(57)【要約】本発明は、免疫原性ＨＩＶ　Ｃ型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。ＤＮＡ免疫化、パッケージング細胞株の作成、およびＨＩＶ　Ｃ型タンパク質の産生を含む用途におけるこのポリヌクレオチドの使用もまた、記載される。また、本明細書中には、新規のＣ型ＨＩＶ配列（例えば、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ、８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡおよび１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ）、これらの新規配列によってコードされるポリペプチド、およびこれらまたは他のＣ型ＨＩＶ配列から生成される合成発現カセットが記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ　Ｐｏｌポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、ここで、該Ｐｏｌポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチド配列が、図８（配列番号３０）；図９（配列番号３１）または図１０（配列番号３２）に示される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。
【請求項２】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号４６のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、少なくとも９７である、発現カセット。
【請求項３】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む、請求項２に記載の発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号４７のＹ個連続したヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、少なくとも１４４である、発現カセット。
【請求項４】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む、請求項３に記載の発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号４９または配列番号９７のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、少なくとも３００である、発現カセット。
【請求項５】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む、請求項４に記載の発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号４９のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、２６１０である、発現カセット。
【請求項６】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む、請求項４に記載の発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号９７のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、２５６５である、発現カセット。
【請求項７】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号５１のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、１４９４である、発現カセット。
【請求項８】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号９９のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、１４９１である、発現カセット。
【請求項９】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号５５；配列番号５７；配列番号１０１；配列番号９６；配列番号１３４または配列番号１３５のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、少なくとも６０である、発現カセット。
【請求項１０】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む、請求項９に記載の発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号５５；配列番号５７；配列番号１０１；配列番号９６；配列番号１３４または配列番号１３５のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、６２４である、発現カセット。
【請求項１１】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号５８のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、３５４である、発現カセット。
【請求項１２】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号６０のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、８７６である、発現カセット。
【請求項１３】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号６２のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、３０１５である、発現カセット。
【請求項１４】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号１０３のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、３００９である、発現カセット。
【請求項１５】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号６４または配列番号６６のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、２９７である、発現カセット。
【請求項１６】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号６８のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、１９６５である、発現カセット。
【請求項１７】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号７０のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、１９７７である、発現カセット。
【請求項１８】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号７２または配列番号１０５のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、少なくとも３０である、発現カセット。
【請求項１９】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む、請求項１８に記載の発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号７２または配列番号１０５のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、７５である、発現カセット。
【請求項２０】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号７４または１０７のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、少なくとも３０である、発現カセット。
【請求項２１】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む、請求項２０に記載の発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号７４または配列番号１０７のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、２４６である、発現カセット。
【請求項２２】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号７６のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、１６８０である、発現カセット。
【請求項２３】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号７８のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、１６６８である、発現カセット。
【請求項２４】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号８０、配列番号８１または配列番号１０９のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、２１６である、発現カセット。
【請求項２５】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号８３のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、９３である、発現カセット。
【請求項２６】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号１１１のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、９０である、発現カセット。
【請求項２７】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号８５または配列番号１１３のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、５７９である、発現カセット。
【請求項２８】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号８７のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、２８８である、発現カセット。
【請求項２９】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号１１５のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、２８７である、発現カセット。
【請求項３０】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号８９または配列番号１１７のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、少なくとも３０である、発現カセット。
【請求項３１】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む、請求項３０に記載の発現カセットであって、，ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号８９のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、２６７である、発現カセット。
【請求項３２】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む、請求項３０に記載の発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号１１７のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、２６１である、発現カセット。
【請求項３３】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号９１のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、少なくとも３０である、発現カセット。
【請求項３４】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む、請求項３３に記載の発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号９１のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、３２１である、発現カセット。
【請求項３５】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号９３または配列番号９４のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、３０９である、発現カセット。
【請求項３６】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号９６のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、少なくとも６０である、発現カセット。
【請求項３７】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む、請求項３６に記載の発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号９６のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、６２４である、発現カセット。
【請求項３８】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号１１９、配列番号１２０；配列番号１２１；配列番号１２２；配列番号１２３；配列番号１２４；配列番号１２５；配列番号１２６；配列番号１２７；配列番号１３１；配列番号１３２または配列番号１３３のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、少なくとも６０である、発現カセット。
【請求項３９】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む、請求項３８に記載の発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号１１９、配列番号１２０；配列番号１２１；配列番号１２２；配列番号１２３；配列番号１２４；配列番号１２５；配列番号１２６；配列番号１２７；配列番号１３１；配列番号１３２または配列番号１３３のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、少なくとも３００である、発現カセット。
【請求項４０】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む、請求項３９に記載の発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号１２３または配列番号１２４のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、２４３３である、発現カセット。
【請求項４１】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む、請求項３９に記載の発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号１２２のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、２３０１である、発現カセット。
【請求項４２】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む、請求項３９に記載の発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号１２５のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、２５１７である、発現カセット。
【請求項４３】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む、請求項３９に記載の発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号１２６または配列番号１２７のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、２５２０である、発現カセット。
【請求項４４】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む、請求項３９に記載の発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号１１９のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、１３７７である、発現カセット。
【請求項４５】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む、請求項３９に記載の発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号１２０または配列番号１２１のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、１８３９である、発現カセット。
【請求項４６】
Ｘ個連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む、請求項３９に記載の発現カセットであって、ここで、（ｉ）該Ｘ個連続したヌクレオチドが、配列番号１３２または配列番号１３３のＹ個連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％のパーセント同一性を有し、（ｉｉ）Ｘが、Ｙと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｙが、１８９０である、発現カセット。
【請求項４７】
配列番号３３に示される配列またはそれから誘導されるフラグメントを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項４８】
請求項４７に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、前記フラグメントが、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｐｕ、ＥｎｖおよびＮｅｆからなる群より選択される遺伝子産物についてのコード配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項４９】
前記フラグメントが、Ｇａｇ遺伝子産物を含む、請求項４８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５０】
前記フラグメントが、Ｅｎｖ遺伝子産物を含む、請求項４８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５１】
前記Ｅｎｖ遺伝子産物が、ｇｐｌ６０、ｇｐｌ４０またはｇｐｌ２０である、請求項５０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５２】
配列番号４５に示される配列またはそれから誘導されるフラグメントを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項５３】
請求項５２に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、前記フラグメントが、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｐｕ、ＥｎｖおよびＮｅｆからなる群より選択される遺伝子産物についてのコード領域を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項５４】
前記フラグメントが、Ｇａｇ遺伝子産物を含む、請求項５３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５５】
前記フラグメントが、Ｅｎｖ遺伝子産物を含む、請求項５３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５６】
前記Ｅｎｖ遺伝子産物が、ｇｐｌ６０、ｇｐｌ４０またはｇｐｌ２０である、請求項５５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５７】
配列番号１２８に示される配列またはそれから誘導されるフラグメントを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項５８】
前記フラグメントが、Ｅｎｖ遺伝子産物ｇｐｌ６０、ｇｐｌ４０またはｇｐｌ２０についてのコード配列を含む、請求項５７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５９】
１つ以上のウイルスポリペプチドまたは抗原をコードする１つ以上の核酸をさらに含む、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の発現カセット。
【請求項６０】
前記ウイルスポリペプチドまたは抗原が、Ｇａｇ、Ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｎｅｆおよびその組み合わせからなる群より選択される、請求項５９に記載の発現カセット。
【請求項６１】
１つ以上のサイトカインをコードする１つ以上の核酸をさらに含む、請求項１〜４６のいずれかに記載の発現カセット。
【請求項６２】
請求項１〜４６のいずれかに記載の発現カセットを含む、選択された宿主細胞における使用のための組換え発現系であって、前記ポリヌクレオチド配列が、該選択された宿主細胞における発現を駆動し得る制御エレメントをさらに含む、組換え発現系。
【請求項６３】
請求項６２に記載の組換え発現系であって、ここで、前記制御エレメントが、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終止シグナル、ポリアデニル化配列、翻訳の開始を最適化するための配列、および翻訳終止配列からなる群より選択される、組換え発現系。
【請求項６４】
請求項６２に記載の組換え発現系であって、ここで、前記転写プロモーターが、ＣＭＶ、ＣＭＶ＋イントロンＡ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＨＩＶ−Ｌｔｒ、ＭＭＬＶ−ｌｔｒ、およびメタロチオネインからなる群より選択される、組換え発現系。
【請求項６５】
請求項１〜４６のいずれかに記載の発現カセットを含む細胞であって、ここで、前記ポリヌクレオチド配列が、該選択された細胞における発現と適合性の制御エレメントをさらに含む、細胞。
【請求項６６】
前記細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞、細菌細胞、酵母細胞、植物、抗原提示細胞、一次細胞、不死化細胞、および腫瘍由来の細胞からなる群より選択される、請求項６５に記載の細胞。
【請求項６７】
前記細胞が、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、ＲＤ細胞、ＣＯＳ−７細胞、およびＣＨＯ細胞からなる群より選択される、請求項６６に記載の細胞。
【請求項６８】
前記細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項６７に記載の細胞。
【請求項６９】
前記細胞が、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ（Ｔｎ５）またはＳｆ９昆虫細胞のいずれかである、請求項６６に記載の細胞。
【請求項７０】
前記抗原提示細胞が、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、幹細胞、およびその前駆細胞からなる群より選択されるリンパ系細胞である、請求項６６に記載の細胞。
【請求項７１】
請求項１〜４６のいずれかに記載の発現カセットを含む、免疫学的応答を生じるための組成物。
【請求項７２】
１つ以上のＰｏｌポリペプチドをさらに含む、請求項７１に記載の組成物。
【請求項７３】
アジュバントをさらに含む、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７４】
請求項５２に記載の発現カセットを含む、免疫学的応答を生じるための組成物。
【請求項７５】
Ｐｏｌポリペプチドをさらに含む、請求項７４に記載の組成物。
【請求項７６】
請求項６０に記載の核酸分子によってコードされる１つ以上のポリペプチドをさらに含む、請求項７４に記載の組成物。
【請求項７７】
アジュバントをさらに含む、請求項７６に記載の組成物。
【請求項７８】
被験体の免疫方法であって、該方法は、請求項７１に記載の組成物を、該被験体における前記発現カセットの発現と適合性である条件下で該被験体に導入する工程を包含する、方法。
【請求項７９】
前記発現カセットが、遺伝子送達ベクターを使用して導入される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記遺伝子送達ベクターが、非ウイルスベクターである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記遺伝子送達ベクターが、ウイルスベクターである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記遺伝子送達ベクターが、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＡＡＶベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびアルファウイルスベクターからなる群より選択される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
前記遺伝子送達ベクターが、シンドビスウイルス由来のベクターである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記遺伝子送達ベクターが、ｃＤＮＡベクターである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
前記遺伝子送達ベクターが、真核生物の層状ウイルス開始系（ＥＬＶＩＳ）である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８６】
前記組成物が、粒子キャリアを使用して送達される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８７】
前記組成物が、金またはタングステンの粒子上にコーティングされ、そして該コーティングされた粒子が、遺伝子銃を使用して前記被験体に送達される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８８】
前記組成物が、リポソーム調製物にカプセル化されている、請求項７９に記載の方法。
【請求項８９】
前記被験体が、哺乳動物である、請求項７９に記載の方法。
【請求項９０】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
被験体における免疫応答を生じる方法であって、該方法は、以下：
請求項１〜４６のいずれかに記載の発現カセットを提供する工程、
適切な宿主細胞中で前記ポリペプチドを発現する工程、
該ポリペプチドを単離する工程、および
該ポリペプチドを、免疫応答を惹起するのに十分な量で該被験体に投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項９２】
被験体における免疫応答を生じる方法であって、該方法は、該被験体の細胞に、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の発現カセットを、前記ポリヌクレオチドの発現および前記ポリペプチドの産生を可能にする条件下で導入し、これによって該ポリペプチドに対する免疫学的応答を誘発する工程を包含する、方法。
【請求項９３】
前記方法が、ＨＩＶポリペプチドの同時投与を包含する、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記被験体への前記ポリペプチドの同時投与が、前記発現カセットの導入の前に行われる、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記被験体への前記ポリペプチドの同時投与が、前記発現カセットの導入と同時に行われる、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記被験体への前記ポリペプチドの同時投与が、前記発現カセットの導入の後に行われる、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
前記ウイルスポリペプチドまたは抗原が、Ｂ型肝炎由来のポリペプチド、Ｃ型肝炎由来のポリペプチド、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項５９に記載の発現カセット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
抗原性Ｃ型ＨＩＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、Ｇａｇ、ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｅｎｖ、およびｎｅｆ）が記載され、免疫原性組成物におけるこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチド産物の使用も記載される。Ｃ型ＨＩＶの南アフリカ改変体由来のポリヌクレオチド配列もまた、記載される。
【０００２】
（発明の背景）
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、現代医学が直面している最も巨大な健康の脅威の１つとして認識されている。この疾患に対する治療法は、未だ存在しない。１９８３年から１９８４年において、３つのグループが、ＡＩＤＳについて疑われる病原性因子を独立して同定した。例えば、Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉら（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２０：８６８−８７１；Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒら、Ｈｕｍａｎ　Ｔ−Ｃｅｌｌ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓｅｓ（Ｇａｌｌｏ，ＥｓｓｅｘおよびＧｒｏｓｓ編、１９８４）；Ｖｉｌｍｅｒら（１９８４）Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ　１：７５３；Ｐｏｐｏｖｉｃら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２４：４９７−５００；Ｌｅｖｙら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２５：８４０−８４２を参照のこと。これらの単離物は、リンパ節腫脹関連ウイルス（ＬＡＶ）、ヒトＴ細胞リンパ指向性ウイルスＩＩＩ型（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）、またはＡＩＤＳ関連レトロウイルス（ＡＲＶ）と多様に呼称されている。これらの単離物の全ては、同じウイルスの株であり、そして、これらの単離物の全ては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と集合的に後に命名された。関連するＡＩＤＳを引き起こすウイルスの単離によって、元来ＨＩＶと呼称された株は、現在ＨＩＶ−１と称され、そしてこの関連するウイルスは、ＨＩＶ−２と呼称される。例えば、Ｇｕｙａｄｅｒら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ　３２６：６６２−６６９；Ｂｒｕｎ−Ｖｅｚｉｎｅｔら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３３：３４３−３４６；Ｃｌａｖｅｌら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ　３２４：６９１−６９５を参照のこと。
【０００３】
ＨＩＶウイルスについての膨大な情報が集められたが、現在までに効果的なワクチンは同定されていない。ワクチン開発のためのいくつかの標的が調べられ、この標的としては、ＨＩＶによってコードされるｅｎｖ遺伝子産物およびＧａｇ遺伝子産物が挙げられる。Ｇａｇ遺伝子産物としては、Ｇａｇ−ポリメラーゼおよびＧａｇ−プロテアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。Ｅｎｖ遺伝子産物としては、モノマー性ｇｐｌ２０ポリペプチド、オリゴマー性ｇｐｌ４０ポリペプチドおよびｇｐｌ６０ポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されない。
【０００４】
Ｈａａｓら（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　６（３）：３１５−３２４，１９９６）は、ＨＩＶ−１による選択的なコドン使用頻度が、ウイルス性タンパク質合成能がないことの実質的な部分の原因と思われることを示唆した。Ａｎｄｒｅら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（２）：１４９７−１５０３，１９９８）は、改変したコドン使用頻度と共に合成ｇｐ１２０配列を使用するＤＮＡワクチン接種によって惹起される免疫応答の増大を記載した。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（Ｊ　Ｖｉｒｏｌ．７１（７）：４８９２−４９０３，１９９７）は、Ｇａｇのコード配列およびＧａｇ−プロテアーゼコード配列のコード配列中に位置づけられる阻害（または、不安定化）エレメント（ＩＮＳ）の不活性化を議論する。
【０００５】
ＨＩＶ−１のＧａｇタンパク質は、ウイルス様粒子の集合に必要である。ＨＩＶ−１　Ｇａｇタンパク質は、集合（ａｓｓｅｍｂｌｙ）、粒子放出後のビリオン成熟、およびウイルス複製における初期の侵入後の段階を含むウイルスの生活環の多くの段階に関連する。このＨＩＶ−１　Ｇａｇタンパク質の役割は、多数であり、そして複雑である（Ｆｒｅｅｄ，Ｅ．Ｏ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２５１：１−１５，１９９８）。
【０００６】
Ｗｏｌｆら（ＰＣＴ国際出願、ＷＯ　９６／３０５２３（１９９６年１０月３日に発行）；欧州特許出願、公開番号０　４４９　１１６　Ａｌ（１９９１年１０月２日に発行））は、特に、免疫学的に重要なエピトープの提示のための非感染性レトロウイルス様粒子状キャリアとして作用するＨＩＶ−１の変更したｐｒ５５　Ｇａｇの用途を記載した。Ｗａｎｇら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２００：５２４−５３４，１９９４）は、ビリオン中への、ＨＩＶ　Ｇａｇ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の集合を研究するための系を記載する。彼らは、ＨＩＶ　Ｇａｇ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質をコードする配列の構築、ＨＩＶ　Ｇａｇタンパク質の存在下のこのような配列の発現、およびこれらのタンパク質のウイルス粒子への集合を記載する。
【０００７】
Ｓｈｉｖｅｒら（ＰＣＴ国際出願、ＷＯ　９８／３４６４０、１９９８年８月１３日発行）は、ＨＩＶ−１（ＣＡＭ１）Ｇａｇコード配列を改変して、ＨＩＶ　Ｇａｇをコードする合成ＤＮＡ分子を産生すること、およびＨＩＶ　Ｇａｇの改変を記載する。この合成分子のコドンは、計画された（ｐｒｏｊｅｃｔｅｄ）宿主細胞によって好まれるコドンであった。
【０００８】
最近、免疫原性組成物におけるＨＩＶ　Ｅｎｖポリペプチドの使用が、記載さる（Ｈｕｒｗｉｔｚらへの米国特許番号第５，８４６，５４６号（１９９８年１２月８日発行）（この特許は、各々が異なったＨＩＶ　ｅｎｖ改変体を発現する４つの異なる組み換えウイルスの混合物を含む免疫原性組成物を記載する）；およびＶａｈｌｎｅらへの米国特許番号第５，８４０，３１３号（１９９８年１１月２４日発行）（この特許は、ＨＩＶ−１　ｇｐ１２０タンパク質のエピトープに対応するペプチドを記載する））。さらに、Ｓｉａらへの米国特許番号第５，８７６，７３１号（１９９９年３月２日発行）は、ＧＰＧＲ配列を含有するＨＩＶ−１単離物のＶ３ループタンパク質のＢ細胞エピトープのアミノ酸配列に直接的に連結されたＧａｇのＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を含むＨＩＶに対する候補ワクチンを記載する。抗原性ＨＩＶポリペプチド（特にＣ型単離物）に対する必要性がなお存在する。
【０００９】
（発明の要旨）
本明細書中に記載されるものは、新規のＣ型ＨＩＶ配列（例えば、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ、８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡおよび１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ）、これらの新規配列によってコードされるポリペプチド、およびこれらまたは他のＣ型ＨＩＶ配列から生成される合成発現カセットである。
【００１０】
特定の実施形態において、本発明は、ＨＩＶ　Ｃ型ポリペプチド（Ｅｎｖ、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｐｒｏｔ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｖｉｆ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖおよび／またはそれらのフラグメント）をコードする合成発現カセットに関する。さらに、本発明また、ＨＩＶ　Ｃ型ポリペプチドの発現の改善、およびウイルス様粒子の産生に関する。ＨＩＶポリペプチド（例えば、Ｇａｇ−，ｐｏｌ−，プロテアーゼ（ｐｒｏｔ）−、逆転写酵素、インテグラーゼ、ＲＮＡｓｅＨ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｖｉｆおよび／またはＥｎｖを含有するポリペプチド）をコードする合成発現カセットが、記載され、この発現カセットの使用も記載される。
【００１１】
従って、本発明の１つの局面は、発現カセットおよびこの中に含まれるポリヌクレオチドに関する。この発現カセットは、代表的には、発現ベクター骨格に挿入されたＨＩＶポリペプチドコード配列を含む。１つの実施形態において、発現カセットは、１以上のＰｏｌ含有ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ここで、このポリヌクレオチド配列は、本明細書中で教示される少なくとも約８５％、好ましくは約９０％、より好ましくは約９５％、およびより好ましくは約９８％（およびこれらの値の間の任意の整数）の配列同一性を有する配列を含む。Ｐｏｌ含有ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列としては、配列番号３０，配列番号３１；配列番号３２；配列番号６２；配列番号１０３；配列番号５８；配列番号６０；配列番号６４；配列番号６６；配列番号６８；配列番号７０；配列番号７６；および配列番号７８に示される配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１２】
本発明のＨＩＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、さらなるポリペプチドをコードする配列を含み得る。ポリペプチドをコードするこのようなさらなるポリヌクレオチドは、例えば、他のウイルスタンパク質（例えば、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎あるいは他のＨＩＶのタンパク質）についてのコード配列（例えば、ＨＩＶ　Ｇａｇポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、ＨＩＶ　Ｅｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列および／またはｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕおよびｎｅｆのうちの１以上をコードするポリヌクレオチド）；サイトカインまたは他の導入遺伝子を含み得る。１つの実施形態において、ＨＩＶ　Ｐｏｌポリペプチドをコードする配列は、逆転写酵素およびインテグラ−ゼに対応するコード領域の欠失によって改変され得る。このポリメラーゼポリペプチドにおけるこのような欠失はまた、作製され得、その結果、このポリヌクレオチド配列は、ヘルパーＴ細胞およびＣＴＬのエピトープを維持する。目的の他の抗原は、同様にポリメラーゼに挿入され得る。
【００１３】
別の実施形態において、発現カセットは、ＨＩＶ　Ｇａｇ含有ポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ここで、Ｇａｇポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書中で教示される配列に対して、少なくとも約８５％、好ましくは約９０％、より好ましくは約９５％、そして最も好ましくは約９８％配列同一性を有する配列を含む。Ｇａｇ含有ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列としては、以下のポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない：図１のヌクレオチド８４４−９０３（Ｇａｇの主要な相同性領域）（配列番号１）；図２のヌクレオチド８４１−９００（Ｇａｇの主要な相同性領域）（配列番号２）；図２４（配列番号５３、Ｇａｇの主要な相同性領域）；図１として提示される配列（配列番号３）；図２２として提示される配列（配列番号５１）；図７０として提示される配列（配列番号９９）；および図２として提示される配列（配列番号４）。上述のように、本発明のＧａｇ含有ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、さらなるポリペプチドをコードする配列を含み得る。
【００１４】
別の実施形態において、発現カセットは、ＨＩＶ　Ｅｎｖ含有ポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含有し、ここで、Ｅｎｖ　ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書中で教示される配列に対して、少なくとも約８５％、好ましくは約９０％、より好ましくは約９５％、そして最も好ましくは約９８％の配列同一性を有する配列を含む。Ｅｎｖ含有ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列としては、以下のポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない：図３のヌクレオチド１２１３〜１３５３（配列番号５）（これは、Ｅｎｖ共通領域をコードする）；図１７として提示される配列（配列番号４６）（これは、９７ヌクレオチド長のＥｎｖ共通領域をコードする）；配列番号４７（これは、１４４ヌクレオチド長のＥｎｖ共通領域をコードする）；図３のヌクレオチド８２〜１５１２（配列番号６）（これは、ｇｐｌ２０ポリペプチドをコードする）；図３のヌクレオチド８２〜２０２５（配列番号７）（これは、ｇｐｌ４０ポリペプチドをコードする）；図３のヌクレオチド８２〜２５４７（配列番号８）（これは、ｇｐｌ６０ポリペプチドをコードする）；配列番号４９（これは、ｇｐｌ６０ポリペプチドをコードする）；図３のヌクレオチド１〜２５４７（配列番号９）（これは、シグナル配列を有するｇｐｌ６０ポリペプチドをコードする）；図３のヌクレオチド１５１３〜２５４７（配列番号１０）（これは、ｇｐ４１ポリペプチドをコードする）；図４のヌクレオチド１２１０〜１３５３（配列番号１１）（これは、Ｅｎｖ共通領域をコードする）；図４のヌクレオチド７３〜１５０９（配列番号１２）（これは、ｇｐｌ２０ポリペプチドをコードする）；図４のヌクレオチド７３〜２０２２（配列番号１３）（これは、ｇｐｌ４０ポリペプチドをコードする）；図４のヌクレオチド７３〜２５６５（配列番号１４）（これは、ｇｐｌ６０ポリペプチドをコードする）；図４のヌクレオチド１〜２５６５（配列番１５）（これは、シグナル配列を有するｐｌ６０　ポリペプチドをコードする）；図２０として提示される配列（配列番号４９）（これは、ｇｐｌ６０ポリペプチドをコードする）；図６８として提示される配列（配列番号９７）（これは、ｇｐｌ６０ポリペプチドをコードする）；図４のヌクレオチド１５１０−２５６５（配列番号１６）（これは、ｇｐ４１ポリペプチドをコードする）；図９０のヌクレオチド７〜１４６４（配列番号１１９）（これは、改変された野生型シグナル配列を有するｇｐｌ２０ポリペプチドをコードする）；図９１のヌクレオチド７〜１９７７（配列番号１２０）（これは、野生型８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡから改変されたシグナル配列（例えば、「改変された野生型リーダー配列」）を含むｇｐ１４０ポリペプチドをコードする）；図９２のヌクレオチド７〜１９７７（配列番号１２１）（これは、改変された野生型８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡシグナル配列を有するｇｐｌ４０ポリペプチドをコードする）；図９３のヌクレオチド７〜２３８８（配列番号１２２）（これは、改変された野生型シグナル配列を有するｇｐｌ６０ポリペプチドをコードする）；図９４のヌクレオチド７〜２５２０（配列番号１２３）（これは、改変された野生型８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡシグナル配列を有するｇｐｌ６０ポリペプチドをコードする）；図９５のヌクレオチド７〜２５２０（配列番号１２４）（これは、改変された野生型８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡシグナル配列を有するｇｐ１６０ポリペプチドをコードする）；図９６のヌクレオチド１３〜２６０４（配列番号１２５）（これは、ＴＰＡ１シグナル配列を有するｇｐ１６０ポリペプチドをコードする）；図９７のヌクレオチド７〜２６０７（配列番号１２６）（これは、改変された野生型８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡシグナル配列を有するｇｐｌ６０ポリペプチドをコードする）；図１００のヌクレオチド１〜２０４９（配列番号１３１）（これは、ＴＰＡ１シグナル配列を有するｇｐｌ４０ポリペプチドをコードする）；図９８のヌクレオチド７〜１６０７（配列番号１２６）（これは、野生型８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡシグナル配列を有するｇｐｌ６０ポリペプチドをコードする）；配列番号１３２のヌクレオチド７〜２０６４（これは、野生型８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡリーダー配列を有するｇｐｌ４０ポリペプチドをコードする）；および配列番号１３３のヌクレオチド７〜２０６４（これは、改変された野生型８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡリーダー配列を有するｇｐｌ４０ポリペプチドをコードする）。
【００１５】
特定の実施形態において、Ｅｎｖコード配列は、さらなる改変、例えば、ｇｐｌ２０ポリペプチドおよびｇｐ４１ポリペプチド（配列番号１２１および配列番号１２４）へのｇｐｌ４０ポリペプチドの切断または可変領域Ｖ１および／またはＶ２（配列番号１１９；配列番号１２０；配列番号１２１；配列番号１２２；配列番号１２３；および配列番号１２４）の欠失を防ぐための切断部位の変異を含む。
【００１６】
別の実施形態において、発現カセットは、ＨＩＶ　Ｎｅｆ含有ポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ここで、Ｎｅｆ　ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書中で教示される配列に対して、少なくとも約８５％、好ましくは約９０％、より好ましくは約９５％、そして最も好ましくは約９８％の配列同一性を有する配列を含む。Ｎｅｆ含有ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列としては、以下のポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない：図２６において提示される配列（配列番号５５）；図７２で提示される配列（配列番号１０１）；図２８で提示される配列（配列番号５７）；図６７で提示される配列（配列番号９６）；図１０３で提示される配列（配列番号１３４）；および図１０４で提示される配列（配列番号１３５）。
【００１７】
別の実施形態において、発現カセットは、ＨＩＶ　Ｒｅｖ含有ポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ここで、Ｒｅｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書中で教示される配列に対して、少なくとも約８５％、好ましくは約９０％、より好ましくは約９５％、そして最も好ましくは約９８％の配列同一性を有する配列を含む。Ｒｅｖ含有ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列としては、以下のポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない：図４３で提示される配列（配列番号７２）；図７６で提示される配列（配列番号１０５）；図４５で提示される配列（配列番号７４）；図７８で提示される配列（配列番号１０７）；および図６２で提示される配列（配列番号９１）。
【００１８】
別の実施形態において、発現カセットは、ＨＩＶ　Ｔａｔ含有ポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、ここで、Ｔａｔポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書中で教示される配列に対して、少なくとも約８５％、好ましくは約９０％、より好ましくは約９５％、そして最も好ましくは約９８％の配列同一性を有する配列を含む。Ｔａｔ含有ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列としては、以下のポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない：図５１で提示される配列（配列番号８０）；図８０で提示される配列（配列番号１０９）；図５２で提示される配列（配列番号８１）；図５４で提示される配列（配列番号８３）；および図８２で提示される配列（配列番号１１１）。
【００１９】
別の実施形態において、発現カセットは、ＨＩＶ　Ｖｉｆ含有ポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ここで、Ｖｉｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書中で教示される配列に対して、少なくとも約８５％、好ましくは約９０％、より好ましくは約９５％、そして最も好ましくは約９８％の配列同一性を有する配列を含む。Ｖｉｆ含有ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列としては、以下のポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない：図５６で提示される配列（配列番号８５）；および図８４で提示される配列（配列番号１１３）。
【００２０】
別の実施形態において、発現カセットは、ＨＩＶ　Ｖｐｒ含有ポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ここで、Ｖｐｒポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書中で教示される配列に対して、少なくとも約８５％、好ましくは約９０％、より好ましくは約９５％、そして最も好ましくは約９８％の配列同一性を有する配列を含む。Ｖｐｒ含有ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列としては、以下のポリヌクレオチドが挙げられるがこれらに限定されない：図５８で提示される配列（配列番号８７）；および図８６で提示される配列（配列番号１１５）。
【００２１】
別の実施形態において、発現カセットは、ＨＩＶ　Ｖｐｕ含有ポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ここで、Ｖｐｕポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書中で教示される配列に対して、少なくとも約８５％、好ましくは約９０％、より好ましくは約９５％、そして最も好ましくは約９８％の配列同一性を有する配列を含む。Ｖｐｕ含有ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列としては、以下のポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない：図６０で提示される配列（配列番号８９）；および図８８で提示される配列（配列番号１１７）。
【００２２】
本発明のさらなる実施形態としては、本明細書中で記載された配列のいずれかのの精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。Ｇａｇ含有ポリペプチドをコードする例示的なポリヌクレオチド配列としては、以下のポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない：図１のヌクレオチド８４４〜９０３（配列番号１）（Ｇａｇの主要な相同性領域）；図２のヌクレオチド８４１〜９００（配列番号２）（Ｇａｇの主要な相同性領域）；図１として提示される配列（配列番号３）；図２として提示される配列（配列番号４）；図２２として提示される配列（配列番号５１）；図７０として提示される配列（配列番号９９）；および図２４として提示される（配列番号５３）（Ｇａｇの主要な相同性領域）。
【００２３】
Ｅｎｖ含有ポリペプチドをコードする、例示的なポリヌクレオチド配列としては、以下のポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない：図３のヌクレオチド１２１３〜１３５３（配列番号５）（Ｅｎｖ共通領域をコードする）；図１７として示される配列（配列番号４６）（９７ヌクレオチド長のＥｎｖ共通領域をコードする）；配列番号４７（１４４ヌクレオチド長のＥｎｖ共通領域をコードする）；図３のヌクレオチド８２〜１５１２（配列番号６）（ｇｐ１２０ポリペプチドをコードする）；図３のヌクレオチド８２〜２０２５（配列番号７）（ｇｐ１４０ポリペプチドをコードする）；図３のヌクレオチド８２〜２５４７（配列番号８）（ｇｐ１６０ポリペプチドをコードする）；配列番号４９（ｇｐ１６０ポリペプチドをコードする）；図３のヌクレオチド１〜２５４７（配列番号９）（シグナル配列を有するｇｐ１６０ポリペプチドをコードする）；図３のヌクレオチド１５１３〜２５４７（配列番号１０）（ｇｐ４１ポリペプチドをコードする）；図４のヌクレオチド１２１０〜１３５３（配列番号１１）（Ｅｎｖ共通領域をコードする）；図４のヌクレオチド７３〜１５０９（配列番号１２）（ｇｐ１２０ポリペプチドをコードする）；図４のヌクレオチド７３〜２０２２（配列番号１３）（ｇｐ１４０ポリペプチドをコードする）；図４のヌクレオチド７３〜２５６５（配列番号１４）（ｇｐ１６０ポリペプチドをコードする）；図４のヌクレオチド１〜２５６５（配列番号１５）（シグナル配列を有するｇｐ１６０ポリペプチドをコードする）；図２０として示される配列（配列番号４９）（ｇｐ１６０ポリペプチドをコードする）；図６８として示される配列（配列番号９７）（ｇｐ１６０ポリペプチドをコードする）；図４のヌクレオチド１５１０〜２５６５（配列番号１６）（ｇｐ４１ポリペプチドをコードする）；図９０のヌクレオチド７〜１４６４（配列番号１１９）（改変した野生型シグナル配列を有するｇｐ１２０ポリペプチドをコードする）；図９１のヌクレオチド７〜１９７７（配列番号１２０）（野生型８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡから改変されたシグナル配列（例えば、「改変した野生型リーダー配列」）を含む、ｇｐ１４０ポリペプチドをコードする）；図９２のヌクレオチド７〜１９７７（配列番号１２１）（改変した野生型８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡシグナル配列を有するｇｐ１４０ポリペプチドをコードする）；図９３のヌクレオチド７〜２３８８（配列番号１２２）（改変した野生型シグナル配列を有するｇｐ１６０ポリペプチドをコードする）；図９４のヌクレオチド７〜２５２０（配列番号１２３）（改変した野生型８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡシグナル配列を有するｇｐ１６０ポリペプチドをコードする）；図９５のヌクレオチド７〜２５２０（配列番号１２４）（改変した野生型８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡシグナル配列を有するｇｐ１６０ポリペプチドをコードする）；図９６のヌクレオチド１３〜２６０４（配列番号１２５）（ＴＰＡ１シグナル配列を有するｇｐ１６０ポリペプチドをコードする）；図９７のヌクレオチド７〜２６０７（配列番号１２６）（改変した野生型８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡシグナル配列を有するｇｐ１６０ポリペプチドをコードする）；図１００のヌクレオチド１〜２０４９（配列番号１３１）（ＴＰＡ１シグナル配列を有するｇｐ１４０ポリペプチドをコードする）；図９８のヌクレオチド７〜１６０７（配列番号１２６）（野生型８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡシグナル配列を有するｇｐ１６０ポリペプチドをコードする）；配列番号１３２のヌクレオチド７〜２０６４（改変した野生型８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡリーダー配列を有するｇｐ１４０ポリペプチドをコードする）；および配列番号１３３のヌクレオチド７〜２０６４（野生型８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡリーダー配列を有するｇｐ１４０ポリペプチドをコードする）。
【００２４】
さらなるＨＩＶポリヌクレオチドをコードする、例示的な精製されたポリヌクレオチドとしては、以下が挙げられる：Ｐｏｌをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号３０、配列番号３１；配列番号３２；配列番号６２；配列番号１０３；配列番号５８；配列番号６０；配列番号６４；配列番号６６；配列番号６８；配列番号７０；配列番号７６；および配列番号７８）；Ｎｅｆをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号５５；配列番号１０１；配列番号５７；配列番号９６）；Ｒｅｖをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号７２；配列番号１０５；配列番号７４；配列番号１０７；配列番号９１）；Ｔａｔをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号８０；配列番号１０９；配列番号８１；配列番号８３；配列番号１１１）；Ｖｉｆをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号８５；配列番号１１３）；ならびにＶｐｒをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号８７；配列番号１１５）；Ｖｐｕをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号８９；配列番号１１７）。
【００２５】
他の実施形態において、本発明は、新規のＣ型株より得られるネイティブのＨＩＶポリペプチドをコードする配列；これらのネイティブの配列のフラグメント；これらの野生型配列を含む発現カセット；ならびに、これらの配列、フラグメントおよび発現カセットの使用に関する。例示的な全長配列は、配列番号３３および配列番号４５に示される。種々のＨＩＶ遺伝子産物をコードする例示的なフラグメントとしては、以下が挙げられる：図１９に示される配列（配列番号４８）（Ｅｎｖをコードする配列）；図６９に示される配列（配列番号９８）（Ｅｎｖをコードする配列）；図２１に示される配列（配列番号５０）（ｇｐ１６０ポリペプチド）；図２３に示される配列（配列番号５２）（Ｇａｇポリペプチド）；図７１に示される配列（配列番号１００）（Ｇａｇポリペプチド）；図２５に示される配列（配列番号５４）（Ｇａｇポリペプチド）；図２７に示される配列（配列番号５６）（Ｎｅｆポリペプチド）；図７３に示される配列（配列番号１０２）（Ｎｅｆポリペプチド）；図３０に示される配列（配列番号５９）（ｐ１５ＲＮＡｓｅＨポリペプチド）；図３２に示される配列（配列番号６１）（ｐ３１インテグラーゼポリペプチド）；図３４に示される配列（配列番号６３）（Ｐｏｌポリペプチド）；図７５に示される配列（配列番号１０４）（Ｐｏｌポリペプチド）；図３６に示される配列（配列番号６５）（Ｐｒｏｔポリペプチド）；図３８に示される配列（配列番号６７）（不活化Ｐｒｏｔポリペプチド）；図４０に示される配列（配列番号６９）（不活化ＰｒｏｔポリペプチドおよびＲＴポリペプチド）；図４２に示される配列（配列番号７１）（ＰｒｏｔポリペプチドおよびＲＴポリペプチド）；図４４に示される配列（配列番号７３）（Ｒｅｖポリペプチド）；図７７に示される配列（配列番号１０６）（Ｒｅｖポリペプチド）；図４６に示される配列（配列番号７５）（Ｒｅｖポリペプチド）；図７９に示される配列（配列番号１０８）（Ｒｅｖポリペプチド）；図４８に示される配列（配列番号７７）（ＲＴポリペプチド）；図５０に示される配列（配列番号７９）（変異したＲＴポリペプチド）；図５３に示される配列（配列番号８２）（Ｔａｔポリペプチド）；図８１に示される配列（配列番号１１０）（Ｔａｔポリペプチド）；図５５に示される配列（配列番号８４）（Ｔａｔポリペプチド）；図８３に示される配列（配列番号１１２）（Ｔａｔポリペプチド）；図５７に示される配列（配列番号８６）（Ｖｉｆポリペプチド）；図８５に示される配列（配列番号１１４）（Ｖｉｆポリペプチド）；図５９に示される配列（配列番号８８）（Ｖｐｒポリペプチド）；図８２に示される配列（配列番号１１６）（Ｖｐｒポリペプチド）；図６１に示される配列（配列番号９０）（Ｖｐｕポリペプチド）；図８９に示される配列（配列番号１１８）（Ｖｐｕポリペプチド）；図６３に示される配列（配列番号９２）（Ｒｅｖポリペプチド）；ならびに図６６に示される配列（配列番号９５）（Ｔａｔポリペプチド）。
【００２６】
本発明のＨＩＶポリペプチドをコードするネイティブなポリヌクレオチド配列および合成ポリヌクレオチド配列は、代表的には、本明細書中に教示される配列と、少なくとも約８５％、好ましくは、約９０％、より好ましくは、約９５％、そして最も好ましくは、約９８％の配列同一性を有する。さらに、特定の実施形態において、本発明のＨＩＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書中に教示される配列と、１００％の配列同一性を示す。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術、合成技術またはそれらの組み合わせによって生成され得る。
【００２８】
本発明は、さらに、選択した宿主細胞における使用のための組換え発現系を包含し、ここで、この組換え発現系は、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドおよび発現カセットを用いる。このような系において、ポリヌクレオチド配列は、選択した宿主細胞における発現と適合性のコントロールエレメントに作動可能に連結される。多数の発現コントロールエレメントが、当該分野で公知であり、これらとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終止シグナル、ポリアデニル化配列、翻訳の開始を最適化するための配列、および翻訳終止配列。例示的な転写プロモーターとしては、ＣＭＶ、ＣＭＶ＋イントロンＡ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＨＩＶ−Ｌｔｒ、ＭＭＬＶ−ｌｔｒおよびメタロチオネンから誘導されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
本発明の別の局面は、本発明の１つ以上の発現カセットを含む細胞を含み、ここで、ポリヌクレオチド配列は、選択された細胞における発現と適合性の制御エレメントに作動可能に連結される。１つの実施形態において、このような細胞は、哺乳動物細胞である。例示的な哺乳動物細胞としては、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、ＲＤ細胞、ＣＯＳ−７細胞およびＣＨＯ細胞が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の実施において有用であり得る他の細胞、細胞型、組織型などとしては、以下から得られるものが挙げられるがこれらに限定されない：昆虫（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ（Ｔｎ５）およびＳｆ９）、細菌、酵母、植物、抗原提示細胞（例えば、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、幹細胞およびそれらの前駆細胞）、一次細胞、不死化細胞、腫瘍誘導細胞。
【００３０】
さらなる局面において、本発明は、免疫学的応答を産生するための組成物を包含し、ここで、この組成物は、代表的には、本発明の少なくとも１つの発現カセットを含有し、そして例えば、発現カセット（例えば、Ｐｏｌポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する１つ以上の発現カセット、Ｇａｇポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する１つ以上の発現カセット、付随ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ネイティブもしくは合成の、ｖｐｕ、ｖｐｒ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ）を有する１つ以上の発現カセット、および／またはＥｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する１つ以上の発現カセット）の組み合わせを含有し得る。このような組成物は、さらに、アジュバント（単数または複数）を含有し得る。これらの組成物はまた、１つ以上のＣ型ＨＩＶポリペプチドを含有し得る。このＣ型ＨＩＶポリペプチドは、組成物中の発現カセットによってコードされるポリペプチドに対応し得るか、または発現カセットによってコードされるものとは異なり得る。組成物中に提供されるように、同じポリペプチドをコードする発現カセットにおけるポリヌクレオチドの例は、以下の通りである：この発現カセットにおけるポリヌクレオチドは、図１のＧａｇポリペプチド（配列番号３）をコードし、そしてこのポリペプチド（配列番号１７）は、図１に示される配列によってコードされるポリペプチドである。組成物中に提供されるように、異なるポリペプチドをコードする発現カセットにおけるポリヌクレオチドの例は、以下の通りである：Ｇａｇポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する発現カセット。そして、組成物中に提供されるこのポリペプチドは、Ｇａｇポリペプチドおよび／またはＧａｇプロテアーゼポリペプチドであり得る。発現カセット（または、本発明のポリヌクレオチド）およびポリペプチドの両方を含有する組成物において、本発明の種々の発現カセットが混合され得、そして／または本明細書中に記載される種々のＣ型ＨＩＶポリペプチドと適合され得る。
【００３１】
別の局面において、本発明は、被験体の免疫化の方法を包含する。本方法において、上記の組成物のいずれかは、被験体中の発現カセットの発現に適合性である条件下で、被験体中にある。１つの実施形態において、発現カセット（または、本発明のポリヌクレオチド）は、遺伝子送達ベクターを使用して導入され得る。この遺伝子送達ベクターは、例えば、非ウイルスベクター、またはウイルスベクターであり得る。例示的なウイルスベクターとしては、Ｓｉｎｄｂｉｓウイルス由来ベクター、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されない。免疫学的応答を生じるために有用な組成物はまた、特定のキャリアを使用して送達され得る。さらに、このような組成物は、例えば、ゴールド粒子またはタングステン粒子、および例えば、遺伝子銃を使用して被験体に送達されるコーティングされた粒子上にコーテジングされ得る。これらの組成物はまた、リポソームとして処方され得る。この方法の１つの実施形態において、被験体は、哺乳動物であり、そして例えば、ヒトであり得る。
【００３２】
さらなる局面において、本発明は、被験体において免疫応答を生じる方法を包含する。本明細書中に記載される発現カセットのいずれかは、適切な細胞において発現されて、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるＣ型ＨＩＶポリペプチドの発現を提供し得る。次いで、ポリペプチドは単離（例えば、続いて精製）され、免疫応答を誘発するのに十分な量で被験体に投与される。特定の実施形態において、本方法は、本明細書中に記載される遺伝子送達技術のいずれかを使用して、本発明の１つ以上の発現カセットまたはポリヌクレオチドを投与する工程を包含する。他の実施形態において、本方法は、本発明の１つ以上の発現カセットまたはポリヌクレオチドおよび１つ以上のポリペプチドを同時投与する工程を包含し、ここで、これらのポリペプチドは、これらのポリヌクレオチドから発現され得るか、または他のサブタイプＣのＨＩＶポリペプチドであり得る。他の実施形態において、本方法は、本発明の複数の発現カセットまたはポリヌクレオチドを同時投与する工程を包含し得る。なおさらなる実施形態において、本方法は、複数のポリペプチド、例えば、本発明のポリヌクレオチドから発現されるポリペプチドおよび／または他のサブタイプＣのＨＩＶポリペプチドを同時投与する工程を包含し得る。
【００３３】
本発明はさらに、被験体において免疫応答を生じる方法を包含し、ここで、被験体の細胞は、選択されたポリヌクレオチドの発現および目的のポリペプチド（例えば、本発明の任意の発現カセットによってコードされる）の産生が可能な条件下で、上記の発現カセットまたは本発明のポリヌクレオチドのいずれかを用いてトランスフェクトされる。この方法によって、ポリペプチドに対する免疫応答が、被験体で誘発される。細胞のトランスフェクションは、エキソビボで行われ得、そしてトランスフェクトされた細胞は、被験体に再導入される。あるいは、またはさらに、細胞は被験体においてインビボでトランスフェクトされ得る。免疫応答は、体液性および／または細胞媒介性（細胞性）であり得る。さらなる実施形態において、この方法はまた、被験体への発現カセットの導入前、導入時および／または導入後に、Ｃ型ＨＩＶポリペプチドを投与する工程を包含し得る。
【００３４】
本発明のこれらおよび他の実施形態は、本明細書中の開示の点から、当業者に容易に思い浮かぶことである。
【００３５】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他で示されない限り、当業者の範囲内の、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来の方法を用いる。このような技術は、文献において十分に説明される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９９、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ　Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｃｏｕｒｓｅ，（Ｒｅａｍら編、１９９８，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）；ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　Ｓｅｒｉｅｓ）、第二版（Ｎｅｗｔｏｎ　＆　Ｇｒａｈａｍ編，１９９７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ）を参照のこと。
【００３６】
本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形、「１つの（ａ、ａｎ）」および「この、その（ｔｈｅ）」は、内容が別に明確に指示されない限り、複数の対象を含む。従って、例えば、参考として「１つの抗原（ａｎ　ａｎｔｉｇｅｎ）」は、このような因子の２以上の混合物を含む。
【００３７】
（１．定義）
本発明の記載において、以下の用語が用いられ、そして以下に示すように規定されることが意図される。
【００３８】
本明細書において用いる場合、「合成」配列とは、Ｃ型ＨＩＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、その発現が本明細書において記載されるように、例えば、コドン置換および阻害性配列の不活性化によって、改変されているポリヌクレオチドをいう。「野生型」または「ネイティブ」の配列とは、本明細書において用いる場合、ポリペプチドコード配列であって、それが天然に見出されるかのように本質的であるポリペプチドコード配列をいう。例えば、Ｃ型単離体において見出されるような、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ，Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｐｕ、Ｅｎｖ、および／またはＮｅｆのコード配列（例えば、ＡＦ１１０９６５、ＡＦ１１０９６７、ＡＦ１１０９６８、ＡＦ１１０９７５、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ、８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡまたは１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ。ＨＩＶゲノムの種々の領域を、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ（配列番号３３）に対して番号付けをして、表Ａに示す。従って、用語「Ｐｏｌ」は、以下のポリペプチドの１つ以上をいう：ポリメラーゼ（ｐ６Ｐｏｌ）；プロテアーゼ（ｐｒｏｔ）；逆転写酵素（ｐ６６ＲＴまたはＲＴ）；ＲＮＡｓｅＨ（ｐ１５ＲＮＡｓｅＨ）；および／またはインテグラーゼ（ｐ３１　ＩｎｔまたはＩｎｔ）。
【００３９】
本明細書において用いる場合、用語「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」とは、以下にさらに考察する任意のいくつかのウイルス由来の非複製性、ウイルスシェルをいう。ＶＬＰは、一般に１つ以上のウイルスタンパク質（例えば、キャプシドタンパク質、コートタンパク質、シェルタンパク質、表面タンパク質、および／またはエンベロープタンパク質と呼ばれるタンパク質が挙げられるがこれらに限定されない）、またはこれらのタンパク質由来の粒子形成ポリペプチドから構成される。ＶＬＰは、適切な発現系におけるタンパク質の組み換え発現の際に自然に形成され得る。特定のＶＬＰを生成するための方法は当該分野で公知であり、そして以下にさらに詳細に考察される。ウイルスタンパク質の組み換え発現後のＶＬＰの存在は、当該分野で公知の従来の技術を用いて（例えば、顕微鏡検査（法）、Ｘ線結晶学、などによって）検出され得る。例えば、Ｂａｋｅｒら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．（１９９１）６０：１４４５〜１４５６；Ｈａｇｅｎｓｅｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：４５０３〜４５０５を参照のこと。例えば、ＶＬＰを、密度勾配遠心分離によって単離するか、および／または特徴的密度バンド形成によって同定し得る。あるいは、低温電子顕微鏡検査（法）を、問題のＶＬＰ調製物のガラス化されたサンプル上で実施し、そして適切な曝露条件下で画像を記録し得る。
【００４０】
特定のウイルスタンパク質由来の「粒子形成ポリペプチド」とは、ＶＬＰ形成を支持する条件下でＶＬＰを形成する能力を有する、全長またはほぼ全長のウイルスタンパク質、ならびにそのフラグメント、または内部欠失を有するウイルスタンパク質を意味する。従って、このポリペプチドは、参照分子の全長配列、フラグメント、短縮配列および部分配列、ならびにアナログ形態および前駆体形態を含み得る。従って、この用語は、このポリペプチドがＶＬＰを形成する能力を保持する限り、この配列に対して欠失、付加、および置換を意図する。従ってこの用語は、特定化されたポリペプチドの天然のバリエーションを含む。なぜならコートタンパク質におけるバリエーションがしばしば、ウイルス単離体の間で生じるからである。この用語は、このタンパク質がＶＬＰを形成する能力を保持する限り、参照タンパク質において天然に存在しない欠失、付加、および置換を含む。好ましい置換は、事実上保存的である置換（すなわち、アミノ酸の側鎖に関連してアミノ酸のファミリー内に生じる置換）である。詳細には、アミノ酸は、一般に、以下の４つのファミリーに分類される：（１）酸性−アスパラギン酸、およびグルタミン酸；（２）塩基性−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時々、芳香族アミノ酸として分類される。
【００４１】
「抗原」とは、宿主の免疫系を刺激して、体液性および／または細胞性抗原特異的応答を起こす１以上のエピトープ（線状、高次構造的、またはその両方のいずれか）を含む分子をいう。この用語は、用語「免疫原」と交換可能に用いられる。通常、Ｂ細胞エピトープは、少なくとも約５アミノ酸を含むが、３〜４アミノ酸まで小さくても可能である。Ｔ細胞エピトープ（例えば、ＣＴＬエピトープ）は、少なくとも約７〜９アミノ酸を含み、そしてヘルパーＴ細胞エピトープは、少なくとも約１２〜２０アミノ酸を含む。通常、エピトープは、約７と１５の間のアミノ酸（例えば、９、１０、１２、または１５アミノ酸）を含む。用語「抗原」とは、サブユニット抗原（すなわち、その抗原が天然に関連している生物全体から分離し、区別される抗原）ならびに、殺傷されるか、弱毒化されるか、または不活性化された細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、もしくは他の微生物の両方を示す。抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメント、および抗原または抗原決定基を模倣し得る合成ペプチドミモトープ）もまた、本明細書中で使用され得る抗原の定義に入る。同様に、例えば、遺伝子治療およびＤＮＡ免疫適用においてインビボで抗原または抗原性決定基を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリペプチドもまた、本明細書中の抗原の定義に含まれる。
【００４２】
本発明の目的のために、抗原は、以下でより十分に記載されるように、いくつかの公知のウイルス、細菌、寄生生物、および真菌に由来し得る。この用語はまた、種々の腫瘍抗原のいずれかを意図し得る。さらに、本発明の目的のために、「抗原」とは、本明細書中に定義しているように、タンパク質が免疫学的応答を誘発する能力を維持する限り、ネイティブ配列に対する改変（例えば、欠失、付加、および置換（一般的には、事実上保存性））を含むタンパク質をいう。これらの改変は、部位特異的変異誘発を通してのような意図的なものであり得るか、または抗原を産生する宿主の変異を通してのような偶然によるものであり得る。
【００４３】
抗原または組成物に対する「免疫応答」は、目的の組成物中に存在する抗原に対する体液性および／または細胞性免疫応答の被験体における発生である。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」とは、抗体分子によって媒介される免疫応答をいうが、一方、「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／または他の白血球によって媒介される免疫応答である。細胞性免疫の１つの重要な局面は、細胞溶解性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的応答を含む。ＣＴＬは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によってコードされるタンパク質に付随して存在するペプチド抗原、および細胞表面上で発現するペプチド抗原に対する特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の破壊の誘導および促進を補助するか、またはこのような微生物に感染した細胞の溶解を補助する。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を含む。ヘルパーＴ細胞は、細胞表面上でＭＨＣ分子に結合するペプチド抗原を提示する細胞に対して、その機能を刺激すること、および非特異的エフェクター細胞の活性を集中することを補助するように作用する。「細胞性免疫応答」はまた、サイトカイン、ケモカイン、および活性化されたＴ細胞および／または他の白血球（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋　Ｔ細胞から誘導される白血球を含む）によって産生される他のそのような分子の産生をいう。
【００４４】
細胞性免疫応答を誘発する組成物またはワクチンは、細胞表面でのＭＨＣ分子と結合する抗原の提示によって、脊椎動物被験体を感作するように働き得る。細胞媒介性免疫応答は、それらの表面で抗原を提示する細胞に、またはその細胞の近傍に方向付けられる。さらに、抗原特異的Ｔリンパ球は、免疫された宿主の将来の防御を可能にするために産生され得る。
【００４５】
特定の抗原が細胞媒介性の免疫学的応答を刺激する能力は、多くのアッセイ（例えば、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞毒性細胞アッセイ、または感作された被験体中で抗原について特異的なＴリンパ球についてアッセイすること）によって決定され得る。このようなアッセイは、当該分野で周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９−４１９９；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９−２３７６を参照のこと。細胞媒介免疫応答を測定する最近の方法には、細胞内サイトカインまたはＴ細胞集団によるサイトカイン分泌の測定、またはエピトープ特異的Ｔ細胞の測定（例えば、テトラマー技術による）（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ，Ａ．Ｊ．およびＯ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，Ｃ．Ａ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７（９）：１３６７−１３７１、１９９８；Ｍｃｈｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５０：５−２１、１９９６；Ｌａｌｖａｎｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９−８６５、１９９７によって概説される）が含まれる。
【００４６】
従って、本明細書中で使用されるような免疫学的応答は、ＣＴＬの産生および／またはヘルパーＴ細胞の産生または活性化を刺激するものであり得る。目的の抗原はまた、抗体媒介免疫応答を誘発し得る。従って、免疫学的応答は、以下の１つ以上の効果を含み得る：Ｂ細胞による抗体の産生；および／またはサプレッサーＴ細胞の活性化および／または目的の組成物もしくはワクチン中に存在する抗原に特異的に方向付けられたγδＴ細胞。これらの応答は、感染性を中和するように、および／または抗体−補体もしくは抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介するように働き、免疫された宿主に対する防御を提供し得る。このような応答は、当該分野で周知の標準的なイムノアッセイおよび中和アッセイを用いて決定され得る。
【００４７】
「免疫原性組成物」とは、被験体への組成物の投与が、目的の抗原性分子に対して体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答のこの被験体における発生を生じる抗原性分子を含む組成物である。この免疫原性組成物は、注射投与、吸入投与、経口投与、経鼻投与、および粘膜投与（例えば、経直腸的または経膣的に）などによって、レシピエント被験体に直接導入され得る。
【００４８】
「サブユニットワクチン」とは、目的の病原体由来（例えば、ウイルス、細菌、寄生生物、または真菌由来）の抗原に由来するか、またはそれに対して相同な、１つ以上の選択された抗原（ただし全ての抗原ではない）を含むワクチン組成物を意味する。このような組成物は、インタクトな病原性細胞もしくは病原性粒子、またはこのような細胞もしくは粒子の溶解物を実質的に含まない。従って、「サブユニットワクチン」は、この病原体由来の、少なくとも部分的に精製された（好ましくは実質的に精製された）免疫原性ポリペプチド、またはそのアナログから調製され得る。従って、このサブユニットワクチンに含まれる抗原を得る方法は、標準的な精製技術、組み換え生成、または合成生成を含み得る。
【００４９】
「実質的に精製された」とは、一般に、物質（化合物、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ポリペプチド組成物）が、サンプル（この物質が存在する）の大部分のパーセントを含むようなこの物質の単離をいう。代表的に、実質的に精製された成分は、サンプル中で、このサンプルの５０％、好ましくは８０〜８５％、より好ましくは９０〜９５％を含む。目的のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの精製のための技術は、当該分野で周知であり、そして例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および密度による沈降を含む。
【００５０】
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列とは、適切な調節配列（すなわち、「制御エレメント」）の制御下に配置された場合、インビボで転写され（ＤＮＡの場合）、そしてポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）、核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン、および３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列としては、ウイルス、原核生物のｍＲＮＡまたは真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡまたは原核生物ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえ挙げられるがこれらに限定されない。終止コドンのような転写終止配列は、コード配列の３’に配置され得る。
【００５１】
代表的な「制御エレメント」としては、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終止シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳終止コドンの３’側に位置する）、翻訳の開始の至適化のための配列（コード配列の５’側に位置する）、および翻訳終止配列が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５２】
「ポリヌクレオチドコード配列」、または選択されたポリペプチドを「コードする」配列とは、適切な調節配列（すなわち、「制御エレメント」）の制御下に配置された場合、インビボで転写され（ＤＮＡの場合）、そしてポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）、核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン、および３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。例示的なコード配列は、本発明の改変されたウイルスポリペプチドコード配列である。転写終止配列は、コード配列の３’に配置され得る。代表的な「制御エレメント」としては、転写調節因子（例えば、プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終止シグナル、およびポリアデニル化配列）；および翻訳の開始の至適化のための配列のような翻訳調節因子（例えば、シャイン−ダルガーノ（リボソーム結合部位）配列、Ｋｏｚａｋ配列（すなわち、例えば、コード配列の５’側に位置する、翻訳の至適化のための配列）、リーダー配列、翻訳開始コドン（例えば、ＡＴＧ）、ならびに翻訳終止配列が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態において、１つ以上の翻訳調節配列または開始配列（例えば、リーダー配列）が、野生型の翻訳開始配列（すなわち、ネイティブ状態でコード領域の翻訳を調節する配列）に由来する。本明細書において記載される方法を用いて改変された野生型のリーダー配列はまた、本発明における用途を見出す。プロモーターとしては、誘導性プロモーター（このプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現は、分析物、補因子、調節性タンパク質などによって誘導される）、抑制性プロモーター（このプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現は、分析物、補因子、調節性タンパク質などによって抑制される）、および構成的プロモーターが挙げられる。
【００５３】
「核酸」分子としては、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列でさえ挙げられるがこれらに限定されない。この用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの任意の既知の塩基性アナログを含む配列を包含する。
【００５４】
「作動可能に連結した（された）」とは、このように記載される成分が、それらの通常の機能を実行するように構成されるエレメントの配置をいう。従って、コード配列に作動可能に連結される所定のプロモーターは、適切な酵素が存在する場合、コード配列の発現を行い得る。プロモーターは、その発現を指向するように機能する限り、コード配列と連続である必要はない。従って、例えば、翻訳されないが転写される、介在する配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてプロモーター配列は、なお、コード配列に「作動可能に連結される」と考えられ得る。
【００５５】
「組換え体」は、核酸分子を記載するために本明細書中で使用される場合、その起源または操作によって：（１）天然には関連していないポリヌクレオチドの全部または一部と関連していないか、および／または、（２）現実には連結されているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結している、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。用語、「組換え体」は、タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。「組み換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、および単細胞物として培養される原核生物微生物または真核生物細胞株を意味する他のこのような用語は、互換可能に用いられ、そして組み換えベクターまたは他の転移ＲＮＡのためのレシピエントとして用いられ得るか、またはレシピエントとして用いられた細胞をいい、そしてトランスフェクトされたもとの細胞の子孫を含む。単一の親細胞の子孫は、偶発的な変異または意図的な変異に起因して、形態もしくはゲノムにおいて、またはもとの親に相補的な総ＤＮＡにおいて、完全に同一である必要はないことが理解される。関連の特性（例えば、所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在）によって特徴付けられるように親に対して十分類似している親細胞の子孫は、この定義によって意図される子孫に含まれ、そして上記の用語によって包含される。
【００５６】
アミノ酸配列「類似性」を決定する技術は、当該分野で周知である。一般に、「類似性」とは、２つ以上のポリペプチドの、適切な部位で比較される、アミノ酸とアミノ酸の的確さを意味し、ここで、アミノ酸は、同一であるか、または類似した化学的特性および／もしくは物理的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する。次いで、いわゆる、用語「類似パーセント」とは、比較するポリペプチド配列間で決定され得る。核酸配列およびアミノ酸配列の同一性を決定する技術もまた、当該分野で周知であって、遺伝子に対するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定する工程（通常、ｃＤＮＡ中間物を介する）およびこれらにコードされるアミノ酸配列を決定する工程、ならびにこれを第２のアミノ酸配列と比較する工程を含む。一般に、「同一性」とは、それぞれ２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に対応するヌクレオチドとヌクレオチドもしくはアミノ酸とアミノ酸の的確さをいう。
【００５７】
２つ以上のポリヌクレオチド配列を、これらの「同一性パーセント」を決定することによって比較し得る。同様に、２つ以上のアミノ酸配列を、「同一性パーセント」を決定することによって比較し得る。核酸配列またはペプチド配列のいずれかに関わらず２つの配列の同一性パーセントは一般に、２つの整列した配列間で的確に一致する数を、短い方の配列の長さで除算して、１００を掛けた数字によって、記載される。核酸配列に対する適切な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ　２：４８２−４８９（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムにより、規定される。このアルゴリズムを拡張して、Ｄａｙｈｏｆｆ、Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、第５補遺、３：３５３−３５８、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、ＵＳＡ）により開発されたスコア付けマトリックスを用いて、ペプチド配列に使用し得、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）により基準化され得る。このアルゴリズムを核酸配列およびペプチド配列に対して実行することは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により、これらのＢｅｓｔＦｉｔ　ｕｔｉｌｉｔｙの適用において、規定される。この方法についての初期パラメーターは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐａｃｋａｇｅ　Ｐｒｏｇｒａｍ　Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）に記載される。他の等しく適切な、配列間の同一性パーセントおよび類似パーセントを計算するプログラムは、一般に当該分野で公知である。
【００５８】
例えば、特定のヌクレオチド配列の参照配列に対する同一性パーセントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを、６つのヌクレオチド位置の初期スコア付け表およびギャップペナルティーと共に用いて決定し得る。本発明の脈絡における、同一性パーセントを確立する別の方法は、ＭＰＳＲＣＨパッケージのプログラム（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈに著作権があり、Ｊｏｈｎ　Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ　Ｓ．　Ｓｔｕｒｒｏｋにより開発され、そしてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により配布される）を用いることである。このパッケージソフトから、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを利用し得、ここで初期パラメータをスコア付け表に使用する（例えば、１２のギャップオープンペナルティー、１のギャップエクステンションペナルティーおよび６のギャップ）。生じたデータから、「一致」した値は、「配列同一性」を示す。配列間の同一性パーセントまたは類似性パーセントを計算する他の適切なプログラムは、一般に当該分野で公知であり、例えば、整列プログラムＢＬＡＳＴもまた初期パラメータで使用し得る。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下の初期パラメータで使用され得る：ｇｅｎｅｔｉｃ　ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０配列；ｓｏｒｔ　ｂｙ＝ＨＩＧＨ　ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ，ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ　ＣＤＳ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスで見出され得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００５９】
当業者は、適切な検索パラメータ（典型的には、好ましいＳｍｉｔｈ　Ｗａｔｅｒｍａｎに基づいたパラメータが上で規定される）を容易に決定し得て、所定の配列に対して使用し得る。例えば、検索パラメータは、該当する配列の大きさに基づいて変化し得る。従って、本発明のポリヌクレオチド配列に対して、本明細書で開示されるポリヌクレオチド配列の長さは、選択されるデータベースに対して検索され、そして基本的に同じ長さの配列に対して比較して、同一性パーセントを決定する。例えば、本発明の代表的な実施形態としては、Ｘ個連続するヌクレオチドを有する単離されたポリヌクレオチドが挙げられ、ここで（ｉ）Ｘ個連続するヌクレオチドは、少なくとも、およその選択されたレベルの同一性パーセントを、本明細書に記載される、Ｙ個連続するヌクレオチドの配列に関して有し、そして（ｉｉ）検索目的のために、Ｘ＝Ｙであり、ここでＹは、選択された参照ポリヌクレオチドの規定された長さである。
【００６０】
本発明の配列としては、配列のフラグメント（例えば、約１５ヌクレオチドから本明細書に記載の全長配列に存在するヌクレオチド数まで（上記の範囲の全ての整数値を含む）（例えば、配列表、図および特許請求の範囲を参照のこと））が挙げられ得る。例えば、本発明のポリヌクレオチド配列のフラグメントは、３０〜６０ヌクレオチド、６０〜１２０ヌクレオチド、１２０〜２４０ヌクレオチド、２４０〜４８０ヌクレオチド、４８０〜１０００ヌクレオチドおよびこれらの間の全ての整数値のヌクレオチドであり得る。
【００６１】
本発明の配列が、例えば配列データベースに対して問い合わせ配列として使用される場合、本発明の合成発現カセット（および精製されたポリヌクレオチド）としては、約８０％〜１００％の配列同一性、８０〜８５％を超える配列同一性、好ましくは９０〜９２％を超える配列同一性、より好ましくは９５％を超える配列同一性、そして最も好ましくは９８％を超え１００％まで（これらの記載される範囲にある全ての整数値を含む）の配列同一性を、本明細書で開示される、合成発現カセット（および精製されたポリヌクレオチド）配列（例えば、特許請求の範囲の配列または本発明の他の配列）に対して有する、関連ポリヌクレオチド配列が挙げられる。
【００６２】
２つの核酸フラグメントは、本明細書で記載される場合、「選択的にハイブリダイズ」するとみなされる。２つの核酸配列分子間の配列同一性の程度は、これらの分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響する。部分的に同一の核酸配列は、完全に同一の配列が標的分子にハイブリダイズするのを、少なくとも部分的に阻害する。完全に同一の配列のハイブリダイゼーションを阻害することは、当該分野で周知のハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザンブロット、ノザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出またはＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと））を用いて評価し得る。このようなアッセイは、選択性の程度を変えること（例えば、低ストリンジェンシーから高ストリンジェンシーに変化する条件の利用）を利用して実施され得る。低ストリンジェンシーの条件を用いる場合、非特異的結合が存在しないことを、配列同一性を不完全な程度でさえも持っていない２次プローブ（例えば、標的分子に約３０％未満の配列同一性を有するプローブ）を用いて評価し得、その結果、非特異的な結合事象が存在しない場合、この２次プローブは、標的にハイブリダイズしない。
【００６３】
ハイブリダイゼーションに基づいた検出システムを利用する場合、標的核酸配列に相補的である核酸プローブが選択され、次いで、適切な条件を選択することによって、プローブと標的配列が、各々に「選択的にハイブリダイズ」、すなわち結合して、ハイブリッド分子を形成する。標的配列に、「中程度のストリンジェント」の下で選択的にハイブリダイズし得る核酸分子は、典型的に、少なくとも約７０％の配列同一性を、選択された核酸プローブの配列に有する、少なくとも約１０〜１４個のヌクレオチド長の標的核酸配列の検出が可能な条件下で、ハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的に、約９０〜９５％を超える配列同一性を、選択される核酸プローブの配列に有する、少なくとも約１０〜１４個のヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。プローブ／標的のハイブリダイゼーションに有用なハイブリダイゼーション条件（プローブおよび標的は、特定の程度の配列同一性を有する）は、当該分野で公知のように決定され得る（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。
【００６４】
ハイブリダイゼーションについてのストリンジェンシー条件に関して、多くの等価な条件を用い得て、特定のストリンジェンシーを、例えば、以下の因子を変えることで確立し得ることは、当該分野で周知である：プローブおよび標的配列の長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液組成物の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中にブロッキング因子（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストランおよびポリエチレングリコール）が存在するかしないか、ハイブリダイゼーション反応温度および時間のパラメータ、ならびに洗浄条件の変更。特定のセットのハイブリダイゼーション条件の選択は、当該分野の標準的方法に従って選択される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、またはＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）。
【００６５】
第１のポリヌクレオチドが、第２のポリヌクレオチド、そのｃＤＮＡ、これらの相補体領域と同じかもしくは実質的に同じ塩基対配列を、有する場合または第１のポリヌクレオチドが、上記のような配列同一性を示す場合に、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドに「由来」する。
【００６６】
第１のポリペプチドが、（ｉ）第２のポリヌクレオチドに由来する第１のポリヌクレオチドによってコードされる場合、または（ｉｉ）第１のポリペプチドが、上記のような配列同一性を第２のポリペプチドに対して示す場合に、第１のポリペプチドは、第２のポリペプチドに「由来」する。
【００６７】
ウイルスポリペプチドが、（ｉ）ウイルスのポリヌクレオチド（ウイルス性ポリヌクレオチド）のオープンリーディングフレームによってコードされる場合、または（ｉｉ）ウイルスポリペプチドが、上記のような配列同一性をウイルスのポリペプチドに対し示す場合に、一般に、ウイルスポリペプチドは、ウイルスの特定のポリペプチド（ウイルス性ポリペプチド）に「由来」する。
【００６８】
「コードされる」とは、ポリペプチド配列をコードする核酸配列に関連し、ここでこのポリペプチド配列またはその一部は、この核酸配列によりコードされるポリペプチドに由来する、少なくとも３〜５個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、そしてさらにより好ましくは少なくとも１５〜２０個のアミノ酸からなる配列を含む。免疫学的にこの配列によってコードされるポリペプチドと同一視され得るポリペプチド配列もまた含まれる。さらに、ポリタンパク質は、ポリペプチドまたはペプチド産物をコードする、２つ以上のポリヌクレオチド配列をインフレーム融合することによって構築され得る。さらに、ポリシストロン（ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）配列コード配列は、互いに隣接するポリペプチド産物をコードする２つ以上のポリヌクレオチド配列を、典型的には１つのプロモーターの制御下に、配置することで産生され得、ここで各ポリペプチドコード配列は、内部リボソーム結合部位に対する配列を含むよう改変され得る。
【００６９】
「精製されたポリヌクレオチド」とは、基本的に、目的のポリヌクレオチドと自然の状態で関連するタンパク質が除かれた（例えば、そのタンパク質の約５０％未満、好ましくは約７０％未満、そしてより好ましくは約９０％未満を含む）、目的のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントに関する。目的のポリヌクレオチドを精製する技術は、当該分野で周知であり、例えば、ポリヌクレオチドを含む細胞を、カオトロピック剤で破壊し、そしてポリヌクレオチドおよびタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび密度に依存した沈殿法により分離する工程を含む。
【００７０】
「核酸免疫化」とは、１つ以上の選択された抗原をコードする核酸分子を、宿主細胞に、抗原またはエピトープのインビボ発現のため導入することを意味する。核酸分子は、レシピエント被験体中に直接導入（例えば、注射、吸入、経口投与、鼻腔内投与および粘膜投与など）され得るか、または宿主から取り出された細胞中にエキソビボ導入され得る。後者の場合に、形質転換された細胞は、被験体中に再導入され、免疫応答が、この核酸分子によってコードされる抗原に対して生じ得る。
【００７１】
「遺伝子移入」または「遺伝子送達」とは、目的のＤＮＡを宿主細胞に正確に挿入する方法またはシステムをいう。このような方法は、組みこまれていない移入ＤＮＡの一過性の発現、染色体外複製および移入レプリコン（例えば、エピソーム）の発現、または移入遺伝子物質の宿主細胞ゲノムＤＮＡ中への組みこみを生じ得る。遺伝子送達発現ベクターとしては、アルファウイルス、ポックスウイルスおよびワクシニアウイルス由来のベクターが挙げられるが、これらに限定されない。免疫化に用いる場合、このような遺伝子送達発現ベクターは、ワクチンまたはワクチンベクターと呼ばれ得る。
【００７２】
「Ｔリンパ球」または「Ｔ細胞」は、抗体を産生しないリンパ球であり、免疫系の細胞性の備えの一部を構成する。Ｔ細胞は、骨髄から胸腺に遊走した未成熟なリンパ球から生じ、これらは、胸腺ホルモンの指令のもとで成熟過程を経ていく。ここで成熟リンパ球は、急速に分裂して、非常に多数に増加する。成熟Ｔ細胞は、特定の抗原を認識および結合する能力に基づいて、免疫応答性になる。抗原がリンパ球表面レセプター結合した場合、免疫応答性Ｔ細胞の活性化は、誘発される。
【００７３】
用語「トランスフェクション」は、外来ＤＮＡの、細胞による取り込みを示すために使用される。外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入された場合、細胞は、「トランスフェクト」されている。多くのトランスフェクション技術は、当該分野で一般に公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら、（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，Ｄａｖｉｓら、（１９８６）Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕら、（１９８１）Ｇｅｎｅ　１３：１９７を参照のこと。このような技術を用いて、１つ以上の外来ＤＮＡ部分を、適切な宿主細胞中に導入し得る。この用語は、遺伝子物質の安定な取り込みおよび一過性の取り込みの両方を意味し、そしてペプチド結合ＤＮＡまたは抗体結合ＤＮＡの取り込みを含む。
【００７４】
「ベクター」は、遺伝子配列を、標的細胞へ移入し得る（例えば、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、粒子性キャリアおよびリポソーム）。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子移入ベクター」は、目的の遺伝子発現を指向し得る任意の核酸構築物をいい、これらは、遺伝子配列を、標的細胞に移入し得る。従って、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。
【００７５】
「自殺遺伝子」（例えば、薬物感受性遺伝子）の標的細胞への移入は、正常細胞に対して比較的無毒である化合物または組成物に対して、細胞を感受性にする。Ｍｏｏｌｔｅｎ，Ｆ．Ｌ．（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．１：２７９−２８７．自殺遺伝子の例は、単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）、シトクロムＰ４５０（Ｍａｎｏｍｅら、（１９９６）Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　３：５１３−５２０）、ヒトデオキシシチジンキナーゼ（Ｍａｎｏｍｅら、（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　２（５）：５６７−５７３）および細菌性酵素シトシンデアミナーゼ（Ｄｏｎｇら、（１９９６）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　７：７１３−７２０）である。これらの遺伝子を発現する細胞は、比較的無毒のプロドラッグであるガンシクロビル（ＨＳＶ−ｔｋ）、シクロホスファミド（シトクロムＰ４５０　２Ｂ１）、シトシンアラビノシド（ヒトデオキシシチジンキナーゼ）または５−フルオロシトシン（細菌性シトシンデアミナーゼ）の影響に対し、感受性にされる。Ｃｕｌｖｅｒら、（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５６：１５５０−１５５２，Ｈｕｂｅｒら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：８３０２−８３０６。
【００７６】
「選択マーカー」または「レポーターマーカー」とは、遺伝子移入ベクターに含まれるヌクレオチド配列をいい、これらは治療的活性を持たないが、むしろ遺伝子移入ベクターのより単純な調製、製造、特徴づけまたは試験を可能にするために含まれる。
【００７７】
「特異的結合因子」とは、分子の特定の結合対のメンバーをいい、ここでこれらの分子の１つは、第２の分子に対し、化学的および／または物理的手段を介して、特異的に結合する。特異的結合因子の１つの例は、選択された抗原に対して指向する抗体である。
【００７８】
「被験体」とは、脊椎動物の亜門のいずれかのメンバー（ヒトおよび他の霊長類（例えば、チンパンジーおよび他の類人猿、ならびに猿種などのヒト以外の霊長類を含む）；家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ）；家庭向けの哺乳動物（例えば、イヌおよびネコ）；実験動物（例えば、マウス、ラットおよびモルモットなどのげっ歯類を含む）；鳥（家庭向けの鳥、野生の鳥および狩猟鳥を含む（例えば、ニワトリ、シチメンチョウおよび他の家禽の鳥、アヒル、ダチョウなど））を含むが、これらに限定されない）を意味する。この用語は、特定の年齢を示さない。従って、成体および新生仔の個体が意図され、含まれる。これらの脊椎動物の全ての免疫系は、同様に機能するので、上記のシステムは、上記脊椎動物種のいずれかにおける使用が意図される。
【００７９】
「薬学的に受容可能」または「薬理学的に受容可能」は、生物学的でない物質またはさもなくば所望されない物質に関する。すなわち、この物質は、処方物または組成物で個体に投与され得て、任意の所望されない生物学的影響を引き起こすことも、有害な様式で、含まれる組成物成分のいずれかと相互作用することない。
【００８０】
「生理学的ｐＨ」または「生理学的範囲にあるｐＨ」とは、約７．２〜８．０に含まれる範囲にあるｐＨを意味し、より典型的には、約７．２〜７．６に含まれる範囲にある。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「処置」とは、以下のいずれかをいう：（Ｉ）従来のワクチンにおけるような、感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の軽減または除去、および（ｉｉｉ）該当する病原体の実質的除去または完全な除去。処置は、予防的に（感染前に）または治療的に（感染後に）実施され得る。
【００８２】
「同時投与」とは、２つ以上の組成物または分子を投与することをいう。従って、同時投与は、同じ投与経路または異なる投与経路を介して、同時に投与する工程または連続して投与する（任意の順番で）工程を含む。同時投与レジメンの限定しない例としては、核酸およびペプチドの同時投与；異なる核酸の同時投与（例えば、本明細書に記載されるような異なる発現カセットおよび／または異なる遺伝子送達ベクター）；および異なるポリペプチドの同時投与（例えば、異なるＨＩＶポリペプチドおよび／または異なるアジュバント）が挙げられる。この用語はまた、同時投与される分子または組成物のうちいずれか１つを複数回投与する工程を含む（例えば、本明細書に記載される１つ以上の発現カセットの複数回投与後の、ポリペプチド含有組成物の１回以上の投与）。分子または組成物が連続して送達される場合に、各投与間の時間は、本明細書の教示を考慮することで、当業者により容易に決定され得る。
【００８３】
「レンチウイルスベクター」および「組換えレンチウイルスベクター」とは、目的の核酸分子を運ぶ核酸構築物をいい、そして特定の実施形態において、目的の核酸分子の発現を指向し得る。レンチウイルスベクターは、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサーもしくは遺伝子座規定エレメント、または遺伝子発現を他の手段（例えば、選択的スプライシング、核ＲＮＡ輸出、メッセンジャーの翻訳後修飾またはタンパク質の転写後修飾）により制御する他のエレメントを含む。このようなベクター構築物はまた、パッケージングシグナル、長い末端反復配列（ＬＴＲＳ）またはこれらの一部、ならびに使用するレトロウイルスに適した正および負のプライマー鎖結合部位を含まなければならない（これらがまだ、レトロウイルスベクターに存在していない場合）。必要に応じて、組換えレンチウイルスベクターはまた、ポリアデニル化を指向するシグナル、選択マーカー（例えば、Ｎｅｏ、ＴＫ、ハイグロマイシン、プレオマイシン、ヒスチジノールまたはＤＨＦＲ）、ならびに１つ以上の制限酵素認識部位および翻訳終結配列を含み得る。例として、このようなベクターは、典型的に、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成の起点および３’ＬＴＲまたはこれらの一部を含む。
【００８４】
「レンチウイルスベクター粒子」とは、本発明の範囲内で使用される場合、少なくとも１つの目的の遺伝子を保持するレンチウイルスをいう。このレトロウイルスはまた、選択マーカーを含み得る。この組換えレンチウイルスは、その遺伝物質（ＲＮＡ）をＤＮＡに逆転写し得、そして感染の際にこの遺伝物質を宿主細胞のＤＮＡに組み込み得る。レンチウイルスベクター粒子は、レンチウイルスエンベロープ、非レンチウイルスエンベロープ（例えば、両性（ａｍｐｈｏ）エンベロープまたはＶＳＶ−Ｇエンベロープ）またはキメラエンベロープを有し得る。
【００８５】
「核酸発現ベクター」または「発現カセット」とは、目的の配列または遺伝子の発現を指向し得る構築物をいう。核酸発現ベクターは、目的の配列または遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。他の制御エレメントも同様に存在し得る。本明細書中に記載される発現カセットは、プラスミド構築物内に含まれ得る。この発現カセットの成分に加えて、このプラスミド構築物はまた、細菌複製起点、１以上の選択マーカー、プラスミド構築物が一本鎖ＤＮＡとして存在することを可能にするシグナル（例えば、Ｍ１３複製起点）、マルチクローニングサイトおよび「哺乳動物」複製起点（例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルスの複製起点）を含み得る。
【００８６】
「パッケージング細胞」とは、組換えレトロウイルスベクターを欠く感染性組換えレトロウイルスの産生のために必要なエレメントを含む細胞をいう。代表的には、このようなパッケージング細胞は、Ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖタンパク質をコードする、タンパク質を発現し得る１以上の発現カセットを含む。
【００８７】
「プロデューサー細胞」または「ベクター産生細胞」とは、組換えレトロウイルスベクター粒子の産生のために必要な全てのエレメントを含む細胞をいう。
【００８８】
（２．本発明を実行する様式）
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特定の処方またはプロセスパラメーターに限定されず、このようなものは、当然異なり得ることが理解されるべきである。本明細書中で使用される専門用語は、本発明の特定の実施形態のみを記載する目的のためであり、限定することを意図しないこともまた、理解されるべきである。
【００８９】
本明細書中に記載の方法および材料に類似するかまたは等価である多くの方法および材料が、本発明の実行において使用され得るが、好ましい材料および方法が、本明細書中に記載される。
【００９０】
（２．１．ＨＩＶゲノム）
ＨＩＶゲノムおよび種々のポリペプチドコード領域を、表Ａに示す。ヌクレオチド位置は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ（配列番号３３、図１１）に対して与えられる。しかし、本発明の開示の技術の観点から、例えば、配列比較プログラム（例えば、本明細書中に記載されるＢＬＡＳＴなど）または構造的特徴の同定およびアラインメント（例えば、種々の領域を同定し得る、本明細書中に記載される「ＡＬＢ」プログラムのようなプログラム）を使用して、他のＨＩＶ株または改変体（例えば、単離株ＨＩＶＩＩＩｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＩＶ−１ＳＦ１６２、ＨＩＶ−１ＳＦ１７０、ＨＩＶＬＡＶ、ＨＩＶＬＡＩ、ＨＩＶＭＮ、ＨＩＶ−１ＣＭ２３５、ＨＩＶ−１ＵＳ４）、種々のサブタイプ由来の他のＨＩＶ−１株（例えば、サブタイプＡ〜Ｇ、およびＯ）、ＨＩＶ−２株および種々のサブタイプ（例えば、ＨＩＶ−２ＵＣ１およびＨＩＶ−２ＵＣ２））、ならびにサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）（これらおよび他の関連のウイルスの記載について、例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第三版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編、１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第二版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編、１９９１）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第三版（Ｆｉｅｌｄｓ，ＢＮ、ＤＭ　Ｋｎｉｐｅ、ＰＭ　Ｈｏｗｌｅｙ、編者、１９９６、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）を参照のこと）中の対応する領域を決定する方法は、当業者に容易に明らかである。
【００９１】
【表１】
2004502445.tif 000002
2004502445.tif 000003
2004502445.tif 000004
当業者が、表Ａに示される任意の配列を整列させて、任意の特定のＨＩＶ遺伝子の相対的な位置を容易に決定し得ることは、容易に明らかである。例えば、本明細書中に記載されるアラインメントプログラムの１つ（例えば、ＢＬＡＳＴ）を使用して、他のＣ型ＨＩＶの配列を、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡと共に整列させて（表Ａ）、遺伝子の位置を決定し得る。
【００９２】
ポリペプチド配列も同様に整列し得る。例えば、図１０３は、種々の株由来のＥｎｖポリペプチド配列の、ＳＦ−１６２に対するアラインメントを示す。共有に係るＷＯ／３９３０３に詳細に記載されるように、Ｅｎｖポリペプチド（例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０およびｇｐ１６０）は、βシートを形成する４つのアンチパラレルβ鎖（β−２、β−３、β−２０およびβ２１）からなる「架橋（ｂｒｉｄｇｉｎｇ）シート」を含む。第一の対のβ鎖（β−２およびβ−３）からの突出は、２つのループ（Ｖ１およびＶ２）である。ＳＦ−１６２に対して、このβ−２シートは、ほぼアミノ酸残基１１３（Ｃｙｓ）〜アミノ酸残基１１７（Ｔｈｒ）を占めるが、β−３は、ほぼアミノ酸残基１９２（Ｓｅｒ）〜アミノ酸残基１９４（Ｉｌｅ）を占める（図１０３を参照のこと）。この「Ｖ１／Ｖ２領域」は、ＳＦ−１６２に対して、ほぼアミノ酸残基１２０（Ｃｙｓ）〜アミノ酸残基１８９（Ｃｙｓ）を占める。β鎖の第二の対（β−２０およびβ−２１）からの突出は、「小ループ」構造であり、本明細書中で「架橋シート小ループ」とも称される。小ループおよび架橋シート小ループの両方の位置は、本明細書中およびＷＯ／３９３０３の技術に従って、ＨＸＢ−２に対して決定され得る。図１０３Ａ〜Ｃにおいて、矢印によって、βシート領域からの欠失配列のおおよその部位もまた示される。「＊」は、本明細書の技術に従って変異され得るＮグリコシル化部位を示す。
【００９３】
（２．２　合成発現カセット）
（２．２．１　Ｃ型ＨＩＶ−１の、Ｐｏｌ−、Ｐｒｏｔ−、Ｒｔ−、Ｉｎｔ−、Ｇａｇ、Ｅｎｖ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ、ＲｎａｓｅＨ、Ｖｉｆ、ＶｐｒおよびＶｐｕの核酸コード配列の改変）
本発明の１つの局面は、対応する野生型配列に対して改善された発現を有する、Ｃ型ＨＩＶ−１コード配列および関連配列の作製である。
【００９４】
（２．２．１．１．　Ｇａｇの核酸コード配列の改変）
ＨＩＶ−１サブタイプＣのＡＦ１１０９６５株およびＡＦ１１０９６７株から得られたＧａｇタンパク質の野生型配列を改変することによる、本発明の例示的な実施形態が、本明細書中に示される（例えば、Ｋｏｒｂｅｒら（１９９８）Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　ａｎｄ　Ａｉｄｓ、Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ、Ｎｅｗ　Ｍｅｘｉｃｏ：Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｎｏｖｉｔｓｋｙら、（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３（５）：４４２７−４４３２（ボツワナ由来の種々のサブタイプＣクローンの分子クローニングについて）を参照のこと）。新規単離株８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ（ＴＶ００１またはＴＶ１とも呼ばれる）および１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ（ＴＶ００２またはＴＶ２とも呼ばれる）に由来する野生型配列の改変もまた、本明細書中に示される。配列番号５２は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来のＧａｇの野生型配列を示し、そして配列番号５４は、同じ株由来のＧａｇの主要な相同領域（表Ａのヌクレオチド１６３２〜１６９４）の野生型配列を示す。配列番号１００は、１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡのＧａｇの野生型配列を示す。
【００９５】
他のＣ型ＨＩＶ−１改変体から得られたＧａｇ配列は、本明細書の技術に従って類似の様式で操作され得る。このような他の改変体としては、Ｃ型ＨＩＶ−１の単離株から得られたＧａｇタンパク質コード配列（例えば、Ｎｏｖｉｔｓｋｙら（１９９９）、前出；Ｍｙｅｒｓら、後出；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第三版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編、１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第二版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編、１９９１）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第三版（Ｆｉｅｌｄｓ，ＢＮ、ＤＭ　Ｋｎｉｐｅ、ＰＭ　Ｈｏｗｌｅｙ、編者、１９９６、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）ならびにワールドワイドウェブ（インターネット）（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎ１．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｉｖＤＢ３／ｐｕｂｌｉｃ／ｗｄｂ／ｓｓａｍｐｕｂｌｉｃおよびｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎ１．ｇｏｖ．）に記載される）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
最初に、ＨＩＶ−１のコドン用法パターンを、得られた核酸コード配列が、高度に発現されるヒト遺伝子において見出されるコドン用法と匹敵するように、改変した（実施例１）。ＨＩＶコドン用法は、コドントリプレットのヌクレオチドＡおよびＴの高含量を反映する。ＨＩＶ−１コドン用法の影響は、ｍＲＮＡの減少した翻訳能力および不安定性を生じる、ＤＮＡ配列中の高いＡＴ含量である。対照的に、高度に発現されるヒトコドンは、ヌクレオチドＧまたはＣを好む。Ｇａｇコード配列を、高度に発現されるヒト遺伝子において見出されるコドン用法に匹敵するように改変した。
【００９７】
第二に、Ｇａｇコード配列のコード配列内に位置する阻害（または不安定）エレメント（ＩＮＳ）が存在する。ＲＲＥは、ＨＩＶがコードするＲｅｖタンパク質と相互作用して、ＩＮＳの発現ダウンレギュレーション効果を克服する、二次ＲＮＡ構造である。ＲＲＥおよびＲｅｖの転写後活性化機構を克服するために、不安定エレメントは、コードされたタンパク質のリーディングフレームを変更しない複数の点変異を導入することによって、不活化され得る。不活化されたＲＲＥ部位を有する、サブタイプＣのＧａｇコード配列は、例えば、図１（配列番号３）、図２（配列番号４）、図５（配列番号２０）および図６（配列番号２６）に示される。同様に、他のサブタイプＣ株に由来する他の合成ポリヌクレオチドは、ＲＲＥ部位を不活化するために改変され得る。
【００９８】
Ｇａｇポリペプチドコード配列の改変は、多くの哺乳動物細胞株（ならびに昆虫細胞を含むがこれに限定されない他の型の細胞株）において、野生型コード配列に対して改善された発現を生じる。さらに、これらの配列の発現は、これらの細胞株によるウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生を生じる（以下を参照のこと）。
【００９９】
（２．２．１．２　Ｅｎｖ核酸コード配列の改変）
同様に、本発明はまた、合成Ｅｎｖコードポリヌクレオチドおよび改変されたＥｎｖタンパク質を含む。野生型のＥｎｖ配列は、Ｃ型ＨＩＶ−１のＡＦ１１０９６８株およびＡＦ１１０９７５株ならびに新規株８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ（配列番号３３）および１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ（配列番号４５）から得られる（例えば、ボツワナ由来の種々のサブタイプＣクローンの分子コローニングについて、Ｎｏｖｉｔｓｋｙら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３（５）：４４２７−４４３２を参照のこと）。８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡの野生型Ｅｎｖ配列は、例えば、配列番号４８（野生型Ｅｎｖ共通領域、表Ａに示されるヌクレオチド７４８６〜７６２９）；および配列番号５０（野生型ｇｐ１６０、表Ａに示されるヌクレオチド６２４４〜８８５３）に示される。１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡの野生型Ｅｎｖ　ｇｐ１６０は、配列番号９８に示される。本明細書中の開示から、Ｅｎｖ　ｇｐ１６０（例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｇｐ１４０）のフラグメントをコードするポリヌクレオチドが、本明細書中に開示されるより大きい全長配列から容易に得られ得ることが、容易に明らかである。他の改変（例えば、Ｖ１および／またはＶ２領域のような領域の欠失；切断部位の変異など）がなされ得ることもまた、容易に明らかである（実施例１を参照のこと）。このような改変の例示的配列は、配列番号１１９〜１２７に示される。
【０１００】
さらに、Ｃ型ＨＩＶ−１改変体から得られるＥｎｖ配列は、本明細書の技術に従って類似の様式で操作され得る。このような他の改変体としては、上記のＣ型ＨＩＶ−１単離株から得られるＥｎｖタンパク質コード配列が挙げられるが、これに限定されない。
【０１０１】
Ｅｎｖについてのコドン用法パターンを、Ｇａｇについて上記のように改変し、その結果、得られた核酸コード配列は、高度に発現されるヒト遺伝子において見出されるコドン用法に匹敵した。本発明を支持して、実行された実験は、合成Ｅｎｖ配列がネイティブなＥｎｖ配列と比較して、高レベルのタンパク質を産生し得たことを示す。
【０１０２】
Ｅｎｖポリペプチドコード配列の改変は、多くの哺乳動物細胞株（ならびに昆虫細胞を含むがこれに限定されない他の型の細胞株）において、野生型コード配列に対して改善された発現を生じる。類似のＥｎｖポリペプチドコード配列は、種々の単離株（Ｇａｇについて上記された株を含む）から得られ得、改変され得、そして改善された発現について試験され得る。
【０１０３】
Ｅｎｖのさらなる改変は、その中に変異および／または欠失を有するＥｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製することを含むが、これに限定されない。例えば、超可変領域（Ｖ１および／またはＶ２）は、本明細書中に記載のように欠失され得る。さらに、例えば、Ｅｎｖ内の架橋シート領域および／またはＮ−グリコシル化部位に対する他の改変もまた、本明細書中の技術に従って実行され得る（図１３０Ａ〜ＣおよびＷＯ／３９３０３を参照のこと）。これらの改変の種々の組み合わせは、本明細書中で記載されるような合成発現カセットを作製するために使用され得る。
【０１０４】
（２．２．１．３　ＨＩＶ−１　Ｐｏｌ核酸コード配列を含む配列の改変）
本発明はまた、合成Ｐｏｌ配列を含む発現カセットを包含する。上記のように、「Ｐｏｌ」は、図７に示されるようなタンパク質コード領域（例えば、ポリメラーゼ、プロテアーゼ、逆転写酵素および／またはインテグラーゼ含有配列）を含むが、これに限定されない。図７に示される領域は、例えば、Ｗａｎら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１６：５６９−５７３；Ｋｏｈｌら（１９８８）ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８５：４６８６−４６９０；Ｋｒａｕｓｓｌｉｃｈら（１９８８）Ｊ．Ｖｉｏｌ．６２：４３９３−４３９７；Ｃｏｆｆｉｎ「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１４３７−１５００頁（Ｒａｖｅｎ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９９０）；Ｐａｔｅｌら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３４：５３５１−５３６３に記載される。従って、本明細書中で例示される合成発現カセットは、１以上のこれらの領域および得られるアミノ酸配列に対する１以上の変化を含む。
【０１０５】
野生型のＰｏｌ配列を、Ｃ型ＨＩＶ−１のＡＦ１１０９７５株、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ株および１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ株から得た（例えば、ボツワナ由来の種々のサブタイプＣクローンの分子クローニングについて、Ｎｏｖｉｔｓｋｙら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３（５）：４４２７−４４３２を参照のこと）。配列番号３４は、Ｐｏｌのｐ２〜ｐ７領域由来のＡＦ１１０９７５の野生型配列を示す（図７および表Ａを参照のこと）。配列番号３５は、ｐ１〜インテグラーゼの最初の６アミノ酸由来のＡＦ１１０９７５の野生型配列を示す（図７および表Ａを参照のこと）。配列番号６３および配列番号１０４は、それぞれ、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡおよび１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ由来のＰｏｌの野生型配列を示す（また表Ａを参照のこと）。
【０１０６】
他のＣ型ＨＩＶ−１改変体から得られた配列は、本明細書の技術に従って類似の様式で操作され得る。このような他の改変体としては、本明細書中に記載されるＣ型ＨＩＶ−１単離株から得られたＰｏｌタンパク質コード配列が挙げられるが、これに限定されない。
【０１０７】
Ｐｏｌについてのコドン用法パターンを、ＧａｇおよびＥｎｖについて上記されたように改変し、その結果、得られた核酸コード配列は、高度に発現されるヒト遺伝子において見出されるコドン用法と匹敵した。
【０１０８】
表Ｂは、本明細書中で例示されるＰｏｌ構築物（例えば、配列番号３０〜３２）において見出される種々の領域のヌクレオチド位置を示す。
【０１０９】
【表２】
2004502445.tif 000005
表Ｂに示すように、例示的な構築物を、種々の様式で改変した。例えば、本明細書中で例示される発現構築物は、インテグラーゼペプチドの最初の６つのアミノ酸をコードする配列を含む。この６アミノ酸の領域は、ＨＩＶプロテアーゼによって認識される、切断認識部位を提供すると考えられる（例えば、ＭｃＣｏｒｎａｃｋら（１９９７）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｓ　４１４：８４−８８を参照のこと）。上記のように、本明細書中に例示される特定の構築物は、１つ以上の導入遺伝子の挿入のための、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を、代表的にはこの構築物の３’末端に含む。さらに、ＲＴにおいて触媒中心から誘導された触媒中心エピトープをコードするカセットは、代表的に、インテグラーゼの６アミノ酸をコードする配列の３’末端を含んだ。このカセット（配列番号３６）は、ＲＴのＩｌｅ１７８〜セリン１９１（配列番号３７のアミノ酸３〜１６）をコードし、そしてこの十分に保存された領域を、可能なＣＴＬエピトープとして維持するために添加された。さらに、これらの構築物は、挿入変位（配列番号３０〜３２の２２５位）を含み、リーディングフレームを保存する（例えば、Ｐａｒｋら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：５１１１を参照のこと）。
【０１１０】
特定の実施形態において、ＲＴの触媒中心および／またはプライマーグリップ領域が、改変される。ＲＴの触媒中心およびプライマーグリップ領域は、例えば、Ｐａｔｅｌら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４：５３５１およびＰａｌａｎｉａｐｐａｎら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１１５７に記載されている。例えば、ＰＲ９７５ＹＭ（配列番号３１）と称される構築物において、ｐ６６ＲＴの１８３位〜１８５位（ＡＦ１１０９７５に対して番号付けられた）においてアミノ酸ＹＭＤＤをコードする野生型配列は、アミノ酸「ＡＰ」をコードする配列と置換される。ＰＲ９７５ＹＭＷＭ（配列番号３２）と称される構築物において、ＹＭＤＤにおける同じ変位がなされ、そしてさらに、プライマーグリップ領域（アミノ酸ＷＭＧＹ、ｐ６６ＲＴの残基２２９〜２３２（ＡＦ１１０９７５に対して番号付けられた））が、アミノ酸「ＰＩ」をコードする配列で置換される。
【０１１１】
Ｐｏｌ配列に対して、コドン利用の変化は、代表的に、−１までのフレームシフトの領域に制限されており、そして再度、Ｇａｇリーディングフレームの末端において開始する；しかし、フレームシフト翻訳領域内の領域も同様に改変され得る。最後に、プロテアーゼポリペプチドコード配列のコード配列内に位置する阻害（すなわち、不安定）エレメント（ＩＮＳ）も同様に、変更され得る。
【０１１２】
本発明の支持によって実験を実施して、合成Ｐｏｌ配列がネイティブＰｏｌ配列と比較してより高レベルのタンパク質を産生し得たことを示し得る。Ｐｏｌポリペプチドコード配列の改変は、多くの哺乳動物細胞株（および他の型の細胞（昆虫細胞が挙げられるがこれらに限定されない））において、野生型コード配列と比較して、改善された発現を生じる。種々の単離物（ＧａｇおよびＥｎｖに関して上記したものを含む）からの改善された発現のために改変および試験された、類似のＰｏｌポリペプチドコード配列が得られ得る。
【０１１３】
（２．２．１．４　他のＨＩＶ配列の改変）
本発明はまた、Ｇａｇ、ＥｎｖおよびＰｏｌ以外の、合成Ｃ型ＨＩＶ配列由来のＨＩＶ遺伝子（Ｇａｇ、Ｅｎｖ、Ｐｏｌ、ならびに例えば、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ（配列番号３３）または１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ（配列番号４５）由来のｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、およびｎｅｆ内の領域が挙げられるが、これらに限定されない）を含む、発現カセットを包含する。他の株から得られた配列は、本明細書の教示に従って類似の様式で操作され得る。
【０１１４】
上記のように、コドン利用パターンは、Ｇａｇ、ＥｎｖおよびＰｏｌに関して上記したように改変され、その結果、得られる核酸コード配列は、高度に発現されるヒト遺伝子において見出されるコドン利用に匹敵する。本発明の支持によって実験を実施して、これらの合成配列が、ネイティブの配列と比較してより高レベルのタンパク質を産生し得たこと、および野生型ポリペプチドコード配列の改変が、多くの哺乳動物細胞株（および他の型の細胞（昆虫細胞が挙げられるがこれらに限定されない））において、野生型コード配列と比較して改善された発現を生じることを示し得る。さらに、核酸配列もまた改変されて、遺伝子の１つ以上の領域に変異を導入し、例えば、その遺伝子産物を非機能的にし得、そして／またはＮｅｆにおけるミリストイル化部位を排除し得る。
【０１１５】
本明細書中で例示される合成発現カセットは、以下を含む：配列番号４９および配列番号９７（それぞれ８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ野生型および１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ野生型に基づいて改変されたＥｎｖ　ｇｐ１６０コード配列）；配列番号５１および配列番号９９（それぞれ８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ野生型および１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ野生型に基づいて改変されたＧａｇコード配列）；配列番号５３（８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ野生型に基づいて改変されたＧａｇの主要な相同性領域）；配列番号５５および配列番号１０１（それぞれ８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ野生型および１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ野生型に基づいて改変されたＮｅｆコード配列）；配列番号５７および配列番号１３４（それぞれ８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ野生型および１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡに基づいて改変された、１２５位における変異を有して非機能的な遺伝子産物を生じるＮｅｆコード配列）；配列番号５８（８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ野生型に基づいて改変されたＲＮＡｓｅＨコード配列）；配列番号６０（８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ野生型に基づいて改変されたインテグラーゼコード配列）；配列番号６２および配列番号１０３（それぞれ８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ野生型および１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ野生型に基づいて改変されたＰｏｌコード配列）；配列番号６４（８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ野生型に基づいて改変されたプロテアーゼコード配列）；配列番号６６（８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ野生型に基づいて改変された不活化プロテアーゼコード配列）；配列番号６８（８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ野生型に基づいて改変された不活化プロテアーゼおよびＲＴ変異配列）；配列番号７０（８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ野生型に基づいて改変されたプロテアーゼおよび逆転写酵素のコード配列）；配列番号７２および配列番号１０５（それぞれ８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ野生型および１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ野生型に基づいて改変された、Ｒｅｖのエキソン１）；配列番号７４および配列番号１０７（それぞれ８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ野生型および１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ野生型に基づいて改変された、Ｒｅｖのエキソン２）；配列番号７６（８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ野生型に基づいて改変された逆転写酵素コード配列）；配列番号７８（８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ野生型に基づいて改変された変異逆転写酵素）；配列番号８０（８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ野生型に基づいて改変された、非機能的Ｔａｔを生じる変異を含むＴａｔのエキソン１）；配列番号８１および配列番号１０９（それぞれ８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ野生型および１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ野生型に基づいて改変された、Ｔａｔのエキソン１）；配列番号８３および配列番号１１１（それぞれ８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ野生型および１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ野生型に基づいて改変された、Ｔａｔのエキソン２）；配列番号８５および配列番号１１３）（それぞれ８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ野生型および１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ野生型に基づいて改変されたＶｉｆコード配列）；配列番号８７および配列番号１１５（それぞれ８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ野生型および１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ野生型に基づいて改変されたＶｐｒコード配列）；配列番号８９および配列番号１１７（それぞれ８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ野生型および１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ野生型に基づいて改変されたＶｐｕコード配列）；配列番号９１（８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ野生型に基づいて改変された、Ｒｅｖのエキソン１およびエキソン２の配列）；配列番号９３（８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ野生型に基づいて改変された、Ｔａｔの変異エキソン１およびＴａｔのエキソン２の配列（ここでエキソン１の変異は、非機能的Ｔａｔを生じる））；配列番号９４（８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ野生型に基づいて改変された、Ｔａｔのエキソン１およびエキソン２の配列）；配列番号９６および配列番号１３５（それぞれ８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ野生型および１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡに基づいて改変された、ミリストイル化部位を排除する変異を含むＮｅｆコード配列）。
【０１１６】
（２．２．１．５　ＨＩＶ−１核酸コード配列を含む配列のさらなる改変）
本明細書中に記載される、Ｃ型ＨＩＶポリペプチドコード発現カセットはまた、例えば、１つ以上の導入遺伝子をコードする、１つ以上のさらなる配列を含み得る。本発明の実施において有用なさらなる配列（例えば、導入遺伝子）としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：さらなるウイルスエピトープ／抗原｛ＨＣＶ抗原（例えば、Ｅ１、Ｅ２；Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ｍ．．ら、米国特許第５，７１４，５９６号（１９９８年２月３日発行）；Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ｍ．．ら、米国特許第５，７１２，０８８号（１９９８年１月２７日発行）；Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ｍ．．ら、米国特許第５，６８３，８６４号（１９９７年１１月４日発行）；Ｗｅｉｎｅｒ，Ａ．Ｊ．ら、米国特許第５，７２８，５２０号（１９９８年３月１７日発行）；Ｗｅｉｎｅｒ，Ａ．Ｊ．ら、米国特許第５，７６６，８４５号（１９９８年６月１６日発行）；Ｗｅｉｎｅｒ，Ａ．Ｊ．ら、米国特許第５，６７０，１５２号（１９９７年９月２３日発行））、ＨＩＶ抗原（例えば、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆおよび／またはｅｎｖ由来のもの）を含むがこれらに限定されない｝をコードするさらなる配列；および腫瘍抗原／エピトープをコードする配列。さらなる配列はまた、非ウイルス供給源に由来し得る（例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、Ｇ−ＣＳＦ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−１α（ＩＬ−１Ｉ）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、ＭＩＰ−１Ｉ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ｃ−ｋｉｔリガンド、トロンボポエチン（ＴＰＯ）およびｆｌｔ３リガンドのようなサイトカイン（例えば、Ｇｅｎｚｙｍｅ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｓｏｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、Ａｍｇｅｎ（Ｔｈｏｕｓａｎｄ　Ｏａｋｓ，ＣＡ）、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｅｘ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）のようないくつかの販売元から市販されている）をコードする配列）。さらなる配列は、例えば２．３節で、以下に記載されている。また、Ｇａｇおよび他のコード配列の、互いに対する配向のバリエーションは、以下に記載されている。
【０１１７】
ＨＩＶポリペプチドコード配列は、他のＣ型ＨＩＶ単離物から得られ得る。例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ　Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ　Ｍｅｘｉｃｏ（１９９２）；Ｍｙｅｒｓら、Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　ａｎｄ　Ａｉｄｓ，１９９７，Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ　Ｍｅｘｉｃｏ：Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと。合成発現カセットは、このようなコード配列を出発物質として使用して、本明細書の教示に従って、生成され得る（例えば、実施例１を参照のこと）。
【０１１８】
さらに、本発明の合成発現カセットは、本明細書中に開示される合成発現カセット配列（例えば、配列番号３０〜３２；配列番号３、４、２０、および２１、ならびに配列番号５〜１７）に対して、８５％より大きい、好ましくは９０％より大きい、より好ましくは９５％より大きい、そして最も好ましくは９８％より大きい配列同一性を有する、関連するポリペプチド配列を含む。種々のコード領域が、図３および４に示されており、例えば図３（ＡＦ１１０９６８）においては、ヌクレオチド１〜８１（配列番号１８）；ヌクレオチド８２〜１５１２（配列番号６）は、ｇｐ１２０ポリペプチドをコードし、ヌクレオチド１５１３〜２５４７（配列番号１０）は、ｇｐ４１ポリペプチドをコードし、ヌクレオチド８２〜２０２５（配列番号７）は、ｇｐ１４０ポリペプチドをコードし、そしてヌクレオチド８２〜２５４７（配列番号８）は、ｇｐ１６０ポリペプチドをコードする。同様に、図９８（配列番号１２７、株８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ）においては、ヌクレオチド１〜６は、ＥｃｏＲ１制限部位であり；ヌクレオチド７〜８７は、野生型（８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来）リーダーシグナルペプチドをコードし；ヌクレオチド８８〜１５６３は、ｇｐ１２０ポリペプチドをコードし；ヌクレオチド８８〜２０６４は、ｇｐ１４０ポリペプチドをコードし；ヌクレオチド８８〜２６０７は、ｇｐ１６０ポリペプチドをコードする。
【０１１９】
（２．３．３　ＨＩＶ−１サブタイプＣおよび関連するポリペプチドをコードする、合成配列の発現）
本発明の合成ＨＩＶコード配列（発現カセット）は、発現のレベルを評価するため、およびＧａｇの場合には、ＶＬＰの産生を評価するために、多数の異なる発現ベクターにクローニングされ得る。ＨＩＶポリペプチドに対する合成ＤＮＡフラグメントは、真核生物発現ベクター（一過性発現ベクター、ＣＭＶプロモーターに基づく哺乳動物ベクター、およびバキュロウイルス発現系において使用するためのシャトルベクターが挙げられる）にクローニングされ得る。対応する野生型配列もまた、同じベクターにクローニングされ得る。
【０１２０】
次いで、これらのベクターは、いくつかの異なる細胞型（種々の哺乳動物細胞株（２９３、ＲＤ、ＣＯＳ−７、およびＣＨＯ、例えば、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．から入手可能な細胞株）が挙げられる）にトランスフェクトされ得る。次いで、細胞株は、適切な条件下で培養され、そして任意の適切なポリペプチド産物のレベルが、上清中で評価され得る（表Ａおよび実施例２を参照のこと）。例えば、ｐ２４は、Ｇａｇ発現を評価するために使用され得る；ｇｐ１６０、ｇｐ１４０またはｇｐ１２０は、Ｅｎｖ発現を評価するために使用され得る；ｐ６ｐｏｌは、Ｐｏｌ発現を評価するために使用され得る；ｐｒｏｔは、プロテアーゼを評価するために使用され得る；ｐ１５は、ＲＮＡｓｅＨを評価するために使用され得る；ｐ３１は、インテグラーゼを評価するために使用され得る；そして他の適切なポリペプチドは、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、ＶｐｕおよびＮｅｆを評価するために使用され得る。さらに、改変されたポリペプチドがまた使用され得、例えば、他のＥｎｖポリペプチドとしては、例えば、ネイティブｇｐ１６０、オリゴマーｇｐ１４０、モノマーｇｐ１２０、ならびにこれらのポリペプチドの改変配列および／または合成配列が挙げられるが、これらに限定されない。これらのアッセイの結果は、合成ＨＩＶポリペプチドコード配列の発現が、対応する野生型配列より有意に高いことを実証する。
【０１２１】
さらに、ウエスタンブロット分析を使用して、合成発現カセットを含む細胞が、ネイティブ発現カセットを含む細胞より高い細胞あたりの濃度で、予測されたタンパク質を発現することを示し得る。ＨＩＶタンパク質は、細胞溶解物と上清との両方において見られ得る。本発明の合成発現カセットでトランスフェクトされた細胞については、産生のレベルは、細胞上清において有意により高い。
【０１２２】
合成発現カセットでトランスフェクトされた哺乳動物細胞からの上清の分画を使用して、これらのカセットが、野生型配列と比較して、ＨＩＶタンパク質の優れた産生（そしてＧａｇの場合には、ＶＬＰの産生）を提供することを示し得る。
【０１２３】
これらのＨＩＶ含有ポリペプチドの、哺乳動物細胞株における効率的な発現は、以下の利点を提供する：ポリペプチドは、バキュロウイルス夾雑物を含まない；確立された方法による産生がＦＤＡによって認可されている；増加した純度；より高い収率（ネイティブコード配列と比較して）；およびＣＨＯ細胞におけるサブタイプＣ　ＨＩＶ含有ポリペプチドの産生（これは、本発明の構築物を使用して得られる増加した発現の非存在下では実行不可能である）の新規方法。例示的な哺乳動物細胞株としては、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＨＴ１０８０、２９３、２９３Ｔ、ＲＤ、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＵＴ、ＳＵＰＴ、Ｃ８１６６、ＭＯＬＴ４／クローン８、ＭＴ−２、ＭＴ−４、Ｈ９、ＰＭ１、ＣＥＭ、およびＣＥＭＸ１７４が挙げられるが、これらに限定されず、このような細胞株は、例えば、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．から入手可能である。
【０１２４】
本発明の合成Ｇａｇ発現カセットはまた、昆虫細胞にトランスフェクトされる場合に、高レベルの発現およびＶＬＰ産生を示す。本明細書中に記載される合成発現カセットはまた、昆虫細胞において高レベルの発現を示す。さらに、より高い全タンパク質収率に加えて、合成ポリペプチドからの最終生成物は、一貫して、ネイティブのＣ型配列からの最終生成物より低い量の夾雑バキュロウイルスタンパク質を含む。
【０１２５】
さらに、本発明の合成発現カセットはまた、酵母ベクターに導入され得、このベクターは次に、酵母細胞（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｅａ；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．およびＴｅｋａｍｐ−Ｏｌｓｏｎ，Ｐ．，米国再発行特許発明第３５，７４９号（１９９８年３月１７日発行）に記載されるようなベクターを使用する）に形質転換され得、そして酵母細胞によって効率的に発現され得る。
【０１２６】
哺乳動物ベクターおよび昆虫ベクターに加えて、本発明の合成発現カセットは、選択された発現制御エレメントを使用して、種々の発現ベクターに組み込まれ得る。任意の所定の細胞型に適切なベクターおよび制御エレメントは、本明細書の教示、および発現ベクターについて当該分野において公知の情報を考慮して、当業者によって選択され得る。
【０１２７】
例えば、合成発現カセットは、所望のコード配列に作動可能に連結された制御エレメントを含むベクターに挿入され得、これによって、選択された細胞型における遺伝子の発現が可能となる。例えば、哺乳動物細胞発現のための代表的なプロモーターとしては、とりわけ、ＳＶ４０初期プロモーター、ＣＭＶプロモーター（例えば、ＣＭＶ極初期プロモーター（ＣＭＶプロモーターはイントロンＡを含み得る））、ＲＳＶ、ＨＩＶ−Ｌｔｒ、マウス乳腺癌ウイルスＬＴＲプロモーター（ＭＭＬＶ−１ｔｒ）、アデノウイルスの主要後期プロモーター（Ａｄ　ＭＬＰ）、および単純疱疹ウイルスプロモーターが挙げられる。他の非ウイルスプロモーター（例えば、マウスメタロチオネイン遺伝子由来のプロモーター）もまた、哺乳動物発現のために用途を見出す。代表的に、転写終結配列およびポリアデニル化配列もまた存在し、翻訳終止コドンに対して３’に位置する。好ましくは、翻訳の開始の最適化のための配列もまた存在し、コード配列に対して５’に位置する。転写終結シグナル／ポリアデニル化シグナルの例としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出に記載されるようなＳＶ４０由来のシグナル、およびウシ成長ホルモンターミネーター配列が挙げられる。スプライスドナー部位およびアクセプター部位を含むイントロンもまた、本発明と共に使用するための構築物中に設計され得る（Ｃｈａｐｍａｎら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６）。
【０１２８】
エンハンサーエレメントもまた、本明細書中において使用されて、哺乳動物構築物の発現レベルを増加させ得る。例としては、Ｄｉｊｋｅｍａら，ＥＭＢＯ　Ｊ．（１９８５）４：７６１に記載されるようなＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、Ｇｏｒｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２ｂ）７９：６７７７に記載されるようなラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）由来のエンハンサー／プロモーター、およびＢｏｓｈａｒｔら，Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１に記載されるようなヒトＣＭＶ由来のエレメント（例えば、ＣＭＶイントロンＡ配列に含まれるエレメント（Ｃｈａｐｍａｎら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６））が挙げられる。
【０１２９】
所望の合成ポリペプチドをコードする配列は、多数の市販のベクターにクローニングされて、このポリペプチドの、適切な宿主系における発現を生じさせ得る。これらの系としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：バキュロウイルス発現｛Ｒｅｉｌｌｙ，Ｐ．Ｒ．ら，ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＶＥＣＴＯＲＳ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ（１９９２）；Ｂｅａｍｅｓら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１１：３７８（１９９１）；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）｝、ワクシニア発現｛Ｅａｒｌ，Ｐ．Ｌ．ら，「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ　ｕｓｉｎｇ　ｖａｃｃｉｎｉａ」Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ．（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編），Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　＆　Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９１）；Ｍｏｓｓ，Ｂ．ら，米国特許第５，１３５，８５５号（１９９２年８月４日発行）｝、細菌における発現｛Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｄｉａ　ＰＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ｝、酵母における発現｛Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．およびＴｅｋａｍｐ−Ｏｌｓｏｎ，Ｐ．，米国再発行特許発明第３５，７４９号（１９９８年３月１７日発行）；Ｓｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｒ．，米国特許第５，６２９，２０３号（１９９７年５月１３日発行）；Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ，Ｇ．，ら，Ａｎｔｏｎｉｅ　Ｖａｎ　Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，６２（１−２）：７９−９３（１９９２）；Ｒｏｍａｎｏｓ，Ｍ．Ａ．，ら，Ｙｅａｓｔ　８（６）：４２３−４８８（１９９２）；Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１８５（１９９０）；Ｇｕｔｈｒｉｅ，Ｃ．，およびＧ．Ｒ．Ｆｉｎｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１９４（１９９１）｝、哺乳動物細胞における発現｛Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒｏｕｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ；例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（Ｈａｙｎｅｓ，Ｊ．ら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１１：６８７−７０６（１９８３）；１９８３，Ｌａｕ，Ｙ．Ｆ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１４６９−１４７５（１９８４）；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１８５巻，５３７−５６６頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ　ＣＡ（１９９１）｝、および植物細胞における発現｛植物クローニングベクター、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ、およびＰｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｔｃａｔａｗａｙ，ＮＪ；Ｈｏｏｄ，Ｅ．ら，Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８：１２９１−１３０１（１９８６）；Ｎａｇｅｌ，Ｒ．ら，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６７：３２５（１９９０）；Ａｎら，「Ｂｉｎａｒｙ　Ｖｅｃｔｏｒｓ」、およびＰｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ａ３：１−１９（１９８８）；Ｍｉｋｉ，Ｂ．Ｌ．Ａ．ら，２４９−２６５頁における他のもの、ならびにＰｌａｎｔ　ＤＮＡ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ａｇｅｎｔｓ（Ｈｏｈｎ，Ｔ．ら編）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｗｉｅｎ，Ａｕｓｔｒｉａ，（１９８７）；Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐ．Ｇ．ＪｏｎｅｓおよびＪ．Ｍ．Ｓｕｔｔｏｎ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ，１９９７；Ｍｉｇｌａｎｉ，Ｇｕｒｂａｃｈａｎ　Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，Ｆｏｏｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｐｒｅｓｓ，１９９８；Ｈｅｎｒｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，Ｃｈａｐｍａｎ　＆　Ｈａｌｌ，１９９７における他のもの｝。
【０１３０】
本発明にはまた、コード配列、および適切な宿主におけるコード領域の発現を可能にする発現制御エレメントを含む発現ベクターが含まれる。これらの制御エレメントは、一般に、プロモーター、翻訳開始コドン、および翻訳終止配列および転写終止配列、ならびにベクターへ挿入を導入するための挿入部位を含む。転写制御エレメントは、Ｍ．Ｋｏｚａｋによって概説されている（例えば、Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ　７（８）：５６３−５７４，１９９６；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ　７６（９）：８１５−８２１，１９９４；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１０８（２）：２２９−２４１，１９８９；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，およびＳｈａｔｋｉｎ，Ａ．Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　６０：３６０−３７５，１９７９）。
【０１３１】
酵母系における発現は、工業的生産の利点を有する。ワクシニアおよびＣＨＯ細胞株による組換えタンパク質の産生は、哺乳動物発現系であるという利点を有する。さらに、ワクシニアウイルスの発現は、以下を含むいくつかの利点を有する：（ｉ）その広範な宿主範囲；（ｉｉ）組換えタンパク質の正確な転写後修飾、プロセシング、折り畳み、輸送、分泌および構築；（ｉｉｉ）比較的可溶性の組換えタンパク質の高レベルな発現；ならびに（ｉｖ）外来ＤＮＡに適合する大きな能力。
【０１３２】
合成ＨＩＶポリペプチドコード発現カセットから組換え的に発現されたポリペプチドは、典型的に、溶解された細胞および培養培地から単離される。精製は、当該分野で公知の方法（塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、サイズ分画およびアフィニティークロマトグラフィーを含む）によって、実施され得る。免疫親和性クロマトグラフィーは、例えば、ＨＩＶ抗原に基づいて作製された抗体を使用して、用いられ得る。
【０１３３】
哺乳動物細胞を使用して本発明のタンパク質を発現させる利点としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：産生のスケールアップのための十分に確立されたプロトコル；ＶＬＰを生成する能力；細胞株が優良製造プロセス（ＧＭＰ）基準を満たすように適合されること；哺乳動物細胞の培養条件が当該分野で公知であること。
【０１３４】
本明細書中に記載される本発明の異なる実施形態の様々な形態は、組み合わされてもよい。
【０１３５】
（２．３　ウイルス様粒子の生成およびパッケージング細胞株を作製するための本発明の構築物の使用）
ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）の群特異的抗原（Ｇａｇ）は、発芽によって種々の真核生物細胞から放出される非感染性ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に自己構築する（Ｆｒｅｅｄ，Ｅ．Ｏ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２５１：１−１５，１９９８による総説）。本発明の合成発現カセットは、種々の異なる細胞型（哺乳動物細胞が挙げられるが、これに限定されない）を使用するＨＩＶ−Ｇａｇウイルス様粒子（ＶＬＰ）の生成に有効な手段を提供する。
【０１３６】
ウイルス粒子は、宿主の免疫系に対する、この粒子に捕捉または結合された抗原の適切な提示のためのマトリクスとして、使用され得る。
【０１３７】
（２．３．１　本発明の合成発現カセットを使用するＶＬＰ生成）
本発明を支持して実験を行って、本発明の合成発現カセットが、ネイティブのＧａｇコード配列と比較して、Ｇａｇタンパク質およびＶＬＰの両方の優れた生成を提供することを証明し得る。さらに、ＶＬＰ生成の電子顕微鏡評価により、推定サイズの遊離の発芽している未成熟ウイルス粒子は、この合成発現カセットを含む細胞によって生成されることが示され得る。
【０１３８】
ウイルス様粒子の生成のために、ネイティブのＧａｇコード配列ではなく、本発明の合成発現カセットを使用することは、いくつかの利点を提供する。第１に、ＶＬＰは、増大した量で生成され得、これによりこのＶＬＰの単離および精製がより容易になり得る。第２に、ＶＬＰは、この合成発現カセットを使用して種々の細胞型で生成され得、特に、哺乳動物細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞）は、ＶＬＰ生成のために使用され得る。ＣＨＯ細胞を使用する生成は、以下を提供する：（ｉ）ＶＬＰ形成；（ｉｉ）正確なミリストイル化および発芽；（ｉｉｉ）非哺乳動物細胞混入物（例えば、昆虫ウイルスおよび／または細胞）の非存在；および（ｉｖ）精製の容易さ。本発明の合成発現カセットはまた、哺乳動物細胞株以外の細胞型における発現を増大するために有用である。例えば、この合成発現カセットをコードするバキュロウイルスベクターで昆虫細胞を感染することにより、高レベルのＧａｇタンパク質の全収率およびより高いレベルのＶＬＰ生成が生じる（野生型コード配列と比較して）。さらに、バキュロウイルスＧａｇ合成発現カセットに感染した昆虫由来の最終産物は、野生型コード配列を使用した場合の最終産物より少ない量の混入昆虫タンパク質を一貫して含む。
【０１３９】
ＶＬＰは、目的の粒子形成ポリペプチドが適切な宿主細胞において組換え発現される場合に、自然に形成され得る。従って、本発明の合成発現カセットを使用して生成されるＶＬＰは、組換え技術を使用して簡便に調製される。下記のように、本発明のＧａｇポリペプチドコード合成発現カセットは、目的の他のポリペプチドコード配列（例えば、ＨＩＶプロテアーゼ、ＨＩＶポリメラーゼ、ＨＣＶコア、Ｅｎｖ、合成Ｅｎｖ；実施例１を参照のこと）を含み得る。このような合成発現カセットの発現は、Ｇａｇポリペプチドを含むＶＬＰならびに目的のポリペプチドを生じる。
【０１４０】
一旦、所望の粒子形成ポリペプチドのコード配列が単離または合成されると、これらのコード配列は、発現に適切な任意のベクターまたはレプリコンにクローニングされ得る。多数のクローニングベクターが、当業者に公知であり、適切なクローニングベクターの選択が可能である。一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）を参照のこと。次いで、このベクターは、適切な宿主細胞を形質転換するために使用される。適切な組換え発現系としては、細菌発現系、哺乳動物発現系、バキュロウイルス／昆虫発現系、ワクシニア発現系、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）発現系、アルファウイルス（例えば、シンドビスウイルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎（ＶＥＥ）ウイルス）発現系、哺乳動物発現系、酵母発現系およびゼノプス発現系が挙げられるが、これらに限定されず、これらは当該分野で周知である。特に好まし発現系は、哺乳動物細胞株、ワクシニア、シンドビス、昆虫および酵母発現系である。
【０１４１】
例えば、多数の哺乳動物細胞株が当該分野で公知であり、そしてＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）から入手可能な不死化細胞株を含み、この不死化細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、新生ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）などが挙げられるが、これらに限定されない。同様に、細菌宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐｐ．）は、本発明の発現構築物を用いる用途を見出す。本発明において有用な酵母宿主としては、特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ　ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。バキュロウイルス発現ベクターと共に使用するための昆虫細胞としては、特に、Ａｅｄｅｓ　ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａおよびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ．が挙げられる。例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　Ｓｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ．１５５５（１９８７）を参照のこと。
【０１４２】
ウイルスベクター（例えば、ポックスファミリーのウイルス（ワクシニアウイルスおよび鳥類ポックスウイルスを含む）由来のベクター）は、真核生物細胞における粒子の生成のために使用され得る。さらに、ワクシニアベースの感染／トランスフェクション系はまた、Ｔｏｍｅｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：４０１７−４０２６およびＳｅｌｂｙら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）７４：１１０３−１１１３に記載されるように、本発明を伴う用途を見出す。この系において、細胞を、始めに、バクテリオファージＴ７　ＲＮＡポリメラーゼをコードするワクシニアウイルス組換え体で、インビトロで感染させる。このポリメラーゼは、Ｔ７プロモーターを保有するテンプレートを転写するのみであるという点で、優れた特異性を示す。感染後、細胞を、Ｔ７プロモーターにより駆動される目的のＤＮＡでトランスフェクトする。ワクシニアウイルス組換え体由来の細胞質において発現されるポリメラーゼは、このトランスフェクトされたＤＮＡをＲＮＡに転写し、このＲＮＡは次いで、宿主翻訳機構によりタンパク質に翻訳される。あるいは、Ｔ７は、精製タンパク質として添加され得るか、または「前駆体」系の場合には酵素として添加される（ＳｔｕｄｉｅｒおよびＭｏｆｆａｔｔ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）１８９：１１３−１３０）。この方法は、多量のＲＮＡおよびその翻訳産物の高レベルの一過性の細胞質生成を提供する。
【０１４３】
選択された発現系および宿主に依存して、ＶＬＰは、粒子形成ポリペプチドが発現されてＶＬＰが形成され得る条件下で、発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を増殖することにより生成される。適切な増殖条件の選択は、当業者の範囲内である。ＶＬＰが細胞内で形成される場合、この細胞は、細胞を溶解するがＶＬＰを実質的にインタクトなまま保つ、化学的手段、物理的手段または機械的手段を使用して破壊される。このような方法は、当業者に公知であり、そして例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅ．Ｌ．Ｖ．ＨａｒｒｉｓおよびＳ．Ａｎｇａｌ編、１９９０）に記載される。
【０１４４】
次いで、この粒子は、それらの完全性を保存する方法（例えば、勾配遠心分離（例えば、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）スクロース勾配、ペレット化など））（例えば、Ｋｉｒｎｂａｕｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：６９３９−６９３６を参照のこと）、ならびに標準的な精製技術（例えば、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィー）によって、単離される（または実質的に精製される）。
【０１４５】
本発明の合成発現カセットを含む細胞により生成されるＶＬＰは、被験体に投与された場合に免疫応答を引き起こすために、使用され得る。本発明の１つの利点は、ＶＬＰが、以前には不可能であったレベルで、合成発現カセットを有する哺乳動物細胞により生成され得るということである。上記のように、このＶＬＰは、Ｇａｇポリペプチド（例えば、Ｇａｇ−プロテアーゼ、Ｇａｇ−ポリメラーゼ、Ｅｎｖ、合成Ｅｎｖなど）に加えて、種々の抗原を含み得る。本発明の合成発現カセットを使用して生成される、精製ＶＬＰは、通常はワクチン組成物の形態で、脊椎動物被験体に投与され得る。組み合わせワクチンもまた使用され得、ここで、このようなワクチンは、例えば、アジュバントサブユニットタンパク質（例えば、Ｅｎｖ）を含む。投与は、単独で処方されたＶＬＰまたは他の抗原と共に処方されたＶＬＰを使用して、行われ得る。さらに、このＶＬＰは、ＤＮＡ免疫（以下を参照のこと）および／または他のワクチンの送達のための合成発現カセットの送達の前か、これと同時か、またはこれに続いて投与され得る。また、ＶＬＰ投与の部位は、投与されている他のワクチン組成物と同じであっても異なっていてもよい。遺伝子送達は、多数の方法によって達成され得、この方法としては、ＤＮＡ、アルファウイルスベクター、ポックスウイルスベクターおよびワクシニアウイルスベクターでの免疫が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４６】
ＶＬＰ免疫刺激（または、ワクチン）組成物は、種々の賦形剤、アジュバント、キャリア、補助物質、調節剤などを含み得る。免疫刺激組成物は、免疫学的応答を開始するのに十分な量のＶＬＰ／抗原を含む。適切な有効量は、当業者によって決定され得る。このような量は、慣用的な試験により決定され得る比較的広い範囲内に含まれ、一般に、約０．１μｇ〜約１０００μｇ、より好ましくは約１μｇ〜約３００μｇの程度のＶＬＰ／抗原の量である。
【０１４７】
キャリアが必要に応じて存在し、ここでこのキャリアは、組成物を受ける個体に対して有害な抗体の生成をそれ自体は引き起こさない分子である。適切なキャリアは、典型的には、ゆっくりと代謝される大きな高分子（例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソーム）、および不活性なウイルス粒子）である。粒子性キャリアの例としては、ポリメチルメタクリレートポリマーから誘導されるキャリア、ならびにポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧとして公知）から誘導される微粒子が挙げられる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅ　ＪＰら、Ｊ　Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１４（２）：１９７−２１０，１９９７；Ｏ’Ｈａｇａｎ　ＤＴら、Ｖａｃｃｉｎｅ　１１（２）：１４９−５４，１９９３を参照のこと。このようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、これらのキャリアは、免疫刺激因子（「アジュバント」）として機能し得る。さらに、抗原は、細菌毒素（例えば、ジフテリア、テタヌス、コレラなど由来の毒素）、およびＥ．ｃｏｌｉ由来の毒素に結合され得る。
【０１４８】
アジュバントはまた、組成物の効力を増大するために使用され得る。このようなアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（１）アルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）；（２）水中油型エマルジョン処方物（ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌細胞壁成分のような他の特定の免疫刺激因子を含むかまたは含まない）（例えば、（ａ）ＭＦ５９（国際公開番号ＷＯ９０／１４８３７）（これは５％　スクアレン、０．５％　Ｔｗｅｅｎ　８０および０．５％　Ｓｐａｎ　８５を含み（必要に応じて種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含む（以下を参照のこと）が、必要ではない）、Ｍｏｄｅｌ　１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｍｅｗｔｏｎ，ＭＡ）のようなマイクロフルイダイザーを使用してサブミクロンの粒子に処方される）、（ｂ）ＳＡＦ（これは、１０％　スクアレン、０．４％　Ｔｗｅｅｎ　８０、５％　プルロニックブロックポリマー（ｐｌｕｒｏｎｉｃ−ｂｌｏｃｋｅｄ　Ｐｏｌｙｍｅｒ）Ｌ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと）を含み、サブミクロンエマルジョンに微小流体化されるか、または大きな粒子サイズのエマルジョンを作製するためにボルテックスされるかのいずれかである）、および（ｃ）ＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）（これは２％　スクアレン、０．２％　Ｔｗｅｅｎ　８０、およびモノホスホリルリピド　Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群から選択される１つ以上の細菌細胞壁成分（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）を含む））；（３）ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）のようなサポニンアジュバントが使用され得るか、またはこれから作製された粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）が使用され得る；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２など）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など；（６）免疫刺激性ＣｐＧモチーフをコードするオリゴヌクレオチドまたはポリマー分子（Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１６０：８７０−８７６，１９９８；Ｓａｔｏ，Ｙ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７３：３５２−３５４，１９９６）、または抗原／オリゴヌクレオチドの複合体｛ポリマー分子は、二本鎖および一本鎖のＲＮＡおよびＤＮＡ、それらの骨格改変体（例えば、メチルホスホネート結合）を含む；あるいは（７）細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素（ＬＴ）（例えば、コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）もしくはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ）、特に、ＬＴ−Ｋ６３（ここでリジンが、６３位の野生型アミノ酸と置換される）、ＬＴ−Ｒ７２（ここでアルギニンが、７２位の野生型アミノ酸と置換される）、ＣＴ−Ｓ１０９（ここでセリンが、１０９位の野生型アミノ酸と置換される）、およびＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（ここでリジンが、９位の野生型アミノ酸と置換され、グリシンが１２９位で置換される））の無毒化変異体（例えば、国際公開番号ＷＯ９３／１３２０２およびＷＯ９２／１９２６５を参照のこと）；および（８）免疫刺激因子として働き、組成物の効力を増大する他の物質。さらに、このようなポリマー分子は、代替のポリマー骨格構造（例えば、ポリビニル骨格（Ｐｉｔｈａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ，２０４：３９，１９７０ａ；Ｐｉｔｈａ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，９：９６５，１９７０ｂ）、およびモルホリノ骨格（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．ら、米国特許第５，１４２，０４７号、０８／２５／９２発行；Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．ら、米国特許第５，１８５，４４４号、０２／０９／９３発行）（これらに限定されない））を含む。種々の他の電荷および無電荷のポリヌクレオチドアナログが報告されている。多数の骨格修飾が当該分野で公知であり、この修飾には、無電荷結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデートおよびカルバメート）および電荷結合（例えば、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエート）が挙げられるが、これらに限定されない。｝；ならびに（７）免疫刺激因子として働いてＶＬＰ免疫刺激（またはワクチン）組成物の有効性を増大する他の物質。ミョウバン、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびＭＦ５９が好ましい。
【０１４９】
ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５０】
ＶＬＰ組成物を用いる投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数用量スケジュールであり得る。複数用量スケジュールは、ワクチン接種の一次過程に、１〜１０の別個の用量が用いられ、続いて他の用量が後の時間間隔（これは、免疫応答を維持および／または強化するように選択される、例えば、第２の用量について１〜４ヶ月）で与えられ、そして必要に応じて、数ヶ月後に引き続く用量（単数または複数）が与えられる、スケジュールである。投薬レジメンはまた、少なくとも部分的に、被験体の要求によって決定され、そしてこれは、医師の判断に依存する。
【０１５１】
疾患の予防が所望される場合、抗原保有ＶＬＰは一般に、目的の病原体の一次感染の前に投与される。処置（例えば、症状および再発の減少）が所望される場合、ＶＬＰ組成物は一般に、一次感染の後に投与される。
【０１５２】
（２．３．２　パッケージング細胞株を作製するための本発明の合成発現カセットの使用）
多数のウイルスベースの系は、哺乳動物宿主細胞に対する遺伝子移入ベクターとして使用するために開発されてきた。例えば、レトロウイルス（特に、レンチウイルスベクター）は、遺伝子送達系に好都合なプラットフォームを提供する。目的のコード配列（例えば、遺伝子治療の用途に有用な配列）は、遺伝子送達ベクターに挿入され得、当該分野で公知の技術を使用してレトロウイルス粒子中にパッケージングされる。次いで、組換えウイルスが単離され、そしてインビボまたはエキソビボのいずれかで、被験体の細胞に送達され得る。多数のレトロウイルス系は、例えば、以下に記載される：米国特許第５，２１９，７４０号；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　７：９８０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　１：５；Ｓｃａｒｐａら（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１８０：８４９；Ｂｕｒｎｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：８０３３；Ｂｏｒｉｓ−Ｌａｗｒｉｅら、（１９９３）　Ｃｕｒｅ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１０２；ＧＢ　２２００６５１；ＥＰ　０４１５７３１；ＥＰ　０３４５２４２；ＷＯ　８９／０２４６８；ＷＯ　８９／０５３４９；ＷＯ　８９／０９２７１；ＷＯ　９０／０２８０６；ＷＯ　９０／０７９３６；ＷＯ　９０／０７９３６；ＷＯ　９４／０３６２２；ＷＯ　９３／２５６９８；ＷＯ　９３／２５２３４；ＷＯ　９３／１１２３０；ＷＯ　９３／１０２１８；ＷＯ　９１／０２８０５；Ｕ．Ｓ．５，２１９，７４０；；Ｕ．Ｓ．４，４０５，７１２；Ｕ．Ｓ．４，８６１，７１９；Ｕ．Ｓ．４，９８０，２８９およびＵ．Ｓ．４，７７７，１２７；米国出願番号０７／８００，９２１；およびＶｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　５３：３８６０−３８６４；Ｖｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　５３：９６２−９６７；Ｒａｍ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　５３：８３−８８；Ｔａｋａｍｉｙａ（１９９２）Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　Ｒｅｓ　３３：４９３−５０３；Ｂａｂａ（１９９３）Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ　７９：７２９−７３５；Ｍａｎｎ（１９８３）Ｃｅｌｌ　３３：１５３；Ｃａｎｅ（１９８４）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８１：６３４９；ならびにＭｉｌｌｅｒ（１９９０）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　１。
【０１５３】
他の実施形態において、遺伝子移入ベクターは、サイトカインまたは他の免疫調節性分子をコードするように構築され得る。例えば、ネイティブのＩＬ−２およびγ−インターフェロンをコードする核酸配列は、それぞれ、米国特許第４，７３８，９２７号および同第５，３２６，８５９号に記載される様にして、得られ得、一方、これらのタンパク質の有用なムテインは、米国特許第４，８５３，３３２号に記載されるようにして得られ得る。ｍＣＳＦの短い形態および長い形態をコードする核酸配列は、それぞれ、米国特許第４，８４７，２０１号および同第４，８７９，２２７号に記載されるようにして得られ得る。本発明の特定の局面において、サイトカインを発現するレトロウイルスベクターまたは免疫調節性遺伝子は、本明細書中（例えば、本発明のパッケージング細胞株を使用する）および国際出願番号ＰＣＴ　ＵＳ　９４／０２９５１（表題「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」）に記載されるようにして、生成され得る。
【０１５４】
本明細書中で使用するために適切な免疫調節性分子の例としては、以下が挙げられる：ＩＬ−１およびＩＬ−２（Ｋａｒｕｐｉａｈら、（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１４４：２９０−２９８，Ｗｅｂｅｒら、（１９８７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１７１６−１７３３，Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒら、（１９９０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１２１７−１２２４および米国特許第４，７３８，９２７号）；ＩＬ−３およびＩＬ−４（Ｔｅｐｐｅｒら、（１９８９）Ｃｅｌｌ　５０３−５１２，Ｇｏｌｕｍｂｅｋら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５４：７１３−７１６および米国特許第５，０１７，６９１）；ＩＬ−５およびＩＬ−６（Ｂｒａｋｅｎｈｏｆら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：４１１６−４１２１および国際公開番号ＷＯ９０／０６３７０）；ＩＬ−７（米国特許第４，９６５，１９５号）；ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２およびＩＬ−１３（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，Ｓｕｍｍｅｒ　１９９４）；ＩＬ−１４およびＩＬ−１５；α−インターフェロン（Ｆｉｎｔｅｒら、（１９９１）Ｄｒｕｇｓ　４２：７４９−７６５，米国特許第４，８９２，７４３号および同第４，９６６，８４３号、国際公開番号ＷＯ８５／０２８６２，Ｎａｇａｔａら（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ　２８４：３１６−３２０，Ｆａｍｉｌｅｔｔｉら（１９８１）Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ．７８：３８７−３９４，Ｔｗｕら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：２０４６−２０５０，およびＦａｋｔｏｒら、（１９９０）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　５：８６７−８７２）；β−インターフェロン（Ｓｅｉｆら、（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：６６４−６７１）；γ−インターフェロン（Ｒａｄｆｏｒｄら（１９９１）Ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　２００８２０１５，Ｗａｔａｎａｂｅら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：９４５６−９４６０，Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒら（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　５０：７８２０−７８２５，Ｍａｉｏら、（１９８９）Ｃａｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３０：３４−４２、ならびに米国特許第４，７６２，７９１号および同第４，７２７，１３８号）；Ｇ−ＣＳＦ（米国特許第４，９９９，２９１号および同第４，８１０，６４３号）；ＧＭ−ＣＳＦ（国際公開番号ＷＯ８５／０４１８８）。
【０１５５】
免疫調節性因子はまた、これらの分子に対するアゴニスト、アンタゴニストまたはリガンドであり得る。例えば、可溶性形態のレセプターは、しばしば、変異形態の因子自体と同様に、これらの型の因子に対するアンタゴニストとして挙動し得る。
【０１５６】
上記の基質をコードする核酸分子、本発明での使用に有利である他の核酸分子は、種々の供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのような寄託所を含む）から、またはＢｒｉｔｉｓｈ　Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｓｙ　Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｃｏｗｌｅｙ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｅｎｇｌａｎｄ）のような商業的供給源から容易に得られ得る。代表的な例としては、ＢＢＧ１２（１２７個のアミノ酸の成熟タンパク質をコードするＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を含む）、ＢＢＧ６（これは、γインターフェロンをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号３９６５６（これは、ＴＮＦをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号２０６６３（これは，αインターフェロンをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号３１９０２、３１９０２および３９５１７（これは、βインターフェロンをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６７０２４（これは、インターロイキン１ｂをコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号３９４０５、３９４５２、３９５１６、３９６２６および３９６７３（これは、インターロイキン２をコードする配列を含む）、５９３９９、５９３９８および６７３２６（これは、インターロイキン３をコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号５７５９２（これは、インターロイキン４をコードする配列を含む）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号５９３９４および５９３９５（これは、インターロイキン５をコードする配列を含む）、ならびにＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６７１５３（これは、インターロイキン６をコードする配列を含む）が挙げられる。
【０１５７】
サイトカイン遺伝子または免疫調節遺伝子を含むプラスミド（国際公開番号ＷＯ９４／０２９５１およびＷＯ９６／２１０１５）は、適切な制限酵素で消化され得、そして目的の特定の遺伝子を含むＤＮＡフラグメントは、標準的な分子生物学的技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、またはＡｕｓｂｅｌら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、遺伝子伝達ベクターに挿入され得る。
【０１５８】
上記の分子をコードするポリヌクレオチド配列は、例えば、遺伝子を発現するｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、またはこれを含むことで公知のベクターから遺伝子を誘導することによって得られ得る。例えば、変更された細胞産物をコードする配列を含むプラスミドは、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．のような寄託所からまたは商業的供給源から得られ得る。目的のヌクレオチド配列を含むプラスミドは、適切な制限酵素で消化され得、そしてこのヌクレオチドを含むＤＮＡフラグメントは、標準的な分子生物学的な技術を使用して遺伝子伝達ベクターに挿入され得る。
【０１５９】
あるいは、本発明での使用のためのｃＤＮＡ配列は、標準的な技術（例えば、フェノール抽出およびｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのＰＣＲ）を使用して、配列を発現するか、または含む細胞から得られ得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出（ＤＮＡを得るためおよびＤＮＡを単離するために使用される技術の記載）を参照のこと。簡潔には、目的の遺伝子を発現する細胞由来のｍＲＮＡは、オリゴ−ｄＴまたはランダムポリマーを使用して、逆転写酵素で逆転写され得る。次いで、この単鎖ｃＤＮＡは、所望の配列のいずれかの側の配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＰＣＲによって増幅され得る（米国特許第４，６８３，２０２号、銅第４，６８３，１９５号、および同第４，８００，１５９号を参照のこと、またＰＣＲ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｒｌｉｃｈ（編），Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照のこと）。
【０１６０】
目的のヌクレオチド配列はまた、ＤＮＡ合成器（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　３９２　ＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＡＢＩ、Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから市販されている））を使用して、クローン化ではなく合成により生成され得る。このヌクレオチド配列は、所望される発現産物の適切なコドンを用いて設計され得る。完全な配列が、標準的な方法によって調製されたオーバーラップオリゴヌクレオチドから構築され、そして完全なコード配列に構築される。例えば、Ｅｄｇｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ　２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２３：１２９９；Ｊａｙら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１を参照のこと。
【０１６１】
本発明の合成発現カセットは、レンチウイルスベクターを使用するために、パッケージング細胞株を構築において使用され得る。
【０１６２】
１つの型のレトロウイルス、マウスの白血病ウイルス、または「ＭＬＶ」は、遺伝子治療適用のために広範に利用されている（一般に、Ｍａｎｎら（Ｃｅｌｌ３３：１５３，１９９３）、ＣａｎｅおよびＭｕｌｌｉｇａｎ（Ｐｒｏｃ，Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８１：６３４９，１９８４）、ならびにＭｉｌｌｅｒら，Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ２ｌｅｒａｐｙ１：５−１４，１９９０を参照のこと）。
【０１６３】
レンチウイルスベクターは、代表的に、５’レンチウイルスＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パーケージングシグナル、１個以上の目的の遺伝子に作動可能に連結したプロモーター、第２のＤＮＡ鎖合成の起点、３’レンチウイルスＬＴＲを含み、ここで、このレンチウイルスベクターは、核輸送エレメントを含む。この核輸送エレメントは、目的のコード配列（例えば、目的の合成Ｇａｇまたは合成Ｅｎｖの発現カセット）の上流（５’）または下流（３’）のいずれかに配置され得る。特定の実施形態において、核輸送エレメントは、ＲＲＥではない。一実施形態において、パッケージングシグナルは、伸長されたパッケージングシグナルである。他の実施形態において、このプロモーターは、組織特異的なプロモーターであるか、あるいはＣＭＶのようなプロモーターである。他の実施形態において、このレンチウイルスベクターは、内部リボソーム導入部位（ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅ）をさらに含む。
【０１６４】
広範な種々のレンチウイルスは、本発明の範囲内で利用され得、これには、例えば、ＨＩＶ、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＦＩＶおよびＳＩＶからなる群から選択されるレンチウイルスが挙げられる。
【０１６５】
本発明の一実施形態において、合成Ｇａｇポリメラーゼ発現カセット（プロモーター、ならびに合成Ｇａｇポリメラーゼおよびｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆまたはｖｉｆのうち少なくとも１個をコードする配列を含む）が提供され、ここで、このプロモーターは、Ｇａｇポリメラーゼおよびｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆまたはｖｉｆに作動可能に連結される。
【０１６６】
本発明のなお別の局面において、宿主細胞（例えば、パッケージング細胞株）（本明細書中に記載される発現カセットのいずれかを含む）が、提供される。例えば、一局面内において、パッケージング細胞株（合成Ｇａｇポリメラーゼをコードする配列、および核輸送エレメントを含む発現カセットを含む）が、提供され、ここで、このプロモーターは、Ｇａｇポリメラーゼをコードする配列に作動可能に連結される。パッケージング細胞株は、ｔａｔ、ｒｅｖ、またはエンベロープを含むプロモーターおよび配列をさらに含み得、ここで、このプロモーターは、ｔａｔ、ｒｅｖ、Ｅｎｖをコードする配列、またはこれらのタンパク質の改変バージョンをコードする配列に作動可能に連結される。このパッケージング細胞株は、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕまたはｖｐｒ（野生型または合成）のうちいずれか１つ以上をコードする配列をさらに含み得る。
【０１６７】
一実施形態において、発現カセット（例えば、合成Ｇａｇポリメラーゼを保有する）は、安定的に組み込まれる。このパッケージング細胞株は、レンチウイルスベクターの導入により、代表的に粒子を生成する。この合成発現カセットのプロモーター調節発現は、誘導性であり得る。代表的に、このパッケージング細胞株は、レンチウイルスベクターの導入により、複製コンピテントウイルスを本質的に含まない粒子を生成する。
【０１６８】
パッケージング細胞株（合成Ｇａｇポリメラーゼ遺伝子の発現を指向する発現カセットを含むか、または本明細書中に記載される合成Ｅｎｖ遺伝子の発現を指向する発現カセットを含む）が、提供される。（他の改変Ｅｎｖ配列の記載に関して、Ａｎｄｒｅ，Ｓ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　７２（２）：１４９７−１５０３、１９９８；Ｈａａｓ，Ｊ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　６（３）：３１５−３２４、１９９６も参照のこと）。レンチウイルスベクターは、ベクター産生細胞株を産生するためにパッケージング細胞株に導入される。
【０１６９】
上記のように、レンチウイルスベクターは、目的の選択された遺伝子または配列を保有または発現するように設計され得る。レンチウイルスベクターは、広範の種々のレンチウイルスから容易に構築され得る（ＲＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ，第２版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８５を参照のこと）。レンチウイルスの代表的な例としては、ＨＩＶ、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＦＩＶおよびＳＩＶが挙げられる。このようなレンチウイルスは、患者の単離物から、またはより好ましくは、ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのような寄託機関または収集機関から得られるか、あるいは、利用可能な技術を使用して公知の供給源から単離されるかのいずれかである。
【０１７０】
レンチウイルス遺伝子送達ベクター（またはビヒクル）の部分は、異なるウイルス由来であり得る。例えば、所定の組換えレンチウイルスベクターにおいて、ＬＴＲは、ＨＩＶ、ＳＩＶ由来のパッケージングシグナル、およびＨｒＶ−２由来の第２の鎖合成の起点由来であり得る。レンチウイルスベクター構築物は、５’レンチウイルスＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、１以上の異種配列、第２のＤＮＡ鎖合成の起点、および３’ＬＴＲを含み得、ここで、このレンチウイルスベクターは、ＲＲＥではない核輸送エレメントを含む。
【０１７１】
簡潔には、末端繰返し配列（「ＬＴＲ」）は、Ｕ５、ＲおよびＵ３と命名された３つのエレメントに分けられる。これらのエレメントは、レトロウイルスの生物学的な活性に寄与する種々のシグナルを含み、これには、例えば、Ｕ３内に配置されるプロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントが挙げられる。ＬＴＲは、このゲノムのいずれかの末端でのそれらの正確な複製に起因して、プロウイルス（組み込まれたＤＮＡ形態）において容易に同定され得る。本明細書中で使用される場合、５’ＬＴＲは、５’プロモーターエレメントおよび十分なＬＴＲ配列を含み、逆転写およびこのベクターのＤＮＡ形態の組み込みを可能にすることが理解されるべきである。この３’ＬＴＲは、ポリアデニル化シグナル、および十分なＬＴＲ配列を含み、逆転写およびこのベクターのＤＮＡ形態の組み込みを可能にすることが理解されるべきである。
【０１７２】
ｔＲＮＡ結合部位および第２のＤＮＡ鎖合成の起点はまた、レトロウイルスが生物学的に活性となるのに重要であり、そして当業者によって容易に同定され得る。例えば、レトロウイルスは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対によってｔＲＮＡ結合部位に結合し、そしてウイルス粒子中にこのレトロウイルスゲノムを運搬する。次いでこのｔＲＮＡは、逆転者酵素によってＤＮＡ合成のためのプライマーとして利用される。このｔＲＮＡ結合部位は、５’ＬＴＲからちょうど下流の位置に基づいて容易に同定され得る。同様に、第２のＤＮＡ鎖合成の起点は、その名前から暗示されるように、レトロウイルスの第２のＤＮＡ鎖合成のために重要である。この領域（この領域は、ポリプリントラクト（ｔｒａｃｔ）との呼ばれる）は、３’ＬＴＲのちょうど上流に位置する。
【０１７３】
５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、および第２のＤＮＡ鎖合成の起点に加えて、組換えレトロウイルスベクター構築物はまた、パッケージングシグナル、および目的の１つ以上の遺伝子またはコード配列を含み得る。さらに、このレンチウイルスは、核輸送エレメント（好ましい実施形態において、ＲＲＥではない）を有する。適切な核輸送エレメントの代表的な例としては、ラウス肉腫ウイルスのエレメント（Ｏｇｅｒｔら、Ｊ　ＶｉｒｏＬ　７０、３８３４−３８４３、１９９６）、ラウス肉腫ウイルスのエレメント（Ｌｉｕ　＆　Ｍｅｒｔｚ、Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖ．、９、１７６６−１７８９、１９９５）およびシミアンレトロウイルスＩ型のゲノムのエレメント（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら、Ｊ　Ｖｉｒｏｌ．６８、７９４４−７９５２、１９９４）が挙げられる。他の潜在的なエレメントとしては、ヒストン遺伝子のエレメント（Ｋｅｄｅｓ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４８、８３７−８７０、１９７０）、α−インターフェロン遺伝子（Ｎａｇａｔａら、Ｎａｔｕｒｅ　２８７、４０１−４０８、１９８０）、β−アドレナリン作用性レセプター遺伝子（Ｋｏｉｌｋａら、Ｎａｔｕｒｅ　３２９、７５−７９、１９８７）、ならびにｃ−Ｊｕｎ遺伝子（Ｈａｔｔｏｒｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５、９１４８−９１５２、１９８８）が挙げられる。
【０１７４】
組換えレンチウイルスベクターは、代表的に、Ｇａｇポリメラーゼコード配列およびＥｎｖコード配列の両方を欠失している。組換えレンチウイルスベクターは、代表的に、２０個未満、好ましくは、１５個、より好ましくは、１０個、そして最も好ましくは、８個の連続したヌクレオチド（ＧａｇポリメラーゼおよびＥｎｖ遺伝子中に見出される）を含む。本発明の１つの利点は、合成Ｇａｇポリメラーゼ発現カセット（これは，組換えレトロウイルスベクター構築のためにパッケージング細胞株を構築するために使用され得る）が、野生型Ｇａｇポリメラーゼ配列に対してほとんど相同性を有さず、従って、合成配列と野生型配列との間の相同組換えの可能性をかなり減少または排除するということである。
【０１７５】
レンチウイルスベクターはまた、目的の１個以上の遺伝子または配列の発現を駆動する組織特異的プロモーターを含み得る。
【０１７６】
レンチウイルスベクター構築物は、目的の１個以上の遺伝子発現されるように生成され得る。これは、ジシストロンカセットまたはオリゴシストロンカセット（例えば、このコード領域は、８０個以下のヌクレオチドによって分離される（一般的に、Ｌｅｖｉｎら、Ｇｅｎｅ　１０８：１６７−１７４、１９９１を参照のこと））の使用を介して、または内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）の使用を介して達成され得る。
【０１７７】
上記の組換えレトロウイルスベクター構築物と共に使用するのに適したパッケージング細胞株は、本明細書中で提供される開示から容易に調製され得る。簡潔に、このパッケージング細胞株が由来する親の細胞株は、種々の哺乳動物の細胞株から選択され得、これには、例えば、２９３、ＲＤ、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＨＴ１０８０、および骨髄腫細胞が挙げられる。
【０１７８】
パッケージング細胞株の生成のために適切な宿主細胞の選択後、１個以上の発現カセットが、欠失されているベクター成分をトランスで捕捉または供給するために、細胞株中に導入される。
【０１７９】
適切な発現カセットの代表的な例は、本明細書中に記載されており、そして合成Ｅｎｖ、合成Ｇａｇ、合成Ｇａｇプロテアーゼ、および合成Ｇａｇポリメラーゼの発現カセットを含み、これらは、プロモーター、ならびに、例えば、Ｇａｇポリメラーゼおよびｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆまたはｖｉｆのうち少なくとも１個をコードする配列を含み、ここで、このプロモーターは、Ｇａｇポリメラーゼおよびｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆまたはｖｉｆに作動可能に連結される。上記のように、ネイティブなコード配列および／または合成コード配列はまた、これらの発現カセットにおいて利用され得る。
【０１８０】
上記の発現カセットを利用することにより、広範な種々のパッケージング細胞株が産生され得る。例えば、一局面において、パッケージング細胞株（合成Ｇａｇポリメラーゼをコードする配列、および核輸送エレメントを含む発現カセットを含む）が、提供され、ここで、このプロモーターは、Ｇａｇポリメラーゼをコードする配列に作動可能に連結される。他の局面において、パッケージング細胞株（プロモーター、およびｔａｔ、ｒｅｖ、Ｅｎｖ、もしくは他のＨＩＶ抗原、またはそれら由来のエピトープをコードする配列を含む）が、提供され、ここで、このプロモーターは、ｔａｔ、ｒｅｖ、Ｅｎｖ、もしくは他のＨＩＶ抗原またはエピトープをコードする配列に作動可能に連結される。さらなる実施形態において、このパッケージング細胞株は、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕまたはｖｐｒのうちいずれか１個以上をコードする配列を含み得る。例えば、このパッケージング細胞株は、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕまたはｖｐｒ単独、ｎｅｆとｖｉｆ、ｎｅｆとｖｐｕ、ｎｅｆとｖｐｒ、ｖｉｆとｖｐｕ、ｖｉｆとｖｐｒ、ｖｐｕとｖｐｒ、ｎｅｆ、ｖｉｆとｖｐｕ、ｎｅｆ、ｖｉｆとｖｐｒ、ｎｅｆ、ｖｐｕとｖｐｒ、ｖｖｉｒ、ｖｐｕとｖｐｒ、またはｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕとｖｐｒの４つ全てのみを含み得る。
【０１８１】
１つの実施形態において、この発現カセットは、安定的に組み込まれる。別の実施形態において、このパッケージング細胞株は、レンチウイルスベクターの組み込みにより、粒子を生成する。さらなる実施形態において、このプロモーターは、誘導性である。本発明の特定の好ましい実施形態において、このパッケージング細胞株は、レンチウイルスベクターの導入により、複製コンピテントウイルスを含まない粒子を生成する。
【０１８２】
改変されたコード配列を含む合成カセットは、選択された細胞株にトランスフェクトされる。（ｉ）代表的に、ＨＩＶコード配列の組み込まれた安定的なコピーを保有し、そして（ｉｉ）これらのポリペプチドの受容可能なレベルを発現する、トランスフェクトされた細胞が選択される（発現は、当該分野で公知の方法により評価され得る（例えば、実施例１〜４を参照のこと））。この細胞株がＶＬＰを産生する能力はまた、変化し得る。
【０１８３】
目的の配列は、上記のように適切なウイルスベクター中に構築される。次いで、この不完全なウイルスは、パッケージング細胞株にトランスフェクトされる。このパッケージング細胞株は、ウイルス用粒子を産生するのに必用なウイルス性機能を提供し、この粒子に目的の配列を含む不完全なウイルスゲノムをパッケージングする。次いで、これらのＶＬＰが単離され、そして例えば、遺伝子送達または遺伝子治療に使用され得る。
【０１８４】
さらに、このようなパッケージング細胞株はまた、ＶＬＰのみを産生するために使用され得、このＶＬＰは、例えば、他の抗原と共に投与するためのアジュバンドとして、またはワクチン組成物に使用され得る。また、パッケージング細胞株中の、ポリペプチド（例えば、抗原）をコードする選択された目的の配列の同時発現はまた、結果として、この選択されたポリペプチドのＶＬＰ中への包理および／またはこの選択されたポリペプチドのＶＬＰとの結合を生じ得る。
【０１８５】
本発明の異なる実施形態の種々の形態（例えば、構築物）が、組み合わせられ得る。
【０１８６】
（２．４　ＤＮＡ免疫および遺伝子送達）
種々のＨＩＶポリペプチド抗原、特にＣ型ＨＩＶ抗原は、本発明の粒子中で使用され得る。ＨＩＶ抗原は、ＤＮＡ免疫構築物中に含まれ得、この構築物は、例えば、インフレーム中で、ポリペプチド抗原（合成または野生型）のコード配列に融合される合成Ｇａｇ発現カセットを含み、この構築物の発現により、目的の抗原を提示するＶＬＰが得られる。
【０１８７】
本発明の実施に使用される特定の目的のＨＩＶ抗原としては、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、ｖｐｒおよび他のＨＩＶ抗原またはそれら由来のエピトープが挙げられる。これらの抗原は、合成（本明細書中で記載される）または野生型であり得る。さらに、パッケージング細胞株は、以下を含む：ｎｅｆのみ、およびＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶなどとしても知られる）（例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｇｐ１６０（ネイティブおよび改変体の両方）が挙げられるが、これらに限定されない）；Ｇａｇ；ならびに種々の単離体由来のｐｏｌ（多様なサブタイプ由来のＨＩＶＩＩＩｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＩＶ−１ＳＦ１６２、ＨＩＶ−１ＳＦ１７０、ＨＩＶＬＡＶ、ＨＩＶＬＡＩ、ＨＩＶＭＮ、ＨＩＶ−１ＣＭ２３５、ＨＩＶ−１ＵＳ４、種々のサブタイプ（例えば、サブタイプＡ〜Ｇ、およびＯ）由来の他のＨＩＶ−１株、ＨＩＶ−２株および種々のサブタイプ（例えば、ＨＩＶ−２ＵＣ１およびＨＩＶ−２ＵＣ２）が挙げられるが、これらに限定されない）。例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ　Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ、Ｎｅｗ　Ｍｅｘｉｃｏ；Ｍｙｅｒｓら、Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　ａｎｄ　Ａｉｄｓ、１９９０、Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ、Ｎｅｗ　Ｍｅｘｉｃｏ；Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと。
【０１８８】
効力を評価するために、本発明の合成発現カセットを使用して有効なＤＮＡ免疫が実施され得、例えば、実施例４に記載されるように実施され得る。マウスは、Ｇａｇ（および／またはＥｎｖ）合成発現カッセットならびにＧａｇ（および／またはＥｎｖ）野生型発現カセットの両方で免疫される。プラスミドＤＮＡを用いたマウスの免疫化は、この合成発現カセットがネイティブな発現カセットに対して免疫原性の明瞭な改良を提供することを示す。また、第２のブースト免疫は、例えば、約２週間後に、第２の免疫応答を誘導する。さらに、ＣＴＬアッセイの結果は、ＤＮＡ免疫化による細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の誘導について、合成Ｇａｇ（および／またはＥｎｖ）発現カセットの増強した効力を示す。
【０１８９】
本発明は、広範の種々の抗原に対する免疫応答を固定し、そしてこれにより、ＨＩＶ感染、特にＣ型ＨＩＶ感染を処置または予防するために使用され得ることが容易に明らかである。
【０１９０】
（２．４．１　本発明の合成発現カセットの送達）
上記の分子をコードするポリヌクレオチド配列は、組換え方法を使用して、例えば、この遺伝子を発現する細胞からのｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、または遺伝子を含むことが知られているベクターから遺伝子を誘導することによって、得られ得る。さらに、所望の遺伝子は、標準的な技術（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのフェノール抽出およびＰＣＲ）を使用して、この遺伝子を含む細胞および組織から直接的に単離され得ることが容易に理解される。ＤＮＡを得るためおよび単離するために使用される技術の記載について、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと。目的の遺伝子はまた、クローン化ではなく、合成により産生され得る。このヌクレオチド配列は、所望される特定のアミノ酸配列について、適切なコドンで設計され得る。一般に、配列が発現される、意図される宿主に対して、好ましいコドンを選択する。完全な配列は、標準的な方法によって調製されるオーバーラップオリゴヌクレオチドから構築され、そして完全なコード配列へと構築される。例えば、Ｅｄｇｅ、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２３：１２９９；Ｊａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８４）２５９：６３１１；Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｗ．Ｐ．Ｃ．、（１９９５）Ｇｅｎｅ　１６４：４９〜５３を参照のこと。
【０１９１】
次に、所望の抗原をコードする遺伝子配列は、本発明の合成発現カセットを含むベクターに挿入され得る。特定の実施形態において、抗原は、Ｇａｇコード配列に挿入され、その結果、複合配列が発現される場合に、Ｇａｇポリペプチドおよび目的の抗原（例えば、Ｅｎｖ（ネイティブまたは改変体）またはＨＩＶ由来の他の抗原（ネイティブまたは改変体））を含むＶＬＰの産物を生じる。挿入は、コード配列内またはコード配列のいずれかの末端（発現されたＧａｇポリペプチドの５’アミノ末端；または発現されたＧａｇポリペプチドの３’カルボキシル末端）で作製され得る（Ｗａｇｎｅｒ，Ｒら、Ａｒｃｈ　Ｖｉｒｏｌ．１２７：１１７−１３７、１９９２；Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２００：１６２−１７５、１９９４；Ｗｕ，Ｘ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９（６）：３３８９−３３９８、１９９５；Ｗａｎｇ，Ｃ−Ｔ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２００：５２４−５３４、１９９４；Ｃｈａｚａｌ，Ｎ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６８（１）：１１１−１２２、１９９４；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７（６）：３１９１−３１９８、１９９３；Ｒｅｉｃｉｎ，Ａ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９（２）：６４２−６５０、１９９５）。
【０１９２】
ｐ５５　Ｇａｇのコード配列の５０％までは、ウイルス様粒子への構築および発現効率に影響を与えることなく欠失され得る（Ｂｏｒｓｅｔｔｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１１）：９３１３−９３１７、１９９８；Ｇａｍｉｅｒ，Ｌ．ら、Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　７２（６）：４６６７−４６７７、１９９８；Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ら、Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　７２（３）：１７８２−１７８９、１９９８；Ｗａｎｇ，Ｃ．ら、Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　７２（１０）：７９５０−７９５９、１９９８）。本発明の一実施形態において、合成Ｇａｇ発現カセットを発現する高いレベルの免疫原性は、異なる構造または非構造のＨＩＶ抗原、マルチエピトープカセット、またはサイトカイン配列をＧａｇ配列の欠失領域に挿入することによって増加され得る。このような欠失は、本発明の技術および当業者に利用可能な情報に従って作製され得る。異種ポリペプチドに融合された全長配列を使用するのに対する、本アプローチの１つの可能な利点は、発現産物のより高い発現効率／分泌効率であり得る。
【０１９３】
配列が、Ｇａｇのアミノ末端に付加される場合、ポリヌクレオチドは、ミリスチン部分のＧａｇ含有ポリペプチドへの付加のためのシグナルをコードする、５’末端のコード配列（例えば、Ｍｅｔ−Ｇｌｙをコードする配列）を含み得る。
【０１９４】
Ｇａｇ含有ポリペプチド構築物がＶＬＰを形成する能力は、本明細書の教示に従って実験的に決定され得る。
【０１９５】
合成発現カセットはまた、コード配列に作動可能に連結された制御エレメントを含み得、これは、目的の種においてインビボで遺伝子の発現を可能にする。例えば、哺乳動物細胞発現の代表的なプロモーターとしては、特に、ＳＶ４０初期プロモーター、ＣＭＶプロモーター（例えば、ＣＭＶ極初期プロモーター）、マウス乳腺ガンウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ　ＭＬＰ）、および単純疱疹ウイルスプロモーターが挙げられる。他の非ウイルスプロモーター（例えば、マウスメタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｅｉｏｎｅｉｎ）遺伝子）に由来するプロモーター）はまた、哺乳動物発現についての使用を見出す。代表的には、転写終止およびポリアデニル化配列もまた存在し、翻訳終止コドンの３’側に位置する。好ましくは、翻訳の開始の最適化のための配列（コード配列の５’側に配置する）もまた存在する。転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルの例としては、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載される、ＳＶ４０由来のもの、ならびにウシ成長ホルモンターミネーター配列が挙げられる。
【０１９６】
エンハンサーエレメントはまた、哺乳動物構築物の発現レベルを増加するために本明細書中で使用され得る。例としては、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊｋｅｍａら、ＥＭＢＯ　Ｊ．（１９８５）４：７６１に記載される）、Ｒｏｕｓ　Ｓａｒｃｏｍａウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）から誘導されるエンハンサー／プロモーター（Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２ｂ）７９：６７７７に記載される）およびヒトＣＭＶに由来するエレメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１に記載される）（例えば、ＣＭＶイントロンＡ配列に含まれるエレメント）が挙げられる。
【０１９７】
さらに、キメラ抗原−コード遺伝子配列を含み、例えば、１つより多くのウイルス単離体に由来する、例えば、目的の複数抗原／エピトープをコードする、プラスミドが構築され得る。
【０１９８】
代表的には、抗原コード配列は、合成コード配列より先にあるか、合成コード配列に続き、そしてキメラ転写ユニットは、目的の抗原および合成コード配列の両方をコードする単一のオープンリーディングフレームを有する。あるいは、複数シストロンカセット（例えば、二シストロンカセット）が構築され得、ＥＭＣＶ　ＩＲＥＳなどを使用して、単一のｍＲＮＡから複数の抗原の発現を可能にする。
【０１９９】
一旦完了すると、構築物は、標準的な遺伝子送達プロトコルを使用して、核酸免疫化のために使用される。遺伝子送達のための方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、同第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号を参照のこと。遺伝子は、直接、脊椎動物被験体に送達されるか、あるいは、被験体由来の細胞に、エキソビボに送達され、そして細胞が被験体に再移植され得るかのいずれかであり得る。
【０２００】
多数のウイルスに基づく系が、哺乳動物細胞への遺伝子移入のために開発された。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための従来のプラットフォームを提供する。選択された配列は、ベクターに挿入され得、そして当該分野で公知の技術を使用してレトロウイルス粒子にパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスは、単離され、そしてインビボまたはエキソビボのいずれかで、被検体の細胞に送達される。多数のレトロウイルス系が記載されている（米国特許第５，２１９，７４０号；ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８９）７：９８０−９９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９０）１：５−１４；Ｓｃａｒｐａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）１８０：８４９−８５２；Ｂｕｒｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：８０３３−８０３７；ならびにＢｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．（１９９３）３：１０２−１０９）。
【０２０１】
多数のアデノウイルスベクターがまた記載されている。宿主ゲノムに組み込まれるレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは、挿入変異に関連する危険を染色体外的に最小化し続ける（Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら、Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒら、Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８８）６：６１６−６２９；ならびにＲｉｃｈら、Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９３）４：４６１−４７６）。
【０２０２】
さらに、種々のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系は、遺伝子送達のために開発されている。ＡＡＶベクターは、当該分野で周知の技術を使用して容易に構築され得る。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号；国際公開番号ＷＯ　９２／０１０７０（１９９２年１月２３日公開）およびＷＯ　９３／０３７６９　（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ　９０（１９９０）（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ，ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７９３−８０１；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：１６５−１６９；ならびにＺｈｏｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９４）１７９：１８６７−１８７５を参照のこと。
【０２０３】
本発明のポリヌクレオチドを送達するために有用な別のベクター系は、Ｓｍａｌｌ，Ｊｒ．，Ｐ．Ａ．ら（１９９７年１０月１４日に発行された、米国特許第５，６７６，９５０号）に記載される、腸管投与される組換えポックスウイルスワクチンである。
【０２０４】
目的の抗原をコードする核酸分子を送達するための用途を見出すさらなるウイルスベクターとしては、ワクシニアウイルスおよびトリポックスウイルスを含む、ポックスファミリーのウイルス由来のベクターである。例として、遺伝子を発現するワクシニア組換え体は、以下のように構築され得る。特定の合成ＨＩＶサブタイプＣポリペプチドコード配列をコードするＤＮＡは、最初に適切なベクターに挿入され、その結果、そのＤＮＡは、ワクシニアプロモーターおよび隣接ワクシニアＤＮＡ配列（例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする配列）に隣接する。次いで、このベクターを使用して、細胞をトランスフェクトし、この細胞をワクシニアで同時に感染させる。相同組換えは、ワクシニアプロモーターおよび目的のコード配列をコードする遺伝子を、ウイルスゲノムに挿入するのに役立つ。得られるＴＫ−組換え体は、細胞を５−ブロモデオキシウリジンの存在下で培養し、そしてそれに対して抵抗性のウイルスプラークを摘み上げることによって選択され得る。
【０２０５】
あるいは、アビポックスウイルス（例えば、鶏痘ウイルスおよびカナリア痘ウイルス）はまた、遺伝子を送達するために使用され得る。組換えアビポックスウイルス（哺乳動物病原体から免疫原を発現する）は、非トリ種に投与される場合、保護免疫を与えることが知られている。アビポックスベクターの使用は、ヒトおよび他の哺乳動物種において特に望ましい。なぜなら、アビポックス属のメンバーは、感受性のトリ種においてのみ産生的に複製し得、従って、哺乳動物細胞に感染しないからである。組換えアビポックスウイルスを産生するための方法は、当該分野において公知であり、そしてワクシニアウイルスの産生に関して上記のように、遺伝子組換えを使用する。例えば、ＷＯ　９１／１２８８２；ＷＯ　８９／０３４２９；およびＷＯ　９２／０３５４５を参照のこと。
【０２０６】
分子結合ベクター（例えば、Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：６８６６−６８６９およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：６０９９−６１０３に記載されるアデノウイルスキメラベクター）はまた、遺伝子送達のために使用され得る。
【０２０７】
アルファウイルス属のメンバー（例えば、限定しないが、Ｓｉｎｄｂｉｓウイルス、Ｓｅｍｌｉｋｉ　Ｆｏｒｅｓｔウイルス、およびＶｅｎｅｚｕｅｌａｎ　Ｅｑｕｉｎｅ　Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓウイルスに由来するベクター）はまた、本発明のポリヌクレオチドを送達するためのウイルスベクターとしての使用を見出す（例えば、発現カセットをコードする合成Ｇａｇ−ポリヌクレオチド）。本発明の方法の実行に有用なＳｉｎｄｂｉｓウイルス由来ベクターの記載について、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：５０８−５１９；ならびに国際公開番号ＷＯ　９５／０７９９５およびＷＯ　９６／１７０７２；ならびに、Ｄｕｂｅｎｓｋｙ，Ｊｒ．，Ｔ．Ｗ．ら、米国特許第５，８４３，７２３号（１９９８年１２月１日発行）、およびＤｕｂｅｎｓｋｙ，Ｊｒ．，Ｔ．Ｗ．，米国特許第５，７８９，２４５号（１９９８年８月４日発行）を参照のこと。
【０２０８】
ワクシニアに基づく感染／トランスフェクション系は、宿主細胞中の目的のコード配列の誘導性一過性発現を提供するために便利に使用され得る。この系において、細胞は、最初に、バクテリオファージＴ７　ＲＮＡポリメラーゼをコードするワクシニアウイルス組換え体を用いてインビトロで感染される。このポリメラーゼは、それがＴ７プロモーターを有するテンプレートのみを転写する点で、すばらしい特異性を示す。感染に続いて、細胞を、Ｔ７プロモーターによって駆動される、目的のポリヌクレオチドを用いてトランスフェクトする。ワクシニアウイルス組換え体から細胞質において発現されるポリメラーゼは、トランスフェクトされたＤＮＡをＲＮＡに転写し、これは、次いで、宿主翻訳機構によってタンパク質に翻訳される。この方法は、大量のＲＮＡおよびその翻訳産物の高いレベルの一過性細胞質産生を提供する。例えば、Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：６７４３−６７４７；Ｆｕｅｒｓｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：８１２２−８ｌ２６を参照のこと。
【０２０９】
ワクシニアウイルス組換え体またはアビポックスウイルス組換え体を用いた感染、あるいは他のウイルスベクターを使用する遺伝子の送達に対する代替のアプローチとして、宿主細胞への導入に続く高レベルの発現を導く増幅系が使用され得る。具体的には、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼについてのコード領域に先行するＴ７　ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが操作され得る。このテンプレートから誘導されるＲＮＡの翻訳は、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを産生し、これは、次いで、より多くのテンプレートを転写する。同時に、発現がＴ７プロモーターの制御下にあるｃＤＮＡが存在する。このように、増幅テンプレートＲＮＡの翻訳から生成するＴ７　ＲＮＡポリメラーゼのいくつかは、所望の遺伝子の転写を導く。いくつかのＴ７　ＲＮＡポリメラーゼが、増幅を開始するために必要とされるので、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼは、転写反応をプライムするために、テンプレートに沿って細胞に導入され得る。ポリメラーゼは、タンパク質として導入され得るか、またはＲＮＡポリメラーゼをコードするプラスミド上に導入され得る。Ｔ７系および細胞を形質転換するためのそれらの使用についてのさらなる考察について、例えば、国際公開番号ＷＯ　９４／２６９１１；ＳｔｕｄｉｅｒおよびＭｏｆｆａｔｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）１８９：１１３−１３０；ＤｅｎｇおよびＷｏｌｆｆ，Ｇｅｎｅ（１９９４）１４３：２４５−２４９；Ｇａｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９４）２００：１２０１−１２０６；ＧａｏおよびＨｕａｎｇ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．（１９９３）２１：２８６７−２８７２；Ｃｈｅｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．（１９９４）２２：２１１４−２１２０；ならびに米国特許第５，１３５，８５５号を参照のこと。
【０２１０】
目的の合成発現カセットはまた、ウイルスベクターなしで送達され得る。例えば、合成発現カセットは、被験体への送達または被験体から誘導される細胞への送達の前に、リポソーム中にパッケージングされ得る。脂質カプセル化は、一般的に核酸に安定に結合し得るか、または核酸を捕捉および維持し得るリポソームを用いて達成される。縮合ＤＮＡの脂質調製物に対する比は、さまざまであり得るが、一般的に約１：１（ｍｇＤＮＡ：マイクロモル脂質）であるか、またはより多くの脂質である。核酸の送達のためのキャリアとしてのリポソーム使用の概説については、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９９１）１０９７：１−１７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｇｙ（１９８３）１０１：５１２−５２７頁を参照のこと。
【０２１１】
本発明における使用のためのリポソーム調製物としては、カチオン性（正に荷電した）、アニオン性（負に荷電した）および中性の調製物が挙げられ、カチオン性リポソームが特に好ましい。カチオン性リポソームは、機能的な形態で、プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６）；ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：６０７７−６０８１）；および精製した転写因子（Ｄｅｂｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）２６５：１０１８９−１０１９２）の細胞内送達を媒介することが示されている。
【０２１２】
カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは、ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹからの商標リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）の下で入手可能である（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６もまた参照のこと）。他の市販されている脂質としては、（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）が挙げられる。他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技法を使用して容易に利用可能な物質から調製され得る。例えば、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記載について、Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４−４１９８；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１１０９２を参照のこと。
【０２１３】
同様に、アニオン性および中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏｌａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から容易に入手可能であるか、または容易に入手可能な物質を使用してたやすく調製され得る。このような物質としては、とりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの物質はまた、適切な比率のＤＯＴＭＡおよびＤＯＴＡＰの出発物質と混合され得る。これらの物質を使用してリポソームを作製する方法は、当該分野で周知である。
【０２１４】
このリポソームは、多重膜のベシクル（ＭＬＶ）、小さな単一膜ベシクル（ＳＵＶ）、または大きな単一膜のベシクル（ＬＵＶ）を含み得る。種々のリポソーム−核酸複合体は当該分野で公知の方法を使用して調製され得る。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、ＭＥＴＨＯＤＳ　ＯＦ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（１９８３）１０１巻：５１２−５２７頁；Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４−４１９８；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７５）３９４：４８３；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ（１９７９）１７：７７）；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７６）４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９７７）７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３３４８）；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１４５；Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１４５；ならびにＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８２）２１５：１６６を参照のこと。
【０２１５】
ＤＮＡおよび／またはタンパク質抗原はまた、Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９７５）３９４：４８３−４９１によって記載される組成物に類似の蝸牛殻（ｃｏｃｈｌｅａｔｅ）脂質組成物で送達され得る。米国特許第４，６６３，１６１号および同第４，８７１，４８８号を参照のこと。
【０２１６】
目的の合成発現カセットはまた、粒子状のキャリアでカプセル化され得るか、粒子状のキャリアに吸収され得るか、または粒子状のキャリアに会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）し得る。このようなキャリアは、選択された抗原の複数コピーを、免疫系に提示し、そして局所的リンパ節における抗原の捕捉および保持を促進する。粒子は、マクロファージによって食作用を受け得、そしてサイトカイン放出を通じた抗原提示を促進し得る。特定のキャリアの例としては、ポリメチルメタクリレートポリマーから誘導されるキャリア、ならびにポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧとして公知）から誘導される微粒子が挙げられ得る。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅ　ＪＰら、Ｊ　Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１４（２）１９７−２１０，１９９７；Ｏ’Ｈａｇａｎ　ＤＴら、Ｖａｃｃｉｎｅ　１１（２）：１４９−５４，１９９３を参照のこと。適切な微粒子はまた、荷電した界面活性剤（例えば、アニオン性界面活性剤またはカチオン性界面活性剤）の存在下で作製されて、正味負の電荷または正味正の電荷を有する表面を有する微粒子を生じ得る。例えば、アニオン性界面活性剤（例えば、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）とともに製造された微粒子（すなわち、ＣＴＡＢ−ＰＬＧ微粒子）は、負に帯電した高分子（例えば、ＤＮＡ）を吸収する（例えば、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７３０８を参照のこと）。
【０２１７】
さらに、他の粒子系およびポリマーは、目的の遺伝子のインビボまたはエキソビボ送達のために使用され得る。例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジンのようなポリマー、ならびにこれらの分子の結合体は、目的の核酸を移すために有用である。同様に、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降または他の不溶性無機塩（例えば、リン酸ストロンチウム、ケイ酸アルミニウム（ベントナイトおよびカオリンを含む）、酸化クロム、ケイ酸マグネシウム、滑石など）は、本発明との使用を見出す。例えば、遺伝子移入に有用な送達系の総説について、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９０）５：１６３−１８７を参照のこと。Ｐｅｐｔｏｉｄｓ（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｎ．ら、１９９８年１１月３日に発行された、米国特許第５，８３１，００５号）もまた、本発明の構築物の送達のために使用され得る。
【０２１８】
さらに、金およびタングステンのような特定のキャリアを使用する微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）送達系は、本発明の合成発現カセットを送達するために特に有用である。この粒子は、送達される合成発現カセットでコーティングされ、そして「遺伝子銃」からの銃粉末放出を使用して、一般的に減圧大気下で高速に加速される。このような技術および従って有用な装置の説明について、例えば、米国特許第４，９４５，０５０号；同第５，０３６，００６号；同第５，１００，７９２号；同第５，１７９，０２２号；同第５，３７１，０１５号；および同第５，４７８，７４４号を参照のこと。また、ニードルレス注入系が使用され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ　１２：１５０３−１５０９，１９９４；Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）。
【０２１９】
本発明の合成発現カセットを運ぶ組換えベクターは、脊椎動物被験体への送達のための組成物に処方される。これらの組成物は、予防的（感染を予防するため）または治療的（感染の後に疾患を処置するため）のいずれかであり得る。組成物は、「治療的有効量」の目的の遺伝子を含み、その結果、免疫応答が、投与される個体において生成されるように、一定量の抗原が、インビボで産生され得る。必要な実際の量は、とりわけ、処置される被験体；処置される被験体の年齢および一般的状態；抗体を合成する、被験体の免疫系の能力；所望される保護の程度；処置される状態の重篤度；選択される特定の抗原およびその投与の様式に依存して、変動する。適切な有効量は、当業者によって容易に決定され得る。従って、「治療的有効量」は、慣用的な試行によって決定され得る比較的広い範囲である。
【０２２０】
組成物は、一般的に、１つ以上の「薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクル」（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノールなど）を含む。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化物質など）は、このようなビヒクル中に存在し得る。核酸取り込みおよび／または発現の特定の促進因子（ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）はまた、組成物中に含まれ得るか、または例えば、限定しないが、ブピバカイン、心臓毒およびスクロースと同時投与され得る。
【０２２１】
一旦処方されると、本発明の組成物は、被験体に直接投与され得る（例えば、上記のように）か、あるいは上記のような方法を使用して、被験体から誘導される細胞にエキソビボで送達され得る。例えば、エキソビボ送達および形質転換された細胞の被験体への再移植のための方法は、当該分野において公知であり、そして、これらの方法としては、例えば、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介トランスフェクション、リポフェクトアミンおよびＬＴ−１媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中でのポリヌクレオチドのカプセル化（対応する抗原を含むかまたは含まない）、および核へのＤＮＡの直接的な微量注入が挙げられ得る。
【０２２２】
合成発現カセット組成物のインビボでの直接的な送達は、一般的に、Ａｃｃｅｌｌ（登録商標）遺伝子送達系（ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）のような、従来のシリンジまたは遺伝子銃のいずれかを使用する注入によって、上記のように、ウイルスベクターを用いてまたは用いないで、達成される。構築物は、経鼻的、直腸的、および膣的、腹腔内的、静脈内的、経口的、または筋肉内的のような、皮下的、上皮的、皮内的、粘膜内的のいずれかで、注入され得る。表皮の細胞へのＤＮＡの送達は、特に好ましい。なぜなら、この投与の様式は、皮膚関連リンパ球へのアクセスを提供し、そしてレシピエントにおけるＤＮＡの一過性の存在を提供するからである。投与の他の様式としては、経口投与または肺投与、坐剤、ニードルレス注入、経皮的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）および経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）適用が挙げられる。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数用量スケジュールであり得る。核酸の投与はまた、ペプチドまたは他の物質の投与と組み合わせられ得る。
【０２２３】
（２．４．２　本発明の合成発現カセットのエキソビボ送達）
１つの実施形態において、Ｔ細胞、および関連する細胞型（限定しないが、抗原提示細胞（例えば、マクロファージ、単球、リンパ球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、幹細胞およびそれらの前駆細胞）が挙げられる）は、本発明の合成発現カセットのエキソビボ送達のために使用され得る。Ｔ細胞は、当業者に公知の種々の手順によって、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から単離され得る。例えば、Ｔ細胞集団は、補助細胞およびＢ細胞の除去によってＰＢＬの集団から「濃縮」され得る。特に、Ｔ細胞濃縮は、抗ＭＨＣクラスＩＩモノクローナル抗体を使用して、非Ｔ細胞の除去によって達成され得る。同様に、他の抗体は、非Ｔ細胞の特定の集団を枯渇させために使用され得る。例えば、抗Ｉｇ抗体分子は、Ｂ細胞を枯渇させるために使用され得、そして抗ＭａｃＩ抗体分子は、マクロファージを枯渇させるために使用され得る。
【０２２４】
Ｔ細胞は、当業者に公知の技術によって、多くの異なる亜集団にさらに分別され得る。二つの大きな亜集団は、細胞表面マーカーＣＤ４およびＣＤ８の差示的発現に基づいて、単離され得る。例えば、上記のようなＴ細胞の濃縮に続いて、ＣＤ４＋細胞は、ＣＤ４に特異的な抗体を使用して濃縮され得る（Ｃｏｌｉｇａｎら、上記を参照のこと）。抗体は、磁気ビーズのような固体支持体に連結され得る。逆に、ＣＤ８＋細胞は、ＣＤ４に特異的な抗体の使用（ＣＤ４＋細胞を除くため）によって濃縮され得るか、または固体支持体に連結したＣＤ８抗体の使用によって単離され得る。ＨＩＶ−１感染患者由来のＣＤ４リンパ球は、Ｗｉｌｓｏｎら、（１９９５）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７２：８８によって記載されるように、形質導入の前または後に、エキソビボで増殖され得る。
【０２２５】
Ｔ細胞の精製後、当業者に公知の遺伝子改変の種々の方法が、本明細書中に記載されるようにして構築された非ウイルスベースまたはウイルスベースの遺伝子移入ベクターを用いて実施され得る。例えば、１つのこのようなアプローチは、ベクター産生細胞に由来する培養物のベクター含有上清による精製Ｔ細胞集団の形質導入を含む。第２のアプローチは、照射した単層のベクター産生細胞と精製Ｔ細胞との共培養を含む。第３のアプローチは、類似する共培養アプローチであるが；精製Ｔ細胞が種々のサイトカインで前刺激され、そして照射したベクター産生細胞との共培養の前に４８時間培養される共培養アプローチを含む。このような形質導入前の前刺激は、効果的な遺伝子移入を増加させる（Ｎｏｌｔａら（１９９２）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０６５）。これらの培養物を増殖させる刺激もまた、患者への再注入のための増加した細胞集団を提供する。共培養に続いて、Ｔ細胞は、ベクター産生細胞単層から回収され、展開され、そして液体窒素中で凍結される。
【０２２６】
１つ以上の本発明の合成発現カセット（単離されたＴ細胞への送達のための適切な制御エレメントを伴う）を含む遺伝子移入ベクターは、公知の方法を用いて構築され得る。
【０２２７】
選択マーカーはまた、遺伝子移入ベクターの構築において使用され得る。例えば、遺伝子転移ベクターで形質導入された哺乳動物細胞に、細胞毒性因子に対する耐性を与えるマーカーが、用いられ得る。細胞毒性因子は、ネオマイシン、アミノグリコシド、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、スルホンアミド、アクチノマイシン、ネトロプシン、ジスタマイシンＡ、アントラサイクリン、またはピラジンアミドであり得るがこれらに限定されない。例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩは、ネオマイシンアナログであるジェネティシン（Ｇ４１８）に対する耐性を与える。
【０２２８】
Ｔ細胞はまた、選択される前に、少なくとも１つの型の増殖因子を含む培地中で維持され得る。特定の細胞型の増殖を維持する種々の増殖因子が当該分野で公知である。このような増殖因子の例は、リンパ球の増殖および活性化を促進するサイトカインマイトジェン（例えば、ｒＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１５）である。特定の型の細胞は、ホルモン（ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）およびヒト成長ホルモンを含む）のような他の増殖因子により刺激される。特定の細胞集団について適切な増殖因子を選択することは、当業者により容易に達成される。
【０２２９】
例えば、白血球（例えば、分化した前駆細胞および幹細胞）は、種々の増殖因子により刺激される。より詳細には、活性化ＴＨおよび活性化マクロファージにより産生される、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦは、骨髄幹細胞を刺激し、骨髄幹細胞は、次いで、多能性幹細胞、顆粒球−単球前駆体、好酸球前駆体、好塩基球、巨核球、および赤血球前駆体に分化する。分化は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、およびＥＰＯのような増殖因子により調節される。
【０２３０】
次いで、多能性幹細胞は、リンパ系幹細胞、骨髄間質細胞、Ｔ細胞前駆体、Ｂ細胞前駆体、胸腺細胞、ＴＨ細胞、ＴＣ細胞、およびＢ細胞に分化する。この分化は、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、およびＩＬ−５のような増殖因子により調節される。
【０２３１】
顆粒球−単球前駆体は、単球、マクロファージ、および好中球に分化する。このような分化は、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、およびＩＬ−８のような増殖因子により調節される。好酸球前駆体は、好酸球に分化する。このプロセスは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−５により調節される。
【０２３２】
好塩基球前駆体のマスト細胞および好塩基球への分化は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、およびＩＬ−９により調節される。巨核球は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、およびＩＬ−６に応答して血小板を産生する。赤血球前駆細胞は、ＥＰＯに応答して赤血球に分化する。
【０２３３】
従って、ＣＤ３結合因子による活性化の間、Ｔ細胞はまた、マイトジェン（例えば、ＩＬ−２のようなサイトカイン）と接触され得る。特に好ましい実施形態において、ＩＬ−２は、約５０〜１００μｇ／ｍｌの濃度でＴ細胞の集団に添加される。ＣＤ３結合因子による活性化は、２〜４日間で実施され得る。
【０２３４】
一旦、適切に活性化されると、Ｔ細胞は、一般的に、Ｔ細胞へのベクターのトランスフェクションを可能にする条件下で、適切な遺伝子移入ベクターと接触することにより改変される。遺伝子改変は、Ｔ細胞集団の細胞密度が、約０．１×１０６と５×１０６との間、好ましくは、約０．５×１０６と２×１０６との間の場合に実施される。多くの適切なウイルスベースおよび非ウイルスベースの遺伝子移入ベクターが、本明細書中での使用のために記載されている。
【０２３５】
形質導入後、形質導入細胞は、公知の技術を用いて、非形質導入細胞から選択される。例えば、形質導入に使用される遺伝子移入ベクターが、細胞毒性因子に対する耐性を与える選択マーカーを含む場合、この細胞は、適切な細胞毒性因子と接触され得、それによって、非形質導入細胞が、形質導入細胞からネガティブ選択され得る。選択マーカーが細胞表面マーカーの場合、この細胞は、特定の細胞表面マーカーに特異的な結合因子と接触され得、それによって、形質導入細胞が、その集団からポジティブ選択され得る。この選択工程はまた、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）技術を伴う（例えば、ＦＡＣＳが特定の細胞表面マーカーを含む集団から細胞を選択するために用いられる場合）か、またはこの選択工程は、標的細胞の捕捉および／またはバックグラウンドの除去のための取り出し可能な支持体として磁気的に応答する粒子の使用を伴う。
【０２３６】
より詳細には、形質導入細胞のポジティブ選択は、選択可能な細胞表面マーカーを発現する形質導入細胞を選別および回収するために、ＦＡＣＳセルソーター（例えば、ＦＡＣＳ　ＶａｎｔａｇｅＴＭ　Ｃｅｌｌ　Ｓｏｒｔｅｒ、Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて実施され得る。形質導入後、この細胞は、特定の細胞表面マーカーに対する蛍光標識された抗体分子を用いて染色される。各々の細胞における結合する抗体の量は、細胞を含む液滴を、セルソーターを通過させることにより測定され得る。染色された細胞を含む液滴に電磁的電荷を与えることにより、形質導入細胞は、他の細胞から分離され得る。次いで、ポジティブ選択細胞は、滅菌回収容器中に収集され得る。これらの細胞選別手順は、例えば、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅＴＭ　Ｔｒａｉｎｉｎｇ　Ｍａｎｕａｌ（特に、セクション３−１１〜３−２８および１０−１〜１０−１７を参照のこと）に詳細に記載されている。
【０２３７】
形質導入細胞のポジティブ選択はまた、発現または特定の細胞表面マーカーに基づく細胞の磁気的分離を用いて実施され得る。このような分離技術において、ポジティブ選択される細胞は、最初に、特定の結合因子（例えば、その細胞表面マーカーと特異的に相互作用する抗体または試薬）と接触される。次いで、この細胞は、（ポジティブ細胞に結合している）特定の結合因子に結合する試薬と結合した取り出し可能な粒子（例えば、磁気応答性粒子）と接触される。次いで、この細胞結合因子−粒子の複合体は、例えば、磁場を用いて非標識細胞から物理的に分離され得る。磁気応答性粒子を用いる場合、標識された細胞は、磁場を用いて容器中に維持され得るが、ネガティブ細胞は除去される。これらおよび同様の分離手順は、当業者に公知である。
【０２３８】
選択された形質導入細胞におけるベクターの発現は、当業者に公知の多くのアッセイにより評価され得る。例えば、ウェスタンブロットまたはノーザン分析は、目的の挿入されたヌクレオチド配列の性質に基づき用いられ得る。一旦、発現が確立され、そして形質転換Ｔ細胞が選択された合成発現カセットの存在について試験されると、それらは、末梢血流を介した患者への注入のために準備される。
【０２３９】
本発明は、初代哺乳動物細胞のエキソビボ集団の遺伝子改変のためのキットを含む。このキットは、代表的に、１つ以上の容器に含まれる少なくとも１つの選択マーカーおよび少なくとも１つの合成発現カセットをコードする遺伝子移入ベクター、補助的な試薬、またはハードウェア、およびこのキットの使用のための指示書を含む。
【０２４０】
（２．４．３　さらなる送達レジーム）
本明細書中に記載される（上記の任意の方法により送達される）任意のポリヌクレオチド（例えば、発現カセット）またはポリペプチドはまた、他のＤＮＡ送達系および／またはタンパク質送達系と組み合わせて使用され得る。非限定的な例として、例えば、１つ以上の分子が「プライミング工程」において送達され、その後１つ以上の分子が「ブースト工程」において送達される、プライム−ブースト法における、これらの分子の同時投与が挙げられる。特定の実施形態において、１つ以上の核酸含有組成物が送達され、その後、１つ以上の核酸含有組成物および／または１つ以上のポリペプチド含有組成物（例えば、ＨＩＶ抗原を含むポリペプチド）が送達される。他の実施形態において、複数の核酸が（同じかまたは異なる核酸分子を）「プライム」し、その後、複数のポリペプチドが（同じかまたは異なるポリペプチドを）「ブースト」する。他の実施例として、複数の核酸の投与および複数のポリペプチドの投与が挙げられる。
【０２４１】
同時投与を含む任意の方法において、種々の組成物は、任意の順序で送達され得る。従って、複数の異なる組成物または分子の送達を含む実施形態において、これらの核酸は、ポリペプチドよりも前に全て送達される必要があるわけではない。例えば、プライミング工程は、１つ以上のポリペプチドの送達を含み得、そしてブースト工程は、１つ以上の核酸および／または１つ以上のポリペプチドの送達を含み得る。複数のポリペプチドが投与され、その後、複数の核酸が投与され得るか、またはポリペプチドおよび核酸の投与が任意の順序で実施され得る。本明細書中に記載される任意の実施形態において、核酸分子は、ポリペプチドの全てまたは一部分をコードし得るか、あるいは全くコードし得ない。従って、本明細書中に記載される１つ以上の核酸分子（例えば、発現カセット）および／または本明細書中に記載される１つ以上のポリペプチドは、任意の順序で、かつ任意の投与経路で同時投与され得る。従って、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの任意の組み合わせが、免疫反応を誘発するために使用され得る。
【０２４２】
（実験）
本発明を実施するための特定の実施形態の例を以下に示す。これらの実施例は、例示の目的のみのために提供され、いかなる手段によっても本発明の範囲を限定することを意図しない。
【０２４３】
使用される数値（例えば、量、温度など）に関する正確性を確証するための努力が成されているが、ある程度の実験的誤差および偏差が、当然、許容されるべきである。
【０２４４】
（実施例１）
（合成発現カセットの作製）
（Ａ．ＨＩＶ−１　Ｅｎｖ、Ｇａｇ、Ｐｏｌ核酸コード配列の改変）
Ｐｏｌコード配列を、Ｃ型株ＡＦ１１０９７５から選択した。Ｇａｇコード配列を、Ｃ型株ＡＦ１１０９６５およびＡＦ１１０９６７から選択した。Ｅｎｖコード配列を、Ｃ型株ＡＦ１１０９６８およびＡＦ１１０９７５から選択した。これらの配列を操作し、それらの遺伝子産物の発現を最大化した。
【０２４５】
第１に、ＨＩＶ−１のコドン使用パターンを、得られる核酸コード配列が高度に発現されるヒト遺伝子において見出されるコドン使用に相当するように改変した。ＨＩＶコドン使用は、高含有量のヌクレオチドＡまたはＴのコドントリプレットを反映する。ＨＩＶ−１コドン使用の効果は、ＤＮＡ配列における高いＡＴ含有量であり、これにより、ｍＲＮＡの翻訳能力が減少し、不安定になる。対照的に、高度に発現するヒトコドンは、ヌクレオチドＧまたはＣを好む。このコード領域を、高度に発現するヒト遺伝子において見出されるコドン使用に相当するように改変した。
【０２４６】
第２に、Ｇａｇのコード配列およびＧａｇプロテアーゼコード配列中に位置する阻害性（または不安定）エレメント（ＩＮＳ）が存在する（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ　Ｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（７）：４８９２−４９０３、１９９７）。ＲＲＥは、ＨＩＶによりコードされるＲｅｖタンパク質と相互作用し、ＩＮＳの発現ダウンレギュレーション効果に打ち勝つＲＮＡ二次構造である。ＲＲＥおよびＲｅｖの翻訳後活性化機構に打ち勝つために、不安定エレメントは、コードされるタンパク質のリーディングフレームを変化しない複数の点変異を導入することにより、不活性化される。図５および６（配列番号３、４、２０、および２１）は、ＡＦ１１０９６５株およびＡＦ１１０９６７株から獲得された合成配列におけるいくつかの残存するＩＮＳの位置を示す。これらの配列に成された変化は、図において囲み表示する。図５および６において、上列は、示される株由来のＧａｇポリペプチドの改変された配列を示す。囲まれた領域の列の下に示されるヌクレオチドは、ＩＮＳをさらに除去するために成された変化を示す。従って、囲み領域に示されるこれらの変化が成される場合、得られる配列は、それぞれ図１および２に示される配列に対応する。
【０２４７】
合成コード配列は、当該分野で公知の方法、例えば、Ｍｉｄｌａｎｄ　Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ、Ｔｅｘａｓ）のような企業により構築される。
【０２４８】
本発明の１つの実施形態において、Ｐｏｌポリペプチドをコードする配列が、合成性の改変されたＧａｇ／Ｅｎｖ発現カセットにより発現されるウイルス様粒子のエピトープの数を増加させるために、合成ＧａｇまたはＥｎｖ配列と共に含まれる。合成ＨＩＶ−１　Ｐｏｌは、（構造的タンパク質およびプロテアーゼに加えて）機能性酵素である逆転写酵素（ＲＴ）およびインテグラーゼ（ＩＮＴ）を発現するので、ＲＴおよびＩＮＴ機能を不活性化することは、いくつかの例において助けとなり得る。ＲＴおよびＩＮＴコード領域におけるいくつかの欠失または変異が、それらのＲＴおよびＩＮＴ活性に関して触媒的に非機能的な酵素を達成するために作製され得る｛Ｊａｙ．Ａ．Ｌｅｖｙ（編集者）（１９９５）Ｔｈｅ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ，Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ．ＩＳＢＮ　０−３０６−４５０３３Ｘ．２１５−２０頁；Ｇｒｉｍｉｓｏｎ，Ｂ．およびＬａｕｒｅｎｃｅ，Ｊ．（１９９５），Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｏｆ　Ａｃｑｕｉｒｅｄ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ　９（１）：５８−６８；Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｋ．ら，（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６６（１１）：６８０６−６８１２；Ｅｓｎｏｕｆ，Ｒ．ら，（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　２（４）：３０３−３０８；Ｍａｉｇｎａｎ，Ｓ．ら，（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　２８２（２）：３５９−３６８；Ｋａｔｚ，Ｒ．Ａ．およびＳｋａｌｋａ，Ａ．Ｍ．（１９９４）Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　Ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　７３（１９９４）；Ｊａｃｏｂｏ−Ｍｏｌｉｎａ，Ａ．ら，（１９９３）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　Ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　Ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　Ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ　９０（１３）：６３２０−６３２４；Ｈｉｃｋｍａｎ，Ａ．Ｂ．ら，（１９９４）Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６９（４６）：２９２７９−２９２８７；Ｇｏｌｄｇｕｒ，Ｙ．ら，（１９９８）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　Ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　Ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　Ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ　９５（１６）：９１５０−９１５４；Ｇｏｅｔｔｅ，Ｍ．ら，（１９９８）　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７３（１７）：１０１３９−１０１４６；Ｇｏｒｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．ら，（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　７２（６）：５０４６−５０５５；Ｅｎｇｅｌｍａｎ，Ａ．ら，（１９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　７１（５）：３５０７−３５１４；Ｄｙｄａ，Ｆ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６６（５１９３）：１９８１−１９８６；Ｄａｖｉｅｓ，Ｊ．Ｆ．ら，（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２（５００２）：８８−９５；Ｂｕｊａｃｚ，Ｇ．ら，（１９９６）Ｆｅｂｓ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　３９８（２−３）：１７５−１７８；Ｂｅａｒｄ，Ｗ．Ａ．ら，（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７１（２１）：１２２１３−１２２２０；Ｋｏｈｌｓｔａｅｄｔ，Ｌ．Ａ．ら，（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５６（５０６５）：１７８３−１７９０；Ｋｒｕｇ，Ｍ．Ｓ．およびＢｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３０（４４）：１０６１４−１０６２３；Ｍａｚｕｍｄｅｒ，Ａ．ら，（１９９６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　４９（４）：６２１−６２８；Ｐａｌａｎｉａｐｐａｎ，Ｃ．ら，（１９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７２（１７）：１１１５７−１１１６４；Ｒｏｄｇｅｒｓ，Ｄ．Ｗ．ら，（１９９５）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　Ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　Ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　Ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ　９２（４）：１２２２−１２２６；Ｓｈｅｎｇ，Ｎ．およびＤｅｎｎｉｓ，Ｄ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｔｙ　３２（１８）：４９３８−４９４２；Ｓｐｅｎｃｅ，Ｒ．Ａ．ら，（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６７（５２００）：９８８−９９３｝。
【０２４９】
さらに、選択されたＢ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープは、ＲＴおよびＩＮＴの機能的改変により欠失される任意のエピトープを置換および増強するために、Ｐｏｌ構築物に加えられ得る（例えば、短縮ＩＮＴの３’末端またはＲＴおよびＩＮＴコード配列の欠失物内に）。あるいは、ＲＴおよびＩＮＴからの選択されたＢ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープ（ＣＴＬエピトープを含む）は、上記の合成Ｇａｇカセットまたは合成Ｐｏｌカセットの発現により形成される最小ＶＬＰに含まれ得る（既知のＨＩＢ　Ｂ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープの説明については、ＨＩＶ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｄａｔａｂｅｓｅ　ＣＴＬ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ；Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉａ、１９８７−１９９７；インターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌを参照のこと）。
【０２５０】
得られる改変コード領域配列を、合成Ｅｎｖ発現カセット；合成Ｇａｇ発現カセット；合成Ｐｏｌ発現カセットとして示す。共通のＧａｇ領域（Ｇａｇ−ｃｏｍｍｏｎ）は、ＡＦ１１０９６５に対してヌクレオチド８４４位〜９０３位（配列番号１）（または配列番号１７のアミノ酸残基約２８２位〜３０１位）に延び、そしてＡＦ１１０９６７に対してヌクレオチド８４１位〜９００位（配列番号２）（または配列番号２２のアミノ酸残基約２８１位〜３００位）に延びる。共通のＥｎｖ領域（Ｅｎｖ−ｃｏｍｍｏｎ）は、ＡＦ１１０９６８に対してヌクレオチド１２１３位〜１３５３位（配列番号５）および配列番号２３のアミノ酸４０５位〜４５１位に延び、そしてＡＦ１１０９７５に対してヌクレオチド１２１０位〜１３５３位（配列番号１１）およびアミノ酸４０４位〜４５１位（配列番号２４）に延びる。
【０２５１】
Ｐｏｌ、Ｇａｇ、およびＥｎｖの合成ＤＮＡフラグメントは、以下の真核生物発現ベクター中にクローニングされる：一過性発現アッセイおよびＤＮＡ免疫研究のためのｐＣＭＶＫｍ２、ｐＣＭＶＫｍ２ベクターは、ｐＣＭＶ６ａ（Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ，Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６）に由来し、そしてカナマイシン選択マーカー、ＣｏｌＥ１複製起点、ＣＭＶプロモーターエンハンサー、およびイントロンＡを含み、その後ろに以下に記載される合成配列のための挿入部位を含み、その後ろにウシ成長ホルモン由来のポリアデニル化シグナルを含む−−ｐＣＭＶＫｍ２ベクターは、ｐＣＭＶ−ｌｉｎｋベクターと、ポリリンカー部位がｐＣＭＶＫｍ２に挿入されてｐＣＭＶ−ｌｉｎｋが作製されるという点でのみ異なる；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における発現のためのｐＥＳＮ２ｄｈｆｒおよびｐＣＭＶＰＬＥｄｈｆｒ；およびｐＡｃＣ１３、バキュロウイルス発現系において使用するためのシャトルベクター（ｐＡｃＣ１３は、Ｍｕｎｅｍｉｔｓｕ　Ｓ．ら、Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１０（１１）：５９７７−５９８２、１９９０に記載されるｐＡｃＣ１２に由来する）。
【０２５２】
簡単に述べると、ｐＣＭＶＰＬＥｄｈｆｒの構築は、以下の通りである。
【０２５３】
ＤＨＦＲカセットを構築するために、ＥＭＣＶ　ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）リーダーを、ｐＣｉｔｅ−４ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）からＰＣＲ増幅し、そしてＸｂａ−ＮｃｏフラグメントとしてｐＥＴ２３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）に挿入し、ｐＥＴ−ＥＭＣＶを獲得した。ｄｈｆｒ遺伝子を、ｐＥＳＮ２ｄｈｒｆからＰＣＲ増幅して翻訳終止コドンの代わりにＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒスペーサーを有する産物を獲得し、そしてＮｃｏ−ＢａｍＨ１フラグメントとして挿入し、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲを獲得した。次に、希釈したｎｅｏ遺伝子をｐＳＶ２Ｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）誘導体からＰＣＲ増幅し、そしてｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲの特有のＢａｍＨ１部位に挿入し、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲ／Ｎｅｏ（ｍ２）を獲得した。最後に、ｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）由来のウシ成長ホルモンターミネーターを、ｎｅｏ遺伝子の下流に挿入し、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲ／Ｎｅｏ（ｍ２）ＢＧＨｔを獲得した。ＥＭＣＶ−ｄｈｆｒ／ｎｅｏ選択マーカーカセットフラグメントを、ｐＥＴ−Ｅ−ＤＨＦＲ／Ｎｅｏ（ｍ２）ＢＧＨｔの切断により調製した。
【０２５４】
ＣＭＶエンハンサー／プロモーターおよびイントロンＡを、ｐＣＭＶ６ａ（Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６）からＨｉｎｄＩＩＩ−Ｓａｌ１フラグメントとしてｐＵＣ１９（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）に移した。Ｎｄｅ１部位からＳａ１部位まで、ｐＵＣ１９のベクター骨格を欠失させた。上記のＤＨＦＲカセットを、ＥＭＣＶ　ＩＲＥＳが、ＣＭＶプロモーターの後にくるように、この構築物に加えた。このベクターはまた、ａｍｐｒ遺伝子およびＳＶ４０複製起点を含んだ。
【０２５５】
（Ｂ．ＨＩＶ−１　ｐ５５Ｇａｇの主要相同性領域（ＭＨＲ）の規定）
ＨＩＶ−１　ｐ５５（Ｇａｇ）の主要相同性領域（ＭＨＲ）は、Ｇａｇのｐ２４−ＣＡ配列中に位置する。それは、およそ２０アミノ酸の保存されたストレッチである。野生型ＡＦ１１０９６５Ｇａｇタンパク質における位置は、２８２〜３０１であり（配列番号２５）、そしてＧａｇ　ＤＮＡ配列については、８４４〜９０３の領域にまたがる（配列番号２６）。合成Ｇａｇタンパク質における位置もまた、２８２〜３０１であり（配列番号２５）、そして合成Ｇａｇ　ＤＮＡ配列については、８４４〜９０３の領域にまたがる（配列番号１）。野生型および合成ＡＦ１１０９６７Ｇａｇタンパク質における位置は、２８１〜３００であり（配列番号２７）、そして改変されたＧａｇ　ＤＮＡ配列については、８４１〜９００の領域にまたがる（配列番号２）。ＭＨＲにおける変異または欠失は、粒子の産生を著しく減少させ得る（Ｂｏｒｓｅｔｔｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１１）：９３１３−９３１７、１９８８；Ｍａｍｍａｎｏ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ　６８（８）：４９２７−４９３６、１９９４）。
【０２５６】
この配列に対するパーセント同一性は、例えば、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎサーチアルゴリズム（Ｔｉｍｅ　Ｌｏｇｉｃ、Ｉｎｃｌｉｎｅ　Ｖｉｌｌａｇｅ、ＮＶ）を以下の例示的なパラメータと共に用いて決定され得る：ウェイトマトリックス＝ｎｕｃ４ｘ４ｈｂ；ギャップオープンペナルティー＝２０；ギャップエクステンションペナルティー＝５。
【０２５７】
（Ｃ．ＨＩＶ−１　Ｅｎｖの共通配列領域の定義）
ＨＩＶ−１　Ｅｎｖの共通配列領域（ＣＳＲ）は、ＥｎｖのＣ４配列中に位置する。これは、約４７アミノ酸の保存されたストレッチである。野生型および合成のＡＦ１１０９６８　Ｅｎｖタンパク質のこの位置は、およそアミノ酸残基４０５〜４５１（配列番号２８）であり、そしてＥｎｖ　ＤＮＡ配列に関して１２１３〜１３５３（配列番号５）の領域にわたる。野生型およびおよび合成のＡＦ１１０９７５　Ｅｎｖタンパク質のこの位置は、およそアミノ酸残基４０４〜４５１（配列番号２９）であり、そしてＥｎｖ　ＤＮＡ配列に関して１２１０〜１３５３（配列番号１１）の領域にわたる。
【０２５８】
この配列に対する％同一性を、例えば、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ検索アルゴリズム（Ｔｉｍｅ　Ｌｏｇｉｃ、Ｉｎｃｌｉｎｅ　Ｖｉｌｌａｇｅ、ＮＶ）を、以下の例示的パラメーター：重量マトリックス＝ｎｕｃ４ｘ４ｈｂ；ギャップオープニングペナルティ＝２０、ギャップ伸長ペナルティ＝５と共に使用して、決定し得る。
【０２５９】
本明細書中に記載される本発明の異なる実施形態の種々の形態を、組み合わせ得る。
【０２６０】
（Ｄ．南アフリカＣ型ＨＩＶ系統由来の例示的なＨＩＶ配列）
新規Ｃ型単離体のＨＩＶコード配列を獲得した。ポリペプチドコード配列を、その遺伝子産物の発現を最大化するために操作した。
【０２６１】
上で考察したように、得られた核酸コード配列が、高度に発現されたヒト遺伝子において見出されるコドンの用法に匹敵するように、ＨＩＶ−１コドンの用法パターンを改変した。このＨＩＶコドンの用法は、コドン三つ組のヌクレオチドＡまたはＴの高い含量を反映する。ＨＩＶ−１コドンの用法の効果は、減少した翻訳能力およびｍＲＮＡの不安定性を生じる、ＤＮＡ配列中の高いＡＴ含量である。相対的に、高く発現されたヒトのコドンは、ヌクレオチドＧまたはＣを好む。これらのコード配列を、高く発現されたヒト遺伝子において見出されるコドンの用法に匹敵するように、改変した。
【０２６２】
以下の表Ｃに、新規の南アフリカＣ型ＨＩＶ単離体（クローン８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ．）由来の例示的な野生型および合成の配列を示す。表Ｄは、新規の南アフリカＣ型ＨＩＶ単離体（クローン８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ．）由来の例示的な合成Ｅｎｖ配列を示す。表Ｅは、南アフリカＣ型ＨＩＶ系統（１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ．）由来の野生型および合成の配列を示す。
【０２６３】
【表３】
2004502445.tif 000006
2004502445.tif 000007
2004502445.tif 000008
【０２６４】
【表４】
2004502445.tif 000009
上記のように、Ｅｎｖコード構築物を、全長のｇｐ１６０構築物のいずれかを使用して、調製し得る。例えば、ｇｐ１４０形態（配列番号１３２）を、ｇｐ１６０（配列番号１２６）を、ヌクレオチド２０６４で短縮することによって作製し；ｇｐ１２０を、ｇｐ１６０（配列番号１２６）を、ヌクレオチド１５５１で短縮することによって作製した（配列番号１２６）。さらなるｇｐ１４０形態およびｇｐ１２０形態を、本明細書中に記載の方法を使用して、作製し得る。１以上の終止コドンを、代表的に付加する（例えば、配列番号１２６のヌクレオチド２６０８〜２６１０）。さらに、野生型のリーダー配列を、改変および／または他のリーダー配列（例えば、ＴＰＡ１リーダー配列）で置換し得る。
【０２６５】
従って、ポリペプチドｇｐ１６０は、ｇｐ１２０およびｇｐ４１のコード配列を含む。ポリペプチドｇｐ４１は、オリゴマー化ドメイン（ＯＤ）および膜貫通ドメイン（ＴＭ）を含むいくつかのドメインからなる。ネイティブのエンベロープにおいて、このオリゴマー化ドメインは、三量体構造を形成する３つのｇｐ４１ポリペプチドの非共有的な会合に必要である：ｇｐ４１三量体（およびそれ自体）との非共有的な相互作用によって、ｇｐ１２０ポリペプチドもまた、三量体構造に組織される。切断部位は、ほぼ、ｇｐ１２０のポリペプチド配列とｇｐ４１に対応するポリペプチド配列との間に存在する。この切断部位を、この部位での切断を防止するために変異し得る。得られたｇｐ１４０ポリペプチドは、ｇｐ１６０の短縮形態に対応し、ここで、ｇｐ４１の膜貫通ドメインは、欠失されている。このｇｐ１４０ポリペプチドは、ｇｐ４１部分のオリゴマー化ドメインの存在によって、単量体形態およびオリゴマー（すなわち、三量体）形態の両方で存在し得る。切断を防止するためにこの切断部位が変異されており、そしてｇｐ４１の膜貫通部分が欠失されている状況において、得られたポリペプチド産物は、「変異」ｇｐ１４０（例えば、ｇｐ１４０．ｍｕｔ）と称される。当業者に明らかなように、この切断部位は、種々の方法によって変異され得る。本明細書中に記載される例示的な構築物（例えば、配列番号１２１および配列番号１２４）において、ｇｐ１２０／ｇｐ４１切断部位における変異は、野生型のアミノ酸配列ＫＲＲＶＶＱＲＥＫＲ（配列番号１２９）を、ＩＳＳＶＶＱＳＥＫＳ（配列番号１３０）に変化させる。
【０２６６】
なお別の実施形態において、超可変領域が欠失され、Ｎ−グリコシル化部位が除去され、そして／または切断部位が変異された。可変領域の欠失（Ｖ１および／またはＶ２）を有する例示的な構築物において、Ｖ２欠失を、（配列番号１２８に対して）約４９９〜約５９３のヌクレオチドを欠失することによって構築し、そしてＶ１／Ｖ２欠失を、（配列番号１２８に対して）約３７５〜約６０２のヌクレオチドを欠失することによって構築した。Ｖ１領域および／またはＶ２領域の相対的な位置もまた、表Ａに示される領域に対するアラインメントによって、容易に決定し得る。表Ｅは、南アフリカＣ型ＨＩＶ系統（１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ．）由来の野生型および合成の配列を示す。
【０２６７】
【表５】
2004502445.tif 000010
任意のＣ型ＨＩＶ系統由来の配列またはクローンが、この系統における所望の改変を達成するために、本明細書中に記載のように改変され得ることは、容易に明らかである。さらに、ポリタンパク質を、ポリペプチドまたはペプチド産物をコードする２つ以上のポリヌクレオチド配列をインフレームで融合させることによって、構築し得る。さらに、ポリシストロン性コード配列を、互いに隣接するポリペプチド産物をコードする、代表的には、１つのプロモーターの制御下にある、２つ以上のポリヌクレオチド配列を配置することによって生成し得、ここで、各ポリペプチドコード配列を、内部リボソーム結合部位の配列を含むように改変し得る。
【０２６８】
本発明の配列（例えば、ＨＩＶポリペプチドをコードする、改変された（合成）ポリヌクレオチド配列）を、欠失、点変異、置換、フレームシフト、および／またはさらなる遺伝的改変（例えば、ポリペプチドに関連する活性の不活化を生じる変異（例えば、プロテアーゼ活性、ｔａｔ活性、または逆転写酵素活性を不活化する変異））によって、改変し得る。このような改変は、当該分野において一般に教示され、そして本発明の教示に関して適用され得る。例えば、表Ａに列挙された「ＨＩＶゲノム領域」に対応する部位を、所望の改変を達成するために、本明細書中で開示される新規配列の対応する領域において改変し得る。さらに、本発明の改変された（合成）ポリヌクレオチド配列を、（例えば、被験体において免疫応答を生成するための組成物における）使用のために、以下の方法を含むが、これらに限定されない種々の方法において、組み合わせ得る：各々が本発明の１つのポリヌクレオチド配列を含む複数の個々の発現カセット（例えば、ｇａｇ発現カセット、ｅｎｖ発現カセットおよびｒｅｖ発現カセット、またはｐｏｌ発現カセット、ｖｉｆ発現カセットおよびｖｐｒ発現カセットなど）；本発明の複数のポリヌクレオチドのインフレーム融合によって生成されたポリタンパク質、ならびに本発明の複数のポリヌクレオチドを使用して生成されたポリシストロン性のポリヌクレオチド。
【０２６９】
（実施例２）
（合成コード配列についての発現アッセイ）
（Ａ．Ｃ型ＨＩＶコード配列）
野生型のＣサブタイプのＨＩＶコード配列（例えば、ＡＦ１１０９６５、ＡＦ１１０９６７、ＡＦ１１０９６８、ＡＦ１１０９７５ならびに新規の南アフリカ系統８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ、８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡおよび１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ由来）を、合成配列がクローニングされたベクターと同じ特徴を有する発現ベクターにクローニングした。
【０２７０】
野生型および合成の配列を保有する種々のベクターについての発現効率を、以下のように評価する。いくつかの哺乳動物細胞株（２９３、ＲＤ、ＣＯＳ−７およびＣＨＯ；全ては、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ　２０１１０−２２０９から獲得した）由来の細胞を、トランスフェクション試薬ＬＴ１（ＰａｎＶｅｒａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、５４５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中の２μｇのＤＮＡを用いてトランスフェクションする。細胞を、減少血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中で５時間インキュベートする。次いで、培地を、以下のような正常な培地で置き換える：２９３細胞、ＩＭＤＭ、１０％ウシ胎仔血清、２％グルタミン（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）；ＲＤおよびＣＯＳ−７細胞、Ｄ−ＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清、２％グルタミン（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）；およびＣＨＯ細胞、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ−１２、１０％ウシ胎仔血清、２％グルタミン（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）。細胞を、４８時間かまたは６０時間のいずれかでインキュベートする。細胞溶解物を、以下の実施例３に記載のように収集する。上清を回収し、そして０．４５μｍシリンジフィルターを介して濾過する。上清を、ＨＩＶ抗原に対するマウスモノクローナル抗体で被覆した９６ウェルのプレート（例えば、Ｃｏｕｌｔｅｒ　ｐ２４アッセイ（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ、ＵＳ）を使用して、評価する。ＨＩＶ−１抗原は、被覆されたウェルに結合する。ＨＩＶに対するビオチン化抗体は、結合した抗原を認識する。結合体化されたストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼは、ビオチンと反応する。色は、ＴＭＢ基質とのペルオキシダーゼの反応から発色する。この反応を、４Ｎ　Ｈ２ＳＯ４の添加によって終了させる。色の強度は、サンプル中のＨＩＶ抗原の量と直接比例する。
【０２７１】
合成Ｃ型ＨＩＶ発現カセットは、種々の細胞株において発現された場合に、ネイティブ（野生型のサブタイプＣ）の配列と比較して、そのタンパク質産物の生成における劇的な増大を提供する。
【０２７２】
（Ｂ．シグナルペプチドリーダー配列）
種々のリーダー配列が発現を駆動する能力を、異なるリーダー配列に作動可能に連結された、野生型または合成のＥｎｖコード発現カセットを細胞にトランスフェクションし、そしてＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットによってＥｎｖポリペプチドの発現を評価することによって、試験した。種々のシグナルペプチドリーダー配列のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を、表４に示す。
【０２７３】
【表６】
2004502445.tif 000011
２９３細胞を、８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ（ＴＶ１ｃ８．２）エンベロープの、ｇｐ１２０形態およびｇｐ１４０形態をコードする、ネイティブの構築物および配列改変された構築物を用いて、標準的な方法を使用して一過的にトランスフェクトした。Ｅｎｖタンパク質を、細胞溶解物および上清中で、内部Ｅｎｖ捕捉ＥＬＩＳＡを使用して、測定した。結果は、以下の表５に示され、そしてＴＶ１ｃ８．２の野生型のシグナルペプチドリーダー配列が、異種ｔｐａリーダー配列を使用して観察されたレベルよりも良いかまたはこのレベルに匹敵するレベルで、コードされたエンベロープタンパク質を効果的に発現するために使用され得ることを示す。さらに、このＴＶ１ｃ８．２リーダーは、ネイティブの形態または配列改変された形態で働き、そしてネイティブのｅｎｖ遺伝子または配列改変されたｅｎｖ遺伝子と共に使用され得る。全ての構築物を、ｐＣＭＶｌｉｎｋ発現ベクターのＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ部位への遺伝子カセットのクローニング後に、試験した。
【０２７４】
【表７】
2004502445.tif 000012
配列改変されたＴＶ１ｃ８．２エンベロープ改変体遺伝子カセットを、安定な哺乳動物細胞株の誘導のために、Ｃｈｉｒｏｎ　ｐＣＭＶ発現ベクターにサブクローニングした。ＴＶ１ｃ８．２エンベロープタンパク質を発現する安定なＣＨＯ細胞株を、トランスフェクション、メトトレキサート増幅およびスクリーニングの標準的な方法を使用して、誘導した。これらの細胞株は、ｔｐａリーダー配列を使用して発現されたタンパク質について観察されたレベルと匹敵するレベルのエンベロープタンパク質を分泌することが見出された。代表的な結果を、ＴＶ１ｃ８．２　ｇｐ１２０を発現する２つの細胞株クローンについて、表６に示す；これらを、類似の様式であるが、ｔｐａリーダーを使用して誘導されたＳＦ１６２サブタイプＢ　ｇｐ１２０を発現する２つの参照クローンと比較する。タンパク質濃度を、半精製されたタンパク質のゲルを走査する濃度測定の後に決定した。検量線を、ＳＦ２　ｇｐ１２０タンパク質の、高度に精製されかつ十分特徴付けられた調製物を使用して作製し、そして試験タンパク質の濃度を決定した。
【０２７５】
【表８】
2004502445.tif 000013
これらの結果をまた、本質的に実施例３に記載のように、ウェスタンブロット分析によって確認した。
【０２７６】
（実施例３）
（発現のウエスタンブロット分析）
（Ａ．ＨＩＶ　Ｃ型コード配列）
ヒト２９３細胞を、実施例２に記載されるように、天然または合成のＨＩＶ　Ｃ型発現カセットを含むｐＣＭＶベースのベクターでトランスフェクトする。細胞を、トランスフェクト後の６０時間、培養する。上清を記載のように調製する。細胞溶解物を、以下のように調製する。この細胞を、リン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄し、界面活性剤（０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５中に１％　ＮＰ４０（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む）で溶解し、そしてこの溶解物を、新しいチューブに移す。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（あらかじめ成型した８−１６％；Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に、２０μｌの上清または１２．５μｌの細胞溶解物を充填する。タンパク質スタンダード（５μｌ，広範なサイズ範囲のスタンダード；ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）もまた、充填する。電気泳動を実施し、タンパク質を、ＢｉｏＲａｄ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｃｈａｍｂｅｒ（ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、製造者の推薦の転写緩衝液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ　Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に転写する。ここで転写は、１００ボルトで９０分間実施する。この膜を、ＨＩＶ−１陽性ヒト患者の血清に曝露し、そしてｏ−フェニレンジアミン二塩化水素化物（ＯＰＤ；Ｓｉｇｍａ）を用いて免疫染色する。
【０２７７】
免疫ブロッティング分析は、合成発現カセットを含む細胞が、ネイティブな発現カセットを含む細胞よりも細胞あたりより高い濃度で、予期したタンパク質を産生することを示す。このタンパク質は細胞溶解物および上清の両方に見られる。産生のレベルは、本発明の合成発現カセットでトランスフェクトした細胞の細胞上清において有意に高い。
【０２７８】
さらに、トランスフェクトした２９３細胞由来の上清を、ショ糖勾配で分画する。この上清のアリコートを、２０％（ｗｔ／ｗｔ）ショ糖溶液が下層に入ったＰｏｌｙｃｌｅａｒＴＭ超遠心チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）に移し、そしてＢｅｃｋｍａｎ　ＳＷ２８ローターで、２８，０００ｒｐｍで２時間の遠心分離に供する。生じるペレットをＰＢＳに懸濁し、２０〜６０％（ｗｔ／ｗｔ）ショ糖勾配上に重層し、そしてＢｅｃｋｍａｎ　ＳＷ４１　ｔｉローターで、４０，０００ｒｐｍで２時間の遠心分離に供する。
【０２７９】
次いで、勾配をおよそ１０×１ｍｌのアリコートに分画した（勾配の最高点で開始し、２０％で終了）。サンプルを１〜９分画から回収し、そして８〜１６％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動に供する。２９３／合成細胞由来の上清は、２９３／ネイティブな細胞由来の上清よりも非常に強いバンドを生じる。
【０２８０】
（実施例４）
（合成ＨＩＶ　Ｃ型発現カセットのインビボでの免疫原性）
（Ａ．免疫）
合成ＨＩＶ　Ｃ型発現カセットのおそらく改善される免疫原性を評価するために、マウス研究を実施する。プラスミドＤＮＡ（合成Ｇａｇ発現カセットを有するｐＣＭＶＫＭ２）を、１００μｌの総注射容積に、以下の最終濃度で希釈する：２０μｇ、２μｇ、０．２μｇ、０．０２μｇおよび０．００２μｇ。希釈したＤＮＡの考えられる陰性の希釈効果に克服するために、各サンプルにおける総ＤＮＡ濃度を、ベクター（ｐＣＭＶＫＭ２）のみを用いて２０μｇにする。コントロールとして、ネイティブのＧａｇ発現カセットのプラスミドＤＮＡを、同様の様式で取り扱う。１２の群（４〜１０匹）のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を、表１におけるスケジュールに従って、筋内で免疫した（１下肢あたり５０μｌ、前脛骨筋中に筋内注射）。
【０２８１】
【表９】
2004502445.tif 000014
１＝「０週間」で最初の免疫
１〜５群および１１〜１５群を、０週間（免疫前）、４週間、６週間、８週間、および１２週間で出血させる。６〜２０群および１６〜２０群を、０週間（免疫前）および４週間で出血させる。
【０２８２】
（Ｂ．体液性免疫応答）
体液性免疫応答を、免疫の０週間後および４週間後（５〜１２群）、さらに免疫の６週間後および８週間後（それぞれ２回目の免疫の２週間後および４週間後）（１〜４群）に、マウス血清の抗ＨＩＶ抗体ＥＬＩＳＡ法（固相酵素免疫検定法）を用いて確認する。
【０２８３】
血清の抗体力価を、適切な抗ＨＩＶポリペプチド（例えば、抗−Ｐｏｌ、抗−Ｇａｇ、抗−Ｅｎｖ、抗−Ｖｉｆ、抗−Ｖｐｕなど）抗体ＥＬＩＳＡを用いて決定する。簡単に言えば、免疫したマウス由来の血清を、ＨＩＶタンパク質（例えば、ｐ５５Ｇａｇタンパク質、Ｅｎｖタンパク質（例えば、ｇｐ１６０もしくはｇｐ１２０）またはＰｏｌタンパク質（例えば、ｐ６、ｐｏｒｔもしくはＲＴ）など）に対して指向された抗体によりスクリーニングする。ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを、１ウェルあたり０．２μｇのＨＩＶタンパク質でオーバーナイトでコートし、そして４回洗浄する；次に、ブロッキングを、ＰＢＳ−０．２％　Ｔｗｅｅｎ（Ｓｉｇｍａ）を用いて２時間行う。ブロッキング溶液の除去後、１００μｌの希釈したマウス血清を添加する。その後、血清を１／２５希釈で試験し、そして連続する３倍希釈で試験する。マイクロタイタープレートを、４回洗浄し、そして第二のペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）とともにインキュベートする。ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、１ウェルあたり１００μｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；Ｐｉｅｒｃｅ）を添加する。各々のウェルの光学密度を１５分後に測定する。この報告される力価は、半分の最大光学密度（Ｏ．Ｄ．）を得る血清の希釈の逆数である。
【０２８４】
合成発現カセットは、ネイティブの発現カセットに対して免疫原性の明らかな改善をもたらす。
【０２８５】
（Ｃ．細胞性免疫反応）
特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の頻度を、ペプチドパルスしたマウス（Ｂａｌｂ／ｃ，ＣＢ６Ｆ１および／またはＣ３Ｈ）ＣＤ４細胞の標準的なクロマチン放出アッセイにより評価した。ＨＩＶポリペプチド（例えば、Ｐｏｌ，ＧａｇまたはＥｖｎ）発現ワクシニアウイルスに感染したＣＤ−８細胞を、陽性コントロールとして使用した。要するに、上記のように免疫したマウスから得た脾臓細胞（エフェクター細胞、Ｅ）を培養し、再刺激し、そしてＧａｇペプチドパルスした標的細胞に対するＣＴＬ活性についてアッセイした（Ｄｏｅ，Ｂ．，およびＷａｌｋｅｒ，Ｃ．Ｍ．，ＡＤＩＳ　１０（７）：７９３〜７９４，１９９６に記載のように）。細胞傷害性活性を、標準的５１Ｃｒ放出アッセイで測定する。標的（Ｔ）細胞を、種々のＥ：Ｔ比率でエフェクター（Ｅ）細胞と共に４時間培養し、そして二つ組のウェルからの平均ｃｐｍを用いて、５１Ｃｒ放出比の割合を計算する。
【０２８６】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性を、ＨＩＶ　ＧａｇまたはＥｎｖ　ＤＮＡで免疫したマウスから回収する脾臓細胞において測定する。ＧａｇまたはＥｎｖ　ＤＮＡで免疫した動物由来のエフェクター細胞は、ＨＩＶポリペプチドパルスしたＳＶ−ＢＡＬＢ（ＭＨＣ適合する）標的細胞（ＣＴＬ反応を示す）の溶解比を示す。ペプチドパルスされ、そしてＭＨＣ非適合マウス系（ＭＣ５７）由来である標的細胞は、溶解しない。
【０２８７】
従って、合成発現カセットは、ＤＮＡ免疫化による細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応の誘導能力の増強を示す。
【０２８８】
（実施例５）
（合成ＨＩＶ　Ｃ型発現カセットを用いる非ヒト霊長類のＤＮＡ免疫化）
非ヒト霊長類を、皮内に、粘膜にまたは両側の四頭筋に、筋内に種々の用量（例えば、１〜５ｍｇ）および合成ＨＩＶＣ型プラスミドの種々の組み合わせを用いて、複数回（例えば、週に０、４、８および２４回）免疫する。この動物を、各々の免疫の２週間後に出血させ、そしてＥＬＩＳＡを単離した血漿を用いて実施する。このＥＬＩＳＡを、二次抗体の結合が抗ヒトＩｇＧ（ｇ鎖特異的）ペルオキシダーゼ結合であり（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＤ　６３１７８）、これを１：５００の希釈で用いたことを除いて、本質的に実施例４に記載のように実施する。５０μｇ／ｍｌの酵母抽出物を、血漿サンプルの希釈物に添加し、そして抗体を結合させて、非ヒト霊長類において予め存在する酵母抗体に起因して非特異的バックグラウンドを減少させる。
【０２８９】
さらに、抗原に対するリンパ増殖性反応をまた、Ｔヘルパー細胞機能の誘導を示す免疫後に評価し得る。
【０２９０】
合成プラスミドＤＮＡは、非ヒト霊長類において免疫原性になることが予測される。
【０２９１】
（実施例６）
（合成ＨＩＶ　Ｃ型発現カセットを含む組換えシンドビスのＲＮＡおよびＤＮＡのインビトロでの発現）
αウイルスベクターにおける合成Ｐｏｌ、ＥｖｎおよびＧａｇ発現カセットの発現効率を評価するために、この選択した合成発現カセットを、プラスミドＤＮＡベースのシンドビスウイルスベクターおよび組換えベクター粒子ベースのシンドビスウイルスベクターの両方にサブクローニングする。具体的には、シンドビスウイルスＲＮＡベクターレプリコンのインビトロでの転写のためのｃＤＮＡベクター構築物（ｐＲＳＩＮ−ｌｕｃ；Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．７０：５０８〜５１９，１９９６）を、プラスミドの直線化のためのＰｍｅＩ部位および異種遺伝子の挿入のためのポリリンカーを含むように改変する。ポリリンカーは、ＸｈｏＩ部位、ＰｍｌＩ部位、ＡｐａＩ部位、ＮａｒＩ部位、ＸｂａＩ部位およびＮｏｔＩ部位（ＸＰＡＮＸＮＦおよびＸＰＮＸＮＲ）を含む２つのオリゴヌクオチドを用いて形成する。
【０２９２】
プラスミドｐＲＳＩＮ−ｌｕｃ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、前出）を、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩを用いて消化し、ルシフェラーゼ遺伝子挿入物を取り除き、ＫｌｅｎｏｗおよびｄＮＴＰを用いて平滑末端化し、そしてＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩ（Ｂｉｏ０１，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）を用いてアガロースゲルから精製する。このオリゴヌクレオチドを、互いにアニールさせ、そしてプラスミドと結合させる。生じる構築物を、ＮｏｔＩおよびＳａｃｌで消化し、最小のシンドビス３’末端配列およびＡ４０トラクトを取り除き、そしてＰＫＳＳＩＮ１−ＢＶ（ＷＯ９７／３８０８７）由来の約０．４ｋｂｐのフラグメントと連結させる。この０．４ｋｂｐのフラグメントを、ＮｏｔＩおよびＳａｃＩを用いるｐＫＳＳＩＮ１−ＢＶの消化、そしてアガロースゲルからのサイズ分画後の精製によって得る。このフラグメントは、完全なシンドビスウイルスの３’末端およびＡ４０トラクトならびに直線化のためのＰｍｅＩ部位を含む。この新しいベクター構築物をＳＩＮＢＶＥと命名する。
【０２９３】
この合成ＨＩＶコード配列を、ＥｃｏＲＩで消化し、ＫｌｅｎｏｗおよびｄＮＴＰを用いて平滑末端化し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩで精製し、ＳａｌＩで消化し、アガロースゲル上でサイズ分画し、そしてＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩを用いてアガロースゲルから精製することによって親プラスミドから得る。この合成ＨＩＶポリペプチドコードフラグメントを、ＸｈｏＩおよびＰｍｔＩで消化したＳＩＮＢＶＥベクターに連結させる。生じるベクターを、ＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩを用いて精製し、そしてＳＩＮＢＶＧａｇで消化する。ベクターＲＮＡレプリコンを、インビトロでＳＩＮＢＶＧａｇから転写させ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、前出）、そして細胞のトランスフェクションに直接使用し得る。あるいは、このレプリコンを、不完全なヘルパーＲＮＡとともに同時トランスフェクションするか、またはαウイルスパッケージング細胞株を用いることによって、組換えベクター粒子中にパッケージし得る。
【０２９４】
このＤＮＡベースのシンドビスウイルスベクターｐＤＣＭＶＳＩＮ−β−ｇａｌ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．７０：５０８〜５１９，１９９６）を、ＳａｌＩおよびＸｂａＩで消化し、β−ガラクトシダーゼ遺伝子挿入物を取り除き、アガロースゲルのサイズ分画後、ＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩを用いて精製する。ＳａｌＩおよびＸｈｏＩでＳＩＮＢＶＧａｇを消化すること、アガロースゲルのサイズ分画後のＧａｇ含有フラグメントのＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩを用いた精製および連結によって、ＨＩＶ　ＧａｇまたはＥｎｖ遺伝子を、ｐＤＣＭＶＳＩＮ−β−ｇａｌに挿入させる。生じる構築物を、ｐＤＳＩＮ−Ｇａｇと呼び、これは本明細書中に記載の任意の方法を使用して、インビボでの投与または処方のため直接的に使用し得る。
【０２９５】
ＢＨＫ細胞および２９３細胞を、それぞれ組換えシンドビスＲＮＡおよびＤＮＡでトランスフェクトする。この上清および細胞溶解物を、Ｃｏｕｌｔｅｒ　ｃａｐｔｕｒｔｅ　ＥＬＩＳＡを用いて試験する（実施例２）。
【０２９６】
ＢＨＫ細胞を、組換えシンドビスＲＮＡを用いてエレクトロポレーションによってトランスフェクトする。
【０２９７】
２９３細胞を、組換えシンドビスＤＮＡを用いてＬＴ−１を使用してトランスフェクトする（実施例２）。合成Ｇａｇ含有プラスミドおよび／またはＥｎｖ含有プラスミドを、陽性コントロールとして使用する。上清および溶解物をトランスフェクションの４８時間後に収集する。
【０２９８】
Ｃ型　ＨＩＶタンパク質を、合成発現カセットを用いて、ＤＮＡおよびＲＮＡベースのシンドビスベクターシステムの両方から効率よく発現させ得る。
【０２９９】
（実施例７）
（合成Ｐｏｌ、Ｇａｇおよび／またはＥｎｖ発現カセットを含む組換えシンドビスレプリコンベクターのインビボでの免疫原性）
（Ａ．免疫）
シンドビスレプリコンにおける組換え合成ＨＩＶ　Ｃ型発現カセットの免疫原性を評価するために、マウスの研究を実施する。この合成発現カセットを有するシンドビスウイルスＤＮＡベクター（実施例６）を、総注射容積（１００μｌ）に以下の最終濃度で希釈する：２０μｇ、２μｇ、０．２μｇ、０．０２μｇおよび０．００２μｇ。希釈したＤＮＡの考えられる陰性の希釈効果を克服するために、各々のサンプルの総ＤＮＡ濃度を、シンドビスレプリコンベクターＤＮＡのみを用いて２０μｇにする。１２群（４〜１０匹）のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を、表２のスケジュールに従って、筋内で免疫した（１下肢あたり５０μｌ、前脛骨筋中に筋内注射）。あるいは、シンドビスウイルス粒子を、表３に示すように、１００μｌ中に以下の用量で調整する：１０３ｐｆｕ、１０５ｐｆｕおよび１０７ｐｆｕ。シンドビスＨＩＶポリペプチド粒子調整物を、マウスに筋内経路および皮下経路を用いて投与する（１部位あたり５０μｌ）。
【０３００】
【表１０】
2004502445.tif 000015
１＝「０週間」で最初の免疫
【０３０１】
【表１１】
2004502445.tif 000016
１＝「０週間」で最初の免疫
群を出血させ、そして体液性および細胞性（例えば、特異的ＣＴＬの頻度）の両方の評価を、本質的に実施例４に記載のように実施する。
【０３０２】
（実施例８）
（新規のＨＩＶ　Ｃ型改変体の同定および配列決定）
ＨＩＶ　Ｃ型をコードする８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡと呼ばれる全長クローンを、単離しそして配列決定した。手短に言えば、ＨＩＶ−１　Ｃ亜型に感染した南アフリカ人の患者由来のゲノムＤＮＡを、アルカリ性溶解および陰イオン交換カラム（Ｑｕｉａｇｅｎ）によりＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）から単離した。全長クローンのゲノムを得るために、二等分を増幅した。後にこれらを、両方のフラグメントにおける特有なＳａｌ１部位を用いてＰｏｌ領域内で、インフレームで一緒に結合させる。増幅のために、業者のプロトコルの後に、２００〜８００ｎｇのゲノムＤＮＡを、緩衝液およびＥｘｐａｎｄ　Ｌｏｎｇ　Ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈａｅｉｍ）の酵素混合物に添加した。このプライマーを既知の全長配列の整列の後に設計した。５’半分のために、２０位置にチミジン（Ｓ１ＦＣＳａｃＴＡ　５’−ＧＴＴＴＣＴＴＧＡＧＣＴＣＴＧＧＡＡＧＧＧＴＴＡＡＴＴＴＡＣＴＣＣＡＡＧＡＡ−３’、配列番号３８）またはシトシン（Ｓ１ＦＴＳａｃＴＡ　５’−ＧＴＴＴＣＴＴＧＡＧＣＴＣＴＧＧＡＡＧＧＧＴＴＡＡＴＴＴＡＣＴＣＴＡＡＧＡＡ、配列番号３９）いずれか、およびＳａｌ１部位を含む２つの正方向プライマーのプライマー混合物を用いた。逆方向プライマーもまた、１３位置にチミジンまたはシトシンのいずれかを含む２つのプライマー（Ｓ１４５ＲＴＳａｌＴＡ　５’−ＧＴＴＴＣＴＴＧＴＣＧＡＣＴＴＧＴＣＣＡＴＧＴＡＴＧＧＣＴＴＣＣＣＣＴ−３’、配列番号４０およびＳ１４５ＲＴＳａｌＴＡ　５’−ＧＴＴＴＣＴＴＧＴＣＧＡＣＴＴＧＴＣＣＡＴＧＣＡＴＧＧＣＴＴＣＣＣＴ−３’配列番号４１）の混合物であり、そしてＳａｌ１部位を含む。３’半分についての正方向プライマーはまた、Ｓａｌ１部位および１２位置にアデニンまたはグアニンを有する２つのプライマー（Ｓ２４ＦＡＳａｌＴＡ　５’−ＧＴＴＴＣＴＴＧＴＣＧＡＣＴＧＴＡＧＴＣＣＡＧＧａＡＴＡＴＧＧＣＡＡＴＴＡＧ−３’配列番号４２およびＳ２４ＦＧＳａｌＴＡ　５’−ＧＴＴＴＣＴＴＧＴＣＧＡＣＴＧＴＡＧＴＣＣＡＧＧｇＡＴＡＴＧＧＣＡＡＴＴＡＧ−３’配列番号４３）の混合物である。逆方向プライマーはＮｏｔ１部位を有する（Ｓ２＿ＦｕｌｌＮｏｔＴＡ　５’−ＧＴＴＴＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＣＴＡＧＡＧＡＴＴＴＴＣＣＡＣＡＣＴＡＣＣＡ−３’配列番号４４）。増幅後のＰＣＲ産物を１％アガロースゲルを用いて精製し、ＴＡクローニング（Ｉｂｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。コロニーを制限分析によって確認し、配列を実証した。全長配列のために、５’半分および３’半分の配列を結合させた。この配列を配列番号３３に示す。さらに、重要なドメインを表Ａに示す。
【０３０３】
１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡと呼ばれる別のクローンもまた、配列決定され、配列番号４５に示す。このドメインは本明細書の技術から見て容易に決定され得る。例えば、表Ａに示されるこれらの配列を整列されることによって、クローン１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡの対応領域を発見する。
【０３０４】
上記のように（実施例１、表Ｃ）、合成発現カセットを、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡまたは１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡから得た１つ以上のポリヌクレオチド配列を用いて生成した。
【０３０５】
本明細書中に記載のポリヌクレオチドは、全てＣｈｉｒｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡに寄託している。
【０３０６】
本発明の好ましい実施形態はいくらか詳細に記載されているが、明らかな改変が添付の請求項により規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなしになされ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１（配列番号３）は、合成Ｇａｇポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。示されるヌクレオチド配列は、Ｃ型ＡＦ１１０９６５株を改変することによって得られ、ＩＮＳのさらなる改変を含む。
【図２】
図２（配列番号４）は、合成Ｇａｇポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。示されるヌクレオチド配列は、Ｃ型ＡＦ１１０９６７株を改変することによって得られ、ＩＮＳのさらなる改変を含む。
【図３】
図３（配列番号９）は、合成Ｅｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。このヌクレオチド配列は、ｇｐ１６０（シグナルペプチドを含む）を示し、Ｃ型ＡＦ１１０９６８株を改変することによって得られた。矢印は、種々の領域のポリヌクレオチドの位置を示しており、これらとしては、以下をコードする配列が挙げられる：シグナルペプチド（ヌクレオチド１〜８１）（配列番号１８）、ｇｐ１２０ポリペプチド（ヌクレオチド８２〜１５１２）（配列番号６）、ｇｐ４１ポリペプチド（ヌクレオチド１５１３〜２５４７）（配列番号１０）、ｇｐ１４０ポリペプチド（ヌクレオチド８２〜２０２５）（配列番号７）およびｇｐ１６０ポリペプチド（ヌクレオチド８２〜２５４７）（配列番号８）。シグナルペプチドをコードするコドンは、ネイティブのＨＩＶ−１シグナル配列から（本明細書中に記載されるように）改変される。
【図４】
図４（配列番号１５）は、合成Ｅｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。このヌクレオチド配列は、ｇｐ１６０（シグナルペプチドを含む）を示し、Ｃ型ＡＦ１１０９７５株を改変することによって得られた。矢印は、種々の領域のポリヌクレオチドの位置を示しており、これらとしては、以下をコードする配列が挙げられる：シグナルペプチド（ヌクレオチド１〜７２）（配列番号１９）、ｇｐ１２０ポリペプチド（ヌクレオチド７３〜１５０９）（配列番号１２）、ｇｐ４１ポリペプチド（ヌクレオチド１５１０〜２５６５）（配列番号１６）、ｇｐ１４０ポリペプチド（ヌクレオチド７３〜２０２２）（配列番号１３）およびｇｐ１６０ポリペプチド（ヌクレオチド７３〜２５６５）（配列番号１４）。シグナルペプチドをコードするコドンは、ネイティブのＨＩＶ−１シグナル配列から（本明細書中に記載されるように）改変される。
【図５】
図５は、ＡＦ１１０９６５から誘導された合成Ｇａｇ配列における、いくつかの残存するＩＮＳの位置を示している。これらの配列に対してなされた変化が、図中で囲まれている。上の列は、示された株由来のＧａｇポリペプチドの、コドンを改変された配列（配列番号２０）を示している。囲んだ領域中の列の下に現れるヌクレオチドは、さらなるＩＮＳを取り除かれ、かつ図１に示される配列（配列番号３）に対応するようになされた変化を示している。
【図６】
図６は、ＡＦ１１０９６７から誘導された合成Ｇａｇ配列における、いくつかの残存するＩＮＳの位置を示している。これらの配列に対してなされた変化が、図中で囲まれている。上の列は、示された株由来のＧａｇポリペプチドの改変された配列（配列番号２１）を示している。囲んだ領域中の系列の下に現れるヌクレオチドは、さらなるＩＮＳを取り除かれ、かつ図２に示される配列（配列番号４）に対応するようになされた変化を示している。
【図７】
図７は、ＨＩＶのＰｏｌ領域における、選択されたドメインを示した概略図である。
【図８】
図８（配列番号３０）は、ＰＲ９７５（＋）と表される合成構築物のヌクレオチド配列を示している。「（＋）」は、逆転写が機能的であることを示している。この構築物としては、以下由来の配列が挙げられる：ｐ２（配列番号３０のヌクレオチド１６〜５４）；ｐ７（配列番号３０のヌクレオチド５５〜２１９）；ｐ１／ｐ６（配列番号３０のヌクレオチド２２０〜３７５）；ｐｒｏｔ（配列番号３０のヌクレオチド３７６〜６７２）、逆転写酵素（配列番号３０のヌクレオチド６７３〜２３５２）；および図７に示される６のアミノ酸のインテグラーゼ（配列番号３０のヌクレオチド２３５３〜２３７０）。さらに、この構築物は、導入遺伝子およびＹＭＤＤエピトープカセット（配列番号３０のヌクレオチド２３７１〜２４２４）を挿入するための複数のクローニング部位（ＭＣＳ、配列番号３０のヌクレオチド２４２５〜２４６３）を含む。
【図９】
図９（配列番号３１）は、ＰＲ９７５ＹＭと表される合成構築物のヌクレオチド配列を示している。図７に示されるように、ＲＴ領域は、触媒中心における変異（ｍｕｔ．ｃａｔ．ｃｅｎｔｅｒ）を含んでいる。「ＹＭ」とは、ヌクレオチドがこの領域において、ＹＭＤＤではなくアミノ酸ＡＰをコードする構築物をいう。逆転写酵素は、この構築物において機能的ではない。この構築物としては、Ｐ２（配列番号３１のヌクレオチド１６〜５４）；ｐ７（配列番号３１のヌクレオチド５５〜２１９）；ｐ１／ｐ６（配列番号３１のヌクレオチド２２０〜３７５）；ｐｒｏｔ（配列番号３１のヌクレオチド３７６〜６７２）、および図７に示される逆転写酵素（配列番号３１のヌクレオチド６７３〜２３４６）由来の配列が挙げられるが、逆転写酵素タンパク質は、機能的ではない。さらに、この構築物は、導入遺伝子およびＹＭＤＤエピトープカセット（配列番号３１のヌクレオチド２３６５〜２４１８）を挿入するための複数のクローニング部位（ＭＣＳ、配列番号３１のヌクレオチド２４１９〜２４５７）を含む。
【図１０】
図１０（配列番号３２）は、ＰＲ９７５ＹＭＷＭと表される合成構築物のヌクレオチド配列を示している。「ＹＭ」とは、ヌクレオチドがこの領域において、ＹＭＤＤではなくアミノ酸ＡＰをコードする構築物をいう。「ＷＭ」とは、ヌクレオチドがこの領域において、ＷＭＧＹではなくアミノ酸ＰＩをコードする構築物をいう。この構築物としては、ｐ２（配列番号３２のヌクレオチド１６〜５４）；ｐ７（配列番号３２のヌクレオチド５５〜２１９）；ｐ１／ｐ６（配列番号３２のヌクレオチド２２０〜３７５）；ｐｒｏｔ（配列番号３２のヌクレオチド３７６〜６７２）、および図７に示される逆転写酵素（配列番号３２のヌクレオチド６７３〜２３４０）由来の配列が挙げられるが、逆転写酵素タンパク質は、機能的ではない。さらに、この構築物は、導入遺伝子およびＹＭＤＤエピトープカセット（配列番号３２のヌクレオチド２３５９〜２４１２）を挿入するための複数のクローニング部位（ＭＣＳ、配列番号３２のヌクレオチド２４１３〜２４５１）を含む。
【図１１】
図１１（配列番号３３）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡのヌクレオチド配列を示す。種々の領域を、表Ａに示す。
【図１２】
図１２（配列番号３４）は、ｐ２ｇａｇからｐ７ｇａｇまでの、ＡＦ１１０９７５　Ｐｏｌの野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図１３】
図１３（配列番号３５）は、ｐ１からインテグラーゼタンパク質の最初の６アミノ酸の、ＡＦ１１０９７５　Ｐｏｌの野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図１４】
図１４（配列番号３６）は、逆転写酵素のＩｌｅ１７８〜セリン１９１をコードするカセットのヌクレオチド配列を示す。
【図１５】
図１５（配列番号３７）は、逆転写酵素タンパク質の触媒中心領域中のエピトープを含むアミノ酸配列を示す。
【図１６】
図１６（配列番号４５）は、１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡのヌクレオチド配列を示す。
【図１７】
図１７（配列番号４６）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｅｎｖコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。この配列は、短い（９７塩基対）共通領域に対応する。
【図１８】
図１８（配列番号４７）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｅｎｖコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。この配列は、Ｅｎｖ中の共通領域に対応する。
【図１９】
図１９（配列番号４８）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ　Ｅｎｖの野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図２０】
図２０（配列番号４９）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｅｎｖ　ｇｐ１６０コードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
【図２１】
図２１（配列番号５０）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ　Ｅｎｖ　ｇｐ１６０の野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図２２】
図２２（配列番号５１）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｇａｇコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
【図２３】
図２３（配列番号５２）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ　Ｇａｇの野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図２４】
図２４（配列番号５３）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｇａｇコードポリヌクレオチド（主要な相同性領域）のヌクレオチド配列を示す。
【図２５】
図２５（配列番号５４）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ　Ｇａｇ主要相同性領域の野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図２６】
図２６（配列番号５５）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｎｅｆコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
【図２７】
図２７（配列番号５６）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ　Ｎｅｆの野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図２８】
図２８（配列番号５７）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｎｅｆコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。この配列は、非機能遺伝子産物を生じる１２５位における変異を含む。
【図２９】
図２９（配列番号５８）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成ＲＮＡｓｅＨコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。ＲｎａｓｅＨは、Ｐｏｌ遺伝子の機能的ドメインであり、ｐ１５に対応する（表Ａ）。
【図３０】
図３０（配列番号５９）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ　ＲＮＡｓｅＨの野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図３１】
図３１（配列番号６０）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成インテグラーゼ（Ｉｎｔ）コードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。Ｉｎｔは、Ｐｏｌ遺伝子の機能的ドメインであり、ｐ３１に対応する（表Ａ）。
【図３２】
図３２（配列番号６１）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ　Ｉｎｔの野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図３３】
図３３（配列番号６２）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｐｏｌコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
【図３４】
図３４（配列番号６３）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ　Ｐｏｌの野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図３５】
図３５（配列番号６４）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成プロテアーゼ（ｐｒｏｔ）コードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
【図３６】
図３６（配列番号６５）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ　Ｐｒｏｔの野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図３７】
図３７（配列番号６６）は、プロテアーゼの不活性化を生じる変異を含む、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成プロテアーゼ（ｐｒｏｔ）コードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
【図３８】
図３８（配列番号６７）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ　不活性化Ｐｒｏｔの野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図３９】
図３９（配列番号６８）は、共に８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来である、合成プロテアーゼ（ｐｒｏｔ）コードポリヌクレオチドおよび合成逆転写酵素（ＲＴ）コードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。Ｐｒｏｔ配列およびＲＴ配列は、共に、遺伝子産物の不活性化を生じる変異を含む。
【図４０】
図４０（配列番号６９）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ　不活性化Ｐｒｏｔ／変異ＲＴの野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図４１】
図４１（配列番号７０）は、共に８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来である、合成プロテアーゼ（ｐｒｏｔ）コードポリヌクレオチドおよび合成逆転写酵素（ＲＴ）コードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
【図４２】
図４２（配列番号７１）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ　ＰｒｏｔおよびＲＴの野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図４３】
図４３（配列番号７２）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成ｒｅｖコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。この示した合成配列は、ｒｅｖのエキソン１に対応する。野生型ｒｅｖは、２つのエキソンを有する。
【図４４】
図４４（配列番号７３）は、Ｒｅｖの８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ　エキソン１の野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図４５】
図４５（配列番号７４）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成ｒｅｖコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。この示した合成配列は、ｒｅｖのエキソン２に対応する。
【図４６】
図４６（配列番号７５）は、Ｒｅｖの８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ　エキソン２の野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図４７】
図４７（配列番号７６）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成ＲＴコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
【図４８】
図４８（配列番号７７）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ　ＲＴの野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図４９】
図４９（配列番号７８）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成ＲＴコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。この合成ポリヌクレオチドは、遺伝子産物を不活性にするＲＴコード配列中の変異を含む。
【図５０】
図５０（配列番号７９）は、ＲＴ遺伝子産物を不活性化する変異を含む、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ　ＲＴの野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図５１】
図５１（配列番号８０）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｔａｔコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。この示した合成配列は、Ｔａｔのエキソン１に対応し、さらに、Ｔａｔ遺伝子産物を非機能的にする変異を含む。野生型Ｔａｔは、２つのエキソンを有する。
【図５２】
図５２（配列番号８１）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｔａｔコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。示した合成配列は、Ｔａｔのエキソン１に対応する。
【図５３】
図５３（配列番号８２）は、Ｔａｔの８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ　エキソン１の野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図５４】
図５４（配列番号８３）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｔａｔコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。示した合成配列は、Ｔａｔのエキソン２に対応する。
【図５５】
図５５（配列番号８４）は、Ｔａｔの８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ　エキソン２の野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図５６】
図５６（配列番号８５）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｖｉｆコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
【図５７】
図５７（配列番号８６）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ　Ｖｉｆの野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図５８】
図５８（配列番号８７）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｖｐｒコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
【図５９】
図５９（配列番号８８）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ　Ｖｐｒの野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図６０】
図６０（配列番号８９）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｖｐｕコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
【図６１】
図６１（配列番号９０）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ　Ｖｐｕの野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図６２】
図６２（配列番号９１）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成ｒｅｖコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。この示した合成配列は、ｒｅｖのエキソン１および２に対応する。
【図６３】
図６３（配列番号９２）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来のｒｅｖのエキソン１および２の野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図６４】
図６４（配列番号９３）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｔａｔコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。この合成ポリヌクレオチドは、Ｔａｔのエキソン１および２の両方を含み、そしてさらに、この遺伝子産物を非機能的にするエキソン１中の変異を含む。
【図６５】
図６５（配列番号９４）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｔａｔコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。この合成ポリヌクレオチドは、Ｔａｔのエキソン１および２の両方を含む。
【図６６】
図６６（配列番号９５）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来のＴａｔのエキソン１および２の野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図６７】
図６７（配列番号９６）は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｎｅｆコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。この配列は、非機能的遺伝子産物を生じる１２５位の変異およびＮｅｆ遺伝子産物のミリストイル化を排除する変異を含む。
【図６８】
図６８（配列番号９７）は、１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｅｎｖ　ｇｐ１６０コードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
【図６９】
図６９（配列番号９８）は、１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ由来のＥｎｖ　ｇｐ１６０の野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図７０】
図７０（配列番号９９）は、１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｇａｇコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
【図７１】
図７１（配列番号１００）は、１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ由来のＧａｇの野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図７２】
図７２（配列番号１０１）は、１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｎｅｆコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
【図７３】
図７３（配列番号１０２）は、１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ由来のＮｅｆの野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図７４】
図７４（配列番号１０３）は、１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｐｏｌコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
【図７５】
図７５（配列番号１０４）は、１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ由来のＰｏｌの野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図７６】
図７６（配列番号１０５）は、１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ由来のＲｅｖのエキソン１由来の合成Ｒｅｖコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
【図７７】
図７７（配列番号１０６）は、１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ由来のＲｅｖのエキソン１の野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図７８】
図７８（配列番号１０７）は、１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ由来のＲｅｖのエキソン２由来の合成Ｒｅｖコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
【図７９】
図７９（配列番号１０８）は、１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ由来のＲｅｖのエキソン２の野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図８０】
図８０（配列番号１０９）は、１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ由来のＴａｔエキソン１由来の、合成Ｔａｔコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
【図８１】
図８１（配列番号１１０）は、１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ由来のＴａｔのエキソン１の野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図８２】
図８２（配列番号１１１）は、１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ由来のＴａｔエキソン２由来の、合成Ｔａｔコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
【図８３】
図８３（配列番号１１２）は、１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ由来のＴａｔのエキソン２の野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図８４】
図８４（配列番号１１３）は、１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｖｉｆコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
【図８５】
図８５（配列番号１１４）は、１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ由来のＶｉｆの野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図８６】
図８６（配列番号１１５）は、１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｖｐｒコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
【図８７】
図８７（配列番号１１６）は、１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ由来のＶｐｒの野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図８８】
図８８（配列番号１１７）は、１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｖｐｕコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
【図８９】
図８９（配列番号１１８）は、１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ由来のＶｐｕの野生型ヌクレオチド配列を示す。
【図９０】
図９０（配列番号１１９）は、８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｅｎｖ　ｇｐ１２０コードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。Ｖ２領域は、欠失している。この配列は、ＥｃｏＲＩ制限部位（ヌクレオチド１〜６）；コドン改変されたシグナルペプチドリーダー配列（ヌクレオチド７〜８７）；ｇｐ１２０コード配列（ヌクレオチド８８〜１４６４）；終止コドン（ヌクレオチド１４６５〜１４６７）；ＸｈｏＩ制限部位（ヌクレオチド１４６８〜１４７３）を含む。
【図９１】
図９１（配列番号１２０）は、８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｅｎｖ　ｇｐ１４０コードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。Ｖ２領域は、欠失している。この配列は、ＥｃｏＲＩ制限部位（ヌクレオチド１〜６）；改変シグナルペプチドリーダー配列（ヌクレオチド７〜８７）；ｇｐ１４０コード配列（ヌクレオチド８８〜１９７７）；終止コドン（ヌクレオチド１９７８〜１９８０）；ＸｈｏＩ制限部位（ヌクレオチド１９８１〜１９８６）を含む。
【図９２】
図９２（配列番号１２１）は、８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｅｎｖ　ｇｐ１４０コードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。Ｖ２領域は、欠失し、この配列は、ｇｐ１４０ポリペプチドのｇｐ１２０ポリペプチドおよびｇｐ４１ポリペプチドへの切断を予防する切断部位中の変異を含む。この配列は、ＥｃｏＲＩ制限部位（ヌクレオチド１〜６）；改変シグナルペプチドリーダー配列（ヌクレオチド７〜８７）；ｇｐ１４０コード配列（ヌクレオチド８８〜１９７７）；終止コドン（ヌクレオチド１９７８〜１９８０）；ＸｈｏＩ制限部位（ヌクレオチド１９８１〜１９８６）を含む。
【図９３】
図９３（配列番号１２２）は、８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｅｎｖ　ｇｐ１６０コードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。Ｖ１／Ｖ２領域は、欠失している。この配列は、ＥｃｏＲＩ制限部位（ヌクレオチド１〜６）；改変シグナルペプチドリーダー配列（ヌクレオチド７〜８７）；ｇｐ１６０コード配列（ヌクレオチド８８〜２３８８）；終止コドン（ヌクレオチド２３８９〜２３９１）；ＸｈｏＩ制限部位（ヌクレオチド２３９２〜２３９７）を含む。
【図９４】
図９４（配列番号１２３）は、８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｅｎｖ　ｇｐ１６０コードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。Ｖ２領域は、欠失している。この配列は、ＥｃｏＲＩ制限部位（ヌクレオチド１〜６）；改変シグナルペプチドリーダー配列（ヌクレオチド７〜８７）；ｇｐ１６０コード配列（ヌクレオチド８８〜２５２０）；終止コドン（ヌクレオチド２５２１〜２５２３）；ＸｈｏＩ制限部位（ヌクレオチド２５２４〜２５２９）を含む。
【図９５】
図９５（配列番号１２４）は、８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｅｎｖ　ｇｐ１６０コードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。Ｖ２領域は、欠失し、そして切断部位が変異している。この配列は、ＥｃｏＲＩ制限部位（ヌクレオチド１〜６）；改変シグナルペプチドリーダー配列（ヌクレオチド７〜８７）；ｇｐ１６０コード配列（ヌクレオチド８８〜２５２０）；終止コドン（ヌクレオチド２５２１〜２５２３）；ＸｈｏＩ制限部位（ヌクレオチド２５２４〜２５２９）を含む。
【図９６】
図９６（配列番号１２５）は、８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｅｎｖ　ｇｐ１６０コードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。このヌクレオチド配列は、ＴＰＡ１リーダー配列を含む。この配列は、ＳａｌＩ制限部位（ヌクレオチド１〜６）；コザック配列（ヌクレオチド７〜１２）；ＴＰＡ１シグナルペプチドリーダー配列（ヌクレオチド１３〜８７）；ｇｐ１６０コード配列（ヌクレオチド８８〜２６０４）；終止コドン（ヌクレオチド２６０５〜２６０７）；ＸｈｏＩ制限部位（ヌクレオチド２６０８〜２６１３）を含む。
【図９７】
図９７（配列番号１２６）、８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｅｎｖ　ｇｐ１６０コードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。この配列は、ＥｃｏＲＩ制限部位（ヌクレオチド１〜６）；改変シグナルペプチドリーダー配列（ヌクレオチド７〜８７）；ｇｐ１６０コード配列（ヌクレオチド８〜２６０７）；終止コドン（ヌクレオチド２６０８〜２６１０）；ＸｈｏＩ制限部位（ヌクレオチド２６１１〜２６１６）を含む。
【図９８】
図９８（配列番号１２７）は、８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ由来の合成Ｅｎｖ　ｇｐ１６０コードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。このヌクレオチド配列は、野生型リーダー配列を含む。この配列は、ＥｃｏＲＩ制限部位（ヌクレオチド１〜６）；ネイティブ（未改変）シグナルペプチドリーダー配列（ヌクレオチド７〜８７）；ｇｐ１６０コード配列（ヌクレオチド８８〜２６０７）；終止コドン（ヌクレオチド２６０８〜２６１０）；ＸｈｏＩ制限部位（ヌクレオチド２６１１〜２６１６）を含む。
【図９９】
図９９（配列番号１２８）は、８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ．由来の野生型ｇｐ１６０のヌクレオチド配列を示す。
【図１００】
図１００（配列番号１３１）は、８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ．由来の合成Ｅｎｖｇｐ１４０コードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。このヌクレオチド配列は、ＴＰＡ１リーダー配列（ヌクレオチド１〜７５）；ｇｐ１４０コード配列（ヌクレオチド７６〜２０４９）；終止コドン（ヌクレオチド２０５０〜２０５２）；を含む。
【図１０１】
図１０１（配列番号１３２）は、８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ．由来の合成ｇｐ１４０コードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。このヌクレオチド配列は、ＥｃｏＲＩ制限部位（ヌクレオチド１〜６）；ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ野生型リーダー配列から改変されたリーダー配列（ヌクレオチド７〜８７）；ｇｐ１４０コード配列（ヌクレオチド８８〜２０６４）；終止コドン（ヌクレオチド２０６５〜２０６７）；ＸｈｏＩ制限部位（ヌクレオチド２０６８〜２０７３）；を含む。
【図１０２】
図１０２（配列番号１３３）は、８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ．由来の合成ｇｐ１４０コードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。このヌクレオチド配列は、野生型ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ非改変リーダー配列を含む。このヌクレオチド配列は、制限部位（ヌクレオチド１〜６）；野生型リーダー配列（ヌクレオチド７〜８７）；ｇｐ１４０コード配列（ヌクレオチド８８〜２０６４）；終止コドン（ヌクレオチド２０６５〜２０６７）；ＸｈｏＩ制限部位（ヌクレオチド２０６８〜２０７３）；を含む。
【図１０３】
図１０３（配列番号１３４）は、１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ．由来の合成Ｎｅｆコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。この配列は、非機能的遺伝子産物を生じる位置１２５の変異を含む。
【図１０４】
図１０４（配列番号１３５）は、１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡ．由来の合成Ｎｅｆコードポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。この合成ポリヌクレオチドは、Ｎｅｆ遺伝子産物のミリストイル化部位を排除する変異を含む。
【図１０５Ａ】
図１０５は、種々のＨＩＶ単離体由来のＥｎｖポリペプチドの整列を示す。矢印の間の領域は、欠失および／または短縮され得るβおよび／または架橋シート領域における（ＴＶ１クローンおよびＴＶ２クローンの）領域を示す。「＊」は、（ＴＶ１クローンおよびＴＶ２クローンの）Ｎ連結グリコシル化部位を意味する。その１つ以上が改変（例えば、欠失および／または変異）され得る。
【図１０５Ｂ】
図１０５は、種々のＨＩＶ単離体由来のＥｎｖポリペプチドの整列を示す。矢印の間の領域は、欠失および／または短縮され得るβおよび／または架橋シート領域における（ＴＶ１クローンおよびＴＶ２クローンの）領域を示す。「＊」は、（ＴＶ１クローンおよびＴＶ２クローンの）Ｎ連結グリコシル化部位を意味する。その１つ以上が改変（例えば、欠失および／または変異）され得る。
【図１０５Ｃ】
図１０５は、種々のＨＩＶ単離体由来のＥｎｖポリペプチドの整列を示す。矢印の間の領域は、欠失および／または短縮され得るβおよび／または架橋シート領域における（ＴＶ１クローンおよびＴＶ２クローンの）領域を示す。「＊」は、（ＴＶ１クローンおよびＴＶ２クローンの）Ｎ連結グリコシル化部位を意味する。その１つ以上が改変（例えば、欠失および／または変異）され得る。
【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図１３】
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【図１０５Ａ】
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【図１０５Ｂ】
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【図１０５Ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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