(57)【要約】本発明は、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物の生物活性を測定する方法に、および発現レベルがＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の生物活性と相関する遺伝子の転写もしくは翻訳生成物をそのようなＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の生物活性の測定に使用することに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物の生物活性を測定する方法であって、発現レベルが該ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の生物活性と相関する遺伝子の発現レベルを生物学的試料中で検出することを含み、該生物学的試料は該ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に曝露させられている、方法。
【請求項２】
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の抗増殖活性が測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞内遺伝子発現レベルを検出することを含む、請求項１もしくは２に記載の方法。
【請求項４】
細胞外遺伝子発現レベルを検出することを含む、請求項１もしくは２に記載の方法。
【請求項５】
クラステリン遺伝子の発現レベルを検出することを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が、
（ｉ）式Ｉ
【化１】
2004516025.tif 000012
〔式中、
ｑは０もしくは１であり、
ｎは、ｑが０であるときには１〜３であり、もしくはｎは、ｑが１であるときには０〜３であり、
Ｒは、ハロゲン、低級アルキル、ヒドロキシ、低級アルカノイルオキシ、低級アルコキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキル−カルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキル−カルバモイル、シアノ、アミノ、低級アルカノイルアミノ、低級アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキルアミノもしくはトリフルオロメチルであるが、幾つかのＲが分子中に存在するとき、これらの基は同一もしくは異なることが可能であり、
ａ）Ｒ１およびＲ２は、それぞれ他のものと独立して、
α）カルバモイル−メトキシ、カルボキシ−メトキシ、ベンジルオキシカルボニル−メトキシ、低級アルコキシカルボニル−メトキシ、フェニル、アミノ、低級アルカノイルアミノ、低級アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキルアミノ、ヒドロキシ、低級アルカノイルオキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキル−カルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキル−カルバモイル、シアノによって、もしくはニトロによって置換されたフェニル；
β）水素；
γ）未置換またはハロ−もしくは低級アルキル−置換ピリジル；
δ）Ｎ−ベンジル−ピリジニウム−２−イル；ナフチル；シアノ；カルボキシ；低級アルコキシカルボニル；カルバモイル；Ｎ−低級アルキル−カルバモイル；Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキル−カルバモイル；Ｎ−ベンジル−カルバモイル；ホルミル；低級アルカノイル；低級アルケニル；低級アルケニルオキシ；または
ε）以下により、即ち
εα）ハロゲン、アミノ、低級アルキルアミノ、ピペラジノ、ジ−低級アルキルアミノ、
εβ）未置換であるかまたは、フェニル部分がハロゲン、低級アルキル、ヒドロキシ、低級アルカノイルオキシ、低級アルコキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキル−カルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキル−カルバモイル、シアノ、アミノ、低級アルカノイルアミノ、低級アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキルアミノによりもしくはトリフルオロメチルにより置換されているところのフェニルアミノ、
εγ）ヒドロキシ、低級アルコキシ、シアノ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキル−カルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキル−カルバモイル、メルカプト、または
εδ）Ｒ４は低級アルキルでありそしてｍは０、１もしくは２である、式Ｒ４−Ｓ（Ｏ）ｍ−を持つ基、
により置換された低級アルキルであるか、または
ｂ）ｑが０であるとき、Ｒ１およびＲ２の一つは、未置換低級アルキルもしくは未置換フェニルであり、そしてＲ１およびＲ２の他のものは、水素を除いてパラグラフａ）で上に与えられた意味の一つを有するか、または
ｃ）Ｒ１およびＲ２は一体となって、アミノ、低級アルカノイルアミノ、低級アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキルアミノ、ニトロ、ハロゲン、ヒドロキシ、低級アルカノイルオキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキル−カルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキル−カルバモイルによりもしくはシアノにより置換されたＣ４〜Ｃ１０−１，４−アルカジエニレンであるか、または９個までの炭素原子を有するアザ−１，４−アルカジエニレンであるか、または
ｄ）ｑが１であるとき、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ他のものと独立して未置換低級アルキルもしくは未置換フェニルであり、またはパラグラフａ）で上に与えられた意味の一つを有し、そして
Ｒ３は、水素、低級アルキル、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキル−カルバモイルもしくはＮ，Ｎ−ジ−低級アルキル−カルバモイルである、
ただし、ｎは０であり、ｑは１であり、Ｒ１およびＲ３はそれぞれ水素であり、そしてＲ２はメチルである、式Ｉを持つ化合物を除く。〕
で示される化合物、
（ｉｉ）式Ｉ
｛式中、ｎは０〜３であり、
ｑは０もしくは１であり、
Ｒは、ハロゲン、低級アルキル、ヒドロキシメチル、アミノメチル、ヒドロキシ、低級アルカノイルオキシ、低級アルコキシ、カルボキシ、低級アルカノイル、ベンゾイル、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキル−カルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキル−カルバモイル、シアノ、アミノ、低級アルカノイルアミノ、低級アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキルアミノもしくはトリフルオロメチルであるが、二つもしくはそれ以上のＲが分子中に存在するとき、これらは互いに同一もしくは異なることが可能であり、
Ｒ１およびＲ２の一つは水素もしくは低級アルキルであり、
そしてＲ１およびＲ２の他のものは
ａ）式ＩＩ
【化２】
2004516025.tif 000013
〔式中、ｕは１〜３であり、そして
少なくとも一つのＲ５はアミジノ、グアニジノ、ウレイド、Ｎ３−低級アルキルウレイド、Ｎ３，Ｎ３−ジ低級アルキルウレイド、Ｎ３−フェニルウレイド、Ｎ３，Ｎ３−ジフェニルウレイド、チオカルバモイル、チオウレイド、Ｎ３−低級アルキルチオウレイド、Ｎ３，Ｎ３−ジ低級アルキルチオウレイド、低級アルコキシカルボニルアミノ、ベンジルオキシカルボニルアミノ、モルホリン−４−カルボニル、ピペラジン−１−カルボニル、４−低級アルキルピペラジン−１−カルボニル、低級アルキルスルホニルアミノ、ベンゼンスルホニルアミノ、トルエンスルホニルアミノ、チオフェン−２−カルボニルアミノ、フラン−２−カルボニルアミノ、ベンジルアミノ、ヒドロキシメチル、アミノメチル、または式−Ｎ＝Ｃ（Ｒ６）−Ｒ７であって、式中Ｒ６は水素もしくは低級アルキルであり、そしてＲ７はジ低級アルキルアミノ、ピペリジノ、４−低級アルキルピペラジノまたはモルホリノである、式を持つ基であり、そして他のＲ５はハロゲン、低級アルキル、ヒドロキシ、低級アルカノイルオキシ、低級アルコキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキル−カルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキル−カルバモイル、シアノ、アミノ、低級アルカノイルアミノ、低級アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキルアミノもしくはトリフルオロメチルであるが、二つもしくはそれ以上のＲ５が分子中に存在するとき、これらは互いに同一もしくは異なることが可能である。〕
で示される基であるか、または
ｂ）式ＩＩＩ
【化３】
2004516025.tif 000014
〔式中、Ｒ８は低級アルコキシもしくはベンジルオキシであり、そしてＲ９はヒドロキシもしくはベンジルオキシである。〕
で示される基であるか、または
ｃ）アミノ基が、一つもしくは二つのヒドキシ−低級アルキル、アミノ−低級アルキル、カルボキシ−低級アルキル、低級アルコキシカルボニル−低級アルキル、ベンジルオキシカルボニル−低級アルキル、あるいは、フェニル部分が未置換であるかまたはハロゲン、低級アルキル、ヒドロキシメチル、アミノメチル、ヒドロキシ、低級アルカノイルオキシ、低級アルコキシ、カルボキシ、低級アルカノイル、ベンゾイル、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキル−カルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキル−カルバモイル、シアノ、アミノ、低級アルカノイルアミノ、低級アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキルアミノもしくはトリフルオロメチルで置換されている、ベンジル基であるところのアミノ低級アルキルであるか、または
ｄ）ピペリジン−１−カルボニル、ピペラジン−１−カルボニル、４−低級アルキルピペラジン−１−カルボニル、モルホリン−４−カルボニル、チオカルバモイル、環炭素原子を介して結合しかつ５員環ならびに、酸素、窒素および硫黄から選択される、１〜４個の環ヘテロ原子を有する複素環式基であるか、または
ｅ）４−低級アルキルピペラジノメチルまたは、ピペラジニル以外の複素環式基により置換されそして５もしくは６員環ならびに酸素、窒素および硫黄から選択される、１〜４個のヘテロ原子を有する低級アルキル基であるか、または
ｆ）Ｒ１０が水素もしくは低級アルキルである、式−Ｃ＝Ｎ−ＯＲ１０を持つ基であるか、または
ｇ）ｑが１であれば、項（ｉｉ）において上述の定義に加えて、ａ）〜ｆ）はまたハロゲン、低級アルキル、トリフルオロメチルもしくは低級アルコキシで置換されたフェニルであってもよく、そして
Ｒ３は、水素、低級アルキル、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキルカルバモイルもしくはＮ，Ｎ−ジ−低級アルキルカルバモイルである。｝
で示される化合物、ならびに
（ｉｉｉ）式Ｉ
｛式中、
ｑは０であり、
ｎは０〜５であり、
Ｒは、ハロゲン、低級アルキル、トリフルオロメチルおよび低級アルコキシから選択される置換基であり、そしてＲ１およびＲ２は、それぞれ他のものと独立して低級アルキル、あるいは未置換であるかまたはハロゲン、トリフルオロメチル、低級アルキルによりもしくは低級アルコキシにより置換されたフェニルであり、ここで、二つの基Ｒ１およびＲ２は水素であることが可能であり、またはＲ１およびＲ２は一体となって、未置換であるかまたは低級アルキルにより置換されたところの２〜５個の炭素原子を有するアルキレン鎖を形成する。｝
で示される化合物、
またはそのような化合物の塩
からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が（Ｒ）−６−（４−ヒドロキシ−フェニル）−４−［（１−フェニル−エチル）−アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンもしくはその塩である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が（Ｒ）−４−［（１−フェニル−エチル）−アミノ］−６−（３−プロピオニルアミノ−フェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンもしくはその塩である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
生化学的試料が、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が投与されていた哺乳動物から得られている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物がヒトである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子の転写もしくは翻訳生成物の使用であって、哺乳動物細胞における該生成物の発現レベルがＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の生物活性と相関し、そのようなＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の生物活性をエキスビボで測定するための、使用。
【請求項１２】
遺伝子がクラステリン遺伝子である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が、請求項６に定義されたような意味の式中の基及び記号を有する式Ｉで示される化合物、もしくはその塩である、請求項１１もしくは１２に記載の使用。
【請求項１４】
ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物の生物活性を測定する方法であって、発現レベルが該ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の生物活性と相関する遺伝子の発現レベルを、該ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が投与された哺乳動物中で検出することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物（以後“ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤”と呼ぶ）の生物活性を測定する方法に、および発現レベルがＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の生物活性と相関する遺伝子の転写もしくは翻訳生成物の、そのようなＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の生物活性の測定ための、使用に関する。
【０００２】
欧州特許ＥＰ  ０  ６８２  ０２７  Ｂ１ならびに国際出願ＷＯ  ９７／０２２６６およびＷＯ  ９８／０７７２６に記載されているピロロピリミジン誘導体のような、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性の阻害剤は抗増殖活性を示すことが示されている。ＷＯ  ９７／０２２６６はまた、ＥＧＦＲチロシンキナーゼの強力なかつ選択的な阻害剤であり、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）−応答性腫瘍に対して抗増殖活性を示すところのピロロピリミジン誘導体である（Ｒ）−６−（４−ヒドロキシ−フェニル）−４−［（１−フェニル−エチル）−アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（以後、化合物Ａという）を開示している。
【０００３】
ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物の薬理学的に有用な性質のため、該阻害剤の生物活性と相関する代替マーカーを同定する必要がある。本発明にしたがって、今回驚くべきことに、クラステリン遺伝子のような特定の遺伝子の発現レベルが化合物ＡのようなＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の生物活性と相関することが見出された。
【０００４】
図面の説明
図１Ａおよび図１Ｂは、化合物Ａの処理に際してＡ４３１細胞におけるリアルタイム逆転写ポリメーラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により測定したクラステリンの発現レベルを示す。図１Ａ：用量応答性；Ａ４３１細胞を１００ｎＭ、３００ｎＭおよび３μＭの化合物Ａで１６もしくは２４時間処理する。図１Ｂ：時間依存性；Ａ４３１細胞を３００ｎＭもしくは３μＭの化合物Ａで４〜２４時間処理する。
Ｙ軸にはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の対照に相対的な発現の倍数をプロットする。誤差棒＝標準偏差（ＳＤ）（ｎ＝３）。
【０００５】
図２は化合物Ａ曝露に際してＡ４３１細胞におけるクラステリン誘導の用量応答を示す。
Ａ４３１細胞を１０ｎＭ〜１μＭの化合物Ａもしくは０．０３％のＤＭＳＯで２４時間処理する。細胞溶解物をウエスタンブロッティングにより抗クラステリン抗体（もしくは対照ブロット用には抗アクチン抗体）で検出する。４３キロダルトン（ｋＤａ）のシグナルはクラステリンの非グリコシル化型を、そして６０ｋＤａのシグナルはグリコシル化された前駆体を表す。レーン１〜５：それぞれ、１μＭ、３００ｎＭ、１００ｎＭ、３０ｎＭおよび１０ｎＭの化合物Ａ；レーン６：０．０３％ＤＭＳＯ。
【０００６】
図３は化合物Ａに曝露に際してＡ４３１細胞におけるクラステリン誘導の時間経過を示す。
Ａ４３１細胞を３００ｎＭの化合物Ａで３２時間（レーン１）、２４時間（レーン２）、１６時間（レーン３）、８時間（レーン４）もしくは４時間（レーン５）、または０．０３％ＤＭＳＯで２４時間（レーン６）もしくは４時間（レーン７）処理する。細胞溶解物をウエスタンブロッティングにより抗クラステリン抗体（もしくは対照ブロット用には抗アクチン抗体）で検出する。４３ｋＤａのシグナルはクラステリンの非グリコシル化型を、そして６０ｋＤａのシグナルはグリコシル化された前駆体を表す。
【０００７】
図４は化合物Ａによるクラステリン誘導とＥＧＦＲの状態との関係を示す。
Ａ４３１（レーン１〜２）、ＭＤＡ−ＭＢ４６８（レーン３〜４）、ＮＣＩ−Ｈ５９６（レーン５〜６）およびＮＣＩ−Ｈ５２０（レーン７〜８）を３００ｎＭの化合物Ａ（レーン２、４、６および８）もしくは０．０３％ＤＭＳＯ（レーン１、３、５および７）でそれぞれ２４時間処理する。細胞溶解物をウエスタンブロッティングにより抗クラステリン抗体で検出する。４３ｋＤａのシグナルはクラステリンの非グリコシル化型を、そして６０ｋＤａのシグナルはグリコシル化された前駆体を表す。ＥＧＦＲの状態：Ａ４３１（＋＋＋＋）；ＭＤＡ−ＭＢ４６８（＋＋＋＋）；ＮＣＩ−Ｈ５９６（＋＋）；およびＮＣＩ−Ｈ５２０（−）。
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明は、クラステリン遺伝子のような、発現レベルが化合物ＡのようなＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の生物活性と相関する遺伝子を提供するが、それはこれらの遺伝子を該チロシンキナーゼ阻害剤の生物活性の代替マーカーとして有用にする。このような代替マーカー即ちバイオマーカーを例えば臨床現場において用いて、例えばＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の用量および投与計画のような使用を最適化することができる。
【０００９】
発現レベルがＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の生物活性と相関する遺伝子をＥＧＦＲを発現する同じ細胞により発現させることができて、かくしてそのような遺伝子の発現レベルを、ＥＦＧＲを発現するいかなる細胞株中で、特に例えばＡ４３１のような表皮由来の細胞株中で、もしくはＥＧＦＲを発現するいかなる組織中で、特に腫瘍組織中で、皮膚中で、毛根中で、および口の粘膜中で測定することができる。
【００１０】
もう一つの可能性として、発現レベルがＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の生物活性と相関する遺伝子を、ＥＧＦＲを傍分泌作用の一部として発現するもの以外の細胞により発現させることができる。それ故に、そのような遺伝子の発現レベルを、該遺伝子を発現する細胞とＥＧＦＲを発現する細胞の両方を含有する同じ組織中で、または上記の遺伝子のみを発現するがＥＧＦＲを発現しない組織もしくは細胞の中で測定することができる。
【００１１】
発現レベルがＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の生物活性と相関する遺伝子は例えば分泌される細胞外タンパク質をコード化することができ、それ故にその発現レベルを、例えば、例えば血漿のような間隙中にもしくは細胞の上澄み液中に存在する蛋白量を基に測定することができる。
【００１２】
発現レベルがＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の生物活性と相関する遺伝子の発現レベルを、例えばＲＴ−ＰＣＲ技法を用いる例えばＲＮＡ発現に基づくか、または例えばウエスタンブロッティング、免疫組織化学もしくはＥＬＩＳＡの技法を用いる例えば蛋白発現に基づくいかなる技術的手段により測定することができる。
【００１３】
本発明は、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物の生物活性を測定する方法に関し、その方法は発現レベルが該ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の生物活性と相関する遺伝子の発現レベルを生物学的試料中で検出することを含むが、該生物学的試料は該ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に曝露されていたものである。
【００１４】
本発明はまた、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物の生物活性を測定する方法に関し、その方法は、哺乳動物のＥＧＦＲ発現細胞をＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に曝露させ、そして発現レベルが該ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の生物活性と相関する遺伝子の発現レベルをエキスビボで検出することを含む。
【００１５】
先のパラグラフの方法の好ましい実施態様では、哺乳動物由来のＥＧＦＲ発現細胞を、そのような阻害剤もしくはその薬学的に許容される塩を該哺乳動物に投与することによりＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に曝露させる。
【００１６】
本発明の方法の好ましい実施態様では、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の抗増殖活性、特に抗腫瘍活性が測定される。
【００１７】
本発明はさらに、哺乳動物細胞における発現レベルがＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の生物活性と相関する遺伝子の転写もしくは翻訳生成物の、そのようなＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の生物活性をエキスビボで測定するための、使用に関する。
【００１８】
本発明はまたＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物の生物活性を測定する方法に関し、該方法は発現レベルが該ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の生物活性と相関する遺伝子の発現レベルを、該ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が投与されていた哺乳動物中で検出することを含む。
【００１９】
本発明はさらにまた、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物の生物活性を測定する方法に関し、該方法は哺乳動物のＥＧＦＲ発現細胞をＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に曝露し、そして発現レベルが該ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の生物活性と相関する遺伝子の発現レベルを検出することを含む。
【００２０】
本発明の好ましい実施態様では、発現レベルがＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の生物活性と相関する遺伝子の細胞内遺伝子発現レベルが検出される。
本発明のもう一つの好ましい実施態様では、発現レベルがＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の生物活性と相関する遺伝子の細胞外遺伝子発現レベルが検出される。
【００２１】
本発明の方法の非常に好ましい実施態様では、生物学的試料は該ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性が投与された哺乳動物より得られる。
【００２２】
好ましくは、以前および以後に使用される一般的用語は、特に指示がなければ、次の意味を有する：
用語“生物学的試料”は例えば組織、細胞株、血漿もしくは血清のような哺乳動物の身体から分離された任意の生物学的材料を含むこと意味する。
好ましくは、ヒトは“哺乳動物”もしくは“哺乳動物の”なる語の範囲内である。
用語“エキスビボ”は哺乳動物の体外を意味する。
【００２３】
用語“ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物（＝ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤）”は、例えばＥＧＦＲの遺伝子組換え細胞内ドメイン［例えば Ｅ． ＭｃＧｌｙｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒｏｐ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０７， ２６５−２７５ （１９９２）を参照］を使用するチロシンキナーゼ阻害アッセイにおいて、そのような化合物はＥＧＦＲチロシンキナーゼドメインのチロシンキナーゼ活性を１０μＭ未満、好ましくは１μＭ未満、さらに好ましくは１００ｎＭ未満、最も好ましくは１０ｎＭ未満の濃度で５０％（ＩＣ５０）だけ阻害することを意味すると理解される。より具体的な意味では、用語“ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物”はそのような化合物は抗増殖活性、特に抗腫瘍活性を示すことを意味すると理解される。
【００２４】
用語“発現レベルがＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の生物活性と相関する遺伝子”は、そのような遺伝子の発現レベルが、投与されたＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の濃度に関係することを意味すると理解される。そのような遺伝子はＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤投与に際して抑制されるかもしくは好ましくは誘導されるかのどちらかであり得る。
【００２５】
もしＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が例えば細胞培養に投与されれば、“発現レベルがＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の生物活性と相関する遺伝子”の発現レベルは細胞培養の上澄み液中のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の濃度との相関を示す。もし一方で、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が例えば哺乳動物に投与されれば、“発現レベルがＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の生物活性と相関する遺伝子”の発現レベルは、そのような哺乳動物の例えば血漿および／もしくは特定の組織、特に腫瘍組織中のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の濃度との相関を示す。
【００２６】
用語“細胞内遺伝子発現レベル”は細胞内における遺伝子の発現レベル、即ち例えばＲＮＡ発現レベルまたは細胞内タンパク質もしくは膜貫通タンパク質の発現レベルに関する。
用語“細胞外遺伝子発現レベル”は細胞外における遺伝子の発現レベル、即ち例えば分泌された細胞外タンパク質の発現レベルに関する。
【００２７】
好ましくは、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤は以下のものを意味する：即ち（ｉ）式Ｉ
【化４】
2004516025.tif 000002
〔式中、
ｑは０もしくは１であり、
ｎは、ｑが０であるときには１〜３であり、もしくはｎは、ｑが１であるときには０〜３であり、
Ｒは、ハロゲン、低級アルキル、ヒドロキシ、低級アルカノイルオキシ、低級アルコキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキル−カルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキル−カルバモイル、シアノ、アミノ、低級アルカノイルアミノ、低級アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキルアミノもしくはトリフルオロメチルであるが、幾つかのＲが分子中に存在するとき、これらの基は同一もしくは異なることが可能であり、
ａ）Ｒ１およびＲ２は、それぞれ他のものと独立して、
α）カルバモイル−メトキシ、カルボキシ−メトキシ、ベンジルオキシカルボニル−メトキシ、低級アルコキシカルボニル−メトキシ、フェニル、アミノ、低級アルカノイルアミノ、低級アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキルアミノ、ヒドロキシ、低級アルカノイルオキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキル−カルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキル−カルバモイル、シアノによって、もしくはニトロによって置換されたフェニル；
β）水素；
γ）未置換またはハロ−もしくは低級アルキル−置換ピリジル；
δ）Ｎ−ベンジル−ピリジニウム−２−イル；ナフチル；シアノ；カルボキシ；低級アルコキシカルボニル；カルバモイル；Ｎ−低級アルキル−カルバモイル；Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキル−カルバモイル；Ｎ−ベンジル−カルバモイル；ホルミル；低級アルカノイル；低級アルケニル；低級アルケニルオキシ；または
ε）以下により、即ち
εα）ハロゲン、アミノ、低級アルキルアミノ、ピペラジノ、ジ−低級アルキルアミノ、
εβ）未置換であるかまたは、フェニル部分がハロゲン、低級アルキル、ヒドロキシ、低級アルカノイルオキシ、低級アルコキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキル−カルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキル−カルバモイル、シアノ、アミノ、低級アルカノイルアミノ、低級アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキルアミノによりもしくはトリフルオロメチルにより置換されているところのフェニルアミノ、
εγ）ヒドロキシ、低級アルコキシ、シアノ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキル−カルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキル−カルバモイル、メルカプト、または
εδ）Ｒ４は低級アルキルでありそしてｍは０、１もしくは２である、式Ｒ４−Ｓ（Ｏ）ｍ−を持つ基、
により置換された低級アルキルであるか、または
【００２８】
ｂ）ｑが０であるとき、Ｒ１およびＲ２の一つは、未置換低級アルキルもしくは未置換フェニルであり、そしてＲ１およびＲ２の他のものは、水素を除いてパラグラフａ）で上に与えられた意味の一つを有するか、または
【００２９】
ｃ）Ｒ１およびＲ２は一体となって、アミノ、低級アルカノイルアミノ、低級アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキルアミノ、ニトロ、ハロゲン、ヒドロキシ、低級アルカノイルオキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキル−カルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキル−カルバモイルによりもしくはシアノにより置換されたＣ４〜Ｃ１０−１，４−アルカジエニレンであるか、または９個までの炭素原子を有するアザ−１，４−アルカジエニレンであるか、または
【００３０】
ｄ）ｑが１であるとき、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ他のものと独立して未置換低級アルキルもしくは未置換フェニルであり、またはパラグラフａ）で上に与えられた意味の一つを有し、そして
Ｒ３は、水素、低級アルキル、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキル−カルバモイルもしくはＮ，Ｎ−ジ−低級アルキル−カルバモイルである、
ただし、ｎは０であり、ｑは１であり、Ｒ１およびＲ３はそれぞれ水素であり、そしてＲ２はメチルである、式Ｉを持つ化合物を除く。〕
で示される化合物、
【００３１】
（ｉｉ）式Ｉ
｛式中、ｎは０〜３であり、
ｑは０もしくは１であり、
Ｒは、ハロゲン、低級アルキル、ヒドロキシメチル、アミノメチル、ヒドロキシ、低級アルカノイルオキシ、低級アルコキシ、カルボキシ、低級アルカノイル、ベンゾイル、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキル−カルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキル−カルバモイル、シアノ、アミノ、低級アルカノイルアミノ、低級アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキルアミノもしくはトリフルオロメチルであるが、二つもしくはそれ以上のＲが分子中に存在するとき、これらは互いに同一もしくは異なることが可能であり、
Ｒ１およびＲ２の一つは水素もしくは低級アルキルであり、
【００３２】
そしてＲ１およびＲ２の他のものは
ａ）式ＩＩ
【化５】
2004516025.tif 000003
〔式中、ｕは１〜３であり、そして
少なくとも一つのＲ５はアミジノ、グアニジノ、ウレイド、Ｎ３−低級アルキルウレイド、Ｎ３，Ｎ３−ジ低級アルキルウレイド、Ｎ３−フェニルウレイド、Ｎ３，Ｎ３−ジフェニルウレイド、チオカルバモイル、チオウレイド、Ｎ３−低級アルキルチオウレイド、Ｎ３，Ｎ３−ジ低級アルキルチオウレイド、低級アルコキシカルボニルアミノ、ベンジルオキシカルボニルアミノ、モルホリン−４−カルボニル、ピペラジン−１−カルボニル、４−低級アルキルピペラジン−１−カルボニル、低級アルキルスルホニルアミノ、ベンゼンスルホニルアミノ、トルエンスルホニルアミノ、チオフェン−２−カルボニルアミノ、フラン−２−カルボニルアミノ、ベンジルアミノ、ヒドロキシメチル、アミノメチル、または式−Ｎ＝Ｃ（Ｒ６）−Ｒ７であって、式中Ｒ６は水素もしくは低級アルキルであり、そしてＲ７はジ低級アルキルアミノ、ピペリジノ、４−低級アルキルピペラジノまたはモルホリノである、式を持つ基であり、そして他のＲ５はハロゲン、低級アルキル、ヒドロキシ、低級アルカノイルオキシ、低級アルコキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキル−カルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキル−カルバモイル、シアノ、アミノ、低級アルカノイルアミノ、低級アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキルアミノもしくはトリフルオロメチルであるが、二つもしくはそれ以上のＲ５が分子中に存在するとき、これらは互いに同一もしくは異なることが可能である。〕
で示される基であるか、または
【００３３】
ｂ）式ＩＩＩ
【化６】
2004516025.tif 000004
〔式中、Ｒ８は低級アルコキシもしくはベンジルオキシであり、そしてＲ９はヒドロキシもしくはベンジルオキシである。〕
で示される基であるか、または
【００３４】
ｃ）アミノ基が、一つもしくは二つのヒドキシ−低級アルキル、アミノ−低級アルキル、カルボキシ−低級アルキル、低級アルコキシカルボニル−低級アルキル、ベンジルオキシカルボニル−低級アルキル、あるいは、フェニル部分が未置換であるかまたはハロゲン、低級アルキル、ヒドロキシメチル、アミノメチル、ヒドロキシ、低級アルカノイルオキシ、低級アルコキシ、カルボキシ、低級アルカノイル、ベンゾイル、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキル−カルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキル−カルバモイル、シアノ、アミノ、低級アルカノイルアミノ、低級アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキルアミノもしくはトリフルオロメチルで置換されている、ベンジル基であるところのアミノ低級アルキルであるか、または
【００３５】
ｄ）ピペリジン−１−カルボニル、ピペラジン−１−カルボニル、４−低級アルキルピペラジン−１−カルボニル、モルホリン−４−カルボニル、チオカルバモイル、環炭素原子を介して結合しかつ５員環ならびに、酸素、窒素および硫黄から選択される、１〜４個の環ヘテロ原子を有する複素環式基であるか、または
【００３６】
ｅ）４−低級アルキルピペラジノメチルまたは、ピペラジニル以外の複素環式基により置換されそして５もしくは６員環ならびに酸素、窒素および硫黄から選択される、１〜４個のヘテロ原子を有する低級アルキル基であるか、または
【００３７】
ｆ）Ｒ１０が水素もしくは低級アルキルである、式―Ｃ＝Ｎ−ＯＲ１０を持つ基であるか、または
【００３８】
ｇ）ｑが１であれば、項（ｉｉ）において上述の定義に加えて、ａ）〜ｆ）はまたハロゲン、低級アルキル、トリフルオロメチルもしくは低級アルコキシで置換されたフェニルであってもよく、そして
【００３９】
Ｒ３は、水素、低級アルキル、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキルカルバモイルもしくはＮ，Ｎ−ジ−低級アルキルカルバモイルである。｝
で示される化合物、または
【００４０】
（ｉｉｉ）式Ｉ
〔式中、
ｑは０であり、
ｎは０〜５であり、
Ｒは、ハロゲン、低級アルキル、トリフルオロメチルおよび低級アルコキシから選択される置換基であり、そしてＲ１およびＲ２は、それぞれ他のものと独立して低級アルキル、あるいは未置換であるかまたはハロゲン、トリフルオロメチル、低級アルキルによりもしくは低級アルコキシにより置換されたフェニルであり、ここで、二つの基Ｒ１およびＲ２は水素であることが可能であり、またはＲ１およびＲ２は一体となって、未置換であるかまたは低級アルキルにより置換されたところの２〜５個の炭素原子を有するアルキレン鎖を形成する。〕
で示される化合物、
またはそのような化合物の塩である。
【００４１】
さらに好ましくは、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤は以下のものを意味する：
（Ｒ）−４−［（１−フェニル−エチル）−アミノ］−６−（３−プロピオニルアミノ−フェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンもしくはその塩。
最も好ましくは、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤は以下のものを意味する：（Ｒ）−６−（４−ヒドロキシ−フェニル）−４−［（１−フェニル−エチル）−アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンもしくはその塩。
【００４２】
上記で好ましいとして説明したＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤を、例えばＥＰ  ０  ６８２  ０２７  Ｂ１、ＷＯ  ９７／０２２６６およびＷＯ  ９８／０７７２６に記載のように、製造することができる。
好ましくは、塩は薬学的に許容される塩である。
【００４３】
発現レベルがＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の生物活性と相関する遺伝子は、好ましくは、下記の表４に記載された遺伝子、さらに好ましくはＴＲＡＩＬ、ＶＡＣ−ベータおよびクラステリン遺伝子、最も好ましくはクラステリン遺伝子である。
【００４４】
実施例
材料および方法：
１．細胞培養
以下の組織培養細胞をそれらのＥＧＦＲ発現状態のために選択した（表１）。ＥＧＦＲ発現はＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｓ （Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ， ＫＹ）からの抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティングにより測定する。細胞株はＡＴＣＣ （Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＮＤ）から入手される。細胞を５％ＣＯ２中３７℃で培養する。
【００４５】
【表１】
2004516025.tif 000005
【００４６】
白血球濃縮フラクション（バフィーコート）を健常ドナーから得る。ＲＰＭＩ １６４０培地２５ｍｌで希釈したバフィーコート１０ｍｌをＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）４ｍｌ上に重ね、１，２００×ｇで１５分間遠心する。境界面の白血球細胞（ＷＢＣ）層を取り出し、細胞をＲＰＭＩ １６４０培地で２回洗浄して、血小板を除去する。ＷＢＣをＲＰＭＩ １６４０プラス１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）中で細胞１億個／１００ｍｌでＴ−１５０フラスコ中で培養し、処理の前に３７℃で１時間インキュベートする。
【００４７】
２．ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤による細胞の処理およびＲＮＡ調製
２．１．ｃＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション用細胞：
２千万個の組織培養細胞（約８０％密集度）もしくは２億個のＷＢＣを３μＭのＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤もしくは０．０３％のＤＭＳＯを含有する培地中で２もしくは２４時間インキュベートする。細胞ペレットから全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離する。ｍＲＮＡをオリゴテックスｍＲＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離する。得られたｍＲＮＡの品質を、アンプリコンサイズの３００塩基対（ｂｐ）を持つベータ−アクチンプライマー（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによりテストする。全ＲＮＡを基準として使用して、オリゴテックスで精製した試料中のｍＲＮＡ濃縮量を計算する。
【００４８】
２．２．リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用細胞：
約８０％密集度におけるＡ４３１細胞２百万個をＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（１００、３００もしくは３０００ｎＭ）または０．０３％ＤＭＳＯで処理し、４、８、１６もしくは２４時間インキュベートする。全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙキットを用いて単離する。
【００４９】
３．ｃＤＮＡアレイハイブリダイゼーション
ＵｎｉＧＥＭハイブリダイゼーション用プローブはＩｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ （Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）により合成される。それぞれのプローブにつき、２００ｎｇ（５０ｎｇ／μｌ）のｍＲＮＡがドライアイス中で送られる。結果は、ＧｅｎｅＤａｔａ提供のＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ を用いて解析される。
【００５０】
４．リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
４．１．プライマーのデザイン：
プライマーおよびプローブをデザインするために、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのプライマー発現ソフトウエアを使用する。ソフトウエアは融点（Ｔｍ）５８〜６０℃のプライマーをデザインした。プライマー発現は通常２００個までの可能な組合せを見出す。以下の特徴を有する最良の組合せを手作業で選択する：
−  ３’末端の最後の５個のヌクレオチド内に３個未満のＧもしくはＣを有するプライマー
−  アンプリコンのサイズが１５０ｂｐ未満。
プライマーおよびプローブはコード化領域内もしくは３’非翻訳領域内のｍＲＮＡ配列よりデザインされる（表２）。
【００５１】
【表２】
2004516025.tif 000006
【００５２】
４．２．ＲＴ−ＰＣＲ反応：
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲのために、１〜５０ｎｇ／反応のＲＮＡ濃度を用いて、１５〜３５サイクルの間のシグナルを得る。それぞれのＲＮＡ標品について、ＲＴ−ＰＣＲ反応を逆転写酵素の有無で実施して、ゲノムＤＮＡの混入をチェックする。テストした全てのＲＮＡ試料において、ゲノムＤＮＡの混入は１％未満である。
初期濃度および全ＲＮＡの品質のばらつきを規格化するために、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）を全ての定量実験において内在性基準として使用する。
ＲＴ−ＰＣＲのために１段階、２酵素システムを選択する。ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ （ＰＥ ＃Ｎ８０８−０２２８）プラス逆転写酵素ＭｕＬＶ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＃ Ｎ８０８−００１８）およびＲＮａｓｅ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＃ ７９９ ０２５）を製造元のプロトコールの記載されたように混合する。標的および基準の反応について三回測定する。
【００５３】
2004516025.tif 000007
【００５４】
４．３．プライマーおよびプローブの最適化：
テストするそれぞれの遺伝子に対するプライマーおよびプローブを下記の計画を用いて最適化する。
最終濃度を示す：
順方向プライマー（ｎＭ）：１００ １００ １００ ３００ ３００ ３００ ９００ ９００ ９００
逆方向プライマー（ｎＭ）：１００ ３００ ９００ １００ ３００ ９００ １００ ３００ ９００
最適濃度として、最低のＣＴ値を持つ反応を最優先に、最高のＲｎ（バックグラウンド蛍光を差し引いた相対蛍光）値を示す反応を第二優先として選択する。
【００５５】
４．４．比較ＣＴ法
比較ＣＴ法を定量に用いる前に、バリデーション実験を行って、標的および基準の効率がほぼ同一であることを確かめる。ＲＴ−ＰＣＲ反応を反応当たり２．５、５、１０、２０、４０および８０ｎｇのＲＮＡ濃度で行う。（インプット量の対数）のΔＣＴに対する勾配の絶対値は＜０．１でなければならない。ΔＣＴ値は３回の測定による平均の標的ＣＴ値から平均の基準ＣＴ値を差し引いて求められる。相対的な定量、基準および標的、を上述のＲＴ−ＰＣＲプロトコールを用いてについて三回行う。
以下の計算を用いて結果を得る。
ΔＣＴ：  ＣＴ標的−ＣＴ基準
ｓ：  差の標準偏差ｓ＝（Ｓ１２＋Ｓ２２）の平方根
ΔΔＣＴ：  ΔＣＴ−ΔＣＴ校正物質（これは任意定数の減算である。それ故に、ΔΔＣＴの標準偏差はΔＣＴの標準偏差に等しい）。
範囲：  校正物質に対して標的に与えられる範囲は発現２−ΔΔＣＴをΔΔＣＴ＋ＳおよびΔΔＣＴ−Ｓで評価することにより決定される。
【００５６】
５．ウエスタンブロット分析
５．１．ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤もしくはＤＭＳＯによる細胞の処理：
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤をＤＭＳＯに溶解して、１０ｍＭの原液を得る。この原液をさらに培地で希釈して１０ｎＭ〜３μＭの最終濃度とする。
３５０万個／１００ｍｍシャーレ／１２ｍｌ培地を５％ＣＯ２中３７℃で２４時間インキュベートする。培地をＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤もしくはＤＭＳＯを含有する培地と交換する。細胞を４〜３２時間インキュベートする。
インキュベーション後、細胞をトリプシン化し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄する。細胞のペレットを−８０℃で凍結する。
【００５７】
５．２．細胞溶解：
最初の実験のために細胞をＭ−ＰＥＲ哺乳動物タンパク質試薬（ＰＩＥＲＣＥ）で溶解する。タンパク質の沈殿および／もしくは凝固のために手順を変更する。以下の方法が再現性のある結果を与える：
凍結ペレットを５００μｌの溶解用緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））中で溶解する。
ゲノムＤＮＡを剪断するするために、細胞溶解物を緑色のＦａｓｔＲＮＡチューブ（Ｂｉｏ１０１＃６０４０−６０１０）を用いて、ＦａｓｔＰｒｅｐ装置中において速度目盛り４で２０秒間処理する。タンパク質濃度をＰＩＥＲＣＥ法 （ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ、 試薬ＡおよびＢ）にしたがって測定する。溶解物のタンパク質濃度を溶解用緩衝液で１μｇ／μｌに調整する。細胞溶解物４部を５倍濃度のＬａｅｍｍｌｉ緩衝液１部と混合し、溶解物を−２０℃で保存する。
【００５８】
５．３．ＳＤＳポリアクリアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ブロッティングおよび検出：
細胞溶解物４０μｌを３分間９５℃にまで加熱し、直接１０％もしくは１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に装てんする。ゲルを１３０Ｖで９０分間標準条件下で泳動させる。分離されたタンパク質を半乾きの状態でＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ， Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃ＩＰＶＨ ２０２ ００）上にブロットにつき４５ｍＡで７０分間ブロットする。
移動後直ちにブロットをＢｌｏｔｔｏ Ａ （Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中５％粉スキムミルク／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中室温で１時間回転プラットフォーム上でインキュベートする。それから、ブロットをＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０中で３回洗浄する。ブロットをＢｌｏｔｔｏ Ａ中０．２μｇ／ｍｌの例えばヤギ抗ヒトクラステリン（Ｃ−１８）抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ｓｃ−６４１９）と１時間、１．５時間、回転プラットフォーム上で室温でインキュベートする。対照ブロットを０．２μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトアクチン（Ｃ−２）抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ｓｃ−８４３２）とインキュベートする。ブロットをＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄する。ブロットをＢｌｏｔｔｏ Ａで１：１０００に希釈した抗ヒツジ／ヤギアルカリホスファターゼ結合第二次抗体（Ｒｏｃｈｅ）もしくは抗マウスアルカリホスファターゼ結合第二次抗体（（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ−２３０２）とインキュベートする。余分の抗体を３回洗浄（ＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で除去する。ブロットを０．０１２５ｍｌ／ｃｍ２（ブロット当たり凡そ１．５ｍｌ）のＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ［登録商標］化学発光基質（ＰＩＥＲＣＥ）で注意深く１分間覆う。過剰の試薬を除去し、そしてブロットを透明なプラスチックのラップでカバーする。ブロットをＸ線フィルム（ＣＬ−ＸＰｏｓｕｒｅ， ＰＩＥＲＣＥ）に１〜１０分間露光させる。
【００５９】
実施例：
実施例１
異なるＥＧＦＲ発現状況を持つ４種の腫瘍細胞株（Ａ４３１、ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＮＣＩ−Ｈ５２０およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８）ならびにＷＢＣを３μＭの化合物Ａに２もしくは２４時間曝露した際の発現プロフィル（ＵｎｉＧＥＭ Ｖアレイ）を分析する。対照として、ＤＭＳＯで同じ期間処理した細胞を使用する。カットオフ値を３に設定した２時間の発現プロフィルは誘導された遺伝子を殆ど示さないで、ごく僅かの抑制された遺伝子、例えば初期増殖応答タンパク質１、を示し、これは二つの細胞株およびＷＢＣで抑制を示す（データは示さない）。２４時間発現のプロフィルからは、Ａ４３１細胞株は、幾つかのディファレンシャルに発現された遺伝子をもって最も有望な結果を示した。ｃＤＮＡアレイのハイブリダイゼーションを同じｍＲＮＡを用いてＵｎｉＧＥＭ １アレイで繰り返す（表３）。
【００６０】
【表３】
2004516025.tif 000008
【表４】
2004516025.tif 000009
【００６１】
二つのｃＤＮＡアレイハイブリダイゼーションは良好な相関を示す（表４）。１０個の遺伝子をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる確認のために以下の基準に基づいて選択する：両方のｃＤＮＡアレイ実験で一貫調節、誘導されたが抑制されていない遺伝子、良好なシグナル対バックグラウンド比（＞５）、好ましくは細胞表面もしくは分泌タンパク質をコード化する遺伝子およびアポトシスもしくは増殖制御とリンクしている遺伝子。ｃＤＮＡアレイハイブリダイゼーションで使用したのと同じＲＮＡをテストすると、化合物Ａ曝露に際しての誘導を選択された遺伝子の全てで確認することができる（表４）。
【００６２】
【表５】
2004516025.tif 000010
【００６３】
３μＭの化合物ＡによるＡ４３１細胞の処理を独立の実験で２回繰り返して、遺伝子発現レベルの誘導を確認する。化合物曝露に際する誘導は、ヒト細胞外タンパク質Ｓ１−５を除いて、全ての遺伝子について繰り返えすことができる（表４）。
遺伝子発現の誘導は、クラステリンについて例示するように、用量および時間依存性を示す（図１Ａおよび１Ｂ）。
【００６４】
３μＭの化合物ＡもしくはＤＭＳＯで２４時間処理した全ての細胞株およびＷＢＣにおいて、ＴＲＡＩＬ、クラステリンおよびＶＡＣ−ベータの発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲでテストする。ＮＣＩ−Ｈ５２０と比べて計算した三つの遺伝子の発現レベルは種々の細胞タイプ間で大きな差を示す（表５）。ＮＣＩ−Ｈ５２０は、この細胞株における三つ全ての遺伝子の低い発現のため、校正物質として指定される。ＶＡＣ−ベータの発現レベルはＮＣＩ−Ｈ５２０細胞およびＷＢＣでは検出限界に到達する。化合物Ａ処理の際してのディファレンシャル発現は、テストした全ての細胞およびＷＢＣでｃＤＮＡアレイハイブリダイゼーション（ＵｎｉＧＥＭ Ｖ）の結果と一致している。Ａ４３１細胞とは対照的に、ＴＲＡＩＬはＷＢＣでは比較的高い基準値の発現レベルを示し、化合物Ａに２４時間曝露後には２．５倍の発現を示す（表５）。
【００６５】
【表６】
2004516025.tif 000011
【００６６】
実施例２：化合物Ａ曝露に際してのＡ４３１におけるクラステリン誘導の用量応答
種々の濃度の化合物Ａに細胞を２４時間曝露に際してのＡ４３１細胞中のクラステリン（ｐｇ８０、アポリポタンパク質Ｊ、補体依存性細胞溶解阻害因子もしくはＴＲＰＭ−２とも呼ばれる；Ｊｅｎｎｅ Ｄ．Ｅ． ａｎｄ Ｔｓｃｈｏｐｐ， Ｊ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６， ７１２３−７１２７， １９８９をも参照）の誘導を分析した。対照として、Ａ４３１細胞を０．０３％ＤＭＳＯで処理する。図２は、増加する濃度の化合物Ａで２４時間処理後のクラステリンタンパク質の誘導を示す。クラステリンの低いレベルの基準値発現が検出され得る。凡そ４３ｋＤａに見られる強いシグナル（Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５， ６１５７−６１６３， １９９６）が化合物Ａの濃度と共に増大して、３００ｎＭで最大に達する。抗クラステリン抗体で検出されるさらに別なシグナルは、グリコシル化型のクラステリン前駆体（５６〜６０ｋＤａおよび７５〜８０ｋＤａ； Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５， ６１５７−６１６３， １９９６）を恐らく表す。抗アクチン抗体とインキュベートした対照のブロットは、レーン当たり等量の蛋白質が装てんされていることを確認する。
【００６７】
実施例３：化合物Ａ曝露に際してのＡ４３１細胞におけるクラステリン誘導の時間経過
３００ｎＭの化合物Ａで４、８、１６、２４および３２時間、もしくは０．０３％ＤＭＳＯで４および２４時間処理したＡ４３１細胞におけるクラステリン誘導を図３に示す。１６時間から３２時間にかけてのクラステリンのシグナルの連続的な増加が検出される。
【００６８】
実施例４：化合物Ａによるクラステリン誘導とＥＧＦＲの状況との関係
ＥＧＦＲの状況とクラステリン誘導との関係を実証するために、四つの異なる細胞株を３００ｎＭの化合物Ａもしくは０．０３％のＤＭＳＯのどちらかで２４時間処理する。図４に示すように、化合物Ａ処理に際しての強いクラステリンのシグナルがＡ４３１およびＭＤＡ−ＭＢ６４８細胞に検出されるが、両方とも高レベルのＥＧＦＲを発現している。中等度のレベルのＥＧＦＲを持つＮＣＩ−Ｈ５９６細胞は化合物Ａによる有意なクラステリン誘導を示さない。ＥＧＦＲを発現しないＮＣＩ−Ｈ５２０細胞は検出可能なクラステリンのレベルを示さない。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】図１Ａは、化合物Ａの処理に際してＡ４３１細胞におけるリアルタイム逆転写ポリメーラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により測定したクラステリンの発現レベルを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、化合物Ａの処理に際してＡ４３１細胞におけるリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により測定したクラステリンの発現レベルを示す。
【図２】図２は化合物Ａ曝露に際してＡ４３１細胞におけるクラステリン誘導の用量応答を示す。
【図３】図３は化合物Ａに曝露に際してＡ４３１細胞におけるクラステリン誘導の時間経過を示す。
【図４】図４は化合物Ａによるクラステリン誘導とＥＧＦＲの状態との関係を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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