(57)【要約】蛍光ポリマーとレセプターと含む化学組成物であって、このレセプターが、標的生物学的因子、および、(ａ)認識エレメントと(ｂ)束縛エレメントと(ｃ)性質を変えるエレメントとを含む化学部分、の両方に対して特異的なレセプターである化学組成物を開示する。蛍光ポリマーおよびレセプターは両方共、支持体上で、同じ場所に配置される。化学部分をレセプターに結合させた場合、性質を変えるエレメントは蛍光ポリマーに十分に接近し、ポリマーによって放出される蛍光を変える。検体サンプルを導入すると、標的生物学的因子はそれが存在する場合はレセプターに結合し、レセプターから化学部分が置換され、検出される蛍光の増加が得られる。標的生物学的因子の存在を検出するアッセイも開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体に付けられた蛍光ポリマー、および
該支持体に付けられた、標的生物学的因子に特異的なレセプター、
を含む組成物であって、
該レセプターが、(ａ)該レセプターと結合可能な認識エレメント、(ｂ)束縛エレメント、および(ｃ)該化学部分が該レセプターに結合された場合に、該蛍光ポリマーによって放出される蛍光が、該レセプターと化学部分との間の結合が生じない場合に放出される蛍光から変わるように、該性質を変えるエレメントが該蛍光ポリマーと十分に近接して配置される、性質を変えるエレメント、
を含む化学部分との複合化に適応している、組成物。
【請求項２】
前記ポリマーが、吸着または共有連結を介して前記支持体に固定される、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記ポリマーが、中性ポリマーおよび荷電されたポリマーからなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリマーが、共有的にまたは非共有的に連結した発色団と凝集とを有して、ポリマー集団が形成される、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
前記発色団が類似する、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
前記発色団が類似しない、請求項４記載の組成物。
【請求項７】
前記ポリマー集団が、第２ポリマーと共有的に連結される、請求項４記載の組成物。
【請求項８】
前記ポリマーおよびレセプターが、前記支持体と共有的に結合される、請求項１記載の組成物。
【請求項９】
前記レセプターが、前記ポリマーと共有的に結合される、請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
前記蛍光ポリマーが、集合したモノマーまたはオリゴマーを含む接合したまたはＪ−凝集したポリマー集合である、請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
前記ポリマーが、接合した高分子電解質、官能化された接合したオリゴマー、非荷電された接合したポリマー、荷電された接合したポリマーおよび接合したポリマー配合物からなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
前記認識エレメントが、化学リガンド、ホルモン、抗体、抗体フラグメント、オリゴヌクレオチド、抗原、ポリペプチド、糖脂質、タンパク質、タンパク質フラグメント、酵素、ペプチド核酸および多糖類からなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
前記束縛エレメントが、単結合、単一の二価原子、二価の化学部分、多価の化学部分、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリアミドおよび非重合性有機構造からなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項１４】
前記性質を変えるエレメントが、メチルビオロゲン、キノン、金属錯体、蛍光染料、非蛍光染料、電子求引部位、電子供与部位およびエネルギー求引部位からなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項１５】
前記支持体が、ストレプトアビジンがコートされた球体、ポリマー微粒子、シリカ微粒子、有機ナノ粒子、無機ナノ粒子、磁気ビーズ、磁気粒子、半導体ナノ粒子量子ドット、膜、スライド、プレートおよび試験管からなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項１６】
前記標的生物学的因子が、タンパク質、ウイルス、細菌、胞子、細胞、微生物、抗体、抗体フラグメント、核酸および毒素からなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項１７】
サンプルがない場合において、請求項１記載の化学組成物によって放出される蛍光を検出する工程、
該サンプルと前記レセプターを有する前記化学部分とを接触させる工程、および
該接触させる工程後に、前記蛍光ポリマーによって放出される蛍光を測定する工程、
を包含する、サンプル中における標的生物学的因子の存在を検出するアッセイであって、
サンプルがない場合に放出される蛍光と比較された、該接触させる工程後に放出される蛍光における差異が、前記生物学的因子の存在を表示するものである、アッセイ。
【請求項１８】
前記サンプル中に存在する標的生物学的因子の量が、蛍光における前記差異の量と相関する、請求項１７記載のアッセイ。
【請求項１９】
前記化学部分が、前記サンプルの前に、前記化学組成物に加えられる、請求項１７記載のアッセイ。
【請求項２０】
前記化学部分および前記サンプルが、前記化学組成物に同時に加えられる、請求項１７記載のアッセイ。
【請求項２１】
前記サンプルが、前記化学部分の前に、前記化学組成物に加えられる、請求項１７記載のアッセイ。
【請求項２２】
前記サンプルおよび化学組成物が、前記化学部分の添加の前にインキュベートされる、請求項１７記載のアッセイ。
【請求項２３】
前記標的生物学的因子が、タンパク質、ウイルス、細菌、胞子、細胞、微生物、抗体、抗体フラグメント、核酸および毒素からなる群から選択される、請求項１７記載のアッセイ。
【請求項２４】
支持体に付けられた蛍光ポリマー、および
該支持体に付けられた化学部分、
を含む組成物であって、
該化学部分が、標的生物学的因子に特異的なレセプター、および、(ａ)該レセプターに結合する認識エレメントと、(ｂ)束縛鎖と、(ｃ)該性質を変えるエレメントおよび該蛍光ポリマーが併せて複合化する場合に、該蛍光ポリマーによって放出される蛍光が区別可能な程度に変わるように該蛍光ポリマーに十分に近接して配置される、性質を変えるエレメントと、を含むＱＴＬバイオ接合、を含み、
該ＱＴＬバイオ接合は、該レセプターへの結合のための親和力を有する因子に曝すことに基づく、該ポリマーからのその後の分離が可能であって、
該レセプターからの該ＱＴＬバイオ接合の分離は、該ポリマーの蛍光における検出可能な変化をもたらす、組成物。
【請求項２５】
(ａ)サンプルがない場合に、請求項１記載の化学組成物によって放出される蛍光を検出する工程、
(ｂ)工程(ａ)の化学組成物と前記化学部分とを接触させる工程、
(ｃ)接触させる工程(ｂ)の後に、蛍光ポリマーによって放出される蛍光を検出する工程、
(ｄ)工程(ａ)の化学組成物と、該化学部分および該サンプルとを接触させる工程、および
(ｅ)接触させる工程(ｄ)の後に、蛍光ポリマーによって放出される蛍光を検出する工程、
を包含する、サンプル中の標的生物学的因子の存在を検出するアッセイであって、
該接触させる工程(ｂ)の後に放出される蛍光と比較された、該接触させる工程(ｄ)の後の蛍光における差異が、該標的生物学的因子の存在を表示する、アッセイ。
【請求項２６】
前記サンプル中に存在する標的生物学的因子の量が、蛍光における前記差異の量と相関する、請求項２５記載のアッセイ。
【請求項２７】
工程(ｄ)において、前記化学部分が、前記サンプルの前に、前記化学組成物に加えられる、請求項２５記載のアッセイ。
【請求項２８】
工程(ｄ)において、前記化学部分および前記サンプルが、前記化学組成物に同時に加えられる、請求項２５記載のアッセイ。
【請求項２９】
工程(ｄ)において、前記サンプルが、前記化学部分の前に、前記化学組成物に加えられる、請求項２５記載のアッセイ。
【請求項３０】
工程(ｄ)において、前記サンプルおよび化学組成物が、前記化学部分の添加の前にインキュベートされる、請求項２５記載のアッセイ。
【請求項３１】
前記標的生物学的因子が、タンパク質、ウイルス、細菌、胞子、細胞、微生物、抗体、抗体フラグメント、核酸および毒素からなる群から選択される、請求項２５記載のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本出願は、２００１年３月１６日出願の米国仮出願第６０／２７６，０９０号および２００１年８月２３日出願の米国仮出願第６０／３１４，１０１号からの優先権を主張する。これらの仮出願全体は出典明示により本明細書に導入されている。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、新規な消光剤−束縛鎖−リガンド(ＱＴＬ)メカニズムによって機能する蛍光バイオセンサーに関する。とりわけ本発明は、同じ固体支持体上で、ＱＴＬバイオ接合および標的検体に対して、蛍光ポリマー(またはポリマー集団、自己集合したポリマーを含む)およびレセプターを同じ場所に配置することによる、ポリマー−ＱＴＬアプローチの改善に関する。
【０００３】
従来技術の説明
ポリマー−ＱＴＬ(消光剤−束縛鎖−リガンド)アプローチは、増幅ステップが蛍光ポリマーに内在する、単一段階であって即効性の、均質なアッセイである。ポリマー−ＱＴＬアプローチは、蛍光変化の観察による、生物学的因子(biological agent)の有効なセンシングのためのシステムを提供する。重要な科学的基礎は、ある荷電された接合したポリマーおよび小分子消光剤から得られる、蛍光の消光の増幅である。加えて、この工程は試薬を必要としないため、本当にシンプルである。
【０００４】
「バイオセンサー」モードでは、ＱＴＬアプローチは、図１に示す図表で示されるように、特別に構成された「消光剤−束縛鎖−リガンド」(ＱＴＬ)単位によって消光される蛍光ポリマーを有することにより、機能する。リガンドに特異的な生物学的レセプターを含む検体を加えると、ポリマー蛍光の「ターンオン」がもたらされるポリマーからＱＴＬ接合が取り除かれると考えられる。蛍光高分子電解質に基づく超消光アッセイは、通常使用される小分子に基づく蛍光アッセイに対して幾つかの利点を供することが示されている。例えば、接合した高分子電解質、染料が垂れ下がった高分子電解質などは、吸収および超消光の両方によって効果的に集光する(１〜５)。ポリマーの増強された吸収力は、これらの材料の一部のサブナノモル溶液であっても視認できるほどに着色するという観察によって示される。これらのポリマーの蛍光は、低濃度であっても検出されることができる。超消光は、ポリマーまたはその繰返し単位の１つに対して、電子伝達またはエネルギー伝達消光剤として働くことができる小分子の存在下で、起こる。
【０００５】
これらのポリマーに対する「Stern-Volmer」消光低数(Ｋsv)は、１０8〜１０9Ｍ-1ほどの高さとして示されており、そして１０11Ｍ-1ほどの高い値も達成できると予想される(６)。
高分子電解質に対して反対に荷電された、消光剤に対するＫsvのこのような高い値は、消光剤と高分子電解質との間の強力な非特異的結合による。その結果生じた増幅した消光は、消光剤がポリマーに近接して束縛する「トラップ部位(trapsite)」への励起子非局在化およびエネルギー移動によって生じる。
【０００６】
増強された超消光は、ポリマーが、表面を有する荷電された支持体、ポリマー微粒子、および無機ナノ粒子に吸着された場合に得られうることも示されている(７，８)。超消光は、「事実上の」ポリマーに自己集合したモノマーまたは小オリゴマーについて、同じ支持された形式で観測される。ポリマー（および「事実上の」ポリマー）の超消光は、特定のバイオ分子についてのバイオレセプター（Ｌ）またはリガンドに対する潜在的超消光成分（Ｑ）束縛鎖（Ｔ）を含むＱＴＬ接合を構成することによって、バイオセンシングに対して適応される(１)。
【０００７】
蛍光に基づくアッセイは、ＱＴＬ接合が使用され、溶液中であるいは溶液-固体または溶液-粒子の界面で支持された形式中のいずれかでポリマーを消光することによって実現される（１，７，８）。例えば、蛍光高分子電解質（接合したポリマーおよびＪ−凝集ポリマーを含む）を、溶液形式における高感度バイオ検出およびバイオアッセイに使用することができる。この検出の基礎は、消光剤-認識接合(例えば、ＱＴＬ分子)の合成に伴う、反対のまたは中性の電荷の消光剤に対する、これらの分子の「超消光」感受性の組合せである。元の配合では、ＱＴＬ接合は、非特異的結合によってポリマー集団を消光する。ＱＴＬ接合のＬ成分と結合することができる標的バイオ因子を加えると、ポリマーからＱＴＬ接合が取り除かれ、そしてポリマー蛍光のターンオンがもたらされる。
【０００８】
蛍光のターンオフ(または変調)アッセイは、ポリマー超消光に基づいて発展してきた（５）。この場合、標的分子は、ＱＴＬ接合のＬ成分に対応する、バイオ因子ＬまたはＬ’であり、そしてレセプターはＬ、Ｌ’またはＱＴＬ接合と強力に相関したバイオ分子である。ある実施態様は、未知量のＬ（またはＬ’)を一定量のレセプターの結合部位に対してＱＴＬ接合と競合させる、直接競合アッセイである。ポリマー蛍光は、存在するＬ（またはＬ’）の量に依存する限度で、結合されていないＱＴＬによって消光される。他の実施態様では、ＱＴＬ接合はレセプターとプレ相関する；ＱＴＬ接合全てがレセプター部位と相関する場合、消光は観察されない。サンプルにＬ（またはＬ’）を加えると、ポリマー蛍光の付随する消光を伴って、ＱＴＬ接合の解放が起こる。
【０００９】
上記のアッセイ形式全ては、ＱＴＬ接合とポリマーとの相関による、ポリマー蛍光の非特異的消光に依存する。これらのアッセイの複雑さは、ポリマーまたはＱＴＬ接合のいずれかあるいは両方を含むアッセイサンプルの他の成分の非特異的相互作用の競合であって、これらは消光の変調をもたらす。本発明において、ポリマー超消光の改変によって、これらの影響を克服し、より多目的でありそしてしっかりしたセンサーを提供する、改善されたアッセイが構成される。
【００１０】
発明の概要
本発明の目的は、特定のバイオ因子に特異的な、消光剤（Ｑ）、束縛鎖（Ｔ）、およびリガンド（Ｌ）で形成される新規な化学部分を提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、本発明の新規なＱＴＬ分子および蛍光ポリマーを使用してサンプル中の標的因子を検出するアッセイを提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、サンプル中の標的生物学的因子をすぐにおよび正確に検出することにある。
【００１３】
標的生物学的因子に対する蛍光ポリマーおよびレセプターが支持体上の同じ場所に配置されることは、本発明の特徴の１つである。
【００１４】
同じ場所に配置された蛍光ポリマーおよびレセプターが支持体に束縛されることは、本発明の他の特徴である。
【００１５】
同じ場所に配置された蛍光ポリマーおよびレセプターが支持体と共有的に連結されることは、本発明の他の特徴である。
【００１６】
レセプターと蛍光ポリマーとが共有的に連結されることも、本発明の特徴である。
【００１７】
蛍光の変化が標的生物学的因子の存在を表示することは、さらなる特徴である。
【００１８】
消光する事象がレセプターとＱＴＬ接合との間の特異的相互作用の結果であることは、本発明の他の特徴である。
【００１９】
集合したモノマーがポリマーのようにふるまうことも、本発明の他の特徴である。
【００２０】
本発明のアッセイが操作的に異なる形式で実施できることは、本発明の利点である。
【００２１】
本発明のさらなる利点は、空間的にリジッドな支持体上にまたは異なる粒子上に特異的なポリマー集団−レセプターの同じ場所に配置された集合を制御する能力によって提供される多機能性である。
【００２２】
本発明によるアッセイが均質でありかつほぼ即効性であることは、本発明の他の利点である。
【００２３】
空間的な（例えばリジッドな支持体上の）あるいは異なる粒子上の、同じ場所に配置されたポリマー集合を制御する能力が、優れた多機能性を提供することも、本発明の他の利点である。
【００２４】
超消光が特異的リガンド−レセプター相互作用によって提供されることは、さらなる利点である。
【００２５】
図面の簡単な説明
図１は、ＱＴＬアプローチの一般的な例示図である。
図２は、本発明で使用される種々の蛍光化合物、消光剤、およびＱＴＬ接合を例示説明する。
図３は、本発明で使用される種々の蛍光化合物、消光剤、およびＱＴＬ接合を例示説明する。
図４は、封入複合体において多糖類と共に使用される染料の構造を例示説明する。
図５は、置換競合アッセイの一般的な例示図である。
図６は、直接競合アッセイの一般的な例示図である。
図７は、ポリマー-バイオ分子の組合せを伴う競合的蛍光「ターンオン」アッセイの例示図である。
図８は、共有／吸着配列による、ポリマーおよびレセプターの同場所配置を例示説明する。
図９は、ポリマーおよびレセプター結合部位の両方の共有的な束縛を例示説明する
図１０は、ポリマーに共有的に連結されたレセプターを例示説明する。
図１１は、サンドイッチＱＴＬアッセイの例示図である。
図１２は、本発明の実施態様で使用される種々の化合物の例示図である。
図１３は、負荷レベルの関数としての、蛍光の消光のグラフ図である。
図１４は、ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体における競合アッセイのグラフ説明である。
図１５は、レセプターに共有的に連結されたポリマー２５を伴う、ＩｇＧアッセイのグラフ説明である。
図１６は、シリカ微粒子表面に共有的に付加したシアニン染料２６の合成を例示説明する。
図１７は、ＱＳＹ−２１スクシニミジルエステルの構造図である。
【００２６】
発明を実施するための最良の形態
ポリマーＱＴＬアプローチにおける重要な科学的基礎は、特定のポリマー（限定するものではないが、発色団が非共有相互作用（例えばＪ−凝集）によって制御される、荷電したポリマー、接合したポリマーおよび染料が垂れ下がった高分子電解質を含む）および小分子消光剤によって得られる、蛍光（超消光）の消光の増幅である。蛍光ポリマーは、集光性能（収集励起）および超消光に対する感受性（すなわち、ある消光剤がポリマー鎖全体からあるいはポリマー、オリゴマー、またはモノマーの収集物からルミネセンスを消すこと）の両方の効力において、通常使用される分子フルオロフォアを上回る増幅を提供する。幾つかの事例では、増強された消光は、ポリマー混合物が使用される場合、またはポリマーが吸着される場合、または表面上への他の状態の集合で、観察され得る。発色団繰返し単位の一部のモノマーまたはオリゴマーが、共有付着または支持体上への吸着のいずれかによって集合する場合に、消光の同じ増強が観察され得る。支持体は、限定するものではないが、下記の何れのものであってもよい：ポリマーまたはシリカ微粒子、有機または無機ナノ粒子、磁気ビーズまたは粒子、半導体ナノ結晶、タグ付き(tagged)またはルミネセンスの粒子、膜および平面のまたは波形の固体表面。
【００２７】
蛍光ポリマー超消光は、「ＱＴＬ」バイオ接合の使用においてバイオセンシング用途として適応される（１，４〜６，８）。バイオセンシングに対するＱＴＬアプローチは、電子伝達による蛍光高分子電解質の超消光およびエネルギー伝達移動消光剤を利用する。最も単純なアプローチでは、蛍光ポリマーＰは、通常Ｐの反対の電荷を有するものであるＱＴＬバイオ接合と相関する複合体を形成する。ＱＴＬバイオ接合は、小分子電子伝達またはエネルギー移動消光剤（Ｑ）を含み、これはリガンドＬに対して共有束縛鎖を経て結び付き、これは特定のバイオ因子またはレセプターに特異的である。バイオ因子によるＱＴＬバイオ接合の結合は、蛍光ポリマーからＱＴＬバイオ接合を取り除くか、あるいは消光効率を改変して、すぐに検出可能な方法でバイオ因子をセンシングする。
【００２８】
「ＱＴＬ」方法で使用できるリガンドの適切な例として、化学リガンド、ホルモン、抗体、抗体フラグメント、オリゴヌクレオチド、抗原、ポリペプチド、糖脂質、タンパク質、タンパク質フラグメント、酵素、ペプチド核酸(ＰＮＡｓ)、および多糖類が含まれる。適切な束縛鎖の例として、限定するものではないが、単結合、単一の二価原子、鎖長で炭素数約１００までの二価の化学分子、多価の化学分子、ポリエチレン、ポリエチレンオキサイド、ポリアミド、少なくとも炭素数約７〜２０の非重合性有機構造、および関連する材料が含まれる。適した消光剤として、メチルビオロゲン、キノン、金属錯体、蛍光および非蛍光染料、およびエネルギー求引、電子求引および電子供与部位が含まれる。リガンド、束縛エレメント、および消光剤のこれらの例示は限定的に解釈されるものではなく、他の適した例示も当業者によって容易に確定できる。
【００２９】
ポリマー−ポリマー集団およびバイオセンシングに対するこれらの用途
図２に示される化合物１および２によって代表される蛍光高分子電解質は、吸着性能に加えて、他の高分子電解質および互いを含んで、反対に荷電されたマクロ分子と相関する非常に強力な傾向がある。カチオン性の接合したポリマー８は、化合物１および２と一緒になって、（特に化合物２中のシアニン置換基の変更によって）近紫外から可視−赤外の範囲にかかる吸収最大波長を有する、一連の３種の蛍光高分子電解質を形成する。
【００３０】
２つの反対に荷電された蛍光高分子電解質の相関は、化合物１および２の相関をふまえて、幾つかの興味深くそして潜在的に有用な効果を導く。例えば、繰返し単位における、化合物１および２の量のほぼ等モルの相関は、全体として中性に近く、分離したネガティブおよびポジティブ電荷の領域からなる集団をもたらす。化合物２は化合物１より低いエネルギーで放出が見られるので、エネルギー移動が生じ得ることが認められる。従って、吸収が主として化合物１による領域への励起は、化合物２による卓越した放出をもたらす。化合物２は非常に鋭い放出を有するので、集団内でのエネルギーの収集は、単一のポリマー内で利用できるものをはるかに超える、吸収性能および放出性能の両方を調節する可能性を提供する。化合物１および２の組合せなどの集団を使用して得られる、最も特筆すべき利点は、アニオン性およびカチオン性の小分子消光剤の両方が、全体としてほぼ中性なポリマー混合物を消光することができることである。結果として、集団は、アニオン性化合物４およびカチオン性化合物３の両方によって（独立して）消光可能であることが認められる。さらに重要なことには、どちらの消光剤が非常に低濃度であっても消光が認められることであり、反対に荷電された小分子による個々のポリマーの消光と比較して、超消光の度合いは、わずかな減衰を示すのみである。
【００３１】
これらの結果は、ポリマー−ポリマーアプローチはポリマー−ＱＴＬ方法によるバイオセンシングに対して明白な利点を提供することを示している。ポリマー集団は、ポジティブにおよびネガティブに荷電されたＱＴＬバイオ接合の両方によって消光され得る。従って、消光/非消光形式において、または競合的アッセイにおいて、ポリマー−ポリマー集団は、より高い感受性および特異性が得られる手段を提供する。さらに、カチオン性またはアニオン性の消光剤による消光の度合いは、ポリマー混合物の化学量論を変えることによって直接調整できる。例えば、ポリマー１およびポリマー２が１００：１の割合で混合された場合、カチオン性ＱＴＬによる超消光が維持され、アニオン性ＱＴＬによる消光は確認されない。しかしながら、このような低い割合であっても、ポリマー２の効果的なエネルギー移動が未だ認められる。ポリマー１とポリマー２とが２：１の割合である場合、カチオン性およびアニオン性ＱＴＬ両方による超消光が認められる。従って、ＱＴＬアッセイは、アニオン性およびカチオン性ポリマー両方の化学量論を変えることによって達成される。超分子クラスターの正味電荷および組合せのエネルギー移動特性の両方が、この方法によって調整されうる。
【００３２】
支持されたポリマーを含む混合物を使用する多重検出
アニオン性蛍光ポリマーおよびカチオン性蛍光ポリマーの相互作用を、ビーズに対するポリマーまたは他の支持された形式へ最初に固定することによって、取り除くことができる。例えば、ポリマー１を加える前の、クレー懸濁液に対するポリマー２の固定は、ポリマー１および２の相関を防ぐことが示されている。この方法において、各ポリマーの独立した超消光は、カチオン性またはアニオン性消光剤の添加に基づく単一の溶液によって達成される。
【００３３】
モノマー、オリゴマーおよび高分子電解質における支持された形式
蛍光高分子電解質（接合されたおよびＪ−凝集ポリマーを含む）を、溶液形式における高感度なバイオ検出およびバイオアッセイに使用することができる。この検出の基礎は、消光剤-認識接合（ＱＴＬ）の合成に伴う、反対のまたは中性電荷の消光剤に対する、これらの分子の「超消光」感受性の組合せにある。ポリマー−ＱＴＬアプローチの改良の１つとして、吸着を介する固体支持体上への蛍光ポリマーの固定が含まれる。幾つかの利点は、この吸着からもたらされ得る。
【００３４】
図２および図３に示される化合物などを非限定的に含む蛍光高分子電解質は、水性または水性-有機混合溶液から、スライド、プレート、反対に荷電されたポリマービーズ（例えば非限定的に、４級アミン誘導ポリスチレンまたはスルホネートポリスチレン）などの反対に荷電された表面上に、および、クレイまたはシリカ、荷電された膜、または他の多孔性材料などの、天然のまたは合成の無機支持体上に、すぐに吸着され得る。一旦これらの支持体上に吸着されると、ポリマーは特定の消光剤に対する感受性と同程度の強烈な蛍光を保持する。これらの形式に導入された蛍光ポリマーを、以下に記載する高度なアッセイに使用することができる。
【００３５】
荷電されたポリマービーズ上への蛍光ポリマーの導入は、蛍光消光モードまたは蛍光非消光モードのいずれかにおける、ポリマーを含むアッセイの改善された性能と同様に、ポリマー蛍光の消光における電荷特異性の反転をもたらし得る。ある実施態様では、アニオン性接合したポリマー１は、水溶液中の低濃度のポジティブに荷電された電子受容体３によって効果的に消光される。しかしながら、その蛍光は、ネガティブに荷電された電子受容体４を加えることによっては、溶液中においておおむね影響がない。ポリマー１を４級アミン(カチオン性)誘導ポリスチレンビーズ(Source 30 Q)の懸濁液で処理する場合、ポリマーは溶液から取り除かれ、そしてビーズ上に不可逆的に吸着される。この支持された形式で、高蛍光ビーズを水溶液中に懸濁させて、同じ消光剤で処理することができる。消光感受性の反転が認められる；支持された形式において、アニオン性電子受容体４はポリマー１を消光し、一方ポリマー１の蛍光はもはやカチオン性電子受容体３によっては消光されない。
【００３６】
蛍光消光の電荷反転を、ポリマー−ＱＴＬアプローチによるバイオセンシングに適応することができる。従って、ＱＴＬ接合５、アニオン性電子受容体４およびビオチンリガンドに類似するアントラキノン消光剤を含むものである、は、ポリマー１の蛍光を消光することも認められる。タンパク質アビジン（ビオチンに特異的なレセプター）を加えると、接合５によってもたらさせる消光は反転し、ポリマー１の蛍光の事実上完全な回復が観察される。これは、ビオロゲンに基づく接合６でみられる、ポリマー１の同様の消光-回復応答を導く水溶液と、対照をなす。ポリマー１および２の両方について、水性または部分的水溶液に溶かす場合、マクロ分子を加えることによるポリマー蛍光に基づく非特異的効果がしばしば観察され、特にタンパク質は部分的な消光または増強を誘導する。これらの相互作用は、センシングで用いられる特定のＱＴＬ接合と相互作用しないと予想される検体タンパク質またはタンパク質によって起こることがあり、そして「検体」タンパク質とポリマーＱＴＬ複合体との相互作用によって、特異的な効果に支障をきたす。これらの非特異的効果は、支持された形式においてポリマーを用いることによって、排除したり軽減したりすることができる。
【００３７】
第２の実施態様はＱＴＬ接合７の使用を含み、エネルギー移動によってポリマー１の蛍光を消光する。アニオン性化合物７は純粋な水溶液中でアニオン性ポリマー１の蛍光を消光しないが、ビーズ上のポリマー１の吸着は、化合物７の添加による消光およびアビジンの添加による蛍光回復をもたらす。
【００３８】
荷電された支持体上への蛍光ポリマーの吸着は、ポリマーの消光における電荷反転を必ずしも導くわけではない。電荷反転またはそれの欠乏を、支持体上の部位へのポリマーの「負荷」の度合いによって調整することができる。他の実施態様では、吸着の結果として、支持されたポリマーにおける増強された消光を得ることができることが示される。従って、カチオン性ポリマー２がアニオン性ラポナイト(Laponite)クレイ粒子上に吸着される場合、少量のアニオン性受容体４を水性懸濁液に加える場合においてポリマー蛍光は未だ消光を受ける。これらの負荷条件において、ポリマー２は化合物３などのカチオン性受容体によって消光されない。これらの条件における化合物４による消光の範囲の定量分析は、クレイ−支持されたポリマー２が、純粋な水溶液におけるものより、より効果的に消光されることを示す（この実施例では３０％を超えるまで）。この実施態様は、支持されたポリマーを使用するポリマー−ＱＴＬアプローチを用いる改善されたバイオセンシングを導く２つのコンセプトを例示説明する。第１のコンセプトは、クレイ粒子上に支持された場合、支持されたポリマーを、反対に荷電された消光剤を「感じ取る」のに使用できることであり、劣化および沈降（水溶液で観察される）に関する改善された安定性を示す。同じポリマーが低い負荷レベルでクレイ上に支持された場合、その蛍光はカチオン性化合物３によって消光され、こうして上記ポリマー１と同様の電荷反転を示す。クレイ−支持されたポリマー２および化合物４によるそれの消光を用いるこれらの実験からの第２のコンセプトは、クレイ粒子上のポリマー−ポリマー相関効果により、高められた消光感受性を得ることができることである。この高められた消光感受性は、Ｊ−凝集ドメイン（または接合したポリマーにおける抱合長さ）の増加によりもたらされ得る。
【００３９】
増強された消光感受性の組合せ、および上記の支持された形式における消光感受性を調整する能力は、感受性および多機能性両方に関するポリマー−ＱＴＬアプローチの潜在性
に及ぶ。加えて、蛍光高分子電解質の、ビーズ、表面、または膜上への固定は、ポリマー−ＱＴＬアプローチの利用性に及び得る。従って、ビーズまたは膜上へのポリマーの強力な吸着は、液体または蒸気の流れを使用する「流動式(flow-through)」モードにおける検体の検出を提供し得る。加えて、吸着による、多穴アレイ形式におけるプレート上へのポリマーの束縛は、高処理スクリーニング系および高速サンプリング用途におけるこれらの形式の使用を示す。その上、ビーズ表面への固定において非特異的効果を除去することは、ＱＴＬに基づくアッセイの実用的な利用を大きく高める。
【００４０】
超分子ビルディングブロックの共有付着に基づく事実上のポリマー
増強された超消光は、吸着された形式において、かなり小さいオリゴマーそしてモノマーさえからも超消光を得る新たな方法を提供する。従って、ｎ＝３〜ｎ＝１０００に変化する繰返し単位大きさの範囲において、ポリマー２を合成することが可能である。第１の近似において、溶液中で、より高い分子量のポリマーは、繰返し単位の数（６）に直接比例しうる「増幅ファクター」による、より高い消光効果を示し得ることが予想される。しかしながら、繰返し単位の数が増加する場合はポリマーの溶解性が低下し、そしてポリマーの複雑さは新たな非放射減衰を誘導して、消光剤の効果を弱める。従って、ポリマー２においては、非常に高分子量のポリマーを使用する最大感受性に達する潜在性は認知できない。吸着された形式における、より小さいオリゴマー（あるいはモノマー）の使用は、隣接するポリマー（またはモノマーあるいはオリゴマー）分子と架橋する広がった凝集の構成によって、効果的な高次ポリマーの構成を可能にする。これは、増強されたレベルの超消光、そして感受性が大きく増強された新たなセンサーを供する。
【００４１】
シリカまたはクレイナノ粒子上のシアニン染料モノマー１５またはオリゴマー１０の集合は、イオン電子伝達またはエネルギー移動消光剤に対する高超消光感受性（すなわち、表面活性化超消光）を示す、「Ｊ」凝集の構成をもたらす。これは、高電荷密度（および得られるクーロン相互作用）および自己集合単位内での励起子相互作用の組合せに起因すると考えられる。これらの集合を、ＱＴＬ蛍光の消光−非消光モードにおけるバイオセンサーとして使用することもできる。これらの事実上のポリマーを、種々のモノマーまたは小さなビルディングブロックから容易に集合させることができ、ポリマー合成、精製および性質決定の困難な工程を回避できる。最近の研究調査において、自己集合した事実上のポリマーは、加えられたマクロ分子に対しての蛍光において感受性が低く比較的安定していることが示されているが、しかし小さな吸着された単位は、特定の状況下において、最も顕著には高度なイオン強度下において、脱離または転位をうけやすいことは明らかである。表面上に集合した小さなビルディングブロックを用いる簡素さとよりしっかりした分析プラットフォームとを組合せたアプローチは、中性または荷電されたナノ粒子、ビーズ、または他のリジッド支持体の表面上におけるモノマーの共有束縛を含む。
【００４２】
ある実施態様では、シアニン−ポリ-Ｌ-リジン１０向けに開発されたものと類似する比較的単純な合成スキームを、０．２μｍ直径のシリカ微粒子の表面に共有付着させたシアニン染料１５の構成において使用できる。微粒子表面に連結したシアニン染料は、モノマーの小さなクラスターとしておよび高度に並べられた凝集としての両方に存在すると判明した。材料を２％ジメチルスルホキシドを含む水に懸濁させた場合、染料クラスターと凝集との間の効率的な励起子(exiton)移動/エネルギー移動が観察される。懸濁液は、２７ｎＭアニオン性消光剤１３の存在下における放出強度において２７％減少も示し、共有的に連結した染料集合の超消光が起こることを示した。微粒子上のシアニン染料モノマー間の相互作用のモードを、表面上に存在する官能基の密度および構造を変えることによって、制御できる。こうしてバイオセンシングの効率を最適化することができる。同様のスキームを使用して、ビーズ、粒子または他の固体表面上に、他のシアニン染料および接合したポリマーオリゴマーなどの他のビルディングブロックを付加させることもできる。
【００４３】
自己集合または共有束縛鎖によって量子ドット上に付加された事実上のポリマー：量子ドットとＱＴＬバイオアッセイとのカップリング
シアニン染料（限定するものではないが、構造１０および１５の発色団を含む）あるいは粒子または表面上に凝集を形成することができる他の分子の集合は、超消光に基づくバイオセンシングにおけるプラットフォームを提供する。
超消光は、集合フィルムの電荷、または表面、またはそれらの組合せによって、制御され得る。バイオセンシングは、蛍光「ターンオン」または「ターンオフ」アッセイによって、そして直接および競合モードで、達成され得る。この集合は比較的強い光吸収性を有し得る一方、多くの事例において、Ｊ−凝集の吸収は非常に鋭く、可視スペクトルの非常に狭い部分に限定される。
集光性能の有意な増強は、高エネルギーで強い吸収（および高い振動力）を有する層または粒子の上部での集合を構成することによって得られうる。
これはLangmuir-Blodgett集合および、層の積み重ね沈着によって組立てられた複合多層フィルムによって達成される。
【００４４】
半導体ナノ粒子「量子ドット」でキャップされた表面上での染料または他の分子の集合の構成は、上記の事実上のポリマーのバイオセンシング能力を高める、便利なおよび効果的な方法を提供する。量子ドットについてここ数年間研究されているが、最近の進展が、高度に安定な、可変サイズの、吸収性能および放出性能の両方における多目的波長選択性の、および制御された表面性能および機能性の、量子ドットの調整を可能にした。従って、事実上のポリマーを構成する支持体として適切に構成されたそして誘導された量子ドットを使用することが可能である。量子ドット「プラットフォーム」は、特定のシアニン染料、シアニン染料凝集、接合したポリマーオリゴマー、またはＱＴＬバイオアッセイで使用できる他のビルディングブロックに対して、良好なエネルギー供与性を有するように選択される。組合せは、感受性を高め、そしてＱＴＬバイオセンサーの波長範囲を広げる、魅力的な、多目的な、そして比較的簡単な方法を提供する。量子ドット上への直接吸着または共有付着あるいはドットへの固定、および、微粒子表面上のポリマーの両方を使用して、量子ドット−センシング集団を構成することができる。量子ドットの例として（限定するものではないが）、ＣｄＳ、ＣｄＳｅおよびＺｎＳが含まれる。
【００４５】
集合に基づくＱＴＬバイオアッセイおよび、天然のおよび官能化された多糖類における染料モノマー、オリゴマー、および接合したポリマーオリゴマーの封入複合体
広範囲の研究調査は、デンプン由来のポリマーのアミロースおよびカルボキシメチルアミロース(ＣＭＡ)であって、これは直鎖の、非変性または誘導された１，４−グルコースポリマーからなるものであるが、程よい線状の立体構造として存在し得る疎水性または両親媒性分子を有する複合体を形成し得ることを示している。複合化「ゲスト」両親媒性物質は制限的な流動性を示し、そして幾つかの事例においては、アミロース（またはＣＭＡ）およびそのゲストを含む同じ溶液中に存在する、他の試薬からの保護の度合いを示す。取り込みは、腔の範囲内でゲストを囲む配糖体のヘリックス状のシースの構成にあると考えられる。異なる半径を有するヘリックスを形成して、異なる大きさのゲストを取り込むことができる。非変性アミロースは全体として中性であるが、ＣＭＡ（カルボキシメチル基の可変負荷によってかなり容易に合成される）はアニオン性である。類似する誘導体化工程で、他の官能基および／または電荷を有するアミロース誘導体を調製することができる。染料または芳香族発色団が導入され、そして水または水性−有機混合物中で低い溶解性を示す、幾つかの両親媒性または親水性分子を、アミロース（またはＣＭＡ）中に取り込まれたゲスト発色団を用いて、アミロースまたはＣＭＡ溶液中に可溶化させることができる。後者の例として、光互変性および熱互変性染料、高度にルミネセンスのスチルベン両親媒性物質、および他の光反応性化合物がある。
【００４６】
アミロース、ＣＭＡ、および他の多糖類は、適切に誘導されたスクアレイン染料、ビススクアレイン、およびポリ（フェニル）エチニルオリゴマーなどの幾つかの接合したポリマーオリゴマーを含む、強く吸収する両親媒性分子を有する複合体を形成することができる。選択されたこれらの化合物の幾つかの構造を図４に示す。各事例において、化合物は、均質溶液中で、実際にまたは潜在的に高い蛍光である。加えて、これらは水に不溶性であるか、あるいは難溶性である。構造上、これらはアミロース、ＣＭＡ、または他の変性アミロースポリマーを有する複合体を形成することができる。荷電されたアミロースポリマーが導入される場合、これらは水に溶解し、強い蛍光を示し、そして他の溶質との非特異的相互作用によって、相関（蛍光を消光する対面相互作用など）および偶発的な消光から幾らか保護される。複数のゲストを収集するアミロースおよびＣＭＡホストの能力は、図４に示されるホスト発色団の幾つかの分子を集めさせる。発色団の高い振動強度は、発色団が直接接していない場合であっても、励起子相互作用を起こさせる。これらの励起子相互作用は、上記と同様の他の「事実上のポリマー」を形成する方法を提供する。この事実上のポリマーは、ゲスト染料またはオリゴマーを含むアミロースまたはＣＭＡヘリックスと近接にされる、電子伝達による消光またはエネルギー移動消光剤に供される。この相関は、消光剤と複合体とのクーロン相互作用を介して、または強い相関を導く他の相互作用によって、得ることができる。故に、これらの消光剤による標的超消光を、図４に示すような同梱の分子から得られるが、個々の分子は超消光に供されない。上記のように、ＱＴＬバイオ接合の使用によって、およびＱＴＬ蛍光の消光−非消光の拡張および競合的アッセイ形式にこれらのバイオ接合を適応することによって、超消光を広げることは容易である。
【００４７】
本発明は、バイオセンシングにおける超消光の使用のさらなる拡張である。表面またはコロイド状の粒子上に、バイオレセプターおよび蛍光ポリマー（または「集合したポリマー」）を同じ場所に配置することによって、２種の成分（ＱＴＬの消光剤（Ｑ）およびポリマー集団）の間の相互作用は、リガンド−レセプター結合によって特異的な相互作用を示す。従って、アッセイは、消光剤とポリマー集団との間の非特異的電荷に基づく相互作用に依存しない。本発明の他の利点は、空間的に（例えばリジッド支持体上）または異なる粒子上における、特定のポリマー集団レセプターの、同じ場所に配置された集合を制御する能力による、多機能性である。これはＱＴＬアプローチの能力を大きく広げ、幾つかの標的因子を多重化するのに使用される。
【００４８】
本発明のアッセイ形式全ては、蛍光ポリマー（または蛍光「自己集合した」ポリマー集合）の同場所配置、および支持体上の標的検体に対する適切なレセプターに依存する。支持体は、微粒子またはナノ粒子、膜、キュベット(cuvette)壁あるいはマイクロタイタープレートまたはガラススライドの表面、あるいは連続的なまたは断続的なサンプリング（照明/検出）によって調べられ得る任意の表面であり得る。このアプローチの直接の利点は、各事例において、特定のリガンド−レセプター相互作用によって超消光が生じることである。以下の部分で幾つかの異なる実施態様を記載する。さらに、アッセイは、特定の要求に応じて操作的に異なる形式で行なわれことができる。
【００４９】
置換競合アッセイ
置換競合アッセイでは、ＱＴＬ接合を用いて、固定された蛍光ポリマーレセプターをプレ処理し、ＱＴＬ接合とレセプターとの結合、および蛍光ポリマーの同時超消光をもたらす。図５に示すように、実際の分析は、集団に対する検体の添加を伴う。ポリマーの蛍光は、検体サンプル中の標的因子のレベルと一緒に、量的に増加する（ターンオン）。適した例として、タンパク質、ウイルス、細菌、胞子、細胞、微生物、抗体、抗体フラグメント、核酸および毒素が含まれる。これらの例において、アッセイは均質であってもよく、アッセイの実時間をレセプターからのＱＴＬの「オフ速度」によって制御してもよい。
【００５０】
直接競合アッセイ
図６に示されるように、直接競合アッセイにおいて、固定された蛍光ポリマー−レセプターは、検体（未知量の標的因子）および既知量のＱＴＬ接合を含む混合物を用いて処理される。ポリマー蛍光は、ＱＴＬ：標的因子の濃度比によって決定される範囲で消光される。蛍光が強い場合ほど、標的因子の濃度が高い。使用されるこのアプローチの利点は、アッセイが均質であり得、かつ即効性に近いことである。標的因子およびＱＴＬ接合の両方が「開いた」レセプター部位に対して直接的に競合するので、応答は非常に迅速であり得る。
【００５１】
他の配合では、サンプルの蛍光強度を測定する前に、固定された蛍光ポリマー−レセプターを、検体サンプルを用いてインキュベートする。次いで、過剰のＱＴＬ接合を用いてサンプルを処理する（必要に応じて次にすすぐ）。ＱＴＬ接合の処置による蛍光の初期読みは、未使用のレセプター部位に対するＱＴＬ接合の結合による消光を示す。初期の蛍光消光が強い場合ほど、標的因子のレベルが小さい。時間を関数とするポリマー蛍光のモニタリングは、標的因子の結合の別の確認と、レセプターでのＱＴＬ接合による置換を提供する。
【００５２】
ポリマー−バイオ分子の組合せに基づく「ターンオン」競合的アッセイ
反応性末端基を含むポリマー（例えばポリマー１０）は、小分子、他のポリマー、およびバイオマクロ分子を含む種々の材料に対して、共有的に連結され得る。得られる「ハイブリッド分子」は同様の溶解性を有し得、そして表面に吸着する個々の高分子電解質成分として同じ能力を一般的に有し得る。これらの表面として、スライドまたはプレート、反対に荷電されたポリマービーズ（例えば、限定するものではないが、４級アミン誘導化ポリスチレンまたはスルホネートポリスチレン）、クレイまたはシリカなどの天然または合成無機支持体、荷電された膜、半導体ナノ結晶、および他の多孔性材料が挙げられる。従って、独立してまたは混合成分として、ハイブリッド分子を使用することによって、超消光の対象になる高い蛍光種を含む、支持された集合を調製できる。ハイブリッド分子を溶液相アッセイで用いることもできる。
【００５３】
ある実施態様では、ポリマー１０などのアミノ酸ポリマーのカルボキシルまたはアミン末端をタンパク質または抗体または抗体フラグメントの一級アミンと連結させて、蛍光化合物２３（図７参照）を得ることができる。この化合物を溶液中で使用することができ、上記のような表面上に沈着させることができる。いずれの形式でも、化合物２３のバイオ分子部分は、それ特有の認識機能を保持し得る。従って、ＱＴＬバイオ接合を有する化合物２３の処理は、消光成分に化合物２３の蛍光を消させる、複合体の構成をもたらす。ＱＴＬ結合部位と競合し得るＬまたはＬ’などの分子を曝すことは、結合したＱＴＬバイオ接合の置換、および化合物からの蛍光のターンオンをもたらす。化合物２３の最も効果的な利用は、一般的には、蛍光種の凝集が増強された超消光感受性をもたらし得る、表面上またはビーズ上または他の支持された形式上であろう。こうしてハイブリッド分子は、その機能が図７に図示される、分子または超分子（支持された形式における）センサーとして作用する。
【００５４】
他の実施態様では、センサー/アッセイは、同じビーズ、粒子、またはナノ構造物上の個別の（すなわち、共有的に連結されていない）ポリマーおよびバイオ分子成分を収集することによって、支持された形式に達する。例えば、カルボキシル官能化ビーズまたは粒子を使用して、タンパク質（上記）上でのアミン基を介したタンパク質、抗体、または抗体フラグメントと共有結合させたり、モノマー（１５など）、オリゴマーまたは１０などの重合性蛍光染料と、吸着または共有付着によって結合させたりできる。染料集団とバイオ分子との間に有意な消光相互作用がなくても、「二重コート」ビーズは強い蛍光を有し得る。繰り返して記載するが、競合的蛍光「ターンオン」アッセイは、バイオ分子と相関するＱＴＬバイオ接合の使用によって構成され得る。さらに、ＱＴＬバイオ接合を加えることによって、染料集団蛍光の消光を得ることができる。結合部位に対してＱＴＬバイオ接合と競合し得る試薬ＬまたはＬ’を加えることによって、ＱＴＬ分子のビーズまたは粒子からの排除、および染料集団蛍光の増加（または非消光）を得ることができる。消光の空間的な範囲が増えるので、好ましい実施態様はＱがエネルギー移動消光剤である場合であろう。これは、レセプター−結合したＱＴＬ分子のFoerster移動半径の範囲内で、全てのポリマーの消光をもたらし得る。表面上に結合されたポリマーにおいて、この半径はおよそ１００オングストロームまたはそれ以上であり得る。
【００５５】
二重コートされたビーズまたは粒子を、蛍光「ターンオフ」競合的または非競合的アッセイに使用することもできる。抗原（ＬまたはＬ’）を用いてビーズ（当初は複合化されていない）を処理することは、抗原のバイオ分子に対する結合をもたらすが、ごく僅かな蛍光変化しかない。ＬまたはＬ’と結合するが競合はしない、一定分量のＱＴＬ分子を加えると、「ターンオフ」応答におけるポリマー蛍光の消光がもたらされ、これは抗原によってふさがれていないレセプター部位の数に比例する。抗原ＬまたはＬ’と競合し得るＱＴＬ分子は、時間依存性の応答を与え、それは、存在する抗原のレベル、およびバイオ分子に対する結合の強さの両方の測定に使用できる。
【００５６】
上記アッセイの主な成分は、支持された（および同じ場所に配置された）蛍光ポリマー−レセプター集団である。これらは、以下の実施態様で概説される（しかし限定されるものではない）ように構成される。第１の実施態様では、レセプターまたは「レセプター結合部位」が、支持体に共有的に付着する。次いで、蛍光ポリマーが、図８に例示説明されるように、同じ支持体上へ吸着され得る。共有的に付着し得るレセプターの例として、アビジン、ニュートルアビジン(neutravidin)またはストレプトアビジンまたは抗体などの、タンパク質、ペプチドおよび核酸が挙げられる。蛍光ポリマーおよびレセプターの両方の負荷の度合いを制御して、多様な感受性およびダイナミックレンジを有するセンサーを得ることができる。第２の実施態様では、図９に示すとおり、支持体にポリマーおよびレセプターの両方が共有的に束縛され得る。他の配合では、図１０に例示説明されるように、反応性基で処理したポリマーまたはオリゴマーが共有連結によってレセプターに束縛され、そして支持体に吸着される。ポリマーはまず吸着されそれからレセプターと共有的に連結されるか、その逆である。「自己集合した」ポリマーによって提供される、増強された超消光を利用するために、蛍光「ポリマー」集団は、自己集合（吸着）または共有連結によって収集され得るモノマーから構成され得る。アッセイの要求および成分「ポリマー」およびレセプターに依存して、自己集合ポリマーを生成する前または後に、レセプターを支持体に共有的に連結させてもよい。
【００５７】
ＱＴＬ接合の蛍光ポリマー−レセプター集団への直接結合に基づくアッセイに加えて、アッセイは第２の認識事象に基づいて構成されてもよい。例えば、現行のプラットフォームを、同一のまたは他のレセプターに対する多様な結合部位を有する標的因子がセンスされるサンドイッチ形式に拡張することもできる。この形式を図１１で例示説明する。標的因子のレセプター部位への結合は、蛍光ポリマーの蛍光の変化をもたらさないか、またはほとんどもたらさない。しかしながら、レセプターにも結合するＱＴＬ接合を加えると、直接アッセイにおいて蛍光を消光するのに十分に接近した消光剤の結合がもたらされる。サンドイッチアッセイなどを適応させて、細菌胞子を含む種々の因子をセンスすることができる。
【００５８】
本発明について概略的に記載してきたが、ある特定の実施例であるが但し説明のみを目的として本明細書に記載され、そして特に断りのない限り限定するものではない記載によって、さらなる理解を得ることができる。
【００５９】
実施例
実施例１
表面上に共有束縛されたストレプトアビジンを含む市販のポリスチレンビーズ（Bangs Laboratories, Inc.,Fishers, INから入手した０．５３ミクロン微粒子）を、アニオン性接合ポリマー２４、ポリ(フェニレンエチニレン)(ＰＰＥ)誘導体（構造２４〜２７を図１２に示す）でコートした。表面上の２４の負荷レベルはポリマーの負荷に依存して制御できる。ビオチン結合部位の数（最大ビオチン−ＦＩＴＣ結合能力＝１．４２μg/微粒子mg）も、可変であり制御可能である。バイオセンシングにおける機能に対する、コートされた微粒子の能力の初期評価において、エネルギー移動消光剤（Molecular Probesから入手したAlexafluor 594）から形成されたＱＴＬ接合を、ストレプトアビジンのリガンドのビオチンと接合させた。別個の研究において、非ビオチン化Alexafluor 594による、ポリマー蛍光の非特異的消光が起こらないことが示された。コーティングのレベルに依存して、Ｋｓｖは、ＱＴＬ濃度の２対数に渡って３×１０7〜３×１０8Ｍ-1の間で変化することが分かった。通常使用される９６穴プレートにおける、レセプターへの直接結合によって検出されるＱＴＬのレベルは、１００フェムトモル未満であった。このアッセイにおいて、ビーズ上への中レベルのポリマー負荷が、最適な初期消光感受性および広範なダイナミックレンジを与えることが示された（図１３参照）。
【００６０】
これらのビーズを用いるアッセイを一般的に扱うために、ビオチン化抗体を使用して特定のレセプターを束縛することができる。ビオチン化抗体の結合は、ポリマーの蛍光の変化をほとんど引き起こさない。しかしながら、抗体によって認識されおよびエネルギー移動消光剤を含む接合を加えると、ポリマー蛍光の消光が得られる。従って、図１４に示すように、ビオチン化捕獲抗体は、抗体に基づくＱＴＬ接合（エネルギー移動消光剤を用いて誘導化された標的抗体）と結合でき、そして１ピコモル未満のレベルで検出できることが示された。
【００６１】
この実施例から、同じビーズを使用して、抗体-抗原相互作用に基づく広範なアレイのアッセイを構成できることは明らかである。一般的な事例では、２つの別の成分が必要とされる：ビオチン化抗体または他のレセプター、および抗体によって認識されるＱＴＬ接合。記載した３つのアッセイ経路全てにおいて、これらのビーズを使用することができる。標識化ビーズ（例えば、ビーズの内部を、明確な蛍光波長を有する蛍光染料タグで標識化されたポリスチレンビーズ）あるいは異なる抗体またはレセプターを有する異なるポリマーの使用により、複合標的検体の同時アッセイができる。
【００６２】
実施例２
カルボキシレート２５によって単官能化された、幾分低い分子量のＰＰＥオリゴマーを、４級アンモニウム誘導化ポリスチレン微粒子上に吸着的にコートさせた。沈着により、ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体を、利用できるカルボキシル官能基を介して、ポリマーに共有的に連結させた。抗体カップリング後、ポリマーの蛍光は強いままであり、光退色に対してほとんど感受性を示さなかった。しかしながら、オリゴマーの集団の蛍光は、蛍光エネルギー移動消光剤、Alexafluor 532に接合する、ヤギ抗ウサギＩｇＧを加えると、特異的に消光した。蛍光消光は、９６穴プレート形式において５００フェムトモルレベル未満で検出された（図１５参照）。加えて、非蛍光エネルギー移動消光剤QSY35とカップリングするヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体は、ビーズ-固定化ポリマー-抗体レセプターとの相関に基づく消光も示した。この事例において、〜数ピコモル濃度範囲でＫSV＝８×１０７Ｍ−１が測定された。
【００６３】
実施例３
シアニン染料は、アニオン性ナノ粒子および微粒子上での誘導されたＪ−凝集を示した。２６などの単独のシアニンモノマーについて、クレイまたはシリカ粒子上への吸着は可逆的であり、従って、異なるシアニン染料またはシアニン混合物でコートされた、個々にコートされた粒子は、シアニンとの交換を示した。Ｎ-エチル基がＮ-オクタデシル基によって置換された２６の誘導体などの両親媒性シアニン染料を使用すると、シリカ微粒子上へ不可逆的に吸着し得る分子が得られることが判明した。従って、個々の両親媒性シアニン染料または両親媒性のシアニンの混合物を、シリカ微粒子上へ個々にコートして、次いで、他の配合のシアニン両親媒性物質でコートされたシリカ微粒子と混合してもよい。混合物は、異なる粒子間でのシアニンの交換を示さず、そのため、複数因子の同時センシングにおいてこれらの混合物の使用が可能である。両親媒性シアニン〜４に対応するような、エネルギー求引両親媒性ゲストを使用すると、同じ放出波長シフトが得られ、および同じホストの両親媒性シアニンとは異なる波長で蛍光発光可能な幾つかの集団を構成することができる。
【００６４】
凝集したシアニン染料の蛍光は、カチオン性もしくはアニオン性エネルギー求引シアニン染料によって、または電子伝達消光剤によって、消光され得る。この消光は、アニオン性ナノ粒子または微粒子上のカチオン性シアニン染料のコーティングのレベルを変えることによって、調製することができる。カチオン性シアニンを用いる粒子の低負荷において、粒子は、曝されたネガティブ電荷の領域を有し、そしてポジティブに荷電された消光剤は付着し（そして高い超消光低数を示し）、一方、潜在的アニオン性消光剤はこれらの非特異的相互作用を介して低い消光を示した。粒子の高負荷においては、状況は逆転し、アニオン性消光剤が興味をひくがしかし非特異的な相互作用と、結果として起こる高い消光低数とを示す一方、カチオン性消光剤は効き目がなかった。クレイナノ粒子において、最適な結果が、シアニンまたはシアニン混合物でクレイ表面をほぼ１００％被覆した場合に得られた。このレベルの被覆において、アニオン性消光剤による選択的な消光が得られた。シアニン染料はクレイナノ粒子上で凝集するため、同じく荷電されたシアニンが共吸着された場合に、最も効果的な消光が生じ得る。
【００６５】
例えば、化合物２６と化合物２７の比率が４００：１である場合、過剰量のシアニン２６に対してエネルギー求引性のカチオン性シアニン２７を加えると、５０％消光が得られる。２７による２６の消光は、２７の高感度な放出をもたらし、およびナノ粒子−支持された集団の励起および放出を分ける潜在的利点を供する。これらの粒子に結合した「自己集合したポリマー」は、上記実施例１および２と同様のセンシングにおける便利なプラットフォームを供する。ストレプトアビジンまたは抗体などの共有的に固定されたレセプターを既に有するアニオン性微粒子またはナノ粒子上への、シアニンモノマーまたは混合物（２６および２７など）のコーティングは、支持体の全て接近可能なアニオン性表面上での、Ｊ−凝集または混合した凝集の領域の構成をもたらし得る。これは、集団を全体的にわずかにカチオン性にし、そのためカチオン性消光剤との非特異的相関は非常に低い感受性となる。しかしながら、カチオン性ＱＴＬ接合は、上記実施例１および２の記載と同様の特異的リガンド-レセプター相互作用によって、粒子と相関し得る。従って、自己集合ポリマーの超消光を、同じ場所に配置されたレセプター−自己集合ポリマー集団における、特定の相関を伴う改善されたバイオセンシングに利用することができる。
【００６６】
実施例４
同種の自己集合したポリマーは、密集して官能化された表面上への、シアニン（または他のモノマー）の共有連結によっても構成され得る。図１６ａに示されるように、２６で表わされる同じシアニン発色団を、２段階における共有付着によって構成することができる。アミン官能化シリカ微粒子は、高レベルの被覆が得られうるプラットフォームを形成できることが判明した。モノマーによってのみコートされた微粒子について、表面の誘導化および反応条件に依存して、少なくとも３種類の異なる構成が得られることが判明した。第１の種類は、モノマーに近い吸収および蛍光である。第２の、長波長吸収の種類は、上記２６のＪ−凝集と非常に似た吸収および放出を示す。長波長でいくぶん広がった放出を示す第３の種類は、混合物が励起される波長であるにもかかわらず、通常は突出した吸収を示さないが、しかし卓越した放出を頻繁に含む。非特異的相互作用による消光は、ほぼピコモルレベルの消光剤で、アニオン性電子伝達染料（ＡＱＳ-ビオチン(5)（図２）、ＫSV＝３×１０７Ｍ−１）およびカチオン性エネルギー移動染料（ＱＳＹ−２１(6)（図１７）、ＫSV＝５．３×１０８Ｍ−１）について観察されることが判明した。上記実施例に記載されるセンサーアナログを構成するために、共有的に結び付いたシアニンは、図１６ｂに示されるカルボキシル基を含む、別の官能化部位の量を変えることによって構成された。一旦染料が表面に束縛されると、上記実施例２で概説するように、カルボキシル部位を使用してレセプターに付加させることができる。共有的に束縛された「自己集合したポリマー」の表面上へレセプターを付加させることは、潜在的消光剤との非特異的相関から染料を保護すること、およびレセプターと特異的に相関するＱＴＬ接合に対する消光相互作用を制限すること、の利点がある。
【００６７】
本用途の発明を、概要的とそして特定の実施態様との両方について記載した。本発明は好ましい実施態様について開示されていると考えられるが、当業者による種々の変更も一般的開示の範囲内から選択され得る。請求の範囲で限定されない限り、本発明は限定的なものではない。
【００６８】
参考文献
【００６９】
【表１】
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【００７０】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】ＱＴＬアプローチの一般的な例示図である。
【図２】本発明で使用される種々の蛍光化合物、消光剤、およびＱＴＬ接合を例示説明する。
【図３】本発明で使用される種々の蛍光化合物、消光剤、およびＱＴＬ接合を例示説明する。
【図４】封入複合体において多糖類と共に使用される染料の構造を例示説明する。
【図５】置換競合アッセイの一般的な例示図である。
【図６】直接競合アッセイの一般的な例示図である。
【図７】ポリマー-バイオ分子の組合せを伴う競合的蛍光「ターンオン」アッセイの例示図である。
【図８】共有／吸着配列による、ポリマーおよびレセプターの同場所配置を例示説明する。
【図９】ポリマーおよびレセプター結合部位の両方の共有的な束縛を例示説明する
【図１０】ポリマーに共有的に連結されたレセプターを例示説明する。
【図１１】サンドイッチＱＴＬアッセイの例示図である。
【図１２】本発明の実施態様で使用される種々の化合物の例示図である。
【図１３】負荷レベルの関数としての、蛍光の消光のグラフ図である。
【図１４】ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体における競合アッセイのグラフ説明である。
【図１５】レセプターに共有的に連結されたポリマー２５を伴う、ＩｇＧアッセイのグラフ説明である。
【図１６】シリカ微粒子表面に共有的に付加したシアニン染料２６の合成を例示説明する。
【図１７】ＱＳＹ−２１スクシニミジルエステルの構造図である。
【図１】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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