(57)【要約】本発明は、添付図面の式１で表される新規オレアナントリテルペノイドオリゴグリコシド化合物（日常的にはコルニクラトニンと呼ばれる）に関する。本発明は、ヤブコウジ科に属するマングローブ植物Aegicerascorniculatum(Blanco)からの前記新規化合物の単離方法をも提供する。本発明は、前記化合物の抗菌特性をも開示する。本発明は、さらに、前記化合物の食品用保存料としての使用に関し、さらに、真菌感染症治療のための、前記化合物の有効量を含む組成物を開示する。
2004527519.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
添付図面の式１で表される新規オレアナントリテルペノイドオリゴグリコシド（日常的にはコルニクラトニン(corniculatonin)と呼ばれる）。式中、Ｒ1は、−ＯＨ、−ＯＡｃおよび ＝Ｏを含む群から選択され、そして、Ｒ2は炭水化物部分である。
【請求項２】
Ｒ1がα構造およびβ構造を取り得る請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記炭水化物が、DまたはL回転を持つモノサッカライドと、αおよびβ構造を持つ糖分子内(intersugar)架橋とのポリサッカライドである請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記炭水化物が、アグリコンに３位で結合しており、かつβ構造を持つ請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記炭水化物部分が、グルコース、ラムノースおよびグルコリン酸(glucorinic acid)を含む請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2が下記式で表される請求項１に記載の化合物。
【化１】
2004527519.tif 000008
【請求項７】
C13− C28オキシド(oxydo)環がβ構造を持つ請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
ディスク拡散アッセイにおける日和見菌類candidasp.およびCryptococcusneoformansの成長を阻害する請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
Microsporumgypseum,Trichophytonmentagrophytes,T.tonsuransおよびT.violaceumの成長を阻害する請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
AspergillusfreseniiおよびA.nigerの成長を阻害する請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
カンジダ症、クリプトコックス症、表皮感染および組織感染の治療に使用する請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
食品用保存料として使用する請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
添付図面の式１で表されるオレアナントリテルペノイドオリゴグリコシド化合物（日常的にはコルニクラトニンと呼ばれる）の単離方法であり、Aegicerascorniculatumの植物部分(plant parts)を有機溶媒に接触させて抽出物を得る工程、前記抽出物を公知の方法により分別する工程、および前記化合物を前記分別した抽出物から公知の方法で単離する工程を含む方法。
【請求項１４】
オレアナントリテルペノイドオリゴグリコシドの製造方法であり、
（i）Aegicerascorniculatumの植物部分を採集し乾燥する工程、
（ii）前記植物部分を有機極性溶媒に一週間浸漬する工程、
（iii）抽出物を濾過して濾液を得る工程、
（iv）前記濾液を公知の方法により濃縮する工程、
（v）濃縮物を、極性の程度が増加する極性溶媒で処理し、異なる層を得る工程、および
（vi）そうして得られた層を分別にかけて前記化合物を得る工程、
を含む方法。
【請求項１５】
前記有機溶媒が、酢酸エチル、メタノール、ヘプタン、ヘキサン、イソオクタン、アセトン、ベンゼン、トルエン、ジエチルエーテル、塩化メチレン、クロロホルム、ブタノール、エタノール、イソプロパノール、１,２−ジクロロエタンおよびそれらの混合物を含む群から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記溶媒が、酢酸エチルおよびメタノールを含む群から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記植物部分が、葉、茎、枝および根を含む群から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記分別をカラムクロマトグラフィーにより行なう請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記カラムクロマトグラフィーを、XAD-2（商品名）, Sephadex （登録商標）LH20, およびシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより行なう請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
溶離に使用する溶媒が、ヘプタン、メタノール、ジクロロメタン、酢酸エチル、ヘキサン、イソオクタン、クロロホルム、１,２−ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、イソプロパノール、ブタノール、水、エタノール、ジエチルエーテルおよびそれらの混合物を含む群から選択される請求項１３に記載の方法。特に好ましい溶離剤は、クロロホルム、メタノールおよびそれらの混合物である。
【請求項２１】
添付図面の式１で表されるオレアナントリテルペノイドオリゴグリコシド化合物の有効量を、任意に薬学的に許容可能な担体とともに含む組成物。
【請求項２２】
ディスク拡散アッセイにおける日和見菌類candidasp.およびCryptococcusneoformansの成長を阻害する請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
Microsporumgypseum,Trichophytonmentagrophytes,T.tonsuransおよびT.violaceumの成長を阻害する請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
AspergillusfreseniiおよびA.nigerの成長を阻害する請求項２０に記載の組成物。
【請求項２５】
カンジダ症、クリプトコックス症、表皮感染および組織感染の治療に使用する請求項２０に記載の組成物。
【請求項２６】
食品用保存料として使用する請求項２０に記載の組成物。
【請求項２７】
クリーム、錠剤、シロップ、ゲル、カプセルおよび粉末等の形態である請求項２０に記載の組成物。
【請求項２８】
添付図面の式１で表されるオレアナントリテルペノイドオリゴグリコシド化合物またはマングローブ植物のAegicerascorniculatuから得られた抽出物の有効量を投与することによる、哺乳類の真菌感染の治療方法。
【請求項２９】
6.25μg 〜 50μg/mlの前記化合物または抽出物を前記患者に投与する請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記患者が人間である請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
添付図面の式１で表されるオレアナントリテルペノイドオリゴグリコシド化合物（日常的にはコルニクラトニンと呼ばれる）またはマングローブ植物のAegicerascorniculatuから得られた抽出物を、カンジダ症、クリプトコックス症、表皮感染および組織感染の治療に使用する方法。
【請求項３２】
添付図面の式１で表されるオレアナントリテルペノイドオリゴグリコシド化合物（日常的にはコルニクラトニンと呼ばれる）またはマングローブ植物のAegicerascorniculatuから得られた抽出物を、食品用保存料として使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は添付図面の式１で表される新規化合物オレアナントリテルペノイドオリゴグリコシド（日常的にはコルニクラトニンと呼ばれる）に関する。本発明は、ヤブコウジ科に属するマングローブ植物Aegicerascorniculatum(Blanco)からの前記新規化合物の単離方法にも関する。本発明は、前記化合物の抗菌性をも開示する。さらに、本発明は、前記化合物の食品用保存料としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Aspergillussp.およびその他多くのカビ類は、しばしば普遍的な食品の汚染菌であり、そして、デンプンおよび脂肪の含有量減少および消化可能なエネルギーレベルの低下により、汚染された食品の品質に影響する(William K. C., Blaney B. J. The potential of mould to reduce the value of foodstuffs. Proceeding of the aquaculture nutrition workshop. Allan G L, Dall W. Eds. Salmadar Bay, NSW-Australia. NSW. Fisher's 1992, 205- 213)。Aspergilliは、シリアル、木の実、ピーナッツ、コットン、フルーツ、食肉、鳥肉およびシーフード製品に発生することが知られている(Jay J. M. 1978. Modern food microbiology, sec. Eds. D. Van Norstrand Company, New York.)。本研究で使用するAspergillusfreseniiおよびA.nigerは、温暖で湿潤な気候を有するインドの沿岸領域において、小麦から作られた食品に普遍的に付随していることが発見された。Aspergillus類の真菌は、アフラトキシン、フムロノシン(fumronosins)、フザリン酸、TA/AALトキシン、ゼアラレノン、およびトリコテシン、5−ブチルピコリン酸および関連する植物に有毒なピリジン誘導体等のマイコトキシンを生産することが知られている。これらのマイコトキシンは、植物および人間を含む様々な種に対して高い毒性を有し、そして、乳および乳製品、豆、シリアル、サツマイモを含む商業上供給される食料、および商業上供給される動物の飼料中に見出される。
【０００３】
植物および動物の病原体ならびに消費される製品および一般的な環境中に存在する毒性代謝産物のレベルをコントロールするために新規な手法および製剤が必要なことは明白である。しかしながら、農薬、殺菌剤および化学的な保存料の広く普及した使用は、抵抗性病原体の発生および進化を引き起こした。環境および健康のケアは発展しつづけることに関係するので、未来の環境標準に適合する新規な殺菌剤の確認または開発が必要である。それらの中でも特に、動物により消費され、したがって、動物および環境に対し低い毒性を有するのは天然物質である。
【０００４】
インド洋領域の海洋生物に由来する生物学的に活性な分子についての出願人の調査中に、マングローブ植物A.corniculatumからの粗製メタノール抽出物が、有望な中枢神経系抑制活性を示した。活性物質の単離工程を単純化するために、前記粗製抽出物を分別した。水性のフラクションが主なフラクションであり、余分は室温で除去した。驚くべきことに、長期間放置しても、前記水性フラクション表面には全く菌が繁殖しないことが確認された。このことは、前記フラクションが抗菌剤として働く何らかの分子を含むに違いないことを示した。抗生物質抵抗性微生物増加および効果的な抗菌剤不足の事実と結びついたこの測定は、新規抗真菌薬の必要性を示した。この目的を意図して、出願人は、活性サポニンの単離につながる前記水性フラクションの研究を行なった。
【０００５】
サポニンは植物中に広く分布するステロイドまたはトリテルペノイドグリコシドである。これらサポニンは多様な生物学的活性を有し、殺菌剤、殺虫剤、抗癌剤、化粧品、食品保存料および成長促進効果を持つ肥料として用いられる薬剤に用途が見出されている。サポニンのさらなる用途は、日常の製品からコレステロールを除去することおよびニワトリ等の家畜にサプリメントを与えて卵のコレステロールレベルを低下させることにある。
【０００６】
アロエの樹由来サポニンおよびp−ヒドロキシ安息香酸エステルを含む食品用保存料が、特願平5−009123号公報に開示されている。アスパラガスから抽出したサポニンを含む抗菌剤が特許2157205号公報に記述されている。フルーツパルプ、タバコおよび種子から単離したサポニンの抗微生物およびペスト活性が、Okunji ら (Int. J. Crude Drug Res., 1990, 28:193-199)、Gruenweller ら (Phytochem., 1990, 29:2485-2490) および Lalithat ら (Int. Pest Control, 1988, 30:42-45)によりそれぞれ記述されている。米国特許第4,477,361号明細書(Sperti G. S. et al. 1984)は、洗浄した表面に対し持続的に塗工される抗微生物性界面活性剤を含む桂皮化合物について記述している。NaHCO3および軽パラフィン系石油等のフィルム形成および／または蒸散抑制コーティングポリマーが、真菌コロニー形成レベルをコントロールすることが報告されている(Horst. et al. Plant Disease, 1992, 247-251; Elad et al. Phytoparasitica, 1989, 17:279-288 and Ziv, et al. Hort. Science, 1993,124)。
【０００７】
Aegicerasmajus(Gaerten) (Aegicerascorniculatumと同義)の樹皮由来トリテルペンサポゲニンがRao および Boseにより研究されている。彼らは、サポニン混合物の普遍的な酸加水分解による生成物としてのエギセラジエノール(aegiceradienol) (Science and Culture, 1958, 24:486)、ゲニンＡ(Rao K. V. et al., J. Ind. Chem. Soc., 1959, 36:358)、エギセラジオール(aegiceradiol) (Rao K. V. et al., Tetrahedron , 1962,18:461)、およびノレキノシスタジエノール(norechinocystadienol) (Rao  K. V. et al.,   J. Org.  Chem.,  1962,  27:1470)の単離を最初に報告した。エギセリン(aegicerin) (Rao K. V., Tetrahedron, 1964, 20:973)は、A.majus(Gaerten)樹皮の非グリコシド性抽出物中に存在することが報告されている。最近、Hensens および Lewis (Henses O. D. et al., Tetrahedron letters, 1965, 4639)は、普遍的なかなり激しい加水分解条件を粗製グリコシド混合物に使用することにより、エギセラジオールまたはエギセラジエノールが人工的に製造できることを示した。
【０００８】
イソラムノース、エキノシスチン酸(echinocystic acid)およびラパノン(rapanone)もまた、Aegicerascorniculatumの成分として知られている(Henses O. D. et al., Aust J. Chem., 1966, 19:169)。このマングローブは、短時間光合成の主生成物としてアスパルテートおよびアラニンを光合成することが知られている(Bhosale L. et al., Photosynthetica, 1983, 17:59)。Payneは、魚の毒素である5-O-メチルエンベリンがこのマングローブ中に存在することを報告している(Payne A. M., Diss. Abst. Int. PT. B. Sci. and Eng. 1991, 51:225)。Chattopadhyayら(Chattopadhyay S. et al., Proceedings of the National Symposium on Marine Resources, Techniques, Evaluation and Management; Vaidyanadhan R. et al., eds., 1990, 5-7)は、ルペオール、アミリン、オレアノール酸およびウルソール酸ならびにカンペステロール、スチグマステロールおよびシトステロールが、それぞれ重要なトリテルペノイドおよびステロールであることを発見した。Anagallisarvensisのサポニンフラクションは、単純ヘルペスウィルスタイプIおよびポリオウィルスに対し有効な抗ウィルス性を持つ(Amoros M. et al., Ann. Pharm. Fr., 1977, 35:371; Pl. Med. Phytoh., 1979, 13:122 and Amoros M. et al., Phytochem, 1987, 26:787)。その粗製グリコシドであるHeteroside Iは、その構成要素ゲニンであるアナガリゲノン(anagalligenone)が、抗菌性でありかつ亜麻仁の出芽を阻害することが報告されている。マウスに対するそのLD50値は、経口で675 mg/Kg であり、そして経皮で30.4mg/Kg である.(Staron T. et al., Phytiat-Phytopharm, 1969, 18:161)。ミシマサイコ(Bupleurumfalcatum)のサイコサポニンは、東洋医学における胆系および抗炎症性疾患治療用生薬であり、ラットにおいて、抗炎症活性に加えいくつかの代謝活性を示している(Yamamoto M. et al., Arzneim Forsch, 1975, 25:1021,1240)。Bupleurumlongeradiatumvar.breviradiatumおよびB.falcatumのサイコサポニンについての比較研究は、経口投与において1.0-3.0g/Kgの前記サポニンは無毒であり、そして、前者の鎮痛作用は後者の２倍であることを示した。両者ともに（経口で500mg/Kg）、マウスにおいて、ヘキサバルビタールナトリウムにより生じた眠りを延長した(Imaoka, I. et al., Shioku Igaku Zasshi, 1970, 26:1; Chem. Abstr., 1970, 73:43769)。Rapaneamelanophloeos(L.) Mez (ヤブコウジ科)由来サクラサポニン(sakurasaponin)は、3 ppmでは軟体動物駆除性を示し、そして、TLCバイオアッセイでは、1μgで、植物病原菌Cladosporiumcucumerinumに対し抗菌性を示す(Ohtani Kazuhiro et al., Phytochem, 1993, 33:83)。
【０００９】
（発明の目的）
本発明の主目的は、添付図面の式１で表される新規オレアナントリテルペノイドオリゴグリコシド化合物を提供することである。
【００１０】
本発明のその他の目的は、ヤブコウジ科に属するマングローブ植物Aegicerascorniculatum(Blanco)からの前記化合物の単離方法を提供することである。
【００１１】
本発明のさらにその他の目的は、前記化合物の抗菌および殺菌特性を研究することである。
【００１２】
本発明のさらにその他の目的は、殺菌剤および食品用保存料として有用な前記化合物を含む組成物を提供することである。
【００１３】
（発明の要約）
本発明は、添付図面の式１で表される新規オレアナントリテルペノイドオリゴグリコシド化合物（日常的にはコルニクラトニンとして知られる）に関する。本発明は、ヤブコウジ科に属するマングローブ植物Aegicerascorniculatum(Blanco)からの前記化合物の製造方法をも提供する。本発明は、さらに、殺菌剤および食品用保存料として有用な前記化合物を含む組成物およびその製造方法をも提供する。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明により、以下に詳しく説明する、添付図面の式１で表される新規オレアナントリテルペノイドオリゴグリコシド化合物（日常的にはコルニクラトニンと呼ばれる）を提供する。より詳しくは、本発明は、マングローブAegicerascorniculatum(Blanco)から単離されるコルニクラトニンの新規組成物の抗菌特性の開示に関する。それらの特性は、ディスク拡散アッセイにおける日和見菌類Candidasp.およびCryptococcusneoformansの成長阻害を含む。このアッセイでは、添付図面の式１で表される前記化合物は、Candidasp.,Cryptococcusneoformans,Microsporumgypseum,Trichophytonmentagrophytes,T.tonsurans,T.violaceumおよび食物腐敗菌Aspergillusfreseniiに対し殺菌性であった。前記二種の日和見菌類を除き、その他の試験した菌類はナイスタチン抵抗性である。
【００１５】
事実上、本発明は、ヤブコウジ科に属するマングローブ植物Aegicerascorniculatum(Blanco)に由来する、添付図面の式１で表されるコルニクラトニンと名付けられた新規オレアナントリテルペノイドオリゴグリコシド化合物を含む、新規抗菌性組成物に関する。前記化合物は、顕著に幅広い抗真菌活性を与えられている。前記活性は、ディスク拡散法により証明し、そして、in vitroでのMIC（最小阻害濃度）として、Candida sp.,Cryptococcusneoformans,Trichophytonmentagrophytes,T.tonsurans,T.violaceum,Microsporumgypseumの菌株に対して、ならびにカビAspergillusfreseniiおよびA.nigerに対して評価した。前記化合物は、Candida sp.,Cryptococcusneoformans,Trichophytonmentagrophytes,T.tonsuras,T.violaceumおよびMicrosporumgypseumに起因する感染に対し、ならびに食品腐敗カビAspergillusfreseniiに対し有効である。対照化合物としては、アンフォテリシンBおよびナイスタチンを採用した。添付図面の式１で表される化合物は、酵母CryptococcusneoformansおよびCandidasp.の菌株の集まりに対する活性が同等であり、それらに対する前記化合物の働きはナイスタチンに抵抗力があり、そのことが、前記化合物を対照化合物ナイスタチンよりも優れた候補としている。試験した全ての菌の菌株は、アンフォテリシンBおよび前記新規化合物に対し感受性であったが、添付図面の式１で表される前記新規化合物は、前記抗生物質よりもわずかに効力が弱かった。
【００１６】
本発明の一実施形態では、本発明は、添付図面の式１で表される新規オレアナントリテルペノイドオリゴグリコシド化合物（日常的にはコルニクラトニンと呼ばれる）を提供する。式中、R1は、 -OH, -OAc および =Oを含む群から選択され、そして R2は炭水化物部分である。
【００１７】
本発明の他の実施形態では、前記R1はαおよびβ構造を取り得る。
【００１８】
本発明のさらにその他の実施形態では、前記炭水化物は、DまたはL回転を持つモノサッカライドと、αおよびβ構造を持つ糖分子内架橋とのポリサッカライドである。
【００１９】
本発明のさらにその他の実施例とは、前記炭水化物はアグリコンに３位で結合しており、かつβ構造を持つ。
【００２０】
本発明のさらにその他の実施例では、前記炭水化物部分は、グルコース、ラムノースおよびグルコリン酸を含む。
【００２１】
本発明のその他の好ましい実施形態では、C13− C28オキシド(oxydo)環はベータ構造を持つ。
【００２２】
本発明の好ましい一実施形態では、新規R2は下記式で表される。
【００２３】
【化２】
2004527519.tif 000003
本発明の一実施形態では、前記化合物は、ディスク拡散アッセイにおける日和見菌類candidasp.およびCryptococcusneoformansの成長を阻害する。
【００２４】
本発明の他の実施形態では、前記化合物は、Microsporumgypseum,Trichophytonmentagrophytes,T.tonsuransおよびT.violaceumの成長を阻害する。
【００２５】
本発明のさらにその他の実施形態では、前記化合物は、AspergillusfreseniiおよびA.nigerの成長を阻害する。
【００２６】
本発明のさらにその他の実施形態では、前記化合物は、カンジダ症、クリプトコックス症、表皮感染および組織感染の治療に使用する。
【００２７】
本発明のさらにその他の実施形態では、前記化合物は、食品用保存料として使用する。
【００２８】
本発明は、添付図面の式１で表されるオレアナントリテルペノイドオリゴグリコシド化合物の単離方法であり、植物部分(plant parts)を有機溶媒に接触させて抽出物を得る工程、前記抽出物を公知の方法により分別する工程、および前記化合物を前記分別した抽出物から公知の方法で単離する工程を含む方法をも提供する。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態では、前記単離方法は、
（i）Aegicerascorniculatumの植物部分を採集し乾燥する工程、
（ii）前記植物部分を有機極性溶媒に一週間浸漬する工程、
（iii）抽出物を濾過して濾液を得る工程、
（iv）前記濾液を公知の方法により濃縮する工程、
（v）濃縮物を、極性の程度が増加する極性溶媒で処理し、異なる層を得る工程、および
（vi）そうして得られた層を分別にかけて前記化合物を得る工程、
を含む。
【００３０】
本発明の一実施形態では、前記有機溶媒は、酢酸エチル、メタノール、ヘプタン、ヘキサン、イソオクタン、アセトン、ベンゼン、トルエン、ジエチルエーテル、塩化メチレン、クロロホルム、ブタノール、エタノール、イソプロパノール、１,２−ジクロロエタンおよびそれらの混合物を含む群から選択される。
【００３１】
本発明の他の実施形態では、前記溶媒は、酢酸エチルおよびメタノールを含む群から選択される。
【００３２】
本発明のさらにその他の実施形態では、前記植物部分は、葉、茎、枝および根を含む群から選択される。
【００３３】
本発明のさらにその他の実施形態では、前記分別をカラムクロマトグラフィーにより行なう。
【００３４】
本発明のさらにその他の一実施形態では、前記カラムクロマトグラフィーを、XAD-2（商品名）, Sephadex （登録商標）LH20, およびシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより行なう。
【００３５】
本発明の他の一実施形態では、溶離に使用する溶媒は、ヘプタン、メタノール、ジクロロメタン、酢酸エチル、ヘキサン、イソオクタン、クロロホルム、１,２−ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、イソプロパノール、ブタノール、水、エタノール、ジエチルエーテルおよびそれらの混合物を含む群から選択される。特に好ましい溶離剤は、クロロホルム、メタノールおよびそれらの混合物である。
【００３６】
本発明は、さらに、添付図面の式１で表されるオレアナントリテルペノイドオリゴグリコシド化合物の有効量を、任意に薬学的に許容可能な担体とともに含む組成物をも提供する。
【００３７】
本発明の一実施形態では、前記組成物は、ディスク拡散アッセイにおける日和見菌類candidasp.およびCryptococcusneoformansの成長を阻害する。
【００３８】
本発明の他の一実施形態では、前記組成物は、Microsporumgypseum,Trichophytonmentagrophytes,T.tonsuransおよびT.violaceumの成長を阻害する。
【００３９】
本発明のさらにその他の実施形態では、前記組成物は、AspergillusfreseniiおよびA.nigerの成長を阻害する。
【００４０】
本発明のさらにその他の実施形態では、前記組成物は、カンジダ症、クリプトコックス症、表皮感染および組織感染の治療に使用する。
【００４１】
本発明のさらにその他の一実施形態では、前記組成物は、食品用保存料として使用する。
【００４２】
さらに、本発明は、添付図面の式１で表されるオレアナントリテルペノイドオリゴグリコシド化合物またはマングローブ植物のAegicerascorniculatuから得られた抽出物の有効量を投与することによる、哺乳類の真菌感染の治療方法を提供する。
【００４３】
本発明の一実施形態では、6.25μg 〜 50μg/mlの前記化合物または抽出物を前記患者に投与する。
【００４４】
本発明のその他の実施形態では、前記患者は人間である。
【００４５】
（図面の簡単な説明）
添付図面において、
図１は、Aegicerascorniculatumから単離して同定した前記新規オレアナントリテルペノイドオリゴグリコシド化合物の構造を示す。図中、R1=  -OH, -OAc および =O であり、そして、
【００４６】
【化３】
2004527519.tif 000004
である。
図２は、C5D5N および DMSOによる1H NMR スペクトルを示す。
図３は、C5D5Nによる13C NMR および DEPT スペクトルを示す。
図４は、ネガティブおよびポジティブモードにおける化合物１のFABMSを示す。
図５は、化合物１のIRスペクトル(KBr)を示す。
【００４７】
実施例により本発明についてさらに述べるが、これらは本発明の範囲を限定するものと解釈すべきでない。上記の詳細かつ包括的な記述と関連して、これら実施例は本発明に対するさらなる理解を提供し、そして、本発明の組成物を製造するための概略を示す。
【００４８】
（実施例）
【実施例１】
【００４９】
（粗製抽出物の製造）
インド西海岸で採集した10Kg（湿潤重量）のAegicerascorniculatum(Blanco)を、メタノールに一週間浸漬して抽出した。抽出液をデカンテーションした後、前記材料をフレッシュなメタノールに浸漬して同様の方法で抽出した。抽出液を合わせ、35℃で減圧濃縮して粗製抽出物(256gms)を得た。本実施例は、A.corniculatumからの粗製メタノール抽出物を製造するために使用する方法論を例示する。
【実施例２】
【００５０】
（粗製抽出物の分別）
前記メタノール抽出物を濃縮して約500mlの水性懸濁液とし、そして次に、極性の増加する溶媒を使用して異なるフラクションに分別した。それらは、クロロホルム、n-ブタノールおよび水性残渣フラクションに分別した。続いての研究のために、n-ブタノールおよび水性フラクションを集めた。
【実施例３】
【００５１】
（化合物１の精製および同定）
式１で表される新規化合物の前記水相からの精製は、前記水相を、まずXAD-2（商品名）で、続いて Sephadex （登録商標）LH20で、繰り返しカラムクロマトグラフィーにかけることによって行なうことができる。XAD-2（商品名）では、固体を充填し、まず水で、そして次にメタノールで溶離させ、対して、Sephadex （登録商標）LH20では、前記物質はメタノールで溶離させた。それを、シリカゲル(60-120 mesh)を通過させてMeOH:CHCl3(1:2)で溶離させることによりさらに精製した。
【００５２】
本発明の目的である式１の新規化合物は、n-ブタノールフラクション中にも存在することが確認された。
【００５３】
クロロホルム：メタノール：水(65 : 35 : 10)によるRf値は0.56である。この新規化合物の構造はスペクトルデータ（チャート１）に基づいて確認し、その化合物１に対し慣用名であるコルニクラトニンを提案した。
【００５４】
コルニクラトニン１は、白色粉末として単離した。分子構造C60H98O27は、13C,1H NMR および高分解能FAB mass スペクトルによる詳細な解析から演繹した。
【００５５】
化合物１は、リーベルマン-バーチャード試験により、トリテルペノイド陽性を示した。IRスペクトルは、3410cm-1にヒドロキシル基の、そして1728にグルコロニン酸(glucoronic acid)のカルボキシル基の吸収を示した。1H NMRスペクトル(C5D5N)は、δ0.756, 0.95, 1.01, 1.04, 1.075, 1.29, 1.528に７個の第三級メチル基の存在を示し、そして、δ1.59 (J=5.4Hz)の二重線は、デオキシ糖（ラムノースおよびフコース）の第二級メチル基と帰属された。さらに、13,28エポキシオレアナン化合物について測定された(Ahmad et al., Phytochem, 1988, 27:304)と同様の、δ3.51 (1H, d, J=6.9Hz) および3.28 (1H, d, J=6.9Hz)に、13,28 エポキシド部分の存在を支持するピークが存在した。このことは、13C NMRスペクトルにおけるδ86.7およびδ77.7の三重線に酸素付加第四級炭素のシグナルが存在したことにより支持された。1H NMRは、さらに、その低磁場領域の4.1(d, J=7.5Hz); 4.7 (d, J=7.1Hz); 5.19 (d, J=7.8Hz); 5.97 (d, J=3.2Hz) および 6.07 (d, J=3.5Hz)に、５個のアノマー水素のシグナルの存在を示した。H-3 および H-16に基づく多重線は、δ3.14および4.05によりそれぞれ明らかであった。H-16水素のシグナルは、オリゴサッカライドの特性によるδ3.9-5領域の相当なスペクトル密集と重なっていた。前記分子における５個の糖ユニットの存在は、13C NMR におけるδ99.9, 100.4, 102, 103.2 および 104.6のシグナルの存在によりさらに確認した。グリコシド間架橋および炭水化物部分のアグリコンへの結合位置は、13C NMRスペクトル観測により確認した。化合物１の糖部分における炭素共鳴の帰属は、トリテルペノイドサポニンのサッカライド鎖と比較し、かつグリコシド形成効果を考慮することにより行なった(Agarwal P. K., Phytochem, 1992, 31:3367)。C-3炭素シグナルの、アグリコンにおけるδ81.0からサポニンにおけるδ90.8へのグリコシド形成シフトは、炭水化物部分はアグリコンのC-3に位置することを示した。アノマー炭素共鳴は、全てのモノサッカライドユニットがC-1で置換されていることを示した。末端のグルコロニン酸およびラムノースの炭素化学シフトは、以上のように帰属することができた。前記分子の糖配列は、ネガティブモードのFAB massスペクトルに基づいて確認した。そのマススペクトルは、m/z (相対強度 %) 1249 [M-H]-, (100); 1103[M-Rha.]-, (13); 1073 [M-GlucA]-, (7.5); 957 [M- (Rha.  +  Rha.)]-,  (4.5);  795  [M-(Rha.  +  Rha.  +  Gluc.)]-,  (5) のピークを示した。146（ラムノース）および176（グルコロニン酸）のフラグメントが同時に消失していることは、二個の末端の糖が枝分かれ側鎖の二つの部位に結合していることを示唆した。この結果は、+ve イオン化 FABMSにおけるm/z (相対強度 %) 1274[M+ Na]+(100); 1128 [(M+ Na) - Rha]+(8.8), 1098[(M+ Na) - GlucA]+(11); 982 [(M+ Na) - (Rha. + Rha)]+ (4)のピークにより確認された。m/z 815のフラグメントは、[(M++ Na) - glycone]+に対応する。このフラグメンテーションは、続いて起こるラムノース、グルコースおよびグルコロニン酸の分子イオンピークの消失に対応する。このデータに基づき、前記好ましい化合物は、新規サポニン3-O-α-rhamnopyranosyl-rhamnopyranosyl-glucopyranosyl-glucoronopyranosylgluco-pyrano side 16 α-hydroxy-13, 28-epoxy oleananeであると同定され、そして、出願人は、これにコルニクラトニンという慣用名を提案した。
【００５６】
化合物１の13C NMRデータ（チャート１）
【００５７】
【数１】
2004527519.tif 000005
【実施例４】
【００５８】
（本発明の組成物の抗菌活性）
表１および２に示す本発明の組成物のin vitroにおける抗菌効果を、以下のアッセイ方法を適用して証明した。
【実施例５】
【００５９】
（用具および手法）
寒天：Microsporumgypseum,TrichophytonmentagrophytesT.tonsurans,T.violaceum,AspergillusfreseniiおよびA.nigerの培養にはCzapek Malt Agar (Himedia laboratories Ltd.) を使用した。CryptococcusneoformansおよびCandidaspにはMycological Agar (Himedia Laboratories Ltd) を使用した。
【実施例６】
【００６０】
（対照化合物）
アンフォテリシンBおよびナイスタチン(Himedia laboratories Ltd.)を比較用標準として使用した。
【実施例７】
【００６１】
（菌株）
Bambolim、Goa Medical CollegeのDr. Savioにより同定され、そして贈呈された酵母および糸状菌の病原性菌株を試験に用いた。Aspergillusの菌株は、感染した小麦パンから無菌針を用いて単離し、菌材(fungal material)は、0.5 %次亜塩素酸を用いて2-3分間表面を滅菌し、そしてさらに、滅菌水中でスモールブラシを用いて洗浄した。洗浄した菌材は、針を用いて滅菌培地に移し、そしてさらに、標準的な手法(Collins and Taylor, 1967)により継代培養して精製した。分類学上の同定は、種々の標準的な検索表(Ainswort et al., 1973; Onion et al., 1981)を用いて行ない、そして、同定は、Pune、Agarkar Research InstituteのAlka Pandeyが確認した。
【実施例８】
【００６２】
（菌株の保存）
酵母菌株(Candidasp.およびCryptococcusneoformans)は、冷蔵温度（3-5℃）において菌用寒天(Himedia Laboratories Ltd)上に単一のコロニーを転移させることにより維持した。糸状菌は、アッセイに必要とするまで、冷蔵温度（3-5℃）においてCzapek Maltの寒天斜面上に維持した。
【実施例９】
【００６３】
（アッセイプロトコール）
ディスク拡散アッセイ：前記化合物の抗菌活性についてスクリーニングするために、ディスク拡散アッセイを使用した。このテストのためのストック溶液は、前記式1で表される化合物5 mgを200μlのジメチルスルホキシド（DMSO）に溶かして調製した。前記ストック溶液10μlをペーパーディスク上に広げ、250μg disk-1の最終濃度を得た。対照ディスクは、ジメチルスルホキシドのみを染み込ませ(reconstituted)、そして28-29℃で乾燥させたものを適用した。完全に乾燥したディスクを、菌を接種したプレートに適用した。そのプレートを室温で42-120時間インキュベートして、培地中における最大成長を得た。前記ディスク周囲の阻害領域を測定した。これらのバイオアッセイにより得られた結果を表１にまとめる。
【００６４】
【表１】
2004527519.tif 000006
（最小阻害濃度(MIC)）
Cryptococcusneoformans,Candidasp.,Microsporumgypseum,Trichophytontonsurans,T.violaceumおよびTrichophytonmentagrophytesを100μl含むように接種物を調整し、そして、適切なプレート上に広げ、ディスクを適用するに先立ち10分間過剰な湿気を吸収させた。アッセイ直前に、本発明の目的である式１で表される試験化合物、対照化合物であるアンフォテリシンBおよびナイスタチンを、それぞれ概算濃度750μ/mg および 4800USPunit/mgのジメチルスルホキシド溶液として３回染み込ませた。MIC用のストック溶液は、1mg, 0.5 mg, および0.25 mg を200μlのジメチルスルホキシド(DMSO)に、そして0.625mg, 0.312 mg を1mlのジメチルスルホキシド(DMSO)に溶かして調製した。このストック溶液から、10μlをペーパーディスク上に広げ、最終濃度50μg disc-1, 25μg disc-1, 12.5μg disc-1,6.25μg disc-1および 3.12μg disk-1を得た。ディスクを、デシケーター中、減圧下、28-29℃で乾燥させ、そして、菌を接種したプレート上に適用した。試験用プレートを、室温において42-120時間インキュベートして最大成長を得、そして、MICを、明確な成長阻害領域を結果として生じた化合物および抗菌剤の最低濃度として決定した。
【００６５】
試験するにあたり、式１の化合物は、全てのアッセイに先立ち、直前にジメチルスルホキシド（DMSO）溶液として染み込ませた。ジメチルスルホキシド（DMSO）単独では、試験したどの微生物についても、検出可能な阻害効果は有しなかった。式１の化合物は、種々の酵母および糸状菌の集団について試験したが、そのうちのいくつかは対照化合物ナイスタチンに対し抵抗性である。糸状菌はナイスタチンに抵抗性であった。
【００６６】
本発明の目的である式１で表される化合物１の、ディスク拡散法におけるin vitro抗菌活性を、下記表２にまとめる。
【００６７】
【表２】
2004527519.tif 000007
上記表２から、式１の化合物は、試験した酵母および糸状菌のうちAspergillusniger以外の全ての菌株に対して殺菌性であったことが明らかである。酵母CryptococcusneoformansおよびCandidasp.に対する活性は対照化合物ナイスタチンに匹敵し、そして、ナイスタチン抵抗性糸状菌に対してさえも活性であることが、式１で表わされる化合物の新規組成物を対照化合物ナイスタチンよりも良い候補としている。前記式１で表わされる化合物の新規組成物は、試験した菌に対しては、抗生物質アンフォテリシンBよりもわずかに効力が弱かった。試験した全ての菌の菌株は、アンフォテリシンBに対し感受性である。
【００６８】
前述の測定に基づき、本発明の目的である前記式１で表される化合物は、アスペルギルス症、カンジダ症等の真菌感染、クリプトコックス症等の内部感染、抗生物質抵抗性菌により引き起こされる表皮感染等のうち一またはそれ以上の治療に有用であると確信できる。それは、食品用保存料としても有用であろう。
【００６９】
本発明の範囲は、前記の記述、実施例および本願で提案する使用方法により限定されず、そして、本発明の趣旨を逸脱しない限りにおいて変更を加えることができる。本願で述べる化合物は、他の有用な実用性を持ち得る。式１で表される本発明の化合物の治療に対する適用は、現在の、または将来の、当業者公知の適切な治療方法および技術により達成できる。さらに、本発明の化合物は、他の有用な化合物の製造における出発原料としての用途を持ち得る。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲およびそれらの均等の範囲内において、この発明の変更および変化をカバーするものと意図する。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】新規オレアナントリテルペノイドオリゴグリコシド化合物の構造を示す。
【図２】C5D5N および DMSOによる1H NMR スペクトルを示す。
【図３】C5D5Nによる13C NMR および DEPT スペクトルを示す。
【図４】ネガティブおよびポジティブモードにおける化合物１のFABMSを示す。
【図５】化合物１のIRスペクトル(KBr)を示す。
【国際公開パンフレット】
2004527519.tif 000009
2004527519.tif 000010
2004527519.tif 000011
2004527519.tif 000012
2004527519.tif 000013
2004527519.tif 000014
2004527519.tif 000015
2004527519.tif 000016
2004527519.tif 000017
2004527519.tif 000018
2004527519.tif 000019
2004527519.tif 000020
2004527519.tif 000021
2004527519.tif 000022
2004527519.tif 000023
2004527519.tif 000024
2004527519.tif 000025
2004527519.tif 000026
2004527519.tif 000027
2004527519.tif 000028
2004527519.tif 000029
2004527519.tif 000030
2004527519.tif 000031
2004527519.tif 000032
2004527519.tif 000033
2004527519.tif 000034
2004527519.tif 000035
2004527519.tif 000036
2004527519.tif 000037
2004527519.tif 000038
【手続補正書】
【提出日】平成15年3月19日(2003.3.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
添付図面の式１で表される新規オレアナントリテルペノイドオリゴグリコシド（日常的にはコルニクラトニン(corniculatonin)と呼ばれる）。式中、Ｒ1は、−ＯＨ、−ＯＡｃおよび ＝Ｏを含む群から選択される。
【化１】
2004527519.tif 000039
【請求項２】
Ｒ1がα構造およびβ構造を取り得る請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記炭水化物が、DまたはL回転を持つモノサッカライドと、αおよびβ構造を持つ糖分子内(intersugar)架橋とのポリサッカライドである請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記炭水化物が、アグリコンに３位で結合しており、かつβ構造を持つ請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記炭水化物部分が、グルコース、ラムノースおよびグルコリン酸(glucorinic acid)を含む請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ1がＯＨである請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
C13− C28オキシド(oxydo)環がβ構造を持つ請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
ディスク拡散アッセイにおける日和見菌類candidasp.およびCryptococcusneoformansの成長を阻害する請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
Microsporumgypseum,Trichophytonmentagrophytes,T.tonsuransおよびT.violaceumの成長を阻害する請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
AspergillusfreseniiおよびA.nigerの成長を阻害する請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
カンジダ症、クリプトコックス症、表皮感染および組織感染の治療に使用する請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
食品用保存料として使用する請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
添付図面の式１で表されるオレアナントリテルペノイドオリゴグリコシド化合物（日常的にはコルニクラトニンと呼ばれる）の単離方法であり、Aegicerascorniculatumの植物部分(plant parts)を有機溶媒に接触させて抽出物を得る工程、前記抽出物を公知の方法により分別する工程、および前記化合物を前記分別した抽出物から公知の方法で単離する工程を含む方法。
【化２】
2004527519.tif 000040
【請求項１４】
オレアナントリテルペノイドオリゴグリコシドの製造方法であり、
（i）Aegicerascorniculatumの植物部分を採集し乾燥する工程、
（ii）前記植物部分を有機極性溶媒に一週間浸漬する工程、
（iii）抽出物を濾過して濾液を得る工程、
（iv）前記濾液を公知の方法により濃縮する工程、
（v）濃縮物を、極性の程度が増加する極性溶媒で処理し、異なる層を得る工程、および
（vi）そうして得られた層を分別にかけて前記化合物を得る工程、
を含む方法。
【化３】
2004527519.tif 000041
【請求項１５】
前記有機溶媒が、酢酸エチル、メタノール、ヘプタン、ヘキサン、イソオクタン、アセトン、ベンゼン、トルエン、ジエチルエーテル、塩化メチレン、クロロホルム、ブタノール、エタノール、イソプロパノール、１,２−ジクロロエタンおよびそれらの混合物を含む群から選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記溶媒が、酢酸エチルおよびメタノールを含む群から選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記植物部分が、葉、茎、枝および根を含む群から選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記分別をカラムクロマトグラフィーにより行なう請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記カラムクロマトグラフィーを、XAD-2（商品名）, Sephadex （登録商標）LH20, およびシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより行なう請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
溶離に使用する溶媒が、ヘプタン、メタノール、ジクロロメタン、酢酸エチル、ヘキサン、イソオクタン、クロロホルム、１,２−ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、イソプロパノール、ブタノール、水、エタノール、ジエチルエーテルおよびそれらの混合物を含む群から選択される請求項１４に記載の方法。特に好ましい溶離剤は、クロロホルム、メタノールおよびそれらの混合物である。
【請求項２１】
添付図面の式１で表されるオレアナントリテルペノイドオリゴグリコシド化合物の有効量を、任意に薬学的に許容可能な担体とともに含む組成物。
【化４】
2004527519.tif 000042
【請求項２２】
ディスク拡散アッセイにおける日和見菌類candidasp.およびCryptococcusneoformansの成長を阻害する請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
Microsporumgypseum,Trichophytonmentagrophytes,T.tonsuransおよびT.violaceumの成長を阻害する請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
AspergillusfreseniiおよびA.nigerの成長を阻害する請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
カンジダ症、クリプトコックス症、表皮感染および組織感染の治療に使用する請求項２１に記載の組成物。
【請求項２６】
食品用保存料として使用する請求項２１に記載の組成物。
【請求項２７】
クリーム、錠剤、シロップ、ゲル、カプセルおよび粉末等の形態である請求項２１に記載の組成物。
【請求項２８】
添付図面の式１で表されるオレアナントリテルペノイドオリゴグリコシド化合物またはマングローブ植物のAegicerascorniculatuから得られた抽出物の有効量を投与することによる、哺乳類の真菌感染の治療方法。
【化５】
2004527519.tif 000043
【請求項２９】
6.25μg 〜 50μg/mlの前記化合物または抽出物を前記患者に投与する請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記患者が人間である請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
添付図面の式１で表されるオレアナントリテルペノイドオリゴグリコシド化合物（日常的にはコルニクラトニンと呼ばれる）またはマングローブ植物のAegicerascorniculatuから得られた抽出物を、カンジダ症、クリプトコックス症、表皮感染および組織感染の治療に使用する方法。
【化６】
2004527519.tif 000044
【請求項３２】
添付図面の式１で表されるオレアナントリテルペノイドオリゴグリコシド化合物（日常的にはコルニクラトニンと呼ばれる）またはマングローブ植物のAegicerascorniculatuから得られた抽出物を、食品用保存料として使用する方法。
【国際調査報告】
2004527519.tif 000045
2004527519.tif 000046