(57)【要約】本発明は、プロカインおよびプロカイン誘導体のようなベンズアミドおよび安息香酸誘導体を含むがこれらに限定されないコルチゾール調節化合物に関し、これらは、老人性鬱病、高血圧、アルツハイマー病、および後天性免疫不全症候群を含むコルチゾールが介在する障害を処置するための組成物および方法において利用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コルチゾールが介在する病態、病気、もしくは障害を処置するための方法であって、それを要する被験者に、以下の構造式(I)の化合物、もしくはそれらの薬学的に許容される塩の治療上有効量を含んだ薬学的組成物を投与することを特徴とする、方法。
【化１】
2006526635.tif 000010
（ここで、式中の、
a） R1 、 R2 、 R3、 R4 および R5 が、独立に、 H 、OH基、ハロ基、 (C1-C6)アルキル基、 (C1-C6) アルコキシ基、 (C3-C6)シクロアルキル基、 (C3-C6)シクロアルキル((C1-C6)アルキル)基、 (C2-C6)アルケニル基、 (C2-C6)アルキニル基、 (C1-C6)アルカノイル基、ハロ(C1-C6)アルキル基、ヒドロキシ(C1-C6)アルキル基、 (C1-C6)アルコキシカルボニル基、または、 (C1-C6)アルキルチオ基、もしくは (C1-C6)アルカノイルオキシ基であるか、あるいは、 R1 と R2とが共に、メチレンジオキシ基となっており、
b） X1 が、 NO2基、 CN基、 -N=O 、 (C1-C6)アルキルC(O)NH- 、イソオキサゾリル基、 N(R6)(R7) 、アリール基、アリール(C1-C6)アルキル基、アリール(C2-C6)アルケニル基、ヘテロアリール基、ヘテロアリール(C1-C6)アルキル基であって、ここで式中の R6 および R7 は、独立に、 H 、 (C1-C6)アルキル基、 (C2-C6)アルケニル基、 (C3-C6)シクロアルキル基、 ((C1-C6)アルキル)基であって、式中のシクロアルキル基は、任意に1〜2個の S 、過酸化物ではない O 、 もしくは N(R8) を含み、ここで式中の R8 は、 H 、 (C1-C6)アルキル基、 (C3-C6)シクロアルキル基、 (C3-C6)シクロアルキル(C1-C6)アルキル基、もしくはベンジル基であるか、あるいは、 R6 および R7 が、前記の N と共に、五員環もしくは六員環である複素環または複素芳香環であって、オプションとして R1 で置換されている、及び、オプションとして1〜2個の S 、過酸化物ではない O 、 もしくは N(R5) を含むような、複素環または複素芳香環を構成しており、
c） (Alk) が、 (C1-C6)アルキル基であり、
d） X および Z が、 =O 、 -O(CH2)mO- 、もしくは -(CH2)m- であって、式中の m が2〜4であるか、あるいは、 X が H であって Z が OH基もしくは SH基であり、
e） Het が、ヘテロアリール基もしくはヘテロシクロアルキル基であって、それぞれが任意に1、2もしくは3個の R1 、またはそれらの組み合わせで置換されているか、あるいは、 Het が (Alk) と NH基とを繋ぐ結合であり、
f） p は0もしくは1である。）
【請求項２】
前記量が、アルツハイマー病と血管性痴呆との少なくとも一方の症候を処置する上で有効な量であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
構造式 I の前記化合物が、ヒトに投与されることを特徴とする、請求項１もしくは２に記載の方法。
【請求項４】
構造式(I)の前記化合物が、 1-(4-シクロプロパンカルボニル-3-メチル-ピペラジン-1-カルボニル)-(1H-インドール-3-イル-メチル)-(4-ニトロベンズアミド)-メタンを含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
コルチゾールが介在する病態、病気、もしくは障害を処置するための方法であって、それを要する被験者に、酢酸=4,5-ジアセトキシ-2-アセトキシメチル-6-[4-(2-ジエチルアミノ-エチルカルバモイル)-2-メトキシフェノキシ]-テトラヒドロ-ピラン-3-イルエステルの有効量を投与することを特徴とする方法。
【請求項６】
コルチゾールが介在する病態、病気、もしくは障害を処置するための方法であって、それを要する被験者に、酢酸=5-アセトキシ-3-(4-ベンゾイル-ピペラジン-1-イル-メチル)-4-ヒドロキシ-4a,8-ジメチル-2-オキソドデカヒドロ-アズレノ[6,5-b]フラン-4-イルエステルの有効量を投与することを特徴とする方法。
【請求項７】
コルチゾールが介在する病態、病気、もしくは障害を処置するための方法であって、それを要する被験者に、 3-(4-ベンゾイル-ピペラジン-1-イル-メチル)-6,6a-エポキシ-6,9-ジメチル-3a,4,5,6,6a,7,9a,9b-オクタヒドロ-3H-アズレノ[4,5-b]フラン-2-オンの有効量を投与することを特徴とする方法。
【請求項８】
コルチゾールが介在する病態、病気、もしくは障害を処置するための方法であって、それを要する被験者に、プロカインもしくはその薬学的に許容される塩の有効量を投与することを特徴とする方法。
【請求項９】
HMG-CoA mRNA基礎量に影響することなくHMG-CoA還元酵素mRNA発現量を抑制するための方法であって、それを要する被験者に、以下の構造式(I)の化合物、もしくはそれらの薬学的に許容される塩の治療上有効量を含んだ薬学的組成物を投与することを特徴とする、方法。
【化２】
2006526635.tif 000011
（ここで、式中の、
a） R1 、 R2 、 R3、 R4 および R5 が、独立に、 H 、OH基、ハロ基、 (C1-C6)アルキル基、 (C1-C6) アルコキシ基、 (C3-C6)シクロアルキル基、 (C3-C6)シクロアルキル((C1-C6)アルキル)基、 (C2-C6)アルケニル基、 (C2-C6)アルキニル基、 (C1-C6)アルカノイル基、ハロ(C1-C6)アルキル基、ヒドロキシ(C1-C6)アルキル基、 (C1-C6)アルコキシカルボニル基、または、 (C1-C6)アルキルチオ基、もしくは (C1-C6)アルカノイルオキシ基であるか、あるいは、 R1 と R2とが共に、メチレンジオキシ基となっており、
b） X1 が、 NO2基、 CN基、 -N=O 、 (C1-C6)アルキルC(O)NH- 、イソオキサゾリル基、 N(R6)(R7) 、アリール基、アリール(C1-C6)アルキル基、アリール(C2-C6)アルケニル基、ヘテロアリール基、ヘテロアリール(C1-C6)アルキル基であって、ここで式中の R6 および R7 は、独立に、 H 、 (C1-C6)アルキル基、 (C2-C6)アルケニル基、 (C3-C6)シクロアルキル基、 ((C1-C6)アルキル)基であって、式中のシクロアルキル基は、任意に1〜2個の S 、過酸化物ではない O 、 もしくは N(R8) を含み、ここで式中の R8 は、 H 、 (C1-C6)アルキル基、 (C3-C6)シクロアルキル基、 (C3-C6)シクロアルキル(C1-C6)アルキル基、もしくはベンジル基であるか、あるいは、 R6 および R7 が、前記の N と共に、五員環もしくは六員環である複素環または複素芳香環であって、オプションとして R1 で置換されている、及び、オプションとして1〜2個の S 、過酸化物ではない O 、 もしくは N(R5) を含むような、複素環または複素芳香環を構成しており、
c） (Alk) が、 (C1-C6)アルキル基であり、
d） X および Z が、 =O 、 -O(CH2)mO- 、もしくは -(CH2)m- であって、式中の m が2〜4であるか、あるいは、 X が H であって Z が OH基もしくは SH基であり、
e） Het が、ヘテロアリール基もしくはヘテロシクロアルキル基であって、それぞれが任意に1、2もしくは3個の R1 、またはそれらの組み合わせで置換されているか、あるいは、 Het が (Alk) と NH基とを繋ぐ結合であり、
f） p は0もしくは1である。）
【請求項１０】
構造式(I)の前記化合物が、(4-シクロプロパンカルボニル-3-メチル-ピペラジン-1-カルボニル)-(1H-インドール-3-イル-メチル)-(4-ニトロベンズアミド)-メタンを含むことを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
カルシウムの輸送および細胞内貯蔵からの放出を調節して、細胞内カルシウム濃度を変化させるための方法であって、それを要する被験者に、以下の構造式(I)の化合物、もしくはそれらの薬学的に許容される塩の治療上有効量を含んだ薬学的組成物を投与することを特徴とする、方法。
【化３】
2006526635.tif 000012
（ここで、式中の、
a） R1 、 R2 、 R3、 R4 および R5 が、独立に、 H 、OH基、ハロ基、 (C1-C6)アルキル基、 (C1-C6) アルコキシ基、 (C3-C6)シクロアルキル基、 (C3-C6)シクロアルキル((C1-C6)アルキル)基、 (C2-C6)アルケニル基、 (C2-C6)アルキニル基、 (C1-C6)アルカノイル基、ハロ(C1-C6)アルキル基、ヒドロキシ(C1-C6)アルキル基、 (C1-C6)アルコキシカルボニル基、または、 (C1-C6)アルキルチオ基、もしくは (C1-C6)アルカノイルオキシ基であるか、あるいは、 R1 と R2とが共に、メチレンジオキシ基となっており、
b） X1 が、 NO2基、 CN基、 -N=O 、 (C1-C6)アルキルC(O)NH- 、イソオキサゾリル基、 N(R6)(R7) 、アリール基、アリール(C1-C6)アルキル基、アリール(C2-C6)アルケニル基、ヘテロアリール基、ヘテロアリール(C1-C6)アルキル基であって、ここで式中の R6 および R7 は、独立に、 H 、 (C1-C6)アルキル基、 (C2-C6)アルケニル基、 (C3-C6)シクロアルキル基、 ((C1-C6)アルキル)基であって、式中のシクロアルキル基は、任意に1〜2個の S 、過酸化物ではない O 、 もしくは N(R8) を含み、ここで式中の R8 は、 H 、 (C1-C6)アルキル基、 (C3-C6)シクロアルキル基、 (C3-C6)シクロアルキル(C1-C6)アルキル基、もしくはベンジル基であるか、あるいは、 R6 および R7 が、前記の N と共に、五員環もしくは六員環である複素環または複素芳香環であって、オプションとして R1 で置換されている、及び、オプションとして1〜2個の S 、過酸化物ではない O 、 もしくは N(R5) を含むような、複素環または複素芳香環を構成しており、
c） (Alk) が、 (C1-C6)アルキル基であり、
d） X および Z が、 =O 、 -O(CH2)mO- 、もしくは -(CH2)m- であって、式中の m が2〜4であるか、あるいは、 X が H であって Z が OH基もしくは SH基であり、
e） Het が、ヘテロアリール基もしくはヘテロシクロアルキル基であって、それぞれが任意に1、2もしくは3個の R1 、またはそれらの組み合わせで置換されているか、あるいは、 Het が (Alk) と NH基とを繋ぐ結合であり、
f） p は0もしくは1である。）
【請求項１２】
前記の構造式(I)の化合物が、 (4-シクロプロパンカルボニル-3-メチル-ピペラジン-1-カルボニル)-2-(1H-インドール-3-イル-メチル)-4-(4-ニトロフェニル)-ブタン-1,4-ジオンを含むことを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記の (Alk) が、 -(CH2)- 、  -(CH2)2- 、  -(CH2)3- 、もしくは -(CH2)4- といった (C1-C4)アルキル基であることを特徴とする、請求項１、９、もしくは１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記の R4および R5 の双方が、 (C1-C6)アルキル基、 (C3-C6)シクロアルキル基、もしくは (C3-C6)シクロアルキル(C1-C6)アルキル基であり、好ましくは (C1-C4)アルキル基もしくは (C3-C6)シクロアルキル基であることを特徴とする、請求項１、９、もしくは１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記の R1、 R2 もしくは R3 の内のひとつまたは二つが、 H もしくは (C1-C6)アルコキシ基であり、好ましくは (C1-C3)アルコキシ基であることを特徴とする、請求項１、９、もしくは１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記の X および Z が =O であることを特徴とする、請求項１、９、もしくは１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記の p が 1 であることを特徴とする、請求項１、９、もしくは１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記の Het が、 1H-インドール-3-イル基、もしくはイミダゾリン-3-イル基であることを特徴とする、請求項１、９、もしくは１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記の構造式 I の化合物が、ヒトのような哺乳類へ経口投与されることを特徴とする、請求項１、９、もしくは１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記の構造式 I の化合物が、ヒトのような哺乳類へ、注射、輸液、吸入、もしくはガス注入によって非経口的に投与されることを特徴とする、請求項１、９、もしくは１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記の構造式(I)の化合物が、薬学的に許容される担体と共に投与されることを特徴とする、請求項１、９、もしくは１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記担体が、溶液、懸濁液、もしくはゲルのような液体であることを特徴とする、請求項１、９、もしくは１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記担体が固体であることを特徴とする、請求項１、９、もしくは１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記の構造式 I の化合物が、 N-[2-((4-シクロプロピルカルボニル)-3-メチルピペラジン-1-イル)-1-(1H-インドール-3-イル-メチル)-2-(オキソ)エチル]-4-ニトロベンズアミドであることを特徴とする、請求項１、９、もしくは１１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コルチゾールを調節する薬剤を含む薬学的組成物に関し、また、そのような組成物を病気の処置に用いる方法に関し、また、そのような組成物と他の薬剤とを配合したものに関し、また、そのような組成物を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
コルチゾール（副腎皮質分泌糖質コルチコイドホルモン）は、脂肪、炭水化物、および蛋白質の代謝に関するものである。ヒトにおいては、コルチゾールは循環している主要な糖質コルチコイドであって、また、睡眠サイクル調節、代謝、免疫、感情正常化、記憶、および学習のような種々の生理的機能に関与している。血漿中のコルチゾール濃度の変動は、筋骨格、消化管系、心血管、内分泌腺、および中枢神経系の病気にも関連する。コルチゾールの過剰産生によって、代謝、認知障害（McEwen, 1994）、および免疫抑制（Chrousos and Gold, 1992）に変動が生じる。視床下部-脳下垂体-副腎系 （ hypothalamic-pituitary-adrenal axis;  HPA axis ） の種々のレベルの異常については、抑鬱および気分変化を含む精神疾患（Kiraly et al., 1997;  Tafet et al., 2001）、後天性免疫不全症候群（AIDS）（Corley, 1996;  Bhansali et al., 2000;  Christeff et al., 2000）、多発性硬化症（Erkut et al., 2002）、痴呆症（認知症）（Maeda et al., 1991;  Polleri et al., 2002）、アルツハイマー病（Swaab et al., 1994;  O'Brien et al., 1996;  Weiner et al., 1997;  Giubilei et al., 2001;  Rasmuson et al., 2002）、および乳癌の結果（Luecken et al., 2002）といった数々の病気に関して報告されている。これらの病気によるホルモンバランスの破壊により、コルチゾールの生成の増大が齎され、脳脊髄液（Swaab et al., 1994;  Erkut et al., 2002）、血液（Weiner et al., 1997;  Bhansali et al., 2000;  Rasmuson et al., 2002）、尿（Maeda et al., 1991）、および唾液（Giubilei et al., 2001）の中のコルチゾール濃度の増大を招く。
【０００３】
細胞内レベルにおいては、コルチゾールなどの糖質コルチコイドは、シトクロムcオキシダーゼの活性を減少させ（Simon et al., 1998）、また、さまざまな細胞株においてアポトーシスを誘導する（Montague and Cidlowski, 1995）ことが示されている。コルチゾールはコレステロールから誘導される。遊離コレステロールの動態化 （ mobilization ） 、および、細胞内貯蔵からミトコンドリア内への輸送とによってステロイド産生が始まり、このミトコンドリア内において、代謝経路の主要な酵素であるシトクロムP-450側鎖切断酵素複合体 （ cytochrome P-450 side-chain cleavage enzyme complex;  P-450scc ） によって、コレステロールが代謝されてプレグネノロンへと変わることになる。コルチコトロピン（ACTH）、および、cAMP依存性プロテインキナーゼ（PKA）を通して機能するそのセカンドメッセンジャーcAMP（環状アデノシン3',5'-一リン酸）などのホルモンは、このプロセスを加速する。ミトコンドリア内へのコレステロール輸送はステロイド生合成の律速段階であるにもかかわらず、ステロイドの生成は、可用な基質コレステロールの量によっても制限される。コレステロールの可用性は、その合成速度に依存し、したがって、細胞質に存在する律速酵素である 3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-補酵素A（HMG-CoA）還元酵素の活性は、HMG-CoAからメバロン酸への転換に関わっている。
【０００４】
高コレステロール血症 （ hypercholesterolemia ） は、心血管系の種々の病態の主要な要因のひとつである。現在、スタチン類 （ statins ） が高コレステロール血症の主要な治療手段として用いられており、これは、スタチン類がHMG-CoAの結合部位を占有し、この基質がHMG-CoA還元酵素 （HMG-CoAレダクターゼ;  HMG-CoA reductase ） の活性部位へとアクセスすることを阻害する（Istvan and Deisenhofer, 2001）ためである。加えて、スタチン類は、高コレステロール血症が重篤な役割を演じると思われているアルツハイマー病の進行を遅らせる（Waldman and Kitharides, 2003）ために治験で用いられている。しかしながら、スタチン類は非常に多くの深刻な副作用を有することが近年報告されている。他に提案されている治療法は、ステロイド産生経路に関連した酵素の活性を阻害することに焦点を絞っている。しかしながら、そのような方法および組成物は、基礎生理であるステロイド産生の阻害を招き、被験者の健康に有害な作用を引き起こすと考えられる。
【０００５】
HIV関連痴呆症 （ HIV関連認知症;  HIV-associated dementia ） （HIV関連痴呆複合症、HIV関連認知／運動複合症、およびAIDS痴呆複合症としても知られる）は、進行性の神経病態であり、米国においてはおよそ58,000人のヒト免疫不全ウイルス（HIV）の患者が罹っているものである。HIV関連痴呆症は皮質下痴呆であると考えられ、職業上もしくは社会上の働きに関する個人の能力を十全に妨害するほどの認知、運動および行動の障害が特徴である。HIV関連痴呆症の初期症状は、以下のような認知障害、運動能力喪失、および／もしくは行動誘発 （ behavioral challenge ） で特徴づけられる。
【０００６】
認知障害:  認知障害に関連する、記憶喪失、集中障害 （ impaired concentration ） 、および、緩徐な反応をともなう行動を特徴とする精神的遅緩 （ mental slowing ） が共通属性となる。
【０００７】
運動能力喪失:  身体の平衡をとることの困難、協調した動作の欠如、脚の脱力、不調法、歩行困難、および／もしくは筆記能力の劣化をともなうようになった人は、運動能力の劣化の徴候を示していると考えられる。
【０００８】
行動誘発:  特徴の無い行動、判断能力の劣化、性格および気分の変動、ならびに精神病の疑いのある行動は、一部の人が経験する行動誘発と見做される。
HIV関連痴呆症を患う人には、この病気が進行する過程において、これらの特性がさまざまな期間と速度で発症する。典型的には、HIV関連痴呆症患者は、この痴呆に因ってもしくは関連して、高確率で早期に死亡することになる。痴呆は衰弱性の病気であり、その犠牲者から生活を文字通り奪ってしまうものである。中枢神経系へのその不可逆的・破壊的な作用によって、記憶喪失、抑鬱、激越、不安、および他の有害な行動が引き起こされる。これらの衰弱性の作用によって、HIV感染者の余命はさらに削られることになる。このウイルスと痴呆症状とは、協調して人間の免疫系、自信、運動能力、および家族関係を破壊し、有効な処置方法は無い。結果として、HIV関連痴呆症を患う人は、早期に死亡することになる。
【０００９】
痴呆症の無い状態であれば、HIV感染者への処置をより有効に、余命を伸ばすように行う機会が与えられる。さらに、この症状が無い状態では、この処置がHIVの増殖を遅らせ、またその有害な作用を遅らせるために有用であると考えられる。
【００１０】
ニューロンにおける細胞内カルシウム濃度の増大、および／もしくは、副腎によるコルチゾール産生の増大は、視床下部-脳下垂体-副腎（HPA）系における変化に因るものであり、また、おそらくは glycoprotein 120（gp 120）がHIV関連痴呆症を齎すトリガーとなっていると考えられる（Corley PA. 1995;  Corley PA. 1996;  Simpson, David M;  Brew, Bruce James 1999）。後天性免疫不全症候群（AIDS）を進行させるウイルスであるHIVは、 glycoprotein 120（gp120）を筆頭とするさまざまなエンベロープ蛋白によって保護されたウイルス粒子を被ったレトロウイルスである。gp120エンベロープ （ gp120外被;  gp120 envelope ） は、ケモカイン共受容体 （ chemokine co receptors ） と同様に、T細胞などの多くの免疫細胞の表面の受容体と結合することによって、宿主細胞の感染を促進する。ウイルス粒子と宿主細胞との融合の後、ウイルス粒子の増殖が始まり、続いて他の細胞への感染が起こる。
【００１１】
宿主細胞へのHIVの侵入を促進することに加え、gp120が直接的もしくは間接的にHIV痴呆症の発症の原因となっていることが研究によって示されている。直接的に関わるとする仮説は、HIVが融合した後に脱ぎ捨てることがあるgp120蛋白が、ニューロン表面上のケモカイン受容体と直接反応し、アポトーシスおよび神経細胞死を促進する、というものである。間接的に関わるとする仮説は、中枢神経系（CNS）の神経細胞以外の細胞（特にマクロファージ、小膠細胞（ミクログリア）、および星状膠細胞（アストログリア））とHIVとが反応することによって、アポトーシスが起こる、というものである。この場合、異物の侵入を抑止する選択的透過膜である血液脳関門（BBB）を越えて、HIVに感染したマクロファージおよび小膠細胞が輸送されることを、gp120が促進している（Kaul, Marcus, et al. 2001）。感染した細胞がひとたび脳に入ると、この細胞が神経毒を放出し、ニューロンへのカルシウムイオン（ Ca2+）の大量の流入を促進してアポトーシスを起こす（Smits, H. A. et al. 2000）。マクロファージ、単球、および小膠細胞に感染したHIVのすべては、gp120を放出する。部分的にはグルタマート再吸収系によって、また、NMDAサブタイプカルシウムチャネルに関連するグルタマート作動性受容体および電位作動性カルシウムチャネルを直接に活性化する（Lipton SA, 1991）ことによって、CNS内の大量のgp120がカルシウムホメオスタシスを破壊する（Lipton SA, 1994）。誘導された多量のカルシウム内向き電流によって、記憶および学習プロセスの障害が誘発され、また、ニューロン死を齎す興奮毒性カスケード （ excitotoxicity cascade ） のトリガーとなる（Choi DW, 1992）。カルシウムイオンは、電気的分極・脱分極を通じた細胞間連絡 （ intercellular communication ） を促進し、また、ニューロンにとって致命的になるほどに Ca2+チャネルを過度に長く開いてしまう（Epstein L and Gendelman H. May 1993）。
【００１２】
カルシウムホメオスタシスへの、gp120の直接的干渉と間接的干渉との組み合わせによって、致死的な細胞死を齎すミトコンドリアの機能障害が引き起こされる（Simpson, David M.）。同時に、gp120は間接的に血中およびCSF中のコルチゾール濃度を増大させ、細胞毒性およびHIV関連痴呆症を齎す（Corley PA. 1995;  Corley PA. 1996）。
【００１３】
ケモカイン受容体も、CD4の共受容体としてgp120エンベロープに結合されて、宿主細胞内への貫入を可能にする（Miller, Richard J. and Meucci, Olimpia 1999）。このCNS細胞への結合によって、細胞が制御不可能なやりかたで興奮せしめられて過負荷をかけられる。続いて、過剰興奮によってグルタマートおよび他の神経毒、ならびに炎症性サイトカインが放出され、アポトーシスに因るニューロン死を引き起こす（Miller, Richard J. and Meucci, Olimpia. 1999）。
【００１４】
HIV患者において観察される、星状膠細胞が大増殖する星状細胞増加症 （ astrocytosis ） は、感染したマクロファージおよび小膠細胞によって産生される過剰グルタマートを除去するための星状膠細胞の作用を、ウイルスが遅延させた際に発症する（Kaul, Marcus et al.2001）。細胞の作用不全を補償するために、余分の星状膠細胞が生成される。星状細胞増加症の結果、より多く感染したマクロファージおよび星状膠細胞がBBBを通過し、大量のニューロン死を齎してHIV関連痴呆を起こす。
【００１５】
HIV関連痴呆の原因は、CNS内部のマクロファージ、小膠細胞、ケモカイン受容体、および星状膠細胞の活性化を軸としたものであり、また、続いて起こるアポトーシスが痴呆を起こすことは明らかである。このようなプロセスを可能としているのは、gp120エンベロープによってHIVがBBBを通過しやすくなっていること、および、ニューロン表面上にて開裂したgp120蛋白がケモカイン受容体と相互作用しうることに因るものであることも同様に明らかである。優勢な理論においては、HIVに関連するコルチゾール量の増大は、HIV関連痴呆の直接の原因であるとも仮定している。
【００１６】
HIV感染の進行は、副腎ステロイド類の産生における複雑な変化をともなう。HIV感染は、視床下部-脳下垂体-副腎（HPA）系の機能の活性化に関連し、血漿中および尿中のコルチゾール量の増大を誘発する（Kumar M, et al. 2001;  Kumar, M, et al. 2000）。コルチゾール量の増大は、HIV感染者とAIDS患者の双方において記録されている。最高で通常量から 20%〜50% の範囲でコルチゾールが増大することが、病気が進行した患者において見出されている。HIVに関連するコルチゾール量の増大は、細胞性免疫の抑圧、およびAIDS関連痴呆を含む、AIDSの病態生理において、主要な役割を果たしているという仮説が立てられている（Corley PA. 1995）。加えて、コルチゾールおよびその受容体が、HIV感染における免疫機能の調節にかかわっていることが経験的な論拠に基づいて示唆されている（Norbiato G, et al. 1997）。
【００１７】
Refaeliらは、コルチゾールとAIDSとを結びつける別方面からの証拠を発見している。これらの研究者は、vpr遺伝子の産生物であるHIV蛋白が、コルチゾールを含む糖質コルチコイドの活性を真似ていることを示した。以前には、vpr蛋白が、自然免疫細胞 （ first immune cells ） の中に交じっている白血球 （ white cells ） であるマクロファージの細胞膜を貫通して、宿主にHIVを感染させると言われていた。Refaeliらのグループは、HIV蛋白が身体を騙し、自身の免疫系を抑制せしめる、ということを示唆する証拠を提示した。vpr蛋白は、I型サイトカインの産生を抑制する。加えて、vpr蛋白は、健康であり感染していないTリンパ球をプログラム細胞死へと誘導することが示されている。ステロイド産生阻害剤であるRU-486を、組織培養細胞に加えたところ、免疫へのvpr蛋白の破壊的作用を回復させることをこれらの研究者が発見した。さらに、vpr蛋白およびRU-486で処置したTリンパ球は、免疫を高めるサイトカインの産生および分泌を続け、また、プログラム細胞死しなかった。
【００１８】
したがって、Corleyが示唆したように、HIVに関連するコルチゾール量の増大は、細胞性免疫の抑制およびHIV関連痴呆を含むAIDSの病態生理に関与している。この結論を踏まえて、Clericiらは、AIDS患者のコルチゾール:DHEAの比の抑制もしくは回復、ならびにI型サイトカイン産生の誘発によって、プログラム細胞死を低減し、HIV感染細胞におけるウイルス増殖を妨害することができると仮定している。
【００１９】
上述した病態における多量のコルチゾールの有害な作用とは対照的に、コルチゾールの基礎量を維持することは生体機能の基礎の保全のために必要なことである。糖質コルチコイドは、蛋白質、炭水化物、および脂質の代謝を調節し、また、急性の身体侵襲要因への順応に不可欠なものでもある（Munck et al, 1994）。基礎的なステロイドの形成に影響することなく、過剰な糖質コルチコイド産生を阻害する化合物の開発は、阻害剤よりは寧ろ活性調節剤の同定が要求されるために、困難なものであるとされている。したがって、コルチゾールが介在する病気もしくは障害への付加的な処置であって、コルチゾールが介在する病気もしくは障害を患う被験者、またはコルチゾールが介在する病気もしくは障害が進行する虞のある被験者へと投与するための組成物が含まれるような処置が必要とされている。このような症状の処置に対しては、素早い活性の呈示、改良された副作用面、低減された投薬量および投薬頻度、改良された患者の服薬率、改良された生体利用度および安全性、ならびに／あるいは、改良された薬物動態的 （ pharmacokinetic ） 、薬動力学的 （ pharmacodynamic ） 、化学的および／もしくは物理的な特性、も望まれるところである。加えて、コルチゾールの基礎量を維持しつつ、コルチゾール量を調節する方法および化合物も必要とされている。後述する考察においては、これらの必要を満たすことを援ける方法、キット、配合物、および化合物を開示している。
【発明の開示】
【００２０】
被験者が罹っているコルチゾールが介在する症状、病気、もしくは障害に対する有用な処置は、処置に使用可能なオプションの欠落、および現在可用なオプションに有用性が欠けていることによって、複雑なものになっている。しかしながら、例えば、プロカインもしくはプロカイン誘導体などの安息香酸誘導体であるようなコルチゾール調節剤は、コルチコステロイドの基礎産生に影響することなく、ホルモン起因の糖質コルチコイドの形成を下方調節することが発見されている。安息香酸誘導体を含む薬学的組成物は、例えば老人性鬱病、気分変化、多発性硬化症、Cushing症候群、高血圧症、痴呆症、およびアルツハイマー病、ならびに後天性免疫不全症候群が含まれるこのようなコルチゾールが介在する症状、病気、または障害の処置ならびに／あるいは抑制のために、被験者に対して、薬剤の薬学的有効量を効率的に与えることができる。これらの組成物は改善された処置オプションを提供し、また、改良された有用性、生体利用度、安全性、ならびに／あるいは、改良された薬物動態的、薬動力学的、化学的および／もしくは物理的な特性、を持つ。本発明は、薬学的組成物、剤型、およびこれらに基づくキット、ならびに、これらの調製方法および使用方法を含む。
【００２１】
さらに、安息香酸誘導体化合物は、他の治療薬と配合してのコルチゾール量を調節する方法および組成物においても有用であると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、コルチゾール調節剤を用いた処置が必要であるような、病気、症状、もしくは障害を処置する方法、キット、配合物、および組成物を指向する。例えばプロカインもしくはプロカイン誘導体のような安息香酸誘導体を含む薬学的組成物が、薬学的組成物を含むコルチゾール調節剤として優れた性能を発揮することが発見されている。病気、症状、もしくは障害の治療においては、治療に必要な薬剤の量を、生体内で搬送し、迅速に薬剤を生体内で利用できるようにすることができる剤型の提供が重要である。本発明の処方は、これらの必要を満たす。
【００２３】
本発明は数多の形態で実施することができるが、本開示は本発明の本質の例示に過ぎないと解釈されるべきであって、示された実施形態によって本発明を制限するものではない、ということが理解されるように、いくつかの特定の実施形態についてここで論じる。
【００２４】
本発明の或る特徴においては、組成物、方法、キット、配合物は、被験者が患うコルチゾールが介在する病気、症状、もしくは障害への、有効な処置もしくは予防に対して有用である。或る形態においては、組成物、方法、キット、配合物は、被験者のコルチゾールの過剰産生に関連する、もしくは起因する病気、症状、または障害への処置あるいは予防にとって有用である。例示するように、本発明は、筋骨格、胃腸管、心血管、内分泌系、および／もしくは中枢神経系（例えば、脳梗塞、脳外傷、網膜損傷、および／もしくは脊髄外傷、虚血、ならびに再潅流、ならびに他の脳あるいは網膜の障害、ならびに神経外科処置に関連した心的外傷が含まれる）の病気または障害を含む皮質が介在する病気 （ a cortical-mediated disease ） 、ならびに、代謝変化、ならびに、認知障害、ならびに、免疫抑制、ならびに、抑鬱および気分変化が含まれる精神病的障害、ならびに、後天性免疫不全症候群、ならびに、多発性硬化症、ならびに、アルツハイマー病、ならびに、ハンチントン病、ならびに、癲癇、ならびに、ラチリズム （ lathyrism ） 、ならびに、筋萎縮性側索硬化症、ならびに、パーキンソン病、ならびに、例えば乳癌を含む癌、の処置あるいは予防において有用である。
【００２５】
［定義］
特に他に定めない限り、明細書および請求項で用いている以下に挙げる語句は、この出願のために定義されており、また、その意味を以下に掲げる。
【００２６】
本開示における「約」 （ "about" ） という語は、「凡そ」 （ "approximately" ） という意味であって、また、例示的には、「約」という語の使用は、例示した範囲から外れた用量も有用且つ安全であろうと考えられ、またそのような用量もまた本発明の範囲に含有される、ということを指している。
【００２７】
「生体利用度」 （"Bioavailability" ） とは、活性基（薬剤もしくは代謝物）が一般的な循環内に吸収され、身体内の薬作用部位において利用可能となる程度のことである。
「コルチゾール調節剤」 （ "cortisol-modulating agent" ） という語句は、任意の病原性のコルチゾール産生の増大を、調節、抑制、もしくは低減するような薬理活性を呈する、任意の薬剤を意味する。さらにこの語句は、コルチゾール産生、および或る生理活性におけるコルチゾールの作用効果の強度を、再均整、または再均整へと向かわせるものも指す。ここで用いている「コルチゾール調節剤」の定義は、コルチゾール調節、コルチゾール調整 （ -regulating ） 、もしくはコルチゾール再均整 （ -re-balancing ） の薬理活性を呈する薬剤であって、望むならば、遊離塩基、遊離酸、塩、エステル、水和物、アミド、鏡像異性体、異性体、互変異性体、プロドラッグ、多形体、誘導体、もしくはそれらの類似物のかたちとすることができる薬剤であり、薬学的に適切、即ち本発明の方法、配合物、キット、および組成物において有用であるような、遊離塩基、遊離酸、塩、エステル、水和物、アミド、鏡像異性体、異性体、互変異性体、プロドラッグ、もしくは誘導体を与えるような薬剤のことをも意味する。
【００２８】
「コルチゾール調節の有効量」 （ "cortisol-modulating-effective amount" ） という語句は、過度の有害な副作用を与えることなく臨床的な改善を齎す量であり、この臨床的な改善には、罹患率の改善、日常生活の安楽さの改善、生存率の改善、より早期の回復、あるいは、徴候、および当業者によって適切な基準として選択される他の指標を、過度の有害な副作用を与えることなく改善または除去すること、が含まれるが、これらに制限はされない、といったような薬理作用効果もしくは治療上の改善を与えるために有効な薬剤の量のことを意味する。
【００２９】
ここで用いているように、「コルチゾールが介在する病気」 （ "cortisol-mediated disease" ） もしくは「コルチゾールが介在する障害」 （ "cortisol-mediated disorder" ） とは、コルチゾールに関連する任意の病気もしくは障害を包含しており、また、筋骨格、胃腸管、心血管（例えば、高血圧および高コレステロール血症を含む）、内分泌系、および／もしくは中枢神経系（例えば、脳梗塞、脳外傷、網膜損傷、および／もしくは脊髄外傷、虚血、ならびに再潅流、ならびに他の脳あるいは網膜の障害、ならびに神経外科処置に関連した心的外傷が含まれる）の病気または障害、ならびに、代謝変化、ならびに、認知障害、ならびに、免疫抑制、ならびに、抑鬱、痴呆、および気分変化が含まれる精神病的障害、ならびに、後天性免疫不全症候群、ならびに、多発性硬化症、ならびに、アルツハイマー病、ならびに、ハンチントン病、ならびに、癲癇、ならびに、ラチリズム、ならびに、筋萎縮性側索硬化症、ならびに、パーキンソン病、ならびに、乳癌を含む癌、を含むが、これらに制限されない。
【００３０】
「誘導体」 （"derivative" ） という語は、類似した構造の別の化合物から、単独の原子、分子、もしくは基の置換反応によって生成される化合物のことを指す。例えば、化合物の水素原子を、アルキル基、アシル基、アミノ基などに置換することによって、あるいは酸素原子を窒素原子に置換することによって、この化合物の誘導体を生成することができる。
【００３１】
「薬剤吸収」 （"Drug absorption" ） もしくは「吸収」 （ "absorption" ） とは、薬剤が投与された部位から、例えば被験者の血流であるような全身循環へと移行するプロセスのことを指す。
【００３２】
「有効量」 （"effective amount" ） もしくは「治療上有効量」 （ "therapeutically effective amount" ） とは、処置された被験者に治療作用効果を与えるために必要な化合物の量のことを指す。
【００３３】
「測定可能な血清中濃度」 （ "measurable serum concentration" ） という語句は、投与後に血流に吸収された治療薬の血清中濃度（典型的には、血清 ml 、 dl もしくは l あたりに対して、治療薬 mmol 、 imol 、 nmol 、 mg 、 mg 、もしくは ng で測定する）のことを意味する。
【００３４】
「代謝」 （"Metabolism" ） とは、身体中での薬剤の化学的生体内変換プロセスのことを指す。
ここで形容詞的に用いている「薬学的に許容される」 （ "pharmaceutically acceptable" ） という語句は、修飾された名詞が薬学的製品に用いるにあたって適切である、という意味である。
【００３５】
ここで用いている「薬学的に許容される担体」 （ "pharmaceutically acceptable carrier" ） もしくは「薬学的に許容される賦形剤」 （ "pharmaceutically acceptable excipients" ） という語句は、任意且つすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗真菌剤および抗菌剤、保存料および抗酸化剤、等張化剤および吸収遅延剤、ならびに類似物を含む。経口摂取可能な物質のための、このような媒体および薬剤の使用方法は、当該技術分野において公知である。本発明に係る組成物と配合禁忌である場合を除いて、従来技術に係る媒体もしくは薬剤の使用を考慮している。
【００３６】
「薬動力学」 （"Pharmacodynamics" ） とは、作用点における薬剤の濃度に依る、観察される生物学的反応を決定する因子のことを指す。
「薬物動態」 （"Pharmacokinetics" ） とは、作用点における薬剤の適切な濃度の達成および維持を決定する因子のことを指す。
【００３７】
「血漿中濃度」 （"Plasma concentration" ） とは、血漿中もしくは血清中の物質の濃度のことを指す。
「血漿中半減期」 （"Plasma half-life" ） とは、血漿中の薬剤の濃度が、最高濃度の50%まで減少するためにかかる時間のことを指す。
【００３８】
コルチゾールが介在する被験者の病気もしくは障害に関しての「抑制する」 （ "prevent" ） もしくは「抑制」 （ "prevention" ） という語は、何も起こらなかった場合には病気もしくは障害が進行しないことを意味するか、あるいは、障害もしくは病気の進行が既にあった場合には障害もしくは病気がさらに進行しないことを意味する。
【００３９】
「プロドラッグ」 （"prodrug" ） という語は、身体内の代謝プロセスによる転換の結果として薬理活性を引き出すような薬剤もしくは化合物（主に活性）のことを指す。プロドラックは、一般的には、被験者への投与とそれに続く吸収の後に、代謝プロセスのようないくつかのプロセスを経て、活性種もしくはより強い活性種に転換するような、薬剤の前駆体のことと見做される。転換プロセスから生じる他の産生物は、容易に身体から排泄される。概してプロドラッグは活性を減じるならびに／または薬剤に溶解度もしくは他の特性を与えるような化学基を有する。この化学基がプロドラッグから切断されると、より強い活性の薬剤が生成する。プロドラッグは可逆剤誘導体 （ reversible drug derivatives ） としてもデザインすることができ、局所組織 （ site-specific tissues ） への薬剤の輸送を促進するための修飾として利用することができる。現在のところ、プロドラッグのデザインは、水が主要な溶媒であるような領域をターゲットとする治療用化合物の有用な水溶性を増大させるようなものとなってきている。例えば、 Fedorak, et al., Am. J. Physiol 269: G21-218 (1995) は、デキサメタゾン-β-D-グルクロニド （ dexamethasone-beta-D-glucuronide ） について記載している。 McLoed, et al. , Gastroenterol., 106:405-413 (1994) は、コハク酸デキサメタゾン-デキストラン類 （ dexamethasone-succinate-dextrans ）について記載している。 Hochhaus, et al., Biomed. Chrom., 6:283-286 (1992) は、 21-スルホ安息香酸デキサメタゾンナトリウム （ dexamethasone-21-sulphobenzoate sodium ） および 21-イソニコチン酸デキサメタゾン （ dexamethasone-21-isonicotinate ） について記載している。加えて、 J. Larsen and H. Bundgaard, Int. J. Pharmaceutics, 37, 87 (1987) は、 N-アシルスルホンアミド類のプロドラッグ誘導体としての可能性の評価について記載している。 J. Larsen et al., Int. J. Pharmaceutics, 47, 103 (1988) は、 N-メチルスルホンアミド類のプロドラッグ誘導体としての可能性の評価について記載している。プロドラッグについては、例えば、 Sinkula et al., J. Pharm. Sci., 64:181-210 (1975) にも記載されている。
【００４０】
ここで用いる「処置する」 （ "treat" ） もしくは「処置」 （ "treatment" ） という語は、コルチゾールが介在する病気もしくは障害に関連するような被験者が罹った障害または病気への処置のすべてを指し、また、これらの障害もしくは病気に罹りやすくなってはいるがまだ罹患したと診断されてはいないような被験者において発症する障害もしくは病気を予防すること、ならびに、例えば障害もしくは病気の進行を止めることのように、障害もしくは病気を阻害すること、ならびに、例えば障害もしくは病気を好転させることのように、障害もしくは病気を寛解させること、ならびに、例えば障害もしくは病気の症状を無くすことのように、障害もしくは病気を寛解させること、を含むがこれらに限定はされない。
【００４１】
本発明は、コルチゾール量の調節のための組成物および方法において用いることができる化合物に関する。本発明に係る化合物は、以下の構造式(I)で表される安息香酸誘導体、あるいはそれらの薬学的に許容される塩である。
【００４２】
【化４】
2006526635.tif 000002
ここで、式中の、
a） R1 、 R2 、 R3、 R4 および R5 が、独立に、 H 、OH基、ハロ基、 (C1-C6)アルキル基、 (C1-C6) アルコキシ基、 (C3-C6)シクロアルキル基、 (C3-C6)シクロアルキル((C1-C6)アルキル)基、 (C2-C6)アルケニル基、 (C2-C6)アルキニル基、 (C1-C6)アルカノイル基、ハロ(C1-C6)アルキル基、ヒドロキシ(C1-C6)アルキル基、 (C1-C6)アルコキシカルボニル基、または、 (C1-C6)アルキルチオ基、もしくは (C1-C6)アルカノイルオキシ基であるか、あるいは、 R1 と R2とが共に、メチレンジオキシ基となっており、
b） X1 が、 NO2基、 CN基、 -N=O 、 (C1-C6)アルキルC(O)NH- 、イソオキサゾリル基、 N(R6)(R7) 、アリール基、アリール(C1-C6)アルキル基、アリール(C2-C6)アルケニル基、ヘテロアリール基、ヘテロアリール(C1-C6)アルキル基であって、ここで式中の R6 および R7 は、独立に、 H 、 (C1-C6)アルキル基、 (C2-C6)アルケニル基、 (C3-C6)シクロアルキル基、 ((C1-C6)アルキル)基であって、式中のシクロアルキル基は、任意に1〜2個の S 、過酸化物ではない O 、 もしくは N(R8) を含み、ここで式中の R8 は、 H 、 (C1-C6)アルキル基、 (C3-C6)シクロアルキル基、 (C3-C6)シクロアルキル(C1-C6)アルキル基、もしくはベンジル基であるか、あるいは、 R6 および R7 が、前記の N と共に、五員環もしくは六員環である複素環または複素芳香環であって、オプションとして R1 で置換されている、及び、オプションとして1〜2個の S 、過酸化物ではない O 、 もしくは N(R5) を含むような、複素環または複素芳香環を構成しており、
c） (Alk) が、 (C1-C6)アルキル基であり、
d） X および Z が、 =O 、 -O(CH2)mO- 、もしくは -(CH2)m- であって、式中の m が2〜4であるか、あるいは、 X が H であって Z が OH基もしくは SH基であり、
e） Het が、ヘテロアリール基もしくはヘテロシクロアルキル基であって、それぞれが任意に1、2もしくは3個の R1 、またはそれらの組み合わせで置換されているか、あるいは、 Het が (Alk) と NH基とを繋ぐ結合であり、
f） p は0もしくは1である。
【００４３】
好ましくは、(Alk) は、 -(CH2)- 、 -(CH2)2- 、 -(CH2)3- 、もしくは -(CH2)4- のような (C1-C4)アルキル基である。
好ましくは、 R1、 R2 および R3 の内のひとつ、二つもしくは三つが、 H である。
【００４４】
好ましくは、 R6および R7 が、独立に、 H 、 (C1-C4)アルキル基、 (C3-C6)シクロアルキル基、 (C3-C6)シクロアルキル(C1-C6)アルキル基、もしくはベンジル基である。
好ましくは、 X1が NO2基である。
【００４５】
好ましくは、 R4および R5 のそれぞれが、 (C1-C6)アルキル基または (C3-C6)シクロアルキル基である。
好ましくは、 R1、 R2 もしくは R3 の内のひとつまたは二つが、 (C1-C6)アルコキシ基である。
【００４６】
好ましくは、 p は1である。
好ましくは、 Z および Y は共に =O である。
好ましくは、 Het は、例えば、 1H-インドール-3-イル基、インダン-3-イル基、もしくは 1H-イミダゾール-4-イル基であるようなヘテロアリール基である。
【００４７】
本発明は、薬学的に許容される希釈剤もしくは担体と組み合わされた、構造式 I の化合物、または薬学的に許容されるこれらの化合物の塩を含み、オプションとして、安定剤、保存剤、および吸収制御剤を含むことができるような、剤型単位 （ unit dosage form ） のような薬学的な組成物も提供する。
【００４８】
加えて本発明は、ヒトのような哺乳類の病態または徴候を抑制もしくは処置するための治療方法であって、病原性物質、またはウイルスもしくはレトロウイルスのような微生物の、哺乳類の細胞への伝染性に関係し、それらの伝染性を阻害することを目的とし、構造式 I の化合物、もしくは薬学的に許容されるその塩の有効量を、このような治療を要する哺乳類に投与することが含まれる、治療方法を提供する。
【００４９】
本発明は、医療において用いるための構造式 I の化合物を提供し、同様に、ヒトのような哺乳類のコルチゾール量を例えば下げるように調節することによって、症状を改善させる処置に対して有用な医薬の製造のための、構造式 I の化合物の使用方法も提供する。
【００５０】
特に別に定めない限りは、以下の定義を用いる。すなわち、ハロ基とは、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基、もしくはヨード基である。アルキル基、アルコキシ基、アルケニル基、アルキニル基などは、直鎖基および分鎖基の双方を意味するが、「プロピル基」 （ "propyl" ） のような個々の基については直鎖基のみを含み、分鎖異性体は「イソプロピル基」 （ "isopropyl" ） と特に分けて呼ぶ。アリール基とは、フェニル基、もしくは、少なくともひとつの芳香環を有して約9〜10個の環員原子を有するオルト縮合系二環炭素環基、を意味する。ヘテロアリール基とは、炭素原子と、過酸化物ではない酸素原子、硫黄原子、ならびに、 X が無いかまたは H 、 O 、 (C1-C4)アルキル基、フェニル基もしくはベンジル基であるような N(X) 、であるような1〜4個の複素原子と、から成る5、6個の環員原子を有する単環芳香環の、環員炭素原子を介して結合する基のことを指し、また、これらから誘導された約8〜10個の環員原子を有するオルト縮合系二環複素環基も指し、特に、ベンゼン誘導体、または、プロピレン、トリメチレン、もしくはテトラメチレン二価基がベンゼン誘導体に縮合したものを指す。
【００５１】
本発明に係る不斉原子を有する化合物が、光学活性体およびラセミ体を持ち、これらを単離できることを当業者は正しく理解できる。化合物の中には、多形性を示すものもある。本発明は、ここで記述する有用な特性を示す本発明に係る化合物の任意のラセミ体、光学活性体、多形体、もしくは立体異性体、またはこれらの混合物をも含み、また、光学活性体を調製する方法（例えば、再結晶の技術、光学活性な出発物質からの合成、不斉合成、もしくは光学活性固定相を用いたクロマトグラフィーによる分離、によってラセミ体を分割する方法）は当該技術分野において公知であり、また、ここで記載する標準試験法、もしくは当該技術分野で公知である他の類似の試験法を用いて抗伝染性活性を定める方法も当該技術分野において公知である、ということを理解されたい。
【００５２】
以下に列挙する好ましい特異値は、図示される基、置換基、および範囲についてのみのものであるが、これは他の定義値、もしくは基および置換基の範囲を定義する範囲の内の別の値を排除するものではない。
【００５３】
特に、 (C1-C6)アルキル基は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、ペンチル基、 3-ペンチル基、もしくはヘキシル基とすることができる。 (C3-C6)シクロアルキル基は、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基もしくはシクロヘキシル基とすることができる。 (C3-C6)シクロアルキル(C1-C6)アルキル基は、シクロプロピルメチル基、シクロブチルメチル基、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、 2-シクロプロピルエチル基、 2-シクロブチルエチル基、 2-シクロペンチルエチル基、もしくは 2-シクロヘキシルエチル基、とすることができる。ヘテロシクロアルキル基およびヘテロシクロアルキルアルキル基は、2〜5個の炭素原子に加えてオプションとして 1〜2個の S 、過酸化物ではない O もしくは N(R8) 、を含み、例えば、モルホリニル基 （ morpholinyl ） 、ピペリジニル基 （ piperidinyl ） 、ピペラジニル基 （ piperazinyl ） 、インダニル基、 1,3-ジチアン-2-イル基、およびこれらの類似物であるような上述のシクロアルキル基を含む。 (C1-C6)アルコキシ基は、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、 sec-ブトキシ基、ペントキシ基、 3-ペントキシ基、もしくはヘキシルオキシ基とすることができる。 (C2-C6)アルケニル基は、ビニル基、アリル基、 1-プロペニル基、 2-プロペニル基、 1-ブテニル基、 2-ブテニル基、 3-ブテニル基、 1,-ペンテニル基、 2-ペンテニル基、 3-ペンテニル基、 4-ペンテニル基、 1-ヘキセニル基、 2-ヘキセニル基、 3-ヘキセニル基、 4-ヘキセニル基もしくは 5-ヘキセニル基とすることができる。 (C2-C6)アルキニル基は、エチニル基、 1-プロピニル基、 2-プロピニル基、 1-ブチニル基、 2-ブチニル基、 3-ブチニル基、 1-ペンチニル基、 2-ペンチニル基、 3-ペンチニル基、 4-ペンチニル基、 1-ヘキシニル基、 2-ヘキシニル基、 3-ヘキシニル基、 4-ヘキシニル基、 もしくは 5-ヘキシニル基とすることができる。 (C1-C6)アルカノイル基は、ホルミル基、アセチル基、プロパノイル基、もしくはブタノイル基とすることができる。ハロ(C1-C6)アルキル基は、ヨードメチル基、ブロモメチル基、クロロメチル基、フルオロメチル基、トリフルオロメチル基、 2-クロロエチル基、 2-フルオロエチル基、 2,2,2-トリフルオロエチル基、もしくはペンタフルオロエチル基とすることができる。ヒドロキシ(C1-C6)アルキル基は、ヒドロキシメチル基、 1-ヒドロキシエチル基、 2-ヒドロキシエチル基、 1-ヒドロキシプロピル基、 2-ヒドロキシプロピル基、 3-ヒドロキシプロピル基、 1-ヒドロキシブチル基、 4-ヒドロキシブチル基、 3,4-ジヒドロキシブチル基、 1-ヒドロキシペンチル基、 5-ヒドロキシペンチル基、 1-ヒドロキシヘキシル基、もしくは 6-ヒドロキシヘキシル基といった、1〜2個の OH基で置換されたアルキル基とすることができる。 (C1-C6)アルコキシカルボニル基は、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、ペントキシカルボニル基、もしくはヘキシルオキシカルボニル基とすることができる。 (C1-C6)アルキルチオ基は、メチルチオ基、エチルチオ基、プロピルチオ基、イソプロピルチオ基、ブチルチオ基、イソブチルチオ基、ペンチルチオ基、もしくはヘキシルチオ基とすることができる。 (C2-C6)アルカノイルオキシ基は、アセトキシ基、プロパノイルオキシ基、ブタノイルオキシ基、イソブタノイルオキシ基、ペンタノイルオキシ基、もしくはヘキサノイルオキシ基とすることができる。アリール基は、フェニル基、インデニル基、もしくはナフチル基とすることができる。また、ヘテロアリール基は、フリル基、イミダゾリル基、トリアゾリル基、トリアジニル基、オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、ピラゾリル基、ピロリル基、ピラジニル基、テトラゾリル基、ピリジル基もしくはそのN-オキシド、チエニル基、ピリミジニル基もしくはそのN-オキシド、1H-インドリル基、イソキノリニル基もしくはそのN-オキシド、またはキノリニル基もしくはそのN-オキシド、とすることができる。
【００５４】
Y および Z が =O （オキソ基）であるような構造式(I)の化合物は、形式的には、複素環α-アミノ酸もしくはヘテロアリールα-アミノ酸のピペラジニルアミドの N-フェナシル誘導体である。したがって、一般的に適用できるペプチド合成方法を、構造式 I の化合物の調製に用いることができる。例えば、公開されたPCT出願 WO 02/094857号、米国特許6,043,218号、6,407,211号、5,583,108号を参照のこと。
【００５５】
一般的には、構造式(I)の化合物は、構造式 II のアミノアルキル誘導体から、以下の反応式1に示したように調製することができ、ここで、式中の Ar は
【００５６】
【化５】
2006526635.tif 000003
であり、 X1、 R1 、 R2 、 R3 、 R4 、 R5、 Het 、 n および p は上記で定義したものであって、また、 X および Y は =O である。
【００５７】
〔反応式1〕
【００５８】
【化６】
2006526635.tif 000004
ここで、式中の L は、 Cl もしくは Br である。
【００５９】
〔構造式 II の化合物の調製〕
構造式 IIa の化合物は、以下の反応式2に示した方法で調製される。
〔反応式2〕
【００６０】
【化７】
2006526635.tif 000005
一般的には、構造式IIa の化合物は二つのステップを以って調製され、まず、方法（a）を介して、構造式 I の化合物を、構造式 III の N-保護アミノアルキル誘導体に転換し、続いて、後述するように III のアミノ保護基を脱離する。
【００６１】
〔構造式 III の化合物の調製〕
〔方法（a）〕
方法（a）においては、式中の PG がアミノ保護基（例えば、 tert-ブトキシカルボニル基 （ tert-butoxycarboyl;  BOC ） 、ベンジルオキシカルボニル基 （ benzyloxycarbonyl;  CBZ ） 、ベンジル基、およびそれらの類似物）である構造式 III の N-保護アミノアルキル誘導体を、構造式 1 の化合物と以下の構造式 4 の化合物とを反応させて調製した。
【００６２】
PG-NH-CH[(CH2)nHet]X        (4)
ここで式中の X は、カルボキシ基（ -COOH ）、もしくは、酸ハロゲン化物のような反応性カルボキシ誘導体である。この反応の条件は、基 X の性質に依って決まる。 X がカルボキシ基である場合には、適切な有機溶媒（例えば、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、およびそれらの類似物）中において、適切なカップリング剤（例えば、 N,N-ジシクロヘキシルカルボジイミド、 1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド、およびそれらの類似物）の存在下で反応が起こり、中間生成物のアミドを得る。 X が、酸塩化物のような酸誘導体である場合には、有機溶媒（例えば、塩化メチレン、ジクロロエタン、 N,N-ジメチルホルムアミド、およびそれらの類似物）中で、トリエチルアミン、ピリジンのような適切な塩基の存在下で反応が起こり、中間生成物のアミドを得る。
【００６３】
一般的には、 N-保護された複素環α-アミノ酸もしくはヘテロアリールα-アミノ酸またはこれらの誘導体であるような構造式 4 の化合物は、市販されているか、または有機化学分野で公知である手法によって調製することができる。
【００６４】
本発明において有用である天然型および非天然型の双方のアミノ酸は、 Sigma-Aldrich および Bachem などのベンダーから市販されている。天然型アミノ酸の例としては、トリプトファンおよびヒスチジンがある。非天然型アミノ酸は、 3-(インダン-3-イル)-2-アミノプロピオン酸、 3-(モルホリン-1-イル)-2-アミノプロピオン酸、 3-(ピペリジン-1-イル)-2-アミノプロピオン酸、 3-(ピペラジン-1-イル)-2-アミノプロピオン酸、 3-(ピリジン-2-イル)-2-アミノプロピオン酸、 4-(ピリジン-2-イル)-2-アミノブタン酸、 4-(イミダゾール-2-イル)-2-アミノブタン酸、 4-(ベンゾフラン-2-イル)-2-アミノブタン酸、 3-(1,3-ジチアン-2-イル)-2-アミノプロピオン酸、およびこれらの類似物を含む。
【００６５】
X が、例えば酸塩化物などの酸誘導体であるような構造式 4 の化合物は、構造式 4 に対応する酸（ X が -COOH ）から、塩化メチレンおよびその類似物などの適切な有機溶媒中で、適切な塩素化剤（例えば、塩化オキシアリル、塩化チオニル、およびそれらの類似物）を用いてカルボキシ基を塩素化することによって調製することができる。
【００６６】
〔方法（b）〕
反応式 C として以下に示すように、上述の方法（a）に記載した反応条件によって、構造式 7 のピペラジンを構造式 6 の化合物と反応させた後にアミノ保護基を除去することによって、構造式 I の化合物を調製することができる。
【００６７】
〔反応式B〕
【００６８】
【化８】
2006526635.tif 000006
反応条件は、上述の方法（a）に記載したものである。方法（b）は、特に、 R5X がアミドもしくはカルボニル基を含むような構造式 IIa の化合物を調製するにあたって適切である。
【００６９】
構造式 I の化合物に、基 [X1(R1)(R2)(R3)Ph]C(O) を導入するためにも用いることができるような構造式 6 の化合物は、一般的には、市販されているか、もしくは当該技術分野で公知である手法によって調製することができる。例えば、臭化ベンジル、臭化3,4-ジクロロベンジル、フェニル酢酸、および 2-フェニルプロピオン酸などのハロゲン化アラルキル類 （ arakyl halides ） もしくはアラルキル酸 （ arakyl acids ） は、市販されている。フェニル酢酸、フェニルプロパノール、 2-ピリジンエタノール、ニコチン酸などの適切な出発物質から、構造式 4 の化合物を合成するための上述した方法（a）によって、その他を調製することができる。
【００７０】
ピペラジン、 2-メチルピペラジン、 3-メチルピペラジン、およびホモピペラジンといった、構造式 7 のピペラジン類およびホモピペラジン類は市販されている。ピペラジン類 7 は、欧州特許公報 0 068 544号、および米国特許3,267,104号に記載されている方法によっても調製することができる。
【００７１】
構造式(I)の化合物は、以下の反応式Cに示したように調製することができ、ここで、式中の Ar は
【００７２】
【化９】
2006526635.tif 000007
である。
【００７３】
〔反応式C〕
【００７４】
【化１０】
2006526635.tif 000008
構造式(I)の化合物は、以下のいずれかの方法によって調製することができる。
【００７５】
(i) 構造式 IIa の化合物と、アシル化剤である Ar-C(O)L との反応。ここで式中の L は、ハロ基（特に、 Cl もしくはBr ）、またはイミダゾール基などのアシル化条件下での脱離基である。この反応において適切な溶媒は、非プロトン性極性溶媒（例えば、ジクロロメタン、THF、ジオキサン、およびこれらの類似物）を含む。ハロゲン化アシルをアシル化剤として用いる場合には、非求核性有機塩基（例えば、トリエチルアミン、もしくはピリジン、好ましくはピリジン）の存在下で反応が行われる。あるいは、
(ii) 構造式 IIa の化合物と、酸無水物とを加熱する。この反応に適切な溶媒は、テトラヒドロフラン、ジオキサン、およびそれらの類似物である。あるいは、
(iii) 構造式 IIa の化合物、もしくは構造式 H2NCH-((Alk)Het)C(O)Ot-Bu  （8） の化合物を、構造式 ArCHO の化合物と、 NaCNBH4の存在下で反応させた後、存在するならばエステル構造を加水分解する。多くのα-アミノ酸=t-ブチルエステル類が、例えば Bachem から市販されている。
【００７６】
したがって、上述の構造式 I において、 R1 の特異値は、 H 、 (C2-C4)アルキル基、 (C2-C4)アルコキシ基、もしくは (C3-C6)ヘテロシクロアルキル基である。
R2の特異値は H である。
【００７７】
R3の特異値は H である。
X1の特異値は NO2基である。
N(R6)(R7) の特異値は、アミノ基、ジメチルアミノ基、ジプロピルアミノ基、シクロヘキシルアミノ基、もしくはプロピルアミノ基である。
【００７８】
(Alk) の特異値は、 -(CH2)- である。
R4の特異値は CH3基である。
R5の特異値はシクロプロピル基である。
【００７９】
別の好ましい化合物としては、 4-N-アルカノイルピペラジン-1-イル-カルボニルアルキルベンズアミド類である構造式 I の化合物がある。
本発明において好ましい化合物は、SP10（図１）である。
【００８０】
薬学的に許容される塩は、例えば、アミンのような充分に塩基性である化合物と、生理学的に許容されるアニオンを与える適切な酸との反応、といった当該技術分野の標準的な手法を用いて得ることができる。アルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム、もしくはリチウム）、アルカリ土類金属（例えば、カルシウムもしくはマグネシウム）、または亜鉛の塩も調製することができる。
【００８１】
理論的に説明されているわけではないが、構造式(I)で示される安息香酸誘導体は、プロカインおよびプロカイン誘導体のような局所麻酔薬と同様に、例えば、副腎細胞内のジブチリルサイクリックAMP（dbcAMP）起因のステロイド合成をHMG-CoA還元酵素mRNAの発現の減少によって阻害すること、あるいは、カルシウム輸送の調節および細胞内貯蔵からの解放などにより細胞内カルシウム濃度を調節すること、のいずれかによって、糖質コルチコイドの循環量を調節すると信じられている。プロカインで行われた前臨床試験では、カルシウム代謝の異常亢進、およびコルチゾール量の増大に対してプロカインが効率的に作用することが示され、代謝経路はgp120の細胞内滲透によって開始されると述べられている。
【００８２】
塩酸プロカインは、生体内の免疫担当細胞の通常の機能発現を変化させることができる非特異的免疫調節剤であるので、塩酸プロカインはより直接的な経路で免疫抑制を軽減する援けとなりえる。したがって、構造式(I)の化合物は、プロカインおよび／もしくはプロカインの生物学的な同等物であるプロカイン誘導体と同様に、HIV関連痴呆症の処置において複数の経路で有用となりうる。これらの化合物は、細胞内のコレステロールに直接に作用し、結果として（コルチゾールを含む）任意のステロイドおよび産生に作用することによって、細胞死を抑止することができる。または、プロカイン誘導体は、上述したようにgp120によって破壊された細胞内カルシウム伝達系を直接のターゲットとして調整することができる。これらの経路は異なるものであるが、反応のメカニズムは同一のままであって──ミトコンドリア死と、その後のgp120の滲透に起因するコルチゾール量の増大とを阻害する。したがって、構造式(I)の化合物は、プロカインおよびプロカイン誘導体と同様に、HIV関連痴呆症──gp120の滲透に因るカルシウム濃度および／もしくはコルチゾールの量の増大に起因する神経細胞死──の原因である疑いのあるものを特異的にターゲットとすることができる。
【００８３】
安息香酸誘導体は、化学的に合成することができ、あるいは、化学物質・天然物質データベースのインシリコスクリーニングによって同定される植物抽出物から誘導することもできる。本発明において有用であるプロカイン誘導体のいくつかを表１に示した。
【００８４】
【表１】
2006526635.tif 000009
本発明に係る化合物は、薬学的に許容される塩、エステル、アミド、鏡像異性体、異性体、互変異性体、多形体、プロドラッグ、もしくはそれらの誘導体を含む。このような塩は、例えば、化合物の正電荷を帯びた置換基（例えばアミノ基）と、アニオンとによって形成することができる。適切なアニオンには、塩化物イオン、臭化物イオン、沃化物イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、リン酸イオン、枸櫞酸イオン、メタンスルホン酸イオン、トリフルオロ酢酸イオン、および酢酸イオンが含まれるが、これらに制限はされない。同様に、化合物の負電荷を帯びた置換基（例えばカルボキシル基）と、カチオンとによって形成することができる。薬学的に許容されるアニオンには、金属イオンおよび有機イオンが含まれる。より好ましい金属イオンは、適切なアルカリ金属（Ia族）塩、アルカリ土類金属（IIa族）塩、および他の生理学的に許容される金属イオンを含む。例示的なイオンとしては、通常の価数のアルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムを含む。好ましい有機イオンは、プロトン化された三級アミン、および四級アンモニウムイオンを含み、これらの一部としてはトリメチルアミン、ジエチルアミン、 N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（N-メチルグルカミン）、およびプロカインが含まれる。例示的な薬学的に許容される酸は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、メタンスルホン酸、酢酸、蟻酸、酒石酸、マレイン酸、リンゴ酸、枸櫞酸、イソ枸櫞酸、琥珀酸、乳酸、グルコン酸、グルクロン酸、ピルビン酸、オキサロ酢酸、フマル酸、プロピオン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、および類似物が含まれる。プロドラッグの例としては、被験者への投与によって、上述の化合物を与える能力を有するようなエステル、および他の薬学的に許容される誘導体が含まれる。
【００８５】
本発明に係る化合物は、通常は薬学的組成物の形状で投与される。これらの組成物は、経口、鼻腔胃、直腸、経皮、非経口（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、髄内もしくは皮内の注射または輸液の技術による投与）、鼻腔内、経粘膜、インプラント、膣、局部、頬、および舌下を含むが限定はされない適切な経路によって投与することができる。このような製剤は、規定通りに、緩衝剤、保存料、滲透促進剤 （ penetration enhancers ） 、共用できる担体、ならびに他の医薬成分もしくは非医薬成分を含むことができる。
【００８６】
本発明には、本発明に係る化合物と、薬学的に許容される担体もしくは賦形剤とを併せて含む薬学的組成物も含まれる。本発明に係る組成物の製造においては、ひとつもしくは複数の組成物と、薬学的に許容される賦形剤とを混合して、賦形剤によって希釈するか、あるいは、カプセル、包 （ sachet ） 、もしくは他のコンテナとすることができるような担体内に封入することができる。本発明に係る組成物を作成する上で担体として用いることができる物質は、薬学分野において一般に使用されている任意の賦形剤とすることができ、また、共用できる薬効物質、および所望の剤型の放出プロファイル特性に基づいて選択されるべきである。
【００８７】
例示すると、薬学的な賦形剤は以下の例から選択される。
(a) アラビアゴム （ acasia ） 、アルギニン酸およびその塩、セルロース誘導体、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、珪酸マグネシウムアルミニウム、ポリエチレングリコール、ゴム類、多糖類の酸 （ polysaccharide acids ） 、ベントナイト、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー、クロスポビドン、ポビドン、ポリメタクリレート類、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、アルファ化デンプン、エチルセルロース、トラガカントゴム、デキストリン、微細結晶セルロース、スクロース（蔗糖）、もしくはグルコース（ブドウ糖）、ならびに類似物といった、結合剤（バインダー）。 
【００８８】
(b) デンプン、アルファ化コーンスターチ、アルファ化デンプン、セルロース、架橋カルボキシメチルセルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスポビドン、架橋ポリビニルピロリドン、クロスカルメロースナトリウム、微細結晶セルロース、アルギニン酸カルシウム錯体、アルギニン酸ナトリウム錯体、粘土類、アルギニン酸塩、ゴム類、もしくはデンプングリコール酸ナトリウム、ならびに、錠剤調製において用いられる任意の崩壊剤、といった崩壊剤。
【００８９】
(c) ラクトース（乳糖）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、硫酸カルシウム、微細結晶セルロース、粉末セルロース、デキストロース、デキストラン塩類、デキストラン、デンプン、アルファ化デンプン、スクロース、キシリトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコール、および類似物といった充填剤。
【００９０】
(d) ラウリル硫酸ナトリウム、ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリソルベート類、ポロクサマー類 （ polaxomers ） 、胆汁酸塩類、グリセリルモノステアラート、 PluronicTM line（BASF）、および類似物といった界面活性剤。
【００９１】
(e) 枸櫞酸、琥珀酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、マレイン酸、グルタル酸炭酸水素ナトリウム （ glutaric acid sodium bicarbonate ） 、およびグルタル酸炭酸ナトリウム、ならびに類似物といった可溶化剤。
【００９２】
(f) 任意の抗酸化剤、緩衝剤、もしくは酸、ならびに使用できる類似物といった安定剤。
(g) ステアリン酸マグネシウム、水酸化カルシウム、滑石、ステアリルフマル酸ナトリウム、硬化植物油、ステアリン酸、ベハピン酸グリセリン （ glyceryl behapate ） 、およびステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸、滑石、蝋類、Stearowet、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、 DL-ロイシン、ポリエチレングリコール類、オレイン酸ナトリウム、もしくはラウリル硫酸ナトリウム、ならびに類似物といった滑沢剤。
【００９３】
(h) オレイン酸、モノステアリン酸グリセリン、ソルビタンモノオレエート、オレイン酸トリエタノールアミン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、オレイン酸ナトリウム、もしくはラウリル硫酸ナトリウム、ならびに類似物といった湿潤剤。
【００９４】
(i) ラクトース、デンプン、マンニトール、ソルビトール、デキストロース、微細結晶セルロース、リン酸水素カルシウム、スクロースに基づく賦形剤、粉砂糖、硫酸カルシウム一水和物、硫酸カルシウム二水和物、乳酸カルシウム三水和物、デキストラン塩類、イノシトール、加水分解された穀物固形物、アミロース、粉末セルロース、炭酸カルシウム、グリシン、もしくはベントナイト、ならびに類似物といった賦形剤。
【００９５】
(j) 滑石、コーンスターチ、 DL-ロイシン、ラウリル硫酸ナトリウム、およびステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸ナトリウム、ならびに類似物といった固結防止剤 （ Anti-adherents ） あるいは流動促進剤 （ glidants ） 。
【００９６】
(k) アラビアゴム、ゼラチン、コロイド二酸化珪素、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、マルトデキストリン、グリセリン、珪酸マグネシウム、カゼイン酸ナトリウム、大豆レシチン、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸二カリウム、ステアリル乳酸カルシウム、カラギーナン、モノグリセリド、ジグリセリド、もしくはアルファ化デンプン、ならびに類似物といった、薬学的に共用できる担体。
【００９７】
加えて、薬剤処方については、例えば Remington's The Science and Practice of Pharmacy (2000) で考察されている。薬剤処方の別の考察については、 Liberman, H. A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N. Y., 1980 に見つけることができる。
【００９８】
コルチゾールが介在する障害の処置のために、本発明に係る組成物を用いて、本発明に係る化合物を、約5ng〜約1000mg、もしくは約100ng〜約600mg、もしくは約1mg〜約500mg、もしくは約20mg〜約400mgの用量で与えることができる。典型的には、体重に対しての有用な服薬量は約0.0001mg/kg〜1500mg/kg 、より好ましくは 1〜1000mg/kg 、より好ましくは約1〜150mg/kgの範囲であり、もっとも好ましくは体重に対して50〜100mg/kgの範囲である。一回分の用量を、一日につき一〜約四回の服用に分割して投与することもでき、また、治療効果を引き出すために、一〜約四回分の用量を一日で投与することもできる。例示的には、本発明に係る組成物の剤型単位は、典型的には例えば本発明に係る化合物を約5ng、50ng、100ng、500ng、1mg、10mg、20mg、40mg、80mg、100mg、125mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、700mg、800mg、900mg、もしくは1000mg含むことができる。剤型は、特定の用量を実行するために用いられる所望の頻度での投与に適合するように選択することができる。
【００９９】
本発明の或る実施形態においては、組成物は有効量を以って被験者に投与され、これは、本発明に係る化合物の治療効果を示すような投薬量が、所望の治療効果を引き出すための或る時間内において被験者の血清中に存在できるように、組成物が投与されるということである。例示的には、絶食している成人（概して少なくとも十時間の絶食をしている）においては、組成物の投与より約五分後の時点から、被験者の血清中において本発明に係る化合物の治療上有効量が得られるように投与される。本発明の別の実施形態においては、被験者への組成物の投与より約十分後の時点から、被験者の血清中において化合物の治療上有効量が得られるようになる。本発明の別の実施形態においては、被験者への組成物の投与より約二十分後の時点から、被験者の血清中において化合物の治療上有効量が得られるようになる。本発明のなおも別の実施形態においては、被験者への組成物の投与より約三十分後の時点から、被験者の血清中において化合物の治療上有効量が得られるようになる。本発明のさらに別の実施形態においては、被験者への組成物の投与より約四十分後の時点から、被験者の血清中において化合物の治療上有効量が得られるようになる。本発明の或る実施形態においては、被験者への組成物の投与より約二十分〜約十二時間の間に、被験者の血清中において化合物の治療上有効量が得られるようになる。本発明の別の実施形態においては、被験者への組成物の投与より約二十分〜約六時間の間に、被験者の血清中において化合物の治療上有効量が得られるようになる。本発明のなおも別の実施形態においては、被験者への組成物の投与より約二十分〜約二時間の間に、被験者の血清中において化合物の治療上有効量が得られるようになる。本発明のさらに別の実施形態においては、被験者への組成物の投与より約四十分〜約二時間の間に、被験者の血清中において化合物の治療上有効量が得られるようになる。また、本発明のなおも別の実施形態においては、被験者への組成物の投与より約四十分〜約一時間の間に、被験者の血清中において化合物の治療上有効量が得られるようになる。
【０１００】
一般に、HIV関連痴呆症に対して治療効果を引き出すために有用であった期間に亘って生体外で有効であった濃度に対応した血清中量を得るために有効であるような塩酸プロカインの量を、患者は投与されることになる。したがって、例えば200nMの有効最大半量 （ a half-maximum effective dose ） とするような、塩酸プロカイン化合物が生体外活性を示すことが見出されるような状況において、HIV関連痴呆症に対して所望の治療効果を引き出す期間に亘って、生体内で概して濃度200nMの有効最大半量が得られるために有効であるような薬剤の量を、患者は投与されることになる。本発明に係る化合物の有効量を測定し決定するために、血清中化合物濃度を標準的な分析技術を用いて測定することができる。
【０１０１】
本発明の或る実施形態においては、本発明に係る化合物の血清中濃度を最大半量で得るために適した服薬量で、本発明に係る組成物が投与される。例示的には、本発明に係る組成物を被験者に投与することにより、約0.01〜約1000nM、もしくは約0.1〜約750nM、もしくは約1〜約500nM、もしくは約20〜約1000nM、もしくは約100〜約500nM、もしくは約200〜約400nMの血清中濃度が得られる。
【０１０２】
本発明に係る考慮された組成物では、本発明に係る化合物を投与後に約五分間〜約二十四時間の間隔をおいて投薬することで、治療効果が得られ、望むならば一日一度もしくは二日に一度の投与とすることも可能である。本発明の或る実施形態では、被験者への組成物の投与から約十分後、約二十分後、約三十分後、もしくは約四十分後に、本発明に係る化合物の用量の最大半量が、約1mg/ml以上、もしくは約5mg/ml以上、もしくは約10mg/ml以上、もしくは約50mg/ml以上、もしくは約100mg/ml以上、もしくは約500mg/ml以上、もしくは約1000mg/ml以上の平均血清中濃度が得られる。
【０１０３】
治療効果を引き出すために必要な、本発明に係る化合物の量は、例えば、血清中への化合物の吸収率、化合物の生物学的利用能、および障害の処置に関する効能といったことに基づいて実験的に定量することができる。しかしながら、任意の特定の被験者への本発明に係る化合物の特定の投薬量は、使用する特定の化合物の活性、被験者の年齢、体重、総合的な健康状態、性別、および食餌（例えば被験者が絶食しているか、もしくは食後かといったことを含む）、投与時間、排出率、薬剤の配合、ならびに処置される特定の障害の重症度、ならびに投与の形態、を含んでいるような種々の要因に依存している。一般に処置用量は、安全性および有効性を最適化するために滴定することができる。典型的には、生体外および／もしくは生体内での初期実験から得られる用量-作用効果の相関が、被験者への投与に適した用量を導き出す上で有用である。一般的に、本発明に関するコルチゾールが介在する障害もしくは病気の処置のための有用な用量を評価するための手引きとして、実験動物による研究を行うことができる。動物の用量とヒトの用量との相関（体表面積平方メートルあたりのミリグラムに基づく）については、 Freireich et al., Cancer Chemother. Rep. 1966, 50, 219 に記載されている。体表面積は患者の身長および体重から概算することができる。 Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardley, New York, 1970, 537 を参照のこと。当業者によって認められる方法にしたがい、投与経路、賦形剤の使用、およびオプションとしての他の治療薬の併用投与に依って、有効な用量を変更することもできる。
【０１０４】
活性成分の毒性および治療上有効性は、例えば、 LD50 （半致死量）および ED50 （半有効量）の定量のような、標準的な薬学的手順によって定量することができる。毒性と有効性との間の用量比は治療係数 （ therapeutic index ） であり、 LD50/ED50 の比で表すことができる。大きな治療係数を呈する化合物が好ましい。毒性の有る副作用を呈する化合物を使用することもできるが、このような化合物を感冒組織の部位へと振り向ける搬送システムをデザインする上では、非感染細胞の潜在的損傷を最小限にとどめ、結果的には副作用を低減するということを考慮して行う必要がある。
【０１０５】
一般的に言って、治療効果を引き出すために有用な期間に亘って、生体外で有効であるとされた濃度を得るために適した血漿中量の、本発明に係る化合物を投与することが望ましい。したがって、例えば、200nMの最大半量で生体外活性を示すことが見出された化合物の場合には、例えば、コルチゾールが介在する障害、および、当業者によって適切に測定されるように選択される他の指標を処置するというような所望の治療効果を引き出せる期間に亘って、生体内濃度200nMの概算最大半量が得られるために有用である量の薬剤を投与するのが望ましい。これらの考慮事項は当該技術分野において公知であり、標準的教科書に記載されている。
【０１０６】
ヒトの処置のために有用であることに加えて、本発明は、哺乳類、齧歯類、および類似物を含むような、獣医学上の動物、爬虫類、鳥類、外来動物、ならびに畜獣が含まれる他の被験者においても有用である。哺乳類には、例えばサルもしくはキツネザルである霊長類、ウマ、イヌ、ブタ、またはネコが含まれる。齧歯類には、ラット、リス、もしくはモルモットが含まれる。
【０１０７】
経口投与のために、薬学的組成物には、本発明に係る化合物の所望の量を含めることができ、また、例えば、錠剤、ハードカプセル、ソフトカプセル、薬用ドロップ、包、トローチ、必須ではない粉末、細粒、懸濁液、エリキシル剤、液体、もしくは、経口投与にあたって妥当である任意の他の形態であるような形態で投与される。例示的には、このような薬学的組成物は、所定の量の化合物を含んだ、錠剤もしくはカプセルのような個別の剤型単位として調製することができる。このような経口投与形態は、例えば緩衝剤をさらに含む。錠剤、丸薬、および類似物は、腸溶コーティングを付加して調製することもできる。
【０１０８】
口内投与もしくは舌下投与のための薬学的組成物には、例えば、スクロース、アラビアゴム、もしくはトラガカントゴムのようなフレーバーベース中の本発明に係る化合物を含む薬用ドロップ、また、ゼラチンおよびグリセリン、または、スクロースおよびアラビアゴムといった不活性ベース中の化合物を含む香錠 （ pastilles ） 、が含まれる。
【０１０９】
経口投与のための液状調剤には、当該技術分野で通常使用される不活性な賦形剤（例えば水）を含んだ薬学的に許容される乳剤、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシル剤が含まれる。このような組成物には、例えば、湿潤剤、乳化剤、および懸濁剤、ならびに、甘味料、フレーバー、香料を含めることもできる。
【０１１０】
経口投与のための適切な液状調剤には、本発明に係る化合物、ならびにβ-シクロデキストリン、または、β-シクロデキストリン=スルホブチルエーテル、ヘプタキス-2,6-ジ-O-メチル-β-シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン、およびジメチル-β-シクロデキストリンといった水溶性のβ-シクロデキストリン誘導体を含む水溶液が含まれるが、これに限定はされない。
【０１１１】
本発明に係る薬学的組成物は、注射（静注、筋肉注射、皮下注射）によって投与することもできる。このような注射可能な組成物には、適切な担体物質として、例えば、生理食塩水、デキストロース、もしくは水を使用することができる。必要であれば、適切な酸、塩基、もしくは緩衝剤を用いて組成物のpH値を調節することもできる。マンニトール、およびポリエチレングリコール（ PEG 400 など）を含んだ適切な賦形剤、分散剤、湿潤剤、もしくは懸濁剤を、組成物に含めることもできる。注射筒内に凍結乾燥された適切な滲透組成物に、本発明に係る化合物を含めることもできる。注射のために、組成物を溶かす水溶液を加えることもできる。
【０１１２】
薬学的組成物は座薬もしくはその類似物の形態として投与することもできる。このような直腸処方には、総量にして例えば約0.075〜約75% w/w、もしくは約0.2〜約40% w/w,、もしくは約0.4〜約15% w/w の本発明に係る化合物を含めるのが好ましい。ココアバター、カカオバター、および他の油脂といった担体物質、ならびにポリエチレングリコール系座薬基剤を、これらの組成物に用いることができる。コーティング（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフィルムコーティング）、および崩壊剤（例えば、クロスカルメロースおよび架橋ポビドン）といった他の担体物質を、望むならば用いることもできる。
【０１１３】
これらの薬学的組成物は、本発明に係る化合物と、ひとつもしくは複数の担体物質とを配合させるステップを含むような任意の適切な薬学的方法によって調製することができる。一般に、組成物は、液体もしくは細粒状固体担体、またはその両方と均一且つ充分に混合され、必要ならばその後に製品として成形される。例えば、化合物の粉末もしくは細粒に、任意にひとつもしくは複数の添加成分を加えて圧縮もしくは流し固めることで錠剤を調製できる。圧縮錠剤は、粉末もしくは細粒といった化合物の流動体に、任意にひとつもしくは複数の結合剤、滑沢剤、不活性な賦形剤、および／もしくは界面活性／分散剤を混合して、適切な機械を用いて圧縮することによって調製することができる。凝固錠剤 （ molded tablets ）は、不活性な希釈液で湿らせた化合物粉末を、適切な機械を用いて流し固めて調製することができる。
【０１１４】
本発明に係る錠剤は、OpadryTM White YS-1-18027A （もしくは別の色）のような従来技術によるコーティング物質でコートすることもでき、コートされた錠剤の総重量のうちの約3%をコーティングの重量とすることができる。本発明に係る薬学的組成物は、患者に投与された後に、当該技術分野で公知である方法によって、本発明に係る化合物が、即座に放出、持続放出、もしくは遅延放出するように処方することができる。
【０１１５】
賦形剤が希釈剤としての役割も果たす場合には、固体、半固体、もしくは液体の物質とすることができ、また、本発明に係る化合物のための溶媒 （ vehicle ） 、担体、もしくは媒体として機能する。したがって組成物を、錠剤、咀嚼錠、丸薬、粉末、薬用ドロップ、包、オブラート包、エリキシル剤、懸濁液、乳濁液、溶液、シロップ、エアロゾル（固体として、もしくは液体媒体中に溶かして）、ソフトカプセル、ハードカプセル、および滅菌パッケージ済み粉末といった形態とすることができる。
【０１１６】
本発明の或る実施形態においては、製造プロセスとして以下の方法のうちのひとつ、もしくはそれらの組み合わせを行うことができる。即ち、(1) 乾燥混合 （空練り;  dry mixing ） 、(2) 直接圧縮、(3) 粉砕、(4) 乾燥造粒もしくは無加水造粒、(5) 加水造粒、または(6) 溶融、である。 Lachman et al., The Theory and Practice of Industrial Pharmacy (1986) 。
【０１１７】
本発明の別の実施形態においては、本発明に係る化合物を薬学的賦形剤と混合し、本発明に係る化合物と賦形剤との均一な （ homogenous ） 混合物を含んだ固形の予備処方組成物を作成することによって、錠剤のような固形組成物を調製することができる。ひとつもしくは複数のこれらの予備処方組成物を均一であると称する場合、化合物が組成物全体に亘ってむらなく分散し、この組成物を同等に有用な剤型単位（錠剤、丸薬、およびカプセルなど）へと容易に再分割できる、ということを意味している。この固形の予備処方は、ここで記載したようなタイプの剤型単位に再分割される。
【０１１８】
圧縮錠剤は、本発明に係る化合物と、加工を援け、製品の特性を改善するように選択された賦形剤とを含む処方を凝縮することによって調製される固体の剤型である。「圧縮錠剤」 （ "compressed tablet" ） という語は、一般的には添加物の少ない、コートされていない経口投与のための錠剤であって、一回の圧縮、もしくは、先立った予備打錠と最終的な圧縮とで調剤される錠剤のことを指す。
【０１１９】
本発明に係る錠剤もしくは丸薬はコートすることも、または、長期間の活性の利点が得られるような別の方法による調合をすることもできる。例えば、錠剤もしくは丸薬は内剤 （ inner dosage ） および外剤 （ outer dosage ） を含むことができ、この後者が前者を被覆するように構成することができる。腸溶層もしくは腸溶コーティングのためには、数多のポリマーの酸、ならびに、ポリマーの酸と、シェラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースとの混合物を含むような種々の物質を用いることができる。
【０１２０】
本発明に係る組成物の継続投与を必要とする患者の、コルチゾールが介在する障害の処置にあたっては、長期持続放出インプラントの使用が適している。ここで用いる「長期」放出 （ "long-term" release ） とは、本発明に係る化合物の治癒力のある量を、少なくとも三十日間、好ましくは六十日間に亘り搬送することができるようにインプラントが組立・構成されていることを意味する。長期持続放出インプラントは、当業者には公知のものであって、上述したような放出システムを含む。
【０１２１】
本発明に係る化合物を用いた方法、キット、および組成物は、例えばスタチン類、ケトコナゾール、メチラポン、アミノグルテチミド、およびエトミデートといったコルチゾールが介在する障害を処置または抑制するための別の薬剤と配合して使用すること（「併用療法」 （ "combination therapy" ） ）も可能である。本発明と連携して用いる場合、即ち併用療法をする場合には、望まざる副作用のすべてではないにせよ多くを、軽減または除去できるような付加作用もしくは相乗作用を得ることができる。これらの薬剤の軽減された副作用は、概して例えば投与された配合物の治療作用効果を得るために必要な用量の軽減につながる。
【０１２２】
「併用療法」という語は、被験者のコルチゾールが介在する障害を処置もしくは抑制するための別の薬剤（正しくは、「治療薬」 （ "therapeutic agents" ） ）と、本発明に係る組成物とを連携して投与することであって、コルチゾールが介在する障害の処置のためのこれらの治療薬の補助活性 （ co-action ） から、有益な作用効果を得ることができる、特定の処置療法の一部としての本発明に係る組成物の投与のことを包含する。併用による有益な作用効果には、治療薬の併用から生じる薬物動態学的もしくは薬力学的な補助活性が含まれるが、これに限定はされない。これらの治療薬の配合物としての投与は、典型的には所定の時間をおいて（選択した配合に応じて、つねに実質的に同時に （ usually substantially simultaneously ） 、分単位、時単位、日単位、週単位、月単位、もしくは年単位とする）行われる。「併用療法」は、一般的には、本発明と配合したときに付随的且つ恣意的な結果を与えるような別々の単独の療法の一部としての、二つ以上の治療薬の投与のことは包含しない方がよい。「併用療法」は、これらの治療薬の連続的な投与、即ち、それぞれの治療薬を異なる時刻に投与すること、さらに、これらの治療薬、もしくは二つ以上の治療薬を実質的に同時に投与することを包含する方がよい。実質的に同時の投与は、例えば、被験者に、それぞれの治療薬を固定比で含んでいる単独の錠剤もしくはカプセルを被験者に投与すること、あるいは、それぞれの治療薬の単独のカプセルもしくは錠剤を複数組み合わせて被験者に投与することによって行うことができる。それぞれの治療薬を連続的投与、もしくは実質的に同時の投与することは、任意の経路で行うことができる。連続的に治療薬を投与することは、狭義においては重篤なことではない。「併用療法」は、さらに、他の生理活性成分と配合した上述した治療薬の投与、ならびに、例えば外科手術であるような非投薬療法と組み合わせた上述した治療薬の投与のことも包含する。或る実施形態においては、本発明に係る薬学的組成物は、コルチゾールが介在する障害を処置するための外科手術もしくは放射線治療（例えば、下垂体癌を伴うCushing症候群、もしくは下垂体癌を伴わないCushing症候群の処置）と組み合わせられる。
【０１２３】
併用療法を構成する治療薬は、配合して一体とした剤型、もしくは、実質的に同時に投与されるような別々の剤型とすることができる。併用療法を構成する治療薬と、二段階の投与を要する療法において投与されるいずれかの薬剤とを連続的に投与することもできる。したがって、複数の間隔をおいた別々の治療薬の投与と併せた、複数の治療薬の連続的な投与を要するような療法とすることもできる。それぞれの治療薬の効力、溶解性、生物学的利用能、血漿中半減期、および動態学的プロファイルといったそれぞれの治療薬の特性に応じて、さらに摂食の影響、ならびに被験者の年齢および病態に応じて、複数の投与ステップの時間間隔を、例えば数分間から数時間から数日間の範囲とすることができる。目的の分子の濃度の生物学的サイクル変化によって、最適の投薬間隔を決定することもできる。同時・実質的に同時・連続的のいずれかで投与される併用療法の治療薬を、或る治療薬の経口投与と、別の治療薬の例えば経口投与、経皮投与、静脈投与、筋肉内投与、もしくは粘膜組織からの直接の吸収による投与、とを要するような療法に含めることもできる。併用療法の治療薬は、吸入スプレーによる経口投与、直腸投与、局所投与、口内投与、舌下投与、または非経口的投与（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、および皮内への注射）のいずれかによって別々にあるいは共に投与される場合のいずれにおいても、それぞれの治療薬は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、もしくは他の処方成分を含んだ適切な薬学的処方とすることができる。
【０１２４】
本発明の別の実施形態においては、コルチゾールが介在する障害を処置するための化合物を、本発明に係るひとつもしくは複数の化合物を含んだキットまたはパッケージの形状に収める。これらの化合物は、時間毎、日毎、週毎、もしくは月毎（または他の周期）の用量を収め、連続的もしくは同時の投与に適するように構成されたキットあるいはパッケージの形状としてパッケージングすることができる。本発明は、連日の投与のための複数の剤型単位を含み、それぞれの剤型単位が本発明に係る少なくともひとつの化合物を含んでいるようなキットもしくはパッケージもさらに提供する。この薬剤搬送システムを用いることによって、本発明に係る任意の化合物の投与を容易なものとすることができる。或る実施形態では、システムは、日毎もしくは週毎に投与されるべき用量を複数含んでいる。キットもしくはパッケージには、併用療法で利用できる他の治療薬を含めることもできる。キットもしくはパッケージには、被験者への説明書のセットを含めることもできる。
【０１２５】
或る特徴として、本発明はコルチゾールが介在する病態、病気もしくは障害を処置する治療方法を指向し、この方法は、本発明に係るひとつもしくは複数の組成物を、この病態、病気、または障害を処置するための有効量で、処置を必要とする被験者へと投与することを含む。この病態もしくは障害を抑制、軽減、または寛解させる薬剤投与法 （ dosage regimen ） は、種々の要因と調和するようにして調節することができる。これらの要因には、被験者の型、年齢、体重、性別、食餌、および健康状態、ならびに、障害もしくは病気の重症度が含まれる。したがって、実際には、この薬剤投与法は広汎に変更することができるものであって、ここで述べる薬剤投与法から逸脱したものとすることも可能である。
【０１２６】
本発明には、被験者へ本発明に係る組成物を投与することによって、臨床的に明らかとなったコルチゾールが介在する病気もしくは障害の進行を、処置、抑制、回復、停止、または遅延させる方法、また、コルチゾールが介在する病気もしくは障害に関連する徴候、またはコルチゾールが介在する病気もしくは障害に因る徴候を処置する方法が含まれる。この被験者は投与の時点で既にコルチゾールが介在する病気もしくは障害に罹っていてもよく、また、コルチゾールが介在する病気もしくは障害が進行するリスクを負っているものであってもよい。被験者のコルチゾールが介在する病気もしくは障害の徴候または病態については、当業者が判定することができるものであって、標準的教科書に記載されている。この方法には、本発明に係るひとつもしくは複数の化合物、組成物、または配合物の、コルチゾールの調節のための有効量を、それらを要する被験者へと投与することが含まれる。
【０１２７】
別の特徴においては、本発明はコルチゾールが介在する病態、病気もしくは障害を処置する治療方法を指向し、この方法は、本発明に係るひとつもしくは複数の組成物を、糖質コルチコイドの基礎産生には影響することなく、ホルモン起因の糖質コルチコイド産生を低減するための有効量で、処置を必要とする被験者へと投与することを含む。さらに、本発明は、HMG-CoA mRNAの基礎量には影響することなく、HMG-CoA還元酵素mRNA発現量を抑制する方法を指向し、この方法には、構造式(I)の化合物のコルチゾールを調節するための有効量を含んだ薬学的組成物を、その抑制を必要とする被験者へと投与することが含まれる。なおも別の実施形態においては、本発明は、細胞内カルシウム濃度の調節方法であって、構造式(I)の化合物のコルチゾールを調節するための有効量を含んだ薬学的組成物を、その調節を必要とする被験者へと投与することによる調節方法を指向する。
【０１２８】
当業者は、本明細書の記述に基づいて本発明を完全な程度で実行することができると考えられる。ここで参照しているすべての発行物は、参照により全面的に開示に含まれる。したがって後述する特定の実施例は、単なる例示であると解釈されるものであって、この開示におけるその他の部分をどこからなりとも限定するものではない。
【０１２９】
《物質および方法》
［物質］
Y1マウス副腎細胞腫 （ Y1 mouse adrenal tumor cells ） は、 American Type Culture Collection（Manassas, VA）から入手し、また、MA-10マウスLeydig細胞腫 （ MA-10 mouse Leydig tumor cells ） は Dr. Mario Ascoli（University of Iowa, Iowa）から提供を受けた。 マウスHepa1-6細胞培地 （ Mouse Hepa1-6 cells medium ） は American Type Culture Collection（Manassas, VA）から入手した。UT-1細胞は Dr. JL Goldstein（Sothwestern University, TX）から提供を受けた。リポ蛋白欠損ウシ胎児血清 （ Fetal-bovine lipo-protein deficient serum;  FBLPDS ） は Intracel Corporation（Frederick, MD）から入手した。F-12K（Kaign's modification of Ham's F-12）およびDMEM培地は American Type Culture Collection から購入し、また、DMEM/Ham's F-12培地、ウマ血清、およびウシ胎児血清（FBS）は InVitrogen Corporation（Carlsbad, CA）から購入した。抗血清は、以下を用いた。即ち、 anti-20-OH-プロゲステロン （ anti-20-OH-progesterone ） （Endocrine Sciences, Calabasas, CA）、 anti-プロゲステロン （ anti-progesterone ） （ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA）、 anti-P-450scc（Research Diagnostics Inc. , Flanders, NJ）、 anti-G3PDH （Trevigen, Inc., Gaithersburg, MD）である。 3H-20a-ヒドロキシプロゲステロン、 3H-プロゲステロン、 3H-コルチコステロン、および 3H-メバロノラクトンは、 PerkinElmer Life Sciences Inc.（Boston, MA）から購入し、また 14C-HMG-CoA は Amersham Pharmacia Biotech（Buckinghamshire, England）から入手した。 The MTT cell proliferation assay kit （MTT細胞増殖分析キット）は Trevigen, Inc.（Gaithersburg, MD）から購入し、 the PepTag assay for nonradioactive detection of PKA kit （PKA非放射性検出のためのPepTag分析キット）は Promega Corporation（Madison, WI）から購入し、 the Varian Bond-Elut NH2カラムは Chrom Tech, Inc.（Apple Valley, MN）から入手した。プロカイン塩酸塩 （ procaine chlorhydrate ） およびコンパクチン （ compactin ） は、 Sigma（St. Louis, MO）から入手した化学物質から得た。塩酸プロカイン （ procaine hydrochloride ） 、硫酸亜鉛七水和物（プロカインの吸収速度を遅らせるために用いた）、アスコルビン酸（抗酸化剤）、安息香酸カリウム（保存料として用いた）、およびリン酸水素二ナトリウム（「プロカインに基づく処方」 （ "procaine-based formulation" ））を含む薬学的組成物と、それの同様の組成物であるがプロカインを欠いているプラシーボ（プラセボ;  偽薬）とは、 Samaritan Pharmaceuticals, Inc.（Las Vegas, NV）から入手した。 RNA STAT-60 は TEL-TEST, Inc.（Friendswood, TX）から入手した。 TaqMan Reverse Transcription Reagents 、ランダムヘキサマー、および SYBR(R) Green PCR Master Mix は Applied Biosystems（Foster City, CA）から入手した。細胞培養サプライは GIBCO（Grand Island, NY）から購入し、また、細胞培養用プラスチック容器は Corning（Corning, NY）から入手した。他のすべての化学物質には、各種の市販品として入手した、分析用の品位のものを用いた。
【０１３０】
［プロカイン誘導体のインシリコスクリーニング］
Interbioscreen（Moscow, Russia）、および Comgenex（Budapest, Hungary）の化学合成物・天然物データベースを、 ISIS software（Information Systems, Inc., San Leandro, CA）を用いて、プロカインと構造の相同性を持つ化合物についてスクリーニングを行った。選択された化合物は、 dbc-AMP起因のステロイド産生を阻害する能力を有するものとしてスクリーニングされたものである。選択された生理活性化合物であるプロカインおよびその誘導体（SPO10-014-016-017）を、図１に示し、また、それぞれの化合物の化学的命名および由来を表１に示した。
【０１３１】
［動物の処置］
雄の生後八十日のSprague-Dawleyラットは、 Charles River Breeding Laboratories（Wilmington, MA）から購入したものである。ラットは the Georgetown University Research Resources Facility において光と温度を調節して飼育し、餌 （ rat chow ） と水とに自由に近づけるようにした。ラットは三匹ずつのグループに分けて飼育し、処置前の二日間をかけて新しい環境に順応させた。すべての実験手順は the Georgetown University animal care and use committee によって検査され承認された。プロカインに基づく処方、およびプラシーボ（双方とも the University of Iowa School of Pharmacy, Iowa によって調製された）を、一日あたり 1ml 、八日間連続でチューブによって投与した。ラットは二十四時間後に屠殺された。抗血清の販売元である ICN Pharmaceuticals （Orangeburg, NY）の提示した条件の下で、採集した血清から有機溶媒で抽出（酢酸エチル:エーテル = 1:1, v/v）して、コルチコステロンをラジオイムノアッセイ （放射免疫測定法;  radioimmunoassay ） （Amri et al., 1996）によって測定した。
【０１３２】
［細胞培養］
Y1マウス副腎細胞腫を、 5% CO2 雰囲気下で、ウマ血清 15% と、FBS 2.5% とを含んだF12K培地で培養した（Brown et al., 1992）。MA-10マウスLeydig細胞腫は、 4% CO2 雰囲気下で、FBS 5% と、ウマ血清 2.5% とを補ったDMEM/F12培地で培養した（Brown et al., 1992）。 H295R ヒト副腎細胞腫は、 37℃、 6% CO2 雰囲気下で、 1% ITS+ [インシュリン（1μg/ml）、トランスフェリン（1μg/ml）、セレン（1 μg/ml）、リノレン酸 （ linoeic acid ） （1μg/ml）、および BSA（1.25mg/ml）]、 2.5% Nuserum 、および 1% ペニシリン/ストレプトマイシン を含んだDMEM/F12で存置した（Amri et al., 1996）。 Hepa1-6マウス肝細胞腫は、 10% FBS を補ったDMEM培地で培養し、また、 UT-1細胞は、 8% FBLPDS および 2% FBS に 40_M コンパクチンを加えたものを補ったDMEM/F12培地で培養した（Chin et al., 1982）。
【０１３３】
［ステロイド産生、および経路の特徴の測定］
Y1細胞とMA-10細胞とを九十六穴プレートで十八時間培養し（一穴あたりの細胞数 2 x 104 ）、その後に塩酸プロカイン、プロカインに基づく処方、もしくはプロカイン誘導体（SP化合物）を濃度を高めながら加えて、四十八時間処置した。培地を取り替えて、細胞を 1mM dbcAMP 、および二十四〜四十八時間の処置によって刺激した。シトクロムP-450scc の活性、および遺伝子の発現を分析するために、培地を取り替えて、細胞を 1mM dbcAMP で刺激し、プロカインおよび／もしくは 22R-ヒドロキシコレステロールを 10mM 加えて、さらに四十八時間かけて培養した。 HMG-CoA還元酵素の活性の役割を分析するために、培地を取り替え、細胞を 1mM dbcAMP で刺激し、プロカインおよび／もしくはメバロン酸を 10mM 加えて、さらに四十八時間培養した。Y1細胞培地およびMA-10細胞培地のそれぞれの 20-OH プロゲステロンおよびプロゲステロンを、RIAで測定した（Brown et al., 1992）。 H295R ヒト副腎細胞腫を四十八穴プレートに一穴あたり 105 細胞となるように播種し、二十四時間培養した。培地を除いた後、細胞をプロカイン、もしくはプロカインに基づく処方の存在下でさらに四十八時間培養した。培養期間終了から四十八時間に亘り、 1mM dbcAMP で細胞を処置した。培地のコルチゾールを、公知であるラジオイムノアッセイで定量した（Amri et al., 1996）。
【０１３４】
［ミトコンドリアの統合性／細胞生存率の分析］
上述した培養手順の最後に、ミトコンドリア統合性 臭化3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム（MTT）分析法（Trevigen, Gaithersburg, MD）を用いて、細胞生存率を分析した。要約すると、 10 l MTT溶液を、 100 l の培地上の細胞に加えた。四時間の培養期間の後、 100 l の洗浄剤を加えて、細胞を37℃で一晩培養した。 the Victor quantitative detection spectrophotometer（EGG-Wallac, Gaithersburg, MD）を用いて、 600nm および 690nm でホルマザンブルー （ formazan blue ） の形成を定量し、結果を (OD600-OD690) で示した。
【０１３５】
［PKA活性の測定］
Y1細胞を六穴プレート内で培養（一穴あたりの細胞数 2 x 105 ）し、ステロイド生合成のために上述した方法で処置した。培養終了時に細胞をPBSで二回洗浄し、抽出緩衝液（ 25mM トリス-塩酸, pH 7.4、 0.5mM EDTA、 0.5mM EGTA、 10mM -メルカプトエタノール （ -mercaptoethanol ） 、 0.5mM PMSF、 1g/ml ロイペプチン、および 1g/ml アプロチニン）を用いて蛋白質を抽出した。18,500g で十五分間の遠心分離の後、上清を取ってPKA活性分析にかけた。試料は、製造者（Promega Corporation, Madison, WI）の推奨するところにしたがってPKA活性の非放射性検出のためのPepTag分析を用いて処理した。
【０１３６】
［イムノブロッティング］
上述した処置手順の終了時に、培養密度 （ confluency ） 90% のY1細胞をPBSで二回洗浄し、抽出緩衝液中で十五秒間の超音波処理を行ってから、 4℃、 18,500g で十五分間の遠心分離を行った。ペレットを氷冷した溶解液 （ lysis buffer ） （抽出緩衝液に 1% Nonidet 40 を溶かしたもの）で再懸濁し、短時間の超音波処理を行ってから、氷温で一時間培養した。遠心分離（22,500g x 30min, 4°C）の後、上清を試料緩衝液 6X （0.27M SDS、 0.6M ジチオトレイトール、 7ml の 0.5M トリス-塩酸, pH 6.8 に溶かした 0.18M ブロモフェノールブルー （ bromphenol blue ） 、および 3ml グリセロール）と混合して、五分間煮沸した。蛋白質を SDS-PAGE（成分として 4〜20% の SDS ポリアクリルアミドジェルを含む）に入れて、ニトロセルロース膜上で電気泳動させた。トランスブロットシートを、 25mM トリス-塩酸, pH 7.5、 150mM NaCl 、および 0.1% Tween 20 に 5% の脱脂粉乳を溶かした溶液でブロックし、 4℃で一晩置いた。その後、一次抗体を 1:800 で anti-P-450scc （Research Diagnostics Inc. Flanders, NJ）で適切に希釈したもの、および 1:200 で anti-StAR（Amri et al., 1996）で適切に希釈したものと共に膜を培養して、ペルオキシダーゼ標識二次抗体 （ peroxidase-conjugated secondary antibody ） （Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）、および高感度化学発光法（Amersham Life, Arlington Heights, IL）によって反応を検出した。適切なバンドの密度を、 the OptiQuant Acquisition & Analysis software（Packard BioScience）を用いて測定した。
【０１３７】
［PBR放射性リガンド結合分析］
放射性リガンド結合分析は、公知の手法（Papadopoulos et al., 1990, J. Biol. Chem. 265, 3772-3779）によって行った。要約すると、細胞を培養フラスコから掻き集めてPBSに入れ、倍散して （ dispersed by trituration ） 、 1200 x g で五分間遠心分離した。細胞をPBS中で再懸濁し、最終濃度を 10〜50μg protein/100μl とした。飽和結合実験 （ Saturation binding studies ）を、指標濃度の放射性リガンド[3H]PK 11195 （比活性 83.5Ci/mmol;  NEN Life Science Products）の存在下で、最終体積を 300μl として行った。非特異結合については、 6μM の相同する非放射性リガンドの存在下で測定した。 4℃での百八十分間の培養の後、 Whatman GF/C filters（Clifton, NJ）で濾過して分析を止め、 10 ml PBS で洗った。放射性結合を液体シンチレーション計数法 （ liquid scintillation counting ） で測定した。結合した [3H]PK 11195 および [3H]コレステロールを、液体シンチレーション法で測定した。 PK 11195 およびコレステロールの解離定数（Kd）、結合部位数（Bmax）、およびHill係数（nH）は、 Curve-Fit （Prism version 3.0, GraphPad Software Inc., San Diego, CA）で定量した。
【０１３８】
［HMG-CoA還元酵素分析］
十二穴プレートに入ったY1細胞（一穴あたりの細胞数 1 x 105 ）を、塩酸プロカインの濃度を高めながら四十八時間に亘り処置した。細胞を氷冷PBSで二回洗い、氷冷分析緩衝液（0.1M スクロース、 40mM KH2P04 、 30mM EDTA 、 50mM KCl 、 5mM DTT 、 0.25%(v/v) の Brij 96, pH 7.4）を加えて氷温で二十分間培養した。 14000g（4°C）で三分間遠心分離した後、上清を回収してHMG-CoA還元酵素活性分析にかけた。総量 150 l の分析用化合物には、 100〜200 g の蛋白質、およびNADPH産生系（ 2.5mM NADP 、 20mM グルコース=6-リン酸塩、および 20U/ml グルコース=6-リン酸塩デヒドロゲナーゼ）が含まれていた。基質（ 14C-HMG-CoA, 0.1Ci）を加えて反応を開始し、四十五分後に 10-1 の 6M HCl を加えて反応を停止した。試料に抽出回収標識 （ extraction recovery marker ） として 3H-メバロノラクトンをさらに加えた。生成物を完全にラクトン化するために、さらに三十分間培養した後、混合物を遠心分離した。上清を Bond-Elut NH2 カラムに入れて、 1ml のトルエン／アセトン（3:1）で溶離した。溶離分を棄て、カラムにさらに 4ml のトルエン／アセトンを加えて、シンチレーションバイアルを回収して 14C-メバロン酸および 3H-メバロノラクトンのシグナルを計数した（Berkhout et al., 1990）。
【０１３９】
別の実験として、細胞を超音波処理して分離した後、プロカインで処置した。ホモジネート中のHMG-CoA還元酵素活性への処置の直接の影響を、上述したように定量した。
［リアルタイムRT-PCR定量法（Q-PCR）］
六穴プレートで十八時間培養した細胞を、塩酸プロカインの濃度を高めながら、示した時間の処置を行った。処置後、細胞を 1mM dbcAMP で二十四時間刺激した。培養終了時に、細胞の total RNA を RNA STAT-60（Tel-Test Inc, Friendswood, TX）を製造者の指示に従って用いて抽出した。HMG-CoA還元酵素mRNAを、 the ABI Prism 7700 sequence detection system（Perkin- Elmer/Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いたQ-PCR法によって測定した。RT反応は、 TaqMan(R) Reverse Transcription Reagents にそれぞれの反応毎に製造者の指示に従って 1g の total RNA およびランダムヘキサマーをプライマーとして加えたものを用いて行った。マウスHMG-CoA還元酵素mRNAをQ-PCR法で測定するために、プライマーおよびプローブの選択にあたり特異的に構成された PE/AB Primer Express software を用いて、 GenBank Accession Number BC 019782 に従ってプライマーを設計した。フォワードプライマーは 5'-CCAAGGTGGTGAGAGAGGTGTT-3' （22 nucleotides）、また逆転写プライマーは 5'-CGTCAACCATAGCTTCCGTAGTT-3' （23 nucleotides）とした。プライマーは Bio-Synthesis Inc.（Lewisville, TX）が合成を行った。 10 l の SYBR(R) Green PCR Master Mix および 1 l のプライマー混合物（各5M）に 2 l の cDNA を溶いたものを含んだ体積 20 l の溶液を含む、反応混合物を用いて反応を行った。サイクルの条件は以下であった。即ち、初期ステップとして50℃で二分間および95℃で十分間、を行った後に、95℃で十五秒および60℃で一1分間、を40サイクル行った。 AmpliTaq Gold ポリメラーゼを、95℃に十分間置いて活性化した。同時に 18S RNA を増幅し、内部対照として用いた。プライマーダイマーのような非特異的PCR産物の汚染を除くために、サイクル手順の後に、すべての最終PCR産物に対して融解曲線分析を行った。また、ゲノムDNA の汚染を除くために、それぞれのサンプルに対して、RT反応を起こさないPCR反応も行った。PCR産物を回収し、 3%(w/v) アガロース電気泳動ゲル上で泳動させて産物の大きさを確認した。 18S RNA およびサンプルの Ct値 （ threshold cycle values;  Ct values ） を、 PE/AB computer software を用いて算出した。 Ct は、反応が最大の指数増殖期にあるところに定めた。依存的転写量を x = 2Ct として計算し、ここで、 Ct = E - C であり、また E = Ctexperiment - Ct18S 、 C - Ctcontrol - Ct18S である。
【０１４０】
［蛋白質測定］
Bio-Rad protein assay kit（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）、および標準としてウシ血清アルブミンを用いて蛋白質を測定した。
【０１４１】
［統計］
統計解析は、INSTAT 3.00 package from GraphPad（San Diego, CA）を用いて、一方向分散解析（ANOVA）および unpaired Student's t test によって行った。
【０１４２】
［実施例1  化合物SP010の合成手順］
［A.  [1-(1H-インドール-3-イルメチル)-2-(3-メチル-ピペラジン-1-イル)-2-オキソ-エチル]カルバミン酸=tert-ブチルエステル （B） ］
Boc-L-トリプトファン （A） (4.556g; 15mmol) を CH2Cl2 （DCM） (60 ml) に溶かし、 1,1'-カルボニルジイミダゾール （CDI） (2.513g, 15.5mmol) を加えてから反応混合液を室温で百分間攪拌した。 2-メチルピペラジン (1.502g; 15mmol) を加え、さらに室温で六時間攪拌を続けた。 1,2-ジクロロエタン （DCE） (15ml) を加え、有機溶液を 5% aq. Na2CO3 、 3% aq. HCl 、および水でそれぞれ洗った。有機層を Na2SO4 で脱水し、濾過して減圧乾燥した。残渣をジエチルエーテル-ヘキサン混合液から再結晶して表記の物質 （B） を白色結晶として得た (3.021g; 52%) 。
【０１４３】
［B.  [2-(4-シクロプロパンカルボニル-3-メチル-ピペラジン-1-イル)-1-(1H-インドール-3-イルメチル)-2-(3-メチル)-2-オキソ-エチル]カルバミン酸=tert-ブチルエステル （C） ］
上述したステップで得たピペラジン誘導体 （B） (3.021g; 7.82mmol) をDCE (30ml) に溶かした。TEA (15.64mmol; 2.81ml) を加えてから、塩化シクロプロパンカルボニル (0.77g; 7.43mmol; 0.674ml) を加えた。反応混合液を室温で五時間攪拌した。有機溶液を 3% aq. HCl 、 3% aq. Na2CO3、および水でそれぞれ抽出した。有機層を Na2SO4 で脱水し、濾過して減圧乾燥し、目的物を白色固体 （D） (3.245g; 91%) として得た。
【０１４４】
［C.  2-アミノ-1-(4-シクロプロパンカルボニル-3-メチル-ピペラジン-1-イル)-3-(1H-インドール-3-イル)-プロパン-1-オン （D） ］
前述のステップで調製した、 Boc-保護されたアミノ酸誘導体 （C） (3.254g; 7.16mmol) をDCM (5ml) に溶かした。TFA (8ml) を氷浴しながら加えた。氷浴を除いて、反応混合液を室温で五時間攪拌した。混合液を減圧乾燥した後に、残渣に 10% aq. NaOH (20ml) を氷浴しながら加えた。水溶液をDCE (2x30ml) で抽出した後、有機層をまとめて水で洗って中和した。有機溶液を Na2SO4 で脱水し、濾過して減圧乾燥して遊離アミンを淡黄色固体 （D） として得た (0.787g; 32%) 。
【０１４５】
［D.  N-[2-(4-シクロプロパンカルボニル-3-メチル-ピペラジン-1-イル)-1-(1H-インドール-3-イル-メチル)-2オキソ-エチル-4-ニトロ-ベンズアミド （SP010） ］
前述のステップで得たアミノ化合物 （D） (0.763g; 1.62mmol) をDCE (30ml) に溶かし、TEA (4.05mmol; 0.565ml) を加えた後、塩化 4-ニトロベンゾイル (0.256g; 1.54mmol) を加えた。反応混合液を室温で五時間攪拌した。有機溶液を 3% aq. HCL 、 3% aq. Na2CO3 、および水でそれぞれ抽出した。有機層を Na2SO4 で脱水し、濾過し減圧乾燥して目的物を黄色固体 （SP010） として得た (0.79g; 96%) 。すべての転換反応の進行はTLCでチェックを行った。各ステップにおける最終生成物の同定および純度は、 1H-NMR および LC-MS分光法で定量した。
【０１４６】
［実施例2  プロカインおよびプロカイン誘導体が、マウスおよびヒト副腎細胞株におけるdbcAMP起因のステロイド産生を阻害する］
dbcAMPで処置したY1細胞は、 20α-ヒドロキシプロゲステロンを凡そ四倍に増大させた（図２Ａ;  p<0.001）。プロカインおよびプロカイン誘導体 SP010 は、用量／作用相関に従って、dbcAMP起因の 20α-ヒドロキシプロゲステロン産生を用量依存的に減少させた（図２Ａ）。濃度 2M で用いたプロカイン誘導体 SP014, SP016, SP017 は、Y1細胞におけるdbcAMP起因の 20α-ヒドロキシプロゲステロン産生を 30〜38% 減少させた（図２Ｃ）。実験したすべての化合物は、Y1細胞のステロイド基礎産生に影響しなかった（データは示していない）。さらに、いずれの化合物も、MTT法を用いて測定した細胞生存率に影響しなかった（図２Ｂ、図２Ｄ）。
【０１４７】
H295R細胞においては、dbcAMPによってコルチゾール産生が四倍に増大した（図３Ａ;  p<0.001）。プロカインにより、dbcAMPが亢進したコルチゾール産生が、図３Ａに示したように用量依存的に減少し（p<0.01 by ANOVA）、コルチゾール基礎産生には影響しなかった（データは示していない）。驚くべきことに、dbcAMPに曝露した細胞は、MTT法によって測定された細胞生存率が激減した（図３Ｂ）。理論的に説明されているわけではないが、dbcAMPで処置した細胞数が減少していないことから考えると、この場合においてMTT法が示した変化というのは、細胞生存率よりも寧ろミトコンドリアの機能を反映したものではないかと思われる。プロカイン（図３Ｂ）は、dbc-AMP起因のミトコンドリアの機能の変化に対して保護作用を呈した。
【０１４８】
副腎細胞とは対照的に、MA-10マウスLeydig細胞腫におけるdbc-AMP起因のプロゲステロン産生に対してプロカインは作用しなかった（図４Ａ）。処置は、MA-10細胞生存率にも影響しなかった（図４Ｂ）。
【０１４９】
［実施例3  プロカインによる雄のSprague-Dawleyラットのコルチコステロン循環量の低減］
プロカインに基づく処方による八日間の処置を施した成年の雄のラットは、血清中のコルチコステロン量が、ANOVAによる分析において有意（p<0.05）に、凡そ 50% 低減された（図５）。成年のマウスにおいても同様の結果が得られた（データは示していない）。
【０１５０】
［実施例4  ステロイド作動性経路の種々のステップへの、プロカインの作用］
dbcAMPにより亢進されたステロイド産生へのプロカインの作用を考察する上で、この化合物のPKA活性への作用を研究した。PKA活性は、PKA特異基質に基づく非放射性検出キットである PepTag(R) A1 peptide (L-R-R-A-S-L-G) を用いて測定した。図６には、dbcAMPにより亢進されたステロイド産生を 90% 阻害（図２Ａ）した 1 M のプロカインが、dbcAMPにより亢進されたPKA活性には、有意な作用を呈さないということが示されている。
【０１５１】
水溶性コレステロールであり、 P-450scc の基質である 22R-ヒドロキシコレステロールは、 20-OHプロゲステロン産生の7.5倍の増大をそれぞれ誘導した。図２Ａに示したように、 1iM プロカインはdbcAMP起因のステロイド産生を 90% 減少させる。しかしながら、プロカインは 22R-ヒドロキシコレステロールのステロイド産生への作用を阻害しない（図７Ａ）。加えて、プロカインは、細胞抽出物のイムノブロット分析によって測定された P-450scc の発現に対して変化を齎さなかった（図７Ｂ）。
【０１５２】
理論的に説明されているわけではないが、上述のデータからは、プロカインは、PKA活性、および、先立つ最終ステロイド産物へのコレステロール代謝に作用を及ぼさない、ということが示唆される。われわれは、ミトコンドリア内へのコレステロール輸送に関連する二つの蛋白質、即ち末梢型ベンゾジアゼピン受容体（PBR）およびステロイド急性調節蛋白質 （ the steroidogenesis acute regulatory protein;  StAR ） の作用について、プロカインによる四十八時間の同一の処置手順を用いて実験を行った。これらの実験から、 1μM のプロカインは、PBRのリカンド結合特性（対照細胞群において Bmax = 27±3 pmol/mg protein 、および Kd = 1.8 nM に対して、プロカインで処置した細胞群では Bmax = 29±4 pmol/mg protein 、および Kd = 1.7nM ）にも、三時間のdbcAMP処置によって2.5倍に誘導された mature 30 kDa StAR蛋白の量（図７Ｃ）にも影響しなかった。これらの結果に鑑みて、コレステロール産生そのものがプロカインから影響を受けるかどうかが研究された。
【０１５３】
［実施例5  プロカインがHMG-CoA還元酵素活性およびmRNA発現を阻害する］
図８Ａは、 1 M のプロカインがdbcAMPおよびメバロン酸に支持された 20α-ヒドロキシプロゲステロン産生を阻害せず、この量のプロカインがHMG-CoA還元酵素によるメバロン酸産生の役割を務める可能性を示している。HMG-CoA還元酵素活性はY1細胞で測定された。プロカインは、これらの細胞のHMG-CoA還元酵素活性を用量依存的に低減した（図８Ｂ）。濃度 1M 、 10M および 100M において、阻害率はそれぞれ 44% 、 72% および 70 であり、また処置の作用はかなり有意（p<0.001 by ANOVA）であった。プロカインの作用が、酵素活性への直接の作用に因るものであるかどうかを解析するために、Y1細胞を超音波処理してプロカインで処置した。HMG-CoA還元酵素活性へのプロカインの直接作用は観察されなかった（対照群 10.1±0.9 pmol/min/mg protein に対して、プロカイン 1μM 、10μM および 100μM の存在下では、それぞれ 9.9±0.01 、 10.3±0.6 、および 10.1±0.1 pmol/min/mg protein ）。
【０１５４】
これらのデータに基づき、われわれは、Q-PCR法によって測定したHMG-CoA還元酵素mRNA発現量へのプロカインの作用を、18SRNAを内部標準として用いて検査した。dbcAMPで二十四時間処置することにより、HMG-CoA還元酵素mRNA発現は1.8倍に誘導された（図９Ａ）。プロカインで二十四時間の前処置をされた細胞では、用量依存的にHMG-CoA還元酵素mRNA量が減少し（p<0.01 by ANOVA）、基礎量に近づいた（図９Ａ）。詳細な経時変化実験 （ detailed time-course studies ） から、六時間のプロカイン処置が、この化合物がdbcAMP起因のHMG-CoA還元酵素mRNA発現を阻害するようになる最も早い時点であり、この作用効果は、細胞がプロカインによる二十四時間の前処置を受けた場合に増大する（データは示さず）、ということが示唆された。HMG-CoA還元酵素mRNA発現の阻害傾向が、大量のHMG-CoA還元酵素を含み、HMG-CoA還元酵素阻害剤のコンパクチンの存在下で生長することから選ばれたモンゴルキヌゲネズミ卵巣細胞クローンであるUT-1細胞（Chin et al., 1982）で観察されているにもかかわらず、この作用効果は有意ではなかった（図９Ｂ）。しかしながら、プロカインはHepa1-6マウス肝細胞腫のdbcAMP起因のHMG-CoA還元酵素mRNA量を有意（p<0.01 by ANOVA）に抑制した（図９Ｃ）。
【０１５５】
［考察］  プロカインおよびプロカイン誘導体は、ひとつのメカニズムにおいては、律速酵素であるHMG-CoA還元酵素mRNAの量を低減して、活性を低減し、コレステロールおよびコルチコステロイド生合成を減少させることによって、生体外および生体内の副腎細胞のホルモン刺激性コルチコステロイド産生を調節する。
【０１５６】
Y1マウス副腎細胞腫は、副腎ステロイド産生の基礎たるメカニズムを理解するために広汎に用いられてきた。これらの細胞においては、20-ヒドロキシラーゼによるプロゲステロンの転換から生じる、ステロイド産生の中間生成物である 20-ヒドロキシ-プロゲステロンが、細胞のステロイド産生の指標として用いられている（Mrotek and Hall, 1977;  Iida et al, 1989;  Brown et al., 1992）。本発明において発見されたように、プロカインは、細胞が基礎として産生する 20-ヒドロキシ-プロゲステロンには影響することなく、Y1細胞内のcAMP起因の 20-ヒドロキシ-プロゲステロンの増大を阻害する。プロカインは、 0.1μM という低濃度において、cAMP起因のステロイド産生を阻害し、この阻害は広範囲の濃度に亘って用量反応的な相関を示す。cAMP起因のステロイド産生へのこのプロカインの調節作用は、マウスY1細胞に限定されるものではなく、主要なステロイド産物としてコルチゾールを産生するH295Rヒト副腎細胞腫においても観察される。ヒト副腎細胞腫はプロカインに対してマウス副腎細胞よりも感度が鈍い。これらの結果は、プロカインが、コリン作動性ムスカリン刺激 （ cholinergic muscarinic stimulation ） のステロイド産生作用を低減すること（Hadjian et al., 1982）、および、ウシ副腎皮質細胞においてdbcAMPのステロイド産生作用を低減すること（Noguchi et al., 1990）、という過去の所見を裏づけて拡張するものである。理論的に説明されているわけではないが、これらのデータと、プロカインが細胞のステロイド基礎産生に影響しないということとを考え合わせると、プロカインは刺激物が存在するときにのみ、その調節活性を呈するという証拠となる。
【０１５７】
実験に用いた化合物のうち、MTT法によって測定された副腎細胞生存率に影響したものは無かった。対照的に、ヒト副腎細胞腫においては、dbcAMPによる処置によって、MTTにおける量が減少し、これは即ち、細胞生存率への作用か、または、ミトコンドリアのジアホラーゼの活性への、ヌクレオチド類似体の作用かのいずれかを示している。この作用はY1細胞では観察されず、また、おそらくH295R細胞では特異的である。プロカインによる処置は、ミトコンドリアの機能へのdbcAMPの作用を回復させた。
【０１５８】
プロカインの作用は、生体外に限定されない。ラットおよびマウスへの、プロカインに基づく処方による八日間の処置によって、血清中コルチコステロイド量がプラシーボに較べて 60% 減少した。したがって、糖質コルチコイド依存の機能を支持するに足るコルチコステロンが残留している。測定されたコルチコステロイド量の 50% は、通常の「ストレスのかかっていない」 （ "unstressed" ） 状況を表していると思われる。ラットが前処置されていない場合、ラットが扱われたことに起因するストレスは、コルチコステロン産生の亢進として反映され、同様に、このステロイドの血漿中濃度の増大として反映される（Kant et al., 1989）。ラットの循環コルチコステロン量について文献調査したところ、報告されている値は、範囲 4〜40ng/ml と大きな幅があることがわかった。したがって、プロカインによる生体内の処置は、「ストレスのかかっていない」副腎の基礎機能には影響しないが、ストレス起因の糖質コルチコイド量を制御して、「通常の」循環コルチコステロン量を低く保つ。プロカインは、ラットの脳溢血モデルにおいて事前に誘導されたコルチコトロピン放出因子からの放出を低減するとも記載されており（Plotsky et al., 1984）、また、イヌの外科的に誘導されたストレスのモデルにおけるACTHの放出を低減するとも記載されている（Ganong et al., 1976）。このようなプロカインの視床下部および下垂体への主要な作用は、実験で観察されたコルチコステロン濃度の減少、さらには副腎細胞への直接の作用を説明するために欠かすことはできず、コルチゾール調節剤としてのプロカインおよびその誘導体への関心は強まる。
【０１５９】
塩酸プロカインはジエチルアミノエタノールと p-アミノ安息香酸とのエステルであり、身体中で容易に加水分解されるために、類似した特性を有し、細胞毒性を持たないような安定且つ有用なプロカイン誘導体を検索した。したがって、プロカイン誘導体は化学データベースのインシリコスクリーニングによって同定され、cAMP-コルチコステロイド産生を調節する能力を検査された。これらの化合物の内では、SP010（表１）が 1μM 程度の低濃度においてプロカインと同様の効能を示し、プロカインと同様の用量／応答作用を呈して、共通する薬学的メカニズムの存在を示唆した。しかしながら、理論的に説明されているわけではないが、SP010は細胞内カルシウム濃度の調節を介してコルチゾール量を調節することができる。細胞内カルシウム濃度の増大は、ステロイド産生亢進経路 （ the steroids synthesis-stimulating pathway ） のキーポイントとなっており、プロカインは、リアノジン受容体活性拮抗により、このカルシウムの増大を調節すると記載されている（Shishan-Barmatz V. and Zchut S. (1994) J. Membr. Biol., 138 (1): 103;  Zahradnikova A. and Palade P. (1993) Biophys. J., 64 (4): 991-1003）。SP010はプロカインの誘導体であるため、SP010がカルシウム経路に同様の調節作用を与え、コルチゾール産生を調節する活性を呈すると仮定することには正当性がある。プロカイン誘導体は、細胞内カルシウム量を変化させるところのcAMP起因のリアノジン受容体 RyR2 mRNA の発現も調節することができ、その調節作用をコルチゾール産生に与えることができる。Y1副腎皮質細胞への、プロカインおよびSP010の用量反応的な作用を仔細に検討すると、SP010はプロカインおよびプロカイン誘導体と同様の効能を有しており、濃度 1 、 10 および 100iM において同様の効能を保っている。これらの化合物はいずれもステロイド基礎産生には影響せず、また細胞生存率にも影響しないということは既に示した。これらの結果からは、共通のプロカイン化学構造に基づいて同定されたSP化合物群は、視床下部-脳下垂体-副腎系の活性の増大に因る病態もしくは関連する病態、ならびにそれに因る多量のコルチゾール生成に対する薬剤の、別の候補となりえるということが示唆される。
【０１６０】
c-AMP起因の副腎ステロイド産生への、プロカインの活性のメカニズムを調査する上で、cAMP起因のPKA活性への作用を再調査した。ホルモン起因のPKA活性は、まずミトコンドリア内へのコレステロール輸送の増大を導き、その後に P-450scc の活性および発現を増大させる。dbcAMPに刺激されたY1細胞の定量からは、プロカインによる処置がこの酵素には影響しないということが明らかになった。加えて、ミトコンドリア膜を自由に通過でき、 P-450scc酵素に基質として直接乗っているコレステロール誘導体であるところの 22R-ヒドロキシコレステロールの存在下で培養された細胞のステロイド産生速度には、プロカインは影響せず（Papadopoulos et al., 1990）、これから、ステロイド産生経路に関連する P-450scc および他の酵素は、プロカインによる処置には影響されないということが示唆される。この結果は、 P-450scc酵素の量がプロカインの影響を受けないことによりさらに支持される。理論的に説明されているわけではないが、全体から鑑みれば、プロカインおよびプロカイン誘導体がステロイド産生に利用されうるコレステロールの量に影響する、ということがこれらのデータから示唆される。このような作用は、コレステロールの細胞内貯蔵からミトコンドリア内への輸送速度の変化に因るものであるか、または、コレステロール産生への作用であるかのいずれかと言える。コレステロールのミトコンドリア内への輸送を仲介するキーとなる二つの調節蛋白質であるところのPBRおよびStARの発現量に対しては、プロカインは作用をしない（Papadopoulos, 1998;  Stocco, 2000）。コレステロール産生の基質であるメバロン酸を、dbcAMPと共に培地に加えると、dbcAMPに亢進されたステロイド産生へのプロカインの阻害作用が打ち消されるという発見からは、プロカインの作用点はメバロン酸の産生よりも前のステップであるということが示唆される。
【０１６１】
メバロン酸・コレステロール生合成における律速酵素はHMG-CoA還元酵素である。プロカインの濃度を高めながら処置した細胞を、dbcAMPで刺激したところ、 14C-HMG-CoA を 14C-メバロン酸に転換することによって測定したHMG-CoA還元酵素の活性が用量依存的に減少した。最大の阻害作用効果は 10μM のプロカインの存在下で得られた。副腎細胞抽出物において測定したHMG-CoA還元酵素の活性が、プロカインの直接の作用を受けないということ、ならびにこの作用が最短で六時間の培養の後に観察されたという事実を考慮すると、プロカインはHMG-CoA還元酵素mRNAの量に対して機能すると考えられる。実際、Y1細胞をdbcAMPで処置すると、cAMPおよびホルモンがHMG-CoA還元酵素の発現を調節するという過去の発見（Ness and Chambers, 2002;  Ngo et al., 2002）に符合するようにHMG-CoA mRNAの量が増大した。プロカインは、dbcAMP起因のHMG-CoA還元酵素mRNAの発現量を用量依存的に阻害するが、HMG-CoA mRNA の基礎量には影響しない。この発見は、cAMP起因のステロイド産生へのプロカインの作用と符合する。 HMG-CoA mRNA の発現へのプロカインの作用の組織特異性を検査するために、二つの型の細胞としてUT-1細胞およびHepa1-6細胞を用いた。UT-1細胞はモンゴルキヌゲネズミ卵巣細胞（CHO-K1）のクローンであり、HMG-CoA還元酵素の競合阻害剤であるコンパクチンの存在下で生長することから選ばれた。この細胞は、通常の細胞の500倍のHMG-CoA還元酵素の活性を有し（Faust et al., 1982）、また、通常の細胞の100〜1,000倍以上の免疫沈降性HMG-CoA還元酵素蛋白質を有する（Chin et al., 1982）。Hepa1-6細胞はマウス肝細胞腫のクローンであり、肝臓はコレステロール産生の主要たる器官であるために用いた。UT-1細胞およびHepa1-6細胞の双方をdbcAMPで処置すると、 HMG-CoA mRNA の発現が誘導される。この作用はU1細胞においては小さなものであって有意ではないが、Hepa1-6細胞においてはロバストなものであり、これは、HMG-CoA還元酵素mRNAの発現および活性へのプロカインの作用の組織特異性が存在するということを示唆している。プロカインがHMG-CoA還元酵素mRNAの量を調節するという発見は新規な知見であり、また、肝臓のコレステロール産生がプロカインによって調節されうるであろうということを示唆するデータは、高コレステロール血症およびそれに関連する病気の分野におけるプロカインの新規な治療用途を導きうる興味深い発見である。cAMP起因の HMG-CoA mRNA の量の減少を介したプロカインの活性メカニズム、ならびに、カルシウム経路の調節をおそらく介したSP010の活性メカニズムは、現行のHMG-CoA還元酵素の活性の調節方法への別種のアプローチを提供する。プロカインを含む局所麻酔薬は、メバロン酸産生の先のステップにおいてステロール生合成に作用し（Bell and Hubert, 1980）、これがコレステロールエステラーゼ活性の阻害（Traynor and Kunze, 1975）およびコレステロールアシルトランスフェラーゼ活性の阻害（Bell, 1981）によるものであるという公算が大きい、ということが既に述べられている。このようなプロカインの作用効果、ならびに、メバロン酸の後のステップにおいて作用するであろうこの分子が、副腎および肝臓のHMG-CoA還元酵素に関して過去に記載されているものと同様に、組織特異性を以って別の作用をすると考えられるということを、本データは排除するものではない。
【０１６２】
コルチゾールの濃度増大は、数多の病気と関連づけられて報告されてきており、また、予後不良であるとも報告されている。上述したような病態における多量のコルチゾールの有害な作用とは対照的に、コルチゾールの基礎量を維持することは、生理的基礎機能の維持のために必要なことである。糖質コルチコイドは蛋白質・炭水化物・脂肪の代謝を調節し、また、急性身体侵襲要因に対して順応するために不可欠なものである（Munck et al, 1994）。ステロイド基礎産生に影響することなく糖質コルチコイドの過剰産生を阻害する化合物の開発は、阻害剤よりも寧ろ活性調節剤の同定が求められるために困難なものであるとされている。ここで示した、プロカイン、およびプロカインに近しい化学的類似性から選択された低分子が、律速酵素であるHMG-CoA還元酵素mRNAの量を低減して活性を低下させ、コレステロールおよびコルチコステロイドの生合成を低減することによって、ならびに／あるいは、細胞内カルシウム濃度を調節することによって、生体外または生体内の副腎細胞ホルモンに亢進されたコルチコステロイド産生を低減するという確証をここに示した。これらの化合物はコルチコステロイドの基礎産生には影響せず、これは病態的な多量の糖質コルチコイド産生のみが影響を受ける、ということを示唆している。AIDS、多発性硬化症、AD、抑鬱、Cushing症候群に係る高血圧症といった高コレステロール病の処置において、このようなコルチゾール調節剤の単独の使用、または病態特異的な治療法との併用のいずれかが有用であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】図１は、本発明に係るプロカインを含む安息香酸誘導体のいくつかと、いくつかのプロカイン誘導体の化学構造式である。
【図２Ａ】図２Ａは、Y1マウス副腎細胞腫における、dbc-AMP起因の 20α-ヒドロキシプロゲステロン産生に対する、プロカインおよびSP-10の作用効果を pg/well で示す棒グラフであって、対照群と比較している。
【図２Ｂ】図２Ｂは、dbc-AMPに誘導されたY1マウス副腎細胞腫における、プロカインおよびSP-10の細胞生存率への作用効果を示す棒グラフであって、対照群と比較している。
【図２Ｃ】図２Ｃは、Y1マウス副腎細胞腫における、dbc-AMP起因の 20α-ヒドロキシプロゲステロン産生に対する、SP014、SP016、およびSP017の作用効果を阻害率で示す棒グラフである。
【図２Ｄ】図２Ｄは、dbc-AMPに誘導されたY1マウス副腎細胞腫における、SP014、SP016、およびSP017の細胞生存率への作用効果を示す棒グラフであって、対照群と比較している。
【図３Ａ】図３Ａは、H296Rヒト副腎細胞腫におけるdbc-AMP起因のコルチゾール産生に対する、プロカインの作用効果を示す棒グラフである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、dbc-AMPに誘導されたH296Rヒト副腎細胞腫における、プロカインの細胞生存率への作用効果を示す棒グラフである。
【図４Ａ】図４Ａは、MA-10マウスライディッヒ細胞腫におけるdbc-AMP起因のプロゲステロン産生に対する、プロカインの作用効果を示す棒グラフである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、dbc-AMPに誘導されたMA-10マウスライディッヒ細胞腫における、プロカインの細胞生存率への作用効果を示す棒グラフである。
【図５】図５は、Sprague-Dawley系雄性ラットの血清中のコルチコステロン量への、プロカインに基づいた処方の作用効果を示すグラフである。
【図６】図６は、dbc-AMP起因のPKA活性の増大に対する、プロカインの作用効果を示すグラフである。
【図７Ａ】図７Ａは、ヒドロキシコレステロール起因の 20α-ヒドロキシプロゲステロン産生に対する、プロカインの作用効果を示す棒グラフである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、dbc-AMP起因の P450scc酵素の発現に対する、プロカインの作用効果を示すイムノブロットである。
【図７Ｃ】図７Ｃは、dbc-AMP起因のStARの発現に対する、プロカインの作用効果を示すイムノブロットである。
【図８Ａ】図８Ａは、Y1細胞における、dbcAMP、および、 20α-ヒドロキシプロゲステロン構造に支持されたメバロン酸への、プロカインの作用効果を示す棒グラフである。
【図８Ｂ】図８Ｂは、dbcAMPで処置したY1細胞における、HMG-CoA還元酵素の活性への、プロカインの作用効果を示す棒グラフである（ ** p<0.01  ***p<0.001, mean±SD ）。100%の活性は、 163±16 pmol/min/mg protein に対応する。
【図９Ａ】図９Ａは、dbcAMPに起因する、Q-PCR法によるHMG-CoA還元酵素mRNAの発現量への、プロカインの作用効果を示す棒グラフであって、対照Y1細胞と比較している。
【図９Ｂ】図９Ｂは、dbcAMPに起因する、Q-PCR法によるHMG-CoA還元酵素mRNAの発現量への、プロカインの作用効果を示す棒グラフであって、対照UT-1細胞と比較している。
【図９Ｃ】図９Ｃは、dbcAMPに起因する、Q-PCR法によるHMG-CoA還元酵素mRNAの発現量への、プロカインの作用効果を示す棒グラフであって、対照Hepa1-6マウス肝癌細胞と比較している。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【国際調査報告】
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