(57)【要約】哺乳類において腎機能を改良するか、又は腎細管上皮細胞又は上皮細胞前駆体の増殖性又は生存性を増強するための材料及び方法が開示される。前記方法は、医薬的に許容できる供給ビークル共に、治療有効量のｚｖｅｇｆ４タンパク質又はｚｖｅｇｆ４タンパク質−コードのポリヌクレオチドを含んで成る組成物を、哺乳類に投与することを含んで成る。ｚｖｅｇｆ４タンパク質は、例えば２種のポリペプチド鎖のジスルフィド−結合されたダイマーを含み、それぞれは配列番号２の残基２５８−３７０を含んで成る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類における腎機能の改良方法であって、医薬的に許容できる供給ビークル共に、治療有効量のｚｖｅｇｆ４タンパク質又はｚｖｅｇｆ４タンパク質−コードのポリヌクレオチドを含んで成る組成物を、前記哺乳類に投与することを含んで成る方法。
【請求項２】
ｚｖｅｇｆ４タンパク質が、前記哺乳類に投与される請求項１記載の方法。
【請求項３】
ｚｖｅｒｇｆ４タンパク質−コードのポリヌクレオチドが、前記哺乳類に投与される請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ｚｖｅｇｆ４タンパク質が２種のポリペプチド鎖のジスルフィド−結合されたダイマーであり、前記鎖の個々が配列番号２の残基２５８−３７０を含んで成る請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記ｚｖｅｇｆ４タンパク質が２種のポリペプチド鎖のジスルフィド−結合されたダイマーであり、前記鎖の個々が配列番号２の残基２５０−３７０を含んで成る請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記ｚｖｅｇｆ４タンパク質が２種のポリペプチド鎖のジスルフィド−結合されたダイマーであり、前記鎖の個々が配列番号２の残基２４６−３７０を含んで成る請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記ｚｖｅｇｆ４タンパク質が２種のポリペプチド鎖のジスルフィド−結合されたダイマーであり、前記鎖の個々が配列番号２の残基ｘ−ｙから成り、
ここでｘが、１６， １７， １８， １９， ２０， ２１， ２２， ２４， ２５， ３５， ５２， １７５， １７６， １７７， １７８， １７９， １８０， １８１， １８２， １８３， １８４， １８５， ２４６， ２５０， ２５３， ２５４， ２５５， ２５６， ２５７， ２５８， ２５９， ２６０， ２６１， ２６２及び２６３から成る群から選択され；そして
ｙが、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、及び３７０から成る群から選択される請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳類が、急性尿細管壊死を有する請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
哺乳類における腎細管上皮細胞又は上皮細胞前駆体の増殖性又は生存性を増強するための方法であって、医薬的に許容できる供給ビークル共に、治療有効量のｚｖｅｇｆ４タンパク質又はｚｖｅｇｆ４タンパク質−コードのポリヌクレオチドを含んで成る組成物を、前記哺乳類に投与することを含んで成る方法。
【請求項１０】
ｚｖｅｇｆ４タンパク質が、前記哺乳類に投与される請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ｚｖｅｒｇｆ４タンパク質−コードのポリヌクレオチドが、前記哺乳類に投与される請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記ｚｖｅｇｆ４タンパク質が２種のポリペプチド鎖のジスルフィド−結合されたダイマーであり、前記鎖の個々が配列番号２の残基２５８−３７０を含んで成る請求項９〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記ｚｖｅｇｆ４タンパク質が２種のポリペプチド鎖のジスルフィド−結合されたダイマーであり、前記鎖の個々が配列番号２の残基２５０−３７０を含んで成る請求項９〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
前記ｚｖｅｇｆ４タンパク質が２種のポリペプチド鎖のジスルフィド−結合されたダイマーであり、前記鎖の個々が配列番号２の残基２４６−３７０を含んで成る請求項９〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記ｚｖｅｇｆ４タンパク質が２種のポリペプチド鎖のジスルフィド−結合されたダイマーであり、前記鎖の個々が配列番号２の残基ｘ−ｙから成り、
ここでｘが、１６， １７， １８， １９， ２０， ２１， ２２， ２４， ２５， ３５， ５２， １７５， １７６， １７７， １７８， １７９， １８０， １８１， １８２， １８３， １８４， １８５， ２４６， ２５０， ２５３， ２５４， ２５５， ２５６， ２５７， ２５８， ２５９， ２６０， ２６１， ２６２及び２６３から成る群から選択され；そして
ｙが、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、及び３７０から成る群から選択される請求項９〜１１のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景：
腎不全は、外傷、ショック、中毒、急性膵炎、敗血症、一定の薬剤への慢性暴露、被毒、及び他の原因の合併症とそて生じることができる。急性尿細管壊死（ＡＴＮ）、すなわち急性腎不全の最も共通する原因は通常、末梢器官への不適切な血流の期間の後に通常生じる。無酸素症又は中毒は、尿細管上皮細胞の死及び急性腎不全への進行を導く。フェナセチン、アスピリン及びアセトミノフェンの組合せへの長期の暴露に起因する慢性鎮痛薬性腎炎はまた、尿細管上皮細胞の壊死のためであることができる。Ｒｏｂｂｉｎｓなど．， Ｂａｓｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗ．Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， １９８１， ４２１−４５６を参照のこと。
【０００２】
虚血症−及び腎毒素−誘発された腎損傷は、急性腎不全の主要原因であり、そして腎尿細管上皮細胞、主に近位尿細管への構造的及び機能的損傷により特徴づけられる（Ｏｌｉｖｅｒなど．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ３０： １３０７−１４３９， １９５１）。近位尿細管上皮への損傷は、複雑な再生工程により修復される。細胞剥離の後、脱分化された近位尿細管細胞が増殖し、そして新しい上皮を確立するために基底膜の露出された領域中に移動する（Ｗａｌｌｉｎなど．， Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ． ６６： ４７４−４８４， １９９２）。多くの観点においては、この腎形成修復工程は、胚間葉が尿細管上皮に転換する場合、ネフロンの発生の後期段階に類似する（Ｗａｌｌｉｎなど．， 前記；Ｈａｍｍｅｒｍａｎｎなど．， Ａ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２６２： Ｆ５２３−５３２， １９９２）。
【０００３】
機能的尿細管上皮は２週間で再生され得るが、ＡＴＮの臨床学的経路は多くの患者において延長され、そして処理は支持的医療、例えば透析から成る。適切な処理なしでは、ＡＴＮは死をもたらす。
腎尿細管上皮細胞のインビボでの増殖を刺激し、そしてそれにより腎機能を刺激するための組成物及び方法についての必要性が当業界において存続する。
【０００４】
発明の記載：
本発明は、哺乳類において腎機能を改良するか、又は腎尿細管上皮細胞又は上皮細胞前駆体の増殖性又は生存生を増強するための材料及び方法を提供する。
本発明の１つの観点においては、医薬的に許容できる供給ビークル共に、治療有効量のｚｖｅｇｆ４タンパク質又はｚｖｅｇｆ４タンパク質−コードのポリヌクレオチドを含んで成る組成物を、その必要な哺乳類に投与することを含んで成る、哺乳類における腎機能の改良方法が提供される。
【０００５】
本発明の第２の観点においては、医薬的に許容できる供給ビークル共に、治療有効量のｚｖｅｇｆ４タンパク質又はｚｖｅｇｆ４タンパク質−コードのポリヌクレオチドを含んで成る組成物を、哺乳類に投与することを含んで成る、哺乳類における腎細管上皮細胞又は上皮細胞前駆体の増殖性又は生存性を増強するための方法が提供される。
【０００６】
上記に開示される方法のある態様においては、ｚｖｅｇｆ４タンパク質は、前記哺乳類に投与される。選択された態様においては、前記ｚｖｅｇｆ４タンパク質が２種のポリペプチド鎖のジスルフィド−結合されたダイマーであり、前記鎖の個々が配列番号２の残基２５８−３７０、配列番号２の残基２５０−３７０又は配列番号２の残基２４６−３７０を含んで成る。他の態様においては、前記ｚｖｅｇｆ４タンパク質が２種のポリペプチド鎖のジスルフィド−結合されたダイマーであり、前記鎖の個々が配列番号２の残基Ｘ−３７０から成り、個々でＸは２４６−２５８の整数であり、そして前記タンパク質が任意には、グリコシル化されている。
【０００７】
上記に開示される方法のある態様においては、ｚｖｅｒｇｆ４タンパク質−コードのポリヌクレオチドは、前記哺乳類に投与される。選択された態様においては、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２の残基２５８−３７０、配列番号２の残基１９−３７０又は配列番号２の残基１−３７０を含んで成る。
【０００８】
本発明の他の態様においては、前記ｚｖｅｇｆ４タンパク質は２種のポリペプチド鎖のジスルフィド−結合されたダイマーであり、前記鎖の個々が配列番号２の残基ｘ−ｙから成り、ここで前記タンパク質は任意には、グリコシル化されており、そしてｘが、１６， １７， １８， １９， ２０， ２１， ２２， ２４， ２５， ３５， ５２， １７５， １７６， １７７， １７８， １７９， １８０， １８１， １８２， １８３， １８４， １８５， ２４６， ２５０， ２５３， ２５４， ２５５， ２５６， ２５７， ２５８， ２５９， ２６０， ２６１， ２６２及び２６３から成る群から選択され；そしてｙが、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、及び３７０から成る群から選択される。
上記に開示される方法の他の態様においては、哺乳類は、急性尿細管壊死を有する。
【０００９】
図式は、配列番号２に示されるアミノ酸配列のＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ親水性プロフィールである。このプロフィールは、スライドする６−残基窓に基づかれている。隠されたＧ、Ｓ及びＴ残基及び暴露されたＨ， Ｙ及びＷ残基は無視された。それらの残基は、小文字により図式に示される。
【００１０】
“保存性アミノ酸置換”はＨｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： １０９１５−１０９１９， １９９２のＢＬＯＳＵＭ６２評点マトリックス、すなわち関連するタンパク質の５００以上のグループの高く保存された領域を表す、タンパク質配列セグメントの約２，０００の局部の複数整列に由来するアミノ酸置換マトリックスにより定義される。本明細書において使用される場合、用語“保存性アミノ酸置換”とは、−１よりも大きなＢＬＯＳＵＭ６２値により表される置換を言及する。例えば、アミノ酸置換は、その置換が０，１，２又は３のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴づけられる場合、保存性である。好ましい保存性アミノ酸置換は、少なくとも１（例えば、１，２又は３）のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴づけられ、ところがより好ましくは保存性置換は、少なくとも２（例えば、２又は３）のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴づけられる。
【００１１】
“ポリペプチド”は、天然において生成されても又は合成的に生成されてもいずれにせよ、ペプチド結合により連結されるアミノ酸残基のポリマーである。約  １０個以下のアミノ酸残基のポリペプチドが、通常“ポリペプチド”として言及される。
【００１２】
用語“タンパク質”は、１又は複数のポリペプチド鎖を含んで成る高分子である。タンパク質はまた、非ペプチド成分、例えば炭水化物基を含むことができる。炭水化物及び他の非ペプチド置換基は、タンパク質が生成される細胞により付加され、そして細胞型により変化するであろう。タンパク質は、それらのアミノ酸主鎖により本明細書において定義され；置換基、例えば炭水化物基は一般的に、特定されないが、しかしそれにもかかわらず、存在することができる。従って、例えば１５〜１５００個のアミノ酸残基“から成る”タンパク質はさらに、１又は複数の炭水化物鎖を含むことができる。
【００１３】
用語“処理する”及び“処理”とは、病理学的状態を好ましく変更し、例えばその症状を緩解する治療及び予防介在性を示すために広く使用される。処理は、疾病の進行を減速するか又は逆転させ、疾病の重症度を低め、疾病を妨げ、又は治療する手順を包含する。
【００１４】
用語“ｚｖｅｇｆ４タンパク質”とは、ｚｖｅｇｆ４ポリペプチドの成長因子ドメイン（例えば、ヒトｚｖｅｇｆ４ （配列番号２）又はマウスｚｖｅｇｆ４（配列番号４）の残基２５８−３７０）を含んで成るタンパク質を示すために、本明細書において使用され、ここで前記タンパク質又はそのタンパク質分解的に活性化された形は、細胞表面ＰＤＧＦ α−及び／又はβ−受容体サブユニットを発現する細胞のためのマイトジェンである。ｚｖｅｇｆ４は、ＰＤＧＦ受容体のαα、αβ及びββイソフォームを活性化することが見出されている。ｚｖｅｇｆ４タンパク質は、下記に開示されるようなホモダイマー及びヘテロダイマーを包含する。当業界において知られている方法を用いて、ｚｖｅｇｆ４タンパク質は、初期メチオニン残基を伴なって又は伴なわないで、グリコシル化されているか又はグリコシル化されていない、ペルギレート化されているか又はペルギレート化されていない種々の形で、及び下記により詳細に開示されるような融合タンパク質として調製され得る。
【００１５】
“ｚｖｅｇｆ４タンパク質コードのポリヌクレオチド”とは、上記で定義されるようなダイマーｚｖｅｇｆ４タンパク質を生成するために後−翻訳プロセッシングされるｚｖｅｇｆ４ポリペプチドを、宿主細胞による発現に基づいて、コードするポリヌクレオチドである。後−翻訳プロセッシング現象は、ジスルフィド結合形成、タンパク質加水分解（分泌ペプチド除去を包含する）及び炭水化物付加を包含するが、但しそれらだけには限定されない。当業者は、ｚｖｅｇｆ４タンパク質コードのポリヌクレオチドの一次翻訳生成物は通常、最終タンパク質とは構造的に異なるであろうことを認識するであろう。さらに、ｚｖｅｇｆ４タンパク質コードのポリヌクレオチドは、操作可能的に連結された転写プロモーター、ターミネーター、及び宿主細胞内でのポリヌクレオチドの発現及び／又は維持を提供するか、又は宿主細胞中に供給する他の遺伝的要素を包含することができる。
【００１６】
本発明は、ｚｖｅｇｆ４を用いて、患者における腎機能を改良するための方法を提供する。ｚｖｅｇｆ４は、血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ）及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に構造的に関連するタンパク質である。このタンパク質はまた、“ＰＤＧＦ−Ｄ”（ＷＩＰＯ公開ＷＯ ００／２７８７９号）としても言及される。ｚｖｅｇｆ４は、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーの成長因子に対して有意な相同性を有する多−ドメインタンパク質である。
【００１７】
ｚｖｅｇｆ４配列、及び他の成長因子に対するその相同性に基づいての構造的予測は、ポリペプチドが細胞増殖、移動、分化又は代謝を調節することによって、組織に対して作用するホモマルチマー又はヘテロマルチマーを形成することができることを示す。実験証拠がそれらの予測を支持する。Ｚｖｅｇｆ４ヘテロマルチマーは、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーのタンパク質、例えばＶＥＧＦ， ＶＥＧＦ−Ｂ， ＶＥＧＦ−Ｃ， ＶＥＧＦ−Ｄ， ｚｖｅｇｆ３／ＰＤＧＦ−Ｃ（ＷＯ ００／３４４７４号）， ＰＩＧＦ （Ｍａｇｌｉｏｎｅなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８： ９２６７−９２７１， １９９１）， ＰＤＧＦ−Ａ （Ｍｕｒｒａｙなど．， アメリカ特許第４，８９９，９１９号；Ｈｅｌｄｉｎなど．， アメリカ特許第５，２１９，７５９号）、又はＰＤＧＦ−Ｂ （Ｃｈｉｕなど．， Ｃｅｌｌ３７： １２３−１２９， １９８４； Ｊｏｈｎｓｓｏｎなど．， ＥＭＢＯ Ｊ． ３： ９２１−９２８， １９８４） のもう１つのメンバーからのポリペプチドを含んで成る。
【００１８】
ｚｖｅｇｆ４ポリペプチド鎖は、成長因子ドメイン及びＣＵＢドメインを含んで成る。成長因子ドメインは、システイン残基、及びＰＤＧＦファミリーの“システインノット（ｃｙｓｔｅｉｎ ｋｎｏｔ）”構造の特徴を有するβ鎖の配置により特徴づけられる。ＣＵＢドメインは、ニューロピリン（Ｔａｋａｇｉなど．， Ｎｅｕｒｏｎ ７： ２９５−３０７， １９９１； Ｓｏｋｅｒなど．， Ｃｅｌｌ ９２： ７３５−７４５， １９９８）、ヒト骨形態発生プロテイン−１（Ｗｏｚｎｅｙなど．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３： １５２８−１５３４， １９８８）、ブタ精子血漿タンパク質及びウシ酸性精子流体タンパク質（Ｒｏｍｅｒｏなど．， Ｎａｔ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏ． ４： ７８３−７８８， １９９７）、及びアフリカツメガエルトロイド−様（ｔｏｌｌｏｉｄ−ｌｉｋｅ）タンパク質（Ｌｉｎなど．， Ｄｅｖ． Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ． ３９： ４３−５１， １９９７）におけるＣＵＢドメインに対して配列相同性を示す。
【００１９】
代表的なヒトｚｖｅｇｆ４ポリペプチド配列は、配列番号２で示され、そして代表的なマウスｚｖｅｇｆ４ポリペプチド配列は、配列番号４で示される。それらのポリペプチドをコードするＤＮＡは、それぞれ配列１及び３で示される。配列番号２で示されるアミノ酸配列の分析は、残基１〜１８が分泌ペプチドを形成することを示す。ＣＵＢドメインは、残基５２から残基１７９に及ぶ。プロペプチド−様配列は、残基１８０から、残基２４５、残基２４９又は残基２５７のいずれかに及び、そしてそのカルボキシル末端で４個の可能性ある分解部位、残基２４５及び２４９で一塩基性部位、残基２４５−２５５で二塩基性部位、及び残基２５４−２５７でフリン又はフリン−様プロテアーゼのための標的部位を包含する。
【００２０】
バキュロウィルス発現システムにおいて生成されるタンパク質は、残基２４９と２５０との間での切断、及び残基１９及び３５でのアミノ末端を有する長い種を示した。成長因子ドメインは、残基２５８から残基３７０及び、そしてＮ−末端での追加の残基（例えば、残基２５０〜２５７又は残基２４６〜２５７）を包含することができる。当業者は、ドメイン境界がいくぶん不明確であり、そして特定された位置から±５個までの残基、異なることが予測され得ることを認識するであろう。マウス及び他の非ヒトｚｖｅｇｆ４における対応するドメインは、配列一列整列から当業者により決定され得る。プラスミンによる十分な長さのヒトｚｖｅｇｆ４の分解は、ｚｖｅｇｆ４ポリペプチドの活性化をもたらした。ウェスターン分析によれば、成長因子ドメインとおよそ同じサイズで移動するバンドが観察された。
【００２１】
シグナルペプチド分解は、残基１８（±３個の残基）の後、ヒトｚｖｅｇｆ４において存在することが予測される。ヒト及びマウスｚｖｅｇｆ配列の比較に基づいて、他のシグナルペプチド分解部位が、残基２３及び／又は２４の後に予測される。この分析は、ｚｖｅｆｇ４ポリペプチド鎖が多くのモノマー種を生成するために分解され得ることを示し、それらのいくつかは表１に示される。ある宿主細胞においては、Ｌｙｓ−２５５の後の分解は、残基２５４−２５５の続く除去をもたらすことが予測されるが、但し、残基２５５でのカルボキシル末端を有するポリペプチドがまた調製され得る。Ｌｙｓ−２５７の後での分解は、残基２５７の続く除去をもたらすことが予測される。実際の分解パターンは、宿主細胞間で変化することが予測される。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
従って、ｚｖｅｇｆ４は、上記に開示されるようにｚｖｅｇｆ４ポリペプチドを含んで成る種々のマルチマー形で調製され得る。それらのｚｖｅｇｆ４ポリペプチドは、ｚｖｅｇｆ４１９−３７０， ｚｖｅｇｆ４５２−３７０， ｚｖｅｇｆ４２４６−３７０， ｚｖｅｇｆ４２５０−３７０及びｚｖｅｇｆ４２５８−３７０を包含する。それらのポリペプチドの変異体及び誘導体はまた、本明細書に開示されるようにして調製され得る。
【００２４】
培養された哺乳類細胞におけるｚｖｅｇｆ４ポリヌクレオチドの発現は、タンパク質加水分解的にプロセッシングされ得るジスルフィド−結合されたダイマータンパク質の生成をもたらす。有糸分裂的に活性的なタンパク質は、ＣＵＢ及びドメイン間領域を除去するために、タンパク質加水分解プロセッシングに基づいて生成される。活性成長因子ドメインダイマーは、切断されたポリヌクレオチドを発現することによって直接的に生成され得る。
【００２５】
ｚｖｅｇｆ４タンパク質は、アミノ又はカルボキシル−末端延長、例えばアミノ−末端メチオニン残基、親和性標識又は標的化ポリペプチドを含んでなる融合タンパク質として調製され得る。例えば、ｚｖｅｇｆ４タンパク質は、精製を促進するために、親和性標識との融合体として調製され得る。主に、抗体又は、他の特異的結合剤が利用できるいずれかのペプチド又はタンパク質が親和性標識として使用され得る。親和性標識は、ポリ−ヒスチジン系、すなわちプロテインＡ （Ｎｉｌｓｓｏｎ など．，  ＥＭＢＯ Ｊ． ４： １０７５， １９８５； Ｎｉｌｓｓｏｎ など．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９８： ３， １９９１）， グルタチオンＳ  トランスフェラーゼ（Ｓｍｉｔｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｇｅｎｅ ６７； ３１， １９８８）， Ｇｌｕ−Ｇｌｕ親和性標識 （Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒなど．，  Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２： ７９５２−４， １９８５）， 物質Ｐ、すなわちＦｌａｇＴＭ ペプチド（Ｈｏｐｐなど．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： １２０４−１２１０， １９８８）、ストレプタビジン結合ペプチド、マルトース結合タンパク質（Ｇｕａｎなど．，Ｇｅｎｅ６７：２１−３０，１９８７）、セルロース結合タンパク質、チオレドキシン、ユビキチン、Ｔ７ポリメラーゼ、又は他の抗原性エピトープ又は結合ドメインを包含する。
【００２６】
例えばマルトース結合タンパク質又はグルタチオンＳトランスフェラーゼへのｚｖｅｇｆ４の融合は、細菌発現システムにおける収率を改良するために使用され得る。それらの場合、融合タンパク質の非−ｚｖｅｇｆ４部分が通常、使用の前、除去されるであろう。融合タンパク質のｚｖｅｇｆ４及び非−ｚｖｅｇｆ４部分の分離は、それらの２種の部分間に特定の分解部位を提供することによって促進される。そのような方法は、当業界において良く知られている。ｚｖｅｇｆ４はまた、標的化ペプチド、例えば抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、その抗原−結合フラグメント、例えばＦ（ａｂ’）２及びフラグメント、一本鎖抗体及び同様のもの）、又は標的組織に結合する他のペプチド成分に融合され得る。
【００２７】
変動は、ｚｖｅｇｆ４タンパク質の生物学的活性変異体を供給するために、配列番号２及び４で示されるｚｖｅｇｆ４アミノ酸配列において行われ得る。そのような変動は、アミノ酸置換、欠失及び挿入を包含する。一般的に、保存性アミノ酸置換が好ましい。理論により結びつけられることは所望されないが、ヒトｚｖｅｇｆ４（配列番号２）の残基２７３−２９５及び３０７−３１７内の残基はリガンド−受容体相互作用に包含され得ると思われる。ｚｖｅｇｆ４タンパク質における特定の位置でのアミノ酸配列変化の効果は、当業界において知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−調査突然変異誘発を用いて評価され得る（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４， １０８１−１０８５， １９８９；Ｂａｓｓなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８８： ４４９８−４５０２， １９９１）。
【００２８】
複数のアミノ酸置換が行われ、そして突然変異誘発及びスクリ−ニングの既知方法、例えばＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ （Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１： ５３−５７， １９８８） 又はＢｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ （Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ２１５２−２１５６， １９８９） により開示されるそれらの方法を用いて試験され得る。使用され得る他の方法は、ファージ表示（例えば、Ｌｏｗｍａｎなど．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３０： １０８３２−１０８３７， １９９１； Ｌａｄｎｅｒなど．， アメリカ特許第５，２２３， ４０９号；Ｈｕｓｅ， ＷＩＰＯ公開ＷＯ９２／０６２０４号）、領域−指図された突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅなど．， Ｇｅｎｅ ４６： １４５， １９８６； Ｎｅｒなど．， ＤＮＡ ７： １２７， １９８８）、及びＳｔｅｍｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ ３７０： ３８９−３９１， １９９４）及びＳｔｅｍｍｅｒ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： １０７４７−１０７５１， １９９４）により開示されるようなＤＮＡシャフリングを包含する。
【００２９】
得られる変異体分子は、受容体結合、マイトジエン活性又は他の性質（例えば、成長因子生成の刺激）について、それらの機能に対して決定的であるアミノ酸残基の同定するために試験される。突然変異誘発は、ｚｖｅｇｆ４変異体ポリペプチドの生物学的活性を検出するために、高体積又は高処理量スクリーニング方法と組み合わされ得る。
【００３０】
ｚｖｅｇｆ４変異体は、当業界において良く知られている種々の方法、例えば受容体競争アッセイ（Ｂｏｗｅｕ−Ｐｏｐｅ ａｎｄ Ｒｏｓｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １０９： ６９−１００， １９８５）により、及び可溶性受容体、例えばＩｇＧ融合タンパク質として生成される受容体（アメリカ特許第５，７５０，３７５号）の使用を通して、受容体結合活性について分析され得る。受容体結合アッセイは、評価のための既知細胞−表面受容体を含む細胞系に対して行われ得る。受容体は、細胞において天然に存在することができ、又は遺伝子工学的に構築された細胞により発現される組換え受容体であり得る。
【００３１】
ｚｖｅｇｆ４変異体の活性は、培養された細胞を用いて、インビトロで測定され得る。例えば、マイトジェン活性は、既知のアッセイ、例えば３Ｈ−チミジン組み込みアッセイ（例えば、Ｒａｉｎｅｓ ａｎｄ Ｒｏｓｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １０９： ７４９−７７３， １９８５及びＷａｈｌなど．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：５０１６−５０２５， １９８８により開示されるような）、色素組み込みアッセイ（例えば、Ｍｏｓｍａｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ６５： ５５−６３， １９８３及びＲａｚなど．、Ａｃｔａ Ｔｒｏｐ． ６８： １３９−１４７， １９９７により開示されるような）、又は細胞計数を用いて測定され得る。
【００３２】
適切な有糸分裂誘発アッセイは、（１）増殖細胞をさらに刺激するｚｖｅｇｆ４タンパク質の能力を調べるために、２０％集密性培養物中への、及び（２）接触−誘発された増殖阻害を克服するｚｖｅｇｆ４タンパク質の能力について調べるために４８時間、集密性で維持される静止細胞中への３Ｈ−チミジンの組み込みを測定する。適切な色素組み込みアッセイは、標的細胞中への色素Ａｌａｍａｒブルー（Ｒａｚなど．， 前記）の組み込みの測定を包含する。また、Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚなど．， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７０： ３９５−４０５， １９７６： Ｅｗｔｏｎ ａｎｄ Ｆｌｏｒｉｎｉ， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １０６： ５７７−５８３， １９８０； 及びＧｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ７３１１−７３１５， １９８９を参照のこと。活性はまた、標的細胞における代謝変化、例えば他のタンパク質の生成における変化（他の成長因子を包含する）を、免疫学的アッセイにより測定することによってアッセイされ得る。
【００３３】
ｚｖｅｇｆ４変異体の生物学的活性は、外因性タンパク質の投与又はｚｖｅｇｆ４変異体ポリヌクレオチドの発現により非ヒト動物において研究され得る。ウィルス供給システム（下記に開示される）が使用され得る。ｚｖｅｇｆ４変異体は、他のｚｖｅｇｆ４タンパク質と組合して、又は他の化合物は、例えば他の成長因子と組合して、個々に投与されるか又は発現され得る。試験動物は、臨床学的徴候、体重、血液細胞計数、臨床学的化学、組織病理学及び同様のもののようなパラメーターの変化についてモニターされる。
【００３４】
ｚｖｅｇｆ４タンパク質、例えば十分な長さのポリペプチド、変異体ポリペプチド、生物学的活性フラグメント及び融合タンパク質は、遺伝子工学的に構築された宿主細胞において、従来の技法に従って生成され得る。適切な宿主細胞は、外因性ＤＮＡにより形質転換されるか又はトランスフェクトされ得、そして培養物において増殖され得るそれらの細胞型であり、そして細菌、菌類細胞、及び培養された高等真核細胞（多細胞生物の培養された細胞を包含する）を包含する。クローン化されたＤＮＡ分子を操作し、そして外因性ＤＮＡを種々の宿主細胞中に導入するための技法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９， 及びＡｕｓｕｂｅｌなど．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， ＮＹ， １９９３により開示される。
【００３５】
一般的に、ｚｖｅｇｆ４ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、その発現のために必要とされる他の遺伝子要素、一般的に発現ベクター内の転写プロモーター及びターミネーターに操作可能的に連結される。ベクターはまた、通常、１又は複数の選択マーカー及び１又は複数の複数起点を含むが、但し当業者は、一定のシステム内で、選択マーカーが別のベクター上に供給され得、そして外因性ＤＮＡの複製が宿主細胞ゲノム中への組み込みにより提供され得ることを認識することであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター及び他の要素の選択は、当業者のレベル内の通常の企画のことである。多くのそのような要素は、文献に記載されており、そして市販されている。例えば、ＷＯ ００／３４４７４号を参照のこと。
【００３６】
典型的な発現システムは、次のものを包含する：酵母、例えばサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（例えば、アメリカ特許第５，５２７，６６８号を参照のこと）又はピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）（アメリカ特許第５，７１６，８０８号、第５，７３６， ３８３号、第５，８５４，０３９号及び第５，９５５，３４９号）； 哺乳類細胞、例えば子供ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １６３２又はＮｏ． ＣＲＬ１０３１４）、ＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ１６５１）、２９３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ１５７３； Ｇｒａｈａｍなど．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ３６： ５９−７２， １９７７）又はチャイニースハムスター卵巣細胞（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１， ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＣＬ６１又はＣＨＯ  ＤＧ４４，Ｃｈａｓｉｎなど．， Ｓｏｍ． Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ． １２： ５５５， １９８６）； バキュロウィルス（Ｌｕｃｋｏｗなど．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７： ４５６−４５７９， １９９３；キット形で入手できる（Ｂａｃ−ｔｏ−ＢａｃＴＭ キット；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ））；及び細菌細胞（例えば、Ｅ．コリ）。適切な細胞は、当業者において知られており、そして公的寄託機関、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡから入手できる。
【００３７】
ｚｖｅｇｆ４は天然に存在しないアミノ酸を含有することができる。天然に存在しないアミノ酸は、トランス−３−メチルプロリン、２，４−メタプロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−メチルグリシン、アロ−トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン、３，３−ジメチルプロリン、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、及び４−フルオロフェニルアラニンを包含する。
【００３８】
天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質中に導入するためのいくつかの方法が当業界において知られている。例えばナンセンス突然変異が化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを用いて抑制されるインビトロシステムが使用され得る。アミノ酸を合成し、そしてｔＲＮＡをアミノアシル化するための方法は、当業者において知られている。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写及び翻訳は、Ｅ．コリＳ３０抽出物及び市販の酵素及び他の試薬の含んで成る細胞フリーシステムにおいて実施される。タンパク質は、クロマトグラフィーにより精製される。例えば、Ｒｏｖｅｒｔｓｏｎなど．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１３：２７２２， １９９１； Ｅｌｌｍａｎ など．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０２： ３０１，１９９１； Ｃｈｕｎｇ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９： ８０６−０９， １９９３； 及びＣｈｕｎｇなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： １０１４５−４９， １９９３を参照のこと。
【００３９】
第２の方法においては、翻訳は、突然変異誘発されたｍＲＮＡ及び化学的にアミノアミル化されたサプレッサ−ｔＲＮＡのマイクロインジェクションによりアフリカツメガエル卵母細胞において行われる（ Ｔｕｒｃａｔｔｉ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： １９９１−９８， １９９６ ）。 第３の方法においては、Ｅ．コリ細胞が、置換される予定である天然のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の不在下で及び所望する天然に存在しないアミノ酸（例えば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン又は４−フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養される。
【００４０】
天然に存在しないアミノ酸は、その天然の相対物の代わりにタンパク質中に導入される。Ｋｏｉｄｅ など．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３３： ７４７０−４６， １９９４を参照のこと。天然に存在するアミノ酸残基は、インビトロ化学的に修飾により天然に存在しない種に転換され得る。化学的修飾は、置換の範囲をさらに拡張するために特定部位の突然変異誘発と組み合わされ得る（Ｗｙｎｎ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ２： ３９５−４０３， １９９３）。
【００４１】
ｚｖｅｇｆ４ポリペプチド又はそのフラグメントはまた、当業界において知られている方法、例えば排他的固相合成、部分固相法、フラグメント宿主又は従来の溶液合成に従っての化学合成により調製され得る。例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５： ２１４９， １９６３； Ｓｔｅｗａｒｔなど．， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ， １９８４； Ｂａｙｅｒ ａｎｄ Ｒａｐｐ． Ｃｈｅｍ． Ｐｅｐｔ． Ｐｒｏｔ． ３： ３， １９８６； 及びＡｔｈｅｒｔｏｎなど．， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９８９を参照のこと。
【００４２】
ｚｖｅｇｆ４タンパク質は、従来のタンパク質精製方法、典型的には、クロマトグラフィー技法の組合せにより精製される。一般的には、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒａｍａｔｏｇｒａｐｈｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｕｐｐｓａｌｅ， Ｓｗｅｄｅｎ， １９８８； 及びＳｃｏｐｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９４を参照のこと。ポリヒスチジン親和性標識（典型的には、約６個のヒスチジン残基）を含んで成るタンパク質は、ニッケルキレート樹脂上での親和性クロマトグラフィーによりより精製される。例えば、Ｈｏｕｃｈｕｌｉなど．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ． ６： １３２１−１３２５， １９８８を参照のこと。ｇｌｕ−ｇｌｕ標識を含んで成るタンパク質は、従来の方法に従って、免疫親和性クロマトグラフィーにより精製され得る。例えば、Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２： ７９５２−４， １９８５を参照のこと。マルトース結合タンパク質融合体は、当業界において知られている方法に従って、アミロースカラム上で精製される。
【００４３】
ｚｖｅｇｆ４は、ノザンブロット及びＰＣＲ分析により示されるように腎臓において高く発現される。下記例においてより詳細に示されるように、ｚｖｅｇｆ４をコードするアデノウィルスベクターの注入によるマウスにおけるｚｖｅｇｆ４の過剰−発現が、腎臓における尿細管上皮細胞増殖を誘発する。処理された動物における尿細管生成は、高められた好塩基球増加の尿細管上皮細胞の存在により特徴づけられた。それらの変化は、関連しないタンパク質を発現する対照アデノウィルスに暴露された動物においては観察されなかった。
【００４４】
それらの発現は、ｚｖｅｇｆ４タンパク質の上昇が、腎臓の糸球体及び血管疾患においてすべてのキープレイヤーである、糸球体間質（筋線維芽細胞のタイプ；Ｐｏｗｅｌｌなど．， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２７７ （Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ４６）： Ｃ１−Ｃ１９， １９９９を参照のこと）、上皮細胞、内皮細胞、平滑筋細胞及び介在性細胞の機能及び中でも、その相互作用を変性できることを示す。さらに、ｚｖｅｇｆ４は、インビトロで、それらの細胞の少なくともいくらかにおいて細胞増殖に影響を及ぼすことが見出された。実験はまた、ｚｖｅｇｆ４の活性が２種のＰＤＧＦ受容体サブユニットα及びβ（ＰＤＧＦ−αＲ及びＰＤＧＦ−βＲ）により介在されることを示している。
【００４５】
それらの受容体サブユニットはほとんどの腎細胞型において広く発現され、そしてそれらの発現は多くの腎臓病理学においてアップレギュレートされる（例えば、Ｉｉｄａなど．， Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８： ６５６０−６５６４， １９９１）。上記に要約され、そして本明細書においてより詳細に開示される実験は、ｚｖｅｇｆ４タンパク質が腎尿細管生存性、再生及び／又は機能に対して正の効果を有することを示す。それらの結果は、ｚｖｅｇｆ４が一定の形の腎不全、例えば急性尿細管壊死又は慢性鎮痛性腎炎を逆転することにおいて有用であることを示す。この場合、ｚｖｅｇｆ４タンパク質は、直接的に哺乳類に供給され得るか、又はｚｖｅｇｆ４タンパク質コードのポリヌクレオチドの哺乳類への供給に続いて、現場生成され得る。
【００４６】
理論にしばられることは望まないが、腎尿細管に対するｚｖｅｇｔ４の発生効果は上皮細胞及び／又は上皮細胞前駆体に対する直接的な又は間接的な効果のためである。“間接的効果”は、影響される細胞に対して直接的に作用する他の因子の生成の刺激を包含する。ｚｖｅｇｆ４は、細胞増殖を刺激し、細胞生存性を増強するか、又は上皮細胞又は上皮細胞前駆体に対してそれらの効果を発揮する他の因子の生成を刺激することができる。例えば、筋線維芽細胞は、上皮細胞の増殖、分化及び移動を刺激するサイトカイン及び成長因子を分泌し、そして器官形成及び創傷治癒において主要役割を演じることが知られている。例えば、Ｐｏｗｅｌｌなど．， 前記；Ｎａｋａｇａｗａなど．， Ａｍ． Ｊ． ｐａｔｈｏｌ． １５５： １６８９−１６９９， １９９９； 及びＭａｔｓｕｍｏｔｏ ａｎｄ Ｎａｋａｍｕｒａ， ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ． ５９： ２９２３−２０３８， ２００１を参照のこと。
【００４７】
ｚｖｅｇｆ４の成長因子ドメインは、分子の活性種であることが見出された。分子のＮ−末端部分を除去するためのタンパク質加水分解プロセッシングが、活性化のために必要とされる。本発明においては、ｚｖｅｇｆ４タンパク質は、単独で、活性成長因子ドメインとして、又はインビボでの活性化を必要とする前駆体として提供され得る。典型的な前駆体は、ｚｖｅｇｆ４１９−３７０及びｚｖｅｇｆ４３２−３７０を包含するが、但しそれらだけには限定されない。融合タンパク質及び他の生物学的活性ｚｖｅｇｆ４変異体がまた使用され得る。
【００４８】
医薬的使用に関しては、ｚｖｅｇｆ４タンパク質は従来の方法に従って配合される。医薬タンパク質についての従来の供給路が使用され得る。急性腎不全の患者の通常、静脈注入、カテーテル法又は透析を包含する処理を受けるので、タンパク質は存在する静脈内ライン、カテーテル又はシャントを通して投与され得る。他の投与路は、静脈、筋肉内及び皮下注射を包含する。一般的に、医薬製剤は、Ｚｃｙｔｏ２１ポリペプチドを、医薬的に許容できるビークル、例えば塩溶液、緩衝溶液、水中、５％デキストロース、又は同様のものと共に含むであろう。製剤はさらに、１又は複数の賦形剤、保存剤、溶解剤、緩衝剤、バイアル表面上のタンパク質損失を妨げるためのアルブミン、等を含むことができる。
【００４９】
配合方法は、当業界において良く知られており、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９ｔｈ ｅｄ．， １９９５に開示される。組成物の“治療的有効量”とは、疾病の進行において統計学的に有意な効果、例えば統計学的に有意な低下、又は器官機能における統計学的に有意な改良を生成する量である。急性腎不全の場合、器官機能の改良は、１又は複数の低められた尿毒症、高められたクレアチニン又はイヌリンクリアランス、電解質バランスの回復、及び高められた尿生成により示される。
【００５０】
ｚｖｅｇｆ４は通常、約１０〜１００μｇ／ｍｌの合計体積の濃度で使用されるが、但し１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度も使用され得る。正確な用量は、処理される症状の性質及び重症度、患者の特徴、等を考慮して、許容される標準に従って医者により決定され；用量の決定は当業者のレベル内である。急性腎不全は生命を脅かす状態であるので、多くの用量が使用され得る。治療用製剤は一般的に、有益な効果を達成するために必要とされる期間、通常数時間〜数週間にわたって投与されるであろう。投与は、処理の期間、連続的又は断続的である。静脈内投与は、１〜数時間の典型的な期間にわたって、ボーラス注射又は注入によってであろう。持効性製剤もまた使用され得る。
【００５１】
ｚｖｅｇｆ４治療は、他の剤、又は腎機能の回復に適切な臨床学的技法と組合され得る。例えば、ｚｖｅｇｆ４は、血管拡張薬と組合して、又は腎動脈における循環を回復するための血管形成と組合して投与され得る。
【００５２】
遺伝子治療は、患者にｚｖｅｇｆ４を供給するために使用され得る。腎臓におけるｚｖｅｇｆ４の発現を促進するためには、腎臓において高く発現される遺伝子（例えば、エリトロポイエチン遺伝子）からの転写プロモーターが使用され得る。治療用ポリヌクレオチドは、ウィルス供給システムにより、患者又は試験動物に供給されえる。このための典型的なウィルスは、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス、及びアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）を包含する。アデノウィルス、すなわち二本鎖ＤＮＡウィルスは現在、異種核酸の供給のための最も研究されている遺伝子トランスファーベクターである。
【００５３】
再考のためには、Ｔ． Ｃ． Ｂｅｃｋｅｒ など．， Ｍｅｔｈ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ． ４３： １６１−８９， １９９４； 及びＪ． Ｔ． Ｄｏｕｇｌａｓ ａｎｄ Ｄ．Ｔ． Ｃｕｒｉｅｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４： ４４−５３， １９９７ を参照のこと。アデノウィルスシステムは次のいくつかの利点を付与する：（ ｉ ）アデノウィルスは比較的大きなＤＮＡ挿入体を適応せしめることができ；（ ｉｉ ）高い力価に増殖され得；（ ｉｉｉ ）広範囲の哺乳類細胞型を感染せしめ；そして（ ｉｖ ）多数の異なったプロモーター、例えば偏在する、組織特異的、及び調節可能なプロモーターと共に使用され得る。また、アデノウィルスは血流において安定しているので、それらは静脈内注射により投与され得る。
【００５４】
アデノウィルスゲノムの一部を欠失することによって、異種ＤＮＡの大きな挿入体（７ｋｂまでの）が提供され得る。それらの挿入体は、直接的な結合により又は同時トランスフェクトされたプラスミドとの相同組換えにより、ウィルスＤＮＡ中に組み込まれ得る。損なわれていない動物に静脈内投与される場合、アデノウィルスは主に、肝臓を標的化する。アデノウィルス供給システムがＥ１遺伝子欠失を有する場合、ウィルスは宿主細胞において複製することができない。しかしながら、宿主の組織（例えば、肝臓）は、異種タンパク質を発現し、そしてプロセッシングするのであろう（そして、分泌シグナル配列が存在する場合、分泌する）。
【００５５】
遺伝子供給の他の方法は、身体から細胞を除去し、そして裸ＤＮＡプラスミドとして細胞中にベクターを導入することを含んで成る。次に、形質転換された細胞が身体に再−移植される。裸ＤＮＡベクターは、当業界において知られている方法、例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシュウム沈殿、遺伝子ガンの使用、又はＤＮＡトランスポーター使用により宿主細胞中に導入される。Ｗｕなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３： １４６２１−１４６２４， １９８８； Ｗｕなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７： ９６３−９６７， １９９２； 及びＪｏｈｎｓｔｏｎ ａｎｄ Ｔａｎｇ， Ｍｅｔｈ， Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４３： ３５３−３６５， １９９４を参照のこと。
本発明は次の非制限例によりさらに例示される。
【００５６】
実施例
例１：
ｚｖｅｇｆ４を、ＶＥＧＦファミリーに対するその相同性により、ヒト慢性骨髄性白血病細胞（Ｋ５６２）ライブラリーからクローンの配列から同定した。追加の配列を、下垂体ライブラリーからのクローンの長い配列読み取りから誘発した。ｚｖｅｇｆ４のアンチセンス発現配列標識（ＥＳＴ）（その５’パートナーが同定される）を見出した。この５’ＥＳＴ（ＥＳＴ４４８１８６；ＧｅｎＢａｎｋ）は、ｚｖｅｇｆ４のための５’未翻訳配列を含むように思えた。プライマーを、配列におけるギャップを閉じることによりＥＳＴ４４８１８６から企画した。
【００５７】
それぞれ２０ｐｍのオリゴヌクレオチドＺＣ２１，９８７（配列番号５）及びＺＣ２１，１２０（配列番号６）、及び１．９３μｇの甲状腺ライブラリーを、５％ＤＭＳＯ及び１／１０体重の市販の試薬（ＧＣ−ＭｅｌｔＴＭ； Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）と共にＰＣＲ反応に使用した。反応を次の通りに行った：９４℃で１分；次に、９４℃で２０秒（３０サイクル）；６７℃で１分；次に７２℃での最終５分間のインキュベーション。得られる８３３−ｂｐの生成物を配列決定し、そして開始ＭＥＴコドン、上流の停止コドン及び５’未翻訳配列を有するコード配列の残りを含むｚｖｅｇｆ４フラグメントであることが見出した。その構成配列は、１，１１０ｂｐの読み取り枠（配列番号１）を含んだ。
【００５８】
例２：
一部のマウスｚｖｅｇｆ４配列を、完全なコード配列を含む、１，２８９ｂｐのＥｃｏＲＩヒトｚｖｅｇｆ４制限消化フラグメントにより、マウスゲノムライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． から得られた）をプローブすることによって得た。プローブを、市販のキット（ＲｅｄｉｐｒｉｍｅＴＭ ＩＩ ランダム−プライムラベリングシステム；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ， Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて、３２Ｐによりラベルした。組み込まれなかった放射能を、市販のプッシュカラム（Ｎｕｃｔｒａｐ（商標）カラム；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ； アメリカ特許第５，３３６，４１２号を参照のこと）を用いて除去した。
【００５９】
２４個のフィルターリフトを、５分間、煮沸し、次に氷冷却した０．１ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液（ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂＴＭ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ； Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）において５０℃で一晩、プレハイブリダイズした。フィルターを、１．０×１０６ｃｐｍ／ｍｌのｚｖｅｇｆ４プローブ、０．１ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、及び５分間、煮沸され、次に氷冷却された０．５μｇ／ｍｌのマウスｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液（ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂＴＭ）において５０℃で一晩ハイブリダイズした。フィルターリフトを、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいて室温で２時間、洗浄し、次に温度を６０℃に１時間にわたって上昇した。−８０℃での一晩の暴露は、７種の推定上の一次ヒットを示した。
【００６０】
それらの主要ヒットの４個を、Ｅ．コリｋ８０２細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． から得られた）上にプレートした。フィルターリフトを調製し、そしてヒトｚｖｅｇｆ４プローブにより一晩ハイブリダイズした。試験された４個の推定上の一次ヒットのうち２個は陽性に近づいた。
【００６１】
ＤＮＡを、１つの陽性プラークから調製し、そしてＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩにより消化した。その消化物を、１％トリス−ボレート−ＥＤＴＡゲル上で試験し、そして２．０ｋｂのダブレット及び２．７ｋｂ／２．９ｋｂのバンドをゲルから切除し、そして従来の方法によりアガロースから切除した。２．０ｋｂの両フラグメントは、ヒトｚｖｅｇｆ４プローブに対して強くハイブリダイズすることが見出された。それらのフラグメントを配列決定し、そしてマウスｖｅｇｆ４ ＣＵＢドメインの一部を含むことを見出した。プライマーを、ＰＣＲ ｃＤＮＡスクリーンへの使用のために前記配列から企画した。
【００６２】
マウスｃＤＮＡのパネルを、プライマーＺＣ２６，３１７（配列番号７）及びＺＣ２６，３１８（配列番号８）によるＰＣＲによりスクリーンした。胚、唾液腺、新生児皮膚及び精巣は、予測される２００ｂｐのサイズの強い生成物を示した。
【００６３】
マウス精巣及び唾液腺ライブラリーを、プライマーＺＣ２６，３１７ （配列番号７）及びＺＣ２６，３１８ （配列番号８）を用いてＰＣＲによりスクリーンした。精巣ライブラリーは、５’末端で不完全であり、そして５’末端でイントロンを含むと思われる１つのクローン、すなわち“ｚｖｅｇｆ４ｍｐｚｐ７ｘ−６”を生成した。唾液腺ライブラリーは、クローンｚｖｅｇｆ４ｍｐｚｐ７ｘ−６に比較して、コードに２２５−ｂｐの欠失を有した１つのクローン、すなわち“ｚｖｅｇｆ４ｍｐｚｐ７ｘ−７”を生成した。ｚｖｅｇｆ４ｍｐｚｐ７ｘ−６及びｚｖｅｇｆ４ｍｐｚｐ７ｘ−７に由来する配列を組合し、十分な長さのマウスｚｖｅｇｆ４ポリヌクレオチド配列（配列番号３）及びマウスｚｖｅｇｆ４ポリペプチド配列（配列番号４）を生成した。
【００６４】
十分な長さのｃＤＮＡクローンを、前記２種のクローンからのフラグメントの二段階連結により生成した。ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ ３’フラグメントを、クローンｚｖｅｇｆ４ｍｐｚｐ７ｘ−６から調製した。５２８−ｂｐのフラグメントを、ゲル精製し、そしてＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化されたファゲミドベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ ＫＳ（＋）； Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に連結した。その得られる構成体３μｇを、１５単位のＥｃｏＲＩにより消化した。線状化されたプラスミドを精製し、そしてクローンｚｖｅｇｆ４ｍｐｚｐ７ｘ−７からの７５４−ｂｐの５’ＥｃｏＲＩフラグメントと連結した。
【００６５】
例３：
カルボキシル末端Ｇｌｕ−Ｇｌｕ親和性標識を有する組換えヒトｚｖｅｇｆ４を、従来の方法に従ってバキュロウィルス発現システムにおいて生成した。培養物を収穫し、そして細胞を、０．０２Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、１ｍＭのＥＤＴＡ， １ｍＭのＤＴＴ， １ｍＭの４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（Ｐｅｆａｂｌｏｃ（商標）ＳＣ； Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｂｅｉｍ）、０．５μＭのアプロチニン、４ｍＭのロイペプチン、４ｍＭのＥ−６７、１％ＮＰ−４０の溶液により、回転器上で４℃で１５分間、溶解した。その溶液を遠心分離し、そして上清液を回収した。２０ｍｌの抽出物を、５０μｌの緩衝液中、誘導体化されたアガロースビーズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）； Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．， Ｐｉｓｃａｔｏｗａｙ， ＮＪ） に接合された抗−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ抗体５０μｌと共に組合わした。
【００６６】
その混合物を、回転器上で４℃で一晩インキュベートした。ビーズを遠心分離により、回収し、そして４℃で３×１５分間、洗浄した。ペレットを、還元剤を含むサンプル緩衝液と共に組合し、そして９８℃で５分間、加熱した。タンパク質を、還元条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、続いて親和性標識に対する抗体を用いてＰＶＤＦ膜上にウェスターンブロットした。２種のバンドを検出し、１つはＭｒ＝約４９ｋＤで及び他の１つはＭｒ＝約２１ｋＤで存在した。配列分析は、２種の配列を含んで成る大きなバンドを示し、１つは配列番号２のＡｒｇ−１９で開始し、そして他は配列番号２のＡｓｎ−３５で開始する。アスパラギン残基は、アスパラギン酸へ脱アミド化されたように思えた。小さな方のバンドは、配列番号２のＳｅｒ−２のＳｅｒ−２５０で開始する。
【００６７】
例４：
組換えバキュロウィルス−感染された昆虫細胞から生成されたアミノ末端Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（ＥＹＭＰＭＥ；配列番号９）標識（ｚｖｅｇｆ４−ｎｅｅ−ＧＦＤ）を有する、組換えアミノ末端Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−標識されたｚｖｅｇｆ４成長因子ドメインを、ならし培地から、カチオン−交換クロマトグラフィー、抗体親和性クロマトグラフィー及びサイズ−排除クロマトグラフィーの組合せにより精製した。２８Ｌの培養物を収穫し、そして培養を０．４μｍのフィルターを用いて濾過した。濾過された培地（ｐＨ７．０、９ｍＳの導電率）を、２５ｍｌのカチオン交換カラム（Ｐｏｒｏｓ（商標）５０ＨＳ； ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ， ＭＡ）上に直接的に負荷した。
【００６８】
カラムを１０カラム体積（ｃｖ）のＰＢＳにより洗浄し、そして結合されたタンパク質を、ＰＢＳ中、２０−１００％の７５０ｍＭのＮａＣｌのグラジエント（緩衝液Ｂ）１５ｃｖ、続いて５ｃｖの１００％緩衝液Ｂにより５ｍｌ／分で溶出した。５ｍｌの画分を集めた。カラムからのサンプルを、ｚｖｅｇｆ４−ｎｅｅ−ＧＦＤの存在について、銀染色よるＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスターンブロットにより分析した。ｚｖｅｇｆ４−ｎｅｅ−ＧＦＤ−含有画分をプール、そして８ｍｌの抗−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ抗体カラム上に負荷し、そしてＰＢＳ中、０．５ｍｇ／ｍｌのＥＹＭＰＩＤ（配列番号１０）ペプチド（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｌａｎｇｈｏｍｅ， ＰＡから得られた）５０ｍｌにより溶出した。
【００６９】
１ｍｌの画分をプールし、そしてＢｉｏｍａｘＴＭ −５濃縮機（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）を用いて０．４ｍｌに濃縮し、そして１６×１０００ｍｍのゲル濾過カラム（ＳｅｐｈａｃｒｙｌＴＭ Ｓ−１００ＨＲ： Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）上に１．５ｍｌ／分で負荷した。精製されたｚｖｅｇｆ４−ｎｅｅ−ＧＦＤを含む画分５ｍｌをプールし、０．２μｍのフィルターを通して濾過し、１００μｌのアリコートを等分し、そして−８０℃で凍結した。精製された最終タンパク質の濃度をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｖｃｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）により、０．４ｍｇ／ｍｌであることを決定し、そして収量を８．４ｍｇであると計算した。
【００７０】
組換えｚｖｅｇｆ４−ｎｅｅ−ＧＦＤを、銀染色（ＦＡＳＴｓｉｌｖｅｒＴＭ， Ｇｅｎｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．， Ｍａｐｌｅｗｏｏｄ， ＭＯ）を用いてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕｐａｇｅＴＭ ４−１２％ゲル；Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）、及びペプチド標識に対する抗体を用いてのウェスターンブロットにより分析した。ならし培地又は精製されたタンパク質を、電気泳動ミニ−セル（Ｘｃｅｌｌ  ＩＩＴＭ ｍｉｎｉ−ｃｅｌｌ； Ｎｏｖｅｘ）を用いて電気泳動し、そしてその装置マニュアルに提供される指針に従って、ブロットモジュール（ＸＣｅｌｌ ＩＩＴＭ； Ｎｏｖｅｘ）を用いて、室温でニトロセルロース（０．２μｌ；Ｎｏｖｅｘ）に移した。
【００７１】
前記移行を、２５ｍＭのトリス塩基、２００ｍＭのグリシン及び２０％メタノールを含む緩衝液において５００ｍＡで１時間、行った。次に、フィルターを、ＰＢＳ中、１０％脱脂粉乳により室温で１０分間ブロックした。ニトロセルロースをすばやくすすぎ、次に、マウス抗−ペプチド一次抗体（２．５％脱脂粉乳を含むＰＢＳにおいて１：１０００に希釈された）を添加した。ブロットを、室温で２時間、又は４℃で一晩、軽く振盪しながらインキュベートした。
【００７２】
インキュベーションに続いて、ブロットを、ＰＢＳにそれぞれ１０分間、洗浄し、次に２．５％脱脂粉乳を含むＰＢＳにおいて１：１０００に希釈された二次抗体（ホースウディシュペルオキシダーゼに接合されたヤギ抗−マウスＩｇＧ）によりラベルし、そしてブロットを室温で２時間、振盪しながらインキュベートした。次に、ブロットを、ＰＢＳによりそれぞれ１０分間、３度洗浄し、次に水によりすばやくすすいだ。ブロットを、市販の化学ルミネセント基質試薬（１：１に混合されたＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）ＵＬＴＲＡ試薬；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． から得られた試薬）を用いて進行せしめ、そしてシグナルを、イメージ分析ソフトウェア（Ｌｕｍｉ−ＩｍａｇｅｒＴＭ  Ｌｕｍｉ Ａｎａｌｙｓｔ ３．０； Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、１０秒〜５分間、又は必要時間、捕獲した。
【００７３】
精製されたｚｖｅｆｇ４−ｎｅｅ−ＧＦＤは、非還元条件下で約３１及び１７ｋＤａでの銀−染色されたゲル上に２種のバンドとして、及び還元条件下で１７ｋＤａの単一バンドとして出現した。これは、非還元条件下でのｚｖｅｇｆ４−ｎｅｅ−ＧＦＤのダイマー形の存在を示した。精製されたタンパク質は、約９０％のダイマー及び１０％のモノマーから成った。
【００７４】
例５：
十分な長さのカルボキシル末端Ｇｌｕ−Ｇｌｕ標識されたｚｖｅｇｆ４（ｚｖｅｇｆ４−ｃｅｅ）を、組換えバキュロウィルス−感染された昆虫細胞から生成した。２Ｌの培養物を収穫し、そして培地を、０．２μｍのフィルターを用いて無菌濾過した。
タンパク質を、抗−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（抗−ＥＥ）ペプチド抗体親和性クロマトグラフィー及びＳ−２００ゲル排除からクロマトグラフィーの組合せによりならし培地から精製した。培養培地（ｐＨ６．０、７ｍＳの導電率）を、２０×８０ｍｍ（２５ｍｌの層体積）抗−ＥＥ抗体親和性カラム上に６ｍｌ／分の流速で直接的に負荷した。
【００７５】
カラムを１０カラム体積のＰＢＳにより洗浄し、次に結合されたタンパク質を、２カラム体積の０．４ｍｇ／ｍｌのＥＹＭＰＴＤペプチド（配列番号１０）（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ ＢｉｏＭｏｌｅｃｕｌｅｓ Ｃｏｒｐ．， Ｌａｎｇｈｏｍｅ， ＰＡ） により溶出した。５ｍｌの画分を集めた。抗−ＥＥ抗体親和性カラムからのサンプルを、ｚｖｅｇｆ４−ｃｅｅの存在について、銀染色を用いてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスターンブロット（抗−ｚｖｅｇｆ４ペプチド抗体及び抗−ＥＥ抗体、並びにＨＲＰ−接合されたヤギ抗−ウサギ二次抗体を用いて、実質的に上記に開示されているようにして）により分析した。
【００７６】
ｚｖｅｇｆ４−ｃｅｅ含有画分をプールし、そしてＢｉｏｍａｙＴＭ−５濃縮機（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．） を用いて、濾過により３．８ｍｌに濃縮し、そして１６×１０００ｍｍのゲル濾過カラム（ＳｅｐｈａｃｒｙｌＴＭ Ｓ−２００ＮＲ； Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）上に負荷した。精製されたｚｖｅｇｆ４−ｃｅｅを含む画分をプールし、０．２μｍのフィルターを用いて濾過し、それぞれ１００μｌに等分し、そして−８０℃で凍結した。精製された最終タンパク質の濃度を、比較アッセイ（ＢＣＡアッセイ試薬；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）及びＨＰＬＣ−アミノ酸分析により決定した。
【００７７】
精製されたｚｖｅｇｆ４−ｃｅｅは、銀染色に関して、非還元条件下で約８５ｋＤａでの単一のバンドとして、但し、還元条件下で約５０ｋＤａでのバンドとして出現し、このことは、非還元条件下でのｚｖｅｇｆ４−ｃｅｅのダイマー形を示す。
【００７８】
例６：
アデノウィルスベクターを調製するために、ｚｖｅｇｆ４の領域をコードするタンパク質を、それぞれ５’及び３’末端でＦｓｅＩ及びＡｓｃＩ制限部位を付加するプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲプライマーを次の通りにして、ＰＣＲ反応において十分な長さのｚｖｅｇｆ４ ｃＤＮＡを含む鋳型と共に使用する：９５℃で５分間のインキュベーション；続いて、９５℃で１分、５８℃で１分及び７２℃で１．５分（１５サイクル）；続いて７２℃で７分；続いて４℃でのソーキング。反応生成物を、ＴＡＥ緩衝液中、１．２％（低溶融）（ＳｅａＰｌａｑｕｅ ＧＴＧＴＭ； ＦＭＣ， Ｒｏｃｋｌａｎｄ， ＭＥ）ゲル上に負荷する。
【００７９】
ｚｖｅｇｆ４ ＰＣＲ生成物をゲルから切除し、そしてシリカゲル膜を含む回転カラム（ＱＩＡｑｕｉｃｋＴＭ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ； Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）を用いて、そのキットの説明書に従って精製する。次に、ｚｖｅｇｆ４生成物を消化し、フェノール／クロロホルム抽出し、ＥｔＯＨ沈殿し、そして２０ｍｌのＴＥ（トリス／ＥＤＴＡ， ｐＨ８）に再水和化する。次に、ｚｖｅｇｆ４フラグメントを、トランスジェニックベクターｐＴＧ１２−８のクローニング部位中に連結する。ベクターｐＴＧ１２−８は、ＮｒｕＩ部位中へのラットインスリンＩＩイントロン（約２００ｂｐ）及びポリリンカー（ＦｓｅＩ／ＰｍｅＩ／ＡｓｃＩ）の挿入により、ｐ２９９９Ｂ４（Ｐａｌｍｉｔｅｒなど．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １３： ５２６６−５２７５， １９９３）から誘導される。
【００８０】
前記ベクターは、マウスメタロチオネイン（ＭＴ−１）プロモーター（約７５０ｂｐ）及びヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）未翻訳領域、並びに１０ｋｂのＭＴ−１ ５’フランキング配列及び７ｋｂのＭＴ−１ ３’フランギング配列を両端に有するポリアデニル化シグナル（約６５０ｂｐ）を含んで成る。その構成体を用いて、エレクトロポレーションによりＥ．コリ宿主細胞（Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｘ ＤＨ１０ＢＴＭ 細胞；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を形質転換する。ｚｖｅｇｆ４ ＤＮＡを含むクローンを、制限分析により同定する。陽性クローンを直接的な配列決定により確かめる。
【００８１】
ｚｖｅｇｆ４ ｃＤＮＡを、ＦｓｅＩ及びＡｓｃＩ酵素を用いて、ｐＴＧ１２−８ベクターから開放する。ｃＤＮＡを１％低溶融アガロースゲル上で単離し、そして次に、ゲルから切除する。ゲルスライスを７０℃で溶融し、等体積のトリス−緩衝されたフェノールにより２度、抽出し、そしてＥｔＯＨ沈殿する。ＤＮＡを１０μｌの水に再懸濁する。
【００８２】
ｚｖｅｇｆ４ ｃＤＮＡを、修飾されたｐＡｄＴｒａｃｋ ＣＭＶ （Ｈｅなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５： ２５０９−２５１４， １９９８） のＦｓｅＩ−ＡｓｃＩ部位中にクローン化する。この構造体は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マーカー遺伝子を含む。ＧＦＰ発現を駆動するＣＭＶプロモーターを、ＳＶ４０プロモーターにより置換し、そしてＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを、ヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルにより置換した。さらに、生来のポリリンカーを、ＥｓｅＩ、ＥｃｏＲＶ及びＡｓｃＩ部位により置換した。ｐＡｄＴｒａｃｋＣＭＶのこの修飾された形は、ｐＺｙＴｒａｃｋと命名される。連結を、ＤＮＡ連結及びスクリーニングキット（Ｆａｓｔ−ＬｉｎｋＴＭ； Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用いて行う。プラスミドを線状化するために、約５μｇのｐＺｙＴｒａｃｋ ｚｖｅｇｆ４プラスミドを、ＰｍｅＩにより消化した。
【００８３】
約１μｇの線状化されたプラスミドを、スーパーコイルｐＡｄＥａｓｙ（Ｈｅなど．， 前記）２００ｎｇと共にＢＪ５１８３細胞中に同時形質転換した。この同時形質転換は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅパルサーを用いて、２．５ｋＶ，２００オーム及び２５μＦで行われる。完全な同時形質転換体を、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む、４個のＬＢプレート上にプレートする。最少コロニーを取り、そしてＬＢ／カナマイシンにおいて拡張し、そして組換えアデノウィルスＤＮＡを、標準のＤＮＡ ｍｉｎｉｐｒｅｐ方法により同定する。ＦｓｅＩ及びＡｓｃＩによる組換えアデノウィルスＤＮＡの消化は、ｚｖｅｇｆ４ ＤＮＡの存在を確かめる。ＤＮＡをＥ．コリＤＨ１０Ｂコンピテント細胞中に形質転換し、そしてＤＮＡをそれから調製する。
【００８４】
約５μｇの組換えアデノウィルスＤＮＡを、２０〜３０ＵのＰａｃＩを含む１００μｌの反応体積において、３７℃で３時間、ＰａｃＩ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により消化する。その消化されたＤＮＡを、等体積のフェノール／クロロホルムにより２度、抽出し、そしてエタノールにより沈殿する。ＤＮＡペレットを、１０μｌの蒸留水に再懸濁する。前日に接種され、そして６０〜７０％の集密性まで増殖された、Ｔ２５フラスコのＱＢＩ−２９３Ａ細胞（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｔｒｅａｌ， Ｃａｎａｄａ）を、ＰａｃＩ消化されたＤＮＡによりトランスフェクトする。ＰａｃＩ消化されたＤＮＡを、無菌ＨＢＳ（１５０ｍＭのＮａＣｌ， ２０ｍＭのＨＥＰＥＳ）により、５０μｌの合計体積まで希釈する。
【００８５】
別々の管において、２０μｌの１ｍｇ／ｍｌのＮ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ， Ｎ， Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ： Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を、ＨＢＳにより１００μｌの合計体積に希釈する。ＤＮＡをＤＯＴＡＰに添加し、ピペットを上下することにより軽く混合し、そして室温で１５分間、放置する。培地を２９３Ａ細胞から除去し、そして１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．１ｍｍのＭＥＭ非必要アミノ酸（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む血清フリーのＭＥＭ−α（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）５ｍｌにより洗浄する。
【００８６】
５ｍｌの血清フリーＭＥＭを添加し、そして細胞を３７℃で維持する。ＤＮＡ／脂質混合物を、フラスコに滴下し、軽く混合し、そして３７℃で４時間インキュベートする。４時間後、ＤＮＡ／脂質混合物を含む培地を吸引し、そして５％ウシ胎児血清を含む完全ＭＥＭ培地５ｍｌにより置換する。トランスフェクトされた細胞を、ＧＦＰ発現及び対象物（ウィルスプラーク）の形成についてモニターする。
【００８７】
組換えアデノウィルスＤＮＡによる２９３Ａ細胞のトランスフェクションの７日後、ＧＦＰを発現する細胞はウィルスプラークを形成し始める。粗ウィルス溶解物を、細胞スクレーパーにより集め、細胞を収集する。溶解物を、５０ｍｌの円錐形管に移す。細胞からほとんどのウィルス粒子を開放するために、３回の凍結／融解サイクルを、ドライアイス／エタノール浴及び３７℃の水浴において行う。
【００８８】
ほぼ集密性（８０〜９０％）の２９３Ａ細胞の１０ｃｍプレートを、感染の２０時間前に設定する。粗溶解物を増幅し（一次増幅）、ｚｖｅｇｆ４ ｒＡｄＶ溶解物の研究ストックを得る。２００ｍｌの祖ｒＡｄＶ溶解物を個々の１０ｃｍプレートに添加し、そしてプレートを４８〜７２時間モニターし、白色光顕微鏡下で細胞変性効果（ＣＰＥ）を、及び蛍光顕微鏡下でＧＦＰの発現を調べる。すべての細胞がＣＰＥを示す場合、この一次ストック溶解物を集め、そして凍結／融解サイクルを上記のようにして行う。
【００８９】
ｚｖｅｇｆ４ ｒＡｄＶの二次増幅を、８０〜９０％の集密性の２９３Ａ細胞の１２の１５ｃｍ組織培養皿から得る。すべての、但し２０ｍｌの５％ＭＥＭ培地を除去し、そして個々の皿を、３００〜５００ｍｌの一次増幅されたｒＡｄＶ溶解物により接種する。４８時間後、細胞をウィルス生成物から溶解し、その溶解物を２５０ｍｌのポリプロピレン遠心分離用ポトル中に集め、そしてｒＡｄＶを精製する。
【００９０】
ＮＰ−４０界面活性剤を、すべての細胞を溶解するために粗溶解物のボトルに添加し、０．５％の最終濃度にする。ボトルを、回転プラットフォーム上に１０分間、置き、そして可能なだけ早く撹拌する。残骸物を、２０，０００ＸＧで１５分間の遠心分離によりペレット化する。上清液を、２５０ｍｌのポリカーボネート遠心分離ボトルに移し、そして０．５体積の２０％ＰＥＧ８００／２．５ＭのＮａＣｌ溶液を添加する。ボトルを氷上で一晩、振盪する。ボトルを、２０，０００ＸＧで１５分間、遠心分離し、そして上清液を漂白溶液中に捨てる。白色沈殿物（沈殿されたウィルス／ＰＥＧ）が、回転マークのいずれかの側にボトルの壁にそって２本の垂直線を形成する。無菌の細胞スクレーパーを用いて、２本のボトルからの沈殿物を２．５ｍｌのＰＢＳに再懸濁する。
【００９１】
そのウィルス溶液を２ｍｌの微小遠心分離管に配置、そしていずれかの追加の細胞残骸を除去するために、微小遠心分離機により１４，０００ＸＧで１０分間、遠心分離する。２ｍｌの微小遠心分離管からの上清液を、１５ｍｌのポリプロピレンスナップキャップ管に移し、そしてＣｓＣｌにより、１．３４ｇ／ｍｌの密度に調節する。ウィルス溶液の体積を評価し、そして０．５５ｇ／ｍｌのＣｓＣｌを添加する。ＣｓＣｌを溶解し、そしてこの溶液１ｍｌの重量を計る。溶液を、ポリカーボネート製の厚壁の３．２ｍｌの遠心分離管（Ｂｅｃｋｍａｎ）に移し、そして３４８．０００ＸＧで２５℃で３〜４時間、回転する。ウィルスは白色バンドを形成する。広−内径ピペット先端を用いて、ウィルスバンドを集める。
【００９２】
グラジエントから回収されたウィルスは、細胞上で使用される前、除去されるべきである多量のＣｓＣｌを包含する。ＳｅｐＨａｄｅｘ（商標）Ｇ−２５Ｍ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ） により予備充填されたＰｈａｒｍａｃｉａ ＰＤ−１０カラムを用いて、ウィルス調製物を脱塩した。カラムを２０ｍｌのＰＢＳにより平衡化した。ウィルスを負荷し、そしてカラムの運転を可能にする。５ｍｌのＰＢＳをカラムに添加し、そして８〜１０滴の画分を集める。個々の画分の１：５０希釈溶液の光学密度を、分光計上で２６０ｎｍで測定し、そして明白なピークを同定する。ピーク画分をプールし、そして１：２５希釈溶液の光学密度（ＯＤ）を決定する。ＯＤを、式（２６０ｎｍでのＯＤ）（２５）（１．１×１０１２）＝ビリオン／ｍｌを用いて、ウィルス濃度に転換する。
【００９３】
ウィルスを貯蔵するために、グリセロールを、精製されたウィルスに１５％の最終濃度まで添加し、軽く混合し、そして−８０℃で等分して貯蔵する。
Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． （Ｍｏｎｔｒｅａｌ， Ｃａｎａｄａ） により開発されたプロトコールに従って、組換えウィルスの感染性を測定する。手短には、２つの９６−ウェル組織培養プレートを、アッセイされる個々の組換えウィルスのための２％ウシ胎児血清を含むＭＥＭにおける、ウェル当たり１×１０４個の２９３Ａ細胞により接種する。２４時間後、１×１０−２〜１×１０−１４の個々のウィルスの１０倍希釈溶液を、２％ウシ胎児血清を含むＭＥＭにおいて製造する。個々の希釈溶液１００μｌを２０ウェルの個々に配置する。３７℃での５日後、ウェルをＣＰＥについて、陽性又は陰性のいずれかを読み取り、そしてＰＦＵ／ｍｌを計算する。
【００９４】
使用されるＴＣＩＤ５０公式は、上記Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． からである。力価（Ｔ）をプレートから決定し、ここで使用されるウィルスを、１０−２〜１０−１４に希釈し、そして感染の５日後、読み取る。個々の希釈度で、ウェルの合計数当たりＣＰＥについて正のウェルの比（Ｒ）を測定する。希釈されていないサンプルの力価は、Ｔ−１０（１＋Ｆ）＝ＴＣＩＤ５０／ｍｌであり、ここでＦ＝１＋ｄ（Ｓ−０．５）、Ｓは比率（Ｒ）の合計であり、そしてｄは希釈シリーズのＬｏｇ１０である（例えば、１０倍の希釈シリーズについてｄ＝１）。ＴＣＩＤ５０／ｍｌをｐｆｕ／ｍｌに転換するために、０．７を力価（＋）についての計算における指数から除去する。
【００９５】
例７：
ヒトｚｖｅｇｆ４ ＤＮＡのタンパク質コード領域を、それぞれ５’及び３’末端でＰｍｅＩ及びＡｓｃＩ制限部位を付加するプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。得られるｚｖｅｇｆ４ ｃＤＮＡを、ｐＺｙＴｒａｃｋ （例６）のＥｃｏＲＶ−ＡｓｃＩ部位中にクローン化した。組換えアデノウィルスを、２９３Ａ細胞において生成し、そしてＣｓＣｌグラジエント上で精製した。ウィルス粒子数を、分光計により決定し、そして感染性粒子数をＴＣＩＤ５０アッセイにより決定した。ウィルスを、ＡｄＺｙｖｅｇｆ４と命名した。
【００９６】
生後、８週目のＣ５７ＢＬ／６マウスを、ＡｄＺｙｖｅｇｆ４により感染せしめ、血清化学、完全な血液計数（ＣＢＣ）、身体及び器官の重量変化、及び組織学に対する効果を決定した。−１日目、マウスを標識し、それぞれ重量を測定し、そしてグループを、処理グループへの分離のために標準化する（檻当たり４匹のマウス）。グループ１マウス（ｎ＝８匹の雌、７匹の雄）は、ＧＦＰ（対照）アデノウィルス（１×１０１１個の粒子）を受けた。グループ２（ｎ＝８匹の雌、６匹の雄）は、ｚｖｅｇｆ４アデノウィルス（１×１０１１個の粒子）を受けた。グループ３（ｎ＝８匹の雌、８匹の雄）は、未処理の対照であった。
【００９７】
０日目で、マウスは適切なアデノウィルス溶液の注射を受けた。１０日目で、血液を、ＣＢＣ及び臨床学的化学測定のために集めた（エーテル麻酔下で）。２０日目、マウスを計量し、そして、ＣＢＣ及び臨床学的化学測定のために血液を集めた後（エーテル麻酔下で）、頸部脱臼により殺した。選択された組織を固定し、そして形態学的変化について評価した。次の病理学的発見は、ＡｄＺｙｖｅｇｆアデノウィルスにより処理された動物の大部分（８０〜１００％）において示され、そして他の２種のグループのいずれかにおいては観察されなかった。
【００９８】
肝臓においては、洞様毛細血管細胞、特に小さな卵形核を有し、そして肝小葉の静脈領域においてより群生する洞様毛細血管を被覆する観察できる細胞質を有さない細胞の適度な増殖が存在した。細胞は、肝線維症の開始及び進行の原因である主要細胞型である、紡錘Ｉｔｏ（星状）細胞であるように思われた。
【００９９】
すべてのＡｄＺｙｖｅｇｆ４処理された動物においては、腎臓の糸球体が拡大され、そして糸球体間質細胞の過細胞性により特徴づけられた。さらに、すべての６匹の雄マウス、及び７匹の雌マウスのうち４匹が、細尿管後退の徴候を示した。それらの変化は、関連しないタンパク質を発現する対照アデノウィルスに暴露された動物においては観察されなかった。細尿管後退は、高められた好塩基球増加を有する細尿管上皮細胞の存在により特徴づけられる。より詳細な組織学的試験は、細尿管間質増殖又は炎症性細胞浸潤の証拠をほとんど示さなかった。
【０１００】
高められた量の気管支肺胞リンパ様組織が、ＡｄＺｙｖｅｇｆ４処理された動物の肺において示された。気管支肺胞リンパ様組織は、いくつかの形の肺線維症において重要な開始体及び関与体である、肺炎症応答の徴候である、肺実質内の血管のまわりのより少ない数の血漿細胞と共に混合されるリンパ球群から主に構成された。
【０１０１】
大腿骨においては、大部分の動物は、骨髄空間を満たす。最少〜重度の骨内膜骨、及び増殖する骨内膜骨のために骨髄空間の損失に起因する低められた量の造血要素を示した。さらに、６匹の雄のうち４匹及び８匹の雌動物のうち２匹が、高められた数の紡錘形状の細胞により特徴づけられた支質細胞の増殖を有した。
【０１０２】
例８：
腎機能の修復を、Ｎａｋａｇａｗａなど． （Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １５５： １６８９−１６９９， １９９９） のモデルを用いて評価した。虚血性尿細管損傷を、両側の腎動脈を正確に５０分間、クランプすることによって、２５０〜３００ｇの体重の雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて誘発した。体温を、恒温動物表に基づいて動物を配置し、そして感温性腎プローブによりモニターすることによって、３７±１℃で維持する。クランプを開放した後、腎臓を、種々の間隔で再灌流する。ｚｖｅｇｆ４を、損傷の後、種々の時点で投与する。手術後、１〜１０日での動物死亡率は、永続的な腎不全の徴候である。腎機能はまた、タンパク尿、血清におけるクレアチニンレベル、及び当業者に知られている他の方法により評価され得る。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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