(57)【要約】本発明は、病原性微生物のインビボ増殖に必要な遺伝子を同定および選択する方法に関する。該方法は、病原性微生物の株を使用すること、これら因子をエンコードする遺伝子における不活性化のために突然変異体を生成させること、実験感染モデルに対するこれら突然変異体の毒性と、無菌マウスモデルにおける腸内コロニー形成に対するそれらの作用を判定すること、及び、インビトロでの血清に対する抵抗性に必須であり、宿主細胞において血清中播種のために必須である細菌遺伝子を選択することを含む。同定された遺伝子の産物を阻害する化合物をスクリーニングすること、及び、血清中病原性微生物の増殖のインビトロ阻害に対する用途。【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原性微生物のインビボ増殖に必要な遺伝子の同定および選択方法であって、
・病原微生物株を使用すること；
・これらの因子をエンコードする遺伝子において、不活化のために突然変異体を生成させること；
・実験感染モデルに対するこれら変異体の毒性と、無菌マウスモデルにおける腸内コロニー形成に対するその変異体の作用を判定すること；および
・インビトロで血清に対する抵抗性に必須であり、宿主内において血清中播種のために必須の細菌遺伝子を選択すること；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
大腸菌(E.coli)株ＥＸＰＥＣまたはストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptcoccus agalactiae)株を使用することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
請求項１または２記載の方法を満足する毒性遺伝子不活化のための変異型核酸。
【請求項４】
血清に感受性であり、マウスモデルにおいて無毒性であり、かつ無菌マウスの腸内コロニー形成可能な変異型核酸。
【請求項５】
配列番号１６〜３０のヌクレオチド配列の一つに対応する単離もしくは精製核酸によりエンコードされる病原性または毒性標的。
【請求項６】
当該核酸が配列番号１６、１７、１９〜３０のヌクレオチド配列の一つに対応する請求項５に記載の病原性または毒性標的。
【請求項７】
当該核酸がｃＤＮＡである請求項５または６に記載の病原性または毒性標的。
【請求項８】
当該核酸がＲＮＡである請求項５または６に記載の病原性または毒性標的。
【請求項９】
当該核酸が、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella typhimurium)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、エルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)、セラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ビブリオ・コレラ(Vibrio cholerae)、シュードモナス・エルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa)、アセチノバクター(Acetinobacter)、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)、ブルコルデリア・シュードマレイ(Burkholderia pseudomallei)、ナイセリア・メニンジティディス(Neisseria meningitidis)、ナイセリア・ゴノレエ(Neisseria gonorrhoeae)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、クロストリジウム・アセトブチリクム(Clostridium acetobutylium)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphyloccus aureus)、およびエンテロコッカス(Enterococcus)からなる病原性菌体の核酸に対応するものである請求項６〜８のいずれか１項に記載の病原性または毒性標的。
【請求項１０】
大腸菌またはストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)の核酸に対応する請求項９記載の病原性または毒性標的。
【請求項１１】
請求項５〜１０のいずれか１項に記載の少なくとも１種の病原性または毒性標的を含んでなるベクター。
【請求項１２】
請求項１１記載のすくなくとも１種のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
請求項５〜１０のいずれか１項に記載の病原性または毒性標的の発現産物。
【請求項１４】
配列番号１〜１５のアミノ酸配列の一つに対応するものであることを特徴とする単離または精製ペプチド。
【請求項１５】
配列番号１、２、４〜１５のアミノ酸配列の一つに対応するものであることを特徴とする請求項１４記載の単離または精製ペプチド。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のペプチドに特異的に結合し得る抗体。
【請求項１７】
血清中病原性微生物の増殖をインビトロで阻害する方法であって、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の病原性または毒性標的の活性を阻害し得るか、もしくは病原性または毒性標的の量を低減し得る化合物、または請求項１５記載のペプチドの活性を阻害し得る化合物の有効量を使用することを含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項６〜１０のいずれか１項に記載の病原性または毒性標的の発現、または請求項１５記載のペプチドの発現を阻害し得る化合物のスクリーニング方法であって、試験化合物と接触させて、前記病原性または毒性標的または前記ペプチドの活性に対する該化合物の可能性のある作用を証明し、その活性化合物を選択することを含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項６〜１０のいずれか１項に記載の病原性または毒性標的により発現されるペプチドの生化学的活性および／または酵素活性を阻害し得る化合物のスクリーニング方法。
【請求項２０】
細菌感染、取分け腸内細菌の場合の腸管外感染を阻害する医薬製品開発のための、請求項１９により選択した化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌感染および／または全身性播種の予防および制御手段開発に際し標的として使用し得る病原性決定基に関する。
【０００２】
細菌起源感染症の現行治療法は、抗生物質を用いる、インビトロで必須の細菌標的の阻害に基づいている。これらの標的は多くの細菌種に保存されており、多様なタイプの感染処置を可能としている。しかし、広域スペクトル抗生物質は宿主の共生叢(commensal flora)に対し活性であるが、共生叢はこれらの抗生物質に対して耐性メカニズムの獲得と伝達を促進し、結果として抗生物質による現行治療の有効性を制限することとなる。従って、新規な抗菌処置が必要である。
【０００３】
このような観点で、本発明は新規の戦略を提供するものであり、その目的は共生状態にある細菌の宿主生体への侵入口での増殖を有意に変えることなく、病原菌を特異的に標的とすることにある。これらの病原体はとりわけ重篤な全身性感染症に関わる細菌、例えば、大腸菌(E.coli)、一般的なエンテロバクター(Enterobacteria)、シュードモナス(Pseudomonas)、アシネトバクター(Acinetobacter)、モラクセラ(Moraxella)およびナイセリア(Neisseria)、またグラム陽性菌としてスタヒロコッカス(Staphlococcus)、エンテロコッカス(Enterococcus)およびストレプトコッカス(Streptococcus)属の細菌である。
【０００４】
特に、重篤な感染症の原因菌は、血清の存在下に増殖可能であり、補体の抗菌作用に抵抗性であることが知られている。この抵抗性は、血液を経由する宿主本体の様々な組織へ感染が播種することを可能とする。
【背景技術】
【０００５】
ヒト血清中で増殖する細菌の能力は、異なる病原性／毒性因子による。しばしば引用されるものの中で考慮すべきものは、補体が細菌の膜に接近する際の莢膜(capsule)に代表される物理的障壁、莢膜の、または因子Ｈがｃ３ｂに結合するのを促進するＯ抗原のシアル酸、および特定の表面タンパク質、例えば、ＰｏｒＡ（ナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae））、ＹａｄＡ（エルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)）またはプロテインＭ(protein M)（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes））などであり（これらは因子Ｈに結合する）、これら因子のすべてが補体の活性化を防害する。
【０００６】
病原菌が発現するかまたは結合する他のタンパク質が補体に対する抵抗性にとって重要であり、補体因子の開裂を引き起こすか、または細菌の表面に結合するのを阻害することが証明されている（非特許文献１）。
【０００７】
グラム陰性細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）が毒性因子であることが知られているが、血清に対する抵抗性に関わるその様々な構成分の役割については、すべての細菌種について確立されている訳ではない。例えば、大腸菌での一部研究では、Ｏ抗原が決定基であると考えられる（非特許文献２）；他の研究では、Ｏ抗原が血清に対する抵抗性にとって莢膜抗原ほどの決定基ではないと考えられる（非特許文献３）。さらに、腸内コロニー形成に関するこれら因子の重要性は未知である。
【非特許文献１】Rautemaa R.; Meri S., Microbes and Infection 1999, 1:785:794
【非特許文献２】Burns S.M. Hull S.I. Infect Immun, 1998, Sept 66(9):4244-53
【非特許文献３】Russo T. et al., Infect Immun, 1995, Apr. 63(4):1263-9
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは表面多糖合成に必要な遺伝子の不活化のために、系統的な変異体の分析を実施し、腸管外感染の原因となる大腸菌(Escherichia coli)株ＥＸＰＥＣにおいて、どの遺伝子が血清に対する抵抗性と血液における播種にとって必須であるかを証明した。これらの結果は動物モデルにおける毒性と腸内コロニー形成に対する突然変異の影響についての研究に基づくものである。
【０００９】
従って、本発明は毒性に必要であるが、インビトロで必須ではない標的を明確にし、この結果、病原性細菌に特異的な新規抗感染性作用剤、とりわけ重篤な感染の原因となる腸管外大腸菌、ならびにストレプトコッカス・アガラクチエ（Streptococcus agalactiae）などのグラム陽性株に特異的な作用剤を提供する新規方法論を目的とするものである。本発明はまたインビボでの血清に対する抵抗性と毒性に必要な遺伝子産物を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は病原性微生物のインビボ増殖に必要な遺伝子の同定および選択方法であって、
・病原微生物株を使用すること；
・毒性因子をエンコードする遺伝子において、不活化のために突然変異体を生成させること；
・実験感染モデルに対するこれら変異体の毒性と、無菌マウスモデルにおける腸内コロニー形成に対するその変異体の作用を判定すること；および
・インビトロで血清に対する抵抗性に必須であり、宿主内において血液中播種のために必須の細菌遺伝子を選択すること；
を含むことを特徴とする方法に関する。
【００１１】
病原性微生物はとりわけ大腸菌のＥＸＰＥＣ株またはストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)である。
【００１２】
本方法にて使用される毒性遺伝子不活化突然変異体は本発明の範囲内に入る。
【００１３】
当該変異体は以下の性質を特徴とする：血清に対し感受性であること；マウスモデルにおいて無毒であること；および無菌マウスの腸管にコロニー形成し得ること。
【００１４】
本発明はまたこのように同定した核酸がエンコードする病原性または毒性因子であって、血液を介しての播種には必要であるが、以下の病原性細菌の腸管内または粘膜コロニー形成には有意な影響を与えない因子を目的とする：エシェリキア・コリ（E. coli）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、エルシニア・ペスティス（Yersinia pestis）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、ビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）、シュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）、アセチノバクター（Acetinobacter）、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）、ブルコルデリア・シュードマレイ（Burkholderia pseudomallei）、ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）、ナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Clostridium acetobutylicum）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphyloccus aureus）、およびエンテロコッカス（Enterococcus）。
【００１５】
とりわけ、本発明は配列番号１６〜３０の配列を有する単離または精製核酸がエンコードする病原性または毒性標的を目的とするものである。
【００１６】
本発明の病原性または毒性標的は、特に、配列番号１６、１７、１９〜３０の配列を有する核酸がエンコードする。
【００１７】
当該核酸はｃＤＮＡまたはＲＮＡである。
【００１８】
とりわけ、本発明は大腸菌の核酸がエンコードする病原性または毒性標的に関する。
【００１９】
本発明のもう一つの態様において、病原性または毒性標的はストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)の核酸がエンコードする。
【００２０】
本発明はまた上記定義の病原性または毒性標的をコードする少なくとも１種の核酸を含んでなるベクターを目的とするものであり、また適切なプロモーターの制御下に少なくとも１種のベクターを含む宿主細胞をも目的とする。
【００２１】
本発明はまた配列番号１〜１５のアミノ酸配列の一つを有する単離または精製したポリペプチドまたはペプチドに対応する病原性または毒性因子を目的とする。
【００２２】
さらに詳しくは、配列番号１、２、４〜１５のアミノ酸配列を有する単離または精製したポリペプチドまたはペプチドに対応する病原性または毒性因子に関する。
【００２３】
当該因子に対応するペプチドおよびポリペプチドに特異的に結合し得る抗体も本発明の一部である。
【００２４】
これらの核酸およびペプチドまたはポリペプチドは、細菌感染の全身播種に対し特異的な阻害作用をもつが、粘膜コロニー形成に対し、または腸内細菌では腸内でのコロニー形成に対し阻害作用をもたない化合物を同定する標的を構成し、このことが共生叢の保存と、該化合物に対する抵抗性の選択回避とを可能とする。
【００２５】
従って、本発明は、血清中病原性微生物の増殖を阻害する方法であって、上記定義の核酸の活性を阻害し得るか、もしくは上記定義の核酸の量を低減し得る化合物、または上記定義のポリペプチドまたはペプチドの活性を阻害し得る化合物の有効量を使用することを含むことを特徴とする方法を目的とする。
【００２６】
本発明はまたこれら核酸の発現、または対応するポリペプチドおよびペプチドの発現を阻害し得る化合物のスクリーニング方法であって、該核酸またはポリペプチドまたはペプチドを試験化合物と接触させて、それらの活性に対する該化合物の可能性のある作用を証明し、その活性化合物を選択することを含むことを特徴とする方法を目的とする。
【００２７】
本発明はまた当該核酸により発現されるポリペプチドおよびペプチドの生化学的活性および／または酵素活性を阻害し得る化合物のスクリーニング方法を目的とする。
【００２８】
このように選択した化合物は、本発明に従い、細菌感染、特に腸内細菌の場合の腸外感染を阻害する医薬製品の製造に使用する。
【００２９】
従って、本発明は全身性細菌播種、菌血症(bacteramia)および敗血症(septicaemia)の予防または治療の新規戦略および新規手段を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明の他の特徴および利点は、図１〜３および表１〜５を参照して、以下の実施例にて示す。
【実施例１】
【００３１】
（配列番号２３に対応する遺伝子）
（１−対象遺伝子の不活化）
全体的戦略は、組換えシステムに基づき、線形(linear)ＤＮＡ断片によって担持される選択対象遺伝子（本事例では抗生物質に抵抗する遺伝子）を用いて、対立遺伝子組換えによって遺伝子を分断(interrupt)することにある。
【００３２】
まず、プラスミドを細菌（例えば、大腸菌）に導入し、途中で、組換えを誘発するタンパク質を導入するようにする。アンピシリン耐性遺伝子担持プラスミドは温度感受性（３０℃）であり、そのため細菌中での使用後に簡単に除去することができる。
【００３３】
該プラスミドは電気穿孔法(electroporation)により細菌に導入する。電気穿孔後に、アンピシリン耐性細菌は該プラスミドを組込んだものとなり、選択可能となる。このステップはプラスミドの許容温度である３０℃で実施する。
【００３４】
（標的遺伝子（ｐｇ２３）に特異的なＰＣＲ断片の合成）
ＰＣＲは選択遺伝子（クロラムフェニコール耐性）を担持するマトリックスプラスミド上、それぞれ配列番号３１および３２の配列を有するプライマーｐｇ２３Ｐ１およびｐｇ２３Ｐ２を用い実施する；これらは以下の２つのパーツからなる：
３’：選択遺伝子（クロラムフェニコール耐性）に２０ｂｐ相同：Ｐ１またはＰ２；
５’：標的遺伝子（ｐｇ２３）に４０ｂｐ相同：Ｈ１またはＨ２
【化１】
2006515155.tif 000002
【００３５】
標的遺伝子Ｈ１およびＨ２に相同の領域に隣接する選択遺伝子（ＣＡＴ：クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）からなるＤＮＡ断片はこのように入手する。
【００３６】
（標的遺伝子の不活化工程）
該プラスミドを含有する細菌を、１００ｍＭのアンピシリンと１ｍＭのＬ−アラビノースの存在下に、ＬＢ培地中３０℃で振盪培養し、組換えシステムを誘発する。細菌が指数増殖期に達したとき（ＯＤ６００ｎｍ＝０．５）、培養を停止し、細菌を採取し、エレクトロコンピテント(electrocompetent)とする。標的遺伝子（ｐｇ２３）に特異的なＰＣＲ産物を電気穿孔法により細菌に導入する。次いで、細菌を非選択性に富む培地（ＳＯＣ培地）にて３７℃で２時間振盪培養し、次いで、選択的ＬＢ寒天培地に塗布する。３７℃で１８時間後、抗生物質に耐性の遺伝子を組込んだ細菌のみが増殖する。
【００３７】
（耐性カセット挿入の検証）
耐性カセット挿入を検証するために、コロニーを直接用いてＰＣＲ反応を実施する。３対のプライマーを使用する：プライマーＦＲ１とＦＲ２は標的遺伝子を組み上げる１対、および耐性カセット内に位置するプライマーと、標的遺伝子の上流または下流いずれかに位置する他のプライマーを用いる２対である。
【００３８】
（突然変異細菌の単離とプラスミドの除去）
ＰＣＲによりこのように検証したコロニーは、選択培地で再分離し、非選択培地上で２回、最後に選択培地上、３７℃で連続的に分離する。最後に、選択した細菌は該プラスミドの不含有を反映するアンピシリン感受性について試験する。３つのクローンは各変異体型についてこのように選択する。
【００３９】
（２−血清の殺菌活性に対する抵抗性に関する突然変異体についての試験）
使用した血清はヒト起源のものである。各実験において、野生型株（Ｓ２６、血清に特に抵抗性を示し、マウスで毒性を示す大腸菌の臨床分離株）および莢膜とリポ多糖（ＬＰＳ）を欠失する株ＥＣＯＲ４に対しても増殖を実施した。この増殖は異なる２種の血清についてそれぞれ３回実施した。増殖は、観察される作用が補体の溶菌作用のみによることを検証するために、補体含有および補体除去（５６℃３０分）血清について並行して実施した。
【００４０】
ＲＰＭＩ対照最小培地(reference minimum medium)中２時間の前培養物を用い、細菌を開始時接種量１０４ｃｆｕ／ｍｌで１００％血清と接触させる。次いで、抗生物質の存在下または不存在下にＬＢ寒天培地上、種々の希釈物を塗布することにより、０、１および４時間目に計数する。３７℃１８時間後、細菌を計数し、得られた結果から増殖曲線を作成する。これらの結果を図１および２に示す。
【００４１】
本実施例では、突然変異体Δｐｇ２３が血清に対しかなりの感受性を示す。１時間目で２ｌｏｇ超、４時間目で４ｌｏｇ超の野生型株との差が実際に観察される。さらに、補体除去血清で得られた結果と血清中ＥＣＯＲ４株で得られた結果は、観察された影響が事実補体の殺菌作用によるものであることを語っている。
【００４２】
（３−マウス動物モデルでの毒性検討）
（接種材料の調製）
野生型突然変異細菌を該株から単離し、抗生物質の存在または不存在下にＬＢ寒天皿上、−８０℃で保存し、３７℃で１８時間インキュベートする。前培養物(preculture)は液体培地で調製する。ＬＢ１０ｍｌ中の１／１０希釈液を用い、培養物を３７℃で２時間、振盪再増殖する。２時間の培養後、ＯＤ６００ｎｍを測定し、生理食塩水にて種々の希釈液を調製し、所望の接種材料を得る。野生型株Ｓ２６については、ＬＤ５０が５×１０５ｃｆｕ／マウスの接種材料に対応し、ＬＤ１００は１×１０６ｃｆｕ／マウスの接種材料に対応する。
【００４３】
（毒性試験）
マウス（６週令のＢａｌｂ／ｃマウス）に腹腔内注射投与し、細菌注射液は１００μｌ容量とする。１回の投与あたり５匹のマウスを使用する。Ｓ２６Δｐｇ２３については、４種の接種材料を試験し、注射の２４時間および４８時間後に生存率を測定した。各実験において、検討は野生型株と並行して実施したが、そのＬＤ５０は５×１０５ｃｆｕ／マウスである。
【００４４】
突然変異体Ｓ２６Δｐｇ２３は、ＬＤ１００の１０倍に等しい用量で注射したが、致死例はなく、従って、大腸菌株Ｋ１  Ｓ２６のｐｇ２３遺伝子の突然変異は相当の毒性低下の原因となっている。
【００４５】
（４−無菌マウス動物モデルにおける腸内コロニー形成の検討）
実験はすべて無菌環境にて、無菌の器具類を用い、振動防止装置(isolator)中で実施し、マウスには無菌の食餌を与える。
【００４６】
（マウス）
マウスは６週令ないし８週令のＣ３Ｈ／Ｈｅ  Ｊ系列の無菌メスマウスである。
【００４７】
１細菌株あたり４匹を使用する。
【００４８】
（接種材料の調製）
野生型および突然変異細菌を該株から単離し、抗生物質の存在または不存在下にＬＢ寒天皿上、−８０℃で保存し、３７℃で１８時間インキュベートする。当該株を液体培地中で培養した後、生理食塩水にて種々の希釈液を調製し、１０７ｃｆｕ／ｍｌの接種材料を得る。
【００４９】
（コロニー形成試験）
細菌の接種は経口的に行う。接種前２４時間、マウスには水を与えない。次いで、マウスに１０７ｃｆｕ／ｍｌの細菌溶液を４時間飲料として与える。飲料容量は０時目と４時間目に測定する。平均してマウスはこの溶液を５ｍｌ吸い込む。次いで糞便を様々な時点で採取し、細菌数を計測して、糞便を生理食塩水に取込み、抗生物質の存在下または不存在下に種々の希釈度でＬＢ寒天皿上に広げ塗布する。
【００５０】
結果を以下の表１に示す。
【表１】
2006515155.tif 000003
【００５１】
野生型株Ｓ２６ならびに突然変異体Ｓ２６Δｐｇ２３について、腸内でのコロニー形成を安定的に確立した。野生型株Ｓ２６および突然変異体Ｓ２６Δｐｇ２３の間に差は認めない。コロニー形成は最終日に腸を取り出し、この臓器を磨り潰して細菌を計数することにより確認する。
【００５２】
（５−選択したポリペプチドのクローニングと発現）
ポリペプチドをエンコードする核酸は、常套のクローニング法に従って、Ｎ−末端ポリ−ＨｉｓタグをもつｐＥＴ−１４ｂなどの原核細胞発現ベクターにクローニングする。
【００５３】
次いで、組換えプラスミドは大腸菌株ＢＬ２１の形質転換に使用する。形質転換細胞をアンピシリンの存在下に選択し、コロニーを単離する。次いで、該タンパク質の発現を誘発するために、該細胞をＩＰＴＧ(Isopropyl-Thio-β-D-Galactopyranoside)の存在下に培養する。該タンパク質を産生するクローンを培養し、細胞溶解により全タンパク質を抽出する。組換えタンパク質はヒスチジンタグアフィニティカラムにより、製造業者のプロトコールに従い精製する。
【００５４】
このように得られたタンパク質を精製し、インビトロで使用してその酵素活性を測定する。
【実施例２】
【００５５】
（感染マウスモデルにおける突然変異株の血清感受性とＬＤ５０測定）
当該突然変異株について、感染マウスモデルにおけるＬＤ５０測定のために、野生型株Ｓ２６大腸菌株と比較する。下記表２に示すように、血清中４時間の培養後に計数されるコロニー形成単位（ｃｆｕ）の数は、突然変異体におけるよりも野生型（ｗｔ）Ｓ２６株においてより高く、突然変異体が血清殺作用に感受性であることを語っていた。異なる突然変異体すべてが、ＬＤ５０（致死用量５０）の増大により示されるように、野生型株よりもはるかに低毒性であるか、または突然変異体ではマウスの５０％殺作用用量に達し得なかったように、全く無毒であった。
【表２】
2006515155.tif 000004
【００５６】
配列１〜１３に対応する標的タンパク質をエンコードする遺伝子の弱毒化した突然変異体は、８日間にわたり動物の糞便中に細菌が残留することで示されるように、無菌マウスの腸になおコロニーを形成し得るものであった。これらの結果を表３に示す。
【表３】
2006515155.tif 000005
【００５７】
８日後に無菌マウスの腸内にコロニーを形成する細菌が、経口的に接種した突然変異株に対応するものであることを証明するために特性化された。
【００５８】
動物の糞便から回収した細菌は、クロラムフェニコール耐性と血清感受性の表現型を有し、変異誘発に際し挿入したクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子もまたＰＣＲにより検出することができた。
【００５９】
標的タンパク質（配列番号１〜１３）をエンコードする遺伝子の突然変異は、表４に示すように、無菌マウスの腸内にコロニーを形成する細菌になお存在した。
【表４】
2006515155.tif 000006
【００６０】
結論として、本実施例にて提示した結果は、ＬＰＳ内部のコア代謝に関与する酵素をエンコードする遺伝子が、大腸菌株において、コロニー形成に必須ではないが、インビボでの補体に対する抵抗性と毒性にとって必要であることを示している。
【００６１】
これらは血液組織における細菌の複製を選択的に遮断する阻害剤にとっての良好な標的となし得る。
【実施例３】
【００６２】
（配列番号１４のタンパク質の突然変異体）
本発明はＢ群ストレプトコッカス（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ：ＧＢＳ）（ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ））の新規な突然変異株に関する。この特定の実施例において、同定した標的は、グラム陽性（＋）細菌中の細胞壁関連リポテイコ酸（ＬＴＡ）中へのＤ−アラニン残基の取込みに関与する配列番号１４のタンパク質をエンコードする配列番号２９の遺伝子に対応する。
【００６３】
配列番号２９の遺伝子は他のグラム陽性細菌に見い出されたｄｌｔＤ遺伝子に相同であり、ｄｌｔ  オペロンの最終遺伝子である。
【００６４】
使用するグラム陽性細菌モデルは病原性株ストレプトコッカス・アガラクティエ(S.agalactiae)ＮＥＭ３１６である。ストレプトコッカス・アガラクティエ(S.agalactiae)はヒトの糞便に共通して見出される細菌であり、系統学的には院内敗血症(nosocomial septicemia)の原因となるグラム陽性細菌に密接している。
【００６５】
ｄｌｔ  オペロンのＧＢＳ突然変異体の毒性は、マウスと新生児ラットモデルにおいて強烈に損なわれる。
【００６６】
興味深いことは、毒性の喪失が、恐らく特定の食細胞において多くの細胞型が産生するデフェンシン（ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ）などの抗微生物カチオン性ペプチドに対する感受性が増大したことによることである。
【００６７】
ストレプトコッカス・アガラクティエ(S.agalactiae)突然変異体の使用は、この場合ｄｌｔＤ遺伝子は不活化しているが、ストレプトコッカス・アガラクティエ(S.agalactiae)の毒性の阻害剤ならびに他のグラム陽性病原菌に対する阻害剤の開発にとって、当該遺伝子産物が良好な標的であることを示している。
【００６８】
（野生型ストレプトコッカス・アガラクティエ(S.agalactiae)のＮＥＭ３１６ＤｔｌＤ突然変異体の構築）
ｄｌｔＤ遺伝子の突然変異体はストレプトコッカス・アガラクティエ（S.agalactiae)ＮＥＭ３１６株から、二重乗り換え(double cross-over)を用い、カナマイシン耐性カセットを挿入することにより構築した。
【００６９】
ストレプトコッカス・アガラクティエ(S.agalactiae)ＮＥＭ３１６のＤｔｌＤ突然変異体を構築するために、ｄｌｔＤに内在するＤＮＡセグメント内の、プロモーターもターミネーターももたないカナマイシン耐性カセットａｐｈＡ−３を転写と同方向に挿入した。この挿入は、適切な酵素で消化した後に、配列番号３３および３４のプライマー、および配列番号３５および３６のプライマーをそれぞれ用いて得られるＰＣＲ産物を連結反応させることにより実施した。
【００７０】
配列番号３３：５’−ＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＧＣＧＴＴＧＡＣＧＡＡＧＧＣＡＧＧ−３’
配列番号３４：５’−ＧＡＣＧＧＧＴＡＣＣＡＴＡＣＣＴＡＴＣＧＴＡＧＧＴＴＧ−３’
配列番号３５：５’−ＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＧＧＧＣＴＴＧＡＴＣ−３’
配列番号３６：５’−ＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＴＴＧＡＴＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＣ−３’
カナマイシン耐性カセットを含む熱感受性シャトルベクターｐＧ＋ｈｏｓｔ５ΩａｐｈＡ−３(Biswas et al., 1993, J Bacteriol. 175: 3628-3635)に、０．４ｋｂのｄｌｔＤのＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ断片を挿入してｐＧ１ΩＥＫａｐｈＡ−３を生成させた。０．８ｋｂの空間的に密接したｄｌｔＤ領域のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片をｐＧ１ΩＥＫａｐｈＡ−３に挿入してｐＧ１ΩＥＫａｐｈＡ−３ＢＰを生成させた。得られたベクターを電気穿孔法によりＮＥＭ３１６に導入した。形質転換体を１０ｍｇ／Ｌのエリスロマイシン含有トッド−ヒューイット（Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ；  ＴＨ）寒天平板上３０℃で選択した。対立遺伝子交換体は、すでに記載された２工程手法（Ｂｉｓｗａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）を用いて、相同組換えにより非許容温度（４２℃）で取得した。
【００７１】
相同配列間の二重乗り換え事象は、結果としてヌクレオチドにおけるカナマイシンカセット欠失および挿入を生じた。この挿入欠失を含む組換え細菌はカナマイシン耐性について選択した。該ｄｌｔＤ遺伝子におけるこの染色体分裂は、組換えクローンの一つにおいて突然変異体のヌクレオチドを配列決定することにより確認した。
【００７２】
（野生型ストレプトコッカス・アガラクティエ(S.agalactiae)ＮＥＭ３１６およびＤｌｔＤ突然変異体の種々抗微生物ペプチドに対する感受性）
カチオン性抗微生物ペプチドに対する野生型ストレプトコッカス・アガラクティエ(S.agalactiae)ＮＥＭ３１６およびＤｌｔＤ突然変異体の感受性は、ディスク拡散法(disk diffusion method)により測定した。２種の株を血液寒天平板上で増殖させ、３７℃で１８時間インキュベートした。各株について、コリスチン(colistin)（５０μｇ）およびポリミキシン(polymixin)（１０μｇ）のディスクを用いて試験した。各化合物に対するＮＥＭ３１６株およびＤｌｔＤ突然変異体の感受性または抵抗性は、ディスク周囲の増殖阻害領域のサイズにより決定した。
【００７３】
ＤｌｔＤ突然変異体は、表５に示すように、カチオン性抗微生物ペプチドである、コリスチンおよびポリミキシンＢに対する感受性の増大を示した。
【表５】
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【００７４】
（マウス動物モデルにおける毒性の検討）
ストレプトコッカス・アガラクティエ(S.agalactiae)の毒性におけるＤｌｔＤの役割について検討した。１０匹群のマウス（６週令Ｂａｌｂ／ｃマウス）に５×１０７の細菌を静脈内接種した。感染後２日目に、野生型株ＮＥＭ３１６で感染させたマウスの８０％が死亡し、ＤｌｔＤ突然変異体を感染させたマウスについては、２匹の死亡例のみを記録した。図１はＤｌｔＤ欠失ＧＢＳ突然変異体で得た結果を説明する。この結果はｄｌｔＤ遺伝子の産物がマウスのＧＢＳの毒性にとって必要であることを証明している。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】血清中のＳ２６および変異体ｐｇ２３の増殖
【図２】補体除去血清中のＳ２６および変異体ｐｇ２３の増殖
【図３】ストレプトコッカス・アガラクティエ(S.agalactiae)のＤｌｔＤ変異体の毒性
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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