(57)【要約】本発明は、ルシフェラーゼＬｕＡＬ、Ｌｕ１６４、Ｌｕ１６、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ５２およびＬｕ２２、そのヌクレオチド配列、アミノ酸配列、およびその活性および使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルシフェラーゼＬｕＡＬ、Ｌｕ１６４、Ｌｕ１６、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ５２またはＬｕ２２またはそれらの機能的等価物の配列を有する、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子。
【請求項２】
該配列がその５'側に位置する機能的プロモーターを含む、請求項１に記載の分子。
【請求項３】
組換えＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターの一成分である、請求項２に記載の分子。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターを有する生物。
【請求項５】
該ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列と同一または相補的な、１０個以上の連続したヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１に記載のヌクレオチド配列によってコードされるペプチド。
【請求項７】
Ｌｕ１６４、ＬｕＡＬまたはＬｕ２２に対する抗体によって免疫学的に認識される、５個以上の連続したアミノ酸を含む、ペプチド。
【請求項８】
請求項１から６までに記載したルシフェラーゼの、細胞系用レポータ遺伝子としての、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ルシフェラーゼＬｕＡＬ、Ｌｕ１６４、Ｌｕ１６、Ｌｕ３９、Ｌｕ４５、Ｌｕ５２およびＬｕ２２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列およびそれらの活性および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
「ルシフェラーゼ」
発光（ルミネッセンス）は励起されたエミッター分子が引き起こす可視スペクトル範囲内の光子放射に与えられる用語である。蛍光とは対照的に、発光のエネルギーは短波長照射の形で外部から供給されるものではない。
【０００３】
化学発光と生物発光とは明確に区別されている。化学発光は、励起分子を与える化学反応に与えられた用語であって、その励起分子自体では、励起水準にある電子が正常エネルギー水準に戻る時に光を放射する。生物発光は、この反応が酵素で触媒される時に使用される用語である。この反応に関与する酵素は、一般にルシフェラーゼと呼ばれる。
【０００４】
発光生物の総説は、Ｈａｓｔｉｎｇｓｅｔａｌ．１９９５にも記載がある。
【発明の開示】
【０００５】
ルシフェラーゼは、ペルオキシダーゼであるか、またはモノオキシゲナーゼおよびジオキシゲナーゼである。この酵素の基質は光放出産物のための出発物質を形成し、ルシフェリンと呼ばれる。その基質は種毎に異なっている。この系の量子収率は、変換される基質分子当り、０．１フォトンと０．９フォトンとの間にある（Ｉｄｅｌｇａｕｆｔｓ，１９９３）。
【０００６】
ルシフェラーゼは、その起源またはその酵素的性質に基づいて分類できる。以下の表は、数型のルシフェラーゼについて全体像を示す。
【０００７】
表１  細菌ルシフェラーゼ
【表１】
2004516828.tif 000002
【０００８】
表２  セレンテラジン依存性真核生物ルシフェラーゼ
【表２】
2004516828.tif 000003
【０００９】
表３  セレンテラジン非依存性真核生物ルシフェラーゼ
【表３】
2004516828.tif 000004
【００１０】
ルシフェラーゼは、その基質特異性に基づいても相互に区別できる。最重要な基質には、セレンテラジン（Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．１９９９）およびルシフェリン、およびこれら二化合物の誘導体が含まれる。これら基質の図およびそのルシフェラーゼによる変換について以下に記載する。
【００１１】
「ルシフェラーゼ基質」
数種のルシフェラーゼ基質およびその変換については下記の実施例に記載する。本明細書に記載する基質は全て、光および二酸化炭素（ＣＯ２）の放出および酸素（Ｏ２）の消費を伴って、酵素的に変換される。補助因子またはエネルギー輸送体（たとえば、ホタル・ルシフェラーゼの場合のＡＴＰ）に対するこの反応の依存性は、酵素特異的である。
【００１２】
セレンテラジン
【化１】
2004516828.tif 000005
エクオリンによるセレンテラジンからセレンテラミドへの変換であって、波長４７０ｎｍの光放射を伴う。
【００１３】
【化２】
2004516828.tif 000006
ホタル・ルシフェラーゼによるルシフェリンからオキシルシフェリンへの変換であって、波長５６０ｎｍの光放射を伴う。
【００１４】
【化３】
2004516828.tif 000007
ウミホタル・ルシフェリンからウミホタル・オキシルシフェリンへのウミホタル・ルシフェラーゼによる変換であって、波長４６０ｎｍの光放射を伴う。
【００１５】
「レポータシステム」
レポータ遺伝子または標識遺伝子は、ある遺伝子の遺伝子産物が単純な生化学的または組織化学的方法を使用すれば、容易に検出できるような遺伝子に、一般的に与えられる用語である。レポータ遺伝子には、少なくとも二つの型が認められている。
１）耐性遺伝子：耐性遺伝子は、その発現が抗生物質、その他、耐性遺伝子が存在しなければ細胞死を起こす物質の培養培地中における存在に対する耐性を細胞に与える遺伝子を示す用語である。
２）レポータ遺伝子：組換えＤＮＡ技術では、レポータ遺伝子の産物は融合標識または非融合標識として使用される。最も通常のレポータ遺伝子には、ベータガラクトシダーゼ（Ａｌａｍｅｔａｌ．１９９０）、アルカリフォスファターゼ（Ｙａｎｇｅｔａｌ．１９９７；Ｃｕｌｌｅｎｅｔａｌ．１９９２）、ルシフェラーゼおよびその他のフォトプロテイン（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ，１９８５；ＰｈｉｌｉｐｓＧＮ，１９９７；Ｓｎｏｗｄｏｗｎｅｅｔａｌ．１９８４）が含まれる。
【００１６】
「Ｍｅｔｒｉｄｉａｌｏｎｇａ種の分類」
節足動物門→→甲殻綱→→櫂脚類
Ｍｅｔｒｉｄｉａｌｏｎｇａ種は甲殻綱、特に櫂脚類または動物プランクトンに属する。
【００１７】
「ｃＤＮＡの単離」
Ｍｅｔｒｉｄｉａｌｏｎｇａ種の生物発光活性を研究するため、白海で標本を採集し（カルテシュ（Ｋａｒｔｅｓｈ）生物学研究所、ロシア）、液体窒素中に保存した。ＭｅｔｒｉｄｉａｌｏｎｇａのｃＤＮＡライブラリーを調製するため、イソチオシアネートを用いるＫｒｉｅｇ（Ｋｒｉｅｇｅｔａｌ．１９９６）の方法により、ＲＮＡを単離した。
【００１８】
ｃＤＮＡは、ＲＴ−ＰＣＴ法で調製した。そのために、ＲＮＡ１０μｇと逆転写酵素（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＧｏｌｄＩＩ）とを次の方式でインキュベーションした。
【００１９】
2004516828.tif 000008
【００２０】
ポリメラーゼを不活化するため、反応産物とプロテイナーゼＫとを、３７℃で３０分間インキュベーションし、ｃＤＮＡをエタノールで沈降させた。ｃＤＮＡを水に溶解し、ＳｆｉＩとともに３７℃で１時間インキュベーションした。反応産物をゲル濾過に付して、小さな断片を分離除去した。次にこの分画したｃＤＮＡをＳｆｉＩ断片と脱リン酸化λＴｒｉｐｌＥｘ２ベクターとに結合した。λファージの発現ライブラリーを調製するために、次にｉｎｖｉｔｒｏパッケージングシステムにＳＭＡＲＴ・ｃＤＮＡライブラリー組立てキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、クローニングしたｃＤＮＡ断片をλファージにパッケージした。
【００２１】
セレンテラジン依存性ルシフェラーゼを発現する可能性のあるｃＤＮＡ挿入体を含む組換えファージは、ライブラリースクリーニングを行うことによって確認した。
【００２２】
そのために、Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ１―Ｂｌｕｅを含む菌叢を９０ｍｍ培養皿に塗布し、３７℃で１０時間インキュベーションした。これを、培養皿当り２５００ファージに感染させ、続いてこれを８時間３７℃でインキュベーションして、プラークを形成させた。続いて培養皿を４℃に１時間放置して軟い寒天を固化させた。
【００２３】
レプリカ平板培養を行うために、ニトロセルロース膜をＥ．ｃｏｌｉＸＬ１―Ｂｌｕｅ懸濁液で飽和した後、乾燥した。乾燥した膜をファージプラークに６０秒間載せた後、新しい寒天プレート上に載せた。続いて、この寒天プレートを３７℃で２時間インキュベーションし、ＳＯＢ培地（＋１０ｍＭ−ＭｇＳＯ４、０．２％マルトース）を４ｍｌ添加した。この菌叢を脱着し、ＬＢ培地（＋２０ｍｍ−ＩＰＴＧ）に再懸濁し、３７℃で１時間インキュベーションした。細菌を遠心分離で収集し、超音波で破砕し、セレンテラジンを添加した後に、光度計で生物発光活性を測定した。
【００２４】
陽性の生物発光シグナルを示す培養プレートをセクターに分け、新たなレプリカ培養を行った。レプリカ培養は、個々の活性なプラークが確認されるまで続行した。陽性プラーク内にあるファージに、ｃＤＮＡ挿入物をサブクローニングするために［ｌａｃｕｎａ］、Ｅ．ｃｏｌｉＢＭ２５．８株内のｐＴｒｉｐｌＥｘ２ベクターにＳＭＡＲＴ・ｃＤＮＡライブラリー組立てキットを製造社の指示書に従って使用してサブクローニングを行った。このｐＴｒｉｐｌＥｘ２・ｃＤＮＡをトランスフェクトしたＥ．ｃｏｌｉを１００μｇ／ｍｌ濃度のアンピシリンを含有するＬＢ培地中、一夜３７℃でインキュベーションした。オーバーエクスプレッションを達成するために、一夜培養物をＬＢ培地で１：１５０に希釈し、３７℃で１時間インキュベーションした。次に、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を最終濃度２０ｍＭになるように加えることによって、インダクションを行った。誘導された培養物を３７℃で１時間インキュベーションし、細菌を遠心分離によって収集した。この細胞をＳＭ緩衝液０．５ｍｌ中、超音波で破砕した。セレンテラジン（１０−４Ｍ、メタノール）１０μＬを添加した後に光度計で化学発光を測定した。
【００２５】
セレンテラジン依存性ルシフェラーゼ活性を示すルシフェラーゼ３種を確認した。このルシフェラーゼをそれぞれＬｕ１６４、ＬｕＡＬ、Ｌｕ２２と命名した。これらルシフェラーゼについては、以下に詳記する。
【００２６】
本発明は、このルシフェラーゼ３種の機能的等価物も包含する。機能的等価物とは、類似の基質スペクトルを持ち、分泌され、さらに少なくとも７０％の相同性があるルシフェラーゼである。８０％または９０％の相同性は、好適である。９５％の相同性は殊に好適である。
【００２７】
このルシフェラーゼは、細胞系、特に受容体、イオンチャネル、トランスポータ、転写因子または誘導系のためのレポータ遺伝子としての使用に適する。
【００２８】
このルシフェラーゼは、例えば力価測定のために、または生化学系、特にプロテイナーゼのための基質として、細菌系内で使用できる。
【００２９】
このルシフェラーゼは、たとえば、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学またはウェスタンブロッティングのために、抗体、その他のタンパク質に結合したレポータ酵素としても使用できる。
【００３０】
このルシフェラーゼは、ＢＲＥＴ系（生物発光共鳴エネルギー遷移系）の中でも使用できる。
【００３１】
このルシフェラーゼは、共焦点顕微鏡術のための、またはタンパク質−タンパク質相互作用の分析のための、融合タンパク質としての使用にも適している。
【００３２】
このルシフェラーゼは、たとえばＥＬＩＳＡまたは固定などのために、ビオチン、ＮＨＳ、ＢｒＣＮまたはその他の結合メディエータと結合したレポータ酵素としても使用できる。
【００３３】
このルシフェラーゼは、さらに、たとえばノーザンおよびサザンブロッティングまたは実時間ＰＣＲなどのために、ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドと結合したレポータ酵素としても使用できる。
【００３４】
本発明はまた、野生型としてまたはタグタンパク質としての本ルシフェラーゼの精製に関し、さらに生体内翻訳系内におけるルシフェラーゼの使用に関する。
【００３５】
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列
ＬｕＡＬ
ルシフェラーゼＬｕＡＬは、分子量２３．７ｋＤａ、等電点８．３２を有するタンパク質である。このコード化ヌクレオチド配列は以下のとおり：
【表４】
2004516828.tif 000009
であり、これから次表のアミノ酸配列：
【表５】
2004516828.tif 000010
、および次表のアミノ酸組成：
【表６】
2004516828.tif 000011
が導かれる。
【００３６】
Ｌｕ１６４
ルシフェラーゼＬｕ１６４は、分子量２３．８ｋＤａ、等電点７．８１を有するタンパク質である。このコード化ヌクレオチド配列は次のとおり：
【表７】
2004516828.tif 000012
であり、これから次表のアミノ酸配列：
【表８】
2004516828.tif 000013
、および次表のアミノ酸組成：
【表９】
2004516828.tif 000014
が導かれる。
【００３７】
Ｌｕ２２
ルシフェラーゼＬｕ２２は、分子量２０．２ｋＤａ、等電点７．８９を有するタンパク質である。このコード化ヌクレオチド配列は次のとおり：
【表１０】
2004516828.tif 000015
であり、これから次表のアミノ酸配列：
【表１１】
2004516828.tif 000016
、および次表のアミノ酸組成：
【表１２】
2004516828.tif 000017
が導かれる。
【００３８】
これらの配列は配列表にも記載する。
【００３９】
ルシフェラーゼの酵素活性および生化学的特性
タンパク質ＬｕＡＬ、Ｌｕ１６４およびＬｕ２２は酵素であって、セレンテラジンを変換する時に光を放射する。それ故、いずれもルシフェラーゼ群に属する。ルシフェラーゼは、細菌および真核生物細胞の双方において有効に発現させることができる。真核生物細胞にて発現させるルシフェラーゼＬｕＡＬ、Ｌｕ１６４およびＬｕ２２は分泌される。細菌で発現すると、分泌は起きない。
【００４０】
ルシフェラーゼの活性は、温度依存的である。ルシフェラーゼＬｕＡＬおよびＬｕ１６４の至適温度は、各々２２℃（ＬｕＡＬ）、２７℃（Ｌｕ１６４）と測定されている。ルシフェラーゼＬｕ２２活性の至適温度は、４℃またはそれ以下である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
実施例
プラスミド／組立て物
以下に記載する組立て物を製造するために使用するベクターは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）とｐＴｒｉｐｌＥｘ２、およびベクターｐＡＳＭｐｌｒ（ｃＡＭＰ感受性プロモータエレメント：ｃｒｅを有する当社内組立て物）であった。このベクターの誘導体は、ｐｃＤＮＡ３−ｘ、ｐＴｒｉｐｌＥｘ２−ｘおよびｐＡＳＭ−ｘと命名した。
【００４２】
ＬｕＡＬ
図１は、ベクターｐＴｒｉｐｌＥｘ２−ＬｕＡＬ、ｐｃＤＮＡ３−ＬｕＡＬ、およびｐＡＳＭ−ＬｕＡＬのプラスミド地図を示す。
【００４３】
図２は、ベクターｐＴｒｉｐｌＥｘ２−Ｌｕ１６４、ｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４、およびｐＡＳＭ−Ｌｕ１６４のプラスミド地図を示す。
【００４４】
図３は、ベクターｐＴｒｉｐｌＥｘ２−Ｌｕ２２、ｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ２２、およびｐＡＳＭ−Ｌｕ２２のプラスミド地図を示す。
【００４５】
Ｌｕ１６４の基質としてのセレンテラジン誘導体
Ｌｕ１６４の基質を確認するために、各種セレンテラジン誘導体の１０μＬ溶液（１０−４Ｍ）を、各々ＣＨＯ−ｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４細胞系列からの上清液１０μＬとともに、インキュベーションし、発光を測定した。各セレンテラジンは、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社（米国）から購入した。
【００４６】
ルシフェラーゼＬｕＡＬおよびＬｕ２２の場合には、ルシフェラーゼＬｕ１６４と比較して相違点が見当らなかった。未修飾セレンテラジン（図Ｂ、セレンテラジンａ）が、Ｌｕ１６４、ＬｕＡＬおよびＬｕ２２のための至適基質であることが確認された。
【００４７】
図４は、Ｌｕ１６４の基質になる可能性があるセレンテラジン誘導体を示し、ここに、８．７ｋＶ、３０秒間光度計で測定した発光のグラフ（ＲＬＵ＝相対光度単位：ｒｅｌａｔｉｖｅｌｉｇｈｔｕｎｉｔ）とセレンテラジン誘導体の分子構造とを示す。
【００４８】
セレンテラジンに依存するルシフェラーゼＬｕ１６４、ＬｕＡＬ、およびＬｕ２２の酵素活性
細菌での発現
細菌発現は、この細菌を発現プラスミドｐＴｒｉｐｌＥｘ２−Ｌｕ１６４、ｐＴｒｉｐｌＥｘ２−ＬｕＡＬ、およびｐＴｒｉｐｌＥｘ２−Ｌｕ２２で形質転換した結果として、Ｅ．ｃｏｌｉのＢＬ２１（ＤＥ３）株内で行った。形質転換した細菌をＬＢ培地中、３７℃で３時間インキュベーションし、１ｍＭ最終濃度になるようにＩＰＴＧを加えて４時間、発現を誘導した。誘導された細菌を、遠心分離で収集し、ＰＢＳに再懸濁し、超音波で破砕した。セレンテラジン（１０−４Ｍ、メタノール）、またはルシフェリン（ホタル・ルシフェリン）を溶解液５μＬ（５ｍｇ／ｍＬ）に加え、化学発光を測定した。
【００４９】
測定は、ＲＬＵ（相対光度単位）によって９．５ｋＶ、３０秒間行った。Ｌｕ１６４、ＬｕＡＬ、Ｌｕ２２の各々の場合に、ＲＬＵの測定値２３００００、３２００００および２６００００が得られた。これら酵素を、各ベクターｐＴｒｉｐｌＥｘ２−Ｌｕ１６４、ｐＴｒｉｐｌＥｘ２−ＬｕＡＬおよびｐＴｒｉｐｌＥｘ２−Ｌｕ２２を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉのＢＬ２１（ＤＥ３）株内で発現した。
【００５０】
真核生物での発現
構成的真核生物発現は、一過性の実験で発現プラスミドｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４、ｐｃＤＮＡ３−ＬｕＡＬおよびｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ２２で細胞を形質転換することによってＣＨＯ細胞内で行った。そのために、９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中の細胞１００００個を塗布し、３７℃で一夜インキュベーションした。このトランスフェクションは、製造社の指示書に従い、Ｆｕｇｅｎｅ６キット（Ｒｏｃｈｅ社）を使用して行った。遺伝子移入を受けた細胞をＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中、３７℃で一夜インキュベーションした。セレンテラジン（１０−４Ｍ、メタノール）添加後、培地（５μＬ）と細胞溶解液（５μＬ）の化学発光を室温、９．５ｋＶ、３０秒間光度計で測定した。
【００５１】
Ｌｕ１６４、ＬｕＡＬおよびＬｕ２２の場合に、各々測定値６８００００、６７００００及び５１００００ＲＬＵ（相対光度単位）の値が得られた。発現は、ベクターｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４、ｐｃＤＮＡ３−ＬｕＡＬおよびｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ２２を使用してＣＨＯ細胞内で行った。
【００５２】
ルシフェラーゼＬｕ１６４、ＬｕＡＬおよびＬｕ２２の放射スペクトル
放射スペクトルを測定するために、Ｅ．ｃｏｌｉのＢＬ２１（ＤＥ３）株細胞をプラスミドｐＴｒｉｐｌＥｘ２−Ｌｕ１６４、ｐＴｒｉｐｌＥｘ２−ＬｕＡＬおよびｐＴｒｉｐｌＥｘ２−Ｌｕ２２で形質転換し、前記３．１に記載のようにしてオーバーエクスプレッションした。細菌溶解液１００μＬ容にセレンテラジン（１０−４Ｍ；５０μＬ）を添加し、放射スペクトルを測定した。各ルシフェラーゼが発する放射スペクトルのグラフを以下に記載する。
【００５３】
ルシフェラーゼＬｕ１６４、ＬｕＡＬおよびＬｕ２２の場合には、基質の形質転換に起因する最大放射は、波長約４９０ｎｍに起きた。
【００５４】
図５は、細菌発現後に観察されるルシフェラーゼＬｕ１６４（Ａ）、ＬｕＡＬ（Ｂ）、およびＬｕ２２（Ｃ）の放射スペクトル（ＲＬＵ＝相対光度単位）を示す。
【００５５】
Ｌｕ１６４およびＬｕＡＬを例としての、ＣＨＯ細胞からのルシフェラーゼＬｕ１６４、ＬｕＡＬおよびＬｕ２２の分泌
真核生物細胞内でのルシフェラーゼＬｕ１６４、ＬｕＡＬおよびＬｕ２２の発現を特徴付けるために、ＣＨＯ細胞にプラスミドｐｃＤＮＡ３−ＬｕＡＬ、ｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４およびｐｃＤＮＡ３−Ｆｉｒｅｌｕｃ、およびｐｃＤＮＡ３．１（＋）を安定的に遺伝子移入した。得られたクローンは、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中で培養した。ホタル・ルシフェラーゼは、非分泌性ルシフェラーゼの陽性対照として使用した。プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）は、ＣＨＯ親細胞の内因性活性があれば検出するための対照プラスミドとして使用した。
【００５６】
ルシフェラーゼの分泌を検出するために、３８４穴マイクロタイタープレートに細胞２０００個を塗布した。２４時間後、培地を去り、細胞をＴｙｒｏｄｅ溶液で洗浄し、新鮮培地３０μＬを加えた。ホタル・ルシフェラーゼの場合には、セレンテラジン（１０−４Ｍ）またはルシフェリンの５μＬを加えた後、最初の測定（０時間）は、光度計で９．５ｋＶ、３０秒間行った。それから１時間から５時間後に１時間から５時間の測定を行った。
【００５７】
図６は、培地中におけるルシフェラーゼ活性の時間依存的増加を示す。ホタル・ルシフェラーゼは分泌されなかった。各ルシフェラーゼＬｕＡＬ、Ｌｕ１６４およびＬｕ２２は分泌性のルシフェラーゼである。
【００５８】
図６は、ｐｃＤＮＡ３−ＬｕＡＬ、ｐｃＤＮＡ３−Ｆｉｒｅｆｌｙ、ｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４またはｐｃＤＮＡ３（ｃＤＮＡ挿入のない対照ベクター）をＣＨＯ細胞に遺伝子移入した後のＣＨＯ細胞培地（５μＬ）内ルシフェラーゼ活性を示す。（ＲＬＵ＝相対光度単位；ｈ＝時間；Ｆｉｒｅｆｌｙ＝ホタル・ルシフェラーゼ）
【００５９】
ルシフェラーゼ活性の温度依存性
ルシフェラーゼＬｕ２２、Ｌｕ１６４およびＬｕＡＬの温度依存性を測定するために、ＣＨＯ細胞にベクターｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ２２、ｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４、ｐｃＤＮＡ３−ＬｕＡＬを一過性に遺伝子移入し、上清液のルシフェラーゼ活性を０℃と４７℃との間の温度で測定した。この測定のために、細胞上清液とセレンテラジン溶液とを５分間測定温度に順応させた。測定は光度計で９．５ｋＶ、３０秒間行った。
【００６０】
図７は、ルシフェラーゼＬｕＡＬ、Ｌｕ１６４およびＬｕ２２の場合に、温度に依存して発光が測定されることを示している。ルシフェラーゼ活性についての至適温度は、ＬｕＡＬでは２７℃である。Ｌｕ１６４およびＬｕ２２の場合は、至適温度はそれぞれ２２℃および４℃またはそれ以下であることが観測された。
【００６１】
図７は、ｐｃＤＮＡ３−ＬｕＡＬ、ｐｃＤＮＡ３−ＦｉｒｅｆｌｙおよびｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４を遺伝子移入した後のＣＨＯ細胞培地（５μＬ）内温度依存性ルシフェラーゼ活性を示す。（ＲＬＵ＝相対光度単位；培地＝ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋１０％ＦＣＳ）
【００６２】
ルシフェラーゼＬｕ１６４、ＬｕＡＬおよびＬｕ２２のＣＨＯ細胞内誘導的発現；ＬｕＡＬを例として
この実験では、ＣＨＯ細胞に、発現プラスミドｐＡＳＭ−ＬｕＡＬを一過性に遺伝子移入して真核生物での発現を誘導した。そのために、９６穴マイクロタイタープレートにウェル当りＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中の細胞１００００個を塗布し、一夜３７℃でインキュベーションした。遺伝子移入は、製造社の指示書に従ってＦｕｇｅｎｅ６キット（Ｒｏｃｈｅ社）を使用して行った。遺伝子移入した細胞は、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中、３７℃で一夜インキュベーションした。次に細胞をフォルスコリン（Ｆｏｒｋｏｌｉｎ；１０−５Ｍ）で５時間誘導した。次に、セレンテラジン（１０−４Ｍ、メタノール）を添加後、培地内および細胞溶解物内の化学発光を、９．５ｋＶ、３０秒間、光度計で測定した。
【００６３】
図８は、ＣＨＯ細胞内におけるＬｕＡＬの誘導性発現を示す。この発現は３７℃で５時間フォルスコリン（１０−５Ｍ）を用いて誘導した。この活性は、細胞上清液１０μＬ中で測定した（ＲＬＵ＝相対光度単位；誘導係数＝誘導ＲＬＵ対非誘導ＲＬＵの比率）。
【００６４】
受容体ＮＰＹ２および受容体Ａ２Ａおよびレポータ遺伝子にＬｕＡＬを使用するものを例としての、ルシフェラーゼＬｕ１６４、ＬｕＡＬおよびＬｕ２２の細胞系内レポータ遺伝子としての使用
細胞に基づく系でＧプロテイン共役受容体の活性化の受容体特異的リガンドによる分析を可能にするために、ルシフェラーゼＬｕＡＬのｃＤＮＡ配列を、発現ベクターｐＡＳＭｐｌｒにクローニングした。この発現ベクター、ｐＡＳＭｐｌｒは、ｃａｍｐ−感受性のプロモータエレメント（ＣＲＥ）を含み、ｃａｍｐの細胞内濃度を間接的に測定することを可能にする。この系では、ルシフェラーゼがレポータ遺伝子として役立っている。
【００６５】
細胞系において、ルシフェラーゼＬｕ２２、Ｌｕ１６４、およびＬｕ２２をレポータ遺伝子として用いることが、Ｇプロテイン共役受容体ＮＰＹ２（神経ペプチド受容体２）およびＡ２Ａ（アデノシン受容体２ａ）を例として、証明された。そのために、安定なクローンＣＨＯ−ｐＡＳＭ−ＬｕＡＬに、ベクターｐｃＤＮＡ３−ＮＰＹ２またはベクターｐｃＤＮＡ３−Ａ２Ａを一過性に遺伝子移入した。受容体ＮＰＹ２はＧｉ−共役受容体である一方で、Ａ２Ａ受容体はＧｓ−共役受容体である。
【００６６】
Ａ２Ａ受容体は、１μＭ−ＮＥＣＡを添加して４時間活性化した。ＮＰＹ２受容体は、１０−５Ｍフォルスコリンの存在下に１０μＭ−ＮＰＹ２ペプチドを加えることによって活性化した。ルシフェラーゼ活性は、セレンテラジン（１０−４Ｍ）添加後、前記培地（３０μＬ）中、光度計で９．５ｋＶ、３０秒間測定した。
【００６７】
図９は、細胞系のためのレポータ遺伝子としてのルシフェラーゼの使用を、Ｇプロテイン共役受容体であるＡ２ＡおよびＮＰＹ２を一例として示すものである。（ＲＬＵ＝相対光度単位）
【００６８】
【表１３】
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【００６９】
【表１４】
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【００７０】
【表１５】
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【００７１】
【表１６】
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【００７２】
【表１７】
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【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】ベクターｐＴｒｉｐｌＥｘ２−ＬｕＡＬ、ｐｃＤＮＡ３−ＬｕＡＬ、およびｐＡＳＭ−ＬｕＡＬのプラスミド地図を示す。
【図２】ベクターｐＴｒｉｐｌＥｘ２−Ｌｕ１６４、ｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４、およびｐＡＳＭ−Ｌｕ１６４のプラスミド地図を示す。
【図３】ベクターｐＴｒｉｐｌＥｘ２−Ｌｕ２２、ｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ２２、およびｐＡＳＭ−Ｌｕ２２のプラスミド地図を示す。
【図４】８．７ｋＶ、３０秒間光度計で測定した発光のグラフ（ＲＬＵ＝相対光度単位：ｒｅｌａｔｉｖｅｌｉｇｈｔｕｎｉｔ）とＬｕ１６４の基質になる可能性があるセレンテラジン誘導体の分子構造とを示す。
【図５】細菌発現後に観察されるルシフェラーゼＬｕ１６４（Ａ）、ＬｕＡＬ（Ｂ）、およびＬｕ２２（Ｃ）の放射スペクトル（ＲＬＵ＝相対光度単位）を示す。
【図６】ｐｃＤＮＡ３−ＬｕＡＬ、ｐｃＤＮＡ３−Ｆｉｒｅｆｌｙ、ｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４またはｐｃＤＮＡ３（ｃＤＮＡ挿入のない対照ベクター）をＣＨＯ細胞に遺伝子移入した後のＣＨＯ細胞培地（５μＬ）内ルシフェラーゼ活性を示す。
【図７】ｐｃＤＮＡ３−ＬｕＡＬ、ｐｃＤＮＡ３−ＦｉｒｅｆｌｙおよびｐｃＤＮＡ３−Ｌｕ１６４を遺伝子移入した後のＣＨＯ細胞培地（５μＬ）内温度依存性ルシフェラーゼ活性を示す。
【図８】ＣＨＯ細胞内におけるＬｕＡＬの誘導性発現を示す。３７℃にて５時間フォルスコリン（１０−５Ｍ）で細胞を誘導した。この活性は細胞上清液１０μＬ中で測定した（ＲＬＵ＝相対光度単位；誘導係数＝誘導ＲＬＵ対非誘導ＲＬＵの比率）。
【図９】Ｇプロテイン共役受容体であるＡ２ＡおよびＮＰＹ２を一例としての、細胞系のためのレポータ遺伝子としてのルシフェラーゼの使用を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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