(57)【要約】本発明は、細胞のタンパク質又はｍＲＮＡのレベルを測定する必要を回避し、代わりに、血中ＣＤ１４レベルの測定を利用する、哺乳動物における既知の又は可能性のあるコレステロール逆輸送増強化合物のスクリーニング、及び／又はそれらの効力の決定のための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の標準血液試料中に存在するＣＤ１４タンパク質のレベルを測定し、一つのＣＤ１４タンパク質測定値を得ること；
被検因子の投与後の哺乳動物の血液試料中に存在するＣＤ１４タンパク質のレベルを測定し、第二のＣＤ１４タンパク質測定値を得ること；及び
前記二つのＣＤ１４タンパク質測定値を比較し、被検因子投与後に得られた測定値が、標準血液試料から得られた測定値より大きいか否かを決定することを含み、前記ＣＤ１４タンパク質が、ｓＣＤ１４及びｍＣＤ１４より選択され、両方の測定が同一である、哺乳動物における被検コレステロール逆輸送増強因子の効力を評価するための方法。
【請求項２】
被検因子が可能性のあるＲＣＴ増強因子である、請求項１の方法。
【請求項３】
被検因子が既知のＲＣＴ増強因子である、請求項１の方法。
【請求項４】
標準血液試料が、被検因子が投与されていない哺乳動物の血液試料である、請求項１の方法。
【請求項５】
標準血液試料が、既知のＲＣＴ増強因子の投与後の哺乳動物の血液試料である、請求項１の方法。
【請求項６】
標準ＲＣＴ増強因子の投与後の哺乳動物の血液試料中に存在するＣＤ１４タンパク質のレベルを測定し、一つのＣＤ１４タンパク質測定値を得ること；
被検因子の投与後の哺乳動物の血液試料中に存在するＣＤ１４タンパク質のレベルを測定し、第二のＣＤ１４タンパク質測定値を得ること；及び
前記二つのＣＤ１４タンパク質測定値を比較し、標準ＲＣＴ増強因子の効力と比較された被検因子の相対効力を決定することを含み、
ＣＤ１４タンパク質がｓＣＤ１４及びｍＣＤ１４より選択され、両方の測定が同一である、哺乳動物における被検コレステロール逆輸送増強因子の相対効力を決定するための方法。
【請求項７】
被検因子が可能性のあるＲＣＴ増強因子である、請求項６の方法。
【請求項８】
被検因子が既知のＲＣＴ増強因子である、請求項６の方法。
【請求項９】
被検因子がＬＸＲリガンドである、請求項１の方法。
【請求項１０】
被検因子がＰＰＡＲアゴニストである、請求項１の方法。
【請求項１１】
被検因子がＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤である、請求項１の方法。
【請求項１２】
被検因子が魚油である、請求項１の方法。
【請求項１３】
被検因子がアルコールである、請求項１の方法。
【請求項１４】
被検因子がビタミンである、請求項１の方法。
【請求項１５】
被検因子がナイアシン、ナイアシンアミド、又はそれらの類似体である、請求項１４の方法。
【請求項１６】
被検因子がＡＣＡＴ阻害剤である、請求項１の方法。
【請求項１７】
被検因子が減量薬である、請求項１の方法。
【請求項１８】
被検因子が、既知の又は可能性のある身体的なＲＣＴ増強の誘導因子である、請求項１の方法。
【請求項１９】
被検因子が、既知の又は可能性のある行動的なＲＣＴ増強の誘導因子である、請求項１の方法。
【請求項２０】
哺乳動物がヒトである、請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
コレステロール逆輸送（ＲＣＴ）は、過剰の組織コレステロールを、処分のため肝臓へと戻す手段である。ＲＣＴの欠陥は、黄色腫及びアテローム性動脈硬化巣の形態で、組織にコレステロールを蓄積させると信じられている。従って、アテローム性動脈硬化症又は黄色腫を有する患者においては、コレステロール逆輸送を増強することが望ましい。
【背景技術】
【０００２】
ＲＣＴを促進するキー遺伝子は、ＡＢＣＡ１（ＡＢＣＡ１は、発表文献においてＡＢＣ１とも呼ばれている）である（Ｍｏｔｔら，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１５２：４５７−４６８（２０００）参照）。この遺伝子は、細胞から高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）へとコレステロールを除去する「ポンプ」として機能すると信じられている。ＲＣＴにおけるこの機能と一致して、細胞へのコレステロール負荷によって、ＡＢＣＡ１遺伝子の発現が増加することが報告されている（Ｌａｎｇｍａｎｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２５７，２９−３３（１９９９））。ＡＢＣＡ１遺伝子の変異は、タンジアー病をもたらす。タンジアー病を有する患者に由来する培養細胞は、コレステロール流出を欠損しており（Ｆｒａｎｃｉｓら．（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６：７８−８７）、患者の状態は、末梢組織への大量のコレステロールの蓄積、及び極めて低いＨＤＬコレステロールレベルによって特徴付けられる。
【０００３】
黄色腫及びアテローム性動脈硬化症を有する患者においてＲＣＴを増強することができる治療を見い出すことは、望ましい。例えば、最近、コレステロールにより誘導されるＡＢＣＡ１のアップレギュレーション及びＲＣＴを媒介するファクターのうちの一つが、転写因子肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）であることが報告された（Ｃｏｓｔｅｔら（２０００），Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７５：２８２４０−２８４５；Ｓｃｈｗａｒｔｚら（２０００），Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ，２７４：７９４−８０２）。このタンパク質は、過剰の細胞内コレステロールレベルを感知し、コレステロール逆輸送を促進する遺伝子発現変化を開始させる。ＬＸＲは、ＲＣＴを促進するよう作用する多数の遺伝子をアップレギュレートすると考えられている。ＡＢＣＡ１をアップレギュレートすることに加え、ＬＸＲは、付加的な「ポンプ」タンパク質であるＡＢＣＡ８、及びＨＤＬから他のリポタンパク質へとコレステロールを移動させるタンパク質であるＣＥＴＰを含む遺伝子をアップレギュレートすると信じられている。従って、ＬＸＲα及びＬＸＲβの両方のリガンドを含むＬＸＲのリガンドは、ＡＢＣＡ１の発現を増加させ、ＨＤＬのレベルを増加させ、それによりアテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、並びに末梢血管疾患及び虚血発作のような関連状態のリスクを減少させる薬物として有用であり得ることが見出されている。ＲＣＴに必要なタンパク質をアップレギュレートするよう作用するその他の因子も、現在進行中の研究の主題となっている。
【０００４】
しかしながら、ＲＣＴに参与している物質の大部分が、細胞内タンパク質であるため、既知の又は可能性のあるＲＣＴ増強薬の効力の決定のため現在利用可能な唯一の方法は、細胞のタンパク質又はｍＲＮＡのレベルを測定することである。これらの型の測定には肝細胞又は脾細胞のような細胞が必要であることから、ヒトにおけるそのようなアッセイのルーチンの使用は妨げられている。従って、哺乳動物、特にヒトにおける既知の又は可能性のあるＲＣＴ増強因子の効力を決定するための非侵襲的かつ効率的な方法を提供する必要が、依然として存在している。
【０００５】
ＣＤ１４は、血漿中の可溶性タンパク質（ｓＣＤ１４）としても、単球及びマクロファージの表面上の膜タンパク質（ｍＣＤ１４）としても発現される５５ｋＤａタンパク質である（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｓ．Ｄ．（１９９９），Ｉｎｎａｔｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｌｉｐｉｄｓ（微生物脂質の自然認識），Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ（炎症：基本原理及び臨床的相関），第３版，Ｊ．Ｉ．Ｇａｌｌｉｎ及びＲ．Ｓｎｙｄｅｒｍａｎ編  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。ｓＣＤ１４は、最初は細菌リポ多糖（ＬＰＳ）との結合タンパク質として特徴決定されたが、それ以降、広範囲のリン脂質と結合し、これらの脂質を膜内外にシャトルしうることが証明されている（Ｙｕ，Ｂ．，Ｈａｉｌｍａｎ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｗｒｉｇｈｔ，Ｓ．Ｄ．（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９，３１５−３２４；Ｖａｓｓｅｌｏｎ，Ｔ．，Ｐｉｒｏｎｋｏｖａ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｄｅｔｍｅｒｓ，Ｐ．Ａ．（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，４４９８−４５０５；Ｖａｓｓｅｌｏｎ，Ｔ．，Ｈａｉｌｍａｎ，Ｅ．，Ｔｈｉｅｒｉｎｇｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｄｅｔｍｅｒｓ，Ｐ．Ａ．（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０，５０９−５２１；Ｗｕｒｆｅｌ，Ｍ．Ｍ．，Ｈａｉｌｍａｎ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｗｒｉｇｈｔ，Ｓ．Ｄ．（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１，１７４３−１７５４；及びＤｅｔｍｅｒｓ，Ｐ．Ａ．，Ｔｈｉｅｂｌｅｍｏｎｔ，Ｎ．，Ｖａｓｓｅｌｏｎ，Ｔ．，Ｐｉｒｏｎｋｏｖａ，Ｒ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｄ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｗｒｉｇｈｔ，Ｓ．Ｄ．（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７，５５８９−５５９６）。
【０００６】
ＣＤ１４のシャトル機能は、不溶性ＬＰＳのＨＤＬ粒子（Ｗｕｒｆｅｌら（前記））又は細胞（Ｈａｉｌｍａｎ，Ｅ．，Ｖａｓｓｅｌｏｎ，Ｔ．，Ｋｅｌｌｅｙ，Ｍ．，Ｂｕｓｓｅ，Ｌ．Ａ．，Ｈｕ，Ｍ．Ｃ．，Ｌｉｃｈｅｎｓｔｅｉｎ，Ｈ．Ｓ．，Ｄｅｔｍｅｒｓ，Ｐ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗｒｉｇｈｔ，Ｓ．Ｄ．（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６，４３８４−４３９０）への輸送速度が、ｓＣＤ１４の添加によって劇的に増強されるという所見によって例証される。この助長された輸送の動力学的分析は、まずＬＰＳがｓＣＤ１４と結合し、次いで結合した脂質がＨＤＬ粒子へと引き渡されることを示している（Ｗｕｒｆｅｌら（前記））。
【０００７】
原形質膜は、ほぼモル当量のリン脂質及びコレステロールを含有しており、細胞は、これら二つの脂質を一緒に輸出することが知られている（Ｏｒａｍ，Ｊ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｓ．（１９９６）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．３７，２４７３−２４９１）。しかしながら、ＣＤ１４が、細胞からのコレステロールの輸出の助長に関与しているか否かは、従来不明であった。
【０００８】
本発明者らは、タンパク質ＣＤ１４がＲＣＴに参与していること、及びＲＣＴを増加させる因子によってＣＤ１４遺伝子がアップレギュレートされることを発見した。従って、可溶型及び膜結合型の両方のＣＤ１４のレベルは、既知の又は可能性のあるＲＣＴ増強因子の効力を決定するための尺度を提供する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の一つの目的は、細胞のタンパク質又はｍＲＮＡのレベルを測定する必要を回避し、代わりに、ＣＤ１４レベルの血中レベル測定を利用する、哺乳動物、特にヒトにおける既知の又は可能性のあるコレステロール逆輸送増強因子の効力を決定するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って、本発明は、哺乳動物の標準血液試料中に存在するＣＤ１４タンパク質のレベルを測定し、一つのＣＤ１４タンパク質測定値を得ること；被検因子の投与後の哺乳動物の血液試料中に存在するＣＤ１４タンパク質のレベルを測定し、第二のＣＤ１４タンパク質測定値を得ること；及び二つのＣＤ１４タンパク質測定値を比較し、被検因子投与後に得られた測定値が、標準血液試料から得られた測定値より大きいか否かを決定することを含む、哺乳動物における被検コレステロール逆輸送増強因子の効力を評価するための方法を提供する。ここで、ＣＤ１４タンパク質は、ｓＣＤ１４及びｍＣＤ１４より選択され、両方の測定で同一である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のさらなる目的及び実施態様は、以下の詳細な説明より明らかとなる。
【００１２】
本発明者らは、タンパク質ＣＤ１４がＲＣＴに参与していることを発見した。ＣＤ１４は、血漿中の可溶性タンパク質（ｓＣＤ１４）としても、単球の表面上の膜タンパク質（ｍＣＤ１４）としても発現される。細胞へのｓＣＤ１４の添加は、細胞のコレステロールのアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ａｐｏＡＩ）への流出を増強し、そして抗体によるｍＣＤ１４の阻止は、細胞のコレステロールの流出を阻止する。この機能と一致して、本発明者らは、ＬＸＲのリガンドであり、細胞からのコレステロール流出を増強することが既知の化合物２２ヒドロキシコレステロールの添加が、ＡＢＣＡ１  ｍＲＮＡのみならずＣＤ１４  ｍＲＮＡのアップレギュレーションも同調的に引き起こすことを観察した。結果として、ＣＤ１４の血中レベルの測定は、ＲＣＴ増強因子の効力の尺度を提供するために使用されうる。
【００１３】
さらに、ＣＤ１４は、血漿中で容易にアッセイされ、かつ安定である。ｓＣＤ１４は血漿に対するＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）により測定可能であり、ｍＣＤ１４は血液単球に対するＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取）により測定可能である。ｓＣＤ１４及びｍＣＤ１４の血中レベルを測定するためのアッセイは、発表文献に記載されている。例えば、ｓＣＤ１４を測定するためのＥＬＩＳＡアッセイは、参照により本明細書に組み込まれるＤｅｔｍｅｒｓ  ＰＡ，Ｚｈｏｕ  Ｄ，Ｐｏｗｅｌｌ  Ｄ，Ｌｉｃｈｅｎｓｔｅｉｎ  Ｈ，Ｋｅｌｌｙ  Ｍ，Ｐｉｒｏｎｋｏｖａ  Ｒ．Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ＣＤ１４）  ａｒｅ  ｆｏｕｎｄ  ｗｉｔｈ  ＣＤ  １６（Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ＲＩＩＩ）  ｉｎ  ａｎ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（内毒素受容体（ＣＤ１４）は、アルカリホスファターゼを含有している好中球の細胞内画分にＣＤ１６（ＦｃガンマＲＩＩＩ）と共に見出される），Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５年８月１５日；１５５（４）：２０８５−９５に記載されている。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，６１４  ＭｃＫｉｎｌｅｙ  Ｐｌａｃｅ  Ｎ．Ｅ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ  ５５４１３の可溶型ヒトＣＤ１４の測定のために利用可能なＥＬＩＳＡキット（最新カタログ番号はＤＣ１４０である）のような、ｓＣＤ１４を測定するための市販のＥＬＩＳＡキットも存在する。
【００１４】
ｍＣＤ１４の血中レベルを測定するためのいくつかのアッセイが、例えばＰａｔｉｎｏ  Ｒ，Ｉｂａｒｒａ  Ｊ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ａ，Ｙａｇｕｅ  ＭＲ，Ｐｉｎｔｏｒ  Ｅ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｃｒｕｚ  Ａ，Ｆｉｇｕｅｒｅｄｏ  Ａ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ，ａｒｔｅｒｉａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ，ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ＣＤ１４  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０００年６月１日；８５（１１）：１２８８−９１；及びＷｒｉｇｈｔら（１９８６），Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，１６３：１２４５−１２５９（いずれも参照により本明細書に組み込まれる）に記載されたようなものを含む、発表文献に記載されている。
【００１５】
本発明は、哺乳動物の標準血液試料中に存在するＣＤ１４タンパク質のレベルを測定し、一つのＣＤ１４タンパク質測定値を得ること；被検因子の投与後の哺乳動物の血液試料中に存在するＣＤ１４タンパク質のレベルを測定し、第二のＣＤ１４タンパク質測定値を得ること；及び上記二つのＣＤ１４タンパク質測定値を比較し、被検因子投与後に得られた測定値が、標準血液試料から得られた測定値より大きいか否かを決定することを含む、本明細書において被検因子と呼ばれる、既知の又は可能性のあるコレステロール逆輸送増強因子の哺乳動物における効力を評価するための方法を提供する。ここで、ＣＤ１４タンパク質は、ｓＣＤ１４及びｍＣＤ１４より選択され、両方の測定が同一である。
【００１６】
本発明を実施するためには、ＣＤ１４の血中レベルの測定が必要とされる。ｓＣＤ１４又はｍＣＤ１４のいずれかが測定されうるが、比較は、同一の型のＣＤ１４の測定値の間でなされるものとする。即ち、ｓＣＤ１４の測定値はその他のｓＣＤ１４の測定値と比較され、ｍＣＤ１４の測定値はその他のｍＣＤ１４の測定値と比較される。
【００１７】
ＲＣＴ増強効力に関して評価される因子を、本明細書において被検因子と呼ぶこととする。被検因子は、哺乳動物で試験されることが望まれ、かつそれが可能な、化学的又は非化学的な任意の因子であり得る。「被検因子」という用語には、ＬＸＲリガンドのような既知のＲＣＴ増強因子、及びＲＣＴ増強活性が未知又は未確認の、可能性のあるＲＣＴ増強因子の両方が包含される。例えば、「被検因子」という用語には、化合物、化合物の混合物、及び医薬品のみならず、ビタミン並びに食物及び栄養補助食品のような消費可能な食品も含まれるものとする。被検因子という用語には、さらに、身体運動及び／又は減量食摂取のような、既知の又は可能性のある身体的及び行動的なＲＣＴ増強の誘導因子が含まれる。試験される身体的及び行動的なＲＣＴ増強の誘導因子は、薬物療法と組み合わされて投与されてもよく、例えば減量食摂取は減量薬と組み合わせて投与されうる。従って、本発明の方法は、例えば、化合物、食物、ビタミン、並びに／又は種々の身体的及び行動的な活動をＲＣＴ増強活性に関してスクリーニングするためにも使用されうるし、また既知のＲＣＴ増強因子の相対活性を評価するためにも使用されうる。本発明は、試験される、又は試験されうる特定の因子の型によって制限されるものではなく、本発明には、ＲＣＴの増強が起こったか否かを示すための生物学的マーカーとしてのＣＤ１４測定値の使用が包含される。
【００１８】
血液試料は、被検因子投与の開始後に選択される任意の時点で採取されうる。当業者であれば、選択された被検因子もしくは因子の組み合わせ及び実験の目的に依って変動しうる、哺乳動物の血液試料が採取される前の、所望の被検因子の投与期間を決定することができる。例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤は、ＬＤＬ低下効果を発揮するまでに約２週間を要するため、毎日のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬療法の開始から２週間から４週間後に血液試料を採取することができ；又は、１回の身体運動の実行もしくは食事の直後、又は数週間もしくは数ヶ月間の運動もしくは減量食のプログラムの後に血液試料を採取することができる。ＲＣＴ増強が起こる場合、それがいつ起こるのかを決定するためには、被検因子の投与中の様々な時点で血液試料が採取されうる。
【００１９】
被検因子の効力を評価するためには、ＣＤ１４血液測定からの結果を、哺乳動物由来の標準血液試料の結果と比較しなければならない。本明細書において意図されるように、「標準」血液試料には、被検因子が哺乳動物へと投与されない場合に得られた試料、及び被検因子とは異なる既知のＲＣＴ増強因子の哺乳動物への投与の後に得られた試料の両方が含まれる。被検因子が、既知の又は可能性のある身体的又は行動的なＲＣＴ増強の誘導因子である場合、標準血液試料は、身体的もしくは行動的な誘導因子なしに得られてもよいし（例えば、安静状態又は減量食の開始前の血液試料）、又は被検因子とは異なる身体運動もしくは減量食の後に得られた標準血液試料のように、結果の比較のための種々の身体的もしくは行動的な活動の後に得られてもよい。
【００２０】
標準血液試料が、既知のＲＣＴ増強因子の投与後に得られる場合、本明細書において標準ＲＣＴ増強因子とも呼ばれる既知のＲＣＴ増強因子は、１個以上の被検因子が効力に関して比較される標準因子として使用されうる。本発明の実施は、標準ＲＣＴ増強因子が標準血液試料を得るために投与される場合には、被検因子が、標準血液試料を得るために投与される標準ＲＣＴ増強因子とは異なる因子であることを必要とする。
【００２１】
被験血液試料及び標準血液試料を入手し、測定する順序は、選択の問題であり、特定の順序に制限されないものとする。
【００２２】
従って、本発明の一つの実施態様は、被検因子が投与されていない哺乳動物の血液試料中に存在するＣＤ１４タンパク質のレベルを測定し、一つのＣＤ１４タンパク質測定値を得ること；被検因子の投与後の哺乳動物の血液試料中に存在するＣＤ１４タンパク質のレベルを測定し、第二のＣＤ１４タンパク質測定値を得ること；及び二つのＣＤ１４タンパク質測定値を比較し、被検因子投与後に得られた測定値が、被検因子が投与されない場合に得られた測定値よりも大きいか否かを決定することを含む、哺乳動物における被検コレステロール逆輸送増強因子の効力を評価するための方法である。ここで、ＣＤ１４タンパク質はｓＣＤ１４及びｍＣＤ１４より選択され、両方の測定で同一である。
【００２３】
本発明のもう一つの実施態様は、標準ＲＣＴ増強因子の投与後の哺乳動物の血液試料中に存在するＣＤ１４タンパク質のレベルを測定し、一つのＣＤ１４タンパク質測定値を得ること；被検因子の投与後の哺乳動物の血液試料中に存在するＣＤ１４タンパク質のレベルを測定し、第二のＣＤ１４タンパク質測定値を得ること；及び二つのＣＤ１４タンパク質測定値を比較し、標準ＲＣＴ増強因子の効力と比較された被検因子の相対効力を決定することを含む、哺乳動物における被検コレステロール逆輸送増強因子の相対効力を決定するための方法である。ここで、ＣＤ１４タンパク質はｓＣＤ１４及びｍＣＤ１４より選択され、両方の測定で同一である。
【００２４】
本発明の方法は、コレステロール逆輸送増強活性を有する任意の因子、及びそのような活性に関してスクリーニングされることが望まれる因子の効力を評価するために有用である。スクリーニングされうる因子のクラスの例には、これらに限定はされないが、ＬＸＲリガンド、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ、及びＰＰＡＲγのアゴニスト、並びに１個以上のＰＰＡＲサブタイプに対する活性を有するアゴニストを含むヒトペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）アゴニスト、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤、米国特許第５，８３４，２８３号に記載されたＡＣＡＴ−１（ＡＣＡＴ  Ｉとも呼ばれる）及びＷＯ９７／４５４３９に記載されたＡＣＡＴ−２（ＡＣＡＴ  ＩＩとも呼ばれる）を含むアシル−補酵素Ａ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤、魚油、ニコチン酸（ビタミンＢ３）、ナイアシンアミド、及びそれらのアナログのようなビタミン、並びにエタノールのようなアルコールが含まれる。
【００２５】
ＬＸＲという用語には、この受容体の全てのサブタイプ、及びそのようなサブタイプをコードする対応する遺伝子が含まれる。特に、ＬＸＲには、ＬＸＲα及びＬＸＲβが含まれ、ＬＸＲのリガンドには、ＬＸＲα及び／又はＬＸＲβのアゴニスト及びアンタゴニストが含まれる。ＬＸＲαは、多様な名称で呼ばれているが、本願の目的のため、ＬＸＲαとは、ＬＸＲα、ＬＸＲａ、ＬＸＲアルファ、ＲＬＤ−１、ＮＲ１Ｈ３と呼ばれる任意の遺伝子、もしくは登録番号Ｕ２２６６２との相同性を有する遺伝子、又はそのようなポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質との相同性を有するタンパク質を意味することを理解されたい。同様に、ＬＸＲβには、ＬＸＲｂ、ＬＸＲβ、ＬＸＲベータ、ＮＥＲ、ＮＥＲ１、ＵＲ、ＯＲ−１、Ｒ１Ｐ１５、ＮＲ１Ｈ２と呼ばれる任意の遺伝子、もしくは登録番号Ｕ０７１３２との相同性を有する遺伝子、又はそのようなポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質との相同性を有するタンパク質が含まれることを理解されたい。ＬＸＲリガンドは、参照により本明細書に組み込まれるＺｈｏｕら（１９９８），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏ，１２：１５９４−１６０４に記載されているような発表されている手法によって同定されうる。ＬＸＲリガンドには、２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール、２０（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、及び２５−ヒドロキシコレステロールのような化合物が含まれ、これらは全てＬＸＲ活性に関して周知である。
【００２６】
ＰＰＡＲアゴニストは当分野において周知であり、既知のアッセイによって同定されうる。ＰＰＡＲγアゴニストの例には、一般的にグリタゾン系と呼ばれる化合物、例えばトログリタゾン、ピオグリタゾン、及びロシグリタゾンが含まれ、さらに、チアゾリジンジオン構造クラスに含まれないＰＰＡＲγアゴニストに加え、チアゾリジンジオン系として知られる構造クラスに含まれる化合物が含まれる。ＰＰＡＲαアゴニストには、例えばクロフィブラート、フェノフィブラート、及びゲムフィブロジルのようなフィブラートクラスの化合物が含まれる。ＰＰＡＲγ及びＰＰＡＲαのアゴニストは、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＺｈｏｕら（１９９８），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏ，１２：１５９４−１６０４に記載されたアッセイにより同定されうる。ＰＰＡＲδアゴニストは、例えばＰＰＡＲδアゴニストの例も提供している、参照により本明細書に組み込まれる１９９７年８月７日公開のＷ０９７／２８１４９に記載されたアッセイにより同定されうる。
【００２７】
ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼに対する阻害活性を有している化合物は、当分野において周知のアッセイを使用して容易に同定されうる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，２３１，９３８号の第６カラム及びＷＯ８４／０２１３１の３０頁から３３頁に記載又は引用されたアッセイを参照のこと。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤には、これらに限定されないが、３−ヒドロキシラクトン環又は対応する開環３，５−ジヒドロキシ酸のいずれかとして存在しうる基を含有している化合物の構造クラスの一部である「スタチン系」として知られる化合物が含まれる。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤には、ラクトン型及び開環ジヒドロキシ酸型のスタチン、並びにそれらの医薬適合性の塩及びエステルが包含される。スタチンクラスのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の例には、これらに限定はされないが、ロバスタチン（米国特許第４，３４２，７６７号参照）；シンバスタチン及び開環ジヒドロキシ酸型シンバスタチン（米国特許第４，４４４，７８４号参照）；プラバスタチン（米国特許第４，３４６，２２７号参照）；フルバスタチン（米国特許第５，３５４，７７２号参照）；アトルバスタチン（米国特許第５，２７３，９９５号参照）；セリバスタチン（米国特許第５，１７７，０８０号参照）、ＮＫ−１０４（米国特許第５，８５６，３３６号参照）、ＺＤ−４５２２（米国特許第５，２６０，４４０号）、並びにそれらの医薬適合性の塩及びエステルが含まれる。
【００２８】
ＡＣＡＴ−１又はＡＣＡＴ−２を選択的に阻害するもの、並びにＡＣＡＴ−１及びＡＣＡＴ−２の両方に対する二重阻害活性を有するものを含む、ＡＣＡＴに対する阻害活性を有している化合物は、例えば参照により本明細書に組み込まれるＣｈａｎｇ  Ｃ．Ｃ．，Ｌｅｅ  Ｃ．Ｙ．，Ｃｈａｎｇ，Ｅ．Ｔ．，Ｃｒｕｚ，Ｊ．Ｃ．，Ｌｅｖｅｓｑｕｅ，Ｍ．Ｃ．，Ｃｈａｎｇ，Ｔ．Ｙ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３５１３２−３５１４１（１９９８），Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｃｙｌ−ＣｏＡ：ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−１（ＡＣＡＴ−１）  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｔｏ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｕｔｉｌｉｚｅｓ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｉｎ  ｍｉｘｅｄ  ｍｉｃｅｌｌｅｓ  ｏｒ  ｉｎ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｍａｎｎｅｒ（本質的に均一に精製された組換えアシル−ＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ−１（ＡＣＡＴ−１）は、高度に協同的に混合ミセル又は小胞の中のコレステロールを利用する）に記載されているような、当分野において周知のアッセイを使用して容易に同定されうる。例えば、ＡＣＡＴ阻害剤には、これらに限定はされないが、米国特許第５，１２０，７３８号；第５，３４０，８０７号；第５，４７５，１３０号；第５，６６８，１３６号；第５，７６０，０８７号に記載された化合物；さらに、公開済の特許出願第Ｗ０９６／２６９２５；Ｗ０９７／１６１８４；ＥＰ０６３５５０１Ａ１（ヨーロッパ出願第９４３０５３０５．８号）Ｓｌｉｓｋｏｖｉｃ，Ｄ．Ｒ．，ＣＩ−１０１１：  Ａｎ  ａｔｙｐｉｃａｌ  ＡＣＡＴ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ（抗アテローム性動脈硬化活性を有する非定型的ＡＣＡＴ阻害剤），Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，ＸＩＶｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｆ．Ａｗｏｕｔｅｒｓ（編）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂ．Ｖ．，４３３−４４１（１９９７）；及びＴａｎａｋａ，Ａ．ら，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｙｌ−ＣｏＡ：ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｏ−ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（アシル−ＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼの阻害剤）．２．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｎ−ａｌｋｙｌ−Ｎ−（ｈｅｔｅｒｏａｒｙｌ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｂｅｎｚｙｌ）−Ｎ’−ａｒｙｌｕｒｅａｓ（新規な一連のＮ−アルキル−Ｎ−（ヘテロアリール置換ベンジル）−Ｎ’−アリール尿素の同定及び構造活性相関），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４１：２３９０−２４１０（１９９８）に記載された化合物が含まれる。
【００２９】
細胞のリン脂質のａｐｏＡ−Ｉへの輸出には、細胞コレステロールの輸出が伴う。ｓＣＤ１４が細胞からのコレステロール流出も助長するか否かを決定するため、以下の実験を実施した。
【実施例１】
【００３０】
細胞からのコレステロール流出のｓＣＤ１４による媒介
［３Ｈ］コレステロールで標識されたＴＨＰ−１細胞を、増加する濃度のｓＣＤ１４、ａｐｏＡ−Ｉ、又は対照タンパク質ＨＳＡと共にインキュベートし、上清中の放射能を決定した。コレステロール流出の初速度を、短時間研究において調査した（３０分、図１ａ、拡張された用量応答は図１ｂ）。驚くべきことに、ｓＣＤ１４は、３０分アッセイにおいて、ａｐｏＡ−Ｉと類似の効力で強力にコレステロール流出を強化することが見出された。ａｐｏＡ−Ｉへのコレステロールの流出は、１０μｇから２０μｇ／ｍｌで飽和可能であるが（図１ａ及び１ｂ）、３０分アッセイにおけるＣＤ１４により媒介されるコレステロール流出は、１００μｇ／ｍｌですら飽和を示さなかった（図１ｂ）。ｓＣＤ１４により媒介される流出の用量依存性は直線的であったため、そしてインキュベーション中にその他のコレステロールアクセプターは存在しなかったため、これらの観察は、コレステロールのｓＣＤ１４との直接的な低親和性の結合と最もよく一致しているようである。
【００３１】
ａｐｏＡ−Ｉ及びｓＣＤ１４によって媒介されるコレステロール流出の上限を、平行な２４時間実験において探究した（図１ｃ）。これらの条件下で、ａｐｏＡ−Ｉは、わずか１０μｇ／ｍｌでほぼ最大のコレステロール流出をもたらし、この流出量は、比較可能な量のｓＣＤ１４によって生じたものをはるかに超えていた。図１ｃ中の用量依存曲線の比較は、ａｐｏＡ−ＩがＣＤ１４より１０倍から２０倍高い能力でコレステロール流出を媒介しうることを示した。これらのデータは、ｓＣＤ１４が単独で細胞からのコレステロール流出を助長しうることを示唆している。しかしながら、血漿中のｓＣＤ１４の濃度は限られており（３μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌ）、ａｐｏＡ−Ｉの濃度ははるかに高いため（およそ１ｍｇ／ｍｌ）、ｓＣＤ１４自体が、血漿中のコレステロールのための重要な貯蔵庫又は目的地である可能性は低い。
【実施例２】
【００３２】
ｓＣＤ１４はａｐｏＡ−Ｉへのコレステロール流出を加速する
ｓＣＤ１４が、主要アクセプターであるａｐｏＡ−Ｉへのコレステロール流出を助長しうるか否かを決定するため、以下の実験を実施した（図２）。これらの研究において、本発明者らは、中程度のコレステロール放出のみを媒介する濃度である、血漿中濃度と類似したｓＣＤ１４の濃度（５μｇ／ｍｌ）を選択した。動力学的分析（図２）は、予想通りのｓＣＤ１４単独により媒介される低い流出、ａｐｏＡ−Ｉへのより大きい流出を示した。しかしながら、本発明者らは、ＣＤ１４及びａｐｏＡ−Ｉが組み合わせられた場合に、明白な流出の加速を観察した。ＣＤ１４非依存性のコレステロール流出を飽和させる高濃度のａｐｏＡ−Ｉ（１００μｇ／ｍｌ）にも関わらず、最初の１時間で、ｓＣＤ１４の添加は、ａｐｏＡ−Ｉへの流出速度の明白な増強を引き起こした。その増強は少なくとも３時間持続した。これらのデータは、ｓＣＤ１４が、細胞からのコレステロール流出の速度へ、重要な寄与をすることを示唆している。ｓＣＤ１４による流出の増強は時間経過の初期にのみ見られ、８時間目にはもはや認められなかったことに注意されたい。これらのデータは、ｓＣＤ１４はコレステロールの目的地への移動を速めるが、ｓＣＤ１４自体はコレステロールの重要な目的地ではないことを示唆している。
【００３３】
１時間目の時点におけるａｐｏＡ−Ｉへのコレステロール流出を、図３においてさらに研究した。これらのデータは、ｓＣＤ１４によって引き起こされる流出の加速を確証し、用量依存性を示している。付加的な研究は、ｓＣＤ１４が、高密度の脂質に乏しい亜種ＨＤＬ３の存在下でも流出を増強するが、血漿ＨＤＬへの流出は有意に増強し得ないことを示した。
【実施例３】
【００３４】
ｍＣＤ１４はａｐｏＡ−Ｉへの脂質流出において役割を果たす
ｓＣＤ１４の役割に関する上記の研究は、ｍＣＤ１４を発現しているマクロファージ様細胞系（ＴＨＰ−１）を利用した。ｍＣＤ１４もａｐｏＡ−Ｉへの脂質輸出に寄与するか否かを決定するため、モノクローナル及びポリクローナルの抗ＣＤ１４抗体をＴＨＰ−１細胞と共にインキュベートし、ａｐｏＡ−Ｉ依存性の脂質流出を測定した。図４ａに示されるように、２個の抗ＣＤ１４  ｍＡｂ、ＭＹ４及びＵＣＨ−Ｍ１、並びにポリクローナル抗ＣＤ１４は、各々、ＴＨＰ−１細胞からａｐｏＡ−Ｉへのコレステロール流出を３４％から３９％阻害した。平行な研究は、類似しているが幾分弱い、これらの抗体によるリン脂質流出の阻害を示した（図４ｂ）。他の抗原（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ５５）に対する抗体は、このアッセイにおいて効果を有していなかったため、抗ＣＤ１４  ｍＡｂによる阻害は特異的であるようである。さらに、阻害は、ＣＤ１４の特定のエピトープに特異的であるようであり、ＣＤ１４の他のエピトープに対する抗体（ＭＥＭ１８、ＲＭＯ５２、及びＡＭＬ２−２３）は、当条件下で阻害を示さなかった（図４ａ及び４ｂ）。
【実施例４】
【００３５】
ＬＸＲによるＣＤ１４の制御
最近の研究は、細胞からのコレステロール流出が、制御性オキシステロールと結合し、ＡＢＣＡ１の発現を増強する転写因子ＬＸＲによって制御されることを示している（Ｃｏｓｔｅｔ，Ｐ．，Ｌｕｏ，Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｎ．，及びＴａｌｌ，Ａ．Ｒ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，２８２４０−２８２４５；及びＳｃｈｗａｒｔｚ，Ｋ．，Ｌａｗｎ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｗａｄｅ，Ｄ．Ｐ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７４，７９４−８０２．）。ＣＤ１４が、細胞からのコレステロール流出における役割をＡＢＣＡ１と共有しているのであれば、ＣＤ１４の発現も、コレステロールホメオスタシスの達成を補助するためにＡＢＣＡ１と平行して制御されるかもしれない。これを試験するため、細胞を、ＬＸＲの特異的リガンドである２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール（２２Ｒ−ＯＨコレステロール）と共にインキュベートし、ＡＢＣＡ１及びＣＤ１４のｍＲＮＡの発現を、リアルタイムＰＣＲによって測定した。図５に示されるように、ＴＨＰー１単球又は肝細胞腫系ＨｅｐＧ２のいずれかへの２２Ｒ−ＯＨコレステロールの添加は、ＡＢＣＡ１発現（図５ａ）のみならずＣＤ１４発現（図５ｂ）をも一貫して上昇させた。ＡＢＣＡ１及びＣＤ１４の誘導に関する用量依存性は、概ね類似しており、およそ１０μＭで最大の半分の誘導が観察された（示されていない）。ＡＢＣＡ１の誘導は、ＣＤ１４の誘導よりわずかに迅速であるようであったが、いずれも、１６時間目までにプラトーレベルに達した。２２Ｒ−ＯＨコレステロールに対するＣＤ１４の応答の大きさは、ＡＢＣＡ１について観察されたものよりも低かったが、これらの２個の細胞型のいずれでも一貫して増加が見られた。ＡＢＣＡ１及びＣＤ１４の平行な制御の観察は、これらの２個のタンパク質のコレステロール流出における機能が共有されていることと一致している。
【００３６】
ｍＲＮＡ発現のリアルタイム定量的ＰＣＲ分析
リアルタイム定量的ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ分析（Ｈｅｉｄ，Ｃ．Ａ．，Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｊ．，Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｐ．Ｍ．（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６，９８６−９９４）を、ＣＤ１４及びＡＢＣＡ１のｍＲＮＡの相対レベルを決定するために使用した。ＲＴ−ＰＣＲ反応及びＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ反応は、製造業者の指示に従い実施した（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，ＴａｑＭａｎ  Ｇｏｌｄ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ及びＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）。配列特異的な増幅は、増幅サイクル中のＦＡＭ（リポーター色素）の増加した蛍光シグナルにより検出した。ヒトＧＡＰＤＨの遺伝子の増幅を、ＲＮＡ量の変動に関する内部対照として、試験された全ての試料に対する同じ反応で実施した。その後、ＣＤ１４及びＡＢＣＡ１  ｍＲＮＡを、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルに対して規準化した。ｍＲＮＡレベルは、処理された細胞が未処理細胞に対する倍率として提示した。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１ａ】コレステロール流出に対するｓＣＤ１４の濃度の効果を示すグラフである。［３Ｈ］コレステロールで標識されたＴＨＰ−１細胞を、ＲＰＭＩ中で、示された濃度のｓＣＤ１４（黒丸）、ａｐｏＡ−Ｉ（白丸）、又はＨＳＡ（逆三角）と共に、３０分間（ａ及びｂ）又は２０時間（ｃ）、インキュベートした。各点は、３回の測定値の平均値±ＳＤ（ａ）、又はデュプリケート試料の平均値±範囲（ｂ及びｃ）を表している。データは、類似の結果の５回の独立した実験の代表である。
【図１ｂ】コレステロール流出に対するｓＣＤ１４の濃度の効果を示すグラフである。［３Ｈ］コレステロールで標識されたＴＨＰ−１細胞を、ＲＰＭＩ中で、示された濃度のｓＣＤ１４（黒丸）、ａｐｏＡ−Ｉ（白丸）、又はＨＳＡ（逆三角）と共に、３０分間（ａ及びｂ）又は２０時間（ｃ）、インキュベートした。各点は、３回の測定値の平均値±ＳＤ（ａ）、又はデュプリケート試料の平均値±範囲（ｂ及びｃ）を表している。データは、類似の結果の５回の独立した実験の代表である。
【図１ｃ】コレステロール流出に対するｓＣＤ１４の濃度の効果を示すグラフである。［３Ｈ］コレステロールで標識されたＴＨＰ−１細胞を、ＲＰＭＩ中で、示された濃度のｓＣＤ１４（黒丸）、ａｐｏＡ−Ｉ（白丸）、又はＨＳＡ（逆三角）と共に、３０分間（ａ及びｂ）又は２０時間（ｃ）、インキュベートした。各点は、３回の測定値の平均値±ＳＤ（ａ）、又はデュプリケート試料の平均値±範囲（ｂ及びｃ）を表している。データは、類似の結果の５回の独立した実験の代表である。
【図２】ｓＣＤ１４及び／又はａｐｏＡ−Ｉによるコレステロール流出の動力学を示すグラフである。［３Ｈ］コレステロールで標識されたＴＨＰ−１細胞を、ＲＰＭＩ中で、５μｇ／ｍｌのｓＣＤ１４及び／又は１００μｇ／ｍｌ  ａｐｏＡ−Ｉの存在下又は非存在下でインキュベートした。各時点で、タンパク質の非存在下でのバックグラウンド流出を測定し、他のデータポイントから差し引いた。黒丸、ｓＣＤ１４；白丸、ａｐｏＡ−Ｉ；逆三角、ｓＣＤ１４及びａｐｏＡ−Ｉ。データは、３回の測定の平均値±ＳＤを表している。データは、類似の結果で繰り返された。
【図３】ｓＣＤ１４が、ａｐｏＡ−Ｉへのコレステロール流出に対する用量依存性の相加的効果を有するが、ＨＤＬへのコレステロール流出に対してはそのような効果を有していないことを示すグラフである。［３Ｈ］コレステロールで標識されたＴＨＰ−１細胞を、示された濃度のｓＣＤ１４を含む、又は含まない、５０μｇ／ｍｌのａｐｏＡ−Ｉ、ＨＤＬ３、又はＨＤＬを含有している緩衝液の中でインキュベートした。白バー、ｓＣＤ１４なし；斜線付きバー、１０μｇ／ｍｌ  ｓＣＤ１４；黒バー、２５μｇ／ｍｌ  ｓＣＤ１４。各時点でタンパク質の非存在下でのバックグラウンド流出を測定し、他のデータポイントから差し引いた。アステリスクは、ｓＣＤ１４の非存在下でのデータと比較して、統計的に有意であることを示す：＊、ｐ＜０．０１；＊＊、ｐ＜０．００１。データは、類似の結果の３回の独立の実験の代表である。
【図４ａ】様々な抗ＣＤ１４抗体によるａｐｏＡ−Ｉ依存性コレステロール流出の阻害を示すグラフである。［３Ｈ］コレステロール（ａ）又は［３Ｈ］コリン（ｂ）で標識されたＴＨＰ−１細胞を、ａｐｏＡ−Ｉ及び／又は様々な抗ＣＤ１４抗体の存在下又は非存在下で、２０時間、インキュベートした。抗体はバーの下に示されている。抗体濃度は、ｍＡｂについては１０μｇ／ｍｌであり、ポリクローナル抗体については１００μｇ／ｍｌであった（ａ及びｂ）。アステリスクは、抗ＣＤ１４の非存在下でのデータと比較して、統計的に有意（ｐ＜０．０１）であることを示す。データは、類似の結果の３回の独立の実験の代表である。
【図４ｂ】様々な抗ＣＤ１４抗体によるａｐｏＡ−Ｉ依存性コレステロール流出の阻害を示すグラフである。［３Ｈ］コレステロール（ａ）又は［３Ｈ］コリン（ｂ）で標識されたＴＨＰ−１細胞を、ａｐｏＡ−Ｉ及び／又は様々な抗ＣＤ１４抗体の存在下又は非存在下で、２０時間、インキュベートした。抗体はバーの下に示されている。抗体濃度は、ｍＡｂについては１０μｇ／ｍｌであり、ポリクローナル抗体については１００μｇ／ｍｌであった（ａ及びｂ）。アステリスクは、抗ＣＤ１４の非存在下でのデータと比較して、統計的に有意（ｐ＜０．０１）であることを示す。データは、類似の結果の３回の独立の実験の代表である。
【図５ａ】ＬＸＲの活性化が、ＡＢＣＡ１及びＣＤ１４のｍＲＮＡ発現を増加させることを示すグラフである。ＴＨＰ−１又はＨｅｐＧ２細胞（５×１０５個／ウェル）を、６穴プレートに播き、緩衝液（白バー）又は２２（Ｒ）−ＯＨコレステロール（１０μＭ、黒バー）と混合した。３７℃での一晩（およそ１６時間）のインキュベーションの後、ＲＮＡ試料を培養細胞から調製し、ＡＢＣＡ１（ａ）及びＣＤ１４（ｂ）のｍＲＮＡを、下記実施例４に記載されるようにして測定した。結果は、対照（未処理細胞）に対する倍率として示されており、データは、デュプリケート決定の平均値±範囲として示されている。
【図５ｂ】ＬＸＲの活性化が、ＡＢＣＡ１及びＣＤ１４のｍＲＮＡ発現を増加させることを示すグラフである。ＴＨＰ−１又はＨｅｐＧ２細胞（５×１０５個／ウェル）を、６穴プレートに播き、緩衝液（白バー）又は２２（Ｒ）−ＯＨコレステロール（１０μＭ、黒バー）と混合した。３７℃での一晩（およそ１６時間）のインキュベーションの後、ＲＮＡ試料を培養細胞から調製し、ＡＢＣＡ１（ａ）及びＣＤ１４（ｂ）のｍＲＮＡを、下記実施例４に記載されるようにして測定した。結果は、対照（未処理細胞）に対する倍率として示されており、データは、デュプリケート決定の平均値±範囲として示されている。
【図１ａ】
2004527737.tif 000002
【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【国際公開パンフレット】
2004527737.tif 000011
2004527737.tif 000012
2004527737.tif 000013
2004527737.tif 000014
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【国際調査報告】
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