(57)【要約】【課題】【解決手段】例えばＸＩＡＰなどのアポトーシス蛋白抑制因子（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＩＡＰ）、ミトコンドリア蛋白のＳｍａｃ／ＤＩＡＢＯＬＯ（以下Ｓｍａｃとする）およびその相同体が関与する経路によって、細胞のアポトーシスを促進するペプチドおよびペプチドミメティック（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）を同定するためのアッセイを開示する。このアッセイを利用して同定された、ＩＡＰ結合ペプチドおよびペプチドミメティックについても開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
検査試薬がアポトーシス蛋白抑制因子（ＩＡＰ）のＢＩＲドメインに結合可能か否かを決定するアッセイであって、：
ａ）前記ＩＡＰのＢＩＲドメインに結合する、検出可能な標識ペプチドあるいはペプチドミメティック（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）化合物を調整する工程であって、この化合物は次式で表されるものであり：Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４
上式中、Ｒ１はＡまたはＡと類似のアミノ酸；
Ｒ２はＶ、Ｔ、あるいはＩ、またはＶ、Ｔ、Ｉと類似のアミノ酸；
Ｒ３はＰあるいはＡ、またはＰ、Ａと類似のアミノ酸；
Ｒ４は任意のアミノ酸あるいはその類似体であり、前記検出可能な標識がＲ４と結合しているものであり；
ここで、前記検出可能な標識の少なくとも１つの測定項目は、前記ＩＡＰに結合しているか若しくは溶液中で解離している前記標識化合物の関数として変化するものである、前記工程と；
ｂ）前記標識化合物を前記ＩＡＰに結合可能にする条件下で、前記ＩＡＰを標識化合物と接触させ、それにより測定可能な標識化合物／ＩＡＰ複合体を形成する工程と；
ｃ）前記標識化合物／ＩＡＰ複合体を検査試薬に接触させる工程と；
ｄ）前記検査試薬によって、前記標識化合物の測定可能な特徴変化を測定することで、前記標識化合物／ＩＡＰ複合体からの標識化合物の置換を測定し、それにより前記検査試薬が前記ＩＡＰに結合可能か否かを決定する工程と
を有する。
【請求項２】
前記標識化合物がペプチドＡＶＰＸであり、Ｘが任意のアミノ酸である、請求項１のアッセイ。
【請求項３】
前記標識が蛍光色素である、請求項１のアッセイ。
【請求項４】
前記標識化合物がペプチドＡＶＰＸ、Ｘが任意のアミノ酸であり、直接あるいは間接的に蛍光色素に結合するものである、請求項３のアッセイ。
【請求項５】
前記標識化合物がペプチドＡＶＰＣ−ｂａｄａｎ色素である、請求項４のアッセイ。
【請求項６】
前記ＢＩＲドメインがＢＩＲ３ドメインまたはＢＩＲ２ドメインである、請求項１のアッセイ。
【請求項７】
前記ＢＩＲドメインが無変化のＩＡＰの一部として与えられる、請求項１のアッセイ。
【請求項８】
前記検査試薬がアポトーシス蛋白抑制因子（ＩＡＰ）のＢＩＲドメインに結合可能か否かを決定するアッセイを実施するための検出可能な標識化合物であって、この化合物は次式であり：Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４
上記式中、Ｒ１はＡまたはＡと類似のアミノ酸；
Ｒ２はＶ、Ｔ、あるいはＩ、またはＶ、Ｔ、Ｉと類似のアミノ酸；
Ｒ３はＰあるいはＡ、またはＰ、Ａと類似のアミノ酸；
Ｒ４は任意のアミノ酸あるいはその類似体であって、前記検出可能な標識がＲ４と結合しているものであり；
ここで、前記検出可能な標識の少なくとも１つの測定項目は、前記ＩＡＰに結合しているか若しくは溶液中で解離している前記標識化合物の関数として変化するものである。
【請求項９】
ペプチドＡＶＰＸを有し、Ｘは任意のアミノ酸である、請求項８の標識化合物。
【請求項１０】
前記標識が蛍光色素である、請求項８の化合物。
【請求項１１】
ペプチドＡＶＰＸを有し、Ｘは任意のアミノ酸であり直接あるいは間接的に蛍光色素に結合するものである、請求項１０の化合物。
【請求項１２】
ＡＶＰＣ−ｂａｄａｎ色素である、請求項１１の化合物。
【請求項１３】
検査化合物がアポトーシス蛋白抑制因子（ＩＡＰ）のＢＩＲ３ドメインに結合可能か否かを決定するアッセイであって：
ａ）ＢＩＲ３ドメインに結合するＡＶＰＩテトラペプチドの標識類似体を提供する工程であって、前記検出可能な標識の少なくとも１つの測定項目は、ＩＡＰに結合しているか若しくは溶液中で解離している前記類似体の関数として変化するものである、工程と；
ｂ）前記類似体をＩＡＰに結合させることを可能にする条件下で、前記ＩＡＰを標識類似体と接触させ、これにより測定可能なＩＡＰ／標識類似体の複合体を形成する工程と；
ｃ）前記ＩＡＰ／標識類似体の複合体を検査化合物と接触させる工程と；
ｄ）前記検査化合物によって、前記標識類似体の測定可能な特徴変化を測定することで、前記ＩＡＰ／標識類似体複合体からの標識類似体の置換を測定し、それにより前記検査化合物が前記ＩＡＰに結合可能か否かを決定する工程と
を有する。
【請求項１４】
前記標識類似体はＡＶＰＸであり、ここでＸは蛍光色素に直接、間接的に結合するものである、請求項１３のアッセイ。
【請求項１５】
前記標識類似体がＡＶＰＣ−ｂａｄａｎ色素である、請求項１３のアッセイ。
【請求項１６】
前記ＩＡＰをＢＩＲ３ドメインで構成されるＩＡＰの一部分で置き換えてなる、請求項１のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願書類では、２００１年５月３１日に出願された米国仮出願番号６０／２９４，６８２および２００２年１月３日に出願された６０／３４５，６３０に対する優先権を主張するものとし、それらの出願の内容はこの参照により本明細書に組み込まれたものとする。
【０００２】
米国特許法第２０２（ｃ）条に従い、米国政府がここに説明する発明について所定の権利を有するものとし、本発明は、一部、米国国立衛生研究所の助成金番号ＧＭ５９３４８−０２による資金援助を受けてなされたものである。
【０００３】
本発明は、細胞増殖性疾患（ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）の予防と治療に対する薬物のデザインと開発分野に関するものである。特に本発明では、例えばＸＩＡＰなどのアポトーシス蛋白抑制因子（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＩＡＰ）とミトコンドリア蛋白のＳｍａｃ／ＤＩＡＢＯＬＯ（以下Ｓｍａｃとする）が関与する経路によって、細胞のアポトーシスを促進するペプチドおよびペプチドミメティック（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）を同定するためのアッセイを示している。本発明は、このアッセイを利用して同定された、ペプチドおよびペプチドミメティックについても示す。
【背景技術】
【０００４】
この明細書では、様々な科学文献、特許、その他の出版物が引用されている。これらの出版物は、それらの引用その全文がこの明細書中に記載されたものとする。
【０００５】
アポトーシス（プログラムされた細胞死）は、すべての多細胞臓器の発達と恒常性維持において中心的な役割を果たしている。アポトーシス経路の変化は、発達障害、癌、自己免疫疾患や神経変性疾患など、多くのヒトの病状と結びつけられてきた。
【０００６】
従って、プログラムされた細胞死の経路は、治療薬の開発において魅力的なターゲットとなった。特に、概念的には細胞を持続させるよりも消滅させる方が容易であるため、従来の放射線療法や化学療法などプロアポトーシス因子を用いた抗癌治療が注目されてきた。これらの治療は、一般的にミトコンドリアを介したアポトーシス経路の活性化を誘発すると考えられている。しかし、これらの治療では分子特異性がなく、より特異的な分子ターゲットが必要である。
【０００７】
アポトーシスは、主にアスパラギン酸を特異的に基質とするシステイン・プロテアーゼ・ファミリーであるカスパーゼの活性化によって進行する。カスパーゼは細胞内で触媒的に不活性なチモーゲンとして産生され、アポトーシス中に活性なプロテアーゼとなるためには蛋白分解処理を受けなければならない。アポトーシス刺激を受けていない通常の生存細胞では、ほとんどのカスパーゼが不活性のままである。一部のカスパーゼが異常に活性化したとしても、その蛋白分解活性は、ＩＡＰ（アポトーシス蛋白抑制因子）と呼ばれる、進化の過程で保存された蛋白質ファミリーが完全に抑制することができる（Ｄｅｖｅｒａｕｘ  &  Ｒｅｅｄ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：２３９−２５２，１９９９）。それぞれのＩＡＰには、いわゆるＢＩＲ（ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ  ＩＡＰ  ｒｅｐｅａｔ）ドメインが１〜３コピー含まれており、成熟カスパーゼと直接相互作用して、その酵素活性を抑制する。ＸＩＡＰ、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、Ｌｉｖｉｎ／ＭＬ−ＩＡＰなど、いくつか明確な哺乳類ＩＡＰが同定されたが（Ｋａｓｏｆ  &  Ｇｏｍｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３２３８−３２４６，２００１；Ｖｕｃｉｃら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１０：１３５９−１３６６，２０００；Ａｓｈｈａｂら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４９５：５６−６０、２００１）、これらはすべて細胞培養中で抗アポトーシス活性を示す（Ｄｅｖｅｒａｕｘ  &  Ｒｅｅｄ，１９９９，ｓｕｐｒａ）。ＩＡＰはほとんどの癌細胞で発現されているため、腫瘍の進行やその後の薬物治療に対する耐性に直接関与している可能性がある。
【０００８】
しかし、アポトーシスを受けるようにシグナルを受けた正常な細胞では、ＩＡＰを介した抑制作用が解除される必要があり、このプロセスは少なくとも一部がＳｍａｃ（カスパーゼの第二のミトコンドリアを介した活性化因子；Ｄｕら、Ｃｅｌｌ  １０２：３３−４２，２０００）またはＤＩＡＢＬＯ（ｐＩ値の低い直接ＩＡＰ結合蛋白質；Ｖｅｒｈａｇｅｎら、Ｃｅｌｌ  １０２：４３−５３，２０００）と命名されたミトコンドリア蛋白質によって進行する。細胞質で合成されたＳｍａｃは、ミトコンドリアの膜間腔を標的とする。アポトーシスが刺激されると、ＳｍａｃはチトクロムＣとともに、逆にミトコンドリアからサイトゾルに放出される。チトクロムＣはＡｐａｆ−ｌの多量体化を誘導し、プロカスパーゼ−９およびプロカスパーゼ−３を活性化するが、Ｓｍａｃは複数のＩＡＰの抑制作用を消失させる。ＳｍａｃはＸＩＡＰ、ｃ−ＩＡＰｌ、ｃ−ＩＡＰ２、ｓｕｒｖｉｖｉｎなど、現在までに検討されたすべてのＩＡＰと相互作用する（Ｄｕら、２０００，ｓｕｐｒａ；Ｖｅｒｈａｇｅｎら、２０００，ｓｕｐｒａ）。従って、Ｓｍａｃは哺乳類においてアポトーシスの優れた制御因子であると考えられる。
【０００９】
Ｓｍａｃは２３９アミノ酸の前駆体分子として合成され、そのＮ末端５５残基は取り込まれた後に除去される、ミトコンドリア標的配列として機能する（Ｄｕら、２０００，ｓｕｐｒａ）。成熟体のＳｍａｃには１８４アミノ酸が含まれ、溶液中でオリゴマーとして機能する（Ｄｕら、２０００，ｓｕｐｒａ）。Ｓｍａｃおよびその様々なフラグメントが、治療薬を同定するターゲットとして利用できることが提唱されてきた。Ｗａｎｇらの米国特許番号６，１１０，６９１では、アミノ酸８残基長以上のＳｍａｃポリペプチドとフラグメントについて報告している。しかし、この特許では、Ｓｍａｃの特定ペプチドフラグメントを治療薬あるいは治療ターゲットとして選択した、構造的な基盤を開示あるいは教示していない。
【００１０】
哺乳類と同様、ハエにも２種類のＩＡＰであるＤＩＡＰ１およびＤＩＡＰ２が含まれ、いくつかのショウジョウバエのカスパーゼと結合し、不活化する（Ｈａｙ，  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．７：１０４５−１０５６，２０００）。ＤＩＡＰ１には２つのＢＩＲドメインがあり、第２のＢＩＲドメイン（ＢＩＲ２）は多くの場合、細胞死を遮断するために必要かつ十分である。ショウジョウバエ細胞では、ＤＩＡＰ１の細胞死阻害フラグメントが３つのプロアポトーシス蛋白Ｈｉｄ、Ｇｒｉｍ、Ｒｅａｐｅｒによって除去され、ＤＩＡＰ１のＢＩＲ２ドメインと物理的に相互作用し、カスパーゼの抑制作用を消失させる。従って、Ｈｉｄ、Ｇｒｉｍ、Ｒｅａｐｅｒは、哺乳類の蛋白質Ｓｍａｃの機能的相同体に相当する。しかし、Ｎ末端の１０残基を除き、Ｈｉｄ、Ｇｒｉｍ、Ｒｅａｐｅｒには互いに配列の相同性がなく、この３つのショウジョウバエ蛋白質とＳｍａｃとの間にも明らかな相同性がない。
【００１１】
同一出願人による同時係属米国特許出願番号０９／９６５，９６７（その全文はこの参照により本明細書に組み込まれる）では、上述のＳｍａｃの生物活性が、ＢＩＲ３ドメインと呼ばれるＸＩＡＰの一部にある特徴的な表面の溝にＮ末端の４残基が結合することと関連している。この結合が、ＸＩＡＰによる細胞アポトーシスの抑制機能を阻害する。この特許ではさらに、ショウジョウバエのプロアポトーシス蛋白質Ｈｉｄ、Ｇｒｉｍ、ＶｅｔｏのＩＡＰ結合蛋白質にあるＮ末端テトラペプチドが、同様に機能していることが開示された。
【００１２】
Ｓｍａｃあるいは他種相同体のＩＡＰ結合ペプチドを基にアポトーシスを促進させる治療薬の開発は、有用な分子を同定する処理能力の高いスクリーニングアッセイがあれば、大きく加速されると思われる。さらに、そのような治療薬の開発は、合理的にデザインされた候補化合物のライブラリを作成することでも促進されると思われる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明では、Ｓｍａｃテトラペプチドや他種相同体のように、ＩＡＰのＢＩＲドメインに結合し、ＩＡＰを介したアポトーシスの抑制を軽減することができる薬物の処理能力の高いスクリーニング、または合理的なドラッグデザインに利用するためのアッセイについて示す。これらのアッセイでは、（１）ＳｍａｃのＮ末端テトラペプチドモチーフと他のＩＡＰ結合蛋白質がＩＡＰを十分に結合させ、（２）哺乳類のＢＩＲ３ドメインとショウジョウバエのＢＩＲ２ドメインにテトラペプチドを特異的に結合させる溝がある、同一出願人による同時係属米国出願番号０９／９６５，９６７で開示された発明に沿った発見を利用している。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
このアッセイは、以下の基本手順で構成される：（ａ）適当なＢＩＲドメイン（好ましくはＢＩＲ３）に結合するＩＡＰ結合テトラペプチドの標識類似体を調整する。ここで、ＩＡＰに結合しているか、溶液中で解離している類似体の関数として、標識の少なくとも１つの測定項目が変化する；（ｂ）類似体をＢＩＲに結合させ、測定可能なＢＩＲ−標識類似体複合体を形成できる条件下で、ＩＡＰのＢＩＲドメインを標識類似体と接触させる；（ｃ）ＢＩＲの結合を検査するため、ＢＩＲ標識類似体複合体と化合物を結合させる；（ｄ）ＢＩＲ−標識類似体複合体が標識類似体で置換されれば、検査化合物によって標識類似体の測定可能な特徴変化を測定し、検査化合物がＩＡＰに結合可能か否かを決定することで、その置換を測定する。好適な実施例では、標識類似体がＡＶＰＸ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）であり、Ｘが蛍光色素と直接あるいは間接的に結合する。好ましくは、標識類似体はｂａｄａｎ色素が結合したＡＶＰＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）である。
【００１５】
本発明では、本発明の方法により、ＸＩＡＰのＢＩＲ３ドメインに結合することが証明された、ペプチドあるいはペプチドミメティックのライブラリも示す。１つの実施例では、これらのペプチドが天然アミノ酸残基で構成される。別の実施例では、ライブラリがペプチドミメティックに基づき、部分的あるいは完全に自然のペプチドではないが、ＩＡＰに結合できるなど、Ｓｍａｃペプチドの物理化学的特徴を模倣している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
小分子の蛋白質−蛋白質相互作用の阻害効率を迅速にアッセイできることは、適した薬物候補を開発する際に重要である。本発明の１つの側面は、アポトーシス蛋白抑制因子（ＩＡＰ）、特に哺乳類ＸＩＡＰのＢＩＲ３ドメインに対する、テトラペプチド分子ライブラリの結合親和性を検討するアッセイである。このアッセイは、検出可能な標識、好ましくは蛍光色素分子に基づいている。好適な実施例では、配列がＳｍａｃのＮ末端３残基とマッチしたトリペプチドのＡＶＰにフルオロフォアを結合させる。従って、この分子の一般構造はＡＶＰ［Ｘ］であり、Ｘがフルオロフォアである。以下、この分子を「ＡＶＰ色素」と呼ぶ。ＡＶＰ色素はＢＩＲ３の溝に入り、色素の周囲が水から蛋白質の疎水性ポケットに変化すると、発光最大値と強度を大きくシフトさせる。分子（天然のＳｍａｃ蛋白質またはテトラペプチド類似体）が色素を置換すると、発光が再びシフトし、水で観察されたスペクトルに戻る。発光強度はテトラペプチドの結合に関連しているため、テトラペプチドによるＡＶＰ色素の置換平衡定数Ｋの予測にこの強度を利用することができる。この平衡定数が大きいほど、テトラペプチドのＢＩＲ３に対する親和性が大きい。このため、最も有望な阻害剤を迅速に決定することができ、効果的な阻害剤の構造情報を次の検討で薬物候補のデザインに取り込むことができる。
【００１７】
上述のＡＶＰ色素−ＢＩＲ３系を例示し、本発明の手順が望ましいが、（１）ＩＡＰ結合テトラペプチドと類似体、（２）ＢＩＲが結合する溝、（３）検出可能な標識の様々な組み合わせを交互に利用し、上述のアッセイの様々な変化型を作成できることは、当業者が理解することとする。特に、同時係属別国出願番号０９／９６５，９６７で述べられ、合意が得られたテトラペプチドＡ−（Ｖ／Ｔ／Ｉ）−（Ｐ／Ａ）−（Ｆ／Ｙ／Ｉ／Ｖ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）を引用する。
【００１８】
メカニズムの説明に限るつもりはないが、標識テトラペプチドであるＡＶＰ色素のＢＩＲ結合溝への結合に根本的に影響する要因には、以下のメカニズムが含まれることとする：
１．認識は、水素結合の相互作用とファンデルワールス力により達成される。
２．ＢＩＲ３表面の溝では、８箇所の分子内水素結合と３箇所の分子間水素結合がＡＶＰＩの結合を支持している。
３．ＳｍａｃのＶａｌ２／Ｉｌｅ４およびＢＩＲ３のＧｌｙ３０６／Ｔｈｒ３０８の中心となる基が３箇所で分子間接触することで、４鎖の逆平行βシートを形成することができる。
４．Ａｌａ１がＧｌｕ３１４およびＧｌｎ３１９に３水素結合を提供し、そのカルボニル基がＧｌｎ３ｌ９およびＴｒｐ３２３と接触する。
５．Ａｌａ１のメチル基が、Ｌｅｕ３０７、Ｔｒｐ３１０、Ｇｌｎ３１９の側鎖で形成される疎水性ポケットにしっかりとはまる。
６．Ｖａｌ２およびＰｒｏ３がＴｒｐ３２３と複数のファンデルワールス相互作用を維持し、Ｐｒｏ３がさらにＴｙｒ３２４と相互作用している。
７．Ｉｌｅ４の側鎖がＬｅｕ２９２、Ｇｌｙ３０６、Ｌｙｓ２９７、Ｌｙｓ２９９と相互作用する。
【００１９】
従って、ＡＶＰ色素には、１つ以上の前述の要因により、標識の結合がＢＩＲ３に対する色素の結合に悪影響しない、フルオロフォアのような適当な検出標識を含むことができる。ＡＶＰ色素に使用する上で特に適した色素は、６−ブロモアセチル−２−ジメチルアミノナフタレン（ｂａｄａｎ）色素である。ｂａｄａｎは蛍光色素であり、その周囲の変化に対する感度は、これまでも蛋白質の結合相互作用の探索に利用されてきた（Ｂｏｘｒｕｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１４５７９−１４５８９，２０００；Ｏｗｅｎｉｕｓら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７７：２２３７−２２５０，１９９９；Ｈｉｒａｔｓｕｋａ，Ｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２９１５６−２９１６３，１９９９）。
【００２０】
ＮＨ３＋−ＡＶＰＣ（ｂａｄａｎ）アミドの合成を以下に説明し、その化学構造を図１に示す。特に明記しない限り、材料はＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）あるいはＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）から購入し、それ以上精製せずに用いた。メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）固相ペプチド合成樹脂およびＦｍｏｃアミノ酸はＡｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ＫＹ）およびＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手した。ｂａｄａｎ色素はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）から入手した。
【００２１】
このペプチドはＭＢＨＡ樹脂に関するＦｍｏｃのプロトコルにより、ハンドシェーカーにて合成した（Ｃｈａｎ，Ｗ．Ｃ．；Ｗｈｉｔｅ，Ｐ．Ｄ．Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ，２０００）。このプロトコルでは樹脂が酸性および塩基性条件下で安定である必要があるため、ＭＢＨＡ樹脂を選択した。Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓペプチドは、トリチル基を用いてシステインのチオールを保護して合成した。アラニンのＦｍｏｃ基を脱保護する前に、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えてトリチル基を除去し、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）存在下でシステインのｂａｄａｎ誘導体とした。アラニンのＦｍｏｃ基をピペリジンで除去し、スカベンジャーとして１０％ｖ／ｖアニソールを含む無水ＨＦを処理し、０℃、４５分間で樹脂の開裂を行った。標識ペプチドは、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８分離用カラムを用い、溶媒Ａ（９９％Ｈ２Ｏ；１％ＣＨ３ＣＮ；０．１％ＴＦＡ）と溶媒Ｂ（９０％ＣＨ３ＣＮ；１０％Ｈ２Ｏ；０．１％ＴＦＡ）の濃度を変化させて溶出することでＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥させてからＨ２Ｏに再溶解（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）した。
【００２２】
ＡＶＰＣ−ｂａｄａｎの吸収、発光特性を図２に示す。図２Ａは、分子水溶液の吸収および発光スペクトルを示している。図２Ｂは、発光スペクトルについて、アセトニトリル（ＡＣＮ）中でＡＶＰＣ−ｂａｄａｎのｓｏｌｖａｔｏｃｈｒｏｍｉｃｉｔｙを示している。図３は、様々な濃度のＢＩＲ３存在下でＡＶＰＣ−ｂａｄａｎの発光スペクトルを示している。
【００２３】
上述のＡＶＰ色素を試験化合物のアッセイに用いるが、試験化合物はＳｍａｃテトラペプチドＡＶＰＩと同様にＸＩＡＰのＢＩＲ３ドメインに結合するため、ＸＩＡＰを介したアポトーシスの抑制を解除することができる。これは、処理能力の高い無細胞アッセイであり、以下のように組み立てられている。ＩＡＰのＢＩＲ３ドメインで構成される蛋白質を、上述の通り、適当な緩衝液を含むアッセイ溶液に入れる。好ましくは、この蛋白質はＢＩＲ３ドメインを含む組換え蛋白質とするが、完全なＩＡＰ蛋白質も用いることができる。試験化合物存在下、一定量のＡＶＰ色素を反応混合液に加える。対照試料には試験化合物存在下でＢＩＲ３と色素を含め、任意に天然テトラペプチドＡＶＰＩ存在下でＢＩＲ３と色素を含めてもよい。特定の励起波長と発光波長、例えば励起波長３８７ｎｍ、発光波長５４５ｎｍで反応混合液の蛍光を測定する。代わりに、特定の励起波長で放出スペクトルを測定してもよい。ある測定では、被検化合物を加え、例えば４６０−４８０ｎｍでスキャンして放出スペクトルを測定する。別の測定では、発光強度を特定の波長、例えば４７０ｎｍで測定する。図３および図４に示すとおり、ＢＩＲ３に結合した色素の放出スペクトルは、溶液中の色素のスペクトルと明らかに異なる。従って、試験化合物の結合親和性は、以下の計算に従い、ＢＩＲ３ドメインから色素を置き換える能力の関数として計算することができる：
【００２４】
【数１】
2004531731.tif 000002
【００２５】
典型的なアッセイの詳細については以下に述べる。
【００２６】
材料：
５０ｍＭ  Ｋｐｈｏｓ緩衝液、ｐＨ７、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ中ＢＩＲ３  ６３μＭ
−７０℃で保存したＢＩＲ３  ０．５ｍｌ×４を氷上で解凍して用いた。
Ｈ２Ｏ中ＡＶＰＣ−ｂａｄａｎ  ４３．８μＭ；４℃に冷却
３８７ｎｍでの吸光度＝０．９２０５；ε３８７ｎｍ＝２１０００Ｍ−１ｃｍ−１
Ｈ２Ｏ中５０ｍＭテトラペプチド溶液；４℃に冷却
５０ｍＭ  Ｋｐｈｏｓ緩衝液、ｐＨ７、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ；４℃に冷却
Ｈ２Ｏ（ＭｉｌｌｉＱ精製）；４℃に冷却
【００２７】
手順
ｂａｄａｎ、ＢＩＲ３、緩衝液の原液を混合した。２．５ｍｌのｂａｄａｎ、１．７５ｍｌのＢＩＲ３、１５．２５ｍｌの緩衝液をガラス製のバイアルに混合し、４℃に冷却した。冷却しておいた９６ウェルプレートの５０ウェルに原液３９０μＬを加えた（ウェルＡ１−Ｅ２）。
【００２８】
ｂａｄａｎ、緩衝液の原液を混合した。１５０μＬのｂａｄａｎおよび１０２０μＬの緩衝液を小さなガラス製のバイアル（冷却）に混合し、３９０μＬずつプレートの３ウェルに加えた（Ｆ１−Ｆ３）。
【００２９】
サンプルの発光スペクトルを測定している間、９６ウェルプレートは氷を入れた絶縁体のバケツに保存した。適当な試験溶液（または対照実験では水）５０μＬをマイクロピペットで加え、この溶液をパスツールピペットで混合してから蛍光キュベットにサンプルを加えた。１つのサンプルをスキャンしている間に、その前のスキャンのキュベットをＥｔＯＨで洗い、次のサンプルを調整した。
【００３０】
ＰＴＩ蛍光光度計の設定は以下の通りである：
λｅｘ＝３８７ｎｍ；発光スペクトルは４２０−６５０ｎｍでスキャンした
スリット＝波長分散５ｎｍ
ＰＭＴ電圧＝７５０ｍＶ
スキャンは１ｎｍ区切りで行い、積分時間は１秒とした。
【００３１】
上述のアッセイを用い、様々なペプチドおよびペプチドミメティックについて、ＸＩＡＰのＢＩＲ３ドメイン結合力をスクリーニングした。例えば、テトラペプチドライブラリを作成し、Ｓｍａｃテトラペプチドの１、２、４位を他の要素で置換した。１つの一連構造では、以下のように置換した：
１．１位：ＸＶＰＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、Ｘ＝セリン、グリシン、アミノ酪酸。
２．２位：ＡＸＰＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、Ｘ＝全天然アミノ酸２０種類。
３．４位：ＡＶＰＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、Ｘ＝全天然アミノ酸２０種類。
上述の置換基について実施したアッセイの結果サンプルを表１に示す。
【００３２】
【表１】
2004531731.tif 000003
【００３３】
テトラペプチドＡＶＰＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＡＩＡＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、ＡＶＡＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）はＳｍａｃのショウジョウバエ相同体の配列に対応する。結果からは、これらの配列を含むテトラペプチドがＢＩＲ３と強く結合することが示された（ＡＶＰＦを表１に示す。他の結果は示していない）。
【００３４】
２位で最も成功した修飾はＡＲＰＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）であった。プラスに荷電したアルギニン残基が、結合ポケットの周囲でマイナスに荷電した残基と接触し、ＡＲＰＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）で強い結合が観察されたと考えられる。
【００３５】
前述の通り、４位を修飾したテトラペプチドライブラリを作成した。下記の表２は、本発明のアッセイで検討した、ライブラリの各ペプチドについて得られた結合定数を示している。
【００３６】
【表２】
2004531731.tif 000004
【００３７】
この結合アッセイの発光スペクトルを図４に示す。図４および表１、表２に示した結果を見ても分かるとおり、テトラペプチドＡＶＰＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）はＢＩＲ３ドメインに強く結合しており、ＡＶＰ色素の置換力が示されている。ＡＶＰＷ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１１）およびＡＶＰＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）も天然ＳｍａｃペプチドであるＡＶＰＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）と同等の結合強度を示した。対照的に、ＡＶＰＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）はＢＩＲ３と弱く結合しただけであった。
【００３８】
要約すると、ここに示したアッセイはＸＩＡＰのＢＩＲ３ドメインに結合できる化合物を同定する上で、効果的であることが証明された。天然のＳｍａｃテトラペプチドよりも結合力の高い、特定のテトラペプチドが同定された。これらのテトラペプチドは、細胞増殖が関与している疾患や病的状態の治療において、アポトーシスを促進させる治療薬として開発することができる。本アッセイは、さらにコンビナトリアル・ケミストリーや他の合理的なドラッグデザイン達成のための手段で作成された、多数の化合物の高処理能力スクリーニングに利用することができる。
【００３９】
これだけに限るものではないが、以下に例を示し、本発明をさらに詳細に説明する。この例には、上述のデータを再提示し、補足するデータが含まれている。この例では、Ｎ−メチル類似体や２置換テトラペプチドＡＲＰＦなど、別のテトラペプチド類似体についても説明する。
【００４０】
例１
天然の結合パートナーを模倣した小分子に基づくアポトーシス蛋白抑制因子の分子ターゲティング
この例では、ＸＩＡＰのＢＩＲ３部分の表面ポケットに対するＳｍａｃのＮ末端をモデルとしたテトラペプチドライブラリの結合を検討するため、蛍光アッセイを用いた。この結果から、相互作用の総結合エネルギーに対する各テトラペプチド残基の寄与分を解析することが可能である。
【００４１】
材料と方法
材料。特に明記しない限り、材料はＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）あるいはＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）から購入し、それ以上精製せずに用いた。メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）固相ペプチド合成樹脂、Ｒｉｎｋアミド樹脂、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）で保護したアミノ酸は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ＫＹ）およびＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手した。６−ブロモアセチル−２−ジメチルアミノナフタレン（ｂａｄａｎ）色素はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）から入手した。
【００４２】
ＡＶＰＣ−ｂａｄａｎの合成。このペプチドはＭＢＨＡ樹脂に関するＦｍｏｃのプロトコルにより合成した。このプロトコルでは固相支持体との結合が酸性および塩基性条件下で安定である必要があるため、ＭＢＨＡ樹脂を選択した。Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＮＨ２（ＡＶＰＣ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）ペプチドは、システインのチオールを保護するトリチル基を用いて合成した。トリフルルオロ酢酸（ＴＦＡ）を処理してトリチル基を除去し、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）存在下でシステインをｂａｄａｎ誘導体とした。アラニンのＦｍｏｃ基をピペリジンで除去し、スカベンジャーとして１０％ｖ／ｖアニソールを含む無水ＨＦを処理し、０℃、４５分間で樹脂の開裂を行った。標識ペプチドは、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８分離用カラムを用い、溶媒Ａ（９９％Ｈ２Ｏ；１％ＣＨ３ＣＮ；０．１％ＴＦＡ）と溶媒Ｂ（９０％ＣＨ３ＣＮ；１０％Ｈ２Ｏ；０．１％ＴＦＡ）の濃度を変化させて溶出することでＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥させてからＨ２Ｏに再溶解した。
【００４３】
Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチル−アミノ酸の合成。Ｎ−メチル−アミノ酸はＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒらの方法に従って合成した（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４８：７７−８１，１９８３）。Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチル−イソロイシンおよびＮ−Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチルフェニルアラニンのシリカゲルクロマトグラフィーを行い（溶出液は５％メタノール／クロロホルムとした）、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチル−バリンはそれ以上精製せずに用いた。
【００４４】
テトラペプチドライブラリの合成。１位のライブラリとＡ（Ｎ−Ｍｅ）ＶＰＩを除き、Ｒｉｎｋアミド樹脂を用いるＦｍｏｃプロトコルにより、すべてのライブラリ分子をＡｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  ３９６  ＭＰＳの自動ペプチド合成機で合成した（Ｃｈａｎ  &  Ｗｈｉｔｅ  （２０００）  Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ）。ＡＶＰＸ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＡＸＰＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）ライブラリについては、Ｘ部分を２０種類すべての天然アミノ酸で置換した。副反応を受けやすいアミノ酸の側鎖は以下のように保護した。つまり、システイン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミンはトリチル基で保護し、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、チロシンはｔ−ブチル基で保護し、リジン、トリプトファンはＢｏｃ基で保護し、ペンタメチルジヒドロベンゾフラン基を用いてアルギニンを保護した。アラニンを加えた後、１ｍｌの９５％ＴＦＡ、２．５％の水、２．５％のトリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）溶液を各ウェルに加え、１時間振盪することで、脱保護と樹脂からのテトラペプチドの開裂を行った。この開裂溶液を回収し、さらに０．５ｍｌの開裂溶液を各ウェルに加え、もう１時間振盪した。開裂溶液を合わせて水２０ｍｌに加え、凍結乾燥し、５ｍｌの水に注いでから、シリンジフィルター（０．２μ）を通して再び凍結乾燥した。
【００４５】
１位のテトラペプチドとＡ（Ｎ−Ｍｅ）ＶＰＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）は、Ｒｉｎｋアミド樹脂を用いたＦｍｏｃプロトコルにより、ハンドシェーカーで合成した。開裂と後処理は上述の通り実施した。テトラペプチド分子のウムは質量スペクトルで確認した。
テトラペプチドを水に再溶解し、テトラペプチドが約２００ｍＭの試験溶液を作成した。外部基準として既知濃度のジオキサン溶液を用い、１Ｈ−ＮＭＲにより１０種類の代表試験溶液の正確な濃度を決定した。他の試験溶液の濃度は、同一のライブラリ合成で得られた既知溶液の平均値として求めた。
【００４６】
ＢＩＲ３の発現と精製。組換えＸＩＡＰ−ＢＩＲ３（２３８−３５８残基）は、ｐＧＥＸ−２Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりＧＳＴ融合蛋白質として過剰に発現した。Ｅ．  ｃｏｌｉ溶菌液中のＧＳＴ−ＢＩＲ３の可溶性分画は、グルタチオンセファロースカラムで精製し、陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｍｏｎｏ−Ｑ、Ａｎｉｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でさらに精製した。融合蛋白質はトロンビンで開裂し、ＧＳＴ蛋白質をグルタチオンセファロースカラムで除去した。ＢＩＲ３蛋白質はさらにゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ３０、Ａｒｎｅｒｓｈａｒｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で精製した。
【００４７】
蛍光実験。発光スペクトルはＰｈｏｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．の蛍光光度計により、Ｘｅアークランプ、ＰＭＴ検出器を用いて記録した。すべての溶液の吸光度は、励起波長（３８７ｎｍ）で０．２未満であった。すべての蛍光実験で用いた緩衝液は、リン酸カリウム５０ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ、１，４−ジチオ−ＤＬ−トレイトール（ＤＴＴ）２ｍＭ、ｐＨ７であった。
【００４８】
ＢＩＲ３に対するＡＶＰＣ−ｂａｄａｎの結合定数決定。２μＭのＡＶＰＣ−ｂａｄａｎ原液２ｍｌ（上述と同一の緩衝液）を、ＢＩＲ３の原液により１５μＬ間隔で０μＭから１０μＭまで滴定した。ＡＶＰＣ−ｂａｄａｎとＢＩＲ３の解離定数は、毎回ＢＩＲ３を加えた後、４７０ｎｍで観察された強度により決定した。
【００４９】
テトラペプチドライブラリのアッセイ。色素がプラスチックに吸着しないように、ガラス管で内側を覆った９６ウェルプレートにサンプルを調整した。測定までの間、プレートは氷上、暗所に保存した。光路長２ｍｍの少量用キュベットを用い、発光スペクトルを収集した。４４μＭのＡＶＰＣ−ｂａｄａｎ水溶液２．５ｍｌ、６３μＭのＢＩＲ３溶液１．７５ｍｌ、緩衝液１５．２５ｍｌを混合し、ＡＶＰＣ−ｂａｄａｎおよびＢＩＲ３がいずれも５．６μＭの原液を調整した。この原液３９０μＬを９６ウェルプレートの５０ウェルに加えた。試験テトラペプチド溶液５０μＬを加えて混合し、すぐに発光スペクトルを測定した。最終的な溶液は、ｂａｄａｎとＢＩＲ３が５μＭ、テトラペプチド溶液が２０−３０μＭとなった。対照として水５０μＬを３ウェルに加え、ＡＶＰＣ−ｂａｄａｎがＢＩＲ３に結合したときに観察される強度を決定した。１９０μＬのＡＶＰＣ−ｂａｄａｎと１０２０μＬの緩衝液を混合し、３９０μＬずつ３ウェルに加えた。これも対照として、５０μＬの水をこの３ウェルに加え、結合していない色素の強度を決定した。４７０ｎｍで観察された試験溶液の強度と対照実験で得られた平均値とを関連付け、平衡定数を決定した。
【００５０】
結果
蛍光を測定する競合アッセイにより、ＸＩＡＰのＢＩＲ３ドメインに対する様々なテトラペプチド類似体の結合を決定した。このアッセイは、環境の変化に感受性の高い蛍光色素分子ｂａｄａｎを基盤としている。ｂａｄａｎは、蛋白質結合の相互作用を探索するために、これまでにも環境変化に対する感受性が利用されてきた色素である。Ｓｍａｃの結合モチーフに基づくテトラペプチドＡｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＮＨ２（ＡＶＰＣ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）をｂａｄａｎの誘導体とし、ＢＩＲ３との結合相互作用を生じさせた。ＡＶＰＣ−ｂａｄａｎがＢＩＲ３表面の溝に結合すると、色素の環境が水から蛋白質内部の疎水性環境に変化し、蛍光最大値と強度が大きくシフトする。蛍光滴定により決定されたＡＶＰＣ−ｂａｄａｎ／ＢＩＲ３複合体のＫＤ値は、０．３１±０．０４μＭである。ＡＶＰＣ−ｂａｄａｎは、すべての競合分子によって蛋白質の結合ポケットから置換されうる。色素が試験分子によって結合ポケットから置換されると、発光が再び水中のスペクトルにシフトする。従って、観察された色素の発光強度は、試験分子によるＡＶＰＣ−ｂａｄａｎの置換の程度と関連させることができる。このため、最も有望な阻害剤を迅速に決定することができ、効果的な阻害剤の構造情報を次の検討で薬物候補のデザインに取り込むことができる。
【００５１】
開始点としてＳｍａｃの４つのＮ末端残基を用い、６種類の関連テトラペプチドライブラリを合成し（スキーム１）、ＢＩＲ３表面のペプチド結合溝からＡＶＰＣ−ｂａｄａｎを置換する能力を評価した。各アミノ酸がＳｍａｃのＢＩＲ３への結合に寄与する程度をｄｅｃｏｎｖｏｌｖｅ（逆畳み込み）するため、テトラペプチドライブラリをデザインした。１位のライブラリは３ペプチドのみで、ＢＩＲ３による結合要素の認識にＡｌａ１が果たしている重要な役割を反映している。３位の役割は、３位にプロリンがない数少ない天然の結合部分の１つである、ＲｅａｐｅｒのＮ末端配列を基本としたテトラペプチドにより検討した（表３）。２位と４位のライブラリは、２０種類の天然アミノ酸すべてを用いて合成した。テトラペプチドＡＲＰＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）は、２つの部位を同時に修飾することで効果が加わる可能性を検討するために合成した。
【００５２】
このテトラペプチドには蛋白分解を受けやすい結合が２箇所あり、１位、２位間のペプチド結合と３位、４位間のペプチド結合である。これらの結合が蛋白分解を受けにくくする方法の１つは、アミドの水素をメチル基に置換することである。Ｎ−メチルアミノ酸を用いていくつかのテトラペプチド相同体を合成し、そのような修飾がＢＩＲ３に対する化合物の親和性に与える影響を検討した。
【００５３】
ライブラリの化合物の解離定数（ＫＤ）を表４に掲載する。テトラペプチド類似体は、様々な程度でＢＩＲ３からｂａｄａｎを置換している（表４、図６Ａ）。
ＫＤ値は０．０２μＭから１００μＭ以上と幅があった。様々な蛋白結合分子で観察された結合モチーフの配列が保存されていることから、ある程度自然に適切な配列に最適化されていることが示されるが、本アッセイで検討した様々なテトラペプチドにより、全体の結合相互作用に対する各部位に特定の寄与が検討される。
【００５４】
【化１】
2004531731.tif 000005
【００５５】
【表３】
2004531731.tif 000006
【００５６】
【表４】
2004531731.tif 000007
【００５７】
考察
第１残基
これまでの研究では、ＳｍａｃのＮ−末端アミノ酸に変異が生じると、ＳｍａｃとＢＩＲ３の結合相互作用が完全に消失すると指摘されていた。ＳｍａｃとＢＩＲ３表面の溝との認識は、８箇所の分子間水素結合とファンデルワールス力の組み合わせに基づいている。Ｎ−末端アラニンが必要であることは、結晶構造から明らかである。Ａｌａ１はＢＩＲ３表面の溝で近くの残基に３つの水素結合を提供し、そのカルボニル基がさらに２箇所と接触している。Ａｌａ１のメチル基は疎水性ポケットにしっかりとはまり、このポケットに立体障害が生じるか、これらの重要な水素結合が妨げられることを避けるため、このアラニン残基の修飾は慎重にデザインする必要がある。結合ポケットでは、次の３残基がＡｌａ１の位置決定に貢献しているが、これらの残基が同一であることはＡｌａ１ほど重要でないように思われる。
【００５８】
１位のライブラリの分子は、いかに結合相互作用がこの位置の修飾に左右されやすいかを証明している。事前の報告と一致し、ＧＶＰＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）では結合が大きく低下し、ＳＶＰＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）でも結合力がなくなったが、天然アミノ酸のアミノイソ酪酸（Ａｂｕ）でわずかに結合力の向上が見られた。
【００５９】
第３残基
ＡＶＡＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）では、他の天然類似体、ＡＶＰＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ＡＶＰＩＡＱＫＳＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）で観察された値と同様の結合親和性が認められる。しかし、２位のライブラリのＡＶＰＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）テトラペプチドで認められる要因と関連し、１０の倍数以上にこの親和性が低下している。これまでの研究でも、プロリンをアラニンに置換すると、結合親和性が低下することが認められた。この観察と３位の天然結合分子が比較的均一であることに基づき（表３）、プロリンを置換すると試験テトラペプチドの結合親和性が低下すると考えられる。
【００６０】
第２残基
前述の通り、自然ではすでにある程度適切な配列に最適化されている。しかし、２位のライブラリではやや驚くべき結果が得られている。天然配列のＡＶＰＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）に関連したＡＲＰＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）やＡＨＰＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）などのテトラペプチドの親和性が高いことは、２位における正の荷電がペプチドの結合親和性を向上させることを示しているように思われる。これは、ＢＩＲ３の結合ポケットを裏打ちしている残基が負に荷電していることを考えると、予想外の結果ではない。それにもかかわらず、表３に示しているＩＡＰの天然結合分子に、２位の残基が正に荷電しているものはない。これまで認められた天然のＩＡＰと相互作用するモチーフは、すべて２位にバリン、トレオニン、イソロイシンなどのβ位（ｂｒａｎｃｈｅｄ）で枝分かれしたアミノ酸を含んである（表３）。この結果から、天然の配列を改良し、次の段階で考えられる結合分子の構造デザインの基本とすることができることが示される。
【００６１】
第４残基
ＢＩＲ３に結合したＳｍａｃのＸ線構造から、第４残基には分子間水素結合がなく、結合モチーフの４残基の中では、第４残基が最も立体的に混み合っていないことが示される。このため、４位は最も修飾に左右されにくいと考えられる。実際に、ＡＶＰＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）テトラペプチド（表４）で見られるＫＤはＡＶＰＣ−ｂａｄａｎよりも大きく、結合が色素の存在でわずかに強化されることが示される。しかし、２位のライブラリよりも４位のライブラリでＫＤの幅がはるかに大きいことが分かる。この位置を修飾すると観察される結合親和性が最も高くなる可能性があるが、結合の相互作用を本質的に破壊してしまう可能性もある。
【００６２】
ＡＶＰＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）テトラペプチドは、群を抜いて最も強く結合するライブラリ分子であり、そのすぐ後をＡＶＰＷ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）が追っている。ＡＶＰＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）も天然類似体のＡＶＰＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）よりわずかに結合親和性が高いと判定された。これらの結果は、４位のアミノ酸に芳香族側鎖があると、ＢＩＲ３に対するテトラペプチドの結合親和性が大幅に上昇することを示している。この結果は系統学的データと一致し、ＩＡＰと相互作用する他の蛋白質は、４位にフェニルアラニンあるいはチロシンがある（表３）。
【００６３】
ＡＲＰＦテトラペプチドを用いて２位および４位で高親和性となる置換を同時に検討した場合、この効果は相加的であることが分かった。結果として、Ｎ位をメチル化したテトラペプチドで見られる結合親和性に対する有害作用は、適切なアミノ酸を選択して親和性を向上させることで、いくらか相殺できる可能性がある。
【００６４】
Ｎ−メチル類似体
第１残基と第２残基間のペプチド結合をＮ−メチル化すると、構造によって決まる水素結合が乱され、対応して結合に大きな作用を示す。対照的に、第４残基のＮ−メチル化は効果がはるかに小さく、このアミドでは水素結合がないことを示す構造データと一致している。分子デザインの観点から、これにより重要なデザインの制約が取り除かれる。疎水性アミノ酸に対する側鎖のエネルギー負担を概算するため、エタノールから水への移動の自由エネルギーΔＧｔ（ＥｔＯＨ−Ｈ２Ｏ）を用いて、結合の自由エネルギーΔＧｂに対する側鎖の寄与を考察すると、明確に一般的傾向に従っている。図６Ｂに示されているとおり、疎水性の高いアミノ酸ははっきりとより強く結合している。この明確な関連性から特定の相互作用はほとんどないことが示されるが、完全に疎水性作用が理解されていないことも示している。例えば、ＷのΔＧｔはＦよりも大きいが、ＡＶＰＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）のΔＧｂはＡＶＰＷ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）よりも大きい。既知の構造に対して様々なペプチドをモデル化し、そのモデルで溶媒と接触する表面部位を決定することで、より詳細な分析結果が得られる可能性がある。
【００６５】
本発明は上記に説明、例示した実施例に限るものではなく、添付の請求項の範囲で変更、修正できるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、ＡＶＰＣ−ｂａｄａｎ色素の化学構造を示している。
【図２】図２は、ＡＶＰＣ−ｂａｄａｎの吸収、発光特性を示している。図２Ａは、分子水溶液の吸収（実線）、発光（波線）スペクトルを示している。図２Ｂは、発光スペクトルについて、アセトニトリル（ＡＣＮ）中でのＡＶＰＣ−ｂａｄａｎのｓｏｌｖａｔｏｃｈｒｏｍｉｃｉｔｙを示している。
【図３】図３は、様々な濃度のＢＩＲ３存在下でＡＶＰＣ−ｂａｄａｎの発光スペクトルを示している。５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．１、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、５．１μＭのｂａｄａｎ色素、励起波長＝３８７ｎｍとして測定した。
【図４】図４は、本文で述べた結合アッセイのサンプルについて、発光スペクトルを示している。表２に結果が示してある。すべてのサンプルは、色素、蛋白質とも５μＭであり、テトラペプチドは５０ｍＭである。緩衝液は５０ｍＭトリス、ｐＨ７．１、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴとした。ここに示したＡＶＰＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）テトラペプチドは、他のサンプルとは別に合成した。
【図５】図５は、（Ａ）水中ＡＶＰＣ−ｂａｄａｎの吸収スペクトル（実線）と発光スペクトル（波線）（励起波長３８７ｍｎ）（これらのスペクトルは図２にも示している）、（Ｂ）ＢＩＲ３を用いたＡＶＰＣ−ｂａｄａｎの滴定を示している。遊離ＡＶＰＣ−ｂａｄａｎの分画は、観察された蛍光強度とすべての色素が結合していると想定される最大強度Ｉ∞の差を結合していない色素の強度とＩ∞の差に関連付けることで決定した。データは例１で考察する。
【図６】図６は、（Ａ）発光強度が小さい順にＡＶＰＣ−ｂａｄａｎ、ＢＩＲ３およびＡＶＰＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）存在下でのＡＶＰＣ−ｂａｄａｎ、ＢＩＲ３およびＡＲＰＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）存在下でのＡＶＰＣ−ｂａｄａｎ、ＢＩＲ３およびＡＶＰＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）存在下でのＡＶＰＣ−ｂａｄａｎ、ＢＩＲ３およびＧＶＰＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）存在下でのＡＶＰＣ−ｂａｄａｎ、ＢＩＲ３およびＡＧＰＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）存在下でのＡＶＰＣ−ｂａｄａｎ、ＢＩＲ３存在下でのＡＶＰＣ−ｂａｄａｎの発光スペクトル、（Ｂ）非極性アミノ酸について、ΔＧｔ（ＥｔＯＨ−Ｈ２Ｏ）で表される疎水性の相互作用（２３）とΔＧｂの相関関係を示している（極性アミノ酸はこのグラフに示していない）。データは例１で考察する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2004531731.tif 000071