(57)【要約】本発明は、いわゆる「クロマチン応答因子」（ＣＲＥ）というゲノムＤＮＡ因子を、約５ｋｄａ未満の分子量を有し、該ＣＲＥに配列特異的に結合する能力を有する化合物と接触させる工程を含む、真核細胞におけるＤＮＡ因子の機能を調節するための方法に関するものであり、該接触工程が、該化合物によるＣＲＥのクロマチンリモデリングを可能にする条件下で行われ、ここで、該ＣＲＥのクロマチンリモデリングが、ゲノム中のいわゆる「調節されるＤＮＡ因子」という１つ以上の他のＤＮＡ要素の活性を変化させる、上記方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムＤＮＡ因子、いわゆる≪クロマチン応答因子≫（ＣＲＥ）を、およそ５ＫＤａ未満の分子量を有し、かつ該ＣＲＥと配列特異的に結合する能力を有する化合物と接触させる工程を含む、真核細胞におけるＤＮＡ因子の機能を調整する方法であって、
該接触工程が、該化合物によるＣＲＥのクロマチンリモデリングを許容する条件の下で実施され、
該ＣＲＥのクロマチンリモデリングが、ゲノムにおける１個以上の他のＤＮＡ因子、いわゆる≪調整されるＤＮＡ因子≫の活性を改変させる、方法。
【請求項２】
クロマチンリモデリングが、ＣＲＥ及び／又は他のＤＮＡ因子のエピジェネティック状態を改変させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＲＥ又は他のＤＮＡ因子が、ヘテロクロマチン、ヘテロクロマチン様ＤＮＡ、ユークロマチン、又はむき出しのＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＣＲＥが、単一コピーＤＮＡ又は多コピーＤＮＡを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＣＲＥが、同一もしくは非同一の配列モチーフ、又は機能的に相互作用する多くの部分に分かれたＤＮＡセグメントを含有している、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＣＲＥが、染色体の構造及び機能に関与しているＤＮＡ因子を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
ＣＲＥが、サテライトＤＮＡを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
他のＤＮＡ因子が、調節ＤＮＡ因子を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ＣＲＥが、局所的又は広範に、該他のＤＮＡ因子に関してシス作用性である、請求項１、２、又は３に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＲＥが、シス作用性であり、かつ該他のＤＮＡ因子内に含有されている、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
他のＤＮＡ因子が、ＣＲＥと直接連結されていないため、ＣＲＥがトランス作用性である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
調整が、以下の効果：染色体機能の回復、染色体機能の消失、染色体機能の増強、染色体機能の減少、染色体機能の抑止、遺伝子機能の時間的又は空間的な特異性の改変、及び染色体機能の維持のうちの１個以上を生じさせる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
調整が、シス又はトランスのエピジェネティック遺伝子サイレンシングの抑制により、遺伝子機能の回復を生じさせる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
調整が、染色体機能に関与しているユークロマチン結合性因子の再分布、置換、もしくは阻害により、又はそのような因子の結合を可能にすることにより、遺伝子機能の消失を生じさせる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
他のＤＮＡ因子が、該細胞に内生的である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
他のＤＮＡ因子が、該細胞に対し異種のものである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ＣＲＥが、該細胞に内生的である、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＣＲＥが、該細胞に対し異種のものである、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１９】
ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、又はｅｘ ｖｉｖｏで実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
配列特異的ＤＮＡ結合性化合物が、ＤＮＡ副溝と結合する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
配列特異的ＤＮＡ結合性化合物が、細胞透過性である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
化合物が、少なくとも５×１０７Ｍ−１の見かけの結合親和性を有する、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
化合物が、少なくとも１×１０９Ｍ−１の見かけの結合親和性を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
化合物が、少なくとも５×１０１０Ｍ−１の見かけの結合親和性を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
配列特異的ＤＮＡ結合性化合物が、少なくとも６ヌクレオチドの配列を特異的に認識する能力を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
該化合物が、有機複素環を含むオリゴマーである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
該複素環が、環状の窒素、酸素、又は硫黄を少なくとも１つ有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
該オリゴマーが、環ＮＨ基が置換されている、ピロール、イミダゾール、トリアゾール、ピラゾール、フラン、チアゾール、チオフェン、オキサゾール、ピリジン、又はこれらの化合物のうちのいずれかの誘導体より選択される複素環を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
複素環式オリゴマーが、Ｎ−メチルピロール（Ｐｙ）及び／又はＮ−メチルイミダゾール（Ｉｍ）を含有している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
複素環式オリゴマーが、β−アラニン及びγ−アミノ酪酸のような脂肪族アミノ酸をさらに含有している、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
−該細胞を、該異種遺伝子を含む核酸配列と、いわゆる異種≪クロマチン応答因子≫（ＣＲＥ）を含む核酸配列とで形質転換する工程、
−該異種ＣＲＥと配列特異的に結合する能力を有する化合物を該細胞へ導入する工程を含む、細胞における異種遺伝子のエピジェネティック状態を調整する方法であって、
該接触工程が、該化合物による異種ＣＲＥのクロマチンリモデリングを許容する条件の下で実施され、
該ＣＲＥのクロマチンリモデリングが、異種遺伝子のエピジェネティック状態を調整する、方法。
【請求項３２】
異種ＣＲＥが、シス又はトランスで染色体機能の調整を可能にするクロマチン状態を有する配列を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
細胞が、真核細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
細胞が、原核細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
細胞が、脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞又は植物細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞、又は酵母細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
異種ＣＲＥが、ＳＡＲ様配列を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
異種ＣＲＥが、ＧＡＧＡＡリピート配列を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
細胞における異種遺伝子のエピジェネティック状態の調整に適した遺伝子発現キットであって、
−該異種遺伝子を含む核酸分子；
−シス又はトランスで染色体機能の調整を可能にするクロマチン状態を有する配列である、いわゆる異種≪ＣＲＥ≫を含む核酸分子；
−およそ５ＫＤａ未満の分子量を有し、かつ該ＣＲＥと配列特異的に結合する能力を有する化合物、を含むキット。
【請求項４０】
異種ＣＲＥが、ＳＡＲ様ＡＴトラクトを含む、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
異種ＣＲＥが、ＧＡＧＡＡリピート配列を含む、請求項３９に記載のキット。
【請求項４２】
遺伝子治療において使用するための、請求項３９に記載のキット。
【請求項４３】
およそ５ＫＤａ未満の分子量を有し、かつシス又はトランスで染色体機能の調整を可能にするクロマチン状態を有する配列であるゲノムＣＲＥと配列特異的に結合する能力を有する化合物を含有している細胞。
【請求項４４】
該化合物が、ＤＮＡ副溝と特異的に結合するものである、請求項４３に記載の細胞。
【請求項４５】
−異種遺伝子を含む核酸分子；
−シス又はトランスの染色体機能の調整を可能にするクロマチン状態を有する配列である、いわゆる異種≪ＣＲＥ≫を含む核酸分子、を付加的に含有している、請求項４３又は４４に記載の細胞。
【請求項４６】
真核細胞である、請求項４３に記載の細胞。
【請求項４７】
請求項４３に記載の細胞を含む、非ヒト生物。
【請求項４８】
非ヒト動物である、請求項４７に記載の生物。
【請求項４９】
トランスジェニック非ヒト動物である、請求項４８に記載の生物。
【請求項５０】
植物である、請求項４７に記載の生物。
【請求項５１】
トランスジェニック植物である、請求項５０に記載の生物。
【請求項５２】
シス又はトランスの染色体機能の調整を可能にするクロマチン状態を有する配列である予定されたＣＲＥと配列特異的に結合する能力を有する化合物であって、ジスタマイシン、ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ、又はＭＡＴＨ２０ではない化合物。
【請求項５３】
５ＫＤａ未満の分子量を有し、かつシス又はトランスの染色体機能の調整を可能にするクロマチン状態を有する配列である予定されたＣＲＥと配列特異的に結合する能力を有する化合物であって、少なくとも６ヌクレオチドの配列を特異的に認識する能力を有する化合物。
【請求項５４】
少なくとも８ヌクレオチドの配列を特異的に認識する能力を有する、請求項５３に記載の化合物。
【請求項５５】
生理学的に許容される賦形剤と配合された、シス又はトランスの染色体機能の調整を可能にするクロマチン状態を有する配列である予定されたＣＲＥと配列特異的に結合する能力を有する化合物（但し、該化合物はジスタマイシン、ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ、又はＭＡＴＨ２０ではない）を含む医薬組成物。
【請求項５６】
生理学的に許容される賦形剤と配合された、５ＫＤａ未満の分子量を有し、かつシス又はトランスで染色体機能の調整を可能にするクロマチン状態を有するＤＮＡ配列である少なくとも６ヌクレオチドを有する予定されたＣＲＥと配列特異的に結合する能力を有する化合物を含む医薬組成物。
【請求項５７】
−異種遺伝子を含む核酸分子；
−生理学的に許容される賦形剤と配合された、シス又はトランスで染色体機能の調整を可能にするクロマチン状態を有する配列である、いわゆる異種≪ＣＲＥ≫を含む核酸分子、を含有する第一の医薬組成物、及び
生理学的に許容される賦形剤と配合された、該ＣＲＥと配列特異的に結合する能力を有する化合物を含む第二の医薬組成物を含む、医薬組成物の複合物。
【請求項５８】
第二の医薬組成物の中のＣＲＥ結合性化合物が、５ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項５７に記載の医薬組成物の複合物。
【請求項５９】
治療における使用のための、シス又はトランスで染色体機能の調整を可能にするクロマチン状態を有するＤＮＡ配列である少なくとも６ヌクレオチドを有する予定されたＣＲＥと配列特異的に結合する能力を有する化合物（但し、該化合物はジスタマイシン、ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ、又はＭＡＴＨ２０ではない）を含む、組成物。
【請求項６０】
治療における使用のための、５ｋＤａ未満の分子量を有し、かつシス又はトランスで遺伝子機能の調整を可能にするクロマチン状態を有するＤＮＡ配列である少なくとも６ヌクレオチドを有する予定されたＣＲＥと配列特異的に結合する能力を有する化合物を含む組成物。
【請求項６１】
治療における使用のための、請求項５７又は５８に記載の組成物の複合物。
【請求項６２】
エピジェネティック状態に起因する遺伝学的障害の治療における使用のための、請求項５７又は５８に記載の組成物の複合物。
【請求項６３】
エピジェネティック状態から発生する遺伝学的障害の処置のための医薬品の調製における、請求項５２〜５４のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項６４】
エピジェネティック状態から発生する遺伝学的障害の処置のための医薬品の調製における、請求項４７に記載の組成物の複合物の使用。
【請求項６５】
障害が、ぜい弱Ｘ症候群、プラーダー−ヴィリ（Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ）症候群、又はウィルムス腫である、請求項６３又は６４に記載の使用。
【請求項６６】
真核細胞における異種遺伝子の発現の非治療的な調整のための、請求項３９に記載のキットの使用。
【請求項６７】
調整が、培養真核細胞において実施される、請求項６６に記載の使用。
【請求項６８】
調整が、トランスジェニック動物又はトランスジェニック植物において実施される、請求項６６に記載の使用。
【請求項６９】
蛍光性であるか又は蛍光標識されている、請求項５２〜５４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７０】
蛍光性であるか又は蛍光標識されている、環状窒素を少なくとも１つ有する環式複素環を含み、場合により脂肪族アミノ酸残基を少なくとも１個含むオリゴマーである、ゲノムＤＮＡと配列特異的に結合することができるＤＮＡ結合性化合物。
【請求項７１】
蛍光標識が、フルオレセイン染料、ダンシル染料、テキサスレッド染料、イソスルファンブルー染料、エチルレッド染料、マラカイトグリーン染料、ローダミン染料、及びシアニン染料のような蛍光染料である、請求項６９又は７０に記載の化合物。
【請求項７２】
染色体及び核におけるＤＮＡのエピジェネティック状態及び位置を探索するための、請求項６９に記載の化合物の使用。
【請求項７３】
エピジェネティック状態から発生する病理学的状態の診断のための、請求項７０に記載の使用。
【請求項７４】
エピジェネティック状態から発生する病理学的状態の症状前（ｐｒｅ−ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ）診断のための、請求項７３に記載の使用。
【請求項７５】
診断、法医学的研究、起源決定（ａｆｆｉｌｉａｔｉｏｎ）研究、又は動物管理における染色体の可視化及びマーキングのための、請求項７０又は７１に記載の化合物の使用。
【請求項７６】
ゲノム内のＣＲＥを同定する方法であって、
−調整される機能を有するＤＮＡ因子を含有するゲノムＤＮＡを、調整されるＤＮＡ因子の上流、下流、又は内部に位置するＤＮＡ因子と配列特異的に結合する能力を有する一連の化合物と接触させること、
−例えばヌクレアーゼのようなクロマチンプローブを使用して、調整されるＤＮＡ因子のエピジェネティック状態を調整することができる化合物を選択すること、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、配列特異的クロマチンリモデリング物質を使用した染色体機能の調整のための方法に関する。本発明は、ゲノム内のクロマチン応答因子を特異的に標的とするクロマチンリモデリング物質、及び細胞における内在性遺伝子及び異種遺伝子の機能の調整におけるそれらの使用にも関する。本発明は、さらに、蛍光性クロマチンリモデリング物質、並びに核内のＤＮＡのエピジェネティック状態及び位置の探索におけるそれらの使用、並びに細胞及び染色体材料の中の特異的ＤＮＡ配列の量推定を含む細胞学的／構造的決定のためのそれらの使用に関する。
【０００２】
真核細胞において、ＤＮＡは、まずクロマチン繊維へと折り畳まれ、次いでいくつかの階層的な組織化レベルによって染色体へと折り畳まれる。この組織化は、異なる染色体機能を助長するため、細胞周期中、動的に変化する。これらの染色体の構造レベルは、進化的に保存されたヒストン、様々な非ヒストンタンパク質、及びオリゴヌクレオチドタンパク質複合体によって引き起こされる。ＤＮＡとこれらの成分との間で形成された複合体はクロマチンと呼ばれる。
【０００３】
一次クロマチン構造は、ＤＮＡが個々のヒストンの周囲に巻き付けられた際に作出される≪ビーズオンアストリング（ｂｅａｄｓ ｏｎ ａ ｓｔｒｉｎｇ）≫構造と見なされ得る。ここで、クロマチンは、細い繊維によって接続された球状粒子の外見を有する。これらのビーズ構造の各々は、ヌクレオソームとして知られ、およそ２００塩基対のＤＮＡと会合している。ヌクレオソーム≪ビーズ≫又は≪コア粒子≫は、各２個のヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４（ヒストンオクタマー）の周囲に緊密に巻き付けられた１４６塩基対の高度に保護されたＤＮＡセグメントを含む。１４６塩基対のストレッチは、円盤形のヒストンオクタマーの周囲をほぼ完全に２回転している。残りのＤＮＡは、隣接ヌクレオソーム間のリンカーを提供する。一個のヒストンＨ１分子が、各ヌクレオソームと会合し、ヒストンオクタマーの周囲のＤＮＡの２回転に≪封をする≫よう機能している。
【０００４】
高次クロマチン構造は、クロマチンが、１回転当たり６個のヌクレオソームを含有している≪ソレノイド≫型構造へと屈曲することによりコンパクト化されていると推察されている、３００オングストロームのフィラメントへの、ヌクレオソームのさらなる集合を含む。間期核においては、大部分のクロマチンがこの型で存在する。染色体の異なる領域における折り畳みの程度の差、即ちクロマチン構造の差は、特定の遺伝子が特定の細胞において活性を有するか否かの決定において重要な役割を果たす。実際、クロマチン状態は、ＤＮＡ結合性因子がＤＮＡへと接近しうるか否かを決定するため、遺伝子制御における主要な上流段階のうちの一つである。従って、クロマチン状態は、遺伝子発現のエピジェネティックな調節における重要な因子である。
【０００５】
クロマチン繊維は、転写的に活性な（コンピテント）ドメインと、不活性なドメインへと分割されると考えられている。実験的には、これらのドメインは、ＤＮａｓｅ　Ｉ、制限酵素のような酵素による消化、又はトポイソメラーゼＩＩによる分解に対するそれらの異なる感受性によって明らかとされる。活性クロマチンドメイン（オープンなドメインとも呼ばれる）は、一般的に、不活性な（接近可能性がより低い）ドメインより、これらの酵素による消化に対する感受性が高い（接近可能性が高い）。球状形態学的レベルにおいては、光学顕微鏡検によって、クロマチン組織化の二極の構造的（エピジェネティック）状態を核内に観察することが可能である。一方はヘテロクロマチンと呼ばれ、もう一方はユークロマチンと呼ばれている。ヘテロクロマチンは、一般に、転写的に不活性な（構造的にコンパクトな）クロマチンを反映しており、ユークロマチンは、一般に、転写的に活性な（コンピテントな）よりオープンなクロマチンに富む。
【０００６】
クロマチン繊維への核因子の接近可能性を増加させることにより染色体機能を助長するクロマチン構造の変化（クロマチンリモデリング）を媒介する活性が、多数記載されつつある。高分子量ＡＴＰａｓｅ依存性活性には、高度に保存された２ＭＤａ多サブユニット集合体であるＳＷＩ／ＳＮＦのような複合体が含まれる。そのような複合体によって引き起こされる改変には、ヒストン上のＤＮＡコンフォメーションの変化、ヒストンコンフォメーションの改変、及びヒストン／ＤＮＡ相互作用の変化が含まれる（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ Ｃ．， ａｎｄ Ｗｏｒｋｍａｎ Ｊ．， Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ２０００， １０：１８７− １９２）。
【０００７】
クロマチンリモデリングは、遺伝子活性化を生じさせるのみならず、遺伝子サイレンシングをもたらす場合もある。これは、内在性ＤＮＡ因子及び異種ＤＮＡ因子の両方に影響する。クロマチンにより媒介される遺伝子サイレンシングに関与している正確な機序は未だ不明であるが、サイレンシング因子（酵素を含む）の結合の助長、又はヘテロクロマチン様状態及び／もしくは化学的改変の伝播を含みうる。挿入された遺伝子が、そのようなクロマチン状態の内部又は近傍に並置された場合、遺伝子サイレンシングが起こりうる。さらに、異種遺伝子の複数コピーの組み込みは、繰り返された配列間の相互作用を生じさせ、次にそれが不活性な遺伝子状態の形成を誘発しうる。実際、リピートにより誘導されたメチル化は、クロマチン改変をもたらしうる。
【０００８】
現在のところ、クロマチンリモデリングに関与しているシス作用性ＤＮＡ因子は、明らかには同定されておらず、それらの作用機序も解明されていない。
【０００９】
候補因子は、多数のクラスターをなしている不規則な間隔で位置するＡ及びＴのラン（Ａトラクトとも呼ばれる）から構成された数百塩基対長の極めてＡＴリッチな断片である≪足場付着領域≫（ＳＡＲ）である。これらのＤＮＡ配列は、核足場と特異的に会合し、おそらくはクロマチンループの基部を画定している。直接的な立証は得られておらず、ＳＡＲ機能と核組織化との間の正確な関係は未解明であるが、高次クロマチン構造及び遺伝子発現におけるＳＡＲの可能性のある関与は、多くの著者によって示唆されている。
【００１０】
幼虫の眼成虫原基において特異的に発現しているＭＡＴＨ２０と呼ばれる高親和性高分子量ＳＡＲ結合タンパク質（Ｇｉｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８）を使用して、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）において得られたデータ。ＭＡＴＨ２０は、逆位の結果としてＸ染色体のヘテロクロマチンの近傍に並置されたｗｈｉｔｅ遺伝子のサイレンシングにより顕在化する斑入り位置効果（ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｖａｒｉｅｇａｔｉｏｎ）（ＰＥＶ）表現型を抑制することが見出された。一つの現在のモデルに基づき、著者らは、ＭＡＴＨ２０が、サテライトＩＩＩリピートの形態の、巨大なおよそ１１Ｍｂの反復ＳＡＲと結合し、それによりヘテロクロマチンの形成及び並置されたユークロマチン領域への伝達を担うコンパクト化（ｃｏｍｐａｃｔｉｎｇ）タンパク質の相互作用を妨害するのだと想像した。この仮説によれば、ＭＡＴＨ２０の結合は、周囲のユークロマチン領域への重合タンパク質の伝播を活発に妨げ、従ってｗｈｉｔｅ遺伝子の活性を回復させるであろう。
【００１１】
他に、ＳＡＲ機能が、ねじりストレスの下で容易に巻き戻される配列により媒介される、という相互に排他的ではないモデルも提唱されている（Ｂｏｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９２ ２５５， １９５−１９７）。
【００１２】
従って、クロマチンリモデリングに関与しているシスＤＮＡ因子の性質、及びそれらの作用機序は、現在のところ、明瞭には同定されていない。従って、遺伝子機能、より一般には染色体機能のエピジェネティックな調節の手段としてのクロマチンリモデリングの使用は、可能とはなっていない。
【００１３】
クロマチンリモデリングに関与しているＤＮＡ配列モチーフの存在及び素性を確立することが、本発明の目的である。
【００１４】
これらの因子のクロマチン状態が特異的にリモデリングされ、その結果として、シス又はトランスの染色体機能の特異的制御が達成されうる手段を同定することも、本発明の目的である。
【００１５】
染色体機能を特異的に制御するために、これらの因子と特異的に相互作用し、クロマチンリモデリングを引き起こす化学的化合物を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００１６】
クロマチン応答因子（ＣＲＥ）と結合する小さいＤＮＡ特異的配列が、モデリングを媒介しうることを確立することも、本発明の目的である。
【００１７】
本発明の目的は、ゲノム内のクロマチン応答因子（ＣＲＥ）の、本発明者らによる同定によって果たされた。本発明者らは、ＣＲＥと配列特異的に結合することができる分子が、クロマチンリモデリングを誘発し、それにより予定された（１個以上の）ゲノムセグメントにおける遺伝子機能を直接的又は間接的に制御することも証明した。
【００１８】
特に、本発明は、ゲノムＤＮＡ因子、いわゆる≪クロマチン応答因子≫（ＣＲＥ）を、該ＣＲＥと配列特異的に結合する能力を有し、好ましくはおよそ５ＫＤａ未満の分子量を有する化合物と接触させる工程を含む、真核細胞におけるＤＮＡ因子の機能を調整する方法〔該接触工程は、該化合物によるＣＲＥのクロマチンリモデリングを許容する条件の下で実施され、該ＣＲＥのクロマチンリモデリングは、ゲノムにおける１個以上の他のＤＮＡ配列の活性を改変させる〕に関する。
【００１９】
従って、本発明者らは、染色体機能が、他のゲノム配列の活性に影響するクロマチン状態を有するＣＲＥと名付けられたＤＮＡ配列によって、シス及びトランスに制御されることを示した。本発明者らは、配列特異的化合物のＣＲＥとの結合が、ＣＲＥのクロマチンリモデリングを引き起こし、それにより制御作用を誘発することも示した。その結果として、ＣＲＥを結合性化合物と接触させることにより、染色体機能が制御されうる。
【００２０】
本発明に関して、クロマチン応答因子（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＣＲＥ）という用語は、シス又はトランスの染色体機能の調整を可能にするクロマチン状態を有するＤＮＡ配列をさす。ＤＮＡ結合性分子によって引き起こされたＣＲＥのクロマチンのリモデリングは、ＣＲＥとは異なる、又はＣＲＥを含む（１個以上の）染色体セグメントの機能の変化を引き起こす。
【００２１】
本発明に関して、≪クロマチンリモデリング≫とは、ヒストンオクタマー上のＤＮＡの回転位相の改変、又はＤＮＡ結合タンパク質へのＤＮＡの改変された接近可能性のような、ヒストンに関するＤＮＡコンフォメーションの変化を含む、任意のクロマチンの変化をさす。ヒストンコンフォメーションは、例えばヒストンオクタマーの成分、ヒストンＨ１、又は非ヒストンタンパク質の再編成又は撤去によっても改変されうる。ＤＮＡ／ヒストン相互作用の変化は、例えば、ヌクレオソーム１個当たりの全ＤＮＡ長の改変により、ヌクレオソーム安定性の減少もしくは増加により、又はシスもしくはトランスのヌクレオソーム可動性の改変により、なされうる。
【００２２】
ＣＲＥのエピジェネティック状態は、クロマチンリモデリングの結果として改変される。ＤＮＡ因子のエピジェネティック状態とは、その配列以外の特徴から発生する因子の情報内容と見なされうる。
【００２３】
ＣＲＥのクロマチンリモデリングにより、シス又はトランスに改変される機能を有する（１個以上の）ＤＮＡ因子は、本明細書において≪調整されるＤＮＡ因子≫と呼ばれるであろう。この因子は、ＤＮＡ及び関連タンパク質である。それは、ＣＲＥの変化の結果として、メチル化のような化学的改変を含むエピジェネティックな改変も受けるかもしれず、例えばＣＲＥのクロマチン状態の変化は、調整されるＤＮＡ因子のクロマチン状態の変化を生じさせ、従ってその機能を改変するかもしれない。しかしながら、このＤＮＡ因子の機能の調整は、ＣＲＥのクロマチンリモデリングにより最初に引き起こされた結合性因子の再分布、置換、阻害、増強のような他の型の変化から最終的に発生するかもしれない。
【００２４】
ＣＲＥ又は（１個以上の）調整されるＤＮＡ因子は、ヘテロクロマチン、ヘテロクロマチン様ＤＮＡ、ユークロマチン、又は裸のＤＮＡを含みうる。好ましい実施態様によると、ＣＲＥはヘテロクロマチン又はヘテロクロマチン様ＤＮＡであり、そのリモデリングはそれをユークロマチン様の接近可能な状態へと変換する。
【００２５】
ＣＲＥは、単一コピーＤＮＡ又は多コピーＤＮＡを含むことができ、それは、同一もしくは非同一の配列モチーフ、又は機能的に相互作用する多成分ＤＮＡセグメントを含有していてもよい。特に好ましいＣＲＥは、サテライトＤＮＡのようなリピート配列、例えば、一連のＧＡＧＡＡリピートを含む。ＣＲＥは、多数のクラスターをなしている不規則な間隔で位置するＡ及びＴのランから構成されたＡＴリッチな断片である足場付着領域（ＳＡＲ）のような、染色体の構造及び機能に関与しているＤＮＡ因子を含みうる。又は、ＣＲＥは、巻き戻しモチーフ、非Ｂ型ＤＮＡ構造（ねじれもしくは屈曲を含有している）、又はヌクレオソームの位置を決定する性向を有するＤＮＡ因子を含みうる。
【００２６】
ＣＲＥは、常にではないが、通常、転写的に不活性な非コーディング配列である。ＣＲＥは、約６〜数千塩基対の範囲の長さを有しうる。後者の場合、ＣＲＥの一部のみが、配列特異的ＤＮＡ結合性分子によって標的とされる。ＣＲＥがリピート配列を包含する場合には、複数の結合性分子がＣＲＥ内に結合するであろう。
【００２７】
調整されるＤＮＡ因子は、ＣＲＥと同じＤＮＡ分子上に存在してもよく、この場合、ＣＲＥはシス作用性であると言われる。調整効果は、ＣＲＥによって、局所的に（即ち、数十塩基対にわたり）発揮されてもよいし、又は広範に（即ち、約１００〜数千塩基対にわたり）発揮されてもよく、実際、染色体全体に及ぶ場合もある。従って、調整されるＤＮＡ因子は、ＣＲＥと直接隣接して位置していてもよいし、又は数十個、数百個、もしくは数千個の塩基対によってＣＲＥから隔離されていてもよい。そのような状況の一例は、異種遺伝子が、ヘテロクロマチン性サテライト領域と並列にゲノムへ組み込まれたような場合である。本発明のこの実施態様は、ｗｈｉｔｅ ｍｏｔｔｌｅｄ ＰＥＶ表現型実験により、下記実施例において例示される。
【００２８】
ＣＲＥ及び調整されるＤＮＡ因子は、一致していてもよい。この場合、ＣＲＥのクロマチンリモデリングは、ＣＲＥ含有ＤＮＡ因子の機能に対する直接的な効果を生じさせる。
【００２９】
本発明のさらなる実施態様によると、ＣＲＥは、調整されるＤＮＡ因子がＣＲＥと同一のＤＮＡ分子上に存在しないため、又はＣＲＥと直接的には連結されていないため、トランス作用性であってもよい。トランス作用性ＣＲＥのクロマチンリモデリングにより発揮される調整効果は、遺伝子機能に影響するＤＮＡ結合性因子の置換、再分布、阻害、又は増強の結果として発生しうる。本発明のこの実施態様は、ｂｒｏｗｎ−ｄｏｍｉｎａｎｔ ＰＥＶ表現型実験により、下記実施例において例示される。
【００３０】
本発明によると、ＣＲＥによって調整される機能を有するＤＮＡ因子（即ち、≪調整されるＤＮＡ因子≫）は、任意の潜在的に活性又は不活性なＤＮＡ因子であり得る。特に好ましいＤＮＡ因子には、ＤＮＡ結合性タンパク質の結合に関与している領域、例えば転写制御領域、遺伝子座調節領域、複製開始点、境界（ｂｏｕｎｄａｒｙ）／遮断（ｉｎｓｕｌａｔｉｏｎ）因子、染色体構造因子が含まれる。
【００３１】
調整前の、調整されるＤＮＡ因子のクロマチン状態は、ヘテロクロマチン性、ヘテロクロマチン様、又はユークロマチン性であり得る。それは、裸のＤＮＡであってもよい。ＣＲＥのクロマチンリモデリングにより媒介された調整の後、調整されるＤＮＡ因子のクロマチン状態は、調整前の状態から変化していてもよいし、又は変化していなくてもよい。しばしば、調整は、ヘテロクロマチン様状態からユークロマチン様状態への、調整されるＤＮＡ因子の変換を含む。
【００３２】
特定のＤＮＡ又は一連のＤＮＡセグメントに対し発揮される限りにおいて、そのＣＲＥの調整効果は特異的である。問題とするＣＲＥに依って、一個の特有のＤＮＡが調整される場合もあるし、又は反対に、複数のＤＮＡセグメントが影響される場合もある。さらに、調整されるＤＮＡに対して発揮された効果は、それ自体、さらなるシス又はトランスの調整効果のカスケードを生じさせるかもしれない。従って、本発明を使用して達成されうる効果のスペクトルは広く、ＣＲＥ及びＣＲＥ結合性分子の選択によって調節されうる。好ましいＣＲＥは、そのゲノムに特有のものである。
【００３３】
ＣＲＥのクロマチンリモデリングにより誘導された調整は、以下の効果：染色体機能の回復、染色体機能の消失、染色体機能の増強、染色体機能の減少、染色体機能の抑止、遺伝子機能の時間的又は空間的な特異性の改変、及び染色体機能の維持のうちの一つ以上を含みうる。特に好ましい効果は、例えばシス又はトランスのエピジェネティック遺伝子サイレンシングの抑制による、遺伝子機能の回復を含む。発明のこの変形実施態様は、異種遺伝子の機能の保証のために特に適用可能であるが、エピジェネティックサイレンシングを受けている内在性遺伝子を活性化するための治療においても使用されうる。
【００３４】
もう一つの好ましい実施態様は、染色体機能に関与しているユークロマチン結合性因子の再分布、置換、もしくは阻害による、又はそのような因子の結合を可能にすることによる、遺伝子機能の消失である。
【００３５】
本発明によると、ＣＲＥ及び（１個以上の）調整されるＤＮＡは、いずれも、細胞に内在するものでありうる。そのような状況においては、本発明に係る染色体機能調整法は、単に、配列特異的ＣＲＥ結合性化合物の細胞への導入を含む。本発明のこの変形実施態様は、染色体再編成の結果として、又は例えば組織特異性及び発達段階特異性の結果としてエピジェネティックサイレンシングを受けている内在性遺伝子の活性化に特に適用可能である。それは、本来は活性である内在性遺伝子の機能の消失を誘導するためにも使用されうる。
【００３６】
もう一つの変形実施態様において、細胞に内在するＣＲＥが、細胞に対し異種の調整されるＤＮＡと組み合わされて使用される。この変形実施態様によると、内在性ＣＲＥが調整効果を発揮することができる染色体位置への組み込みを可能にする条件の下で、調整される異種ＤＮＡが細胞へと導入される。本発明のＣＲＥは、短距離もしくは長距離にわたりシスで効果を発揮するよう選択されうるし、又はトランスで効果を発揮するよう選択されてもよいため、内在性ＣＲＥと異種の調整されるＤＮＡとの間の機能的相互作用を達成することは、過度の努力なしに可能である。この変形実施態様によると、配列特異的ＣＲＥ結合性化合物は、着目している特定の異種ＤＮＡと機能的に相互作用する能力を有するＣＲＥと結合するよう選択される。
【００３７】
さらなる変形実施態様は、内在性の調整されるＤＮＡと併せた、異種ＣＲＥの使用を含む。本発明のこの変形実施態様は、問題の内在性遺伝子に対する調整効果を発揮することができる染色体位置への組み込みを可能にする条件の下で、細胞へ異種ＣＲＥを導入することを含む。ＣＲＥ結合性化合物も導入されなければならない。この場合にも、本発明のＣＲＥは、短距離もしくは長距離にわたりシスで効果を発揮するよう選択されうるし、又はトランスで効果を発揮するよう選択されてもよいという事実が、異種ＣＲＥと内在性の調整されるＤＮＡとの間の機能的相互作用が、過度の努力なしに、達成されることを可能にする。発明のこの変形実施態様は、例えば、含まれる配列の性質の結果として、又は染色体上の位置付けの結果として、内在性ＣＲＥによって十分に制御され得ない染色体配列の活性を調整するために使用されうる。
【００３８】
さらなる変形実施態様は、異種の調整されるＤＮＡと併せた、異種ＣＲＥの使用を含む。本発明のこの変形実施態様は、例えばエピジェネティック遺伝子サイレンシングを抑止又は減少させるための、異種遺伝子のエピジェネティック状態の改変に特に有用である。本発明のこの変形実施態様による方法は、
−細胞を、異種遺伝子を含む核酸配列と、いわゆる異種ＣＲＥを含む核酸配列とで、好ましくは安定的に、形質転換する工程、
−該異種ＣＲＥと配列特異的に結合する能力を有する化合物を細胞へ導入する工程を含む〔該接触工程は、該化合物による異種ＣＲＥのクロマチンリモデリングを許容する条件の下で実施され、
該ＣＲＥのクロマチンリモデリングは、異種遺伝子のエピジェネティック状態を調整する〕。
【００３９】
この変形実施態様によると、異種ＣＲＥ及び調整される異種遺伝子は、同一又は別個のＤＮＡ分子上に存在して細胞へ導入されることができ、それらは、同時又は連続的に導入されうる。さらに、配列特異的結合性化合物の導入は、着目している異種配列を保持する核酸の導入の前に、それと同時に、又はその後に実施されうる。好ましい実施態様においては、ＣＲＥ及び異種遺伝子が、同一ＤＮＡ分子上に存在して細胞へ導入され、続いて、安定的な形質転換が確立された時点で、ＣＲＥ結合性分子が導入される。
【００４０】
この実施態様の場合にも、異種ＣＲＥは、シス又はトランスで異種遺伝子に対し作用しうる。
【００４１】
本発明のこの変形実施態様の好ましい例は、増殖因子、ホルモン、受容体タンパク質、ウイルスタンパク質、制御性ＲＮＡ、癌抑制遺伝子、ヘモグロビン遺伝子、免疫応答に関与している遺伝子、治療用タンパク質因子をコードする異種遺伝子と併せた、ＣＲＥとしてのサテライト配列の使用を含む。
【００４２】
本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、又はｅｘ ｖｉｖｏで実施されうる。ｉｎ ｖｉｖｏ使用が、特に好ましい。ｅｘ ｖｉｖｏ使用の場合には、細胞が、生物から採取され、異種ＣＲＥもしくは異種の調整される遺伝子のいずれか、又は両方を含有するよう遺伝学的に改変され、そして体内へ再移植される。配列特異的ＣＲＥ結合性分子が、経口接種、注入、局所適用等のような任意の適当な方法によって、改変された細胞へ導入される。
【００４３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ使用の場合、本発明の３つの必須成分、即ちＣＲＥ、調整される機能を有するＤＮＡ、及びＣＲＥ結合性化合物が、化合物のＣＲＥとの結合を可能にする条件の下でｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせられる。
【００４４】
本発明によると、クロマチンリモデリングにより媒介される調整が達成される細胞は、真核細胞又は原核細胞であり得る。真核生物が、特に好ましい。適当な例は、脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞、特に哺乳動物細胞、昆虫細胞、又は酵母細胞である。ヒト細胞が使用されてもよい。異種タンパク質の作製において、又は動物モデルにおいて有用な動物種に由来する細胞、例えばウシ細胞、ヒツジ細胞、トリ細胞、サカナ細胞、ウマ細胞、サル細胞等は、全て適当である。植物細胞も特に好ましい。実際、植物に挿入された異種遺伝子は、遺伝子サイレンシングを特に受けやすく、従って本発明の技術が有利である。
【００４５】
本発明の好ましいＣＲＥは、サテライト配列である。しかしながら、本発明は、そのような配列に限定されない。さらなるＣＲＥは、本発明の教示を使用して同定されうる。特に、調整されるＤＮＡ因子の近傍に特異的に結合する一連の化合物が使用され、エピジェネティック状態に影響する、例えば因子の相互作用を助長する、任意の（１個以上の）化合物が選択される。クロマチン構造、例えばヌクレオソーム及びＤＮＡ結合性因子（例えば、転写因子）の位置に関する知識は、候補ＣＲＥモチーフを選択するのに有用である。まず、該調整されるＤＮＡ因子のエピジェネティック状態、及び化合物によるその改変が、ヌクレアーゼのようなクロマチンプローブの助けを借りてｉｎ ｖｉｔｒｏでモニタリングされる。これは、迅速に、所望の特性を有する化合物を同定する。続いて、表現型の変化を評価するため、ｉｎ ｖｉｖｏ実験が実施される。
【００４６】
配列特異的ＣＲＥ結合性化合物は、主溝相互作用、副溝相互作用、リン酸骨格相互作用、又はこれらの結合型の組み合わせによって、ＣＲＥと結合しうる。本発明の特に好ましい実施態様によると、配列特異的化合物は、ＤＮＡ副溝と結合する。
【００４７】
化合物は、好ましくは５ＫＤａ未満、例えば４．５ｋＤＡ未満、又は４ｋＤａ未満の分子量を有する。
【００４８】
配列特異的ＣＲＥ結合性化合物は、好ましくは、細胞へのその導入を大きく助長する細胞透過性を有する。従って、治療目的のためのヒトへの投与を含む動物への投与のため、分子は、経口、局所、又は注入等により投与されうる。
【００４９】
本発明に関して、結合が起こる細胞又は生物が、結合の結果として、容認されない副作用又は毒性を示さない場合、その分子は、配列特異的にＣＲＥ標的と結合すると言われる。容認されない副作用又は毒性とは、生命に危険があること、又は代謝及び生物学的機能の望ましくない妨害を引き起こすのに十分な重大性を有することを意味する。好ましくは、配列特異的に結合する分子は、クロマチン環境において、少なくとも６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも１８ヌクレオチドのＤＮＡ標的配列を特異的に認識することができる。
【００５０】
本発明のＣＲＥ結合性化合物は、好ましくは、フットプリンティング技術のようなｉｎ ｖｉｔｒｏの技術によって測定される、少なくとも５×１０７Ｍ−１というＣＲＥに対する見かけの結合親和性を有する。より好ましくは、化合物は、少なくとも１×１０９Ｍ−１、さらに好ましくは少なくとも５×１０１０Ｍ−１という見かけの結合親和性を有する。
【００５１】
本発明のＣＲＥ結合性化合物の特に好ましい例は、複素環を含むＤＮＡ結合性有機オリゴマー、例えば複素環が環状の窒素、酸素、又は硫黄を少なくとも１個有しているようなものである。
【００５２】
そのようなオリゴマーの例は、環ＮＨ基が置換されている、ピロール、イミダゾール、トリアゾール、ピラゾール、フラン、チアゾール、チオフェン、オキサゾール、ピリジン、又はこれらの化合物のうちのいずれかの誘導体より選択される複素環を含む。そのような化合物は、Ｂａｉｌｌｙ Ｃ．， ａｎｄ Ｃｈａｉｒｅｓ Ｊ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ， Ｖｏｌ９ Ｎ°５， １９９８， ５１３−５３８に記載されている。
【００５３】
特に好ましい化合物は、Ｎ−メチルピロール（Ｐｙ）及び／又はＮ−メチルイミダゾール（Ｉｍ）を含有しており、β−アラニン及びγ−アミノ酪酸のような脂肪族アミノ酸をさらに含有していてもよい。Ｎ−メチルピロール（Ｐｙ）及び／又はＮ−メチルイミダゾール（Ｉｍ）を含有しているこの型のＤＮＡ特異的化合物の合成は、記載されている（Ｇｅｉｅｒｓｔａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ １９９４）。天然に存在するジスタマイシンの構造に基づく、これらの偽ペプチド（ｐｓｅｕｄｏ−ｐｅｐｔｉｄｅｓ）は、逆平行二量体としてＤＮＡの副溝と結合する（Ｐｅｌｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｍｍｅｒ １９８９）。それらの配列特異性は、この二量体の横方向の対形成に依存し、Ｉｍ対Ｐｙ（Ｉｍ／Ｐｙ）はＧＣ塩基対を標的とし、Ｐｙ／ＩｍはＣＧ塩基対を認識し、Ｐｙ／Ｐｙ対は、ＡＴ塩基対又はＴＡ塩基対両方に対し縮重している（ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。Ｐｙ−Ｉｍ化合物は、細胞透過性であることが示されている（Ｇｏｔｔｅｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。これらの化合物を、以後、ポリアミドと呼ぶこととする。
【００５４】
前記の対形成ルールを使用して、あるＣＲＥを認識するよう適切なＣＲＥ−ポリアミドが合成される。ＣＲＥの配列が、ポリアミドの構造及び組成を決定する。多くのＣＲＥ結合性化合物が、これらのルールを適用して作成されうる。
【００５５】
特定のＣＲＥ配列に適合するよう適合化されうる一般式の非制限的な例は、下記式Ｉである。
【数１】
2004501620.tif 000002
〔式中、
−Ａは、芳香族アミノ酸残基、特に環状窒素を少なくとも１個有する複素環、又は脂肪族アミノ酸β−アラニン、又は該芳香族アミノ酸残基の蛍光性誘導体からなる群より選択されるモノマー単位であり；
−ａは、６〜９の整数を表し、
−βはβ−アラニンを表し、
−Ｚは、ジメチルアミノプロピルアミド（Ｄｐ）又はもう一つの末端基、又はそれらの蛍光性誘導体を表し、
−各実線は、共有結合を表し、
−Ｎ及びＣは、それぞれ分子のＮ末端及びＣ末端を示し、但し
−複数のＡモノマー単位は同一であっても又は異なっていてもよい〕。
【００５６】
好ましい実施態様によると、前記式Ｉ中、ａは７又は８である。
【００５７】
さらなる実施態様によると、〔Ａ〕ａは少なくとも４個の芳香族アミノ酸を含み、かつ〔Ａ〕ａは３個を越える連続した芳香族アミノ酸のストレッチを含まない。
【００５８】
好ましくは、式Ｉの複数のＡ単位はＮ−メチルピロール（Ｐｙ）及び／又はＮ−メチルイミダゾール（Ｉｍ）を含む。この型の分子の一例は、式（ＩＩ）を有する。
【００５９】
【数２】
2004501620.tif 000003
【００６０】
〔式中、β及びＺは前記と同義であり、
〔Ａ４〕はβであり、
〔Ａ１〕〜〔Ａ３〕及び〔Ａ５〕〜〔Ａ７〕は、Ｎ−メチルピロール（Ｐｙ）及び／又はＮ−メチルイミダゾール（Ｉｍ）より選択される〕
【００６１】
式ＩＩの好ましい実施態様は、〔Ａ１〕〜〔Ａ３〕及び〔Ａ５〕〜〔Ａ７〕が、各々Ｎ−メチルピロール（Ｐｙ）であるようなものである。
【００６２】
もう一つの好ましい分子は、式（ＩＩＩ）を有する。
【００６３】
【数３】
2004501620.tif 000004
【００６４】
〔式中、β及びＺは前記と同義であり、
〔Ａ１〕〜〔Ａ８〕は、Ｎ−メチルピロール（Ｐｙ）、Ｎ−メチルイミダゾール（Ｉｍ）、及びβアラニン残基より選択され、但し
各ＩｍのＮ末端側に直接隣接している〔Ａ〕は、βアラニン残基である〕
【００６５】
本発明のＣＲＥ結合性分子の特定の例は、
【００６６】
【数４】
2004501620.tif 000005
【００６７】
である。
【００６８】
前記分子は、高い親和性及び特異性を示し、かつ細胞透過性であるため、ＣＲＥとの結合にとって極めて好適である。さらなる詳細は、実施例に提供される。
【００６９】
本発明は、
−該異種遺伝子を含む核酸分子；
−シス又はトランスの染色体機能の調整を可能にするクロマチン状態を有する配列である、いわゆる異種≪ＣＲＥ≫を含む核酸分子；
−およそ５ＫＤａ未満の分子量を有し、かつ該ＣＲＥと配列特異的に結合する能力を有する化合物を含む、細胞における異種遺伝子のエピジェネティック状態の調整に適した遺伝子発現キットにも関する。
【００７０】
そのようなキットの中の異種ＣＲＥは、サテライト配列、例えばＳＡＲ様ＡＴトラクト又はＧＡＧＡＡリピート配列を含みうる。そのようなキットは、遺伝子治療において使用されうる。異種遺伝子は、着目している任意の遺伝子、例えば前掲のものでありうる。
【００７１】
本発明は、好ましくは５ＫＤａ未満の分子量を有し、かつゲノムＣＲＥ（該ＣＲＥは、シス又はトランスの染色体機能の調整を可能にするクロマチン状態を有する配列である）と配列特異的に結合する能力を有する化合物を含有している細胞にも関する。好ましくは、細胞内の化合物はＤＮＡ副溝に結合するが、主溝に結合するもの、及びリン酸骨格に結合するものも企図されうる。
【００７２】
本発明に係る細胞は、さらに、
−異種遺伝子を含む核酸分子；
−いわゆる異種≪ＣＲＥ≫（該異種ＣＲＥは、シス又はトランスの染色体機能の調整を可能にするクロマチン状態を有する配列である）を含む核酸分子をさらに含有していてもよい。
【００７３】
本発明の細胞は、前掲のような真核細胞又は原核細胞でありうる。
【００７４】
そのような細胞を含む非ヒト生物も、本発明の一部を形成する。生物は非ヒト動物でありうる。それは、本発明の３成分、即ちＣＲＥ、調整されるＤＮＡ因子、及びＣＲＥ結合性分子のうちのいずれかが、安定的な形質転換によって細胞へ安定的に導入されているか否かに依って、トランスジェニックである場合もあるし、又はトランスジェニックでない場合もある。
【００７５】
特に好ましい生物は、トランスジェニックでなくてもよいし、又はトランスジェニックであっててもよい植物である。裸子植物及び被子植物が、本発明における使用に特に適しており、後者の群は、単子葉植物及び双子葉植物を含む。
【００７６】
本発明は、予定されたＣＲＥ（該ＣＲＥは、シス又はトランスの染色体機能の調整を可能にするクロマチン状態を有する配列である）と配列特異的に結合する能力を有している化合物（但し、該化合物はジスタマイシン、ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ、ＭＡＴＨ２０ではない）にも関する。
【００７７】
好ましい実施態様において、化合物は、５ＫＤａ未満の分子量を有し、かつ少なくとも６ヌクレオチドの配列を特異的に認識する能力を有する。さらに好ましくは、化合物は、少なくとも８ヌクレオチド、又は少なくとも１０ヌクレオチド、例えば少なくとも１５ヌクレオチド又は１６ヌクレオチドの配列を特異的に認識する能力を有している。化合物は、好ましくは細胞透過性である。
【００７８】
そのような化合物の例は、既に記述された。
【００７９】
本発明の化合物は、ヒト又は動物において使用するための医薬組成物を調製するため、適当な生理学的に許容される賦形剤と組み合わせられ得る。特に好ましい賦形剤は、経口投与用、局所投与用、皮下投与用、筋肉内投与用のものである。
【００８０】
本発明の医薬組成物は、異種ＣＲＥ及び調整される因子の産生のために必要な核酸分子を含む他の医薬組成物と共に使用されてもよい。そのような複合物は、生理学的に許容される賦形剤と配合された、異種遺伝子を含む核酸分子；いわゆる異種≪ＣＲＥ≫（該異種ＣＲＥは、シス又はトランスの染色体機能の調整を可能にするクロマチン状態を有する配列である）を含む核酸分子、を含有する第一の医薬組成物と、
生理学的に許容される賦形剤と配合された、該ＣＲＥと配列特異的に結合する能力を有する化合物を含む第二の医薬組成物とを含む。
【００８１】
本発明に係る化合物、組成物、組成物の複合物、及びキットは、治療において、例えばエピジェネティック状態に起因する遺伝学的障害の治療において使用されうる。そのような障害の例は、ぜい弱Ｘ症候群、及びウィルムス腫のようなインプリンティング障害、及びプラーダー−ヴィリ症候群である。
【００８２】
本発明の化合物及びキットは、細胞、特に真核細胞における異種遺伝子の発現の調整のために非治療的に使用されてもよい。細胞は、培養細胞であってもよいし、又はｉｎ ｖｉｖｏ細胞であってもよい。方法がｉｎ ｖｉｖｏで実施される場合、生物はトランスジェニック又は非トランスジェニックでありうる。
【００８３】
特に好ましい実施態様によると、本発明の化合物は、蛍光性であるか、又は蛍光標識されている。より具体的には、この面は、ゲノムＤＮＡと配列特異的に結合することができるＤＮＡ結合性化合物（該化合物は、環状窒素を少なくとも１個有する環式複素環を含み、場合により少なくとも１つの脂肪族アミノ酸残基を含むオリゴマーであり、蛍光性であるか、又は蛍光標識されている）に関する。前記のＣＲＥ結合性化合物は、本発明のこの面の特に好ましい変形実施態様である。
【００８４】
驚くべきことに、ＤＮＡ結合性分子への蛍光タグの付加は、結合の特異性を改変させないことが、本発明者らによって示された。これは、細胞及び染色体材料の中の特異的ＤＮＡ配列の量推定を含む細胞学的／構造的決定のための蛍光性誘導体の使用を許容する。
【００８５】
蛍光タグは、通常、分子のＮ末端又はＣ末端に付加され、フルオレセイン染料、ダンシル染料、テキサスレッド染料、イソスルファンブルー染料、エチルレッド染料、マラカイトグリーン染料、ローダミン染料、及びシアニン染料のような蛍光染料であり得る。
【００８６】
蛍光性ＣＥＲ結合性分子は、染色体及び核の中のＤＮＡのエピジェネティック状態及び位置の探索、並びにエピジェネティック状態から発生する病理学的状態の診断（症状前診断を含む）のために使用されうる。
【００８７】
本発明の蛍光性誘導体のさらなる用途は、染色体マーキング、診断、法医学的研究、及び起源決定（ａｆｆｉｌｉａｔｉｏｎ）研究である。
【００８８】
本発明の様々な面が、図中に図示されている。
【００８９】
実施例
セクションＩ：ＤＮＡサテライト特異的薬物の合成及び特徴決定
ゲノムプロジェクトは、極めて多数の新規遺伝子を発見するのみならず、必然的に「建築」ＤＮＡ因子を含まざるを得ない、膨大な量の非コーディング配列データをも与える。建築ＤＮＡは、核の秩序、染色体の安定性及び動力学、娘染色分体の粘着、セントロメア及びテロメアの形成を媒介する配列を保有していると推察されている。新技術と組み合わせられたプロテオミクスの道具は、最終的には、発見された遺伝子の多くへの仮の機能の割り当てを可能にするであろうと思われるが（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎ，１９９９）、非遺伝子ＤＮＡ及び建築ＤＮＡを発見し、予測し、それらに機能を割り当てるための設備は十分に整っていない。さらに、染色体生物学を理解するためには、遺伝子機能を理解するのみならず、これらのＤＮＡ因子が、いかにして、細胞分裂による染色体構造特質の遺伝を賦課し、次いで伝達するのかを理解することが必要である。
【００９０】
建築ＤＮＡを研究するための生物学的アッセイは、極めて限定されている。例えば、位置効果による多様化（ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）（ＰＥＶ）の現象は、セントリック（ｃｅｎｔｒｉｃ）ヘテロクロマチンの近くへの遺伝子の位置付けが原因であるが（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， ２０００； Ｋａｒｐｅｎ， １９９４）、セントリックサテライトＤＮＡの機能（もし存在するのであれば）を吟味するための遺伝学的道具は存在しない。ＰＥＶは、配列サテライトリピートによって媒介されるのか、塩基組成によって媒介されるのか、それらのエピジェネティック状態によって媒介されるのか、又は単にそのクロマチンの反復性によって媒介されるのか？　遭遇している、ゲノムの大きな画分への機能の割り当ての難しさを考慮して、本発明者らは、新規な手法及び道具の開発を、非常に重要と見なしている。
【００９１】
染色体凝縮及びＰＥＶに関与している建築ＤＮＡの生物学的役割を研究するために、ここで本発明者らが開発に成功した手法は、ＤＮＡ配列特異的偽ペプチド（Ｇｅｉｅｒｓｔａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４）の合成に基づく。
【００９２】
これらの化合物への本発明者らの関心は、分子生物学及び細胞生物学のための道具としてのそれらの可能性に由来する。配列特異的な副溝結合薬は、繰り返されたＤＮＡ、及び困難なシス作用性因子の役割の吟味を許容しうる。Ｐｙ−Ｉｍ化合物は、蛍光標識された場合、特異的配列のｉｎ ｓｉｔｕ局在位置決定のために使用可能であり、おそらくは、生存細胞における繰り返されたＤＮＡの研究を可能にする。
【００９３】
ここで、本発明者らは、種々のＤＮＡサテライト及びＳＡＲを標的とするポリアミドの合成及び特徴決定を記載する。興味深いことに、本発明者らは、サテライトＩＩＩを標的とする化合物が、このヘテロクロマチン性リピートを大量に巻き戻すこと、及びＳＡＲ特異的ポリアミドが、有糸分裂期アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵抽出物における染色体凝縮を阻害することを観察した。本発明者らは、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の２つの異なるＤＮＡサテライトを標的とするピロール−イミダゾール化合物が、ＰＥＶ及び遺伝子発現に対する劇的な効果を有することも示す（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）。これらの観察は、染色体研究のための配列特異的副溝結合薬の強力な利用可能性を例示している。
【００９４】
実施例１
ＡＴトラクトのターゲティングのためのオリゴピロールの合成
ポリアミドの生物学的可能性を探究するため、本発明者らは、ＤＮＡサテライトＩ、ＩＩＩ、Ｖ、及び散在性ＳＡＲ因子を標的とする化合物の合成を目標とした。サテライトＩ（１．６７２密度）は、ＡＡＴＡＴ単位からなり、約６メガ塩基（Ｍｂ）を包含しており、サテライトＶ（１．７０５密度）は、ＡＡＧＡＧリピートから構成され、約７Ｍｂに達し（Ｌｏｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。サテライトＩＩＩ（１．６８８密度）は、はるかに長い繰り返し単位（３５９ｂｐ）を有し、約１０Ｍｂに及んでいる（Ｈｓｉｅｈ ａｎｄ Ｂｒｕｔｌａｇ，１９７９）。サテライトＩＩＩリピートは、多数のクラスターをなしたＡＴトラクトを配列の顕著な特徴とするＳＡＲと同様の機能上の挙動を示す（Ｋａｓ ａｎｄ Ｌａｅｍｍｌｉ，１９９２）。例えば、ショウジョウバエヒストン遺伝子クラスターに関連したＳＡＲは、８個以上（平均長１０塩基対）のＷ（Ａ又はＴ塩基）のＡＴトラクト２６個を含有している６５６ｂｐのＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｆ１断片によって定義される（Ｇａｓｓｅｒ ａｎｄ Ｌａｅｍｍｌｉ， １９８６； Ｍｉｒｋｏｖｉｔｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９８４）。これらのＡＴトラクトのうちの２０個は、クラスターをなしており、わずか数ヌクレオチド（平均４．５）の混合塩基対配列のスペーサーによって隔離されている。
【００９５】
各ピロールカルボキサミドは１個のＡＴ塩基対と接触するため、結合部位サイズを拡大し、親和性を改善するためには、Ｎ−メチルピロール単位の数を増加させることができる。しかしながら、６個を越えるピロールを含有している化合物の場合、分子と、副溝床に沿った塩基対との位相がずれるため、この予測はもはや有効でない。実際、ピロール−ピロールの距離は、完全なマッチに必要なものよりも約２０％長い（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ ａｎｄ Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ， １９８６）。さらに、５個以上のピロール環を有する化合物は、ＤＮＡヘリックスのピッチに対して過剰に屈曲していることが見出されており、従って、オリゴピロールが長くなるほど結合親和性が低下する（ｄｅ Ｃｌａｉｒａｃ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。このミスマッチ問題を回避するためには、認識因子の整合を回復させ、これらの三日月形分子の湾曲を緩和するために、柔軟なアミノ酸（β−アラニン）をピロール環系の中心に導入することができる（Ｙｏｕｎｇｑｕｉｓｔ ａｎｄ Ｄｅｒｖａｎ， １９８７）。中央にβ−アラニンを含有しているＰ９と名付けられたピロールヘキサマーを合成し（ＰｙＰｙＰｙ−β−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ）、Ｐ７より１００倍高い親和性（Ｋａｐｐ約０．７５ｎＭ）でＷ９と結合することを観察した（図１Ａ）。この後者の値は、図（１Ａ）に示されているものより低いリガンド濃度へと拡張されたフットプリントから得られた。
【００９６】
実施例２
核及び多糸染色体の中のＤＮＡサテライト及びＳＡＲの選択的染色
ショウジョウバエＫｃ核：
ヒストンによってクロマチンへとパッケージングされたＤＮＡの上で探索された場合のオリゴピロールの特異性の問題を解決するために、エピフルオレセンス顕微鏡検による調査のため、単離されたＫｃ核及び多糸染色体を染色するため、ピロールリガンドを蛍光タグ化することの可能性を探究した。配列の優先性がタグ化時に維持され、クロマチンへも及ぶのであれば、染色された核の中のこれらの蛍光性オリゴピロールの主要な標的（サテライトＩ及びＩＩＩ）の位置を強調することが可能であるはずである。
【００９７】
蛍光基を、商業的に入手可能なフルオレセインのスクシニミジル活性エステルを使用して、オリゴピロールとカップリングさせた。蛍光性リガンドのＤｎａｓｅ　Ｉフットプリンティングは、これらの誘導体がタグ化時に異なる影響を受けることを明らかにした。一般に、タグ化は減少した結合親和性をもたらしたが、ＡＴ特異性に影響することはなかった。興味深いことに、いくつかの化合物については、改善されたＳＡＲ特異性係数（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ）が観察された（表１参照）。Ｐ９ＦのＳＡＲ特異性は約４倍増加した。この分子の蛍光モエティは、識別を改善するよう機能しうる。
【００９８】
ショウジョウバエＫｃ核を、臭化エチジウム及びフルオレセインタグ化ピロール化合物で二重染色した。臭化エチジウム（赤色）は、核クロマチンを全体的に染色するが、核小体の高いＲＮＡ濃度のため、この亜核ドメインを著しく際だたせる。
【００９９】
Ｐ９Ｆで観察された染色パターン（緑色）は、印象的な特質を示す；リガンドは、１つ又は２つの亜核位置（図２Ａ及びＢ）に蓄積し、強い緑色の焦点をもたらした。これらの焦点は、一般に核小体に接しており、豊富に存在するＡＴリッチなショウジョウバエサテライトＩ及びＩＩＩにおける予想された局在から発生すると推察される（下記参照）。Ｐ９Ｆにより核質全体に低い緑色シグナルが観察される。
【０１００】
Ｐ９Ｆで得られたこの強い核質局在は、ゲノム全体に豊富に存在する隔離された／短いＡＴトラクトとの結合から発生したと解釈される。
【０１０１】
実施例３：
Ｐ３１によるサテライトＶのＧＡＧＡＡリピートのターゲティング
ＧＡＧＡＡリピートから構成された豊富なサテライトＶを標的とするポリアミド（Ｌｏｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３）を合成した。現在の知識では、ピロール及びイミダゾールから構成された薬物による５′−ＧＮＧ−３′又は５′−ＧＡ−３′を含有している配列のターゲティングは困難であるため、このリピートモチーフと結合するであろう分子の設計は難題であった。しかしながら、ピロールの機能をβ−アラニンが代行しているＩｍ−β−Ｉｍモチーフを使用して、５′−ＧＴＧ−３′を含有している配列のターゲティングが、以前に成功した（Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。β−アラニンは、ピロールと同様に、ＡＴ塩基対及びＴＡ塩基対に対し縮重しているため、本発明者らは、これらの観察に基づき、イミダゾールのＮ末端側の隣に体系的に−アラニンを置くことにより、２個のタンデムＧＡＧＡＡリピートから構成された配列を認識する化合物を設計した。Ｐ３１と名付けられたこの化合物（＝Ｉｍ−β−Ｉｍ−Ｐｙ−β−Ｉｍ−β−Ｉｍ−β−Ｄｐ）の結合親和性及び特異性を、ＤＮＡｓｅ　Ｉフットプリンティングによって評価した。この目的のため、いずれもＧＡＧＡＡリピートを含有している２個の異なるプローブを調査した。図（３Ａ）は、Ｐ３１が、その標的部位結合、この場合には２個のＧＡＧＡＡリピートとｎＭ以下の親和性で結合することを示している（レーン２〜８）。この配列に対するＰ３１の見かけの結合定数は、０．２５ｎＭと推定された。より高い濃度では、２個のミスマッチ部位結合の保護が観察された。これらの部位のうちの一個は、ＡＡＧＴＧモチーフを含有している（図３Ａ）。
【０１０２】
Ｐ３１に関する結合方向及び化学量論を決定するために、本発明者らは、Ｐ３１Ｅと名付けられたＦｅ（ＩＩ）−ＥＤＴＡアナログ（Ｉｍ−β−Ｉｍ−Ｐｙ−β−Ｉｍ−β−Ｉｍ−β−Ｄｐ−ＥＤＴＡ）を調製した。アフィニティ分解を、２個のＧＡＧＡＡリピートを含有しているフットプリントプローブに対し実施したところ（レーン９）、２個のＧＡＧＡＡリピートに隣接している１個の主要な分解部位が明らかとなり、それにより１：１薬物−ＤＮＡ複合体で、１個のＰ３１分子が、２個のＧＡＧＡＡリピートと結合するという仮説が確証された。
【０１０３】
従来の２：１薬物−ＤＮＡ複合体に対立するこの結合モデルの欠点は、Ｐ３１が、親和性は異なるとしても、ＧＣ塩基対及びＣＧ塩基対と縮重して結合すると予想される点である。従って、コンセンサス配列は、ＳＷＳＷＷＳＷＳＷＷ〔式中、ＳはＧ又はＣを表し、ＷはＡ又はＴを表す〕と定義されうる。Ｐ３１のＣＡＣＡＡリピートとの結合を評価するため、本発明者らは、これらのリピートを２個含有し、さらに５個のタンデムＧＡＧＡＡリピートを含有している第二のプローブを使用した。図（３Ａ）は、Ｐ３１が、ＧＡＧＡＡリピートよりもおよそ５倍低い親和性で、ＣＡＣＡＡリピートを保護することを示している（レーン１１〜１５）。さらに、Ｐ３１Ｅを使用したアフィニティ分解反応は、ＧＡＧＡＡ領域内の２個の主要な分解部位を明らかにし（レーン１６）、そのことは、この場合、２個のＰ３１分子がペンタマーＧＡＧＡＡリピートとタンデムに結合していることを示す。やはり、この分子も、矢じりによって示されるような方向で、１：１薬物−ＤＮＡ複合体として結合することが観察される（図３Ａ）。本発明者らは、ＡＴトラクト及びＧＡＧＡＡリピートの特別な構造的特質にとっては、１：１ＤＮＡ−薬物複合体が都合がよいのだと推察する。
【０１０４】
下記実施例においては、ｂｒｏｗｎ−ｄｏｍｉｎａｎｔ遺伝子型の発達中のキイロショウジョウバエに供給されたＰ３１が、ＧＡＧＡ因子（ＧＡＦ）の機能に干渉することを証明する。従って、このタンパク質を用いて、フットプリント実験を実施した。この目的のために使用されたＤＮＡプローブ（ＧＡＦ３１）は、（ＡＡＧＡＧ）２モチーフ（Ｐ３１の標的）に加えて、Ｕｂｘ遺伝子由来の典型的なプロモーター近位ＧＡＦ結合部位を含有している（Ｂｉｇｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。このＵｂｘ部位は、ＧＡＦのペンタマーコンセンサス配列ＧＡＧＡＧを含有している（Ｏｍｉｃｈｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。ＤＮａｓｅ　Ｉフットプリント研究は、ＧＡＦは（ＡＡＧＡＧ）２及びＵｂｘモチーフの両方と結合するが、Ｐ３１は前者のサテライトリピートとのみ相互作用することを示す（図３のパネルＡ及びＢを比較のこと）。
【０１０５】
核及び多糸染色体の中のＧＡＧＡＡサテライトＶの選択的染色：
核及び染色体の染色により、結合標的を視覚的に査定するため、Ｐ３１の蛍光性誘導体を合成した。蛍光性リガンドのＤＮａｓｅ　Ｉフットプリンティングは、Ｐ３１Ｔが、１００倍減少した親和性でＧＡＧＡＡ配列と結合するが、特異性は改変されないことを明らかにした。ショウジョウバエＫｃ核を、ＤＡＰＩ、Ｐ９Ｆ、及びＰ３１Ｔで三重染色し、エピフルオレセンス顕微鏡検によって記録した。核ＤＮＡの青色ＤＡＰＩ背景に対し、それぞれＰ９Ｆ染色及びＰ３１Ｔ染色に由来する別々の緑色及び赤色の焦点が認められるため、ここで得られた顕微鏡写真も印象的である（図４Ａ）。より精密な検査は、これらの焦点が、大部分は重複していないことを明らかにする（パネルＡ及びＢを比較のこと）。
【０１０６】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析は、野生型ハエから得られた多糸染色体においてサテライトＩを検出することは可能であるが、サテライトＶ（（ＧＡＧＡＡ）ｎ）は検出不可であることを示したが、それは、サテライトＶのより重度の過小複製（ｕｎｄｅｒ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｐｌａｔｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８）のためであると推測される。従って、このＧＡＧＡＡリピートの見かけの欠如のため、Ｐ３１Ｔの標的結合部位に対する特異性を、「通常の」多糸染色体を使用して評価することはできない。従って、この制限を回避するため、本発明者らは、ｂｒｏｗｎ（ｂｗ＋）遺伝子のコーディング領域に挿入された、ＧＡＧＡＡリピートから構成されたヘテロクロマチンの大きなブロック（約１．７メガ塩基）を保有しているｂｏｗｎｄｏｍｉｎａｎｔ（ｂｗＤ）ハエから多糸染色体を調製した。このヘテロクロマチン性インサートは、おそらくはそのユークロマチン性の局在化により、通常、多糸化されているらしい（Ｃｓｉｎｋ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， １９９６； Ｄｅｒｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｐｌａｔｅｒｏ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。これらのハエから多糸染色体を調製し、Ｐ９Ｆ、Ｐ３１Ｔ、及びＤＡＰＩで染色した。得られた結果は、印象的であった（図４）。Ｐ３１Ｔ（赤色）は、第２染色体（２Ｒ）の右腕上の遺伝子座５９Ｅにおいて、ｂｗＤ　ＧＡＧＡＡインサートをはっきりと強調した。その他には、染色中心にもユークロマチン性腕上にも、Ｐ３１Ｔ焦点は観察されなかった。周知の多糸染色体の横縞／中間帯パターンは、ＤＡＰＩ染色により青色で明らかにされる。
【０１０７】
要約すると、本発明者らは、フットプリンティング及びエピフルオレセンス顕微鏡検により確立されたように、異なるサテライト特異的ポリアミドを合成した。Ｉｍ−Ｐｙ化合物Ｐ３１は、サテライトＶと特異的に結合することが示された。これらの化合物は全て、１：１薬物−ＤＮＡ複合体として、ＤＮＡ標的と結合する。
【０１０８】
オリゴピロールは、配列特異的にクロマチンリモデリングを媒介する
以前に、本発明者らは、ジスタマイシン（Ｐｙ−Ｐｙ−Ｐｙ）への核の曝露が、クロマチン繊維のオープニングを引き起こし、それによりサテライトＩＩＩにおける制限酵素及びトポイソメラーゼＩＩによる分解を助長することを報告した（Ｋａｓ ａｎｄ Ｌａｅｍｍｌｉ，１９９２）。合成ポリアミドは、クロマチンに対する類似の効果を有するか？　前記のように、サテライトＩＩＩは、３５９ｂｐリピートからなっており、各リピート単位は２個のヌクレオソームへとパッケージングされている。生化学的には、サテライトＩＩＩリピートは、ＳＡＲとしての挙動を示し；核足場、トポイソメラーゼＩＩ、ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ、及びＭＡＴＨ２０と優先的に結合する（Ｇｉｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｋａｓ ａｎｄ Ｌａｅｍｍｌｉ， １９９２）。ショウジョウバエ胚への蛍光性トポイソメラーゼＩＩの微量注入によって証明されるように、トポイソメラーゼＩＩはｉｎ ｖｉｖｏでサテライトＩＩＩにも豊富に存在する（Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。サテライトＩＩＩは、全ての第二ヌクレオソームリンカー内に位置しているリピート１個当たり１個の顕著なトポイソメラーゼＩＩ分解部位を含有している（Ｋａｓ ａｎｄ Ｌａｅｍｍｌｉ， １９９２）。Ｋｃ核を、トポイソメラーゼＩＩに豊むアフリカツメガエル卵抽出物へと曝した場合、細胞分裂停止薬ＶＭ２６の存在下で、トポイソメラーゼＩＩ分解産物が蓄積する。この処理は、ハイブリダイゼーションによって明らかにされるような３５９ｂｐのリピート長を有するＤＮＡラダーを生成させる。ラダーは、ＶＭ２６の添加時にのみ観察される（図７Ａ、左）。興味深いことに、分解は、Ｐ９の添加によって大量に刺激される（Ｐ７によっても（示していない））。分解刺激は、主要リピートバンドの増加した強度（Ｍと標記されている。３５９ｂｐリピート毎に１個の切断）、及びより短い断片へのラダーのシフトによって証明される。刺激は、５００ｎＭで最大となり、より高い濃度で減弱し始める（図７Ａ）。Ｐ９曝露は、ヌクレオソーム内の分解から発生する可能性が最も高い、付加的な小さなバンド（ｍと標記）の出現ももたらす（考察参照）。これらの小さなバンドは、薬物の非存在下では、曝露時間を延長した後ですら、観察されない（データは示していない）。
【０１０９】
次に、本発明者らは、このアッセイにおいてＰ３１の効力を試験した。図７Ａに示されている結果は、Ｐ３１による分解刺激がＰ９より相当低レベルであることを証明している。すなわち、大量の分解刺激が、最低濃度のＰ９で観察されるが（６２ｎＭ、図７Ａ、レーン３）、２００ｎＭまでの濃度のＰ３１では、パターンの有意な強化が観察されない（図７Ａ、レーン８〜１１）。Ｐ３１による分解刺激は、５００ｎＭでのみ、６２ｎＭのＰ９で得られたものに匹敵するようになる（レーン３Ａをレーン１２と比較のこと）。Ｐ９による刺激は、５００〜１０００ｎＭで最大となり、より高い濃度で減少し始める。これらの濃度でＰ３１によって誘導された分解ラダーも、観察された用量応答と一致してＰ９のものより明白でなかった。これらの薬用量実験は、Ｐ９が、Ｐ３１よりおよそ１０倍低い濃度でヘテロクロマチンサテライトＩＩＩをオープンにすることを証明している。
【０１１０】
上記のデータは、合成オリゴピロール化合物Ｐ９及びＰ７（示されていない）が、トポイソメラーゼＩＩによる分解を強く助長することを証明している。薬物処理に対する刺激応答は、まずクロマチンオープニングが起こり、次いで分解が助長されることを反映していると考えられる。
【０１１１】
クロマチンオープニングの概念を支持するさらなる観察は、Ｐ９が制限酵素によるサテライトＩＩＩ内の分解も助長したというものである。サテライトＩＩＩリピートは、トポイソメラーゼＩＩ分解部位の近くにＨａｅＩＩＩ制限配列を含有している。本発明者らは、以前に、クロマチン（ＤＮＡではない）におけるＨａｅＩＩＩによる切断が、ジスタマイシンによって助長されることを証明した（Ｋａｓ ａｎｄ Ｌａｅｍｍｌｉ， １９９２）。本発明者らは、Ｐ９を使用して、同様の観察を得た（データは示していない）。
【０１１２】
セクションＩの考察
本発明者らは、染色体の構造、動力学、及び非遺伝子ＤＮＡの生物学的機能の問題を解決するための新規な道具としての、配列特異的副溝結合性ポリアミドの可能性を探究した。この目的のため、本発明者らは、サテライトＩ（ＡＡＴＡＴ）、Ｖ（ＧＡＧＡＡ）、及びＳＡＲ（ＳＡＲ様サテライトＩＩＩを含む）と相互作用する化合物を合成した。サテライトＩ及びＳＡＲのターゲティングは、ジスタマイシン、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、及びＤＡＰＩのような「従来の」副溝結合薬により達成され得るが、それらの比較的短い結合部位は、高いバックグラウンドシグナルを生じさせる。
【０１１３】
高親和性でＧＡＧＡＡリピートと結合する化合物の合成は、この配列が「困難な」モチーフを含有しているため、化学的に、より難題である。しかしながら、イミダゾール単位及びピロール単位の両方から構成されるモノマーＰ３１により、サテライトＶリピートの感動的なターゲティングが得られた。構造的に、Ｐ３１は、「困難な」三塩基ＧＷＧ配列が、イミダゾールのＮ末端側にβ−アラニンが置かれているＩｍ−β−Ｉｍモチーフにより標的とされうるという最近の観察を拡張する（Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。Ｐ３１においては、２個の連続ＧＡＧＡＡリピートに対するｎＭ以下の親和性を達成するために、この設計原理が体系的に拡張された。この設計は、ＧＡモチーフ及びＧＡＧモチーフを含めることにより、標的とされうる配列の数を増幅する。
【０１１４】
ピロール−イミダゾール薬は、一般に、逆平行の２：１薬物−ＤＮＡ複合体としてＤＮＡ副溝と結合する（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。しかしながら、ここに提示されたアフィニティ分解実験は、オリゴピロールＰ３１Ｆの場合には１：１薬物−ＤＮＡ複合体であることを示唆している。２個の逆平行方向の分子の結合は、副溝の拡大を必要とするため（Ｋｉｅｌｋｏｐｆ ｅｔ ａｌ．， １９９８）、ＡＴトラクトを広げることは、エネルギー論的に過剰に高コストであるのかもしれない。同様に、Ｂ−ＤＮＡオリゴマーの結晶構造は、ＧｐＡステップがＧｐＴステップよりも副溝を狭くする傾向（これは、Ｐ３１とＧＡＧＡＡリピートとの間の２：１複合体にとって不都合であるのかもしれない）を有することを証明した（Ｙａｎａｇｉ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。
【０１１５】
エピフルオレセンス顕微鏡検
ＤＡＰＩ又はヘキストのような配列優先性を有する蛍光ＤＮＡ染料は、細胞生物学、医学、及び細胞遺伝学の有用な日常的な道具である。染色体の構造、機能、及び動力学に関する無数の基礎的な問題が、配列特異的染料を使用して解決されうるため、配列特異的化合物は、もし蛍光性化が成功すれば、科学的可能性を多大に拡張しうる。また、そのような分子は、染色体タイピングのようなよりルーチンの作業を助長し、改善するかもしれない。
【０１１６】
オリゴピロールのＮ末端又はＣ末端への蛍光標識の接合は、簡単ではあるが、これらの位置へのタグ化は、親和性を改変させた（表１）。
【０１１７】
Ｐ３１の主要な核標的も、テキサスレッド誘導体であるＰ３１Ｔにより、単離されたＫｃ核及び多糸染色体を染色することにより証明された。Ｐ３１Ｔ焦点は、セントリックサテライトＶのＧＡＧＡＡリピートを表しているに違いない（図４Ａ〜Ｃ）。Ｐ３１Ｔの主要ＤＮＡ標的の正の同定は、この化合物によって鮮明に強調されたＧＡＧＡＡリピートを有するｂｗＤ多糸染色体の染色により得られた（図４Ｄ）。本発明者らは、ｂｗＤハエ又はＣａｎｔｏｎ Ｓハエに由来する多糸染色体の、ユークロマチン性腕上にも、又は染色中心にも、他のＰ３１シグナルを観察しなかった。これらのサテライト配列の反復性及びこれらの染色体の多糸性は、染色シグナルの検出を助長する。配列特異的ポリアミドによる染色体の標識は、実験的には簡単であり、無数の科学的及び診断的適用へのそのような染料の適用が可能である。言及するまでもなく、多糸染色体は、配列特異的ヘアピンポリアミドの特異性を査定するための理想的な対象であり得る。
【０１１８】
クロマチンオープニング
クロマチン研究は、オリゴピロールＰ９によるＡＴトラクトの滴定が、ヘテロクロマチン性サテライトＩＩＩを大量に巻き戻すことを明らかにした。サテライトＩＩＩのクロマチンオープニングは、Ｋｃ核をアフリカツメガエル卵抽出物に曝した場合の、内在性トポイソメラーゼＩＩによる大量の分解刺激によって証明される。本発明者らは、以前に、ジスタマイシンを使用して、比較的明白ではなかったが類似の観察を得、巻き戻しが、ヌクレオソームリンカー領域からのヒストンＨ１又は別のタンパク質の置換から発生するかもしれないと推論した（Ｋａｓ ａｎｄ Ｌａｅｍｍｌｉ， １９９２； Ｋａｓ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。又は、コアヒストンの副溝接触が、クロマチン繊維のヘテロクロマチン状態の維持にとって重要であるのかもしれない。Ｐ９とは対照的に、サテライトＩＩＩのクロマチンオープニングは、高濃度の化合物Ｐ３１を必要とした。これとは対照的に、添付の論文に、本発明者らは、Ｐ３１はｂｒｏｗｎ−ｄｏｍｉｎａｎｔ対立遺伝子（ｂｗＤ）を構成するヘテロクロマチン性ＧＡＧＡＡインサートをオープンにすることができるが、Ｐ９はそれができないことを示唆するデータを提示する。これらの観察は、ＤＮＡ副溝結合ポリアミドが、サイレンシングを受けている遺伝子に対して、配列特異的クロマチンオープナーとして作用しうることを示唆している。
【０１１９】
材料及び方法
Ｂｏｃ−β−ＰＡＭ−樹脂（ＨＢＴＵ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ｏｔＢｕ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−β−アラニン、及びＢｏｃ−γ−アミノ酪酸は、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ ＡＧ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）より購入した。ＨＯＢｔは、Ｂａｃｈｅｍ製であった。４−アミノ−１−メチルピロール−２−カルボン酸塩酸塩のメチルエステルは、特別注文によりＢａｃｈｅｍによって合成された。ＤＭＦ、アセトニトリル（ＨＰＬＣ等級）、及び３，３′−ジアミノ−Ｎ−メチルジプロピルアミンは、Ａｌｄｒｉｃｈより購入した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）はシグマ製であった。ジクロロメタン（ＤＣＭ）、チオフェノール（ＰｈＳＨ）、エタンジチオール（ＥＤＴ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、チオジグリコール、ピペリジン、Ｎ，Ｎ′−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、及び３−ジメチルアミノ−１−プロピルアミンは、Ｆｌｕｋａ製であった。ＦＬＵＯＳ（５（６）−カルボキシ−フルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍより購入した。全ての試薬を、さらに精製することなく使用した。＃２焼結ガラスフィルターフリットを有するガラス製ペプチド合成反応容器（５ｍｌ）は、Ｖｅｒｒｅｒｉｅ Ｃａｒｏｕｇｅ（Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）より入手した。分析用ＨＰＬＣ及び半調製用ＨＰＬＣは、以前に記載されたようにして（Ｂａｉｒｄ ａｎｄ Ｄｅｒｖａｎ，１９９６）、実施した。エレクトロスプレーイオン化質量スペクトルは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のＴｒｉｏ ２０００装置で、陽イオンモードで得た。
【０１２０】
固相合成のためのピロールの合成
１，２，３−ベンゾトリアゾール−１−イル４−〔ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ〕−１−メチルピロール−２−カルボン酸又はＢｏｃ−Ｐｙ−Ｏｂｔは、４−アミノ−１−メチルピロール−２−カルボン酸メチルエステル塩酸塩より合成した（Ｂａｉｒｄ ａｎｄ Ｄｅｒｖａｎ， １９９６）。
【０１２１】
ピロール化合物の手動固相合成
Ｂｏｃ−ピロールのカップリングは、以前に記載されたようにして（Ｂａｉｒｄ ａｎｄ Ｄｅｒｖａｎ， １９９６）、実施した。Ｂｏｃ脱保護は、９０％ＴＦＡ、５％ＥＤＴ、及び５％ＰｈＳＨ（２×３０秒、１×２０分）を用いて実施した。３−ジメチルアミノ−１−プロピルアミン又は３，３′−ジアミノ−Ｎ−メチルジプロピルアミンによる樹脂からの分解を、記載されたようにして（Ｂａｉｒｄ ａｎｄ Ｄｅｒｖａｎ， １９９６）、実施した。分解後、ＨＰＬＣ精製の前に、ピロールペプチドの沈殿により過剰の有機塩基の大部分を除去した。この目的のため、反応混合物を３〜４倍容量のＤＣＭと混合し、続いて１０倍容量の冷（−２０Ｃ）石油エーテルを添加した。沈殿した生成物を、遠心分離によって収集し、酸性ｐＨを得るため１％ＴＦＡに溶解させた。
【０１２２】
化合物のフルオレセイン標識
特有の第一級アミンを有するオリゴピロールを、ジアミン（３，３′−ジアミノ−Ｎ−メチルジプロピルアミン）による固相からのオリゴペプチドの分解、又はＮ−末端γ−アミノ酪酸スペーサーの脱保護のいずれかによって得た。フルオレセインのＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを、６当量以上のＤＩＥＡと共に３倍過剰に添加した。反応を、室温で１５分間進行させ、フルオレセイン標識されたオリゴペプチドをＨＰＬＣによって精製した。
【０１２３】
Ｐ３１及びＰ３１Ｔの合成
Ｐ３１（Ｉｍ−β−Ｉｍ−Ｐｙ−β−Ｉｍ−β−Ｉｍ−β−Ｄｐ）は、イミダゾール及びピロールを含有しているヘアピンポリアミドに関して以前に記載されたようにして（Ｂａｉｒｄ ａｎｄ Ｄｅｒｖａｎ， １９９６）、Ｂｏｃ−β−ＰＡＭ樹脂から手動固相合成によって段階的に合成した。固相上のイミダゾールアミンのアシル化は不充分な結果を与えるため、溶液中でＢｏｃ−β−Ｉｍ−ＯＨ二量体を調製することによりＢｏｃ−β−アラニンカップリングを実施した。合成及び活性化は、Ｂｏｃ−γ−アミノ酪酸及びイミダゾールの二量体に関して記載されたのと同様であった（Ｂａｉｒｄ ａｎｄ Ｄｅｒｖａｎ， １９９６）。Ｐ３１の蛍光標識のため、固体支持体からの分解を、３，３′−ジアミノ−Ｎ−メチルジプロピルアミンを用いて実施した。ＨＰＬＣ精製の後、商業的に入手可能（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）なテキサスレッドのＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを使用して、Ｃ末端アミンをアシル化した。次いで、得られた化合物を、ＨＰＬＣによって再び精製した。
【０１２４】
ＤＮａｓｅ　Ｉフットプリンティングのためのプローブの調製
合成オリゴヌクレオチドＧＡＴＣＴＡＧＡＣＧＣＡＴＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＣＴＧＴＣＧＡＣＧＣＡＴＴＡＧＴＧ及びＧＡＴＣＣＡＣＴＡＡＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＧＣＧＣＡＡＴＴＡＡＴＡＴＧＣＧＴＣＴＡを、Ｗ９プローブを得るためにハイブリダイズさせ、ライゲーションによりオリゴマー化し、異なるタンデムリピートを得るためＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩで消化した。以下のオリゴヌクレオチドを同様にして調製した：ＧＡＦ３１は、オリゴヌクレオチドＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＧＡＧＡＧＣＧＣＡＡＧＡＧＣＧＴＣＣＣＧＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＡＧＴＡ及びＧＡＴＣＴＡＣＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＴＣＣＣＧＧＧＡＣＧＣＴＣＴＴＧＣＧＣＴＣＴＣＴＣＴＧＡＧから構成され、ＢｒｏｗｎＩはオリゴヌクレオチドＧＡＴＣＣＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＡＣＴＴＡＴＴＡＡＣＡＣＡＡＣＡＣＡ及びＧＡＴＣＴＴＧＴＧＴＴＧＴＧＴＴＡＡＴＡＡＧＴＡＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＧから構成されている。断片を、低融点アガロースゲル上で精製し、次いで、ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩによって切断された改変されたｐＳＰ６４ベクターへとクローニングした。ＨｉｎｄＩＩＩによる消化及びクレノウＤＮＡポリメラーゼによるフィルイン反応の後、末端標識を実施した。標識されたプラスミドを、ＰｖｕＩＩで切断し、低融点アガロースゲルより標的断片を精製した。ショウジョウバエヒストンＳＡＲの６５７ｂｐのＥｃｏＲ１／Ｈｉｎｆ１断片を、改変されたｐＳＰ６４プラスミドのＳｍａＩ部位へクローニングした。ＥｃｏＲ１消化の後、このＳＡＲプローブを末端標識し、次いでＣｌａＩで切断し、得られた３４７ｂｐ断片を低融点アガロースゲルより精製した。
【０１２５】
ＤＮａｓｅ　Ｉフットプリンティング
全ての反応を、４０μｌの総容量で実施した。ポリアミドストック溶液又は緩衝液（参照レーン用）を、２０ｋｃｐｍの放射標識ＤＮＡを含有しているアッセイ緩衝液に添加し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ　ＫＣ１、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ、５ｍＭ　ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ　ＥＧＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴ、及び０．１％ジギトニンという最終濃度を得た。溶液を、室温で少なくとも２時間平衡化させた。フットプリンティング反応を、ＤＮａｓｅストック溶液（緩衝液中におよそ１００ｐｇのＤＮａｓｅ　Ｉを含有）２μｌの添加によって開始させ、室温で２分間進行させた。１．２５Ｍ　ＮａＣｌ、１００ｍＭ　ＥＤＴＡを含有している溶液１０μｌの添加により、反応を停止させた。次に、１％ＳＤＳ溶液５μｌを添加し、続いてポリ（ｄＡ−ｄＴ）１μｇ、サケ精子ＤＮＡ１μｇ、及びグリコーゲン１０μｇを含有している溶液２μｌを添加し、ＤＮＡをエタノール沈殿させた（−２０Ｃで２０分間）。反応物を、８０％ホルムアミドローディング緩衝液４μｌに再懸濁させ、８５Ｃで１０分間変性させ、氷上で冷却し、８％ポリアクリルアミド変性ゲル（５％架橋、８Ｍ尿素）上で３０Ｗで１時間電気泳動した。ゲルを乾燥させ、−７０Ｃにｏ／ｎ曝した。
【０１２６】
ショウジョウバエ核の染色
Ｋｃショウジョウバエ核を単離し（Ｍｉｒｋｏｖｉｔｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９８４）、ＸＢＥ（１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．７、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ　ＣａＣｌ２、１００ｍＭ　ＫＣｌ、５ｍＭ　ＥＧＴＡ、及び５０ｍＭショ糖）で希釈し、新鮮な０．８％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、以前に記載されたようにして（Ｂｏｙ ｄｅ ｌａ Ｔｏｕｒ ａｎｄ Ｌａｅｍｍｌｉ， １９８８）、円形カバーグラス（１０ｍｍ）上にスピンした。洗浄及び染色のため、カバーグラスをパラフィルム上に置かれたＸＢＥ滴６０μｌの上に浮遊させた。遠心分離後、カバーグラスを２回（１分間）洗浄し、６０分間染色し、４回（１分間）洗浄し、次いでＰＰＤＩ（５ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　ｐＨ７．８、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　ＫＣｌ、１ｍＭ　ＥＧＴＡ、１０ｍＭ　ＭｇＳ０４、２ｍＭ　ＣａＣｌ２、７８％グリセロール、１ｍｇ／ｍｌパラフェニレンジアミン）で取り付けた。図（４）パネルＡは、０．５μＭ　Ｐ９Ｆ及び１５μＭ臭化エチジウム（ＥＢ）で染色した。
【０１２７】
その他の方法
トポイソメラーゼＩＩ阻害及び染色体集合は、以前に記載されたのと同様であった（Ｇｉｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｓｔｒｉｃｋ ａｎｄ Ｌａｅｍｍｌｉ， １９９５）。アフィニティ分解実験は、他に記載されているようにして（Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７）実施した。
【０１２８】
セクションＩＩ：ショウジョウバエに供給されたサテライト特異的ＤＮＡ結合薬によって誘導された、特異的な機能獲得表現型及び機能消失表現型
斑入り位置効果（ＰＥＶ）は、ユークロマチン性遺伝子をヘテロクロマチンと並置する染色体編成から発生する、ミュラー（Ｍｕｌｌｅｒ， １９３０）によって発見されたエピジェネティックな遺伝子不活化現象である。ヘテロクロマチンにより媒介される遺伝子サイレンシングは、ＤＮＡ配列の改変を含むのではなく、クロマチン構造の遺伝可能な変化による、遺伝可能なエジェネティックなイベントである。
【０１２９】
ＰＥＶの古典的な例は、ｗｈｉｔｅ遺伝子をＸ染色体のヘテロクロマチンの近くに並置する大きな逆位から発生する、キイロショウジョウバエ対立遺伝子ｗｈｉｔｅ−ｍｏｔｔｌｅｄ（ｗｍ４）である。ｗｍ４ハエの眼の斑入り表現型は、ｗｈｉｔｅ遺伝子がサイレンシングを受けている白色背景の中の、転写的に活性な細胞の、赤色のクローン性のパッチとして認められる（Ｅｌｇｉｎ， １９９６； Ｋａｒｐｅｎ， １９９４； Ｗａｋｉｍｏｔｏ， １９９８）。よく研究されている異なるＰＥＶの例は、キイロショウジョウバエのｂｒｏｗｎ（ｂｗ＋）遺伝子に関係がある（（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｃｏｍａｉ， １９９８により概説されている）。ヘテロクロマチン性ＧＡＧＡＡサテライトリピートの大きな単位（約１．７メガ塩基）の、この遺伝子のコーディング領域への挿入は、ｂｒｏｗｎＤｏｍｉｎａｎｔ（ｂｗＤ）表現型を引き起こす（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。この優性対立遺伝子は、ヘテロクロマチン挿入が、対の野生型ｂｒｏｗｎコピー（ｂｗ＋）をトランスで不活化する（トランス不活化）ヘテロ接合性ハエ（ｂｗＤ／＋）において顕在化するようになる。ｂｗ＋／ｂｗＤハエの表現型は、プテリジン色素の不足による、薄茶色の斑入りの眼として観察される（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｄｒｅｅｓｅｎ，１９８９）。
【０１３０】
ＰＥＶを説明するため、様々な分子モデルが考察されている。ｗｈｉｔｅ−ｍｏｔｔｌｅｄに関しては、エピジェネティックな不活化は、染色体上のヘテロクロマチン状態の伝播に起因すると、しばしば推察されている（Ｌｏｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｔａｒｔｏｆ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。ｂｒｏｗｎ−ｄｏｍｉｎａｎｔ研究に主として由来する他のモデルは、遺伝子サイレンシングが、ヘテロクロマチンの局所的もしくは広範な対形成、及び／又は核内の改変された位置付けによると想像している（Ｃｓｉｎｋ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， １９９６； Ｃｓｉｎｋ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， １９９８； Ｐｌａｔｅｒｏ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。
【０１３１】
キイロショウジョウバエにおける遺伝学的研究は、ＰＥＶに関与している多数のトランス作用性因子の同定をもたらした（Ｅｌｇｉｎ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ， １９９７）。これらの研究は、ヘテロクロマチンの生化学のよりよい理解を可能にするが、高等生物において、ＰＥＶに関与しているシス作用性ＤＮＡモチーフに関しては、ほとんど何も知られていない。ヘテロクロマチン性クロマチン状態は、単に、タンデム配列反復の結果であるかもしれないことが示唆されている（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， １９９８ ＃９７により概説されている）。この示唆は、タンデム遺伝子反復によって引き起こされる遺伝子サイレンシングを意味する、リピート誘導サイレンシング（ｒｅｐｅａｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）（ＲＩＧＳ）と名付けられた現象とリンクしている。ＲＩＧＳは、シロイロナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）において最初に記載されたが（Ａｓｓａａｄ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、マウス及びハエのトランスジーンアレイにおいても観察されている（Ｄｏｒｅｒ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， １９９４； Ｄｏｒｅｒ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， １９９７； Ｇａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。
【０１３２】
真核生物のゲノムは、莫大な量の「非遺伝子」ＤＮＡ（例えば、サテライト）を含有しており、ＰＥＶは、このＤＮＡ画分の役割を突き止めるための、稀であるが、非常に限定された実験機会を提供する。ゲノムの大きな画分について機能を吟味し、割り当てることが困難であることを考慮し、本発明者らは、新規な手法及び道具の開発を極めて重要と見なしている。本発明者らが適用に成功した一つの手法は、人工ＤＮＡ配列特異的阻害剤の合成である（Ｇｉｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｓｔｒｉｃｋ ａｎｄ Ｌａｅｍｍｌｉ， １９９５）。本発明者らは、ＳＡＲ又はＭＡＲと呼ばれる足場（又はマトリックス）付着領域の生物学的役割を吟味することを試み、この経路へと至った。これらの因子は、おそらくは非遺伝子ＤＮＡ因子が機能を実行する様式の代表であろう異常な（「独特の（ｎｏｎｃｏｎｆｏｒｍｉｓｔ）」）機序によって生物学的効果を媒介するらしいため、興味深い（Ｌａｅｍｍｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。ＳＡＲの配列の顕著な特徴は、クラスターをなしたＡＴトラクトをもたらす短い混合配列スペーサーによって一般に隔離されている、多数のＡＴトラクト（Ａ及びＴ塩基の短い配列）である。標準的なシス作用性ＤＮＡ因子とは対照的に、ＳＡＲの特異的相互作用は、正確な塩基配列によって媒介されるのではなく、ＡＴトラクトの狭い副溝、及びおそらくは屈曲のような構造的なＤＮＡの特質によって媒介される（Ａｄａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９； Ｂｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２； Ｋａｓ ａｎｄ Ｌａｅｍｍｌｉ，１９９２）。
【０１３３】
ダーバン及び共同研究者ら（Ｄｅｒｖａｎ ａｎｄ Ｂｕｒｌｉ，１９９９）によって開発された技術に主として基づき、キイロショウジョウバエの異なるＤＮＡサテライトを標的とする化合物を合成し、特徴決定した（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。これらのサテライト特異的薬物は、発生中のキイロショウジョウバエへと供給された場合、明確な機能獲得表現型又は機能消失表現型をもたらしうることが観察された。詳細を、以下に記載する。
【０１３４】
実施例４
オリゴピロールＰ９によるｗｈｉｔｅ−ｍｏｔｔｌｅｄハエのＰＥＶの抑制
前記実施例に記載されたようにして、Ｐ９及びＰ３１と名付けられた２個のモノマーサテライト特異的化合物を合成し特徴決定した。Ｐ９（配列＝ＰｙＰｙＰｙ−β−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ〔式中、Ｐｙ＝Ｎ−メチルピロール、β＝β−アラニン、かつＤｐ＝ジメチルアミノプロピルアミド〕）は、ｎＭ以下の親和性で９Ｗ（Ａ又はＴ塩基）のＡＴトラクトと結合することが見出された。本発明者らは、蛍光タグ化Ｐ９を使用してＫｃ核及び多糸染色体を染色することにより、この化合物が主にサテライトＩ及びＩＩＩと結合することをさらに証明した。サテライトＩは短いＡＡＴＡＴリピートから構成されており、従ってＰ９の高親和性標的である。同様に、ＳＡＲ様サテライトＩＩＩの３５９ｂｐ単位中には多数のＡＴトラクトが存在するため、Ｐ９はこのリピートと特異的に結合することが予想された。化合物Ｐ３１（配列＝Ｉｍ−β−Ｉｍ−Ｐｙ−β−Ｉｍ−β−Ｉｍ−β−Ｄｐ〔式中、Ｉｍ＝Ｎ−メチルイミダゾール〕）は、サテライトＶの２個の連続ＧＡＧＡＡリピートと結合する。Ｐ３１のターゲティングも、核及び多糸染色体を染色するための蛍光標識化合物を使用して、エピフルオレセンスによって確証した。化合物Ｐ９及びＰ３１は、いずれも、図（６Ａ、Ｂ）中に提唱されるような水素結合スキームにより、１：１薬物−ＤＮＡ複合体で、ｎＭ以下の親和性で標的と結合することが見出された。
【０１３５】
本発明者らは、Ｐ９によるサテライトＩＩＩのＡＴトラクトの滴定が、ヌクレオソーム間リンカーにおける制限酵素又はトポイソメラーゼＩＩによる分解の助長によって明らかにされるように、このヘテロクロマチンブロックのオープニングをもたらすことをさらに確立した（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。同様の観察は、以前に、ジスタマイシンでなされた（Ｋａｓ ａｎｄ Ｌａｅｍｍｌｉ， １９９２）。さらに、本発明者らは、Ｐ３１がサテライトＩＩＩをオープンにする効力がＰ９と比較して相当低いことを観察したが、これは、おそらくはＡＴに対する低い親和性のためである。要約すると、本発明者らは、類似した分子量、結合親和性、標的部位サイズ、及び相互作用様式を有する２個のサテライト特異的ポリアミドを合成した。
【０１３６】
サテライトＩＩＩは、染色体Ｘのセントリックヘテロクロマチンの主成分であり、ｗｈｉｔｅ−ｍｏｔｔｌｅｄショウジョウバエのＰＥＶは、ｗｈｉｔｅ遺伝子（対立遺伝子ｗｍ４）をこのセントリックヘテロクロマチンに並置する逆位による。Ｐ９はサテライトをオープンにするため、本発明者らは、この薬物がｗｈｉｔｅ−ｍｏｔｔｌｅｄショウジョウバエのＰＥＶに影響するか否かを追究した。
【０１３７】
ｗｍ４ハエの眼表現型は、極めて不均一である。眼の約６５％が、強く斑入りしており、色素をほとんど有しない準白色から、全体的に白色の背景と多数の赤色パッチとを含有しているものまである（ｗｈｉｔｅ−ｍｏｔｔｌｅｄクラスとして定義される）。残りのハエは、橙色背景の中にしばしば比較的大きな赤色パッチを有する比較的暗い外見を有する眼を有している（ｒｅｄ−ｍｏｔｔｌｅｄクラス）。ｗｍ４ハエの表現型の不均一性のため、本発明者らは、これらの化合物を半合成ハエ培地と直接混合することにより、比較的大規模に実験を実施した。最終濃度１００μＭのＰ９、Ｐ３１を含有しているバイアル、又は化合物を含有していないバイアルを準備した。同数の５〜１０日令のｗｍ４ハエに、３６時間産卵をさせた。次いで、親を除去し、子孫の発達を１８℃という一定の温度で進行させた。本発明者らは、発達中のｗｍ４ハエ又は野生型ハエ（Ｃａｎｔｏｎ Ｓ）へと供給した際、Ｐ９及びＰ３１の有意な毒性を観察しなかった。発達期のタイミングも正常であり、この実験においては、一般に、バイアル１個当たりおよそ９０〜１６０匹のハエが羽化した（表２）。
【０１３８】
眼表現型分析のため、同一日に誕生したハエの幼虫を、薬物を含まないバイアルへと移し、その５日後に判定した。眼表現型を、解剖用顕微鏡下での検査の後に、ｗｈｉｔｅ−ｍｏｔｔｌｅｄ又はｒｅｄ−ｍｏｔｔｌｅｄと定義された２つのクラスへと分類した。この分析は、Ｐ９をＰＥＶの強い抑制剤として同定した。薬物の非存在下では、眼の６２％がｗｈｉｔｅ−ｍｏｔｔｌｅｄと判定され、Ｐ９の存在下で飼育されたハエについては、１１％のみがこの表現型を保持していた。Ｐ９処理時、ハエの約９０％が、ｒｅｄ−ｍｏｔｔｌｅｄ〜赤色の眼表現型を有していた（図７、ＡとＢを比較のこと。表２）。対照的に、Ｐ３１は、ハエの６４％がｗｈｉｔｅ−ｍｏｔｔｌｅｄのままであったため（図７Ｃ、表２）、ｗｍ４眼表現型に対する効果を有していなかった。
【０１３９】
さらにこれらの結果を定量化するため、雄の頭部３０個から赤色眼色素を抽出し、分光測定によりそれらの相対濃度を決定した。図（８）は、Ｐ９で処理されたハエに対応する赤色素レベルが、対照ハエ（薬物なし）、又はＰ３１を供給されたハエのレベルより約３倍高いことを示している。従って、Ｐ９は、極めて著しく、特異的にｗｍ４のＰＥＶを抑制し、野生型ハエの約５０％にまで赤色素レベルを回復させる（図３）。
【０１４０】
さらに、本発明者らは、Ｐ９が、染色体２Ｌの基底に挿入された斑入り化（ｖａｒｉｅｇａｔｉｎｇ）ｗｈｉｔｅレポータートランスジーンのＰＥＶを抑制しないことを見出したが（データは示していない）、このことは、Ｐ９によるＰＥＶの抑制が、Ｐ９のｗｈｉｔｅ遺伝子のプロモーターとの直接的な相互作用の結果である可能性は極めて低いことを示している（考察参照）。
【０１４１】
総合すると、これらの結果は、Ｐ９（Ｐ３１ではない）によるＰＥＶの抑制が、再編成されたｗｈｉｔｅ遺伝子のサイレンシングを減少させる、ＡＴトラクトの滴定に起因する特異的なクロマチンオープニングにより媒介されることを強く示唆している。
【０１４２】
実施例５
Ｐ３１（Ｐ９ではない）はｂｒｏｗｎ−ｄｏｍｉｎａｎｔハエにおける発達遅延を引き起こす　Ｐ９により誘導されるｗｈｉｔｅ−ｍｏｔｔｌｅｄ表現型の抑制は、注目すべき結果であった。それに刺激されて、本発明者らは、ｂｒｏｗｎ（ｂｗ＋）遺伝子と関係した異なるＰＥＶ現象を調査した。ヘテロクロマチンとの近接がシス不活化を引き起こすｗｈｉｔｅ−ｍｏｔｔｌｅｄとは対照的に、ｂｗＤ対立遺伝子により媒介されるＰＥＶは、トランス不活化によって起こる（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｃｏｍａｉ， １９９８）。ｂｗＤにおいて、ｂｒｏｗｎ遺伝子は、コーディング領域に、ヘテロクロマチン性ＧＡＧＡＡサテライトリピートの大きな単位の挿入を含有している。この優性対立遺伝子は、ヘテロクロマチン挿入が対にされた野生型ｂｒｏｗｎコピー（ｂｗ＋）をトランス不活化しているヘテロ接合性ハエ（ｂｗ＋／ｂｗＤ）において顕在化するようになる。
【０１４３】
ｂｗＤのＧＡＧＡＡリピート（ｂｗＤリピートとも呼ばれる）に対するＰ３１の感動的な特異性が、フットプリンティング技術及び免疫蛍光によって証明された。従って、Ｐ３１がヘテロ接合性ｂｗＤハエの眼表現型に影響するであろうか否かを試験することは、極めて興味深かった。ここでは、Ｐ９は、ＧＡＧＡＡリピートと結合しないため、対照化合物として機能する。実験は前記のｗｍ４の場合と同様である。最終濃度１００μＭのＰ３１、Ｐ９を含有している、又は化合物を含有していない、半合成ハエ飼料培地を含むバイアルを準備した。ｓｃａｒｌｅｔ（ｓｔ／ｓｔ）雄と交配されたホモ接合性（ｂｗＤ／ｂｗＤ）雌による産卵を、３６時間進行させた。この交配からの子孫は、ｂｒｏｗｎ遺伝子座に関してはヘテロ接合性であり、ｓｃａｒｌｅｔに関してはホモ接合性である（ｂｗＤ／＋；ｓｔ／ｓｔ）。ｓｃａｒｌｅｔ背景においては、ｂｗＤ眼色の改変を観察することが、はるかに容易となる（Ｔａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。
【０１４４】
対照実験において、Ｐ９に曝されたヘテロ接合性子孫の眼色表現型は薄く（淡黄色）、視覚的に又は眼色素濃度の決定によって判断されるように、薬物なし対照の表現型と区別することは不可能であった（図９Ａ）。ｗｍ４実験において観察されたのと同様に、本発明者らは、Ｐ９によるｂｗＤハエの処理時に、毒性又は発達期のタイミングの改変を認めなかった（表３）。これは、Ｐ３１で得られた結果と著しく対照的である。この化合物は、ハエ発達期のタイミングに大きく影響しただけでなく、得られた子孫の生存率を劇的に減少させた（表３）。２令幼虫の出現に関しては、ほぼ正常なタイミングが認められたが、本発明者らは、蛹化及び羽化の両方に６５〜７５時間の重度の遅延を観察した。この遅延にもかかわらず、ほぼ正常な数の子孫が羽化したが、これらの新生ハエは、脆弱であるらしく、しばしばハエの洪水の中で溺死した。
【０１４５】
Ｐ３１処理子孫の眼表現型の検査は、赤色個眼を含むスポットを、Ｐ９又は未処理ハエと比較して多数含有していることを明らかにした（図９Ａ及びＢ）。これは、眼色素濃度のわずかな増加にも反映される（図８）。小さいが再現可能な眼色素沈着の増加は、ｂｗ＋機能の真の増加ではなく、それらのより進行した令（羽化が６５〜７５時間遅れた）を反映しているのかもしれない。眼色素沈着が出生後に増大することは周知であり、例えば（ｂｗＤ／＋；ｓｔ／ｓｔ）遺伝子型の未処理ハエは、出生時には白色であるが、２日目に薄黄色となる（わずかに色素沈着が起こる）。対照的に、Ｐ３１処理ハエは、出生時、２〜３日目の対照のものとほぼ一致する眼色素沈着レベルを有している。
【０１４６】
要約すると、Ｐ３１によるヘテロ接合性ｂｗＤハエの処理は、有意な程度にはトランス不活化を克服しない。眼表現型は、薄く、強い斑入りのままである。しかし、興味深いことに、Ｐ３１（Ｐ９ではない）は、２日を超える重度の発達遅延を誘導し、Ｃａｎｔｏｎ Ｓハエ又はｗｍ４ハエの処理では観察されなかった、極めて脆弱なハエの子孫を与える。
【０１４７】
Ｐ３１により誘導される発達遅延の、ｂｗＤ対立遺伝子に対する印象的な依存性は、Ｐ３１とＧＡＧＡＡインサートとの間の直接的な相互作用が、何らかの方法で、（１個以上の）発達上の欠陥を引き起こすことを示唆した。この概念と一致して、本発明者らは、発達遅延に対するＰ３１の効果が、ヘテロ接合性ｂｗＤハエよりホモ接合性ｂｗＤハエにおいて重度であることを見出したため、ｂｗＤインサートの効果が定量的であることを見出した。本発明者らは、子孫の約３分の２が蛹期に死亡し、極少数の脆弱なハエが約６５〜７５時間遅れて羽化したことを観察した。これらの実験は、ｂｗＤ対立遺伝子のＧＡＧＡＡインサートとその標的化合物Ｐ３１との間の注目すべき分子的インタープレイを確立した。
【０１４８】
実施例６
ｂｒｏｗｎ−ｄｏｍｉｎａｎｔハエにおいて、Ｐ３１はＴｒｉｔｈｏｒａｘ様対立遺伝子Ｔｒｌ１３Ｃを模倣する
Ａ６→Ａ５ホメオティック変成：驚くべきことに、Ｐ３１子孫のより精密な検査は、第６腹節（Ａ６）のＡ５への明白な変成を明らかにした（図９Ｃ）。このホメオティック変成は、雄において、Ａ５とは対照的に、本来は剛毛がない、腹側Ａ６に存在する剛毛によって顕在化する。剛毛誘導は、Ｐ３１　ｂｗＤ／＋子孫の９０％超に見出され（表３）、各々がＡ６上に１〜１０本（平均＝３．７５本）の剛毛を示した。対照的に、Ｐ９で処理された対照の雄においてはＡ６上に剛毛が観察されなかった。重要なこととして、ｂｒｏｗｎ遺伝子座が野生型であるハエ（例えば、ｗｍ４、表３参照）においては節Ａ６上に剛毛が見出されることはなかったため、Ａ６→Ａ５変成は、Ｐ３１及びｂｗＤ遺伝子型の両方を必要とする。
【０１４９】
前述のように、ｂｗＤホモ接合性は、Ｐ３１により媒介される発達遅延を増加させた。この観察は、Ａ６→Ａ５変成にも及ぶ。Ｐ３１に曝されたヘテロ接合性子孫の約１０％がＡ６上の剛毛を欠いていたが、判定されたホモ接合性ｂｗＤ雄４０匹は全て３〜１０本（平均値＝６本、表３）の剛毛を有していた。従って、このホメオティック変成及び発達遅延は、少なくとも１個のｂｗＤ対立遺伝子を必要とし；両者は、ｂｗＤホモ接合性子孫においてより大きい浸透度を有するようになる。この観察は、ｂｗＤ対立遺伝子と、Ｐ３１に対する感受性との間の分子的リンクをさらに補強する。
【０１５０】
Ａ６→Ａ５変成は、Ａｂｄ−Ｂ遺伝子のいくつかの機能消失対立遺伝子に特徴的であるが、Ｔｒｉｔｈｏｒａｘグループに属する遺伝子の突然変異に関しても観察される（Ｋｅｎｎｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。特に、Ａ６→Ａ５変成は、以前に、ＧＡＧＡ因子（ＧＡＦ（Ｆａｒｋａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４））をコードするＴｒｉｔｈｏｒａｘ様遺伝子のＴｒｌ１３Ｃ対立遺伝子に関しても観察された。Ｔｒｌ１３Ｃは、Ｔｒｌ遺伝子の第１イントロンの中に、中程度に減少したＧＡＦタンパク質レベルをもたらすらしいＰ因子の挿入を有している（Ｂｈａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｆａｒｋａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。ＧＡＦ遺伝子の２個の推定的な無発現突然変異（ＴｒｌＲ６７、ＴｒｌＲ８５）は、幼虫期後期における致死をもたらした（Ｆａｒｋａｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。卵中の大きい母系性のＧＡＦ沈着が幼虫期までの発達の進行を可能にするため、致死は後期に起こるのかもしれないことが示唆されている（Ｂｈａｔ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。
【０１５１】
実施例７
ｓｅｘ ｃｏｍｂ ｒｅｄｕｃｅｄ表現型：Ｐ３１の存在下で飼育されたＴｒｌ１３ＣハエとｂｗＤハエとの間で観察された表現型の相似（Ａ６→Ａ５変成）は、この薬物が何らかの方法でＧＡＦ機能に干渉することを示唆した。従って、本発明者らは、付加的なＴｒｌ１３Ｃ表現型のＰ３１による化学的模倣を検査した。ｔｒｉｔｈｏｒａｘグループ（ｔｒｘ−Ｇ）遺伝子のうちのいくつかは、ｓｅｘ ｃｏｍｂ ｒｅｄｕｃｅｄ（Ｓｃｒ）遺伝子の発現に関与していることが知られている（Ｋｅｎｎｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。本発明者らは、Ｔｒｌ遺伝子も関与しているか否かを試験した。このため、本発明者らは、他の付加的な表現型は記載されていない生存可能なホモ接合性ハエを時々生じさせるＴｒｌ１３Ｃ対立遺伝子を使用した（Ｆａｒｋａｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。本発明者らは、性櫛１個当たりの突起の数に関してホモ接合性Ｔｒｌ１３Ｃ雄を判定し、それらが野生型ハエと比較して有意に減少していることを観察した（表３）。Ｃａｎｔｏｎ Ｓ．ハエ及びＯｒｅｇｏｎ Ｒ． ハエにおいては、平均で、性櫛１個当たり約１１本の突起が見い出されるが、本発明者らは、ホモ接合性Ｔｒｌ１３Ｃにおいて８．６本という平均数を測定し、約３分の１は性櫛１個当たり７本の突起しか有していないことも見出した。さらに、Ｐ３１もホモ接合性／ヘテロ接合性ｂｗＤハエにおいてｓｅｘ ｃｏｍｂ ｒｅｄｕｃｅｄ表現型を模倣するか否かを試験するため、本発明者らは、Ｐ３１又はＰ９でこれらのハエを処理した後、雄の脚を解剖した（表３）。本発明者らのデータは、Ｐ３１の存在下で飼育されたヘテロ接合性ｂｗＤ子孫が、主として７〜８本（平均＝８．１本）の性櫛突起を有していたこと、及びホモ接合性の場合には、この分布がより低い数、主として６本（平均＝７．２本）へとしばしばシフトしたことを示している（図１０及び表３）。従って、この表現型は、ｂｗＤ対立遺伝子に依存しており、ホモ接合性によって増強される。薬物の存在下で飼育された、ｗｍ４ハエ（表３）又はその他のハエストック（下記参照）では、突起の減少は観察されなかった。
【０１５２】
要約すると、ｂｗＤハエのＰ３１処理は、Ｔｒｌ１３Ｃ突然変異体の、Ａ６→Ａ５ホメオティック変成、及びＳｃｒ表現型を模倣する。さらに、ホモ接合性Ｔｒｌ１３Ｃ／Ｔｒｌ１３Ｃハエは、ｒｏｕｇｈ−ｅｙｅ表現型を示すことが知られており（Ｆａｒｋａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）、本発明者らは、ｂｗＤ子孫においても、Ｐ３１による処理の後、わずかな眼の形態異常（ｒｏｕｇｈｅｎｉｎｇ）を観察した（データは示していない）。
【０１５３】
Ｐ３１はヘテロ接合性ｂｗＤ／ｂｗ；Ｕｂｘ１／＋ハエにおける平均棍→翅変成を増強する：ＧＡＧＡ因子は、Ｕｂｘのプロモーターと結合し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでその転写を刺激することが知られている（Ｂｉｇｇｉｎ ａｎｄ Ｔｊｉａｎ， １９８８）。Ｔｒｌ１３Ｃは、Ｕｂｘヘテロ接合体において観察される体節変成を優性に増強するため、Ｔｒｌ遺伝子座もＵｂｘと遺伝学的に相互作用している。すなわち、Ｔｒｌ及びＵｂｘに関して二重ヘテロ接合性のハエは、Ｕｂｘ／＋ハエよりも多く翅様構造へと変成される平均棍を保有している（Ｆａｒｋａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。本発明者らは、Ｐ３１がＵｂｘとＴｒｌ１３Ｃとの遺伝学的相互作用も化学的に模倣するか？を追究した。この問題を解決するため、本発明者らは２個の遺伝子型＋／＋；Ｕｂｘ／＋及びｂｗＤ／ｂｗＤ；Ｕｂｘ１／＋にＰ３１を供給した。後者の遺伝子型は、ｂｗＤ／ｂｗＤ；ｓｔ／ｓｔ雌とｂｗＤ／ｂｗＤ；Ｕｂｘ１／Ｔｍ３，ｓｂ雄との交配により得られた。
【０１５４】
Ｐ３１の存在下で飼育されたこれらの２個の遺伝子型の子孫を、Ａ６→Ａ５変成及び平均棍→翅変成の両方に関して、そしてｓｅｘ ｃｏｍｂ ｒｅｄｕｃｅｄ表現型に関してスコア化した（表３）。本発明者らは、Ｐ３１による処理時、Ｕｂｘ１／＋ハエの子孫においては改変された表現型を観察しなかった（図１１Ｃ、表３）。対照的に、ｂｗＤ／ｂｗＤ；Ｕｂｘ１／＋ハエにおいては、表現型の重度の改変が認められた。Ｐ３１は、それらの発達を、しばしば蛹期より前に、完全に阻止し、新生ハエを与えなかった（表３）。しかしながら、それらのうち（およそ１００匹のうち）８匹は、蛹期後期にまで達し、従って形態学を吟味するために解剖され得た。これらの蛹は全て、２〜６本の剛毛を有する強いＡ６→Ａ５ホメオティック変成（表２）、及び性櫛突起の有意な減少（図５）を有していた。さらに、Ｕｂｘ１に関してヘテロ接合性であり、かつｂｗＤに関してはホモ接合性であった蛹（ｂｗＤ／ｂｗＤ；Ｕｂｘ１／＋）８匹のうちの５匹は、平均棍→翅変成の明らかな徴候を示した（図１１）。この変成は、平均棍の拡大されたサイズ及び灰色という色によって顕在化し、翅の腹側の縁に特徴的な多数の剛毛の、平均棍の基部への出現によっても顕在化した。従って、薬物Ｐ３１と組み合わされたｂｗＤ対立遺伝子は、Ｕｂｘ表現型を増強する。本発明者らは、ｂｗＤ遺伝的背景におけるＰ３１による化学的模倣は、Ｔｒｌ１３ＣのＵｂｘとの遺伝学的相互作用にも拡張されると結論付ける。
【０１５５】
実施例８
Ｐ３１によるＧＡＧＡＡサテライトリピートの大量のオープニング
ＧＡＦは、ＧＡリッチ配列と結合する（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。ＧＡＦの結合配列には相当の可変性が存在するが、ＮＭＲ研究は、最適なコンセンサスとしてペンタマー配列ＧＡＧＡＧを同定した〔中央のＧを除く一塩基対突然変異はＧＡＦ結合に対する中程度の効果のみを有する〕（Ｏｍｉｃｈｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。最近の研究は、単一のトリヌクレオチドリピートＧＡＧが、しばしば、特異的なＧＡＦ相互作用を定義するのに十分であること（Ｗｉｌｋｉｎｓ ａｎｄ Ｌｉｓ，１９９８）、及びこのタンパク質が複数の結合部位と協同的に結合しうることを示した（Ｋａｔｓａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。
【０１５６】
Ｐ３１がＧＡＦコンセンサス配列（ＧＡＧＡＧ）と結合するか否かを試験するため、本発明者らは、２個の連続するｂｗＤリピート（ＧＡＧＡＡＧＡＧＡＡ）に加えて、Ｕｂｘプロモーター配列に相当するＧＡＦに対する高親和性結合部位を含むＤＮＡプローブを使用して、フットプリンティング分析を実施した（Ｂｉｇｇｉｎ ａｎｄ Ｔｊｉａｎ，１９８８）。フットプリントデータの検査は、Ｐ３１は０．１ｎＭの濃度でｂｗＤリピートを保護するが、２５ｎＭまでのリガンド濃度でＵｂｘ　ＧＡＦ部位における結合は認められないことを示した（図７Ａ参照、（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。本発明者らは、ＧＡＦのこの同ＤＮＡプローブとの相互作用も研究し、Ｐ３１とは対照的に、このタンパク質がｂｗＤリピート及びＵｂｘ部位の両方を保護することを観察した（図２Ｂ、（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００））。
【０１５７】
データベース検索は、プロモーター近位ＧＡＦ結合部位が、通常、ｂｗＤリピートから構成されるのではなく、ＧＡＧＡＧコンセンサス、又は複数のＧＡＧモチーフのいずれかによって定義されることを示した。これらの部位はＰ３１にとって不充分な標的であるため、この化合物が遺伝子制御に直接的に干渉する可能性は低いと結論付けられうる。Ｐ３１は、ｂｗＤ遺伝的背景においてのみ活性であるという観察は、この示唆を強く支持する。
【０１５８】
では、化学的に誘導されたＰ３１表現型とｂｗＤサテライトインサートとの間の分子的リンクは何であるのか？　免疫蛍光研究は、ＧＡＦが、細胞周期中、ユークロマチン結合部位とヘテロクロマチン結合部位との間を往復することを証明した。有糸分裂中、ＧＡＦは、中期染色体のヘテロクロマチン性ＡＧリッチサテライトと結合している（Ｐｌａｔｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｒａｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。対照的に、ＧＡＦは、間期多糸染色体のヘテロクロマチン性染色中心からは能動的に排除され、その代りに、ユークロマチン性腕上の数百個の部位と結合しているらしい（Ｒａｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｔｓｕｋｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。染色中心におけるＧＡＦ染色の欠如は、おそらくは、検出の問題、及びこのヘテロクロマチン性サテライトの選択的な過小複製による（本発明者らは、蛍光性Ｐ３１により染色中心にｂｗＤサテライトシグナルを検出し得なかった）。しかし、（Ｐｌａｔｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８）による免疫蛍光研究は、ＧＡＦが、実際、間期においてはヘテロクロマチンではなくユークロマチンと結合していることを証明した。間期核とは対照的に、有糸分裂期染色体のヘテロクロマチン性ＧＡＧＡＡサテライトには強いＧＡＦ染色が観察された。従って、ＧＡＦは、明らかに、有糸分裂中はヘテロクロマチンと結合しており、次いで間期には多数のユークロマチン遺伝子座へと再分布される。
【０１５９】
トポイソメラーゼＩＩによる分解の大量の刺激によって測定されるように、Ｐ９はヘテロクロマチン性サテライトＩＩＩをオープンにすることが証明された（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．．２０００）。本発明者らは、もしかすると、Ｐ３１が、ｂｗＤインサートをオープンにすることにより、ＧＡＦ結合のためのこのヘテロクロマチンの接近可能性を高めるためのかもしれないと主張した。この問題を解決するため、本発明者らは、透過性化されたｂｗＤ唾液腺をＰ３１、Ｐ９のいずれかと共に、又は薬物なしでインキュベートし、次いでＧＡＦ（免疫蛍光による）、全ＤＮＡ（ＤＡＰＩによる）、及びｂｗＤインサート（Ｐ３１Ｔによる）に関して多糸核を三重染色した。染色された多糸腺を、多数の核を検査するため、押しつぶすことなく優しく顕微鏡検のため取り付けた。
【０１６０】
図（１２）は、化合物の非存在下で、又はＰ９と共にインキュベートされた多糸核を示している（上列）。完全な核の厚い多糸腕（青色）は伝播されていないが、ＧＡＦのユークロマチン位置が鮮明な緑色の帯として観察される。ｂｗＤインサートの位置は、Ｐ３１Ｔにより、単一スポットとして赤色で強調されている。注意深い検査は、ｂｗＤをマーキングするＰ３１Ｔシグナルの位置にＧＡＦ染色が起こっていないことを明らかにした。これは、黒色及び白色の挿入写真において、緑色ＧＡＦシグナルが赤色Ｐ３１Ｔシグナルと重複していないため、特に明らかである（図１２、上列）。唾液腺のＰ９への曝露の後に観察された染色パターンは、薬物なしで得られたものと同一である。これらの顕微鏡写真は、ｂｗＤインサート上にＧＡＦシグナルを認めなかった（Ｐｌａｔｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８）により報告された観察を確証する。明らかに、Ｐ９はこのパターンを改変させない。
【０１６１】
対照的に、透過性化された多糸腺のＰ３１とのインキュベーションは、ＧＡＦ（緑色）及びＰ３１Ｔ（赤色）の大量の共局在によって顕在化すれる、劇的なＧＡＦ再分布をもたらす（図７、下列）。これも、緑色ＧＡＦ及び赤色Ｐ３１Ｆの共局在が明らかな、黒色及び白色の挿入写真において最もよく観察される。これらの核の検査は、さらに、ユークロマチン部位におけるＧＡＦ染色が相当に弱いらしく；より少ない部位が観察され、シグナルの強度が減少していることを示す。この観察は、Ｐ３１（Ｐ９ではない）がヘテロクロマチン性ｂｗＤサテライトをオープンにしてＧＡＦ結合を可能にし、ユークロマチン部位からヘテロクロマチン部位へのＧＡＦの大量の再分布をもたらすことを強く示唆する。従って、Ｐ３１処理ｂｗＤハエにおいても類似の再分布が起こっており、ユークロマチン機能のためのＧＡＦの利用可能性の減少が、観察されたホメオティック変成によって顕在化するような、ＧＡＦの「化学的な」遺伝子量効果をもたらすのだと想像することは合理的である。
【０１６２】
セクションＩＩの考察
ＰＥＶに関与しているＤＮＡ配列モチーフをよりよく定義する道具としての配列特異的ポリアミドの実験的可能性が探求された。このエピジェネティック現象は、サテライトヘテロクロマチンの大きなブロックによりシス又はトランスで媒介される確率論的な遺伝子不活化から発生する。２個のサテライト特異的ＤＮＡ結合薬を合成し、ＰＥＶ表現型を示す発達中のキイロショウジョウバエへと供給した。注目すべきことに、これは、使用される薬物及びハエの遺伝的背景に依存して、機能の獲得又は消失をもたらした。最も充分であるのは、なされた実験観察の相互性である。ポリアミド薬Ｐ９（Ｐ３１ではない）はｗｈｉｔｅ−ｍｏｔｔｌｅｄハエのＰＥＶを抑制し（機能獲得）、Ｐ３１（Ｐ９ではない）はｂｒｏｗｎ−ｄｏｍｉｎａｎｔハエにおいてホメオティック変成を媒介した（機能消失）。両現象は、分子的には、薬物により標的とされたＤＮＡサテライトのクロマチンオープニングによって説明される。
【０１６３】
化合物　この研究において使用されたサテライト特異的ＤＮＡ副溝結合薬は、セクションＩにおいて詳細に特徴決定された。簡単に記載すると、化合物Ｐ９は９個（又はそれ以上）のＷのＡＴトラクトを標的とピロールヘキサマーであり、Ｐ３１はイミダゾール単位及びピロール単位の両方から構成されており、２個の連続するＧＡＧＡＡリピートと結合する。両化合物は、それらのＤＮＡ標的配列に対するｎＭ以下の親和性を保有しており、いずれも、１：１（薬物−ＤＮＡ）複合体として結合することが見出された。これらの化合物の主要な核標的は、単離されたＫｃ核及び多糸染色体を蛍光性誘導体（Ｐ９Ｆ及びＰ３１Ｔ）で染色することにより、エピフルオレセンス顕微鏡検を使用して、直接的に明らかにされた。両染料は、Ｋｃ核内の別々の焦点をはっきりとマーキングした。Ｐ９Ｆは主にサテライトＩ及びＩＩＩを標的とし、Ｐ３１ＴはＧＡＧＡＡリピートから構成されたサテライトＶを標的とする（図４＆５、（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．．２０００）参照）。
【０１６４】
ｗｈｉｔｅ−ｍｏｔｔｌｅｄ　本発明者らは、発達中のｗｍ４ハエへのオリゴピロールＰ９の供給が、得られる子孫におけるＰＥＶを有意に抑制することをここで証明した。対照的に、Ｐ３１及び２個の他の化合物は、このハエ系統に対する活性を有していなかった。この結論は、眼表現型の統計的分析及び視覚的分析、並びに単離された眼の抽出により得られた色素レベルの定量的測定に基づく（図２）。この薬理学的実験は、各処理につき９０匹以上の子孫ハエを用いて、比較的大規模に実施され、高度に再現可能であることが見出された。
【０１６５】
ｗｈｉｔｅ−ｍｏｔｔｌｅｄ（ｗｍ４）ハエのＰＥＶは、ｗｈｉｔｅ遺伝子をＸ染色体のヘテロクロマチンの近くに並置する大きな逆位から発生する。このセントリッククロマチンの主成分は、クラスターをなした、可変性のサイズを有する一般に長いＡＴトラクトが配列の顕著な特徴であるＳＡＲ（足場付着領域（Ｋａｓ ａｎｄ Ｌａｅｍｍｌｉ，１９９２））と同様の機能上の挙動を示す、サテライトＩＩＩである。サテライトＩＩＩの３５９ｂｐリピート単位は、７個以上（平均９．４個）のＷ塩基のＡＴトラクトを１０個含有しており、２個の同調された（ｐｈａｓｅｄ）ヌクレオソームに適合している。本発明者らは、オリゴピロールＰ９によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのこれらのＡＴトラクトの滴定が、サテライトＩＩＩを巻き戻すことを証明している（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）。これは、トポイソメラーゼＩＩによる分解の強い助長によって顕在化する。分解は、２個のヌクレオソームリンカーＤＮＡ領域のうちの１個において起こることが知られている（Ｋａｓ ａｎｄ Ｌａｅｍｍｌｉ，１９９２）。
【０１６６】
これらの結果に基づき、Ｐ９が、発達中のハエへ供給された時、サテライトＩＩＩをオープンにし、ヘテロクロマチン状態のｗｍ４への伝播を減少させることにより、類似の挙動を示すと想像することは合理的である。本発明者らの実験は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのクロマチンオープニングとハエにおけるＰＥＶ抑制との間の完璧な相関を明らかにした。サテライトＩＩＩをオープンにする程度が相当低かったＰ３１は、ｗｍ４ハエのＰＥＶを抑制しなかった。ＰＥＶに関与しているシス作用性因子は遺伝学的に同定されていない。ここに提示された薬理学的研究、及び本発明者らの以前のＭＡＴＨ２０発現実験（Ｇｉｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８）は、この重要なエピジェネティック現象を研究するための新規な手法を提供する。両実験系列は強く一致しており、そのことは、ｗｍ４におけるヘテロクロマチン状態及び遺伝子サイレンシングの確立にサテライトＩＩＩの多数のＡＴトラクトが関与していることを示している。
【０１６７】
本発明者らは、Ｐ９及びＭＡＴＨ２０が広範な効果によってヘテロクロマチンのｗｍ４への伝播を減少させる可能性を有望視しているが、ｗｈｉｔｅ遺伝子近傍の局所的結合部位（局所ＳＡＲ）が関与している可能性を完全に除外することはできない。本発明者らは、Ｃ３／２Ｌ及びＢＬ２／Ｙと呼ばれる、２個の異なる斑入りｍｉｎｉｗｈｉｔｅレポーター遺伝子に対するＰ９の効果を研究することにより、この問題を解決することを試みた（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｗａｌｌｒａｔｈ ａｎｄ Ｅｌｇｉｎ，１９９５）。本発明者らは、Ｐ９がこれらのストックにおけるＰＥＶを抑制しないことを観察した（データは示していない）。この観察は、Ｐ９によるＰＥＶの抑制が一般的な現象ではないことを証明するが、Ｃ３／２Ｌ及びＢＬ２／Ｙハエのｍｉｎｉｗｈｉｔｅレポーター遺伝子が、近くのＰ９応答因子を欠いているという可能性もあるため、Ｐ９がより局所的にｗｍ４に対して作用する可能性は除外されない。にも関わらず、本発明者らは、局所作用様式の可能性は低いと見なしており；典型的なＳＡＲの０．５ｋｂと比して巨大である１１ＭｂというサテライトＩＩＩの標的サイズには、広範伝播モデルが都合がよい。
【０１６８】
ＰＥＶがｗｍ４へのヘテロクロマチンの伝播により起こるという概念は、シスサイレンシングがユークロマチン外見からヘテロクロマチン外見への細胞学的変化と相関していることを証明する形態学的研究に由来する（Ｂｅｌｙａｅｖａ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｕｍｂｅｔｏｖａ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。従って、この細胞学的変化が、Ｐ９の存在下で飼育されたハエにおいて逆転されるか否かを研究することは興味深いであろう。
【０１６９】
ｂｒｏｗｎ−ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｂｒｏｗｎ−ｄｏｍｉｎａｎｔ表現型は、相同染色体（一方はｂｗＤ対立遺伝子を保持し、もう一方はｂｒｏｗｎに関して野生型である）の対形成による。ヘニフコフ（Ｈｅｎｉｆｋｏｆｆ）のグループによる重要な遺伝学的実験及び細胞学的実験は、ｂｗＤインサートが、同染色体上に位置するセントリックヘテロクロマチンとの異常な核相互作用を媒介すると想像する魅力的なモデルをもたらした。従って、このモデルによると、ｂｗＤインサートは、対にされたｂｗ＋遺伝子をヘテロクロマチン環境へと固定する。次いで、この異常な局在、ヘテロクロマチン性核コンパートメントが、ｂｗ＋遺伝子のサイレンシングを媒介すると推察される（Ｃｓｉｎｋ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， １９９６； Ｔａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。
【０１７０】
本発明者らの薬理学的実験は、発達中のヘテロ接合性ｂｗＤハエへのＰ９又はＰ３１の供給が、それらの眼表現型に有意には影響しないことを示した。下記の本発明者らの観察は、発達中のｂｗＤ／＋ハエ又はｂｗＤ／ｂｗＤハエへのＰ３１の供給が、Ｔｒｌ（ＧＡＦ）遺伝子のＴｒｌ１３Ｃ対立遺伝子の表現型効果を模倣することを確立した。Ｔｒｌ１３Ｃ対立遺伝子は、ｗｍ４の斑入り表現型を増強（抑制ではない）することが既知であるが、それは、ｂｗＤ／＋ハエの眼表現型には影響しない（Ｓａｓｓ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， １９９８）。従って、Ｐ３１は発達中のハエにおいてＴｒｌ１３Ｃ突然変異（ＧＡＦ機能の部分的消失）を模倣するため、Ｐ３１がｂｗＤ／＋ハエの眼表現型に影響しないことは驚くべきことではない。
【０１７１】
驚くべきことに、Ｐ３１は、発達遅延及びいくつかの明確なホメオティック変成を媒介した。これらの表現型は、全て、ｂｗＤ対立遺伝子の存在に依存し、ｂｗＤの遺伝子量に対し依存性である。ホモ接合性Ｔｒｌ１３Ｃ雄ハエは、腹節Ａ６をＡ５へとホメオティックに変成することが知られている。これは、Ａ６上の剛毛の出現によって観察される（Ｆａｒｋａｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。この変成は、ｂｗＤヘテロ接合性ハエにＰ３１（Ｐ９ではない）を供給することにより「表現型模写」され、ｂｗＤホモ接合性によって増強される（図４、表３）。同じ近似が、ｓｅｘ ｃｏｍｂ ｒｅｄｕｃｅｄ表現型に関して存在する。ホモ接合性Ｔｒｌ１３Ｃ／Ｔｒｌ１３Ｃ雄ハエにおいて、本発明者らは、性櫛１個当たりの突起の減少した数を計数した。これは、Ｓｃｒ遺伝子とＴｒｌ遺伝子との間の遺伝学的相互作用を確立する。類似の減少が、Ｐ３１の存在下で飼育されたｂｗＤ／＋雄において観察され、ｂｗＤ／ｂｗＤ雄においては、性櫛１個当たりの突起の数がさらに減少している（図１０、表３）。従って、Ｐ３１は、薬理学的に驚くほどよくＴｒｌ１３Ｃ対立遺伝子を模倣するが、これは、ヘテロクロマチン性ＧＡＧＡＡインサートを保持しているｂｗＤハエに限定されている。他の遺伝的背景へのＰ３１供給が、これらのホメオティック機能をもたらすことはなかった。
【０１７２】
Ｔｒｌ１３Ｃは、ＧＡＦコーディング遺伝子のイントロン１にＰ因子挿入を保持している。詳細な研究は、この対立遺伝子が低形質性であることを示唆している。従って、観察された表現型は、減少したＧＡＦの用量によると推測される、部分的なＴｒｌの機能の消失から発生する（Ｂｈａｔ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｆａｒｋａｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。観察された薬理学的表現型は、Ａｂｄ−Ｂ及びＳｃｒの機能消失対立遺伝子に相当する。ｂｉｔｈｏｒａｘ複合体のＡｂｄ−Ｂ遺伝子は、腹節Ａ５〜Ａ８の正常な発達に必要とされる。対立遺伝子Ｔｒｌ１３Ｃ及び薬物Ｐ３１がセグメントＡ６にのみ影響するという観察は、シス作用性因子ｉａｂ−６がＧＡＦの標的であることを暗示する（Ｃｅｌｎｉｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。同様に、クロマチン免疫沈降実験は、ＧＡＦがｉａｂ−６因子と結合していることを明らかにした（Ｓｔｒｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。Ｓｃｒ遺伝子に関する分子情報は入手されていないが、Ｔｒｘ−Ｇの遺伝子の突然変異が、Ｓｃｒの機能消失表現型をもたらしうることは周知である。
【０１７３】
Ｐ３１の効果と低形質対立遺伝子Ｔｒｌ１３Ｃとの間の強い表現型上の近似は、Ｐ３１による薬理学的模倣が、減少したＧＡＦ用量から発生することを示唆する。しかしながら、本発明者らは、Ａｂｄ−Ｂ及びＳｃｒの中の遺伝子制御性結合部位に対してＰ３１が主に直接的に作用する可能性を、事実上、除外することができる。第一に、Ｐ３１は、典型的なＧＡＦ結合部位と相互作用しないし（図３、（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）参照）、そのように予想もされない。第二に、ｂｗＤ対立遺伝子の必要性が、Ｐ３１の効果が、このヘテロクロマチン性インサートによって分子的に媒介されることを確立する。
【０１７４】
ＧＡＦは、極めて興味深い細胞周期挙動を示す。それは、中期にはセントリックヘテロクロマチンと結合し、間期には多数のユークロマチン部位へと移動させられる（Ｇｒａｎｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｐｌａｔｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｒａｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。透過性化された多糸腺を用いた本発明者らの実験は、ユークロマチン性結合部位からヘテロクロマチン性ｂｗＤへのＧＡＦの大量の再分布を、Ｐ３１（Ｐ９ではない）が媒介することを示した。多糸染色体のｂｗＤインサートは、薬物で処理しない場合、又はＰ９へ曝した場合にはＧＡＦを欠いているが、Ｐ３１の存在下ではＧＡＦに高度に富んでいる（図７）。本発明者らは、Ｐ３１処理ハエにおけるｂｗＤインサートが、ＧＡＦのための分子シンクとして機能する（そして、セントリックＧＡＧＡＡリピートもそうである）と推察する。これは、Ｐ３１によって媒介されるクロマチンオープニングによって達成される。本発明者らは、間期におけるＧＡＦのヘテロクロマチンへの不適当な再分布は、ユークロマチン性部位におけるＧＡＦの枯渇をもたらすと推察する。代わって、減少したＧＡＦの利用可能性が、観察されたＴｒｌ１３Ｃ対立遺伝子の模倣、すなわち部分的なＧＡＦ機能消失をもたらす。本発明者らの再分布実験は、生存ハエ胚ではなく、透過性化された腺を用いて実施されたが、それはＰ３１がＧＡＦの染色体分布に干渉しうることを証明している。
【０１７５】
ＧＡＧＡＡインサートのＰ３１によるクロマチンオープニングは、広範に起こりうるが、Ｐ３１とＧＡＦとが同一標的配列と共結合しうるか否かを決定することは興味深かった。ＧＡＧＡＧコンセンサス配列と複合体化されたＧＡＦの溶液構造は、その単一ジンクフィンガー及び基本ドメイン（ＢＲ２）が主溝に収縮し、もう一つの基本ドメイン（ＢＲ１）が副溝へと巻き付いている、モジュラー結合様式を明らかにした（Ｏｍｉｃｈｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。これらの基本ドメインは、高親和性相互作用（Ｐｅｄｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６）にとって必要とされるが、本発明者らは、競合結合実験において、Ｐ３１及びＧＡＦがＧＡＧＡＡリピートと共結合しうることを観察した（データは示していない）。
【０１７６】
クロマチンオープニングモデルは、定量的に合理的であるか？　ｂｗＤ動物におけるＧＡＧＡＡリピートの付加的な画分は、ヘテロ接合性遺伝子型及びホモ接合性遺伝子型でそれぞれおよそ１７％又は３４％に達する（Ｐｌａｔｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。Ｐ３１がｂｗＤリピート及びセントリックリピートを同様にオープンにすると仮定すると、ユークロマチン機能のため利用可能なＧＡＦ濃度は、ｂｗ＋ハエと比較して、１７％（ｂｗＤ／ｂｗ＋）又は３４％（ｂｗＤ／ｂｗＤ）減少するであろう。本発明者らは、（ユークロマチン性部位における）この程度の画分減少が、ＧＡＦ遺伝子機能に影響しうると推察することを合理的とみなしている。Ｕｂｘ、ｅｎｇｒａｉｌｅｄ、及びｈｓｐ７０のような、発現のためにＧＡＦを必要とするほとんどの遺伝子が、複数の結合部位を含有しており、ＧＡＦは、そのＰＯＺドメインを介したオリゴマー化によってそのような因子と高度に協同的に結合することが知られている（Ｋａｔｓａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。従って、ＧＡＦ濃度の比較的小さい変化は、いくつかの遺伝子の活性に有意に影響しうると思われる。クロマチンオープニングに関する前記のモデル及びＧＡＦリクルートメントモデルが正しいとすれば、ＧＡＦの過剰発現は、ｂｗＤハエにおけるＰ３１の効果を減少させるはずである。例えば、セントリックヘテロクロマチン及びｂｗＤヘテロクロマチンが生化学的に異なっており、Ｐ３１がｂｗＤインサートのみをオープンにする、というような他の分子シナリオも構想されうる。その場合には、ｂｗＤハエにおいて、ｂｗ＋ハエと比較してはるかに大きいＧＡＦ濃度の相対的減少が達成されるであろう。
【０１７７】
ポリアミドは、細胞透過性であり、かつ組織培養細胞の培地へと添加された場合、標的とされた遺伝子の発現を阻害することが示された（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９； Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９； ＭｃＢｒｙａｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。ここで、本発明者らは、ポリアミドが完全な発達中の生物の遺伝子発現に影響しうることを証明する。これらの実験では、ハエを、産卵から羽化まで、これらの化合物を含有している飼料の存在下で飼育した。本発明者らのハエＭＡＴＨ２０発現データは、ｗｍ４のＰＥＶの抑制が、眼成虫原基の分化が起こる発達のおよそ４８〜７２時間目に、その発現を必要とすることを示した（Ｇｉｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。従って、これらの化合物が、実験条件下で、数日間、化学的に安定であることが結論付けられうる。以前の研究は、ハエ飼料へ添加されたテトラサイクリンがこの抗生物質に対して依存性であるトランス活性化系を制御しうることも証明した（Ｂｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。配列特異的ポリアミドの合成の進歩と組み合わされた、観察されたハエ表現型の注目すべき明瞭な性質は、新規な遺伝子道具としてのこれらの化学物質の有益性を強調する。
【０１７８】
ヘテロクロマチン繊維の構造は未知であり、提示された実験は、ヘテロクロマチン性サテライトがＤＮＡ副溝結合性化合物によってオープンにされる機序とは無関係である。そのような分子は、ＤＮＡ副溝接触を行なうタンパク質の結合に干渉することが知られている（Ｄｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。従って、クロマチンオープニングは、ＨＰ１、Ｄ１、又はさらにはリンカーヒストンＨ１のようなヘテロクロマチン関連タンパク質の置換によるかもしれない。コアヒストンのＮ末端テールは、副溝収縮を行うことが知られており、ヒストンＨ４のテールはクロマチン繊維の高次の折り畳みの媒介に関与している可能性がある（Ｌｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。ＤＮＡ副溝結合薬は、例えば、ヌクレオソーム−ヌクレオソーム相互作用を妨害することにより、ヒストンテールによって作られたそのような相互作用と競合し、次いでヌクレオソームのスライディング、又は高次クロマチンの巻き戻しを促進するのかもしれない。オープンなクロマチン構造の広範な伝播が如何にして媒介されるかは不明である。ヘテロクロマチン化は、伝播の程度が質量作用（ｍａｓｓ ａｃｔｉｏｎ）によって支配される、クロマチン繊維に沿って「重合」する協同的相互作用成分によって発生する、としばしば論じられている。この「重合体」からの単位の妨害又は置換が、エネルギー論的に、伝播にとって不都合であることは容易に分かる。
【０１７９】
ここに報告された所見は、クロマチン接近可能性が、精巧な大きな機構によって制御されるだけでなく、構成性、すなわちあるクロマチンセクションの固有の呼吸（オープニング／クロージング）特性、及びクロマチンのオープニング又はクロージングに関して質量作用によって競合する因子の利用可能性によっても決定されうることも強調する。進化が、構成性の接近可能性を助長するため、「容易に呼吸する」クロマチンセクション（例えば、ＳＡＲ）を、遺伝子制御性配列に隣接して位置付けたのかもしれないと推論することは興味深い。
【０１８０】
遺伝子発現に関与している因子の結合を助長するか、又は反対に抑圧されたヘテロクロマチンの集合を促進する、ＡＴＰによって駆動されるクロマチンリモデリング複合体が、最近、多数記載された（Ｔｙｌｅｒ ａｎｄ Ｋａｄｏｎａｇａ，１９９９）。そのような活性は、クロマチンへとパッケージングされたＤＮＡへのＤＮＡ結合性因子（実験的には、ヌクレアーゼ）の接近を増強するために、ヌクレオソーム可動性（スライディング）又はヌクレオソーム構造の妨害を触媒すると考えられる。クロマチンリモデリング複合体は、極めて大きく、いくつかのタンパク質サブユニットから構成されている。ここで、本発明者らは、低分子が、ヘテロクロマチンリモデリング活性としてハエにおいて機能しうることを証明している。ＤＮＡサテライトは、極めて大きなブロックから構成されており、従って配列特異的化合物により比較的容易に標的とされる。エピジェネティックサイレンシングを受けた遺伝子の活性化剤としてポリアミドが使用されうるか否かをさらに探究することは非常に興味深いであろう。遺伝子サイレンシングは、遺伝子治療、植物、動物、及び微生物へ導入された遺伝子の構成性又は制御型の発現のようなほとんどの遺伝子操作の主要な問題である。遺伝子発現ベクターの天然又は「合成」のシス作用性因子への高親和性ポリアミドのターゲティングにより、エピジェネティックサイレンシングを復帰させる又は抑止することが可能であるかもしれない。
【０１８１】
セクションＩＩの実験法
ハエのポリアミド処理及び眼表現型の決定
ポリアミドを含有している産卵用バイアルは、以下のようにして準備した：２５０ｎｍｏｌのＰ９、Ｐ３１を、１５０μｌのｄｄＨ２０に溶解させ、次いで予め６０℃に加熱された半合成ハエ培地２．３５ｇと混合した。これらのバイアルは、最終的に１００μＭの濃度の化合物を含有していた。室温にまで冷却後、およそ３００匹のｗｍ４ハエ（５〜１０日令）を、産卵用バイアルへと添加した。１８℃で３６時間卵を収集し、次いで母親バエを除去し、一定の温度（１８℃±１）でハエの発達を進行させた。同一日の新生ハエを、新鮮なバイアルに移し、５日後に眼表現型に関して判定した（Ｇｉｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。眼表現型の視覚的な検査については（表１）、雌及び雄両方のハエを判定した。眼色素の光学密度測定については、雄の頭部３０個を選択し、記載されたようにして（Ｈａｚｅｌｒｉｇｇ ｅｔ ａｌ．，１９８４）、色素を抽出し、測定した。
【０１８２】
ｂｗＤハエの薬物処理は、親雌３０匹に産卵をさせたことを除き、ｗｍ４の場合と同様にして実施した。ヘテロ接合性ｂｗＤ／＋；ｓｔ／ｓｔ子孫を得るためには、バージンｂｗＤ／ｂｗＤ；ｓｔ／ｓｔホモ接合性雌３０匹を、ｓｃａｒｌｅｔホモ接合性雄と約５日間交配した後、産卵用実験バイアルへと移した。
【０１８３】
発達遅延、致死、及びホメオティック変成
子孫の致死は、死体及び全ての空の蛹の殻を計数することにより計算した。Ａ６→Ａ５変成は、雄の腹節Ａ６上に形成された剛毛によって検出した。得られた雄成体バエ全て（およそ５０匹）を判定した。性櫛及び平均棍は、記載されたようにして（Ａｓｈｂｕｒｎｅｒ，１９８９）、少なくとも３０個体を解剖し、２４ｘ２４ｍｍカバーグラスの下で０．６ｇ／ｍｌアラビアゴム３０μｌ；４ｇ／ｍｌクロロヒドレート（ｃｈｌｏｒｏｈｙｄｒａｔｅ）；３５％グリセロールへとインキュベートした後、顕微鏡（Ａｘｉｏｐｈｏｔ、Ｚｅｉｓｓ）下で個々に検査し、写真撮影した。二重ヘテロ接合性ハエ（Ｕｂｘ１／＋；ｂｗＤ／＋）の飼育は致死をもたらしたため、本発明者らは、８匹の後期蛹を、注意深く蛹の外被を除去した後、形態学的に解剖した。
【０１８４】
本発明者らは、以前にヘミ接合性（ｈｅｍｉｚｙｇｏｕｓ）ｂｉｔｈｏｒａｘ突然変異体において見出されたように（Ｋａｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９８５）、これらの子孫のうちの雄２匹が、生殖板（ｇｅｎｉｔａｌ ｐｌａｔｅ）の９０°シフトを有していることも見出した。さらなる突然変異表現型が、Ｐ３１処理ハエにおいて、ｂｗＤ／＋に関して時々観察された（データは示していない）。これらの表現型は、背側頭部上の後垂直（ｐｏｓｔｖｅｒｔｉｃａｌ）剛毛の欠失、及び節Ｔ２上の腹側小楯板の三倍化である。Ｐ３１　ｂｗＤ／ｂｗ＋子孫は、全て、ｒｏｕｇｈ ｅｙｅ表現型を有していた（データは示していない）。
【０１８５】
ポリアミドによる核及び多糸染色体の染色、並びに免疫蛍光
Ｋｃ核及び多糸染色体は、他に記載されたようにして（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）、蛍光性ポリアミドで染色した。免疫蛍光については、記載されたようにして（Ａｓｈｂｕｒｎｅｒ，１９８９）、１×ＰＢＳ中でｂｗＤハエ又はＣａｎｔｏｎ Ｓ．ハエから注意深く多糸腺を解剖した。次いで、ｓｏｌ　Ｐ（１ｍＭ　ＭｇＣｌ２及び０．１％ジギトニンが補足された１×ＰＢＳ）中の腺全体を、様々な濃度のＰ３１、Ｐ９と共に、又は化合物なしで室温で６０分間インキュベートした。Ｐ３１（Ｐ９ではない）は、このインキュベーション工程中にＧＡＦの再分布を誘導した。次いで、腺をｓｏｌ　Ｐで５分間２回洗浄し、最終濃度０．８％の新鮮なパラホルムアルデヒドで固定した。腺を、ｓｏｌ　Ｐで５分間５回洗浄し、次いで５％無脂肪乳が補足された同緩衝液中で６０分間ブロッキングした。次いで、腺を０．５％無脂肪乳及びＪｏｒｄａｎ Ｒａｆｆ博士（Ｒａｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９４）より提供されたウサギα−ＧＡＧＡ抗体が補足されたｓｏｌ　Ｐと共に、湿潤チャンバー内で４℃で一夜インキュベートした。一次抗体を洗浄（５×５分間）により除去し、次いでＦＩＴＣ（Ｎｏｒｄｉｃ）でタグ化されたヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートした。腺を、前記と同様に洗浄し、記載されたようにして（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）、ｂｗＤインサートを強調するため、２００ｎＭ　Ｐ３１Ｔで染色した。画像を、ＤｅｌｔａＶｉｓｉｏｎ製の広視野デコンボリューション型イメージングシステムで記録した。
【０１８６】
【表１】
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【０１８７】
【表２】
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【０１８８】
表２：Ｐ９によるｗｍ４ハエのＰＥＶ眼表現型の抑制。新生ハエを、新鮮なバイアルに移し、５日後に眼表現型に関して判定した。Ｐ９のみが、強い斑入り（「ｗｈｉｔｅ ｍｏｔｔｌｅｄ」）のままのハエの割合を強く減少させたことに注意されたい。ＰＥＶの抑制は、ｗｈｉｔｅ遺伝子の活性の増加、すなわち赤色素沈着（図７に示されるような「ｒｅｄ ｍｏｔｔｌｅｄ」のレベルの強化をもたらす。
【０１８９】
【表３】
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【０１９０】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｐ９及びＰ７を用いたＤＮａｓｅ　Ｉフットプリントアッセイ。Ｐ９及びＰ７の存在下でのＤＮａｓｅ　Ｉ分解パターン。リガンド濃度が、各レーンの上に示されている。各ＡＴトラクトの位置は、角括弧によって示されている。パネルＡは、プローブＷ９に対するＰ９及びＰ７のフットプリントを示している。このプローブは、９ｂｐ　ＡＴトラクトを有するオリゴヌクレオチドの頭部−尾部タンデムリピートから構成されている。
【図２】蛍光タグ化オリゴピロールによるショウジョウバエ核の染色。単離されたＫｃ核を、示されているように、臭化エチジウム及びフルオレセインタグ化オリゴピロールで染色した。Ｐ９（パネルＡ）が、サテライトＩ及びＩＩＩを強い緑色焦点として強調すること、並びにＰ９の全体的な核質バックグラウンド染色が低レベルであることに注目されたい。
【図３】Ｐ３１及びＧＡＧＡ因子の結合特異性。パネルＡ：ＧＡＦ３１プローブ及びＢｒｏｗｎ　Ｉプローブに対する、Ｐ３１を用いたＤＮＡｓｅ　Ｉフットプリンティング実験、及びＰ３１Ｅによるアフィニティ分解が、示されている。ＧＡＦ３１プローブ及びＢｒｏｗｎ　Ｉプローブは、（ＡＡＧＡＧ）２モチーフ、及びＵｂｘプロモーター由来のＧＡＧＡ因子（ＧＡＦ）結合部位を含有している（Ｂｉｇｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。Ｐ３１が典型的なＧＡＦ結合（Ｕｂｘ）と結合しないことに注目されたい。Ｂｒｏｗｎ　Ｉオリゴ（タンデムリピート）は、示されているように（ＡＡＧＡＧ）５結合部位、及び縮重Ｐ３１結合部位（ＡＡＣＡＣ）２を含む。使用されたＰ３１濃度（ｎＭ）が示されている。Ｐ３１Ｅ（上）と標記されたレーンは、両プローブにおける１ｎＭのＰ３１Ｅによるアフィニティ分解反応である。これらのプローブ上のＰ３１Ｅの結合方向は、分子のＮ末端側を指している括弧上の矢じりによって示されている。Ｇという文字は、Ｇヌクレオチド分解反応をさす。パネルＢ：ＧＡＦ３１プローブに対する精製されたＧＡＧＡ因子（ＧＡＦ）を用いたＤＮＡｓｅ　Ｉフットプリンティング実験。ＧＡＦは、（ＡＡＧＡＧ）２モチーフ及びＵｂｘプロモーター由来結合部位の両方と結合することに注目されたい。
【図４】蛍光性ポリアミドＰ３１Ｔは、ＧＡＧＡＡサテライトＶを特異的に強調する。単離されたＫｃ核及び多糸染色体を、ＤＡＰＩ（青色）、Ｐ３１Ｔ（テキサスレッド標識Ｐ３１）、Ｐ９Ｆ（フルオレセインタグ化Ｐ９）で染色した。パネルＡ：緑色のＰ９Ｆ焦点は、サテライトＩ及びＩＩＩを強調していると推察される。Ｐ３１Ｔは、ＧＡＧＡＡサテライトの別々の位置をマーキングする。パネルＢ＆Ｃ：黒色パネル及び白色パネルは、それぞれパネルＡの赤色チャンネル及び緑色チャンネルを示している。パネルＤ：ＤＡＰＩ、Ｐ３１Ｔ、及びＰ９Ｆによるｂｒｏｗｎ−ｄｏｍｉｎａｎｔ多糸染色体の染色。多糸横縞形成パターンは青色（ＤＡＰＩ）で示されている。Ｐ３１Ｔは、５９Ｅの対立遺伝子ｂｗＤのヘテロクロマチン性ＧＡＧＡＡリピートを赤色で強調している。
【図５】オリゴピロールは、サテライトＩＩＩのクロマチンオープニングを誘導した。Ｋｃ核を、様々なポリアミドの存在下で、有糸分裂期アフリカツメガエル卵抽出物と共にインキュベートし、次いで、トポイソメラーゼＩＩのいわゆる分解可能な複合体を蓄積させるために、さらにＶＭ２６で処理した。ショウジョウバエサテライトＩＩＩにおける分解を、サザンブロッティングにより明らかにした。サテライトＩＩＩは、３５９ｂｐリピート毎に１個の主要トポイソメラーゼＩＩ分解部位を含有している。分解活性の程度は、基本リピートのマルチマーのラダーの発達により反映される。全てのパネルが、Ｖｍ２６を含む対照（＋）及び含まないレーン（−）を含んでいた。Ｐ９により媒介された大量の分解の活性化（クロマチンオープニング）、及びこのアッセイにおけるＰ３１の減少した活性が示されている。
【図６】ポリアミドＰ９及びＰ３１の結合様式。これらのＤＮＡサテライト特異的ポリアミドの合成及び特徴決定は、実施例に記載されている。化合物Ｐ９及びＰ３１は、いずれも、この図中に提唱されるような水素結合スキームにより、１：１薬物−ＤＮＡ複合体で、ｎＭ以下の親和性でそれらの標的と結合することが見出された。パネルＡ：Ｐ９（Ｐｙ−Ｐｙ−Ｐｙ−β−Ｐｙ−Ｐｙ−Ｐｙ−β−Ｄｐ〔式中、Ｐｙ＝Ｎ−メチルピロール、β＝β−アラニン、Ｄｐ＝ジメチルアミノプロピルアミド〕）のＡＡＴＴＡＡＴＡＴとの複合体に関して提唱された１：１結合モデル。白い丸及び菱形は、それぞれピロール及びβ−アラニンを表す。２個の点を有する円は、塩基の端部の、プリンのＮ３及びピリミジンのＯ２の上の非共有電子対を表す。推定される二叉のアミドＮＨとの水素結合は、破線によって図示されている。パネルＢ：Ｐ３１（Ｉｍ−β−Ｉｍ−Ｐｙ−β−Ｉｍ−β−Ｉｍ−β−Ｄｐ〔式中、Ｉｍ＝Ｎ−メチルイミダゾール〕）のＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧとの複合体に関して提唱された１：１結合モデル。黒丸はイミダゾールを表す。Ｈを含有している円は、グアニンのＮ２水素を表す。破線は、推定される水素結合を図示している。コンセンサス結合配列が示されている。
【図７】Ｐ９によるｗｈｉｔｅ−ｍｏｔｔｌｅｄ眼表現型の特異的な抑制。（示されている）異なるポリアミド薬を、発達中のｗｍ４ハエに供給し、５日令のハエの代表的な眼表現型を示した。ポリアミド（最終濃度１００μＭ）は、産卵から羽化まで、ハエ飼料中に存在していた。サテライトＩＩＩをオープンにするオリゴピロールＰ９のみが、ｗｍ４眼表現型を抑制することが見出された。
【図８】眼色素レベルの決定。３０匹の注意深く解剖されたハエ頭部から眼色素を抽出し、分光測定的に決定した。図（２）中に提示された実験の５日令のｗｍ４雄ハエの色素レベルが示されている。ヘテロ接合性ｂｒｏｗｎ−ｄｏｍｉｎａｎｔハエ（ｂｗＤ／＋）、ｗｈｉｔｅ−ｅｙｅハエ（ｗ６７）、又は野生型ハエ（Ｃａｎｔｏｎ Ｓ．）の眼色素レベルも含まれている。遺伝子型が示されている。化合物Ｐ９のみが、ｗｈｉｔｅ遺伝子の増加した活性をもたらす、ｗｍ４ハエにおけるＰＥＶ抑制剤であることに注意されたい。Ｐ９もＰ３１も、ｂｒｏｗｎ−ｄｏｍｉｎａｎｔハエのＰＥＶは改変しない。
【図９】Ｐ３１はｂｗＤハエにおけるホメオティックな腹部変成を誘導する。代表的な眼表現型及びホメオティック変成が示されている。パネルＡ及びＢは、Ｐ９、Ｐ３１の存在下、又は薬物なし（示されている）で飼育されたヘテロ接合性ｂｒｏｗｎ−ｄｏｍｉｎａｎｔ（ｂｗＤ／＋）ハエの眼表現型を示している。眼色素沈着（赤色個眼）のわずかな増加が、Ｐ３１処理ハエにおいて観察される（パネルＢ）。この増加は、ＰＥＶの真の抑制ではなく、これらのハエのより進行しだ令（６５〜７５時間）（遅延した発達）を反映していると考えられる。パネルＣは、解剖された、Ｐ３１又はＰ９（示されている）の存在下で飼育されたヘテロ接合性ｂｗＤ蛹の腹部を示している。Ｐ３１によって誘導されたＡ６→Ａ５変成は、ハエのＡ６節上の腹板剛毛（矢印）の形成によって顕在化する。野生型雄はＡ６に腹板剛毛を有していない（左）。パネルＤは、解剖された、Ｐ３１（示されている）の存在下で飼育された蛹の腹部を示している。ホモ接合性ｂｗＤ／ｂｗＤハエ（矢印）においては、Ａ６→Ａ５変成の浸透度がより高い（表１）。この変成は、ｂｗＤ対立遺伝子を必要とし、Ｕｂｘ１／＋ハエ又はその他の遺伝子型においては観察されない。
【図１０】Ｐ３１は、ｂｗＤハエにおいてｓｅｘ ｃｏｍｂ ｒｅｄｕｃｅｄ表現型を誘導する。未処理ハエと比較された、Ｐ３１処理（＋Ｐ３１）後に得られた、ヘテロ接合性及びホモ接合性ｂｗＤハエの性櫛表現型の例を示す雄の第１胸脚の写真。ｓｅｘ ｃｏｍｂ ｒｅｄｕｃｅｄ表現型は、ｂｗＤの遺伝的背景においてのみＰ３１（Ｐ９ではない）によって誘導される。突起数の平均値が示されている。
【図１１】Ｐ３１は、ｂｗＤハエにおいてＵｂｘ１の平均棍→翅ホメオティック変成を増強する。Ｐ３１の存在下（＋）又は非存在下（−）で飼育された異なる遺伝子型を有する動物の平均棍の写真。Ｐ３１がｂｗＤ遺伝的背景においてのみ、Ｕｂｘ１の平均棍→翅変成を増強することに注意されたい。従って、Ｐ３１は、Ｔｒｌ１３ＣとＵｂｘとの遺伝学的相互作用を模倣する。
【図１２】Ｐ３１は、間期におけるｂｗＤインサートへのＧＡＦのリクルートメントを誘導する。ＧＡＦ（緑色）に関して免疫染色されたホモ接合性ｂｗＤ多糸核の写真。ＤＮＡはＤＡＰＩによって青色で強調され、ｂｗＤインサートはＰ３１Ｔによって赤色で強調されている。黒色及び白色の挿入パネルは、ｂｗＤ焦点に関する赤色（右）及び緑色（左）チャンネルを別々に示している。使用された薬物が、示されている。ＧＡＦシグナル及びＰ３１Ｔシグナルが、透過性化された腺のＰ３１への曝露の後にのみ重複することに注意されたい。
【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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