(57)【要約】遺伝子もしくは細胞療法レジメンのために適した植え込み可能または挿入可能な医療用デバイス、並びにそれを作製および使用する方法が開示される。本医療用デバイスは遺伝物質を運ぶ生体適合性構造を含む。該生体適合性構造は、少なくともその構造の一部分を被覆するポリマーコーティングを含む。該遺伝物質は、治療的有効量の、第１ポリヌクレオチドによってコードされる一種以上の産物を産生させるために十分な遺伝子発現を確立する第１ポリヌクレオチド配列を含むベクターを含有する第１治療薬、および（ｉ）担体によって運ばれる第２ポリヌクレオチド；（ｉｉ）タンパク質；（ｉｉｉ）非遺伝的治療薬；または（ｉｖ）細胞の内の少なくとも一つを備える第２治療薬を含んでいる。本発明の医療用デバイスおよび方法は、患者の身体内での一種以上の遺伝産物および非遺伝産物の長期発現の良好な組み込みを容易にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝物質を運ぶ生体適合性構造を含有する医療用デバイスであって、前記生体適合性構造が前記構造の少なくとも一部分を被覆するポリマーコーティングを備えており、前記遺伝物質が：
（ａ）治療的有効量の、第１ポリヌクレオチドによってコードされる一種以上の産物を産生するために十分な遺伝子発現を確立する前記第１ポリヌクレオチドを含有するベクターを含んでいる第１治療薬；と
（ｂ）（ｉ）担体によって運ばれる第２ポリヌクレオチド；（ｉｉ）タンパク質；（ｉｉｉ）非遺伝的治療薬、または（ｉｖ）細胞の少なくとも一つを含有する第２治療薬
とを含む医療用デバイス。
【請求項２】
前記第２治療薬が前記第２ポリヌクレオチドであり、前記ベクターが遅延遺伝子発現を確立し、さらに前記担体が初期遺伝子発現を確立する、請求項１記載の医療用デバイス。
【請求項３】
前記ベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１記載の医療用デバイス。
【請求項４】
前記担体がウイルスベクター、プラスミドベクター、非プラスミドベクター、またはそれらの組み合わせである、請求項１記載の医療用デバイス。
【請求項５】
前記担体が裸の核酸分子を運ぶ、請求項１記載の医療用デバイス。
【請求項６】
前記非プラスミドベクターがリポソーム類、リポフェクチン、リポプレックス類、ポリプレックス類、デキストラン類、スターバースト、デンドリマー結合体類、ポリベンレンジメチルスルホキシド、硫酸プロタミン、抗体結合体類、ポリリシン結合体類、グラマシジンＳ、人工結合体類、ウイルスエンベロープ類、ウイルス状粒子類、ナノもしくはミクロ粒子類、またはそれらの組み合わせを含んでいる、請求項４記載の医療用デバイス。
【請求項７】
前記第１ポリヌクレオチドおよび前記第２ポリヌクレオチドが同一である、請求項１記載の医療用デバイス。
【請求項８】
前記ベクター、前記担体、またはそれらの両方が部位特異的である、請求項１記載の医療用デバイス。
【請求項９】
前記第１ポリヌクレオチド、前記第２ポリヌクレオチド、またはそれらの両方が：一酸化窒素シンターゼ；ヒト線維芽細胞増殖因子；血管内皮増殖因子；組織プラスミノーゲンアクチベーター；抗血栓形成薬；エリスロポイエチン；抗酸化物質類；血管新生および抗血管新生薬；平滑筋細胞増殖を阻害する物質類；アンギオペプチン；平滑筋細胞増殖を遮断できるモノクローナル抗体類；抗炎症薬類；カルシウム流入阻害薬類；抗新生腫瘍／抗増殖／抗細胞分裂薬類；抗凝固薬類；アンチトロンビン化合物類；血小板受容体拮抗薬類；アンチトロンビン抗体類；抗血小板受容体抗体類；プロスタグランジン阻害薬類；血小板阻害薬類；血管細胞増殖プロモーター類；転写アクチベーター類；翻訳プロモーター類；血管細胞増殖阻害薬類；増殖因子受容体拮抗薬類；転写リプレッサー類；翻訳リプレッサー類；または複製阻害薬類
からなる群から選択される一種以上の産物をコードする、請求項１記載の医療用デバイス。
【請求項１０】
前記ベクターがウイルスベクターを含んでいる、請求項１記載の医療用デバイス。
【請求項１１】
前記ベクターが熱安定性、複製不全、非免疫原性、またはそれらの組み合わせである、請求項１０記載の医療用デバイス。
【請求項１２】
前記発現が前記遺伝物質に曝露された
細胞の約２０％〜約８０％において達成される、請求項１記載の医療用デバイス。
【請求項１３】
前記遅延発現がｉｎ  ｖｉｖｏ適用の約２日間〜約３週間遅延した発現である、請求項２記載の医療用デバイス。
【請求項１４】
前記ベクター、前記担体、またはそれらの両方が調節配列を含有している、請求項１記載の医療用デバイス。
【請求項１５】
前記細胞がトランスフェクトされた、形質転換された、または形質導入された細胞である、請求項１記載の医療用デバイス。
【請求項１６】
前記細胞が自家細胞である、請求項１５記載の医療用デバイス。
【請求項１７】
前記生体適合性コーティングがポリウレタン、シリコーン、ＥＶＡ、ポリ−Ｌ−乳酸（ＰＬＬＡ）／ポリε−カプロラクトン（ＰＣＬ）混合物類、またはそれらの組み合わせを含んでいる、請求項１記載の医療用デバイス。
【請求項１８】
前記ポリマーコーティングがコーティング層当たり約１〜１０μｍの肉厚を有する約１〜約４０層である、請求項１記載の医療用デバイス。
【請求項１９】
前記構造がステントである、請求項１記載の医療用デバイス。
【請求項２０】
前記ステントがメタリックステントである、請求項１９記載の医療用デバイス。
【請求項２１】
前記ステントが脂肪族ポリエステル混合物類から作られたコイルスプリングである、請求項１９記載の医療用デバイス。
【請求項２２】
前記ステントが脂肪族ポリエステル混合物類から作られたマイクロポーラスチューブである、請求項１９記載の医療用デバイス。
【請求項２３】
前記第１治療薬および前記第２治療薬が前記ポリマーコーティングの同一層に適用されている、または層内に含浸されている、請求項１記載の医療用デバイス。
【請求項２４】
患者において再狭窄を防止もしくは治療する方法であって、前記方法が前記患者の体内の規定部位で請求項１記載のデバイスを適用することを含有する方法。
【請求項２５】
前記部位が血管形成術によるアテローム硬化性病変の治療によって生じた動脈壁への機械的傷害の部位である、請求項２３記載の医療用デバイス。
【請求項２６】
哺乳類の身体への遺伝物質の制御された送達方法であって：
（Ａ）医療用デバイスの少なくとも一部分へポリマーコーティングを適用するステップと；
（Ｂ）遺伝学的に被覆された医療用デバイスを入手するために遺伝物質を前記ポリマーコーティングへ適用するステップであって、前記遺伝物質が：（ａ）治療的有効量の、前記第１ポリヌクレオチドによってコードされる一種以上の産物を産生するために十分な遺伝子発現を確立する前記第１ポリヌクレオチドを含有するベクターを含んでいる第１治療薬；および（ｂ）（ｉ）担体によって運ばれる第２ポリヌクレオチド；（ｉｉ）タンパク質；（ｉｉｉ）非遺伝的治療薬、または（ｉｖ）細胞の内少なくとも一つを含んでいる第２治療薬を備えるステップと；
（Ｃ）前記哺乳類中の規定部位で前記遺伝学的に被覆された医療用デバイスを挿入する、もしくは植え込むステップ
とを含む方法。
【請求項２７】
前記ベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記担体がウイルスベクター、プラスミドベクター、非プラスミドベクター、またはそれらの組み合わせである、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
前記担体が裸の核酸分子を含んでいる、請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
前記非プラスミドベクターがリポソーム類、リポフェクチン、リポプレックス類、ポリプレックス類、デキストラン類、スターバースト、デンドリマー結合体類、ポリベンレンジメチルスルホキシド、硫酸プロタミン、抗体結合体類、ポリリシン結合体類、グラマシジンＳ、人工結合体類、ウイルスエンベロープ類、ウイルス状粒子類、ナノもしくはミクロ粒子類、またはそれらの組み合わせを含んでいる請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
前記第１ポリヌクレオチドおよび前記第２ポリヌクレオチドが同一である、請求項２６記載の方法。
【請求項３２】
前記ベクター、前記担体、またはそれれらの両方が部位特異的である、請求項２６記載の方法。
【請求項３３】
前記第１治療薬、前記第２治療薬、またはそれらの両方が：一酸化窒素シンターゼ；ヒト線維芽細胞増殖因子；血管内皮増殖因子；組織プラスミノーゲンアクチベーター；抗血栓形成薬；エリスロポイエチン；抗酸化物質類；血管新生および抗血管新生薬；平滑筋細胞増殖を阻害する物質類；アンギオペプチン；平滑筋細胞増殖を遮断できるモノクローナル抗体類；抗炎症薬類；カルシウム流入阻害薬類；抗新生腫瘍／抗増殖／抗細胞分裂薬類；抗凝固薬類；アンチトロンビン化合物類；血小板受容体拮抗薬類；アンチトロンビン抗体類；抗血小板受容体抗体類；プロスタグランジン阻害薬類；血小板阻害薬類；血管細胞増殖プロモーター類；転写アクチベーター類；翻訳プロモーター類；血管細胞増殖阻害薬類；増殖因子受容体拮抗薬類；転写リプレッサー類；翻訳リプレッサー類；複製阻害薬類、またはそれらの組み合わせ
からなる群から選択される一種以上の産物の産生を惹起する、請求項２６記載の方法。
【請求項３４】
前記ベクターがウイルスベクターを含んでいる、請求項２６記載の方法。
【請求項３５】
前記ベクターが熱安定性、複製不全、非免疫原性、またはそれらの組み合わせである、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記発現が前記遺伝物質に曝露された細胞の約２０％〜約８０％において達成される、請求項２６記載の方法。
【請求項３７】
前記ベクターが遅延発現であり、前記担体が初期発現担体である、請求項２６記載の方法。
【請求項３８】
前記遅延発現がｉｎ  ｖｉｖｏ適用の約２日間〜約３週間遅延した発現である、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記ベクター、前記担体、またはそれらの両方が調節配列を含有している、請求項２６記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞がトランスフェクトされた、形質転換された、または形質導入された細胞である、請求項２６記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞が自家細胞である、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記コーティングがポリウレタン、シリコーン、ＥＶＡ、ポリ−Ｌ−乳酸（ＰＬＬＡ）／ポリε−カプロラクトン（ＰＣＬ）混合物類、またはそれらの組み合わせを含んでいる、請求項２６記載の方法。
【請求項４３】
前記ポリマーコーティングがコーティング層当たり約１〜１０μｍの肉厚を有する約１〜約４０層である、請求項２６記載の方法。
【請求項４４】
前記構造がステントである、請求項２６記載の方法。
【請求項４５】
前記ステントが脂肪族ポリエステル混合物類から作られたコイルスプリングである、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記ステントが脂肪族ポリエステル混合物類から作られたマイクロポーラスチューブである、請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
前記ステントがメタリックステントである、請求項４４記載の方法。
【請求項４８】
前記第１治療薬および前記第２治療薬が前記ポリマーコーティングの同一層に適用されている、または層内に含浸されている、請求項２６記載の方法。
【請求項４９】
前記治療薬がタンパク質である、請求項２６記載の方法。
【請求項５０】
前記治療薬が小分子である、請求項２６記載の方法。
【請求項５１】
前記治療薬が非タンパク質性薬である、請求項２６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、患者の体内において一種以上の産物および治療薬を制御して送達して長期発現させるための方法および医療用デバイスに関する。詳細には、本発明は、遺伝物質が挿入可能もしくは植え込み可能な医療用デバイスの表面上に被覆され、患者の体内の標的位置へ送達される遺伝子療法もしくは細胞療法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
遺伝子療法は、数多くの難治性心血管疾患と闘うための魅力的なアプローチを提供する。先行技術遺伝子療法レジメンには、臨床状況においてこの療法の適用を失敗させる幾つかの制限事項が付随している。このシステムのｉｎ  ｖｉｖｏ療法が不成功に終わる原因となる数種の要素には、特に治療用遺伝子産物の短期発現、低レベルの遺伝子発現、および部位特異性の欠如が含まれる。宿主ゲノム内への適切な組込みの欠如、または免疫反応による導入遺伝子もしくは担体ベクターの拒絶は、特に遺伝子産物の短期間および低レベルの発現の原因となる数種の要素である。
【０００３】
インターベンショナルラディオロジーにおける進歩並びにバルーン血管形成術およびステント術における革新的デザインは、遺伝子療法および細胞療法レジメンの治療可能性を高めてきた。薬物の長期送達は、薬物のｉｎ  ｖｉｖｏでの持続性かつ局所的送達を通して達成されてきた。従来型局所的薬物投与にとって考えられる一つの短所は、それによって薬物もしくは薬液が送達デバイスから放出される方法が制御不能な点である。しばしば、薬物が放出される全期間を制御および／または延長することが必要になる。例えば、放出時間を数時間から数日間または数週間にさえ延長させることは有益な可能性がある。ステントのような植え込まれたデバイスから薬物が放出される場合には、数ヵ月間という特に長い放出期間がしばしば望ましい。
【０００４】
従来型薬物送達デバイスの治療的使用は、さらに血管壁への外傷増加、薬物の急速なウォッシュアウト、単一作用機序を有する治療薬の使用その他に関連する問題によって制限されている。この主題に関するより包括的な概観については、例えば下記を参照されたい：「内皮傷害後の平滑筋増殖へ制御された外膜ヘパリン送達が及ぼす作用」，Ｅｄｅｌｍａｎ  Ｅ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：３７７３，１９９０；「全身性抗凝固療法を使用せずに内皮傷害後の内膜増殖を阻害する血管周囲ヘパリンの局所的放出」，Ｏｋａｄａ  Ｔ．ら，Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，２５：８９２，１９８９；「イオントフォレーゼによる経心筋的薬物送達：抗不整脈薬療法にとっての新規アプローチ」，Ａｖｉｔａｌｌ  Ｂ．ら，ＣＩＲＣ，８５：１５８２，１９９２；カテーテルを通しての微粒子の直接的な動脈壁内注射：血管形成術後の潜在的薬物送達戦略）”，Ｗｉｌｉｎｓｋｙ  Ｒ．ら，Ａｍｅｒ．Ｈｅａｒｔ  Ｊ．，１２２：１１３６，１９９１；および「ポリマーヘパリン送達システムを使用した全身性作用を伴わない局所的抗凝固」，Ｏｋａｄａ  Ｔ．ら，Ｓｔｒｏｋｅ，１９：１４７０，１９８８。
【０００５】
治療的遺伝子産物のｉｎ  ｖｉｖｏの部位特異性および長期発現を達成するための一つの方法は、裸のＤＮＡもしくはプラスミドＤＮＡの形でのデバイスコーティング内への遺伝物質の取り込みである。しかし、裸のＤＮＡもしくはプラスミドＤＮＡの形質転換効率は、脂質担体もしくはウイルスベクター類によって送達されるＤＮＡに比較して極めて低い。ウイルスベクター類は外来遺伝子を細胞内へ導入する極めて効率的な手段を提供する。残念なことに、ウイルスベクター類は通常は極めて易変性であるので、従って活性を失わずにコーティングプロセスに抵抗することができない。そこで、デバイスコーティング内へのウイルス粒子の組み込みは、その現在の形状では実現可能であるとは思われない。
【０００６】
科学的文献における数例の報告書は、組換えウイルスベクターが血管内皮細胞および平滑筋細胞を含む身体組織内への外来遺伝子の効率的な転移を促進することを指摘している。治療を目的とする初期の戦略は、患者の身体内への形質転換細胞を含有するデバイスの配置による遺伝子導入に基づいていた。細胞培養の必要を未然に回避する標的細胞集団への直接遺伝子導入のコンセプトは、カテーテルを使用する遺伝子送達システムの開発を促進してきた。数種のプロトタイプシステムは、結果として外来遺伝子の発現を生じさせる血管壁へのウイルスベクター類のｉｎ  ｖｉｖｏ送達を証明したが、現在利用可能なシステムは送達されるウイルスの量および感染性、送達中の血管壁への外傷、および送達中の血流の妨害によって制限される。
【０００７】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ユニークな特徴を備えたウイルス粒子である。このウイルスは溶媒および熱安定性であるので、デバイスコーティング内にウイルスを組み込むために必要な処理条件に抵抗できる。さらにその上、このウイルスは活性を消失することなく数ヵ月間に渡って室温で貯蔵できる。遺伝子をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで導入するためのアデノ随伴ウイルスベクター類に由来するベクター類の使用については記載されている（特に、各々が参照してここに組み込まれる米国特許第４，７９７，３６８号、第５，１３９，９４１号および第５，８５１，５２１号を参照）。これらの特許は、その中でレプリカーゼ（ｒｅｐ）またはキャップ遺伝子が欠失して所定の遺伝子に置換されている様々なアデノ随伴ウイルス由来構造体を記載している。
【０００８】
遺伝子のアデノ随伴ウイルス送達の欠点は、タンパク質発現の開始が細胞内への導入から約２週間遅延することである。再狭窄のような増殖性疾患の治療には、一般におそらくデバイス植え込み約３日後にピークとなり、通例は２週間後までに弱まる増殖性反応を達成させるために即時のタンパク質発現を必要とするであろう。
【０００９】
ここに開示されて記載される本発明は、先行技術遺伝子送達および薬物送達システムの上記の制限事項を克服する。本発明のデバイスは、ｉｎ  ｖｉｖｏで制御された安定的な方法で所定のポリヌクレオチド配列の送達を容易にする。挿入可能または植え込み可能な先行技術医療用デバイスに関連する機械的問題は、ここに記載する発明によって、デバイスの多孔性および水和能力の制御を許容し、適正な引張強さを提供できるポリマーコーティングの使用を通して克服された。コーティングプロセス中の安定性、部位特異性およびｉｎ  ｖｉｖｏのポリヌクレオチド配列の発現の安定性に関連する先行技術問題を克服する新規遺伝子療法レジメンを開示する。
【００１０】
これらの特徴、およびここに開示する幾つかのその他の特徴は、遺伝子および細胞療法を含む様々な治療方法にとって本発明の医療用デバイスを望ましいものにする。
【００１１】
（発明の概要）
本発明のある態様では、遺伝物質を運ぶ生体適合性構造を有する医療用デバイスが提供される。生体適合性構造は、その構造の少なくとも一部分を被覆して遺伝物質を運ぶ生体適合性ポリマーコーティングを含んでいる。遺伝物質は、（ａ）治療的有効量の、第１ポリヌクレオチドによってコードされる一種以上の産物を産生するために十分な遺伝子発現を確立する前記第１ポリヌクレオチドを含有するベクターを含んでいる第１治療薬；および（ｂ）（ｉ）担体によって運ばれる第２ポリヌクレオチド；（ｉｉ）タンパク質；（ｉｉｉ）非遺伝的治療薬、または（ｉｖ）細胞の少なくとも一つを含有する第２治療薬を含んでいる。
【００１２】
本発明の遺伝学的に被覆された医療用デバイスは、好ましくはステント、カテーテルもしくはそれらの組み合わせを含んでいる。本発明のより好ましい実施形態では、本発明の医療用デバイスもしくは構造は生体安定性もしくは生分解性物質を含む生体適合性物質から構成されたステントを含んでいる。より好ましくは、ステントはメタリックステントである。このステントはあらゆる形状で、保管中および／または植え込み後にチューブ状もしくは螺旋形デバイスの全部もしくは一部を開いた、拡張した、コイル状もしくはチューブ状の形態で維持するために適したあらゆる生体適合性材料から作られている。ステントのために適切な生体適合性材料には、ステンレススチール、ニッケル、銀、白金、金、チタン、イリジウム、タングステン、Ｎｉ−Ｔｉ合金（即ち、ナイチノール）、インコネル、ポリ−Ｌ−乳酸（ＰＬＬＡ）／ポリε−カプロラクトン（ＰＣＬ）混合物等が含まれるが、それらに限定されない。
【００１３】
本発明の別の態様に従うと、被験者、好ましくは哺乳類において、その被験者に身体の規定の部位に本発明の医療用デバイスを適用することによって再狭窄を阻害もしくは治療する方法が提供される。適用部位は、好ましくは血管形成術におけるアテローム硬化性病変の治療によって生じた動脈壁への機械的傷害の部位である。
【００１４】
本発明のまた別の態様では、被験者への遺伝物質の制御された送達方法が提供される。この方法は下記を含んでいる：（Ａ）医療用デバイスの少なくとも一部分へポリマーコーティングを適用するステップ；（Ｂ）遺伝学的に被覆された医療用デバイスを入手するために遺伝物質を前記ポリマーコーティングへ適用するステップであって、前記遺伝物質が（ａ）治療的有効量の、第１ポリヌクレオチドによってコードされる一種以上の産物を産生するために十分な遺伝子発現を確立する前記第１ポリヌクレオチドを含有するベクターを含んでいる第１治療薬；および（ｂ）（ｉ）担体によって運ばれる第２ポリヌクレオチド；（ｉｉ）タンパク質；（ｉｉｉ）非遺伝的治療薬、または（ｉｖ）細胞の少なくとも一つを含有する第２治療薬を含んでいるステップ；および（Ｃ）前記哺乳類中の規定部位で前記遺伝学的に被覆された医療用デバイスを挿入する、もしくは植え込むステップ。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
ここで使用する下記の用語は、次の通りに定義されている：
ここで使用する「裸のポリヌクレオチド」は、ウイルス、プラスミド、もしくはその他の非プラスミドポリヌクレオチド担体内に組み込まれていないあらゆる核酸分子を含んでいる。
【００１６】
ここで使用する「遺伝物質」には、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養のいずれであろうと、形質転換されたもしくは形質転換されていない状態での細菌、ウイルス、原核生物もしくは真核細胞培養；レポーター遺伝子、マーカー遺伝子、調節塩基配列、アンチセンス分子等を含む天然もしくは外来ポリヌクレオチド類、組換えもしくは天然ポリヌクレオチド類を含む本発明の細胞療法もしくは遺伝子療法において使用されるあらゆる生物学的に活性な物質が含まれている。
【００１７】
ここで使用する「産物」には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含むセンスもしくはアンチセンス方向におけるあらゆるタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチドが含まれる。用語タンパク質、ペプチドおよびポリペプチドは、ここでは置き換え可能に使用される。
【００１８】
ここで使用する「治療薬」には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏでの有益な生物学的もしくは医学的反応を誘発するあらゆる化合物、組成物、もしくは小分子が含まれる。治療薬は、例えばあらゆるタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド類、小分子類、抗生物質類、非遺伝的物質類、治療用ポリマー類、細胞類もしくはそれらの組み合わせである。
【００１９】
ここで使用する「医療用デバイス」には、一部であろうと全体であろうと、あらゆる植え込み可能もしくは挿入可能な医療用デバイスが含まれる。
【００２０】
ここで使用する「ステント」には、グラフトを含む身体開口部もしくは体腔を維持もしくは支持するために使用されるあらゆるチューブ状もしくは螺旋形デバイスが含まれる。
【００２１】
ここで使用する「バルーンカテーテル」には、身体内への挿入後にカテーテルを抜去せずに拡張もしくは収縮させることのできる一つのバルーンもしくは複数のバルーンを有するカテーテルが含まれる。
【００２２】
ここで使用する「治療的有効量」は、使用される特定の作用物質または産物の性質および化学組成に基づいて決定される作用物質または産物の有効な量を意味する。
【００２３】
本発明は、患者の血管構造もしくは導管内に遺伝物質を送達するための医療用デバイスおよび方法を記載する。ここで開示する本発明の方法およびデバイスは、患者の身体内での一種以上の産物および治療物質の送達、標的位置、曝露時間、持続時間および量についての制御を提供する。遺伝子の局所的発現は、特に治療が特定器官もしくは部位に向けられていて身体内のその部位の非全身性曝露を必要とする場合に、化学療法薬の使用を含む治療において特に望ましい。本発明に従って、例えばステントもしくは静脈内カテーテルのようなデバイスの使用と組み合わせた遺伝子送達システムは、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏの両方における遺伝子送達の有効なデバイスおよびシステムを提供する。
【００２４】
本発明の医療用デバイスは、例えば食道、気管、結腸、小腸、胆管、尿管、血管系、腎盂、尿道、気管支、膵管系、腸管、鼻涙管、副鼻腔、眼、ファローピウス管等内へのように、身体内へ導入するために適したデバイスである。
【００２５】
詳細には、ここで開示する本発明に従った医療用デバイスは、あらゆる挿入可能もしくは植え込み可能な医療用デバイスである。本発明の医療用デバイスの例としては、制限なく、カテーテル類、ステント類、針穿刺カテーテル、血液クロットフィルター類、血管グラフト類、ステントグラフト類、胆管ステント類、結腸ステント類、気管支／肺ステント類、食道ステント類、尿管ステント類、動脈瘤充填コイル類およびその他の二重コイルデバイス類、経心筋血行再建術（ＴＭＲ）用デバイス類、経皮的心筋血行再建術（ＰＭＲ）デバイス類、皮下注射針類、軟組織クリップ類、保持デバイス類等が挙げられる。
【００２６】
本発明の医療用デバイスは、よく知られた方法によって標的位置に送達される、および／または植え込まれる。送達は、標的位置へ到達する前の遺伝物質の放出を抑制するのに役立つように被覆された医療用デバイスをカバーするシースを用いて任意に実施される。
【００２７】
この医療用デバイスに含まれる構造は様々な方法で構成することができるが、この構造は好ましくは生体安定性もしくは生分解性材料を含む生体適合性材料から構成されたステントとして作られる。より好ましくは、ステントはメタリックステントである。ステントは、あらゆる形状で、保管中および／または植え込み後にチューブ状もしくは二重コイル装置の全部もしくは一部を開いた、拡張した、コイル状もしくはチューブ状形状で維持するために適したあらゆる生体適合性材料から作られる。ステントのために適切な生体適合性材料には、ステンレススチール、ニッケル、銀、白金、金、チタン、イリジウム、タングステン、Ｎｉ−Ｔｉ合金（即ち、ナイチノール）、インコネル、ポリ−Ｌ−乳酸（ＰＬＬＡ）／ポリε−カプロラクトン（ＰＣＬ）混合物等が含まれるが、それらに限定されない。
【００２８】
本発明のある好ましい実施形態では、ステントのような医療用デバイスの外面上に、生分解性かつ吸収性ポリマーが用意される。本発明に従ったここで開示されるステントは、足場デバイスとして機能するために適正な引っ張り強さを提供し、多孔性および水和能力の制御を許容し、さらに望ましい場合には患者の血管壁の細胞上または細胞へ含浸された遺伝物質にとって非毒性である産物に分解する。
【００２９】
本発明の範囲内に含まれるのは、例えば浮遊沈降法もしくは手作業による鋳造／巻き付け法を使用して脂肪族ポリエステル混合物から製造されたマイクロポーラスチューブもしくはコイルスプリングを含むステントである。
【００３０】
本発明と一緒に使用するためのまた別の好ましい医療用デバイスは、バルーンカテーテルと結合して使用されるコーティングステントである。本発明のこの実施形態に従うと、バルーンカテーテルに取り付けられたステントが動脈内に導入される。バルーンを拡張させるとステントが開大し、ステントを治療される動脈の壁内へわずかに押し入れる。バルーンを収縮させると、動脈壁を支えるためにステントがその場所に残される。より好ましくは、ステントはバルーン拡張型のステントもしくは自己拡張型の、即ちその全体が参照してここに組み込まれる米国特許第５，９５４，７０６号に記載されているナイチノールのような超弾性材料を用いて形成されたタイプのステントである。
【００３１】
本発明はまた、身体内もしくは体腔の壁内の所望の位置で遺伝物質を送達するためのカテーテルを含んでいる。このカテーテルは、好ましくはカテーテルシャフト上に取り付けられた拡張可能な部分を有しており、その拡張可能な部分は好ましくは制御された圧力へ、即ち体腔の断面を満たして体腔の壁に押しつけるために拡張可能である。
【００３２】
このデバイス、もしくは少なくともこのデバイスの標的部位と接触する表面の少なくとも一部分は、ポリマーコーティングを用いて被覆されている。医療用デバイスのあらゆる適切な表面はポリマーコーティングを用いて被覆することができる。被覆すべき表面は、この医療用デバイスの中もしくは上に含まれている例えば壁、穴、溝、スロット、平面、上面もしくは内面等を含むことができる。全面が被覆されることは必要ではなく、むしろ単に表面の一部分だけを被覆することができる。例えば、拡張タイプのカテーテルを使用する場合は、拡張可能な部分の外面の少なくとも一部分がポリマーコーティングを用いて被覆される。
【００３３】
本発明のまた別の好ましい実施形態では、医療用デバイスの表面を保護およびカバーし、それが体内の標的位置へ送達するまで経血管もしくは経導管送達中にコーティングからの遺伝物質の放出を防止するポリマーコーティングが提供される。ポリマーコーティングは、好ましくは医療用デバイスからの遺伝物質の放出動態を調節する。
【００３４】
ポリマーコーティングとしては、あらゆる医学的に容認可能な天然もしくは合成ポリマーが使用される。本発明の一つの実施形態に従うと、ポリマーは例えば水溶性、熱分解性もしくは生分解性ポリマー類を含む。本発明のポリマーの例としては、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル類、ポリ乳酸類、ポリ−Ｌ−乳酸（ＰＬＬＡ）／ポリε−カプロラクトン（ＰＣＬ）混合物類、ポリグリコール酸類、カーボワックス、ゼラチン、キトサン、ポリビニルアルコール、酸化ポリエチレン、ポリエチレングリコール、アルブミン、プルロニックゲルＦ−１２７、コラーゲン、アルギン酸塩類、セルロース化合物類、ポリビニルピロリドン、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
【００３５】
さらにまた本発明の範囲内に含まれるのは、治療薬の放出を許容するために十分な多孔性を備えた生体安定性ポリマー類である。形質転換細胞を含む遺伝物質は放出される必要はないが、生体安定性マトリックス放出タンパク質内に捕捉されたままであってよい。
【００３６】
ポリマーコーティングの肉厚は、全層当たり好ましくは約１〜約１，０００μｍ、より好ましくは約１０〜約１００μｍ、および最も好ましくは約５〜約５０μｍである。ポリマーコーティングの層は、約１〜約４０層を形成し、各層は約１〜約１０ｍμｍ／コーティング層の肉厚を有し、医療用デバイスの適切な一つ以上の表面に塗布される。
【００３７】
医療用デバイスのコーティングされた一つ以上の表面が患者の血液、またはその他の身体内の組織や器官と接触すると、遺伝物質は実質的にそこから放出される。ポリマーコーティング、放出部位または予定される特定遺伝子もしくは細胞療法戦略の選択に依存して、医療用デバイスが標的部位へ到達することを許容するための遺伝物質は放出は、直ちにまたは医療用デバイスが標的部位へ到達することを許容するための約１〜数分間の制御された遅延時間（例えば、１、５、１０、２０、３０、６０もしくは９０分間）の経過後に放出される。
【００３８】
本発明の一つの実施形態に従った遺伝物質には、担体と組み合わされたベクターによって運ばれる一種以上のポリヌクレオチド類が含まれる。ベクターおよび担体は各々第１および第２治療薬の各部分である。ベクター、担体、またはそれらの両方は真核細胞もしくは原核細胞を形質転換する、トランスフェクトする、または形質導入するために使用され、その後それらの細胞はコーティングの同一層もしくは相違する層へ塗布もしくは含浸させられる。用語の形質転換、形質導入およびトランスフェクトはここでは置き換え可能に使用される。本発明のある好ましい実施形態では、遺伝物質はトランスフェクトされた細胞を含有している。
【００３９】
形質転換細胞は、移植部位で所定の産物および治療薬を送達する。送達媒体は、細胞の機能および生存能力を保持するための必要に応じて調製される。細胞療法において使用される細胞は、例えば患者から、または哺乳類もしくは非哺乳類起源を含む種々の起源から、および例えば骨髄、血液もしくは特に肝臓を含む様々な組織および器官から引き出される。一般に、細胞はヒト起源（自家もしくは同種）または動物起源（異種）の細胞である。本発明は、広範囲の発生および増殖条件における細胞の使用を含んでいる。例えば、分化細胞、非分化細胞、幹細胞もしくは前駆細胞の使用は、すべて本発明の範囲内に予期されている。所望の場合は、非分化細胞は所望の細胞タイプへ分化させるために化学的もしくは物理的に誘導される。
【００４０】
本発明に従ってここで記載されるベクターは組換えベクターを含んでいる。好ましくは、ベクターはウイルスもしくはプラスミドベクターであり、より好ましくはベクターは複製不全、熱安定性、部位特異的および遅延性発現ウイルスベクターであるウイルスベクターである。最も好ましくは、ウイルスベクターは安定性でコーティングプロセスに抵抗でき、さらに低免疫原性を有する。本発明の好ましいベクターの一つの例は、アデノ随伴ウイルスベクターである。
【００４１】
本発明のある好ましい実施形態では、本発明のベクターは第１ポリヌクレオチドの発現を概して患者への投与後約１〜約３週間に遅延させる遅延発現ベクターである。患者の身体内での産物の発現およびそのような発現の安定性は、最終的には例えば患者の身体内の特定投与部位、即ち器官、組織または細胞のタイプのような要素によって影響を受ける。
【００４２】
本発明の担体には、例えばウイルスベクター、非ウイルスベクター、非プラスミドベクターまたは裸の核酸が含まれる。担体は、好ましくはそれを運ぶ所定の第２ポリヌクレオチドの一時的発現を提供する早期発現担体である。早期発現担体は、概して患者の身体内への医療用デバイスの適用の約１〜約２日間以内もしくはそれより早くに第２ポリヌクレオチドの発現を生じさせる。この一時的発現は標的細胞中で数週間持続することがある。
【００４３】
本発明の一つの実施形態に従うと、第１ポリヌクレオチドは遅延発現ベクターで運ばれ、第２ポリヌクレオチドは早期発現ベクターで運ばれる。第１ポリヌクレオチドは標的部位もしくはその周囲で細胞のゲノム内に一体化されており、これらの細胞内で治療有効量の一種以上の産物を産生させるために十分なレベルを備えた遅延性の、そして安定性の発現を確立する。遅延発現の例は、約２日間〜約３週間遅延する発現である。十分な頻度の発現とは、ベクターに曝露させられた約５％〜約９０％の細胞において誘発される発現である。平均すると、ベクターに曝露させられた約２０％〜約８０％の細胞が第１ポリヌクレオチドによってコードされた産物を発現する。
【００４４】
本発明の好ましい非プラスミドベクターは、例えばリポソーム類、リポフェクチン、リポプレックス類、ポリプレックス類、デキストラン類、スターバーストデンドリマー結合体類、ポリベンレンジメチルスルホキシド、硫酸プロタミン、抗体結合体類、ポリリシン結合体類、グラマシジンＳ、人工結合体類、ウイルスエンベロープ類、ウイルス状粒子類、ナノもしくはミクロ粒子類、ポリビニルピロリドン、ＳＰ１０１７、またはそれらの組み合わせを含んでいる。
【００４５】
上記で記載したようなベクターおよび担体のデザインは、例えば形質転換された宿主細胞および／または発現することが望まれる産物のタイプの選択のような要素に左右される可能性があることが理解されなければならない。さらに、ベクターコピー数、そのコピー数を制御する能力および例えば抗生物質マーカーまたはアンチセンス分子のような本発明の第１または第２ポリヌクレオチドによってコードされるいずれか他の産物の発現もまた考慮されなければならない。
【００４６】
ウイルスベクター類もしくはウイルス起源に由来するベクター類の非限定的例には、アデノウイルスベクター類、単純ヘルペスウイルスベクター類、パピローマスベクター類、アデノ随伴ウイルスベクター類、レトロウイルスベクター類、アルファウイルスベクター類、レンチウイルスベクター類等が挙げられる。ここで記載するような、本発明のウイルスベクターは、好ましくは複製不全であり、従って標的細胞中で自発的に複製することができない。一般に、本発明の範囲内で使用される複製不全ウイルスのゲノムには、少なくとも感染した細胞中でウイルスの複製のために必要な領域が欠如している。これらの領域は特定の遺伝子配列によって、排除されるか（全体もしくは一部を）、非機能的になるか、または他の配列によって置換されることができる。複製不全ウイルスは、ウイルス粒子を包むために必要なそれのゲノムの配列を保持することができる。
【００４７】
上記で記載したように、本発明の好ましいベクターはアデノウイルスもしくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来のウイルスベクターである。アデノ随伴ウイルス類は安定性かつ部位特異的方法でそれが感染する細胞のゲノム内に組み込む比較的短いサイズのＤＮＡウイルスである。これらのウイルスは細胞増殖、形態または分化に何の影響も誘発することなく広範囲の細胞スペクトラムに感染することができる。さらにその上、それらはヒトの病理に含まれているとは思われず、低い免疫原性を示す。
【００４８】
２種の一般的タイプのアデノ随伴ウイルスベクター類が使用される。第１タイプでは、カプシド遺伝子が欠失しており外来ＤＮＡ（約２ｋｂ）が欠失部位で挿入されている。このタイプのベクターはレプリカーゼ遺伝子を保持しており、宿主ゲノムの特定部位で組み込むことができる。第２タイプのベクターは、外来ＤＮＡの両端で単純に１個以上のＡＡＶ末端反復配列（プラス数個の追加の塩基）を含有している。ある場合では、そのようなベクターは組み込んで＞５０％頻度で形質転換することができるが、しかし部位特異性の発生率は減少する可能性がある。
【００４９】
様々な構造および特性を有する種々の血清型のアデノウイルスが存在する。これらの血清型の中で、本発明の範囲内で好ましいのは２型もしくは５型のヒトアデノウイルス（Ａｄ２もしくはＡｄ５）または動物起源のアデノウイルス類であるが、しかし例えばサブタイプ１、３、４および６〜４２のような他のアデノ随伴ウイルスサブタイプもまた使用できる。それらの本発明の範囲内で使用できる動物起源のアデノウイルスは、イヌ、ウシ、もしくはマウス起源のアデノウイルス類を含んでいる。好ましくは、動物起源のアデノウイルス類は、イヌアデノ随伴ウイルス２型（ＣＡＶ２）である、または混合ヒトおよびイヌ起源のものである。
【００５０】
本発明の範囲内には、Ａｄ：Ｐａｃ−βガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）遺伝子の主要な構造的特徴を共有するアデノウイルス類の使用が含まれる。即ち、本発明には例えば３’末端でＥ１ａエンハンサー／パッケージングシグナルを備える複製不全Ｅ１−、Ｅ３−欠失アデノウイルスの使用が含まれる。これらのウイルス類はＥ１欠失部位にプロモーターに機能的に連結した非アデノウイルスコーディング配列を有している。非アデノウイルスコーディング配列は、マーカー遺伝子であってよい（例、核移行β−Ｇａｌ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等）。コーディング配列は、また治療的に有効な分子をコードする遺伝子であってもよい（それの例は上記に記載されている）。コーディング配列が機能的に連結されているプロモーターは、例えばＣＭＶプロモーター／エンハンサーもしくはＲＳウイルス（ＲＳＶ）プロモーターのような強力なウイルスプロモーター、組織特異的プロモーター、または誘導プロモーター（即ち、メタロチオニンプロモーター）である。
【００５１】
ベクターおよび担体は、各々第１および第２ポリヌクレオチドを運ぶ。第１および第２ポリヌクレオチドは、本発明に従った同一もしくは相違するポリヌクレオチド類であり、あらゆる分子的に容認可能な形状である。分子的に容認可能な形状には、例えばＤＮＡ、リボザイム類、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡ、裸のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ゲノムＤＮＡ等が含まれる。
【００５２】
第１もしくは第２ポリヌクレオチド、またはそれらの両方は一種以上の産物をコードする。産物には、例えばタンパク質類、ペプチド類、ポリペプチド類、またはセンスもしくはアンチセンス方向におけるポリヌクレオチド分子類が含まれる。産物は、サイズおよび形状とは無関係に、あらゆる翻訳修飾、翻訳後修飾、または非翻訳産物であると理解されている。産物には、主要な例として、動物において欠陥もしくは不足を補償できる産物、または身体から有害な細胞を制限もしくは除去するための毒性作用を通して機能する産物が含まれる。
【００５３】
本発明の第１治療薬は遺伝物質を含有するが、本発明の第２治療薬は遺伝物質または非遺伝物質のいずれかを含有することができる。非遺伝物質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏで有益な生物学的もしくは医学的反応を誘発するあらゆる分子もしくは化合物を含有する。有益な生物学的反応の一例は、遺伝物質の細胞内への組み込みの機会を刺激して増加させる反応である。
【００５４】
本発明の治療薬の範囲内には、細胞および組織内への遺伝子導入および組み込みを増強する治療薬類が含まれている。これらの物質には、例えばポリブレン、ポリ−Ｌ−リシン、硫酸デキストラン、ポリビニルピロリドン、ＳＰ１０１７（Ｓｕｐｒａｔｅｋ  Ｐｈａｒｍａ製）、その他のポリカチオン性物質類、デキサメタゾン、例えばＮＰ−４０のような洗剤および脂質類のような組織の透過性を増加させることのできる物質類、および組織の透過性を増加させるＳＤＳが含まれる。本発明の治療薬のまた別の例としては、サイクロスポリン、デキサメタゾンのような免疫抑制剤類、および特にＴＮＦ−αのようなサイトカイン類に対する抗体類が挙げられる。
【００５５】
本発明の産物および治療薬の非限定的例には下記が含まれる：ヘパリン、ヘパリン誘導体類、ウロキナーゼおよびＰＰＡＣＫ（デキストロフェニルアラニンプロリンアルギニンクロロメチルケトン）のような抗血栓形成薬；組織プラスミノーゲンアクチベーター；エリスロポイエチン；抗酸化物質類；血管由来および抗血管由来物質類および要素類；ラパマイシンのような平滑筋細胞増殖を阻害する物質類、アンギオペプチン、平滑筋細胞増殖を遮断できるモノクローナル抗体類；エストロゲンのような抗炎症薬類；カルシウム流入阻害薬類；例えばアンギオスタチンおよびチミジンキナーゼ阻害薬類のような抗新生腫瘍／抗増殖／細胞分裂薬類；ニトロフラントイン；リドカイン、ブピバカインおよびロピバカインのような麻酔薬類；一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）；ＲＧＤペプチド含有化合物であるＤ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇのような抗凝固薬；アンチトロンビン化合物類；血小板受容体拮抗薬類；アンチトロンビン抗体類；抗血小板受容体抗体類；プロスタグランジン阻害薬類；血小板阻害薬類；血管細胞増殖プロモーター類；増殖因子受容体拮抗薬類；転写アクチベーター類および翻訳プロモーター類；増殖因子阻害薬類のような血管細胞増殖阻害薬類；増殖因子受容体拮抗薬類；転写リプレッサー類；翻訳リプレッサー類；複製阻害薬類；阻害抗体類；増殖因子に向けられた抗体類；増殖因子および細胞毒素から構成される二官能分子類、抗体および細胞毒素から構成される二官能分子類、コレステロール降下剤類；血管拡張薬類；内因性血管作用機序を妨害する薬剤；および抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリー因子類のような細胞死から保護するサバイバル遺伝子。
【００５６】
本発明の一つの実施形態に従うと、第１もしくは第２ポリヌクレオチド、またはそれらの両方は、例えば酸性および塩基性線維芽細胞増殖因子類、血管内皮細胞増殖因子、ｈｉｆ−１、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子αおよびβ、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、腫瘍壊死因子α、幹細胞増殖因子およびインスリン状増殖因子、ＡＫＴのような血管新生および抗血管新生薬類、ＣＤＫ阻害薬類を含む細胞周期阻害薬類、網膜芽細胞腫、ｐ５３、ｐ１６、ｐ２７、抗再狭窄剤類、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ＦＡＳリガンド、ｈＫＩＳ、ヘムオキシゲナーゼ、一酸化窒素およびそれらの組み合わせをコードする。
【００５７】
第１または第２ポリヌクレオチド配列、またはそれらの両方によってコードすることのできるまた他の産物には、単球化学誘引タンパク質（ＭＣＰ−１）および骨形成タンパク質のファミリー（ＢＭＰ’ｓ）が含まれる。よく知られているタンパク質類には、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６（Ｖｇｒ−１）、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５およびＢＭＰ−１６が含まれる。現在好ましいＢＭＰ’ｓは、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７のいずれかである。これらのダイマータンパク質類は、単独または他の分子と一緒にホモダイマー類、ヘテロダイマー類、またはそれらの組み合わせとして提供することができる。あるいはまた、または追加して、ＢＭＰ発現に上流または下流作用を誘導することのできる分子類を用意することができる。そのような分子類には、「ヘッジホッグ」タンパク質類、またはそれらをコードする核酸類のいずれかが含まれる。
【００５８】
一般に、第１もしくは第２ポリヌクレオチド、またはそれらの両方は各々ポリヌクレオチド配列の発現を許容する方法で少なくとも一つの転写調節配列に機能的に連結されていてよい。調節配列は当分野で認識されており、遺伝子発現を方向付けるように選択されている。従って、用語の転写調節配列はプロモーター類、エンハンサー類およびその他の発現制御エレメントを含んでいる。そのような調節配列類は、参照してここに組み込まれるＧｏｅｄｄｅｌ；遺伝子発現テクノロジー：酵素学における方法１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，サンディエゴ、カリフォルニア州（１９９０）の中に記載されている。
【００５９】
本発明の範囲内の調節配列には、これらの配列が感染した細胞内でも機能することができることを前提に、例えば自然に遺伝子を発現することに責任を負う配列を含むことができる。これらの配列は、また相違する起源の配列であってよい（種々のタンパク質または合成タンパク質さえを発現させる、または発現を調節することに責任を負っている）。特に、これらの配列は真核生物もしくはウイルス遺伝子の配列またはそれらに由来する配列であってよいが、それらの配列は例えば特異的もしくは非特異的方法で、または誘導性もしくは無誘導性方法で遺伝子の転写を刺激または抑制する。一つの例として、それらは宿主ゲノムまたはウイルスのゲノムに由来するプロモーター配列、特にアデノウイルスＥＩＡおよびＭＬＰ遺伝子のプロモーター類であるＣＭＶもしくはＬＴＲ−ＲＳＶプロモーターであってよい。
【００６０】
本発明の範囲内の他の調節配列には、偏在性プロモータ類（ＨＰＲＴ、ビメンチン、アクチン、チューブリン等）を含む真核細胞プロモーター類、中間フィラメントプロモーター類（デスミン、神経フィラメント類、ケラチン、ＧＦＡＰ等）；治療的遺伝子プロモーター類（ＭＤＲタイプ、ＣＦＴＲ、第ＶＩＩＩ因子等）；組織特異的プロモーター類（平滑筋細胞中のアクチンプロモーター）；細胞を分割する際に優先的に活性化されるプロモーター類、または刺激に反応するプロモーター類（ステロイドホルモン受容体、レチノイン酸受容体等）が含まれる。ＳＶ４０の初期および後期プロモーター類；アデノウイルスもしくはサイトメガロウイルス前初期プロモーター類；ｌａｃ系；ｔｒｐ系；その発現がＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによって差し向けられるＴ７プロモーター；ファージラムダの主要オペレーターおよびプロモーター領域；ウイルスコートタンパク質のためのコントロール領域；３−ホスホグリセラーテキナーゼまたは他の解糖促進性酵素類に対するプロモーター；酸性ホスファターゼのプロモーター類、即ちＰｈｏ５；酵母α化因子のプロモーター類；バキュロウイルス系およびその他の原核細胞もしくは真核細胞またはそれらのウイルス類の遺伝子の発現を制御するために知られている他の配列の多面体プロモーター、およびそれらの様々な組み合わせは本発明の範囲内に含まれている。
【００６１】
本発明のある好ましい実施形態では、第１ポリヌクレオチド、第２ポリヌクレオチドもしくはそれらの両方はコーディング配列の上流で標的細胞の分泌経路内へ合成された産物を差し向けるシグナル配列へ連結されている。このシグナル配列は天然シグナル配列であってよいが、それはまたいずれかの他の機能的シグナル配列（例えば、チミジンキナーゼに対する遺伝子のシグナル配列）、または人工的シグナル配列であってもよい。
【００６２】
医療用デバイス上に保持される遺伝物質の量は有効な発現誘導量である。ここで使用する「有効な発現誘導量」は、一種以上の所定のポリヌクレオチド配列によってコードされた産物の発現を達成する遺伝物質の量を意味する。核酸配列の有効な発現誘導量の核酸配列を決定するための手段は技術においてよく知られている。
【００６３】
上記のように、本発明の第１および第２ポリヌクレオチドは各々ベクターおよび担体によって運ばれる。それらの特定構造およびデザインに従って、ベクターおよび担体分子はレシピエントの身体内でのポリヌクレオチド類の発現および組み込みに影響を及ぼす。本発明のベクターおよび担体系はｉｎ  ｖｉｖｏでの産物の持続的発現を保証する。
【００６４】
本発明のまた別の実施形態に従うと、第２ポリヌクレオチドは第１ポリヌクレオチドと同一であり、さらに標的細胞のゲノム内に組み込む、または標的細胞内で一時的に一種以上の産物を発現する一時的発現経路に流入する初期発現ベクターによって運ばれる。一時的発現は通常、患者へ医療用デバイスを適用後約１〜約４週間持続する。
【００６５】
例えば、第１治療薬はＲＢのような細胞周期阻害遺伝子、例えば血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）のような内皮形成のプロモーターをコードするポリヌクレオチド配列を含んでいる。これらの遺伝子は、遅延発現ベクターによって運ばれる。第２治療薬は、初期発現担体によって運ばれる例えばＦａｓＬのような細胞毒性遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を含んでいる。このため、第１および第２治療薬の放出動態および放出期間は制御される。
【００６６】
一般に、遺伝物質の放出動態は、例えば医療用デバイスの構造、ポリマーコーティングの構造、多孔性および肉厚；遺伝物質（即ち、形質転換細胞類、ポリヌクレオチド担体類等）の性質、治療の標的部位その他を含む数種の要素によって支配される。これらのパラメーターの良好なバランスはデバイスコーティングから患者の身体内の標的部位内もしくは近位への遺伝物質の制御されかつ安定した放出を提供する。
【００６７】
本発明に従って発現した産物は、一般に疾患または組織もしくは器官機能不全の経過を治療、防止またはさもなければ影響を及ぼすためのあらゆる適用において有用である。例えば、産物は血管新生を阻害するため、再狭窄を防止または治療するため、心筋症、心不全もしくは心臓のその他の機能不全を治療するため、嚢胞性線維症もしくは肺のその他の機能不全を治療するため、悪性もしくは非悪性細胞増殖を治療もしくは阻害するため、または特定の組織もしくは器官において神経、血管もしくは組織再生を誘導して治療するために使用される。
【００６８】
本発明のある好ましい実施形態は、血管血栓症および血管形成術後再狭窄、特に冠血管血栓症および血管形成術後再狭窄の治療を提供すること、それによって血管再血栓症および再狭窄症、不安定狭心症、心筋梗塞および突然死の発生率を減少させることである。本発明の医療用デバイスおよび方法は血栓の結果として生じる重度の合併症を有する患者を治療するために使用できる。特定の実施例には、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）を有する患者およびＰＴＣＡ（経皮的冠動脈形成術）が不成功に終わって標的動脈の急性血栓性閉塞を有する患者が含まれる。
【００６９】
本発明の方法によって治療される器官および組織には、注射されるのであろうと植え込まれるのであろうと、およびｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏであろうと、あらゆる哺乳類の組織もしくは器官が含まれる。非限定的例として、心臓、肺、脳、肝臓、骨格筋、平滑筋、腎臓、膀胱、小腸、胃、膵臓、卵巣、前立腺、軟骨および骨が挙げられる。治療に対して敏感であるその他の器官系には、物質が起源からその器官を通って流れる器官系が含まれるので、一つの因子をコーティングで投与できる。代表的器官には、リンパ節、胆管、尿管、肺、脳脊髄液が占めている空間その他が含まれる。この方法で治療できるその他の組織の例には胃および小腸が含まれ、そこでは増殖因子類が潰瘍の修復、皮膚の外部潰瘍、および総合的創傷治癒を促進するのに役立つ。
【００７０】
Ｉｎ  ｖｉｖｏでの適切な標的細胞の形質転換は遺伝子療法における第１ステップを意味しているので、特異的遺伝子送達システムの選択は例えば予定標的の表現型および投与経路のような要素に左右されるであろう。さらにその上、ｉｎ  ｖｉｖｏ形質転換を前提に、特定ポリヌクレオチド構造体が例えばｅｘ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｓｉｔｕ組織培養系において使用するためのような細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質転換のためにも有用であることは理解されるであろう。
【００７１】
ここまで本発明を十分に説明してきたが、本発明は例示のために提供され、ここで明記していない限り本発明を制限することが意図されていない特定実施例を参照することによってより容易に理解されるであろう。
【００７２】
【実施例】
【００７３】
【実施例１】コーティングされたメタリックステントにより媒介された血管内局所的遺伝子導入
本試験においては核特異的βガラクトシダーゼ（Ａｄ−βｇａｌ）に対するＬａｃ  Ｚレポーター遺伝子を運ぶ複製不全組換えアデノウイルスを使用する。ステントのコーティングは、１０秒間に渡りクロスリンカーを含有するゼラチン溶液中にメタリックステントを浸漬し、その後風乾させることによって実施する。コーティングの肉厚は約５〜１０μｍへ制御する。コーティングステントは４．０もしくは３．０ｍｍ  ＰＴＣＡ（経皮的冠動脈形成術）上に取り付け、３分間に渡ってＡｄ−βｇａｌウイルス原液（２×１０１０ｐｆｕ／ｍＬ）内へ沈め、その後ラットの頸動脈内へ植え込む。ステントのコーティングおよび植え込みを有意な数のラットにおいて繰り返す。
【００７４】
動物は植え込み７、１４および２１日後に屠殺する。β−ガラクトシダーゼ発現はＸ−Ｇａｌ染色によって評価する。導入遺伝子の発現は全動物において検出できる。削剥した内皮を備える血管では、遺伝子発現は内膜下、中膜および外膜で所見される。本試験は、タンパク質コーティングメタリックステントによる局所的血管壁へのアデノウイルス媒介性遺伝子導入の実行可能性および有効性を証明する。
【００７５】
【実施例２】吸収性マイクロポーラス血管内ステントの製造または遺伝子および細胞療法の適用
吸収性のマイクロポーラス腔内ステントをポリ−Ｌ−乳酸（ＰＬＬＡ）／ポリε−カプロラクトン（ＰＣＬ）混合物から調製する。螺旋形およびチューブ状の両方のステントデザインは、溶媒鋳造および浮遊沈降製造法によって入手する。それらがステントの機械的特性、多孔性および分解率へ及ぼす影響を調査するためにある範囲のＰＬＬＡ／ＰＣＬ混合物比およびプロセス変量を使用する。高度のＰＬＬＡ比率を含むポリマー混合物は、より高いＰＣＬ含量を有するポリマー混合物より高い弾性係数および最終的引張強さ、より低い伸長、多孔性および分解率を示す。配置および血管壁の支持のために適切な機械的特性を有するステントを入手する。ポリ（エチレンオキシド）は酸膨潤法を使用し、多孔性構造を開き、親水性特徴を改良し、それによって組換えアデノウイルスベクター類の取り込みを可能にしてこれらのデバイス内に組み込む。５０：５０ＰＬＬＡ／ＰＣＬ混合ステントには、組換えアデノウイルス（エシェリヒア・コリβ−ガラクトシダーゼの核内移行変種をコードするＡｄＣＭ  βＧａｌ）を含浸させる。組換えウイルスを含浸させたステントと一緒にインキュベートした培養ＣＶ−１細胞は核移行β−ガラクトシダーゼ活性を発現するが、これはこのデザインの遺伝的に増強された血管内デバイスが実行可能であることを示唆した動態によって、吸収されたウイルスが感染形のマトリックスから放出されることを確証する。
【００７６】
【実施例３】放出されたＤＮＡの生物学的活性
コーティングされた医療用デバイスの表面から放出されたアデノウイルスＤＮＡの生物学的活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトすることによって調査する。結果は、放出されたＤＮＡが生物学的に活性であり、高度のトランスフェクション効率を有していることを示している。
【００７７】
【実施例４】複製不全アデノウイルスベクター類の調製
標準的組換えＤＮＡ法を使用して、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）をコードする遺伝子を発現する複製不全アデノウイルスビリオン類を作製する。プラスミドおよびアデノウイルスＤＮＡの上首尾の組換えは、Ｅ１および／またはＥ３欠失領域内へクローニングされたＶＥＧＦのポリヌクレオチド配列を含めて、全アデノウイルスゲノム（マイナス、例えばＥ１もしくはＥ３欠失）の生成を生じさせる。アデノウイルスは、一種以上のエンドヌクレアーゼ分割部位、即ちアデノウイルスにとって独特の制限部位を含むことができる。様々な部位を使用できる。しかし、好ましくはエンドヌクレアーゼによって認識された配列は、分解部位から下流で長さが少なくとも６塩基、より好ましくは少なくとも８塩基である。エンドヌクレアーゼ分解部位はまたＥ３欠失部位で存在することもできる。組換えビリオン類は複製不全であるが、それはそれらに必須Ｅ１アデノウイルス遺伝子配列が欠如しているためである。しかし、ＨＥＫ２９３細胞系はＥ１遺伝子を用いて安定性でトランスフェクトされ、従ってトランスにおいて必須機能を供給する。従って複製不全組換えアデノウイルスは２９３細胞において複製有効であり、細胞溶解およびビリオン産生を生じさせる。産生したビリオン類は他の細胞タイプにおいては溶菌感染を産生しないが、それらはＶＥＧＦを発現することができる。
【００７８】
【実施例５】複製不全アデノ随伴ウイルスベクター類の調製
複製不全組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）は、２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域によって挟まれた所定のポリヌクレオチド配列を含有するプラスミド、およびＡＡＶをカプシドに包む遺伝子（ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）を運ぶプラスミドをヒトヘルパーウイルス（例えばアデノウイルス）を用いて感染した細胞系内へコトランスフェクトすることによって調製する。ＡＡＶ末端反復（プラス数個の塩基）は外来ＤＮＡの両端上に存在する。産生したＡＡＶ組換え体をその後標準的方法によって精製する。複製不全組換えアデノ随伴ベクター類はさらにまたカプシド遺伝子を欠失させ、さらに外来ＤＮＡを置換することによっても作製する（約２ｋｂ）。ベクター類は、受容体細胞のゲノム内に組み込まれ、これらの細胞を＞５０％頻度で形質転換させる。
【００７９】
【実施例６】アデノ随伴ウイルス遺伝子療法の前臨床／臨床適用
実験１．  再狭窄を防止するために、冠動脈形成術後に一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）含有アデノ随伴ベクターを使用する。適用は、カテーテル（即ち、バルーンチップカテーテル）によって、または例えばステントによって実行する。ＮＯＳ−ＳＭＣ（平滑筋細胞）含有アデノ随伴ウイルスを使用して傷ついたセグメントの再内皮形成を促進して増殖を減少させ、さらにそれによって再狭窄を防止する。
【００８０】
実験２．  アテローム硬化性動脈を治療するために一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）含有アデノ随伴ベクターを使用する。内皮機能不全はアテローム硬化症の初期イベントである。病変部位でのＮＯＳ含有アデノウイルスの導入は複雑な病変への進行を防止し、さらにいったん発生すると治癒を促進する。適用は、上記の通りに実行する（即ち、カテーテルまたはステントによって）。
【００８１】
実験３．  抗癌療法において一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）含有アデノ随伴ベクターを使用する。ＮＯＳを使用して細胞死を促進する。従って、細胞毒性レベルのＮＯＳの生成を実行するために高度に血管新生した腫瘍へＮＯＳアデノウイルスベクターを送達する。適用は、腫瘍組織内への直接注射または植え込み、または例えば静脈内注射によって実行できる。使用した特定アイソフォームはｍＮＯＳである。
【００８２】
【実施例７】２種の発現ベクター類によって運ばれた２種の所定のポリヌクレオチド配列によってコードされた２種の産物の発現
複製不全組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）は、２つのＡＡＶ逆末端反復（ＩＴＲ）領域によって挟まれた血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含有するプラスミド、およびＡＡＶをカプシドに包む遺伝子（ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）を運ぶプラスミドをヒトヘルパーウイルス（例えばアデノウイルス）を用いて感染した細胞系内へコトランスフェクトすることによって調製する。ＡＡＶ末端反復（プラス数個の塩基）は外来ＤＮＡの両端上に存在する。産生したＡＡＶ組換え体をその後標準的方法によって精製する。複製不全組換えアデノ随伴ベクター類はさらにまたカプシド遺伝子を欠失させ、さらに外来ＤＮＡ（約２ｋｂ）を細胞周期阻害薬遺伝子または例えば蒸気で産生した複製不全ＡＡＶ内へクローニングされた血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）のような内皮形成のプロモーターの全体もしくは一部分をコードするポリヌクレオチド配列と置換することによっても作製する。こうして産生したＡＡＶ組換えベクターを遅延発現ベクターとして使用する。所定の第２配列はＦＡＳリガンドをコードするポリヌクレオチド配列である。この配列をＳＶ４０の初期プＲモーターの指示下でアデノウイルス由来ベクター内へクローニングする。ＡＡＶ組換えベクターおよびアデノウイルス由来ベクターをステントの表面上のコーティングの一層または数層上もしくは内に適用する、または含浸させる。ステントは、冠動脈形成術後に再狭窄を防止するために患者に適用する。ＶＥＧＦ含有ＡＡＶ組換えベクターを使用して損傷したセグメントの再内皮形成を促進し、それによって再狭窄を防止する。
【００８３】
初期発現ベクターおよび遅延ベクターの両方がこの療法において有効である。遅延発現ベクターは受容体細胞のゲノム内に組み込まれ、これらの細胞を＞５０％頻度で形質転換する。初期発現ベクターは一時的にＦＡＳ  Ｌの産物を標的細胞への送達の約１もしくは２日後に発現する。ＦＡＳ  Ｌの一時的発現は患者の体内で約１〜４週間持続する。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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