(57)【要約】本発明は概して、使用前に保存のために臓器を凍結するおよび/または乾燥するための組成物および方法に関する。具体的には、本発明は臓器を形成させるために使われる細胞の遺伝的改変であって、その結果、遺伝的に改変された細胞から形成される臓器を乾燥することができる細胞の遺伝的改変に関する。本発明によれば、植物後期胚形成タンパク質HVAI、トレハロース輸送タンパク質、またはトレハロース合成経路をコードする遺伝子で哺乳動物細胞を改変することができる。本発明は同様に、凍結および/または乾燥によって保存されていた臓器で患者を治療する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トレハロース輸送タンパク質をコードする遺伝子を含む哺乳動物細胞。
【請求項２】
トレハロース輸送タンパク質がAGT1である、請求項1記載の哺乳動物細胞。
【請求項３】
トレハロース輸送タンパク質がプロモーターに作動可能に連結される、請求項1記載の哺乳動物細胞。
【請求項４】
プロモーターが誘導的プロモーターおよび構成的プロモーターからなる群より選択される、請求項3記載の哺乳動物細胞。
【請求項５】
安定的にトランスフェクトされる、請求項1記載の哺乳動物細胞。
【請求項６】
ケラチノサイトである、請求項1記載の哺乳動物細胞。
【請求項７】
不死化ケラチノサイトである、請求項6記載のケラチノサイト。
【請求項８】
NIKS細胞である、請求項6記載のケラチノサイト。
【請求項９】
幹細胞、組織培養細胞、初代培養細胞および不死化細胞からなる群より選択される、請求項1記載の哺乳動物細胞。
【請求項１０】
請求項1記載の哺乳動物細胞を含む臓器。
【請求項１１】
皮膚である、請求項10記載の臓器。
【請求項１２】
皮膚、心臓、肝臓、膵臓、腎臓および肺からなる群より選択される、請求項10記載の臓器。
【請求項１３】
乾燥される、請求項10記載の臓器。
【請求項１４】
凍結乾燥される、請求項13記載の臓器。
【請求項１５】
空気乾燥されるかまたは真空乾燥される、請求項13記載の臓器。
【請求項１６】
乾燥される、請求項1記載の細胞。
【請求項１７】
凍結乾燥される、請求項16記載の細胞。
【請求項１８】
空気乾燥されるかまたは真空乾燥される、請求項16記載の細胞。
【請求項１９】
請求項1記載の哺乳動物細胞およびその使用のための使用説明書を含むキット。
【請求項２０】
請求項10記載の臓器および患者の治療におけるその使用のための使用説明書を含むキット。
【請求項２１】
哺乳動物細胞で機能するプロモーターに作動可能に連結されたトレハロース輸送タンパク質をコードする遺伝子を含む哺乳動物発現ベクター。
【請求項２２】
トレハロース合成経路をコードする1つまたは複数の遺伝子を含む哺乳動物細胞。
【請求項２３】
トレハロース合成経路をコードする遺伝子がotsAおよびotsBを含む、請求項22記載の哺乳動物細胞。
【請求項２４】
otsA遺伝子が配列番号:7の核酸配列を有し、otsB遺伝子が配列番号:6の核酸配列を有する、請求項23記載の哺乳動物細胞。
【請求項２５】
otsAおよびotsB遺伝子が少なくとも1つの発現ベクター中に存在し、該otsAおよびotsB遺伝子が少なくとも1つのプロモーターに作動可能に連結される、請求項23記載の哺乳動物細胞。
【請求項２６】
プロモーターが誘導的プロモーターおよび構成的プロモーターからなる群より選択される、請求項25記載の哺乳動物細胞。
【請求項２７】
otsAおよびotsB遺伝子が2つの別の発現ベクター上に載っている、請求項25記載の哺乳動物細胞。
【請求項２８】
2つの別の発現ベクターがおよそotsBを含む発現ベクター1に対しotsAを含む発現ベクター2の割合で存在する、請求項27記載の哺乳動物細胞。
【請求項２９】
otsAおよびotsB遺伝子の機能が単一遺伝子に載っている、請求項23記載の哺乳動物細胞。
【請求項３０】
請求項22記載の哺乳動物細胞を含む臓器。
【請求項３１】
請求項22記載の哺乳動物細胞を含むヒト皮膚同等物。
【請求項３２】
乾燥される、請求項31記載のヒト皮膚同等物。
【請求項３３】
凍結乾燥される、請求項31記載のヒト皮膚同等物。
【請求項３４】
空気乾燥されるかまたは真空乾燥される、請求項31記載のヒト皮膚同等物。
【請求項３５】
乾燥される、請求項22記載の哺乳動物細胞。
【請求項３６】
凍結乾燥される、請求項22記載の哺乳動物細胞。
【請求項３７】
空気乾燥されるかまたは真空乾燥される、請求項22記載の哺乳動物細胞。
【請求項３８】
請求項22記載のヒト皮膚同等物および患者の治療におけるその使用のための使用説明書を含むキット。
【請求項３９】
哺乳動物細胞を保存する方法であって
a) トレハロース輸送タンパク質をコードする遺伝子を含む細胞を提供する段階;
b) トレハロース輸送タンパク質をコードする該遺伝子が発現されてトレハロースが該細胞中に取り込まれるような条件下で該細胞を培養する段階; および
c) 該哺乳動物細胞を乾燥する段階
を含む方法。
【請求項４０】
乾燥する段階の前に細胞を凍結する段階をさらに含む、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
細胞が安定的にトランスフェクトされる、請求項39記載の方法。
【請求項４２】
細胞がケラチノサイトである、請求項39記載の方法。
【請求項４３】
細胞がNIKS細胞である、請求項39記載の方法。
【請求項４４】
NIKS細胞が重層化される、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
哺乳動物細胞が臓器中に存在する、請求項39記載の方法。
【請求項４６】
臓器が皮膚である、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
臓器がヒト皮膚同等物である、請求項45記載の方法。
【請求項４８】
臓器がNIKS細胞を含む、請求項45記載の方法。
【請求項４９】
臓器が重層化NIKS細胞を含む、請求項45記載の方法。
【請求項５０】
乾燥する段階が凍結乾燥する段階を含む、請求項39記載の方法。
【請求項５１】
乾燥する段階が空気乾燥する段階または真空乾燥する段階を含む、請求項39記載の方法。
【請求項５２】
細胞を培養する段階が約5.5またはそれ以下のpHで行われる、請求項39記載の方法。
【請求項５３】
哺乳動物細胞を保存する方法であって、
a) トレハロース合成経路をコードする1つまたは複数の遺伝子を含む哺乳動物細胞を提供する段階;
b) トレハロース合成経路をコードする該遺伝子が発現されるような条件下で該哺乳動物細胞を培養する段階; および
c) 該哺乳動物細胞を乾燥する段階
を含む方法。
【請求項５４】
細胞を乾燥する段階の前に細胞を凍結する段階をさらに含む、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
トレハロース合成経路がotsAおよびotsB遺伝子を含む、請求項53記載の方法。
【請求項５６】
otsA遺伝子が配列番号:7の核酸配列を有し、otsB遺伝子が配列番号:6の核酸配列を有する、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
otsAおよびotsB遺伝子が少なくとも1つの発現ベクター中に存在し、該otsAおよびotsB遺伝子が少なくとも1つのプロモーターに作動可能に連結される、請求項55記載の方法。
【請求項５８】
プロモーターが誘導的プロモーターである、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
プロモーターが構成的プロモーターである、請求項57記載の方法。
【請求項６０】
otsAおよびotsB遺伝子が2つの別の発現ベクター上に載っている、請求項57記載の方法。
【請求項６１】
2つの別の発現ベクターがおよそotsBを含む発現ベクター1に対しotsAを含む発現ベクター2の割合で存在する、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
otsAおよびotsB遺伝子の機能が単一遺伝子に載っている、請求項23記載の哺乳動物細胞。
【請求項６３】
細胞が安定的にトランスフェクトされる、請求項53記載の方法。
【請求項６４】
細胞がケラチノサイトである、請求項53記載の方法。
【請求項６５】
ケラチノサイトがNIKS細胞である、請求項64記載の方法。
【請求項６６】
細胞が臓器中に存在する、請求項53記載の方法。
【請求項６７】
臓器が皮膚である、請求項66記載の方法。
【請求項６８】
臓器がヒト皮膚同等物である、請求項66記載の方法。
【請求項６９】
臓器がNIKS細胞を含む、請求項66記載の方法。
【請求項７０】
乾燥する段階が凍結乾燥する段階を含む、請求項54記載の方法。
【請求項７１】
乾燥する段階が空気乾燥する段階または真空乾燥する段階を含む、請求項54記載の方法。
【請求項７２】
哺乳動物細胞を凍結する方法であって
a) トレハロースを含んでおりトレハロースで細胞外から処理されている、不死化ケラチノサイト細胞を提供する段階;
b) 該細胞をオキシアニオンで処理する段階; 
c) 該細胞を乾燥する段階
を含む方法。
【請求項７３】
細胞を乾燥する段階の前に細胞を凍結する段階をさらに含む、請求項72記載の方法。
【請求項７４】
オキシアニオンがリン酸塩である、請求項72記載の方法。
【請求項７５】
患者を治療する方法であって
a) ある状態に苦しむ患者に乾燥により保存された臓器を提供する段階;
b) 該状態が軽減されるような条件下で該患者を乾燥により保存された該臓器で治療する段階
を含む方法。
【請求項７６】
患者が熱傷、創傷、供与部位創および潰瘍からなる群より選択される状態に苦しんでいる、請求項75記載の方法。
【請求項７７】
臓器が外因性トレハロース輸送体タンパク質を発現する細胞を含む、請求項75記載の方法。
【請求項７８】
臓器がトレハロース合成経路を発現する細胞を含む、請求項75記載の方法。
【請求項７９】
哺乳動物細胞を保存する方法であって
a) トレハロース合成経路をコードする遺伝子を含む細胞を提供する段階;
b) 該細胞が少なくとも5 mMの濃度で細胞内のトレハロースを含むような条件下で該細胞を培養する段階; および
c) 該哺乳動物細胞を凍結する段階
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は概して、使用前に保存のために臓器を凍結するおよび/または乾燥するための組成物および方法に関する。具体的には、本発明は細胞の遺伝的改変であって、その結果、その細胞そのものまたはその細胞から形成される組織および臓器を乾燥することができる細胞の遺伝的改変に関する。なお、本出願は、2003年5月30日付で出願された米国特許仮出願第60/474,334号に対する優先権を主張するものであり、その仮出願はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。本出願は部分的に、ATP助成金番号NIST 70NANB3H3011による資金援助を受けた。米国政府は本発明において一定の権利を有するものである。
【背景技術】
【０００２】
背景
再生医療(TE)の新興分野は、これから数十年の間には臓器の疾患および機能不全の治療で大きな進歩を遂げる態勢にある。現在、細胞に基づく23種の治療薬が米国および欧州で市場向けに承認されていて、そのうちの9種が代用皮膚または移植片であり、開発中の製品は100以上存在している(De Bree, Genomics-based Drug Data Report and Regenerative Therapy (1)2:77-96 (2001))。全体として、この業界には1995年から2001年までに16%の年間成長率があった。「生体構造の」業界(例えば、皮膚、骨、軟骨)は1998年から2001年までに85%の成長を示した。
【０００３】
培養組織および臓器に関する多数の画期的で経済的に重要な用途がヒトの健康分野に存在してはいるが、その産業の完全な経済的潜在力は決して実現されていない。現在、35億ドルを超えるこれらの技術への世界的規模の投資にもかかわらず、世界的に見て、再生医療関連の上場企業のうちで1社しか利益を示していない(Lysaght and Reyes, Tissue Engineering 7(5):485-93 (2001))。さらに、ここ数ヶ月間、この産業の後退によって操業中止または少なくとも2つの製品(Organogenesis社のAPLIGRAFおよびAdvanced Tissue Sciences社のDERMAGRAFT)の市場からの撤退が起こった。
【０００４】
開業医、医療介護提供者および第二者である支払者による培養組織の受け入れに対する主な障害は、効果的かつ効率的に培養組織を保存するための手段がないということである。生存細胞の製品の性質により、それらは長期保存には実用的ではない。現在の培養組織はたいてい、生存性および機能を保持するために入念に管理された条件下で保存および輸送されなければならない。通常、培養組織の製品は生産するのに数週間または数ヶ月かかるが、製造後には数時間または数日間以内に使用されなければならない。結果として、培養組織関連の企業はフル操業でその生産施設を継続的に稼動させなければならず、棚卸損(すなわち、廃棄しなければならない売れ残りの製品)の費用を自社で取り込まなければならない。ただでさえ費用のかかる製造工程に加え、これらの棚卸損によって、価格を非現実的なレベルにせざるを得なかった。1つの具体例として、APLIGRAFは製造するのに約4週間必要とし、6日未満の間に使用可能であり、使用されるまで20℃〜37℃に維持されなければならない。他の例として、EPICELは携帯用のインキュベーターに入れられてCambridge, MAから使用地点まで看護師により輸送されて、到着後すぐに使用されている。このような制約は使いやすくて費用効率の高い製品の開発にとり重大な課題となっている。
【０００５】
冷凍保存法は保存問題の解決法として検討されてきたが、しかし氷形成、冷害および浸透バランスによって組織損傷を引き起こすことが知られている。APLIGRAFに加えて、その他に唯一承認されている皮膚同等物ORCELは現在、凍結製品として臨床試験にあるが、これは使用の前には-100℃未満の温度に維持されなければならないという欠点がある。このことは、高価で、危険性があって、普遍的に利用できない(例えば、田舎の診療所および野戦病院)液体窒素保存の利用を意味している。さらに、凍結製品の送達には、使用の前に組織をうまく融解するために末端利用者側の特別な訓練が必要になる。
【０００６】
したがって、当技術分野において必要とされているものは、保存用に最適化されている改良型の培養細胞および組織ならびに長期の室温保存用の培養組織および細胞を調製する方法である。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明は概して、使用前に保存のために臓器を凍結するおよび/または乾燥するための組成物および方法に関する。具体的には、本発明は細胞の遺伝的改変であって、その結果、その細胞そのものまたはその細胞から形成される組織および臓器を乾燥することができる細胞の遺伝的改変に関する。したがって、いくつかの態様では、本発明は異種の後期胚形成主要タンパク質をコードする遺伝子を含む哺乳動物細胞を提供する。本発明はいずれかの特定の後期胚形成主要タンパク質の使用に限定されることはない。実際に、グループ3植物後期胚形成主要タンパク質を含めて、様々な後期胚形成主要タンパク質の使用を企図するものである。いくつかの特に好ましい態様では、後期胚形成主要タンパク質はHVA1である。他の好ましい態様では、細胞に後期胚形成主要タンパク質遺伝子を安定的にトランスフェクトする。さらに好ましい態様では、後期胚形成タンパク質遺伝子をプロモーターに作動可能に連結する。本発明はいずれかの特定のプロモーターの使用に限定されることはない。実際に、誘導的および構成的プロモーターを含めて、様々なプロモーターを本発明の中で使用することができる。他の好ましい態様では、哺乳動物細胞はケラチノサイトである。いくつかの態様では、ケラチノサイトは初代ケラチノサイトである。他の好ましい態様では、細胞は不死化ケラチノサイトである。特に好ましい態様では、ケラチノサイトはNIKS細胞である。他の好ましい態様では、NIKS細胞を重層化する。他の態様では、細胞は幹細胞、組織培養細胞、初代培養細胞および不死化細胞からなる群より選択される。いくつかの態様では、細胞を乾燥させる。本発明はいずれかの特定の方法によって乾燥された細胞に限定されることはない。実際に、凍結乾燥、空気乾燥および真空乾燥を含むがこれらに限定されない、様々な方法によって、細胞を乾燥させることができる。
【０００８】
他の好ましい態様では、本発明は異種の後期胚形成主要タンパク質を発現する哺乳動物細胞を含む組織または臓器を提供する。本発明はいずれかの特定の臓器に限定されることはない。実際に、本発明は皮膚、心臓、肝臓、膵臓、腎臓および肺を含むがこれらに限定されない、様々な臓器を産生する細胞の使用を企図するものである。いくつかの好ましい態様では、臓器はヒト皮膚同等物である。さらにより好ましい態様では、臓器はNIKS細胞を含む。他の好ましい態様では、臓器は重層化NIKS細胞を含む。いくつかの態様では、臓器を乾燥させる。本発明はいずれかの特定の方法によって乾燥された臓器に限定されることはない。実際に、凍結乾燥、空気乾燥および真空乾燥を含むがこれらに限定されない、様々な方法によって、臓器を乾燥させることができる。
【０００９】
他の態様では、本発明は異種の後期胚形成主要タンパク質を発現する哺乳動物細胞およびその使用のための使用説明書を含むキットを提供する。さらなる態様では、本発明は異種の後期胚形成主要タンパク質を発現する哺乳動物細胞を含む臓器およびその使用のための使用説明書を含むキットを提供する。
【００１０】
いくつかの態様では、本発明は、哺乳動物細胞で機能するプロモーターに作動可能に連結された植物後期胚形成主要タンパク質をコードする遺伝子を載せた哺乳動物発現ベクターを提供する。いくつかの好ましい態様では、後期胚形成主要タンパク質はグループ3植物後期胚形成主要タンパク質である。他の好ましい態様では、後期胚形成タンパク質はHVA1である。
【００１１】
いくつかの態様では、本発明は異種の糖(例えば、トレハロース)輸送タンパク質をコードする遺伝子を含む哺乳動物細胞を提供する。本発明はいずれかの特定のトレハロース輸送タンパク質の使用に限定されることはない。実際に、変異型、バリアントおよび切断型のトレハロース輸送タンパク質を含めて、様々なトレハロース輸送タンパク質の使用を企図するものである。いくつかの好ましい態様では、トレハロース輸送タンパク質はAGT1(例えば、配列番号:3のAGT1)である。他の好ましい態様では、細胞にトレハロース輸送タンパク質(遺伝子)を安定的にトランスフェクトする。さらに好ましい態様では、トレハロース輸送タンパク質をプロモーターに作動可能に連結する。本発明はいずれかの特定のプロモーターの使用に限定されることはない。実際に、誘導的および構成的プロモーターを含めて、様々なプロモーターを本発明の中で使用することができる。他の好ましい態様では、哺乳動物細胞はケラチノサイトである。いくつかの態様では、ケラチノサイトは初代ケラチノサイトである。他の好ましい態様では、細胞は不死化ケラチノサイトである。特に好ましい態様では、ケラチノサイトはNIKS細胞である。他の好ましい態様では、NIKS細胞を重層化する。他の態様では、細胞は幹細胞、組織培養細胞、初代培養細胞および不死化細胞からなる群より選択される。いくつかの態様では、細胞を乾燥させる。本発明はいずれかの特定の方法によって乾燥された細胞に限定されることはない。実際に、凍結乾燥、空気乾燥および真空乾燥を含むがこれらに限定されない、様々な方法によって、細胞を乾燥させることができる。
【００１２】
他の好ましい態様では、本発明は異種のトレハロース輸送タンパク質を発現する哺乳動物細胞を含む組織または臓器を提供する。本発明はいずれかの特定の臓器に限定されることはない。実際に、本発明は皮膚、心臓、肝臓、膵臓、腎臓および肺を含むがこれらに限定されない、様々な臓器を産生する細胞の使用を企図するものである。いくつかの好ましい態様では、臓器はヒト皮膚同等物である。さらにより好ましい態様では、臓器はNIKS細胞を含む。他の好ましい態様では、臓器は重層化NIKS細胞を含む。いくつかの態様では、臓器を乾燥させる。本発明はいずれかの特定の方法によって乾燥された臓器に限定されることはない。実際に、凍結乾燥、空気乾燥および真空乾燥を含むがこれらに限定されない、様々な方法によって、臓器を乾燥させることができる。
【００１３】
他の態様では、本発明は異種のトレハロース輸送タンパク質を発現する哺乳動物細胞およびその使用のための使用説明書を含むキットを提供する。さらなる態様では、本発明は異種のトレハロース輸送タンパク質を発現する哺乳動物細胞を含む臓器およびその使用のための使用説明書を含むキットを提供する。
【００１４】
いくつかの態様では、本発明は、哺乳動物細胞で機能するプロモーターに作動可能に連結されたトレハロース輸送タンパク質をコードする遺伝子を載せた哺乳動物発現ベクターを提供する。
【００１５】
いくつかの態様では、本発明は異種のトレハロース合成経路をコードする遺伝子を含む細胞を提供する。いくつかの態様では、トレハロース合成経路をコードする遺伝子はotsAおよびotsBを含む。いくつかの好ましい態様では、otsAは配列番号:7の核酸配列を有し、otsBは配列番号:6の核酸配列を有する。他の好ましい態様では、ケラチノサイトに異種のトレハロース合成経路遺伝子を安定的にトランスフェクトする。さらに好ましい態様では、異種のトレハロース合成経路をコードする遺伝子をプロモーターに作動可能に連結する。本発明はいずれかの特定のプロモーターの使用に限定されることはない。実際に、誘導的および構成的プロモーターを含めて、様々なプロモーターを本発明の中で使用することができる。いくつかの態様では、otsAおよびotsB遺伝子は同じ発現ベクター中に存在する。他の態様では、それらの遺伝子は2つの異なる発現ベクター上に載っている。いくつかの好ましい態様では、otsAおよびotsB遺伝子は2つの異なる発現ベクター上に載っており、これらの発現ベクターはotsBを含むベクター1に対しotsAを含むベクター2の割合で存在する。いくつかの態様では、otsAおよびotsB遺伝子の機能が1種類の遺伝子および/または1種類の転写産物に含まれている。いくつかの態様では、細胞はケラチノサイトである。いくつかの態様では、ケラチノサイトは初代ケラチノサイトである。他の好ましい態様では、ケラチノサイトは不死化ケラチノサイトである。特に好ましい態様では、ケラチノサイトはNIKS細胞である。他の好ましい態様では、NIKS細胞を重層化する。他の態様では、細胞は幹細胞、組織培養細胞、初代培養細胞および不死化細胞からなる群より選択される。いくつかの態様では、細胞を乾燥させる。本発明はいずれかの特定の方法によって乾燥された細胞に限定されることはない。実際に、凍結乾燥、空気乾燥および真空乾燥を含むがこれらに限定されない、様々な方法によって、細胞を乾燥させることができる。
【００１６】
他の好ましい態様では、本発明は異種のトレハロース合成経路をコードする遺伝子を発現する哺乳動物細胞を含む組織または臓器を提供する。本発明はいずれかの特定の臓器に限定されることはない。実際に、本発明は皮膚、心臓、肝臓、膵臓、腎臓および肺を含むがこれらに限定されない、様々な臓器を産生する細胞の使用を企図するものである。いくつかの好ましい態様では、臓器はヒト皮膚同等物である。さらにより好ましい態様では、臓器はNIKS細胞を含む。他の好ましい態様では、臓器は重層化NIKS細胞を含む。いくつかの態様では、臓器を乾燥させる。本発明はいずれかの特定の方法によって乾燥された臓器に限定されることはない。実際に、凍結乾燥、空気乾燥および真空乾燥を含むがこれらに限定されない、様々な方法によって、臓器を乾燥させることができる。
【００１７】
他の態様では、本発明は異種のトレハロース合成経路をコードする異種遺伝子を発現する哺乳動物細胞およびその使用のための使用説明書を含むキットを提供する。さらなる態様では、本発明は異種のトレハロース輸送タンパク質を発現する哺乳動物細胞を含む臓器およびその使用のための使用説明書を含むキットを提供する。
【００１８】
いくつかの態様では、本発明は、哺乳動物細胞で機能するプロモーターに作動可能に連結された異種のトレハロース合成経路をコードする遺伝子を載せた哺乳動物発現ベクターを提供する。
【００１９】
いくつかの態様では、本発明は哺乳動物細胞を保存する方法であって、a) 植物後期胚形成主要タンパク質をコードする遺伝子を含む細胞を提供する段階; b) 植物後期胚形成主要タンパク質をコードするその遺伝子が発現されるような条件下でその細胞を培養する段階; およびc) その哺乳動物細胞を凍結する段階を含む方法を提供する。いくつかの態様では、この方法はd) その細胞を乾燥する段階をさらに含む。本発明はいずれかの特定の後期胚形成主要タンパク質の使用に限定されることはない。実際に、グループ3植物後期胚形成主要タンパク質を含めて、様々な後期胚形成主要タンパク質の使用を企図するものである。いくつかの特に好ましい態様では、後期胚形成主要タンパク質はHVA1である。他の好ましい態様では、細胞に後期胚形成主要タンパク質を安定的にトランスフェクトする。さらに好ましい態様では、後期胚形成タンパク質遺伝子をプロモーターに作動可能に連結する。本発明はいずれかの特定のプロモーターの使用に限定されることはない。実際に、誘導的および構成的プロモーターを含めて、様々なプロモーターを本発明の中で使用することができる。他の好ましい態様では、哺乳動物細胞はケラチノサイトである。いくつかの態様では、ケラチノサイトは初代ケラチノサイトである。他の好ましい態様では、細胞は不死化ケラチノサイトである。特に好ましい態様では、ケラチノサイトはNIKS細胞である。他の好ましい態様では、NIKS細胞を重層化する。他の態様では、細胞は幹細胞、組織培養細胞、初代培養細胞および不死化細胞からなる群より選択される。本発明はいずれかの特定の方法による乾燥に限定されることはない。実際に、凍結乾燥、空気乾燥および真空乾燥を含むがこれらに限定されない、様々な方法によって、細胞を乾燥させることができる。
【００２０】
いくつかの態様では、細胞を臓器中に組み込む。いくつかの好ましい態様では、臓器は皮膚である。他の好ましい態様では、臓器はヒト皮膚同等物である。いくつかの態様では、臓器はNIKS細胞を含む。他の好ましい態様では、臓器は重層化NIKS細胞を含む。
【００２１】
いくつかの態様では、本発明は哺乳動物細胞を保存する方法であって、a) トレハロース輸送タンパク質(例えば、AGT1を含むが、これに限定されることはない)をコードする遺伝子を含む細胞を提供する段階; b) トレハロース輸送タンパク質をコードするその遺伝子が発現されるような条件下でその細胞を培養する段階; c) トレハロースが輸送タンパク質によって細胞中に取り込まれるような条件下でトレハロースに細胞を曝露する段階; およびd) その哺乳動物細胞を凍結する段階を含む方法を提供する。いくつかの好ましい態様では、細胞にトレハロース輸送タンパク質を安定的にトランスフェクトする。さらに好ましい態様では、トレハロース輸送タンパク質遺伝子をプロモーターに作動可能に連結する。本発明はいずれかの特定のプロモーターの使用に限定されることはない。実際に、誘導的および構成的プロモーターを含めて、様々なプロモーターを本発明の中で使用することができる。いくつかの態様では、曝露する段階は約5.5またはそれ以下のpHで行われる。他の好ましい態様では、哺乳動物細胞はケラチノサイトである。いくつかの態様では、ケラチノサイトは初代ケラチノサイトである。他の好ましい態様では、細胞は不死化ケラチノサイトである。特に好ましい態様では、ケラチノサイトはNIKS細胞である。他の好ましい態様では、NIKS細胞を重層化する。他の態様では、細胞は幹細胞、組織培養細胞、初代培養細胞および不死化細胞からなる群より選択される。本発明はいずれかの特定の方法による乾燥に限定されることはない。実際に、凍結乾燥、空気乾燥および真空乾燥を含むがこれらに限定されない、様々な方法によって、細胞を乾燥させることができる。
【００２２】
いくつかの態様では、細胞を臓器中に組み込む。いくつかの好ましい態様では、臓器は皮膚である。他の好ましい態様では、臓器はヒト皮膚同等物である。いくつかの態様では、臓器はNIKS細胞を含む。他の好ましい態様では、臓器は重層化NIKS細胞を含む。
【００２３】
いくつかの態様では、本発明は哺乳動物細胞を保存する方法であって、a) トレハロース合成経路をコードする遺伝子を含む細胞を提供する段階; b) トレハロース合成経路をコードするその遺伝子が発現されて、細胞がトレハロースを取り込むような条件下でその細胞を培養する段階; およびc) その哺乳動物細胞を凍結する段階を含む方法を提供する。いくつかの態様では、トレハロース合成経路をコードする遺伝子はotsAおよびotsBを含む。いくつかの好ましい態様では、otsAは配列番号:7の核酸配列を有し、otsBは配列番号:6の核酸配列を有する。いくつかの好ましい態様では、細胞にトレハロース輸送タンパク質を安定的にトランスフェクトする。さらに好ましい態様では、トレハロース合成経路をコードする遺伝子をプロモーターに作動可能に連結する。本発明はいずれかの特定のプロモーターの使用に限定されることはない。実際に、誘導的および構成的プロモーターを含めて、様々なプロモーターを本発明の中で使用することができる。いくつかの態様では、otsAおよびotsB遺伝子は同じ発現ベクター中に存在する。他の態様では、それらの遺伝子は2つの異なる発現ベクター上に載っている。いくつかの好ましい態様では、otsAおよびotsB遺伝子は2つの異なる発現ベクター上に載っており、これらの発現ベクターはotsBを含むベクター1に対しotsAを含むベクター2の割合で存在する。いくつかの態様では、otsAおよびotsB遺伝子の機能が1種類の遺伝子および/または1種類の転写産物に含まれている。他の好ましい態様では、哺乳動物細胞はケラチノサイトである。いくつかの態様では、ケラチノサイトは初代ケラチノサイトである。他の好ましい態様では、細胞は不死化ケラチノサイトである。特に好ましい態様では、ケラチノサイトはNIKS細胞である。他の好ましい態様では、NIKS細胞を重層化する。他の態様では、細胞は幹細胞、組織培養細胞、初代培養細胞および不死化細胞からなる群より選択される。本発明はいずれかの特定の方法による乾燥に限定されることはない。実際に、凍結乾燥、空気乾燥および真空乾燥を含むがこれらに限定されない、様々な方法によって、細胞を乾燥させることができる。
【００２４】
いくつかの態様では、細胞を臓器中に組み込む。いくつかの好ましい態様では、臓器は皮膚である。他の好ましい態様では、臓器はヒト皮膚同等物である。いくつかの態様では、臓器はNIKS細胞を含む。他の好ましい態様では、臓器は重層化NIKS細胞を含む。
【００２５】
さらなる態様では、細胞は異種のトレハロース輸送タンパク質、後期胚形成主要タンパク質およびトレハロース合成経路遺伝子の組合せを含む。
【００２６】
他の態様では、本発明は哺乳動物細胞を凍結する方法であって、a) トレハロースを含んでおりトレハロースで細胞外から処理されてもいる、不死化ケラチノサイト細胞を提供する段階; b) その細胞をオキシアニオンで処理する段階; およびc) その細胞を凍結する段階を含む方法を提供する。いくつかの態様では、この方法はd) その細胞を乾燥する段階をさらに含む。いくつかの態様では、オキシアニオンはリン酸塩である。いくつかの好ましい態様では、ケラチノサイトはNIKS細胞である。さらに好ましい態様では、NIKS細胞を重層化する。他の好ましい態様では、NIKS細胞を重層化する。本発明はいずれかの特定の方法による乾燥に限定されることはない。実際に、凍結乾燥、空気乾燥および真空乾燥を含むがこれらに限定されない、様々な方法によって、細胞を乾燥させることができる。
【００２７】
いくつかの態様では、本発明は患者を治療する方法であって、a) ある状態に苦しむ患者に乾燥により保存された臓器を提供する段階; b) その状態が軽減されるような条件下でその患者を乾燥により保存されたその臓器で治療する段階を含む方法を提供する。いくつかの態様では、臓器を凍結乾燥する。他の態様では、臓器を空気乾燥するかまたは真空乾燥する。さらなる態様では、臓器はケラチノサイトを含む。いくつかの好ましい態様では、ケラチノサイトはNIKS細胞である。他の好ましい態様では、NIKS細胞を重層化する。いくつかの態様では、臓器はヒト皮膚同等物である。他の態様では、患者は熱傷、創傷、供与部位創および潰瘍からなる群より選択される病気に苦しんでいる。いくつかの態様では、臓器は外因性トレハロース輸送体タンパク質を発現する細胞を含む。他の態様では、臓器は植物後期胚形成主要タンパク質を発現する細胞を含む。他の態様では、植物後期胚形成タンパク質はHVA1である。さらなる態様では、臓器はトレハロース合成経路を発現する細胞を含む。
【００２８】
他の態様では、本発明は哺乳動物細胞を保存する方法であって、トレハロース合成経路をコードする遺伝子を含む細胞を提供する段階; 細胞が少なくとも5 mMの濃度で細胞内のトレハロースを含むような条件下で細胞を培養する段階; および哺乳動物細胞を凍結する段階を含む方法を提供する。
【００２９】
定義
本明細書で用いる「ヒト皮膚同等物」および「ヒト代用皮膚」という用語は、重層化して扁平上皮となったケラチノサイトのインビトロ由来培養物を指して互換的に用いられる。典型的には、皮膚同等物は器官培養によって産生される。
【００３０】
本明細書で用いる「後期胚形成主要タンパク質」という用語は、タンパク質またはタンパク質をコードする核酸に言及して用いる場合、後期胚形成の間に植物で産生される親水性タンパク質のクラス(例えば、配列番号:1)のことを指す。すなわち、後期胚形成主要タンパク質という用語は、野生型の後期胚形成主要タンパク質に同一であるタンパク質と野生型の後期胚形成主要タンパク質から派生するもの(例えば、後期胚形成主要タンパク質のバリアント、後期胚形成主要タンパク質をコードする領域の一部分を用いて構築されたキメラ遺伝子またはヒト化後期胚形成主要タンパク質)の両方を含む。
【００３１】
本明細書で用いる「グループ3後期胚形成主要タンパク質」という用語は、タンパク質またはタンパク質をコードする核酸に言及して用いる場合、後期胚形成の間に植物で産生される親水性タンパク質のクラスのことを指す。この用語は次の11のアミノ酸モチーフによって特徴付けられるタンパク質を含む: 非極性-非極性-陰性/アミド-X-非極性-陽性-陰性-陽性-非極性-X-塩基性、この例がTAQAAKEKAGE(配列番号:2)である。すなわち、グループ3後期胚形成主要タンパク質という用語は、野生型のグループ3後期胚形成主要タンパク質に同一であるタンパク質と野生型のグループ3後期胚形成主要タンパク質から派生するもの(例えば、グループ3後期胚形成主要タンパク質のバリアント、グループ3後期胚形成主要タンパク質をコードする領域の一部分を用いて構築されたキメラ遺伝子またはヒト化グループ3後期胚形成主要タンパク質)の両方を含む。
【００３２】
本明細書で用いる「HVA1」という用語は、タンパク質または核酸に言及して用いる場合、配列番号:1と約50%を超える同一性を共有し、同様に野生型HVA1の少なくとも1つの活性を有するタンパク質またはタンパク質をコードする核酸のことを指す。したがって、HVA1タンパク質という用語は、野生型HVA1タンパク質に同一であるタンパク質および野生型HVA1タンパク質に由来するもの(例えば、HVA1タンパク質のバリアント、HVA1タンパク質をコードする領域の一部分を用いて構築されたキメラ遺伝子、またはヒト化HVA1タンパク質)の両方を含む。
【００３３】
本明細書で用いる「HVA1の活性」という用語は、野生型HVA1タンパク質の任意の活性のことを指す。この用語はHVA1タンパク質の全ての活性を、単独でまたは組み合わせで含むように意図される。
【００３４】
具体的には「HVA1遺伝子」という用語は、完全長のHVA1のヌクレオチド配列(例えば、配列番号:1に含まれる)のことを指す。しかしながら、この用語はHVA1配列の断片、ならびに完全長のHVA1のヌクレオチド配列内にある他のドメイン、ならびにHVA1のバリアントを含むということも意図される。さらに「HVA1遺伝子のヌクレオチド配列」または「HVA1遺伝子のポリヌクレオチド配列」という用語は、DNA、cDNAおよびRNA (例えば、mRNA)配列を含む。
【００３５】
本明細書で用いる「トレハロース輸送タンパク質」という用語は、タンパク質または核酸に言及して用いる場合、配列番号:3と約50%を超える同一性を共有し、同様に野生型トレハロース輸送タンパク質の少なくとも1つの活性(例えば、トレハロースとの結合)を有するタンパク質またはタンパク質をコードする核酸のことを指す。その結合はELISAなどの標準的方法によりアッセイすることができる。したがって、トレハロース輸送タンパク質という用語は、野生型トレハロース輸送タンパク質に同一であるタンパク質および野生型トレハロース輸送タンパク質に由来するもの(例えば、トレハロース輸送タンパク質のバリアントまたはトレハロース輸送タンパク質をコードする領域の一部分を用いて構築されたキメラ遺伝子)の両方を含む。
【００３６】
本明細書で用いる「トレハロース輸送タンパク質の活性」という用語は、野生型トレハロース輸送タンパク質の任意の活性のことを指す。この用語はトレハロース輸送タンパク質の全ての活性を、単独でまたは組み合わせで含むように意図される。
【００３７】
具体的には「トレハロース輸送タンパク質遺伝子」という用語は、完全長のトレハロース輸送タンパク質AGT1のヌクレオチド配列(例えば、配列番号:3に含まれる)のことを指す。しかしながら、この用語はトレハロース輸送タンパク質配列の断片、ならびに完全長のトレハロース輸送タンパク質のヌクレオチド配列内にある他のドメイン、ならびにトレハロース輸送タンパク質のバリアントを含むということも意図される。さらに「トレハロース輸送タンパク質遺伝子のヌクレオチド配列」または「トレハロース輸送タンパク質遺伝子のポリヌクレオチド配列」という用語は、DNA、cDNAおよびRNA (例えば、mRNA)配列を含む。
【００３８】
本明細書で用いる「トレハロース合成経路」という用語は、タンパク質またはタンパク質をコードする核酸に言及して用いる場合、トレハロースを合成するために必要なタンパク質のことを指す。トレハロース合成経路タンパク質という用語は、野生型トレハロース合成経路タンパク質に同一であるタンパク質および野生型トレハロース合成経路タンパク質に由来するもの(例えば、トレハロース合成経路タンパク質のバリアント、トレハロース合成経路タンパク質をコードする領域の一部分を用いて構築されたキメラ遺伝子、またはヒト化トレハロース合成経路タンパク質)の両方を含む。
【００３９】
本明細書で用いる「otsA」という用語は、タンパク質または核酸に言及して用いる場合、配列番号:4と約50%を超える同一性を共有し、同様に野生型otsAの少なくとも1つの活性を有するタンパク質またはタンパク質をコードする核酸のことを指す。その活性は比色試験などの標準的方法によりアッセイすることができる。したがって、otsAタンパク質という用語は、野生型otsAタンパク質に同一であるタンパク質および野生型otsAタンパク質に由来するもの(例えば、トレハロース合成タンパク質のバリアント(例えば、配列番号:7)、トレハロース合成タンパク質をコードする領域の一部分を用いて構築されたキメラ遺伝子、またはヒト化otsA)の両方を含む。
【００４０】
本明細書で用いる「otsAの活性」という用語は、野生型otsAタンパク質の任意の活性のことを指す。この用語はotsAタンパク質の全ての活性を、単独でまたは組み合わせで含むように意図される。
【００４１】
具体的には「otsA遺伝子」という用語は、完全長のotsAのヌクレオチド配列(例えば、配列番号:4に含まれる)のことを指す。しかしながら、この用語はotsA配列の断片、ならびに完全長のotsAのヌクレオチド配列内にある他のドメイン、ならびにotsAのバリアントを含むということも意図される。さらに「otsA遺伝子のヌクレオチド配列」または「otsA遺伝子のポリヌクレオチド配列」という用語は、DNA、cDNAおよびRNA (例えば、mRNA)配列を含む。
【００４２】
本明細書で用いる「otsB」という用語は、タンパク質または核酸に言及して用いる場合、配列番号:5と約50%を超える同一性を共有し、同様に野生型otsBの少なくとも1つの活性を有するタンパク質またはタンパク質をコードする核酸のことを指す。その活性は比色試験などの標準的方法によりアッセイすることができる。したがって、otsAタンパク質という用語は、野生型otsBタンパク質に同一であるタンパク質および野生型otsBタンパク質に由来するもの(例えば、トレハロース合成タンパク質のバリアント(例えば、配列番号:6)、トレハロース合成タンパク質をコードする領域の一部分を用いて構築されたキメラ遺伝子、またはヒト化otsB)の両方を含む。
【００４３】
本明細書で用いる「otsBの活性」という用語は、野生型otsBタンパク質の任意の活性のことを指す。この用語はotsBタンパク質の全ての活性を、単独でまたは組み合わせで含むように意図される。
【００４４】
具体的には「otsB遺伝子」という用語は、完全長のotsBのヌクレオチド配列(例えば、配列番号:5に含まれる)のことを指す。しかしながら、この用語はotsB配列の断片、ならびに完全長のotsBのヌクレオチド配列内にある他のドメイン、ならびにotsBのバリアントを含むということも意図される。さらに「otsB遺伝子のヌクレオチド配列」または「otsB遺伝子のポリヌクレオチド配列」という用語は、DNA、cDNAおよびRNA (例えば、mRNA)配列を含む。
【００４５】
本明細書で用いる「ガラス化」という用語は、氷晶形成を実質的に阻止できるくらいに素早い速度で試料を凍結する工程のことを指す。
【００４６】
本明細書で用いる「凍結乾燥」という用語は、試料からの水の昇華のことを指す。
【００４７】
本明細書で用いる「空気乾燥」という用語は、空気または他の何らかの気体への曝露によってもたらされる乾燥のことを指す。
【００４８】
本明細書で用いる「真空乾燥」という用語は、真空への曝露による水分の除去のことを指す。
【００４９】
本明細書で用いる「NIKS細胞」という用語は、細胞系ATCC CRL-1219として寄託された細胞の特徴を有する細胞のことを指す。
【００５０】
天然のタンパク質分子のアミノ酸配列に言及して本明細書に「アミノ酸配列」を詳述する場合、「アミノ酸配列」および類似の用語、例えば「ポリペプチド」または「タンパク質」は、アミノ酸配列を、詳述するタンパク質分子にみられる完全な天然型アミノ酸配列には限定しないものとする。
【００５１】
ゲノム型の遺伝子は、イントロンを含むことに加えて、配列の5'および3'末端に位置していてRNA転写物に存在する配列も含む。これらの配列は「隣接」配列または「隣接」領域と呼ばれる(これらの隣接配列は、mRNA転写物に存在する非翻訳配列の5'または3'側に位置する)。5'隣接領域は、遺伝子の転写を制御する、またはそれに影響を及ぼすプロモーターおよびエンハンサーなどの調節配列を含みうる。3'隣接領域は、転写終結、転写後切断およびポリアデニル化を指令する配列を含みうる。
【００５２】
「野生型」という用語は、天然の源から単離した場合にその遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物のことを指す。野生型遺伝子は集団内で最も高い頻度で観察されることから、任意に「正常型」または「野生型」の遺伝子と命名される。これに対して、「改変型」「変異型」および「バリアント」という用語は、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に配列および/または機能的特性の変化(すなわち、変化した特徴)を示す遺伝子または遺伝子産物のことを指す。天然にみられる変異型を単離しうる点に注意されたい; これらは、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較して、変化した特徴を有するという事実によって同定される。
【００５３】
本明細書で用いる「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド」および「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド」という用語は、遺伝子のコード領域、言い換えれば遺伝子産物をコードする核酸配列、を含む核酸配列のことを意味する。コード領域は、cDNA、ゲノムDNAまたはRNAの形態で存在してもよい。DNAの形態で存在する場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは一本鎖(すなわち、センス鎖)でも二本鎖でもよい。転写の適切な開始および/または一次RNA転写物の正しいプロセシングを可能にするために必要であれば、エンハンサー/プロモーター、スプライス部位、ポリアデニル化シグナルなどの適した制御因子を、遺伝子のコード領域の近傍に配置してよい。または、本発明の発現ベクターに用いられるコード領域が、内因性エンハンサー/プロモーター、スプライス部位、介在配列、ポリアデニル化シグナルなど、または内因性および外因性制御因子の両者の組み合わせを含んでもよい。
【００５４】
本明細書で用いる「調節因子」という用語は、核酸配列の発現の何らかの面を制御する遺伝因子のことを指す。例えば、プロモーターは、作動可能に連結されたコード領域の転写開始を促す調節因子である。他の調節因子には、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、転写終結シグナルなどがある。
【００５５】
本明細書で用いる「相補的」または「相補性」という用語は、塩基対合則により関連づけられたポリヌクレオチド(すなわち、ヌクレオチドの配列)に言及して用いられる。例えば、配列「A-G-T」は配列「T-C-A」と相補的である。相補性は、核酸の塩基の一部のみが塩基対合則に従って合致するというように「部分的」でもよい。または、核酸の間に「完全」または「全体的」な相補性があってもよい。核酸鎖の間の相補性の程度は、核酸鎖の間のハイブリダイゼーションの効率および強度に多大な影響を及ぼす。これは、核酸同士の結合に依存する増幅反応ならびに検出方法において特に重要である。
【００５６】
「相同性」という用語は、相補性の程度のことを指す。これは部分的な相同性でもよく、完全な相同性(すなわち、同一性)でもよい。部分的に相補的な配列とは、完全に相補的な配列が標的核酸配列とハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害するもののことであり、これは「実質的に相同な」という機能的用語を用いて呼ばれる。「結合の阻害」という用語は、核酸結合に言及して用いる場合、相同配列の標的配列との結合の競合によって生じる結合の阻害のことを指す。完全に相補的な配列と標的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、ハイブリダイゼーションアッセイ法(サザンまたはノザンブロット法、溶液ハイブリダイゼーションなど)を低度のストリンジェンシー条件下で用いて検討しうる。実質的に相同な配列またはプローブは、低度のストリンジェンシー条件下で、完全に相同な配列と標的配列との結合(すなわち、ハイブリダイゼーション)と競合する、またはそれを阻害すると考えられる。低度のストリンジェンシー条件は非特異的な結合が許容されるような条件というわけではない; 低度のストリンジェンシー条件は、2つの配列の相互の結合が特異的な(すなわち、任意選択的な)相互作用であることを必要とする。非特異的結合がないことは、部分的な程度の相補性すらない(例えば、同一性が約30%未満)第2の標的を用いることによって検証しうる; 非特異的結合がないと、プローブは第2の非相補的な標的とハイブリダイズしないと考えられる。
【００５７】
当技術分野では、様々な同等な条件を用いて低度のストリンジェンシー条件を構成しうることが周知である；プローブの長さおよび性質(DNA、RNA、塩基組成物)ならびに標的の性質(DNA、RNA、塩基組成物、溶液中に存在する、または固定化されているなど)ならびに塩および他の成分の濃度(例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコールの有無)などの要因を考慮し、ハイブリダイゼーション溶液を変更して、上に挙げた条件とは異なるものの同等な低度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を得ることができる。さらに、高度のストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションを促す条件(例えば、ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄段階の温度を高める、ハイブリダイゼーション溶液中にホルムアミドを用いるなど)も当技術分野で周知である。
【００５８】
cDNAまたはゲノムクローンなどの二本鎖核酸配列に言及して用いる場合、「実質的に相同な」という用語は、上記の低度のストリンジェンシー条件下で二本鎖核酸配列の一方または両方のストランドとハイブリダイズしうる任意のプローブのことを指す。
【００５９】
一本鎖核酸配列に言及して用いる場合、「実質的に相同な」という用語は、上記の低度のストリンジェンシー条件下で一本鎖核酸配列とハイブリダイズしうる(すなわち、その相補物である)任意のプローブのことを指す。
【００６０】
本明細書で用いる「結合に関して競合する」という用語は、第1のポリペプチドのバリアントであるか関連性のあるまたは類似性のないポリペプチドである、活性を備えた第2のポリペプチドが結合するものと同じ基質と結合する、活性を備えた第1のポリペプチドに言及して用いられる。第1のポリペプチドによる結合の効率(例えば、動力学または熱力学)は、第2のポリペプチドによる基質結合効率と同じでもよく、それより高くてもよく、それより低くてもよい。例えば、基質との結合に関する平衡結合定数(KＤ)が2つのポリペプチドで異なってもよい。本明細書で用いる「Kｍ」という用語は、酵素に関するミカエリス-メンテン定数のことを指し、これは任意の酵素が酵素触媒反応において最大速度の2分の1を示す特異的基質の濃度として定義される。
【００６１】
本明細書で用いる「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的核酸の対合に言及して用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度(すなわち、核酸間の会合の強度)は、核酸間の相補性の程度、用いる条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのTｍ、および核酸内部のG：C比などの要因による影響を受ける。
【００６２】
本明細書で用いる「Tｍ」という用語は、「融解温度」を指して用いられる。融解温度とは、二本鎖核酸分子の集団の半分が一本鎖に解離する温度のことである。核酸のTｍを算出するための式は当技術分野で周知である。標準的な参考文献に示されているように、核酸が1M NaCl水溶液中にある場合、Tm値の単純な推定値は以下の式によって算出しうる: Tm = 81.5 ＋ 0.41(%G＋C)(例えば、AndersonおよびYoung、「Nucleic Acid Hybridization」中の「Quantitative Filter Hybridization」［1985］を参照)。その他の参考文献には、Tmの算出に配列特性のほかに構造特性も考慮に入れた、より精巧な計算が含まれる。
【００６３】
本明細書で用いる「ストリンジェンシー」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションを行う温度、イオン強度、および有機溶媒などの他の化合物の存在といった条件を指して用いられる。当業者は、直前に記載したパラメータを個別的または共同的に変化させることによって「ストリンジェンシー」条件を変更しうることを認識すると考えている。「高度のストリンジェンシー」条件では、相補的塩基配列の頻度が高い核酸断片の間のみで核酸塩基対合が起こると考えられる(例えば、「高度のストリンジェンシー」条件下でのハイブリダイゼーションは、同一性が約85%〜100%、好ましくは同一性が約70%〜100%であるホモログの間で起こりうる)。中程度のストリンジェンシー条件では、相補的塩基配列の頻度が中程度である核酸の間で核酸塩基対合が起こると考えられる(例えば、「中程度のストリンジェンシー」条件下でのハイブリダイゼーションは、同一性が約50%〜70%であるホモログの間で起こると思われる)。このため、遺伝的に異なる生物に由来する核酸同士に対しては、相補的配列の頻度が通常低いことから、「弱」または「低」ストリンジェンシーの条件がしばしば必要となる。
【００６４】
「高度のストリンジェンシー条件」は、核酸ハイブリダイゼーションに言及して用いる場合、約500ヌクレオチド長のプローブを用いた際に、5×SSPE(43.8 g/l NaCl、6.9 g/l NaH２PO４H２Oおよび1.85 g/l EDTA、pHはNaOHで7.4に調整)、0.5% SDS、5×デンハルト試薬および100 μg/ml変性サケ精子DNAからなる42℃の溶液中での結合またはハイブリダイゼーションの後に、0.1×SSPE、1.0% SDSを含む42℃の溶液中で洗浄を行うことと同等な条件を含む。
【００６５】
「中程度のストリンジェンシー条件」は、核酸ハイブリダイゼーションに言及して用いる場合、約500ヌクレオチド長のプローブを用いた際に、5×SSPE(43.8 g/l NaCl、6.9 g/l NaH２PO４H２Oおよび1.85 g/l EDTA、pHはNaOHで7.4に調整)、0.5% SDS、5×デンハルト試薬および100 μg/ml変性サケ精子DNAからなる42℃の溶液中での結合またはハイブリダイゼーションの後に、1.0×SSPE、1.0% SDSを含む42℃の溶液中で洗浄を行うことと同等な条件を含む。
【００６６】
「低度のストリンジェンシー条件」は、約500ヌクレオチド長のプローブを用いた際に、5×SSPE(43.8 g/l NaCl、6.9 g/l NaH２PO４H２Oおよび1.85 g/l EDTA、pHはNaOHで7.4に調整)、0.1% SDS、5×デンハルト試薬［50×デンハルト試薬は500ml当たり以下のものを含む: 5 g フィコール（Ficoll）(400型、Pharamcia)、5g BSA(第V画分; Sigma)］および100 μg/ml変性サケ精子DNAからなる42℃の溶液中での結合またはハイブリダイゼーションの後に、5×SSPE、0.1% SDSを含む42℃の溶液中で洗浄を行うことと同等な条件を含む。
【００６７】
以下の用語は、2つまたはそれ以上のポリヌクレオチド間の配列の関係を記載するために用いられる: 「参照配列」「配列同一性」「配列一致率」および「実質的同一性」。「参照配列」は、配列比較のための基準として用いられる定義済みの配列である; 参照配列はさらに長い配列のサブセット、例えば、配列一覧表に示された完全長cDNA配列の区域であってもよく、または完全な遺伝子配列を含んでもよい。一般に、参照配列は少なくとも20ヌクレオチド長であり、多くの場合は少なくとも25ヌクレオチド長、しばしば少なくとも50ヌクレオチド長である。2つのポリヌクレオチドはそれぞれ(1) 2つのポリヌクレオチド間で類似した配列(すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部)を含み、(2) さらに2つのポリヌクレオチド間で異なる配列も含みうるため、2つの(またはそれ以上の)ポリヌクレオチド間での配列比較は通常、2つのポリヌクレオチドの配列を、配列類似性のある局所領域の同定および比較のための「比較域(comparison window)」にわたって比較することによって行われる。本明細書で用いる「比較域」とは、少なくとも20個の連続したヌクレオチドである参照配列と比較されるポリヌクレオチド配列である、少なくとも20個の連続したヌクレオチド位置からなる概念的な区域のことを指し、比較域におけるポリヌクレオチド配列の部分は、2つの配列の最適なアライメントのために、参照配列(付加または欠失を含まない)と比較して20%またはそれ未満の付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含みうる。比較域のアライメントのための配列の最適な整列化は、SmithおよびWatermanの局所相同性アルゴリズム［SmithおよびWaterman、Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)］により、NeedlemanおよびWunschの相同性整列化アルゴリズム[NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]により、PearsonおよびLipmanの類似性検索法［PearsonおよびLipman、Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444 (1988)］により、これらのアルゴリズムのコンピュータ・インプリメンテーション(Wisconsin Genetics Software Packageリリース7.0(Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)のGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA)により、または視覚的検査によって行うことができ、種々の方法によって生じた最良のアライメント(すなわち、比較域にわたる相同性の比率が最も高くなるもの)を選択する。「配列同一性」という用語は、2つのポリヌクレオチド配列が比較域にわたって同一である(すなわち、個々のヌクレオチドのレベルで)ことを意味する。「配列一致率」という用語は、最適なアライメントがなされた2つの配列を比較域にわたって比較し、一致する位置の数を得るために両方の配列で同一の核酸塩基(例えば、A、T、C、G、UまたはI)がみられる位置の数を決定し、一致した位置の数を比較域における位置の総数(すなわち、区域サイズ)で割り、配列一致率を得るためにその結果に100を掛けることによって算出される。本明細書で用いる「実質的同一性」という用語は、ポリヌクレオチドが、少なくとも20ヌクレオチドの位置からなる比較域、しばしば少なくとも25〜50ヌクレオチドの位置からなる比較域にわたっての参照配列との比較により、少なくとも85%の配列一致率を有し、好ましくは少なくとも90%〜95%の配列一致率、より一般的には少なくとも99%の配列一致率を有する配列を含むという、ポリヌクレオチド配列の特性��表し、ここで配列一致率は参照配列を、比較域にわたって全体で参照配列の20%またはそれ未満の欠失または付加を含みうるポリヌクレオチド配列と比較することによって算出される。参照配列はさらに長い配列のサブセットであってもよく、例えば、本発明において請求する組成物(例えば、トレハロース輸送タンパク質)の完全長配列のある区域であってもよい。
【００６８】
ポリペプチドに対して適用する場合、「実質的同一性」という用語は、初期設定ギャップウェイト値を用いるGAPまたはBESTFITプログラムなどによって最適なアライメントを行った場合に、2つのペプチド配列が少なくとも80%の配列一致率を共有し、好ましくは少なくとも90%の配列一致率、より好ましくは少なくとも95%の配列一致率またはそれ以上(例えば、99%の配列一致率)を共有することを意味する。同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換による違いであることが好ましい。保存的アミノ酸置換とは、類似した側鎖を有する残基の互換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の一群はグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり、脂肪族-ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の一群はセリンおよびトレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の一群はアスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の一群はフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の一群はリジン、アルギニンおよびヒスチジンであり、ならびに硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の一群はシステインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換の群は以下の通りである：バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リジン-アルギニン、アラニン-バリン、およびアスパラギン-グルタミン。
【００６９】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたは前駆体(例えば、KGF-2)の産生のために必要なコード配列を含む核酸(例えば、DNA)配列のことを指す。ポリペプチドは完全長コード配列によってコードされてもよく、または完全長もしくは断片の所望の活性または機能的特性(例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達など)が保たれる限り、コード配列の任意の部分によってコードされてもよい。この用語には、遺伝子が完全長mRNAの長さに対応するようにコード領域の5'および3'端の両方にそれぞれ約1kbの距離にわたって隣接して位置する配列を含め、構造遺伝子のコード領域も含まれる。コード領域の5'側に位置し、mRNAに存在する配列は5'非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の3'側または下流に位置し、mRNAに存在する配列は3'非翻訳配列と呼ばれる。「遺伝子」という用語は、遺伝子のcDNAおよびゲノム型の両方を含む。遺伝子のゲノム型またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と呼ばれる非コード配列によって分断されたコード領域を含む。イントロンは、核RNA(hnRNA)へと転写される遺伝子の区域である; イントロンはエンハンサーなどの調節因子を含むことがある。イントロンは核内転写産物または一次転写産物から取り除かれるまたは「スプライシングによって切り取られる」; このため、イントロンは伝令RNA(mRNA)転写産物中には存在しない。mRNAは翻訳時に新生ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列または順序を特定する働きをする。
【００７０】
本明細書で用いる「をコードする核酸分子」「をコードするDNA配列」および「をコードするDNA」という用語は、デオキシリボ核酸のストランドに沿って並んだデオキシリボヌクレオチドの順序または配列のことを指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序が、ポリペプチド(タンパク質)鎖に沿って並ぶアミノ酸の順序を決定する。このようにして、DNA配列はアミノ酸配列をコードする。
【００７１】
本明細書で用いる「組換えDNA分子」という用語は、分子生物学の技法によって連結されたDNAの区域を含むDNA分子のことを指す。
【００７２】
「単離された」という用語は、「単離されたオリゴヌクレオチド」または「単離されたポリヌクレオチド」というように核酸に関連して用いられる場合、その天然の源において通常付随している少なくとも1つの混在性の核酸から同定されて単離された核酸配列のことを指す。単離された核酸は、天然に認められるものとは異なる形態または状況で存在する。これに対して、単離されていない核酸とは、天然に存在する状態で認められるDNAおよびRNAなどの核酸のことである。例えば、任意のDNA配列(例えば、遺伝子)は宿主細胞の染色体上に近傍の遺伝子に近接して認められる; RNA配列、例えば特定のタンパク質をコードするmRNAなどは、多数のタンパク質をコードする他の多数のmRNAとの混合物として細胞内に認められる。しかし、トレハロース結合タンパク質をコードする単離された核酸には、例えば、トレハロース結合タンパク質を通常発現する細胞内にあるものの天然の細胞とは異なる染色体位置にあるこの種の核酸、または、天然に認められるものとは異なる核酸配列に隣接しているものが含まれる。単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のいずれの形態で存在してもよい。単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを、タンパク質を発現させるために利用する場合には、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは少なくともセンス鎖またはコード鎖を含むと考えられるが(すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは一本鎖でもよい)、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含んでもよい(すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは二本鎖でもよい)。
【００７３】
本明細書で用いる「部分(portion)」という用語は、ヌクレオチド配列に言及する場合(「所定のヌクレオチド配列の一部分」というように)、その配列の断片のことを指す。断片のサイズは、4ヌクレオチドから、1ヌクレオチドを全ヌクレオチド配列から差し引いたもの(10ヌクレオチド、20、30、40、50、100、200ヌクレオチドなど)までの範囲であってよい。
【００７４】
本明細書で用いる「コード領域」という用語は、構造遺伝子に言及して用いる場合、mRNA分子の翻訳の結果として新生ポリペプチド中に認められるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列のことを指す。真核生物の場合、コード領域の5'側には開始メチオニンをコードするヌクレオチドトリプレット「ATG」が結合しており、3'側には停止コドンを表す3種類のトリプレット(すなわち、TAA、TAG、TGA)の1つが結合している。
【００７５】
本明細書で用いる「精製された」または「精製する」という用語は、試料から混入物を除去することを指す。
【００７６】
本明細書で用いる「ベクター」という用語は、DNA区域を一方の細胞から別の細胞に移行させる核酸分子に言及して用いられる。「媒体(vehicle)」という用語は時折、「ベクター」と互換的に用いられる。
【００７７】
本明細書で用いる「発現ベクター」という用語は、所望のコード配列、および特定の宿主生物において作動可能に連結されたコード配列の発現のために必要な適した核酸配列を含む、組換えDNA分子のことを指す。原核生物における発現のために必要な核酸配列には通常、プロモーター、オペレーター(任意選択的)およびリボソーム結合部位が、しばしば他の配列とともに含まれる。真核細胞はプロモーター、エンハンサーならびに転写終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。
【００７８】
「作動可能に連結された」とは、そう記述された各成分が、それらをその意図した様式で機能させられる関係に並べられていることを指す。コード配列の発現が調節配列に適合する条件下で達成されるように調節配列を連結する場合、調節配列はコード配列に「作動可能に連結」される。
【００７９】
「PCR」とは、Saiki, et al., Nature 324:163 (1986); およびScharf et al., Science 233:1076-1078 (1986); 米国特許第4,683,195号; および米国特許第4,683,202号に記述されているようなポリメラーゼ連鎖反応の技法のことを指す。
【００８０】
「薬学的に許容される担体」とは、ヒトへの投与のために当業者が使用する任意の担体であって、それ自体は抗体の産生、熱などのような望ましくない何らかの副作用を引き起こすことがない担体のことを意味する。適当な担体は通常、大きくて代謝の遅い高分子であり、これはタンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸共重合体または不活性なウイルス粒子とすることができる。そのような担体は当業者に周知である。担体はチログロブリンであることが好ましい。
【００８１】
「過剰発現」および「過剰発現する」という用語ならびに文法的同等物は、対照動物または非トランスジェニック動物における所定の組織中で一般に観察されるレベルの約3倍よりも高い発現レベルを示すmRNAのレベルを指して用いられる。mRNAレベルの測定は、ノザンブロット分析を含むが、これに限定されない、当業者に知られる様々な技法のいずれかを用いて行われる。ノザンブロットには、分析する各組織からローディングしたRNAの量の違いに関する対照とするために適切な対照を含める(例えば、すべての組織中に本質的には同じ量で大量に存在するRNA転写物である28S rRNAの各試料中の量を、ノザンブロット上に認められるGKLF mRNA特異的シグナルを規準化または標準化する手段として用いることができる)。正しいスプライシングを受けたトレハロース結合タンパク質導入遺伝子のRNAのサイズに対応するバンド中に存在するmRNAの量を定量化する; 導入遺伝子プローブとハイブリダイズする他の副次的なmRNA種は導入遺伝子mRNAの発現の定量化には考慮しない。
【００８２】
本明細書で用いる「トランスフェクション」という用語は、外来性DNAの真核細胞への導入のことを指す。トランスフェクションは、リン酸カルシウム-DNA共沈法、DEAE-デキストランを介したトランスフェクション法、ポリブレンを介したトランスフェクション法、電気穿孔法、微量注入法、リポソーム融合法、リポフェクション法、プロトプラスト融合法、レトロウイルス感染法およびバイオリステック法を含む、当技術分野で知られた任意の手段によって行いうる。
【００８３】
「安定的なトランスフェクション」または「安定的にトランスフェクトされた」という用語は、トランスフェクトされた細胞のゲノム中への外来性DNAの導入または組込みのことを指す。「安定なトランスフェクタント」という用語は、ゲノムDNA中に外来性DNAが安定的に組み込まれた細胞のことを指す。
【００８４】
「一過的なトランスフェクション」または「一過的にトランスフェクトされた」という用語は、トランスフェクトされた細胞のゲノム中に外来性DNAが組み込まれない、外来性DNAの細胞への導入のことを指す。外来性DNAはトランスフェクト細胞の核内に数日間存続する。この期間中、外来性DNAは、染色体中の内因性遺伝子の発現を司る調節制御を受ける。「一過的トランスフェクタント」という用語は、外来性DNAを取り込んだものの、このDNAが組み込まれていない細胞のことを指す。
【００８５】
「リン酸カルシウム共沈法」という用語は、核酸を細胞内に導入するためのある技法のことを指す。細胞による核酸の取り込みは、核酸がリン酸カルシウム-核酸共沈物として存在すると高まる。Grahamおよびvan der Ebの原型の技法(Grahamおよびvan der Eb、Virol., 52: 456 [1973])が、いくつかのグループにより、特定の種類の細胞に対して最適化されるように変更されている。これらの様々な変更は当技術分野で周知である。
【００８６】
本明細書で用いる「試料」という用語は、最も広い意味で用いられる。ヒト染色体またはヒト染色体に付随する配列を含む疑いのある試料には、細胞、細胞から単離された染色体(例えば、分裂中期の染色体の展開物)、ゲノムDNA(溶液中に、またはサザンブロット分析用の固体支持体に結合した状態で)、RNA(溶液中に、またはノザンブロット分析用の固体支持体に結合した状態で)、cDNA(溶液中に、または固体支持体に結合した状態で)などが含まれうる。タンパク質を含む疑いのある試料には、細胞、組織の一部、1つまたは複数のタンパク質を含む抽出物などが含まれうる。
【００８７】
本明細書で用いる「応答」という用語は、アッセイ法に言及して用いる場合、検出可能なシグナルの生成(例えば、レポータータンパク質の蓄積、イオン濃度の上昇、検出可能な化学生成物の蓄積)のことを指す。
【００８８】
本明細書で用いる「レポーター遺伝子」という用語は、アッセイしうるタンパク質をコードする遺伝子のことを指す。レポーター遺伝子の例には、ルシフェラーゼ(例えば、deWetら、Mol. Cell. Biol. 7: 725 [1987]ならびに米国特許第6,074,859号; 第5,976,796号; 第5,674,713号; および第5,618,682号を参照されたい; これらはすべて参照により本明細書に組み入れられる)、緑色蛍光タンパク質(例えば、GenBankアクセッション番号U43284; 様々なGFPバリアントがCLONTECH Laboratories社、Palo Alto, CA)から販売されている)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼが含まれるが、これらに限定されることはない。
【００８９】
概要
臓器保存の分野では、3つの問題が際立っている。第一に、トレハロースによる細胞内および細胞外のガラス化はどちらも単離細胞の乾燥保存で有益性を示している。第二に、この有益性はあらゆる場合に明白であるというわけではなく、このことからこの問題に対する他の重要な局面が存在することを示唆している。第三に、組織または臓器に対する乾燥の成功はこれまでに報告されていない。下記のように、本発明はこれらの問題に対する解決策を提供するものである。
【００９０】
緩慢凍結法が現在、生きている哺乳動物細胞および組織の保存および貯蔵に対する産業上の一般的な選択肢になっている。単純な系に対する液相図を図1に示す。培地中の組織をまず冷却する(A)。水の凝固点に達すると(B)、氷が結晶化し始め、溶液中に残存する溶質の濃度を増加、いわゆる「凍結濃縮」させる。この過程は、溶質が共融点で結晶化するまで続く(C)。しかしながら、多成分系がこの理想的な様式で振舞うことはめったにない。通常、および多くの凍結保護溶液の場合には特に、溶質は結晶化せず、溶液はこれがさらなる結晶化の起きないガラスを形成するまで過飽和となる(D)。この時点でそのガラス物質を組成のさらなる変化なしに冷却することができる(E点またはそれ以下)。
【００９１】
緩慢凍結法の間に組織および臓器で損傷が起こる3つの主な機構、つまり細胞外氷晶形成、浸透圧の不均衡および冷却性傷害が存在する(Pegg, Cryo-Letters 22(2):105-114 (2001))。細胞外氷晶形成は細密な臓器構造を破壊する可能性があり、組織および臓器保存に特有の問題である。さらに、凍結濃縮作用は多くの損傷過程をもたらし、それらのなかで最も顕著なのが細胞容積の変化である。細胞外空間が高張性になるにつれて、細胞は水を失って浸透圧の不均衡を回避する。この収縮によって細胞骨格の損傷、細胞の漏出および膜融合が起こる。組織の融解によっては逆の効果、つまり細胞の膨張および破裂が起こる。冷却性傷害は、熱ショックタンパク質の発現またはアポトーシスのような、それ自身の温度降下による代謝性変化の結果である(Liu et al., Tissue Engineering 6(5):539-54 (2000); Baust et al., In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal 36(4):262-270 (2000); Fowke et al., J. Immunol. Meth. 244 (1-2):139-144 (2000))。これらの影響の全てが迅速凍結法によって軽減されることは注目に値する。
【００９２】
哺乳動物の組織および臓器の冷凍保存に関する現在の最新技術は、浸透圧作用の最小化に集中している。凍結を介して組織の生存性を向上させるため、いろいろな化合物、通常はグリセロールまたはジメチルスルホキシド(DMSO)が「浸透保護剤」として添加されている。これらの化合物は容易に細胞膜を越えて細胞内部の浸透圧を増大し、それによってその容積の変動を軽減し、その生存の機会を高める。グリセロールおよびDMSOはその有効性にもかかわらず、これらの系の近似Tgである-100℃を超える温度では細胞および組織損傷の割合の著しい増加によって、細胞を保存するのに使用することができない。さらに、これらの化合物には細胞毒性があり、その実用性を生産規模で制限している真相がある。
【００９３】
従来の浸透保護に代わる手段の1つは、必要に応じて細胞内保護物質を合成する酵母によって例証される。酵母およびその他多くの乾燥耐性生物にとって好まれている保護物質は、糖質のトレハロースである(Leopold, ed. Membranes, metabolism, and Dry Organisms, Cornell Univ. Press, Ithaca (1986))。トレハロースはグルコースからなる非還元性二糖類である。その浸透保護剤としての特質および化学的安定性のほかに、ガラスを形成し水の水素結合特性を模倣するその能力から、トレハロースは本発明者らの提案の研究に適するものである。乾燥した脂質媒体、精子およびマウス胚を安定化させることが明らかにされている(Crowe et al., Biochim. Biophys. Acta 769:141-150 (1984); Storey et al., Cryobiology 37(1):46-58 (1998); Ishida et al., Human Repro. 12(6):1259-62 (1997))。ほとんどの場合、トレハロースの保護物質能はその他の単糖類よりも優れているが、しかしこれを下記の溶液加工技術(solution engineering)の新たな手法によって向上させることができる(Crowe et al., Cryobiology 43(2):89-105 (2001))。
【００９４】
上記のように、保存の間の臓器に対する損傷には氷形成、浸透圧の影響および冷却性傷害が含まれる。迅速凍結法またはガラス化はこれらの障害を克服することができる。図1の経路A→B→F→Gによって描かれるように、ガラス化は氷晶形成を阻止できるくらいに速い速度で試料を凍結する工程である。開始時の溶液からガラスを形成することにより、氷晶の形成なく、溶質濃度は増加せず、細胞収縮が回避されて、浸透保護が不必要になる。このように、ガラス化は組織および臓器の緩慢凍結法に付随する厄介な問題のほとんど全てを解消する; さらに、ガラス化の間の凍結速度は十分に大きいので、アポトーシスの誘導のような冷却による傷害作用が最小化される(Borderie et al., Invest. Ophthal & Visual Sci. 39(8):1511-19 (1998))。適切な場合、ガラス化溶液を使用し(下記を参照されたい)、その工程は高度に拡張可能であり、多くの製品タイプに適応するものと思われる。
【００９５】
しかしながら、産業上の組織保存にガラス化を適用するうえでの重大な課題は、細胞内氷晶形成(IIF)の阻止である(Toner et al., AIChE Jornal 38(10):1512-22 (1992))。細胞がガラス化の間に脱水せず、比較的高いレベルのサイトゾル水を保持するために、この致死作用が生じる(Muldrew et al., Biophys. J. 66:532-41 (1994))。この課題に対する手法の1つはトレハロースを細胞内部に導入することであり、その内部でトレハロースがサイトゾルのTgを増加させて、IIFの可能性を低下させるかまたは排除する。単離されたヒト膵島、懸濁された線維芽細胞およびケラチノサイトの場合に、細胞内トレハロースが凍結後の生存細胞の回復を向上させることが最近明らかになった(Beattie et al., Diabetes 46:519-23 (1997); Eroglu et al., Nature Biotech. 18(2):163-67 (2000))。
【００９６】
細胞内トレハロースはIIFを最小化するが、トレハロースは細胞膜を越えないので、この効果を達成するには革新的な戦略が必要になる。本発明は、哺乳動物細胞を遺伝子操作して、トレハロース輸送タンパク質を発現させることおよび/またはトレハロース合成経路の構成成分を発現させることを含めて、トレハロースを哺乳動物細胞に導入する新たな方法を提供する。これらの方法および組成物は以下にさらに詳細に記述されている。
【００９７】
今日まで、生物物理学的現象、トレハロース合成酵素に対する遺伝子の挿入および外因性の孔形成タンパク質を利用し、トレハロースが単離哺乳動物細胞に導入されている(Eroglu et al., 前記; Guo et al., Nature Biotech. 18(2):168-71 (2000); Lao et al., Cryobiology 42(3):207-17 (2001))。最初に報告された生物物理学的手法では、単離された膵島細胞において液晶-ゲル膜相転移を利用していた(Beattie et al., 前記)。この転移点で、細胞膜はトレハロースなどの小分子に対し透過性になる。これらの研究者らは、この様に膵島細胞を冷凍保存することで、回復する生存細胞の数が倍加されることを見出した。さらに最近になって、熱ショック処理を利用し飲食作用を誘導することにより、細胞内へのトレハロース送達が達成されている(Puhlev et al., Cryobiology 42(3):207-17 (2001); Wolkers et al., Cryobiology 42(2):79-87 (2001))。しかしながら、これらの技術を組織および臓器に適用する場合には、厄介な問題が起こるものと思われる。例えば、臓器は、それぞれが固有の転移温度を有する多数の細胞型からなっているので、全細胞を最適に回復させることは不可能である。
【００９８】
細胞内トレハロースの付加はいかなる場合でも乾燥細胞で有益性を示すというわけではなかった。したがって、本発明は同様に、植物後期胚形成主要(LEA)タンパク質を哺乳動物細胞中に導入することを企図するものである。LEAタンパク質は植物に見られる親水性タンパク質のクラスであり、ヒトを含めて多種多様な生物で相同タンパク質を有する(Shen et al., Plant Mol. Biol. 45(3):327-40 (2001))。LEAはその機能で重要になると思われる繰り返しモチーフのアミノ酸配列に基づいて、いくつかのクラスに分類されている(Dure et al., Plant Molec. Biol. 12(5):475-86 (1989))。本発明は特にグループ3 Leaタンパク質の利用を企図するものであり、このタンパク質は冷凍耐性魚に見出される不凍タンパク質に類似している11アミノ酸の繰り返しを有する(Holmberg et al., Trends Plant Sci. 3(2)"61-66 (1998))。いくつかの線虫では、これらのLEAの出現はトレハロースの蓄積と相関関係がある(Solomon et al., Parasitology 121:409-16 (2000))。いくつかのグループ3 LEAは、非常に効果的な冷凍安定剤になることが示されている(Honjoh et al., Biosci. Biotech. Biochem. 64(8):1656-63 (2000))。これらのタンパク質の機能は、結果的に細胞質のTgの増大をもたらすその強力な糖類との相互作用に依存するものと考えられている(Wolkers et al., Biochim. Biophys. Acta-Prot. Structure and Mol. Enzym. 1544(1-2):196-206 (2001))。
【００９９】
本発明は特に、グループ3 LEAの1つであるオオムギ(ホルデウムブルガレ(Hordeum vulgare))由来のHVA1遺伝子を有する哺乳動物細胞の遺伝子操作を企図するものである。HVA1タンパク質は種子成熟の間におよそ1%の総タンパク質量で見出されている(Straub et al., Plant Mol. Biol. 26(2):617-30 (1994))。比較すると、ヒト細胞中のタンパク質アクチンはおよそ5%の総タンパク質量のレベルで発現されている。HVA1遺伝子はその他の非哺乳動物中にクローニングされてその中で発現されており、その結果、脱水耐性の向上をもたらしている(Zhang et al., J. Biochem. 127(4):611-16 (2000); Xu et al., Plant Phys. 110(1):249-57 (1996))。
【０１００】
本発明は特定の機構に限定されるものではない。実際に、本発明の機構の理解は必要ではない。とはいえ、HVA1タンパク質はいくつかの方法でトレハロースと協調して細胞内のガラス化を促進させるものと考えられる。第一に、LEAは糖類との強力な結合相互作用を有することが明らかにされており、これによってLEAはトレハロースのガラス化挙動を増幅させられる足場を供与できる可能性がある。第二に、そのタンパク質の繰り返し単位は親水性であり、その結果、それらは脱水の間に水分を保って極度の乾燥のなかで「水を置換する」ことができる。第三に、その繰り返し単位はタンパク質との間で相互作用し、その結果、細胞を力学的に安定化するタンパク質ネットワークの形成を可能にするものと考えられる。最後に、HVA1タンパク質はリン酸イオンの結合に適している(Dure et al., Plant J. 3(3):363-69 (1993))。以下の開示のなかで、リン酸塩もトレハロースと相互作用することが示される。このように、乾燥の間に長距離秩序化がトレハロース、リン酸塩およびLEAタンパク質の間で起こりうるともくろむことは理にかなっている。
【０１０１】
臓器保存を成功させるには、細胞外空間は無氷のままでなければならない(Fahy et al., Cryobiology 21: 407-26 (1984))。これが問題である。というのは、これらの区画は水分含有量がいっそう高くTgがいっそう低いからである(図1の点Eに対し点G)。細胞外の氷を形成する傾向を低減させるため、ガラス促進剤(例えば、糖類または高分子)を添加して、より穏やかな冷却速度でガラス化を達成することができる(Miller et al., Pharm. Res. 14(5):578-90 (1997); Crowe et al., Crybiology 35(1):20-30 (1997))。臓器をガラス化するという分野はここ数年のうちに進歩を遂げてきたが、しかし報告の研究では、極低温保存の必要性の原因となるTgの低い保護剤が高濃度で使用されている。この研究の目的は大気保存可能な溶液を開発することである(Song et al., J. Invest. Surg. 13(5):279-88 (2000); Wowk et al., Cryobiology 40(3):228-36 (1997); Brockbank et al., Trans. Proc. 32(1):3-4 (2000))。本明細書の目的には、トレハロースが細胞外のガラス化および乾燥にとって優れた媒体であるものと考えられる。
【０１０２】
その優れたガラス形成能にもかかわらず、最近の研究によってトレハロース溶液のTgを劇的に増加させられることが明らかになっている。長年の間、ホウ酸イオンはポリヒドロキシ化合物と架橋複合体を形成できるということが知られてきた。しかしながら、同じ化学的性質がトレハロースとのホウ酸イオンの混合物にも当てはまるということは最近まで発見されていなかった(Miller et al., J. Phys. Chem. B. 103(46):10243 (1999))。トレハロース-ホウ酸塩はタンパク質および細菌系にとって、はるかに優れた凍結および凍結乾燥保護剤になるということが分かった(Miller et al., Phar, Res. 15(8):1215-21 (1998))。しかしながら、組織保存にホウ酸塩を使用することは、その高pHおよび毒性によって最適状態にはおよばない。したがって、リン酸塩が代替的な架橋剤として同定されている(Hasjim et al., Pharm. Res. 2000)。
【０１０３】
ガラス化工程では、融解は加温の間の再結晶によって損傷の大きな原因になる。この現象を回避する最も直接的な2つの手段は、再結晶が起こる前に試料を乾燥すること(凍結乾燥)または凍結せず直接的に試料を乾燥すること(空気乾燥)である。
【０１０４】
従来の凍結乾燥では、許容可能な水分除去率は氷晶の昇華後に残存する物質の空隙率の結果として達成されるものである。ガラス化系では、氷晶は存在しない; 試料は水拡散が比較的遅いと考えられる固体マトリックスである。空隙率の低下による影響を相殺するために、ガラス転移温度(したがって最大乾燥温度)を上昇させて水分除去率を高めることができれば費用効率の高い乾燥サイクルを得ることができる。本発明はトレハロースとオキシアニオンとの間の架橋結合に基づき非常に高いTgを有するガラス化溶液を提供し、それによって完全に乾燥され、ガラス化された試料の生成を妥当な費用で可能にすることにより、この問題を解決するものである。
【０１０５】
本発明は同様に、大気乾燥によって室温安定な組織製品を生成する方法を提供する。哺乳動物細胞の空気乾燥に関する報告が最近いくつかあった(Wolkers et al., Cryobiology 42(2):79-87 (2001); Guo et al., Nature Biotech. 18(2):168-171 (2000); Puhlev et al., Cryobiology 42(3):207-17 (2001); Gordon et al., Cryobiology 43(2):114-123 (2000); Tablin et al., Cryobiology 43(2):114-23 (2001))。トレハロースおよびHVA1 LEAの両タンパク質の細胞内合成によって、本発明者らは、他の研究者らのものよりも頑強で再現性の高い乾燥保存のための系を開発することができるものと考えられる。
【０１０６】
詳細な説明
本発明は全体として、使用前に保存のために臓器を凍結するおよび/または乾燥するための組成物および方法に関する。具体的には、本発明は細胞の遺伝的改変であって、その結果、その細胞そのものまたはその細胞から形成される組織および臓器を乾燥することができる細胞の遺伝的改変に関する。便宜上、本発明の説明は以下のセクションに分けて行う: A) 凍結および乾燥のための細胞の遺伝的改変および最適化; B) 改変型細胞系; C) 臓器および組織の産生; D) 臓器および組織の保存; およびE) 治療用途。
【０１０７】
A) 凍結および乾燥のための細胞の遺伝的改変および最適化
好ましい態様では、凍結および乾燥の最適化のための遺伝子を発現する哺乳動物細胞(例えば、NIKS細胞)は、以下にさらに詳細に論じられるように、当技術分野において周知の方法を用いる従来の遺伝子発現技術により作製することができる。本発明の実践には、特に指定のない限り、当業者の範囲内にある分子生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来技術を利用するものである。そのような技術は、
2006526413.tif 000002
を含めて、文献のなかで十分に説明されている。
【０１０８】
このように、本発明は、遺伝子操作された組織(例えば、皮膚同等物)を作製するために使われる細胞(例えば、NIKS細胞または幹細胞などの不死化細胞)の遺伝的改変を企図するものである。いくつかの態様では、この細胞は外因性トレハロース輸送タンパク質を発現するように改変される。他の態様では、この細胞は外因性の植物後期胚形成主要(LEA)タンパク質を発現するように改変される。他の態様では、この細胞はトレハロース合成経路を発現するように改変される。本発明は同様に、上記の改変の組み合わせ(例えば、外因性トレハロース輸送タンパク質および外因性LEAタンパク質の両方を発現するような細胞の改変)を企図するものである。
【０１０９】
特に好ましい態様では、本発明は、トレハロース輸送タンパク質、トレハロース合成経路タンパク質またはLEAタンパク質を発現するように改変された細胞(例えば、NIKS細胞)、ならびにトレハロース輸送タンパク質、トレハロース合成経路タンパク質またはLEAタンパク質を発現する細胞(例えば、NIKS細胞)を作製するための組成物および方法を企図するものである。好ましい態様では、この細胞はトレハロース輸送タンパク質、トレハロース合成経路タンパク質またはLEAタンパク質をコードするDNAを含んだ発現ベクターを用いたトランスフェクションによりトレハロース輸送タンパク質、トレハロース合成経路タンパク質またはLEAタンパク質を発現するように誘導される。トレハロース輸送タンパク質、トレハロース合成経路タンパク質またはLEAタンパク質をコードするDNAを含んだ発現ベクターは、結果的に得られるベクターが所望の宿主(例えば、NIKS細胞)内で作動可能となるように、そのDNAを1つまたは複数の調節配列に作動可能に連結させることによって作製することができる。
【０１１０】
本発明のいくつかの態様では、ポリペプチドの細胞内または細胞外産生を容易にする別の分子のコード配列に適切なcDNAの5'末端を正しい枠および方向で連結させることにより、完全長のトレハロース輸送タンパク質、トレハロース合成経路タンパク質もしくはLEAタンパク質またはその断片を融合タンパク質として発現させる。
【０１１１】
ある種の態様では、トレハロース輸送タンパク質、トレハロース合成経路タンパク質またはLEAタンパク質をコードするcDNAをクローニングベクターにクローニングする。好ましい態様では、TAクローニングキットを利用して、この工程を容易にすることができる。
【０１１２】
発現ベクター中でトレハロース輸送タンパク質、トレハロース合成経路タンパク質またはLEAタンパク質をコードするDNAに連結させることができる調節配列は、タンパク質を発現させる宿主細胞内で作動可能なプロモーターである。任意に、エンハンサー配列、機能的なスプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を有するイントロン、タンパク質の分泌を指令するシグナル配列、ポリアデニル化配列、その他の転写終結配列、ならびに宿主細胞のゲノムに相同的な配列のうちの1つまたは複数などの、その他の調節配列を本明細書中で使用することができる。複製起点などの他の配列を同じくベクターに付加して、所望のタンパク質の発現を最適化することができる。さらに、形質転換された宿主細胞内のベクターの存在を選択する目的で、選択可能なマーカーを発現ベクター中に存在させることができる。
【０１１３】
所望の宿主内でトレハロース輸送タンパク質、トレハロース合成経路タンパク質またはLEAタンパク質の発現を可能にできる任意のプロモーターを本発明の中で使用することができる。本明細書中で使用できる哺乳動物プロモーター配列は、高度に発現されるのと宿主の範囲の広い哺乳動物ウイルス由来のものである。実例としては、SV40初期プロモーター、サイトメガロウイルス(「CMV」)前初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス末端反復配列(「LTR」)プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター(Ad MLP)および単純ヘルペスウイルス(「HSV」)プロモーターが挙げられる。さらに、マウスメタロチオネイン遺伝子などの非ウイルス遺伝子に由来するプロモーター配列も本明細書中で有用である。さらに、これらのプロモーターは構成性プロモーターであってもよく、またはホルモン感受性細胞において糖質コルチコイドで誘導できるプロモーターのような調節性プロモーターであってもよい。好ましい態様では、トレハロース輸送タンパク質のDNAをpTETonプラスミド(Clontech)中のプロモーターに作動可能に連結し、これを標的細胞(例えば、NIKS細胞)にトランスフェクトする。
【０１１４】
本発明はトレハロース輸送タンパク質、トレハロース合成経路タンパク質またはLEAタンパク質のいずれかの特定のホモログまたはバリアントの使用に限定されることはない。実際に、トレハロース輸送タンパク質、トレハロース合成経路タンパク質またはLEAタンパク質の各種のバリアントがその対応する野生型タンパク質の活性の少なくとも一部を保持している限り、それらを使用することができる。具体的には、配列番号:1、3、4、5、6および7によりコードされるタンパク質を本発明の中で用いることができるものと考えられる。さらに、低度から高度のストリンジェンシーにおよぶ条件下で配列番号:1、3、4、5、6および7にハイブリダイズする配列によってコードされるバリアントを本発明の中で用いることができるものと考えられる。バリアントを適切なベクターに入れてケラチノサイト内で発現し(以下にさらに詳細に記述する)、このケラチノサイトを用いて皮膚同等物を作製し、この皮膚同等物を遺伝子発現について分析することにより、機能的バリアントをスクリーニングすることができる。
【０１１５】
いくつかの態様では、バリアントは突然変異(すなわち、核酸配列の変化)から生じ、変化したmRNAまたはポリペプチドを一般にもたらし、そのmRNAまたはポリペプチドの構造または機能が変化することもあれば変化しないこともある。遺伝子にはバリアント型がないものもあり、1つまたは多数のバリアント型を有するものもある。バリアントをもたらすよく見られる突然変異変化は、通常、核酸の欠失、付加または置換によるものである。これらのタイプの変化はそれぞれ単独で、または他のものとの組み合わせで起こることがあり、および所定の配列内に1回または複数回の頻度で起こることがある。
【０１１６】
タンパク質のそのリガンドに対する結合親和性の増大などのような目的で、ある機能(例えば、トレハロース輸送タンパク質、LEAまたはトレハロース合成経路の遺伝子の機能)を有するポリペプチドの構造を変化させることが可能であると考えられる。このような改変ポリペプチドまたは核酸は、本明細書中で定義される、タンパク質の活性を有するペプチドの機能的等価物と考えられる。改変ペプチドは、置換、欠失または付加などによってポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を変化させたものから産生させることができる。特に好ましい態様では、これらの改変によって改変タンパク質の活性が著しく低下することはない。言い換えれば、構築体「X」を、これが構造的にではなく機能的に定義される本発明の改変またはバリアントタンパク質類の一員であるかどうかを判定する手段として評価することができる。好ましい態様では、バリアントまたは突然変異タンパク質の活性は本明細書中で説明される方法によって評価される。
【０１１７】
さらに、上記の通り、バリアント型のトレハロース輸送タンパク質、トレハロース合成経路タンパク質、またはLEAタンパク質も、本明細書中にさらに詳細に述べるペプチドおよびDNA分子と同等であるものと考えている。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンによる単独置換、アスパラギン酸のグルタミン酸による単独置換、トレオニンのセリンによる単独置換、またはあるアミノ酸の構造的に類似したアミノ酸による類似の置換(すなわち、保存的変異)は、結果として生じる分子の生物活性に大きな影響を及ぼさないと考えられる。保存的置換とは、側鎖に類似性があるアミノ酸のファミリー内部で起こるもののことである。遺伝子によりコードされるアミノ酸は以下の4つのファミリーに分けることができる: (1)酸性(アスパラギン酸、グルタミン酸); (2)塩基性(リジン、アルギニン、ヒスチジン); (3)非極性(アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン); および(4)非荷電極性(グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン)。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンはまとめて芳香族アミノ酸に分類されることもある。同様の様式で、アミノ酸のレパートリーを、(1)酸性(アスパラギン酸、グルタミン酸); (2)塩基性(リジン、アルギニン、ヒスチジン)、(3)脂肪族(グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン)、任意にはセリンおよびトレオニンを別に脂肪族-ヒドロキシルに分類することもできる; (4)芳香族(フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン); (5)アミド(アスパラギン、グルタミン)；および(6)含硫性(システインおよびメチオニン)(例えば、Stryer編、「生化学(Biochemistry)」、pg. 17-21, 第2版、WH Freeman and Co., 1981を参照されたい)。ペプチドのアミノ酸配列の変化によって機能的ホモログが生じるか否かは、バリアント型ペプチドが野生型タンパク質と類似した様式で機能する能力を評価することによって容易に判定することができる。複数の置換を有するペプチドも同じ様式で容易に調べることができる。
【０１１８】
さらに稀には、バリアントは「非保存的」な変化(例えば、グリシンのトリプトファンによる置換)を含む。類似した少数の差異には、アミノ酸の欠失もしくは挿入、またはその両方も含まれうる。生物活性を損なわずにどのアミノ酸残基を置換、挿入または欠失させうるかを判断するための手引きは、コンピュータプログラム(例えば、LASERGENEソフトウエア、DNASTAR Inc., Madison, Wis.)を用いて得ることができる。
【０１１９】
B) 改変型細胞系
本発明はいずれかの特定の細胞系の改変に限定されることはない。実際に、本発明は様々な細胞系の改変であって、その結果、凍結および/または乾燥によりその細胞系を効果的に保存し、その後に治療目的または他の目的で使用できるその細胞系の改変を企図するものである。
【０１２０】
いくつかの好ましい態様では、トレハロース輸送タンパク質、トレハロース合成経路タンパク質もしくはLEAタンパク質またはその組み合わせを用いて改変される細胞系は幹細胞系を含む。幹細胞は2種類の供給源、つまり分化細胞および胚から得ることができる。例えば、Thompsonの米国特許第5,843,780号は、ヒト胚からの幹細胞系の作製について記述している。成人幹細胞の例としては、造血幹細胞、神経幹細胞、間充織幹細胞、および骨髄間質細胞が挙げられる。これらの幹細胞は脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、筋細胞、骨髄間質細胞および胸腺間質細胞(間充織幹細胞); 肝細胞、血管細胞および筋肉細胞(造血幹細胞); 筋細胞、肝細胞およびグリア細胞(骨髄間質細胞)ならびに、実に、3種類全ての胚葉由来の細胞(成人神経幹細胞)を含めて、種々の細胞型に分化する能力を実証している。
【０１２１】
霊長類胚性幹細胞は、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,843,780号および第6,200,806号に開示されている方法によって好ましく得ることができる。霊長類(ヒトを含む)幹細胞はWiCell, Madison, WIなどの商業的供給源から得ることもできる。胚性幹細胞の単離に好ましい培地は「ES培地」である。ES培地は、20%ウシ胎児血清(FBS; Hyclone)、0.1 mM β-メルカプトエタノール(Sigma)、1%非必須アミノ酸ストック(Gibco BRL)の入った80%ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM; ピルビン酸不含、高濃度グルコース配合物、Gibco BRL)からなる。ウシ胎児血清のバッチを低継代数のマウスES細胞系(ESjt3)、つまりこの試験の目的のためだけに開発された細胞系のクローン性コロニー形成率の試験により比較することが好ましい。バッチによって胚細胞の増殖を補助するその能力が劇的に変化するということが分かっているので、FBSのバッチを比較しなければならないが、胚細胞を補助することに関してFBSのバッチの能力をアッセイする他のいずれかの方法も代替手段として機能するものと考えられる。
【０１２２】
霊長類ES細胞をES細胞培地の存在下、マウス胚線維芽細胞の集密層上に単離する。胚線維芽細胞は非近交系CF1マウス(SASCO)由来の12日齢の胎児から得ることが好ましいが、その他の系統を代替物として使うこともできる。組織培養皿を0.1%ゼラチン(I型; Sigma)で処理することが好ましい。
【０１２３】
アカゲザル胚の場合、正常な卵巣周期を示す成体雌性アカゲザル(4歳齢を超える)を月経出血の証拠がないか毎日観察する(周期の第1日目 = 月経開始日)。血液試料を月経周期の第8日目から始まる卵胞期の間に毎日採血し、黄体形成ホルモンの血清濃度を放射免疫測定により測定する。この雌を月経周期の第9日目から黄体形成ホルモンの急増後の48時間まで受精能の証明された雄性アカゲザルと対にする; 排卵は黄体形成ホルモンの急増の翌日と考えられる。拡張した胚盤胞を排卵から6日後に非外科的子宮洗浄により採取する。この手順によって通常、1月当たりアカゲザル1匹につき平均0.4個〜0.6個の生存胚が回収される(Seshagiri et al. Am J Primatol 29:81-91, 1993)。
【０１２４】
マーモセット胚の場合、規則的な卵巣周期を示す成体雌性マーモセット(2歳齢を超える)を受精能のある雄と5匹までの子孫を抱える家族集団の中で維持する。卵巣周期を黄体中期から後期の間、プロスタグランジンPGF2a類似体クロプロステノール(Estrumate, Mobay Corp, Shawnee, KS) 0.75 gの筋肉注射により制御する。血液試料を第0日に(クロプロステノール注射の直前に)、ならびに第3、7、9、11および13日に採血する。血漿プロゲステロン濃度をELISAにより測定する。排卵日は血漿プロゲステロン濃度が10 ng/mlまたはそれ以上になる前日と考えられる。排卵から8日後に、拡張した胚盤胞をThomsonら（「Non-surgical uterine stage preimplantation embryo collection from the common marmoset」、J Med Primatol, 23:333-336 (1994)）の非外科的な子宮洗浄手順により採取する。この手順によって、1月当たりマーモセット1匹につき1.0個の生存胚が平均して回収される。
【０１２５】
プロナーゼ(Sigma)に短時間曝露することによって胚盤胞から透明帯を除去する。免疫手術の場合、胚盤胞を50倍希釈のウサギ抗マーモセット脾臓細胞抗血清(マーモセット胚盤胞の場合)のDMEMまたは50倍希釈のウサギ抗アカゲザル脾臓細胞抗血清(アカゲザル胚盤胞の場合)のDMEMに30分間曝し、次いでこれをDMEM中で5分間3回洗浄し、次いでこれを5倍希釈のモルモット補体(Gibco)に3分間曝す。
【０１２６】
DMEM中でさらに2回洗浄後、溶解した栄養外胚葉細胞を無傷の内部細胞塊(ICM)から穏やかにピペッティングすることによって除去し、このICMをマウス不活性化(3000 radのガンマ線照射)胚線維芽細胞上に播いて培養した。7日〜21日後、ICM由来の細胞塊を立体顕微鏡で直接観察しながらマイクロピペットを用いて内胚葉生成物から取り出し、これを1%ニワトリ血清の入った0.05%トリプシン-EDTA(Gibco)に3分〜5分間曝し、火炎研磨されたマイクロピペット(flame polished micropipette)を介して穏やかにピペッティングすることによって徐々に分離した。
【０１２７】
分離した細胞を新鮮なES培地中の胚フィーダー層上に再び播いて、コロニー形成について観察する。ES様の形態を示すコロニーを個別に選択し、前述の通り再分割する。ES様の形態は、高い核・細胞質比と大きな核小体を有する緻密なコロニーと定義される。その後、得られたES細胞を、その培養物が密になる1週〜2週ごとに短時間のトリプシン処理またはダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(カルシウムまたはマグネシウム不含および2 mM EDTA含有)への曝露により定期的に分割する。また、初期継代細胞を凍結し液体窒素中に保存する。
【０１２８】
本発明の方法は霊長類胚性幹細胞の使用に限定されることはない。実際に、マウス、ラット、ブタ、ウシおよびヒツジを含むがこれらに限定されない、その他の種由来の胚性幹細胞の使用を企図するものである。これらの種由来の多能性細胞を得る方法は過去に報告されている。例えば、
2006526413.tif 000003
を参照されたい。
【０１２９】
本発明は非胚性幹細胞の使用も企図する。間充織幹細胞(MSC)を髄、骨膜、真皮および中胚葉由来の他の組織から得ることができる(例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,591,625号および第5,486,359号を参照されたい)。MSCは新組織を形成する多能性芽球細胞であり、様々なインビボまたはインビトロの環境による影響に応じて特定型の結合組織(すなわち、特殊化した構成要素を支持する体組織; 具体的には脂肪組織、疎性結合組織、骨組織、軟骨組織、弾性結合組織、骨髄基質、筋肉の結合組織および線維性結合組織)に分化する。これらの細胞は通常、骨髄中に非常に低い頻度で存在しているにすぎないが、骨髄由来の間充織幹細胞を単離し、精製し、培養で、すなわちインビトロで大幅に複製するための様々な方法が報告されている(それぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,197,985号および第5,226,914号ならびにPCT公開番号国際公開公報第92/22584号も参照されたい)。
【０１３０】
造血幹細胞の単離のための様々な方法も報告されている(例えば、全てが参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,061,620号; 第5,750,397号; 第5,716,827号を参照されたい)。本発明の方法を使用して、造血幹細胞からリンパ球系細胞、骨髄球系細胞および赤血球系細胞を産生させることができるものと考えられる。B細胞およびT細胞を含むリンパ球系は、抗体の産生、細胞免疫系の調節、血液中の外来因子の検出、宿主にとって異質の細胞の検出などをもたらす。単球、顆粒球、巨核球ならびにその他の細胞を含む骨髄球系は、血流中の異物の存在を監視し、新生細胞に対する防御をもたらし、血流中の異物を除去し、血小板を産生したりする。赤血球系は酸素運搬体として機能する赤血球をもたらす。
【０１３１】
本発明は、発育中の胎児から通常単離される神経幹細胞の使用も企図する。神経幹細胞の単離、培養および使用は、全てが参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,654,183号; 第5,672,499号; 第5,750,376号; 第5,849,553号; および第5,968,829号に記述されている。本発明の方法では神経幹細胞を使用して、ニューロン、グリア、メラノサイト、頭頸部の軟骨組織および結合組織、様々な分泌腺の実質ならびに心臓の流出路中の細胞を産生させることができるものと考えられる。
【０１３２】
他の好ましい態様では、トレハロース輸送タンパク質、トレハロース合成経路タンパク質もしくはLEAタンパク質またはその組み合わせを用いて改変される細胞系は、重層化して扁平上皮となりうる任意の供給源の細胞または細胞系を含む。したがって、本発明は扁平上皮に分化できるいずれかの特定の供給源の細胞の使用に限定されることはない。実際に、本発明は初代ケラチノサイトおよび不死化ケラチノサイトの両方を含めて、扁平上皮に分化できる様々な細胞系および供給源の使用を企図するものである。細胞の供給源には、ヒトおよび死体ドナーから生検により採取したケラチノサイトおよび真皮線維芽細胞(Auger et al., In Vitro Cell. Dev. Biol.−Animal 36:96-103; 米国特許第5,968,546号および第5,693,332号、これらはそれぞれが参照により本明細書に組み入れられる)、新生児包皮(Asbill et al., Pharm. Research 17(9): 1092-97 (2000); Meana et al., Burns 24:621-30 (1998); 米国特許第4,485,096号; 第6,039,760号; および第5,536,656号、これらはそれぞれが参照により本明細書に組み入れられる)、ならびにNM1細胞(Baden, In Vitro Cell. Dev. Biol. 23(3):205-213 (1987))、HaCaT細胞(Boucamp et al., J. cell. Boil. 106:761-771 (1988)); およびNIKS細胞(細胞系BC-1-Ep/SL; 米国特許第5,989,837号、これは参照により本明細書に組み入れられる; ATCC CRL-12191)などの不死化ケラチノサイト細胞系が含まれる。所望のタンパク質を発現するまたは共発現することができる細胞系を産生させるため、これらの細胞系のそれぞれを以下のように培養するかまたは遺伝的に改変することができる。
【０１３３】
特に好ましい態様では、NIKS細胞を用いる。新規ヒトケラチノサイト細胞系(二倍体に近い不死化ケラチノサイト（near-diploid immortalized keratinocytes）、またはNIKS)の発見により、新たなインビトロ試験方法のためにヒトケラチノサイトを遺伝的に操作する機会が生まれた。NIKS細胞に特有な利点は、遺伝的に均一で病原体を含まないヒトケラチノサイトの安定した供給源であることである。この理由から、それらは、ヒト皮膚により類似した特性を備えた培養皮膚同等物を得るために遺伝子工学およびゲノム遺伝子発現のアプローチを適用するのに有用である。このようなシステムは、試験化合物および配合物の試験のために動物を用いることに代わる重要な選択肢になると考えられる。NIKSケラチノサイト細胞系は、ウィスコンシン大学で同定されて特徴が明らかにされたもので、非腫瘍形成性であり、安定した核型を示し、単層培養および器官培養のいずれにおいても正常な分化を示す。NIKS細胞は培養下で完全に重層化した皮膚同等物を形成する。これらの培養物は、これまでに検討したいずれの基準によっても、初代ヒトケラチノサイトから形成された器官培養物と区別不能である。しかし、初代細胞とは異なり、不死化NIKS細胞は単層培養下で無限に増殖を続けると考えられる。これにより、細胞を遺伝的に操作して、新たな有用な特性を備えた細胞の新たなクローンを単離する機会が得られる(Allen-Hoffmann et al., J. Invest. Dermatol., 114(3): 444-455 (2000))。
【０１３４】
NIKS細胞は、外見上正常な男児から単離されたヒト新生児包皮ケラチノサイトのBC-1-Ep株から生じたものである。初期の継代において、BC-1-Ep細胞は、培養正常ヒトケラチノサイトにとって非定型的な形態的および増殖的な特徴を全く示さなかった。培養BC-1-Ep細胞は重層化を示した上に、プログラム細胞死の特徴も示した。複製寿命を決定するために、BC-1-Ep細胞を老化するまで、標準的なケラチノサイト増殖培地中にて3×105個/100 mm培養皿の密度で連続培養し、毎週継代した(約1: 25の分割比)。第15継代までに、集団内のほとんどのケラチノサイトは、大きく平坦な細胞が認められる発育不全コロニーが数多く存在することから判断して老化したものと考えられた。しかし、第16継代では、細胞サイズの小さいケラチノサイトが明らかに認められた。第17継代までには、培養物には小型ケラチノサイトしか存在しなくなり、大型の老化ケラチノサイトは認められなくなった。この危機的と思われる時期を生き延びた、この結果得られた小型ケラチノサイトの集団は、形態的に均一な外観を示し、細胞間接着および扁平な外観の細胞の生成を含む、典型的なケラチノサイトの特徴を呈するケラチノサイトのコロニーを生じた。この老化時期を生き延びたケラチノサイトを、3×105個/100-mm培養皿の密度で連続培養した。通常の場合、培養物は7日間以内に約8×106個の細胞密度に達した。この安定した細胞増殖速度は少なくとも59回の継代にわたって維持され、このことから細胞が不死性を獲得したことが示された。最初の老化性集団から出現したケラチノサイトは当初、BC-1-Ep/自発的系統と命名され、現在ではNIKSと呼ばれている。NIKS細胞系に対しては、HIV-1、HIV-2、EBV、CMV、HTLV-1、HTLV-2、HBV、HCV、B-19パルボウイルス、HPV-16およびHPV-31のプロウイルスDNA配列の存在に関するスクリーニングが、PCRまたはサザン分析のいずれかを用いて行われている。これらのウイルスはいずれも検出されなかった。
【０１３５】
第3継代の親BC-1-Ep細胞ならびに第31および54継代のNEKS細胞に対して染色体分析を行った。親BC-1-Ep細胞は、XYを含め、46本の正常染色体すべてを有していた。第31継代では、すべてのNIKS細胞が47本の染色体を有し、第8染色体長腕の同腕染色体1本を余分に有していた。他に大きな染色体異常および標識染色体は検出されなかった。第54継代では、すべての細胞が第8染色体の同腕染色体を含んでいた。
【０１３６】
NIKS細胞系およびBC-1-EpケラチノサイトのDNAフィンガープリントは、分析した12個の遺伝子座すべてで同一であり、このことからNIKS細胞が親BC-1-Ep集団から派生したことが示された。NIKS細胞系が親BC-1-EpのDNAフィンガープリントを偶然に有している確率は4×10-16である。ヒトケラチノサイトの3種の異なる源であるED-1-Ep、SCC4およびSCC13yからのDNAフィンガープリントはBC-1-Epのパターンとは異なっていた。このデータは、他のヒトED-1-Ep、SCC4およびSCC13yから単離されたケラチノサイトが、BC-1-Ep細胞とも相互にも類縁関係にないことも示している。NIKSのDNAフィンガープリントのデータは、NIKS細胞系を同定する明確な手法を提供するものである。
【０１３７】
p53機能の喪失は、培養細胞における増殖能力の向上および不死化頻度の増加と相関している。NIKS細胞におけるp53の配列は、発表されているp53配列(GenBankアクセッション番号：M14695)と同一である。ヒトの場合、p53はコドン72のアミノ酸によって区別される2種類の主要な多型として存在している。NIKS細胞におけるp53の対立遺伝子は両方とも野生型であり、コドン72にアルギニンをコードする配列CGCがある。もう一方の一般的な型のp53は、この位置にプロリンを有する。NIKS細胞におけるp53の全配列はBC-1-Ep前駆細胞と同一である。NIKS細胞ではRbも野生型であることが明らかになっている。
【０１３８】
足場非依存的な増殖性はインビボでの腫瘍発生能と高度に相関している。この理由から、寒天またはメチルセルロースを含む培地中でのNIKS細胞の足場非依存的な増殖特性を調べた。寒天またはメチルセルロースを含む培地中に4週間おいた後も、NIKS細胞は単細胞であり続けた。NIKS細胞の緩徐増殖性バリアントを検出するために、このアッセイを合計8週間にわたって継続したが、全く観察されなかった。
【０１３９】
親BC-1-Epケラチノサイトおよび不死化NIKSケラチノサイト細胞系の腫瘍発生能を明らかにするために、無胸腺ヌードマウスの側腹部に細胞を注入した。ヒト扁平上皮がん細胞系SCC4を、これらの動物における腫瘍形成に関する陽性対照として用いた。試料の注入は、SCC4細胞が片側の側腹部に注入され、親BC-1-EpケラチノサイトまたはNIKS細胞が反対側の側腹部に注入されるようにデザインした。この注射方式により、腫瘍形成に関するマウスの個体差をなくすことができ、マウスが腫瘍形成性細胞の盛んな増殖に耐えうることが確認された。親BC-1-Epケラチノサイト(第6継代)およびNIKSケラチノサイト(第35継代)はいずれも無胸腺ヌードマウスにおいて腫瘍を形成しなかった。
【０１４０】
NIKS細胞を表面培養および器官培養における分化能力に関して分析した。表面培養下の細胞に関しては、扁平分化のマーカーである角化膜の形成をモニタリングした。培養ヒトケラチノサイトでは、角化膜の構築早期にインボルクリン、シスタチン-αおよび他のタンパク質から構成される未熟構造の形成が起こり、これが成熟角化膜の内側3分の1を占める。接着性BC-1 Ep細胞またはNIKS細胞系に由来するケラチノサイトのうち角化膜を形成するのは2%未満である。この所見は、集密に達する以前の、活動的に増殖しているケラチノサイトのうち、角化膜を形成するのは5%未満であることを示した以前の研究とも一致する。NIKS細胞系が分化誘導を受けた場合に角化膜を形成しうるか否かを明らかにするために、細胞を表面培養物から採取し、メチルセルロースによって半固体にした培地中で24時間浮遊培養した。ケラチノサイトの細胞間接着および細胞-基層接着の喪失により、ケラチンの差異を伴う発現および角化膜の形成を含む、終末分化の様々な様相をインビトロで誘発することが可能である。NIKSケラチノサイトは親ケラチノサイトと同程度、通常はより多くの角化膜を形成した。これらの所見は、この細胞型に特異的な分化構造の形成を誘発する能力をNIKSケラチノサイトが失っていないことを示す。
【０１４１】
NIKSケラチノサイトが扁平分化を生じうることを確かめるために、この細胞を器官培養下で培養した。プラスチック基層上で増殖させて培地中に浸漬したケラチノサイト培養物は複製するが、分化は限定的であった。詳細には、ヒトケラチノサイトは集密化して、3層またはそれ以上の層のケラチノサイトからなるシートを形成する限定的な重層化を起こす。光学顕微鏡および電子顕微鏡によれば、組織培養下で形成される多層シートと完全なヒト皮膚の構造の間には大きな差がある。これに対して、器官培養法では、ケラチノサイトがインビボに類似した条件下で増殖および分化を行うことが可能である。詳細には、細胞を、真皮線維芽細胞が繊維性コラーゲン基層に包埋したものからなる生理的基層に付着させる。器官培養物は気相培地界面に保つ。これにより、上方のシート内の細胞は空気に曝露され、増殖中の基底細胞はコラーゲンゲルを通して拡散によって供給される栄養分の勾配に接した状態に保たれる。これらの条件下では正しい組織構造が形成され、正常に分化している表皮のいくつかの特徴が明らかに認められる。親細胞およびNIKS細胞系のいずれにおいても、立方基底細胞の単層が表皮と真皮同等物との接合部に存在する。形態が円形で核細胞質比が高いことは、ケラチノサイト集団が活動的に分裂していることを表す。正常ヒト表皮では、基底細胞が分裂するたびに娘細胞が生じ、上方の分化中の組織層に移動する。娘細胞のサイズは拡大し、平坦化して扁平になる。最終的にはこれらの細胞は脱核し、角化した角質構造を形成する。この正常な分化過程は、親細胞およびNIKS細胞のいずれの上層にも認められる。平坦化した扁平細胞の外観がケラチノサイトの上層に認められ、このことから器官培養物で重層化が起こったことが示される。器官培養物の最も上の部分では、脱核した扁平細胞が培養物の表面から剥落する。現在のところ、器官培養下で増殖させた親ケラチノサイトとNIKSケラチノサイト細胞系との間に、光顕レベルでは分化における組織学的な差は認められていない。
【０１４２】
親(第5継代)およびNIKS(第38継代)器官培養物のより詳細な特徴を観察するため、ならびに組織学的な観察所見を確認するために、電子顕微鏡を用いて試料を分析した。親細胞および不死化ヒトケラチノサイト細胞系NIKSを15日間の器官培養を行った後に回収し、重層化の程度を示すために基底層に対して垂直に切片化した。親細胞およびNIKS細胞系はいずれも器官培養下で広範な重層化を生じ、正常ヒト表皮の特徴を備えた構造を形成する。親細胞およびNIKS細胞系の器官培養物には大量のデスモソームが形成される。基底層の形成および基底ケラチノサイト層における随伴性のヘミデスモソームも、親細胞および細胞系の両方に認められた。
【０１４３】
ヘミデスモソームはケラチノサイトの基底層への付着性を高める特殊な構造であり、組織の完全性および強度の維持に役立つ。これらの構造の存在は、親細胞またはNIKS細胞が多孔性支持体に直接付着した領域で特に顕著であった。これらの所見は、線維芽細胞を含む多孔性支持体上で培養したヒト包皮ケラチノサイトを用いて以前に得られた超微細構造の所見と一致する。光顕および電顕レベルでの分析により、器官培養下のNIKS細胞系が重層化し、分化して、正常ヒト表皮に認められるデスモソーム、基底層およびヘミデスモソームなどの構造を形成しうることが示されている。
【０１４４】
C) 臓器および組織の産生
本発明のいくつかの態様では、上記の遺伝的に改変された細胞を使用して臓器および組織を産生させる。いくつかの好ましい態様では、この細胞(例えば、改変型NIKS細胞)を使用してヒト皮膚同等物を産生させる。NIKS細胞からのヒト皮膚同等物の産生は、米国特許第5,989,837号(これは参照により本明細書に組み入れられる)におよび実施例に記述されている。
【０１４５】
この改変型細胞を使用して、その他のタイプの臓器および組織を産生させることもできる。臓器のインビトロ増殖は、全てが参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,140,039号(腱および靱帯); 第5,902,741号(軟骨); 第5,849,588号(肝臓); 第6,022,743号(膵臓); 第5,516,680号(腎臓); 第5,266,480号(皮膚); 第6,121,042号; 第5,962,325号; 第5,510,254号; 第5,518,915号; 第5,843,766号; 第5,863,531号; 第5,763,267号; 第5,785,964号; 第5,591,625号; 第5,486,359号および第5,827,729号に記述されている。
【０１４６】
D) 臓器および組織の保存
いくつかの好ましい態様では、改変型細胞または改変型細胞を含む臓器もしくは組織を凍結および/または乾燥により保存する。凍結および/または乾燥の技術は改変型細胞ならびに改変型細胞を含む臓器および組織に対する保存期間の延長をもたらすものと考えられる。好ましい態様では、凍結されたおよび/または乾燥された細胞、改変型細胞を含む組織および臓器は周囲温度(例えば、約0℃から約38℃におよぶ温度)で約1週間を超える保存期間を有する。より好ましい態様では、凍結されたおよび/または乾燥された細胞、改変型細胞を含む組織および臓器は周囲温度で約1ヶ月を超える保存期間を有する。最も好ましい態様では、凍結されたおよび/または乾燥された細胞、改変型細胞を含む組織および臓器は周囲温度で約6ヶ月を超える保存期間を有する。同様に、好ましい態様では、凍結された細胞、改変型細胞を含む組織および臓器は凍結温度(例えば、約-180℃から約0℃におよぶ温度)で約1週間を超える保存期間を有する。より好ましい態様では、凍結された細胞、改変型細胞を含む組織および臓器は凍結温度で約1ヶ月を超える保存期間を有する。最も好ましい態様では、凍結された細胞、改変型細胞を含む組織および臓器は凍結温度で約6ヶ月を超える保存期間を有する。
【０１４７】
他の好ましい態様では、本発明は、融解および/または再水和後に約70%を超える生存性を示す凍結されたおよび/または乾燥された改変型細胞ならびに改変型細胞を含む組織および臓器を提供する。より好ましい態様では、本発明は、融解および/または再水和後に約80%を超える生存性を示す凍結されたおよび/または乾燥された改変型細胞ならびに改変型細胞を含む組織および臓器を提供する。最も好ましい態様では、本発明は、融解および/または再水和後に約90%を超える生存性を示す凍結されたおよび/または乾燥された改変型細胞ならびに改変型細胞を含む組織および臓器を提供する。
【０１４８】
いくつかの好ましい態様では、細胞、臓器または組織をガラス化する。さらに好ましい態様では、細胞、臓器または組織を凍結乾燥する(すなわち、細胞、臓器または組織中の水を除去しながら細胞、臓器または組織を凍結状態にする)。他の好ましい態様では、細胞、臓器または組織を空気乾燥する。いくつかの特に好ましい態様では、トレハロースを含有する細胞、臓器または組織をトレハロースおよびオキシアニオンの存在下で凍結させる。本発明はいずれかの特定のオキシアニオンの使用に限定されることはない。実際に、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩および硝酸塩を含むがこれらに限定されない、様々なオキシアニオンの使用を企図するものである。
【０１４９】
E) 治療用途
本発明の保存細胞、臓器および組織は治療的に使用できるものと考えられる。
【０１５０】
いくつかの態様では、この細胞、臓器および組織を利用して慢性皮膚創傷を治療する。慢性皮膚創傷(例えば、静脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍、褥瘡)の治療の成功は重大な問題である。そのような創傷の治癒には多くの場合、1年をはるかに上回る治療が必要になる。治療法の選択肢としては現在のところ、包帯法および壊死組織切除法(壊死組織を一掃するために化学物質または外科処置を利用すること)ならびに/または感染症の場合には抗生物質が挙げられる。これらの治療選択肢には長い期間および多量の服薬が必要になる。したがって、医師による慢性創傷の治癒の成功を高めて創傷治癒の速度を速めることができる治療法はこの分野においてまだ満たされていない必要性を満たすことができるであろう。したがって、本発明は、本発明の改変型細胞(例えば、改変型NIKS細胞)を含む皮膚同等物を用いた皮膚創傷の治療を企図するものである。いくつかの態様では、改変型NIKS細胞を創傷部位に局所的に適用する。他の態様では、改変型NIKS細胞を含む皮膚同等物を部分層創傷に対する移植に使用する。他の態様では、改変型NIKS細胞を含む皮膚同等物を全層創傷に対する移植に使用する。他の態様では、改変型NIKS細胞を含む皮膚同等物を使用して、胃腸管を裏打ちする粘膜の内部創傷、潰瘍性大腸炎およびがん治療によって引き起こされる可能性のある粘膜の炎症を含むがこれらに限定されない、多くのタイプの内部創傷を治療する。他の態様では、発現性の改変型NIKS細胞を含む皮膚同等物を一時的または永続的な創傷包帯として使用する。
【０１５１】
改変型細胞を含む皮膚同等物は、創傷閉鎖および熱傷治療の用途にも有用である。熱傷治療および創傷閉鎖のための自己移植片および同種移植片の使用は、Myers et al., A. J. Surg. 170(1): 75-83 (1995)ならびに米国特許第5,693,332号; 第5,658,331号; および第6,039,760号に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。いくつかの態様では、皮膚同等物はDERMAGRAFTまたはEXPRESSGRAFTなどの代用真皮とともに用いることができる。他の態様では、皮膚同等物は標準的なケラチノサイト供給源(例えば、NIKS細胞)および移植片を受けることになる患者由来のケラチノサイトの両方を用いて作製される。したがって、この皮膚同等物は2つの異なる供給源由来のケラチノサイトを含む。他の態様では、皮膚同等物はヒト組織単離物に由来するケラチノサイトを含む。したがって、本発明は、熱傷によって生じた創傷を含む、創傷の閉鎖方法であって、皮膚同等物および創傷に罹患した患者を提供する段階、ならびに創傷が閉鎖される条件下で患者を皮膚同等物によって治療する段階を含む。
【０１５２】
他の態様では、改変型細胞を遺伝子操作して、さらなる治療薬を被験体に提供する。本発明はいずれかの特定の治療薬の送達に限定されることはない。実際には、酵素、ペプチド、ペプチドホルモン、他のタンパク質、リボソームRNA、リボザイムおよびアンチセンスRNAを含むが、これらに限定されない、様々な治療薬を被験体に送達できるものと考えられる。これらの治療薬は、遺伝的障害を是正する目的を含むがこれに限定されない、様々な目的で送達することができる。いくつかの特に好ましい態様では、移植片を野生型組織として機能させる遺伝的先天性代謝異常(例えば、アミノ酸尿(aminoacidopathesis))患者を解毒する目的で、治療薬を送達する。治療薬の送達によって障害が是正されるものと考えられる。いくつかの態様では、改変型細胞に、治療薬(例えば、インスリン、凝固第IX因子、エリスロポエチンなど)をコードするDNA構築体を同時にトランスフェクトし、この細胞を被験体に移植する。その結果、治療薬は移植細胞から患者の血流またはその他の組織に送達される。好ましい態様では、治療薬をコードする核酸を、適したプロモーターに作動可能に連結させる。本発明はいずれかの特定のプロモーターの使用に限定されることはない。実際に、誘導的、構成的、組織特異的およびケラチノサイト特異的なプロモーターを含むが、これらに限定されない、様々なプロモーターの使用が考えられる。いくつかの態様では、治療薬をコードする核酸は、ケラチノサイト内に直接的に導入する(すなわち、リン酸カルシウム共沈法、またはリポソームを介したトランスフェクション法により)。他の好ましい態様では、治療薬をコードする核酸はベクターとして提供し、このベクターを当技術分野において知られる方法によってケラチノサイト内に導入する。いくつかの態様では、ベクターはプラスミドなどのエピソーム性ベクターである。他の態様では、ベクターはケラチノサイトのゲノム中に組み込まれる。組込みベクターの例には、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよびトランスポゾンベクターが含まれるが、これらに限定されることはない。
【０１５３】
さらに、上記の細胞系を様々な細胞移植療法に使用できるものと考えられる。具体的には、上記の細胞系を任意の所望の細胞型に分化させることができる。いくつかの態様では、造血細胞系を上記の細胞系から産生し、これを用いて卵巣がんおよび白血病などの骨髄移植を必要とする疾患、ならびにAIDSなどの免疫系を攻撃する疾患を治療する。他の態様では、上記の細胞系を使用して神経細胞系を産生させる。そのような細胞系の移植によって治療可能な疾患としては、パーキンソン病、アルツハイマー病、ALSおよび脳性麻痺が挙げられる。細胞移植療法によって治療可能なその他の疾患としては、脊髄損傷、多発性硬化症、筋ジストロフィー、糖尿病、肝疾患、心疾患、軟骨置換、熱傷、足部潰瘍および腎臓病が挙げられる。
【０１５４】
したがって、本発明は、上記の改変型細胞系および被験体を提供する段階、ならびにその細胞系が特定の表現形を有する子孫細胞を産生するような条件下で細胞系を被験体に移植する段階を含む、移植療法のための方法を提供する。例えば、いくつかの態様では、この細胞系を被験体の神経系(例えば、脳または脊髄)の中に移植し、その子孫細胞が神経細胞の表現形をとるようになる。他の態様では、この細胞系を被験体の肝臓の中に移植し、移植された細胞の子孫細胞が中胚葉細胞の表現形を示すようになる。
【０１５５】
本発明は同様に、被験体および改変型細胞系または細胞系を提供する段階、ならびにその細胞系が特定の発達結果の方へ分化するかまたは特定の組織に寄与するような条件下で細胞系を被験体に移植する段階を含む、細胞移植療法のための方法を提供する。いくつかの態様では、最も原型に近い改変型細胞(すなわち、幹細胞の形態を有し胚性幹細胞特異的なマーカーを発現している細胞)を細胞移植療法に利用する。他の態様では、改変型細胞系をインビトロで特定の発達結果(すなわち、造血幹細胞または神経幹細胞)の方へ分化するように誘導し、その後、これを移植する。さらなる態様では、改変型細胞をSCIDマウスに移植し、様々な細胞型に分化させる。その後、所望の細胞型をSCIDマウスから単離し、インビトロで増殖させて、細胞移植療法に使用する。
【０１５６】
実験
以下の例は、本発明のいくつかの好ましい態様および局面を示すためにおよびさらに説明するために提供されるものであり、その範囲を制限するものとみなされるべきではない。
【０１５７】
以下の実験の開示においては、以下の略号を用いる: eq(当量); M(モル濃度); μM(マイクロモル濃度); N(規定濃度); mol(モル); mmol(ミリモル); μmol(マイクロモル); nmol(ナノモル); g(グラム); mg(ミリグラム); μg(マイクログラム); ng(ナノグラム); lまたはL(リットル); ml(ミリリットル); μl(マイクロリットル); cm(センチメートル); mm(ミリメートル); μm(マイクロメートル); nm(ナノメートル); ℃(摂氏温度); U(単位)、mU(ミリ単位); min.(分); sec.(秒); %(パーセント); kb(キロベース); bp(塩基対); PCR(ポリメラーゼ連鎖反応); BSA(ウシ血清アルブミン)。
【０１５８】
実施例1
本実施例は皮膚同等物の産生方法について説明するものである。
【０１５９】
培地
器官培養の工程には、以下の6種の異なる培地を用いる: 3T3フィーダー細胞培地(TM); ヒト線維芽細胞増殖培地(FGM); NIKS培地(NM); プレーティング培地(PM); 重層化培地A(SMA); および重層化培地B(SMB)。TMは、単層培養においてNIKS細胞のフィーダー細胞として作用する3T3細胞を増殖させるために用いられる。TMは、10%仔ウシ血清(Hyclone)を加えたダルベッコ変法イーグル培地(DME、GibcoBRL)の混合物である。FGMは、STRATAGRAFT皮膚同等物およびSTATATEST皮膚同等物の真皮同等物層に用いる正常ヒト真皮線維芽細胞(NHDF)を増殖させるために使われる市販の線維芽細胞増殖培地(Clonetics)である。NMはNIKSケラチノサイトを増殖させるために用いられる。NMはハムF-12培地(GibcoBRL)およびDMEの3：1混合物に、2.5% fetal clone II(Hyclone)、0.4 μg/mlヒドロコルチゾン(Calbiochem)、8.4 ng/mlコレラ毒素(ICN)、5 μg/mlインスリン(Sigma)、24 μg/mlアデニン(Sigma)および10 ng/ml上皮増殖因子(EGF、R&D systems)を加えたものである。PMは、NIKS細胞を真皮同等物上に播種する際に用いる培地である。EGFが除去されており、CaCl2(Sigma)が1.88 nmの最終カルシウム濃度にまで添加されていることを除いては、PMはNMと同じである。SMAは、1 mg/mlウシ血清アルブミン(BSA)、1 μMイソプロテレノール、10 μMカルニチン、10 μMセリン、25 μMオレイン酸、15 μMリノール酸、7 μMアラキドン酸、1 μM α-トコフェロール、0.05 mg/mlアスコルビン酸(すべてSigma)および1 ng/ml EGFを添加したPMと同じものである。SMBは、STRATATEST皮膚同等物の上皮重層化段階およびSTRATAGRAFT皮膚同等物の増殖時に用いられる。SMBは、fetal clone II血清補充成分が存在することを除き、SMAと同じものである。
【０１６０】
フィーダーの調製
STRATAGRAFT皮膚同等物の器官培養を開始する前に、3T3フィーダー細胞を調製し、続いてそのまま用いるか、後に用いるために凍結する。3T3細胞を集密に達するまで増殖させ、マイトマイシン-C(TM 5 ml中にマイトマイシン-C 100 μl、Roche)で2時間処理する。続いて細胞を洗浄し、再懸濁した上で、NIKSの増殖を補助する目的で、1.25×106個/100 mm組織培養皿の密度でプレーティングする。凍結したフィーダーを用いる場合には、2.5×106個入りの1mlを含む1本の凍結アンプルを解凍し、新鮮なTMで希釈した上で、1枚の100 mm組織培養皿にプレーティングする。これは、NIKS細胞をプレーティングする1前にNIKS細胞の増殖に必要と考えられるだけの数の培養皿に対して行う。
【０１６１】
真皮同等物の調製
第0日目に、凍結NHDF細胞を解凍してプレーティングを行う。その翌日(第1日目)、細胞にFGMを供給して残留性の凍結保護剤を除去し、第3日目にも再び行う。第4日目に、それらを真皮同等物に用いるために回収する。真皮同等物を調製するには、ラット(tat)尾部コラーゲン(I型、Becton-Dickinson)をまず0.03 N酢酸中に3 mg/mlに希釈して、氷上で冷却する。濃縮ハムF12培地の混合物(通常の8.7倍の強度およびpH 7.5のHEPESで緩衝化)をfetal clone II(ウシ血清を添加した)と混合する。この2種類の溶液は最終の溶液体積の11.5%および10%にする。この培地混合物に1N NaOHを添加する(最終溶液の2.5%)。続いて、この混合物に希釈コラーゲンを添加(74%)する。この混合物に2%体積の懸濁させた線維芽細胞(STRATAGRAFT真皮同等物の場合は1×106個)を添加する。この溶液を穏やかに但し十分に混合し、100 mm組織培養皿内に25個設置した組織培養インサート(Millipore Corp.のMILLICELL)に100 μlずつ分注する。STRATAGRAFT皮膚同等物にはCorning社のTRANSWELLインサートを用いる。各インサートに真皮同等物13 mlを注ぎ入れる。ゲル形成のために30分間おいた後、この培養皿に、10% fetal clone IIを添加したF12培地20 mlを満たす。各真皮同等物の表面に1滴または2滴のF-12-血清混合物を滴下する。STRATAGRAFT皮膚同等物の場合、F-12-血清混合物80 mlを150 mm組織培養皿内のTRANSWELLインサートの周囲に入れて、10 mlを真皮同等物の上に入れる。このインサートは使用時まで37℃、5% CO２、相対湿度90%のインキュベーター内に入れておく。真皮同等物にNIKS細胞を播種する1日前に、それらを、組織培養インサートの底面から培地を供給するための2つの吸い上げ用パッドを備えた滅菌ステンレス製メッシュ(S&S Biopath)の上に載せることによって気相界面に挙上する。
【０１６２】
NIKSの増殖および播種
第0日目に、フィーダーを解凍(必要に応じて)しTM中にプレーティングする。第1日目に、NIKS細胞をフィーダーの上に約3×105個/100 mm培養皿の密度でプレーティングする。第2日目に、NIKS細胞に新鮮なNMを供給して残留性の凍結保護剤を除去する。第4日目および第6日目にもNIKS細胞に供給する。(STRATAGRAFT皮膚同等物サイズの培養の場合、必要とされる細胞の数が増えるので、NIKS培養を1週間早く開始する)。第8日目にNIKS細胞を回収し、カウントし、PM中に再懸濁させる。気相界面に1日間挙上しておいたMIILLICELLまたはTRANSWELLインサートの表面にNIKS細胞4.65×105個/cm2を播く。この培養皿に金属製リフトの下方までPM 30 ml(STRATAGRAFT皮膚同等物の場合には100 ml)を供給し、これを再びインキュベーター内に入れる。第10日目に、この培養物にSMAを供給する。第12、14、16、18、20および22日目に、この培養物にSMBを供給する。第12日目に、この培養物を湿度75%のインキュベーターに移し、この中にその培養物を成熟までの間ずっと入れておく。
【０１６３】
実施例2
本実施例は単離したNIKS細胞の冷凍保存について説明するものである。本研究では、NIKS細胞をトレハロースとともに凍結した後に懸濁した。トレハロース試料のいずれもグリセロール処理対照の50%を超えることはなかったが、およそ500 mMのトレハロースによって最適な回収率となる。グリセロールが細胞外のトレハロースの2倍効果的であるという事実は、この工程における浸透圧による障害の役割を際立たせるものであり、細胞内のトレハロースおよび試料のガラス化による潜在的利益を強調するものである。
【０１６４】
凍結処理の前に低減された温度で細胞を平衡化することで、生存細胞の回収率を改善させることができる。この効果をNIKS細胞で調べるため、単離した細胞をトレハロース添加増殖培地中にて異なる速度で凍結させた。この結果から、長時間予冷することで細胞の回収率が改善することが示唆された。この効果は細胞の膜が液晶相からゲル相に移行するときの細胞の透過性上昇によるものであるかもしれない。
【０１６５】
実施例3
本実施例はトレハロース合成酵素の発現ベクターの構築について説明するものである。トレハロースの生合成には次の2種類の酵素による活性が必要とされる: UDP-グルコースとグルコース-6-リン酸からのトレハロース-6-リン酸の形成を触媒するトレハロース-6-リン酸合成酵素(T6PS)、およびトレハロース-6-リン酸を脱リン酸化することによってトレハロースを生成するトレハロース-6-リン酸脱リン酸化酵素(T6PP)。いくつかの態様では、T6PSおよびT6PPは大腸菌(E. coli)のotsAおよびotsB遺伝子によりコードされる(Kaasen et al., Gene 145(1):9-15 (1994))。他の態様では、otsAおよびotsB遺伝子の機能は1種類の同じ遺伝子にある。例えば、キイロショウジョウバエ(drosophila melanogaster)のotsAおよびotsB遺伝子の機能は単一の遺伝子、つまりtps1遺伝子に含まれている(例えば、Chen et al., J. Biol. Chem. 277:3274 (2002)およびChen et al., J. Biol. Chem. 278:49113 (2003)を参照されたい)。トレハロース発現のタイミングおよび程度を制御するためには、Tet-On制御システムを用いてotsAおよびotsB遺伝子を発現させる(Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(12):5547-51 (1992); Gossen et al., Curr. Opin. Biotech. 5(5):516-20 (1994))。このシステムは遺伝子発現の誘導および終結をそれぞれ、テトラサイクリン誘導体ドキシサイクリンの存在下および非存在下で可能にするものである。
【０１６６】
otsAおよびotsBのコード領域は、公開されている配列(Kaasen et al., 前記)に基づくプライマー、大腸菌の鋳型ゲノムDNAおよびPfuなどの正確性の高いポリメラーゼを用いてPCR法により単離する。TOPO-TAクローニングキット(Invitrogen)を用いて、このPCR産物をクローニングする。ヒト細胞中でのotsAおよびotsB mRNAのプロセッシング、安定性および翻訳を促進させるため、このPCR産物の停止コドンの後ろに、ウサギβ-グロビン由来のイントロンおよびポリ(A)シグナルを含むDNA断片を連結させることができる。7回連続したTetオペレーターと、それに隣接する2つの最小サイトメガロウイルスプロモーターとからなる双方向性のプロモーターを含んだpBI発現ベクター(Clontech, Palo Alto, CA)中に、このotsAおよびotsBのコード領域をクローニングする。otsAおよびotsBのコード領域の完全性を遺伝子特異的なプライマーによるDNA配列決定法で確認して、PCR法またはクローニング手順の間に突然変異が導入されなかったことを確実にする。
【０１６７】
実施例4
本実施例はトレハロース輸送タンパク質の発現ベクターの構築について説明するものである。酵母S.セレビシエ(S. cerevisiae)のAGT1タンパク質は、トレハロース、マルトース、イソマルトース、ツラノース、マルトトリオース、パラチノースおよびメレジトースの細胞内蓄積を誘導するα-グルコシド/H+共輸送体である(Han et al., Mol. Microbiol. 17(6):1093-107 (1995); Plourde-Owabi et al., J. Bacteriol. 181(12):3830-2 (1999))。AGT1のコード領域は、公開されている配列に基づくプライマーを用いてPCR法により増幅する。この増幅用の鋳型cDNAは、トレハロースの輸送を誘導することが知られている条件下で増殖させた酵母からRNAを抽出し、Invitrogen社のSuperscriptII第一鎖cDNA合成キットを用いてそのRNAをcDNAに変換することによって調製する(Stambuk et al., Biochim. Biophys. Acta-General Subjects 1379(1):118-28 (1998))。TOPO-TAクローニングキットを用いて、AGT1のコード領域をクローニングする。mRNAの安定性、プロセッシングおよび翻訳を促進させるためにウサギβ-グロビン遺伝子由来のイントロンおよびポリ(A)シグナルを同様に含んだ、テロラサイクリン応答性の発現ベクターpTRE2-hyg (Clontech)中に、このAGT1のコード領域をクローニングする。コード領域の完全性をAGT特異的プライマーによるDNA配列決定法で確認する。
【０１６８】
実施例5
本実施例は一過的にトランスフェクトされたNIKS細胞、MSC細胞(Clonetics)およびNHDF細胞でのトレハロースの誘導合成/取込みについて説明するものである。実施例3および4に記述したベクター由来の精製DNAをpTet-Onプラスミド(Clontech)とともに適切な細胞型に導入する。pTet-On は、tetリプレッサーのDNA結合ドメインに融合されたVP16トランス活性化ドメインからなるrtTAをコードする。rtTAトランス活性化因子はドキシサイクリンの存在下でtetオペレーターに結合し、遺伝子発現を誘導する。細胞にはTransIt-LT1試薬(Mirus Corp., Madison, WI)を用いてトランスフェクトすることができる。
【０１６９】
細胞におけるトランスフェクションの効率は、前記実施例のpTet-Onおよび発現ベクターとともに、容易に検出可能なレポーター遺伝子を同時にトランスフェクトすることによって最適化される。真核細胞の遺伝子発現および細胞の生理機能を研究するために、一般的なレポーターシステムが広く使われている。用途としては、受容体活性、転写因子、細胞内シグナル伝達、mRNAプロセッシングおよびタンパク質の折り畳みの研究が挙げられる。実験精度を向上させるために、レポーター遺伝子がよく使われる。通常、「実験」遺伝子は特定の実験条件の影響と関連付けられるのに対し、同時にトランスフェクトされる「対照」レポーター遺伝子の活性は内部対照をもたらし、これがベースライン反応の代わりになる。レポーター遺伝子の活性を規準化することで、細胞生存率またはトランスフェクション効率の相違によって引き起こされる実験のばらつきが最小化される。本研究の場合、ホタル由来ルシフェラーゼpGL3-対照ベクター(Promega)が使われている。細胞をトランスフェクションから48時間後に回収し、溶解し、Bright-Glo試薬(Promega)およびWallac Victor Vプレートリーダーを用いてルシフェラーゼ活性を定量化する。otsおよびAGT1発現ベクターの量を滴定して、トランスフェクション効率を最適化する。
【０１７０】
トレハロース生合成遺伝子を一過的にトランスフェクトしたNIKS、NHDFおよびMSC細胞の集団をドキシサイクリン(0、1、10、100、1000 ng/ml)含有培地とともにインキュベートして、otsAおよびotsBの発現を誘導する; 細胞内トレハロースの測定を目的に、その細胞をドキシサイクリンの添加から2、6、12、24および48時間後に回収する。ots遺伝子を発現する細胞の割合はトランスフェクション効率によって制約されるものであり、したがって、細胞の全てがトレハロースを作り出せるというわけではない。さらに、細胞のなかには他のものよりも多くのDNAを取り込んでしまうものもあるので、トレハロースの検出は単に集団の平均をもたらすにすぎない。これらの警告があるにもかかわらず、トレハロースの検出は導入遺伝子の機能に関する強力な手助けとなる。
【０１７１】
培地中へのドキシサイクリンの添加によってトレハロース輸送体の合成を誘導できるようなTet-Onシステムによる制御を受けているその輸送体遺伝子をNIKS、NHDFおよびMSC細胞の集団に一過的にトランスフェクトする。トランスフェクションから24時間後、NIKS細胞およびNHDFをドキシサイクリン(0、1、10、100、1000 ng/ml)含有培地とともにインキュベートして、AGT1の発現を誘導する。輸送体遺伝子の発現誘導から24時間までの時点で、その培養物を25 mM〜1 Mトレハロース含有培地中で10分〜60分間インキュベートする。この処理後、その培養物を新鮮な培地で洗浄し、溶解し、細胞内トレハロースについて定量化する。
【０１７２】
細胞内トレハロースの存在は、Kienleら(Yeast 9(6):607-11(1993))により報告されているトレハロースに対する酵素的エンドポイントアッセイを利用することで判定する。このアッセイでは、トレハロースを酵素的に加水分解してグルコースとし、これをグルコース-6-リン酸が6-ホスホグルコン酸に酸化される際のNADの還元を介して検出する(Glucose (HK) Assay Kit, Sigma)。酵素によるトレハロース消化なしの同型試料で、内因性グルコースのレベルを引き除く。陽性および陰性対照は、トレハロースを既知濃度で添加したおよび添加していない細胞培養液から調製する。
【０１７３】
実施例6
本実施例は、一過的にトランスフェクトされた細胞が空気乾燥を切り抜けて生存できることを実証するものである。一過的にトランスフェクトし、液内単層培養で増殖させた細胞の集団に対し、遺伝子操作細胞が乾燥状態のなかで生存する能力を2通りの方法で評価する。前記実施例の結果に基づいて選択したドキシサイクリンのレベルを利用して、トレハロースを合成するようにまたは必要に応じてトレハロースを培地から取り込むように培養物を誘導する。適当なトレハロース蓄積期間の後に、培地を単層培養物から除去することによって、その培養物を室温で空気乾燥させる。培養物を30分間乾燥し、1週間までの各期間、乾燥状態のなかで保持する。
【０１７４】
再水和の前に高い相対湿度(RH)に曝露することによって、乾燥血小板の機能が著しく増加するということが明らかになっている。したがって、これらの培養物に対する再水和手順を25℃〜37℃の温度で40% RH〜100% RHにおよぶ湿度レベルにその培養物を曝露することによって変化させる。
【０１７５】
水和段階の後、細胞生存性をALAMARBLUEアッセイ(Biosource International)により評価する。ALAMARBLUEは、活発に代謝している細胞の酸化還元活性の感受性指標である。ALAMARBLUEは、これが乾燥後の細胞の代謝挙動に関する非破壊試験であるという点で本研究には有用である。このアッセイでは、活発に増殖しているNIKS細胞または必要に応じてNHDF細胞のプレートを回収し、それらの細胞を、乾燥からの予測細胞回収率の範囲をひとくくりにした種々の密度でプレート培養することにより、標準曲線を作成する。次に、これらのプレートを乾燥/再水和した試験プレートとともに、10%アラマーブルー(alamarBlue)試薬を添加した培地に曝す。活発に増殖している細胞がアラマーブルー色素を取り込んで、これをその青色(酸化)型から赤色(還元)型に還元すると、その色素は自由に培地中に逆戻りできるようになる。サンプリングした培地について最初の6時間は1時間おきに、その後、再び24時間に570 nmの吸光度を測定して、細胞代謝活性の回復率を定量化する。
【０１７６】
乾燥細胞の完全な機能回復の長期的な指標として、乾燥後の少なくとも1週間、プレートを標準的な条件下で培養する。この期間の終わりに、他で報告されている通り、コロニー形成を定量化する(Pegg et al., Cryobiology 44(1):46-53 (2002))。これらの結果に基づいて、ドキシサイクリンの曝露レベルおよびトレハロースの蓄積期間を再評価して、乾燥状態からの生細胞の回復を最適化する。
【０１７７】
実施例7
本実施例はトレハロースに基づく高ガラス転移温度の溶液であって、良好な生物学的適合性を有し、凍結の間の悪影響を軽減し、乾燥効率を向上するその溶液の開発について説明するものである。トレハロース(20%〜60%)とともにデキストラン、ヒドロキシエチルでんぷん、ポリビニルピロリドンおよびポリビニルアルコールを含むポリマー成分(0.1%〜10%)を入れた溶液のTgを測定する。試料調製および示差走査熱量測定法によるTg測定は他で報告されている(Miller et al., J. Phys. Chem. B. 103(46):10243 (1999))。
【０１７８】
トレハロース:ポリマー混合物のガラス転移プロファイルを測定したら、最も有望な系、すなわち、高いTg、調製の容易さ、無毒性および低費用が組み合わさったものをリン酸カリウム塩と組み合わせてガラス化を促進させる。リン酸カリウムは特に、リン酸ナトリウム塩とは異なり、温度によるpHドリフトが比較的少ないという点で有用である(Van den Berg et al., Arch. Biochem. Biophys. 81:319-329 (1959))。全体のリン酸塩濃度は、リン酸塩のトレハロースに対するモル比0.1〜2で変化させることができる。
【０１７９】
実施例8
本実施例は改変型細胞の凍結および乾燥のための手順の開発について説明するものである。乾燥および凍結乾燥工程の開発を成功させるには、保存前のトレハロースの合成/取込みの期間、最適な冷却速度、最終の凍結温度、一次および二次乾燥温度ならびに保存温度/条件を含めて、いくつかの変量を考慮しなければならない(表1)。保存する最初の細胞型はMSCとすることができる。これらの細胞は、本提案で開発された技術の幅広い適用性がないかどうかの優れた試験台になる。それらは培養系で不死であり、直接の商品価値だけではなく多数の細胞型(例えば、軟骨、骨、腱)への分化能も持ち合わせている。すなわち、乾燥をを切り抜けて生存するように遺伝子操作されたMSCは、それ自体が商業的に価値のある製品になる。さらに、市販の培地を用いて、これらの細胞をいくつかの娘細胞型に容易に分化させることができる。乾燥耐性の始原幹細胞系は、同様に乾燥耐性である分化した細胞、組織および臓器をもたらすことができるものと考えられる。試験条件を表にした要約については表1を参照されたい。
【０１８０】
（表１）凍結乾燥の開発に対する実験概要
2006526413.tif 000004
【０１８１】
凍結乾燥
凍結乾燥パラメータの最適化を細胞に対して行う。トレハロースの合成/輸送の誘導は、その組織培養皿からの除去および凍結の60分前までで試験する。凍結速度は20℃/分まで変化させる。一次乾燥温度は溶液のTgからこの値を30℃下回る範囲で変化させる。一次乾燥は、サーモカップルの読みが完全な氷の昇華を示すまで低圧で行う。二次乾燥では、Tg 対 乾燥曲線を作成するため、試料を初期Tgから開始して5℃刻みで25℃まで増加させた温度で10時間保持する。各実験で得られた試料を湿度、ガラス転移温度および生存性について評価する(Miller et al., 前記; Conrad et al., Cryobiology 41(1):17-24 (2000))。この手法は、最も効果的な凍結乾燥溶液を選択するのに必要な熱力学データ、および細胞を効率的に乾燥させるのに必要な動力学データを提供するものである。
【０１８２】
空気乾燥
空気乾燥された細胞での最近の結果を考慮し、本発明者らはこの試料保存の手段を評価するものである。細胞を75%集密になるまでカバースリップ上で培養する。トレハロース生合成およびAGT1発現の誘導を前述のように行う。試料を1分から60分までの異なる時間、保存溶液に浸し、その後、様々な温度の乾燥窒素ガス流の中で空気乾燥させる(表1)。試料をデシケーター中で保存する。組織は細胞試料と同様に誘導および浸漬後、その多孔性培養インサートの中で乾燥させる。乾燥系での吸水による損傷に関する文献を考慮すれば、試料の再水和を制御する必要がある(Crowe et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 86(2):52-23 (1989))。「標準的な」再水和工程として、乾燥細胞を増殖培地で再水和し、37℃で60分間回復させる。研究すべき代替的再水和プロトコルとしては、生理食塩水のみおよび20%マンニトールが挙げられる。再水和時間を0℃から37℃におよぶ温度で10分から24時間まで変化させる。最近の研究によって、加湿段階は乾燥血小板の再水和の前にかなり有益であるということが示唆されている(Wolkers et al., Cryobiology 42(2):79-87 (2001))。
【０１８３】
アッセイ
ミトコンドリア活性に対するMTTアッセイを利用して、細胞およびLSEの生存性を測定する(Mosmann et al., J. Immunol. Meth. 65(1-2):55-63 (1983))。保存試料に対するOD550を適切な対照のそれと比較することによって、生存性を定量化する。長期的な回復を確立するため、標準的な手順にしたがって細胞をプレート培養する。4日増殖させた後、このプレートをトリプシン処理し、計測を行う。LSE中の各細胞層の生存性を判定するため、共焦点レーザー走査顕微鏡を使う(J. Biomed. Mat. Res. 30(3):331-9 (1996))。Dermaphase 9003インピーダンス計(NOVA Technologies Corp)を用いて、LSEのバリアー機能を表面静電容量により直接的に測定する(Boyce et al., J. Invest. Derm. 107(1):82-7 (1996))。他で詳述されている方法を用いて、LSEの組織像を細胞分化(ケラチン-1、インボルクリン、フィラグリン)、増殖(抗体Ki-67に対する抗原)およびアポトーシス(活性カスパーゼ-3)について調べる(Loertsher et al., Toxicol. Appl. Pharmacol. 175(2):121-9 (2000))。新鮮および保存LSEの生検を24時間培養し、その増殖培地をサンプリングし、これをVEGF、TGF-βおよびIL-1α(創傷治癒に関与する全て公知のサイトカイン)の存在についてELISA法で分析することにより、サイトカイン反応を保存前と保存後で比較する。
【０１８４】
実施例9
本実施例はHVA1発現用のベクターの構築およびそのベクターによる細胞のトランスフェクションについて説明するものである。
【０１８５】
発現ベクター構築
トレハロースの合成および取込みのための構築体と同様に、HVA1遺伝子をTet-On制御システムに適合するプラスミド中にクローニングする。HVA1のコード領域は、市販のオオムギcDNA(Stratagene)を使い、公開されている配列に基づくプライマーを用いて、PCR法により単離する(Straub et al., Plant Molec. Biol. 26(2):617-30 (1994))。このHVA1のコード領域をテトラサイクリン応答性ベクターpTRE2中にクローニングする。安定なクローンの選択を可能にするため、ピューロマイシン耐性の発現カセットをこのpTRE2ベクター中にクローニングする。HVA1遺伝子の一過的発現のアッセイおよび安定的にトランスフェクトされたクローン細胞系を作製するための取組みは、前記実施例で説明されているものに同じである。
【０１８６】
単層培養でのLEAタンパク質の合成: HVA1遺伝子の完全なコピーを含む複数のクローンをドキシサイクリンの存在下でのタンパク質の発現について調べる。一連のドキシサイクリンレベルを用いて発現を誘導し、SDS-PAGE分析およびウエスタンブロッティングのため、細胞を2、6、12、24および48時間後に回収する。異なるクローン細胞系は遺伝子を異なるレベルで発現しており、したがって、異なる定常レベルのHVA1 LEAタンパク質を含んでいるものと予想される。したがって、ドキシサイクリンを変化させたタンパク質合成のプロファイルを10個のクローン培養物について繰り返し行う。トレハロースの合成/取込みに関する遺伝子およびHVA1遺伝子はTet-ONシステムにより協調的に制御されているはずなので、様々な時点でトレハロースの蓄積およびHVA1タンパク質の合成について細胞を調べる。
【０１８７】
空気乾燥した細胞に対するLEAタンパク質の効果: 単純な空気乾燥手順を利用して、哺乳動物細胞の乾燥に対する細胞内LEAタンパク質の有効性を早期に示す(Matsuo, J. Opthalmol. 85(5):610-12 (2001))。
【０１８８】
LSEにおけるLEAタンパク質の生合成: LSEは増殖培地にドキシサイクリンを添加し、最も高いLEAタンパク質の生合成レベルをもたらす条件を利用することにより誘導する; 組織は24時間〜48時間誘導をかけて、タンパク質の合成および蓄積を可能にする。SDS-PAGE分析およびウエスタンブロッティングのため、LSEをドキシサイクリンの添加から12、24、36および48時間後に回収する。用量反応曲線を作成して、各組織でのタンパク質の最大蓄積に必要なドキシサイクリンの最小用量を決定する。
【０１８９】
実施例10
本実施例はHVA1および/またはトレハロース合成経路を発現する細胞の保存について説明するものである。本課題は乾燥および凍結乾燥のための開始点が実施例8で同定された最適条件になるということを除いて、実施例8で取った段階を厳密に反映するものである。本実施例と実施例8との間の相違は、対象とする試料がHVA1タンパク質の発現に基づいて細胞質のガラス化傾向を促進していると考えられるという点である。凍結段階の場合、素早く凍結することはIIFの傾向を小さくするので、有利になるものと予想される。凍結乾燥工程でも乾燥工程でも、さらなる細胞質のガラス化は、乾燥サイクルを短縮できるということを意味する高い湿度レベルでの生成物の至適安定性をもたらすものと予想される。さらに、湿度の増大によって、細胞および組織が乾燥状態から素早く回復する可能性が高くなるものと考えられる。
【０１９０】
凍結乾燥の最適化の間には、一次の乾燥温度および圧力、二次の乾燥温度、時間および温度を変える。空気乾燥のパラメータには、乾燥ガスの流速および温度が含まれる。最後に、両乾燥方法に対する再水和条件は実施例8と同様に行う。
【０１９１】
実施例11
本実施例は皮膚同等物の保存のためのパラメータの最適化について説明するものである。アポトーシスは、冷凍保存後の細胞喪失に関する潜在的に重要な原因であると文献のなかで報告されている(Mathew et al., In Vitro & Mol. Toxic. 12(3):163-172 (1999))。報告されているように、アポトーシスを低下させる手法の一つは、初期または後期のアポトーシス酵素、例えば、それぞれカスパーゼ-9またはカスパーゼ-3に対する阻害剤を添加することである。これらの阻害剤は市販されており(Calbiochem)、冷凍保存および乾燥からの回復に有益であることが示されている(Baust et al., In Vitro Cell. & Devel. Biol. Anim. 36(4):262-70 (2000))。したがって、カスパーゼ阻害剤を凍結または乾燥前の様々な時点で保存培地に添加する。カスパーゼ阻害剤の効果は、上述の新鮮および保存LSEに対する組織学的マーカーを用いて評価する。
【０１９２】
カスパーゼ阻害剤を用いるという手法は単離細胞では実証されているが、しかし組織中の細胞にこれらの化合物を送達することは困難である。したがって、siRNAをアポトーシス経路の阻害に用いることを検討した。本実験では、NIKS細胞に2種類のルシフェラーゼ、つまりホタル由来ルシフェラーゼおよびリネラ（rinella）由来ルシフェラーゼを一過的にトランスフェクトした。その後、ホタル由来ルシフェラーゼに対するsiRNA分子をMirus社のTransIT-TKO試薬により細胞に導入したところ、標的遺伝子発現の90%の低下が達成されていることが分かった。この効果は10日間から2週間継続すると予想するのが妥当である。したがって、アポトーシスの低下に対する第二のアプローチとして、単層培養の細胞にカスパーゼ-3遺伝子に対するsiRNAを、その細胞をLSE上に播く直前にトランスフェクトした。14日でLSEは成熟するので、細胞中のsiRNAが依然として機能した状態で保存のための準備が整うものと考えられる。再水和後、この組織はアポトーシスを起こすその能力が著しく抑制されているはずである。この効果が一過性であることを考慮すると、この手法は、腫瘍形成と強く関連付けられている、アポトーシス遺伝子の遺伝的ノックアウトよりもはるかに安全である。
【０１９３】
遺伝子アレイ解析
遺伝子アレイ解析を利用して、乾燥状態から回復後の遺伝子発現の全体的な変化をモニターする。再水和組織および対照(保存されていない)組織由来のRNAを遺伝子発現アレイによるハイブリダイゼーションとデータ解析を行っているGenome Explorations, Inc.に付託する。ビオチン化cDNAプローブをそのRNA試料から作製し、約33,000個の独立遺伝子由来の転写産物を載せたAffymetrix社のU133 GeneChipsにハイブリダイズさせる。各試料を一連の対照RNAに対して規準化後、保存技術によって発現が増加しているかまたは減少している遺伝子を判定することができる。特に興味深いのは、瘢痕化(細胞外マトリックス分子、細胞外プロテアーゼ)、血管新生、創傷治癒およびアポトーシスに関与している遺伝子である。
【０１９４】
保存成功のインビトロ評価
LSEを前記実施例の方法にしたがって再水和し、2週間培養する。この期間中に、どんな遅発性の細胞傷害も明らかになり、本発明者らが開発した保存方法をこの時点まで識別するのに役立つ。再水和後の1日おきに、同型培養物を分析のために殺処理する。全体的な生存性はミトコンドリア活性に対するMTTアッセイを利用して測定する(前記)。LSE中の異なる細胞層の生存性を判定するため、共焦点レーザー走査顕微鏡を使う。LSEのバリアー機能を表面静電容量により直接的に測定し(前記)、組織像を細胞分化、増殖およびアポトーシスについて前記のように調べる。新鮮および保存LSEの生検を24時間培養し、その増殖培地をサンプリングし、これをVEGF、TGF-βおよびIL-1α(創傷治癒に関与する全て公知のサイトカイン)の存在についてELISA法で分析することにより、サイトカイン反応を保存前と保存後で比較する。
【０１９５】
保存成功のインビボ評価
改変型NIKSケラチノサイトおよびNHDFを用いて保存されたLSEは、ヌードマウスに移植するのに適している。Lynn Allen-Hoffmann博士(病理科)およびMichael Schurr医師(助教授、外科)によりウィスコンシン大学で開発された方法に基づく移植プロトコルを利用して、保存LSEのインビボでの正着および機能を評価することができる。移植したLSEのバリアー機能を表面静電容量により毎日測定する。外科処置から7日および14日後に、移植成功の評価を移植部位から採取した生検の免疫組織学的分析によって達成する。インビトロでの研究に関しては、組織切片を適切な細胞分化、増殖およびアポトーシスについて評価する。移植された動物を6ヶ月間、移植片の留置、拒絶、置換、抗原性または予想外の増殖挙動に関する何らかの長期的な徴候がないかモニターする。本研究の後、試験動物を殺処理し、その他の方法では明らかにできなかった何らかの亜慢性毒性がないか調べる。
【０１９６】
実施例12
本実施例は、AGT1遺伝子を発現するpTRE-tight-AGT1-hygベクター(図17)の構築について説明するものである。このベクターの構築では、Ptightプロモーターの5'末端の近位にあるXhoI切断部位を利用した。基礎となるベクター(Col E1)には、第二のXhoI切断部位が細菌の複製起点配列の5'末端近傍に存在していた。したがって、基礎となるベクターの部分消化を最初に行って、第二のXhoI部位で切断されたプラスミド生成物を単離した。その末端を平滑末端化し、ベクターを再連結させた。この工程によってその第二部位が取り除かれ、この結果、XhoI消化と連結の利用によるハイグロマイシンカセット(図17)の挿入が可能になった。
【０１９７】
ハイグロマイシン耐性は、構成的SV40プロモーターの制御下にあるその耐性遺伝子の発現によって与えられる。SV40ポリアデニル化配列を付加して、哺乳動物細胞でのトランス遺伝子の発現を促進させる。
【０１９８】
NIKS細胞におけるAGT1遺伝子の発現をそのmRNAの検出を介して証明した。AGT1 mRNA発現に関するRT-PCRの結果を実証するアガロースゲルを図11に示す。このゲルには、AGT1 mRNAの予想サイズである1.9 kbに、単一バンドが存在している。
【０１９９】
実施例13
本実施例はotsB遺伝子産物における2箇所の潜在的スプライシング部位の発見およびotsA遺伝子におけるいくつかのイントロンの存在について説明するものである。これらのスプライシング事象の存在は、これまでに哺乳動物細胞のotsAおよびBを扱っている報告ではRNAレベルの発現を調べていないという事実から、文献中にはどこにも言及されていない。otsBの場合には、潜在的スプライシングはotsB遺伝子それ自体の中にある部位とその下流のウサギβ-グロビンポリアデニル化(ポリA)配列中の部位との間で起こる。トランス遺伝子の下流でポリアデニル化配列を使用することは、翻訳を終結しトランス遺伝子mRNAの安定性を高めることが知られている。したがって、下流のポリアデニル化配列をpBI-otsAB-hyg構築体中の各トランス遺伝子に付加した。つまりotsB遺伝子は、イントロンを含むことが知られているウサギβ-グロビンポリA配列に先行して存在する。このポリAイントロンは、これがmRNAの安定性を向上し、その効率的な翻訳を補助し、逆転写酵素-PCR(RT-PCR)法によるmRNAの検出を単純化するという点で有用である。しかしながら、この場合には、イントロンのアクセプター部位は、NIKS細胞においてotsBに関するRT-PCRの結果(図6)によって実証されたのと同様に、見かけ上、otsB遺伝子内の2箇所の部位で潜在的スプライシングを引き起こした。
【０２００】
図6はNIKS細胞におけるotsB遺伝子発現に関するRT-PCRの結果を示す。Mirus社(Madison, WI)のTrans-IT Keratinocyte試薬を用いて、この細胞にpBI-otsAB-hyg構築体をトランスフェクトした。発現をドキシサイクリンで24時間誘導し、mRNAを回収した。次いで、この試料をDNAseで処理してゲノムDNAを除去し、逆転写酵素で処理してmRNAからcDNAを得た。次いで、otsB特異的フォワードプライマーとβ-グロビンポリAリバースプライマーとを用いて、このcDNAをPCR増幅した。
【０２０１】
図6では、3本のバンドが明らかである。各バンドは異なるmRNAスプライシング産物に相当する。スプライシング事象の位置を確認するため、各バンドをゲルから切り出し、これを精製し、これをクローニングベクター中に連結し、これを大腸菌に形質転換し、これを増殖させて、再び精製し、これを配列決定した。配列決定の結果から、スプライシングパターンが図7Aに示される通りであることが示唆された。図6のイントロン1産物は、プロセッシングを受けたβ-グロビンポリAを有するotsBに対して予想されるmRNAである。さらに、otsB遺伝子それ自体の中にある2箇所のイントロンドナー部位での切断を示すmRNAが生じた(イントロン2およびイントロン3産物)。これらの選択的スプライシング産物の存在が正しいotsB mRNAの機能を妨害する可能性は低いが、しかしそれらは、得られるタンパク質のレベルを低下させてしまうと考えられる。このスプライシングを部位特異的突然変異誘発法によって取り除いた。イントロン3およびイントロン2部位に対するイントロンドナー部位の配列内でGGT(Gly)からGGG(Gly)の縮重性の一塩基対変化を作り出すことによって、これを達成した。この変化を作り出し、配列決定により検証した。変異型otsBの配列(配列番号:6)は、図18に示されている。
【０２０２】
潜在的スプライス部位を同定し、それらをpBI-otsAB-hyg構築体中のotsB遺伝子の部位特異的突然変異誘発法によって取り除いた(pBI-otsAB*-hygと命名)後に、確証的トランスフェクションをNIKS細胞で行い、続けてRT-PCR解析を行った(図8)。(注記: 結果が類似していたNHDFおよびMSCで類似の解析を行った。)スプライシングを受けたポリA配列がついたotsBに対して予想されるサイズの単一のmRNAバンドを考慮すれば、otsB mRNAの予想外のスプライシングは取り除かれたものと結論付けられた。
【０２０３】
otsB遺伝子に対する調整と並行して、otsA遺伝子も予想外の、望ましくないイントロンスプライシングを含んでいるということが分かった(図9)。この場合には、イントロンスプライシングはotsA遺伝子それ自体の中で完全に起こるということが判明し、隣接領域による結果ではなかった。この現象は文献には報告されていない。異常なスプライシングを取り除くため、そのcDNAバンドをアガロースゲルから切り出し、これを精製し、これをクローニングベクター中に連結し、これを大腸菌に形質転換させて、配列決定のために単離した。この結果を図7Bに示す。otsA遺伝子の開始部位から177 bpにある共通のドナー部位とともに2個のイントロンが同定された。そのアクセプター部位は528bpおよび558 bpに密集しているので、図9のゲル中には不明瞭なダブレットとして出現している。
【０２０４】
今度の場合も、部位特異的突然変異誘発法を利用して、検出されたスプライシング事象を取り除いた。この場合には、ドナー部位についてはGGT (Gly)をGGG (Gly)に変換し、両アクセプター部位についてはCAG (Gln)をCAA (Gln)に変換した。この塩基対変化を配列決定解析により確認した。変異型otsA配列(配列番号:7)を図18に示す。otsBとotsAの両遺伝子が突然変異誘発されたpBI-otsAB-hyg構築体(pBI-otsA*B*-hygと命名)をトランスフェクトした細胞のRT-PCR試験によって、otsBに対しならびにotsA(図10)に対し予想されるバンドが生じた。しかしながら、図10には、非常に薄い第二のバンドがアガロースゲル中でおよそ1 kbのサイズに残っている。このバンドは、さらなる選択的スプライシング産物の存在によるものである可能性が高い。その産物は元の試料に存在していたと思われるが、その他のスプライシング産物の広がりによって容易には認められなかった。
【０２０５】
実施例14
本実施例はNHDFおよびMSCの両者でのotsAおよびotsB遺伝子に対する遺伝子発現の実証について説明するものである。細胞試料に適切なTetON対照プラスミドおよびpBI-otsABまたはpTRE-tight-AGT1応答プラスミドのいずれかをトランスフェクトした。以下のようにRT-PCR法を利用して、遺伝子発現を検出した。トランスフェクトした細胞をドキシサイクリンで誘導し、その結果生じたRNAを回収した。最初の段階として、干渉性のDNAをDNase消化により除去した。次に、逆転写酵素を用いて、残存するRNAをcDNAに変換し戻した。得られたcDNAをPCR法により、対象とする遺伝子に特異的なプライマーを用いて増幅した。
【０２０６】
実施例15
本実施例はNIKS細胞でのトレハロース合成について説明するものである。実験は、前述のTrans-IT keratinocyte試薬とともに化学量論的比率1:9のK14-TetON対照プラスミドおよびpBI-otsAB応答プラスミドをNIKS細胞にトランスフェクトすることによって行った。トランスフェクションから24時間後に、外因性遺伝子の発現を200 ng/mlドキシサイクリンで種々の時間誘導して、細胞内トレハロースの合成および蓄積を可能にした。細胞内トレハロースを定量化するため、細胞をその培養皿から回収し、Beckman-Coulter Multisizer3を用いて同時に個数計測およびサイズ計測し、ペレット状に遠心し、これを3回の凍結融解サイクルによって溶解した。次に、この溶解物をHPLC法により、後述の方法を用いて分析した。これらの実験のいくつかの概要を以下の表に示す。
【０２０７】
（表２）NKS細胞における誘導性トレハロース合成実験の概要
2006526413.tif 000005
【０２０８】
各実験を通じ、トランスフェクトしたNIKS細胞はトレハロースを0.3mM〜1.3 mMの範囲の細胞内濃度まで蓄積させた。NIKS細胞に対し一般に見られる平均細胞容積3200 μm3に基づくと、これは細胞当たりトレハロース0.33pg〜1.42 pgに相当する。このレベルは下記表3に記載のほかの公表結果に十分に匹敵するものである。
【０２０９】
（表３）報告されている細胞内トレハロース蓄積の概要
2006526413.tif 000006
【０２１０】
実験を行って、トレハロース合成を制限している可能性があると考えられる要因を同定した。可能性の1つは、トレハロースの合成および蓄積に応じたトレハロース酵素活性の発現または誘導であった。トレハロースは哺乳動物系において、発現が腸管上皮および腎臓に局在化した状態で存在することが知られている。したがって、トランスフェクトした細胞はこの分解経路を活性化することによってトレハロースの存在に応答可能であったかもしれないが、しかしながらその可能性は低い。
【０２１１】
この部分を詳しく調べるため、RT-PCR法による解析用にRNAをトランスフェクト細胞から回収した。トレハロースのmRNAは、試験したいずれの条件下でも検出されなかった。この結果は細胞中で広い特異性を持つ内因性加水分解酵素の活性によるトレハロース分解の可能性を除外しないのと同時に、細胞がトレハロースそれ自体の存在に対し逆方向には応答していないことを裏付けるものである。
【０２１２】
実施例16
本実施例は誘導的(TetON)および構成的システムを介したトレハロースの蓄積の比較について説明するものである。otsAおよびBの発現を制御するためにケラチン-14(K14)プロモーターを用いて、2種類のベクター構築体を組み立てた。K14は単層培養および器官培養で増殖しているケラチノサイトにおいて高度に発現されているタンパク質である。図16に示されるように、基礎となる同じ構築体から2種類のベクターを組み立てた。K14プロモーターは、otsAまたはotsB遺伝子の発現を指令するために使われる。応答ベクター構築体と同様に、それらの遺伝子はウサギβ-グロビンポリアデニル化配列に先行して存在する。これらの構築体には、ブラストサイジン耐性遺伝子の発現を指令するユビキチン-Cプロモーターも含まれている。
【０２１３】
otsB 対 otsA構築体の異なるレベルのものを比較した。TetONシステムでこの変量を調整することは不可能である。その他のトランスフェクションと同様に、NIKS細胞を凍結ストックから増殖し、これを55 cm2プレート当たり細胞106個で組織培養皿(フィーダー細胞の存在なし)に継代し、これにTransIT-Keratinocyte試薬を用いてベクターをトランスフェクトし、これを24時間後に回収した。細胞をペレット状に遠心し、これを3回の凍結融解サイクルによって溶解した。細胞溶解物をろ過し、これをHPLC法により分析した。この結果を図12に示す。この結果が示す通り、本実験での最適なトランスフェクション条件のなかには、otsAを載せた構築体とotsB構築体との間に2:1の質量比があった。本発明は特定の機構に限定されるものではない。実際に、本発明を実践するうえで機構の理解は必要ではない。とはいえ、この相違は、これらの2つの遺伝子の発現効率およびその2つの酵素の相対活性の先天的な相違によるものであると考えられる。この結果は何度か繰り返された。さらに、その同じ2:1のベクター比を利用し、トレハロースの蓄積期間を48時間まで引き延ばした。これらの結果は、下記表4に要約されている。さらに、図13に示されるように、トレハロースとして定量化したHPLCピークの同一性をトレハロース消化の利用によって確認した。
【０２１４】
（表４）構成的発現下でのトレハロース最大蓄積
2006526413.tif 000007
【０２１５】
これらの結果に基づけば、NIKS細胞がotsAおよびotsB遺伝子の構成的発現によって5 mMの細胞内トレハロース濃度に到達することは明らかに可能である。
【０２１６】
実施例17
本実施例はTetON誘導的システムの制御下にあるAGT1トレハロース輸送タンパク質の遺伝子をトランスフェクトしたNIKS細胞に関して行われた実験について説明するものである。細胞外の環境は輸送体の活性化に影響を及ぼすものと考えられる。この輸送体は、これが最初にマルトース輸送タンパク質として同定された酵母が生まれつき持っているものである。これは4 mMトレハロースのKmを有しpH 5で輸送活性が最大と特徴付けられている。本実施例は哺乳動物細胞でのトレハロースの最大の取込みをもたらす条件の研究について説明するものである。
【０２１７】
pH変化の影響
AGT1輸送体を介して細胞にトレハロースを導入する開始点として、細胞外pHを下げた。NIKS細胞、NHDFおよびMSCをそれぞれpH 5のクエン酸ナトリウム緩衝生理食塩水に様々な時間曝露するという数回の実験を行って、pH曝露それ自体が有意な細胞傷害を引き起こすことはないことを検証した。曝露後、細胞を通常の培地に戻し、1日間継続して増殖させた。その時間の後、細胞を十分に特徴付けられている代謝活性指標のMTT試薬で処理して、pHショックによる培養物の生存性における何らかの変化を定量化した。この結果の概要は下記表に記載されている。全細胞型をpH 5に約30分未満の時間曝露しても培養物の生存性は10%しか低下しなかった。MSCの場合には、生存性の低下はpH5に1時間曝露後でさえも検出されなかった。
24時間後の細胞生存性に及ぼす短時間のpHショックの影響
2006526413.tif 000008
【０２１８】
トレハロースの取込みに及ぼすpHの影響
トレハロース合成の場合と同様に、トレハロースの取込みの初期試験はNIKS細胞で行った。この実験は、取込み段階が含まれていること以外は、トレハロース合成の場合と同じように行った。すなわち、細胞を細胞外トレハロースに一定時間曝露し、その後、細胞外トレハロースを細胞の回収および溶解前に洗い流すというものである。
【０２１９】
50 mM細胞外トレハロースに48時間曝露してもNIKS細胞の増殖に影響を与えないと判明したのに対し、100 mMでは細胞増殖が半分にまで遅れるという初期実験から、使用する細胞外トレハロース濃度を選択した。AGT1輸送体の機能評価は以下のように調べた。トレハロース合成の場合と同じように、NIKS細胞にトランスフェクションを行った(上記を参照されたい)。標準的なプロトコルにしたがって、NIKS細胞にK14-TetON(対照)およびpTRE-tight-AGT1(応答)プラスミドをトランスフェクトした。この試料をブラストサイジンで1日間選択してトランスフェクト細胞を濃縮し、これをフィーダー細胞の入った新しい培養皿に継代した。24時間後、細胞をドキシサイクリンでさらに24時間〜48時間誘導した。次いで、培地または50 mM添加トレハロースの入った緩衝生理食塩水のいずれかよりなる取込み用培地に、細胞を曝露した。取込み後、細胞を洗浄し、回収し、溶解して、その細胞内トレハロースをHPLC法により測定した。この実験の1つから得られた結果を図14に示す。この場合には、取込み用培地のpHを変化させた。見かけ上のトレハロースの取込みは、AGT1タンパク質(プロトン共輸送体)がより活性となる低pHでいっそう高くなる。
【０２２０】
いくつかの態様では、AGT1輸送体を介したトレハロースの輸送を効果的に特徴付けるため、K14-AGT1遺伝子ベクター構築体を使用する。取込み実験では、入念な洗浄にもかかわらず、一部の細胞外トレハロースは溶解段階を通じて持ち越されてしまう。この結果は、トランスフェクトしていない細胞でさえもトレハロースに曝露すると、幾分かの細胞外糖質を含むようになると思われるということである。本発明は特定の機構に限定されるものではない。実際に、本発明を実践するうえで機構の理解は必要ではない。とはいえ、トレハロースは、代替的な内因性経路によっていくらか低いレベルで細胞に侵入できている可能性がある。酵母では、特異性がずっと低い(Km = 100 mM)第二の二糖輸送体が存在するということが知られている。したがって、いくつかの態様では、実験プロトコルを改良して、トレハロースが細胞の回収および溶解段階に持ち越される機会をさらに減らし、それによって実験感度を改善することができる。
【０２２１】
実施例18
本実施例は、本質的には二糖単位に結合したニトロフェノール環であるマーカー分子pNPαGを利用した色素取込み試験について説明するものである。輸送体(AGT1などの)はpNPαGを細胞質に送達し、そこで非特異的加水分解酵素がそれを2つの成分に開裂する。開裂後のニトロフェノール基は400 nmの波長で強力な発色団になる。すなわち、400 nmの吸光度の出現は、糖質の取込みの直接的な指標と見なすことができる。
【０２２２】
NIKS細胞がpNPαGを細胞へのその輸送後に開裂するのに必要な加水分解酵素活性を有するかどうかをまず初めに判定した。溶液中のpNPαGに対する細胞溶解物の効果を評価した。必要な加水分解酵素が存在するなら、pNPαGの開裂を、溶解細胞への曝露時に検出することができるであろう。NIKS細胞を集密にまで組織培養で増殖させて、GloLysis Buffer(Promega)で溶解した。この緩衝液は、通常ルシフェラーゼアッセイに使用されるものであり、感受性酵素を阻害しない細胞溶解向けに最適化されている。終濃度5 mMのpNPαGを細胞溶解物の試料に添加し、同じく細胞なしの溶解用緩衝液の試料に添加した。400 nm (OD400)の吸光度を長時間にわたり測定した。
【０２２３】
図15の結果から、溶解したNIKS細胞は色素を適度な時間のうちに検出可能なレベルで開裂するのに十分なレベルの加水分解酵素活性を含むものと思われる。
【０２２４】
実施例19
本実施例は細胞でのトレハロースの合成および/または取込みを特徴付けるアッセイの開発について説明するものである。屈折率(RI)検出器を備えたBeckman System Gold HPLCを利用し、トレハロースの検出について2本の糖質用カラム、つまりPhenomenex Luna NH2カラムおよびBio-Rad Aminex-87Hカラムを評価した。Phenomenexカラムの1つの利点は、順相モード(糖質検出の場合)でも逆相モード(タンパク質の場合)でも機能するその能力である。このカラムの別の利点は、高い試料処理量を可能にするその流速の速さである。しかしながら、広範なシステム試験およびトラブルシューティング後、その充填材(またはアセトニトリル-水の移動相)は微小な圧力変動を受けやすく、その結果として許容できないほどノイズの多いRIベースラインシグナルを生ずると結論付けられた。
【０２２５】
Aminexカラムは水性移動相を利用し、はるかに安定なベースラインをもたらした。初期の研究では、移動相として製造元推奨の5 mM H2SO4水溶液に従った。これを25 mM H2SO4まで増加させた本レベルとし、試料中の無機塩類による保持時間のドリフトを回避した(以下のトレハロースの項目を参照されたい)。
トレハラーゼ消化- 
未知の化学種に由来し、トレハロースとほとんど同時に溶出する低レベルの妨害物質が存在する。いくつかの手法を利用して、この妨害物質を取り除いた。最初に、移動相の改変を細かく検討した。酵素によるトレハロース消化の利用についても試験した。この手法を利用することによって文献では、トレハロースのピークの同一性が確認されている。トレハラーゼ(ブタ腎臓由来)を利用して、トレハロースレベルを同定し定量化した。トレハラーゼ消化プロトコルで利用したクエン酸ナトリウム緩衝系は、Aminex固定相に固定化されたプロトンの干渉および置換を引き起こし、その結果として注入のたびに顕著なピーク移動をもたらした。移動相の酸性度を増加させることで、この影響を相殺した。
【０２２６】
移動相の検討-
上記のように、初期試験は共溶出ピークの存在を示唆し、酵素消化によるトレハロース定量化の評価を必要とした。Levineにより報告されているこの消化手順は、pH 5.7のクエン酸ナトリウム緩衝液で行われている。緩衝系におけるナトリウムの存在は、Aminexカラムの固定相との干渉を引き起こすものであった。すなわち、そのナトリウムイオンが見かけ上、充填材にイオン結合している水素に取り代わっており、その結果、トレハロースの保持時間が単調な様式で顕著に増加した。この影響を相殺するため、移動相の酸強度を25 mM H2SO4に調整した。この変更によってピークのドリフトがなくなり、さらに、それはトレハロースのピークを未知の共溶出性の化学種から分離するのに役立った。
【０２２７】
トレハロース検出アッセイに対する最終条件は次の通りである:
カラム- Bio-Rad Aminex 87H (4.6×250)
移動相- 25 mM H2SO4水溶液
流速- 0.6 mL/分
温度- 65℃
検出- 屈折率
高酸性の移動相におけるトレハロースピークの分離能増大によって、トレハロースの定量化用の酵素消化法を利用する必要はない。
【０２２８】
細胞溶解手順-
遺伝子操作細胞においてトレハロースの検出能を向上させるため、細胞溶解に関して報告の各種方法を評価した。これらには過塩素酸、トリクロロ酢酸、エタノールおよび水酸化ナトリウムなどの化学物質を用いたトレハロースの抽出、ならびに沸騰および凍結融解などの物理的な細胞溶解法が含まれていた。単純な3回の凍結融解サイクルがトレハロースの完全な放出を可能とするのに効果的であるということが分かった。これらの溶解試料中にスパイクされたトレハロースの分解は、長時間にわたって認められなかった。
【０２２９】
実施例20
本実施例は、K14-otsA-グロビンベクターを含むNIKSおよびK14-otsB-グロビンベクターを含むNIKSの混合集団がどの程度までトレハロースを合成できるかという研究について説明するものである。結果をK14-otsA-グロビンおよびK14-otsB-グロビンの両者を2:1の割合で含むNIKSでのトレハロース合成と比較した。さらなる対照はK14-otsA-グロビンまたはK14-otsB-グロビンを有するNIKSとした。
【０２３０】
NIKS細胞を用いたその他の研究と同様に(上記を参照されたい)、その細胞を凍結ストックから融解し、これを55 cm2培養皿の中の3T3フィーダー細胞上に播いて培養した。細胞を5日間培養した。この時点で、細胞をその培養皿から回収し、K14-otsA-グロビンおよびK14-otsB-グロビンベクターを上記の通り別々にまたは組み合わせて細胞に導入した。次いで、これらの細胞を以下の通り、55 cm2培養皿の中の3T3フィーダー細胞上に正副2枚分播いて培養した:
1. トランスフェクトしていない対照細胞
2. K14-otsA-グロビンをトランスフェクトしたNIKS
3. K14-otsB-グロビンをトランスフェクトしたNIKS
4. K14-otsA-グロビンとK14-otsB-グロビンの両者をトランスフェクトしたNIKS
5. 上記2)および3)の混合物
【０２３１】
2日間の継続培養後、NIKS細胞を回収し、細胞内トレハロース含有量について分析した。Beckman-Coulter Multisizer 3 Counterを利用して、総細胞数および平均細胞容積を測定した。細胞を遠心沈殿させて、そのペレット(沈殿物)を-20℃で凍結した。ペレットを融解し、150 μl DMSOを添加してトレハロースを抽出した。試料を1.8 ml容量の遠心管に移し、これを12,000×gで10分間遠心沈殿した。トレハロース濃度を測定する屈折率検出器を備えたBeckman-Coulter System Gold HPLCをBio-rad HPLC Organic Acid Analysis Column (AMINEX HPX-87H Ion Exclusionカラム)とともに0.6 ml/分、カラム温度65℃、移動相25 mM H2SO4のHPLC用水で利用して、その上清を分析した。その後、細胞内トレハロースを下記に示されるように、DMSO中で行ったトレハロース標準曲線由来のHPLCピーク面積、DMSO抽出容量、総細胞数および個々の細胞容積に基づいて算出した。この結果を図19に示す。
【０２３２】
DMSO中のトレハロース濃度 [mmol/ml] = (ピーク面積×1.17693E-06 - 0.000319101) [mg/ml] / 342.3 [mg/mmol]
【０２３３】
細胞内トレハロース濃度 [mM] = (トレハロース濃度)×(DMSO抽出物の容量) / (細胞数×細胞あたりの容積)。
【０２３４】
以上の本明細書中で言及した全ての刊行物および特許は、参照により本明細書に組み入れられる。本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本発明の記述の方法およびシステムに関する様々な変更および変形が当業者には明らかであろう。本発明を好ましい具体的な態様に関連して記述してきたが、特許請求の範囲に記載される本発明は、そのような具体的な態様に不当に制限されるべきではないものと理解されるべきである。実際に、本発明を実行するために記述した様式に関し、分子生物学、生化学、または関連分野の当業者にとって明らかな種々の変更は、以下の特許請求の範囲に入るものと意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２３５】
【図１】液相図である。
【図２】HVA1の配列を提供する。
【図３】トレハロース輸送タンパク質AGT1の配列を提供する。
【図４】otsAの配列を提供する。
【図５】otsBの配列を提供する。
【図６】NIKS細胞におけるotsB遺伝子発現に関するRT-PCRの結果を表す。
【図７】otsBおよびotsAに関するスプライシングパターンを示す。
【図８】NIKS細胞における変異型otsB遺伝子発現に関するRT-PCRの結果を表す。
【図９】NIKS細胞におけるotsA遺伝子発現に関するRT-PCRの結果を表す。
【図１０】NIKS細胞における変異型otsA遺伝子発現に関するRT-PCRの結果を表す。
【図１１】AGT1 mRNA発現に関するRT-PCRの結果を実証するアガロースゲルを示す。
【図１２】異なるレベルのotsA 対 otsB構築体のトレハロース合成に対する結果を示す。
【図１３】トレハロース消化に関するHPLC分析の結果を示す。
【図１４】異なるpHでのトレハロースの取り込みの結果を示す。
【図１５】溶液中でNIKS細胞溶解物がpNPαGに及ぼす効果を示す。
【図１６】otsAおよびotsBの構成的発現用のベクターを示す。
【図１７】pTRE-tight-AGT1-hygベクターのマップおよびハイグロマイシンカセットを示す。
【図１８】変異型otsA(配列番号:7)およびotsB(配列番号:6)の配列を示す。
【図１９】otsA発現ベクターを含む細胞とotsB発現ベクターを含む細胞との混合物におけるトレハロースのレベルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2006526413.tif 000023
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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