(57)【要約】本発明は、マイクロアレイにおける生体分子またはそのアナローグの検出、および前記マイクロアレイ用の支持体に関し、特に、仮第１メンバー結合分子のアレイまたはライブラリ内の第１メンバー分子と、第２メンバー結合分子との結合を決定またはテストする方法に関する。本発明は、仮第１メンバー結合分子のアレイまたはライブラリ内の第１メンバー分子と、第２メンバー結合分子との結合を決定するのに適したマイクロアレイ用の支持体であって、表面パッチが前記パッチから物質的に識別可能な表面領域内で散在する支持体表面を備える支持体を提供する。
2004537032.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
仮第１メンバー結合分子のスポットのライブラリ内の第１メンバー分子と、第２メンバー結合分子との結合を決定するのに適したマイクロアレイ用の支持体であって、表面パッチが、前記パッチから物質的に識別可能な表面領域内で散在する支持体表面を備えることを特徴とする前記支持体。
【請求項２】
前記パッチは、前記領域が相対的に疎水性であるのに対して、相対的に親水性であることを特徴とする請求項１記載の支持体。
【請求項３】
前記領域の表面は、前記パッチの表面が相体的に親水性の材料を備えたポリプロピレンを本質的に含むのに対して、相対的に疎水性のポリプロピレンを本質的に含むことを特徴とする請求項１または２記載の支持体。
【請求項４】
前記相対的に親水性の材料は、ポリアクリル酸を含むことを特徴とする請求項３記載の支持体。
【請求項５】
空間的にアドレス可能なスポットにおいて、仮第１メンバー結合分子のライブラリを備えることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の支持体。
【請求項６】
１ｃｍ２あたり２５スポットを超えるスポット密度を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の支持体。
【請求項７】
仮第１メンバー結合分子のライブラリ内の第１メンバー分子と、第２メンバー結合分子との結合を決定する方法であって、請求項１〜６のいずれか１項に記載の支持体の使用を含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
前記支持体に前記仮第１メンバー結合分子を含むスポットを供給することと、第２メンバー結合分子を供給することと、第１メンバー分子と前記第２メンバー結合分子との結合を検出することとを含むことを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記結合は、光学活性のある検出可能なマーカーで検出されることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記マーカーは、フルオロフォアを含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記結合は、酵素結合アッセイで検出されることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素結合アッセイは、蛍光基質の産生を含むことを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記酵素は、アルカリホスファターゼであることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
仮第１メンバー結合分子のライブラリ内の第１メンバー分子と、第２メンバー結合分子との結合を決定する方法であって、支持体に１平方センチメートルにあたり少なくとも２５スポットの密度で前記仮第１メンバー結合分子のスポットのライブラリを供給することと、酵素結合アッセイで前記結合を検出することとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記酵素結合アッセイは、蛍光基質の産生を含むことを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記酵素は、アルカリホスタファーゼを含むことを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
仮第１メンバー結合分子のライブラリ内の第１メンバー分子と、第２メンバー結合分子との結合を決定する方法であって、支持体に前記仮第１メンバー結合分子のスポットのライブラリを供給することと、酵素結合アッセイで前記結合を検出することと、光学活性のある検出可能なマーカーの拡散を限定することとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
前記拡散は、前記支持体の表面に、表面パッチが前記パッチから物質的に識別可能な表面領域内で散在する支持体表面を供給することによって、限定されることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記パッチは、前記領域が相対的に疎水性であるのに対して、相対的に親水性であることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記領域の表面は、前記パッチの表面が相対的に親水性の材料を備えるポリプロピレンを本質的に含むのに対して、相対的に疎水性のポリプロピレンを本質的に含むことを特徴とする請求項１８または１９記載の方法。
【請求項２１】
前記相対的に親水性の材料は、ポリアクリル酸を含むことを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
スポットの前記ライブラリは、空間的にアドレス可能であることを特徴とする請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項７〜２２のいずれか１項に記載の方法によって、同定または取得可能な結合部位を含むことを特徴とする合成分子。
【請求項２４】
請求項７〜２２のいずれか１項に記載の方法によって、同定または取得可能な結合部位を含むことを特徴とする結合分子。
【請求項２５】
結合部位を含む合成分子を同定または取得するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の支持体の使用、または請求項７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
結合部位に結合可能な結合分子を同定または取得するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の支持体の使用、または請求項７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
結合分子との結合に干渉または影響するための、請求項２４、２５または２６記載の分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、マイクロアレイにおける（生体）分子またはそのアナローグの検出、および前記マイクロアレイ用の支持体に関し、特に、結合ペアの各メンバーである、仮第１メンバー結合分子のアレイまたはライブラリ内の第１メンバー分子と、第２メンバー結合分子との結合を決定し、またはテストする方法に関し、ならびに高密度マイクロアレイシステムにおける前記ペアの酵素結合検出に関する。
【０００２】
一般的に生体分子である結合分子と、同じく一般的に生体分子であって対応するリガンドとの間の特異的な結合ペアの相互作用または形成は、生命の中心である。細胞は、しばしば、ホルモン、ペプチド、薬品、抗原、エフェクター分子もしくは別のレセプター分子と相互作用または結合するレセプター分子、基質と結合する酵素、抗原と結合する抗体分子、およびタンパク質との核酸などを保持または含有する。「相互作用または結合」とは、結合分子およびリガンド（またはその機能部分）が分子力の範囲内で相互に接近し、相互の特性に影響を及ぼすことを意味する。結合分子とそのリガンドとが、親密性および相互効果の程度の上昇を含む分子認識の様々な段階を通して接近し、これらは結合し、２つのメンバーはペアを形成する。
【０００３】
結合分子は、問題のリガンドの認識を可能にする識別可能な結合部位を含むので、この結合能力を有する。次には、リガンドは対応する結合部位を有し、２つの結合部位が本質的に空間的な相補性によって相互作用することができるときのみ、２つの分子は結合し得る。言うまでもなく、分子は３次元であり、結合部位はたいてい３次元性であり、たいてい一方の結合部位の１つもしくは２つ以上の表面突起または隆起は、３次元鍵−鍵穴配列、時には誘導適合変化において、他方の１つもしくは２つ以上のくぼみまたは凹部に対応する。
【０００４】
結合分子とこれらのリガンドとが生命において果たす中心的な役割に起因して、結合部位、およびこのような部位に関係する分子の結合ペアのメンバーの性質または特性の試験または同定に関心が広がっている。たとえば必要に応じて結合部位またはリガンドを置換または補完するために、問題の結合部位とリガンドとの特定相互作用の正確な性質のみに関心があるのではなく、アナローグ、アゴニスト、アンタゴニスト、または関係する結合部位もしくはリガンドに酷似するその他の化合物を発見または設計するために、相互作用の近似する特性の知識にも関心がある。
【０００５】
結合ペアおよびその個別のメンバーを試験または同定する多目的かつ迅速な方法が知られている。大部分は、核酸検出技術およびこれらの技術を用いる分子ライブラリが全くなければ、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡであっても、相補的核酸鎖による本質的に連続的な核酸伸長のハイブリッド形成を必要とする。タンパク質およびペプチドはたいてい、抗体もしくは誘導体またはこれらの合成変異体を用いて検出される。生体分子のアレイ（マイクロアレイ）は、多くの研究所における標準的な技術に現在用いられている。このようなマイクロアレイに基づく検出は一般的に、特異的結合ペアのメンバーを、光学活性のある検出可能な反応によって検出するという方法を含む。（核酸、ペプチドまたはその他いずれの性質であっても）結合ペアの仮または可能性のある第１メンバーを含むライブラリについて異なる支持体が用いられるが、これらの支持体は、２つのタイプ、多孔性表面および非多孔性表面に大きく分類することができる。このような第１メンバーのアレイまたはライブラリは、供給され、たとえばスポッティングまたはグリッディングによって、このような支持体と、一般に空間的におよび／またはアドレス可能に多くの場合共有結合で結合され、次いで、第２メンバー、すなわち前述のペアの、光学的検出を円滑にするためにマーカー分子（たとえば蛍光化合物）によって直接または間接に広く標識付けされる検出分子または特異的結合分子が、この分子と結合可能な推定第１メンバーのアレイの分子を検出するように供給される。前記第２メンバーはもちろん、核酸、レセプター分子もしくは抗体、またはこれらに類似するものであってもよい。こうして第２メンバーの結合は、支持体における特異的な局在性に起因して前記第１メンバーを同定する。
【０００６】
多孔性表面（膜、セルロースおよび紙）は、おそらく最も古く使用されていたもので、たとえば「ドットブロット(dot blots)」は最近でも広く用いられている。マクロ分子（たとえば、核酸またはペプチド）の合成でさえ、これらの多孔性マトリクスにおいて説明されてきた。紙は、相対的に薄い連続的な多孔性マトリクスとして用いられ、このような第１メンバー構築物はスポット法で合成された。結合ペアは一般的に、直接または間接酵素標識プローブで検出することによって同定され、蛍光基のような、光学活性のある検出可能なレセプター分子によって直接標識付けされたプローブの使用に渡って感度を上昇させる。これらの方法の不都合は、これらのマトリクスにおけるスポット密度が限定されることである。この限定は、中でも、酵素的変化基質のマトリクスにおける拡散を原因とする。この拡散の不都合、および結合ペアの不正確な局在性を避けるために、ペプチド合成の分野において、方法はポリエチレンピン（Geysen 1983）、またはポリプロピレンウェル（Slootstra, 1995; 1997）で説明される。しかしながら、これらの「早期」の方法はすべて、様々な理由で、高密度でないアレイ（約１０〜２０スポット／ｃｍ２以下）が促進されるという不都合を有する。
【０００７】
アレイにおける限定されたスポット密度は、最近非多孔性表面がより広く用いられる理由である。特にゲノミクスの分野において、最近、ポリヌクレオチド配列の巨大なアレイが、種々の表面、多くの場合異なるコーティングによって覆われたスライドガラスにおいて、スポットされる（米国特許第６０１５８８０号、米国特許第５７００６３７号）。１０００スポット／ｃｍ２のアレイ密度は容易に可能である。生体分子（ポリヌクレオチド配列）がｉｎ−ｓｉｔｕで合成される場合、なお一層高い密度が可能である（米国特許第５８７１９２８号）。たとえば、並行して多くの遺伝子の発現をプロフィルするように設計された従来の遺伝子発現アッセイにおいて、ｍＲＮＡは、２つの異なる組織タイプ（たとえば通常および病気のサンプル）から調製される。単離されたｍＲＮＡは、細胞内での発現の現状の断片を表す。このｍＲＮＡは、第１鎖ｃＤＮＡ標識反応を介してＤＮＡに転換される。その後、ターゲットのＤＮＡは、コーティングされたスライドガラスに溶着されるとともに、直接標識付けされたｃＤＮＡプローブは、アレイに対してハイブリッド形成される。ハイブリッド形成されたアレイは、アレイスキャナを用いて画像化され、この結果はいくつかの画像およびデータ分析ソフトウェアツールを用いて発現レベルの違いについて検査される。最近、この目的で、より複雑な多孔性支持表面、いわゆる連続多孔性マトリクスアレイが述べられた（国際公開００／５６９３４）。顕微鏡用スライドにおいて、ポリアクリルアミドの連続スラブがたとえば２０μｍの厚さに形成され、これによって薄い連続多孔性マトリクス（ヒドロゲル）が非多孔性表面（ガラス）と組合される。
【０００８】
前記高密度支持体における特異的結合ペアの検出は一般的に、光学活性のある検出可能な（一般には蛍光）ヌクレオチドまたは抗体を含む直接標識付けされたプローブによって達成される。これらは一般に高感度であり、非特異的結合および高い光安定性を有する。標識付けされたヌクレオチドは、特にマイクロアレイにおけるマルチカラー分析用に、ＦＩＳＨ、染色体同定、全染色体彩色、核型分析および遺伝子マッピング用にも、ＤＮＡおよびＲＮＡプローブを標識付けするのに広く用いられる。標識付けされたヌクレオチドは、単一のサンプル内の多重化に理想的な狭い放射帯域を有する明るく強烈な色彩の範囲で利用可能である。核酸検出に基づくマイクロアレイと同様、タンパク質またはペプチドの分野がまだ発達していないので、タンパク質またはペプチド検出のために、利用可能な蛍光標識プローブは、少数しかない。
【０００９】
本発明は、より多くの結合ペアをより迅速に検出可能にする高密度アレイ（一度に多くの結合発生をテストする）および酵素結合アッセイ（非常に感度が良い）の好都合を組合せる。本発明は、高密度支持体における関心のある分子を検出するために酵素結合アッセイとともに働くことを可能にするマイクロアレイシステムを提供する。本発明は、酵素結合アッセイにおける固体支持体上の高密度構築物をこのようにテストすることを提供し、たとえば第１メンバーが、たとえば１平方センチメートルあたり少なくとも２５スポット、もしくは好ましくは少なくとも５０スポット、より有利に好ましくは少なくとも１００スポット、またはそれ以上、たとえば２００〜５００スポットもしくは１０００スポットの密度で、支持体の表面上（好ましくは片側）に供給または合成される。
【００１０】
好適な実施形態において、本発明は、１平方センチメートルあたり少なくとも２５スポット、もしくは好ましくは少なくとも５０スポット、より有利に好ましくは少なくとも１００スポット、またはそれ以上、たとえば２００〜５００もしくは１０００スポットの密度で前記仮第１メンバー結合分子のスポットのライブラリを備えるポリマー材料の支持体（ポリマー支持体）を提供する。
【００１１】
さらに好適な実施形態において、前記ポリマー材料は、ポリプロピレンを含み、さらに好ましくは、以下に提供されるように、親水性のパッチを備える。
【００１２】
前記第１結合ペアメンバーはたとえば、位置的または空間的にアドレス可能な方法で、スポットまたはグリッドされ、第２メンバーまたは結合分子と相互作用可能な、支持体上の非常に多くの構築物または第１メンバー分子を生じさせる。もちろん、スポットは、第１メンバー分子の構築する収集物が空間的にアドレス可能であり、かつ識別可能である限り、重複してもよい。スポッティングは、たとえば、圧電性ドロップオンデマンド技術を用いて、または小型電磁弁を用いることによって行なわれてもよい。グリッディングは、たとえば、第１メンバーを含む溶液を含有するマイクロタイタープレートからマイクロリットル以下の量のセグメント溶液を採取する１組の個別の針を用いて行なわれてもよい。ペプチドをテストすると、結合反応後、結合していないペプチドを除去するための支持体のその後の脱保護および広範な洗浄は、１ｃｍ２あたり２５〜５０スポット、さらに１００〜２００スポット、または最大５００〜１０００スポットのペプチド構築物密度を少なくとも生じさせる。この密度は、抗体と結合する前記タンパク質の可能性のある大多数のペプチド構築物をスクリーニング可能にする。たとえば、好適な実施形態において、２５，０００から１００，０００の構築物が１０００ｃｍ２において形成され、典型的に、その表面は、直接または間接であろうと、酵素結合アッセイにおける結合のためにスクリーニングされ、蛍光基質は、１ｍＬあたり１〜１０μｇのプローブを含有する１００ｍＬの酵素標識プローブ溶液によって、および確立された技術による光学活性のある検出可能な基質のその後の発達によって生成される。したがって、本発明は、仮第１メンバー結合分子のライブラリ内の第１メンバー分子と、第２メンバー結合分子との結合を決定する方法であって、１平方センチメートルあたり少なくとも２５スポットの密度の前記仮第１メンバー結合分子のスポットのライブラリを有するポリマー（好ましくはポリプロピレンタイプのもの、より好ましくは親水性のパッチを備える）または合成樹脂の支持体を備えることと、酵素結合アッセイ、好ましくは蛍光または化学発光基質の産生を含む前記酵素結合アッセイにおいて前記結合を検出することとを含むことを特徴とする方法を提供する。蛍光基質は、酵素系、たとえばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはその他の基質−酵素系の宿主によって産生されてもよく、これらの酵素系は、たとえばMendoza et al「酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）に基づく高性能マイクロアレイ(High-throughput microarray-based enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), Biotechnique, Eaton Publishing, Natick, US Vol 27, (1999))」から、本技術分野において知られており、ここでは、光学活性のある平坦な、ガラスに基づく支持体が、ガラスにプリントされた抗原の等しくパターンされた数多くのアレイを備えることが述べられている。
【００１３】
ここで提供されるように、間接または直接蛍光検出は、抗体結合構築物の位置を定める。共焦スキャニング検出方法による直接蛍光検出はたとえば、ナノリットル以下の範囲で小滴ペプチド溶液で生成されたスポットにおける抗体検出を可能にし、さらに高い構築物密度を実現可能にする。もちろん、核酸ライブラリは、酵素標識核酸プローブを用いて、類似の方法で形成されてもよい。
【００１４】
さらに、本発明は、仮第１メンバー結合分子のアレイまたはライブラリ内の第１メンバー分子と、第２メンバー結合分子との結合をテストするのに適したマイクロアレイ用の支持体であって、パッチが前記パッチから物質的に識別可能な領域内で散在する表面を備える前記支持体を提供する。一般に、このような表面は、様々な複雑な方法で得られ、これらの方法は、たとえば、マスキング、およびその後の写真露光および現像（国際公開９４／２７７１９参照）、またはプラズマ処理、ポリメリゼーション、光酸化もしくは電子ビーム処理（国際公開９９／５８２４５）を含む。その他の技術（ＣＡ２２６０８０７）は、たとえばコーティングによって疎水性領域と親水性領域とを用いる必要がある不活性の固体支持体材料を要求する。その他（ＧＢ２３３２２７３）は、極めて疎水性の表面、少なくとも用いられるサンプル溶液に対して疎水性の表面を供給し、この後乾燥によってサンプルが前記表面に付着すると考えられる解決方法を求めている。米国特許第５，３６９，１０２号では、一方面は疎水性、その反対面は親水性である２つの相対する表面を有する支持体が、前記親水性の表面に対して細胞を付着させるために供給される。
【００１５】
本発明は、マスキングまたはコーティングが要求されないことと、ポリプロピレンのような表面に通常用いられる移植がすでに適していることとを認識し、供給される出発物質、少なくとも０．５平方センチメートル、好ましくは１平方センチメートルの実質的に平坦な表面は少なくとも、上昇および下降によって特徴付けられた実質的に粗い部分を備える片側または表面であり、これらの上昇および下降は、前記片側または表面に生じる疎水性および親水性のパッチの散在特徴を可能にする。国際公開９９／３２７０５は、様々な移植プロトコルを開示するが、表面の粗い部分、または親水性および疎水性のパッチのパターンに関する要件を開示していない。ここで提供される親水性（通常親水性マトリクスは激しい拡散を引起す。）および疎水性の領域（拡散を阻止する。）のパターンは、特にこれらのパッチが供給材料（スポット）の小滴寸法よりも小さいときに拡散を縮小させ、もちろんこれらのパッチは、スポット密度が最も高いときに最も小さい。
【００１６】
好適な実施形態において、本発明は、本発明に従った支持体を提供し、前記領域の表面は、前記パッチの表面が相対的に親水性の材料、好ましくは移植されたポリアクリル酸を備えるポリプロピレンを本質的に含むのに対して、相対的に疎水性のポリプロピレンを本質的に含み、ここで提供される前記支持体は、１ｃｍ２あたり、２５もしくは５０、好ましくはさらに１００、２００、最も好ましくは最大５００スポットもしくはさらに１０００スポット、またはそれ以上の密度のスポットまたはドット（たとえば、核酸またはペプチド構築物などの第１メンバー分子の収集物）を少なくとも含み、好ましくは前記スポットまたはドットは、位置的にまたは空間的にアドレス可能であり、各前記スポットまたはドットは、少なくとも１個のパッチ、好ましくは３〜５個、５〜１５個、またはそれ以上の親水性パッチまたはピクセルを覆う。
【００１７】
好ましくはポリプロピレンの表面は、均一の移植片で完全に覆われないけれども、これらの表面における好ましくはポリアクリル酸の移植片の表面を占める割合が相対的に高いことに起因して、このように１ｃｍ２あたりの高いペプチドまたはヌクレオチド負荷がなお実現可能である。前述の設定において、移植片は厚ければ厚いほど、より高いペプチドまたは核酸負荷を保持することができる一方で、移植された表面の占める割合が増加するので、供給された材料のより多くの拡散問題を被るのは明らかである。したがって、この材料は、拡散に対する負荷に関して、様々な要求に適合するように形成されることができる。
【００１８】
さらに、本発明は、少なくとも１つのペプチドまたは少なくとも１つのヌクレオチドを追加的に備える本発明に従った固体支持体を提供する。好ましくは、複数のペプチド（または同様にヌクレオチド）を有する固体支持体が提供され、前記ペプチドまたはヌクレオチドは、好ましくはスポット中に供給される。
【００１９】
このようにして、本発明は、仮第１メンバー結合分子のライブラリ内の第１メンバー分子と、第２メンバー結合分子との結合を決定する方法であって、前記仮第１メンバー結合分子のスポットのライブラリを有する支持体（少なくとも１つの表面）を供給することと、酵素結合アッセイにおいて前記結合を検出することと、光学活性のある検出可能なマーカー分子の拡散を限定、小型化、または制限することとを含む方法を提供する。ここで、この拡散は限定され、酵素反応と、その結果生じる（光学活性のある）検出可能なマーカー分子の溶着または局在性とを、さらに高い精度で決定することができ、酵素結合検出を用いるこれまでのマイクロアレイよりも相当高い密度が実現可能であると判断される。特に、本発明は、前記拡散は、表面パッチが、前記パッチと物質的に識別可能な表面領域内で散在する支持体表面を有する前記支持体の少なくとも１つの表面を供給することによって限定される（たとえば図１を参照）。
【００２０】
特に、本発明は、支持体表面材料が親水性に関して変化のある、または不連続な性質を有する支持体（ここでは不連続マトリクスアレイまたはピクセルアレイとも称する）を提供する。ここで提供される高密度マイクロアレイ用支持体の一実施形態において、相対的に親水性のパッチは好ましくは、相対的に疎水性の領域とともに散在する。もちろん、パッチとその周囲領域との間の境界線は鮮明である必要はなく、識別可能な物質的相違または不連続性がパッチの中心と周囲領域の中間線との間に存在すれば足り、したがって、多少緩やかな物質的変化が両者の間に存在する。パッチおよび周囲領域は厳密なマトリクスまたはグリッド形式であってもよいが、これは必須ではない。パッチは一般に、後の段階で支持体表面に供給されるであろう第１メンバー分子の配置された小滴またはスポットの円周の寸法よりも、若干ではあるが、少なくとも少し小さい寸法であり、すなわち、核酸もしくはペプチド、もしくはその他の（生体）分子、またはこれらの組合せであろうと、第１メンバーの、後にスポットされた溶液の円周内に適合する好ましくは少なくとも３〜５個、より好ましくは少なくとも１０〜２０個のたとえば親水性のパッチである。パッチは、マーカー分子が特異的結合ペアに付着した後に光学活性のある検出可能な画像を形成し、これによって第２メンバー分子と結合される第１メンバー分子の収集物を有するスポットが検出されるピクセルと類似する。もちろん、ピクセルまたはパッチの小滴またはスポットに対する１対１の適合はまた、パッチがスポットよりも大きいときであっても実現可能であるが、必ずしもその必要はない。過度に規則的なパターンでパッチを用い、または供給する必要はない。小滴またはスポットが供給されるとき、支持体表面の散在された疎水性特徴が、いずれの水溶液の拡張をも限定するであろうし、したがってまた、後の段階において再び、光学活性のある検出可能な基質（沈殿物または溶液であろうと）の溶液の拡張は、第１メンバーが結合ペアの第２メンバーと結合される位置で行なわれる酵素反応後に形成され、したがって、前記小滴またはスポット円周内の相対的に親水性のパッチの存在は、前記基質を多少なりとも位置決めまたは検出可能にする。ここで提供される好適なパッチは、最終的に、光学活性のある検出可能なまたは蛍光の基質が位置するであろうスポット内のピクセルとして述べられてもよい。もちろん、たとえば相対的に疎水性の性質の溶液または（光学活性のある検出可能な）マーカーがテストされる場合、必要に応じて、パッチは疎水性であってもよく、ここにおいて周囲領域は相対的に親水性である。
【００２１】
好適な実施形態において、ここで提供される前記支持体は、１ｃｍ２あたり、２５もしくは５０、またはさらに１００、２００、または最大５００もしくはさらに１０００スポットの密度のスポットまたはドット（たとえば、核酸またはペプチド構築物などの第１メンバー分子の収集物）を少なくとも含み、好ましくは前記スポットまたはドットは、位置的に、または空間的にアドレス可能であり、各前記スポットまたはドットは少なくとも１個のパッチ、好ましくは３〜５個、もしくはさらに５〜１５個、またはそれ以上のパッチまたはピクセルを覆う。
【００２２】
親水性パッチの寸法は、ポリエチレン、もしくはポリプロピレン、または別の相対的に疎水性の合成樹脂材料などの適切な支持体材料を第一に選択することによって、または所望の寸法のパッチを供給すること、たとえば印刷技術を用いることによって、修正されることができる。下には、支持体表面が相体的に疎水性のポリプロピレン表面から生成され、ここにおいて移植片が相対的に親水性のパッチを形成するように供給される。好適なものは、極めて適した親水性を有するポリアクリル酸を有する移植片を形成することであり、これによって生理的状況下でテストすることが可能となる。パッチ寸法は、ポリエチレンまたはポリプロピレン出発物質の適切な粗い部分を選択することによって影響を受け、前記粗い部分は、研磨もしくは艶出しによって、またはその他の機械的（印刷）もしくは化学的（エッチング）方法によって調節されてもよく、ここにおいて親水性のパッチが生成される。もちろん、親水性のパッチの寸法が小さくなればなるほど、用いられる小滴も小さくなってよく、好ましくは、少なくとも１個のパッチが、用いられた小滴の円周内に入る寸法までである。本発明はまた、仮第１メンバー結合分子のライブラリ内の第１メンバー結合分子の、第２メンバー結合分子との結合を決定する方法であって、本発明に従った支持体の使用を含む方法を提供し、特に、前記支持体に前記仮第１メンバー結合分子を含むスポットを供給することと、第２メンバー結合分子を供給することと、第１メンバー分子と前記第２メンバー結合分子との結合を検出することとを含む方法を提供する。
【００２３】
好ましくは、前記結合は、光学活性の検出可能なマーカーによって検出され、たとえば前記マーカーは、フルオロフォア(fluorophore)を含み、核酸または抗体などのプローブに直接または間接に標識付けされ、これによって本発明に従った支持体はいずれのタイプのマイクロアレイにおいても用いられることができ、拡散の防止は過負荷信号などの問題を回避するために常に歓迎され、しかしながら、好適な実施形態において、本発明は、結合ペアが酵素結合アッセイ技術を介して検出される方法を提供し、別の方法では拡散または漏れを克服することが非常に困難であり、さらなる好都合は、酵素検出の感度がはるかに良いということであり、これによって１つのスポットにスポットされるべき仮第１メンバー分子のより少ない複製物を含むことができ、したがって一般的にはスポット寸法を縮小させ、これによって感度に従う必要なしにスポット密度を増加させることができる。酵素検出は直接標識プローブの検出よりも最大１０〜１０００倍感度が良くなり得る。
【００２４】
適切な酵素−基質の組合せと、本発明に従った方法における使用方法とは、たとえば米国特許第４９３１２２３号によって発見され、ここにおいて、異なる波長の光が２つまたはそれ以上の酵素的に分解可能な化学発光１，２−ジオキセタン(dioxetane)化合物から同時に放射されるという工程が開示され、前記化合物は、異なる酵素によって各前記化合物を分解することによって、前記異なる波長の各放射光について、各化合物中で異なる光を放射するフルオロフォアの含有物を用いて設定される。また、Bronstein et al. 「改良された化学発光法によるウエスタンブロッティング手続（Improved Chemiluminescent Western Blotting Procedure, BioTechniques 12 #5(May 1992) pp. 748-753 )」は、ジオキセタンと結合する負に帯電した置換基を形成するために、酵素が酵素開裂可能な基をジオキセタンから開裂するように、ジオキセタンの酵素との反応を含む光学活性のある検出可能な反応によって、特異的結合ペアのメンバーが検出されるという検定方法を示唆する。Cano et al., J. App. Bacteriology 72 (1992)は、有利には本発明においても用いることができる蛍光アルカリホスファターゼ基質による核酸ハイブリッド形成の実施例を提供し、Evangelista et al., Anal. Biochem. 208 (1992)は、酵素増幅蛍光ＤＮＡハイブリッド形成アッセイにおける試薬の検出として、アクリルおよびアリール置換したサリチルホスフェイト(salicyl phosphates)を教示する。ここにおける詳細な説明において、ＶｉｓｔｒａＥＣＦとして一般的に知られ、かつウエスタンブロッティング、ドットおよびスロットブロッティング法における使用に適するとのみ一般的に考えられた、タンパク質ブロットのアルカリホスタファーゼに基づく検出用の蛍光基質は、モレキュラーダイナミックスフルオルイメージャー(Molecular Dynamics FluorImager)またはストーム(Storm)機器などの蛍光スキャニング装置による使用に用いられる。アルカリホスファターゼの酵素反応は、ここで示すように本発明に従った方法で検出可能な蛍光産生物を産生するために、前記ＥＣＦ基質を脱リン化させる。しかしながら、アルカリホスタファーゼ検出に基づくもののみがここで提供されるのではなく、本発明はまた、米国特許第５２０８１８４号から知られるような蛍光誘導体を含むグリコシド酵素を評価するための基質であって、親油性を保持するとともに、そのために表面の疎水性領域に好ましくは存在する基質を用いるという、本発明に従った方法をも提供する。さらに、本発明は、結合部位（すなわち、検出された第１メンバー分子またはその誘導体に位置する部位）を含む合成分子、または本発明に従った方法によって同定または取得可能な結合部位を含む結合分子を提供する。さらに、結合部位を含む合成分子を同定もしくは取得するための、または結合部位に結合可能な結合分子を同定もしくは取得するための、本発明に従った支持体の使用、または方法が提供されるとともに、結合分子との結合に干渉または影響するための、このように取得した分子の使用が提供される。本発明は、以下の詳細な説明において説明されるが、これに限定されるものではない。
【００２５】
詳細な説明
一例として、主としてペプチドに関連する技術が記載されるが，本発明は核酸またはその他の生体分子の検出にも応用可能である。従来のペプスキャン(Pepscan)の方法は、ピン（Geysen et al）またはウェル（Slootstra et al）を用いる。ポリエチレンピンまたはポリエチレンウェルにおけるポリアクリル酸移植片またはその他のアクリル移植片を、ペプチドの担体として用いる。ＥＬＩＳＡ形式においてテストされた高いペプチド負荷（ポリマーの相互の炭素原子がペプチドを理論上保持することができる）に起因して、ペプチドの抗体に対する極めて低い結合相互作用を検出することができる（ｋＤ＜３Ｍの検出が可能。）。このシステムにおいて、相互作用は、物理的に、すなわちウェル壁によって、常に分離される。技術的に、この概念の小型化は、従来（注射器／針）の液体取扱法の制限に起因して約１０ウェル／ｃｍ２で止まる。設定が小型化される場合、２つの拠点（酵素結合検出方法と組合せた高いペプチド負荷）を無傷のままにするのが望ましい。
【００２６】
粗いポリプロピレン（ＰＰ）支持体は、商業上入手可能であり、全種の応用において、艶なし材料として広く用いられる。この粗いＰＰは、ポリアクリル酸移植片に付着する理想的なテンプレートのようである。たとえば、ＰＰ（ＥＶＡＣＡＳＴ１０７０Ｎ１６、Vink Kunststoffen BV）表面の顕微鏡観察は、丸い高台（丘部）が小さな凹部（谷部）によって分離されていることを明らかにする。図１参照。丘部の頂上のＰＰ表面は、丘部間の谷部の表面と比べて相対的に粗い。凹部が相対的に容易に移植片を受け入れない一方で、粗い表面は、移植片を付着するための好ましい足場のようである。ガンマ線照射を用いる移植手順の期間中、移植片は、表面に沿って規則正しく分散しないが、材料の凹部に対応する物質的に異なる領域によって囲まれたパッチに溶着される。たとえば、ＣｕＳＯ４およびアクリル酸を用いて、移植の期間中、ポリアクリル酸ポリマーの多くは、高台の頂上に移植されるが、凹部には相対的に少ない（図１参照）。したがって、移植されたＰＰ表面支持体において、親水性（ポリアクリル酸移植片）のパッチと、相対的に疎水性（ポリアクリル酸移植片のない、または相対的に少ない場所）領域との多少規則正しいパターンが存在する。親水性（通常、親水性マトリクスは激しい拡散を引起す。）および疎水性領域（拡散を阻止する。）のパターンは、特にパッチが供給材料の小滴寸法よりも小さい場合、拡散を縮小する。ＰＰの表面は均質の移植体で完全に覆われていないけれども、これらのＰＰ表面におけるポリアクリル酸移植片の相対的に高い表面占有率に起因して、１ｃｍ２あたりの高いペプチド負荷が可能となる。前述の設定において、移植片が厚ければ厚いほど、より高いペプチド負荷を保持することができるが、移植された表面の占有率が高くなるので、供給材料の拡散問題をより多く被るであろう。しかしながら、この材料は、拡散に対する負荷に関して様々な要求に適するように形成されることができる。
【００２７】
酵素結合アッセイは、そのまま沈殿するか、または水溶性の産生物中の酵素によって変換される基質を用いる。沈殿産生物の欠点は、清掃期間中に沈殿材料の不溶性が原因でシステムの再利用の可能性が無くなることである。好ましくは、沈殿しない産生物を利用する設定であり、特に、この沈殿しない産生物は、最新の蛍光信号検出応用によって検出が容易であるので、蛍光である。基質（可溶性の産生物を生み出す。）が、表面に、好ましくは過剰の基質材料が後の段階で前記表面から除去される位置に置かれる場合、色素発生は、拡散問題を被らない。この現象は、ポリアクリル酸マトリクスの卓越したぬれ性と組合せて、表面の谷部／丘部または疎水性／親水性の構築によって引き起される。図２は、ストームフルオルイメージャー（モレキュラ−ダイナミックス(Molecular Dynamics)社製）で検出されるように、ｉ）ポリアクリル酸で移植されたＰＰ（ＥＶＡＣＡＳＴ１０７０Ｎ１６、Vink Kunststoffen BV社製）、ｉｉ）ポリアクリル酸で移植されていないＰＰ、およびｉｉｉ）ＣＭＴ−スライドガラス（コーニング(Corning)社製）の、ＶｉｓｔｒａＥＣＦ（２’（２−ベンズチアゾイル}−６’−ヒドロキシ−ベンズチオゾールホスフェイト  ビス−（２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール）塩、アメルシャムファーマシアバイオテック(A mersham Pharmacia Biotech)社製）基質のぬれ性を示す。ポリアクリル酸で移植されたＰＰ−ＥＶＡＣＡＳＴ表面は、多孔性（ポリアクリル酸移植片）材料によって連続的に占有されていないけれども、ストームフルオルイメージャーは、不規則な表面パターンを検出しない。これは、移植されていないＰＰ−ＥＶＡＣＡＳＴまたはＣＭＴ−スライドガラスと対照的である。
【００２８】
（実施例）
実施例１：ポリプロピレン（ＰＰ）支持体（ＥＶＡＣＡＳＴ１０７０Ｎ１６、Vink Kunststoffen BV社製）を、ＰＰ表面においてポリアクリル酸移植片を導入するために、アクリル酸によって移植した。この場合において、固体ＰＰ支持体を、１２、３０または５０ｋＧｙの投与量でガンマ放射線を用いて、ＣｕＳＯ４を含有する６％、９％、または１２％のアクリル酸水溶液の面前で照射した（組合せ：６％アクリル酸および１２ｋＧｙ＝６／１２Ａｃ、９％アクリル酸および３０ｋＧｙ＝９／３０Ａｃ、ならびに１２％アクリル酸および５０ｋＧｙ＝１２／５０Ａｃ）。カルボン酸基を含有する移植された固体支持体を、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾール（ＨＯＢｔ）とともにジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いるｔ−ブチルオキシカルボニルヘキサメチレンジアミン（Ｂｏｃ−ＨＭＤＡ）の結合、次いでトリフルオロ酢酸を用いる前記Ｂｏｃ基の開裂を介して、アミノ基によって機能化した。支持体においてチオール反応性ブロモアセトアミド基を導入するために、アミノ基機能化した支持体を、ＤＣＣまたはＤＣＣ／ＨＯＢｔを用いてブロモ酢酸によって処理した。
【００２９】
システイン残基を含有するペプチドは、安定的なチオエーテル結合を形成するシステイン残基のチオール基を介してブロモ機能化された表面に結合可能であった。ペプチドを、異なる直径（１．５ｍｍ、０．８ｍｍ、０．６ｍｍ、０．４ｍｍおよび０．２５ｍｍ）を有するグリッディングピン（ジェノミックソリューションズ(Genomic Solutions)社製）を用いて、ブロモ機能化された表面にスポットした。ペプチドの異なる濃度を有する溶液を用いた（１ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ、０．０４ｍｇ／ｍＬおよび０．００８ｍｇ／ｍＬ）。（約７〜８ｐＨでの重炭酸塩緩衝液中の）ペプチド溶液の部分標本を、グリッディングピンを用いて支持体に供給したとき、表面におけるブロモ基とペプチドのチオール基との結合が、湿度の高いチャンバ内で達成された（オーバーナイト反応）。広範囲の洗浄は、結合していないペプチドを除去した。用いられたペプチドは、ＧＣＡＳＬＱＧＭＤＴＣＧＫ（Ｎｒ１）、ＣＡＦＫＱＧＶＤＴＣＧＫ（Ｎｒ２）、ＡＰＤＰＦＱＧＶＤＴＣＧＫ（Ｎｒ３）、およびＧＣＡＰＤＰＦＱＧＶＤＴＣＧＫ（Ｎｒ４）である。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定から、親和定数は、抗体ＭａｂＧＯ１（Ｎｒ１  ｋＤ＝＜１０−３、Ｎｒ２  ｋＤ＝３×１０−７、Ｎｒ３  ｋＤ＝４×１０−６、およびＮｒ４  ｋＤ＝６×１０−８）によって知られる。
【００３０】
ペプチドに対する抗体の結合を、蛍光産生物を利用する方法を用いて検出した。ペプチド機能化領域を含有するＰＰ支持体全体を、抗体（５μｇ／ｍＬのＭａｂＧＯ１、オーバーナイトインキュベーション）とインキュベーションした。洗浄後、アルカリホスタファーゼと複合される第２の抗マウス抗体のインキュベーションは、ペプチドに対するＭａｂの結合後に、ペプチド機能化表面（スポット）に酵素アルカリホスタファーゼを導入する。洗浄後、ＶｉｓｔｒａＥＣＦ基質（アメルシャムファーマシアバイオテック社製）溶液の薄膜を前記表面に加えたとき（余った基質は除去された。）、結合した酵素は、蛍光産生物信号をペプチド機能化表面において生じさせた。蛍光産生物信号は、青色蛍光モードにおいてストーム（モレキュラーダイナミックス社製）で数量化されてもよい。図３は、３つの異なる移植体において５つの異なるグリッディングピンと４つの異なるペプチド濃度とを用いてＭａｂＧＯ１に対するペプチドＮｒ１、２、３および４の結合のストーム蛍光信号を示す。図４Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄは、６／１２Ａｃにおけるスポットの最大の蛍光信号を示す。図５は、移植体６／１２Ａｃ、９／３０Ａｃおよび１２／５０Ａｃにおいて０．２ｍｇ／ｍＬでスポットされたペプチドＮｒ１、２、３および４の最大の蛍光信号を示す。
【００３１】
実施例２。グルコースオキシダーゼ。ポリプロピレン（ＰＰ）支持体（ＥＶＡＣＡＳＴ１０７０Ｎ１６、Vink Kunststoffen BV社製）をポリアクリル酸で移植した。固体支持体を、１２ｋＧｙの投与量でガンマ放射線を用いて、ＣｕＳＯ４を含有する６％アクリル酸水溶液の面前で照射し、カルボン酸基を含有する移植された固体支持体を、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾール（ＨＯＢｔ）とともにジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いるｔ−ブチルオキシカルボニルヘキサメチレンジアミン（Ｂｏｃ−ＨＭＤＡ）の結合、次いでトリフルオロ酢酸を用いる前記Ｂｏｃ基の開裂を介して、アミノ基によって機能化した。支持体においてチオール反応性ブロモアセトアミド基を導入するために、アミノ基機能化支持体を、ＤＣＣまたはＤＣＣ／ＨＯＢｔを用いてブロモ酢酸によって処理した。
【００３２】
チオール基を含有するグルコースオキシダーゼ（Ｇｌｕ−ｏｘ−ＳＨ）は、ブロモ機能化表面に対して結合可能であった。グルコースオキシダーゼ（Ｇｌｕ−ｏｘ、１ｍｇ／ｍＬ）におけるチオール基を、２−イミノチオレン（Ｇｌｕ−ｏｘを５倍モル超過する２−イミノチオレン、４５分、室温）を用いて０．１６Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ８）に導入した。Ｇｌｕ−ｏｘ−ＳＨを、異なる直径（１．５ｍｍ、０．８ｍｍ、０．６ｍｍ、０．４ｍｍ、および０．２５ｍｍ）を有するグリッディングピン（ジェノミックソリューションズ社製）を用いてブロモ機能化表面においてスポットした。Ｇｌｕ−ｏｘ−ＳＨの濃度は、０．２５ｍｇ／ｍＬであった。Ｇｌｕ−ｏｘ−ＳＨ溶液（リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中、１ｍＭのTitriplex（ｐＨ７でのＥＤＴＡ））の部分標本を、グリッディングピンを用いて支持体に供給すると、Ｇｌｕ−ｏｘ−ＳＨのチオール基に対する表面のブロモ基の結合が多湿チャンバ（オーバーナイト反応）において達成された。広範囲の洗浄は、結合していないＧｌｕ−ｏｘ−ＳＨを除去した。Ｇｌｕ−ｏｘに対する抗体（ＭａｂＧＯ１）を、蛍光産生物を利用する方法を用いて検出した。Ｇｌｕ−ｏｘ機能化領域を含有するＰＰ支持体全体を、抗体ＧＯ１（５μｇ／ｍＬ）でインキュベーションした。洗浄後アルカリホスタファーゼと複合される第２の抗マウス抗体の後のインキュベーションは、Ｇｌｕ−ｏｘに対するＭａｂの結合後に、Ｇｌｕ−ｏｘ機能化表面（スポット）において酵素アルカリホスタファーゼを導入する。洗浄後、結合した酵素は、ＶｉｓｔｒａＥＣＦ基質（アメルシャムファーマシアバイオテック社製）（余りの基質は除去された。）が導入されるとき、ペプチド機能化表面において蛍光産生物信号を生じさせた。蛍光産生物信号は、青色蛍光モードにおいてストーム（モレキュラーダイナミックス社製）で数量化されてもよい。図８は、５つの異なるグリッディングピンと３つの異なる移植体とを用いてＭａｂＧＯ１に対するＧｌｕ−ｏｘの結合のストーム蛍光信号を示す。
【００３３】
実施例３ａ。頭−尾マトリクススキャン。
完全なマトリクススキャンにおいて、タンパク質のＮ末端配列、たとえば配列［１〜１１］は、図６Ａに示すように、同じタンパク質の完全スキャンの各重複ペプチド配列と、ビルディングブロックとして結合される。次いで、配列［２〜１２］が、同じ組の重複配列などと結合される。結合は、たとえば、第２のビルディングブロックのＣ末端のシステインと、第１ビルディングブロックのブロモアセトアミド修飾したＮ末端との反応によって形成される。これは、たとえばタンパク質配列からのウンデカペプチドのすべての組合せが固体支持体の個別の既知位置で合成されていることを意味する。
【００３４】
実施例３ｂ（２型）。尾−尾マトリクススキャン。
これは、実施例２ａの完全マトリクススキャンと同じスキャンであるけれども、このスキャンにおいて、第２ビルディングブロックのシステインはそのＮ末端に位置し、図６Ａに示すように、構築物における両ビルディングブロックの逆または尾−尾方向を供給する。
【００３５】
両実施例３ａおよび３ｂは、図６Ｂ、６Ｃおよび６Ｄにおいて表す。
実施例４。マルチビルディングブロックスキャン。
【００３６】
本実施例において、チオールの機能がアミノ機能化固体支持体で導入される。これは、たとえばイミノチオレンを有するアミノ基の直接反応によって、またはＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨの結合、次いでピペリジンと、アセチル化と、ＴＦＡ／スカベンジャー混合物を用いるトリチル脱保護とを用いるＦｍｏｃ開裂によって、形成されることができる。このチオール機能化固体支持体を、たとえば、保護されたシステイン残基を含有するブロモアセトアミドペプチドと反応させることができる。第１ペプチドの結合後、システインは、たとえばＴＦＡ／スカベンジャー混合物によって脱保護されることができる。形成された遊離チオール基を、保護されたシステインを再び含有する第２ブロモアセトアミドペプチドを結合するために用いてもよい。この手順は、マルチビルディングブロック構築物を形成するために反復されてもよい。その他の実施例において述べられるように、いくつかのタイプのスキャンを、このマルチビルディングブロックスキャンと組合せて用いてもよい。図７Ａにおいて、実施例は３つのマルチビルディングブロックスキャンについて示す。２つのビルディングブロックスキャンを有する実施例は、図７Ｂ、７Ｃおよび７Ｄにおいて表す。
【００３７】
2004537032.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ポリアクリル酸移植ＰＰの表面構造である。
【図２】異なる表面のＥＣＦ基質のぬれ性を示す。
【図３】５つの異なるグリッディングピン（Ｘ軸上の直径のグリッディングピン）を用いるＭａｂＧＯ１に対するペプチドＮｒ１、２、３および４（Ｙ軸）の結合のストーム蛍光信号。４つの異なるペプチド濃度を３つの異なる移植体（１２／５０Ａｃ、９／３０Ａｃ、および６／１２Ａｃ移植体）においてスポットした。
【図４】４つの異なるペプチド濃度と５つの異なるグリッディングピンとを用いる移植体６／１２ＡｃにおけるペプチドＮｒ１、２、３および４に対するＭａｂＧＯ１の結合の、ストームにより検出されるスポットの最大蛍光信号を示す。ペプチド濃度：図４ａ：１ｍｇ／ｍＬ、図４ｂ：０．２ｍｇ／ｍＬ、図４ｃ：０．０４ｍｇ／ｍＬおよび図４ｄ：０．００８ｍｇ／ｍＬ。
【図５】移植体６／１２Ａｃ、９／３０Ａｃおよび１２／５０ＡｃにおけるペプチドＮｒ１、２、３および４（ペプチド濃度０．２ｍｇ／ｍＬ）に対するＭａｂＧＯ１の結合の、ストームにより検出されるスポットの最大蛍光信号を示す。図４ａ：移植体６／１２Ａｃ，図４ｂ：移植体９／３０Ａｃ，図４ｃ：移植体１２／５０Ａｃ。
【図６Ａ】頭−尾完全マトリクススキャンの概略図である。１２３４５６７８９０１およびＡＢＣＤＥＦＧＨＩＪＫは、タンパク質由来の配列、および尾−尾完全マトリクススキャンの概略図を表す。このスキャンは、図４に示すスキャンと類似するが、システイン残基は第２ビルディングブロックのＮ末端に位置し、両ビルディングブロックの逆または尾−尾方向に導く。両配列は前述のように結合される。このスキャンにおいて、両配列は、完全なタンパク質配列を通じて独立に転換され、可能性のある全配列組合せのライブラリを生じさせる。
【図６Ｂ】Ｎ末端ブロモアセトアミド基を含有する全ペプチド（ｈＦＳＨ由来）のリストである。
【図６Ｃ】ＣまたはＮ末端システインを含有する全ペプチド（ｈＦＳＨ由来）のリストである。
【図６Ｄ】完全マトリクススキャン、すなわち図６Ｂにリストされた全配列と図６Ｃにリストされた全配列との結合後を示し、カード１４５〜１５５および全部で約４０，０００ペプチドの全結合値の全体図（下方）によって実証される。
【図７Ａ】マルチビルディングブロックスキャンの概略図である。１２３４５６７８９０１（ビルディングブロック１）、ＮＯＰＱＲＳＴＵＶＷＸＹ（ビルディングブロック２）およびＢＣＤＥＦＧＨＩＪＫＬＭ（ビルディングブロック３）は、タンパク質由来の連続的配列を表す。ビルディングブロックは、チオールエーテル架橋を介して結合され、実施例３に記載されるように、ビルディングブロック１におけるＣ末端システイン残基（Ｃ）、およびビルディングブロック２のＮ末端におけるブロモアセトアミド基（＄）などの遊離チオール機能反応によって形成される。このスキャンにおいて、全配列は、完全ライブラリを得るために、完全タンパク質配列を通じて同時に続いて転換される。
【図７Ｂ】抗ｈＦＳＨモノクローナル抗体０２によって得られた実施例である。
【図７Ｃ】互いに結合されたペプチドの結合値およびリストである。
【図７Ｄ】完全に詳細な１つのスクエアである。ペプチド＄ＣＫＥＬＶＹＥＴＶＲＶＰＧを、カード０６のシステインと結合した。このカードに対して、ペプチド１〜３６を、グリッディングピンでスポットした。結合値は、下方に示す。化学反応の要約：ポロプロピレン（ＰＰ）表面を、ＣｕＳＯ４および（本ケースでは１２％の）アクリル酸の面前で（本ケースでは５０ｋＧｙ）ガンマ線照射した。カルボン酸機能化ＰＰを、Ｂｏｃ−ＨＭＤＡ／ＤＣＣ／ＨＯＢｔで処理し、次いでトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）による処理が、アミノ基を有する表面を生じさせた。このアミノ基機能化ＰＰ表面に対して、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｓ−トリチル−Ｌ−システイン（Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−（Ｔｒｔ）−ＯＨ）を、ＤＣＣおよびＨＯＢｔを用いて結合した。続いて、Ｆｍｏｃ基が除去され、次いでアミノ基がアセチル化された。ＴＦＡ（スカベンジャーとしてトリエチルシランおよび水を有する）を有する表面の処理は、チオール機能化表面を生じさせた。０．０１５ＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ７〜８、オーバーナイト反応）において、ペプチドを含有するブロモアセチル（またはその他のチオール反応物）は、ＰＰ表面のチオール基と反応させられた。続いて、結合されたペプチドの（Ｓ−ｔ−ブチルチオ保護Ｃｙｓ残基の）ＳｔＢｕ基を、ＮａＢＨ４（０．０１５ＭのＮａＨＣＯ３ｐＨ７〜８中の１４ｍｇ／ｍＬ、３０分、３０℃）を用いて除去し、ペプチドにおける新しいチオール基を生じさせる。その後、ペプチドを含有するブロモアセチル（またはその他のチオール反応物）の第２の組は、前記第１の組と結合され、ペプチド構築物を形成した。この工程は、異なる組のブロモアセチル化ペプチドを用いて数回繰り返してもよい。
【図８】５つの異なるグリッディングピンを用いて３つの異なる移植体におけるＧｌｕ−ｏｘとＭａｂＧＯ１との結合のストーム蛍光信号である。
【図９】ヒト濾胞刺激ホルモン（ｈＦＳＨ）のマトリクススキャンにおいて、ポリクローナル抗ｈＦＳＨ血清Ｒ５１２５（Biotrent 4560-5215）を、１μｇ／ｍＬでテストした。このマトリクスは４個の大きなスクエアから構成される（図の左側）。各大スクエアは、４８個のより小さいスクエアを含む。これらの４８個の各スクエアのチオール基機能化表面に対して、１個のブロモアセチル化ｈＦＳＨペプチド（または対照ペプチド）を、本願に記載されるように、ブロモアセチル基を介して結合した。このようにして、ｈＦＳＨを覆う各重複１３−ｍｅｒペプチドが結合され、１８１個の重複ｈＦＳＨペプチド機能化スクエアおよび１１個の対照ペプチドスクエアを生じさせた。全てのペプチドは、チオール保護ブチルサルフェニル基（Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ））を有するシステインを保有する。
【００３９】
ブロモアセチル化ｈＦＳＨペプチドの同じ組は、ペプチド機能化表面のペプチドの保護ＳｔＢｕ基がｐＨ７〜８で水中ＮａＢＨ４の処理によって除去されるとき、各ペプチド機能化小スクエアと結合されてもよい。各ペプチド機能化スクエア内で、全てのブロモアセチル化ｈＦＳＨ重複ペプチドをスポットし、結合後に、各ペプチド機能化スクエア内で、１８１個の２６−ｍｅｒのｈＦＳＨペプチド構築物（スポット）を生じさせる。このようにして、全部で３２，７６１（１８１×１８１）個の重複ＦＳＨ２６−ｍｅｒペプチド構築物のマトリクススキャンを生じさせる。
【００４０】
結合に用いられる、ペプチド中のシステイン（Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ））の位置は、様々である。ペプチド１（第１の１３−ｍｅｒｈＦＳＨ＝１〜１２Ｃｙｓ）は、Ｃ末端にＣｙｓ（ＳｔＢｕ）を有し、ペプチド２（ｈＦＳＨのペプチドＣｙｓ２〜１３）はペプチドのＮ末端にＣｙｓ（ＳｔＢｕ）を含有する一方で、ペプチド３（ｈＦＳＨのペプチドＣｙｓ３〜１４）はＣ末端にＣｙｓ（ＳｔＢｕ）をさらに有する。ペプチド４（ｈＦＳＨのペプチド４〜１５）は、Ｎ末端Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）をさらに有し、以下同様である。ペプチド１は、左端大スクエアの左端小スクエアに結合され、ペプチド２は、左端大スクエアの左端小スクエアから１つ右に結合され、ペプチド３は、左端大スクエアの左端小スクエアから２つ右に結合され、以下同様である。
【００４１】
図面の右側の２つの拡大されたスクエアは、ペプチド機能化スクエアｎｏ．１５０（上側の拡大されたスクエア＝ｈＦＳＨペプチド１５０〜１６２Ｃｙｓ）およびペプチド機能化スクエアｎｏ．６６（下側の拡大されたスクエア＝ｈＦＳＨのペプチドＣｙｓ６６〜７８）のペプチド構築物に対する抗体Ｒ５１２５の結合を示す。黒色は、ペプチド（黒色四角形）またはペプチド構築物（黒色スポット）に対する抗体の結合を表す。下側の拡大されたスクエアにおいて、第１のスポット（左端）は、対照ペプチド構築物に対する抗体の結合を示し、右隣のスポットは、下側の拡大されたスクエアにおけるｈＦＳＨのＣｙｓ６６〜７８と結合したペプチドｎｏ．１（ｈＦＳＨの１〜１２Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ））を含有するペプチド構築物との結合を表し、さらに１スポット右は、ｈＦＳＨのＣｙｓ６６〜７８を有するペプチド構築物ｈＦＳＨのＣｙｓ（ＳｔＢｕ）２〜１３に対する抗体の結合を示し、以下同様である。白色スポットは、スクエア内のペプチドに対する抗体の結合と比較してペプチド構築物に対する抗体の結合が少ないことを表す。視覚可能なスポットは、スクエア内のペプチドの結合と比較して、ペプチド構築物に対する抗体の結合が等しいことを表さなかった。
【図１】
2004537032.tif 000004
【図２】
2004537032.tif 000005
【図３】
2004537032.tif 000006
【図４ａ】
2004537032.tif 000007
【図４ｂ】
2004537032.tif 000008
【図４ｃ】
2004537032.tif 000009
【図４ｄ】
2004537032.tif 000010
【図５ａ】
2004537032.tif 000011
【図５ｂ】
2004537032.tif 000012
【図５ｃ】
2004537032.tif 000013
【図６Ａ】
2004537032.tif 000014
【図６Ｄ】
2004537032.tif 000015
【図７Ａ】
2004537032.tif 000016
【図８】
2004537032.tif 000017
【国際公開パンフレット】
2004537032.tif 000018
2004537032.tif 000019
2004537032.tif 000020
2004537032.tif 000021
2004537032.tif 000022
2004537032.tif 000023
2004537032.tif 000024
2004537032.tif 000025
2004537032.tif 000026
2004537032.tif 000027
2004537032.tif 000028
2004537032.tif 000029
2004537032.tif 000030
2004537032.tif 000031
2004537032.tif 000032
2004537032.tif 000033
2004537032.tif 000034
2004537032.tif 000035
2004537032.tif 000036
2004537032.tif 000037
2004537032.tif 000038
2004537032.tif 000039
2004537032.tif 000040
2004537032.tif 000041
2004537032.tif 000042
2004537032.tif 000043
2004537032.tif 000044
2004537032.tif 000045
2004537032.tif 000046
2004537032.tif 000047
2004537032.tif 000048
2004537032.tif 000049
2004537032.tif 000050
2004537032.tif 000051
2004537032.tif 000052
2004537032.tif 000053
2004537032.tif 000054
2004537032.tif 000055
2004537032.tif 000056
2004537032.tif 000057
2004537032.tif 000058
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004537032.tif 000059
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004537032.tif 000060
【国際調査報告】
2004537032.tif 000061
2004537032.tif 000062
2004537032.tif 000063
2004537032.tif 000064
2004537032.tif 000065
2004537032.tif 000066