(57)【要約】刺激の存在または非存在に応答して２つの構造状態間で転移するペプチドに関する。本発明は、刺激の存在または非存在を検出するための検定における本発明のペプチドの使用にも関する。本発明は、本発明のペプチドを構築するための方法にも関する。
2006515273.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
刺激に応答して、オリゴマー化し得る第一の構造形態および第二の単量体構造形態間で可逆的に転移可能な、配列および構造二重性を有するペプチドであって、刺激に応答して結合を形成するよう相互作用し、それによりペプチドに前記第二の構造形態をとらせる相互作用モチーフを含むペプチド。
【請求項２】
刺激に応答して、第一の構造形態および第二の構造形態間で可逆的に転移可能な、配列および構造二重性を有するペプチドであって、刺激に応答して結合を形成するよう相互作用し、それによりペプチドに前記第二の構造形態をとらせる相互作用モチーフを含み、αヘリックス構造およびβシート構造間では転移しないペプチド。
【請求項３】
前記第一の構造形態として連続らせん構造を形成する、請求項１または請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドの第一の構造形態はオリゴマー化され得る請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドの第一の構造形態は二量体化されて、平行コイルドコイル二量体を形成する、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
前記第二の構造形態としてヘアピン構造を形成する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドの第二の構造形態が逆平行コイルドコイル単量体である、請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
２つの異なる重ね合わせ配列および構造モチーフを有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項９】
前記第一の配列モチーフは平行コイルドコイル二量体構造のためのコイルドコイルモチーフである請求項８に記載のペプチド。
【請求項１０】
前記第二の配列モチーフは逆平行コイルドコイル単量体構造のためのコイルドコイルモチーフである、請求項８または９に記載のペプチド。
【請求項１１】
前記相互作用モチーフは刺激に応答して共有または非共有結合を形成する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１２】
前記相互作用モチーフは酸化環境に応答してジスルフィド結合を形成するシステイン残基である、請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１３】
前記相互作用モチーフは、対応する金属イオンの存在下で非共有結合を形成する金属結合部位の一部を含む、請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１４】
前記相互作用モチーフは、対応する抗原の存在下で非共有結合を形成する抗体分子の抗原結合部位の一部を含む、請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１５】
前記相互作用モチーフは、対応するリガンドの存在下で非共有結合を形成する受容体のリガンド結合部位の一部を含む、請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１６】
以下の配列：
Ｘ1−（Ｙ）n−（ａｂｃｄｅｆｇ）m−ａｂｃｄｅｆ（（Ｚ）p）ｇ−（ａｂｃｄｅｆｇ）m−ａｂｃｄｅ−（Ｙ）n−Ｘ2
（式中、Ｘ1およびＸ2は、相互作用して結合を形成し得るモチーフであり、
Ｙは、リンカーとして作用し得る任意のアミノ酸であり、
ｎは、独立して０〜２０から選択され、
ａｂｃｄｅｆｇは、ヘプタッド配列モチーフであり、
ｍは、１〜２０であり、
ａｂｃｄｅは、ヘプタッド配列モチーフの最初の５残基であり、
Ｚは、ペプチドの２つの構造形態に適合性であるアミノ酸であり、そして
ｐは、１〜６である）
を有する、請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１７】
前記Ｘ1およびＸ2はジスルフィド結合を形成し得るアミノ酸である、請求項１６に記載のペプチド。
【請求項１８】
前記Ｘ1およびＸ2はシステインである、請求項１７に記載のペプチド。
【請求項１９】
前記Ｙは独立してグリシン、セリンまたはβ−アラニンから選択される、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２０】
前記ヘプタッド配列のｄはロイシンである、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２１】
前記ヘプタッド配列のａは独立してイソロイシン、バリン、リシン、アスパラギンおよびアルギニンから選択されるが、但しａはペプチドの４つのヘプタッド配列につき１つのみにおいてリシン、アスパラギンまたはアルギニンである、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２２】
前記ヘプタッド配列のａはイソロイシンまたはリシンであるが、但しペプチドのヘプタッド配列のうちの１つにおいてはリシンのみである、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２３】
前記ヘプタッド反復のｇおよびｅは逆に荷電され、そしてｇおよびｅの極性がペプチドのＮ末端半分と比較してペプチドのＣ末端半分において逆にされる、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２４】
前記Ｚは独立してグリシン、アラニンおよびグルタミンから選択される、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２５】
前記（Ｚ）pはＡｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−ＡｌａまたはＡｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａである、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２６】
以下の配列：
ＣＧＧＥＩＲＡＬＫＹＥＩＡＲＬＫＱＡＫＱＡＫＩＲＡＬＥＱＫＩＡＡＬＥＧＧＣ、
ＣＧＧＥＩＲＡＬＫＹＥＩＡＲＬＫＱＡＡＱＡＫＩＲＡＬＥＱＫＩＡＡＬＥＧＧＣ、または
ＣＧＧＥＩＲＡＬＫＹＥＩＡＲＬＫＱＡＡＱＡＫＫＲＡＬＥＱＫＩＡＡＬＥＧＧＣ
を有する、請求項１２に記載のペプチド。
【請求項２７】
刺激の存在または非存在を確定するための、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項２８】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載のペプチドを試験溶液とともにインキュベートすること、および前記ペプチドが試験溶液中で第一の構造形態を有するかまたは第二の構造形態を有するかを決定することとを包含する刺激の検出方法であって、前記ペプチドが前記第二の構造形態をとる場合に、前記試験溶液が刺激を含有するとする方法。
【請求項２９】
刺激に応答して第一のおよび第二の構造形態間で可逆的に転移可能な、配列および構造二重性を有するペプチドの構築方法であって、
（ｉ）前記第一のおよび第二の構造形態に関する配列規則を用いてペプチドをデザインおよび製造すること、および
（ｉｉ）刺激に応答して結合を形成するペプチド中に相互作用モチーフを提供することを含み、
前記配列規則はペプチド中で重なり合わされ、前記結合は前記第二の構造形態を安定化し、前記結合の非存在下では、前記第二の構造形態は安定化されず、そしてペプチドは優先的に前記第一の構造形態を形成することを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載のペプチドを構築するための、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
刺激の存在または非存在に応答して２つの構造形態間で転移するペプチドに関する。本発明は、刺激の存在または非存在を検出するための検定における本発明のペプチドの使用にも関する。本発明は、本発明のペプチドを構築するための方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
成功裡のタンパク質およびペプチドデザインは、タンパク質配列および構造に関する信頼できる規則を要する。これは、今日までになされた成功裡のデザインにおける、主としてαヘリックス、特にコイルドコイル構造に対するバイアスに反映され、これらの例としては以下のものが挙げられる：４−ヘリックスバンドル、平行二量体および三量体コイルドコイル、ならびにヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフ。これらの初期αヘリックスデザインは、αヘリックスペプチドのための良好な実験的および理論的モデルと、その結果生じるαヘリックス構造のフォールディングのための規則の展開により裏打ちされた。β−構造のフォールディングおよびデザインに及ぼす試験も進行中である。しかしながら近年、溶液中の高集団化β構造への小ペプチドのフォールディングが報告された。そしてタンパク質中の配列とβ構造を連結する規則が確立されつつある。
【０００３】
第二の構造の大きな相対的動きまたはその変化を意味するタンパク質内の大きな立体配座転位は、タンパク質機能（およびタンパク質機能障害）が引き出され、媒介される手段として漸増的に認識されつつある。例えばセリンプロテアーゼの自殺阻害剤であるセルピンでは、切断部位の切断は、βシートの内部鎖へのネイティブループの形質転換をもたらし（リー，パーク等（Lee, Park et al.）, 天然構造生物学（Natural Structural Biology）, 3(6): 497-500, 1996）、この立体配座変化は、切断セルピンとそれらの標的との間の相互作用を結びつける。アミロイド様構造に再配列するペプチドおよびタンパク質は、β構造が形成される（ローチェットとランスバリー等（Rochet and Lansbury et al.）, 構造生物学における最近の見解（Current Opinion in Structural Biology）, 10(1): 60-60, 2000）別の種類の転位を表し、必ずしもβ構造化されない非折り畳みおよび折り畳みポリペプチドはβシートが豊富な繊維に切り換わる。大規模らせん構造の再配列を包含する立体配座変化の原型的な例は、ウイルス−宿主膜融合と競合的な活性形態へのインフルエンザ血球凝集素の転移である（スケールとワイリー等（Skehel and Wiley et al.）, 生化学の年次論評（Annual Review of Biochemistry）, 69: 531-569, 2000）。同様のテーマに関して、小胞膜の融合を媒介するある種のＳＮＡＲＥ−タンパク質複合体のアセンブリーは、ＳＮＡＲＥ複合体アセンブリーの前に開かなければならない一構成成分のネイティブ立体配座により抑制される（マンスン等（Munson et al.）,天然構造生物学（Nature Structural Biology）, 7(10): 894-902, 2000、トチオ等（Tochio et al.）,サイエンス （Science）, 293 (5530): 698-702, 2001）。タンパク質オリゴマー状態の、次いでタンパク質の機能の変化を伴う構造における転位は、三量体領域の放出およびアセンブリーと、その後のある種の熱ショック転写因子のＤＮＡ結合（ラビンドラン等（Rabindran et al.）, サイエンス（Science）, 259: 230-234, 1993）、ならびにミトコンドリアＡＴＰシンターゼを調節するＩＦ1における二量体−四量体転移（キャベゾン等（Cabezon et al.）, EMBO ジャーナル（Journal）, 20(24): 6990-6996, 2001）を包含する。国際特許出願ＷＯ  ９９／１１６６１は、温度の増大に応答して長さを増大するエラストマーペプチドを含むタンパク質を開示する。しかしながらタンパク質の構造の全体的変化は認められない。最後に、ｐＨ変化および膜への近接は、水溶性球状構造から内在性膜タンパク質に切り換わり、その後、適用膜電位によって開放および閉鎖チャンネル状態間で切り換わるよう、ある種のコリシンドメインを誘発する。
【０００４】
他の場合には、立体配座変化は異常であるかまたはミスフォールディング事象であり、そして疾患を生じると思われる。例えばアルツハイマー型痴呆およびプリオン病では、ペプチドおよびタンパク質のαからβへの構造転移は、アミロイド細繊維の形成および疾患の病因に関与する。ジャ−ベット（Jarvet）等（J. Am. Chem. Soc., 122, 4261-4268, 2000）は、アルツハイマーペプチド断片Ａβ（１２−２８）における係る構造的変化を考察している。
【０００５】
上記の例は内部構造的コンフリクトを有するタンパク質と考えて良く、すなわち、支配的条件に依存して発現する接触可能な異なる折畳み状態ならびに形態を有するタンパク質配列である。これは、タンパク質が熱力学的に最も安定な状態を取る、というアンフィンセンの仮説（アンフィンセン等（Anfinsen et al.）, サイエンス（Science）, 181: 223-230, 1973）に反対するものと思われる。しかしながらこの考えは、新しいものではなく、例えばアミロイド繊維の交差β構造は、全てのポリペプチド鎖に関して真のエネルギー最小値であると長い間考えられており、ネイティブインフルエンザ血球凝集素は、トラップされて、膜融合形態に転移するための誘因を待ち構えるバネ留め式準安定性立体配座として記載されている（キャル等（Carr et al.）, PNAS USA, 94 (26): 14306-14313, 1997）。ネイティブセルピンは、標的プロテアーゼによるその切断が弛緩状態への立体配座転位をもたらす緊張状態として言及され（リー，パーク等（Lee, Park et al.）, 天然構造生物学（Nature Structural Biology） 3(6): 497-500, 1996、ウィストック等（Whisstock et al.）, 生化学の科学における傾向（Trends in Biochmical Sciences）, 23: 63-67, 1998）、そしてある種のＳＮＡＲＥの不活性形態は、ＳＮＡＲＥオリゴマー化モチーフが接近不可能にされる「閉鎖」立体配座として言及される（マンスン等（Munson et al.）, 天然構造生物学（Nature Structural Biology）, 7(10): 894-902, 2000, トチオ等（Tochio et al.）,サイエンス（Science）, 293(5530): 698-702, 2001）。
【０００６】
立体配座スイッチのデザインを考えるための一方法は、単一配列中の２つの異なる構造に関するモチーフを重ね合わせることにより、ペプチドまたはタンパク質内に構造的コンフリクトを設定することである。この方法では、タンパク質フォールディングのアンフィンセンの基本原則には違反していないが、それは単に、代替的構造が採用された場合、一配列モチーフが無効にされるということである。本発明者らは、係る配列および構造二重性を有するポリペプチドに言及する。本発明者らは、この概念を以前に導入し、試験した。特にチアーニ（Ciani）他（J. Biol. Chem., 277, 10150-10155, 2002）は、αヘリックス構造からβヘリックス構造に転移するペプチドをデザインした。試料を冷却し、そのｐＨをｐＨ２に下げて、日数を置くことにより、β構造（アミロイド様繊維）からαヘリックス構造にペプチドの立体配座を逆転することのみができた。このような変化は実用的ではなく、したがって診断等においてペプチドを転移するという任意の実施形態においてほとんど役に立たない。
【０００７】
日本国特許出願ＪＰ−Ａ−７１５７４９９の要約書は、αヘリックス構造およびβシート構造間で可逆的に転移するとして示されるペプチドを開示している。ペプチドの配列を可逆的に転移することを示すデータは提供しておらず、開示されていない。
【０００８】
チャオ（Zhao）等（タンパク質科学（Protein Science）, 10, 1113-1123, 2001）は、温度またはｐＨの変化により、酵母接着タンパク質αアグルチニンがβ構造が卓越する構造から混合α／β構造に可逆的に転移可能である、ということを開示している。リード等（Reed et al.）（生化学（Biochemistry）, 30, 4521-4528, 1991）は、極性条件の変化後に、ｇｐ１２０のＣＤ４結合ドメイン由来のペプチドが、αヘリックス構造からβシート構造に転移することを開示している。係る論文は、他の転移ペプチドを生成またはデザインすることに関する情報を提供していない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
刺激の存在または非存在に応答して異なる２つの構造的立体配座間で可逆的に転移可能なペプチドに関する要件が存在する。加熱または不可逆的化学作用によりタンパク質を変性させるという要件を伴わずに、ペプチドが異なる２つの構造的立体配座間で転移可能であることも望ましい。
【００１０】
ｐＨ、酸化還元条件、金属イオン、抗原またはリガンドを含む種々の異なる刺激の存在を検出するために用いることが可能なペプチドを提供することができることも望ましい。ペプチドの異なる構造的立体配座間を容易に区別することができることも望ましい。
【００１１】
本発明の第一の態様では、刺激に応答して、オリゴマー化し得る第一の構造形態および第二の単量体構造形態間で可逆的に転移可能な配列および構造二重性を有するペプチドであって、刺激に応答して結合を形成するよう相互作用し、それによりペプチドに第二の構造形態をとらせる相互作用モチーフを含むペプチドを提供する。
【００１２】
本発明の第二の態様では、刺激に応答して第一の構造形態および第二の構造形態間で可逆的に転移可能な配列および構造二重性を有するペプチドであって、刺激に応答して結合を形成するよう相互作用し、それによりペプチドに第二の構造形態をとらせる相互作用モチーフを含み、αヘリックス構造およびβシート構造間では転移しないペプチドを提供する。
【００１３】
本発明のペプチド（本発明の第一および第二の態様の両方による）は、ペプチドが２つの異なる構造形態をとり、そして刺激に応答して形態間で可逆的に転移可能となるように、配列および構造的二重性を有する。したがって、ペプチドは２つの構造形態間で可逆的に転移可能であるため、ペプチドを用いて刺激の存在または非存在を検出し、刺激のレベルの変化をモニタリングすることができる。
【００１４】
ペプチドは、加熱または化学反応、例えばｐＨをｐＨ２に下げることによりタンパク質を変性する必要性を伴わずに、異なる構造形態間で転移可能である。さらに構造形態間の転移はまた、比較的迅速に、例えば１または２時間未満で起こる。
【００１５】
「ペプチド」という用語は、本明細書中で用いる場合、アミノ酸のポリマーを指す。ペプチドは任意の長さを有し得るが、しかし好ましくは約２０〜４００アミノ酸の長さである。ペプチドが約３０〜２００アミノ酸長であることがさらに好ましい。係る用語は、ペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化およびリン酸化を指さないかまたは除外する。定義に含まれるのは、非天然アミノ酸を含めたアミノ酸の１つ以上の類似体を含有するペプチドである。
【００１６】
「配列および構造二重性」という用語は、ペプチドが２つの異なる構造に適合性である配列を有することを意味する。一般にペプチドは、ペプチドに２つの異なる構造、すなわち第一のおよび第二の配列および構造モチーフをとらせることが可能な２つの異なる重ね合わせ配列および構造モチーフを有する。好ましくはペプチドの第一の配列モチーフは、平行コイルドコイル二量体構造のためのコイルドコイルモチーフである。ペプチドの第二の配列モチーフが逆平行コイルドコイル単量体構造のためのコイルドコイルモチーフであることも好ましい。
【００１７】
「可逆的に転移する」という用語は、ペプチドが第一のおよび第二の構造形態間で可逆的に転移することを示すために用いられる。したがってペプチドは、第一の構造形態から第二の構造形態に転移し、そして再び元に戻ることが可能である。上記のように、構造が
転移可能な従来技術のペプチドの大多数は、第一の構造から第二の構造に転移可能であることのみで、再び元に戻らない。係る従来技術のペプチドは、一旦ペプチドが第二の構造をとると、それはもはや刺激に応答しないため、再使用はできないし、刺激のレベルの変化をモニタリングするために用いることはできない。
【００１８】
本発明のペプチドの第一のおよび第二の構造形態は任意の構造形態であり得るが、但し、それらは、ペプチドが第一の構造形態または第二の構造形態にある場合、当業者が容易に確定し、ペプチドの第一のおよび第二の構造形態間の比を測定することを可能にするのに十分に互いに異なることが好ましい。本発明の第一の態様では、そして好ましくは本発明の第二の態様では、ペプチドの第一の構造形態はオリゴマー化し、そしてペプチドの第二の構造形態は単量体である。これは、オリゴマーおよび単量体を区別するのが比較的容易であるため、有益である。ペプチドが第一の構造形態であるか第二の構造形態であるかを確定する適切な方法としては、円二色性分光法および非変性ＰＡＧＥが挙げられる。分割タンパク質および酵素も、タンパク質の立体配座変化を検出するために用いられ得る（ゴーシュ等（Ghosh et al.）, J. Amer. Chem. Soc., 122, 5658-9, 2000; ジョンソン等（Johnsson et al.）, PNAS USA, 91, 10340-4, 1994およびホッカー等（Hocker et al.）, Nat. Struct. Biol., 8, 32-36, 2001参照）。
【００１９】
第一の構造形態は、連続らせん構造であることが好ましい。本発明の第一の態様では、そして好ましくは本発明の第二の態様では、第一の構造形態はオリゴマー化可能である。第一の構造形態のペプチドは、ヘテロオリゴマーまたはホモオリゴマーを形成し得る。第一の構造形態のペプチドが平行コイルドコイルホモ二量体であることが特に好ましい。
【００２０】
第二の構造形態は、ヘアピン構造であることが好ましい。第二の構造形態のペプチドが逆平行コイルドコイル単量体であることが特に好ましい。
【００２１】
「相互作用モチーフ」という用語は、本明細書中で用いる場合、刺激に応答して互いに相互作用して単数または複数の共有または非共有結合を形成可能とする任意のモチーフを意味する。相互作用モチーフは、相互作用して単数または複数の非共有結合を形成することが好ましい。結合を形成する相互作用モチーフにより、本発明のペプチドは第二の構造形態をとらされる。
【００２２】
相互作用モチーフは、互いに隣接して、ペプチド中の単一単位として配置され得る。例えば相互作用モチーフが金属結合部位の一部である場合、両方の相互作用モチーフを含む金属結合部位または金属結合部位の一部は、単一単位としてペプチドとともに配置され得る。あるいは相互作用モチーフは、ペプチドの別個の部分で存在し得る。相互作用モチーフはペプチド中の任意の位置に存在し得るが、但し、それは、それらが相互作用して単数または複数の結合を形成し得る場合である。好ましくは、相互作用モチーフが単一単位として存在する場合、それらはペプチドの中央に向けて配置される。好ましくは相互作用モチーフがペプチドの別個の部分で存在する場合、それらはペプチドの各末端にまたは末端近くに存在する。全て相互作用して単数または複数の結合を形成する多数の相互作用モチーフが存在し得る。好ましくは２つの相互作用モチーフのみが存在し、そしてそれらは好ましくはペプチドの各末端に位置する。
【００２３】
相互作用モチーフの多数の特定の例を以下で考察する。
【００２４】
相互作用モチーフは酸化環境の刺激に応答してジスルフィド結合を形成するシステイン残基であり得る。
【００２５】
相互作用モチーフは、対応する金属イオンの存在の刺激に応答して非共有結合を形成す
る金属結合部位の一部を含んでも良い。適切な金属結合部位は当業者に既知であり、例としては、亜鉛フィンガーおよびランタニド結合モチーフが挙げられる。金属結合部位の一部は、本発明のペプチドの一部分に組入れられ、金属結合部位の第二部分は本発明のペプチドの第二部分に組入れられ得るが、ここで、金属イオンが存在する場合、金属結合部位の一部は金属イオンを介して相互作用して、単数または複数の結合を形成する。
【００２６】
相互作用モチーフは、対応する抗原の存在の刺激に応答して非共有結合を形成する抗体分子の抗原結合部位の一部を含んでも良い。当業者は、成功裡の結合抗原に対する抗体分子の単一鎖Ｆｖ断片を用いた。さらに当業者は、タンパク質中に抗体分子の可変部を組入れた。したがって、既知の技法を用いて、本発明のペプチド中に抗体分子の抗原結合領域を、当業者は容易に組入れることができるであろう。抗原結合領域が正確に配向されることを保証するために、抗体分子の適切なフレームワーク領域が含まれ得る。抗体はほぼあらゆる抗原に対して生成され得るので、本発明のペプチドを用いてほぼあらゆる抗原の存在を検出し得る。金属結合部位に関して上記したように、抗原結合部位の部分は、異なる部位で本発明のペプチドに組入れられ得るが、ここで、抗原が存在する場合、抗原結合部位の一部は相互作用して単数または複数の結合を形成する。
【００２７】
相互作用モチーフは、対応するリガンドの存在の刺激に応答して非共有結合を形成する受容体のリガンド結合部位の一部を含み得る。多数のリガンド結合部位は当業者に既知であり、リガンド結合部位の必要な部分は、本発明のペプチド中に組入れられ得る。上記のように、リガンド結合部位の一部は異なる部位で本発明のペプチド中に組入れられ得るが、ここで、リガンドが存在する場合、リガンド結合部位の一部は相互作用して単数または複数の結合を形成する。
【００２８】
本発明のペプチドに立体配座を転移させる刺激は、上記のように、ペプチド中の相互作用モチーフに拠る。刺激は、特定の酸化還元状態、金属イオン、抗原またはリガンドの存在または非存在であり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明の特に好適な一実施形態では、本発明によるペプチドは、
以下の配列：
Ｘ1−（Ｙ）n−（ａｂｃｄｅｆｇ）m−ａｂｃｄｅｆ（（Ｚ）p）ｇ−（ａｂｃｄｅｆｇ）m−ａｂｃｄｅ−（Ｙ）n−Ｘ2
（式中、Ｘ1およびＸ2は、相互作用して結合を形成し得るモチーフであり、
Ｙは、リンカーとして作用し得る任意のアミノ酸であり、
ｎは、独立して０〜２０から選択され、
ａｂｃｄｅｆｇは、ヘプタッド配列モチーフであり、
ｍは、１〜２０であり、
ａｂｃｄｅは、ヘプタッド配列モチーフの最初の５残基であり、
Ｚは、ペプチドの２つの構造形態に適合性であるアミノ酸であり、そして
ｐは、１〜６である）
を有する。
【００３０】
Ｘ1およびＸ2は、刺激の存在または非存在に応答して相互作用して単数または複数の結合を形成し得る任意のモチーフであり得る。上記のように、単数または複数の結合は共有または非共有性であり得る。Ｘ1およびＸ2は、上記のように任意の双方向モチーフを表し得る。好ましくはＸ1およびＸ2は、ジスルフィド結合を形成し得るアミノ酸である。Ｘ1およびＸ2がシステインであることが特に好ましい。
【００３１】
Ｙは、好ましくはグリシン、セリンまたはβ−アラニンから独立して選択される。Ｙが
グリシンであり、そしてnが３であることが特に好ましい。
【００３２】
「ヘプタッド反復」という用語は、らせんコイルドコイル構造を形成し得る任意の７アミノ酸反復を指す。適切なヘプタッド反復配列は、当業者に既知である。
【００３３】
好ましくはヘプタッド配列のｄはロイシンである。ヘプタッド配列のａがイソロイシン、バリン、リシン、アスパラギンおよびアルギニンから独立して選択されることがさらに好ましいが、但しａは、ペプチドの４つのヘプタッド配列中につき１つにおいてのみリシン、アスパラギンまたはアルギニンである。ヘプタッド配列のａがイソロイシンまたはリシンであることが特に好ましいが、但しａはペプチドのヘプタッド配列のうちの１つにおいてはリシンのみである。
【００３４】
上記のようにａおよびｄ残基を制限することにより、２つのらせんコイルドコイル構造を特に良好にコードするヘプタッド反復が形成される、ということが判明した。
【００３５】
ヘプタッド反復のｇおよびｅ残基が逆に荷電され、ｇおよびｅの極性はペプチドのＮ末端半分に比して、ペプチドのＣ末端半分で逆にされることも好ましい。上記のようにｇおよびｅ残基を制限することにより、ヘプタッドは平行コイルドコイル二量体構造および逆平行コイルドコイル単量体構造の形成に適合することも判明した。
【００３６】
ｍは好ましくは１〜５であり、最も好ましくはｍは１または２である。
【００３７】
Ｚは、柔軟性アミノ酸、すなわち、適切な配列構成において、２つの構造形態を収容するのに十分に柔軟性であり得るアミノ酸であり得る。特に基（Ｚ）pは、コイルドコイル構造の一部を形成し、そして逆平行コイルドコイル単量体のヘアピン構造を形成し得る。Ｚは、好ましくはグリシン、アラニンおよびグルタミンから独立して選択される。pが４であることも好ましい。（Ｚ）pがＡｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−ＡｌａまたはＡｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａであることが特に好ましい。
【００３８】
本発明の特定の実施形態によれば、本発明のペプチドは以下の配列を有する：
ＣＧＧＥＩＲＡＬＫＹＥＩＡＲＬＫＱＡＫＱＡＫＩＲＡＬＥＱＫＩＡＡＬＥＧＧＣ（ＣＳＰ−３）、
ＣＧＧＥＩＲＡＬＫＹＥＩＡＲＬＫＱＡＡＱＡＫＩＲＡＬＥＱＫＩＡＡＬＥＧＧＣ（ＣＳＰ−６）、または
ＣＧＧＥＩＲＡＬＫＹＥＩＡＲＬＫＱＡＡＱＡＫＫＲＡＬＥＱＫＩＡＡＬＥＧＧＣ（ＣＳＰ−７）。
【００３９】
ＣＳＰ−３、ＣＳＰ−６およびＣＳＰ−７という名称は、本来のデザイン工程に由来し、図および実験区分と一致することを含めた。
【００４０】
当業者に明らかなように、本発明のペプチドの配列の修飾は、ペプチド特性を変更するためになされ得る。例えば修飾は、それが、立体配座を転移するためにより大きい刺激を要し、それにより高レベルの刺激を検出するためにペプチドを用いさせるよう、ペプチドに対してなされ得る。当業者に既知の他の修飾は、その溶解度等を増大するためにペプチドに対してなされ得る。
【００４１】
本発明はまた、刺激の存在または非存在を確定するための先行の請求項のいずれか一項に記載のペプチドの使用を提供する。
【００４２】
上記のように、本発明のペプチドを用いて刺激の存在または非存在を確定し得る。検出
される刺激は、上記のように用いられる特定のペプチドに拠る。
【００４３】
本発明は、本発明のペプチドを試験溶液とともにインキュベートし、かつペプチドが試験溶液中で第一の構造形態を有するかまたは第二の構造形態を有するかを確定することを包含する刺激の検出方法であって、ペプチドが第二の構造形態をとる場合に、試験溶液が刺激を含有する方法を提供する。
【００４４】
ペプチドの構造の変化は、任意の技法により測定され得る。適切な技法としては、円二色性分光法、蛍光消光、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）および非変性ＰＡＧＥ（特にペプチドが一構造形態でのみオリゴマー化する場合）が挙げられる。分割タンパク質および酵素も、タンパク質の立体配座変化を検出するために用いられ得る（ゴーシュ等（Ghosh et al.）, J. Amer. Chem. Soc., 122, 5658-9, 2000;ジョンソン等（Johnsson et al.）, PNAS USA, 91, 10340-4, 1994およびホッカー等（Hocker et al.）, Nat. Struct.
Biol., 8, 32-36, 2001参照）。ＦＲＥＴの場合、供与体および受容体蛍光体は、それらが立体配座状態のうちの１つのみで互いに近接して運ばれるだけであるよう、ペプチドの一部に付加され得る。
【００４５】
本発明は、刺激に応答して第一のおよび第二の構造形態間で可逆的に切り換わり得る配列および構造二重性を有するペプチドの構築方法であって、
（ｉ）第一のおよび第二の構造形態に関する配列規則を用いてペプチドをデザインおよび製造すること、および、
（ｉｉ）刺激に応答して結合を形成するペプチド中の相互作用モチーフを提供することを含み、
上記配列規則はペプチド中で重なり合わされ、上記結合は第二の構造形態を安定化し、上記結合の非存在下では、第二の構造形態は安定化されず、そしてペプチドは優先的に第一の構造形態を形成することを特徴とする方法も提供する。
【００４６】
第一のおよび第二の構造形態は、任意の構造形態であり得る。種々の構造形態に関する規則は、当業者に既知である。例えば平行コイルドコイル二量体、コイルドコイル逆平行単量体、βシート、コイルドコイル三量体および四量体、４−ヘリックスバンドル、ロイシンに富む反復、亜鉛フィンガー等に関する規則は、既知である（カジャラ等（Kajara et al.）, タンパク質科学（Protein Science）, 11, 1082-1090;およびウールフソン（Woolfson）, 構造生物学における最近の見解（Current Opinion in Structural Biology）,
11, 464-471, 2001）。
【００４７】
好ましくは本方法は、本発明の第一または第二の態様に従ってペプチドを構築するために用いられる。上記の方法において用いられる用語は、本説明で前に示されたものと同じ意味を有する。
【００４８】
「配列規則は重ね合わされる」という用語は、本明細書中で用いる場合、ペプチドの配列が第一のおよび第二の構造形態の両方に関する規則を満たす、ということを意味する。これは、ペプチドが第一のおよび第二の構造形態をとることを可能にする。
【００４９】
「第二の構造形態を安定化する」という用語は、刺激に応答して相互作用モチーフにより形成される結合が第二の構造形態を特異的に安定化し、それによりペプチドに第二の構造形態をとらせる、ということを意味する。結合の非存在下では、ペプチドは優先的に第一の構造形態をとる。したがってペプチドの配列は、第一の構造形態が結合の非存在下で優先的に形成されることを保証するようデザインされる。これは、ペプチドの配列が第一の構造形態の規則を、第二の構造形態の規則より大いに満たす、ということを保証することにより達成され得る。しかしながら結合形成時には、ペプチドの構造は、第二の構造形
態の形成に好都合である配向で安定化される。ペプチドは、構造的コンフリクトを有し、そして結合の存在または非存在が、ペプチドがどの立体配座をとるかを決定する。
【００５０】
次に本発明を添付の図面を参照して例としてのみ説明する。
【実施例】
【００５１】
デザインは、二らせんコイルドコイルに特徴的なヘプタッドおよび関連配列モチーフに基づいた。異なる酸化還元状態で２つの異なる配列モチーフを発現させるために、末端残基をシステインにした。還元状態における平行コイルドコイル二量体（ロイシンジッパー）、ならびに分子内酸化状態における単量体逆平行二らせんコイルドコイル（らせんヘアピン）を促進することを、本発明者らは目標とした。基準ロイシンジッパーに関する鋳型を用いて開始して、代替的らせん−ヘアピン状態を促すための特徴を導入した。中心非基準１１残基単位を作製するための４残基挿入物の導入は、デザインを成功させるために重要であった。挿入物はらせんヘアピンと一致する柔軟性を提供し、その一方、残りはコイルドコイル二量体と適合した。この工程により、異なる条件下での標的構造と一致する特性を有する安定構造が設計された。
【００５２】
＜材料および方法＞
ペプチド合成
標準Ｆｍｏｃ化学を用いて、パイオニアペプチド合成システム（パースペクティブ バイオシステムズ（Perseptive Biosystems））でペプチドを製造した。それらを逆相ＨＰＬＣにより精製し、そしてそれらの同一性をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により確認した。精製ペプチドをｐＨ２で、−２０℃で保存し、２８０ｎｍでのＵＶ吸収により濃度を概算した（ｅ＝１４９０Ｍ-1ｃｍ-1）。６Ｍの塩酸グアニジンを含有する０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５中で、１００ｍＭのペプチド溶液を室温で一晩撹拌することにより、酸化ペプチドを調製した。（１）１．２５％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノール、８Ｍの尿素、５ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．６Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．６中で、４０℃で１時間、１ｍＭのペプチド溶液をインキュベートし；（２）その結果生じた還元ペプチド溶液を０．７５ｍｌの新鮮な０．３６Ｍのヨードアセトアミド溶液と混合して、暗所で室温で１５分間インキュベートし；そして（３）水に対して透析することにより、アルキル化ペプチドを調製した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により、システインの化学修飾を確認した。
【００５３】
分析的超遠心分離
Ａｎ−６０Ｔｉローターを装備したベックマン−オプティマＸＬ−Ｉ分析用超遠心分離機で、５℃で、沈降平衡実験を実行した。０．１ＭのＫＣｌを含有する２５ｍＭのＫリン酸塩緩衝液、ｐＨ７中の１００〜５００ｍＭのペプチド溶液１００ｍｌを、４０，０００、４７，５００／５０，０００および５５，０００／６０，０００ｒｐｍの速度で４８時間平衡させた。ベックマン−オプティマＸＬ−Ａ／ＸＬＩ−Ｉデータ分析ソフトウエア（ｖ４．０）での常法を用いて、データを同時に適合させて、単一の理想的な種または単量体−二量体平衡および固定単量体分子量を推定した。ペプチドの分子量（表２）および部分特異的体積（０．７４１７〜０．７４６１の範囲）をそれらのアミノ酸配列から算定し、５℃での緩衝液の粘度が１．００８ｍｇ・ｍｌ-1であることが分かった。
【００５４】
円二色性分光分析
ペルティエ温度制御計を装備したＪＡＳＣＯ  Ｊ−７１５分光偏光計を用いて、ＣＤ測定を実施した。ペプチド溶液を２５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７中に調製し、１ｍｍまたは１ｃｍクォーツキュベット中で（撹拌しながら）検査した。１ｎｍ間隔、１ｎｍ帯域幅および４秒応答時間を用いて、５℃でスペクトルを記録した。２ｎｍ帯域幅を用いて１℃・分-1勾配により加熱アンフォールディング（thermal unfolding）曲線を記録
し、１℃間隔ごとに１６秒のシグナルを平均した。ベースライン補正後、ペプチド結合の濃度に関して正規化することにより、楕円率(ｍｄｅｇ)をモル楕円率(ｄｅｇ  ｃｍ2ｄｍｏｌ−ｒｅｓ-1)に変換した。
【００５５】
この試験の目的は、その立体配座が簡単な化学修飾により転移可能なペプチドをデザインすることであった。本発明者らの標的立体配座は、平行および逆平行コイルドコイルであり（図１参照）、そして転移のためのこの特定例のトリガーは分子内ジスルフィド架橋であった。配列の末端に置かれたシステイン残基は、平行コイルドコイル二量体に好都合であるよう還元されたままであるか、あるいは分子内で酸化されてヘアピンを形成し、逆平行構造に好都合となる。平行コイルドコイルペプチド(特にロイシンジッパー)の合理的デザインを確実にさせる良好な規則が利用可能である（ハーバリー等（Harbury et al.）,サイエンス（Science）, 262 (5138): 1401-1407, 1993、ウールフソンとアルバー等（Woolfson and Alber et al.）,タンパク質科学（Protein. Sci）, 4(8), 1596-1607, 1995、パンドヤ，スプーナー等（Pandya, Spooner et al.）,生化学 （Biochemistry）, 39(30): 8728-8734, 2000、チアーニ  フントチンソン等（Ciani Huntchinson et al.）, ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）, 277 (12): 10150-10155, 2002）が、その一方、逆平行コイルドコイルに関する同様の規則はまさに探求中であるに過ぎない（オークリー等（Oakley et al.）, 構造生物学における最近の見解（Current Opinion in Structural Biology）, 11(4): 450-457, 2001、ウォルシャウ等（Walshaw et al.）,ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー（Journal of Molecular Biology）, 307(5): 1427-1450, 2001）。このため、転移のデザインにおけるアプローチは反復であった：親ペプチドであるコイルドコイルスイッチペプチド−１(ＣＳＰ−１)を基準二量体ロイシンジッパーとしてデザインした；次に小変化をもたらしてから逆平行形態を安定化し、その一方、平行(ロイシン−ジッパー)状態の不安定化を最小限にした。円二色性(ＣＤ)分光分析および分析的超遠心分離(ＡＵＣ)を用いて、溶液中で種々の反復を特性化した。このようにして、ある状態または他の状態に有利になるようデザインされた修飾を組入れ、試験し、そして指示されたようなデザインに至ることができた。この工程は、適切な状態で所望の標的構造と完全に適合性である特性を有するデザイン、すなわち、還元および酸化状態において、それぞれ二量体および単量体を形成し、そして酸化還元状態に応じて二量体および単量体形態間で転移するペプチドになる。ペプチドは、主としてらせん状であった。そしてそれらは、独特の協調的フォールド化種（unique, co-operatively folded species）形成と一致するＳ字形加熱アンフォールディング転移を有した。
【００５６】
＜結果および考察＞
デザイン原理：
コイルドコイルの疎水性コアを層中に作り上げた。コイルドコイルの通常のヘプタッド配列モチーフａｂｃｄｅｆｇは、コアに対する第一および第四部位(ａおよびｄ)に寄与する。平行ホモ二量体コイルドコイル、例えば標的化ロイシン−ジッパー構造−では、各層は各鎖からの側鎖のミラーリング化ペア、すなわち両ａ(both a)または両ｄ(both d)を含む。これらの部位での残基の選択は、オリゴマー状態の選択に大きく影響する（ハーバリー等（Harbury et al.）,サイエンス（Science）, 262(5138): 1401-1407, 1993；ウルフソン等（Woolfson et al.）,タンパク質科学（Protein. Sci）, 4(8), 1596-1607, 1995； ウォルシャウ等（Walshaw et al.）, ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー（Journal of Molecular Biology）, 307(5): 1427-1450, 2001）。したがって、全てのそのｄ部位Ｌｅｕおよびａ部位Ｉｌｅのうち１つを除いてすべてを有し(表１)、二量体を有するがしかし高次オリゴマーを有さないＣＳＰ−１を基準ロイシンジッパーとしてデザインした（ウルフソン等（Woolfson et al.）, タンパク質科学（Protein. Sci）, 4(8), 1596-1607, 1995；ゴンザレス等（Gonzalez et al.）, 天然構造生物学（Nature Struct. Biol）, 3(12): 1011-1018, 1996）。
【００５７】
配列−配列関係は、逆平行二本鎖コイルドコイルに関しては十分には確立されていない。さらにこれらの構造では、ａ：ｄおよびｄ：ａ対は代替的にコア中に整列する（オークリー等（Oakley et al.）, 構造生物学における最近の見解（Current Opinion in Structural Biology）, 3(10), 658-667, 2001）。ａ：ｄおよびｄ：ａ対間の区別は、単に、最初に指定された位置が線状配列中に最初に現れる残基を示すということである。それにもかかわらず、ｄでのＬｅｕとａでの主としてＩｌｅとの組合せは、このような構造に適合すると思われる（ウォルシャウ等（Walshaw et al.）, ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー（Journal of Molecular Biology）, 307(5): 1427-1450, 2001）。ａ：ｄアラインメントは、最初のデザインに関する明白な結果を有した：基準ヘプタッド反復を用いて、ＣＳＰ−１の酸化形態における巻きは、ａｂｃｄまたはｄｅｆｇａと符合し得る。より大きい柔軟性を得るために、後者を用いたが(表１参照)、これは巻きから生じる代替的なｄ：ａおよびａ：ｄ層を示した。適切な巻きデザインおよび末端でのＣｙｓ残基の配置によりこのレジスタを達成することを本発明者らは目標とした。ＣＳＰ−１に関しては、デザインされた巻きは、中心ａ部位にＬｙｓを作り上げた：この領域におけるらせん構造を不安定化するために、さらに局所配列を基礎となした(表１参照)。
【００５８】
らせん間電荷−電荷相互作用も、ペプチドデザインに組入れられた。平行構造では、連続ヘプタッド反復のｇおよびｅ残基は空間的に近づけて、コア残基と側面を接する。これに基づいて、多数のデザインが逆に荷電したｇ：ｅ対を用いて、特定のらせん−らせん相互作用を達成し（オシェア等（O'Shea et al.）, セル（Cell）, 68(4): 699-708, 1992;
オシェア等（O'Shea et al.）,最新生物学（Current Biology）, 3(10): 658-667, 1993;ヴィンソン等（Vinson et al.）, Genes Dev, 7(6): 1047-58, 1993; コーン等（Kohn et al.）,ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー（Journal of Molecular Biology）, 283: 993-1012, 1998）、４つのこのようなｇ：ｅ対がＣＳＰ−１デザインに含まれた。しかしながら逆平行コイルドコイルでは、ｇ：ｇおよびｅ：ｅ対がコアと側面を接する（モネラ等（Monera et al.）,生物化学会雑誌（Journal of Biological Chemical Society）, 268(26): 19218-19227, 1993; マクレイン等（McClain et al.）, 米化学会誌（Journal of American Chemical Society）, 123(13): 3151-3152, 2001; オークリー等（Oakley et al.）, 構造生物学における最近の見解（Current Opinion in Structural Biology）, 3(10): 658-667, 2001）。これを可能にするために、そして両標的構造中の好ましいらせん間電荷−電荷相互作用を促進するために、ＣＳＰ−１のＮおよびＣ末端間のｇ：ｅ対の極性を転移した。すなわち、Ｎ末端からＣ末端に、ｇ：ｅ対はＧｌｕ：Ｌｙｓ、Ｇｌｕ：Ｌｙｓ、Ｌｙｓ：Ｇｌｕ、Ｌｙｓ：Ｇｌｕを読取る。
【００５９】
最後に、各ペプチドに関しては、コイルドコイル配列にＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓトリペプチドが側面を接して(表１参照)、ジスルフィド結合によりそれらの末端を分子内結合させて、逆平行状態を促進した。
【００６０】
ペプチドの名称は、以下のように得られた：全て、コイルドコイル転移ペプチド（Coiled-coil Switch Peptide）に関してＣＳＰと呼んだ；デザイン反復を示すために、全て、ＣＳＰ−＃と数値を与えられた；分子内ジスルフィド架橋としてそれぞれ還元およびアルキル化された末端Ｃｙｓ残基を用いて、または分子内ジスルフィド架橋として酸化されたものを用いて試験されたかを示すために、全てに「ｒ」または「ｏ」の接尾辞を付けた。
【００６１】
親デザインＣＳＰ−１の特性：
平行コイルドコイル鋳型デザインＣＳＰ−１ｒを、以下のように確認した：まず、ＣＳＰ−１の遊離Ｃｙｓ残基をアルキル化して、実験中の酸化を防止した。ｐＨ７およびペプチド濃度１００μＭで、ＣＳＰ−１ｒはほぼ完全にらせんであった（円二色性(ＣＤ)分光分析により判定して９０％）（図２Ａ参照）。ペプチドの加熱アンフォールディング後に
行われたＣＤ分光分析は可逆的であり、協同転移を示すＳ字形曲線を生じた（図２Ｂ参照）。オリゴマー化系に関して予測されたように、アンフォールディングは濃度依存性であった；転移中点ＴMは、１０ｍＭ試料に関しては５０℃（データは示されていない）で、１００ｍＭペプチドでは６２℃に増大した。ｐＨ７で５℃での分析的超遠心分離（ＡＵＣ）を用いたＣＳＰ−１ｒの沈降平衡分析は、単量体−二量体平衡を明示したが（表２参照）、この場合、単一理想種を想定するデータの加重適合度（weighted fit）は、単量体Ｍr３７６１と比較して、６８８５の分子量を与えた。単量体−二量体モデルに対する適合度は、３３ｍＭという解離定数を生じた（表２参照）。これらのデータはすべて、デザインされたような安定コイルドコイル二量体を形成するＣＳＰ−１ｒと一致する。
【００６２】
ペプチドの還元化（しかしアルキル化されない）ならびにアルキル化したものを用いたＣＤおよびＡＵＣ測定値は、良好に類似した（データは示されていない）。
【００６３】
質量分析および沈降平衡分析により、ジスルフィド架橋ヘアピンＣＳＰ−１ｏを生じるためのＣｙｓ残基の分子内酸化を確認した。単一理想種を想定する沈降平衡データの加重適合度は、単量体Ｍr３６４３と比較して、３２６０の分子量を生じた（表２参照）。ＣＤ測定は、〜２０％のみのらせんと一致するＣＳＰ−１ｏの１００ｍＭ試料に関する限定部分フォールディングを示した（図２Ａ参照）。このシグナルは加熱時にほとんど変化せず（図３Ｂ参照）、一過性の構造（ephemeral structure）とほとんど一致しないかまたは良く一致し、そしてこの挙動はペプチド濃度により変化しなかった。これらのデータは、ＣＳＰ−１ｏがデザインされたように単量体であるが、しかしペプチドにおけるらせん構造は低く、一過性であり、すなわち、ＣＳＰ−１ｏは所望されたような良好ならせんヘアピンを形成しない、ということを示す。
【００６４】
ターン領域のデザイン変更：
ＣＳＰ−１ｏの不十分なフォールディングに関する一つの可能性は、ターン領域が密着しすぎることである。より多くの自由度を提供するための一方法は、単にループ長を増大することである（エフィモフ等（Efimov et al.）, タンパク質エンジニアリング（Protein Engineering）, 4(3), 245-250, 1991）。しかしながらループ長増大はタンパク質を不安定化させがちである（ナギ等（Nagi et al.）,フォールディングとデザイン（Folding & Design）, 2(1): 67-75, 1997; ヴィゲラ等（Viguera et al.）,天然構造生物学（Nature Structural Biology）, 4(11): 939-946, 1997）。さらに本発明のペプチドでは、挿入も平行２本鎖コイルドコイル標的に適合する必要があった。したがって本発明者らは、ＣＳＰ−１配列の中央に４つの残基を付加することを選択した。完全らせん二量体標的に関しては、これは付加的らせん巻きを潜在的に付加し、そしてＣＳＰ−１の中央ヘプタッドの代わりに１１残基（ヘンデカド（hendecad））反復を導入した。多鎖平行コイルドコイルは、このようなヘンデカド挿入物を耐容することが既知である（ルパス等（Lupas et al.）, TIBS, 21: 375-382, 1996; ブラウン等（Brown et al.）,タンパク質-構造機能と遺伝学（Proteins-Structure Function and Genetics）, 26(2): 134-145, 1996; ヒックス等（Hicks et al.）, フォールディングとデザイン（Folding & Design）, 2(3): 149-158, 1997; バークハード等（Burkhard et al.）, 細胞生物学における傾向（Trends
in Cell Biology）, 11(2): 82-88, 2001）。実際、そうでなければヘプタッドベースのコイルドコイル中の１〜６残基間の挿入物に関して、４残基挿入物が最も不安定化しにくい、ということを、近年、本発明者らは確認した（ヒックス等（Hicks et al.）, J. Struct. Biol., 137, 73-81, 2002）。最初にＣＳＰ−２において、ＣＳＰ−１の第二のヘプタッドのｆ位置の後にテトラグリシンを付加して、この考えを本発明者らは試験した（そうでない場合、配列は変更されなかった）（表１参照）。
【００６５】
テトラグリシン挿入がらせん−ヘアピンデザインを改善したか否かを調べるために、ジスルフィド架橋バージョンＣＳＰ−２ｏを本発明者らは作製し、特性化した。沈降平衡分
析は、ペプチドに関して予測されたものと非常に近い有効分子量を有する溶液中の単量体種を示した（表２参照）。ＣＳＰ−１ｏに関して用いたのと同一の緩衝液条件下で、ＣＳＰ−２ｏのＣＤスペクトルは、親ペプチドの約２倍のらせんシグナル（［Θ］222）を示した（図３Ａ）；これから、ＣＳＰ−２ｏは〜４０％がらせんである、と概算された。さらに、ＣＳＰ−２ｏの加熱アンフォールディングから、４０±２℃の中点を有するＳ字形転移が得られた（図３Ｂ参照）。したがってテトラグリシン挿入物は、所望されたように、らせん−ヘアピン状態の構造および安定性を改善した。
【００６６】
しかしながら還元形態のペプチドＣＳＰ−２ｒは、ＣＤスペクトルから判定した場合、部分的にフォールディングされただけであった(〜２０％のみらせんと一致)（図３Ａ参照）。それにもかかわらず、加熱アンフォールディング転移は、Ｓ字形曲線の後者部分および２２．２℃というＴMを示した（図３Ｂ参照）。しかしながら沈降平衡分析は、テトラグリシン挿入が、５℃においてでさえ、二量体化をかなり妨げることを示した。データは最良に適合して単一理想種を想定し、そして単量体に関して予測されたものに近い分子量に戻った（表２参照）。単量体−二量体への適合度は不十分で、１０〜１００ｍＭの範囲での弱解離定数を示した。
【００６７】
したがってＣＳＰ−２では、らせん−ヘアピン形態は安定化されたが、しかしこれはらせん−二量体状態を犠牲にした。おそらくテトラグリシンは、連続らせん鎖を破壊するため、ヘアピン形成に好都合であるが、さらに、それは、柔軟性がありらせん傾向が低いためにらせん二量体を不安定化する。したがってデザインの次の段階は、らせんヘアピンの全体性を保持するのに不十分な中央領域の柔軟性を保持しながら、らせん二量体の安定性の改善を要する。
【００６８】
ヘンデカド挿入物の改良型デザイン：
標的化ターン領域を緊密にするための、そしてらせん傾向を改善するための簡単な一方法は、テトラグリシンをテトラアラニンに置き換えることである。これは、もうひとつの本発明者らのデザイン系において働くが（ヒックス等（Hicks et al.）, 構造生物学雑誌（Journal of Structural Biology）, 137(1-2): 73-81, 2002）、しかし依然として平行二量体をかなり不安定化する。したがって本発明者らは、２つの外側グリシンをＡｌａに置き換えることのみを選択する。テトラペプチド挿入物の第二の位置は、潜在的に１１残基反復の埋もれたｈ部位である（ヒックス等（Hicks et al.）,フォールディングとデザイン（Folding & Design）, 2(3): 149-158, 1997; ハーバリー等（Harbury et al.）,サイエンス（Science）, 282(5393): 1462-1467, 1998）。ジアルジア・ランブリア（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）の細胞骨格タンパク質から取り出されたヘプタッド−ヘンデカド−ヘプタッド配列を有し、同意を得ているペプチドに関する初期の研究に基づいて（ヒックス等（Hicks et al.）, フォールディングとデザイン（Folding & Design）, 2(3): 149-158, 1997）、Ｌｙｓをこの部位に配置した。溶解度およびらせん傾向を改善するために、本発明者らは第三位置Ｇｌｎを作製した。したがってＣＳＰ−３では、ＧＧＧＧ挿入物をＡＫＱＡにより置換した。さらにらせん二量体中の別の潜在的に埋もれたリシンを（すなわち新規のｈ部位に）導入して、本発明者らは本来のデザインのａ部位のＬｙｓをＩｌｅに置き換えた（表１参照）。
【００６９】
ＣＳＰ−３ｒのＣＤスペクトルは、ＣＳＰ−２ｒの約３倍のらせん度の改善を示した（図３Ａ参照）。さらにこの構造は、Ｓ字形転移および４０±２℃のＴMを伴って、加熱によりアンフォールディングした（図３Ｂ参照）。ＣＳＰ−３ｒのらせん含量および安定性は濃度依存性であり、そして沈降平衡分析は単量体−二量体平衡を明示し、解離定数は１９１ｍＭであった。
【００７０】
その酸化形態ＣＳＰ−３ｏでは、ペプチドは、ＣＳＰ−２ｏよりもわずかに改善された
らせん度および熱安定性を示し（図２Ｃおよび図２Ｄならびに図３Ａおよび図３Ｂ参照）、そして沈降平衡分析は、ＣＳＰ−３ｏが単量体であることを確認した（表２参照）。
【００７１】
この段階で、合理的なデザインを確立していれば、両標的構造中の配列を査定できる（図２Ｃおよび図２Ｄ参照）。特にＣＳＰ−３に関しては、二量体およびらせん−ヘアピン形態に関するΔＴMは、１００μＭペプチドでちょうど９℃であった。本発明者らは、デザイン中に導入していた相互作用を検討することを選択した。これらの実験のための出発点は、ＣＳＰ−３であった。
【００７２】
デザインされたらせん間の塩架橋の影響：
ヘアピン状態の熱安定性に対するコア−フランキング荷電残基の寄与を評価するために、ｅおよびｇでの対合が交換されて逆平行コイルドコイルに不利益となる対照ペプチドを、本発明者らは調製した。親ペプチドにおいて４つの逆に荷電したｇ：ｅ対が導入されて平行二量体の形成に好都合であり、そしてペプチド全体の中途でそれらの極性を交換することによりこれらが逆平行らせんヘアピンに適合したということを思い起こしていただきたい。すなわちｇ：ｅ対は、配列に沿って、Ｇｌｕ：Ｌｙｓ、Ｇｌｕ：Ｌｙｓ、Ｌｙｓ：ＧｌｕおよびＬｙｓ：Ｇｌｕを読取る。これらを平行二量体デザインに適合させておくために、しかしながらヘアピン中で潜在的に反発性のｅ：ｅおよびｇ：ｇ相互作用を引き起こすために、本発明者らは極性を交換して、全てのｇ：ｅ対をＧｌｕ：Ｌｙｓ（ＣＳＰ−４）またはＬｙｓ：Ｇｌｕ（ＣＳＰ−５）にした（表１参照）。別の状況では、配列は同一のままであった。したがってＣＳＰ−３、４および５の組成は同一であった。本発明者らは、この種類のペプチドデザイン変更をアナグラム突然変異と呼ぶ。
【００７３】
ＣＳＰ−４ｏおよびＣＳＰ−５ｏはともに、ＡＵＣにおいて単量体として挙動した（表２参照）。両方の場合に、ペプチドは、親ＣＳＰ−３ｏよりわずかに低いらせん性であった（図３Ａ参照）。しかしながら興味深いことに、アナグラム突然変異体の両方が、ＣＳＰ−３ｏと比較して、約２０℃で、かなりそしてほぼ同一量、加熱により不安定化された。これは、シャッフリング実験と、そしてＣＳＰ−３ｏ中に存在する逆に荷電したｅ：ｅおよびｇ：ｇ対が逆平行標的を安定化するというデザイン原理と完全に一致する。
【００７４】
しかしながら、ＣＳＰ−４ｒおよびＣＳＰ−５ｒのコイルドコイル二量体状態に及ぼすデザイン変更ｇ：ｅ相互作用の影響は異なった。両ペプチドはらせん二量体を形成した（図３Ａおよび表２参照）が、しかしＣＳＰ−４ｒの熱安定性はＣＳＰ−３ｒよりも約８℃高く、一方、ＣＳＰ−５ｒの熱安定性は親より１２℃低かった（図３Ｂ参照）。ＣＳＰ−４ｒとＣＳＰ−５ｒの熱安定性におけるこの２０℃の差に関して考え得る説明としては、以下のものが挙げられる：１)ｇ：ｅ対の極性は、局所らせん双極子またはらせんキャッピングに影響を及ぼすが、しかしながらこの作用は同様に逆平行状態に影響を及ぼす、と当然推定し得るが、これは観察されなかった。あるいは、２）ｇ：ｅでのＧｌｕ：Ｌｙｓ対は、平行二量体状態における対応するＬｙｓ：Ｇｌｕ対よりエネルギー的により好ましい。本発明者らは、コイルドコイルペプチドにおける静電的相互作用を試験するよう意図した別の系において同様の作用を観察しているので、この第二の説明の方を選ぶ（JM シップウェイ（Shipway）と  DN ウルフソン（Woolfson）、未発表）。
【００７５】
図３Ｂに示したデータの生成に際して系統的誤差を生じた、ということが判明した。誤差は、正しい値より５℃ペプチドが安定であることを示すために図３Ｂに示されたデータに生じた。この誤差は、結果の実際的意味に影響を及ぼさない。
【００７６】
ヘンデカド挿入物の操作：
平行二量体ＣＳＰ−３ａを安定化するための試みにおいて、ｈのリシンを疎水性残基に置き換えることを本発明者らは決定した。異なる種類の残基がｈ位置で観察される（ブラ
ウン等（Brown et al.）, タンパク質−構造機能と遺伝学（Proteins-Structure Function and Genetics）, 26(2): 134-145, 1996; ヒックス等（Hicks et al.）, フォールディングとデザイン（Folding & Design）, 2(3): 149-158, 1997）が、しかしｈでの残基の選択をより明確に誘導するのを助けるための非基準的ヘンデカド領域を包含する二量体コイルドコイルの高分解能構造の非常に少ない例が存在する。構造は、ヌクレオチド交換因子ＧｒｐＥ（ＰＤＢ識別子１ｄｋｇ（ハリソン等（Harrison et al.）,サイエンス （Science）, 276(5311): 431-435, 1997））および中間体フィラメントタンパク質ビメンチンの２Ｂ領域（ＰＤＢ識別子１ｇｋ４（ストレルコフ等（Strelkov et al.）, EMBO （ジャーナル（Journal）, 21(6): 1255-1266, 2002））を含む。両方の場合に、ｈ位置での側鎖のａ−ｂ結合は、直接互いの方に向く。これは、基準コイルドコイル二量体のａおよびｄ部位でのノブからホールへの（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）パッキングと対照的であり、ノブからホールへの（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）パッキングの場合、側鎖は相補的並列相互作用を生成する（クリック等（Crick et al.）, Acta. Cryst., 6, 689-697, 1953;オシェア等（O'Shea et al.）,サイエンス（Science）, 254(5031): 539-44, 1991; ハーバリー等（Harbury et al.）,サイエンス（Science）, 262(5138): 1401-1407, 1993； ウォルシャウ等（Walshaw et al.）, ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー（Journal of Molecular Biology）, 307(5): 1427-1450, 2001）。ｈでの潜在的な境界側鎖は理想的でない；実際、ＧｒｐＥおよびビメンチンコイルドコイルのＳＯＣＫＥＴ分析（ウォルシャウ等（Walshaw et al.）, ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー（Journal of Molecular Biology）, 307(5): 1427-1450, 2001）は、非基準単位周囲のパッキングは、基準コイルドコイル界面におけるものと比較して、かなり弛緩される、ということを示した。これらの理由のために、ＣＳＰ−３〜ＣＳＰ−６デザイン反復におけるｈ位置の置換のために、小（およびらせんを好む）残基アラニンを、本発明者らは選択した（表１参照）。したがって、ＣＳＰ−６の指示されたａ、ｄおよびｈ位置は全て、疎水性であった。これと一致して、ＣＳＰ−６ｒのらせん度および熱安定度は、他のヘンデカド含有デザインＣＳＰ−２ｒおよびＣＳＰ−３ｒを上回って有意に増大し、純ヘプタッドベースのデザインＣＳＰ−１ｒと同等であった（図３ＡおよびＢ参照）。ＣＳＰ−６ｒが上記デザインと同様、二量体性であったことは重要である（表２参照）。しかしながら興味深いことに、ジスルフィド架橋形態ＣＳＰ−６ｏのらせん度および安定度はともに、ＣＳＰ−３ｏに関して記録されたものと同様であった。その結果、１００μＭのペプチド濃度で測定されたこれらのペプチドの還元および酸化形態間の熱安定度における差ΔＴMは、ＣＳＰ−３〜ＣＳＰ−６反復において約−１０℃から＋２２℃に増大した。
【００７７】
本発明のペプチドを調整するためには、標的立体配座状態間のΔＴMが低いことが必要とされる。もちろん、還元およびアルキル化ペプチドは二量体化するため、それらの熱安定度は濃度を変えることにより調整し得る。実際、１０μＭという低ペプチド濃度で、ＣＳＰ−６ｒは完全らせん二量体のままであったが、しかし６１±２℃というＴM低下を示した。それにもかかわらず、デザイン変更によりＣＳＰ−６に関するΔＴMを低減するために、ヘンデカド単位直後のａ部位のＩｌｅをＬｙｓに置き換えてＣＳＰ−７を生じることにより、平行二量体形態を不安定化することを、本発明者らは試みた（表１参照）。予測どおり、この置換は、ＣＳＰ−７ｒのらせん度および熱安定度の両方を折衷した（図３Ａおよび図３Ｂ参照）。酸化形態ＣＳＰ−７ｏの安定度は、より少ない影響を受けた。その結果、２つの状態間のΔＴMは、ＣＳＰ−６の約＋２２℃からＣＳＰ−７の−１３℃に低減された。
【００７８】
ＣＳＰ−３の酸化形態の還元形態への立体配座の転移の試験
ＣＳＰ−３の酸化形態(ＣＳＰ−３ｏ)を作製して３００μｌ（１００μＭ）にして、波長スキャンを前と同様に実施した。２２２ｎｍでのモル楕円率を記録した。その酸化形態からその還元形態へのペプチドの転移を誘導するために、ジスルフィド結合のための還元
剤を添加した。比較のために２つの還元剤、ＤＴＥおよびβ−メルカプトエタノールを、２０倍余分量（２ｍＭ）で用いた。
【００７９】
１００μＭのＣＳＰ−３ｏ＋２ｍＭの還元剤の試料を作製して、最終容積を３００μｌとし、迅速に混合して、時間スキャンを直ちに開始した。還元剤の添加後にスキャンを開始するのに要した時間を書き留めた。２２２ｎｍで、２０℃で時間スキャンを実施した。ペプチドが完全に還元されるまで、すなわちらせん度のさらなる変化が観察されなくなるまでの、応答時間は４秒、データピッチは１０秒であった。
【００８０】
一度転移実験が完了し、還元ペプチドのスペクトルを記録したら、波長スキャン(１９０〜２６０ｎｍ)を各試料に関して実施した。
【００８１】
酸化試料への余分量の還元剤の添加は、強制ジスルフィド結合を破壊させて、酸化状態から還元状態への転移を誘導した。ＣＤ分光分析による時間経過実験を用いて、転移反応を試験した（図４参照）。
【００８２】
ＤＴＥの存在下での立体配座切換えは、βＭＥの存在下の場合より迅速であった。還元はＤＴＥを用いた場合は７５分で完了したが、これに比してβＭＥの場合は１８０分であった。
【００８３】
時間経過反応から得たデータを、データ分析プログラム  オリジン（Origin）（ｖ．１１）を用いて分析した（図５参照）。
【００８４】
データ分析プログラム  オリジンを用いて、第一の反応に関する単一指数曲線を転移実験からのデータに適合させた。曲線に関する方程式を以下に示す。
ｙ＝Ａｅ-kt＋Ｂ
（式中、Ａ＝シグナルの振幅
Ｂ＝初期シグナル
ｋ＝速度定数
ｔ＝時間）
【００８５】
これにより反応に関する速度定数（ｋ）を生成し、次にこれを用いて、反応に関する半減期（ｔ1/2）を、以下の方程式を用いて決定した：
ｔ1/2＝１ｎ２／ｋ
【００８６】
この分析を、βＭＥを用いた還元実験のために反復した（図６参照）。
【００８７】
ＤＴＥの存在下での反応の速度は、βＭＥを用いたものより速い。これはすなわち、ＤＴＥに関するより短い半減期を生じる（表３参照）。
【００８８】
結果は、ペプチドＣＳＰ−３が酸化形態から還元形態に立体配座を変更し得る、ということを示す。
【００８９】
＜結論＞
簡単な配列−構造規則および反復デザインアプローチを用いて、らせん二量体および単量体らせんヘアピンに関する配列および構造二重性を有するペプチド、すなわち、２つのパターンが重ね合わせられ、一方が二量体ロイシンジッパーと適合性で、そして他方が逆平行コイルドコイルに関する配列を操作することに、本発明者らは成功した。特定の実験において、らせん−ヘアピン状態はジスルフィド架橋を用いて末端を架橋することにより支持され、一方、代替的コイルドコイル二量体は末端Ｃｙｓ残基を還元させたままで保持
することにより支持された。デザイン工程の出発点は、基準ロイシン−ジッパー鋳型ＣＳＰ−１であり、これは、確立されたデザイン規則に基づいてｄｅ  ｎｏｖｏで構築された。このペプチドは、還元状態で予測されたように二量体らせん構造を形成したが、しかし酸化状態では不十分にフォールディングされただけであった。次の段階で、本発明者らは中心非ヘプタッド（non-heptad）単位をペプチド中に導入した（ＣＳＰ−２および上記）。これは、本発明者らのデザイン工程の成功において重要な特徴であった。１１残基(ヘンデカド)単位は、らせんヘアピンにおけるターンのためにより高い柔軟性を可能にしたが、しかしらせん−二量体状態とも適合性であった。標的化モチーフの構造および安定性を最適化するためにはヘンデカド／ターン単位の多少の操作を要し、これは少数の反復で達成された。
【００９０】
後者ＣＳＰ−３、ＣＳＰ−６およびＣＳＰ−７デザインに関するデータの比較は、興味深い（図３Ａおよび図３Ｂ参照）：還元二量体形態は広範囲の熱安定度を示した（ＴMは、それぞれ４０、７５および３４±２℃であった）が、一方、酸化状態に関するものは非常に緊密であった（ＴMはそれぞれ５０、４７および５３±２℃）。したがってヘンデカド挿入物を導入することにより一旦デザインがらせん−ヘアピン標的と適合性にされれば、この構造は配列変化に対して代替的らせん二量体より低感受性になった。これに関する有力な説明は、ヘアピン状態において、ヘンデカドが大部分は２つのらせん領域を一緒に結びつけるためのターンとして作用し、そしておそらくは構造の疎水性コアにほとんど寄与しない、というものである。しかしながら二量体形態では、ヘンデカドのａ、ｄおよびｈ部位の残基はほぼ確実に疎水性界面に寄与し、したがって構造の全体的安定性に寄与する。本実施例は、試みられた型の立体配座転移が二量体状態における相互作用に集中することにより調整され得る、ということを実証する。別の点に関しては、ＣＳＰ−６は、ヘアピンおよび二量体形態(後者はより安定である)間の熱安定度の最大差を示す。したがってその酸化ヘアピン状態のペプチドを用いる場合、形成される二量体は今日のデザインの全ての中で最もストレスを受けまたはフラストレートされたものとみなされ得る。言い換えれば、酸化形態から還元形態への転移において得られる安定化エネルギーは、他のデザインの場合より多い。本発明者らはトリガーとしてジスルフィド結合を用いて酸化還元転移をデザインしたので、酸化および還元状態の安定度の差は、結合の酸化還元電位を調製するための道筋を提供し得る。同一のデザイン原理を用いて、細胞生物学における応用のための調整可能な酸化還元センサーが開発され得る（オステガード等（Ostergaard et al.）, EMBO ジャーナル（Journal）, 20(21): 5853-5862, 2001）。ここに示されたデザインは、ｐＨ（チョン等（Zhong et al.）, 分子細胞（Molecular Cell）, 2(1): 101-108,
1998; スケール等（Skehel et al.）, 生化学の年次論評（Annual Review of Biochemistry）, 69: 531-569, 2000およびキャベゾン等（Cabezon et al.）, EMBO ジャーナル（Journal）, 20(24): 6990-6996, 2001）および小リガンド結合（ミゾウエ等（Mizoue et al.）, 構造生物学における最近の見解（Current Opinion in Structural Biology）, 12:
459-463, 2002）のような溶液条件のより微妙な変化に応答する立体配座転移を操作するためにも用いられ、これが潜在的にペプチドベースのセンサーへの道筋を開く（ゴシュ等（Ghosh et al.）, 米化学会誌（Journal of the American Chemical Society）, 122(23): 5658-5659, 2000）。
【００９１】
上記に引用した文書は全て、参照により本明細書中で援用する。
【００９２】
【表１】
2006515273.tif 000003
【００９３】
【表２】
2006515273.tif 000004
【００９４】
【表３】
2006515273.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】ロイシンジッパーのリボン構造（２ｚｔａ、二量体コイルドコイル）およびセリルｔＲＮＡシンターゼからのらせん腕（helical arm）（１ｓｅｒ、逆平行二本鎖コイルドコイル）を示す。
【図２Ａ】還元およびアルキル化形態（実線）ならびに分子内酸化形態（破線）でのＣＳＰ−１に関するＣＤスペクトルを示す。
【図２Ｂ】還元およびアルキル化形態（実線）ならびに分子内酸化形態（破線）でのＣＳＰ−１に関する加熱アンフォールディング曲線を示す。
【図２Ｃ】還元およびアルキル化形態（実線）ならびに分子内酸化形態（破線）でのＣＳＰ−３に関するＣＤスペクトルを示す。
【図２Ｄ】還元およびアルキル化形態（実線）ならびに分子内酸化形態（破線）でのＣＳＰ−３に関する加熱アンフォールディング曲線を示す。
【図３Ａ】デザイン工程によるＣＳＰペプチドの還元および酸化変異体のらせん度の要約を示す。２２２ｎｍでＣＤシグナルの絶対値により測定したらせん度。×印および実線は還元およびアルキル化ペプチドに関するものであり、○印および破線は酸化ペプチドに関するものである。
【図３Ｂ】デザイン工程によるＣＳＰペプチドの還元および酸化変異体の熱安定度の要約を示す。加熱アンフォールディング曲線の中点（ＴM）として測定した安定度。×印および実線は還元およびアルキル化ペプチドに関するものであり、○印および破線は酸化ペプチドに関するものである。
【図４】ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）およびβ−メルカプトエタノール（βＭＥ）の存在下で還元が完了するのに要した時間を示すグラフである。
【図５】ＤＴＥの存在下でのペプチドＣＳＰ−３の立体配座転移を示すグラフである。
【図６】βＭＥの存在下でのペプチドＣＳＰ−３の立体配座転移を示すグラフである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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2006515273.tif 000017
2006515273.tif 000018
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