(57)【要約】本発明は、緩徐な不活性化を示すA型K+チャネル (slowly-inactivating A-type K+channel)開口作用を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する前立腺肥大症に伴う膀胱刺激症状治療剤、およびslowly-inactivating A-type K+channel開口作用を指標として測定することを含む、前立腺肥大症に伴う膀胱刺激症状治療剤のスクリーニング方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
緩徐な不活性化を示すA型K+チャネル (slowly-inactivating A-type K+channel)開口作用を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する前立腺肥大症に伴う膀胱刺激症状治療剤。
【請求項２】
緩徐な不活性化を示すA型K+チャネル (slowly-inactivating A-type K+channel)開口作用を有する化合物が、N-(5,5-ジオキシド-10-オキソ-4,10-ジヒドロチエノ[3,2-c][1]ベンゾチエピン-9-イル)-3,3,3-トリフルオロ-2-ヒドロキシ-2-メチルプロパンアミドである請求項１に記載の前立腺肥大症に伴う膀胱刺激症状の治療剤。
【請求項３】
緩徐な不活性化を示すA型K+チャネル (slowly-inactivating A-type K+channel)開口作用を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩の治療有効量を投与することを含む前立腺肥大症に伴う膀胱刺激症状の治療方法。
【請求項４】
前立腺肥大症に伴う膀胱刺激症状の治療剤の製造のための、緩徐な不活性化を示すA型K+チャネル (slowly-inactivating A-type K+channel)開口作用を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩の使用。
【請求項５】
緩徐な不活性化を示すA型K+チャネル (slowly-inactivating A-type K+channel)開口作用を指標として測定することを含む、前立腺肥大症に伴う膀胱刺激症状治療剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺肥大症に伴う膀胱刺激症状治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺肥大症（BPH）は、尿道を取り囲むように存在する前立腺の移行領域より発生する良性腺腫である。BPH患者は、膀胱下閉塞症状または膀胱刺激症状を訴える。膀胱下閉塞症状としては、排尿開始の遅れ、排尿時のいきみ、尿線の勢いの低下、尿線の途切れ、排尿後の漏れ、排尿時間の延長、溢流性尿失禁などが挙げられる。膀胱刺激症状としては、昼間または夜間頻尿、尿意切迫感、残尿感、1回排尿量の低下などが挙げられる。BPHによる排尿障害発現には、機能的閉塞と機械的閉塞が関与する。さらにこれらの機能的閉塞および機械的閉塞は、排尿筋または神経における二次的変化を引き起こして、膀胱刺激症状および膀胱下閉塞症状などの複雑な病態を惹起する。
【０００３】
現在、BPHの治療薬としては、例えばα１-アドレナリン受容体遮断薬、抗アンドロジェン薬、植物製剤、アミノ酸製剤などが用いられる。これらのうち、α１-アドレナリン受容体遮断薬としては塩酸タムスロシン、塩酸プラゾシン、塩酸テラゾシン、ウラピジルなどがある。抗アンドロジェン薬としては酢酸クロルマジノン、アリルエストレノール、カプロン酸ゲストノロン、オキセンドロン、フィナステリドなどが用いられる。α１-アドレナリン受容体遮断薬は、交感神経から分泌されるノルアドレナリンによるα１-アドレナリン受容体の活性化により誘起される前立腺部平滑筋の収縮を抑制することにより、尿道の機能的閉塞を抑制する。抗アンドロジェン薬は腫大前立腺そのものを改善して尿道の締め付けを解除することにより、機械的閉塞を抑制する。しかし、α１-アドレナリン受容体遮断薬および抗アンドロジェン薬はBPHの膀胱下閉塞症状のみに効果を示し、膀胱刺激症状の改善に対するそれらの効果は通常不充分である。植物製剤およびアミノ酸製剤は抗炎症作用、抗浮腫作用などを有しており、膀胱頸部の通過障害を軽減し、症状を改善させるが、効果が弱いうえに、投与量が多く、通常は高齢者であるBPH患者に負担になる。また、抗コリン剤の使用は残尿増加および尿閉を引き起こす危険性があるため、BPHを有する患者への抗コリン剤の使用は禁忌であるかまたは制限されている。現在、BPHに伴う膀胱刺激症状を緩解する薬剤がない状態である。
【０００４】
蓄尿および排尿は、末梢および中枢神経系を含む複雑な反射経路の生理的制御を受けている［ユーロロジー（Urology）、50巻、サプルメント6A号、36-52頁（1997年）］。膀胱における充満感はAδ線維およびC線維の二種類の膀胱知覚求心性ニューロンを介して中枢神経系に伝えられる。通常の状態では、C線維は排尿に関与していない（silent）が、刺激性膀胱ではC線維が活性化され関与していることが知られている［クリニカル・ジャーナル・オブ・ペイン（Clinical J. Pain）、16巻、S86-89頁（2000年）］。さらに、BPH患者の約70%が冷水テストに陽性反応を示し（知覚神経C-線維が活性化されていることを示す）、BPH患者は、しばしばC線維の活性化に伴う膀胱刺激症状を示す［ジャーナル・オブ・ユーロロジー（J. Urol.）、160巻、34-38頁（1998年）］。また、BPHで見られるように部分的に尿道が閉塞されたラットの脊髄において知覚神経の新芽形成が起きていることが示されている［ジャーナル・オブ・コンピューター・ニューロロジー（J. Comp. Neurol.）、310巻、401-410頁（1991年）］。このような新芽形成を示す知覚神経はカプサイシン（capsaicin）感受性を有していることからC線維であり、すなわち膀胱下閉塞ラットにおいてもC線維の活性化が確認されている。以上のように、C線維が、BPHに伴う膀胱刺激症状の進展に関与している証拠が蓄積されている。
【０００５】
カリウム（K+）チャネル（K+channel）は種々組織の細胞膜上に存在し、膜電位の調節を介して様々な生理作用に関与している。K+channelは、電位依存性、Ca++感受性、およびその他のチャネルの性質により、種々のタイプに分類される。緩徐な不活性化を示すA型K+チャネル (slowly-inactivating A-type K+channel)は、カプサイシン感受性の脊髄後根神経節（dorsal root ganglion; DRG）細胞に発現しており［ジャーナル・オブ・ニューロフィジオロジー（J. Neurophysiol.）、75巻、2629-2646頁（1996年）］、C線維の興奮性を制御している［ジャーナル・オブ・フィジオロジー（J. Physiol.）、494巻、1-16頁（1996年）］。
【発明の開示】
【０００６】
上記の知見により、我々は、slowly-inactivating A-type K+channelの開口を介してC線維の興奮性を低下させることで、BPH時の膀胱刺激症状を改善できるという仮説を立てた。我々は、slowly-inactivating A-type K+channel開口作用を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩が、前立腺肥大症に伴う膀胱刺激症状の治療に有用であることを見いだし、本発明を完成した。
本発明の目的は、優れたBPHに伴う膀胱刺激症状の治療剤を提供することにある。
【０００７】
本発明は、
（１）slowly-inactivating A-type K+channel開口作用を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するBPHに伴う膀胱刺激症状治療剤、および
（２）slowly-inactivating A-type K+channel開口作用を有する化合物が、N-(5,5-ジオキシド-10-オキソ-4,10-ジヒドロチエノ[3,2-c][1]ベンゾチエピン-9-イル)-3,3,3-トリフルオロ-2-ヒドロキシ-2-メチルプロパンアミドである（１）項記載のBPHに伴う膀胱刺激症状治療剤に関する。
本発明は、
（３）slowly-inactivating A-type K+channel開口作用を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩の治療有効量を投与することを含むBPHに伴う膀胱刺激症状の治療方法、および
（４）BPHに伴う膀胱刺激症状の治療剤の製造のための、slowly-inactivating A-type K+channel開口作用を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩の使用に関する。
さらに本発明は、
（５）slowly-inactivating A-type K+channel開口作用を指標として測定することを含むBPHに伴う膀胱刺激症状治療剤のスクリーニング方法に関する。
【０００８】
本明細書における「slowly-inactivating A-type K+channel開口作用を有する化合物」は、その性質の一つとしてslowly-inactivating A-type K+channel開口作用を有していれば、新規であるか公知であるかを問わず、また化合物の構造などに限定されず、すべてのslowly-inactivating A-type K+channel開口作用を有する化合物を意味する。
本発明で使用されるslowly-inactivating A-type K+channel開口作用を有する化合物としては、(S)-(+)-N-(5,5-ジオキシド-10-オキソ-4,10-ジヒドロチエノ[3,2-c][1]ベンゾチエピン-9-イル)-3,3,3-トリフルオロ-2-ヒドロキシ-2-メチルプロパンアミド［(S)-(+)-N-(5,5-dioxido-10-oxo-4,10-dihydrothieno[3,2-c][1]benzothiepin-9-yl)-3,3,3-trifluoro-2-hydoxy-2-methylpropanamide］（化合物１）などがある。化合物１はWO98/46587中に記載されている化合物1-25と同一化合物である。
【０００９】
【化１】
2004529133.tif 000002
【００１０】
本発明のスクリーニング方法において、slowly-inactivating A-type K+channel開口作用の測定方法は特に限定されないが、例えば後記の試験例１および２に記載の方法などが挙げられる。
【００１１】
本発明で用いられる化合物の薬理作用を試験例で以下に説明する。
【００１２】
試験例１：DRG細胞におけるslowly-inactivating  K+電流増強効果
＜材料および方法＞
動物の準備
試験は成熟Sprague Dawley系雌性ラットを用いて行った。未同定のDRGニューロン群あるいは膀胱を神経支配する特定のDRGニューロン群を用いて、2系列の実験を行った。膀胱を神経支配するDRGニューロン群は、細胞単離7日前にハロタン麻酔下動物の膀胱壁に注入した蛍光色素の4%(w/w) ファースト・ブルー（Fast Blue） (ポリロイ社（Polyloy）, グロス・ウムスタット（Gross Umstat）, ドイツ（Germany）)の逆行性軸索輸送によって標識した。色素は膀胱の背側表面の3〜6部位に28ゲージの注射針を用いて注入した（1部位当り5〜6 μL、総容量20〜30 μL）。各注入部位は、隣接組織が色素で汚染するのを最小限にするため生理食塩水で洗った。
【００１３】
＜細胞分離＞
DRGからの単離ニューロンはハロタン麻酔下動物から調製した。L6およびS1 DRGを動物より切り出し、0.3 mg/mL トリプシン（Type 3、シグマ社）、1 mg/mL コラゲナーゼ（Type 1、シグマ社）および0.1 mg/mLデオキシリボヌクレアーゼ（Type 4、シグマ社）を含むDMEM（シグマ社）5mLを加え35℃で25分間振盪浴槽中で単離した。次いでトリプシン活性を中和させるためにトリプシン阻害剤（Type 2a、シグマ社）を加えた。個々のDRG細胞体は分散させて分離し、ポリ-L-リジンで覆われた35 mmのペトリ皿上に撒いた。
【００１４】
＜電気的記録＞
色素標識された膀胱を支配する一次求心性ニューロンは、蛍光アタッチメント(UV-IAフィルター；励起波長、365 nm)付き倒立型位相差顕微鏡(ニコン社、東京、日本)を用いて特定した。培養皿中の各標識ニューロンに対し、室温(20゜C〜22℃)でギガオーム・シール・ホールセル記録法を実施した。通常、培養皿中には200〜300個の非標識ニューロンのうち、3〜7の標識細胞が含まれている。内液（KOHでpH 7.4に調整した）は以下の通り(mmol/L)： KCl 140、CaCl２1、MgCl２2、EGTA 11、HEPES 10、Mg-ATP 2、Tris-GTP 0.4。パッチ電極の抵抗は、内液で満たされた時1〜4 MΩであった。ニューロンは、NaCl 150、KCl 5、CaCl２2.5、MgCl２1、HEPES 10およびD-glucose 10（以上、mmol/L）を含む外液（NaOHでpH 7.4に調整した）で1.5 mL/minの流速で表面灌流した。全ての記録は、Axopatch-1D パッチクランプ増幅器(アクソン・インストルメンツ社（Axon Instruments）、フォスター・シティ（Foster City）、カルフォルニア州（CA）)を用いて行い、データはPCLAMP ソフトウェア(アクソン・インストルメンツ社（Axon Instruments）)にて取得して解析した。
【００１５】
電位固定記録では、外向きK＋電流と内向きNa＋電流を測定した。K＋電流を単離するため、choline-Cl 150、KOH 5、CaCl２0.03、HEPES 10、Mg(OH)２3およびD-glucose 10（以上、mmol/L）を含む外液（HClでpH 7.4に調整した）に変更した。
未同定DRGニューロンを用いた第1番目の一連の実験では、外向きK＋電流を、-90 mVの保持電位から、長さ800 msの+60 mVの脱分極処置で誘発した後、さらに１秒間の-20 mVの条件付き前パルスの後、セカンド・パルスとして+60 mV まで同様の脱分極パルスを順次与えることにより誘発した。ファースト・ブルーで標識した膀胱求心性ニューロンを用いた第2番目の実験群では、-120mVの保持電位（slowly-inactivating  A-type K+電流が完全に活性化される条件）から活性化された外向きK＋電流から、-40 mVの保持電位（slowly-inactivating  A-type K+電流のほとんどが不活性化されている条件）から活性化された外向きK＋電流を差し引くことによりslowly-inactivating  A-type K+電流を分離した。化合物は低濃度から累積的に適用した。電流は最高点(ピーク)で測定し、対照(化合物適用前)で規格化した。
【００１６】
内向きNa＋電流は、-90 mVの保持電位から＋60 mV、800 msの長さの脱分極処置によって誘発した。電流は最高点(ピーク)で測定し、対照(化合物適用前)で規格化した。
未同定DRGニューロンを用いた実験で得られた結果を第１表〜第５表に、カプサイシン感受性膀胱求心性ニューロンを用いた実験で得られた結果を第６表に示す。第１表には保持電位が-90 mV時（slowly-inactivating  A-type K+電流活性化条件）または-20 mV時（slowly-inactivating  A-type K+電流不活性化条件）の電流変化に対する化合物1の作用を示す。第２表には20 mmol/Lテトラエチルアンモニウム（tetraethylammonium）存在下での化合物１の作用、第３表には5μmol/Lベラパミル（verapamil）存在下での化合物１の作用、第４表には60 mmol/L テトラエチルアンモニウム（tetraethylammonium）存在下での化合物１の作用を示す。第５表には、Na+電流に対する化合物１の作用を示す。第１表〜第５表において、nは例数を表す。
【００１７】
【表１】
2004529133.tif 000003
【００１８】
第１表は、未同定DRG細胞を用いた、膜電位固定法（voltage clamp）で測定した電流に対する化合物1の作用を表している。保持電位（HP）-90 mVから活性化される電流はslowly-inactivating  A-type K+電流を含むK+電流を測定した成績であり、保持電位-20 mVから活性化される電流は遅延整流性K+電流を測定した成績である。第１表より、化合物１は化合物濃度1×10-7〜5×10-7mol/Lをピークにして、slowly-inactivating  A-type K+電流を増強するが、遅延整流性K+電流には影響しない（影響が少ない）ことが示唆される。なお、化合物１の効果（値）は、薬物適用前の値を1とした時の相対値で示す。
【００１９】
【表２】
2004529133.tif 000004
【００２０】
第２表は、遅延整流性 K+電流の阻害剤（blocker）であるテトラエチルアンモニウム存在下での化合物１の作用を表している。遅延整流性 K+電流の阻害剤（blocker）存在下でも、化合物１は同様の結果を示すことにより、化合物１のK+電流増強効果は遅延整流性 K+channelを介したものではないことが示唆される。
【００２１】
【表３】
2004529133.tif 000005
【００２２】
第３表は、遅延整流性 K+電流の阻害剤（blocker）であるベラパミル（verapamil）存在下での化合物１の作用を示している。第３表においても第２表と同様の結果が得られていることにより、化合物１のK+電流増強効果は遅発整流性 K+channelを介したものではないことが示唆される。
【００２３】
【表４】
2004529133.tif 000006
【００２４】
第４表は高濃度のテトラエチルアンモニウム（TEA）存在下での化合物１の作用を表している。高濃度のテトラエチルアンモニウム（TEA）は遅発整流性 K+電流の阻害剤（blocker）として作用する。第４表においても第２表と同様の結果が得られていることにより、化合物１のK+電流増強効果は遅発整流性 K+channelを介したものではないことが示唆される。
【００２５】
【表５】
2004529133.tif 000007
【００２６】
第５表はDRG細胞におけるNa+電流に対する化合物１の作用を表している。化合物１はNa+電流には影響しないことが第５表より明らかである。
【００２７】
【表６】
2004529133.tif 000008
【００２８】
第６表は、ファースト・ブルーで標識されたカプサイシン感受性膀胱求心性ニューロン（C線維と推定されるニューロン）におけるslowly-inactivating  A-type K+電流（IK）および遅延整流性K+電流に対する化合物1の作用を表している。slowly-inactivating  A-type K+電流は、-120 mVの保持電位（slowly-inactivating  A-type K+電流が完全に活性化される条件）から活性化された外向きK+電流から、-40 mVの保持電位（slowly-inactivating  A-type K+電流のほとんどが不活性化される条件）から活性化された外向きK+電流を差し引くことにより単離した。未同定DRGニューロンでの検討と同様に、第６表より化合物１はslowly-inactivating  A-type K+電流を増加させるが、遅延整流性K+電流には影響が少ないことが示された。
【００２９】
試験例２：DRG細胞における膜電位変化
＜材料および方法＞
動物の準備
試験は成熟Sprague Dawley系雌性ラットを用いて行った。未同定のDRG細胞群および膀胱を神経支配する特定の膀胱支配DRGニューロン群は、細胞単離7日前にハロタン麻酔下動物の膀胱壁に注入した蛍光色素の4%(w/w)ファースト・ブルー（Fast Blue） (ポリロイ社（Polyloy）, グロス・ウムスタット（Gross Umstat）, ドイツ（Germany）)の逆行性軸索輸送によって標識した。色素は膀胱の背側表面の3〜6部位に28ゲージの注射針を用いて注入した（1部位当り5〜6 μL、総容量20〜30 μL）。各注入部位は、隣接組織が色素により汚染するのを最小限にするため生理食塩水で洗った。
【００３０】
＜細胞分離＞
DRGからの単離ニューロンはハロタン麻酔下動物から調製した。L6およびS1 DRGを動物より切り出し、0.3 mg/mL トリプシン（Type 3、シグマ社）、1 mg/mL コラゲナーゼ（Type 1、シグマ社）および0.1 mg/mLデオキシリボヌクレアーゼ（Type 4、シグマ社）を含むDMEM（シグマ社）5mLを加え35℃ 、25分間振盪浴槽中で単離した。次いでトリプシン活性を中和させるためにトリプシン阻害剤（Type 2a、シグマ社）を加えた。個々のDRG細胞体は分散させて分離し、ポリ-L-リジンで覆われた35 mmのペトリ皿上に撒いた。
【００３１】
＜電気的記録＞
色素標識された膀胱を支配する一次求心性ニューロンは、蛍光アタッチメント(UV-IAフィルター；励起波長、365 nm)付き倒立型位相差顕微鏡(ニコン社、東京、日本)を用いて特定した。細胞分離6〜8時間以内に、培養皿中の各標識ニューロンに対し、室温(20゜C〜22℃)でギガオーム・シール・ホールセル記録法を実施した。通常、培養皿中には200〜300個の非標識ニューロンのうち、3〜7の標識細胞が含まれている。内液（KOHでpH 7.4に調整した）は以下の通り(mmol/L)： KCl 140、CaCl２1、MgCl２2、EGTA 11、HEPES 10、Mg-ATP 2、Tris-GTP 0.4。パッチ電極の抵抗は、内液で満たされた時1〜4 MΩであった。ニューロンは、NaCl 150、KCl 5、CaCl２2.5、MgCl２1、HEPES 10およびD-glucose 10を含む外液（NaOHでph 7.4に調整した）で1.5 mL/minの流速で表面灌流した。全ての記録は、Axopatch-1D パッチクランプ増幅器(アクソン・インストルメンツ社（Axon Instruments）、フォスター・シティ（Foster City）、カリフォルニア州（CA））を用いて行い、データはPCLAMP ソフトウェア (アクソン・インストルメンツ社（Axon Instruments）)によりデータ解析を行った。
電流固定記録では、DRG細胞の膜電位を化合物適用の前後で測定した。膜電位は、コントロール（化合物適用前）で規格化した
膜電位に対する化合物１の影響を第７表に示す。
【００３２】
【表７】
2004529133.tif 000009
【００３３】
第７表は、DRG細胞における膜電位に対する化合物１の作用を表している。化合物１がslowly-inactivating  A-type K+電流を増強、すなわち外向き電流を増加することにより過分極（膜電位のマイナス側への変化）を誘起することが示されている。この作用は、DRG細胞の興奮性を低下させることを示唆する。
【００３４】
以上の試験例１および試験例２の結果より、化合物１がslowly-inactivating  A-type K+電流の増強作用を有することが明らかとなった。
【００３５】
試験例３：部分的膀胱下閉塞に伴う頻尿抑制作用
実験は斉藤（Saito）らの方法[ジャーナル・オブ・ユーロロジー（J. Urol.）、150巻、1045-1051頁（1993年）]に準じて行った。
実験には、雄性SD系ラット8〜9週令（日本エスエルシー社供給）を使用した。ラットは室温19〜25℃、湿度30〜70%、一日12時間照明（午前7時〜午後7時）の飼育室にて、金属ケージに5-7匹ずつ収容し、市販の固形飼料と水を自由に摂取させて飼育した。
【００３６】
前立腺肥大症（BPH）に類似した尿道閉塞モデルとして、ラットに部分的尿道閉塞を誘起した。ラットをペントバルビタール・ナトリウム（大日本製薬社）50 mg/kgの腹腔内投与により麻酔し、仰臥位にした。下腹部を約１cm正中切開して、膀胱、前立腺および尿道を露出した。膀胱頚部および膀胱基部を前立腺より剥離して、尿道基部に手術糸（3号；夏目製作所社）を2本通した。尿道に沿って、ポリエチレンチューブ（PE-200；ベクトン・ディッキンソン社）を置き、尿道をチューブと共に緩く二重結紮した。このときの結紮は、ポリエチレンチューブで尿道を圧迫せず、かつ糸に弛みがない程度にした。ポリエチレンチューブを抜き取り、尿道を部分的に閉塞した。下腹部の創口を手術糸で縫合した。
【００３７】
部分的尿道閉塞手術5〜7日後に、部分的尿道閉塞ラットおよび偽手術を施したラットを代謝ケージ（KN-649；夏目製作所）に入れた。馴化のため、自由に飲水および摂餌させてラットを1日間飼育し、翌日より排尿試験を開始した。電子天秤（HF-200；エー・アンド・デイ社）を用いて、ラットの排尿量を重量として持続的に測定し、直流アンプ（AD-641G；日本光電社）を介してサーマルアレイレコーダー（RTA-1200；日本光電社）上に記録した。照明下の明期（9〜18時）、消灯下の暗期（19〜4時）をデータ取得時間とし、これらの時間の排尿回数および排尿量を測定し、測定パラメーターとして排尿頻度（9時間あたりの排尿回数）、１回排尿量および総排尿量を求めた。なお、1回排尿量は、9時間の総排尿量を9時間の排尿回数で除することにより算出した。翌日の8〜9時および18〜19時の間の2回、化合物１または溶媒（0.5w/v%メチルセルロース400cP（平均粘度：400センチポワズ）水溶液）を投与して、前日と同様に9〜18時、19〜4時の排尿回数および排尿量を測定し、測定値を求めた。偽手術群については排尿試験初日の排尿頻度、1回排尿量および総排尿量を尿道閉塞群と比較した。排尿頻度、1回排尿量および総排尿量について、群毎に平均±標準誤差を求めた。
排尿頻度、1回排尿量および総排尿量の結果をそれぞれ、第８表、第９表および第１０表に示す。
【００３８】
【表８】
2004529133.tif 000010
【００３９】
【表９】
2004529133.tif 000011
【００４０】
【表１０】
2004529133.tif 000012
【００４１】
試験例３の結果より、化合物１は、排尿頻度を有意に減少させ、かつ１回排尿量を増加させる傾向にあった。以上より、化合物１は前立腺肥大症（BPH）に伴う頻尿治療に有用であることが示唆された。
【００４２】
試験例４：部分的尿道閉塞ラットにおける膀胱容量増加作用
実験は斉藤（Saito）らの方法[ジャーナル・オブ・ユーロロジー（J. Urol.）、150巻、1045-1051頁（1993年）]に準じて行った。
実験には、雄性SD系ラット8〜9週令（日本エスエルシー社供給）を使用した。ラットは室温19〜25℃、湿度30〜70%、一日12時間照明（午前7時〜午後7時）の飼育室にて、金属ケージに5-7匹ずつ収容し、市販の固形飼料と水を自由に摂取させて飼育した。
【００４３】
前立腺肥大症（BPH）に類似した尿道閉塞モデルとして、ラットに部分的尿道閉塞を誘起した。ラットをペントバルビタール・ナトリウム（大日本製薬社）50 mg/kgの腹腔内投与により麻酔し、仰臥位にした。下腹部を約１cm正中切開して、膀胱、前立腺および尿道を露出した。膀胱頚部および膀胱基部を前立腺より剥離して、尿道基部に手術糸（3号；夏目製作所社）を2本通した。尿道に沿って、ポリエチレンチューブ（PE-200；ベクトン・ディッキンソン社）を置き、尿道をチューブと共に緩く二重結紮した。このときの結紮は、ポリエチレンチューブで尿道を圧迫せず、かつ糸に弛みがない程度にした。ポリエチレンチューブを抜き取り、尿道を狭窄した。
引き続き、膀胱カテーテル留置手術を施した。膀胱を露出し、膀胱頂部よりポリエチレンチューブ（PE-50；ベクトン・ディッキンソン社）を挿入して手術糸で固定した。他端を経皮下的に背頸部より導出して、栓をした後、手術糸で皮膚に固定した。膀胱を元の位置に戻して下腹部を手術用糸で縫合した。
【００４４】
尿道閉塞およびカテーテル植え込み手術5〜7日後、部分的尿道閉塞ラットおよび偽手術を施したラットをボールマンケージ（KN-326-1；夏目製作所社）に入れて拘束状態とし、膀胱カテーテルに三方活栓を連結した。三方活栓の一方には圧トランスデューサー（DX-360；日本光電社）を連結し、膀胱内圧信号をひずみ圧力アンプ（AP-601G；日本光電社）を介して増幅して、ポリグラフ（RPM-6008；日本光電社）にて測定し、サーマルアレイレコーダー（RTA-1200;日本光電社）にて記録した。三方活栓の他方には生理食塩液（大塚製薬製薬工場、徳島、日本）を満たした注射筒を接続し、インフュージョンポンプ（KDS220；ニューロサイエンス）にセットした。また、カップを取りつけたFDピックアップ（TB-611T；日本光電社）をボールマンケージの下方にセットしてひずみ圧力アンプに接続し、排尿量を張力変化としてサーマルアレイレコーダー上に記録した。測定準備終了後、室温の生理食塩液を膀胱内に6 mL/hの流速で約30分間持続注入し、排尿収縮が定期的に発現する個体を実験に供した。30〜60分間の安定期間後、手圧排尿により残尿を除去した。5分後、膀胱内への生理食塩液注入を再び開始し、排尿が観察されたら注入を直ちに停止した。排尿発現までの時間より、膀胱容量を算出した（注入速度6 mL/h×注入時間）。膀胱容量から、膀胱収縮時の排尿量（１回排尿量）を減ずることにより残尿量を算出した。30分間の膀胱内生理食塩液注入操作を2〜3回繰り返して測定値を求め、試験化合物または溶媒投与前値とした。その後、試験化合物または溶媒（0.5w/v%メチルセルロース400cP（平均粘度：400センチポワズ）水溶液）を経口投与した。投与1, 2, 3時間後に膀胱内生理食塩液注入を行い、膀胱容量、排尿量および残尿量を測定した。膀胱容量、排尿量および残尿量について、群毎に平均±標準誤差を求めた。
【００４５】
膀胱容量、排尿量および残尿量の結果をそれぞれ、第１１表、第１２表、第１３表に示す。
【００４６】
【表１１】
2004529133.tif 000013
【００４７】
【表１２】
2004529133.tif 000014
【００４８】
【表１３】
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【００４９】
試験例４によれば、化合物１は、膀胱容量を増加させる傾向にあり、排尿量を有意に増加させた。従って、化合物１は、前立腺肥大症（BPH）に起因する部分的尿道閉塞に伴う蓄尿障害を緩解する作用を示すことが明らかとなった。
試験例３および試験例４において、化合物１は前立腺肥大症（BPH）に伴う膀胱刺激症状を緩解する作用を有することが示されており、このことから、slowly-inactivating  A-type K+channel開口作用を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩は前立腺肥大症（BPH）に伴う膀胱刺激症状治療剤として有用であることが示唆される。
【００５０】
試験例５：急性毒性試験
雄性dd系マウス（体重20±1g）を１群3匹用い、試験化合物を経口または腹腔内投与した。投与後7日目の死亡状況を観察し、最小致死量（MLD）値を求めた。
その結果、化合物１のMLDは、経口投与で＞1000mg/kgであった。
以上の試験例１〜５の結果により、slowly-inactivating  A-type K+channel開口作用を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩は、前立腺肥大症（BPH）に伴う膀胱刺激症状の治療剤として有用であることが示された。
【００５１】
slowly-inactivating  A-type K+channel開口作用を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩はそのままあるいは各種の製薬形態で使用することができる。本発明の製薬組成物は、活性成分として、有効な量のslowly-inactivating  A-type K+channel開口作用を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩を薬理学的に許容される担体と均一に混合して製造できる。これらの製薬組成物は、例えば経口または非経口（静脈内を含む）などの投与に対して適する単位服用形態にあることが望ましい。
【００５２】
経口服用形態にある組成物の調製においては、何らかの有用な薬理学的に許容される担体が使用できる。例えば懸濁剤およびシロップ剤のような経口液体調製物は、水、シュークロース、ソルビトール、フラクトースなどの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ゴマ油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを使用して製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤および顆粒剤などは、ラクトース、グルコース、シュークロース、マンニトールなどの賦形剤、でん粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの表面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いて製造できる。錠剤およびカプセル剤は、投与が容易であるという理由で、最も有用な単位経口投与剤である。錠剤やカプセル剤を製造する際には固体の製薬担体が用いられる。
【００５３】
また、注射剤は、例えば蒸留水、塩溶液、グルコース溶液または塩水とグルコース溶液の混合物からなる担体を用いて調製することができる。この際、常法に従い適当な助剤を用いて、溶液、懸濁液または分散液として調製される。
slowly-inactivating  A-type K+channel開口作用を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩は、上記製薬形態で経口的にまたは注射剤などとして非経口的に投与することができ、その有効用量および投与回数は、例えば投与形態、患者の年齢、体重、症状などにより異なるが、1〜900mg／60kg／日、好ましくは1〜200mg／60kg／日が適当である。
以下に、実施例によって本発明の様態を説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
実施例１：  錠剤
常法により、次の組成からなる錠剤を調製した。
化合物１の250 gをマンニトール1598.5 g、でん粉グリコール酸ナトリウム100 g、軽質無水ケイ酸10 g、ステアリン酸マグネシウム40 gおよび黄色三二酸化鉄1.5 gと常法により混合した。この混合物を用い、径8 mmの杵臼をもった打錠機（菊水社製、Purepress Correct-12型）で打錠を行って、錠剤（１錠あたり活性成分25 mgを含有する）を得た。
処方を第１４表に示す。
【００５５】
【表１４】
2004529133.tif 000016
【００５６】
実施例２：  カプセル剤
常法により、次の組成からなるカプセル剤を調製した。
化合物１の500 gをラクトース300 g、軽質無水ケイ酸100 gおよびラウリル硫酸ナトリウム100 gと常法により混合した。この混合物をカプセル充填機（Zanasi社製、LZ-64型）により、ハードカプセル1号に充填し（１カプセルあたり100 mg）、カプセル剤（１カプセルあたり活性成分50 mgを含有する）を得た。
処方を第１５表に示す。
【００５７】
【表１５】
2004529133.tif 000017
【００５８】
実施例３：  注射剤
常法により、次の組成からなる注射剤を調製する。
化合物１の1gを精製ダイズ油100gに溶解させ、精製卵黄レシチン12gおよび注射用グリセリン25gを加える。この混合物を常法により注射用蒸留水で1000mLとして練合・乳化する。得られた分散液を0.2μｍのディスポーザブル型メンブランフィルターを用いて無菌濾過後、ガラスバイアルに2mlずつ無菌的に充填して、注射剤（１バイアルあたり活性成分2mgを含有する）を得る。
処方を第１６表に示す。
【００５９】
【表１６】
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【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明は、slowly-inactivating A-type K+channel開口作用を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するBPHに伴う膀胱刺激症状治療薬、およびslowly-inactivating A-type K+channel開口作用を指標として測定することを含む、BPHに伴う膀胱刺激症状治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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