(57)【要約】本発明は、例えばバクテリオファージプロモーターを用いる、RNA転写による更なるRNA増幅の前に「末端連結」の機序により、第二鎖cDNA合成の効率を増大させる方法に関する。具体的態様において、転写プロモーターは、「末端連結」の同じ機序により、cDNAの5'領域に結合される。遺伝子シグナルは、その後RNA転写により、線形に増幅される。具体的態様において、転写されたRNAの方向は、所望の下流の適用に応じて、センス又はアンチセンスのいずれかである。別の態様において、本発明は、組織学的に染色された組織及び細胞から、RNA、特にmRNAを抽出及び増幅する方法に関する。
2004527236.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、RNA分子を増幅する方法：
該RNA分子を得る段階；
該mRNA分子に、第一のプライマーを導入する段階であって、該第一のプライマーは、該RNA分子の相補的領域に適当な条件下でハイブリダイズする領域を含む、段階；
該RNA分子及び該第一のプライマーに、第二のプライマーを導入する段階であって、該第二のプライマーは、該プライマーの3'末端に少なくとも1個のリボグアニンを含む、段階；
合成により、該第一の相補的核酸分子の3'末端に複数のシトシンが生じる条件下で逆転写酵素を用い該第一のプライマーを伸長することにより、該RNA分子に対する第一の相補的核酸分子が合成される段階であって、該合成により、第一のプライマー及び第二のプライマーに結合したその伸長産物及びRNAを含む、RNA-第一の相補的核酸分子ハイブリッドを生じる、段階；
該ハイブリッドから、該RNA分子及び該第二のプライマーを取り除く段階；
該第一の相補的核酸分子に対する第二の相補的核酸分子を合成する段階であって、該合成により、第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドが生じ、該ハイブリッドが、第二のプライマーに実質的に類似した配列を持つ第三のプライマーと第一相補的核酸分子に結合した第三のプライマーの伸長産物との両方をさらに含む、段階；並びに
該第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドから、少なくとも1個のmRNA分子を転写する段階。
【請求項２】
前記RNA分子がmRNA分子である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記RNAがtRNA分子である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記RNAがrRNA分子である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記RNA分子が、複数のRNA分子から得られる、請求項1記載の方法。
【請求項６】
前記複数のRNA分子が、mRNA、tRNA、rRNA、又はそれらの組合せを含む、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記第一のプライマーが少なくとも2個のポリ(dT)を含む領域を更に含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
前記第一のプライマーが、ランダム配列の短いプライマーである、請求項1記載の方法。
【請求項９】
前記第一のプライマーが、プロモーター領域、制限酵素消化配列、及びそれらの組合せからなる群より選択される領域を更に含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
前記第一のプライマーがプロモーター領域を更に含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
前記プロモーターが、バクテリオファージ転写プロモーターである、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
前記バクテリオファージ転写プロモーターが、T7 RNAポリメラーゼプロモーター、T3 RNAポリメラーゼプロモーター、SP6 RNAポリメラーゼプロモーター、及び組換えプロモーターからなる群より選択される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記第二のプライマーが、その5'末端にランダム配列を、及びその3'末端に少なくとも1個のグアニン、デオキシグアニン、シトシン、又はデオキシシトシンを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
前記第二のプライマーが、その5'末端にランダム配列を、及びその3'末端に少なくとも1個のグアニン又はシトシンを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
前記第二のプライマーが、プロモーター領域、タンパク質翻訳開始領域、制限酵素消化配列、及びそれらの組合せからなる群より選択される領域を更に含む、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
前記第二のプライマーがプロモーターを更に含む、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
前記プロモーターが、バクテリオファージ転写プロモーターである、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
前記バクテリオファージ転写プロモーターが、T7 RNAポリメラーゼプロモーター、T3 RNAポリメラーゼプロモーター、SP6 RNAポリメラーゼプロモーター、及び組換えプロモーターからなる群より選択される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
前記逆転写酵素が、Taq逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、RNAseH活性を欠損しているモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素、RNAseH活性を欠損しているトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素、I型ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV-I)、ラウス関連ウイルス2(RAV2)、ウシ白血病ウイルス(BLV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、HIV-1逆転写酵素、TERT逆転写酵素、及びTth逆転写酵素からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
前記転写段階からのmRNA分子を逆転写する段階を少なくとも1つ更に含む方法であって、該逆転写により少なくとも1個のcDNA分子が生じる、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
前記逆転写段階が少なくとも1種のランダムプライマーによりプライミングされる、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
前記逆転写段階が、該第一の相補的核酸分子、該第二の相補的核酸分子、又はそれらの組合せに結合されたプライマーによりプライミングされる、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
前記cDNA分子が少なくとも1個のプロモーター配列を含む、請求項20記載の方法。
【請求項２４】
前記プロモーターがバクテリオファージ転写プロモーターである、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
前記バクテリオファージ転写プロモーターが、T7 RNAポリメラーゼプロモーター、T3 RNAポリメラーゼプロモーター、SP6 RNAポリメラーゼプロモーター、及び組換えプロモーターからなる群より選択される、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
前記RNAがRNAse消化により取り除かれる、請求項1記載の方法。
【請求項２７】
前記RNAが、RNAse消化により、低濃度MgCl2を含有する溶液中の加熱により、又はそれらの組合せにより取り除かれる、請求項1記載の方法。
【請求項２８】
以下の段階を含む、mRNA分子を増幅する方法：
該mRNA分子を得る段階；
該mRNA分子に、第一のプライマーを導入する段階であって、該第一のプライマーが少なくとも2個のポリ(dT)と、ランダム配列とを含む、段階；
該mRNA分子及び該第一のプライマーに、第二のプライマーを導入する段階であって、該第二のプライマーが、該プライマーの3'末端に少なくとも1個のリボグアニンと、バクテリオファージプロモーター配列とを含む、段階；
合成により、該第一の相補的核酸分子の3'末端に複数のシトシンが生じる条件下で逆転写酵素を用い該第一のプライマーを伸長することにより、該mRNA分子に対する第一の相補的核酸分子を合成する段階であって、該合成により、第一のプライマー及び第二のプライマーに結合したその伸長産物及びmRNAを含むmRNA-第一の相補的核酸分子ハイブリッドが生じる、段階；
該ハイブリッドから、該mRNA分子及び該第二のプライマーを取り除く段階；
該第一の相補的核酸分子に対する第二の相補的核酸分子を合成する段階であって、該合成により、第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドが生じ、該ハイブリッドが、第二のプライマーに実質的に類似した配列を持つ第三のプライマーと第一相補的核酸分子に結合した第三のプライマーの伸長産物との両方をさらに含む、段階；並びに
該第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドから、少なくとも1個のmRNA分子を転写する段階。
【請求項２９】
以下の段階を含む、mRNA分子を増幅する方法：
該mRNA分子を得る段階；
該mRNA分子に、第一のプライマーを導入する段階であって、該第一のプライマーが、少なくとも2個のポリ(dT)と、バクテリオファージプロモーター配列とを含む、段階；
該mRNA分子及び該第一のプライマーに、第二のプライマーを導入する段階であって、該第二のプライマーが、該プライマーの3'末端に少なくとも1個のリボグアニンを含む、段階；
合成により、該第一の相補的核酸分子の3'末端に複数のシトシンが生じる条件下で逆転写酵素を用い該第一のプライマーを伸長することにより、該mRNA分子に対する第一の相補的核酸分子を合成する段階であって、該合成により、第一のプライマー及び第二のプライマーに結合したその伸長産物及びmRNAを含むmRNA-第一の相補的核酸分子ハイブリッドが生じる、段階；
該ハイブリッドから、該mRNA分子及び該第二のプライマーを取り除く段階；
該相補的核酸分子に、該第二のプライマーと実質的に同じ配列を持つオリゴ(dNTP)プライマーを導入する段階；
該第一の相補的核酸分子に対する第二の相補的核酸分子を合成する段階であって、該合成により、第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドが生じる、段階；並びに
該第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドから、少なくとも1個のmRNA分子を転写する段階であって、該少なくとも1個のmRNA分子がアンチセンスmRNAである段階。
【請求項３０】
以下の段階を含む、mRNA分子を増幅する方法：
該mRNA分子を得る段階；
該mRNA分子に第一のプライマーを導入する段階であって、該第一のプライマーが、少なくとも2個のポリ(dT)又はランダム配列の短いプライマーを含む、段階；
該mRNA分子及び該第一のプライマーに、第二のプライマーを導入する段階であって、該第二のプライマーが、該プライマーの3'末端に少なくとも1個のリボグアニンと、バクテリオファージプロモーター配列とを含む、段階；
合成により、該第一の相補的核酸分子の3'末端に複数のシトシンが生じる条件下で逆転写酵素を用い該第一のプライマーを伸長することにより、該mRNA分子に対する第一の相補的核酸分子を合成する段階であって、該合成により、第一のプライマー及び第二のプライマーに結合したその伸長産物及びmRNAを含むmRNA-第一の相補的核酸分子ハイブリッドが生じる、段階；
該ハイブリッドから、該mRNA分子及び該第二のプライマーを取り除く段階；
該相補的核酸分子に、該第二のプライマーと実質的に同じ配列を持つオリゴ(dNTP)プライマーを導入する段階；
該第一の相補的核酸分子に対する第二の相補的核酸分子を合成する段階であって、該合成により、第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドが生じる、段階；並びに
該第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドから、少なくとも1個のmRNA分子を転写する段階であって、該少なくとも1個のmRNA分子がセンスmRNA分子である段階。
【請求項３１】
請求項1記載の方法を用いるRNA分子増幅キットであって、適当な容器に入っており、第一のプライマー、第二のプライマー、第三のプライマー、又はそれらの組合せを備える、キット。
【請求項３２】
前記第一のプライマーが、ランダム配列の短いプライマーである、請求項31記載のキット。
【請求項３３】
前記第一のプライマーが、プロモーター、制限酵素消化配列、及びそれらの組合せからなる群より選択される領域を更に含む、請求項31記載のキット。
【請求項３４】
前記第二のプライマーが、プロモーター、制限酵素消化配列、及びそれらの組合せからなる群より選択される領域を更に含む、請求項31記載のキット。
【請求項３５】
以下の段階を含む、インビトロ転写のための基質を提供する方法：
該mRNA分子を得る段階；
該mRNA分子に第一のプライマーを導入する段階であって、該第一のプライマーが、適当な条件下で該mRNA分子の相補的領域にアニーリングする領域を含む、段階；
該mRNA分子及び該第一のプライマーに、第二のプライマーを導入する段階であって、該第二のプライマーが、該プライマーの3'末端に少なくとも1個のリボグアニンを含む、段階；
合成のより、該第一の相補的核酸分子の3'末端に複数のシトシンが生じる条件下で逆転写酵素を用い該第一のプライマーを伸長することにより、該mRNA分子に対する第一の相補的核酸分子を合成する段階であって、該合成により、第一のプライマー及び第二のプライマーに結合したその伸長産物及びmRNAを含むmRNA-第一の相補的核酸分子ハイブリッドが生じる、段階；
該ハイブリッドから、該mRNA分子及び該第二のプライマーを取り除く段階；
該第一の相補的核酸分子に対する第二の相補的核酸分子を合成する段階であって、該合成により、第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドが生じ、該ハイブリッドが、第二のプライマーに実質的に類似した配列を有する第三のプライマーと第一の相補的核酸分子に結合した第三のプライマーの伸長産物との両方をさらに含む、段階；並びに
該第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドから、少なくとも1個のmRNA分子を転写する段階。
【請求項３６】
以下の段階を含む、組織学的に染色された細胞からRNAを検出する方法：
細胞を得る段階；
細胞からRNAを抽出する段階；及び
RNAを増幅する段階。
【請求項３７】
細胞が組織内にある、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
以下の段階を含む、細胞からRNAを検出する方法：
細胞を得る段階；
細胞を組織学的に染色する段階；
細胞からRNAを抽出する段階；及び
RNAを増幅する段階。
【請求項３９】
細胞が組織内にある、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
組織が新鮮な組織である、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
組織が固定された組織である、請求項39記載の方法。
【請求項４２】
組織が、アセトン、アルデヒド誘導体、エタノール、又はそれらの組合せにより固定されている、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞が、生理学的体液、病理学的滲出液、又は病理学的漏出液に由来する、請求項36又は38記載の方法。
【請求項４４】
生理学的体液が、血液、脳脊髄液、尿、汗、精液、又は唾液である、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
細胞が、血液、骨髄、脳脊髄液、又はいずれか他の生理学的体液又は病理学的滲出液もしくは漏出液中にある、請求項38記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞が骨髄に由来する、請求項36又は38記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞が、インビトロ培養細胞に由来する、請求項36又は38記載の方法。
【請求項４８】
組織学的染色により細胞構造が同定される、請求項36又は38記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞構造が、ミトコンドリア、中心小体、粗面小胞体、滑面小胞体、ペルオキシソーム、エンドソーム、リソソーム、小胞、ゴルジ装置、核、細胞質、又はそれらの組合せである、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
組織学的染色により組織構造が同定される、請求項37又は39記載の方法。
【請求項５１】
前記組織構造が、ラミナ、マトリックス、又はそれらの組合せの構造である、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
組織学的染色液が、アシドブラック1、アシドブルー22、アシドブルー93、アシドフクシン、アシドグリーン、アシドグリーン1、アシドグリーン5、アシドマゼンタ、アシドオレンジ10、アシドレッド26、アシドレッド29、アシドレッド44、アシドレッド51、アシドレッド66、アシドレッド87、アシドレッド91、アシドレッド92、アシドレッド94、アシドレッド101、アシドレッド103、アシドロゼイン、アシドルビン、アシドバイオレット19、アシドイエロー1、アシドイエロー9、アシドイエロー23、アシドイエロー24、アシドイエロー36、アシドイエロー73、アシドイエローS、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、アルシアンブルー、アルシアンイエロー、アルコール可溶性エオシン、アリザリン、アリザリンブルー2RC、アリザリンカルミン、アリザリンシアニンBBS、アリザロールシアニンR、アリザリンレッドS、アリザリンパープリン、アルミノン、アミドブラック10B、アミドシュワルツ、アニリンブルーWS、アントラセンブルーSWR、オーラミンO、アゾカルミンB、アゾカルミンG、アゾイックジアゾ5、アゾイックジアゾ48、アズールA、アズールB、アズールC、ベーシックブルー8、ベーシックブルー9、ベーシックブルー12、ベーシックブルー15、ベーシックブルー17、ベーシックブルー20、ベーシックブルー26、ベーシックブラウン1、ベーシックフクシン、ベーシックグリーン4、ベーシックオレンジ14、ベーシックレッド2、ベーシックレッド5、ベーシックレッド9、ベーシックバイオレット2、ベーシックバイオレット3、ベーシックバイオレット4、ベーシックバイオレット10、ベーシックバイオレット14、ベーシックイエロー1、ベーシックイエロー2、ビエブリッヒスカーレット、ビスマルクブラウンY、ブリリアントクリスタルスカーレット6R、カルシウムレッド、カルミン、カルミン酸、セレスチンブルーB、チャイナブルー、コキニール、コエレスチンブルー、クロムバイオレットCG、クロモトロープ2R、クロモキサンシアニンR、コンゴーコリンス、コンゴーレッド、コットンブルー、コットンレッド、クロセインスカーレット、クロシン、クリスタルポンソー6R、クリスタルバイオレット、ダーリア、ダイヤモンドグリーンB、ダイレクトブルー14、ダイレクトブルー58、ダイレクトレッド、ダイレクトレッド10、ダイレクトレッド28、ダイレクトレッド80、ダイレクトイエロー7、エオシンB、エオシンブルイッシュ、エオシン、エオシンY、エオシンイエロイッシュ、エオシノール、エリーガーネットB、エリオクロムシアニンR、エリスロシンB、エチルエオシン、エチルグリーン、エチルバイオレット、エバンスブルー、ファストブルーB、ファストグリーンFCF、ファストレッドB、ファストイエロー、フルオレセイン、食用グリーン3、ガレイン、ガラミンブルー、ガロシアニン、ゲンチアンバイオレット、ヘマテイン、ヘマチン、ヘマトキシリン、ヘリオファストルビンBBL、ヘルベティアブルー、ヘマテイン、ヘマチン、ヘマトキシリン、ホフマンバイオレット、インペリアルレッド、イングレインブルー、イングレインブルー1、イングレインイエロー1、INT、ケルメス、ケルメス酸、ケルネクトロット、Lac、ラッカイン酸、ラウスバイオレット、ライトグリーン、リサミングリーンSF、ルクソールファストブルー、マゼンタ0、マゼンタI、マゼンタII、マゼンタIII、マラカイトグリーン、マンチェスターブラウン、マルチウスイエロー、メルブロミン、マーキュロクロム、メタニルイエロー、メチレンアズールA、メチレンアズールB、メチレンアズールC、メチレンブルー、メチルブルー、メチルグリーン、メチルバイオレット、メチルバイオレット2B、メチルバイオレット10B、モルダントブルー3、モルダントブルー10、モルダントブルー14、モルダントブルー23、モルダントブルー32、モルダントブルー45、モルダントレッド3、モルダントレッド11、モルダントバイオレット25、モルダントバイオレット39、ナフトールブルーブラック、ナフトールグリーンB、ナフトールイエローS、天然ブラック1、天然レッド、天然レッド3、天然レッド4、天然レッド8、天然レッド16、天然レッド25、天然レッド28、天然イエロー6、NET、天然レッド、ニューフクシン、ナイアガラブルー3B、ナイトブルー、ナイルブルー、ナイルブルーA、ナイルブルーオキサゾン、ナイルブルー硫酸塩、ナイルレッド、ニトロBT、ニトロブルーテトラゾリウム、核ファストレッド、オイルレッドO、オレンジG、オルセイン、パラロスアニリン、フロキシンB、ピクリン酸、ポンソー2R、ポンソー6R、ポンソーB、ポンソー・ド・キシリジン、ポンソーS、プリミューラ、パープリン、ピロニンB、ピロニンG、ピロニンY、ローダミンB、ロスアニリン、ローズベンガル、サフロン、サフラニンO、スカーレットR、スカーレットレッド、スカーラックR、シェラック、シリウスレッドF3B、ソロクロムシアニンR、可溶性ブルー、ソルベントブラック3、ソルベントブルー38、ソルベントレッド23、ソルベントレッド24、ソルベントレッド27、ソルベントレッド45、ソルベントイエロー94、酒精可溶性エオシン、スダンIII、スダンIV、スダンブラックB、サルファーイエローS、スイスブルー、タートラジン、チオフラビンS、チオフラビンT、チオニン、トルイジンブルー、トルイリンレッド、トロパエオリンG、トリパフラビン、トリパンブルー、ウラニン、ビクトリアブルー4R、ビクトリアブルーB、ビクトリアグリーンB、ウォーターブルーI、水溶性エオシン、キシリジンポンソー、又はイエロイッシュエオシンである、請求項36又は38記載の方法。
【請求項５３】
抽出段階が組織からの細胞の解離を更に含む、請求項37又は39記載の方法。
【請求項５４】
解離が、マイクロマニプレータ上でマイクロピペットによるか、又はレーザー捕獲マイクロダイセクションによる、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
増幅段階がRNAからのcDNAの合成を更に含む、請求項36記載の方法。
【請求項５６】
cDNAの合成が、RNAに結合するオリゴヌクレオチドを伴う逆転写酵素によりcDNAを合成する段階をさらに含む、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
RNA増幅法がインビトロ転写である、請求項36記載の方法。
【請求項５８】
増幅が以下の段階を含む方法による、請求項36記載の方法：
RNA分子に第一のプライマーを導入する段階であって、該第一のプライマーが、適当な条件下で、該RNA分子の相補的領域にハイブリダイズする領域を含む、段階；
該RNA分子及び該第一のプライマーに、第二のプライマーを導入する段階であって、該第二のプライマーが、少なくとも1個のリボグアニンを該プライマーの3'末端に含む、段階；
合成により該第一の相補的核酸分子の3'末端に複数のシトシンが生じる条件下で逆転写酵素を用い該第一のプライマーを伸長することにより、該RNA分子に対する第一の相補的核酸分子を合成する段階であって、該合成により、第一のプライマー及び第二のプライマーに結合したその伸長産物及びRNAを含むRNA-第一の相補的核酸分子ハイブリッドが生じる、段階；
該ハイブリッドから、該RNA分子及び該第二のプライマーを取り除く段階；
該第一の相補的核酸分子に対する第二の相補的核酸分子を合成する段階であって、該合成により、第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドが生じ、該ハイブリッドが、第二のプライマーに実質的に類似した配列を持つ第三のプライマーと第一の相補的核酸分子に結合した第三のプライマーの伸長産物との両方を含む、段階；並びに
該第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドから、少なくとも1個のmRNA分子を転写する段階。
【請求項５９】
色素／組織学的染色液、RNA抽出試薬、RNA沈殿担体、オリゴ(dT)プライマー、逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、RNAse失活試薬、末端連結オリゴヌクレオチド、dNTP、NTP、又はそれらの組合せを備える、組織学的に染色された組織中の細胞由来のRNAを検出するための、適当な容器に収容されたキット。
【請求項６０】
RNAポリメラーゼが、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ、又はSP6 RNAポリメラーゼである、請求項59記載のキット。
【請求項６１】
キットが、ベクター、リガーゼ、又はそれらの組合せを更に備える、請求項59記載のキット。
【請求項６２】
色素／組織学的染色液が、アシドブラック1、アシドブルー22、アシドブルー93、アシドフクシン、アシドグリーン、アシドグリーン1、アシドグリーン5、アシドマゼンタ、アシドオレンジ10、アシドレッド26、アシドレッド29、アシドレッド44、アシドレッド51、アシドレッド66、アシドレッド87、アシドレッド91、アシドレッド92、アシドレッド94、アシドレッド101、アシドレッド103、アシドロゼイン、アシドルビン、アシドバイオレット19、アシドイエロー1、アシドイエロー9、アシドイエロー23、アシドイエロー24、アシドイエロー36、アシドイエロー73、アシドイエローS、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、アルシアンブルー、アルシアンイエロー、アルコール可溶性エオシン、アリザリン、アリザリンブルー2RC、アリザリンカルミン、アリザリンシアニンBBS、アリザロールシアニンR、アリザリンレッドS、アリザリンパープリン、アルミノン、アミドブラック10B、アミドシュワルツ、アニリンブルーWS、アントラセンブルーSWR、オーラミンO、アゾカルミンB、アゾカルミンG、アゾイックジアゾ5、アゾイックジアゾ48、アズールA、アズールB、アズールC、ベーシックブルー8、ベーシックブルー9、ベーシックブルー12、ベーシックブルー15、ベーシックブルー17、ベーシックブルー20、ベーシックブルー26、ベーシックブラウン1、ベーシックフクシン、ベーシックグリーン4、ベーシックオレンジ14、ベーシックレッド2、ベーシックレッド5、ベーシックレッド9、ベーシックバイオレット2、ベーシックバイオレット3、ベーシックバイオレット4、ベーシックバイオレット10、ベーシックバイオレット14、ベーシックイエロー1、ベーシックイエロー2、ビエブリッヒスカーレット、ビスマルクブラウンY、ブリリアントクリスタルスカーレット6R、カルシウムレッド、カルミン、カルミン酸、セレスチンブルーB、チャイナブルー、コキニール、コエレスチンブルー、クロムバイオレットCG、クロモトロープ2R、クロモキサンシアニンR、コンゴーコリンス、コンゴーレッド、コットンブルー、コットンレッド、クロセインスカーレット、クロシン、クリスタルポンソー6R、クリスタルバイオレット、ダーリア、ダイヤモンドグリーンB、ダイレクトブルー14、ダイレクトブルー58、ダイレクトレッド、ダイレクトレッド10、ダイレクトレッド28、ダイレクトレッド80、ダイレクトイエロー7、エオシンB、エオシンブルイッシュ、エオシン、エオシンY、エオシンイエロイッシュ、エオシノール、エリーガーネットB、エリオクロムシアニンR、エリスロシンB、エチルエオシン、エチルグリーン、エチルバイオレット、エバンスブルー、ファストブルーB、ファストグリーンFCF、ファストレッドB、ファストイエロー、フルオレセイン、食用グリーン3、ガレイン、ガラミンブルー、ガロシアニン、ゲンチアンバイオレット、ヘマテイン、ヘマチン、ヘマトキシリン、ヘリオファストルビンBBL、ヘルベティアブルー、ヘマテイン、ヘマチン、ヘマトキシリン、ホフマンバイオレット、インペリアルレッド、イングレインブルー、イングレインブルー1、イングレインイエロー1、INT、ケルメス、ケルメス酸、ケルネクトロット、Lac、ラッカイン酸、ラウスバイオレット、ライトグリーン、リサミングリーンSF、ルクソールファストブルー、マゼンタ0、マゼンタI、マゼン��II、マゼンタIII、マラカイトグリーン、マンチェスターブラウン、マルチウスイエロー、メルブロミン、マーキュロクロム、メタニルイエロー、メチレンアズールA、メチレンアズールB、メチレンアズールC、メチレンブルー、メチルブルー、メチルグリーン、メチルバイオレット、メチルバイオレット2B、メチルバイオレット10B、モルダントブルー3、モルダントブルー10、モルダントブルー14、モルダントブルー23、モルダントブルー32、モルダントブルー45、モルダントレッド3、モルダントレッド11、モルダントバイオレット25、モルダントバイオレット39、ナフトールブルーブラック、ナフトールグリーンB、ナフトールイエローS、天然ブラック1、天然レッド、天然レッド3、天然レッド4、天然レッド8、天然レッド16、天然レッド25、天然レッド28、天然イエロー6、NBT、天然レッド、ニューフクシン、ナイアガラブルー3B、ナイトブルー、ナイルブルー、ナイルブルーA、ナイルブルーオキサゾン、ナイルブルー硫酸塩、ナイルレッド、ニトロBT、ニトロブルーテトラゾリウム、核ファストレッド、オイルレッドO、オレンジG、オルセイン、パラロスアニリン、フロキシンB、ピクリン酸、ポンソー2R、ポンソー6R、ポンソーB、ポンソー・ド・キシリジン、ポンソーS、プリミューラ、パープリン、ピロニンB、ピロニンG、ピロニンY、ローダミンB、ロスアニリン、ローズベンガル、サフロン、サフラニンO、スカーレットR、スカーレットレッド、スカーラックR、シェラック、シリウスレッドF3B、ソロクロムシアニンR、可溶性ブルー、ソルベントブラック3、ソルベントブルー38、ソルベントレッド23、ソルベントレッド24、ソルベントレッド27、ソルベントレッド45、ソルベントイエロー94、酒精可溶性エオシン、スダンIII、スダンIV、スダンブラックB、サルファーイエローS、スイスブルー、タートラジン、チオフラビンS、チオフラビンT、チオニン、トルイジンブルー、トルイリンレッド、トロパエオリンG、トリパフラビン、トリパンブルー、ウラニン、ビクトリアブルー4R、ビクトリアブルーB、ビクトリアグリーンB、ウォーターブルーI、水溶性エオシン、キシリジンポンソー、又はイエロイッシュエオシンである、請求項59記載のキット。
【請求項６３】
以下の段階を含む、合成された核酸鎖の3'領域へ核酸配列を組込む方法：
標的核酸鎖を、末端連結オリゴヌクレオチド、及び標的核酸鎖の3'末端領域又は3'末端の上流領域と相補的である第一鎖合成プライマーと共に、第一鎖合成プライマーの標的核酸鎖へのハイブリダイゼーションを促進する条件下で、インキュベーションする段階；及び
プライマーを伸長する段階であって、伸長がポリメラーゼにより行われ、その結果伸長により、第一鎖合成プライマー、標的核酸鎖の相補的配列、及び末端連結オリゴヌクレオチドの相補体を含む核酸鎖が合成される段階。
【請求項６４】
末端連結オリゴヌクレオチドが、少なくとも1個のグアニン、デオキシグアニン、シトシン、又はデオキシシトシンを、末端連結オリゴヌクレオチドの3'末端に含む、請求項63記載の方法。
【請求項６５】
標的核酸鎖がRNAであり、かつポリメラーゼが逆転写酵素であり、その結果伸長段階において合成された核酸が、3'末端に、第一鎖合成プライマー、標的核酸鎖の相補体、及び末端連結オリゴヌクレオチドの相補体を含む第一鎖cDNAである、請求項63記載の方法。
【請求項６６】
RNAがmRNAである、請求項65記載の方法。
【請求項６７】
第一鎖合成プライマーが、少なくとも2個のチミジン残基をその3'末端に含む、請求項65記載の方法。
【請求項６８】
第一鎖合成プライマーが、核酸のランダム六量体配列を含む、請求項65記載の方法。
【請求項６９】
末端連結オリゴヌクレオチドが、グアニン、デオキシグアニン、シトシン又はデオキシシトシン塩基からなる群より選択される、少なくとも2個のヌクレオチドを含む、請求項65記載の方法。
【請求項７０】
以下のさらなる段階を含む、請求項65記載の方法：
第一鎖cDNAを、末端連結オリゴヌクレオチドと共に、末端連結オリゴヌクレオチドの第一鎖cDNAへのハイブリダイゼーションを促進する条件下でインキュベーションする段階；及び
末端連結オリゴヌクレオチドを伸長する段階であって、該伸長がDNAポリメラーゼにより行われ、その結果伸長により、末端連結オリゴヌクレオチドの配列及び第一鎖cDNAの相補的配列を含む第二鎖cDNAが合成される段階。
【請求項７１】
DNAポリメラーゼがTaqポリメラーゼである、請求項70記載の方法。
【請求項７２】
第一鎖合成プライマーが転写プロモーター配列を含む、請求項70記載の方法。
【請求項７３】
末端連結オリゴヌクレオチドが、転写プロモーター配列、及び少なくとも1個のグアニン、デオキシグアニン、シトシン、又はデオキシシトシンを末端連結オリゴヌクレオチドの3'末端に含む、請求項70記載の方法。
【請求項７４】
末端連結オリゴヌクレオチドが、転写プロモーター配列、及び少なくとも1個のグアニン又はシトシンを末端連結オリゴヌクレオチドの3'末端に含む、請求項70記載の方法。
【請求項７５】
以下のさらなる段階を含む、請求項74記載の方法：
第二鎖cDNAを、転写プロモーター配列への結合が可能なRNAポリメラーゼと共にインキュベーションする段階；及び
第二鎖cDNAを転写する段階であって、該転写により、第二鎖cDNAに対し配列が相補的なRNA転写産物が合成される段階。
【請求項７６】
以下のさらなる段階を含む、請求項73記載の方法：
第一鎖cDNAを、転写プロモーター配列に結合可能なRNAポリメラーゼと共にインキュベーションする段階；及び
第一鎖cDNAを転写する段階であって、該転写により、第一鎖cDNAに対し配列が相補的なRNA転写産物が合成される段階。
【請求項７７】
第一鎖合成プライマーが転写プロモーター配列を含み、末端連結オリゴヌクレオチドが、少なくとも1個のグアニン、デオキシグアニン、シトシン、又はデオキシシトシンをその3'末端に含み、かつ転写プロモーター配列は、第一鎖合成プライマーの転写プロモーター配列とは異なる、請求項70記載の方法。
【請求項７８】
以下のさらなる段階を含む、請求項77記載の方法：
第一鎖cDNAを、第一鎖cDNA上に位置する転写プロモーター配列に結合することが可能なRNAポリメラーゼと共にインキュベーションする段階；
第一鎖cDNAを転写する段階であって、該転写により、第一鎖cDNAに対し配列が相補的なRNA転写産物が合成される段階；
第二のcDNA鎖を、第二鎖cDNA上に位置する転写プロモーター配列に結合することが可能なRNAポリメラーゼと共にインキュベーションする段階；並びに
第二鎖cDNAを転写する段階であって、該転写により、第二鎖cDNAに対し配列が相補的なRNA転写産物が合成される段階。
【請求項７９】
合成されたRNA転写産物が、インビトロ翻訳のための鋳型として使用される、請求項75又は78記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、2001年2月14日に出願された、米国特許出願第60/268,664号、名称「新規RNA増幅法」；2001年2月14日に出願された、米国特許出願第60/268,645号、名称「組織学的に染色された組織及び細胞内の遺伝子発現の検出」；2001年7月18日に出願された、米国特許出願第60/306,216号、名称「末端連結によるmRNA増幅の方法及び組成物」；2001年11月7日に出願された、米国特許出願番号不明の、名称「RNA増幅法」；2001年11月7日に出願された、米国特許出願番号不明の、名称「組織学的に染色された組織及び細胞内の遺伝子発現の検出」；並びに、2001年11月9日に出願された、米国特許出願第60/350,176号、名称「末端連結による核酸増幅の方法及び組成物」に優先して請求されるものであり；前記出願は全て本明細書に参照として組入れられている。
【０００２】
発明の分野
本発明は、RNA分子のような、核酸分子を増幅する方法に関する。詳細に述べると、これらの方法は、RNAポリメラーゼによる更なるRNA増幅前に、末端連結(terminal continuation)の機序を用い、第二鎖cDNA合成の効率を増大することに関する。より詳細に述べると、これらの方法は、インビトロ転写のために二本鎖(ds)cDNA分子を提供することに関する。別の態様において、本発明は、特に組織学的に染色された組織からの、遺伝子発現の検出に関連した方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
最新の遺伝子発現プロファイリング又は「分子指紋法」は、典型的には、cDNAアレイ技術を使用し行われる。本質的に、遺伝子アレイは、複数(例えば数百から数千個)の遺伝子の同時調査を可能にする。しかし、この方法は感度が悪いために、その後のRNA抽出には、かなり大量の組織が必要である。この低感度の方法は、ふたつの局面で問題が多い。第一に、組織給源は限定され、及び第二に、多数の均質な組織及び／又は細胞型の収集は複雑であることが多いので、アレイは不均質な細胞集団についてのみ行うことができる。
【０００４】
アンチセンスRNA合成は、限定された量の組織又は細胞から遺伝的シグナルを増幅するために使用されている(Van Gelderら、1990；Eberwineら、1992；米国特許第5,545,522号)。しかし現在使用されているアンチセンスRNA合成法は、遺伝的シグナルの増幅において効率が低い。従って、この方法の全体の感度及び信頼性は、最適なものではない。この方法の効率を増大する上での大きな障害は、問題の多い第二鎖cDNA合成である。現在、第二鎖cDNA合成に使用する手法はふたつあり、これは自己-プライミング及び置換合成である。自己-プライミングは、第一鎖cDNAの3'側に形成されたヘアピンを使用し、第二鎖cDNAの合成を自己-プライミングする(Sambrookら、1989)。しかし、その末端に形成されたループは、S1ヌクレアーゼ消化を用いて取り除かれなければならない。これは制御し難い反応であり、常に5'側シグナルの喪失につながる。加えて、自己-プライミングは、連続移動性(processivity)が比較的低い酵素である、大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノウ断片によってのみ行うことができる。この要因は更に、この方法の効率を低下する。置換合成は、S1ヌクレアーゼ消化を完全に避け、かつRNA増幅において使用される。この反応は、RNAse H、大腸菌DNAポリメラーゼI及びバクテリオファージT4 DNAリガーゼのような複数の酵素を使用し、DNA:RNA複合体においてRNAを消化し、DNA断片を合成し、かつそれらをライゲーションする。概してこの反応は、恐らく関与した複数の酵素的段階により引き起される、低い効率に悩まされる。まとめると、RNA増幅の効率を増大する重要な因子のひとつは、第二鎖cDNA合成効率の増大である。
【０００５】
米国特許第5,545,522号、Van Gelderら(1990)、及びEberwineらの(1992)論文は、その反応において単独の相補的プライマーによりプライミングされたRNAからのcDNAの合成に関連し、ここで該プライマーは、RNAポリメラーゼプロモーター領域の配列に連結されている。アンチセンスRNAは、RNAポリメラーゼにより、cDNAから転写される。
【０００６】
米国特許第5,962,272号は、鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを使用するDNA分子の調製を開示している。RNAは、RNAにアニーリングするcDNA合成プライマーと接触され、かつこのcDNA分子は逆転写され、mRNA−cDNAハイブリッドを作成する。鋳型スイッチオリゴヌクレオチドは、5'側CAP部位にハイブリダイズし、かつ鋳型スイッチオリゴヌクレオチドと相補的であるss cDNAの3'-末端のCAP-依存型伸長のための短い伸長された鋳型として利用される。
【０００７】
PCT出願の国際公開公報第00/75356号は、ポリ(dT)プライマーが、第一鎖cDNAを合成するために逆転写反応をプライミングするような、RNAポリメラーゼ連鎖反応に関する。その後この反応は、dGTPを第一鎖cDNAの3'末端に組込むターミナルトランスフェラーゼテーリング反応、第二鎖cDNA合成反応、及び転写が続く。
【０００８】
更に組織及び細胞の機能的状態(複数)は、世紀を超えて形態学的観察により研究されてきた。最適に調製、すなわち固定、切片作成及び／又は染色された組織の研究は、長期に渡り、組織学的及び組織病理学的研究の主要な方法であった。いくつかの組織学的染色法が、別個の細胞型の可視化ができるように特定の組織構成要素の対比を増大するそれらの能力を基に経験的に開発されている。組織学的染色は、ほとんどの場合、個々の細胞型又はタンパク質には特異的ではないが、古典的組織化学的調製物を、最新のタンパク質(例えば、免疫細胞化学)及び分子生物学的方法論と共に利用することにより、多くの情報を集めることができる。しかし、形態学的観察及び分子生物学的方法により集められた情報は、互いに比較しかつ相関することが困難であることが多い。この問題は、主に、形態学的研究及び分子的研究のための方法は、互いに相容れないと考えられるという事実から生じる。従って、形態学的観察及びRNA増幅のような分子的手法は、同じ組織切片又は細胞で行うことはできないであろう。この制限は、分子レベルでの同時試験を伴う、組織及び識別できる細胞型の形態学的特徴の直接試験を、及び最終的には仮説検定を妨害する。
【０００９】
最新の遺伝子発現プロファイリング又は「分子指紋法」は、典型的には相補的デオキシリボ核酸(cDNA)アレイ技術を用いて行われる。本質的に遺伝子アレイは、同時に複数(例えば、数百から数千個)の遺伝子の調査を可能にする。しかし、この方法は感度が悪いために、その後のRNA抽出には、かなり大量の組織が必要である。この低感度の方法には、ふたつの局面で問題が多い。第一に、組織給源は限定され、及び第二に、多数の均質な組織及び／又は細胞型の収集は複雑であることが多いので、アレイは不均質な細胞集団についてのみ行うことができる。
【００１０】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)は、限られた出発材料しか手に入らない場合に、遺伝的シグナルを増幅するために選択される方法である。しかしRT-PCRは、遺伝子を非線形に増幅するので、これは、遺伝子集団のメンバーの間の量的関係を歪曲する(Phillips及びEberwine、1996)。結果として、PCRは好ましくは、希少遺伝子よりも、豊富な遺伝子を多く増幅し、かつその後の集団に弱いシグナルはPCR増幅により更に曖昧となることがある。PCR増幅のこのバイアスを避ける試みは、PCRサイクルを制限することを含む。しかし、PCR反応の制限されたサイクルの増幅能は、大きく低下される。インビトロRNA転写は、線形に遺伝子を増幅する(Ginsbergら、1999；Ginsbergら、2000)。その結果、増幅された遺伝子集団内のメンバーの当初の量的関係は、保存される。増幅されたRNAは、少量の出発物質のみが入手可能な場合の遺伝子発現プロファイリングのために選択される方法である。本発明は、インビトロRNA転写の方法を用い、組織学的に染色された組織及び細胞から遺伝的シグナルを増幅するために有用である方法論を説明する。
【００１１】
Saitoら(1997)は、組織学的に染色された切片からRNAを抽出し、RNAに鎖-特異的逆転写二重PCR(Chuら、1994)及びサザンブロットを施すことによる、肝組織からのRNAの検出を説明している。
【００１２】
Toら(1998)は、RNA単離を伴わずにマイクロダイセクションされた凍結組織切片からmRNAを分析するための技術を説明している。病巣は、凍結された腫瘍切片からマイクロダイセクションされ、切片は染色され、凍結液中に含浸され、引き続き更なる精製法を行わずに、RT-PCR分析される。
【００１３】
Florellら(2001)は、病理診断のための組織の完全性を維持するため、及び分子分析のためにRNAを提供するためのRNA保存のプロトコールを説明している。新たに摘出された組織は、RNA保存溶液であるRNAlater(商標)で処理され、総RNAが抽出され、その後マイクロアレイ解析及びノーザン分析が行われる。
【００１４】
従って、組織学的に染色された組織からの遺伝的シグナルを線形に増幅する非-PCR-ベースの方法を用いる技術分野には隙間がある。本発明は、このような隙間を埋める方法及び組成物を提供することに関する。
【発明の開示】
【００１５】
発明の概要
本発明は、合成された核酸鎖の3'領域へのオリゴヌクレオチドに対し相補的な配列の追加を生じる新規手法を説明する。このプロセスは、「末端連結」として説明される。合成された核酸鎖の3'領域へのその相補体の追加のために使用されたオリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチド3'末端に、少なくとも1個の特異的ヌクレオチド、好ましくはグアニンもしくはデオキシグアニン、又はシトシンもしくはデオキシシトシンを含む。このオリゴヌクレオチドは、「末端連結オリゴヌクレオチド」として説明される。このオリゴヌクレオチドの相補的配列は、ひとつのプライマー及びひとつの末端連結オリゴヌクレオチドを使用するポリメラーゼ反応により、合成された核酸鎖の3'末端への追加することができる。ひとつのプライマーである「第一鎖合成プライマー」は、標的核酸鎖の3'末端に、又は3'末端の上流にアニーリングし、標的核酸鎖の相補的配列を含む核酸鎖である「第一鎖核酸」のポリメラーゼ-依存型合成を開始する。この「末端連結オリゴヌクレオチド」は追加され、その結果、ポリメラーゼは、第一鎖核酸合成反応の3'末端で末端連結オリゴヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを追加する。結果として、第二鎖核酸合成は、末端連結オリゴヌクレオチド又はそれらの一部でプライミングすることができる。従って「末端連結」は、オリゴヌクレオチドの相補的配列を、第一鎖核酸の3'領域への追加することができ、第二鎖合成のためのオリゴヌクレオチド配列の全て又は一部を含むプライマーの使用を可能にする。
【００１６】
当業者は、第一鎖cDNA及びそれに相補的なプライマーの3'領域に公知の配列を提供することにより、ヘアピンループは形成されず、「自己-プライミング」法に関連した破壊性のS1ヌクレアーゼ消化段階の使用を避けることを知っている。従って「末端連結」反応は、高度に効率的であり、かつ第二鎖cDNAの比較的低効率の「自己プライミング」又は「置換」合成と比べ、改善された感度を提供する。更に、第二鎖cDNAの合成は、Taqポリメラーゼのような頑丈な酵素により行うことができ、このことは、この方法の効率を更に改善する。
【００１７】
標的核酸がRNAである場合、末端連結法は、cDNAである第一鎖核酸の3'末端への末端連結オリゴヌクレオチドの相補的配列を組込むことができる。これは、「ポリメラーゼ」としての逆転写酵素、「第一鎖合成プライマー」としてのポリ(dT)オリゴヌクレオチド、及び末端連結オリゴヌクレオチドの使用により達成することができる。この態様において、末端連結オリゴヌクレオチドに相補的な配列は、第一鎖cDNAの3'末端に組込まれ、ここでこの第一鎖cDNAの配列は、標的RNA鎖の相補的配列である。次にこの末端連結オリゴヌクレオチドは、DNAポリメラーゼの使用による、cDNAの第二鎖合成を開始するためのプライマーとして使用することができる。
【００１８】
従って説明されたように、本発明の方法は、RNA分子の増幅に関する。具体的態様において、本発明の方法は、RNAポリメラーゼによる更なるRNA増幅前に、末端連結の機序の利用により、第二鎖cDNA合成の効率を増大する。別の具体的態様において、当該技術分野において公知の別の方法とは対照的に、これらの方法は、インビトロ転写のためにds cDNA分子を提供することに関する。追加の具体的態様において、当該技術分野において公知の別の方法とは対照的に、これらの方法は、ターミナルトランスフェラーゼテーリング反応を欠き、かつ代りに逆転写酵素のデオキシシチジンを第一鎖cDNAの3'末端に組込む固有の活性を利用する。
【００１９】
加えて、RNA合成プロモーターのような転写プロモーターを、同じ「末端連結」機序を用いて、cDNAの5'領域に結合することができる。すなわち、末端連結オリゴヌクレオチドの相補的配列は、第一鎖cDNAの3'末端に組込まれるので、転写プロモーターをプライマーとして含む末端連結オリゴヌクレオチドを用いる、第二鎖cDNA合成は、第二鎖cDNAの5'末端に転写プロモーターを生じる。従ってこの第二鎖cDNAを鋳型として使用するインビトロ転写が可能であり、センス鎖RNAのRNA増幅を生じる。
【００２０】
続いて転写されかつ増幅されたRNAの方向は、プロモーターが結合した鎖に応じて、「センス」又は「アンチセンス」のいずれかの方向を有するであろう。これは、末端連結オリゴヌクレオチドを転写プロモーターを持つようにデザインし、かつ異なる転写プロモーターを伴う第一鎖cDNA合成プライマーをデザインすることにより、達成することができる。3'-プロモーター結合と比較して、5'プロモーターから合成されたRNAは、現在使用されているアンチセンスRNA合成の欠点を回避し、かつ優先的にmRNAの5'配列を保存する。この利点は、1回より多い増幅ラウンドが必要な場合には、より重要でさえある。更にセンスRNAは、タンパク質翻訳鋳型として用いることができ、これは下流のプロテオミクス研究のための追加的な強力な方法論を提供する。
【００２１】
本発明は、配列-特異的プライミング法を提供することによる、第二鎖cDNAの合成のための高効率な手段を提供する。cDNAに結合されたバクテリオファージプロモーターにより起動されたRNA転写により、RNA増幅が、次に行われる。この方法論を用い、たとえ少量の出発RNAであっても、線形に増幅され、多くの下流の適用に利用することができる。増幅されたRNAの下流の適用は、遺伝子発現プロファイリング、cDNAマイクロアレイ分析、cDNAライブラリー構築、及び二本鎖cDNAへの増幅されたRNAの転換後の差し引きライブラリー構築を含むが、これらに限定されるものではない。出発の総mRNA集団の合成されたセンスRNAも、インビトロタンパク質翻訳のための鋳型として使用することができる。これらの手法のための様々な試薬キットを、本発明の結果として開発し、かつこれらは本発明に含まれる。
【００２２】
現行のRNA増幅法の感度を増大する別の障害は、RNA合成プロモーターの位置である。この方法の重要な成分であるバクテリオファージ転写プロモーターは、例えば、mRNAの3'末端へ、mRNAのポリ(A+)配列に相補的なDNA配列を含むプライマー及びプロモーターを介して結合されている。引き続きの増幅段階は、3'配列を増幅するのに対し、情報に富んだタンパク質コード配列は、mRNAの5'領域に局在化する傾向がある。しかし、この方法の感度は、他の公知の方法を改善し、情報に富んだタンパク質コード配列の喪失を減らす。
【００２３】
「末端連結」反応は、高効率である。この方法は、RNA増幅と組合わせて使用される場合、比較的効率の悪い第二鎖cDNA合成の「置換」合成と比べ、改善された感度を提供する。更に第二鎖cDNAの合成は、頑丈なDNAポリメラーゼにより行われ、更にこの方法の効率を改善する。
【００２４】
更に本発明は、当該技術分野において公知の方法に勝る複数の実験的利点をもたらし、これは以下の点を含む：1)形態学及び「分子指紋」の間の相関に関する適当なプラットフォームを提供し、その結果病態及び遺伝的変化の直接の比較及び評価を促進すること；2)多種多様な給源(例えば、新鮮な組織及び保存用パラフィン-包埋した組織などであるが、これらに限定されるものではない。)からの限定された標的組織又は細胞のみが必要であること。その結果、例え1個の細胞であっても、均質な細胞集団における遺伝子発現の研究が可能である(Ginsbergら、1999；Ginsbergら、2000)；3)遺伝子発現レベルは、診断目的に使用される組織切片から調べることができること；4)ライブラリー構築及び／又は組換えタンパク質発現のような、他の分子的方法と組合わせて使用される場合、適用可能性は、更に差し引きハイブリダイゼーション、新規遺伝子標的のクローニング、並びに最終的にはプローブの作成及び組換えタンパク質の発現にまで拡大され得ること。
【００２５】
当業者は、本明細書に説明された方法及び組成物を基に、組織学的に染色された組織からのRNAの増幅はポリメラーゼ連鎖反応を含まないことを知っている。より詳細に述べると、遺伝的シグナルは、ポリメラーゼ連鎖反応とは異なる方法である、インビトロ転写によるRNA合成を介して増幅される。
【００２６】
本発明の目的は、RNA分子を増幅する方法であり、これは、RNA分子を得る段階；mRNA分子へ第一のプライマーを導入する段階であって、第一のプライマーは、RNA分子の相補的領域へ適した条件下でハイブリダイズする領域を含む段階；RNA分子及び第一のプライマーに第二のプライマーを導入する段階であって、第二のプライマーは、少なくとも1個のリボグアニンをプライマーの3'末端に含む段階；合成が、第一の相補的核酸分子の3'末端にひとつより多いシトシンが存在することを生じる条件下で逆転写酵素を用い、第一のプライマーを伸長することにより、RNA分子に対する第一の相補的核酸分子を合成する段階であって、この合成は、第一のプライマー及び第二のプライマー結合したその伸長産物及びRNAを含むRNA-第一の相補的核酸分子ハイブリッドを生じる、段階；このハイブリッドからRNA分子及び第二のプライマーを取り除く段階；第一の相補的核酸分子に対する第二の相補的核酸分子を合成する段階であって、この合成が、第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドを生じ、ここでこのハイブリッドは更に、第二のプライマーに実質的に類似した配列を伴う第三のプライマー及び第一の相補的核酸分子に結合した第三のプライマーの伸長産物の両方を含む、段階；並びに、第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドから少なくとも1個のmRNA分子を転写する段階を含む。具体的態様において、RNA分子はmRNA分子である。具体的態様において、RNAはtRNA分子である。別の具体的態様において、RNAはrRNA分子である。追加の具体的態様において、RNA分子は、複数のRNA分子から得られる。別の具体的態様において、複数のRNA分子は、mRNA、tRNA、rRNA、又はそれらの組合せを含む。追加の具体的態様において、第一のプライマーは更に、少なくとも2個のポリ(dT)を含む領域を含む。別の具体的態様において、第一のプライマーは、ランダム配列の短いプライマーである。更に具体的態様において、第一のプライマーは更に、プロモーター領域、制限酵素消化配列、及びそれらの組合せからなる群から選択された領域を含む。別の具体的態様において、第一のプライマーは更に、プロモーター領域を含む。追加の具体的態様において、プロモーターはバクテリオファージ転写プロモーターである。別の具体的態様において、バクテリオファージ転写プロモーターは、T7 RNAポリメラーゼプロモーター、T3 RNAポリメラーゼプロモーター、SP6 RNAポリメラーゼプロモーター、及び組換えプロモーターからなる群より選択される。別の具体的態様において、第二のプライマーは、ランダム配列をその5'末端に、及び少なくとも1種のリボグアニンをその3'末端に含む。別の具体的態様において、第二のプライマーは更に、プロモーター領域、タンパク質翻訳開始領域、制限酵素消化配列、及びそれらの組合せからなる群より選択された領域を含む。追加的具体的態様において、第二のプライマーは更にプロモーターを含む。別の具体的態様において、プロモーターは、バクテリオファージ転写プロモーターである。更なる具体的態様において、バクテリオファージ転写プロモーターは、T7 RNAポリメラーゼプロモーター、T3 RNAポリメラーゼプロモーター、SP6 RNAポリメラーゼプロモーター、及び組換えプロモーターからなる群より選択される。更に具体的態様において、逆転写酵素は、Taq逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、RNAseH活性を欠損しているモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素、RNAseH活性を欠損しているトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素、I型ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV-I)、ラウス関連ウイルス2(RAV2)、ウシ白血病ウイルス(BLV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、HIV-1逆転写酵素、TERT逆転写酵素、及びTth逆転写酵素からなる群より選択される。別の具体的態様において、この方法は更に、転写段階からのmRNA分子を逆転写する少なくとも一段階を含み、ここでこの逆転写は、少なくとも1種のcDNA分子の作成を生じる。追加の具体的態様において、この逆転写段階は、少なくとも1種のランダムプライマーによりプライミングされる。別の具体的態様において、この逆転写段階は、第一の相補的核酸分子、第二の相補的核酸分子、又はそれらの組合せに結合されたプライマーによりプライミングされる。追加の具体的態様において、このcDNA分子は、少なくとも1個のプロモーター配列を含む。別の具体的態様において、このプロモーターは、バクテリオファージ転写プロモーターである。具体的態様において、バクテリオファージ転写プロモーターは、T7 RNAポリメラーゼプロモーター、T3 RNAポリメラーゼプロモーター、SP6 RNAポリメラーゼプロモーター、及び組換えプロモーターからなる群より選択される。更なる具体的態様において、RNAは、RNAse消化により取り除かれる。追加の具体的態様において、RNAは、RNAse消化により、低濃度のMgCl2を含有する溶液中での加熱により、又はそれらの組合せにより取り除かれる。
【００２７】
別の本発明の態様において、mRNA分子を増幅する方法があり、これは、mRNA分子を得る段階；mRNA分子に、第一のプライマーを導入する段階であって、第一のプライマーは、少なくとも2個のポリ(dT)、及び、ランダム配列を含む段階；このmRNA分子及び第一のプライマーに、第二のプライマーを導入する段階であって、この第二のプライマーは、このプライマーの3'末端に少なくとも1個のリボグアニン、及び、バクテリオファージプロモーター配列を含む、段階；この合成が、該第一の相補的核酸分子の3'末端に複数のシトシンが存在することを生じる条件下で逆転写酵素を用い、第一のプライマーを伸長することによる、mRNA分子に対する第一の相補的核酸分子を合成する段階であって、この合成は、第一のプライマー及び第二のプライマーに結合したその伸長産物及びmRNAを含むmRNA-第一の相補的核酸分子ハイブリッドを生じる、段階；このハイブリッドから、mRNA分子及び第二のプライマーを取り除く段階；この第一の相補的核酸分子に対する第二の相補的核酸分子を合成する段階であって、この合成は、第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドを生じ、ここでこのハイブリッドは更に、第二のプライマーに実質的に類似した配列を伴う第三のプライマー及び第一相補的核酸分子に結合した第三のプライマーの伸長産物の両方を含む、段階；並びに、この第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドから、少なくとも1個のmRNA分子を転写する段階を含む。
【００２８】
別の本発明の態様において、mRNA分子を増幅する方法があり、これは、mRNA分子を得る段階；このmRNA分子に、第一のプライマーを導入する段階であって、この第一のプライマーは、少なくとも2個のポリ(dT)、及び、バクテリオファージプロモーター配列を含む、段階；このmRNA分子及び第一のプライマーに、第二のプライマーを導入する段階であって、この第二のプライマーは、このプライマーの3'末端に少なくとも1個のリボグアニンを含む、段階；この合成が、この第一の相補的核酸分子の3'末端に複数のシトシンが存在することをを生じる条件下で逆転写酵素を用い、この第一のプライマーを伸長することによる、mRNA分子に対する第一の相補的核酸分子を合成する段階であって、この合成は、第一のプライマー及び第二のプライマーに結合したその伸長産物及びmRNAを含むmRNA-第一の相補的核酸分子ハイブリッドを生じる、段階；このハイブリッドから、mRNA分子及び該第二のプライマーを取り除く段階；この相補的核酸分子に、この第二のプライマーと実質的に同じ配列を持つオリゴ(dNTP)プライマーを導入する段階；この第一の相補的核酸分子に対する第二の相補的核酸分子を合成する段階であって、この合成は、第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドを生じる、段階；並びに、この第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドから、少なくとも1個のmRNA分子を転写する段階であって、この少なくとも1個のmRNA分子はアンチセンスmRNAである段階を含む。
【００２９】
本発明の追加の態様において、mRNAを増幅する方法があり、これは、mRNA分子を得る段階；このmRNA分子に、第一のプライマーを導入する段階であって、この第一のプライマーは、少なくとも2個のポリ(dT)又はランダム配列の短いプライマーを含む、段階；このmRNA分子及び第一のプライマーに、第二のプライマーを導入する段階であって、この第二のプライマーは、このプライマーの3'末端に少なくとも1個のリボグアニン、及び、バクテリオファージプロモーター配列を含む、段階；この合成が、第一の相補的核酸分子の3'末端に複数のシトシンが存在することを生じる条件下で逆転写酵素を用い、第一のプライマーを伸長することによる、このmRNA分子に対する第一の相補的核酸分子を合成する段階であって、この合成が、第一のプライマー及び第二のプライマーに結合したその伸長産物及びmRNAを含むmRNA-第一の相補的核酸分子ハイブリッドを生じる段階；このハイブリッドから、mRNA分子及び該第二のプライマーを取り除く段階；この相補的核酸分子に、第二のプライマーと実質的に同じ配列を持つオリゴ(dNTP)プライマーを導入する段階；この第一の相補的核酸分子に対する第二の相補的核酸分子を合成する段階であって、この合成は、第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドを生じる段階；並びに、この第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドから、少なくとも1個のmRNA分子を転写する段階であって、少なくとも1個のmRNA分子はセンスmRNAである段階を含む。
【００３０】
別の本発明の態様において、請求項１記載の方法を用いRNA分子を増幅するためのキットがあり、ここでこのキットは、適当な容器内にはいっており、かつ第一のプライマー、第二のプライマー、第三のプライマー、又はそれらの組合せを備えている。具体的態様において、第一のプライマーは、ランダム配列の短いプライマーである。別の具体的態様において、第一のプライマーは更に、プロモーター、制限酵素消化配列、及びそれらの組合せからなる群より選択される領域を含む。別の具体的態様において、第二のプライマーは更に、プロモーター、制限酵素消化配列、及びそれらの組合せからなる群より選択される領域を含む。
【００３１】
追加の本発明の態様において、インビトロ転写のための基質を提供する方法があり、これは、mRNA分子を得る段階；このmRNA分子に、第一のプライマーを導入する段階であって、この第一のプライマーは、適当な条件下で該mRNA分子の相補的領域にアニーリングする領域を含む、段階；このmRNA分子及び該第一のプライマーに、第二のプライマーを導入する段階であって、この第二のプライマーは、該プライマーの3'末端に少なくとも1個のリボグアニンを含む、段階；この合成が、第一の相補的核酸分子の3'末端に複数のシトシンが存在することを生じる条件下で逆転写酵素を用い、この第一のプライマーを伸長することによる、mRNA分子に対する第一の相補的核酸分子を合成する段階であって、この合成は、第一のプライマー及び第二のプライマーに結合したその伸長産物及びmRNAを含むmRNA-第一の相補的核酸分子ハイブリッドを生じる、段階；このハイブリッドから、該mRNA分子及び該第二のプライマーを取り除く段階；第一の相補的核酸分子に対する第二の相補的核酸分子を合成する段階であって、この合成は、第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドを生じ、ここで該ハイブリッドは更に、第二のプライマーに実質的に類似した配列を伴う第三のプライマー及び第一相補的核酸分子に結合した第三のプライマーの伸長産物の両方を含む、段階；並びに、この第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドから、少なくとも1個のmRNA分子を転写する段階を含む。
【００３２】
本発明の態様において、RNA分子を増幅する方法があり、これは、該RNA分子を得る段階；該mRNA分子に、第一のプライマーを導入する段階であって、該第一のプライマーは、該RNA分子の相補的領域に適当な条件下でハイブリダイズする領域を含む、段階；該RNA分子及び該第一のプライマーに、第二のプライマーを導入する段階であって、該第二のプライマーは、該プライマーの3'末端に少なくとも1個のリボグアニンを含む、段階；該合成が、該第一の相補的核酸分子の3'末端に1個より多いシトシンが存在することを生じる条件下で逆転写酵素を用い、該第一のプライマーを伸長することにより、該RNA分子に対する第一の相補的核酸分子を合成する段階であって、該合成は、第一のプライマー及び第二のプライマーに結合したその伸長産物及びRNAを含む、RNA-第一の相補的核酸分子ハイブリッドを生じる、段階；該ハイブリッドから、該RNA分子及び該第二のプライマーを取り除く段階；該第一の相補的核酸分子に対する第二の相補的核酸分子を合成する段階であって、該合成は、第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドを生じ、ここで該ハイブリッドは更に、第二のプライマーに実質的に類似した配列を伴う第三のプライマー及び第一相補的核酸分子に結合した第三のプライマーの伸長産物の両方を含む、段階；並びに、該第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドから、少なくとも1個のmRNA分子を転写する段階を含む。具体的態様において、RNA分子は、mRNA分子、tRNA分子、又はrRNA分子である。別の具体的態様において、RNA分子は、複数のRNA分子から得られる。更なる具体的態様において、複数のRNA分子は、mRNA、tRNA、rRNA、又はそれらの組合せを含む。追加の具体的態様において、第一のプライマーは更に、少なくとも2個のポリ(dT)を含む領域を含む。追加の具体的態様において、第一のプライマーは、ランダム配列の短いプライマーである。追加の具体的態様において、第一のプライマーは更に、プロモーター領域、制限酵素消化配列、及びそれらの組合せからなる群より選択される領域を含む。更なる具体的態様において、第一のプライマーは更に、プロモーター領域を含む。別の具体的態様において、プロモーターは、バクテリオファージ転写プロモーターである。追加の具体的態様において、バクテリオファージ転写プロモーターは、T7 RNAポリメラーゼプロモーター、T3 RNAポリメラーゼプロモーター、SP6 RNAポリメラーゼプロモーター、及び組換えプロモーターからなる群より選択される。別の具体的態様において、第二のプライマーは、その5'末端にランダム配列及びその3'末端に少なくとも1個のリボグアニンを含む。更なる具体的態様において、第二のプライマーは更に、プロモーター領域、タンパク質翻訳開始領域、制限酵素消化配列、及びそれらの組合せからなる群より選択される領域を含む。追加の具体的態様において、第二のプライマーは更にプロモーターを含む。別の具体的態様において、プロモーターは、バクテリオファージ転写プロモーターである。更に具体的態様において、バクテリオファージ転写プロモーターは、T7 RNAポリメラーゼプロモーター、T3 RNAポリメラーゼプロモーター、SP6 RNAポリメラーゼプロモーター、及び組換えプロモーターからなる群より選択され��。具体的態様において、逆転写酵素は、Taq逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、RNAseH活性を欠損しているモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素、RNAseH活性を欠損しているトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素、I型ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV-I)、ラウス関連ウイルス2(RAV2)、ウシ白血病ウイルス(BLV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、HIV-1逆転写酵素、TERT逆転写酵素、及びTth逆転写酵素からなる群より選択される。別の具体的態様において、この方法は更に、該転写段階からの該mRNA分子を逆転写する少なくとも1段階を含み、ここで該逆転写は、少なくとも1種のcDNA分子の作成を生じる。追加の具体的態様において、逆転写段階は、少なくとも1種のランダムプライマーによりプライミングされる。更なる具体的態様において、逆転写段階は、該第一の相補的核酸分子、該第二の相補的核酸分子、又はそれらの組合せに結合したプライマーによりプライミングされる。別の具体的態様において、cDNA分子は、少なくとも1個のプロモーター配列を含む。更に具体的態様において、このプロモーターはバクテリオファージ転写プロモーターである。追加の具体的態様において、バクテリオファージ転写プロモーターは、T7 RNAポリメラーゼプロモーター、T3 RNAポリメラーゼプロモーター、SP6 RNAポリメラーゼプロモーター、及び組換えプロモーターからなる群より選択される。別の具体的態様において、RNAは、RNAse消化により取り除かれる。更なる具体的態様において、RNAは、RNAse消化により、低濃度のMgCl2を含有する溶液中での加熱により、又はそれらの組合せにより取り除かれる。
【００３３】
本発明の態様において、mRNA分子を増幅する方法があり、これは、該mRNA分子を得る段階；該mRNA分子に、第一のプライマーを導入する段階であって、該第一のプライマーは、少なくとも2個のポリ(dT)、及びランダム配列を含む、段階；該mRNA分子及び該第一のプライマーに、第二のプライマーを導入する段階であって、該第二のプライマーは、該プライマーの3'末端に少なくとも1個のリボグアニン、及びバクテリオファージプロモーター配列を含む、段階；該合成が、該第一の相補的核酸分子の3'末端に複数のシトシンが存在することを生じる条件下で逆転写酵素を用い、該第一のプライマーを伸長することによる、該mRNA分子に対する第一の相補的核酸分子を合成する段階であって、該合成が、第一のプライマー及び第二のプライマーに結合したその伸長産物及びmRNAを含むmRNA-第一の相補的核酸分子ハイブリッドを生じる、段階；該ハイブリッドから、該mRNA分子及び該第二のプライマーを取り除く段階；該第一の相補的核酸分子に対する第二の相補的核酸分子を合成する段階であって、該合成は、第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドを生じ、ここで該ハイブリッドは更に、第二のプライマーに実質的に類似した配列を伴う第三のプライマー及び第一相補的核酸分子に結合した第三のプライマーの伸長産物の両方を含む、段階；並びに、該第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドから、少なくとも1個のmRNA分子を転写する段階を含む。
【００３４】
別の本発明の態様において、mRNA分子を増幅する方法があり、これは、該mRNA分子を得る段階；該mRNA分子に、第一のプライマーを導入する段階であって、該第一のプライマーは、少なくとも2個のポリ(dT)、及び、バクテリオファージプロモーター配列を含む、段階；該mRNA分子及び該第一のプライマーに、第二のプライマーを導入する段階であって、該第二のプライマーは、該プライマーの3'末端に少なくとも1個のリボグアニンを含む、段階；該合成が、該第一の相補的核酸分子の3'末端に複数のシトシンが存在することを生じる条件下で逆転写酵素を用い、該第一のプライマーを伸長することにより、該mRNA分子に対する第一の相補的核酸分子を合成する段階であって、該合成が、第一のプライマー及び第二のプライマーに結合したその伸長産物及びmRNAを含むmRNA-第一の相補的核酸分子ハイブリッドを生じる、段階；該ハイブリッドから、該mRNA分子及び該第二のプライマーを取り除く段階；該相補的核酸分子に、該第二のプライマーと実質的に同じ配列を持つオリゴ(dNTP)プライマーを導入する段階；該第一の相補的核酸分子に対する第二の相補的核酸分子を合成し、ここで該合成は、第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドを生じる段階；並びに、該第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドから、少なくとも1個のmRNA分子を転写する段階であって、該少なくとも1個のmRNA分子はアンチセンスmRNAである段階を含む。
【００３５】
追加の本発明の態様において、mRNA分子を増幅する方法があり、これは、該mRNA分子を得る段階；該mRNA分子に、第一のプライマーを導入する段階であって、該第一のプライマーは、少なくとも2個のポリ(dT)又はランダム配列の短いプライマーを含む、段階；該mRNA分子及び該第一のプライマーに、第二のプライマーを導入する段階であって、該第二のプライマーは、該プライマーの3'末端に少なくとも1個のリボグアニン及びバクテリオファージプロモーター配列を含む、段階；該合成が、該第一の相補的核酸分子の3'末端に複数のシトシンが存在することを生じる条件下で逆転写酵素を用い、該第一のプライマーを伸長することによる、該mRNA分子に対する第一の相補的核酸分子を合成する段階であって、該合成が、第一のプライマー及び第二のプライマーに結合したその伸長産物及びmRNAを含むmRNA-第一の相補的核酸分子ハイブリッドを生じる、段階；該ハイブリッドから、該mRNA分子及び該第二のプライマーを取り除く段階；該相補的核酸分子に、該第二のプライマーと実質的に同じ配列を持つオリゴ(dNTP)プライマーを導入する段階；該第一の相補的核酸分子に対する第二の相補的核酸分子を合成する段階であって、該合成は、第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドを生じる、段階；並びに、該第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドから、少なくとも1個のmRNA分子を転写する段階であって、該少なくとも1個のmRNA分子はセンスmRNAである段階を含む。
【００３６】
追加の本発明の態様において、請求項1記載の方法を使用する、RNA分子を増幅するキットがあり、ここで該キットは、適当な容器に入っており、かつ該第一のプライマー、該第二のプライマー、該第三のプライマー、又はそれらの組合せを備える。具体的態様において、第一のプライマーは、ランダム配列の短いプライマーである。別の具体的態様において、第一のプライマーは更に、プロモーター、制限酵素消化配列、及びそれらの組合せからなる群より選択される領域を含む。更なる具体的態様において、第二のプライマーは更に、プロモーター、制限酵素消化配列、及びそれらの組合せからなる群より選択される領域を含む。
【００３７】
追加の本発明の態様において、インビトロ転写のための基質を提供する方法があり、これは、該mRNA分子を得る段階；該mRNA分子に、第一のプライマーを導入する段階であって、該第一のプライマーは、適当な条件下で該mRNA分子の相補的領域にアニーリングする領域を含む、段階；該mRNA分子及び該第一のプライマーに、第二のプライマーを導入する段階であって、該第二のプライマーは、該プライマーの3'末端に少なくとも1個のリボグアニンを含む、段階；該合成が、該第一の相補的核酸分子の3'末端に複数のシトシンが存在することを生じる条件下で逆転写酵素を用い、該第一のプライマーを伸長することによる、該mRNA分子に対する第一の相補的核酸分子を合成する段階であって、該合成が、第一のプライマー及び第二のプライマーに結合したその伸長産物及びmRNAを含むmRNA-第一の相補的核酸分子ハイブリッドを生じる、段階；該ハイブリッドから、該mRNA分子及び該第二のプライマーを取り除く段階；該第一の相補的核酸分子に対する第二の相補的核酸分子を合成する段階であって、該合成は、第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドを生じ、ここで該ハイブリッドは更に、第二のプライマーに実質的に類似した配列を伴う第三のプライマー及び第一相補的核酸分子に結合した第三のプライマーの伸長産物の両方を含む、段階；並びに、該第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドから、少なくとも1個のmRNA分子を転写する段階を含む。
【００３８】
別の本発明の態様において、組織学的に染色された細胞からRNAを検出する方法があり、これは、細胞を得る段階；細胞からRNAを抽出する段階；及び、RNAを増幅する段階を含む。具体的態様において、細胞は組織内にある。
【００３９】
別の本発明の態様において、細胞からRNAを検出する方法があり、これは、細胞を得る段階；細胞を組織学的に染色する段階；細胞からRNAを抽出する段階；及び、RNAを増幅する段階を含む。具体的態様において、細胞は組織内にある。更に具体的態様において、組織は新鮮な組織又は固定された組織である。別の具体的態様において、組織は、アセトン、アルデヒド誘導体、エタノール、又はそれらの組合せにより固定されている。具体的態様において、細胞は、生理学的体液、病理学的滲出液、又は病理学的漏出液に由来する。更なる具体的態様において、生理学的体液は、血液、脳脊髄液、尿、汗、精液、又は唾液である。追加の具体的態様において、細胞は、血液、骨髄、脳脊髄液、又はいずれか他の生理学的体液又はいずれかの病理学的滲出液もしくは漏出液中にある。更に具体的態様において、細胞は骨髄に由来している。追加の具体的態様において、細胞は、インビトロにおいて培養した細胞に由来している。別の具体的態様において、組織学的染色は、細胞構造を同定する。更に具体的態様において、細胞構造は、ミトコンドリア、中心小体、粗面小胞体、滑面小胞体、ペルオキシソーム、エンドソーム、リソソーム、小胞、ゴルジ装置、核、細胞質、又はそれらの組合せである。更に具体的態様において、組織学的染色液は、組織構造を同定する。追加の具体的態様において、組織構造は、ラミナ、マトリックス、又はそれらの組合せの構造である。更に具体的態様において、組織学的染色液は、アシドブラック1、アシドブルー22、アシドブルー93、アシドフクシン、アシドグリーン、アシドグリーン1、アシドグリーン5、アシドマゼンタ、アシドオレンジ10、アシドレッド26、アシドレッド29、アシドレッド44、アシドレッド51、アシドレッド66、アシドレッド87、アシドレッド91、アシドレッド92、アシドレッド94、アシドレッド101、アシドレッド103、アシドロゼイン、アシドルビン、アシドバイオレット19、アシドイエロー1、アシドイエロー9、アシドイエロー23、アシドイエロー24、アシドイエロー36、アシドイエロー73、アシドイエローS、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、アルシアンブルー、アルシアンイエロー、アルコール可溶性エオシン、アリザリン、アリザリンブルー2RC、アリザリンカルミン、アリザリンシアニンBBS、アリザロールシアニンR、アリザリンレッドS、アリザリンパープリン、アルミノン、アミドブラック10B、アミドシュワルツ(Amidoschwarz)、アニリンブルーWS、アントラセンブルーSWR、オーラミンO、アゾカルミンB、アゾカルミンG、アゾイックジアゾ5、アゾイックジアゾ48、アズールA、アズールB、アズールC、ベーシックブルー8、ベーシックブルー9、ベーシックブルー12、ベーシックブルー15、ベーシックブルー17、ベーシックブルー20、ベーシックブルー26、ベーシックブラウン1、ベーシックフクシン、ベーシックグリーン4、ベーシックオレンジ14、ベーシックレッド2、ベーシックレッド5、ベーシックレッド9、ベーシックバイオレット2、ベーシックバイオレット3、ベーシックバイオレット4、ベーシックバイオレット10、ベーシックバイオレット14、ベーシックイエロー1、ベーシックイエロー2、ビエブリッヒ(Biebrich)スカーレット、ビスマルクブラウンY、ブリリアントクリスタルスカーレット6R、カルシウムレッド、カルミン、カルミン酸、セレスチンブルーB、チャイナブルー、コキニール、コエレスチン(Coelestine)ブルー、クロムバイオレットCG、クロモトロープ2R、クロモキサンシアニンR、コンゴーコリンス、コンゴーレッド、コットンブルー、コットンレッド、クロセインスカーレット、クロシン、クリスタルポンソー6R、クリスタルバイオレット、ダーリア、ダイヤモンドグリーンB、ダイレクトブルー14、ダイレクトブルー58、ダイレクトレッド、ダイレクトレッド10、ダイレクトレッド28、ダイレクトレッド80、ダイレクトイエロー7、エオシンB、エオシンブルイッシュ、エオシン、エオシンY、エオシンイエロイッシュ、エオシノール、エリーガーネット(Erie garnet)B、エリオクロムシアニンR、エリスロシンB、エチルエオシン、エチルグリーン、エチルバイオレット、エバンスブルー、ファストブルーB、ファストグリーンFCF、ファストレッドB、ファストイエロー、フルオレセイン、食用グリーン3、ガレイン、ガラミンブルー、ガロシアニン、ゲンチアンバイオレット、ヘマテイン、ヘマチン、ヘマトキシリン、ヘリオファストルビンBBL、ヘルベティア(Helvetia)ブルー、ヘマテイン、ヘマチン、ヘマトキシリン、ホフマンバイオレット、インペリアルレッド、イングレインブルー、イングレインブルー1、イングレインイエロー1、INT、ケルメス、ケルメス酸、ケルネクトロット(Kernechtrot)、Lac、ラッカイン酸、ラウスバイオレット、ライトグリーン、リサミングリーンSF、ルクソールファストブルー、マゼンタ0、マゼンタI、マゼンタII、マゼンタIII、マラカイトグリーン、マンチェスターブラウン、マルチウスイエロー、メルブロミン、マーキュロクロム、メタニルイエロー、メチレンアズールA、メチレンアズールB、メチレンアズールC、メチレンブルー、メチルブルー、メチルグリーン、メチルバイオレット、メチルバイオレット2B、メチルバイオレット10B、モルダントブルー3、モルダントブルー10、モルダントブルー14、モルダントブルー23、モルダントブルー32、モルダントブルー45、モルダントレッド3、モルダントレッド11、モルダントバイオレット25、モルダントバイオレット39、ナフトールブルーブラック、ナフトールグリーンB、ナフトールイエローS、天然ブラック1、天然レッド、天然レッド3、天然レッド4、天然レッド8、天然レッド16、天然レッド25、天然レッド28、天然イエロー6、NET、天然レッド、ニューフクシン、ナイアガラブルー3B、ナイトブルー、ナイルブルー、ナイルブルーA、ナイルブルーオキサゾン、ナイルブルー硫酸塩、ナイルレッド、ニトロBT、ニトロブルーテトラゾリウム、核ファストレッド、オイルレッドO、オレンジG、オルセイン、パラロスアニリン、フロキシンB、ピクリン酸、ポンソー2R、ポンソー6R、ポンソーB、ポンソー・ド・キシリジン、ポンソーS、プリミューラ、パープリン、ピロニンB、ピロニンG、ピロニンY、ローダミンB、ロスアニリン、ローズベンガル、サフロン、サフラニンO、スカーレットR、スカーレットレッド、スカーラックR、シェラック、シリウスレッドF3B、ソロクロムシアニンR、可溶性ブルー、ソルベントブラック3、ソルベントブルー38、ソルベントレッド23、ソルベントレッド24、ソルベントレッド27、ソルベントレッド45、ソルベントイエロー94、酒精可溶性エオシ���、スダンIII、スダンIV、スダンブラックB、サルファーイエローS、スイスブルー、タートラジン、チオフラビンS、チオフラビンT、チオニン、トルイジンブルー、トルイリンレッド、トロパエオリンG、トリパフラビン、トリパンブルー、ウラニン、ビクトリアブルー4R、ビクトリアブルーB、ビクトリアグリーンB、ウォーターブルーI、水溶性エオシン、キシリジンポンソー、又はイエロイッシュエオシンである。
【００４０】
具体的態様において、抽出段階は更に、組織から細胞を解離することを含む。具体的態様において、解離は、マイクロマニプレータ上でマイクロピペットにより又はレーザー捕獲マイクロダイセクションによる。更に具体的態様において、増幅段階は、更にRNAからのcDNAの合成を含む。具体的態様において、cDNAの合成は更に、RNAに結合するオリゴヌクレオチドと、逆転写酵素によるcDNAの合成を含む。追加の具体的態様において、RNA増幅法はインビトロ転写である。更に具体的態様において、この増幅は、該RNA分子に、第一のプライマーを導入する段階であって、該第一のプライマーは、該RNA分子の相補的領域に適当な条件下でハイブリダイズする領域を含む段階；該RNA分子及び該第一のプライマーに、第二のプライマーを導入し、ここで該第二のプライマーは、該プライマーの3'末端に少なくとも1個のリボグアニンを含む、段階；該合成が、該第一の相補的核酸分子の3'末端に複数のシトシンが存在することを生じる条件下で逆転写酵素を用い、該第一のプライマーを伸長することによる、該RNA分子に対する第一の相補的核酸分子を合成する段階であって、該合成が、第一のプライマー及び第二のプライマーに結合したその伸長産物及びRNAを含むRNA-第一の相補的核酸分子ハイブリッドを生じる段階；該ハイブリッドから、該RNA分子及び該第二のプライマーを取り除く段階；該第一の相補的核酸分子に対する第二の相補的核酸分子を合成する段階であって、該合成は、第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドを生じ、ここでこのハイブリッドは更に、第二のプライマーと実質的に類似した配列を伴う第三のプライマー及び第一の相補的核酸分子に結合した第三のプライマーの伸長産物の両方を含む段階；並びに、該第一の相補的核酸分子と第二の相補的核酸分子とのハイブリッドから、少なくとも1個のmRNA分子を転写する段階を含む方法を含む。
【００４１】
組織学的に染色された組織中の細胞からRNAを検出するための、適当な容器に収容されたキットは、色素／組織学的染色液、RNA抽出試薬、RNA沈殿担体、オリゴ(dT)プライマー、逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、RNAse失活試薬、末端連結オリゴヌクレオチド、dNTP、NTP、又はそれらの組合せを備えている。具体的態様において、RNAポリメラーゼは、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ、又はSP6 RNAポリメラーゼである。更に具体的態様において、このキットは更に、ベクター、リガーゼ、又はそれらの組合せを備えている。追加的具体的態様において、色素／組織学的染色液は、アシドブラック1、アシドブルー22、アシドブルー93、アシドフクシン、アシドグリーン、アシドグリーン1、アシドグリーン5、アシドマゼンタ、アシドオレンジ10、アシドレッド26、アシドレッド29、アシドレッド44、アシドレッド51、アシドレッド66、アシドレッド87、アシドレッド91、アシドレッド92、アシドレッド94、アシドレッド101、アシドレッド103、アシドロゼイン、アシドルビン、アシドバイオレット19、アシドイエロー1、アシドイエロー9、アシドイエロー23、アシドイエロー24、アシドイエロー36、アシドイエロー73、アシドイエローS、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、アルシアンブルー、アルシアンイエロー、アルコール可溶性エオシン、アリザリン、アリザリンブルー2RC、アリザリンカルミン、アリザリンシアニンBBS、アリザロールシアニンR、アリザリンレッドS、アリザリンパープリン、アルミノン、アミドブラック10B、アミドシュワルツ、アニリンブルーWS、アントラセンブルーSWR、オーラミンO、アゾカルミンB、アゾカルミンG、アゾイックジアゾ5、アゾイックジアゾ48、アズールA、アズールB、アズールC、ベーシックブルー8、ベーシックブルー9、ベーシックブルー12、ベーシックブルー15、ベーシックブルー17、ベーシックブルー20、ベーシックブルー26、ベーシックブラウン1、ベーシックフクシン、ベーシックグリーン4、ベーシックオレンジ14、ベーシックレッド2、ベーシックレッド5、ベーシックレッド9、ベーシックバイオレット2、ベーシックバイオレット3、ベーシックバイオレット4、ベーシックバイオレット10、ベーシックバイオレット14、ベーシックイエロー1、ベーシックイエロー2、ビエブリッヒスカーレット、ビスマルクブラウンY、ブリリアントクリスタルスカーレット6R、カルシウムレッド、カルミン、カルミン酸、セレスチンブルーB、チャイナブルー、コキニール、コエレスチンブルー、クロムバイオレットCG、クロモトロープ2R、クロモキサンシアニンR、コンゴーコリンス、コンゴーレッド、コットンブルー、コットンレッド、クロセインスカーレット、クロシン、クリスタルポンソー6R、クリスタルバイオレット、ダーリア、ダイヤモンドグリーンB、ダイレクトブルー14、ダイレクトブルー58、ダイレクトレッド、ダイレクトレッド10、ダイレクトレッド28、ダイレクトレッド80、ダイレクトイエロー7、エオシンB、エオシンブルイッシュ、エオシン、エオシンY、エオシンイエロイッシュ、エオシノール、エリーガーネットB、エリオクロムシアニンR、エリスロシンB、エチルエオシン、エチルグリーン、エチルバイオレット、エバンスブルー、ファストブルーB、ファストグリーンFCF、ファストレッドB、ファス���イエロー、フルオレセイン、食用グリーン3、ガレイン、ガラミンブルー、ガロシアニン、ゲンチアンバイオレット、ヘマテイン、ヘマチン、ヘマトキシリン、ヘリオファストルビンBBL、ヘルベティアブルー、ヘマテイン、ヘマチン、ヘマトキシリン、ホフマンバイオレット、インペリアルレッド、イングレインブルー、イングレインブルー1、イングレインイエロー1、INT、ケルメス、ケルメス酸、ケルネクトロット、Lac、ラッカイン酸、ラウスバイオレット、ライトグリーン、リサミングリーンSF、ルクソールファストブルー、マゼンタ0、マゼンタI、マゼンタII、マゼンタIII、マラカイトグリーン、マンチェスターブラウン、マルチウスイエロー、メルブロミン、マーキュロクロム、メタニルイエロー、メチレンアズールA、メチレンアズールB、メチレンアズールC、メチレンブルー、メチルブルー、メチルグリーン、メチルバイオレット、メチルバイオレット2B、メチルバイオレット10B、モルダントブルー3、モルダントブルー10、モルダントブルー14、モルダントブルー23、モルダントブルー32、モルダントブルー45、モルダントレッド3、モルダントレッド11、モルダントバイオレット25、モルダントバイオレット39、ナフトールブルーブラック、ナフトールグリーンB、ナフトールイエローS、天然ブラック1、天然レッド、天然レッド3、天然レッド4、天然レッド8、天然レッド16、天然レッド25、天然レッド28、天然イエロー6、NET、天然レッド、ニューフクシン、ナイアガラブルー3B、ナイトブルー、ナイルブルー、ナイルブルーA、ナイルブルーオキサゾン、ナイルブルー硫酸塩、ナイルレッド、ニトロBT、ニトロブルーテトラゾリウム、核ファストレッド、オイルレッドO、オレンジG、オルセイン、パラロスアニリン、フロキシンB、ピクリン酸、ポンソー2R、ポンソー6R、ポンソーB、ポンソー・ド・キシリジン、ポンソーS、プリミューラ、パープリン、ピロニンB、ピロニンG、ピロニンY、ローダミンB、ロスアニリン、ローズベンガル、サフロン、サフラニンO、スカーレットR、スカーレットレッド、スカーラックR、シェラック、シリウスレッドF3B、ソロクロムシアニンR、可溶性ブルー、ソルベントブラック3、ソルベントブルー38、ソルベントレッド23、ソルベントレッド24、ソルベントレッド27、ソルベントレッド45、ソルベントイエロー94、酒精可溶性エオシン、スダンIII、スダンIV、スダンブラックB、サルファーイエローS、スイスブルー、タートラジン、チオフラビンS、チオフラビンT、チオニン、トルイジンブルー、トルイリンレッド、トロパエオリンG、トリパフラビン、トリパンブルー、ウラニン、ビクトリアブルー4R、ビクトリアブルーB、ビクトリアグリーンB、ウォーターブルーI、水溶性エオシン、キシリジンポンソー、又はイエロイッシュエオシンである。
【００４２】
本発明の態様において、核酸配列を合成された核酸鎖の3'領域に組込む方法があり、これは、標的核酸鎖を、末端連結オリゴヌクレオチド、及び標的核酸鎖の3'末端領域又は3'末端の上流領域に相補的である第一鎖合成プライマーと共に、第一鎖合成プライマーの標的核酸鎖へのハイブリダイゼーションを促進する条件下で、インキュベーションする段階；並びに、プライマーを伸長する段階であって、伸長が、ポリメラーゼにより行われ、その結果伸長は、第一鎖合成プライマー、標的核酸鎖の相補的配列、及び末端連結オリゴヌクレオチドの相補体を含む核酸鎖を合成する段階を含む。具体的態様において、末端連結オリゴヌクレオチドは、少なくとも1個のグアニン、デオキシグアニン、シトシン、又はデオキシシトシンを、末端連結オリゴヌクレオチドの3'末端に含む。更に具体的態様において、標的核酸鎖はRNAであり、及びポリメラーゼは、逆転写酵素であり、その結果この伸長段階において合成された核酸は、3'末端に第一鎖合成プライマー、標的核酸鎖の相補体、及び末端連結オリゴヌクレオチドの相補体を含む、第一鎖cDNAである。具体的態様において、RNAはmRNAである。別の具体的態様において、第一鎖合成プライマーは、少なくとも2個のチミジン残基をその3'末端に含む。更に具体的態様において、第一鎖合成プライマーは、核酸のランダム六量体配列を含む。別の具体的態様において、末端連結オリゴヌクレオチドは、グアニン、デオキシグアニン、シトシン又はデオキシシトシン塩基からなる群より選択される少なくとも2個のヌクレオチドを含む。更なる具体的態様において、この方法は更に、第一鎖cDNAを、末端連結オリゴヌクレオチドと共に、末端連結オリゴヌクレオチドの第一鎖cDNAへのハイブリダイゼーションを促進する条件下で、インキュベーションする追加段階；並びに、末端連結オリゴヌクレオチドを伸長する段階であって、該伸長が、DNAポリメラーゼにより行われ、その結果伸長は、末端連結オリゴヌクレオチド配列及び第一鎖cDNAの相補的配列を含む第二鎖cDNAを合成する段階を含む。具体的態様において、DNAポリメラーゼは、Taqポリメラーゼである。別の具体的態様において、第一鎖合成プライマーは、転写プロモーター配列を含む。追加的具体的態様において、末端連結オリゴヌクレオチドは、転写プロモーター配列、及びその末端連結オリゴヌクレオチドの3'末端に少なくとも1個のグアニン、デオキシグアニン、シトシン、又はデオキシシトシンを含む。追加の具体的態様において、末端連結オリゴヌクレオチドは、転写プロモーター配列、及びその末端連結オリゴヌクレオチドの3'末端に少なくとも1個のグアニン又はシトシンを含む。更に具体的態様において、この方法は、第二鎖cDNAを、転写プロモーター配列に結合することが可能なRNAポリメラーゼと共にインキュベーションする段階；及び、第二鎖cDNAを転写する段階であって、転写は、第二鎖cDNAに配列が相補的なRNA転写産物を合成する段階を含む、追加段階を含む。
【００４３】
別の具体的態様において、この方法は更に、第一鎖cDNAを、転写プロモーター配列と結合可能なRNAポリメラーゼと共にインキュベーションする段階；及び、第一鎖cDNAを転写する段階であって、転写が、第一鎖cDNAに配列が相補的なRNA転写産物を合成する段階を含む、追加段階を含む。具体的態様において、第一鎖合成プライマーは、転写プロモーター配列を含み、かつここで末端連結オリゴヌクレオチドは、その3'末端に少なくとも1個のグアニン、デオキシグアニン、シトシン、又はデオキシシトシンを、及び第一鎖合成プライマーの転写プロモーター配列とは異なる転写プロモーター配列を含む。具体的態様において、この方法は更に、第一鎖cDNAを、第一鎖cDNA上に位置した転写プロモーター配列に結合可能なRNAポリメラーゼと共にインキュベーションする段階；第一鎖cDNAを転写する段階であって、転写は、第一鎖cDNAに配列が相補的なRNA転写産物を合成する段階；第二のcDNA鎖を、第二鎖cDNA上に位置した転写プロモーター配列に結合可能なRNAポリメラーゼと共にインキュベーションする段階；並びに、第二鎖cDNAを転写する段階であって、転写は、第二鎖cDNAに配列が相補的なRNA転写産物を合成する段階を含む、追加段階を含む。具体的態様において、合成されたRNA転写産物は、インビトロ翻訳の鋳型として使用される。
【００４４】
本発明のその他の目的、特徴及び利点は、下記の詳細な説明から明らかになると思われる。しかし、本発明の精神及び範囲内の様々な変更及び修飾が、この詳細な説明から当業者には明らかであるので、好ましい本発明の態様を示す詳細な説明及び具体例は、単に例証のために提供されていることは理解されるべきである。
【００４５】
発明の詳細な説明
本明細書において使用される単数形(a又はan)は、ひとつ又はそれよりも多くを意味することができる。「特許請求の範囲」において使用されるように、単語「含む(comprising)」と組合わせて使用される場合、単語「ある"a"又は"an"」は、ひとつよりも、又はひとつ又はそれよりも多くを意味する。本明細書において使用される「別の(another)」は、少なくとも二番目又はそれ以外のものを意味する。
【００４６】
I.定義
本明細書において使用される用語「組織学的に染色された組織」は、様々な構成要素をより多いもしくはより少ない選択性で着色する非常に様々な色素の組合せにより、又は組織内のそれらの正常な位置で化学物質の同定ができる分析の物理的及び化学的方法の組織学的調製物への適用により染色された、組織切片又は細胞として定義される。
【００４７】
本明細書において使用される用語「インビトロ転写」は、生存細胞の外側の条件下でのDNA鋳型からのRNA分子の作成と定義される。
【００４８】
本明細書において使用される用語「レーザー捕獲マイクロダイセクション」は、望ましい細胞を望ましくない細胞から取り出すための、赤外(IR)レーザービームの使用と定義される。好ましい態様において、望ましい細胞は癌細胞であり、望ましくない細胞は正常細胞である。
【００４９】
本明細書において使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、公知の方法(欧州特許第266,032号に開示されているような固相技術を使用する、ホスホトリエステル、亜リン酸、又はホスホロアミダイト化学、又はFroehlerらの論文(1986)に説明されたデオキシヌクレオチドH-ホスホン酸中間体、その後のポリアクリルアミドゲルのような精製)により化学的に合成された、長さが短い一本鎖ポリデオキシヌクレオチドである。具体的態様において、オリゴヌクレオチドは、プライマーである。
【００５０】
本明細書において使用される用語「プライマー」は、鋳型-依存型のプロセスで新生核酸の合成をプライミングすることが可能である核酸を包含することを意味する。
【００５１】
本明細書において使用される用語「ランダム配列の短いプライマー」は、一般式dN1-dN2-.. .dNq(式中、dNは、dAMP、dCMP、dGMP、及びdTMPからなる群よりランダムに選択されるデオキシリボヌクレオチドを表わし、並びにqは、6以上の整数、好ましくは6〜10を表わす。)を有するオリゴヌクレオチドプライマーとして定義される。
【００５２】
本明細書において使用される用語「組換えプロモーター」は、特定の核酸配列の発現を調節する核酸配列を意味し、ここでこのプロモーターは、組換えDNA技術の適用により、遺伝子工学的に操作されている。
【００５３】
本明細書において使用される用語「鋳型連続(TC)オリゴヌクレオチド」は、連続して並んでおり、かつ互いにホスホジエステル結合により共有結合されなていないようなふたつの鋳型を用いる、DNAポリメラーゼによるDNAの相補鎖の鋳型-依存型の合成プロセスにおいて使用されるオリゴヌクレオチドとして定義される。合成されたcDNA鎖は、両鋳型に相補的な1本の連続鎖である。本発明の具体的態様において、第一の鋳型は、ポリ(A)+ RNAであり、及び第二の鋳型は、好ましくは少なくとも2個のリボグアニンをその3'末端に含む鋳型連続オリゴヌクレオチドである。これは一般式dN1-dN2-. . .dNq- rN1-7を有する(式中dNは、dAMP、dCMP、dGMP、及びdTMPから選択されたデオキシリボヌクレオチドを表わし、並びにqは、6以上の整数、好ましくは6〜70を表わし、並びにrNは、リボヌクレオチド、好ましくはリボグアニンヌクレオチドを表わしている。）。これは、典型的には、第一鎖cDNAの3'末端配列に相補的なその配列通じての、第一鎖cDNA 3'末端での結合による、第一鎖cDNAの連続合成のための鋳型を提供する。
【００５４】
本明細書において使用される用語「末端連結反応」は、ふたつの鋳型を用いて、第一鎖cDNAを合成するプロセスとして定義される。第一鎖cDNAの合成は、第一の鋳型の末端で、第二の鋳型として、末端連結オリゴヌクレオチドを用いて連続される。合成されたcDNAは、第一及び第二の鋳型の両方に相補的な一本鎖連続分子である。本発明の具体的態様において、第一の鋳型はRNAであり、及び第二の鋳型は、好ましくは少なくとも1個のリボグアニンを3'末端に含む末端連結オリゴヌクレオチドである。一部の態様において、少なくとも2個のリボグアニンが、3'末端に存在する。
【００５５】
II.本発明
A.一般的態様
本発明は、標的核酸鎖と相補的である合成された核酸鎖の3'末端に、「末端連結オリゴヌクレオチド」に相補的な核酸配列を追加する方法に関する。この方法は、標的核酸鎖を、末端連結オリゴヌクレオチド、並びに標的核酸鎖の3'末端又は3'末端の上流の配列に相補的である「第一鎖合成プライマー」であるプライマーの存在下で、インキュベーションする段階を含む。この第一鎖合成プライマーは、標的核酸鎖上のその相補的配列にアニーリング又はハイブリダイズし、これはポリメラーゼが、標的核酸鎖に相補的な核酸鎖を合成し始めることを可能にする。このポリメラーゼは同じく、末端連結オリゴヌクレオチドを鋳型として使用し、末端連結オリゴヌクレオチドに相補的な配列の、合成された核酸鎖の3'末端への組込みを促進する。
【００５６】
前記方法をcDNAの作成に使用する場合、標的核酸鎖は、好ましくはRNA、より好ましくはmRNAである。mRNAが標的核酸鎖である場合、その結果第一鎖合成プライマーは、好ましくはポリ(dT)を含む。ランダムプライマー、例えばランダム六量体、及び特異的にデザインされたプライマーも、第一鎖合成プライマーとして使用することができる。第一鎖合成プライマー、末端連結オリゴヌクレオチド及び逆転写酵素の添加により、標的RNA鎖配列の配列に相補的である第一鎖cDNAが合成される。加えて、合成された第一鎖cDNAは、その3'末端に末端連結オリゴヌクレオチドの相補的配列及びその5'末端に第一鎖合成プライマーの配列を含む。
【００５７】
本発明は、配列-特異的プライミング法を提供することができることによる、第二鎖cDNAの合成のための高効率の方法を提供する。末端連結オリゴヌクレオチドの相補的配列は、第一鎖cDNAの3'末端に組込まれるので、第二鎖cDNA合成は、末端連結オリゴヌクレオチドによりプライミングすることができる。これは、クレノウ及びDNA PolIのような効率の悪い第二鎖ポリメラーゼの必要性を予め避けており、その理由は、この第二鎖合成は、プライマーにより開始され、例えばヘアピンループによっては開始されないからである。従って、本発明は、高効率の第二鎖cDNA合成ための、頑丈なポリメラーゼの使用を提供する。
【００５８】
下記の6種のポリメラーゼファミリーのポリメラーゼを含むが、これらに限定されるものではない、いずれかのポリメラーゼを、本発明において使用することができる：Pol I、Polα、Polβ、DNA-依存型RNAポリメラーゼ、逆転写酵素、及びRNA-依存型RNAポリメラーゼ(米国特許第5,614,365号)。Pal I-型DNAポリメラーゼの代表例は下記である：バクテリオファージT7、T3、T4、T5、Spo1、Spo2及びSP6 DNAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼI、大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノウ断片、Thermus aquaticus DNAポリメラーゼI(Taq)、Bacillus stearothermophilus DNAポリメラーゼ(Bst)、Thermus thermophilus DNAポリメラーゼ(Tth)、Pyrococcus furiosus DNAポリメラーゼ(Pfu)、Thermococcus litoralis DNAポリメラーゼ(Vent)、及びThermus flavus DNAポリメラーゼI。Taq、Vent、Bst、Tth及びPfuに加え、他の耐熱性DNAポリメラーゼも、本発明に含まれる。Pol-α又はポリメラーゼII-型ポリメラーゼの例は、大腸菌DNAポリメラーゼII及びS. cerevisiae DNAポリメラーゼIIである。RNAポリメラーゼの代表例は、以下を含む：バクテリオファージT7、T3及びSP6 RNAポリメラーゼ、大腸菌RNAポリメラーゼホロ酵素、大腸菌RNAポリメラーゼコア酵素、及びヒトRNAポリメラーゼI、II、III、並びにヒトミトコンドリアRNAポリメラーゼ。
【００５９】
本発明は更に、末端連結法の使用による、cis-調節エレメントの合成された核酸鎖への組込みを提供する。核酸に導入することができるcis-調節エレメントは、転写プロモーター、バクテリオファージ転写プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、メチル化部位、複製起点、マトリックス結合領域、遺伝子座制御領域及び組換えシグナル配列を含むが、これらに限定されるものではない。当該技術分野において公知の他の同様のエレメントも使用することができる。
【００６０】
本発明は更に、末端連結による合成された核酸鎖への核酸の組込みも提供し、ここで組込まれた核酸は、アミノ酸、アミノ酸のひと続き及び抗原性エピトープをコードすることができる。本発明は更に、末端連結による合成された核酸鎖への核酸の組込みを提供し、ここで組込まれた核酸は、修飾シグナルとして機能することができる。
【００６１】
本発明の一態様において、末端連結オリゴヌクレオチド及び／又は第一鎖合成プライマーは、転写プロモーター、好ましくはバクテリオファージ転写プロモーターを含むようにデザインされる。この第一鎖cDNA合成の態様において、cDNA鎖は、転写プロモーターを含む配列に加え、RNAの3'領域に相補的な配列を有する第一鎖合成プライマーをアニーリングすることにより、転写プロモーターをその5'末端に含むことができる。この第一鎖cDNAは更に、末端連結オリゴヌクレオチドが転写プロモーターを含むようにデザインされる場合には、3'末端に転写プロモーターに相補的な配列を含むことができる。あるいは第一鎖cDNAは、末端連結オリゴヌクレオチドが、転写プロモーターの相補的配列を含むようにデザインされる場合には、その3'末端に転写プロモーター配列を含むことができる。cDNAの第一の合成された鎖に相補的な第二鎖cDNAは、鋳型としてcDNAの第一鎖及びプライマーとしての末端連結オリゴヌクレオチドを用いて合成することができる。センス及び／又はアンチセンスRNA増幅反応は、インビトロRNA転写により引き続き行うことができ、cDNAの第一鎖及び第二鎖は、5'末端、3'末端又は両末端のいずれかに組込まれた転写プロモーターを含むことができる。
【００６２】
この方法を用いると、1個の細胞からのRNAのように、線形に増幅された少量の出発RNAであっても、多くの下流での適用に使用することができる。増幅されたRNAの二本鎖cDNAへの転換後、増幅されたRNAの下流適用は、プローブ作成、遺伝子発現プロファイリング、遺伝子多型増幅及び／又は検出、cDNAマイクロアレイ解析、cDNAライブラリー構築、発現ライブラリー構築、単一細胞cDNAライブラリー構築、差し引きライブラリー構築及び競合的アレイハイブリダイゼーションを含むが、これらに限定されるものではない。出発の総RNA集団の合成されたセンスRNAも、インビトロにおけるタンパク質翻訳のための鋳型として使用することができ、ここで得られたタンパク質は、その後更に下流の適用に使用することができる。これらの手法のための様々な試薬キットが、本発明の結果として開発されており、かつ本発明に包含されている。
【００６３】
あらゆる核酸給源を、出発材料として使用することができ、これは、DNA、RNA、リボソームRNA、ミトコンドリアDNA、ミトコンドリアRNA、合成DNA、及び合成RNAを含むが、これらに限定されるものではない。好ましくは、総RNA又はポリ(A)+ mRNAが、出発物質として使用される。単独の細胞から抽出された少量(ピコグラム程度に少ない)の総RNA又はmRNAは、引き続きの増幅に十分である。RNA類の給源は、無脊椎動物からヒトを含む哺乳類まで並びに遺伝的に変更された対象に及ぶ様々な種由来の生検標本及び剖検組織を含むが、これらに限定されるものではない、インビトロ及びインビボ調製由来の組織のような、生物学的給源又は合成給源を含むことができる。微生物ゲノムからのRNAも、出発の遺伝的材料の給源である。RNAは、標準の分子生物学的方法を用いて抽出される。内因性RNase活性の失活と共に、RNaseの混入を避けることに注意しなければならない。
【００６４】
従って本発明は、RNA、好ましくはmRNAを増幅する組成物及び方法に関する。この組成物及び方法は、本明細書に説明された末端連結オリゴヌクレオチドを使用する。本発明の方法は、アニーリングされたプライマーの鋳型-依存型伸長をもたらすのに十分な条件下で、RNA、逆転写酵素、及び末端連結オリゴヌクレオチドにアニーリングすることができるプライマーとRNAを接触し、mRNA−cDNAハイブリッドを作成し、次に第二鎖cDNA合成が続くことを含む。
【００６５】
第一鎖合成は、好ましくは、標的核酸の3'末端で配列に相補的な配列を含む、オリゴヌクレオチドプライマーである「第一鎖合成プライマー」によりプライミングされる。更に第一鎖合成は、標的核酸の3'末端の上流に位置した配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーによりプライミングされる。標的核酸がRNAであるならば、第一鎖合成プライマーの例は、ポリチミジレート[ポリ(dT)]又はランダム六量体のようなランダム配列を含むが、これらに限定されるものではない。加えて、この第一鎖合成プライマーは、他の望ましい配列、例えば転写プロモーター配列、又はデザインされた制限酵素消化配列なども含むことができる(図1及び2)。
【００６６】
第二のプライマーである「末端連結オリゴヌクレオチド」が、第一鎖合成反応混合液中に存在することも好ましい。加えて、望ましいバクテリオファージプロモーター、例えばT7、T3、又はSP6の配列、もしくは他の機能配列が、任意に末端連結 オリゴヌクレオチドの構成要素配列であることができる(図1及び2)。
【００６７】
「末端連結オリゴヌクレオチド」は、その3'末端に少なくとも1個のグアニンもしくはデオキシグアニン(G又はdG)、又はシトシンもしくはデオキシシトシン(C又はdC)を含むことが好ましく、最も好ましくは、少なくとも2個のG又はdG又はC又はdCをその3'末端に含む。あるいは、末端連結オリゴヌクレオチドは、少なくとも1個のアデノシンもしくはデオキシアデノシン(A又はdA)、又はチミジンもしくはデオキシチミジン(T又はdT)をその3'末端に含む。この末端連結オリゴヌクレオチドは更に、ランダム配列又はヌクレオチドからなることもできる。末端連結オリゴヌクレオチドの総長は、約8〜100ヌクレオチド、より好ましくは約15〜75ヌクレオチド、最も好ましくは約20〜50ヌクレオチドの間である。
【００６８】
その3'末端に少なくとも1個のグアニンもしくはデオキシグアニン(G又はdG)、又はシトシンもしくはデオキシシトシン(C又はdC)の短いひと続きを含む「末端連結オリゴヌクレオチド」が好ましいひとつの理由は、末端連結機能の効率のためである。前述の構造は両方とも、末端連結機能の同等の効率を有する。末端連結オリゴヌクレオチドの3'末端のG、dG、C、dCの、A、dA、T、dTとの完全な又は部分的交換は、末端連結反応の効率をわずかに低下する。しかしこの反応も、末端連結産物を作成する。末端連結オリゴヌクレオチドの3'末端のヌクレオチド及び配列の数は、当業者により、経験的に最適化することができ、かつ容易に決定することができる。
【００６９】
プライマーを適当なプロモーターに合致する方法が望ましい。例えば好ましくは、同じRNA転写プロモーターは、cDNAの5'及び3'両末端には追加されない。しかし、T7及びT3のような2種の異なるプロモーターは、cDNAの5'及び3'の両末端に追加することができ、かつ「センス」又は「アンチセンス」RNA合成のいずれかを指示することができる(図3)。転写を開始することが可能なプロモーターを使用することができることも、本発明の範囲内である。
【００７０】
第二鎖cDNA合成は、末端連結オリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的な配列を持つオリゴ(dNTP)によりプライミングされることが好ましい。合成されたcDNA鎖が転写プロモーターを含む態様において、RNAは、このプロモーターに対応するRNAポリメラーゼにより転写することができる。例えば、T7 RNAポリメラーゼは、T7プロモーターにより起動されたRNAを転写するために使用することができるのに対し、SP6 RNAポリメラーゼは、SP6プロモーターにより起動されたRNAを転写するために使用することができる。2種の異なるプロモーターが、cDNAの両端に結合される場合、RNAポリメラーゼは、望ましい転写されたRNAの「センス」又は「アンチセンス」方向に従い選択される。
【００７１】
必要ならば、複数回のRNA増幅を行って良い。引き続きの増幅期間中、RNAの総集団は、cDNAへと逆転写される。この逆転写は、先にcDNAに結合した特異的プライマー、又はランダムプライマー、又は特異的内部領域を増幅するようにデザインされたプライマーのいずれかにより、プライミングされる。本発明のこの態様において、少なくとも1個のRNA転写プロモーターが、引き続き合成された二本鎖cDNAへ組込まれることが好ましい。
【００７２】
これらのcDNAは更に、下流の適用の前に、適当な酵素的操作により遺伝子工学操作又は変更することができる。本方法で作成された核酸の下流の用途は、例えば、プローブ作成、遺伝子発現プロファイリング、遺伝子多型プロファイリング、cDNAライブラリー構築(図4)、発現ライブラリー構築、差し引きライブラリー構築、競合的アレイハイブリダイゼーション、インビトロ翻訳、及び形態学的試験とは無関係のもしくは組合わせた臨床診断を含み得る。
【００７３】
本発明は都合の良いことに、研究又は診断を目的として、適当な試薬キットを開発することができる。
【００７４】
従って、具体的態様において、本発明のプロセスは、少なくとも下記の段階を含む：
1.ポリ(A)+RNA又は総RNAの試料を、mRNAとアニーリングすることができるポリ(dT)プライマー又はランダム配列の短いプライマー、及び逆転写酵素活性を有する酵素と、mRNA−cDNAハイブリッドを作成するためのプライマーの鋳型-依存型伸長を可能にするのに十分な条件下でインキュベーションする段階。一部の態様において、ポリ(dT)プライマーは、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ、又はSP6 RNAポリメラーゼのような、バクテリオファージプロモーター配列も包含している。一部の態様において、単独の細胞から抽出された少量の総RNA又はmRNAは、引き続きの増幅に十分である。
2.段階1から得られた第一鎖cDNA合成混合液を、本発明の末端連結オリゴヌクレオチドと共にインキュベーションする段階。この末端連結オリゴヌクレオチドは、その3'末端に少なくとも1個のリボグアニン残基、その5'末端に可変性のヌクレオチド配列を有し、かつ一部の制限酵素消化部位、RNA合成プロモーター、タンパク質翻訳開始シグナル、又はそれらの組合せを有する。
3.第二鎖cDNAの合成段階。
4.インビトロ転写の段階。
【００７５】
常法と共に本発明の方法を用い、第一鎖cDNA合成は、逆転写の鋳型としてRNAを用いて行われる。プライマーは、RNAへアニーリングされ、プライマー:RNA複合体を形成する。プライマーの伸長は、反応を進行するのに必要な適量の他の構成要素の存在下で、逆転写酵素、又は逆転写酵素活性を有するDNAポリメラーゼにより触媒され、これは例えば, デオキシリボヌクレオチド三リン酸dATP、dCTP、dGTP及びdTP、Mg2+並びに最適緩衝液である。様々な逆転写酵素を使用することができる。好ましくは、逆転写酵素は、モロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV)(米国特許第4,943,531号)又はRNAseH活性を欠損しているM-MLV逆転写酵素(米国特許第5,405,776号)、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素(AMV)、I型ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV-I)、ラウス関連ウイルス2(RAV2)、ウシ白血病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)又はThermus aquaticus(Taq)又はThermus thermophilus (Tth)(米国特許第5,322,770号)である。これらの逆転写酵素は、生物それ自身から単離され得るか、又は場合によっては、商業的に入手することができる。本発明に有用な逆転写酵素は、その酵素をコードしているクローニングされた遺伝子を発現している細胞からも得ることができる。cDNA合成のための出発材料として、酵母及び植物又は動物のようなより高等生物からの、ポリ(A)+RNA又は総RNAを使用することができる。本方法の第一鎖cDNA合成段階は、反応混合液中の本発明の末端連結オリゴヌクレオチドを含むことができるが、これは第一鎖cDNA合成の実行に必要な要素ではない。従って、末端連結オリゴヌクレオチド分子は、第一鎖反応組成物内に含まれ得ること(例えば、第一のプライマーがRNAにアニーリングする期間、又はRNAを逆転写酵素活性を有する酵素と接触する場合)、もしくはこのオリゴヌクレオチドは、第一鎖cDNA合成反応の途中で、又は完了後に添加することができることが理解される。
【００７６】
代替的態様において、ポリ(dT)プライマーの代わりに、mRNAの内部非ポリ(A)+部分へのプライマーが利用される。これらのオリゴヌクレオチドプライマー(複数)は、一般式dN1-dN2- . . . dNq(式中、dNは、dAMP、dCMP、dGMP、及びdTMPから選択されたデオキシリボヌクレオチドを表わし、並びにqは、6以上の整数を表わす。)を有する。
【００７７】
代替的態様において、ランダム配列の短いプライマー集団を使用することができる。これらのプライマーは、十分に短く、好ましくは6〜10個のデオキシオリゴ核酸であり、並びにこれらの配列は、存在する各RNAは、第一鎖cDNAの合成をプライミングするために、それに相補的な配列を有しかつそれをアニーリングする、少なくとも1個のプライマーを有するように十分に可変性である。
【００７８】
第一鎖cDNAの完全な合成の後、逆転写酵素のターミナルトランスフェラーゼ活性は、鋳型とは無関係に、数個の追加のヌクレオチド、主にデオキシシチジン及び／又はデオキシグアニンを、新たに合成されたcDNA鎖の3'末端に追加する。一部の態様において、ヌクレオチドのデオキシシチジン-リッチなひと続きを伴う塩基対であるオリゴ(rG)配列をその3'末端に有する末端連結オリゴヌクレオチドは、第一cDNA鎖に存在し、伸長された鋳型を作成する。その後逆転写酵素は、第一鎖cDNAの末端に結合した末端連結オリゴヌクレオチドに相補的なcDNAの合成を継続する。従って第一のcDNA合成の完全伸長産物は、RNA及び末端連結オリゴヌクレオチドの両方に相補的な配列を含む。
【００７９】
mRNA:cDNAハイブリッドのRNA部分の、第二鎖cDNAとの交換は、RNA:DNA分子におけるRNA鎖の除去を含意し、かつDNAポリメラーゼによるDNA合成も含む。具体的態様において、RNAse Hが利用される。代わりの態様においては、適当な濃度(0.001mM〜0.15mMの範囲など)の塩化マグネシウムの存在下における加熱である。DNA合成を継続しかつライゲーション段階は必要ない。
【００８０】
第二鎖cDNA合成は、末端連結オリゴヌクレオチドの全体又は一部と同じ配列により、オリゴ(dNTP)により、プライミングされる。大腸菌DNA ポリメラーゼI、バクテリオファージT4 DNAポリメラーゼ、バクテリオファージ T7 DNAポリメラーゼ、及び大腸菌DNAポリメラーゼIの巨大断片(クレノウ断片)などの、多種多様なDNAポリメラーゼを使用することができる。具体的態様において、第二鎖cDNA合成のために、耐熱性かつ頑丈なDNAポリメラーゼであるTaq DNAポリメラーゼが使用される。
【００８１】
本発明の別の態様において、本発明は、組織学的に染色された組織からのRNAの増幅及び検出に関する。現在まで、同じく目下組織学的に染色された組織給源からのインビトロ転写によるDNAの増幅は、わかっていないが、しかしPCRベースの方法により遺伝子シグナルを増幅する方法は公知である。すなわち、dsDNA分子を増幅するか、又はRT-PCRによりmRNAを増幅するための、指数関数的なPCR法の使用は公知であるが、特に線形方式のdsDNA分子由来のRNA分子の増幅はわかっていない。好ましい態様において、RNAは、aRNA法(Van Gelderら(1990)；Eberwineら(1992)；米国特許第5,545,522号、これらは全て本明細書に参照として組入れられている。)により、又は他のインビトロ転写法により、増幅され、これらは本発明の対象である。
【００８２】
本発明の目的において、増幅されたRNA集団は、個人の治療及び／又は診断に関連するように、形態学的試験と無関係に又はこれと組合わせて、臨床診断道具として使用される。
【００８３】
本発明は、インビトロ転写による、組織学的に染色された組織及び細胞からの、RNA集団の増幅法を説明している(図5)。増幅されたRNAは更に、RNA増幅、cDNAマイクロアレイ分析、差し引きハイブリダイゼーション、RT-PCR、ライブラリー構築、及び臨床分子診断を含むが、これらに限定されるものではない、下流の研究適用のために、遺伝的に操作される。
【００８４】
1)インビトロ及びインビボ調製物からの生物学的組織を使用することができ、これは、無脊椎動物から、遺伝的に変更された対象及びヒトを含む哺乳類までの範囲の多種多様な種から得た、生検標本及び剖検組織を含むが、これらに限定されるものではない。
【００８５】
2)本発明の試料は、筋肉、結合組織、皮膚、脳、肝臓、尿、骨髄、術中の捺印標本(touch prep)、微小針吸引液を含むが、これらに限定されるものではない細胞材料、並びに脳脊髄液、血液、粘液、唾液、乳汁吸引液(nipple aspirate)、尿、汗、及び糞便を含む全ての細胞性体液に関する。加えて、試料は、腫瘍、リンパ節、病巣、血管、及び外傷により損傷した組織を含むが、これらに限定されるものではない、病理学的組織を含むことができる。
【００８６】
3)新鮮組織及び固定した組織の両方を利用することができるので、固定条件は、順応性がある。これらの試料は、多種多様な試薬により固定することができ、これは、アセトン、アルデヒド誘導体、エタノール、及びそれらの組合せを含むが、これらに限定されるものではない。固定に重要な段階は、RNAse-非含有条件及び緩衝液の使用、組織の迅速な取得(accession)、及び低温である。RNAは、これらの条件下で最良に保存される。凍結された組織並びに様々な架橋及び沈殿用固定液、例えばホルマリン、パラホルムアルデヒド、アセトン及びエタノールなどが利用される。当業者は、本発明は、細胞／組織に加え、体液(例えば、脳脊髄液、血液、唾液、尿、糞便、汗)からのRNAを増幅するために利用されることを認めるであろう。
【００８７】
4)固定後、組織を切り出し、かつRNAの抽出前に、細胞可視化及び診断予測のために組織学的染色液を塗布した。これらの組織学的染色液は、組織試料内の細胞構造、領域構造、ラミナ構造及び核構造を描いている調製物を全て含む。本発明において使用することができる組織学的染色液の例は、以下を含む：ヘマトキシリン及びエオシン、チオニン、クレシルバイオレット、アクリジンオレンジ及び還元銀調製物。RNAの存在が疑わしい場合、アクリジンオレンジ染色を、RNA抽出及びそれに続く増幅前の、関心のある組織及び細胞(複数)中のRNAの可視化に使用することができる(Ginsbergら、1997；Ginsbergら、1998)。
【００８８】
5)個々に同定された細胞又は細胞集団は、マイクロマニプレータに連結されたマイクロピペットを用いて、又はレーザー捕獲マイクロダイセクションにより、組織から解離される(図6)。
【００８９】
6)マイクロダイセクションされた細胞は、RNase活性を即時失活するために、カオトロピック細胞溶解緩衝液に直ちに浸漬されなければならない。市販のRNA抽出試薬(例えばトリゾール)も使用することができる。一般に、ホモジナイゼーション段階は不要である。グリコーゲン又は線状アクリルアミドのような不活性担体の使用は、最大RNA沈殿の助けとなる。
【００９０】
7)このような極微量のRNAは、ほとんど常に望ましい下流での利用の前に最初に増幅されるはずである。RNA増幅の第一段階は、ds-cDNA鋳型を合成することである。この第一鎖cDNAは、RNAにアニーリングするオリゴヌクレオチドによりプライミングされた逆転写酵素により合成される。一部の態様において、TCプライマーは、第一鎖cDNA合成混合液中に含有され、これは合成された第一鎖cDNAの3'末端で鋳型として利用されるであろう。第二鎖cDNAは、第一鎖cDNAを鋳型として用い、DNAポリメラーゼにより合成され、TCプライマーに実質的に類似した配列を持つプライマーによりプライミングされる。
【００９１】
8)組織学的に染色された組織又は細胞から抽出されたRNAは、インビトロRNA増幅により増幅される。実際に、インビトロRNA転写は、この反応を起動するためにプロモーターが必要である。最良のプロモーター候補は、バクテリオファージプロモーターT7、T3、及びSP6である。
【００９２】
9)転写プロモーターは、mRNAの、プロモーター配列を含む特異的ポリ(T)プライマーによるプライミングにより、第一鎖cDNAの3'側にアニーリングすることができる。あるいは、プロモーターは、末端連結を通じて、第一鎖cDNAの5'側に結合することができる(2001年2月14日に出願された米国特許出願、名称「RNA増幅法」)。
【００９３】
10)この手法は、組織学的染色の必須成分、RNA抽出試薬、RNA沈殿担体、プライマー及びds-cDNA鋳型合成のための酵素及びインビトロRNA転写のための酵素を伴う試薬キットを、都合の良いように開発することができる。
【００９４】
11)それらの観点から様々な修飾又は変更は、当業者に示唆され、かつ本発明の範囲に含まれると考えられる。
【００９５】
増幅されたRNA集団から作成されたプローブを使用するハイブリダイゼーションの方法も、本発明の範囲内である。本発明に従い作成されたRNAプローブは、通常の化学的又は酵素的標識法により、放射性同位元素、蛍光色素、ビオチン及び他のレポーター基のいずれかにより、標識されるであろう。他方で、相補的cDNAは、更に本発明において鋳型として作成されたRNAを用いて、合成及び標識され得る。その後標識されたRNA又はcDNAは、当該技術分野において公知の標準ハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用することができ、すなわち標識されたRNA又はcDNAは、ハイブリダイゼーションプローブ中のある種のポリヌクレオチド配列と、ある種の固定された限定されたオリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチドの間のハイブリダイゼーションにより生じた表面のハイブリダイゼーションパターン形成を可能にするのに十分な時間、固体表面に固定された遺伝子の特定のセットに相当している限定されたオリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチドと接触される。シンチレーションカウント、オートラジオグラフィー、蛍光検出、比色アッセイ、光学濃度評価、又は光放出測定などの、利用可能な通常の技術を用いるハイブリダイゼーションパターンは、当該技術分野において周知である(例えば、Sambrookら、1989；Ausubelら、1994、参照)。
【００９６】
好ましい態様において、マイクロアレイは、本発明の方法により、作成されたRNA又はcDNAによりプロービングされる。マイクロアレイは、通常スライドガラス又は膜のいずれかの固形支持体であり、数百又は数千さえもの公知の遺伝子又はDNAがその上にプリントされている。本明細書において使用される用語「固形支持体」は、公知の方法により、結合リガンド又はオリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチド配列の固定のために使用することができる、いずれか公知の基体を意味する。ハイブリダイゼーションの個別のパターンは、本発明により作成されたRNA又はcDNAによるマイクロアレイのプロービングにより作成され、これはRNAが抽出された組織の遺伝子発現プロファイルの確立につながるであろう。
【００９７】
別の態様において、本発明により作成されたRNA又はcDNAは、ノーザン又はサザンハイブリダイゼーション分析におけるように、アガロースゲルにおいて分離され、ナイロン又はニトロセルロース膜のような固形支持体に移され、かつ標識された公知のRNA又はDNAによりプロービングされる。
【００９８】
同じく増幅されたRNAから作成されたcDNAを含むライブラリーを作出する方法も、本発明の範囲内である。cDNAライブラリーを作出するために使用される通常の方法は、大量の出発材料又は少量の出発材料を増幅するPCR段階のいずれかが必要である。両方法共、均質集団から純粋な材料を大量に得ることは困難であるので、細胞の均質集団からのcDNAの作成には適していない。更に低コピー数の遺伝子は、PCR増幅時に検出不能となる。本方法は、均質な細胞集団からcDNAライブラリーを作出するための改善された代替法を提供する。
【００９９】
別の局面において、本発明は、作成された得られたcDNA産物を、cDNA差し引き法で使用するための出発材料として使用する方法を提供する。具体的には、本発明の方法は、ひとつのDNA集団(テスター集団)中に存在するが、別のDNA集団(ドライバー集団)中には余り豊富でないか又は存在しないような高度に濃厚化されたcDNA種の代表を含有するcDNA集団を調製するために、cDNA差し引き法と一緒に使用することができる。本発明の方法で増幅されたテスター及びドライバーds cDNAは、先に説明された抑制的差し引きハイブリダイゼーション技術との組合せにおいて使用することができる(例えば、米国特許第5,565,340号及び米国特許第5,436,142号参照)。
【０１００】
この分野に詳しい当業者は、本発明において作成されたRNA集団中に存在する遺伝子の検出について先の方法の修飾を考案することができるであろう。
【０１０１】
従って、末端連結法の使用は、線形RNA増幅の実質的に改善された感度及び効率を提供する。この改善の恩恵は、最小量の出発材料からの複数の遺伝子の存在及び量を検出することである。
【０１０２】
III.  インビトロ転写
インビトロ転写は、プロモーター、リボヌクレオチド三リン酸を含む、本発明の方法で作成されたような、精製された線状のds cDNA鋳型、好ましくはDTT及びマグネシウムを含有する緩衝液系、及び適当なバクテリオファージRNAポリメラーゼを必要とする。当業者は、転写反応において使用される正確な条件は、具体的用途に必要なRNAの質及び量により変動することがわかる(この反応条件は、大量のRNAを得るための反応条件と比べ、ハイブリダイゼーションプローブとしての標識されたRNAの作成が異なる。)。
【０１０３】
インビトロ転写反応において使用される一般的RNAポリメラーゼは、SF6、T7及びT3ポリメラーゼであり、それらがクローニングされたバクテリオファージについて命名されている。これらのタンパク質の遺伝子は、大腸菌において過剰発現され、かつこれらのポリメラーゼは、精製されかつ市販されている。RNAポリメラーゼは、個別、かつ非常に特異的なプロモーター配列要件を伴うDNA鋳型依存型である。各ファージRNAポリメラーゼのプロモーターコンセンサス配列は、以下のものであり、ここで転写産物に取込まれた第一塩基は、太字で示し、及び効率的転写に必要な最小配列には、下線をつけている：
2004527236.tif 000003
【０１０４】
RNAポリメラーゼがその二本鎖DNAプロモーターに結合した後、ポリメラーゼはふたつのDNA鎖に分離し、かつ相補的5'から3'RNA鎖の合成のための鋳型として3'から5'鎖を利用する。本明細書の方法により作成されたように、プロモーターに対するDNA配列の方向に応じて、この鋳型は、センス鎖又はアンチセンス鎖RNAを作出するようにデザインすることができる。より詳細に述べると、転写プロモーターは、センスRNAが合成される場合、末端連結機序により、dsDNA鋳型に結合しなければならないのに対し、アンチセンスRNAが合成される場合は、転写プロモーターは、mRNA分子にプロモーター配列を有するポリ(dT)プライマーをアニーリングすることにより、ds RNA鋳型に結合されなければならない。転写鋳型をデザインする場合、センス又はアンチセンス転写産物が必要かどうかが決定されなければならない。RNAがmRNAへのハイブリダイゼーション(例えば、インサイチュハイブリダイゼーション、又はヌクレアーゼ保護アッセイ)のためのプローブとして使用される場合、相補的アンチセンス転写産物が必要である。対照的に、センス鎖転写産物は、発現試験、構造試験又は機能試験を行う場合に、もしくは人工的センス鎖RNAを用いRNA量の標準曲線を構築する場合に、使用される。センス又はアンチセンスRNAのいずれかを、マイクロアレイ分析又は逆ノーザンハイブリダイゼーションにおいて使用することができる。
【０１０５】
慣例により、科学雑誌及びデータベースにおいて示されたDNA配列の一本鎖は、配列においてそのmRNAコピー(TはUに変更される)と同じ、コード、(+)又は「センス鎖」である。DNA鋳型中のRNAポリメラーゼプロモーター配列の+1 Gは、転写産物に組込まれた第一塩基である(前記参照)。センスRNAを作成するために、コード鎖の5'末端は、プロモーターの+1 Gに隣接、又は直ぐ下流になければならない。転写されるアンチセンスRNAに関して、非コード鎖の5'末端は、+1 Gに隣接しなければならない。
【０１０６】
IV. 核酸検出
本発明の一部の態様において、核酸の検出、特に本明細書に説明された方法により増幅されたものが、望ましい。好ましい態様において、マイクロアレイは、本発明の方法で作成されたRNAでプロービングされる。
【０１０７】
A. ハイブリダイゼーション
長さ13〜100個のヌクレオチド、好ましくは17〜100個のヌクレオチド間のプローブ又はプライマーの使用、もしくは本発明の一部の局面において長さ1〜2キロベース又はそれ以上のものが、安定しかつ選択性の二重鎖分子の形成を可能にする(Sambrookら、1989)。長さ20塩基を超える連続伸長にわたる相補的配列を有する分子が一般に、得られたハイブリッド分子の安定性及び／又は選択性を増大するために好ましい。一般に、20〜30個の、望ましいならばより長いヌクレオチドの1個又は複数の相補的配列を有するハイブリダイゼーションのために核酸分子をデザインすることが好ましいであろう。このような断片は、例えば、化学的手段による断片の直接合成により、もしくは組換え体作成のための選択された配列の組換えベクターへの導入により、容易に調製される。
【０１０８】
従って本発明のヌクレオチド配列は、DNA及び／又はRNAの相補的ひと続きにより二重鎖分子を選択的に形成するそれらの能力、又は試料からDNA又はRNAの増幅のためのプライマーを提供するそれらの能力について使用され得る。構想された適用に応じて、標的配列のプローブ又はプライマーの選択性の様々な程度を実現するために、様々なハイブリダイゼーション条件を利用することが望ましいであろう。
【０１０９】
高い選択性を必要とする適用について、典型的には、ハイブリッドを形成するために比較的高ストリンジェントな条件を使用することが望ましいであろう。例えば、比較的低塩及び／又は高温条件、例えば温度約50℃〜約70℃での約0.02M〜約0.10M NaClなどである。このような高ストリンジェントな条件は、存在する場合のプローブと標的配列の間のミスマッチをほとんど忍容できないことは、特異的遺伝子の単離又は特異的mRNA転写産物の検出に特に適している。条件は、漸増量のホルムアミドの添加により、よりストリンジェントとなり得ることが一般に理解される。
【０１１０】
ある種の適用のためには、比較的低いストリンジェント条件が好ましいことが理解される。これらの条件下で、ハイブリダイゼーションは、例えハイブリダイズしている鎖の配列が完全に相補的でないが、1個又は複数の位置でミスマッチしていても生じ得る。条件は、塩濃度を増大し及び／又は温度を低下することにより、より低いストリンジェントとすることができる。例えば、中程度のストリンジェンシー条件は、温度約37℃から約55℃で約0.1〜0.25M NaClにより提供されるが、低ストリンジェンシー条件は、温度が約20℃から約55℃で、約0.15M〜約0.9Mの塩(例えばNaCl)で提供される。ハイブリダイゼーション条件は、望ましい結果に応じて容易に操作することができる。
【０１１１】
他の態様において、ハイブリダイゼーションは、例えば50mM Tris-HCl(pH8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、1.0mMジチオスレイトール、温度およそ20℃〜約37℃の条件下で実現することができる。利用される他のハイブリダイゼーション条件は、およそ10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、温度範囲およそ40℃〜約72℃である。具体的態様において、6 XSSPE、KCl、MgCl2、5Xデンハルト液、1M NaPPi、及び200ng/ml剪断したサケ精子DNAを伴う50％ホルムアミド溶液が使用される。
【０１１２】
ある態様において、本発明の定義された配列の核酸を、ハイブリダイゼーション決定のために、標識などの適当な手段と組合わせて使用することは有利であろう。多種多様な適当なインジケーター手段は、当該技術分野において公知であり、これは検出することが可能である蛍光、放射性、酵素又は他のリガンド、例えばアビジン／ビオチンなどを含む。好ましい態様において、放射性試薬又は他の環境に好ましくない試薬の代わりに、蛍光標識、又はウレアーゼ、アルカリホスファターゼもしくはペルオキシダーゼなどの酵素タグを使用することが望ましい。酵素タグの場合、可視的又は分光光度測定的に検出可能な検出手段を提供するため、相補的核酸含有試料との特異的ハイブリダイゼーションを同定するために利用することができる比色インジケーター基質が公知である。
【０１１３】
概して、本明細書において説明されたプローブ又はプライマーは、対応する遺伝子の発現を検出するための、PCR(商標)のような、溶液ハイブリダイゼーションにおける試薬として、更には固相を利用する態様における試薬として有用であることが、企図されている。固相に関与する態様において、被験DNA(又はRNA)は、選択されたマトリックス又は表面に吸着されるかさもなければ固定される。この固定された一本鎖核酸には、次に選択されたプローブとの、望ましい条件下でのハイブリダイゼーションが施される。選択された条件は、特定の状況によって決まるであろう(例えば、G+C含量、標的核酸の型、核酸給源、ハイブリダイゼーションプローブのサイズなどに応じて決まる)。関心のある特定の適用に関するハイブリダイゼーション条件の最適化は、当業者に周知である。非-特異的に結合したプローブ分子を除去するためにハイブリダイズされた分子を洗浄した後、ハイブリダイゼーションが検出され、及び／又は結合した標識の量を決定することにより定量される。代表的固相ハイブリダイゼーション法は、米国特許第5,843,663号、第5,900,481号及び第5,919,626号に開示されている。その他の本発明の実践において使用することができるハイブリダイゼーション法は、米国特許第5,849,481号、第5,849,486号及び第5,851,772号に開示されている。本明細書の本欄において確定されたこれら及び他の参考文献の関連部分は、本明細書に参照として組入れられている。
【０１１４】
B. 核酸増幅
本発明において、最初にRNAを、相補的DNAに転換することが望ましく、かつ具体的態様において、得られたcDNAは、プライマーなどにより増幅される。典型的には、プライマーは、長さが10〜20及び／又は30個の塩基対からなるオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列を使用することができる。プライマーは、二本鎖及び／又は一本鎖形で提供され得るが、一本鎖形が好ましい。
【０１１５】
本明細書において使用される「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「PCR」の技術は、米国特許第4,683,195号に開示されたように、一般に核酸、RNA及び／又はDNAの極微量の特異的小片が、増幅される手法を意味する。概して、関心のある領域の末端から又はこれにわたる配列情報は、利用可能な必要があり、その結果オリゴヌクレオチドプライマーをデザインすることができ；これらのプライマーは、増幅される鋳型の反対鎖と同じ又は類似の配列であろう。2種のプライマーの5'末端ヌクレオチドは、増幅された材料の末端と一致することができる。PCRは、特異的DNA配列、総ゲノムDNAから特異的RNA配列、及び総細胞のRNA、バクテリオファージ又はプラスミド配列などから転写されたcDNAを増幅するために使用することができる。全般的には、Mullisら(1987)；Erlich編集、「PCR Technology」、Stockton Press社、N.Y.、(1989)を参照のこと。本明細書において使用されるように、PCRは、プライマーとしての公知の核酸(DNA又はRNA)の使用、並びに核酸の特異的小片を増幅又は作出するため、もしくは特定の核酸に相補的である特異的小片を増幅又は作出するために、核酸ポリメラーゼを利用することを含む、核酸被験試料を増幅する核酸ポリメラーゼ反応法の例のひとつであると考えられるが、唯一の例ではない。
【０１１６】
核酸に選択的にハイブリダイズするようデザインされたプライマー対は、鋳型核酸と、選択的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触される。望ましい適用に応じて、プライマーに完全に相補的である配列へのハイブリダイゼーションのみを可能にする、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件が、選択され得る。別の態様において、ハイブリダイゼーションは、プライマー配列との1個又は複数のミスマッチを含む核酸の増幅を可能にする低いストリンジェンシー下で起こすことができる。一旦ハイブリダイズされると、鋳型-プライマー複合体は、鋳型-依存型の核酸合成を促進する1種又は複数の酵素と接触される。「サイクル」とも称される複数回の増幅が、十分量の増幅産物が産生されるまで行われる。
【０１１７】
所定の鋳型試料中に存在するオリゴヌクレオチド配列を増幅するために、多くの鋳型依存型のプロセスが利用可能である。最良の公知の増幅法のひとつは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR(商標)と称す)であり、これは詳細に米国特許第4,683,195号、第4,683,202号及び第4,800,159号、並びにInnisらの論文(1988)に開示されており、これらは本明細書に参照として組入れられている。
【０１１８】
逆転写酵素PCR(商標)増幅法は、増幅されたmRNAの量を定量するために行うことができる。RNAをcDNAに逆転写する方法は周知である(Sambrookら、1989参照)。逆転写の代替法は、熱安定したDNAポリメラーゼを使用する。これらの方法は国際公開公報第90/07641号に開示されている。ポリメラーゼ連鎖反応法は当該技術分野において周知である。代表的RT-PCR法は、米国特許第5,882,864号に開示されている。
【０１１９】
別の増幅法は、欧州特許出願第320 308号に開示されているリガーゼ連鎖反応(「LCR」)であり、これはその全体が本明細書に参照として組入れられている。米国特許第4,883,750号は、標的配列へのプローブ対の結合のためのLCRに類似した方法を開示している。米国特許第5,912,148号に開示されたPCR(商標)及びオリゴヌクレオチドリガーゼアッセイ(OLA)を基にした方法も、使用することができる。
【０１２０】
本発明の実践において使用することができる標的核酸配列の増幅のための代替法は、米国特許第5,843,650号、第5,846,709号、第5,846,783号、第5,849,546号、第5,849,497号、第5,849,547号、第5,858,652号、第5,866,366号、第5,916,776号、第5,922,574号、第5,928,905号、第5,928,906号、第5,932,451号、第5,935,825号、第5,939,291号及び第5,942,391号、英国特許出願第2 202 328号、及びPCT出願第PCT/US89/01025号に開示されており、これらは各々その全体が本明細書に参照として組入れられている。
【０１２１】
PCT出願第PCT/US87/00880号に開示されたQbeta Replicaseも、本発明の増幅法として使用することができる。この方法において、標的の領域に相補的な領域を有するRNAの複製配列は、RNAポリメラーゼが存在する試料に添加される。このポリメラーゼは、複製配列をコピーし、その後これは検出され得るであろう。
【０１２２】
制限部位の1本鎖にヌクレオチド5'-[α-チオ]-三リン酸を含む標的分子の増幅を実行するために制限エンドヌクレアーゼ及びリガーゼが使用される等温増幅法も、本発明の核酸増幅において有用であり得る(Walkerら、1992)。米国特許第5,916,779号に開示された鎖置換増幅(SDA)は、複数回の鎖置換及び合成、すなわちニック翻訳が関連する、核酸の等温増幅を実行する別法である。
【０１２３】
他の核酸増幅法は、核酸配列ベースの増幅(NASBA)及び3SRを含む、転写-ベースの増幅システム(TAS)を含む(Kwohら、1989；Gingerasら、PCT出願第88/10315号、これはその全体が本明細書に参照として組入れられている)。欧州特許出願第329 822号は、一本鎖RNA(「ssRNA」)、ssDNA、及び二本鎖DNA(dsDNA)をサイクル的に合成することに関与する、核酸増幅プロセスを開示しており、これは本発明に従い使用することができる。
【０１２４】
PCT出願第89/06700号(全体が本明細書に参照として組入れられているは、標的一本鎖DNA(「ssDNA」)へのプロモーター領域／プライマー配列のハイブリダイゼーション、それに続くこの配列の多くのRNAコピーの転写を基にした、核酸配列増幅計画を開示している。この計画は、サイクル的ではなく、すなわち新規鋳型は、得られたRNA転写産物からは作出されない。別の増幅法は、「race」及び「片側PCR」(Frohman、1990；Oharaら、1989)を含む。
【０１２５】
C.核酸検出
増幅後、増幅産物を鋳型及び／又は過剰なプライマーから分離することが望ましい。ひとつの態様において、増幅産物は、常法を用い、アガロース、アガロース-アクリルアミド又はポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離される(Sambrookら、1989)。分離された増幅産物は、切り出され、かつ更なる操作のためにゲルから溶離される。低融点アガロースゲルを用い、分離されたバンドは、ゲルの加熱により除去することができ、引き続き核酸が抽出される。
【０１２６】
核酸の分離は、当該技術分野において公知のクロマトグラフィー技術によっても実行することができる。本発明の実践において使用することができる多くの種類のクロマトグラフィーがあり、吸着、分配、イオン交換、ヒドロキシアパタイト、分子篩、逆相、カラム、ペーパー、薄層、及びガスクロマトグラフィーに加え、HPLCを含む。
【０１２７】
ある態様において、増幅産物は可視化される。典型的可視化法は、臭化エチジウムによるゲル染色及びUV線下でのバンドの可視化に関連している。あるいは、この増幅産物が全体的に放射性-標識された又は蛍光測定的に-標識されたヌクレオチド標識されている場合は、分離された増幅産物はx-線フィルムに曝露するか、又は適当な励起スペクトル下で可視化することができる。
【０１２８】
一態様において、増幅産物の分離後、標識された核酸プローブは、増幅されたマーカー配列と接触させられる。このプローブは、好ましくは、発色団と複合されるが、放射標識することもできる。別の態様において、このプローブは、抗体もしくはビオチンなどの結合パートナー、又は検出可能な部分を保持する結合パートナーに複合される。
【０１２９】
特定の態様において、サザンブロット及び標識されたプローブとのハイブリダイゼーションにより検出される。サザンブロットに関連したこれらの技術は、当業者には周知である(Sambrookら、1989参照)。前述の一例は、米国特許第5,279,721号に開示されており、これは本明細書に参照として組入れられており、これは核酸の自動電気泳動及び転移のための装置及び方法を開示している。これらの装置は、ゲルの外部での操作を伴わずに、電気泳動及びブロッティングを可能にし、かつ本発明の方法の実行に理想的に適している。
【０１３０】
本発明の実践において使用することができる別の核酸検出法は、米国特許第5,840,873号、第5,843,640号、第5,843,651号、第5,846,708号、第5,846,717号、第5,846,726号、第5,846,729号、第5,849,487号、第5,853,990号、第5,853,992号、第5,853,993号、第5,856,092号、第5,861,244号、第5,863,732号、第5,863,753号、第5,866,331号、第5,905,024号、第5,910,407号、第5,912,124号、第5,912,145号、第5,919,630号、第5,925,517号、第5,928,862号、第5,928,869号、第5,929,227号、第5,932,413号及び第5,935,791号に開示されており、これらは各々本明細書に参照として組入れられている。
【０１３１】
V.キット
本発明の方法に従う試料中のmRNA増幅に必要な必須の材料及び／又は試薬は全て、キット中に集められている。これは一般に、本発明の実践において関心のある個々の核酸に特異的にハイブリダイズするようにデザインされたプローブ又はプライマーを含むであろう。具体的態様において、末端連結プライマー、短いランダムプライマー、及び／又はポリ(dT)プライマーは、キット内に含まれる。増幅に必要な反応混合液を提供するために、様々なポリメラーゼ(逆転写酵素、Taqなど)を含む核酸増幅に適した酵素、デオキシヌクレオチド及び緩衝液も含まれる。このようなキットは更に、特異的核酸又は増幅産物の検出に適した酵素及び他の試薬を含んでも良い。このようなキットは、一般に、適当な手段で、個々の試薬又は酵素に加え、各プローブ又はプライマー対のための個別の容器を含む。
【０１３２】
VI.プライマー合成
本発明において、本発明の方法の実践のために必要なプライマーのためのオリゴヌクレオチド合成を、当該技術分野において説明された1種又は複数の標準方法に従い行うことができる。例えば、Itakura及びRiggsの論文(1980)を参照のこと。追加的に、米国特許第4,704,362号；米国特許第5,221,619号；及び、米国特許第5,583,013号があり、各々、合成的構造遺伝子を調製する、様々な方法を説明している。
【０１３３】
オリゴヌクレオチド合成は、当業者に周知である。オリゴヌクレオチド合成の様々な異なる機序が、例えば、米国特許第4,659,774号、第4,816,571号、第5,141,813号、第5,264,566号、第4,959,463号、第5,428,148号、第5,554,744号、第5,574,146号、第5,602,244号に開示されており、その各々は本明細書に参照として組入れられている。
【０１３４】
基本的に、化学合成は、ジエステル法、トリエステル法、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ法及び固相化学により実行される。これらの方法は更に詳細に以下に考察している。
【０１３５】
A.ジエステル法
ジエステル法は、主にKhoranaとその同僚により、利用可能な状態に最初に開発された(Khorana、1979)。基本段階は、2個の適当に保護されたデオキシヌクレオチドを連結し、ホスホジエステル結合を含むジデオキシヌクレオチドを形成することである。ジエステル法は、DNA分子合成のために良く確立されかつ使用されている(Khorana、1979)。
【０１３６】
B.トリエステル法
ジエステル法とトリエステル法の間の大きな差異は、後者の場合余分な保護基が、反応体及び生成物のリン原子上に存在することである(Itakuraら、1975)。リン酸保護基は、通常クロロフェニル基であり、これはヌクレオチド及びポリヌクレオチド中間体を有機溶媒に可溶性とする。従って精製は、クロロホルム溶液において行われる。この方法の他の改善点は、(i)三量体及びより大きいオリゴマーの結合をブロックすること、(ii)中間体と最終生成物の両方の精製のための高速液体クロマトグラフィーの大規模使用、及び(iii)固相合成である。
【０１３７】
C.ポリヌクレオチドホスホリラーゼ法
これは、多くの有用なオリゴデオキシヌクレオチドを合成するために使用することができるDNA合成の酵素的方法である(Gillamら、1978；Gillamら、1979)。制御された条件下で、ポリヌクレオチドホスホリラーゼは、優先的に単独のヌクレオチドを、短いオリゴデオキシヌクレオチドへ追加する。クロマトグラフィー精製は、望ましい単独付加物を得ることを可能にする。これらの手法を開始するために、少なくとも三量体が必要であり、かつこのプライマーは、いくつかの他の方法により得られなければならない。ポリヌクレオチドホスホリラーゼ法を行い、かつ関連した手法は、ほとんどの生化学者が熟知するものであるという利点を有する。
【０１３８】
D.固相法
ポリペプチドの固相合成のために開発された技術を描く際に、最初のヌクレオチドを固体支持体材料に結合し、かつヌクレオチドの段階的付加により進行することが可能である。全ての混合及び洗浄段階は、簡略化され、かつこの手法は自動化され易い。これらの合成は現在、自動DNAシンセサイザーにより日常的に行われている。
【０１３９】
ホスホロアミダイト化学(Beaucage及びLyer、1992)は、オリゴヌクレオチド合成のために圧倒的に最も広範に使用される結合化学となりつつある。当業者に周知であるように、オリゴヌクレオチドのホスホロアミダイト合成は、活性化された中間体を形成するための活性化剤との反応による、ヌクレオシドホスホロアミダイトモノマー前駆体の活性化、それに続くオリゴヌクレオチド生成物を形成するためのオリゴヌクレオチド鎖(一般に適当な固形支持体に一方の末端が係留されている)を成長するための活性化された中間体の逐次付加に関連している。
【０１４０】
VII.細胞試料
本発明の方法が施されるこれらの細胞試料は、本発明の目的において、不明のもしくは不確かな医学的状態を伴う個体、又はその医学的状態はわかっているが治療手段がまだ決定されていない個体に由来している。代替の態様において、これらの細胞試料は、ゲノム解析のためのデータベースに包含するために細胞が試験される個体に由来している。
【０１４１】
本発明の試料は、尿、骨髄、血液、術中の捺印標本、微小針吸引液を含むが、これらに限定されるものではない細胞材料、並びに脳脊髄液、血液、粘液、唾液、尿、汗、及び糞便を含む全ての細胞性体液に関する。ある具体的態様において、細胞は、例えばアセトン、アルデヒド誘導体、エタノール、及びそれらの組合せを含む当該技術分野において公知の固定液により固定される。別の態様において、細胞は新鮮な組織に由来する。無関係に、細胞試料は、RNAが保存されるRNAse-非含有の条件及び緩衝液中に維持することが好ましい。
【０１４２】
当業者は、捺印標本は、スライド上への塗沫又は押圧、この組織への加圧、及び低温でのエタノール中での固定により作成されることを知っている。具体的態様において、この組織は外科的に摘出され、腫瘍組織を比較的弱い圧力及び正常組織に対し比較的強い圧力を加えることによりスライドガラス上に塗沫され、その後約100％エタノールでおよそ10分間約4℃で固定される。別の具体的態様において、本発明の方法で分析されるべき試料は、当初液体窒素により凍結され、かつ約-80℃で保存される。
【０１４３】
具体的態様において、分析されるべき試料は、主に癌細胞、上皮細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、白血球細胞、筋肉細胞、骨細胞、結合組織細胞、神経細胞及び／又は脳細胞である。
【０１４４】
細胞性の体液又は材料の標本、試料を受取り、かつ給源に応じて、濃縮及び／又は希釈することができる。具体的態様において、これらの試料は更にプロセシング又は調製される。例えば細胞懸濁液は、フィコール-ハイパック密度遠心のような標準技術により精製することができる。顕微鏡スライドは、細胞含量を最適化するために、濃縮した又はプロセシングした標本を用いて作成され、かつ好ましい態様においては、DNA含量についてヨウ化プロピジウムにより、並びに細胞ケラチン、CD19、CD34、CD3、アネキシンV及びそれらの組合せなどの追加の細胞特性については染色液又はマーカーにより染色される。
【０１４５】
VIII. 組織学的染色
本発明の特定の態様において、RNAが増幅される組織又は細胞は、遺伝的シグナル分析の前にいくつかの時点で、組織学的に染色される。組織学的染色液は、組織試料内の細胞構造、領域構造、及びラミナ構造を描く全ての調製物を含む。組織学的染色液は、核、細胞質、ミトコンドリア、中心小体、粗面小胞体、滑面小胞体、ゴルジ装置構造、ペルオキシソーム、エンドソーム、リソソーム並びに糖質、糖タンパク質、脂質及び核タンパク質成分を描く全ての調製物も含む。染色法の例は、ヘマトキシリン及びエオシン、コンゴーレッド、ガリアス銀、チオフラビン、Massonトリクロム、Movatペンタクロム、Verhoeff-van Gieson、トウゴマレシチン、ホスホロウングス酸(phosphorungstic acid)ヘマトキシリン、プルシアンブルー、オイルレッド0、スダン、Fontana-Masson、漂白された顆粒、ギムサ、ムシカルミン、アルシアンブルー-PAS、ルクソールファストブルー、トルイジンブルー、Holmes、Hicks、メチルグリーン-ピロニン、チオニン、クレシルバイオレット、アクリジンオレンジ、並びに例えば免疫組織化学のようなタンパク質媒介された染色、又は例えばインサイチュハイブリダイゼーション、又はインサイチュPCR媒介した染色のような核酸媒介された染色に対するような、還元銀調製物がある。
【０１４６】
当業者は、当該技術分野において公知の様々な組織学的染色液があることを認め、その例を表1に列記した。
【０１４７】
（表１）通常使用される組織学的染色液
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【０１４８】
更に、当業者は、どの染色液及びそれらに関連する方法が、特定の組織、細胞、細胞下構造を特徴付けるのに有用であるかを認め、かつ下記にその例を表2に列記する。
【０１４９】
（表２）方法及び染色液の指標
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【０１５０】
IX. 組織学的調製
生存細胞は極微量でありかつかなり半透明であるので、1種又は複数の組織学的染色液の塗布なしでは、それらの内部構造はほとんど見ることができない。病理学者は、日常的に、組織の例えばヘマトキシリン及びエオシン染色のような、最も一般的に使用される組織化学的染色の後に、組織を試験する。このプロセシングは、下記の一連の段階を含む：固定、脱水、包埋、及び引き続きのミクロトームのような装置による切片作成。これらの段階は、時間がかかり、かつ微細な方法で細胞構造を変更することが多い。例えばホルムアルデヒドによる細胞固定は、細胞の全体的オルガネラ構造を保存するが、細胞内に配置された抗原及び酵素のような物質を破壊することがある。
【０１５１】
病理学者は日常的に、ホルムアルデヒドで固定されかつパラフィンワックス中に包埋され、その後切片作成された組織を試験する。この方法は、最低24時間はかかり、これは良性又は悪性の癌の診断が課題である場合は、命にかかわる。低温維持装置のような、改良されたミクロトームにおいて組織を凍結し、パラフィン包埋に必要な固定及び脱水段階を省略することにより、価値のある時間を短縮することができる。加えて、凍結切片は、それらの酵素及び抗原画分をより頻繁に保持するであろう。凍結切片の使用は、プロセシング時間を短縮するが、これらの組織の長期の保存は不適当であり、かつ細胞内での氷結晶の形成は細胞下の特徴を破壊する。凍結切片がパラフィンと同じくらい薄い切片でないならば、これらはより厚くなる。このことは、顕微鏡解像度の不良及び細胞下構造を残す画像の不良をもたらす。時間及び酵素機能が重要であるならば、凍結切片は好ましい方法である。細胞下の詳細が重要である場合は、他の手法を使用しなければならない。組織学者は、目先の作業に最も適している方法で組織を調製するために、数百の手法から選択しなければならない。
【０１５２】
A.固定
細胞分解は、生物の死後直ぐに始まるので、生物学者は、分解による細胞の構造の変化を防ぐために、細胞を固定しなければならない。慣習的固定は、細胞のタンパク質を更に変性するための、タンパク質の化学架橋(酵素活動及び消化を防ぐため)及び水分の除去に関する。重金属も、それらの変性作用のために使用することができる。
【０１５３】
典型的実験的手法は、一次固定液としてのアルデヒドの使用に関連している。グルタルアルデヒドは、透過型電子顕微鏡(TEM)に使用され、並びにホルムアルデヒドは、通常の光学顕微鏡に使用される。最も頻繁に使用されるホルムアルデヒド溶液は、最初にBakerにより1944年に配合された。
【０１５４】
Bakerのホルマリン固定液は、以下を含有する：塩化カルシウム1.0g、塩化カドミニウム1.0g、ホルマリン、10.0mlに濃縮し、かつ水で100.0mlに希釈。およそ1cmの組織(肝臓、腎臓、膵臓など)塊を、新たに殺傷した生物から迅速に摘出し、かつ固定液上に置いた。これらは、最低4時間、しかし通常は一晩、固定液中に維持することができる。より長く塊を固定液中に残存させると、塊への固定液の浸透がより深くなり、かつより多くのタンパク質の架橋が生じる。従ってこの固定液は、進行性と称される。塊は、無期限にこの固定液中に維持することができるが、組織は長期曝露により脆弱性を増し始め、切片作成がより困難となるであろう。余り推奨されないが、切片は、ホルマリン中に数年放置された塊から切断される。
【０１５５】
後にホルマリンは、強いアレルギー反応(長期曝露による接触皮膚炎)の原因物質として関連づけられ、かつ恐らく発癌物質であり−これは慎重に、常に良く換気した環境で使用しなければならない。ホルマリンは、気体ホルムアルデヒドの39％溶液である。この固定液は一般に、10％ホルマリン又は同等の4％ホルムアルデヒド溶液として使用される。
【０１５６】
B.脱水
ホルムアルデヒドのような固定液は、更に後にこのプロセスにおいて使用されるいずれかの染色手法と反応する可能性を有する。結果的に、あらゆる残留する固定液は、塊を流水中に一晩放置するか、又は水及び／もしくは緩衝液を連続交換することにより、洗浄除去される。組織洗浄には、無数の手段がある(使用する温度、pH及び浸透圧調節した緩衝液)が、通常単純に水道水で洗浄することで十分である。
【０１５７】
組織がパラフィン又はプラスチックに包埋される場合、全ての微量の水は除去されなければならない：水とパラフィンは非混和性である。水の除去は脱水である。脱水プロセスは、組織を一連の漸増するアルコール濃度中を通過させることにより達成される。組織塊は、順次、30％、50％、70％、80％、90％、95％、及び100％アルコールに、各々約2時間で移される。その後これらの塊を、第二の100％エタノール溶液に入れ、全ての水が確実に除去されるようにする。エタノールは含水性であり、大気から水蒸気を吸収することに注意。段階が水が吸収されないことを確実にするために行われる場合は、無水エタノールのみが、無水である。
【０１５８】
C.包埋
脱水後、これらの組織を、パラフィン、ニトロセルロース又は様々なプラスチック配合物中に包埋する。パラフィンは、最も安価であり、従って最も一般的に使用される材料である。より最近になってプラスチックが、主にそれらがより薄い切片が可能になるために、使用されることが増えてきている(パラフィンの5〜7μmと比べ、約1.5μm)。
【０１５９】
D.パラフィン
パラフィン包埋のために、最初に組織をクリアリングする。クリアリングは、エタノール及びパラフィンに混和性である中間液(intermediate fluid)の使用を意味し、その理由は、これら2種の化合物は非混和性であるからである。ベンゼン、クロロホルム、トルエン又はキシロールが最も一般的に使用されるクリアリング剤であるが、組織学者の一部は、様々な油分の混合物を好んでいる(シーダー油、サリチル酸メチル、クレオソート、丁子油、酢酸アミル、又はセロソルブ)。ジオキサンが頻繁に使用され、かつ調製時間が短いという利点を有する。
【０１６０】
最も頻繁に使用されるクリアリング剤は、トルエンである。これは、塊を無水エタノール：トルエンの50:50混合液へ2時間移すことにより使用される。これらの塊を次に、純粋なトルエン中に入れ、次にトルエン及びパラフィン(同じく50:50)の混合液中に入れる。これらは次に56〜58℃の炉(パラフィンの溶融温度)中に入れる。
【０１６１】
この塊を、炉中の純粋なパラフィン中に1時間移し、その後溶融パラフィンの第二のポットに、更に2〜3時間入れる。この期間に、組織塊は、完全に溶融パラフィンにより浸潤される。
【０１６２】
浸潤後、組織を、包埋用型に入れ、かつ溶融したパラフィンを型に注ぎ、塊を形成する。この塊を冷却し、その後切片作成に直ぐ使用できる。
【０１６３】
E.プラスチック
より最近開発されたプラスチック樹脂配合物は、切片が包埋される方法を変え始めている。パラフィンは、超薄切片が必要な電子顕微鏡のためには、単純に適していない。パラフィン及びニトロセルロースは、十分な薄さの切片を得るには余りにも柔らかすぎる。
【０１６４】
代わりに、硬質プラスチックの特別な配合が使用され、かつ基本的方法は、パラフィンに関するものと類似している。変更点は、約1mmの脱水された組織試料を、液体プラスチック中に配置し、これは次に重合に使用され、硬質塊を形成することに関する。このプラスチック塊は、縁を整え、かつウルトラミクロトームにより切片作成され、数百Åの切片を得る。
【０１６５】
比較的軟質のプラスチックも、通常の光学顕微鏡のために使用される。パラフィンで切片作成された組織の平均の厚さは、7〜10μmの間である。しばしばこれは、ふたつの細胞層からなり、結果的に細胞質構造の定義を欠いている。Polysciences JB-4のようなプラスチックにより、鮮鋭さが増大した1〜3μm範囲の組織の切片作成が可能である。これは、光学顕微鏡写真を撮影する際に、特に有用である。しかし切片の厚さが低下するにつれ、コントラストが失われ、薄い切片(1μm)は通常、位相差顕微鏡の使用に加え特別な染色手法が必要となる。
【０１６６】
軟質プラスチックは、標準のスチール製のミクロトーム刃により切片作成することができ、EM作業のために使用されるより硬質のプラスチックの場合のような、ガラス又はダイヤモンドナイフは不要である。
【０１６７】
F.切片作成
ミクロトームは、固定式ナイフホルダー／刃、及び右側に装備されたフライホイルの1回転毎に予め定めた間隔で前進する標本ホルダーからなる、単純な装置である。操作は、デリカテッセンにおいて見られる肉及びチーズのスライサーに類似している。コントロールノブは、1ストローク毎にパラフィン塊を前進させる内部カムを調節する。パラフィンを10μmで切片作成することは比較的容易であるが、5μmに切断するには多くの技術及び実践が必要である。各切片は連続して塊から切り出されるので、全ての切片を顕微鏡スライド上に並べ、かつ組織の一方の端から他端へと連続切片を作成することは可能である。
【０１６８】
ウルトラミクロトームは、標準型ミクロトームの後継機であり、同じくこれは、固定式ナイフ(ガラス又はダイヤモンド)並びに移動する標本が関与する機械装置である。標本又は塊は、マイクロメーターよりもむしろナノメーターで前進する、プラスチック包埋された組織である。操作上、唯一の違いは、より小さい標本の取扱いであり、これは代わりに刃の上に装着された双眼解剖顕微鏡を必要とする。この組織切片は、肉眼でその厚さを見るには余りにも薄く、通常厚さは、水浴表面上でナイフから離れ浮遊する際の切片上の回折図の色により推定する。これらの切片は同じく、直接取扱うには余りにも薄く、従ってこれらはワイヤループに移すか、もしくは水からEMグリッド上へ直接はぎ取る。このプロセスは、色パターンを見るために、正確な角度で光を投射するために装備された良い光源が必要である。
【０１６９】
これらのプラスチックは、スチール製ナイフを破壊するのに十分な固さであるので、新たに調製したガラスナイフ又は市販のダイヤモンドナイフが使用される。ガラスナイフは、1個数ドルの経費であるが、良質のダイヤモンドナイフは、$3,000以上の価格である。いずれも、操作者の1回の不注意なストロークにより、永久的損傷を受けることがある。ダイヤモンドナイフは、一貫したナイフ縁の利点(各使用毎に変動するガラスナイフと異なり)を有するので、これらは、研究室において、訓練を積んだ技術者により使用され、適切に処置するならば数年持ちこたえる。これらは通常、廃棄前に数回研ぐことができる。
【０１７０】
振動(これは平坦でない切片につながる)を最小化するために、ウルトラミクロトームは、重い金属の中に鋳造され(cast)、衝撃吸収台上に装備され、かつ好ましくは相対的に定温の通風(draft)のない環境に配置される。更に振動を最小化するために、一部の製造業者は、塊の機械的前進機構を、組織を金属棒の加熱により前進させるような温度棒と交換している。これは極めて正確であり、薄い切片作成においては究極のものである。当然この利点は、経費及び維持管理を増大し、粗い取扱いに耐える能力を低下する。機械的に前進するウルトラミクロトームは、細胞生物学実験室の作業場に置かれ続けている。
【０１７１】
G.低温維持装置
切片作成が、ミクロトーム又はウルトラミクロトームのいずれで行われるにせよ、組織切片調製の主な遅延点のひとつは、組織の脱水及び包埋に必要な時間である。これは、凍結組織の直接切片作成により克服することができる。典型的には、組織小片は、約-15〜-20℃に急速凍結され(光学顕微鏡作業のため)、かつ低温維持装置と称される装置において迅速に切片作成される。低温維持装置は、フリーザーボックス中に装備されたミクロトームに過ぎない。
【０１７２】
組織小片を、生物から摘出し、金属スタブ上に配置し、かつ粘性の包埋化合物で覆い、これを切片作成に都合の良い形状で保存する。スタッド及び組織は、低温維持装置内に配置し、急速凍結する。この方法は、速さ、ほとんどの酵素及び免疫学的機能の維持(固定は不必要)並びに比較的容易な取扱い(操作の段階が遙かに少ない)という利点がある。凍結段階の間に形成される氷の結晶が、細胞画像を歪曲し(例えば液胞及び膜の破裂)、かつ塊は凍結乾燥又は昇華する傾向があるという欠点もある。従って、これらの塊は、迅速に使用されなければならず、かつ凍結段階から誘導された人工物に対し保護するよう慎重でなければならない。
【０１７３】
温度感受性(又は脂溶性)分子が試験される場合、又はスピードが最重要点である場合(手術途中の病理学的試験など)には、これは好ましい方法である。低温維持装置による切片作成操作は、単独の凍結切片を取扱い、従って全ての操作は低温で操作されなければならないことを除いて、ミクロトームの場合に類似している。
【０１７４】
X.レーザー捕獲マイクロダイセクション
遺伝子配列決定及び増幅技術の開発は、とりわけ、現在、正常試料に加え疾患試料における詳細な分子分析が可能になっている。しかしこれらの洗練された遺伝子試験法の効率は、分析される細胞集団の純度及び精密度によって左右される。単純にホモジナイジングされた巨大な組織試料は、正常細胞と疾患細胞の又は様々な集団の細胞の不純な組合せを生じる。関心のある細胞を組織学的切片から手作業で分離するために機械的道具を用ることは、時間がかかり、かつ極めて労働集約的である。これらの方法のいずれも、最新の分子診断に必要な容易さ、精密さ及び効率を提供しない。
【０１７５】
レーザー捕獲マイクロダイセクション(LCM)のプロセスは、精度、効率及び純度に関する技術の多くの問題点を回避する。レーザービームは、組織切片内の顕微鏡により確定されかつ標的化された細胞に特異的に結合している特別な転写フィルムを限局的に(focally)活性化する。次に細胞が結合した転写フィルムは、薄い組織切片を持ち上げ(lift off)、背後の不要な細胞(これはその後の分析の分子純度を汚染するであろう)は全て残す。透明な転写フィルムを、組織切片表面に当てる。顕微鏡下で、診断病理学者又は研究者は、この薄い組織切片を、それが登載されたスライドガラスを通して観察し、かつ試験する細胞の鏡検的クラスターを選択する。選択された細胞が、視野の中心にある場合、操作者は、顕微鏡視覚(microscopic optic)と一体化している近赤外レーザーダイオードを活性化するボタンを押す。パルス付きレーザービームは、関心のある細胞の真上の転写フィルム上の正確なスポットを活性化する。この正確な位置で、フィルムは溶融し、かつ下側の選択された細胞と融合する。フィルムを取り除いた後、選択された細胞(複数)は、限局的に延伸膨張されたポリマー内にしっかりと保持される一方で、残りの組織は背後に除かれる。このことは、分子抽出及び分析のために標的化されかつプールされた組織切片又は細胞学的調製物内の複数の均質な試料をもたらす。
【０１７６】
Arcturus社(マウンテンビュー、CA)(http://www.arctur.com/)の機器及び方法のような市販のシステムにおいては、フィルムは、透明なバイアルキャップの下側に永久に結合されている。力学的アームは、転写表面を組織上に正確に位置合わせする。顕微鏡は、レーザービームを不連続サイズ(現在は直径30又は60μmのいずれか)に焦点合わせ、正確にパルス化された線量を標的化されたフィルムに送達する。標的化された細胞は、キャップ表面に転写され、かつこのキャップは、分子プロセシングのために直接バイアル上に配置される。標的化パルスのサイズは、操作者により選択される。フィルムに接着した細胞は、それらの形態学的特徴を保持し、かつ操作者は、正確な細胞が得られたことを証明することができる。
【０１７７】
例えば乳房組織によるLCMの例は、URL(http://www.arctur.com/technology/lcm_examples/ex_breast.html)で入手可能である。
【０１７８】
LCMに関連した特定の調製物及び技術に関する方法は、当業者に周知であり、かつURL(http://www.arctur.com/technology/protocols.html)に提供されており、これは以下を含む：パラフィン-包埋された組織、凍結組織、白血球細胞サイトスピン、組織切片の脱パラフィン化、ヘマトキシリン及びエオシン染色、免疫組織化学的染色(IHC)、インターカレート色素染色(蛍光)、メチルグリーン染色、核ファストレッド染色、及びトルイジンブルーO染色。
【０１７９】
特にActurus社の機器を使用する、レーザー捕獲マイクロダイセクション段階の例は、下記を含む：
【０１８０】
1.調製  標準の顕微鏡スライド上に組織又は塗抹標本を調製するための通常のプロトコールに従う。Prep Strip(商標)を塗布し、組織を平坦とし、ほぐれたデブリを取り除いた後、LCMを行う。
【０１８１】
2.配置  CapSure(商標)HSを、関心のある領域内の組織上に置く。CapSure(商標)HSは、組織と接触せずに転写フィルムを維持するように、特別にデザインされている。
【０１８２】
3.捕獲  低電圧赤外レーザーをパルス化する。このレーザーは、転写フィルムを活性化し、これは次に組織に接触するように下側に延伸膨張する。望ましい細胞(複数)が、CapSure(商標)HS転写フィルムに接着する。
【０１８３】
4.マイクロダイセクション  CapSure(商標)HSフィルムキャリアを、フイルム表面に接着した望ましい細胞(複数)と共に懸架する。周囲の組織は無傷のまま残留する。
【０１８４】
5.抽出  CapSure(商標)HS上にExtracSure(商標)をスナップ止めする(snap)。このExtracSure(商標)は、捕獲された細胞から選択されない材料を封を解く(sealing out)間に、低容量の消化緩衝液を受け止めるようにデザインされている。抽出緩衝液を、ExtracSure(商標)の消化ウェルに直接ピペットを使って移す。微量遠心管を一番上に配置する。
【０１８５】
6.分析  微量遠心管を倒置する。遠心後には、溶解液は、管の底に位置する。細胞内容物、DNA、RNA又はタンパク質は、すぐに引き続き分子解析することができる。
【０１８６】
XI.酵素及び核酸：修飾酵素
本発明の具体的態様において、以下に説明されたもののような酵素を、本発明の方法のためのキットを含む、本発明の方法において利用することができる。
【０１８７】
A.制限酵素
制限酵素の例を、下記表3に示す。
【０１８８】
（表３）制限酵素
2004527236.tif 000019
2004527236.tif 000020
2004527236.tif 000021
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【０１８９】
本明細書において使用される用語DNAの「制限酵素消化」は、DNA内のある場所でのみ作用する酵素によるDNAの触媒的切断を意味する。このような酵素は、制限エンドヌクレアーゼと称され、かつそれら各々にとって特異的である部位は、制限部位と称される。本明細書において使用される様々な制限酵素は、市販されており、かつ酵素供給業者により確立されたようなそれらの反応条件、補因子、及び他の必要要件が使用される。制限酵素は、通常、各制限酵素が当初得られた微生物を表わす、大文字、それに続く他の文字、並びに次ぎに特定の酵素を指名する番号で構成された略号により明示されている。一般に、約1μgのプラスミド又はDNA断片は、約20μlの緩衝液中で約1〜2ユニットの酵素と共に使用される。特定の制限酵素に適当な緩衝液及び基質の量は、製造業者により指定される。37℃で約1時間のインキュベーションが、通常使用されるが、これは供給業者の指示に従い変動することができる。インキュベーション後、タンパク質又はポリペプチドを、フェノール及びクロロホルムによる抽出により除去し、消化された核酸が、エタノール沈殿により水性画分から回収される。制限酵素による消化に続けて、細菌アルカリホスファターゼは、末端5'リン酸を加水分解し、DNA断片の2個の制限切断された末端が、制限部位への別のDNA断片の挿入を邪魔するであろう「環状化」又は閉環を形成することを防ぐ。特に記さない限りは、プラスミドの消化後に、5'末端の脱リン酸化は続かない。脱リン酸化のための手法及び試薬は、Sambrookらの論文(1989)に説明されている。
【０１９０】
B.ポリメラーゼ及び逆転写酵素
耐熱性DNAポリメラーゼ
OmniBase(商標)シークエンシング酵素
Pfu DNAポリメラーゼ
Taq DNAポリメラーゼ
Taq DNAポリメラーゼ、シークエンシング用
Taq ミニキット
TaqBead(商標)ホットスタートポリメラーゼ、1.25u/ビーズ、バリア無し
Tfl DNAポリメラーゼ
Tfl DNAポリメラーゼミニキット
Tli DNAポリメラーゼ
Tth DNAポリメラーゼ
DNAポリメラーゼ
DNAポリメラーゼI、クレノウ断片、エキソヌクレアーゼマイナス
DNAポリメラーゼI
DNAポリメラーゼIラージ(クレノウ)断片
DNAポリメラーゼIラージ(クレノウ)断片ミニキット
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
T4 DNAポリメラーゼ
RNAポリメラーゼ
SP6 RNAポリメラーゼ
T3 RNAポリメラーゼ
T7 RNAポリメラーゼ
逆転写酵素
AMV逆転写酵素
M-MLV逆転写酵素
【０１９１】
C.DNA／RNA修飾酵素
リガーゼ
T4 DNAリガーゼ
T4 RNAリガーゼ
キナーゼ
T4ポリヌクレオチドキナーゼ
ヌクレアーゼ
エクソヌクレアーゼIII
Mung Beanヌクレアーゼ
ヌクレアーゼBAL 31
リボヌクレアーゼH
RNase ONETM リボヌクレアーゼ
RQ1 RNase-非含有DNase
S1ヌクレアーゼ
ホスファターゼ
アルカリホスファターゼ、ウシ小腸(CLAP)
【０１９２】
実施例
下記実施例は、本発明の好ましい態様を説明するために含まれる。当業者には、下記実施例において説明された技術は、本発明者らにより本発明の実践において良く機能することが発見された技術を表わしており、従ってその実践の好ましい様式を構成すると考え得ることは理解されなければならない。しかし、当業者は、本説明を鑑み、明らかにされた具体的態様において、多くの変更を行うことができ、かつ発明の精神及び範囲から逸脱することなく依然類似又は同様の結果を得ることは理解しなければならない。
【０１９３】
実施例1：センス及びアンチセンスRNAの末端連結による増幅
末端連結法は、センス及びアンチセンス鎖RNAを含む核酸の効率的線形の増幅を可能にする。現在のRNA増幅法は、遺伝子集団間の量的関係を歪曲するか、もしくはアンチセンスRNAの不充分な合成に限定されるかのいずれかである。
【０１９４】
mRNAは、RNA分解を防ぐ標準の方法を用いて精製する。ピコグラム量程度の、少量のmRNAを、標的核酸鎖として使用する。その5'末端にポリ(dT)及びSP6転写プロモーターを含む第一鎖合成プライマー、その3'末端にT7転写プロモーター配列及び3個のデオキシグアニンを有する末端連結オリゴノ(oligono)ヌクレオチド、並びに逆転写産物を、mRNAに追加する。第一鎖合成プライマーのポリ(dT)配列を、mRNAのポリ(A)尾部にアニーリングし、第一鎖cDNAを合成するための逆転写酵素のプライマーとして利用する。第一鎖cDNAの3'末端で、逆転写酵素は、末端連結オリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列、この場合、T7転写プロモーター-GGGに相補的な配列を追加する(図3)。この配列は第一鎖合成のプライマーとして使用されるので、第一鎖cDNAの5'末端は、SF6プロモーター、それに続くポリ(T)配列を有する。
【０１９５】
RNA消化又は熱変性を用い、mRNAを第一鎖cDNAから解離する。ここで、mRNA::第一鎖cDNA複合体は、他の生物学的適用における試薬として使用するために、単離することができる。解離した第一鎖cDNAに、末端連結オリゴヌクレオチドを追加し、第二鎖cDNA合成のためのTaqポリメラーゼのプライマーとして利用する。この末端連結プライマーは、第一鎖cDNAの3'末端でその相補的配列にアニーリングする。その後Taqポリメラーゼは、第二鎖cDNAを合成し、これはその5'末端に末端連結プライマーの配列を、及び第一鎖cDNAの相補的配列を含む。従ってこの時点で、機能性T7転写プロモーターを第二鎖cDNAの5'末端に、並びに機能性SF6転写プロモーターを第一鎖cDNAの5'末端に含む二本鎖cDNA分子が、形成される。
【０１９６】
インビトロRNA転写は、第二鎖cDNA及び／又は第一鎖cDNAを鋳型として使用し行う。T7ポリメラーゼ及びrNTPの追加により、T7ポリメラーゼは、第二鎖cDNAの5'末端で転写を開始する。転写の鋳型としての第二鎖cDNAにより、センス鎖RNAが増幅される。SP6ポリメラーゼの追加により、SF6ポリメラーゼは、第一鎖cDNAの5'末端から転写を開始する。転写の鋳型としての第一鎖cDNAにより、アンチセンス鎖RNAが増幅される。増幅されたRNAは、逆転写され、豊富な量のcDNAを作成する。加えて増幅されたセンス鎖RNAは、インビトロ翻訳の鋳型として使用することができる。
【０１９７】
実施例2：RNAの線形増幅法
インビトロ転写によるRNA増幅は、RT-PCRに勝る利点を有し、その理由はそれが、異なる遺伝的シグナル間の量的関係をより良く保存する能力を有し、このことは、それを遺伝子プロファイリングの好ましい方法とする特徴であるからである。
【０１９８】
この手法の重要な段階は、その後のRNA転写のための、ds cDNA鋳型の合成である。伝統的方法は、自己-プライミング(Van Gelderら、1990；Eberwineら、1992；米国特許第5,545,522号)又は第二鎖合成をプライミングする置換法のいずれかを使用する。しかし両者とも、その後のRNA転写のためのds cDNA鋳型を作成するには低効率である点が悩ましい。本発明の方法及び材料は、ds cDNA鋳型合成の効率を有意に増大する。図1の流れ図は、ds cDNA鋳型合成のための「末端連結」技術を説明している。プロトコールのいくつかの明白な変更、例えばプロモーターに結合するための第一及び／又は第二のプライマーの選択、異なるプロモーターの選択、制限酵素消化配列又はタンパク質合成開始配列のような機能配列の削除又は追加などは、全て本発明の範囲内である。
【０１９９】
段階1. 第一鎖合成
第一のプライマー(オリゴd(T)プライマー)  10pmol
5'-d(T)24VN-3' (ここで、V=G又はA又はC；N=G又はA又はT又はC)、及び
第二のプライマー(末端連結(TC)プライマー)  10pmol
2004527236.tif 000024
(TCプライマーは、T7 RNA合成プロモーターを含む)は、RNase非含有水7μlの容量内で、単独のニューロン(およそ0.1〜1pgのmRNA含有)由来の総RNAに、この混合液を85℃で2分間加熱することにより、アニーリングし、引き続き、氷上で少なくとも2分間冷却する。第一鎖cDNA合成は、50mM Tris-HCl、pH8.3、75mM KCl；3mM MgCl2；1mM DTT；及び、各1mMのdATP、dGTP、dCTP、及びdTTPを含有する、最終容量20μl中における、アニーリングしたプライマー-RNA 200ユニットへの、M-MLV RNase H-逆転写酵素の添加により開始する。第一鎖合成反応は、42℃で60分間インキュベーションする。
【０２００】
前記以外のプライマー、例えばRNA合成プロモーターを含有するオリゴd(T)プライマー、又はランダム配列の短いプライマーも、この反応において第一のプライマーとして使用することができ；及び、T7プロモーター以外のRNA合成プロモーターを伴うオリゴ、もしくはその5'側にランダム配列及び3'側に複数のrGを伴うプライマーを、TCプライマーとして使用することができる。
【０２０１】
段階2. 第二鎖cDNA合成
第二鎖cDNA合成は、RNase H 1ユニット、25mM Tris-HCl、pH8.3、65mM KCl、及び2mM MgCl2を含有する、最終容量100μlの第一鎖合成反応液の、Taq DNAポリメラーゼ5ユニットとの混合により開始する。この反応は、下記のように逐次温度変化するサーモサイクラーにおいて行う；37℃で10分間、95℃で3分間、50℃で3分間、及び最後に75℃で30分間。この反応は、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール(25:24:1)による1回抽出により終結し、かつ合成されたds cDNAは、2.5M酢酸アンモニウム(最終濃度)、及び1mlの冷たい100％エタノールにより沈殿される。沈殿を促進するために、10μgの線状アクリルアミドを添加する。このds cDNAは、卓上微量遠心機を使った、室温での14,000rpmの遠心によりペレット化し、その後このペレットを風乾する。その後cDNAを、過剰な塩を除去するために、2時間室温で小滴透析(drop dialyze)し、最終容量を下流の実験により望まれるように決定されたように調節する。
【０２０２】
段階3. インビトロRNA増幅
適当な条件において、各ds cDNA鋳型を用い、数百から数千個のRNAコピーをインビトロ転写により転写し、これは当初の遺伝的シグナルの増幅につながる。インビトロ転写は、40mM Tris-HCl、pH7.5、7mM MgCl2、10mM NaCl、2mMスペルミジン、5mM DTT、20ユニットのRNaseインヒビター並びに各0.5mMのATP、GTP、CTP及びUTPを含有する最終容量20μlの反応混合液への、1,000ユニットのT7 RNAポリメラーゼの添加により行った。この反応は、37℃で4時間行う。一部の用途において、転写されたRNAは、下流のプロセシングの前に、更に増幅が施された。この状況において、前記段階1、2及び3は、少なくとも1回は繰り返すことができる。
【０２０３】
実施例3：増幅したRNAプローブのハイブリダイゼーションによる弱い遺伝的シグナルの検出
本発明の方法及び材料を用いて、遺伝的シグナルを検出するためのRNAプローブを効果的に作成する。実施例1に例証した増幅段階後、遺伝的シグナル、特に弱いシグナルを、実質的に増幅する。その結果、増幅せずに検出するには余りにも弱いこれらのシグナルは、容易に検出することができる。この特徴は、出発材料の供給が限られている場合、例えば腫瘍細胞又は個別の神経集団のような臨床試料又は特異的細胞型などに、特に有用である。当業者には、この手法のために使用される個々の段階又は材料、例えばRNAプローブの標識に使用されるレポーター基、支持材料又はハイブリダイゼーション手法は、本手法の最終結果を変更することなく変動することができることが明らかであろう。本発明の方法及び材料を使用することを基にしている、好ましいプロトコール内のこのような変動は、本発明の範囲内である。
【０２０４】
段階1. 増幅されたハイブリダイゼーションプローブの作成
増幅されたRNAプローブの作成は、実施例1に説明されたように、最初に、当初のRNA集団を、ds cDNA鋳型に転換することが必要である。一部の適用において、RNAは、例えば40μCi33P-UTPのような放射性同位元素の組込みにより、転写の間に直接標識され、ハイブリダイゼーションのためのRNAプローブを作成する。標識したRNAプローブの比活性を増大するために、標識されないUTPが、最終濃度5μMに調節される。
【０２０５】
代替の態様において、cDNAプローブは、標識されたデオキシリボ核酸の存在下における逆転写法により作成される。簡単に述べると、0.5μgのランダム六量体が、容量7μlのRNase非含有水中の増幅されたRNAに、混合液の72℃で2分間の加熱、その後氷上で2分間の冷却によりアニーリングする。逆転写は、50mM Tris-HCl、pH8.3、75mM KCl；3mM MgCl2；1mM DTT；6.5μM蛍光Cy3 Cy5標識したdCTP、各1mMのdATP、dGTP、dTTP、及び0.1mMのdCTPを含有する最終容量20μlにおける、200ユニットのM-MLV RNase H-逆転写酵素への、アニーリングしたプライマー:RNA混合液の添加により開始する。このプローブ合成反応液は、42℃で60分間インキュベーションする。その後1ユニットのRNase Hを添加し、かつ反応混合液を37℃で10分間インキュベーションする。このプローブは、Qiagen社から販売されているPCR精製キットを用いて精製する。
【０２０６】
段階2. ハイブリダイゼーション
具体的態様において、作成されたRNAプローブは、逆ノーザンハイブリダイゼーション分析において使用される。DNA配列がわかっている遺伝子は、固形支持体上に整列するか、又は直接スポットし、これはRNAプローブの添加前に、42℃で4時間プレハイブリダイゼーションする。ナイロン膜を使用する場合、プレハイブリダイゼーション段階は、50％ホルムアミド、6xSSPE、5xデンハルト液、0.1％ SDS及び10mM Na2PPi及び200ng/mlサケ精子DNAを含有する、最終容量10mlのプレハイブリダイゼーション溶液において行う。標識したRNAプローブのプレハイブリダイゼーション液への添加後、更に18時間ハイブリダイゼーションを継続する。膜ブロットを、10ml 2xSSC、0.1％SDS、1xSSC、0.1％SDS及び0.5 SSC、0.1％SDSで、42℃で15分間、順次洗浄する。ハイブリダイゼーションシグナル強度は、リン光造影装置(phosphorimager)により検出する。
【０２０７】
代わりの態様において、Cy3又はCy5標識されたプローブを、cDNAマイクロアレイ解析において使用する。スライドガラスを使用する場合、プレハイブリダイゼーション段階は、室温での0.2％SDS中へのスライドガラスの5分間の3回の含浸により行い、引き続きH2Oに95℃で2分間含浸し、かつ窒素ガスで乾燥する。このハイブリダイゼーションは、5xSSC、0.2％SDS中、65℃で、4時間行う。スライドを、3xSSC、0.2％SDSで5分間65℃で、0.1xSSC、0.2％SDSで5分間室温で、及び0.1xSSC及び室温で30秒間、順次洗浄する。これらのスライドを乾燥し、レーザー走査装置を用い画像形成する。
【０２０８】
実施例4：RNA増幅ベースのcDNAライブラリー構築
cDNAライブラリーを構築する通常の手法は、mRNA集団を関心のある組織から入手することから始め、次にこれを逆転写により第一鎖cDNAへ転換する。cDNAの増幅が必要な場合は、二本鎖cDNAは、通常一段階の第二鎖合成又はPCRにより作成される。しかし、通常の手法は、特に出発材料の量が限定されている場合、均一細胞集団からのcDNAライブラリーの構築には適していない。一部の遺伝的シグナルはPCRにより増幅されるが、組織の少量の細胞集団中の低コピー数の遺伝子は、PCRの増幅後に容易に不明確となり及び／又は喪失される。本発明の方法により、様々な異なる組織から収集した極微量のmRNAは、ライブラリー構築前に線形に増幅することができる。従って、細胞特異的遺伝子、特に低コピー数の遺伝子は、濃厚化され、引き続き同定される。
【０２０９】
増幅したRNA集団は、実施例1に例証した3段階により作成し、これには下記の更なる処理を施す(図4に図示)。
段階1. 第一鎖合成-末端連結
100ngの第一のプライマー
2004527236.tif 000025
100ngの末端連結プライマー
2004527236.tif 000026
は、増幅したRNAへ、容量7μlのRNase/DNase非含有水中において、この混合液の85℃で2分間の加熱、その後の氷上で2分間の冷却によりアニーリングする。第一鎖cDNA合成は、アニーリングしたプライマー-RNAの、M-MLV RNase H逆転写酵素200ユニットとの、50mM Tris-HCl、pH8.3、75mM KCl；3mM MgCl2；1mM DTT；及び、各1mMのdATP、dGTP、dCTP、及びdTTPを含有する最終容量20μlにおける混合により、開始する。第一鎖合成反応とは、42℃で60分間インキュベーションする。
【０２１０】
段階2. 第二鎖cDNA合成
第二鎖cDNA合成は、1ユニットのRNase H、25mM Tris-HCl、pH8.3、65mM KCl、及び2mM MgCl2を含有する、最終容量100μl中の、第一鎖合成反応液の5ユニットのTaq DNAポリメラーゼとの混合により、開始する。この反応は、サーモサイクラーにおいて、下記の段階により行う；37℃で10分間、95℃で3分間、50℃で3分間、及び75℃で30分間。次に5ユニットのEcoRI制限酵素を、この反応液に添加し、室温で30分間インキュベーションする。反応を、フェノール：クロロホルムによる1回の抽出により停止し、合成されたds cDNAを、2.5M酢酸アンモニウム(最終濃度)、及び1ml冷100％エタノールの添加により沈殿する。沈殿を促進するために、10mgの線状アクリルアミドを添加する。このペレットは、95％エタノールで1回洗浄し、風乾する。
【０２１１】
段階3：二本鎖DNAの適当なクローニングベクターへのライゲーション
EcoRI制限酵素消化したds cDNAを、適当なクローニングベクターに、標準プロトコール(例えば、λZAP IIベクター(Stratagene社；ラホヤ、CA))を用いて、ライゲーションし、かつ製造業者の指示に従い、Gigapack III金抽出物(Stratagene社；ラホヤ、CA)によりパッケージングする。
【０２１２】
実施例5：本発明の方法を使用するマイクロアレイ検出
図7は、本発明の方法が、高-密度アレイを用いる増幅及び検出にいかに有用であるかを例示している。図7において、およそ8,400 ESTを有するIncyteライフグリッドマイクロアレイを、Ambion社(オースチン、TX)から得た。図7は、有意なシグナル強度及び分布に加え、正常(7A及び7C；NCI)及びアルツハイマー病(7B及び7D；AD)の間のいくつかの強烈な差異を示している。
【０２１３】
実施例6：本発明の方法の比較
図8は、本発明の方法、対、当該技術分野のaRNA法(Van Gelderら、1990；Eberwineら、1992；Miyashiroら、1994)により増幅された同じ組織切片から抽出されたRNAのふたつの同じアリコートの比較を例示している。本発明の新規方法を用いる、低、中及び高度に発現している遺伝子の相対ハイブリダイゼーションシグナル強度は、当該技術分野において公知のaRNA法と比べ、本発明の新規方法を用いて改善される。ハイブリダイゼーション時間、同じ洗浄方式、及びアレイ給源などこの手法の他の段階は全て、同じように行った。有意な遺伝子発現レベルが、β-act、tau44、ネスチン、ウトロフィン、GluR1、GluR3、及びGluR5-7で検出される。
【０２１４】
実施例7：RNAの増幅
この例のための材料及び方法を以下に示す：
RNA調製：総又はmRNAのいずれかのRNAは、組織、単独細胞、又は体液から抽出する(Van Deerlinら、2002；Ginsbergら、2001)。TC法は、単独の細胞(又は集団細胞)レーザー捕獲マイクロダイセッション又は微量吸引と組合わせて使用した場合に、特に有用である。固定された組織からの最適抽出について、単独の細胞又は集団を、250μlのプロテアーゼK溶液(Ambion社、50μg/ml)中で37℃で12時間インキュベーションし、その後抽出する。RNAは、通常の有機的方法(例えば、トリアゾール試薬、Invitrogen社)又は半自動式磁気mRNA抽出法(例えば、KingFisher、ThermoLabsystems社)を用いて抽出することができる。
【０２１５】
RNA増幅：遺伝的シグナルの増幅は、RNA鋳型に相補的な第一鎖cDNAの合成、引き続きの第一鎖cDNAに相補的な第二鎖cDNAの作成、及び最後に鋳型としてds cDNAを用いるインビトロRNA転写を含む。鋳型mRNAに相補的な第一鎖cDNAの合成のために、2種のオリゴヌクレオチドプライマーであるポリd(T)プライマー及びTCプライマーを使用する。TC RNA増幅に使用したポリd(T)プライマーは、ほとんどのmRNAに存在するポリA+配列を利用する通常のプライマーに類似しており、典型的には24 TTPを含む(＋アンチセンス増幅のためのバクテリオファージプロモーター配列；表4参照)。
【０２１６】
（表４）TC RNA増幅法のためのポリD(T)プライマー及びTCプライマーに使用されるオリゴヌクレオチド配列
アンチセンスRNA方向
2004527236.tif 000027
センスRNA方向
2004527236.tif 000028
【０２１７】
TCプライマーは、本質的に、5'末端のオリゴヌクレオチド配列及び3'末端の短いスパンの3個のシトシン(CTP)のふたつの部分からなる。この方法を利用する利点は、インビトロ転写は、バクテリオファージプロモーター(複数)が結合された場所に応じて、「センス」又は「アンチセンス」(又はセンス及びアンチセンスの両方)の方向に方向づけることができることである(表4)。詳細に述べると、アンチセンスRNA増幅(通常のaRNAに類似)について、バクテリオファージプロモーター(すなわち、T7、T3、SP6)配列が、ポリd(T)プライマーに配置される。新規センス方向について、バクテリオファージ配列は、TCプライマーに結合されている(図9A)。
【０２１８】
抽出されたRNAは、1x第一鎖緩衝液(Invitrogen社；カールスバッド、CA)、1mM dNTP、5mM DTT、20UのRNaseインヒビター(Ambion社；オースチン、TX)及び5U逆転写酵素(Superscript II；Invitgogen社；カールスバッド、CA)中のポリd(T)プライマー(100μg/μl)及びTCプライマー(200μg/μl)の存在下で、最終容量20μl中で、逆転写される。合成された1本鎖(ss)cDNAは、下記の逆転写反応液への添加により、ds cDNAに転換される：総容量100μl中、10mM Tris(pH8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.5U RNase H(Invitrogen社)、及び5U Taqポリメラーゼ(PE Biosystems社)。これらの試料は、サーマルサイクラー内に配置され、第二鎖合成が下記のように進行する：RNase H消化段階、37℃で10分間；変性段階、95℃で3分間；アニーリング段階、50℃で3分間；伸長段階、75℃で30分間。この反応は、5M酢酸アンモニウムにより停止する。次にこれらの試料は、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)において抽出し、エタノール沈殿する。これらのcDNAは、卓上型遠心機によりペレット化し、95％エタノールで1回洗浄し、風乾する。その後cDNAを、再懸濁し、0.025μmフィルターメンブレン(Millipore社)上で、50mlのRNase-非含有H2Oに対し、2時間小滴透析する。この試料を、透析膜から収集し、ハイブリダイゼーションプローブを、放射標識、蛍光、又はビオチン組込みを用いるインビトロ転写により合成する。例えば、33Pによる放射標識は、下記の溶液中において生じる：40mM Tris(pH7.5)、7mM MgCl2、10mM NaCl、2mMスペルミジン、5mMのDTT、0.5mMのATP、GTP、及びCTP、10μMの冷たいUTP、20UのRNaseインヒビター、及び40μCiの33P-UTP(Amersham Biosciences社)。この反応は、37℃で4時間行う。合成された放射性同位元素で標識されたRNAプローブを、更に精製することなく、プレハイブリダイゼーション溶液に、直接添加する。
【０２１９】
cDNAアレイ分析  標識されたプローブは、無数のcDNAアレイプラットフォームと組合わせる発現プロファイリングを含む、様々な下流の適用に使用することができる。本発明者らは、典型的にはTC RNA増幅と組合わせた単独細胞のマイクロダイセッションを利用し、マウス脳及びヒト剖検脳組織中の神経変性に関連したパラダイムの分析のための(220-384)cDNA及びESTからなる特別デザインしたcDNAアレイへハイブリダイズする(Ginsbergら、1999；Ginsbergら、1999；Ginsbergら、2000)。詳細に述べると、プラスミド調製物から精製した線状cDNAの1μgを、高-密度ニトロセルロースを用いて、アレイに接着する(Hybond XL、Amersham Biosciences社)。特別デザインしたcDNAアレイ上の各cDNA/ESTは、制限消化及び配列解析により証明される。マウス、ラット、及びヒトのクローンを、これらのアレイ上で連続して用いる。アレイは、6X SSPE、5Xデンハルト溶液、50％ホルムアミド、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、及び変性したサケ精子DNA(200μg/ml)からなる溶液中で、焼き肉用(rotisserie)炉中42℃で、プレハイブリダイズし(12時間)、かつハイブリダイズする(48時間)(Ginsbergら、2001；Ginsbergら、2000；Ginsbergら、1999)。ハイブリダイゼーション後、アレイを、2X SSC/0.1％SDS、0.5X SSC/0.1％SDS及び0.1X SSC/0.1％SDSで、各々20分間、42℃で、順次洗浄する。TCハイブリダイゼーションシグナル強度を、リン光画像形成により検出する。各線状cDNAに結合したTC増幅したRNAの比シグナル強度(空ベクターpBsを用いるバックグラウンドを差し引く)を、アレイの総ハイブリダイゼーションシグナル強度の比として表わし、これによりプローブの比活性及び存在するプローブの絶対量の差異に起因した変動を最小化する。この方法で解析したデータは、mRNAレベルの絶対量はもたらさないが、mRNAレベルの相対的変化の発現プロファイルは作成する。個々のmRNAの相対変化は、個々の比較についての後ろ向き(post-hoc)解析(Newman-Keuls検定)によりANOVAを用いて分析される。更に示差的に発現された遺伝子は、多変量調和(coordinate)遺伝子発現解析のために、機能タンパク質の範疇にクラスター化される。
【０２２０】
TCは再現可能な線形RNA増幅を提供する  TC法のRNA種を増幅する能力を評価するために、収量及びサイズ分布のプロファイルを、RNA6000 LabChip(Agilent Technologies社)を用いる、生体解析(2100 Bioanalyzer、Agilent Technologies社)により推定する。このアッセイは、電気泳動分離及びRNAプロファイル検出のために、キャピラリー装置及び高感度の蛍光RNA色素を使用する。市販の7.5Kbの精製した対照ポリ(A+)(Invitrogen社)の使用により、高度に再現可能な頑丈な線形の増幅が、明らかにされた(図9C)。出発鋳型として対照ポリ(A+)mRNAのアリコートを使用する増幅の調和解析(n=6；3つ組2回の一連の試行)は、r2=0.97であり、同じく高レベルの再現可能性を示している。およそ2500〜3000倍の増幅効率(生体解析を用いて推定される)が、対照ポリ(A+)mRNAにより明らかになる。およそ1000〜1500倍の増幅は、剖検海馬及び前脳基底部を含む様々な脳給源から抽出されたRNAの生体試料を用いて明らかになる(図10A)。RNA増幅効率は、RNA抽出の方法とは無関係のように見え、通常のフェノール:クロロホルム抽出及び半自動磁気ビーズ抽出は両方とも、その後のTC RNA増幅のための高品質の転写産物を生じる(図10B)。加えて、分散プロットは、特別デザインしたcDNAアレイ上での全cDNAクローン(n=96)及び個別のクローン(CREBが示される)の、TC RNA投入濃度と平均ハイブリダイゼーションシグナル強度の間の線形の関係を明らかにしている(図10C)。これらの知見は、aRNA増幅法(Ginsbergら、2000)を用いこの群により得られた線形のデータに厳密に類似している。
【０２２１】
TCは増大した感度を有する  TC RNA増幅法は、1ラウンドの増幅後に、頑丈な及び再現可能なハイブリダイゼーションシグナル強度を生じる。低いハイブリダイゼーションシグナル強度を持つ遺伝子の検出閾値も、大きく増大される。例えば、通常のaRNAを用いて検出に限界があるようないくつかの遺伝子は、TC法により容易に観察することができる(図11A)。全体で、正規化したハイブリダイゼーションシグナル強度のおよそ3.5〜4倍の増加が、特別デザインしたcDNAアレイにおいて認められる(図11B)。重要なことは、増大した感度は、比較的余り豊富でない遺伝子について最大であるように見えることである(図11A)。比較的高いハイブリダイゼーションシグナル強度を持つ遺伝子は、通常のaRNA法とほぼ同じ正規化されたシグナル値を有する。この高度に発現された遺伝子の明らかな漸近線(asymptote)は、TC RNA増幅法を用いる全ての遺伝子の総ハイブリダイゼーションシグナル強度の全体の増加により、容易に説明することができる。従って、正規化のための分母は、より大きくなり、かつ正規化されたシグナル値は、少なく発現された遺伝子について大きくなり、かつ高度に発現された遺伝子はほぼ同じであり続ける。
【０２２２】
TCは様々な組織給源において有効である  TC法は、組織全体に加え、パラフィン包埋した剖検後海馬のような固定された領域において作用することが示されている(図10A；レーン1〜2)。更に、レーザー捕獲マイクロダイセッション又は微量吸引により得られた単独の細胞及び単独細胞の集団を、1ラウンドの増幅に使用することができる (図10A；レーン3〜5)。個々の細胞は、様々な組織化学的染色液(例えば、クレシルバイオレット、チオニン、ヘマトキシリン及びエオシンなど)に加え、免疫組織化学的方法を用い、パラフィン包埋された組織に加え、固定され凍結され切片作成された組織において同定することができる。
【０２２３】
TCは、「アンチセンス」及び「センス」方向の増幅を可能にする  バクテリオファージ転写プロモーターは、通常の方法同様に、ポリd(T)-プロモーターにより、ポリ(A+)尾部のハイブリダイゼーションによりmRNAの3'側に結合した、又はいずれかの遺伝的シグナルの線形の増幅を起動し、もしくは転写プロモーターは、TC法を用い、センス方向のRNA合成を指示することにより、転写産物の5'末端に結合することができる。今日、3'及び5'側TC RNA増幅反応間の総ハイブリダイゼーションシグナル強度において、全般的量的差異は検出されない(図11B)。しかし個々の遺伝子は、示差的に発現されることが同定されている。例えば、神経線維遺伝子NF-M及びNE-Hは、正常なヒト海馬に由来する単独の神経線維-免疫反応性CA1錐体路神経を用い、5'側TC RNA増幅と比べ、3'側TC増幅において相対的増加を示している(表5)。
【０２２４】
（表５）特別にデザインされたcDNAアレイ(230個のcDNA)と組合わせた3'及び5'側TC RNA増幅を使用する、成人脳(N=5脳；5CA1神経細胞小片)由来の個々の神経線維-免疫反応性CA1錐体路神経(N=25)の遺伝子発現解析
A. 3'及び5'側TC RNA増幅法の間で変動しない転写産物のクラス：
アセチルコリン／合成(14)、アルツハイマー病関連遺伝子(n=16)、カテコールアミン合成／輸送体(10)、細胞死／転写アクチベーター(n=15)、細胞骨格エレメント(n=20)、ドパミン受容体／合成(n=8)、GABA受容体／合成(n=15)、神経膠が豊富なタンパク質(n=7)、グルタミン酸受容体／相互作用するタンパク質(n=24)、ホスファターゼ／キナーゼ(n=21)、神経ペプチド(15)、ニューロトロフィン／ニューロトロフィン受容体(n=12)、シナプス／小胞タンパク質(n=16)、カリウム／ナトリウムチャネル(n=14)、及びその他(n=6)。
B. 5'側TC RNA増幅と比べ3'側TC RNA増幅後に、有意に高いハイブリダイゼーションシグナル強度を有するcDNA(n=7)は以下である：fos B、G1uR3、KA2、Kv 1.2、NF-M、NF-H、及びネスチン。
C. 3'側TC RNA増幅と比べ5'側TC RNA増幅後に、有意に高いハイブリダイゼーションシグナル強度を有するcDNA(n=6)は以下である：αCAMKII、D2、GABA Aα1、GABA Aγ3、nAch rα1、及びnAch rα7。
【０２２５】
対照的に、ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットnAchr α1及びnAchr α7は、3'側TC RNA増幅に対し5'側TC増幅において相対的増加を示す。従って、個々の遺伝子及び／又はcDNA/ESTのハイブリダイゼーションシグナル強度は、3'及び5'側TC RNA増幅の間で異なることができ、更にmRNAの総集団は同様の発現レベルを有し、このことは相対的に同等のシグナル検出効率を示している。
【０２２６】
転写産物の5'領域へのTCプライマーアニーリングの機序  本発明の具体的態様において、TCプライマーの優先的に転写産物の5'領域にアニーリングする能力に関する機序があり、これは剖検ヒト脳及びマウス脳を含む、様々な脳組織給源由来の遺伝子の5'領域を評価するために、クローニングを用いて研究された。具体的態様において、Cの(又はGの)スパンを伴うTCプライマーは、CpGアイランド内に優先的にアニーリングする。CpGアイランドとは、遺伝子の5'末端を含む傾向があるゲノムのメチル化されないGCリッチな領域である。推定上は、全ヒト遺伝子の60％を上回るもの(upward)が、CpGアイランドの近傍に配置されることを示唆している(Antequeraら、1993；Crossら、1999)。遺伝子の5'領域を含む領域にアニーリングすることにより、TCプライマーは、遺伝子集団全体の増幅の最大の公算を生じる可能性があり、これはTC RNA増幅後の巨大な転写産物長(図9及び10)並びにcDNAアレイを使用する高い感度及びハイブリダイゼーションシグナル強度(図11)を説明している。
【０２２７】
従って、本実施例において示されたように、遺伝子プロファイリングは、複数の遺伝子の発現を同時に試験するための強力な道具である。このパラダイムは、疾患の病態生理学の価値のある洞察、診断の道具及び新規薬物療法的介入の開発のための指針を提供することができる。しかし遺伝子プロファイリング技術の最も有効な適用に関するひとつの重大な障害は、その後の下流の遺伝子分析に関して少量の試料の利用が比較的困難であることである。レーザー捕獲マイクロダイセクション(Emmert-Buckら、1996；Bonnerら、1997)及び単細胞微量吸引(Ginsbergら、2001；Hembyら、2001)のような技術の開発は、インビトロ及びインビボにおける、単独細胞に加え、均質細胞のクラスターを含む、極微量の出発材料のアクセスを可能にしている。しかし、RNA増幅手法は、cDNAマイクロアレイプラットフォームのための有意なハイブリダイゼーションシグナル強度を作成するための必要要件である。PCRは、この用途には適しておらず、その理由は、指数関数的増幅は、遺伝子プロファイリングに重要なパラメータである、発現された遺伝子間の最適な量的相関関係を保持することができないからである。TC RNA増幅法は、遺伝的シグナルを増幅することに加え、発現された遺伝子間の量的相関関係を保持することの両方の必要要件に合致するプロトコールである。本質的に、TC法は、インビトロRNA転写により、遺伝子シグナルを段階的に増幅する。従って、転写産物は、線形の形で増幅され、増幅された遺伝子間に最初の量的相関関係(複数)を保持することができる。従来のRNA増幅法と比べ、TC法はより頑丈な(およそ3.5〜4倍強いシグナル強度)及び有意に少ない労力(この手法はほぼ2日で完了する)である。
【０２２８】
TC RNA増幅法の重要な構成要素は、高効率での第二鎖cDNA合成である。伝統的に、この段階は、第一鎖cDNAの5'配列が不明である場合は不充分である。これらの条件下において、配列-特異的プライマーは、第二鎖合成をプライミングするように作成される。従って、自己-プライミング又は交換のいずれかの戦略による配列特異的でないプライマーの作成を使用している。対照的に、TC法は、合成された第一鎖cDNAの3'側の公知の配列のオリゴヌクレオチドプライマーに結合し、その結果第二鎖合成のプライミングのための特異的配列プラットフォームを提供している。大半のmRNA増幅手法のように、TC法の第一鎖合成は、ポリd(T)オリゴヌクレオチドプライマーによりプライミングされる。しかし逆転写後、第二の(TC)プライマーの存在と共に、逆転写酵素は、第二のプライマーを鋳型として用いるDNA合成を継続する。従って、合成された第一鎖cDNAは、第二の(TC)プライマーに相補的である3'末端にオリゴヌクレオチドの短いひと続きを有するであろう。このパラダイムは、第一鎖cDNA(5'末端で)の突出した3'配列に関する知識をもたらし、その結果特異的オリゴヌクレオチドは、第二鎖cDNAの合成をプライミングするように作用する。第二の(TC)プライマーの本質的構造要件は、第二のプライマーの3'側でのシトシン又はグアノシンの短いひと続きである。シトシン及びグアノシンのアデニン又はチミジンとの交換は、第二のプライマーの末端連結作用を大きく消滅する。
【０２２９】
具体的態様において、第二のプライマーは、DNA合成を継続するための短い鋳型を提供するために、逆転写反応の終結部位に、相補的C又はGと塩基対形成する。いくつかの可能性のある配置は、この相補的相互作用が生じることに関与している。例えば、逆転写酵素反応は、2、3個のd(C)を非特異的にmRNA鋳型の末端に加えるであろう。d(C)及びd(G)の両方が、TCプライマーオリゴヌクレオチド配列と塩基対形成し得る逆転写酵素活性により追加されることが観察される。しかし本結果を基に、mRNA内のC及びGの短いひと続きは同じく、第二のプライマーの3'末端でG及びCと塩基対形成することができ、その結果適当な条件下での逆転写のための連続的鋳型プラットフォームを提供する。CG-リッチなCpGアイランドの短い領域は、全てのヒト遺伝子のおよそ60％の5'領域で優勢であり、かつゲノム残余を通して有意に少ない頻度であることが認められている(CpGは、推定されるよりも25％少ない頻度である)(Antequeraら、1993；Crossら、1999；Birdら、1987)。CpGアイランドは、それによりTCプライマーが優先的にアニーリングする部位を表わすことができ、かつRNA増幅手法の間に合成される長い転写産物を説明するであろう。更に、G又はCのA又はTとの交換は、TCプライマーの効力をほとんど完全に失わせるであろう。加えて、A及びTのmRNA中の相補的T及びAとのランダム塩基対形成は、第一鎖cDNAの作成に必須である適切な逆転写プロセスを妨害することがある。
【０２３０】
この一連の結果は、主にヒトの剖検標本及び神経変性の動物モデルから得た脳組織に由来している。脳は、過剰な細胞型及び領域の複雑な連結性のために、1個の細胞RNAの探索的研究に関する明白な部位である。しかし、TC RNA増幅法は、はるかに広範な用途がある。実際にインビボ又はインビトロの設定を、TC RNA増幅及びそれに続く下流の遺伝子分析に使用することができる。研究分野は、癌生物学、発生、筋骨格、及びその他の無限のRNA給源を含むが、これらに限定されるものではない。現在の組織給源は、ヒト、サル、ラット及びマウス組織を含み、かつ他の給源は研究中である。この必要要件は、3'末端でポリアデニル化されること(標準RNA増幅と違いはない)及び5'領域でのC又はGの伸長(CpGアイランド又は他の構造のいずれかを通じて)であるように思われる。
【０２３１】
従って、TC RNA増幅は、その後のマイクロアレイ又はプロテオームベースの分析のために、極微量のmRNAを増幅する技術的手段を提供する。考えられる限りでは、合成されたRNAの下流の用途は拡大し、かつRNAの方向は、必要に応じて選択することができる。例えば、アンチセンス方向は、プラスミド-デザインしたcDNAマイクロアレイ分析のために選択することができるのに対し、センス方向は、ライブラリー構築又は下流のプロテオーム用途及びオリゴヌクレオチド-ベースのマイクロアレイプラットフォーム用の転写のために選択することができる。
【０２３２】
実施例8：RNA増幅のため末端連結を使用する1個のマウス歯状回顆粒細胞のcDNAマイクロアレイ
本実施例において、下流のRNA増幅のための末端連結の効率は、シナプス可塑性及び損傷後の神経細胞リモデリングに関連した個々の神経細胞遺伝子発現の研究を可能にする。本実施例においては、成体マウスの歯状回顆粒細胞におけるシナプス及び樹状細胞再組織化を生じるために、下記のふたつのパラダイム的方法が利用される：一側性穿孔経路(PP)の横断及びカイニン酸(KA)の脳内注入。
【０２３３】
PP又はKAによる損傷後、RNAを、損傷から間をおかずに(損傷後1〜5日目)、損傷後時間がたって(損傷後10〜90日目)、並びに損傷せずに(対照)単離した。PP又はKAは、成体C57BL/6マウスに行った。組織学検査を、これらのマウスの脳切片について行い、シナプス及び樹状細胞が再組織化しているマウス歯状回顆粒細胞を同定した。1個の細胞を、単独細胞マイクロダイセクションを用い、組織切片スライドからマイクロダイセクションした(図6)。関心のある細胞は、顕微鏡により同定し、かつ微量吸引装置により回収した(図12)。引き続きRNAを、標準技術を用い単離した。その後単独細胞のRNAを、末端連結法を用いて増幅した(図3)。
【０２３４】
増幅したRNAを用い、cDNAマイクロアレイプローブを作成し、高-密度(〜8,4OOEST)及び特別デザインした(＞225個のcDNA)cDNAアレイプラットフォームをスクリーニングした。図13の結果は、PP横断及びKA注入の両方の後のGluR1、GluR2、GluR6及びGluR7受容体サブユニットの有意なダウンレギュレーションを示している。これらの発現プロファイリングは、シナプス及び樹状細胞の変化に関する初期のバイオマーカーを提供し、並びに薬物療法による介入の新規標的を明らかにすることができる。
【０２３５】
実施例9：RNA増幅のために末梢連結を使用するコリン作用性前脳基底部神経細胞の単一細胞及び領域的cDNAマイクロアレイ分析
本発明の末端連結は、大量の出発材料中の単独の遺伝子又はタンパク質について評価を試みることが困難である海馬を試験するための、正確な組織マイクロダイセクション、RNA増幅、及び発現プロファイリングの組合せを可能にする。この実施例において、第一の目標は、薬物療法による介入ためにアルツハイマー病(AD)の病理進行において早期に脆弱な細胞型における遺伝子調節を評価するための、発現プロファイリング法の利用であった。
【０２３６】
RNAは、コリン作用性前脳基底部(CBF)の様々な部分体(subfield)から収集した個々の神経細胞から単離した。認知障害のない(NCI)対象又はアルツハイマー病(AD)の対象のいずれかの剖検標本から、CBFの部分体からコリン作用性神経細胞を得た。
【０２３７】
コリン作用性前脳基底部組織は、切片作成しかつ固定した。組織学的染色を行い、切片を鏡検し、関心のある細胞又は細胞／領域を同定した。こうして個々のコリン作用性神経細胞を同定し、かつ単独細胞のマイクロダイセクション細胞吸引法を用いて単離した(図12)。
【０２３８】
RNAを、末端連結法を用いて増幅し(図3)、かつ引き続きcDNAを、増幅したRNAを鋳型として用いて十分量合成した。NCI対象又はAD対象から得たcDNAを用い、特別デザインしたcDNAマイクロアレイ及びこれらのマイクロアレイと共に使用するプローブを作出した。このような単独細胞分析は、ニュートロフィン受容体、タンパク質リン酸化酵素及びキナーゼ、並びにシナプスマーカー(シナプシンI、シナプトフィシン、シナプトタグミン、シナプトブレビン、SNAP-29、図14)を含む転写産物の関連のあるクラスにおける、NCI及びAD対象間の変化を明らかにした。図14において、シナプスマーカーの発現は、アルツハイマー病対象から回収された細胞において、有意に低下していた。これらの研究は、AD及び関連した痴呆疾患の病理進行の早期バイオマーカー及び機序を定義する一助となるような、神経変性に対し脆弱な細胞の新規領域及び単独の細胞分子の指紋を提供した。
【０２３９】
実施例10：末端連結RNA増幅を使用する皮質神経細胞のマイクロダイセクションからの遺伝子発現のプロファイリング
小児期の難治性痙攣は、細胞の神経病理に関連することが多い。例えば、微細な形成異常(microdysgenesis)を生じる神経細胞移動異常は、共通の特徴である。微細な形成異常の神経細胞の遺伝子発現を、末端連結を基にしたRNA増幅、マイクロダイセクション及びマイクロアレイ分析を使用し、作成した。
【０２４０】
微細な形成異常の神経細胞を、難治性痙攣障害を伴う小児の側頭皮質の生検標本切除により入手した。痙攣を制御するために、癇癪性病巣は外科的に除去した。切除された組織の神経病理学的観察は、側頭皮質に加え神経節膠腫内に広範な微細な形成異常を示した。
【０２４１】
形成異常な(dysgenic)側頭皮質由来の組織は、承認された外科的標準手法に従い切除し、かつ更に神経病理学的分析のために処理した。薄いパラフィン切片を、抗-NeuN抗体により免疫組織化学的に染色し、神経細胞局在を明らかにした。互いに直接接触していることを明らかにした異常な神経細胞(「クラスター化された神経細胞」)は、レーザー捕獲マイクロダイセクション細胞吸引法を用いて単離した(図6)。レーザー捕獲マイクロダイセクション(LCM)は、顕微鏡を基本とした計測器を使用する(図15)。本質的に、関心のある細胞は、LCM装置の顕微鏡部品を用いて同定され、次にこれらの細胞は、赤外又は紫外のいずれかのレーザーの使用により(セクションA、図12)マイクロフュージキャップ又は膜のいずれかに(セクションB、図12)移される。正常な神経細胞(非-クラスター化)も、対照として使用するために、皮質領域の周囲及び隣接部から単離した。
【０２４２】
末端連結を基本としたRNA増幅を、神経変性及び脳機能に関連している200個を超える遺伝子の同時分析のために特別デザインしたcDNAアレイと組合わせて行った。「クラスター化された」神経細胞5対及び「クラスター化されない」対照神経細胞5対を、96個のブロット遺伝子アレイによる分析のために処理した。予想されたように、遺伝子発現レベルの劇的範囲が、試験した207種の遺伝子にわたり観察された。予備的結果は、個別の細胞経路に由来した遺伝子のいくつかのサブセットが、クラスター化された細胞とクラスター化されない細胞の間で、示差的に調節されたことを示した。これらのデータは、移動性及び痙攣疾患の分子病態生理学の研究に関連しているであろう、ヒト生検標本からの微細な形成異常の細胞の最初の分子指紋を提供した。
【０２４３】
実施例11：示差的に染色した隣接組織の遺伝子発現分析
図16は、異なる染色液で染色した、同一人物の海馬からの、一連の隣接する6μm-厚さの組織切片(パラフィン包埋、150mM塩化ナトリウムを含有する70％エタノール緩衝液)からの遺伝子発現プロファイリングを示している。これらのアレイは全て付随するように合成し、かつRNA増幅は同時に行った。異なる染色条件から吸引した組織を用い、検出可能な明らかな差異はなかった。
【０２４４】
ニッスル染色：クレシルバイオレット：
1.  スライドの脱パラフィン及びddH2Oへの水和(キシレン2x5分間、100％EtOH 2x1分間、95％、80％、70％ddH2Oを各々1分間)。
2.  濾過した1％クレシルバイオレット中に2分間の切片浸漬。
3.  細胞体のみが可視化されかつバックグラウンドが低くなるまでの、95％EtOH中での切片の識別。各スライドのバックグラウンドレベルは、段階4以前に顕微鏡によりチェック。
4.  切片の100％EtOH中へ30分間の浸漬。
【０２４５】
ヘマトキシリン及びエオシン染色：
1.  スライドの脱パラフィン及びddH2Oへの水和(キシレン2x5分間、100％EtOH 2x1分間、95％、80％、70％ddH2Oを各々1分間)。
2.  濾過した希釈していないヘマトキシリン(Gills #2)中に1分間の切片浸漬、及びddH2Oによる洗浄。
3.  1％炭酸リチウム中へのおよそ30秒間の浸漬、及びddH2Oによる洗浄。
4.  切片の1％エオシン溶液中へ1分間の浸漬、及び80％EtOH中での識別、及びddH2Oによる洗浄。
【０２４６】
アクリジンオレンジ染色：
1.  スライドの脱パラフィン及びddH2Oへの水和(キシレン2x5分間、100％EtOH 2x1分間、95％、80％、70％ddH2Oを各々1分間)。
2.  0.2M二塩基性リン酸ナトリウム／0.1Mクエン酸(SC緩衝液；pH4.0)溶液中に5分間の切片浸漬。
3.  アクリジンオレンジ溶液(SC緩衝液中10μg/ml)中15分間の切片浸漬。
4.  切片のSC緩衝液(3x1分間)による洗浄、及び切片のリン酸-緩衝した生理食塩水(PBS；0.12M；pH7.4)を溶媒とする50％エタノール中への2分間の浸漬。
【０２４７】
図16において、ニッスル染色液は、クレシルバイオレット及びチオニンを含有し、かつH&Eは、ヘマトキシリン及びエオシンを意味する。神経線維切片は、当該技術分野において標準の方法により、神経線維に対する抗体を用い染色した。
【０２４８】
実施例12：異なる染色液を用いた総シグナル強度の比較
本発明の方法を、抗体(神経線維、NF)及び組織学的染色液(クレシルバイオレット、CV)により染色した隣接切片を比較するために利用した(図17)。アレイ(220個のcDNA)上の総ハイブリダイゼーションシグナル強度は、平均と標準偏差で示した。抗体、対、組織学的に染色した切片において、有意差は認められず、特にクレシルバイオレットは、例えばプライマーによりRNAをアクセス不能にすることはなかった。
【０２４９】
アレイは、高-密度ニトロセルロース、96ウェルスロットブロット装置、及び12-チャネルマイクロピペッターを用いて作成した。プラスミド調製物から精製した線状化されたcDNAの1μgを、ニトロセルロース膜に最終容量50μlで付着した。特異的亜群に相当するcDNAクローン／EST(およそ220)は、以下を含む：グルタミン酸受容体／輸送体(n=22)、グルタミン酸受容体相互作用タンパク質(n=6)、シナプス／小胞タンパク質(n=10)、即時型／細胞死遺伝子(n=19)、GABA合成／受容体／輸送体(n=17)、細胞骨格エレメント(n=45)、タンパク質リン酸化酵素／キナーゼ(n=23)、ニュートロフィン／ニュートロフィン受容体(n=12)、AD-関連した遺伝子(n=12)、カルシウム結合タンパク質／カルシウムチャネル(n=7)、グリア／小グリアが濃厚化されたマーカー(n=6)、モノアミン合成／輸送体(n=7)、ドパミン受容体／輸送体(n=6)、神経ペプチド／神経ペプチド受容体(n=15)、アセチルコリン合成／受容体(n=15)、カリウム／ナトリウムチャネル(n=11)、陽性対照(n=2)、陰性対照(n=2)、その他(n=15)。特別デザインしたcDNAアレイ上の各cDNA/ESTは、制限消化及び配列分析により証明される。アレイは、6X SSPE、5Xデンハルト溶液、50％ホルムアミド、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、及び変性したサケ精子DNA(200μg/ml)から成る溶液中において、焼き肉用炉において、42℃で、プレハイブリダイズし(12時間)、かつハイブリダイズする(48時間)。ハイブリダイゼーション後、アレイを、2X SSC／0.1％SDS、0.5X SSC／0.1％SDS及び0.1X SSC／0.1％SDSで、各20分間、42℃で順次洗浄する。aRNAハイブリダイゼーションシグナル強度は、リン光画像形成により検出する。空のベクターpBs(アレイ上に二重スポットした)のハイブリダイゼーションシグナル強度を、バックグラウンドを確定するために使用する。各線状化されたcDNAに結合したaRNAの比シグナル強度(バックグラウンドを減算)は、アレイの総ハイブリダイゼーションシグナル強度の比として表わし、これによりプローブの比活性の差異及び存在するプローブの絶対量に起因した変動を最小化した。この方法で解析したデータは、mRNAレベルの絶対的定量はもたらさないが、mRNAレベルの相対変化の発現プロファイルは作成する。個々のmRNAの相対変化は、個々の比較に関する後ろ向き解析(Newman-Keuls検定)によるANOVAを用い解析する。
【０２５０】
参考文献
下記参考文献は、本明細書に示したものを補足する例証的手法又は他の詳細を提供する程に、詳細に本明細書に参照として組入れられている。
特許文献
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2004527236.tif 000030
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刊行物
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【０２５１】
当業者には、好ましいプロトコールにおける第一及び第二のプライマーの配列の修飾のような、若干の修飾は、差し引きcDNAライブラリー、及び発現ライブラリーの構築のような、増幅されたRNA集団の拡大された用途につながり得ることは、明らかであろう。従って、本明細書において説明された実施例及び態様は、例証のみを目的としていること、及びそれに関し様々な修飾又は変更が、当業者により示唆され、かつ本明細書の精神及び範囲並びに「特許請求の範囲」に含まれることは理解されなければならない。
【０２５２】
当業者は、本特許となる発明は、目的の実行によく適合されること、並びにその固有のものに加え言及された目的及び利点を得ることを容易に理解するであろう。本明細書に説明した方法、手法、技術及びキットは、好ましい態様を現在代表するものであり、例示を意図し、範囲を限定することは意図していない。本発明の精神に包含されるかもしくは添付される定義される「特許請求の範囲」により定義されるそれらの変更及び他の使用は、当業者に思い浮かぶであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２５３】
下記図面は、本明細書の一部をなし、かつ本発明のある局面を更に明らかにするために含まれる。本発明は、1個又は複数のこれらの図面を、本明細書に示された具体的態様の詳細な説明と共に参照することにより、より良く理解されるであろう。
【図１】T7プロモーターのmRNAの3'領域への結合、及び末端連結の機序を説明している、本発明の方法の概略的まとめである。
【図２】T7プロモーターのmRNAの5'領域への結合、及び末端連結の機序を説明している、本発明の方法の概略的まとめである。
【図３】T7プロモーターのmRNAの5'領域への結合、及びSP6プロモーターの3'領域への結合、及び末端連結の機序を説明している、本発明の方法の概略的まとめである。
【図４】cDNAライブラリー構築を基にしたRNA増幅の概略を示す。
【図５】組織学的に染色された試料由来のRNAの検出に関する方法の概略的まとめを例示している。
【図６】組織切片からの細胞の微量解離を示している。個々の細胞は、マイクロマニピュレータの誘導下で、マイクロピペットにより微量解離されている。細胞は、マイクロピペットの先端に物理的に結合されているか(図に示すように)、又は液体が充填されたピペットチップに吸引されている。レーザー捕獲マイクロダイセクションも、スライドガラス又はカバースリップに付着された組織切片から1個又は複数の細胞を単離するために使用することができる。
【図７】本発明の方法を用いた、正常(NCI)組織及びアルツハイマー病(AD)組織の発現プロフィールを示している。
【図８】本発明の方法、対、当該技術分野のaRNA法による、同じ組織からのふたつの隣接領域の様々な遺伝子の増幅及び検出を示している。本発明の新規方法を用いた、低、中及び高度に発現している遺伝子の相対ハイブリダイゼーションシグナル強度は、当該技術分野において公知のaRNA法と比べ、改善された。
【図９】図9Aから9Cは、本発明の方法を示している。図9A及び9Bは、本方法を概略的に例示している。図9Cは、頑丈な線形の増幅を示している。
【図１０】図10Aから1OCは、本発明の方法による増幅を示している。図10Aは、剖検された海馬及び前脳基底部を含む様々な脳給源から抽出されたRNAの生物学的試料を利用している。図10Bは、異なる抽出法の比較を示している。図10Cは、線形の関係を明らかにしている、TC RNA投入濃度と、特別にデザインしたcDNAアレイ上の全cDNAクローン及び個々のクローン(CREB)の平均ハイブリダイゼーションシグナル強度との間の散布プロットを示している。
【図１１】図11A及び11Bは、本発明の方法が、低ハイブリダイゼーションシグナル強度を有する遺伝子の検出閾値について増大した感度を有することを示している。図11Aは、豊富さが比較的低い遺伝子について増大した感度を示すドットブロットアッセイを示している。図11Bは、特別デザインしたcDNAアレイの合計の正規化したハイブリダイゼーションシグナルの量を示す。
【図１２】実施例1で説明したマウス歯状回顆粒細胞の微量解離時の顕微鏡野を示す。フレームB及びCの矢印は、単独細胞を除去する吸引装置を示している。
【図１３】実施例8のマイクロアレイ発現データを示す。上側パネルは、GluR1、R2、R3、R4、R6及びR7遺伝子のmRNA発現の代表的未加工(raw)のマイクロアレイ生データを示す。ビヒクルは、陰性対照実験であり、かつKA 1DPL及びKA 5DPLは、カイニン酸の脳内注入を用いるふたつの異なる実験である。下側パネルは、複数の実験からのmRNA発現レベルの平均を示している。
【図１４】実施例9のマイクロアレイ発現データを表わしている。上側パネルは、認知障害を伴わない(NCI)又はアルツハイマー病(AD)のいずれかである対象の神経細胞からのシナプスマーカー遺伝子のmRNA発現の代表的マイクロアレイデータを示している。下側パネルは、複数回の実験から得たこれらの遺伝子の平均mRNA発現レベルを示している。
【図１５】LCMに使用した装置の概略を示している。セクションAにおいて、細胞は、顕微鏡を通して単離されていることが確定される。次にこれらの標的化された細胞は、紫外線又は赤外線レーザービームによる組織からの分離のためにプライミングされる。マイクロフュージキャップ又は膜のいずれかに結合した転写フィルムを、除去のために関心のある細胞(複数)に接着する。次に関心のある細胞(複数)を含むマイクロフュージキャップ又は膜を、装置から取り外す。セクションBは、細胞の転写に寄与する装置の一部を示している。
【図１６】隣接組織切片の、異なる組織化学的染色による、本発明の方法の比較を示す。
【図１７】本発明の方法を用いる、抗体により(神経線維)及び組織学的に(クレシルバイオレット)染色された隣接切片からの総シグナル強度についての定量解析である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際公開パンフレット】
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2004527236.tif 000177
2004527236.tif 000178
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004527236.tif 000179
2004527236.tif 000180
【国際調査報告】
2004527236.tif 000181