(57)【要約】花粉または精子が異系交配されうる、減数分裂を行うトランスジェニック真核生物におけるトランス遺伝子の産生、維持および制御について開示されている；これには、トランスジェニックな動物、植物細胞、植物組織および全植物が挙げられる。さらに詳細には、本発明は、植物胞子不稔性形質（ＧＳＴ）を用いて雄性および／または雌性配偶子または植物配偶子によるトランス遺伝子伝達を制御することに関する。本発明の遺伝子構築物および方法は、トランス遺伝子の望まれない広がりに対する制御能を提供する。さらに、本発明は、分散および／または安定した転移事象のために、植物または他の真核生物のゲノムを強化させるツールおよび方法を提供する。
2004512007.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自殺遺伝子に操作的に連結された雄性配偶子または雌性配偶子特異的プロモーターを含む核酸構築物であって、前記プロモーターおよび前記自殺遺伝子の組合せが目的の遺伝子に連結されている、前記核酸構築物。
【請求項２】
バーナーゼ、雄穂種子２およびジフテリア毒素Ａ遺伝子より成る群から選択される自殺遺伝子に操作的に連結された花粉特異的プロモーターまたは胚珠特異的プロモーターを含む核酸構築物であって、前記プロモーターおよび前記自殺遺伝子の組合せが、除草剤耐性、抗生物質耐性、殺虫剤耐性、窒素固定化、栄養改善およびセルロース含量をコードする遺伝子より成る群から選択される目的の遺伝子または他の目的の作物栽培形質に連結されている、前記核酸構築物。
【請求項３】
前記プロモーターが、花粉特異的プロモーターおよび胚珠特異的プロモーターより成る群から選択される、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項４】
前記自殺遺伝子が、バーナーゼ、雄穂種子２およびジフテリア毒素Ａ遺伝子より成る群から選択される、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項５】
前記目的の遺伝子が、除草剤耐性、抗生物質耐性、殺虫剤耐性、窒素固定化、栄養改善およびセルロース含量をコードする核酸より成る群から選択される、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項６】
請求項１に記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項７】
請求項２に記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項８】
請求項６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項９】
請求項７に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
請求項６または７に記載のベクターを含む組換え植物細胞。
【請求項１１】
請求項６または７に記載のベクターを含むトランスジェニック植物。
【請求項１２】
トランスジェニック植物が核酸構築物についてヘミ接合性である、請求項１１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１３】
植物におけるトランス遺伝子座の雄性伝達を削減または排除する方法であって、
ａ）雄性配偶子特異的プロモーターが自殺遺伝子に操作的に連結された核酸構築物であって、前記プロモーターおよび前記自殺遺伝子の組合せが、異種ポリヌクレオチドに連結されている前記核酸構築物で、植物細胞を形質転換させること、
ｂ）減数分裂を通して前記形質転換植物細胞を増殖させて、前記トランス遺伝子座を欠く雄性配偶子を産生させること、
を含む、前記方法。
【請求項１４】
植物におけるトランス遺伝子座の雄性伝達を削減または排除する方法であって、
ａ）花粉特異的プロモーターが自殺遺伝子に操作的に連結された核酸構築物で植物細胞を形質転換させること、
ｉ）前記自殺遺伝子は、バーナーゼ、雄穂種子２およびジフテリア毒素Ａ遺伝子より成る群から選択される；
ｉｉ）前記プロモーターおよび前記自殺遺伝子の組合せは、異種ポリヌクレオチドに連結されている；
ｉｉｉ）前記異種ポリヌクレオチドは、除草剤耐性、抗生物質耐性、殺虫剤耐性、窒素固定、栄養改善およびセルロース含量をコードするＤＮＡより成る群から選択される；
ｂ）減数分裂を通して前記形質転換植物細胞を増殖させて、前記トランス遺伝子座を欠く雄性配偶子を産生させること、
を含む、前記方法。
【請求項１５】
植物におけるトランス遺伝子座の雌性伝達を削減または排除する方法であって、
ａ）雌性配偶子特異的プロモーターが自殺遺伝子に操作的に連結された核酸構築物であって、前記プロモーターおよび前記自殺遺伝子の組合せが、異種ポリヌクレオチドに連結されている、前記核酸構築物で植物細胞を形質転換させること、
ｂ）減数分裂を通して前記形質転換植物細胞を増殖させて、前記トランス遺伝子座を欠く雌性配偶子を産生させること、
を含む、前記方法。
【請求項１６】
植物におけるトランス遺伝子座の雌性伝達を削減または排除する方法であって、
ａ）胚珠特異的プロモーターが自殺遺伝子に操作的に連結された核酸構築物で植物細胞を形質転換させること、
ｉ）前記自殺遺伝子は、バーナーゼ、雄穂種子２およびジフテリア毒素Ａ遺伝子より成る群から選択される；
ｉｉ）前記プロモーターおよび前記自殺遺伝子の組合せは、異種ポリヌクレオチドに連結されている；
ｉｉｉ）前記異種ポリヌクレオチドは、除草剤耐性、抗生物質耐性、殺虫剤耐性、窒素固定、栄養改善およびセルロース含量をコードするＤＮＡより成る群から選択される；
ｂ）減数分裂を通して前記形質転換植物細胞を増殖させて、前記トランス遺伝子座を欠く雌性配偶子を産生させること、
を含む、前記方法。
【請求項１７】
前記形質転換植物細胞が、核酸構築物についてヘミ接合性である、請求項１３、１４、１５または１６のいずれか一項に記載の形質転換植物細胞。
【請求項１８】
自殺遺伝子に操作的に連結された雄性配偶子または雌性配偶子特異的プロモーターを含む核酸構築物であって、前記プロモーターおよび前記自殺遺伝子の組合せが転移因子に連結されている、前記核酸構築物。
【請求項１９】
トランスポザーゼ遺伝子を更に含む、請求項１８に記載の核酸構築物。
【請求項２０】
目的の遺伝子を更に含む、請求項１８または１９に記載の核酸構築物。
【請求項２１】
前記目的の遺伝子が転移因子と関連する、請求項２０に記載の核酸構築物。
【請求項２２】
花粉特異的プロモーターまたは胚珠特異的プロモーターが、バーナーゼ、雄穂種子２およびジフテリア毒素Ａ遺伝子より成る群から選択される自殺遺伝子に操作的に連結された核酸構築物であって、前記プロモーターおよび前記自殺遺伝子の組合せがトランスポゾンに連結されており、前記トランスポゾンは、除草剤耐性、抗生物質耐性、殺虫剤耐性、窒素固定、栄養改善およびセルロース含量をコードする遺伝子より成る群から選択される選択マーカーを含む、前記核酸構築物。
【請求項２３】
前記プロモーターが、花粉特異的プロモーターおよび胚珠特異的プロモーターより成る群から選択される、請求項２２に記載の核酸構築物。
【請求項２４】
前記自殺遺伝子が、バーナーゼ、雄穂種子２およびジフテリア毒素Ａ遺伝子より成る群から選択される、請求項２２に記載の核酸構築物。
【請求項２５】
請求項１８に記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項２６】
請求項２２に記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項２７】
請求項１８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２８】
請求項２２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２９】
請求項１８または２２に記載のベクターを含む組換え植物細胞。
【請求項３０】
組換え植物細胞が核酸構築物についてヘミ接合性である、請求項２９に記載の組換え植物細胞。
【請求項３１】
請求項１８または請求項２２に記載のベクターを含む、トランスジェニック植物。
【請求項３２】
組換え植物細胞が核酸構築物についてヘミ接合性である、請求項３１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３３】
植物細胞子孫の集団において、分散した転移事象を強化させる方法であって、
ａ）請求項１８乃至２４のいずれか一項に記載の核酸構築物で植物細胞を形質転換させて、形質転換された植物細胞を産生すること、
ｂ）減数分裂を通して前記形質転換植物細胞を増殖させて、分散した転移事象が強化された植物細胞子孫を産生すること、
を含む、前記方法。
【請求項３４】
ｃ）分散した転移事象が強化された前記植物細胞子孫を単離することを更に含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法によって単離される植物細胞。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法によって産生される植物。
【請求項３７】
前記植物細胞が核酸についてヘミ接合性である、請求項３３、３４または３５のいずれか一項に記載の植物細胞。
【請求項３８】
自殺遺伝子に操作的に連結された雄性配偶子または雌性配偶子特異的プロモーターである第一のプロモーターを含み、トランスポザーゼをコードする核酸およびトランスポゾンをコードする核酸を更に含む、核酸構築物。
【請求項３９】
トランスポゾンが選択マーカーに操作的に連結された第二のプロモーターを含み、選択マーカーが自殺遺伝子でない、請求項３８に記載の核酸構築物。
【請求項４０】
花粉特異的プロモーターまたは胚珠特異的プロモーターが、バーナーゼ、雄穂種子２およびジフテリア毒素Ａ遺伝子より成る群から選択される自殺遺伝子に操作的に連結された核酸構築物であって、前記プロモーターおよび前記自殺遺伝子の組合せがトランスポザーゼをコードする核酸に連結されており、前記トランスポザーゼをコードする核酸に連結された前記プロモーターおよび前記自殺遺伝子の組合せは、トランスポゾンを更に含むトランス遺伝子座を含み、前記トランスポゾンは、除草剤耐性、抗生物質耐性、殺虫剤耐性、窒素固定、栄養改善およびセルロース含量より成る群から選択されるメンバーをコードするポリヌクレオチド配列を含む、前記核酸構築物。
【請求項４１】
前記プロモーターが、花粉特異的プロモーターおよび胚珠特異的プロモーターより成る群から選択される、請求項４０に記載の核酸構築物。
【請求項４２】
前記自殺遺伝子が、バーナーゼ、雄穂種子２およびジフテリア毒素Ａ遺伝子より成る群から選択される、請求項４０に記載の核酸構築物。
【請求項４３】
前記トランスポゾンが、除草剤耐性、抗生物質耐性、殺虫剤耐性、窒素固定、栄養改善およびセルロース含量より成る群から選択されるメンバーをコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項４０に記載の核酸構築物。
【請求項４４】
請求項３８に記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項４５】
請求項４０に記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項４６】
請求項４４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４７】
請求項４５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４８】
核酸構築物がヘミ接合性である、請求項４６または４７に記載の宿主細胞。
【請求項４９】
請求項４４または４５に記載のベクターを含む、組換え植物細胞。
【請求項５０】
核酸構築物がヘミ接合性である、請求項４９に記載の組換え植物細胞。
【請求項５１】
請求項４４または４５に記載のベクターを含む、トランスジェニック植物。
【請求項５２】
核酸がヘミ接合性である、請求項５１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５３】
植物細胞子孫の集団において、安定に分散した転移事象を
強化させる方法であって、
ａ）請求項３８乃至４３のいずれか一項に記載の核酸構築物で植物細胞を形質転換させて、形質転換された植物細胞を産生させること、
ｂ）減数分裂を通して前記形質転換植物細胞を増殖させて、安定に分散した転移事象が強化された植物細胞子孫を産生すること、
を含む、前記方法。
【請求項５４】
ｃ）安定に分散した転移事象が強化された前記植物細胞子孫を単離することを更に含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
請求項５４に記載の方法によって単離される植物細胞。
【請求項５６】
請求項５５に記載の植物細胞から産生される植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願についての相互参照）
本発明は、２０００年２月２８日に提出され、その全体が参照文献として本明細書に組込まれている仮出願第６０／１８５，５２４号についての優先権を主張する。
【０００２】
（連邦で支援された研究下で行われた発明についての権利の供述）
本発明は、部分的には、交付番号ＮＩＨ　ＧＭ　Ｒ０１　ＧＭ３８１４８号およびＮＳＦ６１−２５５８号の下で、政府支援で行われた。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、一般に、花粉または精子が異系交配されうる、減数分裂を行うトランスジェニック真核生物におけるトランス遺伝子の産生、維持および制御に関する；これには、トランスジェニックな動物、植物細胞、植物組成物および全植物が挙げられる。さらに詳細には、本発明は、雄性および／または雌性配偶子または植物配偶子によるトランス遺伝子伝達の制御に関する。本発明の遺伝子構築物および方法は、トランス遺伝子の望ましくない広がりに対する制御能を提供する。さらに、本発明は、分散および／または安定した転移事象のために、植物ゲノムまたは他の真核生物ゲノムを強化させるツールおよび方法をも提供する。
【０００４】
（発明の背景）
本明細書の全ての出版物および特許出願は、個々の出版物または特許出願が参照文献として特定的且つ個別に組込まれることを示唆するのと同程度において、参照文献として組込まれている。
【０００５】
トランスジェニック作物およびバイオテクノロジーの使用は、世界中の種子および農薬事業を劇的に変化させている。市販で重要な作物の種子は、除草剤および害敵、特に害虫に耐性であるように遺伝子操作されてきた。米国の農務省による調査（２０００年６月）によると、遺伝的に修飾されたトウモロコシ、大豆および綿花は、２０００年における各作物についての総米国エーカー数のそれぞれ、およそ２５％、５４％および６１％で成長した。
【０００６】
商業的に重要な作物植物での異種形質の未制御伝達は、最近、世界中で、そして作物栽培業界内で主要な懸念である。望ましくないトランスジェニック花粉の散布は、益虫に何気なく害を及ぼし、そして関連植物種にトランス遺伝子の拡散を生じさせる可能性がある。これにより、食品産物の汚染と除草剤および殺虫剤耐性雑草種の生成とに至る可能性がある。
【０００７】
バイオテクノロジー業界は、干ばつ、昆虫、疾病、塩分、霜および除草剤に対して耐性等の形質を、野生植物に比べて適応性の利点を付与しうる栽培植物にトランスファーさせることに興味がある。数種の作物種は、野生種と相互適合性であることが知られている。これらの形質は、セクシャルハイブリダイゼーションを通して、野生雑草のような関連物に不注意にトランスファーされ、経済的および環境的な害を導く可能性がある。飼料草および芝草のほとんどは、栽培化を受けていることが比較的少なく、そして特定の場合（例えば、バミューダグラス（ギョウギシバ））では雑草と考えられうるので、このような遺伝的に形質転換された植物の最終的リリースおよび使用においては高い確率で大きな問題がある。飼料草は、一般に、あまり栽培化されていず、雑草の特徴を保有し、そして非常に異系交配するので、トランスジェニック飼料草の最終的リリースにおいて特別の困難さがある。
【０００８】
商業的に重要な作物植物において異種形質の望ましくない伝達を避ける方法を示すことが非常に望ましい。これが達成され得る場合、異種形質の遺伝子漏洩は制御され、そして望ましくない受取物に対するこれらの形質の広がりが削減される。したがって、トランス遺伝子を含む雄性または雌性配偶子に対する選択をし、それにより異種形質の望ましくない伝達を回避、排除または削減させる遺伝子システムについての必要性が存在する。特に、トランスジェニック（すなわち、異種の）植物配偶子の伝達を防ぐ一方において、同一植物からの非トランスジェニック（すなわち、野生型）植物配偶子の伝達を許容する遺伝子システムの必要性がある。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、商業的に重要な作物植物での異種形質の望ましくない伝達を制御、削減または排除する組換え核酸構築物および方法を提供することである。
【００１０】
（発明の概要）
本発明は、植物における異種形質の広がりを制御する遺伝子構築物および方法に向けられる。制御は、自殺遺伝子を含む雄性または雌性配偶子に対抗して選択する自殺遺伝子に操作的に連結された性特異的プロモーターを提供することによって達成される。自殺遺伝子座は、「植物配偶子自殺形質」（ＧＳＴ）（図１Ａ）と称される。性特異的プロモーターの制御下で自殺遺伝子に目的のトランス遺伝子を連結させることによって、子孫へのトランス遺伝子の伝達は、有効に排除、削減または回避される。ＧＳＴを担持する配偶子が生成されないからである。
【００１１】
１つの態様では、本発明は、目的のトランス遺伝子に連結された花粉特異的プロモーターの制御下、自殺遺伝子から広範に構成されると言える。トランス遺伝子複合体は、植物処女配偶子に導入されて、そしてトランス遺伝子複合体についてヘミ接合性である植物が選択されうる。ヘミ接合性植物によって産生される花粉のみが、自殺遺伝子に物理的に連結しているためにトランス遺伝子を欠いている。これにより、トランス遺伝子複合体によってコードされる異種形質が未制御に広がることが妨げられる。トランス遺伝子複合体を含む花粉が産生されないからである。
【００１２】
本発明の第二の態様は、トランスポゾンに密接した近傍にＧＳＴを位置させ、子孫細胞において分散した転移事象を選択的に強化させることに基づく。これは、ＧＳＴ遺伝子座を欠く配偶子のみが生育できることによるものである。生育配偶子から生成される子孫細胞の一部は転移事象を受けるであろうから、分散転移事象の選択的強化が達成される。これは、トランスポゾンがＧＳＴ（ＧＳＴは、ＧＳＴ遺伝子座を受け継ぐような配偶子を破壊する）にもはや必然的には連結されていないからである（図１Ｂ）。
【００１３】
したがって、本発明は、ＧＳＴトランス遺伝子の排除のため、そして未連結転移についての選択のために使用されうる遺伝子システムを提供する。いかなるトランス遺伝子と一緒にＧＳＴを使用することによっても、ＧＳＴと関連トランス遺伝子の両方の雄性（または雌性植物配偶子特異的プロモーター：自殺構築物の場合には、雌性）伝達を完全に排除することができる（図２）。
【００１４】
本発明は、自殺遺伝子に操作的に連結された雄性配偶子または雌性配偶子特異的プロモーターを含む核酸構築物であって、上記プロモーターおよび上記自殺遺伝子の組合せが目的の遺伝子に連結されたものを提供する。
【００１５】
本発明は、自殺遺伝子に操作的に連結された雄性配偶子または雌性配偶子特異的プロモーターを含む核酸構築物であって、そのプロモーターおよびその自殺遺伝子の組合せが目的の遺伝子に連結されたものを提供する。本発明は、さらに、プロモーターが、花粉特異的プロモーターおよび胚珠特異的プロモーターより成る群から選択されるような核酸を提供する。本発明は、なおさらに、自殺遺伝子が、バーナーゼ、雄穂種子２およびジフテリア毒素Ａ遺伝子より成る群から選択されるような核酸構築物を提供する。本発明は、目的の遺伝子が、除草剤耐性、抗生物質耐性、殺虫剤耐性、窒素固定化、栄養改善およびセルロース含量をコードする核酸より成る群から選択される。
【００１６】
本発明は、バーナーゼ、雄穂種子２およびジフテリア毒素Ａ遺伝子より成る群から選択される自殺遺伝子に操作的に連結された花粉特異的プロモーターまたは胚珠特異的プロモーターを含む核酸構築物であって、プロモーターおよび自殺遺伝子の組合せが、除草剤耐性、抗生物質耐性、殺虫剤耐性、窒素固定化、栄養改善およびセルロース含量をコードする遺伝子より成る群から選択される目的の遺伝子または他の目的の作物栽培用形質に連結されたものを提供する。
【００１７】
本発明は、植物におけるトランス遺伝子座の雄性伝達を削減または排除する方法を提供し、該方法は、
ａ）雄性配偶子特異的プロモーターが自殺遺伝子に操作的に連結された核酸構築物であって、該プロモーターおよび該自殺遺伝子の組合せが、異種ポリヌクレオチドに連結されたもので植物細胞を形質転換させ；
ｂ）減数分裂を通して該形質転換植物細胞を増殖させて、該トランス遺伝子座を欠く雄性配偶子を産生させること、
を含む。
【００１８】
また、本発明は、植物におけるトランス遺伝子座の雄性伝達を削減または排除する方法を提供し、該方法は、
ａ）花粉特異的プロモーターが自殺遺伝子に操作的に連結された核酸構築物で植物細胞を形質転換させること、ここで、
ｉ）該自殺遺伝子は、バーナーゼ、雄穂種子２およびジフテリア毒素Ａ遺伝子より成る群から選択される；
ｉｉ）該プロモーターおよび該自殺遺伝子の組合せは、異種ポリヌクレオチドに連結されている；
ｉｉｉ）該異種ポリヌクレオチドは、除草剤耐性、抗生物質耐性、殺虫剤耐性、窒素固定、栄養改善およびセルロース含量をコードするＤＮＡより成る群から選択される；
ｂ）減数分裂を通して該形質転換植物細胞を増殖させて、該トランス遺伝子座を欠く雄性配偶子を産生させること、
を含む。
【００１９】
また、本発明は、植物におけるトランス遺伝子座の雌性伝達を削減または排除する方法を提供し、該方法は、
ａ）雌性配偶子特異的プロモーターが自殺遺伝子に操作的に連結された核酸構築物であって、該プロモーターおよび該自殺遺伝子の組合せが、異種ポリヌクレオチドに連結されたもので植物細胞を形質転換させ；
ｂ）減数分裂を通して該形質転換植物細胞を増殖させて、該トランス遺伝子座を欠く雌性配偶子を産生させること、
を含む。
【００２０】
さらに、本発明は、植物におけるトランス遺伝子座の雌性伝達を削減または排除する方法を提供し、該方法は、
ａ）胚珠特異的プロモーターが自殺遺伝子に操作的に連結された核酸構築物で植物細胞を形質転換させること、ここで、
ｉ）該自殺遺伝子は、バーナーゼ、雄穂種子２およびジフテリア毒素Ａ遺伝子より成る群から選択される；
ｉｉ）該プロモーターおよび該自殺遺伝子の組合せは、異種ポリヌクレオチドに連結されている；
ｉｉｉ）該異種ポリヌクレオチドは、除草剤耐性、抗生物質耐性、殺虫剤耐性、窒素固定、栄養改善およびセルロース含量をコードするＤＮＡより成る群から選択される；
ｂ）減数分裂を通して該形質転換植物細胞を増殖させて、該トランス遺伝子座を欠く雌性配偶子を産生させること、
を含む。
【００２１】
また、本発明は、形質転換植物細胞が、核酸構築物についてヘミ接合性である本発明の方法によって産生される形質転換植物細胞を提供する。
【００２２】
本発明は、自殺遺伝子に操作的に連結された雄性配偶子または雌性配偶子特異的プロモーターを含む核酸構築物であって、該プロモーターおよび該自殺遺伝子の組合せが転移因子に連結されたものを提供する。また、本発明は、該核酸構築物が、１つ以上のトランスポザーゼ遺伝子を更に含むものを提供する。さらに、本発明は、該核酸構築物が、１つ以上の目的の遺伝子を更に含むようなものを提供する。本発明は、さらになお、目的の遺伝子が転移因子と関連する核酸構築物を提供する。
【００２３】
本発明は、花粉特異的プロモーターまたは胚珠特異的プロモーターが、バーナーゼ、雄穂種子２およびジフテリア毒素Ａ遺伝子より成る群から選択される自殺遺伝子に操作的に連結された核酸構築物であって、該プロモーターおよび該自殺遺伝子の組合せがトランスポゾンに連結されたものを提供するが、ここで、該トランスポゾンは、除草剤耐性、抗生物質耐性、殺虫剤耐性、窒素固定、栄養改善およびセルロース含量をコードする遺伝子より成る群から選択される選択マーカーを含むものである。また、本発明は、プロモーターが、花粉特異的プロモーターおよび胚珠特異的プロモーターより成る群から選択されるような核酸構築物を提供する。また、本発明は、自殺遺伝子が、バーナーゼ、雄穂種子２およびジフテリア毒素Ａ遺伝子より成る群から選択されるような核酸構築物を提供する。
【００２４】
本発明は、植物細胞子孫の集団において、分散した転移事象を強化させる方法を提供し、該方法は、
ａ）前述の核酸構築物のいずれか１つの核酸構築物で植物細胞を形質転換させて、形質転換された植物細胞を産生させること、
ｂ）減数分裂を通して該形質転換植物細胞を増殖させて、分散した転移事象が強化した植物細胞子孫を産生すること、
を含む。
【００２５】
また、本発明は、分散した転移事象が強化された植物細胞子孫を単離する追加的ステップを含むような方法を提供する。また、本発明は、分散転移事象を含む植物細胞および植物を提供し、そして特に核酸についてヘミ接合である植物細胞および植物を提供する。
【００２６】
本発明は、自殺遺伝子に操作的に連結された雄性配偶子または雌性配偶子特異的プロモーターである第一のプロモーターを含み、トランスポザーゼをコードする核酸およびトランスポゾンをコードする核酸を更に含む核酸構築物を提供する。また、本発明は、トランスポゾンが、選択マーカーに操作的に連結される第二のプロモーターを含む核酸構築物において、選択マーカーは自殺遺伝子でないようなものを提供する。
【００２７】
本発明は、花粉特異的プロモーターまたは胚珠特異的プロモーターが、バーナーゼ、雄穂種子２およびジフテリア毒素Ａ遺伝子より成る群から選択される自殺遺伝子に操作的に連結された核酸構築物であって、該プロモーターおよび該自殺遺伝子組合せが、トランスポザーゼをコードする核酸に連結されたものを提供するが、ここで、トランスポザーゼをコードする該核酸に連結された該プロモーターおよび該自殺遺伝子の組合せは、トランスポゾンを更に含むトランス遺伝子座を含み、該トランスポゾンは、除草剤耐性、抗生物質耐性、殺虫剤耐性、窒素固定、栄養改善およびセルロース含量より成る群から選択されるメンバーをコードするポリヌクレオチド配列を含ものである。本発明は、プロモーターが、花粉特異的プロモーターおよび胚珠特異的プロモーターより成る群から選択されるような核酸構築物を提供する。本発明は、さらに、自殺遺伝子が、バーナーゼ、雄穂種子２およびジフテリア毒素Ａ遺伝子より成る群から選択されるような核酸構築物を提供する。また、本発明は、トランスホゾンが、除草剤耐性、抗生物質耐性、殺虫剤耐性、窒素固定、栄養改善およびセルロース含量より成る群から選択されるメンバーをコードするポリヌクレオチド配列を含むような核酸構築物を提供する。
【００２８】
本発明は、植物細胞子孫の集団において、安定に分散した転移事象を強化させる方法を提供し、該方法は、
ａ）本発明の核酸構築物で植物細胞を形質転換させて、形質転換植物細胞を産生させること、
ｂ）減数分裂を通して該形質転換植物細胞を増殖させて、安定に分散した転移事象が強化された植物細胞子孫を産生すること、
を含む。
【００２９】
また、本発明は、安定に分散した転移事象が強化された植物細胞子孫を単離するステップを更に含むような方法を提供する。本発明は、さらに、このような方法によって単離された植物細胞およびその植物細胞から産生される植物を提供する。
【００３０】
本発明は、本発明の核酸構築物を含むベクター、並びに、本発明のベクターを含む宿主細胞、組換え植物細胞およびトランスジェニック植物を提供する。さらに詳細には、本発明は、核酸構築物についてヘミ接合性であるような細胞およびトランスジェニック植物を提供する。
【００３１】
本発明の他の目的、利益および特性は、ここに提供される説明および図面を検討して、当業者に明らかになる。
【００３２】
前述の要約、並びに以下の本発明の詳細な説明は、添付の図面と伴に読取る場合により理解される。本発明を例示する目的のために、ここでは好ましい形態として図面の（複数の）実施形態が示されている。しかし、本発明は、示されている厳密な配列および手段に限定されるものではない。
【００３３】
（詳細な説明）
特に定義されない限り、ここに使用される全ての技術的および科学的語句は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を示す。ここに記述されるものに類似するか、または同等であるあらゆる方法および材料は、本発明の実施および試験のために使用されうるが、好ましい方法および材料が、記述される。
【００３４】
本発明のツールおよび方法が、配偶子を生じる全ての植物に対する使用を示すことは上記から予測される。このような植物としては、それに限定されないが、飼料草、芝草、飼料マメ科植物、野菜、農作物、樹木および装飾用花が挙げられる。
【００３５】
定義
本明細書において、語句「対立遺伝子」は、遺伝子の数種の代替的形態のいずれかを指す。
【００３６】
本明細書において、語句「作物植物」は、任意の商業目的のために育成される任意の植物を指し、そして以下の目的に限定されないが、種子生産、牧草生産、装飾用途、果実生産、ベリー生産、野菜生産、油生産、タンパク質生産、飼料生産、動物放牧、ゴルフ・コース、芝草、花生産、埋め立て、腐食制御、緑肥、土壌耕作／健康の改善、医薬製品／薬剤の生産、食品添加物の生産、喫煙製品、パルプ生産、および材木生産が挙げられる。
【００３７】
本明細書において、語句「交雑受粉」または「交雑」は、１つの植物上の１つの花の花粉が、別の植物の花の胚珠（柱頭）に（人工的に、または自然に）塗布されるプロセスを指す。
【００３８】
本明細書において、語句「栽培変種」は、園芸または作物栽培技術によって生産され、そして野生集団では正常に見出されない植物の変種、株または品種を指す。
【００３９】
語句「分散した転移事象」は、トランスポゾンがトランソポゾン発射部位（供与部位）にもはや連結されない（すなわち、ごく近傍にある）ようにトランスポゾンを移動させることを指す。
【００４０】
語句「雌」は、胚珠を産生する植物を指す。雌性植物は、受精後、一般に種子を産生する。「雌性植物」として称される植物は、雄および雌の両方の生殖器を含みうる。代わりに、「雌性植物」は、自然に（例えば、雌雄異株の種）または除雄（例えば、房の取除きにより）により、雌生殖器のみを含みうる。
【００４１】
本明細書において、語句「雑種世代」は、特定の親世代に続く細胞、組織または生物の全世代のいずれかを指す。親の交配から生じる世代は、第一交雑世代（「Ｆ１」または「Ｆ１」と称される）である一方で、Ｆ１個体の交配から生じるものは、第二交雑世代（「Ｆ２」または「Ｆ２」と称される）である。
【００４２】
語句「配偶子」は、その核（そしてしばしば細胞質）が、類似の起源であるが、しかし反対の性別の別の配偶子のものに融合して、接合子を形成し、新たな個体にまで発達する能力を示す生殖細胞を指す。配偶子は、一倍体であり、そして雄および雌に分化される。
【００４３】
語句「遺伝子」は、生物的機能に関連したＤＮＡの任意のセグメントを指す。したがって、遺伝子としては、それに限定されないが、それらの発現のために必要とされるコーディング配列および／または調節配列が挙げられる。遺伝子は、例えば、他のタンパク質のための認識配列を形成する非発現ＤＮＡセグメントも含みうる。遺伝子は、多様な源から得ることができ、そして目的の源からクローニング、または公知または推定配列情報からの合成が挙げられ、そして所望のパラメーターを有するように設計された配列を含みうる。
【００４４】
本明細書において、語句「遺伝子型」は、個々の細胞、細胞培養、組織、植物、または植物でできた遺伝学作成物を指す。
【００４５】
本明細書において、語句「ヘミ接合性」は、遺伝子が、一倍体細胞または生物での遺伝子、異種配偶子の性での伴性遺伝子、またはその相手のセグメントが欠失された二倍体細胞または生物での染色体のセグメント中の遺伝子として、遺伝子型で一度のみ存在することを特徴とする細胞、組織または生物を指す。
【００４６】
「異種ポリヌクレオチド」または「異種核酸」または「外因性ＤＮＡセグメント」は、特定の宿主に対する外来源から起因するか、同じ源から得られる場合に、それを元の形態から修飾されるポリヌクレオチド、核酸またはＤＮＡセグメントを指す。したがって、宿主細胞での異種遺伝子としては、特定宿主に内因性であるが、修飾された遺伝子が挙げられる。したがって、その語句は、細胞に対して外来または異種であるか、または細胞に同種であるが、そのエレメントが最初に見出されない宿主細胞核酸内の位置にあるＤＮＡセグメントを指す。外因性ＤＮＡセグメントは、外因性ポリペプチドを生じるように発現される。
【００４７】
「異種形質」は、外因性ＤＮＡセグメント、異種ポリヌクレオチドまたは異種核酸によって、形質転換宿主細胞またはトランスジェニック生物に分与される表現型を指す。
【００４８】
本明細書において、語句「ヘテロ接合体」は、少なくとも１つの遺伝子座に存在する、異なる対立遺伝子（所定の遺伝子の形態）を有する二倍体または倍数体の個々の細胞または植物を指す。
【００４９】
本明細書において、語句「ヘテロ接合性」は、特定の遺伝子座での様々の対立遺伝子（所定の遺伝子の形態）の存在を指す。
【００５０】
本明細書において、語句「ホモ接合体」は、少なくとも１つの遺伝子座に同じ対立遺伝子を有する個々の細胞または植物を指す。
【００５１】
本明細書において、語句「ホモ接合性」は、同種染色体セグメント中の１つまたはそれ以上の遺伝子座での同一の対立遺伝子の存在を指す。
【００５２】
本明細書において、語句「ハイブリッド」は、１つまたはそれ以上の遺伝子で異なる親の間の交配から生じる任意の個々の細胞、組織または植物を指す。
【００５３】
本明細書において、語句「同型交配」または「同型交配系統」は、相当に真性な交配株を指す。
【００５４】
本明細書において、語句「系統」は、それに限定されないが、組織培養技術を介して、単独の親植物から植物期に促進された植物の群、または共通の（複数の）親からの子孫のため、遺伝的に非常に類似である同型交配植物の群を含めて広範に使用される。植物は、それが、（ａ）その系統の材料から再生される一次形質転換（Ｔ０）植物である；（ｂ）その系統のＴ０植物から構成される系統を示す；か、または（ｃ）共通の先祖により（例えば、同種交配または自家受粉を介して）、遺伝的に非常に類似する場合、特定の系統に「属する」と思われる。この内容で、語句「系統」は、例えば、ヘテロ接合性（ヘミ接合性）またはホモ接合性条件にある遺伝子または遺伝子の組合せが、植物の所望の形質を付与するように有効に性的交配の点で、植物の系統を示す。
【００５５】
本明細書において、語句「遺伝子座」（複数：「遺伝子座」）は、遺伝的に定義された任意の部位を指す。遺伝子座は、遺伝子、または遺伝子の部分、またはある程度の調節的役割を有するＤＮＡ配列であり得て、そして異なる配列によって占められうる。
【００５６】
語句「雄」は、花粉粉末を生じる植物を指す。「雄性植物」は、一般に、卵を受粉させるための配偶子を生じる性別を指す。「雄性植物」と称される植物は、雄および雌の生殖器の両方を含みうる。代わりに、「雄性植物」は、天然に（例えば、二倍体の種で）、または切除による（例えば、卵巣を除去することにより）かのいずれかで雄性生殖器のみを含みうる。
【００５７】
本明細書において、語句「マス選択」は、個々の植物が選択され、そして次の世代は、それらの種の凝集から繁殖されることを特徴とする選択の形態を指す。
【００５８】
本明細書において、語句「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、一本または二本鎖形態のいずれかでのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびその高分子を指す。特に限定されない限り、その語句は、参照核酸として類似の結合特性を示し、そして天然に生じるヌクレオチドに類似の手段で代謝される天然のヌクレオチドの核酸含有公知類似体を含む。特に指示されない限り、特定の核酸配列は、この保存的に改善されたそれの変異体（例えば、変性コドン置換）および相補配列、並びに明確に示された配列をも暗黙のうちに含む。特に、変性コドン置換は、１つまたはそれ以上の選択（または全ての）コドンの第三位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換される配列を発生させることによって達成されうる（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｃａｓｓｏｌら、（１９９２）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ８：９１−９８（１９９４））。語句核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子でコードされたｍＲＮＡと相互交換可能に使用される。
【００５９】
本明細書において、ＤＮＡセグメントは、それが、別のＤＮＡセグメントと機能的関係に置かれた場合に「操作的に連結された」と言われる。例えば、シグナル配列のためのＤＮＡは、それが、ポリペプチドの分泌に関係するプレタンパク質として表される場合、ポリペプチドをコードするＤＮＡに操作的に連結される；プロモーターまたはエンハンサーは、それが、配列の転写を刺激する場合に、コーディング領域に操作的に連結される。一般に、操作的に連結されたＤＮＡ配列は、連続的であり、そしてシグナル配列の場合には、連続的であり、そして読取相にある。しかし、エンハンサーは、それらが、制御するその転写のコーディング配列と連続的でない必要がある。連結は、従来の制限部位で、またはその遺伝子座に挿入されたアダプターまたはリンカーでのライゲーションによって達成される。
【００６０】
本明細書において、語句「開放受粉」は、遺伝子の流れに有効な防御壁がある密接なものと反対に、ある種の遺伝子の流れに自由にされされた植物集団を指す。
【００６１】
本明細書において、語句「開放受粉集団」または「開放受粉された変種」は、多様性を示すが、しかしその集団または変種が、他から分化されうることによって特徴づけられる１つまたはそれ以上の遺伝子型または表現型特徴をも示す、標準に対して選択される、少なくともある程度の相互交換作用の正常な能力のある植物を指す。他家受粉に対する防御壁を有しないハイブリッドは、開放受粉集団または開放受粉変種である。
【００６２】
本明細書において、語句「胚珠」は、雌性配偶子を指す一方で、語句「花粉」は、雄性配偶子を意味する。
【００６３】
本明細書において、語句「胚珠特異的プロモーター」は、胚珠形成および／または機能に必須の植物の細胞または組織で選択的に核酸配列の発現を調節する、および／または植物での胚珠形成の期間まで核酸配列の発現を制限する核酸配列に広範を指す。
【００６４】
本明細書において、語句「花粉特異的プロモーター」は、花粉形成および／または機能に必須の植物の細胞または組織で選択的に核酸配列の発現を調節する、および／または植物での花粉形成の期間まで核酸配列の発現を制限する核酸配列に広範を指す。
【００６５】
本明細書において、語句「表現型」は、個々の細胞、細胞培養物、植物、または個々の遺伝的作成（すなわち、遺伝子型）および環境の間の相互作用から生じる植物の群の観察可能な特徴を指す。
【００６６】
本明細書において、語句「植物」は、全植物、植物器官（例えば、葉、幹、根など）、種子および植物細胞およびその子孫を指す。本発明の方法に使用されうる植物のクラスは、一般に、単子葉および双子葉植物の両方を含めた形質転換技術に扱いやすい高等植物のクラスと同様に広範である。
【００６７】
本明細書において、語句「プロモーター」は、転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを結合させることに関与したＤＮＡの領域を指す。
【００６８】
本明細書において、語句「組換え」は、組換えＤＮＡとの形質転換を受けた細胞、組織または生物を指す。当初の組換え体は、「Ｒ０」または「Ｒ０」として称される。Ｒ０生成物を自己受粉させることで、「Ｒ１」または「Ｒ１」と称される第一の形質転換世代を生じる。
【００６９】
本明細書において、語句「自己不適合性」は、それらの各々が、類似の交配または受粉の後に交配群の他の配偶子と一体化する能力のある場合（Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｇｎｅｔ．２５：２１５−２３５（１９４３））に、受精を達成するために雄性配偶子および雌性配偶子の、交配または受粉に続く失敗を意味する。
【００７０】
本明細書において、語句「自家受粉された」または「自家受粉」は、１つの植物で１つの花の花粉が、同じ植物での同じまたは異なる花の胚珠（柱頭）に（人工的に、または自然に）使用されることを意味する。
【００７１】
本明細書において、語句「安定に分散した転移事象」は、二次転移事象のような別の転移を受けない分散転移を指す。
【００７２】
本明細書において、語句「自殺遺伝子」は、自殺遺伝子を発現する細胞に致命的である生成物を発現する任意の遺伝子を指す。
【００７３】
本明細書において、語句「合成」は、クローンまたは種子繁殖系統の特定の組を交雑させることによって誘導される１組の子孫を指す。合成は、相互交換作用、自家受粉、および血族受粉から生じる種子の混合物を含みうる。
【００７４】
本明細書において、語句「形質転換」は、核酸（すなわち、ヌクレオチド高分子）が細胞に移行することを指す。本明細書において、語句「遺伝的形質転換」は、ＤＮＡ、特に組換えＤＮＡを細胞に移行および組込むことを指す。
【００７５】
本明細書において、語句「形質転換体」は、形質転換を受けた細胞、組織または生物を指す。元来の形質転換体は、「Ｔ０」または「Ｔ０」と称される。Ｔ０を自家受粉することは、「Ｔ１」または「Ｔ１」と称される第一形質転換世代を生じる。
【００７６】
本明細書において、語句「トランス遺伝子」は、それの機能を確保する手段で生物、宿主細胞またはベクターに挿入された核酸を指す。
【００７７】
本明細書において、語句「トランスジェニック」は、外来または修飾遺伝子が、外来または修飾遺伝子を受ける植物または生物の種以外の同じか、または異なる種から由来することを特徴とする形質転換の種々の方法の内の１つにより外来または修飾遺伝子を受けた細胞、細胞培養物、生物、植物、および植物の子孫を指す。
【００７８】
本明細書において、語句「トランスポザーゼ」は、酵素、複数酵素、またはより一般的に、転移事象を触媒する分子または複数分子を指す。
【００７９】
本明細書において、語句「転移事象」は、供与部位から標的部位までのトランスポゾンの運動を指す。
【００８０】
本明細書において、語句「トランスポゾン」は、それに限定されないが、１つの染色体部位から別のところに移動することができるＤＮＡまたはＲＮＡのセグメントを含めた遺伝子エレメントを指す。
【００８１】
本明細書において、語句「変種」は、他の類似の系統の個体から得られる形態または機能に明瞭である種の内の個体の群から構成される種の細分を指す。
【００８２】
本明細書において、語句「ベクター」は、外来の核酸をコードする任意のプラスミドまたはウイルスに広範を指す。その語句は、例えば、ポリリシン化合物および同等物のような、核酸のバイロンまたは生物への移行を促進する非プラスミドおよび非ウイルス性化合物を含むとも解釈されるべきである。ベクターは、核酸の送出のための送出ベヒクルとして適するウイルス性ベクター、または細胞に対するその変異体であり得るか、またはベクターは、同じ目的のために適する非ウイルスベクターでありうる。細胞および組織に対するＤＮＡの送出のためのウイルスおよび非ウイルスベクターの例は、例えば、Ｍａら（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２７４４−１２７４６頁）に記述されている。ウイルス性ベクターの例としては、それに限定されないが、組換えワクシニア・ウイルス、組換えアデノウイルス、組換えレトロウイルス、組換えアデノ関連ウイルス、組換え鳥痘ウイルス、および同等物が挙げられる（Ｃｒａｎａｇｅら、１９８６、ＥＭＢＯ　Ｊ．　５：３０５７−３０６３；１９９４年８月１８日に刊行された国際特許出願番号ＷＯ９４／１７８１０号；１９９４年１０月２７日に刊行された国際特許出願番号ＷＯ９４／２３７４４号）。非ウイルス性ベクターの例としては、それに限定されないが、リポソーム、ＤＮＡのポリアミン誘導体、および同等物が挙げられる。
【００８３】
（発明の概観）
トランス遺伝子座（目的の遺伝子）の伝達を排除する目的のための、雄性または雌性植物配偶子（小胞子または巨大胞子）の破壊のための構築物および方法が、記述されている。１つの実施形態では、小胞子破壊は、一般に、適切な自殺遺伝子に融合されたか、または性別の内の１つを通して伝達される能力のない遺伝的突然変異の使用を通して、花粉特異的プロモーターを用いて操作される。
【００８４】
ヘミ接合性である場合、トランス遺伝子座の伝達を排除することは、雄性または雌特異的プロモーターの制御下で、自殺遺伝子に目的の遺伝子を連結させることによって達成される。「植物接合体自殺形質」（ＧＳＴ）と称されるこの構築物は、小胞子または巨大胞子に限定される細胞死を誘導し、それによりＧＳＴに連結される目的の遺伝子の伝達を有効に削減または排除する。ＧＳＴ／トランス遺伝子構築物が、ヘミ接合性であるので、花粉粉末の５０％は、生育可能であり、そして非トランスジェニックである。したがって、トランス遺伝子の伝達は、受粉を達成し、そして植物栽培または食品用途のための種子供給を最終的に得るように受粉が起るのを許しながら、制御されうる。多くの植物が、過剰優勢な花粉を生成するので、生成された花粉の５０％の損失は、ほとんどの植物種について種子組に有害に影響しない。１つの例として、トウモロコシ（ゼア・メイズ（Ｚｅａ　ｍａｙｓ））は、７日の開花期間のピークに植物について１０７花粉粉末／日と同じくらい多く生じる（Ｃｏｅら、Ｃｏｒｎ　ａｎｄ　Ｃｏｒｎ　ＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔでのＴｈｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｃｏｒｎ、第三版、編集者；Ｓｐｒａｇｕｅら、８１−２５８（１９８８））。
【００８５】
トランス遺伝子座の雄性伝達を排除することは、分散および／または安定した転移事象のために強化させる新規攻略法としても使用されうる。これは、「植物配偶子の自殺形質」（ＧＳＴ）と一緒に、転移因子および／またはトランスポザーゼ遺伝子を含む「トランス遺伝子複合体」を操作することによって達成される。ＧＳＴは、小胞子に制限される細胞死を誘導し、そして傍の染色体領域、およびトランス遺伝子複合体内のトランスポゾン（供与エレメント）および／またはトランスポザーゼ遺伝子を含めた他のトランス遺伝子の雄性伝達を重篤に削減させる。
【００８６】
トランス遺伝子複合体が、雄親でヘテロ接合性である場合、小胞子のおよそ５０％が、破壊を受け、それによりトランス遺伝子複合体の雄性伝達を避け、そして連結した転移因子の雄性伝達を大いに削減させる。トランスボゾン供与部位および近傍転移のこの排除は、未連結転移、および供与体トランス遺伝子複合体で組換えた転移因子を含む花粉を強化させる総合効果を示す。
【００８７】
転移事象を生き残らせるのは、転移因子内に除草剤選択マーカー遺伝子を含むことによって子孫で容易に選択されうる。ＧＳＴは、トランスポザーゼの源を含む配偶子を排除するトランスポザーゼ源に物理的に連結されもしうる。この配列は、配偶子のトランスポザーゼ源の伝達を避け、それにより継続世代での挿入を安定化させる。
【００８８】
３つのエレメント（自殺遺伝子または突然変異、トランスポザーゼ源およびトランスポゾン）の全部は、分散した安定な転移を発生する確固とした方法を提供するユニットとして操作されうる。小胞子破壊に対する代替攻略法は、トランス遺伝子の雌性伝達を排除する巨大胞子自殺形質を用いて胚珠半不稔性を操作することである。
【００８９】
Ｉ．核酸
Ａ．プロモーター
植物における花粉特異的発現を起動する適切なプロモーターの多くの素晴らしい例がある。花粉特異的プロモーターは、トウモロコシ、コメ、トマト、タバコ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、および他のもののような多くの植物種で確認された（Ｏｄｅｌｌ，Ｔ．Ｏ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３１３：８１０−８１２頁（１９８５）；Ｍａｒｒｓ，Ｋ．Ａ．ら、Ｄｅｖ　Ｇｅｎｅｔ　１４／１号：２７−４１（１９９３）；Ｋｉｍ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓ、１／４：１８８−９４（１９９２）；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ｌ．ら（１９９２）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　４／５：５５７−７１；Ａｌｂａｎｉ，Ｄら、Ｐｌａｎｔ　Ｊ．　２／３：３３１−４２（１９９２）；Ｒｏｍｍｅｎｓ，Ｃ．Ｍ．ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２３１／３：４３３−４１（１９９２）；Ｋｌｏｅｃｋｅｎｅｒ−Ｇｒｕｉｓｓｅｎら、Ｅｍｂｏ　Ｊ．、１１／１：１５７−６６（１９９２）；Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｄ．Ａ．ら、（１９９２）、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ、Ｖｏｌ．１８／２：２１１−１８；Ｋｙｏｚｕｋａ，Ｊ．ら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、Ｖｏｌ．２２８／１−２：４０−８；Ａｌｂａｎｉ，Ｄ．ら（１９９１）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ、Ｖｏｌ．１６／４：５０１−１３；Ｔｗｅｌｌ，Ｄ．ら（１９９１）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．５／３：４９６−５０７；Ｔｈｏｒｓｎｅｓｓ，Ｍ．Ｋ．ら（１９９１）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．１４３／１：１７３−８４；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｓ．ら（１９９１）Ｓｙｍｐ　Ｓｏｃ　Ｅｘｐ　Ｂｉｏｌ　Ｖｏｌ．４５：２２９−４４；Ｇｕｅｒｒｅｒｏ，Ｆ．Ｄ．ら（１９９０）Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ　Ｖｏｌ　２２４／２：１６１−８；Ｔｗｅｌｌ，Ｄ．ら（１９９０）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｖｏｌ．　１０９／３：７０５−１３；Ｂｉｃｈｌｅｒ，Ｊ．ら（１９９０）、Ｅｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｖｏｌ．１９０／２：４１５−２６；ｖａｎ　Ｔｕｎｅｎら、（１９９０）、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｏｌ　２／５：３９３−４０１；Ｓｉｅｂｅｒｔｚ，Ｂ．ら（１９８９）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｏｌ　１／１０：９６１−８；Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｔ．Ｄ．ら（１９８９）Ｄｅｖ　Ｇｅｎｅｔ　Ｖｏｌ　１０／６：４１２−２４；Ｃｈｅｎ，Ｊ．ら（１９８７）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｖｏｌ　１１６／３：４６９−７７）。花粉特異的プロモーターのいくつかの他の例は、ゲンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）で見出されうる。別のプロモーターは、米国特許番号第５，０８６，１６９号；第５，７５６，３２４号；第５，６３３，４３８号；第５，４１２，０８５号；第５，５４５，５４６号および第６，１７２，２７９号にも提供される。
【００９０】
本発明で使用するために適切な数種の他の真核生物の伴性プロモーターがある。例としては、マウスの精子細胞特異的Ｐｇｋ−２プロモーター（Ａｎｄｏら（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２７２／１巻：１２５−８）；ＰＡＣＡＰ精巣特異的プロモーター（Ｄａｎｉｅｌら（２０００）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４１／３：１２１８−２７）；マウスのｍＳＰ−１０精子細胞特異的プロモーター（Ｒｅｄｄｉら（１９９９）Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，６１／５：１２５６−６６）；マウス精子特異的プロモーター（Ｒａｍａｒａら（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２／２：３７１−８）；マウスおよびラットＨ１ｔプロモーター（ｖａｎＷｅｒｔら（１９９６）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６０／３：３４８−６２）；ヒトＰＲＭ１、ＰＲＭ２およびＴＮＰ２精子細胞特異的プロモーター（Ｎｅｌｓｏｎら（１９９５）ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　５／６：３２９−３７頁）；ドロソフィアのエックス伴性プロモーター（Ｃｒｏｗｌｅｙら（１９９５）Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４８／３巻：３７０−４）；マウス精巣ＡＣＥプロモーター（Ｚｈｏｕら（１９９５）Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１６／２巻：２０１−９）；ラットＧＨＲＨ精子形成特異的プロモーター（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら（１９９５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１３６／４：１５０２−８）；ドロソフィアの精巣特異的プロモーター（Ｌａｎｋｅｎａｕら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４／３：１７６４−７５）；精子細胞特異的ｈｓｔ７０遺伝子プロモーター（Ｗｉｄｌａｋら（１９９４）Ａｃｔａ　Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｐｏｌｏｎｉｃａ　４１／２：１０３−５）；およびマウスＰｒｍ−１精子細胞特異的プロモーター（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０／１１：５０７１−５）が挙げられる。
【００９１】
本発明について、任意のプロモーターは、そのプロモーターが、一方の性別（雄または雌）に特異的である場合に適しており、そして同種染色体が、異なる細胞に分離される減数分裂Ｉの後に、遺伝子発現を特異的に起動させる。例えば、減数分裂ＩＩの第四段階での遺伝子発現、花粉突然変異に至る小胞子の後期減数分裂、成熟花粉粉末、または生殖性花粉粉末で、本発明に適する。
【００９２】
Ｂ．自殺遺伝子
植物配偶子の自殺形質（ＧＳＴ）の１つの態様は、歓迎されない減数分裂産物を死滅させる自殺遺伝子の発現に向けられる。その発現が、細胞死を生じる遺伝子の例としては、それに限定されないが、バーナーゼ（Ｃｕｓｔｅｒｓ，Ｊ．Ｂ．ら（１９９７）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　３５／６：６８９−９９；Ｙａｚｙｍｉｎ，Ｓ．ら（１９９９）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　４５２／３：３５１−４；Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｍ．Ｈら（１９９４）Ｅｍｂｏ　Ｊ　１３／１３：２９７６−８４、１９９４）、雄穂種子２（ＤｅＬｏｎｇ，Ａら（１９９３）Ｃｅｌｌ　７４／４：７５７−７６８）、およびジフテリア毒素Ａ遺伝子（Ｄａｙ，Ｃ．Ｄ．ら（１９９５）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１２１／９：２８８７−９５）を含めて文献に記述されたものが挙げられる。自殺遺伝子発現が、後期減数分裂Ｉに制限されるので、トランス遺伝子が、ヘミ接合性であり、そして減数分錬で正常に分離する場合には配偶子の５０％のみが、排除される。生育できる配偶子は、自殺遺伝子を継承しない。
【００９３】
本発明の別の態様によって、半不稔性は、花粉または卵の生育性に必須である遺伝子または複数遺伝子の発現を阻害するアンチセンスＲＮＡ技術を用いても達成されうる。この技術は、下でさらに詳細に検討される。
【００９４】
代わりに、花粉伝達されない欠失のような、性別の一方を通して伝達する能力のない突然変異は、半不稔性を達成するためにも使用されうる。
【００９５】
自殺遺伝子の特別の例としては、それに限定されないが、以下のものが挙げられる。
【００９６】
雄穂種子２（ｔｓ２）　遺伝的および分子的証拠は、ｔｓ２が、フサおよび耳の小スパイクの両方でのめしべ排除のために必要とされることを示す。めしべ細胞でのｔｓ２発現は、核酸完全性の損傷および細胞死で同時発生する。どのようにｔｓ２遺伝子産物が、細胞死経路で機能するかは明らかでない。短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ、特にデヒドロキシステロイド・デヒドロゲナーゼに対するそれの類似性の概念で、２つの可能性が、論理化される。ｔｓ２産物は、細胞生育性のために必要とされる基質、おそらくステロイドを代謝しうる。代わりに、ＴＳ２作用は、細胞死応答を活性化させる信号発生分子の形成を生じうる。（Ｃａｌｄｅｒｏｎ−Ｕｒｒｅａら（１９９９）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２６：４３５）。
【００９７】
ジフテリア毒素Ａ−鎖（ＤＴＡ）　ジフテリア毒素Ａ−鎖（ＤＴＡ）は、タンパク質合成を阻害する、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．：ＵＳＡ、８０：６８５３（１９８３）；Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ｃｅｌｌ、５０：４３５（１９８７）。
【００９８】
ペクテート・リアーゼｐｅｌＥ　エルベニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）ＥＣ１６から得られるペクテートリアーゼｐｅｌＥは、ペクチンを分解し、そして細胞溶解を引起す。Ｋｅｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１６８：５９５（１９８６）。
【００９９】
Ｔ−ｕｒｆ１３（ＴＵＲＦ−１３）　ｃｍｓ−Ｔトウモロコシのミトコンドリアゲノムから得られるＴ−ｕｒｆ１３（ＴＵＲＦ−１３）；この遺伝子は、ミトコンドリアまたは原形質膜を破壊するＵＲＦ１３と称されるポリペプチドをコードする。Ｂｒａｕｎら、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ、２：１５３（１９９０）；Ｄｅｗｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．：ＵＳＡ、８４：５３７４（１９８７）；Ｄｅｗｅｙら、Ｃｅｌｌ、４４：４３９（１９８６）。
【０１００】
Ｇｉｎレコンビナーゼ　ファージＭｕ遺伝子から得られるＧｉｎレコンビナーゼは、植物の細胞で発現される場合に、ゲノム転移および細胞完全性の喪失を引起す部位特異的ＤＮＡレコンビナーゼをコードする。Ｍａｅｓｅｒら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３０：１７０−１７６（１９９１）。
【０１０１】
インドール酢酸−リシンシンターゼ（ｉａａＬ）　シュードモナス・シリンジャエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｙｒｉｎｇａｅ）から得られるインドール酢酸−リシンシンターゼ（ｉａａＬ）は、インドール酢酸（ＩＡＡ）にリシンを接合させる酵素をコードする。植物の細胞で発現される場合、それは、接合を介して、細胞からのＩＡＡの除去による改質発生を引起す。Ｒｏｍａｎｏら、Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，５：４３８−４４６（１９９１）；Ｓｐｅｎａら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ；Ｇｅｎｅｔ．２２７：２０５−２１２（１９９１）；Ｒｏｂｅｒｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．：ＵＳＡ、８７：５７９５−５８０１。
【０１０２】
バーナーゼ　バーナーゼとしても知られる、バシルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）から得られるリボヌクレーアーゼは、それが発現されるような細胞でｍＲＮＡを消化し、そして細胞死に至らせる。Ｍａｒｉａｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ　３４７：７３７−７４１（１９９０）；Ｍａｒｉａｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ　３５７：３８４−３８７（１９９２）。
【０１０３】
ＣｙｔＡ毒素遺伝子　バシルス・ツリンジェンシス・イスラエリエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｉｓｒａｅｌｉｅｎｓｉｓ）から得られるＣｙｔＡ毒素遺伝子は、殺蚊性で、そして溶血性であるタンパク質をコードする。植物細胞で発現される場合、それは、細胞膜の破壊により、細胞の死を引起す。ＭｃＬｅａｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１６９：１０１７−１０２３（１９８７）；Ｅｌｌａｒら、米国特許番号第４，９１８，００６号（１９９０）。
【０１０４】
他の真核生物での自殺遺伝子として使用するための適切な細胞死遺伝子としては、ヒトＰＤＣＤ９（プログラム処理された細胞死９）およびガルス・ガルス（Ｇａｌｌｕｓ　ｇａｌｌｕｓ）選択アポトーシスタンパク質ｐ５２（Ｃａｒｉｍら、（１９９９）Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（スイス国）、８７／１−２：８５−８；シー．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）プログラム処理細胞死ＣＥＤ−３およびＥＧＬ−１（Ｈｅｎｇａｒｔｈｎｅｒら、（１９９９）、５４：２１３−２２；シー．エレガンスＣＥＤ−３：ＩＣＥの哺乳類相同体をコードする遺伝子（インターロイキン−１ベーター−変換酵素）（Ｋｏｎｄｏら（１９９８）Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ　＆　Ｖｉｓｕａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　３９／１３：２７６９−７４）；ＩＣＥ様プロテアーゼＩｃｈ−１Ｌ、ＣＰＰ３２ベーター、Ｍｃｈ２アルファおよびＭｃｈ３アルファをコードする遺伝子（Ｋｏｎｄｏら、（１９９８）５８／５：９６２−７）；または哺乳類細胞死遺伝子Ｎｅｄｄ２（Ｋｕｍａｒら、（１９９７）Ｌｅｕｋｅｍｉａ　１１補遣３：３８５−６）が挙げられる。
【０１０５】
Ｃ．トランス遺伝子および異種核酸
組換えＤＮＡ方法を用いて植物に首尾よく導入される遺伝子としては、それに限定されないが、修飾７Ｓマメ科植物種子保存タンパク質（米国特許番号第５，５０８，４６８号、第５，５５９，２２３号および第５，５７６，２０３号）；除草剤寛容性または耐性（米国特許番号第５，４９８，５４４号および第５，５５４，７９８号；Ｐｏｗｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３２：７３８−７４３（１９８６）；Ｋａｎｉｅｗｓｋｉら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．８：７５０−７５４（１９９０）；Ｄａｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：６７２１−６７２５（１９９１）；フィターゼ（米国特許番号第５，５９３，９６３号）；Ｂｔ遺伝子によって付与される鱗翅類昆虫に対する耐性（米国特許番号第５，５９７，９４５号および第５，５９７，９４６号；Ｈｉｌｄｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３３０：１６０−１６３；Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：９８７１−９８７５（１９８９）；Ｐｅｒｌａｋら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．８：９３９−９４３（１９９０））を含めた細菌、真菌、線虫および昆虫の有害生物に対する耐性；レクチン（米国特許番号第５，２７６，２６９号）；および花の色（Ｍｅｙｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３３０：６７７−６７８（１９８７）；Ｎａｐｏｌｉら、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　２：２７９−２８９（１９９０）；ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｋｒｏｌら、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　２：２９１−２９９（１９９０）を含めた以下の形質：種子保存タンパク質をコードするものが挙げられる。
【０１０６】
特に目的のものは、除草剤に耐性を付与する遺伝子である。例としては、それに限定されないが、以下のものが挙げられる。
【０１０７】
（ｉ）イミダゾアニリンまたはスルホニル尿素のような成長点または分裂組織を阻害する除草剤。このカテゴリーでの例示の遺伝子は、例えば、それぞれＬｅｅら、ＥＭＢＯ　Ｊ．７：１２４１（１９８８）、およびＭｉｋｉら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８０：４４９（１９９０）によって記述されるとおり、突然変異ＡＬＳおよびＡＨＡＳ酵素をコードする。
【０１０８】
（ｉｉ）グリホセート（突然変異５−エノールピルビル−３−ホスフィキメート・シンターゼ（ＥＰＳＰ）およびａｒｏＡ遺伝子により分与される耐性）およびグルホシネート（ホスフィノトリシン・アセチル・トランスフェラーゼ（ＰＡＴ）およびストレプトマイセス・ヒグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）のホスフィノトリシン・アセチル・トランスフェラーゼ（バー）遺伝子）のような他のホスホン化合物、およびピリジノキシまたはフェノキシ・プロピオン酸およびシクロシェノキソン（ＡＣＣエース阻害剤コード化遺伝子）。例えば、グリホセート耐性を付与しうるＥＰＳＰの形態のヌクレオチド配列を開示する、Ｓｈａｈらに対する米国特許番号第４，９４０，８３５号。突然変異体ａｒｏＡ遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号３９２５６号の下で得られ、そして突然変異体遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｃｏｍａｉに対する米国特許番号第４，７６９，０６１号で開示される。Ｋｕｍａｄａらに対する欧州特許出願番号第０　３３３　０３３号およびＧｏｏｄｍａｎらに対する米国特許番号第４，９７５，３７４号は、Ｌ−ホスフィノトリシンのような除草剤に対する耐性を供与するグルタミンシンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を開示する。ホスホリノトリチン−アセチル−トランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｌｅｅｍａｎｓらに対する欧州出願番号第０　２４２　２４６号で提供されている。Ｄｅ　Ｇｒｅｅｆら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　７：６１（１９８９）は、ホスフィノチリシン・アセチル・トランスフェラーゼ活性をコードするキメラ性バー遺伝子を発現するトランスジェニック植物の生成について記述している。セトキシジムおよびハロキシｆｏｐのようなフェノキシ・プロピオン酸およびシクロシェキソンに耐性を供する遺伝子の例は、Ｍａｒｓｈａｌｌら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８３：４３５（１９９２）によって記述されるＡｃｃ１−Ｓ１、Ａｃｃ１−Ｓ２およびＡｃｃ１−Ｓ３遺伝子である。トウモロコシ植物でのホスフィノトリシン・アセチル・トランスフェラーゼをコードするストレプトマイセス・バー遺伝子の発現は、除草剤ホスフィノトリシンまたはグルホシネートに対する寛容性を生じる（米国特許番号第５，４８９，５２０号、参照してここに組込まれる）。
【０１０９】
特定の標的種については、異なる抗生物質または除草剤選択マーカーが、好まれうる。形質転換で日常的に使用される選択マーカーとしては、カナマイシンおよび関連抗生物質に耐性を供するｎｐｔＩＩ遺伝子（ＭｅｓｓｉｎｇおよびＶｉｅｒｒａ、Ｇｅｎｅ　１９：２５９−２６８（１９８２）；Ｂｅｖａｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３０４：１８４−１８７（１９８３））、除草剤ホスフィノトリシンに耐性を供する遺伝子（Ｗｈｉｔｅら、Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１８：１０６２（１９９０）、Ｓｐｅｎｃｅｒら、Ｔｈｅｏｒ　Ａｐｐｌ　Ｇｅｎｅｔ　７９：６２５−６３１（１９９０））、抗生物質ハイグロマイシンに対して耐性を供するｈｐｈ遺伝子（ＢｌｏｃｈｉｎｇｅｒおよびＤｉｇｇｅｌｍａｎｎ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　４：２９２９−２９３１）、およびメトトレキセートに対する耐性を供するｄｈｆｒ遺伝子（Ｂｏｕｒｏｕｉｓら、ＥＭＢＯ　Ｊ．　２（７）：１０９９−１１０４（１９８３））が挙げられる。
【０１１０】
トランスジェニック・アルファ植物は、それに限定されないが、以下のものを含めたアルファおよび非アルファ種の両方から単離される多数の異なる遺伝子を用いて生成した：レポーター遺伝子ｇｕｓＡに融合した初期ノデュリン遺伝子のプロモーター（Ｂａｕｅｒら、Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ　１０（１）：９１−１０５（１９９６）；初期ノデュリン遺伝子（Ｃｈａｒｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．　ｏｆ　Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９４（１６）：８９０１−８９０６（１９９７）；Ｂａｕｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ　１０（１）：３９−４９（１９９７）；ＮＡＤＨ−依存性グルタメートシンターゼ（Ｇａｎｔｔ、Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ　８（３）：３４５−３５８（１９９５）；３つのレシチン遺伝子の各々についてのプロモーター−ｇｕｓＡ融合（Ｂａｕｃｈｒｏｗｉｔｚら、Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ　９（１）：３１−４３（１９９６）；ＣａＭＶプロモーターに融合した海洋軟質サンゴのレニラ・レニホルムス（Ｒｅｎｉｌｌａ　ｒｅｎｉｆｏｒｍｓ）のルシフェラーゼ酵素（Ｍａｙｅｒｈｏｆｅｒら、Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ　７（６）：１０３１−１０３８（１９９５）；Ｍｎ−スーパーオキシド・ジスムターゼｃＤＮＡ（ＭｃＫｅｒｓｉｅら、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　１１１（４）：１１７７−１１８１（１９９６））；バシルス・ツリンジェンシス・デルタ内毒素をコードする合成ｃｒｙＩＣ遺伝子（Ｓｔｒｉｚｈｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９３（２６）：１５０１２−１５０１７（１９９６）；グルカンス（Ｄｉｘｏｎら、Ｇｅｎｅ　１７９（１）：６１−７１（１９９６）；Ｍａｓｏｕｄら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　５（５）：３１３−３２３））；および葉老化遺伝子（米国特許番号第５，６８９，０４２号）。
【０１１１】
組換えＤＮＡ技術を用いてクローバーに首尾よく移動される遺伝子としては、それに限定されないが、以下のものが挙げられる：Ｂｔ遺伝子（Ｖｏｉｓｅｙら、上記）；ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼＩＩ（Ｑｕｅｓｂｅｎｂｅｒｒｙら、上記）；梨ペクチン遺伝子（Ｄｉａｚら、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　１０９（４）：１１６７−１１７７（１９９５）；Ｅｉｊｓｄｅｎら、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｇｏｙ　２９（３）：４３１−４３９（１９９５）；オーキシン反応性プロモーターＧＨ３（Ｌａｒｋｉｎら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　５（５）：３２５−３３５（１９９６）；ヒマワリから得られる種子アルブミン遺伝子（Ｋｈａｎら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　５（３）：１７９−１８５（１９９６）；および酵素ホスフィノトリシン・アセチル・トランスフェラーゼ、バスタ除草剤に対する耐性をコードするベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼおよびアルファ−アミラーゼ阻害剤（Ｋａｎら、上記）をコードする遺伝子。
【０１１２】
他の目的のトランス遺伝子としては、それに限定されないが、リグニン含量、セルロース含量、窒素固定、栄養改善、色、ビタミン含量および組換えで生成されたワクチンが挙げられる。
【０１１３】
Ｄ．部位特異的組換えシステム
形質転換手段の副産物として生じる任意に挿入されるＤＮＡ配列を除去することを可能にしつつ、特定のＤＮＡ遺伝子座への挿入のためのＤＮＡ配列を標的とする方法および構築物は、米国特許番号第５，５２７，６９５号および第６，１１４，６００号に記述される。これらの任意挿入を除去する１つの手段は、部位特異的レコンビナーゼシステムを利用することである。一般に、部位特異的レコンビナーゼシステムは、３つのエレメントから構成される：２対のＤＮＡ配列（部位特異的組換え配列）および特異的酵素（部位特異的レコンビナーゼ）。部位特異的レコンビナーゼは、２つの部位特異的組換え配列の間のみで組換え反応を触媒する。
【０１１４】
それに限定されないが、バクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘシステム、酵母のＦＬＰ／ＦＲＴシステム、ファージＭｕのＧｉｎレコンビナーゼ、イー．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ、大腸菌）のＰｉｎレコンビナーゼ、およびｐＳＲ１プラスミドのＲ／ＲＳシステムを含めて、多数の異なる部位特異的レコンビナーゼシステムが使用されうる。２つの好ましい部位特異的レコンビナーゼシステムは、バクテリオファージＰ１　Ｃｒｅ／ｌｏｘおよび酵母ＦＬＰ／ＦＲＴシステムである。これらのシステムでは、レコンビナーゼ（ＣｒｅまたはＦＬＰ）は、それの個々の部位特異的組換え配列（それぞれｌｏｘまたはＦＲＴ）と特異的に相互作用して、介在配列を逆にするか、または削除する。これらの２つのシステムの各々についての配列は、比較的短い（ｌｏｘについては３４ｂｐ、そしてＦＲＴについては４７ｂｐ）。最近、酵母のＦＬＰ／ＦＲＴシステムは、それが、真核生物（酵母）で正常に機能するので、好ましい部位特異的レコンビナーゼシステムであり、そして十分に特徴づけられる。ＦＬＰ／ＦＲＴシステムの真核生物の起点は、ＦＬＰ／ＦＲＴシステムに、原核生物の部位特異的レコンビナーゼシステムより真核生物細胞でいっそう有効に機能させると思われる。
【０１１５】
ＦＬＰ／ＦＲＴレコンビナーゼシステムは、植物細胞で有効に機能することが示された。トウモロコシおよびコメプロトプラストの両方で、ＦＬＰ／ＦＲＴシステムの作用における実験は、ＦＲＴ部位構造、および存在するＦＬＰタンパク質の量は、切除活性に影響することを示す。一般に、短い不完全ＦＲＴ部位は、完全全長ＦＲＴ部位より切除産物の高い蓄積に至る。部位特異的組換えシステムは、トウモロコシ・プロトプラストでの細胞内および細胞間反応の両方を触媒し、そしてシステムが、組込み反応と同様にＤＮＡ削除のために使用されうることを示す。組換え反応は、可逆的であり、そしてこの可逆性は、各方向で反応の効率に障害を生じさせうる。部位特異的組換え配列の構造を変化させることは、この状況を改善する１つのアプローチである。部位特異的組換え配列は、組換え反応の産物が、逆反応についての基質としてもはや認識されない手段で突然変異され、それにより、組込みまたは削除事象を安定化させうる。
【０１１６】
Ｅ．ベクター
植物での外来ＤＮＡを発現する発現単位
上に提供されるとおり、本発明のいくつかの実施形態は、植物での外部で供給された核酸配列を発現する発現単位（または発現ベクターまたはシステム）を使用する。植物で使用するための発現単位／システム／ベクターを発生する方法は、当業界でよく知られており、そして本発明に使用するために十分に適合されうる。当業者は、ここに供される概要にしたがって本発明の方法で、適切な植物／ベクター／発現システムを容易に使用しうる。
【０１１７】
タンパク質の発現を調節するために使用される発現制御エレメントは、コーティング配列（相同な発現エレメント）に関連して正常に見出される発現制御エレメントか、または異種の発現制御エレメントでありうるかのいずれかでありうる。多様な同種および異種発現制御エレメントが、当業界で知られており、そして本発明で使用するために発現ユニットを作るために容易に使用されうる。例えば、転写開始領域は、オクトパイン、マンノパイン、ノパリンおよびアグロバクテリウム・ツマファシアンス（Ａｇｒｏｂａｖｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍａｆａｃｉａｎｓ）のＴｉプラスミドで見出される同等物のような種々のオパイン開始領域のいずれかが挙げられる。代わりに、植物での遺伝子発現を制御するカリフラワー・モザイク・ウイルス３５Ｓプロモーターのような植物ウイルス性プロモーターも、使用されうる。最後に、プロリフェラ・プロモーター、果実特異的プロモーター、Ａｐ３プロモーター、加熱ショックプロモーター、種子特異的プロモーターなどのような植物プロモーターも、使用されうる。最も好ましいプロモーターは、雄性または雌性配偶子で最も活性である。
【０１１８】
配偶子特異的プロモーター、構築的プロモーター（ＣａＭＶまたはＮｏｓプロモーターのような）、器官特異的プロモーター（トマトから得られるＥ８プロモーターのような）、または誘導性プロモーターは、当業界で知られる標準技術を用いて、タンパク質またはアンチセンス・コード化領域に典型的に連結される。発現ユニットは、転写終結区および／またはエンハンサーエレメントのような補給エレメントを用いることによってさらに最適化されうる。
【０１１９】
したがって、植物での発現については、発現ユニットは、典型的には、タンパク質配列に加えて、植物プロモーター領域、転写開始部位および転写終結配列を含む。予備存在ベクターへの容易な挿入に対処する発現単位の５’および３’末端での特徴的制限酵素部位が典型的に含まれる。
【０１２０】
異種プロモーター／構造的遺伝子またはアンチセンス組合せの構築では、プロモーターは、それが、それの自然な設定で転写開始部位から得られるので、異種転写開始部位からとほぼ同じ距離に位置決めされるのが好ましい。しかし、当業界で知られるとおり、この方向でのある種の変動は、プロモーター機能の損失なしに適応されうる。
【０１２１】
プロモーター配列に加えて、発現カセットは、十分な終結を提供するために構造遺伝子の下流に転写末端領域をも含み得る。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得られうるか、または異なる遺伝子から得られうる。構造遺伝子によってコードされるｍＲＮＡは、有効に加工されるべきである場合、ＲＮＡのポリアデニル化を指示するＤＮＡ配列も、ベクター構築物に共通して添加される。ポリアデニル化配列としては、それに限定されないが、アグロバクテリウム・オクトパイン・シンターゼ信号（Ａｇｒｏｂａｖｔｅｒｉｕｍ　ｏｃｔｏｐｉｎｅ）（Ｇｉｅｌｅｎら、ＥＭＢＯ　Ｊ　３：８３５−８４６（１９８４））またはノパリン・シンテターゼ信号（Ｄｅｐｉｃｋｅｒら、Ｍｏｌ．ａｎｄ　Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：５６１−５７３）（１９８２）が挙げられる。
【０１２２】
生じた発現単位は、高等植物形質転換のために適切であるベクターに連結されるか、またはさもなければ、それに含まれるように構築される。ベクターは、それにより形質転換植物細胞が、培養物中で確認される選択マーカー遺伝子をも典型的に含む。通常に、マーカー遺伝子は、抗生物質耐性をコードする。これらのマーカーとしては、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、およびゲンタマイシンに対する耐性が挙げられる。植物細胞を形質転換させた後、ベクターを有するような細胞は、特定の抗生物質を含む培地で生育するそれらの能力によって確認される。ベクターに細菌またはファージ宿主でクローン化させうる細菌またはウイルス起点の複写配列も、一般に含まれ得て、好ましくは、複写の広範な宿主範囲の原核生物の起点が含まれる。所望の構築物を担持する細菌細胞の選択を可能にする細菌のための選択マーカーも、含まれる。適切な原核生物の選択マーカーも、アンピシリン、カナマイシンまたはテトラサイクリンのような抗生物質に対する耐性を含む。
【０１２３】
別の機能をコードする他のＤＮＡ配列は、当業界で知られるとおり、ベクターにも存在しうる。例えば、アグロバクテリウム形質転換の場合に、植物染色体への連続移行についてのＴ−ＤＮＡ配列も、含まれる。
【０１２４】
本発明の配列は、発現配列タグ（ＥＳＴ）、エピトープまたは蛍光タンパク質マーカーのような種々の他の核酸分子にも融合されうる。
【０１２５】
ＥＳＴは、遺伝子断片、特に、相補性−ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンの３’または５’末端から配列決定された、長さ３００から４００ヌクレオチドである。ほぼ３０，０００のアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）ＥＳＴは、フランスおよびアメリカの共同企業体によって生成された（Ｄｅｌｓｅｎｙら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　４０５（２）：１２９−１３２（１９９７）；アラビドプシス・タリアナ・データベース、ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）。大型ＥＳＴデータベースから誘導される遺伝子−発現アターンの分析の検討のために、例えば、Ｍ．Ｒ．Ｆａｎｎｏｎ、ＴＩＢＴＥＣＨ　１４：２９４−２９８（１９９６）参照。
【０１２６】
生物学的に適合性の蛍光タンパク質プローブ、特にクラゲのアクレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ　ｖｉｃｔｏｒｉａ）から得た自己組立て緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、それらが、生きた細胞での生化学的事象の可視化を可能にするので、細胞、分子および発生の生物学での研究を革新した（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．　７（１１）：８７０−８７６（１９９７）；Ｇｒｅｂｅｎｏｋら、Ｐｌａｎｔ　Ｊ．　１１（３）：５７３−５８６（１９９７）；Ｐａｎｇら、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１１２（３）（１９９６）；Ｃｈｉｕら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６（３）：３２５−３３０（１９９６）；Ｐｌａｕｔｚら、Ｇｅｎｅ　１７３（１）：８３−８７（１９９６）；Ｓｈｅｅｎら、Ｐｌａｎｔ　Ｊ．８（５）：７７７−７８４（１９９５））。
【０１２７】
部位指向性突然変異誘発は、可溶性修飾ＧＦＰ（ｓｍＧＦＰ）と称されるコドン修飾ＧＦＰのいっそう可溶性のバージョンを開発するために使用された。アラビドプシスに導入された場合、コドン修飾ＧＦＰに比較したときに、いっそう多くの蛍光が観察され、そしてｓｍＧＦＰが、その多くが溶解性および機能性形態で存在するので、「より明るい」ことを示唆した（Ｄａｖｉｓら、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６（４）：５２１−５２８（１９９８））。ＧＦＰおよびベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする遺伝子を融合させることによって、研究者らは、アラビドプシスを含めた植物での一過性および安定な発現システムに使用するために最適化された１組の二機能性レポーター構築物を作成できた（Ｑｕａｅｄｖｌｉｅｇら、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７（４）：７１５−７２７（１９９８））。
【０１２８】
Ｂｅｒｇｅｒら（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９４（２）：２２６−２３４（１９９８））は、アラビドプシス・ハイポコチル（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ）表皮細胞のためのＧＦＰマーカー系統の単離を報告する。ゲラニルゲラニル・ピロホスフェート（ＧＧＰＰ）を含めたＧＦＰ−融合タンパク質は、多数のアラビドプシス遺伝子を局在化および特徴付けるために使用された（Ｚｈｕら、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５（３）：３３１−３４１（１９９７））。
【０１２９】
遺伝子無能力化
有効な無能力化修飾の例は、翻訳読取り枠シフトを生じる遺伝子の開始に起る単独ヌクレオチド欠失である。このような枠シフトは、遺伝子を無能力化させ、そして非発現性遺伝子を生じ、そしてそれにより、その遺伝子による機能性タンパク質生成を妨害する。未修飾遺伝子がプロテアーゼをコードする場合、例えば、遺伝子によるプロテアーゼ生成は、プロテアーゼ遺伝子の調節領域またはコーティング領域が妨害される場合に、妨害されうる。
【０１３０】
ヌクレオチドを欠失させることによる遺伝子を無能化させて、一過性読取枠シフトを引起すことに加えて、無能化修飾は、ＤＮＡによりコード化されたタンパク質の形成を有効に回避する遺伝子のＤＮＡ内のヌクレオチドの挿入、置換、介入、または貫入を含めた他の技術によっても可能である。
【０１３１】
あまり特別でない方法の使用により遺伝子を無能力にすることも、当業者の許容性の範囲内にある。あまり特別でない方法の例は、ヒドロキシアミンまたはニトロソグアニジンのようなキメラ突然変異の使用、または遺伝子を任意に突然変異させるガンマ線照射または紫外線照射のような放射線突然変異の使用である。このような突然変異株は、遺伝子が、そのドメインの任意の１つまたはそれ以上について機能性タンパク質を生成する能力がないように無能力化遺伝子を偶然に含みうる。望ましい無能力化された遺伝子は、日常的なスクリーニング技術によって検出されうる。さらなる指針のために、米国特許番号第５，７５９，５３８号参照。
【０１３２】
アンチセンス・コード化ベクター
インシチュでのアンチセンス配列の発生を含めて、アンチセンス構築物を用いて植物における発現を阻害する方法は、例えば、米国特許番号第５，１０７，０６５号；第５，２５４，８００号；第５，３５６，７９９号；第５，７２８，９２６号；および第６，１８４，４３９号に記述される。後者の２つの特許は、「ハイブリッド種子生成についての花粉制御のアンチセンス遺伝子システム」と題される。
【０１３３】
植物での内因性遺伝子の配列を阻害するために使用されうる他の方法は、本発明の方法でも使用されうる。例えば、二重遺伝子の必須領域での三重螺旋の形成は、この目的の役割を果す。適切な一本鎖関係物の設計を許す三重コードも、当業界で知られている（Ｈ．Ｅ．Ｍｏｓｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８：６４５−６５０（１９８７）およびＭ．Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：４５６−４５９（１９８８）参照）。プリン塩基の収縮を含む制御配列における領域は、特に魅力的な標的である。光架橋と一緒に三重螺旋形成は、例えば、Ｄ．Ｐｒａｓｅｕｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：１，３４９−１，３５３（１９８８）に記述されている。
【０１３４】
ＩＩ．形質転換
Ａ．植物形質転換
従来の方法によって、望ましい遺伝子または１組の遺伝子を導入するために、所望の特徴を示す植物が得られるまで、２つの系統の間の性的交雑、そしてその後、ハイブリッド子孫とその親のいずれかとの間の反復戻り交配を必要とする。しかし、この方法は、性的にハイブリッド形成しうる植物に制限され、そして望ましい遺伝子に加えて、遺伝子が、移行される。
【０１３５】
組換えＤＮＡ技術は、植物遺伝学者に、害虫に対する耐性のような、所望の形質についての特定の遺伝子を同定およびクローン化させ、そしてすでに有用な多様な植物にこれらの遺伝子を導入することによって、植物研究者らに、これらの制限を回避させる。いったん外来遺伝子が、植物に導入されると、それにより、その植物は、目的の遺伝子をも含む子孫を生じる従来の植物交配スキーム（例えば、血統交配、単一種子子孫交配スキーム、相反の再発選択）で使用されうる。
【０１３６】
遺伝子は、相同組換えを用いて、部位指向形態で導入されうる。相同組換えは、内因性遺伝子での部位特異的修飾を許し、したがって、継承されるか、または獲得された突然変異が、訂正され得て、および／または新規変化は、ゲノムに操作されうる。
【０１３７】
植物での相同組換えおよび部位指向性組込みは、米国特許番号第５，４５１，５１３号；第５，５０１，９６７号および第５，５２７，６９５号で検討される。
【０１３８】
Ｂ．形質転換方法
トランスジェニック植物を生成する方法は、当業者によく知られている。トランスジェニック植物は、現在、それに限定されないが、電気穿孔；微量注入法；粒子加速またはバイオリスティック衝撃としても知られる微量投射衝撃；ウイルス介在形質転換；およびアグロバクテリウム介在形質転換（例えば、米国特許番号第５，４０５，７６５号；第５，４７２，８６９号；第５，５３８，８７７号；第５，５３８，８８０号；第５，５５０，３１８号；第５，６４１，６６４号；第５，７３６，３６９号および第５，７３６３６９号；Ｗａｔｓｏｎら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｏｏｋｓ（１９９２）；Ｈｉｎｃｈｅｅら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．５：９１５−９２２（１９８８）；ＭｃＣａｂｅら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．６：９２３−９２６（１９８８）；Ｔｏｒｉｙａｍａら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．６：１０７２−１０７４（１９８８）；Ｆｒｏｍｍら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．８：８３３−８３９（１９９０）；Ｍｕｌｌｉｎｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．８：８３３−８３９（１９９０）；およびＲａｉｎｅｒｉら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．８：８３３−３８（１９９０）参照）を含めた多様な異なる形質転換方法によって生成されうる。
【０１３９】
トランスジェニック・アルファルファ植物は、それに限定されないが、アグロバクテリウム指向性形質転換（Ｗａｎｇら、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　２３（３）：２６５−２７０（１９９６）；Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ　１０（３）：３０７−３１５（１９９７）；Ｔｒｉｅｕら、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　１６：６−１１（１９９６））および粒子加速（米国特許番号第５，３２４，６４６号）を含めた多くのこれらの方法によって生成された。
【０１４０】
形質転換は、アグロバクテリウム指向性形質転換を用いてクローバーでも首尾よく達成された（Ｖｏｉｓｅｙら、Ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４（４）：４７５−４８１（１９９４）；Ｑｕｅｓｂｅｎｂｅｒｒｙら、Ｃｒｏｐ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　３６（４）：１０４５−１０４８（１９９６）；Ｋｈａｎら、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　１０５（１）：８１−８８（１９９４）；Ｖｏｉｓｅｙら、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　１３（６）：３０９−３１４（１９９４））。
【０１４１】
遺伝的形質転換は、膨大な飼料および芝草種でも報告されている（Ｃｏｎｇｅｒ　Ｂ．Ｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｏｒａｇｅ　Ｇｒａｓｓｅｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｆｏｒａｇｅ　Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ、ＣＳＳＡ特別出版物番号２６号、Ｃｒｏｐ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ、Ｉｎｃ．Ｅ．Ｃ．Ｂｒｕｍｍｅｒら編、１９９８、４９−５８頁）。これらには、カモガヤ（ダクチリス・グロメラタ・エル．（Ｄａｃｔｙｌｉｓ　ｇｌｏｍｅｒａｔａ　Ｌ．））、ヒロハノウシノケグサ（フェスツカ・アルンジナセア・シェレブ（Ｆｅｓｔｕｃａ　ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ　Ｓｃｈｒｅｂ．））、オオウシノケグサ（フェスツカ・ルブラ・エル．（Ｆｅｓｔｕｃａ　ｒｕｂｒａ　Ｌ．））、メドー・フェスキュー（フェスツカ・プラテンシス・ヒュッズ．（Ｆｅｓｔｕｃａ　ｐｒａｔｅｎｓｉｓ　Ｈｕｄｓ．））、ホソムギ（ロリウム・ペレネ・エル．（Ｌｏｌｉｕｍ　ｐｅｒｅｎｎｅ　Ｌ．））、コヌカグサ（アグロスチス・パルストリス・ヒュッズ．（Ａｇｒｏｓｔｉｓ　ｐａｌｕｓｔｒｉｓ　Ｈｕｄｓ．））およびコヌカグサ（レッドトップ）（アグロスチス・アルバ・エル．（Ａｇｒｏｓｔｉｓ　ａｌｂａ　Ｌ．））が挙げられる。
【０１４２】
このような飼料および芝草での遺伝子トランスファーの成功は、原形質体によるＤＮＡの直接摂取によって、そしてＤＮＡ被覆マイクロ投影法での細胞または組織の衝撃により達成された。両方の場合に、移行は、全植物再生に続く。多くの研究は、形質転換のためのプロトコールを開発および改善することに焦点を当て、そして−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするレポーター遺伝子ｕｉｄＡおよびホスフィノトリシン基剤の除草剤に寛容性を付与する選択可能なマーカーバーを使用した。形質転換の証明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、転写ＲＮＡのノーザンハイブリダイゼーション分析、溶解性タンパク質（遺伝子産物）のウエスタンブロット分析、および総ゲノムＤＮＡのノーザンブロット・ハイブリダイゼーションによって提供された。
【０１４３】
ＩＩＩ．ヘミ接合性
多重コピーが可能であるが、アグロバクテリウム形質転換法を用いて形成されたトランスジェニック植物は、典型的に、１つの染色体に単一の遺伝子を含む。このようなトランスジェニック植物は、添加された遺伝子についてヘミ接合であると呼ばれる。このような植物についてのいっそう正確な名称は、各形質転換植物が、特徴的Ｔ−ＤＮＡ組込み事象（米国特許番号第６，１５６，９５３号）を表すので、独立分離集団である。トランスジェニック遺伝子座は、トランス遺伝子の存在および／または不在によって一般に特徴づけられる。１つの対立遺伝子が、トランス遺伝子の不在に対応するヘテロ接合遺伝子型は、ヘミ接合とも称される（米国特許番号第６，００８，４３７号）。
【０１４４】
正常なヘミ接合性を呈して、自家受粉は、Ｒ１またはＲ１世代としても知られる第一の自家受粉された組換え体世代で、最大限の遺伝子型分離を生じる。Ｒ１世代は、Ｒ０またはＲ０世代としても知られる元の組換え体系統を自家受粉することによって生成される。各挿入物は、連結の不在下で、優性対立遺伝子として作用し、そして唯一のヘミ接合性挿入物を取り入れることが、寛容性発現のために要求されるので、１つの挿入物は、３：１に分離し、２つの挿入物は、１５：１に、３つの挿入物は、６３：１になどに分離する。したがって、比較的少ないＲ１植物は、少なくとも１つの耐性表現型を見出すように育成される必要がある（米国特許番号第５，４３６，１７５号および第５，７７６，７６０号）。
【０１４５】
上に明記されるとおり、ヘミ接合性トランスジェニック再生植物の自家受粉は、およそ２５％が、ホモ接合性トランスジェニック植物であるべきＦ２と同等の子孫を生じるにちがいない。非形質転換対照植物に対するＦ２子孫の自家受粉および検定交雑は、ホモ接合性トランスジェニック植物を同定するため、そしてその系統を維持するために使用されうる。再生植物のために当初に得られた子孫は、交雑受粉から得られる場合、それにより、ホモ接合性トランスジェニック植物の同定は、自家受粉の別の世代を必要とする（米国特許番号第５，５４５，５４５号）。
【０１４６】
ＩＶ．半不稔性および遺伝的不稔フィルター
Ａ．植物配偶子の不稔形質（ＧＳＴ）
ＧＳＴは、２または３のエレメントから構成されうる：伴性プロモーター、自殺遺伝子および都合により、トランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼをコードする領域。正常には、ＧＳＴ構築物は、転写終結区エレメントで終止しる。トランスポゾンまたはトランスポザーゼ限の封入は、分散転移についての選択のアプリケーションに特異的であり、そしてトランス遺伝子の伝達を排除する目的のために必然てきに使用されるものではない。
【０１４７】
使用されうる伴性プロモーターとしては、それに限定されないが、トウモロコシ、コメ、トマト、タバゴ、アラビドプシスおよびバラシカから得られる花粉特異的プロモーターが挙げられる。数種の他の例は、ゲンバンクで見出されうる。プロモーターは、一方の性（雄または雌）に特異的であり、そして同種染色体が、異なる細胞に分離された減数分裂Ｉの後に、遺伝子発現を特異的に起動させる。
【０１４８】
自殺遺伝子が、歓迎されない減数分裂産物を死滅させるために使用される。自殺遺伝子としては、それに限定されないが、バーナーゼ、雄穂種子２およびジフテリア毒素Ａ遺伝子が挙げられる。自殺遺伝子を用いることに対する２つの代替法は、１）花粉または卵の生育性に必須な遺伝子の発現を阻害するアンチセンスＲＮＡ技術を使用すること；または２）花粉で伝達されない欠失のような、性別の内の１つを通した伝達の不可能である突然変異が挙げられる。これらの代替法の両方は、半不稔性を達成するために使用されうる。
【０１４９】
Ｂ．半不稔性および遺伝的不稔フィルター
語句「半不稔性」および「遺伝的不稔フィルター」は、自殺遺伝子発現が、後期減数分裂Ｉに制限されるので、ＧＳＴ遺伝子座が、ヘミ接合性であり、そして減数分裂で正常に分離されるときに、配偶子の５０％のみが、排除されるという概念を伝えるために発明者らによって使用される。これは、ＧＳＴ遺伝子座が、単独コピー（ヘミ接合性条件）でゲノムで存在するときに、自殺遺伝子が、減数分裂の産物のおよそ２分の１に伝達され、そして５０％不稔速度を生じるという事実による。ＧＳＴを受継ぐ花粉は、花粉特異的プロモーターが、自殺遺伝子に操作的に連結される場合に、生存しない。
【０１５０】
５０％生育性花粉の生成は、分散転移の回復のために、および／または雄性受精能力における主要な効果なしに、トランス遺伝子伝達を避けることが必要である。
【０１５１】
Ｃ．植物配偶子の半不稔性
本発明は、特異的トランス遺伝子複合体を継続する配偶子を排除する「遺伝的不稔フィルター」を発生する、花粉半不稔のような植物配偶子の「半不稔性」を利用する技術の使用を記述する。ＧＳＴへの花粉特異的プロモーターの組込みは、このトランス遺伝子複合体を受継ぐ花粉中のＧＳＴに連結されたトランス遺伝子の伝達を避ける。
【０１５２】
このトランス遺伝子複合体は、転移因子および／またはトランスポザーゼ遺伝子のための打上部位をも含みうる。この場合に、トランスポゾン供与体部位および／またはトランスポザーゼと一緒に、トランス遺伝子複合体の排除は、トランス遺伝子複合体で組換えた、またはゲノムを通して分散される（もはやＧＳＴに連結されていない）転移事象を強化させながら、傍の転移を排除する総効果を示す。この方法論は、分散転移より主に局在化されることを支持するトランスポゾン突然変異誘発攻略法の数種の最近の限界を克服する。本発明は、トランスポゾン分散を達成する陰性の選択マーカーの最近の用途で大いに改善する（Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ，Ｖ．ら、（１９９５）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　９／１４：１７９７−８１０；Ｔｉｓｓｉｅｒ，Ａ．Ｆ．ら、（１９９９）Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１１巻：１８４１−１８５２）。さらに、トランスポザーゼ限の伝達を排除する遺伝的不稔フィルターの使用は、子孫で新たに転移されたエレメントを安定化させ、それにより突然変異同定を妨害する体細胞性または二次転移事象を排除する。
【０１５３】
半不稔形質およびそれに関連したトランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼの特性は、自殺遺伝子、プロモーター、トランスポゾンシステム、および種の選択によって詳細では異なりうる。しかし、半不稔と同じ基本的技術は、性的に繁殖されうるトウモロコシ、コメ、大豆、小麦、エンバク、大麦、および動物および真菌のような非植物システムのようなこのような種で、多くの植物、単子葉類および双子葉類の両方で転移を回復するために使用されうることが強調される。さらに、小胞子排除に対する代替攻略法は、巨大胞子自殺形質を操作することによって、トランス遺伝子複合体の雌性伝達を排除することである。
【０１５４】
半不稔形質は、トランスポゾン打上部位および／またはトランスポザーゼ遺伝子のような、特別の染色体領域を担持する減数分裂の産物（配偶子）を排除するために使用される。この「遺伝的不稔フィルター」は、トランス遺伝子複合体の雄性または雌性伝達を排除するために使用される。この排除方法は、未連結（分散）された転移因子または打上部位から組換えたエレメントを強化させる総効果を示す；トランスポザーゼ遺伝子のような、他の遺伝子の伝達を同時に排除し、それにより子孫での転移を安定化するためにも使用される。半不稔性を達成するために、多数の好ましい方法は、本発明によって意図される。１つの方法は、歓迎されない小胞子を死滅させる自殺遺伝子の小胞子特異的発現を支持することに依る。この方法は、適切な自殺遺伝子に融合され、それによって、遺伝子融合を受け継いだ減数分裂の産物のみを死滅させる、花粉特異的プロモーターのような特定のプロモーターを使用することによって達成される。ヘミ接合性条件での単一コピートランス遺伝子について、これは、５０％の配偶子を表す。花粉は、大過剰で生成されるので、花粉生殖能力を５０％まで削減させることは、連続種子生産で主要な成果は示さない。
【０１５５】
半不稔性を生じることに関する本発明の態様は、当業界で知られているハイブリッド種子生産のための全雄性不稔性を達成するのに支援される先の方法と異なる。これらの方法で、支援は、ハイブリッド種子の市販生産を促進する完全な雄性不稔性を達成するためにあった。これは、通常、植物胞子で、または全ての小胞子で自殺遺伝子の発現に関与する。例えば、絨毯の細胞でのバーナーゼ発現は、完全な雄性不稔性を生じる（Ｂｅａｌｓ，Ｔ．Ｐ．ら（１９９７）Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ．Ｖｏｌ．９：１５２７−４５）。ハイブリッド種子生産で、花粉半不稔性は、所望の結果、すなわち、雄性不稔性（雌）親の異系交配を達成するのに不十分である。小胞子特異的自殺遺伝子およびそれに関連したエレメントが、単一コピー（ヘミ接合性条件で）にあるゲノムに存在する場合に、自殺遺伝子は、減数分裂の産物のおよそ２分の１に伝達され、そしてハイブリッド種子生産のために市販で許容できない生育できる花粉生成の速度、５０％半不稔性の平均を生じる。本発明について、５０％生育できる花粉の生産は必須であり、そして分散転移を回復すること、および／またはトランスポザーゼ伝達を回避することが重要である。したがって、植物配偶子の不稔形質は、同時に、他のゲノム（供与体エレメントおよび／またはトランスポザーゼ遺伝子なしに、転移されたエレメントを含む非トランスジェニックおよびゲノムが存在する）に、伝達させながら、歓迎されないゲノムを排除するフィルターとして使用される。１つの実施形態では、本発明は、トランスポゾン打上部位および／またはトランスポザーゼ源を含むトランス遺伝子複合体を排除するためにこの「遺伝的不稔フィルター」を利用する。
【０１５６】
Ｖ．交配方法
開放受粉された集団　ライ麦、多くのトウモロコシおよび砂糖ダイコン、牧草イネ科植物、アルファルファおよびクローバーのようなマメ科植物、およびカカオ、ココナッツ、パーム油およびある種のゴムのような熱帯樹木作物のような作物の開放受粉された集団の改善は、高度（しかし最大限から遠い）のヘテロ接合性を維持しながら、好ましい対立遺伝子の固定に向けた遺伝子頻度を変化させることに基本的に依存する。このような集団での均一性は、不可能であり、そして開放受粉された変種での忠実性−対−型は、個々の植物の特徴的でなく全てとして集団の統計的特性である。したがって、開放受粉された集団の異種性は、同系交配系統、クローンおよびハイブリッドの同種性（または実質的にはそのとおりである）と対照的である。
【０１５７】
集団改善方法は、正常にマス選択と称される純粋に表現型の選択に基づくもの、および子孫試験での選択に基づくものの２つの群に自然に入る。集団間の改善は、開放交配集団の概念を利用し、そして１つの集団から別のものに流れるための遺伝子を可能にする。１つの集団での植物（栽培変種、株、環境型、または任意の生殖質源）は、自然に（例えば、風により）、または手により、またはミツバチ（一般に、アピス・メリフェラ・エル．（Ａｐｉｓ　ｍｅｌｌｉｆｅｒａ　Ｌ．）またはメガチレ・ロツンダタ・エフ．（Ｍｅｇａｃｈｉｌｅ　ｒｏｔｕｎｄａｔａ　Ｆ．））によるかのいずれかによって、他の集団からの植物と交雑される。選択は、望ましい形質を示す植物を、両方の源から単離することによって、１つ（またはしばしば両方）の集団を改善するために使用される。
【０１５８】
開放受粉された集団改善の基本的に２つの一次的方法がある。第一に、集団が、選択された選択手段によって集団で変化される状況がある。成果は、隔離されてそれ自身の中で任意に交配することによって漠然と増殖される改善された集団である。第二に、合成的変種は、集団改善として同じ最終結果を達成するが、しかしそれは、親系統またはクローンから再構築されなければならないことのように、それ自身増殖性でない。開放受粉された集団を改善するためのこれらの植物交配手段は、当業者によく知られており、そして他家受粉植物を改善するために日常的に使用される交配手段の包括的検討は、膨大な文献および記事で提供され、そしてＡｌｌａｒｄ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９６０）；Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｃｒｏｐ　Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，Ｌｏｎｇｍａｎ　Ｇｒｏｕｐ　Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９７９）；ＨａｌｌａｕｅｒおよびＭｉｒａｎｄａ、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｉｎ　ｍａｉｚｅ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，Ｉｏｗａ　Ｓｔａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８１）；およびＪｅｎｓｅｎ、Ｐｌａｎｔ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９８８）が挙げられる。
【０１５９】
マス選択　マス選択で、所望の個々の植物が選択され、収獲され、そして種子は、子孫試験なしに複合されて、続く世代を生じる。選択は、母親のみに基づいていて、そして受粉を超える対照がないので、マス選択は、実質上、選択で任意の交配の形態に等しい。上で主張されるとおり、マス選択の目的は、集団での優れた遺伝子型の比率を増大させることである。
【０１６０】
合成　合成変種は、開放受粉により、変種の連続維持と共に、全ての可能性のあるハイブリッド組合せでの優れた組合せ能力のために選択される多数の遺伝子型を同一育種間で交雑させることによって生成される。ある種の砂糖ダイコンおよびマメ（ビシア（Ｖｉｃｉａ））またはクローンでと同様に、牧草イネ科植物、クローバーおよびアルファルファでと同様に、親が、（多かれ少なかれ自家交配された）種子増殖系統であるかどうかは、根本的に重要でない。親は、しばしば、検定交配または品種系統間交雑することによって、さらに一般には多重交雑により、一般的に組合せた能力で選択される。親の種子系統は、慎重に同系交配されうる（例えば、自家受粉または近親交配により）。しかし、親が、慎重に同系交配されなかった場合でさえ、系統維持の間の系統内の選択は、ある程度同系交配が起ることを保証する。もちろん、クローナル親は、未変換のままであり、そして非常にヘテロ接合性なままである。
【０１６１】
合成物が、親の種子生産プロットから農家まで直接進むか、または１または２周期の増殖を最初に受けなければならなかは、種子生産および種子の需要の規模に依存する。実施では、イネ科植物およびクローバーは、一般に１回または２回操作され、したがって、元の合成から相当に除去される。
【０１６２】
マス選択は、しばしば使用される一方で、子孫試験は、それらの増殖の簡単さおよび対象に対する明らかな関連性、主に、合成での全般的組合せ能力の探索のため、一般に、多重交雑のために好ましい。
【０１６３】
合成に入る親の系統またはクローンの数は、広範に変化する。実際に、親の系統の数は、１０から数百までの範囲にあり、そして１００−２００は、平均である。１００またはそれ以上のクローンから形成される広範な基本の合成は、狭い基本の合成より種子増殖の間にいっそう安定であると予想される。
【０１６４】
ハイブリッド　ハイブリッドは、異なる遺伝子型の親の間の交雑から生じる個別の植物である。市販のハイブリッドは、現在、コーン（トウモロコシ）、モロコシ属、砂糖ダイコン、ヒマワリおよびブロッコリーを含めた多くの作物で集約的に使用される。ハイブリッドは、２つの親を直接交雑させることにより、別の親との単一交雑ハイブリッドを交雑させること（３つの方法または三重交雑ハイブリッド）によって、または２つの異なるハイブリッドを交雑させる（４つの方法または二重交雑ハイブリッド）ことによることを含めた多くの異なる方法で形成されうる。
【０１６５】
厳密に言うと、異系交配（すなわち、開放受粉）集団でのほとんどの個体は、ハイブリッドであるが、しかし語句は、通常、親が、そのゲノムはそれらが異なる種または亜種として認識されるために十分に区別できる個体である場合に保存される。ハイブリッドは、２つの親のゲノムでの定性および／または定量的差異によって、稔性であるか、または不稔性でありうる。ヘテローシス、またはハイブリッド生長力は、通常に、ハイブリッドを形成するために使用された親の系統と比較した場合、ハイブリッドの生長、生存および受精能力の勢いが増加したことを生じる異型接合性が増加したことに関連する。最大限のヘテローシスは、通常、２つの遺伝的に異なり、非常に同系交配された系統を交雑させることによって達成される。
【０１６６】
ハイブリッドの生産は、十分に発達した産業であり、そしてそれらの系統から生じる親系統およびハイブリッドの両方の単離された生産に関与する。ハイブリッド生産方法の詳細な検討のために、例えば、ＷｒｉｇｈｔのＣｏｍｍｅｒｃｉａｌ　Ｈｙｂｒｉｄ　Ｓｅｅｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　８：１６１−１７６、Ｉｎ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｏｒｐ　Ｐｌａｎｔｓ，上記参照。
【０１６７】
ＶＩ．トランスポゾンおよび転移因子
トランスポゾンは、同じ染色体または異なる染色体での供与体染色体部位から標的部位までに転移（運動）の能力のある遺伝的エレメントである。トランスポゾンは、コーティング配列、イントロン、およびプロモーターへの挿入によって突然変異を引起して、そして標的遺伝子活性をしばしば完全に排除する。トランスポゾンによって引起された突然変異は、しばしば、その遺伝子からのトランスポゾンの連続切除によって脱安定化されうる。集約的に「トランスポザーゼ」と称される１つまたはそれ以上のタンパク質が、トランスポゾンの切除および組込みのために必要とされる。トランスポザーゼのそれら自身の源をコードするトランスポゾンは、自立性エレメントと称される。トランスでのトランスポザーゼを供給することが、トランスポザーゼをコードしないが、転移のために必要とされる末端配列、通常転化された反復（非自立性エレメント）を含むトランスポゾンを転移させうる。
【０１６８】
Ａ．Ｄｓエレメント
好ましい実施形態の内の１つで、Ｄｓエレメントは、それが、転移のために必要とされる末端配列（Ｃｏｕｐｌａｎｄ，Ｇ．ら（１９８９）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８６：９３８５−８；Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，Ｓ．ら（１９９５）Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ．２４９：２８１−８）、エンハンサー検出のためのＧＵＳレポーター遺伝子に融合された最小限プロモーター（−４７ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーター）；対峙配向で、遺伝子捕捉目的のためにエンハンサー蛍光、二重スペクトルＧＦＰ遺伝子（Ｈａｓｅｌｏｆｆ，Ｊ．ら（１９９７）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．９４：２１２２−７；Ｈａｓｅｌｏｆｆ，Ｊ．ら（１９９９）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．　１２２：２４１−５９；Ｈａｓｅｌｏｆｆ，Ｊ．（１９９９）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　５８：１３９−５１）に融合されたスプライスアクセプター部位を含むように意図される。このＤｓエレメントは、標的遺伝子転写に関して、一方の挿入配向でエンハンサー捕捉、または他の配向では遺伝子捕捉のためのスクリーニングするために使用されうる。Ｄｓを用いた第二の実施形態は、機能の利得の突然変異を発生するために、Ｄｓエレメントの一方の末端で転写アクチベーターを置換する。両方のエレメントは、部位特異的組換えのためのｌｏｘＰ部位を得る（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｂ．Ｉ．ら（１９９５）７：６８７−７０１；Ｍｅｄｂｅｒｒｙ，Ｓ．Ｌ．ら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２３：４８５−９０；Ｑｉｎ，Ｍ．ら（１９９４）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９１：１７０６−１０）および組織培養および土壌選択のための除草剤（フィナレ（登録商標）（Ｆｉｎａｌｅ））ｂａｒ遺伝子（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｊ．ら（１９８６）ＥＭＢＯ　Ｊ．６：２５１９−２３）を含む。フィナレ（登録商標）は、グルホシネート除草剤の登録商標である。
【０１６９】
Ｂ．植物でのトランスポゾンおよび挿入突然変異の利用性
トランスポゾンは、細菌、真菌、植物および動物ゲノムの遺伝的分析および機能的ゲノム分析で大いに利用性を示す。植物では、遺伝子操作トランスポゾンは、コメ（Ｉｚａｗａ，Ｔ．ら（１９９７）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　Ｖｏｌ．３５／１−２：２１９−２９）、タバコ、アラビドーシス、レタスおよび数種の他のものを含めた数種の種（検討のために、Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ，Ｖ．（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ．Ｖｏｌ．１：１８４−１９０）に首尾よく導入された。数名の調査者は、転移のための陽性選択のための方法（Ｆｅｄｏｒｏｆｆ，Ｎ．Ｖ．ら（１９９３）Ｐｌａｎｔ　Ｊ．Ｖｏｌ．３：２７３−２８９；Ｈｏｎｍａ，Ｍ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　Ｖｏｌ．９０／１３：６２４２−６）、未連結エレメントについての選択（Ｔｉｓｓｉｅｒら、（１９９９）Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｏｌ．１１：１８４１−１８５２；Ｗ．Ｒ．；Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎｒａ（１９９５）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．９／１４：１７９７−８１０）、ゲノムを通しての分散打上部位（Ｃｏｏｌｅｙ，Ｍ．Ｂ．ら（１９９６）Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ　Ｖｏｌ．２５２／１−２：１８４−９４、Ｋｎａｐｐ，Ｓ．ら（１９９４）Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ　Ｖｏｌ．２４３／６：６６６−７３；Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｂ．Ｉ．ら、（１９９１）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｖｏｌ．１２９／３：８３３−４４；Ｔａｋｋｅｎ，Ｆ．Ｌ．ら（１９９８）Ｐｌａｎｔ　Ｊ　Ｖｏｌ．１４／４：４０１−１１、Ｔｈｏｍａｓ，Ｃ．Ｍら（１９９４）Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ　Ｖｏｌ．２４２／５：５７３−８５；ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｂｉｅｚｅｎ，Ｅ．Ａ．ら、１９９６　Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ　Ｖｏｌ．２５１／３：２６７−８０）およびエンハンサーおよび遺伝子捕捉のようなエレメントへの追加特性（検討のために、Ｓｈａｒｋｎｅｓ，Ｗ．Ｃ．、（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：８２７−８３１；Ｗ．Ｒ．；Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎら、（１９９５）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ　９／１４：１７９７−８１０参照）および転写活性化（Ｆｒｉｔｚｅ，Ｋ．ら（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　Ｖｏｌ．４４：２８１−９４；Ｋａｋｉｍｏｔｏ，Ｔ．、（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｖｏｌ．２７４／５２８９：９８２−５；Ｋａｒｄａｉｌｓｋｙ，Ｉ．；ら、（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｖｏｌ．２８６／５４４６：１９６２−５）を含めて、転移事象を受ける効率を増強する巧妙な方法を提案した。
【０１７０】
トランスポゾンの利用性での膨大な進行を考慮した場合でさえ、それらは、機能的ゲノム分析のための制限をなお示す。転移は、しばしば、染色体内であり、しばしば、供与体および標的部位の間の短い物理的距離内にある（Ｍｏｒｅｎｏ，Ｍ．Ａ．ら、（１９９２）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｖｏｌ．　１３１：９３９−９５６；Ａｔｈｍａ，Ｐ．ら、（１９９２）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｖｏｌ．　１３１：１９９−２０９）。この制限は、ほとんどの新たな挿入が、ゲノムを通して任意に分散されたことが分かった多くの小さなエレメントで、供与体部位（打上部位）を囲む領域で起ることを意味する。第二に、転移の方法は、通常には制御されず、そして非常に多くの体細胞性挿入に至り、そしてそれは、子孫に、そして生殖的に伝達された事象で非調和に至りうる発生的に早期の転移伝達されない。体細胞で、そして一過的に転移を制御する能力のなさは、体細胞および生殖の突然変異事象の間の対応なしにより、目的の遺伝子での偽陽性挿入の高いバックグランドを生じうる。
【０１７１】
Ｃ．分散転移を回復する技術の現状の方法
２つの方法は、非分散転移の制限を部分的に克服することが現在利用できる。１つの方法は、ゲノムじゅうの第一の分散トランスポゾン打上部位を利用する。しかし、この方法は、広範に拡大したゲノム保護を達成する多量のトランスジェニック開始系統を必要とする。転移事象を分散する第二の方法は、トランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼを含む供与体部位に対抗して選択するためにｉａａＨ、ｐｅｈＡ、Ｒ４０４、またはシトシン・デアミナーゼ遺伝子のような陰性選択マーカー（類）を使用することである。供与体エレメントに対抗した選択は、傍の（連結された）転移に対抗しても選択して、そして未連結転移のための向上を生じる。陰性選択は、未連結ＤｓおよびＳｐｍ転移を回復するために、アラビドプシスで使用され（Ｗ．Ｒ．；Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎら、（１９９５）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．９／１４：１７９７−８１０；Ｔｉｓｓｉｅｒ，Ａ．Ｆ．ら、（１９９９）Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｏｌ．　１１：１８４１−１８５２）、そして２つの陰性選択マーカーは、予備除草剤変換（Ｏ’ｋｅｅｆｅ，Ｄ．Ｐ．ら、（１９９４）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｖｏｌ．　１０５：４７３−４８２；Ｄｏｔｓｏｎ，Ｓ．Ｂ．ら、（１９９６）Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｎａｌ　Ｖｏｌ．１０／２：３８３−３９２）、土壌選択に論理的になじみやすい方法に基づいた。
【０１７２】
それにもかかわらず、陰性選択マーカーの使用は、多量の独立転移の回復に重大な制限を強いる。第一に、数種のこれらのマーカーは、組織培養基本（Ｗ．Ｒ．；Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎら（１９９５）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．９／１４：１７９７−８１０）；転移（Ｆｅｄｏｒｏｆｆ，Ｎ．Ｖ．ら、（１９９３）Ｐｌａｎｔ　Ｊ．Ｖｏｌ．３：２７３−２８９）、多量の分散転移を回復する方法に大いに費用および時間を加える労働集約的手段の使用を必要とする。第二に、陰性選択は、化合物によって、連結エレメントまたはトランスポザーゼ、またはその両方を担持する子孫の排除に基づく（Ｔｉｓｓｉｅｒ，Ａ．Ｆ．ら、（１９９９）Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｏｌ．　１１：１８４１−１８５２；Ｗ．Ｒ．；Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎら（１９９５）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．９／１４：１７９７−８１０）。子孫排除は、種子数が限定される場合、問題になりうる。例えば、主に自家受粉種であるコメ（オルザ・サチバ（Ｏｒｚａ　ｓａｔｉｖａ））のような植物では、他家交雑は、退屈で、そして時間がかかり、そして十分に得られうる子孫の数を大いに制限する。したがって、転移速度は、低く、そして未連結転移が、少数の転移事象を表す場合、分散転移を回復する陰性選択を使用するのに費用がかかり、そして実行不可能である。例えば、異系交配により、１０，０００転移を回復するために、１−５％転移の速度、５０％減数分裂分離、およびただ３０％の未連結転移を説明するのは、概算の数百万の子孫植物を必要する。最終的に、予備除草剤のような陰性選択性の剤の使用は、重大な環境衝撃を示し得て、そして分散転移を担持する多数の子孫のために選択することが必要とされうる化合物の使用により費用がかかる。さらに、これらの化合物のほとんどは、野外用途のために認可されていない。
【０１７３】
ＶＩＩ．トランスポザーゼ
花で発現されたトランスポザーゼ
突然変異誘発、遺伝子タグ付け、および機能性ゲノム分析のために転移を使用することに関してさらなる制限は、転移方法の間じゅうの発生および一過性の対照の欠如である。ほとんどの場合に、それ自身のプロモーターの制御下で、または構築的プロモーターの制御下でのトランスポザーゼ遺伝子発現は、植物の植物性発生の間に起る。トランスポザーゼ源の植物性発現は、体細胞転移を導く。これらの転移は、これらの体細胞系統が、巨大胞子または小胞子を後に生じる場合のみに、子孫（生殖転移）に伝達される。これは、２つの理由によって問題である。第一に、植物性または早期生殖性発生の間に起る転移は、クローンで増殖され、そして多くの配偶子に後に伝達されて、子孫で回復された多数の非独立エレメントを生じうる。これは、多数の独立の転移が、機能性ゲノム分析または遺伝子タグ付けのために必要とされる場合には望ましくない。第二に、体細胞の転移は、しばしは、表皮系統で、または末端植物構造で生じるもののような、ゲノムを生じる系統を包含しない。これらの転移は、けして部分的に伝達されず、したがって、子孫で未回復している。これは、これらの体細胞事象が、突然変異として組織ＤＮＡサンプルで偽に同定され得て、子孫でなお、けして回復されない問題がある。これは、突然変異スクリーンは、ＰＣＲ基本の例の化合物である場合に特に問題がある（Ｔｉｓｓｉｅｒ，Ａ．Ｆ．ら、（１９９９）Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｏｌ．　１１：１８４１−１８５２；ＭｃＫｉｎｎｅｙ，Ｅ．Ｃ．ら、（１９９５）Ｐｌａｎｔ　Ｊ．Ｖｏｌ．８：６１３−６２２；Ｋｒｙｓａｎ，Ｐ．Ｊ．ら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　Ｖｏｌ．９３：８１４５−８１５０；Ｆｒｅｙ，Ｍら、（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｖｏｌ．２７７：６９６−６９９）。
【０１７４】
本発明の別の実施形態では、体細胞転移の問題を最小限にするために、トランスポザーゼ遺伝子は、小胞子および巨大胞子の生産に至る花の表皮下の系統での遺伝子発現を起動する花特異的プロモーターの制御下に置かれる。このようなプロモーターとしては、非配偶子性のアペテラ（無花冠）１、アペテラ２、アペテラ３、ピスチレート（雄ずいのみの雄花）、およびトウモロコシおよびコメのような他の植物種で見られるそれらの相同体のような遺伝子に見られるものが挙げられる。例えば、アペテラ３プロモーターは、発生中の花の分裂組織の花弁およびガク片の始原細胞でのレポーター遺伝子の発現を起動する。ａｐ３プロモーターの制御下のトランスポザーゼ発現は、花の発生に制限される転移を生じ、そして小胞子を引起す系統で生じる場合に、これらの事象は、次の世代に伝達される。この方法による転移の制御は、２つの効果を示す：１）それが、体細胞の転移を遮断する；および２）それは、花粉が多くの異なる花の分裂組織から誘導される場合に、多量の独立性転移を誘導する。したがって、体細胞組織は、体細胞または二次転移の懸念なしに、サンプル採取され得て、そして各花の分裂組織が、転移事象の独立源になる。
【０１７５】
ＶＩＩＩ．コメ−モデル植物システム
Ａ．米国および世界中でのコメ農業
世界の集団のおよそ半分は、主にコメからその熱量摂取を行う。年間の世界中の生産レベルは、２００百万ヘクタール以上に育成された４００百万メートル・トンを超える（匿名の（２０００）ＵＳＤＡ　Ｗｏｒｌｄ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｓｕｐｐｌｙ　ａｎｄ　Ｄｅｍａｎｄ　Ｅｓｔｉｍａｔｅｓ．ＵＳＤＡ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ　Ｓｅｒｖｉｃｅ．出版物ＷＡＳＤＥ−３６２）。
【０１７６】
現時点で、米国は、１．４百万ヘクタールに栽培された、年当たり７．５百万メートル・トンのコメを生産し、そして市販で１７億米ドルを生じる（匿名の（２０００）ＵＳＤＡ　Ｗｏｒｌｄ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｓｕｐｐｌｙ　ａｎｄ　Ｄｅｍａｎｄ　Ｅｓｔｉｍａｔｅｓ．ＵＳＤＡ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ　Ｓｅｒｖｉｃｅ．出版物ＷＡＳＤＥ−３６２）。この国で生産される３分の２以上のコメは、主にアシアおよびラテンアメリカで、市場に輸出され、そして米国を世界中で三番目に大きな輸出国にした。
【０１７７】
最近育成されたコメ変種のおよそ９９％が、公的交配プログラムの結果であり、そして多くは、国際コメ研究所（ＩＲＲＩ）および熱帯農業の国際センター（ＣＩＡＴ）のようなＣＧＩＡＲ国際研究センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｇｉａｒ．ｏｒｇ／ｉｒｒｉ／ｃｒｕｃｉａｌ．ｈｔｍ）によって支援される交配プログラムから始まる。米国のコメ変種の大半は、アーカンソー、ルイジアナ、ミシシッピー、テキサスおよびカリフォルニアのシュウで開発される。農業バイオテクノロジーは、現代変種のコメ系統を開発するのに徐々に重要になってきている；バイオテクノロジー開発は、この世界的市場で競合する米国コメ農家を大いに支援することが予想される。
【０１７８】
Ｂ．単子葉類開発のためのモデルシステムとしてのコメ
シリアルは、世界で最も重要な食品作物を含み、そして比較的最近の分類群と考えられ、そしてただ６５百万年前に共通の祖先から進化する（Ｍａｒｔｉｎ，Ｗ．ら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ　３３９；４６−４８；Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．ら、（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ．１１：８１−８２）。差異が、ゲノムサイズ、ハプロイド染色体数、および反復配列組成での変動で生じてさえ、この若い歴史は、遺伝子構造および順序における相当な程度の保存に反映される（Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．ら、（１９９３）Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１１：５８４−５８９）。例えば、トウモロコシゲノムは、コメのものより８倍長く（Ａｈｎ，Ｓ．ら、（１９９３）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　９０：７９８０−７９８４）、そして様々の数の染色体に組織化され、さらに、相対的分子分析は、集約的合成が、多量のそれらのゲノムの間で同定されうることを示した（Ａｈｎ，Ｓ．ら、（１９９３）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　９０：７９８０−７９８４；Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ，Ｊ．Ｌ．ら、（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ．９：２５９−２６１）。
【０１７９】
コメは、シリアルイネ科植物についての立派なモデル植物である。コメは、基本的な生物学的問題を調査し、そして収量、ハイブリッド生長力、および単一および多遺伝子の疾患耐性のような作物栽培形質について学ぶために使用されうる。コメの異なる種類が、熱帯氾濫から乾燥地温度までで、多様な環境条件に適合され、その結果、それは、実生活適合性反応のためのモデルである。
【０１８０】
コメは、相当に短い世代時間（９０−１２０日）を示し、そして年当たり３つまたはそれ以上の世代を得ることが可能になる。突然変異の多量収集は、コメで知見され、そして特徴付けられた。
【０１８１】
トランスジェニック・コメは、アグロバクテリウム指向性（Ｈｉｅｉ，Ｙ．ら、（１９９４）Ｐｌａｎｔ　Ｊ．６：２７１−８２；Ｈｉｅｉ，Ｙ．ら、（１９９７）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃ　Ｂｉｏ．３５：２０５−２１８；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら、（１９９７）Ｍｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：２２３−３１）またはバイオリスチック法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．ら、（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．９：９５７−９６２；Ｂｕｃｈｈｏｌｚ，Ｗ．Ｇ．ら、（１９９８）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．８１：３８３−９６）によって有効に生成される。最も重要には、コメは、アラビドプシス・ゲノムのものより約３倍大きい、ゲノムサイズおよそ５００メガベース（Ｍｂ）（Ａｒｕｍａｎａｇａｔｈａｎ，Ｋ．ら、（１９９１）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔ．９：２０８−２１８）を示し、そして２００４の周辺で配列決定されると計画された。グラミナエ（Ｇｒａｍｉｎａｅ）の構成員および重要な作物植物として、植物生物学の重要な態様についての基礎的情報の価値は、コメゲノム学から学ばれうる（ＭｃＣｏｕｃｈ，Ｓ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９５：１９８３−５；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｗ．Ａ．ら、（１９９９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１５３：４５３−７３）。
【０１８２】
Ｃ．コメゲノム学
コメは、最も濃厚に地図決めされた植物ゲノムの内の１つである（ＭｃＣｏｕｃｈ，Ｓ．Ｒ．ら、（１９９７）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．３５：８９−９９；Ｐａｎａｕｄ，Ｏ．ら、（１９９６）Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ．２５２：５９７−６０７）。２つの最も開発された組換えの地図は、３，０００以上のＲＦＬＰおよびＳＳＲマーカーが、地図決定された、Ｃｏｒｎｅｌｌ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ／ｒｉｃｅ／）および日本でのコメゲノムプロジェクト（ＲＧＰ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ）で開発されたものである。コメのＹＡＣ−基本の物理的地図は、６４％以上のゲノムを網羅し、そして４，０００の地図決定されたＥＳＴを含む（Ａｓｈｉｋａｗａ，Ｉ．ら、（１９９９）Ｇｅｎｏｍｅ．４２：３３０−７）。７１，０００クローンのＰＡＣライブラリーが、ＳＴＳおよびＥＳＴで地図決定され、そして地図決定されたクローンは、およそ３０％のゲノムを網羅する。３７，０００および５５，０００構成員を有する２つのＢＡＣライブラリーは、ＢＡＣ末端で配列決定し、そしてフィンガープリンドし、そしてＢＡＣ基本の物理的地図が、構築された（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｃｌｅｍｓｏｎ．ｅｄｕ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｒｉｃｅ／）。
【０１８３】
コメゲノムは、５００Ｍｂ（Ａｒｕｍａｎａｇａｔｈａｎ，Ｋ．ら（１９９１）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔ．９：２０８−２１８）および３４０，０００遺伝子を含むと算定される。国際コメゲノム配列決定プロジェクトは、オリザ・サチバ・エスエスピー．ジャポニカ・シービー．ニッポンバレ（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　ｓｓｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ　ｃｖ．Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）の完全ゲノム配列を得るために、１９９８年に形成された。１０カ国が、この努力に協力している。最近、約１０Ｍｂが、ゲンバンクに提出された。
【０１８４】
Ｄ．トランスポゾン基本のゲノム学プログラムの利用性
トランスポゾンの使用についての主要な判断は、機能性ゲノム研究についての突然変異原の他の型を越えるそれらの固有の利点である。コメでは、Ｔ−ＤＮＡおよびレトロトランスポゾン突然変異誘発は、重大な制限を示す。最近、両方の方法は、連続組織培養選択および挿入を回復する体細胞再生、不十分で、時間がかかり、そして体細胞クローナル変種の導入する傾向がある方法を要求する（Ｂａｏ，Ｐ．Ｈ．ら、（１９９６）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓ．５：９７−１０３；Ｅｖａｎｓ，Ｄ．Ａ．（１９８９）Ｔｒｅｎｄ　Ｇｅｎｅｔ．５：４６−５０）。両方の薬剤は、安定な挿入のみを発生し、そしてそれは、続いて、任意の突然変異体対立遺伝子の利用性を制限する。さらに複雑な問題に対して、Ｔ−ＤＮＡ挿入は、しばしば大きく、複雑な直列であり、そして突然変異体対立遺伝子の分子分析に困難さを引起す（ＭｃＫｉｎｎｅｙ，Ｅ．Ｃ．ら、（１９９５）Ｐｌａｎｔ　Ｊ．８：６１３−６２２；Ｋｒｙｓａｎ，Ｐ．Ｊ．ら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　Ｖｏｌ．９３：８１４５−８１５０；Ｋｒｙｓａｎ，Ｐ．Ｊ．ら（１９９９）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ．１１：２２８３−２２９０；Ｇａｌｂｉａｔｉら、（２０００）Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　＆　Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，出版中）。
【０１８５】
多くの例で、Ｔ−ＤＮＡ−またはレトロトランスポゾン−誘導対立遺伝子のような単独の機能の喪失突然変異は、遺伝子機能を起動するのに十分な情報を提供しない。例えば、データに対する制限された研究に基づいて、多くの遺伝子妨害は、十分に識別できる表現型を生成しない（ＭｃＫｉｎｎｅｙ，Ｅ．Ｃ．ら、（１９９５）Ｐｌａｎｔ　Ｊ．８：６１３−６２２；Ｋｒｙｓａｎ，Ｐ．Ｊ．ら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　Ｖｏｌ．９３：８１４５−８１５０）。しかし、これらの遺伝子の多くは、突然変異体系統の形態学または発生のスクリーニングに基づいて、部分的に冗長、重複または検出されない特異的機能を示すので、これは、遺伝子重要性の欠如を暗示しない。発現分析および別の対立遺伝子のようなさらに詳細な情報は、必須である。
【０１８６】
他方、Ａｃ／Ｄｓシステムのような２エレメントトランスポゾン突然変異誘発は、簡単な挿入による安定な遺伝子妨害を生じうる。遺伝子操作されたＤｓエレメントは、コメ（Ｉｚａｗａ，Ｔ．ら（１９９７）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．３５：２１９−２９）を含めた数種の植物種に首尾よく導入された（検討のために、Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ，Ｒ．Ａ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　Ｖｏｌ．９５：２０２１−６；Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ，Ｖ．（１９９６）Ｔｒｅｎｄ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ．１：１８４−１９０参照）。
【０１８７】
機能性ゲノムについてのトランスポゾンの利用性は、エンハンサーおよび遺伝子捕捉（検討のために、Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ，Ｒ．Ａ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　Ｖｏｌ．９５：２０２１−６；Ｓｈａｒｋｎｅｓ，Ｗ．Ｃ．（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：８２７−８３１；Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ，Ｖ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ら、（１９９５）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．９：１７９７−８１０参照）および転写活性化（Ｆｒｉｔｚｅ，Ｋ．ら、（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　４４：２８１−９４；Ｋａｋｉｍｏｔｏ，Ｔ．、（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７４：９８２−５；Ｋａｒｄａｉｌｓｋｙ，Ｉ．ら、（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８６：１９６２−５）のような合成トランスポゾンへの結合特性により大いに増強された。このような特性を組込むことによって、遺伝的に冗長である遺伝子でさえ、機能的に分析されうる。最も重要には、トランスポゾンを再起動させる能力は、誘導対立遺伝子を有効に発生させ、そしてこれらのエレメントの局在化転移特性によって遺伝子の傍に有効に突然変異させる特徴的な機会を作り出す（Ｌｏｎｇ，Ｄ．ら（１９９７）Ｐｌａｎｔ　Ｊ．１１：１４５−８；Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．Ｄ．Ｇ．ら、（１９９０）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ．２：７０１−７０７；Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｂ．Ｉ．ら（１９９１）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１２９：８３３−４４）。ただ数個の十分に特徴付けられたトランスジェニック系統および適切な遺伝的攻略法で開始して、分散転移の集約的な収集は、連続組織培養選択または再生についての必要性なしに、有効に発生されうる。
【０１８８】
Ｅ．コメゲノムを通して任意に分散するＤｓ
本発明としては、それに限定されないが、コメゲノムを含めた特異的ゲノムに使用されうる方法が挙げられる。コメは、シリアルイネ科植物についての目立ったモデル植物である。コメゲノムに対しする本発明の方法を使用して、１つの目標は、コメゲノムを通して分布される安定なＤｓ挿入の集約的収集を生じることである。この仕事を達成するために、数種の遺伝的攻略法は、非独立転移を最小限にする主要な目標で、コメゲノムを通して分散Ｄｓ転移、および子孫での安定化された転移因子が予測される。本発明の方法で使用するために予測される特異的株は、オリザ・サチバ・エスエスピー．ジャポニカ・シーブイ．ニッポンバレであり、その株は、ＩＲＧＳＰによって配列決定される。
【０１８９】
本発明の１つの実施形態では、コメゲノムを通して任意に分散するＤｓが、予測される。Ｄｓは、しばしば、短い遺伝的距離を越えて局所的に転移する傾向があるので、遺伝的攻略法は、この偏見に対抗するために使用されなければならない。過去に、これは、子孫でのＤｓ打上部位に対して選択することに基本的に関与する種々の方法を用いて（Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ，Ｖ．ら、（１９９５）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　９：１７９７−８１０；Ｔｉｓｓｉｅｒ，Ａ．Ｆ．ら、（１９９９）Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１１巻：１８４１−１８５２）、またはゲノムを通して多くの打上部位を最初に分散させること（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｂ．Ｉ．ら（１９９１）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１２９：８３３−４４；Ｃｏｏｌｅｙ，Ｍ．Ｂ．ら（１９９６）Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ　２５２：１８４−９４；Ｋｎａｐｐ，Ｓ．ら（１９９４）Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ　２４３：６６６−７３；Ｔａｋｋｅｎ，Ｆ．Ｌ．ら（１９９８）Ｐｌａｎｔ　Ｊ　１４：４０１−１１；Ｔｈｏｍａｓ，Ｃ．Ｍら（１９９４）Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ．２４２：５７３−８５；ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｂｉｅｚｅｎ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９６）Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ．２５１：２６７−８０）によって、達成された。
【０１９０】
Ｄｓ転移を分散する２つの攻略法が、予測される。第一の方法は、任意の連結された転移因子と一緒に、打上部位の転移を排除するためにＤｓ打上部位に花粉特異的自殺形質遺伝子を含ませることに広範に向けられる。自殺形質は、適切な細胞死遺伝子の発現を起動する花粉特異的プロモーターを組込むことによって操作される。打上部位構築物は、単一コピーであり、そして保存植物でヘミ接合であり、減数分裂の産物の５０％は、Ｔ−ＤＮＡを引継ぎ、そして遺伝的自殺を受ける；残りの産物は、生育可能な花粉を生成する。打上部位で染色体内で、または染色体外のいずれかで組換えられたそれらの転移Ｄｓは、花粉伝達された。これらのエレメントは、除草剤マーカー（ｂａｒ遺伝子）を、Ｄｓエレメントに組込むことによって、子孫で容易に検出される。除草剤マーカーは、当初の組織培養選択マーカーとして、そして後に、未連結Ｄｓエレメントを収容する子孫における土壌基本の選択として、二重目的の役割を果す。
【０１９１】
花粉自殺法は、未連結転移について選択するための先の攻略法より固有の利点を示す。それの主要な利点は、花粉が、大過剰で生産され、そして花粉半不稔性は、環境的に健全であり、そしてもしあれば、種子生産にほとんど衝撃を示さないことである。子孫では、検定交雑子孫の５０％（または自家受粉の場合に７５％）は、それらが、打上部位（および／または下に説明されるとおりトランスポザーゼ遺伝子）を受継ぐので、簡単に、陰性選択によって選びとられる。コメでは、異系交配が、転移を回復することが要求される場合、種子生産は、限定因子でありうる。さらに、陰性選択のために使用される予備除草剤のような化合物（Ｔｉｓｓｉｅｒ，Ａ．Ｆ．ら、（１９９９）Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１１巻：１８４１−１８５２；Ｄｏｔｓｏｎ，Ｓ．Ｂ．ら、（１９９６）Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｎａｌ　Ｖｏｌ．１０／２：３８３−３９２）は、市販で利用できるか、または野外用途のために連邦で認可されないかいずれかである。組織培養基本の陰性選択（Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ，Ｖ．ら、（１９９５）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　９／１４：１７９７−８１０；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．ら、（１９９５）Ｊｐｎ　Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．７０：４０９−２２）は、コメで実現不可能である。
【０１９２】
本発明の１つの実施形態では、花粉特異的自殺形質は、自殺遺伝子の発現を起動する適切なプロモーターを使用して操作される。数種の自殺遺伝子が、利用でき、そしてバーナーゼ遺伝子（Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｍ．Ｈら（１９９４）ＥＭＢＯ　Ｊ　１３：２９７６−８４）、関連ＲＮエース（Ｆｅｄｏｒｏｖａ，Ｎ．Ｄ．ら（１９９４）Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ（Ｍｏｓｋ）．２８：４６８−７１）、ジフテリア毒素Ａ鎖遺伝子（Ｔｓｕｇｅｋｉ，Ｒ．ら、（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９６：１２９４１−６；Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｏ．ら、（１９９８）Ｐｌａｎｔ　Ｊ．１５：７９９−８０４；Ｕｋ　Ｋｉｍら、（１９９８）Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌｓ．８：３１０−７；Ｄａｙ，Ｃ．Ｄ．ら、（１９９５）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１２１：２８８７−９５）およびその他（Ｄｅｌｏｎｇ，Ａ．ら（１９９３）Ｃｅｌｌ．７４：７５７−７６８）が挙げられる。バーナーゼの使用は、花粉特異的プロモーターに融合されるときに、小胞子自律性細胞死を発しえするために有効な方法であることが示された（Ｃｕｓｔｅｒｓ，Ｊ．Ｂ．ら、（１９９７）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．３５：６８９−９９）。先の方法と対照的に、本発明の方法は、完全な雄性不稔性に対峙した場合、半不稔性を生じることに依存し、そしてそれは、小胞子で特異的バーナーゼ発現を操作することによって本発明の１つの態様で達成されうる。数種のプロモーターが、この目的のために利用でき、そしてコメ（Ｚｏｕ，Ｊ．Ｔ．ら、（１９９４）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｂｏｔａｎｙ．８１：５５２−５６１）およびトウモロコシの両方の花粉特異的プロモーター（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｄ．Ａ．ら、（１９９２）、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．１８：２１１−８）、および数種の双子葉植物種から得られる花粉特異的プロモーター（Ｔｗｅｌｌ，Ｄ．ら（１９９１）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．５／３：４９６−５０７；Ｋｕｌｉｋａｕｓｋａｓ，Ｒ．ら、（１９９７）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．３４：８０９−１４；Ｃｕｓｔｅｒｓ，Ｊ．Ｂ．ら、（１９９７）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．３５：６８９−９９；Ａｌｂａｎｉ，Ｄら、（１９９１）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．　１６：５０１−１３；Ｋｉｍ，Ｙ．ら、（１９９２）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓ．１：１８８−９４；Ｔｗｅｌｌ，Ｄ．ら（１９９０）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｖｏｌ．　１０９：７０５−１３；ｖａｎ　Ｔｕｎｅｎら、（１９９０）、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｏｌ　２／５：３９３−４０１）が挙げられる。好ましい実施形態では、トウモロコシプロモーターのような異種花粉特異的プロモーター（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｄ．Ａ．ら、（１９９２）、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．１８：２１１−８）は、遺伝子スプライシングの可能性を極大にすることが予測される。
【０１９３】
Ｔ−ＤＮＡ（打上部位）を排除する上での花粉自殺機構の効率の評価は、例えば、自殺遺伝子、およびアグロバクテリウム指向性Ｔ−ＤＮＡ形質転換を介してコメのような生物に形質転換されたｂａｒ遺伝子を含む構築物を使用することによって達成されうる（Ｈｉｅｉ，Ｙ．ら、（１９９４）Ｐｌａｎｔ　Ｊ．６：２７１−８２；Ｈｉｅｉ，Ｙ．ら、（１９９７）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃ　Ｂｉｏ．３５：２０５−２１８；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら、（１９９７）Ｍｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：２２３−３１）。その後、数種の単独コピーＴ−ＤＮＡ系統（ＳＣＴＬ）は、サザン分析によって同定される（Ａｕｓｅｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、（１９８７）Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ，編集Ｃｈａｎｄａ，Ｖ．Ｂ．Ｂｏｓｔｏｎ：Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）。Ｔ−ＤＮＡ排除の効力について試験するために、その後、ＰＣＲ実験は、Ｔ−ＤＮＡの伝達を検出するために未選択の異系交配子孫で行われる。この分析は、未選択子孫から得られるＤＮＡプールで行われる（例えば、最小の３８４ＤＮＡプール、各プールは、１２の植物を含む）。この評価手段を用いて、トランスポザーゼ原（下に説明される）、花粉自殺遺伝子、およびＤｓ−ｂａｒエレメントを含むもののような他の構築物が、試験されうることが予測される。
【０１９４】
Ｆ．トランスポザーゼ発現
本発明の別の実施形態は、非独立のものの回復を最小限にしながら、独立の転移について強化させるように指示される。これを達成する１つの方法は、非独立性事象の早期クローナル増殖および減数分裂の転移を回避するために発生中に転移を遅延させることによるものである。転移の発生時期を越える制御は、Ａｃトランスポザーゼ遺伝子を起動する異種プロモーターを用いることによって達成される（Ｒｏｍｍｅｎｓ，Ｃ．Ｍ．ら、（１９９２）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３１：４３３−４１；Ｂａｌｃｅｌｌｓ，Ｌ．ら、（１９９４）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．２４：７８９−９８；Ｓｃｏｆｉｅｌｄ，Ｓ．Ｒ．ら、（１９９２）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ．４：５７３−８２；Ｓｗｉｎｂｕｒｎｅ，Ｊ．ら、（１９９２）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ．４：５８３−９５；Ｇｒｅｖｅｌｄｉｎｇ，Ｃ．ら、（１９９２）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．８９：６０８５−９）。数種の異種プロモーターは、本実施形態で予想される。
【０１９５】
好ましい実施形態では、独立の転移を強化させる攻略法は、無性転移を回避するために、好ましくはメシベ発現を除外しながら（下に説明された理由のため）、花の発生に独占的に、トランスポザーゼ発現を制限することである。花特異的プロモーターは、原始のオシベの形成の間に、トランスポザーゼ発現を起動するために使用され得て、そしてコメ（Ｍｏｏｎ，Ｙ．Ｈ．ら、（１９９９）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．４０：１６７−７７；Ｋａｎｇ，Ｈ．Ｇ．ら、（１９９８）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．３８：１０２１−９；Ｇｒｅｃｏ，Ｒ．ら、（１９９７）Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ．２５３：６１５−２３）またはトウモロコシＭＡＤＳ−ボックス遺伝子プロモーター（Ｍｅｎａ，Ｍ．ら、（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７４：１５３７−４０；Ｍｅｎａ，Ｍ．ら、（１９９５）Ｐｌａｎｔ　Ｊ．８：８４５−５４）のようなメシベ発現を妨げる数種が利用できる。転移の頻度を増強するために、全長ｃＤＮＡおよびＡｃトランスポザーゼの切断バージョンの両方が、コメで使用されうる。切断バージョン（ＯＲＦ１０３−８０７）は、異種植物種での転移の頻度を増強することが示された（Ｈｏｕｂａ−Ｈｅｒｉｎら、（１９９０）Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ．２２４：１７−２３；Ｌｉ，Ｍ．Ｇ．ら、（１９９０）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．８７：６０４４−８）。
【０１９６】
花の発生に対するトランスポザーゼ発現を制限することは、各小花が、転移の独立の源を表すことを意味する。統計的に、非独立の転移の回復は、低く、各葯からの花粉が、独立の転移の源と考えられる場合、それにより同じ葯から得られる花粉から誘導された子孫種子の頻度は、ありそうもなく、種子（小突起当たり１つ）より少なくとも６倍多い葯（小突起当たり６つ）が、生成される。本発明の実施形態は、３５Ｓ起動転移（全長および切断されたもの）およびｂａｒ遺伝子の５’ＵＴＲに挿入された簡単なＤｓエレメントと一緒に、コメに形質転換された花で発現されたトランスポザーゼ構築物の使用が挙げられる。その後、単独コピー挿入物系統が、サザン文政によって同定され、そしてこれらの植物は、野生型雄性不稔のＩＲ３６雌に異系交配される。その後、子孫芽生えは、Ｄｓが排除される子孫を選択するフィナレ（登録商標）（Ｆｉｎａｌｅ）（下を参照）の２つの花の使用にかけられる。Ａｃ／Ｄｓ転移の機構（Ｃｈｅｎ，Ｊ．ら、（１９８７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１１７：１０９−１１６；Ｃｈｅｎ，Ｊ．ら、（１９９２）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１３０：６６５−６７６；Ｇｒｅｅｎｂｌａｔｔ，Ｉ．Ｍ．ら、（１９６２）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．４７：４８９−５０１）に基づいて、これらの子孫の４０％以上が、連結または未連結の転移されたＤｓエレメントを含む。各保存物から得られる登録商標フィナレ耐性子孫が、独立の転移の回復の効率を決定するサザン分析によって分析される。
【０１９７】
いったん転移されると、Ｄｓエレメントは、安定化されることが必要で、なおさらに、再起動される能力を示す。転移Ｄｓエレメントを安定化するために、適切なトランスポザーゼ遺伝子は、Ｄｓ打上部位を含む最終Ｔ−ＤＮＡ構築物内に含まれる。花粉自殺過程またはｂａｒアンチセンス攻略法は、Ｔ−ＤＮＡと一緒にトランスポザーゼ源を排除し、それにより、子孫での任意の転移Ｄｓエレメントを安定化させる。連続世代中にトランスポザーゼを再導入することは、Ｄｓエレメントを容易に不安定化させる可能性があり、そして近隣の遺伝子の突然変異誘発（Ｌｏｎｇ，Ｄ．ら（１９９７）Ｐｌａｎｔ　Ｊ．１１：１４５−８；Ｉｔｏ，Ｔ．ら、（１９９９）Ｐｌａｎｔ　Ｊ．１７：４３３−４４）または任意の単独遺伝子の再構築性（飽和）突然変異誘発（Ｍｏｒｅｎｏ，Ｍ．Ａ．ら、（１９９２）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１３１：９３９−９５６；Ａｔｈｍａ，Ｐ．ら、（１９９２）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１３１；Ｄａｓ，Ｌ．ら、（１９９５）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ．７：２８７−９４）が局在化される。
【０１９８】
（実施例）
実施例１．遺伝的構築物
ｐＹＵ９０４−合成Ｄｓエレメント
転移に必要とされるＡｃの５’末端と３’末端を合わせることによって合成Ｄｓエレメントを構築した。その断片の３’末端にＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位を、そして５’末端にＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ部位の両方を加える一方で、座標４３１２から座標４５６５ｂｐより得られるアクチベーターエレメント（Ａｃ）（ゲンバンク受託Ｘ０１３８０）（配列番号３）の５’末端を増幅するために、プライマーＰ６４３（ａａｇｃｔｔｔｇｇｃｃａｔａｔｔｇｃａｇｔｃａｔｃｃ）（配列番号１）およびＰ６４４（ａａｇｃｔｔｇｃｔｃｇａｇｃａｇｇｇａｔｇａａａｇｔａｇｇａｔｇｇｇａ）（配列番号２）を使用する。座標１から座標２２１ｂｐより得られるＡｃエレメントの３’末端を増幅するために、プライマーＰ６４５（ｇａａｔｔｃｃｃｔｃｇａｇｔａｇｇｇａｔｇａａａｃｇｇｔｃｇｇｔａａｃ）（配列番号４）およびＰ６４６（ｇａａｔｔｃｇａａｔａｔａｔｇｔｔｔｃａｔｇｔｇｔｇａｔ）（配列番号５）を使用し、そして、増幅される断片の５’末端に追加のＥｃｏＲＩ制限部位を加え、その断片の３’末端に追加のＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限部位を加える。ベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、これらの断片を個々にクローニングした。
【０１９９】
プラスミドｐＹＵ８９０は、Ａｃエレメントの５’末端断片を含み、そしてプラスミドｐＹＵ８９２は、Ａｃエレメントの３’末端断片を含んだ。
【０２００】
プラスミドｐＹＵ８９２を、ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化させ、そして２３０塩基対（ｂｐ）ＥｃｏＲＩ挿入物を、ｐＵＣ１９（ゲンバンク受託Ｍ７７７８９）のＥｃｏＲＩ部位にクローニングして、ｐＹＵ８９９を生じた。
【０２０１】
ｐＹＵ８９０を、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化させ、そして２５０塩基対（ｂｐ）挿入物を、プラスミドｐＹＵ８９９のＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングして、プラスミドｐＹＵ９０２を生じた。このプラスミドは、転移に必要とされるＡｃの５’および３’末端と、引き続くクローニング目的のための内部ポリリンカー部位を含む。
【０２０２】
まず、ＳａｃＩおよびＳａｌ　Ｉで消化させ、クレノーで充填し、リゲーションさせることによって、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ　ＩＩ　Ｋ／Ｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の欠失誘導体（ｐＹＵ９０３）を構築した。その後、プラスミドを、Ａｓｐ７１８およびＡｓｐＩで消化させ、クレノーで充填し、そしてリゲーションさせた。誘導プラスミドは、ＫｐｎＩ−ＳａｃＩポリリンカーの制限部位を欠失するが、しかし無傷のＸｈｏＩクローニング部位を有することを表す。
【０２０３】
ｐＹＵ９０２を、ＸｈｏＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化させ、そして内部の５７１ｂｐ断片を、ｐＹＵ９０３のＸｈｏＩ部位にクローニングさせて、ｐＹＵ９０４を生じた（図４Ａ）。このプラスミドは、Ａｃの５’および３’末端と、現時点でそのプラスミドに特有であるＤｓエレメント内に多重クローニング部位を含む。このＤｓエレメントは、「Ｄｓ−ポリリンカー」と称される。
【０２０４】
ｐＹＵ９０５−選択マーカー遺伝子を含むＤｓエレメント
ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈｙｄｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）（ゲンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）受託Ｘ１７２２０）（配列番号６）から得られるｂａｒ遺伝子を含む１．１ｋｂＳｍａＩ断片を、０．６ｋｂ　ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター断片（ＢｅｎｆｅｙおよびＣｈｕａ，１９９０）および３’ポリアデニル化信号エレメント（同等５１４−８１３）（ゲンバンク受託Ｖ０００９０）（配列番号７）に融合させて、プラスミドｐＹＵ１１７を作成した。
【０２０５】
プラスミドｐＹＵ１１７を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｎａＢＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化させ、そしてＣａＭＶ３５Ｓプロモーター−ｂａｒ遺伝子−終結区断片を含む１．８ｋｂ　断片を、クレノー断片ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で充填した。修飾断片を、ｐＹＵ９０４のＳｎ部位にクローニングさせて、ｐＹＵ９０５を生じた（図４Ｂ）。
【０２０６】
ｐＹＵ９０５は、Ｄｓ−ポリリンカー転移因子の内側にＣａＭＶ３５Ｓ起動ｂａｒ遺伝子を含む。この合成Ｄｓエレメントは、「Ｄｓ−ｂａｒ」と称される。
【０２０７】
ｐＹＵ８４６−トランスポザーゼ源
切断読取枠（ＯＲＦａ１０３−８０７）（Ｌｅｅ　ａｎｄ　Ｓｔａｒｌｉｎｇｅｒ，　ＰＮＡＳ　８７：６０４４−６０４８）を有するトランスポザーゼｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＵ１０８Ａを、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化させた。内部の２．１ｋｂ断片を精製し、そして同じ酵素で先に消化させたｐＲＴＬ２（Ｒｅｓｔｒｅｐｏ−ＨａｒｔｗｉｇおよびＣａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６６：５６６２）にサブクローニングさせた。生じたプラスミドｐＹＵ８４６（図５）は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、切断ＡｃトランスポザーゼｃＤＮＡ（アミノ酸１０３−８０７）および３５Ｓポリアデニル化配列の間の転写融合を含んだ。
【０２０８】
ＧＳＴ構築物
バシルス・アミロリキファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のバーナーゼ遺伝子に基づいたＧＳＴ構築物の２つの例は、表１（配列番号１５）および表２（配列番号１６）に示される。これらの構築物は、絨毯特異的タバコプロモーターＴＡ２９（ゲンバンク受託Ａ１８０５２）（配列番号８）を、アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）（Ａｔ５９）から得られる双子葉植物の花粉特異的プロモーター、またはオリザ・サチバ（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ）（コメ）から得られる単子葉植物の花粉特異的プロモーター（ゲンバンク受託Ｚ１６４０２）（配列番号９）に置換することによって誘導される。
【０２０９】
Ａｔ５９プロモーターおよび５’ＵＴＲは、プライマーＰ７５５（ａｃｃｃａｔｇｔｇａｇｔｔｔｃｔｔｔｃｔｔｃｔｃｃａｔ）（配列番号１０）およびＰ７５６（ｔｔａｔａｇｇａａａａｔｔｃｃａｇｃａｇｃｔｃａｇｃａｔ）（配列番号１１）を用いて、エイ．サリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）Ｃｏｌ−ＯゲノムＤＮＡから増幅される。これらのプライマーは、翻訳の開始時に位置決めされる５’ＰｓｔＩクローニング部位および３’ＮｃｏＩ部位を導入しつつ、プロモーターおよび５’ＵＴＲ配列を同時に増幅する。このＮｃｏＩｓを、３’末端にノパリンシンターゼ・ポリアデニル化信号エレメントを含むバーナーゼ遺伝子の０．７４ｋｂ　ＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ部位に融合させて、Ａｔ５９ＰＳＰ：ナーナーゼ：ｎｏｓトランス遺伝子を作成する（表１）（図３Ａ）。
【０２１０】
同様に、コメ花粉特異的プロモーター（ゲンバンク受託Ｚ１６４０２）（配列番号９）は、５’ＥｃｏＲＩ部位を導入し、そして翻訳の開始時に３’ＮｃｏＩ部位を含みつつ、プロモーターおよび５’ＵＴＲ断片を増幅させるプライマーＰ７３１（ｇａａｔｔｃｃｇｇｃｃａｔｇｇｃａｔｃｃｔｔｔａｇ）（配列番号１２）およびＰ７３２（ｃｃａｔｇｇａｔｇａｔｇｔｇｇｃｔｇｃａａａｔｇ）（配列番号１３）を用いてオルザ・サチバ・エスエスピー．インディカ（Ｏｒｚａ　ｓａｔｉｖａ　ｓｓｐ．ｉｎｄｉｃａ）ＩＲ３６ゲノムＤＮＡから増幅される。この０．７４ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−ＮｃｏＩ断片を、３’断片にノパリンシンターゼ・ポリデニル化信号エレメントを含むバーナーゼ遺伝子のＮｃｏＩ部位に連結させて、ＯｓＰＳＰ：バーナーゼ：Ｎｏｓトランス遺伝子を作成する（表２）（図３Ｂ）。
【０２１１】
Ｔ−ＤＮＡ構築物
Ｔ−ＤＮＡベクターｐＰＺＰ２００（ゲンバンク受託Ｕ１０４６０）（配列番号１４）を、ｐＹＵ８４６から得られる３．２ｋｂ　ＰｓｔＩ断片に連結されたＰｓｔＩで消化させて、ｐＹＵ１００１を生じる。ｐＹＵ１００１を、Ａｓｐ７１８で消化させ、クレノーで充填し、そしてＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理した１．２ｋｂ　ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩＡｔ５９：バーナーゼ：ｎｏｓ遺伝子断片（ｐＹＵ１００２）に、または１．３ｋｂクレノーで処理したＥｃｏＲＩ　ＯｓＰＳＰ：バーナーゼ：ｎｏｓ遺伝子断片（ｐＹＵ１００３）に連結させる。
【０２１２】
ｐＹＵ１００２またはｐＹＵ１００３を、ＳａｌＩで消化させ、そしてｐＹＵ９０５から誘導される２．３ｋｂ　ＸｈｏＩＤｓ−ｂａｒエレメントに連結させて、ＧＳＴ，トランスポザーゼ源およびＤｓ−ｂａｒエレメントを含むプラスミドｐＹＵ１００４を得る。
【０２１３】
【表１】
2004512007.tif 000003
【０２１４】
【表２】
2004512007.tif 000004
【０２１５】
実施例２．トランス遺伝子伝達の回避または排除
ヘミ接合性の場合、トランス遺伝子遺伝子座の伝達を排除することは、雄性または雌特異的プロモーターの制御下で、目的の遺伝子を、自殺遺伝子に連結されることによって達成される。「植物配偶子の自殺形質」（ＧＳＴ）と称されるこの構築物は、ＧＳＴを受取る小胞子または巨大胞子に制限される細胞死を誘導して、それによりＧＳＴに連結される目的の遺伝子の伝達を有効に削減または排除させる。
【０２１６】
トランスジェニック花粉から排除することを望む特別の形質を担持する遺伝子（すなわち、目的のトランス遺伝子）は、それが、ＧＳＴに物理的に近傍である限りどのような場所にも入れうる。ＧＳＴトランス遺伝子複合体が、ヘミ接合性であるので、ＧＳＴトランス遺伝子複合体に完全な連結があり、そしてＧＳＴおよび他の遺伝子および／またはトランス遺伝子が組換わる懸念はない。
【０２１７】
本発明の方法は、培養および再生を必要としないインプランタまたは種子形質転換技術と共に使用されうる。この技術の例は、Ｂｅｃｈｔｏｌｄ、Ｎ．ら、（１９９３）ＣＲ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ／Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　３１６：１　１１８−９３；Ｃｈａｎｇ，Ｓ．Ｓ．ら、（１９９０）Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｆｏｕｒｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｉｅｎｎａ，２８頁；Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｋ．Ａ．およびＭａｒｋｓ，Ｄ．Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０８：１−９；Ｌｅｄｏｕｘ，Ｌ．ら、（１９８５）Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｉｎｆ　Ｓｅｒｖ．２２：１−１１；Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｋ．Ａ．（１９９２）Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（編集者Ｋｏｎｃｚ，Ｃ．，Ｃｈｕａ，Ｎ−Ｈ，Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．）２７４−２８９頁；Ｃｈｅｅ，ら、米国特許出願番号第５，３７６，５４３号に記述されている。
【０２１８】
アラビドプシス
ｂａｒトランス遺伝子に連結されるＧＳＴ構築物を含むプラスミド（すなわち、Ａｔ５９ＰＳＰ：バーナーゼ：ｎｏｓまたはＯｓＰＳＰ：バーナーゼ：Ｎｏｓ）を、電気穿刺法によって、アグロバクテリウムに、そしてその後真空浸透法（Ｂｅｃｈｔｏｌｄら、２９９３、上記）を用いてアラビドプシスに形質転換させる。先に検討されるとおり、ｂａｒ遺伝子構築物は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターによって誘導されたホスフィノトリシン・アセチル・トランスフェラーゼ（ＰＡＴ）をコードして、ホスフィノトリシン（ＰＰＴ）に対する耐性を供する。
【０２１９】
形質転換体は、ＰＰＴに対する耐性に基づいて選択され、そしてＴ２種子は、多数の独立の系統から発生される。この種子を、種々の濃度の除草剤を含むＧＭ培地に平板培養させ、そして生殖および生存についてスコアーを取る。野生型または耐性突然変異体のいずれかを過剰発現する多重トランスジェニック系統は、空のベクター対照に致死的である除草剤濃度で相当数の幼植物を生じる。
【０２２０】
トランス遺伝子複合体および当初のトランスジェニック系統に含まれるべきトランス遺伝子または目的の遺伝子は、単独コピーの直列でない複写挿入を示す系統を同定するために、トランス遺伝子遺伝子座の数、およびトランス遺伝子挿入の複雑さとして特徴づけられるのみを必要とする。当初のトランスジェニックの特徴付けは、ＰＣＲおよび／またはサザン分析によって達成され、両方の方法は、ＤＮＡ増幅およびゲル電気泳動の技術の当業者に十分に知られている。
【０２２１】
目的のＧＳＴ／トランス遺伝子のための形質転換植物ヘミ接合、この実施例では、ｂａｒ遺伝子は、適切な統計的手段（例えば、ランダム化された完全ブッロク設計または格子設計）を用いて、目的のトランス遺伝子単独（すなわち、ＧＳＴで、トランス遺伝子内に存在するものはない）についてホモ接合性／ヘテロ接合性の形質転換植物と、そして対照の野生型植物（すなわち、ＧＳＴおよび目的のトランス遺伝子の両方を欠く植物）と同じ生育条件下で育成される。花粉は、個々の植物の各々から収集され、そしてトランス遺伝子について分析し、および／または野生型植物に対して制御される交雑が、行われ、そして種子は、植物基準当たりで収集され、そして結果物の種子／植物を、トランス遺伝子について分析する。
【０２２２】
ＧＳＴ／トランス遺伝子複合体についてヘミ接合性の植物および野生型植物は、その全てが目的のトランス遺伝子を含むことに失敗する花粉および／または種子／植物を生じる。対照的に、トランス遺伝子に対してヘテロ接合性の植物は、目的のトランス遺伝子について正常な分離を示す花粉および種子／植物を生じる。目的のトランス遺伝子に対してホモ接合性の植物は、その全てが目的のトランス遺伝子を含む花粉を生じる。野生型植物を交雑させるときに、目的のトランス遺伝子に対してホモ接合性である植物は、目的のトランス遺伝子について正常な分離パターンを示すＦ２種子／植物を生じる。したがって、ＧＳＴ／トランス遺伝子複合体に対してヘミ接合性の植物は、トランス遺伝子を示す花粉を生じるのに失敗した一方で、トランス遺伝子単独に対してホモ接合性またはヘテロ接合性の植物は、目的のトランス遺伝子を含有する少なくとも同じ花粉を生じる。
【０２２３】
これは、本発明の分散転移態様についてと同じ状況である。当初のトランス遺伝子複合体は、ＧＳＴおよびトランスポゾンの両方および／またはトランスポザーゼを担持する。トランスジェニック系統が発生された後に、それらは、分散転移について選択される。したがって、１つまたは２つのトランスジェニック系統は、連続選択のために必要とされる全てである。別の形質転換は必要ない。形質転換体の選択で支援することが望まれる場合、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター／ｂａｒ遺伝子構築物のような別の任意のトランス遺伝子が添加されうる。
【０２２４】
芝草
遺伝子が、トウモロコシから得られる花粉特異的プロモーターの制御下でバーナーゼをコードすることを特徴とする核酸構築物（ＧＳＴ）は、ラウンドアップ（登録商標）（Ｒｏｕｎｄｕｐ）耐性遺伝子が、ＧＳＴに連結されるように行われる。未受精の（すなわち、野生型）芝草ゲノムを、結果物のトランスジェニック植物がトランス遺伝子複合体に対してヘミ接合性であるように３つのエレメント（トウモロコシの花粉特異的プロモーター、バーナーゼ遺伝子、登録商標ラウンドアップ耐性遺伝子）を含むトランス遺伝子複合体で形質転換させる。
【０２２５】
トランスジェニック植物を、無性で増殖させて、トランス遺伝子複合体に対してヘミ接合性でもある子孫植物を得る。トランスジェニック植物から無性生殖で発生した全ての植物は、ラウンドアップ（登録商標）処置に耐性があるが、交雑受粉を介したラウンドアップ（登録商標）耐性遺伝子の伝達は、生育できないトランスジェニック花粉が生成されるので排除される。
【０２２６】
ＧＳＴ構築物は、雄特異的であるので、ヘミ接合体のトランスジェニック系統は、野生型花粉に交雑させることによって維持されうる。トランス遺伝子排除が要求される（例えば、分散転移についての選択で）場合、それによりヘミ接合体のトランスジェニック系統は、雄（花粉供与体）として使用され、そして野生型雌と交雑される。この例で、非トランスジェニック花粉または分散転移を含む花粉のみが、増殖される。トランス遺伝子の歓迎されない花粉伝達（例えば芝草での除草剤耐性）を排除する目的のために、ヘミ接合体のトランスジェニック系統が栽培され得て、そして野生型花粉のみが生存する。
【０２２７】
アルファルファ
遺伝子が、コメから得られる花粉特異的プロモーターの制御下でバーナーゼをコードすることを特徴とする核酸構築物（ＧＳＴ）は、Ｂｔ遺伝子がＧＳＴに連結されるようになる。未受精の（すなわち、野生型）アルファルファゲノムを、結果物のトランスジェニック植物がトランス遺伝子複合体に対してヘミ接合性であるように３つのエレメント（コメの花粉特異的プロモーター、バーナーゼ遺伝子、Ｂｔ遺伝子）を含むトランス遺伝子複合体で形質転換させる。
【０２２８】
ヘミ接合体のトランスジェニック植物を、無性で増殖させて、トランス遺伝子複合体に対してヘミ接合性でもある子孫植物を得る。植物は、特定の鱗翅類昆虫有害生物に耐性／寛容性があるが、交雑受粉を介したＢｔ遺伝子の伝達は、生育できないトランスジェニック花粉が生成されるので排除される。
【０２２９】
形質転換トウモロコシ
トウモロコシの場合に、ＧＳＴ／トランスジェニック複合体を、トウモロコシゲノムに挿入し、そして「雌」親は、トランス遺伝子複合体を担持する。野生型花粉とのハイブリッド形成により、子孫ハイブリッド種子の１／２が、トランス遺伝子複合体を担持する（機能性ゲノム用途として問題なし）。この制限は、ｆｌｐまたはｌｏｘレコンビナーゼ・システムによって回避される。ＧＳＴ形質は、ハイブリッドが生成されるまで不活性で、そしてホモ接合性に保持される。その点で、ｆｒｔ−またはｃｒｅ−指向性組換えは、ＧＳＴ形質を（転写に対するＤＮＡブロックを除去することによるか、または転写を活性化させることによって）活性化し、現時点で、１／２の代わりに全てのハイブリッド子孫に存在する。活性化ＧＳＴを含むトランス遺伝子複合体は、トランス遺伝子複合体（例えば、減数分裂産物の５０％）を受継ぐ任意の花粉から排除される。
【０２３０】
実施例３．分散転移事象の強化
トランスポゾン打上部位および／またはトランスポザーゼ源に不稔形質を物理的に連結させることによって、「遺伝的不稔フィルター」は、化合物の使用なしに、そして連結転移事象および／またはトランスポザーゼ源を含む子孫に対して選択する必要性なしに、分散および／または安定化転移事象を非常に強化させるために使用される。
【０２３１】
例えば、５０％花粉不稔性が達成される場合、残りの生育できるハプロイドゲノムは、正常な同種の染色体分離、独立の分類および減数分裂組換えのため、自殺遺伝子、およびトランスポゾン打上部位および／またはトランスポザーゼ遺伝子のようなそれに関連したエレメントを受継がなかった。これらの生育可能なゲノムの分画は、新たな転移因子、特に打上部位およびそれに関連した自殺遺伝子から独立に分類するか、または組換えたものを含む。したがって、「遺伝的不稔フィルター」は、打上部位に連結されたままである転移因子を含む配偶子および／またはトランスポザーゼ遺伝子を含む配偶子を排除する。
【０２３２】
残りの生育可能な花粉が、制御された受粉により、または風の受粉によるかのいずれかにより、胚珠を受精するために使用される場合、結果物の子孫の分画は、転移因子を含む。これらの子孫は、ペチニア（ｐｅｔｕｎｉａ），アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＣＰ４　ＥＰＳＰＳ遺伝子のようなトランスポゾンの内側に選択性またはスクリーニング性マーカーの封入（Ｐａｄｇｅｔｔｅ，Ｓ．Ｒ．ら、（１９８７）Ａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｖｏｌ．２５８／２：５６４−７３；Ｋｌｅｅ，Ｈ．Ｊ．ら、１９８７　Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ　Ｖｏｌ．２１０／３：４３７−４２；Ｈｏｅｆ，Ａ．ら、（１９９８）Ｆｏｏｄ　Ａｄｄｉｔ　Ｃｏｎｔａｍ　Ｖｏｌ．１５／７：７６７−７４；Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｌ．Ａ．ら、（１９９６）Ｊ　Ｎｕｔｒ　Ｖｏｌ．１２６／３：７２８−４０）、グリホセート（ラウンドアップ（登録商標））耐性（Ｍａｌｉｋ，Ｊ．ら、（１９８９）Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ　Ｖｏｌ．２／１：１７−２５）；または多様なアセトラクレート・シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子をコードすること、アラビドプシス多除草剤耐性遺伝子、ｃｓｒｌ−４（Ｍｏｕｒａｄ，Ｇ．ら、（１９９４）Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ　Ｖｏｌ．：２４３／２：１７８−８４）またはストレプトマイセスから得られるｂａｒ遺伝子（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｊ．ら（１９８６）ＥＭＢＯ　Ｊ．６：２５１９−２５２３）のようなスルホニルウレア除草剤に対する耐性をコートすること（Ｗｈｉｔｃｏｍｂ，Ｃ．Ｅ．（１９９９）Ｔｏｘｉｃｏｌ　Ｉｎｄ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｖｏｌ．１５／１−２：２３１−９）、ホスフィノトリシン（フィナーレ（登録商標））に対する耐性をコードすることによって容易に同定されて、少数を命名する。
【０２３３】
Ａｃのような自律性エレメントの伝達の場合には、分散された転移Ａｃエレメントを含む子孫は、Ｄｓ誘導レポーター遺伝子の相互活性化のような典型的な遺伝的手段によって同定される。本発明の１つの実施形態では、トランスポゾンは、転移因子を含む生存可能な花粉のみを許す花粉生存性遺伝子を用いて構築され、それにより化合物選択またはスクリーンについての必要性を完全に排除する。
【０２３４】
ＧＳＴ複合体が、転移可能な因子をさらに含む場合、それにより、転移の頻度（連結および未連結部位の両方に）は、トランスポザーゼの源および他の因子によって、高い可能性がある。その７０％が連結されうる５％の転移頻度を確保して、それにより３０％が、未連結で、そしてこれの１５％（ＧＳＴ染色体を用いた転移の任意に独立な分類）は、子孫で回復され、そして転移因子に含まれる除草剤耐性によって容易に同定される。我々が、１００，０００の独立な挿入を回復したい場合、必要とされる種子の数の概算は、必要とされる（１００，０００×２／．３）／０．０５＝１３，３３３，３３３Ｆ１種子である。これらは、３年未満で発生およびスクリーニングされる（個別の植物として回収）。
【０２３５】
実施例４．安定に分散した転移事象の強化
本発明の別の実施形態は、トランス遺伝子複合体で、封入に、トランスポゾン打上部位および自殺トランス遺伝子に加えて、トランスポザーゼ源のような他の遺伝子に向けられる。この実施形態では、「遺伝的不稔フィルター」は、子孫に対するトランスポザーゼ源の伝達をも除外しながら、分散エレメントを強化させる。
【０２３６】
トランスポゾン供与体部位およびトランスポザーゼ遺伝子の同時の排除は、安定化される転移因子を伝達（すなわち、トランスポザーゼ遺伝子の損失により、もはや転移しない）し、それにより別の転移（二次転移）が生じることから回避するさらなる利点を示す。
【０２３７】
本発明の別の実施形態は、別個のトランス遺伝子複合体中にトランスポザーゼ源およびトランスポゾン打上部位を位置決めすることを含む。例えば、打上部位およびトランスポザーゼ源は、別個のエレメント上の１つのゲノムでまとめられうる。さらに、局在転移が望ましい、すなわち、挿入を示す特定の染色体領域を飽和させるか、または目的の遺伝子の傍に挿入を回復させる場合に、トランスポザーゼ源は、連結転移を必然的に排除することなしに、不稔フィルター方法によって排除される。
【０２３８】
実施例５．コメ−モデル植物システム
Ａ．コメ形質転換
コメ・トランスジェニックは、高い処理量のトランスジェニック産物を許す２４穴マイクロタイター基本の方法を使用することによって発生される。その方法は、出版されたプロトコール（Ｈｉｅｉ，Ｙ．ら、（１９９４）Ｐｌａｎｔ　Ｊ．６：２７１−８２；Ｈｉｅｉ，Ｙ．ら、（１９９７）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃ　Ｂｉｏ．３５：２０５−２１８；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら、（１９９７）Ｍｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：２２３−３１）の適合であり、そして円盾状カルス誘導からのトランスジェニックの生成、アグロバクテリウムとの同時栽培、チメンチンでの処置、および発育再生を可能にする全体に液体培養および形質転換システムに関与する。このシステムは、毎月、約５０から１００の独立のトランスジェニック系統を発生させるために使用される。
【０２３９】
各トランスジェニック系統から得られる組織サンプルを収集し、ＤＮＡを抽出し、そしてサザンによって分析して単独コピーＴ−ＤＮＡ挿入物（ＳＣＴＬ）を含む系統を同定した。ＳＣＴＬから得られる発芽物を、微量増殖させ、根付き、そして当業者によく知られる方法によって、土壌に移殖される。
【０２４０】
Ｂ．遺伝学的方法
広範な基本の高容量の交雑プログラムが、保存の世代、種子およびトランスポゾン系統についてＣＩＡＴで利用できる。典型的には、約１０００の制御された（手動の）交雑が、単独、二重、最高および戻り交雑を含めた各周期でなされる。得られたＦ１種子の数は、交雑型および交配対象に依存する。
【０２４１】
交雑が、生物的に安全な認可されたスクリーン室条件下で年間で行われ得る。７から１０日の間隔での親の３つの栽培は、開花を同時に確保するために行われる。親は、大型ポットで育成されるか、または雄性不稔の雌系統を使用するときにハイブリッド形成ブロックでの野外で育成される。
【０２４２】
手での受粉について、交雑の方法は、親植物の選択、円錐花序の除雄（雌親については葯の除去）、グラシンバッグでの除雄された小花の被覆、雄親から収集された花粉を用いた雌親の受粉、グラシンバッグを用いた受粉した円錐花序の被覆、および親、日付、および交雑を行った人の名称についての関連情報を含む交雑タグを用いて交雑するために使用される円錐花序の同定である。コメのハイブリッド形成での詳細な情報について、例えば、Ｃｏｆｆｍａｎ，Ｗ．Ｒ．およびＲ．Ｍ．Ｈｅｒｒｅｒａ（１９８０）Ｒｉｃｅ，Ｉｎ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｏｒｐ　Ｐｌａｎｓ，Ｗ．Ｒ．ＦｅｈｒおよびＨ．Ｈ．Ｈａｄｌｅｙ，Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ３６：５１１−５２２、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ａｇｒｏｎｏｍｉｓｔ参照。
【０２４３】
選択されたＦ１およびＴ１植物は、個々に収獲されて、Ｆ２種子を生産する。受粉の約２５日後、ハイブリッド種子を収獲し、脱穀し、掃除をし、硬貨エンベロープに入れる。この種子を、低湿度および温度下で保存する。Ｔ１種子は、平坦に育成され、そして生殖の２５日および３５日後に、０．０５％フィナーレ（登録商標）の２つの葉質用途によって、除草剤耐性について選択する。
【０２４４】
Ｃ．サンプル追跡
関係のバーコードサンプル追跡データベースは、作業の流れを通して、植物、種子、およびＤＮＡサンプルを追跡するために使用されうる。作成される各トランスジェニックは、特徴的（英数字）識別名に割り振られる。トランスジェニック物から誘導される保存植物は、この識別名および第二の特徴的保存識別名を担持する。生産苗床に入る全ての保存物は、トランスジェニック／保存識別名を担持し、そして各保存物から誘導される検定交雑種子は、各交雑についての特徴的な識別名に割当てられる（Ｔ１種子ロット）。
【０２４５】
フィナーレ（登録商標）選択後、各耐性植物は、特徴的系統識別名が割当てられる。この情報は、２つの切取り部分ラベルを有する植物ラベルにコードされる；各々は、同一の英数字識別名および関連バーコードを持つ。１つの切取り部分ラベルを、組織サンプルに付着させ、そして他方は、その植物に残り、種子包装に最終的にステープルで止める。小型装置のバーコード読取装置が、組織サンプルを、ＤＮＡ抽出行列を通して、そしてＰＣＲ増幅およびＤＮＡ配列決定のために最終的に３８４マイクロタイター平板の位置までサンプルを追跡するデータベースに記録する。
【０２４６】
Ｄ．高処理量ＤＮＡ単離および正常化
組織サンプルを、ＤＮＡ抽出の前に凍結乾燥させる。プラスチック製袋に届けるための凍結乾燥した組織を、デシケーターで密閉する。組織を、市販の１０ガルの染料振蘯装置（Ｆｌｕｉｄ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．）で９６−３８４の試験管を迅速に振蘯させることにより、ジルコニウム・シリカビーズ（ＡＴＧＣ，Ｉｎｃ．）で破砕する。
【０２４７】
先に発表された方法から適合された高処理量平行法を用いて、ＤＮＡを、抽出させ（Ｇａｌｂｉａｔｉら、（２０００）Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　＆　Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，出版中）、そして精製ＤＮＡを、９６フォーマットマイクロタイター平板に保存する。ＤＮＡ濃度を、スペクトルフロー平板読取装置およびゼネシス・ロボット工学作業台（Ｔｅｃａｎ，Ｉｎｃ．）を用いて、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）によってロボット工学的に測定する。
【０２４８】
ＰＣＲ分析のために二次作業台を作るために、ＤＮＡを、適切な量の緩衝液と一緒に各穴からの固定量のＤＮＡを二次作業台に除去することによって、ロボット工学で正常化させる。これらの正常化作業台の母娘レプリカが、ロボット工学で行われ、そしてサンプルを、増幅および配列決定のために配送する。
【０２４９】
組織抽出から正常化までのスプリプトを含めたこの全手段の実行可能性は、トウモロコシとアラビドプシスの両方について可能になった。
【０２５０】
Ｅ．トランスポゾン系統の選択
トランスポゾン系統の選択は、単独コピー系統（ＳＣＬ）、スケールアップ、サンプル追跡、加工および配送、続いて生成相の回復についてのトランスジェニック生産および遺伝的検定に関与する。方法は、アグロバクテリウム接種で、および一次コメ・トランスジェニックでの両方でのＴ−ＤＮＡのＤＮＡフィンガープリント、アグロバクテリウム指向性形質転換プロトコール、およびコメ再生、微量増殖、および翻訳のための方法が挙げられ、そして土壌への翻訳は使用されうる。
【０２５１】
組織を、各トランスジェニック系列から収集し、ＤＮＡ抽出し、そしてサザン分析によって分析して、単独コピーＴ−ＤＮＡ系統（ＳＣＬ）を同定する。全てのＳＣＬは、発育培養で維持され得て、そして微量増殖のために送る。根菜植物は、土壌に移植され、そして転移速度について試験しうる。
【０２５２】
Ｆ．保存生産
転移頻度における遺伝子データは、継続保存産物のための最善のトランスジェニック系統を選択するために使用される。根付いた苗条は、土壌に移殖され、そしてさらに単一分裂によって増殖されて、生産苗床での雄性植物の数を増加する。
【０２５３】
１つの具体例では、転移が、オシベ発達に限定される場合、保存増殖の代替的であるが、しかし相互排他的でない方法は、野生型花粉をトランスジェニック雌植物に交雑させることである−Ｔ−ＤＮＡ排除および転移は、この方向で生じない。したがって、この種子は、各季節に簡単に再度栽培されて、新たな転移選択のための別の保存物を生じうる。
【０２５４】
コメ変種ニッポンバレについての開花時期は、赤道で、または傍で生育される６０日である。赤道位置を使用することによって、毎年ほぼ４つの植物世代を達成することが可能である。メキシコのカリでの省略された世代時間および一定年中成長条件は、コメ遺伝学をアラビドプシスとほぼ同等に有効にする。
【０２５５】
Ｇ．種子生産の基礎
本発明の１つの具体例では、単独分散転移を選択すること、そしてヘミ接合性条件下でこれらの挿入を回復させることである。これは、致死的でない、劣性致死的およびハプロ不十分な雌性突然変異の回復を可能にする。
【０２５６】
Ｔ１種子を生産するために、保存植物を、苗床で雄性不稔雌に対する雄として交雑させる。コメでの有効な他家交雑雄および雄性不稔雌を間作することによって達成されうる。ニッポンバレでの雄性不稔性は、現在、利用できないので、それで核雄性不稔（ｍｓ）突然変異は、オー．サチバ．エスエスピー．インディカ株から苗床でニッポンバレへ遺伝子移入された。遺伝子移入方法は、マーカー支援地図作製および交配、ｍｓ突然変異およびニッポンバレマーカーについてを戻り交配子孫を選択することによって大いに促進される。
【０２５７】
ｍｓ遺伝子座は、先に特徴付けられた単純配列反復（ＳＳＲ）マーカーを用いて最初に地図決定される（ＭｃＣｏｕｃｈ，Ｓ．Ｒ．ら、（１９９７）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．３５：８９−９９；Ｐａｎａｕｄ，Ｏ．ら、（１９９６）Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ．２５２；５９７−６０７）。７０００ＳＳＲ配列は、モオンサントの大まかな設計図（ｗｗｗ．ｒｉｃｅ−ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｏｒｇ）から利用できる。連結されたＳＳＲは、遺伝子移入の間じゅうｍｓ対立遺伝子に続いて使用される一方で、ゲノムじゅうの未連結ＳＳＲは、供与体生殖質に対して選択するために使用される。
【０２５８】
２つの戻り交雑および自家受粉は、ｍｓ対立遺伝子を、ニッポンバレのバックグランドに移行するのに十分である。Ｆ１交雑が行われ、そしてＦ２子孫が発生される。遺伝子移入ｍｓ系統は、Ｔ１種子生産のために利用できる。ｍｓ表現型についての１：１系統分離は、苗床で使用され、ＳＳＲ分析によって遺伝子型で、そして雄性不稔植物細胞で使用される。転移保存は、ｍｓ／ｍｓ雌性植物にハイブリッド形成させて、Ｄｓ系統選択についてのＴ１種子を発生する。
【０２５９】
Ｈ．トランスポゾン系統選択
Ｔ１を、平坦に栽培し、そして２５日齢の幼植物は、０．０５％登録商標フィナーレの花を使用し、続いて１０−１５日後の第二の処置によって選択される。フィナーレ（登録商標）耐性植物は、バーコード化され、そして苗床に間作され、そして自家受粉させて、Ｔ２種子を発生する。
【０２６０】
各植物から得られる組織サンプル（約１−２ｇ葉組織）を、収集し、バーコード管に入れ、凍結乾燥させて、ＤＮＡ抽出のための準備をする。
【０２６１】
各系統から得られるＴ２種子を収集し、脱穀し、バーコード化封筒に入れ、そして保存または公的分布のための準備をする。
【０２６２】
本発明は、特定の具体例に関して開示されたときに、本発明の他の具体例および変動は、本発明の真の概念および範囲から逸脱することなく当業者によって修正されうる。附随の請求項は、具体例および同等の変動のように全てを含むと解釈されることを意図されない。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
花粉特異的プロモーターが、自殺遺伝子に操作的に連結される例示のＧＳＴ（植物配偶子不稔形質）構築物を示す。ＧＳＴ構築物は、目的の遺伝子に物理的に連結されて、トランス遺伝子複合体を形成しうる。ＧＳＴ構築物は、目的の遺伝子の伝達を回避または排除するために使用される。
【図１Ｂ】
転移因子およびトランスポザーゼ源に連結された例示のＧＳＴ構築物を示す。この構築物は、安定に分散されたトランスポゾンについての植物細胞子孫の集団を増すために使用されうる。
【図２】
減数分裂産物からトランス遺伝子複合体を排除し、そして分散転移のために選択するための一般化された攻略法を示す。
【図３】
（Ａ）および（Ｂ）は、ＧＳＴ構築物の概略図を示す。
【図４】
（Ａ）および（Ｂ）は、それぞれ、ｐＹＵ９０４およびｐＹＵ９０５構築物の概略図を示す。
【図５】
ｐＹＵ８４６トランスポザーゼ構築物の概略図を示す。
【図１Ａ】
2004512007.tif 000005
【図１Ｂ】
2004512007.tif 000006
【図２】
2004512007.tif 000007
【図３】
2004512007.tif 000008
【図４】
2004512007.tif 000009
【図５】
2004512007.tif 000010
【国際公開パンフレット】
2004512007.tif 000011
2004512007.tif 000012
2004512007.tif 000013
2004512007.tif 000014
2004512007.tif 000015
2004512007.tif 000016
2004512007.tif 000017
2004512007.tif 000018
2004512007.tif 000019
2004512007.tif 000020
2004512007.tif 000021
2004512007.tif 000022
2004512007.tif 000023
2004512007.tif 000024
2004512007.tif 000025
2004512007.tif 000026
2004512007.tif 000027
2004512007.tif 000028
2004512007.tif 000029
2004512007.tif 000030
2004512007.tif 000031
2004512007.tif 000032
2004512007.tif 000033
2004512007.tif 000034
2004512007.tif 000035
2004512007.tif 000036
2004512007.tif 000037
2004512007.tif 000038
2004512007.tif 000039
2004512007.tif 000040
2004512007.tif 000041
2004512007.tif 000042
2004512007.tif 000043
2004512007.tif 000044
2004512007.tif 000045
2004512007.tif 000046
2004512007.tif 000047
2004512007.tif 000048
2004512007.tif 000049
2004512007.tif 000050
2004512007.tif 000051
2004512007.tif 000052
2004512007.tif 000053
2004512007.tif 000054
2004512007.tif 000055
2004512007.tif 000056
2004512007.tif 000057
2004512007.tif 000058
2004512007.tif 000059
2004512007.tif 000060
2004512007.tif 000061
2004512007.tif 000062
2004512007.tif 000063
2004512007.tif 000064
2004512007.tif 000065
2004512007.tif 000066
2004512007.tif 000067
2004512007.tif 000068
2004512007.tif 000069
2004512007.tif 000070
2004512007.tif 000071
2004512007.tif 000072
2004512007.tif 000073
2004512007.tif 000074
2004512007.tif 000075
2004512007.tif 000076
2004512007.tif 000077
2004512007.tif 000078
2004512007.tif 000079
2004512007.tif 000080
2004512007.tif 000081
2004512007.tif 000082
2004512007.tif 000083
2004512007.tif 000084
2004512007.tif 000085
2004512007.tif 000086
2004512007.tif 000087
2004512007.tif 000088
2004512007.tif 000089
2004512007.tif 000090
2004512007.tif 000091
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004512007.tif 000092
2004512007.tif 000093
【国際調査報告】
2004512007.tif 000094
2004512007.tif 000095
2004512007.tif 000096
2004512007.tif 000097
2004512007.tif 000098
2004512007.tif 000099