(57)【要約】本発明は、動物由来成分を含有しない哺乳動物細胞培養物中でＦＶＩＩポリペプチドを工業的規模で生産する方法を提供する。
2004512835.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞において因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを大規模生産する方法において、
（ｉ） 動物由来成分を欠如する培地を含有する培養容器の中に、因子ＶＩＩを発現するか、あるいは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを発現する哺乳動物細胞を接種し、少なくとも細胞が前もって決定した密度に到達するまで、前記培養物を増殖させ、
（ｉｉ） 動物由来成分を欠如する培地を含有する大規模培養容器に、前記増殖種母培養物を移し、
（ｉｉｉ） 少なくとも前記細胞が前もって決定した密度に到達するまで、動物由来成分を欠如する培地中で前記大規模培養物を増殖させ、
（ｉｖ） 因子ＶＩＩの発現または因子ＶＩＩ関連ポリペプチドの発現に適当な条件下に、動物由来成分を欠如する培地中で工程 （ｉｉｉ） において得られた培養物を維持し、そして
（ｖ）　維持した培養物から因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを回収する、
ことを含んでなる方法。
【請求項２】
工程 （ｉｉ） の前に、累進的に増加する大きさの種母培養容器を使用して工程 （ｉ） を反復することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉｖ） 培地の一部分を規則的に収集し、新鮮な培地と置換することによって、動物由来成分を欠如する培地中で工程 （ｉｉｉ） において得られた培養物を維持することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記の方法がミクロ担体プロセスである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記の方法が、マクロ多孔質担体プロセスである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記の方法が標準的ミクロ担体プロセスである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記の方法がミクロ担体潅流プロセスである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記の方法が懸濁プロセスである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記の方法が潅流プロセスである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記の方法がバッチ／抜き出し−充填プロセスである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記の方法が単純バッチプロセスである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記の方法が供給−バッチプロセスである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記の方法が抜き出し−充填プロセスである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記の接種工程前に、動物由来成分を欠如する培地中で増殖するように前記細胞を適合させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記の接種工程前に、前記細胞が懸濁培養において増殖することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物細胞がＢＨＫ細胞およびＣＨＯ細胞から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記の所望の因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドが、ヒト因子ＶＩＩまたはヒト因子ＶＩＩ関連ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記の因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドが、野生型因子ＶＩＩ、Ｓ５２Ａ−因子ＶＩＩ、Ｓ６０Ａ−因子ＶＩＩ、Ｒ１５２Ｅ−因子ＶＩＩ、Ｓ３４４Ａ−因子ＶＩＩ、およびＧｌａドメインを欠如する因子ＶＩＩａから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記の因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドが少なくとも約１ ｍｇ／ｌ培養物のレベルで生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記の因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドが少なくとも約２．５ ｍｇ／ｌ培養物のレベルで生産される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記の因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドが少なくとも約５ ｍｇ／ｌの培養物のレベルで生産される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記の因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドが少なくとも約８ ｍｇ／ｌ培養物のレベルで生産される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
哺乳動物細胞を大規模培養する方法において、
（ｉ） 動物由来成分を欠如する培地を含有する種母培養容器の中に細胞を接種し、少なくとも細胞が最小クロス接種（ｃｒｏｓｓ−ｓｅｅｄｉｎｇ）密度に到達するまで、前記種母培養物を増殖させ、
（ｉｉ） 動物由来成分を欠如する培地を含有する大規模培養容器に、前記増殖種母培養物を移し、そして
（ｉｉｉ） 少なくとも前記細胞が前もって決定した密度に到達するまで、動物由来成分を欠如する培地中で前記大規模培養物を増殖させる、
ことを含んでなる方法。
【請求項２４】
（ｉｖ） 培地を規則的に収集し、新鮮な培地と置換することによって、動物由来成分を欠如する培地中で工程 （ｉｉｉ） において得られた培養物を維持する、
ことをさらに含んでなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記の工程 （ｉｉ） 前に、累進的に増加する大きさの種母培養容器を使用して工程 （ｉ） を反復することをさらに含んでなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記の方法がミクロ担体プロセスである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記の方法が、マクロ多孔質担体プロセスである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記の方法が標準的ミクロ担体プロセスである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
（ｉｖ） 細胞含有担体の沈降後、培養上清の一部分を規則的に収集し、新鮮な培地と置換することによって、動物由来成分を欠如する培地中で工程 （ｉｉｉ） において得られた培養物を維持する、
ことをさらに含んでなる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
（ｖ） 担体の沈降前に培養の設定点より低い前もって決定した温度に培養物を冷却する、
ことをさらに含んでなる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
担体の沈降前に培養の温度設定点より５ ℃〜３０ ℃低い前もって決定した温度に培養物を冷却する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
培養の温度設定点より５ ℃〜２０ ℃低い前もって決定した温度に培養物を冷却する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
培養の温度設定点より５ ℃〜１５ ℃低い前もって決定した温度に培養物を冷却する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
培養の温度設定点より約１０ ℃低い前もって決定した温度に培養物を冷却する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記の方法がミクロ担体潅流プロセスである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
前記の方法が懸濁プロセスである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３７】
前記の方法が潅流プロセスである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記の方法がバッチ／抜き出し−充填プロセスである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記の方法が単純バッチプロセスである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記の方法が供給−バッチプロセスである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記の方法が抜き出し−充填プロセスである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記の細胞が所望の因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを産生する、請求項２３に記載の方法。
【請求項４３】
前記の所望の因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドが、ヒト因子ＶＩＩまたはヒト因子ＶＩＩ関連ポリペプチドである、請求項２３に記載の方法。
【請求項４４】
因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドが、野生型因子ＶＩＩ、Ｓ５２Ａ−因子ＶＩＩ、Ｓ６０Ａ−因子ＶＩＩ、Ｒ１５２Ｅ−因子ＶＩＩ、Ｓ３４４Ａ−因子ＶＩＩ、およびＧｌａドメインを欠如する因子ＶＩＩａから成る群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項４５】
前記の接種工程前に、前記細胞が動物由来成分を欠如する培地中で増殖するように適合されている、請求項２３に記載の方法。
【請求項４６】
前記の接種工程前に、前記細胞が懸濁培養において増殖することができる、請求項２３に記載の方法。
【請求項４７】
前記の哺乳動物細胞がＢＨＫ細胞およびＣＨＯ細胞から成る群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項４８】
前記の因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドが少なくとも約１ ｍｇ／ｌの培養物のレベルで生産される、請求項２３に記載の方法。
【請求項４９】
前記の因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドが少なくとも約２．５ ｍｇ／ｌの培養物のレベルで生産される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記の因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドが少なくとも約５ ｍｇ／ｌの培養物のレベルで生産される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記の因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドが少なくとも約８ ｍｇ／ｌの培養物のレベルで生産される、請求項５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、哺乳動物細胞を培養する方法およびこのような細胞の大規模または工業的規模の培養において組換えタンパク質を製造する方法に関する。
【０００２】
発明の背景
例えば、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、因子Ｘ、およびプロテインＣを包含する、凝固カスケードに関係するタンパク質は、種々の病理学症状を治療する有用な治療剤であることが証明されている。薬学的製品の源としてヒト血漿を使用することは多数の欠点を有するので、組換え系においてこれらのタンパク質を製造することが好ましい。しかしながら、凝固タンパク質は、例えば、アスパラギン連鎖 （Ｎ−連鎖） グリコシル化；Ｏ−連鎖グリコシル化；およびｇｌｕ残基のγ−カルボキシル化を包含する、種々の共翻訳および翻訳後修飾に暴露される。
【０００３】
この理由で、哺乳動物細胞中でそれらの製造することが好ましく、これにより組換えタンパク質を適当に修飾することができる。しかしながら、哺乳動物細胞の培養は伝統的に動物血清または他の動物由来成分、例えば、アルブミン、トランスフェリン、およびその他の存在下に実施されてきている。無血清培養方法は変動する結果を生成してきている。特に、培養の開始から大規模生産体積を獲得するまで、血清の非存在下に細胞を培養することは問題があった。
【０００４】
こうして、血清または他の動物由来成分を含有しない哺乳動物細胞培養物を大規模に培養して、工業的量の凝固タンパク質、特に組換えヒト因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを製造する方法がこの分野において要求されている。また、発現されたタンパク質の小規模または実験室規模の量に比較して、タンパク質の収量が維持または増加されているか、あるいは動物由来成分、特に血清を含有する培養において生産するとき、発現されるタンパク質の量に比較して、タンパク質の収量が増加されている、動物由来成分を含有しない哺乳動物細胞培養物を大規模に培養する方法がこの分野において要求されている。
【０００５】
発明の要約
本発明は、下記の工程により実施される、哺乳動物細胞において因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを大規模生産する方法を提供する：
（ｉ） 動物由来成分を欠如する培地を含有する培養容器の中に、因子ＶＩＩを発現する哺乳動物細胞を接種し、少なくとも細胞が前もって決定した密度に到達するまで、前記培養物を増殖させ、
（ｉｉ） 動物由来成分を欠如する培地を含有する大規模培養容器に、前記増殖種母培養物を移し、
（ｉｉｉ） 少なくとも前記細胞が前もって決定した密度に到達するまで、動物由来成分を欠如する培地中で前記大規模培養物を増殖させ、
（ｉｖ） 因子ＶＩＩの発現に適当な条件下に、動物由来成分を欠如する培地中で工程
（ｉｉｉ） において得られた培養物を維持し、そして
（ｖ） 維持した培養物から因子ＶＩＩを回収する。
【０００６】
ある態様において、本発明は、動物由来成分を欠如する培地中で懸濁コンピテント哺乳動物細胞を培養することに関する。ある態様において、細胞は動物由来タンパク質を欠如する培地中でおよび／または懸濁培養において増殖するように適合されている。ある態様において、使用する細胞は、工程 （ｉ） における接種工程前に、細胞は動物由来タンパク質を欠如する培地中で増殖するように適合されている。他の面において、本発明は、正の表面電荷を有するマクロ多孔質担体を使用すると、動物由来成分の非存在下に懸濁コンピテント細胞の増殖に適当な環境が得られ、このような細胞による所望のタンパク質を高いレベルで生産できるという発見に基づく。
【０００７】
ある態様において、この方法は、工程 （ｉｉ） の前に、累進的に増加する大きさの種母培養容器を使用して工程 （ｉ） を反復することをさらに含んでなる。
本発明は、また、下記の工程によりを実施する、哺乳動物細胞中で因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを大規模生産する方法を提供する：
（ｉ） 動物由来成分を欠如する培地を含有する種母培養容器の中に細胞を接種し、少なくとも細胞が最小交雑播種密度に到達するまで、前記種母培養物を増殖させ、
（ｉｉ） 動物由来成分を欠如する培地を含有する大規模培養容器に、前記増殖種母培養物を移し、そして
（ｉｉｉ） 少なくとも前記細胞が前もって決定した密度に到達するまで、動物由来成分を欠如する培地中で前記大規模培養物を増殖させる。
【０００８】
ある態様において、この方法は、下記の工程をさらに含んでなる：
（ｉｖ） 培地を規則的に収集し、新鮮な培地と置換することによって、動物由来成分を欠如する培地中で工程 （ｉｉｉ） において得られた培養物を維持する。
ある態様において、この方法は標準的ミクロ担体プロセスであり、下記の工程をさらに含んでなる：
（ｉｖ） 細胞含有担体の沈降後、培養上清の一部分を規則的に収集し、新鮮な培地と置換することによって、動物由来成分を欠如する培地中で工程 （ｉｉｉ） において得られた培養物を維持する。
【０００９】
ある態様において、この方法は標準的ミクロ担体プロセスであり、下記の工程をさらに含んでなる：
（ｖ） 担体の沈降前に培養の温度設定点より低い前もって決定した温度 （５〜３０ ℃、例えば、５〜２０ ℃、または５〜１５ ℃または約１０ ℃） に培養物を冷却する。
【００１０】
本発明は、また、下記の工程によりを実施する、哺乳動物細胞中で因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを大規模生産する方法を提供する：
（ｉ） 因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを発現する哺乳動物細胞を準備し、
（ｉｉ） 動物由来成分を欠如する培地を含有する種母培養容器の中に細胞を接種し、少なくとも細胞が最小交雑播種密度に到達するまで、前記種母培養物を増殖させ、
（ｉｉｉ） 動物由来成分を欠如する培地を含有する大規模培養容器に、前記増殖種母培養物を移し、そして
（ｉｖ） 前記因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドが前記培養により産生される条件下に、少なくとも前記細胞が最小の所望密度に到達するまで、動物由来成分を欠如する培地中で前記大規模培養物を維持する。
【００１１】
ある態様において、工程 （ｉ） における接種前に、細胞は動物由来成分を欠如する培地中の懸濁培養において増殖できるように適合されている。好ましくは、因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドは少なくとも約１ ｍｇ／ｌの培養物、より好ましくは少なくとも約２．５ ｍｇ／ｌの培養物、より好ましくは少なくとも約５ ｍｇ／ｌの培養物最も好ましくは少なくとも約８ ｍｇ／ｌの培養物のレベルで生産される。
【００１２】
ある態様において、細胞は所望のポリペプチド、好ましくは凝固因子、最も好ましくはヒト因子ＶＩＩまたはヒト因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを産生し、所望のポリペプチドは野生型因子ＶＩＩ、Ｓ５２Ａ−因子ＶＩＩ、Ｓ６０Ａ−因子ＶＩＩ、Ｒ１５２Ｅ−因子ＶＩＩ、Ｓ３４４Ａ−因子ＶＩＩ、およびＧｌａドメインを欠如する因子ＶＩＩａを包含するが、これらに限定されない。
ある態様において、本発明のプロセスはミクロ担体型プロセスである；この方法は懸濁細胞型プロセスである。
【００１３】
ある態様において、ミクロ担体プロセスは標準的ミクロ担体プロセスである。標準的ミクロ担体プロセスのある態様において、細胞含有担体の沈降後、培養上清の一部分を規則的間隔で収集し、新鮮な培地と置換する。ある態様において、標準的ミクロ担体プロセスは、担体の各沈降直前に、培養の温度設定点より低い前もって決定した温度 （例えば、５〜３０ ℃、または５〜２０ ℃、または５〜１５ ℃または約１０ ℃） に培養物を冷却する下記の工程をさらに含んでなる。冷却工程は、細胞含有担体の沈降前、１０〜２４０分、例えば、２０〜１８０分、または３０〜１２０分以内に実施される。
【００１４】
ある態様において、この方法はミクロ担体潅流プロセスである。ある態様において、この方法はミクロ担体プロセスであり、そしてミクロ担体はマクロ多孔質担体である。
【００１５】
ある態様において、この方法は下記の工程により実施される：
（ｉ） 動物由来成分を欠如する培地を含有する培養容器の中に、因子ＶＩＩを発現するか、あるいは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを発現する哺乳動物細胞を接種し、少なくとも細胞が前もって決定した密度に到達するまで、前記培養物を増殖させ、
（ｉｉ） （ａ） 動物由来成分を欠如する培地および （ｂ） マクロ多孔質担体を含有する大規模培養容器に、前記細胞が担体中に移動する条件下に、前記増殖種母培養物を移し、
（ｉｉｉ） 少なくとも前記細胞が前もって決定した密度に到達するまで、動物由来成分を欠如する培地中で前記大規模培養物を増殖させ、
（ｉｖ） 因子ＶＩＩの発現に適当な条件下に、動物由来成分を欠如する培地中で工程
（ｉｉｉ） において得られた培養物を維持し、そして
（ｖ）　維持した培養物から因子ＶＩＩを回収する。
【００１６】
好ましくは、ミクロ担体は、
（ａ）　約１５０〜３５０ μｍの全粒子直径を有する；そして
（ｂ）　約０．８〜２．０ ｍｅｑ／ｇの正電荷密度を有する。
好ましくは、マクロ多孔質担体は、
（ａ） 約１５０〜３５０ μｍの全粒子直径を有し、
（ｂ） 約１５〜約４０ μｍの平均孔開口直径をもつ孔を有し、そして
（ｃ）　約０．８〜２．０ ｍｅｑ／ｇの正電荷密度を有する。
【００１７】
ある態様において、ミクロ担体はデキストランをベースとする；ある態様において、マクロ多孔質担体はセルロースをベースとする；担体は前記電荷密度を付与する表面ＤＥＡＥ基を含む。
ある態様において、懸濁細胞プロセスは潅流プロセスである；他の態様において、この方法はバッチ／抜き出し−充填プロセスである。
ある態様において、バッチ／抜き出し−充填プロセスは単純バッチプロセスである；他の態様において、この方法は供給−バッチプロセスである；本発明のなお他の態様において、この方法は抜き出し−充填プロセスである。
【００１８】
ある態様において、使用する細胞はＢＨＫ細胞である；他の態様において、細胞はＣＨＯ細胞である；他の態様において、細胞はＨＥＫ細胞である；他の態様において、細胞はＣＯＳ細胞である；他の態様において、細胞はＨｅＬａ細胞である。ＢＨＫ細胞およびＣＨＯ細胞は好ましい。
ある態様において、ＣＨＯ細胞を第１温度において選択した密度に成長させる。選択した細胞密度に到達したとき、温度を第２温度に低下させる。ある態様において、第１温度は約３０〜３７ ℃であり、そして第２温度は約３０〜３６ ℃である；好ましくは、第１温度はＣＨＯ細胞について約３７ ℃であり、ＢＨＫ細胞について約３６ ℃であり、そして第２温度はＣＨＯ細胞およびＢＨＫ細胞の両方について約３２ ℃である。
ある態様において、酪酸ナトリウムは培養容器中で特定の細胞濃度において特定した濃度に添加する。
【００１９】
供給−バッチプロセスまたは供給−バッチプ抜き出し−充填プロセスのある態様において、使用すべき供給物はグルコースの濃溶液である；他の態様において、供給物は×１０〜５０濃度の細胞培地から成る濃供給物である。ある態様において、供給物は培地成分のあるものが細胞に対して有害であることを改善するように、あるいは単に高い濃度で溶解しないように変性されている。ある態様において、供給物は単一パルス （１日１回、２回、およびその他） で添加される；他の態様において、供給物は２４時間の期間を通じて徐々に供給される。
【００２０】
ある態様において、培養容器はその中のグルコースを一定に維持するために供給速度をコントロールするグルコースセンサーを含有する；他の態様において、培養容器は１ラインバイオマスモニターを含有する （Ａｌｂｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ） （例えば、下記文献を参照のこと：Ｃａｓｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｏｎ−ｌｉｎｅ ｒａｄｉｏ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｉｍｐｅｄａｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ． Ｃｌａｉｒｅ Ｌ． Ｈａｒｄｉｎｇ， Ｊｏｈｎ Ｐ． Ｃａｒｖｅｌｌ ａｎｄ Ｙｕｅ Ｇｕａｎ． Ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ １６ｔｈ ＥＳＡＣＴ Ｍｅｅｔｉｎｇ， Ｌｕｇａｎｏ， ２５ｔｈ ｔｏ ２９ｔｈ Ａｐｒｉｌ １９９９）。
【００２１】
ある態様において、本発明の実施において使用する細胞は、動物由来成分を欠如する培地、例えば、血清を欠如する培地、または動物由来成分およびタンパク質を欠如する培地中で成長するように適合させる。特に好ましい態様において、宿主細胞はヒト因子ＶＩＩまたはヒト因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを発現するように操作され、かつ血清または動物由来成分の非存在下に成長するように適合されたＢＨＫ ２１細胞またはＣＨＯ細胞である。
【００２２】
ある態様において、発現されたタンパク質はヒト因子ＶＩＩである。他の態様において、発現されたタンパク質は野生型因子ＶＩＩに比較して実質的に同一のまたは改良された生物学的活性を有する因子ＶＩＩである。他の態様において、発現されたタンパク質は野生型因子ＶＩＩに比較して変更されたまたは減少した生物学的活性を有する。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、哺乳動物細胞の大規模培養法、特にこのような細胞により発現される所望のポリペプチドを工業的量で製造する方法を提供する。これらの方法は、下記の工程により実施される：
（ｉ） 動物由来成分を欠如する培地を含有する培養容器の中に細胞を接種し、少なくとも細胞が最小交雑播種密度に到達するまで、種母培養物を増殖させ、
（ｉｉ） 動物由来成分を欠如する培地を含有する大規模培養容器に、増殖種母培養物を移し、そして
（ｉｉｉ） 少なくとも前記細胞が有用な密度に到達するまで、動物由来成分を欠如する培地中で大規模培養物を増殖させる。
【００２４】
ある態様において、これらの方法は下記の工程をさらに含んでなる：
（ｉｖ） 培地を規則的に収集し、新鮮な培地と置換することによって、動物由来成分を欠如する培地中で工程 （ｉｉｉ） において得られた培養物を維持する。
後述するプロセスは、動物由来成分を欠如する培地の任意の処方物中の任意の細胞型に適用可能である。
【００２５】
ミクロ担体プロセス：
２つ型のミクロ担体プロセスを使用することができる。これらは次の通りである：
１．　標準的ミクロ担体プロセス。
２．　ミクロ担体潅流プロセス。
標準的ミクロ担体プロセス：
このプロセスは２つ明確な期において操作される。
１．　増殖期。
２．　産生期。
【００２６】
増殖期
標準的ミクロ担体プロセスにおいて、動物由来成分を欠如する培地を含有する培養容器の中に細胞を接種し、少なくとも細胞が最小交雑播種密度に到達するまで増殖させる。引き続いて、（ａ） 動物由来成分を欠如する培地および （ｂ） ミクロ担体を含有する大規模培養容器に、例えば、マクロ多孔質担体を使用するプロセスの場合において担体中に移動することによって、担体が細胞により完全にコロニー化される条件下に、増殖種母培養物を移す。
【００２７】
この増殖期において、担体が完全にコロニー化されるまで、細胞をミクロ担体上で増殖させる。培養容器の底にミクロ担体を沈降させることによって、培地の交換を実施し、次いで槽容積の前もって決定した百分率を取出し、対応する百分率の槽体積の新鮮な培地を容器に添加する。次いでミクロ担体を培地中に再懸濁させ、培地の取出しおよび置換のこのプロセスを前もって決定した間隔で、例えば、２４時間毎に反復する。培地の置換量は細胞密度に依存し、典型的には下記表１に示すように槽体積の１０〜９５％、好ましくは２５％〜８０％であることができる。
細胞密度がタンパク質の発現に適当な値に到達したとき、槽中の培地の６０〜９５％、好ましくは８０％を２４時間毎に交換する。また、８０％の培地の交換は産生期において使用することが好ましい。このプロセスのこの面の概略を表１に示す。
【００２８】
【表１】
2004512835.tif 000003
【００２９】
ＦＶＩＩの産生に適当である設定点のいくつかは、種母培養においてまたはミクロ担体上で、細胞の初期成長に必ずしも適当ではない。例えば、温度、ＤＯＴ、および／またはｐＨは２つ期について異なることがある。産生期と同一のレベルにおける場合でさえ、この段階における培地の交換を実施して、細胞が生きかつ成長するようにさせる。
【００３０】
産生期
増殖期において、細胞が１〜１２×１０６細胞／ｍｌに到達するまで、培養物を増殖させる。この密度に到達すると、培養物は産生期に入る。また、設定点をこの時点において変化させ、ＦＶＩＩの産生に適当な値に設定することができる。
このプロセスのダイヤグラムを第１図に示す。
ミクロ担体を槽の底に沈降させることによって、培地を交換し、次いで槽体積の選択した％を取出し、対応する％の槽体積の新鮮な培地を容器に添加する。槽体積の２５〜９０％を交換することができる；好ましくは、槽体積の８０％を交換する。次いでミクロ担体を培地中に再懸濁させ、この培地の取出しおよび置換のプロセスを１０〜４８時間毎に、好ましくは２４時間毎に実施する。
このプロセスのこの面の概略を表２に示す。
【００３１】
【表２】
2004512835.tif 000004
【００３２】
オプション （１）
産生期の開始および間にあるとき、培養の温度設定点の低下を使用することができる。温度、操作ｐＨおよび培地の交換の頻度を最適化させる。特に、ＣＨＯ細胞系統を使用するとき、温度の低下は好ましい。それぞれ増殖期および産生期における温度範囲および好ましい値は、表１および２において見ることができる。産生期間にＣＨＯ細胞系統について、約３２ ℃の温度は好ましい。
【００３３】
オプション （２）
担体の各沈降直前に、冷却工程を適用することができる。培養物を培養の温度設定点より低い前もって決定した温度　（例えば、５ ℃〜３０ ℃、または５ ℃〜２０ ℃、または５ ℃〜１５ ℃または約１０ ℃） に冷却する。冷却工程は、細胞含有ミクロ担体の沈降前、１０〜２４０分、例えば、２０〜１８０分、または３０〜１２０分以内に実施される。
【００３４】
この工程は典型的には次のようにして実施される：バイオリアクターを冷却し、温度をモニターする。バイオリアクターが設定点温度より低い前もって決定した温度、例えば、培養の設定点よりも１０ ℃低い温度に到達したとき、バイオリアクターの攪拌を停止させ、細胞含有担体を再沈降させる。培地の交換を実施するとき、温度を再び培養の設定点に調節する。添加する新鮮な培地は典型的には培養の設定点に近い温度に加温する。
【００３５】
ミクロ担体潅流プロセス：
このプロセスは標準的ミクロ担体プロセスに類似し、再び２つ明確な期において実施される。
１．　増殖期。
２．　産生期。
【００３６】
このプロセスと前述した標準的プロセスとの間の差は培地を交換する方法である。前述の標準的ミクロ担体プロセスにおいて、槽体積の規定した百分率、例えば、全槽体積の８０％を一度に交換する。潅流プロセスにおいて、培地を連続的に添加し、等しい体積の収集物もまた連続的に取出す。本質的に、培地 （槽体積の規定した％） を前もって決定した期間、例えば、２４時間にわたって徐々に交換する。これは第２図のダイヤグラムに示されている。
培地を容器から出るようにさせるが、ミクロ担体を槽内に保持する分離装置 （または潅流装置） を使用することによって、ミクロ担体を容器中に保持させる。
【００３７】
増殖期
段階的培地の交換を除外して、標準的ミクロ担体プロセスについて記載した通りである。培地の交換は槽体積の％／日、すなわち、２４時間として与えられる。このプロセスのこの面の概略を表３に示す。
【００３８】
【表３】
2004512835.tif 000005
【００３９】
再び、この初期段階において高い培地交換 （例えば、８０％の槽体積） において培養物を潅流させるが、これは産生期であると考えられない。なぜなら、ＦＶＩＩの産生に適当である設定点のいくつかはミクロ担体上で細胞の初期増殖に適当でないことがあるからである。この段階における新鮮な培地の潅流は、細胞を生かしかつ増殖させるために実施される。「標準的ミクロ担体プロセス」と比較する目的で、培地の流速は培地の槽体積の百分率／日 （２４時間） で表される。
【００４０】
産生期
前述のプロセスにおけるように、増殖期において、細胞が１〜１２×１０６細胞／ｍｌに到達するまで、培養物を増殖させる。この密度に到達すると、培養物は産生期に入る。もまた設定点をこの時点において変化させ、ＦＶＩＩに適当な値に設定することができる。
このプロセスのダイヤグラムを第２図に示す。
【００４１】
培地の潅流は連続的に実施される。「標準的ミクロ担体プロセス」と比較する目的で、培地の流速は培地の槽体積の百分率／規定された時間で表される。培地の潅流は２５〜９５％の槽体積／１０〜４８時間であることができる；好ましくは、培地の潅流は８０％／１０〜４８時間、より好ましくは８０％の槽体積／２４時間である。このプロセスのこの面の概略を表４に示す。
【００４２】
【表４】
2004512835.tif 000006
【００４３】
潅流装置
担体を保持するために適当な手段は容器内の沈降装置、例えば、浸漬管である。
オプション
産生期の開始および間にあるとき、培養の温度設定点の低下を使用することができる。温度、操作ｐＨおよび培地の交換の頻度を最適化させる。特にＣＨＯ細胞系統を使用するとき、温度の低下は好ましい。それぞれ増殖期および産生期における温度範囲および好ましい値は、表３および４において見ることができる。産生期間にＣＨＯ細胞系統について、約３２ ℃の温度は好ましい。
【００４４】
懸濁細胞プロセス：
懸濁細胞プロセスについて、下記の２つオプションが存在する：
１．　潅流プロセス。
２．　バッチ／抜き出し−充填プロセス。
【００４５】
潅流プロセス：
このプロセスはミクロ担体潅流について概説したプロセスに類似する。主要な差は次の通りである：１） 細胞を担体中に固定化しないで自由に懸濁させること、および２） 培養容器中に細胞を保持するために使用する潅流装置の特質。この方法は再び２つ明確な期で操作される。
１．　増殖期。
２．　産生期。
【００４６】
増殖期
懸濁細胞−潅流プロセスにおいて、動物由来成分を欠如する培地を含有する培養容器の中に細胞を接種し、少なくとも細胞が最小交雑播種密度に到達するまで増殖させる。引き続いて、動物由来成分を欠如する培地を含有する大規模培養容器に増殖種母培養物を移し、少なくとも前もって決定した細胞密度に到達するまで、増殖させる。
この期において、細胞を懸濁増殖させて培養容器内の細胞数を前もって決定したまたは臨界値に増加させる。培養容器を新鮮な培地で連続的に潅流することによって、培地を交換する。
培地の潅流量は細胞密度に依存し、典型的には下記表５に示すように槽体積の１０〜９５％、好ましくは２５％〜８０％／日 （２４時間） であることができる。
【００４７】
細胞密度が産生期の開始に適当な値に到達したとき、槽中の培地の６０〜９５％、好ましくは８０％を２４時間毎に交換する。また、８０％の培地の交換は産生期において使用することが好ましい。
再び、この初期段階において高い培地交換 （例えば、８０％の槽体積） において培養物を潅流させるが、これは産生期であると考えられない。なぜなら、ＦＶＩＩの産生に適当である設定点のいくつかはマクロ多孔質担体上で細胞の初期成長に適当でないからである。この段階における新鮮な培地の潅流は、細胞を生かしかつ成長させるために実施される。
このプロセスのこの面概略を表５に示す。
【００４８】
【表５】
2004512835.tif 000007
【００４９】
産生期
増殖期において、細胞が１〜１２×１０６細胞／ｍｌに到達するまで、培養物を増殖させる。この密度に到達すると、培養物は産生期に入る。また、設定点をこの時点において変化させ、ＦＶＩＩの産生に適当な値に設定することができる。
培地の潅流は連続的に実施する。比較の目的で、培地の流速は培地の槽体積％／規定した時間により表される。（より標準的な単位はリットル／日である）。培地の潅流は槽体積の１０〜２００％／１０〜４８時間であることができる；好ましくは、培地の潅流は８０％／１０〜４８時間、より好ましくは槽体積の８０％／２４時間である。
このプロセスのこの面の概略を表６に示す。
【００５０】
【表６】
2004512835.tif 000008
【００５１】
潅流装置
多数の細胞保持装置を使用して、培養容器内の細胞の保持を達成することができる。このプロセスに下記の設定の装置のすべてを使用することができる：
１．　外部の沈降ヘッド。
２．　内部の沈降ヘッド。
３．　連続的遠心機。
４．　内部または外部の回転フィルター。
５．　外部のフィルターまたは中空繊維のカートリッジ。
６．　超音波細胞分離装置。
７．　培養容器中のある長さのパイプ。
【００５２】
オプション
産生期の開始および間にあるとき、培養の温度設定点の低下を使用することができる。温度、操作ｐＨおよび培地交換の頻度を最適化させる。特にＣＨＯ細胞系統を使用するとき、温度の低下は好ましい。それぞれ増殖期および産生期における温度範囲および好ましい値は、表５および６において見ることができる。産生期間にＣＨＯ細胞系統について、約３２ ℃の温度は好ましい。
【００５３】
バッチ／抜き出し充填プロセス：
これらは好ましくは操作する最も簡単な型の発酵であり、このフォーマットを使用する懸濁細胞プロセスについて３つの主要なオプションが存在する。
１．　単純バッチプロセス。
２．　供給−バッチプロセス。
３．　抜き出し−充填プロセス。
【００５４】
単純バッチプロセス：
単純バッチプロセスにおいて、動物由来成分を欠如する培地を含有する培養容器の中に細胞を接種し、少なくとも細胞が最小交雑播種密度に到達するまで増殖させる。引き続いて、動物由来成分を欠如する培地を含有する大規模培養容器に増殖種母培養物を移す。次いで培地中の栄養素が消耗されるまで、培養容器を操作する。
このプロセスのこの面の概略を表７に示す。
【００５５】
【表７】
2004512835.tif 000009
【００５６】
オプション
このプロセスの任意の面は操作温度の低下である。このようなバッチプロセスは、使用する細胞系統の増殖に適当な特定の温度における初期増殖相および引き続く前もって決定した細胞密度、例えば、１〜１２×１０６細胞／ｍｌにおける操作温度の低下から成るであろう。これは特にＣＨＯ細胞系統に関係する。ＣＨＯについて好ましいバッチプロセスは、３７ ℃における初期増殖期および引き続く１〜１２×１０６細胞／ｍｌ、好ましくは２〜１０×１０６細胞／ｍｌにおける操作温度の低下から成るであろう。好ましくは、温度低下はＣＨＯ細胞の場合において３７ ℃から３２ ℃であろう。
【００５７】
収集時間を決定しなくてはならない。伝統的バッチは、すべての栄養素が消耗されるようになるまで、操作される。しかしながら、これは典型的には細胞溶解を引き起こし、これは産物に対して損傷であることがあり、あるいはこれは精製に対して問題を引き起こすことがある。
【００５８】
フェドバッチ（ｆｅｄ ｂｕｔｃｈ）プロセス：
前述したように、単純バッチプロセスは培養容器に細胞を接種し、培地中の栄養素が消耗されるまで、槽を操作することから成る。このようなバッチプロセスは、槽に栄養素の濃溶液を供給することによって、延長することができる。これはプロセス時間を延長し、究極的に培養容器内のＦＶＩＩ産生を増加させる。
培養容器中の最も重大な栄養素はグルコース濃度である。供給のコントロールおよび開始はこの栄養素のレベルに関係する。グルコース濃度が臨界値以下に低下するとき、供給を開始し、供給物の添加量はグルコース濃度をこの臨界値に上昇させるために十分な量である。このプロセスのこの面の概略を表８に示す。
【００５９】
【表８】
2004512835.tif 000010
【００６０】
このプロセスの任意の面は操作温度の低下である。このような供給バッチプロセスは、使用する細胞系統の増殖に適当な特定の温度における初期増殖期および引き続く前もって決定した細胞密度、例えば、１〜１２×１０６細胞／ｍｌにおける操作温度の低下から成るであろう。これは特にＣＨＯ細胞系統に関係する。ＣＨＯについて好ましい供給バッチプロセスは、３７ ℃における初期増殖期および引き続く１〜１２×１０６細胞／ｍｌ、好ましくは２〜１０×１０６細胞／ｍｌにおける操作温度の低下から成るであろう。好ましくは、温度低下はＣＨＯ細胞の場合において３７ ℃から３２ ℃であろう。
単純バッチプロセスにおけるように、収集時間は槽の最長の可能な操作と細胞溶解の危険との間の釣合いとして決定しなくてはならない。
【００６１】
供給物の組成および添加方法
使用するために適当な最も簡単な供給物はグルコースの濃溶液である。しかしながら、グルコース単独の供給は、バッチ期を短時間延長するだけである。なぜなら、アミノ酸または脂質またはビタミンのような他の栄養素は引き続いて消耗されるようになるからである。この理由で、濃供給物は好ましいであろう。使用するために適当な最も簡単な濃供給物は×１０〜５０濃度の細胞培地であろう。このプロセスのこの面の概略を表９に示す。
【００６２】
【表９】
2004512835.tif 000011
【００６３】
不都合なことには、培地成分のいくつかは細胞に対して有害であるか、あるいは高い濃度で溶解しないであろう。この理由で、供給物はこれらは問題の成分を低レベルに保持するために変性を必要とすることがある。
また、供給物の投与法は変動性である。供給物は単一パルス （１日に１回、２回、３回およびその他） であるか、あるいは２４時間を通じて徐々に供給することができる。進歩した供給オプションは、培養容器中でグルコース濃度を一定に維持するために、供給速度をコントロールするいくつかの形態のグルコースセンサーを容器中に準備しなくてはならない。
【００６４】
収集時間を決定しなくてはならない。伝統的な、または簡単なバッチは、すべての栄養素が消耗されるようになるまで、操作される。これは供給−バッチ系において特に問題ではない。しかしながら、毒性代謝物質が達成するために、このプロセスは不定的に持続することができない。これは細胞の生活能力を減少させ、究極的に細胞溶解に導く。これは産物に対する損傷を引き起こすか、あるいは引き続く精製に対する問題を引き起こす。
【００６５】
抜き出し−充填プロセス：
抜き出し−充填の２つ型をここにおいて記載する。
１．　単純抜き出し−充填。
２．　供給−バッチ抜き出し−充填。
単純抜き出し−充填：
このプロセスは反復したバッチ発酵に精密に類似する （第３図参照）。バッチ発酵において、細胞は培養容器中で増殖し、培地をこの実験の終わりにおいて収集する。抜き出し−充填プロセスにおいて、栄養素が消耗されるようになる前に、培養容器を収集する。容器から内容物のすべてを取出す代わりに、槽体積の一部分のみを取出す （典型的には槽体積の８０％）。収集後、同一体積の新鮮な培地を容器に戻す。次いで細胞をもう一度容器中で増殖させ、他の８０％の収集物を設定日数後に取る。反復バッチプロセスにおいて、収集後に容器中に残っている細胞を次のバッチのための接種物として使用することができる。
【００６６】
抜き出し−充填プロセスについての概略を表１０に示す。このプロセスを２つ期で操作する。このプロセスの第１期を単純バッチプロセスと同じように操作する。第１収集後、培養容器を再び単純バッチプロセスのように操作する；しかしながら、初期細胞密度がより高いために、バッチの長さは第１バッチよりも短い。これらの短い「反復バッチプロセス」を同じように続ける。
【００６７】
使用すべき抜き出し−充填の概略は次の通りである：
・　初期バッチ期
ｉ．　容器に細胞を接種し、増殖に適当な温度において増殖させる。
ｉｉ．　前もって決定した細胞密度における発現に適当な温度に温度を低下させる。
ｉｉｉ．　接種後７日に、槽体積の前もって決定した、例えば、８０％を取出し、同一容積の新鮮な培地と置換する。
・　反復バッチプロセス
ｉｖ．　増殖に適当な温度に温度を上昇させ、細胞を増殖させる。
ｖ．　前もって決定した細胞密度における発現に適当な温度に温度を低下させる。
ｖｉ．　この期の開始後５日に、槽体積の前もって決定した、例えば、８０％を取出し、同一容積の新鮮な培地と置換する。
ｖｉｉ．　工程ｉｖに戻る。
【００６８】
好ましい態様において、細胞系統はＣＨＯ細胞系統である。ＣＨＯ細胞系統について使用できる抜き出し−充填の簡単な概略は次の通りである：
・　初期バッチプロセス
ｖｉｉｉ．　 容器に細胞を接種し、３７℃において増殖させる。
ｉｘ．　２〜１０×１０６細胞／ｍｌにおいて３２ ℃に温度を低下させる。
ｘ．　接種後７日に、槽体積の前もって決定した、例えば、８０％を取出し、同一容積の新鮮な培地と置換する。
【００６９】
・　反復バッチプロセス
ｘｉ．　３７ ℃に温度を上昇させ、細胞を増殖させる。
ｘｉｉ．　２〜１０×１０６細胞／ｍｌにおいて３２ ℃に温度を低下させる。
ｘｉｉｉ．　この期の開始後５日に、槽体積の前もって決定した、例えば、８０％を取出し、同一容積の新鮮な培地と置換する。
ｘｉｖ．　工程ｘｉに戻る。
培養容器は広い範囲のサイクル時間および広い範囲の抜き出し−充填体積で操作することができる。範囲および好ましい値は表１０から見ることができる。
【００７０】
【表１０】
2004512835.tif 000012
【００７１】
フェドバッチ抜き出し−充填
このプロセスは、フェドバッチプロセスにおいてプロセシングされる型に類似する濃供給物を使用する抜き出し−充填発酵である。単純抜き出し−充填プロセスを使用する問題は、添加する新鮮な培地が反復バッチ発酵にわたって細胞を、持続するために不十分であることである。供給物の添加はこの心配を除去するであろう。供給物は、また、抜き出し−充填プロセスにおいて長いバッチ時間を使用する培養容器の操作を可能とするであろう。
供給物 （表９参照） および添加法は供給−バッチプロセスのそれらと同一であろう。このプロセスの概略を表１１に示す。
【００７２】
【表１１】
2004512835.tif 000013
【００７３】
酪酸ナトリウムの添加：
１つの態様において、本発明の方法は培地に酪酸ナトリウムを添加することを含む。酪酸ナトリウムは、種々の細胞型における組換えタンパク質の産生を引き起こすことが示された。この化学物質は、培養容器中に特定の細胞濃度において特定した濃度で添加される。それはバッチ間にまたは潅流プロセスにおいて規則的基準で添加することができる。この面の概略を表１２に示す。
【００７４】
【表１２】
2004512835.tif 000014
【００７５】
細胞：
本発明の実施において、培養する細胞は好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくは確立された哺乳動物細胞であり、下記のものを包含するが、これらに限定されない：ＣＨＯ （例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、ＣＯＳ−１ （例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ベイビーハムスター腎 （ＢＨＫ）、およびＨＥＫ ２９３ （例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３；Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ３６：５９−７２， １９７７） 細胞系統。
【００７６】
好ましいＢＨＫ細胞系統はｔｋ− ｔｓ１３ ＢＨＫ細胞系統 （ＷａｅｃｈｔｅｒおよびＢａｓｅｒｇａ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：１１０６−１１１０， １９８２）、（以後においてＢＨＫ ５７０細胞と呼ぶ） である。ＢＨＫ ５７０細胞系統は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ） （米国マリイランド州２０８５２、ロックビレパークローンドライブ１２３０１） からＡＴＣＣ受け入れ番号ＣＲＬ １０３１４で入手可能である。また、ｔｋ− ｔｓ１３ ＢＨＫ細胞系統はＡＴＣＣから受け入れ番号ＣＲＬ １６３２で入手可能である。
好ましいＣＨＯ細胞系統は、ＡＴＣＣから受け入れ番号ＣＣＬ ６１で入手可能であるＣＨＯ Ｋ１である。
【００７７】
他の細胞系統は下記のものを包含するが、これらに限定されない：Ｒａｔ Ｈｅｐ Ｉ （ラットヘパトーム；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６００）、Ｒａｔ Ｈｅｐ ＩＩ （ラットヘパトーム；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５４８）、ＴＣＭＫ （ＡＴＣＣ ＣＣＬ １３９）、ヒト肺 （ＡＴＣＣ ＨＢ ８０６５）、ＮＣＴＣ １４６９ （ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９．１）；ＤＵＫＸ細胞 （ＣＨＯ細胞系統） （ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０， １９８０） （ＤＵＫＸ細胞をまたＤＸＢ１１細胞と呼ぶ）、およびＤＧ４４ （ＣＨＯ細胞系統） （Ｃｅｌｌ， ３３：４０５， １９８３およびＳｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２：５５５， １９８６）。
【００７８】
また、３Ｔ３細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、骨髄腫細胞および骨髄腫細胞と他の細胞との融合物は有用である。ある態様において、細胞は、突然変異体または組換え細胞、例えば、それらが由来された細胞型と品質的または定量的に異なるスペクトルの酵素 （タンパク質の翻訳後の修飾を触媒する酵素、例えば、グリコシル化酵素、例えば、グリコシルトランスフェラーゼおよび／またはグルコシダーゼ、またはプロセシング酵素または安定化酵素、例えば、プロペプチド） を発現する細胞であることができる。
【００７９】
ある態様において、本発明の実施において使用する細胞は懸濁培養において増殖することができる。本明細書において使用するとき、懸濁コンピテント細胞は大きい、硬い凝集物を形成しないで懸濁増殖することができる細胞、例えば、単分散性であるか、あるいはほんのわずかの細胞／凝集物で解放された凝集物で増殖する細胞である。懸濁コンピテント細胞は下記のものを包含するが、これらに限定されない：適合または操作しないで懸濁増殖する細胞 （例えば、造血細胞またはリンパ系細胞） および付着依存性細胞　（例えば、上皮細胞または繊維芽細胞） を懸濁増殖に徐々に適合させることによって懸濁コンピテントとされた細胞。
【００８０】
ある態様において、本発明の実施において使用する細胞は付着細胞 （また、足場依存性または付着依存性細胞として知られている） である。本明細書において使用するとき、付着細胞は増殖および成長に適当な表面にそれ自体を付着または定着させることが必要である細胞である。
【００８１】
培地：
本発明は、動物由来成分を欠如する培地中で哺乳動物細胞を培養することを包含する。本明細書において使用するとき、「動物由来」成分は完全な動物において産生される任意の成分 （例えば、血清から単離し、精製されたタンパク質） であるか、あるいは完全な動物において産生される任意の成分を使用することによって作られた成分 （例えば、動物から単離し、精製された酵素を使用して植物源物質を加水分解することによって作られたアミノ酸） である。
【００８２】
対照的に、動物タンパク質の配列を有する （すなわち、動物におけるゲノム起原を有する） が、完全な動物から単離し、精製された成分を欠如する培地中のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養 （例えば、組換え酵母または細菌細胞、または確立された連続的哺乳動物細胞系統、組換え体または非組換え体中の） において産生されるタンパク質は「動物由来」成分ではない（例えば、酵母または細菌細胞中で産生されるインスリン、または確立された哺乳動物細胞系統、例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫまたはＨＥＫ細胞中で産生されるインスリン、またはＮａｗａｌｍａ細胞中で産生されるインターフェロン）。
【００８３】
例えば、動物タンパク質の配列を有する （すなわち、動物におけるゲノム起原を有する） が、組換え細胞中で産生されるタンパク質 （例えば、酵母または細菌細胞中で産生されるインスリン） は「動物由来」成分ではない。したがって、動物由来成分を欠如する細胞培養培地は、組換え的に産生される動物タンパク質を含有できる培地である；しかしながら、このような培地は、例えば、動物の血清またはタンパク質、または動物血清から精製された他の生成物を含有しない。さらに、培地は完全な動物から単離し、精製された任意の他の成分、例えば、脂質、またはアミノ酸を含有しない。このような培地は、例えば、植物に由来する１または２以上の成分を含有することができる。
【００８４】
本発明の条件下に細胞の増殖および維持を支持する、動物由来成分を欠如する細胞培養培地を使用することができる。典型的には、培地は水、モル浸透圧濃度調節因子、緩衝剤、エネルギー源、アミノ酸、無機または組換え鉄源、１または２以上の合成または組換え増殖因子、ビタミン、およびコファクターを含有する。動物由来成分および／またはタンパク質を欠如する培地は、商業的供給会社 （例えば、Ｓｉｇｍａ、ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＧｉｂｃｏおよびＧｅｍｉｎｉ） から入手可能である。
【００８５】
慣用の成分に加えて、因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドの産生に適当な培地は、因子ＶＩＩ中のグルタミン酸残基のγ−カルボキシル化を促進するビタミンＫ１を約０．１〜５０ ｍｇ／ｌ、好ましくは約０．５〜２５ ｍｇ／ｌ、より好ましくは約１〜１０ ｍｇ／ｌ、最も好ましくは約５ ｍｇ／ｌの濃度で含有する。
１つの態様において、培地は下記の組成を有する：
下記表 （表１３〜１４） は、本発明において使用するために適当な培地の組成である。必要に応じて、表１５に記載されている成分の１または２以上を培地に添加する。好ましい範囲は表１５に記載されている。１つの態様において、使用する培地は培地３１８−Ｘである；他の態様において、それは培地ＣＨＯ−Ｋである。
【００８６】
【表１３】
2004512835.tif 000015
【００８７】
【表１４】
2004512835.tif 000016
【００８８】
任意の成分：
【表１５】
2004512835.tif 000017
【００８９】
他の態様において、使用する培地は下記の組成を有する （３１８−Ｕ培地） ：
【表１６】
2004512835.tif 000018
【００９０】
【表１７】
2004512835.tif 000019
【００９１】
１つの態様において、培地は３１８−Ｘ培地であり、細胞系統はＢＨＫ細胞系統である；他の態様において、培地は３１８−Ｕであり、細胞系統はＢＨＫ細胞系統である。他の態様において、培地はＣＨＯ−Ｋであり、細胞系統はＣＨＯ細胞系統である。
好ましい態様において、本発明の実施において使用する細胞は、動物由来成分を欠如する培地、例えば、血清を欠如する培地中の懸濁増殖に対して適合されている。
【００９２】
このような適合手順は下記の文献に記載されている：例えば、Ｓｃｈａｒｆｅｎｂｅｒｇ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｔｏｗａｒｄｓ ｔｈｅ ２１ｓｔ Ｃｅｎｔｕｒｙ， Ｅ． Ｃ． Ｂｅｕｖｅｒｙ ｅｔ ａｌ． （Ｅｄｓ．）， Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， ｐｐ． ６１９−６２３， １９９５ （ＢＨＫおよびＣＨＯ細胞）；Ｃｒｕｚ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｔｅｃｈ． １１：１１７−１２０， １９９７ （昆虫細胞）；Ｋｅｅｎ ＆ Ｓｔｅｗａｒｄ， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：２０３−２１１， １９９５ （骨髄腫細胞）；Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９７２−９７８， １９９３ （ヒト腎臓２９３細胞）。
特に好ましい態様において、宿主細胞はヒト因子ＶＩＩを発現するように操作され、かつ血清または動物由来成分の非存在下に増殖するように適合されたＢＨＫ ２１またはＣＨＯ細胞である。
【００９３】
培養法
本発明は、下記の工程により実施される哺乳動物細胞を大規模培養する方法を提供する：
（ｉ） 動物由来成分を欠如する培地を含有する種母培養容器の中に細胞を接種し、少なくとも細胞が最小交雑播種密度に到達するまで、種母培養物を増殖させ、
（ｉｉ） （ａ） 動物由来成分を欠如する培地を含有する大規模培養容器に、細胞が担体の中に移動する条件下に、増殖種母培養物を移し （マクロ多孔質担体プロセスの場合において） 、そして
（ｉｉｉ） 少なくとも細胞が前もって決定した密度に到達するまで、動物由来成分を欠如する培地中で大規模培養物を増殖させる。
【００９４】
ある態様において、これらの方法は下記の工程による実施される：
（ｉ） 動物由来成分を欠如する培地を含有する種母培養容器の中に細胞を接種し、少なくとも細胞が最小交雑播種密度に到達するまで、種母培養物を増殖させ、
（ｉｉ） （ａ） 動物由来成分を欠如する培地および （ｂ） マクロ多孔質担体を含有する大規模培養容器に、細胞が担体の中に移動する条件下に、増殖種母培養物を移し、そして
（ｉｉｉ） 少なくとも細胞が前もって決定した密度に到達するまで、動物由来成分を欠如する培地中で大規模培養物を増殖させる。
ある態様において、これらの方法は下記の工程をさらに含んでなる：
（ｉｖ） 培地を規則的に収集し、新鮮な培地と置換することによって、動物由来成分を欠如する培地中で工程 （ｉｉｉ） において得られた培養物を維持する。
【００９５】
冷却工程は、１０〜２４０分間、例えば、２０〜１８０分間、または３０〜１２０分間実施した後、細胞含有ミクロ担体を沈降させる。典型的には、この工程は次のようにして実施する：バイオリアクターを冷却し、温度をモニターする。バイオリアクターの温度が培養の設定点より低い前もって決定した温度、例えば、設定点より１０ ℃低い温度に到達したとき、バイオリアクターの攪拌機を停止し、細胞含有担体を沈降させる。培地を交換したとき、温度を再び培養の設定点に調節する。新鮮な培地を添加するとき、それを典型的には培養の設定点に近い温度に前もって加温する。
【００９６】
付着細胞：本発明のある態様において、このプロセスはミクロ担体プロセスであり、使用する細胞は付着細胞である。これらの態様において、増殖期および産生期の両方はミクロ担体の使用を包含する。使用する付着細胞は担体の上に （そしてマクロ多孔質担体を使用する場合、担体の中に） 移動し、そして産生バイオリアクターに移したとき、新しい担体に移動することができる。付着細胞がそれ自体新しい担体に十分に移動することができない場合、細胞含有ミクロ担体とタンパク質分解酵素またはＥＤＴＡとの接触により、付着細胞は担体から遊離することがある。使用する培地 （動物由来成分を含まない） は付着細胞を支持するために適当な成分をさらに含有すべきである；付着細胞の培養に適当な培地は商業的供給会社 （例えば、Ｓｉｇｍａ） から入手可能である。
懸濁適合または懸濁コンピテント細胞をミクロ担体プロセスにおいて使用する場合、細胞の増殖は懸濁において、こうしてミクロ担体の使用を包含する産生期においてのみ実施することができる。
【００９７】
接種および初期増殖：工程 （ｉｉ） のために十分な数の細胞が得られるまで、工程 （ｉ） を反復して種母培養容器の大きさを累進的に増加できることが理解されるであろう。例えば、５リットル、５０リットル、または５００リットルの１または２以上の種母培養容器を順次に使用することができる。種母培養容器は、本明細書において使用するとき、約５リットル〜約１０００リットルの容量を有する容器である。典型的には、細胞を種母培養容器の中に約０．２〜０．４×１０６細胞／ｍｌの初期密度で接種し、培養物が約１．０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度に到達するまで増殖させる。本明細書において使用するとき、最小交雑播種密度は約０．８〜約１．５×１０６細胞／ｍｌである。
【００９８】
ミクロ担体：本明細書において使用するとき、ミクロ担体は下記の性質を有する粒子、しばしばセルロースまたはデキストランをベースとする粒子である：
（ａ） それらは懸濁培養において使用できるために十分に小さい （細胞に対して有意な翦断損傷を引き起こさない攪拌速度を使用する）；
（ｂ） それらは固体、多孔質であるか、あるいは表面上に多孔質コーティングを有する固体コアを有する、および
（ｃ） それらの表面 （多孔質担体の場合において外部および内部） は正に帯電している。
【００９９】
１系列の態様において、ミクロ担体は、約１５０〜３５０ μｍの全体の粒子直径を有する；そして約０．８〜２．０ ｍｅｑ／ｇの正電荷密度を有する。有用なミクロ担体は下記のものを包含するが、これらに限定されない：Ｃｙｔｏｄｅｘ １ＴＭおよびＣｙｔｏｄｅｘ ２ＴＭ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｃｈ． ニュージャージー州ピスカタウェイ）。
１系列の態様において、ミクロ担体は固体担体である。他の系列の態様において、ミクロ担体はマクロ多孔質担体である。
【０１００】
マクロ多孔質担体：本明細書において使用するとき、マクロ多孔質担体は下記の性質を有する粒子、通常セルロースをベースとする粒子である： （ａ） それらは懸濁培養において使用できるために十分に小さい （細胞に対して有意な翦断損傷を引き起こさない攪拌速度を使用する）； （ｂ） それらは細胞が粒子の内部空間の中に移動できるために十分な大きさの孔および内部空間を有する、および
【０１０１】
（ｃ） それらの表面 （外部および内部） は正に帯電している。１系列の態様において、担体は、
（ａ） 約１５０〜３５０ μｍの全体の粒子直径を有し、
（ｂ） 約１５〜約４０ μｍの平均孔開口直径をもつ孔を有し、そして
（ｃ） 約０．８〜２．０ ｍｅｑ／ｇの正電荷密度を有する。
ある態様において、正電荷はＤＥＡＥ （Ｎ， Ｎ−ジエチルアミノエチル） 基により提供される。有用なマクロ多孔質は下記のものを包含するが、これらに限定されない：Ｃｙｔｏｐｏｒｅ １ＴＭおよびＣｙｔｏｐｏｒｅ ２ＴＭ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｃｈ． ニュージャージー州ピスカタウェイ）。Ｃｙｔｏｐｏｒｅ １ＴＭ担体は特に好ましく、これらは２３０ μｍの平均粒子直径、３０ μｍの平均孔大きさ、および１．１ ｍｅｑ／ｇの正電荷密度を有する。
【０１０２】
大規模培養条件：本明細書において使用するとき、大規模培養容器は、少なくとも約１００リットル、好ましくは少なくとも約５００リットル、より好ましくは少なくとも約１０００リットル、最も好ましくは少なくとも約５０００リットルの容量を有する。典型的には、工程 （ｉｉ） は、１５０リットルの培地を含有する５００リットルの培養容器中に、約５０リットルの増殖種母培養物 （約１．０×１０６細胞／ｍｌを有する） を移す。大規模培養は、例えば、温度、ｐＨ、溶解酸素テンション （ＤＯＴ） 、および攪拌速度の適当な条件下に維持され、そして体積は培地を培養容器に添加することによって徐々に増加される。
【０１０３】
ミクロ担体プロセスの場合において、培養容器はまた約７５０ ｇのミクロ担体を含む。移した後、細胞は典型的には最初の２４時間以内に担体表面上に移動する。マクロ多孔質担体プロセスの場合において、培養容器はまた７５０ ｇのマクロ多孔質担体を含む。細胞は典型的には最初の２４時間以内に担体内部の中に移動する。
用語「大規模プロセス」は、用語「工業的規模のプロセス」と互換的に使用することができる。さらに、用語「培養容器」は、用語「槽」、「反応器」および「バイオリアクター」と互換的に使用することができる。
【０１０４】
高いレベルのタンパク質発現：細胞を増殖させて高いレベルの所望のタンパク質を産生させるとき、細胞密度が前もって決定した細胞密度 （例えば、少なくとも約１×１０６細胞／ｍｌ） に到達するまでの期間を「増殖期」と表示する。増殖期は通常工程 （ｉ）、（ｉｉ）、および （ｉｉｉ） を含んでなる。細胞密度が前もって決定した値 （例えば、少なくとも約１×１０６細胞／ｍｌ） に到達するまでの期間を「産生期」と表示する。産生期は通常 （ｉｖ） を含んでなる。適当ならば、結合したパラメーターの変化はこの段階において導入される。
【０１０５】
培養容器：
培養容器は、例えば、慣用の羽根車型により攪拌する、慣用の攪拌された槽反応器 （ＣＳＴＲ） 、または容器の底から空気を導入して攪拌する、エアーリフト反応器であることができる。特定の限界内にコントロールされるパラメーターの例は、ｐＨ、溶解酸素テンション （ＤＯＴ）、および温度である。ｐＨは、例えば、ヘッドスペースガス中のＣＯ２濃度を変化させ、そして必要に応じて培養液体に塩基を添加することによってコントロールすることができる。溶解酸素テンションは、例えば、空気または純粋な酸素またはそれらの混合物でスパージすることによって維持することができる。温度コントロール媒質は水であり、必要に応じて加熱または冷却する。容器を取り囲むジャッケットまたは培養物中に浸漬されたパイピングコイルに水を通過させることができる。
【０１０６】
いったん培地が培養容器から除去されると、それを１または２以上のプロセシング工程にかけて所望のタンパク質を得る。このようなプロセシングは下記のものを包含するが、これらに限定されない：担体の中に固定化された細胞を取出す遠心または濾過；アフィニティークロマトグラフィー；疎水性相互作用クロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；電気泳動手順 （例えば、調製用等電点電気泳動 （ＩＥＦ）；分別溶解度 （例えば、硫酸アンモニウム沈降）；抽出およびその他。一般に、下記の文献を参照のこと：Ｓｃｏｐｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８２；および， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｊ．−Ｃ， ＪａｎｓｏｎおよびＬａｒｓ Ｒｙｄｅｎ， 編者， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９。
【０１０７】
因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドの精製は、例えば、下記のものを包含する：抗因子ＶＩＩ抗体カラム上のアフィニティークロマトグラフィー （例えば、下記文献を参照のこと、Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６１：１１０９７， １９８６；およびＴｈｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７：７７８５， １９８８） および因子ＶＩＩａまたはトリプシン様特異性を有する他のプロテアーゼ、例えば、因子ＩＸａ、カリクレイン、因子Ｘａ、およびトロンビンを使用する、タンパク質分解切断による活性化。例えば、下記の文献を参照のこと：Ｏｓｔｅｒｕｄ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１：２８５３， （１９７２）；Ｔｈｏｍａｓ， 米国特許第４，４５６，６９１号；およびＨｅｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７１：１８３６ （１９８３）。選択的に、因子ＶＩＩはそれをイオン交換クロマトグラフィーカラム、Ｍｏｎｏ−ＱＴＭ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ） またはその他に通過させることによって活性化させることができる。
【０１０８】
大規模生産のためのポリペプチド
ある態様において、本発明の実施において使用する細胞は内因的因子ＶＩＩ遺伝子を発現するヒト細胞である。これらの細胞において、内因的遺伝子は完全であるか、あるいはその場で修飾されているか、あるいは因子ＶＩＩ遺伝子の外側の配列は内因的因子ＶＩＩ遺伝子の発現を変更するように修飾されていることができる。
【０１０９】
他の態様において、組換え遺伝子からヒト因子ＶＩＩを発現させるように、任意の哺乳動物源からの細胞を操作する。本明細書において使用するとき、「因子ＶＩＩ」または「因子ＶＩＩポリペプチド」は野生型因子ＶＩＩ （すなわち、米国特許第４，７８４，９５０号に開示されているアミノ酸配列を有するポリペプチド）、ならびに野生型因子ＶＩＩに関して実質的に同一のまたは改良された生物学的活性を示す因子ＶＩＩの変異型を包含する。用語「因子ＶＩＩ」は非切断 （チモーゲン） 形態の因子ＶＩＩポリペプチド、ならびにそれぞれの生物活性形態を生ずるようにタンパク質分解的にプロセシングされたもの （これは因子ＶＩＩａと表示することができる） を包含する。典型的には、因子ＶＩＩは残基１５２と１５３との間で切断されて因子ＶＩＩａを生ずる。
【０１１０】
本明細書において使用するとき、「因子ＶＩＩ関連ポリペプチド」は、因子ＶＩＩａの生物学的活性が野生型因子ＶＩＩａの活性に関して実質的に変更または減少されている変異型を含む、ポリペプチドを包含する。これらのポリペプチドは、ポリペプチドの生物学的活性を変更または崩壊させる、特異的アミノ酸配列の変更が導入されている因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａを包含するが、これらに限定されない。
【０１１１】
血液凝固における因子ＶＩＩの生物学的活性は、（ｉ） 組織因子 （ＴＦ） に結合するその能力および （ｉｉ） 活性化された因子ＩＸまたはＸ （それぞれ、因子ＩＸａまたはＸａ） を産生する因子ＩＸまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドのタンパク質分解的切断を触媒するその能力に由来する。本発明の目的に対して、例えば、米国特許第５，９９７，８６４号に記載されているように、因子ＶＩＩａの生物学的活性は、因子ＶＩＩ欠乏血漿およびトロンボプラスチンを使用して血液凝固を促進する調製物の能力を測定することによって、定量することができる。
【０１１２】
このアッセイにおいて、生物学的活性は対照試料に関する凝固時間の減少として表され、１単位／ｍｌの因子ＶＩＩ活性を含有するプールしたヒト血清標準と比較することによって「因子ＶＩＩ単位」に変換される。選択的に、因子ＶＩＩａの生物学的活性は、（ｉ） 脂質膜の中に埋め込まれたＴＦと因子Ｘを含んでなる系中で因子Ｘａを産生する因子ＶＩＩａの能力を測定する （Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１９９１９−１９９２４， １９９７）； （ｉｉ） 水性系中の因子Ｘの加水分解を測定する；（ｉｉｉ） 表面プラズモン共鳴をベースとする計装を使用してＴＦに対するその結合を測定する （Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．　４１３：３５９−３６３， １９９７） そして （ｉｖ） 合成基質の加水分解を測定することによって定量することができる。
【０１１３】
野生型因子ＶＩＩに関して実質的に同一のまたは改良された生物学的活性を有する因子ＶＩＩの変異型は、前述したように凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、またはＴＦ結合アッセイの１または２以上において試験したとき、同一細胞型において産生された因子ＶＩＩａの特異的活性の少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％を示す変異型を包含する。
【０１１４】
野生型因子ＶＩＩａに関して実質的に減少した活性を有する因子ＶＩＩ変異型は、前述したように凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、またはＴＦ結合アッセイの１または２以上において試験したとき、同一細胞型において産生された野生型因子ＶＩＩａの特異的活性の約２５％より少ない、好ましくは約１０％より少ない、より好ましくは約５％より少ない、最も好ましくは約１％より少ない特異的活性を示す変異型を包含する。野生型因子ＶＩＩａに関して実質的に変更された活性を有する因子ＶＩＩ変異型は、ＴＦ独立的因子Ｘタンパク質分解活性を示す因子ＶＩＩ変異型およびＴＦに結合するが、因子Ｘを切断しない変異型を包含するが、これらに限定されない。
【０１１５】
因子ＶＩＩの変異型は、野生型因子ＶＩＩと実質的に同一であるか、またはそれよりもすぐれた生物学的活性を示すか、あるいは野生型因子ＶＩＩに関して実質的に変更されたまたは減少した生物学的活性を示すかどうかにかかわらず、１または２以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換により野生型因子ＶＩＩの配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含するが、これらに限定されない。
【０１１６】
野生型因子ＶＩＩと実質的に同一の生物学的活性を有する因子ＶＩＩ変異型の非限定的例は次の通りである：Ｓ５２Ａ−ＦＶＩＩａ、Ｓ６０Ａ−ＦＶＩＩａ （Ｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３５２：１８２−１９２， １９９８）；米国特許第５，５８０，５６０号に開示されているような増加したタンパク質分解安定性を示すＦＶＩＩａ変異型；残基２９０と２９１との間または残基３１５と３１６との間でタンパク質分解的に切断された因子ＶＩＩａ （Ｍｏｌｌｅｒｕｐ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ４８：５０１−５０５， １９９５）；および因子ＶＩＩａの酸化された形態 （Ｋｏｍｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３６３：４３−５４， １９９９）。
【０１１７】
野生型因子ＶＩＩに関して実質的に減少したまたは変更された生物学的活性を有する因子ＶＩＩの非限定的例は次の通りである：Ｒ１５２Ｅ−ＦＶＩＩａ （Ｗｉｌｄｇｏｏｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２９：３４１３−３４２０，１９９０）、Ｓ３４４Ａ−ＦＶＩＩａ （Ｋａｚａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：６６−７２， １９９５）、ＦＦＲ−ＦＶＩＩ （Ｈｏｌｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｖａｓｃ． Ｅｎｄｏｖａｓｃ． Ｓｕｒｇ． １５：５１５−５２０，１９９８）、およびＧｌａドメインを欠如する因子ＶＩＩａ （Ｎｉｃｏｌａｉｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ． ３１７：２４５−２４９， １９９３）。
【０１１８】
下記の実施例は本発明の例示であるが、本発明を限定するものと解釈すべきでない。
実施例
実施例１．因子ＶＩＩの無血清調製
大規模培養において因子ＶＩＩを調製するために、下記の実験を実施した。
因子ＶＩＩエンコーディングプラスミドで形質転換したＢＨＫ細胞系統を、血清の非存在下に懸濁培養で増殖するように適合させた。細胞を無血清懸濁培養に対する適合させ、回転培養において順次に増殖させた；細胞の数が増加するにつれて、新しい培地の添加により体積を徐々に増加させた。
【０１１９】
最後に、マクロ多孔質Ｃｙｔｏｐｏｒｅ １担体 （Ｐｈａｒｍａｃｉａ） を含有する１００リットルの調製バイオリアクターの中に６リットルの種母培養物を接種し、次いで接種後２４時間以内に懸濁細胞は担体の中に固定化されるようになった。３６ ℃、ｐＨ ６．７〜６．９および飽和の５０％の溶解酸素テンション （ＤＯＴ） において、培養を維持した。細胞数が増加するにつれて、新しい培地の添加により調製バイオリアクター中の体積を徐々に増加させた。
【０１２０】
細胞密度がほぼ２×１０６細胞／ｍｌに到達したとき、産生期を開始させ、培地の交換を２４時間毎に実施した：攪拌を停止し、細胞を含有する担体を沈降させ、次いで培養上清の８０％を収集し、新しい培地と置換した。収集した培養上清を濾過して非捕捉細胞 （すなわち、担体の中に固定化されなかった細胞） および細胞破片を除去し、次いでそれ以上プロセシングするために移した。
産生期の間に、細胞は３〜６×１０６細胞／ｍｌおよび２〜７ ｍｇの因子ＶＩＩ／リットルの力価に到達した。
【０１２１】
実施例２．因子ＶＩＩの無血清調製
大規模培養において因子ＶＩＩを調製するために、下記の実験を実施した。
ヒト因子ＶＩＩの発現用プラスミドベクターｐＬＮ１７４は記載された （ＰｅｒｓｓｏｎおよびＮｉｅｌｓｅｎ， １９９６， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３８５：２４１−２４３）。簡単に述べると、それはヒト因子ＶＩＩをコードするｃＤＮＡヌクレオチド配列を保持し、挿入されたｃＤＮＡの転写用マウスメタロチオネインプロモーターの制御下にポリペプチド、および選択可能なマーカーとして使用するためのＳＶ４０初期プロモーターの制御下にマウスジヒドロ葉酸レダクターゼｃＤＮＡを含む。
【０１２２】
γ−カルボキシル化認識配列をコードするプラスミドベクターを構築するために、そのポリペプチドを含む因子ＶＩＩをコードするｃＤＮＡを含有するクローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） を使用した （ｐＬＮ１７１）。（Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１９９１９−１９９２４）。このクローニングベクター上の逆位ＰＣＲ仲介突然変異誘発により因子ＶＩＩのポリペプチド後に因子ＶＩＩをコードするｃＤＮＡの中に、停止コドンをコードするヌクレオチド配列を挿入した。ＮａＯＨを使用する処理および引き続く下記のプライマーとともにＰｗｏ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ） およびＴａｑ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ） ポリメラーゼを使用するＰＣＲにより鋳型プラスミドを変性した：
ａ）　５’−ＡＧＣ ＧＴＴ ＴＴＡ ＧＣＧ ＣＣＧ ＧＣＧ ＣＣＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＧＡＣ−３’
ｂ）　５’−ＣＧＣ ＣＧＧ ＣＧＣ ＴＡＡ ＡＡＣ ＧＣＴ ＴＴＣ ＣＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＣＧＧ ＣＣ−３’
【０１２３】
生ずる混合物をＤｐｎＩで消化して残留鋳型ＤＮＡを消化し、大腸菌 （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） をＰＣＲ生成物で形質転換した。クローンを配列決定により突然変異の存在についてスクリーニングした。正しいクローンからのｃＤＮＡをＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとして、発現プラスミドｐｃＤＮＡ３ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） に移した。生ずるプラスミドをｐＬＮ３２９と命名した。ＣＨＯ Ｋ１細胞 （ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１） を、Ｆｕｇｅｎｅ６法 （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ） に従い、等しい量のｐＬＮ１７４およびｐＬＮ３２９でトランスフェクトした。メトトレキセートを１ μＭに添加し、Ｇ−４１８を０．４５ ｍｇ／ｍｌに添加することによって、トランスフェクタントを選択した。トランスフェクタントのプールを限界希釈法によりクローニングし、クローンからのＦＶＩＩの発現を測定した。
【０１２４】
高い生産性のクローンをさらにサブクローニングし、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ変性イーグル培地中で２．４ ｐｇ／細胞／日の特異的ＦＶＩＩ発現を示すクローンＥ１１を選択した。商業的に入手可能な動物由来成分を含まないＣＨＯ培地 （ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ） 中の無血清懸濁培養に対して、クローンを適合させた。
適合させた細胞を回転培養において順次に増殖させ、細胞の数が増加するにつれて、新しい培地の添加により体積を徐々に増加させた。
２５日後、６リットルの回転培養物を５０リットルのバイオリアクターの中に接種した。細胞をバイオリアクター中で増殖させ、細胞の数が増加するにつれて、新しい培地の添加により体積を徐々に増加させた。
【０１２５】
最後に、マクロ多孔質Ｃｙｔｏｐｏｒｅ １担体 （Ｐｈａｒｍａｃｉａ） を含有する５００リットルの調製バイオリアクターの中に５０リットルの種母培養物を接種し、次いで懸濁細胞は担体の中に固定化されるようになった。３６ ℃、ｐＨ ７．０〜７．１および飽和の５０％の溶解酸素テンション （ＤＯＴ） において、培養を維持した。細胞数が増加するにつれて、新しい培地の添加により調製バイオリアクター中の体積を徐々に増加させた。
【０１２６】
細胞密度がほぼ１０〜１２×１０５細胞／ｍｌに到達したとき、産生期を開始させ、培地の交換を２４時間毎に実施した：攪拌を停止し、細胞を含有する担体を沈降させ、次いで培養上清の８０％を収集し、新しい培地と置換した。収集した培養上清を濾過して非捕捉細胞 （すなわち、担体の中に固定化されなかった細胞） および細胞破片を除去し、次いでそれ以上プロセシングするために移した。
産生期間の間に、細胞は２〜３×１０７細胞／ｍｌおよび８ ｍｇの因子ＶＩＩ／リットルの力価に到達した。
【０１２７】
実施例３．因子ＶＩＩの無血清調製
大規模培養において因子ＶＩＩを調製するために、下記の実験を実施した。
高い生産性ＣＨＯクローンを実施例２に記載されているようにして調製した。
適合させた細胞を回転培養において順次に増殖させ、細胞の数が増加するにつれて、新しい培地の添加により体積を徐々に増加させた。
２５日後、６リットルの回転培養物を５０リットルのバイオリアクターの中に接種した。細胞をバイオリアクター中で増殖させ、細胞の数が増加するにつれて、新しい培地の添加により体積を徐々に増加させた。
【０１２８】
最後に、マクロ多孔質Ｃｙｔｏｐｏｒｅ １担体 （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｃｈ．） を含有する５００リットルの調製バイオリアクターの中に５０リットルの種母培養物を接種し、次いで懸濁細胞は担体の中に固定化されるようになった。３６ ℃、ｐＨ ７．０〜７．１および飽和の５０％の溶解酸素テンション （ＤＯＴ） において、培養を維持した。細胞数が増加するにつれて、新しい培地の添加により調製バイオリアクター中の体積を徐々に増加させた。細胞密度がほぼ１０〜１２×１０５細胞／ｍｌに到達したとき、産生期を開始させ、培地の交換を２４時間毎に実施した：攪拌を停止し、細胞を含有する担体を沈降させ、次いで培養上清の８０％を収集し、新しい培地と置換した。収集した培養上清を濾過して非捕捉細胞 （すなわち、担体の中に固定化されなかった細胞） および細胞破片を除去し、次いでそれ以上プロセシングするために移した。
【０１２９】
第１４日以降から、培地を２ ｇ／ｌのＨＹ−ＳＯＹ （大豆加水分解物タンパク質） で強化した。
第４１日以降から、培養物を設定点より１０ ℃低い温度 （すなわち、２６ ℃） に冷却し、直ちに毎日の培地交換物を導入した。冷却工程の目的は、攪拌を停止する前に、細胞の酸素必要条件を減少させることであり、細胞を有する担体を発酵槽の底に沈降させた。
【０１３０】
産生期間の間に、細胞は２．５〜３．５×１０７細胞／ｍｌおよび８〜１３ ｍｇの因子ＶＩＩ／リットルの力価に到達した。
本明細書において言及したすべての特許、特許出願、および参考文献は、引用することによって本明細書の一部分とされる。
前述の説明に照らして見ると、本発明の多数の変形は当業者にとって明らかとなるであろう。このような明らかの変形は本発明の完全な意図する範囲内に入る。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、標準的ミクロ担体プロセスのダイヤグラムである。
【図２】
図２は、ミクロ担体潅流プロセスのダイヤグラムである。
【図３】
図３は、簡単な抜き出し−充填プロセスのダイヤグラムである。
【図４】
図４は、本発明に従い適当なプロセスの異なる型のダイヤグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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