(57)【要約】本発明は、神経変性疾患の処置のための、特定のトリペプチド誘導体の使用に関する。このトリペプチド誘導体は、次の式（Ｉ）［式中、Ｘは、ＯＨ、（Ｃ1-5）アルコキシ、ＮＨ2、ＮＨ−Ｃ1-5−アルキル、Ｎ（Ｃ1-5−アルキル）2を表し；Ｒ1は、アミノ酸：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ（それぞれ、場合により（Ｃ1-5）アルコキシ基、（Ｃ1-5）アルキル基又はハロゲン原子により置換されていてもよい）、及びＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又はＩｌｅのいずれかから誘導される残基であり；Ｒ2は、アミノ酸：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ｐＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ及びＡｓｎのいずれかから誘導される残基であり；Ｒ3及びＲ4は、独立にＨ、ＯＨ、（Ｃ1-5）アルキル、又は（Ｃ1-5）アルコキシを表し（ただし、Ｒ3及びＲ4は、両方ともＯＨ又は（Ｃ1-5）アルコキシであることはない）；Ｒ5は、Ｈ、ＯＨ、（Ｃ1-5）アルキル又は（Ｃ1-5）アルコキシを表し；そしてＲ0は、好ましくはシンナモイル残基を表す］、又は薬学的に許容しうるその塩を満たす。
2004531480.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性疾患の処置に有用な医薬の製造のための、下記式（Ｉ）：
【化１】
2004531480.tif 000010
［式中、Ｘは、ＯＨ、（Ｃ1-5）アルコキシ、ＮＨ2、ＮＨ−Ｃ1-5−アルキル、Ｎ（Ｃ1-5−アルキル）2を表し；
Ｒ1は、アミノ酸：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ（それぞれ、場合により（Ｃ1-5）アルコキシ基、（Ｃ1-5）アルキル基又はハロゲン原子により置換されていてもよい）、及びＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又はＩｌｅのいずれかから誘導される残基であり；
Ｒ2は、アミノ酸：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ｐＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ及びＡｓｎのいずれかから誘導される残基であり；
Ｒ3及びＲ4は、独立にＨ、ＯＨ、（Ｃ1−Ｃ5）アルキル、又は（Ｃ1-5）アルコキシを表し（ただし、Ｒ3及びＲ4は、両方ともＯＨ又は（Ｃ1-5）アルコキシであることはない）；
Ｒ5は、Ｈ、ＯＨ、（Ｃ1-5）アルキル又は（Ｃ1-5）アルコキシを表し；そして
Ｒ0は、下記式：
【化２】
2004531480.tif 000011
（式中、Ｙは、−ＣＯ−、−ＣＨ2ＣＯ−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ−又は−ＯＣＨ2ＣＯ−を表し、そしてＺは、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、（Ｃ1-4）アルコキシ基、（Ｃ1-4）アルキル基を表すか；あるいは２つの隣接する置換基は、（Ｃ1-3）アルキレンジオキシ基を形成してもよく；そしてｎは、０又は１〜５の整数である）で示される基を表す］で示される化合物、又は薬学的に許容しうるその塩の使用。
【請求項２】
Ｒ1が、アミノ酸：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ（それぞれ、場合により（Ｃ1-5）アルコキシ基、（Ｃ1-5）アルキル基又はハロゲン原子により置換されていてもよい）のいずれかから誘導される残基、又はアミノ酸：Ｉｌｅから誘導される残基である、請求項１記載の使用。
【請求項３】
Ｒ1が、場合により（Ｃ1-5）アルコキシ基、（Ｃ1-5）アルキル基又はハロゲン原子により置換されていてもよい、アミノ酸：Ｐｈｅから誘導される残基である、請求項２記載の使用。
【請求項４】
Ｘが、（Ｃ1-5）アルコキシ、ＮＨ2、ＮＨ−Ｃ1-5−アルキル、又はＮ（Ｃ1-5−アルキル）2である、請求項１〜３のいずれか１項記載の使用。
【請求項５】
Ｒ2が、アミノ酸：Ｇｌｙ又はＩｌｅから誘導される残基である、請求項１〜４のいずれか１項記載の使用。
【請求項６】
Ｒ0が、シンナモイル残基である、請求項１〜５のいずれか１項記載の使用。
【請求項７】
式（Ｉ）の化合物が、シンナモイル−グリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリンアミド、シンナモイル−イソロイシル−フェニルアラニル−Ｌ−プロリンエチルアミド、シンナモイル−イソロイシル−イソロイシル−プロリンアミド、又は薬学的に許容しうるこれらの塩である、請求項１〜６のいずれか１項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経変性疾患、特にアポトーシス過程により引き起こされる疾患の処置のための、トリペプチド誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患は、一般にアポトーシスにより引き起こされる、神経の崩壊又は変性を特徴とする。神経変性疾患の例は、アルツハイマー病、軽度認識障害、パーキンソン病、更にはＡＩＤＳ関連神経障害を含む。例えば、アルツハイマー病では、神経変性が、記憶し、話し、考え、そして決定する能力の破壊をもたらす。これらの障害の理由は、詳しくは知られていない。生化学レベルでは、神経伝達物質であるアセチルコリンの生成の低下を伴う、皮質のコリン作動系の変化を検出することができる。アルツハイマー病に罹病している患者の大脳皮質では、アセチルコリン濃度が２０〜４０％低下している。この結果として、神経終末が攻撃を受け、そしてこのため、最終的には脳細胞、特に海馬の細胞の死に至る。
【０００３】
臨床的には、アルツハイマー病は、３つの別な相を特徴とする：前痴呆の相、軽度痴呆の相、及び重度痴呆の相。前痴呆の相では、特に海馬のレベルにニューロンの変性が観察される。後に、典型的なアミロイド沈着が起こる。
【０００４】
向知性物質を用いるアルツハイマー病の典型的な処置は、物質の投与中、疾患、特に認識障害の症候を軽減させるにとどまる。一旦投与を中止すると、症候が再発する。このことは、海馬における抗神経変性作用とは対照的であり、後者では、海馬のニューロン変性の発生の低下及び好ましくは停止をもたらす。向知性物質は、例えば、EP 0,316,218 B1に開示されている。
【０００５】
よってアルツハイマー病に対する最近の治療的アプローチは、特に、アセチルコリンを酢酸とコリンに分解するアセチルコリンエステラーゼを阻害することによる、アセチルコリン濃度の安定化に取り組んでいる。しかし、アセチルコリンエステラーゼインヒビターの使用は、これが、神経変性の停止又は反転にさえ適切といえない一時的な改善をもたらすだけであるという欠点を示す。
【０００６】
他方では、別々のニューロン集団の生存、成長及び分化に著しい影響を及ぼすとされている、いわゆる神経栄養因子又はニューロトロフィンが知られている。ニューロトロフィンファミリーは、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）及びＣＮＴＦ−ファミリー（毛様体神経栄養因子）を含む。ニューロトロフィンは、分子量２６〜２８kDaの塩基性の小タンパク質である。ＮＧＦは、多くの異なる組織において活性を示す、ニューロトロフィンファミリーの最もよく性状解析されたメンバーである。
【０００７】
末梢神経系（ＰＮＳ）において、ＮＧＦは、交感神経及びある種の知覚神経の発生に決定的に重要である。中枢神経系（ＣＮＳ）において、ＮＧＦは、前脳基底部のコリン作動性ニューロンの発生及び維持に栄養的役割を担う。これはまた、神経再生における成体ＣＮＳ組織においても、ある役割を演じる。
【０００８】
コリン作動性ニューロンは、ＮＧＦの非存在下よりは、むしろその存在下でアセチルコリンを産生することが知られている。更にまた、霊長類へのＮＧＦの投与が、コリン作動性細胞体の再生をもたらすことも証明されている。この知見に基づき、ＮＧＦの活性の変化が、コリン作動性ニューロンの変性の開始点であろうことが仮定される。少なくとも理論的には、神経栄養性物質が、アルツハイマー病のような神経変性疾患の処置に適しているようである。しかし、これらの生理学的に発生する物質は、オートクリン又はパラクリン物質と同様に作用半径が短い。したがって、これらが、血液循環及び他の組織においてタンパク分解を受け、これによって不活化されるため、今日までこれらの適用のために普通の治療経路（経腸又は非経口）を利用することができなかった。また、これらは、ＣＮＳ活性の前提条件である、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過しないことが知られている。
【０００９】
組換えヒトニューロトロフィンによる臨床試験は、これまでのところ失敗している。考えうる脳内投与は、実用性の検討により除外すべきであろう。したがって、ＮＧＦ又は他のニューロトロフィン、更にはこれらのペプチドの断片でのインビトロ実験から実行可能な治療適用への結果の移行は可能性がない。
【００１０】
発明の概要
よって、特に海馬細胞の神経変性の停止及び好ましくは反転をもたらし、そしてまた普通の治療的投与に適しており、このため、神経変性疾患の処置用医薬としてその使用が可能である、特定の物質を提供することが、本発明の目的である。
【００１１】
本発明の目的は、神経変性疾患の処置に有用な医薬の製造のための、式（Ｉ）：
【００１２】
【化３】
2004531480.tif 000003
【００１３】
［式中、Ｘは、ＯＨ、（Ｃ1-5）アルコキシ、ＮＨ2、ＮＨ−Ｃ1-5−アルキル、Ｎ（Ｃ1-5−アルキル）2を表し；
Ｒ1は、アミノ酸：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ（それぞれ、場合により（Ｃ1-5）アルコキシ基、（Ｃ1-5）アルキル基又はハロゲン原子により置換されていてもよい）、及びＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又はＩｌｅのいずれかから誘導される残基であり；
Ｒ2は、アミノ酸：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ｐＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ及びＡｓｎのいずれかから誘導される残基であり；
Ｒ3及びＲ4は、独立にＨ、ＯＨ、（Ｃ1−Ｃ5）アルキル、又は（Ｃ1-5）アルコキシを表し（ただし、Ｒ3及びＲ4は、両方ともＯＨ又は（Ｃ1-5）アルコキシであることはない）；
Ｒ5は、Ｈ、ＯＨ、（Ｃ1-5）アルキル又は（Ｃ1-5）アルコキシを表し；そして
Ｒ0は、下記式：
【００１４】
【化４】
2004531480.tif 000004
【００１５】
（式中、Ｙは、−ＣＯ−、−ＣＨ2ＣＯ−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ−又は−ＯＣＨ2ＣＯ−を表し、そしてＺは、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、（Ｃ1-4）アルコキシ基、（Ｃ1-4）アルキル基を表すか；あるいは２つの隣接する置換基は、（Ｃ1-3）アルキレンジオキシ基を形成してもよく；そしてｎは、０又は１〜５の整数である）で示される基を表す］で示される化合物、又は薬学的に許容しうるその塩の使用により解決される。
【００１６】
詳細な説明
他に記載がなければ、アミノ酸残基は、Ｌ型だけでなくＤ型との両方で存在しうる（Ｌ型が好ましい）。
【００１７】
好ましい化合物は、Ｒ1が、アミノ酸：Ｉｌｅ、又はアミノ酸：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ（それぞれ、場合により１個以上の（Ｃ1-5）アルコキシ基、（Ｃ1-5）アルキル基又は１個以上のハロゲン原子で置換されていてもよい）の１つから誘導される残基、特にＩｌｅ又はＰｈｅ（場合により１個以上の（Ｃ1-5）アルコキシ基、（Ｃ1-5）アルキル基又は１個以上のハロゲン原子で置換されていてもよい）から誘導される残基である、式（Ｉ）の化合物である。
【００１８】
式（Ｉ）において、Ｘは、好ましくは（Ｃ1-5）アルコキシ、ＮＨ2、ＮＨ−（Ｃ1-5）アルキル又はＮ（Ｃ1-5−アルキル）2であり、更に好ましいのは、ＮＨ2、ＮＨ（Ｃ1-3）アルキル及びＮ（Ｃ1-3−アルキル）2である。
【００１９】
Ｒ2は、好ましくはアミノ酸：Ｇｌｙ又はＩｌｅから誘導される残基である。
【００２０】
Ｒ3及びＲ4は、好ましくは相互に独立に、Ｈ、（Ｃ1-5）アルキル又は（Ｃ1-5）アルコキシを表し（ただし、Ｒ3及びＲ4は、両方とも（Ｃ1-5）アルコキシではない）、更に好ましいのは、Ｈ、（Ｃ1-3）アルキル又は（Ｃ1-3）アルコキシである。
【００２１】
Ｒ5は、好ましくはＨ、（Ｃ1-5）アルキル又は（Ｃ1-5）アルコキシを表し、特に好ましいのは、Ｈ、（Ｃ1-3）アルキル又は（Ｃ1-3）アルコキシである。Ｒ0は、好ましくはシンナモイル残基である。
【００２２】
式（Ｉ）の特に好ましい化合物では、Ｒ0は、好ましくはシンナモイル残基であり、Ｒ1は、Ｐｈｅ（場合により１個以上の（Ｃ1-5）アルコキシ基、（Ｃ1-5）アルキル基又は１個以上のハロゲン原子で置換されている）から誘導されるか、又はアミノ酸：Ｉｌｅから誘導される残基であり、Ｒ2は、アミノ酸：Ｇｌｙ又はＩｌｅから誘導される残基であり、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、水素原子を表し、Ｘは、ＮＨ2、ＮＨ−（Ｃ1-3）アルキル又はＮ（Ｃ1-3−アルキル）2である。
【００２３】
式（Ｉ）の特に好ましい化合物では、Ｒ1は、Ｐｈｅ（場合により１個以上の（Ｃ1-5）アルコキシ基、（Ｃ1-5）アルキル基又は１個以上のハロゲン原子で置換されている）から誘導されるか、又はアミノ酸：Ｉｌｅから誘導される残基であり、Ｒ2は、アミノ酸：Ｇｌｙ又はＩｌｅから誘導される残基であり、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、水素原子を表し、Ｘは、ＮＨ2、ＮＨ−（Ｃ1-3）アルキル又はＮ（Ｃ1-3−アルキル）2であり、そしてＹ1及びＹ2は、相互に独立に、Ｈ又は（Ｃ1-3）アルキルを表す。
【００２４】
Ｒは、好ましくはシンナモイル残基である。
【００２５】
最も好ましい式（Ｉ）の化合物は、シンナモイル−グリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリンアミド、シンナモイル−イソロイシル−フェニルアラニル−Ｌ−プロリンエチルアミド、シンナモイル−イソロイシル−イソロイシル−プロリンアミド、又は薬学的に許容しうるこれらの塩である。
【００２６】
アミノ酸に関して使用した略語（フェニルアラニンにはＰｈｅ等、更には部分的にフェニルアラニンにはＦのような１文字コードを以下に使用した）は、当業者には既知である（例えば、BeyerとWalter, Lehrbuch der Organischen Chemie, 第21版, S. Hirzel Verlag Stuttgart 1988を参照のこと）。よって、Ｐｈｅは、フェニルアラニンを意味し、Ｇｌｙはグリシンを意味するなどである。「アミノ酸：Ｐｈｅから誘導される残基」という表現は、よってベンジル（−ＣＨ2−Ｃ6Ｈ5）残基を意味する。したがって、「アミノ酸：Ｇｌｙから誘導される残基」は、水素原子を意味し、「アミノ酸：Ａｌａから誘導される残基」は、メチル基を意味するなどである。
【００２７】
本発明により使用されるトリペプチド誘導体の合成は、特に制限がなく、既知の方法、好ましくは、各アミノ酸又はその誘導体のＬ−又はＤ立体配置が維持される、ペプチド化学の立体特異的製造法により行うことができる。特に適切なものは、EP 0,316,218 B1に開示される合成法である。
【００２８】
本発明により使用される式（Ｉ）の化合物は、親油性物質であり、そして経腸的投与に、また適切な処方にすれば非経口投与にも適している。
【００２９】
１日に体重１キログラム当たり１〜５mg、好ましくは１日に７５〜３７５mgの用量での投与が、通常有効である。抗神経変性作用を達成するために、数日間にわたる投与（例えば、少なくとも４又は５日間）が一般に好ましい。
【００３０】
本発明により使用されるトリペプチド誘導体は、非常に低い毒性を示す。マウスでは、アーウィン（Irwin）試験により１０００mg/kg（経口投与）以下の用量を使用すると、致死作用や痙攣惹起作用は観察されなかった。
【００３１】
本トリペプチド誘導体は、種々の方法、例えば、非経口（静脈内、筋肉内、皮下）、呼吸器管経由（バッカル、舌下、鼻内、気管支内）、経皮経路（経皮（percutane））及び経腸経路（経口）での投与に適した、医薬組成物の製造に使用することができる。
【００３２】
本発明の医薬組成物は、更に薬学的に許容しうる賦形剤、薬学的に許容しうる希釈剤又は補助剤を含む。その処方には、例えば、「レミントンの製剤科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」, 第20版, Williams & Wilkins, PA, USAのような、標準法を利用することができる。
【００３３】
投与剤形は、投与経路に応じて選択され、特に錠剤、カプセル剤、粉剤及び液剤を含む。
【００３４】
経口投与には、好ましくは錠剤及びカプセル剤が使用されるが、これらは、適切な結合剤（例えば、ゼラチン又はポリビニルピロリドン）、適切な賦形剤（例えば、乳糖又はデンプン）、適切な滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）、及び場合により更に別の添加剤を含む。好ましいのは、投与単位当たり（例えば、１錠又は１カプセル当たり）７５〜２２５mg、更に好ましくは１００〜２００mgのトリペプチド誘導体を含む処方である。
【００３５】
経口投与に特に好ましい処方は、シンナモイル−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＰｒｏＮＨ2  １００mg、更には微結晶性セルロース、トウモロコシデンプン、ポビドン（Povidon）２５、クロスポビドン（Crospovidon）、マクロゴール（Macrogol）４０００、二酸化チタン（Ｅ１７１）、及び酸化第二鉄（Ｅ１７２）を含むコーティング錠である。
【００３６】
非経口投与には、滅菌エタノール含有水溶液が好ましい。適切な滅菌水溶液又は生理食塩水は、１０％v/vエタノールを含んでよい。このような溶液１０mlの容量を使用して、注射用の適切な医療装置中で、凍結乾燥シンナモイル−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＰｒｏＮＨ2  １００mgを溶解する。
【００３７】
本発明により使用されるトリペプチド誘導体の抗神経変性作用は、特に非経口又は経腸的に投与されると、驚くべきものである。これらの物質の向知性作用は、EP 0,316,218 B1から知られているが、これらの物質が、投与中の一時的な向知性作用を示すだけでなく、神経変性の停止を示すという知見は、予想できなかった。
【００３８】
本発明により使用される物質の投与は、アルツハイマー病、及び特に軽度認識障害の処置のために好ましい。
【００３９】
本発明により使用されるトリペプチド誘導体の優れた治療的性質は、アルツハイマー病の特に有用なモデルを用いて、以下に更に説明されよう。これらのモデルを用いることにより、本発明で使用されるトリペプチド誘導体の投与は、海馬ニューロンの数を増大させるだけでなく、試験で用いたラットの学習挙動をも改善させることが証明できた。
【００４０】
実験
１．序論
アルツハイマー病の動物モデルは存在しない。トランスジェニックマウスモデルだけが、挙動に関する限り限定的に有用である。したがって我々は、一連の３つのラットモデルを提示する。各モデルは、疾患の生理病理学的特色の１つを再現する：ビンクリスチンモデルにおいて神経原線維変性、Ｇｐ１２０モデルにおいてベータ−アミロイドによる変性、及びデキサメサゾンモデルにおいてアポトーシス。
【００４１】
ビンクリスチンは、同期化剤として使用される抗発癌物質である。この分子は、微小管の紡錘体に結合し、これによって分裂中期の細胞増殖をブロックする。これは、紡錘体阻害剤である。ニューロンは、生理条件下では増殖しないが、軸索は、神経原線維からなり、そしてその構造は、紡錘体の微小管の１つに類似している。ビンクリスチンは、これらの神経原線維に結合し、これによって新生物疾患の処置を受ける患者に末梢神経伝導障害を引き起こす。こういった作用は、主として軸索の白質に影響を及ぼす。ビンクリスチンは、血液脳関門を通過しないため、脳室内投与により与える必要がある。ビンクリスチンの反復ＩＣＶ投与は、アルツハイマー病において観察されるものと類似した異常神経原線維の出現を伴う、伝導経路の変性を引き起こす。この変性は、主として脳室周囲構造に影響を及ぼす。海馬は、その分枝の減少により影響を受けるが、ニューロンの細胞体は変質しない。我々はまた、ビンクリスチンの反復投与が、短期間（最大５日間）だけ可能であることを証明した。この期間の後は、ビンクリスチンがＣＳＦから隣接する神経細胞に拡散するのを防ぐ保護層がグリア細胞上に生成する。ラットには自然発生するアルツハイマー病は存在しないが、ラットは、種々の型の変性病変（ベータ−アミロイド斑、神経原線維及び空胞の変性）を示すであろう。神経原線維変性を引き起こしうるビンクリスチンのＩＣＶ投与は、この疾患の部分的動物モデルとして使用しうる。我々の実験室においてラットに行った試験では、海馬の分枝の減少を示した。ビンクリスチンの投与後、ラットの学習能力は低下するが、海馬の神経原線維変性は観察される。スクリーニングモデルにおいて、この変性を評価することは困難であるため、唯一の評価パラメーターは、学習能力である。このモデルは、我々の実験室において標準化及び検証され、良好な再現性が得られている。
【００４２】
デキサメサゾンは、天然のコルチゾルに類似したコルチコイドである。ストレスが、カテコールアミン及びコルチゾル（ラットではコルチコステロン）の放出を引き起こす。反復性ストレス−「慢性ストレス」−は、グルココルチコイドに対する海馬受容体のダウンレギュレーションをもたらす。ラットで最初に開始されたこれらの試験は、ヒトにおいて確認されたが、そこでは、最初に特定の型の鬱病（湾岸戦争（Golf war）症候群）が観察され、次に認識能力の不可逆的障害が観察される。ヒトでのＭＲＩ試験は、海馬ニューロンの変性を示した。類似の症候群は、副腎皮質機能亢進症（クッシング病（Morbus Cushing））において、又は長期コルチコイド処置（多発性硬化症）中に観察される。ラットでは、デキサメサゾンの反復投与は、最初に海馬のII型受容体のダウンレギュレーションを引き起こし、続いてＣＡII及びＣＡIII層のニューロンの変性が起こる。ラットの学習能力は障害を受ける。このモデルは、我々の実験室において標準化及び検証され、良好な再現性が得られている。
【００４３】
Ｇｐ１２０は、ＨＩＶウイルスの表面糖タンパク質である。この糖タンパク質は、宿主細胞におけるウイルスの結合及びウイルスＲＮＡの移動において基本的な役割を演じている。単離Ｇｐ１２０はまた、細胞のＣＤ４受容体にも結合し、カルシウムイオンが潜り込む細孔の出現を伴う、膜の病変を引き起こすことにより、細胞のアポトーシスを惹起する。細胞の表面で、Ｇｐ１２０は、ベータ−アミロイド沈着にかなり類似した、糖化タンパク質の沈着を形成する。ＨＩＶウイルスは、血液脳関門を通過しないが、ウイルス感染マクロファージは、ここを容易に通過する。一旦ＣＮＳに到達すると、マクロファージは死滅して、Ｇｐ１２０及び他のウイルス成分を含むその細胞内容物を放出する。このＧｐ１２０は、グリア細胞のＣＤ４に結合し、またニューロンにも結合することにより、ＡＩＤＳの最終段階としての複雑な痴呆を引き起こす。観察される病変は、アルツハイマー病のそれに類似しているが、分布は異なっている。アルツハイマー病では、基底及び辺縁系の核のコリン作動性構造が最初に変質するが、一方ＡＩＤＳの複雑な痴呆では、斑の分布は全体にわたる。我々は、このＧｐ１２０モデルを使用して、数回のラット試験を行った。脳脊髄液への投与は、ブドウ糖の局所的消費の低下と血流の低下に関連した、海馬におけるニューロンの重大な減少を引き起こす。変性は、学習能力の障害を誘導する、海馬のＣＡII及びＣＡIII層において観察される。このモデルは、我々の実験室において標準化及び検証され、良好な再現性が得られている。
【００４４】
２．材料と方法
２．１  動物
それぞれ体重が平均２８０〜３００グラムの、オスのウィスターラット（チャールズ・リバー（Charles River）、Saint Aubin les Elbeuf、フランス）を動物実験に使用した。１週間の間、ラットを動物実験室の飼育小屋に入れたが、ここでは下記のパラメーターを制御した：
−  昼／夜リズム：午前７：００／午後７：００
−  温度：２２±１℃
−  湿度：５０±１０％
ラットには飲料水と標準的飼料のＵＡＲ  Ａ０３を自由に摂らせた。
【００４５】
２．２  Ｇｐ１２０モデル
ラット４０匹をエーテルにより軽度に麻酔をかけ、頭蓋の皮膚を切開して、歯科用バーを用いて頭蓋に穴を開けた。金属針を定位固定的に側脳室に導き、次に歯科用セメントを用いて固定した。実験中は毎日、針の開存性を制御した。
【００４６】
針の導入の３日後（手術後ショックから回復）、非麻酔ラットを２群に分けた：
−  生理学的血清５μlを注入したラット１０匹の１群
−  １０nM/kgの量でＧｐ１２０を含む生理学的血清５μlを注入したラット３０匹の１群
【００４７】
この実験室の実験では、変性が、Ｇｐ１２０の用量に依存することが示された；１０nM/kg/日の用量は、海馬ニューロンの４０〜６０％を減少させる。この投与は、５日間毎日反復した。
【００４８】
Ｇｐ１２０の最後の投与の１０日後、ラット３０匹をランダムに１０匹ずつの３群に分けた：
（ｉ）生理食塩水１ml/kg/日を５日間投与した（対照）ラット１０匹の１群
（ii）生理食塩水に溶解したシンナモイル−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−ＰｒｏＮＨ2  １０ml/kg/日を５日間投与したラット１０匹の１群
（iii）タクリン（tacrine）１０ml/kg/日を５日間経口投与したラット１０匹の１群
【００４９】
注射は、午前９：００に行った。
【００５０】
ラット１０匹の第１群（Ｇｐ１２０投与なし）は、同じ条件下で水１ml/kgを投与した。
【００５１】
処置の最後の５日間の間、ラットは、午前１０：００と１１：００の間に３つのモデルの共通の学習条件下においた（以下を参照のこと）。
【００５２】
２．３  デキサメサゾンモデル
ラット４０匹を上述のように保持して操作を加えた。次に、これらを下記の群に分けた：
−  生理学的血清５μl/日を投与したラット１０匹の１群
−  生理学的血清に溶解したデキサメサゾン５０mg/kg/日を投与したラット３０匹の１群。
【００５３】
処置の最後の５日間の間、ラットは、午前１０：００と１１：００の間に３つのモデルの共通の学習条件下においた（以下を参照のこと）。
【００５４】
午前１０：００の最後の学習セッションの後、断頭によりラットを屠殺して、海馬を迅速に取り出し、０℃に冷却したプレートに置いた。グルココルチコイド受容体の数を、標識コルチコイドと、受容体へのコルチコイドの結合に対する特異的インヒビターとを用いる結合方法により求めた（ここでは全アゴニスト）。タンパク含量は、ローリー（Lowry）法により測定した。
【００５５】
各ラットの海馬は、モリブデン酸ナトリウムＥＤＴＡグリセロール緩衝液２ml中にホモジェナイズした。このホモジェネートを１００，０００ｇで６０分間遠心分離した。上清のアリコートを蒸留水に希釈して、タンパク含量をローリー法により測定した。このタンパク質濃度は、１．３〜１．７mg/mlの間であった。
【００５６】
上清の残りを分割して、それぞれ０．２mlの３部にした。デキサメサゾン３Ｈ（アマーシャム（Amersham）５０Ci/mM）を上昇する濃度（２５、５０及び７５nmol/ml）でこれら各部に加えた。他の３つの調製も同じ条件下で行ったが、標識デキサメサゾンを非特異結合させるために、飽和量の受容体の全アンタゴニスト（ＲＵ２８３６２）を加えた。
【００５７】
４℃で一晩のインキュベーション後、タンパク質及び結合デキサメサゾンを吸収させるために活性炭／デキストランを加えた。遠心分離後、上清の放射活性を液体シンチレーションにより測定した。
【００５８】
タンパク含量に対して結合したデキサメサゾンの放射活性量を記録した。結果は、タンパク質１mg当たり受容体に結合した標識コルチコイドがフェムトモルで表される。
【００５９】
２．４  ビンクリスチンモデル
ラットは、３に上述されたように保持及び処置した。次に、これらを下記の群に分けた：
−  ５日間にわたり生理学的血清５μl/日を投与したラット１０匹の１群
−  ５日間にわたり５μg/kgビンクリスチンを含む生理学的血清５μl/日を投与したラット３０匹の１群
【００６０】
本実験では、変性が、ビンクリスチン用量に依存することが示された。５μg/kg/日の用量は、海馬の分枝を４０〜６０％減少させる。
【００６１】
最後の投与後、第２群のラット３０匹をランダムに３つの小群に分けて、３に上述されたように処置した。
【００６２】
２．５  学習
処置の最後の５日間の間、午前１０：００（シンナモイル−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＰｒｏＮＨ2の投与の１時間後）に、ラットを、音回避条件付け（回避応答の条件付け）のため学習ケージに入れた。ラットは、最初は電気ショックから逃れるため、次いでこれを回避するために、ポールに登ることを学習した。この方法は、標準化及び定量化されている（Le Poncin M., Lafitte J.C., Rapin J.R., 「音回避条件付け及び獲得動作の説明に対する数学的アプローチ」, Math. Biosciences 59 (1982) 242-268を参照のこと）。
【００６３】
５日間、ラットは、１日に全部で１０回の試験のために毎日このような学習条件下に置いた。結果は、適切な応答の百分率として表現され、そして応答の動態は、多重指数最大曲線により表される。
【００６４】
我々が実験室で行った全ての実験において、全ての対照動物は、学習の５日目に回避応答を示した（１００％適切な応答）。
【００６５】
曲線の極大は、学習能力を表す。曲線の傾きは、学習速度を評定する。曲線下面積（ＡＵＣ）は、全ての条件付けパラメーターの適切な評価を表す。ラットが早くも０日目に１００％適切な応答を示すならば、曲線下面積の最大値は、５００である。実際には、曲線下平均面積は、１日毎に計算し、そしてこれが最大値１００に達する。絶対対照動物では、この曲線下平均面積は、４０±４に等しい。
【００６６】
２．６  試薬
使用した全ての試薬は、Ｉ級試薬であり、そしてアルドリッチ（Aldrich）（Saint Quentin Fallavier、フランス）から提供されている。
【００６７】
デキサメサゾン３Ｈは、アマーシャム（Amersham）（イギリス）から提供されている。
【００６８】
特異的アゴニスト（ＲＵ２８３６２）は、ルセル（Roussel）から提供されている。
【００６９】
２．７  統計解析
結果は、１実験群当たりラット１０匹から得られる結果の、標準誤差を伴う平均値として表される。
【００７０】
ＡＮＯＶＡ分散分析により、有意な結果は、スチューデント検定（Student's test）を用いて得られる。
【００７１】
変動は、各実験日について最小二乗法の関数として計算される。有意性は、ｔ検定により求められる。
【００７２】
３．結果
３．１  Ｇｐ１２０モデル
ポール登り試験法による音回避条件付け
結果は、下記表Ｉに提示される。各学習日について、表に列挙される値は、回避の百分率に相当する。ラットは、ポールに登ることにより放電を受けるのを回避する。第１日目、動物群のいずれでも回避は観察されない。Ｇｐ１２０を投与したラットでは、学習速度及び能力が有意に低下する。シンナモイル−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＰｒｏＮＨ2で、及びタクリン（ＴＡＡ）での処置は、学習パラメーターを幾分回復させる。この有意な結果は、２、３、及び４日目の曲線下面積及び時間に関して観察される。
【００７３】
【表１】
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【００７４】
ニューロン数
最後の学習セッション後、断頭によりラットを屠殺して、脳を単離して液体窒素で−８０℃に凍結した。５０μmの厚さの切片を「クリオカット（cryo-cut）」で得て、海馬のＣＡIII層のニューロンを顕微鏡下でカウントした。結果は、対照群の百分率として表される。
【００７５】
【表２】
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【００７６】
これらの結果から明らかなように、トリペプチドの投与は、タクリンと同様に、学習能力の改善をもたらす。しかしタクリンとは対照的に、この改善は、ニューロンのあまり重度でない変性を伴う。
【００７７】
３．２  デキサメサゾンモデル
音条件付け
学習能力は、上述のように試験した。結果は、下記の表に要約される。
【００７８】
【表３】
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【００７９】
コルチコイド受容体の測定
結果は、下記の表に要約される。
【００８０】
【表４】
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【００８１】
デキサメサゾンの投与は、海馬におけるコルチコイド受容体の数の非常に劇的な減少を誘導する。この実験において使用した用量及び処置時間では、６０％程度の減少を認めた。本発明により使用されるトリペプチドの投与は、海馬ニューロンの受容体の数の有意な増加をもたらす。タクリンは、同じ条件下では何ら作用を示さない。
【００８２】
このことは、本発明により使用されるトリペプチドでの処置が、学習能力を相当回復させ、そして海馬のレベルでの変性が低下することを示す。これに反して、アセチルコリンが関係している限りアセチルコリンの分解を阻害し、学習挙動を改善するタクリンは、コルチコイド変性のこのモデルにおいて何ら作用を示さない。
【００８３】
３．３  ビンクリスチンモデル
学習挙動は、上述のように試験した。結果は、下記の表に要約される。
【００８４】
【表５】
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【００８５】
これらの結果は、学習能力に及ぼす、本発明により使用される物質の有利な作用を示す。これに反して、タクリンは、このモデルでは作用を示さない。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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