(57)【要約】延伸ポリマー分子の速度を決定するための方法および装置において、分子（１０５）は、１つ以上の検出ステーション（１０１、１０２、１０３）に対して移動する。時間相関検出信号が、分子（１０５）の速度、長さ、およびランドマーク間距離を決定するために、使用される。本発明による、延伸ポリマーの速度を決定するための方法は、以下：ａ）ポリマーにおける少なくとも１つの検出可能な領域を規定する工程；ｂ）複数の線状に連続的な検出ゾーンを通しての、延伸ポリマーの相対運動を引き起こし、検出可能な領域と検出ゾーンとの間の相互作用を引き起こす工程；ｃ）信号振幅プロフィールの各々を、時間相関様式で測定する工程；ならびにｄ）時間相関測定を分析して、ポリマーの速度を決定する工程、を包含する。
2004537045.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
延伸ポリマーの速度を決定するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）該ポリマーにおける少なくとも１つの検出可能な領域を規定する工程；
ｂ）複数の線状に連続的な検出ゾーンを通しての、該延伸ポリマーの相対運動を引き起こし、該検出可能な領域と該検出ゾーンとの間の相互作用を引き起こす工程であって、各検出ゾーンは、所定の距離で間隔を空けており、これによって、複数の信号振幅プロフィールを発生させ、各信号振幅プロフィールは、異なる検出ゾーンにおいて発生され、そして各相互作用前、各相互作用中、および各相互作用後に獲得されるデータを含む、工程；
ｃ）該信号振幅プロフィールの各々を、時間相関様式で測定する工程；ならびに
ｄ）該時間相関測定を分析して、該ポリマーの速度を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記複数の線状に連続的な検出ゾーンが、第１の検出ゾーンおよび第２の検出ゾーンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１の信号振幅プロフィールが、前記第１の検出ゾーンにおいて測定され、そして第２の信号振幅プロフィールが、前記第２の検出ゾーンにおいて測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
各信号振幅プロフィールが、質量中心、輪郭中心、リーディングエッジ、およびリーディングエッジ立上がり時間を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記延伸ポリマーの速度が、以下の工程：
ａ）前記第１の信号振幅プロフィールにおける質量中心の検出と、前記第２の信号振幅プロフィールにおける質量中心の検出との間の時間間隔を決定する工程；および
ｂ）該検出ゾーン間の予め決定された距離を、該時間間隔で除算する工程、
によって決定される質量中心速度である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記延伸ポリマーの速度が、以下の工程：
ａ）前記第１の信号振幅プロフィールの輪郭中心の検出と、前記第２の信号振幅プロフィールの輪郭中心の検出との間の時間間隔を決定する工程；ならびに
ｂ）該検出ゾーン間の予め決定された距離を、該時間間隔で除算する工程、
によって決定される中心間速度である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記延伸ポリマーの速度が、以下の工程：
ａ）前記第１の信号振幅プロフィールのリーディングエッジの検出と、前記第２の信号振幅プロフィールのリーディングエッジの検出との間の時間間隔を決定する工程；ならびに
ｂ）該検出ゾーン間の予め決定された距離を、該時間間隔で除算する工程、
によって決定される縁間速度である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記延伸ポリマーの速度が、以下の工程：
ａ）前記第１の信号振幅プロフィールのリーディングエッジ立上がり時間の検出と、前記第２の信号振幅プロフィールのリーディングエッジ立上がり時間の検出との間の時間間隔を決定する工程；ならびに
ｂ）該検出ゾーン間の予め決定された距離を、該時間間隔で除算する工程、
によって決定される立上がり時間速度である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記検出可能な領域が、固有に検出可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記検出可能な領域が、外因的に検出可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記検出可能な領域が、電磁放射、導電率、熱伝導係数、および放射能を含む群より選択される物理量の測定によって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出可能な領域が、蛍光放射の直接的測定または間接的測定によって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
延伸ポリマーの長さを決定するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）該ポリマーの全長に沿って、検出可能な領域を規定する工程；
ｂ）第１の検出ゾーンおよび第２の検出ゾーンを通して、該延伸ポリマーの相対運動を引き起こす工程であって、該ゾーンは、予め決定された距離で線状に間隔を空けている、工程；
ｃ）該第１の検出ゾーンにおける該延伸ポリマーの検出と、該第２の検出ゾーンにおける該延伸ポリマーの検出との間の時間間隔を測定する工程；
ｄ）該第１の検出ゾーンと該第２の検出ゾーンとの間の予め決定された距離を、工程ｃ）の該時間間隔で除算して、該ポリマーの速度を決定する工程；
ｅ）該検出ゾーンの一方において、該ポリマーが検出される間の時間間隔を測定する工程；ならびに
ｆ）工程ｄ）の該速度に、工程ｅ）の該時間間隔を乗算して、該延伸ポリマーの長さを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１４】
延伸ポリマー上の第１のランドマークと第２のランドマークとの間の距離を決定するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）延伸ポリマー上に、第１のランドマークおよび第２のランドマークを提供する工程；
ｂ）第１の検出ゾーンおよび第２の検出ゾーンを通して、該延伸ポリマーの相対運動を引き起こす工程であって、該ゾーンは、予め決定された距離で線状に間隔を空けており、該第１の検出ゾーンにおける該第１のランドマークおよび第２のランドマークの検出、ならびに該第２の検出ゾーンにおける該第１のランドマークおよび第２のランドマークの検出を引き起こす、工程；
ｃ）該第１の検出ゾーンにおける１つのランドマークの検出と、該第２の検出ゾーンにおける同じランドマークの検出との間の時間間隔を測定する工程；
ｄ）該第１の検出ゾーンと該第２の検出ゾーンとの間の該予め決定された距離を、工程ｃ）の該時間間隔で除算して、該ポリマーの速度を決定する工程；
ｅ）１つの検出ゾーンにおける該第１のランドマークの検出と、同じ検出ゾーンにおける該第２のランドマークの検出との間の時間間隔を測定する工程；ならびに
ｆ）工程ｄ）の該速度に、工程ｅ）の該時間間隔を乗算して、該第１のランドマークと該第２のランドマークとの間の距離を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１５】
前記延伸ポリマーが、延伸ＤＮＡ分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記延伸ポリマーが、延伸ＤＮＡ分子を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記延伸ポリマーが、延伸ＤＮＡ分子を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記延伸ポリマーが、蛍光標識を含み、そしてさらに、前記測定が、蛍光強度の測定である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記延伸ポリマーが、蛍光標識を含み、そしてさらに、前記延伸ポリマーの検出が、蛍光エネルギーの検出を包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記延伸ポリマーが、蛍光標識を含み、そしてさらに、前記ランドマークの検出が、蛍光エネルギーの検出を包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１のランドマークが、第１の蛍光タグで標識されており、そして前記第２のランドマークが、第２の蛍光タグで標識されており、そしてさらに、該第１の蛍光タグおよび該第２の蛍光タグが、異なる区別可能な波長で蛍光エネルギーを放出する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記検出ゾーンが、延伸チャネルに沿って位置しており、該延伸チャネルに沿って、前記ポリマーが移動する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記検出ゾーンが、延伸チャネルに沿って位置しており、該延伸チャネルに沿って、前記ポリマーが移動する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
前記検出ゾーンが、延伸チャネルに沿って位置しており、該延伸チャネルに沿って、前記ポリマーが移動する、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、分子の分析および性質決定の分野に関する。より具体的には、本発明は、検出ステーションに対して移動する、延伸されたポリマー性分子の速度を決定するための方法および装置、ならびにそのような分子の長さ、およびそのような分子上に存在するランドマーク（ｌａｎｄｍａｒｋ）の間の距離を決定する方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
流体サンプル中の単一高分子の構造および 動態の分析は、単一高分子の操作および検出に関する方法論の急速な発展にいくらか起因して、考慮に値する目的を引き付けている。例えば、実験技術および利用可能なハードウェアの最近の発展は、検出感度を劇的に増大させ、その結果、サンプル中の単一色素分子の光学的検出を行い得る。単一色素検出は、水溶液中で、室温でなされ得る（例えば、Ｗｅｉｓｓ、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：１６７６−１６８３を参照のこと）、そしてバックグラウンドを低減するために、極微量でなされ得る。このような単一分子ベースの分析方法は、生物学的高分子（例えば、核酸分子およびタンパク質）の分析において特に有用である。単一分子分析方法は低量のサンプルを必要とし、これによって、大量のサンプル材料を調製する単調な労力を軽減する。例えば、単一分子分析方法は、核酸分子の増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による）なしに核酸分子の構造分析を可能とし得る。単一分子分析方法はまた、個々の分子の分析を可能とし、従って、不均一集団全体を平均化する作用なしに構造特性および／または動態特性の同定において特に有用である。
【０００３】
単一分子の検出と電気泳動とを組み合わせた単一分子電気泳動（ＳＭＥ）方法は、溶液中の単一分子の同定および検出について報告されている（ＣａｓｔｒｏおよびＳｈｅｒａ、１９９５、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７：３１８１−３１８６）。ＳＭＥにおいて、単一分子のサイズ区分は、個々の分子が２つのレーザービーム間の一定の距離を移動するために必要とされる時間を測定することによる、電気泳動速度を決定することにより、達成される。この方法は、ＤＮＡ、蛍光タンパク質および単純な有機性発蛍光団に対して適用されている。例えば、ＳＭＥはＤＮＡ制限フラグメントのサイズ区分のための、単一分子方法を提供する。しかし、ＳＭＥは分子の存在または非存在を検出するのみである。この方法は、分子の内部構造に関する情報を提供しない。
【０００４】
微細加工されたデバイスを使用する単一分子ＤＮＡサイズ区分方法がまた報告されている（Ｃｈｏｕら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１１−１３）。この方法は、挿入された色素の量が分子長に比例するという事実を利用しており、色素分子を挿入することを用いて染色されたＤＮＡの全蛍光強度を測定することによって、単一ＤＮＡ分子の長さを決定する。従って、この方法は分子のサイズを決定するのに電気泳動の移動度を使用しない。この方法もまた、分子の内部構造に関する情報を提供しない。
【０００５】
ＰＣＴ公開第ＷＯ９８／１００９７号は、２色の蛍光を放出する単一分子の検出、ならびに分子量およびその分子の濃度を決定するための方法ならびに装置を開示する。この方法は、異なる発光スペクトルの少なくとも２つの蛍光プローブを用いる個々の分子の標識化を包含する。２つの標識の同時検出は、その分子の存在を示す。分子の速度は、分子が２つのレーザービーム間の一定の距離を移動するのに必要とされる時間を測定することによって決定される。この分子の速度と、その標準的な種の速度との比較によって、１フェムトモル濃度くらいの濃度で存在し得る、その分子の分子量の決定が可能とされる。
【０００６】
単一高分子を性質決定するための他の技術としては、試験溶液中で低コピー数を有する特定の標的核酸配列の、直接的な同定のための、米国特許第５，８０７，６７７号に記載された方法が挙げられる。この方法は、異なる短いオリゴヌクレオチドの混合物の参照の溶液の調製を含む。各々のオリゴヌクレオチドは、標的配列の１セクションに相補的な配列を含み、そして１つ以上の蛍光色素分子で標識される。この参照溶液は、その短いオリゴヌクレオチドが核酸標的とハイブリダイズするのに好ましい条件下で試験溶液とインキュベートされる。１つ以上の標的オリゴヌクレオチドがハイブリダイズした核酸鎖の検出によって、標的配列は、溶液中で同定される。蛍光信号を増幅するために、異なるオリゴヌクレオチドの「カクテル」を使用する。このカクテル中で、これらオリゴヌクレオチドは、標的配列と隣接するが重ならない配列と、ハイブリダイズ可能である。この方法の欠点は、適切な配列のプローブを設計するために、標的核酸配列およびその周辺配列の正確な配列が、既知でなければならないことである。米国特許第５，５９９，６６４号および欧州特許第ＥＰ０３９１６７４号に記載される方法により、ＤＮＡ分子に先ず力を掛け、その結果そのＤＮＡ分子が細長く伸び、次いで、この構造的弛緩動態を測定することによって、ＤＮＡ分子のサイズ区分を可能とする。別の方法（Ｓｃｈｍａｌｚｉｎｇら、１９９８、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７０：２３０３−２３１０；Ｓｃｈｍａｌｚｉｎｇら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１０２７３−１０２７８）において、ＤＮＡ分析（配列決定を含む）のための微細加工されたデバイスを開発して、慣用的な方法（例えば、電気泳動）の少規模バージョンを使用する。
【０００７】
これらの単一分子分析方法のいずれも、その分子の内部構造の決定を可能とはしない。大部分の媒体中でコイル型構造を選択するようなポリマーの自然な傾向は、単一ポリマー鎖における内部構造（例えば、モノマーの直鎖配列）の性質決定への難関である。このようなコイル化の平均の程度は、とりわけ、周囲の溶液とのポリマーの相互作用、ポリマーの剛性、およびそのポリマー自体とのポリマーの相互作用のエネルギーに依存する。大部分の場合、このコイル化はかなり重要である。例えば、ファージＤＮＡは、Ｂ形態では全体で約１６ｍの長さであるが、水中では約１ｍのランダムコイル直径である（Ｓｍｉｔｈら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：２０３−２０６）。
【０００８】
流体の流動によってＤＮＡ分子を延伸する方法が報告されている（Ｐｅｒｋｉｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：２０１６−２０２１；Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：１７２４−１７２７）。１つの方法において、ＤＮＡ分子は、延伸的な流動によって延伸される。分子の延びの推定分布は、時間と延伸の割合の関数として決定される。延伸的な流動において延伸されたＤＮＡ分子の詳細な動態もまた観察されている。別の方法において、ＤＮＡ分子は定常な剪断流によって延伸された。分子の延びの推定分布は、剪断速度の関数として決定される。純粋な延伸的な流動における挙動と対照的に、剪断流における平均のポリマーの延びは、コイル−延伸の鋭敏な推移を示すものではないことが見出された。
【０００９】
ＤＮＡはまた、生体分子を配列決定するための近距離場検出スキームの一部として、電気泳動によって延伸された。ＤＮＡは、解読のための位置にＤＮＡを移動させる電気力を使用して、ゲル中および溶液中の両方における電気泳動によって、延ばされている（米国特許第５，５３８，８９８号）。しかし、巨大ポリマーの延伸の品質を決定するためには何のデータも与えられず、そしてこの技術は、一度に約３メガ塩基を分析するように、限定される。
【００１０】
重力もまた、ＤＮＡを延伸するために使用されている（米国特許第５，７０７，７９７号；Ｗｉｎｄｌｅ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５：１７〜２１）。この技術において、細胞のドデシル硫酸ナトリウム溶解からのＤＮＡの液滴は、ある角度に保持されるスライドを流れ落ちるようにされ得る。重力のこの寄与は、ＤＮＡを過剰に延伸されたＳ−ＤＮＡ形態にまで延伸するのに十分であった。次いで、このＤＮＡはスライド上に固定化され、プロセッシング（例えば、延伸前は比較的困難である、蛍光標識化）をなし得る。
【００１１】
ＤＮＡ分子の延長を含む単一分子ＤＮＡ分析方法は、光学的マッピング（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１１０−１１３；Ｍｅｎｇら、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．９：４３２；Ｊｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：８０４６−８０５１）およびファイバー蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ｆｉｂｅｒ−ＦＩＳＨ）（Ｂｅｎｓｉｍｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：２０９６；Ｍｉｃｈａｌｅｔら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：１５１８）を含む。光学的マッピングにおいて、ＤＮＡ分子は流体サンプル中で細長く、そしてゲルまたは面（ｓｕｒｆａｃｅ）上で延伸された構造で固定される。次いで延伸されてかつ固定されたＤＮＡ分子に対して、制限消化を実施する。次いで、制限フラグメントのサイズを決定することによって、規則正しい制限マップを作成する。ファイバーＦＩＳＨにおいて、ＤＮＡ分子は、分子の梳き（ｃｏｍｂｉｎｇ）によって面上で延伸されてかつ固定される。蛍光性標識プロ−プ配列とのハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ分子上の配列ランドマークの決定を可能とする。両方の方法とも延伸された分子の固定化を必要とし、その結果、分子長および／またはマーカー間の距離を測定し得る。
【００１２】
ＤＮＡ上のマーカー間の距離および長さを測定するための方法は、Ｋａｍｂａｒａらによって開発された（米国特許第５，３５６，７７６号）。この方法は、末端部位および／または内部部位でＤＮＡ分子を蛍光性に標識する工程、および標識された分子を電気泳動を介してゲルを通って移動させる工程を含む。このようにすると、そのＤＮＡ分子は強制的に真直ぐ伸びた構造にされる。この真直ぐ伸びたＤＮＡ分子を、ゲルのない緩衝液中へと移送し、そして蛍光性標識を検出する。２つの標識の検出の間の時間間隔を使用して、標識間の距離を決定する。この２つの標識がＤＮＡ分子の末端を標識する場合、これら標識間の距離は、この分子の長さを測る。この方法は、ＤＮＡ分子の速度を決定するための手段を提供するものではないが、ＤＮＡ分子の移動速度から、ＤＮＡの速度を推定することに依存する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
単一高分子の延伸および性質決定のための、流動ベースの単一分子分析方法は、分子特性（例えば、高分子の長さ、高分子上の２つのランドマーク間の距離、など）の正確な測定の困難さにいくらか起因して、広範には採用されていない。例えば、検出ゾーン（例えば、レーザー励起ゾーン）を通って移動する延伸された高分子の長さを決定するために、高分子の速度を知ることが必要である。この流動移動領域は、種々の公知の方法（例えば、粒子像移動測定（ＰＩＶ））によって測定され得る（例えば、Ｍｅｉｎｈａｒｔら、１９９９、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｆｌｕｉｄｓ  ２７：４１４−４１９；Ｍｅｉｎｈａｒｔら、２０００、Ｍｅａｓ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１１：８０９−８１４を参照のこと）。可撓性の対象物の速度（例えば、延伸ポリマー）は、流動速度と同一ではないかもしれない。例えば、大部分の流動中で、ポリマーの長さは流動と一緒になって移動する場合、変動し得る。特に、ポリマーの長さは流動速度の変動の結果として変動し得る。従って、流動中を移動する単一の延伸ポリマーの速度を測定するための、より迅速で、より容易で、より信頼性が高く、より統合的に適用可能な方法の必要性が存在する。また、単一の延伸ポリマーの長さ、および／または単一の延伸ポリマー上のランドマーク間の距離を決定するための、さらに正確な方法についての必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、単一ポリマーの性質決定のための方法および装置に関する。特に、本発明は、単一の延伸ポリマーが検出ステーションに対して移動するようにされる場合に、これらポリマーの速度の決定のための方法および装置に関する。本発明はまた、単一ポリマーの長さおよび分子量を決定するための方法および装置、ならびにこのようなポリマー上に存在するランドマーク間の距離を決定するための方法および装置に関する。
【００１５】
広範には、延伸ポリマー（例えば、少なくとも１つの検出可能な標識を有するＤＮＡ分子）の速度は、予め決定した距離で離れて間隔が空けられた、直線的に連続する少なくとも２つの検出ゾーンに対して、分子が移動される方法によって、検出され得る。標識は検出ゾーンに対して移動するにつれて、標識はそのゾーンと相互作用して信号振幅プロフィールを形成する。このようなプロフィールの各々は、第１の時間間隔の間にその信号が増加しているリーディングエッジ、第２の時間間隔の間にその信号が実質的に一定である検出振幅、および第３の時間間隔の間にその信号が減少しているトレーリングエッジを含むことを特徴とする。第１時間間隔、第２時間間隔、および第３時間間隔の経過に渡る信号振幅の表記は、信号振幅プロフィールを規定する。各々の信号振幅プロフィールを時間関連の様式で測定し、次いでこの時間関連の測定を分析してポリマーの速度を決定し得る。
【００１６】
従って、１つの実施形態において、個々の標識からのこの信号振幅プロフィールは、予め決定した距離で離れて間隔を空けている、少なくとも２つの直線的に連続する検出ゾーンで決定される。信号振幅プロフィールの選択されたエレメントが、第１検出ゾーンおよび第２検出ゾーンで検出される時間差を測定することによって、そしてそのゾーン間の予め決定した距離を測定時間で除算することによって、ポリマーの速度を決定する。信号振幅プロフィールの選択されたエレメントは、プロフィールのリーディングエッジが検出される場合の信号増加、またはプロフィールのトレーリングエッジが検出される場合の信号減少の間の、プロフィールの質量中心か、プロフィールの時間的中心か、またはいずれかの点（すなわち、半分の行程の点）であり得る。標識は特定の位置に限定される必要のないことに注意されるべきである。信号振幅プロフィールの特徴を２つの異なる検出ゾーンで比較することによって、標識が、ほんの短時間で検出されるような標識であり得（例えば、単一標識されたポリマー性塩基を検出する場合）、またはより長い時間の間に検出され得るような標識であり得る（例えば、挿入性色素で標識されたポリマーが、２つの検出ゾーンを通って完全に移動する場合）。
【００１７】
本発明の第２の実施形態において、ポリマーの長さを決定し得る。この実施形態において、２つの検出ゾーンでのポリマー上の個々の標識を検出する工程に加えて、ポリマーは、その任意の部位が検出ゾーンに対して位置付けられる場合に常に検出可能でなければならない。従って、例えば、このポリマーは挿入性色素を用いて標識され得、この色素はこのポリマー分子の全体の長さに沿って検出可能である。この分子が検出器に対して移動する場合、第１検出ゾーンでの信号振幅プロフィールの選択されたエレメントの検出と、第２検出ゾーンでの信号振幅プロフィールの選択されたエレメントの検出との間の時間差を測定し、そしてそれらゾーン間の予め決定した距離を、その測定時間で除算することによって、ポリマーの速度を決定する。次いで、この値を、このポリマーがいずれかの検出ゾーンで検出された合計時間で乗算し、そして得られる積算が分子の長さである。
【００１８】
本発明の第３の実施形態において、ポリマー上の２つの検出可能なランドマークの間の距離を決定し得る。この実施形態において，２つの検出可能なランドマークはポリマー上に位置し、次いでこのポリマーを、予め決定した距離で間隔を空けて離れた２つの直線的に連続した検出ゾーンに対して移動させる。このポリマーを、その全体の長さに沿って挿入性色素などで標識し得るが、このことは任意である。上記の第１の実施形態に記載される方法を使用して（１つのランドマークまたは任意の挿入性色素のいずれかから得られる信号振幅プロフィールを使用して）、ポリマーの速度を決定し、そして第１検出器でのランドマークの１つの検出と、第２検出器での同一のランドマークの検出との間の時間差を測定する。計算された速度を、ランドマークの検出の間の測定された時間差で乗算する場合、得られる積算はランドマーク間の距離である。
【００１９】
本発明の各々の限定は、本発明の種々の実施形態を含み得る。従って、任意の１つのエレメントまたは任意のエレメントの組み合わせを含む本発明の限定の各々が、本発明の各々の局面において含まれ得ることが、予測される。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、単一の延伸ポリマー性高分子の速度を決定するための方法および装置を提供する。本発明の方法は、複数の検出ゾーンの各々で、延伸ポリマー性高分子の時間関連の測定に基づく。検出ゾーンは、予め決定された間隔で、ポリマーの移動経路に沿って配置される。延伸ポリマー性高分子の信号振幅プロフィール（例えば、蛍光ベースの測定を使用する場合の強度−時間曲線）を、高分子が各々の検出ゾーンを通過する場合に測定する。複数の検出ゾーンでの測定は時間関連（例えば、同調）であり、その結果、異なる検出ゾーンで測定される信号振幅プロフィールの間の時間的間隔もまた決定される。本発明の概略図を、図１に示す。この装置を使用して、図２に示されるような、信号振幅プロフィールを形成する。図２において、この信号振幅プロフィールはポジティブであるが、ネガティブな信号振幅プロフィールもまた包含されることは、当業者には明かであるべきである。例えば、吸収ベースの測定を使用する場合、この信号振幅は、ポリマーが検出ゾーン内に存在する場合に低下する。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、用語「延伸ポリマー高分子」または「引張られたポリマー性高分子」とは、分子の長さが、同一溶媒中で、その回転半径よりも実質的に大きい構造にあるポリマーをいう。おそらくは、この延伸ポリマー性高分子は、その輪郭の長さに実質的に近い長さを有する。延伸ポリマーは、延伸チャネルを通され得る。「延伸チャネル」または「延伸チャネル」とは、ポリマーが横切り得るチャネルまたは孔をいう。いくつかの実施形態において、このチャネルは、延伸ポリマーの断面よりも僅かに大きいのみである開口部を有する。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「検出ゾーン」とは、ポリマー性高分子に対する移動を経験する領域または容積をいう。一般的に、検出ゾーンは、高分子の移動行程にそって固定されるが、本発明は固定した高分子および移動性の検出ゾーンを企図する。高分子またはその一部が検出ゾーンまたはその容積内に存在する場合、検出ゾーンは、高分子からの信号が測定される領域として作用する。レーザー誘発性の蛍光を測定することに基づく実施形態において、検出ゾーンは、レーザービームの励起容量によって規定され、そしてこの信号は、高分子またはその一部が励起容積を通過する場合に、高分子またはその一部によって発光される全蛍光強度である。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「時間関連の測定」とは、異なる検出ゾーンにおいて測定される信号の間の時間的間隔が既知であるような様式で、異なる検出ゾーンにおいて実施される測定をいう。このような時間関連の検出は、全ての検出ゾーンでの測定を実時間で同調させることによって、達成され得る。あるいは、異なる検出ゾーンにおける測定は、異なる検出ゾーンにおける検出の一定の既知の時間遅延によって、時間関連性であり得る。異なる検出ゾーンにおける同調検出および時間遅延検出のための方法は、当該分野で周知であり、そして当業者に明かである。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、「信号振幅プロフィール」とは、測定された信号の時間的プロフィールをいう。各々のこのようなプロフィールは、それが第１の時間間隔の間にその信号が増加しているリーディングエッジ、第２の時間間隔の間にその信号が実質的に一定である検出振幅、および第３の時間間隔の間にその信号が減少しているトレーリングエッジを含むことを特徴とする。第１時間間隔、第２時間間隔、および第３時間間隔の経過に渡る信号振幅の表記は、信号振幅プロフィールを規定する。光学的検出を含む実施形態において、例えば、高分子を蛍光によって検出する場合、この信号振幅プロフィールは、蛍光検出器によって測定される、強度  対  時間の曲線によって表される。好ましくは、検出ゾーンの有限のサイズに起因した信号振幅プロフィールへの寄与は排除される。レーザー励起を含む実施形態において、レーザービームのプロフィールは好ましくは、測定された強度−時間曲線から逆重畳積分される。信号振幅プロフィールへの検出ゾーンの有限のサイズの寄与（例えば、レーザービームのプロフィール）を排除する方法は、当該分野で周知であり、そして当業者によって実施され得る。
【００２５】
本発明はまた、任意の長さのポリマー（全体のゲノムを含む核酸が挙げられる）にその速度および長さの測定を受けることを可能とする方法および構造を提供する。
【００２６】
本発明の方法の実行において、ポリマーは、デバイスに充填され、そして運動的電気的または化学的な力を含み得る（しかしこれらに限定されない）力によって駆動されて、チャネル型構造物を通る。ポリマーの引張りまたは延伸は、同時係属中の出願ＵＳＳＮ０９／６３６，７９３に記載される任意の方法を使用して、達成され得る。ポリマーに対する引張り力は、延伸ＤＮＡ分子の場合、この分子を引張って検出範囲の大きさよりもずっと長くし得るような力である。複数の分子が連続して引張られ得るので、非常に高いスループットのスクリーニング（例えば、１秒間に１つより多くの分子のスクリーニング）を達成し得る。
【００２７】
本発明において、単一の延長され、標識されたポリマーは、検出ゾーンを通過して移動される。このようなゾーンで、ポリマーの標識された単位は、検出器と相互作用して、信号を生じる。本出願中で使用される場合、「通過して移動する」とは、検出ゾーンが静止しておりそして延長されたポリマーが動く状態にある実施形態をいい、ならびに、検出ゾーンが動く状態にありそして延長されたポリマーが静止している実施形態をいう。検出ゾーンおよび延長されたポリマーの両方が動く状態にある実施形態もまた企図される。
【００２８】
本発明は、任意のポリマーを性質決定するために使用され得るが、このポリマーが優勢に（必ずしも排他的ではない）直鎖状または単一鎖の配置を有することが好ましい。このようなポリマーの例としては、デオキシリボ核酸、リボ核酸、ポリペプチド、およびオリゴサッカリドのような、生物学的ポリマーが挙げられる。これらポリマーは、骨格の組成において不均一であり得、従って、一緒に連結した個々のモノマー単位の任意の可能性ある組み合せ（例えば、核酸と連結したアミノ酸を含む、ペプチド核酸（ＰＮＡ））を含む。好ましい実施形態において、これらポリマーは、骨格の組成が均一であり、そして例えば、核酸、ポリペプチドまたはオリゴサッカリドである。用語「骨格」は、ポリマー化学の分野での通常の意味を付与される。本明細書中で使用される核酸は、ヌクレオチドから構成される生体ポリマー（例えば、デオキシリボースの核酸（ＤＮＡ）またはリボースの核酸（ＲＮＡ））である。本明細書中で使用されるタンパク質またはポリペプチドは、アミノ酸からなる生体ポリマーである。最も好ましい実施形態において、延長された対象物とは二重鎖ＤＮＡ分子である。
【００２９】
ポリマーは、複数の個々の単位（すなわち、モノマー単位またはモノマー）から組み上げられ、これは、直接的または間接的のいずれかで他の構築ブロックまたはモノマーと連結されて、ポリマーを形成する構築ブロックである。このポリマーは好ましくは、少なくとも２つの化学的に異なる連結されたモノマーを含む。この少なくとも２つの化学的に異なる連結されたモノマーは、異なる信号を生成し得るか、または異なる信号を生成するよう標識され得る。異なる型のポリマーは、異なるモノマーからなる。例えば、ＤＮＡは、デオキシリボースリン酸の骨格を含む生体ポリマーであり、この骨格に、プリンおよびピリミジン（例えば、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、ヒポキサンチン、ならびに他の天然に存在するヌクレオチド塩基および天然には存在しないヌクレオチド塩基、置換の芳香族部分および非置換の芳香族部分）を結合される。ＲＮＡは、リボースリン酸の骨格を含む生体ポリマーであり、この骨格に、プリンおよびピリミジン（例えば、ＤＮＡについて記載したものであるが、ここではウラシルがチミジンの代りに置き換えられる）を結合される。デオキシリボヌクレオチドは、５’または３’のヒドロキシル基によるエステル結合を介してお互いに結合されて、ＤＮＡポリマーを形成し得る。リボヌクレオチドは、５’、３’または２’のヒドロキシル基によるエステル結合を介してお互いに結合され得る。あるいは、５’、３’または２’のアミノ基を有するＤＮＡ単位またはＲＮＡ単位は、このポリマーの他の単位とのアミド結合を介して結合され得る。
【００３０】
このポリマーは、天然に存在するか、または非天然のポリマーである。ポリマーは、例えば、生化学的精製技術を用いた天然供給源から単離され得る。あるいはポリマーは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いたインビトロ増幅により酵素的に、化学的合成により、または組換え技術により、合成され得る。
【００３１】
本発明の構成は、延長ポリマーの構造的な性質についての情報を伝達するかまたは伝える、物理量の検出によって延長ポリマーを分析する方法と、合わせて用いられる。本明細書中で用いる場合、物理量は、延長ポリマーの一つ以上のモノマーと関連のある特定の型の測定可能な内因的な特性（例えば、天然に存在するＤＮＡの核酸塩基の、明確な吸収極大（本明細書中では、内因的な標識化と称される））、または延長ポリマーの１つ以上のモノマーと特異的に関連する化合物の測定可能な特性（本明細書中では、外因的標識と称される）のいずれかであり得る。好ましくは、物理量は、検出ゾーンのモノマーの数に比例する。外因的標識化ポリマーは、ＤＮＡ鎖中の特定のタイプのすべての核酸塩基（例えば、全てのチミン核酸塩基）が標識化される、特定の蛍光色素で標識され得る。あるいは、外因的な標識化ポリマーは、標的のＤＮＡ内に存在する相補的な配列にハイブリダイズし、従って、「マーク」する。規定の長さおよび規定の配列の、蛍光的に標識されたオリゴヌクレオチドであり得る。この種の外因的な標識は、ランドマークとしてまたは単位特異的なマーカーとして言及される。従って、ランドマークは、長さが１単位より長いポリマー内の、特定の配列を同定する、外因的な標識である。標識ポリマーとして使用され得る分子、すなわちマーカーとしては、さらに、配列特異的な主溝または副溝の結合剤（ｂｉｎｄｅｒ）およびインターカレーター、配列特異的なＤＮＡまたはペプチドに結合するタンパク質、配列特異的ＰＮＡなどが挙げられ得るが、これらに限定されない。検出可能な物理量は、測定することのできる任意の形態となり得る。例えば、検出可能な物理的な量は、電磁放射、電気伝導率、熱伝導率、放射能などであり得る。測定された信号はエネルギー移動、定方向（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）励起、クエンチング、伝導率（抵抗性）の変化、もしくはその他の物理的変化に起因し得る。１つの実施例において、測定される信号は、マーカーとステーションとの間の蛍光共鳴エネルギー移動（「ＦＲＥＴ」）またはステーションの周りの環境に帰する。好ましい実施形態では、測定される信号は、制限されたもしくは局所的な領域における直線的（ｄｉｒｅｃｔ）励起の結果であるか、または、共焦点体積またはスリットに基づく励起の落射から生じる。ポリマーの可能な分析としては以下のものが挙げられるが、これら限定されない：ポリマーの長さの決定、ポリマー配列の決定、ポリマーの速度の決定、２つのポリマーの同一性の程度の決定、「フィンガープリント」をつくり出すポリマーの単位特異的マーカーの特徴的パターンの決定およびサンプル集団内の単位特異的マーカーの統計的分布を用いた不均質なポリマー集団の特徴付け。例示的標識には以下のインターカレーター色素が挙げられるが、これらに限定されない：ＹＯＹＯ−１、ＴＯＴＯ−１、ＹＯＹＯ−３、ＴＯＴＯ−３、ＰＯＰＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＪＯＪＯ−１、ＪＯＪＯ−３、ＢＯＢＯ−１、ＢＯＢＯ−３（分子プローブ由来）；非インターカレーター／骨格染色色素（これらの色素は化学的にＤＮＡの骨格に結合する）：Ｐａｎｖｅｒａ−フルオレセインキット、Ｐａｎｖｅｒａ−Ｃｙ３キット、Ｐａｎｖｅｒａ−Ｃｙ５キット；蛍光プローブ色素：フルオレセイン、テトラメチルローダミン、アレクサ（Ａｌｅｘａ）色素、オレゴン（Ｏｒｅｇｏｎ）色素、サイ（Ｃｙ）色素、ＩＲ色素；およびその他の型の標識（例えば、ラテックス（ｌａｔｅｘ）球面、金粒子およびストレプトアビジン−ビオチン結合体）。
【００３２】
ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９８／３５０１２に記載されているようなポリマー分析に利用できる多くの方法および生成物がある。
【００３３】
ポリマー分析のための多様な方法は、潜在的な感度および解像度（例えば、２つの検出ゾーンの間の最小距離）に違いがある。低解像度の技術は、２つの検出ゾーンの間に大きな距離を有する、２つの検出ゾーンにおいて測定することができる；高解像度の技術は、２つの検出ゾーンの間により小さな距離を有する、２つの検出ゾーンにおいて測定することができる。特定の技術の解像度は、その検出方法が延長ポリマーの、特定の物理量を検出し得る、特定の距離により決定される。例えば、最適な方法の解像度は、回析限界によって決定される。
【００３４】
下記において、簡便さのために、光学的検出方法をしばしば使用する。他の検出方法を光学的方法と合わせて使用し得ること、または光学的検出の代わりに使用し得ることは,当業者に明らかである。
【００３５】
（単一の延長ポリマーの速度）
本発明の方法は、ポリマーが、既知の所定の距離分、離れて間を置かれた、２つ以上の検出ゾーンを通り過ぎて移動する場合、延長ポリマーの時間関連測定に基づく。本発明の装置の実施形態の略図を図１に示す。例えば、検出ゾーン１０１および１０２は、Ｄ１として表される距離分、離れている。図２に示した、対応する時間関連信号振幅プロフィール１０６および１０７は、ポリマー（１０５）が検出ゾーン間の距離Ｄ１を移動するのに要する時間分、時間的に離れている。各々の検出ゾーンをポリマーが通りすぎるとき、信号振幅プロフィールが生じる。これらは、図２に概略的に示される。ここで、ポリマー１０５は、初めにプロフィール１０６を生じる検出ゾーン１０１を通過し、次いで、プロフィール１０７を生じる検出ゾーン１０２を通過し、そして最後にプロフィール１０８を生じる検出ゾーン１０２を通過する。次いで、信号振幅プロフィールはポリマーの速度を決定するために使用される。もちろん、本発明は、三つの検出ゾーンの使用に限定することを意図しない。むしろ、一方で、２つの検出ゾーンを用い得る場合、そのような領域の最大数には、実質的に制限はない。
【００３６】
下記でより詳細に記載するように、図３、４および５で、信号振幅プロフィールから異なるタイプの速度が決定され得る多様な方法を示す。各々の検出ゾーンの対の間の距離は、期待される試験条件および／または測定の要件に基づいて、選択され得る。例えば、ポリマーのポリマー速度がある距離の範囲にわたって変化することが期待されないような、安定した流れを生じる場合、検出領域間より大きい距離が使用され得る。あるいは、流れが速く変化し、そして／またはポリマーの長さが速く変化する場合、（図４に示されるように）接近して位置した複数の検出ゾーンが好ましい。好ましい実施形態において、検出器の間の距離は、延長ポリマーの長さより短い。より短い検出器の間の距離は、両方の検出器において、平均の測定速度を実際に測定された速度により近付ける傾向がある。従って、いくつかの好ましい実施形態において、検出器の間の距離は、検出ゾーンの解像およびそれらの検出方法によって認められる、最小に近づく。例えば、最適な測定に基づく方法において、検出ゾーン間の距離は、回析限界であるか、もしくはそれに近い。
【００３７】
検出ゾーンの間の距離は、当該分野において公知の任意の方法を用いて決定され得る。１つの実施形態において、その距離は、高度空間的解像度を提供する機械システムによって測定される。別の実施形態において、距離は、既知の長さの延長ポリマーを用いて較正することにより、測定され得る。さらに別の実施形態では、距離は、既知の速度の流体流れを用いて較正することにより、測定され得る。このような較正方法が、当該分野で周知である。
【００３８】
その可撓性のために、ポリマーのコンフォメーションは絶えず変化し得る。結果として、ポリマー上の各々の点は、ポリマー上の他の点と異なる速度を有し得る。流体流れの中のポリマーに対して、延長ポリマーの速度はまた、流体流れにより影響を受ける。単一の延長ポリマーの速度は、多様な方法で記載され得る。
【００３９】
図３で、第１および第２の検出ゾーンで測定された、第１の２０１信号振幅プロフィールおよび第２の２０２信号振幅プロフィールに対する、多様な速度の測定が示される。速度決定のために用いる多様な時間間隔が、同様に図３で示される。
【００４０】
延長ポリマーの速度は、質量中心（ＣＯＭ）の速度により表され得る。１つの実施形態において、ＣＯＭは、分子が各々の検出器を通過して移動する際の、信号振幅プロフィールを得、次いで、信号強度の合計の半分を生じた時間を算出することにより見出され得る。ＣＯＭ速度は、延長ポリマーの質量中心が、既知の距離だけ離れた２つの検出ゾーンの間の移動に必要とする時間間隔の決定により測定され得る。この時間間隔は、図３において参照数字２０４で標識されたバーにより表わされる。ＣＯＭ速度は、分子がこの系を通り過ぎる間に延長するかまたは短縮する場合、特に有用である。例えば、インターカレーター信号の測定に基づくＣＯＭ速度は、伸展におけるあらゆる変化を計算に入れるが、それは、変化する伸展領域が、比例的により高い強度もしくはより低い強度のインターカレーター信号を、有するからである。
【００４１】
延長ポリマーの速度はまた、その輪郭中心（つまり、その分子の輪郭の中点の速度（中心間速度））により表され得る。この中心間速度は、この延長ポリマー輪郭中心が、既知の距離だけ離れている２つの検出ゾーンの間の移動に必要とする時間間隔の決定により測定され得る。この時間間隔は、図３において参照数字２０３で標識されるバーにより表される。ポリマーが一様に延長するか否かに依存して、中心間距離速度は、ＣＯＭ速度と同じであり得るか、または異なり得る。特に、ポリマーが一様に延長しない場合、一般的に、中心間速度はＣＯＭ速度と異なる。
【００４２】
延長ポリマーの速度はまた、そのリーディング端部またはトレーリング端部の速度（すなわち、端間速度）により表され得る。延長ポリマーのリーディング端部またはトレーリング端部が、既知の距離だけ離れている２つの検出ゾーン間の移動を必要とする端間速度は時間間隔の決定により測定され得る。この時間間隔は、図３において、参照数字２０６で標識されたバーで表される。
【００４３】
延長ポリマーの速度はまた、有限サイズの領域を通る延長ポリマーのリーディング端部の速度として規定される、立上がり時間速度により表わされ得る。それゆえに、立上がり時間速度は、この領域の入口縁部から出口縁部まで移動するために、ポリマーのリーディング端部に対して必要とされる時間で、領域のサイズを除算することにより測定され得る。この時間間隔は、図３において参照数字２０５で標識されたバーにより表される。立上がり時間速度は、ポリマーのリーディング端部が標識されている場合に、特に有用である。
【００４４】
任意の単一の速度タイプは、延長ポリマーの特徴付けのために、独立的に、または１つ以上の異なる速度タイプの組合せで使われ得る。測定された速度は、ポリマーの長さおよび／または延長ポリマー長のマーカーの間の距離の決定に用いられ得る。
【００４５】
検出方法は、光学的な方法に基づき得、光誘導蛍光測定、吸収測定、光散乱測定および非線型光学測定が挙げられるが、これらに限定されない。このような光学的方法は、当該分野で周知である。例えば、光誘導蛍光測定または吸収測定を用いる場合、励起源、波長、検出器など、どのように選択するかは、当業者に公知である。
【００４６】
いくつかの実施形態において、検出ゾーンで測定される信号は、延長ポリマーの光誘導蛍光である。１つの実施形態において、ポリマーにおけるモノマーのレーザー誘導蛍光が測定される。別の実施形態において、インターカレーター色素分子のレーザー誘導蛍光が測定される。なお別の実施形態において、ポリマーに沿った個々の位置（例えば、リーディング端部もしくはトレーリング端部）で標識化した蛍光マーカー由来の光誘導蛍光が測定される。他の実施形態では、選択された幅のスリットが、検出ゾーンを規定するために用いられる。この実施形態では、励起は、ランプの放射波長から選択され得、検出ゾーンはスリットを通して照射される。スリットを用いる場合、そのスリットは、最も高度な解像度が達成され得るように、光の波長の回析限界に近い幅のスリットであることが好ましい。
【００４７】
他の実施形態では、検出ゾーンで測定される信号は、延長ポリマーの吸光度に基づき得る。そのような実施形態では、測定された波長または吸収した光の波長は、検出範囲内のモノマーの数に比例する。１つの実施形態では、吸収測定においてレーザー励起が用いられる。この実施形態では、選択された波長のレーザービームが、検出ゾーンを規定するために用いられる。別の実施形態では、選択幅のスリットが、検出ゾーンの規定のために用いられる。このように、励起は、ランプの放射波長から選択され得、検出ゾーンはスリットを通して照射される。
【００４８】
検出ゾーンで測定された信号はまた、光分散乱特性を有する分子で標識化されたポリマーにより散乱される光であり得る。上記で記載したように、選択された波長のレーザービームは、検出ゾーンを規定するために用いられ得るか、あるいは、選択幅のスリットが、検出ゾーンを規定するために用いられる。
【００４９】
多様な方法が、本発明において、複数の検出ゾーンを規定するために用いられ得る。光学的測定に基づいた方法において、検出ゾーンは、レーザー照射点を用いて生成され得る。複数のレーザーを用いる実施形態では、各々の点を生成するために、別々のレーザーが用いられ得る。その実施形態では、レーザーは、レーザーの平行出力が顕微鏡対物レンズの出力口に集光されるように、配置される。このように、各々のビームは、顕微鏡対物レンズに異なる角度で侵入する。図６に概略的に示されるように、ビームの角変位は、レーザーの焦点を合わせた点の空間的分離のために、対物レンズにより変えられる。具体的には、図６において、２つの別々のレーザービーム３００、３０２は、それらのビームをサンプル平面３１０上の２つの離れた点３０６、３０８に分解する、顕微鏡対物レンズ３０４を通過する。点の空間的分離は、ビームの角分離の較正により制御され得る。角変位が大きくなるほど、空間的分離はより大きくなる。
【００５０】
他の実施形態では、複数の検出ゾーンは、角変位ビームを生成するために単一のレーザーの出力を分割することにより、規定され得る。図７で、概略的に示される１つの実施形態では、第１の部分的反射ビームスプリッタ３２０および全反射ミラー３２２は、２つのビーム３２４、３２６を生成するために用いられ得、この２つのビーム３２４、３２６は、ビームを顕微鏡対物レンズ３３０の出力開口部に反射する第２の部分反射ビームスプリッタ３２８に集光する。角分離は第１の部分反射ビームスプリッタ３２０と全反射ミラー３２２との間の空間および角度の設定により制御される。好ましい実施形態において、部分反射ビームスプリッタは、薄膜型（ｐｅｌｌｉｃｌｅ）のビームスプリッタである。この薄膜の非常に薄い膜は、ビームスプリッタの背面からのゴーストビームを効果的に回避することを意図する。
【００５１】
さらに別の実施形態では、図８で概略的に示されるように、単色レーザービームを複数のビームに種々の格子次数（例えば、０次（まっすぐな）ビーム、１次ビームおよび高次ビーム）で分割するために、位相格子のような光学的回析要素が用いられる。エネルギーの異なる次数への分散は、位相格子中に形成される溝の深さにより決定される。それに対して、ビームの異なる次数の角分離は、溝の間隔によって決定される。この実施形態では、平行なレーザービームは、全反射ミラー３３０により曲げられ、位相格子３３２を通過する。第２の光学的要素（例えば、レンズ３３４）は、回析光学から分岐されたビームを収集するために、およびビーム３３６、３３８の焦点を再び定めるために使用される。その結果、それらのビームは、部分反射ビームスプリッタ３４０に収束して衝突し、顕微鏡対物レンズ３４０に向かって反射される。
【００５２】
図９に概略的に示される、なお別の実施形態において、単一照射スポット３５０内に形成される交互に明暗のバンドの縞パターンを使用して、検出ゾーンを規定する。延伸ポリマー（例えば、ＤＮＡ分子）が空間的に周期的なバンドを通って移動する。１つの好ましい実施形態において、延伸ポリマーは、１つ以上の蛍光標識で標識される。延伸ポリマーがこのバンドを通って移動する場合、任意の結合された蛍光標識が、照射光に比例して蛍光を発する。従って、蛍光標識の移動は、時間的に周期的な発光を生じる。発光の時間パターンが測定され得、そして空間的周期性（すなわち、縞間隔）を知ることによって、ＤＮＡの速度が、測定された時間的周期性から計算され得る。関連する実施形態において、延伸ＤＮＡ分子の骨格は、蛍光色素で染色される。この実施形態において、連続的により多くの明るいバンドがＤＮＡを照射するにつれて、階段的パターンの発光が観測される。このように限定することを意図しないが、縞パターンは、図９に概略的に示されるように、単一の照射スポットで、単一のレーザーから形成された２つのビーム３５２、３５４を重ね、そしてこれらのビームを、顕微鏡対物レンズ３５６を通すことによって作製され得る。得られる縞間隔は、２つのビームが互いに対して１８０度に配向される場合、照射光の波長の半分である。他の角度において、縞間隔は、より大きく、そしてＤ＝λ／２ｓｉｎ（ｑ）から見出され得、ここで、Ｄは、縞間隔であり、λは、照射レーザーの波長であり、そしてｑは、２つのレーザービーム間の半角である。照射スポットは、好ましくは、十分な数の縞が形成されるような数ミクロンサイズである。
【００５３】
上記光学的方法はまた、組み合わせられ得る。例えば、挿入色素と配列特異的蛍光マーカーとの両方で標識された延伸ＤＮＡ分子が企図される。好ましくは、挿入色素および蛍光マーカーは、異なり、かつ識別可能な波長の光を発する。このような実施形態において、図３および図５の両方に例示される信号振幅プロフィールは、ＤＮＡ分子について同時に決定される。挿入色素および蛍光マーカーの両方からの蛍光を測定するための任意の２重色構成が使用され得る。このような構成は、例えば、Ｄｅｎｉｚら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９６：３６７０−３６７５；およびＨａら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３：６２６４−６２６８に記載される。
【００５４】
単一の高分子ポリマー（例えば、単一のＤＮＡ分子）を伸長させるための当該分野で公知の任意の方法が、本発明において使用され得る。これらとしては、ＵＳＳＮ０９／６３６，７９３に記載される方法が挙げられる。次いで、単一の延伸ポリマーは、好ましくは、延伸分子の経路に沿って配置される装置の検出領域に送達され、この分子の分子特性の測定が実施され得る。
【００５５】
（ポリマーの質量中心速度）
延伸ポリマーのＣＯＭ速度を決定するための種々の方法が使用され得る。検出ゾーンに入る延伸ポリマーの部分の質量を測定し得る任意の検出方法が使用され得る。このような検出方法は、光学的検出方法および電気的検出方法であり得るが、これらに限定されない。
【００５６】
好ましい実施形態において、ＣＯＭ速度は、挿入色素分子で染色されたＤＮＡ分子の測定された強度−時間曲線から決定される。ＤＮＡ分子に結合される挿入色素分子の量がＤＮＡ分子の長さに比例することが当該分野において周知である。例えば、挿入色素ＹＯＹＯ−１は、１：５の色素：塩基対比でＤＮＡ分子に結合する（例えば、Ｌａｒｓｓｏｎら、１９９４，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：８４５９−８４６５を参照のこと）。従って、挿入色素の蛍光強度は、ＤＮＡ分子の長さまたは質量に比例する。従って、ＤＮＡ分子の質量中心は、以下の式に従って、時間の関数として、蛍光強度を積分することによって、測定される蛍光強度−時間曲線から決定され得る：
【００５７】
【数１】
2004537045.tif 000003
ここで、Ｌｃｏｍは、ポリマーに沿った質量中心の位置であり、Ｉ（ｔ）は、時間ｔにおいて測定された蛍光強度であり、ｔ１およびｔ２は、それぞれ、ポリマーが検出ゾーンに入り、そして離れる時間を示し、そしてＬ（ｔ）は、時間ｔにおける検出ゾーンを通ったポリマーの長さである。ｔ１より前の任意の時間が、積分の下限として使用され得、そして時間ｔ２より後の任意の時間が、積分の上限として使用され得る。Ｌ（ｔ）は、式（２）に従って、決定され得る
【００５８】
【数２】
2004537045.tif 000004
ここで、ｖ（ｔ）は、時間ｔにおけるポリマーの速度である。このように、伸長ポリマーの質量中心ｔｃｏｍの時間的位置は、式
【００５９】
【数３】
2004537045.tif 000005
を解くことによって決定され得る。
【００６０】
ポリマーの速度が一定である（すなわち、ｖ（ｔ）＝Ｖ）場合、質量中心の時間的位置は、式
【００６１】
【数４】
2004537045.tif 000006
によって決定され得る。
【００６２】
次いで、ＣＯＭ速度は、既知の距離の２つの検出ゾーン間の距離を、２つの検出ゾーンにおけるＴｃｏｍの差で除算することによって決定される。
【００６３】
別の実施形態において、ＣＯＭ速度は、延伸ポリマーからの固有の刺激された蛍光の測定された強度−時間曲線から決定される。ポリマーのモノマー単位は、検出可能な波長で光および蛍光によって励起され得、強度−時間曲線は、発せられる波長での蛍光をモニターすることによって測定され得る。このアプローチが使用される場合、蛍光モノマーは、ポリマーに沿って均一に分配されることが好ましい。次いで、蛍光強度は、ポリマーの長さまたは質量の測定を提供する。
【００６４】
（ポリマーの中心間速度）
ポリマーを送達するために使用されるチャネルの形状に依存して、ポリマーの速度の中心間近似が使用され得る。例えば、延伸ＤＮＡの中心間速度は、一定のフロープロフィールが形成される場合、使用され得る。中心間速度は、一般的に、質量中心速度とは異なる。中心間速度は、延伸ポリマーの分子輪郭の中点（すなわち、ポリマー輪郭の中心）が、既知の距離だけ離れた２つの検出ゾーン間を進むための時間間隔を測定することによって決定される。延伸ポリマーの中心は、
【００６５】
【数５】
2004537045.tif 000007
によって規定され、
ここで、Ｌ（ｔｃ）、Ｌ（ｔ１）およびＬ（ｔ２）は、式（２）によって規定される。ポリマーの速度が一定である（すなわち、ｖ（ｔ）＝Ｖ）場合、ポリマーの中心の時間的位置は、式
【００６６】
【数６】
2004537045.tif 000008
によって決定され得、
ここで、ｔｃは、ポリマーの測定される信号振幅プロフィール（例えば、強度−時間曲線）の中心の時間的位置であり、そしてｔ１およびｔ２は、それぞれ、信号振幅プロフィールのリーディングエッジおよびトレーリングエッジである。次いで、中心間速度は、２つの検出ゾーン間の距離を、２つの検出ゾーンにおけるｔｃの差で除算することによって決定される。
【００６７】
いくつかの場合、例えば、ポリマーが、その質量がその長さにわたって均一に分布するように伸長される場合、中心間速度は、質量中心速度と同じである。
【００６８】
（ポリマーの端部間速度）
端部間速度は、２つの検出ゾーンを通る延伸分子が入ること、または出ることを使用して決定される。いくつかの実施形態において、リーディングエッジ間速度は、２つの検出ゾーンを通るポリマーのリーディングエッジを測定することによって決定される。他の実施形態において、トレーリングエッジ間速度は、２つの検出ゾーンを通るポリマーのトレーリングエッジを測定することによって決定される。端部間速度は、ポリマーの端部を検出し得る任意の方法で測定され得る。
【００６９】
本発明のいくつかの実施形態において、延伸ポリマーの端部間速度は、各検出ゾーンにおけるセクションで、ポリマーの質量を測定し得る方法によって、２つの検出ゾーンにおいて測定される信号振幅プロフィールから決定される。好ましい実施形態において、ポリマーは、挿入色素を用いてその全体の長さに沿って標識されるＤＮＡ分子である。検出ゾーンへＤＮＡ分子が入ることは、インターカレーター信号の増加によってマークされる。検出ゾーンからＤＮＡ分子が出ることは、インターカレーター信号の減少によってマークされる。検出ゾーンにおける分離の既知の距離を使用して、速度は、強度−時間曲線のエッジおよびそれらのそれぞれの検出ゾーンへの入／出のそれぞれの時間の任意の組合せを使用して決定され得る。１つの実施形態において、ポリマーが検出ゾーンに入る時間または出る時間は、強度−時間曲線がバックグラウンドのレベルから離れ始める時間的位置として同定される。別の実施形態において、ポリマーが入る時間または出る時間は、強度−時間曲線のリーディングエッジまたはトレーリングエッジの半分の高さの時間として同定される。そして、端部間速度は、２つの検出ゾーンの間の距離を、２つの検出ゾーンでの入る時間または出る時間における差で除算することによって決定される。
【００７０】
他の実施形態において、ポリマーは、一端または両端で標識され、そしてこの標識は、端部間速度を決定するために検出される。例えば、ポリマーは、蛍光色素分子を用いて、一端で標識され得る。蛍光信号は、既知の距離だけ離れた２つの検出ゾーンにおいて検出される。端部間速度は、２つの検出ゾーン間の距離を、信号間の測定された時間間隔で除算することによって決定される。ポリマーが、リーディングエッジの場合、その標識端部またはその非標識端部のいずれかで検出ゾーンに入り得るので、ポリマーが、第１の検出ゾーンから第２の検出ゾーンに、リーディング端部およびトレーリング端部を切り換えることなく進むことが重要である。この条件は、２つの検出ゾーン間に、障害が配置されない場合、通常満たされる。
【００７１】
好ましい実施形態において、ポリマーは、同じ色素で両端で標識される。２つの蛍光信号は、各検出ゾーンにおいて検出される。端部間速度は、２つの第１信号または２つの第２信号によって決定され得る。両端におけるポリマーの標識は、一端におけるポリマーの標識よりも好ましい。なぜなら、各検出ゾーンにおけるリーディングエッジおよびトレーリングエッジにおける標識に対応する２つの相関する信号の検出が使用されて、ポリマーの標識された端部の検出を確実にし得るからである。これは、緩い（ｌｏｏｓｅ）色素分子または他の蛍光種がサンプル中に存在し得る場合、特に重要である。別の好ましい実施形態において、ポリマーの２つの端部は、異なる発光スペクトルを有する色素で標識され得る。
【００７２】
（立上がり時間測定からのポリマーの速度）
立上がり時間近似は、ポリマーのリーディングエッジが検出ゾーンを移動するために必要とされる時間で、検出ゾーンの既知の長さを除算することによって、延伸ポリマーの速度の決定を可能にする。あるいは、延伸ポリマーの速度は、ポリマーのトレーリングエッジが検出ゾーンを移動するために必要とされる時間で、検出ゾーンの既知の長さを除算することによって、決定され得る。ＣＯＭ（中心間速度および端間速度）とは対照的に、立上がり時間速度は、１つの検出ゾーンのみを使用して、決定される。
【００７３】
本発明のいくつかの実施形態において、延伸ポリマーの立上がり時間速度は、検出ゾーンにおけるポリマー部分の質量を測定することを可能にする方法によって、検出ゾーンにおいて測定された信号振幅プロフィールから、決定される。好ましい実施形態において、このポリマーは、挿入色素で標識されたＤＮＡ分子である。ＤＮＡ分子が検出ゾーンに入ることは、インターカレーター信号の立上がりによってマークされる。ＤＮＡ分子が検出ゾーンから出ることは、インターカレーター信号の減少によってマークされる。ＤＮＡからのインターカレーター信号は、ＤＮＡ分子の前端が検出ゾーンの遠い縁部に到達する際に、完全強度に達する。従って、強度−時間曲線において、立上がり時間は、強度−時間曲線のリーディングエッジによって表される。次いで、立上がり時間速度は、検出ゾーンの長さを、信号振幅プロフィールのリーディングエッジが完全強度に達するために要する時間間隔で除算することによって、決定される。１つの実施形態において、検出ゾーンは、約２６６ｎｍのビームのウエスト（ｗａｉｓｔ）に収束する、５３２ｎｍのダイオード励起固体レーザーからのレーザー励起ビームのスポットサイズによって、規定される。この実施形態において、立上がり時間速度の分解能は、立上がり時間によって除算された２６６ｎｍである。
【００７４】
（ポリマー上の既知の距離でマーカーで標識されたポリマーの速度の決定）
延伸ポリマーの速度はまた、ポリマー上の既知の距離のマーカー間の時間間隔をモニタリングすることによって、決定され得る。このような実施形態において、ポリマー上の２つ以上のマーカーの間の距離が既知であるので、ポリマーの速度は、単一の検出ゾーンを使用して決定され得る。
【００７５】
好ましい実施形態において、配列特異的マーカーが、ＤＮＡ分子を標識するために使用される。このようなマーカーとしては、例えば、蛍光標識された、規定された配列のオリゴヌクレオチドが挙げられ、これは、標的ＤＮＡ分子上に存在する相補的配列にハイブリダイズし、従って、この配列を「マーク」する。各隣接する対のマーカー間の距離は、好ましくは、検出ゾーンの寸法の半分より大きく、その結果、隣接するマーカーからの信号が区別され得る。次いで、マーカーの対の間の既知の距離を、２つのマーカーからの信号の検出の間の時間間隔で除算することによって、ポリマーの速度が決定される。任意の配列特異的マーカーが、本発明において使用され得る。これらとしては、蛍光標識された、配列特異的な、主溝または副溝の結合剤およびインターカレーター、配列特異的なＤＮＡまたはポリペプチド結合タンパク質、配列特異的なペプチド核酸（ＰＮＡ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
上に記載される方法の２つ以上が組み合わせられて、延伸ポリマーの運動に関するさらなる情報を与え得る。１つの実施形態において、ＣＯＭ速度および端部間速度が決定され、そして延伸ポリマーと比較される。ＣＯＭ速度と端部間速度との間の差異は、そのポリマーの長さが、そのポリマーが検出ゾーンを通過するにつれて変化したかもしれないことを示す。別の実施形態において、立上がり時間速度が使用されて、検出ゾーンの大きさを推定し得る。立上がり時間速度は、同時に決定されたＣＯＭ速度、中心間速度、および／または端部間速度から減算され、その結果、有限の大きさの検出ゾーンの寄与が、排除される。
【００７７】
（ポリマーの長さの決定）
本発明はまた、単一の延伸ポリマーの長さを決定するため、および単一の延伸ポリマーに沿ったタグ間の距離を決定するための方法を提供する。ポリマーの長さまたはポリマー上の２つのマーカー間の距離は、そのポリマーの速度が既知である場合、不連続な検出ゾーンを使用して決定され得る。例えば、ポリマーの速度がｖ（ｔ）である場合、そのポリマーの長さは、検出ゾーンにおいて測定された信号振幅プロフィールから、以下の方程式によって決定され得る：
【００７８】
【数７】
2004537045.tif 000009
ここで、Ｌは、ポリマーの長さであり、そしてｔ１およびｔ２は、信号振幅プロフィールのリーディングエッジおよびトレーリングエッジである。
【００７９】
本発明のいくつかの実施形態において、ポリマーの速度は、時間に依存しない速度Ｖによって近似される。このような実施形態において、ポリマーの長さは、Ｌ＝Ｖ×（ｔ１−ｔ２）と決定され得る。
【００８０】
しかし、ポリマーの速度は、目的の領域の通過の際に変化し得るので、複数の検出ゾーンを延伸ポリマーの経路に沿って提供し、これによって、複数の信号振幅プロフィールが得られ得ることが好ましい。１つの実施形態において、各隣接する対の検出ゾーン間の間隔は、延伸ポリマーの長さよりずっと小さい。このような実施形態において、延伸ポリマーの鎖に沿った、重なった信号振幅プロフィールが得られ得、時間に依存する速度ｖ（ｔ）の決定を可能にする。これは、速度測定の精度を増加させ、そしてより正確なポリマー長さの測定を可能にする。出力の概略を、以下の図４に示す。図４において、延伸ポリマーの４つの信号振幅プロフィールが示されている（任意の相対強度で）。異なる型の速度のいずれかを、複数の検出スキームにおいて使用し得る。例えば、速度決定は、リーディングエッジ速度情報、質量中心推定、立上がり時間推定、およびインターカレーター信号から得られる他の情報の組み合わせを使用することによって、さらに評価され得る。
【００８１】
（単一分子の制限マッピング）
本発明の方法および装置は、ポリマー（例えば、単一分子の制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ））の分析において使用され得る。１つの実施形態において、適切な制限酵素が、制限フラグメントを生成するために使用される。任意の制限酵素が、本発明と組み合わせて使用され得る。多くの制限酵素の認識配列および反応条件は、当業者に周知である。分析されるＤＮＡ分子の配列に依存して、適切な制限酵素が選択され得る。次いで、制限消化からのフラグメントを含むサンプルが、標識される。例えば、標識は、サンプルを挿入色素（例えば、ＹＯＹＯ−１）で染色することを包含し得る。次いで、標識されたフラグメントは延伸され、そして本発明の任意の方法によって検出される。単一の制限フラグメントの長さが測定される領域に、２つ以上の検出ゾーンが配置される。
【００８２】
別の実施形態において、それらの認識配列を認識しそして結合するが、基質ＤＮＡ分子を切断しない、改変された制限酵素が、ＤＮＡ分子を標識するために使用され得る。あるいは、制限酵素は、緩衝液（例えば、低濃度のＭｇ２＋＋の溶液）と組み合わせて使用され得、その結果、この制限酵素は、その認識配列を認識し、そして結合するが、基質ＤＮＡ分子を切断しない。これらの場合の各々において、制限酵素は、例えば、蛍光標識を使用して標識される。次いで、この様式で標識されたＤＮＡ分子は、延伸され、そしてそのＤＮＡ分子に沿った標識間の距離が測定される。もちろん、他の配列特異的標識が、標識された非切断制限酵素の代わりに、またはこの酵素と組み合わせて使用され得る。このような配列特異的標識としては、配列特異的な、主溝または副溝の結合剤、およびインターカレーター、あるいは配列特異的なＰＮＡなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
切断制限酵素と非切断制限酵素との組み合わせもまた、使用され得る。１つの実施形態において、基質を切断する制限酵素を使用して、制限フラグメントを生成し得る。この得られる制限フラグメントは、適切な挿入色素で染色される。次いで、この挿入色素とは異なり、そして区別可能な波長の蛍光色素で標識された、非切断制限酵素が使用されて、これらの制限フラグメントにおける内部制限部位を標識する。両方の波長の同時の検出は、制限フラグメントの長さの決定、および内部配列の同定を可能にする。他の配列特異的標識が、標識された非切断酵素の代わりに、またはこの酵素と組み合わせて、使用され得る。上記のように、このような配列特異的標識としては、配列特異的な、主溝結合剤または副溝結合剤、およびインターカレーターあるいは配列特異的ＰＮＡなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【実施例】
【００８４】
（実施例）
（ファージλ−ＤＮＡの伸長）
図１１Ａ〜１１Ｃ、１２および１３を、図１０に示されるような二重レーザースポット装置を使用して誘導した。ＤＮＡを、以下の設計のエッチングされたナノチャネルを有する石英チップに通して駆動した：ナノチャネルは、電子ビームリソグラフィーを使用して、３００ｎｍの石英チップに形成された。このプロセスは、当該分野において公知の一連のリソグラフ工程を使用し、これは、以下を包含した：ａ）石英ウエハをレジストでコーティングする工程、ｂ）コーティングされたチップ上のパターンを電子ビームに曝露する工程、ｃ）曝露されたレジストをストリップする工程、ｄ）反応性イオンエッチングを使用してエッチングし、真っ直ぐな壁プロフィールを与える工程、およびｅ）残っているレジストを除去する工程。
【００８５】
検出ゾーンは、４８８ｎｍで作動し、そして約２ｍＷのレーザー出力を各スポットに送達する、アルゴンイオンレーザーによって形成された、レーザースポットであった。これらのスポットは、回折限界であり、スポットサイズは、直径約０．５ミクロンであった。これらのレーザースポットは、１５ｍｍの間隔を空けており、そしてＤＮＡ分子の経路内のマイクロチャネル中に位置した。ＤＮＡが２つのレーザースポット検出ゾーンを通って送達されることを層流の線が可能にするような様式で、標識されたＤＮＡを含むキャリア液体をナノチャネルを通して流した。このＤＮＡ分子は、１分子のＹＯＹＯ−１／１０の塩基対の最終濃度でＹＯＹＯ−１を挿入されたλ−ＤＮＡを含んだ。キャリア溶液は、１×ＴＢＥ溶液中１００ｍＭのＤＴＴを含んだ。５０ｐｓｉで送達する流体ドライブを使用して、チャネルを通してＤＮＡを駆動した。チップを、公知の化学活性化シーリング技術を使用してシールした。結合されるべき表面（石英チップおよび石英カバーガラス）を、水酸化アンモニウム：過酸化物：水の混合物を使用して活性化し、７０℃に加熱した。次いで、これらのカバーガラスおよび石英チップを、水中で一緒にプレスし、そしてクランプされたパッケージを焼いて、任意の溶媒を蒸発させ、そして２つの表面の化学結合を起こした。次いで、ＤＮＡサンプル混合物を、毛細管力によってチップに導入した。２つのレーザー励起スポット（１５ミクロン離して配置される）から測定される信号を、Ｎｉｋｏｎ  １．４ＮＡ  １００倍油浸対物レンズを通して収集した。得られる蛍光信号をフィルタリングし、そして２つのアバランシェフォトダイオードによって検出した。次いで、２つのインターカレーター信号由来の信号を、データ捕捉ボードを通して収集し、Ａ／Ｄ変換器によって処理し、そしてコンピュータに格納した。このコンピュータは、データの処理および分子の長さの計算を可能にした。一定の速度の推定を使用して、このシステムを通って移動する分子の速度を誘導した。その速度は、ＣＯＭからＣＯＭの速度の推定／計算であった。λ分子の平均長さは、約１８ミクロンであると測定され、これは、インターカレーター染色からのＤＮＡ分子の長さの、約２０％の増加に対応する。データを、ＭＡＴＬＡＢデータ処理言語で書かれたアルゴリズムを使用して処理した。
【００８６】
図１１Ａ〜１１Ｃは、２つの検出ゾーンにおいて測定された、例示的な信号振幅プロフィールを示す。
【００８７】
図１２は、検出されたλ−ＤＮＡ分子の質量中心速度に基づく、速度ヒストグラムを示す。
【００８８】
図１３は、λ−ＤＮＡ分子の長さヒストグラムを示す。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、本発明の装置の概略図の表示である。
【図２】図２は、図１の装置を使用して測定される、いくつかの信号振幅プロフィールの概略図の表示である。
【図３】図３は、いくつかの時間関連の信号振幅プロフィールの概略図である。
【図４】図４は、複数の検出ゾーンで測定される、いくつかの時間関連の信号振幅プロフィールの概略図である。
【図５】図５は、第１検出ゾーンおよび第２検出ゾーンで検出される信号の概略図である。
【図６】図６は、複数の検出ゾーンでのレーザースポットの形成についての、装置の１つの実施形態の概略図である。
【図７】図７は、複数の検出ゾーンでのレーザースポットの形成についての、装置の第２の実施形態の概略図である。
【図８】図８は、複数の検出ゾーンでのレーザースポットの形成についての、装置の第３の実施形態の概略図である。
【図９】図９は、干渉縞を形成する装置の１つの実施形態の概略図である。
【図１０】図１０は、検出ゾーンを規定するレーザースポットの配置を示す、本発明の装置の概略図である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、２つの検出ゾーンで測定される例示的な信号振幅プロフィールを示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、２つの検出ゾーンで測定される例示的な信号振幅プロフィールを示す。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、２つの検出ゾーンで測定される例示的な信号振幅プロフィールを示す。
【図１２】図１２は、本発明の１つの方法を使用して測定される、λ−ＤＮＡ分子の集団の質量中心速度に基づく速度ヒストグラムを示す。
【図１３】図１３は、本発明の１つの方法を使用して測定される、λ−ＤＮＡ分子の集団の長さのヒストグラムを示す。
【図１】
2004537045.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2004537045.tif 000016
【図８】
2004537045.tif 000017
【図９】
2004537045.tif 000018
【図１０】
2004537045.tif 000019
【図１２】
2004537045.tif 000020
【図１３】
2004537045.tif 000021
【国際公開パンフレット】
2004537045.tif 000022
2004537045.tif 000023
2004537045.tif 000024
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【国際調査報告】
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2004537045.tif 000068