(57)【要約】本発明は、ＫＣＮＱ５活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、いくつかのＫＣＮＱ５関連ポリヌクレオチド配列、およびカリウムチャネルＫＣＮＱ５の活性を修飾する化合物の同定のためのスクリーニングアッセイに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドが次の群：
ａ）カリウムチャネルＫＣＮＱ５のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｃ）ｂ）が１つまたはそれ以上のアミノ酸を欠失しているポリペプチド、または
ｄ）ｂ）が１つまたはそれ以上の置換されたアミノ酸を有するポリペプチド、から選択されるものである、ＫＣＮＱ５活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。
【請求項２】
次の群のポリヌクレオチド配列：
ａ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１のポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
ｂ）ａ）に関するポリヌクレオチド配列に対してストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
ｃ）ａ）に関するポリヌクレオチド配列に対して、低または中程度のストリンジェンシーの条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
ｄ）ａ）、ｂ）、またはｃ）の１つに定義されるポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列
のうち少なくとも１つから選択される請求項１記載のＤＮＡ配列。
【請求項３】
ＤＮＡ配列が哺乳類の部分である請求項１または２記載のＤＮＡ配列。
【請求項４】
ＤＮＡ配列がヒトの部分である請求項１または２記載のＤＮＡ配列。
【請求項５】
ベクターが、
ａ）原核細胞または真核細胞で増加するために適したベクターに関するポリヌクレチドエレメント、
ｂ）請求項１〜４のうちのいずれかに記載のＤＮＡ配列
からなるものである、組換えＤＮＡベクター。
【請求項６】
原核細胞において、特に微生物の細胞において、ベクターを増殖に適当なものとするポリヌクレオチド配列からなる、請求項６記載の組換えＤＮＡベクター。
【請求項７】
微生物の細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃの細胞である、請求項５または６記載の組換えＤＮＡベクター。
【請求項８】
真核細胞において、特に細胞系の細胞または酵母細胞において、ベクターを増殖に適当なものとするポリヌクレオチド配列からなる請求項６記載の組換えＤＮＡベクター。
【請求項９】
細胞系の細胞がＣＯＳ細胞系、Ｈｅｌａ細胞系、または３Ｔ３細胞系であり、酵母細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞である、請求項８記載の組換えＤＮＡベクター。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡ配列が関連ＲＮＡの転写および／または関連タンパク質の発現をさせるプロモーター配列に実施可能に結合するものである、請求項５〜９のいずれかに記載の組換えＤＮＡベクター。
【請求項１１】
プロモーター配列が原核プロモーターである、請求項１０記載の組換えＤＮＡベクター。
【請求項１２】
プロモーター配列が真核プロモーターである、請求項１０記載の組換えＤＮＡベクター。
【請求項１３】
プロモーター配列が誘導可能である請求項１１および１２記載の組換えＤＮＡベクター。
【請求項１４】
請求項５〜１３記載の少なくとも１つの組換えＤＮＡベクターを包含する宿主細胞。
【請求項１５】
宿主細胞が真核細胞または原核細胞である、請求項１４記載の宿主細胞。
【請求項１６】
原核細胞が微生物、特にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃの細胞である、請求項１５記載の宿主細胞。
【請求項１７】
真核細胞が細胞系の細胞、特にＣＯＳ細胞系、Ｈｅｌａ細胞系、または３Ｔ３細胞系の細胞、または酵母細胞、特にＳａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞である、請求項１５記載の宿主細胞。
【請求項１８】
請求項５〜１３のいずれかに記載の組換えＤＮＡベクターにより宿主細胞が形質転換されるものである、請求項１４〜１７のいずれかに記載の宿主細胞の製造。
【請求項１９】
請求項１〜４記載のＤＮＡ配列の一つにコードされたタンパク質。
【請求項２０】
第１に請求項１４〜１７のいずれかに記載の宿主細胞を培養し、第２にその細胞を採集して処理し、次いで第３にタンパク質の精製をするものである、請求項１６記載のタンパク質の製造。
【請求項２１】
ｅ）ＫＣＮＱ５、または請求項１９または２０記載のタンパク質を用意すること；
ｆ）少なくとも１つの化合物を用意すること；
ｇ）請求項１記載のｂ）の化合物をａ）のタンパク質とインキュベートすること；
ｈ）請求項１記載のａ）のタンパク質の活性を測定すること
からなる、請求項１９または２０に記載のＫＣＮＱ活性を有するタンパク質の活性の修飾に適した化合物を同定する方法。
【請求項２２】
請求項１のａ）に記載のタンパク質が、請求項１４〜１７のいずれかに記載の宿主細胞内に提供され、その宿主細胞がそのタンパク質を発現するものである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
請求項１のａ）に記載のタンパク質がＫＣＮＱ３と相互作用するものである、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
次の工程：
ｄ）生物学的材料を提供すること；
ｅ）その生物学的材料とＫＣＮＱ５活性を修飾する化合物または請求項１９または２０記載のタンパク質と、さらに必要な場合には参照目的でＫＣＮＱ５の活性を修飾しない化合物または請求項１９または２０記載のタンパク質をインキュベートすること；
ｆ）生物学的材料とｂ）の化合物をインキュベートした後に、ＫＣＮＱ５または請求項１９または２０記載のタンパク質の活性を測定すること；
からなる、請求項１９または２０記載のＫＣＮＱ５活性を有するタンパク質の検出方法。
【請求項２５】
異なる部分、特にＫＣＮＱ５活性の修飾に好適な化合物からなる試験用キット。
【請求項２６】
ＫＣＮＱ５または請求項１９または２０のいずれかに記載のタンパク質の活性を修飾するのに適した化合物であって、その化合物が請求項２１〜２３のいずれかに従って同定されたものである化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、新規なカリウムチャネルタンパク質であるＫＣＮＱ５に関するものであり、 それは中枢神経系疾患および心血管系疾患の標的であると考えられている。そのタンパク質は中枢神経系および心血管系の疾患の症状を改善する化合物を同定するためのスクリーニングツールとして用いられている。
【０００２】
電位依存性カリウムチャネルは静止膜電位のキー・レギュレーターであり、ニューロンおよび心筋細胞のような電気的に活性な細胞の興奮性を調節する。電位依存性Ｋ＋チャネルのクラスのいくつかがクローン化されており、恐らく全てが４つのα−タンパク質サブユニットの会合によって、オリゴマーのタンパク質を形成する。さらに、４量体のポア複合体は、ポアを形成するα−サブユニットによって媒介される電流を増強および／または修飾する補助的なサブユニットと相互作用できる。
【０００３】
電位依存性Ｋ＋チャネルであるＫＣＮＱファミリーは、元来６個の膜貫通型ドメインおよび特徴的なポア領域を有し、Ｋ＋チャネルタンパク質をコードするＫＣＮＱ１遺伝子（ＫｖＬＱＴ１）のポジショナルクローニングによって確立された。従来、ＫＣＮＱファミリーはその全てがヒト疾患に関連する４つのメンバーからなる。 ＫＣＮＱ１は単一の膜貫通ドメインを有する小さなβ−サブユニットタンパク質であるＫＣＮＥ１と機能的に相互作用し、心筋細胞の緩徐活性化型遅延整流性ＩＫＳ電流を生じる。両方のサブユニットにおける不活性化型突然変異により、ＱＴ延長症候群（ＬＱＴＳ）の患者にて心室活動電位の延長および心室不整脈の危険が増加するという結果になる。また、ＫＣＮＱ１およびＫＣＮＥ１は内耳で発見され、ＫＣＮＥ１およびＫＣＮＱ１の機能的変異のいくつかの欠失は聴力損失と関連する。おそらく腸においてＫＣＮＱ１は構造的に関連したＫＣＮＥ３タンパク質に関与し、異なるＫ＋チャネルを生成している。ＫＣＮＱ１／ＫＣＮＥ３チャネル複合体は、先端の（ａｐｉｃａｌ）ｃＡＭＰ刺激性塩化物イオン分泌におそらく重要である結腸陰窩における基底外側の（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ）ｃＡＭＰ制御されたＫ＋コンダクタンスを示し、それは分泌性下痢および結腸線維症に関係している。
【０００４】
ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３は脳で発現し、多様な脳領域において共局在する（Ｂｉｅｒｖｅｒｔ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．； Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９， ４０３−４０６， １９９８）。一方、ＫＣＮＱ２はＫＣＮＱ１と大変似たＫ＋電流を発生する（Ｓｃｈｒｏｕｄｅｒ， Ｂ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．； Ｎａｔｕｒｅ ３９６， ６８７−６９０， １９９８）。ＫＣＮＱ３は、単独で小さい電流のみを作り出す（Ｗａｎｇ， Ｗ．−Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３， １９４１９−１９４２３， １９９８）。ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３の両方を共発現させることにより、ＫＣＮＱ２単独の電流よりも少なくとも１０倍大きい電流が結果として生じた（Ｗａｎｇ， Ｈ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２， １８９０−１８９３， １９９８）ことから、ＫＣＮＱ３はＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３サブユニットのヘテロマー複合体を形成することによって、ＫＣＮＱ２サブユニットの発現を促進するということが示唆された。ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３をコードする遺伝子は、ヒト胎児のてんかんの形態とそれらが連鎖するためにクローン化され、機能損失（ｌｏｓｓ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）型突然変異は、良性家族性新生児痙攣（ＢＮＦＣ）の患者の両方の遺伝子において同定された（Ｓｉｇｈ， Ｎ． Ａ． ｅｔ ａｌ．； Ｎ． Ｇｅｎｅｔ． １８， ２５−２９， １９９８； Ｃｈａｒｉｉｅｒ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．； Ｎ． Ｇｅｎｅｔ． １８， ５３−５５， １９９８）。てんかんは脳における電気的な異常興奮性によるものであるので、ＫＣＮＱは神経系において重要な安定化の役割を担っているようである。ＫＣＮＱ２／ＫＣＮＱ３電流の生物物理学的および薬理学的な特徴は、ムスカリン様の調節によっても特徴付けられ、同様に神経の興奮性の重要なレギュレータであると考えられている自然のニューロンのＭ型Ｋ＋電流の特徴と極めて類似している。自然のＭ型電流と同様に、ＫＣＮＱ２／ＫＣＮＱ３チャネル活性は、ムスカリン性アセチルコリンアゴニストによって強く減少し、それ故に、現在、ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３サブユニットは自然のＭ型チャネルに貢献すると考えられている。
【０００５】
この遺伝子ファミリーの他のメンバーであるＫＣＮＱ４は、うずまき管の外毛感覚細胞（ｓｅｎｓｏｒｙ ｏｕｔｅｒ ｈａｉｒ ｃｅｌｌ）において発現しており、優性難聴において突然変異している。また、興味深いことには、ＫＣＮＱ／ＫＣＮＱ３共発現で観察されたよりもずっと少ない範囲ではあるが、ＫＣＮＱ３およびＫＣＮＱ４の共発現により電流の振幅が増加する。これにより異なるＫＣＮＱチャンネルが組み合わさって、神経系の異なった部分におけるＭ型電流の変形を生じるという可能性が生じる。
【０００６】
本発明の課題は、多様な疾患の治療のための標的として使用するために、ＫＣＮＱファミリーに属する他のメンバーの遺伝子（タンパク質を含む）を同定することであった。
【０００７】
ＫＣＮＱ５は脱分極によって活性化され、他のＫＣＮＱチャネルによって生じる電流と極めて類似するＫ＋チャネルを作り出す。ＫＣＮＱ５は骨格筋および脳において発現し、その発現パターンは、自然のＭ型電流の基礎になるＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３の発現パターンと重複する。ＫＣＮＱ２と同様に、ＫＣＮＱ５はＫＣＮＱ３と機能的ヘテロマーを形成し、これはおそらく、ニューロンのＭ型チャネルもまたＫＣＮＱ５サブユニットを含むことができるということを示唆するものである。
【０００８】
本発明の主題は、ＫＣＮＱ５活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に関するもので、そのポリペプチドは次の群から選択される：
ａ） カリウムチャンネルであるＫＣＮＱ５のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｂ） ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｃ） ｂ）が１つまたはそれ以上のアミノ酸において欠失するものであるポリペプチド、
ｄ） ｂ）に関して１つまたはそれ以上のアミノ酸が置換されているポリペプチド。
【０００９】
さらに、本発明はＤＮＡ配列に関するものであり、そのＤＮＡ配列は、次の群のポリヌクレオチド配列の少なくとも１つから選択される：
ａ） ＳＥＱ　ＩＤ Ｎｏ．１のポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
ｂ） ａ）に関するポリヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
ｃ） ａ）に関するポリヌクレオチド配列に、低または中程度のストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
ｄ） ａ）、ｂ）、またはｃ）の１つに定義されたようなポリヌクレオチド配列に相補性を有するポリヌクレオチド配列。
【００１０】
上記のようなＤＮＡ配列は、ＫＣＮＱ５に対する遺伝子が存在する各器官のゲノムの部分であることができる。特に、そのＤＮＡ配列は哺乳類またはヒトの部分である。本発明の目的のための哺乳類の内で好ましい種類は、マウスおよびラットである。
【００１１】
さらに、本発明は、組換えＤＮＡベクターに関するものであり、前記ベクターはポリヌクレオチド配列からなり、原核細胞または真核細胞における増殖に好適なベクターに関するもので、ＫＣＮＱ５のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列をコードする、前述のＤＮＡ配列である。この増殖に好適なベクターに関するＤＮＡ配列は、複製起点であることができ、原核細胞または真核細胞において正しく機能する。原核細胞で機能する複製起点の例は、ｃｏｌＥ１ ｏｒｉである。組換えベクターには、さらに、ベクターを含むこれらの生物の増殖を制御するための選択マーカーが必要である。選択マーカーとして好適なものは、抗生物質（例えばアンピシリン、ストレプトマイシン、クロラムフェニコール）から生物を保護する（抗生物質耐性）遺伝子か、または細胞内タンパク質として発現される場合に環境的条件（独立栄養で増殖する条件）から除去された化合物の存在下で増殖させる遺伝子である。
【００１２】
前記の組換えベクターの増殖のための本発明の好ましい実施態様においては、原核細胞はバクテリアである。本発明の特に好ましい変形においては、バクテリアは特にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃのバクテリアである。前記組換えベクターの増殖のための本発明のさらに好ましい実施態様においては、真核細胞は、細胞系の細胞または酵母細胞である。本発明の特に好ましい変形においては、細胞系の細胞がＣＯＳ細胞系、Ｈｅｌａ細胞系または３Ｔ３細胞系の細胞であり、酵母細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞である。
【００１３】
前記組換えＤＮＡはプロモーター配列を提供でき、それはＫＣＮＱ５のアミノ酸配列またはポリヌクレオド配列をコードするＤＮＡ配列に操作可能に結合しており、関連ＲＮＡの転写および／または関連タンパク質の発現をさせる。このプロモーター配列は、原核プロモーターまたは真核プロモーターから本発明の好ましい変形をとることができる。真核プロモーターが真核生物で転写を誘導することができることによって特徴付けられるように、原核プロモーターは、原核生物における転写を誘導することができることによって特徴付けられる。原核プロモーターおよび真核プロモーターの配列の両方が、好ましい誘導プロモーターまたはさらに好ましい構造プロモーターであることができる。誘導プロモーターは、シグナルが存在する場合にのみスイッチされる。
【００１４】
シグナルは生物の代謝によって生じ得る。次に、シグナルはしばしば代謝産物、ホルモン、巨大分子の分解産物または他の代謝誘導物質からなる。また、シグナルは環境から提供され得る。
【００１５】
次に、それは環境由来の放射線照射、温度または化合物から構成され得る。構造プロモーターは、活性化のために誘導する必要が全くない。
【００１６】
さらに本発明は宿主細胞を包含し、この宿主細胞は前記の組換えＤＮＡベクターの少なくとも１つからなる。宿主細胞は原核細胞または真核細胞由来が好ましい。宿主細胞が原核細胞である場合に、宿主細胞はバクテリア、特に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃの細胞であることが好ましい。この宿主細胞が真核細胞で構成される場合には、宿主細胞は細胞系の細胞、特に、ＣＯＳ細胞系、Ｈｅｌａ細胞系または３Ｔ３細胞系または酵母細胞、特にＳａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞であるのが好ましい。
【００１７】
この宿主細胞は、ＫＣＮＱ５のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列をコードするＤＮＡ配列からなる、組換えＤＮＡベクターによって前記の宿主細胞を形質転換させることによって作製することができる。例えばリン酸カルシウム沈殿法またはエレクトロポレーション法によるコンピテント細胞の形質転換のような、微生物学で用いられる通常の方法によって形質転換することができる。
【００１８】
また、本発明は、前記のＤＮＡ配列の１つによりコードされるタンパク質に関する。このタンパク質はＫＣＮＱ５活性を有する。ＫＣＮＱ５活性は、このタイプのトランスポータのイオン輸送によって特徴付けされる。さらに、包含されるものはタンパク質の製造であり、それは最初にＫＣＮＱ５のアミノ酸配列およびポリヌクレオチド配列をコードするＤＮＡ配列を含む組換えベクターを含有する宿主細胞は、関連する細胞のタイプによってバクテリア用または真核細胞用の培地のいずれかから選択される好適な増殖培地にて増殖する。
第２に、この増殖した細胞は遠心分離または濾過のような生化学の常法によって採集され、処理されて、細胞粗抽出物を得る。第３に、次いでこれらの細胞抽出物はサイズ交換クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニテイークロマトグラフィー他といったタンパク質精製に用いられる方法によって精製され、細胞溶解液の他の組成物から単離した興味のあるタンパク質 （ＫＣＮＱ５）を得られる。
【００１９】
さらに、本発明は、化合物の同定のための方法を包含し、その化合物は、
ａ） ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５活性を有するタンパク質を用意すること、
ｂ） 少なくとも１つの化合物を用意すること；
ｃ） ｂ）の化合物とａ）のタンパク質とをインキュベートすること；
ｄ） ａ）のタンパク質の活性を測定すること
からなる、前記のようなＫＣＮＱ５活性を有するタンパク質の活性の修飾に好適である。
本発明の好ましい実施態様において、ａ）からクレームされたようにＫＣＮＱ５活性を有するタンパク質は、前記のような宿主細胞内に提供される。ＫＣＮＱ５は、この発明の目的のために本発明のさらに好ましい変形において、他のタンパク質と相互作用し得る。特に、それはＫＣＮＱ３と相互作用する。このようなスクリーニングアッセイは、ＫＣＮＱ５活性を修飾する少なくとも１つの化合物を同定するのに適用でき、それは中枢神経系または心血管系の疾患に影響を与える。
【００２０】
さらに、本発明は、次の工程；
ａ） 生物学的材料を用意して、
ｂ） 生物学的材料とＫＣＮＱ５活性を有するタンパク質の活性を修飾する化合物、そして必要な場合には参照目的で、ＫＣＮＱ５活性を調節しない化合物と、インキュベートし；
ｃ） 生物学的材料とｂ）の化合物とをインキュベートした後に、ＫＣＮＱ５活性を有するタンパク質の活性を測定すること
からなるＫＣＮＱ５活性を有するクレームされたようなタンパク質の検出方法に関する。
【００２１】
さらに、本発明に包含されるものは、異なる部分、特にＫＣＮＱ５活性を修飾するのに適した化合物からなる試験キットである。
このような化合物は、ＫＣＮＱ５活性を有するタンパク質の修飾のためのこの試験用キットの部分として適用でき、前記のような方法に従って同定され得る。
【００２２】
【実施例】
実施例１：ＫＣＮＱ５の分子クローニングおよび発現
カリウムチャネルＫＣＮＱファミリーの新規なメンバーであるＫＣＮＱ５を単離した。その遺伝子は、脳および骨格筋の異なった領域において発現している。アフリカツメガエル卵母細胞で発現させた場合に、ＫＣＮＱ５は単独では電位依存性であり、Ｋ＋チャネル遮断薬であるＴＥＡに非感受性であるＫ＋選択性電流をゆっくり活性化する、正の膜電圧で著しい内向き整流を示す。関連するＫＣＮＱ３チャネル内で共発現するとＫ＋電流の増幅が４〜５倍に増加した。また、ホモマーのＫＣＮＱ５電流に比較して、ＫＣＮＱ３／ＫＣＮＱ５ヘテロマーの電流は、遅延活性化および内向き整流の減少を示し、ＫＣＮＱ５がＫＣＮＱ３と結合して機能性チャネルタンパク質を形成することを示す。ニューロンＭ様電流の既知のタンパク質サブユニットであるＫＣＮＱ５およびＫＣＮＱ３間における機能的相互作用は、ＫＣＮＱ５がおそらく自然のニューロンＭ様電流に貢献できると示唆される。
最初に、ＫＣＮＱ５遺伝子はＧｅｎＢａｎｋのホモロジーサーチにおいてゲノムサーベイシークエンス（ＢＡＣクローン） （寄託番号 ＡＱ３４４２４３）として同定された。この配列を用いて、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリー （Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓから市販）をスクリーニングした。合成された全長のｃＤＮＡ構築物は、２つの重複するｃＤＮＡクローンから集められて、アフリカツメガエル用発現ベクターであるｐＳＧＥＭ中にサブクローニングされた（Ｖｉｌｌｍａｎｎ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．； Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １７， ７６３４−７６４３）。ｃＤＮＡは自動ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ３１０）を用いて、両鎖の配列決定された。アフリカツメガエル卵母細胞にて発現させるために、キャップ化されたｃＲＮＡはＴ７ ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅキット（ＡＭＢＩＯＮ）を用いて合成した。ノーザンブロット分析用には、ＤＩＧ標識された長さ１．６ｋｂのリボプローブ（主にＣ末端配列を含有する）を製品説明書に従ってＤＩＧ ＲＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ （ＲＯＣＨＥ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから市販）で作製し、一連のヒトＲＮＡブロット（ＣＬＯＮＴＥＣＨから市販）とハイブリダイズした。
【００２３】
実施例２： ＫＣＮＱ５の染色体上の局在性
蛍光Ｉｎ Ｓｉｔｕ ハイブリッド形式 （ＦＩＳＨ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓから市販）分析は、ＫＣＮＱ５の染色体上の位置決定を決定するために実施された。簡単に言えば、ＢＡＣクローン（ＡＱ３４４２４３）から精製されたＤＮＡは、ニックトランスレーション法によってジゴキシゲニンｄＵＴＰで標識し、標識されたプローブをＰＨＡ刺激された末梢血液リンパ球から誘導されたヒトの中期染色体にハイブリダイズした。ＫＣＮＱＳに特異的なシグナルは、蛍光抗ジゴキシゲニン抗体を用いて第６番染色体の長腕（６ｑ１４）に検出され、次にＤＡＰＩで対比染色し、以前６ｐ２１にマップされたゲノムのクローンと共にハイブリダイズすることによって確認した。
【００２４】
実施例３： 電気生理学
アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞をトリカインで麻酔した動物から得た。卵巣をＯＲ ２溶液（ＮａＣｌ ８２．５ｍＭ， ＫＣｌ ２ｍＭ， ＭｇＣｌ２１ｍＭ， ＨＥＰＥＳ ５ｍＭ， ｐＨ ７．４）中で１２０分間コラゲナーゼ（１ｍｇ／１ｍｌ， Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，タイプＩＩ）処理し、
次いでＮＤ−９６（ＮａＣｌ ９６ｍＭ， ＫＣｌ ２ｍＭ， ＣａＣｌ２ １．８ｍＭ， ＭｇＣｌ２ １ｍＭ， ＨＥＰＥＳ ５ｍＭ， ｐＨ ７．４）、さらにピルビン酸ナトリウム（２７５ｍｇ／ｌ）、テオフィリン（９０ｍｇ／ｌ）およびゲンタマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を加えた記録（ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ）溶液中に１８℃で保存した。卵母細胞は、ｈＫＣＮＱ５、ｒＫＣＮＱ３ （ＧｅｎＢａｎｋ 寄託番号 ＡＦ０８７４５４）、ｈＫＣＮＱ２およびｈＫＣＮＱ１をコードする１０ｎｇのｃＲＮＡとそれぞれ個別に注入するか、または１０ｎｇのｈＫＣＮＱ５に加えて、５ｎｇ ｈｌｓｋ （ＫＣＮＥ１）、ｈＭｉＲＰ１（ＫＣＮＥ２）、ｈＭｉＲＰ２（ＫＣＮＥ３）、ｍＭｉＲＰ３（ＫＣＮＥ４）をそれぞれ共に注入した。ｒＫＣＮＱ３は、プローブとしてＤＩＧ標識された（ＲＯＣＨＥ） ＥＳＴクローン（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡ０１９１２９）を用いてλＺＡＰ ｃＤＮＡライブラリー（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）からクローン化された。公開されたシークエンス（１３）から得られたプライマーを用いて、ｈＭｉＲＰ１およびｈＭｉＲＰ２はヒトゲノムＤＮＡから、ｍＭｉＲＰ３はハツカネズミ脳ｃＤＮＡから、クローン化された。
標準的な二電極電圧−固定記録法（ｔｗｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ｖｏｌｔａｇｅ−ｃｌａｍｐ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ）は、室温でＴｕｒｂｏ Ｔｅｃ １０ＣＤ（ＮＰＩ）増幅器、Ｐｕｌｓｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＨＥＫＡ）と組合わせたＩＴＣ−１６インターフェースおよびＰｅｎｔｉｕｍ ＩＩ ＰＣによるデータ収集Ｏｒｉｇｉｎを用いて実施した。
注入後２〜４日間、肉眼で電流を記録した。フィッティング方法は全て、シンプレックス法（Ｓｉｍｐｌｅｘ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）に基づいた。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定は、統計的有意性を試験するために用いられ、Ｐ＜０．０５ならば有意と仮定し、＊によって示した。
【００２５】
実施例４：ＫＣＮＱ５のクローニングおよび組織分布
ＧｅｎＢａｎｋのデータベースのサーチにより、ヒトＢＡＣ末端配列（ＡＱ３４４２４３）は、ＫＣＮＱ Ｋ＋チャネルファミリーと著しく相同性があることが分かった。その配列情報は、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）由来の重複しているｃＤＮＡクローンを単離するために使用され、２つのｃＤＮＡクローンは、全長ｃＤＮＡクローンを作製するため集められた。ｃＤＮＡの開始メチオニンは、ｉｎ ｆｒａｍｅで最初のＡＴＧに決定されて、それと同じフレームで終止コドンを置いた。全長のＫＣＮＱ５ ｃＤＮＡは、９３２アミノ酸のポリペプチドをコードしており、推定される分子量は約１０２ｋＤａである（図１Ａ〜Ｃ）。ヒドロパシイ（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）解析により６個の膜貫通型ドメインを有するトポロジーモデルが立証された。ＫＣＮＱ５は、他のＫＣＮＱタンパク質に著しい相同性を示し、ＫＣＮＱ４に最も近縁である（６５％同一）。ＫＣＮＱ５は、ＫＣＮＱ３およびＫＣＮＱ２に対して約５０％相同であるが、ＫＣＮＱ１に対しては４０％しかない（図１Ｄ）。相同性は、膜貫通領域から膜貫通セグメントであるＳ５およびＳ６間で保存されたＰ−ループまで観察された。ＫＣＮＱタンパク質は大変長いＣ末端尾部に特徴がある。ＫＣＮＱ５は、全てのＫＣＮＱタンパク質のうち最長のＣ末端を有し、ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３がそれに続く。それは、依然として知られていない機能を有する高度に保存された領域を含有するが、その領域は他のＫＣＮＱタンパク質においては頻繁に突然変異している。さらにＢＮＦＣファミリーにおいては、保存されていない３′末端におけるフレームシフト変異により、そのＣ末端に５６アミノ酸を付加して突然変異型ＫＣＮＱ２タンパク質を作製した。驚くべきことに、より大きな変異型タンパク質によって卵母細胞にて生じた電流は、野生型と比較して５０％減少した。さらに、全く同じ位置に終止の突然変異を導入して、最後の７アミノ酸をトランケートすると、チャネル活性が２倍増加した。これらの結果を総合すると、ＫＣＮＱタンパク質のＣ末端領域はチャネルの機能にとって重要であることが示された。
【００２６】
ＫＣＮＱ５タンパク質は、非常に多くのＰＫＣによるリン酸化の可能性のある部位を含んでいるが、ＫＣＮＱ１およびＫＣＮＱ２に存在するｃＡＭＰ依存性リン酸化のためのＮ末端共通部位を欠いている。ＫＣＮＱ２電流に対するＰＫＡの影響に関して、矛盾するデータが報告される一方で、ＫＣＮＱ１およびＩＫＳ電流はＰＫＡにより刺激を受ける。
ノーザンブロット分析により、長さが７．５ｋｂであるＫＣＮＱ５転写産物がヒト骨格筋および脳において検出された。脳において転写産物は、大脳皮質、後脳極、前頭葉、および側頭葉において強い発現で広範に分布する。より低いレベルの転写産物が海馬および被殻において検出された。脳におけるＫＣＮＱ５の発現パターンは、前述のＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３の発現パターンに大変類似しており、その転写産物のサイズはそれぞれ８．５ｋｂおよび１０．５ｋｂであった。ＫＣＮＱ２と対照的に、ＫＣＮＱ５は小脳にはおそらく存在しない。
【００２７】
実施例５：アフリカツメガエル卵母細胞におけるＫＣＮＱ５の発現
カリウムチャネルとしてのＫＣＮＱ５の可能な機能は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＫＣＮＱ５ ｃＲＮＡと共に注入されたアフリカツメガエル卵母細胞の電気生理学的な解析によって検討された。注入後２〜４日間、水を注入したコントロールの卵母細胞では観察されなかった新規な電流が検出された。電流は大変ゆっくりと活性化し（図３Ａ）、実に２秒以内では十分に活性化されなかった。より低い電位で、ＫＣＮＱ５電流は、ＫＣＮＱ１電流と同様、活性化における遅延を示した。＋２０ ｍＶを超える活性化のトレース（ｔｒａｃｅ）は、クロスオーバーの現象を示した。一般的にＫＣＮＱ５電流の活性化は他のＫＣＮＱ電流の活性化よりも遅い。しかし、それは２つの指数関数によって説明され得る。−１００〜＋４０ ｍＶの脱分極パルスの間、電流は１１６±７ｍｓ、および９２７±５１ｍｓの時定数で活性化された（図５）。
【００２８】
ＫＣＮＱ５電流の電流−電圧の関係を図３Ｂに示す。電流は、−６０ ｍＶよりも正の脱分極電位で活性化され、０ ｍＶよりも大きい電位で著しく大きく整流した。強い内向き整流作用のみが、関連ＫＣＮＱ３チャネルに対して証明された。ＫＣＮＱ５の非活性化は、２次指数関数に良く適合する。不活性化の２つの成分は脱分極している電圧である−１００ ｍＶ、次に３ｓ脱分極段階である＋４０ ｍＶまで測定された。時定数は６４±５ｍｓおよび２６９±２４ｍｓであった（図５）。ＫＣＮＱ１尾部の電流は不活性化からの回復を示す特徴的な「かぎ」 を示した。−１００〜＋４０ ｍＶの電圧ではこのような電圧は観察されなかった。さらに、一般的にカリウム電流の不活性化を証明するのに用いられるダブル−パルスプロトコールが実施された。
ＫＣＮＱ５電流のＫ＋選択性を調べるために、末尾電流の逆転電位を５．４、９．６、２０、５４および９６ｍＭ Ｋ＋を含有するバス溶液において測定した。外部Ｋ＋における１０倍の減少により５８ｍＶの逆電位に変化した（図３Ｃ）、これはＫＣＮＱ５が完全にＫ＋選択性であることを示すものである。
ＫＣＮＱ５の薬理学的な特徴を図３Ｄに示す。ＫＣＮＱ５電流は、ＫＣＮＱ３の報告と同様、非選択的Ｋ＋チャネル遮断薬であるＴＥＡに対して非感受性である。一貫して、両方のチャネルタンパク質は、ＴＥＡによる遮断に対する感受性を測定される部位にあるポア領域内にスレオニン残基を含有する。対照的に、この部位のチロシン残基は、ＫＣＮＱ２がＴＥＡに対して高い感受性を示す原因である。非特異的なイオンチャンネル遮断薬であるキニジンは３００μＭでＫＣＮＱ５電流を５０％遮断する。
ＫＣＮＱ１およびＩＫＳの抑制は、これらの電流を完全にまたは強力に遮断する濃度で試験された。それらのことから、クロマノール（ｃｈｒｏｍａｎｏｌ）２９３Ｂは、最も効果的なものであるが、それは１００μＭでＫＣＮＱ５電流を４５％だけブロックした。それに対して、ＫＣＮＱ１はこの濃度で８０％遮断する。クロフィリウム（Ｃｌｏｆｉｌｉｕｍ）は、クラスＩＩＩの抗不整脈剤であり、ＫＣＮＱ１をＩＣ５０＜１０μＭで遮断する。それは、それのＫＣＮＱ３に対する抑制作用（１０μＭで３０％抑制する）と同様に、３０μＭでＫＣＮＱ５電流を４０％減少した。クロフィリウムは、１０μＭでＫＣＮＱ２を少し抑制した。このようにＫＣＮＱ５の薬理学的な特徴は、ＫＣＮＱ２よりもＫＣＮＱ３の薬理学的な特徴に似ている。
【００２９】
実施例６：ＫＣＮＱ５およびＫＣＮＱ３の機能的相互作用
ＫＣＮＱファミリーの全てのメンバーは、相同性を有する機能性へテロマーか、または構造的に異なるＫ＋チャネルサブユニットを形成する。ＫＣＮＱ５もまた異なるタンパク質サブユニットを有する混成チャネルを形成し得るという可能性を調査するために、ＫＣＮＱ５を他のＫＣＮＱタンパク質および異なるＫＣＮＥポリペプチドをコードするｃＤＮＡとアフリカツメガエル卵母細胞で共発現した。
他のＫＣＮＱ１またはＫＣＮＱ２と、または４つの既知のＫＣＮＥペプチド（ＫＣＮＥ１からＫＣＮＥ４）のうちの１つと共発現した後、それらのタンパク質の１つとＫＣＮＱ５との機能的相互作用の証拠は全く観察されなかった。しかし、ＫＣＮＱ５のＫＣＮＱ３との共発現は、結果の電流を著しく変化させた。以前の研究結果と一致して、ＫＣＮＱ３単独で生じた非常に小さな電流はバックグラウンドレベルからはほとんど見分けがつかないが、一方、ＫＣＮＱ５との共注入によってＫＣＮＱ５単独と比較して約４〜５倍電流が増加した。その電流の電圧依存性において著しいシフトは全くなかったが、Ｉ−Ｖ関係図はＫＣＮＱ５／ＫＣＮＱ３電流が正の膜電位で内向き整流が減少したことを示した。
図５に示されるように、ゲート反応速度における変化に伴って電流増幅の増加もまた生じた。ＫＣＮＱ３を混和することにより、活性化の速い成分が著しく遅くなったが、遅い成分には影響しなかった。さらにＫＣＮＱ５／ＫＣＮＱ３電流の速い不活性化はホモマーのＫＣＮＱ５に比較して遅かった。
聞くところによれば、電流増幅における大きな増加に加えて、ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３の会合もまた結果のヘテロマー電流の流入する特徴を変化させた。それ故に、ＫＣＮＱ２／ＫＣＮＱ３電流のゲート反応速度を調べ、それをＫＣＮＱ５／ＫＣＮＱ３と比較した（図５）。不活性化の速い成分と同様に、ＫＣＮＱ２／ＫＣＮＱ３において速い時定数および遅い時定数が共に遅くなった。このようにＫＣＮＱ２／ＫＣＮＱ３ヘテロマーは依然としてＫＣＮＱ３／ＫＣＮＱ５ヘテロマーよりも速く活性化する一方、両方のヘテロマーの不活性化反応速度論には有意差があるとはいえなかった。
【００３０】
脳のいろいろな部位においてＫＣＮＱ５がＫＣＮＱ３と共局在しており、電流が大きく増加し、共発現させた後に観察されたゲート反応速度における違いがみられたことは、ＫＣＮＱ５がＫＣＮＱ３と会合し、機能性チャネルを形成できることを強く示すものである。ＫＣＮＱ２／ＫＣＮＱ３チャネルはニューロンのＭ様電流の分子的基板を構成すると考えられており、さらに我々の結果はＫＣＮＱ５がまたこの生理学的に重要な電流のサブユニットであるということを示唆する。そのＭ様電流は末梢および中枢のニューロンに発現しているが、小脳には説明されていない。不思議なことに、小脳で強く発現しているＫＣＮＱ２に対して、ＫＣＮＱ３およびＫＣＮＱ５は一貫してこの領域では微弱に発現しているか、または全く発現していない。ＫＣＮＱ４もまた機能的にＫＣＮＱ３と相互作用でき、Ｍ様電流を発生し、Ｍ様電流の外生の集団が末梢神経系内および中枢神経系内に存在し、恐らくそれらの反応速度的および薬理的特徴において変化するという可能性を生む。Ｍ様チャネルの分子組成中の不均質性は、さらに他のファミリー由来のＫ＋チャネルの寄与によって増加し得る。
【００３１】
脳内でＫＣＮＱ５タンパク質がＭ様電流に寄与できるという可能性は、ＫＣＮＱ５遺伝子がてんかん疾患に対する推定上の候補であることを示すものである。蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ ｈハイブリッド形式（ＦＩＳＨ）解析によって、我々はＫＣＮＱ５遺伝子を染色体６ｑ１４にマップした。てんかん疾患に関与する第６染色体の２つの座と、進行性ミオクローヌスてんかん２型で欠損している６ｑ２４にある既知の遺伝子、若年性ミオクローヌスてんかん（ＥＪＭ１）の原因である６ｐ１２−ｐ１１にある未知遺伝子があった。 しかし、我々のマッピング結果は、後者の疾患におけるＫＣＮＱ５の関与を排除している。現在、ＫＣＮＱ５の同定により、遺伝的に受け継いだてんかんの他の形態との関与の可能性を研究することができる。
【００３２】
本発明の特許請求の範囲内に記載された方法は、分子生物学に関しては、”Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ； ｅｄｓ．： Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．； Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ； ２０００ （最新版）”、そして生化学に関しては、”Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ； ｅｄｓ．： Ｓｗｉｔｚｅｒ， Ｒ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ １９９９”を参考文献として用いた。
【００３３】
本発明において、ＫＣＮＱファミリーの新規なメンバーがクローン化および同定された。
使用された略語は下記の通りである：
ｃＡＭＰ：サイクリック５’−アデノシンモノホスフェート、ＤＩＧ：ジゴキシゲニン、ＧＣＧ：遺伝子コンピュータグループ，ウィスコンシン　パッケージ　バージョン　１０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ｐａｃｋａｇｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １０）、ＩＫＳ：心臓の遅延整流性電流の遅い成分、ｋｂ：キロベース、ＫＣＮＱ：ＫＣＮＱ遺伝子ファミリーのカリウムチャネル、ＰＨＡ：フィトヘマグルチニン、ＰＫＡ：プロティンキナーゼＡ、ＳＥＭ：平均標準誤差、ＴＥＡ：テトラエチルアンモニウム。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
ＫＣＮＱ５のタンパク質配列および他のＫＣＮＡタンパク質との比較、すなわちヒトＫＣＮＱ５とヒトＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３およびＫＣＮＱ４とのアラインメントを示す。
同定され保存されたアミノ酸は、それぞれ黒および灰色で囲まれている。推定上のＳ１〜Ｓ６の６個の膜貫通ドメインおよびポア領域Ｈ５は点線によって示された。ＫＣＮＱ５配列はＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋデータベースに寄託された。
【図１Ｂ】
図１Ａに続くアラインメントを示す。
【図１Ｃ】
図１Ｂに続くアラインメントを示す。
【図１Ｄ】
ＧＣＧソフトウェアパッケージのＰｉｌｅｕｐプログラムから作製されたヒトＫＣＮＱタンパク質のデンドログラムである。
【図２】
ヒトカリウムチャネルＫＣＮＱ５の組織分布を示す。種々の組織のノーザンブロットおよび ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ （ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を含有するヒト脳の異なる部分からの２つのブロットをＫＣＮＱ５特異的なＤＩＧ標識されたＲＮＡプローブとハイブリダイズした。
【図３】
アフリカツメガエル卵母細胞におけるＫＣＮＱ５の機能的発現を示す。Ａ：ＫＣＮＱ５を卵母細胞に注入し、パルスプロトコールに供し、段階的に保持電圧（−１００ ｍＶ）から膜電位へ上げて−１００〜＋ ５０ ｍＶのパルスを試験し、保持電位に戻した代表的電流図。Ｂ：ＫＣＮＱ５を発現している卵母細胞（ｎ＝１２）でＡのプロトコールを用いて記録されたＩ−Ｖ関係図。Ｃ：細胞外Ｋ＋濃度の関数としてＫＣＮＱ５電流の末尾電流（ｔａｉｌ ｃｕｒｒｅｎｔ）逆転電位。点線は、完全選択的Ｋ＋チャネル（ｎ＝５）に対してネルンストの式に従って描かれた。Ｄ：ＫＣＮＱ５電流に対するＴＥＡ、クロフィリウム、キニジン、およびクロマノール２９３Ｂの効果。積載電流は、同じ実験の間に−１００ ｍＶ〜０ ｍＶの３ｓ脱分極段階の間に得られた。化合物間相互作用において、逆の効果を達成するまで卵母細胞にＮＤ９６が注入された（電流トレースはコントロールに正規化され、５つの卵母細胞から平均化された）。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図４】
ＫＣＮＱ５とＫＣＮＱ３の機能的相互作用を示す。Ａ：図３Ａと同一のプロトコールを用いて、ＫＣＮＱ５およびＫＣＮＱ３を共に注入された卵母細胞から記録された代表的な電流トレース。Ｂ：ＫＣＮＱ３＋ＫＣＮＱ５を発現している卵母細胞（ｎ＝１１）のＩ−Ｖ関係図。Ｃ：１００〜＋４０ ｍＶの３ｓ試験パルスの末端における電流増幅の平均を示す棒グラフ。卵母細胞はＫＣＮＱ５ （ｎ＝１４）、ＫＣＮＱ３（ｎ＝６）、またはＫＣＮＱ５＋ＫＣＮＱ３ （ｎ＝１２）をコードするｃＲＮＡを注入された。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図５】
ホモマーおよびヘテロマーのＫＣＮＱチャネルの活性化および非活性化の時定数。卵母細胞にＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ２のｃＲＮＡを１０ｎｇ注入するか、またはＫＣＮＱ５およびＫＣＮＱ３、またはＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３のｃＲＮＡのそれぞれ１０ｎｇの混合物を注入した。それぞれテキストおよび実験方法に記載のように電流が測定され、活性化および不活性化の時定数に適合させた。アステリスクは有意差を示す。値は（平均して９〜１６個の卵母細胞から）平均±ＳＥＭである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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