(57)【要約】２つ以上の微生物の菌株の新規な混合培地であって、前記混合培地に含まれる前記微生物の菌株の少なくとも１つが酵素的経路の一部を実施する能力に基づいて個別に選択され、前記２つ以上の微生物の菌株が希望するフレーバ化合物に関する完全な経路を一緒に形成する前記混合培地が提供される。好ましくは、混合培地は、ヨーグルト又はチーズのような醗酵製品又はソーセージの生成のための培地である。前記２つ以上の微生物の菌株は、好ましくは共培養される。特に好ましい実施態様は、種々のラクトコッカス属の菌株の組み合わせ及びブレビバクテリウム属の菌株とブドウ球菌属の菌株のそれぞれの組み合わせを含むチーズの製造のためのスタータ培地である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つ以上の微生物の菌株の混合培地であって、前記混合培地に含まれる前記微生物の菌株の少なくとも１つが酵素的経路の一部を実施する能力に基づいて個別に選択され、前記２つ以上の微生物の菌株が希望するフレーバ化合物に関する完全な経路を一緒に形成することを特徴とする前記混合培地。
【請求項２】
高められた、又は特製のフレーバ形成により、乳製品の製造において使用する培地であって、前記微生物の菌株の少なくとも１つは、個々には、希望するフレーバを形成する範囲でアミノ酸を揮発性化合物に変換する能力が少なく、又は変換することができないが、一緒に使用した場合に、希望するフレーバを与える適切な条件下で、１つ以上のアミノ酸を揮発性化合物に変換する、請求項１に記載の混合培地。
【請求項３】
さらに、前記希望するフレーバ化合物への代謝経路に関係しない最適な１つ以上の別の微生物の菌株又は材料を含む請求項１又は２に記載の混合培地。
【請求項４】
前記の少なくとも２つ以上の微生物の菌株が共培養される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の混合培地。
【請求項５】
前記の少なくとも２つ以上の微生物の菌株がラクトコッカス属、乳酸桿菌属、プロピオニバクテリウム属、連鎖球菌属、ブドウ球菌属、ビフィドバクテリウム属、アオカビ属、ブレビバクテリウム属、アースロバクター属、コリネバクテリウム属、サッカロミセス属及びデバリオマイセス属からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の混合培地。
【請求項６】
前記の少なくとも２つ以上の微生物がラクトコッカス属の菌株から選択される、請求項５に記載の混合培地。
【請求項７】
前記の少なくとも２つ以上の微生物の菌株がラクトコッカス属の菌株Ｂ１１５７及びラクトコッカス属の菌株ＳＫ１１０を含む、請求項６に記載の混合培地。
【請求項８】
ラクトコッカス属の菌株Ｂ１１５７とラクトコッカス属の菌株ＳＫ１１０との比が約１：５〜約５：１の範囲である、請求項７に記載の混合培地。
【請求項９】
前記の少なくとも２つ以上の微生物がブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウムカゼイ及びブドウ球菌属、特に腐生ブドウ球菌からなる群から選択される、請求項５に記載の混合培地。
【請求項１０】
前記の少なくとも２つ以上の前記微生物の菌株がブレビバクテリウムカゼイの菌株Ｂ１３９２及び腐生ブドウ球菌の菌株Ｂ１１４４を含む、請求項９に記載の混合培地。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の混合培地の調製方法であって、
希望するフレーバを形成する範囲で、個々には、１つ以上の酸を揮発性化合物に変換する能力の小さい、又は変換する能力のないが、一緒に使用した場合に、希望するフレーバを与える適切な条件下で、１つ以上のアミノ酸を揮発性化合物に変換する２つ以上の微生物の菌株を選択することを含み、
必要により、前記希望するフレーバ化合物への代謝経路に関係しない最適な１つ以上の別の微生物の菌株又は材料を加えることを含んでもよい前記調製方法。
【請求項１２】
食品、食品添加物及びフレーバ化合物の群から選択されるものの生成のための請求項１〜１０のいずれか一項に記載の混合培地の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、一般に、フレーバ生成物（特に、食品中の、又は食品に関する）及びチーズ、ヨーグルト及びソーセージのような醗酵食品の分野に関する。より詳細には、本発明は、スタータ培地として、乳酸菌のような種々の食品用微生物の培養によって、高められたチーズフレーバ生成のための方法及び手段に関する。
【０００２】
背景及び従来技術
微生物によるフレーバ発生は、本質的に微生物及び植物によって行われる酵素的プロセスである。菌類、酵母及び細菌のような種々の微生物では、それらの特異的なフレーバ生成を同定し、選択されている（Ｒ．Ｇ． Ｂｅｒｇｅｒ， １９９２， Ｂｉｏｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌａｖｏｕｒｓ ｐｐ．２１−３２， ｅｄｓ． Ｒ．Ｌ．Ｓ． Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ， Ｂ．Ｖ． Ｃｈａｒｌｗｏｏｄ， Ｇ． ＭａｃＬｅｏｄ及びＡ．Ａ． Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃ． Ｃｈｅｍ．， ＵＫ．を参照のこと）。これらのフレーバは、一連の酵素的段階を経て、増殖培地の化合物又は基質を１つ以上の特異的なフレーバ化合物に変換する微生物の能力により生じる。微生物により生成されたフレーバの市販製品は、通常、醗酵により、又は酪農食品又はソーセージのような食品中又は食品上のインサイツでの増殖により生じる。例えば、チーズの成熟の際、スタータ培地のタンパク質分解酵素はタンパク質の分解において重要な役割を果たす（Ｌａｗら， １９７４， Ｂｉｅ及びＳｊｏｓｔｒｏｍ １９７５ａ； Ｂｉｅ及びＳｊｏｓｔｒｏｍ １９７５ｂ）。タンパク質のこの分解は希望するフレーバの形成及び性質に重要であり、従ってタンパク質分解は広く研究されている（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ及びＣｏｏｌｂｅａｒ １９９３； Ｖｉｓｓｅｒ １９９３； Ｅｘｔｅｒｋａｔｅ及びＡｌｔｉｎｇ １９９５； Ｅｘｔｅｒｋａｔｅら １９９５； Ｌａｗ及びＭｕｌｈｏｌｌａｎｄ １９９５）。スタータ細菌のプロテイナーゼ及びペプチダーゼがカゼインからペプチド及び遊離アミノ酸を放出することが示されている（Ｏｌｓｏｎ １９９０； Ｖｉｓｓｅｒ １９９３； Ｅｎｇｅｌｓ及びＶｉｓｓｅｒ １９９４）。
【０００３】
チーズにおけるアミノ酸放出及びフレーバ形成の間の関係が長い間仮定されていた（Ｍｕｌｄｅｒ １９５２； Ｓｏｌｍｓ １９６９）。アミノ酸は、アルデヒド、酸、アルコール、エステル及び硫黄化合物のような揮発性の芳香化合物の前駆体として機能することによって、直接的に、又は間接的にフレーバに寄与する（Ｅｎｇｅｌｓ及びＶｉｓｓｅｒ １９９６）。近年、アミノ酸の揮発性（フレーバ）化合物への変換がフレーバ発生に繋がる成熟プロセスにおいて重要な役割を果たすことが明らかとなった。アミノ酸変換に関係する多くの酵素は種々のスタータ培地において同定されている（Ｓｃｈｍｉｄｔ及びＬｅｎｏｉｒ １９７４； Ｎａｋａｚａｗａら １９７７； Ｌｅｅ及びＲｉｃｈａｒｄ １９８４； Ｌｅｅら １９８５； Ａｌｔｉｎｇら １９９５； Ｙｖｏｎら １９９７； Ｙｖｏｎら １９９８）。一般に、これらの酵素は、脱アミノ化、アミノ基転移、脱炭酸及びアミノ酸側鎖の切断等の種々のタイプの反応にかかわる。アミノ酸の分解のある特定の一般的経路の調査がＨｅｍｍｅら １９８２により開示され、アミノ酸生成されたチーズの揮発性成分の例を示す以下の表を示すＥｎｇｅｌｓ １９９７により再現された。
【０００４】
【表１】表１
チーズの熟成中のアミノ酸分解により形成される生成物の例
2004501633.tif 000002
【０００５】
すべてのタイプのチーズに存在する乳酸菌（“ＬＡＢ”）はフレーバ化合物をアミノ酸から産生する際に主要な役割を果たす。ラクトコッカスにおいて、酸化的脱アミノ化又は脱炭酸がラクティス菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ）又はクレモリス菌（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）の幾つかの菌株において検出されなかったため、アミノ基転移が芳香族及び分枝鎖アミノ酸の変換における最初のステップである（Ｔｈｉｒｏｕｉｎら １９９５； Ｇａｏら １９９７； Ｙｖｏｎら １９９７； Ｅｎｇｅｌｓ １９９７； Ｅｎｇｅｌｓら ２０００）。最近、ＬＡＢにおける幾つかのトランスアミナーゼが同定され、特徴付けられている（Ｅｎｇｅｌｓ １９９７； Ｙｖｏｎら １９９７； Ｒｏｕｄｏｔ−Ａｌｇａｒｏｎ及びＹｖｏｎ １９９８； Ｇａｏ及びＳｔｅｅｌｅ １９９８； Ｒｉｊｎｅｎら １９９９； Ｙｖｏｎら １９９７）。アミノ酸のアミノ基転移によって産生されるα−ケト酸は、自発的な分解を受け（Ｇａｏら １９９７）、又は対応するアルデヒド又はカルボン酸に酵素的に分解される（Ｔｈｉｒｏｕｉｎら １９９５； Ｓｍｉｔら ２０００）。アミノ基転移反応はアミノトランスフェラーゼによって触媒され、アミノ酸のα−アミノ基をα−ケト酸受容体に変換する。
【０００６】
単一のスタータ培地に加えて、チーズの製造において混合スタータ培地を使用することが一般的な手法である。例えば、ラクトコッカス属の種の混合スタータ培地は、半硬質及び硬質タイプのチーズ（例えば、ゴーダチーズ、チェダーチーズ、ティルジット、サンパウリン（Ｓａｉｎｔ Ｐａｕｌｉｎ））の生成に通常使用される。マースダム（Ｍａａｓｄａｍｍｅｒ）タイプのチーズ（例えば、レールダム（Ｌｅｅｒｄａｍ））のためのプロピオン酸菌属（及びブルガリア菌）を有するラクトコッカス属、プルースディジ（Ｐｒｏｏｓｄｉｊ）タイプのチーズ（例えば、オールドアムステルダム（Ｏｌｄ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）、カンテナ（Ｃａｎｔｅｎａａｒ）、ミルナー（Ｍｉｌｎｅｒ））の調製のためのヘルベティカス（Ｌ． ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）及びサーモフィラス（Ｓ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）を有するラクトコッカス属の種、硬質タイプのチーズ（例えば、パルメザンチーズ、Ｍａｎｃｈｅｖｏ）を生成するためのラクトバシルスヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、アシドフィルス菌及びストレプトコッカスサーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の菌株、エメンタルチーズ及びグリュイエールチーズを生成するためのプロピオン酸菌属を有する同じ培地。さらに、表面熟成を有するチーズのために、例えばペニシリウムカマンベルチ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）（例えば、ブリーチーズ）、ロクフォールチ（Ｐ． ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｉ）（例えば、ロクフォールチーズ）及びレッドスメア（ｒｅｄ−ｓｍｅａｒ）チーズ（サンパウリン（Ｓａｉｎｔ Ｐａｕｌｉｎ）、ケルンヘムカース（Ｋｅｒｎｈｅｍ ｋａａｓ）、ティルジット等）のためのブレビバクテリウム属、デバロマイセス属（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）、ブドウ球菌属、アルスロバクター属及びコリネバクテリウム属の種のような追加の培地が使用される。そのような混合培地において、種々の相互作用が生じ、混合物の組成に影響を与えるだけでなく、フレーバ形成に影響を与える場合がある。培地に存在する酵素に応じて、最終フレーバをもたらすこれらの培地の多くの酵素の寄与によって、異なるフレーバが発生する。
【０００７】
培地の混合物を使用することは、チーズの製造（同様にその他の醗酵）において一般的な手順であるが、これらの培地は、従来、揮発性のフレーバ化合物の形成のための全代謝経路を増強するために選択されてはいなかった。その培地は、ファージ作用に対する感受性の抑制又は低減（ゴーダチーズの製造における一般的な手順）及びチーズの目の形成（例えば、マースダム（Ｍａａｓｄａｍｍｅｒ）、グリュイエールチーズ）のような理由で主に、実際に組み合わせられていた。いわゆるフレーバ形成菌株を有するチーズ（例えば、カマンベールチーズ、プルースディジ（Ｐｒｏｏｓｄｉｊ）チーズ、レッドスメア（ｒｅｄ−ｓｍｅａｒ）チーズ）の場合に、フレーバ形成補助培地が特定のフレーバを形成する能力で選択され、本発明の目的であるその他の使用される培地と一緒に経路を補充することには基づいて選択されていない。
【０００８】
ＤＥ １９９ ０３ ５３８には、中程度の風味及び改善された貯蔵特性を有するウォータケフィール（ｗａｔｅｒ ｋｅｆｉｒ）微生物からの代謝生成物の濃縮水溶液が記載されている。ケフィール微生物は、特に粒子として一緒に増殖する乳酸桿菌属及び酵母培地から分離するのが難しい種々の共生微生物を含む。この参考文献には、培地の個々の菌株により補完された代謝経路を生じる改善されたフレーバ特性を有する混合され、定義される微生物の培地からの生成物を開示も示唆もされていない。
【０００９】
ＥＰ ３５９ ２９５には、３３℃未満で最適成長を示す乳酸菌を含む中温性スタータ及びＡＰＳ１３である好熱性乳酸菌の培地の両方を使用するチーズの調製方法が開示されている。ＡＰＳ１３の使用は中温性培地単独では得られない特徴的なフレーバを生じた。さらに、この方法において、半硬質チーズの製造の技術は影響されない。この参考文献は新しい広範囲のフレーバプロファイルの生成を教示するが、本発明は、スタータ培地における菌株間の特異的な相互作用により、フレーバの配合に対してある特定のフレーバ成分を増加し、又は追加することによってより特異的な風味を増強することに関係している。
【００１０】
ＥＰ ０ ５２１ ３３１では、微生物の種子が少なくとも２つの異なる乳酸生成細菌の菌株を含む豆乳醗酵方法を開示し、その１つは、ヨーグルトのような食品を調製するためのラクトコッカスラクチススブスラクチスバルジアセチラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ ｖａｒ． ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）である。混合培地において特徴付けられる風味を増強する微生物の選択方法については教示されていない。  Ｌ． Ｌｅｓａｇｅ−ＭｅｅｓｅｎらのＪ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５０： １０７−１１３ （１９９６）及びＪ． Ｓｃｉ Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ ７９： ４８７−４９０には、黒色アスペルギルス及びピクノポルスシンナバリナス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）を組み合わせたフェルラ酸（砂糖大根パルプから酵素的に単離された）からのバニリン生成のための２工程生物変換方法が開示されている。最初の工程において、中程度のフェルラ酸は、黒色アスペルギルスによってバニリン酸に代謝され、次いでシンナバリナス（Ｐ． ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）によって１００ｍｇ／ｌの収率でバニリンに変換された。これらの参考文献には、本発明の基礎を形成する混合培地を開示も、示唆もされていない。
【００１１】
乳製品のための多くのスタータ培地が、何年にもわたり試みられ、又は商業的に使用されており、熟成の際のフレーバ化合物の形成を制御するために、種々の研究がフレーバ形成におけるスタータ培地の役割、アミノ酸の変換に関する酵素及び酵素的変換の調節に対して行われた。フレーバ形成を高めるために、遺伝子的アプローチが数年研究されている。驚いたことに、我々は、ある特定の希望する化合物、とくにあるフレーバ化合物の形成への代謝経路を一緒に形成するという点で２つ以上の微生物の組み合わせの作用がフレーバ生成を高めるための優れた方法であることを見出した。
【００１２】
発明の概要
本発明の目的は、２つ以上の微生物の菌株の混合培地であって、前記混合培地に含まれる前記微生物の菌株の少なくとも一部が酵素的経路の一部を実施する能力に基づいて個別に選択され、前記の個別に選択された微生物の菌株が希望するフレーバ化合物に関する完全な経路を一緒に形成する前記混合培地を提供することである。
本発明の他の目的は、高められた、又は特製のフレーバ形成により、醗酵させた製品（例えば、乳製品）の製造において使用する新規のスタータ培地であって、希望するフレーバを形成する範囲でアミノ酸を揮発性化合物に変換する能力が少ない、又は変換することができないが、一緒に使用した場合に、希望するフレーバを与える適切な条件下で、アミノ酸を揮発性化合物に変える２つ以上の微生物の菌株の組み合わせを含む前記スタータ培地を提供することである。前記の２つ以上の微生物の菌株は、好ましくは共培養される。また、必要に応じて、最適な微生物の菌株は、同一又は類似の効果を達成するために、連続して培養することもできるが、この実施態様はそれほど好ましくはない。
【００１３】
本発明の特に好ましい実施態様は、２つのラクトコッカス属の菌株、特にクレモリス菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ）の菌株Ｂ１１５７とクレモリス菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ）の菌株ＳＫ１１０との組み合わせを含むチーズの製造のためのスタータ培地である。本発明の他の特別の実施態様は、ブレビバクテリウム属の菌株とブドウ球菌属の菌株、特にブレビバクテリウムカゼイ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｓｅｉ）の菌株Ｂ１３９２と腐生ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）の菌株Ｂ１１４４の組み合わせを含むチーズの製造のためのスタータ培地である。
本発明の混合培地は、例えば、食品、食品添加物及びフレーバを含む種々の生成物の生成に好適に使用される。好ましい実施態様において、混合培地は乳製品、特にチーズ及びヨーグルト、最も好ましくはチーズの製造においてスタータ培地として使用される。
これらの、及びその他の本発明の目的及び実施態様は、以下の本明細書においてより詳細に記載される。
【００１４】
発明の詳細な説明
緒言で説明したように、微生物によるフレーバ生成は、増殖培地／固体基質における成分を利用し、一連の（大部分の酵素的）プロセスにおいてこの基質を１つ以上のフレーバ化合物に変換する微生物の能力の結果である。
菌株は、培地から基質を放出する完全な順序及び種々の変換工程を実施するその能力で選択されている。フレーバ形成の全産出量は、微生物が示す合せた酵素的活性の結果であった。例えば、アミノ酸はチーズフレーバの発生において重要な役割を果たす。ほとんどの遊離アミノ酸は、タンパク質分解酵素によるミルクからカゼインの加水分解によって遊離される。しかし、チーズフレーバのためのアミノ酸の直接の役割は限定される。フレーバ化合物源として、チーズが熟成する際のアミノ酸の異化がしばしば示唆されている（調査のために、Ｅｎｇｅｌｓ １９９７を参照のこと）。アミノ酸は、酵素的であるが、おそらくは化学的な反応にさらされる。チーズに存在する微生物及び／又はチーズの製造の際に添加される微生物は、タンパク質分解、アミノ基転移及び脱炭酸のような種々の反応を引き起こし、その結果、アミノ酸はついにそれぞれ特異的なフレーバを有する揮発性化合物に分解される。
【００１５】
種々の技術は微生物のフレーバ生成を高めるために適用されている。例えば、このような技術としては、酵素を増殖培地に添加して増殖培地からの基質の放出を高めること、醗酵状態の適応及びフレーバ形成に関連する１つ以上の酵素的工程を増強するための遺伝的アプローチが挙げられる。
一の局面において、本発明は、広い範囲の生成物の生成のための２つ以上の微生物の菌株の混合培地であって、前記混合培地に含まれる前記微生物の菌株の少なくとも一部が酵素的経路の一部を実施する能力に基づいて個別に選択され、前記の個別に選択された微生物の菌株が希望するフレーバ又はフレーバ成分に関して完全な経路を一緒に形成する前記混合培地を提供する。このアプローチは希望するフレーバ化合物又は混合物のより高い生成、同様に菌株をより容易に選択する方法を与えることが分かった。
【００１６】
上述のように、少なくとも必要な範囲で、アミノ酸のフレーバ成分揮発性化合物への一連の変換においてある特定の酵素活性がない、又は不足しているために、フレーバ及び乳製品及びその他の製品の製造で使用される従来技術の培地は、所定の希望するフレーバを生じない。アミノ酸を前記揮発性生成物に変換するのに必要なすべての反応を、一緒に起こすことができる最適な生成物の生成のための混合培地として、２つ以上の微生物の菌株の組み合わせを選択することによって、生成物は高めた、又は特製のフレーバで得られる。従って、本発明の混合培地は、上述のように、新規であると考えられる。
本発明の混合培地は、例えば、食品、食品添加物、フレーバ等の種々の製品の生成に好適に使用できる。製品が食品又は食品添加物である場合、混合培地に含まれる微生物は食品用でなければならない。本発明の好ましい実施態様において、食品は醗酵食品であり、例えば醤油及び豆乳のような醗酵させたソース、ソーセージ、きゅうり、ザウアークラウト及びオリーブのような醗酵野菜、醗酵させたパンのような焼製品、マリネにした魚製品、又はより好ましくは、ヨーグルトのような醗酵乳製品、又は最も好ましくはチーズである。本発明の特に好ましい実施態様において、混合培地は、ヨーグルトのような乳製品、最も好ましくはチーズの生成のためのスタータ培地である。
【００１７】
本発明の混合培地に含まれる微生物は、製造される製品及び希望するフレーバのような多くの因子に応じて、広範囲の好適な微生物から選択される。製品が乳製品である場合、好適な微生物の菌株としては、ラクトコッカス属、例えばクレモリス菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ）又はラクティス菌（ｌａｃｔｉｓ）、乳酸桿菌属、例えばラクトバシルスヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、アシドフィルス菌又はブルガリア菌、プロピオン酸菌属、連鎖球菌、例えばストレプトコッカスサーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ブドウ球菌属、例えばスタヒロコッカスアエクオラム（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｅｑｕｏｒｕｍ）、ビフィドバクテリウム属、アオカビ属、例えばペニシリウムカマンベルチ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）又はロクエホルチ（ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｉ）、ブレビバクテリウム属、例えばブレビバクテリウムリメンス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｅｎｓ）、アルスロバクター属、コリネバクテリウム属、サッカロミセス属、例えば酵母、デバロマイセス（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）、例えばハンセニ（Ｄ． ｈａｎｓｅｎｉｉ）等の菌株が挙げられるが、これらに制限されない。
さらに、本発明の混合培地は、希望するフレーバ化合物への代謝経路に関係しない最適な１つ以上の別の微生物の菌株又は材料を含んでもよい。例えば、目を形成する速い酸性化で使用される菌株。
【００１８】
本発明の他の局面において、上述の混合培地の調製のための方法が提供される。混合培地に含まれる微生物の菌株の選択は、主に希望するフレーバ最終生成物への推定される経路及び／又は前記フレーバ生成物の生産性に基づく。微生物の菌株の性質及び混合培地の使用及び／又は菌株の培養のような種々の技術は、技術的に知られており、当業者は本明細書の記載及び持っている技術に基づいて適切な選択をなすことは難しいことではないであろう。
本発明の混合培地を使用して形成できる好適なフレーバ化合物又は成分としては、例えば３−メチルブタナール、２−メチルブタナール及び２−メチルプロパナールのような分枝鎖アルデヒド、又はその誘導体が挙げられ、それぞれ分枝鎖アミノ酸ロイシン、イソロイシン及びバリンから得られる。同様に、好適なフレーバ芳香族アルデヒド又はその誘導体は、対応する芳香族アミノ酸フェニルアラニン及びチロシンから得られる。また、ジメチルジスルフィド及びジメチルトリスルフィドのような好適な含硫黄フレーバ化合物は、アミノ酸メチオニンからメタンチオールを経て得られる。
本発明のさらに別の局面において、混合培地の使用は、本明細書に記載されるように、例えば食品、食品添加物、飲料、健康食品、フレーバ等の上述の種々の製品の生成のために提供される。本発明の特に好ましい実施態様は、乳製品、特にチーズの調製におけるスタータ培地としての混合培地の使用である。
【００１９】
混合培地による増殖及びフレーバ生成
本発明の典型的な例として、菌株Ｂ１１５７、職人由来（ａｒｔｉｓａｎａｌ ｏｒｉｇｉｎ）のクレモリス菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ）の菌株及び市販のクレモリス菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ）の菌株、ＳＫ１１０を含むミルクの混合培地の使用は、非常に強いチョコレートのようなフレーバを生じた。菌株Ｂ１１５７単独は中程度のチョコレートのようなフレーバを生成するが、ＳＫ１１０単独はこのフレーバを生成しない。ヘッドスペースガスクロマトグラフィーの結果は、官能評価を実証する。チョコレートのようなフレーバを示す高レベルの分枝鎖アルデヒドは、Ｂ１１５７及びＳＫ１１０が一緒に増殖した場合に見られる。
両方の菌株はトランスアミナーゼ活性を含むように見える。さらに、菌株Ｂ１１５７は非常に高い脱炭酸活性を有するが、ミルクのタンパク質からのアミノ酸の放出はこの菌株において制限される。一方、菌株ＳＫ１１０は脱炭酸活性において強く制限されるが、この菌株はタンパク質分解において非常に活性である。明らかに、これらの菌株の組み合わせによって、ＳＫ１１０によって放出される基質はその他の菌株によって直接使用することができ、すべてのフレーバ形成経路を完成させる。
【００２０】
対照的に、菌株Ｂ８５１、職人由来（ａｒｔｉｓａｎａｌ ｏｒｉｇｉｎ）の他のクレモリス菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ）の菌株及び菌株ＳＫ１１０の混合培地は同様の効果を示さなかった。従って、この組み合わせは比較のためにのみ示される。以下において、２つの実験はより詳細に記載される。
クレモリス菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ）の菌株Ｂ１１５７及びＢ８５１はミルクにおいて、同様に産業用クレモリス菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ）の菌株ＳＫ１１０と組み合わせて、個別に増殖され、次いでミルクの培地は官能評価される。表２を参照のこと。
【００２１】
【表２】表２
野生株Ｂ１１５７及びＢ８５１及び産業用菌株ＳＫ１１０と共にインキュベートしたミルクの培地のチョコレートのようなフレーバのスコア（平均±ＳＤ）
2004501633.tif 000003
ａスケール０（なし）から４（非常に強い）；結果は標準偏差を伴う平均値である。
ｂ接種比率
【００２２】
純粋な培地で増殖した場合、菌株Ｂ１１５７はミルクにおいてわずかにチョコレートのようなフレーバを生成した。驚いたことに、このフレーバ形成は産業用菌株ＳＫ１１０で共培養することによって飛躍的に増加した。この知見は、これらの培地がお互いの代謝に直接的な影響を及ぼすことを示唆している。そのような相互作用は実用化におおいに関係する。２つの組み合わせ（１：２及び２：１）においてＳＫ１１０と一緒に培養した場合、菌株Ｂ１１５７及びＢ５８１の増殖は個々の菌株の細胞数を測定することによって確認された。菌株はタンパク質分解活性及び職人の乳製品を含まない源及び産業用菌株からのラクトコッカスの単離物の増殖温度特性の相違に基づいて個別に特徴付けられる。個々の培地及び混合培地の増殖を図１に示す。各菌株は、そのままで、混合物中で両方ともよく増殖できる。菌株間の初期バランスは共増殖の際に安定した状態を保つ。２：１の比の混合は、１：２の比の場合に比べてチョコレートのようなフレーバのより強い強度を示した。好適な比は、一般的に５：１〜１：５の範囲であり、主に目的とされる特性に依存する。菌株Ｂ８５１は、単独で培養した場合、ミルクにおいて中程度のチョコレートのようなフレーバを生成したが、このフレーバの強度は、Ｂ８５１をＳＫ１１０と混合した場合、減少した（表２）。チョコレートのようなフレーバ生成のこの減少は、おそらく、個別の培地における状況と比較して混合培地に存在するＢ８５１細胞の数の減少によるものである（図１）。
【００２３】
官能評価の際に見とめられるチョコレートのようなフレーバ及び分枝鎖アミノ酸から誘導される分枝鎖アルデヒドがミルク及びチーズにおいて麦芽のフレーバの発生を引き起こすことができるという知見（Ｍｏｒｇａｎ １９７６； Ｄｕｎｎ及びＬｉｎｄｓａｙ １９８５； ＭｃＤｏｎａｌｄ １９９２； Ｂａｒｖｉｅｒｉら １９９４； Ｕｒｂａｃｈ １９９３）を考慮して、ミルクの培地サンプルをヘッドスペースガスクロマトグラフィー（ＨＳ−ＧＣ）に供した。ロイシン、イソロイシン及びバリンの変換は、アミノ酸の対応するα−ケト酸へのアミノ基転移、続いて、それぞれ３−メチルブタナール、２−メチルブタナール及び２−メチルプロパナールへの化学的又は酵素的脱炭酸工程を経て進む（Ｙｖｏｎら １９９８； Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら １９９９）。ミルクの培地における個別の菌株及び混合した菌株のインキュベーションの際に形成される分枝鎖アルデヒド、すなわち３−メチルブタナール（“３ＭｅＡ４”）、２−メチルブタナール（“２ＭｅＡ４”）及び２−メチルプロパナール（“２ＭｅＡ３”）の相対量は図２に示される。相対的に高いレベルの、特に３ＭｅＡ４、しかし、また２ＭｅＡ３及び２ＭｅＡ４も、Ｂ１１５７及びＳＫ１１０と共にインキュベートされたミルクの培地で見られた。これらのアルデヒドの非常に少ない量がＢ１１５７単独でインキュベートしたミルクの培地で検出されたが、これらの化合物はＳＫ１１０単独で調製されたミルクの培地にはほとんど存在しなかった。Ｂ８５１及びＳＫ１１０の混合物でインキュベートしたミルクの培地で見られるアルデヒドの量は、Ｂ８５１単独でインキュベートしたミルクで検出されるものよりも少なかった。アルデヒドの量で注目される違いは官能データと対応する。
結果は、ＳＫ１１０及びＢ１１５７の組み合わせにおいて、分枝鎖アルデヒドの形成の完全な経路が積極的に存在することを示す。個々の菌株が高い量でこれらのアルデヒドを生成しないので、このフレーバ形成は各菌株毎に制限されるものと思われる。
【００２４】
ラクトコッカスの酵素による分枝鎖アミノ酸の変換
混合培地におけるフレーバ形成の調節の知見を得るために、分枝鎖アミノ酸の対応するアルデヒドへのＳＫ１１０、Ｂ１１５７及びその混合物による変換経路を調べた。菌株は、単独で、又は２：１の比（ＳＫ１１０：Ｂ１１５７）で共に、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）又はバリン（Ｖａｌ）又はそれらの対応するα−ケト酸（それぞれ、α−ケトイソカプロン酸（ＫＩＣＡ）、α−ケト−β−メチル−ｎ−バレリアン酸又はα−ケトイソバレリアン酸）の非存在下又は存在下で、ミルクでインキュベートした。酵素的変換により形成された揮発性化合物（アルデヒド）は、ＨＳ−ＧＣを用いて定量化した（図３）。ミルクで増殖した菌株Ｂ１１５７はＳＫ１１０の培地よりも高いレベルの２ＭｅＡ３及び３ＭｅＡ４を含んでいたが、２ＭｅＡ４のレベルはＳＫ１１０の培地でのものと見掛け上同様であった。しかし、これらの菌株の混合物（２：１）で調製されたミルクの培地は飛躍的に高いレベルの２ＭｅＡ３及び３ＭｅＡ４を含んでいた。これらの結果は、菌株Ｂ１１５７が分枝鎖アミノ酸をアルデヒドに変換でき、この変換がアミノ基転移、続く脱炭酸によるものであるかもしれなるいことを示す（Ｙｖｏｎら １９９７； Ｙｖｏｎら １９９８； Ｅｎｇｅｌｓ １９９７； Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら １９９９； Ｅｎｇｅｌｓら ２０００）。
【００２５】
Ｂ１１５７及びＢ１１５７とＳＫ１１０との混合物により調製されたミルクの培地へのＬｅｕの添加は、３ＭｅＡ４のレベルの増加を示したが、ＳＫ１１０単独の培地については、効果は見られなかった。Ｂ１１５７を含む培地へのＩｌｅの添加は２ＭｅＡ４の生成の増加を示し、Ｖａｌの添加は２ＭｅＡ３の増加を導いた。α−ケトイソカプロン酸、α−ケト−β−メチル−ｎ−バレリアン酸及びα−ケトイソバレリアン酸のＢ１１５７を含む純粋な培地及び混合培地への添加は、各α−ケト酸由来の対応するアルデヒドの増加を導いた（図３）。これらの結果は、高い濃度のアミノ酸Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ又はそれらの対応するα−ケト酸の存在下で、分枝鎖アミノ酸の対応するα−ケト酸へのアミノ基転移による分解及びα−ケト酸の対応するアルデヒドへの脱炭酸がその非存在下でよりもよりＢ１１５７においてより広範囲に進むことを示す。また、脱炭酸のプロセスはα−ケト酸のミルクへの添加後に認められる。これは、アミノ酸の形成がこの菌株によるアルデヒドフレーバ生成における律速工程であるように見えることを反映している。
【００２６】
遊離アミノ酸分析
ミルクの培地の遊離アミノ酸プロファイルはＳＫ１１０及びＢ１１５７と共にインキュベートされ、その混合物は、タンパク質分解酵素の作用によりアミノ酸パターンがＳＫ１１０によるものとＢ１１５７培地によるものとが異なることを示す（データは示さない）。ＳＫ１１０は分枝鎖アミノ酸（Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌ）を放出することができるが、これらのアミノ酸はＢ１１５７細胞によって遊離されない（図４）。ＳＫ１１０はこれらのアミノ酸を生成できるが、２：１の比のＢ１１５７とＳＫ１１０の混合物では少量のＶａｌのみが検出され、ＬｅｕもＩｌｅも検出されなかった。これは、Ｂ１１５７によるこれらのアミノ酸の分枝鎖アルデヒドへの直接の変換によるものであろう。１：１及び１：２（Ｂ１１５７：ＳＫ１１０）の混合物の場合、分枝鎖アミノ酸はクロマトグラムで存在した。明らかに、ＳＫ１１０がＢ１１５７と同じ又はより高い量で存在した場合、アミノ酸変換酵素は制限された。この結果は、２：１及び１：２（Ｂ１１５７：ＳＫ１１０）の間のチョコレートの強度における官能スコアの違いを実証する（表２）。
【００２７】
アミノトランスフェラーゼ及びデカルボキシラーゼ活性
ロイシンに対するアミノトランスフェラーゼ活性をＢ１１５７、Ｂ８５１、ＳＫ１１０及びその他の２つの天然ニッチ由来のラクティス菌（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ）の菌株、Ｂ１１７３及びＢ８５０（比較のため）のＣＦＥｓで決定した。幾つかの違いが観測されたが、すべての菌株はＫＩＣＡの形成によるアミノトランスフェラーゼ活性を示した。表３を参照のこと。
【００２８】
【表３】表３
ラクティス菌（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ）の菌株の細胞のない抽出物（“ＣＦＥ”）によって形成されるα−ケトイソカプロン酸（“ＫＩＣＡ”）及び３−メチルブタナール（“３ＭｅＡ４”）の相対量
2004501633.tif 000004
１ロイシンを含むＣＦＥのインキュベーション後、ＨＰＬＣの逆層によって決定されるＫＩＣＡの相対量。
２ＫＩＣＡを含むＣＦＥのインキュベーション後、ＨＳ−ＧＣにより決定される３ＭｅＡ４の相対量。
（任意単位で表される面積）
【００２９】
熱処理により不活性化したＣＦＥフラクションはＫＩＣＡの形成を示さなかった（データは示さない）。これらの結果は、試験したすべての菌株が活性なトランスアミナーゼを含むことを示す。
ＫＩＣＡに対する脱炭酸活性は同じ菌株（Ｂ１１５７、Ｂ１１７３、Ｂ８５０、Ｂ８５１及びＳＫ１１０）の細胞を含まない抽出物で測定した。インキュベーションの際に形成される３ＭｅＡ４の量は、ＣＦＥに存在する脱炭酸活性を表す（表３）。Ｂ１１５７由来のＣＦＥの存在下でＫＩＣＡから形成される３ＭｅＡ４の量は、試験したすべての菌株で最も多く、この菌株における高い脱炭酸活性を示唆している。分解はＳＫ１１０由来のＣＦＥでは生じず、この菌株による脱炭酸活性がないことを示している。熱処理したＣＦＥフラクションは３ＭｅＡ４形成を示さず（データは示さない）、この変換が酵素的であることを示し、脱炭酸工程は野生型菌株で特に“活性”であることを見出した。これらのラクトコッカスの菌株は、アミノ酸のそれら自身の合成により依存することが以前から知られており、従ってそれらは、おそらく産業用菌株よりも活性なアミノ酸コンバターゼを有している（Ａｙａｄら １９９９）。結果として、遊離アミノ酸はフレーバ前駆物質として提供され、フレーバ生成に直接的に関係するであろう。
【００３０】
総合すれば、試験した混合物の菌株間の相互作用は図５に概略的に示される。ＳＫ１１０において、カゼインから３−メチルブタナールへの完全な経路は、この菌株における脱炭酸酵素の欠如により進行しない（図５Ｂ）。Ｂ１１５７は非タンパク質分解性菌株であり、従って、続くアミノ基転移及び脱炭酸工程のための基質として提供できる十分な遊離アミノ酸を生成できない（図５Ｃ）。しかし、Ｂ１１５７及びＳＫ１１０が一緒にインキュベートされた場合、菌株はそれらの酵素活性に関して互いに補完し、チョコレートフレーバ成分３−メチルブタナールの高い生成を生じる（図５Ｄ）。一方、その脱炭酸活性はＢ１１５７よりも低いが、菌株Ｂ８５１はすべての分解を成し得る（図５Ｅ）。結果として、中程度のチョコレートのようなフレーバのみが見出される（図５Ｆ及び表２）。Ｂ８５１がＳＫ１１０と混合された場合、チョコレートのようなフレーバの強度はより低いものとして観測される（表２）。これは、Ｂ８５１の純粋な培地と比較して混合物における酵素活性のさらなる“希釈”によるものであるかもしれない（図１）。分枝鎖アルデヒド化合物がその他の化合物と調和する場合、そのような菌株の量及び酵素活性に依存してチョコレートのようなフレーバの強度が抑制され、その結果、そのようなフレーバが肯定的な方法で適用できることを示唆する。これにより、これらの化合物が生乳において異なるフレーバとして認識されている（Ｍｏｒｇａｎ １９７６； Ｍｏｌｉｍａｒｄ及びＳｐｉｎｎｌｅｒ １９９６）理由を説明でき、また幾つかの職人のチーズで重要なフレーバ化合物として認識されている（Ｂｏｓｓｅｔ及びＧａｕｃｈ １９９３； Ｂａｒｂｉｅｒｉら １９９４； Ｎｅｅｔｅｒら １９９６）理由も説明できる。
【００３１】
結論として、ＬＡＢのアミノ酸変換酵素は、フレーバ発生において重要な役割を果たすことができる。混合培地においては、本明細書に記載されるように、これらの混合物の組成に影響を与えるだけでなく、フレーバ生成に重要な影響を与える多くの異なる相互作用が生じ得る（Ｍｅｅｒｓ １９７３）。フレーバ形成経路の知見及び乳酸菌の機能特性の組み合わせは、工業的利用に新たな道を開く。特性のスタータ培地を開発し、同様にフレーバブロックを生成することが、特に使用される。
【００３２】
本発明の別の典型的な例は、表面熟成した（ｓｍｅａｒ）チーズのためのスタータ培地の特別な混合物の使用である。例えば、そのような培地のフレーバ生成は、スタータ培地としてブレビバクテリウム属の菌株及びブドウ球菌属の菌株の組み合わせを使用して高めることができる。チルジット、Ｄａｎｂｏ、リンバーガー及びアッペンツェルのようなスメア熟成したチーズは、その表面に比較的広範囲の微生物を有している。スメアチーズの表面のアルスロバクターニコチアナエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、ブレビバクテリウムリネンス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｎｅｎｓ）、ブレビバクテリウムカゼイ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｓｅｉ）、ミクロコッカスラテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）及びブドウ球菌の存在が詳細に記載されている（Ｉｒｌｉｎｇｅｒ及びＢｅｒｇｅｒｅ １９９９）。これらの微生物、主として細菌及び酵母は、チーズの熟成の際に種々のフレーバ化合物の生成を担っている。驚いたことに、以下の実施例によって示されるように、個々の菌株の培養と比較して、選択した菌株の共培養が飛躍的に高いレベルの重要なフレーバ化合物の生成を導くことが分かった。
【００３３】
ブレビバクテリウムカゼイ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｓｅｉ）Ｂ１３９２の純粋な培地において、メタンチオールの濃度はバックグラウンドよりも高いことが分かったが、メタンチオールはスタヒロコッカスサプロヒティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）Ｂ１１４４のみを含む培地においては検出されなかった（表４）。しかし、メタンチオールの高い濃度は、ブレビバクテリウムカゼイ（Ｂｒａｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｓｅｉ）Ｂ１３９２及びサプロヒティカス（Ｓ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）Ｂ１１４４を含む共培地において形成された。これらの濃度はこれらの菌株の純粋な培地におけるものを上回っていた。
【００３４】
【表４】表４
ブレビバクテリウム属及びブドウ球菌属の培地におけるメタンチオールの形成
2004501633.tif 000005
【００３５】
これらの結果は、スメアチーズの熟成の際のフレーバ形成が本発明の広い概念を用いて最適化できることを示す。
本発明は以下の実施例によってさらに詳しく説明されるが、どのような観点であっても本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。
【００３６】
材料及び方法
化学薬品
アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、α−ケト酸（α−ケトイソカプロン酸（ＫＩＣＡ）、α−ケト−β−メチル−ｎ−バレリアン酸及びα−ケト−イソバレリアン酸）及び塩化チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）をシグマケミカルズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ）から入手し、α−ケトグルタル酸をヤンセンキミカ（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｃｈｉｍｉｃａ）（Ｇｅｅｌ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）からエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）をＢＤＨリミテッド（Ｌｉｍｉｔｅｄ）（Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）から、及びピリドキサル−５’−ホスフェート（ＰＬＰ）をベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）ＧｍｂＨ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。使用したその他のすべての化学薬品は分析用試薬であった。
【００３７】
微生物の選択
天然のフレーバは食品用微生物の酵素活性によって通常得られる。ある特定の微生物の菌株は基質（例えば、アミノ酸又は中間化合物）から最終生成物（特定のタイプのフレーバ）へ導く代謝経路の大部分を含む。そのような最終生成物としては、例えばアルデヒド、ケトン、アルコール、エステル又は硫黄化合物が挙げられる。これらのタイプの菌株を選択する方法は、微生物コレクションを好適な培地でこれらの微生物、例えば細菌を培養することによりフレーバを生成する酵素活性で選別することである。次いで、微生物は、ある特定のフレーバ（化合物）を誘導する経路の各工程で選択される。各工程について、特定の酵素活性の選別が要求される。文献には、そのような活性を選別する種々の方法が報告されている。強いフレーバの影響を有するアルデヒドを得るのに必要な経路が与えられた実施例において、１つの菌株が２工程経路を経て基質（ロイシン）を３−メチルブタナールへ変換できるその他の菌株に遊離アミノ酸を提供する菌株の組み合わせが存在する。２工程経路は、ロイシンのアミノトランスフェラーゼ活性及びアミノトランスフェラーゼによって放出されるα−ケト酸のデカルボキシラーゼ活性からなる。
次の工程は、完全な経路を存在させるために、正しい基質の存在下で選択された細菌の組み合わせを培養することである。驚いたことに、明らかに菌株が選択された経路の中間化合物を交換できるために、すべての経路に１つの細菌の菌株を存在させることが必要とされないことが、本発明により明らかとなった。
【００３８】
微生物及び増殖条件
以下の菌株を使用した。
（ｉ）市販のスタータ培地から得られる菌株クレモリス菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ）ＳＫ１１０（ＮＩＺＯ Ｂ６９７）、（ｉｉ）天然のニッチが起源である菌株クレモリス菌（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ）ＮＩＺＯ Ｂ１１５７、ラクティス菌（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ）ＮＩＺＯ Ｂ８５１、ラクティス菌（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ）ＮＩＺＯ Ｂ８５０及びラクティス菌（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ）ＮＩＺＯ Ｂ１１７３（Ａｙａｄら １９９９）。ラクトコッカス属の菌株を、規定通りに、ＣａＣＯ３及び０．５％の酵母抽出物を有するリトマスミルクに保存し、−４０℃で保持した。菌株Ｂ１１５７及びＢ１１７３は非タンパク質分解性菌株であり、０．５％の酵母抽出物を有するミルクで増殖させたが、ＳＫ１１０、Ｂ８５０及びＢ８５１はタンパク質分解性菌株であり、酵母抽出物のないミルクで培養した。
【００３９】
ブレビバクテリウム属及びブドウ球菌属の菌株をＤＮＢ（ディフコ栄養ブロス）で９６時間（ブレビバクテリウム属）又は一晩（ブドウ球菌属）予め培養した。一定分量のこれらの培地をヘッドスペースバイアルの新鮮なＤＮＢ培地に、６００ｎｍでの光学密度がブレビバクテリウム属について０．０２又はブドウ球菌属について０．０１であるように加えた。これらの培地を３日間インキュベートし、ヘッドスペースオートサンプラーを用いてＧＣにより分析した。濃度は、適切な校正曲線を用いて計算した。
クレモリス菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ）の菌株ＳＫ１１０はニゾ  フード  リサーチから購入できる市販の菌株である。
クレモリス菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ）の菌株Ｂ１１５７は２０００年６月２０日にセントラルブラウブーシメルカルチャー（Ｃｅｎｔｒａａｌ Ｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）（Ｂａａｒｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ）によりＣＢＳ１０８９１７として寄託された。
クレモリス菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ）の菌株Ｂ８５０、Ｂ８５１及びＢ１１７３は、比較のためにのみ本明細書で使用され、ニゾ  フード  リサーチからの依頼に応じて得ることができる。
ブレビバクテリウムカゼイ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｓｅｉ）の菌株Ｂ１３９２は２００１年６月２９日にセントラルブラウブーシメルカルチャー（Ｃｅｎｔｒａａｌ Ｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）（Ｂａａｒｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ）によりＣＢＳ１０９５４３として寄託された。
スタヒロコッカスサプロヒティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）の菌株Ｂ１１４４は２００１年６月２９日にセントラルブラウブーシメルカルチャー（Ｃｅｎｔｒａａｌ Ｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）（Ｂａａｒｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ）によりＣＢＳ１０９５４４として寄託された。
【００４０】
フレーバ生成及び個体群動態
個別に菌株ＳＫ１１０、Ｂ１１５７、Ｂ８５１を１６時間３０℃で、非タンパク質分解性菌株については０．５％の酵母抽出物を有する無菌化したミルクで、タンパク質分解性菌株については酵母抽出物のない無菌化したミルクで予め培養した。天然のニッチから単離した菌株からなる培地を、産業用菌株（ＳＫ１１０）の培地と異なる比で（２：１及び１：２）、１％（ｖ／ｖ）の最終合計接種レベルで混合し、５００ｍｌのスキムＵＨＴミルクで、４８時間３０℃で一緒に増殖した。また、菌株を１％で個別に接種し、同じ条件下で増殖した。
各ミルクの培地における細胞の合計数（コロニー形成単位）は、細胞を以前から記載されている１０％スキムミルク、１．９％β−グリセロホスフェート（ｐＨ ６．９）、０．００１％ブロモクレゾールパープル及び１．３％寒天を含むＧＭＡ寒天（Ｌｉｍｓｏｗｔｉｎ及びＴｅｒｚａｇｈｉ １９７６； Ｈｕｇｅｎｈｏｌｔｚら １９８７）に蒔くことによって決定した。野生型菌株及び産業用菌株の間のカゼインを加水分解する能力及び４０℃で増殖する能力の相違に基づいて（Ａｙａｄら ２０００）、個々の菌株の細胞数を混合個体群において観察できた。
ミルクの培地を、５〜８人の経験豊かなチーズ評価者により官能的に評価した。その特性を記録し、統計的に分析した。フレーバ強度のスケールは０（なし）から４（非常に強い）の範囲であった。
【００４１】
揮発性化合物の分析
使用した培地により形成された分枝鎖アルデヒドを同定し、ヘッドスペースガスクロマトグラフィー（ＨＳ−ＧＣ）を用いて定量化した。使用した分析システムは、スプリットレスインジェクタ（ｓｐｌｉｔｌｅｓｓ ｉｎｊｅｃｔｏｒ）が取り付けられたメガシリーズガスクロマトグラフィー（ＣＥ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｑｕｅｓｔ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）を備えたヘッドスペースオートサンプラーＨＳ８００、水素炎イオン化検出器及び溶融石英キャピラリーカラム（２５ｍ×０．２２ｍｍ内寸、ｄｆ＝１μｍ ＣＰ−Ｓｉｌ５ ＣＢ−ＬＢ、Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から構成された。６０℃で２０分間の平衡時間の後、ヘッドスペースサンプル（１．０ｍｌ）をキャピラリープレカラム（２５ｃｍ×０．５３ｍｍ）に直接注入した（スプリットレス）。後者をオーブンの内側のクライオトラップ（ｃｒｙｏｔｒａｐ）モデル５１５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｑｕｅｓｔ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）に装着した。注入の際に、揮発性化合物を圧縮し（−１５０℃）、このキャピラリープレカラムに吸着させて、次いで急速加熱（１５０℃）によりクロマトグラフィーのカラムに再注入した。ＧＣ分離は、等温条件下で（７０℃）、１．２ｍｌ／ｍｉｎの水素の搬送ガス流速で行った。アルデヒドの同定は標準化合物の保持時間を用いて行った。
【００４２】
Ｌ． ｌａｃｔｉｓの菌株による分枝鎖アミノ酸の酵素的変換
培地を、非タンパク質分解性菌株について０．５％酵母抽出物を含む無菌化したミルクで、一晩３０℃で予め増殖し、続いて個々の培地及び混合培地（Ｂ１１７５＋ＳＫ１１０ ２：１）を、１％（ｖ／ｖ）の最終接種レベルで接種した後、５０ｍｌのＵＨＴミルクで増殖した。次の添加を行った。１）添加なし、２）１０ｍＭロイシン、３）１０ｍＭイソロイシン、４）１０ｍＭバリン、５）１０ｍＭα−ケトイソカプロン酸、６）１０ｍＭα−ケト−β−メチル−ｎ−バレリアン酸及び７）１０ｍＭα−ケトバレリアン酸。菌株により酵素的に形成された揮発性成分を、ガスクロマトグラフィー及び水素炎イオン化検出器と組み合わせたスタティックヘッドスペースインジェクションを直接使用して検出した。カラム及びクロマトグラフィー条件を上述のものと同じにした。
【００４３】
遊離アミノ酸分析
遊離アミノ酸を４１５１アルファプラスアミノ酸分析器（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で決定した。可溶性窒素フラクション（Ｎｏｏｍｅｎ １９７７）を個々の菌株ＳＫ１１０及びＢ１１５７及び異なる比のその混合物でインキュベートしたスキムＵＨＴミルクから１％の最終接種レベルで、４８時間３０℃で調製した。
【００４４】
細胞を含まない抽出物（ＣＦＥ）の調製
菌株を一晩３０℃で、非タンパク質分解性菌株について０．５％の酵母抽出物のみを有する無菌化したミルクで培養した。１％（ｗ／ｖ）のトリクエン酸ナトリウムの添加後、細胞を遠心分離（５分、１００００ｇ、４℃）により回収し、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ７．５）で２回洗浄した。洗浄した細胞を同じ緩衝液中に、約２０のＯＤ６００ｎｍ（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ ３０００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｋ．、ＵＫ）となるように懸濁し、１グラムのガラスビーズ（ジルコニウムビーズφ＝０．１ｍｍ）を有するプラスチックチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ ７２６９４）に加え、氷上に保持した（０℃）。ビードビーター（Ｂｅａｄ ｂｅａｔｅｒ）（汎用オービタルミキサー（ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ Ｏｒｂｉｔａｌ ｍｉｘｅｒ））を用いて３×３分間、細胞を分裂させ、３分間毎の振動後、２分間氷上で冷却した。処理した懸濁液を遠心分離して（３分、１４０００ｇ、４℃）、無処置の細菌及び細胞細片を除去し、上澄み（ＣＦＥ）を収集した。さらに使用するまで、ＣＦＥを−３０℃で保存した。
【００４５】
アミノトランスフェラーゼ及びデカルボキシラーゼ活性の決定
野生型菌株及び産業用菌株ＳＫ１１０のＣＦＥのアミノトランスフェラーゼ活性は以下のように測定した。１００μｌのＣＦＥ（活性な、又は熱処理により不活性な）を１ｍＭのＥＤＴＡ及び２０μＭのＰＬＰを含む２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ７．５）中で、ロイシン（最終濃度２０ｍＭ）及び共基質α−ケトグルタル酸（最終濃度１０ｍＭ）と共にインキュベートした。インキュベーション混合物の最終容積は２００μｌであった。インキュベーションを３０℃で１時間暗がりで行った。０．２ＭのＨＣｌの添加により混合物のｐＨを２．５に下げることによって反応を止めた。高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いてそのピーク面積を測定することにより、インキュベーションの際のα−ケトイソカプロン酸（ＫＩＣＡ）の形成を定量化した。使用したＨＰＬＣ装置は以前に記載されているものである（Ｅｎｇｅｌｓ １９９７）。ＫＩＣＡの相対量はそのピーク面積から決定された。ＨＰＬＣ生データを処理するために、パーキンエルマーネルソンターボクロム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｎｅｌｓｏｎ Ｔｕｒｂｏｃｈｒｏｍ）４．０ソフトウエア（Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ， ＣＡ．）を使用した。
ＣＦＥによるＫＩＣＡの３−メチルブタナール（３ＭｅＡ４）への変換は、水素炎イオン化検出器を有するヘッドスペースガスクロマトグラフィー（上記参照）を用いて、３ＭｅＡ４を決定することによって観測した。活性な、又は熱処理による不活性なＣＦＥ（１００μｌ）を、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０μＭのＴＰＰ及びＫＩＣＡ（最終濃度５ｍＭ）を含む５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ６．０）中で、３５℃で４時間インキュベートした。５０μｌの６Ｍ（ＨＣｌ）を加えて反応を止め、ｐＨを２に下げた。
【００４６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】菌株Ｂ１１５７とＢ８５１（オープンバー）及び菌株ＳＫ１１０（フィルドバー）により調製されたミルクの培地におけるスタータ個体群の変化である。Ａ， 菌株Ｂ１１５７； Ａ１（２：１）、Ａ２（１：２）、菌株Ｂ１１５７：菌株ＳＫ１１０及びＢ， 菌株Ｂ８５１； Ｂ１（２：１）、Ｂ２（１：２）、菌株Ｂ８５１：菌株ＳＫ１１０、ミルクの培地における生存可能な数を表す（複製の平均）。
【図２】ミルクの培地における個々の、及び組み合わせた菌株のインキュベーションの際に形成される分枝鎖アルデヒド２−メチルプロパナール（“２ＭｅＡ３”）、２−メチルブタナール（“２ＭｅＡ４”）及び３−メチルブタナール（“３ＭｅＡ４”）の相対量である。
【図３】以下のミルクの培地において、Ｂ１１５７、ＳＫ１１０及び（Ｂ１１５７＋ＳＫ１１０ ２：１）菌株により形成される分枝鎖アルデヒドの相対量である。添加剤なし（Ａ）、ロイシン（Ｂ）、イソロイシン（Ｃ）、バリン（Ｄ）、α−ケトイソカプロン酸（“ＫＩＣＡ”）（Ｅ）、α−ケト−β−メチル−ｎ−バレリアン酸（Ｆ）及びα−ケト−イソバレリアン酸（Ｇ）。
【図４】ミルクの培地における分枝鎖アミノ酸（Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌ）の相対量である。ミルク（ブランク）及びＳＫ１１０、Ｂ１１５７、（Ｂ１１５７＋ＳＫ１１０ ２：１）、（Ｂ１１５７＋ＳＫ１１０ １：１）及び（Ｂ１１５７＋ＳＫ１１０ １：２）によりインキュベートされたミルクの培地。
【図５】酵素による個々の、及び混合されたラクトコッカスのスタータ培地Ｂ１１５７、Ｂ８５１及びＳＫ１１０からのロイシンの提案された経路である。（Ａ）カゼイン、（Ｂ）ＳＫ１１０、（Ｃ）Ｂ１１５７、（Ｄ）定義された培地（Ｂ１１５７＋ＳＫ１１０）、（Ｅ）Ｂ８５１及び（Ｆ）混合培地（Ｂ８５１＋ＳＫ１１０）の分解の一般的な経路。脱炭酸工程において、細い矢印は低いデカルボキシラーゼ活性を表し、太い矢印は高いでカルボキシラーゼ活性を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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