(57)【要約】本発明は、シナプス伝達に作用し、細胞内取り込み/細胞外放出に影響を及ぼし、またタンパク質のプロセッシングに影響を及ぼす有効活性化合物、及び特に骨粗しょう症又はページェット病を治療するため及び神経疾患や神経筋肉疾患及びその他の神経疾患を治療するために使用することが出来る又は向精神医薬品として使用することが出来る有効活性化合物を同定しまた試験するための試験システムに係わる。本発明は更には、CIC-3、CIC-4、CIC-6及びCIC-7から成る群から選択される一種又はそれ以上の塩素チャンネルが発現していないか又は非機能的に発現している、遺伝子修飾されたヒト以外の哺乳動物、及び一種の動物から誘導される体細胞株、並びに塩素チャンネル類、特にCIC-3、CIC-4、CIC-5、CIC-6及びCIC-7を抑制・阻害するのに適した物質を同定しまた試験するためにこれら哺乳動物や体細胞株を使用する方法にも係わる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩素チャンネルＣｌＣ−３，ＣｌＣ−４，ＣｌＣ−６及びＣｌＣ−７から成る群から選択される一種のタンパク質をコードする核酸配列であって、該核酸配列が突然変異、切断、又は完全な若しくは部分的な欠失によって修飾されることを特徴とする前記核酸配列。
【請求項２】
ＣｌＣ−３，ＣｌＣ−４、ＣｌＣ−６及び/又はＣｌＣ−７をコードする一種又は複数種の核酸配列が、天然の核酸配列を基準として突然変異、切断、又は完全な若しくは部分的な欠失によって修飾されることを特徴とする、生殖細胞及び体細胞が、塩素チャンネルＣｌＣ−１、ＣｌＣ−２，ＣｌＣ−Ｋａ、ＣｌＣ−Ｋｂ、ＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４，ＣｌＣ−５、ＣｌＣ−６及び/又はＣｌＣ−７から成る群から選択される一種のタンパク質をコードする核酸配列を含有する、ヒト以外の哺乳動物。
【請求項３】
ＣｌＣ−１、ＣｌＣ−２，ＣｌＣ−Ｋａ、ＣｌＣ−Ｋｂ及び/又はＣｌＣ−５をコードする核酸配列の一種又は複数種が、さらに突然変異、切断、又は完全な若しくは部分的な欠失によって修飾されることを特徴とする、請求項２において記載されたヒト以外の哺乳動物。
【請求項４】
ＣｌＣ−１、ＣｌＣ−２，ＣｌＣ−Ｋａ、ＣｌＣ−Ｋｂ、ＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４，ＣｌＣ−５、ＣｌＣ−６及び/又はＣｌＣ−７から成る群から選択される一種又はそれ以上の塩素チャンネルを発現しないか又は低減した範囲でしか発現しない細胞株。
【請求項５】
塩素チャンネルＣｌＣ−７を発現するが、塩素チャンネルＣｌＣ−３，ＣｌＣ−４，ＣｌＣ−５及びＣｌＣ−６は発現しないことを特徴とする、請求項４において記載された細胞株。
【請求項６】
塩素チャンネルＣｌＣ−３を発現するが、塩素チャンネルＣｌＣ−４，ＣｌＣ−５，ＣｌＣ−６及びＣｌＣ−７は発現しないことを特徴とする、請求項４において記載された細胞株。
【請求項７】
塩素チャンネルＣｌＣ−４を発現するが、塩素チャンネルＣｌＣ−３，ＣｌＣ−５，ＣｌＣ−６及びＣｌＣ−７は発現しないことを特徴とする、請求項４において記載された細胞株。
【請求項８】
塩素チャンネルＣｌＣ−６を発現するが、塩素チャンネルＣｌＣ−３，ＣｌＣ−４，ＣｌＣ−５及びＣｌＣ−７は発現しないことを特徴とする、請求項４において記載された細胞株。
【請求項９】
核酸配列の一種又はそれ以上が、天然の核酸配列を基準として突然変異、切断、又は完全な若しくは部分的な欠失によって修飾されることを特徴とする、生殖細胞及び体細胞が、塩素チャンネルＣｌＣ−１、ＣｌＣ−２，ＣｌＣ−Ｋａ、ＣｌＣ−Ｋｂ、ＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４，ＣｌＣ−５、ＣｌＣ−６及び/又はＣｌＣ−７から成る群から選択される一種のタンパク質をコードする核酸配列を含有する、遺伝子修飾されたヒト以外の哺乳動物を該塩素チャンネルの一種又はそれ以上を阻害するのに適している物質を同定し且つ試験するために使用する方法。
【請求項１０】
ＣｌＣ−７をコードする配列を除いて、核酸配列の一種又はそれ以上が、天然の核酸配列を基準として突然変異、切断、又は完全な若しくは部分的な欠失によって修飾されることを特徴とする、生殖細胞及び体細胞が、塩素チャンネルＣｌＣ−１、ＣｌＣ−２，ＣｌＣ−Ｋａ、ＣｌＣ−Ｋｂ、ＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４，ＣｌＣ−５、ＣｌＣ−６及び/又はＣｌＣ−７から成る群から選択される一種のタンパク質をコードする核酸配列を含有する、遺伝子修飾された、ヒト以外の哺乳動物を塩素チャンネルＣｌＣ−７を阻害するのに適している物質を同定し且つ試験するために使用する方法。
【請求項１１】
ＣｌＣ−３をコードする配列を除いて、核酸配列の一種又はそれ以上が、天然の核酸配列を基準として突然変異、切断、又は完全な若しくは部分的な欠失によって修飾されることを特徴とする、生殖細胞及び体細胞が、塩素チャンネルＣｌＣ−１、ＣｌＣ−２，ＣｌＣ−Ｋａ、ＣｌＣ−Ｋｂ、ＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４，ＣｌＣ−５、ＣｌＣ−６及び/又はＣｌＣ−７から成る群から選択される一種のタンパク質をコードする核酸配列を含有する、遺伝子修飾された、ヒト以外の哺乳動物を塩素チャンネルＣｌＣ−３を阻害するのに適している物質を同定し且つ試験するために使用する方法。
【請求項１２】
ＣｌＣ−４をコードする配列を除いて、核酸配列の一種又はそれ以上が、天然の核酸配列を基準として突然変異、切断、又は完全な若しくは部分的な欠失によって修飾されることを特徴とする、生殖細胞及び体細胞が、塩素チャンネルＣｌＣ−１、ＣｌＣ−２，ＣｌＣ−Ｋａ、ＣｌＣ−Ｋｂ、ＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４，ＣｌＣ−５、ＣｌＣ−６及び/又はＣｌＣ−７から成る群から選択される一種のタンパク質をコードする核酸配列を含有する、遺伝子修飾された、ヒト以外の哺乳動物を塩素チャンネルＣｌＣ−４を阻害するのに適している物質を同定し且つ試験するために使用する方法。
【請求項１３】
ＣｌＣ−６をコードする配列を除いて、核酸配列の一種又はそれ以上が、天然の核酸配列を基準として突然変異、切断、又は完全な若しくは部分的な欠失によって修飾されることを特徴とする、生殖細胞及び体細胞が、塩素チャンネルＣｌＣ−１、ＣｌＣ−２，ＣｌＣ−Ｋａ、ＣｌＣ−Ｋｂ、ＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４，ＣｌＣ−５、ＣｌＣ−６及び/又はＣｌＣ−７から成る群から選択される一種のタンパク質をコードする核酸配列を含有する、遺伝子修飾された、ヒト以外の哺乳動物を塩素チャンネルＣｌＣ−６を阻害するのに適している物質を同定し且つ試験するために使用する方法。
【請求項１４】
塩素チャンネルＣｌＣ−７を阻害するのに適している物質を同定し且つ試験するために、請求項５において記載された細胞株を使用する方法。
【請求項１５】
骨粗しょう症又はページェット病を治療するのに適している有効活性物質を同定し且つ試験するために、請求項１４において記載された使用方法。
【請求項１６】
塩素チャンネルＣｌＣ−３を阻害するのに適している物質を同定し且つ試験するために、請求項６において記載された細胞株を使用する方法。
【請求項１７】
塩素チャンネルＣｌＣ−４を阻害するのに適している物質を同定し且つ試験するために、請求項７において記載された細胞株を使用する方法。
【請求項１８】
塩素チャンネルＣｌＣ−６を阻害するのに適している物質を同定し且つ試験するために、請求項８において記載された細胞株を使用する方法。
【請求項１９】
向精神医薬品として適している有効活性物質を同定し且つ試験するために、請求項１４及び１６乃至１８において記載された使用方法。
【請求項２０】
下記の操作を行うことから成る、塩素チャンネルＣｌＣ−３，ＣｌＣ−４，ＣｌＣ−５，ＣｌＣ−６及びＣｌＣ−７から成る群から選択される一種又はそれ以上の塩素チャンネルを阻害するのに適している物質を同定し且つ試験するための方法：
ａ）請求項５乃至８において記載された細胞について、当該チャンネルを発現するコンパートメントの内腔ｐＨ及び/又は該チャンネルを囲繞する膜の内外電位差を測定すること、
ｂ）該細胞を一種の物質と接触させること、及び
ｃ）当該チャンネルを発現するコンパートメントの内腔ｐＨ及び/又は該チャンネルを囲繞する膜の内外電位差を測定すること、
かくして該物質の添加の前後における該ｐＨ及び/又は膜電位差の差によって、該物質の有効活性度を測定すること。
【請求項２１】
特定のｐＨによるか又は該コンパートメント内においてｐＨ依存態様で形成される指示物質の検出によって物質のコンパートメント内での蓄積量に基いて該ｐＨを測定することを特徴とする、請求項２０において記載された方法。
【請求項２２】
該電位差を電位差感受性染料又はタンパク質をコードした電位差センサーを用いて測定することを特徴とする、請求項２０において記載された方法。
【請求項２３】
骨粗しょう症及びページェット病を治療する医薬品を製造するために、塩素チャンネルＣｌＣ−７を完全に又は部分的に阻害する物質を使用する方法。
【請求項２４】
神経疾患及び神経筋肉性疾患並びにその他の神経疾患から成る群から選択される疾患を治療する医薬品を製造するために、塩素チャンネルＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４，ＣｌＣ−６及び/又はＣｌＣ−７を完全に又は部分的に阻害する物質を使用する方法。
【請求項２５】
向精神医薬品を製造するために、塩素チャンネルＣｌＣ−３，ＣｌＣ−４、ＣｌＣ−６及び/又はＣｌＣ−７を完全に又は部分的に阻害する物質を使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シナプス伝達に作用し（神経疾患を治療するための有効活性化合物）、細胞内取り込み/細胞外放出に影響を及ぼし、またタンパク質のプロセッシングに影響を及ぼす有効活性化合物、及び特に骨粗しょう症又はページェット病を治療するため及び神経疾患や神経筋肉疾患及びその他の神経疾患を治療するために使用することが出来る又は向精神医薬品として使用することが出来る有効活性化合物を同定しまた試験するための試験システムに係わる。本発明は、更には、ＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４、ＣｌＣ−６及びＣｌＣ−７から成る群から選択される一種又はそれ以上の塩素チャンネルが発現していないか又は非機能的に発現している、ヒト以外の哺乳動物、好ましくはげっ歯動物、及びかかる一種の動物から誘導される体細胞株、並びに塩素チャンネル類、特にＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４、ＣｌＣ−５、ＣｌＣ−６及びＣｌＣ−７に活性において影響を及ぼし、特にこれを抑制・阻害するか又は活性化するのに適した物質を同定しまた試験するためにこれら哺乳動物や体細胞株を使用する方法にも係わる。
【背景技術】
【０００２】
骨粗しょう症は、骨の劣化・破壊が増大した結果、脆弱化する疾患である。骨粗しょう症は、高齢者、特に高齢の女性（ホルモン由来）に多発する。このような理由により、性ホルモン類は、骨劣化・破壊を実際に停止させるものの、大半の症例では深刻な副作用をもたらすが、高齢の女性患者に頻繁に投与されている。特異的な骨粗しょう症薬は、これまでに開発されていない。
【特許文献１】
後記文献一覧参照。
【非特許文献１】
後記文献一覧参照。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の文脈において、驚くべきことに、ＣｌＣ−７タンパク質（塩素チャンネルＣｌＣ−７）タンパク質をコードする核酸配列において突然変異が生起すると、非機能的タンパク質が発現されることになるか、又はかかるタンパク質の発現が完全に抑制されるので、その結果マウスにおいて重篤な骨粗しょう症を惹起することが見い出されたのである。これらの驚くべき結果に基いて、重篤な若年性骨粗しょう症の患者もまた、ＣｌＣ−７遺伝子の突然変異を持っていることが見出されたのである。
【０００４】
ＣｌＣ−７塩素チャンネルは、リソソームの後期細胞内取り込みにおいて存在する圧倒的に細胞内にある塩素チャンネルである。ＣｌＣ−７は、遍在的に発現し、特に、骨破壊細胞である破骨細胞において認められる。非機能的タンパク質の発現をもたらすか又は発現を完全に抑制する（“ノックアウト”と称され、以下においては“ＫＯ”と称する）突然変異によって、破骨細胞が骨を劣化・破壊する能力を発揮するのが防止される。さらに詳細な研究の結果、ＣｌＣ−７が、プロトンポンプと共に所謂“波打ち膜”内に取り込まれることが判明している。この波打ち膜は、骨吸収小腔と境界を接し、酸当量が、プロトンポンプによってこの骨九州小腔内に輸送され、ＨＣｌの小腔内への電気神経学的な輸送が、ＣｌＣ−７が保持する平衡塩素コンダクタンスにより確保されている。小腔内の産生ｐＨが、骨破壊には必須である。適当な塩素コンダクタンスが存在しない場合は、プロトンポンプは、有効にポンプ機能することが出来なくなり、その結果、破骨細胞は、骨吸収小腔を酸性化することが出来なくなりまた骨を破壊することが出来なくなる。
【０００５】
ＣｌＣ−７をノックアウトすることによって、網膜の重篤な退化が生起し、更に中枢神経系（ＣＮＳ）の変性が認められる。これらの観察結果は、後期エンドソーム（細胞内取り込み）及びリソソームの酸性化と退化が、ＣｌＣ−７ノックアウトによって多くの組織内において障害される、という事実に帰結される。
【０００６】
本発明の文脈において、ＣｌＣ遺伝子ファミリーの塩素チャンネルはまた、シナプシス小胞の酸性化にも関与していることが見出されたのである。このことは、例えばＣｌＣ−３チャンネルをノックアウトすることによっても証明されている。かかるノックアウトによって、中枢神経系におけるシナプス伝達の変化及び神経細胞の変性が生起するのである。さらには、その他の塩素チャンネル、例えばＣｌＣ−４やＣｌＣ−７などがシナプシス小胞に存在することが、見出されたのである。シナプス小胞は、神経伝達物質を取り込むが、神経伝達物質は次いで細胞外放出によってシナプス間隙内に遊離・放出され、かくして後流（ダウンストリーム）神経細胞を調節する（刺激するか又は阻害する）のである。神経伝達物質のシナプス小胞内への取り込みは、シナプス小胞の膜を経由したｐＨ勾配及び電位勾配とによって駆動され（参考文献（６２）−（６７）を参照）、その結果シナプス小胞内における塩素チャンネルの活性が、神経経内のシグナル伝達を左右することになる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の文脈において設定された研究によって、ＣｌＣ−１、ＣｌＣ−２、ＣｌＣ−Ｋａ、ＣｌＣ−Ｋｂ、ＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４、ＣｌＣ−５、ＣｌＣ−６及び／又はＣｌＣ−７から成る群から選択された一種又はそれ以上の塩素チャンネル―特に圧倒的に細胞内にある塩素チャンネルであるＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４、ＣｌＣ−５、ＣｌＣ−６及び／又はＣｌＣ−７を阻害するか、それ以外の態様でこれらの活性に影響を及ぼす、即ち例えばかかる塩素チャンネルを活性化するか若しくはその制御を調整する物質の同定及び試験を可能ならしめる試験システムを提供することが可能となったのである。具体的には、塩素チャンネルであるＣｌＣ−７を（部分的に又は完全に）阻害する物質、特に骨粗しょう症又はページェット病を治療するに適した物質を同定しまた試験するための試験システム及びプロセスが提供されるのである。かかる試験システムによれば、神経細胞のシグナル伝達に影響を及ぼし、従って神経疾患を治療するために適した物質の同定を行うことが可能である。
【０００８】
本発明は、ＣｌＣ−塩素チャンネルの（部分的）阻害が破骨細胞の機能を阻害し、従って骨劣化・破壊を妨げる、という考察に基くものである。これと同じ考えに沿った研究が現在、医薬品工業界において実施されているが、具体的にはプロトンポンプの有効な阻害剤が検索されているのである。現在の知識に因れば、特異的にＣｌＣ−７塩素チャンネルに作用するか、これを部分的又は完全に阻害するか若しくはこれを活性化するか又はその制御を調整する物質を同定することが、初めて可能となったのである。ＣｌＣ−７を完全にノックアウトすることによって、他の組織にも影響を及ぼし、また例えば網膜の退化やＣＮＳの変性を起こさせる。従って、ＣｌＣ−７を薬理学的に阻害する（例えば、ＣｌＣ−７阻害剤を投与することによって）ことは、潜在的に同様の効果・影響を持つことになり得るであろう。かかる問題・課題は、一方では当該チャンネルの部分的な阻害だけでも解決可能であり、また他方では所望しない標的器官（例えば目や脳）（例えば血液脳関門によって）に到達しない活性化合物又は医薬品によっても解決可能である。さらには、ＣｌＣ−は破骨細胞の膜内の骨劣化・破壊においてその役割を発揮するが、神経細胞の細胞内小胞に存在するので、細胞内に侵入することが無く、従って特異的に破骨細胞発現ＣｌＣ−７に作用する医薬を設計すればよい。
【０００９】
本発明はまた、神経系におけるシナプス伝達が塩素チャンネルの阻害又は刺激によって影響を受け得るという過程に基くものである。シナプス伝達への介入は、神経疾患及び神経筋肉疾患を治療するために広く用いられている薬理学の原理の一つである。トランスポーターのシナプス小胞内への相当した取り込みに影響を及ぼすか又はシナプス裂から当該細胞内への分泌神経伝達物質の再取り込みに影響を及ぼす医薬を使用するのである。神経伝達物質のシナプス小胞への取り込みは、その膜内に位置するトランスポーターを介して行われるのであるが、かかるトランスポーターは、通常は小胞膜を通過するプロトンの電気化学的勾配と結合し、かかる勾配によって駆動される（参考文献（８１）及び（８２）を参照のこと）。かかる勾配を変化させた場合、伝達物質の取り込みは、変更されることになり、而も場合によっては差別的に変更される。一方では、特殊なＣＬＣチャンネルは、神経細胞又はシナプス小胞の特別な副次集団においてのみ存在する可能性があり（例えば特別な伝達物質について）、他方ではプロトンの電気化学的勾配は、種々の伝達物質が結合する二つの成分（ΔｐＨ及びΔψ）から成る。かくしてアセチルコリンの取り込みは、主としてｐＨ勾配によって駆動され、一方グルタミン酸の取り込みは、主として電気的ポテンシャルによって駆動される。
【００１０】
シナプス小胞におけるプロトンの電気化学的勾配は、プロトンポンプ及び塩素チャンネルとによって組み立てられる。塩素の伝導度が存在すると、勾配の電流成分Δψが減少しまたΔｐＨは増加する。かくして、シナプス小胞内の塩素チャンネルを阻害することによって、ΔｐＨが減少するが、デルタψは増加する。その結果、例えば当該チャンネルが二つの型の小胞の双方に存在するとすれば、アセチルコリンの取り込みは減少するものの、グルタミン酸の取り込みは増加することになる。これとは逆に一つの具体的な実施態様に従えば、個別の塩素チャンネルを特異的に刺激することも見込まれるのである。このことによって、例えばグルタミン酸の取り込みが減少し且つアセチルコリンの取り込みが増加することになるであろう。
【００１１】
シナプス小胞内における神経伝達物質の濃度を調節することが出来る可能性以外に、このような物質はまた、細胞内部における小胞の輸送に、例えば細胞内取り込み及び細胞外放出に影響を及ぼし得る。このことは、ＣＩＣ−５  ＫＯの場合、細胞内取り込み通過が大幅に減少するという観察結果及び細胞内取り込みと細胞外放出の経路が、小胞ｐＨを下げることによって相当程度損傷され得るという事実とから当然に導かれる（報文（６９）ないし（７４）を参照）。
【発明の効果】
【００１２】
ＣｌＣ塩素チャンネルであるＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４、ＣｌＣ−６及び／又はＣｌＣ−７の活性を左右し且つ特にこれを阻害する物質で、圧倒的に細胞内に存在する物質はかくして、神経疾患及び神経筋肉疾患並びにその他の神経疾患のための治療薬剤、またＣｌＣの場合は骨粗しょう症、ページェット病及びその他の骨劣化性疾患のための治療薬剤として適している。本発明の文脈においては、これらのチャンネルタンパク質は従って、かかる疾患を治療するための物質を発見し且つ開発するために分子標的として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
幾つかの測定法が、かかる物質を発見し且つ試験するための方法として適している。本発明の一つの実施態様に従えば、当該物質と標的分子との結合は、当業者には公知の方法によって試験される。このために、チャンネルタンパク質は、内因により、例えば破骨細胞によって発現されるか又は非均質的に、例えば細菌類、酵母類又は哺乳動物細胞などにより発現されるものであり、精製される。適当なプロセスは、当業者にとっては公知である。本発明の一つの実施態様においては、当該物質と当該タンパク質との結合は、公知の方法である蛍光相関分光法及び蛍光強度分布分析法によって検討される（参考文献（８５）ないし（８８）を参照のこと）。又好ましい別の実施態様においては、かかる測定は、同様に公知の方法である、プラズモン共鳴測定法（参考文献（８９）ないし（９４）を参照のこと）によって実施される。また更なる別の実施態様においては、リガンドとＣｌＣチャンネルであるＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４、ＣｌＣ−６及び／又はＣｌＣ−７との結合が、標識化されたリガンドを使用することによって行われるが、かかる標識は、放射性であるか、蛍光であるか又は、同一であるが、標識化されないリガンドと比較した場合特異的に同定することが出来る他の標識である。
【００１４】
塩素チャンネルであるＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４、ＣｌＣ−６及び／又はＣｌＣ−７に作用する物質の同定を行うための、本発明に従った好ましい別の方法は、相当する塩素チャンネルタンパク質が、内因的に又は異種の態様のいずれかで機能的に発現される試験システムからなる。かかるシステムはまた、上記結合プロセスにおいて見出された物質を機能的作用・効果に関して試験するために適している。この場合、測定は、当該チャンネルタンパク質が有する機能を介して行われるのであるが、かかる機能は、独特のシステムにおいて電流、電位差又はｐＨ値を変化させるものであり、次にこれらの何れかを直接的に測定するか、又は検出システムに及ぼすこれらの影響・効果を測定するのである。本発明の好ましい別の実施態様においては、上記した測定は、当該チャンネルの野生型については行わず、例えばより研究し易い別のコンパートメント（例えば原形質膜）に存在していればよい変異型チャンネルタンパク質について行われるのである。
【００１５】
本発明の好ましいまた別の実施態様においては、ＣＩＣ−３、ＣＩＣ−４、ＣＩＣ−６及び／又はＣＩＣ−７の構造を使用して、分子模型作成によって当該チャンネルタンパク質に結合する物質を同定するか又は最適化してもよい。
【００１６】
塩素チャンネルであるＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４、ＣｌＣ−６及び／又はＣｌＣ−７に作用する物質の同定を行うための本発明に従った又好ましい別の実施態様は、相当するチャンネルタンパク質を機能的に発現させるが、他のチャンネルタンパク質は僅かな程度しか存在しないか又は全く存在しない試験システムから成る。かかるシステムは、上記結合プロセスで見出された物質を機能的作用・効果について試験するために適している。この場合、測定は、当該チャンネルタンパク質の機能を介して行われ、かかる機能は、独特のシステムにおいて電流、電位差又はｐＨ値の何れかを変化させるものであり、次にこれらの何れかを直接測定するか又は検出システムに及ぼす影響を測定するのである。
【００１７】
本発明の好ましい一つの実施態様においては、当該物質がチャンネルＣｌＣ−Ｘ（Ｘ＝３，４，６又は７である）に対して有する活性は、専ら又は好ましくは（圧倒的に）当該チャンネルＣｌＣ−Ｘ（例えば、ＣｌＣ−７は目下骨粗しょう症医薬品について研究探索中である）のみを発現する細胞又はその調製物（例えば膜調製物又は小胞）について測定するのである。
【００１８】
特異性は、例えば専ら又は好ましくは（圧倒的に）ＣｌＣ−７チャンネルのみを発現する細胞に対する試験物質の活性を測定することによって試験する。かかる細胞又は細胞株は、例えば塩素チャンネルをコードする核酸配列を含有する生殖細胞及び体細胞をヒト以外の哺乳動物、好ましくはげっ歯動物（特にマウス）から分離することによって得る。これらの細胞においては、当該塩素チャンネルをコードする核酸遺伝子の可能な限り多くのものをー特異的阻害剤を探索中である塩素チャンネルは除くー特定の塩素チャンネルが発現しないか又は非機能的に発現するように突然変異、切断、完全欠失及び／又は部分欠失によって修飾・変成させるのである。この文脈における非機能的とは、当該塩素チャンネルタンパク質が、塩素チャンネルの輸送機能が低減するか又は完全に抑制されるように発現せしめられることを意味する。かかる遺伝子修飾又は遺伝子工学的修飾はまた、ノックアウトとも称される。相当する遺伝子修飾されたマウス（ヒト以外の哺乳動物の一例として）はまた、ノックアウトマウス又はＫＯマウスと称される。天然の変異体は例えば、マウス及びヒトにおいてＣｌＣ−１チャンネルノックアウト生物として存在し、即ちＣｌＣ−１チャンネルの非機能的発現又は欠損発現が人口の一定の百分率で自然に存在し、その結果先天性性筋緊張症が生じる。ＣｌＣ−Ｋ１チャンネル又はＣｌＣ−ＫＢチャンネルのノックアウト生物の場合、尿崩症（マウスにおける）又はバーター(Barter's)症候群（ヒトにおける）が生起する。ヒトにおけるＣＩＣ−５のノックアウトは、デント病(Dent's disease)の原因となる。
【００１９】
ＣｌＣチャンネルに結合するか又はこれらを修飾する物質の特異性は、勿論その他の方法、例えば過剰発現によって得られるチャンネルタンパク質を単離したものを用いて測定することも出来る。相当するチャンネルタンパク質をコードする核酸配列のクローニング及び発現を行うための方法は、当業者には極めて詳細に公知となっている。更にはかかる特異性は、適当な測定法、例えば当業者には公知である“pit assay”（下記を参照）を使用することによって直接測定することが出来る。
【００２０】
イオンチャンネル類及び特に塩素チャンネル類の実験的作成ノックアウトは、当業者には公知であり、例えば付属書類において引用した報文（１）乃至（８）において記載されている。更には、塩素チャンネルをコードする核酸配列についての多くの修飾を行うことによって、当該タンパク質の機能又は発現が欠如することになることも知られている（報文（９）ないし（２４）を参照）。かかる塩素チャンネルの一般的構造構成及びトランスメンブラントポロジーは、図１の略図に示してある。例えば、ドメインＤ３及びＤ５におけるそれぞれの点変異によって、発現がかく乱されるか又は発現が欠如するに到るか、又は塩素チャンネルとしての特性を一切有さないタンパク質が発現されるに到る。同一の作用・影響が、ドメインＤ１０乃至Ｄ１２の領域での切断、又は一般的にはトランスメンブラン貫通ドメインでの切断によって実現することが出来る。塩素チャンネルをコードする遺伝子、即ち核酸配列も完全に欠失させるか又は別のタンパク質をコードする核酸配列によって置換する事も勿論行うことが出来、又は遺伝子発現を制御するプロモーター領域を変異させることが出来る。かかる遺伝子修飾の目的は、当該リボプローブ発現を抑制するか又は当該タンパク質の非機能的発現に影響を及ぼすことである。又はその代わりに、遺伝子工学による修飾によって、トランスポート機能は全く抑制することなくただ単に塩素チャンネル機能の制限をもたらすに過ぎない、所謂ノックダウンもまた可能である。かかるノックダウンストラテジーは、当業者には充分公知であって、例えばアンチセンスストラテジ―又はリボザイムストラテジー、即ちアンチセンスオリゴヌクレオチッドリボザイムを用いたノックダウンを包含するが、これらに限定されるわけではない。かかるノックダウンにおいて使用する方法は、さらに詳細には付属書類において挙げた報文（２５）ないし（３６）において記載されており、ここで明白に言及しておく。
【００２１】
本発明の文脈において、遺伝子修飾したヒト以外の哺乳動物（げっ歯動物、特にマウス）から製作した体細胞株、及び相当する塩素チャンネルＣｌＣｘｘｘの発現がその後体細胞株のゲノム変異によって低減されるか又は廃棄されている細胞株及び／又は当該チャンネルの発現が例えばアンチセンス技術又はリボザイム若しくはＲＮＡｉストラテジーなどその他の方法によってダウンレギュレーションされたものである細胞株を使用することが可能である。かかるダウンレギュレーション又は発現の減少もまた特に誘導可能であり、かくして細胞の生存に係わる種々の問題や同時に幾つかの塩素チャンネルをスイッチすることから派生するその他の問題を防止し又は低減させることが出来る。
【００２２】
塩素チャンネルに特異的な作用を目的として種々の物質を同定しまた試験することは、好ましくは遺伝子修飾したヒト以外の哺乳動物又は好ましくは二つ又は三つの塩素チャンネルが発現していないか又は非機能的にしか発現していない細胞株を用いて行う。塩素チャンネルＣｌＣ−７の場合は、この塩素チャンネルの発現は、障害されるべきではなく、その結果例えばＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４、ＣｌＣ−５及びＣｌＣ−６から成る群から選択される一種又はそれ以上の塩素チャンネルのノックアウト又はノックダウンが生起しなければならない。相当する条件も、特異的に別のチャンネルに作用する物質を同定し又試験する場合にも適用される。即ち、ＣｌＣ−４に関する試験の場合、ＣｌＣ−４チャンネルのみを発現する細胞株を確立しなければならない。っかる物質の試験は、そのままかかる細胞又はかかる細胞から得られた調製物、例えば小胞、膜調製物、特にシナプス小胞調製物又は未精製のタンパク質について行うことが出来る。かかる調製物の単離方法は、当業者にとっては充分公知である。
【００２３】
特定の塩素チャンネルに対する作用の特異性を試験するには、一方では当該物質を発見する目的のために上記したように、試験する細胞間コンパートメント内にかかる特定の塩素チャンネルを主として又は専ら含む細胞株を使用するか、又はかかる細胞株から誘導した上記調製物を使用する。これらの細胞株又は誘導させた調製物で期待通利の作用を示した物質は、次いで当該チャンネルを有さない細胞株又はその誘導調製物について試験する。かかる物質が特異的である場合は、この細胞株には影響を一切及ぼさない。さらに特異性の高い測定法を、対象チャンネルに応じて引き続いて行う。例えばＣｌＣ−７チャンネルに及ぼす影響・効果が骨粗しょう症に関連する場合、培養した野生型（ＷＴ）の破骨細胞を“pit assay”（報文（５２）乃至（５８）を参照）明確な、ぞうげ質、骨又はその他の適当な基質について試験し、また例えば基質内での孔の形成について検討を行うか、又は吸収骨小腔の酸性化について適当な染料（例えば、アクリジンオレンジなど）を用いて検討すればよい（報文（５９）乃至（６１）を参照）。
【００２４】
シナプス小胞の塩素チャンネル（例えばＣｌＣ−３など）の阻害が目的であれば、精製した懸濁状態のシナプス小胞の酸性化を次の工程で染料を用いて測定すればよい（報文（６２）乃至（６４）を参照）。当該チャンネルの阻害は、酸性化速度の抑制として現れるので、その特異性は、相当するＫＯマウスからシナプス小胞を単離することによってチェックすることが出来る。当該物質は、これらマウスから単離したシナプス小胞の酸性化速度には一切影響を及ぼすべきではない。更なる別の工程においては、特定タイプのシナプス小胞に対する特異性は、当該物質の存在下又は不存在下でシナプス小胞における神経伝達物質（例えば放射性標識化した）の取り込みを測定することによって試験すればよい。相当する方法は、当業者にとっては充分に公知である（例えば報文（６６）乃至（６８）を参照）。
【００２５】
体細胞株は、ＫＯマウスの種々の組織から単離することが出来るが、当該材料は、可能な限り無菌状態として、天然状態又は酵素消化を行った後、栄養培地（例えばダルベッコＭＥＭ，好ましくは少なくとも当初は抗生物質を添加して）を入れた適当な細胞培養容器（例えば、皿など）内にいれて、3７℃、５％ＣＯ2として培養する。これらの細胞を細胞培養の標準技法を用いて増殖させるが、本発明のある具体的な実施態様に従えば、当該細胞株は、適当な遺伝子（例えば、ＳＶ４０ｌａｒｇｅＴ抗原、又はテロメラーゼ）でトランスフェクションすることによって不死化する（例えば、報文（３７）乃至（３９）を参照）。又はその代替法として、ＫＯマウスを適当な不死化遺伝子（例えば、immorto mouse、例えば報文（４０）乃至（４２）を参照、やこれらの遺伝子を可能ならば誘導プロモータの制御下で発現するその他のマウス（報文（４３）を参照））を発現するマウス系と交雑させればよい。
【００２６】
具体的には、これらの細胞株はさらに、直接的又は間接的に当該測定法の指示薬として機能するタンパク質を発現する適当な遺伝子構築物をトランスフェクトさせることによって試験システムとして開発することが出来る。例えば、特定のタンパク質配列シグナルに基いて特異的に特定のコンパートメント内に移動させられるキメラタンパク質を発現させることも可能である。かかるキメラユニットの他の部分は、例えば特定のＧＦＰ変異物（例えば報文（４４）乃至（４６）を参照）などｐＨ感受性の蛍光タンパク質などの適当な指示薬タンパク質か、又は指示薬物質、例えば抗体（報文（４９）を参照）、又はビオチン結合染料（報文（４７）を参照）などをこれらのコンパートメント内に移動させるための結合部位を含有する（報文（４４）乃至（５１）を参照）。
【００２７】
かくして本発明の一つの具体的な実施態様は、上記したヒト以外の哺乳動物又は体細胞株（ヒト又はヒト以外の由来の）をシナプス伝達に作用する物質を同定するために使用する方法に係わる。塩素チャンネルであるＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４、ＣｌＣ−６及び／又はＣｌＣ−７の活性を阻害するか又はその他の態様で影響を及ぼす（例えば、その制御・調節作用を活性化するか又は修飾する）物質、特に神経疾患又は神経筋肉疾患及びその他の神経疾患を治療する又は向精神薬として適している物質を同定し又試験するための試験システム及び方法が、提供されるのである。
【００２８】
骨粗しょう症の治療に有用である化合物は、ＣｌＣ−７に影響を及ぼす有効性においてその他の化合物とは識別・区別される。即ち、例えば、ＣｌＣ−３（これは、シナプス小胞に存在する）に対して活性な化合物は、骨粗しょう症の細胞外酸性化には干渉しないはずである。他方では、ＣｌＣ−７に作用する物質は、選択的には、脳血液関門を通過出来ず、従ってＣＮＳにおいて作用を発揮しないように修飾することが出来る。かかる方法は、当業者にとっては充分公知となっている。当該物質は、特異的にある種の神経細胞群に向かわせる（配向させるか又は篩い分ける）か又は当該物質は先ず神経細胞の特異的サブセット内に存在する特異的酵素によって活性物質に代謝させることも考えられる。
【００２９】
特異性に関する試験は、上記したように特定の塩素チャンネル型のみを発現する適当な細胞株を用いて、その細胞由来の調製物（上記を参照）について実施するか、又は例えば培養中の破骨細胞など特異的試験システムにおいて若しくはＷＴ又はＫＯ動物由来のシナプス小胞調製物について実施することが出来る。
【００３０】
本発明は、具体的には塩素チャンネルであるＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４、ＣｌＣ−６及びＣｌＣ−７から成る群から選択される一種のタンパク質をコードする核酸配列であって、突然変異、切断又は完全な若しくは部分的な欠失によって修飾される該核酸配列に係わる。
【００３１】
本発明は更には、塩素チャンネルであるＣｌＣ−１、ＣｌＣ−２、ＣｌＣ−Ｋａ、ＣｌＣ−Ｋｂ、ＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４、ＣｌＣ−６及び／又はＣｌＣ−７から成る群から選択される一種のタンパク質をコードする核酸配列を含む遺伝子修飾された、ヒト以外の哺乳動物、その配偶子又は体細胞であって、ＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４、ＣｌＣ−６及び／又はＣｌＣ−７をコードする該核酸配列が、突然変異、切断及び／又は完全な若しくは部分的な欠失によって修飾される（天然に存在する核酸配列を基準として）ことを特徴とする、前記哺乳動物、その配偶子又は体細胞に係わる。
【００３２】
本発明の一つの好ましい実施態様に従えば、該遺伝子修飾された、ヒト以外の哺乳動物は、更にＣｌＣ−１、ＣｌＣ−２、ＣｌＣ−Ｋａ、ＣｌＣ−Ｋｂ及び／又はＣｌＣ−５をコードする核酸配列であって、突然変異、切断及び／又は完全な若しくは部分的な欠失によって修飾される前記核酸配列を含むのである。
【００３３】
本発明に従えば、ＣｌＣ−１、ＣｌＣ−２、ＣｌＣ−Ｋａ、ＣｌＣ−Ｋｂ、ＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４、ＣｌＣ−６及びＣｌＣ−７から成る群から選択される一種又はそれ以上の塩素チャンネルを発現しない体細胞株は、具体的にはげっ歯動物また特に好ましくはマウスである哺乳動物から樹立されるか又は誘導される。既述したように、これらのヒト以外の哺乳動物からは、例えば小胞やその他の膜調製物、特にシナプス小胞調製物などの、当該塩素チャンネルに関連して適当な発現パターンを有し、従ってＫＯ動物又は細胞株そのものと同様に適している調製物を誘導することも可能である。
【００３４】
本発明は更には、体細胞株であって、塩素チャンネルであるＣｌＣ−１、ＣｌＣ−２、ＣｌＣ−Ｋａ、ＣｌＣ−Ｋｂ、ＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４、ＣｌＣ−６及びＣｌＣ−７、特にＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４、ＣｌＣ−６及びＣｌＣ−７から成る群から選択される塩素チャンネルの発現が、当該体細胞株のゲノム修飾によって低減されている、及び／又は当該チャンネルの発現が、例えばアンチセンス技術又はリボザイムストラテジーなどの他の方法によってダウンレギュレーションされる、前記体細胞株にも係わる。かかるダウンレギュレーションは、当該細胞の生命力に関した諸問題及び幾つかの塩素チャンネルを同時にスイッチすることによって生じる諸問題を防止するか又は低減するために誘導可能である。
【００３５】
上記下細胞株は、またヒト由来であってもよい。
【００３６】
本発明は更には、生殖細胞及び体細胞が、塩素チャンネルＣｌＣ−１、ＣｌＣ−２，ＣｌＣ−Ｋａ、ＣｌＣ−Ｋｂ、ＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４，ＣｌＣ−５、ＣｌＣ−６及び/又はＣｌＣ−７から成る群から選択される一種のタンパク質をコードする核酸配列―該核酸配列の一種又はそれ以上が、突然変異、切断、又は完全な若しくは部分的な欠失によって修飾される（天然の核酸配列を基準として）―を含有する、遺伝子修飾された、ヒト以外の哺乳動物を、該塩素チャンネルの一種又はそれ以上を阻害するのに適している物質を同定し且つ試験するために使用する方法にも係わる。
【００３７】
塩素チャンネルＣｌＣ−１、ＣｌＣ−２，ＣｌＣ−Ｋａ、ＣｌＣ−Ｋｂ、ＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４，ＣｌＣ−５、ＣｌＣ−６及び/又はＣｌＣ−７から成る群から選択されるタンパク質をコードする核酸配列の一種又はそれ以上が、突然変異、切断、又は完全な若しくは部分的な欠失によって修飾される（天然の核酸配列を基準として）が、何れの場合もＣｌＣ−７、ＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４又はＣｌＣ−６をコードする配列の一種が修飾されず、その結果当該塩素チャンネルが通常に、即ち機能的に発現されるようにした哺乳動物である。
【００３８】
哺乳動物の代わりに、上記した細胞株（ヒト及びヒト以外の）又はかかる細胞株から誘導した調製物もまた使用することが出来る。
【００３９】
最後に本発明は、塩素チャンネルＣｌＣ−３，ＣｌＣ−４，ＣｌＣ−５，ＣｌＣ−６及びＣｌＣ−７から成る群から選択される一種又はそれ以上の塩素チャンネルの活性について阻害するか又はその他の態様で影響を及ぼす、即ち例えばその調節を活性化するか又は変更修飾するのに適している物質を同定し且つ試験するための方法に係わる。この方法において、ＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４、ＣｌＣ−６及びＣｌＣ−７から成る群から選択される一種の塩素チャンネルのみを発現する細胞株又は細胞（又はこれらから誘導される調製物、特に例えば小胞などの膜調製物；上記を参照）について、当該チャンネルを発現するコンパートメントの内腔ｐＨ及び/又は該塩素チャンネルを囲繞する膜の内外電位差を測定するのである。これらの細胞株又は細胞を試験するべき物質と接触させ、次いで当該チャンネルを発現するコンパートメントの内腔ｐＨ及び/又は該塩素チャンネルを囲繞する膜の内外電位差を再度測定する。これら物理的パラメーターの一つ又はその双方における変化が、当該試験物質が対象とするチャンネルに影響を及ぼすことを意味する。ｐＨの増加は、当該塩素チャンネルを（部分的に）障害するか又は（部分的に）阻害することを意味する。ｐＨ値の低下は、コンパートメントの酸性化を示し、従って当該塩素チャンネルを活性化する物質を示すのである。電位差の上昇を測定した場合は同様に、当該塩素チャンネルを（部分的に）障害するか又は（部分的に）阻害することを意味する。ｐＨ値の降下は、当該塩素チャンネルを活性化する物質を示すのである。対象とする塩素チャンネルに影響を及ぼす能力に関するある物質の活性は、これらの一つ又は二つの物理パラメーターを変化させるために添加した物質の濃度が低ければ低いほど、それだけ高くなる。
【００４０】
本発明の方法は、塩素チャンネルの活性の変化が、当該塩素チャンネルを発現するコンパートメントの内腔ｐＨ及び/又は当該塩素チャンネルを囲繞する膜の内外電位差を変化させることが出来る、という原理に基くものである。塩素チャンネルは、プロトンポンプの電荷補償を同一小胞内で生起させることが出来（例えば細胞内取り込みや細胞外放出について）、かくしてポンプ出力を高め、従って当該コンパートメントの酸性化を大きくするという効果を有する。同時に、膜の内外電位差を低くする。塩素チャンネルの阻害又はスイッチオフが生起すると、酸性化が低下しまた電位差は大きくなるが、塩素チャンネルの活性を刺激することによって、酸性化は高くなりまた電位差は低下することになる。本発明においては、試験するべき物質が相当する塩素チャンネルに及ぼす影響は、細胞内コンパートメントの酸性化及び/又は電位差の変化という一つ又はそれ以上の効果・影響によって間接的に測定するのである。好ましい使用方法においては、ある特定の塩素チャンネルに対する特異的物質を同定するために、測定を行うコンパートメントは、試験の対象となる塩素チャンネルを可能な限り一種類だけ含むものとするべきである。塩素チャンネル特異性は、別の塩素チャンネルを発現する細胞株を用いて対照試験を行うことによって証明される。コンパートメントが一種類以上の塩素チャンネルを発現する場合は、上記したように別のＫＯ細胞株又はマウスについて行う必要がある。
【００４１】
塩素チャンネルＣｌＣ−３，ＣｌＣ−４，ＣｌＣ−５，ＣｌＣ−６及びＣｌＣ−７から成る群から選択される一種又はそれ以上の塩素チャンネルを阻害するのに適している物質を同定し且つ試験するための、本発明に係わる方法は、下記を特徴とするものである：
ａ）上記した塩素チャンネルの内の一種のみ又は主として若しくは圧倒的に一種のみを発現する細胞について、当該チャンネルを発現するコンパートメントの内腔ｐＨ及び/又は該チャンネルを囲繞する膜の内外電位差を測定すること、
ｂ）該細胞を一種の物質と接触させること、及び
ｃ）当該チャンネルを発現するコンパートメントの内腔ｐＨ及び/又は該チャンネルを囲繞する膜の内外電位差を測定すること、
かくして該物質の添加の前後における該ｐＨ及び/又は膜電位差の差によって、該物質の有効活性度を測定し、求めること。
【００４２】
既述したように、一つの変法は、細胞内小器官のｐＨを直接測定するか又はｐＨの変化の結果生じる細胞影響を測定することから成る。幾つかの方法が、ｐＨ測定を行うために実行可能である。例えば、染料の蛍光がｐＨ依存性であるか又は細胞を染料又はその前駆体と一緒に培養した場合特定のｐＨ値でコンパートメント内に選択的に濃縮されるような染料がいくつかある（例：アクリジンオレンジ、Lysotrackerやその他の染料、Molecular Probes, Eugene, Oregon, USAから販売）。特定のコンパートメントに対する特異性を上げるのは、例えば染料の細胞内取り込みによて実現することが出来る（取り込み時間、速いか又は遅いかに応じて、リソソームコンパートメントに到るまで細胞内取り込みコンパートメントを染色すること；例えば報文（７１）、（７５）、（７６）を参照）。更に特異性を上げることは、染料を結合分子基（例えば特異的抗体又はビオチンなど）を介して特定の標的分子に結合させることによって実現出来るが、かかる標的分子は、大量に又は専ら特定のコンパートメント内において存在する、即ち該細胞株において発現されている（例えば永久トランスフェクションによって）ものであり、かかる細胞株を当該染料と接触させるのである。これらの標的分子は、分子細胞生物学の方法によって、例えば分子を細胞のある適当な装置を経由して特定のコンパートメント内に指向させる標的制御シグナルを分子生物学的方法によって相当する結合モチーフに融合させ、次いで当該物質を試験するために使用した相当する細胞株内においてかかる遺伝子構築物を発現させることによって調製することも出来る。かかる技法を用いて、検討対象のチャンネルを含むコンパートメントのみを重点的に又は極めて特異的に検査し且つ測定することが可能である。特定のｐＨである（例えば、アクリジンオレンジ又はMolecular Probes社製のLysotracker)コンパートメント内に特定物質が集積すること又はコンパートメント内でのｐＨ依存性反応を利用して指示薬物質（例えばｐＨ依存性タンパク質分解切断により）を生成させて、検出し易くした（例えば染料を用いて（報文（９５）及び（９６）を参照。尤も検出はこれにのみ限定されない）間接的試験方法もまた、更なるｐＨ測定方法として使用することが出来る。
【００４３】
又はその代わりに又は更には、これらコンパートメント内の膜電位は、例えば電位感受性染料（例えば報文（６７）を参照）により測定することが出来る。又はその代わりに、特異的に配向させるか又はふるい分けすることが可能である、タンパク質をコードする電位センサーもこの場合使用可能である。
【００４４】
本発明は、骨粗しょう症又はページェット病を治療するための医薬を製造するため、及び神経疾患、神経筋疾患及びその他の疾患を治療するための医薬を製造するため並びに向精神薬を製造するために適している活性化合物を同定し且つ試験することが出来る試験システムを始めて提供するものである。本発明は従って、骨粗しょう症又はページェット病を治療するための医薬を製造するために塩素チャンネルＣＩＣ−７を完全に又は部分的に阻害する物質を使用する方法、及び神経疾患、神経筋疾患及びその他の疾患を治療するための医薬又は向精神薬を製造するために塩素チャンネルＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４、ＣｌＣ−６及び／又はＣｌＣ−７を完全に又は部分的に阻害する物質を使用する方法にも係わるのである。本発明は、更には、塩素チャンネルＣｌＣ−７を完全に又は部分的に阻害する物質を一種類又はそれ以上含んで成る、骨粗しょう症又はページェット病を治療するための医薬組成物（医薬品）、及び塩素チャンネルＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４、ＣｌＣ−６及び／又はＣｌＣ−７を完全に又は部分的に阻害する物質を一種類又はそれ以上含んで成る、神経疾患、神経筋疾患及びその他の疾患を治療するための医薬及び向精神薬にも係わるのである。これらの医薬は、薬学的に許容される担体物質と共に経口又は静脈内投与するために適当な製剤中にかかる活性化合物を含んで成る。
本発明を、実施例を記載してさらに詳細に説明する。
【実施例１】
【００４５】
ＣｌＣ−７を例としたノックアウト動物を作製するためのプロトコール
ＣｌＣ−７ノックアウトマウスを当業者にとっては公知でありまた特に方法記載の成書（例えば、報文（７８）を参照）に詳細に記載されている標準方法によって作製した。この技法は、幾つかの工程を必要とする。第一の工程においては、標的遺伝子（この場合、ＣｌＣ−７チャンネルをコードする遺伝子を含んだ、マウスのゲノム配列）以外に、適当な選択マーカーを含むＤＮＡ構築物を作製。第二の工程においては、標的遺伝子の対立遺伝子をマウスの多能性胚幹細胞においてこのＤＮＡ構築物を用いて相同組換え法により修飾するのであるが、この際対立遺伝子が最早や機能タンパク質をコードしないように修飾する。第三の工程においては、これらの組換え胚幹細胞をマウスのマウスの胞胚内に注入し、次いで擬似妊娠中の養育母（マウス）の子宮内に移植する。養育母マウスは子孫を産むが、これらはキメラである。即ち注入された幹細胞から生じた遺伝学的に修飾された細胞以外に通常の、遺伝学的操作を受けていない注入胞胚の細胞をも含むものである。これらのキメラマウスは、通常の“野生型”（ＷＴ）マウスとペアリングさせる。生まれた子孫は、遺伝学的に修飾された、即ち機能的に破壊された遺伝子が、生殖系統を介して遺伝されているか否かについて試験（例えばサザンブロッティング又はＰＣＲ技法によって）を行う。ポジティブである場合は、これらは、二つの染色体の一方にある当該チャンネル遺伝子が破壊されている、ヘテロ接合動物である。ヘテロ接合動物は、相互に交雑させて、最終的に相当するチャンネル遺伝子が染色体双方において破壊されているホモ接合ノックアウト動物が得られる。
【００４６】
ＣＩＣ−７ノックアウトマウスの場合は、当該遺伝子構築物は、以下のようにして作製した：ラットｃＤＮＡプローブ（報文（７９）において報告されたタンパク質配列）；タンパク質及びｃＤＮＡに対するAccession No.: Z267744 GenBank)を用いて、マウス系統１２９／ＳｖのベクターλＦＩＸＩＩ(Strategene, 11011 North Torrey Pines Road, La  Jolla, CA92037, USA)における市販のゲノムファージをプレートアウト、フィルターのストリップオフ及び放射性標識ｃＤＮＡプローブでハイブリダイゼーションから成る標準方法によって走査した。ハイストリンジェンシー条件下でハイブリダイズさせた幾つかのファージクローンを単離し、精製し次いで制限地図作成、部分配列決定及びＰＣＲによる選択断片の増幅から成る標準方法によって解析した。エクソン２（報文（８０）を参照）を含む、ＣＩＣ−７のゲノム配列のうちサイズがほぼ１４ｋｂである一断片を含んだゲノムクローンを、この遺伝子構築物を作製するために選択した。この目的のために、かかるゲノムクローンを二種類の制限酵素、ＢｇＩＩＩ及びＢｓｒＧＩ、を用いて消化したところ、コードエクソン３，４，５，６及び７を含む配列の一部が除去された。この一部分は、ホスホグリセリン酸塩プロモータで駆動されるネオマイシン耐性カセットを含むサイズがほぼ１．６ｋｂのＤＮＡ断片で、標準操作方法を用いて適当な酵素反応により当該カセットをゲノム配列内に結合することによって置換した。この遺伝子構築物を含む相応したベクターで細菌を形質変換した後、正しい遺伝子構築物を有する細菌コロニーを単離し、次いでＤＮＡを抽出し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後で、チミジンキナーゼカセットをこの遺伝子構築物の５’末端に接続し、ネガティブ選択を行った。再度形質変換を行い、改めて作製した遺伝子構築物を単離してチェックした後、多能性胚性幹細胞（マウス）遺伝子構築物でエレクトロポレーションによりトランスフェクトし、プレートアウトして、適当な培養条件下（分化を防止するため白血病阻害因子（ＬＩＦ）の存在下での“feeder layers”培養）で増殖させた。得られた細胞をＧ４１８（ネオマイシン耐性カセットの存在で選別）で及びガンシクロビル（チミジンキナーゼカセットの欠落で選別）で選別した。耐性クローンを単離し、引き出しして、サザーンブロット解析法によってＣＩＣ−７遺伝子座上の相同組換えについて解析した。染色体上のＣＩＣ−７遺伝子が破壊された（即ち、エクソン３−７が、ネオマイシンカセットで置換された）正しいクローンを増殖させて、次に上記したようにマイクロマニピュレータによる顕微鏡コントロール下でマウス胚胞内に注入することによってエクスパンドさせた。それ以降の操作は、上記した通りであった。この遺伝子修飾は生殖系列を介して遺伝されたので、かくしてＣｌＣ−７ノックアウトマウスが作製されたのである。ＣｌＣ−７チャンネルタンパク質の欠落は、ＣｌＣ−７のアミノ末端ペプチドに対して産生・確立させた特異的抗体を用いて証明した。かかるＣｌＣ−７ＫＯマウスは、思いがけなくも網膜変性及び中枢神経系における幾つかの退化性変化の徴候を伴なう強力な骨粗しょう症の表現型を示した。
【実施例２】
【００４７】
ＣｌＣ−３ＫＯマウスの作製
実施例１において記載したと同様の方法で、第一のトランスメンブラン領域（報文（８３）乃至（８４）を参照）における配列をコードするエクソン３を欠失させたＣｌＣ−３ＫＯマウスを作製した。この遺伝子構築物によって更には翻訳において時期尚早の停止が行われ、その結果極めて小型の切断タンパク質が予測された。ＣｌＣ−３タンパク質は、ＣｌＣ−３のアミノ末端ペプチドにたして産生させた特異的抗体を用いてもこのＫＯマウスには最早や検出されることは無かった。このＣｌＣ−３ＫＯマウスは、海馬の変性及び網膜の変性を示した。このＣｌＣ−３塩素チャンネルは、細胞内の、エンドソームコンパートメント及びシナプス小胞内において存在することを証明することも可能である。ｐＨ測定の結果、ＣｌＣ−３の欠落によってシナプス小胞の酸性化が低下したことが明らかとなった。
参考文献
【００４８】
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【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】Scmidt-Rose及びJentsch (T. Scmidt-Rose及びT.J. Jentsch, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 (1997): 7633-7638)の生化学研究に従ったトランスメンブラントポロジーモデル。Ｎ−及びＣ−末端は、細胞内に位置する。ＣＩＣ−Ｏの当初のHydropathy analysisの結果、１３個までの膜貫通領域（Ｄ１−Ｄ１３）が存在することが明らかとなっている。幾つかの原核細胞のＣＩＣは別として、既知の全てのＣＩＣタンパク質は、Ｃ末端上に二つのＣＢＳ領域を有する(A.Bateman, Trendds Biochem. Sci. 22 (1997) 12-13及びC.P. Ponting, Mol. Med. 75 (1997) 160-163)。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年3月14日(2003.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣｌＣ−１、ＣｌＣ−２，ＣｌＣ−Ｋａ、ＣｌＣ−Ｋｂ、ＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４，ＣｌＣ−５、ＣｌＣ−６及びＣｌＣ−７から成る群から選択される一種又はそれ以上の塩素チャンネルを発現しないか又は低減した範囲でしか発現しない細胞株。
【請求項２】
塩素チャンネルＣｌＣ−７を発現するが、塩素チャンネルＣｌＣ−３，ＣｌＣ−４，ＣｌＣ−５及びＣｌＣ−６は発現しない、請求項１において記載された細胞株。
【請求項３】
塩素チャンネルＣｌＣ−３を発現するが、塩素チャンネルＣｌＣ−４，ＣｌＣ−５，ＣｌＣ−６及びＣｌＣ−７は発現しない、請求項１において記載された細胞株。
【請求項４】
塩素チャンネルＣｌＣ−４を発現するが、塩素チャンネルＣｌＣ−３，ＣｌＣ−５，ＣｌＣ−６及びＣｌＣ−７は発現しないことを特徴とする、請求項４において記載された細胞株。
【請求項５】
塩素チャンネルＣｌＣ−６を発現するが、塩素チャンネルＣｌＣ−３，ＣｌＣ−４，ＣｌＣ−５及びＣｌＣ−７は発現しないことを特徴とする、請求項４において記載された細胞株。
【請求項６】
核酸配列の一種又はそれ以上が、天然の核酸配列を基準として突然変異、切断、又は完全な若しくは部分的な欠失によって修飾されることを特徴とする、生殖細胞及び体細胞が、塩素チャンネルＣｌＣ−１、ＣｌＣ−２，ＣｌＣ−Ｋａ、ＣｌＣ−Ｋｂ、ＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４，ＣｌＣ−５、ＣｌＣ−６及び/又はＣｌＣ−７から成る群から選択される一種のタンパク質をコードする核酸配列を含有する、遺伝子修飾されたヒト以外の哺乳動物を該塩素チャンネルの一種又はそれ以上を阻害するのに適している物質を同定し且つ試験するために使用する方法。
【請求項７】
塩素チャンネルＣｌＣ−７を阻害するのに適している物質を同定し且つ試験するために請求項２において記載された細胞株を使用する方法。
【請求項８】
骨粗しょう症又はページェット病を治療するための行こう活性化合物を同定し且つ試験することを目的とした、請求項７において記載された使用方法。
【請求項９】
塩素チャンネルＣｌＣ−３を阻害するのに適している物質を同定し且つ試験するために請求項３において記載された細胞株を使用する方法。
【請求項１０】
塩素チャンネルＣｌＣ−４を阻害するのに適している物質を同定し且つ試験するために請求項４において記載された細胞株を使用する方法。
【請求項１１】
塩素チャンネルＣｌＣ−６を阻害するのに適している物質を同定し且つ試験するために請求項５において記載された細胞株を使用する方法。
【請求項１２】
向精神医薬品として適している有効活性化合物を同定し且つ試験することを目的とした、請求項７又は請求項９乃至１１の内のいずれか一項において記載された使用方法。
【請求項１３】
下記の操作を行うことから成る、ＣｌＣ−３，ＣｌＣ−４，ＣｌＣ−５，ＣｌＣ−６及びＣｌＣ−７から成る群から選択される一種又はそれ以上の塩素チャンネルを阻害するのに適している物質を同定し且つ試験するための方法：
ａ）請求項１乃至５の内のいずれか一項において記載された細胞について、当該チャンネルを発現するコンパートメントの内腔ｐＨ及び/又は該チャンネルを囲繞する膜の内外電位差を測定すること、
ｂ）該細胞を一種の物質と接触させること、及び
ｃ）当該チャンネルを発現するコンパートメントの内腔ｐＨ及び/又は該チャンネルを囲繞する膜の内外電位差を測定すること、
かくして該物質の添加の前後における該ｐＨ及び/又は膜電位差の差によって、該物質の有効活性度を測定すること。
【請求項１４】
特定のｐＨによるか又は該コンパートメント内においてｐＨ依存態様で形成される指示物質の検出によって物質のコンパートメント内での蓄積量に基いて該ｐＨを測定することを特徴とする、請求項１３において記載された方法。
【請求項１５】
該電位差を電位差感受性染料又はタンパク質をコードした電位差センサーを用いて測定することを特徴とする、請求項１３において記載された方法。
【国際調査報告】
2004531227.tif 000078
2004531227.tif 000079
2004531227.tif 000080
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