(57)【要約】真核細胞起源でありかつＲＮＡサイレンシング経路に関与するポリメラーゼタンパク質が、検出可能なＲＮＡ重合活性を保有する精製された可溶性形態で初めて提供される。このポリメラーゼは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＲＮＡ合成のための方法およびキットにおいて有用である。本発明のポリメラーゼは、ｓｓＲＮＡテンプレートをコピーして、２つのタイプの反応産物（短いＲＮＡコピーおよび長いＲＮＡコピー）を産生する。これは、ｓｓＤＮＡテンプレートもまたコピーし得る。この重合はＲＮＡ合成の開始のためにプライマーを必要としないが、ＲＮＡ合成はプライマーの存在下でも開始され得る。標準的なヌクレオチドに加えて、本発明のポリメラーゼは、多数の改変されたヌクレオチドをも受容する。このポリメラーゼは、多数の下流の適用（例えば、標識されたＲＮＡプローブの産生または生きた細胞においてＲＮＡ干渉効果を誘導するかもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ系において適切なトリガーＲＮＡ分子の生成）において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸産物を産生するための方法であって、ポリメラーゼタンパク質が前記酵素の機能に充分な条件下で核酸テンプレートと接触することを含み、前記ポリメラーゼタンパク質は、
（ａ）全テンプレート長中に分散した前記テンプレートの短い相補的ＲＮＡコピー、および任意選択で
（ｂ）テンプレート長の相補的ＲＮＡコピー
を産生し得るＲＮＡポリメラーゼである方法。
【請求項２】
前記核酸テンプレートがＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記短いＲＮＡコピーとテンプレート長のＲＮＡコピーとの比率が反応条件によって調整され得る、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記短いＲＮＡコピーの長さが反応条件によって調整され得る、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記短いＲＮＡコピーまたはテンプレート長のＲＮＡコピーが、前記テンプレートにアニールされるかまたは前記テンプレートから変性される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸テンプレートが線状または環状である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリメラーゼが真核細胞起源である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリメラーゼが、真菌、緑色植物門、後生動物の界、または動菌類の群から選択される生物起源である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリメラーゼが、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ属およびＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ属のサブセット、好ましくは生物Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓおよびＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍから選択される生物起源である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリメラーゼがＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａのＱＤＥ−１タンパク質またはＱＤＥ−１の変更された誘導体もしくは遺伝学的に改変された誘導体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＲＮＡポリメラーゼが、
（ａ）配列番号１または配列番号３の核酸配列を含む核酸配列；
（ｂ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｃ）遺伝子コードの縮重に起因して（ａ）または（ｂ）の核酸配列とは異なる核酸配列；
（ｄ）ストリンジェントな条件下で（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の核酸配列にハイブリダイズする核酸配列；および
（ｅ）配列番号４のアミノ酸７０９から１４０２を含むポリペプチド、または配列番号２のアミノ酸２から１４０２を含む配列までの、配列番号４のアミノ酸７０９から１４０２を含むポリペプチドよりも長い任意の配列をコードする核酸配列；および
（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を示すアミノ酸配列をコードする核酸配列
の群から選択される核酸配列によってコードされる、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
単離されたポリペプチドであって、
（ｉ）前記ポリペプチドが充分なＲＮＡポリメラーゼ活性を有する；
（ｉｉ）前記ポリペプチドが増強された可溶性を有し、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号１を含む核酸配列によってコードされるポリペプチドの場合よりも、少なくとも３倍高い収率の活性ポリメラーゼを生じる；および
（ｉｉｉ）前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号３の核酸配列を含む核酸配列；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｃ）遺伝子コードの縮重に起因して（ａ）または（ｂ）の核酸配列とは異なる核酸配列；
（ｄ）ストリンジェントな条件下で（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の核酸配列にハイブリダイズする核酸配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸７０９から１４０２を含むポリペプチド、または配列番号２のアミノ酸２から１４０２を含む配列までの、配列番号４のアミノ酸７０９から１４０２を含むポリペプチドよりも長い任意の配列をコードする核酸配列；および
（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を示すアミノ酸配列をコードする核酸配列
の群から選択される核酸配列によってコードされる
ことを特徴とする、単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号２のアミノ酸配列の位置１０１１でアスパラギン酸を有する、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸１から１４０２または７１０から１４０２をコードする核酸配列によってコードされない、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１２に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸配列。
【請求項１６】
遺伝子発現に必要な調節配列と作動可能に連結された、請求項１５に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
ポリメラーゼタンパク質を産生するための方法であって、前記タンパク質の発現に適切な条件下で請求項１７に記載の宿主細胞を培養する工程を含む方法。
【請求項１９】
前記タンパク質が細胞または培養培地から回収され、かつ任意選択で精製される工程を含む、請求項１８に記載の方法
【請求項２０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡを産生するための方法であって、
（ａ）ｓｓＲＮＡテンプレートまたはｓｓＤＮＡテンプレートを提供する工程；
（ｂ）前記ｓｓＲＮＡテンプレートまたはｓｓＤＮＡテンプレートを、ＲＮＡ合成に充分な条件下で請求項１または１２に記載のタンパク質またはポリペプチドと接触させる工程
を含む方法。
【請求項２１】
前記ｓｓＲＮＡテンプレートが、ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ、好ましくはＤＮＡバクテリオファージによりコードされるＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼの群から選択されるポリメラーゼ、最も好ましくはバクテリオファージＴ７、バクテリオファージＴ３またはバクテリオファージＳＰ６のＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡテンプレートを転写することによって提供される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ａ）および（ｂ）が、同じ反応容器中で同時または連続的に実施される、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
新たに産生されたＲＮＡ種が反応混合物から回収される、請求項２０乃至２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記新たに産生されたＲＮＡ鎖が、前記テンプレートとアニールされてｄｓＲＮＡエレメントを形成するか、あるいは前記テンプレートから変性される、請求項２０乃至２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
ＲＮＡ合成がＲＮＡテンプレートまたはＤＮＡテンプレートに相補的な核酸プライマーの３’末端から開始されるか、あるいはＲＮＡ合成がプライマーなしで開始される、請求項２０乃至２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
ＲＮＡ合成のための前記反応混合物が、放射性同位体で任意選択で標識されたかまたは化学的に改変された少なくとも１種のヌクレオシド三リン酸、ｐＨ緩衝液、酢酸アンモニウム、ＰＥＧ、Ｍｇ２＋イオン、Ｍｎ２＋イオンおよび／または非イオン性界面活性剤を含む、請求項２０乃至２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
放射能によりまたは化学的に標識されたＲＮＡプローブを産生するために特に使用され、かつ新たに産生された標識されたＲＮＡを前記反応混合物の成分から精製する任意選択の工程を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記標識されたＲＮＡが、前記任意選択の精製工程後にサザンブロット分析またはノザンブロット分析のためのプローブとして使用される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記標識されたＲＮＡが、前記任意選択の精製工程後に蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析のためのプローブとして使用される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記標識されたＲＮＡが、前記任意選択の精製工程後にマイクロアレイ分析のためのプローブとして使用される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
核酸の二次構造、好ましくはＲＮＡの二次構造を研究するための方法であって、
（ａ）核酸標的分子、好ましくはＲＮＡ標的分子を提供する工程；
（ｂ）放射能によりまたは化学的に標識されたヌクレオチドをさらに含む混合物において、前記標的分子を、ＲＮＡ合成に充分な条件下で請求項１または１２に記載のタンパク質またはポリペプチドと接触させて、その結果前記標的ＲＮＡの一本鎖エレメントが本発明のポリメラーゼによってコピーされる工程；
（ｃ）新たに産生された標識された核酸種を前記反応混合物から回収し、任意選択で精製する工程；
（ｄ）前記標的分子の核酸フラグメントを含むマイクロアレイチップのためのプローブとして前記標識された核酸種を使用する工程；
（ｅ）前記マイクロアレイ分析からのデータを解釈して、前記標的分子のどの部分が一本鎖であるかを推定する工程；および任意選択で
（ｆ）前記標的分子の二次構造または三次構造についてのモデルを構築する工程
を含む方法。
【請求項３２】
核酸−タンパク質相互作用、好ましくはＲＮＡ−タンパク質相互作用を研究するための方法であって、
（ａ）核酸標的および核酸結合タンパク質、好ましくはＲＮＡ標的およびＲＮＡ結合タンパク質を提供する工程；
（ｂ）標的−タンパク質相互作用に充分な条件下で、前記標的と実験混合物中の前記タンパク質の溶液とを接触させ、かつ別個の容器中で前記標的を前記タンパク質を欠く対照溶液と接触させる工程；
（ｃ）前記実験混合物および対照混合物を、ＲＮＡ合成に充分な条件下で請求項１または請求項１２に記載のタンパク質またはポリペプチドと接触させる工程；
（ｄ）新たに産生された標識された核酸種を両方の反応混合物から回収し、任意選択で精製する工程；
（ｅ）前記標的の核酸フラグメントを含む２つの同一なマイクロアレイチップのためのプローブとして２セットの前記標識された核酸種を使用する工程；
（ｆ）前記２つのマイクロアレイ分析からのデータを解釈して、前記標的分子のどの部分がＲＮＡ合成のためにアクセス可能であるかを推定する工程；
（ｇ）前記２つのデータセットを比較して、実験混合物中の標的と対照混合物中の標的との間の差異を決定する工程；および任意選択で
（ｈ）前記２つのデータセット間の差異を、核酸−タンパク質相互作用についてのモデルとして解釈する工程
を含む方法。
【請求項３３】
ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡ干渉を誘導するためのＲＮＡトリガー分子を産生するための方法であって、
（ａ）ＲＮＡテンプレートまたはＤＮＡテンプレートを提供する工程；
（ｂ）核酸テンプレート、請求項１または１２に記載のタンパク質、ヌクレオシド三リン酸および任意選択でｐＨ緩衝液、酢酸アンモニウム、ＰＥＧ、Ｍｇ２＋イオン、Ｍｎ２＋イオンおよび／または非イオン性界面活性剤を含む混合物中で、ＲＮＡ合成に充分な条件下で、前記ＲＮＡテンプレートまたはＤＮＡテンプレートを請求項１または１２に記載のタンパク質またはポリペプチドと接触させる工程；および
（ｃ）ＲＮＡ合成に充分な温度で前記反応混合物をインキュベートする工程
を含む方法。
【請求項３４】
前記ＲＮＡテンプレートまたはＤＮＡテンプレートが細胞またはウイルス起源である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＲＮＡテンプレートが、Ｔ７バクテリオファージ、Ｔ３バクテリオファージおよびＳＰ６バクテリオファージの群から選択されるバクテリオファージから、好ましくは由来するＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡテンプレートを転写することによって提供される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
工程（ａ）および（ｂ）が、同じ反応容器中で同時または連続的に実施される、請求項３３または３５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１または１２に記載のタンパク質またはポリペプチドを含むキット。
【請求項３８】
検出可能なレベルのＲＮＡ合成に必要な添加剤をさらに含む、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
ＲＮＡ合成に充分な濃度でヌクレオシド三リン酸を含む、請求項３７または３８に記載のキット。
【請求項４０】
少なくとも１種のヌクレオシド三リン酸が、放射性同位体で標識されているかまたは化学的に改変されている、請求項３７乃至３９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４１】
請求項１または１２に記載のタンパク質またはポリペプチドによるＲＮＡ合成のためのテンプレートとして働く特徴付けられた能力を有する標準的な核酸調製物をさらに含む、請求項３７乃至４０のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、核酸テンプレートを使用するＲＮＡの酵素的合成に関する。より具体的には、本発明は、転写後遺伝子サイレンシングプロセスに関与する細胞性ＲＮＡポリメラーゼによって触媒されるＲＮＡ合成を扱う。本発明は、このポリメラーゼ、このポリメラーゼの可溶性の活性形態、およびこの可溶性活性ポリメラーゼをコードする核酸を使用することによって、核酸産物を産生するための方法を開示する。このポリメラーゼを核酸テンプレートと接触させることによる、ＲＮＡ合成のための方法およびキットもまた開示される。本発明はまた、ＲＮＡ重合産物の下流の適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）またはＲＮＡサイレンシングとは、真核細胞における配列特異的なＲＮＡ分解機構をいう（Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ、２００２）。ＰＴＧＳおよびウイルスにより誘導される遺伝子サイレンシングという現象は、コサプレッションという名で植物において最初に発見されたが、その後、鎮圧（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）として糸状真菌Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａについて、そして多数の動物および原生動物におけるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として報告されている（ＣｏｇｏｎｉおよびＭａｃｉｎｏ、１９９９；Ｆｉｒｅ、１９９９；Ｆｊｏｓｅら、２００１）。ＲＮＡサイレンシングは、標的テンプレートに対して充分相同な二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡトリガーによって誘導および媒介される。ＲＮＡサイレンシングは、ウイルス性ＲＮＡ、トランスポゾン、ならびに実験条件下での導入遺伝子および合成ｄｓＲＮＡに対する細胞防御のシステムとして使用される（Ｐｌａｓｔｅｒｋ、２００２；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、２００１）。
【０００３】
ＲＮＡサイレンシングの実用上の重要性が増してきている。導入遺伝子により誘導されたＰＴＧＳは、農業において、例えば、ペチュニアにおいて花弁の色を変化させるため、またはトマトにおいてマセレーション（ｍａｃｅｒａｔｉｏｎ）を遅延させるために使用されてきた（Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ、２００２）。配列特異的なｄｓＲＮＡは、ハエ（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）および虫（例えば、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）において同族遺伝子の発現をサイレンシングする研究目的のために使用されている。後者の場合、数千の遺伝子の機能がＲＮＡｉを使用してなされるハイスループットなスクリーニングとして報告されている（Ｂａｒｓｔｅａｄ、２００１；Ｆｒａｓｅｒら、２０００；Ｇｏｎｃｚｙら、２０００；Ｍａｅｄａら、２００１）。最後に、最近の研究は、ＲＮＡサイレンシングが哺乳動物細胞においてポリオウイルスおよびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の複製を妨害するために使用され得ることを実証しており、医学における新たな道を開いている（Ｇｉｔｌｉｎら、２００２；Ｊａｃｑｕｅら、２００２；Ｎｏｖｉｎａら、２００２）。
【０００４】
ＲＮＡサイレンシングの実用的な利用は、この現象の近年行われた目覚しい分子的解明なしでは不可能であった。この方法に関する重要な報告のひとつは線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓにインジェクションまたは給餌さえされたｄｓＲＮＡ分子が、宿主によりコードされる相同なｍＲＮＡの分解をもたらすという結果であった（ＲＮＡｉ；Ｆｉｒｅら、１９９８；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、１９９８；ＴｉｍｍｏｎｓおよびＦｉｒｅ、１９９８）。次いで、植物においてＰＴＧＳが、センスおよびアンチセンス両方に配列特異的な約２５ｎｔのＲＮＡの蓄積と常に関連があることが発見された（ＨａｍｉｌｔｏｎおよびＢａｕｌｃｏｍｂｅ、１９９９）。短いＲＮＡが、二本鎖ＲＮＡｉトリガーがｄｓＲＮＡ種ヌクレアーゼであるＤｉｃｅｒによって、数ヌクレオチド長の３’突出末端を有する２１〜２３ｎｔ長のｄｓＲＮＡへと最初に切断されることが示され、これらのＲＮＡの役割が明らかとなった（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、２００１；Ｚａｍｏｒｅら、２０００）。次いで、しばしば小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と称されるこれらは、相補的ｍＲＮＡとのＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合を介して、さらなるリボヌクレアーゼ複合体ＲＩＳＣを形成し、最終的な分解を引き起こす（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１；Ｈａｍｍｏｎｄら、２０００）。植物および動物に加えて、２３〜２５ｎｔのＲＮＡが最近ＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍおよびＮ．ｃｒａｓｓａについて記載されており、従ってこのことは、真核生物にわたるＰＴＧＳ機構の保存を示唆している（Ｃａｔａｌａｎｏｔｔｏら、２００２；Ｍａｒｔｅｎｓら、２００２）。
【０００５】
ｄｓＲＮＡメディエータはＲＮＡサイレンシングの典型として現在受容されているものの、これらがＰＴＧＳを起こす細胞中でのこれらの現れ方はほぼ未知のままである。これらは、ＲＮＡウイルスの複製中間体または逆反復配列から産生された分子内ヘアピン様転写物として生じ得る。しかしこれは、ＲＮＡサイレンシングが異所的に挿入された導入遺伝子の過剰発現によって誘発される広範な例（コサプレッション；ＣｏｇｏｎｉおよびＭａｃｉｎｏ、１９９９）を説明しない。コサプレッションおよび関連するＲＮＡサイレンシング現象は、細胞性ＲＮＡポリメラーゼによってｄｓＲＮＡトリガーへと転換される異常なｓｓＲＮＡ（ａｂＲＮＡ）によって誘導され得ることが提唱されている（ＷａｓｓｅｎｅｇｇｅｒおよびＰｅｌｉｓｓｉｅｒ、１９９８）。しかし、ａｂＲＮＡの性質ならびにそれらの二重螺旋への変形の詳細は理解されていない。
【０００６】
Ｎ．ｃｒａｓｓａにおいて実施された遺伝学的スクリーニングは、ＰＴＧＳに必須の３つの遺伝子座：ｑｄｅ−１、ｑｄｅ−２およびｑｄｅ−３（鎮圧欠損（ｑｕｅｌｌｉｎｇ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）から；ＣｏｇｏｎｉおよびＭａｃｉｎｏ、１９９７）を同定した。植物および動物において、ＰＴＧＳの遺伝学的レパートリーはより複雑であるが、ｑｄｅ遺伝子のホモログをしばしば含む（ＨｕｔｖａｇｎｅｒおよびＺａｍｏｒｅ、２００２；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、２００１）。これらのうち、ｑｄｅ−３は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＲＮＡｉ経路のｍｕｔ−７もまた含むＲｅｃＱ／ＷＲＮヘリカーゼファミリーのメンバーである（ＣｏｇｏｎｉおよびＭａｃｉｎｏ、１９９９；Ｋｅｔｔｉｎｇら、１９９９）。ｑｄｅ−２の遺伝子産物は、ＲＮＡ結合タンパク質のｅＩＦ２Ｃ／ＡＧＯ１／ＲＤＥ−１／Ｐｉｗｉ／Ｚｗｉｌｌｅ群に属する（ＣｏｇｏｎｉおよびＭａｃｉｎｏ、２０００；Ｆａｇａｒｄら、２０００；Ｔａｂａｒａら、１９９９）。
【０００７】
【非特許文献１】Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ、２００２
【非特許文献２】ＣｏｇｏｎｉおよびＭａｃｉｎｏ、１９９９
【非特許文献３】Ｆｉｒｅ、１９９９
【非特許文献４】Ｆｊｏｓｅら、２００１
【非特許文献５】Ｐｌａｓｔｅｒｋ、２００２
【非特許文献６】Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、２００１
【非特許文献７】Ｂａｒｓｔｅａｄ、２００１
【非特許文献８】Ｆｒａｓｅｒら、２０００
【非特許文献９】Ｇｏｎｃｚｙら、２０００
【非特許文献１０】Ｍａｅｄａら、２００１
【非特許文献１１】Ｇｉｔｌｉｎら、２００２
【非特許文献１２】Ｊａｃｑｕｅら、２００２
【非特許文献１３】Ｎｏｖｉｎａら、２００２
【非特許文献１４】Ｆｉｒｅら、１９９８
【非特許文献１５】Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、１９９８
【非特許文献１６】ＴｉｍｍｏｎｓおよびＦｉｒｅ、１９９８
【非特許文献１７】ＨａｍｉｌｔｏｎおよびＢａｕｌｃｏｍｂｅ、１９９９
【非特許文献１８】Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、２００１
【非特許文献１９】Ｚａｍｏｒｅら、２０００
【非特許文献２０】Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１
【非特許文献２１】Ｈａｍｍｏｎｄら、２０００
【非特許文献２２】Ｃａｔａｌａｎｏｔｔｏら、２００２
【非特許文献２３】Ｍａｒｔｅｎｓら、２００２
【非特許文献２４】ＷａｓｓｅｎｅｇｇｅｒおよびＰｅｌｉｓｓｉｅｒ、１９９８
【非特許文献２５】ＣｏｇｏｎｉおよびＭａｃｉｎｏ、１９９７
【非特許文献２６】ＨｕｔｖａｇｎｅｒおよびＺａｍｏｒｅ、２００２
【非特許文献２７】Ｋｅｔｔｉｎｇら、１９９９
【非特許文献２８】ＣｏｇｏｎｉおよびＭａｃｉｎｏ、２０００
【非特許文献２９】Ｆａｇａｒｄら、２０００
【非特許文献３０】Ｔａｂａｒａら、１９９９
【非特許文献３１】Ｓｃｈｉｅｂｅｌら、１９９３
【非特許文献３２】Ｓｃｈｉｅｂｅｌら、１９９８
【特許文献１】米国特許第６２１８１４２号
【非特許文献３３】Ｍｏｕｒｒａｉｎら、２０００
【非特許文献３４】Ｓｍａｒｄｏｎら、２０００
【非特許文献３５】Ｄａｌｍａｙら、２０００
【非特許文献３６】Ｓｉｊｅｎら、２００１
【非特許文献３７】Ｓｈｉｕら、２００１
【非特許文献３８】Ｃｏｇｏｎｉら、１９９９
【非特許文献３９】ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）
【非特許文献４０】Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４
【非特許文献４１】Ｂｕｔｃｈｅｒら、２００１
【非特許文献４２】Ｈａｎｓｅｎら、１９９７
【非特許文献４３】Ｓｔｅｉｔｚ、１９９８
【非特許文献４４】Ｐｏｃｈら、１９８９
【非特許文献４５】ＭａｋｅｙｅｖおよびＢａｍｆｏｒｄ、２０００
【非特許文献４６】Ｇｕｒｅｖｉｃｈら、１９９１
【非特許文献４７】Ｍａｋｅｙｅｖら、１９９６
【非特許文献４８】Ｌａｕｒｉｌａら、２００２
【非特許文献４９】Ｖａｓｉｌｊｅｖａら、２０００
【非特許文献５０】Ｇｏｔｔｌｉｅｂら、１９９２
【非特許文献５１】ＬｅｗｉｓおよびＦｌｅｍｉｎｇ、１９９５
【非特許文献５２】Ｂｒｅｎｎｅｒ、１９７４
【非特許文献５３】Ｐｒａｉｔｉｓら、２００１
【非特許文献５４】Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、１９９８
【非特許文献５５】ＣｈｉｃａｓおよびＭａｃｉｎｏ、２００１
【非特許文献５６】Ｎｉｓｈｉｋｕｒａ、２００１
【非特許文献５７】Ｌｉｐａｒｄｉら、２００１
【非特許文献５８】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／
【非特許文献５９】ＳａｉｔｏｕおよびＮｅｉ、１９８７
【非特許文献６０】Ｋｏｌｂら、２０００
【非特許文献６１】Ｃｈａｌｆｉｅら、１９９４
【非特許文献６２】Ｙａｒｄｅｎら、１９９２
【非特許文献６３】Ｂｏｗｍａｎら、１９８８
【非特許文献６４】Ｂｅｌｌ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、１９９２
【非特許文献６５】ＨａｎｎａおよびＳｚｏｓｔａｋ、１９９４
【非特許文献６６】Ｑｕｉｇｌｅｙら、１９７８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
遺伝子ｑｄｅ−１は、ウイルス／ウイロイドにより誘導されるＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）をコードするトマトの遺伝子に対する相同性を有する。トマトのＲｄＲＰはこれまで、生化学的に示されたＲＮＡ合成活性を有する唯一の細胞性ＲｄＲＰである（Ｓｃｈｉｅｂｅｌら、１９９３；Ｓｃｈｉｅｂｅｌら、１９９３；Ｓｃｈｉｅｂｅｌら、１９９８）。しかし、このタンパク質がＰＴＧＳプロセスと関連するか否かは現在未知である。さらに、かなりの努力にもかかわらず、組換え供給源から酵素的に活性なトマトＲｄＲＰを産生することはこれまで不可能であった（Ｓｃｈｉｅｂｅｌら、１９９８）。このタンパク質を酵素アッセイに用いられる適切な形態で得るために現在使用される手順は、費用がかかり時間を消費する。ウイロイド感染したトマトの葉数百グラム〜キログラムが出発材料として必要であり、その精製プロトコルは、溶解物の透明化および硫酸アンモニウム沈殿の工程に加えて、多数のクロマトグラフィー工程を含む（Ｓｃｈｉｅｂｅｌら、１９９３；および米国特許第６２１８１４２号を参照のこと）。
【０００９】
興味深いことに、トマトＲｄＲＰの配列ホモログは多数の他の生物においても見出されており、１ゲノム当たり複数のＲｄＲＰ様遺伝子が存在することが非常に頻繁にある。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいてこのような遺伝子が４つ知られており、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍにおいては３つ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいては７つが知られている（Ｍａｒｔｅｎｓら、２００２；Ｍｏｕｒｒａｉｎら、２０００；Ｓｍａｒｄｏｎら、２０００）。これまで、Ｎ．ｃｒａｓｓａのｑｄｅ−１、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｅｇｏ−１およびｒｒｆ−１、ＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍのＲｒｐＡならびにＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＳＧＳ２／ＳＤＥ１のみがＲＮＡサイレンシングと遺伝学的に関連しており、他のＲｄＲＰ遺伝子中の変異は、ＰＴＧＳ表現型に対してほとんど影響がないかまたは全く影響がない（ＣｏｇｏｎｉおよびＭａｃｉｎｏ、１９９９；Ｄａｌｍａｙら、２０００；Ｍａｒｔｅｎｓら、２００２；Ｍｏｕｒｒａｉｎら、２０００；Ｓｉｊｅｎら、２００１；Ｓｍａｒｄｏｎら、２０００）。注目すべきことに、Ｎ．ｃｒａｓｓａの第二のＲｄＲＰ様遺伝子であるｓａｄ−ｌは、未だ特徴付けられていない減数分裂サイレンシング経路において機能することが示されている（Ｓｈｉｕら、２００１）。明らかに、単一の生物由来の異なるＲｄＲＰ様タンパク質が異なる機能を果たし得、これらの機能のうちの１つがＰＴＧＳに関連している。
【００１０】
いくつかの仮説的モデルが、ＲＮＡサイレンシングにおけるＲｄＲＰの役割について提唱されている（図１Ａ）。しかし、精製された活性形態で対応するＲｄＲＰ様タンパク質を入手できないため、これらのモデルの証明は不可能であった。トマトＲｄＲＰの原型がＲＮＡサイレンシングと関連していなかったので、ＰＴＧＳのこれらの成分が実際にＲＮＡ合成を触媒し得るか否かは知られていなかった。ライフサイエンス、医学および農業にとってのＰＴＧＳおよび関連の現象の重要性を考慮すると、ＲＮＡサイレンシング経路から充分量の生物学的に活性なＲｄＲＰ様タンパク質を得、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでそれらの酵素特性を決定することを可能にする方法が当該分野においては緊急に必要である。この活性なＲｄＲＰ様タンパク質を組換え供給源から単離することは非常に有利である。なぜなら、これにより、高いタンパク質収率および知識に基づいた遺伝子操作の可能性の両方が可能となるからである。
【００１１】
重要なことに、真核生物においてＲＮＡサイレンシングを誘導するための現在の好ましい方法（ＲＮＡｉ）は、比較的手間がかかる（ＲＮＡｉプロトコルについては、例えば、Ｂａｒｓｔｅａｄ、２００１；Ｆｒａｓｅｒら、２０００；Ｇｏｎｃｚｙら、２０００；Ｍａｅｄａら、２００１を参照のこと）。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよび多数の他の生物におけるＲＮＡｉは、目的の遺伝子をコードするＤＮＡフラグメントを最初に提供し、このＤＮＡフラグメントを２つの転写反応で転写し（例えば、対向するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよびＴ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを使用する）、２つの相補的ＲＮＡ転写物をアニールさせてｄｓＲＮＡトリガーを形成し、そして最後にこのｄｓＲＮＡを生物または細胞中に送達してＲＮＡｉを誘導することによって、現在行われている。より単純な方法でそれらのコーディングＤＮＡテンプレートからｄｓＲＮＡトリガーを産生できれば、特にハイスループットＲＮＡｉプロジェクトに非常に有利である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ＲＮＡサイレンシングに関与する組換えＲｄＲＰタンパク質およびその遺伝学的に変更された誘導体の効率的な産生を開示する。本発明者らはまた、この組換えＲｄＲＰおよび精製された可溶性形態のその誘導体を提供するための手順を初めて報告する。さらに、新たな開始様式またはプライマー依存的開始様式のいずれかを使用した、異なるテンプレートを用いたこれらのタンパク質のＲＮＡ依存的ＲＮＡ重合活性を使用するための方法およびキットが開示される。初期に記載されたトマトからのＲｄＲＰ調製物とは異なり、本発明の酵素は、以下の２つの別個のタイプのＲＮＡ産物を合成する：（１）広範囲の（全長またはほぼ全長の）コピーおよび（２）全テンプレート長に沿ってこのテンプレートと塩基対合した、短い７〜４０ｎｔ長、主に９〜２１ｎｔ長以内のＲＮＡ。後者のタイプの産物は、ＲｄＲＰについて全く記載されていない。本発明は、この独自の反応様式がＲＮＡｉおよびマイクロアレイ技術を含むいくつかの下流の適用の利益のために如何に使用され得るかを説明する。
【００１３】
本発明は、ＰＴＧＳ経路から新たに単離された組換えポリメラーゼを使用するＲＮＡ重合プロセスを開示する。このポリメラーゼおよびその誘導体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイに適切な可溶性の活性形態で提供される。このポリメラーゼまたはその誘導体を異なるテンプレートと接触させることによるＲＮＡ合成のための方法およびキットが開示される。本発明はまた、ＲＮＡ重合産物の下流の適用（例えば、生きた細胞および無細胞抽出物におけるＲＮＡサイレンシング、または研究および診断目的に適切な標識されたＲＮＡプローブの合成を含む）を開示する。本発明の他の特徴、態様および利点は、以下の説明および添付の特許請求の範囲から明らかとなる。
本発明の以下の本文ならびに以下の詳細な説明は、添付の図面と共に読むとよりよく理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、ＲＮＡサイレンシング経路由来のＲＮＡポリメラーゼ（以前に単離も特徴付けもされていない酵素）を使用することによって、全テンプレート長に沿って分散したＲＮＡテンプレートおよびＤＮＡテンプレートの短い相補的ＲＮＡコピーを産生するための方法を提供する。本発明の利点は、ＲＮＡサイレンシング経路由来のこのポリメラーゼおよびその誘導体が可溶性で酵素活性を有する状態で提供されることである。「ＲＮＡサイレンシング」は、転写後遺伝子サイレンシング、コサプレッション、ウイルスにより誘導される遺伝子サイレンシング、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）などのような、真核細胞において見出されるいくつかの関連現象をいうために本明細書中で使用される一般的用語である。これら全ての現象の一般的な特徴は、ＲＮＡトリガー分子による標的ＲＮＡの配列特異的な分解にある（さらなる詳細については背景技術を参照のこと）。本発明のポリメラーゼタンパク質は真核細胞に起源するか、またはこのような細胞性ポリメラーゼのアミノ酸配列を有するか、またはこのようなポリメラーゼの誘導体である。
【００１５】
本発明の目的のために、開示されたＲＮＡポリメラーゼは、「ポリメラーゼタンパク質」、「ポリメラーゼ」、「細胞性ＲｄＲＰ」または単に「ＲｄＲＰ」、あるいはただタンパク質またはポリペプチドと種々に称される。本発明は、ＲＮＡサイレンシング経路の単離されたポリメラーゼが、適切な条件下でＲＮＡテンプレートまたはＤＮＡテンプレートと接触する場合にｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡ合成し得ることの、最初の直接的な証拠を提供する。
【００１６】
（１．発明の目的）
本発明は、核酸産物を産生するための方法を提供し、この方法は、本発明のポリメラーゼタンパク質がこの酵素の機能に充分な条件下で核酸テンプレートと接触することを含む。
【００１７】
本発明のポリメラーゼタンパク質が核酸テンプレートの短い相補的ＲＮＡコピー（これらのコピーは全テンプレート長中に分散している）および任意選択でテンプレート長の相補的ＲＮＡコピーを産生し得ることは、本発明のポリメラーゼタンパク質に特徴的なことである。言い換えれば、このポリメラーゼタンパク質は、テンプレート長のコピーに加えて、このテンプレートに相補的な非連続のＲＮＡ鎖を合成し得る。これは、ＲＮＡポリメラーゼにとって全く新しい特徴である。
【００１８】
短いＲＮＡコピーまたは短いＲＮＡ鎖とは、本明細書中で７〜４０ｎｔ、主に９〜２１ｎｔの長さのコピーを意味する。短いＲＮＡを構成する核酸産物とテンプレート長の（長い）ＲＮＡを構成する核酸産物との比率は、反応条件によって調整され得る。より具体的には、この比率はイオン濃度によって、例えば、二価金属イオン（例えば、Ｍｎ２＋およびＣａ２＋）の適切な濃度によって調整され得る。また、非連続または短いＲＮＡの長さは、特定の化学物質（例えば、スペルミジン）によってより短いＲＮＡへと調整され得る。
【００１９】
本発明のポリメラーゼタンパク質は、一本鎖ＲＮＡテンプレートまたは一本鎖ＤＮＡテンプレートを使用してＲＮＡ合成を触媒し得、かつこのＲＮＡテンプレートまたはＤＮＡテンプレートは線状または環状であり得る。
【００２０】
産生されたＲＮＡ鎖は通常テンプレートにアニールされるが、これらはまたテンプレートから変性され得る。
本発明のポリメラーゼは真核細胞に起源し得る。具体的には、本発明のポリメラーゼは真菌、緑色植物門、後生動物の界、または動菌類の群から選択される生物に起源し得る。
【００２１】
より具体的には、本発明のポリペプチドは、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ属およびＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ属のサブセット、好ましくはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓおよびＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍから選択される生物に起源し得る。特に、このポリメラーゼはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａのＱＤＥ−１タンパク質またはＱＤＥ−１の変更された誘導体もしくは遺伝学的に改変された誘導体である。
【００２２】
本発明のＲＮＡポリメラーゼは、核酸テンプレートの短い相補的ＲＮＡコピー（これらのコピーは全テンプレート長中に分散している）および任意選択でテンプレート長の相補的ＲＮＡコピーを産生し得、以下の群から選択される核酸配列によってコードされる：
（ａ）任意選択のタグ配列に加えて配列番号１（ＱＤＥ−１タンパク質に対応する）または配列番号３（ＱＤＥ−１の短縮バージョンであるΔＮに対応する）の配列を含む核酸配列；
（ｂ）任意選択のタグ配列に加えて配列番号２（ＱＤＥ−１タンパク質に対応する）または配列番号４（ΔＮに対応する）の配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｃ）遺伝子コードの縮重に起因して（ａ）または（ｂ）の核酸配列とは異なる核酸配列；
（ｄ）ストリンジェントな条件下で（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の核酸配列にハイブリダイズする核酸配列；および
（ｅ）配列番号４のアミノ酸７０９〜１４０２を含むポリペプチドまたは配列番号２のアミノ酸２〜１４０２を有する配列までの、それよりも長い任意の配列をコードする核酸配列；および
（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を示すアミノ酸配列をコードする核酸配列。
任意選択のタグ配列は、配列番号１４（核酸配列）および配列番号１５（アミノ酸配列）として配列表中に示される。
【００２３】
本発明はまた、改善された可溶性を有してより高い収率の活性ポリメラーゼを生じるＲＮＡポリメラーゼ形態を提供する。より具体的には、本発明は、充分なＲＮＡポリメラーゼ活性を有し、増強された可溶性を有して、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号１を含む核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドの場合よりも少なくとも３倍高い収率の活性ポリメラーゼを生じ、かつ以下の群から選択される核酸配列によってコードされる、単離されたポリペプチドを提供する：
（ａ）配列番号３の核酸配列（ΔＮをコードする）を含む核酸配列；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列（ΔＮのアミノ酸配列を有する）を含むポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｃ）遺伝子コードの縮重に起因して（ａ）または（ｂ）の核酸配列とは異なる核酸配列；
（ｄ）ストリンジェントな条件下で（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の核酸配列にハイブリダイズする核酸配列；および
（ｅ）配列番号４のアミノ酸７０９〜１４０２を含むポリペプチド、または配列番号２のアミノ酸２〜１４０２を有する配列までの、配列番号４のアミノ酸７０９〜１４０２を含むポリペプチドよりも長い任意の配列をコードする核酸配列；および
（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を示すアミノ酸配列をコードする核酸配列。
【００２４】
充分なＲＮＡポリメラーゼ活性とは、本明細書中で、上記のような核酸テンプレートの短いＲＮＡコピーおよび長いＲＮＡコピーを産生する、ポリメラーゼの測定可能な活性を意味する。この活性は、このポリメラーゼタンパク質がこの酵素の機能に充分な条件下で核酸テンプレートと接触する場合に測定可能であると規定され、この核酸産物は、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）染色によって検出され得る。
【００２５】
本発明のＲＮＡポリメラーゼの短縮形態をコードする核酸配列によって得られる収率は、全長配列によって得られる収率と比較してより高い。なぜなら、この産物は可溶性かつ活性な形態であるからである。言い換えれば、ＲＮＡポリメラーゼの短縮形態をコードする核酸配列によって得られた活性タンパク質の測定された量は、全長配列によって得られた量よりも高い。全長配列は主に凝集形態でタンパク質を産生し、従って可溶性タンパク質の測定された量はより低い。好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼの短縮形態によって得られた可溶性タンパク質の収率は、ＲＮＡポリメラーゼタンパク質の全長配列によって得られた収率よりも３倍高く、より好ましくは５倍高く、そして最も好ましくは１０倍高い。
【００２６】
本発明のＲＮＡポリメラーゼの最も好ましい短縮形態は、配列番号２のアミノ酸３７７〜１４０２を含むΔＮである。しかし、本発明のＲＮＡポリメラーゼの増強された収率は、ΔＮよりも長いアミノ酸配列（すなわち、１４０２アミノ酸を有する全長配列よりも短いが、配列番号２のＮ末端部分由来のアミノ酸を含む配列）をコードする核酸配列によっても得られ得る。短縮形態はまた、ΔＮよりも短いもの（すなわち、アミノ酸７０９〜アミノ酸１４０２よりも長いアミノ酸配列をコードする核酸配列）であり得る。Ｃｏｇｏｎｉら、１９９９は、全長ＱＤＥ−１およびアミノ酸７１０からアミノ酸１２８０まで伸びるＱＤＥ−１の５７０アミノ酸のフラグメントをコードするアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを開示している。この短縮配列は本発明者らの実験において活性かつ可溶性のＲＮＡポリメラーゼを産生せず、従って、これは、本発明において使用され得るポリペプチドではない。ＱＤＥ−１の全長アミノ酸配列は本発明の方法において使用され得るが、本発明のＲＮＡポリメラーゼの好ましい形態は本発明の可溶性のポリペプチドまたはタンパク質である。
【００２７】
本発明はまた、遺伝子コードの縮重に起因する、配列番号１または配列番号３あるいは配列番号２または配列番号４をコードする配列とは異なる核酸配列に関する。本発明はさらに、例えばＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）に記載されるような従来のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントな条件下で、配列番号１もしくは配列番号３または配列番号２もしくは配列番号４をコードする配列あるいは分解された配列にハイブリダイズする核酸配列に関する。高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハルト溶液および１００μｇの非特異的担体ＤＮＡの溶液中で、約６５℃から７０℃の間であり得る。好ましいプローブは配列番号３であり、これはΔＮをコードする。約０．２×〜０．１×ＳＳＣ未満のイオン強度で当量を有する溶液中で洗浄することによって、過剰なプローブが除去される。典型的な高いストリンジェンシーの洗浄は、５５℃で３０分間２回および６０℃で１５分間３回である。
【００２８】
本発明の核酸配列にハイブリダイズするこれらの核酸配列は、このような核酸配列を保有する任意の生物に原則的に由来し得る。好ましくは、これらの核酸配列は、本明細書中で前記したように真核生物由来である。本発明の核酸配列にハイブリダイズする核酸配列は、例えば、種々の生物のゲノムライブラリーから単離され得る。
【００２９】
このような核酸配列は、本発明の核酸配列またはこれらの配列のフラグメントあるいはこれらの分子の相補配列を使用することによって、例えば、標準的な技術（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１を参照のこと）に従うハイブリダイゼーションによって、同定および単離され得る。
【００３０】
ハイブリダイゼーションプローブとして、配列番号１と同じヌクレオチド配列またはこの配列のフラグメントを正確にまたは実質的に有する核酸分子を使用し得る。好ましくは、配列番号３のヌクレオチド配列が使用される。ハイブリダイゼーションプローブとして使用されるフラグメントはまた、その配列は本発明の核酸配列の配列と実質的に同一である、従来の合成技術によって得られた合成フラグメントであり得る。一旦本発明の核酸配列にハイブリダイズする遺伝子が同定および単離されると、その配列を決定してその配列によりコードされるタンパク質の特性を分析することが必要である。
【００３１】
「ハイブリダイズする核酸配列」という用語には、配列番号１または配列番号３のフラグメント、誘導体および対立遺伝子改変体であって、同一または実質的に類似のタンパク質あるいはその生物学的に活性なフラグメントをコードするものが含まれる。フラグメントは、記載されたタンパク質（または実質的に類似のタンパク質）あるいはその生物学的に活性なフラグメントをコードするのに充分な長さの核酸配列の部分である。これに関して本文の「誘導体」という用語は、これらの分子のヌクレオチド配列が１つまたは複数の位置で上記核酸分子の配列とは異なり、かつこの配列に高度に相同であることを意味する。
【００３２】
「％同一性」とは本明細書中で、対応する位置での同一のヌクレオチドまたはアミノ酸の最大量を与えるように２つのアミノ酸配列が整列される場合に、対応する位置に存在する同一なアミノ酸の百分率を意味する。本発明は、そのアミノ酸配列が配列番号２の特定のアミノ酸配列に対してアミノ酸レベルで少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、なおより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質に関する。同一性％は以下の式によって計算され得る：
（同一な残基の数）×１００％／（長い方の配列である配列番号２の長さ＝１４０２）＝同一性の百分率。
【００３３】
タンパク質操作は、改善された特性を保有する改変されたポリメラーゼを構築するために使用され得る。このような改変には、例えば、ポリメラーゼまたはタンパク質を、テンプレート特異性が低いかまたはより処理のしやすい（もしくは処理のしにくい）ものにするため、あるいはプライマー伸長、配列決定、核酸の増幅などのために酵素を最適化するために、ＱＤＥ−１ポリメラーゼもしくはそのフラグメントまたは実質的に類似の特性を有するタンパク質のアミノ酸配列に変異導入することが含まれ得る。
【００３４】
当該分野の実施形態において、いくつかの改変バージョンのＱＤＥ−１を生成して特徴付けた（図２Ａ）。改変タンパク質の１つはΔＮと称され、これはＱＤＥ−１のＮ末端部分を欠失させたものである。このタンパク質は、全長ＱＤＥ−１の酵素活性を保持し、そしてまた以下の２つのさらなる長所を有する：（１）精製されたΔＮの収率はＱＤＥ−１よりも高い、および（２）ΔＮは＋４℃で保存した場合にＱＤＥ−１よりも安定である（結果省略）。なお別の改変タンパク質として、そのＡｓｐ１０１１残基（全長ＱＤＥ−１について番号付けした）をＡｌａに転換する点変異を有するΔＮを得た。このタンパク質（ΔＮＤＡ）は、ポリメラーゼとして完全に不活性であった。Ａｓｐ１０１１は配列保存（図１Ｂ）に基づくとヌクレオチジル−トランスフェラーゼ反応の触媒に関与することが示唆され、この為に不活性であった可能性が高い。しかし、この変異はΔＮの全体的な折り畳みに影響を与えない。これは、ネイティブゲル電気泳動から明らかである（図３ＣおよびＤを参照のこと；一部結果省略）。
【００３５】
上記のＱＤＥ−１誘導体に加えて、２つの自然発生的なＱＤＥ−１変異体を精製形態で得て特徴付けした。これらは、１アミノ酸変化（Ｈ１１６１Ｙ）または４アミノ酸変化（Ｍ１３１Ｔ、Ｄ８９３Ｇ、Ａ１０００Ｔ、Ｆ１１２４Ｌ）のいずれかを含む全長ＱＤＥ−１タンパク質であった。興味深いことに、両方の変異体が検出可能なＲＮＡポリメラーゼ活性を保持し、全長ＲＮＡ産物および短いＲＮＡ産物の両方を産生できた。
【００３６】
本発明はまた、Ｎ．ｃｒａｓｓａ以外の生物由来の、ＲＮＡサイレンシング経路の精製されたＲｄＲＰタンパク質に関する。図１Ｂは、遺伝子データに従って、ＰＲＧＳに関与するいくつかのＲｄＲＰ様タンパク質を列挙している。本明細書中でポリメラーゼ活性を保有することが示されているＱＤＥ−１に対するそれらの配列類似性を考慮すると、これらの他のタンパク質の少なくともいくつかもまた、精製形態で提供された後にＲＮＡ合成を触媒し得ることが予測される。
【００３７】
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列、ならびに遺伝子発現に必要な調節配列と任意選択で連結されたこの核酸配列を含むベクター、そしてこのベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００３８】
本発明はさらに、ポリメラーゼタンパク質を産生するための方法を提供し、この方法はこのタンパク質の発現に適切な条件下で宿主細胞を培養する工程を含む。このタンパク質は、宿主細胞または培養培地から回収され得、任意選択で精製され得る。
【００３９】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡを産生するための方法を提供し、この方法は、
（ａ）ｓｓＲＮＡテンプレートまたはｓｓＤＮＡテンプレートを提供する工程；
（ｂ）このｓｓＲＮＡテンプレートを、ＲＮＡ合成に充分な条件下で本発明のタンパク質またはポリペプチドと接触させる工程、
を含む。
【００４０】
この反応混合物は、引き続く反応においてそのまま使用され得るか、または新たに賛成されたＲＮＡ種がこの反応混合物から回収され得る。
上記の方法において、工程（ａ）および（ｂ）は、同じ反応容器中で同時または連続的に実施され得る。
【００４１】
一本鎖ＲＮＡがテンプレートとして使用される場合、このｓｓＲＮＡテンプレートは、ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡテンプレートを転写することによって提供される。適切なＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼの例は、好ましくは、Ｔ７バクテリオファージ、Ｔ３バクテリオファージおよびＳＰ６バクテリオファージの群から選択されるバクテリオファージ由来である。
【００４２】
新たに産生されたＲＮＡ鎖は、テンプレートとアニールされてｄｓＲＮＡエレメントを形成するか、あるいはテンプレートから変性される。
この方法において、ＲＮＡ合成はプライマーなしで開始され得るが、ＲＮＡ合成は、ＲＮＡテンプレートまたはＤＮＡテンプレートと相補的な核酸プライマーの３’末端からも開始され得る。
【００４３】
ＲＮＡ合成のための反応混合物は、放射性同位体で任意選択で標識されているかまたは化学的に改変された少なくとも１種のヌクレオシド三リン酸、ｐＨ緩衝液、酢酸アンモニウム、ＰＥＧ、Ｍｇ２＋イオン、Ｍｎ２＋イオンおよび／または非イオン性界面活性剤を含む。この方法は、放射能によりまたは化学的に標識されたＲＮＡプローブを産生するために特に使用され得る。この方法はまた、新たに産生された標識されたＲＮＡを反応混合物の成分から精製する工程を含み得る。精製工程の後、この標識されたＲＮＡ種は、サザンブロット分析またはノザンブロット分析のためのプローブとして使用され得る。この標識されたＲＮＡはまた、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析のためのプローブとしてか、またはマイクロアレイ分析のためのプローブとして使用され得る。
【００４４】
本発明のポリペプチドまたはタンパク質は、種々の応用のため（例えば、核酸構造を研究するため、核酸−タンパク質相互作用を研究するため、およびｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡ干渉を誘導するためのＲＮＡトリガー分子を産生するため）に使用され得る。従って、本発明はまた、核酸の二次構造、好ましくはＲＮＡの二次構造を研究するための方法を提供する。この方法は、
（ａ）核酸標的分子、好ましくはＲＮＡ標的分子を提供する工程；
（ｂ）放射能によりまたは化学的に標識されたヌクレオチドをさらに含む混合物において、この標的分子をＲＮＡ合成に充分な条件下で本発明のタンパク質またはポリペプチドと接触させて、その結果この標的ＲＮＡの一本鎖エレメントが本発明のポリメラーゼによってコピーされる工程；
（ｃ）新たに産生された標識された核酸種を反応混合物から回収し、任意選択で精製する工程；
（ｄ）この標的分子の核酸フラグメントを含むマイクロアレイチップのためのプローブとして標識された核酸種を使用する工程；
（ｅ）このマイクロアレイ分析からのデータを解釈して、標的分子のどの部分が一本鎖であるかを推定する工程；および任意選択で
（ｆ）標的分子の二次構造または三次構造についてのモデルを構築する工程、を含む。
さらに、本発明は、核酸−タンパク質相互作用、好ましくはＲＮＡ−タンパク質相互作用を研究するための方法を提供する。この方法は、
（ａ）核酸標的および核酸結合タンパク質、好ましくはＲＮＡ標的およびＲＮＡ結合タンパク質を提供する工程；
（ｂ）標的−タンパク質相互作用に充分な条件下で、標的と実験混合物中のタンパク質の溶液とを接触させ、かつ別個の容器中でこの標的をこのタンパク質を欠く対照溶液と接触させる工程；
（ｃ）ＲＮＡ合成に充分な条件下で、本発明のタンパク質またはポリペプチドと、実験混合物および対照混合物を接触させる工程；
（ｄ）新たに産生された標識された核酸種を両方の反応混合物から回収し、任意選択で精製する工程；
（ｅ）この標的の核酸フラグメントを含む２つの同一なマイクロアレイチップのためのプローブとして２セットの標識された核酸種を使用する工程；
（ｆ）２つのマイクロアレイ分析からのデータを解釈して、標的分子のどの部分がＲＮＡ合成のためにアクセス可能であるかを推定する工程；
（ｇ）２つのデータセットを比較して、実験混合物中の標的と対照混合物中の標的との間の差異を決定する工程；および任意選択で
（ｈ）２つのデータセット間の差異を、核酸−タンパク質相互作用についてのモデルとして解釈する工程、を含む。
さらに、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡ干渉を誘導するためのＲＮＡトリガー分子を産生するための方法を提供する。この方法は、
（ａ）ＲＮＡテンプレートまたはＤＮＡテンプレートを提供する工程；
（ｂ）核酸テンプレート、本発明のタンパク質、ヌクレオシド三リン酸および任意選択でｐＨ緩衝液、酢酸アンモニウム、ＰＥＧ、Ｍｇ２＋イオン、Ｍｎ２＋イオンおよび／または非イオン性界面活性剤を含む混合物中で、ＲＮＡ合成に充分な条件下で、このＲＮＡテンプレートまたはＤＮＡテンプレートを本発明のタンパク質またはポリペプチドと接触させる工程；および
（ｃ）ＲＮＡ合成に充分な温度でこの反応混合物をインキュベートする工程、を含む。
この方法において、ＲＮＡテンプレートまたはＤＮＡテンプレートは細胞またはウイルス起源であり得る。このＲＮＡテンプレートは、好ましくはＴ７バクテリオファージ、Ｔ３バクテリオファージおよびＳＰ６バクテリオファージの群から選択されるバクテリオファージ由来のＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡテンプレートを転写することによって得られ得る。
この方法において、工程（ａ）および（ｂ）は、同じ反応容器中で同時または連続的に実施され得る。
【００４５】
本発明はまた、本発明のタンパク質またはポリペプチドを含むキットを提供する。このキットは、検出可能なレベルのＲＮＡ合成に必要な添加剤をさらに含み得る。このキットは、例えば、ＲＮＡ合成に充分な濃度でヌクレオシド三リン酸（少なくとも１種のヌクレオシド三リン酸が、放射性同位体で標識されているかまたは化学的に改変されている）および／または本発明のタンパク質もしくはポリペプチドによるＲＮＡ合成のためのテンプレートとして働く特徴付けられた能力を有する標準的な核酸調製物を含み得る。
【００４６】
本発明の主な利点は、この可溶性ポリメラーゼが組換え供給源から得られることである。なぜなら、これは高いタンパク質収率を確実にし、かつまた分子アプローチを使用してポリメラーゼの特性を変更することを可能にするからである。本発明の好ましいポリメラーゼである真菌Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａに起源するＱＤＥ−１タンパク質およびその遺伝学的に変更された形態は、多数のＲＮＡテンプレートをｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用して、２つのタイプの娘ＲＮＡ鎖（短い（７〜４０ｎｔ、好ましくは９〜２１ｎｔ）娘ＲＮＡ鎖および長い（テンプレート長までの）娘ＲＮＡ鎖）を生成し得る。このポリメラーゼタンパク質はＲＮＡ合成の開始のためにプライマーを必要としないが、プライマーからＲＮＡ合成を開始することもできる。
【００４７】
ＱＤＥ−１、ΔＮおよびそれらの誘導体のいくつかによるＲＮＡ合成の効率は充分高く、従ってこのことは、ＲＮＡ産物が多数の実用上の適用のため（例えば、ハイブリダイゼーションに基づく技術のためのＲＮＡプローブを産生するため、または生きた生物においてＲＮＡサイレンシングを誘導するためのＲＮＡトリガーを産生するため）に有利に使用され得ることを示唆する。
【００４８】
（２．本発明のポリメラーゼタンパク質の調製）
本発明は、本発明のタンパク質、好ましくはＮ．ｃｒａｓｓａのＱＤＥ−１タンパク質またはＱＤＥ−１の遺伝学的誘導体の発現および精製の方法を提供する。この方法は、
（ａ）本発明のポリメラーゼタンパク質をコードする配列を有する核酸を含む細胞を培養して、この核酸からタンパク質を発現させる工程；
（ｂ）宿主または培養培地からこのタンパク質を回収する工程；および
（ｃ）少なくとも１回のクロマトグラフィー工程を使用してこのタンパク質を精製する工程、を含む。
【００４９】
本発明の核酸配列は、発現ベクター中の調節エレメントに連結され得、このベクターは、本発明のタンパク質を産生するために選択された宿主細胞中に導入される。当該分野のポリメラーゼの発現は、任意の適切な宿主細胞（例えば、動物、植物、真菌または細菌の細胞）において達成され得る。好ましい本発明の実施形態においては、発現宿主はパン酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを用いた。
【００５０】
宿主細胞におけるその合成の際に、このタンパク質は、以下を含む工程によって好ましくは単離および精製される：
（ａ）宿主細胞を緩衝液中で破壊して、細胞溶解物を得る工程；
（ｂ）遠心分離によってこの溶解物を透明化する工程；
（ｃ）少なくとも１回のクロマトグラフィー工程（好ましくは固定化金属−アフィニティクロマトグラフィー）を使用してこのタンパク質を精製して、ヌクレアーゼ活性およびプロテアーゼ活性を本質的に有さない画分を得る工程。
【００５１】
「ヌクレアーゼおよびプロテアーゼを本質的に有さない」とは本明細書中で、精製されたタンパク質調製物が、検出可能な量のヌクレアーゼおよび／またはプロテアーゼを含まないことを意味する。
特定の実施形態として、ＱＤＥ−１ポリメラーゼおよびその酵素的に活性なＮ末端短縮バージョン（ΔＮ）の発現および精製は、実施例１に記載される。
【００５２】
（３．反応条件）
細胞性ＲｄＲＰの発現および精製のための方法に加えて、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＲＮＡ合成のための方法およびキットにも関する。
その一般的な形態において、ＲＮＡ合成のための方法は以下の工程を含む：
（ａ）ＲＮＡテンプレートまたはＤＮＡテンプレートを提供する工程；
（ｂ）このテンプレートを、ＲＮＡ合成に充分な条件下で本発明のタンパク質と接触させる工程；および任意選択で
（ｃ）新たに産生された核酸種をこの反応混合物から回収する工程。
本発明の特定の実施形態によれば、ＲＮＡ合成のための混合物は実施例２に列挙される成分を含む。この反応混合物は、３０℃で１時間インキュベートされる。幾分変更された条件もまた、検出可能なレベルのＲＮＡ合成をなし得る。具体的には、改変された条件は、以下の群から選択される１つまたはいくつかの変化を意味し得る：
（１）異なる最終濃度の反応混合物中の本発明のタンパク質（好ましくは０．１μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ）；
（２）異なる濃度のヌクレオシド三リン酸（好ましくは０．１ｍＭ〜４ｍＭの各ＮＴＰ）；
（３）異なる濃度のＭｎＣｌ２（好ましくは０ｍＭ〜４ｍＭ）；
（４）異なるインキュベーション温度（好ましくは１５℃〜４２℃）。
【００５３】
（３．１．ＲＮＡテンプレート）
ＲＮＡ合成のための現在好ましい方法は、以下の工程を含む：
（ａ）好ましくは４０μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌの最終濃度で一本鎖ＲＮＡテンプレートを提供する工程；
（ｂ）ｐＨ緩衝液（好ましくはＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８））、Ｍｇ２＋イオン（好ましくは５ｍＭ〜１０ｍＭ）、ヌクレオシド三リン酸（好ましくは０．２ｍＭ〜１ｍＭの各ＮＴＰ）、および任意選択でＭｎ２＋イオン（好ましくは２ｍＭまで）および非イオン性界面活性剤（好ましくは０．１％〜０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）をさらに含む混合物中で、ＲＮＡ合成に充分な条件下でこのＲＮＡテンプレートを本発明のタンパク質（好ましくは１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ）と接触させる工程；
（ｃ）この反応混合物を許容温度（好ましくは２０℃〜３７℃）でインキュベートする工程；および任意選択で
（ｄ）新たに産生された核酸種をこの反応混合物から回収する工程。
【００５４】
本発明のポリメラーゼ、最も好ましくはΔＮおよびＱＤＥ−１の他の誘導体が、広範なｓｓＲＮＡテンプレートを受容して投入ＲＮＡの全てまたはかなりの部分を二本鎖形態に転換することは、非常に有利である（詳細については実施例２および関連の図を参照のこと）。以下の２つの別個のタイプの反応産物がテンプレート配列に関わらず生成されることもまた有利である：（１）テンプレート長に近いかまたはテンプレート長と等しい長いＲＮＡコピーおよび（２）テンプレート長に沿って分散した７〜４０ｎｔ、主に９〜２１ヌクレオチド長の短いＲＮＡオリゴヌクレオチド（本発明の目的のためにｓＲＮＡと称される）（詳細については実施例２および関連の図を参照のこと）。現在好ましい条件下で、両方のタイプのＲＮＡ産物は、そのコーディングテンプレートに結合してｄｓＲＮＡエレメントを形成したままである。二重重合機構に基づいて、本発明者らは転写後遺伝子サイレンシングにおける本発明のＲｄＲＰの役割についての新規のモデルを提唱する（図１１）。
【００５５】
重要なことに、適切な条件を選択することにより、新たに産生された長いＲＮＡコピーと短いＲＮＡコピーとの間の比率を調整することが可能である。特定の例において、二価金属イオン（例えば、Ｍｎ２＋およびＣａ２＋）の濃度は、２つの異なるタイプの反応産物の相対的な量を変化させ得る（図３Ｅ）。さらに、反応条件はまた、所定のＲＮＡテンプレートに対して産生された短いＲＮＡの長さ分布をも調整し得る。図８は、現在好ましい実施形態において、ポリアミンであるスペルミジンの添加が短いＲＮＡの分布をより短い種のほうにシフトさせることを実証している。
【００５６】
本発明の特定の実施形態において、ＱＤＥ−１により触媒されるＲＮＡ合成のためのｓｓＲＮＡテンプレートは、ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡテンプレートを転写することによって提供され得る。好ましくは、このＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼはバクテリオファージ由来である。このバクテリオファージがＴ７バクテリオファージ、Ｔ３バクテリオファージおよびＳＰ６バクテリオファージからなる群から選択されることが最も有利である。当該分野のいくつかの実施形態において、ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡテンプレートの転写およびＱＤＥ−１により触媒される新たに産生された線状ｓｓＲＮＡの複製は、同じ容器中で生じ得る。後者のアプローチの可能性を実証するために、特別な実験を実施した（図１４を参照のこと）。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含む線状ｄｓＲＮＡ（すなわち、ＸｈｏＩで切断したｐＴＺｌｕｃ（−ストップ））を、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびＮ末端短縮バージョンのＱＤＥ−１ポリメラーゼ（ΔＮ）と共に３５℃でインキュベートした。両方のポリメラーゼをこの反応混合物に添加した場合、その反応産物はｓｓＲＮＡおよび異なる形態のｄｓＲＮＡの混合物を本質的に含み、その一方でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのみが存在する場合にはｓｓＲＮＡのみが形成された。
【００５７】
好ましい実施形態において、インタクトなｄｓＲＮＡテンプレート（例えば、ｄｓＲＮＡウイルスのゲノムセグメント）は、検出可能なＲＮＡ合成を指向するために本発明のポリメラーゼによって使用され得ない（図１０Ａ）。しかし、例えば、１分間の煮沸によって反応前に変性されるｄｓＲＮＡは、テンプレートとして有効に受容され得る（結果省略）。
【００５８】
本発明の特定の実施形態において、単離されたＱＤＥ−１ポリメラーゼおよびΔＮポリメラーゼは、ＲＮＡテンプレートにアニールした相補的オリゴヌクレオチドの３’末端からＲＮＡ合成を開始し得る（図１０Ｂ、１０Ｃ、または結果省略。このプライムされたＲＮＡ合成は、特定の実用上の応用（例えば、プライマー伸長方法）のために将来目的となり得る。
【００５９】
（３．２．ＤＮＡテンプレート）
当該分野のいくつかのさらなる実施形態によれば、１セットの一本鎖ＤＮＡ（Ｍ１３ファージ線状ｓｓＤＮＡまたは線状化して熱変性したプラスミドＤＮＡ）は、一本鎖ＲＮＡについての上記と類似の条件下で、ＱＤＥ−１およびΔＮを用いて複製可能であることが示された（図１３および結果省略）。この反応は、テンプレートＤＮＡおよび新たに産生されたＲＮＡレプリカからなる二重鎖を生じる。従って、本発明はｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡを産生するための方法に関し、この方法は、
（ａ）有効に一本鎖の形態でＤＮＡテンプレートを提供する工程；
（ｂ）このＤＮＡテンプレートをＲＮＡ合成に充分な条件下で本発明のタンパク質と接触させる工程；および任意選択で
（ｃ）新たに産生されたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド産物をこの反応混合物から回収する工程、を含む。
ＤＮＡによりプログラムされた反応は、ＲＮＡ形態へのＤＮＡ配列の転写を必要とする方法のために潜在的に有用であり得る。
【００６０】
（４．本発明のポリメラーゼの実用上の適用）
上記の知見に基づいて、本発明は、異なる核酸テンプレートと接触させた本発明のポリメラーゼを使用してＲＮＡを産生するための方法を提供する。これらの方法のいくつかは、いくつかの下流の適用（例えば、干渉するＲＮＡおよびプローブとして使用され得る放射能によりまたは化学的に標識されたＲＮＡを産生すること）のために特に適切である。
【００６１】
（４．１．ＲＮＡ干渉）
本発明は、動物および原生動物においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）ならびに他の真核生物においてＲＮＡサイレンシングとして公知の関連の現象を誘導し得るＲＮＡを産生するための方法に関する。この方法は以下の工程を含む：
（ａ）一本鎖ＲＮＡテンプレートを提供する工程；
（ｂ）この一本鎖核酸テンプレートの少なくとも一部を、二本鎖エレメントを含む産物へと転換するために、ＲＮＡ合成に充分な条件下でこの一本鎖ＲＮＡを本発明のタンパク質と接触させる工程；
（ｃ）充分に精製された形態でこの産物をこの反応混合物から回収する工程；
（ｄ）適切な真核生物系を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでこのＲＮＡ産物のＲＮＡｉ活性をアッセイする工程。
【００６２】
特定の実施形態において、この適切な真核生物系は生きた線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓである。ＲＮＡｉを誘導するために、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）のｍＲＮＡを、ＱＤＥ−１またはΔＮを使用してｄｓＲＮＡ産物に最初に転換した。ＧＦＰを発現する組換えＣ．ｅｌｅｇａｎｓを、この産物を含む溶液中に浸し、その遺伝子サイレンシング効果を、Ｆ１子孫において下限を下回る蛍光を示す虫の百分率としてスコアリングした（図１５）。ＲＮＡサイレンシング機構を支持する他の生物もまた、（背景技術に記載されるように）他の実施形態における潜在的な標的であり得、ｄｓＲＮＡ産物を生物または細胞中に指向させる方法はまた、浸す、注射する、バリスティック、リポフェクションまたは他の送達方法を使用することも可能である。
【００６３】
ＲＮＡｉを誘導する先行技術に記載された方法は通常、ＲＮＡｉ実験のために使用され得るｄｓＲＮＡ分子を形成するように、サイレンシングすべき遺伝子に対して相同なセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡの合成、これら２つの相補的ＲＮＡの引き続く精製ならびにそれらのアニーリングに依存する。図１４に示されるように、本発明は、ｄｓＲＮＡトリガーがＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼを用いた目的の遺伝子の転写と同時に生成され得るという利点を提供する。この連結された系は、センス−アンチセンスアニーリングストラテジーよりも速くて作業が少なく、かつ数千の異なる遺伝子がサイレンシングされかつその対応する現象が決定される必要がある場合、ハイスループットＲＮＡｉ方法に特に歓迎される（更なる詳細については、Ｂａｒｓｔｅａｄ、２００１；Ｆｒａｓｅｒら、２０００；Ｇｏｎｃｚｙら、２０００；Ｍａｅｄａら、２００１を参照のこと）。
【００６４】
本発明の特定の実施形態において、ＲＮＡｉを誘導するためのｄｓＲＮＡトリガー分子は、以下の工程を含む方法に従って、一本鎖ＤＮＡテンプレートを有効に使用して本発明のポリメラーゼによって産生され得る：
（ａ）一本鎖形態でＤＮＡテンプレートを提供する工程；
（ｂ）このＤＮＡテンプレートをＲＮＡ合成に充分な条件下で本発明のタンパク質と接触させる工程；
（ｃ）そのコーディングＤＮＡテンプレートから、新たに産生されたＲＮＡ産物を解離させる工程；
（ｄ）同じ反応混合物または新たな反応混合物中で、ｄｓＲＮＡ産物が形成されるように、ＲＮＡ合成に充分な条件下でこの解離したＲＮＡ産物を本発明のタンパク質と接触させる工程；
（ｅ）充分に精製された形態でこのｄｓＲＮＡ産物をこの反応混合物から回収する工程；
（ｆ）適切な真核生物系を使用して、このＲＮＡ産物のＲＮＡｉ活性をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイする工程。
【００６５】
（４．２．放射能により標識されていないＲＮＡの生成）
未標識または放射能により標識されたヌクレオシド三リン酸に加えて、本発明のポリメラーゼは、化学的に改変されたヌクレオチドをＲＮＡ産物中に取り込み得る。このことにより、非放射能方法により（例えば、蛍光または化学ルミネセンスの検出に基づくもの）を使用してＲＮＡ合成をアッセイすることが可能となる。
【００６６】
好ましい実施形態においては、ｓｓＲＮＡテンプレートを含む標準的なＲＮＡ重合混合物に、クマリン−５−ＣＴＰまたはビオチン−１１−ＣＴＰを補充した。反応を３０℃で１時間インキュベートした。次いでこの反応混合物をゲル濾過スピンカラムを通過させて、反応していないヌクレオチドアナログおよび他の低分子量混入物からＲＮＡ産物を精製した。次いで、新たに産生されたＲＮＡへのヌクレオチドアナログの取り込みを、分光蛍光計（クマリン−５−ＣＴＰの場合）またはドットブロットアッセイ（ビオチン−１１−ＣＴＰの場合）を使用して、フロースルー画分を測定した。両方の場合において、改変されたヌクレオチドの検出可能な部分は、ＲＮＡ産物中に取り込まれた（図１２）。
【００６７】
（４．３．プローブとしての標識されたＲＮＡの使用）
精製された細胞性ＲｄＲＰによって生成された標識されたＲＮＡ産物が、放射能検出または非放射能検出に基づいてさらなる応用のためのＲＮＡプローブとして使用されることもまた、本発明の範囲に含まれる。このような適用の例には、マイクロアレイ技術、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションならびにノザンブロッティングおよびサザンブロッティングが含まれる。本発明のＲｄＲＰが、７〜４０ｎｔ、主に９〜２１ヌクレオチドの好ましい長さを有する短い相補的ｓＲＮＡのかなりの量を産生し得ることは、この応用について、非常に大きな利点である。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態において、反応産物の短いＲＮＡの画分は、変性ゲル電気泳動を使用して、テンプレートおよび長いＲＮＡ産物から精製される（図９Ａ）。例えば、変性条件下でのゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィーを使用した精製のような、他の精製方法もまた可能である。図９Ｃで報告されるように、短いＲＮＡの回収された画分は、引き続き行われるハイブリダイゼーション手順に適切である。本発明のポリメラーゼが全テンプレート長に沿って分散した短いＲＮＡを生成することは、（図９から結論付けられるように）このハイブリダイゼーション手順にとって明らかに利益になる。
【００６９】
（４．４．核酸構造および核酸−タンパク質相互作用を研究するための特殊化された適用）
図８中に示される実験から明らかなように、短いＲＮＡは、有効に一本鎖であって安定な二次構造にも三次構造にも関与しないテンプレートＲＮＡのエレメントに対して産生される。本発明のポリメラーゼのこの特性は、本質的に任意の所定のｓｓＲＮＡ標的（またはｓｓＤＮＡ標的）の二次構造および／または三次構造への洞察を得るための新規な技術を示唆する。現在好ましいバージョンにおいて、この方法は以下の工程を含む：
（ａ）提供されたｓｓＲＮＡ標的が、標識されたｓＲＮＡの合成に充分な条件下で、本発明のポリメラーゼと共に最初にインキュベートされる工程；
（ｂ）標識された短いＲＮＡがこの反応混合物から回収されて、例えば、ゲル電気泳動および／またはクロマトグラフィーを使用して、テンプレートおよび長いＲＮＡ産物から任意選択で精製される工程；
（ｃ）短いＲＮＡ画分が、ＲＮＡ標的の核酸フラグメントを含むマイクロアレイチップ、好ましくは合成オリゴヌクレオチドのアレイを探索するために使用される工程；
（ｄ）次いで、マイクロアレイ分析由来のデータが解釈されて、標的分子の部分が有効に一本鎖であることが推定される工程；および任意選択で
（ｅ）標的ＲＮＡ分子の二次構造または三次構造についてのモデルが構築される工程。
ＲＮＡ−タンパク質相互作用を研究するために上記のアルゴリズムを適合させることも可能である。ＲＮＡ標的へのタンパク質の結合は、結合部位のアクセス可能性を減少させなければならず、かつ同様にＲＮＡの二次構造および三次構造を変更させ得る。従って、ＲＮＡ−タンパク質相互作用についての情報は、以下の２つのデータセットを比較することから収集され得る：１つのデータセットは個々のＲＮＡ標的についてのもの、他の１つのデータセットはＲＮＡ標的とＲＮＡ結合タンパク質との混合物についてのものである。その現在好ましい形態において、ＲＮＡ−タンパク質相互作用を研究するための方法は以下の通りである：
（ａ）ＲＮＡ分子およびＲＮＡ結合タンパク質を提供する工程；
（ｂ）実験混合物を形成するように、ＲＮＡ−タンパク質相互作用に充分な条件下でこのＲＮＡおよびＲＮＡ結合タンパク質の溶液を接触させ、かつ別個の容器中で、対照混合物を形成するように、このＲＮＡをこのＲＮＡ結合タンパク質を欠く対照溶液と接触させる工程；
（ｃ）この実験混合物および対照混合物を、ＲＮＡ合成に充分な条件下で本発明のタンパク質と接触させる工程；
（ｄ）新たに産生された標識された核酸種を両方の反応混合物から回収し、任意選択で精製する工程；
（ｅ）このＲＮＡ標的の核酸フラグメントを含む２つの同一なマイクロアレイチップのためのプローブとして２セットの標識された核酸種を使用する工程；
（ｆ）２つのマイクロアレイ分析からのデータを解釈して、標的分子のどの部分が短いＲＮＡの合成のためにアクセス可能であるかを推定する工程；
（ｇ）２つのデータセットを比較して、実験混合物中のＲＮＡと対照混合物中のＲＮＡとの間の差異を決定する工程；および任意選択で
（ｈ）２つのデータセット間の差異を、ＲＮＡ−タンパク質相互作用についてのモデルとして解釈する工程。
【００７０】
ＲＮＡ構造およびＲＮＡ−タンパク質相互作用を研究するための新規の方法は、非常に長いＲＮＡ標的（例えば、１ｋｂより長いｓｓＲＮＡ）に適用され得る。これは、ＲＮＡ分子の化学的探索または酵素的探索を含む以前に記載された技術を超える明らかな利点であり、数百ヌクレオチドに限定される小さいＲＮＡフラグメントについての情報を生じる。
【００７１】
現在好ましい実施形態においては、上記の両方法はｓｓＲＮＡ標的およびＲＮＡ結合タンパク質を用いて実施されるが、他の実施形態において、ｓｓＤＮＡの空間的構造およびＤＮＡ−タンパク質相互作用についての情報を得るために、ｓｓＤＮＡ標的およびｓｓＤＮＡ結合タンパク質がそれぞれ使用され得る。
本発明のさらなる態様および利点は、添付の実施例および特許請求の範囲から明らかとなる。
【実施例１】
【００７２】
（組換え可溶性ＱＤＥ−１およびその遺伝学的誘導体の発現および精製）
（細胞性ＲｄＲＰ様タンパク質の配列分析）
ＰＴＧＳに関与することが遺伝学的に示された、トマトＲｄＲＰおよび細胞性ＲｄＲＰ様タンパク質のアミノ酸配列を、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４）を使用して整列させた。アラインメントデータに対して構築された類似性プロットは、これらのタンパク質のアミノ末端が、カルボキシ末端部分よりも目だって異なっている（２０％未満の類似性）ことを実証する（図１Ｂ）。この保存された領域内で、１つの特定の範囲が最も高い類似性を示している（図１Ｂ中の「ＨＳ」；および図１Ｃ）。ＲｄＲＰ様タンパク質が実際にＲＮＡ重合活性を保有する場合、この機能に必須のエレメントは、おそらくＣ末端ドメイン内の残基である。ウイルス性ＲｄＲＰにおいて、モチーフＡおよびモチーフＣ内に位置する２つの保存されたカルボキシレートは、ヌクレオチジル転移を触媒する（Ｂｕｔｃｈｅｒら、２００１；Ｈａｎｓｅｎら、１９９７；Ｓｔｅｉｔｚ、１９９８）。配列の状況に基づいて、ＨＳ配列内のＧＳＤＬＤＧＤＸ（配列番号１３）（Ｘは任意のアミノ酸であり得る）ブロック由来の３番目のアスパラギン酸は、ウイルス性ＲｄＲＰのＣモチーフ由来の触媒的アスパラギン酸（ＧＤＤ／Ｎ；Ｐｏｃｈら、１９８９）に対応し得る。
【００７３】
（発現プラスミドの構築）
Ｈｉｓタグ化全長ＱＤＥ−１をコードするＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現プラスミド（ｐＥＭ４１）を構築するために、野生型のイントロンのないＱＤＥ−１遺伝子を、Ｔｕｒｂｏ  Ｐｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびＴａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ＤＮＡポリメラーゼならびにプライマー５’−ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＴＧＡＡＣＣＣＴＡＴＴＡＣＴＣＣＴＡ−３’（配列番号７）（ｑｄｅ１＿ｕｐ３）および５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＡＡＴＣＧＣＣＡＴＴＣＣＣＴＧＴＧＡ−３（配列番号８）（ｑｄｅ１＿ｄｏｗｎ３）の混合物を使用して、Ｎ．ｃｒａｓｓａのゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化したＰＣＲフラグメントをゲル濾過し、同様に切断したベクターｐＹＥＳ２／ＣＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とライゲーションさせた。ＱＤＥ−１インサートの配列をいくつかのｐＥＭ４１クローンで配列決定した。アミノ酸レベルで以前に公開された配列と異ならなかった１つのクローンをさらなる実験のために選択した。
【００７４】
ΔＮ（１ａａ〜３７６ａａを欠くＱＤＥ−１）をコードする２つのプラスミド（ｐＥＭ４２およびｐＥＭ４６）を構築した。この目的のためにＱＤＥ−１遺伝子の３’末端部分を、ｐＥＭ４１から、Ｔｕｒｂｏ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼならびにプライマー５’−ＧＣＴＣＡＡＡＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＣＧＧＡＧＣＧＡＡＧＡＡＡ−３’（配列番号９）（ｑｄｅ１＿ｕｐ２）および５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＡＴＣＧＣＣＡＴＴＣＣＣＴＧＴＧＡ−３’（配列番号１０）（ｑｄｅ１＿ｄｏｗｎ１）を使用して増幅した。このＰＣＲフラグメントをＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩで処理して、同様に切断したベクターｐＥＴ２１ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ）とライゲーションさせて、Ｅ．ｃｏｌｉ発現プラスミドｐＥＭ４２を得た。ＱＤＥ−１のＮｃｏＩ−Ｅｃｏ８１ＩフラグメントをｐＥＭ４２から切り出してｐＥＭ４１中に挿入して、ＱＤＥ−１のＨｉｎｄＩＩＩ−Ｅｃｏ８１Ｉフラグメントを置換し、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した末端を、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントで満たした。得られたプラスミドｐＥＭ４６を使用して、Ｈｉｓタグ化ＱＤＥ−１ΔＮをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて産生した。
【００７５】
（発現および精製）
発現プラスミドｐＥＭ４１を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩＮＶＳｃｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｈｉｓ３Δ１／ｈｉｓ３Δ１  ｌｅｕ２／ｌｅｕ２  ｔｒｐ１−２８９／ｔｒｐ１−２８９  ｕｒａ３−５２／ｕｒａ３−５２）中に導入し、ＱＤＥ−１発現をガラクトースで誘導した。クマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判断されるように、これらの細胞は、誘導されていないＩＮＶＳｃｌ（ｐＥＭ４１）対照および誘導されたＩＮＶＳｃｌ（ｐＹＥＳ２／ＣＴ）対照中には存在しなかった約１６３ｋＤａのタンパク質を産生した。Ｈｉｓタグ特異的抗体がウエスタンブロット上のタンパク質を認識し、このことはその同一性をさらに確認する（データは示さず）。最初の精製実験において、誘導されたＩＮＶＳｃｌ（ｐＥＭ４１）細胞を、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液中で破壊した。これらの条件下で、１６３ｋＤａタンパク質のほとんどは不溶性形態であった。上清画分は、主に低分子量の小量のＨｉｓタグ化種を含んだ（結果省略）。従って本発明者らは、細胞破壊緩衝液中のＮａＣｌの濃度を１Ｍに増大させて非イオン性界面活性剤を導入することによって、細胞破壊緩衝液を最適化した。さらに、そのｐＨを９．３に増大させて、Ｈｉｓタグ化ＱＤＥ−１の理論上の等電点（約８．４のｐＩ）から離し、プロテアーゼインヒビターカクテルを使用してタンパク質分解を妨げた。これらの条件下で、全長ＱＤＥ−１の約３分の１を、ニッケルキレートカラムでの１工程の精製によって純粋な可溶性形態で回収することができた（図２Ａ）。類似の発現および精製ストラテジーを利用して、Ｎ末端から３７６ａａを欠く可溶性の短縮型ＱＤＥ−１（ΔＮ）ならびに可能性のある触媒的アスパラギン酸を破壊するＤ１０１１Ａ点変異を有するΔＮ（ΔＮＤＡ；全長ＱＤＥ−１についての番号付け）を得た（図２Ａ；および図１Ｃを参照のこと）。精製されたタンパク質の典型的な収率は、酵母培地１Ｌ当たり約０．５ｍｇ（ＱＤＥ−１）または３〜５ｍｇ（ΔＮおよびΔＮＤＡ）であった。現在好ましい発現プロトコルおよび精製プロトコルは以下の通りである：
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ培養物（４０ｍｌ）を、ＳＣ−Ｕｒａ，＋Ｇｌｕ最小培地中で２４０ｒｐｍでＯＤ６００が約３になるまで３０℃で一晩増殖させた。これらの細胞を室温で１５００ｇで５分間遠心分離することによって収集し、２０ｍｌのＳＣ−Ｕｒａ，＋Ｒａｆで１回洗浄して、０．４の最終ＯＤ６００になるように３００ｍｌのＳＣ−Ｕｒａ，＋Ｇｌｕ，＋Ｒａｆ中に再懸濁した。攪拌を２８℃で２２時間継続した。次いでこれらの細胞を４℃で５０００ｇで５分間遠心分離することによって回収し、１００ｍｌの氷冷水で洗浄し、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ  ＥＤＴＡフリープロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ；７．５ｍｌ当たり１錠）を含む１５ｍｌの氷冷緩衝液Ｈ−５（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．３）；１Ｍ  ＮａＣｌ；１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０；５％  グリセロール；５ｍＭ  イミダゾール）中に再懸濁した。この懸濁物を、必要になるまで５ｍｌのアリコート中で−８０℃で保存した。タンパク質精製を４℃で実施した。解凍した細胞懸濁物（５ｍｌ）を、予め冷却したフレンチプレスセルに約２０，０００ｐｓｉで２回通過させた。最初の通過後に、ＰＭＳＦを１ｍＭになるように添加した。あるいは、これらの細胞を酸洗浄されたガラスビーズと共に攪拌することによって破壊した。この溶解物を１３，０００ｇで１５分間遠心分離し、その上清を、緩衝液Ｍ−５（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．９）；３００ｍＭ  ＮａＣｌ；０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０；５ｍＭ  イミダゾール）で平衡化した１ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）上にロードした。このカラムを２０ｍｌのＭ−５および１０ｍｌのＭ−５０（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．９）；３００ｍＭ  ＮａＣｌ；０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０；５０ｍＭ  イミダゾール）で洗浄した。組換えタンパク質を、Ｍ−２００（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．９）；３００ｍＭ  ＮａＣｌ；０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０；２００ｍＭ  イミダゾール）を用いてこのカラムから溶出させた。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、タンパク質濃度を、タンパク質バンドを既知量のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むバンドと比較することによって決定した。精製したタンパク質を、比活性の検出可能な損失なしで、氷上で少なくとも２週間保存した。ネガティブ対照として、本発明者らはｐＹＥＳ２／ＣＴプラスミドおよびｐＹＥＳ２／ＣＴ／ｌａｃＺプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＩＮＶＳｃｌ細胞を使用した。
【００７６】
ＱＤＥ−１由来のΔＮタンパク質はまた、以前に公開された発現プロトコル（ＭａｋｅｙｅｖおよびＢａｍｆｏｒｄ、２０００）を使用してｐＥＭ４２で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）においても産生できた。しかし、この組換えタンパク質は、本発明者らの最適化にもかかわらず、不溶性形態であった（結果省略）。
【実施例２】
【００７７】
（ＱＤＥ−１およびその誘導体のＲＮＡ重合活性の特徴付け）
（ＲＮＡテンプレート）
ＲｄＲＰアッセイのための合成ｓｓＲＮＡテンプレートを、原則的に記載されるように（Ｇｕｒｅｖｉｃｈら、１９９１；Ｍａｋｅｙｅｖら、１９９６）、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏのラン−オフ転写によって調製した。この目的のために使用したプラスミドについての参考文献は、図の注釈中に示す。プラスミドｐＥＭ５４を、ルシフェラーゼ遺伝子のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ  ５’末端フラグメントを欠失させることによって、ｐＴＺｌｕｃ（−ストップ）（Ｍａｋｅｙｅｖら、１９９６）から誘導した。ウイルス性ＲＮＡを、精製したウイルス粒子（φ６、ＬＡおよびＴＭＶ）から、フェノールおよびクロロホルムを用いて抽出し、エタノールで沈殿させ、水または１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ中に溶解させた。ＲＮＡ濃度を、２６０ｎｍでの光学密度によって測定し、その品質を標準的なアガロースゲルまたは／およびホルムアルデヒド含有アガロースゲルでの電気泳動によって決定した（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１）。
【００７８】
（精製したＱＤＥ−１はｉｎ  ｖｉｔｒｏで酵素的に活性である）
単離されたＱＤＥ−１を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、２０ｍＭ  酢酸アンモニウム（ＮＨ４ＯＡｃ）、６％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、各１ｍＭのＡＴＰおよびＧＴＰ、各０．２ｍＭのＣＴＰおよびＵＴＰ、０．８単位／μｌ  ＲＮａｓｉｎならびに０．１ｍＣｉ／ｍｌの［α−３２Ｐ］ＵＴＰ（約３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む１０μｌの反応混合物において、その潜在的なＲｄＲＰ活性についてアッセイした。９０μｇ／ｍｌのホタルルシフェラーゼ（ｌｕｃ）ｍＲＮＡをテンプレートとして使用した。反応を、ポリメラーゼ調製物または緩衝液Ｍ−２００の添加によって開始し、次に３０℃で１時間インキュベートした。反応産物を、標準的なアガロースゲル電気泳動とその後のオートラジオグラフィーによって分析した。混合物中のＱＤＥ−１の存在は、２つの別個の反応産物の出現と相関した（図２Ｂ、レーン１および２）。一方の反応産物はｓｓＲＮＡテンプレートよりも僅かにゆっくりとネイティブのアガロースゲル中を移動し（下のバンド）、他方の反応産物はテンプレート長のｄｓＲＮＡと共に移動した（上のバンド）。これらの産物がＱＤＥ−１調製物に混入した酵母の酵素によって合成されたということを排除するために、本発明者らは、ベクター（ｐＹＥＳ２／ＣＴ）またはＨｉｓタグ化ＬａｃＺをコードするプラスミド（ｐＹＥＳ２／ＣＴ／ｌａｃＺ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む、ガラクトースにより誘導された細胞から同様に精製した対照画分をアッセイした。２つの場合のいずれにも重合産物は検出されなかった（結果省略）。
【００７９】
（観察された活性は、ＱＤＥ−１のＣ末端ドメインの機能である）
新たに見出された活性を特徴付けるために、精製された可溶性ΔＮ（ＱＤＥ−１のカルボキシ末端フラグメント）を、上記のようにｌｕｃテンプレートを用いてアッセイした。２つの標識されたＲＮＡ産物は、ＱＤＥ−１により触媒された反応と同様に、オートラジオグラム上に出現した（図２Ｂ、レーン３）。ΔＮの比活性はＱＤＥ−１の比活性と類似であり、従ってこのことは、この触媒にＣ末端ドメインを関与させる。
【００８０】
注目すべきことに、ΔＮＤＡ（推定触媒残基であるＡｓｐ１０１１がＡｌａに変化したΔＮ）を同じ条件下でアッセイした場合、活性は検出されなかった（図２Ｂ、レーン４および５）。ΔＮＤＡにおける活性の喪失がタンパク質の折り畳みにおける変更に起因するものではないことを確認するために、ΔＮおよびΔＮＤＡの両方を、ΔＮについて図２Ｃ中に示されるように、ネイティブ条件下でゲル濾過に供した。ΔＮのピークおよびΔＮＤＡのピークの位置においても形状においても検出可能な差異は存在せず、従ってこのことは、ΔＮＤＡが適切に折り畳まれていることを示す（結果省略）。ΔＮタンパク質のピークの位置は酵素活性のピークと一致し、従ってこのことは、細胞性酵素による潜在的な混入に対するさらなる証拠を提供する（図２Ｄ）。
【００８１】
（ＱＤＥ−１はＲＮＡ依存的ＲＮＡ重合を触媒する）
ＱＤＥ−１によって触媒される反応がＲＮＡ依存的ＲＮＡ重合であることを確認するために、この酵素をテンプレートまたは未標識のヌクレオチド（ＡＴＰ、ＣＴＰおよびＧＴＰ）のいずれかを欠く混合物中でアッセイした。予測されるように、標識された産物はこれら２つの反応において形成されなかった（図３Ａ、レーン２および４）。本明細書中で対照として使用したｄｓＲＮＡウイルスφ６の精製されたＲｄＲＰサブユニット（φ６Ｐｏｌ）は、本発明者らの以前の研究から予測された全長ｄｓＲＮＡ産物を産生した（図３Ａ、レーン１；ならびにＭａｋｅｙｅｖおよびＢａｍｆｏｒｄ、２０００を参照のこと）。φ６Ｐｏｌと同様に、ＱＤＥ−１指向性の反応における上のバンドは、末端から末端までの重合によって生じる可能性が高い。ｓｓ種とｄｓ種との間のその中間の移動度に起因して、より速く移動する産物が不完全な合成の結果として出現し得、テンプレートの一部のみが二本鎖形態に転換される。
【００８２】
ＲＮＡ産物のヌクレオチド組成がテンプレートによって指示されるか否かを試験するために、本発明者らは、ＲＮＡ産物中に取り込まれたα標識されたヌクレオシド−５’−一リン酸に５’側で隣接するヌクレオシドの分布を決定することを可能にする「最近隣」分析を利用した。ＱＤＥ−１を、各０．２ｍＭの４種の未標識ＮＴＰおよび［α３２Ｐ］ＵＴＰの存在下で、ｌｕｃ  ＲＮＡまたはポリ（Ａ）ホモポリマーのいずれかと共にインキュベートした。両方の反応において、標識された産物はアガロースゲル電気始動およびＴＣＡ沈殿によって容易に検出可能であった（結果省略）。これらの反応混合物をＲＮａｓｅ  Ｔ２で消化してヌクレオシド−３’−一リン酸（Ａｐ、Ｃｐ、ＧｐおよびＵｐ）を生成し、これを薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって分離した。テンプレート依存的合成の場合、４種全てのヌクレオシド−３’−一リン酸はｌｕｃテンプレートについて標識されたリン酸を保有し、Ｃｐ、Ｇｐ、ＡｐおよびＵｐは、１．０：１．１：１．４：１．８と分配される。標識されたＵｐのみがポリ（Ａ）プログラムされた反応について予測される。図３Ｂは、これらの予測を完全に確認する。
【００８３】
（ＱＤＥ−１は、ＲＮＡ合成を新たに開始し得る）
多数のＲｄＲＰが、プライマー依存性の開始機構を利用する（Ｂｕｔｃｈｅｒら、２００１；Ｌａｕｒｉｌａら、２００２およびそれらの中の参考文献）。ＱＤＥ−１もまたプライマー依存性の（新たな）開始を支持し得るか否かを試験するために、このポリメラーゼを、γ標識したヌクレオチドの存在下でアッセイした。新たに開始された娘鎖の最初の５’ヌクレオチドは、その三リン酸部分を保持するはずであるが、その一方で、プライムされた合成の場合にはα−リン酸のみが取り込まれる。標識されたＲＮＡ産物を両方とも、［γ−３２Ｐ］ＧＴＰおよび［γ−３２Ｐ］ＡＴＰの存在下で産生したが、［γ−３２Ｐ］ＧＴＰの取り込み効率は顕著に高かった。図３Ｃは、５’Δｍｓ＋ＲＮＡテンプレート（．．．ＵＵＣＣ−３’末端を有するφ６特異的ＲＮＡ；ＭａｋｅｙｅｖおよびＢａｍｆｏｒｄ、２０００）を使用して、ＱＤＥ−１は標識を下のバンド（特に二本鎖種）中に優勢に取り込み、一方で上のバンド（全長ｄｓＲＮＡ）は非常に弱く標識されたことを示す。類似のパターンがｌｕｃテンプレートについて観察された（結果省略）。このことは、部分的ｄｓＲＮＡ種が、テンプレートにアニールした複数コピーの新たに開始された娘鎖を含み得ることを示す。
【００８４】
γ−リン酸がＲＮＡ重合ではなくγ−リン酸転移によって導入されることを排除するために、本発明者らは、標識されたＲＮＡをグアノシル特異的ＲＮａｓｅ  Ｔ１で処理し、その消化物をＴＬＣによって分析した（Ｖａｓｉｌｊｅｖａら、２０００）。この標識は、ｐｐｐＧｐの形態でＱＤＥ−１のＲＮＡ産物から回収された。予測されるように、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによって５’α位置で標識されたオリゴヌクレオチド５’−ＧＵＵＵＵＣＡＣＣＣＵＡＵＣＣＵＣＣＣＣ−３’（配列番号１１）を含む対照消化物において、この標識はｐＧｐの形態で放出された（図３Ｄ）。
【００８５】
（二価カチオンの影響）
全ての既知のＲｄＲＰは二価金属イオンに対して感受性であるので、本発明者らは、ＱＤＥ−１により触媒される反応に対するＭｇ２＋、Ｍｎ２＋およびＣａ２＋の影響を研究した（図３Ｅ）。Ｍｇ２＋濃度の増大は、５ｍＭ〜９ｍＭの範囲内でバンド強度に影響を与えなかった（レーン１〜４）。Ｍｎ２＋は、１ｍＭの濃度で両方の反応産物の合成を刺激した（レーン５）。しかし、２ｍＭ〜４ｍＭまでの［Ｍｎ２＋］の更なる増大は、上のバンドの消失を引き起こし、下のバンドには僅かな影響のみを有した（レーン６〜７）。カルシウムイオンは、４ｍＭでほぼ完全にＲｄＲＰ反応を阻害した（レーン１０）。より低いＣａ２＋濃度で、より速く移動する産物の合成は、上の産物よりも大きく影響を受けた（レーン８〜９）。ＲＮＡ産物の分布に対するＭｎ２＋およびＣａ２＋の影響は、ＱＤＥ−１が異なる反応の最適条件で２つの重合様式を利用し得るという概念と一致する。
【００８６】
（ＱＤＥ−１は多数のｓｓＲＮＡテンプレートを受容する）
ＱＤＥ−１のテンプレート優先性を評価するために、本発明者らはまた、いくつかの他の一本鎖テンプレート（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｍＲＮＡ、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）のゲノムＲＮＡ、ならびにいくつかのＮ．ｃｒａｓｓａのＲＮＡおよびφ６特異的ＲＮＡ）を用いてＱＤＥ−１をアッセイした（図４Ａおよび図６Ａ）。全ての場合において、ＱＤＥ−１は全長ｄｓＲＮＡおよび部分的に二本鎖の種を、ちょうどｌｕｃテンプレートについてと同様に産生した。いくつかの実験において、反応産物を水で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０でのゲル濾過によって電気泳動の前に精製した場合、約２０ｎｔのｓｓＲＮＡとして移動するバンドは、オートラジオグラム上でも明らかであった（図４Ａ中の矢頭）。これらも、部分的にｄｓＲＮＡの産物も、対応するφ６Ｐｏｌレーン中に存在せず、従ってこのことは、これらがＲＮＡサイレンシングプロセスに関与する細胞性ＲｄＲＰの特異的な特性であり得ることを示唆する。
【００８７】
（反応産物の性質）
ＱＤＥ−１重合産物の性質を同定するために２つの独立したアプローチを使用した。第一に、ＲｄＲＰ産物を、ホルムアルデヒド含有ゲルでの電気泳動によって分離した（図４Ｂ）。これらの条件下で、ｄｓＲＮＡ産物のＲＮＡ鎖は完全に変性され、それらの長さに従って移動する。以下の３つのバンドが、ｌｕｃ  ｍＲＮＡプログラムされた反応について検出された：テンプレート長（１×）の弱いバンド、テンプレートの２倍の長さ（２×）のより強いバンドおよび約２０ｎｔ（簡潔にするためにｓＲＮＡ）の位置で移動する最も強いバンド。φ６Ｐｏｌのみが１×産物および２×産物を産生し、ｓＲＮＡの痕跡はなかった。１×種は、新たに開始されたＲＮＡ合成の結果として生じ、その一方で２×は戻って折り畳まれたテンプレートの３’末端の伸長（いわゆる「バックプライミング」；Ｌａｕｒｉｌａら、２００２）に起源することが以前に示されている。従って、ＱＤＥ−１は、バックプライミング様式を主に使用して、ｌｕｃ  ｍＲＮＡの完全またはほぼ完全なコピーを産生した。ネイティブゲル上で、この産物はテンプレート長のｄｓＲＮＡとして移動する（図４Ａを参照のこと）。これらのｓＲＮＡ産物は、不完全なｄｓＲＮＡ産物に見かけ上由来する。この産物はネイティブゲル上でｌｕｃ  ｍＲＮＡよりも顕著にゆっくりと移動するので、複数コピーの相補的ｓＲＮＡは各テンプレート分子に対して産生される可能性が高い。図４Ｂから、ＱＤＥ−１が新たな開始機構を主に使用して、ＧＦＰテンプレートおよびＴＭＶテンプレートに対して、小量のほぼ全長のｄｓＲＮＡを産生することが明らかである。そして再度、２０ｎｔ領域で移動する相補的ｓＲＮＡは、主要な反応産物を示す。
【００８８】
第二のアプローチについて、本発明者らは高いイオン強度でＲＮａｓｅ  Ｉの特性を使用して、ｄｓＲＮＡではなくｓｓＲＮＡを分解した。上記の実験から理解されるように、ＱＤＥ−１が２つの別個のタイプのｄｓＲＮＡエレメントを産生する場合、以下の２つの産物がＲＮａｓｅ  Ｉ消化から保護される：（ｉ）短いｄｓＲＮＡおよび（ｉｉ）（ほぼ）全長のｄｓＲＮＡ（図４Ｃ）。ＲＮａｓｅ保護アッセイを実施するために、標識されたｌｕｃ  ＲＮＡ、４種の未標識ＮＴＰを含みかつ標識されたヌクレオチドを含まないＱＤＥ−１反応混合物を、２５０ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを添加することによってクエンチした。次いで、これらの混合物に、０．０５単位／μｌのＲＮａｓｅ  Ｉ（ＲＮａｓｅ  ＯＮＥ；Ｐｒｏｍｅｇａ）または同容量のＲＮａｓｅ  ＯＮＥ  １×緩衝液を補充し、３０℃で１時間インキュベートした。これらの反応を、０．２％  ＳＤＳの添加によって停止させ、産物を標準的なアガロースゲル電気泳動によって分析した。図４Ｃにおいて予測された両方のＲＮａｓｅ耐性種が電気泳動分離の後に実際に検出され（図４Ｄ）、従ってこのことは本発明者らの結論を支持する。
【００８９】
（ｓＲＮＡは９〜２１ヌクレオチド長である）
ｓＲＮＡの長さを正確に決定するために、本発明者らは、γ標識したＧＴＰの存在下で異なるＲＮＡテンプレートを用いた重合反応を実施した。３０℃でのインキュベーション後、反応産物を高分解尿素含有ＰＡＧＥを使用して分析した。テンプレートに関わらず、ｓＲＮＡは、より短い産物およびより長い産物の時折の弱いバンドを伴って、９マー〜２１マーのオリゴヌクレオチドの集団として出現した（図５および図６Ｂ）。ＱＤＥ−１およびΔＮによるｓＲＮＡパターンは同一であった；ｓＲＮＡはφ６Ｐｏｌ対照においては検出されなかった（図５）。α標識したＵＴＰをγ標識の代わりに使用した場合、より長い産物の相対強度がより高かったという差異のみを有する類似のパターンが得られた（結果省略）。
【００９０】
（プライムされたｓｓＲＮＡテンプレートおよび平滑末端ｄｓＲＮＡテンプレートを用いた反応）
図１Ａ中のモデル１および２は、ＱＤＥ−１がｄｓＲＮＡテンプレートを利用し得、かつ／またはｓｓＲＮＡテンプレートにアニールした相補的プライマーを伸長させ得ることを示す。これらの予測を扱うために、本発明者らは、φ６ビリオンまたは酵母ＬＡウイルス様粒子から抽出された平滑末端ｄｓＲＮＡを用いて、ＱＤＥ−１およびＱＤＥ−１ΔＮをアッセイした（図１０Ａ）。標識された産物は、延長した露光の後にさえ検出されなかった。対称的に、予測されたように、φ６Ｐｏｌは半保存的（鎖置換）機構を介して合成された、容易に検出可能なｄｓＲＮＡ標識産物を産生した（ＭａｋｅｙｅｖおよびＢａｍｆｏｒｄ、２０００）。
【００９１】
ＱＤＥ−１のプライマー伸長能力を評価するために、合成ＲＮＡオリゴヌクレオチド５’−ＣＧＡＣＵＣＡＵＧＧＡＣＣＵＵＧＧＧＡＧ−３’（配列番号１２）を、Ｔ４−ＰＮＫおよび［γ−３２Ｐ］ＡＴＰで標識し、ｓＲ５  ＲＮＡテンプレート（ＥｃｏＲＶで切断したｐＬＭ６５９のＴ７転写物；Ｇｏｔｔｌｉｅｂら、１９９２）とアニールさせ、４０μｇ／ｍｌのＱＤＥ−１（またはφ６Ｐｏｌ）を含むＲｄＲＰ反応混合物および標識されたヌクレオチドを含まないＲｄＲＰ反応混合物（上の記載を参照のこと）中でアッセイした。対照として、同じプライマー−テンプレート基質を、推奨された緩衝液中に５単位のＡＭＶ−ＲＴ（Ｓｉｇｍａ）、８単位のＲＮａｓｉｎおよび各０．５ｍＭの４種のデオキシヌクレオチド三リン酸を含む１０μｌの混合物中で３７℃で１時間インキュベートした。これらの反応混合物を、７．５Ｍの尿素を含む６％  ＰＡＧＥによって分離した（図１０Ｂ）。
【００９２】
検出可能な量の全長伸長産物がＱＤＥ−１のレーンにおいて検出され、「緩衝液のみ」の対照においてはこの位置にバンドは存在しなかった。類似の産物が、φ６Ｐｏｌのレーンにおいても見えた。使用した条件下で、トリ骨髄芽球症ウイルスの逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）は、２つのＲｄＲＰのいずれよりも１０〜２０倍多い伸長産物（ｃＤＮＡ）を産生した（図１０Ｃ）。
【実施例３】
【００９３】
（ＱＤＥ−１ポリメラーゼおよびその誘導体の下流の適用）
（配列特異的プローブとしてのｓＲＮＡの使用）
ｓＲＮＡが全テンプレートに沿って均等に分布する場合、これらはそれらのコーディングテンプレートおよびＲｄＲＰ混合物の他の成分から精製されて、核酸ハイブリダイゼーションに基づく分子技術および細胞技術においてプローブとして使用され得る。この目的のために、ｌｕｃ  ＲＮＡに対して合成されたγ−３２Ｐ標識したｓＲＮＡを、ノザンブロッティングのためのプローブとして使用した（図９Ａ）。以下の６つのＲＮＡをハイブリダイゼーション標的として使用した：図９Ｂ中に示されるような異なる領域にわたるｌｕｃ  ＲＮＡの４つのセンスフラグメント、全長アンチセンスｌｕｃ  ＲＮＡ（ａ−ｌｕｃ）およびφ６  ｓ＋ＲＮＡに起源しかつルシフェラーゼ遺伝子に対する相同性を含まない対照ｓＲ５  ＲＮＡ。
【００９４】
ノザンブロッティングのためのｓＲＮＡプローブを調製するために、上に概説したように、ルシフェラーゼｍＲＮＡを、４種の未標識ＮＴＰおよび［γ−３２Ｐ］ＧＴＰの存在下でＱＤＥ−１と共にインキュベートした。ＲＮＡ産物を変性させ、低融点アガロースゲルでのゲル電気泳動を使用して分離した。標識されたｓＲＮＡを含む領域をゲルから切り出した；ｓＲＮＡを７０℃でアガロースを溶融させることによって回収し、さらなる精製なしで標的ＲＮＡを探索するために使用した。記載されるように（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１）、標的ＲＮＡ（上記で特定したもの）を、ホルムアルデヒド含有ゲル中で分離し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移した。これらのメンブレンを６×ＳＳＣ、７％  ＳＤＳ中で６８℃で４時間ブロッキングし、その後ｓＲＮＡプローブ（約１０５ｃｐｍ／ｍｌ）を含む同じ緩衝液中で４２℃で一晩のハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリダイゼーション後、これらのメンブレンを２×ＳＳＣで室温で３回洗浄し、その後４２℃で２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳで２回洗浄した（各々３０分間の洗浄）。これらのメンブレンを風乾して、ホスホイメージャーで分析した。
【００９５】
この実験の結果を図９Ｃに示す。４つ全てのセンスＲＮＡがプローブによって認識され、従ってこのことは、ｓＲＮＡ集団が異なるテンプレートセグメントに相補的な種を含むことを示唆する。予測されるように、ｓＲ５のレーンにおいてはシグナルは検出されなかった。ａ−ｌｕｃ  ＲＮＡバンドの非常に弱い標識が存在し、これは、プローブ中の低量のセンスｓＲＮＡの存在によって形式的に説明できた。しかし、低いストリンジェンシーの条件を使用したので、これはハイブリダイゼーションのアーチファクトの可能性もある。
【００９６】
（新たに産生されたＲＮＡへの化学的に改変されたヌクレオチドの取り込み）
非放射能標識を含むＲＮＡ産物を生成することは、多数の適用にとって有利である。ＱＤＥ−１およびその誘導体についてこの可能性を探求するために、標識がヌクレオチド塩基に係留されたビオチン−１１−ＣＴＰを用いて反応を実施した。図１２Ａに概説されるように、反応産物をメンブレン上に固定化して、ＨＲＰ−ストレプトアビジンコンジュゲートを用いて探索した。強いシグナルが、ポリメラーゼ（ΔＮ）およびテンプレート（ｌｕｃ）の両方を含む混合物について検出され、従ってこのことは、標識されたシトシンが産物画分中に実際に取り込まれ得ることを示す。クマリン−５−ＣＴＰを標識として使用し、クマリン蛍光を精製された反応産物画分において測定した場合に類似の結果が得られた（図１２Ｂ）。
【００９７】
（ＱＤＥ−１のＲＮＡ産物は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいてＲＮＡｉを誘導する）
ＱＤＥ−１反応産物の生物学的活性を扱うために、本発明者らは、ＲＮＡｉアプローチを利用した。ＲＮＡｉを許容しかつまたＰＴＧＳ経路のＲｄＲＰ成分を有する生物のうち、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓは、最も便利な実験モデルである。基本的なＣ．ｅｌｅｇａｎｓ技術は記載されている（ＬｅｗｉｓおよびＦｌｅｍｉｎｇ、１９９５）。ＲＮＡｉ実験のために、実施例２に記載されるように、２０μｇのＧＦＰ  ｍＲＮＡを、５０μｌの反応混合物中で１μｇのＱＤＥ−１または同容量の緩衝液Ｍ−２００と共に３０℃で１時間インキュベートした。反応産物を、フェノール−クロロホルムで抽出し、２．５Ｍの酢酸アンモニウムの存在下でエタノールで沈殿させた。これらのペレットを、３ｍＭのスペルミジンおよび０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡをさらに補充した１５μｌのＭ９緩衝液（Ｂｒｅｎｎｅｒ、１９７４）中に溶解させた。ＲＮＡ溶液の５μｌのアリコートを、０．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中で、使用の直前に０．５μｌの２０ｍＭ  ＣａＣｌ２と混合した。５〜１０匹の若い成体雌雄同体（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＡＺ２１８；咽頭ＧＦＰ発現；Ｐｒａｉｔｉｓら、２００１）をＭ９で洗浄して、各チューブ中で２０℃で２４時間浸した。次いでこれらの虫を、２０℃でさらに２４時間にわたり、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＯＰ５０−１を薄く播いたＮＧＭプレート上にプレートした。これらの虫を、さらに７２時間にわたり（２０℃）、ＯＰ５０−１の格子を塗った新たなＮＧＭプレートにさらに移した。これらのプレート由来のＦ１子孫を、Ｏｌｉｍｐｕｓ  ＩＸ７０顕微鏡を使用して、咽頭におけるＧＦＰの発現についてスコアリングした。ＧＦＰ発現は、ＱＤＥ−１反応産物で処理した親由来の約６０％のＦ１世代において検出可能にサイレンシングされ、その一方で、全てのＦ１虫は、Ｍ−２００緩衝液対照中で検出可能な咽頭ＧＦＰ蛍光を示した。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】（Ａ）先行技術で示唆されたが実験的に試験されていない、ＲＮＡサイレンシングにおけるＲｄＲＰの役割についての３つの仮説的モデルの図である。第一のモデルにおいて、ＲｄＲＰはｄｓＲＮＡテンプレートを複製し、従って、サイレンシングシグナルを増大させると考えられている（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、１９９８）。このモデル改変は、複数コピーのより短いＲＮＡトリガーを生成するためにｄｓＲＮＡテンプレートがＲｄＲＰによって使用され得ることを示唆する（「拡散性サイレンシング因子」；ＣｈｉｃａｓおよびＭａｃｉｎｏ、２００１）。第二のモデルによれば、ＲｄＲＰはｄｓＲＮＡトリガーの濃度をも増大させるが、その増幅は、ｄｓＲＮＡテンプレートを扱うのではなく、ｍＲＮＡに対して相補的なＲＮＡプライマーの３’末端を伸長させることによって達成される（Ｎｉｓｈｉｋｕｒａ、２００１）。開始ｄｓＲＮＡトリガーを切ることによって産生された小さいアンチセンスＲＮＡは、多数のｍＲＮＡテンプレートにアニールするプライマーとして使用され得、ＲｄＲＰ伸長工程の後に、複数の二次的なｄｓＲＮＡトリガーを生じ得る。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓについての最近の研究により、これらの二次的なトリガーが実際存在し、それらの合成が機能的ｒｒｆ−１遺伝子の存在を必要とすることが実証された（Ｓｉｊｅｎら、２００１）。しかし、プライマーの関与はこの場合直接的に示されていない。これまで、二次的ｄｓＲＮＡのプライマー依存的な合成の唯一の明確な証拠は、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの胚抽出物において実施された研究に由来している（Ｌｉｐａｒｄｉら、２００１）。興味深いことに、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａゲノムは細胞性ＲｄＲＰファミリーの明らかなホモログを含まず、このことは、いくつかの他のポリメラーゼが観察された効果を担っていることを示している。最後に、ＲｄＲＰは、ｄｓＲＮＡ濃度を増大させる補助的増幅装置であるのではなく、ｓｓＲＮＡからの開始ｄｓＲＮＡトリガーの合成のために必要とされ得る（第三のモデル；ＣｏｇｏｎｉおよびＭａｃｉｎｏ、２０００；ＷａｓｓｅｎｅｇｇｅｒおよびＰｅｌｉｓｓｉｅｒ、１９９８）。このモデルは、異常な転写物およびいくつかのウイルス性ｓｓＲＮＡが如何に二本鎖サイレンシングトリガーへと転換され得るかを説明する。（Ｂ）ＰＴＧＳにおける遺伝学的に報告された役割を有する５つのＲｄＲＰ様タンパク質およびトマトの葉から単離されたそれらの生化学的対応物（Ｔ−ＲｄＲＰ）についての類似性プロフィールを示す図である。グラフは、４０ａａのスライディングウインドウを使用して、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ＳｕｉｔｅのＡｌｉｇｎＸプログラムで生成される。これらのタンパク質配列は、以下の番号の元でｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／においてアクセスされ得る：ＱＤＥ−１、ＣＡＢ４２６３４；ＲｒｐＡ、ＣＡＣ４１９７４；ＥＧＯ−１、ＡＡＦ８０３６７；ＲＲＦ−１、ＡＡＦ８０３６８；ＳＧＳ２／ＳＤＥ１、ＡＡＦ７４２０８；Ｔ−ＲｄＲＰ、ＣＡＡ７１４２１。Ｄｉｃｅｒヘリカーゼドメインに対して相同なＲｒｐＡの１ａａ〜４４２ａａフラグメントはアラインメントから排除した。２０％未満の類似性を有する領��を灰色に着色している；２０％以上の類似性を有する領域を黒に着色している。ＨＳとは、細胞性ＲｄＲＰのファミリー内の最も保存された範囲をいう。挿入図は、隣接結合法（ＳａｉｔｏｕおよびＮｅｉ、１９８７）を使用した６つの推定タンパク質配列についての系統発生樹を示す。（Ｃ）ＨＳ範囲についてのタンパク質配列アラインメントを示す図である。黒の影、不変残基；灰色の影、保存された残基。提唱された触媒的役割を有するアスパラギン酸には、アスタリスクで印を付している。
【図２】ＱＤＥ−１およびその遺伝学的誘導体の精製ならびに開始ＲＮＡ重合アッセイを示す図である。（Ａ）精製されたＱＤＥ−１（レーン１）、ΔＮ（レーン２）およびΔＮＤＡ（レーン３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。Ｍ、マーカーレーン。タンパク質標準の分子量は右側に示される。Ｈｉｓタグ化したＱＤＥ−１およびΔＮ（ΔＮＤＡ）の配列から推定した分子量は、それぞれ約１６３ｋＤａおよび約１２２ｋＤａである。（Ｂ）精製したタンパク質を、４種の未標識ＮＴＰおよび［α−３２Ｐ］ＵＴＰの存在下で、９０μｇ／ｍｌのホタルルシフェラーゼ（ｌｕｃ）ｍＲＮＡ（ＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＴ７１ｕｃのＴ７転写物；（Ｋｏｌｂら、２０００）を含む１０μｌの混合物中でアッセイし、その反応産物をネイティブアガロースゲル電気泳動によって分析した。レーン１、Ｍ−２００緩衝液対照；レーン２、１０μｇ／ｍｌのＱＤＥ−１を含む反応；レーン３、１０μｇ／ｍｌのΔＮを含む反応；レーン４、１０μｇ／ｍｌのΔＮＤＡを含む反応；レーン５、１００μｇ／ｍｌのΔＮＤＡを含む反応。ＭｄｓはｄｓＤＮＡマーカーである。上のパネル、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）染色したゲル；下のパネル、オートラジオグラム。テンプレートＲＮＡのｓｓ形態および全長ｄｓ形態の位置は左側に示される。マーカーの長さは右側に示される。（Ｃ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．９）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ；１ｍｌ／分；１ｍｌの画分）で分離したΔＮ（３０μｇ）のＡ２８０溶出プロフィール。矢印は、ゲル濾過マーカー（Ｓｉｇｍａ）の位置を示す：ＢＤ、ブルーデキストラン；βＡＭ、β−アミラーゼ；ＡＤ、アルコールデヒドロゲナーゼ；ＢＳＡ、ウシ血清アルブミン；ＣＡ、カルボニックアンヒドラーゼ；ＣＣ、シトクロムＣ。２０分でのピークは、ＲｄＲＰ保存緩衝液由来の非イオン性界面活性剤に対応する。挿入図、溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。（Ｄ）ｌｕｃ  ＲＮＡテンプレートを使用してＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００画分において測定したＲｄＲＰ活性。活性ピークはΔＮタンパク質の位置に対応することに留意のこと（画分１２〜１４）。
【図３】ＱＤＥ−１がＲＮＡ依存的ＲＮＡ重合を触媒することを示す図である。（Ａ）ＱＤＥ−１（４μｇ／ｍｌ）を、一定量の［α−３２Ｐ］ＵＴＰの存在下で、４種全てのＮＴＰ（１ｍＭのＡＴＰおよびＧＴＰならびに０．２ｍＭのＣＴＰおよびＵＴＰ）を含む混合物（レーン２〜３）または０．２ｍＭのＵＴＰのみを含む混合物（レーン４）のいずれかにおいてインキュベートした。４０μｇ／ｍｌのバクテリオファージφ６  ＲｄＲＰ（レーン１；φ６Ｐｏｌ）を、４種のＮＴＰの存在下で対照としてアッセイした。レーン２を除く全ての場合において、混合物は９０μｇ／ｍｌのｌｕｃ  ＲＮＡを含んだ。反応産物をネイティブ条件下で１％アガロースゲル中で分離した。ｌｕｃ  ＲＮＡのｓｓ形態および全長ｄｓ形態の位置は左側に示される。（Ｂ）１０μｇ／ｍｌのＱＤＥ−１、各０．２ｍＭの４種の未標識ＮＴＰのおよび［α−３２Ｐ］ＵＴＰを含むＲｄＲＰ反応を、９０μｇ／ｍｌのｌｕｃ  ＲＮＡ（トラック２）、１５０μｇ／ｍｌのポリ（Ａ）ホモポリマー（Ｓｉｇｍａ；トラック３）またはＲＮＡなし（トラック１）のいずれかを用いてプログラムした。反応産物を、取り込まれていないヌクレオチドからゲル濾過によって精製して、記載されるように（Ｓｃｈｉｅｂｅｌら、１９９３）ＲＮａｓｅ  Ｔ２消化およびＴＬＣ分離に供した。黒の矢印は４種のヌクレオシド−３’−一リン酸の位置を示す。白抜きの矢印は、ＴＬＣ展開方向を示す。（Ｃ）［γ−３２Ｐ］ＧＴＰの存在下（レーン１、２、４および１＊、２＊、４＊）または［γ−３２Ｐ］ＡＴＰの存在下（レーン３および３＊）で、１００μｇ／ｍｌの５’Δｍｓ＋ＲＮＡを用いて実施したＲｄＲＰ反応についての、ＥｔＢｒ染色したアガロースゲル（レーン１〜４）および対応するオートラジオグラム（１＊〜４＊）。レーン１（１＊）および３（３＊）、２０μｇ／ｍｌのΔＮポリメラーゼ；レーン２（２＊）、２０μｇ／ｍｌのφ６Ｐｏｌ；レーン４、Ｍ−２００緩衝液。他の名称は図２Ｂと同様である。（Ｄ）（Ｃ）と同様に実施した反応を、取り込まれていないヌクレオチドから精製し、ＲＮａｓｅ  Ｔ１で処理し、ＴＬＣで分離した。トラック１、ＲＮＡなし；トラック２、ｌｕｃ  ＲＮＡ；トラック３、Ｔ４  ＰＮＫおよび［γ−３２Ｐ］ＡＴＰで標識した５’末端Ｇを有する対照ＲＮＡオリゴヌクレオチド。黒の矢印、リン酸グアノシンの位置；白抜きの矢印、ＴＣＬ展開方向。（Ｅ）ＱＤＥ−１（４μｇ／ｍｌ）により触媒される反応に対する二価金属イオンの影響。レーン１、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；他の反応は１ｍＭ、２ｍＭまたは４ｍＭのＭｇＣｌ２（レーン２〜４）、ＭｎＣｌ２（レーン５〜７）またはＣａＣｌ２（レーン８〜１０）をさらに含んだ。
【図４】ＱＤＥ−１が２つのタイプの反応産物を生成することを示す図である。（Ａ〜Ｂ）ＲｄＲＰ反応を、９０μｇ／ｍｌのルシフェラーゼｍＲＮＡ（レーン１〜３）、８０μｇ／ｍｌのＧＦＰ  ｍＲＮＡ（レーン４〜６；ＥｃｏＲＩで切断したプラスミドＴＵ５８（Ｃｈａｌｆｉｅら、１９９４）のＴ７転写物）または１００μｇ／ｍｌのＴＭＶゲノムＲＮＡ（レーン７〜１０）を用いてプログラムした。反応は、［α−３２Ｐ］ＵＴＰおよび１０μｇ／ｍｌのＱＤＥ−１（レーン２、５、８）または２０μｇ／ｍｌのφ６Ｐｏｌのいずれかを含んだ。レーン１、４、７は「緩衝液のみ」の対照である。（Ａ）ネイティブ１．２％アガロースゲル。短いＲＮＡ産物（ｓＲＮＡ）は白抜きの矢頭で示される。ｄｓＤＮＡマーカーの位置は右側に示される。（Ｂ）ホルムアルデヒド含有１．５％アガロースゲル。ＲｄＲＰ反応のために使用した一本鎖テンプレートの位置は左側に示される。Ｍｓｓ、２つの３２Ｐ標識したｓｓＲＮＡマーカー（２０ｎｔおよび１７９７ｎｔ）；ＲＮａｓｅ保護アッセイの（Ｃ）模式的結果および（Ｄ）実際の結果。ＲｄＲＰ反応を、７０μｇ／ｍｌの３２Ｐ標識したｌｕｃ  ｍＲＮＡを用いかつ標識したＮＴＰなしで実施した。反応は、４０μｇ／ｍｌのφ６Ｐｏｌ（レーン１、４）４０μｇ／ｍｌのＱＤＥ−１（レーン２、５）またはＭ−２００緩衝液（レーン３、６）を含んだ。実験手順のもとに特定されるように、３０℃で１時間のインキュベーションで、ＥＤＴＡによって重合を停止させ、アリコートをＲＮａｓｅ  Ｉ（レーン４〜６）またはＲＮａｓｅ  Ｉ反応緩衝液（レーン１〜３）と共にインキュベートした。黒の矢頭は、レーン５中の短いｄｓＲＮＡフラグメントの位置を示す。レーン３中のぼんやりした移動の遅いバンドは、ｌｕｃ  ｍＲＮＡの付随物を見かけ上示す。
【図５】ｓＲＮＡのサイズ分布を示す図である。反応を、図４Ａ〜Ｂと同様にであるが［γ−３２Ｐ］ＧＴＰおよびパネルの上部に示した添加剤の存在下で実施した。アリコートを１５分（レーン１〜６）および６０分（レーン７〜１５）の時点で採取し、１５％尿素含有ＰＡＧＥによって分析した。Ｍ、ＤＮＡテンプレートの混合物のＴ７転写によって産生された３２Ｐ標識したｓｓＲＮＡマーカー。マーカーの位置は右側に示される（ｎｔで）。矢印は２１マーのＲＮＡの位置を示す。ゲルの下側半分のみが示されている。
【図６】ＱＤＥ−１が種々のｓｓＲＮＡテンプレートを受容することを示す図である。（Ａ）ＲｄＲＰ反応を、［α−３２Ｐ］ＵＴＰおよび種々のｓｓＲＮＡの存在下で、１０μｇ／ｍｌのＱＤＥ−１あり（偶数レーン）またはなし（奇数レーン）で実施し、ネイティブアガロースゲル電気泳動によって分析した。上のパネル、ＥｔＢｒ染色；下のパネル、オートラジオグラム。ｄｓＤＮＡマーカー（Ｍｄｓ）のサイズは右側に示される。レーン１〜２、φ６ウイルスｓ＋ＲＮＡセグメント（ＸｂａＩで切断したｐＬＭ６５９のＴ７転写物（Ｇｏｔｔｌｉｅｂら、１９９２））；レーン３〜４、ＣＯＴ−１  ｍＲＮＡフラグメント（プライマー５’−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＣＧＴＧＧＴＧＧＴ−３’（配列番号５）および５’−ＴＴＴＴＣＴＧＡＡＴＴＣＴＣＴＴＧＣＣＧＣＴＴＴＴＡＴＴＣＴ−３’（配列番号６）を使用してｐＯＹ１８（Ｙａｒｄｅｎら、１９９２）から誘導されたＰＣＲフラグメントのＴ７転写物）；レーン５〜６、ＶＭＡ−２  ｍＲＮＡ（ＢａｍＨＩで切断したｐＲＢ３０（Ｂｏｗｍａｎら、１９８８）のＴ７転写物）；レーン７〜８、ＶＭＡ−１  ｍＲＮＡ（ＮｏｔＩで切断したｐＲＢ３４（Ｂｏｗｍａｎら、１９８８）のＴ７転写物）；レーン９〜１０、ＶＭＡ−１アンチセンスＲＮＡ（ＥｃｏＲＶで切断したｐＲＢ３４のＴ３転写物）；レーン１１〜１２、ＰＥＰ−４  ｍＲＮＡ（Ａｓｐ７１８で切断されたｐｅｐ４ｃＤＮＡプラスミドのＴ３転写物）；レーン１３〜１４、ＰＥＰ−４アンチセンスＲＮＡ（ＢａｍＨＩで切断されたｐｅｐ４ｃＤＮＡのＴ７転写物）；レーン１５〜１６、ＣＣＧ−２遺伝子のアンチセンスＲＮＡ（Ａｓｐ７１８で切断されたｐＬＷｄＫ１（Ｂｅｌｌ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、１９９２）のＴ３転写物）。ＣＯＴ−１、ＶＭＡ−１、ＶＭＡ−２、ＰＥＰ−４およびＣＣＧ−２はＮ．ｃｒａｓｓａに特異的な遺伝子であり、関連するプラスミドはＦＧＳＣ（Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ、ＵＳＡ）から得た。（Ｂ）（Ａ）と同様にであるが［γ−３２Ｐ］ＧＴＰの存在下で実施したＱＤＥ−１反応を、１６％の変性ＰＡＧＡによって分離した。レーン１、φ６  ｓ＋ＲＮＡ；レーン２、ＣＯＴ−１  ｍＲＮＡフラグメント；レーン３、ＶＭＡ−２  ｍＲＮＡ；レーン４、ＶＭＡ−１  ｍＲＮＡ；レーン５、ＶＭＡ−１アンチセンスＲＮＡ；レーン６、ＰＥＰ−４  ｍＲＮＡ；レーン７、ＰＥＰ−４アンチセンスＲＮＡ；レーン８、ＣＣＧ−２アンチセンスＲＮＡ；レーン９、ｌｕｃ  ＲＮＡ。ｓｓＲＮＡマーカーのサイズは右側に示される。
【図７】ＱＤＥ−１が長いＲＮＡ産物の合成を好ましくはテンプレートの３’末端ヌクレオチドで開始することを実証する図である。（Ａ）ＱＤＥ−１開始部位を決定するために実施されるアッセイのためのフローチャート。ＲｄＲＰ反応を、２０μｇ／ｍｌのＱＤＥ−１、２０μｇ／ｍｌのφ６Ｐｏｌまたは同体積のＭ−２００緩衝液のいずれかの存在下で、標識したヌクレオチドなしで、５’Δｍｓ＋テンプレート（９０μｇ／ｍｌ；図３Ｃもまた参照のこと）を使用して実施した。Ｇ−５０精製した反応産物を、４０％ホルムアミド中で１分間煮沸することによって変性させ、２０％ホルムアミドで平衡化したＳ−４００スピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に直ぐに通過させてｓＲＮＡを除去した。長いＲＮＡを含むフロースルー画分を、５’Δｍｓ＋のアンチセンスコピーに特異的な標識したプライマーとハイブリダイズさせた。プライマー伸長を記載されるように（ＭａｋｅｙｅｖおよびＢａｍｆｏｒｄ、２０００）ＡＭＶ−ＲＴを用いて実施し、伸長産物を変性条件下で７％  ＰＡＧＥによって分離した。（Ｂ）（Ａ）由来のＰＡＧＥ分離した産物の放射能プロフィールを、ホスホイメージングを使用してプロットした。上のグラフは、ＱＤＥ−１（黒の線）およびＭ−２００緩衝液（灰色の線）についてのこのようなプロフィールを示す；中央のグラフは、φ６Ｐｏｌ反応産物についてのものである；下のグラフ（Ｔ７  ＲＮＡＰ）は、その５’末端が５’Δｍｓ＋の３’末端に相補的であるｓＲ５  ＲＮＡに対して実施されたプライマー伸長を示す。テンプレート３’末端配列に対応する位置が各パネル上に示される。このデータは、ＱＤＥ−１がＲＮＡ合成を開始するために３’末端のテンプレートヌクレオチドを好むが、他の開始位置はあまり頻繁に使用されない可能性があることを示す。予測されるように、φ６ＰｏｌおよびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼは、規定された位置（φ６Ｐｏｌの場合、最も３’側のヌクレオチド；ＭａｋｅｙｅｖおよびＢａｍｆｏｒｄ、２０００もまた参照のこと）でＲＮＡ合成を正確に開始する。（Ｃ）（Ａ）と同様に実施したＲｄＲＰ反応の小さいアリコートを、［α−３２Ｐ］の存在下でインキュベートし、ホルムアルデヒド含有アガロースゲル電気泳動によって分析した。テンプレート長のみ（１×；新たに開始された）の産物および２倍テンプレート長（２×；「バックプライミング」によって産生された）の産物がφ６Ｐｏｌの場合に出現するが、一方でこれら２つの産物に加えて、ｓＲＮＡがＱＤＥ−１によって産生される。（Ｂ）中のピークは１×産物に対応する。
【図８】ｓＲＮＡのサイズ分布に対するスペルミジンの影響を示す図である。ＱＤＥ−１を、１ｍＭ  スペルミジンの非存在下（灰色の線）または存在下（黒の線）で、ｌｕｃ  ＲＮＡテンプレートおよび［γ−３２Ｐ］ＧＴＰを含む混合物中で３０℃で１時間インキュベートした。反応産物を変性条件下で１６％  ＰＡＧＥによって分離し、そのｓＲＮＡプロフィールをホスホイメージャーを使用して決定した。スペルミジンが、ｓＲＮＡ合成の全体的な効率に対する影響を実質的に有さずに、ｓＲＮＡのサイズ分布をより短い産物のほうにシフトさせることに留意のこと。ポリアミンはＲＮＡの空間的構造を安定化させることが知られており（例えば、ＨａｎｎａおよびＳｚｏｓｔａｋ、１９９４；Ｑｕｉｇｌｅｙら、１９７８）、このことは、ＱＤＥ−１がＲＮＡテンプレートの露出した一本鎖セグメントを選択的に認識してそれらをｓＲＮＡへとコピーするが、その一方でスペルミジンの添加がこれらのエレメントの有効な長さを減少させることを示唆する。
【図９】ｓＲＮＡが全テンプレート長に沿って合成されることを実証する図である。（Ａ）ｓＲＮＡをｌｕｃ  ｍＲＮＡに対してＱＤＥ−１を用いて合成し、アガロースゲルで精製して、固定化した標的ＲＮＡを探索するために使用した。（Ｂ）図は、ルシフェラーゼ特異的な標的ＲＮＡを示す：ｌｕｃ、ｌｕｃΔｌ（ＥｃｏＲＩで切断したｐＴＺｌｕｃ（−ストップ）のＴ７転写物；Ｍａｋｅｙｅｖら、１９９６））、ｌｕｃΔ２（ＥｃｏＲＶで切断したｐＴＺｌｕｃ（−ストップ）のＴ７転写物）、ｌｕｃΔ３（ＸｈｏＩで切断したｐＥＭ５４のＴ７転写物）およびａ−ｌｕｃ（ＢａｍＨＩで切断したｐＧＥＭｌｕｃのＴ７転写物；Ｐｒｏｍｅｇａ）。（Ｃ）（Ｂ）と同様の標的ＲＮＡおよびφ６特異的ｓＲ５  ＲＮＡ（ＥｃｏＲＶで切断したｐＬＭ６５９のＴ７転写物（Ｇｏｔｔｌｉｅｂら、１９９２））を、ホルムアルデヒド含有１．５％アガロースゲル電気泳動によって分離し、メンブレンに移して、ｌｕｃ特異的ｓＲＮＡを用いて探索した。上のパネル、ＥｔｄＢｒ染色したゲル；下のパネル、ハイブリダイゼーション後のメンブレンのオートラジオグラフ。
【図１０】ｄｓＲＮＡテンプレートおよびプライムしたｓｓＲＮＡテンプレートを用いた反応を示す図である。（Ａ）２００μｇ／ｍｌのφ６ゲノムｄｓＲＮＡ（セグメントＬ、ＭおよびＳ）または１００μｇ／ｍｌのＬＡウイルス様粒子ゲノムｄｓＲＮＡを含むＲｄＲＰ混合物を、４０μｇ／ｍｌのＱＤＥ−１、ＱＤＥ−１ΔＮまたはφ６Ｐｏｌと共にインキュベートし、１％のネイティブアガロースゲル電気泳動によって分析した。実験手順のもとに記載されるように、４０μｇ／ｍｌのＱＤＥ−１もしくはφ６Ｐｏｌまたは５００単位／ｍｌのＡＭＶ−ＲＴを用いて実施したプライマー伸長の（Ｂ）模式的結果および（Ｃ）実際の結果。矢印は、１３６ｎｔの伸長産物の位置を示す。
【図１１】本発明中に示されるデータから現れる、転写後遺伝子サイレンシングについての統合したモデルを示す図である。異常なｓｓＲＮＡ（ａｂＲＮＡ）は、細胞性ＲｄＲＰによってｄｓＲＮＡトリガーへと転換される。全長ｄｓＲＮＡフラグメントまたは短い（９〜２１ｂｐ）ｄｓＲＮＡフラグメントのいずれかが産生される。長いｄｓＲＮＡはＤｉｃｅｒ様ヌクレアーゼによってｓｉＲＮＡへと切断されるが、その一方で短いｄｓＲＮＡエレメントはＲＩＳＣ様ヌクレアーゼによって認識される。後者の事象は、ＱＤＥ−２（ＡＧＯ１／ＲＤＥ−１）によって媒介されるｓＲＮＡの同族ｍＲＮＡへの転移によって進行され得る。ａｂＲＮＡおよびｍＲＮＡ分解産物のいくつかは、ｓｉＲＮＡへと切られる二次的なｄｓＲＮＡトリガーの合成に有効なテンプレートとしてＲｄＲＰによって使用され得る。その起源に関わらず、小さいｓｓＲＮＡはＲＩＳＣにより触媒される切断のためのガイドとして作用する。このプライマー非依存的なシナリオは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるＲＲＦ−１により媒介される二次的なｄｓＲＮＡトリガーの合成についての代替的な説明を提供する（Ｓｉｊｅｎら、２００１）。
【図１２】化学的に改変されたＮＴＰの存在下でのＲＮＡ合成を示す図である。（Ａ）ビオチン−１１−ＣＴＰ（ＮＥＮ）を含む反応混合物を３０℃で１時間インキュベートした。ＲＮＡ産物を、水で平衡化したゲル濾過スピンカラム（ＡｕｔｏＳｅｑ  Ｇ−５０、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を通過させることによって取り込まれていないヌクレオチドから精製した。フロースルー画分由来のアリコートを、３Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＯＨで希釈して、予め湿らせたＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋メンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上にスポットした。このメンブレンを２×ＳＳＣ、２．５％  ＢＳＡ、０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０中で３７℃で１時間ブロッキングし、次いで１：１０００希釈のＨＲＰコンジュゲート化ストレプトアビジン（ＮＥＮ）と共に２８℃で３０分間インキュベートした。このメンブレンを２×ＳＳＣ、０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で４回洗浄し（各洗浄は１０分間）、メンブレンに結合したＨＲＰをＥＬＣ（Ｐｉｅｒｃｅ）を製造業者の指示に従って使用して検出した。Ｐ、２５μｇ／ｍｌのＱＤＥ−１ΔＮポリメラーゼを含むがＲＮＡを含まない反応；Ｒ、９０μｇ／ｍｌのｌｕｃ  ＲＮＡを含むがポリメラーゼを含まない反応；ＰＲ１およびＰＲ２、２５μｇ／ｍｌのＱＤＥ−１ΔＮおよび９０μｇ／ｍｌのｌｕｃ  ＲＮＡの両方を含む反応。上の列は５μｌの元の重合反応に対応し、下の列は０．５μｌの元の重合反応に対応する。反応は、各１ｍＭのＡＴＰおよびＧＴＰ、０．２ｍＭのＵＴＰならびに０．１５ｍＭ（ＰＲ２）または０．２ｍＭ（Ｐ、Ｒ、ＰＲ１）のいずれかのビオチン−１１−ＣＴＰを含んだ。ＰＲ２反応はさらに、０．０５ｍＭの未改変ＣＴＰを含んだ。（Ｂ）ビオチン−１１−ＣＴＰの代わりにクマリン−５−ＣＴＰ標識（ＮＥＮ）を使用したこと以外、反応を（Ａ）と同様に実施した。ゲル濾過工程後、ＲＮＡ産物へのクマリン標識の取り込みを、４０２ｎｍの励起波長を用いた蛍光測定法を使用してスコアリングした。以下の発光スペクトルが示されている：Ｐ、２５μｇ／ｍｌのＱＤＥ−１ΔＮポリメラーゼを含むがＲＮＡを含まない反応；Ｒ、９０μｇ／ｍｌのｌｕｃ  ＲＮＡを含むがポリメラーゼを含まない反応；ＰＲ１、ＰＲ２およびＰＲ３、２５μｇ／ｍｌのΔＮおよび９０μｇ／ｍｌのｌｕｃ  ＲＮＡの両方を含む反応。反応は、各１ｍＭのＡＴＰおよびＧＴＰ、０．２ｍＭのＵＴＰならびに０．０２５ｍＭのクマリン−５−ＣＴＰを含んだ。未改変のＣＴＰを０．２ｍＭになるまで反応Ｐ、ＲおよびＰＲ３に添加し、そして反応ＰＲ２に０．０５ｍＭになるまで添加した。
【図１３】異なるＤＮＡテンプレートの存在下でのＲＮＡ合成を示す図である。（Ａ）および（Ｂ）はそれぞれ、非変性条件下での反応産物のアガロースゲル分離のＥｔＢｒ染色およびオートラジオグラムである。反応を以下のテンプレートを用いてプログラムした：ｌｕｃ、ルシフェラーゼｍＲＮＡ；Ｍ１３、バクテリオファージＭ１３の環状ｓｓＤＮＡゲノム；ＧＥＭ、ＨｉｎｃＩＩで線状化したｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）プラスミド；ＧＥＭ−ｂ、ＨｉｎｃＩＩで線状化し、２分間煮沸することによって変性させ、次に氷上で冷却したｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）プラスミド。示されたところでΔＮを反応混合物に添加して、２５μｇ／ｍｌの最終濃度にした。ＭはｄｓＲＮＡマーカーのレーンである。（Ｃ）アガロースゲル電気泳動によって分析した、熱変性したＱＤＥ−１ΔＮ反応産物のオートラジオグラム。Ｍｓｓは、１７９８ｎｔ長および２０ｎｔ長の標識されたｓｓＲＮＡを含むマーカーのレーンである。
【図１４】Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ指向性の転写およびΔＮ指向性の合成を同じ反応容器中で同時に実施した系を示す図である。反応を、５０ｎｇ／μｌのＸｈｏＩで線状化したプラスミドｐＴＺｌｕｃ（−ストップ）（Ｍａｋｅｙｅｖら、１９９６）を用いてプログラムし、標準的なＱＤＥ−１反応について実施例２で記載した条件下で１時間実施した（インキュベーション温度が３５℃であるという差異がある）。産物をアガロースゲル電気泳動によって分析した。パネルの上部に示されるように、０．２５μｇのΔＮまたは／および４０単位のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、反応混合物１０μｌ当たりに添加した。ＭはｄｓＤＮＡマーカーのレーンである。左のパネル、エチジウムブロマイド染色；右のパネル、対応するオートラジオグラム。
【図１５】ＱＤＥ−１反応産物を使用してＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおける遺伝子特異的なサイレンシングを誘導したＲＮＡｉ実験を示す図である。ＱＤＥ−１反応産物は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいてＲＮＡｉを誘導し得る。ＱＤＥ−１のＧＦＰ特異的ｄｓＲＮＡ産物（ａ〜ｂ）またはＧＦＰｓｓＲＮＡ（ｃ〜ｄ）のいずれかによって処理した雌雄同体のＦ１子孫の代表的な画像が示されている。（ａ）および（ｃ）中の写真は、Ｈｏｆｆｍａｎモジュレーションコントラストを使用して撮影した；（ｂ）および（ｄ）は対応する蛍光画像である。（ａ〜ｂ）中の３匹の虫のうち２匹が検出可能なＧＦＰ蛍光を示さないことに留意のこと。類似の結果がΔＮポリメラーゼ反応産物を使用して得られた（結果省略）。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年7月28日(2005.7.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006503562000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年9月13日(2005.9.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸産物を産生するための方法であって、単離されたポリメラーゼタンパク質が前記酵素の機能に充分な条件下で核酸テンプレートと接触することを含み、前記ポリメラーゼタンパク質は、
（ａ）全テンプレート長中に分散した前記テンプレートの短い相補的ＲＮＡコピー、および任意選択で
（ｂ）テンプレート長の相補的ＲＮＡコピーを産生し得るＲＮＡポリメラーゼである方法。
【請求項２】
前記核酸テンプレートがＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記短いＲＮＡコピーとテンプレート長のＲＮＡコピーとの比率が反応条件によって調整され得る、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記短いＲＮＡコピーの長さが反応条件によって調整され得る、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記短いＲＮＡコピーまたはテンプレート長のＲＮＡコピーが、前記テンプレートにアニールされるかまたは前記テンプレートから変性される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸テンプレートが線状または環状である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリメラーゼが真核細胞起源である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリメラーゼが、真菌、緑色植物門、後生動物の界、または動菌類の群から選択される生物起源である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリメラーゼが、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ属およびＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ属のサブセット、好ましくは生物Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓおよびＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍから選択される生物起源である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリメラーゼがＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａのＱＤＥ−１タンパク質またはＱＤＥ−１の変更された誘導体もしくは遺伝学的に改変された誘導体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＲＮＡポリメラーゼが、
（ａ）配列番号１または配列番号３の核酸配列を含む核酸配列；
（ｂ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｃ）遺伝子コードの縮重に起因して（ａ）または（ｂ）の核酸配列とは異なる核酸配列；
（ｄ）ストリンジェントな条件下で（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の核酸配列にハイブリダイズする核酸配列；および
（ｅ）配列番号2のアミノ酸７０９から１４０２を含むポリペプチド、または配列番号２のアミノ酸２から１４０２を含む配列までの、配列番号2のアミノ酸７０９から１４０２を含むポリペプチドよりも長い任意の配列をコードする核酸配列；および
（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を示すアミノ酸配列をコードする核酸配列
の群から選択される核酸配列によってコードされる、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）ｓｓＲＮＡテンプレートまたはｓｓＤＮＡテンプレートを提供する工程；
（ｂ）前記ｓｓＲＮＡテンプレートまたはｓｓＤＮＡテンプレートをｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＲＮＡ合成に充分な条件下でポリメラーゼと接触させる工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｓｓＲＮＡテンプレートが、ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ、好ましくはＤＮＡバクテリオファージによりコードされるＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼの群から選択されるポリメラーゼ、最も好ましくはバクテリオファージＴ７、バクテリオファージＴ３またはバクテリオファージＳＰ６のＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡテンプレートを転写することによって提供される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記反応が同じ反応容器中で同時または連続的に実施される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
新たに産生されたＲＮＡ種が反応混合物から回収される、請求項１２乃至１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記新たに産生されたＲＮＡ鎖が、前記テンプレートとアニールされてｄｓＲＮＡエレメントを形成するか、あるいは前記テンプレートから変性される、請求項１２乃至１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ＲＮＡ合成がＲＮＡテンプレートまたはＤＮＡテンプレートに相補的な核酸プライマーの３’末端から開始されるか、あるいはＲＮＡ合成がプライマーなしで開始される、請求項１２乃至１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ＲＮＡ合成のための前記反応混合物が、放射性同位体で任意選択で標識されたかまたは化学的に改変された少なくとも１種のヌクレオシド三リン酸、ｐＨ緩衝液、酢酸アンモニウム、ＰＥＧ、Ｍｇ２＋イオン、Ｍｎ２＋イオンおよび／または非イオン性界面活性剤を含む、請求項１２乃至１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
放射能によりまたは化学的に標識されたＲＮＡプローブを産生するために特に使用され、かつ新たに産生された標識されたＲＮＡを前記反応混合物の成分から精製する任意選択の工程を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記標識されたＲＮＡが、前記任意選択の精製工程後にサザンブロット分析またはノザンブロット分析のためのプローブとして使用される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記標識されたＲＮＡが、前記任意選択の精製工程後に蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析のためのプローブとして使用される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記標識されたＲＮＡが、前記任意選択の精製工程後にマイクロアレイ分析のためのプローブとして使用される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
単離されたポリペプチドであって、
（ｉ）前記ポリペプチドが充分なＲＮＡポリメラーゼ活性を有し、かつ核酸テンプレートと接触させた場合に、前記テンプレートの短い相補的なＲＮＡコピーを産生し得、前記ＲＮＡコピーは、全テンプレート長中に分散し、任意選択で、テンプレート長の相補的ＲＮＡコピーを産生し得る；
（ｉｉ）前記ポリペプチドが増強された可溶性を有し、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号１を含む核酸配列によってコードされるポリペプチドの場合よりも、少なくとも３倍高い収率の活性ポリメラーゼを生じる；および
（ｉｉｉ）前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号３の核酸配列を含む核酸配列；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｃ）遺伝子コードの縮重に起因して（ａ）または（ｂ）の核酸配列とは異なる核酸配列；
（ｄ）ストリンジェントな条件下で（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の核酸配列にハイブリダイズする核酸配列；
（ｅ）配列番号２のアミノ酸７０９から１４０２を含むポリペプチド、または配列番号２のアミノ酸２から１４０２を含む配列までの、配列番号２のアミノ酸７０９から１４０２を含むポリペプチドよりも長い任意の配列をコードする核酸配列；および
（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を示すアミノ酸配列をコードする核酸配列
の群から選択される核酸配列によってコードされる
ことを特徴とする単離されたポリペプチド。
【請求項２４】
請求項２３に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸配列。
【請求項２５】
遺伝子発現に必要な調節配列と作動可能に連結された、請求項２４に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２７】
ポリメラーゼタンパク質を産生するための方法であって、前記タンパク質の発現に適切な条件下で請求項２６に記載の宿主細胞を培養する工程を含む方法。
【請求項２８】
前記タンパク質が細胞または培養培地から回収され、かつ任意選択で精製される工程を含む、請求項２７に記載の方法
【請求項２９】
核酸の二次構造、好ましくはＲＮＡの二次構造を研究するための方法であって、
（ａ）核酸標的分子、好ましくはＲＮＡ標的分子を提供する工程；
（ｂ）放射能によりまたは化学的に標識されたヌクレオチドをさらに含む混合物において、前記標的分子を、ＲＮＡ合成に充分な条件下で、テンプレートとしての前記核酸標的の短い相補的なＲＮＡコピーであって、テンプレート長のｓｓＲＮＡ領域中に分散しているＲＮＡコピー、任意選択で、テンプレート長の相補的ＲＮＡコピーを産生し得る単離されたＲＮＡポリメラーゼと接触させて、その結果前記標的ＲＮＡの一本鎖エレメントが前記ポリメラーゼによってコピーされる工程；
（ｃ）新たに産生された標識された核酸種を反応混合物から回収し、任意選択で精製する工程；
（ｄ）前記標的分子の核酸フラグメントを含むマイクロアレイチップのためのプローブとして前記標識された核酸種を使用する工程；
（ｅ）前記マイクロアレイ分析からのデータを解釈して、前記標的分子のどの部分が一本鎖であるかを推定する工程；および任意選択で
（ｆ）前記標的分子の二次構造または三次構造についてのモデルを構築する工程
を含む方法。
【請求項３０】
核酸−タンパク質相互作用、好ましくはＲＮＡ−タンパク質相互作用を研究するための方法であって、
（ａ）核酸標的および核酸結合タンパク質、好ましくはＲＮＡ標的およびＲＮＡ結合タンパク質を提供する工程；
（ｂ）標的−タンパク質相互作用に充分な条件下で、前記標的と実験混合物中の前記タンパク質の溶液とを接触させ、かつ別個の容器中で前記標的を前記タンパク質を欠く対照溶液と接触させる工程；
（ｃ）前記実験混合物および対照混合物を、ＲＮＡ合成に充分な条件下で、テンプレートとしての前記核酸標的の短い相補的なＲＮＡコピーであって、タンパク質によって覆われていないテンプレート長中に分散しているＲＮＡコピー、任意選択で、テンプレート長の相補的ＲＮＡコピーを産生し得る単離されたＲＮＡポリメラーゼと接触させる工程；
（ｄ）新たに産生された標識された核酸種を両方の反応混合物から回収し、任意選択で精製する工程；
（ｅ）前記標的の核酸フラグメントを含む２つの同一なマイクロアレイチップのためのプローブとして２セットの前記標識された核酸種を使用する工程；
（ｆ）前記２つのマイクロアレイ分析からのデータを解釈して、前記標的分子のどの部分がＲＮＡ合成のためにアクセス可能であるかを推定する工程；
（ｇ）前記２つのデータセットを比較して、実験混合物中の標的と対照混合物中の標的との間の差異を決定する工程；および任意選択で
（ｈ）前記２つのデータセット間の差異を、核酸−タンパク質相互作用についてのモデルとして解釈する工程
を含む方法。
【請求項３１】
ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡ干渉を誘導するためのＲＮＡトリガー分子を産生するための方法であって、
（ａ）ＲＮＡテンプレートまたはＤＮＡテンプレートを提供する工程；
（ｂ）核酸テンプレート、ＲＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸および任意選択でｐＨ緩衝液、酢酸アンモニウム、ＰＥＧ、Ｍｇ２＋イオン、Ｍｎ２＋イオンおよび／または非イオン性界面活性剤を含む混合物中で、ＲＮＡ合成に充分な条件下で、前記ＲＮＡテンプレートまたはＤＮＡテンプレートを、前記テンプレートの短い相補的なＲＮＡコピーであって、全テンプレート長中に分散しているＲＮＡコピー、任意選択で、テンプレート長の相補的ＲＮＡコピーを産生し得る前記単離されたＲＮＡポリメラーゼと接触させる工程；および
（ｃ）ＲＮＡ合成に充分な温度で前記反応混合物をインキュベートする工程、
を含む、方法。
【請求項３２】
前記ＲＮＡテンプレートまたはＤＮＡテンプレートが細胞またはウイルス起源である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＲＮＡテンプレートが、Ｔ７バクテリオファージ、Ｔ３バクテリオファージおよびＳＰ６バクテリオファージの群から選択されるバクテリオファージから、好ましくは由来するＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡテンプレートを転写することによって提供される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
工程（ａ）および（ｂ）が、同じ反応容器中で同時または連続的に実施される、請求項３１または３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項２３に記載のポリペプチドを含むキット。
【請求項３６】
検出可能なレベルのＲＮＡ合成に必要な添加剤をさらに含む、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
ＲＮＡ合成に充分な濃度でヌクレオシド三リン酸を含む、請求項３５または３６に記載のキット。
【請求項３８】
少なくとも１種のヌクレオシド三リン酸が、放射性同位体で標識されているかまたは化学的に改変されている、請求項３５乃至３７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３９】
請求項２３に記載のポリペプチドによるＲＮＡ合成のためのテンプレートとして働く特徴付けられた能力を有する標準的な核酸調製物をさらに含む、請求項３５乃至３８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４０】
核酸の二次構造を研究するため、核酸−タンパク質相互作用を研究するため、またはＲＮＡトリガー分子を産生するための、請求項１に記載の方法の使用。
【国際調査報告】
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2006503562.tif 000036
2006503562.tif 000037
2006503562.tif 000038
2006503562.tif 000039
2006503562.tif 000040