(57)【要約】本発明は、標的生物のゲノムに挿入しうる核酸構築物を提供する。本構築物は、胚発生の性決定期／または配偶子形成時に活性化されるプロモーター、ならびに性決定に不可欠な遺伝子の発現を阻害する遮断物質からなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物における表現型性別を改変するための構築物であって、
ａ）規定された時間空間的パターンで一過性に活性化され、ｂ）と機能的に結合している、第１の核酸分子、
ｂ）動物における正常な性発生を変化させる遮断分子をコードする、第２の核酸分子
を含む構築物。
【請求項２】
第１のおよび第２の核酸分子のそれぞれが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらのハイブリッド分子である、請求項１記載の構築物。
【請求項３】
第１のおよび第２の核酸分子のそれぞれが、完全長分子またはその生物活性断片である、請求項１記載の構築物。
【請求項４】
第１の核酸分子が、プロモーター領域をコードするＤＮＡ分子である、請求項１記載の構築物。
【請求項５】
プロモーターが胚発生および／または配偶子形成時にのみ活性化され、性決定に一致する時間空間的ドメインで発現される、請求項４記載の構築物。
【請求項６】
プロモーターが、配列番号：３に示されるヌクレオチド配列を有する、請求項５記載の構築物。
【請求項７】
第２の核酸分子が、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、センスＲＮＡ、およびリボザイムからなる群より選択される遮断分子をコードする、請求項１記載の構築物。
【請求項８】
第２の核酸分子がアンチセンスＲＮＡまたはｄｓＲＮＡである、請求項７記載の構築物。
【請求項９】
第２の核酸分子が、配列番号：８または配列番号：１３に示したヌクレオチド配列を有する、請求項７記載の構築物。
【請求項１０】
ブダペスト条約の下にオーストラリア政府分析研究所（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に寄託され、アクセッション番号ＮＭ００／１４９１１またはＮＭ００／１４９０７が付与されている、請求項１記載の構築物。
【請求項１１】
ａ）配列番号：３に示されるヌクレオチド配列；
ｂ）ａ）の配列の生物活性断片；
ｃ）ａ）もしくはｂ）の配列と少なくとも７５％の配列相同性を有する核酸分子；
または
ｄ）ａ）もしくはｂ）の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる核酸分子
を有するプロモーターをコードする、核酸分子。
【請求項１２】
ａ）配列番号：８もしくは配列番号：１３に示されるヌクレオチド配列；
ｂ）ａ）の配列のいずれか１つの生物活性断片；
ｃ）ａ）もしくはｂ）に示された配列と少なくとも７５％の配列相同性を有する核酸分子；または
ｄ）ａ）もしくはｂ）に示された配列のいずれか１つとストリンジェントな条件下で結合しうる核酸分子
を含む遺伝子のコード領域をコードする、核酸分子。
【請求項１３】
動物における正常な性発生を変化させて繁殖不能性または表現型性別の変化をもたらすことが可能な遮断分子をコードする核酸分子。
【請求項１４】
遮断分子が、アンチセンスＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、センスＲＮＡ、およびリボザイムからなる群より選択される、請求項１３記載の核酸分子。
【請求項１５】
遮断分子がｄｓＲＮＡである、請求項１３記載の核酸分子。
【請求項１６】
遮断分子が、配列番号：８または配列番号：１３に示される核酸配列によってコードされる、または部分的にコードされる、請求項１３記載の核酸分子。
【請求項１７】
動物における表現型性別を変化させる方法であって、
１）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の構築物によって動物細胞を安定的に形質転換させる段階；および
２）該細胞を宿主生物に移植し、それによって移植細胞から動物全体を発生させる段階
を含む方法。
【請求項１８】
安定的な形質転換がマイクロインジェクション、トランスフェクション、または感染によって行われ、構築物が相同組換えによってゲノムに安定的に組み込まれる、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
宿主生物が形質転換細胞と同じ属のものである、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
宿主生物が脊椎動物である、請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
宿主生物が無脊椎動物である、請求項１７記載の方法。
【請求項２３】
宿主生物が、魚類、両生類、および軟体動物からなる群より選択される、請求項１７記載の方法。
【請求項２４】
魚類が、ゼブラフィッシュ、コイ、サケ、カダヤシ、テンチ、ヤツメウナギ、ハゼ、ティラピア、およびマスからなる群より選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
両生類が、オオヒキガエルおよびウシガエルからなる群より選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
軟体動物が、カキ、カワホトトギスガイ、イガイダマシ、ニュージーランドキリガイダマシ、スクミリンゴガイ、アフリカマイマイ、またはビオンファラリア属（Ｂｉｏｍｐｈａｌａｒｉａ）およびブリヌス属（Ｂｕｌｉｎｕｓ）の腹足類からなる群より選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
請求項１７記載の方法によって生産されたトランスジェニック動物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本出願は、動物集団における性比の制御、ならびに外来動物の拡散の防止および影響の軽減にそれを用いることに関する。特に、本発明は、有害生物集団に系統的に導入することができ、その実効的な性比を歪曲させて、生殖不全、集団減少、および可能性としては根絶をもたらす、構築物に関する。この遺伝的技法には、畜産学において一方の性別の系統を作製するという用途もある。
【０００２】
発明の背景
外来性有害生物は世界的に重大な環境問題の一つである。ヤギ、ネコ、ウサギ、およびコイは、娯楽または農業の目的で国際的に売買され、野外に逃げて有害な集団を形成した数百もの種のうち、最も知られた一部に過ぎない。バラスト水、国際貨物の中、および他の媒体を介して偶然に持ち込まれた外来種は、世界中の生態系への侵入およびその歪曲を続けている。陸上、淡水、および海洋の生態系はいずれもこれらの種によって著しく破壊されており、その程度の大きさから、外来有害動物に関する社会的関心は世界的な問題となっている。
【０００３】
有害生物集団を管理しようとの取り組みには長い歴史がある。３種類の幅広いアプローチが開発されており、それらの成功率はさまざまである。これらのアプローチは、１）物理的除去、これは毒物および他の殺生物剤を含む、２）環境レメディエーション、これは外来種が乱れた環境における唯一の問題であるという仮定に基づく、および３）生物的防除、これは通常、攻撃用の病原体または捕食者を導入し、それによって標的有害生物集団を防除することを伴う。これらのアプローチはどれも普遍的には適用可能でなく、この３つにはいずれも重大な限界がある。そのよい一例がオオヒキガエル（Ｂｕｆｏ ｍａｒｉｎｕｓ）であり、これは害虫集団に対する防除因子として広範囲に導入されたが、それ自体が問題種となった。オオヒキガエルは皮膚に有毒な腺があるため多くは捕食されず、このため捕食による影響を受けにくい；広範囲にわたる研究にもかからわず、それに対して使用できる上に、望ましい在来性両生類種に障害を及ぼすリスクが高くない病原体、病原因子または殺生物剤は見つかっていない；さらに、ヒキガエルの歴史から、それが単純な環境操作では大きな影響を受けないことが示されている。現段階では、オオヒキガエルに対して、コイおよびティラピアのような外来性魚類種に対して、さらには歴史的に有用なアプローチが奏功しないか実用的でない他の多くの目立った有害生物に対して、有効な防除戦略はない。これらの種の多くは現在、完全な非管理状態にあり、防除がなされていない。
【０００４】
同様の問題は、在来性であるにもかかわらず大きな経済的、生態学的、および衛生的なリスクとなっている動物集団の管理にも存在する。最も顕著な例の１つは、住血吸虫症の原因となる寄生虫の中間宿主であるビオンファラリア属およびブリヌス属の腹足類である。寄生虫のライフサイクルを破壊する試みとして、宿主腹足類を優先的に根絶させるには至らないまでも、それを管理することによって、アフリカ、南米およびアジアにおけるヒト感染率を抑えるためのさまざまな取り組みが行われた（ＬａｒｄａｎｓおよびＤｒｉｓｓｏｕｓ、１９９８）。腹足類種ではほかにも他の動物寄生体および他の複数のヒト疾患の中間宿主として作用するものがあり、これには例えば、線虫アンジオストロジラス・カノネンシス（Ａｎｇｉｏｓｔｒｏｇｙｌｕｓ ｃａｎｏｎｅｎｓｉｓ）が原因であり、導入された複数の腹足類種によって媒介されるハワイの好酸球性髄膜脳炎などがある。現段階では、中間宿主集団の管理によってこれらの疾患を管理する有効な戦略はない。
【０００５】
したがって、有害性の大きい外来性および在来性のさまざまな有害生物種を実際に根絶させるには至らないまでも、その影響を抑制するための方法を提供することには、依然として需要がある。
【０００６】
本発明者らは、両生類、魚類、および軟体動物に対して適用でき、おそらくは他の動物に対しても適用可能と思われる、このような方法を開発した。本発明者らは、ひとたび標的集団に導入されるとその性比を次第に歪曲し、最終的には集団の生殖的生産量が減少を始めるところまで至らせる、ある種の遺伝子構築物を設計した。これはその結果として、集団サイズの減少につながり、場合によっては局地的な絶滅をもたらす可能性がある（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、１９６７；Ｗｅｒｒｅｎら、１９８１）。
【０００７】
したがって、この「ドーターレス（ｄａｕｇｈｔｅｒｌｅｓｓ）」構築物が提供すると思われる、有害生物に対する既存の管理方法よりも優れたいくつかの主な利点には、以下のものが含まれる：
【０００８】
１．外来性有害生物集団を管理するための、種特異的で、このため本質的に安全な方法の提供。この遺伝的アプローチにより、非標的種に対して重大な障害作用を及ぼす恐れのある、環境破壊性のある毒物、または病原体、疾患もしくは捕食者の導入の必要性が回避される。「ドーターレス」構築物の使用によってもたらされる有害生物集団の長期にわたる累進的減少により、例えば、殺生物剤の放出後に死んだ大量の動物を処理する必要性などに起因する、巻き添え損害（ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ ｄａｍａｇｅ）がなくなる。
【０００９】
２．有効な選択肢が現時点では存在しない、オオヒキガエル、コイおよびアフリカマイマイ（Ｇｉａｎｔ Ａｆｒｉｃａｎ Ｓｎａｉｌ）などの外来性有害生物種に対する防除方法の提供。
【００１０】
３．住血吸虫症の中間宿主であり、有効な防除の選択肢がないビオンファラリア属の腹足類などのように、ヒトおよび動物の疾患に対する媒介生物として作用する在来種および外来種に対する防除方法の提供。
【００１１】
４．管理対象の有害生物に対する必要以上の苦痛を伴わない、人道的で長期的な有害生物防除法の提供。
【００１２】
５．極めて費用対効果に優れた有害生物防除法の提供。長期的な防除および（可能性としては）根絶は、有害生物集団に組み込まれて広がった遺伝子構築物を有する動物を減少させる、低コストで手間のかからないプログラムによって実現可能である。
【００１３】
本発明者らが開発した遺伝学的技法は、両性分化能のある胚生殖腺を完全な機能を備えた雄のみとして発生させる遺伝子構築物を標的集団に導入することにより、すべての雄性系統の自己増殖をもたらす。したがって、この技法を、爬虫類、両生類、魚類、軟体動物および他の何らかの無脊椎動物の飼育業において、すべて雄の子孫を産ませるために用いることも可能と考えられる。雄の子孫は生殖腺の発生に大量のエネルギーを投じない（成熟した雄の生殖腺は成熟した雌の生殖腺よりもはるかに小さい）ため、魚の海洋牧場などの動物飼育業では好まれることがしばしばである。本発明の適用により、単一性別の同腹仔を産ませる代替的な技法がないかその信頼性が低い動物ですべて雄を飼育することが可能となり、その結果、生産性が向上するとともに、逃げ出した動物によって野生化集団が成立する可能性が低くなる。
【００１４】
発明の概要
最も一般的な局面において、本明細書に開示する本発明は、任意の標的生物のゲノムに挿入しうる核酸構築物を提供する。本構築物は、胚発生の性決定期および／または配偶子形成時に活性化されるプロモーター、ならびに性決定に不可欠な遺伝子の発現を阻害する遮断物質（ｂｌｏｃｋｅｒ）からなる。
【００１５】
したがって、１つの局面において、本発明は、動物における表現型性別を改変するための構築物であって、
ａ）規定された時間空間的パターンで一過性に活性化され、ｂ）と機能的に結合している、第１の核酸分子、
ｂ）動物における正常な性発生を変化させる遮断分子をコードする、第２の核酸分子
を含む構築物を提供する。
【００１６】
第１および第２の核酸のそれぞれは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらのハイブリッド分子であってよい。核酸分子という用語が完全長分子またはその生物活性断片を含むことは明瞭に理解されると考えられる。
【００１７】
好ましくは、第１の核酸分子はプロモーター領域をコードするＤＮＡ分子である。より好ましくは、プロモーターは胚発生および／または配偶子形成時にのみ活性化され、性決定に一致する時間空間的ドメインで発現される。最も好ましくは、このＤＮＡ分子は配列番号：３に示したヌクレオチド配列を有する。
【００１８】
好ましくは、第２の核酸分子は、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、センスＲＮＡまたはリボザイムからなる群より選択される遮断分子（ｂｌｏｃｋｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）をコードする。より好ましくは、この分子はアンチセンスＲＮＡまたはｄｓＲＮＡである。最も好ましくは、このＤＮＡ分子は配列番号：８および１３に示したヌクレオチド配列を有する。
【００１９】
配列番号：１４および配列番号：１９に示した、第１の核酸分子（プロモーター）および第２の核酸分子（遮断物質）の両方が組み入れられた構築物の試料は、オーストラリア政府分析研究所（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に２０００年１０月４日に寄託され、それぞれ寄託番号ＮＭ００／１４９１１およびＮＭ００／１４９０７が与えられている。
【００２０】
第２の局面において、本発明は、プロモーターをコードし、規定された時間空間的パターンで一過性に活性化される核酸分子を提供する。より好ましくは、プロモーターは、胚発生または幼虫発生過程における限られた時期にのみ活性がある。最も好ましくは、核酸は、配列番号：３に示したヌクレオチド配列を有するプロモーターである。
【００２１】
第３の局面において、本発明は、
ａ）配列番号：３に示したヌクレオチド配列；または
ｂ）ａ）の配列の生物活性断片；または
ｃ）ａ）もしくはｂ）の配列と少なくとも７５％の配列相同性を有する核酸分子；
または
ｄ）ａ）もしくはｂ）の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる核酸分子
を有するプロモーターをコードする、核酸分子を提供する。
【００２２】
第４の局面において、本発明は、
ａ）配列番号：８もしくは配列番号：１３に示したヌクレオチド配列；または
ｂ）ａ）の配列のいずれか１つの生物活性断片；または
ｃ）ａ）もしくはｂ）に示された配列と少なくとも７５％の配列相同性を有する核酸分子；または
ｄ）ａ）もしくはｂ）に示された配列のいずれか１つとストリンジェントな条件下で結合しうる核酸分子
を含む遺伝子のコード領域をコードする、核酸分子を提供する。
【００２３】
第５の局面において、本発明は、動物における正常な性発生を変化させて繁殖不能性または表現型性別の変化をもたらすことが可能な遮断分子をコードする核酸分子を提供する。
【００２４】
好ましくは、遮断分子は、アンチセンスＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、センスＲＮＡおよびリボザイムからなる群より選択される。より好ましくは、本分子はｄｓＲＮＡである。最も好ましくは、遮断分子は配列番号：８および１３によってコードされる、または部分的にコードされる。
【００２５】
第６の局面において、本発明は、動物における性発生を変化させるための構築物であって、
ａ）規定された時間空間的パターンで一過性に活性化され、ｂ）と機能的に結合している、第１の核酸分子、
ｂ）遮断分子をコードする第２の核酸分子
を含み、
前記第１の核酸分子の活性化が、動物における繁殖不能性の誘導または表現型性別の改変を行う第２の核酸の発現を制御するような、構築物を提供する。
【００２６】
第７の局面において、本発明は、動物における表現型性別を変化させる方法であって、
１）本発明による構築物によって動物細胞の安定的な形質転換を行う段階；および
２）その細胞を宿主生物に移植し、それによって移植細胞から動物全体を発生させる段階
を含む方法を提供する。
【００２７】
好ましくは、安定的な形質転換はマイクロインジェクション、トランスフェクションまたは感染によって行われ、構築物は相同組換えによってゲノムに安定的に組み込まれる。
【００２８】
第８の局面において、本発明は、本発明による構築物によって安定的な形質転換を受けたトランスジェニック動物を提供する。
【００２９】
好ましくは、宿主生物は形質転換細胞と同じ属のものである。より好ましくは、宿主生物は脊椎動物および無脊椎動物を含む任意の動物である。最も好ましくは、宿主生物は、魚類、両生類および軟体動物からなる群より選択される。魚類には、ゼブラフィッシュ、コイ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃａｒｐ）、サケ、カダヤシ、テンチ、ヤツメウナギ、ハゼ（ｒｏｕｎｄ ｇｏｂｙ）、ティラピアおよびマスが非制限的に含まれる。両生類には、オオヒキガエルおよびウシガエルが非制限的に含まれる。軟体動物には、カキ（Ｐａｃｉｆｉｃ ｏｙｓｔｅｒ）、カワホトトギスガイ、イガイダマシ（ｓｔｒｉｐｅｄ ｍｕｓｓｅｌ）、ニュージーランドキリガイダマシ、スクミリンゴガイ、アフリカマイマイ、ならびにビオンファラリア属およびブリヌス属の疾病媒介性腹足類が非制限的に含まれる。
【００３０】
改変型および変形型の構築物を、化学処理もしくは酵素処理によってインビトロで作製してもよく、または組換えＤＮＡ技術によってインビボで作製してもよい。このような構築物は、例えば、１つまたは複数のヌクレオチド置換、欠失または挿入がある点で開示されるものと異なると思われるが、本発明の構築物または核酸分子の生物活性を実質的に保っている。
【００３１】
発明の詳細な説明
本発明の実施には、別に指示のない限り、当技術分野の範囲にある従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術を用いる。このような技法は当業者に周知であり、文献中に詳細に説明されている。例えば、「ＤＮＡクローニング：実践的アプローチ（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；「オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」（Ｍ．Ｊ． Ｇａｉｔ編、１９８４）；「核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」（Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５）；「転写および翻訳（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）」（Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；「動物細胞培養（Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）」（Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６）；「不死化細胞および酵素（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ）」（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；パーバル（Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ）、「分子クローニング実践ガイド（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（１９８４）およびサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第１２版（１９８９）を参照されたい。
【００３２】
定義
以下の定義は、組換えＤＮＡ技術に用いられる数多くの用語を用いている。このような用語によって与えられる範囲を含めて、明細書および特許請求の範囲に関して明確で一貫した理解が得られるように、以下の定義を提示する。
【００３３】
「核酸分子」または「ポリ核酸分子」とは、本明細書において、あらゆる形態のデオキシリボ核酸およびリボ核酸、すなわち、一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなどのことを指す。
【００３４】
「二本鎖ＤＮＡ分子」とは、正常な二本鎖らせんの状態にある、重合型のデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン）のことを指す。この用語は分子の一次構造および二次構造のみを指し、それを特定の三次形態に限定するものではない。したがって、この用語は、線状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、ウイルス、プラスミドおよび染色体などに認められる二本鎖ＤＮＡを含む。個々の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を議論する際には、本明細書では配列を、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡと相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’の向きのみの配列を表示するという通常の慣習に従って記載してよい。
【００３５】
ＤＮＡ配列がアミノ酸配列に「対応する」とは、遺伝暗号に従ったＤＮＡ配列の翻訳によってそのアミノ酸配列が生じる（すなわち、ＤＮＡ配列がそのアミノ酸配列を「コードする」）ことをいう。
【００３６】
１つのＤＮＡ配列が別のＤＮＡ配列に対応するとは、２つの配列が同じアミノ酸配列をコードすることをいう。
【００３７】
２つのＤＮＡ配列が「実質的に同等である」とは、規定された長さのＤＮＡ配列にわたってヌクレオチドの少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％が一致することをいう。実質的に同等な配列は、例えば、個々の系に対して定義されたストリンジェントな条件下での、サザンハイブリダイゼーション実験において同定可能である。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は当技術分野の範囲内にある。例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第１２版（１９８９）、第Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ巻「核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」を参照されたい。しかし通常、核酸分子のハイブリダイゼーションまたはアニーリングのための「ストリンジェントな条件」は、（１）洗浄に低イオン強度および高温を用いる、例えば０．０１５Ｍ ＮａＣｌ／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、５０℃、または（２）ハイブリダイゼーション時にホルムアミドなどの変性剤を用いる、例えば５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドに加えて０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ６．５、さらに７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム、４２℃というものである。
【００３８】
もう１つの例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０□ｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳおよび１０％デキストラン硫酸、４２℃を用い、４２℃の０．２×ＳＳＣおよび５５℃の０．１×ＳＳＣで洗浄を行うというものである。
【００３９】
ＤＮＡ構築物の「異種」領域またはドメインとは、より大きなＤＮＡ分子の内部にあるが、自然界ではその大きな分子に付随しては認められない、ＤＮＡの特定可能なセグメントのことである。このため、異種領域が哺乳動物遺伝子をコードする場合には、その遺伝子は通常、その起源生物のゲノム中で、哺乳動物のゲノムＤＮＡとは隣接しないＤＮＡと隣接している。異種領域のもう１つの例は、コード配列自体が自然界では認められない構築物である（例えば、ゲノムのコード配列が、イントロン、または天然の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列を含んでいるｃＤＮＡなど）。対立遺伝子変異または天然の変異イベントでは、本明細書に定義したＤＮＡの異種領域は生じない。
【００４０】
「遺伝子」とは、プロモーターおよびコード領域、ならびにイントロンならびに５’および３’非コード配列およびエンハンサー因子などの非コード領域に付随するすべてのＤＮＡ配列を含む。
【００４１】
「コード領域」とは、開始コドン、通常ＡＴＧから終止コドンＴＡＡまでのコドンのインフレーム配列のことであり、これはイントロンを含んでも含まなくともよい。
【００４２】
「コード配列」とは、タンパク質またはペプチド配列に対応する、またはそれをコードするコドンのインフレーム配列のことである。２つのコード配列は、配列またはそれらの相補配列が同じアミノ酸配列をコードするならば、互いに対応している。適切な調節配列を伴ったコード配列はインビボで転写されてポリペプチドへと翻訳される。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は通常、コード配列の３’側に位置すると考えられる。
【００４３】
「プロモーター配列」とは、細胞内でＲＮＡポリメラーゼと結合して、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域のことである。コード配列は、プロモーター配列と結合したＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、それが次にコード配列によってコードされるタンパク質へと翻訳される場合、細胞においてプロモーター配列の「制御下」にある。
【００４４】
本発明の目的のためのプロモーター配列はコード配列の翻訳開始コドンと３’末端で結合し、上流方向にはバックグラウンドを上回る検出可能なレベルで転写を開始するために必要な最小数の塩基または因子を含む。プロモーター配列の内部には、転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングにより首尾良く定義される）のほかに、ＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が存在すると考えられる。真核生物プロモーターは、常にとは限らないが多くの場合、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含み、原核生物プロモーターは−１０および−３５コンセンサス配列に加えてシャイン−デルガーノ配列を含む。
【００４５】
細胞が外因性ＤＮＡによる「形質転換を受けた」とは、このような外因性ＤＮＡが細胞壁の内部に導入されたことをいう。外因性ＤＮＡは細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組み込まれても（共有結合しても）よく、組み込まれなくてもよい。例えば、原核生物および酵母では、外因性ＤＮＡはプラスミドなどのエピソーム因子上に維持されうる。真核細胞に関しては、安定的形質転換細胞とは、染色体複製によって内部の外因性ＤＮＡが娘細胞に遺伝されるもののことである。この安定性は、真核細胞が、外因性ＤＮＡを含む娘細胞の集団から構成される細胞系またはクローンを樹立する能力によって示される。
【００４６】
ＤＮＡの「組込み」は、マイクロインジェクション、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）、電気穿孔またはリポフェクションを用いたＤＮＡの細胞内への物質移動の後に非相同組換えを用いて行わせることができる。相同組換えおよび／または制限酵素を介した組込み（ＲＥＭＩ）またはトランスポゾンなどの代替的な技法も含まれ、改良された組込み法であると考えてよい。
【００４７】
「クローン」とは、単一の細胞または共通の祖先から有糸分裂によって派生した細胞集団のことである。
【００４８】
「細胞」、「宿主細胞」、「細胞系」、および「細胞培養物」は本明細書で互換的に用いられ、このような用語はすべて、子孫を含むものと理解される必要がある。「細胞系」とは、多くの世代にわたってインビトロで安定的に増殖しうる初代細胞のクローンのことである。すなわち、「形質転換体」および「形質転換細胞」という用語は、初代対象細胞、およびそれに由来する培養物を、培養物が継代された回数にかかわらず含む。また、すべての子孫は、作為的または偶発的な変異のためにＤＮＡ内容の点で厳密に同一ではないと思われることも理解される必要がある。
【００４９】
ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質などの外来性物質を生物体に導入するために用いられる。典型的なベクターには、組換えウイルス（ＤＮＡの場合）およびリポソーム（タンパク質の場合）が含まれる。「ＤＮＡクローニングベクター」とは、プラスミド、ファージまたはコスミドなどの自律複製性ＤＮＡ分子のことである。一般に、ＤＮＡクローニングベクターは１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、そこでベクターの必須な生物機能を損なわずにこの種のＤＮＡ配列を決定可能な様式で切断し、その内部に複製およびクローニングを生じさせるためのＤＮＡ断片をスプライス導入することが可能である。クローニングベクターは、そのクローニングベクターによる形質転換を受けた細胞の同定に用いるのに適したマーカーを含んでもよい。
【００５０】
「発現ベクター」はＤＮＡクローニングベクターと類似しているが、適切な宿主細胞によるタンパク質合成の指令を可能とする調節配列を含む。これは通常、プロモーターがＲＮＡポリメラーゼと結合してｍＲＮＡの転写を開始することのほか、リボソーム結合部位および開始シグナルがｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指令することを意味する。ＤＮＡ配列を発現ベクターの適切な部位かつ正しいリーディングフレームに組み入れた後に、ベクターにより適切な宿主細胞の形質転換を行うことにより、ＤＮＡ配列に対応するｍＲＮＡの産生、さらに通常は、ＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の産生が可能となる。
【００５１】
「プラスミド」は、染色体外でまたは宿主細胞染色体の一部として、宿主細胞内で複製しうるＤＮＡ分子のことであり、大文字および／または数字の前および／または後に小文字の「ｐ」を付して命名される。本明細書の出発材料となるプラスミドは市販されていて、制限を受けずに入手可能であり、または本明細書に開示する方法および／もしくは発表された手順に従ってこの種の入手可能なプラスミドから構築することもできる。状況によっては、当業者には明らかと考えられるが、当技術分野で知られた他のプラスミドを本明細書に記載のプラスミドと互換的に用いてもよい。
【００５２】
「制御配列」とは、機能的に結合したヌクレオチドコード配列の特定の宿主細胞における発現のために必要なＤＮＡ配列のことである。原核生物における発現に適した制御配列には、例えば、複製起点、プロモーター、リボソーム結合部位および転写終結部位が含まれる。真核生物における発現に適した制御配列には、例えば、複製起点、プロモーター、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーが含まれる。
【００５３】
「外因性」因子とは、宿主細胞に対して外来性のもの、または宿主細胞に対して同種性ではあるがその因子が宿主細胞内の通常は認められない位置にあるもののことである。
【００５４】
ＤＮＡの「消化」とは、ＤＮＡ中の特定の位置のみに作用する酵素によるＤＮＡの触媒性切断のことである。この種の酵素は制限酵素または制限エンドヌクレアーゼと呼ばれ、この種の酵素が切断するＤＮＡ内部の部位は制限部位と呼ばれる。ＤＮＡ内部に複数の制限部位がある場合には、消化によって２つまたはそれ以上の線状化ＤＮＡ断片（制限断片）が生じると考えられる。本明細書で用いる種々の制限酵素は市販されており、酵素の製造者によって定められた反応条件、補助因子および他の必要条件を用いる。制限酵素は一般に、各制限酵素が最初に得られた微生物を表す大文字およびそれに続く他の文字、さらに個々の酵素を表す数字からなる略号によって命名される。一般に、約２０μｌの緩衝液中にある約１〜２単位の酵素で約１μｇのＤＮＡが消化される。個々の制限酵素に適した緩衝液および基質の量は製造者によって指定される、および／または当技術分野で周知である。
【００５５】
制限消化物からの所定のＤＮＡ断片の「回収」または「単離」は、一般に、「制限断片」と呼ばれる消化産物をポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル上で電気泳動によって分離し、既知の分子量のマーカーＤＮＡ断片と対比した移動度に基づいて関心対象の断片を同定して、求める断片を含むゲルの部分を切り出した上で、例えば電気溶出によってゲルからＤＮＡを分離することによって行われる。
【００５６】
「連結」とは、２つの二本鎖ＤＮＡの間にホスホジエステル結合を形成させるプロセスのことを指す。別に特記しない限り、連結は、連結させるほぼ等モル量のＤＮＡ断片０．５μｇ当たり１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いる既知の緩衝液および条件を用いて行う。
【００５７】
「オリゴヌクレオチド」とは、エンゲルス（Ｅｎｇｅｌｓ）ら、Ａｇｎｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ２８：７１６〜７３４（１９８９）などに記載された既知の方法（例えば、トリエステル、ホスホルアミダイトまたはホスホネート化学を含む）によって化学合成された、短い一本鎖または二本鎖のポリデオキシヌクレオチドのことである。これらは続いて、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製される。
【００５８】
本明細書で用いる「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は一般に、米国特許第４，６８３，１９５号に記載されたような、求めるヌクレオチド配列のインビトロ増幅のための方法のことを指す。一般に、ＰＣＲ法では、テンプレート核酸と選好的にハイブリダイズしうる２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いるプライマー伸長合成の反復サイクルを行う。典型的な場合、ＰＣＲ法に用いるプライマーは増幅しようとするヌクレオチド配列の両端にあるまたは隣接するテンプレート中のヌクレオチド配列に対して相補的と考えられるが、増幅しようとするヌクレオチド配列に対して相補的なプライマーを用いてもよい。ワング（Ｗａｎｇ）ら、「ＰＣＲプロトコール（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、ｐｐ．７０〜７５（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９０）；オフマン（Ｏｃｈｍａｎ）ら、「ＰＣＲプロトコール（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、ｐｐ． ２１９〜２２７；トリグリア（Ｔｒｉｇｌｉａ）ら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：８１８６（１９８８）を参照のこと。
【００５９】
「ＰＣＲクローニング」とは、全ゲノムＤＮＡおよび全細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡを含む、適した細胞または組織源からの核酸中に存在する、求める特定のヌクレオチド配列を増幅するためにＰＣＲ法を用いることを指す。 フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：８９９８〜９００２（１９８８）；サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７〜４９２（１９８８）；マリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５５：３３５〜３５０（１９８７）を参照のこと。
【００６０】
「ｍＡＲプロモーター」とは、配列番号：３に示したヌクレオチド配列によってコードされるプロモーターのことを指す。「遮断分子」とは、好ましくはアロマターゼ発現遺伝子をコードし、配列番号：８および配列番号：１３に示した配列を含む、アンチセンスＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、センスＲＮＡまたはＤＮＡのことを指す。しかし、正常な性発生を妨げて、繁殖不能性または発現される表現型性別の変化をもたらしうる任意の核酸分子が含まれることを当業者は理解すると考えられる。したがって、本明細書で用いる「遮断分子ＲＮＡ」および「遮断分子ＤＮＡ」という用語は、扱うものがＲＮＡまたはＤＮＡのいずれの種であるかに左右されるが互換的である。ｍＡＲプロモーターおよび遮断分子の配列バリアントを、例えば部位特異的変異誘発もしくはＰＣＲ変異誘発によって合成的に作製してもよく、または魚類および他の動物種にみられる配列番号：３もしくは配列番号：８および配列番号：１３に示したヌクレオチド配列の対立遺伝子形態および他の天然のバリアントの場合のように、それが天然に存在してもよい。
【００６１】
アロマターゼ遮断分子のヌクレオチド配列バリアントは、それらに機能的な活性がある限り、本発明の範囲に含まれる。「機能的に活性がある」および「機能的活性」とは、遮断分子バリアントが動物における正常な性発生を遮断しうる、または発現される表現型性別を変化させうることを意味する。このためアロマターゼ遮断分子のヌクレオチド配列バリアントは一般に、最大の相同性が得られるように配列を整列化した後に、例えばニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）ら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３〜４５３（１９７０）により記載されたアルゴリズムの変法であるフィッチ（Ｆｉｔｃｈ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：１３８２〜１３８６（１９８３）による評価で、配列番号：８または配列番号：１３に示したヌクレオチド配列と少なくとも約７５％が共通していると考えられる。
【００６２】
アロマターゼ遮断分子のヌクレオチド配列バリアントは、適切なヌクレオチド変化を遮断分子ＤＮＡに導入することにより、またはインビトロ合成により調製される。このようなバリアントは、配列番号：８および配列番号：１３に示した遮断分子ヌクレオチド配列内のヌクレオチドからの欠失、またはヌクレオチドの挿入もしくは置換を含む。このようなバリアントが本明細書に記載の望ましい特徴を有する限り、遮断分子のヌクレオチド配列バリアントが得られる欠失、挿入および置換の任意の組み合わせを用いてよい。遮断分子のヌクレオチド配列バリアントを得るために配列番号：８および配列番号：１３のそれぞれに示したヌクレオチド配列に加えた変化が、宿主細胞内でそれが活性化された際に遮断分子のさらなる改変をもたらす可能性もある。
【００６３】
アロマターゼ遮断分子核酸のヌクレオチド配列バリアントの構築には、変異部位の位置および変異の性質という２つの主要な変数がある。これらは配列番号：８および配列番号：１３に示したヌクレオチド配列からのバリアントであり、対立遺伝子または自然界に存在しないバリアントを得るために遮断分子ＤＮＡを変異させることによって作製された、分子の天然の対立遺伝子形態または遮断分子の規定の変異形態であってよい。一般に、選択される変異の位置および性質は、改変しようとする遮断分子の特徴に依存すると考えられる。
【００６４】
ヌクレオチド配列の欠失は一般に、約１〜３０ヌクレオチド、より好ましくは約１〜１０ヌクレオチドの範囲であり、典型的には連続性である。
【００６５】
ヌクレオチド配列の挿入には、１ヌクレオチドから数百ヌクレオチドまでの長さの範囲にわたる融合のほか、単一または複数のヌクレオチドの配列内挿入が含まれる。配列内挿入（すなわち、配列番号：８および配列番号：１３に示したヌクレオチド配列の内部への挿入）は一般に、約１〜１０ヌクレオチド、より好ましくは１〜５ヌクレオチド、最も好ましくは１〜３ヌクレオチド配列の範囲である。
【００６６】
バリアントの第３の群は、配列番号：８および配列番号：１３に示したヌクレオチド配列内のヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換されたものである。好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、さらにより好ましくは１〜２個、最も好ましくは１個のみのヌクレオチドが除去されて異なるヌクレオチドがその場所に挿入される。このような置換を行うのに最も関心がもたれる部位は、遮断分子の機能的活性に重要である可能性が高い部位である。
【００６７】
遮断分子ＤＮＡはインビトロ合成によって得られる。ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡライブラリーまたは種々のＤＮＡのある種の他の混合物の内部にある遮断分子ＤＮＡの同定は、放射性同位体などの検出可能部分により標識したオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを用いることによって首尾良く行われる。ケラー（Ｋｅｌｌｅｒ）ら、「ＤＮＡプローブ（ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅｓ）」、ｐｐ．１４９〜２１３（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）を参照のこと。遮断分子ＤＮＡをコードするＤＮＡを同定するためには、ハイブリダイゼーションプローブが、他の種における同等な遮断分子ＤＮＡの相同体、または本命書に記載のそのバリアントもしくは誘導体をコードうるＤＮＡと、選択したハイブリダイゼーション条件下で選好的にハイブリダイズしうるように、ハイブリダイゼーションプローブのヌクレオチド配列を選択することが好ましい。遮断分子を入手するためのもう１つの方法は、例えばエンゲルス（Ｅｎｇｅｌｓ）ら、Ａｇｎｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ２８：７１６〜７３４（１９８９）により記載された方法の１つを用いる化学合成である。
【００６８】
例えばＤＮＡシークエンシングまたは制限エンドヌクレアーゼ分析による判定で、遮断分子のヌクレオチドコード配列の全体が単一のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは他のＤＮＡとして得られていなければ、適切なＤＮＡ断片（例えば、制限断片またはＰＣＲ増幅産物）を複数のＤＮＡから回収し、互いに共有結合させて全コード配列を構築してもよい。ＤＮＡ断片を共有結合させる好ましい手段は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼなどのＤＮＡリガーゼ酵素を用いる連結によるものである。
【００６９】
「単離された」遮断分子核酸とは、同定され、他のポリペプチドをコードする混入性核酸から分離された（または別の形式で実質的に遊離された）遮断分子核酸のことである。単離された遮断分子は、プラスミドもしくは発現ベクターに組み入れることができ、または本明細書のアッセイ法および核酸ハイブリダイゼーション法の考察の項でさらに説明する標識を用いてプローブ用の目的に標識することもできる。
【００７０】
本発明の求める結果が雌性機能が抑制された動物である場合には、遮断分子をインビトロで発現させ、単離し、精製した上で特定の生物に送達しうることは理解されると考えられる。送達の様式は、注射および摂取を含む任意の既知の手順であってよい。さらに、遮断分子を発現しうる本発明の構築物を、アデノウイルスのようなウイルスベクターによって送達してもよい。
【００７１】
部位特異的変異誘発は、遮断分子ＤＮＡなどのＤＮＡの置換、欠失および挿入バリアントを調製するのに好ましい方法である。この技法は当技術分野で周知であり；ゾラー（Ｚｏｌｌｅｒ）ら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． １００：４６６８〜５００（１９８３）；ゾラー（Ｚｏｌｌｅｒ）ら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． １５４：３２９〜３５０（１９８７）；カーター（Ｃａｒｔｅｒ）、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． １５４：３８２〜４０３（１９８７）；ホロビッツ（Ｈｏｒｗｉｔｚ）ら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． １８５：５９９〜６１１（１９９０）を参照、求める特定の機能的性質を有するバリアントであるトリプシンおよびＴ４リゾチームのアミノ酸配列バリアントの作製に用いられている。ペリー（Ｐｅｒｒｙ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６：５５５〜５５７（１９８４）；クレーク（Ｃｒａｉｋ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：２９１〜２９７（１９８５）。
【００７２】
簡潔に述べると、遮断分子ＤＮＡの部位特異的変異誘発を行う際には、求める変異をコードするオリゴヌクレオチドを遮断分子ＤＮＡの一本鎖とまずハイブリダイズさせることにより、遮断分子ＤＮＡを変化させる。ハイブリダイゼーションの後に、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、遮断分子ＤＮＡの一本鎖をテンプレートとして用いて、ＤＮＡポリメラーゼを用いて第２鎖全体を合成させる。こうすることで、求める変異をコードするオリゴヌクレオチドが、結果として得られる二本鎖ＤＮＡに組み入れられる。
【００７３】
ハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして用いるためのオリゴヌクレオチドは、天然ＤＮＡの精製またはインビトロ合成などの任意の適した方法によって調製しうる。例えば、オリゴヌクレオチドは、ナラング（Ｎａｒａｎｇ）ら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８：９０〜９８（１９７９）；ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８：１０９〜１５１（１９７９）；カルサー（Ｃａｒｕｔｈｅｒ）ら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４：２８７〜３１３（１９８５）により記載されたものなどの種々の技法を用いて容易に合成される。適したハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーを選択するための一般的なアプローチは周知である。ケラー（Ｋｅｌｌｅｒ）ら、「ＤＮＡプローブ（ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅｓ）」、ｐｐ．１１〜１８（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）。典型的には、ハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーは１０〜２５個またはそれ以上のヌクレオチドを含むと考えられ、オリゴヌクレオチドが一本鎖ＤＮＡテンプレート分子と選好的に確実にハイブリダイズするように、配列の一方の側に求める変異をコードする少なくとも５ヌクレオチドを含むと考えられる。
【００７４】
図に示したアミノ酸配列と比べてアミノ酸残基の複数の挿入、欠失または置換または組み合わせを含むアロマターゼ遮断分子のアミノ酸配列バリアントを作製するために、アロマターゼ遮断分子ＤＮＡに複数の変異を導入する。変異させる部位が密接した位置にある場合には、求めるすべての変異をコードする単一のオリゴヌクレオチドを用いて変異を同時に導入してもよい。しかし、変異させる部位が互いにある程度離れた位置にある（約１０ヌクレオチドよりも隔たっている）場合には、求める変化のすべてをコードする単一のオリゴヌクレオチドを作製することはより困難である。この代わりに、２つの代替的な方法のいずれかを用いうる。
【００７５】
第１の方法では、求める変異のそれぞれに対して別個のオリゴヌクレオチドを作製する。続いて、これらのオリゴヌクレオチドを一本鎖テンプレートＤＮＡと同時にアニーリングさせると、テンプレートから合成されたＤＮＡの第２鎖は求めるアミノ酸置換のすべてをコードすると考えられる。
【００７６】
もう１つの方法では、２回またはそれ以上の回数の変異誘発を用いて、求める変異体を作製する。１回目は単一の変異の導入に関して述べた通りである：あらかじめ調製したＤＮＡの一本鎖をテンプレートとして用いて、求める第１の変異をコードするオリゴヌクレオチドをこのテンプレートとアニーリングさせ、続いてヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子を作製する。２回目の変異誘発では、１回目の変異誘発で作製した変異ＤＮＡをテンプレートとして利用する。このため、このテンプレートはすでに１つまたは複数の変異を含んでいる。続いて、求める別のアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドをこのテンプレートとアニーリングさせると、結果として得られるＤＮＡ鎖は１回目および２回目の変異誘発の両方に由来する変異をコードすることになる。結果として得られたこのＤＮＡは、３回目およびそれ以降の変異誘発におけるテンプレートとして用いることができる。
【００７７】
ＰＣＲ変異誘発法も、ｚＢＭＰ２プロモーターおよび遮断分子のヌクレオチド配列バリアントを作製するのに適している。ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）、「ＰＣＲプロトコール（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、ｐｐ．１７７〜１８３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９０）；バレット（Ｖａｌｌｅｔｔｅ）ら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：７２３〜７３３（１９８９）。簡潔に述べると、少量のテンプレートＤＮＡをＰＣＲにおける出発材料として用いる場合には、テンプレートＤＮＡ中の対応する領域からの配列とは幾分異なるプライマーを用いて、プライマーがテンプレートと異なる位置のみでテンプレート配列とは異なる特定のＤＮＡ断片を比較的大量に作製することができる。プラスミドＤＮＡへの変異の導入のためには、例えば、変異の位置に一部重複して変異を含むようにプライマーの一方を設計する；もう一方のプライマーの配列はプラスミドＤＮＡの対向鎖内部のヌクレオチド配列と同一でなければならないが、この配列はプラスミドＤＮＡのどこに位置してもよい。しかし、第２のプライマーの配列は、プライマーが結合したＤＮＡの増幅領域全体の末端を容易にシークエンシングしうるように、第１のプライマーから２００ヌクレオチド以内にあることが好ましい。ここに述べたようなプライマー対を用いるＰＣＲ増幅により、プライマーによって特定される部位が異なり、およびおそらくは他の部位も異なる（これはテンプレートのコピーは幾分誤りが多いためである）、ＤＮＡ断片の集団が得られる。ワーグナー（Ｗａｇｎｅｒ）ら、「ＰＣＲのトピックス（ＰＣＲ Ｔｏｐｉｃｓ）」、ｐｐ．６９〜７１（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、１９９１）を参照のこと。
【００７８】
テンプレートと増幅されるＤＮＡ産物との比が極めて低い場合には、ＤＮＡ断片産物の大半に求める変異が組み入れられる。このＤＮＡ産物は、標準的な組換えＤＮＡ法を用いるＰＣＲテンプレートとして利用して、プラスミド中の対応する領域を置換するために用いられる。別の場所への変異を、第２の変異プライマーを用いることによって同時に導入することもでき、または異なる変異プライマーを用いる第２のＰＣＲを行い、結果として得られた２つのＰＣＲ断片を三者（またはそれ以上の）連結でプラスミド断片と同時に連結させることによって導入することもできる。
【００７９】
バリアントを調製するためのもう１つの方法であるカセット変異誘発法は、ウエルズ（Ｗｅｌｌｓ）ら、Ｇｅｎｅ、３４：３１５〜３２３（１９８５）により記載された技法に基づく。出発材料は、変異させるｍＡＲプロモーターまたは遮断分子ＤＮＡを含むプラスミド（または他のベクター）である。変異させるｍＡＲＯＭプロモーターまたは遮断分子ＤＮＡ中のコドンを同定する。同定された変異部位の両側に一意的な制限エンドヌクレアーゼ部位があることが必要である。このような制限部位が存在しない場合には、上記のオリゴヌクレオチドを介した変異誘発法を用いて、ｍＡＲプロモーターおよび遮断分子ＤＮＡの中の適切な位置にそれを作製してもよい。プラスミドＤＮＡをこれらの部位で切断して線状化する。制限部位の間のＤＮＡ配列をコードするものの、求める変異を含んでいる二本鎖オリゴヌクレオチドを、２つのオリゴヌクレオチド鎖を別個に合成した後に標準的な技法を用いてハイブリダイズさせる標準的な手順を用いて合成する。この二本鎖オリゴヌクレオチドはカセットと呼ばれる。このカセットを、それがプラスミドと直接連結しうるように、線状化プラスミドの両端と適合する５’および３’末端を有するように設計する。このプラスミドはこれで変異したｍＡＲプロモーターまたは遮断分子ＤＮＡ配列を含むことになる。
【００８０】
ｍＡＲプロモーターおよび遮断分子ＤＮＡを、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたはインビトロ合成の産物のいずれかを問わず、さらにクローニングを行うため、または発現のための複製可能なベクター中に連結する。「ベクター」とは、宿主細胞内で自律複製を行えるプラスミドおよび他のＤＮＡのことであり、このため、適合性のある宿主細胞と組み合わせて２つの機能を遂行するのに有用である（ベクター−宿主系）。機能の１つは、ｍＡＲプロモーターおよび遮断分子をコードする核酸のクローニング、すなわち、使用可能な量の核酸の生産を容易にすることである。もう１つの機能は、アロマターゼ遮断分子の発現を指令することである。これらの機能の一方または両方がベクター−宿主系によって遂行される。ベクターは、遂行する機能、さらにはクローニングまたは発現のために用いる宿主細胞に依存して種々の構成要素を含むと考えられる。
【００８１】
アロマターゼ遮断分子を産生させるための発現ベクターは、上記のアロマターゼ遮断分子をコードする核酸を含むと考えられる。本発明のアロマターゼ遮断分子を、組換え細胞培養物において直接発現させてもよく、または、異種ポリペプチド、好ましくは異種ポリペプチドとアロマターゼ遮断分子との間の接合部に特異的な切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドとの融合物として発現させてもよい。
【００８２】
組換え宿主細胞による発現の一例では、細胞にアロマターゼ遮断分子ＤＮＡを含む発現ベクターをトランスフェクトし、それによってコードされるアロマターゼ遮断分子を、組換え宿主細胞を増殖させた培地から回収する。しかし、本明細書に開示する発現ベクターおよび方法は、広範囲にわたる原核生物および真核生物に対する使用に適している。
【００８３】
原核生物は、本発明に有用なＤＮＡの初期クローニングおよびベクターの構築に用いうる。しかし、原核生物をアロマターゼ遮断分子によってコードされるｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のために用いてもよい。原核宿主細胞において産生されたポリペプチドはグリコシル化されていないことが一般的である。
【００８４】
単離されたＤＮＡのクローニングおよび発現のためには、宿主細胞と適合性のある種に由来する複製起点および他の制御配列を含むプラスミドまたはウイルスベクターを、原核宿主細胞とともに用いる。例えば、大腸菌の形質転換には、大腸菌種に由来するｐＢＲ３２２プラスミドを用いることが一般的である。ボリバル（Ｂｏｌｉｖａｒ）ら、Ｇｅｎｅ ２：９５〜１１３（１９８７）。ＰＢＲ３２２は、プラスミドによる形質転換を受けた細胞を容易に同定または選択できるように、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性用の遺伝子を含む。発現ベクターとしての役割を果たすためには、ｐＢＲ３２２プラスミドまたは他のプラスミドもしくはウイルスベクターは、宿主細胞内で働いて、プロモーターの下流に挿入されたＤＮＡのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物をもたらすプロモーターも含む、または含むように改変する必要がある。ランガグワラ（Ｒａｎｇａｇｗａｌａ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：４７７〜４７９（１９９１）。
【００８５】
原核生物のほかに、酵母などの真核微生物を、本発明に有用なＤＮＡのクローニングまたは発現のための宿主として用いてもよい。真核微生物として最もよく用いられるのは、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）すなわち一般的なパン酵母である。酵母細胞における求めるＤＮＡのクローニングまたは発現のために有用なプラスミドはよく知られており、酵母細胞内でｍＲＮＡ転写物を産生させる働きをする種々のプロモーターについても同様である。
【００８６】
さらに、多細胞生物に由来する細胞を、本発明に有用なＤＮＡのクローニングまたは発現のための粛として用いてもよい。最もよく用いられるのは哺乳動物細胞であり、この種の細胞のインビトロでの維持または増殖のための手順（こうした手順は一般に組織培養と呼ばれる）はよく知られている。クルーズ（Ｋｒｕｓｅ）＆パターソン（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ）編、「組織培養（Ｔｉｓｓｕｒｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ）」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９７７）。有用な哺乳動物細胞の例には、２９３、ＨｅＬａおよびＷＩ−３８などのヒト細胞系、ＣＯＳ−７およびＶＥＲＯなどのサル細胞系、ならびにＢＨＫ−２１およびＣＨＯなどのハムスター細胞系があり、これらはすべてアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２ ＵＳＡから公的に入手可能である。
【００８７】
発現ベクターは、クローニングベクターとは異なり、宿主生物によって認識される、アロマターゼ遮断分子核酸と機能的に結合したプロモーターを含む必要がある。プロモーターは、遺伝子の開始コドンの上流に位置し、その遺伝子の転写（すなわち、ｍＲＮＡの合成）を制御する非翻訳配列である。プロモーターは一般に、誘導性および構成性という２つの種類に分類される。誘導性プロモーターは、培養条件の何らかの変化、例えば、栄養素の有無または温度の変化に反応して、その制御下に置かれたＤＮＡの高レベルの転写を開始させるプロモーターである。
【００８８】
宿主細胞におけるアロマターゼの発現を遮断する目的でアロマターゼ遮断分子ＤＮＡと機能的に結合させうるプロモーターは、さまざまなものが知られている。天然のアロマターゼＤＮＡに付随するプロモーターを用いることができないというわけではない。しかし、異種プロモーターの方が一般に、より高度の転写をもたらし、発現されるアロマターゼの収量も多いと考えられる。
【００８９】
原核宿主に用いるのに適したプロモーターには、ラクタマーゼおよびラクトースのプロモーター、ゲッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４４〜５４８（１９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ゲッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ８：４０５７〜４０７４（１９８０）、およびｔａｃプロモーター、ドゥベール（ｄｅＢｏｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：２１〜２５（１９８３）などのハイブリッドプロモーターが含まれる。しかし、他の既知の細菌プロモーターも適している。それらのヌクレオチド配列は発表されており、シーベンリスト（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ）ら、Ｃｅｌｌ ２０：２６９〜２８１（１９８０）、それによって当業者は、必要な制限部位を与えるリンカーまたはアダプターを用いて、それらをＤＮＡと機能的に結合させることができる。ウー（Ｗｕ）ら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． １５２：３４３〜３４９（１９８７）を参照。
【００９０】
酵母宿主に用いるのに適したプロモーターには、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、ヒッツェマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）ら、Ｊ． ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５５：１２０７３〜１２０８０（１９８０）；キングスマン（Ｋｉｎｇｓｍａｎ）ら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． １８５：３２９〜３４１（１９９０）、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼなどの他の解糖酵素のものが含まれる。ドッドソン（Ｄｏｄｓｏｎ）ら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ ｒｅｓ． １０：２６２５〜２６３７（１９８２）；Ｅｍｒ、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． １８５：２３１〜２７９（１９９０）。
【００９１】
哺乳動物細胞において有用な発現ベクターには、一般に、ウイルスに由来するプロモーターが含まれる。例えば、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来するプロモーターがよく用いられる。さらに、アロマターゼをコードする天然のＤＮＡに付随するプロモーターまたは他の制御配列も、この種の制御配列が組換えＤＮＡ発現に用いる特定の宿主細胞内で作用するならば、利用することが可能であり、それが望ましいことがしばしばである。
【００９２】
プロモーターに加えて発現ベクターに望まれるその他の制御配列にはリボソーム結合部位があり、真核宿主細胞とともに用いる発現ベクターの場合にはエンハンサーがある。エンハンサーは通常約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性因子であり、プロモーターに作用して転写レベルを上昇させる。哺乳動物遺伝子（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリンの遺伝子）由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている。しかし、用いるエンハンサーは真核細胞ウイルス由来のものであることが一般的である。その例には、複製起点の後期側にあるＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ １００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。クリーグラー（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ）、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． １８５：５１２５２７（１９９０）を参照のこと。
【００９３】
発現ベクターが、転写終結のため、およびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のために必要な配列を含んでもよい。バルバス（Ｂａｌｂａｓ）ら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． １８５：１４〜３７（１９９０）；レビンソン（Ｌｅｖｉｎｓｏｎ）、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． １８５：４８５〜５１１（１９９０）。真核宿主細胞とともに用いる発現ベクターの場合には、このような転写終結配列を真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの非翻訳領域から入手してもよい。これらの領域はポリアデニル化部位ならびに転写終結部位を含む。バーンスタイル（Ｂｉｒｎｓｔｅｉｌ）ら、Ｃｅｌｌ ４１：３４９〜３５９（１９８５）。
【００９４】
一般に制御配列とは、特定の宿主細胞における機能的に結合したコード配列の発現のために必要なＤＮＡ配列のことである。「発現」とは、転写および／または翻訳のことを指す。「機能的に結合した」とは、配列が通常の機能を遂行しうるようにお互いが配置された状態で、酵素連結または他の手段により、２つまたはそれ以上のＤＮＡ配列を共有結合することを指す。例えば、プレ配列または分泌リーダー用のＤＮＡを、それがポリペプチドの分泌にかかわるプレタンパク質として発現される場合には、ポリペプチド用のＤＮＡと機能的に結合させる；プロモーターまたはエンハンサーを、それが配列の転写に影響するならば、コード配列と機能的に結合させる；または、リボソーム結合部位を、それが翻訳を促すような位置にある場合には、コード配列と機能的に結合させる。一般に、「機能的に結合した」とは、結合したＤＮＡ配列が連続性であり、分泌リーダーの場合には連続性かつリーディングフレーム内にあることを意味する。結合は好都合な制限部位での連結によって行う。このような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドのアダプターまたはリンカーを、標準的な組換えＤＮＡ法とともに用いる。
【００９５】
発現ベクターおよびクローニングベクターが、１つまたは複数の選択した宿主細胞におけるベクターの複製を可能にする配列を含むことも考えられる。一般にクローニングベクターでは、この配列はベクターが宿主染色体とは独立して分裂することを可能にするものであり、これは複製起点または自律複製配列を含む。このような配列はさまざまな細菌、酵母およびウイルスに関して知られている。プラスミドｐＥＲ３２２由来の複製起点はほとんどのグラム陰性細菌に適しており、２μプラスミドの起点は酵母に適し、種々のウイルス起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマまたはアデノウイルス由来のもの）は、哺乳動物細胞でのクローニングベクターに有用である。ほとんどの発現ベクターは「シャトル」ベクターであり、すなわちそれらは少なくとも１種類の生物で複製可能である上に、別の生物に発現のためにトランスフェクトすることができる。例えば、ベクターを大腸菌にてクローニングし、続いて同じベクターを、宿主細胞染色体と独立した複製が可能ではないとしても、酵母または哺乳動物細胞に発現のためにトランスフェクトすることができる。
【００９６】
発現ベクターが、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）のコード配列などの増幅可能な遺伝子を含んでも良い。ＤＨＦＲ遺伝子を含む発現ベクターを含む細胞は、ＤＨＦＲの競合的拮抗薬であるメトトレキサートの存在下で培養可能である。これによってＤＨＦＲ遺伝子の多数のコピーが、アロマターゼ遮断分子をコードするＤＮＡ配列などの、発現ベクターを構成する他のＤＮＡ配列の多数のコピーとともに合成される。リンゴールド（Ｒｉｎｇｏｌｄ）ら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｉ． Ｇｅｎｅｔ． １：１６５〜１７５（１９８１）。このようにして、細胞により産生されるアロマターゼ遮断分子のレベルを高めることもできる。
【００９７】
発現ベクターによってコードされるＤＨＦＲタンパク質を、トランスフェクションの成功に関する選択マーカーとして用いてもよい。例えば、形質転換前の宿主細胞にＤＨＦＲ活性がなければ、アロマターゼ遮断分子およびＤＨＦＲタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターによる形質転換が成功したことを、メトトレキサートを含む培地中での細胞増殖によって判定することができる。同じく、アロマターゼ遮断分子、ＤＨＦＲタンパク質およびアミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターによる形質転換を行った哺乳動物細胞を、カナマイシンまたはネオマイシンなどのアミノ配糖体抗生物質を含む培地中での細胞増殖によって判定することができる。真核細胞は内因性ＡＰＨ活性を通常は発現しないため、ＡＰＨタンパク質をコードする遺伝子（これは一般にｎｅｏｒ遺伝子と呼ばれる）は、ベクターによるトランスフェクションを受けた細胞を容易に同定または選択しうるような、広範囲の真核宿主細胞における優性選択マーカーとして用いうる。ヒメネス（Ｊｉｍｉｎｅｚ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、２８７：８６９〜８７１（１９８０）；コルベレ−ガラピン（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ）ら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１〜１４（１９８１）；オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）＆ベルグ（Ｂｅｒｇ）、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、３：２８０２８９（１９８３）。
【００９８】
アロマターゼ遮断分子を発現する組換え宿主細胞の同定および単離に用いうる選択マーカーは他にも数多く知られている。例えば、酵母で用いるのに適した選択マーカーは、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である。スティンチコーム（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ２８２：３９〜４３（１９７９）；キングスマン（Ｋｉｎｇｓｍａｎ） ら、Ｇｅｎｅ ７：１４１〜１５２（１９７９）；チェンパー（Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ）ら、Ｇｅｎｅ １０：１５７１６６（１９８０）。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファンの存在下での増殖能力がない酵母変異株、例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ． ４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２ ＵＳＡから入手可能）に対する選択マーカーとなる。ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８５：１２（１９７７）。酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔｒｐ１の欠陥の存在はさらに、トリプトファンの非存在下での増殖によって形質転換を検出するのに有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２が欠損した酵母株（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ２０６２２または３８６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
【００９９】
アロマターゼ遮断分子をコードするＤＮＡの一過性発現をもたらす発現ベクターは、本発明において特に有用である。一般に、一過性発現には、宿主細胞が発現ベクターの多数のコピーを蓄積し、続いて発現ベクターによってコードされる求めるポリペプチドを高レベルで合成するように、宿主細胞内で効率的に複製しうる発現を用いる。適した発現ベクターおよび宿主細胞を含む一過性発現系により、クローニングされたＤＮＡによりコードされるポリペプチドの陽性同定が首尾良く行えるようになるほか、このようなポリペプチドを望ましい生物的または物理的性質に関して迅速スクリーニングすることも可能になる。ヤン（Ｙａｎｇ）ら、Ｃｅｌｌ ４７：３〜１０（１９８６）；ウォン（Ｗｏｎｇ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：８１０〜８１５（１９８５）；リー（Ｌｅｅ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：４３６０〜４３６４（１９８５）。このため、一過性発現系は、機能的活性のあるバリアントを同定する目的で、アロマターゼ遮断分子のアミノ酸配列バリアントをコードするＤＮＡを発現させるために本発明で特に有用である。
【０１００】
アロマターゼ遮断分子のアミノ酸配列バリアントの特徴を前もって予測することは困難なことが多いため、機能的活性のあるものを同定するためにこの種のバリアントの何らかのスクリーニングが必要なことは理解されると考えられる。このようなスクリーニングは、受容体結合に関するルーチン的なアッセイまたは細胞増殖、細胞分化もしくは細胞生存に関するアッセイを用いて、またはアロマターゼ遮断分子と選択的に結合して機能的活性のあるアロマターゼ遮断分子に影響を及ぼすモノクローナル抗体、例えばアロマターゼ遮断分子の活性部位または受容体結合部位と選択的に結合するモノクローナル抗体を用いるイムノアッセイを用いて、インビトロで行ってもよい。
【０１０１】
本明細書で用いる「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、プラスミドまたは発現ベクターなどの望ましい核酸を宿主細胞に導入するプロセスのことを指す。宿主細胞の性質に応じて、さまざまな形質転換およびトランスフェクションの方法を用いることができる。大腸菌細胞の場合、最も一般的な方法では、細胞を塩化カルシウムおよび他の塩の水溶液で処理する。哺乳動物細胞の場合、最も一般的な方法は、リン酸カルシウムもしくはＤＥＡＥデキストランを介したトランスフェクション、または電気穿孔である。サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、ｐｐ． １．７４〜１．８４および１６．３０〜１６．５５（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）。形質転換またはトランスフェクションの後には、望ましい核酸が宿主細胞ゲノムに組み込まれるか、または染色体外因子として存在すると思われる。
【０１０２】
上記のプラスミドおよび発現ベクターによる形質転換またはトランスフェクションを受けた宿主細胞を、プロモーターの誘導のため、または薬剤耐性もしくは他の選択マーカーもしくは表現型に関する選択のために適するように変更した従来の栄養培地中で培養する。温度、ｐＨなどの培養条件は、クローニングまたは発現に用いる宿主細胞の培養のために以前から用いられているものが適しており、これらは当業者には明らかであると考えられる。
【０１０３】
本明細書のベクターのクローニングまたは発現に適した宿主細胞は、原核生物、酵母、ならびに昆虫、カキ、下等脊椎動物および哺乳動物宿主細胞を含む、高等真核生物のものである。適した原核生物には、グラム陰性菌またはグラム陽性菌などの真正細菌、例えば大腸菌、枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｉｉｌｉｓ）などのバチルス属、緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）などのシュードモナス属、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）または霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）が含まれる。
【０１０４】
原核生物のほかに、糸状菌または酵母などの真核微生物も、遮断分子をコードするベクターのために適した宿主である。出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または一般的なパン酵母は、下等真核宿主微生物の中で最もよく用いられている。しかし、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ビーチ（Ｂｅａｃｈ）およびナース（Ｎｕｒｓｅ）、Ｎａｔｕｒｅ ２９０：１４０〜１４２（１９８１）、ピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クレッグ（Ｃｒｅｇｇ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：４７９〜４８５（１９８７）；スレクリシュナ（Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８：４１１７〜４１２５（１９８９）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ケース（Ｃａｓｅ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７６：５２５９〜５２６３（１９７９）、ならびに、偽巣性コウジ菌（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ）、バランス（Ｂａｌｌａｎｃｅ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｉｎｍｕｎ． １１２：２８４〜２８９（１９８３）；ティルバーン（Ｔｉｌｂｕｒｎ）ら、Ｇｅｎｅ ２６：２０５〜２２１（１９８３）；イェルトン（Ｙｅｌｔｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：１４７０〜１４７４（１９８４）および黒色アスペルギルス（Ａ． ｎｉｇｅｒ）、ケリー（Ｋｅｌｌｙ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ． ４：４７５〜４７９（１９８５）などのアスペルギルス宿主といった、さまざまな他の属、種および菌株もよく用いられており、本明細書において有用である。
【０１０５】
アロマターゼ遮断分子の発現のために適した宿主細胞には、多細胞細胞生物に由来するものもある。このような宿主細胞は、複雑なプロセシングおよびグリコシル化の活動を行うことができる。原則的に、脊椎動物または無脊椎動物の培養物にかかわらず、任意の高等真核細胞培養物が使用可能である。しかし、グリコシル化の種特異性、組織特異性および細胞特異性のために、ラーデマッハー（Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒ）ら、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５７：７８５〜８３８（１９８８）、外来性宿主細胞におけるＨｏｘＣＧのグリコシル化の程度またはパターンは、自然下で発現される細胞から入手したアロマターゼ遮断分子のものとは異なると考えられる。
【０１０６】
無脊椎動物細胞の例には、昆虫および植物の細胞が含まれる。さまざまなバキュロウイルス株および変異株、ならびにそれらに対応する、ヨトウガ（ケムシ）、ネッタイシマカ（カ）、ヒトスジシマカ（カ）、キイロショウジョウバエ（ショウジョウバエ）およびカイコガ宿主細胞などの宿主由来の許容される昆虫宿主細胞が同定されている。ラクコウ（Ｌｕｃｋｏｗ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７〜５５（１９８８）；ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、「遺伝子工学（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」第８巻、ｐｐ．２７７〜２７９（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、１９８６）；マエダ（Ｍａｅｄａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：５９２〜５９４（１９８５）。
【０１０７】
ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマトおよびタバコなどの植物細胞培養物を宿主として利用することができる。一般的には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌のある種の菌株とインキュベートすることによって植物細胞のトランスフェクションを行う。植物細胞とＡ．ツメファシエンス（Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）とのインキュベーション中に、ＤＮＡが細胞内に移行して細胞がトランスフェクトされ、導入されたＤＮＡ適切な条件下で発現されるようになる。加えて、ノパリン合成酵素のプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列ならびにリブロース二リン酸カルボキラーゼのプロモーターなどのように、植物細胞との適合性のある調節配列およびシグナル配列を用いることもできる。デピッカー（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ）ら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｉ． Ｇｅｎ． １：５６１〜５７３（１９８２）。ヘレラ−エストレラ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１０：１１５〜１２０（１９８４）。さらに、Ｔ−ＤＮＡ ７８０遺伝子の上流から単離したＤＮＡセグメントは、組換えＤＮＡを含む植物組織において、植物で発現可能な遺伝子の転写レベルを活性化または上昇させることができる。欧州特許第３２１，１９６号（１９８９年６月２１日に発行）。
【０１０８】
しかし、最も関心が高いのは脊椎動物細胞であり、培養（組織培養）下で脊椎動物細胞を増殖させることは近年ではルーチン的な手順となっている。クルーズ（Ｋｒｕｓｅ）＆パターソン（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ）編、「組織培養（Ｔｉｓｓｕｒｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９７３）。有用な哺乳動物宿主細胞の例には、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎細胞系（懸濁培養下での増殖用にサブクローニングされた２９３細胞）、グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら、Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ． ３６：５９〜７２（１９７７）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＤＨＦＲが欠損したＣＥＯ細胞を含む、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６〜４２２０（１９８０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ２３：２４３〜２５１（１９８０）；サル腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、３８３：４４〜６８［１９８２］）；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）がある。
【０１０９】
アロマターゼ遮断分子および適切な制御配列をコードするヌクレオチド配列を含む適したベクターの構築には、標準的な組換えＤＮＡ法を用いる。ＤＮＡを切断して断片化し、適合させた上で、必要なベクターが生じる望ましい形態で互いに連結させる。
【０１１０】
ベクター中に正しい配列が構築されたことを確認する分析のためには、ベクターを、制限消化（ベクター中の予想される制限エンドヌクレアーゼの存在を確認するため）および／またはサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７２：３９１８〜３９２１（１９７９）のジデオキシチェーンターミネーター法によるシークエンシングによって分析する。
【０１１１】
本発明のアロマターゼ遮断分子を産生させるために用いる細胞は、さまざまな培地中で培養しうる。宿主細胞の培養には、ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＮ、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が適している。さらに、ハム（Ｈａｍ）ら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． ５８：４４〜９３（１９７９）；バーンズ（Ｂａｒｎｅｓ）ら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０２：２５５〜２７０（１９８０）；ボッテンシュタイン（Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎ）ら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． ５８：９４〜１０９（１９７９）；米国特許第４，５６０，６５５号；第４，６５７，８６６号；第４，７６７，７０４号；もしくは第４，９２７，７６２号；またはＰＣＴ特許公報・国際公開公報第９０／０３４３０号（１９９０年４月５日に発行）に記載された培地の任意のものを、宿主細胞のための培地として用いてよい。これらの培地の任意のものに対して、必要に応じてホルモンおよび／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリンまたは上皮増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質、微量元素（通常、最終濃度がマイクロモル濃度の範囲として存在する無機化合物と定義される）、およびグルコースまたは等価なエネルギー源を補充してもよい。任意の他の必要な補助添加物質を、当業者に知られていると考えられる適切な濃度で含めてもよい。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現用に選択した宿主細胞に以前から用いられているものであり、当業者には明らかであると考えられる。
【０１１２】
本開示において言及する宿主細胞には、培養インビトロの培養下にある細胞のほかに、例えば移植またはインプランテーションの結果として、宿主動物の体内にある細胞も含まれる。
【０１１３】
さらに、例えばＰＣＴ特許公報・国際公開公報第９１／０６６６７号（１９９１年５月１６日に発行）に記載されたように、本発明のアロマターゼ遮断分子を相同組換えによって作製してもよいと考えている。簡潔に述べると、この方法では、アロマターゼ遮断分子をコードする内因性遺伝子を含む細胞に対して、（１）ＤＨＦＲなどの増幅可能な遺伝子、および（２）長さが少なくとも約１５０塩基対であり、細胞ゲノム中でアロマターゼ遮断分子をコードする遺伝子の内部または近傍にあるヌクレオチド配列と相同な、少なくとも１つの隣接配列、を含む相同ＤＮＡをトランスフェクトする。形質転換は、相同ＤＮＡが組換えによって細胞ゲノムに組み込まれる条件下で行う。続いて、相同ＤＮＡが組み込まれた細胞を、増幅可能な遺伝子が増幅され、それに伴ってアロマターゼ遮断分子の遺伝子が増幅される選択条件下におく。その結果得られた細胞を、求める量のアロマターゼ遮断分子の産生に関してスクリーニングする。アロマターゼ遮断分子をコードする遺伝子の近傍にある隣接配列は、例えば、配列番号：８および配列番号：１３に示したアロマターゼ遮断分子のヌクレオチド配列を出発点として用いるゲノムウォーキング法により、容易に同定される。スポーレル（Ｓｐｏｅｒｅｌ）ら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． １５２：５９８〜６０３（１９８７）を参照。
【０１１４】
遺伝子増幅および／または遺伝子発現は、例えば、ＤＮＡを定量化するための従来のサザンブロット法により、またはｍＲＮＡを定量化するためのノーザンブロット法により、本明細書に提供した配列に基づく、適切に標識されたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを用いて、試料中にある状態で直接測定しうる。種々の標識を用いることができ、放射性同位体、特に３２Ｐを用いることが最も一般的である。しかし、ポリヌクレオチドへの導入用にビオチン修飾ヌクレオチドを用いるといった、他の技法を用いてもよい。ビオチンは後にアビジンまたは抗体との結合部位としての役割を果たすが、後者を放射性同位体、蛍光団、発色団などのさまざまな標識で標識してもよい。または、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む特異的な二重鎖を認識しうる抗体を用いてもよい。これらの抗体を続いて標識した上で、二重鎖を表面に対して結合させて表面に二重鎖が形成されると二重鎖に結合した抗体の存在が検出されるようなアッセイを行ってもよい。
【０１１５】
または、遺伝子発現を、遺伝子産物の発現を直接定量化するための、組織切片の免疫組織化学染色および細胞培養物または体液のアッセイなどの免疫学的な方法によって測定することもできる。免疫組織化学染色法の場合いは、細胞試料を一般的には脱水および固定によって調製した後に、結合させる遺伝子産物に対して特異的な標識抗体と反応させる（抗体は通常、視覚的に検出可能なもの、例えば酵素標識、蛍光標識、発光性標識などである）。本発明に用いるのに適した特に感度の高い染色法は、スー（Ｈｓｕ）ら、Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈ． ７５：７３４〜７３８（１９８０）に記載されている。免疫組織化学染色および／または試料液のアッセイのために有用な抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。本明細書に提供するＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対する抗体を調製することが好都合である。
【０１１６】
本明細書の説明および特許請求の範囲の全体を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、ならびに「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」といったこの用語の変形物は、「非制限的に含む」ことを意味しており、他の添加物、成分、整数または段階を除外することを意図したものではない。
【０１１７】
ここで、以下の非制限的な実施例のみを参照することにより、本発明をさらに説明する。しかし、以下の実施例は例示的なものに過ぎないことが理解される必要があり、いかなる形でも上記の本発明の一般性を制限するものとみなされるべきではない。本明細書で言及するアミノ酸配列は、標準的な一文字表記で表している。
【０１１８】
実施例１　有害動物の存在量を制御するための性分化構築物の有効性の評価　
Ａ．メンデル遺伝モデル
有害生物集団の性比に影響を及ぼし、それによって有害生物の存在量に影響を及ぼすという本発明の有効性を明らかにすることを目的として、本出願者らは、導入した性分化構築物（ＳＤＣ）、すなわち、表現型性別を決定する構築物の効果を評価するためのメンデル遺伝モデルを用いた。本モデルは、構築物が安定であって染色体に組み込まれること、ＳＤＣの１つのコピーが遺伝子型の性別とは無関係に雄性をもたらすこと、および、トランスジェニック魚が集団内では稀であり、このためすべての交雑は野生型の雌に対するものであることを仮定している。
【０１１９】
任意の染色体対上でＳＤＣに関してホモ接合性である雄の導入により、Ｆ１世代では１００％雄が生じる。ＳＤＣが染色体に組み込まれておらず、次の世代にプラスミドとして伝達される親の魚でも、発現パターン次第では同じことが成り立つ。
【０１２０】
第２に、以後の世代の性比はＦ１個体におけるＳＤＣの数に依存する。詳細には、すべての交配で染色体のランダムな組み合わせが起こると仮定すると、世代Ｋ＋１におけるＳＤＣを有する染色体の数の分布は、形式（ａ＋ｂ）Ｎ（ここでＮは世代Ｋの各々の雄におけるＳＤＣを有する染色体の数に等しく、ａおよびｂは１である）に世代ＫにおいてＮ＝０、１、２、３、４．．．Ｎｍａｘを保有する雄の数をかけた二項分布である。Ｎ＝４とした場合の雄の子孫のタイプの比は、ＳＤＣを持たない子孫（このため雌である）が１、１つのコピーを保有するものが４、２つを保有するものが６、３つを保有するものが４、４つのコピーを保有するものが１であり、性比は１５／１となる（雄が９４％）。次の世代では、ＳＤＣの１つのコピーを保有する４匹の雄から生じる性比は５０：５０となり、２つのコピーを保有する６匹の雄からはＮ＝０、１および２のそれぞれに関して１：２：１の比で子孫が生じ、３つのコピーを保有する４匹からはＮ＝０、１、２および３のそれぞれに関して１：３：３：１の比で子孫が生じ、４つのコピーを保有する１匹の雄からはＮ＝０、１、２、３および４のそれぞれに関して１：４：６：４：１の比で生じると考えられる。第２世代におけるＳＤＣ数の累積分布は、Ｎ＝０、１、２、３および４のそれぞれに関して１５：３２：１０：５：１であり、性比は４８／１５となる（雄が７６％）。
【０１２１】
第３に、すべての交配が野生型の雌（Ｎ＝０）とのものであるため、平均Ｎは各世代で減少し、その係数は約２である。エンドポイントは平均が１未満となることであり、それから以降の世代では天然の性染色体の支配的な影響のために性比は５０：５０をわずかに上回る程度となる。しかし、Ｎの分布はゼロで切り捨てられるため、各世代での性比の５０：５０に向かう低下は緩徐であり、漸近的に５０：５０へと近づく。
【０１２２】
各世代における集団平均に関するＮの非対称的分布の影響を図１に示す。放流した個体は３２本の染色体（２本の性染色体を含む）を含み、３２本のすべてにＳＤＣを有する、すなわち、それらは１６対の染色体対のすべてでＳＤＣに関してホモ接合性であると仮定する。すべての交配は野生型雌とのものである。Ｆ１ではすべての子孫が１６個のＳＤＣを保有するため、１００％が雄である。予想された通り、以後の各世代におけるＳＤＣを有する染色体の平均数は、Ｆ３では約８に減少し、Ｆ４では４をわずかに上回る。しかしその後、平均１に向かっての低下は、左方への歪曲および以後の世代からのＮ＝０個体の消失（それらは雌であるため）のために劇的に緩徐になる。
【０１２３】
性比に対する影響を図２に示しており、ここでは、２、４、８および１６対のホモ接合性対（それぞれＮ＝４、８、１６および３２）を保有する個体を放流した場合に以後の世代で生じた雄の割合を比較している。検討した中で最多のＮ（３２）では、Ｆ４に至る際に生じた全子孫の９９％が雄であり、Ｆ７に至る際には雄が９０％を上回り、Ｆ１０でも依然として雄が８４％と偏っている。染色体数が多い種（例えば、コイ）では、ＳＤＣの多数のコピーを大半またはすべての染色体に載せることにより、全滅させるために必要な世代数からみて有効な「無限の」コピー数が得られ、１０世代を上回れば雄が１００％またはそれに近い程度に雄への偏りが生じる。
【０１２４】
実施例２　有害動物の存在量を制御するための性分化構築物の有効性の評価　
Ｂ．集団モデル
性決定構築物の導入が有害生物集団の生存に及ぼす影響を評価するために、本発明者らはよく知られた有害生物（コイ、Ｃｙｐｒｉｎｕｓ ｃａｒｐｉｏ）の現実的な集団モデルに対する構築物を開発し、その能力を評価した。本モデルはエクセル（Ｅｘｃｅｌ）を用いて実行し（図３）、これには以下の特徴を組み込んだ：
【０１２５】
生殖能力のある雌の開始時点での数（ｔ０での）は稚魚の収容力によって決定し、その後に自然死亡率または捕獲率によって修正した。
【０１２６】
ｔ０の時点での性比は５０：５０とする。
【０１２７】
環境収容力は稚魚１０００匹とする。
【０１２８】
各年の新たな加入体の自然（補充していない）数は、リッカーの放流−加入の関係により、収容力からみた成魚の数に基づいて決定した。リッカー曲線の形状は、２つの主要なパラメーターを変更することによって改変しうる。
【０１２９】
例示を目的として、最初の試行では、環境変動によって生じる加入率および死亡率の年次変動はないものと仮定した。
【０１３０】
性成熟の年齢は２歳と設定した。
【０１３１】
死亡率は年齢特異的であり、稚魚および成魚の生活史の時期とは無関係に変動する可能性があると考えられる。死亡率が９９％となる年齢は１０歳に設定した。
【０１３２】
魚釣りによる死亡率は、自然死亡率とは無関係に変動する可能性があると考えられ、変動を伴うサイズ（年齢）依存性とした。
【０１３３】
ＳＤＣを保有する個体は加入体（ｒｅｃｒｕｉｔ）として放流する。
【０１３４】
ＳＤＣの効果は、雌の遺伝子型を不妊化させること、またはそれらを機能を備えた雄に転換させることであると設定しうる。
【０１３５】
モデルの目的から、ＳＤＣの効果は放流後のＮ世代にわたって雄を１００％生じさせることであり、Ｎは１〜５の範囲であるとした。Ｎ＋１では、子孫の性比は直ちに５０：５０に低下するものとした。実施例１に基づくならば、これは、ＳＤＣを有する染色体を多数備えた個体の放流が集団の性比に及ぼす効果に対する控えめな評価である。このため、本モデルは控えめなものである。
【０１３６】
本モデルに対して指定した一般的なパラメーター値を図３に示しており、これらはモデル種として採用したコイに関する最良の推定値である。多数の異なるシナリオの下でこのモデルを動作させ、種々の異なる放流方式、放流魚の種々のＳＤＣコピー数（＝性比が野生型の１：１に戻るまでの世代数）の併用効果、捕獲の影響、モデル能力の環境変動の影響、および雌の不妊化のみを引き起こした（それらを機能を備えた雄にさせるのではない）構築物と対比したＳＤＣの効果を検討した。
【０１３７】
モデルの主な結果を図４〜８に示す。
【０１３８】
Ｎ＝５世代のＳＤＣのコピーを保有する２５匹（自然加入率２．５％）、１５０匹（５％）および１００匹（１０％）の稚魚を毎年追加することが、以後の５０年にわたる集団性比、加入率および成魚集団数に及ぼす影響を、図４に示している。ＳＤＣ保有稚魚の導入は、標的集団の自然加入率の長期的な低下を引き起こし、その率は放流魚の数が増えるに伴って増加する。この影響は集団内に残る雌の数の減少によるものであり、その結果としての加入率の低下はリッカーの放流−加入関係の非線形性により約１０年にわたって緩衝される。放流−加入の関係を線形化すると、自然加入率および成魚数の即時的かつ急激な減少が生じる（提示していないシミュレーションの結果）。天然コイ集団の最良推定値である生物学的パラメーターの下で、毎年５０匹のＳＤＣ保有稚魚を放流し、加入率および成魚死亡率の空間動態および自然変動による不可避な複雑化を無視すると（以下の考察を参照）、標的集団は放流から約５０年で絶滅する。毎年放流するＳＤＣ保有稚魚の数を１００匹に増やすと（自然加入率１０％）、標的種が絶滅するまでの期間は短くなる。
【０１３９】
標的集団サイズの減少の速度および程度は、以後の各世代における性比に対するコピー数の影響に基づいて予想される通り、ＳＤＣコピー数によって変化する（図５）。最も低いレベルとして、ＳＤＣの影響が放流世代（Ｎ＝０）のみに限定されると仮定すると、５％の自然加入率（例えば、５０匹のＳＤＣ保有稚魚）で毎年放流することにより、自然加入率は累積的に約７％抑制され、集団の性比は雌１匹当たり雄約１．１匹へと長期的に推移するが、集団サイズに対する影響は無視しうる程度である（非線形的な放流−加入率関係の緩衝効果のため）。Ｆ１の子孫がすべて雄（すなわちＮ＝１世代）となることを実現するためにＳＤＣのコピー数を増やすと、加入率は徐々に低下して５０年後には最初の約８０％となり、集団の性比はＮ＝０世代のＳＤＣによって生じるものを幾分上回るのみであり、親バイオマスは長期的かつ緩徐に減少する。ＳＤＣ保有魚の放流の影響は、Ｎ＝３およびＮ＝５の世代ではるかに顕著である。放流からそれぞれ３世代および５世代にわたる雄の側に大きく偏った性比の蓄積効果により、各世代における雄の数は指数的に増加し、その結果として集団の性比は急激に高まり、自然加入率および成魚集団数の減少速度は急となる。
【０１４０】
Ｎ＝５世代のＳＤＣの影響を、遺伝上の雌を機能を備えた雄には転換させず雌の不妊化のみを引き起こす同等な構築物によるものと比較することにより、高コピー数による相乗効果も示された（図６）。５０匹の稚魚を毎年放流すると、ＳＤＣが雌を雄に転換させる場合には、成魚数の減少率は５０年で９０％を上回るが、構築物が雌の不妊化させるのみである場合は約３０％の減少に過ぎない。いずれの場合にも放流計画のエンドポイントは標的集団の絶滅であるが、雌を雄保有体に転換することによって生じる集団では雄保有体の数の増加による累積効果のために減少速度は大きく高まる。しかしながら、伴性的な繁殖不能性をもたらす構築物によっても有害生物の防除を達成することができる。
【０１４１】
集団の減少速度を、野生型の雄および雌を標的集団から捕獲すること、または別の形式で除去することによって高めることもできる（図７）。毎年の少量の捕獲（成魚の約１．４％を毎年除去）（例えば、大きな成魚を標的とする選択的漁獲による）で、モデル化した系では絶滅までの期間が１０年以上も短縮される；漁獲圧を「中等度」レベル（約５．３％を毎年除去）に強化すると絶滅までの期間はさらに１０〜１５年短縮される。
【０１４２】
毎年の捕獲による影響は、例えば干魃によって引き起こされる、成魚の自然死亡率の大きな変動率から予想されるものと類似している。野生型の成魚が系から除去される速度を高める任意の要因は、放流−加入関係によって標的集団が雌の数の減少の影響を緩衝する能力を低下させることにより、消失速度を高める。同様に、消失速度は自然加入率と対比したＳＤＣ保有稚魚の放流数にも依存する。これは図８に示されており、ここでは自然加入率を南方振動指数（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ）の線形関数として変動させている（雨量の少ない年＝加入率が低い、これは野外観測と一致する）。放流率は人為的な繁殖計画であるため一定に保つことができるが、自然加入率は環境条件に依存して変動する。このため、放流率を自然加入率の５％とすると、加入率の高い年では例外的に自然加入率の低い年の１０００％を上回る可能性があり、その影響でＳＤＣを保有する雄の繁殖成功率およびその結果としての雌集団の減少速度が急激に高くなる。
【０１４３】
自然界では、集団の減少速度は空間動態にも依存すると考えられるが、これはこれらが遺伝子拡散およびＳＤＣの波及の速度に影響するためである。放流方式は波及速度が最大となるように最適化することができる。集団間の遺伝子拡散の制限が長期的生存度に及ぼす影響は、遺伝子交換の速度およびＳＤＣのコピー数に依存する。コピー数が少なく、遺伝子拡散が少なければ、周辺集団に対する影響はわずかであると考えられる；この値の一方または両方が高ければ、周辺集団は放流集団とほぼ同じ消失速度にさらされると考えられる。コピー数および遺伝子拡散の集団減少に対する相互作用のために、放流動物におけるコピー数は、必要に応じて標的手段に対する影響が最大限に保ったままで、周辺集団に対する放流の影響が最小となるように調整することができる。これが望ましいと思われる一例は、北米五大湖における侵害性のヤツメウナギ集団の防除のためにＳＤＣを用いることであり、低コピー数の個体を五大湖に放流することで、北大西洋の在来性のヤツメウナギ集団に対するリスクを最小限に抑えながら、ヤツメウナギを局地的に減少させ、可能性としては絶滅させることもできると思われる。
【０１４４】
実施例３　動物の性決定におけるアロマターゼの役割
アロマターゼは、検討されたすべての脊椎動物でＣ１９ステロイド（アンドロゲン）をＣ１８ステロイド（エストロゲン）に変換する酵素である（Ｏｚｏｎ、１９７２）。特に、アロマターゼは両性分化能のある胚または幼態の生殖腺（脊椎動物では初期状態が雄である）に作用し、雄性ホルモン（アンドロゲン）を雌性ホルモン（エストロゲン）に変換し、生殖腺の発生を卵巣経路に移行させる。アロマターゼは、腹足類（Ｏｂｅｒｄｏｓｔｅｒ、１９９７；Ｍａｔｔｊｉｅｓｓｅｎ ＆ Ｇｉｂｂｓ、１９９８）、二枚貝（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、１９９７）および棘皮動物（Ｈｉｎｅｓら、１９９２）を含むさまざまな無脊椎動物類における性決定に重要な酵素であるとも考えられている。
【０１４５】
アロマターゼ活性は、水中（水棲動物の場合）または飼料中に特異的かつ非可逆的な阻害剤（特に４−ヒドロキシアンドロステンジオンおよび１，４，６−アンドロスタトリエン−３−１７−ジオン）を添加することにより、化学的に阻害することができる（表１の参考文献を参照）。下等脊椎動物（魚類、両生類および爬虫類）におけるアロマターゼ阻害は遺伝上の雌の部分的または完全な雄性化を引き起こし、同腹仔の表現型性別に最大１００％が雄であるとの偏りを生じる。このような下等脊椎動物では、雄性化した雌は、遺伝的な性別は異なるものの、完全な機能を備え、生殖能力があり、外見上も正常な雄である（Ｐｉｆｅｒｒｅｒら、１９９４）。アロマターゼ阻害剤による短期間の処理は、雄が支配的な同腹仔を産ませるために養殖魚業者が用いている標準的な方法である（大きな生殖腺を形成するためのエネルギーを投じないため、雄は雌よりも価値が大きい）。高等脊椎動物（鳥類）におけるアロマターゼの阻害は、正常な雌生殖腺形成が破壊されることによる雌の不妊化をもたらす（Ｓｈｉｍａｄａら、１９９６）。同様の影響は、ベッティン（Ｂｅｔｔｉｎ）ら（１９９６）により軟体動物（腹足類）でも示されている。腹足類におけるアロマターゼの阻害が機能を備えた雄をもたらすか否かは不明であるが、少なくとも１つの種では高レベルのトリブチルスズ汚染（これは芳香族化を競合的に阻害すると考えられている）が少なくとも初期造精組織の発生を引き起こす（Ｇｉｂｂｓら、１９８８）。哺乳動物では、アロマターゼはさまざまな生理的活動に関与しており、その阻害は広範囲にわたる生理的機能不全をもたらすと考えられる。
【０１４６】
アロマターゼ阻害に対する表現型性別の感受性は、生殖腺形成の一連の発生過程に起因して時期特異的である。ピフェラー（Ｐｉｆｅｒｒｅｒ）ら（１９９４）は、魚の胚（サケ）を水溶性アロマターゼ阻害剤で２時間処理しただけで、この場合には卵から５０％が孵化した３日後に、雄が９８％にも達する偏りが生じたことを示している。
【表１】アロマターゼ阻害が表現型性別に影響を及ぼすことが示された種
2004511226.tif 000002
【０１４７】
実施例４　ゼブラフィッシュおよびメダカの飼育プロトコール
ゼブラフィッシュの繁殖および飼育のプロトコールは一般にウェスターフィールド（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ）（１９９５）に従い、メダカについてはヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）（１９７５）に従った。ゼブラフィッシュは現地のペットショップから購入した；しかし、当業者はゼブラフィッシュを世界中の研究所（例えば、神経科学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ、ＵＳＡ）からも同じく入手しうることを理解すると考えられる。メダカの１ｆ系統は東京大学生物科学部門（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｋｙｏ）から入手した。メダカおよびゼブラフィッシュはいずれも２７〜２８℃の循環流システムの下で屋内飼育した。胚は自然交配によって入手し、胚用培地（Ｅｍｂｒｙｏ Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ、１９９５）に移し、２６〜２７℃の卓上インキュベーター中で３〜４日齢となるまでインキュベートした。続いてそれらを２７〜２８℃に保った養殖用水槽に移し、市販の微粒状魚餌（Ｔｅｔｒａｍｉｎ）および生きたアルテミア（Ａｒｔｅｍｉａ）を与えて飼育した。約３カ月後に、魚を標準的な魚用水槽に移して成魚と並べた。成魚には魚餌を毎日与え、新たに孵化したまたは凍結したアルテミアを時折与えた。
【０１４８】
実施例５　メダカ卵巣シトクロムＰ４５０アロマターゼプロモーターの単離およびＧＦＰ発現ベクターの構築
提唱した構築物用のプロモーターおよび／または遺伝子の良い候補を同定するために、本出願者らは、脊椎動物および無脊椎動物の双方から多数の動物を検討した。最終的に、本出願者らは詳細に研究されている魚類のモデルであるゼブラフィッシュ（Ｂｒａｃｈｙｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）およびメダカ（Ｏｒｙｚｉａｓ ｌａｔｉｐｅｓ）に決定した。これらの魚類モデルを選択した理由は、特徴がかなり調べられていて、小型であり、繁殖および飼育が比較的容易なためである。さらに、メダカの性決定機構（ＸＸ／ＸＹ、雄は異型配偶子）は詳細に記載されているため、これは性比の操作を検討する上で理想的なバックグラウンドをなしている。
【０１４９】
キンギョの脳および卵巣では２種類の全く異なるＰ４５０アロマターゼ転写物が発現されており、このことは魚類ではヒトと異なり、少なくとも２つの遺伝子座がＰ４５０アロマターゼをコードすることを意味する（ＴｃｈｏｕｄａｋｏｖａおよびＣａｌｌａｒｄ、１９９８）。また、このことは、Ｐ４５０アロマターゼ遺伝子座のそれぞれが別々のセットの組織特異的調節因子によって調節されることを意味する。雌の子孫と推定されるものにおいてＰ４５０アロマターゼ遮断物質を作動させるために天然の卵巣特異的プロモーターを用いることにより、雄性化／不妊化をもたらす空間的かつ時間的な同調性が確保されるはずである。
【０１５０】
メダカ卵巣Ｐ４５０アロマターゼプロモーターは、メダカゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲによって増幅した。発表されている（ｇｅｎｅｂａｎｋ寄託番号Ｄ８２９６９）メダカ卵巣Ｐ４５０アロマターゼ遺伝子に基づいてプライマーを設計した。
【０１５１】
メダカ卵巣Ｐ４５０アロマターゼプロモーターの増幅に用いたプライマーは以下の通りである：
順方向プライマー（ｍＡｒｏｍ５’／１Ｆ）
2004511226.tif 000003
逆方向プライマー（ｍＡｒｏｍ５’／１１７０Ｒ）
2004511226.tif 000004
【０１５２】
増幅産物の５’および３’末端にそれぞれＳａｃＩ部位およびＫｐｎＩ部位があるようにプライマーを設計した。増幅の後に１１７０ｂｐの産物をＳａｃＩおよびＫｐｎＩで消化し、改変ＧＦＰレポーター遺伝子（ＧＭ２、Ｃｏｒｍａｃｋら、１９９６を参照）を含むｐＧＥＭ−ＥＧＦＰ中への定方向クローニングを行って、発現構築物ｐｍＡｒ５’ＧＦＰを得た（図９）。
【０１５３】
本発明者らは、Ｐ４５０アロマターゼの卵巣特異的発現の制御はこのＳａｃＩ−ＫｐｎＩ断片に帰する可能性が高く、これは性決定構築物（Ｓｅｘ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ 構築物）の制御に有用であると判断した。しかし、本発明者らは、適切な時間空間的パターンを備えた任意のプロモーターを最終的な性決定構築物に用いうることを確信している。
【０１５４】
構築物ｐｍＡｒ５’ＧＦＰをゼブラフィッシュ胚に挿入し、それが魚類の卵巣アロマターゼ遺伝子に関して予想される時間空間的パターンを付与するか否かを検討した。本構築物および以後のすべての構築物は以下の手順を用いて調製し、発生中の胚にマイクロインジェクションによって導入した。
【０１５５】
注入前にすべてのＤＮＡ調製物は適宜線状化してゲル精製（Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を行った。針は、細線維入りのホウケイ酸ガラス製毛細管（ＧＣ１００ＴＦ−１５、Ｃｌａｒｋ Ｅｌｅｃｔｒｏｍｅｄｉｃａｌ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）から、Ｐ−８０ＰＣマイクロピペットプラー（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．）を用いて作製した。針には、１×注入バッファー（１０Ｘ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ；５ｍＭ ＥＤＴＡ；１Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ ７．２）で１００ｎｇ／ｌに希釈した精製ＤＮＡを、手操作ピペットを用いて後方から充填した。注入は、２台のナリシゲ（Ｎａｒｓｈｉｇｅ）ＭＮ−１５１三次元マイクロマニピュレーターを装着した解剖顕微鏡上で行った。注入中は胚を油圧（鉱油）式ホールディングピペットによって固定した。ＤＮＡ溶液の注入は、注入針保持器と窒素タンクの間に接続した足操作式の三方プランジ弁（Ｆｅｓｔｏ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を用いて空気圧により行った。別に明確に指示しない限り、注入は一細胞期の胚に対して行った。注入した胚は上記の通りにインキュベートして飼育した。
【０１５６】
注入の後に、初期胚は標準的な蛍光イソチオシアナート（ＦＩＴＣ）フィルターセットを装着したツァイス（Ｚｅｉｓｓ）顕微鏡によりＵＶ照射下で観察したが、後期胚は観察の前に０．１２５％２−フェノキシエタノール（Ｓｉｇｍａ Ｐ−１１２６）を含む胚用培地中で麻酔した。ＧＦＰを発現している胚の顕微鏡写真を分析用に撮影した。
【０１５７】
表２に注入試験に関してまとめた。注入約３１時間後（ｈｐｉ）にＧＦＰを発現している胚は、検討したいずれのバッチでも約１３％であった。
【表２】ＰＭＡＲ５’ＧＦＰを注入した胚における、注入約３０〜３１時間後の時点でのＧＦＰ発現の結果
2004511226.tif 000005
【０１５８】
プロモーターは雌の胚のみで活性があると予想されるため、一過性発現の比率は通常よりも低いと考えられる（以下の実施例９を参照）。最初の発現は約２４〜２５ｈｐｉで検出され、これは咽頭胚期（ｐｈａｒｙｎｇｕｌａ）と一致していた。３１ｈｐｉの時点で、９つのＧＦＰ発現胚のうち４つでは前後軸方向の中間に位置する腹側領域に発現がみられた（図１０）。この領域は、咽頭胚期にあるゼブラフィッシュの胚原始生殖細胞塊の位置に相当する。陽性発現がみられた残りの５つの個体のうち、１つは網膜での発現であり、それ以外は心臓腔の背側または腹側での発現であった（データは提示せず）。すべての発現胚で発現は９６ｈｐｉの時点が最も顕著であった。これらの結果は、このプロモーター断片がＰ４５０アロマターゼ遺伝子の卵巣発現に必要な調節因子をすべて含むことを示している。脳での発現がみられた胚はなく、これはメダカおよびゼブラフィッシュではいずれも、キンギョと同じくＰ４５０アロマターゼが複数の遺伝子座によってコードされると考えられるという証拠を提供するものである。
【０１５９】
メダカ卵巣Ｐ４５０アロマターゼのプロモーター配列は配列番号：０３に示している。
【０１６０】
実施例６　メダカおよびゼブラフィッシュの卵巣Ｐ４５０アロマターゼｃＤＮＡの単離およびクローニング
ゼブラフィッシュおよびメダカの双方から、トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）（Ｇｉｂｂｃｏ ＢＲＬ）を供給元の指示に従って用いて、卵巣全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡを、Ｓｍａｒｔ ｃＤＮＡキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を用いてそれぞれの完全長ｃＤＮＡを作製するためのテンプレートとして用いた。次にそれぞれの全ｃＤＮＡを、ゼブラフィッシュおよびメダカの卵巣Ｐ４５０アロマターゼの特異的増幅のためのテンプレートとして用いた。プライマーは、発表されているゼブラフィッシュ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ寄託番号ＡＦ００４５２１）およびメダカ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ４Ｄ８２９６８）に基づき、コード領域の全体を含むように設計した。
【０１６１】
ゼブラフィッシュ卵巣Ｐ４５０アロマターゼの増幅に用いたプライマーは以下の通りである：
順方向プライマー（ｚＡｒｏｍ１Ｆ）
2004511226.tif 000006
逆方向プライマー（ｚＡｒｏｍ１５７１Ｒ）
2004511226.tif 000007
【０１６２】
メダカ卵巣Ｐ４５０アロマターゼの増幅に用いたプライマーは以下の通りである：順方向プライマー（ｍＡｒｏｍＵ１）
2004511226.tif 000008
逆方向プライマー（ｍＡｒｏｍＬ１）
2004511226.tif 000009
【０１６３】
特異的ｃＤＮＡを市販のＴＡクローニングキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｐＧＥＭＴｅａｓｙベクター中にクローニングし、その実体をシークエンシングによって確認した。この結果得られた、ゼブラフィッシュおよびメダカの卵巣Ｐ４５０アロマターゼを有するクローンを、それぞれｐｚＡｒｃＤＮＡおよびｐｍＡｒｃＤＮＡと命名した（データは提示せず）。
【０１６４】
実施例７　ゼブラフィッシュＰ４５０卵巣アロマターゼに関するプロモーターおよび遮断物質ＤＮＡの複合構築物
本出願者は、ゼブラフィッシュにおける候補遺伝子の発現を遮断する目的で、アンチセンス（ＩｚａｎｔおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８４）および二本鎖ＲＮＡ（ｄ５ＲＮＡ）（ＧｕｏおよびＫｅｍｐｈｕｅｓ、１９９５）の２種類を構築した。
【０１６５】
アンチセンス構築物は、１．２９１ｋｂのゼブラフィッシュ卵巣アロマターゼｃＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩ断片としてｐｚＡｒ ｃＤＮＡから切り出し、ＣｌａＩ／ＥｃｏＲＩで線状化したｐｍＡｒ５’ＧＦＰ中に定方向クローニングすることによって作製した。この結果得られたＧＦＰ−アロマターゼアンチセンス融合構築物ｐｒｎＡ５’ＧｚＡｎ（図１１；ＡＧＡＬ参照番号ＮＭ００／１４９１１）を制限消化およびシークエンシングによって確認した。この融合構築物は、メダカアロマターゼプロモーターの調節下でＧＦＰおよびゼブラフィッシュ卵巣アロマターゼアンチセンスを共発現しうる。ＧＦＰと卵巣アロマターゼアンチセンスとの共発現は、形質転換胚を識別するための容易に検出しうるマーカーとなる。ｐｍＡ５’ＧｚＡｎは胚への注入用にＳａｃＩで線状化した。
【０１６６】
ゼブラフィッシュ卵巣Ｐ４５０アロマターゼアンチセンスのＤＮＡ配列は配列番号：８として提示している。
【０１６７】
二本鎖アロマターゼ遮断物質は、３つの分子を定方向的に連結することによって構築した。第１のセグメントはメダカアロマターゼプロモーターおよびＧＦＰからなる１．８ｋｂ断片であり、これはｐｍＡｒ５’−ＧＦＰからＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩを用いて切り出した。
【０１６８】
第２のセグメントは、発表されているｃＤＮＡ配列（ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＡＦ００４５２１；Ｂａｕｅｒ，Ｍ．Ｐ．およびＧｏｅｔｚ，Ｆ．Ｗ．）中の配列２〜５０２による、ｚＡｒｏｍａｌａｓｅ ｃＤＮＡの５００ｂｐ断片である。この断片は以下のプライマーを用いて増幅した：
順方向プライマーｚＡｒｏｍＸ（Ｅｃｏ）．Ｆ
2004511226.tif 000010
逆方向プライマーｚＡｒｏｍＸ（Ｓａｌ）．Ｒ
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【０１６９】
この結果得られた増幅産物には、クローニングを容易にするために、５’末端にＥｃｏＲＩ部位があり、３’末端にＳａｌＩ部位がある。第３の切片は、以下のプライマーを用いて増幅したｃＤＮＡの３０３ｂｐ断片（塩基７〜３０９）である：
順方向プライマーｚＡｒｏｍ（Ｐｓｔ．）Ｆ ２
2004511226.tif 000012
逆方向プライマーｚＡｒｏｍ（Ｓａｌ）．Ｒ
2004511226.tif 000013
【０１７０】
これらのプライマーにより、クローニング用のＰｓｔＩ部位が５’末端に、ＳａｌＩ部位が３’末端に生じる。第２の断片と連結すると、第３のセグメントはｃＤＮＡの５’末端の逆向き反復配列を形成する（塩基２〜３０９）。
【０１７１】
第３の切片である３ｋｂのベクター骨格は、ｐｍＡｒ５’ＧＦＰをＳａｃＩ−ＸｂａＩで消化することによって入手した。この結果得られた融合構築物ｐｍＡ５’Ｇ−ｚＤＳ（図１２；ＡＧＡＬ参照番号ＮＭ００／１４９０７）は、メダカアロマターゼプロモーターの調節下でＧＦＰおよびゼブラフィッシュ卵巣アロマターゼ二本鎖ＤＮＡを共発現することができる。ＧＦＰと卵巣アロマターゼ遮断物質との共発現は、形質転換胚を識別するための容易に検出しうるマーカーとなる。ｐｍＡ５’Ｇ−ｚＤｓは胚への注入用にＳａｃＩで線状化した。
【０１７２】
二本鎖プロモーター／遮断物質連結クローンのＤＮＡ配列は配列番号：１３として示している。アンチセンスプロモーター／遮断物質連結クローンのＤＮＡ配列は配列番号：１４として示している。
【０１７３】
実施例９　ゼブラフィッシュの表現型性別に対するＤＳアロマターゼ遮断物質の効果に関する実験
遺伝子構築物が表現型性別を決定する有効性を示すために、本出願者らは、ゼブラフィッシュにおける一過性発現により構築物の試験を行った。
【０１７４】
構築物ｐｍＡｒ５’ＧＦＰ（図９）をゼブラフィッシュ胚に挿入し、それが魚類の卵巣アロマターゼ遺伝子に関して予想される時間空間的発現パターンを付与するか否か、およびそれが予想通り遺伝上の雌のみで発現されるか否かを検討した。アロマターゼ遮断物質が雄の表現型を生じうるか否かを検討するために、融合構築物ｐｍＡｒ５’Ｇ−ｚＤＳ（図１２、配列番号：１５）も同じくゼブラフィッシュ胚に導入した。本構築物および以後のすべての構築物は、以下の手順を用いて調製し、発生中の胚にマイクロインジェクションによって導入した。
【０１７５】
注入前にすべてのＤＮＡ調製物は適宜線状化してゲル精製（Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を行った。針は、細線維入りのホウケイ酸ガラス製毛細管（ＧＣ１００ＴＦ−１５、Ｃｌａｒｋ Ｅｌｅｃｔｒｏｍｅｄｉｃａｌ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）から、Ｐ−８０ＰＣマイクロピペットプラー（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．）を用いて作製した。針には、１×注入バッファー（１０Ｘ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ；５ｍＭ ＥＤＴＡ；１Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ ７．２）で１００ｎｇ／ｌに希釈した精製ＤＮＡを、手操作ピペットを用いて後方から充填した。注入は、２台のナリシゲ（Ｎａｒｓｈｉｇｅ）ＭＮ−１５１三次元マイクロマニピュレーターを装着した解剖顕微鏡上で行った。注入中は胚を油圧（鉱油）式ホールディングピペットによって固定した。ＤＮＡ溶液の注入は、注入針保持器と窒素タンクの間に接続した足操作式の三方プランジ弁（Ｆｅｓｔｏ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を用いて空気圧により行った。別に明確に指示しない限り、注入は一細胞期の胚に対して行った。注入した胚は上記の通りにインキュベートして飼育した。
【０１７６】
注入の後に、初期胚は標準的な蛍光イソチオシアナート（ＦＩＴＣ）フィルターセットを装着したツァイス（Ｚｅｉｓｓ）顕微鏡によりＵＶ照射下で観察したが、後期胚は観察の前に０．１２５％２−フェノキシエタノール（Ｓｉｇｍａ Ｐ−１１２６）を含む胚用培地中で麻酔した。ＧＦＰを発現している胚の顕微鏡写真を分析用に撮影した。
【０１７７】
性別は、サトウ（Ｓａｔｏｈ）およびエガミ（Ｅｇａｍｉ）（１９７２）などの基準に従って顕微鏡検査により決定した。稚魚の調製および検査には、フメーソン（Ｈｕｍａｓｏｎ）（１９７９）に概ね従った標準的な組織学手順を用いた。簡潔に述べると、稚魚を養殖槽から網で取り出して、１ｐｐｍの２−フェノキシエタノール溶液中で安楽死させた。続いて魚を直ちに１０％中性緩衝ホルマリンで全身固定した。組織をパラフィンワックス浸潤用にルーチン的に処理し、矢状切片（４μｍ）をヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。組織切片をライツ（Ｌｅｉｔｚ）顕微鏡を用いて標準的な照射下で観察した（１００〜４００倍）。卵巣は腸とウキブクロとの間に位置し、肝臓に隣接する長い臓器として同定され、高度に染色された大きな細胞を伴う舗装路面様構造を特徴とし、さらに、大きな稚魚では卵巣腔の初期を呈する。個体発生初期に生じるため、卵巣は通常、極めて成長が遅いものを除いて、孵化後３０日のすべてのゼブラフィッシュで容易に同定される。
【０１７８】
表３にｐｍＡｒ５’ＧＦＰを用いた２件の注入試験についてまとめた。注入約３１時間後（ｈｐｉ）にＧＦＰを発現している胚の比率は約３０〜４０％であった。
【表３】注入約３０〜３１時間後の時点でｐＭＡＲ５’ＧＦＰを発現している孵化３０日後の稚魚の表現型性別
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【０１７９】
生殖腺と推定される部位でＧＦＰを発現した孵化３０日後の１１匹の稚魚を性別判定のために無作為に選択した。この１１匹はすべて明らかな卵巣があった。検査した１１匹の稚魚がすべて雌であったことが偶然のみによる確率は、注入した胚の最初の性比を雄：雌が５０：５０と仮定すると２１１分の１であり、これは０．００１％未満である。本発明者らはこの実験から、ゼブラフィッシュではｐｍＡｒｏｍが遺伝上の雌のみで発現されることを確認した。
【０１８０】
この実験に基づき、本発明者らは、ｐｍＡｒｏｍによって駆動される遮断性構築物において雄の個体が１匹でも存在すれば、本発明が予想通り機能することの証拠になると結論した。
【０１８１】
以後の試験では、性別を上記の通りに、または個体の肉眼検査によって判定した。詳細には、性別を判定する魚を２−フェノキシエタノール溶液中での麻酔によって鎮静させた。続いて、それらを麻酔用水槽液から取り出し、湿らせたポリウレタンフォームのブロックに刻み入れたスロット中に挟んだ。このスロットにより魚は腹側面を露出して静置される。放出された精子が活性化されないように、腹側の湿分をペーパータオルで吸い取った。露出した腹部を、プラスチック製の鞘を付けた細い鋏で丁寧に絞り出すようにして配偶子を放出させた。配偶子を腹部からガラス製毛細管に収集した。毛細管の内容物を顕微鏡用スライドガラスに滴下し、複合顕微鏡により倍率４００倍で観察した。精子が存在すれば明らかである。
【０１８２】
表４にｐｍＡｒ５’Ｇ−ｚＤＳ融合構築物を用いた注入試験についてまとめた。受精率が低いため胚生存率は低くなり、このため検査用の稚魚の数は少数であった。
【表４】注入約３０〜３１時間後の時点でｐＭＡＲ５’Ｇ−ＺＤＳ融合構築物由来のＧＦＰを発現している孵化３０日後の稚魚の表現型性別
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【０１８３】
第１の実験では、３匹の魚を孵化後４週齡の時点で屠殺して表現型性別を評価した。２匹は明らかに雌であり、十分に発達した顕著な卵巣を有していた。３匹目には卵巣がなかった。腸とウキブクロとの間に位置する小さくて長い濃染構造が初期精巣として同定された。この標本の性別が雄であることは、タスマニア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔａｓｍａｎｉａ）の専門的な魚病理学者によっても独立して確認された。
【０１８４】
バッチ１の残りの魚およびバッチ２のすべての魚は３カ月齢まで飼育し、その後に上記のように腹部を丁寧に絞って卵または精子を放出させることによって性別をアッセイした。解剖顕微鏡で観察することによって放出物質の生存度をアッセイした。バッチ１では、生殖腺でＧＦＰを発現した残りの１０匹のうち９匹は雄であり（活動的に泳ぐ精子を伴う）、１匹が雌であった。バッチ２ではＧＦＰを発現した５匹すべてが活動的に泳ぐ精子を伴っていた。
【０１８５】
ｐｍＡｒ５’Ｇ−ｚＤＳ融合構築物を発現する魚の大多数で、性決定に対する本発明の予想された作用が確認されている。さらに、２件の実験により、ｐｍｒ５’Ｇ−ｚＤＳ融合構築物を発現する魚の性比には、ｐｚｆＡｒ５’ＧＦＰのみを発現する魚と比べて有意差が認められ（雄１８匹：雌３匹に対して雄０匹：雌１１匹）（χ二乗＝２２．６、ｄｆ＝１、ｐ＜０．００１）、仮定した５０：５０の性比との間にも差がみられた（χ二乗＝４．０１、ｄｆ＝１、ｐ＜０．０５）。
【０１８６】
続いて、バッチ１からの３匹の雄を野生型雌と交配させた。これらはすべてゼブラフィッシュに典型的な交尾行動を示し、いずれも野生型雌との間に子孫を設け、受精卵を生じた。
【０１８７】
本発明者らは、これらの実験から、 １）アロマターゼプロモーターは遺伝上の雌のみで発現される、２）ｐｍＡｒ５Ｇ−ｚＤＳ構築物は遺伝上の雌を雄の表現型へと発生させる、３）性転換した個体は雄と同じ生殖能力を持つ、と結論した。この構築物の作用がこの時点で一致しないことは、標本間にコピー数およびおそらくは用量依存的反応の差がある可能性があることからみて、驚くには当たらない。
【０１８８】
実施例１０　抑制可能なアロマターゼ遮断物質
繁殖目的には、性分化構築物を保有する正常な雌を生じさせるために、アロマターゼ遮断物質を一時的に抑制することが有用と思われる。これを実現するために、本出願者らは、外部から調節される遺伝子スイッチとして市販の抑制因子またはＴｅｔ−反応性ＰｈＣＭＶ＊−１プロモーターを用いた。ＰｈＣＭＶ＊−１は、４２ｂｐのｔｅｔオペレーター配列（ｔｅｔＯ）の７個のコピーからなるＴｅｔ−反応性因子（ＴＲＥ）を含む。この因子は、完全なＣＭＶプロモーターの一部であるエンハンサーを欠く最小ＣＭＶプロモーター（ＰｍｉｎＣＭＶ）のすぐ上流にある。このため、ＰｈＣＭＶ＊−１はトランス活性化タンパク質（ｔＴＡ）がｔｅｔＯと結合していなければ静止状態にある。テトラサイクリン感受性因子は、ゴッセン（Ｇｏｓｓｅｎ）およびブジャール（Ｂｕｊａｒｄ）（１９９２；ｔｅｔ−ｏｆｆ）、ゴッセン（Ｇｏｓｓｅｎ）ら（１９９５；Ｔｅｔ−ｏｎ）ならびにキストナー（Ｋｉｓｔｎｅｒ）ら（１９９６）によって記載されていっる。ヘルマン・ブジャール（Ｈｅｒｍａｎｎ Ｂｕｊａｒｄ）によって開発されたテトラサイクリン調節系（Ｔｅｔ−Ｏｆｆ系）では、テトラサイクリン（Ｔｃ）またはドキシサイクリンＤｏｘ；Ｔｃ誘導体の１つ）の添加により、ｔＴＡのＴｅｔ−反応性因子との結合が妨げられる。これはさらに、薬剤を除去するまでＴＲＥからの遺伝子発現も遮断する。この相補的な系も開発されている（Ｔｅｔ−Ｏｎ系）。Ｔｅｔ−Ｏｎ系では、ドキシサイクリンの添加によって逆トランス活性化因子ｒｔＴＡのｔｅｔＯプロモーターとの結合が可能となり、ＴＲＥからの遺伝子発現を招く。ＴＲＥからの遺伝子発現は薬剤を除去するまで続く。テトラサイクリン反応性因子には投与が容易という利点がある。テトラサイクリンは魚類および貝類の培養で日常的に用いられる抗生物質であり（Ｓｔｏｆｆｒｅｇａｎら、１９９６を参照）、容易に皮膚膜を透過しながらその生物活動は維持させるほか、生物全体の浸漬による投与が可能である。制御可能なＴｅｔ−Ｏｎ／Ｏｆｆ発現系の使用は、ＢＡＳＦ社（ＢＡＳＦ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ）に譲渡された米国特許第５，４６４，７５８号にカバーされている。
【０１８９】
Ｔｅｔ−Ｏｎ（商標）およびＴｅｔ−ｏｆｆ（商標）遺伝子発現系ならびにＴｅｔ反応性の両方向性ベクターであるｐＢＩおよびｐＢＩ−ＧＦＰは販売元（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から購入した。ｐｚＢＭＰ２−Ｔｅｔ−Ｏｆｆ構築物は、ＰｍｉｎＣＭＶプロモーターをＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩ断片としてｐＴｅｔ−Ｏｆｆから切り出し、それをｐｚＢＭＰ２−（１．４）由来のＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ断片としての１，４１４ｂｐのｚＢＭＰ２プロモーターと、定方向性クローニング配列ＡＧＡＬ参照番号ＮＭ９９／０９０９９）によって置換することによって作製した。
【０１９０】
空間的および時間的に規定されたアロマターゼプロモーターの制御下でｔＴＡの発現をもたらす１つの構築物を開発した。発現されたｔＴＡ複合体はＴＲＥ（ｔｅｔ反応性因子）と結合し、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）中にクローニングされたＧＦＰおよび関心対象の第２の遺伝子の発現を引き起こす。この第２の遺伝子はアンチセンスまたは二本鎖ＲＮＡなどの遮断物質配列をコードすることが理想的である。このように、遮断物質配列およびｅＧＦＰの発現は、ＴＲＥの活性化を介して、空間的および時間的に調節されたプロモーターの制御下におかれる。
【０１９１】
この構築物は３種類の因子をまとめて形成させた（図１３）。第１の因子にはクロンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から供給されたｐＧＩ−ｅＧＦＰベクターを用い、ＡｐａＩおよびＳａｌＩを用いてＳＶ４０ポリＡセグメントを切り出すことによってプラスミドｐＢｉ（−ＳＶ４０）が得られるように改変した。この結果得られた末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで充填した後に再連結し、有効なプラスミドを再構成した。
【０１９２】
第２の因子は、ｐｍＡｒ５’−Ｔｅｔ−ＯｆｆプラスミドからＨｉｎｄＩＩＩを用いてメダカアロマターゼプロモーターおよびｔＴＡコード配列を切り出すことによって作製した。続いてこの断片をｐＢｉ（−ＳＶ４０）のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、第２の構築物ｐＢｉ−ｍＡｒｔＴＡを得た。
【０１９３】
第３の因子は、ゼブラフィッシュｄｓＲＮＡアロマターゼ遮断物質またはメダカ由来のもののいずれかを含むＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片からなる。ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片の末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで充填し、この断片をｐＢｉ−ＢＭＰｔＴＡのＰｖｕＩＩ部位と連結した。この結果、ゼブラフィッシュアロマターゼを抑制可能な形で遮断しうる最終的な構築物を得た（ｐＢｉＴ−ｄｓ．ｚＡｒｏｍａ；配列番号：１６）。
【０１９４】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】１６対の染色体上にホモ接合性にＳＤＣの３２個のコピーを保有するファウンダー雄から１０世代にわたる、種々の数（Ｎ）の性分化構築物（ＳＤＣ）を保有する雄性子孫の度数分布を示したものである。
【図２】放流動物における種々のコピー数（Ｎ）の性分化構築物（ＳＤＣ）が、その子孫での雄の割合に及ぼす影響を１０世代にわたって示したものである。
【図３】基本的なコイ集団モデルに関するパラメーター値、年齢特異的な捕獲、自然死亡率および性成熟の分布、ならびにリッカー曲線を示している。
【図４】ＳＤＣのコピーを含むさまざまな数のコイ稚魚の年１回放流による影響で、５世代を経るまでにすべてが雄の同腹仔となったことを示している。
【図５】ＳＤＣを有するさまざまな数の染色体を保有するコイ稚魚の放流による影響を示している。
【図６】性分化構築物を保有するコイ稚魚による影響と、雌の繁殖能力を失わせる構築物を保有するものによる影響との違いを示している。
【図７】５世代を経るまでにすべて雄性の同腹仔が産まれるように５０匹のＳＤＣ保有稚魚を年１回放流する条件に関して、成魚の捕獲が集団の減少速度に及ぼす影響を示している。
【図８】コイ集団の動態を制御する２．５％放流方式の有効性に対する、加入率における年次間変動の影響を示している。
【図９】ｐｍＡｒ５’−ＧＦＰのプラスミドマップを示している。転写単位は、１１７０ｂｐのメダカ卵巣Ｐ４５０アロマターゼプロモーターの調節下にある、改変されたＧＦＰコード配列（Ｃｏｒｍａｃら、１９９６）からなる。
【図１０】約３１ｈｐｉのゼブラフィッシュ胚における、メダカ卵巣Ｐ４５０アロマターゼプロモーターにより駆動されるＧＦＰ発現を示している。
【図１１】メダカ卵巣Ｐ４５０アロマターゼプロモーターによって駆動される、ＧＦＰ−ゼブラフィッシュアンチセンス融合構築物（ｐｍＡ５’ＧｚＡｎ）のプラスミドマップを示している。
【図１２】メダカ卵巣Ｐ４５０アロマターゼプロモーターによって駆動される、ＧＦＰ−二本鎖ゼブラフィッシュＲＮＡ融合構築物のプラスミドマップを示している。
【図１３】ｅＧＦＰおよびアロマターゼ遮断物質の遺伝子配列の調節のためのＴｅｔ−ｏｆｆおよびｔｅｔ反応性因子を含む単一の構築物のプラスミドマップを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年12月10日(2002.12.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物における表現型性別を改変するための構築物であって、
ａ）規定された時間空間的パターンで一過性に活性化され、ｂ）と機能的に結合している、第１の核酸分子、
ｂ）動物における正常な性発生を変化させる遮断分子をコードする、第２の核酸分子
を含む構築物。
【請求項２】
第１のおよび第２の核酸分子のそれぞれが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらのハイブリッド分子である、請求項１記載の構築物。
【請求項３】
第１のおよび第２の核酸分子のそれぞれが、完全長分子またはその生物活性断片である、請求項１記載の構築物。
【請求項４】
第１の核酸分子が、プロモーター領域をコードするＤＮＡ分子である、請求項１記載の構築物。
【請求項５】
プロモーターが胚発生および／または配偶子形成時にのみ活性化され、性決定に一致する時間空間的ドメインで発現される、請求項４記載の構築物。
【請求項６】
プロモーターが、配列番号：３に示されるヌクレオチド配列を有する、請求項５記載の構築物。
【請求項７】
第２の核酸分子が、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、センスＲＮＡ、およびリボザイムからなる群より選択される遮断分子をコードする、請求項１記載の構築物。
【請求項８】
第２の核酸分子がアンチセンスＲＮＡまたはｄｓＲＮＡである、請求項７記載の構築物。
【請求項９】
第２の核酸分子が、配列番号：８または配列番号：１３に示したヌクレオチド配列を有する、請求項７記載の構築物。
【請求項１０】
ブダペスト条約の下にオーストラリア政府分析研究所（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に寄託され、アクセッション番号ＮＭ００／１４９１１またはＮＭ００／１４９０７が付与されている、請求項１記載の構築物。
【請求項１１】
ａ）配列番号：１３に示されるヌクレオチド配列；
ｂ）ａ）の配列の生物活性断片；
ｃ）ａ）もしくはｂ）に示される配列と少なくとも７５％の配列相同性を有する核酸分子；または
ｄ）ａ）もしくはｂ）に示される配列とストリンジェントな条件下で結合しうる核酸分子
を含む遺伝子のコード領域をコードする、核酸分子。
【請求項１２】
動物における正常な性発生を変化させて繁殖不能性または表現型性別の変化をもたらすことが可能な遮断分子をコードする核酸分子。
【請求項１３】
遮断分子が、アンチセンスＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、センスＲＮＡ、およびリボザイムからなる群より選択される、請求項１２記載の核酸分子。
【請求項１４】
遮断分子がｄｓＲＮＡである、請求項１２記載の核酸分子。
【請求項１５】
遮断分子が、配列番号：８または配列番号：１３に示される核酸配列によってコードされる、または部分的にコードされる、請求項１２記載の核酸分子。
【請求項１６】
動物における表現型性別を変化させる方法であって、
１）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の構築物によって動物細胞を安定的に形質転換させる段階；および
２）該細胞を宿主生物に移植し、それによって移植細胞から動物全体を発生させる段階
を含む方法。
【請求項１７】
安定的な形質転換がマイクロインジェクション、トランスフェクション、または感染によって行われ、構築物が相同組換えによってゲノムに安定的に組み込まれる、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
宿主生物が形質転換細胞と同じ属のものである、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
宿主生物が脊椎動物である、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
宿主生物が無脊椎動物である、請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
宿主生物が、魚類、両生類、および軟体動物からなる群より選択される、請求項１６記載の方法。
【請求項２２】
魚類が、ゼブラフィッシュ、コイ、サケ、カダヤシ、テンチ、ヤツメウナギ、ハゼ、ティラピア、およびマスからなる群より選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
両生類が、オオヒキガエルおよびウシガエルからなる群より選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
軟体動物が、カキ、カワホトトギスガイ、イガイダマシ、ニュージーランドキリガイダマシ、スクミリンゴガイ、アフリカマイマイ、またはビオンファラリア属（Ｂｉｏｍｐｈａｌａｒｉａ）およびブリヌス属（Ｂｕｌｉｎｕｓ）の腹足類からなる群より選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
請求項１６記載の方法によって生産されたトランスジェニック動物。
【国際調査報告】
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