(57)【要約】共翻訳転位プロセスおよび分泌または膜タンパク質の製造に干渉する化合物を同定するための、リポーター遺伝子タンパク質に融合および／結合されたシグナルペプチドを含む融合タンパク質をコード化するＤＮＡを含む細胞を含むアッセイ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
共翻訳転位プロセスならびに分泌および／または膜タンパク質の製造に干渉する化合物を得るための、候補化合物のスクリーニングを目的とするスクリーニング方法またはスクリーニングアッセイにおける選択された異種シグナルペプチドに融合したリポータータンパク質をコード化するＤＮＡ構築物の使用。
【請求項２】
共翻訳転位プロセスならびに分泌および／または膜タンパク質の製造に干渉する化合物が医薬上有用な化合物である、請求項１記載の使用。
【請求項３】
分泌および／または膜タンパク質の製造に干渉する化合物の同定方法であって、候補化合物の存在および不存在下において分泌されたタンパク質の量ならびに上記分泌および／または膜タンパク質の小胞体の膜を横切る共翻訳転位の範囲または程度を測定することを包含する方法。
【請求項４】
共翻訳転位プロセスならびに細胞による分泌および／または膜タンパク質の製造に干渉する化合物を同定し、そして所望により選択する方法であって、
ａ１．リポータータンパク質に結合した異種シグナルペプチドを含む融合タンパク質をコード化するＤＮＡによりトランスフェクションされた細胞においてリポーター遺伝子タンパク質の発現を可能にするかまたは刺激し、
ｂ１．候補化合物のそれぞれ不存在または存在下で工程ａ１.で製造された分泌リポータータンパク質を検出し、そして候補化合物のそれぞれ不存在または存在下で工程ａ１.で製造されたリポーター遺伝子タンパク質の量に差異があるか否かを測定し、そして所望により
ｃ１．候補化合物、すなわちその存在下において工程ａ１.で製造されたリポーター遺伝子タンパク質の量が、上記候補化合物の不存在下において工程ａ１.で製造されたリポーター遺伝子タンパク質の量とは異なる候補化合物を選択し、そして所望により化学的誘導体化後、所望により上記の選択された化合物を医薬として使用する
工程を含む方法。
【請求項５】
共翻訳転位プロセスならびに細胞による分泌および／または膜タンパク質の製造に干渉する化合物の同定方法であって、
ａ．リポータータンパク質に結合した異種シグナルペプチドを含む融合タンパク質をコード化するＤＮＡを提供し、
ｂ．工程ａ.で得られたＤＮＡをＤＮＡベクターへ導入し、
ｃ．工程ａ.または工程ｂ.で得られたＤＮＡを細胞へトランスフェクションし、
ｄ．適切な条件下工程ｃ.で得られたトランスフェクション細胞におけるリポーター遺伝子タンパク質の発現を可能にするかまたは刺激し、
ｅ．候補化合物のそれぞれ不存在または存在下、工程ｄ.で生成された分泌リポータータンパク質を検出し、そして
ｆ．候補化合物のそれぞれ不存在または存在下において工程ｅ.で生成されたリポーター遺伝子タンパク質の量であって、工程ｅ.に従い測定された量に差異があるか否かを測定し、そして所望により
ｇ．候補化合物、すなわちその存在下において工程ｄ.で生成されたリポーター遺伝子タンパク質の量が、上記候補化合物の不存在下で工程ｄ.で生成されたリポーター遺伝子タンパク質の量とは異なる候補化合物を選択し、そして所望により化学的誘導体化後、所望により上記の選択された化合物を医薬として使用する
工程を含む方法。
【請求項６】
工程ａ.または工程ａ１.におけるＤＮＡがそれぞれ追加アミノ酸をコード化する追加介在ＤＮＡ配列を含む、請求項４〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
追加アミノ酸をコード化する追加介在ＤＮＡ配列が、請求項４または５のいずれか１項記載の方法で工程ａ.または工程ａ１.に従い使用される融合タンパク質の一部である分泌および／または膜タンパク質のシグナルペプチドに近接した成熟ＤＮＡ配列のＤＮＡ配列から得られる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
共翻訳転位プロセスおよび分泌または膜タンパク質の製造に干渉する化合物の同定用アッセイであって、リポーター遺伝子タンパク質に融合および／または結合したシグナルペプチドを含む融合タンパク質をコード化するＤＮＡを含む細胞を実質的エレメントとして包含するアッセイ。
【請求項９】
さらにリポーター遺伝子タンパク質に融合および／または結合したシグナルペプチドを含む第二融合タンパク質をコード化するＤＮＡを含み、シグナルペプチドまたはリポーター遺伝子タンパク質が、第一融合タンパク質におけるシグナルペプチドまたはリポーター遺伝子タンパク質とはそれぞれ異なる、請求項８記載のアッセイ。
【請求項１０】
請求項８または９のいずれか１項記載のアッセイを含み、さらに上記リポーター遺伝子タンパク質(複数も可)を製造するための細胞処理および／または培養手段、および適切な環境における上記リポーター遺伝子タンパク質の検出手段を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スクリーニング方法、すなわち化合物、例えば有機化合物のスクリーニング方法、例えば細胞における分泌および／または膜タンパク質の製造に干渉する、例えば細胞における分泌および／または膜タンパク質の製造を阻害する化合物の同定方法に関するものである。上記化合物は、例えば細胞における分泌または膜タンパク質の(非)製造に基く病気、例えば細胞において分泌または膜タンパク質が仲介する病気の処置における医薬として有用であり得る。
【背景技術】
【０００２】
分泌および／または膜タンパク質の製造に干渉する化合物の同定方法については既に提案されている。上記方法はむしろ基質特異的であり得、概して一般化され得ない。現在我々は、小胞体(ＥＲ)の膜を横切る共翻訳転位プロセスにおいて細胞タンパク質製造の制御により分泌および／または膜タンパク質の製造に干渉する化合物の新規同定方法を見出した。すなわち、我々は、驚くべきことに、細胞における分泌および／または膜タンパク質の合成に干渉、例えば阻害する化合物の同定方法で使用され得る細胞タンパク質製造の新規制御レベルを同定した。本発明による方法は基質特異的ではなく、普遍的に適用可能である。
【０００３】
ＥＲの膜を横切る共翻訳転位および同膜への挿入は、例えば真核生物細胞において(Matlack et al.,１９９８)、ほとんどの分泌および膜タンパク質の翻訳合成における初期段階の一つである。疎水性先導配列またはシグナルペプチド(ＳＰ)がリボソームから出現すると、古典的ＥＲ／ゴルジ経路を通り細胞から輸出されることになる新生(ナセント)分泌および膜タンパク質が認識され、ＥＲ膜にターゲッティングされる。シグナル認識粒子(ＳＲＰ)がＳＰおよびリボソームに結合することにより、連続したタンパク質連鎖伸長を一時的に停止させる。ＳＲＰとその特異的レセプター(ＳＲ)の相互作用を通じたリボソーム−新生鎖／シグナル配列−ＳＲＰ複合体のＥＲ膜へのターゲッティングにより、翻訳停止状態が解除される。リボソーム−新生鎖複合体は転位チャネルへ転移され(トランスロコン、Ｓｅｃ６１複合体)、異なる機能を伴う幾つかの膜タンパク質により高次複合構造が形成され、ポリペプチド連鎖伸長が再開する。それに続いて転位チャネルへ新生鎖が挿入されると、リボソームおよびトランスロコン間に安定した複合体が形成される。次いで、新生鎖は親水性トランスロコンチャネルを通じて転位され、ＳＰはＥＲ膜へ取込まれ、たいていの場合開裂する。転位に付随して、Ｎ−結合グリコシル化タンパク質は、ＥＲのルーメンでコア−グリコシル化され、既存の貫膜ドメインはＥＲ膜へ挿入される。
【０００４】
分泌および膜タンパク質の製造が、新生分泌または膜タンパク質鎖の共翻訳転位プロセスを伴う阻害剤化合物の特異的干渉により阻害されることおよびＳＰがこのプロセスにおいて重大な役割を演じることが見出された。すなわち、驚くべきことに、この化合物群の標的タンパク質はＥＲ膜に局在する転位機構の一構成要素であり得、分泌または膜タンパク質のＳＰを認識し、それと相互作用することにより新生タンパク質鎖が膜を横切るのを助けることが見出された。新たなタンパク質発現調節レベルとしての共翻訳転位の発見は、ＳＰの他の構造サブクラスが他のタンパク質に存在し得、そして異なるが特異的な方法で転位機構と相互作用し得ることを示唆している。したがって、この相互作用は、この事象および後続の各タンパク質の製造に特異的に干渉する物質の同定に使用され得る。
【０００５】
さらに我々は、タンパク質の非ＳＰ部分、すなわちＳＰのＣ−末端アミノ酸および分泌または膜タンパク質のＣ−末端アミノ酸間のアミノ酸配列の全部または一部をリポータータンパク質、例えば利用可能な検出方法の使用により検出され得るタンパク質と置き換えたとき、上記と同じ発見が得られることを見出した。これは、共翻訳転位プロセスが本質的に分泌または膜タンパク質の性質とは関係無いが、ＳＰの性質により異なるという概念を立証している。
【０００６】
さらに我々は、上記ＳＰ−リポーター遺伝子融合体をコード化するＤＮＡが、候補化合物の不存在下または存在下で、既知方法を用いて例えば哺乳類発現ベクターにおいて哺乳類プロモーターの３'末端にＤＮＡを導入することにより、生きている細胞へ導入され、発現されたとき、細胞外環境へのリポータータンパク質の分泌が、シグナルペプチドが由来するそのタンパク質の候補化合物感受性を反映していることを見出した。すなわち、選択された異種ＳＰにより細胞の転位機構に融合、従ってそこに指向したリポータータンパク質をコード化するＤＮＡ構築物を候補化合物のスクリーニングに使用することにより、シグナルペプチドが由来するそのタンパク質の製造に干渉する化合物が得られる。
【０００７】
一態様において、本発明は、候補化合物をスクリーニングするためのスクリーニング方法またはスクリーニングアッセイにおいて、例えば分泌および／または膜タンパク質の選択された異種シグナルペプチドに融合された、例えば選択された異種シグナルペプチドにより細胞の転位機構に融合および指向されたリポータータンパク質をコード化するＤＮＡ構築物の使用を提供するもので、共翻訳転位プロセスおよび例えば上記分泌および／または膜タンパク質の製造に干渉する化合物、例えば選択されたシグナルペプチドが由来するそのタンパク質の製造に干渉する化合物、例えば医薬上有用な化合物が得られる。
【０００８】
選択された異種シグナルペプチドに融合された上記リポータータンパク質をコード化するＤＮＡは、適切な発現ベクターへクローン化され得、得られたベクターは生きている細胞へ導入され得る。こうして得られた細胞は、スクリーニング目的に使用されることにより、例えば古典的ＥＲ／ゴルジ経路を介して輸出される分泌または膜タンパク質により仲介される病気の治療／予防において、医薬上有用である化合物の同定を可能にするアッセイシステムをもたらし得る。すなわち本発明によると、転位機構の機能に干渉し、ＳＰを伴う分泌および／または膜タンパク質の共翻訳転位プロセスに特異的に干渉する化合物が、迅速で単純な手段により同定され得る。
【０００９】
別の態様において、本発明は、分泌および／または膜タンパク質の製造に干渉する化合物の同定および例えば選択方法であって、候補化合物の存在および不存在下において分泌されたタンパク質の量ならびに上記分泌および／または膜タンパク質の小胞体の膜を横切る共翻訳転位の範囲または程度を測定することを含む方法を提供する。
【００１０】
上記方法に用いられる手段は、アッセイまたはキットに含まれ得る。
【００１１】
別の態様において、本発明は、共翻訳転位プロセスならびに細胞による分泌および／または膜タンパク質の製造に干渉する化合物の同定、および例えば選択方法であって、
ａ．リポータータンパク質に結合した異種シグナルペプチドを含有、例えばこれを成分とする融合タンパク質をコード化するＤＮＡであって、例えば追加アミノ酸をコード化する追加介在ＤＮＡ配列、例えば近接成熟配列からの追加配列を伴う場合も伴わない場合もあるＤＮＡを提供し、
ｂ．工程ａ.で得られたＤＮＡをＤＮＡベクター、例えば哺乳類発現ベクターへ導入し、
ｃ．工程ａ.または工程ｂ.で得られたＤＮＡを細胞へトランスフェクションし、
ｄ．適切な条件下工程ｃ.で得られたトランスフェクション細胞におけるリポーター遺伝子タンパク質の発現を可能にするかまたは刺激し、
ｅ．候補化合物のそれぞれ不存在または存在下、工程ｄ.で生成された分泌リポータータンパク質を検出し、そして
ｆ．候補化合物のそれぞれ不存在または存在下において工程ｅ.で生成されたリポーター遺伝子タンパク質の量であって、工程ｅ.に従い測定された量に差異があるか否かを測定し、例えばおよび所望により
ｇ．候補化合物、すなわちその存在下において工程ｅ.で生成されたリポーター遺伝子タンパク質の量が、上記候補化合物の不存在下で工程ｅ.で生成されたリポーター遺伝子タンパク質の量とは異なる候補化合物を選択し、例えば上記の選択された化合物を医薬として使用する
工程を含む方法を提供する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、共翻訳転位プロセスならびに細胞による分泌および／または膜タンパク質の製造に干渉する化合物を同定し、そして例えば選択する方法であって、
ａ１．リポータータンパク質に結合した異種シグナルペプチドを含有、例えば成分とする融合タンパク質をコード化するＤＮＡであって、例えば適切な条件下追加アミノ酸をコード化する追加介在ＤＮＡ配列を伴う場合も伴わない場合もあるＤＮＡによりトランスフェクションされた細胞においてリポーター遺伝子タンパク質の発現を可能にするかまたは刺激し、
ｂ１．候補化合物のそれぞれ不存在または存在下で工程ａ１.で製造された分泌リポータータンパク質を検出し、そして候補化合物のそれぞれ不存在または存在下で工程ａ１.で製造されたリポーター遺伝子タンパク質の量に差異があるか否かを測定し、例えばそして所望により
ｃ１．候補化合物、すなわちその存在下において工程ａ１.で製造されたリポーター遺伝子タンパク質の量が、上記候補化合物の不存在下において工程ａ１.で製造されたリポーター遺伝子タンパク質の量とは異なる候補化合物を選択し、例えばそして、例えば化学的誘導体化後、上記の選択された化合物を医薬として使用する
工程を含む方法を提供する。
【００１３】
差異がそれぞれ工程ｆ.またはｂ１で測定される場合、候補化合物は、明らかに共翻訳転位プロセス、すなわち細胞における分泌および／または膜タンパク質の製造に干渉する。候補化合物、すなわちその存在下において工程ｅ.または工程ａ１.でそれぞれ製造されたリポーター遺伝子タンパク質の量が、上記候補化合物の不存在下において製造されたリポーター遺伝子タンパク質の量とは異なる候補化合物は、例えば古典的ＥＲ／ゴルジ経路を介して輸出される分泌または膜タンパク質により仲介される病気の治療／予防における、医薬として有用であり得る。分泌または膜タンパク質の製造、例えば共翻訳転位に干渉し得る候補化合物は、例えば化学物質および天然抽出物のライブラリー、低分子量(ＬＭＷ)化合物、ペプチド、抗体、組換えＤＮＡ分子および発現ライブラリー、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを包含する。本明細書で使用されている「シグナルペプチド」は、ＥＲ／ゴルジ経路を介して分泌および／または膜タンパク質を輸出し得るペプチド／タンパク質配列、例えばシグナルペプチドそれ自体、シグナルアンカーを含むシグナルペプチド等を含む。
【００１４】
一般的に、タンパク質をコード化するＤＮＡ分子は、例えば慣用的方法により、例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーからのクローニングにより、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)増幅およびクローニングにより適切なものとして得られ、例えば市販の供給源またはヒトＤＮＡプローブのＡＴＣＣ／ＮＩＨ保管所から得られる。タンパク質のヌクレオチド配列は、一般に、公開データベース、例えばジェンバンクおよびＥＭＢＬまたは出版物から入手され得る。
【００１５】
適切なリポータータンパク質は、
−例えば上記タンパク質を含む細胞培養培地において、上記タンパク質の好都合および高感度の検出を可能にし、そして
−上記融合タンパク質の共翻訳転位およびその後続輸出のプロセスに干渉しない
タンパク質、例えば胎盤分泌アルカリ性ホスファターゼ(ＳＥＡＰ)を包含する。
【００１６】
例えば追加アミノ酸をコード化する追加介在ＤＮＡ配列を伴う場合も伴わない場合もある、リポータータンパク質に連結された異種シグナルペプチドを含む融合タンパク質で、以後「本発明融合タンパク質」と称するものは、例えばＰＣＲ−ライゲーション−ＰＣＲ突然変異誘発法(AliおよびSteinkasserer、１９９５)に従い適切に製造され得る。適切なベクター発現系へのサブクローニング方法は、例えば標準手順を含む、例えば慣用的な方法に従い、例えばそれと同様にして適切に実施され得る。
【００１７】
適切な条件下で追加アミノ酸をコード化する追加介在ＤＮＡ配列は、例えば、工程ａ.または工程ａ１.にそれぞれしたがい本発明方法で使用される融合タンパク質の一部である分泌および／または膜タンパク質のシグナルペプチドに近接する成熟ＤＮＡ配列からのＤＮＡ配列の一部を含み得る。
【００１８】
適切なベクター系は、
−構成的または誘導性である、転写開始に有効なプロモーターエレメント、
−転写ターミネーター、
−ポリアデニル化(ポリ(Ａ))シグナル配列、
−細菌性複製起点、
−細菌増殖およびプラスミドＤＮＡを安定して組込んだ哺乳類細胞の選択についての選択マーカー
を含み得る。
【００１９】
構成的または誘導性である、適切な転写開始に有効なプロモーターエレメント、転写ターミネーター、ポリアデニル化(ポリ(Ａ))シグナル配列、および細菌性複製起点は、使用される宿主細胞の性質により異なり得、例えば慣用的な方法に従い、例えばそれと同様にして適切に選択され得る。適切な選択マーカーは、宿主細胞に表現型を付与する遺伝子を含むことにより、形質転換細胞の同定を可能にし、好ましくは特定された条件下での成長を有利に行わせる。細菌についての適切な選択マーカーは公知であり、例えばアンピシリン、カナマイシンおよびテトラサイクリンについての耐性遺伝子を包含する。安定した哺乳類セルラインを確立するため、適切な選択マーカー、例えばハイグロマイシン、ネオマイシンを含む、例えば公知選択マーカーが使用され得る。
【００２０】
宿主細胞へトランスフェクションされ得る適切な発現ベクターは、適切に選択され得、そして例えば慣用的方法に従い、例えばそれと同様にして、または本明細書記載の方法により、適切に宿主細胞へトランスフェクションされ得る。適切な宿主細胞には、ベクターと適合し得、選択された構成的または誘導的プロモーターからの組換えｃＤＮＡ融合遺伝子の発現をうまく駆動する宿主細胞が含まれる。
【００２１】
本発明融合タンパク質の発現は、例えば一時的または宿主ゲノムへの安定した組込み後であり得る。一時的発現は、哺乳類細胞における組換え遺伝子の発現を研究するのに好都合で迅速な方法である。一般に、細胞がＤＮＡを獲得すると、それらは数日間から数週間にわたって一時的にそれを発現した後、ＤＮＡは最終的に集団から失われる。プラスミドＤＮＡの宿主染色体への安定した組込みについての選択により、所望の組換え遺伝子産物を無限に発現する安定したトランスフェクションセルラインが製造され得る。一時的トランスフェクションプロトコルおよび安定セルライン生成プロトコルは公知であり、例えば電気穿孔法および例えば市販のトランスフェクション試薬、例えばカチオン性リン脂質(例、リポフェクタミン(登録商標)、ベーリンガー)、活性化デンドリマー(スーパーフェクト(登録商標)、キアゲン)等を介したトランスフェクションを含む。
【００２２】
組換えＳＰ−リポーター遺伝子ｃＤＮＡは、構成的または誘導的に発現され得る。構成的プロモーターエレメント、例えばサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)即時−初期または後期プロモーターの利点は、それらが広く多様な細胞型において非常に高活性であり、外部刺激因子を追加せずとも高レベルの発現を確実にすることである。他方遺伝子発現の誘導制御を行わせる誘導性系は、所望時のみの組換えｃＤＮＡの発現を確実にする。好ましいプロモーターは、本発明融合タンパク質を高レベルで発現する。
【００２３】
本発明融合タンパク質を発現する試験細胞はまた、好ましくは、本発明融合タンパク質のプロモーターと同じであるかまたは同じ特異機能(すなわち転写開始機能)を有するプロモーターから、細胞質ゾル特異性／毒性対照タンパク質、例えばルシフェラーゼを発現する。適切に処理すると、上記細胞は、分泌されない(輸出されない)細胞質ゾル特異性／毒性対照タンパク質を製造する。上記細胞は、例えば慣用的方法に従い、例えばそれと同様にして適切に得られる。
【００２４】
細胞に基くアッセイにおける分泌および細胞質リポータータンパク質の適切な検出アッセイが使用され得、例えばウエスタン・ブロット、ＥＬＩＳＡおよび酵素リポータータンパク質、例えば分泌胎盤アルカリ性ホスファターゼまたはルシフェラーゼを検出するための比色または蛍光に基く方法が含まれ得る。上記アッセイでは全て、本発明融合タンパク質を発現する試験細胞を候補化合物のそれぞれ存在および不存在下でインキュベーションする。
【００２５】
一旦試験細胞が構築されると、輸出阻害剤、すなわち輸出を阻害する候補化合物(＝阻害剤)は、例えば本明細書記載のアッセイを含む、適切な細胞に基くスクリーニングアッセイにより同定され得る。好ましいアッセイにおいては、本発明融合タンパク質を発現する細胞を、候補化合物で処理し、分泌されたリポータータンパク質の量を、処理をせずに測定した量と比較する。阻害剤無しで行なわれたアッセイの場合と比べて、阻害剤の存在下で行なわれたアッセイで細胞外、細胞表面または細胞上清から検出されたタンパク質の量が低減化している場合、化合物は輸出を阻害する(＝阻害剤)と見なされる。好ましくは、阻害剤は、リポータータンパク質の輸出を少なくとも５０％、さらに好ましくは８０％またはそれより大きい率で低減化させる。好ましくは、阻害剤は、用量依存的方法でリポータータンパク質の輸出を低減化させる。好ましくは、細胞質ゾル特異性および毒性対照、例えばルシフェラーゼに対し顕著な効果を呈するべきではない。候補化合物、例えば阻害剤は、例えば化学物質および天然抽出物のライブラリー、低分子量(ＬＭＷ)化合物、抗体、組換えＤＮＡ分子および発現ライブラリー、ＤＮＡ、ＲＮＡ等を含む様々な供給源から適切に得られる。本発明による分泌および／または膜タンパク質の製造を阻害することが見出された候補化合物の効果が、アッセイで使用されているＳＰに特異的であることを確実にするために、本発明スクリーニングに使用されるシグナルペプチドとは異なり、本発明によるスクリーニングに使用されるリポーター遺伝子タンパク質とは異なるリポーター遺伝子タンパク質に結合されているシグナルペプチドを含有、例えば必須的に、例えば成分とする融合タンパク質をコード化するさらなるＤＮＡが、本発明スクリーニングに使用されている細胞に存在し得る。候補化合物がリポーター遺伝子タンパク質の一つの製造を阻害し、存在する他のリポーター遺伝子タンパク質の製造は阻害しない場合、阻害作用は細胞に対する候補化合物の毒性作用に起因しないという証拠になる。逆に両リポーター遺伝子の製造が阻害される場合、候補化合物は使用されている細胞に対する毒性作用または共翻訳転位プロセスに対する非特異的阻害作用を有することが強く示唆される。
【００２６】
別の態様において、本発明は、リポーター遺伝子タンパク質に融合されたシグナルペプチドを含有、例えば必須的に、例えば成分とする融合タンパク質をコード化するＤＮＡを含む細胞であって、上記リポーター遺伝子を製造させ得る細胞における、例えば共翻訳転位で、分泌または膜タンパク質の製造に干渉する化合物の同定、例えばおよび所望による選択方法であって、候補化合物のそれぞれ不存在または存在下で製造されたリポーター遺伝子タンパク質の量に差異があるか否かを測定し、例えばそして所望により化合物、すなわちその存在下において製造されたリポーター遺伝子タンパク質の量が、上記化合物の不存在下において製造されたリポーター遺伝子タンパク質の量と比べて異なる化合物を選択し、例えばそして、例えば化学的誘導体化後、上記化合物を医薬として使用する工程を含む方法を提供する。
【００２７】
別の態様において、本発明は、共翻訳転位プロセスおよび分泌または膜タンパク質の製造に干渉する化合物を同定するためのアッセイであって、リポーター遺伝子タンパク質に融合および／または結合されたシグナルペプチドを含有、例えば必須的に、例えば成分とする融合タンパク質をコード化するＤＮＡを含む細胞を実質的エレメントとして含み、例えばおよび所望ならば、さらに例えば細胞刺激を含む、細胞処理により上記リポーター遺伝子タンパク質を製造させる手段、例えばおよび適切な環境において上記リポーター遺伝子タンパク質を検出する手段を含むアッセイを提供する。
【００２８】
別の態様において、本発明は、さらに、リポーター遺伝子タンパク質に融合および／または結合されたシグナルペプチドを含有、例えば必須的に、例えば成分とする第二融合タンパク質をコード化するＤＮＡを含む上記アッセイであって、上記シグナルペプチドおよびリポーター遺伝子が、第一融合タンパク質におけるシグナルペプチドおよびリポーター遺伝子タンパク質とは異なり、例えばさらに、例えば細胞刺激を含む、細胞処理により、所望ならば、上記リポーター遺伝子タンパク質を製造させる手段、例えばおよび適切な環境において上記リポーター遺伝子タンパク質を検出する手段を含むアッセイを提供する。
【００２９】
別の態様において、本発明は、上記第一融合タンパク質を含み、そしてさらに、第一融合タンパク質におけるリポーター遺伝子タンパク質とは異なるリポーター遺伝子タンパク質を含有、例えば必須的に、例えば成分とするタンパク質をコード化し、その発現が、第一融合タンパク質の発現の場合と同一であるかまたは同じ特異機能(すなわち、転写開始機能)を有するプロモーター、例えば構成的または誘導性である、同じ真核生物プロモーターにより駆動されるＤＮＡを含み、例えば、そしてさらにその発現が上記プロモーターにより駆動される特異性／毒性対照タンパク質を含み、例えばそして所望ならば、さらに例えば細胞刺激を含む、細胞処理により上記リポーター遺伝子タンパク質、例えばそして上記特異性／毒性対照タンパク質を製造させる手段、例えばそして適切な環境において上記リポーター遺伝子タンパク質、例えばそして上記特異性／毒性対照タンパク質を検出する手段を含む、上記アッセイを提供する。
【００３０】
第一および第二融合タンパク質、例えばそして上記特異性／毒性対照タンパク質のＤＮＡは、同じ(宿主)細胞または異なる細胞に位置し得、すなわち異なる細胞の混合物が使用され得る。
【００３１】
上記アッセイは、キット、例えばスクリーニングキットの形態であり得る。
【００３２】
別の態様において、本発明は、上記アッセイを含むキット、例えばスクリーニングキットであって、さらに例えば細胞刺激を含む、細胞処理により上記リポーター遺伝子タンパク質(複数も可)、例えばそして上記特異性／毒性対照タンパク質を製造させる手段、そして適切な環境において上記リポーター遺伝子タンパク質を検出する手段を含むキットを提供する。
【００３３】
本発明による方法、アッセイおよびキットは、スクリーニングによる医薬活性化合物(医薬)の同定に有用である。医薬活性化合物は、分泌および／または膜タンパク質(複数も可)の発現が関連しているあらゆる種類の病気、例えばＩＬ−４、ＩＬ１２ｐ４０、ＭＣＰ１、ＶＣＡＭ−１、ＶＥＧＦが介する疾患、例えばアレルギーおよび炎症性疾患、アトピー性皮膚炎、乾癬、アテローム性動脈硬化症、喘息、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患、および／または癌、および組織移植拒絶の予防に活性を示す化合物を包含する。
【００３４】
以下の実施例では、温度は全て摂氏で与えられており、未補正である。
【００３５】
以下の略語が使用されている：
ａａ：アミノ酸
ＡｍＳ：硫酸アンモニウム
ＣＭＶ：サイトメガロウイルス
ＤＴＥ：ＥＤＴＡ
Ｅｎｄｏ Ｆ：エンドグリコシダーゼＦ
ＥＲ：小胞体
ＩＣＡＭ−１：細胞内接着性分子１
ＩＧＥＰＡＬ：オクチルフェニルポリエチレングリコール
ＩＬ−４：インターロイキン４
ＩＬ−１２ｐ４０：インターロイキン１２ｐ４０
ＭＣＰ−１：単球走化性タンパク質１
ＰＡＧＥ：ポリアクリルアミド電気泳動
ＰＢＳ：燐酸緩衝食塩水
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
【００３６】
ＰＭＳＦ：フェニルメチルスルホニルフルオリド
ｐＮＰＰ：ｐ−ニトロフェニル‐ホスフェート
ＲＴ：逆転写
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＥＡＰ：分泌アルカリ性ホスファターゼ
ＳＲ：シグナル認識粒子受容体
ＳＲＰ：シグナル認識粒子
ＳＰ：シグナルペプチド
ＴＣＡ：トリクロロ酢酸
ＴＥＡ：トリエタノールアミン
ＴＧＦ−α：トランスフォーミング成長因子α
ＴＮＦ−α：腫瘍壊死因子α
ＶＥＧＦ：血管内皮増殖因子
ｗｔ：野生型
ＶＣＡＭ−１：血管細胞接着性分子−１
【００３７】
「候補化合物」はＷＯ９６／０３４３０に開示された化合物、例えば式：
【化１】
2004531221.tif 000002
で示される化合物であり得る。
【実施例】
【００３８】
実施例１
発現プラスミドおよび融合遺伝子の構築
哺乳類細胞における一時的発現および無細胞翻訳を可能にするＥ−セレクチンおよびＩＣＡＭ−１発現ベクターｐＣＤＭ８−Ｅ−セレクチンおよびｐＣＤＭ８−ＩＣＡＭ−１は、Ｒ＆Ｄシステムズから入手される。ＶＣＡＭ−１ ｃＤＮＡは、以下の通りＴＮＦ−α刺激一次ヒト臍静脈内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)から全ＲＮＡの逆転写により得られる。供給者の勧告に従いトリゾール(ギブコ)による全ＲＮＡの抽出後、約３μｇ総ＨＵＶＥＣ ＲＮＡでの逆転写(ＲＴ)ＰＣＲを、それぞれＮ−およびＣ−末端ＶＣＡＭ−１特異的センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーによる標準条件下アドヴァンテージ・ハイ・フィデリティーＰＣＲキット(クロンテク)を用いて遂行する。プライマーをテーリングし、コザック配列のＫｐｎＩ制限部位５'および停止コドンのＸｈｏＩ部位３'を導入する。
【００３９】
それに応じて、テンプレートとしてプラスミドｐＢＣ１２／ＰＬＡＰ４８９(Berger et al.,１９８８)および同様にテーリングしたＳＥＡＰ特異的センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲにより胎盤ＳＥＡＰを増幅する。ＳＥＡＰおよびＶＣＡＭ−１ ｃＤＮＡを単離し、ｐＣＲ２.１ベクター(ＴＡクローニングキット、インビトロゲン)へクローン化する。配列決定により全配列を確認し、それに続いて、ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩフラグメントとして哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３.１(＋)(インビトロゲン)へサブクローニングすることにより、構成的即時−初期ＣＭＶプロモーター制御下での一時的発現およびバクテリオファージＴ７プロモーターからの無細胞翻訳を行わせる。ＳＰ−遺伝子融合構築物を作製するため、組換えＰＣＲ−ライゲーション−ＰＣＲ突然変異誘発法を使用する(AliおよびSteinkasserer)。簡単に述べると、一次ＰＣＲ反応において、ＳＰ(ＰＣＲ産物Ａ)および成熟配列(ＰＣＲ産物Ｂ)についてのそれぞれ適切な特異的プライマーを用いて、２つの融合遺伝子フラグメントを独立して増幅させる。ほぼ等モル量の各ＰＣＲ産物ＡおよびＢをリン酸化し、ライゲーションする。最後に、可能なライゲーションの組み合わせから、所望の融合遺伝子構築物を、ＳＰの５'センスプライマーおよび成熟配列の３'アンチセンスプライマーを用いた二次ＰＣＲによるライゲーション反応のアリコートから特異的に増幅する。これらのプライマーにより、コザック配列のＫｐｎＩ部位５'および停止コドンのＸｈｏＩ部位３'を上記要領で導入する。完全融合遺伝子ＰＣＲ産物を、ＫｐｎＩ／ＸＨｏＩフラグメントとして発現ベクターｐｃＤＮＡ３.１(＋)へサブクローニングし、全配列を配列決定により確認する。
【００４０】
実施例２
細胞培養および一時的トランスフェクション
５％加湿ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で１０％加熱不活化胎児牛血清(ＦＣＳ、バイオ−ウイタッカー)および各々１００単位／ｍｌのペニシリン(ＢＣ)およびストレプトマイシン(ギブコ−ＢＲＬ)を補ったダルベッコ修飾イーグル培地(ＡＭＥＭ、ギブコ−ＢＲＬ)で、ＨＥＫ２９３細胞を維持する。５％加湿ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で１０％ＦＣＳ、５×１０−４ＭジブチリルｃＡＭＰ(シグマ)、１μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン(シグマ)および１０ｎｇ／ｍｌヒトＥＧＦ(ベーリンガー)を補った内皮細胞基礎培地(ＥＢＭ、クロネティクス・コーポレーション)でＨＵＶＥＣ細胞を培養する。約８時間１００Ｕ／ｍｌのＴＮＦ−αとのインキュベーションにより、ＶＣＡＭ−１製造を刺激する。一時的トランスフェクションを行うため、トランスフェクション前日、ＨＥＫ２９３細胞を６ウェルまたは２４ウェル細胞培養皿へそれぞれ６×１０５細胞／ウェルまたは１.５×１０５細胞／ウェルの密度で接種し、飽和密度の５０〜７０％に増殖させる。供給者の勧告に従いスーパーフェクト試薬(キアゲン)を用いて、それぞれ２μｇまたは１μｇのプラスミドＤＮＡにより細胞をトランスフェクションする。候補化合物の添加をそれぞれ行わないかまたは行って細胞を約２４〜４８時間指示濃度でインキュベーションする。プロテアソーム阻害実験のため、トランスフェクションの５時間後にラクタシスチン(カルビオケム)を５μＭの濃度でそれぞれ単独または候補化合物と一緒に加える。
【００４１】
実施例３
タンパク質分析
ウェスタンブロットおよび後続のイムノブロット分析により、細胞におけるタンパク質発現を分析する。細胞を、０.２５ＭのＮａＣｌ含有ＰＢＳ中でかき集め、ペレット化し、５００μｌのＨ２Ｏ中の溶解緩衝液((１００ｍｇデオキシコール酸／１８０ｍｌ ＰＢＳ、５Ｍ ＮａＣｌ、１％ＩＧＥＰＡＬ、３０μｌプロテアーゼ阻害剤カクテル、１錠剤完結、ミニ、ＥＤＴＡフリー(ベーリンガー・マンハイム))５０μｌに再懸濁し、３０分間氷上でインキュベーションする。試料を激しく渦状に攪拌し、１３０００ｒｐｍ、４°(エッペンドルフ遠心機５４０２)で６分間遠心分離した後、上清を新たな管に移し、タンパク質濃度を測定する(ＢＣＡアッセイ、ピアス)。
【００４２】
細胞ライゼートを、還元性５×ラエムリ試料緩衝液(０.２Ｍトリス−ＨＣｌ ｐＨ８.８、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍしょ糖、１ｍＭ ＤＴＥ、ブロモフェノールブルー＋１/６の２０％ＳＤＳ)と５：１または非還元性２×ラエムリ試料緩衝液(バイオラッド)と２：１でそれぞれ混合し、９９℃で５分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(４〜２０％勾配レディ・ゲル、バイオラッド)で電気泳動的に分離する。半乾燥トランスファーセル(トランス−ブロットＳＤ、バイオラッド；半乾燥ブロッティングバッファー、４８ｍＭのトリス、３９ｍＭのグリシン、１.３ｍＭのＳＤＳ、２０％メタノール、ｐＨ９.２)またはタンクブロット・トランスファーセル(ミニ・トランス−ブロット・エレクトロフォレティック・トランスファーセル、バイオラッド、タンクブロットバッファー、２５ｍＭのトリス、２００ｍＭのグリシン、２０％メタノール)を用いて、タンパク質をプロトランニトロセルローストランスファーメンブラン(シュライヒェル・ウント・シュエル)にブロットする。ポンソーＳ溶液(シグマ)でのタンパク質染色により、ブロッティング効率を制御する。一時的トランスフェクション細胞における各組換えタンパク質の発現を、適切な特異抗体、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体および製造者の使用説明書に従ったＥＣＬウエスタン・ブロッティング検出キット(アマーシャム・ファルマシア・バイオテク)を用いるイムノブロット分析および後続のフルオログラフィーにより測定する。タンパク質発現を、走査デンシトメトリーにより定量する。タンパク質のグリコシル化を、エンドＦ(ベーリンガー・マンハイム)での脱グリコシル化により分析する。等量の細胞ライゼートおよび２×エンドＦバッファー(１００ｍＭのＫＰＯ４、７.４、２０ｍＭのＥＤＴＡ、０.４％ＳＤＳ)を１分間１００℃で加熱する。ＳＤＳを０.５〜２％ＩＧＥＰＡＬ(「ノニデットＰ４０」またはオクチルフェニルポリエチレングリコール、シグマ)により中和し、試料の半分を３７℃で１時間７μｌ試料につき１ＵのエンドＦとインキュベーションする。試料の未処理の半分を陰性対照として用いる。試料をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離し、タンパク質を上記と同様ウェスタンブロット分析により検出する。
【００４３】
実施例４
分泌リポータータンパク質ＳＥＡＰの検出
蛍光に基くアッセイまたは報告された方法(Berger et al.,１９８８)によるｐＮＰＰの加水分解を伴う４０５ｎｍでの吸光度を測定するアッセイを用いて、細胞上清におけるヒト胎盤ＳＥＡＰレベルを測定する。簡単に述べると、５００μｌアリコートの培地を培養皿から除去し、１分間１４０００×ｇで清澄化し、６５℃で５分間加熱する。培地のアリコート(１０μｌ〜１００μｌ)を、９６ウェル平底培養皿(ヌンク)において２００μｌの最終容量で１×ＳＥＡＰ緩衝液(１.０Ｍのジエタノールアミン、ｐＨ９.８、０.５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＬ−ホモアルギニン)に調節し、１０分間３７℃に予め加温する。３７℃に予め加温しておいた１×ＳＥＡＰ緩衝液中の１２０ｍＭのｐＮＰＰ２０μｌを加え、３７℃での吸光度変化をプロットする。加熱工程およびアッセイ緩衝液中におけるＬ−ホモアルギニンの含有により、内生ホスファターゼ活性が阻害される。蛍光に基くアッセイによりＳＥＡＰレベルを測定するため、アットー・フォスＡＰフルオレセント・サブストレート・システム(プロメガ)を製造会社の使用説明書に従い使用する。
【００４４】
実施例５
無細胞翻訳／転位アッセイ
２５μｌの最終体積および[３５Ｓ]−メチオニン(レディヴュ、１０ｍＣｉ／ｍｌ、アマーシャム)の存在下で、供給者の推奨に従いバクテリオファージＴ７ポリメラーゼを用いてカップリングしたＴＮＴ網状赤血球ライゼート系(プロメガ)で無細胞翻訳を実施する。ＥＲ膜を横切る共翻訳転位を試験するため、イヌ膵臓ミクロソーム(プロメガ)は翻訳反応中反応混合物２５μｌにつき１〜２.５μｌ間の濃度で存在する。翻訳／転位後、２.５μｌの反応混合物を、９５℃で５分間ＳＤＳローディング緩衝液(１２.５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６.８、８０μＭのＥＤＴＡ、２６ｍＭのＤＴＴ、１％ＳＤＳ、１００ｇ／ｍｌブロモフェノールブルー、０.０１％ＮａＮ３)中で変性させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(４〜２０％勾配または１５％エクセルゲル、ファルマシア)にかける。ゲルをオートラジオグラフィーにより分析し、インスタント・ホスホイメージャー(パッカード)を用いて定量する。沈降実験を行うため、１０μｌ〜１５μｌの反応混合物を、１００μｌの０.２５Ｍしょ糖、２０ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのトリエタノールアミン(ＴＥＡ)、ｐＨ７.５で希釈し、氷上で１０分間インキュベーションし、ベックマンＴＬ１００ポリアロマー管中１００μｌしょ糖クッション(０.５Ｍしょ糖、１４０ｍＭ酢酸ナトリウム、２０ｍＭのＥＤＴＡ、２.５ｍＭのＭｇＯＡｃ、５０ｍＭのＴＥＡ)にかぶせる。試料を４°で５分間１０００００ｒｐｍの遠心分離(ベックマンＴＬ１００)にかける。少なくとも３０分間氷上で２倍量の飽和ＡｍＳ溶液を加えることにより、クッションを含む上清を沈澱させる。生じた沈澱物を、４°で１５分間１００００ｒｐｍの遠心分離により集め、１ｍｌの５％氷冷ＴＣＡおよび１ｍＬのアセトンにより交互に洗浄する。風乾後、沈澱物を、トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５で濃化したＳＤＳ試料緩衝液に溶かし、上記と同様ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにかける。プロテアーゼ保護アッセイを行うため、翻訳転位反応物を氷上に置き、ＣａＣｌ２を補って最終濃度２ｍＭにする。プロテイナーゼＫ(ベーリンガー・マンハイム)を加えて１２.５μｇ／ｍｌの最終濃度にし、氷上で３０分間消化を遂行させる。氷上１０ｍＭの最終濃度で１０分間ＰＭＳＦとインキュベーションし、それに続いて３０μｌのＳＤＳ試料緩衝液を加え、５分間９５°に即時加熱することにより、タンパク質分解を終結させる。試料を上記と同様ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにかける。
【００４５】
実施例６
ＶＣＡＭ−１糖蛋白質製造の阻害
真菌由来のシクロデプシペプチド(cyclopdepsipeptide)の新規物質分類が最近報告されており、それらはＩＣＡＭ−１およびＥ−セレクチンに対してヒト内皮細胞で接着性分子ＶＣＡＭ−１の発現を強力かつ優先的に阻害する(Boger et al.,１９９９、Foster et al.,１９９４)。
【００４６】
それに続いて、この化合物クラス(「候補化合物」)の誘導体は、主として転写後レベルでＶＣＡＭ−１製造を抑制することが示された。ＨＥＫ２９３細胞および異種ＣＭＶプロモーターの制御下でＶＣＡＭ−１およびＥ−セレクチンの両方を発現するプラスミドを用いる一時的発現実験では(図１参照)、この化合物クラスの阻害効果が再現され得ることから、この化合物クラスは主として転写後に作用するという概念が裏付けられている。ＨＥＫ２９３細胞を、上記要領によりＶＣＡＭ−１またはＥ−セレクチンを発現するプラスミドによりトランスフェクションする。図１に示した通り、候補化合物を増加濃度で加える。トランスフェクションの４８時間後、ＶＣＡＭ−１およびＥ−セレクチンの発現をウエスタンブロットおよび後続のイムノブロット分析によりモニターし、ハウスキーピング遺伝子βアクチンの発現に対する外挿法により定量する。図１に示されている通り、トランスフェクションＨＥＫ２９３細胞において、ＶＣＡＭ−１およびＥ−セレクチンタンパク質は、それぞれ完全グリコシル化１００および１１５ｋＤＡタンパク質として合成される(図１、レーン２、矢印参照)。ＶＣＡＭ−１の発現は増加濃度の候補化合物ＣＰにより阻害されず、Ｅ−セレクチンの合成は影響されない(図１、レーン３〜６参照)。候補化合物は、５ｎＭ未満の低ナノモル範囲でＶＣＡＭ−１糖蛋白質合成の５０％を阻害し、これは内皮細胞で得られた結果に匹敵している(Foster et al.,１９９４)。
【００４７】
実施例７
ＶＣＡＭ−１の共翻訳転位の阻害
Ｉ型貫膜タンパク質、例えば接着性分子ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１およびＥ−セレクチンは、翻訳され、ＥＲ膜のレベルで共翻訳的に細胞膜へ挿入される。候補化合物がタンパク質発現のこの初期段階で干渉しているという可能性を調べるため、無細胞アッセイ系における共翻訳転位プロセスに対する薬剤の効果を分析する。接着性分子ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１およびＥ−セレクチンの完全長ｃＤＮＡは、イヌ膵臓ミクロソーム(プロメガ)のそれぞれ不存在または存在下において無細胞網状赤血球ライゼート系で転写および翻訳される。タンパク質に放射性標識を付し、オートラジオグラフィーにより視覚化する。図２Ａで示されている通り(レーン１および２を比較)、ミクロソームの不存在下ではなく存在下では、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１およびＥ−セレクチンについての２つのタンパク質バンドが検出される。分子量のシフトは、ミクロソーム膜のルーメンで生じているコア−グリコシル化に起因する。グリコシル化酵素は無細胞系ではミクロソーム膜内でのみ活性を呈するため、これらの結果は、３種の完全長タンパク質が全て有効にターゲッティングされ、転位され、それに続いてＥＲ由来のミクロソーム小胞のルーメンでコア−グリコシル化されていることを示唆している。有効な転位を試験するため、プロテアーゼを翻訳後に加えて、ミクロソーム小胞のリン脂質二層による分解から保護される転位タンパク質について検定する（NicchittaおよびBlobel、１９９０）。図２Ｂに示されている通り(レーン１および２を比較)、各接着性分子の低分子量、非グリコシル化および非転位形態が完全に消化されているのとは対照的に、高分子量タンパク質部分およびコア‐グリコシル化形態はタンパク質加水分解(的分解)を受けていない。さらに、各タンパク質のコア−グリコシル化形態は(非グリコシル化形態とは対照的に)、しょ糖密度勾配遠心分離実験において膜画分と共に沈降する(図２Ｃ参照)。
【００４８】
これらの結果を考え合わせると、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１およびＥ−セレクチンタンパク質が、コア‐グリコシル化、プロテアーゼ保護および膜会合形態の出現により立証された通り無細胞系においてＥＲ由来のミクロソーム小胞のルーメンへ有効に共翻訳的転位されることが分かる。タンパク質の無細胞共翻訳的転位に対する候補化合物の効果を試験するため、候補化合物(ＣＰ)を翻訳／転位アッセイに加える。図２Ａおよび２Ｂで示されている通り、ＶＣＡＭ−１のコア−グリコシル化およびプロテアーゼ保護形態のみが、増加濃度の候補化合物により阻害されることから、ミクロソーム膜を横切る転位は阻害されるが、翻訳そのものは阻害されないことが分かる。対照的に、ＩＣＡＭ−１の転位は使用されている候補化合物の２０〜３０倍高濃度で阻害されるだけで、Ｅ−セレクチンは試験濃度では耐性を呈することが示されている(図２Ａ、ＢおよびＣ参照)。
【００４９】
無細胞翻訳／転位アッセイで得られたこれらのデータは、候補化合物が細胞においてＥＲ膜を横切る共翻訳転位に特異的に干渉する結果、細胞質ゾル区画への非グリコシル化、完全長前駆タンパク質の誤局在化が誘発され、そこで不正確に折りたたまれると予測されることから、予想通り急速に分解されることを強く示唆している。この発見はまた、ＶＣＡＭ−１タンパク質が充分な量の候補化合物で処理した細胞からは全く検出され得ない理由を説明し得る(図１、レーン５参照)。ほとんどのミスフォールディングされたタンパク質は、ユビキチン−プロテアソーム経路により細胞の細胞質ゾルで分解される（Voges et al.,１９９９）。候補化合物クラスが細胞において選択的にＶＣＡＭ−１の共翻訳転位に干渉することにより、タンパク質の誤局在化、ミスフォールディングおよび分解が誘発されるという直接証拠を提供するため、ＶＣＡＭ−１ ｃＤＮＡで一時的にトランスフェクションした細胞を、候補化合物およびラクタシスチン、すなわちプロテアソーム分解経路の特異的阻害剤により共処理する(LeeおよびGoldberg、１９９８)。図３で示されている通り（上方パネル、レーン３および５比較）、ラクタシスチンとのこれらの細胞の共処理の結果、候補化合物単独での処理後には存在しない低分子量のポリペプチド部分が蓄積される。それに続いて、エンドＦによる脱グリコシル化(図３参照、下方パネル)実験により、このポリペプチドは、完全長、非グリコシル化ＶＣＡＭ−１タンパク質として同定される。これらのデータは、候補化合物クラスが、共翻訳転位に特異的に干渉することにより細胞におけるＶＣＡＭ−１糖タンパク質合成を阻害するという第一の直接証拠を提供する。
【００５０】
実施例８
ＶＣＡＭ−１のシクロペプトリド感受性ドメインの同定
先導配列またはＳＰは、古典的ＥＲ／ゴルジ経路により細胞から輸出された可溶性および内在性膜タンパク質のターゲッティングおよび転位において中心的役割を演じる。薬剤感受性付与におけるＳＰの潜在的役割を立証するため、化合物感受性ＶＣＡＭ−１および化合物耐性Ｅ−セレクチンｃＤＮＡのＳＰおよび成熟配列を合わせてキメラ融合構築物を設計する(図４参照)。これらのキメラ融合構築物に対する候補化合物の効果を、無細胞翻訳／転位アッセイおよび一時的トランスフェクションＨＥＫ２９３細胞の両方において試験する(図４参照)。Ｅ−セレクチンからのＳＰを含むＶＣＡＭ−１突然変異体分子は、候補化合物、例えば式(Ｉ)の化合物に対し耐性であることが示されており、ＶＣＡＭ−１からのＳＰを伴うＥ−セレクチン突然変異体分子は上記化合物に対し部分的に感受性を示すことが見出された。これらの結果は、シグナルペプチドが薬剤感受性の付与に必要とはされるが、充分ではなく、ＶＣＡＭ−１の成熟ドメインからの近接配列が充分な候補化合物感受性について必要とされ得ることを示唆している。それに続いて、候補化合物処理に対し充分な感受性を示すＶＣＡＭ−１の最小候補化合物感受性ドメインは、ＶＣＡＭ−１のＳＰの１５ａａ＋近接成熟ドメインの４ａａとして特定された（図４、ＶＣＡＭＳＰ１５＋４／Ｅ−Ｓｅｌ参照）。
【００５１】
実施例９
ＳＰ−ＳＥＡＰアッセイの確立および確認
本発明アッセイ(系)の原理を確立するため、およびその第一の証明として、化合物感受性および無感受性の各タンパク質のＳＰ、およびリポーター遺伝子として胎盤ＳＥＡＰの成熟配列を用いてＳＰ−リポーター遺伝子融合構築物を作製する(図５参照)。これらのＳＰ−ＳＥＡＰ融合構築物は、増加濃度の候補化合物の不存在または存在下において細胞で一時的に過剰発現されることが見出された。最後に、培地へのリポーターＳＥＡＰタンパク質の分泌を測定する。
【００５２】
図６で示されている通り、リポータータンパク質ＳＥＡＰの分泌は、シグナルペプチドがもともと誘導されたタンパク質の化合物感受性を反映している。予測通り、ＳＥＡＰおよびＥ−セレクチンＳＰ−ＳＥＡＰ融合タンパク質は、化合物無感受性であることが見出され、対照的にＶＣＡＭＳＰ−は候補化合物に僅かな感受性を示し、ＶＣＡＭ ＳＰ(１５＋４)−ＳＥＡＰ構築物は充分な感受性を用量依存的に示す。
【００５３】
実施例１０
様々な疾患プロセスで重大な役割を演じる選択されたタンパク質標的のＳＰ−ＳＥＡＰ遺伝子融合構築物の機能性
本発明で特許請求の範囲に主張されている新規アッセイ系をさらに確認するため、我々は、実施例１記載の方法と同様にしてＳＰ−ＳＥＡＰ融合構築物を作製したが、ただし、様々な疾患プロセスで重大な役割を演じる他のタンパク質標的のＳＰを使用し、そして増加濃度の上記化合物ＣＰの不存在または存在下における哺乳類細胞での一時的過剰発現によりそれらの機能性を試験した(図７)。ＩＬ−４は、アレルギー性炎症疾患(例、アレルギー、喘息、多発性硬化症、アトピー性皮膚炎)、ＩＬ−１２ｐ４０は炎症性および自己免疫疾患、ＭＣＰ−１は炎症性疾患(例、アテローム性動脈硬化症、慢性関節リウマチ、多発性硬化症)およびＶＥＧＦは病的血管形成に伴う病状(例、固体腫瘍の転移、乾癬)における標的として選択された。図７で示されている通り、ＳＰ−ＳＥＡＰ遺伝子融合構築物は全て機能的であった。さらに、ＩＬ−４、ＩＬ−１２ｐ４０およびＭＣＰ−１ ＳＰ−ＳＥＡＰ融合構築物は、増加濃度の化合物ＣＰに対し無感受性であり、ＶＥＧＦ ＳＰ−ＳＥＡＰ構築物は、ＶＣＡＭ−１ ＳＰ−ＳＥＡＰ構築物と比べて増加濃度の化合物ＣＰに対し用量依存的に感受性を示した。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、示された通りの増加濃度の化合物ＣＰによる処理後のトランスフェクションされていないかまたはＶＣＡＭ−１またはＥ−セレクチン ｃＤＮＡを発現するプラスミドによりトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞のウエスタンブロット分析を示す。使用された抗体は、ＶＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチンまたは内生β−アクチンに特異的であった。分子量マーカーはｋＤａで右に示されている。
【図２】図２は、翻訳／転位実験のオートラジオグラムを示す。ミクロソーム膜の不存在または存在下で網状赤血球ライゼートを用いて、放射性標識したＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１およびＥ−セレクチンを合成した。化合物ＣＰを示された増加濃度で加えた。直接(Ａ)、プロテアーゼ処理後(Ｂ)または沈降遠心分離後(Ｃ)、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いでオートラジオグラフィーにより翻訳／転位生成物を分析した。Ｓ、上清；Ｐ、ミクロソームペレット。矢印は、コア‐グリコシル化タンパク質を示し、アステリスクは非グリコシル化タンパク質を表す。分子量マーカーはｋＤａで右に示されている。
【図３】図３は、上部パネルにおいて、処理していないか、または化合物ＣＰおよびラクタシスチン単独により処理または化合物およびラクタシスチンにより共処理した、ＶＣＡＭ−１タンパク質を発現するプラスミドにより一時的にトランスフェクションした細胞のウエスタンブロット分析を示す。下方パネルは、エンドグリコシダーゼＦ(エンドＦ)による消化後における翻訳／転位試料のアリコートのウエスタンブロット分析を示す。
【図４】図４は、ＶＣＡＭ−１の化合物感受性ドメインを特定するのに使用されたＳＰ−融合構築物を概略的に示す。右側には、ＨＥＫ２９３細胞における融合タンパク質の一時的発現後の成熟完全グリコシル化タンパク質または無細胞翻訳／転位アッセイにおける共翻訳転位後のコア‐グリコシル化形態の製造の５０％を阻害する化合物ＣＰの濃度が示されている(ｎ.ｄ．測定されず)。
【図５】図５は、本発明アッセイ系を確立および確認するのに使用したＳＰ−ＳＥＡＰ融合構築物を概略的に示す。
【図６】図６は、増加濃度の化合物ＣＰによる処理後示されたＳＰ−ＳＥＡＰ融合構築物を発現するプラスミドにより一時的にトランスフェクションした細胞の上清におけるＳＥＡＰ活性を示すグラフである。
【図７】図７は、増加濃度の化合物ＣＰによる処理後示されたＳＰ−ＳＥＡＰ融合構築物を発現するプラスミドにより一時的にトランスフェクションした細胞の上清におけるＳＥＡＰ活性を示すグラフである。ＳＥＡＰ活性を、化合物ＣＰの添加を伴わない対照(ｃｔｌ)試料の％としてプロットする。示された結果は、トリプリケイトウェルの平均である。標準偏差はＳＤを示す。
【００５５】
参考文献リスト
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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