(57)【要約】本発明は、タンパク質混合物の定量的マススペクトロメトリック分析のための、酸不安定同位体コード抽出剤（ａｃｉｄ−ｌａｂｉｌｅ ｉｓｏｔｏｐｅ−ｃｏｄｅｄ ｅｘｔｒａｃｔａｎｔｓ）（ＡＬＩＣＥ）と名付けられた新規化合物を提供する。その化合物は、全ペプチド混合物からシステイン含有ペプチドを捕捉するために使用されるチオール反応基、酸不安定リンカー、及び非生物学的ポリマーを含有している。２個の酸不安定リンカーのうちの１個が、同位体的に標識され、従ってマススペクトロメトリック分析を通したペプチド／タンパク質の直接的な定量を可能にする。ペプチドの捕捉には機能的なタンパク質は必要とされないため、結合工程、洗浄工程、及び溶出工程を通して、比較高い割合（％）の有機溶媒を、ペプチド、特に疎水性ペプチドを可溶化するために使用することができ、従ってはるかに高いペプチドの回収が許容される。さらに、ペプチドは、非生物学的ポリマー（ＡＬＩＣＥ）と共有結合的に連結されるため、非特異的結合種を完全に除去するため、よりストリンジェントな洗浄が可能となる。最後に、ＡＬＩＣＥにより捕捉されたペプチドは、穏和な酸性条件下で高い収率でポリマー支持体から容易に溶出させることが可能であり、さらなる試料操作なしに、直接的な下流のマススペクトロメトリック分析を許容する。本発明者らの新規な二重カラム二次元液体クロマトグラフィ−マススペクトロメトリー（２Ｄ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）設計と組み合わされたＡＬＩＣＥ法は、より優れたダイナミックレンジ及び感度を有する、タンパク質混合物の定量的マススペクトロメトリック分析のための一般的なアプローチであることが立証される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を含有している混合物の分析のための方法であって、
（ａ）試料のタンパク質内のジスルフィド結合を還元し、それによりシステイン含有タンパク質内にチオール基を提供する工程；
（ｂ）ブロッキング試薬により試料中の遊離チオールをブロッキングする工程；
（ｃ）試料中のタンパク質を消化し、ペプチドを提供する工程；
（ｄ）消化されたペプチド内のジスルフィド結合を還元し、それにより反応のためのシステイン含有ペプチド内にチオール基を提供する工程；
（ｅ）試料中のシステイン含有ペプチドを安定同位体でディファレンシャルに標識されうるリンカーを介してポリマータグに付加されたチオール特異的反応基を含む試薬と、反応させる工程であって、ポリマータグは、システイン含有ペプチドと共有結合を形成する工程；
（ｆ）ポリマー結合ペプチドを洗浄し、非共有結合的に結合した種類を除去する工程；
（ｇ）システイン含有ペプチドを溶出させる工程；及び
（ｈ）溶出したペプチドを定量的マススペクトロメトリー（ＭＳ）分析に供する工程を含む方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、
第二の試料に対して工程（ａ）〜（ｄ）を実施する工程；
第二の試料の中のシステイン含有標識を、安定同位体で標識された型の試薬と反応させる工程であって、反応工程（ｅ）において、使用される試薬は、同位体で標識されていない型の試薬である工程；
工程（ｅ）の後の反応した試料のペプチドと、反応した第二の試料のペプチドとを混合する工程；及び
混合物中のペプチドに対して工程（ｇ）及び（ｈ）を実施する工程をさらに含む方法。
【請求項３】
試薬が、α−ハロアセチル及びマレイミドからなる群より選択されるチオール特異的反応基を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ブロッキング試薬が、メタンチオスルホン酸メチルである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
試薬が、下記式：
Ａ１−リンカー−Ａ２−ポリマー
［式中、Ａ１は、チオール反応基であり、かつＡ２は、ポリマーが結合する酸不安定基である］を有している、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ポリマーと結合した酸不安定基が、下記構造：
【化１】
2004531694.tif 000023
を有している、請求項５記載の方法。
【請求項７】
試薬内のポリマーが、ポリマー樹脂である、請求項５記載の方法。
【請求項８】
ポリマー樹脂が、ポリスチレン及びポリエチレングリコールからなる群より選択されるポリマーを含むホモポリマー又はヘテロポリマーである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
リンカーが、少なくとも６個の水素原子の安定同位体による置換を含有している、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
リンカーが、１０個の安定同位体を含有している、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
安定同位体が、重水素である、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
同位体で標識されていない試薬が、
【化２】
2004531694.tif 000024
である、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
同位体で標識された試薬が、下記式：
【化３】
2004531694.tif 000025
なる式を有する、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
溶出したペプチドが、高速液体クロマトグラフィ−マススペクトロメトリー（ＭＳ）分析、二次元液体クロマトグラフィＭＳ、又はＭＳ／ＭＳ分析に供される、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
タンパク質が、トリプシンを使用して消化される、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
リンカーを介して非生物学的ポリマーに付加されたチオール特異的反応基からなる群より選択される、システイン含有ペプチドの捕捉に有用な化合物。
【請求項１７】
リンカーが、少なくとも６個の原子の安定同位体による置換を含有している、請求項１６記載の化合物。
【請求項１８】
リンカーが１０個の安定同位体を含有している、請求項１６記載の化合物。
【請求項１９】
安定同位体が重水素である、請求項１７記載の化合物。
【請求項２０】
下記：
【化４】
2004531694.tif 000026
からなる群より選択される、請求項１６記載の化合物。
【請求項２１】
請求項１６の化合物を含む、質量スペクトル分析によるタンパク質の分析のための試薬キット。
【請求項２２】
実質的に同一のディファレンシャルに標識されたシステインタグ化試薬のセットを含む、請求項２１の試薬キット。
【請求項２３】
分析されるタンパク質の消化において使用するための１個以上のタンパク質分解酵素をさらに含む、請求項２２の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明は、ハイスループットな定量的タンパク質分析の分野に関し、より具体的には、そのような分析において使用するための新規な試薬に関する。
【０００２】
定量的タンパク質分析のための大部分のアプローチは、タンパク質分離、最も一般には高分解能二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）によるタンパク質種類分離を、選択され分離されたタンパク質種のマススペクトロメトリー（ＭＳ）又はタンデムマススペクトロメトリー（ＭＳ／ＭＳ）に基づく配列同定と組み合わせることにより、達成される。
【０００３】
Ｓ． Ｐ． Ｇｙｇｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ， １７：９９４−９９９（１９９９年１０月）は、三つの機能因子：特異的化学反応性、同位体的にコードされたリンカー、及びアフィニティタグからなる同位体コードアフィニティタグ（ｉｓｏｔｏｐｅ−ｃｏｄｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇｓ）（ＩＣＡＴ）と名付けられた試薬クラスに基づく、定量的タンパク質分析へのアプローチを記載している。Ｇｙｇｉによって記載された試薬は、アフィニティタグとしてビオチンを利用し、複雑なペプチド混合物からシステイン含有ペプチドを分離するためにビオチン−アビジンアフィニティ結合に頼っている。
【０００４】
ＩＣＡＴアプローチは、伝統的な２Ｄ−ＰＡＧＥ／ＭＳアプローチに優る多くの利点を有してはいるが、いくつかの本質的な限界を保有している。例えば、ＩＣＡＴは、システイン含有ペプチドに比較的大きな化学的なモエティを追加するが、この官能性は、衝突誘起解離（ＣＩＤ）条件の下で極めて不安定であり、従って下流のデータ分析を複雑にする。濃縮が、タンパク質（アビジン）とビオチン化されたペプチドとの間の非共有結合的アフィニティ結合に頼っているため、非特異的結合も懸念される。最後に、捕捉されたペプチドは、ＭＳ適合性の条件を使用した場合に、容易にはアビジンビーズから高い回収率で溶出されない。従って、タンパク質混合物の定量的マススペクトロメトリック分析の性能を改良するための更なる試薬及び方法が、当分野においては必要とされている。
【０００５】
発明の概要
本発明は、タンパク質を含有している混合物の定量分析に有用な、ポリマーに基づく化合物を提供する。有利なことに、本発明の化合物は、タグ化のために使用されるペプチドと共有結合的に結合し、タグ化されたペプチドが、より厳密な洗浄技術に供されることを許容する。従って、タグ化されたペプチドは、非特異的に結合した種を含まずに、より容易に精製される。これは、ＭＳスペクトルのバックグラウンドを低下させ、従ってタンパク質の定量及び同定におけるダイナミックレンジ及び感度を増加させる。
【０００６】
一つの面において、本発明は、タンパク質を含有している混合物の定量分析のための方法を提供する。本法は、（ａ）試料のタンパク質内のジスルフィド結合を還元し、システイン含有タンパク質内に遊離チオール基を提供すること；（ｂ）ブロッキング試薬を用いて、還元されたタンパク質の遊離チオールをブロッキングすること；（ｃ）トリプシンのような酵素を使用して、試料中のタンパク質を消化すること；（ｄ）消化工程後、ペプチドを還元すること；（ｅ）（場合により、いずれかの還元工程の前又は後に）安定同位体でディファレンシャルに標識されうるリンカーを介してポリマータグと共有結合したチオール特異的反応基を含む試薬と、システイン含有ペプチドを反応させること；（ｆ）ポリマーと結合したペプチドを洗浄し、非共有結合的に結合した化合物を除去すること；（ｇ）システイン含有ペプチドを溶出させること；及び（ｈ）分取されたペプチドを定量的マススペクトロメトリー（ＭＳ）分析に供することを含む。一つの実施態様において、本法は、第二の試料に対し工程（ａ）〜（ｄ）を実施すること；第二の試料の中のシステイン含有ペプチドを安定同位体で標識された型の試薬と反応させること（反応工程（ｅ）において、使用される試薬は、同位体で標識されていない型の試薬である）；工程（ｅ）の後の反応した試料のペプチドと、反応した第二の試料のペプチドとを混合すること；及び混合物中のペプチドに対し工程（ｇ）及び（ｈ）を実施することをさらに含む。
【０００７】
もう一つの面において、本発明は、システイン含有ペプチドの捕捉に有用な化合物を提供する。この化合物は、リンカーを介して非生物学的ポリマーに付加されたチオール特異的反応基から構成される。一つの望ましい実施態様において、試薬は、Ａ１−リンカー−Ａ２−ポリマー［式中、Ａ１はチオール反応基であり、かつＡ２はポリマーが付加される酸不安定基である］なる式を有している。
【０００８】
さらにもう一つの面において、本発明は、本発明の化合物を含む、タンパク質の質量スペクトル分析のための試薬キットを提供する。
【０００９】
本発明の他の面及び利点は、以下の好ましい実施態様の詳細な説明においてさらに記載される。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、システイン含有ペプチドの捕捉に有用な酸不安定同位体コード抽出剤（ＡＬＩＣＥ）を使用した、タンパク質の定量分析のための新規なアプローチを提供する。先行技術に優るこのアプローチの利点は、混合物からシステイン含有ペプチドを分取するためのビオチン−アビジンアフィニティ結合が、酸不安定共有結合に交換されている点である。結合が共有結合性であるため、疎水性のタンパク質及びペプチドを溶液中に維持するための手順において、よりストリンジェントな洗浄剤又は有機溶媒を使用することが可能であり、従って全体的なペプチド回収を最大にする。さらに、本発明の化合物及び方法は、非特異的なペプチド−タンパク質結合を回避する。洗浄工程における全ての検出可能な非共有結合種の除去も達成されうる。従って、最終システイン含有ペプチド溶液は、はるかに低い汚染度を有し、従ってＭＳ分析の感度及びダイナミックレンジが増加する。最後に、ＡＬＩＣＥ標識は、サイズが小さく、ＭＳ／ＭＳ分析においてフラグメンテーションを起こさないため、下流のＭＳ分析及びデータベース探索を妨害しない。
【００１１】
一つの実施態様において、本発明は、Ａ１−リンカー−Ａ２−ポリマー［式中、Ａ１はチオール反応基であり、かつＡ２はポリマーが付加される酸不安定基である］なる式の化合物を提供する。あるいは、酸不安定基が存在せず、ポリマーが直接リンカーに付加されていてもよい。
【００１２】
最も好ましくは、ポリマーは非生物学的ポリマーである。本明細書において使用されるように、非生物学的ポリマーには、酸不安定基が存在する場合には酸不安定基と、又はリンカーと共有結合を形成する無機ポリマー及び有機ポリマーが含まれる。好適には、選択される有機ポリマーは、本発明の方法の工程を干渉しない、例えば、塩基性条件下、及び混合物を溶液中に維持するのに必要な洗浄剤及び／又は有機溶媒の存在下で、安定である。一つの好適な実施態様において、本発明において使用されるポリマーは、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリアクリルアミド、ポリアクリレイン、ポリエチレングリコール等を含有しているホモポリマー又はヘテロポリマーから構成された固体基質である。適当なポリマー及び固体基質、例えば樹脂、ビーズ等は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ及びＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒを含む、多様な商業的供給元より入手されてもよいし、又は既知の技術を使用して合成されてもよい。適当な合成技術の一例は、下記実施例１に提供される。しかしながら、本発明はそのように制限はされない。
【００１３】
一つの実施態様において、ポリマーは、酸性試薬を使用して容易に溶出しうる能力を本発明の化合物に供給する酸不安定基を介してリンカーと共有結合させられる。一つの好ましい実施態様において、ポリマーと結合した酸不安定基は、以下の構造を有している：
【００１４】
【化５】
2004531694.tif 000002
【００１５】
［式中、リンカーは、−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＯ−、又はその他のアミドもしくはエステルである］。しかしながら、安定性及び酸性溶出可能性に関して類似の特質を化合物に供給する、その他の適当な基を含有するその他の構造も、容易に合成されうる。適当な酸不安定基の例には、以下のものが含まれる。
リンクアミド（Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ）リンカー：
【００１６】
【化６】
2004531694.tif 000003
【００１７】
ＤＨＰリンカー：
【００１８】
【化７】
2004531694.tif 000004
【００１９】
サイバー（Ｓｉｂｅｒ）リンカー：
【００２０】
【化８】
2004531694.tif 000005
【００２１】
トリチル（Ｔｒｉｔｙｌ）リンカー：
【００２２】
【化９】
2004531694.tif 000006
【００２３】
ワング（Ｗａｎｇ）リンカー：
【００２４】
【化１０】
2004531694.tif 000007
【００２５】
ある種の実施態様において、この機能がリンカーによって供給され、酸不安定基が存在しなくてもよい。
【００２６】
リンカーは、ＭＳ技術において使用するための安定同位体でディファレンシャルに標識されうる任意の構造である。一つの実施態様において、リンカーは、炭素原子、及び場合によってはＯ、Ｓ、ＮＨ、ＮＲ、ＮＲ′、ＣＯ、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、Ｓ−Ｓ、ＳＯ２、Ｃ（Ｏ）−ＮＲ′、ＣＳ−ＮＲ′、又はＳｉ−Ｏより選択される原子１個又は２個より構成された主鎖に、１〜１００個、約３〜約５０個、又は約５〜約１５個の原子を含有している。場合により、Ｃ原子のうちの１個以上が、小さいアルキル基（Ｃ１〜Ｃ６）、アルケニル基、アルコキシ基、アリール基、又はジアリール基で置換されていてもよい。例えば、リンカーは、場合により前記のように置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、又はアルキニル基でありうる。もう一つの例において、リンカーは、それ自体、場合により置換されていてもよい１個以上のＣ原子と結合したＯ基、Ｓ基、ＮＨ基、ＮＲ基、ＮＲ′基、ＣＯ基、Ｃ（Ｏ）Ｏ基、Ｃ（Ｏ）Ｓ基、Ｓ−Ｓ基、ＳＯ２基、Ｃ（Ｏ）−ＮＲ′基、ＣＳ−ＮＲ′基、又はＳｉ−Ｏ基を１個以上含有していてもよい。
【００２７】
一つの実施態様において、リンカーは、約４〜約１２個の原子の安定同位体による置換を含有している構造（例えば、アルキル基）である。しかしながら、ある種の実施態様において、リンカーは、少なくとも６個の原子の安定同位体による置換を含有していることが望ましい。例えば、ＭＳが有用である分子量範囲の上限（例えば、約２０００〜３５００Ｄａ）のペプチドの場合、必要とされるディファレンシャルな分析を達成するためには、リンカーが８個、１０個、１２個、又はそれ以上の置換を含有していることが望ましいが、ＭＳの分子量範囲の下限（例えば、約５００〜２０００Ｄａ）のペプチドは、わずか４〜６個の置換を必要としてもよい。選択された数の置換のため、リンカー内の水素原子、窒素原子、酸素原子、炭素原子、又は硫黄原子のうちの１個以上が、同位体的に安定な同位体：２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、又は３４Ｓで置換されうる。
【００２８】
従って、リンカー基は、所望の同位体置換の数に適合する構造を有している。この構造の選択は、本発明の制限ではない。リンカー内の１個以上の原子を安定同位体で置換することができ、化学的には実質的に同一であるが、同位体的には識別可能な１個以上の化合物を作成することができる。さらに、又は別法として、リンカーが、場合により、化合物に所望の酸不安定特性を与えてもよい。
【００２９】
本発明の化合物は、さらに、システイン残基と反応性、好ましくは特異的に反応性の官能基を含有している。望ましくは、反応基は、マレイミド基（以下参照）
【００３０】
【化１１】
2004531694.tif 000008
【００３１】
、又はＸ−ＣＨ２ＣＯ−のようなα−ハロアセチル基のいずれかからなる群より選択される。最も好適には、Ｘは、ヨードアセチル、ブロモアセチル、又はクロロアセチルの官能性を形成するヨウ素、臭素、及び塩素のようなハロゲンより選択される。
【００３２】
もう一つの別実施態様において、チオール反応基は、
【００３３】
【化１２】
2004531694.tif 000009
【００３４】
等のような、その他のα−、β−共役二重結合構造より選択されてもよい。さらなる他の反応基は、システイン含有ペプチドとの結合において使用するためのその他のチオール特異的反応基を含有するよう、容易に合成されうる。
【００３５】
一つの好ましい実施態様において、本発明の化合物は、式：
【００３６】
【化１３】
2004531694.tif 000010
【００３７】
を有する。一つの望ましい実施態様において、この化合物は、以下のように同位体的に修飾される。
【００３８】
【化１４】
2004531694.tif 000011
【００３９】
しかしながら、本発明はそのように制限はされない。当業者であれば、他の安定同位体を用いて軽いＡＬＩＣＥを容易に提供することができよう。さらに、当業者であれば、本明細書に提供された案内を参照して、その他の適当な化合物を容易に作製することができよう。
【００４０】
本発明の化合物の使用法
本発明の化合物は、混合物中の１個以上のタンパク質の定量及び同定のためのマススペクトロメトリック法において特に有用である。本発明の方法により分析されるペプチドは、最も好ましくは約５００〜約３５００ダルトン（Ｄａ）のサイズであるが、それよりも大きくてもよい。好適には、これらのペプチドは、複雑な混合物の中でタンパク質の酵素消化により形成させられる。タンパク質混合物は、細胞もしくは組織の培養物に由来する試料、又は生物学的流体、細胞、もしくは組織でありうる。培養物由来の試料には、細胞ホモジネート及び細胞画分が含まれる。生物学的流体には、尿、血液（例えば、全血、血漿、及び血清を含む）、脳脊髄液、涙、便、唾液、及び洗浄液が含まれる。混合物は、タンパク質、脂質、炭水化物、及び核酸を含みうる。本発明の方法は、ＭＳ法及び（ＭＳ）ｎ法を利用する。現在のところ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化ＭＳ（ＭＡＬＤＩ／ＭＳ）法及びエレクトロスプレーイオン化ＭＳ（ＥＳＩ／ＭＳ）法が好ましい。しかしながら、その他の多様なＭＳ技術及び（ＭＳ）ｎ技術も選択されうる。
【００４１】
一つの実施態様において、本発明は、本発明の化合物を使用したプロテオームの定量分析のための方法を提供する。典型的には、試料は、前記定義のような起源より得られる。試料は、同一起源に由来する組織として得られる、又は別の起源より得られてもよい参照タンパク質混合物と比較されうる。試料タンパク質混合物を第二の試料又は参照タンパク質混合物と比較する場合には、これらの混合物は、一方の試料のみを、重い安定同位体を含有している化合物と反応させる点を除き同一の反応条件を適用して、別々にプロセシングされる。試料を比較しない場合には、（１個以上の）本発明の化合物との反応の点までの別々のプロセシングは、必要ではなく、許容される。
【００４２】
典型的には、タンパク質試料は、有機溶媒を含有していてもよい適当な緩衝液に可溶化される。最後のペプチド溶出工程を除き、手順の全体を通して、混合物のｐＨは、塩基性条件下で維持される。最も好適には、ｐＨは６．５〜９、より好ましくは約７．５〜８．５、最も好ましくは約７．２〜７．５に維持される。
【００４３】
（１個以上の）試料又は参照混合物の中のタンパク質のジスルフィド結合が、遊離ＳＨ基へと還元される。場合により、この工程は、前述のタンパク質又はタンパク質混合物の可溶化と組み合わされてもよい。適当な還元剤には、トリ−ｎ−ブチルホスフィン（ＴＢＰ）、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、及びトリス−（β−カルボキシエチル）ホスフィンが含まれる。しかしながら、その他の適当な還元剤も代用されうる。一つの実施態様において、タンパク質２ｍｇのジスルフィド結合は、アセトニトリル（ＡＣＮ）２０μＬに予め溶解させた８Ｍ尿素、２００ｍＭ重炭酸アンモニウム、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、５μｍｏｌ ＴＢＰを使用して変性させられ、約３７℃で１時間ｐＨ８．５でインキュベートされる。もう一つの実施態様において、タンパク質は、５０ｍＭトリス緩衝液、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、５ｍＭ ＴＢＰ（ｐＨ８．５）の中で３７℃で１時間インキュベートされてもよい。しかしながら、塩基性域のｐＨへと緩衝されたその他の濃度のこれらの成分及び／又はその他の還元剤を選択し、様々な時間インキュベートしてもよい。
【００４４】
遊離チオール（ＳＨ）は、提供された塩基性条件下で機能し、後の工程の性能を妨害しない適当なブロッキング試薬、例えばメタンチオスルホン酸メチル（ＭＭＴＳ）を使用してブロッキングされる。ＭＭＴＳが好ましいが、ｏ−メチルイソ尿素を含む（これに限定はされない）その他の適当なブロッキング試薬も、当業者によって選択されうる。
【００４５】
試料中のタンパク質は、酵素消化される。この方法における使用に適したプロテアーゼは、塩基性条件及び手順と適合性のプロテアーゼの中から容易に選択されうる。ある種の情況においては、試料中の任意の変性可溶化剤が、使用される１個以上のプロテアーゼの活性と適合性である点へと希釈されるまで、試料混合物を希釈することが必要であるかもしれない。一つの実施態様において、プロテアーゼはトリプシンである。もう一つの実施態様において、プロテアーゼはエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌより商業的に入手可能）である。さらにもう一つの例において、塩基性ｐＨにおいて類似の活性レベルを有しているプロテアーゼの混合物が使用される。そのようなプロテアーゼには、特にアミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼが含まれうる。別法として、タンパク質混合物は、複数の消化工程に供される。例えば、タンパク質混合物は、Ｌｙｓ−Ｃによる消化に供された後、トリプシンによる消化に供されうる。混合物が複雑な混合物である場合、複数の消化は特に望ましい。当業者であれば、単一の消化工程が必要であるか、又は複数の工程が必要であるかを容易に決定することができよう。さらにもう一つの別実施態様において、試料がペプチド、ポリペプチド、又は小さなタンパク質（例えば、約５００〜５０００Ｄａ）を含有している場合には、タンパク質消化が省略されうる。
【００４６】
好適には、ペプチドは、ブロッキング試薬を除去するために、本発明の化合物と反応させられる前に、再び還元される。還元工程は、前記の試薬を使用して実施される。一つの適当な実施態様において、混合物は、３７℃での１時間の５μｍｏｌのＴＢＰとのインキュベーションにより還元される。しかしながら、その他の適当な濃度、試薬、インキュベーションの温度及び時間も、容易に代用されうる。
【００４７】
選択された本発明の化合物及び対応する同位体的に重い化合物は、試料と反応させられる。典型的には、参照試料が、同位体的に重い化合物で標識され、（１個以上の）実験試料が同位体的に軽い型の化合物で標識される。しかしながら、標識は逆であってもよい。場合により、この標識反応は、本法の任意の段階において、例えばいずれかの還元工程の前に実施されうる。
【００４８】
タグ化反応の完了後、同位体的に異なる化合物（例えば、対応する軽い化合物及び重い化合物）で標識された試料の一部が、一定量、合わせられ、その後の全工程がプールされた試料に対して実施される。好ましくは、等量の各試料がプールされる。
【００４９】
プールされた試料は、非共有結合的に結合した種を除去するため洗浄される。本発明の化合物の使用は、先行技術の試薬が耐えうるよりも厳しい洗浄工程の使用を許容する。例えば、一つの好適な方法は、５０％アセトニトリル（ＡＣＮ）５×１ｍＬ、３０％ＡＣＮ  ５×１ｍＬ、９０％ＡＣＮ ５×１ｍＬ、（非希釈）ＡＣＮ ５×１ｍＬ、及びジクロロメタン１０×５ｍＬを利用する。しかしながら、ＡＣＮの濃度は変動させられうる。別法として、その他の適当な溶媒が代用されうる。適当な溶媒の例には、アセトニトリル又はジクロロメタンと類似した極性特性を有する有機溶媒が含まれる。さらにもう一つの適当な方法は、任意の残存している洗浄剤又は界面活性剤を効率的に除去する高濃度の有機溶媒を利用する。
【００５０】
タグ化されたペプチドは、リンカー又は酸不安定基とそれが共有結合しているポリマーとの結合を破壊し、本発明の軽い化合物又は重い化合物でタグ化されたペプチドの溶出を可能にする酸性溶出によって選択的に分取される。例えば、最後の洗浄物は、１〜５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含むジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）を使用して溶出させられうる。本発明の方法を使用した場合のペプチド回収は、７５％を超えていると推定される。好適には、利用される試料及び溶媒によっては、回収率はさらに高くなり、例えば８０％、８５％、及び９０％を超えることができる。
【００５１】
次いで、分取された、単離された誘導体化されたペプチドは、ＭＳ技術を使用して分析される。タグ化されたペプチドの起源であるタンパク質の量及び配列同一性の両方が、自動多段階ＭＳにより決定されうる。これは、連続的スキャンにおいて、キャピラリーカラムから溶出するペプチドの相対量の測定と、選択されたペプチドの配列情報の記録とを交互に行うデュアルモードで、質量分析計を稼動させることによって達成される。ペプチドは、同位体的に軽い型又は重い型の本発明の化合物でそれぞれタグ化されており、従ってアフィニティ−タグ化された試薬内にコードされた質量差だけ質量が異なる同一配列のペプチドイオンの対の相対シグナル強度を、ＭＳモードで測定することにより定量される。ペプチド配列情報は、ＭＳｎモードで稼動する質量分析計における衝突誘起解離（ＣＩＤ）のための特定の質量対電荷（ｍ／ｚ）比のペプチドイオンを選択することにより自動的に作出される。次いで、コンピューター検索アルゴリズムを使用して、得られたＣＩＤスペクトルが、配列決定されたペプチドの起源であるタンパク質を同定するため、自動的に配列データベースと相関させられる。従って、ディファレンシャルに標識されたペプチド試料のＭＳ分析及びＭＳｎ分析によって作出された結果の組み合わせは、単一の自動稼動で、タンパク質混合物の成分の相対量及び配列同一性を決定する。別法として、ＭＳモードのみで稼動する質量分析計を用いて、単離されたペプチドのＭＳ分析によって、より正確な相対的定量が得られうる［実施例２：装置類の自動ＬＣ／ＭＳを参照のこと］。
【００５２】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳを実施するための機器、及びそのような機器を使用するための技術は、国際公開第ＷＯ９３／２４８３５号、米国特許第５，２８８，６４４号、Ｒ． Ｂｅａｖｉｓ ａｎｄ Ｂ． Ｃｈａｉｔ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７： ６８７３−６８７７ （１９９０）； Ｂ． Ｃｈａｉｔ ａｎｄ Ｋ． Ｓｔａｎｄｉｎｇ， Ｉｎｔ． Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ， Ｉｏｎ Ｐｈｙｓ．， ４０：１８５ （１９８１）、及びＭａｍｙｒｉｎ ｅｔ ａｌ， Ｓｏｖ． Ｐｈｙｓ． ＪＥＴＰ， ３７：４５ （１９７３）（これらは全て参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。簡単に説明すると、例えばＱスイッチルモニクス（Ｌｕｍｏｎｉｃｓ）ＨＹ４００ネオジム／イットリウムアルミニウムザクロ石レーザー（「Ｎｄ−ＹＡＧ」）（３５５ｎｍ、１０ｎｓｅｃ出力パルス）の周波数三重（ｔｒｉｐｌｅｄ）出力を、レンズ（１２インチ焦点距離）により、溶融シリカウィンドウを通し質量分析計内部の試料へと集束させる。レーザーにより形成された生成イオンは、３０ｋＶという静電ポテンシャルにより加速される。次いで、イオンは、３０μＰａという真空に維持された２ｍの管を降下し、それらの管の末端への到達が、例えばＬｅｃｒｏｙ  ＴＲ８８２８Ｄ一時記録機を使用して検出され記録される。最大２００の個々のレーザーショットの一時記録が総合され、得られたヒストグラムが質量スペクトルとしてプロットされる。ピークの重心の決定及びデータ換算は、ＶＡＸワークステーション又はその他のコンピュータシステムを使用して実施されうる。しかしながら、その他の機器及び技術も、既知であり、本発明のペプチドの分析のため容易に利用されうる。
【００５３】
試薬キット
本発明は、さらに、質量スペクトル分析によるタンパク質の分析のための試薬キットを提供する。典型的には、そのようなキットは、１個以上の本発明の化合物を含有しているであろう。最も好適には、キットは、実質的に同一のディファレンシャルに標識された化合物（同位体的に軽い化合物及び重い化合物）のセットを含有しているであろう。一つの望ましい実施態様において、キットは、化合物のポリマー部分が、固体支持体、例えばビーズ又は樹脂としても機能するような本発明の化合物を含有しているであろう。キットは、さらに、１個以上のタンパク質分解酵素、ブロッキング試薬、可溶化洗浄剤カクテル、又は洗浄溶液を含有しうる。その他の適当な成分は、当業者に容易に明からとなろう。
【００５４】
本発明の方法及びキットは、タンパク質の存在、欠如、不足、又は過剰が、正常又は疾患の状況と関連している、多様な臨床的及び診断的なアッセイのために使用されうる。本発明の方法及びキットは、細胞及び組織におけるタンパク質発現の定性的及び定量的な分析のために使用されうる。方法及びキットは、細胞又は生物学的流体における発現レベルが、薬物、毒素、環境変化、又は状態もしくは細胞状況の変化、例えば、疾患状況、悪性疾患、部位特異的突然変異、遺伝子治療、又は遺伝子ノックアウトにより影響を受けるタンパク質をスクリーニングするためにも使用されうる。
【００５５】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供されるのであって、本発明の範囲を制限するものではない。当業者であれば、特定の試薬及び条件が以下の実施例に概説されているが、修飾を施すことが可能であり、それらも本発明の本旨及び範囲に包含されるものであることを認識するであろう。
【００５６】
実施例
実施例１−本発明の化合物の合成
Ａ．リンカー及びアフィニティタグの調製
無水マレイン酸（０．９８ｇ、酢酸１５ｍｌ中１０．０ｍｍｏｌ）の溶液を、６−アミノカプロン酸（１．３１ｇ、酢酸５ｍｌ中１０ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。得られた混合物を、室温で２時間撹拌した。２時間後、混合物を４．５時間加熱還流させた（油浴温度約１１０〜１２０℃）。酢酸を真空で除去し、淡黄色の固体３．３ｇを得た。この固体をクロマトグラフィ（２０％酢酸エチルを含むヘキサン、次いで５０％酢酸エチルを含むヘキサン）に供し、純粋な標的化合物（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−イル）−ヘキサン酸；４３％収率）０．９２ｇを得た。この反応は、下記のスキームに図示されており、ここで酢酸はＨＯＡｃと略記されている。
【００５７】
【化１５】
2004531694.tif 000012
【００５８】
Ｂ．樹脂の調製
ＮｏｖａＳｙｎ ＴＧ Ｓｅｉｂｅｒ樹脂（１ｇ、０．１５ｍｍｏｌ／ｇ）として商業的に購入した保護されたポリマーを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（８ｍＬ）中で撹拌し、次いでピペリジン（２ｍＬ）を添加した。反応混合物を１０分間撹拌し、次いで、固体をろ過し、塩化メチレンで洗浄し、次いで真空下で乾燥させた。次いで、この乾燥した固体を、さらに１０分間ＤＭＦ（８ｍＬ）中でピペリジン（２ｍＬ）と共に再び撹拌した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を記録したところ、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）の痕跡は示されなかった。次いで、固体を濾過し、塩化メチレンで洗浄し、低圧下で乾燥させ、遊離アミンポリマー約１ｇを得た。この反応を、下記合成スキームにより図示する。
【００５９】
【化１６】
2004531694.tif 000013
【００６０】
ポリマーは、ポリエチレングリコールとポリスチレンとのコポリマーである。
【００６１】
Ｃ．本発明の化合物の調製
パートＢに記載されたようにして合成された脱保護されたポリマー（１ｇ、０．１５ｍｍｏｌ／ｇ）を、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中で撹拌した。この混合物に、パートＡに記載された反応から生じた化合物（０．０９５ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）（０．０６ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）、及びＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（０．１０２ｇ、０．５ｍｍｏｌ）を連続的に添加した。反応混合物を３時間撹拌し、固体を濾過し、酢酸エチル、エーテル、及び塩化メチレンで連続的に洗浄した。次いで、固体を真空で乾燥させ、以下に図示される生成物（本発明のＡＬＩＣＥ）約１ｇを得た。
【００６２】
【化１７】
2004531694.tif 000014
【００６３】
実施例２−装置類
当業者に既知の技術及び装置類を、それらを使用する新規な方法と組み合わせて利用して、本発明を実施した。具体的には、自動ＬＣ／ＭＳ単独を使用して、また、当分野において利用可能な装置類を使用した新規な自動２次元ＬＣ／ＬＣ／ＭＳシステムを使用して、データを得た。これらの機器、及びその使用法を、以下に記載する。
【００６４】
Ａ．自動ＬＣ／ＭＳ
自動ＬＣ／ＭＳは、ＡＢＩ  １４０Ｃマイクログラジエントシリンジポンプシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ， ＭＡ）を装備したＬＣ／ＭＳマイクロマス（ＭｉｃｒｏＭａｓｓ）Ｑ−ＴｏＦ２質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ， Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ， ＵＫ）を使用して達成した。試料を、ポリスルホエチル（ＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ）Ａ（１２μＭ、３００Å）（ＰｏｌｙＬＣ Ｉｎｃ．， Ｃｏｌｕｍｂｉａ， ＭＤ）が充填された強陽イオン交換（ＳＣＸ）カラム、１００μｍ×６ｃｍインテグラフリット（ＩｎｔｅｇｒａＦｒｉｔ）カラム（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ， Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ）に注入した。次いで、５００ｍＭ  ＫＣｌを含む０．１Ｍ酢酸の溶液を使用して、ＹＭＣ−Ｇｅｌ  １０μＭ  Ｃ１８ビーズ（ＹＭＣ Ｉｎｃ．， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＮＣ）が充填されたＲＰ−Ｃ１８カラム、７５μｍ×１０ｃｍピコフリット（ＰｉｃｏＦｒｉｔ）カラム（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ， Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ）へと試料を溶出させた。ＲＰ−Ｃ１８カラムを、９６％酢酸／４％ＡＣＮで平衡化し、次いで以下の勾配を実行した：２５０μＬ／分で、（ｉ）７５分で４〜６５％ＲＰ−Ｂ、（ｉｉ）次の７分で６５〜９８％ＲＰ−Ｂ、（ｉｉｉ）５分間９８％ＲＰ−Ｂで維持、そして（ｉｖ）次の３分で９８〜１％ＲＰ−Ｂ。移動相緩衝液は、ＲＰ−Ａ：０．１Ｍ酢酸、１％ＡＣＮ、及びＲＰ−Ｂ：０．１Ｍ酢酸、９０％ＡＣＮであった。データは、ＭＳモードのみで取得した。
【００６５】
Ｂ．自動２Ｄ−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ
自動化２Ｄ−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳは、図１Ａ及び１Ｂに示されるようなシステムを使用して達成した。具体的には、２Ｄ  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳフィニガン（Ｆｉｎｎｉｇａｎ）ＬＣＱデカ（Ｄｅｃａ）イオントラップ質量分析計に、逆相ポンプ（ＲＰ）としてのアプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）１４０Ｃマイクログラジエントシリンジポンプシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ｒａｍｉｎｇｈａｍ， ＭＡ）、及び強陽イオン交換（ＳＣＸ）及び脱塩のポンプとしてのアギレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）１１００シリーズバイナリーポンプを取り付けた。ポンプは、小型電動装置（ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ａｃｔｕａｔｏｒ）を有するＶＩＣＩ  １０ポートマイクロボア２ポジションバルブ（Ｖａｌｃｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＣＯ Ｉｎｃ．， Ｈｏｕｓｔｏｎ， ＴＸ）に接続した。強陽イオン交換カラム、５０×１ｍｍポリスルホエチルＡ（ＰｏｌｙＬＣ Ｉｎｃ．， Ｃｏｌｕｍｂｉａ， ＭＤ）をポート９に接続し、ＹＭＣ−Ｇｅｌ  １０μｍ  Ｃ１８ビーズ（ＹＭＣ Ｉｎｃ．， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＮＣ）が充填された２個の７５ｍｍ×１０ｃｍインテグラフリットカラム（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ， Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ）を、ポート２と５の間、及び７と１０の間にそれぞれ接続した。もう一つのピコフリットカラム（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ）に充填された７５μｍ×３ｃｍ  Ｃ１８カラムは、バルブ及びチタンユニオンからの分解能の損失を回復させるため、チタンボルテージユニオンと質量分析計の加熱されるキャピラリーとの間に設置した。
【００６６】
質量分析計とポンプとバルブとの間の自動化は、接触閉鎖（ｃｏｎｔａｃｔ ｃｌｏｓｕｒｅ）を使用して達成した。まず、試料を、図１Ｂに示されるような位置１０のポートバルブを有するレオダイン（Ｒｈｅｏｄｙｎｅ）注入バルブ（Ｒｈｅｏｄｙｎｅ， Ｒｏｈｎｅｒｔ Ｐａｒｋ， ＣＡ）を使用して、ＳＣＸカラムに担荷させ、未結合のペプチドが、ＲＰ−１８カラムと結合し、画分０に溶出するようにした。この二重Ｃ１８カラム設計では、一方のＲＰ−Ｃ１８カラム（図１ＡのカラムＡ）は、ペプチド分離のための質量分析計とオンラインとなっており、もう一方のＣ１８カラム（図１ＡのカラムＢ）は、再生され、ＳＣＸカラムから溶出したペプチド試料を担荷され、脱塩される。各ＨＰＬＣ勾配の実行が完了した後、２個のＲＰ−Ｃ１８カラムの位置を２ポジション１０ポートバルブを使用して切り替え（図１Ｂ）、平衡化、ＳＣＸからの試料の担荷、及び脱塩のための時間遅延が、効率的に排除されるようにした。ペプチド画分を、以下の塩工程を使用して、ＳＣＸカラムからＲＰ−Ｃ１８カラムへと溶出させた：（ｉ）５％、（ｉｉ）１０％、（ｉｉｉ）１５％、（ｉｖ）２０％、（ｖ）３０％、（ｖｉ）４０％、（ｖｉｉ）５０％、（ｖｉｉｉ）６５％、（ｉｘ）８５％、（ｘ）９８％、（ｘｉ）９８％、（ｘｉｉ）９８％、及び（ｘｉｉｉ）９８％、ＳＣＸ−Ｂ：ＳＣＸ−Ａ、１０分間、１μＬ／分。各溶出の前に、ＲＰ  Ｃ１８カラムを平衡化するため、１００％ＳＣＸ−Ａを１μＬ／分で２０分間流し、各塩溶出の後、溶出（ｉ）〜（ｉｖ）については２０分間、溶出（ｖ）及び（ｖｉ）については２５分間、溶出（ｖｉｉ）及び（ｖｉｉｉ）については３０分間、そして溶出（ｉｘ）〜（ｘｉｉｉ）については３５分間、１μＬ／分で１００％ＳＣＸ−Ａを流した。次いで、ＲＰ  Ｃ１８カラムからの塩をリンスするため、残りの時間は、流速を２００ｎＬ／分へと低下させた。４００ｎＬ／分で、ａ）７５分で１〜６５％ＲＰ−Ｂ、ｂ）次の７分で６５〜９８％ＲＰ−Ｂ、ｃ）５分間９８％ＲＰ−Ｂで維持、そしてｄ）次の３分で９８〜１％ＲＰ−Ｂという直線的なＲＰ勾配を使用して、ペプチドを、１個のＣ１８カラムから質量分析計へと溶出させた。移動相緩衝液は、ＲＰ−Ａ：０．１Ｍ酢酸、１％ＡＣＮ；ＲＰ−Ｂ：０．１Ｍ酢酸、９０％ＡＣＮ；ＳＣＸ−Ａ：０．１Ｍ酢酸、１％ＡＣＮ；ＳＣＸ−Ｂ：５００ｍＭ  ＫＣｌ（図１Ａ及び１Ｂ）であった。
【００６７】
実施例３−ＭＳ分析のためのプロテオームの調製
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）２ｍｇを、８Ｍ尿素、２００ｍＭ重炭酸アンモニウム、及び２０ｍＭ  ＣａＣｌ２ ２００μＬに可溶化した。アセトニトリル（ＡＣＮ）２０μＬに予め溶解させた５μｍｏｌのトリブチルホスフィン（ＴＢＰ）を、可溶化されたタンパク質混合物へ添加し、得られた溶液を３７℃で１時間インキュベートした。タンパク質混合物に、１１μｍｏｌのＭＭＴＳを添加し、混合物を１０分間ボルテックス処理した。タンパク質溶液を、１００ｍＭ重炭酸アンモニウムで１：１に希釈し、Ｌｙｓ−Ｃ（２％ｗ／ｗ）４０μｇを添加した。次いで、この混合物を３７℃で５時間インキュベートした。得られた溶液を水で１：１に希釈し、次いで、３７℃でトリプシン（２％ｗ／ｗ）で１５時間さらにタンパク質を消化した。得られたペプチド溶液を乾燥させ、次いで５０％アセトニトリル／２００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）で再構成させた。システイン含有ペプチドのジスルフィド結合を、３７℃でＴＢＰ（５μｍｏｌ）で１時間還元した。次いで、ＡＬＩＣＥ樹脂５０ｍｇ（約１１．５μｍｏｌの反応部位）をペプチド溶液に添加し、溶液を室温で１時間ボルテックス処理した。溶液を合わせ、カラム（テフロンコックストップ（ｃｏｃｋｓｔｏｐ）を有するガラス型）に担荷させ、樹脂を、以下の溶媒で順に洗浄した：１）５０％ＡＣＮ  ５×１ｍＬ、２）３０％ＡＣＮ  ５×１ｍＬ、３）９０％ＡＣＮ  ５×１ｍＬ、４）純粋ＡＣＮ  ５×１ｍＬ、５）ジクロロメタン（ＤＣＭ）１０×５ｍＬ。
【００６８】
次いで、システイン含有ペプチドを、連続流方法論を使用して、５％ＴＦＡを含むＤＣＭにより樹脂から溶出させた。得られたペプチド溶液を乾燥させ、１％酢酸を含む水で再構成させた。再構成したペプチド溶液を、さらなる処理なしに、直接（前記のような）自動２Ｄ−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析に供した。データベース探索と組み合わされたＭＳ分析は、タンパク質の同一性及び量の両方を与えた。
【００６９】
ＡＬＩＣＥアプローチを使用した場合、又は使用しない場合のシステイン含有ペプチドの全回収を比較するため、酸性溶出の前及び後の混合物からＭＳ分析のための試料を採取した。以下の発表されているウシ血清アルブミンの配列（一文字アミノ酸記号を使用）に関して、結果を以下に提供する。
【００７０】
【表１】
2004531694.tif 000015
2004531694.tif 000016
【００７１】
この研究は、洗浄後に樹脂から溶出するペプチドは、全て、排他的にシステイン含有ペプチドであるため、従来の試薬の使用に関連した非特異的結合が、本発明の化合物を使用した場合には問題とならないことを証明した。これは、従来のＩＣＡＴ試薬と比較して、はるかにストリンジェントな洗浄条件の使用を、本発明の化合物が許容するためである。従って、本発明の化合物は、その後のＭＳ分析において、より低い「ノイズ」、より優れたダイナミックレンジ及び感度を提供する。
【００７２】
より具体的には、この研究において、３５個のシステインのうち３３個が捕捉された。１個のＣｙｓ含有ペプチドＹＮＧＶＦＱＥＣＣＱＡＥＤＫ（配列番号１の残基１８４〜１９７）のみが、単離の前にも、又は後にも回収されなかった。ＣＡＳＩＱＫ（配列番号１の残基２２３〜２２８）及びＬＣＶＬＨＥＫ（配列番号１の残基４８３〜４８９）は、単離の後にのみ認められた。これは、本発明の化合物によって提供された、より優れたダイナミックレンジ及び感度による可能性が高い。未測定であるが、全回収率（％）は７５％を超えていたと予想される。複数のシステインを含有しているペプチドは、全て、本発明のモデル化合物ＡＬＩＣＥによって均一に修飾されたため、捕捉工程における立体障害は問題とならない。全てのＣＩＤ実験から、観察された断片は、ＡＬＩＣＥ標識に由来するものではなく、このことは、化合物が、ＭＳ／ＭＳ実験、及びその後のフラグメントイオンに基づくデータベース探索によるタンパク質同定を妨害しないであろうことを示している。
【００７３】
実施例４−ＡＬＩＣＥ、単純タンパク質混合物、並びに自動ＬＣ／ＭＳ及び２Ｄ−ＬＣ／ＭＳを使用したシステイン含有ペプチドの捕捉
各々８個のタンパク質を含有している混合物を２個、調製した。以下の表は、これらの混合物の組成を示している。
【００７４】
【表２】
2004531694.tif 000017
【００７５】
タンパク質混合物Ａ及びタンパク質混合物Ｂ（全タンパク質３２３ｎｍｏｌ）を、それぞれ６Ｍ尿素、５％３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、及び５０ｍＭトリスＨＣｌで可溶化した。イソプロパノール（ＩＰＡ）６．３μＬに予め溶解させた１１．３μｍｏｌのトリブチルホスフィン（ＴＢＰ）を、可溶化された各タンパク質混合物に添加し、得られた溶液を３７℃で１時間インキュベートした。各タンパク質混合物に、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２００μＬ及びＩＰＡ  ３．５μＬに予め溶解させた３４μｍｏｌメタンチオスルホネート（ＭＭＴＳ）を添加し、混合物を３０分間反応させた。各タンパク質溶液を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で４倍に希釈し、３７℃で１６時間トリプシン（５％ｗ／ｗ）で消化した。全ペプチド混合物から、４２％（各混合物から２１％）を将来の作業のため取り分け、残りの５８％（１８７ｎｍｏｌ全タンパク質）を乾燥させ、６０％アセトニトリル（ＡＣＮ）／４０％１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）１．５ｍＬで再構成させた。システイン含有ペプチドのジスルフィド結合を、３７℃で１時間ＴＢＰ（１８．７μｍｏｌ）により還元した。次いで、各溶液を、過剰のＴＢＰ及びＡＣＮを除去するため、１０分間真空濃縮し、ＡＣＮを使用して元の容量にまで再構成させた。各溶液に、軽いＡＬＩＣＥ樹脂又は重いＡＬＩＣＥ樹脂のいずれか５５μｍｏｌ（３×ＴＢＰモル当量）を添加し、溶液を室温で１時間撹拌した。最終濃度１％のβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）の添加によって、反応を停止させた。
【００７６】
次いで、タンパク質混合物を合わせ、カラム（テフロンコックストップを有する溶融ガラス型）に担荷させ、樹脂を以下の溶媒で順に洗浄した：（ｉ）５０：５０ＡＣＮ：水溶液５０ｍＬ、（ｉｉ）純粋ＡＣＮ  ５０ｍＬ、（ｉｉｉ）５０：５０ＡＣＮ：ジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液５０ｍＬ、そして（ｉｖ）純粋ＤＣＭ  ５０ｍＬ。
【００７７】
断続的に振とうしながらの１５分間のインキュベーション、次いで１５ｍＬの連続流という連続流方法論を使用して、５％ＴＦＡを含むＤＣＭ  ３×５ｍＬによる溶出により、システイン含有ペプチドを単離した。得られたペプチド溶液を乾燥させ、２％ＡＣＮを含む１％酢酸／水で再構成させた。再構成させたペプチド溶液を、さらなる処理なしに、直接ＨＰＬＣ−ＭＳマイクロマスＱ−ＴｏＦ２装置（ＭｉｃｒｏＭａｓｓ， Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ， ＵＳ）、及び２Ｄ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱ Ｄｅｃａ、Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）分析に供した。データベース探索と組み合わされたこれらの分析は、タンパク質の同一性及び量の両方を与えた。システイン含有ペプチドの単離に関する化学反応を、以下のスキームに図示する。
【００７８】
【化１８】
2004531694.tif 000018
【００７９】
マススペクトロメトリック分析の結果を、以下の表に提供する。この表中、Ｍ＃＝酸化型メチオニン残基；Ｃ＊＝軽いＡＬＩＣＥ及び重いＡＬＩＣＥで標識されたシステイン残基である。
【００８０】
【表３】
2004531694.tif 000019
2004531694.tif 000020
2004531694.tif 000021
2004531694.tif 000022
【００８１】
この研究は、ＡＬＩＣＥによる定量が、以下の要因：重いＡＬＩＣＥの同位体不純度；重いＡＬＩＣＥ及び軽いＡＬＩＣＥにより修飾された同一ペプチドの異なる溶出プロフィール；非特異的な酵素分解、を考慮に入れた後に正確であることを証明した。このＡＬＩＣＥによる改良された定量精度は、複数のシステイン含有ペプチドが存在する場合、さらに明白である。よりストリンジェントな洗浄条件が非特異的結合種を完全に除去したため、システイン残基を含まないペプチドは、最終的な捕捉されたペプチド混合物の中にほとんど認められなかった。さらに、大量の有機溶媒の使用も、手順全体を通してのペプチドの損失を最小限に抑えた。最後に、新規な自動２Ｄ−ＬＣ／ＭＳ設計と組み合わされた、システイン含有ペプチドの単離によるペプチド混合物の単純化は、全体的な試料担荷許容量、試料分析のスピード、並びにタンパク質混合物のＭＳ分析のダイナミックレンジ及び感度を増加させる。この実験は、さらに、ＡＬＩＣＥとシステイン含有ペプチドとの間の反応が、効率的かつ化学量論的であり、複数のシステイン残基を有するペプチドがＡＬＩＣＥにより完全に修飾されたため、立体障害の効果が懸念されないことも確認した。例えば、リゾチームに由来する３個のシステイン残基を有するトリプシンペプチド（ＮＬＣ＊ＮＩＰＣ＊ＳＡＬＬＳＳＤＩＴＡＳＶＮＣ＊ＡＫ、配列番号：２）は、重い又は軽いＡＬＩＣＥのいずれかによって均一に標識された（この重い質量と軽い質量との対間の質量差（示していない）は、正確に３０Ｄａである）。軽いＡＬＩＣＥで標識されたペプチドのピーク強度は極めて低かったが、軽いＡＬＩＣＥで標識されたペプチドも、重いＡＬＩＣＥで標識されたペプチドも、ＭＳ／ＭＳ分析のための自動２Ｄ−ＬＣ／ＬＣ／ＭＳシステムによって効率的に拾い上げられた。その後のデータベース探索は、それぞれ軽いＡＬＩＣＥ及び重いＡＬＩＣＥによって修飾されたシステイン残基を有するＮＬＣ＊ＮＩＰＣ＊ＳＡＬＬＳＳＤＩＴＡＳＶＮＣ＊ＡＫ［配列番号：２］として、ペプチドを同定した。
【００８２】
この明細書中に引用された全ての出版物が、参照により本明細書に組み込まれる。特に好ましい実施態様に関して本発明を説明してきたが、本発明の本旨を逸脱することなく、修飾を施すことが可能であることが理解されよう。そのような修飾は、添付の特許請求の範囲の範囲内に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
本発明の自動２Ｄ−ＬＣ／ＭＳシステムの概略図である。
【図１Ｂ】
本発明の自動２Ｄ−ＬＣ／ＭＳシステムの概略図である。
【図１Ａ】
2004531694.tif 000027
【図１Ｂ】
2004531694.tif 000028
【国際公開パンフレット】
2004531694.tif 000029
2004531694.tif 000030
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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