(57)【要約】そのサブユニットの１個は、ＩＬ−１８Ｒの細胞外ドメインまたはその断片を含み、他方は、ＡｃＰＬの細胞外ドメインまたはその断片を含む、２個のサブユニットを含む、可溶性、ヘテロ２量体インターロイキン１８（ＩＬ−１８）受容体分子が記述されている。好ましくは、可溶性の、ヘテロ２量体受容体は、ＩＬ−１８ＲまたはＡｃＰＬの何れか単独よりも高い親和性を持って、ＩＬ−１８に結合する。
2004512026.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２個のサブユニットを含む可溶性のヘテロ２量体インターロイキン１８（ＩＬ−１８）受容体分子であって、該サブユニットの１個はＩＬ−１８Ｒの細胞外ドメインまたはその断片を含み、他方はＡｃＰＬの細胞外ドメインまたはその断片を含むことを特徴とする受容体分子。
【請求項２】
ＩＬ−１８ＲまたはＡｃＰＬのいずれよりも高い親和性をもってＩＬ−１８に結合する、請求項１の可溶性のヘテロ２量体受容体。
【請求項３】
２個のサブユニットを含む可溶性のヘテロ２量体インターロイキン１８（ＩＬ−１８）受容体分子であって、該サブユニットの夫々はペプチドに付加したＩＬ−１８ＲまたはＡｃＰＬの可溶性部分を含み、ここで、２個の該サブユニットは前記付加ペプチドを介して会合することを特徴とする受容体分子。
【請求項４】
各ペプチドが免疫グロブリン鎖またはその断片である、請求項３の可溶性の受容体。
【請求項５】
各ペプチドが免疫グロブリン重鎖またはその断片である、請求項３の可溶性の受容体。
【請求項６】
各ペプチドがロイシンジッパーの一部である、請求項３の可溶性の受容体。
【請求項７】
該サブユニットが化学的架橋により会合している、請求項１の可溶性の受容体。
【請求項８】
該サブユニットが単一のポリペプチド単鎖を形成する、請求項１の可溶性の受容体。
【請求項９】
前記ＩＬ−１８ＲおよびＡｃＰＬがヒト由来である、請求項１の可溶性の受容体。
【請求項１０】
請求項１の可溶性のヘテロ２量体ＩＬ−１８および製薬的に受容できる担体を含む製薬組成。
【請求項１１】
請求項１の可溶性のヘテロ２量体受容体を製造する方法であって、２個の該サブユニットを、化学的に架橋することにより、ペプチドリンカーで連結することにより、または組換え法により直線的ポリペプチド単鎖を形成することにより、会合することを特徴とする方法。
【請求項１２】
可溶性の２量体受容体を製造するための組成物であって、ペプチドに付加されたＩＬ−１８Ｒの可溶性部分を含む融合タンパク質のためのコード配列を含むキメラポリヌクレオチド、およびペプチドに付加されたＡｃＰＬの可溶性部分を含む融合タンパク質のためのコード配列を含むキメラポリヌクレオチドを含むことを特徴とする組成。
【請求項１３】
請求項１２のキメラポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１３の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１５】
可溶性のヘテロ２量体受容体を製造する方法であって、前記融合タンパク質の両方が発現される条件下で請求項１４の細胞を培養すること、および前記タンパク質を収得することを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項８の可溶性受容体をコード化するポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１６のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１７の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１９】
単鎖の可溶性ヘテロ２量体受容体を製造する方法であって、単鎖ヘテロ２量体受容体が発現される条件下で請求項１８の細胞を培養し、そして前記タンパク質を収得することを含んで成る方法。
【請求項２０】
ＩＬ−１８の効果を阻害する方法であって、請求項１の可溶性、ヘテロ２量体ＩＬ−１８受容体を哺乳動物に投与することを含んで成る方法。
【請求項２１】
ＩＬ−１８の発現またはＩＬ−１８受容体を有する細胞の過剰なもしくは不適切な活性と関連した病理学的状態を治療する方法であって、その様な治療を必要とする患者に、有効量の、請求項１の可溶性、ヘテロ２量体ＩＬ−１８受容体分子を投与することを特徴とする方法。
【請求項２２】
前記患者がヒトである、請求項２１の方法。
【請求項２３】
前記病理学的状態が自己免疫不全または炎症状態である、請求項２１の方法。
【請求項２４】
該病理学的状態がリュウマチ性関節炎または多発性硬化症である、請求項２１の方法。
【請求項２５】
哺乳動物におけるＩＬ−１８仲介炎症またはＩＬ−１８仲介免疫応答を抑制する方法であって、その様な治療を必要とする患者に、有効量の、請求項１の可溶性、ヘテロ２量体ＩＬ−１８受容体分子を投与することを含んで成る方法。
【請求項２６】
該哺乳動物がヒトである、請求項２５の方法。
【請求項２７】
ＩＬ−１８分子を検出する方法であって、ＩＬ−１８分子を含むであろう試料を、標識付けされている、請求項１の可溶性、ヘテロ２量体ＩＬ−１８受容体分子と接触させることを含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヘテロ２量体を含む、たとえば可溶性の多量体インターロイキン １８（ＩＬ−１８）受容体分子に関する。
【０００２】
発明の背景
以前ＩＦＮ−γ（インターフェロンガンマ）誘導因子と呼ばれたインターロイキン １８（ＩＬ−１８）は、多くの生物活性を示すサイトカインである。これらの生物活性は、細胞、たとえば活性化されたＴ−またはＮＫ−細胞上の細胞表面、すなわち細胞質膜、にＩＬ−１８分子が結合することにより仲介される。ＩＬ−１８受容体は、少なくとも２個のサブユニットを含む。すなわちＩＬ−１８Ｒ（ＩＬ−１Ｒ関連タンパク質、ＩＬ−１Ｒｒｐ、ＩＬ−１８Ｒα、２ＦＩまたは「結合鎖」としても知られる）およびＡｃＰＬ（副タンパク質様ＩＬ−１８−ＡｃＰＬ、ＩＬ−１８Ｒβまたは「信号鎖」としても知られる）である。高い親和性をもってＩＬ−１８に結合する作用物質に対する需要がある。このような作用物質は、たとえば試料中のＩＬ−１８を検出するために、または、たとえば細胞表面に存在するＩＬ−１８受容体へのＩＬ−１８の結合に干渉することにより、ＩＬ−１８により仲介される病理的状態を治療するために使用できる。
【０００３】
発明の記述
本発明は、たとえば可溶性の、多量体ＩＬ−１８受容体分子（ｓＩＬ−１８Ｒ）に関するものであって、少なくとも２個のサブユニットを含み、その内の１つは、受容体ＩＬ−１８Ｒの細胞外ドメインまたはその断片もしくは変形を含み、他方は受容体ＡｃＰＬの細胞外ドメインまたはその断片もしくは変形を含むものであって、ここで、前記可溶性受容体分子はＩＬ−１８ＲまたはＡｃＰＬポリペプチドのいずれか単独よりも、高い親和性をもってＩＬ−１８に結合している。好ましくは、ｓＩＬ−１８Ｒは、ＩＬ−１８に結合する高い親和性を示す。好ましい具体例において、可溶性ＩＬ−１８受容体は、上述した如く２個の異なるサブユニットを含むヘテロ２量体受容体である。
【０００４】
「可溶性」の多量体受容体は、本明細書において、その受容体のサブユニットの夫々が、受容体の細胞外ドメインの一部または全てを含むが、細胞膜内に完全長受容体を通常維持する膜貫通ドメインの一部または全てを欠いている、多量体受容体を意味する。かくて、たとえば、その様な可溶性受容体またはそのサブユニットの１個が哺乳動物細胞内で組替え的に産生される場合、それは、細胞表面に残るよりは、むしろ細胞質膜を通して組換え型宿主細胞から分泌され得る。一般的には、本発明の可溶性受容体は、水溶液に溶解できる。然しながら、ある条件下では、受容体は、標準的手段で容易に溶解する封入体の形であり得る。「多量体」または「ヘテロ多量体」により、２個またはそれ以上の異なるサブユニットを含むことを意味する。「ヘテロ２量体」受容体は、２個の異なるサブユニットを含む。
【０００５】
本発明の好ましい具体例において、ヘテロ２量体ＩＬ−１８受容体の１個のサブユニットは、ＩＬ−１８Ｒの１以上の生体機能（生物活性）を示し、そして他のサブユニットは、ＡｃＰＬの１以上の生体機能（生物活性）を示す。ここで使われている、ＩＬ−１８Ｒの「生物活性」と言う術語は、少なくともある程度、ＩＬ−１８に結合する、および／またはＡｃＰＬのＩＬ−１８への、または他分子への結合を調節する（たとえば、促進する、変化する）能力を意味する。ＩＬ−１８に結合する、および／またはその様な結合を調節する他のポリペプチド、またはその断片もしくは変形もまた本発明に含まれる。
【０００６】
「高親和性結合」は、ここに約１００ ｐＭから 約１ ｎＭを意味する。「低親和性結合」は、ここに約１０ ｎＭから 約１００ ｎＭを意味する。ＩＬ−１８結合を測定する幾つかの分析法に関する記述については、例４を参照のこと。
本発明の１具体例において、ＩＬ−１８Ｒ−およびＡｃＰＬ−含有サブユニットは、化学的架橋により会合する。
他の具体例において、ＩＬ−１８ＲおよびＡｃＰＬサブユニットは、ＩＬ−１８ＲおよびＡｃＰＬの可溶部分に付加している、抗体分子のペプチドたとえばロイシンジッパー部分のような部分または同様なものを介して会合している。
他の具体例において、ＩＬ−１８ＲおよびＡｃＰＬサブユニットは、単鎖ポリペプチド
を形成する（に存在する）。
【０００７】
本発明は、ＩＬ−１８を含むであろう試料中のＩＬ−１８を検出する方法にも関するものであって、該試料を、標識付けされている上述の如き可溶性のヘテロ２量体ＩＬ−１８受容体と接触させることおよび該標識を検出することを含む。
本発明はまた、過剰な、または不適切な量を含むＩＬ−１８の発現、および／またはＩＬ−１８受容体を操作する細胞の過剰または不適切な活性と関連した状態（たとえば病理学的状態）を治療したりまたは予防したりする方法にも関するものであって、その様な治療を必要とする患者に、有効量の、上述の如き可溶性のヘテロ２量体のＩＬ−１８受容体を投与することを含む。
【０００８】
本発明の可溶性の、多量体ＩＬ−１８受容体は、いかなる適切な方法でも、たとえば、サブユニットを個別に調製し次いでそれらを会合させるか、または既にサブユニットを含む巨大分子を調製することにより、調製できる。ＩＬ−１８に結合するおよび／またはＩＬ−１８にポリペプチドの結合を調整するいかなる受容体ポリペプチドも本発明に含まれることを理解すべきであるが、明瞭にするために、本出願の開示は、主としてＩＬ−１８ＲおよびＡｃＰＬに焦点を置いている。
【０００９】
ＩＬ−１８およびＡｃＰＬは、マウスおよびヒトの両方を起源として特徴付けられ、クローン化され、配列付けをされ、およびそれらの多くから精製されている。またそれらは、少なくとも他の哺乳動物種、たとえば牛、ブタ、種々のヒト以外の霊長類起源のものから特徴付けられている。ＩＬ−１８ＲおよびＡｃＰＬの精製、操作、および／またはクローン化、および／またはそれらの配列の開示については、たとえば、Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ （１９９９），Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０３， １１−２４； Ｔｏｒｉｇｏｅ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２， ２５， ７３７−７４２； Ｐａｒｎｅｔ ｅｔ ａｌ． （１９９６）． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１， ３９６７−７０； ＥＰ８６４ ５８５ およびＥＰ８５０ ９５２； ＷＯ９７／３１０１０； 米国特許Ｎｏ． ５，７７６，７３１；またはＧｒｅｅｎｆｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０， １３， ７５７−７６５；あるいはＢｏｒｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８）． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３， ２９， ４４５−４５０を参照せよ。
【００１０】
ＩＬ−１８ＲおよびＡｃＰＬの機能ドメインは、同定されている。たとえば、ヒトＩＬ−１８Ｒの少なくとも１個の分離株は、細胞外ドメイン（アミノ酸 １−３１０）、膜貫通領域（アミノ酸３１１−３３２）および細胞質ドメイン（アミノ酸 ３３２−５２２）を従えたシグナルペプチド（アミノ酸 −１９から −１まで）を含む（ＷＯ９７／３１０１０）。ヒトＡｃＰＬの少なくとも１個の分離株は、細胞外ドメイン（アミノ酸 １−３４２）、膜貫通領域（アミノ酸３４３−３６７）および細胞質ドメイン（アミノ酸 ３６８−５８５）を従えたシグナルペプチド（アミノ酸 −１４から −１まで）を含む（Ｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３， ２９，　４４５−５０）。
【００１１】
本発明の可溶性の、ヘテロ２量体受容体サブユニットは、もし上に定義したように、生物活性が保たれかつ分子が可溶性のままであるならば、ＩＬ−１８ＲまたはＡｃＰＬの細胞外ドメインまたはその断片に加えて、シグナル塩基配列の配列、膜貫通領域、および／または受容体の細胞質ドメイン、あるいはこれらの領域の断片を含むことができる。これらの部分は、野生型分子と同じような直線配列または相対的配置である必要はなく、また内部的削除を含むことができる。
【００１２】
本発明の受容体サブユニットは、シグナルペプチド配列の全てもしくは一部を含むこができ、または全く含まないこともできる。ＩＬ−１８ＲまたはＡｃＰＬの細胞外ドメイン、および上に定義した如く夫々の受容体ポリペプチド鎖からの、任意に、１またはそれ以上の他の部分を含む分子は、ここに「受容体の可溶性部分」として指定される。この時、分子は可溶性でかつ上に定義した如き活性を示す。
【００１３】
受容体ポリペプチドの可溶性部分の単離は、上記参照に開示されているような、通常の、当業者に認識されている手順を用いて、本質的に完全長の受容体の単離から始めることができる。本質的に完全長の受容体ＩＬ−１８ＲまたはＡｃＰＬは、種々のｉｎ ｖｉｖｏの供給源から（たとえば、肺、脾臓、上皮細胞、内皮細胞、間質細胞、軟骨細胞、単球、顆粒細胞、リンパ細胞、神経細胞、など）、タンパク質（たとえば、リンパ細胞、末梢血Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む造血細胞）の１または両方を発現する確立した細胞株から、受容体の１または両方を分泌するリンパ腫細胞またはその断片から、またはポリペプチドを発現しおよび任意に分泌する組換え型細胞から単離できる。
【００１４】
「本質的に完全長」は、上述した全てのまたはほとんど全ての受容体ドメインを含むことを意味する。結果として、本質的に完全長のタンパク質の可溶性部分を単離できる。たとえば、可溶性部分は、それが細胞に結合していようとなかろうと、１以上のタンパク質分解酵素（たとえば、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、ブロメライン、パパイン、牛腸活素、コラゲナーゼ、因子ＩＸ、ポリユビキチン加工酵素、など）で、または化学的開裂（たとえば、臭化シアンなどで）により、完全長受容体ポリペプチドから開裂できる。受容体の天然発生の可溶性型（たとえば、「デコイ」受容体）もまた、ヘテロ２量体の可溶性受容体を生成するために使用できる。勿論、１以上の受容体ドメインは、前述の如く、個別に調製でき、かつ当業者に認識されている手順を用いて、「受容体の可溶性部分」を形成するために他のドメインに結合される。
【００１５】
あるいは、いずれかの受容体の可溶性部分は、通常の方法を用いて、組換え的に調製できる。最初の工程として、その様な可溶性部分をコード化するポリヌクレオチド断片（たとえば、ＤＮＡ断片）は、多種の操作の何れかにより生成される。たとえば、それは、より大きなポリヌクレオチド（たとえば、ゲノム配列、ｃＤＮＡ、など）から適切な制限酵素を用いて開裂できる。これは、ヒトおよびマウスのＩＬ−１８Ｒ（たとえば、Ｐａｒｎｅｔ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ および米国特許Ｎｏ．５，７７６，７３１参照）またはヒトおよびマウスのＡｃＰＬ（たとえば、Ｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ参照）の公表された配列に基づいて選択できる。
【００１６】
他の具体例においては、そのような可溶性部分をコードするポリヌクレオチド断片は、より長い鋳型からのＰＣＲ増幅により、上述の様な公表された配列に基づく適切な先駆体を選択することにより生成できる。先駆体の選択、増幅に対する条件、および増幅された断片のクローン化を含む、ＰＣＲ増幅の方法は、通常のものである。たとえば、Ｉｎｎｉｓ， Ｍ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， 編、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａ− ｔｉｏｎｓ， １９９０， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡおよびＷｕ ｅｔ ａｌ．，　編、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，　１９８９， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡを参照せよ。他の具体例において、そのような可溶性部分をコード化するポリヌクレオチド断片は、化学合成によって生成できる。
【００１７】
上述の組替え型の組合せ、または非−組替え型法、あるいは他の通常の方法もまた採用できる。勿論、１またはそれ以上の受容体ドメインに相当するポリヌクレオチド断片は、上述の如く個別に調製でき、かつ当業者に認識されている手順を用いて、「受容体の可溶性部分」に相当するポリヌクレオチドを形成するために、他のドメインをコード化する断片に結合される。
【００１８】
ＩＬ−１８ＲまたはＡｃＰＬの可溶性部分をコード化するポリヌクレオチドは一旦単離されると、種々の調整要素の制御下、種々の発現ベクターの何れかにクローン化される、そうして原核生物、酵母、および哺乳動物、昆虫または植物の細胞を含む宿主とした種々の型の細胞に、または遺伝子組換えをした、ヒトで無い動物中に発現される。好ましい具体例で、発現した可溶性部分は細胞により分泌される；天然または異種の先導配列（シグナルペプチド）を、分泌を促進するために採用できる。
【００１９】
核酸をクローンする方法は、当業界では日常的で通常のものである。本出願に記述されている分子生物学の方法、たとえば、単離、クローン化、修飾、標識付け、操作、配列化、その他核酸および／またはタンパク質を処理または分析すること、を記述している一般的な参照のためには、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９８９）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９９５）． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｎ．Ｙ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ； Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９８６）， Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９８５）， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， ＩＬ Ｐｒｅｓｓ； Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ， Ｎ．Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．； およびＣｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．を見よ。さらに、クローン化および受容体タンパク質の特徴付けに特に重点をおいて開示している他の参照には、たとえば、米国特許Ｎｏ．５，９１９，９０３、Ｎｏ．５，５３６，６５７およびＮｏ．５，７７６，７３１、ＥＰ ８６４ ５８５およびＷＯ ９７／３１０１０が含まれる。
【００２０】
可溶性受容体またはそのサブユニットをコード化する核酸は、また遺伝子組換え種を生成するために、植物または動物（たとえば、マウス種、ウサギ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒトでない霊長類、など）にもクローンできる；そうして遺伝子組換え物から発現された産物は、単離できる。この目的のための遺伝子組換え形生物を生成しおよび利用する方法は、日常的であり、以下に記述されている。たとえば、Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８６） Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ Ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ； Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９， ８６； Ｐａｌｍｉｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９８５） Ｃｅｌｌ ４１， ３４３； Ｋｒａｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９８５） Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅ Ｅａｒｌｙ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｍｂｒｙｏ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ； Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１５， ６８０； Ｐｕｒｃｅｌ ｅｔ ａｌ．， （１９８６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４， １２８１； Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， 米国特許Ｎｏ．５，１７５，３８５；およびＫｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．， 米国特許Ｎｏ．５，１７５，３８４を参照せよ。
【００２１】
本発明の「ＩＬ−１８Ｒ」および「ＡｃＰＬ」受容体およびその可溶性部分は、天然由来または、本発明で定義されている如く、その変化がポリペプチドの通常の機能を本質的に変更しない、意図的に形成された、野生型のヒトまたはマウスの受容体の種々の変形（誘導体）またはその断片を含む。
【００２２】
その様な変形ポリペプチドは、野生型マウスまたはヒトの受容体の匹敵する部分に本質的同一性を示す。本発明で使用されている如く「本質的同一性」または「本質的類似性」という術語は、ポリペプチド（または核酸）が、少なくとも約１０から約１００またはそれ以上のアミノ酸残基またはヌクレオチドの比較窓のいたるところで、参照配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性、または好ましくは少なくとも約９５％の、あるいはより好ましくは参照配列に対して少なくとも約９８％の配列同一性を有する配列を含むことを示す。２つのポリペプチド配列が本質的に同一であるという証拠は、１つのタンパク質が、第２のタンパク質に対して生じた抗体と免疫学的に反応性があることである。２個の核酸配列が本質的に同一である証拠は、第１の核酸がコード化するポリペプチドは、第２の核酸によりコード化されるポリペプチドと免疫学的に交差反応性があることである。
【００２３】
本発明の変形ポリペプチドは、１個以上の天然由来の（たとえば天然の突然変異を通じて）または非天然由来の（たとえば、位置指定の変異誘発によるような意図的な修飾による）修飾、たとえば、保守的なまたは非保守的な何れかの、挿入、削除および／または置換、を有するポリペプチドを含む。「保守的な置換」によりは、Ｇｌｙ、Ａｌａ；　Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ； Ａｓｐ、Ｇｌｕ； Ａｓｎ、Ｇｌｎ； Ｓｅｒ、Ｔｈｒ； Ｌｙｓ、Ａｒｇ； およびＰｈｅ、Ｔｙｒのような組合せによることを意味する。変形は、たとえば同族体、突然変異タンパク質、および模倣体を含むことができる。変換後の修飾を含む多種のタンパク質修飾が含まれる。
【００２４】
変換後修飾は、天然由来または合成的に産生された、他の化学的部分、たとえばグリコシル基、リピド、リン酸塩、アセチル基、などとの共有または凝集的抱合体を、およびまたたとえば、端末アミノ酸の開裂も同様に含む。たとえば、米国特許Ｎｏ．５，９３５，８３５に開示された修飾を参照せよ。本発明は、生物活性に対して本質的でないシステイン残基は、削除されるかまたは他のアミノ酸で置換されているポリペプチドのような変形をも含む。それにより正しくない分子内ジスルフィド架橋の形成；代わりのｍＲＮＡスプライシングで生じる天然由来の変形；および遺伝子多形（たとえば対立変動）を反映する変更型、を防止する。受容体ポリペプチドの「断片」は、切り取られた分子が好ましい生物活性を保持する限り、如何なる長さの、およびポリペプチドの如何なる部分からのものでもあり得る。
【００２５】
本発明の可溶性のヘテロ２量体受容体またはそのサブユニットは、治療目的のためまたは検出のために有益である、ポリペプチドの少なくとも１つに結合するまたは組み込まれる部分を含むことができる。検出可能な部分は、たとえば放射性同位元素、放射性核種、燐光および蛍光体、生物発光標識、などであり得る。
【００２６】
本発明は、また本発明の可溶性ヘテロ２量体受容体のサブユニットに相当する核酸（たとえば融合タンパク質）、または単鎖の可溶性ヘテロ２量体受容体に関する。その様な核酸は、その発現を支配するコード配列および調節配列の両方を含む。そのようなヘテロ２量体受容体（たとえば、マウスもしくはヒトのＩＬ−１８ＲまたはＡｃＰＬ受容体、あるいはペプチドリンカーの可溶性部分）の部分に相当する核酸配列は、相当する野生型分子をコード化する核酸に対して本質的同一性を示す。２個の核酸に「本質的同一性」を与える性質は、上記に定義されている。２個の核酸が本質的な同一性を示すさらなる証拠は、２個の分子が選択された高度にストリンジェントな条件下でお互いに混成することである。
【００２７】
高度にストリンジェントな条件は、配列に依存し、環境パラメーターが異なれば異なる。一般的には、高度にストリンジェントな条件は、定められたイオン強度およびｐＨで、特定の配列に対する熱融解点（Ｔｍ）より約５℃から２０℃低く選択する。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全に合致したプローブに混成する温度（定められたイオン強度およびｐＨ下）である。典型的には、高度にストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ ７で少なくとも約０．２モル濃度、および温度が少なくとも約６０℃の条件であろう。
【００２８】
本発明の核酸は、１以上の天然または非天然由来の修飾、突然変異、多形、などを含むことができる；そして該核酸は、遺伝子コードの変質を反映して、基本組成に関して野生型の対照物とは異なることができる。
種々の通常の、当業者に認識された方法は、可溶性のヘテロ２量体（または多量体）のＩＬ−１８受容体分子を形成するために２個（またはそれ以上）の異なるサブユニットを会合させる（たとえば、共有または非共有で結合する；結びつける；付着する；架橋する；連結する；つなぐ）ために使用できる。可溶性のヘテロ２量体または多量体受容体を生成、精製、および特徴付ける典型的な方法を、下記に開示する。
【００２９】
たとえば、ＷＯ９７／３１０１０； ＷＯ９９／３７７７２； 米国特許Ｎｏ． ５，９１９，９０３； 米国特許Ｎｏ．５，４７０，９５２； Ｃｒｏｚｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｅｕｒ． Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ， Ｆｉｒｓｔ Ｊｏｉｎｔ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＩＣＳ ａｎｄ ＩＳＩＣＲ； およびＡｒｕｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ８， １８６７−７７を見よ。本発明の可溶性ヘテロ２量体を形成するためにサブユニットを会合するために使用できる一般的種類の方法は、たとえば、１）化学的架橋によりサブユニットを結びつける；　２）融合または混成タンパク質生成のためにＩＬ−１８ＲおよびＡｃＰＬの可溶性部分に、ペプチドのような部分を追加する、そうして追加された部分を介して融合または混成タンパク質を連結する； ３）ポリペプチド単鎖を形成するためにＩＬ−１８ＲおよびＡｃＰＬの可溶性部分を連結する、ことを含む。
【００３０】
最初の範疇で、種々の通常の方法のどれでも、２個のポリペプチド鎖を化学的に結びつける（架橋する）ために使用できる。共有結合は、現存する側鎖の直接縮合（たとえば、システイン残基間のジスルフィド結合の形成）または外部架橋分子の組み入れのいずれかにより、達成できる。多くの２価のまたは多価の試薬がポリペプチドを結びつけるのに有益である。
【００３１】
一般に、使用される架橋剤は、たとえばε−アミノ基またはチオール基と反応する２官能基試薬である。これら架橋剤は、２つの範疇に分類できる。すなわち、同質−、および異質−２官能基試薬である。同質２官能基試薬は、たとえば遊離のチオール（たとえば、ジスルフィド結合の還元で生成された）と反応でき、そうしてたとえば、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＮＴＢ）およびｏ−フェニレンジマレイミド（Ｏ−ＰＤＭ）を含むことができる。これらは、そのような遊離のチオールを有する２個のポリペプチド間にチオエーテル結合を形成できる。異質２官能基試薬は、それが第２のポリペプチドと反応できるようにするポリペプチドに、反応基を導入できる。
【００３２】
たとえば、Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）は、遊離チオール基を導入するために１級アミノ基と反応できる。他の化学的架橋剤は、たとえばカルボジイミド、ジイソシアネート、ジアゾベンゼン、ヘキサメチレンジアミン、ジマレイミド、グルタルアルデヒド、４−サクシンイミジル−オキシカルボニル−α−メチルα（２−ピリジルチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）およびＮ−サクシンイミジル−Ｓアセチルチオ酢酸（ＳＡＴＡ）を含む。ポリペプチドをその様な試薬と架橋する操作は、当業者に良く知られている。たとえば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｉｍｍｕｎｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔａｌｏｇ ＆ Ｈａｎｄｂｏｏｋ （１９９１） Ｅ８−Ｅ３９； Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ． （１９８４）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６０， １６８６； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８２， ８６４８； Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ． 米国特許Ｎｏ．４，６７６，９８０（１９８７年６月３０日）およびＢｒｅｎｎｅｎ （１９８６） Ｂｉｏｔｅｃｈ．４， ４２４を参照せよ。
【００３３】
架橋剤の２個の反応基の間のスペーサーアームは、種々の長さと化学的組成を有するだろう。スペーサーアームが長いほど、共役ポリペプチドの柔軟性はよくなる。一方、架橋のある特定の成分（たとえばベンゼン基）は、反応基により大きい安定性を与える、または種々の観点の作用に対して化学結合の耐性を増す（たとえば、還元剤に対するジスルフィド結合の抵抗力）。下記のようなペプチドリンカーまたはリンカーペプチドのようなペプチドスペーサーの使用もまた企てられている。
【００３４】
会合方法の第２の範疇は、注目の受容体の可溶性部分に種々の部分（たとえば、ペプチド、本発明で時々「ペプチドリンカー」または「融合ドメイン」とよばれる）のいずれかを付加するために使用でき、これにより交配種または融合タンパク質を生成する、そうして交配種または融合タンパク質は、付加部分を介して会合される。付加ペプチドを介する可能な会合の多くの型の内の幾つかを、図１Ｂに図示する。
１具体例において、ビオチンおよびアビジン（ストレプトアビジン）のような部分は、通常の方法を用いて、受容体の可溶性部分に複合する、そうしてこれらの部分は２個のサブユニットを会合するために相互に作用する。
【００３５】
好ましい具体例において、付加された部分は、ペプチド（「ペプチドリンカー」）である。使用される広汎なペプチドプリンカーの中に、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）融合タンパク質、またはその２量化モチーフ；ＰＤＺ２量化ドメイン；ＦＫ−５０６ ＢＰ （結合タンパク質） またはその２量化モチーフ；ｐ５３の天然または人工の螺旋−回転−螺旋２量化ドメイン、およびタンパク質Ａまたはその２量化ドメイン、ドメインＢ、がある。
最も好ましい具体例において、付加ペプチドは、ロイシンジッパーの成分である。ロイシンジッパー部分は、しばしばヒトの転写因子ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓから取られる。例５は、ヘテロ２量体ｓＩＬ−１８Ｒを生成するためのロイシンジッパーの使用を示している。
【００３６】
他の最も好ましい具体例において、付加ペプチドは、免疫グロブリン、たとえば、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、または好ましくはＩｇＧ、の部分である。たとえば、１個の可溶性受容体部分に、重鎖の定常部領域を含むペプチド、またはその断片を付加し、そうして他の受容体部分に、軽鎖の相当する定常部領域、またはその断片を付加する。好ましくはこの時に、ヒンジ領域からのチオール含有アミノ酸が存在する。このように、２個の付加部分は、抗体鎖の夫々に付加した可溶性受容体部分を持つＦａｂ断片に似た分子を生成するために、たとえばジスルフィド結合を介してお互いに結合できる。
【００３７】
他の具体例において、付加部分は、免疫グロブリン重鎖の部分（たとえば定常部領域のＣＨ２部分および／またはＣＨ３部分を含む）である。この重鎖は、２量化重鎖に通常責任のあるジスルフィド結合を介して会合でき、それにより各抗体鎖に付加した可溶性受容体部分と共にＦｃ断片に類似した分子を形成する。例６は、ヘテロ２量体のｓＩＬ−１８Ｒを生成するために付加されたＩｇＧ断片を含む受容体サブユニットの使用を説明している。
【００３８】
勿論、２個のサブユニットは、如何なる相対的順番または配位で配置した、上述の部分の如何なる組合せ、たとえば、ロイシンジッパー部分および免疫グロブリンドメインの連結配置、を介しても会合できる。
本発明の「ペプチドリンカー」は、「ＩＬ−１８Ｒ」および「ＡｃＰＬ」受容体に関して、上述の如何なる型の断片または「変形」をも含む。
【００３９】
ペプチドリンカーは、２個のサブユニットがお互いの活動を、たとえば立体障害により干渉することを防止し、また適度なタンパク質折り畳みをするために適度の柔軟性を与えるべきである；しかしながら、２個のサブユニットが、好ましくは高い親和性でＩＬ−１８に結合するための適切な空間配置を取るために、必要に応じてお互いに干渉できるようにすべきである。それ故、たとえばさらに別の「第２のリンカー部分」または「ヒンジ部分」に付加することにより、その長さ、アミノ酸組成、および／または構造を変えることによりペプチドリンカーを修飾することが望ましいだろう。
【００４０】
多種の第２のリンカー部分の中には、たとえば、小さな、好ましくは中性および極性または非極性の、種々の長さおよび組合せで、たとえばグリシン、セリン、スレオニンまたはアラニンのようなアミノ酸の索；ポリリジン；などがある。代わりに、複数のリンカーおよび／または第２のリンカー部分が使用できる。柔軟なヒンジ領域、たとえば、例として、ヒトのＩｇＧのヒンジ領域、またはある間隔でセリンもしくはスレオニンにより遮られたポリグリシン反復を使用することが時には望ましい。
【００４１】
ペプチドリンカーの長さと組成は、可溶性受容体の望ましい性質、たとえばＩＬ−１８に結合するその能力、を最適化するために、当業界の熟練者により容易に選択できる。ＩＬ−１８への結合の通常の測定法を、下記に述べる。たとえば、例４およびＴｈｏｍａｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）． Ｊ． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．１８， １０７７−１０８８ （ＢＩＡコアチップについたヘテロ２量体に結合したＩＬ−１８）；Ｔｏｒｉｇｏｅ ｅｔ ａｌ． （１９９７）． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２， ２５７３７−２５７４２（細胞に結合したＩ１２５−ＩＬ−１８）； Ｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ． （２０００）． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６４， ３２４６−３２５４（Ｉ１２５−ＩＬ−１８のヘテロ２量体への結合と引き続くプロテインＡへの固定化）；Ｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３， ２９４４５− ２９４５０ （ＩＬ−１８誘発ＮＦ−κＢレポーター遺伝子活性化の阻害）； Ｎｏｖｉｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０， １２７−１３６（ＩＬ−１８誘発ＩＦＮ−γ産生の阻害（これはまた動物で測定できる））； およびＷＯ９７／３１０１０（ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは動物のいずれかで、プロスタグランジンＥ２合成の阻害を測定する間接的測定法）である。
【００４２】
ペプチドリンカーは、当業界で通常の技術の一つ、たとえば、上述の化学的共役（必要ならば、適切なアミノ酸基の誘導体化後）；ビオチン／アビジン相互作用を介する付加；当業界で認識されている方法によりペプチドの共有結合（たとえば適切な酵素を使用）；組換え方法；またはそれらの組合せ、に明らかである種々の方法により、交配種または融合分子を形成するために受容体の可溶性部分に付加できる。本発明の「交配」タンパク質は、受容体の可溶性部分を含む部分およびリンカーペプチドを含む部分が、ペプチド連結以外の連結を介して（たとえば、化学共役によりまたはビオチン／アビジン相互作用を介して）連結しているタンパク質である。本発明の「融合」タンパク質は、その様な部分が、好ましくは組換え操作により達成されるペプチド結合により連結されているタンパク質である。
【００４３】
組換え型融合タンパク質を作る方法は、通常のものであり、以下に記述されている。たとえば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ． （１９９１） ＰＮＡＳ ８８， １０５３５； Ｂｙｒｎ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｎａｔｕｒｅ ３４４， ６７７； Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．（１９９２）“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｓｕｐｐｌ． ４， ｐｐ． １０．１９．１ ｔｏ １０．１９．１１； ＷＯ９３／１０１５１； および米国特許Ｎｏ．５，４５７，０３５である。典型的な方法を、例５および６に示す。各融合タンパク質は、１個の発現ベクターに独立に発現されるか、または２またはそれ以上の融合タンパク質が同じ発現ベクターに発現される。一般的に、融合タンパク質には、形質移入体（形質転換体）の選択を容易にするために、選択可能な標識で印しを付ける。
【００４４】
可溶性受容体部分は、２個のサブユニットが会合する際に、１個または両方のサブユニットが望ましい生物活性を示す能力に該連結が干渉しないなら、可溶性受容体部分がそのＮ−末端またはＣ−末端のいずれかを介して連結するように、各サブユニットに配置できる。好ましい具体例において、２個の可溶性受容体部分は、Ｎ−末端領域内に在る分子の「作動部分」への物理的制約を最小にするために、そのＣ−端末を介して連結する。配位の幾つかの可能な型を、図１Ｂに示す。
【００４５】
上述の如く形成された交配または融合分子の対は、非共有または共有結合により付加した部分を介してお互いに会合できる。非共有結合は、たとえば、ロイシンジッパー、ビオチン／アビジン相互作用、水素結合、ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ力、疎水性相互作用、などを含む。可能な共有結合には、たとえば、天然に生成するジスルフィド結合（たとえば、修飾されたＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片の形成）、または上述の如く化学的架橋反応により形成される結合がある。付加は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（たとえば、試験管内で）または細胞内で起こりえる。
【００４６】
好ましい具体例において、付加は細胞内で起こる。夫々が２個の異なる融合タンパク質のうちの１個をコード化している。２個の離れたキメラポリヌクレオチドは、同じ宿主細胞内に形質移入され、そうして共発現される。その様に産生された融合ポリペプチドは、細胞内または分泌中にお互いに連結すると信じられている。それらは、細胞溶解物から精製され、または好ましくは、細胞から分泌され、そうして培養培地から精製される。たとえば、例５および６を参照せよ。２個の融合タンパク質は、同一の発現ベクターまたは２個の異なる発現ベクターのいずれかから発現できる。
【００４７】
もし望ましければ、細胞内で産生される２個の組替え型融合タンパク質の相対的な量は、たとえば、異なる強度の促進因子からそれらを発現することにより規制できる。たとえば、もしサブユニットＡの付加ペプチドが高周波数でホモ２量体を生じ、一方サブユニットＢの付加ペプチドが低周波数でホモ２量体を生じるならば、サブユニットＢをサブユニットＡよりも遥かに高い水準で発現させることにより、望ましいヘテロ２量体の形成を促すことができる。最適な相対的な量は、日常的な実験で経験的に決定できる。
【００４８】
本発明はまた、上述の如く融合タンパク質をコード化するキメラポリヌクレオチド、その様な融合タンパク質を発現する宿主細胞、および該融合タンパク質が発現しタンパク質を収穫（回収）するような条件下でその様な細胞を培養することを含むその様な融合タンパク質を作る方法にも関する。本発明の融合タンパク質は、上述の様にキメラポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ変換によっても作れる。本発明はまた、本発明の新規交配または融合タンパク質と免疫反応する抗体（たとえば、モノクローナル抗体）にも関する。
【００４９】
会合方法の第３の範疇では、組替え型技術は、単鎖のポリペプチド分子を形成するために、枠組みの中で、２個の受容体の夫々の可溶性部分を連結するために用いられる。図１Ｃは、幾つかの可能な組合せを図示している。好ましくは、受容体部分は、ある長さまたはアミノ酸組成、最も好ましくは柔軟なループ構造のリンカーペプチドによりお互いから離れており、これにより２個の受容体部分は、最適な相互作用のためにお互いから適切な距離および適当な配置にある。
【００５０】
典型的なリンカーペプチドは、小さな、好ましくは中性の、および極性または非極性何れかの、種々の長さおよび組合せで、たとえば、グリシン、セリン、スレオニンまたはアラニンのようなアミノ酸の索；ポリリジン；などである。リンカーペプチドは少なくとも１個のアミノ酸をもつことができるし、５００またはそれより多いアミノ酸を有するだろう。好ましくは、リンカーは約１００個より少ないアミノ酸、最も好ましくは約１０個から３０個のアミノ酸である。ヒトのＩｇＧのヒンジ領域またはある間隔でセリンもしくはスレオニンにより遮られたポリグリシン反復のような柔軟なリンカードメインは、単独でまたは他の部分との組合せで使用できる。
【００５１】
その様な直線的な単鎖のヘテロ２量体受容体を生成するために使用できる組替え体方法は、通常のものである。さらに、２個の可溶性受容体部分が、可溶性のヘテロ２量体受容体の最適機能を発揮させる距離および配置で並ぶように、定例的な操作でリンカーペプチドを選択しパラメーターを最適化できる。米国特許Ｎｏ．４，９３５，２３３およびＮｏ．４，７５１，１８０を参照せよ。
【００５２】
本発明はまた、上述の如き単鎖のヘテロ２量体の可溶性受容体分子をコード化するキメラポリヌクレオチド；その様なタンパク質を発現する宿主細胞；タンパク質が発現する条件下でそのような細胞を培養し収穫（回収）することを含むその様なタンパク質をつくること；およびその様な新規の単鎖ポリペプチドと免疫反応的な抗体（たとえば、モノクローナル抗体）にも関する。本発明の単鎖ヘテロ２量体可溶性受容体はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのその様なキメラポリヌクレオチドの変換により作られる。
【００５３】
上述の如きヘテロ２量体受容体に加えて、可溶性ＩＬ−１８受容体は、如何なる組合せ（たとえば、ＩＬ−１８Ｒの２個の複製およびＡｃＰＬの１個の複製；ＩＬ−１８ＲおよびＡｃＰＬ夫々２個の複製；ＩＬ−１８ＲおよびＡｃＰＬ夫々の３または４個の複製、など）においても、３個以上の受容体サブユニットを連結するために、上記方法の何れか１つを外挿するかまたはそれらの組合せによって、作る事ができる。幾つかの可能な変形を、図１Ｄに要約してある。
好ましくは、可溶性２量体受容体は、「単離される」、たとえば、天然に起こる以外の形で、たとえば、緩衝液で、キットまたは医薬品成分の一部として、再調製を待つ乾燥形で、などである。
【００５４】
種々の通常の方法は、本発明の可溶性受容体を単離および／または精製するために使用できる。望ましい精製度は、タンパク質の意図した用途に依存するだろう。たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＩＬ−１８結合研究は、時によると１個以上の受容体サブユニットをコード化するベクターで形質移入された細胞からの上澄み液を使って実施される。典型的に、受容体は、本質的に精製される。ここで使用される術語「本質的に精製される」は、本質的に汚染内生物質、たとえば、例として他のタンパク質、リピド、炭水化物、核酸およびそれが天然に会合している他の生物物質、を含まない受容体に関する。たとえば、本質的に純粋な分子は、少なくとも、関心事の分子の、重量で、約６０％、好ましくは約７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％である。
【００５５】
本発明の可溶性受容体および／またはそのサブユニットは、可溶性タンパク質（好ましくは培養液中に分泌されたあとで）として、またはそれらは、たとえば、８Ｍのグアニジニウム塩酸塩および透析によりそれらから定量的に抽出される、封入体としてのいずれかで、細胞から回収できる。使用できる通常の精製方法は、たとえば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、および／またはゲル濾過を含む。好ましい具体例において、親和性クロマトグラフィーは、たとえば、ＩＬ−１８または他の適切な配位子；適切なレクチン、たとえば、例として小麦胚芽凝集素；ある種の可溶性受容体に存在するＦｃ部分に結合できるプロテインＡまたはプロテインＧ；またはＩＬ−１８Ｒおよび／またはＡｃＰＬに対し特異的な抗体を含むカラムで使用される。
【００５６】
ことに好ましい具体例において、各受容体は、適切な親和性カラムに結合できる部分、好ましくは開裂可能なもの、で「標識付け」される。たとえば、１個または両方のサブユニットは、金属キレートクロマトグラフィーによる迅速な精製が出来るように、ポリＨｉｓ（たとえば、Ｈｉｓ６）；ストレプトアビジンに結合しイミノビオチンで溶出できるＳｔｒｅｐ−標識；アミロースに結合し、マルトースで溶出できるマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）；または親和性クロマトグラフィーにより分離できる他のその様な部分で、標識付けられる。代わりに、１または両方のサブユニットを抗体があるエピトープ、たとえば、ＦＬＡＧ（商標）ペプチド、Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ， ＣＴより入手可能）で標識付けできる。
【００５７】
他のその様な抗原識別子は米国特許Ｎｏ．５，０１１，９１２およびＨｏｐｐ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６， １２０４に述べられている（その様なエピトープの付加により、たとえば、選択的免疫沈降反応、ウエスタンブロットでの検出、またはバイオアッセイにおける活性減耗／阻害ができる）。親和性標識を使用する典型的方法については、たとえば、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｙ Ｓ． Ｔｕａｎ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ６３， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， １９９７ならびに例５および６を見よ。上述の標識付け法の何れの組合せも勿論使用できる。
【００５８】
もし２量体受容体の調製方法が、ヘテロ２量体のみならずホモ２量体の形成をもたらすなら、好ましいヘテロ２量体は、２つの型の間の差別化を許す種々の操作の何れか、たとえば、クロマトグラフィー技術、または調製用、非変性アクリルアミドゲルからの受動的溶出、によりホモ２量体から分離できる。最も好ましい具体例において、夫々のサブユニットは異なる標識をつけられ、二重に標識を付けられた２量体の可溶性受容体は、標識を１個だけ付けたホモ２量体から、親和クロマトグラフィーにより分離される。例５および６を参照せよ。
受容体の純度は、たとえば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、およびアミノ端末アミノ酸配列解析を含む標準的方法を用いて測定できる。
【００５９】
本発明はまた、その過剰なまたは不適切な量を含み、および／またはＩＬ−１８受容体を処理する細胞の過剰なまたは不適切な活性を持つ、ＩＬ−１８の発現に関連した状態（たとえば、病理学的条件）を治療または防止する方法にも関するものであって、その様な治療を必要とする患者への上述の如く有効量の可溶性、ヘテロ２量体ＩＬ−１８受容体の投与を含むものである。如何なる機構にも束縛されることを望むものではないが、本発明の可溶性、ヘテロ２量体ＩＬ−１８受容体は、ＩＬ−１８に結合することにより、かくしてそれを機能的に不活性化し、および／または天然の受容体への内生ＩＬ−１８の結合を競うことにより、ＩＬ−１８拮抗薬として働くだろうことが示唆される。
【００６０】
あるいは、また如何なる機構にも束縛されることを望むものではないが、本発明の可溶性、ヘテロ２量体ＩＬ−１８受容体は、たとえば、身体の特定の場所にＩＬ−１８を隔離するための「流し」として働くことにより、それによりそれらの場所でのＩＬ−１８の有効濃度を増加することにより、ＩＬ−１８作動薬として働くだろう。
【００６１】
ＩＬ−１８の活性は、たとえば、天然キラー（ＮＫ）細胞の細胞毒性の誘発；細胞溶解性Ｔ細胞反応の促進；活性化ＴおよびＮＫ細胞の増殖の刺激；休息および活性化ＴおよびＮＫ細胞によるＩＦＮ−γの誘発を含む、多数のサイトカインの規制（刺激または抑制）；Ｔｈ−１−型ヘルパー細胞応答の促進；および破骨細胞増殖の阻害を含む。本発明の可溶性ＩＬ−１８受容体と接触することによりＩＬ−１８を妨害したり修飾したりすることは、これらの、または他の、ＩＬ−１８により仲介される活性のいずれをも調整することができ、そうして直接的または間接的に、ＩＬ−１８により仲介される状態または疾患を改善するために使用できる。ＩＬ−１８が疾患を（直接的にまたは間接的に）引き起こしたり、または憎悪したりする時に、疾患はＩＬ−１８により仲介されるといえる。
【００６２】
本発明の可溶性２量体受容体を、それを必要とする患者に投与することにより治療または予防できる多くのＩＬ−１８関連の状態には、種々の炎症状態（例えば、慢性炎症）、免疫疾患（たとえば、自己免疫性またはアロ抗原誘発の）およびアレルギー疾患がある。治療または予防できる状態には、たとえば、エンドトキシン血症に関わる肝毒症、敗血症性ショック、ならびに多発性硬化症、リューマチ性関節炎、Ｃｒｏｈｎ病、狼そう腎炎、乾癬、喘息、悪性貧血、萎縮性胃炎、Ｗｅｇｅｎｅｒ肉芽腫症、円盤状紅斑性狼瘡、潰瘍性大腸炎、炎症性大腸疾患、甲状腺機能高進症、自己免疫溶血性貧血、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡、Ａｄｄｉｓｏｎ病、Ｈｏｄｇｋｉｎ病、種々の白血病（たとえば、ＡＬＬ、ＣＬＬ、ＡＭＬ、およびＣＭＬを含む）、ＨＩＶ感染症、過剰のＩＦＮ−γの産生または投与から生じる敗血症性ショック、インスリン耐性および若年型糖尿病、アトピー性皮膚炎、および急性または慢性移植拒絶（たとえば、移植臓器対個体反応疾患）を含む自己免疫性脱髄疾患がある。
【００６３】
当業界の技術の１つで、本発明の可溶性２量体受容体の活性を、種々の適切なｉｎ ｖｉｔｒｏもしくは細胞培養分析法のいずれかで、または動物モデルで、測定可能である。たとえば、その様な受容体が拮抗薬または作動薬として働いているかを決定でき、および活性の量を定量できる。幾つかのその様な分析法がここに議論されている。他のｉｎ ｖｉｔｒｏ法は、たとえば、移植臓器対個体反応疾患を評価する系（たとえば、例としてＦａｎｓｌｏｗ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８， ７３９−７４１を見よ）およびたとえば多発性硬化症のような自己免疫脱髄疾患に対する動物モデル（たとえば、ＥＡＥモデル）を含む。
【００６４】
ＭＳの動物モデルの記述のためには、たとえば、Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ． （２０００）． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． Ｔｏｄａｙ ６， ８８−９１ およびＳｗａｎｂｏｒｇ （１９９５）． Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ． ７７， ４−１３を見よ。可溶性受容体を試験するためにＥＡＥ動物モデルを用いる幾つかの方法の記述のためには、たとえば、Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ． （１９９１）． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４６， ２９８３−２９８９ およびＳｅｌｍａｊ ｅｔ ａｌ． （１９９５）． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ． ５６， １３５−１４１を見よ。またＤｉｎａｒｅｌｌｏ （１９９９） Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０３， １１−２４も見よ。
【００６５】
本発明の可溶性受容体は、他の匹敵する治療薬に対して記述されているような、通常の用量および投与法を用いて投与できる。
投与用量は、当業界の熟練者に知られている通常の手順で測定できる。たとえば、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ， 編、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを見よ。一般に、有効用量は、望ましい効果、たとえば、天然の受容体への内生のＩＬ−１８の結合を阻害するに十分な量である。
【００６６】
用量は、副作用、たとえば、望ましからぬ交差反応、アナフィラキシー反応、など、を生じる程多すぎてはいけない。考慮すべき因子は、含まれる特定の薬剤の活性、薬剤の代謝安定性および作用時間、投与の方法および時間、薬剤の組合せ、排泄速度、治療されている種、年齢、体重、一般的健康、性別、食事、および治療下の宿主の特定の疾患状態の重度を含む。たとえば、本発明の受容体に対する適切な治療の処方計画は、約１ ｎｇ／ｋｇ／日と約 １０ ｍｇ／ｋｇ／日の間の用量を患者に投与することを含む。
【００６７】
適切な投与方法は、非経口および非経口以外の投与を含む。非経口経路は、たとえば、静脈内、動脈内、門脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、髄空内、くも膜下、脳室内、頭蓋内、胸膜内または他の注射経路を含む。非経口以外の投与経路は、たとえば、経口、経鼻、経皮、経肺、直腸内、舌下、経膣、眼を含む。投与はまた、連続的輸液、局部投与、埋め込み（ゲル、膜、など）からの徐放、および／または静脈注射によるだろう。
【００６８】
種々の方法の投与に有益な医薬品組成のための、賦形剤、希釈剤および／または担体を含む処方成分は、当業界で通常のものであり、たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９０に記述されている。受容体を、たとえば、薬理的に受容できる液体、固体、または半固体担体で、担体または標的分子（たとえば、抗体、ホルモン、成長因子、など）に連結して、処方することができ、および／またはｉｎ ｖｉｖｏでの投与前に、リポソーム、マイクロカプセルまたは徐放調製品（ヘテロ２量体受容体を発現する細胞を含む）内に取り込むことができる。
【００６９】
本発明はまた、ＩＬ−１８分子を検出する方法（たとえば、実験的または診断的方法）に関するものであって、ＩＬ−１８分子を含む試料を、標識付けられている請求項１の可溶性、ヘテロ２量体ＩＬ−１８受容体分子と接触させることを含むものである。通常の部分の受容体を、たとえば放射性または蛍光性物質で標識付けし、そうして標識を検知するために使用できる。その様な分析法は、勿論定量的にできる。１具体例において、その様な分析法は、関心事の薬剤が、受容体（たとえば、ヒトまたはマウスの細胞；試験管内で、培養液内で、または動物内で）に結合するために入手できるＩＬ−１８の量を細胞内で、増加したり減少したりすることを、および／または、それがＩＬ−１８の生物活性（たとえば、可溶性受容体に結合する）を調節する（阻害または促進する）ことを、測定するために使用される。幾つかの具体例においては、交差種試薬、たとえば、ヒトのＩＬ−１８に結合するマウス受容体、が使用できる。
【００７０】
本発明の分析法は、たとえば、試薬の実験的性格付けのため、有望な治療薬の選別のため、体液中のＩＬ−１８の水準により示せる疾患の診断のため、または治療の効果を監視するため、に使用できる。
本発明の種々の他の特色および付随する長所は、本発明を付図に関連して考慮するとより良く理解できるので、より完全に認められるであろう：
【００７１】
さらなる詳細説明なしに、当業者は、前記の記述を用いて、本発明を極限まで利用できる。前記の好ましい特定の具体例は、従って、単に例示的あって、如何なる風にも開示の残余を限定するものではないと解釈すべきである。
前記のおよび下記の例において、全ての温度は摂氏度（℃）で補正をせずに示され；そうでないと示さない限り、全ての割合と百分率は重量による。
上記または下記で引用した、および図面中の全ての特許出願、特許および出版物の全開示は、ここに参照により組み入れられている。
【００７２】
例
１．　ヒトおよびマウスのＩＬ−１８受容体のクローニング
ヒトおよびマウスのＩＬ−１８受容体は、逆転写−合成酵素連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりクローンされ得る。たとえば、マウス受容体サブユニットＩＬ−１８Ｒ（受け入れ番号Ｕ４３６７３）およびＡｃＰＬ（受け入れ番号ＡＦ０７７３４７）は、以下の様にクローンされる。すなわち、全ＲＮＡは、ＡＫＲ／Ｊマウスから誘導される、マウスＴ細胞クローンＤｏｒｒｉｓから調製される。ＲＴは、オリゴ−ｄＴ先駆体を用いるＣｌｏｎｔｅｃｈ社製“Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＲＴ−ｆｏｒ−ＰＣＲ ｋｉｔ”を使用し、実施される。そうして引き続くＰＣＲは、２個のサブユニットのコード配列の５’および３’端末に相当する先駆体を用いて実施される。完全長ｃＤＮＡは、５’および３’先駆体中に改変された制限酵素部位を介して、真核細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）ＭＹＣＨＩＳＢまたは ｐｃＤＮＡ３．１（−）ＰＵＲ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローンされる。マウスのＩＬ−１８ＲおよびＡｃＰＬのｃＤＮＡの配列は確認される。
【００７３】
２．ｍＩＬ−１８Ｒを発現する安定な細胞株の形成
ヒト胚性腎臓線維芽細胞株２９３は、マウスのＩＬ−１８に応答しない。図１Ａは、２９３細胞中のマウスＩＬ−１８（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）への応答能が、マウスのＩＬ−１８ＲおよびＡｃＰＬの発現ベクター両方の過渡的形質移入後に、最適であることを示す。２９３細胞は、示した如く、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＩＬ−１８ＲおよびＡｃＰＬ発現ベクターと共に、ＮＦ−κＢ依存ルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で共−形質移入される。形質移入の２４時間後、細胞は、さらに４時間ＩＬ−１８に暴露される。ＩＬ−１８誘発ＮＦ−κＢは、細胞溶解質中でルシフェラーゼ活性により測定される。
【００７４】
安定な、ネオマイシン耐性２９３クローンは、α−Ｍｙｃ抗体を用いるウエスタンブロット法により測定される如く、組換え型タンパク質でＣ−端末Ｍｙｃ標識を認識する、完全長マウスＩＬ−１８Ｒを発現することを立証される。図１Ｂは、このクローンでのＩＬ−１８応答能がマウスＡｃＰＬの過渡的形質移入を必要とすることを示す。マウスＩＬ−１８ＲおよびＡｃＰＬ両方を発現する、安定なネオマイシン−およびプロマイシン−耐性２９３クローンが、生成される。
【００７５】
３．ＩＬ−１８結合研究
ＩＬ−１８ＲおよびＡｃＰＬ両方を発現する２９３細胞の安定なクローンを、融合まで６孔プレートで培養する。細胞をＰＢＳで１回洗浄する。細胞を、０．５ ｍＬ ＰＢＳ中、室温で１５分間、１００，０００ ｃｐｍ（〜１０ ｎＭ）のＩ１２５−ＩＬ−１８（Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ）とインキュベートする。そうして、全結合を測定する。非特定結合を、インキュベーション中に１μＭの冷ＩＬ−１８を含むことにより測定する。細胞抽出物を１０％のＳＤＳ中で溶解により調製する。遊離ＩＬ−１８は、結合ＩＬ−１８を鉱油を通して旋回させて分離する。結合ＩＬ−１８の量は、シンチレーションカウンターで直接計数して測定する。
高い親和性ＩＬ−１８受容体がＩＬ−１８ＲおよびＡｃＰＬサブユニットを含むことを示す、重要な特定結合が観測できる。
【００７６】
【表１】
2004512026.tif 000003
【００７７】
４． ＩＬ−１８結合および／または活性を測定するｉｎ ｖｉｔｒｏ分析法
（Ａ）ＮＦ−κＢ形成
マウスの胸腺腫株ＥＬ４で、ＩＬ−１８は同種の受容体に結合し、転写因子ＮＦ−κＢの迅速形成をもたらす。ＮＦ−κＢは、電子移動度位相分析法（ＥＭＳＡ）により核抽出物中に検出できる。ＩＬ−１８結合の阻害は、細胞刺激前にα−ＩＬ−１８抗体または可溶性ＩＬ−１８受容体と共にタンパク質のインキュベーションをすることにより測定できる。
【００７８】
たとえば、マウスＩＬ−１８は、ＰＢＳ、Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅ社製ウサギα−マウスＩＬ−１８ポリクロナール抗体、対照ウサギ血清ＩｇＧ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ 社製ラットα−マウスＩＬ−１８モノクローナル抗体、対照ラットＩｇＧ２ａ、またはホモ２量体ＩＬ−１８Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質の何れかと前混合する。３７℃で２時間のインキュベーション後、混合物はＥＬ−４細胞を刺激するために使用される。ＩＬ−１８の最終濃度は５０ ｎｇ／ｍＬである。３０分後、細胞は収穫され、核抽出物が調製される。ＥＭＳＡは、ＮＦκＢコンセンサスプローブ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いて実施される。
【００７９】
（Ｂ） ＮＦ−κＢ依存ルシフェラーゼ活性
図２Ａおよび２Ｂは、ＩＬ−１８がマウスＩＬ−１８およびＡｃＰＬ両方を過渡的または安定的に発現する２９３細胞にルシフェラーゼ活性を誘発することを示す。２９３細胞は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を促すコンセンサスＮＦ−κＢ結合部位の３個の複製を含むベクターで形質移入される。マウスＩＬ−１８は、ＮＦ−κＢの形成を誘発する。これは次にルシフェラーゼ遺伝子を促すプロモーターを活性化する。ルシフェラーゼ活性の阻害は、可溶性ＩＬ−１８受容体の機能的証明である。
【００８０】
（Ｃ）ＩＦＮ−γ解放分析法
マウスのＴｈ１クローンＡｅ７は、図３に示した如く、標準ＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）により測定可能な、ＩＦＮ−γの意味のある量を分泌するためにマウスのＩＬ−１２およびＩＬ−１８に相乗的に応答する。ＩＬ−１８の等モルのα−ＩＬ−１８との前インキュベーションは、ＩｇＧを制御するものではないが、ＩＦＮ−γ分泌を阻害する。分析法は、可溶性ＩＬ−１８受容体がＩＦＮ−γ産生を阻害する能力を試験するために使用できる。
【００８１】
図３に示す例において、Ａｅ７細胞を、抗原で刺激してから７日間静置し、次いで９６孔のプレートに５ ｘ １０５ 細胞／ｍＬで置く。ＩＬ−１２（５ ｐＭ）またはＩＬ−１８（１００ ｐＭ）を加える。ラットα−マウスＩＬ−１８モノクローナル抗体または複基準標本に合わせたラットＩｇＧ２ａを、培地に加える前に、３７℃で２時間、ＩＬ−１８（等モル）と前インキュベートする。４８時間後、培養培地中のＩＦＮ−γの量を、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ ＩＦＮ−γ Ｃｙｔｏｓｃｒｅｅｎ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔを用いて測定する。
【００８２】
（Ｄ）免疫沈降法
α−ＩＬ−１８または可溶性ＩＬ−１８受容体のＩＬ−１８への直接結合は、共−免疫沈降実験により測定できる。たとえば、α−Ｆｃ抗体を用いて、ＩＬ−１８をα−ＩＬ−１８または可溶性ＩＬ−１８受容体のＦｃ−融合版の何れかと共沈できる。ＩＬ−１８をウエスタンブロット法で検出できる。この方法で、ＩＬ−１８と可溶性ＩＬ−１８受容体の間の相互作用を定量的に測定する。
【００８３】
たとえば、ＲＤＩラットα−マウスＩＬ−１８モノクローナル抗体またはラットＩｇＧ２ａ複基準制御参照抗体を、４℃で１時間、３０μＬの（５０％ ｖ／ｖ）タンパク質Ａ／Ｇアガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）と混合する。ビーズを冷ＰＢＳで３回洗浄し、１Ｍ ＮａＣｌを含む０．５ ｍＬ　ＰＢＳに再懸濁する。マウスＩＬ−１８（１０ ｎｇ）を加え、混合物を４℃で１時間インキュベートする。ビーズを洗浄し、免疫沈降したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより溶解する。ウエスタンブロット法を、Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅ ウサギα−マウスＩＬ−１８ポリクロナール抗体を用いて実施する。
【００８４】
（Ｅ）ＢＩＡコア
Ｔｈｏｍａｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｉｆｎ． Ｃｙｓ． Ｒｅｓ． １８： １０７７−１０８８に叙述された如く、ＢＩＡコア分析法により、ＩＬ−１８および可溶性ＩＬ−１８受容体の間の相互作用の定量的測定をする。
【００８５】
５． 可溶性ＩＬ−１８受容体−ロイシンジッパーヘテロ２量体
「ＰＣＲ縫製」を、キメラマウスのＩＬ−１８受容体タンパク質をコード化するＤＮＡ配列を生成するために使用する。たとえば、マウスのＩＬ−１８Ｒ（ＡＡ１−３１４）の細胞外領域を、ヒトｃ−ＦＯＳタンパク質のロイシンジッパー（ＬＺ）領域（ＡＡ１６１−１９９）に融合する。マウスのＡｃＰＬ（ＡＡ２０−３４４）の細胞外領域を、ヒトｃ−ＪＵＮタンパク質のＬＺ領域（ＡＡ２７７−３１５）に融合し、ｐ−ＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１（Ｓｉｇｍａ社）に挿入する。したがって、この融合タンパク質は、Ｎ−末端ＦＬＡＧ標識を含む。ＩＬ−１８Ｒ−ＬＺｆおよびＡｃＰＬ−ＬＺｊキメラタンパク質をコード化する発現ベクターを、２９３細胞に過渡的に形質移入する。細胞抽出物は、４８時間後に調製しＦＯＳ−ＪＵＮヘテロ２量体は、α−ＦＬＡＧ抗体カラムを使って精製する。ＬＺヘテロ２量体中のマウスＩＬ−１８ＲおよびＡｃＰＬ両方の存在を、ウエスタンブロット法により確認する。
【００８６】
ヒトの２９３細胞を、ＦＬＡＧ−ＡｃＰＬ−ＬＺｊｕｎ、ＩＬ−１８Ｒ−Ｌｚｆｏｓ、またはＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて両方で、過渡的に形質移入する。細胞抽出物を調整し、タンパク質試料（５μＬ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより溶解する。ＦＯＳ−ＪＵＮヘテロ２量体は、α−ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）により２重形質移入抽出物から免疫沈澱し、ＦＬＡＧペプチド（Ｓｉｇｍａ）により溶出する。精製ヘテロ２量体の試料（５μＬ）もまた同じゲル中に溶解する。ウエスタン移動後、ブロットを、α−ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ）またはα−ＦＯＳ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）抗体のいずれかで精査する。
【００８７】
６．可溶性ＩＬ−１８受容体−Ｆｃヘテロ２量体
例５に述べた如く、マウスのＩＬ−１８ＲおよびＡｃＰＬの細胞外領域を、マウス免疫グロブリン（亜種）Ｆｃ（ＣＨ１とＣＨ２の間のヒンジ域、ＡＡ２２１から出発する）に融合し、かん状ウイルスの発現ベクターに挿入する。組換え型かん状ウイルスを生成し、融合タンパク質をＳｆ９昆虫細胞に共発現する。２量体ＩＬ−１８受容体をα−Ｆｃおよびα−ＦＬＡＧ抗体カラムを用いて精製する。精製タンパク質調製品は、ＡｃＰＬホモ２量体およびＩＬ−１８Ｒ／ＡｃＰＬヘテロ２量体の集団からなる。細胞を、ＡｃＰＬ発現ウイルスに比べて３倍多いＩＬ−１８Ｒ発現ウイルスで感染することにより、ヘテロ２量体の収率を促進できる。可溶性ＩＬ−１８受容体Ｆｃヘテロ２量体の存在を、ウエスタンブロット法により確認する。
【００８８】
Ｓｆ２１細胞を、ＩＬ−１８Ｒ−Ｆｃ、ＦＬＡＧ−ＡｃＰＬ−Ｆｃ、またはモル比〜３：１の両方で、感染する。２重感染物からの上澄み液を４８時間後に収穫し、α−ＦＬＡＧ抗体カラム（Ｓｉｇｍａ）を通して処理する。上澄み液試料、カラム通過液、カラム洗浄液、および溶出液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより溶解する。ウエスタンブロット法を、α−マウスＦｃ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて実施する。未変性の溶出液試料もまたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより溶解する。
【００８９】
７．　ＩＬ−１８受容体ヘテロ２量体を試験するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ分析法およびｉｎ ｖｉｖｏモデル
（Ａ）Ｉｎ ｖｉｔｒｏ。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでＩＬ−１８を阻害する可溶性ＩＬ−１８受容体ヘテロ２量体の能力を試験するための分析法は、上記の例２、３、および４に記述されたものを含む。
（Ｂ）Ｉｎ ｖｉｖｏ。Ｉｎ ｖｉｖｏでＩＬ−１８を阻害する可溶性ＩＬ−１８受容体ヘテロ２量体の能力を試験するためのモデルは、下記のものを含む：Ｐ． ａｃｎｅｓ／ＬＰＳ処理ヌードマウスでの肝臓障害（Ｏｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｎａｔｕｒｅ ３７８：８８−９０）；　ＳＪＬマウスでの ＰＬＰ誘発、養子移入実験的自己免疫脳脊髄炎（Ｌｅｏｎａｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９９５）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．１８１：３８１−３８６）；　およびＤＢＡ／１マウスでのＩＩ型コラーゲン誘発関節炎（Ｇｒａｃｉｅ ｅｔ ａｌ． （１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． １０４：１３９３−１４０１）。
【００９０】
前記の例は、そこで用いられた本発明の一般的にまたは特定に記述された反応物および／または操作条件を置き換えることにより、同様の成功をもって繰り返せる。
前記の記述から、当業界の熟練者は、本発明の本質的な特徴を容易に保証でき、本発明の精神および範囲から離れること無く、種々の用途や状態に適応させるために、本発明の種々の変化や修正をすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ヘテロ２量体および多量体の幾つかの例を示す。パネルＡは、化学的架橋を図示する；パネルＢは、付加した部分を介しての連結を図示する（一般的な付加ペプチド；抗体断片の重鎖／軽鎖相互作用；抗体断片の重鎖／重鎖相互作用）；パネルＣは、単鎖ポリペプチドを図示する；およびパネルＤは、４量体を図示する。
【図２Ａ】
図２Ａは、ＩＬ−１８Ｒおよび／またはＡｃＰＬ発現ベクターで形質移入された２９３細胞でのＩＬ−１８応答能を示す。
【図２Ｂ】
図２Ｂは、ＩＬ−１８Ｒを発現するおよびＡｃＰＬ発現ベクターで形質移入される細胞でのＩＬ−１８応答能を示す。
【図３】
図３は、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８はＡｅ７細胞内でＩＦＮ−γ分泌を相乗的に誘発することを示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004512026.tif 000051
2004512026.tif 000052
【国際調査報告】
2004512026.tif 000053
2004512026.tif 000054
2004512026.tif 000055