(57)【要約】【課題】簡単、経済的、そして確実な方法で実施できる、患者の全血、血漿および（または）血清のアルファ・オキソアルデヒドを検出する方法を提供する。【解決手段】本発明は、患者の全血、血漿および（または）血清中のアルファ・オキソアルデヒドを検出する方法に関し、当該方法は、呼気試料を前記患者の全血、血漿および（または）血清中の少なくとも１つ又は複数のアルファ・オキソアルデヒドの存在を確認するために分析し、この分析結果から推定される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の全血、血漿および（または）血清中のアルファ・オキソアルデヒドを検出する方法であって、呼気試料が、前記患者の全血、血漿および（または）血清中の少なくとも１つ又は複数のアルファ・オキソアルデヒドの存在を確認するために分析され、前記方法は当該分析結果から推定される。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記呼気試料中のアルファ・オキソアルデヒドの濃度が測定され、そこから、患者の前記全血、血漿および（または）、血清中のアルファ・オキソアルデヒドの濃度が推定される。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法であって、メチルグリオキサル、グリオキサールおよび（または）３−デオキシグルクロンが、アルファ・オキソアルデヒドとして検出される。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれかに記載の方法であって、前記呼気試料は、試料バッグおよび（または）適当な試料コンテナで密封され、並びに（または）インピンジャーを通して導かれる。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれかに記載の方法であって、呼気試料中のアルファ・オキソアルデヒドが誘導体化媒体によって誘導体化され、生じた誘導体が測定される。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記誘導体は、蛍光分析器、測光器、および（または）クロマトグラフィーで検出される．
【請求項７】
請求項１ないし４のいずれかに記載の方法であって、呼気試料中のアルファ・オキソアルデヒドは、電気化学的により、分光法により、酵素により、および（または）免疫化学的により検出されるアルファ・オキソアルデヒドによって測定される。
【請求項８】
請求項１ないし４のいずれかに記載の方法であって、呼気試料中のアルファ・オキソアルデヒドが、質量分析計によって測定される。
【請求項９】
請求項１ないし４のいずれかに記載の方法であって、呼気試料に含まれているメチルグリオキサルがグリオキサラーゼを伴った乳酸塩に変換され、続いて当該乳酸塩がセンサにより検出される。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、患者の全血中、血漿中、および（または）血清中におけるアルファ・オキソアルデヒドを検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
腎臓障害あるいは目のレンズの曇りのように、長年の糖尿病疾患（つまりインシュリン依存、又は非インシュリン依存の糖尿病）の結果発生する合併症は、決まって発見が困難であり、しかもしばしば遅いステージでしか発見されない。これら合併症および間接疾患に共通する原因は、しばしば、コラーゲン、酵素あるいは他の細胞の成分と共にグリコレートを形成し、このメカニズムによってセル毒素の役割を果たすことが可能な反応的代謝産物にある。この疾患に対応するマーカーは、研究所における複雑な血液解析を経てのみ得られる最新の技術によって検出できる。
【０００３】
最近の３〜４年で、長年の糖尿病における間接疾患を解明するための実験は、細胞毒素のアルファ・オキソアルデヒドが重大かつ原因的な役割を果たすことを示した（Ｂｅｉｓｓｗｅｎｇｅｒら（１９９９）糖尿病、４８巻、頁１９８―２０２）。従ってこれに関連して、特に、アルファ・オキソアルデヒドの役割、例えばメチルグリオキサル、グリオキサールあるいは３−デオキシグルクロン等が議論された。これらの物質は赤血球中で形成され、全血中の、血漿中の、および血清中の非常にわずかな濃縮において生じる。
【０００４】
これに関連して、アルファ・オキソアルデヒド、メチルグリオキサルに特に注目する。メチルグリオキサルは、トリオースリン酸（ケトン体の変形現象化）から、およびさらにトレオニンの変形現象化中に発生可能であり、グリオキサラーゼによってさらに分解される。その後、メチルグリオキサルは、イミダゾロン誘導体およびビス・リシル架橋の構成を備えた蛋白質と反応する。蛋白質のこの架橋は、コラーゲンの安定化、およびその結果としての細胞膜の肥厚に結びつくことが可能である。従って、これらの反応は、少なくとも腎不全およびレンズ曇りのような糖尿病合併症の一部について説明する。
【０００５】
単独の血糖測定は、糖尿病患者の場合には現在のところ通常のことであるが、全血、血しょう、又は血清中の短時間のメチルグリオキサル濃縮に関して直接の結論を導かない。
【０００６】
従来の技術によれば、アルファ・オキソアルデヒドの測定は従ってもっぱら侵襲的に、つまり血漿から達成される。インシュリン依存の糖尿病を患った患者の場合には、Ｔｈｏｒｎａｌｌｙ　Ｔ．Ｊの「糖化および糖尿病合併症の進行。グルコース、メチルグリオキサルおよび酸化ストレスの関与の一元化」（内分泌学および新陳代謝、１９９６年、３月、頁１４９―１６６）により検出できる。血しょうの中の直接のメチルグリオキサル濃度は、健康な比較被験者と比較して５〜６倍高く、インシュリン依存の糖尿病を患った患者の場合には２〜３倍高い。また、アルファ・オキソアルデヒドの測定は尿において可能であるが、生理学条件的に尿中に期待される濃度が非常に低く、あまりに高度な分析の複雑さを要するので、文献に記載されていない。従って、血しょうの中のアルファ・オキソアルデヒドの直接の測定が要求される。
【０００７】
従来の技術に基づくこれら検査方法の結果、定期的な検査、および全血、血漿、及び血清中のメチルグリオキサルなどのアルファ・オキソアルデヒドの低減を目的として、可能な限り必要に応じて投薬することは、非常に高価である。
【０００８】
ＷＯ＿９８／５７＿１４５＿Ａ１は、適当なガスの試料の分析によって、病気など生物学上の状態の早期発見用の方法について記述する。
【０００９】
ＷＯ＿９９／５６＿７９０＿Ａ２は、糖尿病の診断のために使用される呼気テストの実施用の診断キットについて記述する。
【００１０】
ＤＤ＿２１９＿２８７＿Ａ１は、測定用キュベット、フィルタ、レンズおよび電源ユニットを使用して、放射線吸収に基づく呼気ガス中のアセトンの濃度の選択的な測定に基づき糖尿病患者の血糖をチェックする測定器について記述する。
【００１１】
従来技術によるこれらの方法は、結果的に非常に複雑で高価で、それ故、現在まで、全血、血漿あるいは血清中のアルファ・オキソアルデヒド含有量を測定するための定期的な検査用には適切ではなかった。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
したがって本発明の目的は、簡単、経済的、そして確実な方法で実施できる、患者の全血、血漿および（または）血清のアルファ・オキソアルデヒドを検出する方法を提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
この目的は、請求項１の特徴を備えた方法によって達成される。本発明による方法の有利な展開は従属項において提供される。
【００１４】
本発明による方法は、例えば、検査が患者自身に行なわれるのではなく、単に、患者の呼気試料（つまり呼気ガスおよび（または）呼気凝縮物）が検査されることに基づく。この方法により、アルファ・オキソアルデヒドも呼気において検出される。さらに、主として血漿の中に存在するアルファ・オキソアルデヒドは明らかに、細胞膜を容易に通過することができる。その結果、これらは呼気ガスあるいは呼気凝縮物において検出できる。更に、アセトンなど他の既知のマーカーとは対照的に、それらは代謝に特有で、大気に遍在して存在することがない。従って、１つの簡単で、経済的で、確実で、定期的で、かつ非侵襲性の、全血、血漿および血清中のアルファ・オキソアルデヒド組成物のモニタリングが、糖尿病患者の場合に可能である。その結果、適当な薬物治療によって、糖尿病に起こり得る間接疾患の危険は低減できる。従って、長年の糖尿病を患った患者の場合に、糖尿病合併症の回避用の新しい方策を導入する可能性がある。例えば、いわゆる腐食性合成物の処理により血液中のアルファ・オキソアルデヒドの濃度を減じられることが可能である。このタイプの治療は、発明による非侵襲性の検査方法に支持され、単に通常の方式で可能である。
【００１５】
試料の取得は、対応する試料採取バッグおよび（または）適当な試料コンテナに息を吹き込むことによって、あるいはインピンジャーを通して呼気を導くことにより達成できる。このインピンジャーは、直接検出（蛍光、あるいは測光器による）の、あるいはクロマトグラフィーによる測定のために誘導体化媒体で満たすことができる。さらに、電気化学的、分光法（例えばＩＲ分光法）、酵素あるいは免疫化学的な検出のための試薬でインピンジャーを充填することも可能である。
【００１６】
１つの検査法は、グリオキサラーゼによる、メチルグリオキサルの乳酸塩への酵素変換、および続く、乳酸塩の改良されたセンサでの測定にある。
【００１７】
そのために、本発明において、呼気試料（つまり呼気、呼気凝縮物の両方）の成分がすべて、アルファ・オキソアルデヒド含有量の分析に適しているということが重要である。
【００１８】
なお上記の発明の概要は、本発明の必要な特徴の全てを列挙したものではなく、これらの特徴群のサブコンビネーションも又発明となりうる。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本実施例において、タイプＩＩ糖尿病を患った女性患者の呼気試料が、アルファ・オキソアルデヒド、グリオキサールおよびメチルグリオキサルのために採取され検査された。検査方法として、Ｚｕｒｅｋ他（分析者、１９９９年、１２４巻、頁１２９１―１２９５）によるＤＮＰＨ法が用いられた。
【００２０】
呼気の試料採取は以下のように実施された：
チューブを備えた吹き口を介して、容積３０リットルの試料バッグ（ここではＴｅｄｌａｒ（登録商標）バッグ）が検査人／患者によって息を吹き込まれた。
【００２１】
続いてＴｅｄｌａｒバッグによる試料採取は、収集過程にわたって、規定された体積を管理することができるように実施された。
【００２２】
試料採取に続き、規定された空気体積（体積流れ＜２リットル／ｍｉｎの場合の２０リットル）が、集めた物質を含むカルトゥーシュを介して、ポンプによってバッグから吸い取られる。購入可能なカルトゥーシュは、集めた物質としての２、４−ジニトロフェニルヒドラジン（Ｓｕｐｅｌｃｏ：項目番号５０５３５８）で覆われたシリカゲルで満たされる。アルファ・オキソアルデヒドは以下の等式で反応して２、４−ジニトロヒドラゾンになり、シリカゲル上に保持される。
【００２３】
【化１】
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【００２４】
結果として生ずる誘導体は、４ｍｌのアセトニトリルによりカルトゥーシュから続いて溶離される。また、得られた溶離液は、乾燥により体積が減少する。残りの残留物は、５００μｌのアセトニトリルによって再び溶かされる。２０μｌの部分標本は分析用のＨＰＬＣシステムへ転送される。
【００２５】
逆相クロマトグラフィーの原理によるＨＰＬＣ方法は、分析のために以下の順序立ったパラメーターと共に用いられる。：
【００２６】
カラム：Ｈｙｐｅｒｓｉｌ　ＢＤＳ　Ｃ１８、カラム長１０ｃｍ、カラム径：４ｍｍ、粒子サイズ：３μｍ
移動相：アセトニトリルおよび水の混合物（０．５ｍｌ／ｍｉｎの体積流れ）
出発状態：アセトニトリルおよび水の混合物（５０：　５０；体積比率）
変化率：１０分以上にわたる固定の出発状態、その後２７分以内にアセトニトリルの体積比率を１００％に。データは３６０および４０４ｎｍのＵＶ検出によって検出され、ヒューレット・パッカードのケム−ステーション（Ｈｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ　Ｃｈｅｍ−Ｓｔａｔｉｏｎ）で記録した。
【００２７】
図１：中味の識別を保護するために、収集カルトゥーシュの溶離物の一部は、上記の条件の下でＨＰＬＣシステムを用いて分析された。ＨＰＬＣシステムは、ＵＶ検知器に加えて質量分析計を利用可能な状態で備える（図１）。後者の中味の識別は、それらの分子量によって、およびさらに分子が特有の分子破片へ分解することにより可能になる。
【００２８】
アルファ・オキソアルデヒドの誘導体の規定された量が、溶離液のさらなる部分に加えられ、溶体は、ＨＰＬＣおよびＵＶ検出によって分析された（標準添加の原理）（図２）。誘導体の添加量に依存して、対応する合成物のクロマトグラム中の信号が増加する。そしてこれにより、識別が確かになる。
【００２９】
図１では、アセトンのピークおよびメチルグリオキサルのピークが直ちに検出される。従って、さらに呼気試料の中で代謝産物メチルグリオキサルを検出できる。そしてその結果、非侵襲的に、かつ直ちに、患者の血漿中にメチルグリオキサルが存在することを代謝の特異性に基づいて示す。
【００３０】
メチルグリオキサルは遍在して発生しないので、患者の環境に起因する測定のひずみや測定結果の虚偽は起こり得ない。
【００３１】
健康な比較被験者によるさらなる比較検査中において、アルファ・オキソアルデヒドは、その呼気中において現在まで検出できなかった。
【００３２】
実施例として、健康な比較被験者の呼気試料が、上記の方法に対応して検査された。図３は、健康な被験者に結果として生ずるクロマトグラムを示す。アルファ・オキソアルデヒドの保持時間領域において検討可能な信号は検出されない。図４に示すように、クロマトグラムにおいてメチルグリオキサル基準の追加の後、１９．５０分に信号が現われた。
【００３３】
以上、本発明を実施形態を用いて説明したが、本発明の技術的範囲は上記実施形態に記載の範囲には限定されない。上記実施形態に、多様な変更または改良を加えることができる。そのような変更または改良を加えた形態も本発明の技術的範囲に含まれ得ることが、特許請求の範囲の記載から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】糖尿病患者のクロマトグラムである。
【図２】メチルグリオキサルによるピークを有する糖尿病患者のクロマトグラムである。
【図３】非糖尿病患者の呼気試料である。
【図４】非糖尿病患者のピーク有り試料である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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