(57)【要約】本発明は、ＡＢＣＣ１１遺伝子の様々なエクソンに対応する核酸、ならびに新規な完全長のＡＢＣＣ１１タンパク質をコードするｃＤＮＡに関する。本発明は、ＡＢＣＣ１１遺伝子中またはＡＢＣＣ１１遺伝子の対立遺伝子によって産生される対応するタンパク質中の一般に多型、特に突然変異を検出するための手段にも関する。
2004531241.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜３０のいずれか１つまたはその相補的なヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項２】
配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列のうち、少なくとも８個の連続したヌクレオチドを含む単離された核酸。
【請求項３】
配列番号１〜３０のいずれか１つまたはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸と、少なくとも８０％のヌクレオチドが同一である単離された核酸。
【請求項４】
核酸が、配列番号１〜３０のいずれか１つまたはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸と、８５％、９０％、９５％、または９８％のヌクレオチドが同一である、請求項３に記載の単離された核酸。
【請求項５】
配列番号１〜３０のいずれか１つまたはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸と、厳密性の高い条件下でハイブリッドを形成する単離された核酸。
【請求項６】
配列番号１〜３０のいずれか１つにおいて示されるヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項７】
配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列のうち、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む、ＡＢＣＣ１１遺伝子に特異的なヌクレオチド・プローブまたはヌクレオチド・プライマー。
【請求項８】
配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含む、ＡＢＣＣ１１遺伝子に特異的なヌクレオチド・プローブまたはヌクレオチド・プライマー。
【請求項９】
ａ）増幅反応に必要な試薬の存在下で、第１のヌクレオチド・プライマーが核酸領域の５’の位置でハイブリッドを形成し、第２のヌクレオチド・プライマーが核酸領域の３’の位置でハイブリッドを形成する２つのヌクレオチド・プライマーと核酸を接触させること、および
ｂ）増幅した核酸領域を検出すること
を含む請求項１に記載の核酸の領域を増幅する方法。
【請求項１０】
２つのヌクレオチド・プライマーが、
ａ）配列番号１〜２９のいずれか１つのヌクレオチド配列または相補的なヌクレオチド配列のうち、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド・プライマー、
ｂ）請求項７〜９のいずれか一項に記載のヌクレオチド・プライマー、
ｃ）配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的な配列を有する核酸を含むヌクレオチド・プライマー
からなる群から選択される請求項１に記載の核酸の領域を増幅する方法。
【請求項１１】
ａ）そのハイブリダイゼーション位置が核酸領域のそれぞれ５’および３’に位置する２つのヌクレオチド・プライマーと、場合によって、
ｂ）増幅反応に必要な試薬
とを含む請求項１に記載の核酸を増幅するためのキット。
【請求項１２】
２つのヌクレオチド・プライマーが、
ａ）配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列または相補的なヌクレオチド配列のうち、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド・プライマー、
ｂ）請求項７〜９のいずれか一項に記載のヌクレオチド・プライマー、
ｃ）配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的な配列を有する核酸を含むヌクレオチド・プライマー
からなる群から選択される請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
マーカー化合物を含む、請求項７〜９のいずれかに記載のヌクレオチド・プローブまたはヌクレオチド・プライマー。
【請求項１４】
ａ）１）配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列のうち、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド・プローブ、
２）請求項７〜９のいずれか一項に記載のヌクレオチド・プライマー、
３）配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含むヌクレオチド・プローブ
からなる群から選択されるヌクレオチド・プローブと核酸を接触させること、および
ｂ）核酸とプローブで形成される複合体を検出すること
を含む請求項１に記載の核酸を検出する方法。
【請求項１５】
プローブが担体上に固定されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ａ）１）配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列または相補的なヌクレオチド配列のうち、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド・プローブ、
２）請求項７〜９のいずれか一項に記載のヌクレオチド・プライマー、
３）配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含むヌクレオチド・プローブ
からなる群から選択されるヌクレオチド・プローブと、場合により、
ｂ）ハイブリダイゼーション反応に必要な試薬
とを含む請求項１に記載の核酸を検出するためのキット。
【請求項１７】
プローブが担体上に固定されている、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
請求項１に記載の核酸を含む組換えベクター。
【請求項１９】
ベクターがアデノウイルスである、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載の組換えベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１に記載の核酸を含む組換え宿主細胞。
【請求項２２】
配列番号３１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項２３】
請求項２２に記載の核酸を含む組換えベクター。
【請求項２４】
請求項２２に記載の核酸を含む組換え宿主細胞。
【請求項２５】
請求項２３に記載の組換えベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項２６】
ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｂ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチド断片またはポリペプチド変異体、および
ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むポリペプチドに相同的なポリペプチド
からなる群から選択される単離されたポリペプチド。
【請求項２７】
請求項２６に記載の単離されたポリペプチドに対する抗体。
【請求項２８】
抗体が検出可能な化合物を含む、請求項２７に記載の抗体。
【請求項２９】
ａ）ポリペプチドを請求項２７に記載の抗体と接触させること、および
ｂ）ポリペプチドと抗体で形成された抗原／抗体複合体を検出すること
を含むポリペプチドを検出する方法。
【請求項３０】
ａ）請求項２７に記載の抗体と、
ｂ）ポリペプチドと抗体で形成された抗原／抗体複合体の検出を可能にする試薬
とを含むポリペプチドを検出するための診断キット。
【請求項３１】
請求項１に記載の核酸と、生理的に適合する賦形剤とを含む薬剤組成物。
【請求項３２】
請求項１８に記載の組換えベクターと、生理的に適合する賦形剤とを含む薬剤組成物。
【請求項３３】
発作性運動誘発性舞踏アテトーゼに罹った患者の予防用および／または治療用薬剤を製造するための請求項１に記載の核酸の使用。
【請求項３４】
発作性運動誘発性舞踏アテトーゼに罹った患者の予防用および／または治療用薬剤を製造するための請求項２１に記載の組換えベクターの使用。
【請求項３５】
発作性運動誘発性舞踏アテトーゼに罹った患者の予防用／または治療用薬剤を製造するための、配列番号３１のアミノ酸配列を含む単離されたＡＢＣＣ１１ポリペプチドの使用。
【請求項３６】
配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、生理的に適合する賦形剤とを含む薬剤組成物。
【請求項３７】
発作性運動誘発性舞踏アテトーゼの予防用または治療用の活性成分をスクリーニングするための、配列番号３１のアミノ酸配列を含む単離されたＡＢＣＣ１１ポリペプチドの使用。
【請求項３８】
発作性運動誘発性舞踏アテトーゼの予防用または治療用の活性成分をスクリーニングするための、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＡＢＣＣ１１ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞の使用。
【請求項３９】
ａ）少なくとも１つのＡＢＣＣ１１ポリペプチドと検出可能なマーカーを含む基質とを含む膜小胞を調製すること、
ｂ）ステップａ）で得た小胞を作用薬または拮抗薬の候補化合物とインキュベートすること、
ｃ）検出可能なマーカーを含む基質の放出量を定性的かつ／または定量的に測定すること、および
ｄ）作用薬または拮抗薬の候補化合物とともにまだインキュベートしていない膜小胞による標識基質放出の測定値と、ステップｂ）で測定した基質の放出量とを比較すること
を含むＡＢＣＣ１１ポリペプチドの作用薬または拮抗薬をスクリーニングする方法。
【請求項４０】
ａ）検出可能なマーカーで標識した陰イオンを含むＡＢＣＣ１１ポリペプチドを発現する細胞をインキュベートすること、
ｂ）ステップａ）の細胞を洗浄して細胞中に侵入していない過剰の標識陰イオンを除去すること、
ｃ）ステップｂ）で得た細胞をＡＢＣＣ１１ポリペプチドの作用薬または拮抗薬の候補化合物とともにインキュベートすること、
ｄ）細胞からの標識陰イオンの流出量を測定すること、および
ｅ）作用薬または拮抗薬の候補化合物とともにまだインキュベートしていない細胞で測定した標識陰イオンの流出量と、ステップｄ）で測定した標識陰イオンの流出量とを比較すること
を含むＡＢＣＣ１１ポリペプチドの作用薬または拮抗薬をスクリーニングする方法。
【請求項４１】
請求項２４または２５に記載の組換え宿主細胞を含む移植片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＢＣＣ１１遺伝子に対応する新規な核酸、および新規なＡＢＣＣ１１タンパク質をコードするｃＤＮＡに関する。本発明は、ＡＢＣＣ１１遺伝子における、またはＡＢＣＣ１１遺伝子の対立遺伝子形（ａｌｌｅｌｉｃ  ｆｏｒｍｓ）によって産生される対応するタンパク質における一般には多型を、とりわけ突然変異を検出するための手段にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＴＰ結合領域（ＡＢＣ）輸送体スーパーファミリーは、最大の遺伝子ファミリーの１つであり、膜を通る多種多様な物質のエネルギー依存性輸送に関わる機能的に多様な膜タンパク質グループをコードしている（Ｄｅａｎ等、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ、１９９５、５、７７９〜８５）。活性な輸送体タンパク質は、細菌からヒトへの進化の過程で極めて良好に保存されているタンパク質ファミリーを構成している（ＡｍｅｓおよびＬｅｃａｒ、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、１９９２、６、２６６０〜２６６６）。ＡＢＣタンパク質は、様々な物質、例えば、イオン、アミノ酸、ペプチド、糖、ビタミン、またはステロイド・ホルモンの細胞外および細胞内の膜輸送に関与している。特徴が明らかな４０個のヒトのメンバーのうち１１個のメンバーは、ヒトの疾患に付随すると記述されており、なかでもＡＢＣＡ１、ＡＢＣＡ４（ＡＢＣＲ）およびＡＢＣＣ７（ＣＦＴＲ）はそれぞれタンジール病（Ｂｏｄｚｉｏｃｈ  Ｍ等、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９９、２２（４）；３４７〜３５１；Ｂｒｏｏｋｓ−Ｗｉｌｓｏｎ等、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、１９９９、２２（４）、３３６〜３４５；Ｒｕｓｔ  Ｓ等、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９９、２２、３５２〜３５５；Ｒｅｍａｌｅｙ  Ａ  Ｔ等、）、スタガルト病（Ｌｅｗｉｓ  Ｒ  Ａ等、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９９、６４、４２２〜４３４）、および嚢胞性線維症（Ｒｉｏｒｄａｎ  ＪＭ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９、２４５、１０６６〜１０７３）に関与していると考えられている。これらの意味するところは、ＡＢＣ遺伝子ファミリーが機能的に重要な役割を果たしているということであり、新しい遺伝子ファミリー・メンバーの発見は、ヒト疾患の生理病理学に新たな洞察を与えるはずである。
【０００３】
プロトタイプのＡＢＣタンパク質はＡＴＰと結合し、ＡＴＰの加水分解エネルギーを使用して様々な分子の細胞膜を通る輸送を駆動している。真核生物に由来するほとんどのＡＢＣ機能性タンパク質は、完全輸送体（ｆｕｌｌ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）をコードしており、それぞれが２つのＡＴＰ結合領域（ヌクレオチド結合性フィールド、ＮＢＦ）および２つの膜貫通（ＴＭ）領域からなっている。完全な輸送体のほとんどは、ＴＭ−ＮＢＦ−ＴＭ−ＮＢＦの形で配列している（Ｄｅａｎ等、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ、１９９５、５、７９〜７８５）。
【０００４】
ＡＴＰ結合領域のアミノ酸配列を解析することによって、ＡＢＣ遺伝子をサブファミリーに分類できるようになった（Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ等、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ、１９９６、５、１６４９〜１６５５）。現在、最近のＨＵＧＯの分類によれば、ヒトゲノムではＡＢＣ  ＡからＡＢＣ  Ｇと命名された７つのＡＢＣ遺伝子サブファミリー、すなわち、ＡＢＣＡ（ＡＢＣ１サブファミリー）、ＡＢＣＢ（ＭＤＲ／ＴＡＰサブファミリー）、ＡＢＣＣ（ＣＦＴＲ／ＭＲＰサブファミリー）、ＡＢＣＤ（ＡＬＤサブファミリー）、ＡＢＣＥ（ＯＡＢＰサブファミリー）、ＡＢＣＦ（ＧＣＮ２０サブファミリー）、およびＡＢＣＧ（白色（ｗｈｉｔｅ）サブファミリー）が記載されている。これらのサブファミリーの大多数は、膜貫通領域の配列中にかなり保存されていることも示す、類似の遺伝子構成（ｇｅｎｅ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）を有する遺伝子を含む。しかし、ＡＢＣタンパク質は極めて多様な物質を輸送し、いくつかの異なるサブファミリーのメンバー同士が、同じサブファミリー内のタンパク質同士よりも基質の認識において高い類似性を互いに有することが示された。このサブファミリーのうち５つは、酵母のゲノム中にもあることから、これらのグループが真核生物の進化の初期に存在し、維持されてきたことがわかる（Ｄｅｃｏｔｔｉｇｎｉｅｓ等、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、１９９７、１３７〜４５；Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ等、１９９５、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。
【０００５】
ヒトにおいて同定された数個のＡＢＣ輸送タンパク質は、様々な疾患に関連している。腫瘍細胞における多剤耐性の表現型のいくつかは、やはりＡＢＣ輸送体構造を有するＭＤＲ（多剤耐性）タンパク質をコードする遺伝子に関連している。別のＡＢＣ輸送体は、ニューロンおよび腫瘍の病態に関連し（米国特許第５,８５８,７１９号）、あるいは金属のホメオスタシス異常によって引き起こされる疾患に関与している可能性がある（Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９９９  Ｄｅｃ  ６；１４６１（２）：１８〜４０４）。
【０００６】
ヒトＡＢＣＣサブファミリーは、現在、同定された１０種のメンバー（ＡＢＣＣ１〜１０）を有し、このうち７種は多剤耐性様（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ｌｉｋｅ）（ＭＲＰ）サブグループに由来し、２種はスルホニル尿素受容体（ＳＵＲ）サブグループに由来し、１種はＣＦＴＲ遺伝子である。ＭＲＰ様タンパク質は、有機陰イオン輸送体である。すなわち、ＭＲＰ様タンパク質は、例えばメトトレキセート（ＭＴＸ）などの陰イオン性薬物、ならびにグルタチオン（ＧＳＨ）、グルクロナート、サルフェートなど酸性リガンドと結合する中性薬物を輸送し、ヌクレオシド・アナログに対する耐性にある役割を果たしている（Ｃｕｉ等、Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、１９９９、５５、９２９〜３７；Ｋｏｏｌ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、１９９９、９６、６９１４〜９；Ｓｃｈｕｅｔｚ等、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、１９９９、５、１０４８〜５１；Ｗｉｊｎｈｏｌｄｓ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、２０００、９７、７４７６〜８１）。より具体的には、ＡＢＣＣ１、ＡＢＣＣ２、およびＡＢＣＣ３は、ＧＳＨ、グルクロナート、サルフェート、およびＭＴＸなど他の有機陰イオンに結合する薬物を輸送し、一方、ＡＢＣＣ４およびＡＢＣＣ５タンパク質は、ＰＭＥＡを含めたヌクレオチド・アナログおよびプリン塩基アナログに対する耐性を付与する。いくつかのＡＢＣＣサブファミリー・メンバーにおけるいくつかの遺伝的変異は、ヒトの様々な遺伝病に関連することが確認された。例えば、嚢胞性線維症は、ＡＢＣＣ７遺伝子、すなわちＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子）遺伝子の突然変異によって引き起こされる（Ｒｉｏｒｄａｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９、２４５、１０６６〜７３）。ＡＢＣＣサブファミリーの別のメンバーであるＡＢＣＣ２遺伝子は、デュビン・ジョンソン症候群に関連がある（Ｗａｄａ等、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ、１９９８、７、２０３〜７）。また、最近、ＡＢＣＣサブファミリーに属する別の遺伝子であるＡＢＣＣ６遺伝子のコード配列における突然変異が、結合組織の遺伝的障害である弾力線維性仮性黄色腫の表現型の原因であることが確認された（Ｂｅｒｇｅｎ等、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、２０００、２５、２２８〜３１；Ｌｅ  Ｓａｕｘ等、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、２０００、２５、２２３〜７）。同様に、スルホニル尿素受容体であるＡＢＣＣ８すなわちＳＵＲ１は、乳児期の家族性持続性高インシュリン性低血糖症（ｆａｍｉｌｉａｌ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎｅｍｉｃ  ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉａ）に関与していると考えられる（Ｔｈｏｍａｓ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５、２６８、４２６〜９）。
したがって、ＡＢＣＣサブファミリーに由来する新しい遺伝子の特徴を決定することによって、トランスロカーゼ活性を有し、ヒトの病理に主要な役割を果たし得る生物学的に重要な輸送体が得られる可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本出願人らは、ＡＢＣＣタンパク質サブファミリーに属し、ＡＢＣＣ１１と命名された新規な遺伝子を発見しその特徴を明らかにした。また、この新たに発見した遺伝子は、アミノ酸配列、特に膜貫通領域（ＴＭ）およびＡＴＰ結合領域（ＮＢＤ）内のアミノ酸配列がかなり保存されており、類似の遺伝子構成を有する。特に、この遺伝子は、ＡＢＣＣ５、ＡＢＣＣ２、およびＡＢＣＣ３など他のＡＢＣＣサブファミリー・メンバーに、具体的にはＡＴＰ結合ドメインにおいて、より具体的にはＣ末端ＡＴＰ結合ドメインにおいて密接に関係していると思われる。ＡＢＣＣ１１タンパク質は、ＡＢＣＣ４およびＡＢＣＣ５と同様、他のよく知られたサブグループのメンバーであるＡＢＣＣ１（ＭＲＰ１）よりも小さく、余分のＮ末端ドメインを欠いていると考えられるが（Ｂｏｒｓｔ等、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ、２０００、９２、１２９５〜３０２）、これは輸送機能には不要である（Ｂａｋｏｓ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、１９９８、２７３、３２１６７〜７５）。構造的に類似したＡＢＣタンパク質は、膜を通して類似した物質を輸送することが多いので、ＡＢＣＣ１１タンパク質がＡＢＣＣ４遺伝子および／またはＡＢＣＣ５遺伝子と機能的類似性、すなわち、ＰＭＥＡなどのヌクレオチド・アナログおよびプリン塩基アナログに対する耐性を有すると考えることは理に適っている（Ｓｃｈｕｅｔｚ等、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、１９９９  ５、１０４８〜５１；Ｗｉｊｎｈｏｌｄｓ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、２０００、９７、７４７６〜８１）。
【０００８】
また、本出願人らは、新規な遺伝子ＡＢＣＣ１１を、ヒト１６番染色体の１６ｑ１２遺伝子座にある領域に位置づけた。この領域は、発作性運動誘発性ジスキネジー（ｐａｒｏｘｙｓｍａｌ  ｋｉｎｅｓｉｇｅｎｉｃ  ジスキネジー）（ＰＫＤ）、すなわち発作性運動誘発性舞踏アテトーゼ（ＰＫＣ）（Ｔｏｍｉｔａ等、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ、１９９９、６５、１６８８〜９７；Ｂｅｎｎｅｔｔ等、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、２０００、５４、１２５〜１３０）、および発作性舞踏アテトーゼを伴う乳児けいれん、すなわちＩＣＣＡ症候群（Ｌｅｅ等、１９９８、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔ、１０３、６０８〜６１２）と一般に称される２つの遺伝的病理と統計上関連している領域である。これらの結果は、発作性運動誘発性舞踏アテトーゼおよび／または発作性舞踏アテトーゼを伴う乳児けいれんなどの発作性障害に対しヒト１６番染色体上の候補位置にＡＢＣＣ１１があるという仮説を支持するものである。
【０００９】
発作性ジスキネジーの中で最も多いタイプである発作性運動誘発性舞踏アテトーゼ（ＰＫＣ）は、突然の随意運動、ストレス、または興奮によって誘発される、舞踏病および筋緊張異常を含めた反復性で頻繁な不随意運動および不随意姿勢の発作によって特徴づけられる障害である（Ｓｗｏｂｏｄａ等、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、２０００、５５、２２４〜３０）。その発症は小児期または青年期初期であり、その頻度と重症度は年齢とともに減弱し、抗けいれん薬を用いた治療が効く。ＰＫＣは、家族性で散発的に起こり、女性よりも男性で多く発症する。これは、大部分の家族において、不完全浸透度の常染色体優性形質として遺伝する。この遺伝子座は、ヒト染色体１６ｑ１１〜ｑ１２に位置づけられている（Ｔｏｍｉｔａ等（１９９９）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６５、１５８８〜１６９７；Ｂｅｎｎｅｔｔ等（２０００）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５４、１２５〜１３０）。
【００１０】
重複する遺伝子座は、発作性舞踏アテトーゼを伴う乳児けいれん（ＩＣＣＡ）の遺伝子を含むと予想されている（Ｌｅｅ等（１９９８）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１０３、６０８〜６１２）。ＩＣＣＡ症候群は、ヒト１６番染色体の動原体周囲領域に関連する神経性の症候群であり、自発的に起こるか様々な刺激によって誘発される不随意運動障害および発作を特徴とする。
さらに、本出願人らは、ＡＢＣＣ１１遺伝子の発現パターンをＰＣＲおよびＥＳＴデータベース・マイニングによって決定した。それによれば、ＡＢＣＣ１１遺伝子は、ＰＫＣの病因に関わっている可能性があるＣＮＳや筋肉などの組織中で発現することが示唆される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、システイニル・ロイコトリエンなどの有機陰イオン輸送体、メトトレキセートなどの陰イオン性薬物、ならびにグルタチオン（ＧＳＨ）、グルクロナート、サルフェートなど酸性リガンドに結合する中性薬物の輸送に、あるいはその染色体候補領域が１６番染色体、より正確には１６ｑ腕、さらに正確には発作性運動誘発性舞踏アテトーゼに対する１６ｑ１２遺伝子座に位置する病理に関与している可能性が高いヒトＡＢＣＣ１１遺伝子の核酸に関する。
したがって、本発明の第１の主題は、配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸である。
本発明は、配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列のうち、少なくとも８個の連続したヌクレオチドを含む核酸にも関する。
本発明は、配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸と、少なくとも８０％のヌクレオチドが同一である核酸にも関する。
本発明は、配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸と、少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％のヌクレオチドが同一である核酸にも関する。
本発明は、配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列と、厳密性の高い条件下でハイブリッド形成する核酸にも関する。
【００１２】
本発明は、完全長ヒトＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする核酸、特にｃＤＮＡ分子にも関する。したがって、本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
本発明は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸にも関する。
本発明によれば、配列番号３１のアミノ酸配列を含む１３８２アミノ酸の完全長ＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードする配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸が見出された。
したがって、本発明は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸にも関する。
したがって、本発明は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むポリペプチドにも関する。
本発明は、配列番号３１のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドにも関する。
【００１３】
本発明は、ＡＢＣＣ１１遺伝子における、またはこれらの遺伝子の対立遺伝子によって産生される対応するタンパク質における一般には多型、とりわけ突然変異を検出するための手段にも関する。
本発明は、別の一態様によれば、例えば１個または複数のヌクレオチドの置換、付加、欠失など少なくとも１つの二多型性（ｂｉａｌｌｅｌｉｃ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を含むＡＢＣＣ１１遺伝子のヌクレオチド配列にも関する。
【００１４】
ＡＢＣＣ１１核酸領域に位置する核酸配列、特に突然変異または多型のいずれか１つを含む核酸配列とハイブリッドを形成するヌクレオチド・プローブまたはヌクレオチド・プライマー（ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、ｃＤＮＡ）が見出された。
【００１５】
本発明によるヌクレオチド・プローブまたはヌクレオチド・プライマーは、配列番号１〜３０のいずれか１つを含む核酸またはその相補的なヌクレオチド配列のうち、少なくとも８個の連続したヌクレオチドを含む。
本発明によるヌクレオチド・プローブまたはヌクレオチド・プライマーは、本発明による核酸、特に配列番号１〜３０のいずれか１つを含む核酸またはその相補的なヌクレオチド配列の１０、１２、１５、１８または２０〜２５、３５、４０、５０、７０、８０、１００、２００、５００、１０００、１５００の連続したヌクレオチド長を有することが好ましい。
あるいは、本発明によるヌクレオチド・プローブまたはヌクレオチド・プライマーは、本発明による核酸、特に配列番号１〜３０のいずれか１つを含む核酸またはその相補的なヌクレオチド配列の１２、１５、１８、２０、２５、３５、４０、５０、１００、２００、５００、１０００、１５００の連続したヌクレオチド長を含む断片からなりかつ／またはこれらを含む。
したがって、本発明によるヌクレオチド・プローブまたはヌクレオチド・プライマーの定義は、先に定義した厳密性の高いハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１〜３０のいずれか１つを含む核酸またはその相補的なヌクレオチド配列とハイブリッドを形成するオリゴヌクレオチドを包含するものである。
【００１６】
本発明によるヌクレオチド・プライマーは、本発明による核酸、より具体的には配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む核酸またはその相補的なヌクレオチド配列を増幅するために使用することができる。
【００１７】
本発明の別の一主題は、試料に含まれる本発明による核酸、より具体的には配列番号１〜３０のいずれか１つを含む核酸、その相補的なヌクレオチド配列、配列番号１〜３０のいずれか１つで示される核酸またはその相補的なヌクレオチド配列を増幅するための方法に関する。この方法は、以下のステップ、すなわち、
ａ）標的核酸が存在すると推定される試料を、増幅反応に必要な試薬の存在下で、増幅しようとする標的核酸領域のそれぞれ５’側および３’側にそのハイブリダイゼーション位置がある一対のヌクレオチド・プライマーと接触させること、および
ｂ）増幅した核酸を検出することを含む。
【００１８】
本発明は、配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸、配列番号１〜３０のいずれか１つまたはその相補的なヌクレオチド配列の核酸断片または変異体が、試料中に存在するかどうかを検出する方法にも関する。この方法は、以下のステップ、すなわち
１）本発明による１個または複数のヌクレオチド・プローブを、試験しようとする試料と接触させること、
２）プローブと試料中に存在する核酸とで形成される複合体を検出することを含む。
本発明による検出方法の特定の一実施形態によれば、オリゴヌクレオチド・プローブは担体上に固定されている。
別の一態様によれば、オリゴヌクレオチド・プローブは検出可能なマーカーを含む。
【００１９】
本発明の別の一主題は、ａ）配列番号１〜３０のいずれか１つまたはその相補的なヌクレオチド配列、あるいはｂ）配列番号１〜３０のいずれか１つで示される配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸の全部または一部を増幅するためのボックスまたはキットである。このボックスまたはキットは、
１）増幅しようとする標的核酸のそれぞれ５’側および３’側にそのハイブリダイゼーション位置がある本発明による一対のヌクレオチド・プライマーと、場合によっては、
２）増幅反応に必要な試薬とを含む。
このような増幅ボックスまたは増幅キットは、好ましくは、上述の少なくとも一対のヌクレオチド・プライマーを含む。
【００２０】
本発明は、試料中の本発明による核酸の有無を検出するためのボックスまたはキットにも関し、このボックスまたはキットは、ａ）本発明による１個または複数のヌクレオチド・プローブとｂ）ハイブリダイゼーション反応に必要な適切な試薬を含む。
第１の態様によれば、この検出ボックスまたはキットは、ヌクレオチド・プローブおよびプライマーが担体上に固定されていることを特徴とする。
第２の態様によれば、この検出ボックスまたはキットは、ヌクレオチド・プローブおよびプライマーが検出可能なマーカーを含むことを特徴とする。
上述の検出キットの特定の一実施形態によれば、このようなキットは、対象とする標的核酸を検出するために、あるいは本発明による核酸のコード領域または非コード領域における突然変異を検出するために使用できる、本発明による複数のオリゴヌクレオチド・プローブおよび／またはプライマーを含む。本発明の好ましい一実施形態によれば、標的核酸は、配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列または相補的な核酸配列を含む。あるいは、標的核酸は、配列番号１〜３０のいずれか１つまたは相補的なヌクレオチド配列を含む核酸の核酸断片または変異体である。
【００２１】
別の好ましい一実施形態によれば、本発明によるプライマーは、一般に、配列番号１〜３０のいずれか１つまたはその相補的な配列の全部または一部を含む。
本発明は、本発明による核酸を含む組換えベクターにも関する。このような組換えベクターは、
ａ）配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸、
ｂ）配列番号１〜３０のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸、
ｃ）配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸のうち、少なくとも８個の連続したヌクレオチドを有する核酸、
ｄ）配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸と、少なくとも８０％のヌクレオチドが同一である核酸、
ｅ）配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸と、８５％、９０％、９５％、または９８％のヌクレオチドが同一である核酸、
ｆ）厳密性の高いハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列または相補的なヌクレオチド配列を含む核酸とハイブリッド形成する核酸、および
ｇ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸からなる群から選択される核酸を含むことが好ましい。
【００２２】
第１の実施形態によれば、所望とする宿主細胞の形質転換または形質移入後に、本発明による組換えベクターを使用してそのベクター中に挿入した核酸を増幅する。
第２の実施形態によれば、本発明による組換えベクターは、本発明による核酸に加え、調節シグナル、すなわち核酸およびそのコードされたｍＲＮＡの転写および／または翻訳を誘導または制御するヌクレオチド配列を含む発現ベクターに相当する。
好ましい一実施形態によれば、本発明による組換えベクターは、特に以下の諸成分、すなわち
（１）挿入しようとする核酸の発現を調節するためのプロモーターおよび／またはエンハンサー配列などのエレメントまたはシグナル、
（２）このようなベクターに挿入しようとする本発明による核酸内に含まれ、（１）に記載した調節エレメントまたはシグナルと整合する位置にあるヌクレオチド・コード領域
、および
（３）（２）に記載した核酸のヌクレオチド・コード領域の転写の開始および停止に適切な核酸を含む。
【００２３】
本発明は、様々な物質の輸送に関与し、また、１６番染色体、より正確には１６ｑ腕、さらに正確には発作性運動誘発性舞踏アテトーゼに対する１６ｑ１２遺伝子座にその染色体候補領域が位置する病理に関わるＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ核酸を含む組換え欠損ウイルスにも関する。
本発明の別の好ましい一実施形態では、この組換え欠損ウイルスは発作性運動誘発性舞踏アテトーゼに関わるＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードするｇＤＮＡ核酸を含む。ＡＢＣＣ１１ポリペプチドは配列番号３１のアミノ酸配列を含むことが好ましい。
本発明は、別の好ましい一実施形態では、ＲＳＶ−ＬＴＲまたはＣＭＶ初期プロモーターから選択されるプロモーターの制御下にあるＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードする核酸を含む組換え欠損ウイルスに関する。
【００２４】
特定の一実施形態によれば、本発明による核酸を宿主細胞、特に哺乳動物から得られる宿主細胞にインビボで導入する方法は、適切な調節配列の制御下に置かれた本発明の薬剤として適合するベクターおよび「裸の」核酸を含む製剤を、選択した組織、例えば平滑筋組織に局所注射して導入するステップを含み、この「裸の」核酸はこの組織の細胞によって吸収される。
本発明の特定の一実施形態によれば、ＡＢＣＣ１１タンパク質をインビボで産生するための組成物が提供される。この組成物は、生理的に許容されるビヒクルおよび／または賦形剤中にある溶液状態の、適切な調節配列の制御下に置かれてＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードする核酸を含む。
したがって、本発明は、適切な調節エレメントの制御下に置かれて配列番号３０のアミノ酸配列を含むＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物にも関する。
したがって、本発明は、発作性運動誘発性舞踏アテトーゼに罹った患者または対象の予防用または治療用の、ＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする核酸を含む薬剤組成物と１個または複数の生理的に適合する賦形剤との組合せにも関する。
このような組成物は、適切な調節エレメントまたはシグナルの制御下に置かれて配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む核酸を含むことが好ましい。
【００２５】
また、本発明は、発作性運動誘発性舞踏アテトーゼなどの染色体１６ｑ１２上に位置する病理の影響を受けている患者または対象の予防用または治療用の、本発明による組換えベクターを含む薬剤組成物と１個または複数の生理的に適合する賦形剤との組合せを対象とする。
本発明は、染色体遺伝子座１６ｑ１２上に位置する病理の予防用の、あるいはより具体的には発作性運動誘発性舞踏アテトーゼに罹った対象の治療用の薬剤を製造するための、ＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする本発明による核酸の使用にも関する。
本発明は、染色体遺伝子座１６ｑ１２上に位置する病理の予防用の、あるいはより具体的には発作性運動誘発性舞踏アテトーゼに罹った対象の治療用の薬剤を製造するための、ＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする核酸を含む本発明による組換えベクターの使用にも関する。
したがって、本発明の別の主題は、ＡＢＣＣ１１タンパク質、すなわち発作性運動誘発性舞踏アテトーゼに関わるポリペプチドをコードする本発明による核酸を含む組換えベクターである。
【００２６】
本発明は、ＡＢＣＣ１１遺伝子の欠損に伴う、または染色体遺伝子座１６ｑ１２上に位置する病理に伴う疾患や病状の治療用および／または予防用の薬剤組成物を調製するためのこのような組換えベクターの使用にも関する。
本発明は、任意の一生物活性ＡＢＣＣ１１ポリペプチドを長期にわたり効果的にインビボで発現させるための、本発明によるこのような組換えベクターを用いてエクスビボで遺伝子改変し体内に移植する細胞の使用、または体内に移植する組換えベクター産生細胞の使用にも関する。
本発明は、発作性運動誘発性舞踏アテトーゼに罹った対象の予防用および／または治療用の薬剤を製造するための、ＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする本発明による核酸の使用にも関する。
本発明は、発作性運動誘発性舞踏アテトーゼに罹った対象の予防用および／または治療用の薬剤を製造するための、本発明によるＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードする核酸を含む本発明による組換えベクターの使用にも関する。
【００２７】
本発明は、発作性運動誘発性舞踏アテトーゼに罹った対象の予防用および／または治療用の薬剤を製造するための、本発明によるＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードする核酸を含む本発明による組換え宿主細胞の使用にも関する。
本発明は、メトトレキセート（ＭＴＸ）などの陰イオン性薬物、ＧＳＨ複合薬物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｄｒｕｇｓ）、グルクロナート複合薬物、サルフェート複合薬物など酸性リガンドに結合した中性薬物の輸送障害に関連する病理の治療用および／または予防用の薬剤組成物を調製するための、本発明による組換えベクター、好ましくは組換え欠損ウイルスの使用にも関する。
本発明は、ＰＫＣなど染色体遺伝子座１６ｑ１２上に位置する病理の治療用および／または予防用の薬剤組成物を調製するための、このような組換えベクターまたは組換え欠損ウイルスの使用に関する。したがって、本発明は、本発明による１種または複数の組換えベクターまたは組換え欠損ウイルスを含む薬剤組成物にも関する。
【００２８】
本発明は、生物活性ＡＢＣＣ１１タンパク質を長期にわたり効果的にインビボで発現させるための、本発明によるウイルスを用いてエクスビボで遺伝子改変し体内に移植する細胞の使用、または体内に移植するこのようなウイルスの産生細胞の使用にも関する。
本発明は、本発明によるＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードする核酸をウイルス・ベクター中に取り込むことができ、これらのベクターが生物活性な成熟ポリペプチドの効果的な発現を可能にすることを示す。より具体的には、本発明は、ＡＢＣＣ１１タンパク質のインビボでの発現を、アデノウイルスの直接投与、あるいは産生細胞またはこのような核酸を取り込むアデノウイルスまたはレトロウイルスで遺伝子改変した細胞の移植によって得ることができることを示す。
【００２９】
この点で、本発明の別の一主題は、１種または複数の本発明による組換え欠損ウイルスに感染した哺乳動物細胞に関する。より具体的には、本発明は、これらのウイルスに感染したヒト細胞の集団に関する。これらの細胞は、特に血液由来の細胞（全能性幹細胞または前駆体）、線維芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、ケラチノサイト、平滑筋細胞、内皮細胞、グリア細胞などでもよい。
【００３０】
本発明の別の一主題は、１種または複数の本発明による組換え欠損ウイルスに感染した哺乳動物細胞または組換えウイルス産生細胞、および細胞外マトリックスを含む移植片に関する。本発明による移植片は、１０5〜１０10細胞を含むことが好ましい。これらの移植片は１０6〜１０8細胞を含むことがより好ましい。
より具体的には、本発明の移植片中の細胞外マトリックスは、ゲル化化合物と、場合によっては、細胞を定着させる担体を含む。
【００３１】
本発明は、本発明の核酸、より具体的には、配列番号１〜３０のいずれか１つまたはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸を含む組換え宿主細胞にも関する。
本発明は、本発明の核酸、より具体的には、配列番号１〜３０のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸を含む組換え宿主細胞にも関する。
【００３２】
別の一態様によれば、本発明は、本発明による組換えベクターを含む組換え宿主細胞にも関する。したがって、本発明は、本発明のあらゆる核酸、より具体的には、配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸を含む組換えベクターを含む組換え宿主細胞にも関する。
本発明は、具体的には、配列番号１〜３０のいずれか１つまたはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸を含む組換えベクターを含む組換え宿主細胞に関する。
本発明は、配列番号１〜３０のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸を含む組換えベクターを含む組換え宿主細胞にも関する。
本発明は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む組換えベクターを含む組換え宿主細胞にも関する。
【００３３】
本発明は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、そのペプチド断片、またはその変異体を産生するための方法にも関する。この方法は、以下のステップ、すなわち
ａ）前記ポリペプチドをコードする核酸を適切なベクターに挿入すること
ｂ）予め形質転換した宿主細胞を適切な培養培地中で培養すること、またはステップａ）の組換えベクターを宿主細胞に形質移入すること、
ｃ）この馴化した培養培地を回収すること、または例えば超音波処理や浸透圧衝撃によってこの宿主細胞を溶解すること、
ｄ）ステップｃ）で得られた培養培地または細胞溶解物から前記ポリペプチドを分離して精製すること、および
ｅ）適切であれば、産生された組換えポリペプチドの特徴を明らかにすることを含む。
【００３４】
配列番号３１のアミノ酸配列を有するポリペプチドと「相同」であると称されるポリペプチドも本発明の一部を成す。このような相同なポリペプチドは、等価なアミノ酸で置換された１個または複数のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む。
本発明によるＡＢＣＣ１１ポリペプチドは、特に１）配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、２）配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドのポリペプチド断片または変異体、または３）配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに「相同」なポリペプチドについてのものである。
【００３５】
特定の一実施形態では、本発明による抗体は、１）配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、２）配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドのポリペプチド断片または変異体、または３）配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに「相同」なポリペプチドに対する抗体である。このような抗体は、Ｋｏｚｂｏｒ等（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ（１９８３）４：７２）によって記述されたトリオーマ法またはハイブリドーマ法を用いて産生される。
【００３６】
したがって、本発明の主題は、さらに、試料中の本発明によるポリペプチドの有無を検出する方法であり、この方法は以下のステップ、すなわち、
ａ）１）配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、２）配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドのポリペプチド断片または変異体、または３）配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに「相同」なポリペプチドに対する抗体と試験試料とを接触させること、および
ｂ）形成された抗原／抗体複合体を検出することを含む。
【００３７】
本発明は、試料中の本発明によるポリペプチドの有無を診断または検出するためのボックスまたはキットにも関する。このボックスは、
ａ）１）配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、２）配列番号３１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドのポリペプチド断片または変異体、または３）配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに「相同」なポリペプチドに対する抗体と、
ｂ）形成された抗原／抗体複合体の検出を可能にする試薬とを含む。
【００３８】
本発明は、本発明による核酸を含む薬剤組成物にも関する。
本発明は、発作性運動誘発性舞踏アテトーゼなど染色体遺伝子座１６ｑ１２上に位置する病理の治療のための、本発明によるＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードする核酸を含む薬剤組成物および本発明によるＡＢＣＣ１１ポリペプチドを含む薬剤組成物も提供する。
本発明は、ＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする本発明による核酸を移入しインビボで発現させることを含む、発作性運動誘発性舞踏アテトーゼなど染色体遺伝子座１６ｑ１２に位置する病理の治療のための新しい治療手法にも関する。
したがって、本発明は、患者や対象における発作性運動誘発性舞踏アテトーゼなど染色体遺伝子座１６ｑ１２に位置する病理の治療および／または予防のための新しい手法を提供する。本発明は、具体的には、このような病理を引き起こす遺伝子の欠損を修復または促進する方法を提供する。
したがって、本発明は、発作性運動誘発性舞踏アテトーゼなど染色体遺伝子座１６ｑ１２に位置する遺伝子の機能障害に罹った対象の予防用および／または治療用に、ＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする核酸と１種または複数の生理的に適合するビヒクルおよび／または賦形剤とを組み合わせる薬剤組成物にも関する。
【００３９】
本発明の特定の一実施形態によれば、ＡＢＣＣ１１タンパク質のインビボでの産生のための組成物が提供される。この組成物は、生理的に適合するビヒクルおよび／または賦形剤中にあり溶液状態で適切な調節配列の制御下に置かれてＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードする核酸を含む。
したがって、本発明は、適切な調節エレメントの制御下に置かれて配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む組成物にも関する。
このような組成物は、適切な調節エレメントの制御下に置かれて配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む核酸を含むことが好ましい。
【００４０】
本発明は、メトトレキセート（ＭＴＸ）などの陰イオン性薬物、ＧＳＨ複合薬物、グルクロナート複合薬物、サルフェート複合薬物など酸性リガンドに結合した中性薬物を輸送する機能の障害に罹った対象の予防用または治療用に、本発明による組換えベクターと１種または複数の生理的に適合するビヒクルおよび／または賦形剤とを組み合わせる薬剤組成物にも関する。
【００４１】
別の一態様によれば、本発明の別の主題は、メトトレキセート（ＭＴＸ）などの陰イオン性薬物、ＧＳＨ、グルクロナート、サルフェートなど酸性リガンドに結合した中性薬物の輸送の機能障害によって引き起こされる疾患を治療する予防上または治療上の療法である。この療法は、本発明によるＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードする核酸と、１種または複数の生理的に適切なビヒクルおよび／または賦形剤とを組み合わせて患者に投与する
ことを含む。
本発明は、メトトレキセート（ＭＴＸ）などの陰イオン性薬物、ＧＳＨ、グルクロナート、サルフェートなど酸性リガンドに結合した中性薬物の輸送の機能障害に罹った患者や対象の予防用および／または治療用の、配列番号３１のアミノ酸配列を有するポリペプチドと１種または複数の生理的に適切なビヒクルおよび／または賦形剤とを治療上有効な量含む薬剤組成物に関する。
本発明は、配列番号３１のアミノ酸配列を有するポリペプチドと１種または複数の生理的に適切なビヒクルおよび／または賦形剤とを治療上有効な量含む、ＰＫＣの予防用および／または治療用の薬剤組成物にも関する。
本発明は、ＰＫＣの予防および／または治療するための薬剤組成物にも関しており、そのような方法は、本発明によるＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードする核酸と１種または複数の生理的に適切なビヒクルおよび／または賦形剤とを組み合わせて患者に投与することを含む。
【００４２】
特定の一実施形態によれば、少なくとも本発明による核酸を宿主細胞、特に哺乳動物から得られる宿主細胞にインビボで導入する方法は、薬剤として適合するベクターおよび適切な調節配列の制御下に置かれた本発明による「裸の」核酸を含む製剤を、選択した組織、例えば平滑筋組織に局所注射して導入するステップを含み、この「裸の」核酸はこの組織の細胞によって吸収される。
【００４３】
さらに別の一態様によれば、本発明の別の主題は、メトトレキセート（ＭＴＸ）などの陰イオン性薬物、ＧＳＨ、グルクロナート、サルフェートなど酸性リガンドに結合した中性薬物の輸送の機能障害によって引き起こされる疾患を治療する予防上または治療上の療法である。この療法は、本発明によるＡＢＣＣ１１ポリペプチドと１種または複数の生理的に適切なビヒクルおよび／または賦形剤とを組み合わせた治療上有効な量を患者に投与することを含む。
【００４４】
本発明は、ＡＢＣＣ１１タンパク質に作用する小分子および化合物をスクリーニングして、メトトレキセート（ＭＴＸ）などの陰イオン性薬物、ＧＳＨ、グルクロナート、サルフェートなど酸性リガンドに結合した中性薬物の輸送を修復または改善できるポリペプチドの作用薬および拮抗薬を同定し、その輸送機能障害を効果的に治療およびまたは予防するための方法も提供する。これらの方法は、メトトレキセート（ＭＴＸ）などの陰イオン性薬物、ＧＳＨ複合薬物、グルクロナート、サルフェートなど酸性リガンドに結合した中性薬物の輸送の欠陥による疾患の治療に使用する小分子および化合物を同定するために有用である。
したがって、本発明は、メトトレキセート（ＭＴＸ）などの陰イオン性薬物、ＧＳＨ複合薬物、グルクロナート、サルフェートなど酸性リガンドに結合した中性薬物の輸送の機能障害に起因する疾患の予防用および／または治療用活性成分をスクリーニングするための、発明によるＡＢＣＣ１１ポリペプチドまたはＡＢＣＣ１１ポリペプチドを発現する細胞の使用にも関する。
【００４５】
本発明は、化合物または小分子、ＡＢＣＣ１１ポリペプチドの作用薬または拮抗薬をスクリーニングする方法にも関する。この方法は、以下のステップ、すなわち
ａ）ＡＢＣＣ１１ポリペプチドと検出可能なマーカーを含む脂質基質とを含む膜小胞を調製すること、
ｂ）ステップａ）で得た小胞を作用薬または拮抗薬の候補化合物とインキュベートすること、
ｃ）検出可能なマーカーを含む脂質基質の放出量を定性的かつ／または定量的に測定すること、および
ｄ）ステップｂ）で得た放出測定値を、作用薬または拮抗薬の候補化合物とともにまだインキュベートしていない小胞による標識脂質基質の放出測定値と比較することを含む。
【００４６】
第１の特定の実施形態では、ＡＢＣＣ１１ポリペプチドはそれぞれ配列番号３１を含む。
本発明は、化合物または小分子、ＡＢＣＣ１１ポリペプチドの作用薬または拮抗薬をスクリーニングする方法にも関する。この方法は、以下のステップ、すなわち
ａ）対応するＡＢＣＣ１１ポリペプチドを自然に発現する細胞、またはＡＢＣＣ１１をコードする核酸を細胞に形質移入した後に対応するＡＢＣＣ１１ポリペプチドを発現する細胞、例えば細胞系を得ること、
ｂ）検出可能なマーカーで標識した陰イオンの存在下で、ステップａ）の細胞をインキュベートすること、
ｃ）これらの細胞に侵入していない過剰の標識陰イオンを除去するためにステップｂ）の細胞を洗浄すること、
ｄ）ステップｃ）で得た細胞をＡＢＣＣ１１ポリペプチドの作用薬または拮抗薬の候補化合物とともにインキュベートすること、
ｅ）標識陰イオンの流出量（ｅｆｆｌｕｘ）を測定すること、および
ｆ）ステップｅ）で測定した標識陰イオンの流出量値を、ＡＢＣＣ１１ポリペプチドの作用薬または拮抗薬の候補化合物の存在下でインキュベートしていない細胞で測定した標識陰イオンの流出量値と比較することを含む。
特定の一実施形態では、ＡＢＣＣ１１ポリペプチドは配列番号３０を含む。
【００４７】
一般的な定義
本発明は、完全長を含む本発明のＡＢＣＣ１１ポリペプチド、自然に発生する形のＡＢＣＣ１１、およびこれらの抗原性断片をコードするヒト遺伝子を、あらゆる動物、具体的には哺乳動物またはトリ、より具体的にはヒト源から単離しようとするものである。
【００４８】
本発明によれば、当業者に周知の従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術が使用される。このような技術は、文献に詳しく説明されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．２ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｇｌｏｖｅｒ、１９８５、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｐｒａｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉ巻およびII巻  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＭＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，ＬＴＤ．、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ.Ｋ.；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ、１９８５、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ、１９８４、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、１９８６、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；およびＰｅｒｂａｌ、１９８４、Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ）。
【００４９】
本明細書で使用する「遺伝子」という用語は、ポリペプチドをコードするヌクレオチドの集合を指し、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ核酸を含む。
「単離された」という用語は、本発明では、その本来の環境（生体物質が天然に存在する環境）から取り出された生体物質（核酸またはタンパク質）を表す。
例えば、植物や動物に自然な状態で存在するポリヌクレオチドは単離されていない。その同じヌクレオチドが、自然に挿入されている植物や動物のゲノム中の隣接する核酸から分離されると、「単離された」状態にあるとみなせる。
このようなポリヌクレオチドはベクターに入れることができ、かつ／またはこのようなポリヌクレオチドは組成物に含めることができるが、それでもこのベクターまたは組成物はポリヌクレオチドの自然な環境を構成していないので、依然として単離された状態にある。
【００５０】
「精製された」という用語は、他の化合物が存在せず完全に純粋な形で物質が存在するということではない。そうではなくこれは相対的な定義である。
ポリヌクレオチドは、出発材料または天然の材料を少なくとも１桁、好ましくは２桁または３桁、好ましくは４桁または５桁純度を高めた後に「精製された」状態になる。
本明細書では、「ヌクレオチド配列」という表現を用いて、ポリヌクレオチドまたは核酸を表すことができる。「ヌクレオチド配列」という表現は、遺伝物質自体を包含し、したがってその配列に関する情報のみに限定されない。
【００５１】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、または「ヌクレオチド配列」という用語は、一本鎖または二重、すなわち二本鎖の形をしたＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、またはｃＤＮＡ配列、あるいは２個以上のヌクレオチドのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を包含する。
「核酸」は、ヌクレオチドと呼ばれる共有結合したサブユニットからなる高分子化合物である。核酸には、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）およびポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）があり、両者は一本鎖でも二本鎖でもよい。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および半合成（ｓｅｍｉ−ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）ＤＮＡなどがある。タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、センス配列またはコード配列と呼ばれる。
【００５２】
「ヌクレオチド」という用語は、天然のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）、ならびに（１）プリンのアナログ、（２）ピリミジンのアナログ、または（３）糖アナログなどの少なくとも１つの修飾体を含む修飾ヌクレオチドの両方を表し、このような修飾ヌクレオチドの例は、例えば、国際公開第９５／０４  ０６４号に記載されている。
本発明では、第１のヌクレオチドの各塩基が、これとは向きが反対である第２のポリヌクレオチドの相補的な塩基と対をなす場合、第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドと「相補的」であるとみなす。相補的な塩基は、ＡとＴ（またはＡとＵ）、またはＣとＧである。
「異種」ＤＮＡは、天然には細胞内にない、または細胞の染色体部位にはないＤＮＡを指す。異種ＤＮＡは、好ましくは細胞にとって異質な遺伝子を含む。
【００５３】
本明細書で使用する「相同」という用語は、そのすべての文法的な形およびスペル変化において、スーパーファミリー（例えば、免疫グロブリン・スーパーファミリー）由来のタンパク質および異なる種（例えば、ミオシンＬ鎖など）由来の相同タンパク質を含めて「共通の進化の起源」を有するタンパク質間の関係を指す（Ｒｅｅｃｋ等、１９８７、Ｃｅｌｌ  ５０：６６７））。このようなタンパク質（およびこれらをコードする遺伝子）は配列相同性を有し、これらの高度な配列類似性として表れている。
したがって、「配列類似性」という用語は、そのすべての文法的な形において、核酸間やタンパク質のアミノ酸配列間の同一性または一致の程度を指し、これらは共通の進化の起源を共有していてもしていなくてもよい（Ｒｅｅｃｋ等、同上参照）。しかし、一般的な使用法でも本願でも、「相同」という用語は、「高度に」などの副詞で修飾されるときには、配列類似性を指し共通の進化の起源を指さないことがある。
【００５４】
特定の一実施形態では、少なくとも約５０％（好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９０％または約９５％）のヌクレオチドが規定の長さのＤＮＡ配列にわたって一致する場合、２つのＤＮＡ配列は「実質的に相同」または「実質的に類似」である。実質的に相同な配列は、配列データ・バンクにおいて、または例えばその特定の系に対して規定される厳密な条件下でのサザン・ハイブリダイゼーション実験において、利用可能な標準のソフトウェアを用い、これらの配列を比較することによって確認することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは当業者には周知である。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ等、同上；Ｇｌｏｖｅｒ等（１９８５．ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉ巻およびII巻  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅａｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＭＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ.Ｋ.）；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ（１９８５．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）を参照されたい。
【００５５】
同様に、特定の一実施形態では、３０％を超えるアミノ酸が同一であり、または約６０％を超えるアミノ酸が類似（機能的に同一）である場合、２つのアミノ酸配列は「実質的に相同」または「実質的に類似」である。類似配列または相同配列は、例えば、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ７、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）重層プログラム（ｐｉｌｅｕｐ  ｐｒｏｇｒａｍ）を用いた整列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）によって確認することが好ましい。
２つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間の「同一性百分率」は、本発明では、最適に並べられた２つの配列を、比較用ウィンドウを通して比較して決定する。
したがって、比較用ウィンドウ内のヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適な整列が得られるように、（付加または欠失を含まない）基準配列に対して付加または欠失（例えば「ギャップ」）を含むことがある。
この百分率は、比較する２つの（核酸またはペプチド）配列に対して同一の核塩基または同一のアミノ酸残基が観察される位置の数を測定し、次いで２つの塩基間またはアミノ酸残基間で同一な位置の数を比較用ウィンドウ内の総位置数で割り、次いでその結果を１００倍して配列同一性百分率を求めることによって計算される。
【００５６】
比較用の最適配列整列は、ＷＩＳＣＯＮＳＩＮ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ＳＯＦＴＷＡＲＥ
ＰＡＣＫＡＧＥ社、ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ＣＯＭＰＵＴＥＲ  ＧＲＯＵＰ（ＧＣＧ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｏｃｔｏｒ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩＳＣＯＮＳＩＮのパッケージに含まれている既知のアルゴリズムを利用したコンピュータを用いて達成することができる。
説明のために示すと、ＢＬＡＳＴソフトウェア（１９９６年３月のＢＬＡＳＴ  １.４.９バージョン、１９９８年２月のＢＬＡＳＴ  ２.０.４バージョン、および１９９８年９月のＢＬＡＳＴ  ２.０.６バージョン）を利用し、デフォルトのパラメータだけを使用して配列同一性百分率を算出することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、１９９０、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：３３８９〜３４０２）。Ｂｌａｓｔは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等のアルゴリズムを利用して、基準「問い合せ」配列に類似／相同な配列を探索する。この問い合せ配列および使用するデータベースはペプチド・タイプでも核タイプでもよく、任意の組合せが可能である。
【００５７】
本明細書では、「対応する」という用語は、類似性または同一性の測定対象となる分子と正確な位置が同一でも異なっていても、類似または相同な配列を指すために使用する。核酸またはアミノ酸配列の整列はスペースを含んでいてもよい。したがって、「対応する」という用語は、配列類似性を指し、アミノ酸残基またはヌクレオチド塩基の番号付けを指すのではない。
【００５８】
本発明によるＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードする遺伝子は、ゲノムＤＮＡでもｃＤＮＡでも、任意のソース、具体的にはヒトｃＤＮＡまたはゲノムのライブラリーから単離することができる。遺伝子を得る方法は、上述の通り当技術分野では周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．２ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。
【００５９】
したがって、ＡＢＣＣ１１遺伝子の分子クローニング用核酸源としてあらゆる動物細胞を使用することができる。前記ＤＮＡは、クローン化されたＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ「ライブラリー」）から当分野で既知の標準操作によって得ることができ、好ましくは、タンパク質および／または転写物を高度に発現する組織から調製したｃＤＮＡライブラリーから、化学合成により、ｃＤＮＡクローニングにより、あるいは所望の細胞から精製したゲノムＤＮＡまたはそれらの断片のクローニングにより得られる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．２ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｇｌｏｖｅｒ、１９８５、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉ巻およびII巻  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＭＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ.Ｋ.参照）。
【００６０】
ゲノムＤＮＡ由来のクローンは、コード領域に加え調節およびイントロンＤＮＡ領域を含むことがあり、ｃＤＮＡ由来のクローンはイントロン配列を含まない。そのソースにかかわらず、適切なベクターに遺伝子を分子クローン化してその遺伝子を増殖すべきである。
ゲノムＤＮＡ由来の遺伝子の分子クローニングでは、ＤＮＡ断片が生成し、そのいくつかは所望の遺伝子をコードしている。ＤＮＡは、様々な制限酵素を用いて特定の部位で切断することができる。あるいは、マンガンの存在下でＤＮアーゼを使用してＤＮＡを断片化することができる。また、ＤＮＡは例えば超音波処理によって物理的に切断することができる。次いで、この線状ＤＮＡ断片を、アガロースやポリアクリルアミドのゲル電気泳動、およびカラム・クロマトグラフィーを含め、ただしこれらだけに限定されない標準技術によりサイズによって分離することができる。
【００６１】
ＤＮＡ断片が生成した後、所望のＡＢＣＣ１１遺伝子を含む特定のＤＮＡ断片をいくつかの方法によって同定することができる。例えば、ＡＢＣＣ１１遺伝子の一部、その特定のＲＮＡ、またはそれらの断片が多量に入手でき、精製でき、標識できる場合、標識プローブとの核酸ハイブリダイゼーションによってその生成したＤＮＡ断片をスクリーニングすることができる（ＢｅｎｔｏｎおよびＤａｖｉｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９７７）、１９６：１８０；Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ.Ｓ.Ａ.（１９７５）７２：３９６１）。例えば、以下の具体例でなされたように、ＡＢＣＣ１１タンパク質に対して得られる部分的なコード配列情報に対応するオリゴヌクレオチド・セットを調製し、ＡＢＣＣ１１をコードするＤＮＡ用プローブとして、または（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ用ポリＴプライマーと併用して）ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ用プライマーとして使用することができる。本発明によるＡＢＣＣ１１核酸またはポリペプチドに極めて特異的な断片を選択することが好ましい。このプローブに実質的に相同なＤＮＡ断片がハイブリッドを形成する。上述したように、相同性の程度が大きいほど、より厳密なハイブリダイゼーション条件を使用することができる。特定の一実施形態では、様々な厳密性のハイブリダイゼーション条件を使用して相同ＡＢＣＣ１１遺伝子を同定する。
【００６２】
例えば、遺伝子が、本明細書に示すＡＢＣＣ１１タンパク質の等電点電気泳動アミノ酸組成または部分的アミノ酸配列を有するタンパク質産物をコードする場合、その遺伝子の諸特性に基づいてさらに選択を行うことができる。したがって、発現産物の物理的、化学的、または免疫的諸特性に基づいたアッセイによって、その遺伝子の有無を検出することができる。例えば、ＡＢＣＣ１１について知られているのと類似または同一の電気泳動、等電点電気泳動すなわち非平衡ｐＨゲル電気泳動挙動、タンパク質分解消化地図、または抗原性の諸性質を示すタンパク質を産生するｃＤＮＡクローン、すなわち適切なｍＲＮＡをハイブリダイゼーションにより選択するＤＮＡクローンを選択することができる。
【００６３】
本発明によるＡＢＣＣ１１遺伝子は、ｍＲＮＡ選択によって、すなわち、核酸ハイブリダイゼーションとその後のインビトロでの翻訳によっても同定することができる。この操作に従えば、ヌクレオチド断片を使用してハイブリダイゼーションにより相補的なｍＲＮＡが単離される。このようなＤＮＡ断片は、利用可能な精製されたＡＢＣＣ１１  ＤＮＡでもよいし、部分的なコード配列情報から設計された合成オリゴヌクレオチドでもよい。単離したｍＲＮＡ生成物のインビトロ翻訳産物を免疫沈降分析または機能性アッセイ（例えば、チロシンホスファターゼ活性）にかけて、ｍＲＮＡ、したがって所望の配列を含む相補的なＤＮＡ断片を同定する。さらに、細胞から単離したポリソームが、本発明によるＡＢＣＣ１１ポリペプチドに対する特異的な固定された抗体に吸着することによって特定のｍＲＮＡを選択することができる。
【００６４】
放射性同位体で標識されたＡＢＣＣ１１  ｃＤＮＡを、（吸着したポリソームから）選択したｍＲＮＡを鋳型として用いて合成することができる。次いで、放射性同位体標識ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡをプローブとして用いて、相同ＡＢＣＣ１１  ＤＮＡ断片を他のゲノムＤＮＡ断片の中から同定する。
【００６５】
本発明による核酸の「変異体」は、基準のポリヌクレオチドとは１個または複数の塩基が異なる核酸を意味すると理解される。核酸変異体は、天然に存在する対立遺伝子変異体（ａｌｌｅｌｉｃ  ｖａｒｉａｎｔ）など天然起源のものでもよいし、例えば、突然変異生成技術によって得られる非天然変異体でもよい。
一般に、基準（通常、野生型）核酸と核酸変異体の相違は小さく、基準核酸と核酸変異体のヌクレオチド配列は極めて類似しており、多くの領域では同一である。核酸変異体中に存在するヌクレオチド修飾はサイレントなことがあり、すなわち、核酸変異体によってコードされるアミノ酸配列を変えないことがある。
しかし、核酸変異体のヌクレオチドの変化は、基準核酸によってコードされるポリペプチドと比べたときに、核酸変異体によってコードされるポリペプチドに置換、付加、または欠失をもたらすことがある。また、コード領域のヌクレオチド修飾は、ポリペプチドのアミノ酸配列に保存的または非保存的な置換をもたらすことがある。
本発明による核酸変異体は、基準核酸のポリペプチドと同じ機能または生物活性、あるいは最初の基準核酸によってコードされるポリペプチドに対する抗体によって認識される能力を実質的に保存しているポリペプチドをコードしていることが好ましい。
したがって、いくつかの核酸変異体は、問題のタンパク質の構造と活性の関係をその系統的な研究により推定することを可能にするポリペプチド変異体をコードすることになる。対象とする疾患に関連したこれらの変異体に関する知識は欠くことができない。というのは、これにより病理原因を分子レベルで理解することが可能になるからである。
【００６６】
「断片」は、基準核酸に比べて長さが短く、基準核酸と同一のヌクレオチド配列を共通部分にわたり含むヌクレオチド配列を意味すると理解される。本発明によるこのような核酸「断片」は、それが適切であれば、その断片が一構成体であるより大きなポリヌクレオチドに含まれていてもよい。このような断片は、本発明による核酸の８、１０、１２、１５、１８、２０〜２５、３０、４０、５０、７０、８０、１００、２００、５００、１０００、または１５００個の連続したヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含み、あるいはこれらからなっている。
【００６７】
「核酸分子」は、一本鎖の形でも二本鎖ヘリックスでも、リン酸エステル・ポリマーの形のリボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、またはシチジン；「ＲＮＡ分子」）、またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）、あるいはこれらのホスホロチオネート、チオエステルなどあらゆるリン酸エステル類似体を指す。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、およびＲＮＡ−ＲＮＡヘリックスが可能である。核酸分子という用語は、特にＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子においては、その分子の１次構造および２次構造のみを指し、どんな特定の３次構造にも限定されない。したがって、この用語は、なかでも線状または環状のＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、プラスミド、および染色体中に見られる二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を議論する際には、本明細書では、非転写ＤＮＡ鎖（すなわち、ｍＲＮＡと相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’方向への配列のみを示す常法に従って配列を記載することがある。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を行ったＤＮＡ分子である。
核酸分子は、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で核酸分子の一本鎖を他の核酸分子にアニールできる場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡなど別の核酸分子と「ハイブリッド可能」である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、同上を参照）。温度およびイオン強度の条件によって、ハイブリダイゼーションの「厳密性」が決まる。相同な核酸を予備スクリーニングする場合、５５°のＴmに対応する厳密性の低いハイブリダイゼーション条件、例えば、５×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ、０.２５％乳、ホルムアミドなし；または、３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳを使用することができる。中程度の厳密性のハイブリダイゼーション条件は、これよりも高いＴm、例えば、４０％ホルムアミド、５×または６×ＳＣＣに対応する。厳密性の高いハイブリダイゼーション条件は、最も高いＴm、例えば、５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＣＣに対応する。ハイブリダイゼーションには、２つの核酸が相補的な配列を含む必要があり、ハイブリダイゼーションの厳密性によっては塩基間のミスマッチが起こり得る。核酸をハイブリッドするのに適切な厳密性は、核酸の長さおよび相補性の程度、当分野で周知の変数によって決まる。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸ハイブリッドのＴm値は高くなる。核酸ハイブリダイゼーションの（Ｔmの高さに対応する）相対安定性は、以下の順、すなわち、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡの順に減少する。１００ヌクレオチドよりも長いハイブリッド用にＴmの計算式が誘導されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、同上を参照）。これよりも短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの場合、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、同上を参照）。好ましくは、ハイブリッド可能な核酸の長さの下限は少なくとも約１０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチドであり、より好ましくはその長さは少なくとも約２０ヌクレオチドである。
【００６８】
特定の一実施形態では、「標準ハイブリダイゼーション条件」という用語は５５℃のＴmを指し、上述の条件が利用される。好ましい一実施形態ではＴmは６０℃であり、より好ましい一実施形態ではＴmは６５℃である。
【００６９】
本発明の「厳密性の高いハイブリダイゼーション条件」とは、以下の条件を意味すると理解される：
１．膜競合およびプレハイブリダイゼーション：
−混合物：４０μｌサケ精子ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）
＋４０μｌヒト胎盤ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）
−９６℃で５分間変性し、次いでこの混合物を氷中に浸漬する。
−２×ＳＳＣを除去し、ホルムアミド混合物４ｍｌをこの膜を含むハイブリダイゼーション・チューブ中に注入する。
−２つの変性ＤＮＡの混合物を添加する。
−回転させながら４２℃で５〜６時間インキュベートする。
２．標識プローブ競合：
−反復の量に応じ、標識し精製したプローブにＣｏｔ  Ｉ  ＤＮＡ１０〜５０μｌを加える。
−９５℃で７〜１０分間変性する。
−６５℃で２〜５時間インキュベートする。
３．ハイブリダイゼーション：
−プレハイブリダイゼーション混合物を除去する
−サケ精子ＤＮＡ４０μｌとヒト胎盤ＤＮＡ４０μｌとを混合し、９６℃で５分間変性し、その後氷中に浸漬する。
−ハイブリダイゼーション・チューブに４ｍｌのホルムアミド混合物、２つのＤＮＡ混合物、および変性標識プローブ／Ｃｏｔ  Ｉ  ＤＮＡを添加する。
−回転させながら４２℃で１５〜２０時間インキュベートする。
４．洗浄および暴露：
−２×ＳＳＣ中室温で１回洗浄し、リンスする。
−室温２×ＳＳＣで、および６５℃０.１％ＳＤＳで５分間２回洗浄
−６５℃で１５分間、０.１×ＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳで２回洗浄
−膜を透明プラスチック・ラップに包み、暴露する。
【００７０】
上述のハイブリダイゼーション条件を、厳密性の高い条件下、２０ヌクレオチド長から７００ヌクレオチド長の核酸分子のハイブリダイゼーションに適用する。当業者に既知の技術に従って、上述のハイブリダイゼーション条件を、ハイブリダイゼーションしようとする核酸の長さまたは選択した標識のタイプに応じて調整できることは言うまでもない。適切なハイブリダイゼーション条件を、例えば、ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ（１９８５、同上）のマニュアルに含まれる教示に従って調整することができる。
【００７１】
本明細書で使用する「オリゴヌクレオチド」という用語は、本発明による核酸にハイブリッド可能な通常少なくとも１５ヌクレオチドの核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、例えば32Ｐ−ヌクレオチドまたはビオチンなどの標識を共有結合したヌクレオチドで標識することができる。一実施形態では、標識オリゴヌクレオチドをプローブとして使用して、本発明によるＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードする核酸の存在を検出することができる。別の一実施形態では、オリゴヌクレオチド（その一方または両方を標識することができる）を、ＡＢＣＣ１１核酸の完全長または断片をクローニングするために、あるいはＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする核酸の存在を検出するために、ＰＣＲプライマーとして使用することができる。別の一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＡＢＣＣ１１  ＤＮＡ分子と三重らせんを形成することができる。一般に、オリゴヌクレオチドは合成により調製され、好ましくは核酸合成装置で合成される。したがって、オリゴヌクレオチドは、チオエステル結合などの自然には生成しないリン酸エステル類似結合で調製することができる。
【００７２】
「相同組換え」とは、ベクターの外来ＤＮＡ配列を染色体に挿入することを指す。ベクターは、相同組換えのための特異的な染色体部位を標的とすることが好ましい。特異的な相同組換えの場合、ベクターは、染色体へのこのベクターの相補的な結合および取り込みを可能にするのに十分な長さの、染色体配列と相同な領域を含む。相同領域が長いほど、また、配列類似性の程度が大きいほど、相同組換えの効率が増加し得る。
【００７３】
ＤＮＡ「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれたとき、インビトロまたはインビボの細胞内でポリペプチドに転写され翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端側の開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端側の翻訳停止コドンで決まる。コード配列は、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物の（例えば、哺乳動物の）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、さらには合成ＤＮＡ配列などであるが、これらだけに限定されない。コード配列が真核細胞における発現を意図したものである場合、通常、ポリアデニレーション・シグナルおよび転写終結配列がコード配列の３’側に置かれる。
転写および翻訳制御配列は、宿主細胞でコード配列の発現をもたらす、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどのＤＮＡ調節配列である。真核細胞では、ポリアデニレーション・シグナルが制御配列である。
【００７４】
「調節領域」は、核酸の発現を調節する核酸配列を意味する。調節領域は、特定の核酸（相同領域）の自然な発現をもたらす配列を含むことができ、また、（異なるタンパク質、さらには合成タンパク質の発現をもたらす）異なる起源の配列を含むことができる。特に、この配列は、真核生物またはウイルスの遺伝子配列、あるいは特異的または非特異的、誘発的または非誘発的に遺伝子の転写を刺激または抑制する誘導配列（ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）とすることができる。調節領域は、複製開始点、ＲＮＡスプライス部位、エンハンサー、転写終結配列、ポリペプチドを標的細胞の分泌経路に誘導するシグナル配列、およびプロモーターを含む。
「異種ソース」由来の調節領域は、発現される核酸と天然では無関係な調節領域である。異種調節領域には、異なる種由来の調節領域、異なる遺伝子由来の調節領域、ハイブリッド調節配列、および自然には発生しないが当業者によって設計される調節配列が含まれる。
「カセット」とは、ベクターの特異的制限部位に挿入可能なＤＮＡセグメントを指す。このＤＮＡセグメントは、対象とするポリペプチドをコードし、カセットおよび制限部位は、転写および翻訳のための適切な読み枠に確実にカセットを挿入できるように設計される。
【００７５】
「プロモーター配列」は、細胞のＲＮＡポリメラーゼを結合させ、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始できるＤＮＡ調節領域である。本発明では、プロモーター配列は、その３’末端で転写開始部位に結合し、上流側（５’方向）に伸びて、バックグラウンド以上の検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最低数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列内には、（例えば、ヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングで都合よく規定される）転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合をもたらすタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）がある。
コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写するときには、細胞内の転写および翻訳制御配列の「制御下」にあり、次いでｍＲＮＡはｔｒａｎｓ−ＲＮＡでスプライスされ、このコード配列によってコードされるタンパク質に翻訳される。
「シグナル配列」は、細胞表面に発現されるタンパク質のコード配列の始めに含まれる。この配列は、成熟ポリペプチドのＮ末端にあるシグナル・ペプチドをコードする。シグナル・ペプチドは、宿主細胞を誘導してポリペプチドを動かす。「トランスロケーション・シグナル配列」という用語は、本明細書では、この種のシグナル配列を指すために使用する。トランスロケーション・シグナル配列は、真核生物および原核生物に固有の様々なタンパク質に関連していることが見出され、両方のタイプの生物で機能することが多い。
「ポリペプチド」は、共有結合したアミノ酸残基からなる高分子化合物である。アミノ酸は、次の一般構造を有する。
【化１】
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【００７６】
アミノ酸は、側鎖Ｒに基づき７つのグループに分類される：（１）脂肪族側鎖、（２）水酸（ＯＨ）基を含む側鎖、（３）イオウ原子を含む側鎖、（４）酸性基またはアミド基を含む側鎖、（５）塩基性基を含む側鎖、（６）芳香族環を含む側鎖、および（７）側鎖がアミノ基と融合したイミノ酸であるプロリン。
【００７７】
「タンパク質」は、生細胞において構造的役割や機能的役割を果たすポリペプチドである。
本発明のポリペプチドおよびタンパク質は、グリコシル化されていてもいなくてもよい。
「相同性」は、共通の進化起源を反映した配列の類似性を意味する。ポリペプチドまたはタンパク質は、それらのアミノ酸の多くが（１）同一であり、または（２）化学的に類似したＲ側鎖を有する場合、相同性または類似性を有すると言われる。核酸は、それらのヌクレオチドの多くが同一であれば相同性を有すると言われる。
【００７８】
「単離されたポリペプチド」または「単離されたタンパク質」は、その天然状態では通常それに付随している化合物（例えば、他のタンパク質またはポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質）が、実質的にないポリペプチドまたはタンパク質である。「単離された」という意味は、他の化合物との人工または合成混合物、あるいは生物活性を妨害せず、例えば、不完全な精製、安定剤の添加、または薬剤として許容される製剤への配合のために存在し得る不純物の存在を除外しない。
【００７９】
本発明によるポリペプチドの「断片」は、そのアミノ酸配列が基準ポリペプチドのアミノ酸配列よりも短く、これらの基準ポリペプチドの全体にわたって同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味すると理解される。このような断片は、それが適切であれば、これらの断片をその一部とするより大きなポリペプチドに含まれていてもよい。本発明によるポリペプチドのこのような断片は、５、１０、１５、２０、３０〜４０、５０、１００、２００、または３００アミノ酸長とすることができる。
【００８０】
本発明によるポリペプチドの「変異体」は、基準ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも１つのアミノ酸残基の１つまたは複数の置換、付加、または欠失を含むポリペプチドを主に意味すると理解され、このアミノ酸置換は保存的でも非保存的でもよいと理解される。
ポリペプチドまたはタンパク質の「変異体」は、ポリペプチドまたはタンパク質から誘導され、ポリペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つの生物学的特性を維持するあらゆる類似体、断片、誘導体、または突然変異体である。異なるポリペプチドまたはタンパク質の変異体は天然に存在することもある。これらの変異体は、タンパク質をコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列の違いを特徴とする対立遺伝子変異体であってもよく、スプライシングが異なり、翻訳後修飾を含むことがある。変異体は、実質的に同じ生物活性を有するが異なる種から得られる関連タンパク質も含む。
【００８１】
当業者であれば、単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、または交換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ）を含む変異体を産生することができる。これらの変異体は、とりわけ、（ａ）１つまたは複数のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸で置換された変異体、（ｂ）１つまたは複数のアミノ酸がポリペプチドまたはタンパク質に付加した変異体、（ｃ）１つまたは複数のアミノ酸が置換基を含む変異体、および（ｄ）ポリペプチドまたはタンパク質が血清アルブミンなど別のポリペプチドと融合した変異体を含むことができる。これらの変異体を得るための技術は、遺伝子工学（サプレッション、欠失、変異など）、化学的技術、および酵素技術を含めて、当業者の知るところである。
もしこのような対立遺伝子変異体、類似体、断片、誘導体、突然変異体、ならびに選択的ｍＲＮＡスプライシング体および選択的翻訳後修飾体を含めた修飾体が、結果的にポリペプチドの生物学的諸特性のいずれかを保持するポリペプチドの誘導体である場合、これらは本発明の範囲に含まれるものである。
【００８２】
「ベクター」は、別のＤＮＡセグメントがそれに結合して、その結合セグメントが複製され得るプラスミド、ウイルス、ファージ、コスミドなどのレプリコンである。「レプリコン」は、インビボでのＤＮＡ複製の自律的単位として機能する、すなわち、それ自体の制御の下で複製が可能な遺伝因子（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。
本発明は、本発明のＡＢＣＣ１１ポリペプチドの類似体および誘導体をコードする遺伝子を含むクローニング・ベクターにも関する。ＡＢＣＣ１１タンパク質に関係する誘導体および類似体の産生および使用は本発明の範囲に含まれる。特定の一実施形態では、この誘導体または類似体は機能的に活性であり、すなわち、本発明の完全長、野生型ＡＢＣＣ１１ポリペプチドに伴う１つまたは複数の機能的活性を示すことができる。
機能的に等価な分子を生成する置換、付加、または欠失によって核酸のコード配列を変えてＡＢＣＣ１１誘導体を生成することができる。元のＡＢＣＣ１１よりも機能的活性が亢進または増大した誘導体を生成することが好ましい。あるいは、このような誘導体は、本発明のＡＢＣＣ１１ポリペプチドの天然リガンドに対し同等またはそれ以上の親和性を有するＡＢＣＣ１１細胞外ドメインの可溶な断片をコードすることもできる。このような可溶な誘導体は、ＡＢＣＣ１１に結合するリガンドの阻害剤候補でありうる。
【００８３】
ヌクレオチド・コード配列の縮重のため、ＡＢＣＣ１１遺伝子のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を本発明を実施するのに使用することができる。このＤＮＡ配列は、他の種由来の対立遺伝子、相同遺伝子、この配列内の同じアミノ酸残基をコードする異なるコドンを置換して改変し、サイレントな変化を生じさせたＡＢＣＣ１１遺伝子の全体または一部を含むヌクレオチド配列を含むが、これらだけに限定されない。同様に、本発明のＡＢＣＣ１１誘導体は、ＡＢＣＣ１１タンパク質のアミノ酸配列内の残基を機能的に等価なアミノ酸残基で置換して保存的なアミノ酸置換をもたらす改変された配列を含むＡＢＣＣ１１タンパク質のアミノ酸配列の全体または一部を含有する配列を、主要なアミノ酸配列として含むＡＢＣＣ１１誘導体であるが、これらだけに限定されない。例えば、機能的に等価なものとして働きサイレントな改変をもたらす極性の類似した別のアミノ酸で、この配列内の１つまたは複数のアミノ酸残基を置換することができる。この配列内のアミノ酸を置換するアミノ酸は、配列内のアミノ酸が属するクラスの別のメンバーから選択することができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。芳香族環構造を含むアミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンである。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンなどがある。正に帯電した（塩基）アミノ酸としては、アルギニン、ロイシン、ヒスチジンなどがある。負に帯電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸などがある。このような改変は、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動または等電点によって測定される見掛け分子量には影響しないと考えられる。
【００８４】
特に好ましい置換は、
−正の電荷を保持するような、ＡｒｇのＬｙｓによる置換、およびその逆の置換、
−負の電荷を保持するような、ＡｓｐのＧｌｕによる置換、およびその逆の置換、
−遊離のＯＨを保持できる、ＴｈｒのＳｅｒによる置換、および、
−遊離のＣＯＮＨ2を保持できる、ＡｓｎのＧｌｎによる置換である。
特に好ましい特性を有するアミノ酸を置換するためにアミノ酸置換を行うこともできる。例えば、別のＣｙｓとのジスルフィド架橋が可能な部位としてＣｙｓを導入することができる。特に「触媒的な」部位としてＨｉｓを導入することができる（すなわち、Ｈｉｓは酸または塩基として作用し、生化学触媒の中では最も一般的なアミノ酸である）。Ｐｒｏは、特にその平面構造のために導入することができ、タンパク質構造中にβターンを生じる。
【００８５】
本発明のＡＢＣＣ１１誘導体および類似体をコードする遺伝子を、当分野で既知の様々な方法により生成することができる。この遺伝子を生成する操作は、遺伝子またはタンパク質レベルで行われる。例えば、クローン化したＡＢＣＣ１１配列を、当分野で知られている多数の方法のいずれかによって修飾することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９、同上）。この配列を、適切な部位で制限エンドヌクレアーゼを用いて切断し、必要であればさらに酵素で修飾し、単離し、インビトロで連結することができる。ＡＢＣＣ１１かＡＢＣＣ１２のどちらかの誘導体または類似体をコードする遺伝子の生成では、修飾された遺伝子が、所望の活性がコードされている領域において、翻訳停止シグナルで中断されずに、確実にＡＢＣＣ１１遺伝子と同じ翻訳読み枠内に留まるようにすべきである。
【００８６】
また、ＡＢＣＣ１１をコードする核酸は、インビトロまたはインビボで突然変異を起こして、翻訳、開始、および／または停止配列を生成および／または破壊し、あるいはコード領域内に変異を生じ、かつ／または新しい制限エンドヌクレアーゼ部位を形成しまたは既存の制限エンドヌクレアーゼ部位を破壊して、インビトロでの修飾をさらに促進することができる。このような変異は、突然変異したＡＢＣＣ１１遺伝子産物の機能的活性を亢進するものであることが好ましい。なかでもインビトロでの部位特異的な突然変異生成およびＴＡＢ（登録商標）リンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用を含めた当分野で既知のあらゆる突然変異生成技術を使用することができる（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ等、（１９７８）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：６５５１；ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ、（１９８４）ＤＮＡ、３：４７９〜４８８；Ｏｌｉｐｈａｎｔ等、（１９８６）Ｇｅｎｅ  ４４：１７７；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ等、（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ.Ｓ.Ａ.８３：７１０；Ｈｕｙｇｅｎ等、（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２（８）：８９３〜８９８）。ＰＣＲ技術は、部位特異的突然変異生成に好ましい（Ｈｉｇｕｃｈｉ、１９８９、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ中の「Ｕｓｉｎｇ  ＰＣＲ  ｔｏ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒ  ＤＮＡ」、：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、６章、ｐｐ.６１〜７０）。
【００８７】
次いで、同定し単離したＡＢＣＣ１１遺伝子を適切なクローニング・ベクターに挿入することができる。当分野で既知の多数のベクター−宿主系を使用することができる。使用可能なベクターとしては、プラスミド、改変されたウイルスなどがあるが、これらだけに限定されない。ただし、ベクター系は使用する宿主細胞に適合したものでなければならない。ベクターの例は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラムダ誘導体などのバクテリオファージ、ｐＢＲ３２２誘導体またはｐＵＣプラスミド誘導体などのプラスミド、例えば、ｐＧＥＸベクター、ｐｍａｌ−ｃ、ｐＦＬＡＧなどであるが、これらだけに限定されない。クローニング・ベクターへの挿入は、例えば、相補的な付着末端を有するクローニング・ベクターにＤＮＡ断片を連結することによって行うことができる。しかし、このＤＮＡを断片化するために使用する相補的な制限部位がクローニング・ベクター内に存在しない場合、このＤＮＡ分子の末端を酵素で修飾することができる。あるいは、ヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ末端上に連結することによって任意の所望の部位を作製することができる。なお、これらの連結されたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特異的に化学合成されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。組換え分子は、形質転換、形質移入、感染、エレクトロポレーションなどによって宿主細胞に導入することができ、その結果多数の遺伝子配列コピーが生成する。クローン化された遺伝子は、シャトル・ベクター・プラスミド上に含めることが好ましい。シャトル・ベクター・プラスミドは、クローニング細胞、例えば大腸菌での増殖をもたらし、望むならば、その後適切な発現細胞系内に挿入するための精製を容易にする。例えば、シャトル・ベクターは、２種以上のタイプの生物内で複製できるベクターであり、大腸菌由来の配列と酵母２ｍプラスミド由来の配列とを連結することによって、大腸菌でも酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）でも複製されるシャトル・ベクターを調製することができる。
別法では、所望の遺伝子を適切なクローニング・ベクターに「ショット・ガン」法で挿入した後に、同定し単離することができる。所望の遺伝子を、クローニング・ベクターに挿入する前に、例えばサイズ分画により濃縮することができる。
【００８８】
ＡＢＣＣ１１ポリペプチドまたは抗原性断片をコードするヌクレオチド配列、その誘導体または類似体、または機能的に活性な誘導体は、そのキメラ・タンパク質を含めて、適切な発現ベクター、すなわち、挿入するタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクターに挿入することができる。このようなエレメントを、本明細書では「プロモーター」と称する。したがって、本発明のＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードする核酸は、本発明の発現ベクター中のプロモーターと作用的に関連している。ｃＤＮＡおよびゲノム配列共にこのような調節配列の制御の下でクローン化し発現することができる。発現ベクターは、好ましくは複製開始点も含む。
【００８９】
必要な転写および翻訳シグナルを、組換え発現ベクター上に設けることができ、あるいはＡＢＣＣ１１をコードする元の遺伝子および／またはそのフランキング領域により供給することができる。
【００９０】
利用可能な宿主−ベクター系としては、ウイルス（例えば、ワクシニア・ウイルス、アデノウイルスなど）に感染した哺乳動物細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；酵母ベクターを含有する酵母などの微生物；またはバクテリオファージで形質転換された細菌、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡなどがあるが、これらだけに限定されない。ベクターの発現エレメントは、強度および特異性が様々である。利用する宿主−ベクター系に応じて、いくつかの適切な転写および翻訳エレメントのうちのいずれか１つを使用することができる。
本発明の組換えＡＢＣＣ１１タンパク質、またはその機能性の断片、誘導体、キメラ構築物、または類似体は、組換えによってコード配列が組み込まれた後、染色体上で発現することがある。この点で、いくつかの増幅系のうちいずれかを用いて安定な遺伝子発現を高レベルで達成することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９、同上を参照）。
その中の組換えベクターが本発明によるＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードする核酸を含んだ細胞は、ＡＢＣＣ１１ポリペプチドの発現がこの細胞によってもたらされる条件の下で適切な細胞培養培地中で培養する。
クローニング・ベクターにＤＮＡ断片を挿入する既述の方法のいずれかを使用して、適切な転写／翻訳制御シグナルおよびタンパク質コード配列からなる遺伝子を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロでの組換えＤＮＡ技術および合成技術およびインビボでの組換え（遺伝的組換え）が含まれる。
【００９１】
ＡＢＣＣ１１ポリペプチドの発現は、当分野で既知の任意のプロモーター／エンハンサー・エレメントによって制御され得るが、これらの調節エレメントは、発現用に選択した宿主中で機能しなければならない。ＡＢＣＣ１１遺伝子発現を制御するために使用できるプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、１９８１  Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４〜３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ等、１９８０  Ｃｅｌｌ  ２２：７８７〜７９７）、ヘルペス・チミジンキナーゼ・プロモーター（Ｗａｇｎｅｒ等、１９８１  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ.Ｓ.Ａ.７８：１４４１〜１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ等、１９８２  Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９〜４２）；β−ラクタマーゼ・プロモーターなど原核生物の発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ等、１９７８  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ.Ｓ.Ａ.７５：３７２７〜３７３１）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ等、１９８３  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ.Ｓ.Ａ.８０：２１〜２５）；Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ、１９８０、２４２：７４〜９４の「Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ」も参照；Ｇａｌ４プロモーターなど酵母または他の菌類由来のプロモーター・エレメント、ＡＤＣ（アルコール・デヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロール・キナーゼ）プロモーター、アルカリ・ホスファターゼ・プロモーター；および組織特異性を示し、トランスジェニック動物に利用されている動物転写制御領域：すい臓腺房細胞で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ等、１９８４  Ｃｅｌｌ  ３８：６３９〜６４６；Ｏｒｎｉｔｚ等、１９８６  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９〜４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９８７）；すい臓ベータ細胞で活性なインシュリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ、１９８５  Ｎａｔｕｒｅ：３１５：１１５〜１２２）、リンパ球細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ等、１９８４  Ｃｅｌｌ  ３８：６４７〜６５８；Ａｄａｍｅｓ等、１９８５  Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３〜５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ等、１９８７  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６〜１４４４）、精巣、乳房、リンパ球、および肥満細胞で活性なマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ等、１９８６  Ｃｅｌｌ  ４５：４８５〜４９５）、肝臓で活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ等、１９８７  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：２６８〜２７６）、肝臓で活性なアルファ−フェトタンパク質遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ等、１９８５  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９〜１６４８；Ｈａｍｍｅｒ等、１９８７  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：５３〜５８）、肝臓で活性なアルファ１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ等、１９８７  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１〜１７１）  骨髄細胞で活性なベータ−グロブリン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ等、１９８５  Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８〜３４０；Ｋｏｌｌｉａｓ等、１９８６  Ｃｅｌｌ  ４６：８９〜９４）、脳の希突起こう細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ等、１９８７  Ｃｅｌｌ  ４８：７０３〜７１２）、骨格筋で活性なミオシンＬ鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ、１９８５  Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３〜２８６）、および視床下部で活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ等、１９８６  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２〜１３７８）などがあるが、これらだけに限定されない。
【００９２】
本発明のＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターは、一般的な５通りの手法で同定することができる：（ａ）所望のプラスミドＤＮＡまたは特異的ｍＲＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、（ｂ）核酸ハイブリダイゼーション、（ｃ）選択マーカー遺伝子機能の有無、（ｄ）適切な制限エンドヌクレアーゼを用いた分析、および（ｅ）挿入された配列の発現。第１の手法では、核酸をＰＣＲで増幅して増幅産物を検出する。第２の手法では、挿入したマーカー遺伝子と相同な配列を含むプローブを用いた核酸ハイブリダイゼーションによって、発現ベクターに挿入した外来遺伝子の存在を検出することができる。第３の手法では、ベクター中の外来遺伝子の挿入により引き起こされる特定の「選択マーカー」遺伝子機能（例えば、ｂ−ガラクトシダーゼ活性、チミジン・キナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルス中の閉塞体（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）の形成など）の有無に基づいて組換えベクター／宿主系を同定および選択することができる。別の例では、ＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードする核酸がベクターの「選択マーカー」遺伝子配列内に挿入された場合、ＡＢＣＣ１１遺伝子機能が働かないことによってＡＢＣＣ１１核酸を含む組換え体を同定することができる。第４の手法では、適切な制限酵素を用いた消化により組換え発現ベクターを同定する。第５の手法では、発現されるタンパク質が機能的に活性なコンホメーションをとる場合、組換えによって発現される遺伝子産物の活性、生化学的諸特性、または免疫学的諸特性を評価することによって、組換え発現ベクターを同定することができる。
【００９３】
多種多様な宿主／発現ベクターの組合せを、本発明の核酸を発現させるのに使用することができる。有用な発現ベクターは、例えば、染色体のセグメント、非染色体性ＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列で構成することができる。適切なベクターには、ＳＶ４０の誘導体および既知の細菌プラスミド、例えば、大腸菌プラスミドｃｏｌ  Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈ等、１９８８、Ｇｅｎｅ  ６７：３１〜４０）、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体、ＲＰ４などのプラスミド；ファージＤＮＡ、例えばファージ１の多数の誘導体、例えばＮＭ９８９、ならびに他のファージＤＮＡ、例えばＭ１３および繊維状一本鎖ファージＤＮＡ；２ｍプラスミドまたはその誘導体などの酵母プラスミド；昆虫または哺乳動物細胞に有用なベクターなどの真核細胞に有用なベクター；ファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を使用するように改変したプラスミドなどプラスミドとファージＤＮＡの組合せから誘導されるベクターなどがある。
【００９４】
例えば、バキュロウイルス発現系では、ｐＶＬ９４１（ＢａｍＨ１クローニング部位；Ｓｕｍｍｅｒｓ）、ｐＶＬ１３９３（ＢａｍＨ１、ＳｍａＩ、ＸｂａＩ、ＥｃｏＲ１、ＮｏｔＩ、ＸｍａIII、ＢｇｌII、およびＰｓｔＩクローニング部位；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＶＬ１３９２（ＢｇｌII、ＰｓｔＩ、ＮｏｔＩ、ＸｍａIII、ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ、ＳｍａＩ、およびＢａｍＨ１クローニング部位；ＳｕｍｍｅｒｓおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＢｌｕｅＢａｃIII（ＢａｍＨ１、ＢｇｌII、ＰｓｔＩ、ＮｃｏＩ、およびＨｉｎｄIIIクローニング部位、ｂｌｕｅ／ｗｈｉｔｅ組換えスクリーニングが可能；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）など、ただしこれらだけに限定されない非融合（ｎｏｎ−ｆｕｓｉｏｎ）トランスファー・ベクター、ｐＡｃ７００（ＢａｍＨ１およびＫｐｎＩクローニング部位、ここでＢａｍＨ１認識部位は開始コドンで始まる；Ｓｕｍｍｅｒｓ）、ｐＡｃ７０１およびｐＡｃ７０２（ｐＡｃ７００と同様  読み枠が異なる）、ｐＡｃ３６０（多角体タンパク質開始コドン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｃｏｄｏｎ）の３６塩基対下流ＢａｍＨ１クローニング部位；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（１９５））、およびｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（３種の異なる読み枠、ＢａｍＨ１、ＢｇｌII、ＰｓｔＩ、ＮｃｏＩ、およびＨｉｎｄIIIクローニング部位を有する、ＰｒｏＢｏｎｄ精製用Ｎ末端ペプチド、およびプラークのｂｌｕｅ／ｗｈｉｔｅ組換えスクリーニング；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（２２０）など、ただしこれらだけに限定されない融合（ｆｕｓｉｏｎ）トランスファー・ベクターの両方を使用することができる。
【００９５】
本発明での使用が考えられる哺乳動物発現ベクターには、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーターなどの誘導性プロモーターを有するベクター、例えば、ＤＨＦＲ発現ベクターを含む任意の発現ベクター、またはｐＥＤ（ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＳｂａＩ、ＳｍａＩ、およびＥｃｏＲＩクローニング部位、クローン化された遺伝子とＤＨＦＲの両方を発現するベクターを含む；Ｋａｕｆｍａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１６.１２（１９９１）参照）などのＤＨＦＲ／メトトレキセート共増幅（ｃｏ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）ベクターなどがある。あるいは、ｐＥＥ１４（ベクターがグルタミン合成酵素および遺伝子クローンを発現するＨｉｎｄIII、ＸｂａＩ、ＳｍａＩ、ＳｂａＩ、ＥｃｏＲＩ、およびＢｃｌＩクローニング部位、；Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）などのグルタミン合成酵素／メチオニンスルホキシイミン共増幅ベクターを含む。別の一実施形態では、ｐＲＥＰ４（ＢａｍＨ１、ＳｆｉＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄIII、ＮｈｅＩ、ＰｖｕII、およびＫｐｎＩクローニング部位、構成的ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ハイグロマイシンで選択可能なマーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４（ＢａｍＨ１、ＳｆｉＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄIII、ＮｈｅＩ、ＰｖｕII、およびＫｐｎＩクローニング部位、構成的ｈＣＭＶ前初期遺伝子、ハイグロマイシンで選択可能なマーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＥＰ４（ＫｐｎＩ、ＰｖｕＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄIII、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＳｆｉＩ、ＢａｍＨ１クローニング部位、誘導性メタロチオネインIIａ遺伝子プロモーター、ハイグロマイシンで選択可能なマーカー：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ８（ＢａｍＨ１、ＸｈｏＩ、Ｎｏｔｌ、ＨｉｎｄIII、ＮｈｅＩ、およびＫｐｎＩクローニング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ヒスチジノールで選択可能なマーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ９（ＫｐｎＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄIII、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＳｆｉＩ、およびＢａｍＨＩクローニング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、Ｇ４１８で選択可能なマーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＥＢＶＨｉｓ（ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ハイグロマイシンで選択可能なマーカー、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂で精製できエンテロキナーゼで切断されるＮ末端ペプチド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）など、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）の制御下でエピソームの発現を誘導するベクターを使用することができる。本発明で使用する選択可能な哺乳動物発現ベクターは、ｐＲｃ／ＣＭＶ（ＨｉｎｄIII、ＢｓｔXI、ＮｏｔＩ、ＳｂａＩ、およびＡｐａＩクローニング部位、Ｇ４１８選択；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲｃ／ＲＳＶ（ＨｉｎｄIII、ＳｐｅＩ、ＢｓｔXI、ＮｏｔＩ、ＸｂａＩクローニング部位、Ｇ４１８選択；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などである。本発明により使用されるワクシニア・ウイルス哺乳動物発現ベクター（Ｋａｕｆｍａｎ、１９９１、同上を参照）は、ｐＳＣ１１（ＳｍａＩクローニング部位、ＴＫ−およびｂ−ｇａｌ選択）、ｐＭＪ６０１（ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＡｆｌＩ、ＮａｒＩ、ＢｓｐＭII、ＢａｍＨＩ、��ｐａＩ、ＮｈｅＩ、ＳａｃII、ＫｐｎＩ、およびＨｉｎｄIIIクローニング部位；ＴＫ−およびｂ−ｇａｌ選択）、およびｐＴＫｇｐｔＦ１Ｓ（ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＡｃｃＩ、ＨｉｎｄＩＩ、ＳｂａＩ、ＢａｍＨＩ、およびＨｐａクローニング部位、ＴＫまたはＸＰＲＴ選択）などであるが、これらだけに限定されない。
【００９６】
酵母発現系も、本発明に従って、ＡＢＣＣ１１ポリペプチドを発現するために使用することができる。例えば、非融合ｐＹＥＳ２ベクター（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＧｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢａｍＨ１、ＳａｃＩ、Ｋｐｎ１、およびＨｉｎｄIIIクローニング部位；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨ１、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、およびＨｉｎｄIIIクローニング部位、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂で精製されエンテロキナーゼで切断されるＮ末端ペプチド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の２つを挙げるだけではあるが、本発明に従って使用することができる。
【００９７】
特定の組換えＤＮＡ分子を同定し単離した後、当分野で既知のいくつかの方法を用いてこれを増殖させることができる。適切な宿主系および増殖条件を確立した後、組換え発現ベクターを増殖させ、多量に調製することができる。先に説明したように、使用できる発現ベクターは、以下のベクターまたはその誘導体などであるが、これらだけに限定されない：ワクシニア・ウイルスまたはアデノウイルスなどのヒトまたは動物ウイルス；バキュロウイルスなどの昆虫ウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージ・ベクター（例えば、ラムダ）、ならびにプラスミドおよびコスミドＤＮＡベクターなどが２、３挙げられる。
【００９８】
また、挿入配列の発現を調節し、遺伝子産物を所望の特定の形式で修飾および加工する宿主細胞株を選択することができる。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後プロセシング、および修飾（例えばシグナル配列の、例えばグリコシル化、切断）について特徴的で特異的な機序を有する。適切な細胞系または宿主系を選択して、発現した外来タンパク質の所望の修飾およびプロセシングを確実にすることができる。例えば、細菌系での発現を用いて、非グリコシル化コア・タンパク質産物を産生することができる。しかし、細菌で発現される膜貫通ＡＢＣＣ１１タンパク質は、正しく折り畳まれないことがある。酵母での発現は、グリコシル化産物を産生することができる。真核細胞での発現では、異種タンパク質「本来の（ｎａｔｉｖｅ）」グリコシル化および折り畳みが起こる可能性を高くすることができる。また、哺乳動物細胞での発現は、ＡＢＣＣ１１活性を再構成または構成できるツールを提供するものである。さらに、ベクター／宿主発現系が異なると、タンパク質分解などのプロセシング反応への影響度が異なることがある。
【００９９】
ベクターは、所望の宿主細胞に当分野で既知の方法、例えば、形質移入、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、ＤＮＡベクター輸送体（例えば、Ｗｕ等、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３〜９６７；ＷｕおよびＷｕ、１９８８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１〜１４６２４；Ｈａｒｔｍｕｔ等、カナダ国特許出願第２,０１２,３１１号、１９９０年３月１５日出願を参照）によって導入される。
【０１００】
このようなＤＮＡを細胞内に導入する場合、外来または異種ＤＮＡを細胞に「形質移入」する。形質移入されたＤＮＡが表現型の変化を起こす場合、細胞は外来または異種ＤＮＡで「形質転換」されている。好ましくは、形質転換ＤＮＡは、（共有結合で）染色体ＤＮＡに組み込まれてその細胞のゲノムを構成すべきである。
【０１０１】
内在性膜タンパク質として発現する組換えマーカー・タンパク質を、標準法により単離し精製することができる。一般に、内在性膜タンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００ポリオキシエチレン・エステル、Ｉｐａｇｅｌ／ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０）（オクチルフェノキシ）−ポリエトキシエタノール、ジゴキシン、デオキシコール酸ナトリウムなど、それらの混合物を含めて、ただしこれらだけに限定されない界面活性剤で膜を溶解して得ることができる。懸濁液を超音波処理して溶解性を上げることができる。溶解した形のタンパク質は、培養液を回収することによって、または封入体を溶解することによって、例えば、上述のように、界面活性剤で処置することによって、また、必要であれば超音波処理または他の機械的な加工によって得ることができる。可溶性または溶解性タンパク質は、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、等電点電気泳動、２次元ゲル電気泳動、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、免疫親和性、およびサイズ分離用カラム・クロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、免疫沈降、または他の標準のタンパク質精製技術など様々な技術を用いて単離することができる。
【０１０２】
あるいは、本発明による核酸またはベクターを、リポフェクションによってインビボで導入することができる。過去１０年間、リポソームを利用してインビトロで核酸を封入および形質移入することが増加している。リポソームで媒介された形質移入で直面する困難や危険を制限するように設計された合成陽イオン性脂質を使用して、マーカーをコードする遺伝子をインビボで形質移入するためのリポソームを調製することができる（Ｆｅｌｇｎｅｒ等（１９８７．ＰＮＡＳ  ８４／７４１３）；Ｍａｃｋｅｙ等（１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：８０２７〜８０３１）；Ｕｌｍｅｒ等（１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５９：１７４５〜１７４８）。陽イオン性脂質の使用により、負に帯電した核酸の封入を促進し、負に帯電した細胞膜との融合を促進することもできる（Ｆｅｌｇｎｅｒ等、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３７：３８７〜３８８）。核酸の移送に特に有用な脂質化合物および組成物は、国際公開第９５／１８８６３号および同９６／１７８２３号、および米国特許第５,４５９,１２７号に記載されている。外来遺伝子を特定の器官にインビボで導入するためにリポフェクションを使用することには、実用上の利点がある。特定の細胞に対するリポソームの分子ターゲティングは、有益な一分野である。特定のタイプの細胞を対象に形質移入することは、すい臓、肝臓、腎臓、脳など、異質の細胞を含む組織において特に好ましいことは明らかである。ターゲティングのために、脂質を他の分子に化学的に結合させることができる［Ｍａｃｋｅｙ等、同上を参照］。標的とするペプチド、例えば、ホルモンまたは神経伝達物質、および抗体などのタンパク質、または非ペプチド分子をリポソームと化学的に結合させることができる。
【０１０３】
陽イオン性オリゴペプチド（例えば、国際公開第９５／２１９３１号）、ＤＮＡ結合タンパク質由来のペプチド（例えば、国際公開第９６／２５５０８号）、陽イオン性ポリマー（例えば、国際公開第９５／２１９３１号）などの他の分子も、インビボでの核酸の形質移入を容易にするために有用である。
【０１０４】
裸のＤＮＡプラスミドとしてベクターをインビボで導入することも可能である（米国特許第５,６９３,６２２号、同第５,５８９,４６６号、および同５,５８０,８５９号参照）。遺伝子治療用の裸のＤＮＡベクターを、当分野で既知の方法、例えば、形質移入、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム沈殿法、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクター輸送体の使用（例えば、Ｗｕ等、１９９２、同上；ＷｕおよびＷｕ、１９８８、同上；Ｈａｒｔｍｕｔ他、カナダ国特許出願第２,０１２,３１１号、１９９０年３月１５日出願；Ｗｉｌｌｉａｍｓ等、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２７２６〜２７３０を参照）によって所望の宿主細胞に導入することができる。受容体を媒介とするＤＮＡ送達手法も使用することができる（Ｃｕｒｉｅｌ等、１９９２、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１４７〜１５４；ＷｕおよびＷｕ、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９〜４４３２）。
【０１０５】
「薬剤として許容されるビヒクルまたは賦形剤」としては、投薬方法として薬剤的に許容され、無菌であり、適切な分散剤、湿潤剤、および懸濁剤を用いて配合される水性懸濁液でも油性懸濁液でもよい、稀釈剤およびフィラーが挙げられる。個々の薬剤として許容される担体および活性化合物と担体の比は、組成物の溶解性および化学的諸性質、個々の投与形態、および標準の製剤上の実務で決まる。
【０１０６】
本発明の核酸、ポリペプチド、ベクター、または宿主細胞は、好ましくは、薬剤として許容されるビヒクルまたは賦形剤中、インビボで導入される。「薬剤として許容される」という句は、生理的に許容され、ヒトに投与した時に胃ぜん動の異常亢進、めまいなどアレルギーや類似の有害反応を通常は起こさない分子体（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｎｔｉｔｉｅｓ）および組成物にあてはまる。好ましくは、本明細書で使用する「薬剤として許容される」という用語は、連邦政府または州政府の規制当局、あるいは米国薬局方、または動物、より具体的にはヒトへの使用が一般に認められた他の薬局方に列記されている規制当局によって認可されたことを意味する。「賦形剤」という用語は、前記化合物とともに投与される稀釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。このような薬剤担体は、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など石油、動物、植物、または合成起源の液体を含めて、水や油などの無菌液体とすることができる。好ましくは、水、水溶液、食塩水、水性ブドウ糖、およびグリセロール溶液が、賦形剤、特に注射液として使用される。適切な薬剤の賦形剤は、Ｅ.Ｗ.Ｍａｒｔｉｎ著「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。
【０１０７】
したがって、本発明は、治療に有効な量の遺伝子治療用ＡＢＣＣ１１ポリペプチドを発現するベクターを送達しようとするものである。「治療に有効な量」という句は、本明細書では、宿主の活性、機能、および応答における臨床的に有意な障害を少なくとも約１５パーセント、好ましくは少なくとも５０パーセント、より好ましくは少なくとも９０パーセント減少させ、さらに好ましくは防止するのに十分な量を意味するのに使用する。あるいは、治療に有効な量は、宿主の臨床的に有意な状態を改善するのに十分な量である。
【０１０８】
ＡＢＣＣ１１遺伝子の核酸
本出願人らは、ＡＢＣＣ１１と称する新規なヒトＡＢＣＣ様遺伝子を同定した。本出願人らは、この新規な遺伝子が染色体１６ｑ１２領域（図２）上に位置することも明らかにした。
本出願人らは、ＡＢＣＣ１１遺伝子が独特な発現パターンを有することも明らかにし、対応するタンパク質が組織特異的な機能を果たすことができることを示した（実施例５）。実際に、ＡＢＣＣ１１遺伝子の発現パターンを、１６種の異なるヒト組織のｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）についてＲＴ−ＰＣＲで検討した。発現パターンから、腎臓、ひ臓、および結腸を除くすべての組織で、約５ＫｂのＡＢＣＣ１１転写物が発現することが判明した。
本出願人らは、さらに、ＡＢＣＣ１１の全コード配列（ＣＤＳ）に対応する転写候補配列を決定し、本発明によるＡＢＣＣ１１が２９個のエクソンと２８個のイントロンを含むことを明らかにした。エクソンにはすべてＧＴおよびＡＧジヌクレオチドが隣接し、真核生物遺伝子のスプライス部位に対するコンセンサス配列と一致した（表１）。
【０１０９】
【表１】
2004531241.tif 000004
【０１１０】
したがって、本出願人らは、対応するＡＢＣＣ１１遺伝子または試料中のヌクレオチド発現産物を検出する様々な手段を作り出すのに本発明による特に有用な、新規なヒトＡＢＣＣ１１遺伝子のエクソン配列の特徴を明らかにした。
ＡＢＣＣ１１遺伝子のいくつかのエクソンをそのヌクレオチド配列で特徴づけて表２に示した。ヒトＡＢＣＣ１１遺伝子は、サイズが７２〜２５２ｂｐの２９個のエクソンからなる。ＡＢＣＣ１１遺伝子の２８個のイントロンのうち、１８個はクラス０（スプライスはコドンとコドンの間で起こる）、４個はクラス１（コドンは第１と第２のヌクレオチド間で中断される）、６個はクラス２（スプライスはコドンの第２と第３のヌクレオチド間で起こる）である。
【０１１１】
【表２】
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【０１１２】
したがって、本発明は、配列番号１〜３０のいずれか１つまたはその相補的な配列を含む核酸にも関する。
本発明は、配列番号１〜３０のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸にも関する。
本発明は、配列番号１〜３０のいずれか１つまたは相補的なヌクレオチド配列のうち、少なくとも８個の連続したヌクレオチドを含む核酸にも関する。
また、本発明の主題は、配列番号１〜３０のいずれか１つまたはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸と、少なくとも８０％のヌクレオチドが同一である核酸である。
本発明は、配列番号１〜３０のいずれか１つを含む核酸と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％のヌクレオチドが同一である核酸にも関する。
本発明は、配列番号１〜３０のいずれか１つまたはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸と、厳密性の高い条件下でハイブリッド形成する核酸にも関する。
【０１１３】
ＡＢＣＣ１１タンパク質をコードするｃＤＮＡ分子
さらに、本出願人らは、ヒトＡＢＣＣ１１遺伝子に対応するｃＤＮＡ配列および全コード配列（ＣＤＳ）を決定し、完全長ヒト対応タンパク質をコードした（実施例２）。
新規なヒトＡＢＣＣ１１遺伝子のｃＤＮＡ分子は、配列番号１で示される４８６２ヌクレオチドからなり、発作性運動誘発性舞踏アテトーゼの障害に罹っていない対象中で産生される１３８２アミノ酸（ａａ）のＡＢＣＣ１１ポリペプチド（配列番号３１）に対応する４１８２ヌクレオチドのコード配列を含む。配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含む新規なヒトＡＢＣＣ１１遺伝子のｃＤＮＡ分子は、位置３１８のヌクレオチドから位置４４９９のヌクレオチド（ＴＡＡ停止コドンの塩基Ａ）までのオープン・リーディング・フレームを含む。本発明によれば、ＡＢＣＣ１１  ｃＤＮＡ（配列番号１）は、配列番号１のヌクレオチド３５１（ＡＴＧ翻訳開始コドンの塩基Ａ）からヌクレオチド４４９９までの４１４９ｂｐのコード配列を含み、配列番号３１の１３８２アミノ酸の完全長ＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードする。
【０１１４】
したがって、本発明は、配列番号１またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸を対象とする。
本発明は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸にも関する。
本発明は、配列番号１またはその相補的なヌクレオチド配列のうち、少なくとも８個の連続したヌクレオチドを含む核酸にも関する。
また、本発明の主題は、配列番号１のヌクレオチドを含む核酸またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸と、少なくとも８０％のヌクレオチドが同一である核酸である。
本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸と、少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％のヌクレオチドが同一である核酸にも関する。
本発明の別の一主題は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸と、厳密性の高い条件下でハイブリッド形成する核酸である。
【０１１５】
本発明は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸にも関する。
本発明は、配列番号３１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸にも関する。
本発明は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドにも関する。
本発明は、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドにも関する。
本発明は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそのペプチド断片と、少なくとも８０％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドにも関する。
本発明は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％のアミノ酸が同一であるポリペプチドにも関する。
本発明によるポリペプチドは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む本発明によるポリペプチドの４、５〜１０、１５、１８または２０〜２５、３５、４０、５０、７０、８０、１００または２００の連続したアミノ酸長を有することが好ましい。
【０１１６】
ヒドロパシー・プロファイルに基づくトポロジー予測および他の既知のＡＢＣ輸送体との比較から、コードされたＡＢＣＣ１１タンパク質は、（Ｗａｌｋｅｒ  ＡおよびＢドメイン、およびシグネチャー・モチーフ（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｍｏｔｉｆｓ）を含めた）２つのＡＴＰ結合ドメインおよび２つの膜貫通ドメインを含む完全ＡＢＣ輸送体であることが示唆された（図１）。ＡＢＣＣ１１のアミノ酸配列は、４１％がヒトＡＢＣＣ５タンパク質と同一であり、３６％がヒトＡＢＣＣ４、３２％がヒトＡＢＣＣ２およびＡＢＣＣ３タンパク質と同一である。ＡＢＣＣ１１タンパク質は、ＡＢＣＣ４およびＡＢＣＣ５タンパク質同様、サブグループの他の周知のメンバーであるＡＢＣＣ１（ＭＲＰ１）よりも小さく、余分なＮ末端ドメインを欠いていると思われるが（Ｂｏｒｓｔ等、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ、２０００、９２、１２９５〜３０２）、このＮ末端ドメインは輸送機能には不要であることが判明している（Ｂａｋｏｓ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、１９９８、２７３、３２１６７〜７５）。
【０１１７】
【表３】
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【０１１８】
ＡＢＣＣ１１、ＡＢＣＣ１２、およびＡＢＣＣ５遺伝子のアミノ酸配列の整列から、配列全体にわたり４９〜４１％の同一性が示されている（表３および図１）。
【０１１９】
ＡＢＣＣサブファミリー・タンパク質の系統学的解析によって、ＡＢＣＣ１１遺伝子とＡＢＣＣ５遺伝子の進化上の密接な関係が明らかとなっている（図４）。また、系統樹の解析によって、ＡＢＣＣ８とＡＢＣＣ９遺伝子が最近２組に分岐したこと、一方、ＡＢＣＣ１０が共通祖先から最初に分離した遺伝子の１つであることが示唆されている。ＡＢＣＣ１、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＣ３、およびＡＢＣＣ６の各遺伝子は明確に規定されたサブ・クラスターを構成し、一方、ＡＢＣＣ４とＣＦＴＲ（ＡＢＣＣ７）遺伝子は明らかに初期に分岐したにもかかわらず別の確実なサブセットを形成している。
【０１２０】
ＡＢＣＣ１１遺伝子内の多型性
家族の数人が発作性運動誘発性舞踏アテトーゼに罹った家族に属する数人のゲノムＤＮＡについて、ＡＢＣＣ１１遺伝子の突然変異を分析することができる。本発明に従って、ＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードするＡＢＣＣ１１遺伝子のコード領域で、単一のヌクレオチド多型を同定した。この変異は、より正確には第１エクソン中に位置し、その中で配列番号１の位置５６にあるＧ（グアニン）はＡ（アデニン）で置換され、その結果配列配列番号３１の位置１９でアルギニン（Ｒ）はヒスチジン（Ｈ）で置換されていた。
【０１２１】
試料中のＡＢＣＣ１１の突然変異配列を検出する手段、特に、ＡＢＣＣ１１の突然変異配列と特異的にハイブリッド形成するプローブ、または上記変異を有するＡＢＣＣ１１遺伝子の領域を選択的に増幅することを可能にするプライマー対を作製するために、ＡＢＣＣ１１の正規の配列を突然変異配列（ゲノム配列、メッセンジャーＲＮＡ、ｃＤＮＡ）から区別することを可能にする構造的特徴を利用することができる。特に、増幅された核酸断片の長さを区別することによって、上記特異的プローブを利用して増幅断片をハイブリダイゼーションにかけることによって、またはこれらの増幅断片を直接配列決定することによって、これらの突然変異の存在を検出することが可能である。
【０１２２】
本発明によるＡＢＣＣ１１遺伝子多型の多型塩基の１つを含む所与の対立遺伝子と特異的にハイブリッドを形成するヌクレオチド・プローブまたはヌクレオチド・プライマーを利用して、対象から得たＤＮＡサンプル中のこれらの多型を検出することもできる。
説明のために示すと、適切なヌクレオチド・プライマーは、例えば、その３’末端塩基が前記多型性を有する断片の多型塩基の５’側のすぐ近くに位置する塩基とハイブリッドを形成するプライマーである。特異的なプライマーのハイブリダイゼーション・ステップ後、例えば蛍光によって示差的に標識された、前記多型の多型塩基に相補的な２つのジデオキシヌクレオチドの混合物で伸長させるステップ、次いで得られた蛍光シグナルを検出するステップによって、２つの示差的に標識された蛍光ジデオキシヌクレオチドのどちらが取り込まれたかを決定し、この多型に存在する多型塩基の性質を直接推定することが可能になる。
【０１２３】
様々な手法を用いて、ジデオキシヌクレオチドを標識し検出することができる。ＦＲＥＴ（「蛍光共鳴エネルギー移動」）に基づく均一相での方法が、ＣｈｅｎおよびＫｗｏｋ（１９９７）によって記述されている。この方法によれば、多型性を含むゲノムＤＮＡの増幅された断片を、５’末端をフルオレセインで標識したプライマーとともに、標識ジデオキシヌクレオチド三リン酸および修飾Ｔａｑポリメラーゼの存在下でインキュベートする。相補的なゲノムＤＮＡ配列上に存在する対立遺伝子に特異的な標識ジデオキシヌクレオチドの取り込みによって、標識プライマーを１塩基分伸長させる。この遺伝子型決定反応の最後に、分離や精製を行わずに標識ジデオキシヌクレオチドの２つの標識化合物の蛍光強度を直接分析する。これら全ステップを、同じチューブで実施し、実時間でモニターされる蛍光シグナルで修飾して実施することができる。別の一実施形態によれば、伸長されたプライマーを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析法によって分析することができる。多型部位に位置する塩基を、マイクロシークエンシング・プライマーの質量増加を測定して同定する（ＨａｆｆおよびＳｍｉｒｎｏｖ、１９９７）。
このようなヌクレオチド・プライマーを、例えば担体上に固定することができる。また、各プライマーがそれぞれ本発明によるＡＢＣＣ１１遺伝子の多型性の１つを検出するのに適している複数の上記特異的プライマーを、担体上に例えば整然と固定することができる。
【０１２４】
本発明によるＡＢＣＣ１１遺伝子の多型は、対象における所与の対立遺伝子の存在と所与の病理、特に、染色体領域１６ｑ１２、好ましくはコレステロールの逆輸送の障害に関連する病理とすでに関連付けられている病理の１つに対するこの対象の素因との関連性を研究する際に、特に遺伝マーカーとして有用である。
【０１２５】
複雑な形質（表現型）の遺伝分析方法には、様々なタイプがある（ＬａｎｄｅｒおよびＳｃｈｏｒｋ、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６５、２０３７〜２０４８、１９９４）。一般に、遺伝子型と表現型の統計的に有意な相関を示そうとする現況技術で記載されているいずれの方法においても、本発明による二多型性が有用である。二多型性は、連鎖解析および対立遺伝子共有法で使用することができる。本発明による二多型性を使用して、関連性の研究に使用される、すなわちその形質の作用を受けている家族を利用する必要がなく、さらに複雑かつ散発性の形質に関連する遺伝子の同定を可能にする手法に使用される検出可能な形質（表現型）に関連する遺伝子を同定することが好ましい。
【０１２６】
本発明による二多型性を使用する他の統計的方法は、例えばＦｏｒｓｅｌｌ等（Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、１９９７、４２：８９８〜９０３）、Ｘｉｏｎｇ等（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９９、６４：６２９〜６４０）、Ｈｏｒｖａｔｈ等（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９８、６３：１８８６〜１８９７．）、Ｓｈａｍ等（Ａｎｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９５、５９：３２３〜３３６）、またはＮｉｃｋｅｒｓｏｎ等（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１９９２、１２：３７７〜３８７）によって記述されている方法である。
【０１２７】
ヌクレオチド・プローブおよびプライマー
本発明による核酸（ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、ｃＤＮＡ）とハイブリッドを形成するヌクレオチド・プローブおよびプライマーも、本発明の一部を成す。
本発明によれば、配列番号１〜３０のいずれか１つまたは相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドから誘導される核酸断片は、試料中のＡＢＣＣ１１遺伝子またはその断片またはその（突然変異体または多型を含む）変異体のヌクレオチド配列の少なくとも１コピーの存在を検出するのに有用である。
本発明によるヌクレオチド・プローブまたはプライマーは、配列番号１〜３０のいずれか１つまたはその相補的なヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含む。
本発明によるヌクレオチド・プローブまたはプライマーは、配列番号１〜３０のいずれか１つまたは相補的なヌクレオチド配列を含む核酸のうち、少なくとも８個の連続したヌクレオチドを含む。
本発明によるヌクレオチド・プローブまたはプライマーは、本発明による核酸、特に配列番号１〜３０のいずれか１つまたは相補的なヌクレオチド配列を含む核酸の１０、１２、１５、１８または２０〜２５、３５、４０、５０、７０、８０、１００、２００、５００、１０００、１５００の連続したヌクレオチド長を有することが好ましい。
あるいは、本発明によるヌクレオチド・プローブまたはプライマーは、本発明による核酸、より具体的には配列番号１〜３０のいずれか１つまたは相補的なヌクレオチド配列を含む核酸の１２、１５、１８、２０、２５、３５、４０、５０、１００、２００、５００、１０００、１５００の連続したヌクレオチド長を有する断片からなりかつ／またはそれらを含む。
【０１２８】
したがって、本発明によるヌクレオチド・プローブまたはプライマーの定義は、上で定義した厳密性の高いハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１〜３０のいずれか１つまたは相補的なヌクレオチド配列を含む核酸とハイブリッドを形成するオリゴヌクレオチドを包含する。
本発明によるヌクレオチド・プライマーまたはプローブは、クローニングおよび制限酵素作用、あるいはＮａｒａｎｇ等（１９７９、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、６８：９０〜９８）またはＢｒｏｗｎ等（１９７９、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、６８：１０９〜１５１）によるリン酸ジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅ等（１９８１、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ、２２：１８５９〜１８６２）によるジエチルホスホアミダイト法、または欧州特許第０,７０７,５９２号に記載の固体担体に関する技術などの技術に従って行う直接的な化学合成を含めて、当業者に周知の任意の適切な方法によって調製することができる。
【０１２９】
本発明による核酸はそれぞれ、上記オリゴヌクレオチド・プローブおよびプライマーを含めて、所望であれば、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段によって検出できるマーカーを組み入れることによって標識することができる。例えば、このようなマーカーは、放射性同位体（32Ｐ、33Ｐ、3Ｈ、35Ｓ）、蛍光分子（５−ブロモデオキシウリジン、フルオレセイン、アセチルアミノフルオレン、ジゴキシゲニン）、またはビオチンなどのリガンドからなるものでもよい。プローブの標識化は、好ましくは、プライマー伸長により、あるいは５’末端または３’末端に付加することにより、標識分子をポリヌクレオチドに組み入れて実施する。核酸断片の非放射性標識の例は、特にフランス国特許第７８  １０９  ７５号、またはＵｒｄｅａ等（１９８８、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１１：４９３７〜４９５７）、またはＳａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ等（１９８８、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２６（１０）：１９３４〜１９３８）の論文に記載されている。
【０１３０】
好ましくは、本発明によるヌクレオチド・プローブおよびプライマーは、Ｕｒｄｅａ等（１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ．、２４：１９７〜２００）、あるいは欧州特許第０,２２５,８０７号（ＣＨＩＲＯＮ）に記載のプローブなどシグナルの増幅を可能にするタイプの構造的特徴を持つことができる。
【０１３１】
本発明によるオリゴヌクレオチド・プローブは、特に、ゲノムＤＮＡを用いたサザン・ブロット法で、あるいは試料中の対応する転写体を発現させようとするときには対応するメッセンジャーＲＮＡを用いたノーザン・ブロット法で使用することができる。
本発明によるプローブおよびプライマーを、ＰＣＲ増幅産物の検出あるいはミスマッチの検出に使用することもできる。
本発明によるヌクレオチド・プローブまたはプライマーを、固体担体上に固定することができる。このような固体担体は当業者には周知であり、マイクロタイター・プレートのウェル、ポリスチレン・ビーズ、磁気ビーズ、ニトロセルロース・バンド、またはラテックス粒子などの微粒子の表面を含む。
【０１３２】
したがって、本発明は、試料中の配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列または相補的なヌクレオチド配列を含む核酸、または配列番号１〜３０のいずれか１つの核酸断片または変異体または相補的なヌクレオチド配列の存在を検出する方法にも関する。この方法は、以下のステップ、すなわち
１）本発明による１個または複数のヌクレオチド・プローブまたはプライマーを試験試料と接触させること、
２）プローブと試料中に存在する核酸とで形成される複合物を検出することを含む。
本発明による検出方法の特定の一実施形態によれば、オリゴヌクレオチド・プローブおよびプライマーは担体上に固定されている。
別の一態様によれば、オリゴヌクレオチド・プローブおよびプライマーは検出可能なマーカーを含む。
【０１３３】
また、本発明は、試料中の本発明による核酸の存在を検出するためのボックスまたはキットに関する。このボックスまたはキットは、
ａ）１個または複数の上記ヌクレオチド・プローブまたはプライマー、
ｂ）適切であれば、ハイブリダイゼーション反応に必要な試薬を含む。
【０１３４】
第１の態様によれば、検出ボックスまたはキットは、プローブまたはプライマーが担体上に固定されていることを特徴とする。
第２の態様によれば、検出ボックスまたはキットは、オリゴヌクレオチド・プローブが検出可能なマーカーを含むことを特徴とする。
上記検出キットの特定の一実施形態によれば、このようなキットは、対象とする標的核酸を検出するために、あるいは本発明による核酸、より具体的には配列番号１〜２８のいずれか１つまたは相補的なヌクレオチド配列を含む核酸のコード領域または非コード領域における突然変異を検出するために使用できる本発明による複数のオリゴヌクレオチド・プローブおよび／またはプライマーを含む。
【０１３５】
したがって、本発明によるプローブは、担体上に固定され、「ＤＮＡチップ」などのマトリックス中に配列することができる。このような配列マトリックスは、特に米国特許第５,１４３,８５４号、国際公開第９０／１５０７０号、同第９２／１００９２号に記載されている。
【０１３６】
オリゴヌクレオチド・プローブが高密度で固定された担体マトリックスは、例えば、米国特許第５,４１２,０８７号および国際公開第９５／１１９９５号に記載されている。
本発明によるヌクレオチド・プライマーを使用して、本発明による核酸のいずれか１つ、より具体的には配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列または相補的なヌクレオチド配列を含む核酸を増幅することができる。あるいは、本発明によるヌクレオチド・プライマーを使用して配列番号１〜３０のいずれか１つまたは相補的なヌクレオチド配列の核酸断片または変異体を増幅することができる。
【０１３７】
特定の一実施形態では、本発明によるヌクレオチド・プライマーを使用して、配列番号１〜３０のいずれか１つ、配列番号１〜３０のいずれか１つで示される、または相補的なヌクレオチド配列を含む核酸を増幅することができる。
【０１３８】
本発明の別の一主題は、本発明による核酸、より具体的には試料に含まれるａ）配列番号１〜３０のいずれか１つまたは相補的なヌクレオチド配列、ｂ）配列番号１〜３０のいずれか１つで示されるまたは相補的なヌクレオチド配列を含む核酸を増幅する方法に関する。この方法は、以下のステップ、すなわち、
ａ）標的核酸が存在すると推定される試料を、増幅反応に必要な試薬の存在下で、増幅しようとする標的核酸領域のそれぞれ５’側および３’側にそのハイブリダイゼーション位置がある一対のヌクレオチド・プライマーと接触させること、および
ｂ）増幅した核酸を検出することを含む。
好ましくは、上記ヌクレオチド・プライマーのいずれかを上記増幅方法を実施するのに使用する。
【０１３９】
また、本発明の主題は、本発明による核酸、より具体的には配列番号１〜３０のいずれか１つまたは相補的なヌクレオチド配列、または配列番号１〜３０のいずれか１つで示されるまたは相補的なヌクレオチド配列を含む核酸を増幅するためのボックスまたはキットである。このボックスまたはキットは、
ａ）増幅しようとする標的核酸のそれぞれ５’側および３’側にそのハイブリダイゼーション位置がある一対の本発明によるヌクレオチド・プライマーと、場合によっては、
ｂ）増幅反応に必要な試薬とを含む。
このような増幅ボックスまたはキットは、好ましくは、少なくとも一対の上記ヌクレオチド・プライマーを含む。
【０１４０】
また、本発明の主題は、配列番号１〜３０のいずれか１つまたは相補的なヌクレオチド配列を含む核酸の全部または一部を増幅するためのボックスまたはキットである。このボックスまたはキットは、
１）増幅しようとする標的核酸のそれぞれ５’側および３’側にそのハイブリダイゼーション位置がある一対の本発明によるヌクレオチド・プライマーと、場合によっては、
２）増幅反応に必要な試薬とを含む。
このような増幅ボックスまたはキットは、好ましくは、少なくとも一対の上記ヌクレオチド・プライマーを含む。
【０１４１】
本発明は、試料中の本発明による核酸の存在を検出するためのボックスまたはキットにも関する。このボックスまたはキットは、
ａ）本発明による１個または複数のヌクレオチド・プローブ、
ｂ）適切であれば、ハイブリダイゼーション反応に必要な試薬を含む。
【０１４２】
第１の態様によれば、検出ボックスまたはキットは、ヌクレオチド・プローブおよびプライマーが担体上に固定されていることを特徴とする。
第２の態様によれば、検出ボックスまたはキットは、ヌクレオチド・プローブおよびプライマーが検出可能なマーカーを含むことを特徴とする。
上記検出キットの特定の一実施形態によれば、このようなキットは、対象とする標的核酸を検出する、あるいは本発明による核酸のコード領域または非コード領域における突然変異を検出するために使用することができる本発明による複数のオリゴヌクレオチド・プローブおよび／またはプライマーを含む。本発明の好ましい一実施形態によれば、標的核酸は、配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列、または相補的な核酸配列を含む。あるいは、標的核酸は、配列番号１〜３０のいずれか１つまたは相補的なヌクレオチド配列を含む核酸の核酸断片または変異体である。
【０１４３】
本発明によるヌクレオチド・プライマーは、対象の遺伝子型を決定する方法、および／または集団の遺伝子型を決定する方法に特に有用であり、特に、対象中の特定の対立遺伝子形または特定の形の対立遺伝子群（ハプロタイプ）と、これら対象中の特定の表現型（形質）、例えば１６番染色体上、より正確には１６ｑ腕上、さらに正確には１６ｑ１２遺伝子座にその病理の染色体候補領域が位置する発作性運動誘発性舞踏アテトーゼなどの疾患をこれらの対象にもたらす素因の存在との関連性の研究に特に有用である。
【０１４４】
組換えベクター
本発明は、本発明による核酸を含む組換えベクターにも関する。本発明では「ベクター」は、一本鎖または二本鎖の形の環状または線状のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を意味すると理解される。
好ましくは、このような組換えベクターは、以下の核酸、すなわち、
ａ）配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸、
ｂ）配列番号１〜２９のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸
ｃ）配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸のうち、少なくとも８個の連続したヌクレオチドを含む核酸、
ｄ）配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸と、少なくとも８０％のヌクレオチドが同一である核酸、
ｅ）配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸と、８５％、９０％、９５％、または９８％のヌクレオチドが同一である核酸、
ｆ）厳密性の高いハイブリダイゼーション条件下で、１）配列番号１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸とハイブリッドを形成する核酸、
ｇ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸、および
ｈ）アミノ酸配列配列番号３１を含むポリペプチドをコードする核酸から選択される核酸を含む。
【０１４５】
第１の実施形態によれば、所望の宿主細胞の形質転換または形質移入後に、本発明による組換えベクターを用いて、ベクターに挿入された核酸を増幅する。
第２の実施形態によれば、本発明による組換えベクターは、本発明による核酸に加え、調節シグナルすなわち核酸およびそのコードされたｍＲＮＡの転写および／または翻訳を誘導または制御するヌクレオチド配列を含む発現ベクターに相当する。
好ましい一実施形態によれば、本発明による組換えベクターは、特に、以下の成分、すなわち
（１）プロモーターおよび／またはエンハンサー配列など、挿入する核酸の発現を調整するエレメントまたはシグナル、
（２）このようなベクターに挿入する本発明による核酸の中に含まれ、（１）に記載の調節エレメントまたはシグナルと合致する位置にあるヌクレオチド・コード領域、および  （３）（２）に記載した核酸のヌクレオチド・コード領域の転写を開始および停止するための適切な核酸を含む。
【０１４６】
また、本発明による組換えベクターは、それらを増幅または発現しようとする宿主細胞の１個または複数の複製開始点、マーカーまたは選択可能なマーカーを含むことができる。
例として示すと、細菌プロモーターを、ＬａｃＩまたはＬａｃＺプロモーター、Ｔ３またはＴ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター、ラムダ・ファージＰＲまたはＰＬプロモーターとすることができる。
【０１４７】
真核細胞のプロモーターは、単純ヘルペス・ウイルス（ＨＳＶ）のウイルス・チミジン・キナーゼ・プロモーター、またはマウス・メタロチオネイン−Ｌプロモーターを含む。
【０１４８】
一般に、適切なプロモーターを選択する場合、当業者は、好ましくは、先に引用したＳａｍｂｒｏｏｋ等の本（１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．２ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）またはＦｕｌｌｅｒ等（１９９６、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ等（編）中のＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）によって記述されている技術を参照することができる。
【０１４９】
ＡＢＣＣ１１遺伝子のいずれか１つのゲノム配列を発現させようとするときには、好ましくは、大きな挿入配列を含むことができるベクターを使用する。特定の一実施形態では、好ましくは、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ（１９９２、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．、８：１〜１６；１９９４、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ、５：３９７〜４０４）によって記述されたベクターｐｌ５８またはベクターｐｌ５８／ｎｅｏ８などのＰ１バクテリオファージ・ベクターなどのバクテリオファージ・ベクターを使用する。
【０１５０】
本発明による好ましい細菌ベクターは、例えば、ベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）、あるいはｐＡＡ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＮＩＴＥＤ  ＳＴＡＴＥＳ）などのベクターである。
ベクターｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＡ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴＩ、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などの市販のベクターでもよい。
これらは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来のＳｆ９系統（受託番号ＣＲＬ  １７１１）の細胞を形質移入するために使用されるベクターｐＶＬ１３９２／１３９３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）などのバキュロウイルス型のベクターでもよい。
これらは、タイプ２または５のヒト・アデノウイルスなどのアデノウイルス・ベクターでもよい。
【０１５１】
本発明による組換えベクターは、レトロウイルス・ベクターまたはアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）でもよい。このようなアデノ随伴ベクターは、例えば、Ｆｌｏｔｔｅ等（１９９２、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、７：３４９〜３５６）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ等（１９８９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３：３８２２〜３８２８）、またはＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ＢＡ等（１９９６、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、５９：５６１〜５６９）によって記述されている。
【０１５２】
本発明によるポリヌクレオチドの発現を可能にするには、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入しなければならない。本発明によるポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、プライマー培養（ｐｒｉｍｅｒ  ｃｕｌｔｕｒｅ）または細胞系の形で細胞を形質転換または形質移入するための当業者に周知の技術によって、インビトロで実施することができる。ＡＢＣＣ１１欠損に関連する疾患を予防し治療するために、本発明によるポリヌクレオチドをインビボまたはエクスビボで導入することもできる。
【０１５３】
本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを宿主細胞に導入するために、当業者は、好ましくは、リン酸カルシウム沈殿法（Ｇｒａｈａｍ等、１９７３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６〜４５７；Ｃｈｅｎ等、１９８７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、７：２７４５〜２７５２）、ＤＥＡＥデキストラン（Ｇｏｐａｌ、１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：１１８８〜１１９０）、エレクトロポレーション（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ、１８９６、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、６：７１６〜７１８；Ｐｏｔｔｅｒ等、１９８４、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．、８１（２２）：７１６１〜５）、ダイレクト・マイクロインジェクション（ｄｉｒｅｃｔ  ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）（Ｈａｒｌａｎｄ等、１９８５、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１０１：１０９４〜１０９５）、ＤＮＡを入れたリポソーム（Ｎｉｃｏｌａｕ等、１９８２、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１４９：１５７〜７６；Ｆｒａｌｅｙ等、１９７９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６：３３４８〜３３５２）など様々な技術を参照することができる。
【０１５４】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入した後、その細胞のゲノムにそれを安定に組み込むことができる。相同組換えによってゲノムの正確な部位でこの組込みを行うことができ、あるいは無作為に組込みを行うこともできる。いくつかの実施形態では、細胞周期に無関係にまたは同期してポリヌクレオチドを保持し複製することを可能にする配列を含むエピソーム断片の形で、ポリヌクレオチドを宿主細胞中で安定に維持することができる。
【０１５５】
特定の一実施形態によれば、本発明によるポリヌクレオチドを宿主細胞、特に哺乳動物から得られる宿主細胞にインビボで導入する方法は、適切な調節配列の制御下に置かれた本発明による薬剤として適合するベクターおよび「裸の」ポリヌクレオチドを含む製剤を、選択した組織、例えば心筋組織のレベルで局所注射することによって導入するステップを含み、この「裸の」ポリヌクレオチドはこの組織の筋細胞によって吸収される。
【０１５６】
インビトロおよびインビボで使用する「裸の」ポリヌクレオチドを含む組成物は、例えば国際公開第９５／１１３０７号（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、Ｉｎｓｅｒｍ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｔｔａｗａ）、Ｔａｃｓｏｎ等の論文（１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２（８）：８８８〜８９２）、およびＨｕｙｇｅｎ等の論文（１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２（８）：８９３〜８９８）に記載されている。
【０１５７】
本発明の特定の一実施形態によれば、ＡＢＣＣ１１タンパク質をインビボで産生する組成物が提供される。この組成物は、適切な調節配列の制御下に置かれたＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードする、生理的に許容されるベクター中の溶液状態のポリヌクレオチドを含む。
【０１５８】
選択した宿主生物に注射するベクターの量は、注射部位に応じて変わる。一指針として、動物、好ましくはＡＢＣＣ１１欠損に関連する疾患を発症しそうな患者の体内に、ＡＢＣＣ１１タンパク質をコードするポリヌクレオチド約０.１〜約１００μｇを注射することができる。
したがって、本発明は、ＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする核酸と、１つまたは複数の生理的に適合する賦形剤との組合せを含む、ＡＢＣＣ１１欠損に罹った患者や対象の予防または治療のための薬剤組成物にも関する。
このような組成物は、適切な調節エレメントまたはシグナルの制御下に置かれた配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸を含むことが好ましい。
【０１５９】
本発明の別の主題は、本発明による組換えベクターと、１つまたは複数の生理的に適合する賦形剤との組合せを含む、ＡＢＣＣ１１欠損に罹った患者や対象の予防または治療のための薬剤組成物である。
本発明は、発作性運動誘発性舞踏アテトーゼに罹った対象の予防用または治療用薬剤を製造するための、ＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする本発明による核酸の使用に関する。
本発明は、発作性運動誘発性舞踏アテトーゼの予防用薬剤を製造するための、ＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする核酸を含む本発明による組換えベクターの使用にも関する。
さらに、本発明は、メトトレキセート（ＭＴＸ）などの陰イオン性薬物、ＧＳＨ、グルクロナート、サルフェートなど酸性リガンドに結合した中性薬物の輸送機能障害に関連する病理の治療用または／および予防用の薬剤を製造するための、ＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする核酸を含んだ本発明による組換えベクターの使用にも関する。
【０１６０】
本発明は、メトトレキセート（ＭＴＸ）などの陰イオン性薬物、ＧＳＨ、グルクロナート、サルフェートなど酸性リガンドに結合した中性薬物の輸送障害に関連する病理の治療用および予防用の薬剤を製造するための、ＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする核酸を含む本発明による組換えベクターの使用にも関する。
したがって、本発明の別の主題は、ＡＢＣＣ１１タンパク質またはポリペプチドをコードする本発明による核酸を含む組換えベクターである。
本発明は、欠損または発作性運動誘発性舞踏アテトーゼと関連する疾患または病態の治療用および／または予防用薬剤組成物を製造するためのこのような組換えベクターの使用にも関する。
【０１６１】
本発明は、少なくとも１つの生物活性ＡＢＣＣ１１ポリペプチドを長期にわたり効果的にインビボで発現させるための、本発明によるこのような組換えベクターを用いてエクスビボで遺伝子改変し体内に移植する細胞の使用、または体内に移植する組換えベクター産生細胞の使用にも関する。
【０１６２】
体細胞遺伝子治療法に有用なベクターおよびこのようなベクターを含む組成物
本発明は、ＡＢＣＣ１１欠損に関連した病理の治療のための新しい治療手法にも関する。本発明は、遺伝子治療、発作性運動誘発性舞踏アテトーゼに関わるＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする遺伝子の移送およびインビボでの発現によりＡＢＣＣ１１欠損に関連した病理を治療できる可能性を実証することによって、従来技術の欠点に対する有利な解決策を提供するものである。したがって、本発明は、発作性運動誘発性舞踏アテトーゼなど１６ｑ１２遺伝子座に位置する病理の特異的かつ効果的な治療を可能にする簡単な手段を提供する。
【０１６３】
遺伝子治療は、病気に冒された細胞または器官に遺伝情報を導入することによって、欠損または異常（突然変異、異常発現など）を修正し、治療の対象となるタンパク質の発現を誘発するものである。この遺伝情報を、器官から取り出した細胞中にエクスビボで導入し、次いで修正した細胞を体内に戻すこともできるし、あるいはインビボで適切な組織に直接導入することもできる。後者の場合、様々な技術、なかでもＤＮＡとＤＥＡＥ−デキストランの複合物（Ｐａｇａｎｏ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、１（１９６７）８９１）、ＤＮＡと核タンパク質との複合物（Ｋａｎｅｄａ等、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：３７５）、ＤＮＡと脂質との複合物（Ｆｅｌｇｎｅｒ等、１９８７、ＰＮＡＳ  ８４：７４１３）、リポソームの使用（Ｆｒａｌｅｙ等、１９８０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５５：１０４３１）などを含めた様々な形質移入技術がある。さらに最近では、遺伝子の移送用ベクターとしてウイルスを使用することが、これら物理的形質移入技術の有望な代案として行われている。これに関連して、様々なウイルスが、特定の細胞集団に感染するそれらの能力について評価されてきた。特に、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＨＭＳ、ＭＭＳなど）、ＨＳＶウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびアデノウイルス。
【０１６４】
したがって、本発明は、ＡＢＣＣ１１をコードする遺伝子を移送しインビボで発現させる、ＡＢＣＣ１１欠損に関連する病理を治療するための新しい治療手法にも関する。特に好ましい様式で、本出願人は、今回、ＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする核酸を含む組換えベクターを構築し、これらの組換えベクターをインビボで投与することが可能であり、また、この投与によって、細胞病理作用（ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔ）を起こすことなく、少なくとも１つの生物活性ＡＢＣＣ１１タンパク質をインビボで安定かつ効果的に発現させることが可能になることを発見した。
【０１６５】
アデノウイルスは、ＡＢＣＣ１１遺伝子のいずれか１つを移送し発現させる特に効率的なベクターの１つである。組換えアデノウイルスをベクターとして使用すると、所望の治療効果をもたらすのに十分なレベルでこの遺伝子を発現させることが可能になる。この遺伝子の安定な発現を可能にすることができるレトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などの他のウイルス・ベクターも、本特許請求の範囲に記載されている。
したがって、本発明は、ＡＢＣＣ１１欠損を治療し予防するための新しい手法を提供しようとするものである。
したがって、本発明の別の主題は、ＡＢＣＣ１１タンパク質またはポリペプチドをコードする本発明による核酸を含む組換え欠損ウイルスである。
【０１６６】
本発明は、ＡＢＣＣ１１欠損の治療および／または予防に有用であり得る薬剤組成物を調製するためのこのような組換え欠損ウイルスの使用にも関する。
本発明は、生物活性ＡＢＣＣ１１ポリペプチドを長期にわたり効果的にインビボで発現させるための、本発明によるこのような組換え欠損ウイルスを用いてエクスビボで遺伝子改変し体内に移植する細胞の使用、または体内に移植する組換え欠損ウイルス産生細胞の使用にも関する。
本発明は、制御された発現を誘導でき、かつ通常ＡＢＣＣ１１の発現に関与しない器官においてこのタンパク質の有害な効果を及ぼすことがないので特に有益である。特に、本発明のベクターを産生する細胞、または本発明のベクターにエクスビボで感染した細胞の移植によって、かなりの量のＡＢＣＣ１１タンパク質が放出される。
【０１６７】
本発明で産生されるＡＢＣＣタンパク質輸送体の活性は、ヒトＡＢＣＣ１１型のものでも動物ＡＢＣＣ１１型のものでもよい。本発明で使用する核酸配列（ｎｕｃｌｅｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＲＮＡ（レトロウイルスの場合）、または例えば、１つまたは複数のイントロン（ｇＤＮＡ）を挿入したｃＤＮＡからなるハイブリッド構築体でもよい。これは、合成または半合成配列を含むこともできる。特に有利には、ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡを利用する。特に、ｇＤＮＡを使用するとヒト細胞での発現性が良くなる。これらを本発明によるウイルス・ベクターに取り込ませるには、好ましくは、例えば部位特異的な突然変異生成、特に適切な制限部位を挿入する突然変異生成によってこれらの配列を修飾する。従来技術に記載されている配列は、本発明による使用向けにはまったく構成されておらず、実質的な発現を得るためには、前もって手直しが必要になることがある。本発明では、ヒトＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする核配列を使用することが好ましい。また、ＡＢＣＣ１１タンパク質の誘導体をコードする構築体を使用することもできる。ＡＢＣＣ１１タンパク質の誘導体は、例えば、本来の配列に対する変異、欠失、および／または付加によって得られる任意の配列、および親油性物質を輸送する活性を有する産物をコードする任意の配列を含む。これらの改変を、当業者に既知の技術を用いて行うことができる（以下の一般的な分子生物学技術を参照されたい）。次いで、このようにして得られた誘導体の生物活性を、特に実施例に示すように、細胞からの物質の流出量を測定して容易に決定することができる。本発明ではこれらの誘導体を、プローブとしてそれらの本来の配列または断片を用いたハイブリダイゼーションによって、核酸ライブラリーから得ることもできる。
【０１６８】
これらの誘導体は、特に、それらの結合部位に対して高い親和性を有する分子、プロテアーゼに対してより大きな耐性を示す分子、より高い治療効果またはより少ない副作用または、場合によっては、新しい生物学的諸特性を有する分子である。これらの誘導体は、インビボでの発現性を向上させた改変ＤＮＡ配列も含む。
【０１６９】
第１の実施形態では、本発明は、ＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含む組換え欠損ウイルスに関する。本発明の別の好ましい一実施形態では、組換え欠損ウイルスは、ＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を含む。このＡＢＣＣ１１ポリペプチドはそれぞれ配列番号３１のアミノ酸配列を含むことが好ましい。
本発明のベクターを、様々なタイプのウイルスから調製することができる。アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペス・ウイルス（ＨＳＶ）、またはレトロウイルス由来のベクターを使用することが好ましい。移植しようとする細胞の直接投与、またはエクスビボでの改変にはアデノウイルス、また、産生細胞の移植にはレトロウイルスを使用することが好ましい。
【０１７０】
本発明によるウイルスには欠損があり、すなわち標的細胞中で自己複製できない。したがって、一般に、本発明で使用する欠損ウイルスのゲノムは、感染細胞中でウイルスが複製するのに必要な最低限の配列を欠いている。これらの領域を、（完全にまたは部分的に）除去するか、機能しないようにするか、他の配列、特にＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする核配列で置換することができる。それでも、欠損ウイルスは、ウイルス粒子のキャプシド形成に必要なゲノム配列を保持していることが好ましい。
【０１７１】
より具体的にアデノウイルスに関しては、構造および諸特性が幾分異なる様々な血清型の特徴が明らかとなっている。これらの血清型の中でも、タイプ２または５のヒト・アデノウイルス（Ａｄ  ２またはＡｄ  ５）、あるいは動物起源のアデノウイルス（国際公開第９４／２６９１４号参照）が、本発明では好ましく使用される。本発明で使用できる動物起源のアデノウイルスには、イヌ、ウシ、ネズミ（例：Ｍａｖ１、Ｂｅａｒｄ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５（１９９０）８１）、ヒツジ、ブタ、トリ、またはサル（例：ＳＡＶ）起源のアデノウイルスなどがある。この動物起源のアデノウイルスは、好ましくはイヌ・アデノウイルス、より好ましくはＣＡＶ２アデノウイルス（例えば、ＭａｎｈａｔｔａｎまたはＡ２６／６１株（ＡＴＣＣ  ＶＲ−８００））である。好ましくは、ヒトまたはイヌまたは混合起源のアデノウイルスを本発明では使用する。本発明の欠陥アデノウイルスは、ＩＴＲ、キャプシド形成を可能にする配列、およびＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする配列を含むことが好ましい。本発明のアデノウイルスのゲノムでは、少なくともＥ１領域を機能しなくすることが好ましい。本発明のアデノウイルスのゲノムにおいて、Ｅ１遺伝子と、Ｅ２、Ｅ４、Ｌ１〜Ｌ５遺伝子の少なくとも１つを機能しなくすることがさらに好ましい。当業者に既知の任意の技術によって、特に、対象とする遺伝子における完全な抑圧、置換、部分的欠失、あるいは１つまたは複数の塩基の付加によって、対象とするウイルス遺伝子を機能しなくすることができる。このような改変は、インビトロ（単離されたＤＮＡ上で）またはイン・サイチュで、例えば、遺伝子工学技術、変異誘発物質を用いた処置によって行うことができる。他の領域、特にＥ３（国際公開第９５／０２６９７号）、Ｅ２（同第９４／２８９３８号）、Ｅ４（同第９４／２８１５２号、同第９４／１２６４９号、同第９５／０２６９７号）、およびＬ５（同第９５／０２６９７号）領域も改変することができる。好ましい一実施形態によれば、本発明によるアデノウイルスは、Ｅ１およびＥ４領域に欠失があり、不活性化されたＥ１領域に、ＡＢＣＣ１１をコードする配列が挿入されている。別の好ましい一実施形態によれば、Ｅ１領域に欠失があり、そこにＥ４領域およびＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする配列（フランス国特許出願第９４  １３３５５号）が挿入されている。
【０１７２】
本発明による組換え欠損アデノウイルスは、当業者に既知の任意の技術（Ｌｅｖｒｅｒｏ等、１９９１  Ｇｅｎｅ  １０１；欧州特許第１８５  ５７３号；およびＧｒａｈａｍ、１９８４、ＥＭＢＯ  Ｊ．、３：２９１７）によって調製することができる。特に、これらの組換え欠損アデノウイルスは、アデノウイルスととりわけＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする核酸を有するプラスミドとの相同組換えによって調製することができる。この相同組換えを、このアデノウイルスとプラスミドを適切な細胞系に同時形質移入した後に行う。これに使用する細胞系は、好ましくは（ｉ）これらのエレメントによって形質転換可能でなければならず、（ii）欠損アデノウイルス・ゲノム部分を、好ましくは組換えの危険性を避けるために組み込まれた形で補完できる配列を含まなければならない。系の例としては、特にそのゲノム中に組み込まれたＡｄ５アデノウイルスのゲノムの左部分（１２％）を含むヒト胚性腎系２９３（Ｇｒａｈａｍ等、１９７７、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９）、または特に国際公開第９４／２６９１４号および同第９５／０２６９７号に記載されているＥ１およびＥ４機能を補完できる系などがある。
【０１７３】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、比較的小さいＤＮＡウイルスであり、感染した細胞のゲノム中に安定かつ部位特異的に組み込まれる。このウイルスは、細胞の増殖、形態、または分化にいかなる影響も及ぼすことなく、多様な細胞に感染することができる。また、このウイルスはヒトの病理に関与しないと考えられる。ＡＡＶのゲノムは、クローン化され、その配列が決定され、その特徴が明らかにされている。このゲノムは約４７００塩基を含み、その両端にこのウイルスの複製開始点として働く約１４５塩基の逆方向反復領域（ＩＴＲ）を含む。このゲノムの残りの部分は、キャプシド形成機能を有する２つの基本領域に分割される。このゲノムの左部分はｒｅｐ遺伝子を含み、ウイルス複製およびウイルス遺伝子の発現に関与している。このゲノムの右部分は、ウイルス・キャプシド・タンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を含む。
【０１７４】
遺伝子をインビトロおよびインビボで移送するのにＡＡＶ由来のベクターを使用することは、文献（特に国際公開第９１／１８０８８号；国際公開第９３／０９２３９号；米国特許第４,７９７,３６８号、同第５,１３９,９４１号、欧州特許第４８８  ５２８号を参照されたい）に記載されている。これらの出願特許は、ｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子が欠失し対象とする遺伝子で置換されたＡＡＶ由来の様々な構築体、およびインビトロ（培養細胞上で）またはインビボ（直接生体内に）で対象とする前記遺伝子を移送するためのこの構築体の使用について記載している。しかし、これらの文献のうち、ＡＢＣＣ１１タンパク質のインビボまたはエクスビボでの移送および発現に組換えＡＡＶを使用すること、あるいはこのような移送の利点について記載または示唆しているものはない。本発明による組換え欠損ＡＡＶは、ヒト・ヘルパー・ウイルス（例えば、アデノウイルス）に感染した細胞系に、２つのＡＡＶ逆方向反復領域（ＩＴＲ）が両端についたＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする配列を含むプラスミドとＡＡＶキャプシド形成遺伝子（ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子）を有するプラスミドとを同時形質移入して調製することができる。次いで、生成した組換えＡＡＶを常法により精製する。
【０１７５】
ヘルペス・ウイルスおよびレトロウイルスについては、組換えベクターの構築が広く文献に記載されている。特に、Ｂｒｅａｋｆｉｅｌｄ等（１９９１、Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、３：２０３）；欧州特許第４５３２４２号、同第１７８２２０号、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ他（１９８５）；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ、（１９８５．ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３：６８９）などを参照されたい。
【０１７６】
特に、レトロウイルスは、分裂中の細胞に感染する組込みウイルス（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓｅｓ）である。レトロウイルスのゲノムは、基本的に、２つの長末端反復（ＬＴＲ）、キャプシド形成配列、および３つのコード領域（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を含む。レトロウイルス由来の組換えベクターでは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ各遺伝子は、一般に、完全にまたは部分的に欠失しており、対象とする異種核酸配列で置換されている。これらのベクターは、特にＭｏＭｕＬＶ（「ネズミ・モロニー白血病ウイルス」；ＭｏＭＬＶとも呼ばれる）、ＭＳＶ（「ネズミ・モロニー肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「ハーベイ肉腫ウイルス」）；ＳＮＶ（「ひ臓壊死ウイルス」）；ＲＳＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）、またはフレンド・ウイルスなどの様々なタイプのレトロウイルスから生成させることができる。
【０１７７】
本発明によるＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする配列を含む組換えレトロウイルスを構築するには、特にＬＴＲ、キャプシド形成配列、および前記コード配列を含むプラスミドを一般に構築し、次いでそれを使用して、プラスミドに欠けているレトロウイルス機能を途中で付与できるいわゆるキャプシド形成細胞系（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）を形質移入する。したがって、このキャプシド形成系は、一般にｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ各遺伝子を発現することができる。このようなキャプシド形成系、特にＰＡ３１７系（米国特許第４,８６１,７１９号）、ＰｓｉＣＲＩＰ系（国際公開第９０／０２８０６号）、およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２系（国際公開第８９／０７１５０号）は従来技術に記載されている。また、組換えレトロウイルスは、転写活性を抑制するためにＬＴＲに改変を含み、ｇａｇ遺伝子の一部を含む拡張キャプシド形成配列を含むことができる（Ｂｅｎｄｅｒ等、１９８７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６１：１６３９）。次いで、生成した組換えレトロウイルスを常法により精製する。
【０１７８】
本発明を実施するには、組換え欠損アデノウイルスを使用することが好ましい。アデノウイルスの特に有益な諸特性は、親油性物質輸送活性を有するタンパク質をインビボで発現するのに好ましい。本発明によるアデノウイルス・ベクターは、精製した懸濁液をインビボで直接投与するのに、あるいは細胞、特に移植の点で自己細胞をエクスビボで形質転換するのに特に好ましい。また、本発明によるアデノウイルス・ベクターは、これに加えて、特に感染効率が極めて高く、少量のウイルス懸濁液を用いて感染させることができるなど多くの利点を持つ。
【０１７９】
本発明の別の特に好ましい実施形態によれば、ＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする配列を含むレトロウイルス・ベクターを生成する系を、インビボでの移植に使用する。この目的に使用できる系は、本発明によるＡＢＣＣ１１およびＡＢＣＣ１２タンパク質のいずれか１つをコードする核配列を含むレトロウイルスを生成できるように改変された特にＰＡ３１７細胞（米国特許第４,８６１,７１９号）、ＰｓｉＣｒｉｐ細胞（国際公開第９０／０２８０６号）およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２細胞（米国特許第５,２７８,０５６号）である。例えば、血液細胞系の前駆体である全能性幹細胞を対象から収集し単離することができる。次いで、これらの細胞を、培養時、ウイルス・プロモーター、非ウイルス・プロモーター、またはマクロファージに特異的な非ウイルス・プロモーターの制御下またはそれ自身のプロモーターの制御下にあるＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする配列を含むレトロウイルス・ベクターで形質移入することができる。次いで、これらの細胞を対象中に戻す。これらの細胞の分化により、ＡＢＣＣ１１タンパク質を発現する血球が生成する。
【０１８０】
本発明のベクターにおいては、ＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする配列を、感染細胞中でその発現を可能にするシグナルの制御下に置くことが好ましい。このシグナルは相同の発現シグナルでも異種の発現シグナル、すなわちＡＢＣＣ１１タンパク質の発現を自然にもたらすシグナルとは異なるシグナルでもよい。このシグナルは、特に他のタンパク質の発現をもたらす配列、または合成配列でもよい。特に、このシグナルは、特異的な形式などで、あるいは誘導的な形式などで遺伝子の転写を刺激しまたは抑制する、真核生物遺伝子配列またはウイルス遺伝子配列または誘導配列（ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）でもよい。例として、このシグナルは、感染しようとする細胞のゲノム由来のプロモーター配列、ウイルスのゲノム由来のプロモーター配列、および特にアデノウイルスのＥ１Ａ遺伝子または主要後期プロモーター（ｍａｊｏｒ  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）（ＭＬＰ）遺伝子のプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲなどでもよい。真核生物のプロモーターは、ユビキタス・プロモーター（ＨＰＲＴ、ビメンチン、α−アクチン、チューブリンなど）、中間径フィラメント（デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰなど）のプロモーター、（ＭＤＲ、ＣＦＴＲ、または第VIII因子型などの）治療用遺伝子のプロモーター、組織特異的プロモーター（ピルビン酸キナーゼ、ビリン、腸の脂肪酸結合タンパク質のプロモーター、平滑筋細胞のα−アクチンのプロモーター、肝臓に特異的なプロモーター；Ａｐｏ  ＡＩ、Ａｐｏ  ＡII、ヒト・アルブミンなど）、または（ステロイド・ホルモン受容体、レチノイン酸受容体など）刺激に対応するプロモーターなどでもよい。また、これらの発現配列は、エンハンサーまたは調節配列などを付加して改変することができる。また、挿入遺伝子が発現配列を含まないときには、この挿入遺伝子を欠損ウイルスのゲノムのこのような配列の下流に挿入することができる。
【０１８１】
特定の一実施形態では、本発明は、ＲＳＶ−ＬＴＲまたはＣＭＶ初期プロモーターから選択されるプロモーターの制御下にあるＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする核酸を含む組換え欠損ウイルスに関する。
上述したように、本発明は、親油性物質の輸送に関連した病理の治療および／または予防用薬剤組成物を調製するための上記ウイルスの使用にも関する。
【０１８２】
本発明は、上記１つまたは複数の組換え欠損ウイルスを含む薬剤組成物にも関する。これらの薬剤組成物を、局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、または経皮経路などによる投与用に処方することができる。本発明の薬剤組成物は、注射製剤、特に例えば患者の門脈中などへの静脈内注射用の、薬剤として許容されるビヒクルまたは生理的に適合する賦形剤を含むことが好ましい。これらのビヒクルまたは賦形剤は、特に滅菌等張液または乾燥した、特に凍結乾燥した組成物に類するものであり、滅菌水か生理食塩水かによるが、これらを添加すると注射溶液の調製が可能になる。患者の門脈中に直接注射することが好ましい。というのは、これにより肝臓での感染を標的とし、したがってこの器官に治療効果を集中することができるからである。
【０１８３】
注射に使用する組換え欠損ウイルスの用量は、様々なパラメータ、特にウイルス・ベクター、使用する投与方法、関連する病理、または所望の治療期間に応じて調節することができる。一般には、本発明による組換えアデノウイルスを、１０4〜１０14ｐｆｕ／ｍｌ、好ましくは１０6〜１０10ｐｆｕ／ｍｌの用量で処方し投与する。「ｐｆｕ」（プラーク形成単位）という用語は、ウイルス溶液の感染力に対応するものであり、適切な培養細胞を感染させ、感染細胞の溶解から生じるプラークの数を通常４８時間後に測定して決定する。ウイルス溶液のｐｆｕ滴定量を測定する技術は、文献に詳細に記載されている。
【０１８４】
レトロウイルスに関して、本発明による組成物は、移植の目的で産生細胞をじかに含む。
この点で、本発明の別の一主題は、本発明による１つまたは複数の組換え欠損ウイルスに感染した任意の哺乳動物細胞に関する。より具体的には、本発明は、このようなウイルスに感染した任意のヒト細胞集団に関する。これらは、特に血液に由来する細胞（全能性幹細胞または前駆体）、線維芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、ケラチノサイト、平滑筋および内皮細胞、グリア細胞などとすることができる。
【０１８５】
本発明による細胞は、初代培養に由来するものでもよい。これらの細胞は、当業者に既知の任意の技術で収集し、次いで、これらの増殖を可能とする条件下で培養することができる。より具体的に線維芽細胞の場合は、生検、例えばＨａｍ（１９８０）により記述された技術によってこれらの細胞を容易に得ることができる。これらの細胞は、そのまま使用してウイルスに感染させることができ、あるいは後で使用するために例えば凍結させて貯蔵して自己のライブラリーを樹立することもできる。本発明による細胞は、例えばすでに樹立されているライブラリーから得て、二次培養することができる（例えば、欧州特許第２２８４５８号、同第２８９０３４号、同第４０００４７号、同第４５６６４０号を参照されたい）。
【０１８６】
次いで、生物活性ＡＢＣＣ１１タンパク質を産生する能力を培養中の細胞に付与するために、これらの細胞を本発明による組換えウイルスで感染させる。感染は、当業者に既知の技術に従ってインビトロで行われる。特に、使用する細胞のタイプおよび細胞当たりの所望のウイルス・コピー数に応じて、当業者は、感染多重度および、場合によっては、生成する感染サイクル数を調節することができる。これらの細胞をインビボで投与しようとするときには、これらのステップを適切な無菌条件下で実施しなければならないことは容易に理解されよう。これらの細胞を感染するのに使用する組換えウイルスの用量は、当業者が所望の目的に従って調節することができる。上述のインビボでの投与条件は、インビトロでの感染にも適用することができる。レトロウイルスでの感染の場合、本発明による組換えレトロウイルス産生細胞に感染する細胞を同時培養することもできる。これにより、レトロウイルスの精製が不要になる。
【０１８７】
本発明の別の一主題は、本発明による１つまたは複数の組換え欠損ウイルスまたは組換えウイルスを産生する細胞に感染した哺乳動物細胞および細胞外マトリックスを含む移植片に関する。本発明による移植片は、１０5〜１０10細胞を含むことが好ましい。本発明による移植片は、１０6〜１０8細胞を含むことがより好ましい。
より具体的には、本発明の移植片中の細胞外マトリックスは、ゲル化化合物および、場合によっては、細胞の固定を可能とする担体を含む。
【０１８８】
本発明による移植片の調製には、様々なタイプのゲル化剤を使用することができる。ゲル化剤は、ゲル構造を有するマトリックス中に細胞を封入し、適切であれば担体上にこの細胞を容易に固定できるようにするのに使用される。したがって、特にコラーゲン、ゼラチン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、レクチンなど様々な細胞接着剤をゲル化剤として使用することができる。本発明ではコラーゲンを使用することが好ましい。これは、ヒト、ウシ、またはネズミ由来のコラーゲンとすることができる。タイプＩコラーゲンを使用することがより好ましい。
【０１８９】
上述のように、本発明による組成物は、好ましくは、細胞の固定を可能とする担体を含む。固定という用語は、細胞を担体に接着および／または付着させる任意の形態の生物学的および／または化学的および／または物理的相互作用を指す。また、細胞は使用する担体を覆っても、この担体内部に侵入しても、あるいはその両方でもよい。本発明では、固体で無毒および／または生体適合性の担体を使用することが好ましい。特に、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）繊維または生物起源の担体を使用することができる。
したがって、本発明は、親油性物質の輸送に関連した病理を治療または予防するための極めて有効な手段を提供するものである。
また、この治療法は、ヒトおよびヒツジ、ウシ、家畜（イヌ、ネコなど）、ウマ、魚などあらゆる動物に適用することができる。
【０１９０】
組換え宿主細胞
本発明は、本発明の核酸、より具体的には、配列番号１〜３０から選択されるヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸を含む組換え宿主細胞に関する。
本発明は、本発明の核酸、およびより具体的には、配列番号１〜３０で示されるヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸を含む組換え宿主細胞にも関する。
【０１９１】
別の一態様によれば、本発明は、本発明による組換えベクターを含む組換え宿主細胞にも関する。したがって、本発明は、本発明の核酸のいずれか、より具体的には、配列番号１〜３０から選択されるヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸を含む組換えベクターを含む組換え宿主細胞にも関する。
本発明は、配列番号１〜３０のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸を含む組換えベクターを含む組換え宿主細胞にも関する。
【０１９２】
本発明による好ましい宿主細胞は、例えば以下の
ａ）原核生物の宿主細胞：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株（ＤＨ５−α株）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株、あるいはシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ）などの菌株；
ｂ）真核生物の宿主細胞：ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２）、Ｃｖ  １細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ  １６５０）、Ｓｆ−９細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ  １７１１）、ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−６１）、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−６３６１）、またはヒト赤白血病Ｋ５６２（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２４３）である。
【０１９３】
ＡＢＣＣ１１ポリペプチドを産生するための方法
本発明は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを産生するための方法にも関し、この方法は以下のステップ、すなわち、
ａ）前記ポリペプチドをコードする核酸を適切なベクターに挿入すること、
ｂ）予め形質転換した宿主細胞を適切な培養培地中で培養すること、またはステップａ）の組換えベクターを宿主細胞に形質移入すること、
ｃ）この馴化した培養培地を回収すること、または例えば超音波処理や浸透圧衝撃によってこの宿主細胞を溶解すること、
ｄ）ステップｃ）で得られた前記培養培地または細胞溶解物から前記ポリペプチドを分離し生成すること、および
ｅ）適切であれば、産生された組換えポリペプチドの特徴を明らかにすることを含む。
【０１９４】
本発明によるポリペプチドは、このポリペプチドに対する、あるいはその断片またはその変異体に対する抗体をその上に予め固定した免疫親和性クロマトグラフィー・カラムに対する結合によって特定することができる。
【０１９５】
別の一態様によれば、本発明による組換えポリペプチドを、当業者に既知の方法および、例えば、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ等（１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ.Ｙ.）に記載されている方法によって、適切な一連のクロマトグラフィー・カラムを通して精製することができる。
【０１９６】
本発明によるポリペプチドは、従来の化学合成技術により、均一溶液中または固相中で調製することもできる。説明のために示すと、本発明によるポリペプチドは、Ｈｏｕｂｅｎ  Ｗｅｙｌ（１９７４、Ｍｅｕｔｈｏｄｅ  ｄｅｒ  Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｅ．Ｗｕｎｓｃｈ編、１５−Ｉ：１５−II）によって記述された均一溶液中での技術、またはＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６５、Ｎａｔｕｒｅ、２０７（９９６）：５２２〜５２３；１９６５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１５０（６９３）：１７８〜１８５）によって記述された固相合成技術によって調製することができる。
【０１９７】
配列番号３１から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに「相同」なポリペプチドも本発明の一部を成す。このような相同ポリペプチドは、配列番号３０の等価なアミノ酸で置換された１個または複数のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む。
本発明による「等価なアミノ酸」は、例えばＤ型残基によるＬ型残基の置換、または当業者に周知の技術によるピログルタミン酸でのグルタミン酸（Ｅ）の置換を意味すると理解される。説明のために示すと、少なくとも１つのＤ型残基を含むペプチドの合成がＫｏｃｈ（１９７７）によって記述されている。別の一態様によれば、同一クラスに属する２つのアミノ酸、すなわち非荷電極性と非極性、塩基性と酸性アミノ酸の２つも等価なアミノ酸とみなせる。
【０１９８】
レトロ−インバース結合（ＮＨＣＯ）、カルバ（ｃａｒｂａ）結合（ＣＨ2ＣＨ2）、またはケトメチレン結合（ＣＯ−ＣＨ2）など少なくとも１つの非ペプチド結合を含むポリペプチドも本発明の一部を成す。
少なくとも１個のアミノ酸の１つまたは複数の付加、欠失、置換を含む本発明によるポリペプチドは、その非改変ポリペプチドに対する抗体によって認識される能力を保持していることが好ましい。
【０１９９】
抗体
本発明によるＡＢＣＣ１１ポリペプチド、特に１）配列番号３１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド、２）配列番号３０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドのポリペプチド断片または変異体、または３）配列番号３１から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに「相同」なポリペプチドを、抗体、特に患者の正常型または改変型ＡＢＣＣ１１ポリペプチドの産生を検出するための抗体の調製に使用することができる。
【０２００】
配列番号３１から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと「相同」なポリペプチドに対する抗体も本発明の一部を成す。このような抗体は、配列番号３１の等価なアミノ酸で置換された１個または複数のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む相同ポリペプチドを対象とする。
本発明での「抗体」は、特にポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体または断片（例えば、Ｆ(ａｂ)’2断片およびＦａｂ断片）または本発明の標的ポリペプチドまたは標的ポリペプチド断片を認識する一次抗体のドメインを含むあらゆるポリペプチドを意味すると理解される。
モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７）によって記述された技術に従ってハイブリドーマから調製することができる。
【０２０１】
本発明によれば、組換え産生しまたは化学合成によって産生したポリペプチド、その断片またはその他の誘導体またはその類似体は、融合タンパク質を含めて、免疫原として使用して本発明によるポリペプチドを認識する抗体を産生することができる。このような抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂ断片、およびＦａｂ発現ライブラリーなどがあるが、これらだけに限定されない。本発明の抗ＡＢＣＣ５抗体、抗ＡＢＣＣ４抗体、または抗ＡＢＣＣ１抗体は交差反応性であってもよく、例えば、異なる種由来の対応するＡＢＣＣ１１ポリペプチドを認識することもできる。ポリクローナル抗体は交差反応性である可能性がより高い。あるいは、本発明の抗体は、ＡＢＣＣｌｌの単一の型に対して特異的であってもよい。このような抗体は、ヒトＡＢＣＣ１１に特異的であることが好ましい。
【０２０２】
当分野で既知の様々な手順を、ＡＢＣＣ１１ポリペプチドまたはその誘導体またはその類似体に対するポリクローナル抗体の産生に使用することができる。抗体を産生する場合、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどを含めて、ただしこれらだけに限定されない様々な宿主動物を、ＡＢＣＣ１１ポリペプチド、またはその誘導体（例えば、断片または融合タンパク質）を注射して免疫することができる。一実施形態では、ＡＢＣＣ１１ポリペプチドまたはその断片を、免疫原性の担体、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホール・リンペット・ヘモシニアン（ＫＬＨ）と複合することができる。フロインド・アジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの無機質ゲル、リゾレシチン、ｐｌｕｒｏｎｉｃポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホール・リンペット・ヘモシニアン、ジニトロフェノールなどの界面活性物質、およびＢＣＧ（カルメット・ゲラン菌（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ））、コリネバクテリウム・パルヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）などの潜在的に有用なヒト・アジュバントを含めて、ただしこれらだけに限らない様々なアジュバントを宿主種に応じて使用して免疫応答を増大させることができる。
【０２０３】
ＡＢＣＣ１１ポリペプチドに対するモノクローナル抗体、あるいはその断片、その類似体、またはその誘導体を調製する場合、培養中の連続細胞系を用いて抗体分子を産生するあらゆる技術を使用することができる。これらの技術には、最初にＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７）によって開発されたハイブリドーマ技術、ならびにトリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ等、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４：７２；Ｃｏｔｅ等、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ.Ｓ.Ａ.、８０：２０２６〜２０３０）、およびヒト・モノクローナル抗体を産生するＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、ｐｐ.７７〜９６中のＣｏｌｅ等、１９８５）などがあるが、これらだけに限定されない。本発明の別の一実施形態では、モノクローナル抗体を無菌動物中で産生することができる（国際公開第８９／１２６９０号）。実際、本発明によれば、ＡＢＣＣ１１ポリペプチドに特異的なマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物活性を有するヒト抗体分子由来の遺伝子とともにスプライシングすることによって、「キメラ抗体」を産生するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、１９８４、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９：８７０；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ等、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ、３１２：６０４〜６０８；Ｔａｋｅｄａ等、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２〜４５４）を使用することができる。このような抗体は本発明の範囲に含まれる。ヒト抗体またはヒト化抗体はそれ自体、免疫応答、特にアレルギー応答を異種抗体よりも極めて誘発し難いので、このようなヒト抗体またはヒト化キメラ抗体を、（下記の）ヒトの疾患または障害の治療に使用することが好ましい。
【０２０４】
本発明によれば、一本鎖抗体の産生用に記述された技術（Ｈｕｓｔｏｎに与えられた米国特許第５,４７６,７８６号および同第５,１３２,４０５号；同第４,９４６,７７８号）を、ＡＢＣＣ１１ポリペプチドに特異的な一本鎖抗体を産生するために手直しすることができる。本発明の別の一実施形態により、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築のために記述された技術（Ｈｕｓｅ等、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５〜１２８１）を利用して、ＡＢＣＣ１１ポリペプチド、またはその誘導体または類似体に対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片を迅速かつ容易に同定することが可能になる。
【０２０５】
抗体分子のイディオタイプを含む抗体断片を既知の技術により生成することができる。例えば、このような断片は、抗体分子をペプシン消化して産生することができるＦ(ａｂ’)2断片、Ｆ(ａｂ’)2断片のジスルフィド架橋を還元して生成することができるＦａｂ’断片、およびこの抗体分子をパパインおよび還元剤で処置して生成することができるＦａｂ断片などであるが、これらだけに限定されない。
【０２０６】
抗体の産生においては、所望の抗体のスクリーニングを、当分野で既知の技術、例えば、放射性免疫測定法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫放射線測定法、ゲル内沈降反応、免疫拡散測定法、（例えば、コロイド状金、酵素、または放射性同位体標識を使用した）イン・サイチュ免疫測定法、ウェスタン・ブロット法、沈殿反応、凝集測定法（例えば、ゲル凝集測定法、血球凝集測定法）、補体結合測定法、免疫蛍光測定法、プロテインＡ測定法、および免疫電気泳動測定法などによって実施することができる。一実施形態では、一次抗体上の標識を検出することによって抗体の結合を検出する。別の一実施形態では、二次抗体の結合または一次抗体に対する試薬を検出することによって一次抗体を検出する。別の一実施形態では、二次抗体を標識する。免疫測定法で結合を検出するための多数の手段が当分野では知られており、本発明の範囲に含まれる。例えば、ＡＢＣＣ１１ポリペプチドの特異的なエピトープを認識する抗体を選択するには、そのようなエピトープを含有するＡＢＣＣ１１ポリペプチド断片に結合する産物に対して生成されるハイブリドーマを分析することができる。特定の動物種由来のＡＢＣＣ１１ポリペプチドに特異的な抗体を選択する場合、その動物種の細胞から発現された、または単離されたＡＢＣＣ１１ポリペプチドと積極的に結合するかどうかで選択することができる。
【０２０７】
前記抗体を、上記任意の検出技術または当分野で既知の技術を用いて、ＡＢＣＣ１１ポリペプチドの局在化および活性に関係する当分野で既知の方法に使用することができ、例えば、ウェスタン・ブロット法の場合、適切な生理的試料などにおけるイン・サイチュでのＡＢＣＣ１１ポリペプチドの測定レベルに使用することができる。
特定の一実施形態では、ＡＢＣＣ１１ポリペプチド活性に作用し（ａｇｏｎｉｚｅ）または拮抗する抗体を生成することができる。このような抗体を、リガンドを同定する下記アッセイを用いて試験することができる。
本発明は、１）配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、２）配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドのポリペプチド断片または変異体、または３）配列番号３１から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに「相同」なポリペプチドに対する抗体に関する。これは、本発明の一部を成し、Ｋｏｚｂｏｒ等（１９８３、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、２（１）：７〜１６）によって記述されたトリオーマ技術またはハイブリドーマ技術で産生される。
【０２０８】
本発明は、米国特許第４,９４６,７７８号またはＭａｒｔｉｎｅａｕ等（１９９８、Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２８０（１）：１１７〜１２７）に記載された一本鎖Ｆｖ抗体断片（ＳｃＦｖ）にも関する。
本発明による抗体は、Ｒｉｄｄｅｒ等（１９９５、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）、１３（３）：２５５〜２６０）によって記述されたファージ・ライブラリーまたはＲｅｉｎｍａｎｎ等（１９９７、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ、１３（１１）：９３３〜９４３）およびＬｅｇｅｒ等（１９９７、Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、８（１）：３〜１６）によって記述されたヒト化抗体を利用して得られる抗体断片も含む。
【０２０９】
本発明による抗体製剤は、試料中の抗原の有無および／または量を確認するための免疫学的検出試験に有用である。
また、本発明による抗体は、当業者に周知の技術に従い、同位体または非同位体の、例えば蛍光性の検出可能なマーカー、あるいはビオチンなどの分子と結合できる検出可能なマーカーを含むことができる。
したがって、本発明の別の主題は、試料中の本発明によるポリペプチドの有無を検出する方法である。この方法は、以下のステップ、すなわち、
ａ）１）配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、２）配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドのポリペプチド断片または変異体、または３）配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドと「相同」なポリペプチドに対する抗体と試験試料とを接触させること、および
ｂ）形成された抗原／抗体複合体を検出することを含む。
【０２１０】
本発明は、試料中の本発明によるポリペプチドの有無を診断または検出するためのボックスまたはキットにも関する。このボックスは、
ａ）１）配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、２）配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドのポリペプチド断片または変異体、または３）配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドと「相同」なポリペプチドに対する抗体と、
ｂ）形成された抗原／抗体複合体の検出を可能にする試薬とを含む。
【０２１１】
薬剤組成物および治療方法
本発明は、ＡＢＣＣ１１機能性ポリペプチド、特に配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドの有効量を産生することができる治療上有効な量のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、コレステロールまたは炎症性脂質の輸送欠陥を予防および／または治療するための薬剤組成物にも関する。
本発明は、本発明によるＡＢＣＣ１１ポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸を含む薬剤組成物、および染色体遺伝子座１６ｑ１２上に位置する疾患を予防および／または治療するための本発明によるＡＢＣＣ１１ポリペプチドを含む薬剤組成物も提供する。
本発明は、本発明によるＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする核酸をインビボで移送し発現することを含む、親油性物質の輸送に関連した病理を治療するための新しい治療手法にも関する。
したがって、本発明は、発作性運動誘発性舞踏アテトーゼなどの病理を治療および／または予防する新しい手法を提供する。
したがって、本発明は、メトトレキセート（ＭＴＸ）などの陰イオン性薬物、ＧＳＨ複合薬物、グルクロナート、サルフェートなど酸性リガンドに結合した中性薬物を輸送する機能の障害に罹った対象を予防または治療するための、ＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする核酸と１つまたは複数の生理的に適合するビヒクルおよび／または賦形剤との組合せを含む薬剤組成物にも関する。
【０２１２】
本発明の特定の一実施形態によれば、ＡＢＣＣ１１タンパク質をインビボで産生する組成物が提供される。この組成物は、適切な調節配列の制御下に置かれＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードする核酸を、生理的に許容されるビヒクルおよび／または賦形剤中に溶液状態で含む。
したがって、本発明は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、適切な調節エレメントの制御下に置かれた核酸を含む組成物にも関する。
このような組成物は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、適切な調節エレメントの制御下に置かれた核酸を含むことが好ましい。
【０２１３】
別の一態様によれば、本発明の別の主題は、親油性物質の輸送欠陥によって引き起こされる疾患を治療する予防的および／または治癒的治療法である。このような方法は、本発明によるＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードする核酸を患者に投与するステップを含み、適切であれば、この核酸は１つまたは複数の生理的に適合するビヒクルおよび／または賦形剤と組み合わされている。
【０２１４】
本発明は、ＡＢＣＣ１１遺伝子欠損に罹った対象を予防または治療するための、１つまたは複数の生理的に適合する賦形剤と組み合わせた本発明による組換えベクターを含む薬剤組成物にも関する。
【０２１５】
特定の一実施形態によれば、本発明による核酸を宿主細胞、特に哺乳動物から得られる宿主細胞にインビボで導入する方法は、適切な調節配列の制御下に置かれた本発明による薬剤として適合するベクターおよび「裸の」核酸を含む製剤を、選択した組織、例えば平滑筋組織に局所注射して導入するステップを含み、この「裸の」核酸はこの組織の細胞によって吸収される。
【０２１６】
本発明は、予防用および／または治療用の様々な形態の薬剤、より具体的には発作性運動誘発性舞踏アテトーゼに罹った対象の治療用薬剤を製造するための、ＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする本発明による核酸の使用にも関する。
本発明は、発作性運動誘発性舞踏アテトーゼに罹った対象の予防用および／または治療用薬剤を製造するための、ＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする核酸を含む本発明による組換えベクターの使用にも関する。
本発明は、予防用および／または治療用の様々な形態の薬剤、より具体的にはメトトレキセート（ＭＴＸ）などの陰イオン性薬物、ＧＳＨ複合薬物、グルクロナート、サルフェートなど酸性リガンドに結合した中性薬物の輸送障害に罹った対象の治療用薬剤を製造するための、ＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする本発明による核酸の使用にも関する。
【０２１７】
本発明は、メトトレキセート（ＭＴＸ）などの陰イオン性薬物、ＧＳＨ複合薬物、グルクロナート、サルフェートなど酸性リガンドに結合した中性薬物の輸送欠陥の予防用および／または治療用薬剤を製造するための、ＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする核酸を含む本発明による組換えベクターの使用にも関する。
【０２１８】
本発明は、上記の通り、発作性運動誘発性舞踏アテトーゼに関連した病理の治療および／または予防用薬剤組成物を調製するための、本発明による組換え欠損ウイルスの使用にも関する。
本発明は、メトトレキセート（ＭＴＸ）などの陰イオン性薬物、ＧＳＨ複合薬物、グルクロナート複合薬物、サルフェート複合薬物など酸性リガンドに結合した中性薬物の輸送に関連する欠陥の治療用および／または予防用の薬剤組成物を調製するための組換え欠損ウイルスの使用に関する。したがって、本発明は、本発明による１つまたは複数の組換え欠損ウイルスを含む薬剤組成物にも関する。
本発明は、体内に移植され、生物活性ＡＢＣＣ１１ポリペプチドを長期にわたり効果的にインビボで発現することができる、本発明によるウイルスによりエクスビボで遺伝子改変された細胞、またはウイルスなどの産生細胞の使用にも関する。
【０２１９】
本発明は、ＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードする核酸をウイルス・ベクター中に取り込むことができ、これらのベクターが生物活性な成熟ポリペプチドの効果的な発現を可能にすることを示す。より具体的には、本発明は、ＡＢＣＣ１１遺伝子のインビボでの発現が、アデノウイルスの直接投与、あるいは産生細胞またはこのようなＤＮＡを取り込むアデノウイルスまたはレトロウイルスで遺伝子改変された細胞の移植によって得られること示す。
【０２２０】
本発明の薬剤組成物は、注射製剤、特に例えば患者の門脈中などへの静脈内注射用の、薬剤として許容されるビヒクルまたは生理的に適合する賦形剤を含むことが好ましい。これらのビヒクルまたは賦形剤は、特に滅菌等張液または乾燥した、特に凍結乾燥した組成物に類するものであり、滅菌水か生理食塩水かによるが、これらを添加すると注射溶液の調製が可能になる。患者の門脈中に直接注射することが好ましい。というのは、これにより肝臓での感染を標的とし、したがってこの器官に治療効果を集中することができるからである。
【０２２１】
「薬剤として許容されるビヒクルまたは賦形剤」としては、投薬方法として薬剤的に許容され、無菌であり、また、適切な分散剤、湿潤剤、および懸濁剤を用いて配合される水性懸濁液または油性懸濁液でもよい稀釈剤およびフィラーが挙げられる。個々の薬剤として許容される担体および活性化合物と担体の比は、組成物の溶解性および化学的諸性質、個々の投与形態、および標準の製剤上の実務で決まる。
【０２２２】
本発明の核酸、ポリペプチド、ベクター、または宿主細胞は、好ましくは、薬剤として許容されるビヒクルまたは賦形剤中、インビボで導入される。「薬剤として許容される」という句は、生理的に許容され、ヒトに投与した時に胃ぜん動の異常亢進、めまいなどアレルギーや類似の有害反応を通常は起こさない分子および組成物を指す。好ましくは、本明細書で使用する「薬剤として許容される」という用語は、連邦政府または州政府の規制当局、あるいは米国薬局方、または動物、より具体的にはヒトへの使用が一般に認められた他の薬局方に列記されている規制当局によって認可されたことを意味する。「賦形剤」という用語は、前記化合物とともに投与される稀釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。このような薬剤担体は、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など石油、動物、植物、または合成起源の液体を含めて、水や油などの無菌液体とすることができる。好ましくは、水、水溶液、食塩水、水性ブドウ糖、およびグリセロール溶液が、賦形剤、特に注射液として使用される。適切な薬剤の賦形剤は、Ｅ.Ｗ.Ｍａｒｔｉｎ著「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。
【０２２３】
本発明による薬剤組成物は、経口、直腸、非経口、静脈内、皮下、または皮内経路により同じように問題なく投与することができる。
【０２２４】
別の一態様によれば、本発明の別の主題は、コレステロールまたは炎症性脂質の輸送欠陥によって引き起こされる疾患を治療する予防的および／または治癒的治療法であり、ＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードする核酸を患者または対象に投与することを含む。この核酸は１つまたは複数の生理的に適合するビヒクルおよび／または賦形剤と組み合わされている。
【０２２５】
別の一実施形態では、本発明による核酸、組換えベクター、および組成物は、小胞、特にリポソーム（Ｌａｎｇｅｒ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：１５２７〜１５３３；Ｔｒｅａｔ等、１９８９、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ、Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編）、Ｌｉｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ.３５３〜３６５；およびＬｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ、Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編）、Ｌｉｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ.３１７〜３２７中のＬｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ、１９８９を参照されたい）に入れて送達することができる。
【０２２６】
別の一態様では、本発明による核酸で形質転換され、本発明によるＡＢＣＣ１１ポリペプチドを高いレベルで発現する組換え細胞を、ＡＢＣＣ１１ポリペプチドを必要とする対象に移植することができる。本発明による核酸をコードするＡＢＣＣ１１で形質転換された自己細胞を移植して拒絶反応を防止することが好ましい。あるいは、免疫認識および免疫拒否を防止するポリマー・マトリックス内の可溶性因子を産生する非自己細胞を遮蔽する技術を利用できる。
【０２２７】
本発明による核酸、ポリペプチド、組換えベクター、組換え宿主細胞、および組成物の投与対象は、好ましくはヒトであるが、あらゆる動物とすることもできる。したがって、当業者に容易に理解されるように、本発明の方法および薬剤組成物は、あらゆる動物、特に、ネコまたはイヌなどの家で飼う動物、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、およびブタなどの家畜、（自然状態または動物園内の）野生動物、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコなどの研究動物、ニワトリ、シチメンチョウ、鳴きん類などのトリを含めて、ただしこれらだけには限定されない哺乳動物に投与するのに、すなわち、獣医用に特に適している。
先に定義した核酸、組換えベクター、または組換え宿主細胞を含む薬剤組成物を患者や対象に投与することが好ましい。
【０２２８】
ＡＢＣＣ１１ポリペプチドの作用薬化合物または拮抗薬化合物をスクリーニングする方法
別の一態様によれば、本発明は、コレステロールまたは炎症性脂質の輸送欠陥による疾患を治療するのに有用な治療用化合物または小分子をスクリーニングする様々な方法にも関する。
したがって、本発明は、ＡＢＣＣ１１遺伝子の障害から生ずる疾患の予防用および／または治療用活性成分をスクリーニングするための、ＡＢＣＣ１１ポリペプチドまたはＡＢＣＣ１１ポリペプチドを発現する細胞の使用にも関する。産物ライブラリーをあらゆる既存技術でスクリーニングするために、ＡＢＣＣ１１ポリペプチドの触媒部位およびオリゴペプチド断片または免疫原性断片を使用することができる。このタイプのスクリーニングに使用されるポリペプチド断片は、溶液中で遊離していても、固体担体、細胞表面、または細胞中に結合していてもよい。次いで、ＡＢＣＣ１１ポリペプチド断片と試験薬剤との結合複合体の形成を測定することができる。
【０２２９】
対象とするタンパク質に対して親和性を有する産物が入手可能な大量スクリーニング（ｈｉｇｈ−ｆｌｕｘ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）に使用できる別の産物スクリーニング技術が、国際公開第８４／０３５６４号に記載されている。この方法をＡＢＣＣ１１タンパク質に適用すると、様々な産物が固体表面上で合成される。これらの産物は対応するＡＢＣＣ１１タンパク質またはその断片と反応し、その複合物が洗い流される。次いで、ＡＢＣＣ１１タンパク質と結合している産物を当業者に既知の方法によって検出する。ペプチドを捕捉し、それを担体上に固定するために非中和抗体も使用することができる。
【０２３０】
ＡＢＣＣ１１中和性競合抗体（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、ＡＢＣＣ１１タンパク質、およびＡＢＣＣ１１タンパク質と結合可能な産物を用いた産物スクリーニング方法を実施することも可能である。このように、これらの抗体を使用して、ＡＢＣＣ１１ポリペプチドまたはタンパク質を含む共通抗原単位を有するペプチドの存在を検出することができる。
【０２３１】
ＡＢＣＣ１１活性を増加させる能力を評価すべき産物としては、特にこの分子の活性化に関与するキナーゼ特異的ＡＴＰ相同体、ならびに前記キナーゼに起因する脱リン酸化を回避できるホスファターゼを挙げることができる。特にホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤のテオフィリンおよび３−イソブチル−１−メチルキサンチン型またはアデニルシクラーゼ活性化薬フォルスコリンでもよい。
したがって、本発明は、ヒトＡＢＣＣ１１をコードする核酸を構成的に発現するか、または導入した哺乳動物、昆虫、細菌、または酵母の膜または小胞、すなわちすべて合成型または細胞型の膜または小胞の間で、コレステロールまたは親油性物質をトランスロケーションする方法に基づいて、産物、すなわち、化合物、小分子などをスクリーニングする任意の方法の使用に関する。このために、標識親油性物質類似体を使用することができる。
【０２３２】
また、多数の輸送体が破損することが記載されている（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈａｚｅｌ等、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７４：１９３４〜４１）ことから、特徴的な表現型を有する細胞の突然変異体を使用することを考え、ＡＢＣＣ１１タンパク質でその機能を補完し、これら全部をスクリーニングの目的で使用することが可能である。
【０２３３】
本発明は、基質を輸送する活性を有する化合物または小分子、すなわちＡＢＣＣ１１ポリペプチドの作用薬または拮抗薬をスクリーニングする方法にも関する。この方法は、以下のステップ、すなわち、
ａ）ＡＢＣＣ１１ポリペプチドと検出可能なマーカーを含む基質とを含む膜小胞を調製すること、
ｂ）ステップａ）で得た小胞を作用薬または拮抗薬の候補化合物とインキュベートすること、
ｃ）検出可能なマーカーを含む基質の放出量を定性的かつ／または定量的に測定すること、および
ｄ）ステップｂ）で得た放出測定値を、作用薬または拮抗薬の候補化合物とともにまだインキュベートしていない小胞による標識基質の放出測定値と比較することを含む。
【０２３４】
ＡＢＣＣ１１ポリペプチドは配列番号３１のアミノ酸配列を含む。
上記スクリーニング方法の第１の態様によれば、この膜小胞は、当業者に周知の技術に従って調製することができる合成脂質小胞である。この特定の態様によれば、ＡＢＣＣ１１タンパク質を組換えタンパク質とすることができる。
第２の態様によれば、この膜小胞は、少なくとも１つのＡＢＣＣ１１ポリペプチドを発現する細胞由来の原形質膜の小胞である。この細胞は、ＡＢＣＣ１１ポリペプチドを自然に発現する細胞、または少なくとも１つのＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードする核酸またはＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードする核酸を含む組換えベクターを形質移入した細胞とすることができる。
【０２３５】
上記スクリーニング方法の第３の態様によれば、この基質は、メトトレキセート（ＭＴＸ）などの陰イオン性薬物である。
上記スクリーニング方法の第４の態様によれば、この基質は、ＧＳＨ複合薬物、グルクロナート複合薬物、またはサルフェート複合薬物など酸性リガンドに結合する中性薬物である。
第５の態様によれば、この基質は、例えば3Ｈまたは125Ｉから選択される同位体で放射性標識されている。
第６の態様によれば、この基質は、ＮＢＤまたはピレンなどの蛍光化合物で標識されている。
第７の態様によれば、標識基質およびＡＢＣＣ１１ポリペプチドを含む膜小胞を、ステップｂ）の前に固体担体表面に固定する。
第８の態様によれば、小胞によって放出される蛍光または放射能の測定は、ＡＢＣＣ１１ポリペプチドによる基質輸送の活性を直接反映するものである。
【０２３６】
本発明は、陰イオンを輸送する活性を有する化合物または小分子、すなわちＡＢＣＣ１１ポリペプチドの作用薬または拮抗薬をスクリーニングする方法にも関する。この方法は、以下のステップ、すなわち、
ａ）ＡＢＣＣ１１ポリペプチドを自然に発現する細胞、またはＡＢＣＣ１１をコードする核酸を細胞に形質移入した後にＡＢＣＣ１１ポリペプチドを発現する細胞、例えば細胞系を得ること、
ｂ）検出可能なマーカーで標識した陰イオンの存在下で、ステップａ）の細胞をインキュベートすること、
ｃ）これらの細胞に侵入していない過剰の標識陰イオンを除去するためにステップｂ）の細胞を洗浄すること、
ｄ）ステップｃ）で得た細胞をＡＢＣＣ１１ポリペプチドの作用薬または拮抗薬の候補化合物とともにインキュベートすること、
ｅ）標識陰イオンの流出量を測定すること、および
ｆ）ステップｅ）で測定した標識陰イオンの流出量の値を、ＡＢＣＣ１１ポリペプチドの作用薬または拮抗薬の候補化合物の存在下でまだインキュベートしていない細胞で測定した標識陰イオンの流出量の値と比較することを含む。
【０２３７】
第１の特定の実施形態では、ＡＢＣＣ１１ポリペプチドは配列番号３１のアミノ酸配列を含む。
第２の態様によれば、上記スクリーニング方法に使用する細胞は、ＡＢＣＣ１１ポリペプチドを自然には発現しない細胞、または低レベルのＡＢＣＣ１１ポリペプチドしか発現しない細胞でもよく、これらの細胞にはＡＢＣＣ１１ポリペプチドをコードする核酸の発現を誘導できる本発明による組換えベクターが形質移入されている。
第３の態様によれば、この細胞は、陰イオン輸送に自然の欠陥を有する細胞、あるいはＶｅｒａｐａｍｉｌ（商標）、テトラエチルアンモニウムなどの１つまたは複数の陰イオン・チャネル阻害剤で前処理した細胞とすることができる。
【０２３８】
このスクリーニング方法の第４の態様によれば、この陰イオンはＫl25Ｉ塩またはＮａ125Ｉ塩などの放射性標識ヨウ化物である。
第５の態様によれば、標識陰イオンの流出量を実験中定期的に測定し、それによってこの流出量の動力学的な測定を確立することが可能になる。
第６の態様によれば、培養細胞の上清中に存在する標識陰イオン量を所定の時間に測定することによって標識陰イオンの流出量の値を決定する。
第７の態様によれば、細胞溶解物で観測される放射能と培養細胞の上清で観測される放射能との合計に相当する全放射能に対する培養細胞の上清で観測される放射能の比率として標識陰イオンの流出量の値を決定する。
【０２３９】
インターロイキンおよび作用薬または拮抗薬の候補化合物の産生を刺激する化合物の存在下で；
以下の実施例は、さらに本発明を説明するものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０２４０】
ゲノム・データベース中のヒトＡＢＣＣ１１遺伝子の検索
ＧｅｎｅＢａｎｋ  ＨＴＧＳデータベースの検索を、ＴＢＬＡＳＴＮおよびＴＢＬＡＳＴＰの各プログラムを用いて既知のＡＢＣ輸送体ヌクレオチド配列およびタンパク質配列を問い合せとして実施した。Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）  Ｐａｃｋａｇｅに含まれているＰＩＬＥＵＰプログラムを用いてアミノ酸整列を作成した。ゲノム分析パイプラインＩ上のＧＲＡＩＬおよびＧｅｎｅｓｃａｎの各プログラムを用いて、新しい遺伝子のゲノム構造を予測した。
ヒトＡＢＣＣ１１輸送体遺伝子配列を、ＧｅｎＢａｎｋ  ＨＴＧＳデータベースの細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローン＃ＡＣ００７６００上に検出した。ｃＤＮＡ配列決定、ゲノム構造予測プログラム、およびコンピュータ検索により、ＡＢＣＣサブファミリーに属する新しい遺伝子の配列およびゲノム構造を決定した。
発現された配列タグ（ＥＳＴ）クローン配列および遺伝子の５’領域および３’領域から予想されたｃＤＮＡ配列からプライマーを設計した。ＡＢＣＣ１１  ｃＤＮＡ配列を、精巣または肝臓のｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＰＣＲ増幅によって確認した。ＡＢＩ  ３７７シークエンサーを用いて製造者（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の手順に従い配列を決定した。ゲノム配列（ＢＡＣ  ＡＣ００７６００）とｃＤＮＡ配列を比較して、イントロンの位置を決定した。
【実施例２】
【０２４１】
放射線ハイブリッド・マッピング（Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｈｙｂｒｉｄ  Ｍａｐｐｉｎｇ）（図２）
ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ４放射線ハイブリッド・パネル（ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｈｙｂｒｉｄ  ｐａｎｅｌ）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用い製造者の手順に従いマッピングして、染色体上のヒトＡＢＣＣ１１遺伝子の位置を決定した。
放射線ハイブリッド・マッピングによれば、ＡＢＣＣ１１はヒト染色体１６の動原体領域に位置し、マーカーＤ１６Ｓ３０９３およびＤ１６Ｓ４０９が隣接していた（図２）。この領域は５.４ｃＭまたは１３２.５ｃＲを含んでおり、この領域には組換えマーカーおよび／またはマップされた多型マーカーが存在しないことからさらに範囲を限定することはできなかった。ＡＢＣＣ１１遺伝子は、１６ｐマーカーＤ１６Ｓ３０９３（１１９.４０ｃＲ）よりも１６ｑマーカーＤ１６Ｓ４０９（１３.２４ｃＲ）の近くに位置づけられるので（図２）、染色体１６ｑ１２.１上に位置している可能性が最も高い。ＡＢＣＣ１２は、同じ遺伝子座に位置し、ＡＢＣＣ１１からは約２００ｋｂ離れている。ＡＢＣＣ１１とＡＢＣＣ１２は直列に並び、それらの５’末端は動原体に面している。２つの別のＡＢＣＣサブファミリー遺伝子ＡＢＣＣ１およびＡＢＣＣ６は、同じ染色体の短腕１６ｐｌ３.１（Ｃｏｌｅ等（１９９２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８、１６５０〜１６５４；Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ等（１９９６）Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５、１６４９〜１６５５）に位置づけられた。ＡＢＣＣ１およびＡＢＣＣ６の各３’末端は、互いにわずか約９ｋｂしか離れておらず、そのためこれらの遺伝子は反対方向を向いている（Ｃａｉ等、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ、２０００、７８、３６〜４６）。
【０２４２】
発作性運動誘発性舞踏アテトーゼ（ＰＫＣ）の遺伝子座は、マーカーＤ１６Ｓ３０９３とマーカーＤ１６Ｓ４１６との間の１６ｐ１１.２〜ｑｌ２.１に割り当てられた（Ｔｏｍｉｔａ等、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ、１９９９、６５、１６８８〜９７；Ｂｅｎｎｅｔｔ等、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、２０００、５４、１２５〜３０；図２）。重複する遺伝子座は、発作性舞踏アテトーゼを伴う乳児けいれん（ＩＣＣＡ；Ｌｅｅ等、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ、１９９８、１０３、６０８〜１２）の遺伝子を含むと予想されている。染色体１６上の新規なイオン・チャネル遺伝子中の突然変異は、ＰＫＣおよび／またはＩＣＣＡをもたらす恐れがあることが示唆された（Ｂｅｎｎｅｔｔ等、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、２０００、５４、１２５〜３０）。ＡＢＣＣサブファミリーの別のメンバーである嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）は、サイクリックＡＭＰによって制御されるチャネルとして、また、他のイオン・チャネルおよび輸送体の制御因子として機能するので（Ｋｌｅｉｚｅｎ等、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２０００、７９、５４４〜５６）、この遺伝子がイオン・チャネル（または制御因子）として機能し得ること、およびこれらの突然変異が疾患の表現型をもたらす恐れがあることはもっともなことである。ＡＢＣＣ１１の発現の分析から、この遺伝子が筋や脳組織で発現し、骨格筋や脳に関係するＰＫＣの病因の作業仮説を支持するものであることが示されている。要約すると、染色体上の位置、考えられる機能、および発現プロファイルから、この遺伝子はＰＫＣ／ＩＣＣＡに対する有望な候補である。
【実施例３】
【０２４３】
系統学的解析（図５）
ＡＢＣＣサブファミリー・タンパク質の系統学的解析によって、ＡＢＣＣ１１遺伝子とＡＢＣＣ１２遺伝子が比較的最近２組に分岐したことが明白である（図５）。この得られた隣接合流樹（ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ  ｔｒｅｅ）によって、ＡＢＣＣ１１／ＡＢＣＣ１２のクラスターとＡＢＣＣ５遺伝子の進化上の密接な関係が最大の信頼度（１００レベルのブートストラップ（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ）支持）で示されている（図５）。また、この近隣結合樹の解析によって、ＡＢＣＣ８遺伝子とＡＢＣＣ９遺伝子が最近２組に分岐し、一方、ＡＢＣＣ１０が共通祖先から分離した最初の遺伝子の１つであると考えられることが示唆された。ＡＢＣＣ１、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＣ３、およびＡＢＣＣ６の各遺伝子は明確に規定されたサブ・クラスターを構成し、一方、ＡＢＣＣ４とＣＦＴＲ（ＡＢＣＣ７）の各遺伝子は明らかに初期に分岐したにもかかわらず別の確実なサブセットを形成している。
【実施例４】
【０２４４】
細胞系
ヒト赤白血病Ｋ５６２細胞を、アメリカ組織培養コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＭＤ）から入手して、１０％ウシ胎児血清、２−グルタミン２ｍＭを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。９−（２−ホスホニルメトキシエチル）アデニン（ＰＭＥＡ）に耐性のある細胞Ｋ５６２／ＰＭＥＡを、Ｈａｔｓｅ等（Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、１９９６、５０、１２３１〜４２）によって記述されたようにして誘導した。Ｔ−リンパ芽球細胞系ＣＥＭおよび（−）２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）に耐性のあるＣＥＭ−３ＴＣ細胞を選択した。細胞系ＣＥＭｓｓおよびＣＥＭ−ｒ１は、Ｒｏｂｂｉｎｓ等（Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、１９９５、４７、３９１〜７）によって記述された。ＣＥＭ−ｒ１は、ＡＢＣＣ４を過剰発現するので、ＰＭＥＡに対して高い耐性がある（Ｓｃｈｕｅｔｚ等、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、１９９９、５、１０４８〜５１）。これら６個の細胞系（野生型と耐性細胞系の３組）由来のＲＮＡすべてを、ＴＲＩＺＯＬ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いて単離し、図３に示したサイクル数とオリゴヌクレオチド・プライマーを変えてＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ産物をサブクローニングし、配列を直接決定して確認した。
【０２４５】
逆転写
全容積１１.５μｌ中で、オリゴｄＴ５００ｎｇと混合したｍＲＮＡ  ｐｏｌｙ（Ａ）＋（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）５００ｎｇを７０℃で１０分間変性し、次いで氷上で冷却した。ＲＮＡｓｉｎ１０単位、ＤＴＴ１０ｍＭ、ｄＮＴＰ０.５ｍＭ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ第１鎖（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ）緩衝液、およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）２００単位を添加後、反応物を４２℃で４５分間インキュベートした。
【０２４６】
ＰＣＲ
各ポリメラーゼ連鎖反応は、各ｄＮＴＰ４００μＭ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）２単位、各プライマー０.５μＭ、ＭｇＣｌ2２.５ｍＭ、ＰＣＲ緩衝液、およびＤＮＡ５０ｎｇ、またはｃＤＮＡ約２５ｎｇ、または初期ＰＣＲ混合物１／５０ｅを含んでいた。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ９７００サーマル・サイクラー中、９６ウェル・マイクロタイター・プレート中で反応を３０サイクル実施した。９４℃１０分間の最初の変性後、各サイクルは、３０秒（９４℃）の変性ステップ、３０秒（６４℃２サイクル、６１℃２サイクル、５８℃２サイクル、および５５℃２８サイクル）のハイブリダイゼーション・ステップ、および１分／ｋｂ（７２℃）の伸長ステップからなった。最後に７２℃７分間伸長させてＰＣＲを終了した。ＲＴ−ＰＣＲの場合、逆転写酵素のない対照反応およびｃＤＮＡの代わりに水を含んだ反応をサンプルごとに実施した。
【０２４７】
ＤＮＡ配列決定
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分析・定量し、Ｐ１００カラムを用いて精製した。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ＢｉｇＤｙｅターミネーター・サイクル配列決定キット（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、精製したＰＣＲ産物の配列を決定した。この配列決定反応混合物を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ−１００微量濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ）を用いて精製した。ＡＢＩ  ３７７  ＤＮＡシークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で製造者（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の手順に従い、配列決定反応物の配列を決定した。
【０２４８】
プライマー
ＧＣＧパッケージのＰｒｉｍｅソフトウェア、またはオリゴ４（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）ソフトウェアを用いて、オリゴヌクレオチドを選択した。プライマーをＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌｔｄから取り寄せ、精製せずに使用した。
【実施例５】
【０２４９】
ヒト組織およびヌクレオチド耐性細胞系におけるＡＢＣＣ１１の発現
ＡＢＣＣ１１遺伝子の発現パターンを、ＰＣＲにより多重組織発現アレイ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｒｒａｙｓ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）上で遺伝子特異的プライマーを用いて検討し、約５００ｂｐのＰＣＲ断片を得た（図３）。約５０００ｂｐのｍＲＮＡ種がノーザン・ブロットによって観測された。発現実験に使用したプライマーは、エクソン７からエクソン１０までのＡＢＣＣ１１  ＣＤＮＡを増幅し、５２７ｐｂのＰＣＲ断片が得られた（図３）。肺の場合、これよりも小さな（４１９ｐｂ）断片も検出された（図３）。このＰＣＲ産物の配列を直接決定して、短い方のＰＣＲ産物がＡＢＣＣ１１遺伝子のエクソン９を欠いていることが判明した。これらの結果は繰返し実験で確認されたことから、ＡＢＣＣ１１エクソン９の読み飛ばしがインビボで頻繁に起きているのかもしれない。エクソンの読み飛ばし現象および選択的スプライシング現象は、Ｒｉｃｋｅｒｓ等（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）９４、３１１〜３１３）およびＢｅｌｌｉｎｃａｍｐｉ等（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２００１）２８３、５９０〜５９７）によっていくつかのＡＢＣ遺伝子で記述されている。
ＡＢＣＣ１１  ＥＳＴの組織源（ｔｉｓｓｕｅ  ｓｏｕｒｃｅ）をｄｂＥＳＴ公開データベースおよびＩｎｃｙｔｅ  ＬｉｆｅＳｅｑ  Ｇｏｌｄ商用（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）データベースで系統的に解析して、その大部分が乳癌組織（１７）由来である２９個のＥＳＴを得た。これ以外のＥＳＴは、前立腺（５クローン）、精巣（３）、ＣＮＳ（２）、および結腸（２）由来であった。筋ライブラリー由来のＥＳＴはなかった。
【０２５０】
この新しい遺伝子がＡＢＣＣ５に対して幅広い（およびＡＢＣＣ４に対してある程度の）構造的類似性を示したので、Ｋ５６２とＫ５６２−ＰＭＥＡ、ＣＥＭｓｓとＣＥＭ−ｒ１、ＣＥＭとＣＥＭ−３ＴＣの３組の細胞系における発現も評価した。ＰＭＥＡに対する耐性によりＫ５６２−ＰＭＥＡ系とＣＥＭ−ｒ１系を選択し、シチジン・ヌクレオシド類似体３ＴＣに対する耐性によりＣＥＭ−３ＴＣを選択した。親細胞系とＰＭＥＡ耐性細胞系ではＡＢＣＣ１１の発現レベルに差は認められなかった。これとは対照的に、ＣＥＭ−３ＴＣ細胞系は、親細胞系ＣＥＭに比べてＡＢＣＣ１１の発現が２〜３倍再現性良く増大した。ＡＢＣＣ１１とＡＢＣＣ５（図１および図５）の進化上の密接な関係を考慮し、ＡＢＣＣ５によるヌクレオチド類似体の選択的な輸送を実証した最近の研究（Ｗｉｊｎｈｏｌｄｓ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、２０００、９７、７４７６〜８１）とさらに照らし合わせると、これは興味深い知見となる可能性がある。また、ＣＥＭ−３ＴＣの流出量耐性表現型は、ＡＢＣＣ４の過剰発現では部分的にしか説明されず、これらの細胞においてＡＢＣＣ１１がより多く発現することから、さらなる検討が必要である。
【実施例６】
【０２５１】
ＡＢＣＣ１１の完全なｃＤＮＡを含む発現ベクターの哺乳動物細胞における構築
ＡＢＣＣ１１遺伝子は、哺乳動物細胞中で発現することがある。一般的な真核生物の発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写開始を可能にするプロモーター、タンパク質をコードする配列、転写終結に必要なシグナル、および転写物のポリアデニレーションに必要なシグナルを含む。発現ベクターは、エンハンサー、コザック配列、ｍＲＮＡのスプライシングに必要な配列などのさらに別のシグナルも含む。ＳＶ４０ウイルス・プロモーターの初期要素（ｅａｒｌｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ）および後期要素（ｌａｔｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）、レトロウイルスＬＴＲ、またはＣＭＶウイルス初期プロモーターを用いて有効な転写が得られる。一方、アクチン・プロモーターなどの細胞要素も使用することができる。本発明を実施するために多数の発現ベクターを使用することができる。このようなベクターの一例はｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【実施例７】
【０２５２】
正常なＡＢＣＣ１１ポリペプチドおよび突然変異ＡＢＣＣ１１ポリペプチドの産生
実施例２にその単離について記載した対応する完全なｃＤＮＡによってコードされる正常なＡＢＣＣ１１ポリペプチド、または実施例２に記載した技術に従ってその完全なｃＤＮＡを得ることもできる突然変異ＡＢＣＣ１１ポリペプチドは、細菌または昆虫細胞の各発現系においてバキュロウイルス・ベクターを用いて、あるいはワクシニア・ウイルス・ベクターを含む哺乳動物細胞やそれを含まない哺乳動物細胞において容易に産生することができる。これらの方法はすべて、現在広範に記載されており、当業者には既知である。その詳細な記述の１つが、例えばＦ．Ａｕｓｕｂｅｌ等（１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ）にある。
【実施例８】
【０２５３】
突然変異ＡＢＣＣ１１ポリペプチドに対する抗体の産生
本発明における抗体を、様々な方法によって調製することができる（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｒｏｇｅｒ  Ｂｒｅｎｔ、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、Ｄａｖｉｄ  Ｄ．Ｍｏｏｒｅ、Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ、Ｊｏｈｎ  Ａ．Ｓｍｉｔｈ、Ｋｅｖｉｎ  Ｓｔｒｕｈｌ−Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １巻、１１章、１９８９）。例えば、本発明のポリペプチドを発現する細胞を動物に注射して抗体を含む血清の産生を誘導する。記載された方法の１つでは、タンパク質を調製し、汚染を避けるために精製する。次いで、このような製剤を、より高い活性を有するポリクローナル抗血清を産生する目的で動物に導入する。
【０２５４】
この好ましい方法では、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。このようなモノクローナル抗体をハイブリドーマ技術を用いて調製することができる（Ｋｏｈｌｅｒ等、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５；Ｋｏｈｌｅｒ等、１９７６、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２；Ｋｏｈｌｅｒ等、１９７６、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６：５１１；Ｈａｍｍｅｌｉｎｇ等、１９８１、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ.Ｙ.、ｐｐ.５６３〜６８１）。一般に、このような方法ではポリペプチドを用いて、さらに好ましくはこのポリペプチドを発現する細胞を用いて動物（好ましくはマウス）を免疫する必要がある。これらの細胞を適切な組織培養培地中で培養することができる。しかし、（５６℃で不活化した）１０％ウシ胎児血清を補充し、非必須アミノ酸約１０ｇ／ｌ、ペニシリン１０００Ｕ／ｍｌ、およびストレプトマイシン約１００μｇ／ｍｌを補充したイーグル培地（修正Ｅａｒｌｅ）中でこれらの細胞を培養することが好ましい。
【０２５５】
これらのマウスのひ細胞を抽出して、適切な骨髄腫細胞系と融合させる。ただし、ＡＴＣＣから入手できる親の骨髄腫細胞系（ＳＰ２０）を使用することが好ましい。融合後、得られたハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地で選択的に維持し、次いでＷａｎｄｓ等（１９８１、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、８０：２２５〜２３２）によって記述された限界希釈法によりクローン化する。このような選択後に得られたハイブリドーマ細胞を検査して、前記ポリペプチドに結合可能な抗体を分泌するクローンを同定する。
さらに、前記ポリペプチドに結合可能な別の抗体を、抗イディオタイプ抗体を用いた２段階操作によって産生することができる。このような方法は、その抗体自体が抗原であり、したがって別の抗体を認識する抗体を得ることが可能であるという事実に基づいている。この方法によれば、前記タンパク質に特異的な抗体を用いて動物、好ましくはマウスを免疫することができる。次いでこの動物のひ細胞を用いてハイブリドーマ細胞を産生し、この特異的抗体タンパク質複合体に結合するその能力が前記ポリペプチドでブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するために、このハイブリドーマ細胞をスクリーニングする。これらの抗体を用いて動物を免疫して、このタンパク質に特異的な抗体を大量に生成させることができる。
【０２５６】
本明細書に記載する方法に従い、本発明の抗体のＦａｂ断片、Ｆ(ａｂ’)２断片、および他の断片を使用することが好ましい。このような断片は、一般には、（Ｆａｂ断片を産生するために）パパイン、（Ｆ(ａｂ’)２断片を産生するために）ペプシンなどの酵素を利用したタンパク質分解性の切断によって産生される。あるいは、組換えＤＮＡ技術または合成化学技術を適用して、このタンパク質を認識する分泌断片を産生することができる。
抗体をヒトにインビボで使用する場合、「ヒト化」キメラ・モノクローナル抗体を使用することが好ましい。このような抗体を、上記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞由来の遺伝子構築体（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）を用いて産生することができる。キメラ抗体を産生する方法は、当業者には既知である（総説としてＭｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２）；Ｏｉ等（１９８６、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、４：２１４）；Ｃａｂｉｌｌｙ他、米国特許第４,８１６,５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ他、欧州特許第１７１４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ他、欧州特許第１７３４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ等、国際公開第８６０１５３３号；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ等、国際公開第８７０２６７１号；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ等；（１９８４、Ｎａｔｕｒｅ、３１２：６４３）；およびＮｅｕｂｅｒｇｅｒ等（１９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１４：２６８）を参照されたい）。
【実施例９】
【０２５７】
ＡＢＣＣ１１遺伝子における多型性／突然変異の決定
ＡＢＣＣ１１遺伝子転写物配列中またはゲノム配列中の多型性または突然変異の検出を、様々な手順に従い実施することができる。好ましい方法は、配列を直接決定することである。
ｍＲＮＡ調製物を得ることができる患者の場合、好ましい方法は、ｃＤＮＡを調製しそれらの配列を直接決定することである。ＤＮＡしか入手できない患者の場合、および対応する遺伝子の構造が未知か部分的にしかわからない転写物の場合、そのイントロン−エクソン構造ならびに対応する遺伝子のゲノム配列を正確に決定する必要がある。したがって、これには、第一に、検討する転写物に対応するゲノムＤＮＡ  ＢＡＣクローンまたはコスミド・クローンを単離し、対応するクローンの挿入断片の配列を決定し、ｃＤＮＡ配列と得られるゲノムＤＮＡの配列とを比較してイントロン−エクソン構造を決定する必要がある。
【０２５８】
直接配列決定による突然変異の検出技術は、疾患に対するホモ接合体から、または少なくとも８個体（検討対象の病理に罹った４個体および罹患していない４個体）から、または検討対象集団の少なくとも３２の血縁でない個体から得られるＡＢＣＣ１１遺伝子のゲノム配列を比較することからなる。この配列の相違が多型性を形成する。野生型タンパク質のアミノ酸配列を改変する多型性はすべて、前記タンパク質の機能に影響を及ぼし得る突然変異でもよく、系統中の（遺伝型−表現型の相関を示す）突然変異および疾患の同時分離（ｃｏｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）の研究に対し、あるいは薬理ゲノム研究における治療に使用する分子に対する薬理応答（ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の研究に対し、あるいは散発性症例の解析のための症例と調節との関連性の研究においてより具体的に考えることが好ましい。
【実施例１０】
【０２５９】
突然変異または転写の相違に起因する発作性運動誘発性舞踏アテトーゼなど染色体遺伝子座に関連する疾患の原因遺伝子の同定
実施例９に記載の方法に従って同定される突然変異のうち、疾患の表現型に関連する突然変異はすべて原因となり得る。これらの結果は、罹患した個体およびその親類すべての遺伝子配列を決定することによって確認される。
また、実施例４に記載の方法に従い、罹患または非罹患個体に特異的なＲＮＡを用いたノーザン・ブロットまたはＲＴ−ＰＣＲ分析によって、検討対象の遺伝子の発現レベルにおける注目すべき変化を、特に遺伝子が転写されない状況で検出することが可能になる。
【実施例１１】
【０２６０】
ＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする核酸を含む組換えベクターの構築
ヒトＡＢＣＣ１１タンパク質をコードする核酸の合成：
ヒト細胞（例えば、胎盤組織、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ、またはＴＨＰ１細胞）から単離したＲＮＡ（５００ｎｇ）すべてを、ヒトＡＢＣＣ１１遺伝子のｃＤＮＡを合成する原料として用いることができる。ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する方法は当分野では周知である。例えば、「Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ｏｎｅ  ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ」（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）システムを使用することができる。
ＡＢＣＣ１１  ｃＤＮＡに特異的なオリゴヌクレオチド・プライマーをこの目的に使用することができる。これらのオリゴヌクレオチド・プライマーを、ＡＢＩ  ３９４型のＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてホスホアミダイト法により合成することができる。
前記ジデオキシヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＧＴＰ各２００μＭ、ならびにパイロコッカス・フリオース（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）の存在下で、テンプレートとしてヒトＡＢＣＣ１１  ｃＤＮＡ５０ｎｇ、および制限酵素ＮｏｔＩ（５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’）によって認識される部位をその５’末端に含む先に使用したＡＢＣＣ１１特異的オリゴヌクレオチド・プライマー０.２５μＭを用いて、第２の増幅ステップで組換えベクター中に挿入しようとするｃＤＮＡ領域の両側に配置されるように、制限酵素ＮｏｔＩによって認識される部位を増幅したＡＢＣＣ１１  ｃＤＮＡ中に組み入れることができる。
ＰＣＲ反応をＰＣＲ用サーモサイクラー装置（Ｃｅｔｕｓ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ、ＵＳＡ）中で３０サイクルを超えて実施することができ、各サイクルは９５℃１分間の変性ステップ、５０℃１分間の再生ステップ、および７２℃２分間の伸長ステップを含む。
【０２６１】
発現ベクター中へのヒトＡＢＣＣ１１遺伝子ｃＤＮＡのクローニング：
次いで、発現ベクター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーター配列、エンハンサー配列、およびＳＶ４０ポリアデニレーション・シグナル（Ｂｅｇ等、１９９０、ＰＮＡＳ、８７：３４７３；Ａｐｐｌｅｂａｕｍ−Ｂｏｄｅｎ、１９９６、ＪＣＩ  ９７）を含むｐＣＭＶベクターのＮｏｔＩ制限部位内にヒトＡＢＣＣ１１  ｃＤＮＡ挿入断片をクローン化して、ｐＡＢＣＣ１１と命名される発現ベクターを産生することができる。
クローン化したｃＤＮＡの配列は、（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡによって市販されている）反応セット「ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｄｙ」を用いて、ＡＢＩ  ３１０型キャピラリー・シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）中で２本の鎖上の配列を決定して確認することができる。
【０２６２】
ヒトＡＢＣＣ１１遺伝子ｃＤＮＡを含む組換えアデノウイルス・ベクターの構築：
発現ベクターｐＣＭＶ−βの改変：
発現ベクターｐＣＭＶ−β（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ、Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ受託番号Ｕ０２４５１）のβ−ガラクトシダーゼｃＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩで消化して除去し、５’末端から３’末端までに以下の部位、すなわちＮｏｔＩ、ＡｓｃＩ、ＲｓｒII、ＡｖｒII、ＳｗａＩ、およびＮｏｔＩを含むＮｏｔＩ制限部位領域でクローン化されたマルチ・クローニング部位で置き換えることができる。このマルチ・クローニング部位の配列は、
５’−ＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣＣＧＧＡＣＣＧＣＣＴＡＧＧＡＴＴＴＡＡＡＴＣＧＣＧＧＣＣＣＧＣＧ−３’である。
【０２６３】
改変発現ベクターｐＣＭＶのＥｃｏＲＩ部位とＳａｎＩ部位の間のＤＮＡ断片を単離し、シャトル・ベクターｐＸＣＸＩＩ（ＭｃＫｉｎｎｏｎ等、１９８２、Ｇｅｎｅ、１９：３３；ＭｃＧｒｏｒｙ等、１９８８、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１６３：６１４）の改変ＸｂａＩ部位にクローン化することができる。
【０２６４】
シャトル・ベクターｐＸＣＸＩＩの改変：
５’末端から３’末端までに
５’ＣＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣＧＧＣＣＴＣＣＧＴＧＧＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＣ−３’の配列を有するＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｆｉＩ、ＰｍｅＩ、ＮｈｅＩ、ＳｒｆＩ、ＰａｃＩ、ＳａｌＩ、およびＸｂａＩの各制限部位を含むマルチ・クローニング部位を、ベクターｐＸＣＸＩＩ（ＭｃＫｉｎｎｏｎ等、１９８２、Ｇｅｎｅ  １９：３３；ＭｃＧｒｏｒｙ等、１９８８、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１６３：６１４）のＸｂａＩ部位（３３２９位置のヌクレオチド）に挿入することができる。
次いで、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、ＦＶ４０のドナー・スプライシング部位（ｄｏｎｏｒ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ）およびアクセプター・スプライシング部位（ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ）、およびＦＶ４０のポリアデニレーション・シグナルを含む改変ベクターｐＣＭＶ−βから単離したＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ  ＤＮＡ断片を、改変シャトル・ベクターｐＸＣＸのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ部位中にクローン化することができ、このベクターをｐＣＭＶ−１１と呼ぶ。
【０２６５】
シャトル・ベクターｐＡＤ１２−ＡＢＣＡの調製：
ヒトＡＢＣＣ１１  ｃＤＮＡを上述のようにＲＴ−ＰＣＲ反応により得て、ベクターｐＣＭＶ−１２中のＮｏｔＩ部位にクローン化し、ベクターｐＣＭＶ−ＡＢＣＣ１１を得る。
【０２６６】
ＡＢＣＣ１１組換えアデノウイルスの構築：
ヒトＡＢＣＣ１１  ｃＤＮＡを含む組換えアデノウイルスを、ＭｃＧｒｏｒｙ等（１９８８、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１６３：６１４）によって記述された技術に従って構築することができる。
手短に言えば、ベクターｐＡＤ１２−ＡＢＣＡに、Ｃｈｅｎ等（１９８７、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、７：２７４５〜２７５２）の技術に従ってベクターｔＧＭ１７を同時形質移入する。
同様に、ベクターｐＡＤ１２−ルシフェラーゼを構築し、ベクターｐＪＭｌ７を同時形質移入した。
組換えアデノウイルスをＰＣＲ増幅によって確認し、ヒト胎生腎細胞系ＨＥＫ  ２９３（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）中で大規模に増幅する前に、２つの精製サイクルにかける。
アデノウイルス・ベクターで感染後４８〜７２時間に感染細胞を収集し、５回の凍結融解溶解サイクルにかける。
【０２６７】
この粗製溶解物をＦｒｅｏｎ（Ｈａｌｏｃａｒｂｏｎｅ  １１３、Ｍａｔｈｅｓｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔ、Ｓｃａｕｃｕｓ、Ｎ．Ｊ．ＵＳＡ）を利用して抽出し、０.２％ネズミ・アルブミン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を補充した塩化セシウム中で２回沈降させ、ＮａＣｌ１５０ｎＭ、Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７.４）１０ｍＭ、ＫＣｌ５ｍＭ、ＭｇＣｌ2１ｍＭ、およびＣａＣｌ2１ｍＭからなる緩衝液で徹底した透析を行う。
この組換えアデノウイルスを−７０℃で貯蔵し、それを動物に投与する前に、あるいは培養中の細胞とともにインキュベーションする前に滴定する。
欠失領域の構造部分（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｏｒｔｉｏｎ）に位置するオリゴヌクレオチド・プライマーを用いたＰＣＲ増幅を利用してスクリーニングすることにより、野生型が混入したアデノウイルスがないことを確認する。
【０２６８】
ヒトＡＢＣＣ１１  ｃＤＮＡの発現の確認：
配列番号３０で示されるアミノ酸配列の全部または一部を含むＡＢＣＣ１１タンパク質由来の合成ポリペプチド断片を注射することによって、ウサギおよびニワトリ中で上述のようにしてヒトＡＢＣＣ１１ポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体を調製することができる。これらのポリクローナル抗体を使用して、細胞モデルおよび動物モデルにおけるヒトＡＢＣＣ１１遺伝子の発現を免疫ブロット法および／または免疫検出法によって検出および／または定量する。
【０２６９】
細胞中のヒトＡＢＣＣ１１  ｃＤＮＡのインビトロでの発現：
ＨＥＫ２９３系およびＣＯＳ−７系の各細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）、ならびにタンジール病患者または低αリポタンパク血症に罹った患者由来の初代培養物中の線維芽細胞に、リポフェクトアミン（ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて、あるいは塩化カルシウムを利用した共沈殿（Ｃｈｅｎ等、１９８７、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、７：２７４５〜２７５２）によって発現ベクターｐＣＭＶ−ＡＢＣＣ１１（５〜２５μｇ）を形質移入する。
これらの細胞をベクターｐＡＢＣＣ１１−ＡｄＶ（感染の指数（Ｉｎｄｅｘ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、ＭＯＩ＝１０）で感染させることもできる。
ヒトＡＢＣＣ１１の発現は、形質移入された細胞および／または感染細胞を用いて、免疫ブロット法ならびにａｐｏＡ−１により誘導されるコレステロールの流出量の定量によってモニターすることができる。
【０２７０】
様々な動物モデルにおけるＡＢＣＣ１１遺伝子のインビボでの発現：
実験０日目に、１０8〜１０9溶解プラーク形成単位（ｐｆｕ）を含む精製組換えアデノウイルス（ｐＡＢＣＡ−ＡｄＶまたはｐＬｕｃｉｆ−ＡｄＶ）を含有する適切な量（１００〜３００μｌ）の培地を、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、対照マウスおよびトランスジェニック・マウス・モデルまたはノックアウト・マウス・モデル）の伏在静脈中に注入する。
コレステロールまたは炎症性脂質の輸送におけるＡＢＣＣ１１タンパク質の生理上の役割を、アデノウイルスの投与前（０日）と投与後（２、４、７、１０、１４日）のコレステロールまたは適切な炎症性脂質の総量を測定することによって評価する。
コレステロールおよび炎症性脂質の輸送に対するＡＢＣＣ１１遺伝子発現の効果を評価するために、放射性標識された産物を利用した動力学的研究を、ベクターｒＬｕｃｉｆ−ＡｄＶおよびｒＡＢＣＡ−ＡｄＶの投与から５日後に実施する。
また、Ｖａｉｓｍａｎ（１９９５）およびＨｏｅｇ（１９９６）の教示に従い、ＡＢＣＣ１１、ＣＭＶ、またはａｐｏＥなど内在性プロモーターの制御下にあるヒトＡＢＣＣ１１  ｃＤＮＡを含む構築体を用いて、ＡＢＣＣ１１遺伝子を過剰発現するトランスジェニック・マウスおよびトランスジェニック・ウサギを生産することができる。
【０２７１】
本発明は、本明細書に記載する特定の実施形態によってその範囲を限定されるものではない。実際、本明細書に記載する実施形態に加えて様々な本発明の変形が、前述の説明および添付した図面から当業者には明白になるはずである。このような変形は添付した特許請求の範囲の範囲内に含まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【０２７２】
【図１】ＡＢＣＣ１１、ＡＢＣＣ１２、およびＡＢＣＣ５タンパク質の配列を示す図である。同一アミノ酸を影付きで、ギャップをピリオドで示す。Ｗａｌｋｅｒ  ＡおよびＢモチーフ、およびＡＢＣ輸送体ファミリー・シグネチャ配列（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）Ｃは、下線を引きそれぞれの文字で標識してある。Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｐａｃｋａｇｅ中のＰＩＬＥＵＰプログラムを用いてアミノ酸配列を並べた。膜貫通セグメント候補を太字で示す。
【図２】１６番染色体の物理地図、ならびにヒトＡＢＣＣ１１遺伝子およびＡＢＣＣ１２遺伝子の局在化を示す図である。マーカーＤ１６Ｓ３０９３とＤ１６Ｓ４０９が隣接したヒトＡＢＣＣ１１遺伝子とＡＢＣＣ１２遺伝子は約２００ｋｂ離れており、頭−尾形式で構成され、これらの５’末端は動原体に面している。ＩＣＣＡ遺伝子座、ＰＫＣ遺伝子座、およびそれらの重複する遺伝子座を角括弧で示す。ＡＢＣＣ１１遺伝子およびＡＢＣＣ１２遺伝子をそれぞれ灰色および黒の矢印で示す。
【図３】ヒトＡＢＣＣ１１遺伝子のヒトＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡ（ＭＴＣ（商標）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）上でのＰＣＲによる発現プロファイルを示す図である。各レーンは、１６個のヒト組織／細胞からの正規化された第一鎖（ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ）ｃＤＮＡを含む。すなわち、レーン１〜１６は、それぞれ心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、筋、腎臓、すい臓、ひ臓、胸腺、精巣、卵巣、腸、結腸、白血球、および前立腺のｃＤＮＡである。Ｎは負の対照であり、Ｍはマーカー（１ｋｂ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ）のレーンである。以下のプライマー対は特定の遺伝子産物を増幅した：ＡＢＣＣ１１：順方向  ５’−ＡＧＡ  ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＣＡＴ  Ｃ−３’、逆方向  ５’−ＧＴＴ  ＣＣＴ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＴＧＣ−３’。
【図４】ＡＢＣＣ１１遺伝子およびＡＢＣＣ１２遺伝子のスプライシング・パターンを示す図である。空白の枠はエクソンを示し、縦の線はスプライス部位を示す。各遺伝子のエクソン数を図の上下に示す。塗りつぶした枠は、ＡＢＣドメインをコードするエクソンである。
【図５】ＡＢＣＣサブファミリーの遺伝子の系統的関係を示す図である。ＣＬＵＳＴＡＬＷプログラムを用いて、ＡＢＣＣサブファミリー・メンバーすべての完全なタンパク質配列を並べた。相違の程度（ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｍｅａｓｕｒｅ）をアミノ酸当たりの置換数で示す。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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