(57)【要約】新規ポリペプチド、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び関連する組成物及び方法が、ｚｃｙｔｏｒ１７、すなわち新規サイトカイン受容体に関して開示される。前記ポリペプチドは、インビトロ及びインビボで、造血、リンパ及び骨髄細胞の増殖及び／又は進化を刺激するリガンドを検出するための方法内に使用され得る。リガンド−結合受容体ポリペプチドはまた、インビトロ及びインビボでリガンド活性を阻止するためにも使用され得る。ｚｃｙｔｏｒ１７をコードするポリヌクレオチドは、染色体５に位置し、そしてヒト疾病状態に関連するゲノムの領域を同定するために使用され得る。本発明はまた、タンパク質の生成方法、その使用方法及びそれに対する抗体を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号２２７（Ｐｒｏ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｂ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５１９（Ｇｌｕ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｃ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５４３（Ｌｅｕ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｄ）アミノ酸番号５４４（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｅ）アミノ酸番号５４４（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）の配列番号４６に示されるようなアミノ酸配列；
（ｆ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｇ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）の配列番号４６に示されるようなアミノ酸配列；
（ｈ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；及び
（ｉ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）の配列番号４６に示されるようなアミノ酸配列；
からである、アミノ酸残基の配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
（ａ）ヌクレオチド番号２２８〜ヌクレオチド番号８５１の配列番号１に示されるようなポリヌクレオチド；
（ｂ）ヌクレオチド番号２２８〜ヌクレオチド番号１７２７の配列番号１に示されるようなポリヌクレオチド；
（ｃ）ヌクレオチド番号２２８〜ヌクレオチド番号１７９９の配列番号１に示されるようなポリヌクレオチド；
（ｄ）ヌクレオチド番号１８００〜ヌクレオチド番号２３６６の配列番号１に示されるようなポリヌクレオチド；
（ｅ）ヌクレオチド番号１７９１〜ヌクレオチド番号２１０８の配列番号４５に示されるようなポリヌクレオチド；
（ｆ）ヌクレオチド番号２２８〜ヌクレオチド番号２３６６の配列番号１に示されるようなポリヌクレオチド；
（ｇ）ヌクレオチド番号２１９〜ヌクレオチド番号２１０８の配列番号４５に示されるようなポリヌクレオチド；
（ｈ）ヌクレオチド番号１７１〜ヌクレオチド番号２３６６の配列番号１に示されるようなポリヌクレオチド；
（ｉ）ヌクレオチド番号１６２〜ヌクレオチド番号２１０８の配列番号４５に示されるようなポリヌクレオチド；及び
（ｊ）上記（ａ）〜（ｉ）に対して相補的なポリヌクレオチド配列；
の群からの配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドがさらに、配列番号２の残基５２０（Ｉｌｅ）〜５４３（Ｌｅｕ）から成るトランスメンブランドメインを含んで成る請求項１記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドがさらに、配列番号２の残基５４４（Ｌｙｓ）〜７３２（Ｖａｌ）又は配列番号４６の残基５４４（Ｌｙｓ）〜６４９（Ｉｌｅ）から成る細胞内ドメインを含んで成る請求項１記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが、細胞増殖、レポーター遺伝子の転写の活性化により測定されるような活性を有し、又はさらに、抗体に結合し、
ここで前記抗体が、
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号２２７（Ｐｒｏ）を含んで成るポリペプチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５１９（Ｇｌｕ）を含んで成るポリペプチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５４３（Ｌｅｕ）を含んで成るポリペプチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸番号５４４（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）を含んで成るポリペプチド；
（ｅ）配列番号４６のアミノ酸番号５４４（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）を含んで成るポリペプチド；
（ｆ）配列番号２のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）を含んで成るポリペプチド；
（ｇ）配列番号４６のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）を含んで成るポリペプチド；
（ｈ）配列番号２のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）を含んで成るポリペプチド；及び
（ｉ）配列番号４６のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）を含んで成るポリペプチド；
から成る群からのアミノ酸の配列を含んで成るポリペプチドに対して生ぜしめられ、そして
前記単離されたポリペプチドへの前記抗体の結合が、生物学的又は生化学的アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ、ラジオイムノ−沈殿、ウェスターンブロット又は酵素連結されたイムノソルベントアッセイにより測定される請求項１記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
次の作用可能に連結された要素：
転写プロモーター；
アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列、又はアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）の配列番号４６に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードするＤＮＡセグメント；及び
転写ターミネーターを含んで成り、
ここで前記プロモーターが前記ＤＮＡセグメントに作用可能に連結され、そして前記ＤＮＡセグメントが前記転写ターミネーターに作用可能に連結されることを特徴とする発現ベクター。
【請求項７】
前記ＤＮＡセグメントに作用可能に連結される分泌シグナル配列をさらに含んで成る請求項６記載の発現ベクター。
【請求項８】
請求項７記載の発現ベクターを含んで成る培養された細胞であって、前記ＤＮＡセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する細胞。
【請求項９】
前記ＤＮＡセグメントが、アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜２２７（Ｐｒｏ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；又はアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５１９（Ｇｌｕ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド；及び
転写ターミネーターをコードし、
ここで前記プロモーター、ＤＮＡセグメント及びターミネーターが作用可能に連結される請求項６記載の発現ベクター。
【請求項１０】
前記ＤＮＡセグメントに作用可能に連結される分泌シグナル配列をさらに含んで成る請求項９記載の発現ベクター。
【請求項１１】
前記ポリペプチドがさらに、配列番号２の残基５２０（Ｉｌｅ）〜５４３（Ｌｅｕ）から成るトランスメンブランドメインを含んで成る請求項９記載の発現ベクター。
【請求項１２】
前記ポリペプチドがさらに、配列番号２の残基５４４（Ｌｙｓ）〜７３２（Ｖａｌ）、又は配列番号４６の残基５４４（Ｌｙｓ）〜６４９（Ｉｌｅ）から成る細胞内ドメインを含んで成る請求項９記載の発現ベクター。
【請求項１３】
請求項９記載の発現ベクターを導入されている培養された細胞であって、前記ＤＮＡセグメントによりコードされる可溶性受容体ポリペプチドを発現する細胞。
【請求項１４】
融合タンパク質をコードするＤＮＡ構造体であって、
（ａ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号１９（Ａｌａ）の配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号３２（Ａｌａ）の配列番号５４のアミノ酸配列；
（ｃ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号２２７（Ｐｒｏ）の配列番号２のアミノ酸配列；
（ｄ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５１９（Ｇｌｕ）の配列番号２のアミノ酸配列；
（ｅ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５４３（Ｌｅｕ）の配列番号２のアミノ酸配列；
（ｆ）アミノ酸番号５２０（Ｉｌｅ）〜アミノ酸番号５４３（Ｌｅｕ）の配列番号２のアミノ酸配列；
（ｇ）アミノ酸番号５４４（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）の配列番号２のアミノ酸配列；
（ｈ）アミノ酸番号５４４（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）の配列番号４６のアミノ酸配列；
（ｉ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）の配列番号２のアミノ酸配列；及び
（ｊ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）の配列番号４６のアミノ酸配列：
から成る群から選択されたアミノ酸残基の配列を含んで成るポリペプチドをコードする第１ＤＮＡセグメント；及び
追加のポリペプチドをコードする少なくとも１つの他のＤＮＡセグメントを含んで成り、ここで前記第１及び他のＤＮＡセグメントが読み取り柄を整合して連結され；そして前記第１及び他のＤＮＡセグメントが前記融合タンパク質をコードすることを特徴とするＤＮＡ構造体。
【請求項１５】
次の作用可能に連結された要素：
転写プロモーター；
請求項１４記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ構造体；及び
転写ターミネーターを含んで成り、
ここで前記プロモーターが前記ＤＮＡ構造体に作用可能に連結され、そして前記ＤＮＡ構造体が前記転写ターミネーターに作用可能に連結されることを特徴とする発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１５記載の発現ベクターを含んで成る培養された細胞であって、前記ＤＮＡ構造体によりコードされるポリペプチドを発現する細胞。
【請求項１７】
融合タンパク質の生成方法であって、
請求項１６記載の細胞を培養し；そして
前記細胞により生成されるポリペプチドを単離することを含んで成る方法。
【請求項１８】
（ａ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号２２７（Ｐｒｏ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｂ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５１９（Ｇｌｕ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｃ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５４３（Ｌｅｕ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｄ）アミノ酸番号５４４（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｅ）アミノ酸番号５４４（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）の配列番号４６に示されるようなアミノ酸配列；
（ｆ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｇ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）の配列番号４６に示されるようなアミノ酸配列；
（ｈ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；及び
（ｉ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）の配列番号４６に示されるようなアミノ酸配列：
から成る群からのアミノ酸残基の配列を含んで成る単離されたポリペプチド。
【請求項１９】
前記ポリペプチドがさらに、配列番号２の残基５２０（Ｉｌｅ）〜５４３（Ｌｅｕ）から成るトランスメンブランドメインを含んで成る請求項１８記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
前記ポリペプチドがさらに、配列番号２の残基５４４（Ｌｙｓ）〜７３２（Ｖａｌ）又は配列番号４６の残基５４４（Ｌｙｓ）〜６４９（Ｉｌｅ）から成る細胞内ドメインを含んで成る請求項１８記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが、細胞増殖、レポーター遺伝子の転写の活性化により測定されるような活性を有し、又はさらに、抗体に結合し、
ここで前記抗体が、
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号２２７（Ｐｒｏ）を含んで成るポリペプチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５１９（Ｇｌｕ）を含んで成るポリペプチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５４３（Ｌｅｕ）を含んで成るポリペプチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸番号５４４（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）を含んで成るポリペプチド；
（ｅ）配列番号４６のアミノ酸番号５４４（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）を含んで成るポリペプチド；
（ｆ）配列番号２のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）を含んで成るポリペプチド；
（ｇ）配列番号４６のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）を含んで成るポリペプチド；
（ｈ）配列番号２のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）を含んで成るポリペプチド；及び
（ｉ）配列番号４６のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）を含んで成るポリペプチド：
から成る群からのアミノ酸の配列を含んで成るポリペプチドに対して生ぜしめられ、そして
前記単離されたポリペプチドへの前記抗体の結合が、生物学的又は生化学的アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ、ラジオイムノ−沈殿、ウェスターンブロット又は酵素連結されたイムノソルベントアッセイにより測定される請求項１８記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２２】
ポリペプチドの生成方法であって、
請求項８記載の細胞を培養し；そして
前記細胞により生成されるポリペプチドを単離することを含んで成る方法。
【請求項２３】
（ａ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号２２７（Ｐｒｏ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｂ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５１９（Ｇｌｕ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１８に示されるようなアミノ酸配列；及び
（ｄ）配列番号２２に示されるようなアミノ酸配列の群からのアミノ酸セグメントを含んで成り、ここで前記ポリペプチドが、造血受容体により通常会合されるトランスメンブラン及び細胞内ドメインを実質的に有さないことを特徴とする単離されたポリペプチド。
【請求項２４】
ポリペプチドの生成方法であって、
請求項１３記載の細胞を培養し；そして
前記細胞により生成されるポリペプチドを単離することを含んで成る方法。
【請求項２５】
ポリペプチドに対する抗体の生成方法であって、
（ａ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）の配列番号２におけるアミノ酸の連続配列を含んで成る、９〜７１３個のアミノ酸から成るポリペプチド；
（ｂ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）の配列番号４６におけるアミノ酸の連続配列を含んで成る、９〜６３０個のアミノ酸から成るポリペプチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号２２７（Ｐｒｏ）を含んで成るポリペプチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５１９（Ｇｌｕ）を含んで成るポリペプチド；
（ｅ）配列番号２のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５４３（Ｌｅｕ）を含んで成るポリペプチド；
（ｆ）配列番号２のアミノ酸番号５４４（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）を含んで成るポリペプチド；
（ｇ）配列番号４６のアミノ酸番号５４４（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）を含んで成るポリペプチド；
（ｈ）配列番号２のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）を含んで成るポリペプチド；
（ｉ）配列番号４６のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）を含んで成るポリペプチド；
（ｊ）配列番号２のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）を含んで成るポリペプチド；
（ｋ）配列番号４６のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）を含んで成るポリペプチド；
（ｌ）配列番号２のアミノ酸残基４３〜４８を含んで成るポリペプチド；
（ｍ）配列番号２のアミノ酸残基１５７〜１６２を含んで成るポリペプチド；
（ｎ）配列番号２のアミノ酸残基１５８〜１６３を含んで成るポリペプチド；
（ｏ）配列番号２のアミノ酸残基２２１〜２２６を含んで成るポリペプチド；及び
（ｐ）配列番号２のアミノ酸残基４２６〜４３１を含んで成るポリペプチド；
の群からのポリペプチドにより動物を接種し、ここで前記ポリペプチドが、抗体を生成するために動物において免疫応答を誘発し；そして
前記動物から抗体を単離することを含んで成る方法。
【請求項２６】
配列番号２又は４６のポリペプチドに対して特異的に結合する請求項２５記載の方法により生成される抗体。
【請求項２７】
前記抗体が、モノクローナル抗体である請求項２６記載の抗体。
【請求項２８】
請求項１８、１９、２０又は２１のいずれか１項記載のポリペプチドに対して特異的に結合する抗体。
【請求項２９】
サイトカイン受容体タンパク質のモジュレータ−の存在を、試験サンプルにおいて検出する方法であって、
請求項９記載の発現ベクターを導入されている細胞を培養し、ここで前記細胞が試験サンプルの存在及び不在下でＤＮＡセグメントによりコードされるタンパク質を発現し；
生物学的又は生化学的アッセイにより、試験サンプルの存在及び不在下でのタンパク質の活性のレベルを比較し；そして
試験サンプルにおけるモジュレーターの存在を、前記比較から決定する；
ことを含んで成る方法。
【請求項３０】
試験サンプル内のサイトカイン受容体リガンドの検出方法であって、
（ａ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号２２７（Ｐｒｏ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｂ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５１９（Ｇｌｕ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１８に示されるようなアミノ酸配列；及び
（ｄ）配列番号２２に示されるようなアミノ酸配列；
の群からのアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドと試験サンプルとを接触せしめ；そして
前記サンプルにおけるリガンドへの前記ポリペプチドの結合を検出することを含んで成る方法。
【請求項３１】
前記ポリペプチドが、培養された細胞内に膜結合され、そして前記検出段階が培養された細胞における生物学的応答を測定することを含んで成る請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記生物学的応答が、細胞増殖又はレポーター遺伝子の転写の活性化である請求項３１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景：
ホルモン及びポリペプチド増殖因子は、多細胞生物の細胞の増殖及び分化を制御する。それらの拡散性分子は、細胞のお互いの連絡を可能し、そして細胞、及び器官の形成、そして損傷された組織の修復に関して作用する。ホルモン及び成長因子の例は、ステロイドホルモン（例えば、テストステロン）、副甲状腺ホルモン、卵胞刺激ホルモン、インターロイキン、血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリトロポエチン（ＥＰＯ）及びカルシトニンを包含する。
【０００２】
ホルモン及び成長因子は、受容体に結合することによって細胞代謝に影響を及ぼす。受容体は、細胞内のシグナル化経路、例えば第２メッセンジャーシステムに結合される内在性膜タンパク質であり得る。他の種類の受容体は、可溶性分子、例えば転写因子である。サイトカイン、すなわち細胞の増殖及び／又は分化を促進する分子のための受容体が、特に興味の対象である。サイトカインの例は、赤血球細胞の成長を刺激するエリトロポエチン（ＥＰＯ）；巨核球系の細胞の成長を刺激するトロンボポエチン（ＴＰＯ）；及び好中球の成長を刺激する顆粒球−刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を包含する。それらのサイトカインは、貧血、血小板減少症及び好中球減少症を有する患者における正常な血液細胞レベルの回復、又は癌のための化学療法の受容において有用である。
【０００３】
それらのサイトカインファミリーの例示されたインビボ活性は、他のサイトカイン、サイトカインアゴニスト及びサイトカインアンタゴニストの莫大な臨床学的可能性及びそれらの必要性を示す。本発明は、新規造血サイトカイン受容体、及び関連する組成物及び方法を提供することにより、それらの必要性と取り組む。
本発明は、当業者に明らかであるそれらの及び他の使用のために、そのようなポリペプチドを提供する。本発明のそれらの及び他の観点は、本発明の次の詳細な記載の基づいて明らかに成るであろう。
【０００４】
発明の記載：
１つの観点においては、本発明は、（ａ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号２２７（Ｐｒｏ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｂ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５１９（Ｇｌｕ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｃ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５４３（Ｌｅｕ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｄ）アミノ酸番号５４４（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｅ）アミノ酸番号５４４（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）の配列番号４６に示されるようなアミノ酸配列；（ｆ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｇ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）の配列番号４６に示されるようなアミノ酸配列；（ｈ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；及び（ｉ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）の配列番号４６に示されるようなアミノ酸配列から成る群から選択されたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸残基の配列を含んで成るポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０００５】
１つの態様においては、上記に開示される単離されたポリヌクレオチドは、（ａ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号２２７（Ｐｒｏ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｂ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５１９（Ｇｌｕ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｃ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５４３（Ｌｅｕ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｄ）アミノ酸番号５４４（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｅ）アミノ酸番号５４４（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）の配列番号４６に示されるようなアミノ酸配列；（ｆ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｇ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）の配列番号４６に示されるようなアミノ酸配列；（ｈ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；及び（ｉ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）の配列番号４６に示されるようなアミノ酸配列から成る群から選択されたアミノ酸残基の配列を含んで成る。
【０００６】
もう１つの態様においては、上記に開示される単離されたポリヌクレオチドは、（ａ）ヌクレオチド番号２２８〜ヌクレオチド番号８５１の配列番号１に示されるようなポリヌクレオチド；（ｂ）ヌクレオチド番号２２８〜ヌクレオチド番号１７２７の配列番号１に示されるようなポリヌクレオチド；（ｃ）ヌクレオチド番号２２８〜ヌクレオチド番号１７９９の配列番号１に示されるようなポリヌクレオチド；（ｄ）ヌクレオチド番号１８００〜ヌクレオチド番号２３６６の配列番号１に示されるようなポリヌクレオチド；（ｅ）ヌクレオチド番号１７９１〜ヌクレオチド番号２１０８の配列番号４５に示されるようなポリヌクレオチド；（ｆ）ヌクレオチド番号２２８〜ヌクレオチド番号２３６６の配列番号１に示されるようなポリヌクレオチド；（ｇ）ヌクレオチド番号２１９〜ヌクレオチド番号２１０８の配列番号４５に示されるようなポリヌクレオチド；（ｈ）ヌクレオチド番号１７１〜ヌクレオチド番号２３６６の配列番号１に示されるようなポリヌクレオチド；（ｉ）ヌクレオチド番号１６２〜ヌクレオチド番号２１０８の配列番号４５に示されるようなポリヌクレオチド；及び（ｊ）（ａ）〜（ｉ）に対して相補的なポリヌクレオチド配列から成る群から選択された配列を含んで成る。
【０００７】
もう１つの態様においては、上記に開示される単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２の残基５２０（Ｉｌｅ）〜５４３（Ｌｅｕ）から成るトランスメンブランドメインをさらに含んで成るポリペプチドをコードする。
【０００８】
もう１つの態様においては、上記に開示される単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２の残基５４４（Ｌｙｓ）〜７３２（Ｖａｌ）又は配列番号４６の残基５４４（Ｌｙｓ）〜６４９（Ｉｌｅ）から成る細胞内ドメインをさらに含んで成るポリペプチドをコードする。
【０００９】
もう１つの態様においては、上記に開示される単離されたポリヌクレオチドは、細胞増殖、レポーター遺伝子の転写の活性化により測定されるような活性を有するポリペプチドをコードし、又は前記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドはさらに、抗体に結合し、ここで前記抗体が、（ａ）配列番号２のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号２２７（Ｐｒｏ）を含んで成るポリペプチド；（ｂ）配列番号２のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５１９（Ｇｌｕ）を含んで成るポリペプチド；（ｃ）配列番号２のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５４３（Ｌｅｕ）を含んで成るポリペプチド；（ｄ）配列番号２のアミノ酸番号５４４（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）を含んで成るポリペプチド；（ｅ）配列番号４６のアミノ酸番号５４４（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）を含んで成るポリペプチド；（ｆ）配列番号２のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）を含んで成るポリペプチド；（ｇ）配列番号４６のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）を含んで成るポリペプチド；（ｈ）配列番号２のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）を含んで成るポリペプチド；及び（ｉ）配列番号４６のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）を含んで成るポリペプチドから成る群からのアミノ酸の配列を含んで成るポリペプチドに対して生ぜしめられ、そして前記単離されたポリペプチドへの前記抗体の結合が、生物学的又は生化学的アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ、ラジオイムノ−沈殿、ウェスターンブロット又は酵素連結されたイムノソルベントアッセイにより測定される。
【００１０】
第２の観点においては、本発明は、次の作用可能に連結された要素：転写プロモーター；アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列、又はアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）の配列番号４６に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるポリペプチドをコードするＤＮＡセグメント；及び転写ターミネーターを含んで成り、ここで前記プロモーターが前記ＤＮＡセグメントに作用可能に連結され、そして前記ＤＮＡセグメントが前記転写ターミネーターに作用可能に連結されることを特徴とする発現ベクターを提供する。１つの態様においては、上記に開示される発現ベクターは、前記ＤＮＡセグメントに作用可能に連結される分泌シグナル配列をさらに含んで成る。
【００１１】
第３の観点においては、本発明は、前記ＤＮＡセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する、上記に開示されるような発現ベクターを含んで成る培養された細胞を提供する。もう１つの態様においては、上記に開示される発現ベクターは、アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜２２７（Ｐｒｏ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；又はアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５１９（Ｇｌｕ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド；及び転写ターミネーターをコードし、ここで前記プロモーター、ＤＮＡセグメント及びターミネーターが作用可能に連結されることを特徴とするＤＮＡセグメントを含んで成る。もう１つの態様においては、上記に開示される発現ベクターは、前記ＤＮＡセグメントに作用可能に連結される分泌シグナル配列をさらに含んで成る。もう１つの態様においては、上記に開示される発現ベクターは、配列番号２の残基５２０（Ｉｌｅ）〜５４３（Ｌｅｕ）から成るトランスメンブランドメインをさらに含んで成る。
【００１２】
もう１つの態様においては、上記に開示される発現ベクターは、配列番号２の残基５４４（Ｌｙｓ）〜７３２（Ｖａｌ）、又は配列番号４６の残基５４４（Ｌｙｓ）〜６４９（Ｉｌｅ）から成る細胞内ドメインをさらに含んで成る。
もう１つの観点においては、本発明は、前記ＤＮＡセグメントによりコードされる可溶性受容体ポリペプチドを発現する、上記に開示されるような発現ベクターを導入されている培養された細胞を提供する。
【００１３】
もう１つの観点においては、本発明は、（ａ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号１９（Ａｌａ）の配列番号２のアミノ酸配列；（ｂ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号３２（Ａｌａ）の配列番号５４のアミノ酸配列；（ｃ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号２２７（Ｐｒｏ）の配列番号２のアミノ酸配列；（ｄ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５１９（Ｇｌｕ）の配列番号２のアミノ酸配列；（ｅ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５４３（Ｌｅｕ）の配列番号２のアミノ酸配列；（ｆ）アミノ酸番号５２０（Ｉｌｅ）〜アミノ酸番号５４３（Ｌｅｕ）の配列番号２のアミノ酸配列；（ｇ）アミノ酸番号５４４（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）の配列番号２のアミノ酸配列；（ｈ）アミノ酸番号５４４（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）の配列番号４６のアミノ酸配列；（ｉ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）の配列番号２のアミノ酸配列；及び（ｊ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）の配列番号４６のアミノ酸配列から成る群から選択されたアミノ酸残基の配列を含んで成るポリペプチドをコードする第１ＤＮＡセグメント；及び追加のポリペプチドをコードする少なくとも１つの他のＤＮＡセグメントを含んで成り、ここで前記第１及び他のＤＮＡセグメントが読み取り柄を整合して連結され；そして前記第１及び他のＤＮＡセグメントが前記融合タンパク質をコードすることを特徴とする、融合タンパク質をコードするＤＮＡ構造体を提供する。
【００１４】
もう１つの観点においては、本発明は、次の作用可能に連結された要素：転写プロモーター；上記に開示されるような融合タンパク質をコードするＤＮＡ構造体；及び転写ターミネーターを含んで成り、ここで前記プロモーターが前記ＤＮＡ構造体に作用可能に連結され、そして前記ＤＮＡ構造体が前記転写ターミネーターに作用可能に連結されることを特徴とする発現ベクターを提供する。
【００１５】
もう１つの観点においては、本発明は、前記ＤＮＡ構造体によりコードされるポリペプチドを発現する、上記に開示されるような発現ベクターを含んで成る培養された細胞を提供する。
もう１つの観点においては、本発明は、上記に開示されるような細胞を培養し；そして前記細胞により生成されるポリペプチドを単離することを含んで成る、融合タンパク質の生成方法を提供する。
【００１６】
もう１つの観点においては、本発明は、（ａ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号２２７（Ｐｒｏ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｂ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５１９（Ｇｌｕ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｃ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５４３（Ｌｅｕ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｄ）アミノ酸番号５４４（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｅ）アミノ酸番号５４４（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）の配列番号４６に示されるようなアミノ酸配列；（ｆ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｇ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）の配列番号４６に示されるようなアミノ酸配列；（ｈ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；及び（ｉ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）の配列番号４６に示されるようなアミノ酸配列から成る群から選択されたアミノ酸配列の対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸残基の配列を含んで成る単離されたポリペプチドを提供する。
【００１７】
１つの観点においては、上記に開示される単離されたポリペプチドは、（ａ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号２２７（Ｐｒｏ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｂ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５１９（Ｇｌｕ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｃ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５４３（Ｌｅｕ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｄ）アミノ酸番号５４４（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｅ）アミノ酸番号５４４（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）の配列番号４６に示されるようなアミノ酸配列；（ｆ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｇ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）の配列番号４６に示されるようなアミノ酸配列；（ｈ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；及び（ｉ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）の配列番号４６に示されるようなアミノ酸配列から成る群から選択されたアミノ酸残基の配列を含んで成る。
【００１８】
もう１つの態様においては、上記に開示される単離されたポリペプチドはさらに、配列番号２の残基５２０（Ｉｌｅ）〜５４３（Ｌｅｕ）から成るトランスメンブランドメインを含んで成る。もう１つの態様においては、上記に開示される単離されたポリペプチドはさらに、配列番号２の残基５４４（Ｌｙｓ）〜７３２（Ｖａｌ）又は配列番号４６の残基５４４（Ｌｙｓ）〜６４９（Ｉｌｅ）から成る細胞内ドメインを含んで成る。もう１つの態様においては、上記に開示される単離されたポリペプチドは、細胞増殖、レポーター遺伝子の転写の活性化により測定されるような活性を有し、又は前記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドがさらに、抗体に結合し、ここで前記抗体が、（ａ）配列番号２のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号２２７（Ｐｒｏ）を含んで成るポリペプチド；（ｂ）配列番号２のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５１９（Ｇｌｕ）を含んで成るポリペプチド；（ｃ）配列番号２のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５４３（Ｌｅｕ）を含んで成るポリペプチド；（ｄ）配列番号２のアミノ酸番号５４４（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）を含んで成るポリペプチド；（ｅ）配列番号４６のアミノ酸番号５４４（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）を含んで成るポリペプチド；（ｆ）配列番号２のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）を含んで成るポリペプチド；（ｇ）配列番号４６のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）を含んで成るポリペプチド；（ｈ）配列番号２のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）を含んで成るポリペプチド；及び（ｉ）配列番号４６のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）を含んで成るポリペプチドから成る群からのアミノ酸の配列を含んで成るポリペプチドに対して生ぜしめられ、そして前記単離されたポリペプチドへの前記抗体の結合が、生物学的又は生化学的アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ、ラジオイムノ−沈殿、ウェスターンブロット又は酵素連結されたイムノソルベントアッセイにより測定される。
【００１９】
もう１つの観点においては、本発明は、上記に開示されるような細胞を培養し；そして　前記細胞により生成されるポリペプチドを単離することを含んで成る、ポリペプチドの生成方法を提供する。
【００２０】
もう１つの観点においては、本発明は、（ａ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号２２７（Ｐｒｏ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｂ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５１９（Ｇｌｕ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列； （ｃ）配列番号１８に示されるようなアミノ酸配列； （ｄ）配列番号２２に示されるようなアミノ酸配列；及び（ｅ）（ａ）（ｂ）に対して少なくとも９０％同一である配列のから成る群から選択されたアミノ酸セグメントを含んで成り、ここで前記ポリペプチドが、造血受容体により通常会合されるトランスメンブラン及び細胞内ドメインを実質的に有さないことを特徴とする単離されたポリペプチドを提供する。もう１つの観点においては、本発明は、上記に開示される細胞を培養し；そして前記細胞により生成されるｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドを単離することを含んで成る、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドの生成方法を提供する。
【００２１】
もう１つの観点においては、本発明は、（ａ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）の配列番号２におけるアミノ酸の連続配列を含んで成る、９〜７１３個のアミノ酸から成るポリペプチド；（ｂ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）の配列番号４６におけるアミノ酸の連続配列を含んで成る、９〜６３０個のアミノ酸から成るポリペプチド；（ｃ）配列番号２のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号２２７（Ｐｒｏ）を含んで成るポリペプチド；（ｄ）配列番号２のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５１９（Ｇｌｕ）を含んで成るポリペプチド；（ｅ）配列番号２のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５４３（Ｌｅｕ）を含んで成るポリペプチド；（ｆ）配列番号２のアミノ酸番号５４４（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）を含んで成るポリペプチド；（ｇ）配列番号４６のアミノ酸番号５４４（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）を含んで成るポリペプチド；（ｈ）配列番号２のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）を含んで成るポリペプチド；（ｉ）配列番号４６のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）を含んで成るポリペプチド；（ｊ）配列番号２のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）を含んで成るポリペプチド； （ｋ）配列番号４６のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）を含んで成るポリペプチド；（ｌ）配列番号２のアミノ酸残基４３〜４８を含んで成るポリペプチド；（ｍ）配列番号２のアミノ酸残基１５７〜１６２を含んで成るポリペプチド；（ｎ）配列番号２のアミノ酸残基１５８〜１６３を含んで成るポリペプチド；（ｏ）配列番号２のアミノ酸残基２２１〜２２６を含んで成るポリペプチド；及び（ｐ）配列番号２のアミノ酸残基４２６〜４３１を含んで成るポリペプチドの群からのポリペプチドにより動物を接種し、ここで前記ポリペプチドが、抗体を生成するために動物において免疫応答を誘発し；そして前記動物から抗体を単離することを含んで成る、ポリペプチドに対する抗体の生成方法を提供する。
【００２２】
もう１つの観点においては、本発明は、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドに対して特異的に結合する、上記に開示されるような方法により生成される抗体を提供する。１つの態様においては、上記に開示されるような抗体は、モノクローナル抗体である。
もう１つの観点においては、本発明は、上記に開示されるようなポリペプチドに対して特異的に結合する抗体を提供する。１つの態様においては、上記に開示されるような抗体は、上記に開示されるようなポリペプチドに対して特異的に結合する。
【００２３】
もう１つの観点においては、本発明は、上記に開示されるような発現ベクターを導入されている細胞を培養し、ここで前記細胞が試験サンプルの存在及び不在下でＤＮＡセグメントによりコードされるｚｃｙｔｏｒ１７タンパク質を発現し；生物学的又は生化学的アッセイにより、試験サンプルの存在及び不在下でのｚｃｙｔｏｒ１７の活性のレベルを比較し；そして試験サンプルにおけるｚｃｙｔｏｒ１７活性のモジュレーターの存在を、前記比較から決定することを含んで成る、ｚｃｙｔｏｒ１７タンパク質活性のモジュレータ−の存在を、試験サンプルにおいて検出する方法を提供する。
【００２４】
もう１つの観点においては、本発明は、（ａ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号２２７（Ｐｒｏ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｂ）アミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号５１９（Ｇｌｕ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｃ）配列番号１８に示されるようなアミノ酸配列；及び（ｄ）配列番号２２に示されるようなアミノ酸配列の群からのアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドと試験サンプルとを接触せしめ；そして前記サンプルにおけるリガンドへの前記ポリペプチドの結合を検出することを含んで成る、試験サンプル内のｚｃｙｔｏｒ１７受容体リガンドの検出方法を提供する。
【００２５】
１つの態様においては、前記ポリペプチドが、培養された細胞内に膜結合され、そして前記検出段階が培養された細胞における生物学的応答を測定することを含んで成る方法が提供される。もう１つの態様においては、前記生物学的応答が、細胞増殖又はレポーター遺伝子の転写の活性化である、上記に開示されるような方法が提供される。
本発明を詳細に記載する前、次の用語を定義することで本発明の理解を助けることができる：
【００２６】
“親和性標識”とは、第２ポリペプチドの精製又は検出を提供し、又は基質への第２ポリペプチドの結合のための部位を供給するために、第２ポリペプチドに結合され得るポリペプチドセグメントを示すために本明細書において使用される。主に、抗体又は、他の特異的結合剤が利用できるいずれかのペプチド又はタンパク質が親和性標識として使用され得る。親和性標識は、ポリ−ヒスチジン系、すなわちプロテインＡ （Ｎｉｌｓｓｏｎ など．，　ＥＭＢＯ Ｊ． ４： １０７５， １９８５； Ｎｉｌｓｓｏｎ など．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９８： ３， １９９１）， グルタチオンＳ　トランスフェラーゼ（Ｓｍｉｔｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｇｅｎｅ ６７； ３１， １９８８）， Ｇｌｕ−Ｇｌｕ親和性標識 （Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒなど．，　Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２： ７９５２−４， １９８５）， 物質Ｐ、すなわちＦｌａｇＴＭ ペプチド（Ｈｏｐｐなど．，　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： １２０４−１２１０， １９８８）、ストレプタビジン結合ペプチド、又は他の抗原性エピトープ又は結合ドメインを包含する。一般的に、Ｆｏｒｄ など．， Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２：９５−１０７， １９９１を参照のこと。親和性標識をコードするＤＮＡは、商品供給者（例えばＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ； Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ， Ｎｅｗ Ｈｅｖｅｎ， ＣＴ； Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）から入手できる。
【００２７】
用語“対立遺伝子変異体”とは、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の複数の遺伝子の二者択一形のいずれかを示すために、本明細書において使用される。対立遺伝子変異は、突然変異を通して天然では生じ、そして集団内の表現型多型現象をもたらすことができる。遺伝子突然変異は、サイレントであり（コードされたポリペプチドにおいて変化がない）、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語、対立遺伝子変異体はまた、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書において使用される。
【００２８】
用語“アミノ−末端”及び“カルボキシル−末端”とは、ポリペプチド内の位置を示すために本明細書において使用される。その情況が可能である場合、それらの用語は、接近性又は相対的位置を示すためにポリペプチドの特定の配列又は一部に関して使用される。例えば、ポリペプチド内の対象配列のカルボキシル末端側に位置する一定の配列は、その対象配列のカルボキシル末端に隣接して位置するが、しかし完全なポリペプチドのカルボキシル末端では必ずしも必要ではない。
【００２９】
用語“相補体／抗−相補体対”とは、適切な条件下で、非共有的に会合される安定した対を形成する非同一性成分を示す。例えば、ビオチン及びアビジン（又はストレプタビジン）は、相補体／抗−相補体対の基本型メンバーである。他の典型的な相補体／抗−相補体対は、受容体／リガンド対、抗体／抗原（又はハプテン又はエピトープ）対、センス／アンチセンス　ポリヌクレオチド対、及び同様のものを包含する。相補体／抗−相補体対の続く解離が所望される場合、その相補体／抗−相補体対は好ましくは、＜１０９Ｍ−１の結合親和性を有する。
【００３０】
用語“ポリヌクレオチド分子の相補体”とは、相補的塩基配列、及び対照配列に比較して逆の配向を有するポリペプチド分子である。例えば、配列５’ ＡＴＧＣＡＣＧＧＧ ３’ は、５’ ＣＣＣＧＴＧＣＡＴ ３’に対して相補的である。
用語“ｃｏｎｔｉｇ ”とは、他のポリヌクレオチドに対する一連の連続した同一の又は相補的な配列を有するポリヌクレオチドを示す。連続した配列とは、ポリヌクレオチドの全体において、又はその一部に沿って、一定の長さのポリヌクレオチド配列を“オーバーラップ”すると言われる。例えば、ポリヌクレオチド配列５’−ＡＴＧＧＣＴＴＡＧＣＴＴ−３’ に対する代表的なｃｏｎｔｉｇ とは、５’−ＴＡＧＣＴＴｇａｇｔｃｔ−３’及び３’−ｇｔｃｇａｃＴＡＣＣＧＡ−５’である。
【００３１】
用語“縮重ヌクレオチド配列”とは、１又は複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列（ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチドに比較して）を示す。縮重コドンは、ヌクレオチドの異なったトリプレットを含むが、しかし同じアミノ酸残基をコードする（すなわち、ＧＡＵ及びＧＡＣトリプレットはそれぞれＡｓｐをコードする）。
【００３２】
用語“発現ベクター”とは、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能に連結される興味あるポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る線状又は環状ＤＮＡ分子を示すために使用される。そのような追加のセグメントは、プロモーター及びターミネーター配列及び複製の１又は複数の起点、１又は複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、及び同様のものを包含する。発現ベクターは一般的に、プラスミド又はウィルスＤＮＡから誘導され、又は両者の要素を含むことができる。
【００３３】
用語“単離された”とは、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドがその天然の遺伝的環境から除去され、そして従って、他の無関係な又は所望しないコード配列を有さず、そして遺伝子的に構築されたタンパク質生成システム内での使用のために適切な形で存在することを示す。そのような単離された分子は、それらの天然の環境から分離され、そしてｃＤＮＡ及びゲノム　クローンを含む分子である。本発明の単離されたＤＮＡ分子は、通常関係しない他の遺伝子を含まないが、しかし天然において存在する５’及び３’ 未翻訳領域、例えばプロモーター及びターミネーターを含むことができる。関連する領域の同定は、当業者に明らかであろう（例えば、Ｄｙｎａｎ ａｎｄ Ｔｉｊａｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３１６： ７７４―７８， １９８５を参照のこと）。
【００３４】
“単離された”ポリペプチド又はタンパク質は、その生来の環境以外の条件、例えば血液及び動物組織とは別の条件下で見出されるポリペプチド又はタンパク質である。好ましい形においては、単離されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。高く精製された形、すなわち９５％以上の純度、より好ましくは９９％以上の純度でポリペプチドを供給することが好ましい。この情況下で使用される場合、用語“単離された”とは、他の物理的形、例えばダイマー形又は他のグリコシル化された又は誘導体化された形での同じポリペプチドの存在を排除しない。
【００３５】
“作用可能に連結された”とは、ＤＮＡセグメントに適用される場合、前記セグメントが、それらの意図された目的のために協力して機能し、例えば転写がプロモーターにおいて開始し、そしてコードセグメントを通してターミネーターに進行するよう配列されることを示す。
用語“オルト体（ｏｒｔｈｏｌｏｇｙ）”とは、異なった種からのポリペプチド又はタンパク質の機能的相対物である、１つの種から得られるポリペプチド又はタンパク質を示す。オルト体間の配列の差異は、特定化の結果である。
“パラ体（ｐａｒａｌｏｇｓ）”とは、生物によって製造される、異なっているが，しかし構造的に関連するタンパク質である。パラ体は、遺伝子重複を通して生じると思われる。例えば、α−グロビン、β−グロビン及びミオグロビンは、お互いパラ体である。
【００３６】
“ポリヌクレオチド”は、５’末端から３’末端に読み取られるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーである。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ及びＤＮＡを包含し、そして天然源から単離され、インビトロで合成され、又は天然及び合成分子の組み合わせから調製され得る。ポリヌクレオチドのサイズは、塩基対（略語“ｂｐ”）、ヌクレオチド（“ｎｔ”）、又はキロ塩基（“ｋｂ”）として表される。ここで、後者の２つの用語は、一本鎖又は二本鎖であるポリヌクレオチドを記載する。この用語が二本鎖分子に適用される場合、それは全体の長さを示すために使用され、そして用語、“塩基対”に等しいことが理解されるであろう。二本鎖ポリヌクレオチドの二本の鎖は長さにおいてわずかに異なり、そしてその末端が酵素分解の結果として異なることは、当業者により理解されており；従って、二本鎖ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチドは一対に成り得ない。
【００３７】
“ポリペプチド”は、天然において生成されても又は合成的に生成されてもいずれにせよ、ペプチド結合により連結されるアミノ酸残基のポリマーである。約　１０個以下のアミノ酸残基のポリペプチドが、通常“ポリペプチド”として言及される。
【００３８】
“プローブ及び／又はプライマー”とは、本明細書において使用される場合、ＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。ＤＮＡはｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡのいずれかであり得る。ポリヌクレオチドプローブ及びプレイマーは、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ、一般的に合成オリゴヌクレオチドであるが、しかしクローン化されたｃＤＮＡ又はゲノム配列又はその補体から生成され得る。分析用プローブは一般的に、少なくとも２０個の長さのヌクレオチドであるが、但し幾分短いプローブ（１４〜１７個のヌクレオチド）が使用され得る。
【００３９】
ＰＣＲプライマーは、少なくとも５個の長さのヌクレオチド、好ましくは１５又はそれ以上のｎｔ、よりも好ましくは２０〜３０のｎｔである。短いポリヌクレオチドは、遺伝子の小さな領域が分析のために標的化される場合に使用され得る。遺伝子の全体的な分析のためには、ポリヌクレオチドは、全エキソン又はそれ以上を含んで成る。プローブは、検出できるシグナルを供給するために、当業界において良く知られている技法を用いて多くの源、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ， Ｉｎｃ．， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ及びＡｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．， Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬから市販されている、酵素、放射性核種、蛍光団、化学ルミネセンス、常磁性粒子及び同様のものによりラベルされ得る。
【００４０】
用語“プロモーター”とは、ＲＮＡ ポリメラーゼの結合及び転写の開始を提供するＤＮＡ配列を含む遺伝子の部分を示すために本明細書において使用される。プロモーター配列は通常、遺伝子の５’ 非コード領域に見出されるが、しかし必ずしもそうではない。
用語“タンパク質”は、１又は複数のポリペプチド鎖を含んで成る高分子である。タンパク質はまた、非ペプチド成分、例えば炭水化物基を含むことができる。炭水化物及び他の非ペプチド置換基は、タンパク質が生成される細胞により付加され、そして細胞型により変化するであろう。タンパク質は、それらのアミノ酸主鎖により本明細書において定義され；置換基、例えば炭水化物基は一般的に、特定されないが、しかしそれにもかかわらず、存在することができる。
【００４１】
用語“受容体”は、生物活性分子（すなわち“リガンド”）に結合し、そして細胞上のリガンドの効果を仲介する細胞関連タンパク質、又はそのようなタンパク質のポリペプチドサブユニットを示す。受容体へのリガンドの結合は、細胞におけるエフェクタードメインと他の分子との間の相互作用を引き起こす受容体におけるコンホメーション変化（及び多くの場合、受容体多重化、すなわち同一油又は異なった受容体サブウニットの会合）をもたらす。この相互作用は、細胞の代謝の変更を誘導する。受容体−リガンド相互作用に連結される代謝現象は、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、細胞増殖、ｃＡＭＰ生成の上昇、細胞カルシュウムの代謝、膜脂質の代謝、細胞付着、イノシトール脂質の加水分解、及びリン脂質の加水分解を包含する。
【００４２】
細胞−表面サイトカイン受容体は、下記により詳細に記載されるように、多−ドメイン構造により特徴づけられる。それらの受容体は、正に荷電された残基（Ｌｙｓ又はＡｒｇ）を通常、端に有する、疎水性アミノ酸残基（典型的には、約２１−２５個の残基）の配列により特徴づけられるトランスメンブランドメインに固定され得る。一般的に、受容体は、膜結合され、シトソール性又は核性であり；モノマー（例えば甲状腺刺激ホルモン受容体、β−アドレナリン性受容体）、又はマルチマー（例えばＰＤＧＦ受容体、成長ホルモン受容体、ＩＬ−３受容体、ＧＭ―ＣＳＦ受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、エリトロポイエチン受容体及びＩＬ―６受容体）であり得る。用語“受容体ポリペプチド”とは、受容体ポリペプチド鎖及びその一部、例えば単離された機能的ドメイン（例えば、リガンド−結合ドメイン）を表すために使用される。
【００４３】
用語“分泌シグナル配列”とは、それが合成される細胞の分泌路を通してより大きなポリペプチドを、より大きなポリペプチドの成分として方向ずけるポリペプチド（“分泌ペプチド”）をコードするＤＮＡ配列を示す。前記のより大きなポリペプチドは、分泌路を通しての移動の間、分泌ペプチドを除去するために通常分解される。
【００４４】
“可溶性受容体”とは、細胞膜に結合されない受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は、最も通常には、トランスメンブラン及び細胞質ドメインを欠いているリガンド−結合受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は、追加のアミノ酸残基、例えばポリペプチドの精製を提供し、又は基質へのポリペプチドの結合のための部位、又は免疫グロブリン不変領域配列を提供する親和性標識を含んで成る。多くの細胞−表面受容体は、タンパク質加水分解により、又は交互にスプライシングされたｍＲＮＡから翻訳される天然に存在する可溶性相対物を有する。受容体ポリペプチドは、それがそれぞれ、膜固定化又はシグナルトランスダクションを提供するために、それらのセグメントの十分な部分を欠いている場合、トランスメンブラン及び細胞内ポリペプチドセグメントを実質的に有さないと言われる。
【００４５】
用語“スプライス変異体”とは、遺伝子から転写されるＲＮＡの二者択一の形を示すために、本明細書において使用される。スプライス変異は、転写されたＲＮＡ分子内の、又は通常低いが、別々に転写されたＲＮＡ分子間の二者択一のスプライシング部位の使用を通して天然において生じ、そして同じ遺伝子から転写されるいくつかのｍＲＮＡをもたらすことができる。スプライス変異体は、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語スプライス変異体はまた、遺伝子から転写されるｍＲＮＡのスプライス変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書において使用される。
【００４６】
不正確な分析方法（例えば、ゲル電気泳動）により決定されるポリマーの分子量及び長さは、おおよその値であることが理解されるであろう。そのような値が“約”Ｘ又は“おおよそ”Ｘとして表される場合、その言及されたＸの値は、正確には±１０％であることが理解されるであろう。
本明細書に引用されるすべての文献はそれらのすべてを引用により組み込まれる。
【００４７】
本発明は、クラスＩサイトカイン受容体の構造を有するタンパク質をコードする新規ＤＮＡ配列の発見に一部、基づかれている。推定されるアミノ酸配列は、コードされた受容体が、ｇｐ１３０、ＬＩＦ、ＩＬ−２、オンコスタチンＭ受容体（ＯＳＭ−Ｒ）、ＷＳＸ−１受容体（Ｓｐｒｅｃｈｅｒ ＣＡなど．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ２４６： ８１−９０ （１９９８） ），ＤＣＲＳ２ （ＷＩＰＯ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ＷＯ００／７３４５１号）、ＩＬ−２受容体β−サブユニット及びβ−共通受容体（すなわち、ＩＬ−３、ＩＬ−５及びＧＭ−ＣＳＦ受容体β−サブユニット）を包含する受容体サブファミリーに属することを示した。そのポリペプチドがマウスｚｃｙｔｏｒ１７として命名された。ｚｃｙｔｏｒ１７ポリヌクレオチド配列は、予測されるタンパク質の完全なコード配列をコードする。ｚｃｙｔｏｒ１７は、免疫調節、アポプトシス細胞経路、細胞−細胞シグナル化分子、成長因子受容体又は成長因子ホルモン活性を有する細胞外マトリックス結合タンパク質、又は同様のものに関与する新規サイトカイン受容体である。
【００４８】
ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドの配列は、ゲノムＤＮＡ及びその対応するポリヌクレオチド配列を含む同定されたクローンから推定された。前記クローンは前立腺ライブラリーから得られた。そのような配列について調べられ得る他のライブラリーは、ＰＢＬ、精巣、単球、胸腺、膵臓、リンパ節、骨髄、ヒト赤白血病、肺（例えば、ＷＩ−３８細胞）及び急性単球白血病細胞系、他のリンパ球及び造血細胞系、及び同様のものを包含する。
【００４９】
代表的なｚｃｙｔｏｒ１７コードのＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号１（ヌクレオチド１７１〜２３６６（その推定される７３２個のアミノ酸配列が配列番号２で記載される）；配列番号４５（ヌクレオチド１６２〜２１０８）（その推定される６４９個のアミノ酸配列が配列番号４６で記載される）；及び配列番号５３（ヌクレオチド４９７〜２４８２）（その推定される６６２個のアミノ酸は配列番号５４で記載される）により記載される。全体として、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチド（配列番号２，４６又は５４）は、十分な長さのポリペプチドセグメント（配列番号２の残基１（Ｍｅｔ）〜残基７３２（Ｖａｌ）；配列番号４６の残基１（Ｍｅｔ）〜残基６４８（Ｉｌｅ）；配列番号５４の残基１（Ｍｅｔ）〜残基６６２（Ｉｌｅ））を表す。ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドのドメイン及び構造特性は、さらに下記に記載される。
【００５０】
配列番号１のＤＮＡ配列によりコードされるｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドの分析は、１９個のアミノ酸残基（配列番号２の残基１（Ｍｅｔ）〜残基１９（Ａｌａ））の予測される分泌シグナルペプチド、及び７１３個のアミノ酸（配列番号２の残基２０（Ａｌａ）〜残基７３２（Ｖａｌ））を含んで成る７３２個のアミノ酸（配列番号２）をコードする読み取り枠を表す。
配列番号４５のＤＮＡ配列によりコードされるｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドの分析は、１９個のアミノ酸残基（配列番号４６の残基１（Ｍｅｔ）〜残基１９（Ａｌａ））の予測される分泌シグナルペプチド、及び６３０個のアミノ酸（配列番号４６の残基２０（Ａｌａ）〜残基６４９（Ｉｌｅ））を含んで成る６４９個のアミノ酸（配列番号４６）をコードする読み取り枠を表す。
【００５１】
配列番号５３のＤＮＡ配列によりコードされるｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドの分析は、３２個のアミノ酸残基（配列番号５４の残基１（Ｍｅｔ）〜残基３２（Ａｌａ））の予測される分泌シグナルペプチド、及び６３０個のアミノ酸（配列番号５４の残基３３（Ａｌａ）〜残基６６２（Ｉｌｅ））を含んで成る６６２個のアミノ酸（配列番号５４）をコードする読み取り枠を表す。
【００５２】
ＷＳＸＷＳモチーフ（配列番号３）（配列番号２及び４６の残基２１１〜２１５；及び配列番号５４の残基２２４〜２２８に対応する）の他に、受容体は、約２００個のアミノ酸残基（配列番号２及び４６の残基２０（Ａｌａ）〜２２７（Ｐｒｏ）；配列番号５４の残基３３（Ａｌａ）〜２４０（Ｐｒｏ））のサイトカイン結合ドメインを含む細胞外ドメイン（配列番号２及び４６の残基２０（Ａｌａ）〜５１９（Ｇｌｎ）；配列番号５４の残基３３（Ａｌａ）〜５３２（Ｇｌｎ））；ドメインリンカー（配列番号２及び４６の残基１２２（Ｔｈｒ）〜１２５（Ｐｒｏ）；配列番号２の残基１３５（Ｔｈｒ）〜１３８（Ｐｒｏ））；終わりから２番目の鎖領域（配列番号２及び４６の残基１９４（Ｐｈｅ）〜２０２（Ａｒｇ）；配列番号５４の残基２０７（Ｐｈｅ）〜２１５（Ａｒｇ））；フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（配列番号２及び４６の残基２２８（Ｃｙｓ）〜５１９（Ｇｌｎ）；配列番号５４の残基２４１（Ｃｙｓ）〜５３２（Ｇｌｙ））；トランスメンブランドメイン（配列番号２及び４６の残基５２０（Ｉｌｅ）〜５４３（Ｌｅｕ）；配列番号５４の残基５３３（Ｉｌｅ）〜５５６（Ｌｅｕ））；“Ｂｏｘ Ｉ”シグナル化部位（配列番号２及び４６の残基５５４（Ｔｒｐ）〜５６０（Ｐｒｏ）；配列番号５４の残基５６７（Ｔｒｐ）〜５７３（Ｐｒｏ））及び“Ｂｏｘ ＩＩ”シグナル化部位（配列番号２及び４６の残基６１７（Ｇｌｎ）〜６２０（Ｐｈｅ）；配列番号５４の残基６３０（Ｇｌｎ）〜６３３（Ｐｈｅ））を含む完全な細胞内シグナル化ドメイン（配列番号２の残基５４４（Ｌｙｓ）〜７３２（Ｖａｌ）；配列番号４６の残基５５４（Ｌｙｓ）〜６４９（Ｉｌｅ）；及び配列番号５４の残基５５７（Ｌｙｓ）〜６６２（Ｉｌｅ））を含んで成る。
【００５３】
当業者は、それらのドメイン境界はおおよそであり、そして既知タンパク質との一列整列及びタンパク質折りたたみの予測に基づかれることを理解するであろう。それらのドメインの他に、コードされる受容体における保存された受容体特性は、配列番号２及び４６に示されるように、位置３０でのＣｙｓ残基（配列番号５４に示されるような位置４３）での保存されたＣｙｓ残基、位置４０−４２（配列番号５４に示されるような位置５３−５５）でのＣＸＷモチーフ（ここで、Ｘはいずれかのアミノ酸である）、位置１７０（配列番号５４に示されるような位置１８３）でのＴｒｐ残基、及び位置２０２（配列番号５４に示されるような位置２１５）での保存されたＡｒｇ残基を包含する。上記に記載されるｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチド領域、ドメイン、モチーフ、残基及び配列をコードするその対応するポリヌクレオチドは、配列番号１、４５及び５３に示される。
【００５４】
さらに、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドの切断された形は、天然において発現されると思われる。両形は、可溶性ｚｃｙｔｏｒ１７受容体をコードする。フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン内の切断された“長形”の可溶性ｚｃｙｔｏｒ１７受容体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１７に示され、そしてその対応するポリペプチドは配列番号１８に示される。この切断された形は、配列番号２及び４６の残基１（Ｍｅｔ）〜３２４（Ｌｙｓ）をコードし、そして従って、損なわれていないシグナル配列、ＷＳＸＷＳ（配列番号３）モチーフ、リンカー、サイトカイン結合ドメイン、最後から２番目の鎖、及び保存されたＣｙｓ、ＣＸＷモチーフ、Ｔｒｐ及びＡｒｇ残基を含んで成る。
【００５５】
サイトカイン結合ドメインの末端で切断された、“短形”の可溶性ｚｃｙｔｏｒ１７受容体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２１に示され、そしてその対応するポリペプチドは、配列番号２２に示される。この切断された形は、配列番号２及び４６の残基１（Ｍｅｔ）〜２２５（Ｇｌｕ）と同一であり、そして次に分岐する２３９個の残基ポリペプチドをコードし、そして従って、上記のように、損なわれていないシグナル配列、ＷＳＸＷＳ（配列番号３）モチーフ、リンカー、サイトカイン結合ドメイン、最後から２番目の鎖、及び保存された、Ｃｙｓ、ＣＸＷモチーフ、Ｔｒｐ及びＡｒｇ残基を含んで成る。十分な長さの形のｚｃｙｔｏｒ１７に比較しての切断された形の複一列整列が図１に示される。
【００５６】
さらに、配列番号１， ４５， １７及び２１のｚｃｙｔｏｒ１７ ｃＤＮＡは、配列番号２， ４６， １８及び２２のｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドと同じ読み取り枠（ＯＲＦ）でポリペプチドをコードする他の開始メチオニン（配列番号１のヌクレオチド７５で、配列番号４５のヌクレオチド６６で、配列番号１７のヌクレオチドで、及び配列番号２１のヌクレオチド６６で）を使用できるポリペプチドをコードする。前記他の開始メチオニンの使用は、配列番号２， ４６， １８及び２のＮ−末端に整合して、３２個のアミノ酸（配列番号４８に示される）を付加する。さらに、配列番号５３のヌクレオチド５３６は、他の開始メチオニンとして使用し、従って、配列番号２， ４６， １８及び２２と同じＮ−末端（配列番号５４のアミノ酸１４（Ｍｅｔ）で開始する）及びシグナルポリペプチド配列を生成する。さらに、配列番号２， ４６， １８及び２２の配列におけるアミノ酸番号２（同様に配列番号５４におけるアミノ酸番号１５（Ｍｅｔ）での）での第２Ｍｅｔはまた、ポリペプチドのための他の開始メチオニンとしても作用することができる。
【００５７】
トランスメンブラン領域、及び保存され、そして低い変動性のモチーフの存在は一般的に、タンパク質における重要な構造領域と相互関係するか、又はその領域を定義する。低い変動性の領域（例えば、疎水性クラスター）は、一般的に、構造的に重要な領域に存在する（Ｓｈｅｐｐａｒｄ， Ｐ． など．， 前記）。低い変動性のそのような領域はしばしば、まれな又は数少ないアミノ酸、例えばトリプトファンを含む。そのような保存され且つ低い変動性のモチーフを端に有し、そしてそのモチーフ間の領域は、より変動性であるが、しかし、それらは重要な構造及び活性、例えば結合ドメイン、生物学的及び酵素学的活性、シグナルトランスダクション、細胞−細胞相互作用、組織極性ドメイン及び同様のものに関連し、又はそれらを明確にすることができるので、しばしば機能的に有意である。
【００５８】
上記のｚｃｙｔｏｒ１７における保存されたアミノ酸残基の領域は、新規ファミリーメンバーを同定するための手段として使用され得る。例えば、逆転写−ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、種々の組織源又は細胞系から得られるＲＮＡからの保存された領域をコードする配列を増幅するために使用され得る。特に、ｚｃｙｔｏｒ１７配列から企画された高い変性プライマーがこの目的のために有用である。そのような変性プライマーの企画及び使用は、当業者により容易に実施され得る。
【００５９】
本発明はまた、ポリヌクレオチド分子、例えば本明細書に開示されるｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドをコードするＤＮＡ及びＲＮＡ分子を提供する。当業者は、遺伝子コードの縮重の観点から、相当の配列変動がそれらのポリヌクレオチド分子間で可能であることを容易に認識するであろう。配列番号４、４７及び５５は、配列番号２、４６及び５４のｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドをコードするすべてのＤＮＡを包含する縮重ＤＮＡ配列である。当業者はまた、配列番号４、４７及び５５の変性配列がＵとＴとを置換することによって、それぞれ、配列番号２、４６及び５４をコードするすべてのＲＮＡ配列も供給することを理解するであろう。
従って、配列番号４のヌクレオチド１−２１９６、配列番号４７のヌクレオチド１−１９４７及び配列番号５５のヌクレオチド１−１９８６を含んで成るｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチド−コードのポリヌクレオチド及びそれらのＲＮＡ相当物は、本発明により包含される。表１は、縮重ヌクレオチド位置を示すために、配列番号４、４７及び５５内に使用される１文字コードを示す。“解”は、コード文字により示されるヌクレオチドである。“相補体”とは、相補的ヌクレオチドのためのコードを示す。例えば、コードＹはＣ又はＴのいずれかを示し、そしてその相補体ＲはＡ又はＧを示し、ＡはＴに対して相補的であり、そしてＧはＣに対して相補的である。
【００６０】
【表１】
2004501628.tif 000002
与えられたアミノ酸のためのすべての可能なコドンを包含する配列番号４、４７及び５５に使用される縮重コドンが表２に示される。
【００６１】
【表２】
2004501628.tif 000003
【００６２】
当業者は、いくらかのあいまいさが、個々のアミノ酸をコードするすべての可能なコドンの代表である縮重コドンの決定において導入されることを理解するであろう。例えば、セリン（ＷＳＮ）のための縮重コドンは、ある環境下で、アルギニン（ＡＧＲ）をコードすることができ、そしてアルギニン（ＭＧＮ）のための縮重コドンは、ある環境下で、セリン（ＡＧＹ）をコードすることができる。類似する関係が、フェニルアラニン及びロイシンをコードするコドン間に存在する。従って、縮重配列により包含されるいくつかのポリヌクレオチドは、変異体アミノ酸配列をコードすることができるが、しかし当業者は、配列番号２、４６及び５４、又は５７および９３のアミノ酸配列への参照によりそのような変異体配列を容易に同定することができる。変異体配列は、本明細書に記載のようにして官能性について容易に試験され得る。
【００６３】
当業者はまた、異なった種が“選択的コドン使用法”を示すことも理解するであろう。一般的には、Ｇｒａｎｔｈａｍ，など．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ８： １８９３−９１２， １９８０； Ｈａａｓ， など．， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ６： ３１５−２４， １９９６；　Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ、など．，Ｇｅｎｅ　１３：３５５−６４，１９８１；Ｇｒｏｓｊｅａｎ　ａｎｄ　Ｆｉｅｒａ，Ｇｅｎｅ　１８：１９９−２０９、１９８２；Ｈｏｌｍ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１４：３０７５−８７、１９８６；Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５８：５７３−９７，１９８２を参照のこと。本明細書において使用される場合、用語、“選択的コドン使用法”又は“選択的コドン”とは、一定の種の細胞に最も頻繁に使用され、従って個々のアミノ酸をコードする可能なコドンの１又は少数の代表を好むタンパク質翻訳コドンを言及する技術的用語である（表３を参照のこと）。
【００６４】
例えば、アミノ酸トレオニン（Ｔｈｒ）は、ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、又はＡＣＴによりコードされるが、しかし哺乳類細胞においては、ＡＣＣが最も通常に使用されるコドンであり；他の種においては、例えば昆虫細胞、酵母、ウィルス又は細菌においては、異なったＴｈｒコドンが好ましい。特定の種のための選択的コドンは、当業界において知られている種々の方法により、本発明のポリヌクレオチド中に導入され得る。
【００６５】
例えば、組換えＤＮＡ中への選択的コドン配列の導入は、特定の細胞型又は種内でタンパク質の翻訳により効果的にすることによって、そのタンパク質の生成を増強する。従って、配列番号４、４７及び５５に開示される縮重コドン配列は、当業界において通常使用され、そして本明細書において開示される種々の細胞型及び種においてポリペプチドの発現を最適化するための鋳型として作用する。選択コドンを含む配列は、種々の種における発現について試験され、そして本明細書に開示される官能性について試験され得る。
【００６６】
本発明の好ましい態様においては、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１、４５又は５４、復は５７および９３、又はそれに対して相補的な配列の類似するサイズの領域に対して、緊縮条件下でハイブリダイズするであろう。一般的に、緊縮条件は、定義されたイオン強度及びｐＨで、特定の配列のための熱溶融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くあるよう選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が好ましく適合されたプローブに対してハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度及びｐＨ下で）である。
【００６７】
Ｔｍを計算するための多くの等式は当業界において知られており、そして種々の長さのＤＮＡ、ＲＮＡ及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド及びポリヌクレオチドプローブ配列に対して特異的である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ など．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ １９８８）； Ａｕｓｕｂｅｌ など．， （ｅｄｓ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９８７）； Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ （ｅｄｓ．）， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９８７）； 及びＷｅｔｍｕｒ， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６：２２７ （１９９０）を参照のこと）。配列分析ソフトウェア、例えばＯＬＩＧＯ６．０（ＬＳＲ； Ｌｏｎｇ Ｌａｋｅ， ＭＮ）及びＰｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ４．０ （Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｂｉｏｓｏｆｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ； Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）， 並びにインターネット上のサイトが所定の配列を分析し、そして使用者の定義された基準に基づいてＴｍを計算するための手段を入手できる。
【００６８】
そのようなプログラムはまた、定義された条件下で所定の配置を分析し、そして適切なプローブ配列を同定することができる。典型的には、５０以上の塩基対の長いポリヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションは、計算されたＴｍよりも約２０〜２５℃低い温度で行われる。５０以下の塩基対の小さなプローブに関しては、ハイブリダイゼーションは典型的には、Ｔｍ又はそれよりも５〜１０℃以下で行われる。これは、ＤＮＡ−ＤＮＡ及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに関して、最大速度のハイブリダイゼーションを可能にする。低い温度でのより高い程度の緊縮性は、緩衝溶液における個々の１％ホルムアミドに関して、約１℃ハイブリッドのＴｍを低めるホルムアミドの添加により達成され得る。
【００６９】
適切な緊縮ハイブリダイゼーション条件は、約４０〜５０％のホルムアミド、約６×までのＳＳＣ、約５×のＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、０〜約１０％のデキストラン硫酸及び約１０〜２０μｇ／ｍｌの変性された市販のキャリヤーＤＮＡを含んで成る溶液において約４２℃での５時間〜一晩インキュベーションに等しい。一般的に、そのような緊縮条件は、２０〜７０℃の温度及び６×までのＳＳＣ及び０〜５０％のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション緩衝液を包含し；次にハイブリダイゼーションに続いて、約２×までのＳＳＣによるフィルターの洗浄を伴う。
【００７０】
例えば、適切な洗浄緊縮性は、０．１×のＳＳＣ〜２×のＳＳＣ， ０．１％のＳＤＳ， ５５℃〜６５℃の温度に等しい。異なった程度の緊縮性が、標的配列に対する最大の特異的結合を達成するためには、ハイブリダイゼーション及び洗浄の間に使用され得る。典型的には、ハイブリダイゼーションに続く洗浄は、ハイブリダイズされた複合対からハイブリダイズされていないポリヌクレオチドプローブを除去するために、高い程度の緊縮性で行われる。緊縮ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、プローブの長さに依存し、Ｔｍ，ハイブリダイゼーション及び使用される洗浄溶液において影響され、そして通常　当業者により実験的に決定される。
【００７１】
前で示されたように、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡを包含する。ＤＮＡ及びＲＮＡを調製するための方法は、当業界において良く知られている。一般的には、ＲＮＡは、多量のｚｃｙｔｏｒ１７ ＲＮＡを生成する組織又は細胞から単離される。そのような組織及び細胞は、ノザンブロット（Ｔｈｏｍａｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７： ５２０１， １９８０）により同定され、そしてＰＢＬ、膵臓、胸腺、骨髄、前立腺、リンパ組織、ヒト赤白血病細胞系、急性単球白血病細胞系、他のリンパ球及び造血細胞系、及び同様のものを包含する。
【００７２】
前記活性、又はＲＮＡ生成細胞又は組織が同定されると、全ＲＮＡは、グアニジウム　ＨＣｌ抽出、続くＣｓＣｌグラジエントにおける遠心分離による単離により調製され得る（Ｃｈｉｒｇｗｉｎなど．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：５２−９４， １９７９）。ポリ（Ａ）＋　ＲＮＡは、Ａｖｉｖ ａｎｄ Ｌｅｄｅｒ （Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９： １４０８−１４１２， １９７２ ）の方法を用いて全ＲＮＡから調製される。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、既知の方法を用いて、ポリ（Ａ）＋　ＲＮＡから調製される。他方では、ゲノムＤＮＡが単離され得る。次に、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、例えばハイブリダイゼーション又はポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により同定され、そして単離される（Ｍｕｌｌｉｓ， アメリカ特許第４，６８３，２０２号）。
【００７３】
ｚｃｙｔｏｒ１７をコードする十分な長さのクローンは、従来のクローニング方法により得られる。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンが好ましいが、但し、いくつかの用途（例えば、トランスジェニック動物における発現）に関しては、ゲノムクローンを使用し、又は少なくとも１つのゲノムイントロンを含むようｃＤＮＡクローンを修飾することが好ましい。ｃＤＮＡ及びゲノムクローンを調製するための方法は、よく知られており、そして当業者のレベルの範囲内であり、そしてライブラリーをプローブし又は感作するために、本明細書に開示される配列又はその一部の使用を包含する。発現ライブラリーは、ｚｃｙｔｏｒ１７、受容体フラグメント、又は他の特定の結合パートナーに対する抗体によりプローブされ得る。
【００７４】
本発明のポリヌクレオチドはまた、ＤＮＡ合成機械を用いても合成され得る。現在、好ましい方法は、ホスホラミジット方法である。化学的に合成された二本鎖ＤＮＡが遺伝子又は遺伝子フラグメントの合成のために必要とされる場合、個々の相補的鎖が、別々に製造される。短い遺伝子（６０〜８０ｂｐ）の生成は技術的に直接的であり、そして相補的鎖の合成及び続いて、それらのアニーリングにより達成され得る。しかしながら、より長いポリヌクレオチド（３００ｂｐ以上）の生成に関しては、化学的ＤＮＡ合成の間、個々のサイクルのカップリング効率はめったに１００％でないので、特定の工程が通常使用される。この問題を解決するために、合成遺伝子（二本鎖）が、２０〜１００個の長さのヌクレオチドである一本鎖フラグメントから調整形でアセンブルされる。
【００７５】
十分な長さの遺伝子を調製するための他の手段は、特定組みのオーバーラップするオリゴヌクレオチド（４０〜１００個のヌクレオチド）を合成することである。３’及び５’の短いオーバーラップする相補的領域（６〜１０個のヌクレオチド）がアニーリングされた後、大きなギャップが残存するが、しかし短い塩基対合された領域は、その構造体を一緒に維持するのに十分に長く且つ十分に安定性である。ギャップが満たされ、そしてＤＮＡ複合体がＥ．コリＤＮＡポリメラーゼＩによる酵素ＤＮＡ合成により完結される。酵素合成の完結の後、ニックがＴ４ ＤＮＡリガーゼにより密閉される。
【００７６】
二本鎖構造体は、ＤＮＡ配列分析により確かめられる完全な遺伝子配列を形成するために、お互い連続的に連結される。Ｇｌｉｃｋ ａｎｄ Ｐａｓｔｅｒｎａｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， （ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ． １９９４）； Ｉｔａｋｕｒａ など．， Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５３： ３２３−５６， １９８４及びＣｌｉｍｉｅ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓａ． ＵＳＡ ８７： ６３３−７， １９９０を参照のこと。さらに、転写及び翻訳の正しい開始及び停止のためのシグナルを含む他の配列が一般的に付加される。
【００７７】
本発明はさらに、他の種（オルト体）からの相対物リガンド及びポリヌクレオチドを供給する。これらの種は、哺乳類、鳥類、両性類、ハ虫類、魚類、昆虫及び他の脊椎及び無脊椎動物種を包含するが、但しそれらだけには限定されない。特に興味あるものは、他の哺乳類種、例えばネズミ、ブタ、羊、ウシ、犬、ネコ、馬及び他の霊長類ポリペプチドからのｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドである。ヒトｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドのオルト体は、従来のクローニング技法と組合して、本発明により供給される情報及び組成物を用いてクローン化され得る。例えば、ｃＤＮＡは、ｚｃｙｔｏｒ１７を発現する組織又は細胞型から得られるｍＲＮＡを用いてクローン化され得る。
【００７８】
ｍＲＮＡの適切な源は、本明細書に開示される配列から企画されたプローブによりノザン　ブロットをプローブすることによって同定され得る。次に、ライブラリーが陽性の組織又は細胞系のｍＲＮＡから調製される。次に、オルト体のｚｃｙｔｏｒ１７−コードのｃＤＮＡが種々の方法、例えば完全な又は部分的なヒトｃＤＮＡにより、又は前記開示される配列に基づく１又は複数の変性プローブにより、プローブすることによって単離され得る。ｃＤＮＡはまた、本明細書に開示される代表的なヒトｚｃｙｔｏｒ１７配列から企画されたプライマーを用いて、ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ， 前記）を用いてもクローン化され得る。さらなる方法においては、ｃＤＮＡライブラリーが宿主細胞を形質転換し、又はトランスフェクトするために使用され、そして興味あるｃＤＮＡの発現がｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドに対する抗体により検出され得る。類似する技法がまた、ゲノム　クローンの単離に適用され得る。
【００７９】
ヒトｚｃｙｔｏｒ１７のマウスオルト体についてのポリヌクレオチド配列は、同定されており、そして配列番号５６で示されており、そしてその対応するアミノ酸配列は、配列番号５７で示される。配列番号５６のＤＮＡ配列によりコードされるマウスｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドの分析は、４５個のアミノ酸残基（配列番号５７の残基１（Ｍｅｔ）〜残基４５（Ａｌａ））の推定される分泌シグナルペプチド及び６１７個のアミノ酸（配列番号５７の残基４６（Ｖａｌ）〜残基６６２（Ｃｙｓ））の成熟ポリペプチドを含んで成る６６２個のアミノ酸をコードする読み取り枠を示した。さらに、１８個のアミノ酸残基（配列番号５７の残基２８（Ｍｅｔ）〜残基４５（Ａｌａ））及び６１７個のアミノ酸の同じ成熟ポリペプチド（配列番号５７の残基４６（Ｖａｌ）〜残基６６２（Ｃｙｓ））の第２の予測される分泌されるシグナルペプチドを含んで成る追加のＭｅｔ残基、Ｍｅｔ（２８）が開始メチオニンとして使用され得る。
【００８０】
配列番号５７の残基２２４−２２８に対応するＷＳＸＷＳモチーフ（配列番号３）の他に、受容体は、約２００個のアミノ酸残基のサイトカイン−結合ドメイン（配列番号５７の残基４６（Ｖａｌ）〜２４０（Ｐｒｏ））及びフィブロネクチンＩＩＩドメイン（配列番号５７の残基２４１（Ｈｉｓ）〜５３３（Ｇｌｕ））を含む、配列番号５７の残基４６（Ｖａｌ）〜５３３（Ｇｌｕ）の細胞外ドメイン；ＣＸＷモチーフ（配列番号５７の残基６６（Ｃｙｓ）〜６８（Ｔｒｐ））；ドメインリンカー（配列番号５７の残基１４２（Ｔｈｒ）〜１４５（Ｐｒｏ））；最後から２番目の鎖領域（配列番号５７の残基２０７（Ｐｈｅ）〜２１４（Ａｒｇ））；トランスメンブランドメイン（配列番号５７の残基５３４（Ｉｌｅ）〜５５０（Ｉｌｅ））；“ＢｏｘＩ”シグナル部位（配列番号５７の残基５６８（Ｃｙｓ）〜５７４（Ｐｒｏ））、及び“ＢｏｘＩＩ”シグナル化部位（配列番号５７の残基６２８（Ｇｌｕ）〜６３１（Ｉｅｕ））を含む完全な細胞内シグナル化ドメイン（配列番号５７の残基５５１（Ｌｙｓ）〜６６２（Ｃｙｓ））を含んで成る。
【００８１】
クラスＩサイトカイン受容体に共通する保存された残基は、残基５６（Ｃｙｓ）、１８７（Ｔｒｐ）及び２１５（Ａｒｇ）で存在する。ヒト及びマウスアミノ酸配列の比較は、ヒト及びオルト体ポリペプチドの両者が上記の対応する構造特性を含むことを示す（図２を参照のこと）。マウスｚｃｙｔｏｒ１７についての成熟配列は、ヒト配列におけるＡｌａ３３（配列番号５４に示されるような）に対応する、Ｖａｌ４６（配列番号５７に示されるような）で開始する。配列番号５４及び配列番号５７に対応する全アミノ酸配列にわたって、マウス及びヒト配列間に約６１％の同一性が存在する。
【００８２】
上記の％同一性は、Ｋｔｕｐ＝１、ギャップ開放ペナルティー＝１２、ギャップ延長ペナルティー＝２及び置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、並びにデフォールとして設定される他のＦＡＳＴＡパラメーターを有するＦＡＳＴＡプログラムを用いて決定された。上記に記載されるマウスｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチド領域、ドメイン、モチーフ、残基及び配列をコードする、その対応するポリヌクレオチドは、配列番号５６に示される通りである。
【００８３】
さらに、切断された可溶性形のマウスｚｃｙｔｏｒ１７受容体ポリペプチドは、天然において発現すると思われる。切断された可溶性形のマウスｚｃｙｔｏｒ１７受容体についてのポリヌクレオチド配列は、同定されており、そして配列番号９２で示されており、そしてその対応するアミノ酸配列は、配列番号９３で示される。配列番号９２のＤＮＡ配列によりコードされる切断された可溶性形のマウスｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドの分析は、４５個のアミノ酸残基（配列番号９３の残基１（Ｍｅｔ）〜残基４５（Ａｌａ））の推定される分泌シグナルペプチド及び５０２個のアミノ酸（配列番号９３の残基４６（Ｖａｌ）〜残基５４７（Ｖａｌ））の成熟ポリペプチドを含んで成る５４７個のアミノ酸をコードする読み取り枠を示した。
【００８４】
さらに、１８個のアミノ酸残基（配列番号９３の残基２８（Ｍｅｔ）〜残基４５（Ａｌａ））及び５０２個のアミノ酸の同じ成熟ポリペプチド（配列番号９３の残基４６（Ｖａｌ）〜残基５４７（Ｖａｌ））の第２の予測される分泌されるシグナルペプチドを含んで成る追加のＭｅｔ残基、Ｍｅｔ（２８）が開始メチオニンとして使用され得る。
【００８５】
配列番号９３の残基２２４−２２８に対応するＷＳＸＷＳモチーフ（配列番号３）の他に、受容体は、約２００個のアミノ酸残基のサイトカイン−結合ドメイン（配列番号９３の残基４６（Ｖａｌ）〜２４０（Ｐｒｏ））及びフィブロネクチンＩＩＩドメイン（配列番号９３の残基２４１（Ｈｉｓ）〜５３３（Ｔｒｐ））を含む、配列番号９３の残基４６（Ｖａｌ）〜５３３（Ｔｒｐ）の細胞外ドメイン；ＣＸＷモチーフ（配列番号９３の残基６６（Ｃｙｓ）〜６８（Ｔｒｐ））；ドメインリンカー（配列番号９３の残基１４２（Ｔｈｒ）〜１４５（Ｐｒｏ））；最後から２番目の鎖領域（配列番号９３の残基２０７（Ｐｈｅ）〜２１５（Ａｒｇ））；及びＣ−末端領域（残基５５１（Ｌｅｕ）〜５４７（Ｖａｌ））を含んで成る。
【００８６】
クラスＩサイトカイン受容体に共通する保存された残基は、残基５６（Ｃｙｓ）、１８７（Ｔｒｐ）及び２１５（Ａｒｇ）で存在する。ヒト及びマウスアミノ酸配列、例えば切断された可溶性マウスｚｃｙｔｏｒ１７の比較は、ヒト及びオルト体ポリペプチドの両者が上記の対応する構造特性を含むことを示す（図２を参照のこと）。上記に記載される、切断された可溶性マウスｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチド領域、ドメイン、モチーフ、残基及び配列をコードするその対応するポリヌクレオチドは、配列番号９２に示される通りである。
【００８７】
サイトカイン受容体サブユニットは、細胞外ドメイン、細胞膜にポリペプチドを固定するトランスメンブランドメイン、及び細胞内ドメインを含んで成る多重−ドメイン構造により特徴づけられる。細胞外ドメインはリガンド−結合ドメインであり得、そして細胞内ドメインはシグナルトランスダクションに包含されるエフェクタードメインであり得るが、但しリガンド−結合及びエフェクター機能は、マルチマー受容体の別々のサブユニット上に存在する。マルチマー受容体は、ホモダイマー（例えば、ＰＤＧＦ受容体αα及びββイソフォーム、エリトロポエチン受容体、ＭＰＬ及びＧ−ＣＳＦ受容体）、サブユニットがそれぞれリガンド−結合及びエフェクタードメインを有するヘテロダイマー（例えば、ＰＤＧＦ受容体αβイソフォーム）、及び種々の機能を有する成分サブユニットを有するマルチマー（例えば、ＩＬ−２， ＩＬ−３， ＩＬ−４， ＩＬ−５， ＩＬ−６， ＩＬ−７及びＧＭ−ＣＳＦ受容体）を包含する。
【００８８】
いくつかの受容体サブユニットは、多くの受容体に共通する。例えば、単独ではリガンドを結合できないが、しかし細胞内シグナルトランスダクションドメインを包含するＡＩＣ２Ｂサブユニットは、ＩＬ−３及び ＧＭ−ＣＳＦ受容体の成分である。多くのサイトカイン受容体は、その構造及び機能に基づいて、４種の関連するファミリーの１つに配置され得る。例えば、造血受容体は、保存されたシステイン残基及びＷＳＸＷＳモチーフ（配列番号３）を含むドメインの存在により特徴づけられる。サイトカイン受容体構造は、Ｕｒｄａｌ， Ａｎｎ． Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２６： ２２１−２２８， １９９１及びＣｏｓｍａｎ， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ５：９５−１０６， １９９３により再考されている。新規生物学的機能を生物が獲得するための選択的圧力下で、新規のファミリーメンバーは、多重遺伝子ファミリーの存在を導く存在する受容体遺伝子の重複から、たぶん生まれる。
【００８９】
従って、ファミリーメンバーは、祖先遺伝子の痕跡を含み、そしてそれらの特徴は、追加のファミリーメンバーの単離及び同定において利用され得る。従って、サイトカイン受容体スーパーファミリーは、いくつかのファミリー、例えば免疫グロブリンファミリー（例えば、ＣＳＦ−１， ＭＧＦ， ＩＬ−１及びＰＤＧＦ受容体）；ヘマトポイエチンファミリー（例えば、ＩＬ−２受容体β−サブユニット、ＧＭ−ＣＳＦ受容体のα−サブユニット、ＧＭ−ＣＳＦ受容体β−サブユニット、及びＧ−ＣＳＦ，ＥＰＯ， ＩＬ−３， ＩＬ−５， ＩＬ−６， Ｉｌ−７及びＩＬ−９受容体）；ＴＮＦ受容体ファミリー（例えば、ＴＮＦ（ｐ８０）ＴＮＦ （ｐ６０） 受容体、ＣＤ２７，ＣＤ３０， ＣＤ４０， Ｆａｓ及びＮＧＦ受容体）に再分割される。
【００９０】
ｚｃｙｔｏｒ１７配列の分析は、それがｇｐ１３０， ＬＩＦ， ＩＬ−１２， ＷＳＡ−１， ＩＬ−２受容体β−サブユニット、ＩＬ−３， ＩＬ−４及びＩＬ−６受容体と同じ受容体サブファミリーのメンバーであることを示唆する。このサブファミリーにおける一定の受容体（例えば、Ｇ−ＣＳＦ）は、シグナルを形質導入するホモダイマーを形成するために会合する。サブファミリーの他のメンバー（例えば、ＩＬ−６， ＩＬ−１１及びＬＩＦ受容体）は、リガンドを結合し、そしてシグナルを形質導入するために第２サブユニット（β−サブユニットと呼ばれる）と結合する。
【００９１】
特定のβ−サブユニットは、多くの特定のサイトカイン受容体サブユニットと会合する。例えば、β−サブユニットｇｐ１３０（Ｈｉｂｉなど．，Ｃｅｌｌ６３：１１４９−１１５７， １９９０）は、ＩＬ−６， ＩＬ−１１及びＬＩＦに対して特異的な受容体サブユニットと会合する（Ｇｅａｒｉｎｇなど．， ＥＭＢＯＪ． １０： ２８３９−２８４９， １９９１； Ｇｅａｒｉｎｇなど．，アメリカ特許第５，２８４，７５５号）。オンコスタチンＭ（Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ）は、ＬＩＦ受容体及びｇｐ１３０のヘテロダイマーに結合する。ＣＮＴＦは、ＣＮＴＦ受容体、ＬＩＦ受容体及びｇｐ１３０サブユニットを含んで成るトリマー受容体に結合する。
【００９２】
当業者は、配列番号１、４及び５３５に開示される配列がヒトｚｃｙｔｏｒ１７の単一の対立遺伝子を表し、そして対立遺伝子変動及び交互のスプライシングが生じることが予測されることを認識するであろう。この配列の対立遺伝子変異体は、標準の方法に従って、異なった個人からのｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。配列番号１、４５及び５３に示されるＤＮＡ配列の対立遺伝子変異体、例えばサイレント突然変異を含むそれらの変異体及び突然変異がアミノ酸配列変更をもたらすそれらの変異体は、配列番号２、４６、５４、５７復は９３の対立遺伝子変異体であるタンパク質と同じように、本発明の範囲内である。
【００９３】
ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドの性質を保持する、もう１つのスプライスされたｍＲＮＡ、例えば配列番号３４から生成されるｃＤＮＡは、そのようなｃＤＮＡ及びｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドと同じように、本発明の範囲内に包含される。それらの配列の対立遺伝子変異体及びスプライス変異体は、当業界において知られている標準の方法に従って、異なった個人又は組織からのｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。例えば、上記の及び配列番号１７及び１８、又は配列番号２１及び２２での短形及び長形の可溶性ｚｃｙｔｏｒ１７受容体は、ｚｃｙｔｏｒ１７の対立遺伝子又はスプライス変異体であると思われる。
【００９４】
本発明はまた、配列番号２、４６又は５４のポリペプチド、及びそれらのオルト体、例えば配列番号５７及び９３に対して実質的に類似する単離されたｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドも提供する。用語“実質的に類似する”とは、配列番号２、４６又は５４に示される配列又はそれらのオルト体、例えば配列番号５７及び９３に対して、少なくとも７０％、及びより好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドを示すために本明細書において使用される。そのようなポリペプチドは、より好ましくは、配列番号２、４６及び５４、又はそのオルト体に対して、少なくとも　９０％、及び最も好ましくは９５％又はそれ以上同一であろう。
【００９５】
％配列同一性は、従来の方法により決定される。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌなど．， Ｂｕｌｌ． Ｍａｔｈ． Ｂｉｏ． ４８ ： ６０３−６１６， １９８６及びｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｕｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９ ：１０９１５−１０９１９， １９９２を参照のこと。手短に言及するば、２種のアミノ酸配列が、１０のギャップ開始ペナルティー、１のギャップ拡張ペナルティー、及び表３（アミノ酸は標準の１文字コードにより示される）に示されるようなＨｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ （前記）の“ｂｌｏｓｕｍ ６２”評点マトリックスを用いて、その整合評点を最適化するために整合される。次に、％同一性が次のようにして計算される：
【００９６】
【数１】
2004501628.tif 000004
【００９７】
【表３】
2004501628.tif 000005
【００９８】
ポリヌクレオチド分子の配列同一性は、上記に開示されるような割合を用いて、類似する方法により決定される。
当業者は、２種のアミノ酸配列を整列するために多くの確立されたアルゴリズムが存在することを理解している。Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎの“ＦＡＳＴＡ”類似性調査アルゴリズムは、本明細書に開示されるアミノ酸配列及び推定上の変異体ｚｃｙｔｏｒ１７のアミノ酸配列により共有される同一性のレベルを試験するための適切なタンパク質整列方法である。前記ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ２４４４ （１９８８）， 及びＰｅａｒｓｏｎ， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８３： ６３ （１９９０） により記載される。
【００９９】
手短には、ＦＡＳＴＡがまず、問題の配列（例えば、配列番号２、４６、５４、５７、及び９３）及び保存性アミノ酸置換、挿入又は欠失を考慮しないで、最高密度の同一性（ｋｔｕｐ変数が１である場合）又は対の同一性（ｋｔｕｐ＝２である場合）のいずれかを有する試験配列により共有される領域を同定することによって配列を特徴づける。次に、最高密度の同一性を有する１０の領域が、アミノ酸置換マトリックスを用いて、すべての対合されたアミノ酸の類似性を比較することによって再評価され、そして前記領域の末端が、最高の評点に寄与するそれらの残基のみを含むよう“整えられる”。
【０１００】
“カットオフ”値（配列の長さ及びｋｔｕｐ値に基づいて予定された式により計算される）よりも高い評点を有するいくつかの領域が存在する場合、その整えられた初期領域が、その領域がギャップとのおおよその一列配列を形成するために結合され得るかどうかを決定するために試験される。最終的に、２種のアミノ酸配列の最高評点領域が、アミノ酸挿入及び欠失を可能にする、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ ｗｉｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４４， １９７０； Ｓｅｌｌｅｒｓ， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２６： ７８７， １９７４）の変法を用いて整列される。
【０１０１】
ＦＡＳＴＡ 分析のための例示的なパラメーターは次のものである：ｋｔｕｐ＝１、ギャップ開始ペナルティー＝１０、ギャップ拡張ペナルティー＝１及び置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。それらのパラメーターは、Ａｐｐｅｎｄｉｘ ２ ｏｆ Ｐｅａｒｓｏｎ， １９９０ （前記）に説明されるように、評点マトリックスを調節することによってＦＡＳＴＡプログラム中に導入され得る。
【０１０２】
ＦＡＳＴＡはまた、上記に開示されるような割合を用いて、核酸分子の配列同一性を決定するためにも使用され得る。ヌクレオチド配列比較のためには、ｋｔｕｐ値は、誤りとして設定される他のＦＡＳＴＡパラメーターを伴って、１〜６、好ましくは３〜６、最も好ましくは３であり得る。
【０１０３】
ＢＬＯＳＵＭ６２表（表３）は、関連するタンパク質の５００以上のグループの高く保存された領域を表す、タンパク質配列セグメントの約２，０００の局部の複数整列に由来するアミノ酸置換マトリックスである［Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： １０９１５ （１９９２） ］。従って、ＢＬＯＳＵＭ６２置換頻度は、本発明のアミノ酸配列中に導入され得る保存性アミノ酸置換を定義するために使用され得る。
【０１０４】
化学的性質に基づいてのみアミノ酸置換を企画することが可能であるが（上記のように）、用語“保存性アミノ酸置換”とは、−１よりも大きなＢＬＯＳＵＭ６２値により表される置換を言及する。例えば、アミノ酸置換は、その置換が０，１，２又は３のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴づけられる場合、保存性である。このシステムによれば、好ましい保存性アミノ酸置換は、少なくとも１（例えば、１，２又は３）のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴づけられ、ところがより好ましくは保存性置換は、少なくとも２（例えば、２又は３）のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴づけられる。
【０１０５】
変異体ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチド又は実質的に相同のｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドは、１又は複数のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するものとして特徴づけられる。それらの変化は、好ましくは、保存性アミノ酸置換（表４を参照のこと）及びタンパク質及びポリペプチドの折りたたみ又は活性に実質的に影響を及ぼさない他の置換；小さな欠失、典型的には１〜約３０個のアミノ酸の欠失；及び小さなアミノ−又はカルボキシル−末端の延長、例えばアミノ−末端メチオニン残基、約２０〜２５個までの残基の小さなリンカーペプチドの延長、又は親和性標識の延長である。従って、本発明は、配列番号２、４６、５４、５７又は９３のその対応する領域（標識、延長、リンカー配列及び同様のものを除く）に対して８０％、好ましくは少なくとも９０％、及びより好ましくは９５％又はそれ以上の同一性を有する配列を含んで成るポリペプチドを包含する。親和性標識を含んで成るポリペプチドはさらに、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドと親和性標識との間にタンパク質分解部位を含む。好ましいそのような部位は、トロンビン分解部位及び第Ｘａ因子分解部位を含む。
【０１０６】
【表４】
2004501628.tif 000006
【０１０７】
本発明はさらに、種々の他のポリペプチド融合体、及び１又は複数のポリペプチド融合体を含んで成る関連するマルチマータンパク質を提供する。例えば、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドは、アメリカ特許第５，１５５，０２７号及び第５，５６７，５８４号に開示されるようなダイマータンパク質への融合として調製され得る。それに関しての好ましいダイマータンパク質は、免疫グロブリン不変領域ドメインを包含する。免疫グロブリン−ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチド融合体は、種々のマルチマーｚｃｙｔｏｒ１７類似体を生成するために、遺伝子的に構築された細胞において発現され得る。補助ドメインは、特定の細胞、組織又は高分子（例えば、コラーゲン）に対してそれらを標的化するためにｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドに融合され得る。ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドは、複数の成分、例えば精製のための親和性標識及び標的化ドメインに融合され得る。ポリペプチド融合はまた、特にドメイン間に、１又は複数の切断部位を含むことができる。Ｔｕａｎなど．， Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４： １−９， １９９６を参照のこと。
【０１０８】
本発明のタンパク質はまた、天然に存在しないアミノ酸残基を含んで成る。天然に存在しないアミノ酸は、トランス−３−メチルプロリン、２，４−メタプロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−メチルグリシン、アロ−トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン、３，３−ジメチルプロリン、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、及び４−フルオロフェニルアラニンを包含する。
【０１０９】
天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質中に導入するためのいくつかの方法が当業界において知られている。例えばナンセンス突然変異が化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを用いて抑制されるインビトロシステムが使用され得る。アミノ酸を合成し、そしてｔＲＮＡをアミノアシル化するための方法は、当業者において知られている。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写及び翻訳は、Ｅ．コリＳ３０抽出物及び市販の酵素及び他の試薬の含んで成る細胞フリーシステムにおいて実施される。タンパク質は、クロマトグラフィーにより精製される。例えば、Ｒｏｖｅｒｔｓｏｎなど．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１３：２７２２， １９９１； Ｅｌｌｍａｎ など．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０２： ３０１，１９９１； Ｃｈｕｎｇ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９： ８０６−０９， １９９３； 及びＣｈｕｎｇなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： １０１４５−４９， １９９３を参照のこと。
【０１１０】
第２の方法においては、翻訳は、突然変異誘発されたｍＲＮＡ及び化学的にアミノアミル化されたサプレッサ−ｔＲＮＡのマイクロインジェクションによりアフリカツメガエル卵母細胞において行われる（ Ｔｕｒｃａｔｔｉ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： １９９１−９８， １９９６ ）。 第３の方法においては、Ｅ．コリ細胞が、置換される予定である天然のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の不在下で及び所望する天然に存在しないアミノ酸（例えば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン又は４−フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養される。
【０１１１】
天然に存在しないアミノ酸は、その天然の相対物の代わりにタンパク質中に導入される。Ｋｏｉｄｅ など．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３３： ７４７０−４６， １９９４を参照のこと。天然に存在するアミノ酸残基は、インビトロ化学的に修飾により天然に存在しない種に転換され得る。化学的修飾は、置換の範囲をさらに拡張するために特定部位の突然変異誘発と組み合わされ得る（Ｗｙｎｎ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ２： ３９５−４０３， １９９３）。
【０１１２】
限定された数の非保存性アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、及び不自然なアミノ酸が、ｚｃｙｔｏｒ１７アミノ酸により置換され得る。
【０１１３】
本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−走査突然変異誘発により同定され得る（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４： １０８１−１０８５， １９８９； Ｂａｓｓなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ｓｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８： ４４９８−５０２， １９９１）。後者の技法においては、単一のアラニン突然変異が分子中のあらゆる残基で導入され、そして得られる変異体分子が、前記分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するために、下記に開示されるようして、生物学的活性（例えば、リガンド結合及びシグナルトランスダクション）について試験される。
【０１１４】
また、Ｈｉｌｔｏｎなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： ４６９９−５７０８， １９９６を参照のこと。リガンド−受容体相互作用の部位はまた、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異に関して、核磁気共鳴、結晶学、電子回折又は光親和性ラベリングのような技法により決定され得る。例えば、ｄｅ Ｖｏｓ など．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５： ３０６−３１２， １９９２； Ｓｍｉｔｈ など．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４： ８９９−９０４， １９９２； Ｗｌｏｄａｖｅｒ など．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３０９： ５９−６４， １９９２を参照のこと。必須アミノ酸の同一性は、関連する受容体による相同体の分析からも推定され得る。
【０１１５】
構造統合性の維持に対して決定的である領域又はドメイン内に存在するアミノ酸残基の決定が行われ得る。それらの領域内で、多かれ少なかれ、変化に耐性であり、そして分子の全体的な三次構造を維持するであろう特定の残基を決定することができる。配列構造を分析するための方法は、高いアミノ酸又はヌクレオチド同一性を有する複数配列の一列整列、及び利用できるソフトウェアー（例えば、ｔｈｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩ（商標）ｖｉｅｗｅｒ ａｎｄ ｈｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｔｏｏｌｓ； ＭＳＩ， Ｓａｎ Ｄｉｒｇｏ， ＣＡ）、二次構造性質、二元パターン、相補的パッケージング及び埋もれた極性相互作用を用いてのコンピューター分析を包含するが、但しそれらだけには限定されない（Ｂａｒｔｏｎ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ５：３７２−３７６， １９９５及びＣｏｒｄｅｓなど．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ６： ３−１０， １９９６）。一般的に、分子への修飾を企画するか又は特定のフラグメントを同定する場合、構造の決定は、修飾された分子の活性を評価することによって付随されるであろう。
【０１１６】
アミノ酸配列の変更が、生物学的活性に対して必須である高次構造体の破壊を最少にするためにｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドにおいて行われる。例えば、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドが１又は複数のヘリックスを含む場合、アミノ酸残基の変更が、分子のヘリックス幾何学的及び他の成分を破壊しないよう行われ、ここでコンホメーションの変化が、いくらかの決定的な機能、例えば分子の、その結合パートナー、例えばＡ及びＤヘリックス、すなわち配列番号２の残基４４， ４７及び１３５への結合を妨害する。アミノ酸配列の変更の効果は、例えば上記に開示されるようなコンピューターモデルにより予測され得、又は結晶構造の分析により決定され得る（例えば、Ｌａｐｔｈｏｒｎなど．， Ｎａｔ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２： ２６６−２６８， １９９５）。
【０１１７】
当業界において良く知られている他の技法は、標準の分子（例えば、生来のタンパク質）と変異体タンパク質の折りたたみを比較する。例えば、変異体及び標準の分子におけるシステインパターンの比較が行われ得る。質量分光及び還元及びアルキル化を用いての化学的修飾は、ジスルフィド結合に関連するか又はそのような関連を有さないシステイン残基を決定するための方法を提供する（Ｂｅａｎなど．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０１： ２１６−２２６， １９９２； Ｇｒａｙ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ２： １７３２−１７４８， １９９３： 及びＰａｔｔｅｒｓｏｎなど．， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６６： ３７２７−３７３２， １９９４）。一般的に、修飾された分子が標準の分子と同じジスルフィド結合パターンを有さない場合、折りたたみが影響を及ぼされると思われる。
【０１１８】
折りたたみを測定するためのもう１つの良く知られており、且つ許容できる方法は、円ニ色性（ＣＤ）である。修飾された分子及び標準の分子により生成されるＣＤスペクトルの測定及び比較は、通常のことである（Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎ ７：２０５−２１４， １９９０）。結晶学は、折りたたみ及び構造を分析するためのもう１つの良く知られた方法である。核磁気共鳴（ＮＭＲ）、消化ペプチドマッピング及びエピトープマッピングはまた、タンパク質とポリペプチドとの間の折りたたみ及び構造的類似性を分析するための既知方法でもある（Ｓｃｈａａｎａｎなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７： ９６１−９６４， １９９２）。
【０１１９】
配列番号２、４６、５４、５７及び９３に示されるようなｚｃｙｔｏｒ１７タンパク質配列のＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ親水性プロフィールが生成され得る（Ｈｏｐｐなど．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７８： ３８２８， １９８１； Ｈｏｐｐ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． Ｍｅｔｈ． ８８： １−１８， １９８６及びＴｒｉｑｕｉｅｒなど．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１： １５３−１６９， １９９８）。図１を参照のこと。前記プロフィールは、スライドする６−残基窓（ｓｌｉｄｉｎｇ ｓｉｘ−ｒｅｓｉｄｕｅ ｗｉｎｄｏｗ）に基づかれている。埋もれたＧ， Ｓ及びＴ残基及び暴露されたＨ， Ｙ及びＷ残基は無視された。
【０１２０】
例えば、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドにおいては、親水性領域は、配列番号２及び４６のアミノ酸残基４３〜４８（配列番号５４の残基５６〜６１）；配列番号２及び４６のアミノ酸残基１５７〜１６２（配列番号５４の残基１７０〜１７５）；配列番号２及び４６のアミノ酸残基１５８〜１６３（配列番号５４の残基１７１〜１７６）；配列番号２及び４６のアミノ酸残基２２１〜２２６（配列番号５４の残基２３４〜２３９）；及び配列番号２及び４６のアミノ酸残基４２６〜４３１（配列番号５４の残基４３９〜４４４）を包含する。
【０１２１】
当業者は、親水性又は疎水性が、全体的な構造及び生物学的プロフィールを破壊しないよう、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドのアミノ酸配列における修飾を企画する場合、考慮されるであろうことを認識するであろう。Ｖａｌ， Ｌｅｕ及びＩｌｅから成る群、又はＭｅｔ， Ｇｌｙ， Ｓｅｒ， Ａｌａ， Ｔｙｒ及びＴｒｐから成る群から選択された疎水性残基の置換が特に興味の対象である。例えば、置換に耐性の残基は、配列番号２、４６、５４、５７及び９３に示されるような残基を包含する。システイン残基は、置換に対して比較的耐性であろう。
【０１２２】
必須アミノ酸の正体はまた、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドとの、クラスＩサイトカイン受容体ファミリーメンバー間の配列類似性の分析から推定され得る。前に記載された“ＦＡＳＴＡ”分析のような方法を用いて、高い類似性の領域が、タンパク質ファミリー内に同定され、そして保存された領域のためのアミノ酸配列を分析するために使用される。構造に基づいて変異体ポリヌクレオチドを同定するためのもう１つのアプローチは、可能性ある変異体ポリヌクレオチドをコードする核酸分子が、上記で論じられたように、配列番号１、４５又は５３のヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズできるかどうかを決定することである。
【０１２３】
本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸を同定する他の方法は、当業界において知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン走査突然変異誘発である（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４： １０８１ （１９８９）；Ｂａｓｓ など．， Ｐｒｏ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８： ４４９８ （１９９１）； Ｃｏｏｍｂｓ ａｎｄ Ｇｏｒｅｙ， “Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”， ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ａｕａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ， Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ （ｅｄ．）， Ｐ． ２５９−３１１ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９８））。後者の技法においては、単一のアラニン突然変異が分子におけるあらゆる残基で導入され、そして得られる変異体分子が、分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するために、下記に開示されるように、生物学的又は生化学的活性について試験される。また、Ｈｉｌｔｏｎなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： ４６９９ （１９９６） を参照のこと。
【０１２４】
本発明はまた、本明細書において定義されるようなｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドの機能的フラグメント、及びそのような機能的フラグメントをコードする核酸分子を包含する。本明細書において定義されるような、“機能的” ｚｃｙｔｏｒ１７又はそのフラグメントは、その増殖又は分化活性により、特殊化された細胞機能を誘発し、又は阻害するその能力により、又は可溶性又は固定された抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体、ｚｃｙｔｏｒ１７リガンドに特異的に結合するその能力により特徴づけられる。さらに、機能的フラグメントはまた、シグナルペプチド、細胞内シグナルドメイン、及び同様のものを包含する。前に本明細書において記載されたように、ｚｃｙｔｏｒ１７は、クラスＩサイトカイン受容体構造により特徴づけられる。
【０１２５】
従って、本発明はさらに、（ａ）本明細書に記載される細胞外ドメイン、サイトカイン−結合ドメイン、又は細胞内ドメインを含んで成るポリペプチド分子；及び（ｂ）１又は複数のそれらのドメインを含んで成る機能的フラグメントを包含する融合タンパク質を提供する。融合タンパク質の他のポリペプチド部分は、もう１つのクラスＩサイトカイン受容体、例えばｇｐ１３０， ＬＩＦ， ＩＬ−１２，ＷＳＸ−１， ＩＬ−２受容体β−サブユニット及びβ−共通受容体（すなわち、ＩＬ−３，ＩＬ−５及びＧＭ−ＣＳＦ受容体β−サブユニット）により、又は可溶性融合タンパク質の分泌を促進する非生来の及び／又は関連のない分泌シグナルペプチドにより寄与され得る。
【０１２６】
核酸分子の通常の欠失分析は、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドをコードする核酸分子の機能的フラグメントを得るために行われ得る。例示されるように、配列番号１、４５又は５３のヌクレオチド配列又はそのフラグメントを有するＤＮＡ分子は、一連の欠失を得るためにＢａｌ３１ヌクレアーゼにより消化され得る。次に、それらのＤＮＡフラグメントが正しい読み取り枠を整合して発現ベクター中に挿入され、そして発現されたポリペプチドが単離され、そしてｚｃｙｔｏｒ１７活性について、又は抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体又はｚｃｙｔｏｒ１７受容体を結合する能力について試験される。エキソヌクレアーゼ消化のための１つの方法は、欠失を導入するためにオリゴヌクレオチド−指図された突然変異誘発を使用し、又は所望するｚｃｙｔｏｒ１７フラグメントの生成を特定するために停止コドンを使用することである。他方では、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリヌクレオチドの特定のフラグメントは、ポリメラーゼ鎖反応を用いて合成され得る。
【０１２７】
機能的ドメインを同定するための標準の方法は、当業者に良く知られている。例えば、インターフェロンのいずれかの又は両末端での切断に対する研究が、Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｄｉ Ｍａｒｃｏ， ｐｈａｒｍａｃ． Ｔｈｅｒ． ６６： ５０７ （１９９５） により要約されている。さらに、タンパク質の機能的分析のための標準技法は、例えばＴｒｅｕｌｔｅｒなど．， Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２４０： １１３ （１９９３）， Ｃｏｎｔｅｎｔ など．， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓｉ ｏｆ ｔｈｅ ４２ ｋＤａ ２−５Ａ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ”， ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ＩＳＩＲ−ＴＮＯ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｃａｎｔｅｌｌ （ｅｄ．）， Ｐａｇｅｓ ６５−７２ （Ｎｉｊｈｏｆｆ １９８７）， Ｈｅｒｓｃｈｍａｎ， “Ｔｈｅ ＥＧＦ Ｅｎｚｙｍｅ”， ｉｎ Ｃｏｒｔｒｏｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ， Ｖｏｌ． １， Ｂｏｙｎｔｏｎ など．， （ｅｄｓ．） ｐａｇｅｓ １６９−１９９ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）， Ｃｏｕｎａｉｌｌｅａｕ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： ２９２７０ （１９９５）； Ｆｕｋｕｎａｇａ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： ２５２９１ （１９９５）； Ｙａｍａｇｕｃｈｉ など．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５０： １２９５ （１９９５）； 及びＭｅｉｓｅｌなど．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ３０： １ （１９９６）により記載される。
【０１２８】
複数アミノ酸置換は、突然変異誘発及びスクリーニングの既知方法、例えばＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ （ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１： ５３−５７， １９８８）又はＢｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ（ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８６：２１５２−２１５６，１９８９ ）により開示される方法を用いて行われ、そして試験される。手短に言及すれば、それらの著者は、ポリペプチドにおける複数の位置を同時ランダム化し、機能的ポリペプチドをスクリーンし、そして次に個々の位置での可能な置換の範囲を決定するために、突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定するための方法を開示する。使用され得る他の方法は、ファージ表示（例えば、Ｌｏｗｍａｎ など．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３０ ： １０８３２−１０８３７，１９９１； Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，２２３，４０９号； Ｈｕｓｅ， ＷＩＰＯ公開ＷＯ ９２／０６２０４号）、及び領域−指図された突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ など．， Ｇｅｎｅ ４６ ： １４５， １９８６； Ｎｅｒ など．， ＤＮＡ ７ ： １２７， １９８８ ）を包含する。
【０１２９】
開示されるｚｃｙｔｏｒ１７ ＤＮＡ及びポリペプチド配列の変異体は、Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３７０ ： ３８９−９１， １９９４， Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： １０７４７−５１， １９９４及びＷＩＰＯ公開ＷＩ９７／２００７８により開示されるように、ＤＮＡ　シャフリングを通して生成され得る。手短に言及すれば、変異体ＤＮＡ分子が、ランダムに導入された点突然変異をもたらす、親ＤＮＡのランダム断片化、続く、ＰＣＲを用いてのアセンブリーによるインビトロ相同組換えにより生成される。この技法は、前記工程中に追加の変動性を導入するために、親ＤＮＡのファミリー、例えば異なった種からの対立遺伝子変異体又はＤＮＡを用いて改良され得る。所望する活性の選択又はスクリーニング、突然変異誘発及びアッセイの続くさらなる相互作用が、有害な変化に対して同時に選択しながら、所望する突然変異について選択することによって、配列の急速な“進化”を提供する。
【０１３０】
本明細書に開示されるような突然変異誘発方法は、宿主細胞におけるクローン化された突然変異誘発されたｚｃｙｔｏｒ１７受容体ポリペプチドの活性を検出するために高処理量の自動化されたスクリーニング方法と組み合わされ得る。これに関する好ましいアッセイは、下記に記載される、細胞増殖アッセイ及びバイオセンサー−に基づくリガンド−結合アッセイを包含する。活性受容体又はその一部（例えば、又はリガンド−結合フラグメント、シグナル化ドメイン及び同様のもの）をコードする突然変異誘発されたＤＮＡ分子が、宿主細胞から回収され、そしてすぐに、近代的装置を用いて配列され得る。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の急速な決定を可能にし、そして未知の構造のポリペプチドに適用され得る。
【０１３１】
さらに、本発明のタンパク質（又はそのポリペプチドフラグメント）は、多機能分子を供給するために、他の生物活性分子、特に他のサイトカインに連結され得る。例えば，ｚｃｙｔｏｒ１７可溶性受容体からの１又は複数のヘリックスが、それらの生物学的性質又は生成の効率を高めるために、他のサイトカイン可溶性受容体に連結され得る。
【０１３２】
従って、本発明は、１又は複数のｚｃｙｔｏｒ１７のドメインを含んで成るセグメントが他のポリペプチドに融合されている一連の新規ハイブリッド分子を提供する。融合は好ましくは、組換え生成システムにおけるキメラ分子の発現を可能にするためにＤＮＡレベルをスプライシングすることにより行われる。次に、その得られる分子は、改良された溶解性、改良された安定性、延長されたクリアランス半減期、改良された発現及び分泌レベル、及び薬物力学についてアッセイされる。そのようなハイブリッド分子はさらに、成分タンパク質又はポリペプチド間に追加のアミノ酸残基（例えば、ポリペプチドリンカー）を含んで成る。
【０１３３】
本明細書に論議される方法を用いて、当業者は、シグナルトランスダクション又はリガンド結合活性を保持する、配列番号２、４６、５４、５７又は９３の種々のポリペプチドフラグメント又は変異体を同定し、そして／又は調製することができる。例えば、サイトカイン−結合ドメイン（配列番号２及び４６の残基２０（Ａｌａ）〜２２７（Ｐｒｏ）；配列番号５４の残基３３（Ａｌａ）〜２４０（Ｐｒｏ））、細胞外ドメイン（配列番号２及び４６の残基２０（Ａｌａ）〜５１９（Ｇｌｕ）；配列番号２の残基３３（Ａｌａ）〜５３２（Ｇｌｕ））、又はその対立遺伝子変異体又は種オルト体（例えば、本明細書に記載されるような、配列番号５７及び９３、及びその機能的フラグメント）に対して実質的に相同であり、そして野生型ｚｃｙｔｏｒ１７タンパク質のリガンド−結合活性を保持する種々のポリペプチドを調製することによって、ｚｃｙｔｏｒ１７を、“可溶性受容体”にすることができる。
【０１３４】
そのようなポリペプチドは、トランスメンブラン及び細胞内ドメインの一部又はすべてからの追加のアミノ酸を包含することができる。そのようなポリペプチドはまた、一般的に本明細書に開示されるような追加のポリペプチドセグメント、例えばラベル、親和性標識及び同様のものも包含することができる。
【０１３５】
変異体及び融合タンパク質を包含するいずれかのｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチド、例えば変異体、可溶性受容体及び融合ポリペプチド又はタンパク質に関しては、当業者は、上記表１及び２に示される情報を用いて、その変異体をコードする十分な縮重ポリヌクレオチド配列を用意に生成することができる。
【０１３６】
本発明のｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチド、例えば十分な長さのポリペプチド、生物学的に活性のフラグメント及び融合ポリペプチドは、従来の技法に従って、遺伝的に構築された宿主細胞において生成され得る。適切な宿主細胞は、外因性ＤＮＡにより形質転換又はトランスフェクトされ得、そして培養において増殖され得るそれらの細胞型であり、そして細菌、菌類細胞、及び培養された高等真核細胞を包含する。真核細胞、特に多細胞生物の培養された細胞が好ましい。クローン化されたＤＮＡ分子を操作し、そして種々の宿主細胞中に外因性ＤＮＡを導入するための技法は次の文献に開示される：Ｓａｍｂｒｏｏｌ など．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９， 及びＡｕｓｕｂｅｌ など．， ｅｄｓ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｓ．， ＮＹ， １９８７。
【０１３７】
一般的に、本発明のｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、その発現のために必要とされる他の遺伝子的要素、例えば一般的に、発現ベクター内の転写プロモーター及びターミネーターに作用可能に連結される。ベクターはまた、通常、１又は複数の選択マーカー及び１又は複数の複製の起点を含むであろうが、しかし当業者は、一定のシステム内で、選択マーカーが別のベクター上に供給され得、そして外因性ＤＮＡの複製が宿主細胞ゲノム中への組み込みにより供給され得ることを認識するであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター及び要素の選択は、当業者のレベルの範囲内の通常のことである。多くのそのような要素は文献に記載されており、そして商業的供給者を通して入手できる。
【０１３８】
ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドを、宿主細胞の分泌路中に方向づけるためには、分泌シグナル配列（又は、シグナル配列、リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）が、発現ベクターに供給される。分泌シグナル配列は、ｚｃｙｔｏｒ１７の配列であり得、又はもう１つの分泌されたタンパク質（例えばｔ−ＰＡ ）に由来し、又は新たに合成され得る。分泌シグナル配列は、ｚｃｙｔｏｒ１７ ＤＮＡ配列に作用可能に連結され、すなわち２つの配列は正しく読み取り枠を整合して連結され、そして宿主細胞の分泌経路中に新しく合成されたポリヌクレオチドを方向づけるように配置される。分泌シグナル配列は通常、興味あるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’ 側に位置するが、但し一定の分泌シグナル配列は、興味あるＤＮＡ配列の他の場所に位置することもできる（例えば、Ｗｅｌｃｈなど．，アメリカ特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄなど．， アメリカ特許第５，１４３，８３０号を参照のこと）。
【０１３９】
他方では、本発明のポリペプチドに含まれる分泌シグナル配列は、分泌路中に他のポリペプチドを方向づけるために使用される。本発明はそのような融合ポリペプチドを提供する。シグナル融合ポリペプチドが製造され得、ここで配列番号２及び４６のアミノ酸１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸１９（Ａｌａ）又は配列番号５４のアミノ酸１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸３２（Ａｌａ）又は配列番号５７又は９３のアミノ酸２８（Ｍｅｔ）〜アミノ酸４５（Ａｌａ）に由来する分泌シグナル配列が当業界において知られている方法及び本明細書に開示される方法を用いて、もう１つのポリペプチドに作用可能に連結されている。
【０１４０】
本発明の融合ポリペプチドに含まれる分泌シグナル配列は好ましくは、分泌路中い追加のペプチドを方向づけるためにその追加のペプチドにアミノ末端的に融合される。そのような構造体は、当業界において知られている多くの用途を有する。例えば、それらの新規の分泌シグナル配列融合構造体は通常分泌されないタンパク質の活性成分の分泌を方向づけることができる。そのような融合は、分泌路を通してペプチドを方向づけるためにインビボ又はインビトロで使用され得る。
【０１４１】
培養された哺乳類細胞または、本発明内の適切な宿主である。外因性ＤＮＡを 、哺乳類宿主細胞中に導入するための方法は、リン酸カルシュウム−仲介トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒなど．， Ｃｅｌｌ １４ ： ７２５， １９７８； Ｃｏｒｓａｒｏ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７ ：６０３， １９８１； Ｇｒａｈａｍ など．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２； ４５６， １９７３），エレクトロポレーション（ Ｎｅｕｍａｎｎ など．， ＥＭＢＯ Ｊ． １： ８４１−８４５， １９８２ ）； ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション（Ａｕｓｕｂｅｌ など．， 前記）、及びリポソーム−仲介トランスフェクション（Ｈａｗｌｅｙ −Ｎｅｌｓｏｎ など．， Ｆｏｃｕｓ １５： ７３， １９９３； Ｃｉｃｃａｒｏｎｅ　など．，Ｆｏｃｕｓ １５： ８０， １９９３ ）を包含する。
【０１４２】
培養された哺乳類細胞における組換えポリペプチドの生成は、例えばｌｅｖｉｎｓｏｎ など．， アメリカ特許第４，７１３，３３９ 号； Ｈａｇｅｎ など．， アメリカ特許第４，７８４，９５０ 号； Ｐａｌｍｉｔｅｒ など．， アメリカ特許第 ４，５７９，８２１ 号； 及びＲｉｎｇｏｌｄ， アメリカ特許第 ４，６５６，１３４ 号により開示される。培養された適切な哺乳類細胞は、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １６５）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １６５１）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １６３２）、ＢＨＫ ５７０ （ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １０３１４ ）、２９３（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １５７３ ； Ｇｒａｈａｍ など．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏ． ３６： ５９−７２， １９７７ ）、及びチャイニーズ　ハムスター卵巣（例えば　ＣＨＯ−Ｋ１； ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＣＬ６１ ）細胞系を包含する。
【０１４３】
追加の適切な細胞系は当業界において知られており、そして公的な寄託所、例えば Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手できる。一般的に、強い転写プロモーター、例えばＳＶ−４０ 又はサイトメガロウィルスからのプロモーターが好ましい。例えば、アメリカ特許第４，９５６，２８８ 号を参照のこと。他の適切なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子からのプロモーター（アメリカ特許 ４，５７９，８２１ 号及び第 ４，６０１，９７８ 号）、アデノウィルス主要後期プロモーターを包含する。
【０１４４】
薬物選択は一般的に、外来性ＤＮＡが挿入されている、培養された哺乳類細胞を選択するために使用される。そのような細胞は通常、“トランスフェクタント”として言及される。選択剤の存在下で培養され、そしてそれらの子孫に興味ある遺伝子を伝達することができる細胞は、“適切なトランスフェクタント”として言及される。好ましい選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。選択は、ネオマイシン型薬物、例えばＧ−４１８又は同様のもの存在下で実施される。“増幅”として言及される方法である選択システムは、興味ある遺伝子の発現レベルを高めるためにも使用される。
【０１４５】
増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトランスフェクタントを培養し、そして次に、導入された遺伝子の生成物を高レベルで生成する細胞を選択するために選択剤の量を高めることによって実施される。好ましい増幅可能選択マーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼである。他の耐薬物性遺伝子（例えば、ヒグロマイシン耐性、複数薬物耐性、ピューロマイシン　アセチルトランスフェラーゼ）もまた、使用され得る。変更された表現型を導入する他のマーカー、例えば緑色蛍光タンパク質、又は細胞表面タンパク質、例えばＣＤ４，　ＣＤ８，クラスＩ　ＭＨＣ、胎盤アルカリホスファターゼが、ＦＡＣＳ分類又は磁気ビース分離技法のような手段により、トランスフェクトされていない細胞とトランスフェクトされた細胞とを分類するために使用され得る。
【０１４６】
他の高等真核細胞、例えば昆虫細胞、植物細胞及び鳥類細胞もまた、宿主として使用され得る。植物細胞において遺伝子を発現するためのベクターとしてのアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ ）の使用は、Ｓｉｎｋａｒなど．、Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． （ Ｂａｎｇａｌｏｒｅ ） １１： ４７−５８， １９８７ により再考されている。昆虫細胞の形質転換、及びそこにおける外来性ポリペプチドの生成は、Ｇｕａｒｉｎｏ など．，アメリカ特許第５，１６２，２２２号；及びＷＩＰＯ公開ＷＯ９４／０６４６３号により公開される。
【０１４７】
昆虫細胞は、オートグラファ・カリホルニカ（ Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ）核多角体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）に通常由来する組換えバキュロウィルスにより感染され得る。Ｋｉｎｇ， Ｌ． Ａ． ａｎｄ Ｐｏｓｓｅｅ， Ｒ．Ｄ．， Ｔｈｅ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｏｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ； Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ， Ｄ． Ｒ． ．， Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．， １９９４； 及びＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ｃ． Ｄ．， Ｅｄ．， Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， １９９５を参照のこと。組換えｚｃｙｔｏｒ１７バキュロウィルスを製造するための第２の方法は、Ｌｕｃｋｏｗ （ Ｌｕｃｋｏｗ， ＶＡ， など．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ６７： ４５６６−７９， １９９３ ） により記載されるトランスポゾンに基づくシステムを利用する。
【０１４８】
トランスファーベクターを利用するこのシステムは、Ｂａｃ−ｔｏ−ＢａｃＴＭキット（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，　ＭＤ）として市販されている。このシステムは、“ｂａｃｍｉｄ”　と呼ばれる大きなプラスミドとして、Ｅ．コリに維持されるバキュロウィルスゲノム中に、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドをコードするＤＮＡを移動せしめるために、Ｔｎ７トランスポゾンを含むトランスファーベクター、ｐＦａｓｔＢａｃＩ ＴＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ）を利用する。Ｈｉｌｌ−Ｐｅｒｋｉｎｓ， Ｍ．Ｓ． ａｎｄ Ｐｏｓｓｅｅ， Ｒ．Ｄ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７１： ９７１−６， １９９０； Ｂｏｎｎｉｎｇ， Ｂ．Ｃ． など．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７５： １５５１−６， １９９４； 及びＣｈａｚｅｎｂａｌｋ， Ｇ． Ｄ．， ａｎｄ　Ｒａｐｏｐｏｒｔ， Ｂ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７０： １５４３−９，１９９５ を参照のこと。
【０１４９】
さらに、トランスファーベクターは発現されたｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドのＣ−又はＮ−末端でエピトープ標識、例えばＧｌｕ−Ｇｌｕ　エピトープ標識をコードするＤＮＡとのイン−フレーム融合体を含むことができる（Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒ， Ｔ． など．， Ｐｅｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８２： ７９５２−６， １９８５）。当業界において知られている技法を用いて、ｚｃｙｔｏｒ１７を含むトランスファーベクターにより、Ｅ．コリが形質転換され、そして組換えバキュロウィルスの表示である断続的ｌａｃＺ遺伝子を含むｂａｃｍｉｄａ についてスクリーンされる。組換えバキュロウィルスゲノムを含むｂａｃｍｉｄ ＤＮＡ が、通常の技法を用いて単離され、そしてスポドプテラ・フルギペルダ（ Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ）細胞、例えばＳｆ９ 細胞をトランスフェクトするために使用される。ｚｃｙｔｏｒ１７を発現する組換えウィルスが結果的に生成される。組換えウィルス　ストックは、当業者において通常使用される方法により製造される。
【０１５０】
組換えウィルスは、宿主細胞、典型的には、アワヨトウの幼虫、スポドプテラ・フルギペルダに由来する細胞系を感染せしめるために使用される。一般的には、Ｇｌｉｃｋ ａｎｄ Ｐａｓｔｅｒｎａｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， ＡＳＭ Ｐｒｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．， １９９４を参照のこと。もう１つの適切な細胞系は、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）に由来するＨｉｇｈ ＦｉｖｅＯＴＭ細胞系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である（アメリカ特許第５，３００，４３５号）。市販の血清フリー培地が、細胞を増殖し、そして維持するために使用される。
【０１５１】
適切な培地は、Ｓｆ９細胞のためには、ＳＦ９００ＩＩＴＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），又はＥＳＴ　９２１ＴＭ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）； 及びＴ． ｎｉ 細胞のためには、Ｅｘ−ＣｅｌｌＯ４０５ＴＭ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌｅｎｚａ， ＫＳ）又はＥｘｐｒｅｓｓ ＦｉｖｅＯＴＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ）である。使用される方法は一般的に、入手できる実験用マニュアルに記載されている（Ｋｉｎｇ， Ｌ． Ａ． ａｎｄ Ｐｏｓｓｅｅ， Ｒ． Ｄ．， 前記； Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ， Ｄ． Ｒ． など．， 前記；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ｃ． Ｄ．， 前記）。上清液からのｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドの続く精製は、本明細書に記載される方法を用いて達成され得る。
【０１５２】
菌類細胞、例えば酵母細胞はまた、本発明内で使用され得る。これに関して、特に興味ある酵母種は、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）， ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びピチア・メタノリカ（ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ） を包含する。外因性ＤＮＡによりＳ．　セレビシアエ細胞を形質転換し、そしてそれから組換えポリペプチドを生成するための方法は、例えばＫａｗａｓａｋｉ， アメリカ特許第４，５９９，３１１号；Ｋａｗａｓａｋｉ など．， アメリカ特許第４，９３１，３７３号；Ｂｒａｋｅ， アメリカ特許第４，８７０，００８号；Ｗｅｌｃｈなど．， アメリカ特許第５，０３７，７４３号；及びＭｕｒｒａｙ など．， アメリカ特許第４，８４５，０７５号により開示される。形質転換された細胞は、選択マーカー、通常、耐薬物性、又は、特定の栄養物（例えばロイシン）の不在下で増殖する能力により決定される表現型により選択される。
【０１５３】
サッカロミセス・セレビシアエへの使用のための好ましいベクターシステムは、グルコース含有培地における増殖により形質転換された細胞の選択を可能にする、Ｋａｗａｓａｋｉ など． （アメリカ特許第４，９３１，３７３号）により開示されるＰＯＴ１ベクターシステムである。酵母への使用のための適切なプロモーター及びターミネーターは、解糖酵素遺伝子（例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ， アメリカ特許第４，５９９，３１１号；Ｋｉｎｇｓｍａｎなど．， アメリカ特許第４，６１５，９７４号；及びＢｉｔｔｅｒ， アメリカ特許第４，９７７，０９２ 号を参照のこと）及びアルコール　デヒドロゲナーゼ遺伝子からのものを包含する。また、アメリカ特許第４，９９０，４４６ 号；第５，０６３，１５４号；第５，１３９，９３６ 号；及び第４，６６１，４５４号を参照のこと。
【０１５４】
他の酵素、例えばハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（ Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ）、クルイベリミセス・ラクチス（ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ）、クルイベリミセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ ）、ウスチラゴ・マイジス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ ）、ピチア・パストリス（ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア・グイレルモンジ（ Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ ）、及びカンジタ・マルトサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ ）のための形質転換システムは、当業界において知られている。
【０１５５】
例えば、Ｇｌｅｅｓｏｎ など．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １３２： ３４５９−３４６５， １９８６ 及びＣｒｅｇｇ， アメリカ特許第４，８８２，２７９ 号を参照のこと。アスペルギラス細胞は、Ｍｃｋｎｉｇｈｔ など．，アメリカ特許第４，９３５，３４９号の方法に従って使用され得る。アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）を形質転換するための方法は、Ｓｕｍｉｎｏ ．， アメリカ特許第５，１６２，２２８号により開示される。ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）を形質転換するための方法は、Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ， アメリカ特許第４，４８６，５３３号により開示される。
【０１５６】
組換えタンパク質の生成のための宿主としてのピチア・メタノリカの使用は、ＷＩＰＯ公開ＷＯ９７／１７４５０， ＷＯ９７／１７４５１、ＷＯ９８／０２５３６及びＷＯ９８／０２５６５に開示される。Ｐ．メタノリカの形質転換に使用するためのＤＮＡ分子は通常、形質転換の前、好ましくは線状化される、二本鎖の環状プラスミドとして調製されるであろう。Ｐ．メタノリカにおけるポリペプチド生成のためには、プラスミドにおけるプロモーター及びターミネーターは、Ｐ．メタノリカ遺伝子、例えばＰ．メタノリカ　アルコール利用遺伝子（ＡＵＧ１又はＡＵＧ２）のものであることが好ましい。他の有用なプロモーターは、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＨＡＳ）、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＭＤ）、及びカタラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子のものを包含する。
【０１５７】
宿主染色体中へのＤＮＡの組み込みを促進するためには、宿主ＤＮＡ配列を両端に有するプラスミドの完全な発現セグメントを有することが好ましい。ピチア　メタノリカへの使用のための好ましい選択マーカーは、アデニンの不在下でａｄｅ２宿主細胞の増殖を可能にする、ホスホリボシル−５−アミノイミダゾールカルボキシラーゼ（ＡＩＲＣ； ＥＣ． ４．１．１．２１）をコードするＰ．メタノリカＡＤＥ２遺伝子である。メタノールの使用を最少にすることが所望される大規模産業方法のためには、両メタノール利用遺伝子（ＡＵＧ１及びＡＵＧ２）が欠失されている宿主細胞を使用することが好ましい。
【０１５８】
分泌されたタンパク質の生成のためには、液胞プロテアーゼ遺伝子（ＰＥＰ４及びＰＲＢ１）を欠いている宿主細胞が好ましい。エレクトロポレーションが、Ｐ．メタノリカ細胞中への、興味あるポリペプチドをコードするＤＮＡを含むプラスミドの導入を促進するために使用される。２．５〜４．５ｋＶ／ｃｍ，好ましくは約３．７５ｋＶ／ｃｍの電場の強さ、及び１〜４０ｍ秒、最も好ましくは約２０ｍ秒の時定数（ｔ）を有する、指数的に減衰する、パルスされた電場を用いて、エレクトロポレーションによりＰ．メタノリカ細胞を形質転換することが好ましい。
【０１５９】
原核宿主細胞、例えば細菌Ｅ．コリ、バシラス及び他の属の菌株はまた、本発明において有用な宿主細胞である。それらの宿主を形質転換し、そしてそこにクローン化される外来性ＤＮＡ配列を発現するための技法は、当業界において良く知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．， 前記を参照のこと）。細菌、例えばＥ．コリにおいてｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドを発現する場合、そのポリペプチドは、典型的には不溶性顆粒として細胞質に保持され得、又は細菌の分泌配列により細胞周辺腔に向けられ得る。
【０１６０】
前者の場合、細胞は溶解され、そして顆粒が回収され、そして例えばグアニジンイソチオシアネート又はウレアを用いて変性される。次に、変性されたポリペプチドが再生され、そして例えばウレア、及び還元された及び酸化されたグルタチオンの組み合わせの溶液に対する透析、続く緩衝溶液に対する透析により、前記変成体を希釈することによってニ量体化され得る。後者の場合、ポリペプチドは、細胞周辺腔の内容物を開放するために細胞を破壊し（例えば、音波処理又は浸透ショックにより）、そしてタンパク質を回収することによって、細胞周辺腔から可溶性及び機能性形で回収され、それにより、変性及び再生のための必要性を回避することができる。
【０１６１】
形質転換され又はトランスフェクトされた宿主細胞は、選択された宿主細胞の増殖のために必要とされる栄養物及び他の成分を含む培養培地において、従来の方法に従って培養される。種々の適切な培地、例えば定義された培地及び複合培地は、当業界において知られており、そして一般的には、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン及び鉱物を含む。培地はまた、必要とされる場合、成長因子又は血清のような成分も含むことができる。
【０１６２】
増殖培地は一般的に、外因的に付加されたＤＮＡを含む細胞を、例えば発現ベクター上に担持される選択マーカーにより補足され、又は宿主細胞中に同時トランスフェクトされる必須栄養物における薬物選択又は栄養欠乏により選択するであろう。Ｐ．メタノリカ細胞は適切な炭素源、窒素源及び微量栄養物を含んでなる培地において、約２５℃〜３５℃の温度で培養される。液体培養物は、従来の手段、例えば小さなフラスコの振盪又は発酵器のスパージングにより十分なエアレーションを提供される。Ｐ．メタノリカのための好ましい培養培地は、ＹＥＰＤ（２％Ｄ−グルコース、２％のＢａｃｔｏＴＭペプトン（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｄｅｔｒｏｉｔ， ＭＩ）， １％のＢａｃｔｏＴＭ　酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）， ０．００４％のアデニン及び０．００６％のＬ−ロイシン）である。
【０１６３】
本発明の１つの観点においては、ｚｃｙｔｏｒ１７サイトカイン受容体（例えば、トランスメンブラン及び細胞内ドメイン）は、培養された細胞により生成され、そして細胞は、受容体のためのリガンド、例えば天然のリガンド、及び天然のリガンドのアゴニスト及びアンタゴニストについてスクリーンするために使用される。このアプローチを要約すると、受容体をコードするｃＤＮＡ又は遺伝子がその発現のために必要とされる他の遺伝子要素（例えば、転写プロモーター）と組合され、そしてその得られる発現ベクターが宿主細胞中に挿入される。ＤＮＡを発現し、そして機能的受容体を生成する細胞が選択され、そして種々のスクリーニングシステム内に使用される。
【０１６４】
本発明の新規受容体の発現及び受容体−介在性シグナルのトランスダクションへの使用のために適切な哺乳類細胞は、β−サブユニット、例えばｇｐ１３０を発現する細胞、及びｇｐ１３０及びＬＩＦ受容体を同時発現する細胞を包含する（Ｇｅａｒｉｎｇなど．， ＥＭＢＯ． Ｊ． １０：２８３９−２８４８， １９９１； Ｇｅａｒｉｎｇ など．， アメリカ特許第５，２８４，７５５号）。これに関して、同じサブファミリーにおける受容体、例えばＩＬ−６又はＬＩＦに結合する他のサイトカインに対して応答性である細胞を使用することが一般的に好ましい。なぜならば、そのような細胞は必要なシグナルトランスダクション経路を含むであろうからである。
【０１６５】
このタイプの好ましい細胞は、ヒトＴＦ−１細胞系（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２００３）及びＤＡ−１細胞系を包含する（Ｂｒａｎｃｈなど．， Ｂｌｏｏｄ ６９： １７８２， １９８７； Ｂｒｏｕｄｙ など．， Ｂｌｏｏｄ ７５； １６２２−１６２６， １９９０）。他方では、適切な宿主細胞は、所望する細胞応答のために必要とされるβ−サブユニット又は他の細胞成分を生成するために構築され得る。例えば、ネズミ細胞系ＢａＦ３ （Ｐａｌａｃｉｏｓ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ， Ｃｅｌｌ ４１： ７２７−７３４， １９８５； Ｍａｔｈｅｙ− Ｐｒｅｖｏｔなど．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ６： ４１３３−４１３５， １９８６），　子供ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞系、又はＣＴＬＬ−２細胞系（ＡＴＴＣ ＴＩＢ−２１４）が、マウスｇｐ１３０サブユニット、又はマウスｇｐ１３０及びＬＩＦ受容体、並びにｚｃｙｔｏｒ１７発現するためにトランスフェクトされ得る。
【０１６６】
同じ種からの宿主細胞及び受容体を使用することが一般的に好ましいが、しかしながら、このアプローチは、いずれかの種からの多数の受容体サブユニットを発現するための細胞系の構築を可能にし、それにより、種特異性から生じる可能性ある制限を克服する。他方では、マスス受容体ｃＤＮＡの種相同体、例えばＢａＦ３細胞系におけるマウスｃＤＮＡが、同じ種からの細胞系内でクローン化され、そしてその細胞内で使用され得る。従って、１つの造血成長因子、例えばＩＬ−３に依存する細胞系が、ｚｃｙｔｏｒ１７リガンド、又は抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体に依存性になるように構築され得る。
【０１６７】
機能的ｚｃｙｔｏｒ１７を発現する細胞が、スクリーニングアッセイ内に使用される。種々の適切なアッセイは、当業界において良く知られている。それらのアッセイは、標的細胞における生物学的反応の検出に依存する。１つのそのようなアッセイは、細胞増殖アッセイである。細胞は、試験化合物の存在又は不在下で培養され、そして細胞増殖は、例えばトリチウム化されたチミジンの組み込みを測定することにより、又はＡｌｙｍａｒ ＢｌｕｅＴＭ （ＡｃｃｕＭｅｄ， Ｃｈｉｃａｇｏ， ＩＬ） 又は３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）（Ｍｏｓｍａｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ６５： ５５−６３， １９８３）の代謝性分解に基づく比色分析により検出される。
【０１６８】
他のアッセイ型は、レポーター遺伝子を発現するよう、さらに構築される細胞を用いる。レポーター遺伝子は、レポーター−連結経路に応答するプロモーター要素に連結され、そしてアッセイは、レポーター遺伝子の転写の活性化を検出する。これに関しての好ましいプロモーター要素は、血清応答要素、ＳＴＡＴ又はＳＲＥである（例えば、Ｓｈａｗなど．， Ｃｅｌｌ ５６３−５７２， １９８９を参照のこと）。好ましいそのようなレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子である（ｄｅ Ｗｅｔなど．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７： １９８７）。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、当業界において知られている方法を用いて発光により検出される（Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９： １９０９４−２９１０１， １９９４； Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ ａｎｄ Ｇｏｉｆｆｉｎ， Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎｏｔｅｓ ４１； １１， １９９３）。
【０１６９】
ルシフェラーゼアッセイキットは、例えばＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩから市販されている。この型の標的細胞系は、化学物質、細胞−ならし培養培地、菌類ブイヨン、土壌サンプル、水サンプル及び同様のもののライブラリーをスクリーンするために使用され得る。例えば、細胞−又は組織−ならし培地サンプルのバンクが、リガンドを生成する細胞を同定するために標的細胞に対してアッセイされ得る。
【０１７０】
次に、陽性細胞が、プールに分けられ、宿主細胞中にトランスフェクトされ、そして発現される、哺乳類細胞発現ベクターにおいてｃＤＮＡライブラリーを生成するために使用される。次にトランスフェクトされた細胞からの培地サンプルがアッセイされ、続くプールの分割、トランスフェクション、継代培養、及び陽性細胞の再アッセイが伴ない、リガンドを発現するクローン細胞系が単離され得る。腎臓、肝臓、膵臓、胸腺、他のリンパ組織により条件付けされた培地サンプルが、スクリーニング方法への使用のためのリガンドの好ましい源である。
【０１７１】
ｚｃｙｔｏｒ１７のための天然のリガンドはまた、ｚｃｙｔｏｒ１７を発現するサイトカイン−依存性細胞系を突然変異誘発し、そしてそれを、オートクライン増殖について選択する条件下で培養することによって同定され得る。ＷＩＰＯ公開ＷＯ９５／２１９３０号を参照のこと。典型的な方法においては、ｚｃｙｔｏｒ１７を発現する細胞が、例えばＥＭＳにより突然変異誘発される。次に、細胞が、必要とされるサイトカインの存在下で回収され、次に、サイトカインを欠いている培養培地にトランスファーされる。
【０１７２】
生存細胞が、リガンドに対して競争するために、可溶性受容体ポリペプチドを、本明細書に記載されるｚｃｙｔｏｒ１７サイトカイン−結合ドメインを含んで成る培養培地に添加することにより、又はｚｃｙｔｏｒ１７受容体を発現するトランスフェクトされた細胞に比較して、野生型細胞に基づくならし培地をアッセイすることにより、ｚｃｙｔｏｒ１７のためのリガンドの生成についてスクリーンされる。この方法に使用するための好ましい細胞系は、ｇｐ１３０又は、ＩＦ受容体と組合してｇｐ１３０を発現するためにトランスフェクトされる細胞を包含する。好ましいそのような宿主細胞系は、トランスフェクトされたＣＴＬＬ−２細胞（Ｇｉｌｉｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｎａｔｕｒｅ ２６８： １５４−１５６， １９７７）及びトランスフェクトされたＢａＦ３細胞を包含する。
【０１７３】
さらに、ｚｃｙｔｏｒ１７可溶性受容体ポリペプチドを使用する分泌トラップ方法は、ｚｃｙｔｏｒ１７リガンドを単離するために使用され得る（Ａｌｄｒｉｃｈ， など．， Ｃｅｌｌ ８７： １１６１−１１６９， １９９６）。既知の又は疑わしいリガンド源から調製されたｃＤＮＡ発現ライブラリーが、ＣＯＳ−７細胞中にトランスフェクトされる。ｃＤＮＡライブラリーベクターは一般的に、ＣＯＳ−７細胞における増殖のためのＳＶ４０起点、及び高い発現のためのＣＭＶプロモーターを有する。トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞は、単層において増殖され、そして次に固定され、そして浸透せしめられる。
【０１７４】
次に、本明細書に記載される、標的化されているか、又はビオチン−ラベルされたｚｃｙｔｏｒ１７可溶性受容体が、細胞像と接触して配置され、そして抗−相補的分子、すなわちｚｃｙｔｏｒ１７リガンドを発現する、単層における細胞の結合を可能にされる。従って、リガンドを発現する細胞が、受容体分子により結合されるであろう。ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）により接合される抗−標的抗体（Ｉｇ融合体のための抗−Ｉｇ、ＦＬＡＧ−標的化された融合体のためのＭ２又は抗−ＦＬＡＧ、 ストレプタビジン及び同様のもの）は、標的化されているか、又はビオチン−ラベルされたｚｃｙｔｏｒ１７可溶性受容体が結合しているそれらの細胞を可視化するために使用される。
【０１７５】
ＨＲＰは、チラミド試薬、例えばチラミド−ＦＩＴＣの付着を触媒する。市販のキットが、この検出のために使用され得る（Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ ＴＳＡ−ＤｉｒｅｃｔＴＭ Ｋｉｔ； ＮＥＮ Ｌｉｆｅ ＳｃｉｅｎｃｅＰｒｏｄｕｃｔｓ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ）。ｚｃｙｔｏｒ１７受容体リガンドを発現する細胞は、緑色の細胞として蛍光顕微鏡下で同定され、そしてＡｌｄｒｉｃｈ，など．， 前記に概略されるように、プラスミド救助のための方法を用いてのリガンドの続くクローニング、クローンが同定されるまでの続くラウンドの分泌トラップアッセイのために採取されるであろう。
【０１７６】
受容体として、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドの活性は、受容体結合及び続く生理学的細胞応答に関連する細胞外酸性化速度又はプロトン排泄を測定する珪素基材のバイオセンサーマイクロフィジオメーターにより測定され得る。典型的な装置は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡにより製造されるＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒＴＭ Ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒである。種々の細胞応答、たとえば細胞増殖、イオン輸送、エネルギー生成、炎症応答、調節及び受容体活性化及び同様のものが、この方法により測定され得る。例えば、ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ， Ｈ．Ｍ． など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７： １９０５−１９１２， １９９２； Ｐｉｔｃｈｆｏｒｄ， Ｓ． など．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２２８： ８４−１０８， １９９７； Ａｒｉｍｉｌｌｉ， Ｓ． など．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ２１２： ４９−５９， １９９８； Ｖａｎ Ｌｉｅｆｄｅ， Ｉ． など．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３４６： ８７−９５， １９９８を参照のこと。
【０１７７】
マイクロフィジオメーターは、付着性又は非付着性真核又は原核細胞をアッセイするために使用され得る。時間にわたって細胞培地における細胞外酸性化の変化を測定することによって、マイクロフィジオメーターは、種々の刺激、例えばｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストに対する細胞応答を直接的に測定する。好ましくは、マイクロフィジオメーターは、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドを発現しない対照の真核細胞に比較して、ｚｃｙｔｏｒ１７−発現性真核細胞の応答を測定するために使用される。ｚｃｙｔｏｒ１７−発現性真核細胞は、ｚｃｙｔｏｒ１７−調整刺激に対して応答性である細胞を創造するか、又は天然において発現性のｚｃｙｔｏｒ１７細胞、例えばリンパ球、膵臓、胸腺組織、又はＰＢＬに由来するｚｃｙｔｏｒ１７−発現性細胞である細胞を創造する、本明細書に記載されるように、アデノウィルスベクターを通して、ｚｃｙｔｏｒ１７がトランスフェクトされているか、又は感染されている細胞を包含する。
【０１７８】
対照に比較して、マウスｚｃｙｔｏｒ１０を発現する細胞の応答における細胞外酸性化の上昇又は低下により測定される差異が、ｚｃｙｔｏｒ１７−調節された細胞応答の直接的に測定である。さらに、そのようなｚｃｙｔｏｒ１７−調節された応答は、種々の刺激下でアッセイされ得る。また、マイクロフィジオメーターを用いれば、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドを発現する細胞を供給し、前記細胞の第１部分を試験化合物の不在下で培養し、前記細胞の第２部分を試験化合物の存在下で培養し、そして前記細胞の第１部分に比較して、前記細胞の第２部分の細胞応答の上昇又は低下の変化を検出することを含んでなる、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストを同定するための方法が提供される。ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドのためのアンタゴニスト及びアゴニストは、この方法を用いて急速に同定され得る。
【０１７９】
本発明により提供される追加のアッセイは、ハイブリッド受容体ポリペプチドの使用を包含する。それらのハイブリッドポリペプチドは、２種の一般的なクラスに分けられる。第１のクラスにおいては、配列番号２の残基５４４（Ｌｙｓ）〜７３２（Ｖａｌ）、配列番号４６の残基５４４（Ｌｙｓ）〜６４９（Ｉｌｅ）、配列番号５４の残基５５７（Ｌｙｓ）〜６６２（Ｉｌｅ）又は配列番号５７の残基５５１（Ｌｙｓ）〜６６２（Ｃｙｓ）を含んで成るｚｃｙｔｏｒ１７の細胞内ドメインは、第２受容体のリガンド−結合ドメインに連結される。好ましくは、第２受容体は造血サイトカイン受容体、例えばｍｐｌ受容体である（Ｓｏｕｙｒｉなど．， Ｃｅｌｌ ６３： １１３７−１１４７， １９９０）。ハイブリッド受容体はさらに、いずれかの受容体に由来するトランスメンブランドメインを含んで成るであろう。
【０１８０】
次に、ハイブリッド受容体をコードするＤＮＡ構造体が宿主細胞中に挿入される。ハイブリッド受容体を発現する細胞が、結合ドメインのためのリガンドの存在下で培養され、そして応答についてアッセイされる。このシステムは、容易に入手できるリガンドを用いて、ｚｃｙｔｏｒ１７により介在されるシグナルトランスダクションを分析するための手段を提供する。このシステムはまた、特定の細胞系がｚｃｙｔｏｒ１７により形質導入されたシグナルに応答できるかどうかを決定するためにも使用され得る。
【０１８１】
第２クラスのハイブリッド受容体ポリペプチドは、第２受容体、好ましくはサイトカイン受容体の細胞質ドメイン及びトランスメンブランドメインと共に、ｚｃｙｔｏｒ１７の細胞外（リガンド結合）ドメイン（配列番号２及び４６の残基２０（Ａｌａ）〜５１９（Ｇｌｕ）；配列番号５４の残基３３（Ａｌａ）〜５３２（Ｇｌｕ））又はサイトカイン−結合ドメイン（配列番号２及び４６の残基２０（Ａｌａ）〜２２７（Ｐｒｏ）；又は配列番号５４の残基３３（Ａｌａ）〜２４０（Ｐｒｏ）；配列番号５７の残基４６（Ｖａｌ）〜５３３（Ｇｌｕ）；又は配列番号９３の残基４６（Ｖａｌ）〜５３３（Ｔｒｐ））を含んで成る。
【０１８２】
トランスメンブランドメインは、いずれかの受容体に由来することができる。この第２クラスのハイブリッド受容体は、第２受容体により形質導入されるシグナルに応答することが知らされている細胞において発現される。それらの２種のハイブリッド受容体は、受容体に基づいくアッセイシステム内での広範囲の細胞型の使用を可能にする。
【０１８３】
次に、ｚｃｙｔｏｒ１７のためのリガンドを発現することが見出された細胞が、リガンド−コードのｃＤＮＡが上記に開示されるように単離され得るｃＤＮＡライブラリーを調製するために使用される。従って、本発明は、新規受容体ポリペプチドの他に、受容体のためのポリペプチドリガンドをクローニングするための方法を提供する。
【０１８４】
ｚｃｙｔｏｒ１７構造及び組織発現は、初期造血又は胸腺細胞発生及び免疫応答調節又は炎症において役割を演じることができる。それらの工程は、１又は複数のサイトカインのそれらの同種受容体への結合に応答しての細胞増殖及び分化の刺激を包含する。この受容体に関して観察される組織分布の観点から、アゴニスト（天然のリガンドを包含する）及びアンタゴニストは、インビトロ及びインビボ用途において莫大な可能性を有する。
【０１８５】
受容体アゴニストに同定される化合物は、インビトロ及びインビボで、標的細胞の増殖及び進化を刺激するために有用である。例えば、アゴニスト化合物又は抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体は、定義された細胞培養培地の成分として有用であり、そして細胞培養において通常使用される血清を置換するために、単独で又は他のサイトカイン及びホルモンと組合して使用され得る。従って、アゴニストは、Ｔ−細胞、Ｂ−細胞、及びリンパ球及び骨髄性系の他の細胞、及び培養における造血細胞の増殖及び／又は進化又は活性化を特別に促進することにおいて有用である。
【０１８６】
ｚｃｙｔｏｒ１７又は抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体及び結合パートナーのためのアゴニストリガンドは、細胞−介在性免疫性の刺激において、及びリンパ球増殖の刺激のために、例えば免疫抑制に関与する感染、例えば一定のウィルス感染の処理の研究への使用において有用である。追加の使用は、悪性形質転換が抗原性である腫瘍細胞をもたらす、腫瘍抑制のためのマウスモデルへの使用を包含する。アゴニストリガンド又は抗―ｚｃｙｔｏｒ１７抗体及び結合パートナーは、エフェクター細胞、例えばＴ−細胞、ＮＫ（天然のキラー）細胞又はＬＡＫ（リンパ性の活性化されたキラー）細胞の活性化を通して介在され得るか、又はアポプトシス経路を通して直接的に誘発され得る、細胞毒性を誘発するために使用され得る。
【０１８７】
アゴニストリガンド又は抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体及び結合パートナーはまた、影響された細胞型のレベルを高めることによって白血球減少の処理において、及び骨髄移植の後、Ｔ−細胞レパートリーの再生の増強のために、又は単球増殖又は活性化のために、及び本明細書に記載される診断および他の使用のために有用である。
【０１８８】
アンタゴニストリガンド、化合物又は抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体は、免疫型の抑制、例えば自己免疫疾患、例えばリュウマチ様関節炎、多発性硬化症、真性糖尿病、炎症性腫疾患、クローン病、等の処理に使用され得る。免疫抑制はまた、組織又は器官移植の拒絶を低めるために、及び影響された細胞型の増殖を阻害することによってＴ−細胞、Ｂ−細胞又は単球特異的白血病又はリンパ腫、及び他の免疫細胞癌を処理するためにも使用され得る。さらに、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリヌクレオチド、抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体及び結合パートナーが、単球を検出するために、及びそのような自己免疫疾患、特に単球が高められるか又は活性化される疾病状態の診断を助けるために使用され得る。
【０１８９】
ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドはまた、リガンドの循環レベルの検出のための診断システムにも使用され得る。関連する態様においては、ｚｃｙｔｏｒ１７受容体ポリペプチドに結合する抗体又は他の剤は、循環受容体ポリペプチドを検出するために使用され得る。ｚｃｙｔｏｒ１７は、配列番号１８及び２２に示される可溶性受容体形により示されるような可溶性受容体として天然において発現されると思われる。高められたレベルか又は低められたレベルのリガンド又は受容体ポリペプチドは、病理学的状態、例えば癌の表示であり得る。そのような受容体ポリペプチドは、病理学的工程に寄与し、そして基礎をなす疫病の間接的マーカーであり得る。
【０１９０】
例えば、ヒト血清における高められたレベルの可溶性ＩＬ−２は、広範囲の炎症及び腫瘍性状態、例えば心筋梗塞、ぜん息、重症筋無力症、リウマチ様関節炎、急性Ｔ−細胞白血病、Ｂ−細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、結腸癌、乳癌及び卵巣癌に関連している（Ｈｅａｎｅｙなど．， Ｂｌｏｏｄ８７：８４７−８５７，１９９６）。同様に、ｚｃｙｔｏｒ１７は、活性化された単球において高められ、そして従って、ｚｃｙｔｏｒ１７及び／又はその可溶性受容体は、炎症及びそれに関連する新生状態についてのマーカーにより結合されるか又はそれらとして作用することができる。
【０１９１】
ｚｃｙｔｏｒ１７受容体又は“可溶性受容体”のリガンド−結合ポリペプチドは、ｚｃｙｔｏｒ１７サイトカイン結合ドメイン（ヒト受容体配列番号２及び４６の残基２０（Ａｌａ）〜２２７（Ｐｒｏ）；又はヒト受容体配列番号５４の残基３３（Ａｌａ）〜２４０（Ｐｒｏ））、又は細胞外ドメイン（配列番号２及び４６の残基２０（Ａｌａ）〜５１９（Ｇｌｕ）；又は配列番号５４の残基３３（Ａｌａ）〜５３２（Ｇｌｕ））、又は非ヒト受容体のその対応する領域、例えば配列番号５７及び９３について記載されるその対応する領域をコードする切断されたＤＮＡを発現することによって調製され得る。好ましくは、細胞外ドメインは、トランスメンブラン及び細胞内ポリペプチドセグメントを実質的に有さない形で調製され得る。
【０１９２】
さらに、上記ｚｃｙｔｏｒ１７サイトカイン結合ドメイン内のリガンド−結合ポリペプチドフラグメントはまた、本明細書に記載される使用のためのｚｃｙｔｏｒ１７可溶性受容体として作用することができる。宿主細胞化らの受容体ポリペプチドの輸送を方向づけるためには、受容体ＤＮＡは、分泌ペプチド、例えばｔ−ＰＡ分泌ペプチド又はｚｃｙｔｏｒ１７分泌ペプチドをコードする第２ＤＮＡセグメントに結合される。分泌された受容体ポリペプチドの精製を促進するためには、Ｃ−末端延長、例えばポリ−ヒスチジン標識、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ標識ペプチド、物質Ｐ， ＦｌａｇＴＭ ペプチド（Ｈｏｐｐなど．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：１２０４−１２１０， １９８８； Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ， ＣＴから入手できる）、又は抗体又は他の特定の結合剤が利用できるもう１つのポリペプチド又はタンパク質が、受容体ポリペプチドに融合され得る。
【０１９３】
もう１つのアプローチにおいては、受容体細胞外ドメインは、２種の不変領域ドメインを含み、そして可変領域を欠いている、免疫グロブリン、Ｈ鎖不変領域、典型的には、Ｆｃフラグメント（例えば、Ｆｃ４）との融合体として発現され得る。そのような融合体は典型的には、マルチマー分子として分泌され、ここでＦｃ部分はお互いジスルフィド結合され、そして２種の受容体ポリペプチドがお互い密接に接近して整列されている。このタイプの融合体は、溶液から同種リガンドを親和性精製するために、インビトロアッセイ手段として、リガンドを特異的に滴定することによってインビボでシグナルを阻止するために、及び循環リガンドを結合し、そしてそれを循環から洗浄するために、それらを非経口投与することによってインビボでのアンタゴニストとして使用され得る。
【０１９４】
リガンドを精製するためには、ｚｃｙｔｏｒ１７−Ｉｇキメラが、リガンドを含むサンプル（例えば、細胞−ならし培地又は組織抽出物）に、受容体−リガンド結合を促進する条件（典型的には、生理学的に近い温度、ｐＨ及びイオン強度）下で添加される。次に、キメラ−リガンド複合体が、固体支持体（例えば、不溶性樹脂ビーズ）上に固定されているタンパク質Ａを用いて、混合物により分離される。次に、リガンドは、従来の化学的技法、例えば塩又はｐＨグラジエントを用いて溶出される。他方では、キメラ自体は、固体支持体に結合され、そして結合及び溶出は上記のようにして行われる。集められた画分は、所望する純度に達するまで、再分別され得る。
【０１９５】
さらに、ｚｃｙｔｏｒ１７可溶性受容体は、リガンドの存在が所望されない治療又は他の用途において、インビボ又はインビトロでリガンドを結合するために、“リガンドシンク（ｌｉｇａｎｄ ｓｉｎｋ）”、すなわちアンタゴニストとして使用され得る。例えば、多量の生物活性ｚｃｙｔｏｒ１７リガンドを発現する癌においては、ｚｃｙｔｏｒ１７可溶性受容体は、インビボで、リガンドの直接的なアンタゴニストとして使用され得、そして疾病に関連する進行及び病状の低下を助けることができる。さらに、ｚｃｙｔｏｒ１７可溶性受容体は、ｚｃｙｔｏｒ１７受容体を過剰発現する癌の進行を、それらの癌の増殖を増強するリガンドをインビボで結合することによって遅延するために使用され得る。ｚｃｙｔｏｒ１７可溶性受容体のための類似するインビトロ用途が、例えば、ｚｃｙｔｏｒ１７リガンドの不在下で増殖する細胞系を選択するために負の選択として使用され得る。
【０１９６】
さらに、ｚｃｙｔｏｒ１７可溶性受容体は、インビボで、又は組織サンプルにおいて、ｚｃｙｔｏｒ１７リガンド−発現性癌を検出するために、インビボで又は診断用途において使用され得る。例えば、ｚｃｙｔｏｒ１７可溶性受容体は、本明細書に記載されるような放射性ラベル又は蛍光ラベルに接合され得、そしてインビトロリガンド−受容体型結合アッセイ又は蛍光イメージングアッセイを用いて、組織サンプルにおけるリガンドの存在を検出するために使用され得る。さらに、放射性ラベルされたｚｃｙｔｏｒ１７可溶性受容体は、当業界において知られている放射性−イメージングを通して、リガンド発現性固形腫瘍を検出するために、インビボで投与され得る。
【０１９７】
本発明の分子は、免疫系の単級／マクロファージアームに特に使用される。たとえば、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）は、単核食細胞の有能な活性化因子である。インターフェロンγによるＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＴＩＢ−２０２）の活性化に基づいてのｚｃｙｔｏｒ１７の発現の上昇は、この受容体が単球活性化に包含されることを示唆する。単球は、それらが成熟し、そしてマクロファージによる種々の組織に移動する不完全に分化された細胞である。
【０１９８】
マクロファージは、リンパ球に対する抗原を提供することによって免疫応答における中心的役割を演じ、そして多くのサイトカインを分泌することによってリンパ球に対する補助細胞として補助的役割を演じる。マクロファージは、細胞外分子をインターナライズすることができ、そして活性化に基づいて、細胞内微生物及び腫瘍細胞を殺害する高められた能力を有する。活性化されたマクロファージはまた、急性又は局部炎症を刺激することにおいても包含される。さらに、単球−マクロファージ機能は、種々の疾病状態において異常であることが示されている。例えば、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， ＲＢ， Ｎｅｗ Ｅｎｇ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３１８： ７４７−７５２， １９９８を参照のこと。
【０１９９】
当業者は、ｚｃｙｔｏｒ１７のアゴニストが有用であることを認識するであろう。例えば、単球の抑制された移動が、感染の素因を有する集団、例えば新生児、コルチコステロイド又は他の免疫抑制治療を受ける患者、及び真生糖尿病、熱傷又はＡＩＤＳを有する患者において報告されている。ｚｃｙｔｏｒ１７のためのアゴニスト、例えば抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体及び結合パートナー、並びに天然のリガンドは、それらの集団において感染を移動し、そしてたぶん妨げる単球の能力の上昇をもたらすことができた。慢性肉芽腫の疾患を有する患者からの単核食細胞による食細胞性殺害の根深い欠陥がまた存在する。これは、皮下膿瘍、及び肝臓、肺、膵臓及びリンパ節における膿瘍の形成をもたらす。ｚｃｙｔｏｒ１７のアゴニスト、例えば抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体及び結合パートナー、並びに、天然のリガンドは、この食細胞欠陥を補正し、又は改良することができた。
【０２００】
さらに、欠陥性単球細胞毒性が、癌及びＷｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群（湿疹、血小板減少症及び再発性感染）を有する患者において報告されている。ｚｃｙｔｏｒ１７のアゴニスト、例えば抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体及び結合パートナー、並びに天然のリガンドによる単球の活性化は、それらの状態の処理を助けることができる。単球−マクロファージシステムは、いくつかの脂質−貯蔵疾患（スフィンゴリピドーシス）、例えばＧａｕｃｈｅｒ’ｓ病に優先的に包含される。感染に対する耐性は、ｚｃｙｔｏｒ１７に対するアゴニスト、例えば抗−ｚｃｙｔｏｒ１７及び結合パートナー、並びに天然のリガンドにより処理され得る、マクロファージ−機能の欠陥のために、低められ得る。
【０２０１】
さらに、当業者は、ｚｃｙｔｏｒ１７のアンタゴニストが有用であることを認識するであろう。例えばアテローム硬化症性病変においては、最初の異常性の１つは、内皮細胞への単球／マクロファージの局在化である。それらの病変は、ｚｃｙｔｏｒ１７に対するアンタゴニストの使用により妨げられ得る。抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体及び結合パートナーはまた、ｚｃｙｔｏｒ１７の天然のリガンドに対するアンタゴニストとしても使用され得る。
【０２０２】
さらに、単芽球性白血病は、マクロファージの生物学的生成物の開放に影響を及ぼす種々の臨床学的異常性により結合され、それらの例としては、血清及び尿における高レベルのリゾチーム及び高熱を包含する。さらに、そのような白血病は、単球細胞の異常上昇を示す。それらの結果は、たぶん、本明細書に記載されるような、ｚｃｙｔｏｒ１７に対するアンタゴニストにより妨げられる。さらに、抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体及び結合パートナーは、白血病単球細胞の殺害を方向づけるために、本明細書に記載されるようにして、分子、例えば毒性成分及びサイトカインに接合され得る。
【０２０３】
当業界において知られており、そして本明細書に開示される方法を用いて、当業者は、本明細書に開示される疾病状態、例えば炎症、癌又は感染、並びに単球細胞を包含する他の疾病状態におけるｚｃｙｔｏｒ１７アゴニスト及びアンタゴニストの活性を容易に評価することができた。さらに、ｚｃｙｔｏｒ１７が単級−特異的態様で発現され、そしてそれらの疾病が単球細胞の異常性、例えば細胞増殖、機能、局在化及び活性化を包含するので、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド及び抗体は、そのような単球細胞異常性を検出し、そして疾病の存在を示すための特徴として使用され得る。そのような方法は、患者から生物学的サンプル、例えば血液、唾液又は生検を取り、採取し、そしてそれと正常な対照サンプルとを比較することを包含する。
【０２０４】
組織学的、細胞学的、流動細胞計測性、生化学的及び他の方法が、ｚｃｙｔｏｒ１７の相対的レベル又は局在化、又はｚｃｙｔｏｒ１７を発現する細胞を測定するために使用され得、すなわち患者サンプルにおける単球が正常対照に比較される。対照と比較しての、ｚｃｙｔｏｒ１７発現のレベル（上昇又は下降）の変化、又は単球の数又は局在化の変化（例えば、それらが正常に存在しない組織における単球細胞の上昇又は浸潤）が、疾病の表示である。そのような診断方法はまた、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド又は抗体に結合される放射分析、蛍光及び比色標識の使用を包含することができる。そのような方法は、当業者において良く知られており、そして本明細書に開示される。
【０２０５】
ｚｃｙｔｏｒ１７活性を有するアミノ酸配列は、ｚｃｙｔｏｒ１７リガンドを結合し、そして従って、内因性ｚｃｙｔｏｒ１７受容体によるｚｃｙｔｏｒ１７リガンドの結合を妨げることによって免疫系を調節するために使用され得る。ｚｃｙｔｏｒ１７アンタゴニスト、例えば抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体はまた、内因性ｚｃｙｔｏｒ１７受容体によるｚｃｙｔｏｒ１７リガンドの結合を阻害することによって免疫系を調節するために使用され得る。
【０２０６】
従って、本発明は、適切な量のポリペプチドを欠いており、又は過剰のｚｃｙｔｏｒ１７リガンドを生成する対象へのｚｃｙｔｏｒ１７活性を有するタンパク質、ポリペプチド及びペプチド（例えば、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチド、ｚｃｙｔｏｒ１７類似体（例えば、抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗−イジオタイプ抗体）、及びｚｃｙｔｏｒ１７融合タイプ質）の使用を包含する。ｚｃｙｔｏｒ１７アンタゴニスト（例えば、抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体）はまた、過剰のｚｃｙｔｏｒ１７リガンド又はｚｃｙｔｏｒ１７のいずれかを生成する対象を処理するために使用され得る。適切な対象は、哺乳類、例えばヒトを包含する。
【０２０７】
ｚｃｙｔｏｒ１７は、単球細胞においてアップレギュレーションされることが示されており、そして炎症の調節に包含され得る。本発明のポリペプチドは、アッセイされ、そして炎症を改良するために使用され得るか、又は炎症のためのマーカーとして使用され得る。ｚｃｙｔｏｒ１７の前炎症及び抗炎症性質を決定するための方法は、当業界において知られており、そして本明細書に論じられる。さらに、それは、急性相反応体、例えば血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、α１−アンチキモトリプシン及びハプトグロビンの生成のアップ−レギュレーションに包含され得る。
【０２０８】
そしてｚｃｙｔｏｒ１７リガンドの発現は、炎症応答に関与するインビボでのリポ多糖（ＬＰＳ）の注入に基づいて高められ得る（Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒ， Ｌ． など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９７： １０１４４−１０１４９， ２０００）。急性相タンパク質、例えばＳＡＡの生成は、炎症が有益である短期生存機構であると思われるが、しかしながら、長い期間、急性相タンパク質の維持が、慢性炎症に寄与し、そしてヒト健康に対して有害であり得る。再考のためには、Ｕｈｌａｒ、Ｃｍ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ， ＡＳ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６５： ５０１−５２３， １９９９， 及びＢａｕｍａｎｎ Ｈ， ａｎｄ Ｇａｕｌｄｉｅ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １５： ７４−８０， １９９４を参照のこと。
【０２０９】
さらに、急性相タンパク質ＳＡＡは、いくつかの慢性炎症患者の病因に関係し、アテローム硬化症及びリウマチ様関節炎に関与し、そしてアミロイド症において沈着するアミロイドＡタンパク質への前駆体である（Ｕｈｌａｒ， ＣＭ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ， 前記）。従ってｚｃｙｔｏｒ１７のためのリガンドが、前炎症性分子として作用し、そしてＳＡＡの生成を誘発する場合、アンタゴニストが、炎症性疾患、及びリガンドにより誘発される急性相応答タンパク質に関連する他の疾病の処理において有用であろう。そのようなアンタゴニストが、本発明により提供される。
【０２１０】
例えば、炎症を減じるための方法は、炎症を低めるのに十分な量の、可溶性ｚｃｙｔｏｒ１７含有受容体又は抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体の組成物を、炎症を有する哺乳類に投与することを含んで成る。さらに、炎症を有する哺乳類における炎症応答を抑制するための方法は、（１）血清アミロイドＡタンパク質のレベルを決定し；（２）許容できる医薬ビークル中、本明細書に記載されるような可溶性ｚｃｙｔｏｒ１７サイトカイン受容体ポリペプチドを含んで成る組成物を投与し；（３）血清アミロイドＡタンパク質の後投与レベルを決定し；（４）段階（３）における血清アミロイドＡタンパク質のレベルに、段階（１）における血清アミロイドＡタンパク質のレベルを比較することを含んで成り、ここで血清アミロイドＡタンパク質の上昇又は下降の欠失が炎症応答の抑制の表示である。
【０２１１】
本発明の受容体は、少なくとも１つのｚｃｙｔｏｒ１７受容体サブユニットを含む。ヘテロダイマー可溶性受容体に包含される第２の受容体ポリペプチドは、クラスＩサイトカイン受容体サブユニットを包含する受容体サブファミリーに属する。本発明によれば、モノマー又はホモダイマーｚｃｙｔｏｒ１７受容体ポリペプチドの他に、可溶性ｚｃｙｔｏｒ１７受容体＋可溶性クラスＩ受容体ヘテロダイマー成分を含んで成る態様により例示されるように、ヘテロダイマー可溶性ｚｃｙｔｏｒ１７受容体は、天然のｚｃｙｔｏｒ１７リガンドのアンタゴニストとして作用することができる。他の態様は、ｚｃｙｔｏｒ１７を含んで成る可溶性マルチマー受容体を包含する。
【０２１２】
ｚｃｙｔｏｒ１７ ｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡの組織分布の分析は、ｍＲＮＡレベルが単球及び前立腺細胞において最高であり、そして活性化された単球、及び活性化されたＣＤ４＋， ＣＤ８＋及びＣＤ３＋細胞において高められることを示した。従って、ｚｃｙｔｏｒ１７は、炎症及び免疫応答の誘発に包含される。従って、本発明の特定の態様は、炎症及びヒト疾病又は病状、例えば膵炎、Ｉ型糖尿病（ＩＤＤＭ）、膵臓癌、Ｇｒａｖｅｓ病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、結腸及び小腸癌、憩室症、自己免疫疾患、敗血症、器官又は骨髄移植；外傷、手術又は感染による炎症；アミロイドーシス；巨脾腫；対宿主性移植片病において；及び炎症の阻害、免疫抑制、造血、免疫、炎症又はリンパ細胞、マクロファージ、Ｔ−細胞（Ｔｈ１及びＴｈ２細胞、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞）の増殖の低下、病原体又は抗原に対する免疫応答の抑制の場合、アンタゴニストとしての可溶性ｚｃｙｔｏｒ１７ヘテロダイマーの使用に向けられる。
【０２１３】
さらに、活性化された免疫細胞、例えば活性化されたＣＤ４＋及びＣＤ１９＋細胞におけるｚｃｙｔｏｒ１７発現の存在は、ｚｃｙｔｏｒ１７が、外来性侵入体、例えば微生物及び細胞残骸に対する身体の免疫防御反応に包含され、そして炎症及び癌形成の間、免疫応答において役割を演じることができたことを示した。ｚｃｙｔｏｒ１７機能に対して作用性又は拮抗性である本発明の抗体及び結合パートナーは、免疫応答及び炎症を改良するために使用され得る。
【０２１４】
さらに、本明細書に記載されるｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチド、モノマー、ホモダイマー、ヘテロダイマー及びマルチマー及び／又はｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチド、モノマー、ホモダイマー、ヘテロダイマー及びマルチマー自体を結合する抗体又は結合ポリペプチドは、次のことを実施するために有用である：
１）急性炎症、外傷、組織損傷、手術、敗血症又は感染の結果としての炎症、及び慢性炎症疾患、例えばぜん息、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、慢性大腸炎、巨脾腫、リウマチ様関節炎、再発性急性炎症性エピソード（例えば、結核）、及びアミロイドーシス及びアラローム硬化症、Ｃａｓｔｌｅｍａｎ病、ぜん息、及び急性相応答の誘発に関連する他の疾病の処理においてｚｃｙｔｏｒ１７受容体を通してのシグナル化を拮抗するか又は阻止するために；
【０２１５】
２）ｚｃｙｔｏｒ１７を通して免疫細胞（例えば、リンパ球、単球、白血球）におけるシグナル化を妨げるか又は阻害するために、自己免疫疾患、例えばＩＤＤＭ、多発生硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、リウマチ様関節炎及びＩＢＤの処理においてｚｃｙｔｏｒ１７受容体を通してのシグナル化を拮抗するか又は阻害するために（Ｈｕｇｈｅｓ Ｃなど．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５３： ３３１９−３３２５， １９９４）； 他方では、抗体、例えばｚｃｙｔｏｒ１７含有受容体に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）はまた、自己免疫疾患を処理するために所望しない免疫細胞を消耗するためのアンタゴニストとしても使用され得る。
【０２１６】
ぜん息、アレルギー及び他のアトピー性疾患は、免疫応答を阻害するか又は攻撃性細胞を消耗するために、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１７受容体又はｚｃｙｔｏｒ１７／ＣＲＦ２−４ヘテロダイマーに対するＭＡｂにより処理され得る。本発明のポリペプチド及び抗体を用いて、ｚｃｙｔｏｒ１７を通してシグナル化を阻止し、又は阻害することはまた、膵臓、肝臓及びニューロン細胞の疾病を治療することができる。
【０２１７】
ＩＤＤＭ、ＮＩＤＤＭ、膵炎及び膵癌のためにも有益であり得る。ｚｃｙｔｏｒ１７は、拮抗性ＭＡｂが癌増殖を阻害し、そして免疫介在性殺害を標的化する、癌のＭＡｂ治療のための標的物として作用することができる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ． ａｎｄ Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ， Ｈ： Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １６： １０１５−１０１６， １９９８）。可溶性ｚｃｙｔｏｒ１７モノマー、ホモダイマー、ヘテロダイマー及びマルチマーに対するＭＡｂはまた、腎症、糸球体硬化症、膜ニューロパシー、アミロイドーシス（他の組織の中で腎臓に影響を及ぼす）、腎動脈硬化症、種々の起原の糸球体腎炎、腎臓の線維増殖疾患、及びＳＬＥ、ＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、腎腫瘍及び他の疾病に関連する腎機能不全を処理するためにも有用であり；
【０２１８】
３）自己免疫疾患、例えばＩＤＤＭ、ＭＳ、ＳＬＥ、重症筋無力症、リウマチ様関節炎及びＩＢＤの処理においてｚｃｙｔｏｒ１７受容体を通してのシグナル化を作用するか又は開始するために；抗−ｚｃｙｔｏｒ１７、抗−ヘテロダイマー及びマルチマーモノクローナル抗体は、分化するリンパ球又は他の免疫細胞をシグナル化し、増殖を変更し、又は自己免疫性を改良する、サイトカイン又は細胞表面タンパク質の生成を変えることができる。特に、サイトカイン分泌の他のパターンに対するＴ−ヘルパー細胞応答の調節が、疾病を改善するために自己免疫応答を偏向することができる（Ｓｍｉｔｈ ＳＡなど．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０： ４８４１−４８４９， １９９８）。
【０２１９】
同様にアゴニスト性抗−ｚｃｙｔｏｒ１７、抗−ヘテロダイマー及びマルチマーモノクローナル抗体は、ぜん息、アレルギー及びアトピー性疾患に関与する免疫細胞を表示し、消耗し、そして偏向するために使用され得る。ｚｃｙｔｏｒ１７によるシグナル化はまた、膵臓、腎臓、下垂体及びニューロン細胞の疾病に有益であり得る。ＩＤＤＭ、ＮＩＤＤＭ、膵癌のために有益であり得る。ｚｃｙｔｏｒ１７は、シグナル化ＭＡｂが癌増殖を阻害し、そして免疫介在性殺害を標的化する、膵臓のＭＡｂ治療のための標的物として作用することができる（Ｔｕｔｔ、ＡＬなど．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６１： ３１７５−３１８５， １９９８）。同様に、Ｔ−細胞特異的白血病、リンパ腫及び癌は、本発明のｚｃｙｔｏｒ１７含有の可溶性受容体に対するモノクローナル抗体により処理され得る。
【０２２０】
本明細書に記載される可溶性ｚｃｙｔｏｒ１７モノマー、ホモダイマー、ヘテロダイマー及びマルチマーポリペプチドは、上記に記載されるような自己免疫疾患、アトピー性疾患、ＮＩＤＤＭ、膵炎及び腎機能不全の処理においてｚｃｙｔｏｒ１７リガンド活性を中和するか、又は阻止するために使用され得る。可溶性形のｚｃｙｔｏｒ１７は、Ｔ細胞により介在される抗体応答を促進するために、及び／又はリンパ球又は他の免疫細胞によるＩＬ−４又は他のサイトカインの生成を促進するために使用され得る。
【０２２１】
本発明の可溶性ｚｃｙｔｏｒ１７含有受容体は、その天然のリガンドのアンタゴニストとして有用である。そのようなアンタゴニスト効果は、直接的な中和又はその天然のリガンドの結合により達成され得る。アンタゴニスト使用の他に、本発明の可溶性受容体は、ｚｃｙｔｏｒ１７リガンドを結合し、そしてそのリガンドを身体内の異なった組織、器官及び細胞に輸送するために、そのリガンドのためのキャリヤータンパク質として作用することができる。
【０２２２】
本発明の可溶性受容体は、特定の部位、例えば組織、特定の免疫細胞、単球又は腫瘍に可溶性受容体−リガンド複合体を方向づける、分子、ポリペプチド又は化学的成分に融合されるか又はカップリングされ得る。例えば、急性感染又はいくつかの癌においては、有益性は、炎症及び局部急性相応答タンパク質の誘発に起因することができる。従って、本発明の可溶性受容体は、前−炎症性リガンドの作用を特異的に方向づけるために使用され得る。Ｃｏｓｍａｎ， Ｄ． Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ５： ９５−１０６， １９９３； 及びＦｅｒｍａｎｄｅｚ−Ｂｏｔｒａｎ， Ｒ． Ｅｘｐ． Ｏｐｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｒｕｇｓ ９： ４９７−５１３， ２０００を参照のこと。
【０２２３】
さらに、本発明の可溶性受容体は、分解又はクリアランスからリガンドを安定化するか、又は身体内の作用の部位にリガンドを標的化することによって、リガンドの生物利用性及び／又は治療効力を高めるために、ｚｃｙｔｏｒ１７リガンドの安定化のために使用され得る。例えば、天然に存在するＩＬ−６／可溶性ＩＬ−６Ｒ複合体は、ＩＬ−６を安定化し、そしてｇｐ１３０受容体を通してシグナル化することができる。Ｃｏｓｍａｎ， Ｄ． 前記及びＦｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｂｏｔｒａｎ， Ｒ， 前記を参照のこと。さらに、ｚｃｙｔｏｒ１７は、リガンド／可溶性受容体複合体を含むよう、同種リガンド、例えばそのリガンドと共に組合され得る。
【０２２４】
そのような複合体は、コンパニオン受容体サブユニットを提供する細胞からの応答を刺激するために使用され得る。ｚｃｙｔｏｒ１７／リガンド複合体の細胞特異性は、単独で投与されるリガンドについて見られるその特異性とは異なる。さらに、前記複合体は、異なった薬力学的性質、例えば影響を及ぼす半減期、用量／応答性及び器官又は組織特異性を有する。従って、ｚｃｙｔｏｒ１７／リガンド複合体は、免疫応答を増強し、又は糸球体間質細胞又は肝細胞を刺激するためにアゴニスト活性を有することができる。
【０２２５】
他方では、ＩＬ６／ＩＬ６Ｒ複合体に対する応答に類似する複合体とヘテロダイマー化するシグナル化サブユニットを発現する組織のみが、影響され得る（Ｈｉｒｏｔａ Ｈ． など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９２： ４８６２−４８６６， １９９５； Ｈｉｒａｎｏ， Ｔ． ｉｎ Ｔｈａｍａｓｏｎ， Ａ． （ＥＤ．） “Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”， ３ｒｄ ＥＤ．， ｐ． ２４８−２０９）。ＩＬ１２及びＣＮＴＦのための可溶性受容体／サイトカイン複合体は、類似する活性を示す。
【０２２６】
ｚｃｙｔｏｒ１７ホモダイマー、ヘテロダイマー及びマルチマー受容体ポリペプチドはまた、リガンドの循環レベルの検出のために、及び急性相炎症応答の検出において、診断システム内で使用され得る。関連する態様においては、本発明のｚｃｙｔｏｒ１７可溶性受容体に特異的に結合する抗体又は他の剤は、循環性受容体ポリペプチドを検出するために使用され得；逆に言えば、ｚｃｙｔｏｒ１７可溶性受容体自体が、循環性又は局部的に作用するリガンドポリペプチドを検出するために使用され得る。リガンド又は受容体ポリペプチドの高められた又は低められたレベルが、炎症又は癌を包含する病理学的状態の表示であり得る。さらに、急性相タンパク質又は分子、例えばｚｃｙｔｏｒ１７リガンドの検出は、一定の疾病状態（例えば、リウマチ様、関節炎）における慢性炎症状態の表示であり得る。そのような状態の検出は、疾病診断を助け、そして正しい治療の医者による選択を助けるよう作用する。
【０２２７】
分化は進行性で且つ動的な工程であり、多能性幹細胞で始まり、そして最終的に分化された細胞で終結する。拘束なしに系統に再生することができる多能生幹細胞は、細胞系統への拘束が行われる場合、失われる一組の分化マーカーを発現する。前駆体細胞は、細胞が成熟に向かって細胞系統路を進行する場合に、発現され続けることができても又はできなくても良い一組の分化マーカーを発現する。成熟細胞により独占的に発現される分化マーカーは通常、機能的性質のもの、例えば細胞生成物、細胞生成物を生成するための酵素、及び受容体である。
【０２２８】
細胞集団の分化の段階は、細胞集団に存在するマーカーの同定によりモニターされる。筋細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、クロンドロサイト、腺維芽細胞及び網様細胞は、通常の間葉幹細胞に起因すると思われる（Ｏｗｅｎなど．， Ｃｉｂａ Ｆｄｎ． Ｓｙｍｐ． １３６： ４２−４６， １９８８）。間葉幹細胞のためのマーカーはまだ十分には同定されておらず（Ｏｗｅｎなど．， Ｊ． ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． ８７： ７３１−７３８， １９８７）、その結果、同定は、通常、前駆体及び成熟細胞段階で行われる。本発明の新規ポリペプチドは、間葉幹細胞及び単球又は他の前駆体細胞を、インビボ及びエクスビボの両者で単離するための研究のために有用である。
【０２２９】
最終分化又は脱分化の方の経路に特定細胞型を刺激する化又は調節する因子が、通常の前駆体又は幹細胞に起因する全細胞集団に影響を及ぼすことを示唆する証拠が存在する。従って、本発明は、リンパ細胞、造血細胞、及び内皮細胞の増殖の刺激または阻害を包含する。従って、本発明の分子、例えば、可溶性ｚｃｙｔｏｒ１７受容体、サイトカイン−結合フラグメント、抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体、センス及びアンチセンスポリヌクレオチドは、腫瘍細胞、及び特にリンパ球、造血、前立腺、ン内皮及び甲状腺細胞の阻害に使用できる。
【０２３０】
分化を測定するアッセイは例えば、組織、酵素活性、機能的活性又は形態学的変化の段階−特異的発現に関連する細胞−マーカーを測定することに包含する（Ｗａｔｔ， ＦＡＳＥＢ， ５： ２８１−２８４， １９９１； Ｆｒａｎｃｉｓ， Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ５７： ６３−７５， １９９４； Ｒａｅｓ， Ａｄｖ． Ａｎｉｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｅｓ， １６１−１７１， １９８９； すべては引用により本明細書に組み込まれる）。他方では、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチド自体は、組織の段階−特異的発現に関連する追加の細胞表面又は分泌されたマーカーとして作用することができる。ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドの直接的な測定、又はそれが分化するにつれての組織における発現のその損失は、たとえば前立腺組織又は単球細胞の同定又は分化のためのマーカーとして作用することができる。
【０２３１】
同様に、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドの直接的な測定、又は組織における発現のその損失が、それらが腫瘍の進行を受けるにつれて、組織又は細胞において決定され得る。前癌又は癌状態における細胞の侵襲性及び運動性の上昇、又はｚｃｙｔｏｒ１７の発現の獲得又は損失が、正常な組織に比較して、腫瘍進行における形質転換、侵襲性及び転移についての診断として作用することができる。進行又は転移の腫瘍段階の知識は、所定の個々の癌患者のために、最も適切な治療又は処理の攻撃性を選択する上で医薬を助けるであろう。
【０２３２】
発現（ｍＲＮＡ又はタンパク質のいずれかの）の獲得及び損失を測定する方法は、当業界において良く知られており、そして本明細書に記載されており、そしてｚｃｙｔｏｒ１７発現に適用され得る。例えば、細胞運動性を調節するポリペプチドの出現又は消出が、前立腺癌の診断及び予後を助けるために使用され得る（Ｂａｎｙａｒｄ， Ｊ． ａｎｄ Ｚｅｔｔｅｒ， Ｂ． Ｒ．， Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔ． Ｒｅｖ． １７： ４４９−４５８， １９９９）。細胞運動性、活性化、増殖又は分化のエフェクターとして、発現のｚｃｙｔｏｒ１７獲得又は損失がリンパ球、造血、内皮、甲状腺及び他の癌についての診断分析として作用することができる。
【０２３３】
さらに、ｚｃｙｔｏｒ１７は単球及び前立腺特異的、ポリヌクレオチドプローブ、抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体及び検出であるので、組織におけるｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドの存在は、単球又は前立腺組織が例えば、疾病又は癌性前立腺の切除を包含する手術の後、又は疾病又は感染された組織又は単球癌における単球浸潤の評価において、存在するかどうかを評価するために使用され得る。本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド及び抗体は、すべての前立腺組織が、手術の後、例えば前立腺癌についての手術の後、切除されるかどうかを決定するための助剤として使用され得る。
【０２３４】
そのような場合、癌からの回復を最大にし、そして再発を最少にするために、すべての可能性ある疾病組織を除去することは特に重要である。さらに、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体は、単球湿潤が、疾病又は癌からの回復性をモニターするために、疾病組織（例えば、炎症性又は感染された）に存在するかどうかを決定するための助剤として使用され得る。好ましい態様は、組織学的に又は現場使用され得る。蛍光性、放射性ラベルされた、又は比色的にラベルされた抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体及びｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチド結合パートナーを包含する。
【０２３５】
さらに、腫瘍進行及び転移に対するｚｃｙｔｏｒ１７の活性及び効果が、インビボで測定され得る。いくつかの同系マウスモデルが、腫瘍進行に対するポリペプチド、化合物又は他の処理の影響を研究するために開発されて来た。それらのモデルにおいては、培養継代された腫瘍細胞が、腫瘍ドナーと同じ株のマウス中に移植される。細胞は、受容体マウスにおいて類似する特徴を有する腫瘍中に増殖し、そして転移がまた、そのモデルのいくつかにおいて生じるであろう。本発明者の研究のための適切な腫瘍モデルは、中でも、Ｌｅｗｉｓ肺癌（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ−１６４２）及びＢ１６黒色腫（ＡＴＣＣ Ｎｏ． Ｃｒｌ−６３２３）を包含する。それらは、インビトロで容易に培養され、そして操作される、Ｃ５７ＢＬ６マウスと同種の通常使用される腫瘍系である。
【０２３６】
それらの細胞系のいずれかの移植に起因する腫瘍は、Ｃ５７ＢＬ６マウスの肺に転移することができる。Ｌｅｗｉｓ肺癌モデルが最近、脈管形成のインヒビターを同定するためにマウスに使用されている（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ＭＳ， など． Ｃｅｌｌ ７９： ３１５−３２８， １９９４）。Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスが、組換えタンパク質、アゴニスト又はアンタゴニストの毎日の注入、又は組換えアデノウィルスの１回の注入を通して、実験剤により処理される。この処理に続いて３日で、１０５〜１０６個の細胞が背面の皮膚下に移植される。他方では、細胞自体が、タンパク質が全身的によりもむしろ腫瘍部位で又は細胞内で合成されるよう、移植の前、組換えアデノウィルス、例えばｚｃｙｔｏｒ１７を発現するアデノウィルスにより感染され得る。
【０２３７】
マウスは、通常５日以内に眼に見える腫瘍を進行する。腫瘍が３週間までの間、増殖され、この間、それらは対照の処理グループにおいて１５００−１８００ｍｍ３のサイズに達することができる。腫瘍サイズ及び体重が、その実験を通して注意してモニターされる。殺害の時点で、腫瘍が、肺及び肝臓と共に除去され、そして計量される。肺の重量が、転移性腫瘍負荷量と相互関係することが示された。さらなる測定として、肺表面転移が計数される。切除された腫瘍、肺及び肝臓が、当業界において知られており、そして本明細書に記載される方法を用いて、組織学的試験、免疫組織化学及び現場ハイブリダイゼーションのために調製される。従って血管構造を回復し、そして転移を受ける腫瘍の能力に対する、問題の発現されたポリペプチド、例えばｚｃｙｔｏｒ１７の影響が評価され得る。
【０２３８】
さらに、アデノウィルスとは別に、移植された細胞がｚｃｙｔｏｒ１７により一時的にトランスフェクトされ得る。安定したｚｃｙｔｏｒ１７トランスフェクトの使用、及びインビボでのｚｃｙｔｏｒ１７発現を活性化する誘発性プロモーターの使用は、当業界において知られており、そして転移のｚｃｙｔｏｒ１７誘発を評価するためにこのシステムに使用され得る。さらに、精製されたｚｃｙｔｏｒ１７又はｚｃｙｔｏｒ１７ならし培地が、このマウスモデルに直接的に注入され、そして従って、このシステムに使用される。一般的な文献については、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ＭＳ， など． Ｃｅｌｌ ７９： ３１５−３２８， １９９４， 及びＲｕｓｃｉａｎｏ Ｄ， など、Ｍｕｒｉｎｅ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｌｉｖｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ， Ｉｎｖａｓｉｏｎ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １４： ３４９−３６１，１９９５を参照のこと。
【０２３９】
ヒト血液学的悪性に由来する腫瘍細胞の増殖及び散在に対するｚｃｙｔｏｒ１７及びその誘導体（接合体）の活性がまた、マウスの異種移植モデルにおいてインビボで測定され得る。ヒト腫瘍細胞が、集合的には、異種移植モデルとして言及される、ヒト腫瘍細胞が免疫欠損マウス中に移植されているいくつかのマウスモデルが開発されている。Ｃａｔｔａｎ， ＡＲ ａｎｄ Ｄｏｕｇｌａｓ， Ｅ Ｌｅｕｋ． Ｒｅｓ． １８： ５１３−２２， １９９４； 及びＦｌａｖｅｌｌ， ＤＪ． Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １４： ６７−８２， １９９６を参照のこと。疾病モデルの特徴は、マウスに供給される細胞の型及び量により変化する。
【０２４０】
典型的には、腫瘍細胞は、急速に増殖し、そして血液において循環し、そして多くの器官系に存在することが見出され得る。そのようなモデルにおいて試験するための適切な治療方法は、抗体誘発性毒性、リガンド−毒素接合体又は細胞い基づく治療を包含する。養子免疫療法として通常言及される後者の方法は、ヒト免疫系の成分（すなわち、リンパ球、ＮＫ細胞）による動物の処理を包含し、そしてｚｃｙｔｏｒ１７又は他の免疫調節剤と細胞とのエクスビボインキュベーションを包含することができる。
【０２４１】
リンパ組織、例えば胸腺における発現を示されたこの新規ＤＮＡに対応するｍＲＮＡは、骨髄及び前立腺、単球及び活性化された単球、ＣＤ１９＋ Ｂ細胞において発現され、そして脾臓、リンパ節及び末梢血液リンパ球において発現され得る。それらのデータは、免疫細胞の増殖、分化及び／又は活性化におけるｚｃｙｔｏｒ１７受容体のための役割を示し、そして免疫応答の進行及び調節における役割を示唆する。このデータはまた、ｚｃｙｔｏｒ１７とそのリガンドとの相互作用が骨髄性細胞の増殖及び進化を刺激し、そしてＩＬ−２，ＩＬ−６，ＬＩＦ，ＩＬ−１１，ＩＬ−１２及びＯＳＭのように（Ｂａｕｍａｎｎなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８： ８４１４−８４１７， １９９３）、肝細胞における急性相タンパク質合成を誘発することができる。
【０２４２】
本発明のポリペプチドを８０％以上の純度、より好ましくは９０％以上の純度、さらに好ましくは９５％以上の純度に精製することが好ましく、そして汚染性高分子、特に他のタンパク質及び核酸に対して、９９．９％以上の純度であり、そして感染性及び発熱性剤を有さない医薬的に純粋な状態が特に好ましい。好ましくは、精製されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に有さない。
【０２４３】
発現された組換え体ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチド（又はｚｃｙｔｏｒ１７キメラ又は融合ポリペプチド）は、分別及び／又は従来の精製方法及び媒体を用いて精製され得る。硫酸アンモニウム沈殿及び酸又はカオトロピック剤抽出は、サンプルの分別のために使用される。典型的な精製段階は、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、ＦＰＬＣ及び逆相高性能液体クロマトグラフィーを包含する。適切なクロマトグラフィー用媒体は、誘導体化されたデキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特別なシリカ及び同様のものを包含する。ＰＥＩ、ＤＥＡＥ、ＱＡＥ及びＱ誘導体が好ましい。
【０２４４】
典型的なクロマトグラフィー用媒体は、フェニル、ブチル又はオクチル基により誘導体化されたもの、例えばフェニル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ｐｈａｒｍａｃｉａ），Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ブチル６５０（Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ， Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ， ＰＡ）、オクチル−Ｓｅｐｈａｒｒｏｓｅ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）及び同様のもの；又はポリアクリル樹脂、例えばＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ７１ （Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ）及び同様のものを包含する。適切な固体支持体は、ガラスビーズ、シリカ基材の樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋されたアガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋されたポリアクリルアミド樹脂及びそれらが使用される条件下で不溶性である同様のものを包含する。
【０２４５】
それらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基及び／又は炭水化物成分によるタンパク質の結合を可能にする反応性基より変性され得る。カップリング化学物質の例は、臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化及びカルボジイミド　カップリング化学物質のためのカルボキシル及びアミノ誘導体を包含する。
【０２４６】
それらの及び他の固体媒体は当業界において良く知られており、そして広く使用されており、そして商業的供給者から入手できる。支持媒体にリガンド又は受容体ポリペプチドを結合するための方法は当業界において良く知られている。特定方法の選択は、通常のことであり、そして選択された支持体の性質により一部決定される。例えば、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ， １９８８を参照のこと。
【０２４７】
本発明のポリペプチドは、アニオン及びカチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除、及び親和性クロマトグラフィーを包含する方法の組み合わせより単離され得る。例えば、固定された金属イオン吸着（ＩＭＡＣ）クロマトグラフィーが、ヒスチジンに富んでいるタンパク質、及びポリヒスチジン標識を含んでなるそれらのタンパク質を精製するために使用され得る。手短に言及すれば、ゲルがまず、二価金属イオンにより荷電され、キレートが形成される（ Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３： １−７， １９８５）。
【０２４８】
ヒスチジンに富んでいるタンパク質が、使用される金属イオンに依存して、異なった親和性を有するこのマトリックスに吸着され、そして競争溶出、ｐＨの低下、又は強いキレート化剤の使用により溶出されるであろう。他の精製方法は、レクチン親和性クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化されたタンパク質の精製を包含する（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， Ｖｏｌ． １８２， “Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”， Ｍ． Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ， （ ｅｄ．）， Ａｃａｄ． Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９０， ｐｐ． ５２９−３９）。本発明のさらなる態様においては、興味あるポリペプチド、及び親和性標識（例えばマルトース−結合タンパク質、ＦＬＡＧ標識、Ｇｌｕ−Ｇｋｕ標識、免疫グロブリンドメイン）の融合体が、精製を促進するために構成され得る。
【０２４９】
さらに、当業界において記載される方法を用いて、ポリペプチド融合体又はハイブリッドｚｃｙｔｏｒ１７タンパク質が、他のマウス又はヒトサイトカイン受容体ファミリータンパク質、又は異種タンパク質と組合して、本発明のｚｃｙｔｏｒ１７の領域又はドメインを用いて構成される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ など．， 前記；Ａｌｔｓｃｈｕｌ など．， 前記；Ｐｉｃａｒｄ， Ｃｕｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｌｏｇｙ， ５： ５１１−５， １９９４及びそれらにおける引例）。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける大きなドメイン又は領域の生物学的重要性の決定を可能にする。そのようなハイブリッドは、反応運動学、結合を変更し、基質特異性を抑制し、又は拡張し、又はポリペプチドの組織及び細胞局在性を変更し、そして未知の構造のポリペプチドに適用される。
【０２５０】
融合タンパク質は、その融合タンパク質の個々の成分を調製し、そしてそれらを化学的に接合することによって、当業者に知られている方法により調製され得る。他方では、正しく読み取り枠を整合して融合タンパク質の１又は複数の成分をコードするポリヌクレオチドは、既知の技法を用いて生成され、そして本明細書に記載される方法により発現され得る。例えば、生物学的機能を付与するドメインの一部又はすべてが、本発明のｚｃｙｔｏｒ１７と、もう１つのサイトカインファミリーメンバーからのその機能的に同等のドメインとの間で交換され得る。
【０２５１】
そのようなドメインは次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：分泌シグナル配列、細胞外サイトカイン結合ドメイン、フィブロネクチン第ＩＩＩドメイン、トランスメンブランドメイン、及び細胞内シグナル化ドメイン、Ｂｏｘ Ｉ及びＢｏｘ ＩＩ部位。そのような融合タンパク質は、構成される融合体に依存して、本発明のポリペプチド又は他の既知のファミリータンパク質と同じか又は類似する生物学的機能プロフィールを有することが予測される。さらに、そのような融合タンパク質は、本明細書に開示されるように、他の性質も示すことができる。
【０２５２】
標準の分子生物学及びクローニング技法が、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドと、それらが融合されるそれらのポリペプチドとの間の同等のドメインを交換するために使用され得る。一般的に、興味あるドメイン、例えば本明細書に記載されるｚｃｙｔｏｒ１７ドメインをコードするＤＮＡセグメントが、追加のポリペプチド（例えば、ｇｐ１３０， ＬＩＦ， ＩＬ−１２， ＷＳＸ−１， ＩＬ−２又は他のクラスＩサイトカイン受容体）をコードする少なくとも１つの他のＤＮＡセグメントに読み取り枠を接合して作用可能に結合され、そして本明細書に記載されるように、適切な発現ベクター中に挿入される。
【０２５３】
一般的に、ＤＮＡ構造体は、ポリペプチドのその対応する領域をコードするいくつかのＤＮＡセグメントが、完全な融合タンパク質又はその機能的部分をコードする単一の構造体を製造するために読み取り枠を整合して、作用可能に連結されるように、製造される。例えばＤＮＡ構造体は、Ｎ−末端からＣ−末端側に、単一のポリペプチドを含んで成る融合タンパク質、続いて、サイトカイン結合ドメイン、続いてトランスメンブランドメイン、続いて細胞内シグナル化ドメインをコードする。そのような融合タンパク質は、本明細書に記載されるように、発現され、単離され、そして活性についてアッセイされ得る。さらに、そのような融合タンパク質は、本明細書に記載のような抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体を生成するために動物を接種するのに使用されるべきｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドのフラグメントを発現し、そして分泌するために使用され得る。
【０２５４】
例えば、分泌シグナル配列は、サイトカイン結合ドメイン、トランスメンブランドメイン、細胞内シグナル化ドメイン又はそのサブフラグメント、又はそれらの組合せ（例えば、トランスメンブランに融合される細胞外サイトカイン結合ドメインを含んで成る作用可能に連結されるポリペプチド、又は本明細書に記載されるｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドフラグメント）に作用可能に連結され、本明細書に記載のようにして精製され得、そして本明細書に記載のようにして、抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体を生成するために動物に接種されるべき抗原として作用することができるｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドのフラグメントが分泌される。
【０２５５】
ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチド又はそのフラグメントはまた、化学的合成を通して調製され得る。ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドはモノマー又はマルチマーであり得；グリコシル化されても又はグリコシル化されなくても良く；ペルギレ−ト化されても又はペルギレ−トされなくても良く；そして開始メチオニンアミノ酸残基を含んでも又は含まなくても良い。
【０２５６】
本発明のポリペプチドはまた、排除固相合成、部分固相合成、フラグメント縮重又は従来の溶液合成により合成され得る。ポリペプチドを合成するための方法は、当業界において良く知られている。例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５： ２１４９， １９６３； Ｋａｉｓｅｒなど．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３４： ５８５，１９７０を参照のこと。固体支持体上での所望するペプチドの完全な合成の後、ペプチド−樹脂は、その樹脂からポリペプチドを分解する試薬と共に存在し、そしてほとんどの側鎖保護基を除去する。そのような方法は、当業界において十分に確立されている。
本発明の分子の活性は、細胞の分化及び増殖を側定する種々のアッセイを用いて測定され得る。そのようなアッセイは、当業界において良く知られている。
【０２５７】
本発明のタンパク質は、例えば、リンパ性、免疫性、炎症性、脾臓性、血液又は骨疾患の処理及び診断において有用であり、そして培養された細胞を用いてインビトロで、又は適切な動物モデルに本発明の分子を投与することによってインビボで測定され得る。例えば、ｚｃｙｔｏｒ１７可溶性受容体ポリペプチドを発現する宿主細胞は、アルギン酸塩環境下で包埋され、そして受容体動物中に注入（移植）され得る。アルギネート−ポリ−Ｌ−リシン微小封入、透過性膜封入及び拡散チャンバーは、トランスフェクトされた哺乳類細胞又は一次哺乳類細胞を捕獲するための手段として記載されている。
【０２５８】
それらのタイプの非免疫原性“封入”は、微小環境への栄養物ノトランスファーを可能にしそして又は、捕獲された細胞により分泌され又は開放されるタンパク質及び他の高分子の受容体動物への拡散を可能にする。最も重要なことには、カプセル又は微小環境は、受容体動物の免疫応答から外来性の包埋された細胞をマスクし、そして遮断する。そのような微小環境は、注入される細胞の寿命を、数時間又は数日（裸細胞）から数週間（包埋された細胞）まで拡張することができる。アルギン酸塩糸は、包埋された細胞を生成するための単純且つ迅速な手段を提供する。
【０２５９】
アルギン酸塩糸を生成するために必要とされる材料は、当業者に知られている。製造されると、そのアルギン酸塩糸は、インビトロで、及びその糸を用いて得られるデータに基づいて、インビボで、比較的強く且つ耐久性がある。そのアルギン酸塩糸は容易に操作でき、そしてその方法論は多くの調製のために評価できる。典型的な方法においては、３％のアルギン酸塩が、無菌水において調製され、そして滅菌濾過される。アルギン酸塩糸の調製の直前、アルギン酸塩溶液が再び濾過される。約５０％の細胞懸濁液（１ｍｌ当たり約５×１０５個〜約５×１０７個の細胞を含む）が３％アルギン酸塩溶液と共に混合される。
【０２６０】
１ｍｌのアルギン酸塩／細胞懸濁液が、約１５分間にわたって、１００ｍＭの滅菌濾過されたＣａｃｌ２ 溶液中に押し出され、“糸（Ｔｈｒｅａｄ）”が形成される。次に、押し出された糸は、５０ｍＭのＣａｃｌ２の溶液に移され、そして次に２５ｍＭのＣａｃｌ２の溶液に移される。次に、糸が、脱イオン水によりすすがれ、その後、ポリ−Ｌ−リシンの０．０１％溶液においてインキュベートすることによって糸を被覆する。最後に、糸は乳酸塩化されたリンガー溶液によりすすがれ、そして注射器（針のない）中に溶液から抜き取られる。次に大きな孔の針がその注射器につけられ、そして糸が最少量の乳酸塩化されたリンガー溶液において受容体中の腹腔内注入される。
【０２６１】
本発明のタンパク質をアッセイするためのインビボアプローチは、ウィルス供給システムを包含する。この目的のための典型的なウィルスは、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、ワクシニアウィルス及びアデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）を包含する。アデノウィルス、すなわち二本鎖ＤＮＡウィルスは現在、異種拡散の供給のための最も研究されている遺伝子トランスファーベクターである（Ｔ． Ｃ． Ｂｅｃｋｅｒ など．， Ｍｅｔｈ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ． ４３： １６１−８９， １９９４； 及びＪ． Ｔ． Ｄｏｕｇｌａｓ ａｎｄ Ｄ．Ｔ． Ｃｕｒｉｅｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４： ４４−５３， １９９７ を参照のこと）。
【０２６２】
アデノウィルスシステムは次のいくつかの利点を付与する：（ ｉ ）アデノウィルスは比較的大きなＤＮＡ挿入体を適応せしめることができ；（ ｉｉ ）高い力価に増殖され得；（ ｉｉｉ ）広範囲の哺乳類細胞型を感染せしめ；そして（ ｉｖ ）多数の異なったプロモーター、例えば偏在する、組織特異的、及び調節可能なプロモーターと共に使用され得る。また、アデノウィルスは血流において安定しているので、それらは静脈内注射により投与され得る。
【０２６３】
アデノウィルスゲノムの一部が欠失されているアデノウィルスを用いて、直接的な結合により又は同時トランスフェクトされたプラスミドとの相同組換えにより、ウィルスＤＮＡ中に組み込まれ得る。典型的なシステムにおいては、必須Ｅ１遺伝子がウィルスベクターから欠失され、そしてウィルスは、Ｅ１遺伝子が宿主細胞（ヒト２９３細胞系が典型である）により供給されなければ、複製しないであろう。損なわれていない動物に静脈内投与される場合、アデノウィルスは主に、肝臓を標的化する。
【０２６４】
アデノウィルス供給システムがＥ１遺伝子欠失を有する場合、ウィルスは宿主細胞において複製することができない。しかしながら、宿主の組織（例えば、肝臓）は、異種タンパク質を発現し、そしてプロセッシングするのであろう（そして、分泌シグナル配列が存在する場合、分泌する）。分泌されたタンパク質は高く血管化された肝臓において循環に入り、そして感染された動物に対する効果が決定され得る。
【０２６５】
さらに、ウィルス遺伝子の種々の欠失を含むアデノウィルスベクターは、そのベクターに対する免疫応答を低めるか又は排除するために使用され得る。そのようなアデノウィルスは、Ｅ１−欠失され、そしてさらに、Ｅ２Ａ又はＥ４の欠失を含む（Ｌｕｓｋｙなど．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ２０２２ （１９９８）； Ｒａｐｅｒ など．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９： ６７１ （１９９８））。さらに、Ｅ２ｂの欠失はまた、免疫応答を低めることが報告されている（Ａｍａｌｆｉｔａｎｏなど．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：９２６ （１９９８））。さらに、完全なアデノウィルスゲノムを欠失することによって、異種ＤＮＡの非常に大きな挿入体が収容され得る。すべてのウィルス遺伝子が欠失されている、いわゆる“不活性（ｇｕｔｌｅｓｓ）”アデノウィルスの生成は、異種ＤＮＡの大きな挿入体の挿入のために特に好都合である（Ｙｅｈ ａｎｄ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ， ＦＡＳＥＢ Ｊ． １１： ６１５ （１９９７） を参照のこと）。
【０２６６】
アデノウィルスシステムはまた、インビトロでのタンパク質生成のためにも使用され得る。アデノウィルス感染された非−２９３細胞を、その細胞が急速に分裂しないような条件下で培養することによって、前記細胞は長時間、タンパク質を生成することができる。例えば、ＢＨＫ細胞は、細胞工場において集密性まで増殖され、次に興味ある分泌されたタンパク質をコードするアデノウィルスベクターに暴露される。次に、細胞が、有意な細胞分裂を伴わないで、感染された細胞の数週間の生存を可能にする血清フリー条件下で増殖せしめられる。
【０２６７】
他方では、アデノウィルスベクター感染された２９３Ｓ細胞が、有意な量のタンパク質を生成するために、比較的高い細胞密度で、付着細胞として、又は懸濁培養において増殖せしめられ得る（ Ｇａｒｎｉｅｒ など．， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５： １４５−５５， １９９４ を参照のこと）。いずれかのプロトコールにより、発現され、分泌された異種タンパク質が、細胞における発現されたタンパク質の素因に依存して、細胞培養物上清液、溶解物又は、膜画分から反復して単離され得る。感染された２９３Ｓ 細胞生成プロトコールにおいては、分泌されていないタンパク質が効果的に得られる。
【０２６８】
ｚｃｙｔｏｒ１７に関して観察される組織分布の観点においては、アゴニスト（生来のリガンド／基質／補因子／等を包含する）及びアンタゴニストは、インビトロ及びインビボ用途において莫大な可能性を有する。ｚｃｙｔｏｒ１７アゴニストとして同定される化合物は、インビオロ及びインビボで、免疫及び造血細胞の増殖の刺激において有用である。例えば、ｚｃｙｔｏｒ１７可溶性受容体及びアゴニスト化合物は、定義された細胞培養培地の化合物として有用であり、そして細胞培養において通常使用される血清を置換するために、単独で又は他のサイトカイン及びホルモンと組合して使用され得る。
【０２６９】
従って、アンタゴニストは、培養物におけるＴ−細胞、Ｂ−細胞、及びリンパ性及び骨髄系の増殖及び／又は進化を特異的に促進することにおいて有用である。さらに、ｚｃｙｔｏｒ１７可溶性受容体、アゴニスト又はアンタゴニストは、単離された一次骨髄培養物からのコロニー形成の刺激を測定するためにも有用である。そのようなアッセイは、当業界において良く知られている。
アンタゴニストはまた、リガンド−受容体の部位を特徴づけるための研究試薬としても有用である。ｚｃｙｔｏｒ１７活性（ｚｃｙｔｏｒ１７アンタゴニスト）の阻害は、抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体及び可溶性ｚｃｙｔｏｒ１７受容体、並びに他のペプチド及び非−ペプチド剤（例えば、リボザイム）を包含する。
【０２７０】
ｚｃｙｔｏｒ１７はまた、その活性のインヒビター（アンタゴニスト）を同定するためにも使用され得る。試験化合物は、ｚｃｙｔｏｒ１７の活性を阻害する化合物を同定するために、本明細書に開示されるアッセイに添加される。本明細書に開示されるそれらのアッセイの他に、サンプルは、ｚｃｙｔｏｒ１７結合、オリゴマー化、又はｚｃｙｔｏｒ１７−依存性細胞応答の刺激／阻害を測定するよう企画された種々のアッセイにより、ｚｃｙｔｏｒ１７活性の阻害について試験され得る。例えばｚｃｙｔｏｒ１７−発現性細胞系は、ｚｃｙｔｏｒ１７−刺激された細胞経路に応答するレポーター遺伝子構造体によりトランスフェクトされ得る。
【０２７１】
このタイプのレポーター遺伝子構造体は、当業界において知られており、そして一般的に、アッセイ検出可能タンパク質、例えばルシフェラーゼをコードする遺伝子に作用可能に連結されるｚｃｙｔｏｒ１７−ＤＮＡ応答要素を含むであろう。ＤＮＡ応答要素は、サイクリックＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）、ホルモン応答要素（ＨＲＥ）、インスリン応答要素（ＩＲＥ）（Ｎａｓｒｉｎ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７： ５２７３−７， １９９０）及び血清応答要素（ＳＲＥ）（Ｓｈａｗ など．， Ｃｅｌｌ ５６： ５６３−７２， １９８９）を包含するが、但しそれらだけには限定されない。サイクリックＡＭＰ応答要素は、Ｒｏｅｓｔｌｅｒ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３ （１９）： ９０６３−６， １９８８及びＨａｂｅｎｅｒ， Ｍｏｌｅｃ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ４ （８）： １０８７−９４， １９９０に再考される。
【０２７２】
ホルモン応答要素は、Ｂｅａｔｏ， Ｃｅｌｌ ５６： ３３５−４４ｌ， １９８９に再考される。候補体化合物、溶液、混合物又は抽出物、又は種々の細胞型からのならし培地は、レポーター遺伝子発現のｚｃｙｔｏｒ１７刺激の上昇により明らかなように、ｚｃｙｔｏｒ１７受容体の活性を増強する能力について試験される。このタイプのアッセイは、受容体の結合を通して、又はシグナルカスケードの一部の刺激により、ｚｃｙｔｏｒ１７シグナルトランスダクション活性を直接的に刺激する化合物を検出するであろう。それ自体、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドに応答する細胞を供給し、試験化合物の不在下で細胞の第１部分を培養し、試験化合物の存在下で前記細胞の第２部分を培養し、そして前記細胞の第１部分に比較して、前記細胞の第２部分の細胞応答における上昇性を検出することを含んで成る、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドのアゴニストを同定するための方法が提供される。
【０２７３】
さらに、上記のレポーター遺伝子構造体を含むが、しかしｚｃｙｔｏｒ１７受容体を発現しない第３細胞は、前記レポーターの非−特異的な、又は非−ｚｃｙｔｏｒ１７−介在性刺激を評価するための対照細胞として使用され得る。従って、アゴニスト、例えば天然のリガンドは、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチド機能を刺激し、又は増強するために有用である。
【０２７４】
ｚｃｙｔｏｒ１７リガンド−結合ポリペプチド、例えば本明細書に記載される細胞外ドメイン又はサイトカインドメインはまた、リガンドの精製のためにも使用される。前記ポリペプチドは、固体支持体、例えばアガロース、架橋されたアガロース、ガラス、セルロース樹脂、シリカ基材の樹脂、ポリスチレン、架橋されたポリアクリルアミド又は使用の条件下で安定している同様の材料のビーズ上に固定される。
【０２７５】
固体支持体にポリペプチドを結合するための方法は、当業界において知られており、そしてアミン化学、臭化シアノゲン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化及びヒドラジド活性化を包含する。得られる媒体は一般的に、カラムの形で形状化され、そしてリガンドを含む流体が、受容体ポリペプチドへのリガンドの結合を可能にするために、カラムに１又は複数回、通される。次に、リガンドが、塩濃度の変化、カオトロピック剤（グアニジンＨＣｌ）、又はリガンド−受容体結合を破壊するｐＨを用いて溶出される。
【０２７６】
リガンド−結合受容体（又は抗体、補体／抗補体対の１つのメンバー）、又はその結合フラグメント、及び市販のバイオセンサー装置を用いるアッセイシステムが、好都合には、使用され得る（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ；又はＳＥＬＤＩＴＭ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ， Ｉｎｃ． Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）。そのような受容体、抗体、補体／抗補体対のメンバー、又はフラグメントは、受容体チップの表面上に固定される。この装置の使用は、Ｋａｒｌｓｓｏｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １４５： ２２９−４０， １９９１ 及びＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２３４： ５５４−６３，１９９３により開示される。
【０２７７】
受容体、抗体、メンバー又はフラグメントは、アミン又はスルフヒドリル化学を用いて、流動細胞内の金フィルムに結合されるデキストラン繊維に共有結合される。試験サンプルが細胞に通される。リガンド、エピトープ又は補体／抗補体対の反対のメンバーがサンプルに存在する場合、それは、それぞれ固定された受容体、抗体又はメンバーに結合し、金フィルムの表面のプラズモン共鳴の変化として検出される、媒体の屈折率の変化を引き起こす。このシステムは、オン−及びオフ−速度の決定を可能にし、これから、結合親和性が計算され、そして結合の化学量の評価が可能にされる。
【０２７８】
リガンド−結合受容体ポリペプチドはまた当業界において知られている他のアッセイシステム内でも使用され得る。そのようなシステムは、結合親和性の決定のためのスカチャード分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ， Ａｎｎ． ＮＹ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ５１：６６０−７２， １９４９）及び熱量測定アッセイ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３： ５４５−４８， １９９１；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５： ８２１−２５， １９９１）を包含する。
【０２７９】
ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドはまた、ｚｃｙｔｏｒ１７エピトープ、ペプチド又はポリペプチドに特異的に結合する抗体を調製するためにも使用され得る。ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチド又はそのフラグメントは、動物を接種し、そして免疫応答を誘発するための剤（免疫原）として作用する。当業者は、抗原性エピトープ担持のポリペプチドがｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチド（例えば、配列番号２、５４、５７及び同様のもの）の少なくとも６、好ましくは少なくとも９及びより好ましくは少なくとも１５〜約３０個の連続したアミノ酸残基を含むことを認識するであろう。ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドの大きな部分、すなわちアミノ酸配列の３０〜１００個の残基〜その全体の長さの残基を含んでなるポリペプチドが含まれる。
【０２８０】
抗原又は免疫原エピトープはまた、本明細書に記載されるように、結合された標識、アジュバンド及びキャリヤーを含むことができる。適切な抗原は、配列番号２のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号７３２（Ｖａｌ）、又は連続した９〜７１３個又は３０、又は５０〜７１３個のそのアミノ酸フラグメント；及び配列番号４６のアミノ酸番号２０（Ａｌａ）〜アミノ酸番号６４９（Ｉｌｅ）、又は連続した９〜６３０個又は３０、又は５０〜６３０個のそのアミノ酸フラグメント；及び配列番号５４のアミノ酸番号３３（Ａｌａ）〜アミノ酸番号６６２（Ｉｌｅ）、又は連続した９〜６３０個又は３０、又は５０〜６３０個のそのアミノ酸フラグメントによりコードされるｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドを含む。
【０２８１】
抗原として使用するための好ましいペプチドは、細胞外ドメイン、サイトカイン結合ドメイン、フィブロネクチン第ＩＩＩ形ドメイン、細胞内シグナル化ドメイン、Ｂｏｘ Ｉ及びＢｏｘ ＩＩ部位、本明細書に開示される他のドメイン及びモチーフ、又はそれらの込み合わせ；及びｚｃｙｔｏｒ１７親水性ペプチド、例えば埋もれたＧ、Ｓ及びＴ、及び暴露されたＨ、Ｙ及びＷ残基が無視される、スライド性６−残基鏡に基づいて、Ｈｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ親水性プロフィールから決定される、疎水性プロットから当業者により推定されるそれらのペプチドである。
【０２８２】
ｚｃｙｔｏｒ１７親水性ペプチドは、（１）配列番号２及び４６のアミノ酸残基４３〜４８（配列番号５４の残基５６〜６１）；（２）配列番号２及び４６のアミノ酸残基１５７〜１６２（配列番号５４の残基１７０〜１７５）（３）配列番号２及び４６のアミノ酸残基１６８〜１６３（配列番号５４の残基１７１〜１７６）；（４）配列番号２及び４６のアミノ酸残基２２１〜２２６（配列番号５４の残基２３４〜２３９）；及び（５）配列番号２及び４６のアミノ酸残基４２６〜４３１（配列番号５４の残基４３９〜４４４）から成る群から選択されたアミノ酸配列を含んで成るペプチドを包含する。さらに、例えばＤＮＡＳＴＡＲ Ｐｒｏｔｅａｎ プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ， ＩＮＣ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用いて、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ ｐｌｏｔ Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ ｐｌｏｔから推定される親水性ペプチドはまた、適切な抗原である。
【０２８３】
さらに、保存されたモチーフ、及びｚｃｙｔｏｒ１７の保存されたモチーフ間の可変領域が適切な抗原である。この免疫応答から生成される抗体は、本明細書に記載のようにして単離され、そして精製され得る。ポリクローナル及びモノクローナル抗体を調製し、そして単離するための方法は、当業界において良く知られている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｏｌｉｇａｎ， など．， （ｅｄｓ．）， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９５； Ｓａｍｂｒｏｏｋ など．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９； 及びＨｕｒｒｅｌｌ， Ｊ．Ｇ．Ｒ．， Ｅｄ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ， １９８２ を参照のこと。
【０２８４】
当業者に明らかなように、ポリクローナル抗体は、種々の温血動物、例えば馬、ウシ、ヤギ、羊、犬、鶏、ウサギ、マウス、及びラットを、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチド又はそのフラグメントにより接種することにより生成され得る。ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドの免疫性は、アジュバント、例えばミヨウバン（水酸化アルミニュウム）又はフロイント完全又は不完全アジュバントの使用により高められ得る。免疫化のために有用なポリペプチドはまた、免疫グロブリン　ポリペプチド又はマルトース結合タンパク質との融合体ポリペプチド、例えばｚｃｙｔｏｒ１７又はその一部の融合体を包含する。ポリペプチド免疫原は、十分な長さの分子又はその一部であり得る。ポリペプチド部分が“ハプテン−様”である場合、そのような部分は、免疫化のために、高分子キャリヤー（例えば、カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又は破傷風トキソイド）に都合良く連結又は結合され得る。
【０２８５】
本明細書で使用される場合、用語“抗体”とは、ポリクローナル抗体、親和性精製されたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び抗原結合フラグメント、例えばＦ（ａｂ’）２及びＦａｂタンパク質分解性フラグメントを包含する。遺伝子的に構築された損なわれていない抗体又はフラグメント、例えばキメラ抗体、Ｆｖフラグメント、一本鎖抗体及び同様のもの、並びに合成抗原結合ペプチド及びポリペプチドもまた包含される。非ヒト抗体は、ヒト骨格及び不変領域上に非ヒトＣＤＲのみを移植することによって、又は完全な非ヒト可変ドメインを組み込むことによって（任意には、暴露された残基の置換によってヒト−様表面によりそれらのドメインを“おおう（ｃｌｏａｋｉｎｇ）”ことによって；ここで結果物は“張り合わされた”抗体である）、ヒト適合され得る。
【０２８６】
多くの場合、ヒト適合された抗体は、正しい結合特性を増強するために、ヒト可変領域骨格ドメイン内に非ヒト残基を保持することができる。ヒト適合化抗体を通して、生物学的半減期が高められ、そしてヒトへの投与に基づく有害な免疫反応の可能性が低められる。さらに、ヒト抗体は、ＷＩＰＯ公開ＷＯ９８／２４８９３号に開示されるように、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むよう構築されたトランスジェニック非−ヒト動物において生成される。好ましくは、それらの動物における内因性免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えにより不活性化されるか又は排除される。
【０２８７】
本明細書において有用な抗体を生成するか又は選択するための他の技法は、インビトロで、ｚｃｙｔｏｒ１７タンパク質又はペプチドにリンパ球を暴露し、そしてファージ又は類似するベクターにおける抗体表示ライブラリーを選択すること（例えば、固定された又はラベルされたｚｃｙｔｏｒ１７タンパク質又はペプチドの作用を通して）を包含する。可能性あるｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ（ファージ表示）又は細菌、例えばＥ．コリ上に表示されるランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、多くの手段、例えばランダム突然変異誘発及びランダムポリヌクレオチド合成を通して得られる。
【０２８８】
それらのランダムペプチド表示ライブラリーは、タンパク質又はポリペプチドであり得る既知の標的物、例えばリガンド又は受容体、生物学的又は合成高分子、又は有機又は無機物質と相互作用するペプチドについてスクリーンするために使用され得る。そのようなランダム　ペプチド表示ライブラリーを創造し、そしてスクリーニングするための技法は、当業界において知られており（Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，２２３，４０９ 号； Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第４，９４６，７７８ 号； Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，４０３，４８４ 号及びＬａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，５７１，６９８ 号、及びＫａｙなど．， Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｕｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９６））、そしてランダムペプチド表示ライブラリー及びそのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ （Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ． （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ． （Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ） 及びＰｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ． （Ｐｉｃｃａｔａｗａｙ， ＭＪ） から市販されている。ランダムペプチド表示ライブラリーは、ｚｃｙｔｏｒ１７に結合するタンパク質を同定するために、本明細書に開示されるｚｃｙｔｏｒ１７配列を用いてスクリーンされ得る。
【０２８９】
ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドと相互作用するそれらの“結合ペプチド”は、受容体を発現する細胞を標識するために；親和性精製により相同体ポリペプチドを単離するために使用され得る；それらは薬物、トキシン、放射性核種及び同様のものに直接的にまたは間接的に接合され得る。それらの結合ペプチドはまた、分析方法に、例えば発現ライブラリーをスクリーニングし、そして活性を中和するためにも使用され得る。結合ペプチドはまた、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドの循環レベルを決定するために；根本的な病理学又は疾病のマーカーとして可溶性ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドを検出し又は定量化するために、診断アッセイにも使用され得る。それらの結合ペプチドはまた、ｚｃｙｔｏｒ１７結合及びシグナルトランスダクションをインビトロ及びインビボで阻止するために、ｚｃｙｔｏｒ１７ “アンタゴニス”として使用することができる。それらの抗−ｚｃｙｔｏｒ１７結合ペプチドは、ｚｃｙｔｏｒ１７と結合するリガンドの作用を阻害するために有用である。
【０２９０】
抗体は、１）それらが限界レベルの結合活性を示す場合、及び２）それらが関連するポリペプチド分子と有意に交差反応しない場合、特異的に結合すると考えられる。限界レベルの結合は、本明細書における抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体が対照（非−マウスｚｃｙｔｏｒ１０）ポリペプチドへの結合親和性よりも少なくとも１０倍高い親和性を伴って、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチド、ペプチド又はエピトープに結合するかどうか決定される。好ましくは、抗体は、１０６Ｍ−１又はそれ以上、好ましくは１０７Ｍ−１又はそれ以上、より好ましくは１０８Ｍ−１又はそれ以上、及び最も好ましくは１０９Ｍ−１又はそれ以上の結合親和性（Ｋａ）を示す。抗体の結合親和性は、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ 分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ， Ｇ．， Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ５１： ６６０−６７２， １９４９）を用いて、当業者によって容易に決定され得る。
【０２９１】
抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体は関連するポリペプチド分子と有意に交差反応しないかどうかは、例えば、標準のウェスターンブロット分析を用いて、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドであるが、しかし知られていない関連するポリペプチドを検出する抗体により示される（Ａｕｓｕｂｅｌ など．， 前記）。既知の関連するポリペプチドの例は、従来技術に開示されているそれらのもの、例えば既知のオルト体及びパラ体、及びタンパク質ファミリーの類似する既知メンバー（例えば、ｇｐ１３０， ＬＩＦ， ＷＳＸ−１及びＩＬ１２受容体）である。スクリーニングはまた、非ヒトｚｃｙｔｏｒ１７及びｚｃｙｔｏｒ１７変異体ポチペプチドを用いて行われ得る。さらに、抗体は、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドに対して特異的に結合する集団を単離するために、既知の関連するポリペプチドに“対してスクリーンされ得る”。
【０２９２】
例えば、ｚｃｙｔｏｒ１７に対して生ぜしめられた抗体は不溶性マトリックスに付着される関連するポリペプチドに吸着され；ｚｃｙｔｏｒ１７に対して特異的な抗体は適切な緩衝液条件下で前記マトリックスを通して流れるであろう。スクリーニングは、既知の溶接に関連するポリペプチドに対して交差反応しないポリクローナル及びモノクローナル抗体の単離を可能にする（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （ｅｄｓ．）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８８； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｏｌｉｇａｎ， など． （ｅｄｓ．）， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９５）。
【０２９３】
特異的抗体のスクリーニング及び単離は当業界において当業界において良く知られている。Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｐａｕｌ （ｅｄｓ．）， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， １９９３； Ｇｅｔｚｏｆｆなど．， Ａｄｖ．ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４３： １−９８， １９８８； Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｇｏｄｉｎｇ， Ｊ．Ｗ． （ｅｄｓ．）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．， １９９６； Ｂｅｎｊａｍｉｎ など．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２： ６７−１０１， １９８４を参照のこと。特異的に結合する抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体は、当業界において知られており、そして下記に開示される多くの方法により検出され得る。
【０２９４】
当業者に知られている種々のアッセイがｚｃｙｔｏｒ１７タンパク質又はペプチドに特異的に結合する抗体を検出するために使用され得る。典型的なアッセイは、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ ｌａｎｅ （Ｅｄｓ．）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｅｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８８ に詳細に記載されている。そのようなアッセイの代表的な例は次のものを包含する：同時免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、ラジオイムノ沈殿、酵素結合の免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロット又はウェスターンブロットアッセイ、阻害又は競争アッセイ、及びサンドイッチアッセイ。さらに、野生型対変異体のｚｃｙｔｏｒ１７タンパク質又はペプチドに結合する抗体がスクリーンされ得る。
【０２９５】
ｚｃｙｔｏｒ１７に対する抗体は、ｚｃｙｔｏｒ１７を発現する細胞、例えばｚｃｙｔｏｒ１７を天然において発現する細胞、例えば単球及び前立腺細胞、及びｚｃｙｔｏｒ１７により形質転換される細胞を標識するために；アフィニティー精製によりｚｃｙｔｏｒ１７を単離するために； ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドの循環レベルを決定するための診断アッセイのために；根本的な病理学又は疾病のマーカーとして可溶性ｚｃｙｔｏｒ１７を検出し又は定量化するために；ＦＡＣＳ を使用する分析方法において、発現ライブラリーをスクリーニングするために；抗−インディオタイプ抗体を生成するために；及びインビトロでｚｃｙｔｏｒ１７活性を阻止するための中和抗体又はアンタゴニスとして使用され得る。
【０２９６】
適切な直接的標識又はラベルは、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子及び同様のものを包含し；間接的な標識又はラベルは、中間体としてのビオチン−アビジン又は他の補体／抗−補体対の使用を特徴とする。本発明書における抗体及び結合タンパク質はまた、薬物、トキシン、放射性核種、及び同様のものに直接的に又は間接的に接合され得、そしてそれらの接合体はインビボ診断又は治療用途のために使用され得る。さらに、ｚｃｙｔｏｒ１７又はそのフラグメントに対する抗体は、アッセイ、例えば当業界において知られているウェスターンブロット又は他のアッセイにおいて、変性されたｚｃｙｔｏｒ１７又はそのフラグメントを検出するためにインビトロで使用され得る。
【０２９７】
ｚｃｙｔｏｒ１７に対する抗体は、受容体を発現する細胞を標識し、そしてｚｃｙｔｏｒ１７発現レベルをアッセイするために、可溶性受容体ポリペプチドの循環レベルを決定するために診断アッセイ内での親和性精製のために、蛍光−活性化された細胞分類を用いる分析方法のために有用である。二価抗体は、ｚｃｙｔｏｒ１７リガンドの効果を模倣するアゴニストとして使用され得る。
【０２９８】
本明細書における抗体はまた、薬剤、トキシン、放射性核種及び同様のものに直接的に又は間接的に接合され得、そしてそれらの接合体は、治療用途を研究するためのネズミモデルにおいて、又は治療の用途において、インビボ診断のために使用される。例えば、本発明のｚｃｙｔｏｒ１７を認識する抗体又は結合ポリペプチドは、対応する抗−相補的分子（すなわち、ｚｃｙｔｏｒ１７受容体）を発現する組織又は器官を同定し、又は処理するために使用され得る。より特定には、抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体又はその生物活性フラグメント又は一部が、検出可能な又は細胞毒性の分子に連結され、そしてｚｃｙｔｏｒ１７分子を発現する細胞、組織又は器官を有する哺乳類に供給され得る。
【０２９９】
適切な検出可能分子は、ｚｃｙｔｏｒ１７（上記に開示される結合ペプチドを包含する“結合ポリペプチド”、抗体、又はその生物活性フラグメント又は一部に直接的に又は間接的に結合され得る。適切な検出可能分子は、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子、及び同様のものを包含する。適切な細胞毒性分子は、ポリペプチド又は抗体に直接的に又は間接的に結合され得、そして細菌又は植物毒性（例えば、ジフテリア毒素、プソイドモナシス内毒素、リシン、アブリン及び同様のもの）、及び治療用放射性核種、例えばＩ−１３１、レニウム−１８８又はイットニウム−９０（ポリペプチド又は抗体に直接的に結合されるか、又はキレ−ト成分により間接的に結合される）を包含する。
【０３００】
結合ポリペプチド又は抗体はまた、細胞毒性薬物、例えばアドリアマイシンに結合され得る。検出可能又は細胞毒性分子の間接的な結合に関しては、検出可能又は細胞毒性分子は相補的／抗相補的対のメンバーにより結合され得、ここで他のメンバーは結合ポリペプチド又は抗体部分に結合される。それらの目的のためには、ビオチン／ストレプタビジンが典型的な相補的／抗相補的対である。
【０３０１】
もう１つの態様においては、結合ポリペプチド−毒素融合タンパク質又は抗体−毒素融合タンパク質は、標的化された細胞又は組織阻害又は除去（例えば、癌細胞又は組織を処理するために）のために使用され得る。他方では、結合ポリペプチドが複数の機能ドメイン（すなわち、活性化ドメイン又はリガンド結合ドメイン、及び標的化ドメイン）を有する場合、標的化ドメインのみを包含する融合タンパク質は、検出可能分子、細胞毒性分子又は相補的分子を、興味ある細胞又は組織型に向けるために適切である。例えば、単一のドメインのみのを包含する融合タンパク質が相補的分子を含む場合、抗−相補的分子は検出可能又は細胞毒性分子に接合され得る。従って、そのようなドメイン−相補的分子融合タンパク質は、一般的抗−相補的−検出可能／細胞毒性分子接合体のための一般的標的化ビークルを表す。
【０３０２】
もう１つの態様においては、ｚｃｙｔｏｒ１７−サイトカイン融合タンパク質又は抗体−サイトカイン融合タンパク質は、結合ポリペプチドサイトカイン又は抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体が過剰増殖性細胞を標的化する場合、標的組織（例えば、血液、リンパ球、結腸及び骨髄癌）のインビボ殺害を増強するために使用され得る（一般的には、Ｈｏｒｎｉｃｋなど．， Ｂｌｏｏｄ ８９： ４４３７−４４４７， １９９７を参照のこと）。記載される融合タンパク質は、作用の所望する部位へのサイトカインの標的化を可能にし、それにより、サイトカインの高められた局部濃度を提供する。適切な抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体は、所望しない細胞又は組織（例えば、腫瘍又は白血病）を標的化し、そして融合されたサイトカインはエフェクター細胞による改良された標的細胞溶解を仲介する。例えば、この目的のための適切なサイトカインは、インターロイキン−２及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＭ）を包含する。
【０３０３】
他方では、本明細書に記載されるｚｃｙｔｏｒ１７結合ポリペプチド又は抗体融合タンパク質は、ｚｃｙｔｏｒ１７−調節されたアポプトシス経路を直接的に刺激することにより、標的組織のインビボ殺害の増強のために使用され、ｚｃｙｔｏｒ１７を発現する高増殖性細胞の細胞死がもたらされる。
本明細書に記載される生物活性結合ポリペプチド又は抗体接合体は、経口、静脈内、動脈内又は管内供給され得、又は作用の意図された部位に局部的に導入され得る。
【０３０４】
サイトカイン受容体に結合する４−ヘリックス束サイトカイン、及び活性化されたリンパ球により生成される他のタンパク質は、身体を通して細胞の分化、活性化、レクルートメント及び恒常性において重要な生物学的役割を演じる。治療有用性は、免疫調節を必要とする疾病、例えば自己免疫疾患、例えばリウマチ様関節炎、多発生硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス及び糖尿病の処理を包含する。
【０３０５】
ｚｃｙｔｏｒ１７受容体アンタゴニスト又はアゴニスト、例えば可溶性受容体、抗−受容体抗体及び天然リガンドは、炎症の調節において重要であり、そして従って、リウマチ様関節炎、ぜん息、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、クローン症、膵炎及び敗血症の処理において有用である。腫瘍細胞殺害の仲介においてｚｃｙｔｏｒ１７アンタゴニスト又はアゴニスト、例えば可溶性受容体、抗−受容体抗体及び天然リガンドの役割が存在し、そして従って、癌の処理において有用である。ｚｃｙｔｏｒ１７アンタゴニスト又はアゴニスト、例えば可溶性受容体、抗−受容体抗体及び天然リガンドは、移植片拒絶を低めるために、又は対宿主性移植片病の予防において重要である免疫系の抑制において有効的な治療剤である。
【０３０６】
他方では、ｚｃｙｔｏｒ１７アンタゴニスト又はアゴニスト、例えば可溶性受容体、抗−ｚｃｙｔｏｒ１７受容体抗体及び天然リガンドは、感染性疾病に対する免疫性を高めることにおいて、免疫無防備状態の患者、例えばＨＩＶ＋患者の処理において、又はワクチンを改良することにおいて重要である免疫系を活性化することができる。特に、ｚｃｙｔｏｒ１７アンタゴニスト又はアゴニスト、例えば可溶性受容体、及び天然リガンドは、ＮＫ細胞又はそれらの前駆体を、調節し、刺激又は拡張し、そしてウィルス感染の処理において治療的価値を、及び抗−腫瘍因子として提供する。ＮＫ細胞は転移性腫瘍細胞の排除において重要な役割を演じると思われ、そして転移及び固形腫瘍を有する患者は、低められたレベルのＮＫ細胞活性を有する（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅなど．， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２３０： ２２１−２４４， １９９８）。
【０３０７】
ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ｚｃｙｔｏｒ１７活性を高め、又は阻害することが所望される遺伝子治療用途内で有用である。哺乳類が突然変異誘発されたｚｃｙｔｏｒ１７遺伝子を有するか、又はそれを欠いている場合、ｚｃｙｔｏｒ１７遺伝子が哺乳類の細胞中に導入され得る。１つの態様においては、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドをコードする遺伝子がウィルスベクターにおいてインビボで導入される。そのようなベクターは、弱毒化された又は欠陥ＤＮＡウィルス、例えばヘルペス単純ウィルス（ＨＳＶ）、乳頭種ウィルス、エプスタイン−バールウィルス（ＥＢＶ）、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）及び同様のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０３０８】
ウィルス遺伝子を完全に又はほとんど完全に欠いている欠陥ウィルスが好ましい。欠陥ウィルスは、細胞中への導入の後、感染性ではない。欠陥ウィルスベクターの使用は、ベクターが他の細胞を感染することを心配しないで、特定の局在化された領域における細胞への投与を可能にする。特定のベクターの例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：欠陥ヘルペスウィルス１（ＨＳＶ１）ベクター（Ｋａｐｌｉｔｔ など．， Ｍｏｌｃ． Ｃｅｌｌ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２： ３２０−３０， １９９１）、弱毒化されたアデノウィルス　ベクター、例えばＳｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄａｔ など． （Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９０： ６２６−３０， １９９２） により記載されるベクター、及び欠陥アデノ−関連ウィルスベクター（Ｓａｍｕｌｓｋｉ など．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１： ３０９６−１０１， １９８７； Ｓａｍｕｌｓｋｉ など．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３： ３８２２−２８，１９８９）。
【０３０９】
もう１つの態様においては、ｚｃｙｔｏｒ１７遺伝子は、次の文献に記載のようにして、レトロウィルスベクターに導入され得る：Ａｎｄｅｒｓｏｎ など．， アメリカ特許第５，３９９，３４６号；Ｍａｎｎ など．， Ｃｅｌｌ ３３： １５３， １９８３； Ｔｅｍｉｎ など．， アメリカ特許第４，６５０，７６４号；Ｔｅｍｉｎ など．， アメリカ特許第４，９８０，２８９号；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ など．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２： １１２０， １９８８； Ｔｅｍｉｎ など．， アメリカ特許第５，１２４，２６３ 号；Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ など．， ＷＩＰＯ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ９５／０７３５８ 号；及びｋｕｏ など．， Ｂｌｏｏｄ ８２： ８４５−５２， １９９３。 他方では、ベクターは、リポソームを用いてのインビボリポフェクションにより導入され得る。
【０３１０】
合成カチオン脂質が、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製するために使用され得る（Ｆｅｌｇｎｅｒ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４： ７４１３−１７， １９８７； 及びＭａｃｋｅｙ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ８０２７−３１， １９８８）。インビボで特定の器官中に外因遺伝子を導入するためへのリポフェクションの使用は、一定の実際的な利点を有する。特定細胞へのリポソームの分子標的化は、１つの領域の利点を表す。
【０３１１】
より特定には、特定細胞へのトランスフェクションの方向づけは、１つの有益な分野を提供する。例えば、特定細胞型へのトランスフェクションの方向づけが、細胞異質性を有する組織、例えば膵臓、肝臓、腎臓及び脳において特に好都合であることは明白である。脂質は、標的化のために他の分子に科学的に得られる。標的化されたペプチド、例えばホルモン又は神経伝達物質、及びタンパク質、例えば抗体又は非ペプチド分子は、化学的にリポソームに結合され得る。
【０３１２】
身体から細胞を除去し、そして裸ＤＮＡプラスミドとしてベクターを導入し、そして次に、身体中に形質転換された細胞を再移植することは可能である。遺伝子治療のための裸ＤＮＡベクターは、所望する宿主細胞中に、当業界において知られている方法、例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子ガンの使用、又はＤＮＡベクタートランスポーターの使用により導入され得る（例えば、Ｗｕ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７： ９６３−７， １９９２； Ｗｕ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３： １４６２１−２４， １９８８）。
【０３１３】
アンチセンス方法は、ｚｃｙｔｏｒ１７遺伝子転写を阻害するために、例えばインビボでの細胞増殖を阻害するために使用され得る。ｚｃｙｔｏｒ１７−コードのポリヌクレオチドのセグメントに対して相補的であるポリヌクレオチド（例えば、配列番号１、４５、５３又は５７に示されるようなポリヌクレオチド）は、ｚｃｙｔｏｒ１７−コードのｍＲＮＡに結合し、そしてそのようなｍＲＮＡの翻訳を阻害するよう企画される。そのようなアンチセンスポリヌクレオチドは、細胞培養物、又は対象において、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチド−コードの遺伝子の発現を阻害するために使用される。
【０３１４】
さらに、細胞表面分子として、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドは、細胞中に遺伝子療法を導入するための標的物として使用され得る。この用途は、ｚｃｙｔｏｒ１７が通常発現される細胞、例えばリンパ組織、骨髄、前立腺、甲状腺、単球及びＰＢＬ、又はｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドを発現できる癌細胞中に治療遺伝子を導入するために、特に適切である。例えば、上記のようなウィルス遺伝子療法は、ウィルス受容体よりもむしろ細胞受容体、例えばｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドを発現する特定の細胞型に標的化され得る。抗体、又は標的細胞表面上のｚｃｙｔｏｒ１７分子を認識する他の分子が、ウィルスの感染を方向づけ、そして標的細胞に遺伝子治療材料を投与するために使用され得る。
【０３１５】
ＷＯＯ， Ｓ．Ｌ．Ｃ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ， １４： １５３８， １９９６； Ｗｉｃｋｈａｍ， Ｔ．Ｊ． など．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １４： １５７０−１５７３， １９９６； Ｄｏｕｇｌａｓ， Ｊ．Ｔ． など．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １４： １５７４−１５７８， １９９６； Ｒｉｈｏｖａ， Ｂ．， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７： １４９−１６９， １９９７； 及びＶｉｌｅ， Ｒ．Ｇ． など．， Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． Ｔｏｄａｙ ４： ８４−９２， １９９８を参照のこと。例えば、ｚｃｙｔｏｒ１７−特異的抗体に結合されるウィルス−中和性Ｆａｂフラグメントを含むニ特異的抗体が、ｚｃｙｔｏｒ１７受容体を発現する細胞にウィルスを方向づけ、そして遺伝子要素を含むウィルスの細胞中への効果的侵入を可能にするために使用され得る。例えば、Ｗｉｃｋｈａｍ， Ｔ．Ｊ． など．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１： ７６６３−７６６９， １９９７； 及びＷｉｃｋｈａｍ， Ｔ．Ｊ．， など．， Ｊ． Ｖｉｒｏ． ７０：６８３１−６８３８， １９９６ を参照のこと。
【０３１６】
さらに、抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体及び結合フラグメントは、ｚｃｙｔｏｒ１７を特異的に発現する細胞、例えば本明細書に記載される、単核細胞、リンパ細胞、例えば非活性化された及び活性化された単球細胞、例えば活性化されたＣＤ３＋、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞、ＣＤ１９＋ Ｂ−細胞、及び他の細胞を標的化し、そして分類するために使用され得る。そのような細胞標的化及び分類方法は、当業界において良く知られている（例えば、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ”， ３ｒｄ Ｅｄ．， Ａｌｂｅｒｔ， Ｂ． など． （Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｌｏｎｄｏｎ ＆ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９４を参照のこと）。当業者は、細胞を研究するための細胞組織型の分離の重要性及び特定の細胞組織型の分離のためへの抗体の使用を認識するであろう。
【０３１７】
基本的には、細胞型の表面に結合する抗体は、抗体により認識される細胞のみが付着するであろう親和性表面を形成するために、種々のマトリックス、例えばコラーゲン、多糖ビーズ又はプラスチックにカップリングされる。次に、結合された細胞は、従来の技術により回収される。他の方法は、蛍光活性化された細胞ソーター（ＦＡＣＳ）による細胞の分離を包含する。この技法においては、蛍光色素に結合される抗体により細胞をラベリングする。次に、ラベルされた細胞は、ＦＡＣＳ機械によりラベルされていない細胞から分離される。ＦＡＣＳ分離においては、単一の列で移動する個々の細胞が、レーザービームを通過し、そして個々の細胞の蛍光が測定される。
【０３１８】
わずかにさらなる下流の小滴（ほとんどは、１つの細胞を含むか又はまったく含まない）が、振動ノズルにより形成される。単一の細胞を含むその小滴は、それらが含む細胞が蛍光であるかどうかに依存して、形成の瞬間で、正又は負の電荷を自動的に付与され、そして次に、強い電界により適切な容器中に偏向される。そのような機械は、１０００の細胞のうち１つを選択し、そして１秒当たり約５０００個の細胞を分類できる。これは、細胞培養物について均等な細胞集団を生成する。
【０３１９】
当業者は、本発明のｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドに対する抗体は、必ずしもすべての組織型がｚｃｙｔｏｒ１７受容体を発現せず、そして生物学者がさらなる研究及び／又は身体中への治療的再移植のために特定の細胞型を分離することができることは重用であるので、有用である。これは、細胞、例えばｚｃｙｔｏｒ１７が発現される免疫細胞において特に適切である。
【０３２０】
本発明はまた、診断用途に使用される試薬を提供する。例えば、ｚｃｙｔｏｒ１７遺伝子、すなわちｚｃｙｔｏｒ１７ ＤＮＡ又はＲＮＡ又はその副配列を含んで成るプローブは、ｚｃｙｔｏｒ１７遺伝子が染色体５上に存在するかどうか、又は突然変異が生じたかどうかを決定するために使用され得る。ｚｃｙｔｏｒ１７は染色体５の５ｑ１１領域に存在する（例４を参照のこと）。ｚｃｙｔｏｒ１７遺伝子座での検出できる染色体異常型は、異数性、遺伝子コピー数変化、異種性の損失（ＬＯＨ）、トランスロケーション、挿入、欠失、制限部位変更及び転位を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０３２１】
それらの異常性は、コード配列内、イントロン内、又は上流のプロモーター及び調節領域を包含するフランキング配列内で発生することができ、そしてコード配列内での物理的変更、又は遺伝子発現レベルでの変化として明らかである。そのような異常性は、分子遺伝学的技法、例えば制限フラグメント長さ多型現象（ＲＥＬＰ）分析、蛍光現場ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ技法を用いる短いタンデム反復体（ＳＴＲ）分析、及び当業界において知られている他の遺伝子連鎖分析技法を用いることによって、本発明のポリヌクレオチドを用いて検出され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．， 前記；Ａｕｓｕｂｅｌ など．， 前記；Ｍａｒｉａｎ， Ｃｈｅｓｔ １０８： ２５５−６５， １９９５）。
【０３２２】
遺伝子位置の正確な知識は、次のような多くの目的のために有用である：１）配列が存在するコンティグの一部であるかどうかの決定及び種々の形、例えばＹＡＣ， ＢＡＣ又はｃＤＮＡクローンにおける追加の周囲遺伝子配列の獲得；２）同じ染色体領域への結合を示す遺伝的な疾病についての可能な候補体遺伝子の提供；及び３）特定遺伝子が有する機能の決定を助けるモデル生物、例えばマウスの相互参照。
【０３２３】
ｚｃｙｔｏｒ１７遺伝子は、染色体５の５ｑ１１領域に位置する。既知機能のいくつかの遺伝子はこの領域に位置する。例えば、密接に関連するクラスＩサイトカイン受容体ｇｐ１３０はまた、染色体５ｑ１１に位置し、このことは、５ｑ１１領域がサイトカイン受容体発現のための重要な領域であることを示唆する。ｚｃｙｔｏｒ１７は５ｑ１１染色体領域（ｑ−アーム上の動原体の第１の遠位領域）に位置し、そしてｇｐ１３０はｚｃｙｔｏｒ１７から約９２．７ｋｂの遠位に存在すると思われる。さらに、密接に関連するクラスＩサイトカイン受容体ＬＩＦＲは、５ｐ１３−ｐ１２領域におけるｐ−アーム上の動原体のすぐ他の側上に位置する。
【０３２４】
ｇｐ１３０サイトカイン受容体は、サイトカイン、例えばＩＬ−６、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）及び繊毛好中球因子（ＣＮＴＦ）によるシグナル化を可能にするヘテロダイマー複合体を形成するために、いくつかの他のサイトカイン受容体により共有される。さらに、ｇｐ１３０は、シグナル化するためにｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドと共に、ヘテロダイマー、トリマー（例えば、ｇｐ１３０＋ＬＩＦ因子を有する）、又はマルチマー複合体を形成することができる。さらに、本明細書に論じられるように、サイトカイン受容体、例えばｚｃｙｔｏｒ１７及びｇｐ１３０は、免疫細胞機能、移動、炎症及び同様のものにおいて重要な役割を演じる。ｚｃｙｔｏｒ１７ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体は、ｚｃｙｔｏｒ１７遺伝子又はタンパク質における欠陥、又は染色体５の５ｑ１１領域での周囲の染色体領域における欠陥を検出するための診断物としての主要な使用を提供する。
【０３２５】
さらに、いくつかの疾病関連遺伝子が、ヒト障害に関連する５ｑ１１領域において密集する。当業者は、５ｑ１１におけるマーカー、例えば本発明のｚｃｙｔｏｒ１７ポリヌクレオチドが、５ｑ１１におけるその周囲の異常がヒト疾病に関連することが知られているので、ヒト疾病に関連する染色体異常の検出において有用であるこをを認識するであろう。例えば、５ｑ１１−ｑ１３．３重複、部分的トリソミー及びトランスロケーションは、複数の異常性、例えば精神分裂症、すなわち通常の精神病に関連している。さらに、Ｍａｒｏｔｅａｕｘ−Ｌａｍｙ症候群、又はムコ多糖ＶＩ型（５ｑ１１−ｑ１３）及びＫｌｉｐｐｅｌ−Ｆｅｉｌ症候群（５ｑ１１．２）が、この遺伝子座でのトランスロケーションに関連している。
【０３２６】
さらに、それらの疾病は、５ｑ１１領域染色体の大きな染色体転位、例えば染色体重複、トランスロケーション又は異質性の損失に連結される。本明細書に記載される当業界において知られている方法と共に、本発明のポリヌクレオチドを用いて、５ｑ１１での又はその周囲でのそのような転位が検出され得る。さらに、他の遺伝子座の中で、裂手／足奇形、１型（ＳＨＦＭ１）（５ｑ）、 Ｓａｎｄｈｏｆｆ病（５ｑ１３）、グルココルチコイド受容体（５ｑ３１）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）（５ｑ１１．２−ｑ１３．２）、脊椎筋アトピー（５ｑ１２．２−ｑ１３．３）、及び下垂体ホルモン欠損（５ｑ） についてのそれらの遺伝子座は、すべてヒト疾病において明白であり、そしてヒトゲノムのこの領域に位置する。
【０３２７】
ＷＷＷサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｈｔｂｉｎ−ｐｏｓｔ／ｏｍｉｍ／ｇｅｔｍａｐ？ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ＝５ｑ１１及び周囲の遺伝子座）上の染色体３の２の領域について、Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｏｆ Ｍａｎ （ＯＭＩＭ） 遺伝子地図を参照のこと。それらのすべては、ｚｃｙｔｏｒ１７遺伝子と同じ染色体領域への連鎖を示す遺伝性疾病についての可能性ある候補体遺伝子として作用する。
【０３２８】
同様に、ｚｃｙｔｏｒ１７遺伝子座自体における欠陥は、本明細書に論じられるような遺伝性ヒト疾病状態をもたらすことができる。当業者は、サイトカイン受容体の欠陥がヒトにおける疾病状態を引き起こすことが知られていることを理解するであろう。例えば、成長ホルモン受容体突然変異は、小人症をもたらし（Ａｍｓｅｌｅｍ， Ｓなど．， Ｎｅｗ Ｅｎｇ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２１： ９８９−９９５， １９８９）、ＩＬ−２受容体γ突然変異は重度の組合された免疫欠損（ＳＣＩＤ）をもたらし（Ｎｏｇｕｃｈｉ， Ｍなど．， Ｃｅｌｌ ７３： １４７−１５７， １９９３）、ｃ−Ｍｐｌ突然変異は血小板減少をもたらし（Ｉｈａｒａ， Ｋなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９６： ３１３２−３１３６， １９９９）、そして重度のマイコバクテリア及びサルモネラ感染がインターロイキン−１２受容体−欠失患者をもたらす（ｄｅ Ｊｏｎｇ， Ｒなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０： １４３５−１４３９， １９９８）。
【０３２９】
従って、同様に、ｚｃｙｔｏｒ１７における欠陥は、疾病状態、又は疾病又は感染に対する敏感性を引き起こすことができる。ｚｃｙｔｏｒ１７遺伝子は５ｑ１１領域ｚｃｙｔｏｒ１７に位置するので、ポリヌクレオチドプローブは、ヒト疾病、例えば免疫細胞癌、骨髄癌、前立腺癌、甲状腺、上皮小体又は他の癌、又は免疫疾患に関連する、染色体５ｑ１１損失、トリソミー、重複又はトランスロケーションを検出するために使用され得る。さらに、本発明の分子、例えば本発明のポリペプチド、アンタゴニスト、アゴニスト、ポリヌクレオチド及び抗体は、ｚｃｙｔｏｒ１７遺伝子欠陥に関連する、検出、診断予防及び処理を助けるであろう。
【０３３０】
本発明の分子、例えば本発明のポリペプチド、アンタゴニスト、アゴニスト、ポリヌクレオチド及び抗体は、ｚｃｙｔｏｒ１７遺伝子欠陥に関連する、検出、診断予防及び処理を助けるであろう。
【０３３１】
診断は、疾病のタイプ及び適切な関連する治療の決定において医者を助けることができるか、又は遺伝的カウンセリングを助けることができる。それ自体、本発明の抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体、ポリヌクレオチド及びポリペプチドは、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチド、ｍＲＮＡ又は抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体の検出のために使用され、従って当業界において知られており、そして本明細書において記載される方法を用いて、本明細書に記載されるようにして、遺伝的疾病又は癌の検出のためのマーカーとして作用し、そしてそのために直接的に使用される。
【０３３２】
さらに、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリヌクレオチドプローブは、ヒト疾病に関連する染色体５ｑ１１欠失及びトランスロケーション、又は悪性又は他の癌における染色体転位に関与することが予測される、腫瘍の悪性進行又は他の５ｑ１１突然変異に関与する他のトランスロケーションに関連する異常性又は遺伝子型を検出するために使用され得る。同様に、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリヌクレオチドプローブが、染色体１２ｑ１５三染色体性、及びヒト疾病又は自然流産に関連する染色体欠失に関連する異常性又は遺伝子型を検出するために使用され得る。従って、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリヌクレオチドプローブは、それらの欠陥の関連する異常性又は遺伝子型を検出するために使用され得る。
【０３３３】
上記で論じられるように、ｚｃｙｔｏｒ１７遺伝子自体における欠陥は、遺伝性ヒト疾病状態をもたらすことができる。本発明の分子、例えば本発明のポリペプチド、アンタゴニスト、アゴニスト、ポリヌクレオチド及び抗体は、ｚｃｙｔｏｒ１７遺伝子欠陥に関連する疾病の検出、診断予防及び処理を助ける。さらに、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドプローブは、ｚｃｙｔｏｒ１７染色体遺伝子座で、疾病又は非疾病の個人間での対立遺伝子差異を検出するために使用され得る。それ自体、ｚｃｙｔｏｒ１７配列は、法的なＤＮＡプロフィーリングにおける診断として使用され得る。
【０３３４】
一般的に、患者における遺伝子異常性又は異常型を検出するために遺伝子連鎖分析に使用される診断方法は、当業界において知られている。分析用プローブは一般的に、少なくとも２０個の長さのｎｔを有するが、但し幾分短いプローブも使用され得る（例えば、１４−１７ｎｔ）。ＰＣＲプライマーは、少なくとも５個の長さのｎｔ、好ましくは１５又はそれ以上の長さのｎｔ、より好ましくは２０−３０個の長さのｎｔである。遺伝子又は染色体ＤＮＡの全体的な分析のために、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリヌクレオチドプローブは、完全なエキソン又はそれ以上を含むことができる。エキソンは、ｚｃｙｔｏｒ１７配列（配列番号５４）とｚｃｙｔｏｒ１７についてのヒトゲノムＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＣ００２７８１号）とを比較することによって、容易に決定される。
【０３３５】
一般的に、患者における遺伝子異常性又は異常型を検出するために遺伝子連鎖分析に使用される診断方法は、当業界に知られている。ほとんどの診断方法は、（ｉ）潜在的に疾病の患者、疾病の患者又は劣性疾病対立遺伝子の可能性ある非疾病キャリヤーから遺伝子サンプルを得；（ｉｉ）ｚｃｙｔｏｒ１７ポリヌクレオチドプローブと共に遺伝子サンプルをインキュベートすることにより（ここで、前記ポリヌクレオチドは、ＲＦＩＰ分析においては、相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするであろう）、又は適切なＰＣＲ反応条件下でＰＣＲ反応において、センス及びアンチセンスプライマーと共に遺伝子サンプルをインキュベートすることにより、第１反応生成物を生成し；
【０３３６】
（ｉｉｉ）前記第１反応生物を、電気泳動及び／又は他の既知方法により可視化し、例えば、前記第１反応生成物を、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリヌクレオチドプローブ（ここで、前記ポリヌクレオチドは第１反応の相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするであろう）により可視化し、そして（ｉＶ）正常又は対照の個人からの遺伝子サンプルの第２対照反応生成物と、前記可視化された第１反応生成物とを比較する段階を含んで成る。
【０３３７】
第１反応生成物と対照反応生成物との間の差異は、疾病又は潜在的に疾病の患者における遺伝子異常性の、又は非疾病患者についてのヘテロ接合性劣性キャリヤー表現型の存在の、又は疾病患者からの腫瘍における遺伝子欠陥の存在の、又は胎児又は移植前胚における遺伝子異常性の存在の表示である。例えば、制限フラグメントパターン、ＰＣＲ生成物の長さ、ｚｃｙｔｏｒ１７遺伝子座の反復性配列の長さ、及び同様のもの差異は、遺伝子異常性、遺伝子異常型、又は正常な対照に比較しての対立遺伝子差異の表示である。対照は、サンプルの試験及び利用性に依存して、影響されていないファミリーメンバー又は無関係の個人からであり得る。
【０３３８】
本発明内への使用のための遺伝子サンプルは、患者からのいずれかの組織又は他の生物学的サンプル、例えば血液、唾液、精子、胚細胞、羊水及び同様のもの（但し、それらだけには限定されない）から単離されたゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡを包含する。ポリヌクレオチドプローブ又はプライマーは、ＲＮＡ又はＤＮＡであり得、そして配列番号１、４５又は５３の一部、配列番号１、４５又は５３の補体、又はそれらのＲＮＡ同等物を含んで成る。ヒト疾病表現型ヘの遺伝子連鎖分析を示すそのような方法は、当業界において良く知られている。
【０３３９】
診断における、ＰＣＲに基づく方法の参照のためには、一般的、次の文献を参照のこと：Ｍａｔｈｅｗ （ｅｄ．）， Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９１）， Ｗｈｉｔｅ （ｅｄ）， ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ， １９９３）， Ｃｏｔｔｅｒ （ｅｄ）， ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９６）， Ｈａｎａｕｓｅｋ ａｎｄ Ｗａｌａｓｚｅｋ （ｅｄｓ．）， Ｔｕｍｏｒ Ｍａｒｋｅｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ。（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９８）． Ｌｏ （ｅｄ）， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９８）， 及びＭｅｌｔｚｅｒ （ｅｄ）， ＰＣＲ ｉｎ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ． Ｉｎｃ． １９９８））。
【０３４０】
ｚｃｙｔｏｒ１７遺伝子座に関連する突然変異は、直接的名突然変異分析のための標準の方法、例えば制限フラグメント長さ他型現象分析、ＰＣＲ技法を用いる短いタンデム反復体分析、増幅−不応性突然変異システム分析、一本鎖コンホメーション多型現象検出、ＲＮアーゼ切断方法、変性グラジエントゲル電気泳動、蛍光−助力のミスマッチ分析、及び当業界において知られている他の遺伝子分析により、本発明の核酸分子を用いて検出され得る
【０３４１】
（例えば、Ｍａｔｈｅｗ （ｅｄ．）， Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ． Ｉｎｃ． １９９１）， Ｍａｒｉａｎ， Ｃｈｅｓｔ １０８：２５５ （１９９５）， Ｃｏｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｔｓｏｎｇａｌｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃｓ （Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９６）， Ｅｌｌｅｓ （ｅｄ．） Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９６）， Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ （ｅｄ．）， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９６）， Ｂｕｒｒｅｎ など． （ｅｄｓ．）， Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｖｏｌ． ２： Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９９８）， Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ など． （ｅｄｓ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９８）， 及びＲｉｃｈａｒｄｓ ａｎｄ Ｗａｒｄ， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｔｅｓｔｉｎｇ，” ｉｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｐａｇｅｓ ８３−８８ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓａ． Ｉｎｃ． １９９８） を参照のこと）。
【０３４２】
突然変異についてのｚｃｙｔｏｒ１７遺伝子の直接的な分析は、対象のゲノムＤＮＡを用いて行われ得る。末梢血液リンパ球から得られるゲノムＤＮＡを増幅するための方法は、当業者に良く知られている（例えば、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉなど． （ｅｄｓ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ａｔ ｐａｇｅ ７．１．６ ｔｏ ７．１．７ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９８） を参照のこと）。
【０３４３】
“トランスジェニックマウス”として言及される、ｚｃｙｔｏｒ１７遺伝子を発現するように構築されたマウス、及び“ノックアウトマウス”として言及される、ｚａｌｐｈａ１１リガンド遺伝子機能の完全な不在を示すマウスがまた、生成され得る（Ｓｎｏｕｗａｅｒｔなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７： １０８３， １９９２； Ｌｏｗｅｌｌなど．， Ｎａｔｕｒｅ ３６６： ７４０−７４２， １９９３； Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４： １２８８−１２９２， １９８９； Ｐａｌｍｉｔｅｒなど．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ２０： ４６５−４９９， １９８６）。例えば、偏在的に、又は組織−特異的又は組織−制限されたプロモーター下でｚｃｙｔｏｒ１７を過剰発現するトランスジェニックマウスは、過剰発現が表現型を引き起こすかどうかを決定するために使用さえ得る。
【０３４４】
例えば、野生型ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチド、そのポリペプチドフラグメント又は変異体の過剰発現は、正常な細胞工程を変更することができ、ｚｃｙｔｏｒ１７発現が機能的に適切であり、そしてｚｃｙｔｏｒ１７、そのアゴニスト又はアンタゴニストのための治療標的物を示すことができる組織を同定する表現型をもたらす。例えば、構築する好ましいトランスジェニックマウスは、“優性−陰性”表現型を発現するマスス、例えば結合されるトランスメンブランドメインと共に細胞外サイトカイン結合ドメインを含んで成るｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチド（配列番号２及び４６のアミノ酸２０（Ａｌａ）〜５４３（Ｌｅｕ）；又は配列番号５４の３３（Ａｌａ）〜５５６（Ｌｅｕ））を過剰発現するマウスである。
【０３４５】
もう１つの好ましいトランスジェニックマウスは、ｚｃｙｔｏｒ１７可溶性受容体、例えば本明細書に開示されるそれらの受容体を過剰発癌するマウスである。さらに、そのような過剰発現は、ヒト疾病との類似性を示す表現型をもたらすことができる。同様に、ノックアウトｚｃｙｔｏｒ１７マウスは、ｚｃｙｔｏｒ１７がインビボで絶対的に必要とされる場所を決定するために使用され得る。ノックアウトマウスの表現型は、ｚｃｙｔｏｒ１７アンタゴニスト、例えば本明細書に記載されるそれらのもののインビボ効果を予測することができる。マウスｚｃｙｔｏｒ１７ ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ（配列番号５６及び／又は９２）およびゲノムＤＮＡは、ノックアウトマウスを生成するために使用される。
【０３４６】
それらのトランスジェニック及びノックアウトマウスは、ｚｃｙｔｏｒ１７遺伝子及びそれによりコードされるタンパク質をインビボシステムにおいて研究するために使用され得、そして対応するヒト又は動物疾病（例えば、市販の生存動物集団におけるそれらの疾病）のためのインビボモデルとして使用され得る。本発明のマウスモデルは、免疫系モデル、すなわち癌生物学及び進行の研究のための炎症又は腫瘍モデルとして特に適切である。そのようなモデルは、ヒト免疫疾患、炎症及び癌に使用される治療分子の開発及び効力において有用である。
【０３４７】
ｚｃｙｔｏｒ１７発現の上昇、及びｚｃｙｔｏｒ１７発現の下降が、単球、単球活性化、及び前立腺細胞に関連し、そして炎症及び癌に関連するので、トランスジェニックマウス及びノックアウトマウスの両者は、ヒト患者のための有用な動物モデルとして作用する。さらに、好ましい態様においては、ｚｃｙｔｏｒ１７トランスジェニックマウスは、特定の疾病、特に単球に関連する疾病のための動物モデルとして作用することができる。さらに、本明細書に記載される、ｚｃｙｔｏｒ１７に対して向けられた、ｚｃｙｔｏｒ１７アンチセンスポリヌクレオチド又はリボザイムのトランスジェニックマウス発現がまた、上記トランスジェニックマウスと同じようにして使用され得る。
【０３４８】
医薬使用のためには、本発明の可溶性受容体ポリペプチドは、従来の方法に従って、非経口、特に静脈内又は皮下供給のために配合される。静脈内投与は、１〜数時間の典型的な期間、ボーラス注射又は注入により行われるであろう。一般的に、医薬製剤は、ｚｃｙｔｏｒ１７可溶性受容体ポリペプチドを、医薬的に許容できるビークル、例えば塩溶液、緩衝溶液、水中、５％デキストロース、又は同様のものと共にを含むであろう。製剤はさらに、１又は複数の賦形剤、保存剤、溶解剤、緩衝剤、バイアル表面上のタンパク質損失を妨げるためのアルブミン、等を含むことができる。
【０３４９】
配合方法は、当業界において良く知られており、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９ｔｈ ｅｄ．， １９９５に開示される。治療用量は、一般的に、０．１〜１００μｇ／ｋｇ患者の体重／日、好ましくは０．５〜２０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり、そして正確な用量は処理される病状の性質及び重症度、患者の特徴、等を考慮して、許容できる標準に従って、臨床医により決定される。用量の決定は、当業者のレベル内である。タンパク質は、急性処理のために、１週間又はそれ以下にわたって、しばしば１〜３日間にわたって投与され得、又は慢性処理のためには、数ヶ月〜数年にわたって使用され得る。一般的に、ｚｃｙｔｏｒ１７可溶性受容体ポリペプチドの治療的有効量は、臨床学的に有意な効果を生成するのに十分な量である。
【０３５０】
本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、さらに、遺伝学及び分子生物学、タンパク質化学、及び抗体生成及び分析に関連する実験用実習キットにおいて教育用用具として有用であろう。その独得のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のために、ｚｃｙｔｏｒ１７の分子は、試験のための標準として、又は“未知”として使用され得る。例えば、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリヌクレオチドは、ｚｃｙｔｏｒ１７が発現されるべき遺伝子である、融合構造体を包含する、細菌、ウィルス又は哺乳類発現のための発現構造体をいかにして調製するかを学生に教授するために；ポリヌクレオチドの制限エンドヌクレアーゼ切断部位を決定するために；組成におけるｚｃｙｔｏｒ１７ポリヌクレオチドのｍＲＮＡ及びＤＮＡ位置を決定するために（すなわち、ノザン及びサザンブロット、及びポリメラーゼ鎖反応による）；そして核酸ハイブリダイゼーションにより関連するポリヌクレオチド及びポリペプチドを同定するために、補助体として使用され得る。
【０３５１】
ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドは、抗体の調製；ウェスターンブロットによるタンパク質の同定；タンパク質の精製；発現された合計のタンパク質に対する割合としての発現されたｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドの重量の決定；ペプチド分解部位の同定；アミノ及びカルボキシル末端標識のカップリング；アミノ酸配列分析；及び生来の及び標識されたタンパク質（すなわち、受容体結合、シグナルトランスダクション、増殖及び分化）の生物学的活性のインビトロ及びインビボでのモニターリングのための補助体として、教育的に使用され得る。
【０３５２】
ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドはまた、分析熟練、例えば、質量分析学、コンホメーション、例えば４個のαヘリックスを決定するために、円ニ色性を、原子の立体構造を詳細に決定するために、Ｘ−線結晶学を、溶液におけるタンパク質の構造を表すために、核磁気共鳴分光学を教授するためにも使用され得る。例えば、ｚｃｙｔｏｒ１７を含むキットが、学生の分析熟練を開発するために未知のタンパク質として、又は学生の熟練の試験として、分析する学生に与えられ得る。アミノ酸配列は教師によっては知られており、すなわちタンパク質は学生の熟練を決定し、又はその熟練を進展せしめるための試験として学生に提供されるので、教師は、学生がポリペプチドを正しく分析したかどうかを知ることができる。あらゆるポリペプチドはユニークであるので、ｚｃｙｔｏｒ１７の教育的利用はそれ自体ユニークであろう。
【０３５３】
さらに、ｚｃｙｔｏｒ１７は組織−特異的発現を有し、そしてクラスＩサイトカイン受容体構造及び明白な染色体局在化、及び発現パターンを有するポリペプチドであるので、活性は増殖アッセイ、本明細書に記載されるルシフェラーゼ及び結合アッセイを用いて測定され得る。さらに、単球、前立腺、リンパ及び他の組織におけるｚｃｙｔｏｒ１７ポリヌクレオチド及びポリペプチドの発現は、診断及び組織−特異的同定及び方法の使用において学生を訓練するために分析され得る。さらに、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリヌクレオチドは、その遺伝子座が知られているので、染色体検出及び診断方法の使用に基づいて学生を訓練するために使用され得る。
【０３５４】
さらに、学生は、ヒト染色体１について、及びより特定には、ｚｃｙｔｏｒ１７遺伝子が位置する遺伝子座５ｑ１１について訓練され、そして教育され得る。そのようなアッセイは、当業界において良く知られており、そしてサイトカイン受容体タンパク質について学生を教授し、そしてｚｃｙｔｏｒ１７と当業界における他のサイトカイン受容体との間の種々の性質、例えば細胞に対する細胞効果、酵素運動学、種々の抗体結合親和性、組織特異性及び同様のものを試験するために、教育環境において使用され得る。
【０３５５】
ｚｃｙｔｏｒ１７に対して特異的に結合する抗体は、ｚｃｙｔｏｒ１７を精製し、抗体をコードするポリヌクレオチドをクローニングし、そして配列決定するために、親和性クロマトグラフィーカラムをいかにして調製するかを学生に教授するための教授援助として、及び従って、ヒト適合された抗体をいかにして企画するかを学生に教授するための実習課目として使用され得る。さらに、ｚｃｙｔｏｒ１７に対して特異的に結合する抗体は、例えば当業界において知られている組織学的及び現場方法を用いて、活性化された単球細胞、分類細胞又はリンパ及び前立腺癌組織の検出への使用のための教授助剤として使用され得る。
次に、ｚｃｙｔｏｒ１７遺伝子、ポリペプチド又は抗体は、試薬会社によりパッケージされ、そして学生が分子生物学の分野において熟練を得るために大学及び他の教育機関に市販される。個々の遺伝子及びタンパク質はユニークであるので、個々の遺伝子及びタンパク質は、実験実習課目における学生のためのユニークな挑戦及び学習経験を創造する。ｚｃｙｔｏｒ１７遺伝子、ポリペプチド又は抗体を含むそのような教育用キットは、本発明の範囲内で有ると思われる。
【０３５６】
本発明は、次の非−制限的例によりさらに例示される。
実施例
例１．十分な長さのヒトｚｃｙｔｏｒ１７ ｃＤＮＡの同定及び単離
ｚｃｙｔｏｒ１７を、ヒトゲノムＤＮＡからの予測される十分な長さのｃＤＮＡとして同定した。その予測される十分な長さのｚｃｙｔｏｒ１７ポリヌクレオチドの配列は、配列番号１に示され、そして対応するポリペプチドは、配列番号２に示される。組織源から十分な長さのｃＤＮＡを得るためには、５’及び３’　ＲＡＣＥを使用した。いくつかのオリゴヌクレオチドプライマーを、同定されたゲノム配列ＡＱ００２７８１（Ｇｅｎｂａｎｋ）から企画した。前記プライマーを、ゲノム配列内を内部的にプライミングするために使用し、究極的には、十分な長さのｃＤＮＡを単離した。
【０３５７】
Ａ．ｚｃｙｔｏｒ１７のための５’ＲＡＣＡ：
５’ＲＡＣＥ生成物を、鋳型としてＨＰＶＳ ｃＤＮＡライブラリー、及びプライマーとしてオリゴヌクレオチドＺＣ１２，７０１（配列番号５）及びＺＣ２７，８９８（配列番号６）を用いて生成した。ＨＰＶＳは、ヒト前立腺上皮細胞系（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ−２２２１）から生成された自家ｃＤＮＡライブラリーである。ＰＣＲ反応は、５０μｌの反応体積において、鋳型としてのｃＤＮＡライブラリーから調製されたプラスミドＤＮＡ約１μｇ、５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、５μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、 ２０ｐモルの個々のオリゴヌクレオチド及び１μｌ（５．０単位）のＴａｇポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を使用した。
【０３５８】
この第１回目の５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ反応を次の通りに行った：９４℃で１分、６５℃で１分、７２℃で２分、次に７２℃で７分（３０サイクル）；４℃でのソーキング。５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ生成物のアリコートを除去し、そして１．０％アガロースゲル上で分析した。複数のバンドがゲル上に見られた。
【０３５９】
残る５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ生成物をエタノール沈殿し、そして１：５０に希釈した。第２回目の固定された５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ反応を行い、鋳型ｃＤＮＡ配列を増幅した。このＰＣＲ反応は、ＺＣ１２，７０１（配列番号５）及びＺＣ２７，８９８（配列番号６）の内部の配列にアニーリングするよう企画された、オリゴヌクレオチドＺＣ１４，０６３（配列番号７）及びＺＣ２７，８９９（配列番号８）を使用した。この固定されたＰＣＲ反応を、上記に開示される前記第１回目の５’ＲＡＣＥ反応により行った。
【０３６０】
得られるＤＮＡ生成物を、１．０％アガロースゲル上で電気泳動し、そして約９００ｂｐでの卓越したバンドが見られた。ＤＮＡバンドをゲル精製し、そして標準の方法を用いて配列決定した。配列分析は、ＤＮＡ生成物がゲノムＡＱ００２７８１ ＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ）の一部を含み、そして翻訳開始メチオニン残基及び５’未翻訳配列を含むよう、５’末端上でのｚｃｙｔｏｒ１７のためのｃＤＮＡ配列を延長すると思われることを示した。５’ＲＡＣＥ生成物のポリヌクレオチド配列は、配列番号９に示される。
【０３６１】
Ｂ．ｚｃｙｔｏｒ１７のための３’ＲＡＣＥ：
３’ＲＡＣＥのためのプライマーを、上記で得られた５’ＲＡＣＥ生成物（配列番号９）を用いて企画した。３’ＲＡＣＥ生成物を、鋳型としてヒト前立腺自家ｃＤＮＡライブラリー及びプライマーとしてオリゴヌクレオチドＺＣ２８，４８１（配列番号１０）及びＺＣ６，３４６（配列番号１１）を用いて生成した。この第１回目の３’ＲＡＣＥ ＰＣＲ反応は、例１Ａに記載される条件を用いて行われた。３’ＲＣＥ ＰＣＲ生成物のアリコートを除去し、そして１．０％アガロースゲル上で分析した。複数のバンドがゲル上で見出された。
【０３６２】
残る３’ＲＡＣＥ ＰＣＲ生成物をエタノール沈殿し、そして１：４０に希釈した。第２回目の固定された３’ＲＡＣＥ ＰＣＲ反応を行い、鋳型ｃＤＮＡ配列を増幅した。このＰＣＲ反応は、ＺＣ２８，４８１（配列番号１０）及びＺＣ６，３４６（配列番号１１）の内部の配列にアニーリングするよう企画された、オリゴヌクレオチドＺＣ２８，４８０（配列番号１２）及びＺＣ２６，４０５（配列番号１３）を使用した。この固定されたＰＣＲ反応を、上記に開示されるようにして行った。得られるＤＮＡ生成物を、１．０％アガロースゲル上で電気泳動し、そして約２１００ｂｐでの卓越したバンドが見られた。
【０３６３】
残るＤＮＡをエタノール沈殿し、そして１：４０に希釈した。第３回目の固定された３’ＲＡＣＥ ＰＣＲ反応を行い、鋳型ｃＤＮＡ配列を増幅した。このＰＣＲ反応は、ＺＣ２８，４８０（配列番号１２）及びＺＣ２６，４０５（配列番号１３）の内部の配列にアニーリングするよう企画された、オリゴヌクレオチドＺＣ２７，８９５（配列番号１４）及びＺＣ５，２００（配列番号１５）を使用した。この固定されたＰＣＲ反応を、上記に開示されるようにして行った。
【０３６４】
得られるＤＮＡ生成物を、１．０％アガロースゲル上で電気泳動し、そして約２０００ｂｐでの卓越したバンドが見られた。ＤＮＡバンドをゲル精製し、そして配列決定した。配列分析は、ＤＮＡ生成物が５’ ＲＡＣＥ生成物（配列番号９）の一部を含み、そして翻訳停止コドン及び５’未翻訳配列を含むよう、３’末端上でのｚｃｙｔｏｒ１７のためのｃＤＮＡ配列を延長すると思われることを示した。３’ＲＡＣＥ生成物のポリヌクレオチド配列は、配列番号１６に示される。十分な長さのｚｃｙｔｏｒ１７のポリヌクレオチド配列が配列番号４５に示され、そしてその対応するポリペプチド配列は配列番号４６で示される。
【０３６５】
Ｃ．ｚｃｙｔｏｒ１７についての第２の５’ＲＡＣＥはもう１つの十分な長さのｚｃｙｔｏｒ１７を同定した：
５’ＲＡＣＥ生成物を、鋳型としてＷＩ−３８ ｃＤＮＡライブラリー、及びプライマーとしてオリゴヌクレオチドＺＣ１２，７０１（配列番号５）及びＺＣ２７，８９９（配列番号８）を用いて生成した。ＷＩ−３８は、ヒト胚肺細胞系（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ−７５）から生成された自家ｃＤＮＡライブラリーである。
【０３６６】
ＰＣＲ反応は、５０μｌの反応体積において、鋳型としてのｃＤＮＡライブラリーから調製されたプラスミドＤＮＡ約１μｇ、５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、５μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、 ２０ｐモルの個々のオリゴヌクレオチド及び１μｌ（５．０単位）のＴａｇポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を使用した。この第１回目の５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ反応を次の通りに行った：９４℃で１分、６５℃で１分、７２℃で２分、次に７２℃で７分（３０サイクル）；４℃でのソーキング。５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ生成物のアリコートを除去し、そして１．０％アガロースゲル上で分析した。複数のバンドがゲル上に見られた。
【０３６７】
残るＤＮＡをエタノール沈殿し、そして１：５０に希釈した。第２回目の固定された５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ反応を行い、鋳型ｃＤＮＡ配列を増幅した。このＰＣＲ反応は、ＺＣ１２，７０１（配列番号５）及びＺＣ２７，８９９（配列番号８）の内部の配列にアニーリングするよう企画された、オリゴヌクレオチドＺＣ１４，０６３（配列番号２５）及びＺＣ２７，９００（配列番号５１）を使用した。この固定されたＰＣＲ反応を、上記に開示される前記第１回目の５’ＲＡＣＥ反応により行った。得られるＤＮＡ生成物を、１．０％アガロースゲル上で電気泳動し、そして約１２００ｂｐでの卓越したバンドが見られた。ＤＮＡバンドをゲル精製し、そして標準の方法を用いて配列決定した。
【０３６８】
配列分析は、ＤＮＡ生成物がゲノムＡＱ００２７８１ ＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ）の一部を含み、そして翻訳開始メチオニン残基及び５’未翻訳配列を含むよう、５’末端上でのｚｃｙｔｏｒ１７のためのｃＤＮＡ配列を延長すると思われることを示した。ＤＮＡ配列決定は、このもう１つの開始メチオニン（ヌクレオチド４９７で配列番号５３に示される）からの翻訳から生成されるポリペプチドが、Ｎ−末端で読み取り枠における追加の１３個のアミノ酸（ＭＫＬＳＰＱＰＳＣＶＮＬＧ；配列番号５２）により、配列番号４６に示されるアミノ酸とは異なる、第２の十分な長さ形のｚｃｙｔｏｒ１７を生成することを示した。第２の十分な長さの形のｚｃｙｔｏｒ１７のポリヌクレオチド配列は、配列番号５３に示され、そしてその対応するポリペプチド配列は配列番号５４に示される。第２の十分な長さの形のｚｃｙｔｏｒ１７（配列番号５３及び５４）はたぶん、最も一般的に発現される形である。
【０３６９】
例２．切断された形のヒトｚｃｙｔｏｒ１７ ｃＤＮＡの同定及び単離
Ａ．フィブロネクチンドメインで切断されたｚｃｙｔｏｒ１７の変異体形をコードするｃＤＮＡの単離
切断された可溶性形のｚｃｙｔｏｒ１７についての３’ＲＡＣＥ生成物を、３’ＲＡＣＥについての上記に記載されるプロトコール（例１Ｂ）と同一のプロトコールを用いて生成したが、但し、出発材料は、ＨＲＶＳ ｃＤＮＡライブラリーであった。ＨＰＶＳは、ヒト前立腺上皮細胞系（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ−２２１）から生成された自家ｃＤＮＡライブラリーである。第３回目の固定された３’ＲＡＣＥからその得られる生成物を、１．０％アガロース上で電気泳動し、そして約７００ｂｐでの卓越したバンドが見られた。
【０３７０】
ＤＮＡバンドをゲル精製し、そして配列決定した。配列分析は、ＤＮＡ生成物が５’ＲＡＣＥ生成物（配列番号９）の一部を含み、そしてサイトカイン−結合ドメインの末端近くに翻訳停止コドンを含むようｚｃｙｔｏｒ１７のためのｃＤＮＡ配列を延長するよう思えたことを示した。これは、フィブロネクチンドメイン内で切断された受容体の発現された可溶性形を表すことができた。フィブロネクチンドメインで切断された、可溶性形のｚｃｙｔｏｒ１７のポリヌクレオチド配列は、配列番号１５に示され、そしてその対応するポリペプチド配列は配列番号１８に示される。
【０３７１】
Ｂ．サイトカイン−結合ドメインの末端で切断されたｚｃｙｔｏｒ１７形をコードするｃＤＮＡの単離：
ｚｃｙｔｏｒ１７の切断された形のための３’ＲＡＣＥ生成物を、鋳型としてＨＰＶＳ ｃＤＮＡライブラリー及びプライマーとしてＺＣ２７，８９５（配列番号１４）及びＺＣ６，３４７（配列番号１１）を用いて生成した。この第１回目の３’ＲＡＣＥ ＰＣＲ反応を次の通りに行った：９４℃で１分、６５℃で１分、７２℃で２分、次に７２℃で７分（３０サイクル）；４℃でのソーキング。３’ＲＡＣＥ ＰＣＲ生成物のアリコートを除去し、そして１．０％アガロースゲル上で分析した。複数のバンドが、ゲル上で見出された。
【０３７２】
残るＤＮＡをエタノール沈殿し、そして１：４０に希釈した。第２回目の固定された３’ＲＡＣＥ ＰＣＲ反応を行い、鋳型ｃＤＮＡ配列を増幅した。このＰＣＲ反応は、ＺＣ２７，８９５（配列番号１４）及びＺＣ６，３４６（配列番号１１）の内部の配列にアニーリングするよう企画された、オリゴヌクレオチドＺＣ２７，８９７（配列番号１９）及びＺＣ５，０２０（配列番号１５）を使用した。この固定されたＰＣＲ反応を、上記例１に開示される前記第１回目の５’ＲＡＣＥ反応により行った。得られるＤＮＡ生成物を、１．０％アガロースゲル上で電気泳動し、そして約１１００ｂｐでの卓越したバンドが見られた。ＤＮＡバンドをゲル精製し、そして配列決定した。配列分析は、ＤＮＡ生成物がゲノムＡＱ００２７８１ ＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ）の一部を含み、そしてサイトカイン−結合ドメインの末端で翻訳停止コドンを含むよう、３’末端上でのｚｃｙｔｏｒ１７のためのｃＤＮＡ配列を延長すると思われることを示した。
【０３７３】
上記配列が実際、ゲノムＡＱ００２７８１ ＤＮＡ配列とオーバーラップしたことを確かめるために、追加のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ生成物を、鋳型としてＨＰＶＳ ｃＤＮＡライブラリー、及びプライマーとしてＺＣ２８，４８１（配列番号１０）及びＺＣ２８，５２１（配列番号２０）を用いて生成した。ＰＣＲ反応を次の通りに行った：９４℃で１分、６５℃で１分、７２℃で２分、次に７２℃で７分（３０サイクル）；４℃でのソーキング。得られるＤＮＡ生成物を、１．０％アガロースゲル上で電気泳動し、そして約８００ｂｐでの卓越したバンドが見られた。
【０３７４】
ＤＮＡバンドをゲル精製し、そして配列決定した。配列分析は、これがｚｃｙｔｏｒ１７の切断された形であったことを確かめた。これは、サイトカイン−結合ドメインの末端近くで切断された受容体の発現された可溶性形を表すことができた。この可溶性形のｚｃｙｔｏｒ１７のポリヌクレオチド配列は、配列番号２１に示され、そしてその対応するポリペプチド配列は配列番号２２に示される。
もう１つの切断された３’ＲＡＣＥ生成物を、フィブロネクチンドメインで切断されたｃＤＮＡ変異体の単離について上記に記載されるプロトコール（例２Ａ）を用いて単離した。単離されたＰＣＲ生成物の配列決定は、配列番号２１に示されるような可溶性形のｚｃｙｔｏｒ１７の配列を確証した。
【０３７５】
例３．ノザンブロット及びＰＣＲを用いての組織パネルにおけるヒトｚｃｙｔｏｒ１７の組織分布
Ａ．ノザンブロットを用いてのヒトｚｃｙｔｏｒ１７組織分布：
Ｈｕｍａｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｓ （Ｈｕｍａｎ １２−ｌａｎｅ ＭＴＮ Ｂｌｏｔ Ｉ ａｎｄ ＩＩ， 及びＨｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＭＴＮ Ｂｌｏｔ ＩＩ； Ｈｕｍａｎ Ｅｎｃｏｃｒｉｎｅ ＭＴＮ， Ｈｕｍａｎ Ｆｅｔａｌ ＭＴＮ Ｂｌｏｔ ＩＩ， Ｈｕｍａｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ａｒｒａｙ） （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）， 及び種々の組織を含む自家プロットを、プローブし、ヒトｚｃｙｔｏｒ１７発現の組織分布を決定した。
【０３７６】
自家調製されたブロットは、次の組織及び細胞系ｍＲＮＡを含んだ：ＳＫ−Ｈｅｐ−１細胞、ＴＨＰ１細胞、副腎（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；腎臓（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、肝臓（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；脊椎（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、精巣（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ヒトＣＤ４＋Ｔ−細胞、ヒトＣＤ８＋Ｔ−細胞、ヒトＣＤ１９＋Ｔ−細胞、ヒト混合されたリンパ球反応物（ＭＬＲ）、ＴＨＰ１細胞系（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＴＴＢ−２０２）、Ｕ９３７細胞系、ｐ３３８Ｄ１マウスリンパ芽球細胞系（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＣＬ−４６）（イノマイシンにより刺激されているか又はされていない）；及びＷＩ−３８ヒト胚肺細胞系（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ−２２２１）（イノマイシンにより刺激されているか又はされていない）。
【０３７７】
約５００ｂｐのＰＣＲ由来のプローブを、鋳型として、５’ＲＡＣＥ（例１Ａ）（配列番号９）、及びプライマーとしてオリゴヌクレオチドＺＣ２８，５７５（配列番号２３）及びＺＣ２７，８９９（配列番号２４）を用いて増幅した。ＰＣＲ増幅を次の通りに行った：９４℃で１分、６５℃で１分及び７２℃で１分（３０サイクル）；続いて７２℃で７分（１サイクル）。ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動により可視化し、そして約５００ｂｐのＰＣＲ生成物を、本明細書に記載のようにしてゲル精製した。プローブを、ＰＲＩＭＥ ＩＴ ＩＩＴＭ Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） を用いて、その製造業者の説明書に従って、放射性ラベルした。プローブを、ＮＵＣＴＲＡＰＴＭ プッシュカラム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて精製した。
【０３７８】
ＥＸＰＲＥＳＳＨＹＢＴＭ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ） 溶液を、プレハイブリダイゼーションのために、及びノザンブロットのためのハイブリダイゼーション溶液として使用した。プレハイブリダイゼーションは、６８℃で２時間、行われた。ハイブリダイゼーションは、約１．５×１０６ｃｐｍ／ｍｌのラベルされたプローブにより６８℃で一晩を要した。プローブを、室温で２×ＳＳＣ、０．０５％のＳＤＳにより３度、続いて、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにより５０℃で１０分間、１度、洗浄した。
【０３７９】
いくつかの薄いバンドが、数日の暴露の後、見られた。約９ｋｂの転写体が、気管、骨格筋及び胸腺に見られ；約２ｋｂの転写体がＰＢＬ、ＨＰＶ、Ｕ９３７及びＴＨＰ−１細胞に見られ；そして約１．２ｋｂの転写体が胎盤、骨髄及び甲状腺、及びＨＰＶ及びＵ９３７細胞に見られた。上記列挙されるすべての組織においては、シグナルの強さは薄かった。ほとんどの正常な組織においては、ほとんど発現が出現せず、このことは、ｚｃｙｔｏｒ１７の発現する細胞又は組織の活性化に依存することを示唆する。
【０３８０】
ノザン分析をまた、ヒト癌細胞系ＭＴＮＴＭ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ） を用いて行う。ＰＣＲ及びプロービング条件は上記の通りである。癌系における強いシグナルは、ｚｃｙｔｏｒ１７が、活性化された細胞において発現され、そして／又は癌性疾病状態を、示すことを示唆された細胞において発現され、そして／又は癌性疾病状態を示すことを示唆する。さらに、当業界において知られている方法を用いての、活性化されたリンパ球細胞のノザンブロット又はＰＣＲ分析はまた、ｚｃｙｔｏｒ１７が活性化された免疫細胞において発現されるかどうかを示すことができる。
【０３８１】
Ｂ．ＰＣＲを用いての組織パネルにおける組織分布：
ヒト組織からのｃＤＮＡのパネルを、ＰＣＲを用いて、ｚｃｙｔｏｒ１７発現についてスクリーンした。パネルは自家製造され、そして種々の正常及び癌性ヒト組織からの９４種のマラソンｃＤＮＡ及びｃＤＮＡサンプルを包含し、そして細胞系は下記表５に示される。前記ｃＤＮＡは自家ライブラリーからであり、又はマラソンｃＤＮＡは自家ＲＮＡ調製物、すなわちＣｌｏｎｔｅｃｈ ＲＮＡ又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＲＮＡからであった。マラソンｃＤＮＡは、マラソン−ＲｅａｄｙＴＭ キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を用いて製造され、そしてクラスリンプライマーＺＣ２１，１９５（配列番号４９）及びＺＣ２１，１９６（配列番号５０）によりＱＣ試験し、そして次に、クラスリンバンドの強さに基づいて希釈された。
【０３８２】
パネルサンプルの性質を評価するために、品質管理（ＱＣ）についての次の３種の試験を行った：（１）ライブラリーのために使用されるＲＮＡ品質を評価するために、自家ｃＤＮＡを、個々のｃＤＮＡライブラリーについてのベクター配列に対して特異的であるベクターオリゴによるＰＣＲにより、平均挿入体について試験し；（２）パネルサンプルにおけるｃＤＮＡの濃度の標準化を、５’ベクターオリゴＺＣ１４，０６３（配列番号２５）及び３’α−チューブリン特異的オリゴプライマーＺＣ１７，５７４（配列番号２６）又は３’Ｇ３ＰＤＨ特異的オリゴプライマーＺＣ１７，６００（配列番号２７）を用いて、十分な長さのαチューブリン又はＧ３ＰＤＨ ｃＤＮＡを増幅するために、標準のＰＣＲ方法を用いて達成し；
【０３８３】
そして（３）サンプルを、可能なリボソーム又はミトコンドリアＤＮＡ汚染について調べるために配列決定に送った。パネルを、ヒトゲノムのＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ， Ａｌｔｏ， ＣＡ）陽性対照サンプルを含む９６−ウェル形式において組みたてた。個々のウェルは約０．２〜１００ｐｇ／μｌのｃＤＮＡを含んだ。ＰＣＲ反応を、オリゴＺＣ２６，３５８（配列番号２８）及びＺＣ２６，３５９（配列番号２９）、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ ＴａｑＴＭ （ＴＡＫＡＲＡ Ｓｈｕｚｏ Ｃｏ． ＬＴＤ， Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｇｒｏｕｐ， Ｊａｐａｎ）， 及びＲａｄｉｌｏａｄ 色素（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．， Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ＡＬ）を用いて組みたてた。
【０３８４】
増幅を次の通りに行った：９４℃で２分（１サイクル）、９４℃で３０秒、６６．３℃で３０秒及び７２℃で３０秒（３５サイクル）、続いて７２℃で５分（１サイクル）。約１０μｌのＰＣＲ反応生成物を、４％アガロースゲルを用いての標準のアガロースゲル電気泳動にゆだねた。正しい推定されるＤＮＡフラグメントサイズを、リンパ節、前立腺、甲状腺、ＨＰＶ（前立腺上皮）、ＨＰＶＳ（選択された前立腺上皮）、肺腫瘍、子宮腫瘍反応及びゲノムＤＮＡ反応において観察した。プライマーの１つが、ゲノム又はｚｃｙｔｏｒ１７短形可溶性受容体（配列番号２１）にアニーリングすることができ、これは、発現パターンが、この他の形のｚｃｙｔｏｒ１７のパターンであり得ることを示唆する。
【０３８５】
前立腺組織（２種のサンプル）、ＨＰＶ（前立腺上皮）、ＨＰＶＳ（選択された前立腺上皮）及びゲノムについてのＤＮＡフラグメントを切除し、そしてＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）を用いて、製造業者の説明書に従って精製した。フラグメントを、それらが実際、ｚｃｙｔｏｒ１７であることを示すために、配列決定により確かめた。
【０３８６】
【表５】
2004501628.tif 000007
【０３８７】
【表６】
2004501628.tif 000008
【０３８８】
Ｂ．ＰＣＲ及びノザンによるｚｃｙｔｏｒ１７の発現分析：
受容体の発現に影響を及ぼす細胞及び成長条件の注釈は、リガンド源のその機能を誘発し、そしてその源を予測する有用な手段である。このためには、本発明者は広範囲の種類の組織及び細胞型を調査した。熱安定性ポリメラーゼＡｄｖａｎｔａｇｅ ＩＩＴＭ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ） を、オリゴヌクレオチドプライマーＺＣ２９，１８０（配列番号７３）及びＺＣ２９，１７９（配列番号７４）、及び下記に列挙される１〜１０ｎｇの種々のｃＤＮＡ鋳型と共に、３０の増幅サイクル（９４℃で３０秒；６６℃で２０秒；６８℃で１．５分）の間、使用した。これに続いて、個々の反応２０％を、０．８％アガロース、ＴＡＥ／臭化エチジウムゲル上で行い、そしてＵＶ光により可視化した。次に、サンプルを、バンドの強度に基づいて評点を付けた。下記表７を参照のこと。
【０３８９】
【表７】
2004501628.tif 000009
【０３９０】
強い陽性のＰＣＲシグナルのうち、２種は、ヒト単球細胞系Ｕ９３７及びＴＨＰ１からであった。
前立腺上皮系と共にそれらの２種の細胞系を、ノザンブロットによる分析のために選択した。種々の組織からのｍＲＮＡを用いてのノザン分析による転写体の可視化でのこれまでの試みは、強く且つ拡散性のシグナルを、７〜１０ｋｂの驚くべき大きなサイズ範囲で生成し、これは、このデータを解釈するのに困難にしている。変性ホルムアルデヒド／ＭＯＰＳ／０．８％アガロースゲルを調製し（ＲＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ， Ｆａｒｒｅｌｌ， ＲＥ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、そして２μｇのポリＡ＋ｍＲＮＡを、ＲＮＡラダー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）と共に、個々のサンプルについて試験した。
【０３９１】
次に、ゲルを、Ｈｙｂｏｎｄナイロン（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ， ＵＫ）に移し、ＵＶ架橋し、そしてオリゴＺＣ２８，５７５（配列番号２３）及びＺＤ２７，８９９（配列番号２４）によるＰＣＲにより生成され、そしてＭｅｇａｐｒｉｍｅ ３２Ｐキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によりラベルされたヒトｚｃｙｔｏｒ１７に、プローブを用いて６８℃で一晩、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液（Ｄｌｏｎｔｅｃｈ， ＬａＪｏｌｌａ， ＣＡ）においてハイブリダイズした。ノザンブロットを、６５℃で１５分間、０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳにより連続的に洗浄し、そして強化スクリーンにより７日間、フィルムに照射した。卓越した８ｋｂのバンドが、前立腺上皮及びＵ９３７系の両者において見出され、そしてより薄いバンドがＴＨＰ１レーンに存在した。
【０３９２】
ハイブリダイゼーションとして使用されるｃＤＮＡを最適化するために、４種の異なった領域の十分な長さのヒトｚｃｙｔｏｒ配列を、ＰＣＲにより増幅し、ラベルし、ゲノム及び増幅されたｃＤＮＡライブラリーＤＮＡを含むサザンブロットに、上記のようにしてハイブリダイズした。本明細書においてプローブＡ−Ｄと命名された４種のプローブを、次のプライマー対を用いて増幅した：（Ａ）ＺＣ２８，５７５（配列番号２３）、ＺＣ２７，８９９（配列番号２４）；（Ｂ）ＺＣ２７，８９５（配列番号６４）、ＺＣ２８，９１７（配列番号７３）；（Ｃ）ＺＣ２８，９１６（配列番号７５）、ＺＣ２８，９１８（配列番号７６）；及び（Ｄ）ＺＣ２８，９１６（配列番号７５）、ＺＣ２９，１２２（配列番号６５）。
【０３９３】
ＰＣＲによりｚｃｙｔｏｒ１７を含むことが示されている、増幅されたｃＤＮＡライブラリーと共にゲノムＤＮＡを、ＥｃｏｒＩ及びＸｈｏＩにより消化し、挿入体を生成し、そして重複ＴＡＥ／０．８％アガロースゲル上に負荷し、０．５ＭのＮａＯＨ、１．５ＭのＮａＣｌにより変性し、Ｈｙｂｏｎｄにブロットし、ＵＶ架橋し、そして明確なプローブによりそれぞれハイブリダイズした。プローブＢは、最少の非特異的結合及び最強のシグナルを有することが見出された。従って、プローブＢを、すべての続くハイブリダイゼーションのために使用した。
【０３９４】
ＴＨＰ１細胞が循環性単球の卓越したモデルであり、そして低レベルでｚｃｙｔｏｒ１７を発現する場合、本発明者は、ｚｃｙｔｏｒ１７の発現を高めるために、種々の化合物によりそれらを処理した。細胞を、２×１０５／ｍｌの密度に増殖し、種々の刺激培地により洗浄し、そしてそれに再懸濁し、４〜３０時間、増殖し、そしてＲＮＡ調製のために収穫した。個々の培地を、次の薬剤又はサイトカイン対の１つにより補充した：
【０３９５】
ＬＰＳ ２μｌ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）、ｈＴＮＦα ２ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）、ｈＧＭＣＳＦ ２ｎｇ／ｍｌ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）、ｈＩＦＮγ ５０ｎｇ／ｍｌ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）， ｈＭＣＳＦ １ｎｇ／ｍｌ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）， ｈＩＬ６ １ｎｇ／ｍｌ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）、ｈＩＬ１β ２ｎｇ／ｍｌ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）、ｈＩＦＮγ ５０ｎｇ／ｍｌ＋ｈＩＬ４ ０．４ｎｇ／ｍｌ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）、ｈＩＦＮγ ５０ｎｇ／ｍｌ＋ｈＩＬ１０ １ｎｇ／ｍｌ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）、ＰＭＡ １０ｎｇ／ｍｌ （Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ） 及び未処理の対照。
【０３９６】
培養期間の最後で、全ＲＮＡを、ＲＮＡｅａｓｙ Ｍｉｄｅ−キット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）を用いて調製した。ポリＡ＋ＲＮＡを、ＭＰＧキット（ＣＰＧ、Ｌｉｎｃｏｌｎ　Ｐａｒｋ，ＮＪ）を用いて、前記全ＲＮＡから選択した。個々の状態からのポリＡ＋ＲＮＡ２μｇを、ホルムアルデヒド／ＭＯＰＳ／アガロースゲル上に負荷し、上記のようにして、ナイロンに移し、そしてＵＶ照射した。次に、それらのノザンブロットを、上記のようにして、プローブＢに対して、６８℃で一晩、ハイブリダイズし、６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにより高い緊縮性下で洗浄し、フィルムに一晩、照射し、次に、シグナル定量化のためにリン光体スクリーンに照射した（図２を参照のこと）。
【０３９７】
卓越した８ｋｂのｍＲＮＡ及び比較的弱い２．８ｋｂのバンドが、すべてのレーンに見られた。ｚｃｙｔｏｒ１７ ｍＲＮＡの２０倍の上昇がｈＩＦＮγにより３０時間、処理された細胞からのＲＮＡに見られ、この効果は、ＩＬ４による同時処理によりわずかに弱められた。ｍＲＮＡにおけるマイナーな３倍の上昇がＬＰＳ、ＴＮＦαＧＭ−ＣＳＦにより処理された細胞からのＲＮＡに見出されたが、ＭＣＳＦ、ＩＬ６及びＩＬ１βはｚｃｙｔｏｒ１７ ｍＲＮＡレベルに対して効果を有さなかった。一緒に考えると、このデータは、単球マクロファージ生物学において、及びそれらの細胞が関係するいずれかの数の疾病工程の延長により、ｚｃｙｔｏｒ１７受容体及びそのリガンドについての役割を示唆する。
【０３９８】
例４．ｚｃｙｔｏｒ１７遺伝子のＰＣＲに基づく染色体マッピング
ｚｃｙｔｏｒ１７を、市販のＧｅｎｅｂｒｉｄｇｅ ４ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｈｙｂｒｉｄ（ＲＨ）Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐａｎｅｌ （Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ＡＬ）を用いて、染色体５にマッピングした。そのＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ ４ ＲＨ Ｐａｎｅｌは、９３の放射線ハイブリッドクローンの個々からのＰＣＲ可能ＤＮＡ、及び２種の対照ＤＮＡ（ＨＦＬ ドナー及びＡ２３受容体）を含む。公開されているＷＷＷサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃｏｎｔｉｇ／ｒｈｍａｐｐｅｒ．ｐｌ）は、ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ ４ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｈｙｂｒｉｄ Ｐａｎｅｌにより構成されたヒトゲノムのＷｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＴ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ’ｓ放射線ハイブリッド地図（“ＷＩＣＧＲ”放射線ハイブリッド地図）に関してのマッピングを可能にする。
【０３９９】
ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ ４ ＲＨ Ｐａｎｅｌによるｚｃｙｔｏｒ１７のマッピングのために、２０μｌの反応体をＰＣＲのために適合する９６−ウェルマイクロタイタープレート（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）に提供し、そして”ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎ ９６” 熱サイクラー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において使用した。個々の９５のＰＣＲ反応体は、２μｌの１０×ＫｌｅｎＴａｑ ＰＣＲ反応緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）、１．６μｌのｄＮＴＰ混合物（それぞれ２．５ｍＭ、ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）、１μｌのセンスプライマー、ＺＣ２７，８９５ （配列番号１４）、１１μｌのアンチセンスプライマー、ＺＣ２７，８９９ （配列番号２４）、２μｌのＲｅｄｉＬｏａｄ （Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ＡＬ）、０．４μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＫｌｅｎＴａｑ ポリメラーゼ混合物（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）、２５ｎｇ の個々のハイブリッドクローン又は対照からのＤＮＡ、及び２０μｌの合計体積のためのｄｄＨ２Ｏから構成された。
【０４００】
反応を同量の鉱油により被覆し、そして密封した。ＰＣＲサイクラー条件は次の通りであった：９４℃で５分間の変性、初期の１サイクル、９４℃で４５秒間の変性、５４℃で４５秒間のアニーリング及び７２℃で１．２５分間の延長、３５サイクル、続いて７２℃で７分間の延長、最終の１サイクル。反応を、２％アガロースゲル上で電気泳動により分離し（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ， ＮＪ）、そして臭化エチジウムによる染色により可視可した。
その結果は、ｚｃｙｔｏｒ１７が染色体５ ＷＩＣＧＲ放射線ハイブリッド地図上で骨格マーカーＡＦＭ１８３ＹＢ８から６．７２ｃＲ＿３０００に位置することを示した。周囲遺伝子／マーカーの使用は、５ｑ１１染色体領域におけるｚｃｙｔｏｒ１７を位置決定する。
【０４０１】
例５．ＭＰＬ− ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドキメラ、すなわちｚｃｙｔｏｒ１７細胞内シグナル化ドメインに融合される、ＭＰＬ細胞外及びＴＭドメイン
ネズミＭＰＬ受容体の５’細胞外ドメインを、１１６４ｂｐのフラグメントを生成する、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩによる消化により、ネズミＭＰＬ受容体を含むプラスミド（ＰＨＺ１／ＭＰＬプラスミド）から単離した。消化物を、１％アガロースゲル上に負荷し、そしてフラグメントを、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の説明書に従って単離した。
【０４０２】
ＭＰＬ細胞外ドメイン及びトランスメンブランドメインの残りを、プライマーＺＣ６，６７３（配列番号５８）及びＺＣ２９，０８２（配列番号５９）により、ＰＣＲを用いて生成した。反応条件は次の通りであった：９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で２分（１５サイクル）、続いて７２℃で７分；次に４℃でのソーキング。ＰＣＲ生成物を１％アガロースゲル上に負荷し、そして約４００ｂｐのＭＰＬ受容体フラグメントを、ＱｉａｑｕｉｃｋＴＭ ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の説明書に従って単離した。
【０４０３】
ヒトｚｃｙｔｏｒ１７の細胞内ドメインを、ｚｃｙｔｏｒ１７受容体ｃＤＮＡ（＃２３／ｐＣＡＰ）を含むプラスミドから、プライマーＺＣ２９，０８３（配列番号６０）及びＺＣ２９，１４５（配列番号６１）によるＰＣＲを用いて単離した。ｚｃｙｔｏｒ１７受容体コード配列に対応するポリヌクレオチド配列は、配列番号５４に示さる。反応条件は上記の通りであった。ＰＣＲ生成物を、１％アガロースゲル上に負荷し、そして約３２０ｂｐのｚｃｙｔｏｒ１７フラグメントを、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて、製造業者の説明に従って単離した。
【０４０４】
上記の単離されたフラグメントの個々を、１：１の体積比で混合し、そしてＺＣ６６７３（配列番号５８）及びＺＣ２９，１４５（配列番号６１）を用いてのＰＣＲ反応に使用し、ｚｃｙｔｏｒ１７キメラの５’ＭＰＬ部分を創造した。反応条件は次の通りであった；９４℃で１分；５５℃で１分、７２℃で２分（１５サイクル）；続いて、７２℃で７分；次に４℃でのソーキング。全ＰＣＲ生成物を、１％アガロースゲル上に負荷し、そして７００ｂｐのＭＰＬ− ｚｃｙｔｏｒ１７キメラフラグメントを、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の説明書に従って単離した。
【０４０５】
ＭＰＬ− ｚｃｙｔｏｒ１７キメラフラグメントを、ＢａｍＨＩ（ＢＲＬ）及びＸｂａＩ （Ｂｏｅｒｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ） により、製造業者の説明書に従って消化した。全消化物を、１％アガロースゲル上に負荷し、そして分離されたＭＰＬ− ｚｃｙｔｏｒ１７キメラを、ＱｉａｑｕｉｃｋＴＭ ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の説明書に従って単離した。その得られる分解されたＭＰＬ− ｚｃｙｔｏｒ１７キメラ及び上記５’ＭＰＬ ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを、下記のようにして発現ベクター中に挿入し、完全なＭＰＬ− ｚｃｙｔｏｒ１７キメラ受容体を生成した。
【０４０６】
受容体発現ベクターｐＺＰ−７を、ＥｃｏＲＩ（ＢＲＬ）及びＸｂａＩ（ＢＲＬ）により、製造業者の説明書に従って消化し、そして上記のようにしてゲル精製した。このベクターフラグメントを、上記で単離された、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ切断されたＭＰＬ− ｚｃｙｔｏｒ１７キメラ及び、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ ５’ＭＰＬフラグメントと共に連結反応において組合した。この連結は、Ｔ４リガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、室温で１時間、行われた。
【０４０７】
連結のサンプルを、ＤＨ１０Ｂ ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸＴＭ エレクトロコンピテントＥ．コリ細胞においてエレクトロポレートした（２５μＦ、２００Ω、１．８Ｖ）。形質転換体を、ＬＢ＋Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎプレート上にプレートし、そして単一のコロニーを、ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ）によりスクリーンし、そしてＥｃｏＲＩにより消化し、ＭＰＬ− ｚｃｙｔｏｒ１７キメラを調べた。正しいコロニーのＥｃｏＲＩ消化は、約２ＫＢのフラグメントを生成する。ＭＰＬ−ｚ ｚｃｙｔｏｒ１７キメラ配列の確認を、配列分析により行った。この挿入体は、３．１ｂｐであり、そして十分な長さであった。
【０４０８】
例６．Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを用いてのＢＡＦ３アッセイにおける、ＭＰＬ− ｚｃｙｔｏｒ１７キメラに基づく増殖
Ａ． ＢａＦ３細胞発現のＭＰＬ− ｚｃｙｔｏｒ１７キメラの構成：
ＢａＦ３、すなわちネズミ骨髄に由来するインターロイキン−３ （ＩＬ−３） 依存性プレ−リンパ球細胞系（Ｐａｌａｃｉｏｓ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ， Ｃｅｌｌ ４１： ７２７−７３４， １９８５； Ｍａｔｈｅｙ−Ｐｒｅｖｏｔ など．，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ６：４１３３−４１３５， １９８６）を、１０％熱−不活性化されたウシ胎児血清、１ｎｇ／ｍｌのネズミＩＬ−３ （ｍＩＬ−３） （Ｒ＆Ｄ． Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）、２ｍＭのＬ−ｇｌｕｔａＭａｘ−１ＴＭ （Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）， １ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）及びＰＳＮ抗生物質（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）により補充された完全倍地（ＲＰＭＩ培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．， Ｌｅｎｅｘａ， ＫＳ））において維持した。
【０４０９】
エレクトロポレーションの前、ｐＺＰ−５Ｎ／ＭＰＬ− ｚｃｙｔｏｒ１７プラスミドＤＮＡ（例４）を調製し、そしてＱｉａｇｅｎ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の説明書に従って精製した。エレクトロポレーションのためのＢａＦ３細胞を、ＲＰＭＩ培地により２度洗浄し、そして次に、ＲＰＭＩ培地に１０７個の細胞／ｍｌの細胞密度で再懸濁した。１ｍｌの再懸濁されたＢａＦ３細胞を、３０μｇのｐＺＰ−７／ＭＰＬ− ｚｃｙｔｏｒ１７プラスミドＤＮＡと共に混合し、そして別々の使い捨てエレクトロポレーションチャンバー（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）に移した。
【０４１０】
室温で、細胞に、エレクトロポレーション装置（Ｃｙｔｏ−Ｐｕｌｓｅ）により供給される５ｘ２ｍｓの連続したショック（６００Ｖ）を与えた。エレクトロポレートされた細胞を、５０ｍｌの完全培地に移し、そしてインキュベーターに、１５−２４時間（３７℃、５％ＣＯ２）配置した。次に、ＧｅｎｅｔｉｃｉｎＴＭ （Ｇｉｂｃｏ） 選択物（１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８）をＴ−１６２フラスコにおける細胞に添加し、Ｇ４１８−耐性プールを単離した。この後、ＢａＦ３／ＭＰＬ− ｚｃｙｔｏｒ１７細胞と呼ばれる、トランスフェクトされたＢａＦ３細胞のプールを、下記のようにして、シグナル化能力についてアッセイした。
【０４１１】
Ｂ． Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ増殖アッセイを用いてのＢａＦ３／ＭＰＬ− ｚｃｙｔｏｒ１７細胞のシグナル化能力の試験：
ＢａＦ３／ＭＰＬ− ｚｃｙｔｏｒ１７細胞を、回転沈降し、そして上記のようであるが、しかしＩＬ−３を含まない完全培地（この後“ｍＩＬ−３フリー培地”と称する）により洗浄した。細胞を回転せしめ、そして３度洗浄し、ｍＩＬ−３の除去を確かにした。次に、細胞を、血球計により計数した。細胞を、ｍＩＬ−３フリー培地を用いて、ウェル当たり１００μｌの体積に５０００個の細胞を含むような９６−ウェル形式でプレートした。
【０４１２】
ＢａＦ３／ＭＰＬ− ｚｃｙｔｏｒ１７細胞の増殖を、ｍＩＬ−３フリー培地により、２００ｎｇ ／ｍｌ，１００ｎｇ／ｍｌ， ５０ｎｇ／ｍｌ， ２５ｎｇ／ｍｌ， １２．５ｎｇ／ｍｌ， ６．２５ｎｇ／ｍｌ， ３．１ｎｇ／ｍｌ， １．５ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈されたネズミトロンボポエチン（ｍＴＰＯ）を用いて評価した。１００μｌの希釈されたｍＴＰＯを、ＢａＦ３／ＭＰＬ− ｚｃｙｔｏｒ１７細胞に添加した。全アッセイ体積は２００μｌである。負の対照を、ｍＴＰＯの添加を伴なわないで、ｍＴＬ−３フリー培地のみを用いて同時に実験した。アッセイプレートを、３７℃で、５％ＣＯ２において３日間、インキュベートし、この時点で、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ （Ａｃｃｕｍｅｄ， Ｃｈｉｃａｇｏ， ＩＬ） を、２０μｌ／ウェルで添加した。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅは、細胞の代謝活性に基づいて蛍光計読み取りを与え、そして従って、負の対照に比較しての細胞増殖の直接的な測定である。
【０４１３】
プレートを再び、３７℃で、５％ＣＯ２において、２４時間インキュベートした。プレートを、ＳｏｆｔＭａｘＴＭ Ｐｒｏプログラムを用いて、５４４ （励起） 及び５９０ （放射）の波長で、ＦｍａｘＴＭ プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｓｕｎｎｙｒａｌｃ， ＣＡ）上で読み取った。
結果は、トロンボポエチンが５０ｎｇ／ｍｌ及びそれ以上のｍＴＯＰ濃度でバックグラウンドよりも約９−１３倍、増殖を誘発するので、ｚｃｙｔｏｒ１７受容体の細胞内部分のシグナル化能力を確証した。
【０４１４】
例７．ｚｃｙｔｏｒ１７−ｍｐｌポリペプチドキメラ、すなわちＭｐｌ細胞内シグナル化ドメイン及びＴＭドメインに融合されるｚｃｙｔｏｒ１７細胞外ドメインの構成
ｚｃｙｔｏｒ１７受容体の細胞外ドメインを、ｚｃｙｔｏｒ１７受容体を含むプラスミドから、配列番号１、４５、１７又は２１に示されるｚｃｙｔｏｒ１７の細胞外ドメイン又はその一部、又は配列番号５３又は５６の対応する領域を増幅するよう企画されたプライマーによるＰＣＲを用いて単離した。好ましい反応条件は次の通りであった：９５℃で１分；９５℃で１分、４５℃で１分、７２℃で２分（３５サイクル）；続いて、７２℃で１０分；次に１０℃でのソーキング。ＰＣＲ生成物を、１％低融点アガロース（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）上に負荷し、そしてｚｃｙｔｏｒ１７受容体フラグメントを、ＱｉａｑｕｉｃｋＴＭ ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の説明書に従って単離した。
【０４１５】
ＭＰＬの細胞内及びトランスメンブランドメインを、ｚｃｙｔｏｒ１７細胞外ドメインの３’末端、及びＭＰＬ細胞内及びトランスメンブランドメイン及びＺＣ１７，２０６（配列番号３３）の５’末端に及ぶプライマーによるＰＣＲを用いて単離した。好ましい反応条件は上記の通りであった。ＰＣＲ生成物を、１％低融点アガロース（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）上に負荷し、そして約４５０ｂｐのＭＰＬフラグメントを、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて、製造業者の説明に従って単離した。
【０４１６】
上記の単離されたフラグメントの個々を、１：１の体積比で混合し、そしてｚｃｙｔｏｒ１７及びＺＣ１７，２０６（配列番号３３）の細胞外ドメインを増幅するために使用される５’プライマーを用いてのＰＣＲ反応に使用し、ｚｃｙｔｏｒ１７−ｍｐｌキメラを創造した。好ましい反応条件は次の通りであった；９５℃で１分；９５℃で１分、５５℃で１分、７２℃で２分（３５サイクル）；続いて、７２℃で１０分；次に１０℃でのソーキング。全ＰＣＲ生成物を、１％低融点アガロース（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）上に負荷し、そして約１．２ｋｂのｚｃｙｔｏｒ１７−ｍｐｌキメラフラグメントを、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の説明書に従って単離した。
【０４１７】
ｚｃｙｔｏｒ１７−ｍｐｌキメラフラグメントを、ＥｃｏＲＩ（ＢＲＬ）及びＸｂａＩ （Ｂｏｅｒｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ） により、製造業者の説明書に従って消化した。全消化物を、１％低融点アガロース（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）上に負荷し、そして分離されたｚｃｙｔｏｒ１７−ｍｐｌキメラを、ＱｉａｑｕｉｃｋＴＭ ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の説明書に従って単離した。その得られる分解されたｚｃｙｔｏｒ１７−ｍｐｌキメラを、下記のようにして発現ベクター中に挿入した。
【０４１８】
受容体発現ベクターｐＺＰ−５Ｚを、ＥｃｏＲＩ（ＢＲＬ）及びＨｉｎｄＩＩＩ（ＢＲＬ）により、製造業者の説明書に従って消化し、そして上記のようにしてゲル精製した。このベクターフラグメントを、上記で単離された、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ切断されたｚｃｙｔｏｒ１７−ｍｐｌキメラ及び、ＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩリンカーフラグメントと共に連結反応において組合した。この連結は、Ｔ４リガーゼ（ＢＲＬ）を用いて、１５℃で一晩、行われた。連結のサンプルを、ＤＨ１０Ｂ ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸＴＭ エレクトロコンピテントＥ．コリ細胞においてエレクトロポレートした（２５μＦ、２００Ω、２．３Ｖ）。形質転換体を、ＬＢ＋Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎプレート上にプレートし、そしてＰＣＲによりスクリーンされた単一のコロニーを、上記のようなＰＣＲ条件を用いて、ｚｃｙｔｏｒ１７細胞外ドメインプライマー及び及びＺＣ１７，２０６（配列番号２５）を用いて、ｚｃｙｔｏｒ１７−ｍｐｌキメラを調べた。ｚｃｙｔｏｒ１７−ｍｐｌキメラ配列の確認を、配列分析により行った。
【０４１９】
例８．十分な長さのｚｃｙｔｏｒ１７を発現する発現ベクターｐＺｐ７ｐｘ／ ｚｃｙｔｏｒ１７の構成
Ａ．発現のための十分な長さのｚｃｙｔｏｒ１７ ｃＤＮＡのクローニング：
十分な長さのｃＤＮＡを得るために、５’及び３’ＰＣＲ生成物を単離し、そして内部ＰｓｔＩ部位を用いて連結した。ＰＣＲプライマーを、ヌクレオチド配列（配列番号５３）を用いて企画し、そしてそれは、クローニング目的のためのＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限部位を含む。
【０４２０】
５’ＰＣＲを、鋳型としてＷＩ−３８ ｃＤＮＡライブラリー及びプライマーとしてオリゴヌクレオチドＺＣ２９，３５９（配列番号６２）及びＺＣ２７，８９９（配列番号６３）を用いて生成した。ＷＩ−３８は、ヒト胚の肺細胞系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２２１）から生成された自家ｃＤＮＡライブラリーである。この５’ＰＣＲ反応は次の通りに行われた：９４℃で１分、６５℃で１分、７２℃で２分、次に７２℃で７分（３０サイクル）；１０℃でのソーキング。ＰＣＲ反応は、ｃＤＮＡライブラリーから調製された約３μｇのプラスミド、２０ｐモルの個々のオリゴヌクレオチド及び５単位のＰＷＯ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を使用した。
【０４２１】
５’ＰＣＲ生成物の約９０％を、エタノール沈殿し、ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩにより消化し、そして１．０％アガロースゲル上でゲル精製した。約６００ｂｐのバンドを切除し、そしてＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩにより消化されたクローニングベクターｐＵＣ１８への連結のために使用した。得られる形質転換体を配列決定し、ｚｃｙｔｏｒ１７ ｃＤＮＡ配列を確かめた。それらの形質転換体の１つに関して、プラスミドＤＮＡを調製し、そしてＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩにより消化した。得られる約６００ｂｐのバンドをゲル精製し、そして下記連結のために使用し、十分な長さのｃＤＮＡを形成した。
【０４２２】
３’ＰＣＲ生成物を、鋳型としてヒト精巣自家ｃＤＮＡライブラリー及びプライマーとしてオリゴヌクレオチドＺＣ２７，８９５（配列番号６４）及びＺＣ２９，１２２（配列番号６５）を用いて生成した。この３’ＰＣＲ反応は次の通りに行われた：９４℃で４５秒、６５℃で４５秒、７２℃で２分、次に７２℃で７分（３０サイクル）；１０℃でのソーキング。３’ＰＣＲ反応物を、１．０％アガロースゲル上でゲル精製し、そして腫瘍１５００ｂｐバンドを切除した。このバンドを、Ｚｅｒｏｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＰＣＲ Ｂｌｕｎｔ ＩＩ ＴＯＰＯベクター中にクローン化した。得られる形質転換体を配列決定し、ｚｃｙｔｏｒ１７ ｃＤＮＡ配列を確かめた。それらの形質転換体の１つに関して、プラスミドＤＮＡを調製し、そしてＰｓｔＩ及びＸｈｏＩにより消化した。
【０４２３】
その得られる約１５００ｂｐのバンドをゲル精製した。３部分連結を、上記５’ＢａｍＨＩ〜ＰｓｔＩフラグメント、３’ＰｓｔＩ〜ＸｈｏＩフラグメント、及びＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩにより消化された発現ベクターｐＺｐ７ｐＸにより行った。これは、ｐＺｐ７ｐ／ｚｃｙｔｏｒ１７と称する、ｚｃｙｔｏｒ１７のための十分な長さのｃＤＮＡを含むｐＺｐ７ｐＸプラスミド（配列番号５３）を生成した。ｐＺｐ７ｐ／ｚｃｙｔｏｒ１７における十分な長さのｚｃｙｔｏｒ１７ ｃＤＮＡは、配列番号５３の位置１８８８でＴをＧに変えるサイレント突然変異を有する（配列番号５４の残基４６４でＧｌｙ残基をコードする）。
【０４２４】
この突然変異はサイレントであるので、ｐＺｐ７ｐ／ｚｃｙｔｏｒ１７におけるｚｃｙｔｏｒ１７ ｃＤＮＡは、配列番号５４に示されるようなポリペプチドをコードする。プラスミドｐＺｐ７ｐＸは、ＣＭＶプロモーター、イントロンＡ、コード配列の挿入のための複数の制限部位、及びヒト成長ホルモンターミネーターを有する発現カセットを含む哺乳類発現ベクターである。プラスミドはまた、複製のＥ．コリ起点、ＳＶ４０プロモーター、エンハンサー及び複製の起点を有する哺乳類選択マーカー発現単位、ピューロマイシン耐性遺伝子、及びＳＶ４０ターミネーターを有する。
【０４２５】
例９．Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ を用いてのＢａＦ３アッセイにおけるｚｃｙｔｏｒ１７に基づく増殖を評価するための細胞の構成
Ａ． ｚｃｙｔｏｒ１７−ＭＰＬ受容体を発現するＢａＦ３細胞の構成：
ｚｃｙｔｏｒ１７−ＭＰＬ受容体を発現するＢａＦ３細胞を、上記例７に記載されるｚｃｙｔｏｒ１７発現ベクター３０μｌを用いて、上記例６Ａに従って構成した。ｐＺＰ−５Ｚ／ ｚｃｙｔｏｒ１７受容体プラスミドを発現するＢａＦ３細胞を、ＢａＦ３／ ｚｃｙｔｏｒ１７−ｍｐｌとして命名した。それらの細胞を、例１０及び１８に記載のようにして、ｚｃｙｔｏｒ１７活性についてスクリーンするために使用した。
【０４２６】
Ｂ． ｚｃｙｔｏｒ１７受容体を発現するＢａＦ３細胞の構成：
十分な長さのｚｃｙｔｏｒ１７受容体を発現するＢａＦ３細胞を、上記例８に記載されるｚｃｙｔｏｒ１７発現ベクター３０μｌを用いて、上記例６Ａに従って構成した。ｐＺＰ−５Ｚ／ ｚｃｙｔｏｒ１７受容体プラスミドを発現するＢａＦ３細胞を、ＢａＦ３／ ｚｃｙｔｏｒ１７として命名した。それらの細胞を、例１０及び１８に記載のようにして、ｚｃｙｔｏｒ１７活性についてスクリーンするために使用した。
【０４２７】
例１０．Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ 増殖アッセイによる、ＢａＦ３／ ｚｃｙｔｏｒ１７−ＭＰＬ細胞及びＢａＦ３／ ｚｃｙｔｏｒ１７細胞を用いてのｚｃｙｔｏｒ１７活性についてのスクリーニング
ＢａＦ３／ ｚｃｙｔｏｒ１７−ｍｐｌキメラ細胞及びＢａＦ３／ ｚｃｙｔｏｒ１７細胞（例９）を回転沈降し、そしてそれぞれ、ｍＩＬ−３フリー培地（例６）により洗浄した。細胞を回転せしめ、そして３度洗浄し、ｍＩＬ−３の除去を確保した。次に、細胞を血球計により計数した。細胞を、ｍＩＬ−３フリー培地を用いて、ウェル当たり１００μｌの体積に５０００個の細胞を含むような９６−ウェル形式でプレートした。
【０４２８】
ｚｃｙｔｏｒ１７リガンドについての源を同定するために、種々の細胞系からの約１２４個のならし培地サンプルをスクリーンした。１００μｌの個々のならし培地サンプルを、ＢａＦ３／ＭＰＬ− ｚｃｙｔｏｒ１７キメラ細胞及びＢａＦ３／ ｚｃｙｔｏｒ１７細胞に添加して。すべての既知のサイトカインをまた、両細胞系に対して約１００ｐｇ／ｍｌ〜２５０ｎｇ／ｍｌの濃度でスクリーンした。負の対照を、ｍＩＬ−３を有さない培地のを用いて、同時に試験した。２５０ｐｇ／ｍｌの濃度でのマウスＩＬ−３を、正の対照として使用した。
【０４２９】
アッセイプレートを、３７℃、５％のＣＯ２で３日間、インキュベートし、この時点で、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ （Ａｃｃｕｍｅｄ， Ｃｈｉｃａｇｏ， ＩＬ） を、２０μｌ／ウェルで添加した。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅは、生存細胞の数に基づいて、蛍光情報を付与し、そして従って、負の対照に比較しての細胞増殖の直接的な測定である。プレートを再び、３７℃、５％ＣＯ２下で、２４時間インキュベートした。プレートを、５４４（励起）及び５９０（発光）の波長で、ＳｏｆｔＭａｘＴＭ Ｐｒｏ プログラムを用いて、ＦｍａｘＴＭ プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）上で読み取った。
【０４３０】
ならし培地サンプル又は既知のリガンドに応答して、ＢａＦ３／ ｚｃｙｔｏｒ１７−ｍｐｌキメラ細胞系又はＢａＦ３／ ｚｃｙｔｏｒ１７細胞系のいずれかの増殖を示す結果は、リガンドのための源を同定し、そしてｚｃｙｔｏｒ１７受容体がホモダイマーとしてシグナル化し、又はＢａＦ３細胞に存在する受容体と共にヘテロダイマー化するか、又はマルチマー化することを示唆する。シグナルが存在しない場合、実際の受容体−シグナル化複合体は、ＢａＦ３細胞に存在しないもう１つの受容体サブユニットと共にヘテロダイマー化するか、又はマルチマー化することができる。下記例１８及び１９を参照のこと。
【０４３１】
例１１．次のｚｃｙｔｏｒ１７可溶性受容体を発現する哺乳類発現ベクターの構成：ｚｃｙｔｏｒ１７ ＣＥＥ， ｚｃｙｔｏｒ１７ ＣＦＬＧ，ｚｃｙｔｏｒ１７ ＣＨＩＳ及びｚｃｙｔｏｒ１７−Ｆｃ４
Ａ． ｚｃｙｔｏｒ１７ ＣＥＥ， ｚｃｙｔｏｒ１７ ＣＦＬＧ及びｚｃｙｔｏｒ１７ ＣＨＩＳを含むｚｃｙｔｏｒ１７哺乳類発現ベクターの構成：
発現ベクター、すなわちｐＺｐ９ｚｃｙｔｏｒ１７ＣＥＥを、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドの可溶性、細胞外ドメインの発現のために調製し、ここで前記構造体は、予測される開始メチオニンから成り、そして予測されるトランスメンブランドメインに隣接して切断され、そしてＣ−末端Ｇｌｕ−Ｇｌｕ標識（配列番号３４）を有するｚｃｙｔｏｒ１７ポリペプチドを発現するよう企画されている。
【０４３２】
約１５００ｂｐのＰＣＲ生成物を、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ制限部位を付加するためにＰＣＲプライマーとしてＺＣ２９，４５１（配列番号６６）及びＺＣ２９，１２４（配列番号６７）を用いて生成した。ヒトＨＰＶＳ自家ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、そしてＰＣＲ増幅を次の通りに行った：９４℃で１分、６５℃で１分、７２℃で１．５分、次に７２℃で７分（３０サイクル）；１０℃でのソーキング。ＰＣＲ反応をエタノール沈殿し、そしてＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素により消化した。消化されたＰＣＲ生成物を１．０％アガロースゲル上でゲル精製し、そして約１５００ｂｐのバンドを切除した。次にこのバンドを、次のサイクリングにより、同一のプライマーを用いて再増幅した：９４℃で１分、６５℃で１分、７２℃で３分、次に７２℃７分；１０℃でのソーキング。
【０４３３】
ＰＣＲ反応をエタノール沈殿し、そしてＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素により消化した。消化されたＰＣＲ生成物を１．０％アガロースゲル上でゲル精製し、そして約１５００ｂｐのバンドを切除した。この切除されたＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにより切断されたプラスミドＣＥＥｐＺｐ９中にサブクローン化し、ｚｃｙｔｏｒ１７のＧＬＵ−ＧＬＵ Ｃ−末端標識された可溶性受容体、すなわちｚｃｙｔｏｒ１７ＣＥＥｐＺｐ９を生成した。ｚｃｙｔｏｒ１７ＣＥＥｐＺｐ９におけるｚｃｙｔｏｒ１７ＣＥＥ ｃＤＮＡ中の細胞外ドメインは、配列番号５３の位置１７０５でのＴをＣに変更するサイレント突然変異（配列番号５４の残基４０３でのＰｒｏ残基をコードする）を有する。この突然変異はサイレントであるので、ｚｃｙｔｏｒ１７ＣＥＥｐＺｐ９におけるｚｃｙｔｏｒ１７ ｃＤＮＡは、配列番号５４に示されるようなポリペプチドをコードする。
【０４３４】
さらに、使用される構造体のために、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ残基対を、ｚｃｙｔｏｒ１７の可溶性細胞外ドメインのＣ−末端側に及びそのＣ−末端Ｇｌｕ−Ｇｌｕ標識（配列番号３４）の前に挿入する。ｚｃｙｔｏｒ１７細胞外ドメインのＣ−末端での標識は、配列番号９１に示されるような修飾されたＧｌｕ−Ｇｌｕ標識であった。プラスミドＣＥＥｐＺｐ９は、マウスメタロチオネイン−１プロモーター、コード配列の挿入のための複数の制限部位及びヒト成長ホルモンターミネーターを有する発現カセットを含む哺乳類発現ベクターである。プラスミドはまた、複数のＥ．コリ起点、ＳＶ４０プロモーター、エンハンサー及び複製の起点を有する哺乳類選択マーカー発現単位、ＤＨＦＲ遺伝子及びＳＶ４０ターミネーターを有する。
【０４３５】
標準の分子生物学技法を用いて、ｚｃｙｔｏｒ１７ＣＥＥｐＺｐ９を、ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）中に、その製造業者の説明書に従ってエレクトロポレートし、そして１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上にプレートし、そして一晩インキュベートした。コロニーを、制限分析によりスクリーンし、又はＤＮＡからのＰＣＲを個々のコロニーから調製した。陽性クローンの挿入体配列を、配列分析により確かめた。大規模プラスミド調製を、ＱＩＡＧＥＮ（商標）Ｍａｘｉ ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の説明書に従って行った。
【０４３６】
同じ方法を用いて、一列に並んでの６個のＨｉｓ残基から成るＣ−末端ｈｉｓ標識及びＣ−末端フラッグ（配列番号３５ ）標識、すなわちｚｃｙｔｏｒ１７ ＣＦ１．ＡＧを有するｚｃｙｔｏｒ１７可溶性受容体を調製した。それらの構造体を調製するためには、前記ベクターは、ｇｌｕ−ｇｌｕ標識（配列番号３４ ）の変わりにＨＩＳ又はＦＬＡＧ（商標）標識のいずれかを有する。
【０４３７】
Ｂ．可溶性ヒトｚｃｙｔｏｒ１７受容体、すなわちｚｃｙｔｏｒ１７−Ｆｃ４の哺乳類発現構成：
発現ベクター、ｐＥＺＥ−２ｈｚｃｙｔｏｒ１７／Ｆｃ４を調製し、ＰＦ ＣＨＯ細胞においてｈｚｃｙｔｏｒ１７のＣ末端Ｆｃ４標識された可溶性型（ヒトｚｃｙｔｏｒ１７−Ｆｃ４）を発現した。ＰＦ ＣＨＯ細胞は、タンパク質フリーの培地（ＥｘＣｅｌｌ３２５ＰＦ培地；ＪＲＨ Ｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ）において増殖のために適合された自家ＣＨＯ細胞系である。前記自家ＣＨＯ細胞系は、本来、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞に起因した（Ｇ．Ｕｒｌａｕｂ， Ｊ． Ｍｉｔｃｈｅｌｌ， Ｅ． Ｋａｓ， Ｌ．Ａ． Ｃｈａｓｉｎ， Ｖ．Ｌ．， Ｆｕｎａｎａｇｅ， Ｔ．Ｔ． Ｍｙｏｄａ ａｎｄ Ｊ．Ｌ． Ｈａｍｌｉｎ， “Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｇａｍｍａ Ｒａｙｓ ａｔ ｔｈｅ Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ Ｌｏｃｕｓ： Ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎｓ”， Ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ．， １２： ５５５−５６６ （１９８６））。
【０４３８】
ｚｃｙｔｏｒ１７受容体の細胞外ドメインからのポリヌクレオチド配列を含む、ｚｃｙｔｏｒ１７ ｃＤＮＡのフラグメントを、Ｆｃ４ポリヌクレオチド配列（配列番号３６）に整合して融合し、ｚｃｙｔｏｒ１７−Ｆｃ４融合体（配列番号６８及び６９）を生成した。ｐＥＺＥ−２ベクターは、Ｆｃ４ポリヌクレオチド配列、及び標準の分子生物学技法を用いてＣ−末端Ｆｃ４融合体の急速な構成を可能にするクローニング部位を含む哺乳類発現ベクターである。
【０４３９】
ヒトｚｃｙｔｏｒ１７の細胞外ドメイン、及びそれぞれ、５’及び３’末端上にコードされるＦｓｅＩ及びＢｇｌＩＩ部位と共に、Ｆｃ４の最初の２個のアミノ酸（Ｇｌｕ及びＰｒｏ）を含む、１５６６塩基対のフラグメントをＰＣＲにより生成した。このＰＣＲフラグメントを、ヒトｚｃｙｔｏｒ１７の細胞外ドメインを含むプラスミド（ｐＺｐ９ｚｃｙｔｏｒ１７ＣＥＥ）（例１１Ａ） からの増幅により、プライマーＺＣ２９，１５７（配列番号７０）及びＺＣ２９，１５０（配列番号７１）を用いて生成した。
【０４４０】
ＰＣＲ反応条件は次の通りであった：９５℃で１分、６０℃で１分及び７２℃で２分（２５サイクル）；７２℃で１０分（サイクル）；続いて４℃でのソーキング。フラグメントを、ＦｓｅＩ及びＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼにより消化し、そして続いて、１％ゲル電気泳動、及びＱｉａＱｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてのバンド精製により精製した。得られる精製されたＤＮＡを、ＦｓｅＩ及びＢｇｌＩＩ部位のＦｃ４ ３’を含む、ＦｓｅＩ及びＢｇｌＩＩにより前もって消化されたｐＥＺＥ−２ベクター中に、室温で５時間、連結した。
【０４４１】
２０μｌの連結混合物を、３７μｌのＤＨ１０ＢエレクトロコンピテントＥ．コリ（Ｇｉｂｃｏ）において、製造業者の説明書に従ってエレクトロポレートした。形質転換された細胞を、４００μｌのＬＢ培地に希釈し、そして１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上にプレートした。クローンを制限消化により分析し、そして陽性クローンをＤＮＡ配列決定のために送り、融合構造体の配列を確かめた。１μｌの陽性クローンを用いて、３７μｌのＤＨ１０ＢエレクトロコンピテントＥ．コリを形質転換し、そしてＬＢ／ａｍｐプレート上に画線培養した。単一のコロニーを、この画線培養されたプレートから、２５０ｍｌのＬＢ／ａｍｐ培地に採取し、次に、２５０ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で一晩、増殖せしめた。この培養物を、ＱｉａｇｅｎプラスミドＭａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、７５０μｇの精製されたＤＮＡを生成するために使用した。
【０４４２】
例１２．ｚｃｙｔｏｒ１７可溶性受容体ポリペプチドのトランフェクション及び発現
ＢＨＫ ５７０細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ−１０３１４）， ＤＧ４４ ＣＨＯ， 又は他の哺乳類細胞を、８００μｌの適切な血清フリー（ＳＦ）培地（例えば、ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ） において、約１．２×１０６個の細胞／ウェル（６−ウェルプレート）でプレートする。細胞を、血清フリー（ＳＦ）培地において、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ （Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ） を用いて、製造業者の説明書に従って、ｚｃｙｔｏｒ１７ ＣＥＥ， ｚｃｙｔｏｒ１７ ＣＦＬＧ， ｚｃｙｔｏｒ１７ ＣＨＩＳ又はｚｃｙｔｏｒ１７−Ｆｃ４（例１１）を含む発現プラスミドによりトランスフェクトする。可溶性受容体を発現する単一のクローンを単離し、スクリーンし、そして細胞培養培地において増殖せしめ、そして標準の方法を用いて精製する。
【０４４３】
Ａ．可溶性ヒトｚｃｙｔｏｒ１７ ＣＥＥ受容体の哺乳類発現：
ＢＨＫ５７０細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ： ＣＲＬ−１０３１４）を、Ｔ−７５組織培養フラスコにプレートし、そしてＤＭＥＭ／ＦＢＳ培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ， （Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）、５％ウシ胎児血清、１ｍＭのＬ−グルタミン（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌｅｎｅａ， ＫＳ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ））において、３７℃で５％ＣＯ２において、約５０〜７０％の集密性まで増殖した。次に、細胞を、血清フリー（ＳＦ）培地配合物（ＤＭＥＭ、１０ｍｇ／ｍｌのトランスフェリン、５ｍｇ／ｍｌのインスリン、２ｍｇ／ｍｇのフェチュイン、１％のＬ−グルタミン及び１％のピルビン酸ナトリウム）において、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ （Ｇｉｂｃｃｏ ＢＲＬ） を用いて、ｚｃｙｔｏｒ１７ＣＥＥ（例１１Ａ）を含むプラスミドによりトランスフェクトした。
【０４４４】
１０μｇのプラスミドＤＮＡ ｐＺｐ９ｚｃｙｔｏｒ１７ＣＥＥ（例１１Ａ）を、１５ｍｌの管中に希釈し、ＳＦ培地により５００μｌの最終合計体積にした。５０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを、４５０μｌのＳＦ培地と共に混合した。そのＬｉｐｏＦｅｃｔａｍｉｎｅ混合物を、ＤＮＡ混合物に添加し、そして室温で約３０分間インキュベートした。４ｍｌのＳＦ培地を、ＤＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合物に添加した。細胞を５ｍｌのＳＦ培地により１度すすぎ、吸引し、そしてＤＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合物を添加した。細胞を３７℃で５時間インキュベートし、そして次に、５ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地を添加した。
【０４４５】
フラスコを３７℃で一晩インキュベートし、この後、細胞を、１：２、１：１０及び１：５０で、１５０ｍｍのプレートに１μＭのメトトレキセート又は１０μＭのメトトレキセート（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を含む上記からの選択培地（ＤＭＥＭ／ＰＢＳ培地）中に分けた。トランスフェクションの約１０日後、１μＭのメトトレキセート耐性コロニーの１つの１５０ｍｍプレートを、トリプシン処理し、細胞をプールし、そして細胞の半分を１０μＭのメトトレキセートに再プレートし、ｚｃｙｔｏｒ１７ＣＥＥタンパク質の発現をさらに増殖した。この増幅された細胞のプールからのならし培地サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスターン分析を用いて、発現レベルについて試験した。
【０４４６】
Ｂ．可溶性ヒトｚｃｙｔｏｒ１７−Ｆｃ４受容体の哺乳類発現：
２０μｇのｐＥＺＥ−２ｈｚｃｙｔｏｒ１７Ｆｃ４プラスミドＤＮＡ（例１１Ｂ）を、ｐＥＺＥ−２ベクター内を１度切断し、そして発現のために必要な遺伝子を妨げない制限酵素であるＦｓｐＩによる制限消化により線状化した。２００μｇの剪断されたサケ精子ＤＮＡを、キャリヤーＤＮＡとして添加し、そして次に、ＤＮＡを、０．１体積の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）及び２．２体積のエタノールの添加により沈殿せしめ、続いて４℃での１５分間の氷インキュベーション及びマイクロ遠心分離を行った。
【０４４７】
得られるＤＮＡペレットを、７０％エタノールにより洗浄し、そして空気乾燥し、その後、１００μｌのＰＦ ＣＨＯ非−選択増殖培地（２１ｇ／ｌのＰＦ ＣＨＯ　Ｅｘ細胞３２５／２００ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）／１００ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）／１×ＨＴ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ））に再懸濁した。５×１０６個のＰＦ ＣＨＯ継代４３細胞を、６００μｌのＰＦ ＣＨＯ非−選択増殖培地におけるＤＮＡに添加し、そして次に、０．４ｃｍギャップＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ （ＢｉｏＲａｄ） エレクトロポレーションキュベットを用いて、１０７０μＦのキャパシタンス及び３８０Ｖを用いてのＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎにおいてエレクトロポレートした。
【０４４８】
エレクトロポレートされた細胞を、非選択増殖培地において４８時間、回収し、その後、−ＨＴ培地（２１ｇ／ｌのＰＦ ＣＨＯ Ｅｘ細胞３２５／２００ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）／１００ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）において選択した。細胞を−ＨＴ培地において５日間、選択し、その後、５０ｎｍのＭＴＸ選択のために５×１０５／ｍｌで継代した。５０ｎｍのＭＴＸで選択された細胞を、振盪フラスコに６×１０５／ｍｌで接種し、ならし培地を生成した。得られる７２時間のならし培地を、ヒトＩｇに対して生成された抗体によりウェスターンブロットをプローブすることによって分析した。細胞は、約１ｍｇ／ｌでｈｚｃｙｔｏｒ１７／Ｆｃ４タンパク質を生成した。
【０４４９】
Ｃ．可溶性ヒトｚｃｙｔｏｒ１７−Ｆｃ４受容体の大規模哺乳類発現：
２００μｇのｐＥＺＥ−２ｈｚｃｙｔｏｒ１７Ｆｃ４プラスミドＤＮＡ（例１１Ｂ）を、ｐＥＺＥ−２ベクター内を１度切断し、そして発現のために必要な遺伝子を妨げない制限酵素であるＦｓｐＩによる制限消化により線状化した。２００μｇのＣＨＯゲノムＤＮＡ（自家調製された）を、キャリヤーＤＮＡとして添加し、そして次に、ＤＮＡを、０．１体積の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）及び２．５体積のエタノールの添加により沈殿せしめ、続いて室温でのマイクロ遠心分離を行った。５複製ＤＮＡペレットを製造し、そして形質転換した。
【０４５０】
得られるＤＮＡペレットを、７０％エタノールにより洗浄し、そして空気乾燥し、その後、１００μｌのＰＦ ＣＨＯ非−選択増殖培地（２１ｇ／ｌのＰＦ ＣＨＯ　Ｅｘ細胞３２５／２００ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）／１００ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）／１×ＨＴ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ））に再懸濁した。１０×１０６個のＰＦ ＣＨＯ細胞を、６００μｌのＰＦ ＣＨＯ非−選択増殖培地におけるＤＮＡに添加し、そして次に、０．４ｃｍギャップＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ （ＢｉｏＲａｄ） エレクトロポレーションキュベットを用いて、９５０μＦのキャパシタンス及び３８０Ｖを用いてのＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎにおいてエレクトロポレートした。
【０４５１】
エレクトロポレートされた細胞を、プールし、そして−ＨＴ培地（２１ｇ／ｌのＰＦ ＣＨＯ Ｅｘ細胞３２５／２００ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）／１００ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）において選択した。細胞を−ＨＴ培地において１４日間、選択し、その後、５０ｎｍのＭＴＸ選択のために４×１０５／ｍｌで継代した。細胞を２００ｎＭのＭＴＸで、及び次に１μＭのＭＴＸで増殖した。−ＨＴ， ５０ｎＭ及び１μＭのプールを、４８時間、１×１０６／ｍｌの接種し、そしてその得られるならし培地を、ヒトＩｇに対して生成された抗体によりウェスターンブロットをプローブすることによって分析した。
【０４５２】
Ｄ．可溶性ヒトｚｃｙｔｏｒ１７−Ｆｃ４受容体の過渡的哺乳類発現及び精製：
ｐＥＺＥ−２ｈｚｃｙｔｏｒ１７／Ｆｃ４プラスミドＤＮＡ（例１１Ｂ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ （Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ） を用いて、本明細書に記載のようにして、及び製造業者の説明書に従って、ＢＨＫ細胞の４０ｍａｘｉプレート中に導入した。細胞を一晩、回収し、すすぎ、そして血清フリー培地（自家製造されたＳＬ７Ｖ４）を再供給した。７２時間後、培地を集め、そして濾過し、そして細胞を血清フリー培地に再供給した。７２時間後、培地を再び集め、そして濾過した。
【０４５３】
過渡的にトランスフェクトされたＢＨＫ細胞からの血清フリーならし培地（２×１．５Ｌのバッチ）を、２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、０．５ＭのＮａＣｌの溶液中、１．５ｍｌのプロテインＡ−アガロースカラム上に供給した。カラムをこの緩衝液により集中的に洗浄し、そして次に、結合されたタンパク質を、１ｍｌの０．２Ｍのグリシン（ｐＨ２．５）、０．５ＭのＮａＣｌ溶液により溶出した。溶出されたタンパク質を、０．１ｍｌの２Ｍのトリス（ｐＨ８．５）中に集めた。
アリコートを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のために集め、そして多量のｚｃｙｔｏｒ１７−Ｆｃを、ＰＢＳに対して一晩、透析した。可溶性受容体を無菌濾過し、そして−８０℃でアリコートで配置した。
【０４５４】
例１３．Ｅ．コリにおけるｚｃｙｔｏｒ１７可溶性受容体の発現
Ａ．ｈｕｚｃｙｔｏｒ１７／ＭＢＰ−６Ｈ融合ポリペプチドを発現する発現ベクターｐＣＺＲ２２５の構成：
マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）にＣ−末端で融合されるｚｃｙｔｏｒ１７可溶性受容体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、相同組換えにより構成する。融合ポリペプチドは、本明細書に記載されるｚｃｙｔｏｒ１７可溶性受容体のいずれかに融合される約３８８個のＮ−末端アミノ酸ＭＢＰ部分を含む。ｚｃｙｔｏｒ１７ ｃＤＮＡのフラグメント（配列番号１、４５、１７又は２１）を、本明細書に記載のようなＰＣＲを用いて単離する。
【０４５５】
次の２種のプライマーを、標準のＰＣＲ反応におけるｚｃｙｔｏｒ１７フラグメントの生成に使用する：（１）１つは、約４０ｂｐのベクターフランキング配列及び約２５ｂｐのアミノ末端に対する配列を含み、及び（２）もう１つは、前記フランキングベクター配列に対応する３’末端約４０ｂｐ及びｚｃｙｔｏｒ１７のカルボキシル末端に応答する配列約２５ｂｐを含む。１００μｌのＰＣＲ反応物２μｌを、分析するために、１×ＴＢＥ緩衝液中、１．０％アガロースゲル上で試験し、そして予測されるおおよそのフラグメントが見られる。残るＰＣＲ反応物を、第２のＰＣＲ管において組合し、そして無水エタノール４００μｌにより沈殿せしめる。沈殿されたＤＮＡを、下記のようにして、ＳｍａＩ切断された受容体ベクターｐＴＡＰ１７０中への組換えのために使用し、ＭＢＰ− ｚｃｙｔｏｒ１７融合体をコードする構造体を生成する。
【０４５６】
プラスミドｐＴＡＰ１７０は、プラスミドｐＲＳ３１６及びｐＭＡＬ−ｃ２に由来する。プラスミドｐＲＳ３１６は、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）シャトルベクターである（Ｈｉｅｔｅｒ Ｐ． ａｎｄ Ｓｉｋｏｒｓｋｉ， Ｒ．， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２２： １９−２７， １９８９）。ｐＭＡＬ−Ｃ２ （ＮＥＢ）は、Ｅ．コリ発現プラスミドである。それは、ｔａｃプロモーター駆動ＭａｌＥ（ＭＢＰコードの遺伝子）、続いて、Ｈｉｓ標識、トロンビン切断部位、クローニング部位及びｒｒｎＢターミネーターを担持する。ベクターｐＴＡＰ９８を、酵母相同組換えを用いて構成する。１００ｎｇのＥｃｏＲＩ切断された、ｐＭＡＬ−ｃ２を、１μｇのＰｖｕＩ切断されたｐＲＳ３１６， １μｇのリンカーと共に組合し、そして１μｇのＳｃａＩ／ＥｃｏＲＩ切断されたｐＲＳ３１６を、ＰＣＲ反応において組合す。ＰＣＲ生成物を、１００％エタノール沈殿により濃縮する。
【０４５７】
コンピテント酵母細胞（Ｓ．セレビシアエ）を、約１μｇの上記ｚｃｙｔｏｒ１７受容体ＰＣＲ生成物及び１００ｎｇのＳｍａＩ消化されたｐＴＡＰ９８ベクターを含む混合物数１０μＬと共に組合し、そして標準方法を用いてエレクトロポレートし、そしてＵＲＡ−Ｄプレート上にプレートし、そして３０℃でインキュベートする。
【０４５８】
約４８時間後、単一プレートからＵｒａ＋酵母形質転換体を採取し、ＤＮＡを単離し、そしてエレクトロコンピテントＥ．コリ細胞（例えば、ＭＣ１０６１， Ｃａｓａｄａｂａｎなど．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １３８， １７９−２０７）を形質転換し、そして標準方法を用いて、ＭＭ／ＣＡ＋ＡＭＰ １００ｍｇ／ｌプレート（Ｐｒｙｏｒ ａｎｄ Ｌｅｉｔｉｎｇ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｚｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ． １０：３０９−３１９， １９９７）上にプレーｔする。細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと共に、ＭＭ／ＣＡにおいて、２時間、３７℃で、振盪しながら増殖する。
【０４５９】
その培養物１ｍｌを、１ｍＭのＩＰＴＧにより誘発する。２〜４時間後、個々の培養物２５０μｌを、酸により洗浄されたガラスビーズ２５０μ、及び５％βＭＥ及び色素を含むＴｈｏｍｅｒ緩衝液（８Ｍの尿酸、１００ｍＭトリス、ｐＨ７．０， １０％グリセロール、２ｍＭのＥＤＴＡ，５％ＳＤＳ）２５０μｌと共に混合する。サンプルを１分間、振盪し、そして６５℃に１０分間、加熱する。その２０μｌを、４％〜１２％ＰＡＧＥゲル（ＮＯＶＥＸ）上のライン当たりに負荷する。ゲルを、１×ＭＥＳ緩衝液において試験する。陽性クローンを、ｐＣＺＲ２２５と命名し、そして配列決定分析にゆだねる。
【０４６０】
１μｌの配列決定ＤＮＡを用いて、ＢＬ２１株を形質転換する。細胞を、２．０ｋＶ， ２５μＦ及び４００オームで電気パルスする。エレクトロポレーションに続いて、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＭＭ／ＣＡ溶液０．６ｍｌ上にプレートする。細胞を、ＭＭ／ＣＡにおいて増殖し、そして上記のようにして、ＩＰＴＧにより誘発する。陽性クローンを用いて、Ｈｕｚｃｙｔｏｒ １７／ＭＢＰ−６Ｈ融合タンパク質のタンパク質精製のために、標準技法により増殖する。
【０４６１】
Ｂ．Ｅ．コリ発酵からのｈｕｚｃｙｔｏｒ１７／ＭＢＰ−６Ｈ可溶性受容体の精製：
特にことわらない限り、すべての操作は４℃で行われた。次の方法を、ｈｕｚｃｙｔｏｒ１７／ＭＢＰ−６Ｈ可溶性受容体ポリペプチドを精製するために使用した。ＰＣＺＲ２２５構造体を含み、そしてｈｕｚｃｙｔｏｒ１７／ＭＢＰ−６Ｈ可溶性受容体（例１３Ａ）を発現するＥ．コリ細胞を、ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ ＩＩ （１２ｇ／ｌのカゼイン、２４ｇ／ｌの酵母抽出物、１１．４ｇ／ｌのリン酸二カリウム、１．７ｇ／ｌのリン酸一カリウム；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ， Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ， ＭＤ） において増殖し、そして０．５％グリセロールにおいて凍結した。ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ ＩＩ及びグリセロール中、２０ｇの凍結細胞を用いて、タンパク質を精製した。凍結細胞を融解し、そしてプロテアーゼインヒビター溶液（抽出緩衝液）において１：１０に希釈し、その後、細胞を溶解し、そしてｈｕｚｃｙｔｏｒ１７／ＭＢＰ−６Ｈ可溶性受容体タンパク質を開放した。
【０４６２】
希釈された細胞は、２０ｍＭの最終濃度のトリス（ＪＴ Ｂａｋｅｒ， Ｐｈｉｌｉｐｓｂｕｒｇ， ＮＪ）、１００ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ， Ｍａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ， Ｐａｒｉｓ， ＫＹ）、０．５ｍＭの弗化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ， Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）、２μｇ／ｍｌのロイペプチン（Ｆｌｕｋａ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）及び２μｇ／ｍｌのアプロチニン（Ｓｉｇｍａ）を含んだ。−７〜−１０℃の温度及び３０Ｋ ＰＳＩを有するＦｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓ細胞分解システム（Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ．， Ｗａｒｗｉｃｋ， ＵＫ）を用いて、細胞を溶解した。希釈された細胞を、Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓの前及び後、Ａ６００読み取りにより切断について調べた。溶解された細胞を、１８．０００Ｇで４５分間、遠心分離し、分解された細胞残骸を除去し、そして上清液を用いて、タンパク質を精製した。
【０４６３】
アミロース樹脂の２５ｍｌカラム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）（下記のようにして調製された） を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ， ２．５ｃｍ Ｄ×１０ｃｍ Ｈのガラスカラムに入れた。カラムを充填し、そして１０カラム体積（ＣＶ）のアミロース平衡化緩衝液（２０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）により平衡化した。上清液を、アミロース樹脂にバッチ負荷し、そして一晩、振動した。樹脂をカラムに入れ、そして１０ＣＶのアミロース平衡化緩衝液により洗浄した（重力による）。カラムを、１０ＣＶのアミロース平衡化緩衝液により洗浄し、次に約２ＣＶのアミロース平衡化緩衝液＋１０ｍＭのマルトース（Ｆｌｕｋａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により溶出した（重力による）。５ｍｌの画分を、クロマトグラフィー上で集め、そして２８０及び３２０ｎＭでの吸光度を読み取った。アミロースカラムを、１ＣＶの蒸留水、５ＣＶの０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（Ｓｉｇｍａ）、５ＣＶの蒸留水、及び次に５ＣＶのアミロース平衡化緩衝液により再生した。
【０４６４】
興味ある画分をプールし、そしてＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ）において、４×４ＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）（Ｓｉｇｍａ）により透析し、低分子量汚染物を除去し、緩衝液を交換し、そして脱塩した。ＰＢＳの交換の後、収穫された材料は、精製されたｈｕｚｃｙｔｏｒ１７／ＭＢＰ−６Ｈポリペプチドを表した。精製されたｈｕｚｃｙｔｏｒ１７／ＭＢＰ−６Ｈポリペプチドを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色、及びウサギＨＲＰ接合抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ， Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ， ＰＡ）によるウェスターンブロットにより分析した。ｈｕｚｃｙｔｏｒ１７／ＭＢＰ−６Ｈポリペプチドの濃度は、ＢＣＡ分析により測定される場合、１．９２ｍｇ／ｍｌであった。
精製されたｈｕｚｃｙｔｏｒ１７／ＭＢＰ−６Ｈポリペプチドを、ウサギへの注射のために調製し、そして抗体生成のために、Ｒ＆Ｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ （Ｓｔａｎｗｏｏｄ， ＷＡ） に送った。ウサギに注射し、抗−ｈｕｚｃｙｔｏｒ１７／ＭＢＰ−６Ｈ血清を生成した（下記例１５）。
【０４６５】
例１４．ｚｃｙｔｏｒ１７可溶性受容体ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体を、精製されたｈｕｚｃｙｔｏｒ１７／ＭＢＰ−６Ｈポリペプチド（例１３）により、２匹の雌Ｎｅｗ ｚｅａｌａｎｄ 白色ウサギを免疫化することによって、調製する。ウサギは、完全フロイントアジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）中、精製されたタンパク質２００ｍｇの初期腹腔内（ＩＰ）注射、続いて、不完全フロイトアジュバント中、精製されたタンパク質１００μｇの追加免疫ＩＰ注射を、３週ごとに与えられる。第３の追加免疫注射の投与後７〜１０日で、動物は放血され、そして血清が集められる。次に、ウサギを、追加免疫し、そして３週ごとに放血する。
【０４６６】
ｚｃｙｔｏｒ１７−特異的ポリクローナル抗体を、ＣＮＢｒ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ １ｇ当たり約１０ｍｇの精製されたｈｕｚｃｙｔｏｒ１７／ＭＢＰ−６Ｈポリペプチドを用いて調製されるＣＮＢｒ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ４Ｂタンパク質カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ）を用いて、ウサギ血清から親和性精製し、続いて、ＰＢＳにおける２０倍の透析を一晩、行う。ｚｃｙｔｏｒ１７−特異的抗体を、抗体標的物として適切な１μｇ／ｍｌのタンパク質抗原を用いてのＥＬＩＳＡ力価調査により特徴づけるウサギ抗−ｚｃｙｔｏｒ１７親和性精製された抗体の検出の下限（ＬＬＤ）を、標準方法を用いて決定する。
【０４６７】
例１５．ｚｃｙｔｏｒ１７受容体モノクローナル体
ｚｃｙｔｏｒ１７可溶性受容体モノクローナル抗体を、本明細書に記載される精製された組換え可溶性ｚｃｙｔｏｒ１７タンパク質により、雄ＢａｌｂＣマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）を免疫化することによって、調製する。マウスは、完全フロイントアジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）中、精製されたタンパク質２０ｍｇの初期腹腔内（ＩＰ）注射、続いて、不完全フロイトアジュバント中、精製されたタンパク質１０μｇの追加免疫ＩＰ注射を、２週ごとに与えられる。第３の追加免疫注射の投与後７〜１０日で、動物は放血され、そして血清が集められ、そして抗体力化を評価する。
【０４６８】
脾臓細胞を、高い力価のマウスから収穫し、そして４：１の融合比の脾臓細胞：骨髄腫細胞を用いて、ＰＥＧ １５００ （Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， ＵＫ） を用いて、ネズミＳＰ２／０骨髄腫細胞に融合する（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｅ． Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ． Ｌａｎｅ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）。融合の後、１０日間の増殖に続いて、特定の抗体−生成ハイブリドマーを、抗体標的物として、精製された組換えｚｃｙｔｏｒ１７可溶性受容体タンパク質（例６Ｃ）を用いて、ＥＬＩＳＡにより、そして抗体標的物として、ｚｃｙｔｏｒ１７配列を発現するＢａ Ｆ３細胞（例８）を用いて、ＦＡＣＳにより同定する。両方法によるその得られる陽性ハイブリドマーを、限界希釈法により３度クローン化する。
【０４６９】
例１６．ＯＲＩＧＥＮアッセイを用いてのｚｃｙｔｏｒ１７受容体へテロダイマー化の評価
可溶性ｚｃｙｔｏｒ１７受容体ｚｃｙｔｏｒ１７ ＣＦＬＡＧ （例１１）、又はｇｐ１３０ （Ｈｉｂｉ， Ｍ． など．， Ｃｅｌｌ６３： １１４９−１１５７， １９９０） を、５倍モル過剰のスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｃｅ， Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）との反応により、製造業者のプロトコールに従って、ビオチニル化する。可溶性ｚｃｙｔｏｒ１７受容体及び他の可溶性受容体サブユニット、例えば可溶性ｇｐ１３０， ＬＩＦ， ＩＬ−１２， ＷＳＸ−１， ＩＬ−７Ｒα（ｓＩＬ−７Ｒα）又はＩＬ−２受容体−γ（ｓＩＬ−２Ｒγ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）、又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１０受容体（ＩＬ−２１Ｒ；通常アメリカ特許出願９４／４０４，６４１号所有）を、５倍モル過剰のＲｕ−ＢＰＹ−ＮＨＳ（Ｉｇｅｎ、Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）により、製造業者のプロトコールに従って、ラベルする。
【０４７０】
可溶性ｚｃｙｔｏｒ１７受容体のビオチニル化され、そしてＲｕ−ＢＰＹ−ＮＨＰ−ラベルされた形は、それぞれＢｉｏ− ｚｃｙｔｏｒ１７受容体及びＲｕ− ｚｃｙｔｏｒ１７と命名され；他の可溶性受容体サブユニットのビオチニル化され、そしてＲｕ−ＢＰＹ−ＮＨＳ−ラベルされた形も同様に命名され得る。アッセイを、ｚｃｙｔｏｒ１７へテロダイマー受容体を結合するリガンドを発現する細胞からのならし培地を用いて、又は精製されたリガンドを用いて行うことができる。好ましいリガンドは、クラスＩヘテロダイマーサイトカイン受容体、例えばｇｐ１３０， ＬＩＦ， ＩＬ−１２， ＩＬ−２， ＩＬ−４， ＩＬ−７， ＩＬ−９， ＩＬ−１５， ｚａｌｐｈａ １１ リガンド（ＩＬ−２１）（通常、アメリカ特許出願０９／５２２，２１７号所有）、ＴＳＬＰ（Ｌｅｖｉｎｅ，ＳＤなど．， 前記；Ｉｓａｋｓｅｎ， ＤＥなど．， 前記；Ｒａｙ， ＲＪなど．， 前記；Ｆｒｉｅｎｄ， ＳＬなど．，前記）を結合することができるそれらのリガンドである。 【０４７１】
初期受容体結合特徴化のために、一連サイトカイン又はならし培地を、それらがｚｃｙｔｏｒ１７受容体ホモダイマー化を介在することができるかどうか、及びそれらが上記の可溶性サブユニットｚｃｙｔｏｒ１７受容体へのヘテロダイマー化を介在できるかどうかを決定するために試験する。これを行うために、５０μｌのならし培地又はＴＢＳ−Ｂ含有の精製されたサイトカインを、例えば４００ｎｇ／ｍｌのＲｕ− ｚｃｙｔｏｒ１７受容体及びＢｉｏ− ｚｃｙｔｏｒ１７、又は４００ｎｇ／ｍｌのＲｕ− ｚｃｙｔｏｒ１７受容体及びＢｉｏ−ｇｐ１３０、又は４００ｎｇ／ｍｌのＲｕ−ＩＬ２Ｒγ及びＢｉｏ− ｚｃｙｔｏｒ１７を含むＴＢＳ−Ｂ（２０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、ｐＨ７．２）５０μｌと組合す。
【０４７２】
室温での１時間のインキュベーションに続いて、３０μｇのストレプタビジン被覆された、２．８ｍｍの磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ， Ｉｎｃ．， Ｏｓｌｏ， Ｎｏｒｗａｙ）を添加し、そしてその反応を、室温でさらに１時間インキュベートする。次に、２００μｌのＯＲＩＧＥＮアッセイ緩衝液（Ｉｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を添加し、そして受容体会合の程度を、Ｍ８　ＯＲＩＧＥＮ分析機（Ｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いて測定する。
【０４７３】
例１７．ｚｃｙｔｏｒ１７ 受容体へテロダイマーを生成するための構造体
分泌されたヒトｚｃｙｔｏｒ１７へテロダイマーを発現するベクターを構成する。この構造体においては、ｚｃｙｔｏｒ１７の細胞外サイトカイン−結合ドメインを、ＩｇＧガンマ１（ＩｇＧγ１）（配列番号３７ 及び３８）のＨ鎖に融合し、そしてヘテロマ−サイトカイン受容体サブユニット（例えば、ｇｐ１３０， ＬＩＦ， ＩＬ−１２， ＷＳＸ−１又はＩＬ−２受容体成分（ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−２Ｒγ）、ＩＬ−４／ＩＬ−１３受容体ファミリー受容体成分（ＩＬ−４Ｒα、ＩＬ−ＢＲα、ＩＬ−１３Ｒα’）、インターロイキン受容体サブユニット（例えば、ＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−７Ｒα、ＩＬ−９Ｒα）、又はｚａｌｐｈａ １１受容体（ＩＬ−２１Ｒ））の細胞外部分を、ヒトカッパＬ鎖（ヒトκＬ鎖）（配列番号３９及び４０）に融合する。
【０４７４】
Ａ．ＩｇＧγ１及びヒトκＬ鎖融合ベクターの構成：
ＩｇＧγ１（配列番号３７）のＨ鎖を、Ｚｅｍ２２９Ｒ哺乳発現ベクター（ＡＴＣＣ寄託番号６９４４７号）中にクローン化し、その結果、５’ＥｃｏＲＩ及び３’ＮｈｅＩ部位を有するいずれかの所望するサイトカイン受容体細胞外ドメインをクローン化でき、Ｎ−末端細胞外ドメイン−Ｃ−末端ＩｇＧγ１融合体をもたらすことができる。この構造体に使用されるＩｇＧγ１フラグメントを、鋳型としてＣｌｏｎｔｅｃｈ ｈＦｅｔａｌ Ｌｉｖｅｒ ｃＤＮＡライブラリーからＩｇＧγ１配列を単離するために、ＰＣＲを用いることにより製造する。
【０４７５】
ＰＣＲ生成物を、本明細書に記載される方法を用いて、精製し、そしてＭｌｕＩ及びＥｃｏＲＩ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）により消化し、エタノール沈殿し、そして本明細書に開示される標準の分子生物学技法を用いて、ＭｌｕＩ及びＥｃｏＲＩにより前もって消化されたＺｅｍ２２９中にＭｌｕＩ／ＥｃｏＲリンカーを含んで成る、オリゴＺＣ１１，４４０（配列番号４１）及びＺＣ１１、４４１（配列番号４２）と共に連結する。
【０４７６】
ヒトκＬ鎖（配列番号３９）を、Ｚｅｍ２２８Ｒ哺乳類発現ベクター（ＡＴＣＣ寄託番号６９４４６号）においてクローン化し、その結果、５’ＥｃｏＲＩ部位及び３’ＫｐｎＩ部位を有する、いずれかのサイトカイン受容体細胞外ドメインがクローン化し、Ｎ−末端サイトカイン細胞外ドメイン−Ｃ−末端ヒトκＬ鎖融合体をもたらすことができる。ＫｐｎＩ部位はヒトκＬ鎖配列（配列番号３９におけるヌクレオチド６２の後を、ＫｐｎＩ酸素により分解される）内に位置するので、特定のプライマーが、サイトカイン受容体の所望する細胞外ドメインの３’末端を、このＫｐｎＩ部位中にクローン化するよう企画される。前記プライマーは、その得られるＰＣＲ生成物が、ＫｐｎＩ部位までのヒトκＬ鎖（配列３９）のセグメントと共に、所望するサイトカイン受容体細胞外ドメインを含むよう企画される。
【０４７７】
このプライマーは好ましくは、配列番号３９に５’側で融合される所望するサイトカイン受容体細胞外ドメインの３’末端の少なくとも１０個のヌクレオチドの部分を含んで成る。この構造体に使用されるヒトκＬ鎖フラグメントを、上記で使用されるのと同じＣｌｏｎｔｅｃｈヒト胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリーからヒトκＬ鎖配列を単離するために、ＰＣＲを用いることによって製造する。ＰＣＲ生成物を、本明細書に記載される方法を用いて精製し、そしてＭｌｕＩ及びＥｃｏＲＩ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）により消化し、エタノール沈殿せしめ、そして本明細書に開示される標準の分子生物学技法を用いて、ＭｌｕＩ及びＥｃｏＲＩにより前もって消化されたＺｅｍ２２８Ｒ中に、上記ＭｌｕＩ／ＥｃｏＲＩリンカーにより連結する。
【０４７８】
Ｂ．融合ベクター構造体中へのｚｃｙｔｏｒ１７受容体又はヘテロダイマーサブユニット細胞ドメインの挿入：
上記構造ベクターを用いて、ＩｇＧγ１に融合されるｚｃｙｔｏｒ１７を有する構造体を製造する。この構成は、標準方法（例えば、例７）及びＥｃｏＲＩ及びＮｈｅＩ制限部位を供給するオリゴを用いて、前立腺ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）又は活性化されたｃＤＮＡライブラリーからの本明細書に記載されるｚｃｙｔｏｒ１７受容体の細胞外サイトカイン−結合ドメイン（配列番号２のアミノ酸１５（Ｃｙｓ）〜２３０（Ｐｒｏ））を、ＰＣＲ処理することによって行われる。その得られるＰＣＲ生成物を、本明細書に記載のようにして、ＥｃｏＲＩ及びＮｈｅＩにより消化し、ゲル精製し、そして上記の前もってＥｃｏＲＩ及びＮｈｅＩ消化され、そしてバンド−精製されたＺｅｍ２２９Ｒ／ＩｇＧγＩ中に連結する。得られるベクターを、配列決定し、ｚｃｙｔｏｒ１７／ＩｇＧガンマ１融合体（ｚｃｙｔｏｒ１７／Ｃｈ１ ＩｇＧ）が正しいことを確認する。
【０４７９】
κＬ鎖に融合されるヘテロダイマーサイトカイン受容体サブユニット細胞外ドメインを有する別々の構造体をまた、上記のようにして構成する。サイトカイン受容体／ヒトκＬ鎖の構成を、標準方法を用いて、例えばリンパ球ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、及びＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩ制限部位を供給するオリゴから、ＰＣＲにより上記のようにして行う。得れれるＰＣＲ生成物を、ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩにより消化し、そして次に、この生成物を、上記のようにして、前もってＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩ消化され、そしてバンド−精製されたＺｅｍ２２８Ｒ／ヒトκＬ鎖ベクター中に連結する。得られるベクターを配列決定し、サイトカイン受容体サブユニット／ヒトκＬ鎖融合体が正しいことを確認する。
【０４８０】
Ｄ．ｚｃｙｔｏｒ１７及びヘテロダイマーサイトカイン受容体サブユニット細胞外ドメインの同時−発現：
約１５μｇの個々の上記ベクターを、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓＴＭ 試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いて、製造業者の説明書に従って、哺乳類細胞、例えばＢＨＫ−５７０細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ−１０３１４）中に同時トランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞を、１μＭのメトトレキセート（ＭＴＸ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）及び０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）において、１０日間、選択する。得られるトランスフェクタントのプールを、１０μｍのＭＴＸ及び０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８において再び選択する。
【０４８１】
得られる二重選択された細胞のプールを用いて、タンパク質を生成する。このプールの３種の画分（Ｎｕｎｃ， Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて、血清フリーのならし培地１０Ｌを生成する。このならし培地を、１ｍｌのタンパク質−Ａカラム上に通し、そして約１０， ７５０μｌの画分に溶出する。最高のタンパク質濃度を有する画分をプールし、そしてＰＢＳに対して透析する（１０ｋＤのＭＷのカットオフ）。最終的に、透析された材料を、通常の方法を用いてのアミノ酸分析（ＡＡＡ）のために提供する。
【０４８２】
例１８．ｚｃｙｔｏｒ１７受容体とヘテロダイマー化又は多重化する受容体サブユニットの決定
本明細書に記載される標準の方法を用いて、追加のヘテロダイマーサイトカイン受容体サブユニットによりトランスフェクトされたＢａＦ３／ＭＰＬ−ｚｃｙｔｏｒ１７キメラ細胞（例６）は、ＴＰＯ（例６）の存在下でルシフェラーゼレポーターへのヘテロダイマーｚｃｙｔｏｒ１７受容体複合体のシグナルトランスダクション応答を測定するために、バイオアッセイ細胞系として作用する。ＴＰＯリガンドの存在下でシグナル化する追加のＭＰＬ−クラスＩサイトカイン受容体融合体によるＢａＦ３／ＭＰＬ− ｚｃｙｔｏｒ１７細胞トランスフェクションは、ヘテロダイマーサイトカイン受容体サブユニットがｚｃｙｔｏｒ１７受容体シグナル化のために必要とされることを決定する。この目的のためへのＭＰＬ−受容体融合体の使用は、ｚｃｙｔｏｒ１７受容体のための天然のリガンドの存在についての必要性を緩和する。
【０４８３】
ＭＰＬ−クラスＩサイトカイン受容体融合体を、ＭＰＬ受容体の細胞外ドメイン及びトランスメンブランドメイン、及び所望するクラスＩサイトカイン受容体の細胞内シグナルドメインを用いて、例５に従って製造する。ＢａＦ３／ＭＰＬ− ｚｃｙｔｏｒ１７バイオアッセイ細胞系を、例６におけるようにして、個々のＭＰＬ−クラスＩサイトカイン受容体融合体により同時トランスフェクトし、ＢａＦ３／ＭＰＬ− ｚｃｙｔｏｒ１７／ＭＰＬ−クラスＩサイトカイン受容体細胞系を形成する。
【０４８４】
受容体複合体は、ｇｐ１３０， ＬＩＦ， ＩＬ−１２又はＷＳＸ−１成分、又は１又は複数のＩＬ−２受容体成分（ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−２Ｒγ）、１又は複数のＩＬ−４／ＩＬ−１３受容体ファミリー受容体成分（ＩＬ−４Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα’）、及び他のインターロイキン受容体（例えば、ＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−７Ｒα、ＩＬ−９Ｒα、ＩＬ−２１Ｒ（Ｚａｌｐｈａ １１受容体））を含んで成るＭＰＬ−サイトカイン受容体融合体と組合してのｚｃｙｔｏｒ１７受容体を包含するが、但しそれらだけには限定されない。次に、個々の独立した受容体複合体細胞系を、ＴＰＯ（例６）の存在下でアッセイし、そして増殖性を、通常の方法（例えば、例６に記載されるようなＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイ）を用いて測定する。
【０４８５】
ＢａＦ３／ＭＰＬ−ｚｃｙｔｏｒ１７バイオアッセイ細胞系は、バックグラウンドルシフェラーゼ活性についての対照として作用し、そして従って、種々の受容体複合体組み合わせによりシグナル化を比較するための基線として使用される。さらに、ルシフェラーゼレポーターアッセイ（レポーター遺伝子の転写の活性化）によるアッセイはまた、増殖の誘発にもかかわらず、シグナル化を測定する手段として使用され得る。
【０４８６】
さらに、ＢａＦ３／ＭＰＬ−クラスＩサイトカイン受容体細胞系を構成し、ホモダイマー化に基づいてシグナル化することが知られているそれらのクラスＩサイトカイン受容体についてのＭＰＬ−クラスＩサイトカイン受容体ホモダイマー化効果を制御することができる。正しい受容体複合体の存在下でのＴＰＯは、ＴＰＯの存在下で、バックグラウンドより約５倍又はそれ以上、ＢａＦ３／ＭＰＬ− ｚｃｙｔｏｒ１７／ＭＰＬ−クラスＩサイトカイン受容体細胞系の増殖を高めることが予測される。
【０４８７】
例１９．インビトロでのｚｃｙｔｏｒ１７受容体の再構成
ｚｃｙｔｏｒ１７−シグナル化複合体に包含される成分を同定するために、受容体再構成の研究を、次の通りにして行う。例えば、ルシフェラーゼレポーター哺乳類発現ベクタープラスミドにより、本明細書に記載される標準方法を用いて、トランスフェクトされたＢＨＫ５７０細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ−１０３１４）は、ｚｃｙｔｏｒ１７リガンドの存在下でルシフェラーゼレポーターに対する、トランスフェクトされたｚｃｙｔｏｒ１７受容体複合体からのシグナルトランスダクション応答を測定するために、バイオアッセイ細胞系として作用する。
【０４８８】
ＢＨＫ細胞は、ＢＨＫ細胞がｚｃｙｔｏｒ１７受容体を内因的に発現しない場合において使用され得る。他の細胞系は使用され得る。典型的なルシフェラーゼレポーター哺乳類発現ベクターは、次の４種の遺伝子からのＳＴＡＴ転写因子結合要素を含む相補的オリゴヌクレオチドＺＣ１２，７４９配列番号４３）及びＺＣ１２，７４８（配列番号４４）により構成されたＫＺ１３４プラスミドである：修飾されたｃ−ｆｏｓ Ｓｉｓ誘発性要素（ｍ６７ＳＩＥ又はｈＳＩＥ）（Ｓａｄｏｗｓｋｉ， Ｈ． など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１： １７３９−１７４４， １９９３）、 ｐ２１ ＷＡＦ１遺伝子からのｐ２１ ＳＩＥ１（Ｃｈｉｎ，Ｙ． など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２： ７１９−７２２， １９９６）、β−カゼイン遺伝子の乳腺応答要素（Ｓｃｈｍｉｔｔ−Ｎｅｙ， Ｍ． など．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１： ３７４５−３７５５， １９９１）、及びＦｃｇ ＲＩ遺伝子のＳＴＡＴ誘発性要素（Ｓｅｉｄｅｌ，Ｈ． など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９２： ３０４１−３０４５， １９９５）。
【０４８９】
それらのオリゴヌクレオチドは、Ａｓｐ７１８−ＸｈｏＩ適合性末端を含み、そして同じ酵素により消化されたｃ−Ｆｏｓプロモーター（Ｐｏｕｌｓｅｎ， Ｌ．Ｋ． など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３： ６２２９−６２３２， １９９８）を有し、そしてネオマイシン選択マーカーを含む受容体ホタルルシフェラーゼレポーターベクター中に、標準の方法を用いて連結された。ＫＺ１３４プラスミドを用いて、ＢＨＫ又はＢａＦ３細胞を標準のトランスフェクション及び選択方法により安定してトランスフェクトし、それぞれ、ＢＨＫ／ＫＺ１３４又はＢａＦ３／ＫＺ１３４細胞系を製造する。
【０４９０】
バイオアッセイ細胞を、ｚｃｙｔｏｒ１７受容体のみによりトランスフェクトし、ｚｃｙｔｏｒ１７受容体及び種々の他の既知受容体サブユニットの１つにより同時にトランスフェクトする。受容体複合体は、ｚｃｙｔｏｒ１７受容体のみ、ｇｐ１３０， ＬＩＦ， ＩＬ−１２またはＷＳＸ−１受容体サブユニット、又は１又は複数のＩＬ−２受容体成分（ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−２Ｒγ）を有するｚｃｙｔｏｒ１７受容体、１又は複数のＩＬ−４／ＩＬ−１３受容体ファミリー受容体成分（ＩＬ−４Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα’）を有するｚｃｙｔｏｒ１７受容体、及び他のインターロイキン受容体（例えば、ＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−７Ｒα、ＩＬ−９Ｒα、ＩＬ−２１Ｒ（Ｚａｌｐｈａ １１受容体））と、ｚｃｙｔｏｒ１７受容体との種々の組み合わせを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０４９１】
次に、個々の独立した受容体複合体細胞系を、サイトカイン−ならし培地又は精製されたサイトカインの存在下でアッセイし、そしてルシフェラーゼ活性を通常の方法を用いて測定する。トランスフェクトされていないバイオアッセイ細胞系は、バックグランドルシフェラーゼ活性のための対照として作用し、そして従って、種々の受容体複合体組み合わせによるシグナルを比較するための基線として使用される。正しい受容体複合体の存在下でｚｃｙｔｏｒ１７受容体を結合するならし培地又はサイトカインは、バックグラウンドよりも約５倍又はそれ以上のルシフェラーゼ読み取りを付与することが予測される。
【０４９２】
他方では、ＢａＦ３／ ｚｃｙｔｏｒ１７−ｍｐｌ及びＢａＦ３／ ｚｃｙｔｏｒ１７（例１０）細胞系が上記のように同時−トランスフェクトされ、そして増殖が測定される類似するアッセイを行うことができる。
【０４９３】
例２０．十分な長さのｚｃｙｔｏｒ１７を発現するＢａＦ３細胞の構成
ＢａＦ３、すなわちネズミ骨髄に由来するインターロイキン−３ （ＩＬ−３） 依存性プレ−リンパ球細胞系（Ｐａｌａｃｉｏｓ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ， Ｃｅｌｌ ４１： ７２７−７３４， １９８５； Ｍａｔｈｅｙ−Ｐｒｅｖｏｔ など．，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ６：４１３３−４１３５， １９８６）を、１０％熱−不活性化されたウシ胎児血清、２ｎｇ／ｍｌのネズミＩＬ−３ （ｍＩＬ−３） （Ｒ＆Ｄ． Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）、２ｍＭのＬ−ｇｌｕｔａＭａｘ−１ＴＭ （Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）， １ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）及びＰＳＮ抗生物質（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）により補充された完全倍地（ＲＰＭＩ培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．， Ｌｅｎｅｘａ， ＫＳ））において維持した。
【０４９４】
エレクトロポレーションのためのＢａＦ３細胞を、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）により２度洗浄し、そして次に、ＲＰＭＩ培地に１０７個の細胞／ｍｌの細胞密度で再懸濁した。１ｍｌの再懸濁されたＢａＦ３細胞を、３０μｇのｐＺＰ７ＰＸ／ｚｃｙｔｏｒ１７プラスミドＤＮＡと共に混合し、そして別々の使い捨てエレクトロポレーションチャンバー（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）に移した。次に、細胞に、エレクトロポレーション装置（ＣＥＬＬ−ＰＯＲＡＴＯＲＴＭ； Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）により供給される２回の連続したショック（８００ １Ｆａｄ／３００Ｖ； １１８０ １Ｆａｄ／３００Ｖ）を与えた。
【０４９５】
次に、エレクトロポレートされた細胞を、２０ｍｌの完全培地に移し、そして４８時間（３７℃、５％ＣＯ２）、インキュベーターに配置した。次に、細胞を回転沈降し、そしてＴ７５フラスコに２μｇ／ｍｌのピューロマイシン（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎを含む完全培地２０ｍｌに再懸濁し、ピューロマイシン耐性プールを単離した。この後、ＢａＦ３／ｚｃｙｔｏｒ１７細胞と呼ばれる、トランスフェクトされたＢａＦ３細胞のクローン系を、下記のようにして単離した。
【０４９６】
ＢａＦ３／ｚｃｙｔｏｒ１７細胞を血球計により計数し、そして２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含む完全培地においてウェル当たり１００μｌの体積において、１細胞／ウェル、０．１細胞／ウェル及び０．０１細胞／ウェルでプレートした。１５個のクローンをＴ７５フラスコに拡大し、そして５個のクローンを、ＲＮＡ生成についてアッセイした。細胞をＰＢＳにより１度、洗浄し、そして血球計により計数し、５×１０６個の細胞を回転沈降し、そして培地を除去した。
【０４９７】
トランスフェクトされなかったＢａＦ３細胞をまた計数し、そしてペレット化した。ペレットのうち４個を−８０℃で一晩、凍結した。ＲＮＡを、Ｓ．Ｎ．Ａ．Ｐ．ＴＭ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造業者の説明書に従って単離し、そして全ＲＮＡ収率を、分光計により決定した。次に、ｚｃｙｔｏｒ１７ ＲＮＡの量を、ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてのＲＴ−ＰＣＲにより、製造業者の説明書に従って、ｚｃｙｔｏｒ１７−特異的プライマーＺＣ２９，１８０（配列番号７２）及びＺＣ２９，１２２（配列番号６５）を用いて決定した。ｚｃｙｔｏｒ１７ ＲＮＡの強いバンドを付与する１つのクローンを、可能性あるリガンドを試験するために、ＢａＦ３ Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ増殖アッセイ（例６）への使用のために選択した。
【０４９８】
例２１．マウス精巣ｃＤＮＡライブラリーからのマウスｚｃｙｔｏｒ１７のクローニング
マウス精巣ｃＤＮＡライブラリーを、マウスｚｃｙｔｏｒ１７の十分な長さのクローンについてスクリーンした。前記ライブラリーを、２４ＬＢ＋Ａｍｐプレート上に、６５，５００ｃｆｕ／プレートでプレートした。フィルターリフトを、合計約１．６×１０６個のコロニーに対して、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ （Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ） を用いて調製した。フィルターを配向のために熱い針により印を付け、そして次に、０．５ＭのＮａＯＨ及び１．５Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）において６分間、変性した。次に、ＤＮＡを、ＵＶ架橋剤（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（商標）， Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｌｏｌｌａ， ＣＡ）を用いて、１２００ジュールでフィルターに固定した。次に、フィルターを、室温で一晩、放置乾燥した。
【０４９９】
次の日、フィルターを、０．２５×ＳＳＣ， ０．２５％のＳＤＳ及び１ｍＭのＥＤＴＡから成る前−洗浄緩衝液により６５℃で前−洗浄した。細胞残骸を、Ｋｉｍｗｉｐｅｓ（商標）（Ｋｉｍｂｅｒｌｙ−Ｃｌａｒｋ）を用いて、手動的に除去し、そしてその溶液を１時間にわたって３度、変えた。フィルターを空気乾燥し、そして必要とされるまで、室温で貯蔵した。次に、フィルターを、２０ｍｌのＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂＴＭ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）において、６３℃で約３時間、プレハイブリダイズした。
【０５００】
プローブＢ（例３Ｃ）を、オリゴヌクレオチドプライマーＺＣ２７，８９５（配列番号６４）及びＺＣ２８，９１７（配列番号７３）を用いて、ヒトｚｃｙｔｏｒ１７鋳型からのＰＣＲにより生成し、そして市販のキット（Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ； Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を用いて、製造業者の説明書に従って、３２Ｐにより放射性ラベルした。プローブを、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＴＭ プッシュカラム（ＮａｃＴｒａｐ（商標）カラム；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）を用いて精製した。プローブを、１００℃で１５分間、変性し、そしてＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂＴＭ に添加した。
【０５０１】
フィルターを、１．６×１０６ｃｐｍ／ｍｌのプローブを含むハイブリダイジング溶液１５ｍｌにおいて６３℃で一晩ハイブリダイズした。フィルターを、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ及び１ｍＭのＥＤＴＡにより５５℃で洗浄し、そして−８０℃で４．５日間、Ｘ−線フィルムに照射した。１３個の陽性体を、プラグとしてプレートから採取し、そして１．７ｍｌの管における１ｍｌのＬＢ＋ａｍｐに配置した。管を４℃で一晩、配置した。それらの１３個の陽性体を、さらなる２回の精製にゆだねた。第三プレートを、フィルターリフトが取られた後、３７℃で増殖し、そして単一のコロニーを採取し、そして配列決定した。それらのうち３個は、ｚｃｙｔｏｒ１７のマウスオルト体の配列を含むことが決定された。
【０５０２】
さらに、ＰＣＲ生成物を、鋳型としてＣＴＬＬ−２ ｃＤＮＡ、及びプライマーとしてオリゴヌクレオチドＺＣ３８，２３９（配列番号８８）及びＺＣ３８，２４５（配列番号８９）を用いて生成した。ＣＴＬＬ−２はマウス細胞毒性Ｔリンパ球細胞系（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＴＴＢ−２１４）である。このＰＣＲ反応を次の通りに行った：９５℃で１分（１サイクル）、９５℃で１５秒、６８℃で３分、次に６８℃で１０分（３０サイクル）；４℃でのソーキング。ＰＣＲ反応は、約０．５ｎｇのｃＤＮＡ、２０ｐモルの個々のオリゴヌクレオチド、及び１μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ ＩＩポリメラーゼ混合物（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）を用いた。
【０５０３】
ＰＣＲ生成物の約６％を、上記のように、新規のＰＣＲ反応において鋳型として使用し、但し、オリゴヌクレオチドＺＣ３８，２３９（配列番号８８）及びＺＣ３８，２３８（配列番号９０）を使用した。このＰＣＲ反応は次の通りに行われた：９４℃で４５秒、６５℃で４５秒、７２℃で１分、次に７２℃で７分（３０サイクル）；１０℃でのソーキング。ＰＣＲ反応のほとんどを、１．０％アガロースゲル上に負荷し、そして約３６０ｂｐでの卓越したバンドを切除し、ＤＮＡフラグメントを溶出し、そしてＤＮＡ配列決定を行った。
【０５０４】
マウスｚｃｙｔｏｒ１７ポリヌクレオチドの配列は、配列番号５６に示され、そしてその対応するアミノ酸配列は配列番号５７に示される。さらに、切断された可溶性形のマウスｚｃｙｔｏｒ１７ポリヌクレオチドは配列番号９２に示され、そしてその対応するアミノ酸配列は配列番号９３に示される。
【０５０５】
例２２．ＰＣＲを用いての組織パネルにおけるヒトｚｃｙｔｏｒ１７の組織分布
ヒト組織からのｃＤＮＡのパネルを、ＰＣＲを用いて、ｚｃｙｔｏｒ１７発現についてスクリーンした。パネルは自家製造され、そして種々の正常及び癌性ネズミ組織からの９４種のマラソンｃＤＮＡ及びｃＤＮＡサンプルを包含し、そして細胞系は下記表７に示される。前記ｃＤＮＡは自家ライブラリーからであり、又はマラソンｃＤＮＡは自家ＲＮＡ調製物、すなわちＣｌｏｎｔｅｃｈ ＲＮＡ又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＲＮＡからであった。マウスマラソンｃＤＮＡは、マラソン−ＲｅａｄｙＴＭ キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を用いて製造され、そしてマウストランスフェリンプライマーＺＣ１０，６５１（配列番号７９）及びＺＣ１０，５６５（配列番号８０）によりＱＣ試験し、そして次に、トランスフェリンバンドの強さに基づいて希釈された。
【０５０６】
パネルサンプルにおける増幅されたライブラリーサンプルの性質を評価するために、品質管理（ＱＣ）についての次の３種の試験を行った：（１）ライブラリーのために使用されるＲＮＡ品質を評価するために、自家ｃＤＮＡを、個々のｃＤＮＡライブラリーについてのベクター配列に対して特異的であるベクターオリゴによるＰＣＲにより、平均挿入体について試験し；（２）パネルサンプルにおけるｃＤＮＡの濃度の標準化を、５’ベクターオリゴＺＣ１４，０６３（配列番号７）及び３’α−チューブリン特異的オリゴプライマーＺＣ１７，５７４（配列番号２６）又は３’Ｇ３ＰＤＨ特異的オリゴプライマーＺＣ１７，６００（配列番号２７）を用いて、十分な長さのαチューブリン又はＧ３ＰＤＨ ｃＤＮＡを増幅するために、標準のＰＣＲ方法を用いて達成し；そして（３）サンプルを、可能なリボソーム又はミトコンドリアＤＮＡ汚染について調べるために配列決定に送った。
【０５０７】
パネルを、ヒトゲノムのＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ， Ａｌｔｏ， ＣＡ）陽性対照サンプルを含む９６−ウェル形式において組みたてた。個々のウェルは約０．２〜１００ｐｇ／μｌのｃＤＮＡを含んだ。ＰＣＲ反応を、オリゴＺＣ３８，０６５（配列番号７７）及びＺＣ３８，０６８（配列番号７８）、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ ＴａｑＴＭ （ＴＡＫＡＲＡ Ｓｈｕｚｏ Ｃｏ． ＬＴＤ， Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｇｒｏｕｐ， Ｊａｐａｎ）， 及びＲａｄｉｌｏａｄ 色素（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．， Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ＡＬ）を用いて組みたてた。増幅を次の通りに行った：９４℃で５分（１サイクル）；９４℃で３０秒（５サイクル）；９４℃で３０秒、５６℃で３０秒及び７２℃で３０秒（３５サイクル）、続いて７２℃で５分（１サイクル）。
【０５０８】
約１０μｌのＰＣＲ反応生成物を、４％アガロースゲルを用いての標準のアガロースゲル電気泳動にゆだねた。正しい推定されるＤＮＡフラグメントサイズを、脳、ＣＤ９０＋細胞、樹状突起、胚、ＭＥＷｔ＃２、Ｔｕｖａｋ−前立腺細胞系、唾液腺、皮膚及び精巣において観察した。
皮膚及び精巣についてのＤＮＡフラグメントを切除し、そしてＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）を用いて、製造業者の説明書に従って精製した。フラグメントを、それらが実際、ｚｃｙｔｏｒ１７であることを示すために、配列決定により確かめた。
【表８】
2004501628.tif 000010
例２３．同時定量的ＲＴ／ＰＣＲを用いての種々の組織におけるｚｃｙｔｏｒ１７発現
Ａ．定量的ＲＴ−ＰＣＲのためのプライマー及びプローブ：
ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ） を用いて同時定量的ＲＴ−ＰＣＲは、これまでに記載されている（Ｈｅｉｄ， Ｃ．Ａ． など．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６： ９８６−９９４， １９９６； Ｇｉｂｓｏｎ， Ｕ．Ｅ．Ｍ． など．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９９５−１００１； Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ， Ｓ． など．， Ｅｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３９： ４７５６−４７６４， １９９８を参照のこと）。
【０５０９】
この方法は、レポーター及び消光剤蛍光色素の両者を含む遺伝子特異的プローブの使用を組み込む。プローブが損なわれていない場合、レポーター色素発光は、消光色素の密接した接近性のために無効にされる。追加の遺伝子−特異的前方向及び逆方向プライマーを用いてのＰＣＲ延長の間、プローブは、プローブからレポーター色素を開放するＴａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により分解され、蛍光発光の上昇がもたらされる。
【０５１０】
ｚｃｙｔｏｒ１７発現の同時定量化ＲＴ−ＰＣＲ分析のために使用されるプライマー及びプローブを、プライマー企画ソフトウェアーＰｒｉｍｅｒ ＥｘｐｒｅｓｓＴＭ （ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ） を用いて企画した。ヒトｚｃｙｔｏｒ１７のためのプライマーを、ゲノムＤＮＡの増幅を排除するためにイントロン−エキソン連結に及ぶよう企画した。前方向プライマー、ＺＣ３７，８７７（配列番号８１）及び逆方向プライマー、ＺＣ３７，８７６（配列番号８２）を、７３ｂｐの生成物を合成するために約３００ｎＭの濃度でＰＣＲ反応（下記）に使用した。ＺＧ３７，７７６（配列番号８３）と称する、その対応するｚｃｙｔｏｒ１７ ＴａｑＭａ（商標）プローブを合成し、そしてＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによりラベルした。ＺＧ３７，７７６プローブを、レポーター蛍光色素（６−カルボキシ−フルオレセイン）（ＦＡＭ）（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により５’末端で、及び消光剤蛍光色素（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）（ＴＡＭＲＡ）（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により３’末端でラベルした。
【０５１１】
試験されるＲＮＡサンプルの統合性及び性質を試験するための対照として、すべてのＲＮＡサンプル（下記）を、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （カタログ番号４３０４４８３）から指図されたプライマー及びプローブ組を用いて、ｒＲＮＡについてスクリーンした。キットは、ｒＲＮＡ前方向プライマー（配列番号８４）、ｒＲＮＡ逆方向プライマー（配列番号８５）、及びｒＲＮＡ ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（配列番号８６）を含む。ｒＲＮＡプローブを、レポーター蛍光色素ＶＩＣ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によりその５’末端で、及び消光剤蛍光色素ＴＡＭＲＡ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によりその３’末端でラベルした。そのｒＲＮＡ結果はまた、内因性対照としても作用し、そして試験サンプルに見られるｚｃｙｔｏｒ１７ ｍＲＮＡ発現結果の標準化を可能にする。
【０５１２】
血液を何人かの匿名のドナーから採血し、そしてＰＢＭＣを単離した。次に、種々の免疫細胞サブセット（ＣＤ３＋， ＣＤ４＋， ＣＤ８＋， ＣＤ１４＋， ＣＤ１９＋， ＣＤ４５ＲＡ， ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ５６＋）を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃからのＭｉｃｒｏｂｅａｄｓ 及びＭａｇｎｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ を用いて単離した。ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｄｉｐｒｅｐＴＭ キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）を用いて、製造業者の説明書に従って、それらの休止状態におけるＣＤ４５ＲＡ，ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ５６＋集団のすべてから調製した。ＣＤ３＋，ＣＤ４＋及びＣＤ８＋集団を、２００ｎｇ／ｍｌのプレート結合された抗−ＣＤ３抗体及び５μｇ／ｍｌの可溶性抗−ＣＤ２８抗体を用いて活性化し、そして細胞を、０，４及び１６時間でのＲＮＡ単離のために集めた。
【０５１３】
ＣＤ１９＋サンプルを、ヒト扁桃から単離し、そして０．５μｇ／ｍｌのイノマイシン及び１０ｎｇ／ｍｇのＰＭＡにより活性化した。次に、細胞を、０， ４及び２４時間で集め、そしてＲＮＡを単離した。ヒトＣＤ１４＋単球を、０．１μｇ／ｍｌのＬＰＳ又は１．０μｇ／ｍｌのＬＰＳのいずれかにより２０時間、活性化した。次に休止の及び活性化細胞を集め、そしてＲＮＡを単離した。さらに、ＲＮＡを、休止の及び活性化された（１０．０μｇ／ｍｌのＬＰＳ）ヒト単球細胞系ＨＬ−６０、ＴＨＰ−１（ＡＴＴＣ Ｎｏ． ＴＩＢ−２０２）及びＵ９３７から単離した。ＴＨＰ−１ ＲＮＡを、それは、ノザンブロットによりｚｃｙｔｏｒ１７を発現することが示されているので（例３）、対照として使用した。
【０５１４】
Ｂ．同時定量性ＲＴ−ＰＣＲ：
ｚｃｙｔｏｒ１７ ｍＲＮＡの相対的レベルを、１−段階ＲＴ−ＰＣＲ方法（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、全ＲＮＡサンプルを分析することによって決定した。ｚｃｙｔｏｒ１７を発現するＴＨＰ−１細胞からの全ＲＮＡを、標準方法により単離し、そして定量化のために使用される標準曲線を生成するために使用した。曲線は、ｒＲＮＡスクリーンについて０．２５〜０．０００２５ｎｇ／μｌ、及びｚｃｙｔｏｒ１７スクリーンについて２５０〜０．２５ｎｇ／μｌの一連の１０倍希釈から成り、そして個々の標準曲線点は、三重反復して分析された。ヒト細胞からの全ＲＮＡサンプルをまた、ヒトｚｃｙｔｏｒ１７転写体レベル及び内因性対照としてのｒＲＮＡのレベルについて三重反復して分析した。
【０５１５】
２５μｌの合計体積においては、個々のＲＮＡサンプルを、次のものを含む１−段階ＲＴ−ＰＣＲ反応にゆだねた：緩衝液Ａ（５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ）中、約５０ｎｇの全ＲＮＡ；適切なプライマー（ｒＲＮＡサンプルのための約５０ｎＭのｒＲＮＡプライマー（配列番号８４及び８５）及びｚｃｙｔｏｒ１７サンプルのための約３００ｎＭのＺＣ３７，８７７（配列番号８１）及びＺＣ２２，２７６（配列番号８７）プライマー）；適切なプローブ（ｒＲＮＡサンプルのための約５０ｎＭのｒＲＮＡ ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（配列番号８６）及びｚｃｙｔｏｒ１７サンプルのための約１００ｎＭのＺＧ３７，７７６（配列番号８３）プローブ）；５．５ｍＭのＭｇＣｌ２；３００μＭの個々のｄ−ＣＴＰ， ｄ−ＡＴＰ及びｄ−ＧＴＰ， 及び６００μＭのｄ−ＵＴＰ； ＭｕＬｖ逆転写酵素（０．２５Ｕ／μｌ）；ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ（０．０２５Ｕμｌ）（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；及びＲＮアーゼインヒビター（０．４Ｕ／μｌ）（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。ＰＣＲ熱サイクリング条件は次の通りであった：４８℃で３０分間の１つのサイクルの初期逆転写（ＲＴ）段階；続いて、９５℃で１０分間のＡｍｐｌｉＴａｑ ＧｏｌｄＴＭ （ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） 活性化段階；続いて、９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の４０サイクルの増幅。
【０５１６】
相対的ｚｃｙｔｏｒ１７ ＲＮＡレベルを、製造業者ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （Ｕｓｅｒ Ｂｅｌｌｅｔｉｎ ＃２： ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １１， １９９７） により記載されるような標準曲線方法を用いて決定した。ｒＲＮＡ測定値を用いて、ｚｃｙｔｏｒ１７レベルを標準化した。前述のことを試験する３種の実験を行った。下記表９及び１０に示されるデータは、ｒＲＮＡに対するｚｃｙｔｏｒ１７ ｍＲＮＡの比である。
【０５１７】
【表９】
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【０５１８】
【表１０】
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【０５１９】
末梢血液からの休止ＣＤ１９＋Ｂ細胞にｚｃｙｔｏｒ１７メッセージのいくらの発現が存在するが、ヒト扁桃から単離された、休止の及び活性化されたＣＤ１９＋Ｂ細胞は最少の発現のみを示した。休止記憶Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＯ）、生来のＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ）及びＮＫ細胞（ＣＤ５６＋）はすべて、ｚｃｙｔｏｒ１７メッセージについて陰性であることが試験された。しかしながら、ＣＤ３＋Ｔ細胞においては、ｚｃｙｔｏｒ１７メッセージは、抗−ＣＤ３及び抗−ＣＤ２８抗体による４時間の活性化に続いて、約０．７２の比率への劇的なアップレギュレーションを受けた。次に、その比率は、活性化後、１６時間までに０．５１に低下した。活性化の前、ｚｃｙｔｏｒ１７ ｍＲＮＡは、休止ＣＤ３＋Ｔ細胞においては検出されなかった。
【０５２０】
前記結果は、ｚｃｙｔｏｒ１７が休止ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットにおいて適切なレベルで存在しなかったことを示した。抗−ＣＤ３及び抗−ＣＤ２８抗体による４時間の活性化に続いて、ＣＤ＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの両者において生成されるｚｃｙｔｏｒ１７メッセージの実質的なアップレギュレーションが存在するように思える。活性化の１６時間後までに、ｚｃｙｔｏｒ１７ ｍＲＮＡは、ＣＤ４＋Ｔ細胞において０．４１に、及びＣＤ８＋Ｔ細胞において０．１３に低下した。
【０５２１】
休止及び活性化された単球細胞系ＴＨＰ−１及びＵ９３７の両者において、ｚｃｙｔｏｒ１７メッセージの非常に高い発現が存在した。ＨＬ−６０、すなわち前−分化された単球細胞系は、活性化に基づくｚｃｙｔｏｒ１７　ｍＲＮＡ発現の低下を示した。それらの結果は、ノザンブロットにより行われる発現結果（例２）を支持する。休止の、及び０．１μｇ／ｍｌ及び１．０μｇ／ｍｌのＬＰＳにより活性化された−次ＣＤ１４＋単球においては、ｚｃｙｔｏｒ１７メッセージの非常に低い発現が存在した。
前述から、本発明の特定の態様が例示の目的のために本明細書において記載されて来たが、種々の修飾が本発明の範囲内で行われ得ることが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリヌクレオチド配列の配列番号４６，１８，５４，２及び２２の複数の一列整列である。
【図２】図２は、ヒトｚｃｙｔｏｒ１７（ＺＣＹＴＯＲ）（配列番号５４）及びマウスｚｃｙｔｏｒ１７（Ｍ１７Ｒ−Ｏ）（配列番号５７）の一列整列である。それらの２種の配列間では、同一の残基（：）、保存された残基（．）及びギャップ（．．）が示される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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