(57)【要約】本発明は、ＤＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＫＳＸ5ＱＸ6ＡＷＧＳＳＸ7ＲＸ8Ｘ9ＹＴＦＳＸ10ＶＥＸ11ＦＷＸ12Ｘ13ＹＮＮＩＨＸ14ＰＳＫＬＸ15Ｘ16ＧＡＤである一般配列（Ｉ）により規定された、翻訳因子ｅＩＦ４Ｅの保存領域に一つまたは複数の突然変異を有するポティウイルス（ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）抵抗性植物の入手方法に関するものである。これにおいて、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ15およびＸ16はそれぞれ中性アミノ酸を表し、Ｘ5およびＸ14は塩基性アミノ酸を表し、Ｘ11は酸性アミノ酸を表し、Ｄ、Ｋ、Ｓ、Ｑ、Ａ、Ｗ、Ｇ、Ｒ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｖ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、ＰおよびＬはそれぞれが通常一文字でコードする意味のものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験対象の植物において：
・−Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ15およびＸ16がそれぞれ中性アミノ酸を表し、
−Ｘ5およびＸ14が塩基性アミノ酸を表し、
−Ｘ11が酸性アミノ酸を表し、
−Ｄ、Ｋ、Ｓ、Ｑ、Ａ、Ｗ、Ｇ、Ｒ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｖ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、ＰおよびＬがそれぞれが通常一文字でコードする意味のものである、
以下の一般配列（Ｉ）
ＤＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＫＳＸ5ＱＸ6ＡＷＧＳＳＸ7ＲＸ8Ｘ9ＹＴＦＳＸ10ＶＥＸ11ＦＷＸ12Ｘ13ＹＮＮＩＨＸ14ＰＳＫＬＸ15Ｘ16ＧＡＤ
によって規定された領域を含むｅＩＦ４Ｅタンパク質（以下「野生型ｅＩＦ４Ｅタンパク質」と呼ぶ）、あるいは前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列の有無（有無は「タンパク質」と「ヌクレオチド配列」にかかると思います）を検出し、
・前記配列（Ｉ）の少なくとも一つの中性アミノ酸が、電荷を帯びたアミノ酸に置換し、および／または前記配列（Ｉ）の電荷を帯びた少なくとも一つのアミノ酸が、中性アミノ酸または逆の電荷を帯びたアミノ酸に置換することにより配列（Ｉ）によって規定されたものから由来した領域を含む、突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質、または前記タンパク質のコード配列の有無を検出し；
・そして突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質または前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列が検出され、野生型のｅＩＦ４Ｅタンパク質または前記タンパク質のコード配列が検出されない植物を選別すること、
からなることを特徴とする、ポティウイルスに抵抗性のある植物の選別方法。
【請求項２】
試験対象の植物で、請求項１に規定したような突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質または前記タンパク質のコード配列の有無を検出すること、そして前記突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質または前記タンパク質のコード配列が検出される植物を選別することが含まれることを特徴とする、ポティウイルスに抵抗性のある植物の入手に使用可能な植物の選別方法。
【請求項３】
前記突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質が、
ａ）前記配列（Ｉ）のアミノ酸Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3またはＸ4の少なくとも一つが、電荷を帯びたアミノ酸に置換し、そして
ｂ）前記配列（Ｉ）の他の中性アミノ酸の少なくとも一つが、電荷を帯びたアミノ酸に置換し、および／または前記配列（Ｉ）の電荷を帯びた少なくとも一つのアミノ酸が、中性アミノ酸もしくは逆の電荷を帯びたアミノ酸に置換すること、
により上記の配列（Ｉ）によって規定されたものから由来した領域を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ａ）請求項１または３に規定された、野生型または突然変異型のｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
ｂ）ポリヌクレオチドａ）に相補的なポリヌクレオチド；
ｃ）ポリヌクレオチドａ）またはｂ）の少なくとも１０ｂｐの断片；
の中から選択される、ポティウイルスに抵抗性のある植物を選別するためのツールの使用。
【請求項５】
選択される植物が、ナス科、アブラナ科、キク科および／またはウリ科のグループに属することを特徴とする、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
選択される植物がナス科であることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記ｅＩＦ４Ｅタンパク質が、
・ポリペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で表されるタンパク質；
・ポリペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で表されるタンパク質；
・ポリペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で表されるタンパク質；
・ポリペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９で表されるタンパク質；
・ポリペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２で表されるタンパク質のグループ；
・ポリペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３で表されるタンパク質のグループ；
の中から選ばれることを特徴とする、請求項４に記載の使用。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドが、
・配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリヌクレオチド
・配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のポリヌクレオチド
・配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のポリヌクレオチド
・配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のポリヌクレオチド
ならびに、それらに相補的なポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドあるいは相補的ポリヌクレオチドの少なくとも１０ｂｐの断片の中から選ばれることを特徴とする、請求項４に記載の使用。
【請求項９】
・試験対象の植物から抽出したＤＮＡを適切な制限酵素で消化し、
・消化したＤＮＡを変性させ、
・前記変性したＤＮＡを、請求項４から８のいずれか一つに規定されたポリヌクレオチドで構成された、前もって少なくとも一つのマーカーを付けたプローブと共に存在させ、それにより前記ポリヌクレオチドと前記ＤＮＡのハイブリダイゼーションを実施し、
・ＤＮＡおよびハイブリダイゼーションしていないプローブを除去し、
・マーカーによりハイブリダイゼーションを明らかにし、
・マーカーの付いたプローブとハイブリダイズした標的と抵抗性または感受性のある対立遺伝子との共分離に対応するハイブリダイゼーション特性を有する植物を選別し、感受性植物と抵抗性植物との区別は、ハイブリダイゼーションした断片の大きさの違いによって行う、
ことを特徴とする、ポティウイルスに抵抗性のある植物の選別方法。
【請求項１０】
使用する制限酵素がＥｃｏＲＩであることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
・試験対象の植物のＤＮＡからｅＩＦ４Ｅ遺伝子のコード配列をＰＣＲにより増幅し、
・増幅産物を適合した制限酵素で消化し、
・場合によっては得られた断片を分離し、
・そして、前記増幅産物の制限消化特性によって抵抗性または感受性のある植物を選別する、
ことを特徴とする、ポティウイルスに抵抗性のある植物の選別方法。
【請求項１２】
ポティウイルスに感受性のある植物が、ＴｓｐＲＩ酵素またはそのイソシゾマーによる切断部位の存在を明確にする制限消化特性によって検出され、ポティウイルスに抵抗性のある植物が、ＴｓｐＲＩ酵素またはそのイソシゾマーによる前記切断部位が存在しないこととＭｖｎＩ酵素またはそのイソシゾマーによる切断部位の存在とを明確にする制限消化特性によって検出されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ｅＩＦ４Ｅ遺伝子のコード配列のＰＣＲ増幅が、オリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９をプライマーとして用いることによって行われることを特徴とする、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１または３のいずれかに規定された突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で表されることを特徴とする、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
以下のシーケンス
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９
によって規定されるグループの中から選ばれることを特徴とする、植物のｅＩＦ４Ｅタンパク質のコード配列をＰＣＲ増幅するためにプライマーとして使用可能なポリヌクレオチド。
【請求項１７】
・ａ）ポティウイルス感受性に関与する少なくとも一つのｅＩＦ４Ｅ対立遺伝子にはあり、ポティウイルス抵抗性に関与するｅＩＦ４Ｅ対立遺伝子にはない、制限部位Ｉを認識する酵素；
ｂ）ポティウイルス抵抗性に関与する少なくとも一つのｅＩＦ４Ｅ対立遺伝子にはあり、ポティウイルス感受性に関与するｅＩＦ４Ｅ対立遺伝子にはない、制限部位ＩＩを認識する酵素：
の中から選ばれた少なくとも一つの制限酵素；そして
・制限部位Ｉおよび／または制限部位ＩＩを含むｅＩＦ４Ｅまたはその一部の増幅を可能にする、一対のヌクレオチドプライマー、
を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項１８】
・配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９で規定される一対のプライマー；
・ＴｓｐＲＩまたはそのイソシゾマーとＭｖｎＩまたはそのイソシゾマーから選ばれた、少なくとも一つの制限酵素；
を含むことを特徴とする、前記請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
好ましくはセンス配列：ＣＧ＾ＣＧとアンチセンス配列：ＧＣ＾ＧＣに対応するＭｖｎＩによる制限部位、および／または好ましくはセンス配列：ＮＮＣＡＳＴＧＮＮ＾とアンチセンス配列：＾ＮＮＧＴＳＡＣＮＮに対応するＴｓｐＲＩによる制限部位の、ポティウイルス抵抗性または感受性のオリゴヌクレオチドマーカーとしての使用。
【請求項２０】
ポティウイルス抵抗性植物の選別のための、前記請求項１または３のいずれかに規定された、野生型もしくは突然変異型のｅＩＦ４Ｅタンパク質または前記タンパク質に特異的な抗体の使用。
【請求項２１】
前記ｅＩＦ４Ｅタンパク質が、
・ポリペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で表されるタンパク質；
・ポリペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で表されるタンパク質；
・ポリペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で表されるタンパク質；
・ポリペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９で表されるタンパク質；
・ポリペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２で表されるタンパク質のグループ；
・ポリペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３で表されるタンパク質のグループ；
の中から選ばれることを特徴とする、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
請求項１または３のいずれかに規定された、突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質。
【請求項２３】
・ポリペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９で表されるタンパク質；
・ポリペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２で表されるタンパク質の変種；
・ポリペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３で表されるタンパク質のグループ；
の中から選ばれることを特徴とする、請求項２２に記載の突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質。
【請求項２４】
請求項１または３のいずれかに記載の突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質または前記ポリペプチドの少なくとも６つのアミノ酸からなる断片に、特異的に対抗する抗体。
【請求項２５】
前記植物のゲノムの中に前記ポティウイルスへの抵抗性に関与するｅＩＦ４Ｅ遺伝子の対立遺伝子を導入することを含むことを特徴とする、少なくとも一つのポティウイルスに抵抗性のある植物の非生物学的な入手方法。
【請求項２６】
・突然変異誘発、有利には「Ｔｉｌｌｉｎｇ法」、
・相同組み換え、
・過剰発現、
・挿入／欠失、
・「遺伝子サイレンシング」／遺伝子導入
・およびそれらの組み合わせ
の中から選ばれた一つの方法を実施することにより、抵抗性対立遺伝子の出現が引き起こされることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項４から６および請求項８のいずれか一つに規定されたポリヌクレオチドを少なくとも一つ含むことを特徴とする、構成された遺伝子単位。
【請求項２８】
遺伝子単位を少なくとも一つ含むことを特徴とする、請求項２７に記載の植物細胞の形質転換ベクター。
【請求項２９】
請求項２８に記載の少なくとも一つのベクターまたは請求項２７に記載の少なくとも一つの遺伝子単位を用いて形質転換した植物細胞。
【請求項３０】
請求項２８に記載の少なくとも一つのベクターまたは請求項２７に記載の少なくとも一つの遺伝子単位を用いて形質転換した微生物。
【請求項３１】
請求項２８に記載の少なくとも一つのベクターまたは請求項２７に記載の少なくとも一つの遺伝子単位を用いて形質転換した植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポティウイルス（ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）に抵抗性のある植物の選別、または入手の方法に関するものである。本方法は特にナス科、ウリ科、アブラナ科およびキク科の植物に応用することができる。本発明はまた、ポティウイルスへの抵抗性を付与し、および／またはこれらのポティウイルスへの抵抗性または感受性の遺伝子を標識することができるようにする配列をも対象としている。
【背景技術】
【０００２】
ポティウイルスとして分類されるもののうちで典型的なものはジャガイモＹウイルス即ちＰＶＹであり、そのポティウイルス群こそが、植物ウイルス群で最も重要なものである。事実、ポティウイルスは現に調査中の３０を越える科の植物に感染する能力がある。この群に含まれるものは、少なくとも１８０種あり、それは現に知られている植物ウイルスの三分の一に相当する。ポティウイルスは、（例えばモモアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ）のような）アブラムシによって非持続的な仕方で媒介される。ポティウイルスによって引き起こされる症状は、（モザイク病、葉脈が黄色くなるなどの）葉の色合いの異常、葉の変形、植物全体の壊死につながりかねない葉脈の壊死、そして病変植物の背丈の大幅な低下であり、これは生産性に大きく影響する。
【０００３】
ナス科、ウリ科、アブラナ科およびキク科の植物は、特にポティウイルスに感受性がある。ナス科の中でも特にトマトとトウガラシ（またはピーマン）に感染するポティウイルスとしては、世界に少なくとも七種が判別されている：ジャガイモＹウイルス（ＰＶＹ）は栽培区域全体に存在するが、他のものは、大陸に特有のものである（アメリカ大陸ではタバコエッチウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  ｖｉｒｕｓ）、ピーマン斑紋ウイルス（Ｐｅｐｐｅｒ  Ｍｏｔｔｌｅ  Ｖｉｒｕｓ）そしてペルートマトウイルス（Ｐｅｒｏｕ  Ｔｏｍａｔｏ  Ｖｉｒｕｓ）、アフリカではピーマン葉脈斑紋ウイルス（Ｐｅｐｐｅｒ  Ｖｅｉｎａｌ  Ｍｏｔｔｌｅ  Ｖｉｒｕｓ）とポティウイルスＥ、そしてアジアではチリ葉脈斑紋ウイルス（Ｃｈｉｌｉ  Ｖｅｉｎａｌ  Ｍｏｔｔｌｅ  Ｖｉｒｕｓ）。しかしながら、このような棲み分けはもはや絶対的なものではなく、本来発生した区域外で確認されたポティウイルスが幾つもある。フランスで、そして、更に一般的に地中海地域で優勢なポティウイルスは、ＰＶＹである。７０年代に発生したＰＶＹの疫病は、屋外の畑で栽培しているところに広がった後に、ハウス栽培にも浸透していったが、そこで１９８２年からはっきりと目立つようになったのは、新たに単離されたＰＶＹであり、それは、トマトについて特に重篤な壊死の症状を発生させるものであった（Ｇｅｂｒｅ−Ｓｅｌａｓｓｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。そのようなポティウイルスのうちの幾つかについては、抵抗性対立遺伝子をくぐり抜けるそれぞれ独自の適性に沿って、単離したものを分類することが可能である。トウガラシのｐｖｒ２遺伝子に対するＰＶＹがまさにそれであり、ｐｖｒ２遺伝子は、品種改良業者が昔から使っている唯一の遺伝子であるが、地中海周辺と熱帯地域ではくぐり抜けられてしまう。フランスではＰＶＹが多くを占めているものの、種子の市場が国際化するにつれて、外国に種子を輸出する品種改良業者が、そのような様々なポティウイルスへの抵抗性を制御する遺伝子を用いなければならなくなっている。更に一般的には、ポティウイルスによる感染が経済に与える影響の大きいこと、そして、その種の感染症に対処する直接的な手段がないことを考えると、抵抗性をもつ植物変種を研究することが、植物の品種改良を行う上での基本方針となる。
【０００４】
ポティウイルスの構造は、エンベロープのないフィラメント状であり（ＬａｎｇｅｎｂｅｒｇならびにＺｈａｎｇ，１９９７）、長さは６８０から９００ｎｍで幅が１１から１５ｎｍである（ＤｏｕｇｈｅｒｔｙならびにＣａｒｒｉｎｇｔｏｎ，１９８８；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。ウイルスのゲノムは、長さが約１０ｋｂの一本鎖ＲＮＡによって構成されている。その一本鎖ＲＮＡは、３’末端にポリＡを有し、５’末端でＶｐｇと呼ばれるウイルスタンパク質と結合している（Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。そのウイルスＲＮＡは、ポリタンパク質の切断、ゲノムの複製、細胞間運動と長距離運動、アブラムシによる媒介などに関わる１０種のタンパク質をコードしている。ウイルスへの対処は間接的にしか行うことができない。実際に可能なのは、病気を媒介する動物（この場合にはアブラムシ）を排除するか、そのウイルス感染および／またはそのような媒介動物に抵抗性のある変種を栽培するだけのことである。
【０００５】
病原体（ウイルス、細菌、菌類または線虫）による侵害に対し、植物は、感染から身を守るあるいは抵抗する幾つかの戦略を有している。そのような防衛戦略のなかでも、植物が実施可能なのは、以下のようなものである：
・物理的な障壁を生成し強化する機械的防衛システムで、その物理的障壁を構成するものは、葉の表面を覆う分厚いクチクラおよび／または細胞壁に堆積したカロースかリグニンである。そのようにして、病原体が植物の中に入り込んで活動することを難しくする。
・例えばタンニン、フィトアレキシン、その他の様々なタンパク質複合体のような毒性の化合物を合成する、化学的もしくは生物化学的防衛システム。
【０００６】
防衛戦略のなかでも、（種の全ての個体が所定の病原体に対する抵抗性を有する場合の）非宿主抵抗性は、（その種の少なくとも一つの個体が病原体の一つの株に感受性がある場合の）宿主抵抗性と区別されるものである。宿主抵抗性は、今日まで最もよく知られ、その特徴も最も理解されているものであり、優性な主遺伝子が関与するものである。そのような主遺伝子がその病原体の非病原性に特異的な遺伝子と共に存在している場合には、植物と病原体との間での不適合が作用していることになり、植物には抵抗性がある。このような相互作用はＦｌｏｒ（１９５５）に記述されており、それはまた遺伝子対遺伝子モデルとも呼ばれ、感染部位での植物組織の局所的な壊死と関連することが非常に多い（過敏性反応）。かなり広範囲に広まってはいるものの、この「遺伝子対遺伝子」モデルが普遍的とは言えないのは、説明された抵抗性システムの中に、このモデルに沿って作用しないものが幾つかあるためで、その違いは特に抵抗性遺伝子の作用態様にある。遺伝子には、劣性のもの、超優性のものあるいは不完全優性を表すものもある。同一の抵抗性遺伝子と相互作用を行いうる非病原性遺伝子は幾つもある。抵抗性が多遺伝子性のものであることも数多くあり、その場合は、その植物の中にある複数の遺伝子がその抵抗性に関わっており、そのそれぞれに部分的な保護作用があり、様々なメカニズムを制御する能力がある。
【０００７】
今日まで、そのような「遺伝子対遺伝子」モデルに沿った優性遺伝子が数多くクローニングされている。それらは多岐にわたる病原体（ウイルス、菌類、細菌、昆虫、線虫）に対して作用するものではあるが、遺伝子構造は似通っている。保存領域の存在により、大きく分けて４つの主要なクラスの優性遺伝子を明らかにすることが可能となった（Ｈａｍｍｏｎｄ−Ｋｏｓａｃｋ  ｅｔ  Ｊｏｎｅｓ，１９９７）。
【０００８】
とくに、ポティウイルスに対する抵抗性の４０％は劣性であると概算されるのに対し、他のウイルス群においてこの比率は、平均して２０％にしか達しない。Ｆｒａｓｅｒ（１９９２）が発表した仮説によると、劣性の抵抗性は、「遺伝子対遺伝子」タイプの優性の抵抗性と異なっている可能性があり、その原因は、植物の内部でウイルスが周期を全うするのに必要な宿主遺伝子の生成物が不足しているか特異な変質が生じていることであると考えられる。それゆえ、そのような感受性に対する優性対立遺伝子は、そのような植物／病原体間の相互作用に関わる生成物が入手可能であることに対応していると考えられる。
【０００９】
ＶＰｇタンパク質をコードするウイルス遺伝子における点突然変  異は、複数の宿主／病原体の組み合わせにおいて、ポティウイル  スに対する抵抗性をくぐり抜けることに関わっていることが判明  している。このことは、ＴＶＭＶ／タバコ（ｎｉｃｏｔｉａｎａ    ｔａｂａｃｕｍ）（ｖａ遺伝子）、ＰＶＹ／トマト（ｐｏｔ−  １遺伝子）、ＬＭＶ／レタス（ｍｏ１遺伝子）そしてＰＳｂＭＶ  ／エンドウ（ｓｂｍ１遺伝子）のような組み合わせで見られた（  Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｍｏｒｅｌ，２００１  ，Ｒｅｄｏｎｄｏ，２００１、Ｎｉｃｏｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。これは他のウイルス遺伝子も作用しうるという可能  性を排除するものではない。
【００１０】
一方、Ｗｉｔｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）が示したところによると、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｓｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅのアイソフォームは、カブモザイクウイルス（ＴｍＭＶ）のウイルスタンパク質ＶＰｇと相互作用する。この同様の相互作用は、ＴＥＶのＶＰｇとタバコおよびトマトのｅＩＦ４Ｅとの間で検出されている（Ｓｃｈａａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【００１１】
ｅＩＦ４Ｅ遺伝子は真核生物ＲＮＡ翻訳開始因子をコードする。ｅＩＦ４Ｅは、翻訳因子ｅＩＦ４Ｆのサブユニットの一つに対応するものである（小麦胚芽では、それはｐ２６サブユニットに対応する）。翻訳因子ｅＩＦ４Ｅは、ｍＲＮＡのキャップのｍ7Ｇのところで結合する。ｅＩＦ４Ｅの構造は、トリプトファン残基に富んだ領域に特徴がある（シロイヌナズナでは１０、小麦では１１そして哺乳類では１２）。これらのトリプトファン残基は、ｍ7Ｇ官能基への結合に関わっている可能性がある（Ｒｕｄｄ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。翻訳因子ｅＩＦ４Ｅは、多重遺伝子族によりコードされる。例えばシロイヌナズナでは、ｅＩＦ４Ｅのコピーが４つ識別されている（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｒｏｂａｇｌｉａ  ｅｔ  ｃｏｌｌ．，ｃｏｍ．ｐｅｒｓ．）。そのようなコピーは、二つずつで、４４から８２％の同一性を示す。
【非特許文献１】Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｍｏｒｅｌ，２００１，Ｒｅｄｏｎｄｏ，２００１
【非特許文献２】Ｓｃｈａａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０００
【非特許文献３】Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｒｏｂａｇｌｉａ  ｅｔ  ｃｏｌｌ．，ｃｏｍ．ｐｅｒｓ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
そのような研究は全て、ｅＩＦ４Ｅ／ＶＰｇ相互作用と植物のポティウイルスに対する感受性との相関関係について言及しているが、そのような相互作用が抵抗性につながる可能性があることについては、いずれも強調してはおらず、示唆さえもしていない。逆に、Ｓｃｈａａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０００においては、ＶＰｇ／ｅＩＦ４Ｅ相互作用の遺伝的決定要因は、ポティウイルスが（ＶＰｇを介して）抵抗性をくぐり抜けることができるようにするものとは別物であるため、ＶＰｇ／ｅＩＦ４Ｅ相互作用は抵抗性において役割を果たしていないということまで示されている。
【００１３】
それゆえ、このような技術の現状において、植物のポティウイルスに対する抵抗性もしくは感受性に関与するｅＩＦ４Ｅタンパク質ならびにそれに対応する遺伝子を明らかにしたのは、本発明者等による功績である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者等が特に注目したのは、ポティウイルスに対する抵抗性を有する様々な植物が、ｅＩＦ４Ｅタンパク質の同一の領域に点突然変異を有していることである；この領域は、多様な植物種、特にナス科に由来するｅＩＦ４Ｅタンパク質の間で非常によく保存されているが、以下のような一般配列（Ｉ）によって規定されるものである：
ＤＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＫＳＸ5ＱＸ6ＡＷＧＳＳＸ7ＲＸ8Ｘ9ＹＴＦＳＸ10ＶＥＸ11ＦＷＸ12Ｘ13ＹＮＮＩＨＸ14ＰＳＫＬＸ15Ｘ16ＧＡＤ
これにおいて、
・Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ15およびＸ16はそれぞれ中性アミノ酸を表し、
・Ｘ5およびＸ14は塩基性アミノ酸を表し、
・Ｘ11は酸性アミノ酸を表し、
・Ｄ、Ｋ、Ｓ、Ｑ、Ａ、Ｗ、Ｇ、Ｒ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｖ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、ＰおよびＬはそれぞれが通常一文字でコードする意味のものである。
【００１５】
ここで「中性アミノ酸」として定義するのは、次のものから選ばれた任意のアミノ酸である：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、グルタミン、アスパラギン。「電荷を帯びたアミノ酸」として定義するのは、次のものから選ばれた任意のアミノ酸である：ヒスチジン、リジン、アルギニン、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩。これらの電荷を帯びたアミノ酸のうち、リジンあるいはアルギニンは塩基性アミノ酸であり、そしてグルタミン酸塩とアスパラギン酸塩は酸性アミノ酸である。
【００１６】
配列（Ｉ）もまた、添付の配列表にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１として示した。
【００１７】
本発明者等がピーマンで明らかにした突然変異は次のようなものである：
・配列（Ｉ）の中性アミノ酸Ｘ3の塩基性アミノ酸による置換。
・配列（Ｉ）の中性アミノ酸Ｘ7の塩基性アミノ酸による置換。
・配列（Ｉ）のＣ末端にあるアスパラギン酸塩残基の中性アミノ酸による置換。
【００１８】
Ｘ3の突然変異は、異なる二種のポティウイルス抵抗性を示すピーマンの系統（ｐｖｒ２1およびｐｖｒ２2）において観察された。ｐｖｒ２1表現型のピーマンには更にＸ7の位置に突然変異があり、ｐｖｒ２2表現型のピーマンには更にＣ末端の位置に突然変異がある。
【００１９】
トマトについて、本発明者等は特に次のような突然変異を観察した：
・配列（Ｉ）の中性アミノ酸Ｘ1の塩基性アミノ酸による置換。
・配列（Ｉ）のＡＷＧＳＳの構成単位におけるＡｌａ残基の酸性アミノ酸による置換。
【００２０】
真核生物においてｅＩＦ４Ｅ遺伝子配列が非常に高度に保存されていることにより、そして、マウスと酵母のｅＩＦ４Ｅタンパク質の３Ｄ構造が入手可能であることから（Ｍａｒｃｏｔｒｉｇｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｅｌｌ  ８９：９５１−９６１；Ｍａｔｓｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．４：７１７−７２４）、ピーマンとトマトにおけるｅＩＦ４Ｅの３Ｄ構造に対する突然変異の位置を決定することが可能である。これらの突然変異は全て物理的に近く、タンパク質の表面にある。また、これらの突然変異は、真核生物で非常によく保存されているアミノ酸に関するものではなく、ｅＩＦ４Ｅの本質的な機能、即ち、キャップの認識ならびにｅＩＦ４ＥとｅＩＦ４Ｇまたは４Ｅ結合タンパク質との相互作用に関わるアミノ酸に関するものでもない。
【００２１】
しかしながら、おそらくこれらの突然変異が、ＶＰｇ／ｅＩＦ４Ｅ間の相互作用に、この相互作用に関与する一つまたは複数の領域においてｅＩＦ４Ｅの構造を改変することにより、効果を発揮することが考えられる。このような構造の改変は、おそらく、電荷の異なるアミノ酸によるアミノ酸の置換（電荷を帯びたアミノ酸による中性アミノ酸の置換、あるいは逆に、電荷を帯びたアミノ酸の中性アミノ酸または逆の電荷を帯びたアミノ酸での置換）の結果として生じるものであり、本発明者等が明らかにした全ての突然変異に共通する点である。それゆえ、植物のｅＩＦ４Ｅタンパク質の配列（Ｉ）により規定される領域において同じタイプの別の突然変異が発生し、それが同様の構造の改変を引き起し、ＶＰａ／ｅＩＦ４Ｅ間の相互作用に同様の効果を生じさせるであろうということが当然推測される。
【００２２】
特に、中性アミノ酸Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3またはＸ4のうちの少なくとも一つを電荷を帯びたアミノ酸、特に塩基性アミノ酸で置換することが、ポティウイルス抵抗性において重要な役割を果たしていることが判明した。
【００２３】
そのような観察により、ポティウイルスに抵抗性または感受性のある植物をスクリーニングおよび／または入手するためのツール、特に遺伝子ツールを提供することができる。
【００２４】
本発明は更に詳細には、ポティウイルスに抵抗性のある植物の選別方法に関するものであり、試験対象の植物において以下のことを検出することを含んでいることを特徴とする：
・上記の配列（Ｉ）によって規定された領域を含むｅＩＦ４Ｅタンパク質（以下「野生型ｅＩＦ４Ｅタンパク質」と呼ぶ）、または前記タンパク質のコード配列の有無の検出；
・前記配列（Ｉ）の少なくとも一つの中性アミノ酸が、電荷を帯びたアミノ酸、好ましくは塩基性アミノ酸に置換し、および／または前記配列（Ｉ）の電荷を帯びた少なくとも一つのアミノ酸が、中性アミノ酸もしくは逆の電荷を帯びたアミノ酸に置換することにより上記の配列（Ｉ）によって規定されたものから由来した領域を含む、突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質、または前記タンパク質のコード配列の有無；
・そして、突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質または前記タンパク質のコード配列が検出され、野生型ｅＩＦ４Ｅタンパク質または前記タンパク質のコード配列が検出されない植物の選別。
【００２５】
本発明はまた、ポティウイルス抵抗性のある植物を得るために使用可能な植物を選別する方法をも対象としており、該方法は、試験対象の植物における上記に規定したような突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質または前記タンパク質のコード配列の有無の検出、そして前記突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質または前記タンパク質のコード配列が検出される植物の選別を含むことを特徴とする。
【００２６】
本発明の望ましい実施態様の一つによると、前記突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質は、
ａ）前記配列（Ｉ）のアミノ酸Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3またはＸ4の少なくとも一つが、電荷を帯びたアミノ酸に置換し、そして
ｂ）前記配列（Ｉ）の他の中性アミノ酸の少なくとも一つが、電荷を帯びたアミノ酸に置換し、および／または前記配列（Ｉ）の電荷を帯びた少なくとも一つのアミノ酸が、中性アミノ酸もしくは逆の電荷を帯びたアミノ酸に置換すること：
により上記の配列（Ｉ）によって規定されたものから由来した領域を含んでいる。
【００２７】
野生型または突然変異型のｅＩＦ４Ｅタンパク質の有無の検出は、所望の形態のｅＩＦ４Ｅタンパク質に特異的に対抗する抗体を用いることにより行うことができる。配列（Ｉ）によって規定されたｅＩＦ４Ｅ領域の、野生型あるいは突然変異型のどちらかに対抗する抗体が特に考えられる。
【００２８】
野生型ｅＩＦ４Ｅタンパク質のコード配列、あるいは突然変異型ｅＩＦ４Ｅタンパク質のコード配列の有無の検出には、数多くのツールが用いられる；特に考えられるのは、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子配列に由来するポリヌクレオチド、特に、上記に規定されたようなｅＩＦ４Ｅの野生型対立遺伝子と突然変異型対立遺伝子のいずれかと選択的にハイブリダイズする能力のあるポリヌクレオチド、あるいは所望の突然変異を含むｅＩＦ４Ｅ領域の増幅を可能にするポリヌクレオチドである；また、野生型には存在するが突然変異型には存在しない（あるいはその逆の）標的配列を認識する制限酵素も考えられる。
【００２９】
そういうわけで、本発明は、
ａ）上記に規定されたような、野生型または突然変異型のｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
ｂ）ポリヌクレオチドａ）に相補的なポリヌクレオチド；
ｃ）ポリヌクレオチドａ）またはｂ）の少なくとも１０ｂｐの断片；
ｄ）上記に規定されたような、野生型または突然変異型のｅＩＦ４Ｅタンパク質に対抗する抗体；
から選択された、ポティウイルスに抵抗性のある植物の選別ツールを使用することを対象としている。
【００３０】
特に、本発明は、ポティウイルス抵抗性植物の選別方法を対象とするものであり、以下のような（あるいはそれと似通った）遺伝子ツールのグループの中から選んだ少なくとも一つの選別手段を使用することを含んでいることを特徴とする：
*Ａ／以下の中から選んだ少なくとも一つの配列の全てまたは一部：
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６および８、
・遺伝子コードの縮重によるこれらの配列の類似物、
・これらの配列の少なくとも一つおよび／またはこれらの類似物の少なくとも一つに相補的なｃＤＮＡ配列；
*Ｂ／配列Ａの少なくとも一つの転写産物の全てまたは一部；
*Ｃ／配列Ａの少なくとも一つの翻訳産物の全てまたは一部；
*Ｄ／Ｃの少なくとも一つの翻訳産物に特異的な少なくとも一つの抗体の全てまたは一部；
*Ｅ／そしてツールＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄを組み合わせたもの。
【００３１】
好ましくは、選別ツールはツールＡ／および／またはＢ／から選ばれ、更に好ましくは、ツールＡから選ばれるものである。
【００３２】
このように単純で、容易で信頼性の高い、ポティウイルスに抵抗性または感受性のある植物の特定により、本発明者等は、このように、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子に対応する配列の使用に基づく新しい方法を開発した。
【００３３】
本発明の対象である方法は特にナス科、ウリ科、アブラナ科およびキク科の植物に応用されるものであり、更に詳細には、トマト属（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、ソラヌム属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）、キュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）などの植物に応用されるものである。
【００３４】
これに関係するポティウイルスは、例えばジャガイモＹウイルス（ＰＶＹ）、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）および／またはレタスモザイクウイルス（ＬＭＶ）および／またはズッキーニ黄斑モザイクウイルス（ＺＹＭＶ）および／またはカブモザイクウイルス（ＴｕＭＶ）である。
【００３５】
本発明の方法を実施するために、検出手段としてヌクレオチド配列および／またはペプチド配列または制限酵素を用い、プローブまたはプライマーを、ポティウイルスに抵抗性または感受性のある植物の選別に用いる。
【００３６】
そのような検出手段には、特にヌクレオチドプローブまたはヌクレオチドプライマーが含まれる。
【００３７】
本発明で「プライマー」が意味するものは、ポティウイルス抵抗性に関与する突然変異を含む可能性のあるｅＩＦ４Ｅ遺伝子配列を増幅するために使用可能な、全てのポリヌクレオチド配列である。中でも特に、配列（Ｉ）により規定されるｅＩＦ４Ｅ領域のコード配列の全てまたは一部またはそれに由来する突然変異配列ｅＩＦ４Ｅの全てまたは一部の増幅に使用可能なポリヌクレオチドのことである。
【００３８】
本発明で「プローブ」が意味するものは、野性型ｅＩＦ４Ｅ遺伝子または上記に規定したような突然変異ｅＩＦ４Ｅ遺伝子とハイブリダイズする、全てのポリヌクレオチド配列である。中でもポティウイルス抵抗性に関与するｅＩＦ４Ｅ遺伝子の対立遺伝子あるいはポティウイルス感受性に関与するｅＩＦ４Ｅ遺伝子の対立遺伝子と選択的にハイブリダイズする能力のあるヌクレオチド配列が含まれる。
【００３９】
これらのプローブとこれらのプライマーを、ポティウイルスに抵抗性がある、または感受性がある植物に特異的なマーカーとして用いることができる。
【００４０】
本発明にかなうよう、（Ａ）から（Ｅ）の遺伝子ツール（あるいはそれと似通ったもの）、更には特異的な制限酵素を用いて、ポティウイルスに抵抗性がある植物と感受性がある植物との間の区別を行うことができる。特異的な制限酵素については以下に説明する。
【００４１】
ヌクレオチド配列（Ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６および８は、真核生物ＲＮＡ翻訳開始因子をコードする、ポティウイルス抵抗性に関わる様々なナス科植物のｅＩＦ４Ｅ遺伝子に対応するものである。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８はポティウイルス抵抗性の劣性ｅＩＦ４Ｅ対立遺伝子に対応しているのに対し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４および６は、ポティウイルスに感受性のある優性ｅＩＦ４Ｅ対立遺伝子を示している。
【００４２】
それゆえ、本発明にかなった、ポティウイルスに抵抗性または感受性のある遺伝子の選別手段または標識手段が発見されたことになる。本発明の選別方法は、二つのタイプの選別手段もしくは標識手段を、別々にまたは一緒に作用させることができる。
【００４３】
本発明はまた、参照配列に特異的なポティウイルス感受性／抵抗性に対するｅＩＦ４Ｅ遺伝子マーカーの機能を保持する、そのようなヌクレオチド配列（Ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６および８と同等のもの全てをも当然包含する。ＤＮＡについては、遺伝子的縮重による類似物と、参照配列に相補的なｃＤＮＡ配列である。参照配列（Ａ）のポリヌクレオチド同等物もまたそれらの転写産物（ＲＮＡ）（Ｂ）の中に存在する。（Ａ）および（Ｂ）に由来する、他の細胞内マーカーを構成するタンパク質（Ｃ）は、ポティウイルスに抵抗性のある、または感受性のある植物の選別を行うことを可能にする。標的（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）の他に、本発明の選別手段は、相補的ヌクレオチド標的（Ａ）および（Ｂ）とハイブリダイズする適性を有するヌクレオチドプローブとも、さらにはまた、特異的抗原標的（Ｃ）と結合する適性を有するタンパク質性の検出手段（抗体Ｄ）ともなりうる。そのような全ての同等の手段（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）に（Ｄ）を組み合わせて選別ツール（Ｅ）とすることも考えられる。
【００４４】
本発明による手段はまた、配列（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）の断片の一切に（Ｄ）を組み合わせたものも対象とするものである。「断片」は、本発明では次のものを指す：
・参照配列の少なくとも１０、２０、３０、５０、１００、２００、３００、４００、５００個の連続したヌクレオチドからなる一つのポリヌクレオチド；好ましい断片は、前記参照配列とストリンジェントな条件で選択的にハイブリダイズする能力のあるものである。
・参照配列の少なくとも３、６、１０、１５、３０、６０、１００、１５０、２００個の連続したアミノ酸からなるポリアミノ酸；好ましい断片は、前記参照配列とストリンジェントな条件で選択的にハイブリダイズする能力のあるもの。
【００４５】
本発明の好適な方式によると、本方法の特徴は、
・請求項１に記載したツールＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅのうちの少なくとも一つおよび／または少なくとも一つの制限酵素からなる少なくとも一つの検出手段を、試験対象の植物のゲノム抽出物および／またはタンパク質抽出物と共に存在させ、
・場合によって対合および／またはハイブリダイズおよび／または消化した、前記ゲノム抽出物および／またはタンパク質抽出物を、少なくとも一回分離し、
・場合によって生じる対合および／またはハイブリダイゼーションおよび／または消化を明らかにし、
・そして、結果の読み取りを実行し、それにより、少なくとも一種のポティウイルスに抵抗性のある対立遺伝子（ｐｖｒ２1）または感受性のある対立遺伝子（ｐｖｒ+）の有無についての最終的な結論を下す。
【００４６】
この方法は、植物の遺伝的特徴の検出および認識の分野で既に知られている方法論の枠内に含まれているものである。
【００４７】
選別の方針の基礎を一つまたは複数の特異的な制限酵素を用いることに置いている、本方法の第一の実施態様によれば、本方法は以下のような方法論に合致しうるものである：
・例えばプライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８および／または１９を用いて、試験対象の植物のＤＮＡに基づき、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子のコード配列をＰＣＲにより増幅し、
・増幅産物を適した制限酵素で消化し、
・場合によって得られる断片を分離し、
・そして前記増幅産物の制限消化特性により、抵抗性あるいは感受性のある植物を選別する。
【００４８】
例えば、ポティウイルスに感受性のある植物は、ＴｓｐＲＩ酵素またはそのイソシゾマーによる切断部位の存在を明確にする制限消化特性によって検出することが可能であり、そして、ポティウイルスに抵抗性のある植物は、ＴｓｐＲＩ酵素またはそのイソシゾマーによる前記切断部位が存在しないこととＭｖｎＩ酵素またはそのイソシゾマーによる切断部位の存在とを明確にする制限消化特性によって検出することが可能である。
【００４９】
選別態様が相補的ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションである場合に対応する、本方法の第二の実施態様によると、本方法は、好ましくは以下のものから成るものである：
・植物のＤＮＡを抽出し、
・場合によってはＤＮＡを少なくとも一つの制限酵素を用いて酵素消化し、
・場合によっては消化したＤＮＡを変性させ、
・このように変性させたＤＮＡを、ハイブリダイゼーションするよう、それ自体前もって変性させて少なくとも一つのマーカーを付けたプローブと共に存在させ、
・ＤＮＡおよびハイブリダイズしていないプローブを除去し、
・マーカーによりハイブリダイゼーションを明らかにし、
・そしてマーカーの付いたプローブとハイブリダイズした標的と抵抗性または感受性のある対立遺伝子との共分離に対応するハイブリダイゼーション特性を有する植物を選別する。
【００５０】
ＤＮＡが制限酵素で消化された場合には、感受性植物と抵抗性植物の区別は、ハイブリダイゼーションした断片の大きさの違いによって行うことができる。
【００５１】
それはまた、抵抗性対立遺伝子または感受性対立遺伝子と選択的にハイブリダイズすることのできるプローブを用いても実施することができる。一本鎖分子のプローブと標的とのハイブリダイゼーションは、好ましくは、選択的なハイブリダイゼーションが可能になるような、当業者に周知の方法で決定可能な、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で行う。一般的にハイブリダイゼーションと洗浄の温度は、所定のｐＨと所定のイオン強度で、参照配列のＴｍよりも少なくとも５℃低い。典型的には、１５から５０個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドには少なくとも３０℃であり、５０個を超えるヌクレオチドからなるポリヌクレオチドには少なくとも６０℃である。
【００５２】
選択的にハイブリダイズする能力のある配列と参照配列との間の相互作用によって生じるシグナルのレベルは、バックグラウンドノイズを生じさせる他のＤＮＡ配列の相互作用によるものよりも、一般的には、１０倍、好ましくは１００倍の強度がある。
【００５３】
例えば32Ｐのような放射性元素を用いて、あるいはペルオキシダーゼのようなグラフト化した酵素を用いて標識したプローブを使うと、ハイブリダイゼーションを質的および量的に明らかにすることができる。
【００５４】
第一または第二の実施態様で用いたＤＮＡは、全ＤＮＡでもｃＤＮＡでもよい。
【００５５】
本発明の方法の、（数ある中でも）第三の実施態様は、選別態様が抗体／抗原の結合である場合に対応するものであり、本方法は、好ましくは、以下に説明され、本発明の対象としても含まれるアミノ酸配列の一つの全てまたは一部で構成された、ポリペプチドの部分が存在することを検出するものである。この方法は、試験対象のサンプルを上記に説明したような抗体と接触させ、つぎに形成された抗原／抗体の複合体を検出することから成っていてもよい。
【００５６】
選別態様がどうであるにせよ、本発明による選別方法は信頼性があり、感度が優れている。
【００５７】
本発明はまた、前記の配列（Ｉ）の中性アミノ酸の少なくとも一つが、電荷を帯びたアミノ酸、好ましくは塩基性アミノ酸に置換し、および／または、前記配列（Ｉ）の電荷を帯びた少なくとも一つのアミノ酸が、中性アミノ酸または逆の電荷を帯びたアミノ酸に置換することにより上記の配列（Ｉ）によって規定されたものから由来した領域を含む、突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードするポリヌクレオチドも対象としている。
【００５８】
好ましい実施態様によると、前記ポリヌクレオチドは、
ａ）前記配列（Ｉ）のアミノ酸Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3またはＸ4の少なくとも一つが、電荷を帯びたアミノ酸に置換し、そして
ｂ）前記配列（Ｉ）の他の中性アミノ酸の少なくとも一つが、電荷を帯びたアミノ酸に置換し、および／または前記配列（Ｉ）の電荷を帯びた少なくとも一つのアミノ酸が、中性アミノ酸または逆の電荷を帯びたアミノ酸に置換すること：
により上記の配列（Ｉ）によって規定されたものから由来した領域を含む、突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする。
【００５９】
本発明によるポリヌクレオチドは、例えばポティウイルス抵抗性に関与する配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２または２３の変形をコードするものである。
【００６０】
他の態様からすると、本発明は、以下の配列の全てまたは一部を含んだグループから選ばれた配列で記述されることを特徴とするヌクレオチド配列に関するものである。
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８
【００６１】
ヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２は、タバコのＤＮＡから得た、タバコの遺伝子に対応しているｃＤＮＡ配列である。ヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４は、ポティウイルスに感受性のあるトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の変種のｅＩＦ４Ｅタンパク質のコード配列である。配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６および８は、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ）の変種であるＹｏｌｏ  ＷｏｎｄｅｒとＹｏｌｏ  ＹそれぞれのｅＩＦ４Ｅタンパク質のコード配列である。
【００６２】
本発明はまた、ポティウイルス抵抗性に関与する、上記に規定したような、少なくとも一つの突然変異を含む余地のあるｅＩＦ４Ｅ遺伝子またはその一部分を増幅できるようにするプライマーをも対象とするものである；中でも、配列（Ｉ）によって規定されたｅＩＦ４Ｅ領域をコードするｅＩＦ４Ｅ配列、あるいはそれに由来する突然変異配列を増幅できるようにするプライマーに関するものである。
【００６３】
本発明にかなうようなプライマーは、本発明で説明されているヌクレオチド配列またはペプチド配列に基づき当業者が容易に規定できるものである。
【００６４】
非限定的な例として、以下のことが挙げられる：ヌクレオチドプライマー配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０および１１で構成される増幅プライマー；クローニングプライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０から１７；ヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０および２１で構成されるＢＡＣライブラリーをスクリーニングするプライマー。
【００６５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８および１９は、Ｙｏｌｏ  ＷｏｎｄｅｒトウガラシのｅＩＦ４Ｅのコード配列に由来するプライマーであり、それらは、とりわけＰＣＲによる増幅、そして酵素による消化により、ポティウイルス抵抗性対立遺伝子ｐｖｒ2と感受性対立遺伝子ｐｖｒ+のヌクレオチド配列を検出することを可能にする。変性したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８および１９と変性していないＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２から１７のクローニングプライマーは、タバコ、トマトそしてシロイヌナズナ属のｅＩＦ４Ｅ配列のアラインメントを基に規定され、そしてトマトとトウガラシのゲノムにおいてｅＩＦ４Ｅを検出するｃＤＮＡプローブの合成（ＲＡＣＥ）に用いられる。ＢＡＣバンクをスクリーニングするプライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０および２１は変性していない。これらのプライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０から１７、２０および２１は、場合によっては、ポティウイルスへの抵抗性または感受性の特性を検出する際に（選別ツールの構成で）直接または間接的に使用可能である。
【００６６】
本発明はまた、前記配列（Ｉ）の中性アミノ酸の少なくとも一つが、電荷を帯びたアミノ酸、好ましくは塩基性アミノ酸に置換し、および／または前記配列（Ｉ）の電荷を帯びた少なくとも一つのアミノ酸が、中性アミノ酸または逆の電荷を帯びたアミノ酸に置換することにより上記の配列（Ｉ）によって規定されたものから由来した領域を含む、突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質も対象としている。
【００６７】
好ましい実施態様によると、前記突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質は、
ａ）前記配列（Ｉ）のアミノ酸Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3またはＸ4の少なくとも一つが、電荷を帯びたアミノ酸に置換し、そして
ｂ）前記配列（Ｉ）の他の中性アミノ酸の少なくとも一つが、電荷を帯びたアミノ酸に置換し、および／または前記配列（Ｉ）の電荷を帯びた少なくとも一つのアミノ酸が、中性アミノ酸もしくは逆の電荷を帯びたアミノ酸に置換すること：
により上記配列（Ｉ）によって規定されたものから由来した領域を含む。
【００６８】
本発明はまた、ヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６および８の翻訳産物、即ち以下の配列の全てまたは一部からなるグループの中から選ばれたポリペプチドをも対象とするものである：
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９
【００６９】
アミノ酸配列で構成された、植物のポティウイルス抵抗性または感受性を選別する手段は、好ましくは、検出位置の決定を可能にする標的として用いられる。この場合、それらのペプチド標的に特異的な検出手段の実施の下地となる間接的選別手段が重要となる。これらの検出手段は、有利には、本発明の他の対象である抗体である。このように前記抗体は、翻訳産物Ｃの少なくとも一つ、そして更に詳細には、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、５、７、９、２２もしくは２３、またはこれらの少なくとも６つのアミノ酸からなる断片の、全てまたは一部に特異的に対抗するようにされていることを特徴とする。
【００７０】
上記に規定したようなポリペプチドに対抗する抗体は、当業者に周知の従来の技法で調製可能である（例えばＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５；Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８３，Ｍａｒｔｉｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。本発明による抗体には、同位体により、または同位体でないもの、例えば蛍光により検出可能なマーカーを含んでいてもよいし、あるいは更には、当業者に周知の技法によりビオチンのような分子と結合させてもよい。
【００７１】
本発明のもう一つの側面は、少なくとも一つのポティウイルスに抵抗性のある植物を検出する、プローブで構成される選別手段に関するものであり、これらのプローブは、それ自体で用いられるものである。この側面で規定するプローブは、少なくとも一つのポティウイルスに抵抗性のある植物を検出するためのものである。
【００７２】
第一の範疇に属するプローブは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６および８の全てまたは一部に対応する少なくとも一つの配列を、それぞれのプローブが含んでいることを特徴とする。この第一の範疇の中では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６および８の全てまたは一部、そして特に一般配列（Ｉ）に規定されたｅＩＦ４Ｅタンパク質領域をコードする部分の全てまたは一部に対応する、少なくとも一つの配列を含むプローブが特に望ましい。
【００７３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６は、Ｙｏｌｏ  Ｗｏｎｄｅｒトウガラシに由来する感受性のプローブである。これは、二つのヌクレオチド塩基により、Ｙｏｌｏ  Ｙトウガラシに由来する抵抗性のプローブであるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８とは区別される。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６および８に示されるこれらの突然変異は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６では制限部位ＴｓｐＲＩ、そしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８ではＭｎｖＩに対応しており、それぞれ、Ｙｏｌｏ  Ｗｏｎｄｅｒにおけるポティウイルス感受性とＹｏｌｏ  Ｙにおけるポティウイルス抵抗性のマーカーとなっている。
【００７４】
これらのプローブは、選択的ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションシグナルの有無の検出により、あるいは、感受性対立遺伝子と抵抗性対立遺伝子を区別して切断することができる適切な制限酵素、例えば、ＥｃｏＲＩ、ＴｓｐＲＩ、またはＭｎｖＩにより消化して、次に制限消化産物とそのプローブをハイブリダイズさせることにより、抵抗性植物と感受性植物の区別に用いられる。抵抗性植物と感受性植物との区別は、後者の場合は、ハイブリダイズした断片の大きさの違いでなされる。
【００７５】
本発明はまた、上記に規定したような本発明による方法の第一の実施態様に従った、他の選別方法を実施することを可能にするツールをも供給するものである。その第一の実施態様によれば、ｅＩＦ４Ｅ配列のＰＣＲ増幅を最初に行う。その増幅に次いで、制限酵素による選択的消化を行う。それゆえ、ここで作用するツールには二つのタイプがある：一つまたは複数の制限酵素と、ｅＩＦ４Ｅ配列の増幅を可能にする一つまたは複数のＰＣＲプライマーである。
【００７６】
本発明は特に、ポティウイルス抵抗性またはポティウイルス感受性に関与するｅＩＦ４Ｅ対立遺伝子を検出することを可能にするキットを対象としており：
・ａ）ポティウイルス感受性に関与する少なくとも一つのｅＩＦ４Ｅ対立遺伝子にはあり、ポティウイルス抵抗性に関与するｅＩＦ４Ｅ対立遺伝子にはない、制限部位Ｉを認識する酵素；
ｂ）ポティウイルス抵抗性に関与する少なくとも一つのｅＩＦ４Ｅ対立遺伝子にはあり、ポティウイルス感受性に関与するｅＩＦ４Ｅ対立遺伝子にはない、制限部位ＩＩを認識する酵素：
の中から選ばれた少なくとも一つの制限酵素；そして
・制限部位Ｉおよび／または制限部位ＩＩを含むｅＩＦ４Ｅまたはその一部の増幅を可能にする、一対のヌクレオチドプライマー、
を含むことを特徴とする。
【００７７】
例えば：
・配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で表されるポティウイルス感受性に関与するｅＩＦ４Ｅ対立遺伝子を検出するための制限酵素は、センス配列ＮＮＣＡＳＴＧＮＮ＾そしてアンチセンス配列＾ＮＮＧＴＳＡＣＮＮによって規定される制限部位を認識するＴｓｐＲＩ、またはそれのイソシゾマーである。ヌクレオチドプライマーは、ＴｓｐＲＩ部位を含むｅＩＦ４Ｅ配列の全体または少なくともその一部を増幅することが可能になるように選ばれる。
・配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で表されるようなポティウイルス抵抗性に関与するｅＩＦ４Ｅ対立遺伝子を検出するための制限酵素は、センス配列ＣＧ＾ＣＧそしてアンチセンス配列ＧＣ＾ＧＣによって規定される制限部位を認識する、ＭｖｎＩまたはそのイソシゾマー（ここの「一つ」とりました）である。ヌクレオチドプライマーは、ＭｖｎＩ部位を含むｅＩＦ４Ｅ配列の全体または少なくともその一部を増幅することが可能になるように選ばれる。
【００７８】
どちらの場合にも、例えばプライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９が使用可能である。
【００７９】
上記に示したように、ポティウイルスに感受性または抵抗性を有する植物の検出は、野生型または突然変異型のｅＩＦ４Ｅタンパク質の有無の検出によっても実施することが可能である。
【００８０】
このように、本発明は、ポティウイルスに抵抗性のある植物を選別するために、上記に規定したような、野生型または突然変異型のｅＩＦ４Ｅタンパク質またはそのようなタンパク質に特異的な抗体を用いることを包含する。
【００８１】
好ましくは、前記ｅＩＦ４Ｅタンパク質は、
・ポリペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で表されるタンパク質；
・ポリペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で表されるタンパク質；
・ポリペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で表されるタンパク質；
・ポリペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９で表されるタンパク質；
・ポリペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２で表されるタンパク質のグループ；
・ポリペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３で表されるタンパク質のグループ；
の中から選択される。
【００８２】
このように、本発明にかなったポティウイルス抵抗性の検出手段の範疇は、該手段のそれぞれが、本発明にかなった突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質の全てまたは一部、とりわけ上記に規定したような抵抗性に関与する突然変異を有するタンパク質の少なくとも６つのアミノ酸からなる断片に特異的な抗体を、少なくとも一つ含んでいることを特徴とする。
【００８３】
例えば、抵抗性の検出手段は、上記に規定したようなポリペプチド配列の全てまたは一部、とりわけ抵抗性に関与する突然変異を有する配列の少なくとも６つのアミノ酸からなる断片に特異的な抗体により構成されることが可能である。
【００８４】
本発明はまた、以下の配列を含むグループの中から選ばれた少なくとも一つのアミノ酸配列によりそれぞれ構成された、ポティウイルス感受性または抵抗性検出手段に関するものでもある：
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３；
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５；
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７；
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９；
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２；
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３；
【００８５】
本発明は更に詳細には、以下の配列：
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３；
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５；
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７；
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９；
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２；
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３；
からなるグループの中から選択したアミノ酸配列に特異的な少なくとも一つの抗体、または前記配列の一つの少なくとも６つのアミノ酸からなる断片、特に配列（Ｉ）によって規定されるその配列の領域の断片によりそれぞれが構成された、ポティウイルス感受性の検出手段に関するものである。
【００８６】
好ましくは、それぞれのヌクレオチドプローブまたは上述した全ての他の検出手段は、感受性配列の検出の核心であるヌクレオチドハイブリダイゼーションまたは抗原／抗体結合の指標として有用な、少なくとも一つのマーカーを備えている。有利には、このマーカーは、分光学的に、光化学的に、生物化学的に、免疫化学的に、あるいは他の化学的手段により検出可能なものである。例えばそのようなマーカーは、放射性同位体32Ｐ、3Ｈ、蛍光分子（５−ブロモデオキシウリジン、フルオレセイン、アセチルアミノフルオレン）、またはビオチンのようなリガンドからなる。更に詳細には、特にヌクレオチドプローブに関しては、これらのマーカーは、好ましくは、プライマー伸長により、あるいは３’または５’末端に付加することにより、標識した分子をポリヌクレオチドに組み込むことによって行う。
【００８７】
好ましくは、ポティウイルス抵抗性植物の検出に用いる配列は、ヌクレオチドプローブまたはヌクレオチドプライマーとして用いる。
【００８８】
いうまでもなく、上述の検出手段の全ては、指定した配列のみに厳密に限定されるものではなく、特に、考慮する機能を保持する、上記に規定したような、類似の配列によって構成される同等物の全てを包含するものである。
【００８９】
当業者は、プローブおよびプライマーを調製する様々な方法に完全に精通しているが、その方法に含まれるのは、クローニングによるもの、制限酵素の作用によるもの、あるいは更に、Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）のホスホジエステルによる方法または欧州特許発明第０７０７５９２号明細書に記載の固体担体による技術のような技術に従った直接的な化学合成によるものである。必要であれば、上記に説明したように検出可能な分子またはマーカーを組み込んで、核酸を標識することも可能である。核酸断片を非放射性標識する例は、特に仏国特許発明第７８１０９７５号明細書、またはＵｒｄｅａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）もしくはＳａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）に記載されている。
【００９０】
他の様相によれば、本発明は、少なくとも一つのポティウイルスに抵抗性／感受性を有する植物を検出するために上記に規定した検出手段を使用することに関するものである。
【００９１】
本発明にかなうよう、ポティウイルス抵抗性／感受性のオリゴヌクレオチドマーカーとして、偶然に知られたｅＩＦ４Ｅ配列のＭｖｎＩおよび／またはＴｓｐＲＩ制限部位を用いる。
【００９２】
好ましくは、オリゴヌクレオチドマーカーとして用いる制限部位は、以下のものに対応する：
・センス配列：ＣＧ＾ＣＧとアンチセンス配列：ＧＣ＾ＧＣ
・および／またはセンス配列：ＮＮＣＡＳＴＧＮＮ＾とアンチセン  ス配列：＾ＮＮＧＴＳＡＣＮＮ。
【００９３】
これらの制限部位を、発現した配列のポティウイルス抵抗性のマーカー（またはラベルまたはタグ）として利用することは、制限酵素（例えばＭｖｎＩおよび／またはＴｓｐＲＩ）と、ｅＩＦ４Ｅ配列の増幅のためのプライマー、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  １８および／または１９を用いる、上述した検出方法の第一の実施態様に近いものである。
【００９４】
ＭｖｎＩおよびＴｓｐＲＩ制限部位の特異性に鑑みて、本発明はまた、ポティウイルス抵抗性／感受性のオリゴヌクレオチドマーカーとして、上述のＭｖｎＩおよびＴｓｐＲＩ制限部位、そして、好ましくは、センス配列：ＣＧ＾ＣＧおよびアンチセンス配列：ＧＣ＾ＧＣに対応する制限部位、ならびに／またはセンス配列：ＮＮＣＡＳＴＮＮ＾およびアンチセンス配列：＾ＮＮＧＴＳＡＣＮＮに対応する制限部位を使用することを包有するものである。
【００９５】
更にもう一つの他の様相によれば、本発明は、上記に規定したような抗体タイプまたはポリヌクレオチドタイプの少なくとも一つの検出手段を含む、ポティウイルス抵抗性／感受性植物を選別するためのキットに関するものである。キットは、場合によっては、ハイブリダイゼーションまたは増幅反応の実施に必要な試薬を含む。
【００９６】
本発明はまた、上記に説明した方法、および／またはツールの活用、および／または上記に規定した選別キットの使用により得られた植物も対象とする。好ましくは、これらの植物は、ナス科、ウリ科、アブラナ科およびキク科に属する植物である。更に好ましくは、トマト、トウガラシ、および／またはレタスの中から選ばれたものである。
【００９７】
実施例として、本発明者等は、ＲＦＬＰ（制限断片長多型）分析のための手順に従って、本発明の対象である方法を実施する。そのために、本発明者は、本発明の対象であるプローブを32Ｐで標識し、分析対象のトウガラシのＤＮＡをＥｃｏＲＩで制限酵素消化する、従来のＲＦＬＰ手順を用いた。この方法を用いた結果、本発明者等は、ポティウイルス抵抗性植物と感受性植物との間で異なるハイブリダイゼーション特性を得ることができ、これにより、感受性植物か抵抗性植物であるかを選別することが可能となる。抵抗性植物は、つぎに連続的な交配による植物改良プログラムに用いてもよい。
【００９８】
本発明は、ポティウイルス抵抗性植物または感受性植物を選別することのみに関するものではない。実際、本発明者等が劣性のポティウイルス抵抗性を決定するｅＩＦ４Ｅ遺伝子を識別することができる限りでは、今後、少なくとも一つのポティウイルスに抵抗性（または感受性）のある、遺伝子を改変した植物の新しい変種が得られることが考えられる。
【００９９】
それゆえ、本発明は、少なくとも一つのポティウイルスに抵抗性（または感受性）のある、遺伝子を改変した植物の新しい変種を、非生物学的に得る方法に関するものであり、その特徴は、基本的に、前記ポティウイルスへの抵抗性（または感受性）に関与するｅＩＦ４Ｅ対立遺伝子がこれらの植物のゲノム中に現れるように、および／または対立遺伝子をこれらの植物のゲノムに導入するようにすることである。
【０１００】
この方法の有利な実施態様によれば、抵抗性の対立遺伝子の出現は、以下から選択した方法を用いることにより生じる：
・突然変異誘発、有利には「Ｔｉｌｌｉｎｇ法」、
・相同組換え、
・過剰発現、
・挿入／欠失、
・「遺伝子サイレンシング」／遺伝子導入
・およびそれらの組み合わせ。
【０１０１】
上記の非生物学的な生成方法で使用されうるツールもまた、本発明に不可欠なものである。
【０１０２】
このように本発明は、転写および場合によっては翻訳を制御する適切なエレメントの制御下に置かれた、突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする、本発明にかなうようなポリヌクレオチドを含む、構成された遺伝子単位の全てを対象とする。
【０１０３】
前記突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質は、有利には、ポティウイルス抵抗性に関与する配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２または２３の変形の中から選ぶことが可能である。
【０１０４】
本発明の対象はまた、任意の構成された遺伝子単位であり、以下のものを含むことを特徴とする：
・上記に規定した、少なくとも一つの遺伝子ツールＡ／および／またはＢ／、
・ならびに／または、以下の配列の全てまたは一部を含むグループから選択した少なくとも一つのヌクレオチド配列：
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８
・ならびに／または少なくとも一つのＭｖｎＩおよび／またはＴｓｐＲＩ制限部位、好ましくはセンス配列：ＣＧ＾ＣＧとアンチセンス配列：ＧＣ＾ＧＣに対応する少なくとも一つの制限部位、および／またはセンス配列：ＮＮＣＡＳＧＴＮＮ＾とアンチセンス配列：＾ＮＮＧＴＳＡＣＮＮに対応する制限部位を含む、ｅＩＦ４Ｅ因子をコードする少なくとも一つのヌクレオチド配列。
【０１０５】
本発明の対象の範疇となる、他の遺伝子の形質転換ツールは、上述のように構成された遺伝子単位を少なくとも一つ含む、植物細胞を形質転換する任意のベクターによって構成される。全ての既知の適切なクローニングベクター（ファージ／プラスミド／コスミドなど）が考えられる。
【０１０６】
上述に規定したように、少なくとも一つのベクターや少なくとも一つの構成された遺伝子単位によって形質転換した植物細胞と微生物もまた、本発明の目的とするものである。
【０１０７】
高いレベルでは、本発明は、上述したような少なくとも一つのベクター、および／または少なくとも一つの構成された遺伝単位、および／または形質転換した植物細胞、および／または形質転換した微生物を用いて形質転換した植物を包含するものである。
【０１０８】
遺伝子改変の直接的または間接的な技法のすべては、当業者に周知のものである。更なる詳細については、以下の実施例で説明する。
【０１０９】
図の説明
・図１は、サザンブロット分析によるゲルを示しており、様々な感受性または抵抗性トウガラシで見られた、ポティウイルス抵抗性のｅＩＦ４Ｅマーカーの特性の差異を示している。トウガラシのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ酵素で消化し、タバコｅＩＦ４ＥのｃＤＮＡ−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２−とハイブリダイズさせた（実施例３）。
・図２は、トウガラシのポティウイルス抵抗性に関与するｅＩＦ４Ｅ遺伝子のＰＣＲ増幅を示しており、感受性と抵抗性との間で異なるＭｖｎＩ制限部位を明らかにしている（実施例４）。
・図３は、ポティウイルス感受性または抵抗性を有する様々なトウガラシの変種の、ｅＩＦ４Ｅタンパク質配列のアラインメントを示している。
・図４は、ポティウイルス感受性または抵抗性を有する様々なトマトの変種の、ｅＩＦ４Ｅタンパク質配列のアラインメントを示している。
【実施例１】
【０１１０】
トマトおよびトウガラシのプローブの入手
【０１１１】
トマトとトウガラシのｃＤＮＡを、トマトとトウガラシの全ＲＮＡ抽出物から、３’および５’ＲＡＣＥ法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）社によって市販されているＳｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）によって得ることができ、その際に、タバコ、トマトおよびシロイヌナズナ属のｅＩＦ４Ｅ配列のアラインメントに基づいて規定される変性プライマーを用いた。ｃＤＮＡの３’部分を、３’ＲＡＣＥ法によりクローニングした。５’ＲＡＣＥ法により完全なｃＤＮＡを得るために、３’ＲＡＣＥ法で得た配列のＴＡＧとポリＡ尾部との間に規定されたプライマーを用いた。
【０１１２】
３’ＲＡＣＥの二つの手順に用いたプライマーは以下のものである：
手順１：ＴＣＴＡＧＡＴＡＣＡＡＹＡＡＴＡＴＣＣＡＹＣＡＣＣＣＡＡＧＣＡＡ＝ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０
手順２：ＴＣＴＡＧＡＴＧＧＧＲＧＣＡＧＡＣＴＴＴＣＡＹＴＧＴＴＴ＝ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１
【０１１３】
５’ＲＡＣＥの三つの手順に用いたプライマーは、以下の表Ｉに示した：
【０１１４】
【表１】
2006503544.tif 000002
【実施例２】
【０１１５】
ポティウイルス抵抗性植物のハイブリダイゼーションおよび選別のためのテスト（遺伝子座ｐｖｒ２／ｐｖｒ１／ｐｖｒ５により制御された抵抗性）
【０１１６】
分析対象の植物のＤＮＡ抽出
【０１１７】
植物（ナス科、ウリ科、アブラナ科およびキク科）のＤＮＡ抽出を、Ｆｕｌｔｏｎ  ｅｔ  Ｔａｎｋｓｌｅｙ，１９９５のＤＮＡマイクロ抽出プロトコールに基づく標準的な抽出プロトコールに従って行う。
【０１１８】
アガロースゲルでのＤＮＡの消化および分離
【０１１９】
続くプロトコールで用いるのは、１μｇのＤＮＡ当たり２．５Ｕの酵素である。酵素の量は反応物の量の１０％を下回っていなければならない。反応物の量は、ウェルのサイズの関数として算出される：用いる反応槽およびコームのタイプと、ゲルの量（一般には３００ｍｌ）によって決まる。酵素特異的な緩衝液の量とスペルミジンの量は、それぞれ反応物の量の１０％を占めなければならない：
・ｘ  μｌ  ＤＮＡ
・１×緩衝剤
・１×スペルミジン（４ｍＭ）
・１μｇのＤＮＡ当たり２．５Ｕの酵素
・反応物の量に十分なＨ2Ｏ
【０１２０】
消化を３７℃で一晩行う。それと並行して、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したバクテリオファージλのサンプルを用意する：ウェル当たり０．５μｇ。消化の後に、ＤＮＡが正しく消化されたことを、１μｌの消化産物について、１％アガロースゲル、１×ＴＡＥで検証する。消化が正しく行われていた場合、ローディングバッファーを添加する。ローディングバッファーは、全量の少なくとも１０％（あるいは２０％）を占めなければならない。したがって、１０μｌのＥＴＢを含む１×ＮＥＢ、１％アガロースゲル３００ｍｌに載せる。泳動は、１×ＮＥＢバッファーの中で２４時間、２５Ｖで行う（泳動はゲルの縁から２ｃｍのところで停止する）。
【０１２１】
ナイロン膜への転写
【０１２２】
Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋膜と一枚のＷａｔｔｍａｎ紙を、ゲルの大きさに合わせて裁断する。０．２５ＮのＨＣｌが１Ｌ入った平らな反応槽に、攪拌しながらゲルを３０分浸す（青が黄色になる）。
【０１２３】
この間に、ブロッターを次のように用意する：
・一枚のＷａｔｔｍａｎ紙を２×ＳＳＣで濡らし、それをブロッターの多孔プレートに載せる。
・つぎにその膜を濡らして、後にプラスチックスクリーンで覆われる、Ｗａｔｔｍａｎ紙の上に載せる。
【０１２４】
ゲルを蒸留水の入った反応槽の中ですすぎ、つぎにそのブロッターのスクリーンの上に載せるが、その際、気泡が生じないようにし、そのシステムの気密性を確認する。ブロッターを最大値の５０ｍｂで始動させる。ゲルの上に少しの０．４Ｎの水酸化ナトリウムを注ぐ。水酸化ナトリウムをしみ込ませたスポンジ二つをゲルに載せ、浸潤するまで水酸化ナトリウムに浸す。
【０１２５】
転写は２時間から３時間行う。膜を、２×ＳＳＣを入れた容器の中で１０から１５分濯ぎ、つぎに乾かして、８０℃で２時間焼く。
【０１２６】
プローブの調製
【０１２７】
32ＰでのＰＣＲ標識によるプローブの調製は、ＰＣＲまたはプラスミドで直接増幅した、最大で３ｋｂのプローブに関するものであり、濃度が１から５ｎｇ／μｌのプローブの主要なバンドを明らかにすることができる。
【０１２８】
反応条件を以下の表２にまとめた：
【０１２９】
【表２】
2006503544.tif 000003
【０１３０】
１００ｍＭの保存溶液から、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰを１０ｍＭに希釈：
・１００ｍＭのｄＮＴＰを５μｌ
・Ｈ2０を４５μｌ
１００ｍＭの保存溶液から、ｄＣＴＰを１ｍＭに希釈：
・１００ｍＭのｄＣＴＰを０．５μｌ
・Ｈ2０を４９．５μｌ
混合物  ＡＴＧ＋ｄＣＴＰ：
・１０ｍＭのｄＡＴＰ  ２．５μｌ  最終濃度：５０μＭ
・１０ｍＭのｄＴＴＰ  ２．５μｌ  最終濃度：５０μＭ
・１０ｍＭのｄＧＴＰ  ２．５μｌ  最終濃度：５０μＭ
・１ｍＭのｄＣＴＰ    ２．５μｌ  最終濃度：５μＭ
・Ｈ2０を４９０μｌ
【０１３１】
プローブの標識を、以下のＰＣＲサイクルを３０回行って行う：
・９４℃で３０秒
・５２℃で４５秒
・７２℃で１分３０秒
【０１３２】
一旦標識すると、次にプローブを以下のプロトコールに従って変性させる：
・各プローブを、０．８ＮのＮａＯＨを１６０μｌ＋（ランダムプライミングで）標識したラムダを２から５μｌ入れたチューブに添加し、
・５分間インキュベートし、
・２００μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌで中和する。
【０１３３】
ハイブリダイゼーション
【０１３４】
ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９８４）によるプロトコール
【０１３５】
ａ−６５℃で一晩のプレハイブリダイゼーション
【０１３６】
２から６半分のブロットに、チューブ一本当たり２０ｍｌのハイブリダイゼーション*バッファーを用いる。これを超えて、２５ｍｌのバッファーを用いるが、チューブ当たり１０の半分のブロットを越えることはない。ハイブリダイゼーションバッファーを入れた容器の中で膜を濡らし、軽く絞り、その後に（全体を）丸めてチューブの中に入れる。
プレハイブリダイゼーションの間に、チューブの気密性と、膜が正しく広がることを確認し、そうでなければ向きを変える。
【０１３７】
*プレハイブリダイゼーションバッファーとハイブリダイゼーションバッファーの組成：
【０１３８】
５００ｍＬ当たり：ＮａＣｌが２１．９１ｇ；クエン酸ナトリウムが１８．３８ｇ；Ｈ2Ｏが３８０ｍＬ；２０％ＳＤＳが１５ｍＬ；ｐＨ７．５の１Ｍ  ＮａＰＯ4が２５ｍＬ；１００×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液が２５ｍＬ；０．２５ＭのＥＤＴＡが５ｍＬ；５０％デキストラン硫酸が５０ｍＬ。
【０１３９】
ｂ−６５℃での少なくとも１６時間のハイブリダイゼーション
【０１４０】
チューブを開く前に温度を下げ、ネジが濡れないようにする。変性したプローブ（０．８ＭのＮａＯＨ中に５分間置いた後に１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌで変性を停止する）を加える。このような条件下で、ハイブリダイゼーションは４８ないし７２時間続くことがある。
【０１４１】
ｃ−洗浄
【０１４２】
容器（またはトレイ）を、６５℃で予熱した、４０ｍＭのＮａＰｉを含む大量のバッファー（１％ＳＤＳ（Ｓｅｒｖａ））で洗浄する。約５から１０枚の半分の膜につき：
・攪拌しながら６５℃で２０分の洗浄を一回。洗浄するには、膜を一枚一枚、予熱したバッファーを入れた新しいトレイの中に移し入れる。（少なくとも最初の２回は）放射性の洗浄バッファーを、このために用意した容器に注ぎ入れる。
・６５℃に加熱した新しいバッファーの中で２、３分の濯ぎを一回。
【０１４３】
ｄ−露出
【０１４４】
そのような膜を、吸収紙を敷いた上に寝かせて脱水するのであるが、その構成は、青い紙一枚を下地にして、Ｔｏｒｋの巻紙タイプの白い紙で覆ったものである：膜は、乾燥させてしまってはならない。該膜をつぎに露出用のビニール袋に入れ、１つの増感紙が付いた小箱の中に置く。
【０１４５】
ガイガー・カウンターで測定した信号に従って、一晩から数日の間、−８０℃で露出する。
【０１４６】
ｅ−リハイブリダイゼーションの前の膜のデハイブリダイゼーション
【０１４７】
膜のデハイブリダイゼーションを、（４０枚の半分の膜につき１リットルの）８０℃で加熱した０．１％ＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡの中で、室温で２０分間行う。膜はつぎに、２×ＳＳＣ溶液の中で十分間すすぐ。最後に、膜の水気を取った上で、ビニール袋の中で湿りけを保った状態で、４℃で保管する。
【実施例３】
【０１４８】
ポティウイルス抵抗性とｅＩＦ４Ｅの間の相関関係
【０１４９】
これらの感染テストで用いるウイルス物質は、ジャガイモから得たＰＶＹ  Ｎ−６０５（Ｊａｋａｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、またはトマトのＰＶＹ−ＬＹＥ８４あるいはＰＶＹ−ＬＹＥ２４０ｒ（Ｌｅｇｎａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）そしてトウガラシから単離されたＰＶＹ−Ｔｏ７２、ＰＶＹ−Ｓｉ１５（Ｄｏｇｉｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、さらにＴＥＶ  ＣＡＡ−１０単離体（Ｌｅｇｎａｎｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９６）である。同一のプロトコールを、遺伝子座ｐｖｒ２／ｐｖｒ１／ｐｖｒ５および／またはｐｏｔ−１により制御される他の全てのＰＶＹおよびＴＥＶの単離体に用いる。単離体を、Ｂｏｓの手順（Ｂｏｓ，１９６９）に従って維持し、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．Ｘａｎｔｈｉｉで増殖させた後、水平に二枚の葉を広げた状態の子葉段階のトマトまたはトウガラシに接種する。ウイルス接種物は、Ｌｅｇｎａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５，１９９６）やＤｏｇｉｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）の記事で説明されたように調製する。植物の子葉および最初の二枚の葉には、機械的に接種する。接種後のそれらの反応を観察するために、制御した条件の下（１４時間照明、夜間１８℃で日中２４℃）、培養室で、系統について評価する。接種の４週間後、Ｌｅｇｎａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５，１９９６）やＤｏｇｉｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）に記載されたようにＥＬＩＳＡテスト（酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ））を用いて、ＰＶＹまたはＴＥＶのカプシド抗原の有無について、植物を個別に評価した。全て当業者に周知である他のプロトコールもまた、ポティウイルスの植物への機械的な接種に使用可能である。
【０１５０】
付属の図１に示したゲルは、ｅＩＦ４Ｅマーカーとｐｖｒ２遺伝子座により制御されるポティウイルス抵抗性との間に観察される違いを示している。このようにポティウイルス抵抗性とｅＩＦ４Ｅ遺伝子のコピーとの間の共分離が完全であることが、５００を越える植物の分離の際に、一つの子孫において観察された。
【０１５１】
トウガラシのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ酵素で消化し、そしてタバコｅＩＦ４ＥのｃＤＮＡ−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２−とハイブリダイズした（トマトのｃＤＮＡまたはトウガラシのｃＤＮＡとハイブリダイズすると、同じＲＦＬＰ特性が得られた）。
【０１５２】
感受性植物（Ｓ）の有する制限消化断片は、「低い」もので７ｋｂであるのに対し、抵抗性植物（Ｒ）の有する制限消化断片は「高い」もので７ｋｂである。異型接合体植物（Ｈｔ）は、二つの制限消化断片があり、（劣性遺伝子により）感受性を有するものである。
【実施例４】
【０１５３】
ポティウイルス抵抗性に関与するｅＩＦ４Ｅの突然変異を明らかにする
【０１５４】
１）ポティウイルス感受性トウガラシの遺伝子型と抵抗性の遺伝子型のコピー間で異なる制限部位を明らかにする
【０１５５】
従来のシークエンシング技術により、トウガラシの変種「Ｙｏｌｏ  Ｗｏｎｄｅｒ」（ポティウイルス感受性でｐｖｒ２+対立遺伝子を有する）のｅＩＦ４Ｅ遺伝子とトウガラシの変種「Ｙｏｌｏ  Ｙ」（ポティウイルス抵抗性でｐｖｒ２1対立遺伝子を有する）のそれとの間の点突然変異を明らかにした。つまり、位置２００において、Ｙｏｌｏ  ＷｏｎｄｅｒのｅＩＦ４Ｅのコード配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６がＴを呈する一方で、Ｙｏｌｏ  ＹのｅＩＦ４Ｅのコード配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８ではＡを呈する。同様に位置２３６においては、Ｙｏｌｏ  Ｗｏｎｄｅｒのコード配列がＴを呈する一方で、Ｙｏｌｏ  Ｙのコード配列はＧを呈する。
【０１５６】
第一の点突然変異は、Ｙｏｌｏ  Ｗｏｎｄｅｒにのみ存在するＴｓｐＲＩ制限部位（あるいはそのイソシゾマー）に対応するものである。この異なる制限部位は、Ｙｏｌｏ  ＷｏｎｄｅｒとＹｏｌｏ  ＹのｃＤＮＡについてＰＣＲを行って確認した：ｃＤＮＡの５’と３’におけるプライマーの規定およびＴｓｐＲＩ酵素によるＰＣＲ増幅産物の消化。
【０１５７】
（ＭｖｎＩ酵素についても同様のプロトコールを用いるが、消化についてはこの酵素では７０℃で行う。）
【０１５８】
第二の点突然変異は、Ｙｏｌｏ  Ｙにのみ存在するＭｖｎＩ制限部位（あるいはそのイソシゾマー）に対応するものである。この異なる制限部位は、Ｙｏｌｏ  ＷｏｎｄｅｒとＹｏｌｏ  ＹのｃＤＮＡについてＰＣＲを行って確認した：ｃＤＮＡの５’と３’におけるプライマーの規定およびＭｖｎＩ酵素によるＰＣＲ増幅産物の消化。
ｃＤＮＡにおけるＰＣＲ反応
センスプライマー：ＡＡＡ  ＡＧＣ  ＡＣＡ  ＣＡＧ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＣＡ＝ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８
アンチセンスプライマー：ＴＡＴ  ＴＣＣ  ＧＡＣ  ＡＴＴ  ＧＣＡ  ＴＣＡ  ＡＧＡ  Ａ＝ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９
【０１５９】
反応条件を表３に示した。
【０１６０】
【表３】
2006503544.tif 000004
【０１６１】
ＭｖｎＩ酵素による消化：ＰＣＲ産物を８μｌ＋酵素を２Ｕ＋酵素バッファーを１．３μｌ＋Ｈ2Ｏを１３．５μｌ、３７℃で二時間。１×ＴＡＥ、１．２％アガロースゲルで移動。
【０１６２】
添付の図２に示したゲルは、トウガラシのポティウイルス抵抗性に関わるｅＩＦ４Ｅ遺伝子のＰＣＲ増幅産物を示しており、感受性と抵抗性との間で異なるＭｖｎＩ制限部位を明らかにする。
バンド１：
・ポティウイルス感受性（Ｓ）のトウガラシＹｏｌｏ  ＷｏｎｄｅｒのｅＩＦ４Ｅ遺伝子のＰＣＲ増幅産物−ｐｖｒ２＋対立遺伝子−
・そしてＭｖｎＩによる酵素的消化の不存在。
バンド２：
・ポティウイルス抵抗性（Ｒ）のトウガラシＹｏｌｏ  ＹのｅＩＦ４Ｅ遺伝子のＰＣＲ増幅産物−ｐｖｒ２1対立遺伝子−
・そしてＭｖｎＩ制限部位を明らかにする。
バンド３：
・１ｋｂラダーサイズマーカー
【０１６３】
２）ポティウイルス抵抗性に関与するｅＩＦ４Ｅの突然変異を明らかにする
【０１６４】
様々なポティウイルス感受性または抵抗性トウガラシの変種のｅＩＦ４Ｅ遺伝子のシークエンシングによって、ｅＩＦ４Ｅの同一の領域における、ポティウイルス抵抗性に関与する突然変異が明らかとなった。
【０１６５】
様々な変種のｅＩＦ４Ｅタンパク質配列のアラインメントを図３に示す。
図３の説明：
ＹＷ＝Ｙｏｌｏ  Ｗｏｎｄｅｒ  Ｓ／ｐｖｒ２+
ＤＤＬ＝Ｄｏｕｘ  Ｌｏｎｇ  ｄｅｓ  Ｌａｎｄｅｓ種  Ｓ／ｐｖｒ２+
ＰＭ１００８＝ＰＶＹ（０）に抵抗性のあるもの
ＹＹ＝Ｙｏｌｏ  Ｙ／ｐｖｒ２1
Ａｖｅｌａｒ＝ｐｖｒ２1対立遺伝子
Ｖａｎｉａ＝ｐｖｒ２1対立遺伝子
ＰＭ９９４＝ＰＶＹ（０）に抵抗性のあるもの
Ｆｌｏｒｉｄａ  ＶＲ２＝Ｆｌｏｒｉｄａ種／ｐｖｒ２2
Ｃ６９＝ＣＭ３３４とＹｏｌｏ  Ｗｏｎｄｅｒ／ｐｖｒ５の間の雑種Ｆ１に由来する系統ＨＤ
ＣＭ３３４＝Ｃｒｉｏｌｌｏ  ｄｅ  Ｍｏｒｅｌｏｓ３３４種／ｐｖｒ５
ＰＭ１０１４＝ＰＶＹ（０）に抵抗性のあるもの
Ｐｅｒ＝遺伝子座ｐｖｒ２における永続的な／部分的な抵抗性（ＱＴＬ）
太字で下線付き＝ＰＭ１００８を除く抵抗性のあるもの全てに共通の突然変異
グレーで上線付き＝ｐｖｒ２1対立遺伝子に特異的な突然変異
下線なしの太字＝ｐｖｒ２2対立遺伝子に特異的な突然変異
下線付きの細字＝ｐｖｒ５対立遺伝子に特異的な突然変異
黒いハイライト＝ＰＭ１００８遺伝子型に特異的な突然変異
これらの様々な変種もまた配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２で示される。
【実施例５】
【０１６６】
ポティウイルス抵抗性の劣性遺伝子についてのトウガラシとトマトの間のシンテニー（トマトのｐｏｔ−１遺伝子とトウガラシのｐｖｒ２遺伝子座）
【０１６７】
ポティウイルス抵抗性に関わる五つの主遺伝子と複数のＱＴＬを、トウガラシゲノムでマッピングした。ゲノムマッピングするための共通のＲＦＬＰプローブ、そしてトマトゲノムとトウガラシゲノムの間でマーカーの順序が高度に保存されているおかげで、トウガラシのポティウイルス抵抗性因子をトマトのマップ上に載せることができる。トウガラシのポティウイルス抵抗性遺伝子座のトマト染色体における位置、ならびに関与するＲＦＬＰマーカーの位置を、出典と共に表４にまとめた。トウガラシおよびトマトのゲノム領域とポティウイルス抵抗性遺伝子との対応を厳密に明らかにするために、ＴＧ１３５およびＣａｂ３ＲＦＬＰマーカーを、トウガラシの既存の遺伝子連鎖地図上（Ｌｅｆｅｂｖｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，参照）に付け加える。
【０１６８】
【表４】
2006503544.tif 000005
【０１６９】
ａ−ｐｏｔ−１遺伝子のＡＦＬＰおよびＲＦＬＰ標識
【０１７０】
全ＤＮＡを、Ｆ２植物の新鮮な葉約１ｇから抽出する（Ｃａｒａｎｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【０１７１】
ＰＶＹ株Ｎ６０５に対して完全な感受性を有するＦ３ファミリーを生産した６つのＦ２植物（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ  ＭｏｓｐｏｍｏｒｉｓｔとＬ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ  ＰＩ２４７０８７のＦ１雑種の自家受精に由来する）のＤＮＡサンプル（ｐｏｔ−１+／ｐｏｔ−１+）と、ポティウイルスに対して完全な抵抗性を有するＦ３ファミリーを生産する９つのＦ２植物のＤＮＡサンプルを、大量単離分析（ｂｕｌｋｅｄ  ｓｅｇｒｅｇａｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）とｐｏｔ−１のＡＦＬＰタギングを行うためにまとめた。
【０１７２】
ＡＦＬＰマーカーは、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＭｓｅＩ制限酵素を用いて、Ｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）のプロトコールに従って生成する。最初の増幅は、プライマーと一つの選択したヌクレオチドを用いて行い、二度目は、プライマーと三つの選択したヌクレオチドを用いて行う。
【０１７３】
ｐｏｔ−１に結合したＡＦＬＰマーカーを、Ｌ．ｈｉｒｓｕｔｕｍをＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍに遺伝子浸透して得た系統でマッピングし（Ｍｏｎｔｆｏｒｔｅ  ａｎｄ  Ｔａｎｋｓｌｅｙ  ２００１）、それにより、ｐｏｔ−１をトマト染色体に当てはめる。
【０１７４】
標的染色体上に位置決定したＲＦＬＰマーカーをマッピングすることにより、その当てはめが有効になる。ＲＦＬＰによる方法はＳａｌｉｂａ−Ｃｏｌｏｍｂａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）に記載されている。Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ  Ｍｏｓｐｏｍｏｒｉｓｔ（ポティウイルス感受性）とＬ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ  ＰＩ２４７０８７（ポティウイルス抵抗性）との間の多型性のスクリーニングは、三つの制限酵素（ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＸｂａＩ）と前もってトマトでマッピングしたＲＦＬＰマーカー（ＣＴ、トマトの表皮組織のｍＲＮＡに由来したトマトｃＤＮＡ；ＴＧ、トマトゲノムＤＮＡのクローン；クロロフィルａ／ｂ結合ポリペプチドをコードするＣＡＢ３プローブ、Ｔａｎｋｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）を用いる。このスクリーニングで別のマーカーを３番染色体にマッピングすることができる。
【０１７５】
分子マーカー（ＡＦＬＰ、ＲＦＬＰ）と抵抗性のデータについての分離比分析は、Ｍａｐｍａｋｅｒ／Ｅｘｐ  ｖ．３．０ソフトウェアを用いて行い、その際、最小のＬｏｄは４．０で、最大の組換えパーセンテージは０．３である。そして、組換えパーセンテージをＫｏｓａｍｂｉの地図作成関数（Ｋｏｓａｍｂｉ，１９４４）を用いて、センチモルガン（ｃＭ）での地図上の距離に変換する。
【０１７６】
これらの結果により、トマトのＰＶＹ抵抗性についてのｐｏｔ−１遺伝子を、３番染色体上に位置決定することができ、この遺伝子がトウガラシのｐｖｒ２遺伝子座のように、同じＲＦＬＰマーカーに隣接していることを示すことを可能にする。
【０１７７】
ｂ−トマトでのｅＩＦ４Ｅのマッピング
【０１７８】
並行して、トマトｅＩＦ４ＥのｃＤＮＡを、Ｌ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉをＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍに遺伝子浸透して得た系統について、上述したＲＦＬＰ法を用いてマッピングした（Ｅｓｈｅｄ  ａｎｄ  Ｚａｍｉｒ，１９９５）。この作業は、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の５つのコピーを位置決定することを可能にする。これらのコピーの一つが３番染色体上のｐｏｔ−１遺伝子と同じゲノム領域に位置決定され、このように、トウガラシとトマトの間のポティウイルス抵抗性にシンテニーがあること、つまりは、抵抗性を選別するマーカーおよびツールとしてｅＩＦ４Ｅが使えることが確認された。
【０１７９】
ポティウイルス抵抗性の劣性遺伝子についてトウガラシとトマトの間にシンテニーがあることが明らかになったため、ｅＩＦ４Ｅがトウガラシにおいて抵抗性遺伝子であれば、ｅＩＦ４Ｅはトマトにおいても抵抗性遺伝子であるといってよい。
【０１８０】
ｃ−ポティウイルス抵抗性に関与するトマトｅＩＦ４Ｅ遺伝子のクローニング
【０１８１】
トウガラシから単離したものと類似したトマトｅＩＦ４Ｅ遺伝子のｃＤＮＡを、実施例１で説明した３’および５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ法に従ってトマトから分離し、クローニングした；この遺伝子をｅＩＦ４Ｅ−２と名付けた。
【０１８２】
この遺伝子（ＰＶＹおよびＴＥＶに感受性のある、Ｌ．Ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍの変種“Ｍｏｓｐｏｍｏｒｉｓｔ”）のコード配列を、配列表に参照番号ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で示す。
【０１８３】
従来のシークエンシング法により、（ＰＶＹおよびＴＥＶに感受性がある）Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ“Ｍｏｓｐｏｍｏｒｉｓｔ”およびＬ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ  Ｐ１１３４４１７のトマト遺伝子型のｅＩＦ４Ｅ−２遺伝子と（ＰＶＹおよびＴＥＶに抵抗性があり、その抵抗性はｐｏｔ−１劣性遺伝子に制御されている）Ｌ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ  ＰＩ２４７０８７遺伝子型のｅＩＦ４Ｅ−２遺伝子との間の点突然変異が明らかとなった。
【０１８４】
配列のアラインメントを図４に示す。
説明：Ｍｏｓｐｏ＝Ｍｏｓｐｏｍｏｒｉｓｔ；ＰＩ１３＝ＰＩ１３４４１７；ＰＩ２４＝ＰＩ２４７０８７
太字で下線付き：ＰＩ２４７０８７でのみ観察される突然変異；太字で下線無し：Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍとＬ．ｈｉｒｓｕｔｕｍの種間突然変異。
Ｌ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ  ＰＩ１３４４１７のｅＩＦ４Ｅタンパク質とＬ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ  ＰＩ２４７０８７のそれもまた配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３で示される。
【実施例６】
【０１８５】
Ｙｏｌｏ  Ｗｏｎｄｅｒ遺伝子型のｅＩＦ４Ｅコード配列に規定されるプライマーによるトウガラシゲノムＢＡＣライブラリーのスクリーニング、抵抗性との共分離の実証およびｐｖｒ２と共分離するｅＩＦ４Ｅ遺伝子のゲノム構造の決定。
【０１８６】
トウガラシＢＡＣライブラリーは、Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ  Ｙｏｌｏ  ＷｏｎｄｅｒとＣ．ａｎｎｕｕｍ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌとの間の交配による雑種Ｆ１に由来する、半数体倍加系統ＨＤ２０８から構成した。ＨＤ２０８は、感受性の優性対立遺伝子ｐｖｒ２＋を含んでいる。
【０１８７】
高分子量のＤＮＡ抽出は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｇｒ．ｏｒｇ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｊａｇ／ｐａｐｅｒｓ００／ｐａｐｅｒ３００／ｉｎｄｅｘｐａｇｅ３００．ｈｔｍｌに記載された方法で行った。ＤＮＡをつぎに部分的且つ別々に三つの制限酵素（ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）で消化し、それにより、そのゲノム全体の代表性を増大させた。消化したＤＮＡをベクターｐＣＵＧＩＢＡＣＩにクローニングした。
【０１８８】
トウガラシＢＡＣライブラリーを構成する２３９２３２個のクローンのインサートの平均サイズは１２５ｋｂであり、これは１０ゲノム相当の理論的代表性に対応している（トウガラシのゲノムサイズ３０００Ｍｂｐ）。このＢＡＣライブラリーを、ＰＣＲによるスクリーニングのために、６２３個のＤＮＡプールに構成する（一つのプールは３８４個のクローンのＤＮＡ混合物に対応する）。
【０１８９】
以下のプライマーを、Ｙｏｌｏ  ＷｏｎｄｅｒのｅＩＦ４Ｅのコード配列に規定した：
・Ｐｉｍ１：５’ＡＧＡ  ＣＴＴ  ＴＣＡ  ＴＴＧ  ＴＴＴ  ＣＡＡ  ＧＣＡ  ＴＡＡ３’＝ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０
・Ｐｉｍ４：５’ＧＡＴ  ＴＡＧ  ＡＡＡ  ＧＴＧ  ＣＡＡ  ＡＣＡ  ＣＣＡ  ＡＴＡ  Ｃ３’＝ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１
【０１９０】
この一対のプライマーで増幅されるのは、ｃＤＮＡでは４９３ｂｐのバンドであり、そしてＨＤ２０８のゲノムＤＮＡでは１８００ｂｐのバンドである。この一対のプライマーを用いてトウガラシのＢＡＣライブラリーをスクリーニングした。四つのＢＡＣクローンが１８００ｂｐのバンドを有することが識別された（クローン２７−ＢＩ、５−２Ｈ、１１１−４Ｈおよび１８４−４Ｈ）。
【０１９１】
これら四つのＢＡＣクローンをＥｃｏＲＩで消化したところ、制限消化特性は、それらがオーバーラップし、同一の遺伝子座に対応することを示している。全てのＢＡＣクローンが、ベクターｐＧＥＭ３Ｚｆにクローニングした７ｋｂのＥｃｏＲＩバンドを示している。ＥｃｏＲＩで消化して得られたこの７ｋｂのバンドは、ポティウイルス抵抗性と共分離するものに対応している（実施例３参照）。
【０１９２】
（１＝クローン２７−ＢＩ；２＝クローン５−２Ｈ；３＝クローン１１１−４Ｈ；４＝クローン１８４−４Ｈ）
【０１９３】
この７ｋｂの断片の中に１８００ｂｐの増幅産物が存在することにより、これら四つのＢＡＣクローンが有するｅＩＦ４Ｅ遺伝子がクローニングされたｃＤＮＡに対応していることが確認される。この７ｋｂのインサートのシークエンシングにより、５５００ｂｐという遺伝子のサイズ、そしてエクソン／イントロン構造：５つのエクソンと４つのイントロンを明らかにすることが可能となる。
【実施例７】
【０１９４】
ポティウイルス感受性におけるｅＩＦ４Ｅの役割を検証する、（ｐｖｒ２１対立遺伝子を有する）抵抗性のトウガラシの遺伝子型におけるＹｏｌｏ  ＷｏｎｄｅｒのｅＩＦ４Ｅ  ｃＤＮＡの一過的発現の実験
【０１９５】
ｐｖｒ２＋感受性対立遺伝子がＹｏｌｏ  ＷｏｎｄｅｒのｅＩＦ４Ｅ遺伝子に対応しているという仮説の有効性を立証するために、ＰＶＸ（ポテトウイルスＸ）のウイルスベクター（Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）を介したＹｏｌｏ  ＷｏｎｄｅｒのｅＩＦ４ＥのｃＤＮＡの一過的発現の実験を、ｐｖｒ２1対立遺伝子を有するＹｏｌｏ  Ｙの抵抗性遺伝子型で行う。
【０１９６】
Ｙｏｌｏ  Ｗｏｎｄｅｒの感受性遺伝子型に由来するｅＩＦ４ＥのｃＤＮＡを、発現ベクターＰＶＸ−ＣＥＳ−３５Ｓのクローニング部位ＣｌａＩおよびＳａｌＩに、正しい方向で、クローニングする。
【０１９７】
Ｙｏｌｏ  Ｙの抵抗性遺伝子型（ｐｖｒ２1対立遺伝子を有する）に、この組換えプラスミドとポテトウイルスＹ（ＰＶＹ）病原型０の両方を接種する。組換えベクターＰＶＸを介したＹｏｌｏ  Ｗｏｎｄｅｒの感受性遺伝子型に由来するｅＩＦ４Ｅ遺伝子の一過的発現により、ＰＶＹが抵抗性遺伝子型で増殖することが可能になる。ＰＶＹを、ＥＬＩＳＡ法またはＲＴ−ＰＣＲ法で検出する（Ｌｅｇｎａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，１９９６，Ｄｏｇｉｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【０１９８】
組換えプラスミドを受け取ったＣ．ａｎｎｕｕｍ  Ｙｏｌｏ  ＷｏｎｄｅｒとＹｏｌｏ  Ｙの二つの遺伝子型は、ＰＶＹに感受性を有する：接種した葉と植物全体の葉のウイルスを、接種十日後にＥＬＩＳＡ法とＲＴ−ＰＣＲ法で検出する。
【０１９９】
同様に、どちらもＴＥＶ（タバコエッチルウイルス）に感受性のあるＹｏｌｏ  ＷｏｎｄｅｒとＹｏｌｏ  Ｙに由来するｅＩＦ４Ｅ対立遺伝子を、ＴＥＶ抵抗性のトウガラシの遺伝子型において発現させた：Ｆｌｏｒｉｄａ  ＶＲ２。この発現により、このような抵抗性のある親においても（ＥＬＩＳＡ法とＲＴ−ＰＣＲ法で検出される）ＴＥＶの増殖が可能になることが観察される。
【０２００】
変種Ｍｏｓｐｏｍｏｒｉｓｔ（感受性対立遺伝子ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を有する）から得たトマトｅＩＦ４Ｅ−２のｃＤＮＡもまた、同じプロトコールに従ってＹｏｌｏ  Ｙ抵抗性トウガラシ遺伝子型で発現させた。
【０２０１】
トマトｅＩＦ４Ｅ−２のｃＤＮＡを発現するＹｏｌｏ  ＹトウガラシのＰＶＹに対する感受性の回復もまた観察された。
【０２０２】
これらの結果は、様々なポティウイルスへの感受性にｅＩＦ４Ｅが関わっていることを裏付けるものであり、更に、このシステムが異種で機能することを示している（トウガラシで機能するトマト遺伝子）。
【実施例８】
【０２０３】
ポティウイルス抵抗性植物を作るための、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子およびＲＮＡ翻訳開始複合体遺伝子における突然変異の検索
【０２０４】
ｅＩＦ４Ｅ多重遺伝子族のメンバーは、真核生物翻訳開始複合体を形成する少なくとも８つのタンパク質からなる複合体に属しうる（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ  １９９６）。
【０２０５】
ポティウイルス抵抗性植物を作るために、ｅＩＦ４Ｅおよび翻訳開始複合体の他の遺伝子における突然変異体の識別と解析を、４つの手順で進め、ＴＩＬＬＩＮＧシステムを用いる（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｌｏｃａｌ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  ＩＮ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，ＭｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）：
【０２０６】
（１）化学的突然変異誘発によるトマトの突然変異体を集める。そこで選んだ遺伝子型は、ミニトマト、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ  Ｍｉｃｒｏｔｏｍであり、その生物学的特徴は興味深い（Ｍｅｉｓｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０００）：ポティウイルス（ＰＶＹ、ＴＥＶおよびＰＶＭＶ）に感受性があり、高密度（平方メートルあたり１０００植物体／ｍ2）で成育するものであり、世代時間は３から４カ月である。突然変異は、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）での化学的突然変異誘発で得られる（Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２）：３００００粒の種への突然変異誘発、突然変異体の播種および５０００のＭ１植物からのＭ２世代の生産。
【０２０７】
（２）Ｍ２ファミリーの２０の植物体からのＤＮＡ抽出および１０００００のＭ２植物体（５０００ファミリー）の個体群からの三次元ＤＮＡプールの構成。
【０２０８】
（３）標的遺伝子のＰＣＲ増幅および変性ＨＰＬＣ法による突然変異の検索。翻訳開始複合体に関与する遺伝子配列はｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｄｂ／ｌｇｉ．で入手可能である。ＰＣＲ産物をつぎに変性し対合させて、ヘテロ二本鎖の形成を可能にする。つぎに突然変異を、変性ＨＰＬＣ法（ＭｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）やヘテロ二本鎖における「ミスマッチ」の検出を可能にする酵素（ＣＥＬ１酵素、Ｏｌｅｙｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）を用いて検出する。
【０２０９】
（４）ポティウイルスに対する反応を評価する為の突然変異体の解析：感受性表現型から抵抗性表現型への変更。ポティウイルス（ジャガイモウイルスＹ、タバコエッチウイルス、ピーマン葉脈斑紋ウイルス）の接種と検出の手順は、実施例３で説明したものと同じである。
【実施例９】
【０２１０】
遺伝子導入を伴ってもよい方法によるポティウイルス抵抗性植物の作成
【０２１１】
実施例８に代わるものとして、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の抵抗性対立遺伝子（ここではトウガラシで識別された）またはポティウイルス抵抗性（実施例１から８に基づいて識別される）を付与する他の全てのｅＩＦ４Ｅ対立遺伝子を、部位特異的突然変異誘発（Ｈｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、相同組換え（Ｋｅｍｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）のような方法や、過剰発現の方法により、ｉｎ  ｐｌａｎｔａで導入することができる。過剰発現の実験において、抵抗性を付与するｅＩＦ４Ｅ対立遺伝子を、ｉｎ  ｐｌａｎｔａでの遺伝子導入により、ＣａＭＶウイルス３５Ｓタイプの強力なプロモーターの制御下で発現させる（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｂｅｖａｎ  １９８４）。
【０２１２】
抵抗性植物の作成は、遺伝子サイレンシングのようなタイプの方法による内因性ｅＩＦ４Ｅ遺伝子のノックアウト（転写後遺伝子サイレンシング（Ｐｏｓｔ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｎａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ））により、そして遺伝子導入によるポティウイルス抵抗性を付与するｅＩＦ４Ｅの形態の同時発現によってもまた可能である。ＰＴＧＳによる特異的なノックアウトは、それを内因性ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の５’ＵＴＲと逆の方向にすることにより実施可能である；遺伝子導入により発現する抵抗性を付与するｅＩＦ４Ｅの形態は、内因性ｅＩＦ４Ｅの５’ＵＴＲを有していない。ＰＴＧＳによる５’ＵＴＲに対するノックアウトのこのような特異性は、ＰＴＧＳのメカニズムを理解することによる新しいデータに基づくものである（Ｎｉｓｈｉｋｕｒａ  ２００１）。
【図面の簡単な説明】
【０２１３】
【図１】サザンブロット分析によるゲルを示した図。
【図２】ｅＩＦ４Ｅ遺伝子のＰＣＲ増幅を示した図。
【図３】ｅＩＦ４Ｅタンパク質配列のアラインメント。
【０２１４】
参考文献一覧
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Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８．Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．１１：１２４−１３０
Ｋｅｍｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  ３８９，８０２−８０３
Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５
Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２．Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．９３：１０９．１２３
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【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図３】
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【国際調査報告】
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