(57)【要約】本発明は、gad2遺伝子の5'領域における多型の同定に基づく、肥満、特に病的肥満の診断および治療の新しい方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肥満、特に病的肥満、になりやすい素因をヒト被験者において診断するための方法であって、コーディング配列が配列番号：1によって表されるgad2遺伝子の5'隣接領域の配列中に生殖細胞系の変化が存在するかどうかを判定することを含み、前記変化とは次の変異、配列番号：2の第2137番のヌクレオチドにある-243 A>G、配列番号：2の第780番のヌクレオチドにある-1.6kb G>A、配列番号：2の第376番のヌクレオチドにある-2004 A>T、のうち少なくとも1つ存在することであり、該変化が肥満になりやすい素因を示す方法。
【請求項２】
肥満が病的肥満である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ヒト被験者における肥満になりやすい素因を、被験者由来の試料から診断するための方法であって、試料におけるgad2遺伝子の発現産物のレベルが調べられる方法。
【請求項４】
発現産物がRNAもしくはタンパク質、またはGABAである、請求項3記載の方法。
【請求項５】
配列番号：16および17において各々表されているSNPのアレル+61450 C>A、および+83897 T>Aを含む病的肥満に対する保護性ハプロタイプを検出することからなる段階をさらに含む、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
【請求項６】
配列番号：4〜15より選択される、肥満になりやすい素因を検出するためのプライマーまたはプローブ。
【請求項７】
配列番号：4、5、8、9、12および13からなるプライマーもしくはプローブのセット、または配列番号：6、7、10、11、14および15からなるプライマーもしくはプローブのセットを含む、肥満になりやすい素因を検出するためのキット。
【請求項８】
配列番号：16もしくは17またはその相補的な配列の10〜13個の連続したヌクレオチドからなる、保護性ハプロタイプの検出を可能にするプライマーまたはプローブをさらに含む、請求項7記載のキット。
【請求項９】
候補となる肥満薬をスクリーニングするための方法であって、（i）肥満薬であることが推測される化合物、（ii）GAD2ポリペプチド、を組み合わせ、かつGAD2ポリペプチドの化合物への結合の量を測定することを含む方法。
【請求項１０】
候補となる肥満療法薬をスクリーニングするための方法であって、（i）GAD2の結合パートナー、（ii）GAD2ポリペプチド、および（iii）肥満療法薬であることが推測される化合物、を組み合わせ、かつGAD2ポリペプチドのその結合パートナーへの結合の量を測定することを含む方法。
【請求項１１】
GAD2結合パートナーがL-グルタミン酸である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
候補となる肥満療法薬をスクリーニングするための方法であって、（i）gad2遺伝子の結合パートナー、（ii）gad2遺伝子、および（iii）肥満療法薬であることが推測される化合物、を組み合わせ、かつgad2遺伝子のその結合パートナーへの結合の量を測定することを含む方法。
【請求項１３】
gad2遺伝子の結合パートナーがIK2（Ikaros 2）である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
請求項9〜13のいずれか1項記載の方法によって同定された化合物と共に、薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１５】
肥満、特に病的肥満の治療を目的とする薬剤の調製のための、請求項9〜13のいずれか1項記載の方法によって同定された化合物の、または請求項14記載の組成物の使用。
【請求項１６】
肥満、特に病的肥満の治療を目的とする薬剤の調製のための、gad2のmRNAに相補的なアンチセンス分子またはSiRNAの使用。
【請求項１７】
インスリン分泌の調節のための請求項15または16記載の使用。
【請求項１８】
gad2遺伝子の5'隣接領域の断片であって、特に（配列番号：2の第2137番のヌクレオチドにおける）-243 A>G変異を前記領域中に含むセンス分子の、肥満の治療を目的とする薬剤の製造のための使用。
【請求項１９】
ゲノム中に、制御エレメントと動作可能に連結したgad2の核酸配列またはそのコーディング配列が組み込まれているトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、前記配列の発現が、前記哺乳動物において同じ種の非トランスジェニック哺乳動物と比べてGAD2タンパク質および／またはGABAプールのレベルを増大する、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項２０】
ゲノムが内因性gad2遺伝子の破壊を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、破壊が選択可能なマーカー配列の挿入を含み、かつ該破壊により、結果的に野生型非ヒト哺乳動物と比較したGABAレベルの異常を非ヒト哺乳動物が示すこととなる、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項２１】
マウスである、請求項19または20記載の哺乳動物。
【請求項２２】
肥満を研究するための、または候補となる抗肥満薬を試験するためのモデルとしての請求項19〜21のいずれか1項記載の哺乳動物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒト遺伝学の分野に属し、gad2遺伝子の5'領域における多型の同定に基づく、肥満、特に病的肥満の診断および治療の新規方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
病的肥満は、重篤な疾患過程であり、この過程では身体表面の脂肪組織の蓄積が過剰になり、その他の身体臓器に害を及ぼし、または損傷を与え、かつ、合併症と呼ばれる、重篤でしかも生命にかかわる健康上の問題を引き起こす（または予想可能に引き起こすことになる）。
【０００３】
人々の肥満度指数（BMI＝身長（cm）／（重さ（kg））2）が40に等しいか、またはそれを超える場合、彼らは病的肥満である、とされる。
【０００４】
多数の科学的研究により、病的肥満に対する遺伝的疾病素質が存在することが明らかにされている。
【０００５】
第10染色体のある領域が肥満と関連づけられてきたが（Hagerら、Nature Genetics 1998；20：304-38）、最近それがドイツ人の若い肥満被験者のコホートにおいて（Hinneyら、2000, Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 2000；85 (8)：2962-5）、ならびに、白人およびアメリカ黒人において（Priceら、2001, Diabetologia 1999, 42 : 555-9）、およびオールド・オーダー・アーミッシュ（Hsuehら、2001, The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 2001; 86 (3): 1199-1205）においても確認された。
【発明の開示】
【０００６】
3つの新しい一塩基変異多型（SNP）が本発明の枠組みにおいて同定され、この領域に、より詳細にはgad2遺伝子の5'領域に位置づけられた。これらのSNPが、病的肥満の被験者における肥満と明らかな関係を示す一方、この領域におけるその他のSNPは、この関係を示さない。
【０００７】
本発明の枠組みにおいて、gad2遺伝子とは、そのコーディング配列が配列番号：1で表される遺伝子を示すことを意味する。
【０００８】
gad2遺伝子の5'隣接領域とは、配列番号：2の第1〜第2379番のヌクレオチドを含む領域、および特に配列番号：2の第1〜第2379番のヌクレオチドに存在する領域を示すことを意味する。配列番号：2のヌクレオチド第2380〜第2382番は、gad2遺伝子の開始コドン（ATG）を表す。
【０００９】
従って、最初の態様において、本発明は、肥満、特に病的肥満になりやすい素因を、ヒト被験者において診断するための方法であって、それは、gad2遺伝子の5'隣接領域の配列中に生殖細胞系の変化が存在するかどうかを判定することを含み、該変化とは次の変異、配列番号：2の第2137番のヌクレオチドにある-243 A>G、配列番号：2の第780番のヌクレオチドにある-1.6kb G>A、配列番号：2の第376番のヌクレオチドにある-2004 A>T、のうち少なくとも1つ存在することであり、該変化は肥満になりやすい素因を示す方法に関する。
【００１０】
gad2遺伝子の5'隣接領域は、配列番号：2の第1〜第2379番のヌクレオチドによって表され、かつ本発明によるSNPは、配列番号：2の第376番（素因のある患者におけるT、および素因のない患者におけるAの存在）、第780番（素因のある患者におけるA、および素因のない患者におけるGの存在）、および第2137番（素因のある患者におけるG、および素因のない患者におけるAの存在）のヌクレオチドに位置する。
【００１１】
本発明は、より一般的には、gad2遺伝子の5'プロモータ領域の研究に関する。実際に、発明者らは、本願において示されている特異的なSNPの存在が、gad2遺伝子の5'領域への核因子の結合増大につながり、従って転写の増大につながることを明らかにした。
【００１２】
従って、GAD2タンパク質のより高い発現につながる、gad2遺伝子のプロモータ領域におけるその他の改変もまた、GABAプールの増大のために、肥満になりやすい素因につながるという推測は確かなものである。GABAの食欲増進効果のために、これが摂食行動を変える場合がある。
【００１３】
従って、1つの態様において、本発明は、ヒト被験者において肥満になりやすい素因を診断するための方法であって、該試料におけるgad2遺伝子の発現産物のレベルが調べられる方法に関する。
【００１４】
本発明による発現産物は、RNAもしくはタンパク質、またはGABAのような、言ってみれば「二次的な」発現産物が含まれることが意味されている。最後のものは実際にはまさにgad2遺伝子の発現産物ではないが、GAD2タンパク質の産生の増大はGABA濃度の増大につながる。
【００１５】
mRNA発現の変化は、当技術分野において周知の任意の手法によって検出することができる。これらには、ノーザン・ブロット解析、PCR増幅およびRNAプロテクションが含まれる。
【００１６】
1つの態様において、試料のmRNAは、gad2遺伝子プローブと、該プローブの該gad2遺伝子に対応するRNAへのハイブリダーゼーションに適した条件下で接触させられ、かつ該プローブのハイブリダイゼーションが決定され、かつハイブリダイゼーション後のシグナルのレベルが標準（参照）シグナル（それは非肥満患者または肥満患者のどちらかから得られる）と比較される。
【００１７】
ハイブリダイゼーション複合体からはシグナルが放出され、これはプローブの、またはmRNAの標識によるものである可能性がある。使用してもよい種々の標識は、当業者に周知であり、32P、33P、35S、3Hまたは125Iを挙げることができる。非放射性標識は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジオキシゲニンのようなリガンド、ハプテン、色素、または放射線発光、化学発光、生物発光、蛍光もしくは燐光試薬のような発光試薬より選択してもよい。
【００１８】
本願において記載されているSNPを同定するために、gad2遺伝子5'領域プローブを、該試料から単離したゲノムDNAと、該プローブの該遺伝子へのハイブリダーゼーションに適した条件下で接触させることが可能であり、かつ該プローブのハイブリダイゼーションが決定される。
【００１９】
前記gad2遺伝子5'領域プローブは、「野生型」DNA（すなわち、検索されたSNPがプローブ上に存在せず、かつハイブリダイゼーションは試料中のDNAに本発明によるSNPが何も存在しない場合に起こる）または「変異型」DNA（すなわち、検索されたSNPを持っていて、かつ試料中のDNAにSNPが存在する場合にのみハイブリダイゼーションが起こる）のどちらかである。
【００２０】
当業者には、本態様において用いるアレル特異的プローブ、それらの長さ、またはハイブリダイゼーション条件を決定する手法が周知である。例えば55〜65℃で0.2X SSCおよび0.1% SDSの高ストリンジェンシー条件下、または以下に記載されているような条件下における高ストリンジェンシー条件は、偽陽性を防ぐために好ましい。
【００２１】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、Sambrookら（（1989） Molecular cloning: a laboratory manual. 第2版. Cold Spring Harbor Lab, Cold Spring Harbor, ニューヨーク）に記載されているように定義をし、次の条件を伴うようにすることが可能である：5xまたは6x SCC、50〜65℃。ハイブリダイゼーションのためにやはり用いることができる高度にストリンジェントな条件は、以下の条件によって定義される：6x SSC、60〜65℃。
【００２２】
DNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリダイゼーションは、2つの段階で行ってもよい：（1）5xまたは6x SSC（1x SSCは0.15M NaCl＋0.015Mクエン酸ナトリウム溶液に相当する）、50%ホルムアミド、7%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、10xデンハルト液、5%硫酸デキストラン、1%サケ精子DNAを含むリン酸緩衝液（20mM、pH7.5）中に3時間42℃におけるプレハイブリダイゼーション；（2）55〜65℃、より好ましくは60〜65℃の温度で20までの間のハイブリダイゼーション、その後の異なる洗浄（2x SSC＋2% SDS、次に0.1x SSC＋0.1% SDSにおいて約20分間）。最後の洗浄は約50〜65℃で約30分間、0.2x SSC＋0.1% SDSにおいて、および／または同じ温度で0.1x SSC＋0.1% SDSにおいて行われる。これらの高ストリンジェンシー・ハイブリダーゼーション条件は、当業者によって適合されてもよい。実際、当業者は、SSCおよびSDSの濃度ならびにハイブリダーゼーションおよび洗浄の温度を変化させることによって、最良のストリンジェンシー条件を決定することができる。
【００２３】
もう1つの態様において、前記発現産物は、前記試料中のgad2遺伝子によってコードされるポリペプチドである。特に、該ポリペプチドを、免疫ブロット法または免疫細胞化学によって検出してもよい。
【００２４】
増大したGAD2発現を検出するために、GAD2に特異的な抗体を用いることができる。免疫学的検定法は、当技術分野において周知の任意の簡便な方式において行うことができる。これらには、ウエスタンブロット、免疫組織化学検定法、およびELISA法が含まれる。
【００２５】
従って、GAD2ポリペプチドと反応する抗体およびそのような抗体の反応性断片もまた本発明の範囲内に包含される。抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、組換え体、キメラ、単鎖および／または二重特異性であってよい。好ましい態様において、抗体またはその断片は、ヒト由来のものか、または「ヒト化」される、すなわち患者に投与した場合に抗体に対する免疫反応を防ぐかまたは最小限にするように調製される。
【００２６】
抗体断片は、本発明のポリペプチドに反応性の任意の断片であってもよい。本発明は、本発明によるポリペプチドまたはその断片を、選択された哺乳動物に抗原として提示し、その後周知の手法、例えばKohlerおよび Milstein （1975 Nature 256, 495）の手法によって、その哺乳動物の細胞（例えば、脾細胞）を特定の癌細胞と融合させることによって不死化細胞株を作り出すことによって産生される、ハイブリドーマもまた包含する。
【００２７】
本発明による抗体は、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、FabまたはF(ab')2断片である。それらは、検出用に、免疫複合体または標識抗体であってもよい。
【００２８】
もう1つの態様において、本発明は、変性または非変性ポリアクリルアミドゲルで前記試料からの一本鎖DNAの電気泳動移動度の変化を観察することにより、該試料におけるgad2遺伝子5'領域の生殖細胞系の配列に変化が存在するかどうかを判定することによって行われる。前記一本鎖核酸は、適したプライマーを用いたゲノムDNAの増幅、および変性（ゲルと電気泳動の条件は通常そのような目的のために変性条件になっている）の後に得ることができる。
【００２９】
もう1つの態様において、本発明は、前記試料からのgad2遺伝子5'領域の全体または一部の増幅、および該増幅DNAの、例えばチェイン・ターミネーション・エクステンションによる配列決定によって、行われる。
【００３０】
もう1つの態様において、前記試料中に特異的gad2変異体アレルが存在し、この場合においてのみ増幅が起こるかどうかを決定するために、アレル特異的オリゴヌクレオチド・プライマーが用いられる。この方法は、当技術分野において周知である。
【００３１】
もう1つの態様において、前記試料からのgad2遺伝子5'領域の全体または一部は、クローニング配列を生成するためにクローニングされ、かつ該クローニング配列の配列が決定される。クローニングは、当技術分野において周知のベクター、例えばpUCまたはpBRベクターなどにおいて行われる。
【００３２】
一般に、本発明は、被験者において、肥満、とりわけ病的肥満になりやすい素因を該被験者の試料から決定するための方法であって、それは、（1）該試料から単離されたgad2遺伝子ゲノムDNAの5'領域と（2）配列番号：2により表されるようなgad2遺伝子のDNAのヒト野生型5'領域に相補的な核酸プローブとの間に不一致が存在するかどうかを、分子（1）および（2）を二本鎖を形成させるためにお互いに対してハイブリダイズさせた場合、該不一致が配列番号：2の第376、780、2137番のヌクレオチドに存在する3つの同定されたSNPのうち少なくとも1つの存在に起因する場合に、判定することを含む方法に関する。
【００３３】
もう1つの態様において、本発明は、前記試料におけるgad2遺伝子の5'隣接領域の配列の増幅が行われ、かつ増幅された配列の、野生型gad2遺伝子5'隣接領域配列（配列番号：2により表されるような）または変異型gad2遺伝子5'隣接領域配列（そこでは配列番号：2の第376、780、2173番のヌクレオチドに位置する3つのSNPのうちの少なくとも1つが存在する）に由来する1つまたは複数の核酸プローブへのハイブリダイゼーションが決定される方法に関する。
【００３４】
本発明は、前記試料におけるgad2遺伝子5'隣接領域の、野生型または変異型gad2遺伝子5'隣接領域配列に由来する1つまたは複数の核酸プローブとのインサイチュー・ハイブリダイゼーションを決定することを含む方法にもまた関する。
【００３５】
もう1つの態様において、本発明は、配列番号：4〜15より選択される肥満になりやすい素因を検出するためのプライマーまたはプローブを目的とする。本発明は、配列番号：4、5、8、9、12および13からなるプライマーもしくはプローブのセット、または配列番号：6、7、10、11、14および15からなるプライマーもしくはプローブのセットを含む、肥満になりやすい素因を検出するためのキットもまた包含する。本キットは、配列番号：16もしくは17またはその相補配列の、10〜13個の連続したヌクレオチドからなる、保護性ハプロタイプの検出を可能にするプライマーまたはプローブをさらに含んでもよい。
【００３６】
本発明は、特に遺伝的感受性が疑われる家系における患者のための、肥満、とりわけ病的肥満の治療および／または予防における新領域を切り開く。
【００３７】
実際に、gad2遺伝子の5'領域におけるSNPの存在、および本発明の枠組みにおいて同定された多型が存在する場合に該領域への核因子の結合が増大することを示すデータによって、これらの多型の存在が、おそらく転写の増大を介して、gad2の発現を増大するということが、可能となり、かつ信じ得るものとなる。さらに、gad2遺伝子の活性増大は、GABAプールの、GABAの食欲増進効果の増大につながり、それが、同定された変異のキャリアにとって、摂食行動を変じ、かつ病的肥満の発生の一因となる可能性がある。
【００３８】
従って、本発明は、候補となる肥満薬をスクリーニングするための方法であって、（i）肥満薬であることが推測される化合物、（ii）GAD2ポリペプチドを組み合わせ、かつ該化合物へのGAD2ポリペプチドの結合の量を測定することを含む方法にも関する。実際に、GAD2酵素の阻害剤はGABAの生成を妨げ、単独またはその他の治療と共同で、肥満を治療するための有用な薬剤として考慮することができる。
【００３９】
本発明は、候補となる肥満療法薬をスクリーニングするための方法であって、（i）GAD2の結合パートナー、（ii）GAD2ポリペプチド、および（iii）肥満療法薬であることが推測される化合物を組み合わせ、かつGAD2ポリペプチドのその結合パートナーへの結合の量を測定することを含む方法にも関する。
【００４０】
ある特定の態様において、前記結合パートナーはL-グルタミン酸である。
【００４１】
本発明は、候補となる肥満療法薬をスクリーニングするための方法であって、それは（i）gad2遺伝子の結合パートナー、（ii）gad2遺伝子、および（iii）肥満療法薬であることが推測される化合物を組み合わせ、かつgad2遺伝子のその結合パートナーへの結合の量を測定することを含む方法にも関する。この態様において、「gad2遺伝子」という用語は、gad2遺伝子座における5'隣接領域を含むものとして理解されるべきであり、それには本発明の多型、特に-243 A>Gが含まれる。
【００４２】
特に、前記gad2遺伝子の結合パートナーはIK2（Ikaros 2）であり、そのアミノ酸配列は配列番号：3によって表されている。
【００４３】
化合物の核酸またはタンパク質への結合を評価するための方法は、当技術分野において周知であり、好ましくはインビトロで行われる。そのような目的を達成する方法は、核酸またはタンパク質を固形支持体に結合させ、試験するための化合物をそこに流し、かつ支持体を通過後の化合物の回収率を調べることであってもよい。パラメータを調節することにより、結合親和性を決定することもまた可能である。化合物および核酸またはタンパク質が標識されている場合、化合物が、FRET、SPA...を含むその他の方法によっても見出されてもよい。検定法は、例えば本発明によるベクター上の本発明の核酸を含む、および／または本発明によるタンパク質を発現している、細胞でも行ってもよい。これは、膜を通り抜け細胞内に達する化合物の能力の情報もまた与える。これらの細胞は、細菌細胞、または哺乳動物細胞であり得る。
【００４４】
本発明の方法により、GAD2タンパク質の生物活性、および、特に、産生されたGABAの量の増大を阻害し得る化合物の、スクリーニング、検出および／または同定もまた可能になる。
【００４５】
本発明は、従って、V(D)J組換えおよび／またはDNA修復が関係している疾患の治療に有用である可能性のある化合物の検出、同定、および／またはスクリーニングを可能にする。それにもかかわらず、本発明による方法によって同定された化合物は、薬剤療法治療において使用するために、より優れた活性および／またはより小さい毒性を有するよう最適化される必要がある可能性がある。
【００４６】
実際に、新しい薬剤の開発は、しばしば以下を基準として行われる；
-  関連したモデルに沿い、適当な方法による、測定される活性を有する化合物のスクリーニング、
-  最初のスクリーニング試験からの、必要とされる特性を有する化合物の選択（本明細書では、GAD2またはGABA産生の調節）、
-  選択された化合物の構造（特に、それらがペプチド、タンパク質、または核酸である場合は配列（可能であれば三次配列）、それらが化合物である場合は化学式およびバックボーン）の決定、
-  構造の改変（例えば、立体化学的なコンホメーションを変えること（例えばペプチドにおけるアミノ酸のLからDへの転移）、特にバックボーンに基または遊離基をグラフト化（grafting）することによるペプチド性バックボーンまたは化学的バックボーンへの置換基の付加、ペプチドの改変（特に、Gante「Peptidomimetics」, Angewandte Chemie-International Edition Engl. 1994,33. 1699-1720を参照のこと）による、選択された化合物の最適化、
-  しばしばよく研究された病理学により近いモデルである、適当なモデルによる、「最適化された」化合物の試験およびスクリーニング。この段階で、動物モデル、特にげっ歯類（ラットまたはマウス）またはイヌまたは非ヒト霊長類、がしばしば用いられ、それは肥満の、および、化合物の投与後の該モデルにおける表現型の変化を探すための、優れたモデルである。
【００４７】
本発明は、記載されているような段階または同等の段階に従った後に最適化された化合物もまた包含する。
【００４８】
本発明は、薬学的に許容される賦形剤および本発明による方法によって同定された化合物を含む薬学的組成物、ならびに、本発明による方法によって同定された化合物の、肥満、特に病的肥満を治療および／または予防することを目的とする薬剤の製造のための使用にもまた関する。
【００４９】
本発明は、肥満、特に病的肥満の治療のための方法であって、本発明の化合物または薬学的組成物を投与することを含む方法にもまた関する。
【００５０】
gad2遺伝子およびタンパク質の活性を低下させるために、肥満を治療するための薬学的組成物において、特にgad2のmRNAに相補的な、アンチセンス分子またはSiRNAを用いることが可能である。
【００５１】
本発明は、インスリン分泌の調節のための、上記で定義した化合物またはアンチセンス分子もしくはSiRNAの使用にもまた関する。
【００５２】
本発明は肥満の治療のための方法であって、アンチgad2アンチセンス分子の投与またはGAD2タンパク質の量を低下させるための任意の手段を含む方法に関する。当業者は、アンチセンス分子を設計する手段、およびその分子のバックボーンに導入できる修飾（ホスホロチオエート、メチルホスホン酸...）について認識している。
【００５３】
アンチセンス・ポリヌクレオチド配列は、当業者に評価されるように、gad2遺伝子の発現を阻止するかまたは低下させるのに有用である。例えば、gad2遺伝子（またはgad2遺伝子座からのその他の配列、特に5'隣接領域）の全体または一部が含まれたポリヌクレオチド・ベクターが、アンチセンス方向でプロモータの制御下に置かれ、かつ細胞に導入されてもよい。細胞内におけるそのようなアンチセンス構築物の発現は、gad2転写および／または翻訳を妨げる。
【００５４】
または、「センス」戦略が予測されてもよく、この場合、gad2遺伝子の5'領域の一部（特に配列番号：2の第2137番のヌクレオチドにおける -243 A > G変異を含む）を含む核酸オリゴヌクレオチドまたはプローブが、転写を活性化する核因子の結合に対する競合因子とするために、細胞内に導入される。センス戦略において用いることができるgad2遺伝子の5'隣接領域の断片の大きさは、好ましくはおよそ50〜150塩基である。
【００５５】
本発明は、肥満を研究するために有用な新しい動物モデルであり、gad2遺伝子の発現が増大している動物モデルにもまた関する。特に、この遺伝子の発現は、部位特異的もしくは時期特異的なプロモータ、または誘導性のプロモータを用いて、条件的にのみ増大させることができる。従って、本発明による動物の膵臓においてのみ、または脳においてのみ、gad2遺伝子発現を増大させることが可能である。本発明による動物を得るための方法は、当業者によって周知であり、本発明の方法により同定され得る一部の薬剤を試験するために特に有用である。
【００５６】
トランスジェニック動物を得るための、動物のゲノムへの構築物の挿入は、当業者によって周知の方法によって行われてもよく、無作為であることができる、または標的化されることができる。簡単に言えば、当業者は、ゲノム中に挿入するための配列を適当なプロモータおよび選択マーカー（例えばネオマイシン抵抗性を与えるタンパク質をコードする遺伝子）と共に含むベクターを構築して、動物の胚性幹（ES）細胞に導入してもよい。次に細胞を選択マーカーによって選択し、例えば胚盤胞へのマイクロインジェクションによって、胚に組み込み、それを妊娠中のメスの子宮を灌流することによって回収することができる。胚の再移植および形質転換動物の選択、これに続く可能な戻し交配によって、そのようなトランスジェニック動物を得ることが可能になる。適切な配列が隣接している場合、より「不要なもののない（cleaner）」動物を得るために、選択マーカー遺伝子は部位特異的リコンビナーゼの使用によって切除されてもよい。
【００５７】
従って本発明は、そのゲノム中に制御エレメントと動作可能に連結したgad2遺伝子の核酸配列またはそのコーディング配列の核酸配列が組み込まれているトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、該コーディング配列の発現が、該哺乳動物においてGAD2タンパク質および／またはGABAプールのレベルを同じ種の非トランスジェニック哺乳動物に比例して増大する、トランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。
【００５８】
上記態様に向けて予見されるgad2配列は、本発明の動物のゲノム中に導入したヒトgad2遺伝子配列、またはプロモータが過剰発現を誘導するために改変されている内因性gad2遺伝子配列であってもよい。例えば、マウスのgad2コーディング配列は、周知であり、GenBankにおいてNM_008078の番号で見出すことができる。その他の動物におけるその他の内因性gad2遺伝子は、配列間の相同性を使用して同定してもよい。
【００５９】
さらに、本発明は、GAD2と肥満との間の関連を試験するための動物モデルとしての、そのゲノムが内因性gad2遺伝子の破壊を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物にもまた関する。特に、前記破壊は選択可能なマーカー配列の挿入を含み、かつ該破壊により、結果的に野生型非ヒト哺乳動物と比較したGABAレベルにおける欠損を前記非ヒト哺乳動物が示すこととなる。
【００６０】
特に、前記破壊はホモ接合性破壊であり、かつ該ホモ接合性破壊はGAD2をコードする内因性遺伝子のヌル変異をもたらす。
【００６１】
米国特許第6,087,555号は、ノックアウトマウスを得る1つの方法を記載しており、この特許の一般的開示は、参照により本明細書に組み入れられる（第5段54行目から第10段13行目）。この特許において、OPGノックアウトマウスが記載されているが、同様の方法がGAD2ノックアウトマウスにも当てはまる。当業者はHoganら（Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; 1986）においてもまた情報を見出す。
【００６２】
本発明の哺乳動物は、好ましくはげっ歯類、特にラットまたはマウスである。
【００６３】
実施例
実施例1：肥満とSNPとの間の相関
Gad2遺伝子は、L-グルタミン酸からのγアミノ酪酸（GABA）の生成を触媒するグルタミン酸脱炭酸酵素のアイソフォーム（GAD65）をコードし、脳および膵島細胞の両方において発現する。GABAは、中枢神経系（CNS）の最も強力な抑制性神経伝達物質のうちの1つである。GABAは、ガストリンおよびソマトスタチンの分泌を調節し、様々な組織においてグルコースの取り込みを促進する場合がある（ErdoおよびWolff、1990 J Neurochem; 54 (2): 363-72）。
【００６４】
gad2遺伝子の5'隣接領域に位置する3つのSNP（-243 A>G変異体（5'UTRI）；-1.6kb G>A（SNP 668）；-2004 A>T（SNP 669））は、病的肥満の被験者において肥満との正の相関を示した。
【００６５】
これらの多型を持ったDNA断片は、以下のプライマーーのセットによって増幅することができる。
【００６６】
gad2遺伝子の多型は、直接配列決定によって、またはLightCycler（商標）技術（Roche、Manheim、ドイツ）によって、遺伝子型同定された。LightCycler検定法は、蛍光共鳴エネルギー転移を可能にする蛍光色素で標識したハイブリダイゼーション用プローブに基づいている（Blomekeら、1999、Anal Biochem、275、93-7）。SNP遺伝型同定は、融解曲線解析を用いて行われた。PCRは、light Cyclerでの解析の前に9700装置（Applied Biosystems、Forster city、USA）で行われた。PCR検定法およびLightCycler検定法に用いられるプライマー配列は以下の表に記載する。
【００６７】
2006509519.tif 000002
（Fは蛍光タグを表す）
【００６８】
PCR増幅は、50ngヒトゲノムDNA、10pmolの各々のプライマー、2.5mmol/l MgCl2、2.5mmol/lのdNTP、および0.2UのTaq Goldポリメラーゼを含む最終反応容量20□lのPCR緩衝液において行った。PCR産物のためのサーマルサイクリング条件は、1サイクルの95℃12分；35サイクルの95℃15秒、55℃15秒、72℃30秒；1サイクルの72℃10分；1サイクルの15℃15分：であった。
【００６９】
加えて、摂食抑制（restrained eating）および「潜在的肥満」を研究するため、認知的摂食抑制、脱抑制および空腹を、「Three factor eating questionnaire or TFEQ」（Stunkard AJ および Messick S、1985 J Psychosom Res; 29(1) : 71-83)により解析した。
【００７０】
369人の病的に関連性を持たない肥満被験者において相関研究を行った（平均BMI：47.3±7.4kg/m2；平均年齢：46±12歳；女性／男性：294/75）。
【００７１】
381人の関連性を持たない非肥満、非糖尿病被験者の一組（平均BMI：22.8±2.44 kg/m2；平均年齢：58.3±14.1歳；女性／男性：228/152）を対照群として用いた。表1は、3つのSNP（-243 A>G変異体（5'UTRI）；-1.6kb G>A（SNP 668）；-2004 A>T（SNP 669））の遺伝子型分布およびアレル頻度を示す。
【００７２】
（表１）242 A>G、1.6kb G>Aおよび1.7kb A>T SNPの遺伝子型分布およびアレル頻度
2006509519.tif 000003
【００７３】
共優性および優性モデルのもとで、-243 A>Gおよび-1.6kb G>A SNPは、病的肥満と相関していた（優性モデルのもとで各々のp値が0.004および0.02）。-2004 A>T変異体については相関の傾向が観察された。
【００７４】
これらの3つのSNPの相対危険度を概算した：O.R=1.55 （95% CI[1.14 2.12]）（UTR5I ; -243）; O.R=1.45（95% CI[1.06 2]）（SNP668;-1.6kb）; O.R=1.34（95%CI[0.97 1.84]）（SNP669;-2004）。
【００７５】
これらの結果を再現するため、もう一組の、関連を持たない316人の病的肥満被験者において、3つのSNPの遺伝子型同定を行った。-243 A>Gについて同様な結果が得られ（優性モデルのもとで、p=0.009）、-1.6kb G>A SNPについて相関の傾向が得られた（優性モデルのもとで、p=0.06）。
【００７６】
肥満関連表現型についての分散分析を行い（BMI、レプチン、体脂肪率、インスリン血症...）、3つのSNPと摂食行動の3要素との間で有意な相関が観察された。
【００７７】
ヒトの摂食行動を試験するため、被験者にはStunkardら（前記）が確立したTFEQ（3要素摂食質問表）質問表に記入させた。TFEQ によって評価した3つの固定要素：認知的摂食抑制（Qres）、脱抑制（Qdis）および空腹（Qhun）の分散分析が表2に示されている。
【００７８】
表2は、-243 A>G（5'UTRI）変異体に関して得られた結果を示している。同様な結果が-1.6kb G>A（SNP 668）および-2004 A>T（SNP 669）変異体に関して得られた。
【００７９】
（表２）食糧摂取行動パラメータに対する分散分析
2006509519.tif 000004
【００８０】
共優性モデルを用い、GGキャリアがヘテロ接合および野生型の被験者より低い抑制スコアを示すことが見出された（p値＝0.06）。彼らはまた、ヘテロ接合および野生型の被験者よりも高い脱抑制（p値＝0.03）および高い空腹（p値＝0.001）スコアを示した。さらに、GGキャリアはAGおよびAAキャリアよりも若く（p値＝0.04）、また、若い年齢において最高体重に達するらしい（p値＝0.03）ことが観察された。これらのデータは、gad2変異体による摂食行動の変化が、病的肥満のより若い発症の発現の一因となり得ることを示唆する。
【００８１】
実施例2：gad2遺伝子のプロモータ変異体の機能的研究
候補となる結合部位を検索するために、gad2遺伝子の5'隣接領域の配列をtransfacサーバ：http://transfac.gbf.de/cgi-bin/matにサブミットした。
【００８２】
コンピュータでの解析により、-243 A>G（配列番号：2の第2137番のヌクレオチドに位置する）、および-1.6kb G>A（配列番号：2の第780番のヌクレオチドに位置する）が、Ikaros 2（IK2）応答エレメント予測部位の近くに位置することが示された。IK2は、ヒトリンパ球で高度に発現する転写因子であり、そのアミノ酸配列は、配列番号：3によって表されている。
【００８３】
-243 A>G変異体がDNAへの核タンパク質結合を変えるかどうかを試験するために、野生型および変異部位の配列を有するプライマーならびにMIN6細胞の核抽出物を用いたゲルシフトアッセイ法を行った（図2）。
【００８４】
ゲルシフトアッセイ法の結果により、IK2応答エレメント部位への核タンパク質のインビトロ結合が存在することが示された。明らかに、核タンパク質は応答エレメントG変異体への高い親和性を有する（1列目に対して6列目）。同様な結果がAおよびGアレルの競合により得られた（2対3列目；6対8列目；7対9列目）。
【００８５】
第-243番のアレル変異がGAD2転写レベルに影響するかどうかを調べるため、ホタル・ルシフェラーゼ・リポータ構築物を用いた一過性同時トランスフェクションを行い、βTC3細胞（ネズミのインスリノーマ細胞株）における野生型および変異型プロモータの近位プロモータ活性を測定した。トランスフェクション効率を標準化するため、ウミシイタケ・ベクターを用いた。-243 A>G変異体構築物の転写活性は、野生型構築物と比べて、8.61倍高かった（n=8、p<0.0001）（図3）。
【００８６】
-243 A>GのGアレルによって誘導される、観察された転写活性の増大は、遺伝学的な結果：
- -243 A>G変異体の肥満との相関（p=0.004、O.R=1.55（95% CI[1.14-2.12]））
- GGを持った者は、より低い食事制限スコア（p=0.06）、より高い脱抑制スコア（p=0.03）およびより高い空腹スコアパラメータ（p=0.001）を有する、
と一致する。
【００８７】
これらの結果は、核タンパク質（IK2転写因子の可能性がある）の結合が、変異体アレルの存在下において増大したこと、およびGad2遺伝子、従ってGABAプールを、トランス活性化する可能性があることを示す。それ故に、GABAの食欲増進効果が増大するかもしれず、かつ摂食行動を変じて-243 A>G変異体のGキャリアの病的肥満の発現の一因となる可能性がある。
【００８８】
本結果は、IK2応答エレメントにやはり近接するその他のSNPに一般化されてもよい。
【００８９】
本願において示されている証拠は、ヒトの肥満におけるGABA経路の関与を暗示する。これは、肥満の一般的形態につながる分子機構のより良い理解に向けての重要な段階である。GABA作動性ニューロンが食糧摂取を調節するシグナルの統合に関係していることは明らかと思われる。gad2遺伝子の5'領域におけるSNPの同定および、これらの存在が主要酵素（GAD2)の発現を調節し、それがひいてはGABAプールを調節することの実証によって、肥満に対する薬剤への新しい展望が開かれる。
【００９０】
最も高頻度なアレルであるSNP +61450 C>A、および +83897 T>Aを含む、（病的肥満に対する）保護性ハプロタイプの同定。
【００９１】
実施例3：最も高頻度なアレルであるSNP +61450 C>A、および+83897 T>Aを含む、（病的肥満に対する）保護性ハプロタイプの同定
次に、HTRおよびPM+EH+法の両方によって、SNP -243 A>G、+84 G>A、+61450 C>Aおよび+83897 T>Aのハプロタイプ分析を行った。SNP +84 G>Aを残りの3つのSNPの各々とともに含むハプロタイプは、病的肥満との相関を改善させず、実際にSNP +84 G>Aの相関は、その他の3つのSNPとのそれのLD（に起因した（データを示さず）。従って、SNP +84 G>Aは、さらなるハプロタイプ分析から除外した。3つのSNP、-243 A>G、+61450 C>A、および+83897 T>Aを含むハプロタイプ構造を、次に、肥満の家族歴を有する575人の関連を持たない病的肥満患者、および646人の非肥満被験者において調べた。SNP -243、+61450および+83897によって規定される8つの可能なハプロタイプのうち、6つのハプロタイプのみが1%より高い頻度を示し、それらを合わせた保有率は、母集団において見られたハプロタイプのうち2%を除く全てを包含した（表3）。
【００９２】
（表３）575人の病的肥満および646人の対照被験者における肥満の状態のハプロタイプ分析
3つ（-243、+61450、+83897）および2つ（+61450、+83897）のSNPをカバーするハプロタイプが調べられた。おのおののハプロタイプに対する、家族に基づいた相関試験。Znormが正であることは、罹患のある子孫において過剰なアレルがあることを意味する。
2006509519.tif 000005
1  野生型アレル、2  変異型アレル。対応するヌクレオチドは、括弧の中の添字として示されている。
【００９３】
症例と対照との間のハプロタイプ傾向回帰（haplotype trend regression）（HTR）によって行ったハプロタイプ頻度の比較により、肥満との相関の証拠が経験的p値である0.0004によって示された。この積極的な結果はPM+EH+解析によって確認された（P=0.0002）。野生型アレル（A-C-T）を有するハプロタイプの頻度は、病的肥満群と比較して、非肥満において有意に高かった（表1）。SNP -243 A>GにおけるリスクGアレルが、いくつかのハプロタイプについて、ハプロタイプ分析で考慮に入れることができない1%より低い頻度で存在することは、特筆すべきである。SNP -243、+61450、および+83897は強い連鎖不均衡にあり、これらのマーカー間のχ2は556〜1265の範囲であり、従ってp値は＜0.00001であった。
【００９４】
加えて、SNPHAPによって検定したハプロタイプの正確度の事後確率は、本研究に含まれた被験者の98%について>0.98であった。被験者の残りの2%については、事後確率は0.88〜0.98の範囲であった。さらに、野生型の背景、+61450 C>Aに対してのCC、または+83897 T>Aに対してのTTについて、病的肥満とのSNP -243 A>Gの相関は、依然として有意であった（各々、p=0.01およびp=0.03）。-243 A>Gの独自の効果は、病的肥満と有意な相関を示したSNP +61450 C>A、および+83897 T>Aのハプロタイプ分析によって確認され、一括的置換が経験的p値、<0.0001を示していた。野生型アレル（C-T）を持ったハプロタイプの推定頻度は、病的肥満群と比較して非肥満において高いままであった（p=0.0049）。従って、（C-T）ハプロタイプは、肥満に対して「保護性」効果を示した（OR=0.81 95% CI[0.681-0.972]）。
【００９５】
実施例4：連鎖、家族性相関およびGAD SNPの連鎖の証拠との相関
188の核家族（612個体）において、家族性相関および連鎖の証拠との相関が調べられた。最初に、連鎖の領域において期待されるように、SNP -243 A>G、+61450 C>A、および+83897 T>Aは、2つの肥満の状態と有意な連鎖を示し、各々2.54、1.86、および4.54のMLSを呈した（データを示さず）。GADのSNPは、確実に肥満との連鎖を示し、それゆえに、それらは家族に基づいた相関試験を調べるに値した。
【００９６】
家族に基づいた相関試験（FBAT）を用いて、発明者らが確立した連鎖背景における相関を検出した。発明者らは、単一SNP解析において、SNP +61450 C>A、および+83897 T>Aに関して罹患のない子孫における相関および過剰な野生型アレルを（各々、Z=-2.17 p=0.03およびZ=-2.09 p=0.03）、およびSNP -243 A>Gに関して罹患した子孫における相関の傾向および過剰なGアレルを（Z=1.87、p=0.06）観察した。SNP +61450 C>Aおよび+83897 T>Aのハプロタイプ分析に関して、肥満との相関についての包括的試験は、有意であった（χ2=7.637、p値=0.02）。保護性野生型（C-T）ハプロタイプは、罹患のない子孫において過剰であった（Z=-1.94、p値=0.05）（表1）。
【００９７】
連鎖の証拠との有意な相関は、SNP +61450 C>Aに関して観察された。（A-A）遺伝子型に関して一致した罹患同胞対を有する17核家族は、ロッド値4.13、p=0.02（このロッド値が1000回のシミュレーションのうち20回達し、Cアレル頻度を、対照コホートにおける値である0.72と見積もったため）を示した。Cアレル頻度を0.68（病的肥満コホートにおける値）と考えると、0.06のp値が観察された。この遺伝子型に一致しない残りの同胞対は、1.75のロッド値を示した。従って、SNP +61450 C>Aが観察された連鎖を説明することを、除外することはできない。
【００９８】
実施例5：GAD2 SNPによるインスリン分泌の調節。
β細胞からのGABA放出がインスリン分泌を強力に阻害することが示唆されたため（Shiら、2000）、本発明者らは、非糖尿病対照被験者において、空腹時インスリンに対する、およびホメオスタシスモデルにより評価された細胞機能（HOMA-B%）に対する、GAD2 SNPの可能な効果を調べた。発明者らは、+83897 T>Aに関してホモ接合（AA）被験者がより低い空腹時インスリンレベルおよびHOMA B指数を示すことを見出し（Kruskal-Wallis検定法のp値：空腹時インスリンおよびHOMA Bについて各々0.0091および0.01）（図6）、インスリン分泌に対する、おそらくGAD65のより高い酵素活性が介在する膵臓β細胞におけるGABAプールの増大を介した、GAD2 SNPの有害な効果を示唆した。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】gad2遺伝子、および本発明の枠組みにおいて同定されるSNPの頻度の略図である。
【図２】第-243番のヌクレオチドの性質による、gad2遺伝子の5'領域における核タンパク質の結合を試験するゲルシフトアッセイ法を示す。mt=変異体（G）；wt=野生型（A）。
【図３】-243 A>G変異体のβTC3細胞における転写活性に対する効果を示す。相対的ルシフェラーゼ単位を、平均値±標準偏差で表している。
【図１】
2006509519.tif 000006
【図２】
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【図３】
2006509519.tif 000008
【配列表】
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【国際調査報告】
2006509519.tif 000009
2006509519.tif 000010
2006509519.tif 000011
2006509519.tif 000012
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