(57)【要約】【課題】本発明は、新規な造血幹細胞及び血管内皮細胞増殖促進の機能を有する刺激因子に関する。即ち、ヒト血液血管細胞造成因子（HAPO）である。【解決手段】公知のアミノ酸配列に基づき、複数のプライマーを設計し、PCR法によって、多種の遺伝子断片が得られ、原核細胞で二重酵素切断部位における発現ベクターへクローニングし、89bp及び558bpの両断片をengineered bacteria中で発現させ、酵素により切断されて、31.8KD及び20.11KD分子量のHAPO（それぞれ292及び186アミノ酸）を得、精製後、ウサギに免疫し、特異的抗体が得られた。【選択図】図１
2004531239.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表で表されるいずれかのアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその活性化断片であることを特徴とするヒト血液血管細胞造成因子（HAPO）。
【請求項２】
ニッケルイオン・キレートクロマトグラフィー及び/又はヘパリン親和性クロマトグラフィーを含むことを特徴とするHAPOの精製法。
【請求項３】
以下のA〜Cのいずれかを含むことを特徴とするHAPOをコードするcDNA分子。
A  配列表で表されるいずれかの塩基配列の全塩基配列、
B  配列表で表される塩基配列の一部、または
C  塩基配列A又はBにハイブリダイズできる塩基配列
【請求項４】
以下の工程を含むことを特徴とするHAPOのcDNAクローニング方法。
1）HAPOにおけるアミノ酸配列に基づき、公知の遺伝子コードによって前記アミノ酸配列に対応する塩基配列を推定する工程
2）特異的プライマーを設計し、PCRによって増幅が行れる工程
3）特異的cDNA増幅産物をプローブとして、ヒトcDNAライブラリーよりHAPOのcDNAをスクリーニングする工程
【請求項５】
前記ヒトcDNAライブラリーが、ヒト胎児肝cDNAライブラリーであることを特徴とする請求項4に記載のクローニング方法。
【請求項６】
請求項3に記載のDNA分子を含むことを特徴とするHAPO発現用プライスミド。
【請求項７】
プライスミドが構築したpET32cから選ばれるものであることを特徴とする請求項6に記載のプラスミド。
【請求項８】
HAPO及び/又はその突然変異体を含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項９】
さらに、サイトカイン及び血球造成因子を含有することを特徴とする請求項8に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記サイトカイン及び血球造成因子が、幹細胞因子、インターロイキン3, 6及び11、赤血球造成因子、単球と顆粒細胞コロニー刺激因子及び血小板第4因子から選ばれる1種以上であることを特徴とする請求項9に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ポリサッカリッドを、さらに含有することを特徴とする請求項8乃至10項のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ポリサッカリッドがヘパリンであることを特徴とする請求項11に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
HAPO及び/又はその突然変異体を含有することを特徴とする、血液血管細胞増殖の探索又はHAPO受容体の探索用試薬。
【請求項１４】
抗HAPOモノクローナル抗体或いはポリクローナル抗体に対する抗原の作製において、前記抗原が、HAPO又はその突然変異タンパク質を含有することを特徴とする抗原の作製法。
【請求項１５】
請求項14に記載の方法により該抗原を用いて調製される抗体。
【請求項１６】
HAPO又はその突然変異体を含有することを特徴とする、血液血管細胞、内皮細胞、造血幹細胞の増殖用試薬。
【請求項１７】
HAPO、その突然変異体又は請求項8乃至11項のいずれかに記載の医薬組成物から選ばれる1種以上であることを特徴とする、血液血管細胞、内皮細胞、造血幹細胞の増殖や、血小板欠乏症及び/又は全血球減少症の治療用薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、造血幹/始原細胞及び血管内皮細胞増殖の促進を機能する新規な刺激因子に関する。即ち、ヒト血液血管細胞造成因子（hemangiopoietin、以下、単にHAPOと称する）である。具体的に、HAPO及びその変異体cDNAクローニング、原核細胞用発現、組み換えHAPOタンパク質の調製・精製、HAPOに対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の作製、in  vivo及びin  vitroなどでのHAPOの生物学的機能などに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの末梢血における血球の寿命が短く、骨髄における造血幹細胞が血球を増殖することによって補充されることは必要である。生体が、刺激に応答する状態において、例えば、感染の場合、活性化したT-細胞が各種サイトカインを分泌することによって血球の産生が行われる；酸素欠乏時、EPOを大量的に発現するため、末梢血における成熟血球の数量を迅速に増加する；造血細胞の増殖・分化について、サイトカインがその周囲の間質細胞の表面分子との刺激に依存するものである。造血細胞が、このような刺激を受けなければ、細胞増殖を中止し、細胞死亡を引き起こすことができる。20年前から、サイトカインが血球の制御機能を有することを、大量に見出し、それらのメカニズムを詳細に検討されているのは現状である。
【０００３】
血球は、赤血球、白血球、巨核球を三つに大別される。骨髄における多能性幹細胞（plulipotent stem cell）が、リンパ系幹細胞または骨髄系幹細胞（CFU-GEMM）に分化され、さらに刺激によりリンパ球、赤血球、顆粒球（好中球、好酸球、好塩基球）、マクロファージ、巨核球（血小板）に分化される。造血に関与するサイトカインとして、間質細胞、T-細胞、単球、マクロファージなどにより産生される。普通な造血について、間質細胞により産生されるが、刺激により造血する場合、刺激を受けたT-細胞により産生される。IL-3は、多能性造血幹細胞（pluripotential hemopoietic stem cell）及び前駆細胞（committed hemopoietic stem cell）の増殖に刺激を与えることができ、多能性幹細胞クローニング刺激因子と称される。GM-CSFは、顆粒球及びマクロファージに活性化する作用を有する以外、その他の始原細胞にも同様な刺激機能を持っている。ただし、EPOが赤血球、G-CSFが顆粒球、M-CSFが単球/マクロファージ及びIL-5が好酸球に刺激する機能を有する。最初に、TPOが巨核球系に対して増殖・分化の促進機能を有することを知られていたが、最近では、TPOは標的細胞として多く発見された。G-CSF、IL-6、IL-11、IL-12、白血病阻止因子（LIF）及び幹細胞因子（SCF）が造血幹細胞の増殖や自己更新に対して、非常に重要である。目前、その他の細胞因子の新発見について、血液学における課題とっている。
【０００４】
現代な生物医学では、胚胎生育期間において、血球と血管細胞は同一する祖先細胞から由来するものであると認識されている。すなわち、血液血管幹細胞（hemangioblast）がある。この細胞増殖を促進する因子は、血球と血管内皮細胞に二重の機能を有すべきであり、また胚胎生育早期におけるタンパク質である。本発明者らは、再生不良性貧血の患者より尿中から細胞増殖の促進に対する機能を有する因子(HAPO)を単離し、サイトカインのタイプを同定した。RT-PCR法によってmRNAのレベルでHAPO発現を検出した。結果として、HAPOがヒト胎児肝臓、胎児脾臓で発現できることを見出した。HAPOが胚胎生育時期におけるタンパク質であると推定される。本発明によれば、HAPOが血液幹細胞/始原細胞及び血管内皮細胞増殖促進の機能も有することを見出した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、再生不良性貧血の患者より血清及び尿中に由来する新規な細胞増殖促進の因子を提供することを目的とする。in vivo/in vitroで培養したマウス骨髄及びin vitroで培養したヒト血管内皮細胞及び骨髄細胞を解析した結果、該因子が、二重な造血幹細胞と血管内皮細胞増殖促進の機能を有し、生物学的機能の観点から考慮すれば、ヒト血液血管細胞造成因子（hemangiopoietin）（以下、HAPOと略称する）と名付けした。
【０００６】
本発明を別の目的は、公知のアミノ酸配列に基づいて、PCR増幅法及び突然変異法を用いて、HAPOポリペプチド様組成物の変異体をセットでクローニングし、原核細胞でHAPOの発現系統を樹立し、活性化した組み換えヒト型HAPOをスクリーニングし、それを製造するところにある。
本発明を他の目的は、HAPOの精製方法を確立するところにある。
本発明を他の目的は、HAPOに対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を作製するところにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の実施様態において、公知の塩基配列に基づいて、PCR増幅法によって複数のプライマー対を設計し、一連の遺伝子断片を得、これをBamHI及びHaindIII二重酵素切断部位で構築した原核細胞用発現ベクターpET32c（+）へクローニングし、所望の発現ベクターpET32c-HAPOsを構築した。そのうち、558bp及び879bpの両断片がBL21 engineering bacteriaへの融合形態で可溶性が効率的高い融合タンパク質を発現でき、また腸キナーゼの酵素切断によって外来アミノ酸を含有しないHAPOの精製タンパク質を得た。本発明のHAPO変異体及び組換え体について、HAPOにおけるアミノ酸配列ドメインを解析することによって、活性化した発現領域及び部位特異的/ランダム突然変異に対した若干のアミノ酸発現断片をスクリーニングし、高活性化したHAPOを得ることが期待されている。
【０００８】
本発明のHAPO精製は、例えば、イオン交換クロマトグラフィー（DEAEイオン交換クロマトグラフィー、SPイオン交換クロマトグラフィー）,アフィニティークロマトグラフィー及び濾過滅菌、濃縮、凍結乾燥など通常の方法によって行うことができる。
本発明の実施様態において、SDS-PAGEによる精製法を用いてウサギに4回免疫することによって、特異的抗ウサギrh-HAPOポリクローナル抗体を得ることに成功した。二重免疫拡散法により検出すると、希釈度が1：8である陽性が示される。Western Blotにつき解析し、該抗体が組み換えHAPOタンパク質を特異的識別できることが判明された。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、以下のようにいくつかの重要な働きを果たしている。
１）本発明は、HAPOの構造及びその機能を明らかにするため、クローニングによって得られたHAPO遺伝子断片に基づいて、HAPOのengineered bacteriaを構築し、組換えHAPO及びその変異体を調製する；
２）HAPO及びその変異体を血液血管造成因子とし、血球増殖の制御や血管新生のメカニズム解明に広く適用でき、またインビトにおける造血幹細胞、始原細胞などを大量に増殖するための重要な生物的試薬として有用である；
３）HAPOタンパク質或いはその活性化したポリペプチド又はその突然変異体が、例えば、造血因子（IL-3、SCF、EPO、TPO及びSCFなど）と相容的使用され、造血機能障害症を治療することができる；
４）HAPOが血管内皮細胞増殖促進に対する作用を有するため、HAPOを心臓血管疾患を治療する遺伝子治療剤として有用であることが期待されている；
５）HAPO及びその抗体が、HAPOの受容体を探す重要な手段とし有用であり、これが、従来受容体を検出する通常の方法によって行われる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１１】
〔実施例１〕pET-32c（+）ベクターの構築
HAPO遺伝子を発現させるため、pET-32c（+）ベクターの構築した。MscIとBamHIの制限部位の間でベクターに存在するチオレドキシン（Trx.Taq）を除去した後、得られたエンテロキナーゼ配列をトロンビン配列に構築し、発現された融合タンパク質をトロンビンによって切断し原始タンパク質が得られた。即ち、MscIとBamHIの制限部位の間で、下記の配列に置換された：
2004531239.tif 000003
構築したベクターは、後述する工程に使用される。
【００１２】
〔実施例２〕HAPO及びHAPOに対応する改変体cDNAの調製
HAPOに対応するcDNA配列に基づいてコンピュータにて解析することによってプライマー2対を設計し、PCR技術によって、異なるHAPOのcDAN断片をそれぞれ増幅し、クローニングに用られる制限酵素(restriction endonuclease)識別部位を含む558bpと876bpの両サイズ断片が得られた。上記PCR法によって得られたMPO断片（558bp）の上流のプライマーは5'-GCG  GTA  GGA TCC  GAT  GCC  ACC  TGC  AAC  TGT-3'であり、その下流のプライマーが5'-AGC  GTA  AAG CTT  CTA  ATC  AGA  ATT  AGG  TGG  AAG-3'である。得られたHAPO断片（879bp）の上流のプライマーは5'-GCG  GTA  GGA TCC  GAT  GCC  ACC  TGC  AAC  TGT-3'であり、その下流のプライマーが5'-CAG  GTA  AAG CTT  CTA  GGT  GGG  TGC  AGA  CTT  GAT-3'である。これらのプライマーの5'末端と3'末端には、それぞれBamHI及びHindIII酵素切断部位を導入する。保存したHAPOのcDNAを鋳型とし、ハイファイ（HIFI）のPfu  DNA  ポリメラーゼによって増幅される。PCR反応プログラムにて、最初に94℃で5分間反応させた後、94℃で45秒、65℃で1.5分、72℃で3分を1反応サイクルとして30サイクル繰り返し、最後は72℃で10分間反応させた。
【００１３】
〔実施例３〕発現ベクターの構築
モレキュラー・クローニングは、例えば、Molecular Cloning（A Laboratory Manual）（Sambrook T. et al., Cold Spring Harbor Laboratory（1989），New York）に記載の方法などに従って行うことができる。PCR産物及び構築したpET32cベクターは、それぞれBamHI/HindIIIで二重消化し、DE-81濾紙にて精製したバンドを回収する。常套手段に従って、挿入された断片とプラスミドベクターを連結反応し、連結物を形質転換する。BamHI/HindIIIで二重消化し、陽性クローンを同定すると共に、上海バイオエンジニアリング社へ送り、所望のクローニングを発現させた。アミノ酸配列により想定された31.8KDのHAPO（876bp）タンパクは、そのN末端に融合タンパク質（約17.4KD）を連結し、発現されたタンパク質は約58.2KDのタンパク質であると推定される。またアミノ酸配列により想定された20.1KDのHAPO（555bp）タンパク質は、そのN末端に融合タンパク質（約17.4KD）を連結し、発現されたタンパク質は約37.5KDのタンパク質であると推定される（図1）。
【００１４】
〔実施例４〕組換えタンパク質の発現及びSDS-PAGEによる同定
アンピシリン含有（3ml）のLB培地に単一陽性コロニーを接種し、37℃で一夜振った後、アンピシリン含有（3ml）のLB培地に30μl接種し、37μlで3時間振動して培養後、IPTGを最終濃度が1mmol/Lとなるように加えた。6時間保ち、培養液を1ml採取した。遠心して2×SDS緩衝液を50μl充填し、100℃で10分間沸騰した。5μlを取り、12％SDS-PAGEにより発現するタンパク質を検定し、コマシー・ブラィリント・ブルで染色した。レーザー・スキャニング・デンシトメーター（LKB社製、UltroScan XL）を用いて組換えタンパク質の発現レベルを定量した。組み込んだプラスミドが大腸菌内にpET-HAPOを発現させたことが判明された。558bp断片が39KDの融合タンパク質を発現させ、得られた目的タンパク質は培養液におけるタンパク質総量の30-35％の範囲にある。876bp断片が58KDの融合タンパク質を発現させ、得られた目的タンパク質はタンパク質総量の10％である（図2）。
【００１５】
可溶性組換えタンパク質の検定は以下のように行うことができる。誘発処理して培養液を100ml取り、7000r/min、10分間遠心して、上清を除去した。10mlの緩衝液1/10（V）（50mmol/L Tris-HCl、pH8.0、2mmol/EDTA）に懸濁し、例えばポロテアーセインヒビター（PMSF）を最終濃度が1μmol/Lとなるように加え、氷上に置いた。細胞を超音波処理して清澄するように破壊し、4℃で12000r/min、15分間遠心して、その上清は可溶性タンパク質であり、沈殿には不可溶な封入体が含まれている。さらにそれぞれサンプル培養液を300μl取り、12％のSDS-PAGEにて検定した結果、発現産物の可溶性タンパク質が95％以上であることが示された。
【００１６】
〔実施例５〕組換えヒトHAPOの調製及びその精製法
HAPO融合たんぱく質の調製
誘発により発現された後、細胞を超音波処理して破壊し、12000r/min、4℃で15分間遠心し、その後、例えば、ニッケルカラムに汚れることを防止するには、不純なタンパク質、脂質、糖質などを除去し、DEAE-陰イオン交換カラムにて粗単離が必要である。さらに組換えタンパク質はPharmacia社製のChelating Sepharose Fast Flowを行い、操作方法は取り扱い説明書に準じてニッケルカラムにおける平衡が用いられたクロマトグラフィーに掛けて、洗浄する。粗単離したサンプルをニッケルイオン・キレートクロマトグラフィーに掛けて、融合した目的タンパク質をカラムに結合させ、洗浄後、6倍カラム（体積）の120mMイミダゾール含有のTris-HCl緩衝液で溶出し、溶出液を緩衝液（5mM  Tris-HCl  pH7.8）で48時間透析した。タンパク質の濃度を測定し、酵素切断に使用する。
【００１７】
HAPO融合タンパク質の崩壊
酵素と融合タンパク質の比例を1：100とし、トロンビンにより融合タンパク質を25℃で12時間崩壊し、該崩壊物はニッケルイオン・キレートクロマトグラフィーによって精製された。外来アミノ酸無含有のHAPOタンパク質が得られた。さらにSPイオンカラムを利用して精製する。濾過滅菌、タンパク質の定量、分割して入れ、凍結乾燥することによって、精製したHAPO製品（100μg/瓶）が得られた（図3）。
【００１８】
〔実施例６〕組換えヒトHAPOポリクローナル抗体の作製
ウサギを1週間飼養し、健常なウサギを4-6匹取った。常用するカルメット−ゲラン桿菌で初回ウサギに免疫を行う。コマシー・ブラィリント・ブルまたは250MmKClで染色する。目的バンドを切出し、乳鉢へ液体窒素を通して、ゲルを砕く。ゲルとアジュバント（v：v）を1：1の比例で混合し、ペースト化した。調製したゲルは1-2mg抗原／匹のゲルである。初回免疫1週間後（1-2mg抗原／匹）、以下のようにウサギに免疫した。
1）２又は3週間後、追加免疫量が1-2mg抗原／匹
2）さらに1週間後、追加免疫量が1-2mg抗原／匹（二重免疫拡散法により抗体の有無をモニターする）
3）さらに1週間後、最終免疫で追加免疫量が1-2mg抗原／匹
その2週間後、ウサギの耳縁から静脈より血液を採取し、寒天-二重免疫拡散法により抗HAPO抗体の産出が検出された。エンザイム-リンクドイムノソルベントアッセイ（ELISA）により抗体の力価を測定する。血清には含まれている目的抗体が陽性である次第、ウサギの血液を大量に採取し、37℃で採取した血液を1-2時間放置して、その後、4℃で一晩保存した。無菌の条件で遠心してその血清を回収し、分割していれ（0.2ml/瓶）、-70℃で長期保存する状態にする。
【００１９】
〔実施例７〕HAPOの放射照射によるマウス骨髄細胞に対する効果
Balb/cマウスにセシウム（Cs）を4.5Gy放射線照射し、2群にランダムに分ける。試験群では、マウスにHAPO（15μg/匹）を10日間注射し、対照群では、PBSで注射した。放射線照射後、１２日目末梢血における血液を採取し、血小板、白血球及び赤血球の数量を測定する。その後、頚錐脱臼によりマウスを致死せしめ、大腿骨を摘出し、注いで骨髄細胞を回収した。以下のように細胞計数を行う。骨髄における単核細胞（MNC）の計数、拭き取り法による巨大核（MK）の計数、及び流動又は半流動の方法によりMKと巨大核始原細胞（CFU-MK）、蛍光細胞分析分離装置（FACS）により骨髄におけるCD34陽性細胞の数量を測定する。その結果として、マウス骨髄におけるMNCの試験群は対照群より1.7倍、MKが3.8倍、CD34陽性細胞が4.3倍に増加した（図4）。末梢血における血小板と白血球は対照群よりやや増加している（図5）。HAPOが造血細胞成長促進の機能を有し、またマウス骨髄構築の効果があるものであることが示唆されている。
【００２０】
〔実施例８〕液体培養におけるHAPOの骨髄細胞増殖に対する効果
BALB/Cマウス大腿骨、脛骨の骨髄細胞を採取し、24ウエルプレートの各ウェル（細胞懸濁液（2×106cell/ml））に細胞を0.5ml接種した。10％FCS含有の培地（IMDM）、10％FCS+5％Pig  serum含有の培地（IMDM）でHAPO因子（500ng/ml）を接種した。37℃で5％CO2/95％エアで液体培養し、3.5日毎に新鮮な液体を半分交換する。4週間目培養した細胞一部をWright's stainingにより染色し、写真撮影し、その結果は図6に示す。
【００２１】
HAPO因子の試験群と対照群を比較すると、細胞数の増加は明らかで、かつHAPOのPig serumに対する相乗効果があることがわかる。もう一つ培養した細胞一部を抗体標識で付し、流動細胞計数器を用いてCD34+、Sca-1、flk-1の細胞の数を計数した（図7）。HAPO添加の試験群は対照群に比べて、CD34+、Sca-1、flk-1の細胞の数量が多く増えた。HAPOが造血幹細胞/始原細胞の増殖を促進するほか、骨髄内皮細胞（Flk-1）増殖促進の効果があることが示唆されている。
【００２２】
〔実施例９〕HAPOの長期間培養におけるマウス骨髄始原細胞（LTC-IC）に対する効果
間質細胞層を樹立するため、以下のように行う。マウス骨髄細胞を採取し、24ウエルプレート中で（1×106cell/ウエル）を接種し、3.5日目造血細胞を除去し、新鮮な培養液を交換した。間質細胞が融合した状態でその培養液を全部吸出し、新鮮な培養液を2回洗浄し、1ml培養液を加えた。セシウム（1200cGy）で放射照射し、培地を除去する。その後、スクリーニングされたマウス骨髄における単核細胞（50,000cell/ウエル）を照射処理した間質細胞含有の培地に0.5ml（10％ウシ胎児血清、10％ウマ血清、0.1μM琥珀酸ヒドロコルチゾン、200mMグルタミン）接種し、33℃で5％CO2/95％エア、100％湿度でCO2インキュベーターで培養した。PBS及びHAPO添加をそれぞれ対照群と試験群にした。3.5日間隔培養液を半分に交換し、5週間培養し、液体培地を除去し、メチルセルローズ含有の培地（EPO3U/ml、GM-CSF20ng/ml、G-CSF20 ng/ml、IL-3 20ng/ml、IL-6 ng/ml、20ng/ml、SCF50 ng/ml）を加えた。33℃で5％CO2/95％エア100％湿度でCO2インキュベーターで14日培養し続いた。倒立顕微鏡にてCFCのコロニー数を計数する。結果は図8に示す。
【００２３】
14日培養してから、顕微鏡にて100 ng/mlのHAPO添加の各試験群では、4-7個コロニー形成をそれぞれ観察したが、PBS対照群ではコロニー形成が見られなかった。図8には、AがPBS対照群、BがHAPO添加の試験群で1個コロニーである。
【００２４】
〔実施例１０〕HAPOのヒト骨髄細胞増殖促進に対する効果
健常なヒト骨髄細胞を採取し、リンパ細胞分離液で単核細胞を単離し、IMDM培地に細胞懸濁液（5×104cells/ml）3週間培養後、それぞれ1,000個細胞を採取し、1mlメチルセルローズの半流動培地（IL-3、SCF、GM-CSF、EPOを含む）へ接種し、試験群ではHAPOを加える。37℃で5％CO2/95％エア100％湿度で培養し、14日目コロニーの数を計数する。結果は図9に示す。
【００２５】
〔実施例１１〕HAPOのヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖に対する効果
ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）の培養はJaffe法に準ずて改良した方法により行う。
生体の胎児臍帯（長さ15〜25cm）を摘出し、無菌のHands溶液中にて4℃で保存する。24時間培養する。臍帯の両端にチューブを挿入し、PBSで静脈内の残血を完全に洗浄し、0.3％トリプシンを注入した。止血鉗子で両端のチューブをきちんと挟んで、37℃で水浴15〜17分間インキューベートした。PBSで消化液を、血清含有の遠心用チューブへ注ぐ。1,000rpmで10分間遠心してHUVECが得られた。またM199培養液（20％FCS、80IU/mlペニシリン、80IU/mlストレプトマイシン、0.3mg/ml L-グルタミン）を添加し、培養瓶に接種した。37℃で5％CO2条件で24時間培養後、培養液を交換し、2〜3日過ぎて培養細胞が単層に融合した際に、倒立顕微鏡にて形態を観察し、VIII因子に関与する抗原に対する間接免疫蛍光法によって同定する。0.25％トリプシンでHUVECVs単層を消化し、96ウエルプレートの各ウエル（1×104 /ウエル）へ単一細胞の懸濁液（20％FCSのM199倍地を含む）を接種し、継代培養する。MTT法によってHAPOのHUVECsの増殖に対する効果を検定する。二代目のHUVECsが24時間培養継続後、それぞれにVEGF で100ng/ml、HAPO 5000ng/ml、HAPO 500ng/ml、HAPO 50ng/ml、HAPO 5ng/ml培養液で48時間培養後、各ウエルにMTT（5mg/ml）を20μl加え、37℃で4時間インキューベ−トした後、その上清を除去し、各ウエルへそれぞれDMSO 150μl加え、10分間振動し、結晶物を十分に溶解させ、空白の穴を基準0にし、ELISA装置にて各穴で490nmの吸光度を測定する。結果は図10に示す。
In vivo/in vitroの試験によれば、HAPOの巨大核、造血幹細胞/始原細胞及び血管内皮細胞の増殖に対して活性化する効果があることが示される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】原核細胞で発現するためのベクターの構築。
【図２】HAPOの発現図中、2a：558bpHAPOの発現、M：タンパク質基準、1：pET−HAPO558無誘導、2：pET−HAPO558誘導、3,4：精製したHAPO；2b：558bpHAPO発現、M：タンパク質基準、1：空白ベクター無誘導、2：空白ベクター誘導、3：pET−HAPO876無誘導、4：pET−HAPO876誘導。
【図３】トロンビンによって切断された図である。図中、M：標準分子量；A: トロンビン無添加；B:トロンビンによって切断された（8時間25℃）；C:トロンビンによって切断された（12時間25℃）；D：精製したHAPO。
【図４】大腿骨中の単球、巨核球(MK)及びCD34陽性幹細胞/始原細胞の数量を示す；
【図５】末梢血における血小板（PLT）、白血球（WBC）及び赤血球（RBC）の数量を示す；
【図６】マウス骨髄細胞の増殖促進の作用を有するHAPOである。A：対照群、B：HAPO添加、C：ブタ再障害性血清添加、D：ブタ再障害性血清添加+HAPO；
【図７】マウス骨髄細胞中におけるCD34+、Sca-1及びflk-1細胞に影響を与えたHAPOである。図中、7aは、HAPOが長期間培養におけるマウス骨髄細胞に影響を与えた。7bは、HAPOが長期間培養におけるマウス内皮細胞に影響を与えた。
【図８】HAPOが、長期間培養におけるマウス骨髄始原細胞（LTC-IC）に作用することを示す。A：対照群、B：HAPO添加。
【図９ａ】HAPOが液体培養におけるヒト骨髄細胞に対する作用することを示す。A：HAPOの添加後、三週間培養し、大きなニコローを示す。B：対照群。
【図９ｂ】HAPOがヒト骨髄細胞−ニコロ形成において作用することを示している。C、D：14日後、HAPOを添加し、形成されたニコローを示している。E：対照群。
【図１０】HAPO がHUVECs増殖に対する作用を有することを示す。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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