(57)【要約】本発明は、ＧＨ（成長ホルモン）欠乏症、特に孤立性成長ホルモン欠乏症ＩＩ（ＩＧＨＤ  ＩＩ）を診断するための方法及びキットに関する。この方法は、バリン１１０をフェニルアラニンに変化させるＧＨ−１のエキソン４中のミスセンス変異Ｇ６１９１−Ｔを分析するステップを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バリン１１０をフェニルアラニンに変化させるＧＨ−１のエキソン４中のＧ６１９１からＴへのミスセンス変異の存在または不在をインビトロで分析することを特徴とする患者サンプル中の常染色体優性遺伝孤立性ＧＨ欠乏症（ＩＧＨＤ  ＩＩ）の診断方法。
【請求項２】
ＧＨ−１のエキソン３のスキッピングを引き起こすＧＨ−１スプライス部位変異の存在または不在を分析することをも含むことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
スプライス部位変異がイントロン３ドナースプライス部位の第２塩基の＋２ＴからＣへのトランジションであることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の方法。
【請求項４】
患者が正常なサイズの下垂体前葉を有していることを特徴とする請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
患者のＧＨ−１遺伝子またはＧＨ−１遺伝子から誘導されるフラグメントを増幅させることを特徴とする請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
イントロン３及び／またはエキソン２−５を増幅させることを特徴とする請求の範囲第５項に記載の方法。
【請求項７】
患者のＧＨ−１遺伝子をＰＣＲ増幅にかけ、患者のＧＨ−１遺伝子の重複成分フラグメントをネステッドＰＣＲにかけることを特徴とする請求の範囲第５項または第６項に記載の方法。
【請求項８】
増幅フラグメントを制限酵素で消化させることを特徴とする請求の範囲第１項〜第７項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
増幅フラグメントを配列決定することを特徴とする請求の範囲第１項〜第７項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
バリン１１０をフェニルアラニンに変化させるＧＨ−１のエキソン４中のＧ６１９１からＴへのミスセンス変異の存在または不在を分析する手段を含むことを特徴とする患者サンプル中の常染色体優性遺伝孤立性ＧＨ欠乏症（ＩＧＨＤ  ＩＩ）の診断用キット。
【請求項１１】
ＧＨ−１のエキソン３のスキッピングを引き起こすＧＨ−１スプライス部位変異の存在または不在を分析する手段をも含むことを特徴とする請求の範囲第１０項に記載のキット。
【請求項１２】
分析手段がイントロン３ドナースプライス部位の第２塩基の＋２ＴからＣへのトランジションであるスプライス部位変異を分析するためであることを特徴とする請求の範囲第１１項に記載のキット。
【請求項１３】
ＧＨ３．２（ｎｔ６５７８−６６００）、ＧＨ５．１（ｎｔ５５０３−５５２５）、ＧＨ５．２（ｎｔ５５５５−５５７７）、ＧＨ３．４（ｎｔ６５４７−６５６８）、ＧＨ５．７（ｎｔ５８１６−５８３５）、ＧＨ３．７（ｎｔ６１２１−６１４０）から選択される１つ以上の特定ＧＨ−１プライマー対を含むことを特徴とする請求の範囲第１０項〜第１２項のいずれかに記載のキット。
【請求項１４】
配列決定プライマーＧＳ５．８（ｎｔ５６２９−５６４８）、ＧＳ３．８（ｎｔ６４９５−６５１５）を含むことを特徴とする請求の範囲第１０項〜第１３項のいずれかに記載のキット。
【請求項１５】
１つ以上の制限酵素ＭｖｎＩＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＤｄｅＩ、ＭａｅＩＩを含むことを特徴とする請求の範囲第１０項〜第１３項のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＨ（成長ホルモン）欠乏症、特に孤立性成長ホルモン欠乏症ＩＩ（ＩＧＨＤ  ＩＩ）を診断するための方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
孤立性成長ホルモン欠乏症（ＩＧＨＤ）の症例の大部分は特発性である（１）。ＩＧＨＤの一宿主性劣性遺伝はＧＨ−１の完全欠乏（ＩＧＨＤ  ＩＡ）（２）により、より最近ではＧＨＲＨ受容体遺伝子のナンセンス変異（３）により引き起こされることが分かった。優性伝達（ＩＧＨＤ  ＩＩ）はエキソン３のスキッピングを引き起こすＧＨ−１スプライス部位変異の存在において主に認められた（４，５）。このインフレーム欠失により、４０アミノ酸の損失及び多分誤って折り畳まれたｄｅ１３２−７１ＧＨが生じる。ＩＧＨＤ  ＩＩの家族での前記変異の罹患率は高く、最高１００％である（６）。変異タンパク質の優性ネガティブ効果は僅かしか解明されていない（７）。インビトロ研究の結果、神経内分泌細胞におけるｄｅ１３２−７１ＧＨの存在下での野生型ＧＨの不十分な貯蔵及び分泌を含む細胞特異的メカニズムが示唆された（８，９）。ＧＨ−１のイントロン３での数種のスプライス部位変異が報告されている（４，５，１０〜１３）。ＧＨ−１が非常にコンパクトな遺伝子構造を有しているために、スプライシングは保存スプライス部位外での点突然変異によっても影響される（１４）。更に、最近２つのＧＨ−１ミスセンス変異（Ｐ８９Ｌ及びＲ１８３Ｈ）がＩＧＨＤ  ＩＩに関与していた（１５，１６）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明はＩＧＨＤ  ＩＩの診断用の新規マーカーを提供する。このマーカーにより、小児患者を早期に正確に診断できる。本発明者らは、ＧＨ−１のエキソン３のスキッピングを引き起こすスプライス部位変異とＧＨ−１ミスセンス変異により優性ネガティブ効果を持つ変異ＧＨが生ずることを知見した。よって、ＧＨ欠乏症が疑われる小児をミスセンス変異について調べることも非常に重要である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
第１態様で、本発明は、バリン１１０をフェニルアラニンに変化させるＧＨ−１のエキソン４中のＧ６１９１からＴへの新しいミスセンス変異の存在または不在をインビトロで分析することを含む患者サンプル中の常染色体優性遺伝孤立性ＧＨ欠乏症（ＩＧＨＤ  ＩＩ）の診断方法に関する。好ましくは、前記方法はＧＨ−１のエキソン３のスキッピングを引き起こすＧＨ−１スプライス部位変異の存在または不在を分析することをも含む。１つの好ましい実施態様において、スプライス部位変異はイントロン３ドナースプライス部位の＋２ＴからＣへの第２塩基の新しいトランジションである。従って、本発明はＩＧＨＤ  ＩＩのための２つの新規な疾患マーカーを提供する。
【０００５】
本発明の方法は好ましくは、患者のＧＨ−１遺伝子またはＧＨ−１遺伝子から誘導されるフラグメントを増幅することを含む。イントロン３及び／またはエキソン２−５を増幅することが好ましい。好ましい実施態様では、前記方法は患者のＧＨ−１遺伝子をＰＣＲにかけ、患者のＧＨ−１遺伝子の重複成分フラグメントをネステッドＰＣＲにかけることを含む。増幅させたフラグメントを突然変異の検出のために制限酵素で消化させても、または直接配列決定してもよい。
【０００６】
第２態様で、本発明は、バリン１１０をフェニルアラニンに変化させるＧＨ−１のエキソン４中のＧ６１９１からＴへのミスセンス変異の存在または不在を分析する手段を含む患者サンプル中の常染色体優性遺伝孤立性ＧＨ欠乏症（ＩＧＨＤ  ＩＩ）の診断用キットに関する。
【０００７】
前記手段は、１つのヌクレオチド多型を含むＧＨ−１遺伝子の一部を分析するための試薬、プライマー等をも含み得る。好ましくは、前記キットはＧＨ−１のエキソン３のスキッピングを引き起こすＧＨ−１スプライス部位変異の存在または不在を分析する手段をも含む。好ましくは、スプライス部位変異はイントロン３ドナースプライス部位の＋２ＴからＣへの第２塩基の新しいトランジションである。
【０００８】
本発明のキットは、ＧＨ３．２（ｎｔ６５７８−６６００）、ＧＨ５．１（ｎｔ５５０３−５５２５）、ＧＨ５．２（ｎｔ５５５５−５５７７）、ＧＨ３．４（ｎｔ６５４７−６５６８）、ＧＨ５．７（ｎｔ５８１６−５８３５）、ＧＨ３．７（ｎｔ６１２１−６１４０）から選択される１つ以上の特定ＧＨ−１プライマー対、及び配列決定プライマーＧＳ５．８（ｎｔ５６２９−５６４８）、ＧＳ３．８（ｎｔ６４９５−６５１５）を含み得る。前記キットは、配列決定プライマーの代わりに１つ以上の制限酵素ＭｖｎＩＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＤｄｅＩ、ＭａｅＩＩを含み得る。
【０００９】
常染色体優性遺伝孤立性ＧＨ欠乏症（ＩＧＨＤ  ＩＩ）は、ＧＨの正常構造を改変させるＧＨ−１の突然変異により引き起こされる。本発明者らは、１組のオランダ人家族及び４組のドイツ人家族からの１６の家族性ＩＧＨＤ  ＩＩ症例及び１つの散発性ＩＧＨＤ  ＩＩ症例をＰＣＲ増幅したｇＤＮＡの直接配列決定及びリンパ球ｍＲＮＡの異所性転写物分析にかけて調査した。更に、患者の臨床データも分析した。ＧＨ−１のイントロンＩＩＩ中に２つの既に報告されている突然変異及び１つの新しいスプライス部位変異（＋１ＧからＣへの、＋１ＧからＡへの、及び新しい＋２ＴからＣへの）が検出され、これらがエキソン３スキッピングの原因である。本発明者らはＧＨ−１のエキソン４中に新しいＧ６１９１からＴへのミスセンス変異を見つけた。この突然変異により哺乳動物及び数種の非哺乳動物ＧＨ中に高度に保存されているバリン１１０がフェニルアラニンに変化する。正常なＧＨ構造をタンパク質レベルで改変させる可能性が高いこの突然変異によっても、主ＲＮＡ転写物のスプライシングは影響されなかった。
【００１０】
ＧＨ−１ミスセンス変異の小児患者に比してＧＨ−１スプライス部位変異の小児患者では、成長不全はより早期に発症し、症状もより重い。更に、表現型の重症度はたとえ同じ家族内でも個人毎にかなり異なっていた。診断時の年令は０．８〜９．６（中央値５．１）才であり、診断時の身長は−２．５〜−８．１（中央値−４．０）ＳＤ値であった。多くの小児患者は診断時−１．７〜＋３．３（中央値−０．４）ＳＤ値のＢＭＩで痩せていた。５人の成人患者は−１．８〜−４．５（中央値−３．６）ＳＤ値の最終身長、求心性肥満及び筋発育不全を有していた。治療前、すべての小児患者のＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰ３血清レベルはかなり低下していた（ＩＧＦ−１の中央値１５．１μｇ／Ｌ、ＩＧＦＢＰ３の中央値９１０μｇ／Ｌ）。全部で２５刺激試験での最高ＧＨピークは０．１〜５．０（中央値０．９）μｇ／Ｌであり、このことは重篤なＧＨ欠乏症であることを暗示していた。ＭＲＩで研究した下垂体前葉の大きさは２人の小児患者では正常であり、他の２人の小児患者ではやや小さかった。ＧＨで置換すると、治療小児患者のすべてにおいて良好な巻き返し成長(catch-up growth)を生じた。ホルモンデーターは一様に重篤なＧＨ−及びＩＧＦ−Ｉ欠乏症を示しているのに対して成長不全はたとえ同じ家族内であってもかなり変動しているとの矛盾から、乳児期の成長ホルモン依存の成長の発生及び支配は個人毎に異なることが示唆される。下垂体前葉の大きさは正常であるが重篤なＧＨ−及びＩＧＦ−Ｉ欠乏を有する小児患者はＧＨ−１スプライス部位変異及びミスセンス変異の両方について調べなければならない。
【００１１】
（発明の詳細説明）
以下、本発明を添付図面を参照してより詳細に説明する。
【００１２】
図１〜３には５組の家族（Ｎｏ．１〜５）の家系図が示されている。家族４及び家族５はすでに報告されている（５，１７）。小児患者はすべて診断時思春期前であり、ｆＴ４、ＴＳＨ、プロラクチン及びコルチゾールレベルは正常であった。一人を除くすべての患者でＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰ３の基礎血清レベルを測定した。７人の患者で２つの独立のＧＨ刺激試験を実施し、インスリン試験は３人の患者で実施した。若い（１才未満）という理由で２人の患者にはいずれの試験も課さなかったが、２人の患者のうち１人は自発発症低血糖症中病的に低いＧＨレベルを有していた。１２人の小児患者のうち、１１人に対してｒｈＧＨ（用量中央値０．１７ｍｇ／ｋｇ／週）をｓｃ投与して治療した。下垂体領域の狭い走査及びガドリニウム注射を伴うＭＲイメージングを４人の患者及び３家族からの１人の親患者で実施した。親及び患者からインフォームドコンセントを得た後遺伝子分析のために血液サンプルを採取した。
【００１３】
材料及び方法
（ホルモン測定）
異なる臨床センターで、刺激に対する正常応答について１０μｇ  ＧＨ／Ｌの同一カットオフレベルを有している幾つかのアッセイ（ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）によりＧＨ血清レベルを測定した。家族１、２、３及び５のＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰ３濃度をＢｌｕｍｅら（１８）の同一アッセイを用いて測定した。
【００１４】
（ＤＮＡ及びＲＮＡ抽出）
ゲノムＤＮＡを、凍結ＥＤＴＡ血液（５ｍｌ）から最初の血液溶解後クロロホルム抽出する抽出キット（イタリー国トリエステに所在のＴａｌｅｎｔのＧｅｎｏｍｉｘ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｃａｌｅ−ｕｐ）を用いて抽出した。末梢リンパ球からＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ及びＳａｃｃｈｉ（１９）に記載されている方法に従って全ＲＮＡを抽出した。
【００１５】
（オリゴヌクレオチドプライマー）
逆転写反応のために、使用したプライマーは報告されているＧＨ−１配列（２０）のヌクレオチド６５７８−６６００（ＧＨ３．２）に対応していた。ＧＨ３．２及び上流プライマー５５０３−５５２５（ＧＨ５．１）を用いてＰＣＲを実施した。ネステッドＰＣＲの上流プライマーはヌクレオチド５５５５−５５７７（ＧＨ５．２）に対応し、下流プライマーはヌクレオチド６５４７−６５６８（ＧＨ３．４）に対応していた。ＭｖｎＩＩ、ＮｌａＩＩＩ及びＤｄｅＩを用いる制限消化分析のために、ネステッドＰＣＲを上流プライマーＧＨ５．７（５８１６−５８３５）及び下流プライマーＧＨ３．７（６１２１−６１４０）を用いて実施した。使用した配列決定プライマーはＧＳ５．８（５６２９−５６４８）及びＧＳ３．８（６４９５−６５１５）であった。
【００１６】
（ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ）
ＲＮＡ（５μｇ）をＰＣＲ緩衝液において逆転写し、全ｃＤＮＡを既に記載されている（５）ネステッドＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲ産物（反応容量１０μｌ）を８％  ＰＡＧＥで電気泳動にかけた。
【００１７】
（ゲノムＤＮＡのＰＣＲ）
ゲノムＤＮＡをネステッドＰＣＲにより増幅させた。第１ＰＣＲは、最終容量５０μｌとしてＱｉａｇｅｎ  ＰＣＲ緩衝液中で０．２μｇのｇＤＮＡ、１００ｐｍｏｌずつの各プライマーＧＨ５．１及びＧＨ３、２．５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ドイツ国ハンブルグに所在のＱｉａｇｅｎ）、０．２ｍｍｏｌ／ｌずつの各ｄＮＴＰを用いて実施した。反応混合物をサイクル（９５℃×６０秒；６５℃×６０秒；７２℃×９０秒）に３０回かけた。この反応物のアリコート（０．２μｌ）を、上流プライマーＧＨ５．２及び下流プライマーＧＨ３．４、或いは（制限酵素分析のためには）センスプライマーＧＨ５．７及びアンチセンスプライマーＧＨ３．７を用いてネステッドＰＣＲで増幅させた。
【００１８】
（制限消化）
完全イントロン３を含むＧＨ−１の３２５ｂｐフラグメント（５８１６−６１４０）を、１０μｌのＰＣＲ産物を含む容量３０μｌ中で２０ＵのＭｖｎＩＩ、２０ＵのＮｌａＩＩＩまたは１０ＵのＤｄｅｌＩ（ドイツ国のＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて３時間消化した。エクソン２からエクソン５のゲノム配列を含むＧＨ−１の１０１４ｂｐフラグメント（５５５５−６５６８）を同一条件下で４ＵのＭａｅＩＩ（ドイツ国のＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて消化した。フラグメントを８％  ＰＡＧＥに流した後エチジウムブロミドで染色して可視化した。
【００１９】
（直接配列決定）
ＰＣＲ産物を、７−ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰを含むテルモシーケンスサイクル配列決定キットを用いて直接二本鎖配列決定した、反応は製造業者（ドイツ国のＡｍｅｒｓｈａｍ）が推奨しているように実施した。配列決定プライマーをＩＲ−８００フルオレッセンス色素で５’−標識した。ＰＣＲ産物を変性条件下でＬｉ−ＣＯＲ  ＤＮＡ自動配列決定装置４２００にかけた。
【００２０】
結果
ＰＣＲ増幅ゲノムＤＮＡを直接配列決定したところ、家族１、４及び５の患者ではイントロン３のドナースプライス部位の第１塩基のヘテロ接合性点突然変異が検出された。詳しくは、本発明者らは、家族１ではＧからＡへのトランジション、家族４及び５では本発明者らが既に報告したＧからＣへのトランスバージョン（５，１７）を知見した。家族２では、イントロン３ドナースプライス部位の第２塩基のＴからＣへのトランジションを伴う新しいスプライス部位変異が検出された。完全イントロン３を含む３２７ｂｐ  ＤＮＡフラグメント（５８１６−６１４０）をＮｌａＩＩＩ（家族１）、ＭｖｎＩ（家族２）（図２）及びＤｄｅｌＩ（家族４及び５）（５，１７）を用いて制限フラグメント分析したところ、４家族のすべての患者で突然変異が検出されたが、非患者では検出されなかった。家族５のプロバンドでリンパ球ｍＲＮＡの異所性転写物分析を実施したところ、エクソン３を欠く短いｍＲＮＡの存在が示された（図４のレーン１）（５）。
【００２１】
家族３に関して、本発明者らは、Ｎｏ．６１９１のＧからＴへのトランスバージョンを伴うエクソン４における新しいヘテロ接合性点突然変異を検出した。ＧＨ欠乏症との共分離は、すべての患者においてＭａｅＩＩ認識部位のヘテロ接合性ロスを示したＭａｅＩＩでの制限フラグメント分析により証明された（図３）。Ｇ６１９１からＴへの突然変異はヒトＩｇＭ遺伝子においてエキソンスプライシングエンハンサーとして作用すると報告されていた（２１）配列と相同であったエキソン輸送性(exonic motive)内にあったので、本発明者らは末梢リンパ球ＲＮＡの異所性転写物を分析した。認められた主ＧＨ  ｍＲＮＡフラグメントは、主要ＲＮＡスプライシングの欠陥を除いて対照と同一であった（図４のレーン２）。ミスセンス変異により、変異成長ホルモンのＮｏ．１１０でバリンからフェニルアラニンヘのアミノ酸置換が生じた（Ｖ１１０Ｆ  ＧＨ）。ＧＨ配列のアラインメントから、哺乳動物及び数種の非哺乳動物ＧＨにおいてＶａｌ  １１０が高度に保存されていることが明らかとなった（図５）。
【００２２】
小児患者の診断時の臨床的特徴を表１に要約する。
【００２３】
【表１】
2004527254.tif 000002
【００２４】
Ｐｒａｄｅｒら（２２）からＳＤ値を得た。遺伝子型−表現型関係をよりうまく比較するために、ＧＨ−１スプライス部位変異を有する小児患者（家族１、２、４及び５）及びＧＨ−１ミスセンス変異を有する小児患者（家族３）からの臨床データを別々に示す。診断時の年令及び低身長は、図６に示すように同じ家族であってもメンバーにより非常に異なる。全体として、ＧＨ−１スプライス部位変異を有する小児患者は、ＧＨ−１ミスセンス変異を有する小児患者に比してより早期に発症し、成長不全度も重い傾向を示した（表１及び図６）。１２人の小児患者のうち２人のみ（５．１才及び７．１才）がＢＭＩ  ＳＤ値が２．２及び３．３の過体重であった。骨年令は平均で１．６年（０．５〜３．６年）遅かった。ＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰ３はすべての小児患者で病的に低かった（表２）。
【００２５】
【表２】
2004527254.tif 000003
【００２６】
すべての被験小児において刺激ＧＨレベルは刺激薬に関係なく非常に低かった（表３）。２５刺激試験のうち３個の試験でＧＨレベルは３μｇ／Ｌ以上に達した（表３）。
【００２７】
【表３】
2004527254.tif 000004
【００２８】
１０人の小児を０．１７ｍｇ／ｋｇ／週のｒｈＧＨをｓｃ注射して２年以上治療した。治療の最初の２年間の平均成長速度は１０．０ｃｍ／年（７．０〜１２．５ｃｍ／年）に上昇した。これは、２．１倍（１．７〜３．６倍）という成長速度の平均増幅に等しかった。下垂体のＭＲイメージングによれば、家族２及び５の２人の小児患者はＡｒｇｙｒｏｐｏｕｌｏｕら（２３）に従って正常な形態及び正常な下垂体前葉サイズを有しており（−０．５〜−０．６ＳＤＳ）、家族１及び２の２人の小児患者（−２．５〜−２．６ＳＤＳ）及び家族１の１人の成人患者は身長はやや小さいが正常な下垂体を有していた。ＧＨ−１スプライス部位変異を有する５人の成人患者（女性４人）は、受精能は正常であるが、低身長−３．６（−２．７〜−４．２）、求心性肥満、筋発育不全を呈していた。ＩＧＦ−１血清レベルは非常に低かった（表２）。Ｖ１１０Ｆ  ＧＨを有する母親は低身長（−１．８ＳＤＳ）だけでなく、求心性肥満、筋発育不全を呈していた。彼女の７回の妊娠はすべて順調と報告されていた。
【００２９】
検討
家系図からＩＧＨＤの常染色体優性伝達が示唆された５家族のすべての患者がＧＨ−１の有害な点突然変異を有しており、ＩＧＨＤ  ＩＩにおける前記突然変異の非常に高い発生率が示唆された。１家族で見られた１つの新しいスプライス部位変異はイントロン３ドナースプライス部位の高保存第２塩基に影響を与えた（＋２ＴからＣへ）。イントロン３の第１塩基の突然変異に関して示されているようなこの突然変異の予測される影響はスプライシング中のエキソン３のスキッピングである（４，５）。生じたｄｅ１３２−７１  ＧＨは野生型ＧＨに対して優性ネガティブ効果を発揮し、この効果は細胞特異性であり、ＥＢＶ形質転換したリンパ球（７）またはＣＯＳ細胞（８，９）のような非分泌型細胞型では認められない。野生型ＧＨとＮｏ．５３の１つのシステインを欠くｄｅ１３２−７１  ＧＨ間でのヘテロダイマー形成が優性ネガティブ効果に関する最初の仮説であった（４）。Ｎｏ．１６５の非対システインを欠く組換え二重突然変異ｄｅ１３２−７１，Ｃ１６５Ａ  ＧＨがインビトロで同じ効果を有していたという所見（９）により上記理論は最近問題とされてきた。ｄｅ１３２−７１  ＧＨ及び野生型ＧＨは神経内分泌細胞株には蓄積せず、このことは分子基礎が未だ未知である（２４）細胞内安定性が低下していることが暗示される（９）。これに関連して、ＧＨ−１のミスセンス変異によっても優性ネガティブ効果を有する突然変異ＧＨが生じることは重要である。
【００３０】
ＧＨ−１のＶ１１０Ｆ突然変異を報告したのは本発明者らが初めてである。その遺伝的基礎は、脊椎動物ゲノムにおける突然変異の一般的ホットスポットであるＣｐＧジヌクレオチドにおけるＣからＴへのトランジションである（２５）。この突然変異により、哺乳動物、数種の両生類及び鳥類において完全に保存されているバリンがフェニルアラニンに変化する。バリンは第３のα−ヘリックスのＮ末端の隣に位置し、ＧＨの４つのα−ヘリックスバンドルの密に充填されたコアに組み込まれている（２６）。この位置により嵩高のフェニルアラニンが存在すると、ＧＨの正常な折り畳みが妨げられやすい。最近、ＩＧＨＤ  ＩＩと共分離する２つの他のＧＨ１ミスセンス変異、すなわちＰ８９Ｌ及びＲ１８３Ｈが報告された（１５，１６）。Ｖ１１０Ｆと同様に、両突然変異により高保存のアミノ酸に変化が生ずる。プロリン８９はＧＨの第２α−ヘリックスにおいてねじれを形成するが、ロイシンはそのようなことはない（２４）。アルギニン１８３はシステイン１８２のジスルフィド結合の隣にあり、この形成はより嵩高のヒスチジンにより妨害され得る（２４）。しかしながら、培養した神経内分泌細胞における２つのミスセンス変異の影響は未だ明らかにされていない。
【００３１】
従来、ＧＨ−１欠陥のスクリーニングは、診断時に−４．５ＳＤ値以下の身長を有する重篤な成長不全が見られたときに実施されていた（６）。この定義による重篤な低身長は診断時我々の患者の１／３にしか当てはまらず、ＩＧＨＤ  ＩＩの成長不全は予想よりも重症でないと思われる。スプライス部位変異を有する小児は、ミスセンス変異を有する小児に比して診断時より若く、身長も低かった。Ｐ８９Ｌ突然変異を有する家族からも中程度の成長不全が報告された（１６）。加えて、本発明者らは、１人以上の小児患者がいる３組の家族で３．０ＳＤ値を越える身長差の２つの突然変異グループの同胞間での家族間変動性が顕著であることを見つけた。この成長変動性は成長ホルモンまたはＩＧＦ−Ｉ欠乏の重篤性と相関しなかった。なぜならば、最高の成長速度を示し、成長不全は僅かである患者を含めたすべての被験者でホルモンレベルが非常に低かったからである。優性遺伝のバソプレシン欠乏について記載されているような（２４）ＩＧＨＤ  ＩＩにおけるＧＨ欠乏症の遅い進行についての証拠は実質的にない。全身ＧＨ−及びＩＧＦ−Ｉレベル以外のファクターが成長不全の差に関与しているに違いない。この未知ファクターが明らかにＧＨ依存成長の発症及び支配を調節している。前記の未知ファクターの幾つかもラロン症候群で報告（２７）されている成長不全の高い変動性に関与している可能性がある。
【００３２】
一宿主性疾患の下垂体解剖の系統的検査に関するデーターは僅かである（２９）。下垂体前葉のホルモン産生細胞の約５０％はソマトトロピン細胞である（２９）。特発性ＧＨＦを有する小児の最近のＭＲＩ所見から、下垂体前葉の大きさと分泌型ＧＨ能力にポジティブな関係があることが示唆された（３０）。これはＩＧＨＤ  ＩＩの症例ではない。ＭＲＩで検査した４人の小児患者のうち、２例は正常な下垂体前葉、他の２例は中程度の発育不全を示した。正常なサイズの下垂体前葉は２人のＩＧＨＤ  ＩＡの小児患者でも報告されており、このことからＧＨの存在が正常なサイズの下垂体前葉の前提条件ではないことが示唆される（３１）。従って、重篤なＧＨ及びＩＧＦ−１欠乏症の存在と正常もしくはほぼ正常な大きさの下垂体前葉を組み合わせると、原因となるＧＨ−１突然変異の存在がかなり示唆される。こうした場合、分子診断が遺伝的カウンセリング及びＧＨの長期間置換の推奨の基礎を確立する。
【００３３】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】既に報告されている家族４及び５の家系図を示す。黒丸及び黒四角は患者を指す。
【図２】家族１及び２の家系図、及び制限酵素ＭｖｎＩ（家族１）またはＮｌａＩＩ（家族２）で消化後の家族メンバー（１〜９）及び正常な対照（Ｃ）由来の増幅ＧＨ−１フラグメントの電気泳動分析を示す。下線は制限酵素の認識部位に下線を施した。未消化フラグメントのバンドを矢印で指す。消化後２つの小さなバンドが現れたことから明らかなように、ヘテロ接合性スプライス部位変異により各酵素につき１つの新しい認識部位が生じている。Ｍ＝分子量マーカー。
【図３】家族３の家系図、及び制限酵素ＭａｅＩＩで消化後の家族メンバー（１〜９）及び正常な対照（Ｃ）由来の増幅ＧＨ−１フラグメントの電気泳動分析を示す。制限酵素の認識部位に下線を施した。未消化フラグメントのバンドを矢印で指す。ヘテロ接合性突然変異はＭａｅＩＩの認識部位を壊すので、患者のＤＮＡフラグメントは不完全に消化されている。Ｍ＝分子量マーカー。
【図４】増幅ＧＨ−１  ｃＤＮＡの電気泳動分析を示す。レーン１は、ＧＨ−１イントロン３＋１ＧからＣへのドナースブライス部位突然変異を有する患者（家族５）からの増幅ｃＤＮＡを含み、この患者では正常対照（Ｃ）と比較して主要フラグメント（矢印ｂ）が短く、これはエクソン３の消失を示す。レーン２は、新しいＧ６１９１からＴへのミスセンス変異（Ｖ１１０Ｆ）を有する１人の患者についての同一分析を示す。主フラグメントのサイズはミススプライシングを除いて対照フラグメント（Ｃ）と同じである（矢印ａ）。Ｍ＝分子量マーカー。
【図５】ヒトＧＨ配列（アミノ酸１０４〜１１７）と哺乳動物及び非哺乳動物ＧＨの配列のアラインメントを示す。Ｎｏ．１１０のバリンは高度に保存されており、第３α−ヘリックスのＮ末端の隣に位置している。
【図６】１２人のＩＧＨＤ  ＩＩ小児患者の診断時の年令及び身長ＳＤ値の比較である。同胞からのデーターのバーは同じステッチで示す。黒色バーはＶ１１０Ｆ  ＧＨを持つ家族からのデーターを示す。たとえ同じ家族であっても、ＩＧＨＤ  ＩＩにおける成長不全の高変動が明白である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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