(57)【要約】本発明は、医薬に、特にガンの化学療法に有益な予後予測方法に関する。本発明の目的は、固定、又は固定され、且つパラフィンにて包埋された組織のＥＲＣＣ１発現レベルを評価するため、及び患者の腫瘍細胞におけるＥＲＣＣ１ｍＲＮＡの量を試験により白金を基本とした化学療法を決定する方法を提供し、ならびにそれに対し所定の閾値発現レベルと比較する方法を提供することである。より具体的には、本発明が、オリゴヌクレオチド・プライマー対にＥＲＣＣ１を、及びＥＲＣＣ１ｍＲＮＡのレベルを検出するためにこれらの使用を含む方法を提供する。
2004518429.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の腫瘍を治療するための白金を基礎とする化学療法を決定する方法において、
（ａ）  腫瘍の組織試料を得、そしてその試料を固定することによる、固定された腫瘍組織を得る工程；
（ｂ）  固定された腫瘍組織からｍＲＮＡを単離する工程；
（ｃ）  ストリジェントな条件下ＥＲＣＣ１遺伝子領域にハイブリダイズする１対のプライマーを用いてｍＲＮＡの増幅を行い、増幅された試料を得る工程；
（ｄ）  増幅された試料においてＥＲＣＣ１ｍＲＮＡ量を決定する工程；
（ｅ）  内部コントロール遺伝子のｍＲＮＡ量と、工程（ｄ）からのＥＲＣＣ１ｍＲＮＡ量とを比較する工程；及び
（ｆ）  増幅された試料のＥＲＣＣ１ｍＲＮＡ量、及びＥＲＣＣ１遺伝子発現に対する所定の閾値に基づいて白金を基本とする化学療法の構成を決定する工程；
を含む方法。
【請求項２】
オリゴヌクレオチド・プライマーが、オリゴヌクレオチド・プライマー対ＥＲＣＣ１，又は実質的にそれに同じオリゴヌクレオチド・プライマー対から成る請求項１記載の方法。
【請求項３】
腫瘍が、非小細胞の肺ガン（ＮＳＣＬＬＣ）の腫瘍である請求項１記載の方法。
【請求項４】
ＥＲＣＣ１遺伝子発現の閾値レベルが、内部コントロール遺伝子発現レベルの約６．７ｘ１０−３倍である請求項１記載の方法。
【請求項５】
患者の腫瘍を治療するための白金を基本とする化学療法の処方にて腫瘍を治療する方法において、
（ａ）  腫瘍の組織試料を得、そしてその試料を固定ことによる、固定された腫瘍組織を得る工程；
（ｂ）  固定された腫瘍組織からｍＲＮＡを単離する工程；
（Ｃ）  ＥＲＣＣ１遺伝子領域にストリジェントな条件下にてハイブリダイズする１対のオリゴヌクレオチド・プライマーを用いてｍＲＮＡを増幅処理し、増幅された試料を得る工程；
（ｄ）  増幅された試料におけるＥＲＣＣ１ｍＲＮＡ量を決定する工程；
（ｅ）  内部コントロール遺伝子のｍＲＮＡ量と、工程（ｄ）からのＥＲＣＣ１ｍＲＮＡ量を比較する工程；及び
（ｆ）  ＥＲＣＣ１遺伝子に対する決定された遺伝子発現レベルが、所定の閾値より低い場合、遺伝子毒性薬剤を含む白金を基本とする化学療法の処方を提供する工程；
を含む方法。
【請求項６】
前記腫瘍が、非小細胞の肺ガン（ＮＳＣＬＬＣ）腫瘍である請求項５記載の方法。
【請求項７】
遺伝子毒性薬剤が、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）又その組み合わせである請求項５記載の方法。
【請求項８】
固定し、パラフィン包埋の組織試料におけるＥＲＣＣ１発現レベルを決定する方法において、
（ａ）  組織試料の脱パラフィンを行い、脱パラフィンされた試料を得る工程；
（ｂ）  効果的な量のカオトロピック薬剤の存在下、脱パラフィン化した試料からｍＲＮＡを単離する工程；
（ｃ）  ＥＲＣＣ１遺伝子領域にストリジェント条件下にてハイブリダイズする１対のオリゴヌクレオチド・プライマーを用いるｍＲＮＡを増幅処理し、増幅された試料を得る工程；
（ｄ）  内部コントロール遺伝子のｍＲＮＡの定量化に対するＥＲＣＣ１ｍＲＮＡ量の定量化を決定する工程；
を含む方法。
【請求項９】
オリゴヌクレオチド・プライマーの対が、オリゴヌクレオチド・プライマーの対ＥＲＣＣ１、又は実質的にそれに類似した１対のオリゴヌクレオチド・プライマーから成る請求項８記載の方法。
【請求項１０】
内部コントロール遺伝子がβ−アクチンである請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記ｍＲＮＡの単離処理が以下により、
（ａ）  有効な濃度のカオトロピック化合物を含む溶液における組織試料を、約７５から１００℃の範囲の温度、約５分から１２０分の時間により加熱する工程；及び
（ｂ）  前記カオトロピック溶液から前記ｍＲＮＡを回収する工程；
によって行われる請求項８記載の方法。
【請求項１２】
配列番号１の配列を有するオリゴヌクレオチド・プライマー及び／又はそれに実質的に同一のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号２の配列を有するオリゴヌクレオチド・プライマー及び／又はそれに実質的に同一のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
オリゴヌクレオチド対ＥＲＣＣ１又はそれに実質的に同一のオリゴヌクレオチド対、を含むＥＲＣＣ１遺伝子の発現を検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、医療、特にガンの化学療法に有益である予後予測の方法に関する。より具体的に本発明は、患者の腫瘍細胞遺伝子の発現を評価（ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）することに関する。ＤＮＡを標的とする化学療法としての薬剤、特に白金を基本とする方法にてＤＮＡに損傷を与える薬剤により治療された患者の生存性が、ヒトのＤＮＡの修復に関与する遺伝子から発現されるｍＲＮＡを検査することにより評価される。
【０００２】
発明の背景
正常な細胞が腫瘍性に形質転換を受け、そして悪性細胞に成った時に、ガンが生じる。形質転換された（悪性の）細胞が、細胞の現象型の特定及び細胞増殖を抑制するという正常な生理的制御を回避する。したがって個人の体内にて形質転換された細胞が、増殖し腫瘍を形成する。腫瘍が見い出だされる時、臨床目的としては、個人が治療を受ける時に、悪性細胞を選択的に破壊するが、正常細胞に生ずる何らかの損傷を緩和させることである。
【０００３】
化学療法は、ガン細胞に選択的な毒性（細胞毒性）のある薬剤を使用することに基づいている。一般的分類の幾つかの化学療法薬剤が、核酸の合成、タンパク質の合成、及び他の生体の代謝過程を妨害する薬剤を含めて、開発されてきた。これらは、一般的抗代謝薬剤として言及されている。他の分類の化学療法薬剤が、細胞ＤＮＡに損傷を与える。こうした分類の薬剤は、一般的に遺伝子毒素として言及されている。よく所望される化学療法薬剤又はその薬剤の組み合わせに対し個体の腫瘍形成の感受性が、試用治療期間の後にしか正確に評価することができない。成功しなかった試験期間に使われた経過時間にて、進行の急激な悪性腫瘍の臨床治療に重大な危険が提示される。
【０００４】
細胞ＤＮＡの損傷における修復は、重要な生物的プロセスであり、細胞の酵素ＤＮＡ修復機構により行われる。細胞ゲノムの未修復損傷部が、ＤＮＡの複製を阻害し、新に生成されるＤＮＡの正しい複製に傷害を与え、及び／又は細胞の生存に必要な遺伝子発現を阻害する可能性がある。
【０００５】
従って一般的に遺伝子毒性薬剤は、不活性期の非分裂細胞よりＤＮＡ合成に働く活性な分裂細胞に有為的に強い毒性があると、考えられる。体内の多くの組織の正常な細胞が不活性期であり、そして細胞サイクルの再入及び分裂を頻繁に行うわけではない。細胞分裂周期間の時間が有意的に長くなれば、化学療法の遺伝子毒素にて行われた正常細胞ＤＮＡの損傷を、修復することができる。結果としてガン細胞を殺すための幾つかの選択が行われる。多くの治療処方では、これら一般分類に２以上属する化学療法薬剤を、共に投与することにより、ガン細胞に対する選択性の改良するための試行には、反映されている。
【０００６】
固形状の腫瘍における有効な化学療法は、薬剤を組み合わせることが必要なことから、単一のそれぞれの薬剤に対する抵抗性又は感受性の決定剤を、同定しそして定量することが、組み合わせ化学療法を個体に処方する重要なツールとなってきた。
【０００７】
細胞ＤＮＡの損傷に示され、広く用いられている２種の遺伝子毒性の抗ガン剤は、シスプラチン（ＤＤＰ）及びカルボプラチンである。近年シスプラチン及び／又はカルボプラチンが、呼吸、胃腸及び生殖管の、中空神経系の、及び頭部や首における鱗状器官の、ガン腫及び肉腫を含む、上皮及び間葉細胞の選択された、多様な腫瘍新生物質の治療に用いられる。他の薬剤と組み合わせたシスプラチンが、精巣ガン腫瘍の治療に好まれ、そして多くの例において継続的に快癒方向になるか、消失状態を形成する（Ｌｏｅｈｒｅｒらの１９８４，１００ Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．７０４）。シスプラチン（ＤＤＰ）が、鎖内に付加物を形成しＤＮＡ構造を破壊する。ＤＤＰなどの白金系薬剤に対する抵抗性が、白金付加物に対する寛容性を高め、薬剤の蓄積を減少させ、あるいはＤＮＡの修復を高めることに帰することになる。ＤＤＰへの抵抗性が多因性であるが、おそらくＤＮＡ修復機構の変化が重要な役割を果たしている。白金系薬剤により形成されるなどの塊状ＤＮＡ付加物の切除（ｅｘｃｉｓｉｏｎ）による修復には、ＤＮＡ損傷の認識、及び切除（ｅｘｃｉｓｉｏｎ）に関与する遺伝子が介在すると見られる。ＣｌｅａｖｅｒらのＣａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １１：８７５−８８２（１９９０）；Ｈｏｅｉｊｍａｋｅｒｓ らのＣａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２：３１１−３２０（１９９０）；Ｓｈｉｖｊｉ らのＣｅｌｌ ６９：３６７−３７４（１９９２）を参照。実際に酵素ＤＮＡ修復機構の１又は複数の要素における遺伝子欠陥を誘導する細胞が，シスプラチンに極めて高い感受性を有す。Ｆｒａｖａｌらの（１９７８），５１ Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．１２１，Ｂｅｃｋ ａｎｄ Ｂｒｕｂａｋｅｒ（１９７３），１１６Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｏｌ １２４７を参照。
【０００８】
切除修復交差−相補（（ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）（ＥＲＣＣ１））遺伝子が、ＤＮＡ付加物の修復に必須である。ヒトＥＲＣＣ１遺伝子がクローンされてきた。Ｗｅｓｔｅｒｖｅｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１０：４２５−４２８（１９８４）；Ｔａｎａｋａ ら、Ｎａｔｕｒｅ３４８：７３−７６（１９９０）を参照。
【０００９】
その幾つかを、この遺伝子に欠陥のあるヒト及びハムスターの変異化細胞株を用いることにより研究し、そしてびヒト腫瘍組織を研究することにより、ＥＲＣＣ１によりコードされる産生物が、白金−ＤＮＡ付加物の切除による修復に関与していることが明示された。Ｄａｂｈｏｌｋａｒら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８４：１５１２−１５１７（１９９２）；Ｄｉｊｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：６０５８−６０６２（１９８８）；Ｈａｎｓｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：３５−４０（１９９０）を参照。
【００１０】
ＤＮＡ−修復欠陥ＣＨＯ細胞にトランスフェクトされた時、ＥＲＣＣ１が、白金−ＤＮＡ付加物を修復できると共にシスプラチンに細胞抵抗性を与える。Ｈａｎｓｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：３５−４０（１９９０）を参照。切除による修復の最近受け入れられたモデルが、損傷の認識／切除する工程が、切除修復過程における速度の限定を示唆している。
【００１１】
白金を基本とする治療を受けているガン患者から悪性細胞におけるＥＲＣＣ１などの切除修復遺伝子発現の相対的なレベルが、研究されてきた。Ｄａｂｈｏｌｋａｒら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８４：１５１２−１５１７（１９９２）を参照。胃ガン患者のＥＲＣＣ１の過剰発現が、腫瘍応答にマイナスの刺激を有し、シスプラチン（ＤＤＰ）／フルオロウラシルの化学療法としての処方により治療された場合、最終的に生存することが報告されている（Ｍｅｔｚｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １６：３０９，１９９８）。最近の実証として、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ（ＧＥＭ））が、ＥＲＣＣ１ヌクレオチド切除修復（ＮＥＲ）活性を調節することを明示している。従って腫瘍内部のＥＲＣＣ１の発現レベルが、ＤＤＰであるかどうかを決定する主要な予後予測因子となり、そしてＧＥＭがガン患者の療法に有効となるであろう。
【００１２】
組織的な分析と、その後のアーキバル保存（ａｒｃｈｉｖａｌ ｓｔｏｒａｇｅ）ができるよう、大部分の病理試料が、一定に固定され且つパラフィンに包埋（ＦＲＥ）される。従って大部分の生検組織の試料は、遺伝子発現の分析に有益でない、それはこうした研究には、遺伝子発現が正確に測定できるよう、ＲＮＡの高い集合性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）が必要である。最近の遺伝子発現レベルは、タンパク質発現レベルを監視するための免疫組織化学による染色処理を用いることにより、こうした固定した包埋試料を定性的にのみ監視することができる。
【００１３】
現在まで、ＥＲＣＣ１発現のものを含む定量的な遺伝子発現の研究が、新鮮な組織又は凍結組織からＲＮＡの逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅に限定されてきた。Ｒｅｅｄらによる米国特許第５，７０５，３３６では、卵巣腫瘍組織からＥＲＣＣ１ｍＲＮＡを定量し、そしてその組織が白金を基本とする化学療法に感受性であるかどうか決定する方法が、開示されている。Ｒｅｅｄらは、凍結された卵巣腫瘍の生検からのＥＲＣＣ１のｍＲＮＡを定量化した。
【００１４】
Ｒｅｅｄら記載のようにヘルス・ケアーの専門家による凍結組織を使用すると、実質的に不都合であることが提示されている。ＲＮＡによる定量性の遺伝子マーカ・アッセイを計画している場合に、組織及び後のｍＲＮＡの変性を避けるために生検を迅速に搬送することが、重要な関心事である。生検を行うヘルス・ケアーの専門家が、組織試料のレシートに基づいてＲＮＡ抽出手法を迅速に行うよう備えられた施設に前記組織試料を、迅速に搬送しなければならない。こうした施設が利用できない場合、療法する人が、ｍＲＮＡの変性を防止するよう試料を迅速に凍結しなければならない。組織及びＲＮＡが変性する前に、こうした診断施設に有効に抽出できるよう、診断施設に到着するまで、前記組織試料が、冷凍状態を維持されなければならない、しかしながら遠方になる場合がある。ある場合、液体窒素やドライアイスを備えた特別搬送装置（ｃｏｕｒｉｅｒｓ）を用いて輸送中の凍結組織の挿入可能性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を維持することは、来るだけで極めて経費が高くなる。
【００１５】
定まった生検は、基質（ストローマ）及び腫瘍組織の異種混合物を含む。新鮮又は凍結組織とは異なるＦＰＥ生検組織試料は、容易に顕微解剖され、そしてストローマーと腫瘍組織に分離され、そのため新鮮又は凍結組織を使用するより有意的な利点を提供する。しかしながら、固定組織、特に固定され、パラフィン包埋の組織からＲＮＡを単離すると、高いＲＮＡの変性が生じ、それが遺伝子発現の研究に一般的に適応することができない。
【００１６】
生物による試料からＲＮＡを精製するには、多くの技術が存在するが、ＦＰＥ試料からＲＮＡの単離には、全く信頼性がない。たとえば、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ（米国特許第５，３４６，９９４号）では、フェノール及びグアニジン・イソチオシアネートを用いて液相分離により組織から、ＲＮＡを精製する方法が記載されている。生物としての試料を、フェノール及びグアニジン・イソチオシアネート水溶液にて均質化し、その後均等化された溶液にクロロホルムを混合した。その後遠心分離により均質化された質物を、有機相、中間相、及び水溶液相に分離する。有機相にタンパク質を、中間相にＤＮＡを、水溶液相にＲＮＡが分けられる。ＲＮＡを水溶液相から沈殿させることができる。残念ながら、固定、及びパラフィン包埋の（ＦＰＥ）組織試料に、この方法を適用することができない。
【００１７】
ＲＮＡを単離するための他の周知な技術では、典型的にグアニジン塩かフェノール抽出物のいずれかが利用され、それは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、（１９８９）ａｔ ｐｐ．７．３−７．２４，ａｎｄ ｉｎ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、（１９９４） ａｔ ｐｐ．４．０．３−４．４．７における例として記載されている。再度周知の方法では、パラフィン包埋の組織試料からＲＮＡの単離における再生可能な定量結果が、全く提供されなかった。
【００１８】
従ってパラフィン包埋の組織からＲＮＡを単離する技術が、特に腫瘍組織の遺伝子発現の研究に必要とされ、その理由として特定のリセプター又は酵素の発現レベルを、特定治療の成功の可能性を決定するため使用できるからである。
【００１９】
提示された遺伝子毒性ガン治療の早期予後予測を提供するためのパラフィン包埋の組織からＥＲＣＣ１ｍＲＮＡを定量化する方法が必要である。結果として、固定、及びパラフィン包埋（ＦＰＥ）の組織におけるＥＲＣＣ１の定量化を得るための努力が、成功していないが技術的に集中して行われてきた。従って本発明の目的は、固定、及びパラフィン包埋（ＦＰＥ）の組織におけるＥＲＣＣ１レベルの評価、及びＤＮＡ損傷剤による治療に患者の腫瘍の抵抗可能性を予後予測する方法を提供し、患者の腫瘍細胞におけるＥＲＣＣ１ｍＲＮＡ量の調査、ＤＮＡ・白金処理剤により生成されるＤＮＡに、ある種の損傷の創生、及びそれと所定の閾値発現レベルのと比較する工程を提供することである。
【００２０】
発明の要約
本発明の１つの観点において、固定、及びパラフィン包埋（ＦＰＥ）の腫瘍細胞から得られるＥＲＣＣ１ｍＲＮＡ発現のレベルを評価するための方法を提供する。
【００２１】
本発明の別の観点において、固定、及びパラフィン包埋（ＦＰＥ）の組織試料から内部分子コントロールに対するＥＲＣＣ１ｍＲＮＡの発現量を定量する方法を提供する。この方法は、前記試料から全ｍＲＮＡの単離、及び内部分子コントロール遺伝子のｍＲＮＡの定量に関するＥＲＣＣ１ｍＲＮＡ量の決定を含む。
【００２２】
本発明のこの観点の例において、ＥＲＣＣ１−５０４Ｆ（配列ＩＤ番号１）又はＥＲＣＣ１−５４７Ｒ（配列ＩＤ番号２）の配列、及び実質的にそれに同一の配列を有するオリゴヌクレオチド・プライマーを提供する。さらに本発明は、配列ＩＤ番号１又は配列ＩＤ番号２、あるいはそれに相補する配列に、ストリジェント条件下にてハイブリダイズする配列を有するオリゴヌクレオチド・プライマーを提供する。
【００２３】
本発明のさらに別の観点において、固定、及びパラフィン包埋 （ＦＰＥ）の腫瘍試料からＲＮＡを単離する工程、試料中のＥＲＣＣ１の遺伝子発現レベルを決定する工程、試料中のＥＲＣＣ１遺伝子の発現レベルと、所定のＥＲＣＣ１遺伝子に対する閾値レベルとを比較する工程、そして所定の閾値レベルとＥＲＣＣ１遺伝子の発現レベルとの比較の結果に基づいて化学療法の構成を決定する工程を含む、患者に対する化学療法の処方を決定する方法を提供する。
【００２４】
さらに本発明は、ｐｒｅ−ＴａｑＭａｎＴＭ技術により分析された試料の内部コントロールに対する周知のＥＲＣＣ１発現レベルに対し、ＴａｑＭａｎＴＭ技術を用いて分析される組織試料における内部コントロール遺伝子に対するＥＲＣＣ１の補正されていない遺伝子発現（ＵＧＥ）を、正規化する方法に関する。
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明が、腫瘍におけるＥＲＣＣ１ｍＲＮの量が、ＤＮＡと白金による薬剤にて治療された患者の生存性と関係するということを、ある程度見出している。ＥＲＣＣ１ｍＲＮＡを高レベルに発現する腫瘍を有する患者が、白金を基本とする化学療法に抵抗性があり、そのことが、生存可能性のレベルが有意的に低いと考えられる。逆にいえば、ＥＲＣＣ１ｍＲＮＡ発現量の低い腫瘍のある患者が、白金を基本とする化学療法に感受性があると考えられ、有意的に高レベルの生存可能性を有している。患者の腫瘍におけるＥＲＣＣ１ｍＲＮＡの相対的発現が、それを所定の閾値発現レベルと比較することにより判定される。
【００２６】
本発明は、内部コントロールの遺伝子発現に対し、固定、及びパラフィン包埋（ＦＰＥ）の組織におけるＥＲＣＣ１ｍＲＮＡの発現量を定量化する方法に関する。本発明者が、固定、及び包埋の組織におけるＥＲＣＣ１の発現を正確にアセスメントできるオリゴヌクレオチド・プライマーを開発した。本発明によるオリゴヌクレオチド・プライマーであるＥＲＣＣ１−５０４Ｆ（配列ＩＤ番号第１）、ＥＲＣＣ１−５７４Ｆ（配列ＩＤ番号第２）、又は実質的にそれに等しいオリゴヌクレオチド・プライマーが、固定、及びパラフィン包埋（ＦＰＥ）の腫瘍試料から抽出されたＲＮＡと共に使用される。次にこのＥＲＣＣ１の遺伝子発現の測定が、白金を基本とする化学療法の予後予測のため使用することができる。
【００２７】
本発明のこうした例は、第１が、ＦＰＥ試料からＲＮＡの信頼性のある抽出を行う方法、及び第２が、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を行うための、１対のオリゴヌクレオチド・プライマー、好ましくはオリゴヌクレオチド・プライマー対であるＥＲＣＣ１−５０４Ｆ（配列ＩＤ番号１）及びＥＲＣＣ１−５７４Ｒ（配列ＩＤ番号２）、又はそれに実質的に等しいオリゴヌクレオチドを使用することによる試料中のＥＲＣＣ１ｍＲＮＡ含量の決定、を含んでいる。ＲＮＡが、１９９９年１２月２０日に出願された米国特許出願番号０９／４６９，３３８に記載され、そしてその全体を引例として本明細書取り入れられている、こうした試料からｍＲＮＡを単離するいずれかの方法にて、ＦＰＥ細胞より抽出される。
【００２８】
本方法は、患者のある種の組織に適応することができる。腫瘍組織の抵抗性を試験するためには、腫瘍組織を試験することが好ましい。好ましい例において、腫瘍が得られる患者から１部の正常組織を、さらに試験する。正常組織が、白金を基本とする化学療法の化合物に抵抗性があり、すなわち有意的に高いレベルのＥＲＣＣ１遺伝子の発現を示すと期待されが、腫瘍が、こうした化合物に感受性があり、すなわち有意的に低いレベルのＥＲＣＣ１遺伝子の発現を示すと、期待される、その患者が、化学療法化合物を有意的に高い量にて治療することが可能である。
【００２９】
閾値より低いＥＲＣＣ１遺伝子発現レベルを示す患者が、化学療法化合物の有意的に高い量にて治療することが可能であり、その理由が閾値より高いＥＲＣＣ１遺伝子発現レベルを発現する腫瘍を有する患者より有意的に高い生存可能性を有すると期待されるからである。
【００３０】
別の観点として、閾値レベルより高いＥＲＣＣ１遺伝子発現レベルを発現する腫瘍を有する患者が、示された予測として低い生存可能性に対し、化学療法から有意な利点を何も引き出すことができないことを、臨床者が決定することができる。
【００３１】
本発明の方法は、広範囲な腫瘍の種類に適用することができる。これは、個人の「腫瘍発現の形状（ｐｒｏｆｉｌｅｓ）」に備えることが出来、これによりＥＲＣＣ１の発現レベルが、個々の患者の試料にて決定され、そして種々の化学療法に対する応答が予測される。好ましくは、本発明の方法が、固形状の腫瘍に適用され、最も好ましくは、非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）腫瘍に適用されることである。特定種の腫瘍に本発明による幾つか適用例では、白金を基本とする化学療法に特定のＥＲＣＣ１発現と臨床的抵抗性との関連性を可能にするデータセットを翻訳することにより、生存可能性に対するＥＲＣＣ１遺伝子発現レベルの関係を確認することが好ましい。
【００３２】
本明細書に定義されているような「所定の閾値レベル」は、腫瘍が、白金を基本とする化学療法による処方に対し、抵抗性のある可能性が見出された補正した相対レベルのＥＲＣＣ１腫瘍発現である。この閾値レベルより低い腫瘍発現レベルが、白金を基本とする化学療法による処方に対する腫瘍の感受性に見出されるはずである。ＥＲＣＣ１の補正された相対発現の範囲が、ＥＲＣＣ１の率として表され、すなわち白金を基本とする化学療法による処方に応答する腫瘍中のβ−アクチンが、約６．７ｘ１０−３より少ない。白金を基本とする化学療法による処方に応答しない腫瘍が、ＥＲＣＣ１の相対発現、すなわち約６．７ｘ１０−３より多いβ−アクチン率を有している。実施例４を参照。
【００３３】
さらに「所定の閾値レベル」は、白金を基本とする化学療法による処方を受けた患者が、生存の可能性の低いと考えられる腫瘍の補正された相対的ＥＲＣＣ１発現レベルとして定義される。白金を基本とする化学療法による処方を受けている患者の閾値より低い腫瘍の補正された相対ＥＲＣＣ１発現レベルが、患者の高い生存可能性と関係している。閾値による補正相対ＥＲＣＣ１発現が、ＥＲＣＣ１：β−アクチンの比率として表され、約６．７ｘ１０−３、図１である。実例４を参照。しかしながら、本発明は、内部コントロール遺伝子としてβ−アクチンの使用に限定していない。
【００３４】
本発明のこの実例の方法を行うには、腫瘍細胞を患者から単離することが好ましい。固形又はリンパ様腫瘍又はその１部が、患者から外科的に切除されるか、又は定まった生検により得られる。凍結又は新鮮な試料から単離されたＲＮＡが、典型的な先行技術としてのいずれかの方法により細胞から抽出される、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｉｓｃｈｅｒ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，（２ｎｄ ｅｄ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８９）を参照。抽出過程中ＲＮＡの変性を避けるための配慮が行われることが、好ましい。
【００３５】
しかしながら、生検の後患者から得られた組織が、通常はホルマリン（ホルムアルデヒド）又はグルタルアルデヒド、あるいはアルコールの液浸により良く固定される。固定化された生物的な試料が、しばしば脱水、及び当業者に周知のパラフィン又は他の固形状支持体に包埋される。さらに非包埋の、固定組織を、本方法にて使用することができる。こうした固形支持体を、試料のため有機溶媒にて除去することができ、その後の保持されていた組織を再水和できることが想定される。
【００３６】
ＲＮＡが、１９９９年１２月２０に出願された米国特許出願第０９／４６９，３３８号に記載され、その実体を引例としてここに取り入れられているいずれかの方法によりＦＰＥ細胞から抽出される。本明細書に記載されている、固定、及び包埋（ＦＰＥ）の組織試料が、保存可能又は記録保持可能な組織試料を指している。ＲＮＡが、最初に脱パラフィン化した記録保持可能な病理試料又は生検試料より単離することができる。例示的な脱パラフィン法は、たとえばキシレンなどの有機溶媒によりパラフィン化された試料を洗浄する工程を含む。脱パラフィン化した試料を、低級アルコール水溶液により再水和することができる。適切な低級アルコールには、たとえばメタノール、エタノール、プロパノール、及びプタノールが含まれる。脱パラフィン化試料が、たとえば濃度を減少させて低級アルコールにて洗浄を続けて再水和することができる。別の選択肢として、その試料には、脱パラフィン化及び再水和が同時に行われる。その後ＲＮＡがその試料から抽出される。
【００３７】
ＲＮＡを抽出するための固定試料又は固定及び脱パラフィン化試料が、装置、音波又は均質化させる他の手段を用いて均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｄ）することができる。
【００３８】
再水和された試料が、グアニジウム・チオシアネート（グアニジウム・イソチオシアネートとしても販売されている）などのカオトロピック剤を含む溶液にて均質化することができる。均質化された試料を、カオトロピック溶液中約５０から１００℃の温度範囲にて加熱し、そこには、グアニジウム化合物などのカオトロピック剤の有効量を含む。好ましいカオトロピック剤が、グアニジウム・チオシアネートである。
【００３９】
ＲＮＡが、カオトロピック剤のない状態にて単離されたものより約１０倍以上の量を、パラフィン包埋の試料から精製されるように、「カオトロピック剤の有効濃度」が選択される。カオトロピック剤は、グアニジウム化合物、尿素、ホルムアミド、ヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ポタジウム・チオシアネート、及び同様の化合物を含む。本発明による方法の好ましいカオトロピック剤は、グアニジウム・イソチオシアネート（グアニジウム・チオシアネートとしても販売されている）、及びグアニジウム・ハイドロクロライドなどのグアニジウム化合物である。多くのアニオンイオンの対イオン（ｃｏｕｎｔｅｒｉｏｎｓ）が有益であり、当業者がこうした適切なアニオンによる多くのグアニジウム塩を調製することができる。本発明に用いられるグアニジウム溶液の有効な濃度が、約１から約５Ｍの範囲、好ましくは約４Ｍの値の濃度を有する。ＲＮＡがすでに溶液中にあるならば、試料における達成すべき最終濃度が、約１から約５Ｍの範囲であるよう有意的に高い濃度にすることができる。さらにグアニジウム溶液は、Ｔｒｉｓ−Ｃｌなど適切な生化学緩衝液により、好ましくは約３から約６のｐＨ、より好ましくは約４のｐＨの緩衝液とされる。カオトロピック溶液が、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、及びβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）などの還元剤を含むことができる。さらにカオトロピック溶液が、ＲＮＡｓｅ阻害剤を含むことができる。
【００４０】
均質化された試料が、カオトロピック溶液中約５０から約１００℃の範囲の温度に加熱することができ、そこには、グアニジウム化合物などのカオトロピック剤の有効量を含む。好ましいカオトロピック剤が、グアニジウム・チオシアネートである。
【００４１】
次にＲＮＡが、たとえばフェノール・クロロホルム抽出、イオン交換クロマトグラフィ、又はサイズ排除クロマトグラフィにより、溶液から回収される。次にＲＮＡを、抽出、電気泳動、クロマトグラフィ、沈降法、又は他の適切な技術を用いて、さらに精製することができる。
【００４２】
新鮮、凍結又は固定されたものから精製された全ｍＲＮＡより、ＥＲＣＣ１ｍＲＮＡを定量化すること、たとえば技術的に共通する逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法を用いて行うことが好ましい。ＥＲＣＣ１ｍＲＮＡの定量化のもう１つの方法では、たとえば分子ビーコン、及び複数のＰＣＲに有益な他の標識化されたプローブの使用が含まれる。さらに本発明は、ＩｎｖａｄｅｒＴＭＡｓｓａｙ（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）とよく似た、たとえば蛍光標識化プローブを用い、ＰＣＲのない系の使用によりＥＲＣＣ１ｍＲＮＡの定量化が予測される。最も好ましくは、ＥＲＣＣ１ｃＤＮＡ及び内部コントロール又はハウスキーピング遺伝子（たとえばβ−アクチン）が、蛍光を基本とする実時間検出方法（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００又は７９００配列検出系（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ［ＴａｑＭａｎＴＭ］，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ．）又はＨｅｉｄら記載の（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １９９６；６：９８６−９４４）及びＧｉｂｓｏｎら記載の（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １９９６；９９５−１００１）の同様の系を用いて行われる。ＡＢＩ７７００（ＴａｑＭａｎＴＭ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）の出力が、Ｃｔ’ｓ、つまり「サイクル閾値（ｃｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓ）」に発現される。ＴａｑＭａｎＴＭ系の場合、試料中に非常に多くの標的分子を有する高い発現遺伝子が、有意的に少ない標的分子（高いＣｔ）を伴う相対発現の低い遺伝子より、有意的に少ないＰＣＲサイクル（低いＣｔ）を伴うシグナルを生成する。
【００４３】
本明細書に用いられるように、「ハウスキーピング」遺伝子又は「内部コントロール」が、構成的又は全体的に発現される任意の遺伝子を含むことを意味し、これらの存在が、ＥＲＣＣ１ｍＲＮＡレベルを評価を可能にする。こうした評価は、遺伝子転写の全体にわたる構造的レベルの決定、及びＲＮＡ修復の変化に対するコントロールを含む。「ハウスキーピング」遺伝子、又は「内部コントロール」が、シクロピレン遺伝子、βアクチン遺伝子、トランスフェラーゼ受容体遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子などを含むが、それに限定されない。最も好ましくは、ＥａｄｓらのＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９９；５９：２３０２−２３０６に記載のβアクチン遺伝子である。ＲＮＡ修復の変化に対するコントロールには、「調整（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）ＲＮＡ」の使用が必要である。「調整（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）ＲＮＡ」が、予め正確に定量されたコントロールＲＮＡの任意な利用資源であると、意図されたものである。好ましくは、Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃａｔ．＃７３５０１７）が用いられる。
【００４４】
本明細書に用いられる「非補正遺伝子発現（Ｕｎｃｏｒｒｅｃｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＵＧＥ））」が、ＴａｑＭａｎＴＭ装置によって生成される内部コントロール遺伝子に対するＥＲＣＣ１発現の数値による出力を言及している。ＵＧＥを決定するために使用される式が、実施例３に示され、図２に試料の計算値を表している。
【００４５】
さらに本発明の観点は、非ＴａｑＭａｎＴＭ技術から誘導される「周知の相対遺伝子発現」により、ＴａｑＭａｎＴＭ 装置から要求される非補正遺伝子発現（ＵＧＥ）を正規化する方法を提供する。好ましくは、周知の非ＴａｑＭａｎＴＭから誘導される相対ＥＲＣＣ１、すなわちβアクチンの発現値が、組織試料からのＴａｑＭａｎＴＭから誘導されるＥＲＣＣ１ ＵＳＧ値により正規化される。
【００４６】
本明細書に用いられている「補正された相対ＥＲＣＣ１発現」は、正規化されたＥＲＣＣ１発現を指しており、これによりＵＧＥを、ＥＲＣＣ１特定補正因子（ＫＥＲＣＣ１）と乗して、内部コントロール遺伝子に対するＥＲＣＣ１発現レベルの周知の範囲と比較することのできる値となっている。実施例３及び図２に、これらの計算の細部を示している。これらの数値は、特定試料の「補正された相対ＥＲＣＣ１発現」が、「所定の閾値」レベルより上になるか下になるかを、決定することができる。βアクチンのレベルに対する補正された相対ＥＲＣＣ１発現の所定の閾値レベルが、約６．７ｘ１０−３である。ＥＲＣＣ１に対して特異的なＫＥＲＣＣ１である、内部コントロールβアクチン及び調整剤（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）、Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃａｔ．＃７３５０１７）が、１．５４ｘ１０３である。
【００４７】
「周知の相対遺伝子発現」値が、前に分析された組織試料から誘導され、そして構造的に発現される内部コントロール遺伝子（たとえばβアクチン、ＧＡＰＤＨなど）に対する標的遺伝子のＲＴ−ＰＣＲシグナル比に基づいている。
【００４８】
好ましくはこうした組織試料が、ホルマリンに固定、及びパラフィン包埋の試料であり、そしてＲＮＡが、実施例１にて、及び１９９９年１２月２０に出願され、その全体を引例により本明細書に組み入れられた米国特許出願第０９／４６９，３３６記載の手順に従って、ここから抽出される。内部コントロールに対する遺伝子発現を定量化する技術的に周知な標準定量ＲＴ−ＰＣＲ技術が、用いられる。Ｐｒｅ− ＴａｑＭａｎＴＭ技術ＰＣＲ反応が、サイクルの固定数（すなわち３０）として行われ、そして終点における値がそれぞれの試料に対して記載されている。次にこれらの値が、βアクチンに対するＥＲＣＣ１発現の率として記載されている。Ｒｅｅｄらによる米国特許番号第５，７０５，３３６に、記載されている。
【００４９】
ＫＥＲＣＣ１を、βアクチン以外の内部コントロール遺伝子及び／又はＨｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃａｔ．＃７３５０１７）より異なる較正ＲＮＡに対し、決定することができる。それをするために、そうした特定の内部コントロール遺伝子にＥＲＣＣ１の発現が、すでに決定されている（すなわち「周知の相対遺伝子発現」）組織試料に、内部コントロール遺伝子と較正剤といてのＲＮＡとを共に較正しなければならない。好ましくは、こうした組織試料は、ホルマリンによる固定、及びパラフィン包埋の（ＦＰＥ）試料であり、そしてＲＮＡが、実施例１において、及び１９９９年１２月２０日に出願され、その全体が引例により本明細書に取り入れられている、米国特許出願番号第０９／４６９，３３８に記載されている方法にしたがって、これらから抽出される。そうした決定が、標準のｐｒｅ−ＴａｑＭａｎＴＭ、技術的に周知の計量的なＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて行うことができる。そうした決定下、こうした試料が、実施例３に記載された新規な内部コントロール、及び／又は較正剤（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）ＲＮＡに対し特異的な新規なＫＥＲＣＣ１の決定に有益なＥＲＣＣ１の「周知な相対遺伝子発現」レベルを有している。
【００５０】
本発明の方法は、広範囲な組織及び腫瘍類に適用でき、そうしたことが、患者の臨床治療の評価として、そして胸部、頭部及び首部、肺、食道、結腸、及びその他の部分を含むある種のガンに対する診断又は予後予測のツールとして使用することができる。好ましい例における本方法は、Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ（ＮＳＣＬＣ）の予後予測に適用される。
【００５１】
前化学療法治療の腫瘍生検が、一般的に極めて少量の不均質組織だけを含む、固定され、パラフィン包埋（ＦＰＥ）の組織としてのみ、通常利用することができる。ＥＲＣＣ１遺伝子発現が、ストロマ組織により感染されない腫瘍組織において決定できるように、そうしたＦＰＥ試料が、顕微解剖に容易に対処することができる。さらにそうした試料が両方の種類の組織をしばしば含むことから、生検組織試料内のストロマと腫瘍組織との間における比較を、行うことができる。
【００５２】
一般的にＥＲＣＣ１遺伝子領域を側面に位置する（ｆｌａｎｋｓ）任意のオリゴヌクレオチド対を、本発明の方法を行うために用いることができる。本発明に使用するためのＥＲＣＣ１遺伝子領域にストリンジェントな条件下にてハイブリダオズするプライマーが、２０−１０００の間の塩基対、好ましくは５０−１００の間の塩基対、最も好ましくは１００以下の塩基の産生物を増幅する。
【００５３】
本発明は、特異的なオリゴヌクレオチド・プライマー、及びそれに実質的に同一のオリゴヌクレオチド・プライマーを提供し、それが、ＦＰＥ組織におけるＥＲＣＣ１発現の特定の正確な評価を可能にする。好ましくは、オリゴヌクレオチド・プライマー、ＥＲＣＣ１−５０４Ｆ（配列ＩＤ番号第１）、及びＥＲＣＣ１（配列ＩＤ番号第２）、（さらにオリゴヌクレオチド・プライマー対ＥＲＣＣ１として本明細書に言及されている）、及びそれに実質的に等しいオリゴヌクレオチド・プライマーである。オリゴヌクレオチド・プライマー、ＥＲＣＣ１−５０４Ｆ（配列ＩＤ番号第１）、及びＥＲＣＣ１（配列ＩＤ番号第２）が、ストリンジェントな条件下にてＥＲＣＣ１遺伝子（配列ＩＤ番号第７）にハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡを単離する何らかの方法によって、ＦＰＥ細胞より抽出したＲＮＡを使用すると、ＥＲＣＣ１ｍＲＮＡレベルを測定するため特に有効であることが示され、たとえば実施例１及び１９９９年１２月２０日に出願され、その全体に対し引例により本明細書に取り入れられている、米国特許出願第０９／４６９，３３８に記載されている。
【００５４】
本明細書に使用される核酸の内容における「実質的な同一」は、ストリジェントな条件下における標的にハイブリダイゼーションすることを意味し、さらにその核酸断片又はこれらの相補鎖が、比較される場合、適切なヌクレオチドの挿入、欠失を伴う適正に構成された場合と同一であり、その正しい構成が、少なくとも約６０％のヌクレオチド、典型的に少なくとも約７０％のヌクレオチド、より典型的に少なくとも約８０％のヌクレオチド、一般的に少なくとも約９０％、及びより一般的に少なくとも約９５−９８％のヌクレオチドである。ハイブリダイゼーションが、特異性の全体的な欠損よりも有意的に高い選択性である場合、選択的ハイブリダイゼーションが存在する。Ｋａｎｅｈｉｓａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：２０３−２１３（１９８４）を参照。
【００５５】
本発明は、オリゴヌクレオチド・プライマー配列であるＥＲＣＣ１−５０４Ｆ（配列ＩＤ番号１）、その相補鎖、又はＥＲＣＣ１−５７４Ｒ（配列ＩＤ番号２）、又はその相補鎖の全て、又は１部に、ストリジェントな条件下（本明細書にて明示されたように）にてハイブリダイズする、実質的に同一のオリゴヌクレオチドを含む。
【００５６】
ストリジェントなハイブリダイゼーションの条件下、高い相補鎖、つまり実質的に同様の核酸配列のみハイブリダイズする。好ましくは、そうした条件が、２０連続するヌクレオチドから４以上のミスマッチ、より好ましくは２０連続するヌクレオチドから２以上のミスマッチ、最も好ましくは、２０連続するヌクレオチドから１又は複数のミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを阻止する。
【００５７】
核酸のハイブリダイズする部分が、典型的には少なくとも１０（たとえば１５）の長さのヌクレオチドである。ハイブリダイズ核酸のハイブリダイズする部分が、オリゴヌクレオチド・プライマーＥＲＣＣ１−５０４Ｆ（配列ＩＤ番号１）、その相補鎖、又はＥＲＣＣ１−５７４Ｒ（配列ＩＤ番号２）、又はその相補鎖の１部又は全ての配列に、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも９５％、又は最も好ましくは９８％の同一である。
【００５８】
ストリジェントな条件下、核酸試料にオリゴヌクレオチド・プライマーをハイブリダイゼーションすることが、以下に明示されている。核酸の二重化又はハイブリット化の安定性が、溶融温度（Ｔｍ）として表され、それは、プローブが標的ＤＮＡから解離する温度である。この溶融温度が必要なストリジェントな条件を明確にするために用いられる。プローブに実質的に同一である配列が同定されるなら、同定よりむしろ、相同ハイブリダイゼーションのみが、特定濃度の塩（たとえばＳＳＣ又はＳＳＰＥ）によって生ずる最低温度を最初に確立することが、有益である。次に１％のミスマッチが生ずると、Ｔｍの温度が１℃低くなると想定され、従ってハイブリダイゼーション反応における最後の洗浄温度が、低下する（たとえばプローブと９５％以上相同である配列が求められる場合、最終の洗浄温度が５℃だけ低くなる）。実際にＴｍの変化が、１％のミスマッチ当り０．５℃と１．５℃の間となる得る。
【００５９】
ストリジェントな条件では、５ｘＳＳＣ／５ｘＤｅｎｈａｒｔ’ｓ溶液／１．０％のＳＤＳ、６８℃にてハイブリダイズすること、及び０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、室温にて洗浄することが含まれる。中位のストリジェントな条件は、３ｘＳＳＣ、４２℃にて洗浄することを含む。塩濃度及び温度のパラメータを、プライマーと標的核酸との間を同定する最適なレベルを実現するため変化させる。さらにこうした条件に関する指針として、先行技術、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｉｓｃｈｅｒ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，（２ｎｄｅｄ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８９） ａｎｄ Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌらｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９４）を容易に利用することができる。
【００６０】
本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド・プライマーが、固定又は固定及びパラフィン包埋の組織、及び凍結又は新鮮な組織におけるＥＲＣＣ１遺伝子発現を正確に評価（ａｓｓｅｓｍｅｎｔ）することができる。このことは、ＦＰＥ試料から誘導されるＲＮＡが、新鮮又は凍結された組織のＲＮＡに対し有意的に断片化されるという事実にかかわらずである。
【００６１】
従って、本発明の方法は、ＦＰＥ組織におけるＥＲＣＣ１発現レベルの評価の使用に適切であり、今まで、固定された組織を用いるＥＲＣＣ１遺伝子発現を評価する方法がなかった。
【００６２】
腫瘍にて発現されるＥＲＣＣ１ｍＲＮＡの量を測定することから、技術専門家が、特定の遺伝子毒に対する腫瘍の臨床における抵抗性、又は特定の遺伝子毒を受ける患者の生存可能性に関する予後予測を可能にする。白金を基本とする化学療法又は同様の種類のＤＮＡ損傷を含む化学療法が、好ましい遺伝子毒である。
【００６３】
白金を基本とする化学療法にてＤＮＡが「塊状付加物」となり、ここで最初の影響として二重ラセンの３次元構造を変形させることである。こうした化合物が、単独又はゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ（Ｇｅｍ））又は５−フルオロウラシル（５−Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ（５−ＦＵ））などの別の化学療法を伴い投与される手段である。白金を基本とする遺伝子毒性化学療法が、共有結合のＤＮＡ付加物を形成する重金属の配位化合物を含む。一般的にこれらの重金属がＤＮＡと共有結合し、適切な部分にｃｉｓ−イントラストランド−ジヌクレオチド・付加物を形成する。一般的にこれらの分類が、ｃｉｓ−ジアミンジクロロプラチニウム（ＩＩ）（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、及びｃｉｓ−ジアミン−（１，１−シクロブタンジカルボキシレイト）プラチニウム（ＩＩ）（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ｃｉｓ−ジアミノ−（１，２−シクロヘキシル）ジクロロプラチニウム（ＩＩ）、及びｃｉｓ−（１，２−エチレンジアミン）ジクロロプラチニウム（ＩＩ）により表される。最初の白金の薬剤には、前記任意の代表的化合物に類似するか又は誘導される化合物が含まれる。
【００６４】
白金配位化合物により現段階で治療可能な腫瘍が、髄芽腫及び神経芽腫を伴う精巣、子宮内膜、頚部、胃、鱗状細胞、副腎皮質、及び小細胞悪性腫瘍を含む。そのＤＮＡ付加物を迅速に修復するため、Ｔｒａｎｓ−ジアミンジクロロプラチニウム（ＩＩ）（ｔｒａｎｓ−ＤＤＰ）が、臨床的に実用的でないと考えられる。本明細書の化学療法の薬剤としてＴｒａｎｓ−ＤＤＰの使用では、選択されない細胞における毒性が低く、選択された細胞における毒性が相対的に高い化合物を提供できることになる。好ましい例における白金化合物は、シスプラチンである。
【００６５】
一般的に多くの化合物が、白金を基本とする化学療法の薬剤により与えられる。たとえば、ＢＥＰ（ブレオマイシン、エトポシド、シスプラチン）が、睾丸ガンに使用され、ＭＶＡＣ（メトトレキシエイト（ｍｅｔｈｉｔｒｅｘａｔｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、シスプラチン）が、膀胱ガンとして用いられ、ＭＶＰ（ミトマイシンＣ、ビンブラスチン、シスプラチン）が、非小細胞肺ガンの治療に用いられる。多くの研究にて、白金含有薬剤の間の相互作用が記載されている。たとえば、治療薬剤の相乗作用では、白金を基本とする化学療法に含まれる多くの強力な薬剤が報告されている。これに対し最近の非常に簡潔な文章の文献一覧、すなわちＯｋａｍｏｔｏらの、Ｕｒｏｌｏｇｙ２００１；５７：１８８−１９２．；Ｔａｎａｋａらの、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ２０００；２１：３１３−３１５；Ｓｌａｍｏｎらの、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ２００１；２８：１３−１９；Ｌｉｄｏｒらの、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １９９３；９２：２４４０−２４４７；Ｌｅｏｐｏｌｄらの、ＮＣ１ Ｍｏｏｒｓｅｌ らの、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｒｎａｌ ｏｆ Ｃｓｎｃｅｒ １９９９；８０：９８１−９９０を含む。
【００６６】
別の遺伝子毒性薬剤は、永続的な遺伝子損傷を形成する薬剤であり、ガンの臨床治療における化学療法薬剤として使用するには、好ましい。遺伝子毒素に誘発されるＤＮＡ損傷の細胞修復の割合、及び細胞分裂サイクルを介した細胞の増加率が、遺伝子毒素による治療の結果に影響を与える。
【００６７】
修復されない細胞ゲノムの損傷が、ＤＮＡの複製を阻害し、新たに合成されるＤＮＡの複製適合性を損じ、細胞の生存に必要な遺伝子発現を妨げることになる。従って遺伝子毒性薬剤における細胞毒性の１つの決定因子（細胞の死に寄与する傾向性）が、細胞を修復に対し、そこから形成されるゲノム損傷の抵抗因子である。永続的なゲノムの損傷を形成する、たとえば少なくとも細胞が細胞サイクルを入るまでゲノムに残っている遺伝子毒性薬剤が、一般的に一過性にて、容易に修復される遺伝子損傷を形成する薬剤より有意的に効果的な細胞毒素である。
【００６８】
多くのガン治療に使用され、ＥＲＣＣ１発現レベルに有意に影響される一般的分類の遺伝子毒性化合物が、ＤＮＡアルキル化剤、及びＤＮＡ挿入剤である。ソラーレン（ｐｓｏｒａｌｅｎｓ）は、遺伝子毒性化合物であり、乾癬、白斑、菌による感染、皮膚におけるＴリンパ腫など皮膚疾患を光化学療法における治療に有益であると知られている。Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｐａｒｔ２ Ｃａｒｄｉｎａｌ Ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｄｉｓｅｓｅ，Ｃｈ．６０（１２ｔｈ ｅｄ．１９９１）を参照。ＤＮＡをアルキル化又はＤＮＡに挿入可能なメンバーの他の一般分類の遺伝子毒性化合物が、合成及び天然に供給される抗生物質を含む。本明細書に特に関係のあるもののうち、抗腫瘍性の抗生物質があり、それが以下の化合物すなわち、アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）；アクチノマイシン（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）Ａ、Ｃ、Ｄ（別にはジアクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）として知られている）又はＦ（別にはＫＳ４）；アザセリン（ａｚａｓｅｒｉｎｅ）；ブレオマイシン；カルミノマイシン（カルビシン）、デアウノマイシン（ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ）（デアウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ））又は１４−ヒドロキシデアウノマイシン（アドリアマイシン又はドキソルビシン）；ミトマイシンＡ、Ｂ又はＣ；ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；ポリカミシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）（ミトラミシン（ｍｉｔｈｒａｍｙｃｉｎ））；などにより表される上記分類の化合物を含むが、それに限定されない。
【００６９】
共通的に用いられそしてＤＮＡをアルキル化する更に別の分類の遺伝子毒性薬剤が、ハロエチルニトロソウレア、特にコロロエチルニトロソウレアを含む薬剤である。この広範囲な分類のうちの代表的なメンバーが、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ミムスチン、ラニムスチン及びストレプトゾトシンを含む。ハロエチルニトロソウレアの第１薬剤は、先の任意の代表的化合物に類似または誘導体でも良い。
【００７０】
ＤＮＡをアルキル化するメンバーである、さらに他の一般分類である遺伝子毒性薬剤には、硫黄及び窒素マスタードが含まれる。これらの化合物が、グアニンのＮ１７原子に共有結合した付加物を形成することによりほぼＤＮＡを損傷する。この広範囲な分類のうち代表的メンバーには、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、シクロホスフォアミド、イフォスフアミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、メチロロエタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｏｅｔｈａｍｉｎｅ）、ノベムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｉｎ）、トロフォスフォアミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）などが含まれる。ゲノム損傷の配位座として１又は複数の予め明示されたゲノム標的の選択が所望されると、選択された細胞ゲノムの特定配列と共有結合又は非共有結合して相互作用するオリゴヌクレオチド又はその類似物質が、遺伝子毒性薬剤としても用いることも可能である。
【００７１】
ＤＮＡをアルキル化するメンバーである、別の分類の薬剤は、エチレンイミン、及びメチルメラミンを含む。これらの分類では、たとえばアルトレトアミン（（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）ヘキサメチルメラミン）、トレエチレンフォスフォロアミド（ＴＥＰＡ）、トリエチレンチオフォスフォロアミド（ＴｈｉｏＴＥＰＡ）、及びトリエチレンメラミンが含まれる。
【００７２】
さらに別の分類のＤＮＡアルキル化薬剤には、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）として表されるアルキル・スルフォネート；ベンゾデパ（ｂｅｎｚｏｄｅｐａ）により表されるアジニジン（ａｚｉｎｉｄｉｎｅｓ）；たとえばミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）、ミトクサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、及びプロカルバジン（ｐｒｏｃａｂａｚｉｎｅ）により表される他の薬剤が含まれる。これら分類のそれぞれが、それぞれ表される化合物の類似物質及びその誘導物質を含む。
【００７３】
本発明が記載されているように、本発明の実施は、以下に提供される実験例によって表される。明示された例において用いられる材料及び方法が、種々の方法にて変更できるということが、当業者には理解できよう。こうした変更が、本発明の範囲内に入ると意図する。
【００７４】
実施例
実施例１
ＦＰＥ組織よりＲＮＡの単離
ＲＮＡｇａ，以下の一般手順によりパラフィン包埋の組織から抽出される。
【００７５】
Ａ．  切片の脱パラフィン化および水和処理：
（１）  約１０μＭの断片の１部を、１．５ｍＬのプラスチックの遠心分離チューブに入れる。
【００７６】
（２）  ６００μＬのキシレンを加え、そしてその混合物を室温（約２０から２５℃） にて、約１０分間激しく振動させる。
【００７７】
（３）  その試料を、ベンチ・トップ遠心分離機の最大速度（約１０−２０，０００ｘｇ）にて、室温で約７分間遠心分離にかける。
【００７８】
（４）  ほとんどのパラフィンが溶解されるまで工程２および３を、繰り返えす。元の試料部に含まれるパラフィン量により、通常は２回以上必要である。
【００７９】
（５）  キシレン溶液を、低級アルコール、好ましくは１００％エタノール（約６００μＬ）にて、３分間激しく振動させて除去する。
【００８０】
（６）  工程（３）と同様、チューブを約７分間遠心分離にかける。その上清液がデカント（ｄｅｃａｎｔｅｄ）され廃棄される。ペレットは白色となる。
【００８１】
（７）  工程５および６が、継続的に希釈をより多くするエタノール溶液、すなわち最初が約９５％のエタノール、次に約８０％、そして最後が約７０％のエタノールにより繰り返される。
【００８２】
（８）  その試料を、工程（３）と同様に室温にて７分間、遠心分離にかける。その上清液を廃棄し、そしてペレットを室温にて、５分間乾燥する。
【００８３】
Ｂ．フェノールとクロロホルムによるＲＮＡの単離
（１）  ０．５％のサルコシンおよび８μＬのジチオセレイトールを含む４００μＬのグアニジン・イソチオシアネート溶液を加える。
【００８４】
（２）  次にその試料を、組織ホモジェナイザー（Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ，ＩＫＡ−Ｗｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ）により、低速（速度１）から高速（速度５）の速度を、漸次増大させながら約２乃至３分間均質化する。
【００８５】
（３）  次にその試料を、約９５℃にて約５−２０分間加熱する。９５℃に加熱する前に、試料を含むチューブ・キャップに細い測定針を刺し入れることが、好ましい。他の選択肢として、そのキャップが、プラスチックのクランプ又は実験用フイルムにて貼り付けることができる。
【００８６】
（４）  次にその試料を、ｐＨ４．０の酢酸ナトリウムの５０μＬ ２Ｍとフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（１０：１．９３：０．０３６）の６００μＬとにより抽出する、その比の液は、イソアミルアルコールとクロロホルムとの比が１：４９の溶液３．６ｍＬとフェノール１８ｍＬとを混合することによる新たに調製されたものである。その溶液を約１０秒間激しく振動し、次に約１５分間氷上にて冷却する。
【００８７】
（５）  その溶液を、最大速度にて約７分間遠心分離にかける。上部（水溶液）の相を新しいチューブに移し変える。
【００８８】
（６）  そのＲＮＡを約１０μＬのグリコーゲン、及び４００μＬのイソプロパノールより、３０分間、−２０℃にて沈析させる。
【００８９】
（７）  そのＲＮＡを、ベンチトップ（ｂｅｎｃｈｔｏｐ）遠心分離機に、最大速度にて約７分間遠心分離することによりペレット化し、その上清液がデカント（ｄｅｃａｎｔｅｄ）さら、廃棄される。そしてそのペレットを、約７０から７５％のエタノールを約５００μＬにて洗浄する。
【００９０】
（８）  その試料を、７分間細大速度にて遠心分離にかける。その上清液をデカント（ｄｅｃａｎｔｅｄ）し、そしてペレットを空気乾燥する。次にさらなる実験用として、そのペレットを適切な緩衝液に溶解する（たとえば５０ｐＩ．５ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．０）。
【００９１】
実施例２
ｍＲＮＡ逆転写及びＰＣＲ
逆転写：ＲＮＡを、顕微解剖又は非顕微解剖にて、ホルマリンに固定し、パラフィン包埋（ＦＰＥ）の組織から単離し、その組織を、実施例１に示し、そしてそれが、１９９９年１２月２０日に出願され、その全体が引例により本明細書に組み入れられている米国特許出願第０９／４６９，３３８に上に記載されている。エタノールにより、次に遠心分離により沈降させた後、そのＲＮＡペレットを、５ｍＭのＴｒｉｓ／Ｃｌを５０μｌ、ｐＨを８．０にて溶解した。Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素が、デオキシヌクレオチドの存在下、１本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ鋳型にハイブリットされるオリゴヌクレオチドを伸長させ、相補鎖を生成させる。生成されたＲＮＡが、任意の６量体（ｈｅｘａｍｅｒｓ）及びＬｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｔａｓｅ）により逆転写される。逆転写が、「逆転写ミックス（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘ）」の２５．５μｌとＲＮＡ溶液２５μｌとを混合することにより行われた。その反応が、２６℃、８分間（任意の６量体（ｈｅｘａｍｅｒｓ）をＲＮＡに結合させるため）、４２℃、４５分間（Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素反応のため）、及び９５℃、５分間（ＤＮＡｓｅの熱による不活性化のため） 、サーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）にて行われた。
【００９２】
「逆転写ミックス」は、１０ｕｌ ５Ｘ緩衝液（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、３７５ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、任意の６量体（ｈｅｘａｍｅｒｓ） ０．５ｕｌ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌを５５０ｕｌ、ｐＨ７．５にて溶解された５０ Ｏ．Ｄ．）、５ｕｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）、５ｕｌ ０．１Ｍ ＤＴＴ、１．２５ｕｌ ＢＳＡ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌにおける３ｍｇ／ｍｌ 、ｐＨ７．５）、１．２５ｕｌ ＲＮＡ Ｇｕａｒｄ ２４、８００Ｕ／ｍｌ（ＲＮＡｓｅ阻害剤）（Ｐｏｒｃｉｎｅ ＃２７−０８１６、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）及び２．５ｕｌ ＭＭＬＶ ２００Ｕ／ｕｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ Ｃａｔ ＃２８０２５−０２）から成る。
【００９３】
反応成分の最終濃度は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ ｄＮＴＰ、１．０ｍＭ ＤＴＴ、０．００３７５．ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．６２Ｕ／ｕｌ ＲＮＡ Ｇｕａｒｄ ａｎｄ １０ Ｕ／ｕｌ ＭＭＬＶである。
【００９４】
ｍＲＮＡ発現のＰＣＲによる定量化
ＥＲＣＣ１ ｃＤＮＡ及び内部コントロール又はハウスキーピング遺伝子（たとえばβアクチン）ｃＤＮＡが、蛍光を基本とする実時間検出方法（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００又は７９００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ［ＴａｑＭａｎＴＭ］，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて行われ、その実時間検出方法が、Ｈｅｉｄら（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １９９６；６：９８６−９９４）；Ｇｉｂｓｏｎらの（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ１９９６；６：９９５−１００１）に記載されている。簡単に言うと、この方法では、順方及び逆方プライマー内を特異的にアニールする、２重に標識化された蛍光遺伝子ＴａｑＭａｎＴＭオリゴヌクレオチド・プローブ、（ＥＲＣＣ１−５３０Ｔｃ（配列ＩＤ番号３）、Ｔｍ＝７０℃）が、使用される。反応混合物を含むキャプされたウエル内をレザー刺激すると、そのプローブが、ＰＣＲ伸長中ＤＮＡポリメラーゼの５’から３’のヌクレアーゼ活性により切断され、そして３’レポータ染料（６ＦＡＭ）の発光を引き起こすまで、３’消光剤染料（ＴＡＭＲＡ）の発光が引き起こされる。したがって、アンプリコンの生成は、ＴａｑＭａｎＴＭのＣＣＤ（電荷結合素子）検出カメラにより検出される蛍光シグナルの発光を引き起こし、そしてＰＣＲ反応の純粋な指数成長の期間内の閾値サイクル（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）にて生成されるシグナル量が、関係する配列の開始する複製数を反映する。内部コントロール遺伝子の開始する複製数と関係配列の開始する複製数とを比較すると、相対遺伝子発現レベルが提供される。ＴａｑＭａｎＴＭの分析は、２つの測定絶対値（ａｂｓｏｌｕｔｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）間の比（関係遺伝子／内部コントロール遺伝子）として発現される値を生成する。
【００９５】
ＰＣＲ反応混合物が、調製されたｃＤＮＡを含む０．５μｌの逆転写反応物から成り、その調製されたｃＤＮＡでは、６００ｎＭ以上の各オリゴヌクレオチド・プライマー（ＥＲＣＣ１−５０４Ｆ（配列ＩＤ番号１）、Ｔｍ＝５９℃、及びＥＲＣＣ１−５７４Ｒ（配列ＩＤ番号２）、Ｔｍ＝５８℃）、２００ｎＭのＴａｑＭａｎＴＭプローブ（配列ＩＤ番号３）、５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，２００μＭの各ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，４００μＭのｄＴＴＰ，５．５ｍＭのＭｇＣｌ２，及び基準染料を含む１ｘＴａｑＭａｎＴＭ緩衝液、最終的に２５μｌ以下の容量（全ての薬剤がＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）が記載されている。サイクリング条件は、９５℃にて１０分間、その後９５℃にて１５秒間を４５サイクル、そして６０℃にて１分間である。内部コントロール遺伝子β−アクチンの定量化に使用されるオリゴヌクレオチドが、β−アクチン ＴａｑＭａｎＴＭプローブ（配列ＩＤ番号４）、β−アクチン−５２９Ｆ（配列ＩＤ番号５）、及びβ−アクチン−６５１Ｒ（配列ＩＤ番号６）であった。
【００９６】
オリゴヌクレオチド・プライマーＥＲＣＣ１−５０４Ｆ（配列ＩＤ番号１），及びＥＲＣＣ１−５７４Ｒ（配列ＩＤ番号２）、が上記反応に用いられ、７１ｂｐの産生物を増幅することになる。
【００９７】
実施例３
ＥＲＣＣ１に対する非補正遺伝子発現の決定：
２対の並行した反応、すなわち「試験」としての反応、及び「較正」としての反応が行われた。ＥＲＣＣ１増幅反応及びβ−アクチン内部コントロール増幅反応が、試験反応である。個々のＥＲＣＣ１及びβ−アクチン増幅反応が、較正物質（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）ＲＮＡ鋳型にて行われ、そして較正反応として言及される。ＴａｑＭａｎＴＭ装置では、４種の異なるサイクル閾値（Ｃｔ）値、すなわち試験反応からＣｔＥＲＣＣ１及びＣｔβ−ａｃｔｉｎ、及び較正反応からＣｔＥＲＣＣ１及びＣｔβ−ａｃｔｉｎが生成されことになる。２種の反応のＣｔ値における相違が、以下の式により決定される。
【００９８】
ΔＣｔｔｅｓｔ＝ ＣｔＥＲＣＣ１− Ｃｔβ−ａｃｔｉｎ    （「試験」反応から）
ΔＣｔｃａｌｉｂｒａｔｏｒ＝ ＣｔＥＲＣＣ１− Ｃｔβ−ａｃｔｉｎ    （「較正」反応から）
次の工程が、以下の式により、負のΔＣｔに数値２を上揚することを含む。
【００９９】
２−ΔＣｔｔｅｓｔ      （「試験」反応から）
２−ΔＣｔｃａｌｉｂｒａｔｏｒ    （「較正」反応から）
次にＴａｑＭａｎＴＭ装置からＥＲＣＣ１に対する非補正遺伝子発現を得るために、以下の式にて行なわれる、すなわち、
ＥＲＣＣ１に対する非補正遺伝子発現（ＵＧＥ）＝ ２−ΔＣｔｔｅｓｔ／２−ΔＣｔｃａｌｉｂｒａｔｏｒ
周知の相対ＥＲＣＣ１発現レベルによるＵＧＥの正規化：
正規化の計算は、ＥＲＣＣ１に特異的な補正因子（ＫＥＲＣＣ１）と特定のキャリブレータＲＮＡとＵＧＥとの乗算を伴う。さらに補正因子ＫＥＲＣＣ１が、任意の内部コントロール遺伝子、及び任意の予め正確に定量されたキャリブレータＲＮＡに対し決定することができる。好ましくは、内部コントロール遺伝子β−アクチン、及び予め正確に定量されたキャリブレータＲＮＡ・Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃａｔ．＃７３５０１７）を使用することである。これらの薬剤が与えられた場合補正因子ＫＥＲＣＣ１が１．５４ｘ１０−３となる。
【０１００】
正規化が、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｓ，ｔｈｅ ＴａｑＭａｎＴＭｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ，ｉｎ Ｕｓｅｒ Ｂｕｉｉｅｉｎ＃２に記載され、且つ上記のΔＣｔ法の変更（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を用いて行われる。この方法を行うようにＵＧＥの６種の異なる試料を、上記ＴａｑＭａｎＴＭ方法を用いてＥＲＣＣ１発現に対して分析した。内部コントロール遺伝子β−アクチン、及びキャリブレータ・ＲＮＡ・Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃａｔ．＃７３５０１７）を使用した。
【０１０１】
各試料、ＡＧ２２１，ＡＧ２２２，ＡＧ２５２，成人の肺、ＰＣ３，ＡｄＣｏｌの周知の相対ＥＲＣＣ１発現レベルを、その相当するＴａｑＭａｎＴＭに誘導されるＵＧＥにて除することにより、非平均の補正因子Ｋが得られる。
【０１０２】
Ｋｕｎａｖｅｒａｇｅｄ＝周知の値／ＵＧＥ
次にＫ値全ては、キャリブレータＲＮＡ及びβ−アクチンからのＥＲＣＣ１、Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃａｔ．＃７３５０１７）に特異的な単一ＫＥＲＣＣ１補正因子を決定するために、平均が行われる。
【０１０３】
したがって、ｐｒｅ−ＴａｑＭａｎＴＭＥＲＣＣ１発現研究から成るスケールに、未知の組織の試料における補正された相対ＥＲＣＣ１発現を決定するために、１つには、ＴａｑＭａｎＴＭ装置から誘導される非補正遺伝子発現データ（ＵＧＥ）を、補正因子に特異的なＫＥＲＣＣ１にて乗算して、同じ内部コントロール遺伝子及びキャリブレータＲＮＡを使用することから得られる。
【０１０４】
補正された相対ＥＲＣＣ１発現＝ＵＧＦｘＫＥＲＣＣ１
ＫＥＲＣＣ１が、予め正確に定量化されたキャリブレータＲＮＡ又は内部コントロール遺伝子を使用して、決定することができる。さらに予め正確に定量化されたキャリブレータＲＮＡの供給資源が、上記方法に記載の周知な相対ＥＲＣＣ１発現レベルにて、試料に対する較正を行うことができ、又は上記のＨｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃａｔ．＃７３５０１７）などの予め較正されたキャリブレータＲＮＡに対し、現段階で較正することができる。
【０１０５】
たとえば、次のＫＥＲＣＣ１が、異なる内部コントロール遺伝子、及び／又は異なるキャリブレータＲＮＡに決定される場合、そうした特定の内部コントロール遺伝子に対するＥＲＣＣ１発現レベルが、すでに決定されている組織試料に、内部コントロール遺伝子とキャリブレータＲＮＡを共に較正しなければならない。
【０１０６】
こうした決定には、技術的に周知の定量化ＲＴ−ＰＣＲ技術を、標準ｐｒｅ−ＴａｑＭａｎＴＭを使用して行うことができる。これらの試料に対する周知の発現レベルを、相当するＵＧＥレベルにて除し、その試料に対してのＫ値を決定する。次にＫ値を、周知の試料数によて平均値を計算し、異なる内部コントロール遺伝子、及び／又はキャリブレータＲＮＡに対する新たな特異的ＫＥＲＣＣ１を決定する。
【０１０７】
実施例４
全ての患者は、予測されるマルチセンターの３部門（ａｒｍ）の無作為試験のシスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）／ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）部（ａｒｍ） （進行性ＮＳＣＬＣにおける、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ／Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ（ＣＧ）対Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ／ Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ／Ｖｉｎｏｒｅｌｂｕｎｅ（ＣＧＶ）対Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ／Ｖｉｎｏｒｅｌｂｕｎｅの後にＩｆｏｓｆａｍｉｄｅ／Ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ（ＧＶ／ＩＶ）の直列に二重鎖（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｄｏｕｂｌｅｔｓ）、とするＳｐａｎｉｓｈ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｒｏｕｐ Ｐｈａｓｅ ＩＩＩ試験（ｔｒｉａｌ）、ＧＥＰＣ／９８−０２） に登録された。全患者は、Ｇｅｍ １２５０ｍｇ／ｍ２１日、８日に加え３週に１回ＣＤＤＰ １００ｍｇ／ｍ２１日を受けた。
【０１０８】
ＧＥＰＣ／９８−０２に対する適格性基準が、測定段階ＩＶ（無症候性の場合適切な脳転移）、又は段階ＩＩＩＢ（悪性胸膜、および／または心臓周囲の滲出、および／または鎖骨上の膜症）ＮＳＣＬＣであり、そしてＥａｓｔｅｒｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐ（ＥＣＯＧ）性能得点０−２であった。全ての患者が、研究に入る前に胸部Ｘ線、および胸部、および腹部上部のコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）走査法を行い、少なくとも６週間毎に評価を繰り返し行った。腫瘍応答を、完全な応答、１部応答、安定疾患、および進行性疾患としてＷＨＯ基準により評価した。腫瘍を、腫瘍測定の基準を確定するために使用される同じ画像表示方法による治療中に再評価した。
【０１０９】
全ｍＲＮＡを顕微解剖されたＦＰＥ前処理腫瘍試料より単離し、そして補正された相対ＥＲＣＣ１発現を、試料２および３に記載のように定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した。こうした試料からｍＲＮＡの単離方法が、実施例１および１９９９年１２月２０日出願され、その全体を引例により本明細書に組み入れられている、米国特許出願番号０９／４６９，３３８に記載されている。
【０１１０】
統計による分析
Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ試験を、補正される相対ＥＲＣＣ１発現の連続試験による変動可能性と、および二分肢による変動（ｄｉｃｈｏｔｏｍｏｕｓ ｖａｒｉａｂｌｅｓ）（患者の性別、年齢のメジアンより上および下の年齢、体重欠損の存在、胸膜滲出の存在、腫瘍の段階）との間の有意的な関連性のために使用した。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験を、複数の群（ＥＣＯＧ性能状況、組織病理学）の中の補正される相対ＥＲＣＣ１発現の有意差を試験するために使用した。Ｆｉｓｈｅｒの抽出試験を、応答、および二分肢され、補正される相対ＥＲＣＣ１発現値を含む、臨床病理的値の範疇としての分析のため使用した。
【０１１１】
全ての患者が、最初の研究治療より、死、またはそれが中止されるまで追跡した。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線およびＬｏｇ［範囲試験を、生存および疾患のない生存の単一変異分布を分析するために使用した。Ｍｉｌｌｅｒ、及びＡｉｅｇｍｕｎｄ（Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ、１９８２；３８：１０１１−１０１６）、及びＨａｌｐｅｒｎ（Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ１９８２；３８：１０１７−１０２３）の最大、ｃｈｉ−ｓｑｕａｒｅ法が、グループ化強度の測定に使用される統計的なＬｏｇ範囲試験を伴い、発現値は、悪性と良性の予後予測のサブクループ（生存する可能性の点から）に患者を最も適切に分離するよう決定するために適用される。最大のｃｈｉ−ｓｑｕａｒｅに基づく関連強度の測定として解釈することのできるＰ値を測定するために、１０００ブート・ストラップ様シュミレーション（１０００ｂｏｏｔ−ｓｔｒａｐ−ｌｉｋｅ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ）が、非関連性の仮定に基づいて最大ｃｈｉ−ａｑｕａｒｅ統計の分布を想定して使用された。（Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ１９８２；３８：１０１７−１０２３）を参照。一変量分析に有意差のあったＣｏｘ’の比例危険モデリング（Ｃｏｘ’ｓ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ ｈａｚａｒｄｓ ｍｏｄｅｌｉｎｇ）の因子は、その諸因子が、生存に有意的に影響を及ぼす可能性があることを同定するため行われた。ＳＰＳＳ版１０．０．５ソフトウエア（ＳＰＳＳ ＩｎＣ．，Ｃｈｉｃａｇｏ ＩＩＩ）を、全ての統計分析に使用した。全てのＰ値が両側であった。
【０１１２】
補正された相対ＥＲＣＣ１の発現レベル：
ＥＲＣＣ１ｍＲＮＡ発現が、分析される５６試料にて検出できることである。内部コントロール・ハウスキーピング遺伝子、βアクチンの発現に対する、メジアンにより補正された相対ＥＲＣＣ１発現が、６．７ｘ１０−３（０．８ｘ１０−３−２４．６ｘ１０３の範囲）であった。
【０１１３】
補正される相対ＥＲＣＣ１発現レベルと任意の諸因子、年齢 （Ｐ＝０．６６）、性別（Ｐ＝０．１８）、無作為抜き取り６ヶ月前における体重欠損の存在（Ｐ＝０．７４）、腫瘍段階（ＩＩＩＢ対ＩＶ、Ｐ＝０．３９）、または胸膜の滲出の存在（Ｐ＝２５，全Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ試験）との関係付けに有意差がなかった。さらに異なる性能状態の等級（Ｐ＝０．４８、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験）または異なる腫瘍細胞種（４種の腫瘍全て、Ｐ＝０．１０、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験） による患者間の補正される相対ＥＲＣＣ１発現レベルに有意差がないが、補正される相対ＥＲＣＣ１発現レベルが、腺ガン（メジアン５．２ｘ１０−３，Ｐ＝０．０１５， Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験）と比較してＳＣＣ腫瘍（メジアン８．６ｘ１０−３）において有意的に高かった。
【０１１４】
化学療法に対する応答：
応答に評価できる４７人の患者に対し良く生ずる腫瘍の応答を、図３に示している。全体にわたる応答率が、４４．７％である。完全な応答、および部分的応答すなわち「応答する」腫瘍（メジアン４．３ｘ１０−３、範囲１．２ｘ１０−３−２４．６ｘ１０−３）における補正される相対ＥＲＣＣ１発現レベルが、安定な疾患、および進行性の疾患すなわち「非応答性」腫瘍（メジアン７．８５ｘ１０−３、範囲０．８ｘ１０−３−２４．３ｘ１０−３、Ｐ＝０．３１ Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験）におけるレベルと有意的に相違しなかった。任意にＥＲＣＣ１レベル（すべてＦｉｓｈｅｒ’の抽出試験）より高い、および低い補正される相対ＥＲＣＣ１発現レベルにより、応答する、および非応答腫瘍の比率の間に有意的な差がない。閾値より低い（「低」発現、５２％の応答値） 補正される相対ＥＲＣＣ１発現レベルによる腫瘍における応答率が、閾値より高い（「高」発現、３６．４％の応答値、Ｆｉｓｈｅｒ’の抽出試験、Ｐ＝０．３８） 補正される相対ＥＲＣＣ１発現レベルによる腫瘍に対するより有意的に高い。
【０１１５】
患者全体における生存性と補正された相対ＥＲＣＣ１発現レベルとの関連付け：
メジアンとしての全体における生存期間が、３６．６週間（範囲０−１１３．４週）であり、メジアンとしての進行性に対する期間が、２４．４週間（範囲０−１０２．９４週）であった。閾値補正された相対ＥＲＣＣ１発現レベルを同定するようＬｏｇランク試験（ｌｏｇ ｒａｎｋ ｔｅｓｔ）および最大ｃｈｉ−ｓｑｕａｒｅ統計を用いて、患者を予後予測の悪いサブグループ、と良好なサブグループに分離し、その識別範囲がメジアンを含み、そのため生存分析のための閾値として使用されることを示している。したがって、閾値補正相対ＥＲＣＣ１発現値を、ＮＳＣＬＣに６．７ｘ１０−３であると決定した。図１は、閾値補正相対ＥＲＣＣ１発現レベルより上、下の腫瘍内の補正相対ＥＲＣＣ１発現レベルを伴う患者用のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒの生存曲線を示している。
【０１１６】
図４に示すように、閾値より低い補正相対ＥＲＣＣ１発現レベルを有する患者が、閾値より高い補正相対ＥＲＣＣ１発現レベルを有する患者の２０．４週（９５％Ｃ．Ｉ．６．９，３３．９週）と比較して、メジアンとして有意的に長い生存期間、６１．６週（９５％Ｃ．Ｉ．４２．４，８０．７週）を有した。腫瘍段階として調整され、補正された相対ＥＲＣＣ１発現の高、低と全体の生存性との間を関係付けるＬｏｇ ｒａｎｋ統計値が３．９７で、Ｐ値が０．０４６であった。調整されなかったＬｏｇ ｒａｎｋの結果を表４に示す。
【０１１７】
別の補正相対ＥＲＣＣ１発現の閾値５．８ｘ１０−３を試験した。それはこの値が、胃ガンの患者に対する全体の生存性との関連性があると、これまでの研究において値が示されていた（ＭｅｔｚｇｅｒらのＪ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １９９８；１６：３０９−３１６）からである。全体生存性は、この研究におけるＮＳＣＬＣ患者のクループに対して有意的に良好であり、この研究においては、有意的に高い６．７ｘ１０−３の補正相対発現閾値レベルが、より強力な識別値であるが、全体の生存率は、５．８ｘ１０−３（ｌｏｇ ｒａｎｋ統計値６．３７、Ｐ＝０．０１１）より低いＥＲＣＣ１レベルの値と比較して５．８ｘ１０−３より低い補正相対ＥＲＣＣ１発現レベルであった。
【０１１８】
Ｋａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ生存曲線、及びｌｏｇ ｒａｎｋ試験を使用する一変量分析（ｕｎｉｖａｒｉａｂｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）により全体の生存性と有意的に関連付けられる他の因子は、前処理に体重の欠損があること、及びＥＣＯＧの性能状態（表２）である。患者の年齢（Ｐ＝０．１８）、性別（Ｐ＝０．８７）、腫瘍の段階（Ｐ＝０．９９）、腫瘍の細胞種（Ｐ＝０．６３）、及び胸膜の滲出の存在（Ｐ＝０．７１）が、全体の生存の有意的な予後予測因子でない。補正された相対ＥＲＣＣ１発現レベル、ＥＣＯＧの性能状態、及び体重の欠損が、Ｃｏｘ比例危険回帰モデル多重変動分析（Ｃｏｘ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ ｈａｚａｒｄｓ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌ ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｂｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）（図４）における生存の有意的な予後予測因子として存在する。腫瘍段階に層化されたＣｏｘ回帰モデル（Ｃｏｘ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌ）に対するＰ値は、ＥＲＣＣ１に対し０．０３８、体重の欠損に対し０．０１７、及びＥＣＯＧの性能状態に対し０．０２（ＰＳ ０対１又は２）であった。
【０１１９】
本研究は、低いＥＲＣＣ１ｍＲＮＡ発現レベルとガン患者に白金を基本とする化学的療法による治療後の生存性の改良との間の関連を見出した。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＮＳＣＬＣの補正された相対ＥＲＣＣ１の発現に対するシスプラチン／ゲム（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ／Ｇｅｍ）治療を受けた全体にわたる患者の生存を示すグラフである。
患者の補正された相対ＥＲＣＣ１の発現（Ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ Ｒｅｌａｔｉｖｅ ＥＲＣＣ１ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が、６．７ｘ１０−３の閾値より有意的に低いことが、非常に良好な生存性と関連していた。一方で患者の補正された相対ＥＲＣＣ１の発現（Ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ Ｒｅｌａｔｉｖｅ ＥＲＣＣ１ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が、６．７ｘ１０−３の閾値より有意的に高いことが、非常に悪い生存性（Ｐ＝０．００９ログランクテスト（Ｌｏｇ ｒａｎｋ ｔｅｓｔ）と関連していた。
【図２】
図２は、内部コントロール遺伝子に関する補正された相対ＥＲＣＣ１発現の計算の仕方を示すチャートである。このチャートは、２種の試験試料（未知の１及び２）により得られたデータを含む、そして補正されていない遺伝子発現データ（ＵＧＥ）の決定の仕方を表している。さらにチャートが、ｐｒｅ−ＴａｑＭａｎＴＭ技術により決定された周知の相対ＥＲＣＣ１値と共にＴａｑＭａｎＴＭ装置により生成されるＵＧＥの正規化の仕方を示している。これは、補正因子ＫＥＲＣＣ１に対し、ＵＧＦを多重にすることにより行われる。図の内部コントロール遺伝子が、β−アクチンであり、そして較正物質としてのＲＮＡは、Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃａｔ．＃７３５０１７）である。
【図３】
図３は、腫瘍段階及び細胞の種類、の研究における５６人の患者の統計的詳細を示す表である。受け入れられる処理サイクルの介在数が、３（１−６の範囲）であった。１４人の患者（２５％）が、前に化学療法を受けていたが、そのほとんどが（９人の患者）タキサン（ｔａｘａｎｅ）療法だけ、又はＤＤＰ又はカボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）と組み合わせて受けていた。５６人の患者の３人が、放射性治療を受け、そして５人の患者が１次腫瘍の外科的切除を受けていた。
【図４】
図４は、閾値より低い補正相対ＥＲＣＣ１発現レベルの患者が、閾値より高い補正相対ＥＲＣＣ１発現レベルの患者に２０．４週（９５％Ｃ．Ｉ．６．９，３３．９週）と比較して６１．６週（９５％Ｃ．Ｉ．４２．２、８０．７週）と有意的に長いメジアンの生存性を有したことを示している表である。腫瘍段階に対し調整されると、低い又は高いＥＲＣＣ１発現の高低、と全体生存性との間を関係付ける定常的ログ・ランク（ｌｏｇ ｒａｎｋ ｓｔａｔｉｓｔｉｃ）が３．９７で、Ｐ値が０．０４６であった。調整されていないログ・ランク（ｌｏｇ ｒａｎｋ）の結果が、この図に示されている。さらに示されているものは、Ｋａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ 生存曲線（ｓｕｒｖｉｖａｌ ｃｕｒｖｅｓ）及びログ・ランク・テスト（ｌｏｇ ｒａｎｋ ｔｅｓｔ）を用いる一変量分析による全体生存性と有意的に関連する因子である。これらは、前処理による体重の低減及びＥＣＯＧの性能状態の存在であった。患者の年齢（Ｐ＝０．１８）、性別（Ｐ＝０．８７）、腫瘍段階（Ｐ＝０．９９）、腫瘍細胞の種類（Ｐ＝０．６３）、及び胸膜浸出の存在（Ｐ＝０．７１）は、全体的生存性の予後予測を示す有意な因子ではなかった。補正された相対ＥＲＣＣ１発見レベル（Ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ Ｒｅｌａｔｉｖｅ ＥＲＣＣ１ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ）、ＥＣＯＧ性能状態、及び体重の低減が、Ｃｏｘ比例危険軽減モデルの多重分析における生存性の有意な予後予測を示す因子として存在する。腫瘍段階に層化されたＣｏｘ軽減モデルのＰ値が、ＥＲＣＣ１に対し０．０３８、体重の低減に対し０．０１７、及びＥＣＯＧ性能状況（ＰＳ０対１又は２）に対し０．０２であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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