例１０：　ＩＰＡＳはＨＩＦ−１α／Ａｒｎｔ複合体のＤＮＡ結合活性を抑制する
ＩＰＡＳ／ＨＩＦ−１α複合体の機能を解明するために、ＨＲＥオリゴヌクレオチドプローブおよびｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳タンパク質を使用した電気泳動移動度シフト解析を実施した。ＩＰＡＳ／ＨＩＦ−１αへテロ二量体、並びにＨＩＦ−１αもしくはＩＰＡＳ自体はＨＲＥへ結合することに失敗した。従ってＩＰＡＳ／ＨＩＦ−１α複合体はＨＲＥの制御下で遺伝子の発現を媒介することにおいて不活性であると思われた。さらに、ＨＩＦ−１α／Ａｒｎｔ複合体のＤＮＡ結合活性はＩＰＡＳの共在によって抑制されたがコントロール翻訳産物によっては抑制されなかったので（図４ｅ）、これはＩＰＡＳ／ＨＩＦ−１α複合体がＨＩＦ−１α／Ａｒｎｔ　ＤＮＡ結合複合体より機能的に優勢である可能性を示している。
【００４３】
実施例１１：　角膜細胞内へのＩＰＡＳアンチセンスの導入はＶＥＧＦ遺伝子の発現および低酸素誘導性を刺激する
低酸素シグナル伝達および例えば角膜上皮内での強度の発現におけるＩＰＡＳの優勢な負の機能の有意性は何であるのか？正常角膜の顕著な特徴は完全無血管状態であり、角膜機能にとっては透明性の維持が不可欠である。眼を一晩閉鎖することによって、角膜環境は低酸素誘導遺伝子発現を刺激するのに十分な程度低酸素性となり得るが１３，１４、根底にある機序は解明されていないが角膜における血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）は通例阻止される。
【００４４】
ＩＰＡＳが低酸素応答性ＶＥＧＦ発現をダウンレギュレートするという事実を前提に、我々は角膜内における低酸素誘導性ＶＥＧＦ発現に及ぼすＩＰＡＳの作用を解明することを試みた。この目的のため、ＩＰＡＳレベルを操作するために、角膜上皮細胞の初代培養をアンチセンスＩＰＡＳ発現プラスミド（またはコントロール空ベクター）によりトランスフェクトし、低酸素刺激を行って、もしくは行わずに２４時間インキュベートし、その後ノーザンブロッティングによって肝臓癌細胞系と比較してＶＥＧＦ　ｍＲＮＡ発現をモニターした。肝臓癌細胞系は以前に証明された１０，１２ように低酸素処理によってＶＥＧＦの高レベル誘導を示した（図５）。これとは際立って対照的に、コントロールベクターでトランスフェクトされた角膜細胞はＶＥＧＦ発現の低い基礎レベルおよび低酸素による中等度の誘導を示したが、これは角膜血管新生の低プロファイルに対する機序を示している可能性がある。際立って、ＩＰＡＳアンチセンスの角膜細胞内への導入はＶＥＧＦ遺伝子の基礎発現および低酸素誘導性の両方を回復させ（図５）、これはＩＰＡＳが特に低酸素条件における角膜における血管新生性ＶＥＧＦ発現を鎮める際の重要な役割を有する可能性があることを示している。
【００４５】
参考文献
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４．ワン，ジー・エル（Ｗａｎｇ，　Ｇ．Ｌ．），ジァン，ビー・エイチ（Ｊｉａｎｇ，　Ｂ．Ｈ．），リュ，イー・エイ（Ｒｕｅ，　Ｅ．Ａ．）およびセメンツァ，ジー・エル（Ｓｅｍｅｎｚａ，　Ｇ．Ｌ．）　Ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　１　ｉｓ　ａ　ｂａｓｉｃ−ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ−ＰＡＳ　ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｏ２　ｔｅｎｓｉｏｎ（低酸素誘導因子１は細胞酸素分圧によって調節されるベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックスＰＡＳヘテロ二量体である）．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９２，　５５１０−５５１４（１９９５）．
５．エマ，エム（Ｅｍａ，　Ｍ．）ら．　Ａ　ｎｏｖｅｌ　ｂＨＬＨ−ＰＡＳ　ｆａｃｔｏｒ　ｗｉｔｈ　ｃｌｏｓｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ　ｔｏ　ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　１　ａｌｐｈａ　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｔｈｅ　ＶＥＧＦ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｓ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｌｕｎｇ　ａｎｄ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（低酸素誘導因子１αとの緊密な配列類似性を有する新規ｂＨＬＨ−ＰＡＳ因子はＶＥＧＦ発現を調節し、肺および血管の発生に関係している可能性がある）．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９４，　４２７３−４２７８（１９９７）．
６．カッリオ，ピー・ジェイ（Ｋａｌｌｉｏ，　Ｐ．Ｊ．），ウィルソン，ダブリュ・ジェイ（Ｗｉｌｓｏｎ，　Ｗ．Ｊ．），オブライエン，エス（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，　Ｓ．），マキノ，ワイ（Ｍａｋｉｎｏ，　Ｙ．）およびポーリンガー，エル（Ｐｏｅｌｌｉｎｇｅｒ，　Ｌ．）　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　１　ａｌｐｈａ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ　ｐａｔｈｗａｙ（ユビキチン−プロテアソーム経路による低酸素誘導転写因子１αの調節）．　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２７４，　６５１９−６５２５（１９９９）．　国際特許出願第００／２９４３７号も参照。
７．マックスウェル，ピー・エイチ（Ｍａｘｗｅｌｌ，　Ｐ．Ｈ．）ら．　Ｔｈｅ　ｔｕｍｏｕｒ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＶＨＬ　ｔａｒｇｅｔｓ　ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ｏｘｙｇｅｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ　［ｓｅｅ　ｃｏｍｍｅｎｔｓ］（腫瘍サプレッサータンパク質ＶＨＬは酸素依存性タンパク質分解のための低酸素誘導因子を標的とする［注釈を参照］）．　Ｎａｔｕｒｅ　３９９，　２７１−２７５（１９９９）．
８．ウィーセナー，エム・エス（Ｗｉｅｓｅｎｅｒ，　Ｍ．Ｓ．）ら．　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ＰＡＳ　ｄｏｍａｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ−１　ｂｙ　ｈｙｐｏｘｉａ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｗｉｔｈ　ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｆａｃｔｏｒ−１α（低酸素による内皮ＰＡＳドメインタンパク質１の誘導：特徴付けおよび低酸素誘導因子１αとの比較）．　Ｂｌｏｏｄ　９２，　２２６０−２２６８（１９９８）．
９．リ，エイチ（Ｌｉ，　Ｈ．），コ，エイチ・ピー（Ｋｏ，　Ｈ．Ｐ．）およびホィットロック，ジェイ・ピー（Ｗｈｉｔｌｏｃｋ，　Ｊ．Ｐ．）　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ　ｋｉｎａｓｅ　１　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｙ　ｈｙｐｏｘｉａ．　Ｒｏｌｅｓ　ｏｆ　Ａｒｎｔ　ａｎｄ　ＨＩＦ　１　ａｌｐｈａ（低酸素によるホスホグリセリン酸キナーゼ１遺伝子発現の誘導。ＡｒｎｔおよびＨＩＦ−１αの役割）．　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　２７１，　２１２６２−２１２６７（１９９６）．
１０．フォーシーズ，ジェイ・エイ（Ｆｏｒｓｙｔｈｅ，　Ｊ．Ａ．）ら．　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｂｙ　ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　１（低酸素誘導因子１による血管内皮細胞増殖因子遺伝子転写の活性化）．　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１６，　４６０４−４６１３（１９９６）．
１１．ポーリンガー，エル（Ｐｏｅｌｌｉｎｇｅｒ，　Ｌ．）　ｉｎ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　（誘導性遺伝子発現において）（編集：Ｂａｅｕｅｒｌｅ，　Ｐ．Ａ．）１７７−２０５（Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，　ボストン，１９９５）．
１２．グラディン，ケイ（Ｇｒａｄｉｎ，　Ｋ．）ら．　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｈｙｐｏｘｉａ　ａｎｄ　ｄｉｏｘｉｎ　ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ｐａｔｈｗａｙｓ：ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｒｎｔ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ（低酸素とジオキシン情報伝達経路の間の機能的干渉：Ａｒｎｔ転写因子の補充のための競合）．　Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１６，　５２２１−５２３１（１９９６）．
１３．サカー，エイ（Ｔｈａｋｕｒ，　Ａ．），ウィルコックス，エム・ディ（Ｗｉｌｌｃｏｘ，　Ｍ．Ｄ．）およびステイプルトン，エフ（Ｓｔａｐｌｅｔｏｎ，　Ｆ．）　Ｔｈｅ　ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ　ａｎｄ　ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ　ｔｅａｒｓ：　ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ（一晩を経過したヒト涙液中の炎症誘発性サイトカンおよびアラキドン酸代謝物；ホメオスタシス機序）．　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１８，６１−７０（１９９８）．
１４．サック，アール・エイ（Ｓａｃｋ，　Ｒ．Ａ．），ビートン，エイ・アール（Ｂｅａｔｏｎ，　Ａ．Ｒ．）およびセイス，エス（Ｓａｔｈｅ，　Ｓ．）　Ｄｉｕｒｎａｌ　ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｔｅａｒ　ｆｌｕｉｄ：ａ　ｐｏｓｓｉｂｌｅ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｒｎｅａｌ　ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ（ヒト涙液中のアンギオスタチンにおける日変化：角膜新生血管の阻止における潜在的役割）．　Ｃｕｒｒ．　Ｅｙｅ．　Ｒｅｓ　１８，　１８６−１９３（１９９９）．
１５．ラヴィ，アール（Ｒａｖｉ，　Ｒ．）ら．　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒ　ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｂｙ　ｐ５３−ｉｎｄｕｃｅｄ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　１α（低酸素誘導因子１αのｐ５３誘発性壊変による腫瘍血管新生の調節）．　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　１４，３４−４４（２０００）．
１６．ズンデル，ダブリュ（Ｚｕｎｄｅｌ，　Ｗ．）ら．　Ｌｏｓｓ　ｏｆ　ＰＴＥＮ　ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ　ＨＩＦ−１−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＰＴＥＮ損失はＨＩＦ−１媒介性遺伝子発現を促進する）．　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　１４，３９１−３９６（２０００）．
１７．リ，ジェイ（Ｌｉ，　Ｊ．）ら．　ＰＲ　３９，　ａ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｆ　ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ（血管新生のペプチド性制御因子）．　Ｎａｔ．　Ｍｅｄ．　６，４９−５５（２０００）．
１８．ノートン，ジェイ・ディ（Ｎｏｒｔｏｎ，　Ｊ．Ｄ．），ディード，アール・ダブリュ（Ｄｅｅｄ，　Ｒ．Ｗ．），クラッグス，ジー（Ｃｒａｇｇｓ，　Ｇ．）およびサブリツキー，エフ（Ｓａｂｌｉｔｚｋｙ，　Ｆ．）　Ｉｄ　ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（細胞増殖および分化におけるＩｄヘリックス・ループ・ヘリックスタンパク質）．　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　８，５８−６５（１９９８）．
１９．エディ，エス・アール（Ｅｄｄｙ，　Ｓ．Ｒ．）　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｕｓｉｎｇ　ｈｉｄｄｅｎ　Ｍａｒｋｏｖ　ｍｏｄｅｌｓ（隠れマルコフモデルを使用したマルチプル・アライメント）．　Ｉｓｍｂ　３，　１１４−１２０（１９９５）．
２０．カッリオ，ピー・ジェイ（Ｋａｌｌｉｏ，　Ｐ．Ｊ．）ら．　Ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｈｙｐｏｘｉｃ　ｃｅｌｌｓ：ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＣＢＰ／ｐ３００　ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｆａｃｔｏｒ−１　ａｌｐｈａ（低酸素細胞中の情報伝達：低酸素誘導因子−１αによるＣＢＰ／ｐ３００コアクチベーターの誘導性核移行および補充）．　Ｅｍｂｏ　Ｊ　１７，　６５７３−６５８６（１９９８）．
２１．バーティルソン，ジー（Ｂｅｒｔｉｌｓｓｏｎ，　Ｇ）ら．　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｈｕｍａｎ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｄｅｆｉｎｅｓ　ａ　ｎｅｗ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ　ｆｏｒ　ＣＹＰ３Ａ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ（ヒト核受容体の同定はＣＹＰ３Ａ誘導のための新規シグナル経路を規定する）．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ９５，　１２２０８−１２２１３（１９９８）．
【図面の簡単な説明】
【図１】
マウスＩＰＡＳ配列および発現。
（ａ）
マウスＩＰＡＳの推定アミノ酸配列。ベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス（ｂＨＬＨ）およびＰＡＳＡおよびＢのドメインを示した。
（ｂ）
ＩＰＡＳおよび低酸素誘導因子の構造的特徴の略図である。ｂＨＬＨおよびＰＡＳモチーフ内での各タンパク質のＩＰＡＳとの同一性率を示した。ｂＨＬＨ、ベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス；ＰＡＳ、Ｐｅｒ／Ａｒｎｔ／Ｓｉｍ；Ｎ−もしくはＣ−ＴＡＤ、Ｎ末端もしくはＣ末端転写活性化ドメイン。
（ｃ）
成熟マウス組織におけるＩＰＡＳ発現のノーザンブロット解析。種々の成熟マウス組織からのポリ（Ａ）＋　ＲＮＡ（４．５μｇ）を、３２Ｐ標識ＩＰＡＳ　ｃＤＮＡプローブを用いてハイブリダイズした。ＲＮＡマーカーの位置はｋｂ単位で右側に示した。
（ｄ）−（ｏ）
Ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析。成熟マウスの角膜（ｄ−ｇ）、網膜（ｈ−ｋ）、および小脳（ｌ−ｏ）の切片を、ｍＩＰＡＳ（ｄ，ｅ，ｈ，ｉ，ｌおよびｍ）またはｍＨＩＦ−１α（ｆ，ｇ，ｊ，ｋ，ｎおよびｏ）のアンチセンスＲＮＡプローブを用いてハイブリダイズした。明（ｄ，ｆ，ｈ，ｊ，ｌおよびｎ）および暗領域（ｅ，ｇ，ｉ，ｋ，ｍおよびｏ）を示した。Ｃ、角膜；Ｅｐ、上皮；Ｓ、固有質；ＬＥ、水晶体上皮；ＧＣ、顆粒細胞層；ＩＮＬ、内顆粒層；Ｒ＆Ｃ、桿状体および錐状体；Ｇ、顆粒層；Ｐ、プルキンエ細胞；Ｍ、分子層。
【図２】
ＩＰＡＳは低酸素誘導因子の優勢な負の調節因子である。
（ａ）
ＩＰＡＳはＨＲＥ駆動レポーター遺伝子を転写活性化しない。大量のＩＰＡＳ発現ベクター（ＣＭＶ　ＩＰＡＳ）をＨＲＥ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子と一緒にＨｅＬａ細胞内へコトランスフェクトした。細胞を正常酸素（２１％　Ｏ２）もしくは低酸素（１％　Ｏ２）状態のどちらかで２４時間インキュベートし、細胞のルシフェラーゼ発現を測定した。
（ｂ）、（ｃ）
ＩＰＡＳは低酸素誘導因子媒介性遺伝子発現を抑制する。ＩＰＡＳ発現ベクター、ＨＲＥ−ルシフェラーゼレポーター、およびＨＩＦ−１α（ｂ）もしくはＨＬＦ（ｃ）発現ベクター（各々、ＣＭＶ　ＨＩＦ−１αもしくはＣＭＶ　ＨＬＦ）をＨｅＬａ細胞内に導入した。正常酸素（２１％　Ｏ２）もしくは低酸素（１％　　Ｏ２）状態での２４時間に渡るインキューベンション後、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果は、レポーター遺伝子単独でトランスフェクトした細胞のルシフェラーゼ活性と比較した誘導倍率として表示した。平均値±ＳＤ（標準偏差）を示した。
（ｄ）
ＩＰＡＳはＨＩＦ−１αおよびＨＬＦタンパク質レベルに影響を及ぼさない。ＨｅＬａ細胞をＦＬＡＧ−タグ付きＩＰＡＳ発現プラスミド（１．０μｇ／２１．５ｃｍ２　ｄｉｓｈ）でトランスフェクトし、６時間に渡り低酸素に暴露させた。全細胞抽出物（５０μｇ）を調製し、本質的にはＨＩＦ−１α（ノーバス［Ｎｏｖｕｓ］社製）、ＨＬＦ（ノーバス［Ｎｏｖｕｓ］社製）、およびＦＬＡＧエピトープ（シグマ［Ｓｉｇｍａ］社製）に対する抗体類を使用して、以前に報告されたように６、イムノブロット解析を受けさせた。
【図３】
ＩＰＡＳは特異的に低酸素誘導ｍＲＮＡ発現を減弱させる。
（ａ）
低酸素誘導遺伝子発現はＩＰＡＳ過剰発現細胞中では損なわれている。野生型（Ｈｅｐａｌｃ１ｃ７）もしくはＩＰＡＳ−安定的トランスフェクトされた（Ｈｅｐａ　ＩＰＡＳ）マウス肝臓癌細胞系を正常酸素（Ｎ）もしくは低酸素（Ｈ）状態のどちらかで２４時間に渡って培養した。細胞からポリ（Ａ）＋ＲＮＡを単離し、放射標識マウスＩＰＡＳ、ＰＧＫ１、ＶＥＧＦおよび指標としてβ−アクチンｃＤＮＡプローブを用いてハイブリダイズした。
（ｂ）
転写レベルでのＩＰＡＳによる低酸素誘導遺伝子発現の抑制。ＨＲＥルシフェラーゼレポーターはＨＩＦ−１α発現ベクターとともに、もしくは、なしに、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７もしくはＨｅｐａＩＰＡＳ細胞内へトランスフェクトした。細胞は２１％もしくは１％のＯ２濃度のどちらかの条件下で培養し、ルシフェラーゼアッセイを受けさせた。レポーター遺伝子単独でトランスフェクトしたＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞のルシフェラーゼ含量をコントロールとして使用し、結果はコントロールと比較した誘導倍率として示した。
（ｃ）
ＩＰＡＳはＨＩＦ−１α／Ａｒｎｔ複合体のＨＲＥへの結合を抑制する。正常酸素もしくは低酸素のＨｅｐａ１ｃ１ｃ７およびＨｅｐａＩＰＡＳ細胞からの核抽出液を３２Ｐ標識ＨＲＥオリゴヌクレオチドプローブを使用するＥＭＳＡによって解析した。星印は核抽出液中の構成的な（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）ＨＲＥ結合活性の位置を示しており、矢印は低酸素誘導ＨＩＦ−１α／Ａｒｎｔ−ＤＮＡ複合体の位置を示している１２。非標識ＨＲＥ（Ｓ）もしくは非関連配列（ＮＳ）による競合アッセイおよび抗ＨＩＦ−１α抗体および抗Ａｒｎｔ抗体によるスーパーシフト形成を示した。
（ｄ）
ＩＰＡＳはドキシン誘導遺伝子発現に影響を及ぼさない。Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７およびＨｅｐａＩＰＡＳ細胞はＴＣＤＤ（１０ｎＭ）で、もしくは、なしで、２４時間かけて処理し、細胞からのポリ（Ａ）＋　ＲＮＡを３２Ｐ標識マウスＣＹＰ１Ａ１、ＩＰＡＳおよびβ−アクチンｃＤＮＡプローブを用いてハイブリダイズした。
（ｅ）
ＩＰＡＳはＴＣＤＤ媒介ＸＲＥレポーター遺伝子発現に影響を及ぼさない。Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７およびＨｅｐａＩＰＡＳ細胞をＸＲＥレポータープラスミドでトランスフェクトし、ＴＣＤＤ存在下もしくは不在下での２４時間のインキュベーション後に、ルシフェラーゼ活性をモニターした。結果は、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞のリガンドフリーコントロールと比較したルシフェラーゼ活性の誘導倍率として表示した。平均値±ＳＤ（標準偏差）を示した。
【図４】
ＩＰＡＳは非機能的複合体を形成するためにＨＩＦ−１αを標的とする。
（ａ）
ＩＰＡＳはＨＩＦ−１αと物理的に相互作用する。Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳されたＧＳＴ−ＩＰＡＳもしくはＧＳＴを３５Ｓ標識ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳ＡｒｎｔもしくはＨＩＦ−１αと混合し、抗ＧＳＴ抗体を用いた免疫沈降反応を実施した。沈降物はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、その後オートラジオグラフィーにかけた。ローディングコントロールとして、１０％のインプットＡｒｎｔおよびＨＩＦ−１αが示された。
（ｂ）
ＨＩＦ−１αのＮ−末端構造はＩＰＡＳとのヘテロ二量体化のために不可欠である。３５Ｓ標識ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳ＩＰＡＳをＨＩＦ−１αの様々なフラグメントのＧＡＬ４−融合物と一緒にインキュベートし、抗ＧＡＬ４抗体もしくは免疫前コントロール血清のどちらかで免疫沈降させた。沈降した分画はＳＤＳ　ＰＡＧＥによって解析し、結果はオートラジオグラフィーによって入手した。インプットＩＰＡＳの１０％をコントロールとして示した。
（ｃ）、（ｄ）
ＩＰＡＳおよびＨＩＦ−１α間のｉｎ　ｖｉｖｏ相互作用。ＣＯＳ７細胞は、指標としての、ＧＡＬ４−駆動レポーター遺伝子と共に、ＧＡＬ４−ＨＩＦ−１α／１−３３０およびＶＰ１６−ＩＰＡＳ（ｃ）またはＧＡＬ４−ＩＰＡＳおよびＶＰ１６−Ａｒｎｔ（ｄ）に対する様々な量の発現ベクターでトランスフェクトされた。２４時間のインキュベーション後、細胞のルシフェラーゼ活性を測定した。結果は、レポーター遺伝子単独でトランスフェクトした細胞のルシフェラーゼ含量と比較した誘導倍率として表示した。
（ｅ）
ＩＰＡＳ／ＨＩＦ−１αへテロ二量体はＨＲＥへ結合できない。様々な組み合わせのｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳ＩＰＡＳ、ＨＩＦ−１α、およびＡｒｎｔ、または指標として非定型的（ｕｎｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ）網状赤血球ライセートを３２Ｐ標識ＨＲＥオリゴヌクレオチドプローブと混合し、タンパク質ＤＮＡ複合体形成をＥＭＳＡによってモニターした。結果はオートグラフィーによって可視化した。
【図５】
角膜上皮細胞中の血管新生増殖因子の産生をサイレンシングすることにおけるＩＰＡＳの関与。
マウス角膜上皮細胞の初代培養をアンチセンスＩＰＡＳ発現プラスミドもしくは空ベクター（ベクター）のどちらかでトランスフェクトし、正常酸素（Ｎ、２１％　Ｏ２）または低酸素（Ｈ、１％　Ｏ２）条件下で２４時間インキュベートした。細胞から全ＲＮＡｓを抽出し、放射標識マウスＶＥＧＦｃＤＮＡプローブを使用したノーザンブロット解析を実施した。全ＲＮＡ形正常酸素および低酸素Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞はＶＥＧＦ誘導のための参照として供された。ローディングコントロールとして、１８ＳＲＮＡレベルが示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年7月19日(2002.7.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記から選択される単離核酸分子：
（ａ）配列番号２で示されるヌクレオチド配列を有する核酸分子；
（ｂ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）に定義された核酸分子のポリペプチドコード領域に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができ、さらに生物学的に活性な哺乳動物ＩＰＡＳポリペプチドまたはそれの機能的に等価な改変形態をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子；および
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）に定義されたヌクレオチド配列への遺伝暗号の結果として縮重しており、さらに生物学的に活性な哺乳動物ＩＰＡＳポリペプチドまたはそれの機能的に等価な改変形態をコードする核酸配列を有する核酸分子。
【請求項２】
請求項１記載の核酸分子によってコードされる単離哺乳動物ＩＰＡＳポリペプチド。
【請求項３】
配列表における配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する請求項２記載の単離哺乳動物ＩＰＡＳポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に定義された核酸配列を備えるベクター。
【請求項５】
請求項１に定義された核酸配列を担持していてその発現を媒介できる複製型発現ベクター。
【請求項６】
請求項４または５記載のベクターを宿す培養宿主細胞。
【請求項７】
哺乳動物ＩＰＡＳポリペプチドを産生するためのプロセスであって、それにより前記ポリペプチドが産生する条件下で請求項６記載の宿主細胞を培養する工程と、前記ポリペプチドを回収する工程とを備えるプロセス。
【請求項８】
哺乳動物ＩＰＡＳ核酸分子の発現を活性化させるために有用な物質を同定するための、下記の工程を備える方法：
（ｉ）候補物質を請求項１記載の哺乳動物ＩＰＡＳヌクレオチド酸分子と接触させる工程；および
（ｉｉ）前記候補物質が前記哺乳動物ＩＰＡＳ核酸分子の発現を活性化させるかどうかを判定する工程。
【請求項９】
血管新生および／または腫瘍増殖を抑制するために有用な物質を同定するための、下記の工程を備える方法：
（ｉ）候補物質を請求項１記載の哺乳動物ＩＰＡＳヌクレオチド酸分子と接触させる工程；および
（ｉｉ）前記候補物質が前記哺乳動物ＩＰＡＳヌクレオチド配列の発現を活性化させるかどうかを判定する工程であって、前記活性化が血管新生および／または腫瘍増殖を抑制するために有用な物質の指標となる工程。
【請求項１０】
哺乳動物ＩＰＡＳポリペプチドの生物学的活性を刺激するために有用な物質を同定するための、下記の工程を備える方法：
（ｉ）候補物質を請求項２または３記載の哺乳動物ＩＰＡＳポリペプチドと接触させる工程；および
（ｉｉ）前記候補物質が前記ポリペプチドの生物学的活性を刺激するかどうかを判定する工程。
【請求項１１】
血管新生および／または腫瘍増殖を抑制するために有用な物質を同定するための、下記の工程を備える方法：
（ｉ）候補物質を請求項２または３記載の哺乳動物ＩＰＡＳポリペプチドと接触させる工程；および
（ｉｉ）前記候補物質が前記ポリペプチドの生物学的活性を刺激するかどうかを判定する工程であって、前記刺激が血管新生および／または腫瘍増殖に関連する医学的状態の治療のために有用な物質の指標となる工程。
【請求項１２】
血管新生性疾患または腫瘍増殖を治療するための薬剤の製造における請求項８〜１１のいずれか１項記載の方法によって同定された物質の使用。
【請求項１３】
請求項８〜１１のいずれか１項記載の方法によって同定された物質の有効量を対象者に投与することを備える血管新生性疾患または腫瘍増殖を治療するための方法。
【請求項１４】
前記血管新生性疾患が虚血性心血管性傷害、脳卒中または糖尿病性微小血管疾患に関連している請求項１２または１３記載の使用または方法。
【国際調査報告】
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