(57)【要約】トリ発育不良症候群（ＭＡＳ）の原因物質を単離し、これから起こる疾患の予防において使用されるワクチンを調製するために使用した。ワクチンは少なくとも２種のトリウイルス−レオウイルスおよびアデノウイルス−を含有し、所望により家禽に影響を及ぼすもう一つ別のウイルスを含んでも良い。ワクチン中に組み入れられる場合にウイルスは、生、弱毒化された生、または不活化であってもよい。ワクチンそれ自体を、新生または発育中のヒヨコ、または成鳥に卵内投与することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬的に許容される担体中にトリレオウイルスおよびトリアデノウイルスを含む、トリ吸収不良症候群に関連する病状に対するワクチン。
【請求項２】
少なくとも２種の生、生−弱毒化または不活化ウイルスを含み、少なくとも１種のウイルスがトリレオウイルスであり、少なくとも１種のウイルスがトリアデノウイルスである、トリ吸収不良症候群ワクチン。
【請求項３】
トリレオウイルスおよびトリアデノウイルスおよび家禽に感染する少なくとも１種の他のウイルスを含む、トリ吸収不良症候群に関連する病状に対するワクチン。
【請求項４】
約１０４〜１０１０ＴＣＩＤ５０の不活化トリレオウイルスおよび約１０４〜１０１０ＴＣＩＤ５０の不活化トリアデノウイルスを含む請求項１〜３のいずれか一つに記載のワクチン。
【請求項５】
家禽に影響を及ぼす少なくとも１種の他のウイルスをさらに含む請求項１〜４のいずれか一つに記載のワクチン。
【請求項６】
前記ウイルスがビルナ様ウイルスである請求項５記載のワクチン。
【請求項７】
約１０２〜１０６ＴＣＩＤ５０の生トリレオウイルスおよび約１０２〜１０６ＴＣＩＤ５０の生トリアデノウイルスを含む請求項１〜６のいずれか一つに記載のワクチン。
【請求項８】
トリ吸収不良症候群から生じる病状に対するワクチンを産生する方法であって、トリレオウイルスおよびトリアデノウイルスの適当な試料を単離し、次いで単離されたウイルスを医薬的に許容される担体と共にワクチン中に組み入れることを含む方法。
【請求項９】
トリ吸収不良症候群に関連する病状に対して予防接種する方法であって、トリレオウイルスおよびトリアデノウイルスを含有するワクチンを家禽に投与することを含む方法。
【請求項１０】
トリ吸収不良症候群に関連する病状に対する家禽の予防接種用の医薬の製造における、少なくとも１種のトリレオウイルスおよび少なくとも１種のトリアデノウイルスの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は鳥類の疾患に対するワクチンに関し、さらに詳細には、トリ吸収不良症候群（ＭＡＳ）に関連する疾患に対するワクチン、ならびにこれを家禽に投与する方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
トリ吸収不良症候群（ＭＡＳ）は、成長期の家禽、特にニワトリの疾患であり、食肉用またはブロイラーが最も一般的に影響を受ける。この症候群は、オランダでブロイラーにおける「ラントおよび成長阻害症候群」として報告されている（Ｋｏｕｗｅｎｈｏｖｅｎら；１９７８）。これは世界的には別の名前で知られている。別称としては、感染性成長阻害症候群、吸収不全症候群、ヘリコプター病、感染性前胃炎、脆弱骨病および大腿骨頭壊死が挙げられる。
【０００３】
Ｋｏｕｗｅｎｈｏｖｅｎら（Ａｖｉａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １７，８７９−８９２、１９８８）はさらに、５つの基準によりＭＡＳを定義した：
１）１日令のヒヨコの感染後３週間までの成長障害；
２）黄橙色類粘液から湿った糞の排出；
３）血漿アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性の増大；
４）血漿カロチノイド濃度（ＰＣＣ）の減少；および
５）近位脛骨の肉眼的に拡張された骨端成長板。
状態はさらに、成長阻害、貧弱な羽根、皮膚着色の欠損、腸炎および骨疾患により特徴づけられる。
【０００４】
Ｖｅｒｔｏｍｍｅｎら（１９８０ａおよび１９８０ｂ）は、感染したヒヨコから得た腸ホモジネートを１日令ブロイラーに経口接種することにより病気を伝染させた。この実験において、低い血漿カロチノイドレベルおよび上昇した血漿アルカリホスファターゼ活性はＭＡＳの診断に適当な手段であることが証明された。さらに別に実験において、ＭＡＳは感染したヒヨコから得た肝臓ホモジネートを１日令のブロイラーに経口接種することにより伝染した。何年もの研究にもかかわらず、ＭＡＳの病因は完全には確立されておらず、該疾患は依然として養鶏業の重大な問題である。ウイルスが原因であると考えられているが、細菌または他の微生物は原因物質として排除されていない。
【０００５】
ＭＡＳの発生に関連するウイルスは、おそらくはレオウイルス、ロタウイルス、パルボウイルス、エンテロ様ウイルスおよびトガ様ウイルスを包含する（Ｍ．Ｓ．ＭｃＮｕｌｔｙおよびＪ．Ｂ．ＭｃＦｅｒｒａｎ；１９３３）。しかしながら、ＭｃＮｕｌｔｙ，Ｗｏｒｌｄ  Ｐｏｕｌｔｒｙ１４、５７−５８（１９８８）は、原因物質の正体はまだ知られていないと仮定し、産生部位の慎重な管理によるコントロールを推奨している。本発明者らは、アデノウイルスがＭＡＳの発生において役割を果たす可能性があると考えている。
【０００６】
現在のところ、ＭＡＳ様疾患はオランダにおけるレイヤー代替鶏において発生する。この疾患は、ヒヨコの成長に悪影響を及ぼし、また成熟したメンドリの産卵能にも悪影響を及ぼす。該疾患は全国的に起こるが、該疾患は影響されやすいヒヨコに感染させることにより確認されていない。
ＥＰ１０２４１８９は、ＭＡＳの腸の症状に対して保護するためのワクチンをトリレオウイルスから調製できることを示している。しかしながら、ＭＡＳに関連する腸の症状および骨疾患の両方に対してかなり高い程度まで保護するワクチンが必要とされている。出来るだけ多くのＭＡＳのウイルス性原因物質に対して保護する必要もある。
従って、本発明の目的は、商業的種類の鳥類、例えばニワトリ、シチメンチョウおよび他の家禽、特に「ブロイラー」エージのもの等におけるＭＡＳの予防用ワクチンを提供することである。
ワクチンは、望ましくは１以上のウイルス、例えばレオウイルスおよびアデノウイルスを含み、おそらくはさらなるウイルス、例えばビルナ様ウイルスを含有する。
【０００７】
（発明の概要）
本発明はトリ吸収不良症候群（ＭＡＳ）に関連する疾患に対して予防接種する方法であって、家禽検体にトリレオウイルスおよびトリアデノウイルスを含有するワクチンを投与することを含む方法を提供する。
さらに別の具体例において、本発明は医薬的に許容される担体中にトリレオウイルスおよびトリアデノウイルスを含む、ＭＡＳに関連する疾患状態に対するワクチンを提供する。
【０００８】
本発明はさらに、トリ吸収不良症候群に対するワクチンを製造する方法であって、トリレオウイルスおよびトリアデノウイルスの適当な検体を単離し、次いで単離されたウイルスを医薬的に許容される担体と共にワクチン中に組み入れることを含む方法を提供する。
【０００９】
トリ吸収不良症候群に対するコンビネーションワクチンも記載する。該ワクチンは約１０４〜１０１０ＴＣＩＤ５０の不活化トリレオウイルスおよび約１０４〜１０１０ＴＣＩＤ５０の不活化トリアデノウイルスを含む。ワクチンはさらに、ＭＡＳにより引き起こされるのと類似した症状を引き起こす、ビルナ様ウイルスなどの家禽の疾患に関連する１以上の追加のウイルスも含有し得る。
【００１０】
トリ吸収不良症候群に対するコンビネーションワクチンはさらに生ウイルスも含有し得る。この具体例において、約１０２〜１０９ＴＣＩＤ５０の生トリレオウイルスおよび約１０２〜１０９ＴＣＩＤ５０の生トリアデノウイルスを含むＭＡＳに対するワクチンが提供される。生ウイルスは弱毒化されるのが望ましい。この種類のワクチンも、生、好ましくは弱毒化された形態において前記ビルナ様ウイルスなどの追加のウイルスも含有することができる。
本発明の前記および他の特徴および利点は、以下に記載される本発明の好ましい具体例の詳細な記載からさらに明らかになるであろう。
【００１１】
（好適な実施態様の詳細な記載）
本発明は、少なくとも２種のトリウイルスを含有するＭＡＳ疾患状態に対するトリワクチンを提供する。好ましくは、これらのウイルスはレオウイルスおよびアデノウイルスである。
【００１２】
本発明の一部としてワクチンにおいて用いられるトリレオウイルスおよびアデノウイルスは、生、生弱毒化または不活化された形態において使用することができる。本発明はさらに別の態様において、トリレオウイルスおよびアデノウイルス感染の結果起こる疾患状態、例えばＭＡＳに関して観察される腸疾患状態に対する家禽の保護において用いられるワクチンであって、本発明のトリレオウイルスおよびアデノウイルスならびに医薬的に許容される担体または希釈剤を含むワクチンを提供する。
【００１３】
本発明のトリレオウイルスおよびアデノウイルスは、生弱毒化または不活化ウイルスとしてワクチン中に組み入れることができる。トリレオウイルスおよびアデノウイルスの前記のＭＡＳに関連する疾患状態を誘発する性質は、トリレオウイルスおよびアデノウイルスが生弱毒化または不活化形態であるならば著しく低下するかまたは完全に存在しない。本発明のトリレオウイルスおよびアデノウイルスの弱毒化は、Ｇｏｕｖｅａら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１２６、２４０−２４７、１９８３）において開示されているような、この目的に関して当該分野において利用可能な方法により達成することができる。簡単に言うと、標的動物からウイルスを単離した後、ウイルス懸濁液を一次鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）上に接種する。単離物がＣＰＥを産生できなければ、ＣＰＥが観察されるまでウイルスを繰り返し（例えば約３〜１０回）継代させる。ＣＰＥが見えたらすぐに、細胞および細胞培養液を集め、凍結させ、解凍し、遠心分離により清澄化させ、トリレオウイルス単離株を含有する上清を等分し、−２０℃で保存する。ウイルスをさらに弱毒化するためにこのプロセスを繰り返す（例えば、約１０〜１００回）。
【００１４】
本発明のワクチンは、利用可能な方法、例えば商業的に入手可能な生および不活化ウイルスワクチンを調製するために通常用いられる方法により調製することができる。獣医学ワクチン組成物の調製は特に「Ｈａｎｄｂｕｃｈ  ｄｅｒ  Ｓｃｈｕｔｚｉｍｐｆｕｎｇｅｎ  ｉｎ  ｄｅｒ  Ｔｉｅｒｍｅｄｉｚｉｎ」（Ｍａｙｅｒ，Ａ．ら編、Ｖｅｒｌａｇ  Ｐａｕｌ  Ｐａｒｅｙ、Ｂｅｒｌｉｎ  ｕｎｄ  Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ、１９８４）および「Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ｐｅｔｅｒｓ，Ａ．Ｒ．ら編、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ  Ｌｔｄ．１９９３）に記載されている。簡単に言うと、感受性基質に生または生弱毒化形態において本発明のトリウイルスを接種し、所望の感染力価または抗原含量までウイルスが複製するまで増殖させ、その後ウイルス含有物質が集められ、予防活性を有する医薬組成物に処方される。
【００１５】
前記定義のトリウイルスの複製を支持できる基質は、トリウイルスを基質に適応させた後に必要ならば本発明のワクチンを産生するために使用できる。適当な基質は、例えば一次（トリ）細胞培養物、例えばニワトリ胚肝細胞（ＣＥＬ）、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）またはニワトリ腎細胞（ＣＫ）、哺乳動物細胞系、例えばＶＥＲＯ細胞系またはＢＧＭ−７０細胞系、トリ細胞系、例えばＱＴ−３５、ＱＭ−７、ＬＭＨまたはＪＢＪ−１を包含する。典型的には、細胞の接種後、ウイルスを約３〜１０日間増殖させ、その後、細胞培養上清を収穫し、所望により細胞デブリスを除去するために濾過するかまたは遠心分離する。
【００１６】
別法として、本発明のワクチンの一部としてのウイルスは、孵化鶏卵において増殖させることができ、続いて慣例法によりウイルス材料を収穫する。生弱毒化ウイルスを含有する本発明のワクチンを（凍結）懸濁液または凍結乾燥形態において調製し、輸送し、販売することができる。ワクチンはさらに、かかる組成物に関して慣例的に用いられる医薬的に許容される担体または希釈剤を含有する。担体は、安定剤、防腐剤および緩衝剤を含む。適当な安定剤は、これらに限定されるわけではないが、ＳＰＧＡ、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、シュークロース、デキストラン、グルタメート、グルコースまたはイノシトール）、タンパク質（例えば、乾燥乳清、アルブミンまたはカゼイン）またはゼラチンを含むその分解生成物を包含する。適当な緩衝剤は、例えば、アルカリ金属リン酸塩である。適当な防腐剤は、チオメロサール、メルチオレートおよびゲンタマイシンである。必要に応じて、本発明の生ワクチンはアジュバントを含んでもよい。アジュバント活性を有する適当な化合物および組成物の例は不活化ワクチンの調製について以下に記載するのと同じである。
【００１７】
本発明のワクチンを注射、例えば筋肉内、または皮下経路により投与することが可能であるが、生ワクチンは好ましくはトリ予防接種について通常用いられる安価な塊投与技術により投与される。これらの技術は、例えば飲料水およびスプレー予防接種を包含する。生ワクチンを投与するための別の方法は、卵内、点眼液およびくちばしを浸漬する投与法を包含する。
【００１８】
典型的には、本発明の生ワクチンは、トリ１羽につき約１０２〜１０９ＴＣＩＤ５０のトリレオウイルスおよび約１０２〜１０９ＴＣＩＤ５０のトリアデノウイルスの複合投与量、好ましくはトリ１羽あたり約１０２〜１０６ＴＣＩＤ５０のトリレオウイルスおよび約１０２〜１０６ＴＣＩＤ５０のトリアデノウイルスの範囲の用量で投与することができる。本明細書において用いられる「ＴＣＩＤ５０」なる用語は、「５０％組織培養感染性用量」を意味する。
【００１９】
本発明のトリレオウイルスおよびアデノウイルスワクチンは、ニワトリにおいて有効に用いることができるが、他の家禽、例えばシチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウ、ハト、ウズラおよびチャボも該ワクチンでうまく予防接種できる。ニワトリは、ブロイラー、繁殖用ストックおよび産卵ストックを包含する。ＭＡＳに関して観察される疾患状態は、主にブロイラーにおいて報告されているので、本発明は好ましくはかかる疾患状態に対してブロイラーを保護するのに用いられるワクチンを提供する。
【００２０】
本発明のもう一つ別の好ましい具体例において、本発明はさらに、不活化形態においてトリレオウイルスおよびアデノウイルスを含むＭＡＳ疾患状態に対するワクチンを提供する。不活化ワクチンの主な利点は高レベルの保護抗体が長時間獲得されることである。この性質は不活化ワクチンをブリーダー予防接種に特に好適にする。
【００２１】
増殖段階後に収穫されたウイルスの不活化の目的は、ウイルスの再生をなくすことである。一般に、これは化学的または物理的手段により達成することができる。化学的不活化は、例えば、酵素、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、エチレン−イミンまたはその誘導体、ならびに当該分野で利用可能な他の化合物でウイルスを処理することにより行うことができる。必要ならば、不活化化合物をその後中和する。ホルムアルデヒドで不活化された物質は、例えば、チオスルフェートで中和することができる。物理的不活化は、ウイルスをエネルギーの高い放射線、たとえばＵＶ光またはγ線にさらすことにより行うこともできる。必要に応じて、処理後、ｐＨを約７の値に調節することができる。
【００２２】
不活化トリレオウイルスおよびアデノウイルスを含有するワクチンは、例えば、この目的に適した１以上の前記の医薬的に許容される担体または希釈剤を含むことができる。好ましくは、本発明の不活化ワクチンは、アジュバント活性を有する１以上の化合物を含む。この目的に適した化合物または組成物は、水酸化アルミニウム、オキシドのリン酸塩、例えばＢａｙｏｌ  ＦまたはＭａｒｃｏｌ  ５２などの鉱油、または植物油ベースの水中油または油中水エマルジョン、例えばビタミンＥアセテートを含有するもの、およびサポニンを包含する。
【００２３】
不活化ワクチンは通常、非経口、例えば筋肉内または皮下投与されるが、当該分野において利用可能な他の方法なども意図される。本発明のワクチンは活性成分として有効量のトリレオウイルスおよびアデノウイルス、すなわち有毒なウイルスによる攻撃に対して予防接種を受けた鳥類またはその子孫において免疫を誘発する免疫化トリレオウイルスおよびアデノウイルス物質量を含む。免疫は、本明細書においては、予防接種を受けていない群と比較して、予防接種後の鳥の集団における著しく高いレベルの防御の誘発と定義される。
【００２４】
不活化ワクチンは、トリ１羽につき、約１０４〜１０１０ＴＣＩＤ５０のトリレオウイルスおよび約１０４〜１０１０ＴＣＩＤ５０のトリアデノウイルスに相当する複合抗原性を含有し得る。
【００２５】
本発明のさまざまな具体例の生または不活化ワクチンを受容する動物の年齢は、現在商業的に入手可能な生または不活化トリレオウイルスワクチンを受容する動物のものと同じである。例えば、ブロイラーは本発明の生弱毒化ワクチンで１日令以降から直接予防接種することができる。ブロイラーブリーダーなどの親ストックのワクチン接種は、本発明の生弱毒化または不活化ワクチンまたは両者の組み合わせで行うことができる。このタイプの免疫付与プログラムの利点は、若いトリに縦に伝えられる母親由来の抗体により提供される１日令子孫の直接的防御を包含する。典型的なブリーダーワクチン接種プログラムは、６週令のブリーダーに生弱毒化ワクチンを接種し、続いて１４〜１８週令の間で不活化ワクチンを接種することを包含する。別法として、生ワクチン接種に続いて１０〜１２週および１６〜１８週令で不活化ワクチンを２回接種することができる。他のワクチン接種法は当該分野で利用可能な方法に従った卵内投与を包含する。
【００２６】
本発明はさらに、本発明のトリレオウイルスおよびトリアデノウイルスに加えて、家禽に感染する他の病原体の１以上のワクチン成分を含む他のコンビネーションワクチンも包含する。このような家禽に感染する他の病原体とは、本発明のトリレオウイルスおよびアデノウイルスと抗原的に異なるものを意味し、例えば腱滑膜炎に関連するトリレオウイルス株を包含する。
【００２７】
好ましくは、コンビネーションワクチンにおけるワクチン成分は、家禽に感染する病原体の生弱毒化または不活化形である。特に、本発明はワクチン成分の全てが不活化形であるコンビネーションワクチンを提供する。
【００２８】
好ましくは、コンビネーションワクチンは、ビルナ様疾患ウイルス、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、伝染性ファルビキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、家禽アデノウイルス（ＦＡＶ）、ＥＤＳウイルスおよびシチメンチョウ鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴＶ）を含む。ビルナ様疾患ウイルスは、ＭＡＳを引き起こさないように見えるが、その症状の多くは原発病と関連する徴候に類似しているか、または寄与するので、特に適当である。
【００２９】
実施例
以下の実施例は、説明のためだけのものであり、本発明の範囲を制限するものではないと解釈するべきである。
【００３０】
オランダにおけるレイヤー代替幼鳥におけるＭＡＳの発生は、３０羽の１日令のブロイラーヒヨコに、現場の感染したトリから得た均質化された腸を素嚢中へ接種することで疾患が伝染することにより確認された。
隔離された予防接種を受けたヒヨコは、感染後４週間まで低下した成長を示した。トリは粘液性の黄色がかった糞をし、死後に薄い液状の腸内容物が見られた。血液サンプルの生化学的検査により低い血漿カロチノイド濃度および増加したアルカリホスファターゼ活性が示された。１５および２８日令の感染したヒヨコにおいて骨異常が観察された。実験的に感染させたヒヨコからの腸および肝臓からのニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）およびニワトリ腎臓（ＣＫ）細胞に関してレオウイルスおよびアデノウイルスを単離した。これらのウイルスは、実験的に感染させたヒヨコからの肝臓および腸からの細胞培養物の電子顕微鏡検査を用いて同定した。約６５ｎｍの同定されていないウイルス様粒子を細胞培養物において電子顕微鏡検査により検出した。
【００３１】
以下の用語および略語を以下の実施例全体において使用する：
ＡＬＰ：血漿アルカリホスファターゼ活性
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着検定
ＨＩ：赤血球凝集阻害
ＭＡＳ：吸収不良症候群
ＰＡＧＥ：ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＰＢＳ：リン酸塩緩衝塩溶液
【００３２】
実施例１
材料および方法
ＭＡＳ疾患状態の臨床的徴候を示す現場からの１０羽のヒヨコからサンプリングした腸（十二指腸および盲腸を含む）から接種物を調製した。腸を−２０℃で保存した。実験室用ブレンダーを用いて１００グラムのこれらの腸を１００ｍｌのＰＢＳ中で均質化した。１日令のブロイラーヒヨコを予防接種するためにこのホモジネート（５０％ｗ／ｖ）を使用した。
【００３３】
８０羽の１日令ブロイラーヒヨコを商業的孵化場から入手した。ヒヨコを４０羽ずつ２群に分け、別々のアイソレーター中で飼育した。糞の観察を可能にするために、アイソレーターの床を紙で覆った。４０羽のヒヨコ（２群）に、素嚢中に挿管することにより、０．５ｍｌの腸ホモジネートを接種した。他方の４０羽のヒヨコ（１群）には接種せず、非感染対照とした。ヒヨコに商業的ブロイラー用餌を自由に与え、飲み水には自由に摂らせた。これらは家禽の疾患に対して予防接種しなかった。
ヒヨコをＭＡＳの臨床的徴候に関して毎日観察した。異常および死亡数を記録した。
【００３４】
接種後（感染後）３、８、１５および２８日に、多数のランダムなトリ（表１参照）を個々に体重を量り、殺した。死後、各トリの両脛骨近位端の縦断面における骨端軟骨板の変化の発生により顕微鏡的に骨疾患を評価した。
ヒヨコを感染当日、感染後１５および２８日に絶息死させた後にヘパリン化チューブ中に個々に血液サンプルをサンプリングした。血漿を使用するまで−２０℃で保存した。カロチノイド濃度（石油エーテル抽出物の光学密度として表す）およびアルカリホスファターゼ活性（１リットルあたりの単位で表す）を測定した。
レオウイルスに対する抗体の存在を感染後２８日の２群からのヒヨコ（ｎ＝５）からサンプリングしたサンプルにおいて研究した。ＡＧＰ技術を用いて血清学を行った。
【００３５】
肝臓、腸、腸の内容物を、接種したトリおよび対照トリから、感染後４、８、１５および２８日にトリを殺した後に集めた。同じ群のヒヨコからサンプリングした臓器および腸内容物をプールした。プールしたサンプルを秤量し、Ｄｕｐｈａｒ特別細胞培地（Ｇｉｂｃｏ；カタログ番号０４１−９０８８９；ロット番号２５Ｑ５５６２）と混合し、無菌実験室用ブレンダーを用いることにより均質化した。ホモジネートの１〜４ｍｌを、ラベルを貼ったバイアル中で保存した。微生物学的調査に用いられるバイアルの一部に、グリセリンおよびｆ．ｃ．ｓ．（Ｇｉｂｃｏカタログ番号０１１−９０００２）の混合物（３：１；ｖ／ｖ）を添加した。全てのバイアルを−７０℃で保存した。選択されたホモジネートを、ＳＰＦ卵（ＣＡＭおよび尿嚢液）、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）、ニワトリ腎細胞（ＣＫＣ）の接種によりウイルスの存在に関して調べた。別の選択されたホモジネートおよび細胞培養物を、電子顕微鏡検査法（ＥＭ）によりウイルスの存在について調べた。
【００３６】
血液寒天プレート上およびＡＢＡＰプレート上、好気性および嫌気性条件下、２群からのヒヨコの感染に用いられる接種物、ならびに１群（非感染対照）からのヒヨコおよび２群（感染群）からのヒヨコから接種後４、８、１５および２８日にサンプリングされた腸および肝臓から調製されたホモジネートに関して、微生物学的調査を行った。
ＭＡＳを診断するためにこの実験において用いられるパラメータは次のものであった：成長の遅れ、黄色がかった粘液性の糞、貧相な羽根、低い血漿カロチノイド濃度および高いアルカリホスファターゼ活性。
【００３７】
結果
２群からのヒヨコはすべてＭＡＳの臨床的徴候を示し、７羽のヒヨコが生後１週目に死に、３羽のヒヨコが２週目に死んだ。非感染対照ヒヨコ（１群）は正常に発育し、疾患の臨床的徴候を示さなかった。
感染後異なる時期のヒヨコの平均体重を下記の表１に示す。接種されたヒヨコ（２群）は同じ年齢の対照ヒヨコ（１群）よりも平均体重が実質的に少なかった。感染後１５日の２群からの１羽のヒヨコと感染後２８日のこの群からの３羽のヒヨコにおいて骨疾患が見られた。２群からのヒヨコから得た腸は非常に青白く、水っぽく、黄色がかった粘液性内容物で膨張していた。青白い肝臓が２群のヒヨコにおいて見られた。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
感染後異なる時期のヒヨコから採取された血漿サンプルにおけるアルカリホスファターゼ活性およびカロチノイド濃度の平均値を表１に示す。接種されたヒヨコ（２群）は同じ時期の非感染対照よりも実質的に低い血漿カロチノイド濃度および実質的に高い血漿アルカリホスファターゼ活性を有していた。
ＡＧＰによりレオウイルスに対する抗体は検出されなかった。
【００４０】
接種後８日（第二継代）および１５日（第一継代）の２群のヒヨコからサンプリングされた腸ホモジネートおよび接種後１５日の２群からのヒヨコからサンプリングされた肝臓ホモジネートからのニワトリ腎細胞に関してアデノウイルスが単離された。アデノウイルスは接種後１５日の２群からのニワトリからサンプリングされた肝臓ホモジネートからのニワトリ胚繊維芽細胞（第二継代）に関しても単離された。
【００４１】
レオウイルスは、接種後４、８および２８日の２群（第一継代）からのヒヨコからサンプリングされた腸ホモジネートからのニワトリ腎臓細胞に関して単離され、レオウイルスはまた、感染後４および２８日にサンプリングされた感染したヒヨコの肝臓から得られるニワトリ腎細胞（第一継代）に関しても単離された。
【００４２】
接種後１５日に２群のヒヨコから得られる肝臓の細胞培養物（ニワトリ腎細胞第二継代；ニワトリ胚繊維芽細胞、第四継代）において電子顕微鏡検査法により約６５ｎｍのウイルス様粒子が検出された。対照トリから集められた腸および肝臓からはウイルスは単離されなかった。
【００４３】
２群のヒヨコの接種に用いられる腸ホモジネートから、また接種後４、８、１５および２８日の１群および２群のヒヨコからサンプリングされた腸および肝臓から調製されたホモジネートからも血漿寒天プレート上で好気的および嫌気的にグラム陰性およびグラム陽性菌（環菌および球菌）が単離された。
【００４４】
現場の感染したトリから得られる腸物質を接種した後、２群からのヒヨコはＭＡＳにかかっていた。この群からのヒヨコは全てこの病気の重い臨床的徴候（成長不全、骨疾患、貧相な羽根、低い血漿カロチノイド濃度および高い血漿アルカリホスファターゼ活性）を示した。この観察は、レイヤー代替鶏におけるＭＡＳの発生を支持する。
【００４５】
以前の研究（Ｖｅｒｔｏｍｍｅｎら；Ａｖｉａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ９：１３３−１４２）と対照的に、感染したヒヨコはこの実験においてＭＡＳで死んだ。
レオウイルスおよびアデノウイルスは、感染したヒヨコに由来する腸ホモジネートおよび肝臓ホモジネートから単離された。これらのウイルスは対照ヒヨコからは単離されなかった。この観察は、これらのウイルスがこの実験において用いられるヒヨコにより伝達されず、これらのヒヨコを接種するために用いられる腸ホモジネートに由来するものであったことを示すようである。
【００４６】
しかしながら、細菌学的結果から肝臓ホモジネートが腸起源のグラム陰性菌を含有していたことを明らかになった。この発見は、肝臓がサンプリング時に腸内容物で汚染されたことを示唆する。このことは、肝臓ホモジネートから単離されたウイルスはおそらくは腸由来であり、肝臓における増加から生じるものではないことを意味する。ＡＧＰ試験はレオウイルスに対する抗体を示さなかった。この観察は、ＡＧＰ試験が沈降素を検出するのみであるので、セロコンバージョンを排除しない。細胞培養物において電子顕微鏡検査法により検出される約６５ｎｍのウイルス様粒子が興味深い。これらの粒子の写真を撮影したが、同定にはさらに電子顕微鏡調査が必要であった。
【００４７】
実施例２
この研究の目的は、ＭＡＳの伝達に関与する感染性物質が末梢血により広がるかどうかを調査することであった。これは、一日令のブロイラーの素嚢中に感染したヒヨコから由来する膵臓、卵黄嚢および肝臓のホモジネートを接種することにより行った。
【００４８】
２０羽の一日令ブロイラーヒヨコ（１群）を、素嚢中に挿管することにより０．５ｍｌの腸ホモジネート（−７０℃で保存）を接種し、次いで鉋屑を敷いた床上で飼育した。ヒヨコを接種後４日に殺した。腸物質での汚染を回避するために、肝臓、膵臓、卵黄嚢および腸を慎重に取り出した。腸を−７０℃で保存した。肝臓、膵臓および卵黄嚢を均質化した。それぞれ２０羽の一日令のブロイラーヒヨコの３つの新しい群（２、３および４群）を素嚢中に挿管することにより接種するためにこれらのホモジネートを使用した。鉋屑を敷いた床上のリングにおいて異なる室内でこれらの群を飼育した。全実験期間中これらに商業的ブロイラー用飼料を与え、飲み水は自由に摂らせた。
接種後５および２１日に、各群からのヒヨコを体重測定し、殺した。
【００４９】
各トリの両脛骨の近位端の縦断面における骨端軟骨板の変化の発生により顕微鏡的に骨疾患を評価した。肝臓、膵臓および卵黄嚢を集めた。膵臓ホモジネートで感染したヒヨコ（４群）から集めた素嚢を集めた。ウイルスを単離するためにサンプルを−７０℃で保存した。血漿アルカリホスファターゼ活性を感染後２１日にサンプリングした血液において測定した。
【００５０】
感染したヒヨコはＭＡＳの臨床的徴候、すなわち、成長の遅れ、骨異常、黄色がかった粘液性の糞、高い血清ＡＬＰ活性などを発現した。このことは、ＭＡＳの伝達に関与する感染性物質が末梢血を介して腸から他の器官へ感染後すぐに広がることを示唆する。
ＭＡＳの臨床的徴候は、膵臓ホモジネートを接種されたヒヨコ（４群）において最も著しく、このことは臓器ごとの感染性物質の量が異なることを示唆する。
【００５１】
レオウイルスおよびアデノウイルスに対する抗体は感染後２１日にサンプリングされた血漿において検出されなかった。
結果から、次のように結論づけられる：ＭＡＳは、一日令のブロイラーの素嚢中に挿管することにより、感染したヒヨコから由来する腸、肝臓、卵黄嚢および膵臓のホモジネートを接種することにより伝達することができる。ＭＡＳの伝達に関与する物質は：−７０℃で数ヶ月間保存することができ、経口的に感染したヒヨコの腸から膵臓、肝臓および卵黄嚢へヒヨコの感染後５日以内に広がり得る。ＭＡＳの伝達に関与する物質の量は様々な臓器において異なり、おそらくは膵臓において最も高い。これらの結果は、レオウイルスおよびアデノウイルスのＭＡＳにおける役割をさらに調査しなければならないことを示す。
【００５２】
材料および方法
２０羽の一日令ブロイラーヒヨコを商業的孵化場から購入した。素嚢中に挿管することによりヒヨコに１．０ｍｌの腸ホモジネートを接種し、次いで鉋屑上、床上のリング（０．８０ｍ２床面積）において飼育した。接種後４および２１日に１群からのヒヨコを殺した。死後、各トリの両脛骨の近位端の縦断面における骨端軟骨板の変化の発生により顕微鏡的に骨疾患を評価した。腸物質での汚染を回避するために、これらのヒヨコの肝臓、膵臓、卵黄嚢および腸を慎重に取り出した。サンプルを−７０℃で保存した。
【００５３】
接種後４日の１群から集めた肝臓、膵臓および卵黄嚢からホモジネートを調製した。素嚢中に挿管することにより２０羽の一日令のブロイラーヒヨコの新しい３つの群（２、３および４群）を接種するために、これらのホモジネートを使用した。
２群に１．０ｍｌの肝臓ホモジネートを接種し、３群には１．０ｍｌの卵黄嚢ホモジネート、４群には０．６ｍｌの膵臓ホモジネートを接種した。群を鉋屑上、床上でリング（０．８０ｍ２）において異なる室内で飼育した。全実験期間中ヒヨコに商業的ブロイラー用飼料を与え、飲み水を自由に摂らせた。
【００５４】
接種後５および２１日に、２、３および４群からのヒヨコを体重測定し、殺し、顕微鏡的骨疾患を、各トリの両脛骨近位端の縦断面における骨端軟骨板の変化の発生により評価した。肝臓、膵臓および卵黄嚢を集めた。
４群からのヒヨコからも素嚢を集めた。サンプルを−７０℃で保存した。
【００５５】
タイムテーブル
１日：１群の接種：２０羽の１日令ブロイラーに腸ホモジネートを接種。
４日：１群からの１０羽のヒヨコを殺し、続いて死体解剖を行った。
感染後４日：肝臓、卵黄嚢および膵臓のサンプリング
４日：２群に肝臓ホモジネートを接種し、３群に卵黄嚢ホモジネートを接種
感染後４日：４群に膵臓ホモジネートを接種
９日：２群および３群からの１０羽のヒヨコおよび４群からの５羽のヒヨコを殺し、続いて死体解剖を行った。ウイルス単離のためのサンプリング：肝臓、腸、膵臓および卵黄嚢
２１日：１群からの９羽のヒヨコを殺し、続いて死体解剖を行った。
感染後２１日
２４日：２群からの９羽のヒヨコおよび３および４群からの１０羽のヒヨコを殺し、続いて死体解剖した。ウイルス単離のためのサンプリング：肝臓、腸、膵臓、および卵黄嚢。４群からは素嚢も。ＡＬＰならびにレオウイルスおよびアデノ（ＢＣ１４）ウイルスに対する抗体を測定するために血液サンプルを採取した。
【００５６】
１群からのヒヨコを感染させるために使用する腸ホモジネートは、第一の実験（実施例１）において使用したものと同じであった。これは、トリが殺された後にＭＡＳの臨床的徴候を示す現場からの１０羽のヒヨコからサンプリングされた腸（十二指腸および盲腸を含む）から調製した。腸を−２０℃で保存した。実験室用ブレンダーを用いて、１００グラムのこれらの腸を１００ｍｌのＰＢＳ中に均質化した。このホモジネートを−７０℃で保存した。
【００５７】
２群からのヒヨコを接種するために用いられる肝臓ホモジネートを、これらのヒヨコの感染後４日に１群からのヒヨコから集めた肝臓から調製した。肝臓をＰＢＳ（５０％ｗ／ｖ）中で均質化させた。
３群からのヒヨコを接種するために用いられる卵黄嚢ホモジネートを、これらのヒヨコの感染後４日に１群からのヒヨコから集められた卵黄嚢から調製した。卵黄嚢をＰＢＳ（５０％ｗ／ｖ）中で均質化させた。
４群からのヒヨコを接種するために用いられる膵臓ホモジネートを、これらのヒヨコの感染後４日に１群からのヒヨコから集められた膵臓から調製した。膵臓をＰＢＳ（２０％ｗ／ｖ）中で均質化させた。
【００５８】
ヒヨコをＭＡＳの臨床的徴候に関して毎日観察した。異常および死亡数を記録した。２、３および４群からのヒヨコを５日および２１日令で体重測定した。１群からのヒヨコを２１日令で体重測定した。ＭＡＳを診断するために用いられるパラメータは次のものであった：成長の遅れ、黄色がかった粘液性の糞、貧相な羽根、骨異常および高い血漿アルカリホスファターゼ活性。
【００５９】
感染後２１日令の１、２、３および４群からのヒヨコを殺した後、血液サンプルを個々のヘパリン化チューブ中に採集した。血漿を使用するまで４℃で保存した。アルカリホスファターゼ活性（１リットルあたりの単位で表す）をオランダ、デーヴェンテルの動物保健所で測定した。
【００６０】
レオウイルスおよびアデノウイルスに対する抗体の存在は、感染後２１日の１、２，３および４群からのヒヨコからサンプリングした血液において研究した。ＨＩおよびＥＬＩＳＡ技術を用いて血清学を行った。
【００６１】
肝臓、腸、卵黄嚢および膵臓を感染後５および２１日に集めた。サンプルを−７０℃で保存した。選択されたホモジネートを、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）およびニワトリ腎細胞（ＣＫＣ）の接種によりウイルスの存在について調べた。
【００６２】
１、２および４群からのヒヨコはＭＡＳの重い臨床的徴候を示した。４群からの５羽のヒヨコは、接種の翌日に死亡した。これらのヒヨコは盲腸が膨張し、一部のヒヨコは素嚢に血液があった。感染後２１日のヒヨコの平均体重を表２に示す。感染したヒヨコの平均体重は標準の８００ｇより少なかった。１、２、３および４群からのヒヨコにおいて骨異常が見られた。骨異常は１および４群からのヒヨコにおいて最も著しかった。これらのヒヨコにおいては、両脚の近位脛骨の骨端軟骨板の異常だけでなく、ガラス質の拡大した顎体部および結核性肋骨が見られた。１および４群からのヒヨコの腸は非常に血色が悪く、水っぽい黄色がかった粘液性内容物で膨張していた。３群からのヒヨコにおいては、中程度の骨疾患が見られるだけで、これらのヒヨコの腸において異常は見られなかった。
【００６３】
感染後２１日にヒヨコから採取した血漿サンプルにおけるアルカリホスファターゼ活性の平均値を表２に示す。血漿アルカリホスファターゼ活性は予想されるよりも実質的に高かった（２１日令で標準３．０００から６．０００Ｕ／Ｌ）。
【００６４】
【表２】
2006503863.tif 000003
レオウイルスおよびアデノウイルス（ＢＣ１４）に対する抗体は検出されなかった。
【００６５】
結果
この実験において、ＭＡＳは、一日令のブロイラーの素嚢中に挿管することにより腸、肝臓、卵黄嚢および膵臓のホモジネートを接種することにより伝染した。感染したヒヨコはＭＡＳの臨床的徴候、すなわち、成長の遅れ、骨異常、黄色がかった粘液性の糞、高い血漿ＡＬＰ活性などを発現した。ＭＡＳの臨床的徴候は、腸ホモジネートで感染したヒヨコ（１群）および膵臓ホモジネートで感染したヒヨコ（４群）において最も著しかった。１群のヒヨコを感染させるために用いられた腸ホモジネートは使用前に数ヶ月間−７０℃で保存した。このことは、ＭＡＳの伝達に関与する感染性物質は−７０℃で保存できることを示す。
【００６６】
ＭＡＳは肝臓、卵黄嚢および膵臓のホモジネートでのヒヨコを接種することにより伝染した。これらのホモジネートは、腸ホモジネートで経口感染した後５日のヒヨコから得られる物質から調製された。このことは、ＭＡＳの伝達に関与する感染性物質は感染後すぐに腸から他の臓器に広がることを示す。ＭＡＳの臨床的症状は、膵臓物質を接種したヒヨコ（４群）において最も著しかった。この群からのヒヨコは、素嚢において病変を示し、数羽のヒヨコは感染後まもなく死亡した。ＭＡＳの臨床的徴候は他の群からのヒヨコにおいてはそれほど著しくなかった。この観察結果は、臓器ごとの感染性物質の量が異なることを示唆する。
【００６７】
この実験中に観察されたＭＡＳの臨床的徴候は、前の実験（実施例１）中に観察されたものよりも重くなかった。これは、おそらくはヒヨコの飼育における実験間の差異によるものであろう。この実験において、ヒヨコは床上に鉋屑を敷いたリングにおいて飼育した。実施例１からの実験において、ヒヨコは紙で覆われた床の上でアイソレーター中で飼育した。この場合においては、ヒヨコは新しい糞と絶え間なく接触している。このようにヒヨコが新しい糞と絶え間なく接触していることは、ＭＡＳの臨床的徴候の最適な発現に必須であると思われる。
【００６８】
レオウイルスは４群からのヒヨコの膵臓から単離したが、このウイルスに対する抗体は、感染後２１日にサンプリングされた血清におけるＥＬＩＳＡによっては検出されなかった。ＨＩ試験によってアデノウイルス（ＢＣ１４）に対する抗体は検出されなかった。１種の血清型しか試験していないので、このことによりＭＡＳの原因物質としてアデノウイルスは排除されない。
【００６９】
実施例３
５０羽の一日令ブロイラーヒヨコを１０羽ずつの５群に分け、次のようにして素嚢中に挿管することにより接種した：１群（感染対照）腸ホモジネート；２群（レオウイルス）１０６．７ＴＣＩＤ５０レオウイルス；３群（アデノウイルス）１０８．２ＴＣＩＤ５０アデノウイルス；４群（アデノウイルスおよびレオウイルス）１０６．７ＴＣＩＤ５０レオウイルスと１０８．２ＴＣＩＤ５０アデノウイルスの組み合わせ。５群（非感染対照）は接種しなかった。各群を、針金の床と糞を集める装置を有するステンレス鋼ケージ上、独立した動物飼育室中で飼育した。接種後１４および２２日に、各群からのヒヨコを体重測定し、殺した。
【００７０】
各トリの両脛骨近位端の縦断面における骨端軟骨板の変化の発生により顕微鏡的に骨疾患を評価した。腸（膵臓を含む）を集め、ウイルス単離のために−７０℃で保存した。血漿アルカリホスファターゼ活性を感染後２２日にサンプリングされた血液において測定した。
感染後２２日にサンプリングされた血漿においてレオウイルスおよびアデノウイルスに対する抗体は検出されなかった。
【００７１】
アデノウイルス、レオウイルスおよびこれらのウイルスの組み合わせで一日令のヒヨコを感染させると、結果として成長の遅れ、ＭＡＳ様臨床的徴候および骨疾患が起こるが、血漿アルカリホスファターゼ活性は増大しなかった。臨床的徴候および骨疾患は１群のヒヨコにおいて最も重かった。
感染後２２日に、４群のヒヨコの平均体重（６６７グラム）は感染した対照の平均体重（１群：５６０グラム）に匹敵したが、３群（レオウイルス、８３７グラム）および５群（非感染対照、９１３グラム）のヒヨコの平均体重とは実質的に異なっていた。
【００７２】
これらの結果から、アデノウイルス、レオウイルスおよびこれらのウイルスの組み合わせでヒヨコを感染させることによりＭＡＳは部分的に再現されると結論づけられた。
【００７３】
商業的孵化場から入手した５０羽の一日令ブロイラーヒヨコを１０羽ずつの５群に分け、次の接種物を素嚢中に挿管することにより接種した：
１群（感染対照）：０．５ｍｌの腸ホモジネート；
２群（レオウイルス）：０．５ｍｌ；１０６．７ＴＣＩＤ５０レオウイルスを含有；
３群（アデノウイルス）：０．５ｍｌ；１０８．２ＴＣＩＤ５０アデノウイルスを含有；
４群（アデノウイルスおよびレオウイルス）：１．０ｍｌの組み合わせ；１０６．７ＴＣＩＤ５０レオウイルスと１０８．２ＴＣＩＤ５０アデノウイルスを含有；
５群（非感染対照）：接種せず。
【００７４】
各群を、独立した動物飼育室中、ワイヤフロア（０．５ｍ２）および糞を集める装置を有するステンレス鋼ケージ上で飼育した。ケージの床を紙で覆い、トリを新しい糞と接触させた。ヒヨコに商業的ブロイラーマッシュ（ＣＡＶＯ−ＬＡＴＵＣＯ）を自由に与え、コップから提供される飲料水を自由に摂らせた。ヒヨコをＭＡＳの臨床的徴候について毎日観察した。感染後１４および２２日に、各群からのヒヨコを個々に体重測定し、殺した。死後、各トリの両脛骨近位端の縦断面における骨端軟骨板の変化の発生を測定することにより顕微鏡的に骨疾患を評価した。腸および膵臓を集め、−７０℃で保存した。感染後２２日に各群からのヒヨコから血液サンプルを採取した。これらの血液サンプルにおいてアルカリホスファターゼ活性を測定した。
【００７５】
タイムテーブル
０日：ヒヨコの接種
１４日：各群からのヒヨコの死体解剖。腸および膵臓の採集。
２２日：各群からのヒヨコの死体解剖。腸、膵臓および血液サンプルの採集。
【００７６】
１群からのヒヨコを感染させるために用いた腸ホモジネートは、第一の実験（実施例１）において使用したものと同じであった。これは、ＭＡＳの臨床的徴候を示す現場からの１０羽のヒヨコから採取された腸（十二指腸、膵臓および盲腸を含む）から調製した。
【００７７】
腸を−２０℃で保存した。１００グラムのこれらの腸を、実験室用ブレンダーを用いて１００ｍｌのＰＢＳ中に均質化した。このホモジネートを−７０℃で保存した。
【００７８】
３および４群からのヒヨコを感染させるために使用したレオウイルスは実施例１由来であった。これは感染した対照から採取したニワトリ腎細胞（ＣＫＣ）上で単離された。ウイルスをこの実験において使用する前にＣＫＣ上で増殖させた。レオウイルス接種物は、１ｍｌあたり１０７．０ＴＣＩＤ５０を含有していた。
【００７９】
２および４群からのヒヨコを感染させるために使用したアデノウイルスは実施例１由来であった。これは感染した対照から採取したニワトリ腎細胞（ＣＫＣ）上で単離された。ウイルスをこの実験において使用する前にＣＫＣ上で増殖させた。レオウイルス接種物は、１ｍｌあたり１０８．５ＴＣＩＤ５０を含有していた。
【００８０】
方法
ヒヨコをＭＡＳの臨床的徴候に関して毎日観察した。異常および死亡数を記録した。各群からのヒヨコを１４日および２１日に体重測定した。ＭＡＳを診断するために用いられるパラメータは次のものであった：成長の遅れ、黄色がかった粘液性の糞、貧相な羽根、骨異常、血漿および下肢の青白さおよび高い血漿アルカリホスファターゼ活性。
【００８１】
感染後２２日に各群からのヒヨコを殺した後、血液サンプルを個々にヘパリン化チューブ中に採取した。使用するまで血漿を４℃で保存した。アルカリホスファターゼ活性（１リットルあたりの単位で表す）をオランダの動物保健所で測定した。
【００８２】
レオウイルスおよびアデノウイルスに対する抗体の存在は、感染後２１日の各群からのヒヨコからサンプリングされた血漿において測定された。ＨＩおよびＥＬＩＳＡ技術を用いて動物保健所で血清学を行った。
【００８３】
腸および膵臓を感染後１４および２２日に各群から集めた。サンプルを−７０℃で保存した。選択されたホモジネートを次いでニワトリ腎細胞（ＣＫＣ）の接種によりウイルスの存在について調べた。
【００８４】
結果
死後観察された平均体重、平均ＡＬＰよび骨疾患を表３Ａに示す。１群のヒヨコ（感染対照）はＭＡＳを発症し、死亡したこの群からの２羽のヒヨコはＭＡＳの臨床的徴候を有していた。４群（アデノウイルスおよびレオウイルス）からの２羽のヒヨコは、ＭＡＳの臨床的徴候（成長の遅れ、骨疾患、色素不足）を示して死亡した。死亡した２群（アデノウイルス）からの１羽のヒヨコはＭＡＳにかかっていなかった。これは心膜炎で死亡した。
【００８５】
死後、１４および２２日に１、２、３および４群からのヒヨコにおいて骨異常が見られた。１４日に、近位脛骨の骨端軟骨板において異常が見られた。これらは１群（感染した対照）からのヒヨコにおいて最も重かった。
【００８６】
２２日に、１群（感染した対照）および４群（アデノウイルスおよびレオウイルスの混合物）からのヒヨコにおいて骨異常は最も著しかった。これらのヒヨコにおいて、両脚の近位脛骨の骨端軟骨板の異常ならびにガラス質の拡大した顎体部および結核性肋骨が見られた。
【００８７】
１群（感染した対照）および４群（アデノウイルスおよびレオウイルスの混合物）のヒヨコは、２２日に下肢の血色が悪く（感染した対照において最も著しい）、血漿ＡＬＰ活性の測定のために採取された血漿サンプルも非常に青白かった。全ての感染したヒヨコは、感染後１４および２２日に対照（５群）よりも平均体重が少なかった。
【００８８】
【表３】
2006503863.tif 000004
【００８９】
臨床的化学
感染後２２日にヒヨコから採取された血漿サンプルにおけるアルカリホスファターゼ活性の平均値を表３Ａに示す。１群（感染した対照）の平均血漿アルカリホスファターゼ活性は２２日に１４．４４０であった。これは、他の群における平均ＡＬＰ値（２０００〜３０００）よりも実質的に高かった。
【００９０】
感染後２２日にサンプリングされた血清において、ＨＩ試験を用いてアデノウイルス（ＥＤＳ）に対する抗体は検出されず、ＥＬＩＳＡ試験を用いてレオウイルスに対する抗体は検出されなかった。
ウイルス単離は、感染後１４日に集められた腸（膵臓を含む）に関して行った。腸をＰＢＳ（１：１、ｗ／ｖ）中で均質化した。ウイルス単離の結果を表３Ｂにまとめる。
【００９１】
測定されたウイルス価は一日令のヒヨコを感染させるために使用した接種物の力価よりもかなり低かった。最低希釈物はいくつかの要因（一次細胞、腸ホモジネート、わずかなｃｐｅ）のために判断できなかったので、ウイルス価は慎重に解釈されなければならない。滴定は新しい単層に関して継続したが、この操作が力価の値に影響を及ぼした可能性がある。
【００９２】
１、２および３群から単離されたウイルスは、一日令のこれらのヒヨコを感染させるために使用されたものと同一であった。これは、４群においても同様であった。この群において、ウイルス単離はレオウイルスにより過剰成長された定性試験細胞培養物におけるのと一致しなかった。
【００９３】
【表４】
2006503863.tif 000005
【００９４】
考察
一日令のヒヨコをアデノウイルス、レオウイルスおよびこれらのウイルスの組み合わせで感染させると、その結果、成長の遅れ、ＭＡＳ様臨床的徴候および骨疾患が起こった。
【００９５】
４群（アデノウイルスおよびレオウイルスの混合物）は、２２日で、この群からのヒヨコの平均体重（６６７グラム）が、２群（アデノウイルス、８０３グラム）、３群（レオウイルス、８３７グラム）および５群（非感染対照、９１３グラム）の平均体重よりも実質的に低かったので、最も興味深い；
・この群からのヒヨコの体重における増加は１４日から２２日の間で２８７グラムであった。これは、非感染対照（１群）の体重の増加（２７３グラム）に匹敵した：
・死後、これらのヒヨコは両脛骨における骨端軟骨板の変化およびガラス質の拡大された顎体部肋骨を示した。これらは感染した対照においても見られた（さらに重かった）。
・この群のヒヨコは色素不足であり、感染後２２日に採集された血清は非常に青白かった。感染した対照（１群）と対照的に、血漿アルカリホスファターゼ活性はアデノウイルス、レオウイルスまたはこれらのウイルスの組み合わせで感染したヒヨコにおいては増加しなかった。従って、ＭＡＳの症状はこれらのウイルス単離物でヒヨコを感染させることにより全て再現されるわけではないと結論づけられた。
【００９６】
実施例４
商業的孵化場から入手した２０羽の一日令ブロイラーヒヨコを５羽ずつ４群に分け、素嚢中に挿管することにより１羽あたり０．５ｍｌの接種物を接種した。
【００９７】
群をアイソレーター中で飼育した。ヒヨコに自由に餌を与え、飲料水を自由に摂らせた。これらをＭＡＳの臨床的徴候について毎日観察した。感染後１４日に、ヒヨコをそれぞれ体重測定し、殺し、死体解剖した。腸（膵臓を含む）を集め、−６０℃以下で保存し、血漿アルカリホスファターゼ活性を測定するために血液サンプルを採取した。
【００９８】
ＭＡＳは３群（感染した対照；腸ホモジネート）のヒヨコにおいて再現された。ビルナ様ウイルスで感染したヒヨコ（１群）およびビルナ様ウイルス、アデノウイルスおよびレオウイルスの組み合わせで感染したヒヨコ（２群）はＭＡＳを発症しなかった。これらは生後１週中は非常に不健康であり、その後、回復した。
【００９９】
これらのヒヨコのほとんどは血色が悪く、１６日の死体解剖では中程度の骨異常を示したが、アルカリホスファターゼ活性は正常範囲内であり、血漿は黄色であった。
本実験の結果は、試験したビルナ様ウイルスは、単独またはアデノウイルスおよびレオウイルスとの組み合わせで若いニワトリにおいて疾患（下痢および多少の成長の遅れ）を引き起こし得るが、ＭＡＳは引き起こさないことを示す。
【０１００】
これらの結果から、試験されたビルナ様ウイルスはＭＡＳの原因物質ではないようであると結論づけられた。しかしながら、ＭＡＳに対する、トリレオウイルスおよびトリアデノウイルスを含有するワクチン中にビルナ様ウイルスを組み入れることは、本発明のさらに別の態様として非常に望ましい。
【０１０１】
材料および方法
腸を均質化し、−６０℃以下で保存した。１群のヒヨコを感染させるために使用した腸ホモジネートは、第一の実験（実施例１）において使用したものと同一であった。これはＭＡＳの臨床的徴候を示す現場からの１０羽のヒヨコから採取された腸（十二指腸、膵臓および盲腸を含む）から調製された。
【０１０２】
腸を−２０℃で保存した。実験室用ブレンダーを用いて１００グラムのこれらの腸を１００ｍｌのＰＢＳ中に均質化させた。
ホモジネートを−６０℃以下で保存した。２群からのヒヨコを感染させるために使用したレオウイルスは実施例１由来のものであった。感染した対照から採取された腸からＦｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅアニマルヘルスプロトコルにしたがってニワトリ腎細胞（ＣＫＣ）上で単離した。ウイルスをＣＫＣ上で増殖させ、この実験において使用するまで−６０℃以下で保存した。接種物は０．５ｍｌあたり１０８．２ＴＣＩＤ５０アデノウイルスを含有していた。
【０１０３】
実施例１由来の２群からのヒヨコを感染させるために使用したアデノウイルスを、感染した対照から採取された肝臓からのニワトリジン族細胞（ＣＫＣ）に関して単離した。ウイルスをＣＫＣに関して増殖させ、この実験において使用するまで−６０℃で保存した。接種物は０．５ｍｌあたり１０８．２ＴＣＩＤ５０アデノウイルスを含有していた。
ビルナ様ウイルスを、前の実験においてヒヨコを感染させるために使用した腸ホモジネートから単離した。
【０１０４】
ホモジネートをＱｔ３５培地で１：４０希釈した。Ｑｔ３５単層（７×１０４細胞／ｃｍ２）を接種するためにこの懸濁液を使用した。ＣＰＥは約１ヶ月後に見られた。第二継代を次いで開始した。ビルナ様ウイルスを翌週第二継代においてＥＭ下で観察した。この実験においてヒヨコを感染させるために使用した細胞培養物は、数ヶ月後に入手した（数ヶ月前に入手した物質のＱｔ３５単層の第二継代）。
２０羽の一日令ブロイラーヒヨコを商業的孵化場から入手し、５羽ずつの４群に分け、素嚢中に挿管することにより、０．５ｍｌの表４Ａに示す接種物を接種する。
【０１０５】
【表５】
2006503863.tif 000006
【０１０６】
群をアイソレーター中で飼育した。トリを新しい糞と接触させるために各アイソレーターの床を紙で覆った。ヒヨコに商業的ブロイラーマッシュ（ＣＡＶＯ−ＬＡＴＵＣＯ）を自由に与え、コップから提供された飲料水を自由に摂らせた。これらをＭＡＳの臨床的徴候について毎日観察した。感染後１６日に、各群からのヒヨコを個々に体重測定し、殺し、死体解剖した。腸（膵臓を含む）を集め、−６０℃以下で保存した。死後、全てのヒヨコから血液サンプルを採取した。これらの血液サンプルから調製された血漿においてアルカリホスファターゼ活性を測定した。
【０１０７】
０日：ヒヨコの接種
１６日：全ヒヨコの体重測定。死体解剖。腸、膵臓および血液サンプルの採集。
２２日：各群からのヒヨコの死体解剖。腸、膵臓および血液サンプルの採集。
【０１０８】
ヒヨコをＭＡＳの臨床的徴候について毎日観察した。異常および死亡数を記録した。ヒヨコを１６日に体重測定し、殺し、死体解剖した。ＭＡＳを診断するために用いられるパラメータは次のものであった：成長の遅れ、黄色がかった粘液性の糞、貧相な羽根、骨異常および高い血漿アルカリホスファターゼ活性。
【０１０９】
感染後１６日にヒヨコを殺した後、血液サンプルを個々にヘパリン化チューブ中に採取した。血漿を調製し、色（青白色または黄色）について調べた。アルカリホスファターゼ活性（１リットルあたりの単位で表す）をオランダ、デーヴェンテルの動物保健所でこれらの血漿サンプルにおいて測定した。
腸および膵臓を感染後２１日に各群から集めた。サンプルを−６０℃以下で保存した。
【０１１０】
結果
腸ホモジネートで感染したヒヨコ（感染対照；３群）においてＭＡＳが再現された。これらのヒヨコは、成長の遅れ、色素不足、骨異常、青白い血漿および高い血漿アルカリホスファターゼ活性を示した。ビルナ様ウイルスまたはビルナ様ウイルス、アデノウイルスおよびレオウイルスの混合物で感染したヒヨコは、生後第１週中は不健康であった。しかしながら、第１週後、ヒヨコは回復した。死後、血色の悪い腸および中程度の骨奇形がこれらのヒヨコにおいて見られた。
【０１１１】
異なる日令での平均体重および１６日の死体解剖の結果を表４Ｂに示す。
【表６】
2006503863.tif 000007
【０１１２】
３群（感染対照）からの血液サンプルは青白色であった。１群（ビルナ様ウイルス）、２群（ウイルスの組み合わせ）および４群（非感染対照）から得られる血漿は黄色であった。３群（感染対照）の血漿アルカリホスファターゼ活性は、１群（ビルナ様ウイルス）、２群（ウイルスの組み合わせ）および４群（非感染対照）の血漿アルカリホスファターゼ活性よりも実質的に高かった。色および平均血漿アルカリホスファターゼ活性に関する血漿の検査結果を表４Ｂに示す。
【０１１３】
３群のヒヨコ（感染対照；腸ホモジネート）においてＭＡＳが再現された。これらのヒヨコは、疾患の臨床的徴候の全て、すなわち、発育阻害、青白い下肢および血漿、高い血漿アルカリホスファターゼ活性、骨異常などを示した。
【０１１４】
ビルナ様ウイルスで感染したヒヨコ（１群）およびビルナ様ウイルス、アデノウイルスおよびレオウイルスの混合物で感染したヒヨコ（２群）は、生後第１週中は非常に不健康であったが、その後、ヒヨコは回復した。これらのヒヨコのほとんどは、青白い下肢、青白い筋肉（胸）組織および中程度の骨異常を有していた。これらは成長が阻害されず、青白い血漿ではなかった。１群（ビルナ様ウイルス）および２群（ビルナ様ウイルス、アデノウイルスおよびレオウイルスの組み合わせ；ヒヨコの４／５）の血漿ＡＬＰ値は４群（非感染対照）の血漿ＡＬＰ値と同じ範囲内であった。２群からのヒヨコは１４．０６０Ｕ／ＩのＡＬＰ値を有していた。この例外の信頼性についての疑問は評価するのが多少困難である。真の値であるのか、または実験室における試験物質の汚染によるか。さらに、この値は３群における平均血漿ＡＬＰ値（４２．１４３Ｕ／Ｌ）よりもかなり低かった。この実験の結果は、試験されたビルナ様ウイルスは若いニワトリにおいて、単独またはアデノウイルスおよびレオウイルスとの組み合わせにおいていくつかの著しい疾患状態（下痢および多少の成長の遅れ）を引き起こすが、ＭＡＳは引き起こさないようであることを示す。
【０１１５】
実施例５
この研究の目的は、実施例３からのヒヨコから得られる腸物質で一日令のヒヨコを感染させることによりＭＡＳにおけるアデノウイルスおよびレオウイルスの役割を調べることである。
【０１１６】
商業的孵化場から入手した５０羽の一日令ブロイラーヒヨコを、１０羽ずつ５群に分け、素嚢中に挿管することにより０．５ｍｌの腸ホモジネートを接種した。腸ホモジネートは実施例３からの感染したヒヨコ由来であった。
１群：実施例３由来のホモジネート｛１群（感染対照）｝：１ｍｌあたり１０４．９ＴＣＩＤ５０レオウイルスを含有；
２群：実施例３由来のホモジネート｛３群（アデノウイルス）｝：１ｍｌあたり１０４．６ＴＣＩＤ５０アデノウイルスを含有；
３群：実施例３由来のホモジネート｛２群（レオウイルス）｝：１ｍｌあたり１０４．６ＴＣＩＤ５０レオウイルスを含有；
４群：実施例３由来のホモジネート｛４群（アデノウイルス＋レオウイルス）｝：１ｍｌあたり１０４．３ＴＣＩＤ５０アデノウイルスを含有し、レオウイルスが存在していた；
５群：非接種対照。
【０１１７】
群を、ステンレス鋼ケージ上、独立した動物飼育室中で飼育した。ヒヨコに餌を自由に与え、飲料水を自由に摂らせた。これらをＭＡＳの臨床的徴候について毎日観察した。感染後６、１４および２１日に、ヒヨコを個々に体重測定した。
２１日にヒヨコを殺し、死体解剖し、腸（膵臓を含む）を集め、−７０℃で保存し、血漿アルカリホスファターゼ活性ならびにアデノウイルスおよびレオウイルスに対する抗体価を測定するために血液サンプルを採取した。
この実験の結果は、ＭＡＳにおけるレオウイルスおよびアデノウイルスの役割に関する前の実験（実施例３）の結果に匹敵した。
【０１１８】
ＭＡＳは１群（感染対照）のヒヨコの３／１０において再現され、２群（アデノウイルス）、３群（レオウイルス）および４群（アデノウイルスおよびレオウイルスの組み合わせ）のヒヨコにおいて部分的に再現された（骨疾患、青白く膨張した腸、および色素不足）。
【０１１９】
この実験の結果は、ＭＡＳが１以上の病原体により引き起こされる多因子性疾患であり、これらの病原体のそれぞれが該疾患の特定の臨床的徴候、すなわち、阻害された成長、色素不足、骨疾患、黄色がかった粘液性の糞および高い血漿アルカリホスファターゼ活性の原因であることを示す。
結果から、試験されたアデノウイルスおよびレオウイルスはＭＡＳに関与する可能性がかなりあり、アデノウイルスは色素不足、骨異常の発生に関与し、レオウイルスは腸の異常に関与すると結論づけられる。黄色がかった粘液性の糞、生長阻害および高いＡＬＰ活性を誘発するためには別の要因が必要である。従って、ＭＡＳ疾患状態に対して家禽を保護するためには少なくともこれらの２種のウイルスを含有するワクチンを用いなければならないようである。
【０１２０】
材料および方法
この実験においてヒヨコを感染させるために使用した接種物は実施例３由来であった。これらは、感染後２１日に実施例３において１群（感染対照）、２群（レオウイルスで感染）、３群（アデノウイルスで感染）および４群（アデノウイルスおよびレオウイルスの組み合わせで感染）のヒヨコから集められた腸（膵臓を含む十二指腸）から調製した。
腸（群ごとにプール）をＰＢＳと混合し（重量／重量１：１）、実験室用ブレンダーを用いて均質化した。ウイルス価をＦｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅアニマルヘルスプロトコルにしたがって測定した。ホモジネートを−７０℃で使用する日まで保存した。
【０１２１】
商業的孵化場から入手した５０羽の一日令ブロイラーヒヨコを１０羽ずつ５群に分け、次のようにして素嚢中に挿管することにより０．５ｍｌの腸ホモジネートを接種した：
【表７】
2006503863.tif 000008
【０１２２】
各群を、独立した動物飼育室中、針金の床（０．５ｍ２）および糞を集める装置を有するステンレス鋼ケージ上で飼育した。ケージの床を紙で覆い、トリを新しい糞と接触させた。ヒヨコに商業的ブロイラーマッシュ（ＣＡＶＯ−ＬＡＴＵＣＯ）を自由に与え、コップから提供される飲料水を自由に摂らせた。ヒヨコをＭＡＳの臨床的徴候について毎日観察した。感染後６、１４および２１日に、各群からのヒヨコを個々に体重測定した。
【０１２３】
２１日にヒヨコを殺し、死体解剖し、腸（膵臓を含む）を集め、−７０℃で保存した。感染後２１日に各群からのヒヨコから血液サンプルを採取した。アデノウイルスおよびレオウイルスに対する抗体価をこれらの血液サンプルにおいて測定した。１、４および５群のヒヨコから採取された血液サンプルにおいてアルカリホスファターゼ活性を測定した。
【０１２４】
タイムテーブル
０日：ヒヨコの接種
６日：各群からの全ヒヨコの体重測定。
１４日：全ヒヨコの体重測定。
２１日：死体解剖。腸、膵臓および血液サンプルの採集。
２２日：各群からのヒヨコの死体解剖。腸、膵臓および血液サンプルの採集。
【０１２５】
ヒヨコをＭＡＳの臨床的徴候について毎日観察した。異常および死亡数を記録した。ヒヨコを６、１４および２１日令で体重測定した。ＭＡＳを診断するために用いられるパラメータは次のものであった：成長の遅れ、黄色がかった粘液性の糞、貧相な羽根、骨異常、および高い血漿アルカリホスファターゼ活性。
【０１２６】
感染後２１日に各群からのヒヨコを殺した後、血液サンプルを個々にヘパリン化チューブ中に採取した。血漿を使用するまで４℃で保存した。１、４および５群のヒヨコからの血液サンプルにおいてアルカリホスファターゼ活性（１リットルあたりの単位で表す）を測定した。
レオウイルスおよびアデノウイルスに対する抗体の存在を、感染後２１日に各群からのヒヨコからサンプリングした血液において測定した。ＨＩおよびＥＬＩＳＡ技術を用いて血清学を行った。
感染後２１日に各群から腸および膵臓を集めた。サンプルを−７０℃で保存した。
【０１２７】
結果
感染した対照（１群）がＭＡＳを発症した。疾患の臨床的徴候の全て（成長の遅れ、黄色がかった粘液性の糞、貧相な羽根、骨異常および高い血漿アルカリホスファターゼ活性）がこれらのヒヨコにおいて観察された。成長の遅れは、生後第１週に始まった。
【０１２８】
４群｛Ｉｎｏ（アデノウイルスおよびレオウイルス）｝のヒヨコは、生後第１週中は非常に不健康であった。この群からの２羽のヒヨコはこの期間中にＭＡＳの臨床的兆候（成長の遅れ、青白く膨張した腸）を示して死亡した。これらのヒヨコは、この期間中黄色っぽい粘液性の糞をした。
１群（Ｉｎｏ１；感染対照）の３／１０のヒヨコ、２群（Ｉｎｏ２；アデノウイルス）の９／１０のヒヨコおよび４群（Ｉｎｏ４；アデノウイルスとレオウイルスの混合物）の８／８のヒヨコにおいて骨疾患が観察された。これらのヒヨコも非常に青白い下肢を有していた。
２群（Ｉｎｏ２、アデノウイルス）、３群（Ｉｎｏ３、レオウイルス）および４群からのヒヨコの平均体重は、６日令で感染していない対照（５群）の平均体重よりも少なかったが、これより後の時期ではそうではなかった。
【０１２９】
異なる時期での平均体重および２１日の死体解剖の結果を表５Ａにまとめる。血漿アルカリホスファターゼ活性の要約を表５Ｃに示す。接種調製物の詳細を下記の「接種調製物の項」に記載する。
【表８】
2006503863.tif 000009
【０１３０】
感染後２１日に、１、４および５群のヒヨコから採取された血漿サンプルにおけるアルカリホスファターゼ活性の平均値も表５Ａに示す。
感染対照（１群）の血漿アルカリホスファターゼ活性は、同程度である５群（非感染対照）および４群｛Ｉｎｏ４（アデノウイルスおよびレオウイルス）｝の血漿アルカリホスファターゼ活性よりも実質的に高かった。
２１日に採取された血液サンプルにおいてレオウイルスおよびアデノウイルスに対する抗体は検出されなかった。
【０１３１】
この実験の結果は、ＭＡＳにおけるレオウイルスおよびアデノウイルスの役割に対する前の実験（実施例３）の結果に匹敵する。両実験において、ＭＡＳはアデノウイルス、レオウイルスおよびその組み合わせでヒヨコを経口感染させた後に部分的に再現された。第一の実験において、細胞培養されたウイルス（高力価）を使用した。この実験において、動物継代されたウイルス（比較的低力価）を使用した。このことは、ウイルスの動物継代はその有効性およびＭＡＳを再現する能力を変更しないことを示唆する。このことはおそらくこれらのウイルスが症候群の一部を形成するだけであることを意味する。
【０１３２】
この実験の結果（表５に記載）はこの結論を支持する。これらは、ＭＡＳの臨床的徴候はいくつかの病原体の複合作用から生じることを示唆する。これはさらに、これらの病原体のそれぞれが疾患の特定の臨床的徴候、すなわち、阻害された成長、色素不足、骨疾患、黄色がかった粘液性の糞および／または高い血漿アルカリホスファターゼ活性に関与し、ＭＡＳ疾患に対するワクチンはこれらの病原体のすくなくとも２つを含むべきであることを示唆する。
【０１３３】
【表９】
2006503863.tif 000010
【０１３４】
この実験の結果は次のことを示す：
・アデノウイルスは色素不足および骨異常の原因である；
・アデノウイルスは黄色がかった粘液性の糞を引き起こし得る；
・レオウイルスは血色の悪い膨張した腸の原因である（この実験において；実施例３において、レオウイルスは骨疾患も引き起こした）。
・アデノウイルスおよびレオウイルスは高い血漿ＡＬＰの原因ではないようであり；このパラメータについては他のさらなる要因が原因のようである。
・この実験の結果は、アデノウイルスおよびレオウイルスの成長阻害における役割について決定的でない。第１週に死亡した４群からの２羽のヒヨコは成長が阻害されたヒヨコであった。しかしながら、生き残ったヒヨコは成長阻害ではなかった。アデノウイルスおよびレオウイルス感染ヒヨコ（２、３および４群）の平均体重は、感染後２１日で感染していない対照（５群）の平均体重と実質的に異なっていなかった。このことは、実施例３（ＭＡＳにおけるアデノウイルスおよびレオウイルスの役割に関する第一の実験）の結果と対照的であった。この実験において、アデノウイルスおよびレオウイルスは（両方とも細胞培養において）成長の遅れを引き起こした。
【０１３５】
実施例３とこの実験間の差は、おそらくこの実験において使用したホモジネートにおけるかなり低いウイルス価によるものである。
感染していない対照の平均体重は２１日で６９１グラムであった。これらのヒヨコは最終週中、高エネルギーブロイラー飼料のかわりに低エネルギー初年鶏用飼料を与えたので、通常（７６０グラム）よりも低かった。
【０１３６】
結果から、試験したアデノウイルスおよびレオウイルスはＭＡＳに関与する可能性が非常にあり、アデノウイルスは色素不足および骨異常の発生に関与し、レオウイルスは腸異常および骨異常に関与すると結論づけられた。結果は、成長阻害については決定的でなく；黄色がかった粘液性の糞および高い血漿ＡＬＰ活性を引き起こすには別の要因が必要である。
【０１３７】
【表１０】
2006503863.tif 000011
【０１３８】
実施例６
この実験において、要因が細菌、ウイルスまたはタンパク質であるかを決定するために分析した。これは、腸ホモジネートを分画し（遠心分離：低速、高速および超遠心）、続いて一日令ブロイラーヒヨコをこれらのフラクションで感染させることにより行った。
商業的孵化場から入手した３０羽の一日令ブロイラーヒヨコを５羽ずつの６群に分け、素嚢中に挿管することにより、ヒヨコ１羽あたり０．５ｍｌの接種物を接種した。
【０１３９】
【表１１】
2006503863.tif 000012
【０１４０】
１、２、３および４群をアイソレーター中で飼育した。５および６群はステンレス鋼ケージ上、異なる動物飼育室中。ヒヨコは自由に飼料を与え、飲料水を自由に摂取させた。これらをＭＡＳの臨床的徴候について毎日観察した。
【０１４１】
感染後１４日に、ヒヨコを個々に体重測定し、殺し、死体解剖した。腸（膵臓を含む）を集め、−６０℃以下で保存し、血漿アルカリホスファターゼ活性を測定するために血液サンプルを採取した。
３群（フラクション３；主にウイルス）、４群（フラクション４、復元された腸ホモジネート）、および５群（フラクション５；腸ホモジネート）のヒヨコにおいてＭＡＳが再現された。ＭＡＳは１群（フラクション１；細菌）および２群（フラクション２；タンパク質、小分子および小ウイルス）のヒヨコにおいて部分的に再現された（骨疾患、および高いＡＬＰ）。
【０１４２】
この実験の結果は、細菌がＭＡＳの原因物質であることを排除する。症候群は無菌フラクション３で再現されたのでウイルスが必要とされる。タンパク質、毒素または他の小分子はフラクション２および３中に存在するので、その関与はこの結果により完全に排除されない。これらの小分子の関与は、電気泳動技術を用いてさらに調べることができる。結果から、ＭＡＳはウイルス病因を有すると結論づけられた。低分子量粒子および分子の可能な役割は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によりさらに調べることができる。
【０１４３】
材料および方法
１、２、３および４群のヒヨコを感染させるために使用した接種物は、実施例２からの１群の感染したヒヨコからサンプリングされた腸から調製した。腸を均質化し、この実験において使用するまで−６０℃以下で保存した。ホモジネートを解凍し、フラクションを低速（ＬＳ）、高速（ＨＳ）および超遠心分離（ＵＣ）により調製した。ヒヨコを感染させるためにＬＳおよびＨＳ後の合わせたペレット、ＵＣ後の上清およびＵＣ後のペレットを使用した。
【０１４４】
商業的孵化場から入手した３０羽の一日令ブロイラーヒヨコを５羽ずつ６群に分け、素嚢中に挿管することにより表６Ａに示す接種物０．５ｍｌを接種した。
【表１２】
2006503863.tif 000013
【０１４５】
１、２、３および４群をアイソレーター中で飼育した。５および６群を、針金の床（０．５ｍ２）と糞を集める装置を有するステンレス鋼ケージ上、独立した動物飼育室中で飼育した。トリを新しい糞と接触させるためにアイソレーターおよびケージの床を紙で覆った。ヒヨコに商業的ブロイラーマッシュ（ＣＡＶＯ−ＬＡＴＵＣＯ）を自由に与え、コップから提供される飲料水を自由に摂取させた。ヒヨコをＭＡＳの臨床的徴候について毎日観察した。感染後１４日に、各群からのヒヨコを個々に体重測定し、殺し、死体解剖した。腸（膵臓を含む）を集め、−７０℃で保存した。死後、すべてのヒヨコから血液サンプルを集めた。これらの血液サンプルから調製された血漿においてアルカリホスファターゼ活性を測定した。
【０１４６】
０日：ヒヨコの接種
１４日：全ヒヨコの体重測定、死体解剖、腸、膵臓および血液サンプルの採集。
【０１４７】
方法
ヒヨコをＭＡＳの臨床的徴候に関して毎日観察した。異常および死亡数を記録した。ヒヨコを１４日に体重測定し、殺し、死体解剖した。
ＭＡＳを診断するためのこの実験において用いられるパラメータは次のものであった：成長の遅れ、黄色い粘液性の糞、貧相な羽根、骨異常および高いアルカリホスファターゼ活性。
【０１４８】
感染後１４日にヒヨコを殺した後、血液サンプルを個々にヘパリン化チューブ中に採取した。血漿を調製し、色（青白色または黄色）について調べた。アルカリホスファターゼ活性（１リットルあたりの単位で表す）をこれらの血漿サンプルにおいて測定した。
腸および膵臓を感染後２１日に各群から集めた。サンプルを−６０℃以下で保存した。
選択されたホモジネートを、ニワトリ腎細胞（ＣＫＣ）の接種によりウイルスの存在について調べた。
【０１４９】
結果
１群（フラクション１を接種；ペレット）のヒヨコは感染後第１日中は非常に不健康であり、１羽のヒヨコが死亡した。これらは１４日に体重が最低であった。死後、骨疾患が見られた。血漿ＡＬＰ値はこれらのヒヨコにおいて最高であった。
２群（低分子量粒子および分子）のヒヨコは骨疾患、高いＡＬＰおよび低い体重を有していた。
【０１５０】
ＭＡＳの全臨床的徴候（成長の遅れ、血色の悪い下肢、血色が悪く膨張した腸、黄色がかった粘液性の糞、貧相な羽、骨異常および高い血漿アルカリホスファターゼ活性）が３群（フラクション３；ウイルス）、４群（フラクション４；組み換え腸ホモジネート）および５群（腸ホモジネート）のヒヨコにおいて見られた。成長の遅れは生後第１週から始まった。
【０１５１】
異なる時期での平均体重および１４日の死体解剖の結果を表６Ｂに記載する。
【表１３】
2006503863.tif 000014
【０１５２】
２、３、４および５群から得られる血液サンプルは青白かった。１群および６群から得られる血漿は暗（黄）色であった。１、２、３、４および５群の血漿アルカリホスファターゼ活性は、６群（非感染対照）の血漿アルカリホスファターゼ活性よりも実質的に高かった。血漿の色および平均アルカリホスファターゼ活性に関する調査結果も表６Ｂに示す。フラクションの生物学的調査の結果を表６Ｃに記載する。
【０１５３】
【表１４】
2006503863.tif 000015
【０１５４】
結果
この実験の結果は、次の理由から細菌がＭＡＳの原因物質であることを除外し、この疾患のウイルス性病因を示す：
・ＭＡＳはフラクション３で再現された。このフラクション（超遠心後のペレット）は無菌で、ウイルスからなっていた。
・ＭＡＳはフラクション２で部分的に再現された。２群のヒヨコは低体重で、骨疾患、青白い血漿および高い血漿ＡＬＰ値を有していた。これらは膨張した血色の悪い腸を有していなかった。フラクション２（ＵＣ後の上清）も無菌で、主に低分子量粒子および分子からなると考えられた。
・ＭＡＳはフラクション１で部分的に再現された。１群（フラクション１を接種；ＬＳおよびＨＳ後のペレット）のヒヨコは感染後第１日中非常に不健康であり、１羽のヒヨコが死亡した。これらは１４日で平均体重が最低であり、死後に骨疾患を有し、非常に高い血漿ＡＬＰ値を有していた。これらは膨張した血色の悪い腸、血色の悪い下肢および青白い血漿を有していなかった。フラクション１（ＬＳおよびＨＳ後のペレット）は主に組織および細菌からなると考えられたが、このフラクションの調製操作はこのフラクション中のウイルスの存在を排除しない。
【０１５５】
この実験の結果は、ウイルスがＭＡＳの原因物質であることを示すが、フラクション中に存在し得るタンパク質、毒素または他の物質が関与することを排除しない。ＭＡＳにおけるこれらの小物質の考えられる関与は、該フラクションをＰＡＧＥに付すことによりさらに調べることができる。
【０１５６】
実施例７
１０４〜１０１０ＴＣＩＤ５０の範囲内の不活化トリレオウイルスおよび１０４〜１０１０ＴＣＩＤ５０の範囲内の不活化トリアデノウイルスの組み合わせを含有するワクチンを調製し、ヒヨコに投与する。ワクチンはＭＡＳに関連する症状から動物を保護するのに有効である。
【０１５７】
実施例８
１０２〜１０９ＴＣＩＤ５０の範囲内の生弱毒化トリレオウイルスおよび１０２〜１０９ＴＣＩＤ５０の範囲内の生弱毒化トリアデノウイルスの組み合わせを含有するワクチンを調製し、ヒヨコに投与する。ワクチンはＭＡＳに関連する症状から動物を保護するのに有効である。
【０１５８】
本発明を様々な具体例のいくつかにおいて説明したが、本発明の全体的な真の精神および範囲から逸脱することなく、当業者がこれに修正を加えることができることは十分に予想される。
【国際調査報告】
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