(57)【要約】本発明は、ＢＡＳＢ０５５ポリペプチドと、ＢＡＳＢ０５５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、組み換え技術を利用してそのようなポリペプチドを産生する方法とを提供する。本発明はまた、それらを用いた診断、予後予測、治療の方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％が一致するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％が一致する、請求の範囲第１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求の範囲第１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載のポリペプチドの免疫原性断片であって、この免疫原性断片の免疫活性が、配列番号２のポリペプチドと実質的に同じであることを特徴とする免疫原性断片。
【請求項６】
配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号１のポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでおり、配列番号１の配列またはその断片を有する標識されたプローブを用いてストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件下で適切なライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求の範囲第６〜８項のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、発現ベクターまたは生きた組み換え微生物。
【請求項１０】
請求の範囲第６〜８項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを発現させる方法であって、これらポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含む発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換させ、そして、そのポリヌクレオチドのうちの任意の１つを発現させるのに十分な条件下でこの宿主細胞を培養することを含む、ポリヌクレオチドの発現方法。
【請求項１１】
請求の範囲第１〜５項のいずれか１項に記載のポリペプチドの有効量と、医薬として許容される担体とを含むワクチン組成物。
【請求項１２】
請求の範囲第６〜８項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの有効量と、医薬として許容される担体とを含むワクチン組成物。
【請求項１３】
少なくとも１つの別のナイセリア・メニンギティディス抗体を含む、請求の範囲第１１項または第１２項に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
請求の範囲第１〜５項のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは免疫原性断片に対して免疫特異的な抗体。
【請求項１５】
ナイセリア・メニンギティディスの感染を診断する方法であって、請求の範囲第１〜５項のいずれか１項に記載のポリペプチド、またはこのポリペプチドに対して免疫特異的な抗体が、そのような感染が疑われる動物に由来する生物学的サンプルに存在するかどうかを同定することを含む診断方法。
【請求項１６】
動物に免疫応答を発生させる薬剤の製造のための、請求の範囲第１〜５項のいずれか１項に記載のポリペプチドを免疫学的に有効な量含む組成物の使用。
【請求項１７】
動物に免疫応答を発生させる薬剤の製造のための、請求の範囲第６〜８項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを免疫学的に有効な量含む組成物の使用。
【請求項１８】
請求の範囲第１〜５項のいずれか１項に記載のポリペプチドに対する少なくとも１つの抗体と、医薬として許容される担体とを含む、ナイセリア・メニンギティディスに感染した病人の治療において有用な治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、ポリヌクレオチド（本明細書では、“ＢＡＳＢ０５５ポリヌクレオチド”と呼ぶ）、これらポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド（本明細書では、“ＢＡＳＢ０５５”、または“ＢＡＳＢ０５５ポリペプチド”と呼ぶ）、ならびにこれらを産生させるための組み換え材料と方法に関するものである。別の側面として、本発明は、これらポリペプチドおよびポリヌクレオチドの利用方法にも関する。利用方法としては、例えば、細菌感染に対するワクチンが含まれる。さらに別の側面として、本発明は、所定の病原菌に感染したことを検出するための診断法にも関する。
発明の背景
ナイセリア・メニンギティディス（髄膜炎菌）は、ヒト上気道からしばしば単離されるグラム陰性細菌である。この細菌は、菌血症や髄膜炎などの侵入性細菌性疾患を引き起こすことがある。髄膜炎の発生には、地理差、季節差、年差が見られる（シュワルツ， Ｂ．、ムーア， Ｐ．Ｓ．、ブルーム， Ｃ．Ｖ．、Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ．、 第２巻（補）、Ｓ１８〜Ｓ２４ページ、１９８９年）。温和な気候の国においては、この疾患はたいてい血清型Ｂの菌株によって起こり、人口１０万人あたり１年に１〜１０人の割合で発生するが、時にはさらに大きな割合になることもある（カツマルスキー， Ｅ．Ｂ．（１９９７）、Ｃｏｍｍｕｎ． Ｄｉｓ． Ｒｅｐ． Ｒｅｖ．、第７巻、Ｒ５５〜５９ページ、１９９５年；ショルテン， Ｒ．Ｊ．Ｐ．Ｍ．、ビールマー， Ｈ．Ａ．、プールマン， Ｊ．Ｔ． 他、Ｃｌｉｎ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．、第１６巻、２３７〜２４６ページ、１９９３年；クルス， Ｃ．、パベス， Ｇ．、アギラール， Ｅ． 他、Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ． Ｉｎｆｅｃｔ．、第１０５巻、１１９〜１２６ページ、１９９０年）。
【０００２】
血清型Ａの髄膜炎菌が優勢な主に中央アフリカにおいては、感染者の割合が人口１０万人あたり１年に１０００人に達することがある（シュワルツ， Ｂ．、ムーア， Ｐ．Ｓ．、ブルーム， Ｃ．Ｖ．、Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ．、 第２巻（補）、Ｓ１８〜Ｓ２４ページ、１９８９年）。全体として、髄膜炎のほとんどは血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ−１３５、Ｙの髄膜炎菌によって起こり、４価のＡ、Ｃ、Ｗ−１３５、Ｙ多糖ワクチンが利用できる（アルナン， Ｊ．、アルマンジョン， Ｆ．、ミナール， Ｍ．Ｃ．、ラフェ， Ｃ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｓｔａｎｄ．、第１０巻、３３５〜３３９ページ、１９８２年）。
【０００３】
多糖ワクチンは、現在、輸送タンパク質と化学的に結合させるという改良が続けられている（リーバーマン， Ｊ．Ｍ．、チュー， Ｓ．Ｓ．、ウォン， Ｖ．Ｋ． 他、ＪＡＭＡ、第２７５巻、１４９９〜１５０３ページ、１９９６年）。
【０００４】
血清型Ｂのワクチンは利用できない。というのも、Ｂ莢膜多糖は免疫原性を示さないことが判明したからである。これは、宿主の成分と構造的に似ていることが原因である可能性が高い（ヴァイル， Ｆ．Ａ．、アーテンシュタイン， Ｍ．Ｓ．、ブラント， Ｍ．Ｌ． 他、Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．、第１２６巻、５１４〜５２２ページ、１９７２年；フィンネ， Ｊ．Ｍ．、レイノネン， Ｍ．、メケレ， Ｐ．Ｍ．、Ｌａｎｃｅｔ、第２巻、３５５〜３５７ページ、１９８３年）。
【０００５】
長年にわたって努力が続けられ、髄膜炎菌の外膜に基づいたワクチンが開発された（デ・モラエス， Ｊ．Ｃ．、パーキンズ， Ｂ．、カマルゴ， Ｍ．Ｃ． 他、Ｌａｎｃｅｔ、第３４０巻、１０７４〜１０７８ページ、１９９２年；ブジューン， Ｇ．、ホイビー， Ｅ．Ａ．、グロンスビー， Ｊ．Ｋ． 他、Ｌａｎｃｅｔ、第３３８巻、１９９１年）。このワクチンは、年長の子ども（４歳より上）と青少年では５７〜８５％に効果のあることがわかった。
【０００６】
このワクチンの中には細菌の外膜成分が多数存在している。例えば、ＰｏｒＡ、ＰｏｒＢ、Ｒｍｐ、Ｏｐｃ、Ｏｐａ、ＦｒｐＢである。しかし、観察されている防御効果に対するこれら成分の寄与は、さらに明確にする必要がある。細菌の他の外膜成分であるＴｂｐＢやＮｓｐＡなどは、動物またはヒトの抗体を用いることにより、免疫防御に関係している可能性のあることが明らかにされている（マルタン， Ｄ．、カデュー， Ｎ．、アメル， Ｊ．、ブロドゥー， Ｂ．Ｒ．、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、第１８５巻、１１７３〜１１８３ページ、１９９７年；リソロ， Ｌ．、メートル−ヴィルモット， Ｃ．、デュマ， Ｐ． 他、Ｉｎｆ． Ｉｍｍｕｎ．、第６３巻、８８４〜８９０ページ、１９９５年）。免疫防御のメカニズムは、抗体を媒介とした細菌の活性とオプソニン食菌作用に関係しているであろう。
【０００７】
抗体を媒介としたあらゆるメカニズムを合わせ持たせるのに菌血症モデル動物が用いられている（サウッコネン， Ｋ．、レイノネン， Ｍ．、アブディライ， Ｈ．、プールマン， Ｊ．Ｔ．、Ｖａｃｃｉｎｅ、第７巻、３２５〜３２８ページ、１９８９年）。髄膜炎に対する免疫にとって後期補体成分を媒介とした殺菌メカニズムが極めて重要であることが、一般に認められている（ロス， Ｓ．Ｃ．、ローゼンタール， Ｐ．Ｊ．、バーベリック， Ｈ．Ｍ．、デンセン， Ｐ．、Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．、第１５５巻、１２６６〜１２７５ページ、１９８７年）。
【０００８】
ナイセリア・メニンギティディスに感染する頻度は、過去数十年の間に劇的に上昇した。これは、多数の抗生物質に対する耐性を持った菌の出現と、免疫系が弱い人の増加が原因である。標準的な抗生物質のいくつかまたはすべてに耐性のあるナイセリア・メニンギティディスが単離されるのはもはや珍しいことではない。この現象により、これまでに遭遇したことのない医療上の必要性が生じ、新しい抗菌剤、ワクチン、薬剤スクリーニング法、この生物を検出するための診断法に対する要求が生まれている。
発明の要約
本発明は、ＢＡＳＢ０５５に関するものであり、中でも、ＢＡＳＢ０５５ポリペプチド、ＢＡＳＢ０５５ポリヌクレオチド、ならびにこれらを産生させるための組み換え材料と方法に関する。別の側面として、本発明は、これらポリペプチドおよびポリヌクレオチドの利用方法にも関する。利用方法には、特に、微生物による疾患の予防ならびに治療が含まれる。さらに別の側面として、本発明は、微生物の感染に伴う疾患や異常を検出するための診断法にも関する。例えば、ＢＡＳＢ０５５ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現または活性を検出するための方法に関する。
【０００９】
当業者であれば、この明細書の以下の記述やそれ以外の箇所を読むことにより、この明細書に開示された本発明の精神および範囲におけるさまざまな変更や修正を容易に思いつくであろう。
発明の説明
本発明は、ＢＡＳＢ０５５ポリペプチドとポリヌクレオチドに関するものであり、それについて以下に詳細に説明する。特に、本発明は、ナイセリア・ゴノロエアエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）ＭｔｒＣタンパク質に対するアミノ酸配列の相同性により関係付けられる、ナイセリア・メニンギティディスのＢＡＳＢ０５５のポリペプチド及びポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、配列番号１で与えられるヌクレオチド配列と配列番号２で与えられるアミノ酸配列をそれぞれ有するＢＡＳＢ０５５に関する。“ＤＮＡ”として以下の配列リストに示した配列は、本発明の一実施態様の具体例を表わしているものと理解する。当業者であれば、そうした配列を一般にポリヌクレオチド（リボポリヌクレオチドを含む）において利用できることがわかるはずだからである。
ポリペプチド
本発明の一側面によれば、この明細書で“ＢＡＳＢ０５５”、または“ＢＡＳＢ０５５ポリペプチド”と呼ぶナイセリア・メニンギティディスのポリペプチドのほか、生物学的、診断上、予防上、臨床上、または治療上有効なこれらポリペプチドの変異体と、これらを含む組成物とが提供される。
【００１０】
本発明によれば、以下のものがさらに提供される。
（ａ）配列番号２と少なくとも８５％が一致、好ましくは少なくとも９０％が一致、さらに好ましくは少なくとも９５％が一致、最も好ましくは少なくとも９７〜９９％が一致または完全に一致したアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
（ｂ）配列番号１の全長にわたって配列番号１と少なくとも８５％が一致、好ましくは少なくとも９０％が一致、さらに好ましくは少なくとも９５％が一致、それ以上に好ましくは少なくとも９７〜９９％が一致または完全に一致したポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド。
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％が一致、好ましくは少なくとも９０％が一致、さらに好ましくは少なくとも９５％が一致、それ以上に好ましくは少なくとも９７〜９９％が一致または完全に一致したポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド。
【００１１】
配列番号２で与えられるＢＡＳＢ０５５ポリペプチドは、ナイセリア・メニンギティディス菌株ＡＴＣＣ１３０９０に由来するＢＡＳＢ０５５ポリペプチドである。
【００１２】
本発明により、ＢＡＳＢ０５５ポリペプチドの免疫原性断片も提供される。すなわち、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドと同じか実質的に同じ免疫活性を有するＢＡＳＢ０５５ポリペプチドの連続部分が提供される。要するに、この断片（必要であれば担体と結合したときの断片）は、ＢＡＳＢ０５５ポリペプチドを認識する免疫応答を向上させることができる。この免疫原性断片は、例えば、Ｎ末端のリーダー配列、および／または膜貫通領域、および／またはＣ末端のアンカー領域を欠いたＢＡＳＢ０５５ポリペプチドを含んでいてもよい。好ましい一実施態様では、本発明によるＢＡＳＢ０５５の免疫原性断片は、配列番号２の全長にわたって配列番号２と少なくとも８５％が一致、好ましくは少なくとも９０％が一致、さらに好ましくは少なくとも９５％が一致、最も好ましくは少なくとも９７〜９９％が一致したポリペプチドの細胞外領域の実質的にすべてを含んでいる。
【００１３】
断片とは、本発明の任意のポリペプチドの任意のアミノ酸配列の全部ではなく一部と完全に一致したアミノ酸配列を有するポリペプチドのことである。ＢＡＳＢ０５５ポリペプチドの場合のように、断片は、“独立して”いてもよい。すなわち、より大きなポリペプチドに含まれていてその一部または一領域を形成していてもよい。最も好ましいのは、より大きな単一のポリペプチドの中の単一の連続領域を形成していることである。
【００１４】
好ましい断片としては、例えば、配列番号２のアミノ酸配列またはその変異体の一部を含む先の切れたポリペプチドが挙げられる。具体例としては、アミノ末端および／またはカルボキシル末端のアミノ酸配列を含む連続残基列がある。宿主細胞によって、または宿主細胞内で産生された本発明のポリペプチドが分解された形態も好ましい。さらに好ましいのは、構造上または機能上の特性を有する断片、例えば、α螺旋とα螺旋形成領域、βシートとβシート形成領域、ターンとターン形成領域、コイルとコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、柔軟領域、表面形成領域、基質結合領域、抗体高指示領域を含む断片などである。
【００１５】
好ましい断片としては、さらに、配列番号２のアミノ酸配列からの連続したアミノ酸を少なくとも１５、２０、３０、４０、５０、または１００個有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、あるいは、配列番号２のアミノ酸配列から切断または除去した少なくとも１５、２０、３０、４０、５０、または１００個の連続したアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドが挙げられる。
【００１６】
本発明のポリペプチド断片は、ペプチド合成によって対応する完全長ポリペプチドを産生するのに用いることができる。したがって、この断片は本発明の完全長ポリペプチドを産生するための中間体として用いることができる。
【００１７】
特に好ましいのは、いくつかのアミノ酸、例えば５〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個、または１個のアミノ酸の置換、欠失、または付加が任意に組み合わされた変異体である。
【００１８】
本発明のポリペプチドまたは免疫原性断片は、“成熟”タンパク質の形態でもよいし、前躯体または融合タンパク質などのより大きなタンパク質の一部でもよい。分泌配列またはリーダー配列、プロ配列、複数のヒスチジン残基など精製に役立つ配列を含む付加アミノ酸配列、組み換え体産生の間の安定性を維持するための付加配列が含まれていると望ましいことがしばしばある。さらに、最終的に得られる分子の免疫性を向上させるため、外来性ポリペプチド、脂質テイル、またはポリヌクレオチド配列を付加することも考えられる。
【００１９】
一側面によれば、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその断片と、さまざまなサブクラスの免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）のＨ鎖またはＬ鎖の定常領域のさまざまな部分とを含む、遺伝子工学による可溶性融合タンパク質に関する。免疫グロブリンとして好ましいのは、ヒトＩｇＧ、特にＩｇＧ１のＨ鎖の定常部分であり、そのヒンジ領域で融合が起こる。特別な実施態様では、血液凝固第Ｘａ因子でもって切断することのできる切断配列を組み込むだけでＦｃ部分を除去することができる。
【００２０】
さらに本発明は、遺伝子工学によってこの融合タンパク質を調製する方法と、この融合タンパク質を利用した薬剤のスクリーニング、診断、治療に関する。本発明のさらに別の側面は、この融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにも関する。融合タンパク質の技術に関する実例は、国際特許出願番号ＷＯ９４／２９４５８とＷＯ９４／２２９１４に見ることができる。
【００２１】
このタンパク質は、化学的に結合させたり組み換え融合タンパク質として発現させたりすることにより、非融合タンパク質と比べて発現系内での発現レベルを向上させることができる。融合パートナーは、Ｔヘルパー・エピトープ（免疫性融合パートナー）、好ましくはヒトによって認識されるＴヘルパー・エピトープを提供するのに役立ったり、もとの組み換えタンパク質よりも高い効率でタンパク質を発現させる（発現エンハンサー）のに役立ったりする可能性がある。融合パートナーは、免疫性融合パートナーであると同時に発現エンハンサー・パートナーにもなっていることが好ましかろう。
【００２２】
融合パートナーは、インフルエンザ菌に由来するプロテインＤと、インフルエンザ・ウイルスに由来する非構造タンパク質ＮＳ１（ヘマグルチニン）を含んでいる。別の融合パートナーは、ＬｙｔＡとして知られるタンパク質である。このタンパク質のＣ末端部を用いることが好ましい。ＬｙｔＡは、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニン・アミダーゼと、アミダーゼＬｙｔＡ（ｌｙｔＡ遺伝子によってコードされている（Ｇｅｎｅ、第４３巻、２６５〜２７２ページ、１９８６年））と、ペプチドグリカン骨格における所定の結合を特異的に分解するオートリシンを合成する肺炎球菌に由来する。ＬｙｔＡタンパク質のＣ末端領域は、コリンや、ＤＥＡＥなどのコリンのアナログに対する親和性に関与している。この特性を利用して、融合タンパク質の発現に役立つ、大腸菌のＣ−ＬｙｔＡを発現するプラスミドが開発されている。Ｃ−ＬｙｔＡ断片をアミノ末端に有するハイブリッド・タンパク質の精製については、Ｂｉｏｔｅｃｈｅｎｏｌｏｇｙ、第１０巻、７９５〜７９８ページ、１９９２年に記載されている。ＬｙｔＡタンパク質のＣ末端にあって残基番号１７８から始まる繰り返し部分、例えば残基番号１８８〜３０５を用いることが可能である。
【００２３】
本発明には、上記のポリペプチドの変異体も含まれる。すなわち、参照基準と比べて保存されたアミノ酸置換だけが異なるポリペプチドも含まれる。なお保存されたアミノ酸置換とは、１つの残基が特性の似た別の残基で置換されることである。そうした置換の典型例は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン相互の置換；セリンとトレオニンの置換；酸性残基であるアスパラギン酸とグルタミン酸の置換；アスパラギンとグルタミンの置換；塩基性残基であるリジンとアルギニンの置換；芳香性残基であるフェニルアラニンとチロシンの置換である。
【００２４】
本発明のポリペプチドは、適切な任意の方法で調製することができる。そうしたポリペプチドとしては、単離した天然のポリペプチド、組み換えによるポリペプチド、合成したポリペプチド、これらの方法を組み合わせて作ったポリペプチドが挙げられる。このようなポリペプチドを調製する方法は従来技術で周知である。
【００２５】
本発明のポリペプチドはナイセリア・メニンギティディスから由来したものであることが最も好ましいが、分類学上同じ属の他の生物から得られたものも好ましい。本発明のポリペプチドは、例えば、分類学上同じ科または目の生物から得られたものでもよい。
ポリヌクレオチド
本発明の１つの目的は、ＢＡＳＢ０５５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、特にこの明細書でＢＡＳＢ０５５と表記するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することである。
【００２６】
本発明の特に好ましい実施態様では、このポリヌクレオチドは、完全長の遺伝子を含んでいて配列番号１で与えられる配列を有するＢＡＳＢ０５５ポリペプチドをコードする領域、またはその変異体をコードする領域を含んでいる。
【００２７】
配列番号１で与えられるＢＡＳＢ０５５ポリヌクレオチドは、ナイセリア・メニンギティディス菌株ＡＴＣＣ１３０９０に由来するＢＡＳＢ０５５ポリヌクレオチドである。
【００２８】
本発明のさらに別の側面によれば、ＢＡＳＢ０５５ポリペプチドとポリヌクレオチド、特にナイセリア・メニンギティディスのＢＡＳＢ０５５ポリペプチドとポリヌクレオチドをコードおよび／または発現する、単離された核酸分子が提供される。そのような核酸分子としては、例えば、未処理のＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、Ｂ−ＤＮＡ、Ｚ−ＤＮＡが挙げられる。本発明のさらに別の実施態様として、生物学的、診断上、予防上、臨床上、または治療上有効なポリヌクレオチドとポリペプチド、これらの変異体、これらを含む組成物がある。
【００２９】
本発明の別の側面は、配列番号２の推定アミノ酸配列を有するＢＡＳＢ０５５ポリペプチドをコードしており、少なくとも１つの完全長遺伝子を含む単離されたポリヌクレオチドと、このポリヌクレオチドと密接に関係したポリヌクレオチドと、これらの変異体に関する。
【００３０】
本発明の特に好ましい実施態様では、ナイセリア・メニンギティディスに由来し、配列番号２のアミノ酸配列を含むＢＡＳＢ０５５ポリペプチド、またはそのアミノ酸配列からなるＢＡＳＢ０５５ポリペプチド、またはその変異体が提供される。
【００３１】
配列番号１で与えられるポリヌクレオチド配列など、この明細書の情報を用いると、標準的なクローニング法およびスクリーニング法を利用し、次に完全長のクローンを得ることによって、ＢＡＳＢ０５５ポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドを得ることができる。なお標準的なクローニング法およびスクリーニング法としては、出発材料としてナイセリア・メニンギティディス細胞を用いて細菌から染色体ＤＮＡのクローニングとシークエンシングを行なう方法がある。例えば配列番号１で与えられるポリヌクレオチド配列などの本発明のポリヌクレオチド配列を得るためには、大腸菌またはそれ以外の適切な宿主の中で、ナイセリア・メニンギティディスの染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーを、部分配列から由来し、好ましくは１７マーまたはそれよりも長い放射線標識したオリゴヌクレオチドでプローブするのが一般的である。次に、厳しい条件でのハイブリダイゼーションを行なうと、プローブのＤＮＡと同じＤＮＡを有するクローンを識別することができる。もとのポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列から設計したシークエンシング用プライマーを用いたハイブリダイゼーションを通じてこのように同定された個々のクローンをシークエンシングすることにより、ポリヌクレオチド配列を両方の方向に伸長させ、完全長遺伝子の配列を決定することができる。都合のよいことに、このようなシークエンシングは、例えばプラスミド・クローンから調製した変性した二本鎖ＤＮＡを用いて実施することができる。適切な方法は、マニアティス， Ｔ、フリッチ， Ｅ．Ｆ．、サムブルック他、『分子クローニング：実験室マニュアル』第２版（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州、１９８９年）に記載されている（特に「ハイブリダイゼーションによるスクリーニング」１．９０と、「変性した二本鎖ＤＮＡ鋳型のシークエンシング」１３．７０を参照のこと）。直接的にゲノムＤＮＡのシークエンシングを行なって完全長遺伝子の配列を得ることもできる。本発明の証拠として、配列番号１で与えられる各ポリヌクレオチドは、ナイセリア・メニンギティディスに由来するＤＮＡライブラリーの中で発見された。
【００３２】
さらに、配列番号１で与えられる各ＤＮＡ配列は、配列番号２で与えられるアミノ酸残基とほぼ同数のアミノ酸残基を有するタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームを含んでいる。このタンパク質の推定分子量は、当業者には周知のアミノ酸残基の分子量の値を用いて計算することができる。
【００３３】
配列番号１のポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド番号１の開始コドンとヌクレオチド番号１２３７から始まる終止コドンの間で、配列番号２のポリペプチドをコードしている。
【００３４】
本発明のさらに別の側面によれば、以下のものを含む単離されたポリヌクレオチド、または以下のものからなる単離されたポリヌクレオチドが提供される。
（ａ）配列番号１の全長にわたって配列番号１と少なくとも８５％が一致、好ましくは少なくとも９０％が一致、さらに好ましくは少なくとも９５％が一致、それ以上に好ましくは少なくとも９７〜９９％が一致または完全に一致したポリヌクレオチド配列、または
（ｂ）配列番号２の全長にわたって配列番号２と少なくとも８５％が一致、好ましくは少なくとも９０％が一致、さらに好ましくは少なくとも９５％が一致、それ以上に好ましくは少なくとも９７〜９９％が一致または１００％正確に一致したポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列。
【００３５】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ナイセリア・メニンギティディス以外の種からのホモログやオーソログも含め、配列番号１の配列またはその断片からなる標識したプローブまたは検出可能なプローブ、あるいはこれらの配列またはその断片を含む標識したプローブまたは検出可能なプローブを用いてストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件（例えば、温度が４５〜６５℃、ＳＤＳの濃度が０．１〜１％）のもとで適切なライブラリーをスクリーニングし、完全長遺伝子および／またはそのポリヌクレオチド配列を含むゲノム・クローンを単離するステップを含む方法によって得ることができる。
【００３６】
本発明により、配列番号１の中のコード配列（オープン・リーディング・フレーム）と全長にわたって一致するポリヌクレオチド配列が提供される。さらに本発明により、成熟ポリペプチドのためのコード配列またはその断片のほか、成熟ポリペプチドのためのコード配列またはリーディング・フレーム中にあって別のコード配列を有する断片が提供される。別のコード配列とは、例えば、リーダー配列または分泌配列、プレタンパク質配列、プロタンパク質配列、プレプロタンパク質配列をコードする配列である。本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの非コード配列も含んでいてよい。例示するならば、少なくとも１つの非コード５’配列や３’配列、例えば転写はされるが翻訳はされない配列や、終結シグナル（ρ依存性終結シグナルやρ非依存性終結シグナルなど）、リボソーム結合部位、コザック配列、ｍＲＮＡを安定化させる配列、イントロン、ポリアデニル化シグナルなどが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。ポリヌクレオチド配列は、付加アミノ酸をコードする付加コード配列も含んでいてよい。例えば、融合したポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列をコードすることができる。本発明のいくつかの実施態様では、マーカー配列は、ｐＱＥベクター（キアジェン社）の中に与えられるヘキサヒスチジン・ペプチド（ゲンツ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第８６巻、８２１〜８２４ページ、１９８９年）、またはＨＡペプチド・タグ（ウイルソン他、Ｃｅｌｌ、第３７巻、７６７ページ、１９８４年）である。そのどちらも、融合することになるポリペプチド配列を精製するのに役立てることができる。本発明のポリヌクレオチドは、構造遺伝子と、それにもともと付随していて遺伝子の発現を制御する配列とを有するポリヌクレオチドも含んでいる。ただし、本発明のポリヌクレオチドに含まれているのがそれだけとは限らない。
【００３７】
配列番号２のＢＡＳＢ０５５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１のヌクレオチド番号１〜１２３６に含まれるポリペプチド・コード配列と同じであってよい。あるいは、遺伝暗号の冗長性（縮重）の結果として、配列番号２のポリペプチドをコードする配列であってもよい。
【００３８】
“ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド”という表現は、この明細書では、本発明のポリペプチド、特に細菌のポリペプチド、さらに特定するならば、配列番号２で与えられるアミノ酸配列を有するナイセリア・メニンギティディスのＢＡＳＢ０５５ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドのことを意味する。この表現は、ポリペプチドをコードする単一の連続領域または不連続領域（例えば、組み込まれたファージ、組み込まれた挿入配列、組み込まれたベクター配列、組み込まれたトランスポゾン配列によって中断されたポリヌクレオチド、またはＲＮＡの編集、ゲノムＤＮＡの再構成のために中断されたポリヌクレオチド）に加え、やはりコード配列および／または非コード配列を含んでいる可能性のある付加領域を含むポリヌクレオチドのことも意味する。
【００３９】
本発明はさらに、配列番号２の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体をコードする、この明細書に記載したポリヌクレオチドの変異体にも関する。本発明のポリヌクレオチドの断片は、例えば、本発明の完全長ポリヌクレオチドを合成するのに用いることができる。
【００４０】
さらに、特に好ましい実施態様によれば、配列番号２で与えられるＢＡＳＢ０５５ポリペプチドのアミノ酸配列のうち、いくつかのアミノ酸残基、例えば５〜１０個、１〜５個、１〜３個、２個、１個、０個のアミノ酸残基が置換、変更、欠失、および／または、付加された状態が任意に組み合わされたＢＡＳＢ０５５変異体をコードするポリヌクレオチドが提供される。その中でも特に好ましいのは、ＢＡＳＢ０５５ポリペプチドの特性および活性を変化させないサイレントな置換、付加、欠失である。
【００４１】
さらに、本発明の好ましい実施態様によれば、全長にわたって少なくとも８５％が、配列番号２で与えられるアミノ酸配列を有するＢＡＳＢ０５５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと一致するポリヌクレオチドと、そのポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドが提供される。この点に関し、全長にわたって少なくとも９０％が一致するポリヌクレオチドが特に好ましく、そうした特に好ましいポリヌクレオチドの中でも、少なくとも９５％が一致するポリヌクレオチドが特に好ましい。さらに、少なくとも９５％が一致するポリヌクレオチドの中でも少なくとも９７％が一致するポリヌクレオチドがさらに好ましく、その中でも少なくとも９８％一致するもの、少なくとも９９％一致するものがそれ以上に好ましく、少なくとも９９％一致するものがより一層好ましい。
【００４２】
好ましい実施態様によれば、配列番号１のＤＮＡによってコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的な機能または活性を保持しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００４３】
本発明の好ましいいくつかの実施態様によれば、ＢＡＳＢ０５５ポリヌクレオチド配列、例えば配列番号１のポリヌクレオチドと特にストリンジェント条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドが提供される。
【００４４】
本発明はさらに、この明細書に記載したポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。この点に関し、本発明は、特に、この明細書に記載したポリヌクレオチドと厳しい条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。この明細書で用いる“厳しい（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件”、“厳しいハイブリダイゼーション条件”という表現は、配列間で少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％が一致した場合にのみ起こるハイブリダイゼーションのことを意味する。厳しいハイブリダイゼーション条件の具体例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、２０μｇ／ｍｌの変性、切断したサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃にて一晩培養し、次に、ハイブリダイゼーション用支持体を約６５℃にて０．１×ＳＳＣの中で洗浄するというものである。ハイブリダイゼーションと洗浄の条件は周知であり、例えばサムブルック他、『分子クローニング：実験室マニュアル』第２版（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州、１９８９年）の特に第１１章に記載されている。本発明のポリヌクレオチド配列には溶液ハイブリダイゼーションを行なうこともできる。
【００４５】
本発明によればさらに、配列番号１で与えられるポリヌクレオチド配列にとって完全な遺伝子を含む適切なライブラリーを、配列番号１で与えられるこのポリヌクレオチド配列またはその断片を有するプローブを用いて厳しいハイブリダイゼーション条件のもとでスクリーニングし、そのポリヌクレオチド配列を単離することにより得られるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、またはそうしたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。そのようなポリヌクレオチドを得るのに役立つ断片としては、例えば、この明細書の別の箇所に詳しく説明したプローブやプライマーが挙げられる。
【００４６】
本発明のポリヌクレオチド・アッセイに関してはこの明細書の別の箇所に説明してあるが、例えば本発明のポリヌクレオチドをＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーション用プローブとして用い、ＢＡＳＢ０５５をコードする完全長ｃＤＮＡやゲノム・クローンを単離したり、ＢＡＳＢ０５５遺伝子との一致度が高い他の遺伝子、特に配列の一致度が高いｃＤＮＡやゲノム・クローンを単離したりすることができる。このプローブは、一般に、少なくとも１５のヌクレオチド残基または塩基対を含んでいることになろう。このプローブは、少なくとも３０のヌクレオチド残基または塩基対を含んでいることが好ましく、少なくとも５０のヌクレオチド残基または塩基対を含んでいてもよい。特に好ましいプローブは、２０以上かつ３０未満のヌクレオチド残基または塩基対を含むことになろう。
【００４７】
ＢＡＳＢ０５５遺伝子のコード領域は、配列番号１で与えられるＤＮＡ配列を用いてオリゴヌクレオチド・プローブを合成し、このプローブを用いてスクリーニングを行なうことによって単離できる。そこで、本発明の遺伝子と相補的な配列を有する標識したオリゴヌクレオチドを用いてｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、ライブラリーのどのメンバーにプローブがハイブリダイズするかを確認する。
【００４８】
完全長ＤＮＡを得るため、または短いＤＮＡを伸長させるためには、当業者が利用している周知の方法がいくつかある。例えば、ｃＤＮＡ末端高速増幅（ＲＡＣＥ）法に基づいた方法である（例えば、フローマン他、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、第８５巻、８９９８〜９００２ページ、１９８８年を参照のこと）。最近この技術が改良されて例えばＭａｒａｔｈｏｎ（登録商標）法（クロンテック・ラボラトリーズ社）となり、従来よりも長いｃＤＮＡの探索が非常に簡単になった。このＭａｒａｔｈｏｎ（登録商標）法では、ｃＤＮＡは選択した組織から抽出したｍＲＮＡから調製され、“アダプター”配列が各末端部に連結される。次に、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド・プライマーとアダプター特異的なオリゴヌクレオチド・プライマーを組み合わせて核酸の増幅（ＰＣＲ）を行ない、ＤＮＡの“欠けている”５’末端を増幅する。次に、“入れ子になった”プライマー、すなわち増幅された産物の中でアニールするよう設計されたプライマー（代表例は、アダプター配列において３’末端をさらにアニールするアダプター特異的なプライマーや、選択した遺伝子配列において５’末端をさらにアニールする遺伝子特異的なプライマー）を用いてＰＣＲ反応を繰り返す。次に、この反応の産物をＤＮＡシークエンシングにより解析し、存在しているＤＮＡに直接この産物を結合させることによって、あるいは５’プライマーを設計するための新しい配列情報を用いて独立した完全長ＰＣＲを行なうことによって完全長ＤＮＡを構成し、完全な配列を得ることができる。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチドとポリペプチドは、例えば、疾患、中でもヒトの疾患の治療法や診断法を発見するための研究試薬、研究材料として使用することができる。これについてはこの明細書においてポリヌクレオチド・アッセイとの関連で詳しく説明する。
【００５０】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１〜２の配列から導かれたオリゴヌクレオチドである。これらポリヌクレオチドは、この明細書に記載した方法、好ましくはＰＣＲにおいて利用して、ここで同定したポリヌクレオチドの全体または一部が、感染した組織内の細菌の中で転写されるかどうかを確かめるのに用いることができる。このような配列は、病原体の感染段階や感染タイプの診断にも利用できると考えられている。
【００５１】
本発明により、成熟タンパク質に対してアミノ末端またはカルボキシル末端にアミノ酸が付加されたポリペプチド、または成熟ポリペプチド内のアミノ酸からなるポリペプチド（成熟した形態が例えばポリペプチド鎖を２本以上持っている場合）をコードするポリヌクレオチドも提供される。このような配列はいろいろな機能を有するが、中でも、タンパク質を前躯体から成熟した形態へと処理する際にある役割を演じていたり、タンパク質の輸送を可能にしたり、タンパク質の半減期を長くしたり短くしたり、アッセイまたは産生のためにタンパク質の取り扱いを容易にしたりできる可能性がある。生体内では一般的なことだが、付加されたアミノ酸は細胞の酵素によって成熟タンパク質から除去される可能性がある。
【００５２】
本発明のあらゆるポリヌクレオチドのそれぞれについて、相補的なポリヌクレオチドが提供される。これら相補的なポリヌクレオチドは、対象となる各ポリヌクレオチドに対して完全に相補的であることが好ましい。
【００５３】
前躯体タンパク質は、成熟タンパク質に１つまたはそれ以上のプロ配列が融合した形態であるため、不活性になっている可能性がある。プロ配列を除去すると、そうした不活性な前躯体は一般に活性化される。プロ配列のいくつかまたはすべてを除去すると活性化させることができる。一般に、このような前躯体をプロタンパク質と呼ぶ。
【００５４】
本発明のいくつかのポリヌクレオチドを記述するにあたって、ヌクレオチドに対する標準的な表記であるＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ／Ｕに加え、“Ｎ”という表記も用いることができる。“Ｎ”は、ＤＮＡまたはＲＮＡの４つのヌクレオチドのうちの任意のものがＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列の中の指定された位置に現われてよいことを意味している。ただし、正しいリーディング・フレームで隣接したヌクレオチドの位置と組み合わせて読んだ場合に、Ｎがそのリーディング・フレーム内で早すぎる終止コドンを発生させる効果を持つような核酸ではないことが好ましい場合は除く。
【００５５】
要するに、本発明のポリヌクレオチドがコードできるのは、成熟タンパク質、成熟タンパク質＋リーダー配列（これをプレタンパク質と呼ぶことができよう）、プレタンパク質のリーダー配列ではないプロ配列を１つまたはそれ以上有する成熟タンパク質前躯体、またはプレプロタンパク質である。プレプロタンパク質というのはプロタンパク質の前躯体であり、リーダー配列と１つまたはそれ以上のプロ配列を含んでいる。プロ配列は、一般に、活性がある成熟した形態のポリペプチドを生み出すための処理ステップにおいて除去される。
【００５６】
本発明の１つの側面によれば、本発明のポリヌクレオチドを疾病の治療または予防、特に遺伝子免疫法に利用する方法が提供される。
【００５７】
本発明のポリヌクレオチドを遺伝子免疫法に利用する際には、適切なデリバリー方法を用いることが好ましかろう。例えば、プラスミドＤＮＡを筋肉に直接注射する方法（ウォルフ他、Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．、第１巻、３６３ページ、１９９２年；マンソープ他、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ． Ｔｈｅｒ．、第４巻、４１９ページ、１９８３年）、特定のタンパク質担体と複合体を形成したＤＮＡのデリバリー（ウー他、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、第２６４巻、１６９８５ページ、１９８９年）、ＤＮＡ−リン酸カルシウム沈殿法（ベンヴェニスティとリシェフ、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、第８３巻、９５５１ページ、１９８６年）、さまざまな形態のリポソーム内にＤＮＡを包み込む方法（カネダ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４３巻、３７５ページ、１９８９年）、粒子衝撃（タン他、Ｎａｔｕｒｅ、第３５６巻、１５２ページ、１９９２年；アイゼンブラウン他、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、第１２巻、７９１ページ、１９９３年）、クローニングしたレトロウイルス・ベクターを用いたインビボ感染（シーガー他、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、第８１巻、５８４９ページ、１９８４年）といった方法がある。
ベクター、宿主細胞、発現系
本発明は、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むベクターと、本発明のベクターを用いて遺伝子改変した宿主細胞と、組み換え技術による本発明のポリペプチドの産生とに関する。本発明のＤＮＡ構造体に由来するＲＮＡを用いてそのようなタンパク質を産生させるには、細胞フリーな翻訳系も用いることができる。
【００５８】
本発明の組み換えポリペプチドは、発現系を含む遺伝子改変した宿主細胞をもとにして当業者に周知の方法で調製することができる。したがって、さらに別の側面として、本発明は、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む発現系と、その発現系を用いて遺伝子改変した宿主細胞と、組み換え技術による本発明のポリペプチドの産生とに関する。
【００５９】
本発明のポリペプチドを遺伝子組み換えにより産生させるには、遺伝子工学により宿主細胞に発現系またはその一部、あるいは本発明のポリヌクレオチドを組み込む。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するには、標準的な実験の手引書に記載されている方法を用いる。実験の手引書としては、例えば、デイヴィス他、『分子生物学における基本的な方法』（１９８６年）、サムブルック他、『分子クローニング：実験室マニュアル』第２版（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州、１９８９年）がある。方法としては、例えば、リン酸カルシウム・トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランを媒介としたトランスフェクション、トランスベクション、微量注入、陽イオン性脂質を媒介としたトランスフェクション、電気穿孔、形質導入、スクレープ・ローディング、バリスティック導入、感染がある。
【００６０】
適切な宿主細胞の代表例としては、細菌細胞である連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、大腸菌、放線菌、シアノバクテリア、枯草菌、モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、インフルエンザ菌、髄膜炎菌の細胞；菌類の細胞である酵母、クルイヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロミセス、担子菌、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、コウジカビの細胞；昆虫の細胞であるショウジョウバエＳ２、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９の細胞；動物の細胞であるＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３、ＣＶ−１、バウエス黒腫の細胞；植物の細胞である裸子植物、被子植物の細胞が挙げられる。
【００６１】
本発明のポリペプチドを産生させるのに多彩な発現系を用いることができる。そのようなベクターとしては、特に、染色体由来のベクター、エピソーム由来のベクター、ウイルス由来のベクターが挙げられる。具体的には、細菌プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、トランスポゾン由来のベクター、酵母エピソーム由来のベクター、挿入要素由来のベクター、酵母染色体要素由来のベクターや、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ピコルナウイルス、レトロウイルス、アルファウイルスなどのウイルスに由来するベクターのほか、これらの組み合わせに由来するベクター、例えばプラスミドとバクテリオファージの遺伝子要素であるコスミドとファージミドの組み合わせに由来するベクターが挙げられる。発現系構造体は、発現の調節と発生を制御する領域を含んでいてよい。一般に、宿主内でポリヌクレオチドの維持、伝播、発現および／またはポリペプチドの発現をさせるのに適した任意の系またはベクターを用いて発現させることができる。周知のさまざまな一般的な方法のうちの任意の方法を用いて適切なＤＮＡ配列を発現系に挿入することができる。そうした方法は、例えば、サムブルック他、『分子クローニング：実験室マニュアル』（前掲）に記載されている。
【００６２】
真核生物における組み換え発現系においては、翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔、細胞周辺腔、または細胞外環境に分泌させるため、適切な分泌シグナルが、発現されるポリペプチドに組み込まれている可能性がある。このシグナルは、ポリペプチドにとって内在性である可能性と、異種性シグナルである可能性とがある。
【００６３】
本発明のポリペプチドは、周知の方法によって組み換え細胞培養物から回収し、精製することができる。周知の方法としては、例えば、硫酸アンモニウムまたはエタノールによる沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロース・クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティ・クロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィ、レクチン・クロマトグラフィが挙げられる。精製にはイオン金属アフィニティ・クロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）を利用するのが最も好ましい。ポリペプチドが細胞内合成、単離、精製の間に変性した場合には、周知の方法を用いてタンパク質を再度折り畳み、活性な立体配座を再現することができる。
【００６４】
発現系は、ウイルスや細菌などの生きた組み換え微生物であってもよい。対象とする遺伝子を生きた組み換えウイルスや細菌のゲノムに挿入することができる。この生きたベクターを接種して生体に感染させると、抗原が生体内で発現し、免疫応答が誘導されることになる。この目的で使用されるウイルスや細菌としては、例えば、ポックスウイルス（例えばワクシニア、禽痘、カナリア痘）、アルファウイルス（シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ベネズエラ馬脳炎ウイルス）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ピコルナウイルス（ポリオウイルス、ライノウイルス）、ヘルペスウイルス（水痘帯状ヘルペスウイルスなど）、リステリア菌、サルモネラ菌、ナイセリア菌、ＢＣＧが挙げられる。これらのウイルスや細菌は毒性を持っている可能性があり、生ワクチンを得るためにさまざまな方法で毒性を弱めることができる。このような生ワクチンも本発明の一部である。
診断法、予後予測法、血清型分類法、突然変異検出法
本発明は、本発明のＢＡＳＢ０５５ポリヌクレオチドとポリペプチドを診断用試薬として用いることにも関する。真核生物、特に哺乳類、その中でもヒトにおけるＢＡＳＢ０５５ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを検出することにより、疾病の診断、疾病の段階分類、感染した生体の薬剤に対する反応を診断する方法が提供されることになる。真核生物、特に哺乳類、その中でもヒト、その中でもＢＡＳＢ０５５遺伝子またはタンパク質を含む生物に感染したヒト、またはその生物の感染が疑われるヒトは、周知のさまざまな方法ならびにこの明細書に記載した方法によって、核酸またはアミノ酸レベルで検出することが可能である。
【００６５】
予後、診断、またはそれ以外の解析のためのポリペプチドとポリヌクレオチドは、感染が推定される個体および／または感染した個体の体内物質から得ることができる。他の任意の供給源、特にＤＮＡまたはＲＮＡに由来するポリヌクレオチドは、直接検出に用いること、あるいは解析を行なう前にＰＣＲまたはその他の任意の方法で酵素による増幅を行なうことができる。ＲＮＡ、特にｍＲＮＡや、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡも同様にして用いることができる。増幅を行なうことにより、個人に感染した生物またはその個人の体内に住み着いている生物の種や菌株のキャラクテリゼーションを、その生物から選択したポリヌクレオチドの血清型を分析することにより実現できる。増幅された産物を、関連した生物、好ましくは同じ属の異なる種、または同じ種の異なる株から選択した参照配列の血清型と比較した場合のサイズ変化により、欠失および挿入を検出することができる。点突然変異は、増幅したＤＮＡを、標識したＢＡＳＢ０５５ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズさせることにより同定できる。完全に一致した配列、またはかなりの割合が一致した配列は、ＤＮＡとＲＮＡのそれぞれについてＤＡアーゼまたはＲＮアーゼによる消化によって、あるいは溶解温度または再生キネティックスの差を検出することによって、不完全にしか一致していない複製、またはかなりの割合が一致していない複製と区別することができる。ポリヌクレオチド配列の差は、参照配列と比較した場合のゲル中におけるポリヌクレオチド断片の電気泳動における移動度の変化としても検出することができる。その場合に変性剤は用いても用いなくてもよい。ポリヌクレオチドの差は、ＤＮＡまたはＲＮＡを直接シークエンシングすることによっても検出することができる。例えば、マイヤーズ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３０巻、１２４２ページ、１９８５年を参照のこと。特定の位置における配列の変化は、ＲＮアーゼ、Ｖ１、Ｓ１保護アッセイなどのヌクレアーゼ保護アッセイや、化学的切断法によっても明らかにすることができる。例えば、コットン他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第８５巻、４３９７〜４４０１ページ、１９８５年を参照のこと。
【００６６】
別の実施態様では、ＢＡＳＢ０５５ヌクレオチド配列またはその断片を含むオリゴヌクレオチド・プローブをアレイに構成して、例えば遺伝子突然変異、血清型、分類、同定のスクリーニングを効果的に行なうことができる。アレイ技術は周知で一般性があるため、遺伝子発現、遺伝子連鎖、遺伝子可変性などの分子遺伝学のさまざまな問題に適用することができる（例えば、チー他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７４巻、６１０ページ、１９９６年を参照のこと）。
【００６７】
そこで別の側面として、本発明は、以下のものを含む診断キットに関する。
（ａ）本発明のポリヌクレオチド、好ましくは配列番号１のヌクレオチド配列、またはその断片；
（ｂ）（ａ）の配列と相補的なヌクレオチド配列；
（ｃ）本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号２のポリペプチド、またはその断片；
（ｄ）本発明のポリペプチドに対する抗体、好ましくは配列番号２のポリペプチドに対する抗体。
【００６８】
このようなキット（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）のいずれもが実質的な成分を含んでいることが理解されよう。このようなキットは、特に、疾病の診断または疾病に対する感受性の診断に用いられる。
【００６９】
本発明は、診断用試薬としての本発明のポリヌクレオチドの利用法にも関する。本発明のポリヌクレオチド、好ましくは配列番号１のポリヌクレオチドが突然変異して過少発現、過剰発現、または変化した発現を起こすと疾病や病原性と関係してくるので、そうした突然変異を検出することは診断の手段となり、疾病の診断、疾病の予後予測、疾病段階の決定、疾病に対する感受性の確認の参考にしたり、そうしたことを明確にしたりすることができる。このようなポリヌクレオチドに突然変異を起こした生物、特にそのような状態の感染生物は、さまざまな方法、例えばこの明細書の別の箇所に記載した方法によってポリヌクレオチド・レベルで検出することができる。
【００７０】
本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドに突然変異または多型（対立遺伝子の変異）を有する生物からの細胞は、さまざまな方法によってポリヌクレオチドまたはポリペプチドのレベルで検出し、例えば血清型を決めることもできる。例えば、ＲＴ−ＰＣＲを利用してＲＮＡにおける突然変異を検出することができる。ＲＴ−ＰＣＲを自動化した検出システム、例えばジーンスキャンと組み合わせることが特に好ましい。ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡに対してもＰＣＲを行なうことができる。一例として、ＢＡＳＢ０５５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的なＰＣＲプライマーを用いて突然変異を同定したり解析したりすることができる。
【００７１】
本発明によれば、１、２、３、または４個のヌクレオチドが５’末端および／または３’末端から除去されたプライマーがさらに提供される。このプライマーは、特に、個体に由来するサンプル、例えば体を構成している物質に由来するサンプルから単離したＢＡＳＢ０５５ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを増幅するのに用いることができる。感染した個体から単離したポリヌクレオチドをこのプライマーを用いて増幅すると、次にさまざまな方法によりそのポリヌクレオチドの配列を明らかにすることができる。このようにして、ポリヌクレオチド配列における突然変異を検出し、その突然変異をもとにして、感染状態またはその段階や進行状況の診断および／または予後予測、感染体の血清型決定および／または分類を行なうことができる。
【００７２】
本発明によればさらに、疾病の診断、好ましくは細菌感染の診断、さらに好ましくはナイセリア・メニンギティディスによって起こる感染を診断する方法も提供される。この方法には、個体に由来するサンプル、例えば体を構成している物質に由来するサンプルから、配列番号１の配列を有するポリヌクレオチドの発現レベルの上昇を測定する操作が含まれる。ＢＡＳＢ０５５ポリヌクレオチドの発現の上昇または減少は、ポリヌクレオチドの定量法として当業者には周知の方法のうちの任意の方法を用いて測定することができる。そうした方法としては、例えば、増幅法、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＮアーゼ保護法、ノーザン・ブロット法、分光法、その他のハイブリダイゼーション法がある。
【００７３】
さらに、対照用の正常組織サンプルと比べることによってＢＡＳＢ０５５ポリペプチドの過剰発現を検出するという本発明の診断法を利用し、例えば感染の存在を検出することができる。宿主に由来するサンプル、例えば体を構成している物質に由来するサンプル中のＢＡＳＢ０５５ポリペプチドのレベルを測定するのに用いることができるアッセイ法は当業者には周知である。そうしたアッセイ法としては、放射線免疫検定法、競合結合アッセイ、ウエスタン・ブロット解析法、抗体サンドイッチ・アッセイ、抗体検出法、ＥＬＩＳＡ法などがある。
【００７４】
本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド・アレイの成分、好ましくは高密度アレイまたはグリッドの成分として用いることができる。この高密度アレイは、診断および予後予測に特に有効である。例えば、それぞれが、異なる遺伝子に加えて本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むスポットの集合を用い、体を構成している物質から得られた、またはそうした物質に由来するプローブを用い、ハイブリダイゼーションまたは核酸増幅などを利用してプロービングを行ない、個体の体内に特定のポリヌクレオチド配列または関連した配列が存在しているかどうかを決定することができる。そのようなものが存在しているということは、病原体、特にナイセリア・メニンギティディスが存在していることを示唆している可能性があり、疾病または疾病進行の診断および／または予後予測を明確にするのに役立つ可能性がある。配列番号１のポリヌクレオチド配列の多数の変異体を含むグリッドが好ましい。配列番号２のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列の多数の変異体を含むグリッドも好ましい。
抗体
本発明のポリペプチドとポリヌクレオチド、またはその変異体、またはそれを発現する細胞を免疫原として用い、そのようなポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して免疫特異的な抗体を産生させることができる。
【００７５】
本発明の好ましいいくつかの実施態様によれば、ＢＡＳＢ０５５ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する抗体が提供される。
【００７６】
本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する抗体は、本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド、あるいはエピトープを有するその一方または両方の断片、あるいはその一方または両方のアナログ、あるいはその一方または両方を発現する細胞を、動物、好ましくはヒトでない動物に一般的なプロトコルに従って投与することにより得ることができる。モノクローナル抗体を調製するためには、連続的細胞系培養によって産生される抗体を提供する任意の従来法を用いることができる。さまざまな方法があり、例えば、ケーラー， Ｇ、ミルシュタイン， Ｃ．、Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻、４９５〜４９７ページ、１９７５年；コズボー他、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、第４巻、７２ページ、１９８３年；コール他、『モノクローナル抗体とガン治療』（アラン Ｒ． リス社、１９８５年）の７７〜９６ページが挙げられる。
【００７７】
一本鎖の抗体の産生法（アメリカ合衆国特許第４，９４６，７７８号）を利用して本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する一本鎖の抗体を産生させることができる。また、トランスジェニック・マウス、またはそれ以外の生物や動物、例えば哺乳類を利用して、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する免疫特異的なヒト化した抗体を発現させることができる。
【００７８】
別の方法として、ファージ提示法を利用して、抗ＢＡＳＢ０５５を処理するためにスクリーニングされたヒト由来リンパ球のＰＣＲ増幅されたｖ−遺伝子のレパートリーから、あるいは実験されたことのないライブラリーから、本発明のポリペプチドに対する結合活性を有する抗体遺伝子を選択することができる（マッカファーティ他、Ｎａｔｕｒｅ、第３４８巻、５５２〜５５４ページ、１９９０年；マークス他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１０巻、７７９〜７８３ページ、１９９２年）。これら抗体の親和性は、例えばチェーン・シャッフリングによって向上させることもできる（クラクソン他、Ｎａｔｕｒｅ、第３５２巻、６２８ページ、１９９１年）。
【００７９】
上記の抗体を用いて本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを発現するクローンを単離または同定し、例えばアフィニティ・クロマトグラフィによってそのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを精製することができる。
【００８０】
したがって、特にＢＡＳＢ０５５ポリペプチドまたはＢＡＳＢ０５５ポリヌクレオチドに対する抗体を用いて感染、特に細菌感染を治療することができる。
【００８１】
ポリペプチドの変異体として、抗原、エピトープ、または免疫に関して等価な変異体は、本発明の特別な一側面を構成する。
【００８２】
抗体またはその変異体を修飾して個体の中で免疫性を低下させることが好ましい。例えば、個体がヒトである場合、抗体が“ヒト化され”ていて、ハイブリドーマに由来する抗体の相補性決定領域がヒトのモノクローナル抗体に移植されていることが最も好ましい。これについては、例えば、ジョーンズ他、Ｎａｔｕｒｅ、第３２１巻、５２２〜５２５ページ、１９８６年、またはテンペスト他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第９巻、２６６〜２７３ページ、１９９１年に記載されている。
アンタゴニストとアゴニスト−アッセイと分子
本発明のポリペプチドとポリヌクレオチドは、例えば細胞、細胞フリーな調製物、化合物ライブラリー、天然産物の混合物の中で小さな分子からなる基質やリガンドの結合力を評価するのに用いることもできる。これら基質やリガンドは、天然の基質やリガンドでもよく、構造または機能を似せた人工物でもよい。例えば、コリガン他、『免疫学における最新のプロトコル』、第１（２）巻、第５章、１９９１年を参照のこと。
【００８３】
スクリーニング法により、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、そのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを有する細胞または膜、またはそのポリペプチドの融合タンパク質に対する候補化合物の結合を、その候補化合物に直接または間接に付随する標識を用いて容易に測定することが可能である。また、スクリーニング法では、標識した競合化合物との競合が起こることがある。さらに、これらスクリーニング法においてポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む細胞に対する適切な検出システムを用いることにより、候補化合物が、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性化または抑制によってシグナルを発生するかどうかをテストすることができる。活性のインヒビターは、一般に、既知のアゴニストの存在下で分析し、候補化合物が存在していることによってそのアゴニストが活性化に及ぼす効果を観測する。構成的に活性なポリペプチドおよび／または構成的に発現するポリペプチドとポリヌクレオチドを用い、アゴニストまたはインヒビターの存在下で、候補化合物がそのポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性化を抑制するかどうかをテストすることにより、逆アゴニストまたは逆インヒビターのスクリーニングができる。さらに、スクリーニング法は、候補化合物を本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む溶液と混合して混合物にし、その混合物中のＢＡＳＢ０５５ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの活性を測定し、その混合物のＢＡＳＢ０５５ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの活性を基準と比較する操作だけを含むようにすることが可能である。融合タンパク質、例えばＦｃタンパク質とＢＡＳＢ０５５ポリペプチドとから作られる融合タンパク質は、すでに説明したように、本発明のポリペプチドのアンタゴニストや、系統発生上および／または機能上関連したポリペプチドのアンタゴニストを同定するためのハイスループット・スクリーニング・アッセイにも用いることができる（Ｄ． ベネット他、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、第８巻、５２〜５８ページ、１９９５年；Ｋ． ヨハンソン他、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、第２７０巻（１６）、９４５９〜９４７１ページ、１９９５年を参照のこと）。
【００８４】
本発明のポリペプチドと結合および／または相互作用するポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体は、付加化合物が細胞内におけるｍＲＮＡおよび／またはポリペプチドの産生に及ぼす効果を検出するスクリーニング法を設計するのにも用いることができる。例えば、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体を用いてポリペプチドの分泌レベルまたは細胞付随レベルを測定するため、従来技術において標準的な方法によりＥＬＩＳＡを構成することができる。これは、適切に処理した細胞または組織からのポリペプチドの産生を抑制または促進する可能性のある薬剤（それぞれ、アンタゴニスト、アゴニストと呼ばれる）を発見するのに利用できる。
【００８５】
本発明により、ＢＡＳＢ０５５ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの作用を促進（アゴニスト）または阻止（アンタゴニスト）する化合物、特に細菌発育抑制性および／または殺菌性の化合物を同定するための化合物スクリーニング法も提供される。このスクリーニング法にはハイスループット技術を含めることが可能である。例えば、アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするため、ＢＡＳＢ０５５ポリペプチドと、そのポリペプチドの基質またはリガンドを標識したものとを含む合成反応用混合物、細胞の区画（例えば膜、細胞外被、細胞壁）、またはこれらのうちの任意のものの調製物を、ＢＡＳＢ０５５のアゴニストまたはアンタゴニストの可能性がある候補化合物の不在下または存在下で培養する。候補化合物がＢＡＳＢ０５５ポリペプチドを作動させる能力または拮抗する能力は、標識したリガンドの結合の低下、またはそのような基質からの産物の産生低下となって現われる。ＢＡＳＢ０５５ポリペプチドの効果を誘起することなく結合する分子は、よいアンタゴニストである可能性が最も高い。よく結合する分子や、場合によっては基質からの産物の産生率を上昇させる分子、シグナル伝達を増加させる分子、化学チャネルの活性を増大させる分子は、アゴニストである。状況に応じて起こる基質からの産物の産生、シグナル伝達、化学チャネルの活性の割合やレベルは、レポーター系を用いることによって容易に検出することができる。この点に関して役に立つ可能性のあるレポーター系としては、測色用に標識した基質が産物に変換されたもの、ＢＡＳＢ０５５ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの活性の変化に関与するレポーター遺伝子、従来技術で既知の結合アッセイが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【００８６】
ＢＡＳＢ０５５のアゴニストを探すアッセイの別の一例は、競合抑制アッセイにとって適切な条件下で、ＢＡＳＢ０５５と潜在的なアゴニストとを、ＢＡＳＢ０５５と結合する分子、ＢＡＳＢ０５５と結合する組み換え分子、天然の基質またはリガンド、あるいは基質またはリガンドを真似たものと結合させるという競合アッセイである。ＢＡＳＢ０５５を放射活性物質または測色用化合物などで標識すると１つの結合分子に結合したり産物に変換されたりするＢＡＳＢ０５５の数を正確に測定できるため、潜在的なアンタゴニストの効果を評価することができる。
【００８７】
潜在的なアンタゴニストとしては、特に、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドと結合し、そのことによってその活性または発現が抑制されたり消えたりする小さな有機分子、ペプチド、ポリペプチド、抗体が挙げられる。潜在的なアンタゴニストとしては、結合分子の同じ部位に結合するがＢＡＳＢ０５５によって誘起される活性を誘起せず、そのことによってＢＡＳＢ０５５ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドが結合するのを排除してＢＡＳＢ０５５ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの作用または発現を阻止する小さな有機分子、ペプチド、密接な関係のあるタンパク質などのポリペプチド、抗体も可能である。
【００８８】
潜在的なアンタゴニストとしては、ポリペプチドの結合部位と結合してその部位を占拠し、そのことによって細胞と結合する分子の結合を阻止し、正常な生物活性を抑制する小さな分子も挙げられる。小さな分子の実例としては、小さな有機分子、ペプチド、ペプチド様分子が挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。これ以外の潜在的なアンタゴニストとしては、アンチセンス分子がある（この分子の説明に関しては、オカノ、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、第５６巻、５６０ページ、１９９１年；『遺伝子発現のアンチセンス・インヒビターとしてのオリゴデオキシヌクレオチド』、ＣＲＣプレス、ボカ・ラトン、フロリダ州、１９８８年を参照のこと）。好ましい潜在的なアンタゴニストとしては、ＢＡＳＢ０５５と関係のある化合物、ＢＡＳＢ０５５の変異体が挙げられる。
【００８９】
さらに別の側面として、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその断片と、さまざまなサブクラスの免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）のＨ鎖またはＬ鎖の定常領域のさまざまな部分を含む遺伝子組み換え可溶性融合タンパク質に関する。免疫グロブリンとして好ましいのは、ヒトＩｇＧ、特にＩｇＧ１のＨ鎖の定常部分であり、そのヒンジ領域において融合が起こる。特別な実施態様によると、Ｆｃ部は、血液凝固第Ｘａ因子を用いて切断することのできる切断配列を組み込むことによって簡単に除去することができる。本発明はさらに、遺伝子工学によるこの融合タンパク質の調製方法と、この融合タンパク質を利用して行なう薬剤のスクリーニング、診断、治療にも関する。本発明のさらに別の側面は、そのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにも関する。融合タンパク質に関する技術の実例は、国際特許出願ＷＯ９４／２９４５８、ＷＯ９４／２２９１４に見ることができる。
【００９０】
この明細書に記載した各ポリヌクレオチド配列は、抗菌化合物の発見や開発に用いることができる。コードされたタンパク質は、発現すると、抗菌薬剤をスクリーニングするためのターゲットとして用いることができる。さらに、コードされたタンパク質のアミノ末端領域をコードしているポリヌクレオチド配列、シャイン・ダルガルノ配列、または個々のｍＲＮＡの翻訳を容易にする配列を用いてアンチセンス配列を構成し、対象とするコード配列の発現を制御することができる。
【００９１】
本発明により、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニスト、アンタゴニストを利用して、１つまたは複数の病原体と、感染後の発病の原因である真核生物の宿主、好ましくは哺乳類の宿主との間の最初の物理的相互作用を阻止するという利用法も提供される。特に、本発明の分子は、細菌、中でもグラム陽性菌および／またはグラム陰性菌が、留置器具上の真核生物、好ましくは哺乳類の細胞外マトリックス・タンパク質に、または傷の細胞外マトリックス・タンパク質に付着するのを阻止するのに用いること；真核生物、好ましくは哺乳類の細胞外マトリックス・タンパク質と、組織の損傷をもたらす細菌のＢＡＳＢ０５５タンパク質の間に細菌が付着するのを阻止するのに用いること、および／または；留置器具の移植その他の外科的方法とは異なる経緯により感染したことによって発病が普通に進行するのを阻止するのに用いることができる。
【００９２】
本発明のさらに別の側面によれば、ＢＡＳＢ０５５アゴニストとアンタゴニスト、好ましくは細菌発育抑制性および／または殺菌性のアゴニストとアンタゴニストが提供される。
【００９３】
本発明のアゴニストとアンタゴニストは、例えば、疾病の予防、抑制、および／または、治療に用いることができる。
【００９４】
さらに別の側面として、本発明は、本発明のポリペプチドのミモトープに関する。ミモトープは、天然のペプチドと（配列または構造が）非常によく似たペプチド配列であり、天然のペプチドを認識する抗体によって認識される。ミモトープはまた、適切な担体と結合した場合に、天然のペプチドを認識する抗体を強化することもできる。
【００９５】
ペプチド・ミモトープは、選択したアミノ酸を付加したり、欠失させたり、置換したりすることによって特定の目的用に設計することができる。したがってペプチドは、タンパク質担体と容易に結合できるように修飾することができる。例えば、いくつかの化学的結合法にとっては末端にシステインを含むようにすることが望ましかろう。それに加え、タンパク質担体と結合したペプチドにおいて、そのペプチドの結合した末端とは反対側に疎水性末端を含むようにして、そのペプチドの結合していないこの自由な末端がタンパク質担体の表面と会合したままになっているようにすることが望ましかろう。そうすることにより、このペプチドが、もとの分子全体の文脈にあるときのペプチドの配座と非常によく似た配座になる。例えばペプチドは、Ｎ末端のシステインとＣ末端の疎水性のアミド化された尾部を持つように変えることができる。また、１つまたはそれ以上のアミノ酸についてＤ−立体異性体を付加または置換して、例えばペプチドの安定性を向上させるという好ましい誘導体を作ることができる。
【００９６】
また、ペプチド・ミモトープは、ファージ提示法などの方法を利用し、本発明のポリペプチドと結合することのできる抗体を用いて同定することができる（ＥＰ ０ ５５２ ２６７ Ｂ１）。この方法により、天然のペプチドと構造が似ており、したがってアンチ天然のペプチド抗体に結合できるが、必ずしも天然のポリペプチドとは配列がそれほど似てはいない多数のペプチド配列が生まれる。
ワクチン
本発明の別の側面は、個体、特に哺乳類、好ましくはヒトにおいて免疫応答を誘起する方法に関する。この方法は、その個体を、感染、特に細菌感染、中でもナイセリア・メニンギティディスの感染から保護するため、抗体および／またはＴ細胞免疫応答を発生させるのに十分なＢＡＳＢ０５５ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、あるいはその断片または変異体をこの個体に接種する操作を含んでいる。
【００９７】
本発明により、そのような免疫応答によって細菌の複製速度が遅くなる方法も提供される。本発明のさらに別の側面は、個体において免疫応答を誘起する別の方法に関する。この方法は、その個体に核酸ベクター、配列、またはリボザイムを供給してＢＡＳＢ０５５ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、あるいはその断片または変異体の発現を指示し、ＢＡＳＢ０５５ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、あるいはその断片または変異体を生体内で発現させて、疾病がすでにその個体、好ましくはヒトの体内で発生しているかどうかどうかに関係なく、その個体をその疾病から保護するために、抗体および／またはＴ細胞（例えばサイトカイン産生Ｔ細胞または細胞障害性Ｔ細胞を含む）の免疫応答の発生などの免疫応答を誘起する操作を含んでいる。遺伝子投与の一例は、その遺伝子を、粒子のコーティングなどとして望む細胞の中に急いで入れるというものである。このような核酸ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボザイム、修飾された核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−タンパク質複合体、またはＲＮＡ−タンパク質複合体を含むことができる。
【００９８】
本発明のさらに別の側面は、個体、好ましくはヒトに導入されたときにその個体の体内で免疫応答を誘起することができて、その個体にＢＡＳＢ０５５ポリヌクレオチドおよび／またはそれによってコードされたポリペプチドに対する免疫応答を誘起する免疫性組成物に関する。この免疫性組成物は、組み換えＢＡＳＢ０５５ポリヌクレオチドおよび／またはそれによってコードされたポリペプチド、および／または、このＢＡＳＢ０５５ポリヌクレオチド、それによってコードされたポリペプチド、または本発明の他のポリペプチドの抗体をコードし発現するＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含んでいる。この免疫応答を治療または予防に利用することが可能である。また、この免疫応答は、抗体免疫の形態および／または細胞免疫の形態、例えばＣＴＬまたはＣＤ４＋Ｔ細胞から生まれる細胞免疫の形態を取ることができる。
【００９９】
ＢＡＳＢ０５５ポリペプチドまたはその断片を、補タンパク質または化合物断片と融合させることが可能である。補タンパク質または化合物断片は、それ自体は抗体を産生させても産生させなくてもよいが、第１のタンパク質を安定化させて、抗原特性および／または免疫特性、好ましくは保護特性を有する融合タンパク質または修飾タンパク質を産生させることができるものである。したがって、組み換え融合タンパク質は、例えばインフルエンザ菌、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、β−ガラクトシダーゼなどの抗原性補タンパク質、またはそのタンパク質を可溶化しその産生と精製を容易にする任意の他の比較的大きな補タンパク質からのリポタンパク質をさらに含んでいることが好ましい。さらに、補タンパク質は、そのタンパク質を受け入れる生物の免疫系を一般的に刺激するという意味のアジュバントとして作用することができる。補タンパク質は、第１のタンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかに付着することができる。
【０１００】
本発明のワクチン組成物では、ＢＡＳＢ０５５ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド、その断片、そのミモトープ、その変異体が、上記の生きた組み換えベクター、例えば生きた細菌ベクターなどのベクター内に存在していてもよい。
【０１０１】
ＢＡＳＢ０５５ポリペプチドにとっては、生きていないベクター、例えば細菌の外膜小胞、すなわち“泡状突起”も適している。ＯＭ泡状突起はグラム陰性菌の２層膜の外膜に由来するものであり、クラミジア・トラコマティス（Ｃ． ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）やオウム病クラミジア（Ｃ． ｐｓｉｔｔａｃｉ）を始めとする多数のグラム陰性菌において記録されている（ツー， Ｌ．他、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．、第１６３巻、２２３〜２２８ページ、１９９８年）。泡状突起を発生させると報告されている細菌性病原体としては、ボルデテラ・ペルトゥシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、ブルセラ・オヴィス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｏｖｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、レジオネラ・プヌーモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、ナイセリア・ゴノロエア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、スードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、イェルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）などがあるが、これだけに限定されるわけではない。
【０１０２】
泡状突起（Ｂｌｅｂｓ）は、もともとの配座において外膜タンパク質を提供できるという利点があり、したがってワクチンに特に有効である。泡状突起は、外膜にある１つまたはそれ以上の分子の発現が変化するように細菌を遺伝子改変することにより、ワクチン用に改良することもできる。そこで、例えば外膜の所望の免疫タンパク質の発現、例えばＢＡＳＢ０５５ポリペプチドの発現を（例えばプロモーターを変化させることによって）導入したり上方調節したりすることができる。その代わりに、あるいはそれに加えて、関係のない外膜分子（例えば、非保護抗原、または免疫優勢であるが可変性のあるタンパク質）または、有害な外膜分子（例えば、ＬＰＳなどの毒性分子、または自己免疫応答を誘起する可能性のある分子）の発現を下方調節することができる。こられの方法について以下に詳しく説明する。
【０１０３】
ＢＡＳＢ０５５遺伝子の非コード・フランキング領域は、その遺伝子の発現にとって重要な調節領域を含んでいる。この調節は、転写レベルと翻訳レベルの両方で起こる。遺伝子のオープン・リーディング・フレームの上流または下流に位置しているこれら領域の配列は、ＤＮＡシークエンシングによって得ることができる。この配列情報により、潜在的な調節モチーフを決定すること、例えばさまざまなプロモーター要素、ターミネーター配列、誘起可能な配列要素、リプレッサー、相変異の原因となる要素、シャイン・ダルガルノ配列、潜在的な二次構造を有する調節関与領域のほか、これ以外のタイプの調節モチーフや調節配列を決定することができる。
【０１０４】
この配列情報により、ＢＡＳＢ０５５遺伝子の自然な発現を変化させることができる。遺伝子発現の上方調節は、プロモーター、シャイン・ダルガルノ配列、潜在的なリプレッサー、オペレータ要素、または関係のある他の要素を変えることによって実現できる。同様に、発現の下方調節は、似たような変更によって実現することができる。また、相変異配列を変化させることにより、遺伝子の発現を相変異の制御下に置いたり、この調節から独立させたりすることができる。別の方法では、遺伝子を１つまたはそれ以上の誘起要素の制御下に置いて、発現を制御できるようにすることができる。そうした制御の具体例としては、温度シフトによる誘起や、誘起性基質の付加、例えば選択した炭水化物またはその誘導体、微少元素、ビタミン、補因子、金属イオンなどの付加が挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【０１０５】
上記のような変更は、いくつかの異なったやり方で導入することができる。遺伝子の発現に関係する配列の変更は、生体内でランダムな突然変異を起こした後に望む表現型を選択することによって実現できる。別の方法は、興味の対象となる領域を分離した後、その領域をランダムに突然変異させること、または部位特異的突然変異による置換、挿入、または欠失を起こさせることにより変化させることからなる。次に、このように変化した領域を相同的組み換えによって細菌の遺伝子に再導入して、遺伝子の発現に及ぼす効果を評価することができる。別の方法では、対象となる領域の配列に関する知識を利用して、天然の調節配列の全部または一部を置換または除去する。この場合、ターゲットとなる調節領域を分離・変更して、別の遺伝子からの調節要素、さまざまな遺伝子からの調節要素の組み合わせ、合成した調節要素、またはそれ以外の任意の調節要素が含まれるように、あるいは野生型の調節配列の特定の部分が除去されるようにする。するとこれらの変更された配列は、相同的組み換えを通じて細菌の遺伝子に再導入することができる。遺伝子発現の上方調節に利用できる可能性のある好ましいプロモーターとしては、ナイセリア・メニンギティディスまたはナイセリア・ゴノロエアに由来するプロモーターであるｐｏｒＡ、ｐｏｒＢ、ｌｂｐＢ、ｔｂｐＢ、ｐ１１０、１ｓｔ、ｈｐｕＡＢ；ｏｍｐＣＤ、ｃｏｐＢ、ｌｂｐＢ、ｏｍｐＥ、ＵｓｐＡ１；ＵｓｐＡ２；モラクセラ・カタラーリス（Ｍ． Ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）に由来するＴｂｐＢ；インフルエンザ菌に由来するｐ１、ｐ２、ｐ４、ｐ５、ｐ６、ｌｐＤ、ｔｂｐＢ、Ｄ１５、Ｈｉａ、Ｈｍｗｌ、Ｈｍｗ２が挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【０１０６】
一実施態様によれば、遺伝子の発現は、（この遺伝子の上方配列を分離し、この配列をインビトロで変化させ、相同的組み換えによってゲノムを再導入する操作を通じて）この遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターと交換することにより変化させることができる。上方調節された発現は、細菌内と、細菌から選別した（細菌が作った）外膜小胞の中の両方で実現することができる。
【０１０７】
別の実施態様によれば、上記の方法を利用して、ワクチンへの応用特性が改善された組み換え細菌株を生み出すことができる。そうした株としては、毒性を弱めた株、特定の抗原の発現が増えた株、免疫応答を妨げる遺伝子がノックアウトされた（またはその遺伝子の発現が低下した）株、免疫優勢なタンパク質の発現が調節された株、外膜小胞の選別が調節された株が挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【０１０８】
そこで本発明によれば、ＢＡＳＢ０５５遺伝子の変化した上流領域も提供される。この変化した上流領域は、外膜に位置するＢＡＳＢ０５５タンパク質の発現レベルを変化させる異種性調節要素を含んでいる。本発明のこの側面による上流領域は、ＢＡＳＢ０５５遺伝子の上流にある配列を含んでいる。上流領域は、ＢＡＳＢ０５５遺伝子のすぐ上流から始まり、通常は、ＡＴＧ開始コドンからこの遺伝子の約１０００ｂｐ上流を超えない位置まで続いている。ポリシストロン性配列（オペロン）に位置する遺伝子の場合、上流領域は、対象となる遺伝子の直前、またはオペロン内の最初の遺伝子の前から始まることがある。本発明のこの側面による変化した上流領域は、ＡＴＧの５００〜７００ｂｐ上流の位置に異種性プロモーターを含んでいることが好ましい。
【０１０９】
そこで本発明により、変化した細菌の泡状突起内に、ＢＡＳＢ０５５ポリペプチドが提供される。さらに本発明によれば、膜をベースとした生きていない泡状突起ベクターを生み出すことのできる宿主細胞が提供される。さらに本発明によれば、異種性調節要素を含む変化した上流領域を有するＢＡＳＢ０５５遺伝子を含む核酸が提供される。
【０１１０】
さらに本発明によれば、本発明による宿主細胞と細菌の泡状突起を調製する方法が提供される。
【０１１１】
本発明によれば、さらに、組成物、特にワクチン組成物が提供されるほか、本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドと免疫促進性ＤＮＡ配列を含む方法が提供される。免疫促進性ＤＮＡ配列についてはサトウ， Ｙ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７３巻、３５２ページ、１９９６年に記載されている。
【０１１２】
本発明によれば、さらに、ナイセリア・メニンギティディスに感染したモデル動物における遺伝子を使った免疫確立実験で用いられるポリヌクレオチド構造体中において、上記のポリヌクレオチド、またはその特定の断片で細菌細胞の表面タンパク質の非可変領域をコードすることが知られている断片を用いる方法も提供される。このような実験は、予防または治療のための免疫応答を起こすことのできるタンパク質エピトープを同定する上で特に役立つであろう。この方法により、感染に対して抵抗力のある動物、あるいは感染を除去することのできる動物の必要な器官に由来する特別な価値を有するモノクローナル抗体を、哺乳類、特にヒトにおける細菌感染、特にナイセリア・メニンギティディスの感染の予防薬または治療方法の開発のためにまもなく調製できるようになると考えられている。
【０１１３】
本発明には、本発明の免疫性組み換えポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドと、適切な基剤、例えば医薬として許容される担体とを含むワクチン製剤も含まれる。ポリペプチドとポリヌクレオチドは胃で分解される可能性があるため、それぞれを非経口的に投与することが好ましい。例えば、皮下、筋肉内、静脈内、皮内に投与する。非経口投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝溶液、細菌発育抑制化合物、製剤を個体の体液、好ましくは血液と等張にする溶質とを含む可能性のある水性、非水性の無菌注射液や；分散剤または増粘剤を含む可能性のある水性、非水性の無菌分散液が挙げられる。製剤は、単位用量、または複数回用量の容器、例えば密封したアンプルやガラス瓶の形態にすることができる。製剤は、凍結乾燥状態にして保管し、使用する直前に無菌基剤を添加するだけでよいようにすることができる。
【０１１４】
本発明のワクチン製剤は、その製剤の免疫性を向上させるためにアジュバント系をさらに含んでいてもよい。アジュバント系は、ＴＨ１タイプの応答を選択的に増加させることが好ましい。
【０１１５】
免疫応答は、大きく２つの典型的なカテゴリーに分けることができる。それは、体液を媒介とした免疫応答と細胞を媒介とした免疫応答である（伝統的に、抗体と、防護のための細胞エフェクター機構をそれぞれ特徴とする）。応答のこれらカテゴリーは、ＴＨ１タイプの応答（細胞を媒介とした応答）、ＴＨ２タイプの応答（体液を媒介とした応答）と呼ばれている。
【０１１６】
典型的なＴＨ１タイプの免疫応答は、抗原特異的でハプロタイプが限定された細胞毒性のあるＴリンパ球と、ナチュラルキラー細胞の応答とを生み出すことが特徴であると言えよう。マウスでは、ＴＨ１タイプの応答は、ＩｇＧ２ａサブタイプの抗体を産生することを特徴とするのに対し、ヒトでは、この応答はＩｇＧ１タイプの抗体に対応する。ＴＨ２タイプの免疫応答は、免疫グロブリンのさまざまなイソタイプを産生させることを特徴とする。例えばマウスでは、ＩｇＧ１、ＩｇＡ、ＩｇＭが産生される。
【０１１７】
これら２つのタイプの免疫応答が展開するときに裏で操っているのはサイトカインであると考えることができる。ＴＨ１タイプのサイトカインがハイレベルだと、所定の抗原に対して細胞を媒介とした免疫応答が誘起され、ＴＨ２タイプのサイトカインがハイレベルだと、その抗原に対して体液を媒介とした免疫応答が誘起される傾向がある。
【０１１８】
ＴＨ１タイプの免疫応答とＴＨ２タイプの免疫応答の区別は厳密ではない。実際には、個体は、ＴＨ１が優勢である、あるいはＴＨ２が優勢であると記述される免疫応答を支持することになる。しかし、ネズミ類のＣＤ４＋ｖｅＴ細胞クローンにおいてモスマンとコフマンによって記述されているサイトカイン・ファミリーを考えると便利なことがしばしばある（モスマン， Ｔ．Ｒ．とコフマン， Ｒ．Ｌ．、「ＴＨ１細胞とＴＨ２細胞：さまざまな機能特性へと通じるさまざまなパターンのリンホカイン分泌」、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第７巻、１４５〜１７３ページ、１９８９年）。一般に、ＴＨ１タイプの応答には、Ｔリンパ球によるＩＦＮ−γとＩＬ−２というサイトカインの産生が伴っている。ＴＨ１タイプの免疫応答の誘起にしばしば直接関係する他のサイトカイン、例えばＩＬ−１２は、Ｔ細胞によって産生されない。これとは逆に、ＴＨ２タイプの応答には、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１３の分泌が伴っている。
【０１１９】
ある種のワクチン・アジュバントは、ＴＨ１タイプまたはＴＨ２タイプのサイトカイン応答のいずれかを刺激するのに特に適していることが知られている。一般に、ワクチン接種後または感染後の免疫応答のＴＨ１：ＴＨ２のバランスを示す最良の指標としては、抗原で再度刺激した後にインビトロでＴリンパ球によるＴＨ１タイプまたはＴＨ２タイプのサイトカイン産生を測定すること、および／または、抗原特異的な抗体反応のＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａの比を測定することが挙げられる。
【０１２０】
したがってＴＨ１タイプのアジュバントは、インビトロで抗体によって再度刺激を受けたときに、分離したＴ細胞群を選択的に刺激してＴＨ１タイプのサイトカインをハイレベルに産生させ、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球と、ＴＨ１タイプのアイソタイプに伴う抗原特異的免疫グロブリン応答の両方の展開を促進するアジュバントである。
【０１２１】
ＴＨ１タイプの細胞応答を選択的に刺激することのできるアジュバントは、国際特許出願ＷＯ９４／００１５３、ＷＯ９５／１７２０９に記載されている。
【０１２２】
３デ−Ｏ−アクリル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）は、そうしたアジュバントの１つである。これは、ＧＢ２２２０２１１（リビ）により公知である。化学的には、これは、３デ−Ｏ−アクリル化モノホスホリル脂質Ａと４、５、または６アクリル化した鎖の混合物であり、リビ・イムノケム社、モンタナ州が製造している。３デ−Ｏ−アクリル化モノホスホリル脂質Ａの好ましい形態は、欧州特許第０ ６８９ ４５４ Ｂ１号（スミスクライン・ビーチャム・バイオロジカルズ社）に開示されている。
【０１２３】
３Ｄ−ＭＰＬの粒子は十分小さくし、０．２２ミクロンの膜を通過して滅菌濾過されることが好ましい（欧州特許第０ ６８９ ４５４号）。
【０１２４】
３Ｄ−ＭＰＬは、一用量あたり１０μｇ〜１００μｇ、好ましくは２５〜５０μｇ含まれることになろう。そのとき抗原は、典型例では一用量あたり２〜５０μｇ含まれることになろう。
【０１２５】
別の好ましいアジュバントとしてはＱＳ２１がある。これは、キラヤに由来するＨｐｌｃ精製された非毒性の分画である。場合によっては、これに３デ−Ｏ−アクリル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）を混合し、さらに基剤を混合することもできる。
【０１２６】
ＱＳ２１の製造方法は、アメリカ合衆国特許第５，０５７，５４０号に開示されている。
【０１２７】
ＱＳ２１を含む非反応性アジュバント製剤は、過去の文献に記載されている（ＷＯ９６／３３７３９）。ＱＳ２１とコレステロールを含むそのような製剤は、抗原と合わせて処方したときにＴＨ１を刺激するアジュバントとしてうまくいくことが知られている。
【０１２８】
ＴＨ１タイプの細胞応答を選択的に刺激するさらに別のアジュバントとしては、免疫調節性オリゴヌクレオチドがある。例えばメチル化されていないＣｐＧ配列が、ＷＯ９６／０２５５５に開示されている。
【０１２９】
ＴＨ１を刺激する上記のようなさまざまなアジュバントの組み合わせも、ＴＨ１タイプの細胞応答を選択的に刺激するアジュバントとして考えられる。例えば、ＱＳ２１を３Ｄ−ＭＰＬと合わせて処方することができる。ＱＳ２１：３Ｄ−ＭＰＬの比は、典型的には１：１０から１０：１であろうが、１：５から５：１であることが好ましく、実質的に１：１であることもしばしばある。最適な相乗効果が得られるＱＳ２１：３Ｄ−ＭＰＬの比の好ましい範囲は、２．５：１から１：１である。
【０１３０】
本発明のワクチン組成物には基剤も含まれていることが好ましい。基剤は、水中油型乳剤、またはアルミニウム塩、例えばリン酸アルミニウムや水酸化アルミニウムである。
【０１３１】
好ましい水中油型乳剤は、スクワレン、αトコフェロール、トゥイーン８０などの代謝可能な油である。特に好ましい側面では、本発明のワクチン組成物中の抗原は、そのような乳剤中でＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬと結合している。さらに、水中油型乳剤は、スパン８５および／またはレシチンおよび／またはトリカプリリンを含んでいてもよい。
【０１３２】
ヒトに投与する場合には、典型的には、ＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬがワクチン中に、一用量あたり１μｇ〜２００μｇ、例えば１０〜１００μｇ、好ましくは１０μｇ〜５０μｇ含まれることになろう。水中油型乳剤は、典型的には、２〜１０％のスクワレン、２〜１０％のαトコフェロール、０．３〜３％のトゥイーン８０を含むことになろう。スクワレン：αトコフェロールの比は、等しいか１未満であることが好ましい。というのも、このようにすると乳剤がより安定になるからである。スパン８５が１％のレベルで存在していてもよい。場合によっては、本発明のワクチンに安定剤がさらに含まれていることが望ましい。
【０１３３】
非毒性の水中油型乳剤は、毒性のない油、例えばスクワランまたはスクワレンと、乳化剤、例えばトゥイーン８０とを水溶性基剤の中に含んでいることが好ましい。水溶性基剤は、例えばリン酸緩衝溶液にすることができる。
【０１３４】
水中油型乳剤中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ、トコフェロールを含む特に強力なアジュバント製剤は、ＷＯ９５／１７２１０に記載されている。
【０１３５】
本発明により、本発明のワクチン製剤に加えて他の抗原、特にガンの治療、自己免疫疾患や関連した疾患の治療に有効な抗原を含む多価のワクチン組成物が提供される。そのような多価のワクチン組成物には、上記のＴＨ−１を誘起するアジュバントが含まれていてもよい。
【０１３６】
本発明を特定のＢＡＳＢ０５５ポリペプチドとポリヌクレオチドに関して記述してきたが、本発明には、天然に存在するポリペプチドとポリヌクレオチドの断片や、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの免疫特性に実質的に影響を与えない付加、欠失、または置換を伴う同様の組み換えたポリペプチドとポリヌクレオチドも含まれるものと理解する。
【０１３７】
抗原は、１個の細菌全体（死んだもの、または生きたもの）の形態として、または細胞以下の分画の形態として供給することもできる。その中には、もちろんナイセリア・メニンギティディスそのものを供給することも含まれる。
組成物、キット、投与
本発明のさらに別の側面によれば、１個の細胞または多細胞生物に投与するための、ＢＡＳＢ０５５ポリヌクレオチドおよび／またはＢＡＳＢ０５５ポリペプチドを含む組成物が提供される。
【０１３８】
本発明は、この明細書に記載したポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、あるいはそのアゴニストまたはアンタゴニストを含む組成物にも関する。本発明のポリペプチドとポリヌクレオチドは、細胞、組織、または生物に対して使用するために、無菌でない、または無菌の１つまたは複数の基剤、例えば個体に投与するのに適した医薬担体と組み合わせて用いることができる。このような組成物は、例えば、媒体に添加する量、すなわち治療に効果がある量の本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドと、医薬として許容される担体または賦形剤とを含んでいる。担体としては、生理的食塩水、緩衝生理的食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールのほか、これらの組み合わせが挙げられるが、これだけに限定されない。製剤は、投与形態に合致している必要がある。本発明はさらに、本発明の上記組成物の１つまたはそれ以上の成分を充填した１つまたはそれ以上の容器を備える診断用、薬理学用のパックまたはキットにも関する。
【０１３９】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、その他の化合物は、単独で、あるいは他の化合物、例えば治療用化合物と組み合わせて用いることができる。
【０１４０】
本発明の薬理学的組成物は、効果的かつ使いやすい任意の方法で投与することができる。具体例としては、特に、局所的、経口、肛門、膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻孔内、皮内の投与が挙げられる。
【０１４１】
治療において、あるいは予防として、活性な薬剤を注射可能な組成物として、例えば無菌の好ましくは等張の水性分散液として、個体に投与することができる。
【０１４２】
さらに別の側面では、本発明により、治療に効果的な量のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド、例えば本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニストのペプチド、または小分子化合物を可溶形態にしたものを、薬理学的に受容可能な基剤または賦形剤と組み合わせて含む薬理学的組成物が提供される。基剤としては、生理的食塩水、緩衝生理的食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、これらの組み合わせが挙げられるが、これだけに限定されない。本発明はさらに、本発明の上記組成物の１つまたはそれ以上の成分を充填した１つまたはそれ以上の容器を備える薬理学用のパックまたはキットにも関する。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、その他の化合物は、単独で、あるいは他の化合物、例えば治療用化合物と組み合わせて用いることができる。
【０１４３】
組成物は、投与経路、例えば全身か経口かに応じて適した形態にされることになる。全身投与の好ましい形態としては、注射、典型的には静脈内注射が挙げられる。他の注射経路、例えば皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射も可能である。全身投与の別の手段としては、胆汁塩、フシジン酸（ｆｕｓｉｄｉｃ ａｃｉｄｓ）、または他の洗浄剤といった浸透剤を用いた経粘膜投与や経皮投与が挙げられる。さらに、本発明のポリペプチドまたはその他の化合物を溶腸性製剤またはカプセル化製剤の形態にすることができる場合には、経口投与も可能である。これら化合物の投与は、軟膏、ペースト、ゲル、溶液、粉末などの形態で局所的および／または限局的に行なうことも可能である。
【０１４４】
哺乳類、特にヒトへの投与では、活性のある薬剤の１日の用量が０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、典型的には１ｍｇ／ｋｇとなることが予想される。いずれにせよ、内科医が、個人にとって最適な実際の用量を決定することになる。用量は、個々人の年齢、体重、反応によって異なる。上記の用量は、平均的な場合の例である。もちろん、用量がより多かったりより少なかったりするほうが好ましい場合も存在しており、それも本発明の範囲に含まれる。
【０１４５】
要求される用量の幅は、選択したペプチド、投与経路、製剤の性質、患者の疾病の性質、医者の判断に応じて変化する。しかし適切な用量は、患者の体重１ｋｇにつき０．１〜１００μｇである。
【０１４６】
ワクチン組成物は、注射可能な形態が都合がよい。従来のアジュバントを用いて免疫応答を増大させることができる。ワクチンの適切な単位用量は、体重１ｋｇにつき抗体が０．５〜５μｇであり、このような用量を１〜３週間の間隔で１〜３回投与することが好ましい。上記の幅の用量だと、本発明の化合物を用いた場合に不都合な中毒効果が観察されてその化合物を投与するのに適した個体に投与できなくなることはなかろう。
【０１４７】
しかし、利用可能な化合物が多彩であり、投与経路によって効果が異なることを考えると、必要とされる用量の幅は広いことが予想される。例えば、経口投与の場合には、静脈内注射による投与よりも用量を多くする必要があろう。用量レベルの差は、従来技術で周知のように、最適化のための標準的な経験的作業によって調節することができる。
配列データベース、有形媒体に記憶させた配列、アルゴリズム
ポリヌクレオチドとポリペプチドの配列は、２次元構造や３次元構造を決定したり、似たホモロジー配列をさらに同定したりするための貴重な情報源となる。コンピュータで読むことのできる媒体にデータを記憶させ、記憶させたデータを既知の巨大分子構造プログラムにおいて利用したり、ＧＣＧプログラム・パッケージなどの周知の探索ツールを用いて配列データベースを探索したりすることにより、こうしたことが非常に容易になる。
【０１４８】
本発明により、特徴的な配列またはストリングの解析法、特に遺伝子配列またはコードされたタンパク質配列の解析法も提供される。好ましい配列解析法としては、例えば、一致解析や類似性解析などの配列ホモロジー解析法、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質の構造の解析、配列集合分岐解析、配列モチーフ解析、オープン・リーディング・フレーム決定、核酸塩基コーリング、コドン利用解析、核酸塩基トリミング、シークエンシング・クロマトグラムのピーク解析が挙げられる。
【０１４９】
ホモロジーを同定するための、コンピュータに基づいた方法が提供される。この方法は、本発明のポリヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチド配列をコンピュータが読むことのできる媒体に与え；この第１のポリヌクレオチド配列を少なくとも１つの第２のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列と比較してホモロジーを同定するステップを含んでいる。
【０１５０】
ホモロジーを同定するための、コンピュータに基づいた別の方法も提供される。この方法は、本発明のポリヌクレオチド配列を含む第１のポリペプチド配列をコンピュータが読むことのできる媒体に与え；この第１のポリペプチド配列を少なくとも１つの第２のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列と比較してホモロジーを同定するステップを含んでいる。
【０１５１】
この明細書で引用したあらゆる出版物や参考文献は、特許や特許出願なども含め、個々の出版物や参考文献が十分に説明されたものとして、参考のために特別かつ個別に組み込むよう指示されているかのようにして、その全体が参考としてこの明細書に組み込まれている。この特許出願のほうに優先権があることをわれわれが主張する他のあらゆる特許出願も、出版物や参考文献に関して上に説明したのと同様にして、その全体が本明細書中に援用される。
定義
従来技術で知られている“一致（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）”は、２つまたはそれ以上のポリペプチド配列、あるいは場合によっては２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列を比較することによって決まる関係である。従来技術では、“一致”は、複数のポリペプチド配列あるいは場合によっては複数のポリヌクレオチド配列の間でストリング同士の一致によって決まる配列関連度のことも意味する。“一致”は、既知の方法を用いて容易に計算することができる。そうした方法は、例えば以下の文献に記載されているが、これだけに限定されるわけではない。『計算分子生物学』、レスク， Ａ．Ｍ．編、オックスフォード大学出版、ニューヨーク州、１９８８年；『バイオコンピューティング：情報学とゲノム計画』、スミス， Ｄ．Ｗ．編、アカデミック・プレス、ニューヨーク州、１９９３年；『配列データのコンピュータ解析』、第１部、グリフィン， Ａ．Ｍ．とグリフィン， Ｈ．Ｇ．編、ヒューマナ・プレス、ニュージャージー州、１９９４年；『分子生物学における配列解析』、フォン・ハイネ， Ｇ．、アカデミック・プレス、１９８７年；『配列解析プライマー』、グリブスコフ， Ｍ．とドゥヴルー， Ｊ．編、Ｍ ストックトン・プレス、ニューヨーク州、１９９１年；カリージョ， Ｈとリップマン， Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．、第４８巻、１０７３ページ、１９８８年。一致を確認する方法は、テストする配列同士の一致が最大になるように設計する。さらに、一致を確認する方法は、誰もが利用可能なコンピュータ・プログラムにコード化されている。２つの配列の間の一致を確認するのにコンピュータ・プログラムを用いる方法としては、ＧＣＧプログラム・パッケージのＧＡＰプログラム（ドゥヴルー， Ｊ．他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１２巻（１）、３８７ページ、１９８４年）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ（アルトシュール， Ｓ．Ｆ．他、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、第２１５巻、４０３〜４１０ページ、１９９０年）、ＦＡＳＴＡ（ピアーソンとリップマン、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第８５巻、２４４４〜２４４８ページ、１９８８年）があるが、それだけに限定されるわけではない。ＢＬＡＳＴファミリーのプログラムは、ＮＣＢＩその他のソースから誰でも利用することができる（『ＢＬＡＳＴマニュアル』、アルトシュール， Ｓ．他、ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ ベセスダ、ＭＤ ２０８９４；アルトシュール， Ｓ．他、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、第２１５巻、４０３〜４１０ページ、１９９０年）。よく知られているスミス・ウォーターマンのアルゴリズムも一致を確認するのに用いることができる。
【０１５２】
ポリペプチド配列を比較するためのパラメータには以下のものがある。
アルゴリズム：ニードルマンとヴンシュ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、第４８巻、４４３〜４５３ページ、１９７０年、
比較行列：ヘニコフとヘニコフ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第８９巻、１０９１５〜１０９１９ページ、１９９２年によるＢＬＯＳＳＵＭ６２、
ギャップ・ペナルティ：８、
ギャップ長ペナルティ：２。
【０１５３】
これらパラメータを含む有用なプログラムは、ジェネティックス・コンピュータ・グループ（マディソン、ウィスコンシン州）から“ギャップ”プログラムとして誰でも利用することができる。上記のパラメータは、ペプチドを比較するためのデフォルト・パラメータである（端部のギャップに対するペナルティはない）。
【０１５４】
ポリヌクレオチドを比較するためのパラメータには以下のものがある。
アルゴリズム：ニードルマンとヴンシュ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、第４８巻、４４３〜４５３ページ、１９７０年、
比較行列：一致＝＋１０、不一致＝０、
ギャップ・ペナルティ：５０、
ギャップ長ペナルティ：３。
ジェネティックス・コンピュータ・グループ（マディソン、ウィスコンシン州）から“ギャップ”プログラムとして利用できる。これらパラメータは、核酸を比較するためのデフォルト・パラメータである。
【０１５５】
ポリヌクレオチドとポリペプチドに対する“一致”の好ましい意味は、場合に応じて以下の（１）と（２）で与えられる。
【０１５６】
（１）実施態様のポリヌクレオチドがさらに、配列番号１の参照配列と少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７、または１００％一致したポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを含んでいる。このポリヌクレオチド配列は、配列番号１の参照配列と一致していてもよいし、参照配列と比べて所定の数までヌクレオチドが変化していてもよい。この変化は、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、置換（トランジションやトランスバージョンを含む）、または挿入のいずれかである。またこの変化は、参照ヌクレオチド配列の５’末端または３’末端の位置に起こってもよいし、これら末端の間の任意の位置に起こり、参照配列のヌクレオチドの間に個別に点在するか、または参照配列内の１つまたはそれ以上の連続的なグループの中に点在していてもよい。変化するヌクレオチドの数は、配列番号１のヌクレオチドの総数に、パーセント一致を定義する整数を１００で割った値を掛け、次にその積を配列番号１のヌクレオチドの総数から差し引くことによって決まる。すなわち、
ｎｎ≦ｘｎ−（ｘｎ・ｙ）
となる。ここに、ｎｎは変化したヌクレオチドの数であり、ｘｎは配列番号１のヌクレオチドの総数であり、ｙは、５０％の場合に０．５０、６０％の場合に０．６０、７０％の場合に０．７０、８０％の場合に０．８０、８５％の場合に０．８５、９０％の場合に０．９０、９５％の場合に０．９５、９７％の場合に０．９７、１００％の場合に１．００であり、・は、積演算の記号であり、ｘｎとｙの積が非整数になった場合には、その値よりも小さな最も近い整数に丸めた後にｘｎから差し引く。配列番号２のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列の変化により、このコード配列中にナンセンス突然変異、ミスセンス突然変異、またはフレームシフト突然変異が発生し、そのことによって、そうした変化後のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドが変化する可能性がある。
【０１５７】
例えば、本発明のポリヌクレオチド配列は、配列番号１の参照配列と一致していてもよい。すなわち、このポリヌクレオチド配列は、１００％一致していてもよいし、参照配列と比べて所定数までの核酸変化が含まれていてパーセント一致が１００％よりも小さくなっていてもよい。この変化は、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、置換（トランジションやトランスバージョンを含む）、または挿入のいずれかである。またこの変化は、参照ポリヌクレオチド配列の５’末端または３’末端の位置に起こってもよいし、これら末端の間の任意の位置に起こり、参照配列の核酸の間に個別に点在するか、または参照配列内の１つまたはそれ以上の連続的なグループの中に点在していてもよい。所定のパーセント一致に対する変化した核酸の数は、配列番号１の核酸の総数に、パーセント一致を定義する整数を１００で割った値を掛け、次にその積を配列番号１の核酸の総数から差し引くことによって決まる。すなわち、
ｎｎ≦ｘｎ−（ｘｎ・ｙ）
となる。ここに、ｎｎは変化した核酸の数であり、ｘｎは配列番号１の核酸の総数であり、ｙは、例えば７０％の場合に０．７０、８０％の場合に０．８０、８５％の場合に０．８５などであり、・は、積演算の記号であり、ｘｎとｙの積が非整数になった場合には、その値よりも小さな最も近い整数に丸めた後にｘｎから差し引く。
【０１５８】
（２）実施態様のポリペプチドがさらに、配列番号２の参照配列と少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７、または１００％一致したポリペプチド配列を含む単離されたポリペプチドを含んでいる。このポリペプチド配列は、配列番号２の参照配列と一致していてもよいし、参照配列と比べて所定の数までアミノ酸が変化していてもよい。この変化は、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換（保存された置換や保存されていない置換を含む）、または挿入のいずれかである。またこの変化は、参照ポリペプチド配列のアミノ末端またはカルボキシル末端の位置に起こってもよいし、これら末端の間の任意の位置に起こり、参照配列のアミノ酸の間に個別に点在するか、または参照配列内の１つまたはそれ以上の連続的なグループの中に点在していてもよい。変化するアミノ酸の数は、配列番号２のアミノ酸の総数に、パーセント一致を定義する整数を１００で割った値を掛け、次にその積を配列番号２のアミノ酸の総数から差し引くことによって決まる。すなわち、
ｎａ≦ｘａ−（ｘａ・ｙ）
となる。ここに、ｎａは変化したヌクレオチドの数であり、ｘａは配列番号２のアミノ酸の総数であり、ｙは、５０％の場合に０．５０、６０％の場合に０．６０、７０％の場合に０．７０、８０％の場合に０．８０、８５％の場合に０．８５、９０％の場合に０．９０、９５％の場合に０．９５、９７％の場合に０．９７、１００％の場合に１．００であり、・は、積演算の記号であり、ｘａとｙの積が非整数になった場合には、その値よりも小さな最も近い整数に丸めた後にｘａから差し引く。
【０１５９】
例えば、本発明のポリペプチド配列は、配列番号２の参照配列と一致していてもよい。すなわち、このポリペプチド配列は、１００％一致していてもよいし、参照配列と比べて所定数までのアミノ酸変化が含まれていてパーセント一致が１００％よりも小さくなっていてもよい。この変化は、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換（保存された置換や保存されていない置換を含む）、または挿入のいずれかである。またこの変化は、参照ポリペプチド配列のアミノ末端またはカルボキシル末端の位置に起こってもよいし、これら末端の間の任意の位置に起こり、参照配列のアミノ酸の間に個別に点在するか、または参照配列内の１つまたはそれ以上の連続的なグループの中に点在していてもよい。所定のパーセント一致に対する変化するアミノ酸の数は、配列番号２のアミノ酸の総数に、パーセント一致を定義する整数を１００で割った値を掛け、次にその積を配列番号２のアミノ酸の総数から引くことによって決まる。すなわち、
ｎａ≦ｘａ−（ｘａ・ｙ）
となる。ここに、ｎａは変化したアミノ酸の数であり、ｘａは配列番号２のアミノ酸の総数であり、ｙは、例えば７０％の場合に０．７０、８０％の場合に０．８０、８５％の場合に０．８５などであり、・は、積演算の記号であり、ｘａとｙの積が非整数になった場合には、その値よりも小さな最も近い整数に丸めた後にｘａから差し引く。
【０１６０】
この明細書で生物に関して用いる“個体”は、多細胞真核生物のことを意味する。その中には後生生物、哺乳類、ヒツジ科動物、ウシ科動物、類人猿、霊長類、ヒトが含まれるが、これだけに限定されるわけではない。
【０１６１】
“単離された”とは、天然の状態から“人間の手によって”変えられたことを意味する。すなわち、そうしたことが自然界で起こるならば、もとの環境から変化しているか、隔離されている、あるいはその両者が起こっている。例えば、生物の体内に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは“単離されて”はいないが、その同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドが自然の状態で共に存在している物質から分離されている場合には、この明細書で用いる意味で“単離されて”いる。さらに、形質転換、遺伝子操作、またはそれ以外の組み換え技術によって生体内に導入されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、その生体の中にまだ存在しているとしても、その生物が生きているか死んでいるかには関係なく、“単離され”ている。
【０１６２】
“ポリヌクレオチド”とは、一般に、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドのことである。それは修飾されていないＲＮＡまたはＤＮＡでもよいし、修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡでもよく、１本鎖の領域と２本鎖の領域を含んでいる。
【０１６３】
“変異体”とは、参照用のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、主要な特性は維持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドのことである。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、参照ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なっている。変異体のヌクレオチド配列における変化により、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が異なることもあるし、異ならないこともある。ヌクレオチドの変化により、参照配列によってコードされるポリペプチドにおいてアミノ酸の置換、付加、欠失、融合、切断が起こることがある。これについては以下に説明する。ポリペプチドの典型的な変異体は、参照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なっている。一般に、差は、参照ポリペプチドの配列と変異体が全体として非常に似ており、多くの領域で配列が一致しているものに限定される。変異体と参照ポリペプチドの違いは、アミノ酸配列において１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、付加、欠失が任意に組み合わさったものである可能性がある。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされたアミノ酸でもよいし、遺伝暗号によってコードされていないアミノ酸でもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体などの自然に起こる変異体でもよいし、自然に起こることが知られていない変異体でもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの自然には起こらない変異体は、突然変異技術または直接的合成によって作ることができる。
【０１６４】
“疾患”とは、細菌の感染によって起こるあらゆる疾患、または細菌感染と関連したあらゆる疾患のことを意味し、例えば、上気道感染、菌血症や髄膜炎などの侵入性細菌疾患が挙げられる。
実施例
以下の実施例は、当業者には周知かつ当然となっている標準的な方法で実施する。ただし、別の方法を詳しく記載した場合は別である。実施例は単なる例示であって、本発明がそれだけに限定されることはない。
実施例１：ナイセリア・メニンギティディス血清型Ｂ株ＡＴＣＣ１３０９０中のＢＡＳＢ０５５の配列
ナイセリア・メニンギティディス菌株ＡＴＣＣ１３０９０のＢＡＳＢ０５５遺伝子の配列を配列番号１に示す。ＢＡＳＢ０５５ポリヌクレオチド配列を翻訳したものが配列番号２に示してあるが、これは、ナイセリア・ゴノロエアエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）ＭｔｒＣタンパク質との類似性が有意である。ＢＡＳＢ０５５ポリペプチドは、リポタンパク質に特徴的なシグナル配列を含む。
実施例２：組み換えＢＡＳＢ０５５を発現させるためのプラスミドの構成
Ａ：ＢＡＳＢ０５５のクローニング
遺伝子操作によってＮｄｅ ＩとＸｈｏ Ｉという制限部位をそれぞれ増幅用プライマーである順方向Ｌｉｐ１１−Ｆｍ／ｐ（５’−ＡＧＧ ＣＡＧ ＡＧＧ ＣＡＴ ＡＴＧ ＧＣＴ ＴＴＴ ＴＡＴ ＧＣＴ ＴＴＴ ＡＡＧ ＧＣＧ ＡＴＧ ＣＧ−３’）［配列番号３］と逆方向Ｌｉｐ１１−ＲＣｆ／ｐ（５’−ＡＧＧ ＣＡＧ ＡＧＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＴＣ ＣＧＣ ＴＴＣ ＡＧＡ ＡＧＣ ＡＧＴ ＴＴＴ ＧＧＣ ＴＴＣ−３’）［配列番号４］に組み込んだことにより、少コピー数の大腸菌発現プラスミドｐＴＬＺ２にＢＡＳＢ０５５ ＰＣＲ産物を方向性クローニングすることが可能になった。その結果、ＢＡＳＢ０５５タンパク質を、Ｃ末端に（ヒスチジン）６アフィニティ・クロマトグラフィ・タグを含む融合タンパク質として発現させることができた。シリカゲルをベースとしたスピン・カラム（キアジェン社）を製造メーカーの指示に従って用い、ＢＡＳＢ０５５ ＰＣＲ産物を増幅反応の産物から精製した。クローニングに必要なＮｄｅ Ｉ末端とＸｈｏ Ｉ末端を生み出すため、Ｎｄｅ Ｉ制限酵素とＸｈｏ Ｉ制限酵素を製造メーカー（ライフ・テクノロジーズ社）が勧める方法に従って順番に用いて精製したＰＣＲ産物を完全に消化させた。第１回目の消化の後、ＰＣＲ産物を上記のスピン・カラムによって精製して塩類を除去し、殺菌水の中に溶離させた。次いで、第２回目の酵素による消化を行なわせた。消化されたＤＮＡ断片は、シリカゲルをベースとしたスピン・カラムを用いて再び精製し、ｐＴＬＺ２プラスミドと連結させた。
【０１６５】
Ｂ：発現ベクターの生産
連結のための発現プラスミドｐＴＬＺ２を調製するため、Ｎｄｅ ＩとＸｈｏ Ｉの両方を用いてＰＣＲ産物を同様に完全に消化させ、仔ウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ、５’末端を約０．０２ユニット／ピコモル、ライフ・テクノロジーズ社）を製造メーカーの指示に従って用い、自己連結が起こらないよう処理した。調製されるベクターに対してモル量が約５倍過剰な消化断片を用い、連結反応をプログラムした。標準的な約２０μｌの連結反応（約１６℃、約１６時間）を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（約２．０ユニット／反応、ライフ・テクノロジーズ社）を用いて従来技術で周知の方法に従って行なった。連結反応のアリコート（約５μｌ）を用い、従来技術で周知の方法に従って電気的抗体産生能力のあるＢＬ２１ ＤＥ３細胞を形質転換した。形質転換した細胞を３７℃にした約１．０ｍｌのＬＢ培養液の中で約２〜３時間成長させた後、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレートで培養した。形質転換した細胞がすべてｐＴＬＺ２プラスミド（ＡｐＲ）を含んでいるようにするため、この選択用培地には抗生物質を入れた。プレートを３７℃にて約１６時間培養した。殺菌した楊枝で個々のＡｐＲコロニーを取り出し、新鮮なＬＢ ＡｐＲプレートと約１ｍｌのＬＢ ＡｐＲＲブロス培養物に“パッチ状に”接種した。パッチ状プレートと培養液培養物の両方を、標準的な培養器（プレート）または振動式水浴の中で３７℃にて一晩培養した。
【０１６６】
細胞全体をベースとしたＰＣＲ解析法により、形質転換体がＢＡＳＢ０５５ ＤＮＡ挿入物を含んでいるかどうかを確認した。このとき、一晩培養した約１．０ｍｌのＬＢ Ｋｎ培養液培養物を１．５ｍｌのポリプロピレン・チューブに移し、ベックマン・マイクロ遠心分離装置の中で遠心分離すること（約３分、室温、約１２，０００×ｇ）により、細胞を回収した。細胞ペレットを殺菌水約２００μｌの中に分散させ、約１０μｌのアリコートを用いて、順方向と逆方向のＢＡＳＢ０５５増幅用プライマーを両方含み最終容積が約５０μｌのＰＣＲ反応をプログラムした。ＰＣＲ反応成分の最終濃度は、Ｔａｑポリメラーゼを約５．０単位用いた点を除き、実施例２に示すのとほぼ同じであった。９５℃での最初の変性ステップを長くして３分間にし、細菌細胞の熱破壊とプラスミドＤＮＡの解放が確実に行なわれるようにした。ＡＢＩモデル９７００熱サイクラーを用い、３ステップの熱増幅プロファイル、すなわち９５℃で４５秒間、５５〜５８℃で４５秒間、７２℃で１分間を３２サイクル行なって、溶解した形質転換サンプルからＢＡＳＢ０５５ ＰＣＲ断片を増幅した。熱増幅の後、反応によるアリコート約２０μｌをアガロースゲル電気泳動（トリス酢酸ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）緩衝溶液中に０．８％のアガロース）によって解析した。ＤＮＡ断片は、ゲル電気泳動にかけ、臭化エチジウム染色した後に紫外線を照射することにより目で見えるようにした。ＤＮＡ分子のサイズの基準となるもの（１Ｋｂのラダー、ライフ・テクノロジーズ社）を試験サンプルと同時に電気泳動にかけ、ＰＣＲ産物のサイズを評価するのに用いた。予想されるＰＣＲ産物を産生する形質転換体が、ＢＡＳＢ０５５発現構造体を含む菌株として同定された。次にこの菌株を含む発現プラスミドについて、組み換えＢＡＳＢ０５５の発現を誘起するかどうかを解析した。
【０１６７】
Ｃ：ＰＣＲポジティブな形質転換体の発現解析
上記のようにして同定されたそれぞれのＰＣＲポジティブな形質転換体について、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含む約５．０ｍｌのＬＢ培養液をパッチ・プレートからの細胞に接種し、振動させながら（約２５０ｒｐｍ）３７℃にて一晩培養した。シードとなる一晩培養した培養物のアリコート（約１．０ｍｌ）を、約２５ｍｌのＬＢ Ａｐブロスを含む１２５ｍｌの三角フラスコの中に接種し、培養物の濁度がＯ．Ｄ．６００で約０．５に達するまで、すなわち中ログ相に達するまで（通常は約１．５〜２時間）、振動させながら（約２５０ｒｐｍ）３７℃にて培養した。このとき、培養物のほぼ半分（約１２．５ｍｌ）を第２の１２５ｍｌのフラスコに移し、ＩＰＴＧ（１．０モルのストックを殺菌水中に調製したもの、シグマ社）を添加することによって、発現が誘起される組み換えＢＡＳＢ０５５の最終濃度を１．０ｍＭにした。ＩＰＴＧにより誘起される培養物と、ＩＰＴＧによって誘起されない培養物の両方を、さらに約４時間にわたって振動させながら３７℃にて培養を続けた。両方の培養物からのサンプル（約１．０ｍｌ）を誘起期間が過ぎた後に除去し、マイクロ遠心分離装置の中で室温にて約３分間遠心分離することにより細胞を回収した。個々の細胞ペレットを約５０μｌの殺菌水の中に分散させ、２−メルカプトエタノールを含む等容積の２×ラメリＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝溶液と混合し、沸騰した水浴の中に約３分間入れてタンパク質を変性させた。ＩＰＴＧにより誘起される未精製の細胞と、ＩＰＴＧによって誘起されない細胞の両方のライセートを、それぞれ同じ量（約１５μｌ）だけ、まったく同じ１２％トリス／グリシン・ポリアクリルアミド・ゲル（厚さ１ｍｍのミニゲル、ノヴェックス社）の上に載せた。標準的なＳＤＳ／トリス／グリシン・ランニング緩衝溶液（バイオラド社）を用いて、従来から知られている条件のもと、ＩＰＴＧにより誘起される細胞とＩＰＴＧによって誘起されない細胞の両方のライセート・サンプルならびにあらかじめ染色した分子量マーカー（ＳｅｅＢｌｕｅ、ノヴェックス社）を電気泳動にかけた。電気泳動の後、一方のゲルをクーマッシー・ブリリアント・ブルーＲ２５０（バイオラド社）で染色し、ＩＰＴＧにより誘起可能な新規なＢＡＳＢ０５５タンパク質が目で見えるように脱染色した。他方のゲルは、ＢｉｏＲａｄ Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩブロッティング装置とタウビンのメタノール（２０％）トランスファー緩衝溶液を用い、約２時間かけて４℃にてＰＶＤＦ膜（孔のサイズが０．４５ミクロン、ノヴェックス社）の上に電気泳動転写した。膜のブロッキングと抗体の培養を従来技術で周知の方法に従って行なった。モノクローナル抗（ヒスチジン）５抗体を用い、次に第２の抗体としてＨＲＰ（キアジェン社）が結合したウサギの抗マウス抗体を用い、ＢＡＳＢ０５５組み換えタンパク質の発現を確認し、同定した。抗ヒスチジン抗体の反応パターンを目で見られるようにするため、ＡＢＴ不溶性基質、またはアマーシャムＥＣＬ化学的蛍光系を備えたハイパーフィルムを用いた。
実施例３：組換えＢＡＳＢ０５５脂質化状態の分析
ＢＡＳＢ０５５組換えタンパク質が脂質化されているかどうかを決定するために、脂質特異的組み込みタグとして３Ｈ−グリセラル及び３Ｈ−パルミチン酸を用いた放射標識実験を開始した。上記発現プラスミドを含むＢＬ２１ ＤＥ３ Ｅ．ｃｏｌｉ株の培養物を、Ｍ９最小培地上で培養し、そして３時間のＩＰＴＧ誘導の間に５０μＣｉの３Ｈ−グリセラル又は３Ｈ−パルミチン酸のいずれかでパルス標識付けした。取り込まれなかった同位体を除去するための洗浄ステップの後、放射標識された培養物の全細胞溶解産物を、グラジエント・ポリアクリルアミド・ゲル（４〜２０％）上で走らせ、固定し、そして次に真空下で乾燥させた。オートラジオグラフを、上記乾燥ゲルを約７日間−７０℃においてＨｙｐｅｒ ｆｉｌｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に露出させることより作製した。ＩＰＴＧ誘導性クマシー染色タンパク質と同じサイズの可視性バンドが両標識付けにより検出された。３Ｈ標識がＩＰＴＧ誘導性タンパク質中に取り込まれたということは、上記ＢＡＳＢ０５５タンパク質がＥ．ｃｏｌｉにおいてある程度まで脂質化されているという結論を支持する。
実施例４：組換えＢＡＳＢ０５５の産生
細菌株
ナイセリア・メニンギティディスに由来するＢＡＳＢ０５５をコードするｐＴＬＺ２プラスミドを含む組み換え発現大腸菌株ＢＬ２１ ＤＥ３を利用して、組換えタンパク質を精製するための細胞群を生産した。発現菌株を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（”Ａｐ”）を含むＬＢ寒天プレート上で培養し、プラスミドが確実に維持されるようにした。−８０℃の低温で保存するため、菌株を、等しい濃度の抗生物質を含むＬＢブロスの中で増殖させ、次に３０％（ｗ／ｖ）グリセロールを含む等容積のＬＢブロスと混合した。
培地
組み換えタンパク質の産生に用いる発酵用培地は、１００μｇ／ｍｌのＡｐを含む２×ＹＴブロス（ディフコ社）である。発泡防止剤（Ａｎｔｉｆｏａｍ ２０４、シグマ社）を０．２５ｍｌ／Ｌの割合で発酵装置に添加した。ＢＡＳＢ０５５組み換えタンパク質の発現を誘起するため、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を発酵装置に添加した（最終的に１ｍＭ）。
発酵
作業容積５０ｍｌを有する５００ｍｌのシード用三角フラスコに、急速解凍した培養物０．３ｍｌ、または選択した寒天プレート培養物からのいくつかのコロニーを接種し、振動プラットフォーム（Ｉｎｎｏｖａ ２１００、ニュー・ブランスウィック・サイエンティフィック社）上で１５０ｒｐｍで振動させながら約１２時間にわたって３７±１℃にて培養した。次にこのシード用培養物を、２×ＹＴブロスとＡｐ抗生物質の両方を含む作業容積５−Ｌの発酵装置に接種した。発酵装置（Ｂｉｏｆｌｏ３０００、ニュー・ブランスウィック・サイエンティフィック社）をラッシュトン圧縮機内で３７±１℃、０．２〜０．４ＶＶＭ空気散布、２５０ｒｐｍにて運転した。ｐＨは、フラスコのシード用培養物と発酵装置のどちらにおいても制御しなかった。発酵の間、発酵装置内のｐＨは６．５〜７．３であった。培養物の成長が中ログ相に達したとき（Ｏ．Ｄ．６００が約０．７単位）にＩＰＴＧ（１．０モルのストックを殺菌水中に調製したもの）を発酵装置に添加した。細胞を約２〜４時間を誘起し、次に２８ＲＳ Ｈｅｒａｅｕｓ（セパテック社）またはＲＣ５Ｃ高速遠心分離装置（ソーヴァル・インスツルメンツ社）を用いて遠心分離することによって回収した。細胞ペーストは、処理するときまで−２０℃で保存した。
精製
イミダゾールと、バイオテクノロジー品質またはそれ以上の品質の試薬は、すべてアメレスコ・ケミカルズ社、ソロン、オハイオ州から調達した。トリトンＸ−１００（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシ−エタノール）、トリトンＸ−１１４、リン酸ナトリウム、単塩基、尿素は、試薬品質またはそれ以上の品質であり、シグマ・ケミカル社、セントルイス、ミズーリ州から調達した。ダルベッコ・リン酸緩衝溶液（１×ＰＢＳ）は、クォリティ・バイオロジカル社、ゲサーズバーグ、メリーランド州から調達した。ダルベッコ・リン酸緩衝溶液（１０×ＰＢＳ）は、バイオホワイタッカー社、ウォーカーズヴィル、メリーランド州から調達した。ＢＳＡフリーなペンタ−ヒスチジン抗体は、キアジェン社、ヴァレンシア、カリフォルニア州から調達した。ぺルオキシダーゼが結合したＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅというヤギの抗マウスＩｇＧは、ジャクソン・イムノ・リサーチ社、ウエスト・グローヴ、ペンシルベニア州から調達した。他の化学薬品はすべて、試薬品質またはそれ以上の品質であった。
【０１６８】
ニッケル−ケラチン・セファロース・ファースト・フロー樹脂は、ファルマシア社、スウェーデンから調達した。プレキャストのトリス−グリシン４〜２０％と１０〜２０％ポリアクリルアミド・ゲル、あらゆるランニング緩衝溶液と溶液、ＳｅｅＢｌｕｅであらかじめ染色した基準サンプル、ＭｕｌｔｉＭａｒｋ多色基準サンプル、ＰＶＤＦトランスファー膜は、ノヴェックス社、サン・ディエゴ、カリフォルニア州から調達した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色キットは、第一化学薬品株式会社、東京、日本から調達した。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色溶液は、バイオラド・ラボラトリーズ社、ハーキュールズ、カリフォルニア州から調達した。Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）ＰＦ ０．２ｍ注射器フィルターは、ポール・ゲルマン・サイエンシーズ社、アン・アーバー、ミシガン州から調達した。廃棄可能なＧＤ／Ｘ ２５ｍｍ注射器フィルターは、ホワットマン社、クリフトン、ニュージャージー州から調達した。透析チュービング８，０００ＭＷＣＯは、バイオデザイン社、オッド・ニューヨーク、カーマル・ニューヨークから調達した。ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬とスネイク・スキン透析チュービング３，５００ＭＷＣＯは、ピアース・ケミカル社、ロックフォード、イリノイ州から調達した。
抽出プロトコル
細胞ペーストは、室温で３０〜６０分間かけて解凍した。この材料を５〜６ｇ測り、廃棄可能な５０ｍｌの遠心分離管に入れた。組換えＢＡＳＢ抗原を、１．０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１１４による細胞膜の抽出により精製し、そして３７℃におけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ１１４の濁点に基づき相分離させた。このＴｒｉｔｏｎ Ｘ１１４相を、１０％グリセロール、５％エチレン・グリコール、及び０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで希釈した。これを、ニッケル・キレート化セファロース・ファースト・フローに通過させた。このタンパク質をその後、２００ｍＭのイミダゾールで溶離し、ヒスチジン・タグを有するタンパク質をアフィニティ精製し、９０％を超える純度のタンパク質を得た。
最終製剤
ＢＡＳＢ０５５は、０．１％のトリトンＸ−１００と１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４に対し、それを一晩で３回交換して透析することによって製剤にした。精製されたタンパク質をキャラクテリゼーションし、抗体を産生させるのに用いた。それについて以下に説明する。
生化学的キャラクテリゼーション：ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタン・ブロット解析
精製した組み換えタンパク質を４〜２０％のポリアクリルアミド・ゲル上で分解させ、すでに説明したように１００Ｖで１時間かけて電気泳動することによりＰＶＤＦ膜に移動させた（セベイン他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第７６巻、４３５０〜４３５４ページ、１９７９年）。次にＰＶＤＦ膜を、５％の脱脂ドライミルクを含む２５ｍｌのダルベッコ・リン酸緩衝溶液で予備処理した。以後の培養はすべて、この予備処理した緩衝溶液を用いて行なった。
【０１６９】
アンチ・ヒスチジン尾部抗体の希釈物を用いてＰＶＤＦ膜を室温にて１時間にわたって培養した。次にＰＶＤＦ膜を、洗浄用緩衝溶液（１５０ｍＭの塩化ナトリウムと０．０５％のトゥイーン−２０（商標）を含む２０ｍＭのトリス緩衝溶液、ｐＨ７．５）を用いて２度洗浄した。ＰＶＤＦ膜を、ぺルオキシダーゼで標識した種特異的複合体を１：５０００に希釈したもの２５ｍｌを用いて室温にて３０分間培養した。次にＰＶＤＦ膜を洗浄用緩衝溶液を用いて４回洗浄し、３−アミノ−９−エチルカルバゾールと尿素ぺルオキシド（ザイメド社、サンフランシスコ、カリフォルニア州）をそれぞれ１０分間用いて現像した。
【０１７０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（図１Ａ）からは、９０％を超える純度に精製された約５０ｋＤａのタンパク質が得られたことがわかる。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのウエスタン・ブロット（図１Ｂ）より、このタンパク質が抗テトラ（ヒスチジン）抗体に対して反応していることもわかる。
組換えＢＡＳＢ０５５を用いたマウスの免疫確立
大腸菌の中で発現した部分精製した組み換えＢＡＳＢ０５５タンパク質を０日目、１４日目、２８日目の３回にわたってＢａｌｂ／Ｃマウスに注射した（１０匹／グループ）。マウスには、皮下経路で約５μｇの抗原を２通りの製剤にして注射した。１つは、１００μｇのＡｌＰＯ４に吸収させたもの、もう１つはＳＢＡＳ２乳剤（ＳＢＡＳ２乳剤は、一用量あたり５μｇのＭＰＬと５μｇのＱＳ２１を含んでいる）にしたものである。ＳＢＡＳ２乳剤だけで免疫を確立したマウスからなるネガティブ対照群も実験に追加した。２８日目（１４日ポストＩＩ）と３５日目（７日ポストＩＩＩ）にマウスから血を抜き取り、特異的な抗ＢＡＳＢ０５５抗体が検出されるかどうかを調べた。特異的な抗−ＢＡＳＢ０５５抗体を、部分的に精製されたＢＡＳＢ０５５タンパク質及びＥ．ｃｏｌｉタンパク質についてＥｌｉｓａにより計測した。抗体応答を、異なるナイセリア・メニンギティディスＢ株に対してテストされたとき、ウェスタン−ブロッティングによっても評価した。（７日ポストＩＩＩのみ）における両配合群からのプールされた血清（１０匹マウス／群からのもの）を上記アッセイにおいてテストした。図２に示す結果は、上記抗体応答が極めて良好であり、一方同じくポジティブである抗−Ｅ．ｃｏｌｉ抗体応答（図３）が、上記特異的ＢＡＳＢ０５５応答（図２）よりもかなり低いということを明確に示している。上記ＡｌＰＯ４配合物は、最高の抗体レベルを誘導する。図４と図５に示すウェスタン−ブロットは、上記ＢＡＳＢ０５５タンパク質が５０ｋＤａの予想されたＭＷにおいてよく認識されていることを確信させる。
【０１７１】
ウエスタン・ブロット法によるさまざまなナイセリア・メニンギティディス血清型Ｂ菌株におけるＢＡＳＢ０５５エピトープの認識
この試験では、免疫を確立したマウスの（プールした）血清をウエスタン・ブロット法によりテストし、７つの異なるナイセリア・メニンギティディスＢ菌株と部分精製した組み換えＢＡＳＢ０５５タンパク質でＢＡＳＢ０５５エピトープが認識されるかどうかを調べた。７つの菌株とは、Ｈ４４／７６（Ｂ：１５：Ｐ１．７、１６、系統ＥＴ−５）、Ｍ９７ ２５０６８７（Ｂ：４：Ｐ１．１５）、ＢＺ１０（Ｂ：２ｂ：Ｐ１．２、系統Ａ４）、ＢＺ１９８（Ｂ：ＮＴ＊：−、系統３）、ＥＧ３２８（Ｂ：ＮＴ＊、系統ＳＴ−１８）、ＮＧＰ１６５（Ｂ：２ａ：Ｐ１．２、ＥＴ３７クラスター）、ＡＴＣＣ１３０９０（Ｂ：１５：Ｐ１．１５）ナイセリア・メニンギティディスＢ菌株である（＊とはＮＴ、すなわち型分類されない、の意味である）。
【０１７２】
簡単に説明すると以下のようになる。サンプル緩衝溶液で（９５℃にて１０分間）処理した各サンプル１０μｌ（＞１０８細胞／レーン）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲル（トリス−グリシン４〜２０％、ノヴェックス社、コード番号ＥＣ６０２８）に入れる。電気泳動による移動が１２５ボルトで９０分間にわたって起こる。その後、バイオラド・トランスブロット・システム（コード番号１７０−３９３０）を用いて１００ボルトで１時半にわたりタンパク質をニトロセルロース・シート（０．４５μｍ、バイオラド社、コード番号１６２−０１１４）に移す。ＰＢＳ−０．０５％トゥイーン２０（商標）を用いてフィルターを室温にて一晩ブロックし、ＡｌＰＯ４製剤とＳＢＡＳ２製剤の両方からの抗ＢＡＳＢ０５５抗体を含むマウス血清で培養する。これら血清をＰＢＳ−０．０５％トゥイーン２０（商標）の中で１００倍に希釈し、軽く振動させながらニトロセルロース・シート上で室温にて２時間にわたって培養する。ＰＢＳ−０．０５％トゥイーン２０（商標）の中で５分間洗浄するステップを３回繰り返した後、ニトロセルロース・シートを、同じ洗浄用緩衝溶液の中で１／５００に希釈した適切な複合体（ヒツジに由来するビオチニル化した抗マウスＩｇ抗体、アマーシャム社、コード番号ＲＰＮ１００１）とともに、軽く振動させながら室温にて１時間にわたって培養する。この膜を上記のようにして３回洗浄し、洗浄用緩衝溶液の中で１／１０００に希釈したストレプトアビジン−ぺルオキシダーゼ複合体（アマーシャム社、コード番号１０５１）を用い、撹拌しながら３０分間にわたって培養する。最後に３回繰り返して洗浄した後、３０ｍｇの４−クロロ−１−ナフトール（シグマ社）、１０ｍｌのメタノール、４０ｍｌのＰＢＳ、３０μｌのＨ２Ｏ２を含む５０ｍｌの溶液の中で２０分間培養している間に顕色が起こる。膜を蒸留水で数回洗浄しているときに染色を止める。
【０１７３】
図４と図５に示した結果から、テストしたすべての菌株が、５０ｋＤａ付近のこの主要なバンドに加え、同じく上記抗原に関係するであろうより低い分子量における２〜３の他のバンドに対して明らかな反応性を提示することがわかる。この結果は、ＢＡＳＢ０５５タンパク質がおそらくすべてのナイセリア・メニンギティディスＢ菌株において発現していることを意味する。両図４と図５において、組み換えＢＡＳＢ０５５タンパク質は、マウス血清によっても同じＭＷにおいて認識されている。しかしながら、Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物による最後のレーン（図５）に示されるように、マウス血清により認識される最低のバンド（＜９ｋＤａ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ汚染物に関係するようである。
【０１７４】
【化１】
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【０１７５】
寄託した材料
ナイセリア・メニンギティディス血清型Ｂ株を含む寄託物を１９９７年６月２２日にアメリカ基準培養コレクション（この明細書では“ＡＴＣＣ”と表記）に寄託し、寄託番号１３０９０が与えられた。この寄託物はナイセリア・メニンギティディス（アルブレヒトとゴーン）と表記され、ナイセリア・メニンギティディス単離体から構成された、凍結乾燥された１．５〜２．９ｋｂの挿入体ライブラリーである。この寄託物は、Ｉｎｔ． Ｂｕｌｌ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． Ｎｏｍｅｎｃｌ． Ｔａｘｏｎ．、第８巻、１〜１５ページ、１９５８年に記載されている。
【０１７６】
ナイセリア・メニンギティディス菌株寄託物は、この明細書では、“寄託された菌株”または“寄託された菌株のＤＮＡ”と呼ぶ。
【０１７７】
寄託された菌株は、完全長ＢＡＳＢ０５５遺伝子を含んでいる。寄託された菌株に含まれているポリヌクレオチドの配列と、それによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、この明細書における配列の記述と何らかの問題が起こったときに照合する対象となる。
【０１７８】
菌株の寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいてなされた。菌株は、特許発行の際に一般に対して公開されてそれが取り消されることはなく、しかもその際の制約または条件もない。寄託された菌株は当業者の便宜のために提供されるだけであり、３５ＵＳＣ§１１２のもとで必要とされるように、寄託が効力発生のために必要とされることを認めるものではない。
【０１７９】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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