(57)【要約】サイトカイン調節因子過剰発現細胞によって産生されるヒトサイトカイン混合物および産生方法が、開示される。この混合物は、サイトカイン調節因子の過剰発現条件下でヒトサイトカイン産生細胞を培養する工程、サイトカイン産生を誘導するためにこの細胞を処理する工程、およびこの細胞によって産生されたサイトカイン混合物を単離する工程によって、調製される。ヒトサイトカインの混合物を含む組成物であって、該ヒトサイトカインが、（ａ）サイトカインの混合物を産生し得るヒト細胞株を培養する工程であって、該ヒト細胞株がサイトカイン調節因子の過剰発現によって特徴付けられる、工程；（ｂ）該サイトカイン調節因子過剰発現細胞株を処理して、サイトカインの混合物の増強された産生をもたらす工程；および（ｃ）該培養されたサイトカイン調節因子過剰発現細胞株によって産生されたサイトカインを収集する工程；によって産生される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトサイトカインの混合物を含む組成物であって、該ヒトサイトカインが、以下：
（ａ）サイトカインの混合物を産生し得るヒト細胞株を培養する工程であって、該ヒト細胞株がサイトカイン調節因子の過剰発現によって特徴付けられる、工程；
（ｂ）該サイトカイン調節因子過剰発現細胞株を処理して、サイトカインの混合物の増強された産生をもたらす工程；および
（ｃ）該培養されたサイトカイン調節因子過剰発現細胞株によって産生されたサイトカインを収集する工程；
によって産生される、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、ここで前記サイトカイン調節因子過剰発現細胞株が、サイトカイン調節因子をコードする核酸配列を用いた形質転換によって産生される、組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物であって、ここで前記サイトカイン調節因子過剰発現ヒト細胞株が、サブクローニングおよび選択によって産生される、組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物であって、ここで処理する工程が、プライミングを意味する、組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物であって、ここで処理する工程が、プライミングおよび誘導を意味する、組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の組成物であって、ここで収集する工程が、選択されたサイトカインの同時精製によって、前記産生されたサイトカインを分画する工程を意味する、組成物。
【請求項７】
癌の処置における使用のための請求項１に記載の組成物であって、前記産生されるサイトカインが、以下：
インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターフェロン−ω（ＩＦＮ−ω）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、ナチュラルキラー増強因子（ＮＫＥＦ）、ナチュラルキラー細胞刺激因子（ＮＫＳＦ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる群より選択される２つ以上のサイトカインを含む、組成物。
【請求項８】
ウイルス感染の処置における使用のための請求項１に記載の組成物であって、ここで前記産生されるサイトカインが、以下：
インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターフェロン−ω（ＩＦＮ−ω）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる群より選択される、２つ以上のサイトカインを含む、組成物。
【請求項９】
炎症状態の処置における使用のための請求項１に記載の組成物であって、ここで前記産生されるサイトカインが、以下：
インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）およびトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）からなる群より選択される、２つ以上のサイトカインを含む、組成物。
【請求項１０】
ヒトサイトカインの混合物を含む組成物であって、該ヒトサイトカインが、以下：
（ａ）サイトカインの混合物を産生し得るヒト細胞株を培養する工程であり、該細胞株が抗アポトーシスタンパク質の過剰発現によって特徴付けられる、工程；
（ｂ）抗アポトーシスタンパク質過剰発現細胞株を処理して、サイトカインの混合物の増強された産生をもたらす工程；および
（ｃ）培養された、該抗アポトーシスタンパク質過剰発現細胞株によって産生されたサイトカインを収集する工程；
によって産生される、組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組成物であって、ここで前記抗アポトーシスタンパク質過剰発現細胞ヒト細胞株を改変または選択して、サイトカイン調節因子の過剰発現によってさらに特徴付けられる細胞株を得る、組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組成物であって、ここで前記抗アポトーシスタンパク質およびサイトカイン調節因子過剰発現細胞株が、サイトカイン調節因子をコードする核酸配列を用いる形質転換によって作製される、組成物。
【請求項１３】
請求項１１に記載の組成物であって、ここで前記抗アポトーシスタンパク質およびサイトカイン調節因子過剰発現細胞株が、サブクローニングおよび選択によって作製される、組成物。
【請求項１４】
細胞培養物においてヒトサイトカインの混合物を産生する方法であって、該方法が、以下：
（ａ）該ヒトサイトカインの混合物を産生し得るヒト細胞株を培養する工程；
（ｂ）該培養されたヒト細胞株を選択または改変する工程であって、ここでサイトカイン調節因子が、該細胞株によって過剰発現される、工程；
（ｃ）該培養されたサイトカイン調節因子過剰発現細胞株を処理して、サイトカイン産生をもたらす工程；および
（ｄ）該培養され、処理された細胞株によって産生される該サイトカインを収集する工程、を包含する、方法。
【請求項１５】
請求項１６に記載の方法であって、ここで前記サイトカイン調節因子過剰発現細胞株が、サイトカイン調節因子をコードする核酸配列を用いる形質転換によって作製される、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、ここで前記サイトカイン調節因子増強ヒト細胞株が、サブクローニングおよび選択によって産生される、方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法であって、ここで前記サイトカイン調節因子過剰発現細胞株がさらに改変されて、抗アポトーシスタンパク質を発現する、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、ここで処理する工程が、プライミングを意味する、方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法であって、ここで処理する工程が、プライミングおよび誘導を意味する、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、ここで前記サイトカインが以下：
（ａ）癌の処置における使用のための、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターフェロン−ω（ＩＦＮ−ω）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、ナチュラルキラー増強因子（ＮＫＥＦ）、ナチュラルキラー細胞刺激因子（ＮＫＳＦ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、のうちの２つ以上；
（ｂ）ウイルス感染の処置における使用のための、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターフェロン−ω（ＩＦＮ−ω）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、のうちの２つ以上；ならびに
（ｃ）炎症状態の処置における使用のための、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）およびトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）のうちの２つ以上、
からなる群より選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ウイルス感染、癌、炎症障害、他のサイトカイン応答性障害の処置における使用のためのサイトカインの選択された混合物を含む、ヒト細胞株によって産生される組成物およびこの組成物を産生する方法に関する。
【０００２】
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【０００３】
（発明の背景）
サイトカインは、癌、ウイルス感染、および炎症を含む、多くのヒトの病理の処置において有用である。特に、サイトカイン処置は、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）または組織壊死因子（ＴＮＦ）、等のような、単一の、単離されかつ一般には組換えのサイトカインを投与する工程を含む。いくつかの処置の効果が認められているが、改善の程度は、最適状態には及ばず、そしてこれらのサイトカインは、一般的に、１つ以上のさらなる処置様式と組み合わせて投与される。
【０００４】
単球、マクロファージ、Ｂ細胞、樹状細胞、ＴＨ１およびＴＨ２、肥満細胞、ＮＫ細胞ならびに骨髄細胞などの、サイトカインをインビボで産生する細胞は、サイトカインの複合混合物を代表的に産生する。従って、単独で投与された場合、単一のサイトカインが、十分に効果的ではなくても、驚くべきことではない。
【０００５】
従って、天然のサイトカインの混合物と類似する、インビボで産生されたサイトカインの混合物を含むサイトカイン組成物を、臨床上の使用のために、調製することが、所望され得る。高レベルのサイトカインを産生および分泌する細胞培養系においてそのようなサイトカイン混合物を産生することが、特に所望され得る。
【０００６】
特許出願番号第０９／５９５，３３８号およびその仮の先行出願は、サイトカイン調節因子過剰発現条件下およびサイトカイン誘導条件下で、サイトカイン産生ヒト細胞を増殖させることにより、高レベルのサイトカインを産生する細胞培養方法を開示する。本出願は、改善されたサイトカイン組成物を得る方法、およびサイトカインの混合物を含む組成物を使用する方法に関連する方法によって産生されたサイトカインの混合物に関する。
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、サイトカインの混合物を産生し得、かつサイトカイン調節因子および／または抗アポトーシスタンパク質の過剰発現によって特徴付けられるヒト細胞株を培養する工程、細胞株を処理し、サイトカインの混合物の増強された産生をもたらす工程、ならびにこの細胞によって産生されたサイトカインを収集する工程によって産生される、ヒトサイトカインの混合物を含む組成物を提供する。この細胞株は、プライミングまたはプライミングおよび誘導によって処理され得る。
【０００８】
サイトカイン調節因子過剰発現細胞株は、サイトカイン調節因子をコードする核酸配列および／もしくは抗アポトーシスタンパク質をコードする核酸配列を用いた形質転換によってか、またはサブクローニングおよび選択によって作製され得る。
【０００９】
ひとつのアプローチにおいて、このサイトカインは、選択されたサイトカインの同時精製によって、収集される。
【００１０】
癌の処置における使用のための本発明の１つの局面において、このサイトカイン混合物は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターフェロン−ω（ＩＦＮ−ω）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、ナチュラルキラー増強因子（ＮＫＥＦ）、ナチュラルキラー細胞刺激因子（ＮＫＳＦ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる群より選択される２つ以上のサイトカインを含む。
【００１１】
ウイルス感染の処置における使用のための本発明の別の局面において、このサイトカイン混合物は、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターフェロン−ω（ＩＦＮ−ω）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる群より選択される２つ以上のサイトカインを含む。
【００１２】
炎症状態の処置における使用のための本発明の別の局面において、このサイトカイン混合物は、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）およびトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）からなる群より選択される２つ以上のサイトカインを含む。
【００１３】
本発明はさらに、細胞培養においてヒトサイトカインの混合物を産生する方法を提供し、この方法は、サイトカインの混合物を産生し得、かつサイトカイン調節因子および／または抗アポトーシスタンパク質の過剰発現によって特徴付けられるヒト細胞株を培養する工程、この細胞株を処理し、サイトカイン混合物の増強された産生をもたらす工程、ならびにこの細胞によって産生されたサイトカインを収集する工程を包含する。この細胞株は、プライミングまたはプライミングおよび誘導によって処理され得る。
【００１４】
本発明の実施において、この方法は、癌の処置における使用のため、ウイルス感染の処置のため、および／または炎症状態の処置のために、上に示される選択されたサイトカインの混合物を産生するために用いられ得る。
【００１５】
本発明の、これらの目的および特徴ならびに他の目的および特徴は、以下の本発明の詳細な説明から、より完全に明らかになる。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
（１．定義）
他に示されない限り、本明細書中に使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明の当業者にとってそれらの用語が意味するのと同じ意味を有する。当該分野の定義および用語に関して、当業者は、特にＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ＦＭら、１９９３に導かれる。記載された特定の方法論、プロトコール、および試薬は、変化し得るので、本発明が、これらに限定されないことは、理解されるべきである。
【００１７】
用語「ベクター」は、本発明中に使用される場合、異なる宿主細胞の間を転移するように設計された核酸構築物をいう。「発現ベクター」は、外来細胞中で異種ＤＮＡフラグメントを組み込みかつ発現する能力を有するベクターをいう。多くの原核細胞発現ベクターおよび真核細胞発現ベクターが、市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。クローニングベクターまたは発現ベクターは、さらなるエレメントを含み得る（例えば、この発現ベクターは、２つの複製系（例えば、ヒト細胞における発現のための複製系ならびに原核細胞宿主におけるクローニングおよび増幅のための複製系）を有し、従ってそれが２種の生物において維持されるのを可能にし得る）。クローニングベクターおよび発現ベクターはまた、選択マーカーも代表的に含む。
【００１８】
本明細書中に使用される場合、用語「選択マーカーをコードするヌクレオチド配列」とは、哺乳動物細胞において発現し得、そしてそこでその選択マーカーの発現が、発現された遺伝子を含有する細胞に、選択的薬剤の存在下で増殖する能力を付与する、ヌクレオチドコード配列をいう。
【００１９】
本明細書中に使用される場合、用語「プロモーター」とは、下流遺伝子の転写を指向するように機能する核酸配列をいう。このプロモーターは、標的遺伝子が発現されている宿主細胞に一般的に適切である。このプロモーターは、他の転写調節核酸配列および翻訳調節核酸配列（「制御配列」）と一緒になり、所定の遺伝子を発現するために必要とされる。一般的に、転写調節配列および翻訳調節配列としては、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、ならびにエンハンサー配列またはアクチベーター配列が挙げられるが、これらに限定されない。プロモーターは、構成的であるかまたは誘導性であり得、そして天然に存在するプロモーター、操作されたプロモーターまたはハイブリッドプロモーターであり得る。ハイブリッドプロモーターは、１つ以上のプロモーターのエレメントを組み合わせ、当該分野において一般に公知であり、そして本発明の実施において有用である。
【００２０】
用語「制御配列」とは、特定の宿主生物における、作動可能に連結したコード配列の発現に必要とされるＤＮＡ配列をいう。原核細胞に適する制御配列は、代表的に、プロモーター、必要に応じてオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞が、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを用いることが、公知である。
【００２１】
「異種の」核酸構築物または「異種の」核酸配列は、それが発現される細胞にとってネイティブではない配列の一部を含む。制御配列に関して、異種とは、その発現が現在制御されている遺伝子と同じ遺伝子を、天然では制御するように機能しない制御配列（すなわちプロモーターまたはエンハンサー）をいう。一般的に、異種の核酸配列は、その細胞に対してか、またはそれらの核酸配列が存在するゲノムの一部に対して内因性でなく、そして感染、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等によってその細胞に添加されている。「異種の」核酸構築物は、天然の細胞中に見出される制御配列／ＤＮＡコード配列の組み合わせと同じかまたは異なる、制御配列／ＤＮＡコード配列の組み合わせを含み得る。
【００２２】
本明細書中に使用される場合、組換えＤＮＡ構築物またはベクターに関連する用語「作動可能に連結された」とは、選択されたコード配列を有効に制御するために互いに直接連結された、組換えＤＮＡ構築物またはベクターのヌクレオチド成分をいう。一般的に、「作動可能に連結された」ＤＮＡ配列は、連続していて、そして分泌リーダー配列の場合は、連続しかつリーディングフレームにあっている。しかし、エンハンサーは、連続している必要がない。連結は、簡便な制限部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合、これらの合成オリゴヌクレオチドアダプタまたは合成オリゴヌクレオチドリンカーは、従来の実行に従って用いられる。
【００２３】
本明細書中に使用される場合、用語「遺伝子」とは、ポリペプチド鎖の産生に関連するＤＮＡのセグメントを意味し、このセグメントは、コード領域の前および後ろの領域（例えば５’非翻訳（５’ＵＴＲ）配列または「リーダー」配列および３’ＵＴＲ配列または「トレーラー」配列）ならびに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含んでも含まなくてもよい。
【００２４】
「ベクターを用いてトランスフェクトされた細胞」とは、ベクターに曝され、そしてそのベクターによってコードされたタンパク質の発現を可能にする様式で、自己修復遺伝子エレメントのようにか、またはその細胞のゲノム中への組み込みによってかのいずれかで、ベクターを取り込んだ細胞をいう。その発現は、ベクター中の構成的プロモーターの制御下にあり得、その場合において、タンパク質の発現は、誘導剤の非存在下で起こるか、または、誘導性プロモーター（ベクター遺伝子の発現または高レベルの発現を達成するために培養培地中に誘導物質の存在を必要とする）の制御下で起こる。
【００２５】
本明細書中に使用される場合、「組換え」とは、異種の核酸配列の導入によって改変された細胞またはベクター、あるいはその細胞がそのように改変された細胞に由来すること、に対する言及を含む。従って、組換え細胞は、改変された遺伝子発現（天然の（非組換え）細胞内と同一な形態では見出されない遺伝子の発現、または意図的な人の介在の結果として別なふうに異常に発現されるか、過小発現されるか（ｕｎｄｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）、もしくは全く発現されない、天然の遺伝子の発現など）を示す。
【００２６】
本明細書中に使用される場合、哺乳動物細胞に関して、用語「形質転換された」、「安定的に形質転換された」または「トランスジェニック」とは、その哺乳動物細胞が、２世代以上にわたり維持される、ゲノムに組み込まれた非天然（異種の）核酸配列を有することを意味する。
【００２７】
本明細書中に使用される場合、用語「発現」とは、ポリペプチドが、遺伝子の核酸配列に基づいて産生される、プロセスをいう。このプロセスは、代表的に、転写および翻訳の両方を含むが、しかしある場合においては、翻訳なしでの転写をいい得る。
【００２８】
用語「サイトカイン調節因子の発現」とは、サイトカイン調節因子遺伝子の転写および翻訳をいい、その産物としては、前駆体ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後プロセシングされたポリペプチド、およびそれらの誘導体が挙げられ、そしてそれらは、マウスの酵素、サルの酵素のような他の種由来のサイトカイン調節因子を含む。
【００２９】
従って、用語「ＰＫＲ発現」とは、ＰＫＲをコードする核酸配列の転写および翻訳をいい、その産物としては、前駆体ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後プロセシングされたポリペプチド、およびそれらの誘導体が挙げられ、そしてそれらは、マウスの酵素、サルの酵素のような他の種由来のＰＫＲを含む。
【００３０】
本明細書に用いられる場合、用語「生物学的活性」および「生物学的に活性な」とは、培養物中の細胞株中の特定のタンパク質に帰する活性をいう。そのようなタンパク質の「生物学的活性」が、培養条件に依存して幾分か変化し得、かつ一般的には、活性の範囲として報告されることは、理解される。従って、タンパク質の「生物学的に不活性な」形態とは、そのタンパク質の公知の活性を防害する様式で改変されたタンパク質の形態をいう。
【００３１】
本明細書に用いられる場合、用語「サイトカイン調節因子の生物学的活性」および「生物学的に活性なサイトカイン調節因子」とは、特定のサイトカイン調節因子またはそのサイトカイン調節因子の任意のフラグメント、誘導体、もしくはアナログに関連する任意の生物学的活性（例えば、酵素活性など）をいう。
【００３２】
本明細書において用いる場合、用語「通常のレベルのサイトカイン調節因子の活性」および「通常のレベルのサイトカイン調節因子の発現」とは、改変されていないか、誘導されていないか、プライミングされていないか、または感染されていない特定の型の細胞（例えば、特定の型の親細胞株）において存在すると決定された、サイトカイン調節因子の発現または活性のレベルをいう。そのような「通常の」サイトカイン調節因子の活性または「通常の」サイトカイン調節因子の発現が、サイトカイン調節因子をコードする核酸配列の導入によって改変されていないか、またはサイトカイン調節因子の過剰発現について選択されていない所定の型の細胞について一般的に観測される、ある範囲のサイトカイン調節因子の活性または発現として報告されることが、理解される。
【００３３】
従って、用語「ＰＫＲの生物学的活性」および「生物学的学的に活性なＰＫＲ」とは、ＰＫＲ、またはＰＫＲのフラグメント、ＰＫＲの誘導体もしくはＰＫＲのアナログに関連する任意の生物学的活性（真核生物の翻訳開始因子２（ｅｌＦ−２）および転写因子（ＮＦ−κＢなど）のような基質のリン酸化を含む、自動リン酸化活性およびキナーゼ活性を特に含む、酵素活性など）をいう。
【００３４】
「通常の」サイトカイン調節因子の活性または発現の範囲は、培養条件に依存して幾分か変化し得る。例えば、Ｕ９３７細胞株は、Ｎａｍａｌｗａ細胞株のサイトカイン調節因子活性の通常範囲とは異なるサイトカイン調節因子の活性の通常範囲を有する。従って、サイトカイン調節因子の過剰発現とは、サイトカイン調節因子をコードする核酸配列の導入によって改変されていないか、またはサイトカイン調節因子の過剰発現について選択されていない、刺激されず（プライミングも誘導もされず）、かつ感染されていない所定の型の細胞で一般的に観測される、通常範囲のサイトカイン調節因子発現の範囲を超える発現レベルを意味する。
【００３５】
従って、サイトカイン調節因子の「過剰発現」とは、ＰＫＲのコード配列を含むベクターの導入により改変されていないか、またはＰＫＲの過剰発現について選択されていない、刺激されず（プライミングも誘導もされず）かつ感染されていない所定の型の細胞で一般に観測されるものより高い、サイトカイン調節因子の活性、発現または産生の範囲を意味する。
【００３６】
１つの好ましい局面において、サイトカイン調節因子の過剰発現とは、用いられる特定の培養条件下での同じ細胞株について、サイトカイン調節因子の活性、発現、または産生の通常のレベルよりも、少なくとも１２５％（１．２５倍または１．２５×）、好ましくは少なくとも１５０％、２００％、３００％、もしくは４００％、または５００％もしくはそれより高いレベルの、サイトカイン調節因子の活性、発現または産生を意味する。言いかえれば、サイトカイン調節因子を過剰発現する細胞株は、代表的に、サイトカイン調節因子の過剰発現を生じるのに効果的な様式での、選択も、改変も、プライミングも処理もされていない同じ型の細胞によって示されるサイトカイン調節因子の発現または産生のレベルよりも少なくとも１．２５倍そして好ましくは１．５倍（１．５×）、２倍（２×）、３倍（３×）、４倍（４×）、５倍（５×）またはそれより高いレベルのサイトカイン調節因子の産生または発現を代表的に示す。
【００３７】
ある場合においては、ＰＫＲのようなサイトカイン調節因子を過剰発現する細胞株は、用いられる特定の培養条件下で、サイトカイン調節因子の過剰発現を生じるのに効果的な様式での選択も、改変も、プライミングも処理もされていない同じ型の細胞によって代表的に示されるサイトカイン調節因子の発現または産生のレベルよりも１０倍（１０×）またはそれより高い、サイトカイン調節因子の発現または産生のレベルを示す。
【００３８】
本明細書中に使用される場合、活性、発現、および産生に関して、用語「通常レベルのサイトカイン」および「通常レベルのタンパク質」とは、サイトカイン調節因子の過剰発現を生じるのに効果的な様式での選択も、改変も、プライミングも処理もされていない、特定の型の親細胞において存在することが決定されたサイトカインもしくは他のタンパク質の活性、発現、または産生のレベルをいう。例としては、増強されたサイトカイン調節因子の活性、発現、産生を生じるのに効果的な様式での選択も、プライミングも処理もされていない、野生系の（「親」）細胞株、および導入されたサイトカイン調節因子コード配列を含まない細胞株が挙げられる。そのような「通常の」サイトカインもしくは他のタンパク質の活性、発現、または産生が、所定の型の細胞で代表的に観測される、ある範囲の活性、発現、または産生として報告され、そして培養条件に依存して幾分か変化し得ることが理解される。
【００３９】
サイトカインもしくはタンパク質の活性、発現または産生に関して用語「増強されたレベルの」および「通常のレベルを超える」は、互換的に用いられ得る。この用語は、用いられる特定の培養条件下での同じ細胞株の親細胞（ここで、この親細胞は、サイトカインもしくはタンパク質の活性、発現、または産生の増加を生じるのに効果的な様式での、選択も、改変も、プライミングも処理もされていない）によって示される、サイトカインもしくはタンパク質の活性、発現、または産生のレベルよりも、少なくとも１２５％（１．２５倍または１．２５×）、好ましくは少なくとも１５０％、２００％、３００％もしくは４００％、または５００％もしくはそれより高いレベルの、サイトカインもしくはタンパク質の活性、発現または産生のレベルをいう。いくつかの場合においては、サイトカインもしくはタンパク質の活性、発現、または産生の増加は、その親細胞株のサイトカインもしくはタンパク質の活性、発現、または産生の１０倍（１０×）以上である。
【００４０】
本明細書中に使用される場合、用語「アポトーシス細胞死を阻害する」とは、細胞株が、サイトカインもしくは他のタンパク質の発現または産生の目的のために培養される期間にわたって、細胞死プロセスを部分的にかまたは完全に阻害することを意味する。このような阻害は、アポトーシス細胞死の量が、アポトーシスを効果的に阻害する様式で改変されていない細胞株において観測されるアポトーシス細胞死の量と比べて、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％そしてさらに好ましくは８０％以上減少することを一般的に意味する。
【００４１】
用語「アポトーシスを阻害するタンパク質」とは、細胞中で発現した場合に、アポトーシス、ならびに特に、サイトカイン調節因子の過剰発現および／またはサイトカイン誘導に関連するアポトーシスを阻害するタンパク質をいう。アポトーシスを効果的に阻害するタンパク質の例としては、ＣｒｍＡ、Ｂｃｌ−２ａ、Ｂｃｌ−ＸＬ、真核生物翻訳開始因子２α（ｅｌＦ−２α）の改変形態および真核生物翻訳開始因子（ｅｌＦ−３）の改変形態、Ｆａｓ−関連デスドメイン（Ｆａｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｅａｔｈ  ｄｏｍａｉｎ）（ＦＡＤＤ）の改変形態、Ｂｃｌ−Ｘｓの改変形態、Ｂｃｌ−２相同アンタゴニスト／キラー（ＢＡＫ）の改変形態ならびにＢＡＸの改変形態が挙げられるが、これらに限定されず、好ましくはＢｃｌ−２ａまたはＢｃｌ−ＸＬである。
【００４２】
ＣｒｍＡ、Ｂｃｌ−２またはＢｃｌ−ＸＬの「過剰発現」とは、各々、ＣｒｍＡ、Ｂｃｌ−２もしくはＢｃｌ−ＸＬをコードするベクターを用いてトランスフェクトされていない所定の型の細胞、およびアポトーシスを受けるように刺激された所定の型の細胞において一般的に観測されるより高いＣｒｍＡ、Ｂｃｌ−２もしくはＢｃｌ−ＸＬの活性または発現の範囲を意味する。
【００４３】
「サイトカイン」とは、リンパ球および他の免疫細胞への多様な効果を発揮することによって、免疫応答の強度および持続期間を制御する低分子量の調節タンパク質の一群をいう。
【００４４】
「サイトカイン産生細胞」とは、インビボおよび細胞培養物中にサイトカインを分泌する細胞（代表的には血液細胞）をいう。そのような細胞としては、単球、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、内皮細胞、上皮細胞、ＴＨ１およびＴＨ２（Ｔ−ヘルパー細胞）、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、好酸球肥満細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、骨芽細胞由来の細胞、メラノサイト、血小板、種々の他の免疫系細胞、膵臓実質、神経膠細胞およびそのような細胞型に由来する腫瘍細胞が挙げられる。
【００４５】
ヒト培養細胞株に関連して本明細書中に使用される場合、用語「改変すること」および用語「細胞株の改変」とは、親のヒト細胞株に、サイトカイン調節因子をコードする異種の核酸配列および／または抗アポトーシスタンパク質をコードする異種核酸配列を、導入することをいう。異種の核酸構築物中のコード配列は、異種の起源または、自己の起源のものであり得る。
【００４６】
サイトカイン調節因子過剰発現細胞を「選択すること」とは、一般的に、１つ以上のサイトカイン調節因子過剰発現細胞をサブクローニング、スクリーニングおよび選択すること、ならびにサイトカイン調節因子過剰発現細胞株を産生するためにその細胞を増殖させることをいう。
【００４７】
スクリーニングとしては、以下にさらに記載されるような、生物学的活性の機能的アッセイ、タンパク質アッセイおよびサイトカイン調節因子ｍＲＮＡのアッセイが代表的に挙げられる。
【００４８】
サイトカイン調節因子過剰発現細胞株に関連して本明細書中に用いられる場合、用語「プライミング」とは、代表的に、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）またはインターフェロン−βのような、任意の多くの薬剤にその細胞を曝すことを特にいう。
【００４９】
サイトカイン調節因子過剰発現細胞株に関連して本明細書中に使用される場合、用語「誘導」および「誘導すること」とは、微生物性の（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ）誘導剤（センダイウイルス、脳心筋炎ウイルス、単純疱疹ウイルスもしくはニューカッスル病ウイルスなど）に、細胞を曝すことか；またはポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）（ポリＩＣ）、もしくはポリｒ（Ｉ）：ポリｒ（Ｃ）（ポリｒＩＣ）、ヘパリン、硫酸デキストラン、シクロヘキサミド、アクチノマイシンＤ、酪酸ナトリウム、カルシウムイオノフォア、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、リポ多糖類（ＬＰＳ）およびそれらの誘導体（例えば、３−デアシルＬＰＳ、およびコンドロイチン硫酸）からなる群より選択される、少なくとも１つの非微生物性の（ｎｏｎ−ｍｉｃｒｏｂｉａｌ）誘導剤に、その細胞を曝すことを代表的にいう。誘導剤の特定の例としては、プロスタグランジンＥ２誘導のための表面の粗さ、ＴＧＦ−β誘導のためのチタン粒子、ＴＮＦ−α誘導のための窒化珪素、ＥＰＯおよびＶＥＧＦ誘導のための低酸素、ならびにオステオプロテゲリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）誘導のためのＩＬ−１−α、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βが、挙げられる。
【００５０】
サイトカイン調節因子過剰発現細胞株に関連して本明細書中に使用される場合、用語「処理すること」および「処理された」とは、一般に誘導をいうが、しかしプライミングおよび／または誘導および／または添加剤（ＤＥＡＥデキストランなど）に曝すことに関して用いられ得る。
【００５１】
本明細書中に使用される場合、用語「サイトカイン混合物」とは、ヒト細胞株によって産生された２種以上のサイトカインを含む組成物をいう。
【００５２】
ヒトの被験体または患者に関連して本明細書中に使用される場合、用語「処置する」、「処置」および「治療」とは、治癒的治療、予防的治療（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ）、および予防的治療（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）をいう。
【００５３】
（ＩＩ．サイトカイン調節因子）
多くの因子が、細胞（例えばヒト細胞）におけるサイトカインの誘導および／または増強された発現に関連することが公知である。これらの因子としては、サイトカイン特異的転写調節因子および他のタンパク質に特異的な転写調節因子（例えば、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ−１、ＩＲＦ−３およびＩＲＦ−７）、サイトカインレセプター、核因子κＢ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  κＢ）（ＮＦ−κＢ）、アクチベータータンパク質−１（ＡＰ−１）、核因子ＩＬ−６（ＮＦ−ＩＬ６）、ならびに特にＰＫＲ）が挙げられる。
【００５４】
一般的に、これらの因子のいずれかの発現または活性の増強は、サイトカインをコードする１つ以上の遺伝子の通常の発現よりも高い発現を生じ得る。ＰＫＲが、サイトカインの発現および他のタンパク質の発現を調節し得るタンパク質の例として本明細書中に用いられる；しかし本発明が、（本明細書において「サイトカイン調節因子」すなわち「ＣＲＦ」と称される）任意の多くのサイトカイン増強因子およびタンパク質増強因子（例えば、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）インデューサー、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＧＦおよびＰＤＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＧＦ、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−β、ＩＬ−１、ＩＦＮ（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）またはケモカイン（ＩＬ−８、マクロファージ炎症タンパク質［ＭＩＰ−１ａ＆ＭＩＰ−１ｂ］および単球走化性タンパク質［ＭＣＰ］））；他の細胞シグナル伝達因子（例えば、ＰＭＡ、カルシウムイオノフォア、酪酸ナトリウムまたは内毒素）；ポリＩ：Ｃ、二本鎖ＲＮＡまたはウイルス性アナログ；ＰＨＡ、ヒートショック、病原体感染（例えば、ウイルス感染）を含む、ＰＫＲを活性化し得る、細胞性ストレスシグナル；ならびに増強されたサイトカイン産生を生じるサイトカイン調節因子の発現を増強する任意の因子、を意図することが、理解される。
【００５５】
ヒト細胞におけるサイトカイン調節因子の発現／活性を増加させることによって、サイトカイン産生が増加し得る。従って、サイトカイン調節因子のより高い構成的レベルを発現するか、またはサイトカイン調節因子の発現が、より高いレベルに誘導される、ヒト細胞培養物は、サイトカイン混合物の産生に有用である。
【００５６】
本発明の方法は、サイトカイン調節因子を過剰発現する特定の方法を必要としない、サイトカイン調節因子を過剰発現する細胞の使用に基づく。
【００５７】
真核生物開始因子−２（ｅｌＦ−２α）（この因子は、一旦リン酸化されると、タンパク合成の阻害を導く（Ｈｅｒｓｈｅｙら、１９９１））のリン酸化を含む、多様な機能がＰＫＲに帰する。ＰＫＲのこの特定の機能が、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βの抗ウイルス活性および抗増殖性活性を媒介を担う機構の１つであることが示唆された。ＰＫＲのさらなる生物学的な機能は、例えば、ＩｋＢのリン酸化による、シグナル伝達因子としての推定の役割であり、これは、核因子ｋＢ（ＮＦ−ｋＢ）の放出および活性化を生じる（Ｋｕｍａｒ  Ａら、１９９４）。
【００５８】
ＰＫＲが、ＩＦＮ発現の転写活性化を媒介することが、以前に示されている（Ｄｅｒ  ＤおよびＬａｕ  ＡＳ、１９９５）。この観察と一致して、ＰＫＲに対するアンチセンスを用いたＵ９３７細胞のトランスフェクトによってか、またはＰＫＲ−欠損変異株の発現による内因性ＰＫＲ活性の抑制は、ウイルス感染に対する応答において、ＩＦＮ誘導の減少を生じた（Ｄｅｒ  ＤおよびＬａｕ  ＡＳ、１９９５）。
【００５９】
共有に係る米国特許第６，１５９，７１２号において記載されているように、ＰＫＲをコードする核酸配列を用いてトランスフェクトされた細胞が、インターフェロンの増強された産生を示すことも、示された。
【００６０】
ＰＫＲが腫瘍サプレッサーおよびアポトーシスの誘導因子として機能し得ることもまた示唆された。（例えば、Ｃｌｅｍｅｎｓ  ＭＪら、１９９９；Ｙｅｕｎｇ，Ｌａｕら、１９９６；Ｋｏｒｏｍｉｌａｓら、１９９２を参照のこと）。最近の成果は、活性形態のＰＫＲの発現が、おそらくＦａｓレセプターのアップレギュレーションを通じて、アポトーシスを誘発することを示す（Ｄｏｎｚｅ  Ｏ  ら、１９９９）。
【００６１】
本発明は、サイトカイン導入因子をコードする核酸配列の導入によってか、または通常のレベルを上回る１つ以上の内因性サイトカイン調節因子を産生する条件下で、形質転換されていない細胞、もしくはアポトーシス阻害遺伝子のみを用いて形質転換された細胞の培養によって、ＰＫＲのようなサイトカイン調節因子を過剰に産生するサイトカイン産生細胞を使用する。これは、選択、プライミング、および／またはさらなる処理（誘導など）によって達成され得る。
【００６２】
ＰＫＲに関して、増強された産生／発現に対するさらなるアプローチは、ＰＫＲ阻害因子、ｐ５８（これは通常ＰＫＲ活性を阻害する）を不活性化するかまたはそのレベルを減少することを含む。ｐ５８の変異、改変または遺伝子ターゲッティングによる切除は、増強されたＰＫＲ活性を生じることが示されている（Ｂａｒｂｅｒ，Ｇ．Ｎ．ら、１９９４）。さらには、ＰＫＲの発現を増強し得る、ＰＫＲの、天然のアクチベーター、合成アクチベーターまたは組換えアクチベーター（例えば、ＰＫＲアクチベータータンパク質、ＰＡＣＴ（Ｐａｔｅｌ，Ｒ．Ｃ．およびＳｅｎ，Ｇ．Ｃ．、１９９８））が使用され得る。
【００６３】
（ＩＩＩ．本発明の方法および組成物）
（Ａ．サイトカインの組み合わせ）
サイトカインは、種々の生化学的プロセスの刺激を導くシグナル伝達の前にそれらの同族のレセプターと結合することによって生物学的活性を誘発する。いくつかの場合においては、そのようなレセプターの発現が、特定のシグナルによって調節される。サイトカインは、正のフィードバックのループまたは負のフィードバックのループに関連し得、それにより、同じであるかまたは異なるサイトカインのレセプターの発現を制御し得る。そのようなレセプターは、サイトカインを産正する細胞と同じ型の細胞であるか、または異なる型の細胞であり得る。サイトカインは、免疫応答および炎症性の応答を媒介および調節するように作用する。
【００６４】
細胞性サイトカイン供給源が、個々のサイトカイン各々の顕著な特徴であり、そして個々のサイトカインが、複数の多様な型の細胞によって産生され得ることが、理解される。さらに、所定のサイトカインは、（１）１つ以上の型の細胞にて作用し得、（２）同じ細胞にて１つ以上の効果を有し得、（３）別のサイトカインと共有された活性を有し得、そして（４）例えば、それらの効果と拮抗をすることによってかまたは協同をすることによって、他のサイトカインの合成または効果に影響し得る。
【００６５】
本明細書中に記載された方法は、治療使用のための２種以上のサイトカインの混合物、および特に、（本明細書に参考として明白に援用される、共有に係る米国特許出願第０９／６６０，４６８号において詳述されているように）癌、ウイルス感染、または炎症の処置に使用するためのサイトカイン混合物の産生においてにおいて有用性を見出す。
【００６６】
本発明の方法を用いてその発現が増加され得る例示的なサイトカインとしては、インターフェロン（α、βおよびγ）、インターロイキン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−２およびＩＬ−４〜１３）、腫瘍壊死因子αおよび腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）ならびにそれら各々の可溶性レセプター（ｓＴＮＦ−Ｒ）、コロニー刺激因子（顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；およびＩＬ−３）、血管新生因子（線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；および血小板由来増殖因子１および血小板由来増殖因子２（ＰＤＧＦ−１およびＰＤＧＦ−２）ならびに抗血管新生因子（アンギオスタチンおよびエンドスタチン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
概して、本発明は、２種以上のサイトカインの産生を生じるのに効果的な様式で、適切な条件下で培養されるか、改変されるか、選択されるか、プライミングされるかおよび／または処理された、サイトカイン調節因子の発現および／または抗アポトーシスタンパク質の発現によって特徴付けられる細胞株によって産生されるサイトカイン混合物を提供する。本発明はさらに、そのような細胞株によって産生されるサイトカイン混合物を提供する。好ましいアプローチにおいて、これらのサイトカインが、この細胞株によって産生され、培地中に分泌されそして単離される（細胞培養培地中にまた存在する、望まれない成分から精製される）。
【００６８】
好ましい混合物としては、（１）インターフェロンα（ＩＦＮ−α）およびインターフェロンβ（ＩＦＮ−β）；（２）インターフェロンα、インターフェロンβおよびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）；（３）インターフェロンαおよびインターフェロンγ；（４）インターフェロンβおよびインターフェロンγ；（５）インターフェロンα、インターフェロンβおよびインターフェロンγのうちの１種ならびに腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）；（６）インターフェロンα、インターフェロンβおよびインターフェロンγのうちの１種ならびにＴＮＦ−β（ＴＮＦ−β）；（５）インターフェロンα、インターフェロンβおよびインターフェロンγのうちの１種ならびにインターロイキン−２（ＩＬ−２）；（６）インターフェロンγおよびインターロイキン−１ｂ（ＩＬ−１ｂ）；（７）インターフェロンγおよびマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）；（８）インターフェロンγ、インターロイキン−４および腫瘍壊死因子−α；（９）インターロイキン−２およびインターロイキン−１２；（１０）インターロイキン−２、インターロイキン−４またはインターロイキン−６のうちの１種および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；（１１）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン−２およびインターフェロンαまたはインターフェロンβが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
１つの好ましい抗癌組成物または抗腫瘍組成物は、ＩＬ−１−α、ＩＬ−１−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、オンコスタチン、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＮＫＥＦ、ＮＫＳＦ、ＴＲＡＩＬ、およびＭ−ＣＳＦの中より選択される２種以上のサイトカインを含み、より好ましくは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＴＮＦ−α、ナチュラルキラー細胞増強因子（ＮＫＥＦ）、ナチュラルキラー細胞刺激因子（ＮＫＳＦ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）およびＧＭ−ＣＳＦの中より選択される２種以上のサイトカインを含む。好ましくは、この組成物は、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１およびＴＧＦ−βの中より選択されるサイトカインを除去するために処理される。ウイルス感染の処置における使用に関して、好ましくは、この組成物は、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、およびＧＭ−ＣＳＦの中より選択される２種以上のサイトカインを含み、より好ましくは、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＴＧＦ−β、ＩＬ−８、ＩＬ−１２およびＧＭ−ＣＳＦの中より選択される２種以上のサイトカインを含む。好ましくは、この組成物は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびオンコスタチンの中より選択されるサイトカインを除去するために処理される。
【００７０】
炎症状態の処置における使用に関して、好ましくは、この組成物は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＩＬ−１ｉ、ＩＦＮ−β、ＴＧＦ−β、およびＩＦＮ−γの中より選択される２種以上のサイトカインを含み、そして好ましくはＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γおよびＴＧＦ−βの中より選択される２種以上のサイトカインを含む。好ましくは、この組成物は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＧＦ−β、およびオンコスタチン中より選択されるサイトカインを、この組成物より除去するために処理される。
【００７１】
本発明のサイトカイン混合物またはサイトカイン組成物は、癌、ウイルス感染または炎症の処置における有用性を見出す。一般的に、投与されるサイトカインの総用量は、任意の１つのサイトカイン成分が、より低い用量で（例えば、単独で投与される場合のそのサイトカインの通常の用量の１０％〜５０％）投与されるように調節される。
【００７２】
（Ｂ．サイトカイン混合物の産生のための細胞および培養条件）
本発明は、所望のサイトカイン混合物（例えば、癌の処置、ウイルス感染の処置、または炎症の処置に適する混合物）を産生するそれらの能力について選択された、ヒトサイトカインを産生する細胞に依存する。
【００７３】
従って、本発明は、対応する親細胞株（これは、改変されず、選択されず、プライミングされず、そして誘導されていない）と比べて増強された、サイトカイン混合物の産生を生じるに効果的な様式で、選択され、改変され、プライミングされかつ／またはプライミングおよび誘導された細胞を含む細胞株を提供する。
【００７４】
サイトカイン混合物の産生における使用のための親細胞株の例としては、Ｂ細胞（例えば、Ｎａｍａｌｗａ細胞、２９３細胞、ＣＣＲＦ−ＳＢ細胞またはＲａｊｉ細胞）、単球細胞（Ｕ９３７、ＴＨＰ−１）、Ｆｌｏｗ  １０００細胞、Ｆｌｏｗ  ４０００細胞、線維芽細胞（ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＦＳ−４細胞、ＦＳ−７細胞、Ｔ９８Ｇ細胞およびＭＧ−６３細胞）、Ｔ細胞（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞、およびＪｕｒｋａｔ細胞）ならびに他の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
サイトカイン混合物の産生における使用のための親細胞株の例としては、単球／マクロファージ系統の細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞を含む、リンパ球系統の細胞、肥満細胞、線維芽細胞、骨髄細胞、ケラチノサイト、骨芽細胞由来細胞、メラノサイト、内皮細胞、血小板、種々の他の免疫系細胞、肺上皮細胞、膵臓実質細胞、神経膠細胞およびそのような細胞型から誘導された腫瘍細胞が挙げられるが、これらに限定されない。種々のサイトカインに関する、主要な細胞性の供給源が、以下の表１に提供される。これらの細胞から誘導される細胞株は、本明細書中に記載される方法を用いる、サイトカイン混合物の産性における使用に適切な候補である。
【００７６】
（表１  種々のサイトカインの細胞性供給源）
【００７７】
【表１】
2004529851.tif 000002
癌（固形腫瘍、黒色腫、白血病、および他の型の癌および新生物を含む）の処置における使用について、サイトカイン混合物の産生に適するヒト細胞としては、Ｂリンパ球（Ｂ−細胞）、単球細胞、およびＴヘルパー細胞が挙げられる。インビトロでの培養に適する、単離されたＢ細胞の親細胞株の例は、Ｎａｍａｌｗａ細胞、２９３細胞、およびＲａｊｉ細胞である。適切な単球の親細胞株は、Ｕ９３７細胞およびＴＨＰ−１細胞である。インビトロでの培養のために入手可能なＴヘルパー細胞１およびＴヘルパー細胞２（ＴＨ１、ＴＨ２）を含むＴ細胞としては、Ｊｕｒｋａｔ細胞、およびＣＥＭ細胞が挙げられる。
【００７８】
ウイルス感染（ＨＩＶ、肝炎ウイルス（例えば、ＨＢＶウイルス、およびＨＣＶウイルス）、および他のヒト病原性ウイルスによる感染を含む）の処置における使用に適するサイトカイン混合物の産生に適するヒトサイトカイン産生細胞としては、一般的に、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）株および線維芽細胞細胞株が挙げられる。インビトロでの培養に適する単離されたＢ細胞の親細胞株の例は、上に示される。適切な線維芽細胞の親細胞株は、ＭＲＣ５細胞、ＨＦＦ細胞、およびＷＩ−３８細胞である。
【００７９】
炎症（喘息、アレルギー、および慢性関節リウマチを含む）の処置における使用に適するサイトカイン混合物の産生に適するヒトサイトカイン産生細胞は、一般的に、上に例示されたような、Ｔヘルパー細胞を含む、Ｔ細胞である。
【００８０】
一般的には、Ｕ９３７細胞は、ＦＧＦおよびｓＴＮＦ−Ｒの産生に好ましく；Ｊｕｒｋｅｔ細胞は、ＩＬ−３およびＴＮＦ−βの産生に好ましく；線維芽細胞は、ＦＧＦおよびアンギオスタチンの産生に好ましく；Ｕ９３７細胞は、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＩＬ−６およびそれらのホモログの産生に好ましく；ＪｕｒｋｅｔおよびＨＵＴを含むＣＤ４発現細胞は、ＴＮＦ−βの産生に好ましく；そしてＪｕｒｋａｔ（細胞）およびＮａｍａｌｗａ（細胞）を含むＴ細胞およびＢ細胞は、ＩＬ−８およびそのホモログの産生に好ましい。
【００８１】
従って、本発明は、対応する親細胞株と比較して増強された、サイトカイン混合物の産生を生じるに効果的な様式で、選択され、改変され、プライミングされかつ／またはプライミングおよび誘導された細胞を含む細胞株を提供する。
【００８２】
これらの選択された細胞は、サイトカイン調節因子およびサイトカインを過剰発現する条件下で培養される。サイトカイン混合物の産生に有用な細胞は、代表的に親細胞株を培養するために使用される条件下で培養される。一般的に、これらの細胞は、生理学的な塩および栄養素を含有する標準培地（例えば、胎仔ウシ血清などの血清が０．１〜１０％補充され得る標準細胞培養培地ＲＰＭＩ、ＭＥＭ、ＩＭＥＭ  ＤＭＥＭ、またはＦ１２）中で培養される。あるいは、無血清、および／または動物性タンパク質を含まない培地もしくはタンパク質を含まない培地が用いられ得、それらの多くの例は、例えばＰｒｏ２９３のように市販されている。培養条件もまた、標準的である（例えば、培養物は、所望のレベルのサイトカイン産生が達成されるまで、固定培養またはローラー培養中で３７℃でインキュベートされる）。大規模産生に関して、発酵槽が、バッチモードまたは灌流モードで、細胞の培養に用いられ得る。Ｎａｍａｌｗａ細胞からのサイトカイン産生のための例示的な培地および培養条件は、実施例３において記載される。
【００８３】
一般的に、所定の細胞株について好ましい培養条件は、科学文献中にか、および／またはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのような細胞株の供給源から見出され得る。初代の細胞株（例えば、線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、内皮細胞、樹状細胞、および単球）について好ましい培養条件もまた、一般的に、科学文献中より入手可能である。細胞増殖が確立された後、その細胞は、１種以上のサイトカイン調節因子の過剰発現を引き起こすか、または可能とするに効果的な条件に曝され、サイトカイン混合物の増強された産生のために、プライミングされ、ならびに／またはプライミングおよび誘導される。
【００８４】
外因的に提供された、サイトカイン調節因子をコードする核酸配列が、誘導性プロモーターの制御下にある場合、適切な誘導剤（例えば、金属塩または抗生物質）が、サイトカイン発現／サイトカイン産生の誘導に効果的な濃度で、培地に添加される。
【００８５】
（ＩＶ．増強されたサイトカイン産生）
（Ａ．サイトカイン調節因子の増強された発現）
サイトカイン調節因子（例えば、ヒト細胞中のＰＫＲ）の発現／活性の増加によって、ヒトサイトカイン混合物の産生が、増加され得る。従って、より高い構成的レベルのサイトカイン調節因子を発現するか、またはサイトカイン調節因子の発現がより高いレベルに誘導され得る、ヒト細胞培養物は、サイトカイン混合物の産生に有用である。
【００８６】
一旦、サイトカイン調節因子を過剰発現するかまたは過剰産生する細胞株が得られると、その細胞株は、サイトカイン産生の増加を生じるのに効果的な様式で、さらにプライミングおよび／または誘導される。
【００８７】
１つの好ましいアプローチにおいて、この方法は、（ａ）サイトカイン調節因子を過剰発現し得るヒト細胞を培養する工程；（ｂ）サイトカイン調節因子を過剰発現するのに十分な条件下で、サイトカイン調節因子、またはそのアナログもしくはホモログのコード配列を含む異種の核酸構築物を、細胞に導入する工程；異種の核酸を組み込んだ細胞について選択またはスクリーニングする工程および（ｃ）プライミングの工程；ならびに（ｄ）サイトカイン遺伝子の発現を誘導するのに適するように細胞を処理する工程を包含する。
【００８８】
ひとつの好ましい実施形態において、このサイトカイン調節因子は、ＰＫＲであり、そしてこの細胞は、ＰＫＲの過剰発現を誘導し得る。好ましい局面において、ＰＫＲを過剰発現し得る細胞は、より高いレベルのＰＫＲ発現またはＰＫＲ産生を生じる様式で、プライミングおよび／または誘導される。
【００８９】
本発明によって提供される、細胞株の選択、改変、培養条件、プライミング、またはプライミングおよび誘導の組み合わせは、所定の細胞株による、有意に増強されたサイトカインの産生（例えば、本明細書中に記載されるように、選択、改変、プライミングおよび誘導無しの、同じ培養条件下で同じ細胞株によって示されるサイトカインの産生または発現のレベルと比較して、少なくとも２００％（２倍または２×）、２５０％（２．５倍または２．５×）、４００％３倍または３×）、４００％（４倍または４×）、５００％（５倍または５×）、および好ましくは１０００％（１０倍または２×）、またはそれ以上のサイトカインの産生もしくは発現の増加を示す、増加）を生じる。いくつかの場合においては、本発明の方法は、１００倍（１００×）〜１０００倍（１０００×）以上のサイトカインの産生の増加を生じる。
【００９０】
従って、本発明の１つの局面は、単離された細胞集団（すなわち、サイトカイン混合物を発現するかまたはサイトカイン混合物を産生する、細胞株）に関する。本明細書中に使用される場合、用語「集団」とは、単独の親細胞から誘導された、２つ以上の細胞の群をいう。
【００９１】
細胞培養物におけるサイトカインの産生に代表的に関連する課題（例えば、非組換え哺乳動物系からの低収量、微生物系において産生されるタンパク質、不適切なグリコシル化、適切な翻訳後修飾の欠如または不適切な折りたたみ（ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ））は、本発明の方法において排除される。
【００９２】
（Ｂ．アポトーシスの阻害）
アポトーシスまたはプログラム細胞死は、細胞固有の自殺プロセスであり、それにより、望まれない個々の細胞が、遺伝的に決定されたプログラムを受け、染色体ＤＮＡフラグメント化、ＲＮＡの分解そして最終的な細胞死に至る（Ｏｒｒｅｎｉｕｓ  １９９５；Ｓｔｅｌｌａｒ  １９９５；Ｖａｕｘ  １９９３において再検討される）。一旦アポトーシスに委ねられると、細胞は新しい段階のタンパク質合成を受け、そして、特徴的な細胞質凝集、核クロマチン凝集、膜のブレッビング（ｂｌｅｂｂｉｎｇ）およびオリグヌクレオソームラダーとして検出されるＤＮＡの最終的な分解を含む種々の形態的な変化／生理学的な変化を受ける。
【００９３】
前炎症性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインの典型として、ＴＮＦは、活性化された免疫細胞によって、病原体排除、抗ウイルス活性、および腫瘍破壊のプロセスの間に産生される細胞傷害性タンパク質である。しかし、ＴＮＦ−αが、代謝的障害、消耗、および造血の抑制を誘導するので、インビボでの高レベルのＴＮＦ−αは、有害であり得る。細胞レベルで、ＴＮＦ−αは、スーパーオキシドラジカルの産生、リソソーム酵素の活性化（Ｌａｒｒｉｃｋら、１９９０；Ｌｉｄｄｉｌら、１９８９）、およびエンドヌクレアーゼ活性の活性化によるＤＮＡフラグメント化（Ｒｕｂｉｎら、１９８８）を誘導し、アポトーシスを導く。
【００９４】
ＰＫＲは、ＴＮＦ−αのシグナル伝達経路においてかつアポトーシスの誘導において役割を果たすことが公知である。ＰＫＲを過剰発現するＵ９３７細胞もまた、増大したアポトーシスを示すことが示された（例えば、Ｙｅｕｎｇ  ＭＣら、１９９６およびＹｅｕｎｇ  ＭＣら、１９９９を参照のこと）。
【００９５】
アポトーシスに関連する個々の癌原遺伝子は、アポトーシスを受けている細胞中で発現し得、個々の癌原遺伝子の発現の調節がそのプロセスに影響を与えることが、観測された。例示的な癌原遺伝子としては、ｃｅｄ−３、ｃｅｄ−４、ｃｅｄ−９およびＩｃｅなどの他の遺伝子に加えて、ｃ−ｍｙｃ、Ｆａｓ（ＡＰＯ−１）、ｐ５３、およびＢｃｌ−２が挙げられる（Ｓｔｅｌｌａｒ、１９９５；Ｃｏｈｅｎ、１９９３）。
【００９６】
アポトーシスを阻害することによって、本明細書中に記載される細胞株は、培養物中でより長い寿命を有し、サイトカインの生合成の増加および／またはその細胞がサイトカインを産生するように機能する期間の増加を示す。
【００９７】
従って、本発明の１つの好ましい局面において、アポトーシスを阻害し得る、選択された遺伝子タンパク質（例えば、ＣｒｍＡ、Ｂｃｌ−２Ａ、Ｂｃｌ−ＸＬまたはそれらのホモログ）は、宿主細胞中で、過剰発現され、アポトーシス細胞死の抑制または遅延を生じる。
【００９８】
他の場合において、アポトーシスに関連するタンパク質の「改変形態」は、細胞中で発現される。アポトーシスに関連するタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制することは、アポトーシス細胞死の抑制または遅延を生じ得、そして内因性遺伝子の変異、相同組換えまたは部位特異的突然変異誘発、遺伝子欠失または遺伝子の切除あるいはアポトーシスに関連するタンパク質をコードする遺伝子の破壊または変化された発現を生じるのに効果的な任意の方法を含むが、これらに限定されない方法によって、もたらされ得る。
【００９９】
アポトーシスに関連するタンパク質としては、ｅｌＦ−２ａまたはｅｌＦ−２α、ｅｌＦ−３、ＦＡＤＤ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、ＢＡＫ、ＢＡＸなどが挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質の「改変形態」とは、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失または挿入（アミノ酸置換が特に好ましい）を含む誘導体ポリペプチド配列を一般的に有する、天然のタンパク質の誘導体形態または改変体を意味する。このアミノ酸の置換、挿入または欠失は、ポリペプチド配列内の任意の残基で起こり得、タンパク質の生物学的活性を防害する。従って、改変体タンパク質または誘導体タンパク質をコードする、対応する核酸配列は、「突然変異した」遺伝子もしくはコード配列、または遺伝子もしくはコード配列の「改変形態」と考えられ、この核酸配列はさらに、本発明の範囲に含まれる。
【０１００】
例として、ヒト細胞培養物における、アポトーシス細胞死プロセスの抑制が、以下によって達成され得る：（１）アポトーシスを阻害し得るタンパク質の過剰発現（その例としては、ＣｒｍＡ、Ｂｃｌ−２ａおよびＢｃｌ−ＸＬまたはそれらのホモログが挙げられるが、これらに限定されない）；（２）例えば、相同組換えまたは部位特異的突然変異誘発（これにより、ＰＫＲの下流の基質を阻害する）を用いる各々の内因性遺伝子の突然変異によって調製される、ｅｌＦ−αまたは真核生物翻訳開始因子（ｅｌＦ−３）の変異形態の過剰発現による、ｅｌＦ２−α（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ａ  ４５７４９７）のリン酸化の抑制；（３）例えば、相同組換えまたは部位特異的突然変異誘発を用いる内因性ＦＡＤＤ遺伝子の突然変異によって調製される、ＦＡＤＤの変異形態の過剰発現による、内因性ＦＡＤＤ活性の抑制；あるいは（４）相同組換えまたは部位特異的突然変異によってか、またはＢＡＸ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ２２４７３）、ＢＡＫ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＥ２２１６６６）およびＢｃｌ−ＸＳ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ２０１２２）の１つ以上の遺伝子切除または遺伝子欠失による、Ｂｃｌ−２ａの１つ以上のプロアポトーシス（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）対応物（例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫ、および／またはＢｃｌ−ＸＳ）についての内因性遺伝子の変異による、トランスドミナント（ｔｒａｎｓｄｏｍｉｎａｎｔ）変異体の使用。
【０１０１】
細胞死は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いる染色細胞によってか、またはアポトーシス細胞死に特異的なアッセイの使用により（例えば、アネキシンＶを用いる染色（Ｖｅｒｍｅｓら、１９９５）によって）検出され得る。壊死細胞死は、関連する細胞の形態の顕微鏡観察と一緒に、細胞生存率のアッセイの組み合わせの結果を評価することによって、アポトーシス細胞死と区別され得る。
【０１０２】
１つのアプローチにおいて、抗アポトーシス機能についての細胞のトランスフェクションおよび細胞の選択が、サイトカイン調節因子の過剰発現に関して既に「安定化された」細胞を使用して実施されるように、サイトカイン調節因子過剰発現細胞株が提供され、そして、抗アポトーシス遺伝子を含むベクターを用いてトランスフェクトされる。この場合には、サイトカイン調節因子過剰発現細胞株は、サイトカイン調節因子をコードする核酸配列の、サブクローニングおよび選択によってか、またはその核酸配列の導入および発現によって調製され得る。
【０１０３】
代替的なアプローチにおいて、この細胞は、最初に抗アポトーシス遺伝子を含むベクターを用いてトランスフェクトされ、次いで、好首尾な形質転換株はさらに、サイトカイン調節因子をコードする核酸配列を含むベクターを用いてさらにトランスフェクトされ得る。これにより、第２のトランスフェクションおよび選択が、抗アポトーシス機能が既に「安定化された」細胞を用いて実施されることが可能になる。あるいは、抗アポトーシス機能が既に「安定化された」細胞が、サイトカイン調節因子の過剰発現のためにサブクローニングおよび選択され得る。
【０１０４】
特にサイトカイン調節因子の過剰発現条件下で、サイトカイン合成に関連するアポトーシスを阻害することによって、細胞培養物中のサイトカイン産生を増強する方法はさらに、共有に係る米国特許出願第０９／７７２，１０９号（これは、本明細書中に参考として明白に援用される）において記載される。
【０１０５】
（Ｖ．増加する、内因性サイトカイン調節因子活性、内因性サイトカイン調節因子の発現および／または内因性サイトカイン調節因子の産生）
本発明に従って、１種以上のサイトカイン調節因子およびサイトカイン混合物を発現し得る細胞株が、以下でさらに詳述されるように、限界希釈クローニング（本明細書中に「サブクローニング」として参照される）に供され、増強されたサイトカイン調節因子活性ならびに／あるいはｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現でスクリーニングされ、増強されたサイトカイン活性および／または発現でさらにサブクローニングおよび選択され得ることが見出されている。このような増強されたサイトカイン調節因子過剰発現のマーカーとして用いられ得る例示的なサイトカインとしては、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ、ならびにＩＦＮが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０６】
この方法の実施において、１種以上のサイトカイン調節因子および１種以上のサイトカインを発現し得る細胞株（本発明中で「親細胞株」として称される）が、当業者によって通常使用される標準法を用いて、同定されそして単一細胞の限界希釈クローニングに供される。一般的に、サブクローニング工程は、９６ウェルのプレートで、少なくとも１回、そして代表的には連続して３〜５回実施される。サブクローンは、親細胞の培養に代表的に使用される培養条件を用いて、約３０万〜５０万細胞／ｍｌの集団が得られるまで増殖される。次いでこのサブクローンは、サイトカイン調節因子の発現およびサイトカインの発現についてアッセイされる。
【０１０７】
サイトカイン調節因子の発現および／またはサイトカイン調節因子の産生についての例示的なアッセイとしては、生物学的活性の機能的アッセイ、ウエスタンブロットのようなタンパク質アッセイおよびサイトカイン調節因子ｍＲＮＡについてのアッセイ（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）およびサイトカイン調節因子をコードする核酸配列に基づく適切な標識化プローブを用いる、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング、またはインサイチュハイブリダイゼーション）が挙げられる。
【０１０８】
親細胞株のサイトカイン調節因子の発現または産生のレベルよりも、少なくとも２倍（２×）、そして好ましくは３倍（３×）、４倍（４×）、５倍（５×）以上の、サイトカイン調節因子の発現または産生のレベルを示すサブクローンが、選択される。いくつかの場合においては、そのように選択されたサブクローンは、親細胞株のサイトカイン調節因子の発現または産生のレベルの、１０倍（１０×）以上のサイトカイン調節因子の発現または産生のレベルを示す。
【０１０９】
代表的に、選択されたサブクローンは、サイトカイン調節因子およびサイトカインの増強された産生を生じるのに効果的な様式で処理される前に、プライミング剤に曝されることによってプライミングされる。代表的なプライミング剤は、以下にさらに記載される。次いで、選択されたサブクローンは、サイトカイン調節因子の増強された発現およびサイトカイン混合物の増強された産生を生じるのに効果的な様式で誘導される。
【０１１０】
（ＶＩ．細胞中での異種の核酸構築物の発現により増加するサイトカイン調節因子）
本発明はまた、サイトカイン調節因子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを用いて、形質導入されたか、形質転換されたかまたはトランスフェクトされた宿主細胞も提供する。培養条件（温度、ｐＨなど）は、形質導入、形質転換、トランスフェクションの前に親宿主細胞に既に用いられた条件であり、その条件は、当業者に明らかであり得る。
【０１１１】
１つのアプローチにおいて、ヒト細胞株は、発現ベクターを用いてトランスフェクトされ、この発現ベクターは、細胞株中で１種以上のサイトカイン調節因子が過剰発現されるように、宿主細胞株において機能し、１種以上のサイトカイン調節因子をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結された、プロモーターまたは生物学的に活性なプロモーターフラグメントまたは１つ以上の（例えば、一連の）エンハンサーを有する。
【０１１２】
１つのアプローチにおいて、親細胞は、適切な増殖培地における細胞培養がサイトカイン調節因子核酸配列の過剰発現を導くように、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下の、サイトカイン調節因子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを用いて、トランスフェクトされる。この細胞はまた、サイトカイン調節因子の過剰発現および／またはサイトカイン産生の条件下で、細胞におけるアポトーシスを阻害するタンパク質を発現する第２のベクターによってもトランスフェクトされる。
【０１１３】
実施例は、本発明における使用に適するヒトサイトカイン産生細胞を得るための、例示的なベクターおよびトランスフェクション方法を記載する。この細胞は、サイトカイン調節因子遺伝子および抗アポトーシス遺伝子を含むベクターを用い、第２のトランスフェクションの前に選択された好首尾な形質転換体を用いて、連続してトランスフェクトされる。これにより、第２のトランスフェクションおよび選択が、サイトカイン調節因子遺伝子または抗アポトーシス遺伝子の発現に関して既に「安定化された」細胞を用いて実施されることが可能になる。ベクター構築物およびトランスフェクション条件は、従来のものであり、当業者に公知である。特に、そのようなベクター構築物において、選択されたヒト細胞中に導入され得、そしてその中で複製し得る、適切なプラスミドまたは他のベクターを、例えば、商業的供給源から入手する（ここでこのプラスミドはまた、選択マーカー、挿入部位、および適切な制御エレメント（例えば終止配列）も備え得る）ことは、周知である。サイトカイン調節因子（ＰＫＲ遺伝子）の例示的なコード配列および抗アポトーシス遺伝子（Ｂｃｌ−ＸＬ）の代表的なコード配列は、実施例１において参照され、そしてそれらは、引用されるように、ＧｅｎＢａｎｋより得られ得る。
【０１１４】
ヒト細胞における使用に関して適切なクローニングベクターおよび発現ベクターが、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ  ＦＭら（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（これらは、本明細書中に参考として明白に援用される）において記載される。代表的なプロモーターは、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターの両方を含み、それらの例としては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、応答エレメント（ＴＲＥ）を含むプロモーターおよびメタロチオネインプロモーターが挙げられる。
【０１１５】
（Ａ．ベクター）
１種以上のサイトカイン調節因子をコードする天然もしくは合成のポリヌクレオチドフラグメント（「サイトカイン調節因子をコードする核酸配列］）または抗アポトーシス遺伝子は、ヒト細胞中に導入され得、かつそこで複製し得る、異種の核酸構築物またはベクターに組み込まれ得る。本明細書中に開示されるベクターおよび方法は、宿主細胞における１つ以上のサイトカイン調節因子または抗アポトーシス遺伝子の発現のための使用に適する。任意のベクターは、それが、導入されるヒト細胞中で複製可能かつ生存可能である限り、使用され得る。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者に公知であり、かつ市販されている。
【０１１６】
ベクターは、それによってＤＮＡが標的細胞に送達される、手段である。哺乳動物細胞への核酸構築物の送達に関して当該分野において公知の方法としては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターを用いる、ウイルス性の方法が挙げられる。一般的には、ウイルス性ベクター（例えば、レトロウイルスベクターおよびアデノウイルスベクター）による遺伝子移入の効率は、非ウイルス性のベクターの効率より高い。レトロウイルスベクター（最も広範に用いられる両栄養性マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）ベクターを含む）は、複製している細胞のみを感染し得、そして代表的に、それらの形質導入速度は、アデノウイルスベクターの速度よりも低い。しかし、レトロウイルスベクターが宿主ゲノムに組み込むので、導入遺伝子の発現は、持続的である。ベクター構築物を保有する治療的遺伝子が、２つの独立する構築物（これは、パッケージングのための構造タンパク質を発現し、これによって複製可能なレトロウイルスの産生を取り巻くの安全性の問題に対処する）を保有するパッケージング細胞に導入されるレトロウイルスベクターが、最近、開発されている（ＳａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｕｒｇ、１９９７）。
【０１１７】
アデノウイルスベクターは、高効率で、多くの細胞型（休止している細胞型および複製している細胞型）に感染し得る。最近、ハイブリッドアデノ／レトロウイルスベクターが記載されている（例えば、Ｂｉｌｂａｏら、１９９７を参照のこと）。アデノ随伴ウイルスベクターもまた、強い宿主免疫応答を引き起こすことなく、宿主染色体への導入遺伝子の組み込み、および導入遺伝子の構成的な発現を容易にする。
【０１１８】
人工的な染色体（例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベクター）もまた、細胞に、異種の核酸構築物を組み込むために用いられ得る。
【０１１９】
ヒト細胞における使用に関して適切なクローニングベクターおよび発現ベクターもまた、参考として本明細書中に明白に援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９およびＡｕｓｂｅｌ  ＦＭら、１９８９に記載される。ＤＮＡコード配列は、多様な手順によってプラスミドまたはベクター（本明細書においては集合的に「ベクター」という）に挿入され得る。一般的に、ＤＮＡ配列が、標準的な手順によって適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。そのような手順および関連のサブクローニング手順は、当業者の知識の範囲であると考えられる。
【０１２０】
代表的に、そのようなベクターは、選択マーカー、挿入部位、および適切な制御エレメント（例えば、終止配列）を備える。このベクターは、調節配列を含み得、この調節配列は、例えば、非コード配列（例えば、イントロンおよび制御エレメント（すなわち、宿主細胞において（および／または、可溶性タンパク抗原をコードする改変された配列が通常発現しない、ベクターもしくは宿主細胞の環境において）そのコード配列の発現に効果的であり、そのコード配列に作動可能に連結されている、プロモーターおよび終止エレメントまたは５’および／もしくは３’非翻訳領域））を含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターは、当業者に公知であり、そして、多くが市販されている。
【０１２１】
例示的なプロモーターとしては、構成的プロモーターおよび誘導プロモーターの両方が挙げられ、それらの例としては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、記載されたようなｔｅｔ−ｏｎ系またはｔｅｔ−ｏｆｆ系におけるｔｅｔ応答性エレメント（ＴＲＥ）を含有するプロモーター（ＣｌｏｎＴｅｃｈ  ａｎｄ  ＢＡＳＦ）、βアクチンプロモーターおよび特定の金属塩の添加によってアップレギュレートされ得るメタロチオネインプロモーターが挙げられる。多数の適切なベクターおよびプロモーターは、当業者に公知であり、市販されていて、かつＳａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されている。１を超えるプロモーターのエレメントを組み合わせる、ハイブリッドプロモーターもまた、本発明の方法における有用性を見出す。ハイブリッドプロモーターの構築のための方法は、当該分野において周知である。
【０１２２】
そのような発現ベクターにおける使用のための選択マーカーは、一般的に当該分野において公知であり、そして適切な選択マーカーの選択は、宿主細胞に依存する。代表的なマーカー遺伝子は、抗生物質または他の毒物（例えば、アンピシリン、メトトレキサート、テトラサイクリン、ネオマイシン（ＳｏｕｔｈｅｒｎおよびＢｅｒｇ、Ｊ．、１９８２）、ミコフェノール酸（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ、１９８０）、プロマイシン、ゼオマイシン（ｚｅｏｍｙｃｉｎ）またはハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）（Ｓｕｇｄｅｎら、１９８５））に対する耐性を与えるタンパク質をコードする。
【０１２３】
本発明の１つの好ましい実施形態において、サイトカイン調節因子の過剰発現および／または抗アポトーシス遺伝子の発現は、各々、構成的であるかまたは誘導性であるかのいずれかである適切なプロモーターの制御下で、外因的に提供されたサイトカイン調節因子および／または抗アポトーシスタンパク質をコードする核酸配列細胞を含む細胞を用いて、細胞培養物における発現に適する条件下で達成される。
【０１２４】
（Ｂ．核酸コード配列）
サイトカイン調節因子をコードする核酸配列を含むベクターは、細胞に導入され得、その細胞による、１種以上のサイトカイン調節因子の過剰発現を生じ得る。
【０１２５】
そのようなベクターにおける使用のための例示的なコード配列としては、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３５６６３に見出されるヒトｐ６８  ＰＫＲ遺伝子、マウスＰＫＲ遺伝子ならびに他のｅｌＦ−２−αキナーゼ（酵母ＧＣＮ２およびヘミン調節インヒビターを含む）由来のコード配列が挙げられるが、これらに限定されない（Ｗｅｋ  ＲＣ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １９９４；１９：４９１−４９６）。本発明の実施における使用のためのサイトカイン調節因子としては、ＩＳＧ（２−５Ａシンテターゼ  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００６１８７、ＩＳＧγ３  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２０３８、ＭｘＡ  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号３０８１７、ＭｘＢ  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号３０８１８）、ＩＲＦ−１  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２１９８、ＩＲＦ−３  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１５７１、ＩＲＦ−７Ａ  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ５３８３０、ＩＲＦ−７Ｂ  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ５３８３１  ＩＲＦ−７Ｃ  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ５３８３２、サイトカインレセプター、ＮＦ−κＢ  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３９９８、ＡＰ−１  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ０４１１１、ＮＦ−ＩＬ６  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ５２５６０、ＰＫＣインデューサー、ｐ３８  ＭＡＰＫ  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０１５２５６、Ｊａｋ３  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００２１５、ＳＴＡＴ  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００７３１５、ＩＦＮ−γ  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ００２１９、ＩＦＮ−β  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｖ００５３４、ＩＦＮ−α  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ００２０７、ＴＮＦ−α  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０２９１０、ＴＮＦ−β  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１６４４１、ＧＭ−ＣＳＦ  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００７５８、Ｇ−ＣＳＦ  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０３６５５、ＥＧＦ  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１９６３、ＰＤＧＦα  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２６０７、ＰＤＧＦβ  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２６０９、ＴＧＦβ  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ６０３１６、ＩＬ−１、ケモカイン（ＩＬ−８  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ２８１３０、ＭＩＰ−１ａ  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２９８３、ＭＩＰ−１ｂ  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ０４１３０）、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ１  ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２９８２）、ＰＭＡ、カルシウムイオノフォア、酪酸ナトリウムまたは内毒素、ポリＩ：Ｃ、ｄｓＲＮＡ、ウイルス性アナログ、ＰＫＲを活性化する細胞性ストレスシグナル（ヒートショック、病原体感染）、ＰＫＲ発現を制御するプロモーターと相互作用する因子、形質導入および転写シグナル（ＳＴＡＴ）ならびに増強されたサイトカイン産生をもたらす任意の因子が挙げれられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
さらに、サイトカイン調節因子をコードする核酸配列の変異体形態または改変体形態は、サイトカイン調節因子の過剰発現における使用のためにベクター構築物に含まれ得る。本発明の実施における使用に関するポリヌクレオチドとしては、スプライス改変体、天然の核酸コード配列に相補的な配列およびそれらの新規フラグメントが挙げられる。このポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態でもＤＮＡの形態でもよく、かつメッセンジャーＲＮＡ、合成ＲＮＡおよび合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ならびにゲノムＤＮＡを含み得る。このＤＮＡは、二本鎖でも一本鎖でもよく、そして一本鎖である場合は、コード鎖でも非コード（アンチセンス、相補的な）鎖でもよい。発現の際、これらのサイトカイン調節因子の変異体形態または改変体形態は、活性を増加させるかまたは減少させ得る。
【０１２７】
１つのアプローチにおいて、変異サイトカイン調節因子コード配列は、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ部位特異的突然変異誘発キット（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）を用いて生成される。ＣａｉおよびＷｉｌｌｉａｍｓ（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９８；２７３：１１２７４−１１２８０）は、キナーゼ活性（基質のリン酸化）からの（ｅｌＦ−αに関する）基質結合の分離を示す一連のＰＫＲ変異体を記載する。減少したＰＫＲ活性を示すこれらの変異体は、基質の結合にあまり効果的でなくキナーゼ活性が低いにもかかわらず、ＰＫＲを発現する細胞を生成するために細胞のトランスフェクションに用いられ得る。
【０１２８】
選択されたサイトカイン調節因子コード配列が、周知の組換え技術に従って適切なベクターに挿入され得、サイトカイン調節因子を過剰発現し得る細胞株を形質転換するために用いられ得る。
【０１２９】
本発明に従う、サイトカイン調節因子および抗アポトーシスタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列または遺伝子は、スプライス改変体、全長遺伝子のフラグメント、融合タンパク質のコード配列、天然もしくは全長遺伝子の改変形態またはこれらの機能的等価物、を含み、本明細書中で、集合的に、各々、「サイトカイン調節因子をコードする核酸配列」および「抗アポトーシスタンパク質をコードする核酸配列」として参照される。
【０１３０】
遺伝コードの固有の縮重に起因して、実質的に同じアミノ酸配列をコードする他の核酸配列または機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他の核酸配列は、ＣＲＦをコードする核酸配列または抗アポトーシスタンパク質をコードする核酸配列を、クローニングおよび発現するために用いられ得る。従って、所定の、ＣＲＦをコードする核酸配列または抗アポトーシスタンパク質をコードする核酸配列ＣＲＦに関して、遺伝コードの固有の縮重の結果として、同じアミノ酸配列をコードする多数のコード配列が生成され得ることが、理解される。例えば、トリプレットＣＧＴは、アミノ酸アルギニンをコードする。アルギニンは、代替的にＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、およびＡＧＧによってコードされる。従って、コード領域におけるそのような置換は、本発明にカバーされる、配列改変体に含まれることが、理解される。任意のこれらの配列改変体および全てのこれらの配列改変体は、ＣＲＦをコードする核酸配列または抗アポトーシスタンパク質をコードする核酸配列のネイティブな形態について本明細書中に記載されたのと同じ様式で用いられ得る。
【０１３１】
「改変体」ＣＲＦをコードする核酸配列または「改変体」抗アポトーシスタンパク質をコードする核酸配列は、天然のポリペプチド配列から１つ以上のアミノ酸が変化した、「改変体」ＣＲＦまたは「改変体」抗アポトーシスタンパク質のアミノ酸配列をコードし得、これらの両方が、本発明の範囲に含まれる。同様に、ＣＲＦまたは抗アポトーシスタンパク質に関連して、用語「改変形態」とは、天然のＣＲＦもしくは天然の抗アポトーシスタンパク質をコードする核酸配列、または天然のＣＲＦもしくは天然の抗アポトーシスタンパク質のアミノ酸配列の、誘導体形態または改変体形態を意味する。特に、「改変形態の」天然ＣＲＦもしくは「改変形態の」天然抗アポトーシスタンパク質、またはこれらのタンパク質のコード配列は、各々、少なくとも１つのアミノ酸または少なくとも１つの核酸の、置換、除去または挿入を含有する誘導体配列を有する。
【０１３２】
本発明の実施における使用に関してのポリヌクレオチドは、天然のＣＲＦもしくは天然の抗アポトーシスタンパク質およびそれらのスプライス改変体をコードする配列、このコード配列に相補的な配列ならびにＣＲＦをコードするポリヌクレオチドの新規フラグメントもしくは抗アポトーシスタンパク質をコードするポリヌクレオチドの新規フラグメントを含む。このポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態でもＤＮＡの形態でもよく、かつメッセンジャーＲＮＡ、合成ＲＮＡおよび合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ならびにゲノムＤＮＡを含み得る。このＤＮＡは、二本鎖でも一本鎖でもよく、そして一本鎖である場合は、コード鎖でも非コード（アンチセンス、相補的な）鎖でもよい。
【０１３３】
当業者によって理解され得るように、いくつかの場合においては、天然に存在しないコドンを保持するヌクレオチド配列の産生が、有利であり得る。特定の真核生物宿主に好ましいコドン（Ｍｕｒｒａｙ，Ｅら、１９８９）は、例えば、ＣＲＦ発現の速度もしくは抗アポトーシスタンパク質発現の速度を増加するためにか、または所望の特性（例えば、天然に存在する配列を用いて生成された転写産物よりも長い半減期）を有する組換えＲＮＡ転写産物を生成するために、選択され得る。
【０１３４】
天然のＣＲＦをコードするヌクレオチド配列または天然の抗アポトーシスタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、クローニング、プロセシングおよび／または細胞による発現を改変する変化を含むが、これらに限定されない、種々の理由のために、コード配列を変化するために操作され得る。
【０１３５】
１つのアプローチにおいて、本発明の実施における使用のための、異種の核酸構築物または異種の発現ベクターは、その活性形態が所望されるタンパク質のコード配列（例えば、ＰＫＲによって本明細書中に例示される、サイトカイン調節因子（ＣＲＦ）のコード配列、またはＣｒｍＡ，Ｂｃｌ−２もしくはＢｃｌ−ＸＬによって本明細書中に例示される、抗アポトーシスタンパク質のコード配列）を含む。
【０１３６】
本発明の１つの一般的な実施形態において、ＣＲＦをコードする核酸配列は、天然のコード配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、８５％、９０％または９５％以上の配列同一性を有する。例えば、ヒトＰＫＲの発現に有用なコード配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３５６６３に見出される配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、８５％、９０％または９５％以上の配列同一性を有する。
【０１３７】
サイトカイン調節因子をコードする核酸配列の場合、そのコードされたアミノ酸配列が、天然のサイトカイン調節因子の生物学的活性を保持する限り、置換、挿入または欠失は、その配列中の任意の残基で起こり得る。
【０１３８】
別の一般的な実施形態において、本発明は、ＣｒｍＡ、Ｂｃｌ−２ａ、Ｂｃｌ−ＸＬの核酸コード配列、またはＧｅｎＢａｎｋに見出されるそれらの天然のコード配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、８５％、９０％または９５％以上の配列同一性を有するそれらのホモログを提供する。例えば、ヒトｐ６８  ＰＫＲ遺伝子の発現に有用なコード配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３５６６３に見出される配列に対して少なくとも７０％、好ましくは８０％、８５％、９０％または９５％以上の配列の同一性を有する。
【０１３９】
ＣｒｍＡ、Ｂｃｌ−２ａ、Ｂｃｌ−ＸＬの核酸コード配列またはそれらのホモログの改変体形態を、ヒト細胞に導入する場合、その置換、挿入または欠失は、そのコードされたアミノ酸配列が天然の抗アポトーシスタンパク質の生物学的活性を維持する限り、その配列中の任意の残基で起こり得る。
【０１４０】
関連する実施形態において、アポトーシスは、アポトーシスに関連するタンパク質（例えば、ｅｌＦ−２ａまたはｅｌＦ−２α、ｅｌＦ−３、ＦＡＤＤ、Ｂｃｌ−ＸＳ、ＢＡＫ、ＢＡＸなど）の、改変コード配列の導入によって、阻害され得る。この実施形態において、この改変された、ｅｌＦ−２ａまたはｅｌＦ−２α、ｅｌＦ−３、ＦＡＤＤ、Ｂｃｌ−ＸＳ、ＢＡＫあるいはＢＡＸのコード配列は、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失または挿入を含む誘導体ポリペプチド配列を一般的に有する、天然のタンパク質の誘導体形態または改変体形態をコードし、これらのアミノ酸の置換、欠失または挿入は、そのタンパク質の生物学的活性を防害するように、そのポリペプチド配列中の任意の残基に導入される。
【０１４１】
２つの配列間の同一性を決定し、これによって改変体のコード配列を解析し得る、例示的なコンピュータープログラムとしては、インターネットのＮＩＨウェブサイトから公然に入手可能な、ひと続きのＢＬＡＳＴプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、およびＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰならびにＴＢＬＡＳＴＮ）が挙げられるが、これらに限定されない。Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９７も参照のこと。代表的に、配列検索は、ＧｅｎＢａｎｋ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅおよび他の公のデータベース中の核酸配列に対して、核酸配列を比較する場合に、ＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて実施される。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅおよび他の公のデータベース中のアミノ酸配列に対して、全てのリーディングフレームで翻訳されている核酸配列を検索するのに適している。ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＳＴＸの両方は、オープンギャップペナルティ１１．０、および拡張ギャップペナルティー１．０のデフォルトパラメーターを用いて実行され、ＢＬＯＳＵＭ−６２マトリクスを用いる［Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７を参照のこと］。
【０１４２】
一般的に、改変体コード配列の解析における２つ以上の配列間の同一性の程度は、オープンギャップペナルティ１０．０、拡張ギャップペナルティー０．１を含むデフォルトパラメーターを用い、そしてＢＬＯＳＵＭ３０と類似の同様のマトリクスを用いて作動される配列解析プログラム（例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ６．５のＣＬＵＳＴＡＬ−Ｗプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２：４６７３−４６８０．１９９４））を用いて実施される。これら各々の配列解析プログラムは、インターネット上の種々の場所で入手可能である。
【０１４３】
２つの配列間の関係はまた、ハイブリダイゼーションによっても特徴付けられる。核酸配列は、２つの配列が中程度に高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で互いに特異的にハイブリダイズする場合、参照の核酸配列に「選択的にハイブリダイズ可能」であるとみなされる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体またはプローブの融点（Ｔｍ）に基づく。代表的に「最大のストリンジェンシー」は、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍの５°下）で生じ；「高いストリンジェンシー」は、Ｔｍの約５〜１０°下で生じ；「中間のストリンジェンシー」は、プローブのＴｍの約１０〜２０°下で生じ；そして「低いストリンジェンシー」は、Ｔｍの約２０〜２５°下で生じる。機能的には、最大のストリンジェンシーの条件は、厳密な同一性またはほぼ厳密な同一性を有する配列を同定するのに用いられる；一方、高いストリンジェンシーの条件は、約８０％以上の配列同一性を有する配列を同定するのに用いられる。
【０１４４】
中程度および高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、当該分野において周知である（例えば、本明細書中に参考として明白に援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、９章および１１章、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、１９９３、を参照のこと）。高いストリンジェンシーの条件の例としては、約４２℃での、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性キャリアーＤＮＡでのハイブリダイゼーションと、その後の、室温での２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳでの２回の洗浄ならびに４２℃での０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳでのさらに２回の洗浄とが挙げられる。
【０１４５】
サイトカイン調節因子の核酸コード配列は、クローニング、プロセッシング、および／または細胞によるサイトカイン調節因子の発現を改変する変化を含むが、これらに限定されない、種々の理由によって変化され得る。
【０１４６】
異種の核酸配列構築物は、（ｉ）単離された；（ｉｉ）さらなるコード配列（例えば、融合タンパク質またはシグナルペプチドをコードする配列）と組み合わせた、；（ｉｉｉ）非コード配列（例えば、イントロンおよび制御エレメント（例えば、適切な宿主におけるコード配列の発現に効果的な、プロモーターエレメントおよび終止エレメントまたは５’および／もしくは３’の非翻訳領域）と組み合わせた、；ならびに／あるいは（ｉｖ）コード配列が異種の遺伝子であるようなベクターまたは宿主環境中の、１つ以上のサイトカイン調節因子のコード配列単独、または１つ以上の抗アポトーシスタンパク質のコード配列、その改変体、フラグメント、スプライス改変体と組み合わせた１つ以上のサイトカイン調節因子のコード配列を含み得る。
【０１４７】
本発明はまた、上記のように、１つ以上のサイトカイン調節因子をコードする核酸配列単独または１つ以上の抗アポトーシスタンパク質のコード配列と組み合わせて１つ以上のサイトカイン調節因子をコードする核酸配列を含む、組換え核酸構築物も使用し得る。代表的に、この構築物は、コード配列が、順方向または逆方向で挿入された、ベクター（例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター）の形態をとる。
【０１４８】
（Ｃ．宿主細胞の選択および形質転換）
上記のように、核酸コード配列を含むベクターが、適切なプロモーターおよび制御配列と一緒になって、ヒト細胞を形質転換し、細胞に、１つ以上のサイトカイン調節因子単独、または１つ以上の抗アポトーシスタンパク質のコード配列と組み合わせて１つ以上のサイトカイン調節因子を過剰発現させ、それによりサイトカイン混合物の産生を増強するために使用される。
【０１４９】
本発明の１つの局面において、異種の核酸構築物が、細胞（確立された好ましい細胞株）中に、インビトロで、核酸コード配列を移入するために使用される。長期間の、サイトカイン混合物の高収率の産生のために、安定な発現もまた、好ましい。従って、安定な形質転換株を生成するのに効果的な任意の方法が、本発明の実施において用いられ得る。
【０１５０】
本発明の実施には、他に示されない限り、当該分野に含まれる、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の、従来の技術が用いられ得る。そのような技術は、文献中に完全に例示される。例えば、本明細書中に参考として明確に援用される、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第二版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９）、「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；および「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）、を参照のこと。
【０１５１】
親細胞または親細胞株は、クローニングベクターまたは発現ベクターを用いて遺伝子的に改変され（すなわち、形質導入されるか、形質転換されるかまたはトランスフェクトされ）得る。このベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形態でもよい。
【０１５２】
異種の核酸配列の発現のために細胞に核酸を導入する多数の方法もまた、当業者に公知であり、その方法としては、エレクトロポレーション；細胞対細胞の融合；核のマイクロインジェクションまたは単細胞への直接のマイクロインジェクション；細菌プロトプラストのインタクトな細胞との融合；ポリカチオン（例えば、ポリブレンまたはポリオルニチン）の使用；リポソーム、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）またはリポフェクチンとの膜融合が媒介するトランスフェクション；ＤＮＡでコートされた微小な発射体を用いる高速ボンバードメント；リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿物とのインキュベーション；ＤＥＡＥ−デキストランが媒介するトランスフェクション；改変ウイルス核酸による感染などが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｄａｖｉｓ，Ｌ．、Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．およびＢａｔｔｅｙ，Ｉ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９８６．を参照のこと）。
【０１５３】
遺伝子的に改変された細胞は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選択するかまたは細胞に導入された１つ以上の核酸コード配列の発現を増幅するのに適切なように改変された、従来の栄養培地中で培養される。その培養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、発現について選択された宿主細胞に既に用いられている条件であり、そして当業者に明らかである。一般的に、１つ以上の核酸コード配列が導入されている細胞の子孫は、導入された配列を含むと考えられる。
【０１５４】
（Ｄ．サイトカイン調節因子発現の増強およびサイトカイン発現の増強）
一般的に、一旦１つ以上のサイトカイン調節因子単独でか、または１つ以上の抗アポトーシスタンパク質と組み合わせて１つ以上のサイトカイン調節因子を過剰発現する細胞株が生成されると、細胞培養物からのサイトカイン混合物の生成を増強するためおよび／もしくはのサイトカインの回収を容易にするためのさらなる工程が用いられる。そのような工程は、（１）１種以上のサイトカイン調節因子の発現を増強するのに効果的な条件下で細胞を培養する工程；（２）サイトカインの回収を容易にするのに効果的な条件下で細胞を培養する工程；（３）細胞をプライミングする工程；および（４）１種以上のサイトカイン調節因子および１種以上のサイトカインの産生を誘導するために細胞を処理する工程（誘導）、のうちの１つ以上を含む。
【０１５５】
１種以上のサイトカイン調節因子の発現を増強するのに効果的な条件下で細胞を培養する工程は、発現を容易にする因子（例えば、誘導性プロモーターを活性化するのに効果的な濃度で培地に添加された、金属塩、または抗生物質）を含有する培地での培養を含む。
【０１５６】
サイトカインの回収を容易にするのに効果的な条件下で細胞を培養する工程は、血清を含まない培地および／またはタンパク質を含まない培地における培養を含む。
【０１５７】
プライミングは、代表的には誘導の前に、細胞をプライミング剤に曝すことによって１種以上のサイトカインの増強された産生を生じる、周知の現象である。代表的なプライミング剤としては、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）および他のホルボールエステル、カルシウムイオノフォア、インターフェロン−α、インターフェロン−γ、インターフェロン−β、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ、ＥＧＦまたはケモカイン（ＩＬ−８、ＭＣＰまたはＭＩＰ）、酪酸ナトリウム、内毒素、ＰＨＡ、ＬＰＳならびにそれらの誘導体（例えば、３−デアシルＬＰＳ）、ウイルス（例えば、ニューカッスル病ウイルス）、キナーゼアクチベーター（例えば、ＰＫＲのタンパク質アクチベーター、ＰＡＣＴ）、あるいは転写アクチベーター（ＮＦ−ＫＢ、ＩＲＦ−３およびＩＲＦ−７を含むＩＲＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＫＲインヒビターであるｐ５３、の抑制もまた、増強されたＰＫＲ活性を生じることが示された（Ｔａｎ  ＳＬ、Ｇａｌｅ  ＭＪ  Ｊｒ、Ｋａｔｚｅ  ＭＧ、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １８（５）：２４３１−４３、１９９８）。あるいは、血清および増殖因子（例えば、ＩＬ−３）の剥奪は、細胞中のＰＫＲ活性を誘導するために用いられ得る。プライミング剤の適切な濃度は、科学文献中に見出され得る。
【０１５８】
例として、５〜５０ｎＭの範囲（代表的には約１０ｎＭ）のＰＭＡの濃度が、適切である。特定のサイトカイン混合物を産生する特定の型の細胞のそのようなプライミングおよび誘導のための薬剤および条件を含む、プライミング剤の最適な濃度ならびにプライミング剤の最適な組み合わせ、が変化することは、理解される。しかし、そのような条件は、当業者によって、大量の実験をすることなく決定され得る。
【０１５９】
誘導または処理とは、微生物性（ウイルス性、細菌性、または真菌性）インデューサー、インデューサー（例えば、内毒素または細菌の細胞壁含有抽出物）または非微生物性インデューサーとして作用し得る微生物抽出物の、細胞培養物への添加をいう。例示的な非微生物性インデューサーとしては、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）（例えば、ポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）もしくはポリｒ（Ｉ）：ポリｒ（Ｃ）（ポリＩＣ）またはウイルス性ｄｓＲＮＡ（例えば、センダイウイルスＲＮＡ））、低分子（例えば、ポリアニオン、ヘパリンデキストランサルフェート、コンドロイチンサルフェート）およびサイトカインが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６０】
ウイルス性の誘導の例示的な方法としては、（１）生きたウイルス（例えば、センダイウイルス、脳心筋炎ウイルスまたは単純疱疹ウイルス）に曝すこと；（２）殺された前述のウイルスに曝すこと；または（３）単離した二本鎖ウイルスＲＮＡに曝すことが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、サイトカイン誘導は、特定の細胞においてサイトカイン産生を刺激することが知られている特定のサイトカインを添加することによって、産生され得るかまたは増強され得る。一般的に、誘導剤の添加の後、細胞はさらに、所望のレベルの誘導または分泌されたサイトカインが得られるまでインキュベートされる。一般的に、３７℃での少なくとも１２〜４８時間、そして７２〜９６時間までのインキュベーションで十分である。
【０１６１】
誘導剤が、サイトカイン産生を誘導するのに効果的な量（例えば、培養培地においてサイトカイン混合物の産生を得るのに効果的な（例えば、約０．００１〜１００μｇ／ｍｌ））およびサイトカイン産生を誘導する期間で、添加される。
【０１６２】
本方法の１つの例示的な適用において、細胞は、ＩＦＮ−βを用いて約２４時間プライミングされ、その後ポリＩ：Ｃおよびシクロへキシミドを含有する培地に約５時間曝され、最後１時間の間アクチノマイシンＤが添加される。
【０１６３】
本方法の別の例示的な適用において、細胞は、ＩＦＮ−βを用いて約２４時間プライミングされ、次いでウイルス性インデューサー（例えば、センダイウイルス（ＳＶ））を用いた約１時間の処理によって誘導され、その後ポリＩ：Ｃおよびシクロへキシミドを含有する培地に約５時間曝され、最後１時間の間アクチノマイシンＤが添加される。
【０１６４】
実施例１は、ＣｒｍＡ発現細胞株の生成およびこの細胞のさらなる誘導（ｓｕｐｅｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）またはウイルス性の誘導を記載する。実施例２は、本発明の実施における使用に適する、例示的なベクター、トランスフェクション方法および、抗アポトーシスタンパク質（Ｂｃｌ−ＸＬ）もまた発現するサイトカイン調節因子過剰発現細胞株の産生、を記載する。実施例３は、例示的なサイトカイン調節因子過剰発現細胞株、および抗アポトーシスタンパク質もまた発現するサイトカイン調節因子過剰発現株による、サイトカイン産生を記載する。
【０１６５】
１つの好ましいアプローチにおいて、サイトカイン調節因子の過剰発現および１種以上のサイトカインの産生は、ＤＥＡＥデキストランを用いた細胞のさらなる処理によってもたらされる。別のアプローチにおいて、サイトカイン調節因子発現は、サイトカイン調節因子をコードする核酸配列の発現を制御するプロモーターと相互作用する、別の調節因子によって増強され得る。内因性のＰＫＲをコードする核酸配列の発現は、インターフェロン誘導性ＧＡＳエレメント、ＩＬ−６感受性のＮＦ−ＩＬ６およびＡＰＲＦエレメント、ならびにＮＦ−κＢエレメントを含む調節因子によって調節され得る（例えば、Ｊａｇｕｓ  Ｒ．ら、１９９９およびＷｉｌｌｉａｍｓ  ＢＲ、１９９９）
代表的には、培養、プライミングおよび処理（すなわち、誘導）後の種々の時点で、培養培地は、１種以上の選択されたサイトカインの存在について検査される。選択されたサイトカインの存在は、周知の生物学的アッセイに従って、直接的な検出（例えば、抗体結合アッセイ）によってか、または種々のサイトカイン応答性細胞の活性に対する培養培地の効果によって間接的に、アッセイされる。
【０１６６】
１つの例示的なアプローチにおいて、培養の工程は、血清を含有する培地中で実施され、誘導の工程は、実質的に無血清および／またはタンパク質フリーの培地中で実施される。このアプローチは、サイトカイン混合物が得られる最終的な細胞培養培地が、最小限の添加された血清タンパク質を有し、従ってヒトへの投与に適するサイトカイン組成物を得るためのより単純な精製方法にそれ自体役立つという利点を提供する。
【０１６７】
別の例示的なアプローチにおいて、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）を用いるＰＫＲ過剰発現Ｎａｍａｌｗａ４１０２７細胞株のプライミング、それに次ぐポリＩ：Ｃを用いる誘導は、野生型のＮａｍａｌｗａ細胞株で観測される発現よりも高いＰＫＲ発現を誘導するのに効果的であった。図６＊は、野生型のＮａｍａｌｗａ細胞によるＴＮＦ−β産生、ＩＬ−６産生およびＩＬ−８産生と比較した、ＮａｍａｌｗａＰＫＲ＋４１０２７細胞におけるポリＩ：Ｃ誘導後の増強されたＴＮＦ−β産生、ＩＬ−６産生およびＩＬ−８産生を例示する。これらの結果は、サブクローニングおよび選択によって誘導されるＰＫＲ過剰発現細胞株が、実施例３においてさらに記載されるように、サイトカイン混合物を産性することを示す。
【０１６８】
（ＶＩＩ．サイトカイン調節因子の評価法およびサイトカイン発現の評価法）  サイトカイン調節因子およびサイトカインの、活性、発現、および／または産生は、当該分野において公知の方法によって決定され得る。例としては、生物学的活性の機能的アッセイおよびノーザンブロットまたはｍＲＮＡの逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が挙げられる。発現されたタンパク質を検出するために、例えば、イムノアッセイが用いられ得る。
【０１６９】
あるいは、発現は、免疫学的方法（例えば、発現を直接的に評価するための細胞または組織切片の免疫組織化学的染色（例えば、間接免疫蛍光アッセイ）、ＥＬＩＳＡ、競合的イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット等）によって測定され得る。免疫組織化学的染色および／またはサンプル流体のアッセイに有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれでもよく、そして任意の哺乳動物において調製され得る。
【０１７０】
例としては、内因性のＰＫＲをコードする核酸配列もしくは外因的に提供されたＰＫＲをコードする核酸配列の存在、増幅および／または発現は、サンプル中で直接的に（例えば、ＰＫＲ活性、ＰＫＲ発現および／またはＰＫＲ産生のアッセイによって）測定され得る。そのようなアッセイとしては、自動リン酸化アッセイ、ｅｌＦ２αリン酸化アッセイ、キナーゼアッセイ；ｍＲＮＡの転写を定量化するためのノーザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析またはＲＮＡ分析）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラ−ゼ連鎖反応）、またはＰＫＲをコードする核酸配列に基づく、適切な標識化プローブを用いた、インサイチュハイブリダイゼーション；および従来のサザンブロッティングが挙げられる。
【０１７１】
そのような方法の詳細は、当業者に公知であり、そのような方法を実施するための多くの試薬は、市販されている。一般的に、サイトカイン分析のためのキットは、市販され、そして公知のサイトカインまたは他のタンパク質の発現レベルの定量的なイムノアッセイに用いられ得る（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓより入手可能なサイトカイン検出キット）。
【０１７２】
（ＶＩＩＩ．サイトカイン産生）
サイトカイン調節因子および／または抗アポトーシスタンパク質を過剰発現する細胞によって産生されたサイトカインは、培地中に分泌され、そして、例えば、細胞培養培地から、望まれない成分を取り除くことによって、精製または単離され得る。一般的に、サイトカインを分画して、選択された特性（例えば、特定の結合因子（例えば、抗体またはレセプター）に対する結合親和性）を有するか；または選択された分子量の範囲、もしくは選択された等電点の範囲を有するサイトカインを分離する。
【０１７３】
（Ａ．サイトカインの精製および／または単離）
適切な期間にわたる、１種以上の細胞株の選択、改変、プライミングおよび処理（すなわち、誘導）の組み合わせの後、サイトカイン混合物の産生が、達成される。次いで、細胞が産生したサイトカイン混合物を含有する培養培地が収集され、そしてサイトカインが、この細胞株培養物から、単離および／または精製される。収集された培養培地が、懸濁された細胞を含有する程度まで、この培地は、低速で遠心分離されるか、ろ過されるか、または細胞および細胞の残骸を取り除くためのそれ以外の処理をされる。その培地はさらに、サイトカインの分子量範囲（代表的には約１０〜４０ｋＤ）の外側にある低分子成分（例えば、発熱物質）および高分子成分を取り除くために、（例えば、ダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）または分子ふるい（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｅｖｅ）クロマトグラフィーによって）処理され得る。
【０１７４】
所望のサイトカイン混合物を得るために、サイトカイン産生細胞からの培養培地は、結合因子（例えば、抗体またはレセプター）への各々のサイトカインの結合親和性、それらの分子量または等電点を利用する、種々のタンパク質単離手順に供される。例示的な手順としては、抗体アフィニティカラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー；エタノール沈降；逆相ＨＰＬＣ；シリカ上またはカチオン交換樹脂（例えば、ＤＥＡＥ）上のクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング（ｃｈｒｏｍａｔｏｆｏｃｕｓｉｎｇ）；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈降；またはゲルろ過（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を用いる）が挙げられる。タンパク質精製の種々の方法が、使用され得、そしてそのような方法は、当該分野において公知でありそして例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８２、１９９０；Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８２において記載されている。選択される精製工程は、用いられる産生プロセスの特質および産生された特定のサイトカイン混合物に依存し得る。
【０１７５】
好ましい単離方法において、所望のサイトカイン混合物を含有する組成物は、親和性クロマトグラフィーを用いる、選択されたサイトカインの単離によって同時精製される。この方法は、親和性媒体として、所望のサイトカインに結合する、精製された抗サイトカイン抗体またはサイトカイン特異的レセプターを使用する。多くのサイトカインに対して特異的な抗体は、市販されている（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔａｌｏｇ  ２０００−２００１（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））。
【０１７６】
さらに、サイトカイン−抗体相互作用に適するアフィニティカラムは、商業的会社（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）より入手し得る。本発明に従うサイトカイン組成物を調製するためのそのようなカラムの使用において、このカラムは、溶液（例えば、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ））を用いて平衡化され、そして所望のサイトカインに対して選択された抗体が、抗体が結合し得るように予め平衡化されたアフィニティカラム上にロードされる。細胞培養物から直接にかまたは部分的な精製の後に得られるサイトカイン含有培養培地が、低温（例えば、４℃）に冷却され、そしてアフィニティカラム上にロードされる。次いでこのカラムは、サイトカインが対応する抗体に結合することを可能にするように、タンブリングデバイス上で室温にて１２〜１８時間インキューベートされる。
【０１７７】
インキュベーションの後、このカラムが、１つ以上の洗浄溶液（例えば、ＴＢＳ）を用いて洗浄され、次いで、結合したサイトカインが、適切な溶出緩衝液を用いて溶出される。例えば、各々本明細書中において、タンパク精製のためのアフィニティクロマトグラフィーの使用についての詳細を提供する、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、（１９８９）および米国特許第４，３８５，９９１号、同第３，９８３，００１号、同第４，９３７，２００号、および同第５，９７２，５９９号を参照のこと。
【０１７８】
クラマトグラフィーによる分離は、複数の異なるアフィニティカラムの各々を用いて、選択されたサイトカイン混合物から各個々のサイトカインを連続的に除去し、そして得られた個々に精製されたサイトカインを組み合わせることによってか、または好ましくは、最終的なサイトカイン組成物または混合物に含まれるいくつかのサイトカインに対して複数の抗体が結合したカラムを含む、アフィニティカラム材料と共に細胞培地を混合することによって実施され得る。本発明の別の局面に従って、このサイトカイン混合物を処理して、選択された指標において公知の価値をほとんど有さないかもしくは公知の価値を有さないサイトカインか、または治療的効果に対する負の影響を有することが知られているかもしくはおそらく有するサイトカインを取り除き得る。
【０１７９】
本発明のサイトカイン組成物またはサイトカイン混合物は、本明細書中に記載された方法によって調製されたサイトカイン産生細胞によって産生された２種以上のサイトカインを含む。その混合物中のサイトカインは、それらの特定の生物学的活性単独によってかまたはその混合物の他の成分と組み合わせた生物学的活性について、そして癌、ウイルス感染、および炎症の処置におけるそれらの役割または潜在的な利益について選択される。これらの決定は、存在する臨床試験データ、インビトロでの細胞の研究および種々のサイトカインの作用に関する科学文献からの情報に基づいてなされる。
【０１８０】
（ＩＸ．本発明のサイトカイン組成物の使用）
本発明のサイトカイン組成物またはサイトカイン混合物は、経口送達、眼内送達、経皮送達、経皮（ＴＤ）注射、筋内（ＩＭ）注射、皮下（ＳＣ）注射、静脈内（ＩＶ）注射、腹腔内（ＩＰ）注射、および腫瘍周囲注射を含むが、これらに限定されない経路によってかまたは吸入によって投与され得る。好ましい投与の経路は、筋内経路、皮下経路または静脈内経路による注射である。典型的には、処置は、所望の終点（例えば、腫瘍の負荷の減少、ウイルス感染の除去、または炎症の症状の減少）に達するまで継続される。当業者によって理解されるように、処置効果の好ましい指標は、処置下の疾患状態に依存して変化する。任意の治療的レジメンを用いる場合、本発明のサイトカイン混合物を用いる処置の持続期間は、処置効果の評価結果に従い調整される。そのような評価は、処置下の疾患状態に適する頻度で、規則的に実施される。例えば、悪性の癌の効果的な処置は、新生物細胞のさらなる拡散を防ぎ、死亡率を減少させなくてはならない（すなわち、この疾患を有する患者の生存期間を増加しなくてはならない）。
【０１８１】
サイトカイン混合物投与に関する適切なレジメンは、多様であるが、最初の投与、その後の、次の投与まで１以上の間隔での反復投与によって類型化される。
【０１８２】
本発明の方法の１つの例示的な適用において、サイトカインは、インターフェロン−αまたはインターフェロン−βであり、そしてその投薬量は、患者１人あたり投与１回あたりのサイトカイン総濃度で約３００〜５００万ＩＵから約１５００万〜２０００万ＩＵで変化する（ここで、平均的な患者は、７０ｋｇであり、かつ代表的なサイトカイン組成物は、約１×１０８ＩＵ／ｍｇ〜約１×１０９ＩＵ／ｍｇの特異的活性を有する）。
【０１８３】
本発明の方法の別の例示的な適用において、サイトカインは、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＦＮγであり、そしてその投薬量は、患者１人あたり投与１回あたりのサイトカイン総濃度で約１００〜３００万ＩＵから約５００万〜１０００万ＩＵで変化する（ここで平均的な患者は、７０ｋｇである）。
【０１８４】
代表的な治療のレジメンにおいて、サイトカイン混合物は、４〜６週間にわたって、１〜３回／週投与される。しかし、いくつかの場合においては、サイトカイン混合物の投与は、数年以上の不定の期間にわたって継続され得る（例えば、ＭＳの処置のためのインターフェロン−β投与の場合）。
【０１８５】
現在、外科手術、放射線療法、および化学療法は、癌処置の主な方法である。サイトカイン混合物の投与が、これらの他の癌療法ならびにモノクローナル抗体および癌ワクチンを含む新規の緊急の処置様式と組み合わせられ得ることが意図される。本明細書中に記載の方法が、外科手術、放射線療法、および化学療法のいずれか１つと相乗的にかまたは相加的に相互作用し得、より高い治療的効果を生むことが、理解される。いくつかの場合においては、癌処置の改善された方法は、従来の癌処置を組み合わせ得る（例えば、サイトカイン混合物の投与と組み合わせた、化学療法または放射線療法）。
【０１８６】
上記の処置のレジメンは、例示的な目的のために示され、そしてこの処置レジメンは、患者の応答に依存して、必要とされるように調整され得る。
【０１８７】
本明細書中に引用されるすべての特許および参考文献は、本明細書によってその全体が参考として明確に援用される。
【０１８８】
以下の実施例は、本発明を例示するが、いずれの様式においても本発明を限定することを意図しない。
【０１８９】
（実施例１）
（トランスジェニックＣｒｍＡ発現細胞株の調製および特徴づけ）
（Ａ．トランスジェニックＣｒｍＡ発現細胞株の調製）
ｐＥＦ  ＦＬＡＧ−ｃｒｍＡ−ｐｕｒｏ発現ベクターを、Ｈｕａｎｇら（１９９７）によって記載されたベクターに基づく、ＭｉｚｕｓｈｉｍａおよびＮｅｇａｔａ（ＮＡＲ  １８、５３２２、１９９０）によって記載されたｐＥＦ  ＢｏｓベクターにインフレームでＣｒｍＡのコード配列を挿入することによって構築した。ｐＥＦ  ＦＬＡＧ−ｃｒｍＡ−ｐｕｒｏは、強力な延長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーターの制御下にある抗アポトーシスＣｒｍＡタンパク質をコードする全長のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１４２１７；牛痘ウイルス白色痘疹改変体（ＣＰＶ−Ｗ２）（ＣｒｍＡ）遺伝子、完全なコード配列）およびｐＧＫプロモーターの制御下にあるプロマイシン耐性遺伝子を含む。さらなる注目すべき特徴は、ＣｒｍＡを発現する細胞株の検出を容易にするためにＣｒｍＡ核酸配列に付加されたＮ末端ＦＬＡＧエピトープ（Ｈｏｐｐら、１９８８）のコード配列である。
【０１９０】
このベクターはまた、以下：（ｉ）ｍＲＮＡの安定性増強のためのポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列（ｉｉ）エピソーム複製および単純なベクターのレスキューのためのＳＶ４０起点；（ｉｉｉ）Ｅ．ｃｏｌｉにおける選択および維持のためのアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起点；ならびに（ｉｖ）ｐＥＦ  ＦＬＡＧ−ｃｒｍＡ−ｐｕｒｏを用いたトランスフェクション後に、プラスミド含有真核生物細胞の選択および同定を可能とするプロマイシン耐性マーカー（Ｐｕｒｏ）を含む。
【０１９１】
トランスフェクションの前日に、６ウェルプレートに５×１０４／ウェルでＭＧ−６３細胞を播種した。２μｇのｐＥＦ  ＦＬＡＧ−ｃｒｍＡ−ｐｕｒｏプラスミドＤＮＡを１００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（血清、タンパク質または抗体を含まない）に懸濁した。リポフェクタミン試薬（Ｇｉｂｃｏ、１０μｌ）を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ血清フリー培地を用いて１００μｌまで希釈した。この２つの溶液を穏やかに混合した後、ＤＮＡリポソーム複合体形成を可能にするように、この混合物を室温で４５分間インキュベートした。ＭＧ−６３細胞の処理の直前に、６００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ無血清培地を、ＤＮＡ−リポソーム混合物を含む反応管に添加し、最終的なトランスフェクション溶液を得た。ＰＢＳを用いて細胞を洗浄し、次いで最終的なＤＮＡ−リポソーム混合物を添加し、そして３７℃で４時間インキュベートした。この後、１ｍｌのＭＥＭ−５％ＦＢＳを添加し、さらに１６時間インキュベートした。この培養物の上清を穏やかな吸引によって取り除き、そして新しい細胞増殖培地（５％ＦＢＳを補充したＭＥＭ）を添加した。４８時間のインキュベーションの後、選択マーカー（ジェネチシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（Ｇ４１８、５００μｇ／ｍｌ））を含有する新しい培地（５％ＦＢＳを有するＭＥＭ）を添加し、当該分野において公知の標準的な方法論を用いて安定なトランスフェクト株を選択した。概して、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いた選択により３〜４週間で大量の安定な形質転換体の集団を得た。
【０１９２】
（Ｂ．トランスジェニックＣｒｍＡ発現細胞株の特徴付け）
（１．増加した細胞生存率）
野生型（ＷＴ）ＭＧ−６３細胞およびＣｒｍＡ発現（ＣｒｍＡ−＃２）ＭＧ−６３細胞を、以下の手順を用いて、センダイウイルス（ＳＶ）誘導およびさらなる誘導（ＳＩ；Ｉｎｏｕｅ  Ｉら、１９９１）によって処理した。
【０１９３】
細胞を、２４ウェルプレート中に２．５×１０４細胞／ウェルの細胞密度で播種し、その後５％のＣＯ２濃度で３７℃でインキュベートした。インキュベーションの後、ＩＦＮ−β（１００ＩＵ／ｍｌ）を用いて２４時間、細胞をプライミングした。次いでこの細胞を、２００μｌのＭＥＭ培地（２％の仔ウシ血清（ＦＢＳ）を補充）中の１０００ヘマグルチニン単位のＳＶを各ウェルに添加し、そして１時間インキュベートし、その後ポリＩ：Ｃ（１００μｇ／ｍｇ）およびシクロへキシミド（５μｇ／ｍｌ）を含有する３００μｌの新しい培地を添加し、そしてさらに５時間インキュベートすることによって誘導した。最後の１時間の間、アクチノマイシンＤを、４μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。誘導プロセスの後、処理した細胞を、ＰＢＳを用いて３回洗浄し、全てのインデューサーを取り除き、そして２％ＦＢＳを含有する新しいＭＥＭ中に再懸濁した。
【０１９４】
センダイウイルス（ＳＶ）±によってもさらなる誘導（ＳＩ）によっても処理されていない、野生型（ＷＴ）ＭＧ−６３細胞およびＣｒｍＡ発現（ＣｒｍＡ＃２）ＭＧ−６３細胞をコントロール（ＵＴ）として用いた。各々の型の細胞の生存率を、標準的なヨウ化プロピジウムＦＡＣＳアッセイを用いて測定した。図１に示すように、ＣｒｍＡ発現は、ＳＶ／ＳＩ性の誘導細胞死を阻害する（ＳＶ誘導およびＳＩ処理の２０時間後のＣｒｍＡ発現細胞の８０％までの生存率によって示される）。対照的に、同じ条件に曝された野生型ＭＧ−６３細胞の２０％のみが、このプロセスを生存した。
【０１９５】
（２．サイトカインの増強された産生）
細胞を、２０時間インキュベートし、次いで各ウェルから培養培地を収集し、ＥＬＩＳＡによってインタフェロン−β（ＩＦＮ−β）産生についてアッセイした。このＩＦＮ−β  ＥＬＩＳＡを、供給者によって記載されたように実施した（Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−β  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ；販売ＴＦＢ，Ｉｎｃ、および製造ＦＵＪＩＲＥＢＩＯ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）。図２に示すように、ＣｒｍＡ＃２  ＭＧ−６３細胞によって、ＭＧ−６３野生型の対応物と比較して、非常により多くのＩＦＮ−βを産生した。
【０１９６】
ＣｒｍＡ発現（ＣｒｍＡ−＃２）ＭＧ−６３細胞を、０、２ｍＭ、４ｍＭ、および８ｍＭのヌクレオシドアナログ２−アミノプリン（２−ＡＰ）（ＰＫＲの公知のインヒビター）を含有する培地においてさらなる誘導（ＳＩ）処理に供した。
【０１９７】
プライミングの前日に、５％のＣＯ２濃度、３７℃の２４ウェルプレート中に２．５×１０４細胞／ウェルの密度にて細胞を播種することによって、ＳＩ（さらなる誘導）処置を実施した。インキュベーションの後、この細胞をＩＦＮ−β（１００ＩＵ／ｍｌ）を用いて２４時間プライミングし、次いでポリＩ：Ｃ（１００μｇ／ｍｌ）およびシクロヘキシミド（５μｇ／ｍｌ）を含有する５００μｌの新しい培地を添加し、そしてこの細胞をさらに５時間インキュベートした（最後の１時間の間、アクチノマイシンＤを最終濃度４μｇ／ｍｌまで添加した）。この誘導プロセスの後、全てのインデューサーを取り除くために、処理した細胞をＰＢＳを用いて３回洗浄し、そして２％ＦＢＳを含有する新しいＭＥＭ中に再懸濁した。
【０１９８】
図３に示すように、２−ＡＰは、用量に依存的な様式で、ＩＦＮ−β産生を阻害し、これによりＰＫＲがＩＦＮ−β発現の調節において役割を果たすことを確認した。
【０１９９】
（３．ウエスタンブロットによるＦｌａｇ−ＣｒｍＡタンパク質発現の分析）
上に示したように調製した、親野生型細胞株（ＭＧ−６３−ＷＴ）およびＣｒｍＡ形質転換体（ＭＧ−６３−ＣｒｍＡ−＃２）の細胞を、１００ｍｍディッシュ中で１００％コンフルエンスまで培養した。冷たいリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で細胞を洗浄し、細胞スクレーパーを用いて１．５ｍｌの微小遠心分離管中に収集した。ＰＢＳを用いたさらなる洗浄の後に、この細胞を溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ［ｐＨ  ７．５］、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．２５％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＫＣＬ、１ｍＭ  ジチオトレイトール、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１×Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｃｏｃｋｔａｉｌ［Ｒｏｃｈｅ］）中、氷上で１０分間インキュベートし、次いで１０，０００ｇで１０分間遠心分離した。この溶解物上清を新しい微小遠心分離管に移し、製造者によって提供されたプロトコールに従ってＢＲＬキットを用いて、タンパク質濃度を測定した。タンパク質１００μｇを含有する細胞溶解物を、４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＭＯＰＳゲル上にロードし、そして電気泳動分離に供し、その後ゲルをＰＶＤＦ膜上にブロットした。さらにこの膜を５％ミルクＰＢＳ中で一晩ブロットし、そして１：５００希釈で一次抗ラットＦｌａｇ抗体（Ｄｒ．Ａ  Ｓｔｒａｓｓｅｒ（Ｒｏｙａｌ  Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）厚意により提供された）に１時間曝した。ブロットされた膜をＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を用いて３回洗浄し、そして二次抗ラットＨＲＰ結合体化抗体（１：２０００）と共に１時間インキュベートした。Ｆｌａｇ−ＣｒｍＡタンパク質の存在を、ＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて検出した。
【０２００】
ＣｒｍＡ発現プラスミドを用いてトランスフェクトされた細胞の各々のサンプルは、発現を示さなかった親野生型コントロール細胞（ＭＧ６３−ＷＴ）と対照的に、高レベルのＦｌａｇ−ＣｒｍＡ発現を示した。
【０２０１】
（実施例２）
（ＰＫＲ単独またはＰＫＲおよび抗アポトーシスタンパク質を過剰発現するＮａｍａｌｗａ細胞株）
（Ａ．ｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｂｃｌ−ＸＬの調製）
ｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｂｃｌ−ＸＬベクター（Ｈｕａｎｇら、１９９７）は、抗アポトーシスＢｃｌ−ＸＬタンパク質をコードし、強力な延長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーターに作動可能に連結された全長ｃＤＮＡを含む。このベクターのさらなる顕著な特徴は、高レベルのＢｃｌ−ＸＬを発現する細胞株の選択を容易にするために、Ｂｃｌ−ＸＬタンパク質に付加されたＮ末端ＦＬＡＧエピトープ（Ｈｏｐｐら、１９８８）である。
【０２０２】
このベクターはまた、ｉ）ｍＲＮＡの安定性増強のためのポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列；ｉｉ）エピソーム複製および単純なベクターのレスキューのためのＳＶ４０起点；ｉｉｉ）Ｅ．ｃｏｌｉにおける選択および維持のためのアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起点；ならびにｉｖ）Ｂｃｌ−ＸＬおよびＰＫＲのトランスフェクション後に、プラスミドを含有する真核生物細胞の選択および同定を可能とするプロマイシン耐性マーカー（Ｐｕｒｏ）を含む。
【０２０３】
（Ｂ．ｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＰＫＲの調製）
ｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＰＫＲベクターは、全長ヒトＰＫＲ分子（５５１アミノ酸；Ｍｅｕｒｓら、１９９０；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ００２７５９）をコードするｃＤＮＡを含み、このｃＤＮＡは、配列ＭＤＹＫＤＤＤＤＫをコードするＮ末端ＦＬＡＧタグ（Ｈｏｐｐら、１９８８）を含むようにポリメラーゼ連鎖反応によって改変され、そしてＦＬＡＧ−ＰＫＲのコード配列がＣＭＶプロモーターの制御下で発現するように、真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に挿入されている。
【０２０４】
このベクター（ｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＰＫＲと呼ばれる）は、ＰＫＲ転写に適する様々な特徴を含み、その特徴は以下：ｉ）高レベルのｍＲＮＡ発現のためのヒトＣＭＶの極初期遺伝子由来のプロモーター配列；ｉｉ）ｍＲＮＡの安定性を増強するためのウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子由来のポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列；ｉｉｉ）エピソーム複製および単純なベクターのレスキューのためのＳＶ４０起点；ｉｖ）Ｅ．ｃｏｌｉにおける選択および維持のためのアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起点；ならびにｖ）プラスミドを含有する真核生物細胞のトランスフェクション後の選択および同定を可能とするＧ４１８耐性マーカー（Ｎｅｏ）を含む。
【０２０５】
第二のＰＫＲベクター（ｐＴＲＥ−ＰＫＲと称される）を、同じＰＫＲ  ｃＤＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから得たｐＴＲＥプラスミドの制限／挿入部位へと挿入することによって調製した。このｐＴＲＥプラスミドは、最初に記載されたｐＫＲベクターの作製において用いられたｐＦＬＡＧに類似するが、挿入遺伝子を制御するために用いられるＣＭＶプロモーターの上流にテトラサイクリン応答性エレメントを含む。
【０２０６】
（Ｃ．６Ａ細胞株（Ｂｃｌ−ＸＬ陽性かつＰＫＲ陽性）の調製）
ヒトＢリンパ芽球細胞株Ｎａｍａｌｗａ（ＷＴ）を、プラスミド（ｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｂｃｌ−ＸＬおよびｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＰＫＲ）を用いて連続的にトランスフェクトした。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）を８００ｕＦ、３００Ｖの設定で用い、１５μｇのｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｂｃｌ−ＸＬプラスミド含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１０％のＦＢＳを含む）を用いた４×１０６の対数的に増殖するＮａｍａｌｗａ細胞のエレクトロポレーションによって、安定なトランスフェクト株を得た。大量の安定な形質転換体を、２μｇ／ｍｌのプロマイシン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いた３〜４週間の選択によって得、そして下記のフローサイトメトリーによってＢｃｌ−ＸＬ発現についてスクリーニングした。この大量のトランスフェクト株を洗浄し、アセトン透過性にし、続いて２μｇ／ｍｌマウス抗ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体（ＩＢＩ）を用い、次いでフィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（１μｇ／ｍｌ；Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて染色した。細胞を、ＦＡＣＳｃａｎで分析し、それらの前方光散乱特性および側方光散乱特性に基づいて生きた細胞および死細胞を識別し、そしてＢｃｌ−ＸＬ発現細胞を蛍光強度のレベルによって識別した。次いで、ｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＰＫＲを用いて、高レベルのＢｃｌ−ＸＬ発現形質転換体（Ｎａｍａｌｗａ−Ｂｃｌ−ＸＬ）をトランスフェクトした。
【０２０７】
安定な高レベルＢｃｌ−ＸＬ発現トランスフェクト株を、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）を８００μＦ、３００Ｖの設定で用い、１５μｇのｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＰＫＲプラスミド含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１０％のＦＢＳを含む）を用いた４×１０６の対数的に増殖するＮａｍａｌｗａ−Ｂｃｌ−ＸＬ細胞のエレクトロポレーションによって得た。２ｍｇ／ｍｌのジェネチシン（Ｇ４１８、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いた３〜４週間の選択によって大量の安定な形質転換株を得た。続いて、クローン株を、限界希釈クローニングにより得、そしてウェスタンブロット分析（Ｈｕａｎｇら、１９９７）によってＢｃｌ−ＸＬ発現およびＰＫＲ発現について分析した。これらのタンパク質を、２μｇ／ｍｌの抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を用い、その後、ヤギ抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼ結合体を用い、そしてＥＣＬ検出法（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて同定した。例示的なＢｃｌ−ＸＬ陽性かつＰＫＲ陽性の細胞株を、６Ａと称した。
【０２０８】
（Ｄ．Ａ９細胞株（ＰＫＲ陽性）の調製）
Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）を８００μＦ、３００Ｖの設定で用い、１５μｇのｐＴＲＥ−ＰＫＲプラスミド含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１０％のＦＢＳを含む）を用いた、４×１０６の対数的に増殖するＮａｍａｌｗａ細胞のエレクトロポレーションによって、安定な高レベルＰＫＲ発現トランスフェクト株を得た。２ｍｇ／ｍｌのジェネチシン（Ｇ４１８、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いた３〜４週間の選択によって大量の安定な形質転換株を得た。続いて、限界希釈クローニングによりクローン株を得、そしてウェスタンブロット分析（Ｈｕａｎｇら、１９９７）によってＰＫＲ発現について分析した。
【０２０９】
（Ｅ．トランスジェニックＢｃｌ−ＸＬ発現かつＰＫＲ発現Ｎａｍａｌｗａ細胞株の特徴づけ）
（１．増加した細胞生存率）
野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＷＴ）ならびに実施例２Ｃおよび実施例２ＤからのＡ９細胞およびＡ６細胞を、ＰＫＲ過剰発現およびサイトカイン誘導の条件下で培養物中の細胞生存率について試験した。特に、ＰＫＲおよびＢｃｌ−ＸＬで２重にトランスフェクトＮａｍａｌｗａ細胞（６Ａ細胞株）、ＰＫＲでトランスフェクトされたＮａｍａｌｗａ細胞（Ａ９細胞株）ならびに親Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＷＴ）を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で２．５×１０５細胞／ｍｌで培養した。この細胞を２０ｍＭのＰＭＡ（プライミング剤）を用いて２０時間処理し、その後２００μｇ／ｍｌのポリｒ（Ｉ）：ポリｒ（Ｃ）および１０μｇ／ｍｌのＤＥＡＥデキストラン（ポリＩＣ誘導）を用いて７２時間か、または２００ＨＡＵ／１×１０６細胞のセンダイウイルスを用いて４８時間のいずれかで処理した。処理の後で、ＦＡＣＳｃａｎでのフローサイトメトリーを用いて、細胞生存率を評価した。
【０２１０】
図４Ａは、センダイウイルス誘導後、細胞生存率が、ＰＫＲでトランスフェクトされたＮａｍａｌｗａ細胞（Ａ９細胞株）ならびに親Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＷＴ）に関して類似し、ＰＫＲおよびＢｃｌ−ＸＬで２重にトランスフェクトされたＮａｍａｌｗａ細胞（６Ａ細胞株）についてはより高い生存率が認められたことを示す。
【０２１１】
図４Ｂは、ポリＩＣ誘導後、細胞生存率が、ＰＫＲおよびＢｃｌ−ＸＬで２重にトランスフェクトされたＮａｍａｌｗａ細胞（６Ａ細胞株）ならびに親Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＷＴ）に関して類似し、ＰＫＲでトランスフェクトされたＮａｍａｌｗａ細胞（Ａ９細胞株）については、より低い生存率が認められたことを示す。
【０２１２】
（２．インターフェロン−αの増加した発現）
ポリＩＣおよびセンダイウイルスによるサイトカイン（両方ともＰＫＲ過剰産生条件下）誘導後、ＩＦＮ−α産性のレベルをまた、これら３つの細胞株において分析した。この培養物の上清を収集し、ＥＬＩＳＡキットの供給者（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって提供された手順に従って、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−αレベルについて分析した。
【０２１３】
図５Ａ中に示す結果は、センダイウイルス誘導後、ＰＫＲおよびＢｃｌ−ＸＬで２重にトランスフェクトされたＮａｍａｌｗａ細胞（６Ａ細胞株）によるＩＦＮ−α産生が、ＰＫＲでトランスフェクトされたＮａｍａｌｗａ細胞（Ａ９細胞株）のＩＦＮ−α産生および親Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＷＴ）のＩＦＮ−α産生よりも有意に高かったことを示す。
【０２１４】
図５Ｂ中に示す結果は、ポリＩＣ誘導後、ＰＫＲでトランスフェクトされたＮａｍａｌｗａ細胞（Ａ９細胞株）ならびにＰＫＲおよびＢｃｌ−ＸＬで２重にトランスフェクトされたＮａｍａｌｗａ細胞（６Ａ細胞株）による、ＩＦＮ−α産生が、親Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＷＴ）によるＩＦＮ−α産生よりも有意に高かったことを示す。
【０２１５】
（実施例３）
（調製およびＰＫＲ過剰発現Ｎａｍａｌｗａ細胞株によるサイトカイン産生）
（Ａ．サイトカインおよび治療的タンパク質過剰発現Ｎａｍａｌｗａ細胞株の調製）
野生型のＮａｍａｌｗａ細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．）より得た。これらの細胞を、以下に詳述するように、培養し、サブクローニングし、選択し、プライミングしそして誘導した。
【０２１６】
野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞株を、０．５〜１５％の範囲の濃度でウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で培養した。個々の細胞を、当業者によって通常用いられる標準法を用いて、９６ウェルプレート中で培養することによる、限界希釈クローニング（「サブクローニング」）に供した。このサブクローニング工程を１〜５回実施し、そしてサブクローンを、親細胞株を培養するために典型的に使用される培養条件を用いて増殖させ、約３０〜５０万細胞／ｍｌの集団を得た。次いでサブクローンを、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、ＰＫＲ自己リン酸化アッセイ（ＤｅｒおよびＬａｕ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９２：８８４１−８８４５、１９９５）、ｅｌＦ２αリン酸化の測定について公開された方法を用いるヒストンリン酸化についてのアッセイ（Ｚａｍａｎｉａｎ−Ｄａｒｙｏｕｓｈ、Ｄｅｒ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ  １８：３１５−３２６、１９９９）およびキナーゼアッセイ（ＰＫＲの免疫沈降によって実施される、キナーゼ活性についてのインビトロでのアッセイ）（Ｚａｍａｎｉａｎ−Ｄａｒｙｏｕｓｈら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０：１２７８−１２９０、２０００）によって、ＰＫＲ発現およびＰＫＲ活性についてアッセイした。
【０２１７】
親細胞株よりも少なくとも２倍より高いキナーゼ活性を示すサブクローンを選択した。選択したサブクローンをまた、ウェスタンブロットおよびノーザンブロットによってＰＫＲ産生および／またはＰＫＲ発現についてスクリーニングした。次いで、選択したサブクローンを、誘導前にプライミングを用いてか、または用いずに誘導し、ＰＫＲおよびサイトカインの活性、産生および／または発現をさらに増強した。
【０２１８】
例示的なＰＫＲ過剰発現細胞株（Ｎａｍａｌｗａ  ＰＫＲ＋＋４１０２７細胞（サブクローン：２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７．Ｃ１．Ａ９）およびＮａｍａｌｗａ  ＰＫＲ＋＋４１０２７細胞（サブクローン：２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７．Ｇ３．Ｃ１）と称される）を、本発明を例示するために、本明細書中に用いる。
【０２１９】
（Ｂ．ＰＫＲ過剰発現Ｎａｍａｌｗａ細胞の特徴づけ）
（１．Ｎａｍａｌｗａ  ＰＫＲ＋＋４１０２７細胞のサブクローンによるＴＮＦ−β、ＩＬ−６およびＩＬ−８の発現）
Ｎａｍａｌｗａ  ＰＫＲ＋＋４１０２７細胞（サブクローン：２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７．Ｃ１．Ａ９）およびＷＴ  Ｎａｍａｌｗａ細胞を、細胞密度５．０×１０５細胞／ｍｌで、２０ｎＭのホルボールミリステートアセテートを用い、６ウェルプレートで２０時間、前処理した。その後、２００μｇ／ｍｌのポリＩ：Ｃを用いてさらに７２時間、処理し、サイトカイン発現を誘導した。誘導の２４時間後、４８時間後、７２時間後に、処理した細胞から培養物の上清を取り出し、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を介してＴＮＦ−β産生、ＩＬ−６産生およびＩＬ−８産生を評価した。
【０２２０】
図６は、野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞によるＴＮＦ−β産生、ＩＬ−６産生およびＩＬ−８産生と比較した、Ｎａｍａｌｗａ  ＰＫＲ＋＋４１０２７細胞（サブクローン：２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７．Ｃ１．Ａ９）における、ポリＩ：Ｃ誘導後の増強されたＴＮＦ−β産生、ＩＬ−６産生およびＩＬ−８産生を例示する。ＴＮＦ−β産生のレベルは、誘導後７２時間が最も高く、この時点でこのＮａｍａｌｗａ  ＰＫＲ＋＋４１０２７細胞（サブクローン：２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７．Ｃ１．Ａ９）は、野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞よりも約３倍高いＴＮＦ−β産生を示した。同様に、ポリＩ：Ｃを用いた誘導後７２時間で、Ｎａｍａｌｗａ  ＰＫＲ＋＋４１０２７細胞（サブクローン：２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７．Ｃ１．Ａ９）において、親のコントロールの誘導と比べて１０倍を超えるＩＬ−６誘導およびＩＬ−８誘導が存在した（図６）。
【０２２１】
（２．サイトカインおよび治療的タンパク質過剰発現細胞株における増強されたＩＦＮ−γ産生）
Ｎａｍａｌｗａ  ＰＫＲ＋＋４１０２７細胞（サブクローン：２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７．Ｇ３．Ｃ１）を、細胞密度５．０×１０５細胞／ｍｌで、２０ｎＭのホルボールミリステートアセテートを用い、６ウェルプレート中で２０時間にわたり３７℃で前処理し、サイトカイン発現のプライミングをした。この処理の後で、１００μｇ／ｍｇ  ポリ（Ｉ）ポリ（Ｃ）および１０ｕｇ／ｍｌのＤＥＡＥデキストランにさらに４８時間曝し、サイトカイン発現を誘導した。誘導後４８時間で、処理した細胞から培養物の上清を取り出し、そしてＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓより得たキットを用いるＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−γの発現および分泌について評価をした。製造者の指示に従い、このＥＬＩＳＡを実施した。
【０２２２】
（３．サイトカインおよび治療的タンパク質過剰発現細胞株における複数のサイトカインの増強された産生）
１０％ＦＢＳが補充されたＤＭＥ／Ｆ１２培地中で培養したＮａｍａｌｗａ  ＰＫＲ＋＋４１０２７細胞（サブクローン：２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７．Ｃ１．Ａ９）を、細胞密度７〜８×１０５細胞／ｍｌで、１ｍＭの酪酸ナトリウムを用い、６ウェルプレートで２４時間、３７℃で前処理し、サイトカイン発現のプライミングをした。この処理の後で、センダイウイルス（１００ＨＡ単位）にさらに２４〜４８時間にわたって曝し、サイトカイン発現を誘導した。誘導後２４時間または４８時間で、処理した細胞から培養物の上清を取り出し、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓより得たキットを製造者の指示に従い用いるＥＬＩＳＡによって、サイトカインまたは治療的タンパク質の発現および分泌を評価した。検出されたサイトカイン発現または治療的タンパク質発現のレベルを示す結果を、表２に提供する。
【０２２３】
（表２．Ｎａｍａｌｗａ４１０２７細胞＆からのサイトカイン発現または他の治療的タンパク質発現）
【０２２４】
【表２】
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１プライミング条件および誘導条件の意の特定のセットのもとで検出されたサイトカイン発現のレベルは、所定の細胞株が発現し得るサイトカインの総数も、絶対的なレベルも示さない。プライミング剤および誘導剤の選択およびその濃度、インキュベーション温度、培地および培地添加物、ｐＨ、細胞密度、培容器の構造、エアレーション、撹拌、ならびに他の培養条件が挙げられるが、これらに限定されないパラメータは、サイトカイン発現の最終的なレベルに影響し得る。
【０２２５】
（実施例４）
野生型（ＷＴ）ＭＧ−６３細胞、ＣｒｍＡ発現ＭＧ−６３細胞またはＣｒｍＡおよびＰＫＲ発現ＭＧ−６３細胞を、以下にさらに記載するように調製および処理し、サイトカイン産生を誘導した。
【０２２６】
（Ａ．ＣｒｍＡまたはＣｒｍＡおよびＰＫＲでトランスフェクトされたＭＧ−６３細胞は、サイトカイン混合物を産生する）
ヒト骨芽細胞腫ＭＧ−６３細胞を、ＡＴＣＣより得、そして５％のＣＯ２の存在下で、５％のＦＢＳを補充したＭＥＭ中で、３７℃で維持する。このＭＧ−６３細胞を、リポフェクタミンを用い（（製造者；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）によって示唆された手順を用いて）、（１）ＰＥＦ  Ｆｌａｇ−ＣｒｍＡ（プロマイシン）プラスミド（これに関するプラスミドマップおよび構築方法は、Ｈｕａｎｇ  ＤＣら、（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９９７  Ｊａｎ  ３０；１４（４）：４０５−１４）に記載されている）（Ｄｒ．Ｓｔｒａｓｓｅｒ提供）を用いてトランスフェクトした。個々の細胞クローンを、限界希釈（３〜５細胞／ｍｌ）および９６ウェルプレートを用いた個々の抗生物質耐性コロニーの選択によって単離した。
【０２２７】
続いて、ＣｒｍＡ発現ＭＧ−６３細胞を、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いて、ｐｅｔ  Ｖ５−ＰＫＲｗｔプラスミド（ブラスチシジン（ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）；Ｄｒ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｂ．Ｒ．Ｇ．；Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎによって提供された）でトランスフェクトし、そして安定な細胞株を、１．５μｇ／ｍｌプロマイシンおよび１０μｇ／ｍｌのブラスチシジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の存在下で選択した。個々の細胞クローンを、限界希釈（３〜５細胞／ｍｌ）および９６ウェルプレートを用いた個々のブラスチシジン耐性コロニーの選択によって単離した。ＰＫＲ発現を、Ｖ５エピトープタグ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたウェスタンブロットによって評価した。
【０２２８】
ＳＩ（さらなる誘導）を、Ｉｎｏｕｅ  Ｉら（１９９１）によって記載されたように実施した。さらなる誘導の１日前に、細胞を、６ウェルプレート中に播種し、５％のＣＯ２存在下、３７℃でインキュベートした。次の日、細胞を、１００ＩＵ／ｍｌのＩＦＮ−βおよび１ｍＭの酪酸ナトリウムを用いてプライミングした。２４時間後、ポリＩ：Ｃ（１００μｇ／ｍｌ）およびシクロヘキシミド（５μｇ／ｍｌ）を含有する新しい培地を５時間にわたり添加した。最後の１時間の間、アクチノマイシンＤを、最終濃度４μｇ／ｍｌまで添加した。次いで、細胞を、全てのインデューサーを取り除くためにＰＢＳを用いて３回洗浄し、そして培地を５％の血清を含有するＭＥＭに交換した。２０時間のインキュベーションの後、この培地を、製造者（Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓおよびＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の説明書に従って実施されるアッセイを用いる、ＥＬＩＳＡによるサイトカイン分析のために収集した。この分析の結果を表３に示す。この表は、分析したサイトカインのうち、ＭＧ−６３細胞が発現するＩＦＮβ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＦＧＦおよびＶＥＧＦを示す。
【０２２９】
（表３．ＭＧ−６３細胞からのサイトカイン発現または他の治療的タンパク質発現）
【０２３０】
【表３】
2004529851.tif 000004
（実施例５）
（発現の分析）
Ｎａｍａｌｗａ  ＰＫＲ＋＋４１０２７細胞（サブクローン：２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７．Ｃ１．Ａ９）のサイトカイン発現プロファイルを、ＰＮＡＳ  １９９８、９５：１５６２３−１５６２８において記載されたようにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）ヒト遺伝子チップを用いて決定した。
【０２３１】
ＲＮＡを、ローラーボトル中の、１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥ／Ｆ１２培地において培養したＮａｍａｌｗａ  ＰＫＲ＋＋４１０２７細胞（サブクローン：２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７．Ｃ１．Ａ９）からの発現を分析するために調製した。この細胞を、細胞密度７〜８×１０５細胞／ｍｌで、１ｍＭの酪酸ナトリウムを用いて２４時間３７℃でプライミングし、１２００ｒｐｍで遠心分離し、そして１％のＦＢＳを有する新しい増殖培地中に密度１×１０７細胞／ｍｌで再懸濁した。この処理の後、さらに６０〜９０分間、センダイウイルス（１００ＨＡ単位）に曝し、その後、３倍容積の新しい培地を添加し、そして４８時間インキュベートし、サイトカイン発現を誘導した。この処理の最後に細胞を、収集し、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６２、１５６−１５９（１９８７）に記載の一工程の酸グアニジニウムチオシアネート／フェノール／クロロホルム抽出法によって、遺伝子チップ分析のためにＲＮＡを調製した。
【０２３２】
（表４．誘導後のＡ９（ＰＫＲトランスフェクトされた）Ｎａｍａｌｗａ細胞の遺伝子チップ発現の結果）
【０２３３】
【表４】
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2004529851.tif 000006
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前述より、本発明のどれだけ多様な目的および特徴が満たされるかが、認められ得る。ここで当業者は、前述の記載より、本発明の広範な教示が多様な形態で実施され得ることを理解し得る。従って、本発明を、その特定の実施形態および実施例と共に記載してきたが、特許請求された本発明から逸脱することなく、多様な変化および改変がなされ得ることが、理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、さらなる誘導およびＳｅｎｄａｉウイルスを用いるウイルス誘導後の、親野生型（ＷＴ）ＭＧ−６３細胞およびＣｒｍＡ発現（ＣｒｍＡ−＃２）ＭＧ−６３細胞における、細胞生存率のヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ）アッセイの結果を示す。
【図２】
図２は、さらなる誘導およびセンダイウイルス処理後の、親野生型（ＷＴ）ＭＧ−６３細胞およびＣｒｍＡ−発現（ＣｒｍＡ−＃２）ＭＧ−６３細胞におけるインターフェロン−β産生を示す。
【図３】
図３は、さらなる誘導後のＣｒｍＡ−発現（ＣｒｍＡ−＃２）ＭＧ−６３細胞におけるインターフェロン−β産生に対する０、２ｍＭ、４ｍＭ、８ｍＭの２−アミノプリン（２−ＡＰ；ＰＫＲインヒビター）の効果を示す。
【図４Ａ】
図４Ａは、センダイウイルス（図４Ａ）によるサイトカイン誘導後の、生存可能な６Ａ細胞株、Ａ９細胞株およびＷＴ細胞株のパーセンテージを示す。
【図４Ｂ】
図４Ｂは、ポリＩＣ（図４Ｂ）によるサイトカイン誘導後の、生存可能な６Ａ細胞株、Ａ９細胞株およびＷＴ細胞株のパーセンテージを示す。
【図５Ａ】
図５Ａは、センダイウイルス（図５Ａ）を用いた処理後の、Ｎａｍａｌｗａ細胞形質転換体６Ａ細胞株、Ｎａｍａｌｗａ細胞形質転換株Ａ９細胞株およびＷＴ細胞株において産生されたＩＦＮ−αレベルを示す。
【図５Ｂ】
図５Ｂは、ポリＩＣ（図５Ｂ）を用いた処理後の、Ｎａｍａｌｗａ細胞形質転換体６Ａ細胞株、Ｎａｍａｌｗａ細胞形質転換株Ａ９細胞株およびＷＴ細胞株において産生されたＩＦＮ−αレベルを示す。
【図６】
図６は、Ｎａｍａｌｗａ野生型（ＷＴ）およびＮａｍａｌｗａＰＫＲ−過剰発現細胞株であるＮａｍａｌｗａＰＫＲ＋＋４１０２７細胞（サブクローン：２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７．Ｃ１．Ａ９）の培養物中の、ＴＮＦ−βサイトカイン、ＩＬ−４６サイトカインおよびＩＬ−８サイトカインの同時発現を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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