(57)【要約】本発明は、潜在的サイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ）感染を保有する患者のＣＤ８＋クラスＩ ＭＨＣ拘束性細胞傷害性Ｔ−リンパ球により認識される免疫原性エピトープ類であるペプチドを提供する。ペプチドは、活性なウィルス複製が存在しない条件下にてＣＴＬを活性化することができ、そしてしたがって、正常な被検体および免疫不全被検体によりＨＣＭＶに対する細胞性免疫応答を誘導するために有用である。ＨＣＭＶに対するワクチン（アジュバントを伴うものおよび伴わないもの）および免疫学的および診断用試薬が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０： １に示されるペプチド。
【請求項２】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０： ２に示されるペプチド。
【請求項３】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０： １およびＳＥＱ ＩＤ Ｎ０： ２からなる群から選択されるペプチドを含む、ヒトサイトメガロウィルスに対するワクチン。
【請求項４】
アジュバントをさらに含む、請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
前記アジュバントがＤＮＡアジュバントである、請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０： １およびＳＥＱ ＩＤ Ｎ０： ２からなる群から選択されるペプチドおよびＤＮＡアジュバントを含む、ヒトサイトメガロウィルスに対するワクチン。
【請求項７】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０： １およびＳＥＱ ＩＤ Ｎ０： ２からなる群から選択されるペプチドを提示する抗原提示細胞を含む、ヒトサイトメガロウィルスに対する細胞ワクチン。
【請求項８】
請求項３に記載のワクチンを投与することを含む、ヒトサイトメガロウィルス感染に対する免疫応答をモジュレートする方法。
【請求項９】
請求項７に記載のワクチンを投与することを含む、ヒトサイトメガロウィルス感染に対する免疫応答をモジュレートする方法。
【請求項１０】
ヒトサイトメガロウィルスに対してワクチン接種が必要な哺乳動物にワクチン接種する方法であって、請求項３に記載のワクチンを前記哺乳動物に対して投与することを含む、前記方法。
【請求項１１】
ヒトサイトメガロウィルスに対してワクチン接種が必要な哺乳動物にワクチン接種する方法であって、請求項７に記載のワクチンを前記哺乳動物に対して投与することを含む、前記法補。
【請求項１２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２からなる群から選択されるペプチドをコードする遺伝子を含有する、組換えウィルスベクター。
【請求項１３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２からなる群から選択されるペプチドを含む、免疫学的試薬。
【請求項１４】
診断用試薬である、請求項１３に記載の免疫学的試薬。
【請求項１５】
β−２ミクログロブリン、蛍光マーカーを連結したストレプトアビジンと複合体を形成するビオチン化ＭＨＣクラスＩ分子、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２からなる群から選択されるペプチドの複合体を含む、請求項１４に記載の診断用試薬。
【請求項１６】
前記複合体が四量体複合体である、請求項１５に記載の診断用試薬。
【請求項１７】
前記複合体が二量体複合体である、請求項１５に記載の診断用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０００年１０月２０日に出願した先の同時係属中の仮出願シリアルＮｏ． ６０／２４１，９４４に基づく優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府の支援に基づく研究に関する陳述
本発明は、連邦保健社会福祉省（ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）からのグランドＮｏ． ＣＡ３０２０６、Ｎｏ． ＣＡ７７５４４およびＮｏ． ＣＡ３３５７２の形式で政府のサポートを受けた。政府は、本発明において特定の権利を有することができる。
【０００３】
発明の背景
１．　技術分野
［０００１］　本発明は、ヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ）に関し、そして特にヒトにおいてＨＣＭＶのＴ−細胞エピトープ類を産生するタンパク質に由来するペプチドフラグメントに関する。ペプチドフラグメントエピトープ類は、ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を、ＨＣＭＶにより感染されたヒト細胞を認識しそして溶解する様に方向付けることができる。
【０００４】
２．　背景技術の記載
［０００２］　ＨＣＭＶゲノムは、比較的大型（約２３５，０００塩基対）のものであり、そして２００以上のタンパク質をコードすることができる。ＨＣＭＶは、構造的機能または酵素的機能を有するカプシドタンパク質により囲まれる二本鎖ＤＮＡの核複合体、そして外部糖ペプチド−および糖脂質−含有膜エンベロープを含む。
【０００５】
［０００３］　ＨＣＭＶ感染は、比較的共通なものであり、そして健康で、免疫適格性の子供または成人においては、通常は自己−制御式である（Ｌ． Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５４：２２１−２５４ （１９９０））。しかしながら、ウィルスは、胎児または乳児においては重度な疾患を引き起こす可能性がある。例えば、ＨＣＭＶは、活動性な感染を保有する母親からｉｎ ｕｔｅｒｏで感染を受ける子供における先天性の精神発育遅滞の共通した原因である。その他の新生児は、疾患の兆候を示すまでのある期間、サイトメガロウィルスを保有する可能性がある。全ての新生児のうちのおよそ１０％が、ＨＣＭＶを保有する。
【０００６】
［０００４］　活動性なＨＣＭＶ感染を有する患者は、しばしば唾液腺、脳、腎臓、肝臓、および肺を含む、患者の生存に関わる器官の少なくともいくつかの機能障害を患う。さらに、ＨＣＭＶは、単核細胞症および間質性肺炎を含む幅広い範囲の古典的な症候群に関連する。ＨＣＭＶはまた、腫瘍形成能およびカポジ肉腫を含む特定の型の悪性腫瘍と関連している可能性を有する。
【０００７】
［０００５］　ＨＣＭＶ感染がなければ健康な成人における、持続的で一見すると無症候性のＨＣＭＶ感染もまた、特定の個体において、健康リスクの問題を提起する場合がある。例えば、冠動脈血管形成術を受けた個体は、時々後になって動脈リモデリングの結果として再狭窄を引き起こす。ある研究において、約１／３のそのような再狭窄を起こした患者が、その動脈病変において検出可能なＨＣＭＶ ＤＮＡを有しており（Ｅ． Ｓｐｅｉｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：３９１−３９４ （１９９４））、別の研究においては、ＨＣＭＶ血清陽性患者がそれらの血清陰性対照よりも５倍も再狭窄を引き起こしやすかった（Ｙ．Ｆ． Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ． Ｍｅｄ． ３３５：６２４−６３０ （１９９６））。これらの研究から、ＨＣＭＶが感染した宿主細胞の数を減らすことにより、特定の個体に利益をもたらすことができることが示唆される。
【０００８】
［０００６］　ＨＣＭＶはまた、免疫無防備状態の患者において罹患率および死亡率と関連する。ＨＣＭＶは、後天性免疫不全症（ＡＩＤＳ）を患う患者の治療において、重要な検討事項である。ＨＣＭＶの特徴的な合併症はウィルス性網膜炎であり、これはもし治療しないままにしておくと、失明に至る可能性がある。ＨＣＭＶウイルス血症のその他の疾患症状発現には、脳炎、腸炎および肺炎が含まれる。剖検の際に、重度のＨＣＭＶ網膜症を有するＡＩＤＳ患者の大半において、ＨＣＭＶ疾患の多−臓器関与が存在する。歴史的には、ＨＣＭＶ疾患は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞レベルが１００／ｍｍ３以下にまで減少するＨＩＶ−感染個体を襲う、より破壊的な日和見感染の一つであった。
【０００９】
［０００７］　ＨＣＭＶは、例えば、免疫抑制された臓器移植患者において、日和見感染を引き起こす可能性がある。抗ウィルス化学療法を使用する前には、ＨＣＭＶ感染が実質的な割合の骨髄移植後合併症の原因であった（Ｊ． Ｍｅｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ． １５３：４７８−４８８ （１９８６））。実質的な抗−ＨＣＭＶ活性を有するガンシクロビルなどの薬物を使用することにより、骨髄移植後ＨＣＭＶ感染と関連する合併症は減少した（Ｇ． Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ． Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ． Ｍｅｄ． ３２４：１００５−１０１１ （１９９１）； Ｊ．Ｍ． Ｇｏｏｄｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ． Ｍｅｄ． ３２５：１６Ｃ１−１６０７ （１９９１））。しかしながら、ガンシクロビルの予防的投与は、好中球減少症や致死的細菌疾患や致死的真菌疾患の数の増加を含む、いくつかのネガティブな結果を有する。同様に重要なことは、ガンシクロビルもまた、細胞性免疫およびＣＭＶに対する特異的細胞性応答の再構築を遅らせる。この結果、移植の約９０日後に発症する“後期ＣＭＶ疾患”と呼ばれる合併症を引き起こす。後期ＣＭＶ疾患は、病的状態または致死を引き起こす可能性があり、そして移植後すぐに予防的または治療的ガンシクロビル治療のいずれかを受けた患者において最も一般的なものである。
【００１０】
［０００８］　ＣＤ８＋ ＣＴＬ応答は、ＨＣＭＶなどの急性ウィルス感染に対する哺乳動物宿主応答において重要であると考えられている。ＨＣＭＶ感染がはびこりそして持続的であり、そして免疫抑制状態の患者において再び活性化される可能性がありそして臨床的に顕性となる、という知見から、ウィルス−特異的Ｔ−細胞が持続的な感染の制御およびＨＣＭＶ疾患からの回復において重要な役割を果たしていることが示唆される。
【００１１】
［０００９］　ヒトにおいて、免疫抑制された骨髄移植レシピエントにおけるＨＣＭＶ疾患の発症からの防御は、測定可能なＣＤ８＋ ＨＣＭＶ−特異的クラスＩ ＭＨＣ−拘束性Ｔ細胞応答の回復と相関関係にある（Ｑｕｉｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎ． Ｅｎｇ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３０７：７−１３ （１９８２）； Ｒｅｕｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ７８：１３７３−１３８０ （１９９１））。ドナー−由来のＨＣＭＶ−特異的ＣＤ８＋ ＣＴＬクローンをアレルゲン性の骨髄移植レシピエントに対して移植すると、結果として検出可能なＣＴＬ−ベースのＨＣＭＶ免疫を引き起こし、そして骨髄移植後のＨＣＭＶ疾患を統計的に顕著に減少させる（Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎ． Ｅｎｇ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３３：１０３８−１０４４ （１９９５））。うまく適用されたとしても、このアプローチは、ＨＣＭＶ−特異的ＣＴＬをｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導するために、非常に労働集約的かつ非常に費用がかかる洗練された研究室設備が必要とされる、という欠点を有する。
【００１２】
［０００１０］　ヒトサイトメガロウィルスは比較的一般的であるが、今なおいくつかの極めて重症な健康状態と関連しているため、骨髄移植レシピエント、固形器官移植、心臓病患者、ＡＩＤＳ患者あるいは妊娠期間の女性、における疾患の発生率および重症度を減少させることができるワクチンが非常に望まれていた。減弱生ＣＭＶ、減弱ポックス−ウィルスに保持させたＣＭＶタンパク質そしてＣＭＶ膜タンパク質の可溶性アナログを含む、いくつかのＨＣＭＶワクチンが開発中である。残念ながら、それらの開発において多大な努力が行われているにもかかわらず、ＦＤＡは、これらのワクチンのいずれも、安全かつ効率的なものとして承認していない。
【００１３】
［０００１１］　ＣＴＬエピトープ類を使用するワクチン開発は、個体を感染性疾患および癌に対して免疫化するために幅広く受け入れられている戦略となっている。ＣＴＬエピトープ類の特異性および細胞内タンパク質プロセッシングが必要とされないという事実により、それらが全タンパク質を免疫源として使用することに対する魅力的な代替法となる。このようなワクチンを開発するため、宿主にＨＣＭＶを認識させるウィルスタンパク質を同定しなければならない。
【００１４】
［０００１２］　腫瘍抗原、ウィルス抗原、および自己−タンパク質を含む様々な抗原がペプチドへプロセッシングされ、それが抗原提示細胞の表面上で提示するためにＭＨＣクラスＩに対して運ばれる（Ｒｅｄｄｅｈａｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３７：６５１−６５３ （１９８９）； Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ．４：３２１−３２７ （１９９８）； Ｖｉｓｓｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５４：３９９１−３９９８ （１９９５）））。 細胞性タンパク質またはウィルス性タンパク質の８〜１２アミノ酸フラグメントがＭＨＣクラスＩのペプチド結合溝中に埋め込まれているという発見以来、これらのフラグメントのアミノ酸配列を同定することにかなりの注目が集められてきた（Ｊｏｙｃｅ ａｎｄ Ｎａｔｈｅｎｓｏｎ １９９４； Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ ｅｔ ａｌ． １９９３）。これらのペプチドのいくつかを同定し、ワクチンに製剤化し、そして特定のウィルス性疾患および癌に対する効率について評価した（Ｖｉｔｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ． １９９５； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． １９９０）。
【００１５】
［０００１３］　ウィルスのライフサイクルは、ワクチンを標的化してウィルス産生および伝播を最大限防止するための最も効率的な時間枠について、洞察を提供する。ＨＣＭＶが宿主細胞中に侵入しそして脱殻した後、ウィルスゲノムはその後、極めて初期ウィルスタンパク質（０−２時間）、初期ウィルスタンパク質（２−２４時間）および後期ウィルスタンパク質（＞２４時間）を介して連続的に発現される。しかしながら、ｐｐ６５やｐｐ１５０などの特定のウィルス構造タンパク質は、ウィルス粒子内に大量に存在するため、細胞中にシャペロン化（ｃｈａｐｅｒｏｎｅｄ）される。
【００１６】
［０００１４］　ウィルス構造タンパク質であるｐｐ１５０は、ほとんどの無症候性ＨＣＭＶ血清陽性個体の末梢血に由来するＨＣＭＶ−特異的クラスＩ ＭＨＣ拘束性ＣＴＬに対する標的抗原として同定された。ｐｐ１５０またはｐｐ６５に対するＣＴＬ（しばしば認識される別のマトリックスタンパク質）は、ＨＣＭＶ−感染細胞を感染１時間以内に、そしてウィルス遺伝子の発現が存在しない場合に、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて認識しそして溶解することができる（Ｒｉｄｄｅｌｌ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８９：９−３４ （１９９４））。したがって、ＨＣＭＶ ｐｐ１５０に対するＣＴＬは、ＨＣＭＶ再活性化および疾患の拡大を制限するために重要なエフェクター細胞である。そのような細胞性免疫応答を免疫無防備状態の個体および正常な個体の両方において誘導する能力は、有効なワクチンを生成する際には非常に重要なものであろう（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８３：１９７１−１９７９ （１９９４））。ワクチンのために有用なｐｐ６５配列に基づくペプチドは、Ｕ．Ｓ．特許６，０７４，６４５に記載され、その開示は参考文献として本明細書中に援用される。
【００１７】
［０００１５］　個々のＭＨＣクラスＩ分子は、所定のモチーフのペプチドに優先的に結合する。モチーフの特定の位置のアミノ酸配列は不変であり、所定のペプチドをＭＨＣクラスＩ分子に対して高い親和性で結合させることができる。これらの不変なアミノ酸を“アンカーポジション”と呼ぶ（Ｆａｌｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０−２９６ （１９９１））。その後の研究により、アンカーポジション以外のアミノ酸位置もまた、ＭＨＣクラスＩ分子に対して結合するペプチドの特異性に寄与することが示唆された。さらに、ＭＨＣクラスＩ分子とは相互作用しないＣＴＬエピトープ内部の位置での残基が、Ｔ細胞と相互作用する可能性があり、これはおそらく、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が結合することによる。アミノ酸残基のＭＨＣ構造またはＴＣＲ構造に対する結合は、独立的に制御されており、そのため多くの場合におけるＴＣＲ結合性アミノ酸残基の置換が抗原提示細胞の表面上のＭＨＣ分子に対する結合を妨害しない可能性がある。
【００１８】
［０００１６］　エドマン分解の後にＮ−末端配列解析を使用して、ＭＨＣクラスＩペプチド結合性溝に対して結合するペプチドの配列を決定した。ＨＰＬＣ−分離ペプチド混合物のマススペクトロメトリーにより、個々のペプチドの一次配列を解明することができる。ほとんどの場合において、これらのペプチドの長さは９〜１１アミノ酸の間である。ＭＨＣに結合するペプチドフラグメントは、“天然にプロセスされるエピトープ類”と呼ばれる。
【００１９】
［０００１７］　いくらかの研究者たちは、所定の長さ、すなわち９〜１１アミノ酸、のペプチドのいずれが個々のＨＬＡクラスＩアリルに最適に結合しうるのかを、そのアリルに対して特異的なモチーフにそれらが従っているかという点のみに基づいて、予測しようとした（Ｆａｌｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０−２９６ （１９９１））。しかしながら、これらの方法は、ウィルスタンパク質の内在性プロセッシングの結果として、Ｔ細胞による正しい結合または正しい認識のいずれも、確実には予想しない。
【００２０】
［０００１８］　もう一つのＨＣＭＶタンパク質であるｐｐ６５による実験では、利用可能なモチーフプログラムが免疫原性ウィルスタンパク質に対して特異的なヒトＴ−細胞により認識される配列を正しく予想するためには、十分に適合していないことが示された。天然にプロセスされたエピトープ類の同定には、一般的に、切断解析、重複性ペプチド、およびアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかからの１アミノ酸除去の後に認識および結合をアッセイすることからなるペプチド欠失を含む、力ずくのアプローチ（ｂｒｕｔｅ−ｆｏｒｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ）が必要とされる。従って、エピトープマッピングは、ほとんど完全に経験に基づくものである（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ５５：５１９−５３１ （２０００））。
【００２１】
［０００１９］　ＣＴＬは、哺乳動物生物がウィルスによる感染およびおそらくは癌に対して自身を防御する、重要な手段である。プロセスされた型の抗原、例えばウィルス性タンパク質最小細胞傷害性エピトープ、は、ＭＨＣクラスＩ分子と組み合わせてＴ細胞により認識される。ウィルスおよび腫瘍−特異的Ｔ細胞の機能的研究の結果、８〜１２アミノ酸のペプチドからなる最小細胞傷害性エピトープが、抗原提示細胞が、正しいＭＨＣ分子の文脈においてエピトープを提示する限りにおいて、ＣＤ８＋ ＣＴＬにより溶解されるべき抗原提示細胞をプライム化することができることを確認した。
【００２２】
［０００２０］　細胞中へのタンパク質の侵入の経路から、それがＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子のいずれかと結合する抗原としてプロセスさせるかどうかを決定する。タンパク質分解の内在性経路またはクラスＩ経路は、感染性ウィルスが存在する場合、しばしば細胞により使用される。ウィルスの核タンパク質は、細胞内でプロセスされ、そして分解された部分は、ＭＨＣクラスＩ分子を介して表面に輸送される。ウィルスのエンベロープ糖タンパク質は、細胞表面分子であるため、ＣＴＬ認識を必須には誘導しない。ウィルスの核タンパク質は、主としてプロセスされたエピトープ類の形状で存在するが、しばしばＣＤ８＋ ＣＴＬにより認識される標的抗原である（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈｉｌｏｓ． Ｔｒａｎｓ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄ．（Ｂｉｏｌ）． ３２３：５２７−５３３ （１９８９））。
【００２３】
［０００２１］　外来性経路（ピノサイトーシスなど）を介して細胞に侵入する抗原は、典型的にはクラスＩ ＭＨＣ分子によっては処理されず、そして提示されない。タンパク質を直接的に細胞質中に導入するための方法は、したがって、ワクチン開発者たちの一つの焦点となっていた。組換えワクシニアウィルスを使用して細胞を感染させ、大量の細胞内抗原を送達することができるが、しかしながらこれらのウィルスそれ自体は、免疫抑制状態のヒト、例えば骨髄移植レシピエントあるいはＡＩＤＳ患者における疾患を引き起こす潜在力を有する。減弱ワクシニアウィルス、例えば修飾ワクシニアアンカラまたはカナリアポックスウィルスは、免疫抑制状態の個体に対して、抗原およびタンパク質の送達に関して代替法を提供する。最近刊行された報告では、最小型のエピトープワクチンを、それらをウィルスから作製されたタンパク質として送達するか、または最小エピトープをペプチドの形状で使用するかに関わらず、使用することが提唱されたＩｓｈｉｏｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６２：３９１５−３９２５ （１９９９）； Ｆｕ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２（２）：１４６９−１４８１ （１９９８）； Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２（６）：５１７４−５１８１ （１９９８）。ワクチン接種の別のアプローチは、抗原性タンパク質をアジュバントと混合し、そして混合物を皮下注射により皮膚の下に導入することである。
【００２４】
［０００２２］　細胞傷害性Ｔリンパ球を誘起する別の可能性のあるアプローチは、特定のＭＨＣ拘束性要素の文脈において特異的なウィルス抗原に対して定義される最小細胞傷害性エピトープを使用して、ウィルスに対するＴ細胞記憶応答をブーストすることである。最小細胞傷害性エピトープが致死用量の感染性ウィルスによるチャレンジに対する防御的免疫を提供する能力は、文献において検討された。内部化もしくはプロセッシングを必要とすることなく細胞表面分子の外部的結合を介して、それがＭＨＣクラスＩ分子に対して結合できることから、ワクチン開発者たちは、最小細胞傷害性エピトープをワクチンとして使用することに徐々に興味を大きくしていった。
【００２５】
［０００２３］　最小細胞傷害性エピトープ類は、一般に、ヘルパーＣＤ４エピトープと組み合わせた脂質化ペプチドの形状で投与する場合に最も効果的であった（Ｖｉｔｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９５：３４１−３４９ （１９９５） ａｎｄ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５９：１３８３−１３９２， １９９７））。しかしながら、単独で投与されたペプチドもまた、非常に効果的であり得る。検討されたその他のワクチン修飾には、小胞体貯留（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）に対するＫＤＥＬなどのシグナル配列や最大の活性を達成するための標的化が含まれる。文献中には、特定の型の抗原提示細胞（例えば樹状細胞）により提示された最小細胞傷害性エピトープが、ウィルス性感染が存在しない場合にまたはウィルスまたは腫瘍細胞と接触させる前に、一次免疫応答を引き起こす可能性がある、という証拠も存在する。
【００２６】
［０００２４］　ペプチドおよびその機能性配列変異体を、そのアミノ末端にＨＴＬエピトープが共有結合した、キメラ脂質化ペプチドまたはキメラペプチドとしてのワクチンとして製剤化することができる。ＨＴＬエピトープは、ヒトＭＨＣクラスＩＩに対して幅広い応答性を有し、古典的なヘルパー応答を刺激する、いずれのペプチドであってもよい。そのような分子には、破傷風毒素由来のアミノ酸８３０−８４３（Ｐ． Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． １９：２２３７−２２４２ （１９８９））、ＨＩＶエンベロープタンパク質由来のＨＴＬエピトープ類（Ｊ．Ａ． Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８８：８７６−８８４ （１９９１））、または既知アンカー残基から推測される合成物（ＰＡＤＲＥ）（Ｊ． Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７５１−７６１ （１９９４））が含まれるが、これらのものに限定されない。
【００２７】
［０００２５］　ＨＴＬ＋ＣＴＬエピトープの脂質化は、好ましくは、ＨＴＬエピトープのアミノ末端において起こり、ここでＨＴＬエピトープはＣＴＬエピトープについてのアミノ末端である。適した脂質部分は、既知であり、文献中に記載される（Ｈ． Ｓｃｈｉｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１：２６４９−２６５４ （１９９１）； Ａ． Ｖｉｔｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９５：３４１−３４９ （１９９５）； Ｋ． Ｄｅｒｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４２：５６１−５６４ （１９８９））。あるいは、ＣＴＬエピトープはそのアミノ末端で、その後ＨＴＬエピトープで脂質化されていてもよく、あるいは脂質がカルボキシ末端で、その後ＣＴＬまたはＨＴＬエピトープのいずれかで結合していてもよい。非脂質化ワクチン、並びにモノ−脂質化、ジ−脂質化、およびトリ−脂質化ワクチンが、本発明により使用するために企図される。３つのアミノ酸スペーサーが、ＨＴＬとＣＴＬエピトープとの間に挿入されていてもよく、またはエピトープ類はインフレームで直接的に融合されていてもよい。あるいは、そのアミノ末端を脂質化されたＣＴＬエピトープを、共有結合を伴わずにＨＴＬエピトープとともに投与してもよい。
【００２８】
［０００２６］　特定のＨＣＭＶ抗原およびＣＴＬにより認識されるエピトープ類を同定するための多大な努力にもかかわらず、天然にプロセスされたこれらのエピトープ類は、ＨＣＭＶ感染を予防しそして治療する効果的な方法とともに、商業的に利用可能なものではない。したがって、このような臨床的に重要な疾患に対するペプチド−ベースのワクチンは、大きな価値を有する可能性がある。
【００２９】
発明の概要
［０００２７］　したがって、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示されるペプチドを含む。さらなる態様において、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２からなる群から選択されるペプチドを含む、ヒトサイトメガロウィルスに対するワクチンを含む。
【００３０】
［０００２８］　さらにさらなる態様において、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２からなる群から選択されるペプチドを提示する抗原提示細胞を含む、ヒトサイトメガロウィルスに対する細胞性ワクチンを含む。
【００３１】
［０００２９］　さらにさらなる態様において、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示されるペプチドをコードする遺伝子を発現する組換えウィルスベクターを含む。
【００３２】
［０００３０］　さらにさらなる態様において、本発明は、上述したワクチンまたは細胞性ワクチンを投与することを含む、ヒトサイトメガロウィルス感染に対する免疫応答をモジュレートする方法を含む。
【００３３】
［０００３１］　さらにさらなる態様において、本発明は、ヒトサイトメガロウィルスに対するワクチン接種が必要な哺乳動物にワクチン接種する方法であって、前記哺乳動物に対して上述したワクチンまたは細胞性ワクチンを投与することを含む前記方法を提供する。
【００３４】
［０００３２］　さらにさらなる態様において、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２からなる群から選択されるペプチド、およびアジュバント、好ましくはＤＮＡアジュバントを含むヒトサイトメガロウィルスに対するワクチンを提供する。
【００３５】
［０００３３］　さらにさらなる態様において、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２からなる群から選択されるペプチドを含む免疫学的試薬を提供する。
好ましい態様の詳細な説明
［０００３４］　本発明は、ＨＣＭＶに対して効果的なワクチンを作製するために有用なペプチドに関する。これらのペプチドワクチンは、それらがＨＣＭＶに感染したヒトの免疫細胞により認識される正確なエピトープ類であり、そして感染に対して好結果の応答を提供するため、ＨＣＭＶ−感染細胞に対する細胞性免疫応答を誘導することができる。これらのペプチドは、したがって、ＨＣＭＶ感染細胞の効果的な殺傷を刺激することができ、そして感染しているが無症候性のヒトにおいても同様である。本発明のペプチドは、ヒト宿主において抗原提示細胞の表面にルーチンにそして首尾よく提示されるエピトープ類であり、そのことがＭＨＣクラスＩに対する生産的な結合とヒトにおけるＨＣＭＶに対する細胞性免疫応答の誘導を補償している
［０００３５］　ワクシニアウィルス中で発現するｐｐ１５０タンパク質の短縮物を、ｐｐ１５０−特異的Ｔ細胞クローンに対してスクリーニングした。これらのＣＴＬクローンは、確立した方法を使用してＨＣＭＶ−血清陽性ボランティアから樹立した（Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎ． Ｅｎｇ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３３（１６）：１０３８−１０４４ （１９９５）； ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ−Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｖｉｒｏｌ． ４３：１０３−１１０ （１９９４）； Ｙｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７（９）：４０７４−４０８６ （１９９６）； Ｄｉａｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， ９０：１７５１−１７６７ （１９９７）； ＬａＲｏｓａ ｅｔ’ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９７：１７７６−１７８６ （２００１））。ｐｐ１５０遺伝子の全体にわたりおよそ１００−２００ヌクレオチドの連続的なアミノ末端欠失およびカルボキシ末端欠失を有する組換えワクシニアウィルスを、ｐｐ１５０−特異的Ｔ細胞による殺傷のために細胞を感作する能力について試験した。タンパク質の制限された領域がそのクローンの細胞傷害性Ｔ細胞応答を媒介するペプチドを含有するものとして同定されるまで、同定した配列の長さをカバーする連続的なより小さな短縮ペプチドを試験した。１００アミノ酸程度の長さのペプチドが同定された場合、同定した配列の長さをカバーする一連の重複するペプチドを、さらに解析するために合成した。これらの方法を使用して、３つのアミノ酸により重複する１５ ｍｅｒペプチドを使用して１００アミノ酸配列をスキャンすると、全部で２０種のペプチドが必要とされる。
【００３６】
［０００３６］　試験のため、自己由来およびＨＬＡミスマッチ（対照）リンパ球細胞株を、５０μＭの濃度で１〜２時間、スキャニングペプチドにより感作し、そして洗浄した。対応するＣＴＬをその後、ペプチドにより感作したクロム化ＥＢＶＬＣＬ（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルストランスフォームリンパ球細胞）とともにインキュベートし、そして標準的なクロム放出アッセイを行った。溶解の感受性を決定し、そしていずれかの陽性のペプチドを、そのＴ細胞クローンのＨＬＡアリルに対応する最小細胞傷害性エピトープが定義されるまで、アミノ末端とカルボキシ末端の両方をさらに短縮した。表Ｉは、示されたＨＬＡアリルを有するヒトによりｐｐ１５０から天然にプロセスされるペプチドエピトープ類を提供する。
【００３７】
【表１】
2004512039.tif 000002
［０００３７］　ワクチンエピトープ類は、一次構造に関わらず、標準的な製剤バッファー（ＰＢＳ／１０％ＤＭＳＯまたはより高濃度のＤＭＳＯ／０．０１％トリフルオロ酢酸または同一濃度または異なる濃度のその他の酸またはアルコール）中で１回、前腕またはその他の身体の部位において皮下（ｓ．ｃ．）にて注入することができる。ワクチンをＰＢＳまたはいずれかその他の医薬的に適合性のビヒクル中で投与することができる。３〜６週間後に、同一物質のブースター注入を投与することができる。必要であれば、複数回のブースター注入を３〜６週間おきに連続的に投与することができる。
【００３８】
［０００３８］　ワクチンを、患者またはリスクのある個体に対して、もしくはウィルスに対して陽性であるかまたは陰性であるかのいずれかの骨髄移植のドナーに対して、投与することができる。ワクチンペプチドの説明的な例としては、以下のものが含まれる：
【００３９】
【表２】
2004512039.tif 000003
ここで、Ｘは、シクロヘキシルアラニンまたはフェニルアラニンであり、そして“Ｐａｍ”はパルミチン酸である。３つのＡまたはそれに代わる構造のスペーサー（下線部）をワクチンペプチド間で置き換えることができる。上記に示されたペプチドのフォーマットは、（アミノ末端から）以下の様に記載することができる：脂質−ＫＳＳ−−ＨＴＬエピトープ（斜体）−−アミノ酸スペーサー（下線部）−−ＣＴＬエピトープ。ＣＴＬおよびＨＴＬエピトープ類の位置は、置き換えることができる。ＣＴＬエピトープ（またはその機能的配列改変体）を、リーダー配列を付加することによりさらに修飾することができ、および／またはアミノ酸ＫＤＥＬをカルボキシ末端に追加して、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０： ８に例示されるような小胞体中の保持および標的化を補助することができる。パルミチン酸またはステアリン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、カプリン酸およびデカン酸を含むがこれらには限定されないいずれかの適した脂質を使用することができる。好ましい脂質部分には、パルミチン酸が含まれる。あるいは、脂質を含まないワクチンの形態を使用して、付随的なアジュバントとともにまたは伴わずに、免疫原性を引き起こす適切なＴ−ヘルパーエピトープを選択することができる。ＫＳＳなどの配列を非脂質化ペプチドのアミノ末端に含んで、可溶性における補助とすることができる。その他のワクチン製剤には、Ｎ−末端にアミノ酸の右旋型（ｄｅｘｔｒｏ ｆｏｒｍ）を有するペプチドが含まれる。非脂質化ワクチンは、ＫＳＳリンカー配列を必要としない。
【００４０】
［０００３９］　アジュバントは、一部のワクチン製剤を形成することができる。完全または不完全フロイントのアジュバント、水酸化アルミニウムなどのアジュバントが企図されるが、しかしながら好ましいアジュバント、特にヒトにおいて使用するためのアジュバントは、ＤＮＡアジュバントである。シトシン−ホスフェート−グアノシン（ＣｐＧ）を含む具体的な配列を含む一本鎖ＤＮＡアジュバントは当該技術分野において既知であり、そして本発明により使用することが企図される。これらのＣｐＧ配列を欠損するＤＮＡアジュバントもまた、本発明により有用である。例示的なＤＮＡアジュバントには、２つのＣｐＧモチーフを有する２０ｍｅｒのヌクレオチド、または一般的には約２０〜約２５ヌクレオチド長のいずれかのＤＮＡオリゴマーを含むことができる。配列の安定性は、チオエート基を有するヌクレオチドバックボーン中のホスフェート基を置換して、ホスホロ−ジエステルバックボーンではなく、ホスホロ−チオエートバックボーンを生成することにより、増大することができる。
【００４１】
［０００４０］　本発明のワクチンはまた、ＤＮＡワクチンとして製剤化することができる。適切なワクチンには、１またはそれより多いＨＣＭＶペプチドまたは本発明の類似体をコードする遺伝子を発現する、組換えウィルスベクター、例えばポックスウィルス、が含まれる。これらのワクチンは、従来技術において既知の方法にしたがって構築することができる。要約すると、これらのペプチドをワクチンとして単独でまたはその他のペプチド配列と組み合わせて、アジュバントの存在下または非存在下において投与することができる。あるいは、ウィルスまたはＤＮＡ構築物を利用して送達される免疫原性タンパク質由来の最小ＣＴＬエピトープにより、ウィルスの減少または排除のために重要であることが示されたＣＴＬ応答を誘導することもできる。
【００４２】
［０００４１］　本発明のペプチドを免疫学的方法において使用して、患者においてまたは患者由来のサンプルにおいて、ｐｐ１５０−反応性ＣＴＬを検出することもできる。以下に記載するクロム放出アッセイなどのアッセイまたはいずれか既知のアッセイが適している。ｐｐ１５０ペプチドを認識する特異的Ｔ細胞クローンを、例えば、Ａｌｔｍａｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９４−９６， １９９６）または米国特許Ｎｏ． ５，７３４，０２３（これらの開示は参考文献として本明細書中に援用される）中に記載された様な四量体試薬またはＬａ Ｒｏｓａら（Ｂｌｏｏｄ ９７（６）：１７７６−１７８６， ２００１）およびＧｒｅｔｅｎら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：７５６８−７５７３， １９９８）（これらの開示は参考文献として本明細書中に援用される）中に開示された様な二量体試薬など、ＳＥＱ ＩＤ ＮＱ： １または２に示されるペプチドを含む免疫学的試薬を使用することにより検出することができる。
【００４３】
［０００４２］　ＭＨＣ四量体は一般的に当該技術分野において既知であり、そしてβ−２ミクログロブリン、蛍光マーカーと結合したストレプトアビジンと複合体形成しているビオチン化ＭＨＣクラスＩ分子、そして抗原性ペプチド、例えばｐｐ１５０ペプチドなど、の複合体からなる。ＭＨＣクラスＩアリルおよびペプチドを組み合わせると、クラスＩアリルの文脈におけるそのペプチド抗原を認識するＴ細胞の特異的認識を可能にする。個々の複合体の親和性は概して低いため、複数の複合体がしばしば互いに連結して結合を増大する。蛍光標識した四量体を使用して、特異的に結合するＴ細胞を、例えば蛍光活性化細胞ソーティングなどの既知の技術を使用して分離することができる。ｐｐ１５０ペプチド抗原を使用する同一の診断試薬の二量体複合体もまた使用することができる。
【００４４】
［０００４３］　当業者は、そのような二量体試薬または四量体試薬を使用することになれており、そして当該技術分野において既知の様々な診断方法において使用するためにそのような試薬を構築しそして使用することが十分に可能である。同様に、当業者は、有用な試薬またはこれらの試薬の改変体を容易に合成することができる。
【００４５】
［０００４４］　以下の実施例は、添付の請求の範囲を限定するのではなく、説明することを意図している。
【００４６】
【実施例】
実施例１．　ＨＣＭＶ−特異的Ｔ−細胞クローンの誘導
［０００４５］　４０〜５０ ｍｌの全末梢血サンプルをＨＣＭＶ血清陽性ボランティアから得た（標準的な抗体方法により検出した）。全血は１４００ ｒｐｍで１０分間、卓上遠心分離器で分離し、そして赤血球を取り除いた。白血球細胞（ＷＢＣｓ）をＦｉｃｏｌｌ−ＨｙＰａｑｕｅ（ＤｕＰｏｎｔ）密度勾配遠心を使用して以下の様にして分離した。バッフィーコートをリン酸緩衝塩類溶液を使用して１２ ｍｌまで希釈し、そして６ ｍｌをＦｉｃｏｌｌ−ＨｙＰａｑｕｅの上部に重層した。２０００ ｒｐｍで１５〜３０分間、卓上遠心分離器で遠心分離した後、白血球細胞を含む境界部分を取り出し、ＰＢＳで希釈し、１０００ ｒｐｍで８〜１２分間ペレット化した。細胞を再びＰＢＳで再懸濁し、そして上述したようにもう一度洗浄した。白血球細胞を、プールされたＡＢ＋（血液型）ＨＣＭＶ血清陰性ドナーから得たヒト血清を含有するＴ細胞培地（ＴＣＭ）中にて、４〜５百万細胞／ｍｌで再懸濁した。
【００４７】
実施例２．　ＬＣＬ抗原−提示細胞の誘導
［０００４６］　同時に、自己由来抗原提示細胞株をＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｕｎｉｔ ７．２２， Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ Ｐｒｅｓｓ （１９９３））中に記載される方法にしたがって、末梢血白血球のＥｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒウィルス不死化を行うことにより調製した。細胞傷害性Ｔリンパ球および抗原提示細胞を同一の個体から誘導し、細胞株間でのＨＬＡ適合性を確実にした。
【００４８】
実施例３．　ＨＣＭＶによるＴ細胞クローンのＩｎ ｖｉｔｒｏ刺激
［０００４７］　Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激を開始するため、同一のボランティアから得た白血球細胞としての自己由来皮膚線維芽細胞の単層を、１２−ウェルプレート中に細胞を１０５細胞／ｍｌ／ウェルで、１０％ヒトＡＢ＋血清を含有するＤＭＥＭ中にて２４時間プレーティングすることにより樹立した。培養中にて２４時間の後、線維芽細胞を、ＨＣＭＶビリオン（ＡＤ１６９またはＴｏｗｎｅ系統）により２時間、１〜５の間の感染重複度（ＭＯＩ）にて感染させた。培地およびウィルスを単層から吸引除去し、そして１ ｍｌの新鮮な培地を添加した。単層をさらに４時間培地中でインキュベートし、その後培地を吸引除去した。８〜１０×１０６の白血球細胞を含有する２ ｍｌの培地を、ＨＣＭＶ感染線維芽細胞を含有するそれぞれのウェルに添加した。白血球細胞および線維芽細胞を、５０ Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、４ ｍＭ Ｌ−グルタミン、２５μＭ ２−メルカプトエタノール、１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１０％ヒトＡＢ＋血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で培養した。細胞を７日間共インキュベートした。血清が使い果たされた場合には血清を置換し、あるいは細胞の増殖が活発である場合には培養を拡大した。
【００４９】
［０００４８］　白血球細胞を、上述したように調製したＨＣＭＶ−感染自己由来線維芽細胞の新鮮な単層上にプレーティングすることにより、第７日に再刺激した。さらに、γ−照射（２５００ ｒａｄ）自己由来末梢血白血球（ＷＢＣよりも５−倍以上）をフィーダー細胞として添加し、そしてこの２回目の刺激の第２日および第４日に、培地に組換えＩＬ−２（１０ ＩＵ／ｍｌ， Ｃｈｉｒｏｎ−Ｃｅｔｕｓ）を追加した。急速な細胞増殖を示したウェルには、培地が消費されたときに、ＩＬ−２を含有する新鮮な培地を供給した。培養中にて１２〜１６日後、細胞を回収し、そしてクロム放出アッセイにおけるＨＣＭＶマトリックスタンパク質の認識についてアッセイした。
【００５０】
実施例４．　クロム放出アッセイ
［０００４９］　ＨＣＭＶ ｐｐｌ５０に対するＤＮＡを含有する組換えワクシニアウィルスまたは野生型ウィルス、ＷＲ系統、を用いた感染による自己由来またはＨＬＡ−ミスマッチ（対照）標的抗原提示細胞を調製した。一晩感染させた後、抗原提示細胞をクロム−５１とともにインキュベートし、そしてアッセイを既知の方法に従って行った。クロム放出アッセイにおいて、ワクシニア−感染標的細胞をクロム−５１でロードし、そしてその後Ｔ−細胞（エフェクター細胞）と混合した。好ましくは、細胞を、２０：１から１：１まで変化する一連のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）細胞比で混合した。４時間のインキュベーション期間の後、細胞をインキュベートした培地を回収した。培地中への放射活性の放出（Ｒｅ）を、ガンマシンチレーションカウンターで定量した。感染抗原提示細胞が自発的な溶解を示し、そして細胞傷害性Ｔリンパ球の非存在下での放射活性の放出（ＲＳ）の程度を、それぞれのウィルスベクターについて確立した。標的細胞中に取り込まれそして放出可能な放射活性の最大量（Ｒｍａｘ）を、界面活性剤（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００； Ｓｉｇｍａ）溶液中で標的細胞の溶解により確立した。細胞傷害性の割合は、以下の様に表現した：
１００×（（Ｒｅ）−（Ｒｓ））／（（Ｒｍａｘ）−（Ｒｓ））
自発的放出（Ｒｓ）が３０％未満ではなかった場合には、アッセイは許容不可能であるとみなされ、そして繰り返された。ｐｐ１５０についての肯定的な結果から、試験されたポリクローナル集団において、ウィルスにより発現されるｐｐ１５０ ＨＣＭＶタンパク質を認識するＴ細胞が存在することが示される。
【００５１】
実施例５．　ｐｐ１５０感染線維芽細胞を利用したＣＴＬクローンの誘導
［０００５０］　ＣＴＬを誘導するさらに別の方法は、ｐｐ１５０を含むＨＣＭＶタンパク質の組換え型を発現する自己由来抗原提示細胞を作製することである。実施例１において記載した線維芽細胞の単層を、ｐｐ１５０ Ｖａｃにより感染させ、そしてウィルスを数時間のあいだ細胞上で増殖させる。単層を洗浄し、そしてＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒＴＭ装置（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＬａＪｏｌｌａ， ＣＡ）を使用して照射する。この手順により、ワクシニアウィルスのさらなる増殖を不活性化するが、しかしながら発現は継続させる。白血球細胞を実施例３に記載したように、単層に添加する。この刺激は、ＨＣＭＶタンパク質に対して向けられるものであり、そしてｐｐ１５０に対して特異的な免疫応答に焦点を当てるものである。
【００５２】
実施例６．　ＣＴＬエピトープの同定
［０００５１］　皮膚線維芽細胞上のＨＣＭＶによるかまたはｐｐｌ５０ Ｖａｃ−感染線維芽細胞により２回刺激された白血球細胞を、９６ウェルＵ−底プレート中で限界希釈することによりクローン化した。抗−ＣＤ４抗体を結合させた常磁性ビーズを使用して、白血球細胞からＣＤ４＋ Ｔ細胞を枯渇させた。フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡によりアッセイしたところ、得られた集団は、概して信頼性の高いＴ細胞サブセットマーカーであるＣＤ８＋が９０〜９５％のあいだであり、そして概してほとんどの末梢血Ｔ細胞のマーカーであるＣＤ３＋が９９％であった。この最終的な集団を、０．３〜３細胞／ウェルのあいだの濃度で、最終容量１５０μｌで、プレート化した。それぞれのウェルはまた、５０〜１００ ＩＵ／ｍｌの組換えＩＬ−２（Ｃｈｉｒｏｎ−Ｃｅｔｕｓ）および０．５μｇ／ｍｌ ＰＨＡ（Ｍｕｒｅｘ）を添加したヒトＡＢ＋血清を含有するＴ細胞培地中に、γ−照射した１．０〜３．０×１０５同種異系末梢血単核細胞を含有した。
【００５３】
［０００５２］　３日間の培養の後、ＰＨＡを７５μｌをｒＩＬ−２を添加した新鮮な培養培地に交換することにより２−倍に希釈した。ウェルに３〜４日ごとに新鮮なｒＩＬ−２を添加し、そして培地を必要に応じて置換した。細胞を１２〜１４日に新鮮な同種異系の末梢血単核細胞により上述したように再刺激し、そしてプレートを個々のウェルでの増殖について注意深く観察した。見ることができる細胞増殖は、増殖しているＴ細胞をより大きなウェルに移す必要性があることを示した。Ｔ細胞を２週間ごとに最刺激し、そしてより大きなウェルに段階的に移した。
【００５４】
［０００５３］　数百万個の細胞の蓄積の段階において、あるものは冷凍保存し、別のものをクロム放出アッセイのために使用した。標的細胞はＨＣＭＶ感染した線維芽細胞、感染していない線維芽細胞、または野生型ワクシニアまたはｐｐ１５０または短縮型ｐｐ１５０を発現するワクシニアウィルスのいずれかで感染させた自己由来白血球細胞株であった。ＨＬＡミスマッチ型線維芽細胞および白血球を対照として使用した。ＨＣＭＶおよびｐｐｌ５０−特異的であり、そして自己由来標的に対してのみ反応性であるＴ細胞クローンを、陽性なものとして選択した。異なるＨＬＡ表現型を有するＴ細胞クローンを、異なるＨＬＡ遺伝子型を有するボランティア由来の初めの末梢血サンプルを使用して、同様に単離した。ｐｐ１５０から取り出した合成１５〜２０アミノ酸ペプチドおよびその欠損物を含む、より小さな部分のｐｐ１５０を提示する標的細胞を使用したこの方法を繰り返すことにより、その特定のＨＬＡアリルのための最小細胞傷害性エピトープを発見した。
【００５５】
［０００５４］　すべてのペプチドの純度を、移動相としてアセトニトリル／ＴＦＡを使用するＶｙｄａｃ Ｃ１８カラム上でＨＰＬＣにより確認した。好ましくは、ペプチドは純度７０〜８０％以上であるべきであり、そしてクラスＩ拘束性ペプチドを認識するＣＴＬの特徴であるＣＤ８＋状態を確認すべきである。
【００５６】
実施例７．　骨髄移植患者の免疫化
［０００５５］　本発明による治療的に活性な型の抗原性ペプチドを、一回投与または骨髄移植の前所定日数または所定週数により分割された複数回投与において組織の贈与の前十分な時間に（たとえば６〜８週間）、ＨＣＭＶ−血清陽性骨髄移植ドナーに対して投与し、抗−ＨＣＭＶ細胞性免疫応答の発生を可能にする。抗原性ペプチドを明細書中で記載したパラメータにしたがって、または既知の方法のいずれかに従って作製することができ、アジュバントとともにまたは伴わずに投与することができる。好ましくは、複数投与を与える。操作されていない骨髄移植物をレシピエントに対して与えるべきである場合、そのような移植物には２５％またはそれより多い成熟Ｔ細胞を含有しうる。免疫化されたドナー骨髄中に存在するＴ細胞により骨髄移植レシピエントに対する活性免疫を付与しうる。あるいは、Ｔ細胞−枯渇骨髄移植物を使用すべき場合、レシピエント患者にＨＣＭＶ免疫を与えるために移植後（たとえば、約２１〜３５日後）に、免疫化したドナー由来のＴ細胞のアリコートを患者に対して投与した。
【００５７】
実施例８．　子どもを持っている期間の健康成人女性の免疫化
［０００５６］　本発明に従う抗原性ペプチドの治療型を、受胎前または受胎後のいずれかの子供を有する期間のＨＣＭＶ−陰性またはＨＣＭＶ−陽性女性に対して投与する。単一または複数−エピトープワクチンを含むワクチンは、女性と接触する可能性がある胎児および子供の第一次のＨＣＭＶ感染を予防しまたは減少させる。ワクチンを使用して、新規なＨＣＭＶ感染を予防し、または発生途上の胎児に対して有害でありうる存在する感染を限定的にする。
【００５８】
実施例９．　修飾ワクシニアアンカラ株（ＭＶＡ）感染ＥＢＶ−ＬＣＬの認識
［０００５７］　ＨＣＭＶ ｐｐ１５０を発現する組換え修飾ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）を使用して、ＨＬＡ Ａ＊０３０１アリルまたはＡ＊６８ｘｘアリルを有する個体由来のＥＢＶ ＬＣＬを感染させた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２のエピトープ類に特異的なＴ−細胞クローンは、実施例３について記載したように行ったクロム放出アッセイにおいてこれらの標的を認識することができた。非常に実質的な溶解（＞６０％特異的細胞傷害性）が見られ、野生型ＭＶＡを発現する標的により見られたものよりも５倍以上の特異性を有した。
【００５９】
実施例１０．　ＣＭＶペプチドと複合体形成したＨＬＡ四量体試薬を用いたＣＭＶ免疫性についてのスクリーニング
［０００５８］　末梢血を、同意を得た後に、同種異系造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）のヒトドナーおよびレシピエントから採取する。好都合なことに、研究参加者は、脊髄形成異常を含む血液学的悪性性について同種異系ＨＳＣＴを受けた、関連するきょうだいのドナーおよびレシピエントであってもよい。ドナーおよび／またはレシピエントは、ＣＭＶ血清陽性であり、そしてすべてはＨＩＶ−陰性である。ドナーサンプルは、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）の投与の前、そして３〜５日後、移植のための細胞の採取時に取り出される。レシピエント血液サンプルを、移植（幹細胞注入）の４０、９０、１２０、１５０および１８０日後に取り出す。ＣＭＶ再活性化についてのモニタリングを、ＰＣＲおよび血漿サンプルについての血液培養シェルバイアルアッセイの両方により、通常の患者管理の一部として、１週間に２回行う。ＣＭＶ再活性化を検出する場合（２回の陽性のＰＣＲアッセイとしてまたは１回の陽性血液培養結果として定義）、患者を予防的ガンシクロビルにより６週間の間治療する。
【００６０】
［０００５９］　末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、標準的密度勾配遠心分離により、ヘパリン化血液から単離し、洗浄し、１０％ＤＭＳＯを含むＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ， Ｌｏｇａｎ， ＴＵ）中で再懸濁し、分配し、そして液体Ｎ２中で冷凍保存する。解凍したＰＢＭＣに対して研究を行い、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することなくまたは刺激することなく、直接的にアッセイした。細胞を以下のようにして調製した四量体試薬であるＨＬＡ Ａ＊０３０１（Ａ３）またはＨＬＡ Ａ＊６８０１（Ａ６８）により標識した。四量体試薬を既知の方法を使用して、再フォールディングしそして精製する。都合よくは、試薬は、多少変更したＭＡＩＤ Ｔｅｔｒａｍｅｒ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙにより使用される手順を使用して調製することができる（ｗｗｗ．ｅｍｏｒｙ．ｅｄｕ／ＷＨＳＣ／ＹＥＲＫＥＳ／ＶＲＣ／ｔｅｔｒａｍｅｒ．ｈｔｍｌ）。簡単に述べれば、ベクターｐＨＮ１中でクローン化したＡ３またはＡ６８重鎖およびβ−２−ミクログロブリン（β２Ｍ）を、Ｅ． ｃｏｌｉ ＸＡ９０中で発現し、そしてそれぞれペプチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または２により再フォールディングする。再フォールディングしたＨＬＡ−Ａ３またはＡ６８／β２Ｍ／ペプチド複合体を、酵素ＢｉｒＡ（Ａｖｉｄｉｔｙ Ｉｎｃ．）を使用してビオチン化し、そしてその後Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００ゲルろ過カラムを使用するＦＰＬＣにより精製した後、ＭｏｎｏＱイオン交換カラムにより精製する。精製したビオチン化ＨＬＡ−Ａ３またはＡ６８／β２Ｍ／ペプチド複合体を、ストレプトアビジン−ＰＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）またはストレプトアビジン−ＡＰＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）のいずれかと結合させる。典型的には細胞の標識化は、０．５μｇのテトラマーを使用して０．５〜１．０×１０６細胞を５０〜１００μｌ容量のＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ中で２０分間染色することにより行う。その後細胞を洗浄し、そしてＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒＴＭ（ＢＤＩＳ）フローサイトメーター上で解析した。リンパ球ゲートを前方および側面散乱に基づいて設定し、そして最小で３０，０００のゲート化現象を捕捉した。四分区画を陰性対照に基づいて設定し、そして四量体−陽性細胞の数を白血球集団のパーセントとして表現する。
【００６１】
実施例１１．　ペプチド刺激に対する白血球によるＩＦＮ−γ産生の検出
［０００６０］　ＰＢＭＣの解凍したアリコートを冷バッファー（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ）で洗浄し、そして実施例１０において記載したように調製した四量体試薬により、またはいずれかの従来法により、２０分間標識する。その後細胞を洗浄し、１０％ＦＣＳを添加した１ ｍｌ ＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で再懸濁し、そして３７℃にて一晩、５％Ｃ０２インキュベーター中でインキュベートする。Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇＴＭ， Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を１時間後に１μＭになるまで添加する。あるアリコートに対してはウィルスエピトープペプチド（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：１または２）を１０μｇ／ｍｌで添加し、そして他のものには関係のないＨＬＡ−拘束性ペプチドを陰性対照として添加する。後日に、細胞を洗浄し、そして個別の１２×７５ ｍｍチューブ中にアリコート当たり１×１０６細胞となるようにさらにアリコートに分ける。細胞を４℃にて２０分間、５０μｌのバッファー中でインキュベーションすることによりＣＤ８に対するＦＩＴＣ−結合抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）により標識する。その後細胞を洗浄し、固定し、そして浸透性にし（Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ， Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｌａ Ｊｏｌｉａ， ＣＡ）、その後４℃にて２０分間、５μｌのＩＦＮ−γに対するＡＰＣ−結合抗体により標識する。標識した細胞を洗浄し、フローサイトメトリーにより解析する。
【国際公開パンフレット】
2004512039.tif 000004
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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