(57)【要約】本出願において、ブタインターロイキン−１２レセプターのブタβ−１鎖およびブタβ−２鎖をコードする遺伝子が、クローニングされた。また、本出願において、両方の鎖の相補的ＤＮＡの完全配列が、決定された。さらに、本出願において、優れた細胞性免疫に関連する改変体が、見出された。なおさらに、本出願において、新規分子の用途が、考察される。本発明は、ブタβ−１鎖のｃＤＮＡ分子サブユニットおよびブタβ−２鎖のｃＤＮＡ分子サブユニットによりコードされる、ブタＩＬ−１２レセプターに関する。
2004511231.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタβ−１鎖のｃＤＮＡ分子サブユニットおよびブタβ−２鎖のｃＤＮＡ分子サブユニットによりコードされる、ブタＩＬ−１２レセプター。
【請求項２】
ブタインターロイキン−１２レセプターのブタβ−１鎖をコードするｃＤＮＡ分子であって、該ｃＤＮＡ分子は、図１に示されるヌクレオチド配列を有する、ｃＤＮＡ分子。
【請求項３】
ブタインターロイキン−１２レセプターのブタβ−２鎖をコードするｃＤＮＡ分子であって、該ｃＤＮＡ配列は、図５に示されるヌクレオチド配列を有する、ｃＤＮＡ分子。
【請求項４】
所定の病原体に対して強力な細胞性免疫応答を発生することができるブタを同定する方法であって、該方法は、
（ａ）所定の病原体を特定する工程；および
（ｂ）ＩＬ−１２レセプターの対立遺伝子改変体を有するブタを選択する工程であって、該対立遺伝子改変体は、該改変体を有さないブタと比較して優れた能力をブタに付与し、該能力は、該病原体に対して感染またはワクチン接種の際に強力な細胞性応答を発生させる、工程、
を包含する、方法。
【請求項５】
請求項１に記載のｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列を有する分子であって、該アミノ酸配列は図１に示される、分子。
【請求項６】
請求項２に記載のｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列は図５に示される、分子。
【請求項７】
ブタ集団の細胞性免疫応答を改善するための方法であって、該方法は、
（ａ）ＩＬ−１２レセプターの対立遺伝子改変体を有するブタを選択する工程であって、該対立遺伝子改変体は、該改変体を有さないブタと比較して優れた能力をブタに付与し、該能力は、該病原体に対して感染またはワクチン接種の際に強力な細胞性応答を発生させる、工程；および
（ｂ）該選択したブタを、ブタ育種に関する当業者に公知の方法に従って育種する工程、
を包含する、方法。
【請求項８】
請求項３のｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列を有する分子であって、該アミノ酸配列は、図５に示されるアミノ酸位置番号３４２でセリンを生じる、１２５４位の対立遺伝子改変体を有する、分子。
【請求項９】
請求項８に記載の分子であって、前記改変体が、１２５４位において、ＡからＣへのヌクレオチド変化を生じる、分子。
【請求項１０】
請求項８に記載の分子であって、ブタにおける感染性因子に対する高いＩＦＮ−γ応答または高い細胞媒介性免疫に関連することがさらに特徴付けられている、分子。
【請求項１１】
請求項８に記載の分子であって、ブタにおける感染性因子ＰＲＲＳＶに対する高いＩＦＮ−γ応答または高い細胞媒介性免疫に関連することがさらに特徴付けられている、分子。
【請求項１２】
請求項８に記載の分子であって、微生物に対する高い免疫応答に関連することがさらに特徴付けられている、分子。
【請求項１３】
請求項８に記載の分子であって、ウイルスに対する高い免疫応答に関連することがさらに特徴付けられている、分子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
ブタＩＬ−１２レセプターの遺伝的性質を決定する。
【０００２】
ブタインターロイキン−１２レセプターのブタβ−１鎖およびブタβ−２鎖をコードする遺伝子をクローン化した。両鎖の相補的ＤＮＡの完全な配列を決定した。免疫機能と互いに関連づけられる改変体（多型体）を同定した。
【０００３】
インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、３５ｋＤａおよび４０ｋＤａの分子量を有する２つのサブユニットからなるヘテロ二量体サイトカインである。両サブユニットは、種を越えて高度に保存される（２つのブタＩＬ−１２サブユニットの予想アミノ酸配列は、ヒト対応物と約８５％相同である）（ＦｏｓｓおよびＭｕｒｔａｕｇｈ，１９９７）。ＩＬ−１２は、ネイティブのＴ細胞のＩＦＮ−γを産生し得る記憶／エフェクターＴ細胞への有効な分化に必要とされる、単一の重要な因子である。ＮＫ細胞刺激因子としても公知である、ＩＬ−１２は、明らかな前炎症機能を有するサイトカインである。ＩＬ−１２は、活性化Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増殖を刺激し、そして細胞傷害性Ｔリンパ球およびＮＫ細胞の両方の溶解活性もまた刺激する（Ｒｏｍａｎｉら、１９９７；ＴｒｉｎｃｈｉｅｒｉおよびＳｃｏｔｔ，１９９４；Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，１９９７）。ＩＬ−１２の生物学的活性は、特定の細胞表面レセプターに対する結合を介して媒介される。
【０００４】
ヒトＩＬ−１２レセプターは、ＩＬ−１２レセプターβ−１およびＩＬ−１２レセプターβ−２と呼ばれ、そして各々１３０ｋＤａの推定分子量を有する、２つのβ型サイトカインレセプターサブユニットから構成されるジスルフィド連結オリゴマーからなる。これらの２つのサブユニットが合わさると、高い親和性のＩＬ−１２レセプターが生じるが、各々が独立して発現された鎖は、ＩＬ−１２に対して低い親和性を示す（Ｐｒｅｓｋｙら、１９９６，１９９８）。ＩＬ−１２レセプターβ−１サブユニットおよびＩＬ−１２レセプターβ−２サブユニットの両方の発現は、ＣＤ４＋リンパ球、ＣＤ８＋リンパ球およびＮＫ細胞の活性化の後にアップレギュレートされる（Ｓｚａｂｏら、１９９７；Ｗｕら、１９９７）。しかし、２つのＩＬ−１２レセプターサブユニットの発現は、少なくとも転写レベルで、差次的に調節されると考えられている。両方の鎖についてのｍＲＮＡの産生は、Ｔ細胞の活性化の間に誘導されるが、ＩＬ−１２レセプターβ−２遺伝子の転写は、このサブユニットのみが、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βにより阻害され、β−１サブユニットはこれらにより阻害されないという点で、より厳密に制御されると考えられている（Ｗｕら、１９９７）。ＩＬ−１２の生物学的活性は、このサイトカインに対するレセプターの細胞表面発現に依存する。このβ−１レセプターの対立遺伝子改変体は、ヒトの、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａのような細胞内の病原体に対する防御免疫を生じる能力に影響することが示されている。
【０００５】
インターロイキン１２は、感染因子に対する感染またはワクチン接種に応答して生じる免疫の性質の決定に重大な影響を与える。この効果は、このサイトカインの、リンパ系細胞上のその細胞表面レセプターに対する結合を介して媒介される。
【０００６】
ＩＬ−１２レセプターの遺伝子改変体が、他の種に存在する場合、選択的な育種は、動物群（ａｎｉｍａｌ　ｈｅｒｄ）の健康を改善し得る。ＩＬ−１２は、細胞媒介性免疫の発生の調節に重大な影響を与えるので、ＩＬ−１２により提供される分化シグナルに対して応答する優れた能力を有する、ＩＬ−１２レセプター対立遺伝子を保有する動物を、ブタ集団内に存在させることが可能である。従って、これらの動物は、病原体に対する感染またはワクチン接種の際に、強力な細胞性免疫応答を生じるという遺伝的性質がある。優れた細胞性免疫応答は、この型の免疫が疾患からの防御に影響を与える感染性疾患に対して、より高いレベルの防御免疫を提供するようである。必要とされることは、所定の病原体に対して強力な細胞性免疫応答を生じ得る動物（例えば、ブタ）を同定する遺伝マーカーを開発することである。
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、優れた細胞性免疫を有するブタを同定し得る遺伝マーカーに関する。このマーカーは、２つのサブユニットからなるＩＬ−１２レセプター遺伝子の対立遺伝子改変体である。
【０００８】
本発明の１つの局面は、本明細書中に開示されるｃＤＮＡ分子によりコードされるブタＩＬ−１２レセプターである。ブタインターロイキン−１２レセプターのブタβ−１鎖をコードするｃＤＮＡ分子は、図１および２に示されるヌクレオチド配列を有する。β−１鎖のｃＤＮＡ配列から縮重したアミノ酸配列を有する分子もまた、図１および２に示される。ｃＤＮＡ分子の改変体は、６２８〜６６４位の３７個のヌクレオチドを欠く、ブタインターロイキン−１２レセプターのブタβ−１鎖をコードし、そして図３および４に示されるＩＬ−１２Ｒ　β部分の未熟終結を生じる。ｃＤＮＡ配列から縮重したアミノ酸配列を有する分子もまた、図５および６に示される。ブタインターロイキン−１２レセプターのブタβ−２鎖をコードするｃＤＮＡ分子は、図５および６に示されるヌクレオチド配列を有する。ｃＤＮＡ配列から縮重したアミノ酸配列を有する分子もまた、図５および６に示される。この分子は、感染因子に対する高いＩＦＮ−γ応答または細胞媒介免疫を有することが見出されたブタに存在する。
【０００９】
本発明の１つの局面は、１２５４位の対立遺伝子改変体（図５に示される３４２番目のアミノ酸位置でセリンを生じる）を有するアミノ酸配列の分子である。この改変体は、アデニンからシトシンへの、１２５４位のヌクレオチド変化から生じる。この改変体は、ブタにおける感染因子ＰＲＲＳＶ（ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ　Ｖｉｒｕｓ））に対する高いＩＦＮγ応答または細胞媒介免疫を有することが見出されたブタに存在する。
【００１０】
本発明はまた、所定の病原体に対する強力な細胞性免疫応答を生じ得るブタを同定する方法に関する。この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）所定の病原体を特定する工程；および
（ｂ）ＩＬ−１２レセプターの対立遺伝子改変体を有するブタを選択する工程であって、この対立遺伝子改変体は、この改変体を有さないブタと比較して、優れた能力をこのブタに付与し、この能力は、この病原体に対する感染またはワクチン接種の際に強力な細胞性応答を発生させる、工程。
【００１１】
本発明の別の局面は、ブタ群の細胞性免疫応答を改善するための方法である。この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）ＩＬ−１２レセプターの対立遺伝子改変体を有するブタを選択する工程であって、この対立遺伝子改変体は、この改変体を有さないブタと比較して、優れた能力をこのブタに付与し、この能力は、病原体に対する感染またはワクチン接種の際に強力な細胞性応答を発生させる、工程；および
（ｂ）この選択したブタを、ブタ育種に関する当業者に公知の方法に従って育種して、改善された細胞性免疫を有するブタを産生する工程。
【００１２】
（発明の説明）
本発明は、ブタのＩＬ−１２Ｒ遺伝子型に基づく優れた細胞媒介性免疫を有するブタを同定するための方法および組成物に関する。このレセプターおよびそのコード配列が、同定された。ブタＩＬ−１２レセプターを形成する２つのサブユニットのｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列が開示される。これらのクローニングされたブタ遺伝子およびＩＬ−１２レセプター遺伝子型の差異に起因するブタの推定される免疫応答は、以前に報告されていない。
【００１３】
ブタＩＬ−１２レセプターの両方の鎖の全長配列に関して得られた情報は、機能において異なるこれらの遺伝子の対立遺伝子改変体を同定するのに有用である。ＩＬ−１２は、Ｔ細胞の表面上のそのレセプターに結合するので、この遺伝子に関する構造的（配列）バリエーションは、レセプターの機能性に影響し得る。本発明は、感染因子に対して細胞性免疫応答を発生するブタの能力に対して影響を有するようである、ＩＬ−１２レセプターの機能性に対する対立遺伝子のバリエーションの効果に関する。背景において考察されるように、ＩＬ−１２は、細胞媒介性免疫の発生を制御することが知られている。
【００１４】
ブタＩＬ−１２レセプターのクローニングおよび配列決定は、優れた細胞性免疫を有する動物の同定における第１の工程である。レセプターの２つの鎖をコードする遺伝子の配列（β−１鎖を示す図１〜４、ならびにβ−２を示す図５および６）を得たので、改変体なしのブタと比較して、微生物に対するより高いレベルの細胞性免疫応答を可能にする、これらの遺伝子の対立遺伝子改変体を同定した。
【００１５】
ＩＬ−１２レセプターは、２つの鎖（サブユニット）（ＩＬ−１２Ｒ　β−１鎖およびＩＬ−１２　β−２鎖）からなる。各鎖は、個々にクローニングされ、そして配列決定された。図１〜４は、ＩＬ−１２Ｒ　β−１鎖のＤＮＡ配列を示す。コード配列の未成熟な終結を生じる、ＩＬ−１２レセプター　β−１鎖の改変体が発見された。この改変体において、得られたタンパク質翻訳は、未成熟に終結する（図１および図２を参照のこと）。ＩＬ−１２Ｒ　β−１鎖の改変体は、６２８位〜６６４位の３７ヌクレオチドを欠く。この欠失は、ＩＬ−１２Ｒ　β−１タンパク質の未成熟な終結を生じる。
【００１６】
ＩＬ−１２Ｒ　β−２　ｃＤＮＡ配列を決定するために、ブタの４つの群を、Ｐｉｇ　Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　Ｃｏｍｐａｎｙ（ＰＩＣ）から得た。ブタの各群を配列決定し、ＩＬ−１２Ｒ　β−２　ｃＤＮＡを決定した。これらの配列を比較し、以下の多型を決定した：２４５位（ＧからＴへの変化：グリシンからシステイン、非保存的置換、リーダー配列中に位置する）；５５６位（ＴからＧへの変化：アスパラギン酸からグルタミン酸、保存的置換）；８９０位（ＡからＧへの変化：イソロイシンからバリンへ、保存的置換）；１２５４位（ＡからＣへの変化：チロシンからセリンへ、非保存的置換）；２２３３位（ＣからＴへの変化：アスパラギン酸からアスパラギン酸、同一性を変更しない）；および２４４０位（ＣからＴへの変化：ヒスチジンからヒスチジン、同一性を変更しない）。
【００１７】
この分子のＩＬ−１２レセプター　β−２（ＩＬ−１２Ｒ　β−２）鎖の対立遺伝子バリエーションは、ブタが感染因子に対して細胞性免疫応答を発生する能力に対して強い影響を与える。発見された改変体全てのうち、ブタＩＬ−１２　β−２サブユニット遺伝子内の１２５４位における多型（ＡからＣへのヌクレオチド変化）（図５および６）（これは、インタクトなブタＩＬ−１２Ｒ　β−２鎖の３４２番目のアミノ酸位にセリンまたはチロシンのいずれかを生じる）は、特に興味深かった。この変化は、感染因子に対する細胞媒介性免疫応答の強度に影響を与える。前者のアミノ酸は、ヒト起源、マウス起源、またはウシ起源のいずれかのＩＬ−１２Ｒ　β−２中の対応する位置にのみ検出された。ブタのヌクレオチド１２５４位にセリンを発現するＩＬ−１２　β−２対立遺伝子は、ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルスでの免疫に対する、より大きな宿主インターフェロン−γ応答と関連する（図７）。この対立遺伝子の発現は、おそらく、一般的なブタの他の微生物に対する、より高いインターフェロンγ応答と関連する。
【００１８】
最初に、ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に対する改変生ウイルス（ＭＬＶ）ワクチンを用いたワクチン接種に応答した、ブタの群で誘発されたウイルス特異的免疫を、評価した。ＭＬＶは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｉｈｇｅｌｈｅｉｍ　Ｖｅｔ　Ｍｅｄｉｃａによって製造される非ビルレント弱毒化ワクチンである。ＰＲＲＳＶは、アルテリウイルス株（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎからのＶＲ２３３２菌株）である。この注射実験からの１匹のブタ（７８５ｇ番と称する）は、特有であった。この動物において、このウイルスを用いた免疫に応答して誘発された末梢血中のＰＲＲＳＶ特異的ＩＦＮ分泌細胞の頻度は、この群の他の９匹のブタのいずれかの頻度の、２倍より多かった。従って、このブタは、ＰＲＲＳＶ抗原に対して高い応答者（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）のようであった。この観察を拡張し、そして高い応答者の表現型についての遺伝的な基礎を決定するために、ブタ７８５ｇの母親および父親を繁殖させ、そしてこの元々の動物に対する２４匹の完全な同胞を生成した。ＩＬ−１２Ｒ　β−２鎖の１２５４位についてこれらのブタの遺伝子型を、表１に示す。
【００１９】
（表１：ブタ７８５ｇの完全な同胞のＩＬ−１２Ｒ　β−２遺伝子型）
【００２０】
【表１】
2004511231.tif 000003
＊遺伝子型は、ブタＩＬ−１２Ｒ　β−２鎖のアミノ酸３４２番のＩＬ−１２Ｒ　β−２座位に存在する対立遺伝子を示す（ａ＝チロシンおよびｃ＝セリン）。ＡからＣへのヌクレオチド１２５４位における変化は、チロシンからセリンへのアミノ酸３４２の非保存的置換を生じる。
【００２１】
表１に記載されるブタを用いて、ＩＬ−１２Ｒ　β−２について「ｃ」対立遺伝子を発現する動物は、この対立遺伝子を発現しないブタよりも、ＰＲＲＳＶ改変生ウイルスワクチンを用いた免疫後に、高いウイルス特異的ＩＦＮ−γ応答を発生する能力をより有するようであった。図７に示されるように、ＩＬ−１２Ｒ　β−２ａ／ｃ遺伝子型を有するブタのウイルス特異的ＩＦＮ−γ応答は、ＩＬ−１２Ｒ　β−２ａ／ａ遺伝子型を有するブタよりも、ワクチン接種後６週間、有意に高かった（ｐ＜０．０１）。ＩＬ−１２Ｒ　β−２ｃ／ｃ遺伝子型を有するブタのＩＦＮ−γ応答は、ＩＬ−１２Ｒ　β−２ａ／ａ遺伝子型を有するブタのＩＦＮ−γ応答よりも有意に高くなかった、ＩＬ−１２Ｒ　β−２ｃ／ｃ遺伝子型を有するブタは、ＩＬ−１２Ｒ　β−２ａ／ｃブタで見られる傾向と同じ高い応答傾向が続いた。
【００２２】
（材料および方法）
（配列決定したブタＩＬ−１２Ｒ　β−２　ｃＤＮＡのヌクレオチド１２５４位に対する「Ａ」および「Ｃ」のホモ接合体およびヘテロ接合体を区別するための方法）
ブタＩＬ−１２Ｒ　β２　ｃＤＮＡのヌクレオチド１２５４位と関連する多型を同定するために、このテンプレートの一部の増幅の間に作製されるアンプリコン中に、１個の新規ＥｃｏＲ　Ｉ部位または２個の新規ＥｃｏＲ　Ｉ部位のいずれかを作製するように、プライマーを操作した。順方向ＰＣＲプライマー（配列番号１）（ＧＡＣＴＡＣＡＣＡＡＧＡＣＡＡＣＡＧＡＡＴＴ）は、多型部位のすぐ上流のヌクレオチドストレッチ（配列番号２）（ＧＡＣＴＡＣＡＡＡＡＧＡＣＡＡＣＡＧＡＴＴＴ）にほぼ同一である。このプライマーの使用によって、アデノシン部分に変換された第３の上流チミジンが生じる。従って、シトシンが多型部位に存在する場合、ＥｃｏＲ　Ｉ認識配列（ＧＡＡＴＴＣ）が作製される。アデノシンが存在する場合、ＥｃｏＲ　Ｉ認識配列は、作製されない。逆方向ＰＣＲプライマー（配列番号３）（ＴＡＴＴＡＴＧＣＡＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＣＣＣ；相補鎖−（配列番号４）ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣＴＧＣＡＴＡＡＴＡ）は、多型部位の下流のヌクレオチドストレッチ（配列番号５）（ＧＧＧＡＡＴＧＣＣＡＣＡＣＴＧＣＡＧＡＡＴＡ）にほぼ相補的である。このプライマーの使用によって、７位におけるグアノシンのチミジン部分への変換が生じ、ＥｃｏＲ　Ｉ認識配列の作製が生じる。
【００２３】
Ａ／Ｃ多型の区別は、以下の様式で達成される。最初に、ＲＮＡを、フィトヘマグルチニンのようなマイトジェンに曝露することによって事前に活性化したブタ白血球から単離する。ＩＬ−１２Ｒ　β２転写物は、休止細胞中で検出可能なレベルで存在しないので、ＩＬ−１２Ｒ　β２転写物の産生が刺激される必要があることに注意するべきである。従って、ＲＮＡは、ランダムヘキサマーをプライマーとして使用することによって逆転写され、生じるＩＬ−１２Ｒ　β２　ｃＤＮＡの部分は、「プルーフ−リーディング」ポリメラーゼによって増幅される。上記に示した２個のプライマーによって作製されたアンプリコンは、１２７ｂｐ長であり、そしてアデノシン部分またはシトシン部分が多型部位に存在するか否かに依存して、それぞれ、１個の獲得ＥｃｏＲ　Ｉ認識部位または２個の獲得ＥｃｏＲ　Ｉ認識部位のいずれかを含む。ＥｃｏＲ　Ｉでの生成物の消化によって、１１０（アデノシン）ｂｐの生成物または９０（シトシン）ｂｐの生成物のいずれかを生じ、これらの生成物は、ポリアクリルアミドゲル中での相対的な移動度に基づいて容易に同定され得る。
【００２４】
（細胞媒介性免疫のブタＩＦＮ−γ　ＥＬＩＳＰＯＴ決定のための方法）
ＰＲＲＳウイルスワクチンを用いた免疫に対する細胞性免疫応答の大きさを、ＩＦＮ−ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを利用することによって定量した。簡単に言うと、９６ウェルのＩｍｍｕｌｏｎ　ＩＩＴＭプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｉｎｃ．）を、２４μｇ／ｍｌの０．１Ｍ　炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中のｍＡｂ　Ｐ２Ｇ１０溶液の１ウェルあたり、５０ｍｌでコーティングした。４℃で一晩のインキュベーション後、各ウェルを滅菌ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、５％ブタ胎仔血清を補充した５０μｌ　ＲＰＭＩを用いて、５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で２時間インキュベートした。ワクチン接種したブタまたはコントロールのブタ由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、５×１０５生存細胞／ウェルでプレートした。全てのサンプルにおいて、生存色素排除によって確認した場合、９８％より多くのＰＢＭＣが生存可能であった。ＰＲＲＳＶに対するインビトロリコール応答を、生ウイルスの形態の抗原の添加によって刺激した。ＰＢＭＣを、５％　ＣＯ２雰囲気中３７℃にて２０時間、ウイルス抗原に曝した。その後、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ−２０を補充したリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて６回洗浄することによって、細胞を除去した。次いで、０．０５％　ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中の０．２５μｇ／ｍｌ　ビオチン標識ｍＡｂ　Ｐ２Ｃ１１の５０μｌを、各ウェルに添加し、そしてこのプレートを３７℃にて１時間インキュベートした。洗浄後、０．３１μｇ／ｍｌのストレプトアビジン西洋ワサビベルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ；Ｚｙｍｅｄ；Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）の５０μｌを、各ウェルに添加し、このプレートを３７℃にてさらに１時間インキュベートした。過剰なＳＡ−ＨＲＰを、これらのウェルを３回洗浄することによって除去し、次いで、ＴＭＢ膜ペルオキシダーゼ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）の５０μｌを、各ウェルに添加した。この化合物の加水分解によって、青色の点が発生し、この青色の点の大きさおよび強度は、結合ＩＮＦ−の量に直接比例する。ウイルス特異的ＩＦＮ−ＳＣの頻度を、この青色の点を数えることによって決定した。
【００２５】
（免疫を改善するようにブタを選択し、そして育種するための方法）
改善された免疫を発現する育種のためのブタを選択するために、前に材料および方法の節で示したように、配列決定したブタＩＬ−１２Ｒ　β−２　ｃＤＮＡのヌクレオチド１２５４位におけるＡおよびＣのホモ接合体およびヘテロ接合体を区別する方法を介して、ブタをまずスクリーニングする。このスクリーニングプロセスが生じた後、Ｃマーカーを含むブタを選択する。選択後、これらのブタを、ブタ育種に関する当業者に公知の従来の方法によって育種し、集団中の「Ｃ」多型の頻度を増大させる。
【００２６】
（ブタＩＬ−１２Ｒサブユニット中の多型を同定する方法）
２つのブタＩＬ−１２Ｒサブユニット遺伝子内の多型を同定するために、これらの全体をコードするインタクトなオープンリーディングフレームを、それぞれの転写物由来の重複しているＲＴ−ＰＣＲ産物をスクリーニングすることによって決定した。最初に、ＲＮＡの供給源は、ＰＯＣによって提供された上記に言及した４つのブタの群の各々由来の、ランダムに選択された３匹のブタから得られた活性化Ｔ細胞であった。比較のために、ＧＥＮＥＴＩＰＯＲＣ育種株（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｉｌｌｉｎｏｉｓ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｓｗｉｎｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｆａｒｍ）由来のブタについても同様の決定を行った。これらの動物は、ＰＲＲＳ改変生ウイルス（ＭＬＶ）でのワクチン接種に応答して誘発された免疫を評価する未関連の実験において、関係する動物であった。この群の１０匹のうち、ブタ７５８ｇは、そのＰＲＲＳウイルス特異的ＩＦＮ−γ分泌細胞の頻度が、他の９匹のブタのいずれかの頻度の２倍よりも大きかったという点で、特有であった。さらに、ブタ７５８ｇの応答の新規性は、ＰＲＲＳ　ＭＬＶワクチンを用いた免疫が弱い細胞媒介性免疫応答の誘発を示したという事実からみても、なおより明らかであった。この点において、ＩＦＮ−γ分泌細胞の頻度は、通常、１００万単核細胞あたり、５０〜１５０の間の範囲である。従って、これらの値に基づいて、ブタ７５８ｇは、ＰＲＲＳウイルス抗原を呼び戻すことの、高い応答者であると考えられ、一方、例えば、ブタ８３４ｂは、低い応答者であると考えられた。これらの免疫応答表現型における相違に起因して、ＩＬ−１２レセプターの推定一次構造を決定した。
【００２７】
（レセプターを発見する方法）
最初に、縮重プライマーの対（マウスＩＬ−１２およびヒトＩＬ−１２のβ−１サブユニットおよびβ−２サブユニットをコードするｃＤＮＡにおける代表的な保存配列）を使用して、ＲＴ−ＰＣＲによってそれぞれのブタｃＤＮＡの内部を増幅した。その後、両方のｃＤＮＡの残りを、「プライマーウォーキング」と組み合わせた５’ＲＡＣＥおよび３’ＲＡＣＥによって得た。両方の実体を、両方向に完全に配列決定した。ＩＬ−１２Ｒ　β−１　ｃＤＮＡのコード部分は、２１９６ヌクレオチドであり、一方、ＩＬ−１２Ｒ　β−２　ｃＤＮＡのコード部分は、２５８３ヌクレオチドである。
【００２８】
ＩＬ−１２Ｒの両方の鎖が、Ｉ型サイトカインレセプターファミリー（ｇｐ１３０、顆粒球コロニー刺激因子レセプター、および白血球阻害因子レセプターを含む）のメンバーである。このファミリーの全メンバーが、いくつかの構造特徴を共有する。従って、ブタＩＬ−１２Ｒ鎖の両方が、これらの特徴を有し、この特徴としては、細胞外ドメインのアミノ末端部分中のＣｙｓ−Ｃｙｓ対（Ｃ／ＣｘＷ）モチーフ（配列番号６）、Ｃ末端部分中のＴｒｐ−Ｓｅｒ−ｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ＷＳｘＷＳ）モチーフが挙げられる。おそらく、これらの配列は、リガンド相互作用およびタンパク質構築に寄与する。さらに、ブタＩＬ−１２Ｒ　β−２鎖の細胞内部分は、ヒトおよびマウスの対応物において保存される３つのチロシンを含む。これらの２つの種において、これらの３つのチロシンは、ＩＬ−１２Ｒの誘発の際にリン酸化されるようになり、そして休止細胞質転写因子の活性化を誘導する。さらに、両方のブタＩＬ−１２Ｒ鎖の細胞内ドメインが、アミノ酸の２つの領域（ボックス１およびボックス２と称する）を有し、これらの領域は、シグナル伝達に必要とされる。ボックス１は、疎水性アミノ酸のクラスターの前にＰｒｏ−Ｘ−Ｐｒｏ配列を含む。第２のモチーフであるボックス２は、このファミリーの全メンバー中で保存されていない独特な配列を有する。これら全ての構造特徴の存在は、この同定された２つのブタＩＬ−１２Ｒサブユニットがサイトカインレセプターのスーパーファミリーの真のメンバーであることを、明確に実証する。
【００２９】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ブタＩＬ−１２Ｒ　β−１鎖のｃＤＮＡ配列（配列番号７）を示す。ヌクレオチド配列は下であり、推定アミノ酸配列（配列番号８）は上である。ＩＬ−１２レセプター　β−１鎖の改変体は、コード配列の未熟な終結を生じ、そして短縮型タンパク質は、欠失を有する（下線部）。得られた配列は、β−１鎖の全長配列に順序正しく従う。遺伝子の一部は、改変体において欠失し、下流に終止コドンを生じる。これは、タンパク質翻訳の未成熟な終結を生じる。
【図２】
図２は、上のアミノ酸配列なしでのよりコンパクトな形態での図１のヌクレオチド配列（配列番号７）である。
【図３】
図３は、ブタＩＬ−１２Ｒ　β−１　ｃＤＮＡ中の６２８位〜６６４位の３７ヌクレオチドを欠く改変体である（配列番号９および１０）。この欠失は、ＩＬ−１２Ｒ　β−１タンパク質の未成熟な終結を生じる。この改変体のヌクレオチド配列は、ブタＩＬ−１２Ｒ　β−１　ｃＤＮＡ中の図１の５８位から２３１８位にわたる（図３の１位は、図１の５８位である）。
【図４】
図４は、ヌクレオチドコードに対応するアミノ酸なしの図３（配列番号９）である。
【図５】
図５は、ブタＩＬ−１２Ｒ　β−２　ｃＤＮＡ（配列番号１２および１１）のアミノ酸配列および対応するヌクレオチド配列を示す。β−２鎖に関するバリエーションは、アミノ酸配列をチロシンからセリンに変化させる。コードされるアミノ酸をチロシンからセリンに変化させる、位置番号１２５４でのＡ→Ｃ（下線部）の変異（多型）が存在する。この変化は、感染因子に対する増加した応答を引き起こすセリンによるチロシンの非保存的置換を生じる。
【図６】
図６は、ヌクレオチド配列のみを示す図５（配列番号１１）である。
【図７】
図７は、ＰＲＲＳＶ　ＭＬＶワクチンでの免疫後のブタの細胞性免疫応答の強度を示す。２４時間の完全な同胞ブタ（表１に示す）を、ＰＲＲＳＶ　ＭＬＶワクチンを用いて９週齢および１２週齢で免疫した。末梢血液単核細胞を、第２の免疫の２週間後にこれらのブタから単離し、そしてＰＲＲＳＶウイルスで２０時間刺激した。ＩＦＮ−γ分泌細胞の頻度を、本明細書中の材料および方法の節に記載されるように、ＩＦＮ−γ　ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、１９８８）で決定した。得られた結果を、ＩＬ−１２Ｒ　β−２ｃ／ｃ（８匹のブタ）、ＩＬ−１２Ｒ　β−２ａ／ｃ（９匹のブタ）、ＩＬ−１２Ｒ　β−２ａ／ａ（７匹のブタ）の応答者のブタの遺伝子型に従って２つの群に分類した。これらの４週間のデータを、ＡＮＯＶＡ（分散分析）によって分析した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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