(57)【要約】本発明は、鱗翅目昆虫からのデサチュラーゼの組換え発現によって、不飽和脂肪酸、好ましくは共役リノール酸（CLA）などの共役多価不飽和脂肪酸を製造する方法に関するものである。発現は好ましくは、植物、酵母、真菌およびソウ類の群から選択される生物で行う。さらに本発明によれば、鱗翅目昆虫からのデサチュラーゼの組換え発現のための組換え発現カセット、ならびにそれによって形質転換されたトランスジェニック生物がある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
不飽和脂肪酸を含むトリグリセリドの製造方法であって、植物、酵母、真菌およびソウ類の群から選択される生物における、鱗翅目昆虫からの少なくとも１種の脂肪酸デサチュラーゼの組換え発現を含む、上記方法。
【請求項２】
前記脂肪酸デサチュラーゼが、脂肪酸、脂肪酸CoAエステルまたはその他の脂肪酸誘導体におけるC8、C9、C10、C11またはC12位に二重結合を形成することができるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記脂肪酸デサチュラーゼが、脂肪酸鎖長がＣ原子16もしくは18個である脂肪酸、脂肪酸CoAエステルまたはその他の脂肪酸誘導体においてシスまたはトランス二重結合を特異的に形成する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記脂肪酸デサチュラーゼが、配列番号２、４、６、８、10、12、14または22によって記載される脂肪酸デサチュラーゼのいずれかと少なくとも65％の相同性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記脂肪酸デサチュラーゼの核酸配列が、
ａ）そのセンス鎖に配列番号15または17によって記載される配列モチーフ、または
ｂ）そのアンチセンス鎖に配列番号16または18によって記載される配列モチーフ
を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記不飽和脂肪酸が共役リノール酸を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記生物が、ムコール・シルシネロイデス、モルティエレラ・アルピナ、ピチウム・インシジオサム、クリプトコッカス・カルバタス、アマニ、大豆、アブラナ、ココナッツ、ギネアアブラヤシ、紅花、トウゴマ、落花生、カカオ木およびヒマワリからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法によって製造されるトリグリセリド。
【請求項９】
食品、飼料、化粧品またはファインケミカルの製造における請求項８に記載のトリグリセリドの使用。
【請求項１０】
E11-デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドであって、C16および／またはC18アシル-CoA脂肪酸を優先的に変換し、
ａ）配列番号２、４、６および22に示したアミノ酸配列、および
ｂ）配列番号２、４、６または22に示したアミノ酸配列のいずれかと少なくとも65％の相同性を有するアミノ酸配列、および
ｃ）配列番号２、４、６または22に示した配列の少なくとも20個の連続アミノ酸残基の断片を含むアミノ酸配列
からなる群から選択される少なくとも１個の配列を包含する、上記ポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号22に示したアミノ酸配列によって記載される請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項１３】
植物、植物体、ソウ類、酵母または真菌で機能性であるプロモーターの制御下に鱗翅目昆虫からの脂肪酸デサチュラーゼをコードする少なくとも１個の核酸配列を含む組換え発現カセット。
【請求項１４】
前記プロモーターが、ムコール・シルシネロイデス、モルティエレラ・アルピナ、ピチウム・インシジオサム、クリプトコッカス・カルバタス、アマニ、大豆、アブラナ、ココナッツ、ギネアアブラヤシ、紅花、トウゴマ、落花生、ココア豆およびヒマワリからなる群から選択される少なくとも１種の生物で機能性である、請求項１３に記載の組換え発現カセット。
【請求項１５】
前記脂肪酸デサチュラーゼが、
ａ）配列番号２、４、６、８、10、12、14または22に示したアミノ酸配列、および
ｂ）配列番号２、４、６、８、10、12、14または22に示したアミノ酸配列の一つと少なくとも65％の相同性を有するアミノ酸配列、および
ｃ）配列番号２、４、６、８、10、12、14または22に示した配列の少なくとも20個の連続アミノ酸残基の断片を包含するアミノ酸配列
からなる群から選択される少なくとも１個の配列を含むポリペプチドによって記載される、請求項１３または１４に記載の組換え発現カセット。
【請求項１６】
前記脂肪酸デサチュラーゼが、配列番号22に示したアミノ酸配列によって記載される、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の組換え発現カセット。
【請求項１７】
請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の少なくとも１個の発現カセットを含む組換え発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１３〜１６のいずれかに記載の少なくとも１個の組換え発現カセット、または請求項１７に記載の組換え発現ベクターを含むトランスジェニック生物。
【請求項１９】
植物である、請求項１８に記載のトランスジェニック生物。
【請求項２０】
ムコール・シルシネロイデス、モルティエレラ・アルピナ、ピチウム・インシジオサム、クリプトコッカス・カルバタス、大豆、アマニ、アブラナ、ココナッツ、ギネアアブラヤシ、紅花、トウゴマ、落花生、カカオ木およびヒマワリからなる群から選択される、請求項１８または１９に記載のトランスジェニック生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鱗翅目昆虫からのデサチュラーゼの組換え発現による、不飽和脂肪酸、好ましくは共役リノール酸（CLA）などの共役多価不飽和脂肪酸の製造方法に関する。発現は好ましくは、植物、酵母、真菌およびソウ類の群から選択される生物で行う。さらに本発明によれば、鱗翅目昆虫からのデサチュラーゼの組換え発現のための組換え発現カセット、ならびにそれによって形質転換されたトランスジェニック生物がある。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸およびトリグリセリドは、食品業界、動物栄養、化粧品および医薬部門で広く使用されている。特に貴重で必要とされている不飽和脂肪酸は、共役不飽和脂肪酸として知られているものである。共役多価不飽和脂肪酸は、他の多価不飽和脂肪酸と比較して相対的に希少である。共役脂肪酸の例には、共役リノール酸類（CLA;共役リノール酸）、α−パリナリン酸（18:4オクタデカテトラエン酸）、エレオステアリン酸（18:3オクタデカトリエン酸）、共役リノレン酸類、ジモルフェコール酸（dimorphecolic acid）およびカレンズル酸（calendulic acid）がある（図式１参照）。
【０００３】
図式１：共役多価不飽和脂肪酸
【化１】
2006503546.tif 000002
【０００４】
CLAは、炭素原子８、９、10または11から始まる共役二重結合系によって識別されるリノール酸の位置および構造異性体の総称である。例をいくつか図式２に示してある。
【０００５】
それらの各位置異性体には幾何異性体が存在する。すなわち、シス−シス、トランス−シス、シス−トランス、トランス−トランスである。
【０００６】
図式２：共役リノール酸の４種の異性体
【化２】
2006503546.tif 000003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
CLA異性体(9Z,11E)-CLAおよび(10E,12Z)-CLAは、生理活性異性体として知られている。CLAは主として、動物起源の食品に認められる。特に、反芻動物の肉および乳製品で高いCLA濃度が認められ、牛肉および子羊肉ではCLA約３〜４mg／脂肪gであり（Chin ら. (1992) J Food Comp Anal 5:185-197）、乳製品ではCLA約３〜７mg/脂肪ｇである（Dhiman ら. (1999) J Dairy Sci 82:2146-56）。その場合、それぞれで約80％の濃度での(9Z,11E)-CLAが主要な異性体である。高等植物にはごく微量のCLAが含まれているだけであり、現在までのところ、植物では前記２種の生理活性CLA異性体は認められていない。
【０００８】
CLAには広範囲の陽性効果が認められている。そこでCLAを投与することで、ヒトおよび動物において体脂肪が減少し、動物において飼料が体重に変換される割合が増加する（Park ら. (1997) Lipids 32:853-858; Park ら. (1999) Lipids 34:235-241; WO 94/16690; WO 96/06605; WO 97/46230; WO 97/46118）。CLAの投与はまた、例えばアレルギー（WO 97/32008）または癌（Banni ら. (1999) Carcinogenesis 20: 1019-1024; Thompson ら. (1997) Cancer Res 57:5067-5072）に対しても陽性効果を有する。CLAの抗動脈硬化効果も確認されている（Wilson ら. (2000) Nutr Res 20:1795-1805）。研究は異性体および異性体混合物を用いて行われている。
【０００９】
CLAは、リノール酸のアルカリ異性化によって合成することができる。工業的規模では、例えばヒマワリ油、紅花油などのリノール酸含有量の高い植物油が主として用いられている。アルカリ性条件下での180℃を超える加熱が、下記の２つの反応を触媒する。
【００１０】
（１）トリグリセリド骨格の脂肪酸エステル結合が加水分解され、遊離脂肪酸が放出され、
（２）２個以上の二重結合を有する非共役不飽和脂肪酸が共役する。
【００１１】
市販のCLA油は、各種CLA異性体ならびに他の飽和および不飽和脂肪酸の混合物を含む。これらの生理的に不活性で非天然の異性体が存在するために、生理活性異性体である(9Z,11E)CLAおよび(10E,12Z)CLAの骨の折れる精製が必要であるか、あるいはその異性体混合物がヒトや動物について健康上有害ではないことを示す必要がある。これまでのところ、経済的に妥当な方法でアルカリ異性化によって個々のCLA異性体を製造することは可能にはなっていない。分別結晶によって、異性体(9Z,11E)-CLAおよび(10E,12Z)-CLAをそれぞれ濃縮することが可能となる。しかしながら、上記の全ての方法で個々の異性体を高品質で製造することは不可能である。上記の方法では、反応生成物は通常、メチルエステルまたはエチルエステルに変換されることから、天然型のCLA、すなわち遊離脂肪酸またはトリアシルグリセリドが得られない。
【００１２】
化学的変換のこれらの欠点は、生体触媒作用によってリノール酸をCLAに変換することで克服することができる。例えば、反芻動物の第一胃の各種微生物は、生体水素化プロセスの際にリノール酸をCLAに変換することができる。それは特に、CLAイソメラーゼの酵素活性によって行われる。この酵素活性については、ブチリビブリオ−フィブリソルベンス（Kepler および Tovee (1966) J Biol Chem 241:1350）、プロピオニバクテリウム−アクネス（Deng ら, 1st International Conference on CLA, 2001, Alesund, Norway）、クロストリジウム−スポロゲネスおよびラクトバチルス−ロイテリ（WO 99/32604; WO 01/00846）で報告されている。今日までに報告されているCLAイソメラーゼは、基質として遊離脂肪酸を利用する。ラクトバチルス−ロイテリおよびプロピオニバクテリウム−アクネスからのCLAイソメラーゼをコードする遺伝子がクローニングされており、プロピオニバクテリウムからのイソメラーゼが異種微生物で機能的に発現されている。微生物によるリノール酸のCLAへの生体変換はアルカリ異性化に比べて質的利点を有するが、発酵コストのためにそれは経済的に不利であり、遊離脂肪酸のみを生じて、トリグリセリドは形成されない。しかしながら、遊離脂肪酸は不利な嗅覚的特性を有しており、食品および飼料部門での使用には本質的に適していない。次段階で遊離脂肪酸を変換すること（例えば、リパーゼの触媒作用によるグリセリンまたはグリセリド）が可能であるが、複雑である。
【００１３】
細菌CLAイソメラーゼに基づく方法は、他の生物に常に適用可能である。これまでのところ、CLAイソメラーゼが遊離リノール酸をCLAに変換することが明らかになっている（Cepler および Tove (1967) J Biochem Chem 242: 5686-5692）。例えば植物などの高等生物では、リノール酸は主としてエステル化体で存在する。トリアシルグリセリドなどの脂質は貯蔵型を構成し、アシル−CoAなどのチオエステルは活性型の脂肪酸を構成する。
【００１４】
トランス二重結合を有する脂肪酸は極めて希である。一部の植物の種子油が、トランス位での二重結合を有する脂肪酸を含む。そうして、各種のカラマツソウ類の種子油でE5-脂肪酸が検出されている（Rankoff ら. (1971) J Amer Oil Chem Soc 48: 700-701）。さらに、E5-デサチュラーゼ活性がセイヨウオダマキ（Aquilegia vulgaris）で報告されている（Longman ら. (2000) Biochem Soc Trans 28:641-643）。しかしながら、トランス−バクセン酸（E11-オクタデセン酸）やE10-オクタデセン酸を含む植物は報告されていない。
【００１５】
植物における脂肪酸の脱飽和が主として下記の２つの機序によって起こり得ることが知られている。
【００１６】
（１）色素体において脂肪酸ACPエステルが、主として９位で可溶性デサチュラーゼによって脱飽和され、
（２）小胞体上で、膜脂質、特にホスファチジルコリン類が優先的に、膜結合デサチュラーゼによって６位、12位および15位でさらに脱飽和される。
【００１７】
一部の植物では、共役脂肪酸がコンジュガーゼの活性によって産生される（Crombie ら. (1984) J Chem Soc Chem Commun 15:953-955; Crombie ら. (1985) J Chem Soc Perkin Trans 1:2425-2434; Fritsche ら. (1999) FEBS Letters 462: 249-253; Cahoon ら. (2001) J Biol Chem 276:2637-2643; Qiu ら. (2001) Plant Physiol 125:847-855）。カレンズル酸、エレオステアリン酸またはプニカ酸などの共役脂肪酸の生合成が、D12-デサチュラーゼによるオレイン酸のリノール酸への脱飽和、そして特異的共役トリエン形成デサチュラーゼ（コンジュガーゼ）によるZ9-もしくはZ12-二重結合の共役トリエン脂肪酸への転位を伴うさらなる脱飽和を介して進行する。カレンズル酸の産生以外に、クイらの報告（Qui ら. (2001) Plant Physiol 125:847-855）には、コンジュガーゼの酵素活性による共役リノール酸の産生も記載されている。しかしながら、この二次活性の欠点は、その酵素活性が共役リノール酸の望ましくない8,10-異性体を生じるという点である。
【００１８】
鱗翅目からのフェロモンデサチュラーゼは、広範囲の基質特異性および脱飽和機序を示す（Roelofs および Wolf (1988) J Chem Ecol 14:2019-2031; Roelofs (1995) Proc Nat Acad Sci USA 92:44-49; Tillman ら. (1999) Insect Biochem 29:481-514）。これらの酵素活性によって、広範囲の鎖長を有し、異なる位置に二重結合を有し、立体配置が異なる異常な不飽和脂肪酸CoA誘導体が産生される。それらはフェロモンの生合成の出発原料として働く。リュウら（Liu ら.）は、蛾類（「明褐色リンゴ蛾（light brown apple moth）」）のフェロモン生合成で何らかの役割を果たすと考えられるフェロモン腺からのE11-デサチュラーゼについて報告している（Liu WT ら. (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99(2):620-624）。
【００１９】
ニップルら（Knipple ら., Genetics 2002 Dec;162(4):1737-52）は、蛾およびハエのフェロモン腺から単離されたこれら昆虫からの各種膜内在性デサチュラーゼを比較している。ワタアカミムシガからのアシル-CoAデサチュラーゼ（PgosVASQ）の断片が記載されている。相当する配列が、GenBank受託番号AF482921で寄託されている。デサチュラーゼの完全な配列も特異的活性も報告されていない。それは単に、他のデサチュラーゼとの相同性に基づいて名付けられたものである。
【００２０】
そこで本発明の目的は、不飽和脂肪酸、好ましくはCLAなどの共役多価不飽和脂肪酸が多いトリグリセリドを生じる新規な方法を提供することにある。本発明者らは、この目的が本発明によって達成されることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明の第１の主題は、鱗翅目昆虫からの少なくとも１種の脂肪酸デサチュラーゼの組換え発現による不飽和脂肪酸を含むトリグリセリドの製造方法に関するものである。
【００２２】
好ましくは、不飽和脂肪酸を含むトリグリセリドの前記製造方法は、植物、酵母、真菌およびソウ類の群から選択される生物での鱗翅目昆虫からの少なくとも１種の脂肪酸デサチュラーゼの組換え発現を含む。
【００２３】
好ましい実施形態において、脂肪酸、脂肪酸CoAエステルまたはその他の脂肪酸誘導体でのC8、C9、C10、C11またはC12位に二重結合を形成することができる脂肪酸デサチュラーゼを用いる。特に好ましいものは、脂肪酸鎖長が16または18Ｃ原子である脂肪酸、脂肪酸CoAエステルまたはその他の脂肪酸誘導体にシスまたはトランス二重結合を特異的に形成することができる脂肪酸デサチュラーゼである。非常に好ましいものは、配列番号２、４、６、８、10、12、14または22によって記載される脂肪酸デサチュラーゼのうちのいずれかと少なくとも65％の相同性を有する脂肪酸デサチュラーゼである。
【００２４】
ある好ましい実施形態では前記方法を、不飽和脂肪酸として共役リノール酸を製造するのに用いる。
【００２５】
さらに本発明によれば、本発明による方法によって製造されるトリグリセリド、ならびに食品、飼料、化粧品またはファインケミカルの製造におけるそれらの使用がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
多くの生物、特に植物において、脂肪酸は細胞質ゾル中に主としてCoAエステルの形で存在する。酵母および動物では、アシル-CoA脂肪酸の脱飽和が不飽和脂肪酸の主要な合成経路であるが、植物ではこの機序はかなり希である（Cahoon EB ら. (2000) Plant Physiol. 124: 243-251）。驚くべきことに、鱗翅目からのデサチュラーゼの組換え発現によって飽和および不飽和脂肪酸CoAエステルの脱飽和が生じることが明らかになっている。最終的な結果は、両方の活性CLA異性体が産生され、貯蔵脂質に組み込まれるというものである。
【００２７】
本発明による方法の利点は特に、例えば菜種またはヒマワリなどの油含有量の高い生物、好ましくは植物、酵母、真菌またはソウ類を原料としたCLA含有トリグリセリドの直接製造の可能性である。鱗翅目昆虫からの真核生物酵素を用いることで、原核生物タンパク質にしばしば関連する毒性効果を起こすことなく良好な発現を行うことができる。
【００２８】
「脂肪酸デサチュラーゼ」とは、脂肪酸または例えば好ましくは脂肪酸CoAエステルなどのその誘導体に二重結合を導入することができる酵素を指す。適切であれば、それにはNADPH、NADHあるいは酸素などの補因子がさらに必要となる場合がある。この文脈で好ましいものには、脂肪酸がＣ原子14、16、18または20個、好ましくはＣ原子18個の鎖長を有するアシル-CoA脂肪酸を基質として利用することができるデサチュラーゼである。
【００２９】
好ましくは、脂肪酸デサチュラーゼという用語は、脂肪酸またはその誘導体、例えば好ましくは脂肪酸CoAエステルにおけるC8、C9、C10、C11またはC12位に二重結合を形成することができる酵素を包含する。特定の構造異性体、すなわち具体的にはシスまたはトランス二重結合を生じるデサチュラーゼも好ましい。この文脈では具体的には、問題の構造異性体が少なくとも60％、好ましくは少なくとも80％、特別に好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％の量で形成されることを意味するものと理解される。特別に好ましいものは、脂肪酸またはその誘導体、例えば好ましくは脂肪酸CoAエステルにおいて、CLA異性体で認められるような二重結合を形成するデサチュラーゼである。
【００３０】
鱗翅目からの脂肪酸デサチュラーゼの「好ましい必須の特徴」とは、下記の特徴のうちの少なくとも一つを有する酵素を指す。
【００３１】
ｉ）C8、C9、C10、C11もしくはC12位でのシス二重結合、あるいはC8、C9、C10、C11もしくはC12位でのトランス二重結合の特異的形成。
【００３２】
ii）脂肪酸鎖長がＣ原子16および／または18個である脂肪酸、脂肪酸CoAエステルおよび他の脂肪酸誘導体に対する基質特異性。この文脈において、基質特異性とは、指定鎖長の基質を異なる鎖長の基質より急速に変換するという脂肪酸デサチュラーゼの特徴を指す。この文脈において、好ましい基質の変換率は、好ましくない基質と比較して、少なくとも50％、好ましくは少なくとも100％、特別に好ましくは少なくとも200％、最も好ましくは少なくとも500％上昇する。
【００３３】
好ましくは、特徴ｉ）およびii）のうちの少なくとも一つである。
【００３４】
脂肪酸デサチュラーゼという用語は、孤立二重結合を導入することができる酵素だけでなく、基質中の１個の二重結合から開始して共役二重結合系を形成することができるコンジュガーゼも包含するものである。この文脈では、移動するのは好ましくは第１の二重結合である。
【００３５】
好ましいコンジュガーゼの例には、
ａ）Z11二重結合をE10およびZ12の２個の二重結合に変換するコンジュガーゼ（「Z11-(E10,Z12)-コンジュガーゼ」）、
ｂ）E11二重結合をE10およびZ12の２個の二重結合に変換するコンジュガーゼ（「E11-(E10,Z12)-コンジュガーゼ」）、
ｃ）Z10二重結合をE10およびZ12の２個の二重結合に変換するコンジュガーゼ（「Z10-(E10,Z12)-コンジュガーゼ」）
がある。
【００３６】
すなわちこれらの酵素は、(E10,Z12)-コンジュガーゼ類と称することができる。これらの酵素はまた、E10-デサチュラーゼ類とも称することができる。特別に好ましいE10-デサチュラーゼの必須の特徴は、脂肪酸がＣ原子18個の鎖長を有する脂肪酸または脂肪酸CoAエステルのC-10位でのトランス二重結合の導入である。
【００３７】
さらに好ましいコンジュガーゼには、
ｄ）Z10二重結合をZ9およびE11の２個の二重結合に変換するコンジュガーゼ（「Z10-(Z9,E11)-コンジュガーゼ」）、
ｅ）E10二重結合をZ9およびE11の２個の二重結合に変換するコンジュガーゼ（「E10-(Z9,E11)-コンジュガーゼ」）、
ｆ）Z11二重結合をZ9およびE11の２個の二重結合に変換するコンジュガーゼ（「Z11-(Z9,E11)-コンジュガーゼ」）
がある。
【００３８】
すなわち、これらの酵素は、(Z9,E11)-コンジュガーゼ類と称することができる。これらの酵素はまた、E11-デサチュラーゼ類とも称することができる。特別に好ましいE11-デサチュラーゼの必須の特徴は、脂肪酸がＣ原子18個の鎖長を有する脂肪酸または脂肪酸CoAエステルのC-11位でのトランス二重結合の導入である。
【００３９】
最も好ましいものは、脂肪酸鎖長がＣ原子18個である脂肪酸または脂肪酸CoAエステルなどの脂肪酸誘導体に対する基質特異性を有するE10-、E11-、Z10-およびZ11-デサチュラーゼ、ならびにZ11-(E10,Z12)-コンジュガーゼ、E11-(E10,Z12)-コンジュガーゼ、Z10-(Z9,E11)-コンジュガーゼおよびE10-(Z9,E11)-コンジュガーゼである。
【００４０】
脂肪酸デサチュラーゼは好ましくは、アトヒゲコガ科、トラガ科、ヒトリガ科、カイコガ科、シンクイガ科、ホソハマキガ科、ボクトウガ科、スイコバネガ科、キバガ科、シャクガ科、ホソガ科、コウモリガ科、トンボマダラ科、カレハガ科、シジミチョウ科、ドクガ科、ハモグリガ科、モグリチビガ科、ヤガ科、シャチホコガ科、タテハチョウ科、マルハキバガ科、アゲハチョウ科、シロチョウ科、ミノガ科、トリバガ科、メイガ科、ヤママユガ科、スカシバガ科、スズメガ科、ハマキガ科、スガ科およびマダラガ科からなる群から選択される鱗翅目の種由来のものである。特に好ましいものは、ハマキガ科、メイガ科、アゲハチョウ科、ヤガ科およびシャクガ科からなる群から選択される鱗翅目類からの脂肪酸デサチュラーゼである。
【００４１】
E11-デサチュラーゼまたはそれをコードする核酸配列は好ましくは、ディアファニア・ヒアリナタ（Diaphania hyalinata）、ディアファニア・ニチダリス（Diaphania nitidalis）、ナスノメイガ、ヨーロッパアワノメイガ、セサミア・グリセセンス（Sesamia grisescens）、イモキバガ、ニホンニセメムシガ、ムネシクテーナ・フラビダリス（Mnesictena flavidalis）、キトガリキリガ、クロホシフタオ、ヒノキハモグリガ、ブラディナ種（Bradina sp.）、ディクロクロシス・プンクチフェラリス（Dichrocrocis punctiferalis）、ネッタイマダラメイガ、パルピタ・ユニオナリス（Palpita unionalis）、セリオデス・コルダリス（Sceliodes cordalis）、アニソデス種（Anisodes sp.）、チャノハマキホソガ、キンモンホソガ、ベニスズメ、タバコスズメ、シルポファーガ・エクセルパリス（Scirpophaga excerpalis）、ツマキオオメイガ、アンドラカ・ビプンクタタ（Andraca bipunctata）、 ワタアカミムシガまたはジアトラエ・サッカラリス（Diatraea saccharalis）の生物から単離される。E11-デサチュラーゼまたはそれをコードする核酸配列は特別に好ましくは、上記昆虫のフェロモン腺から単離される。言及することができる例としては、薄茶色リンゴ蛾（light brown apple moth）（エピフィアス・ポストビッタナ（Epiphyas postvittana））（配列番号２）、ヨーロッパアワノメイガ（配列番号４）およびニセアワノメイガ（配列番号６）のフェロモン腺からのE11-デサチュラーゼである。特別に好ましいものは、配列番号22に示したワタアカミムシガからのE11-デサチュラーゼである。上記生物からのE11-デサチュラーゼは、植物アシル-CoA脂肪酸誘導体を基質として受容する。
【００４２】
これらのデサチュラーゼまたはその変異体の使用は、それによってE11二重結合が可能となる限りにおいて特に有利である。そのデサチュラーゼは好ましくは、すでに能力がある場合でなければ、好ましくはC16および／またはC18アシル-CoA基質を変換することができることを目的として至適化する（例えば、配列番号22に示したワタアカミムシガからのデサチュラーゼなど）。従って、本発明のさらに別の主題は、E11-デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドであって、C16および／またはC18アシル-CoA脂肪酸を優先的に変換し、
ａ）配列番号２、４、６および22に示したアミノ酸配列、および
ｂ）配列番号２、４、６または22に示したアミノ酸配列のいずれかと少なくとも65％の相同性を有するアミノ酸配列、および
ｃ）配列番号２、４、６または22に示した配列の少なくとも20連続アミノ酸残基の断片を含むアミノ酸配列
からなる群から選択される少なくとも１個の配列を包含するポリペプチドに関するものである。
【００４３】
前記ポリペプチドは特別に好ましくは、配列番号22によって示されるアミノ酸配列によって記載されるものである。本発明のさらに別の主題は、前記デサチュラーゼをコードする核酸分子に関するものである。その配列は特別に好ましくは、配列番号21に示したものである。
【００４４】
E10-デサチュラーゼまたはそれをコードする核酸配列は好ましくは、ジクロクロシス・クロロファンタ（Dichrocrocis chlorophanta）、ジクロクロシス・プンクチフェラリス（Dichrocrocis punctiferalis）、クワコ、カイコガ、コロラジア・ベルダ（Coloradia velda）、ヘミロイカ・エグランテリナ（Hemileuca eglanterina）、ヘミロイカ・エレクトラ・エレクトラ（Hemileuca electra electra）、ヘミロイカ・エレクトラ・モジャベンシス（Hemileuca electra mojavensis）、ヘミロイカ・ヌッタリ（Hemileuca nuttalli）またはワタノメイガの生物から単離されたものである。E10-デサチュラーゼまたはそれをコードする核酸配列は特別に好ましくは、上記昆虫のフェロモン腺から単離される。
【００４５】
E9-デサチュラーゼまたはそれをコードする核酸配列は好ましくは、エピプレマ・プラキフェラ（Epiplema plaqifera）、フィロノリクター・コリリ（Phyllonorycter coryli）、フィロノリクター・ハリセラ（Phyllonorycter harrisella）、フィロノリクター・シルベラ（Phyllonorycter sylvella）、キバガ、ブリオトロファ類（Bryotropha sp.）、ブリオトロファ・テレラ（Bryotropha terrella）、ゲレチア・ベツラエ（Gelechia betulae）、リンゴコカクモンハマキ、エクサルテマ・アペンディセウム（Exartema appendiceum）、ザイラフェラ・カナデンシス（Zeiraphera canadensis）、ロキソステゲ・ネオブリテラリス（Loxostege neobliteralis）、ヨーロッパアワノメイガ、ジオリクテリア・クラリオラリス（Dioryctria clarioralis）、ジオリクテリア・メルケリ（Dioryctria merkeli）、ジオリクテリア・レシノセラ（Dioryctria resinosella）、シロイチモジヨトウ、スポドプテラ・トリチュラタまたはポリア・グランディス（Polia grandis）の生物から単離される。E9-デサチュラーゼまたはそれをコードする核酸配列は特別に好ましくは、上記昆虫のフェロモン腺から単離される。
【００４６】
E8-デサチュラーゼまたはそれをコードする核酸配列は好ましくは、フィロノリクター・サポルテラ（Phyllonorycter saportella）、フィロノリクター類またはジクロクロシス・プンクチフェラリス（Dichrocrocis punctiferalis）の生物から単離される。E8-デサチュラーゼまたはそれをコードする核酸配列は特別に 好ましくは、上記昆虫のフェロモン腺から単離される。
【００４７】
Z11-オクタデセン酸を製造する上で有利に用いることができるZ11-デサチュラーゼが、カイコガ（Ando ら. (1988) Agric Biol Chem. 52:473-478）、イラクサギンウワバおよびアメリカタバコガ（Knipple ら. (1998) Proc Nat Acad Sci USA 95:15287-15292）について報告されている。さらなるZ11-デサチュラーゼまたはそれをコードする核酸配列は好ましくは、タバコスズメガ、サウスウエスタンコーンボーラー、 ミスジアオリンガ、クサオビリンガ、コナガ 、カイコガまたはジアファニア・ニチダリス（Diaphania nitidalis）から単離することができる。言及することができる例には、アメリカタバコガ（配列番号８）、イラクサギンウワバ（配列番号10）およびアルギロテニア・ベルチナナ（Argyrotaenia velutinana）（配列番号12）からのデサチュラーゼがある。Z11-デサチュラーゼまたはそれをコードする核酸配列は特別に好ましくは、上記昆虫のフェロモン腺から単離される。
【００４８】
Z10-デサチュラーゼまたはそれをコードする核酸配列は好ましくは、クテノシュースティス・フィリシス（Ctenopseustis filicis）、シュードキセンテラ・スポリアナ（Pseudexentera spoliana）、ヘミロイカ・エグランテリナ（Hemileuca eglanterina）、ヘミロイカ・エレクトラ・エレクトラ（Hemileuca electra electra）、ヘミロイカ・エレクトラ・モジャベンシス（Hemileuca electra mojavensis）、ヘミロイカ・ヌッタリ（Hemileuca nuttalli）、ユーロドープ・アドベネラ（Eurhodope advenella）、マメストラ・コンフィグラタ（Mamestra configurata）またはジクロクロシス・プンクチフェラリス（Dichrocrocis punctiferalis）の生物から、特別に好ましくは上記昆虫のフェロモン腺から単離される。言及することができる例は、プラノトトリクス・オクト（Planototrix octo）からのデサチュラーゼ（配列番号14）である。
【００４９】
(E10,Z12)-コンジュガーゼまたはそれをコードする核酸配列は好ましくは、カイコガ、フィロノリクター・クラタエゲラ（Phyllonorycter crataegella）、アモルビア・クネアナ（Amorbia cuneana）、エゾシロヒメハマキ、ノトセリア・ウドマンニアナ（Notocelia uddmanniana）、クワコ、コロラジア・ベルダ（Coloradia velda）、ヘミロイカ・エグランテリナ（Hemileuca eglanterina）、ヘミロイカ・エレクトラ・エレクトラ（Hemileuca electra electra）、ヘミロイカ・エレクトラ・モジャベンシス（Hemileuca electra mojavensis）、ヘミロイカ・ヌッタリ（Hemileuca nuttalli）、ワタノメイガ、ロンドチア・メンシアナ（Rondotia menciana）、アムフィオン・フロリデンシス（Amphion floridensis）、イブキスズメ、マツクロスズメ、タバコスズメガ、スフィンクス・ドルピフェラルム（Sphinx drupiferarum）、ミスジアオリンガ、ヒメコブガまたはオオワタノメイガから単離される。(E10,Z12)-コンジュガーゼまたはそれをコードする核酸配列は特別に好ましくは、上記昆虫のフェロモン腺から単離される。
【００５０】
(Z9,E11)-コンジュガーゼまたはそれをコードする核酸配列は好ましくは、ジアトラエ・サッカラリス（Diatraea saccharalis）、ホソバコスガ、マツノマダラメイガ、ステノマ・セクロピア（Stenoma cecropia）、ファロニジア・マンニアナ（Phalonidia manniana）、フキトリバ、マツノマダラメイガ；ジオリクトリア・ルベラ（Dioryctria rubella）、ミエロプシス・テトリセラ（Myelopsis tetricella）、ナミガタウスキアオシャク、ナミスジチビヒメシャク、スポドプテラ・デスコインシ（Spodoptera descoinsi）、スポドプテラ・エリダニア（Spodoptera eridania）、スポドプテラ・ラティファシア（Spodoptera latifascia）、スポドプテラ・リットラリス（Spodoptera littoralis）またはハスモンヨトウから単離される。(Z9,E11)-コンジュガーゼまたはそれをコードする核酸配列は特別に好ましくは、上記昆虫のフェロモン腺から単離される。
【００５１】
Z11-デサチュラーゼとZ11-コンジュガーゼのいずれも、基質として植物アシル-CoA脂肪酸誘導体を受容し、植物での鱗翅目からのこれら２種のデサチュラーゼの組合せ発現により、(10E,12Z)-CLAが産生され、それが貯蔵脂質に組み込まれる。
【００５２】
所望のCLA異性体、特に(9Z,11E)-CLAおよび(10E,12Z)-CLAを製造することを目的としたコンジュガーゼまたはデサチュラーゼの互いのまたは植物酵素との可能な組合せがいくつかある。下記のプロセスは例示を目的としたものと理解すべきであり、限定的なものではない。
【００５３】
１）例えばE11-デサチュラーゼによるC11位のトランス−脱飽和を介してステアリン酸を原料として、トランス−バクセン酸を製造することができる（図式３）。
【化３】
2006503546.tif 000004
【００５４】
図式３：ステアリン酸を原料とする(9Z,11E)-CLAおよび(10E,12Z)-CLAの産生の生合成経路
パルミチン酸を原料として、例えばE9-デサチュラーゼによってC9位でのトランス−脱飽和を介して、パルミトオレイン酸（9E-ヘキサデセン酸）が産生される。次に、エロンガーゼの酵素活性を介してパルミトオレイン酸を延長して、トランス−バクセン酸を得ることができる（図式４）。
【化４】
2006503546.tif 000005
【００５５】
図式４：パルミチン酸を原料とする(9Z,11E)-CLAおよび(10E,12Z)-CLA産生の生合成経路
次に、トランス−バクセン酸をD9-デサチュラーゼによって変換して、(9Z,11E)-CLA異性体を得ることができる。哺乳動物およびヒトにおいて、トランス−バクセン酸が内因性D9-デサチュラーゼの酵素活性によってCLAに変換されることが示されている（WO 99/20123; Santora JE ら. (2000) J Nutr 130:208-215; Adlof RO ら. (2000) Lipids 35: 131-135）。同様に、E11-デサチュラーゼを発現する昆虫細胞が、得られたE11-脂肪酸原料をZ9,E11-脂肪酸に変換する能力を有することが示されている（Liu WT ら. (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99(2):620-624）。同様に、植物D9-デサチュラーゼは、トランス−バクセン酸の(Z9,E11)-CLA異性体への変換を触媒することができる。特別に好ましい実施形態では、この変換は、Z9-デサチュラーゼのさらなる発現によってさらに増加し得る。この文脈で好ましいものは、例えば酵母Z9-デサチュラーゼなどの細胞質ゾル的に活性なZ9-デサチュラーゼである。そこで、トランス−デサチュラーゼを発現させることで、植物での(Z9,E11)-CLA異性体の産生が可能となる。特に有利な(9Z,11E)-CLA異性体は、植物Z9-デサチュラーゼの効果の結果として形成される。
【００５６】
２）ステアリン酸を原料として、C10位でのトランス脱飽和によって、相当するE10-オクタデセン酸が最初に形成される（図式３）。別法として、C8位でのトランス脱飽和を介して、パルミチン酸を原料としてE8-ヘキサデセン酸を製造することができる。次に、エロンガーゼの酵素活性を介してE8-ヘキサデセン酸を変換して、E10-オクタデセン酸を得ることができる（図式４）。この脂肪酸をD12-デサチュラーゼの活性によって変換することで、(E10,Z12)-CLA異性体が得られる。この反応はまた、植物D12-デサチュラーゼによっても触媒される。特に好ましい実施形態では、この変換速度は、Z12-デサチュラーゼのさらなる発現によってさらに増加させることができる。
【００５７】
３）鱗翅目からの相当する(E10,Z12)-コンジュガーゼも用いることができる。そのコンジュガーゼは、例えばZ11-オクタデセン酸（シス−バクセン酸）、E11-オクタデセン酸（トランス−バクセン酸）またはZ10-オクタデセン酸を(E10,Z12)-CLAに変換する。そのためには最初に、Z11-デサチュラーゼの効果の結果としてステアリン酸をZ11-オクタデセン酸に、上記のようにトランス−バクセン酸に、あるいはZ10-デサチュラーゼによってZ10-オクタデセン酸に変換する。
【００５８】
４）鱗翅目からの(Z9,E11)-コンジュガーゼはさらに、(Z11)-、(Z10)-または(E10)-デサチュラーゼと有利に結合することもできる。ステアリン酸を原料として、これらのデサチュラーゼは、Z11-オクタデセン酸(シス−バクセン酸)、Z10-オクタデセン酸またはE10-オクタデセン酸を産生し、それらは次に(Z9/E11)-コンジュガーゼによる変換を受けて(Z9,E11)-CLAを与える。
【００５９】
そうして製造されたCLA脂肪酸またはCoA脂肪酸エステルなどのその誘導体は、膜脂質およびトリアシルグリセリドに貯蔵される。
【００６０】
望ましい酵素活性は、鱗翅目昆虫、特には上記の昆虫種で局在していた。それに関しては、本発明で提供するアッセイ系を用いた（実施例２、３および４）。
【００６１】
これらの活性をコードする酵素またはそれをコードする核酸配列は、当業者が習熟しているか、あるいは相当する既知配列からの突然変異誘発による推定される方法で、対象生物から単離することができる。
【００６２】
蛋白配列または酵素活性、機能性または表現型に相当するcDNA配列を見出すことは、生化学および分子生物学における従来の仕事である。当業者は、この問題を解決するための各種方法に精通している。例えばこれらの方法は、デサチュラーゼまたはコンジュガーゼ活性を測定するための本発明の範囲内で提供されるアッセイに基づいたものである（特に、実施例３参照）。対象とするデサチュラーゼ／コンジュガーゼの特異的活性を、例えば実施例２、３および４に記載のガスクロマトグラフィーによって、脂肪酸パターンを分析することで求める。デサチュラーゼまたはコンジュガーゼ活性が検出されている生体材料を原料として、このアッセイを用いることで、対象とする蛋白またはデサチュラーゼもしくはコンジュガーゼ活性を有する蛋白をコードする核酸を単離し、それを分析することが可能となる。
【００６３】
例えば、発現クローニングを方法として用いることができる。この方法は非常に多くの場合、特定の酵素活性、特定の機能性または特定の表現型を原料として、それに関わる遺伝子またはその遺伝子に相当するcDNAを単離するのに用いられてきた（Dalboge H (1997) FEMS Microbiology Reviews 21(1):29-42, Simonsen H および Lodish HF (1994) Trends Pharmacol Sci 15(12):437-441）。従来の発現クローニング方法は、多くの場合について報告されており、例えば膜タンパク質、分泌因子および膜横断チャンネルについてのものがある（Masu Y ら. (1987) Nature 329(6142):836-838; Wong GG ら. (1985) Science 228(4701):810-815; Lustig KD ら. (1996) Development 122(12): 4001-4012; Smith WC および Harlおよび RM (1992) Cell 70(5):829-840; Lemaire P ら. (1995) Cell 81(1):85-94; Gillissen B ら. (2000) Plant Cell 12(2):291-300; Lotan T および Hirschberg J (1995) FEBS Letters 364:125-128）。
【００６４】
下記に記載の発現クローニングと称される一般法では、例えば各種文献（Maniatis T, Fritsch EF および Sambrook J, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) および in Silhavy TJ, Berman ML および Enquist LW, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) および in Ausubel FM ら. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. および Wiley Interscience）に記載の通常の組換えおよびクローニング法を用いる。
【００６５】
通常、デサチュラーゼまたはコンジュガーゼ活性を生じさせることができる生物、細胞または組織を原料として、発現ライブラリを得ることができる。例えば最初に、当業者が習熟している方法で前記生物、細胞または組織からmRNAまたは好ましくはポリ(A)-mRNAを単離し、単離されたものに基づいてcDNAを得る（Gubler U、Hoffman BJ (1983) Gene 25:263-269）。当業者は、mRNAまたはポリ(A)-mRNAを単離するための各種系に習熟しており、それらは市販されている。例えばその合成は、「クイック・プレプ・マイクロmRNA精製キット（Quick Prep Micro mRNA Purification Kit）」（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech））を用いて行うことができる。第１の鎖cDNA合成は好ましくは、逆転写酵素を用いてオリゴ(dT)プライマーによって行う（Borson ND ら. (1992) PCR Methods Appl 2:144-148; Chenchik A ら. (1994) CLONTECHniques 9(1):9-12）。全長cDNAの形成を可能とする各種系が公知であり、市販されている。言及することができる例は、「SMART（商標）cDNAライブラリ構築キット」（Clontech、カタログ番号K1051-1）である。このキットでは、SMART（商標）技術(SMART＝RNAテンプレートの５’末端でのスイッチ機序）を用いて、cDNAライブライの形成を行う（Herrler M (2000) J Mol Med 78(7):B23）。特異的オリゴヌクレオチドおよび長距離PCRと称される方法を用いる。その方法については、実施例４に記載されている。
【００６６】
１本鎖突出を有するアダプターを２本鎖cDNAに連結することができる。そのアダプターによって、制限酵素によって開裂され、適合性の付着端を有する発現ベクターでのクローニングが可能となる。好ましくはクローニングは、読み取りの方向が固定され、存在し得るプロモーターがcDNA挿入から開始してセンスRNAを形成するような方向とする。例として使用されるSMART（商標）系では、適合性のSfiI(A)およびSfiI(B)突出を、SfiI（組換え配列GGCCNNNN!NGGCC）開裂ベクターへの-有向クローニングに用いる。各場合において、１個のcDNA分子をベクター分子にクローニングすることで、最終的に同一の基本ベクターに基づき、組立cDNAに関して異なる複数のベクターが存在し、発現ライブラリを形成する。この発現ライブラリはまた、デサチュラーゼまたはコンジュガーゼトランス遺伝子を発現することができるベクターを含む。好適な発現ベクターは基本的には、形質転換生物で活性型のデサチュラーゼまたはコンジュガーゼを組換え発現することができるもの全てである。言及することができる例には、大腸菌での組換え発現用のλ−TriplEX2ベクター（切り取り後、pTriplEX2ベクター；製造者：Clontech）または酵母サッカロミセス・セレビシエ（S.cerevisiae）での組換え発現用のベクターpYES2（製造者：Invitrogen）である（実施例４参照）。
【００６７】
適切であれば、正規化を行って、個々の遺伝子の発現レベルにおける差を補償して、発現される各遺伝子に対するcDNAを、実際の発現レベルとは独立に、同様のコピー数を有する発現ライブラリで表すことができる。ポリ(A)-mRNA、cDNAおよび標準化cDNA（US5,482,845）の形成については、各種系が報告されている（Soares MB ら. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:9228-9232; Carninci P ら. (2000) Genome Res 10:1617-1630; Bonaldo MF ら. (1996) Genome Res 6:791-806）。
【００６８】
しかしながら、サブトラクション発現ライブラリを確立することもできる。その方法では、デサチュラーゼまたはコンジュガーゼを有する生物、細胞または組織のcDNAを、可能であれば同じ属および種のその活性を持たない生物、細胞または組織のcDNAと比較する。当業者は、デサチュラーゼまたはコンジュガーゼ活性を有する生体材料でのみ発現されるcDNAの標的単離方法について習熟している。そのような方法および系については報告があり、市販されている。言及することができる例には、希少および／または選択的に発現されるcDNAの1000倍を超える濃縮を可能とする「PCR-セレクト（PCR-Select；商標）cDNAサブトラクションキット」（製造者：Clontech）または「サブトラクター（Subtractor；商標）キット」（製造者：Invitrogen）がある。サブトラクションハイブリダイゼーションを用いて、両方の生体材料に存在する全てのcDNAが除去される（Chu ZL ら. (1997) Proc Nat Acad Sci USA 94:10057-10062; Hudson C ら. (1997) Cell 91:397-405; Mueller CGF ら. (1997) J Exp Med 186:655-663; von Stein OD ら. (1997) Nucleic Acids Res 25:2598-2602; Wong BR ら. (1997) J Biol Chem 272:25190- 25194; Yokomizo T ら. (1997) Nature 387:620-624; Zhicheng S および Jacobs-Lorena M (1997) J Biol Chem 272:28895-28900）。
【００６９】
その発現ライブラリにおけるcDNAは、例えば原核生物細胞または真核生物細胞で組換え発現することができ、それらについて次に、デサチュラーゼまたはコンジュガーゼタンパク質についてのアッセイ、例えばデサチュラーゼまたはコンジュガーゼ活性についてのアッセイを行う。
【００７０】
発現ライブラリからデサチュラーゼまたはコンジュガーゼを組換え発現するベクターを単離するには、発現ライブラリは好ましくは、生物に形質転換される。好ましくは、前記生物の個々の細胞を、各細胞またはその細胞から出発して再生される各生物が、１種のベクター分子のみで形質転換されるように形質転換する。基本的に、活性デサチュラーゼまたはコンジュガーゼを組換え発現することができる全ての生物またはそれに由来する細胞が、形質転換に好適である。それらの生物は、原核生物および真核生物であることができる。好ましいものは、全ての植物、それに由来する細胞、さらには例えばソウ類などの他の光合成生物である。言及することができる例には、大腸菌などの細菌、サッカロミセス属もしくはピチア属などの酵母、COSもしくはCHOなどの哺乳動物細胞、あるいはクロオコッカス科などの光合成活性生物の細胞での組換え発現に基づく系があるが、これらに限定されるものではない。好ましい生物は真核生物であり、特別に好ましくは脂肪酸またはアシル-CoA脂肪酸を合成することができる真核生物である。好ましくは、その形質転換に使用される発現ベクターは、良好に形質転換された細胞の選択を可能とする選択マーカー、例えばアミノ酸欠乏についての選択のための耐性構成物質またはアミノ酸合成遺伝子を含む。さらなる選択方法については、下記で説明する。
【００７１】
好ましい実施形態では、発現クローニングを酵母で行うことができる。そのためには例えば、ベクターpYES2に基づくInvitrogenからの酵母発現系を用いることが可能である。pYES2は、サッカロミセス・セレビシエ中の組換え蛋白の誘導発現用の高コピーエピソームベクターである。形質転換酵母株は、ウラシル欠乏に基づいて選択される（pYES2は、ura3遺伝子を含む）。
【００７２】
さらに好ましい発現ベクターおよび形質転換生物を得るためのトランスフェクション方法は、トランスジェニック生物を得る上で一般的に使用される方法に従ったものである。
【００７３】
総数の形質転換生物またはそれに由来する細胞から開始して、デサチュラーゼもしくはコンジュガーゼを組換え発現することができるものおよび／または相当するデサチュラーゼもしくはコンジュガーゼ活性を有するものを濃縮および単離する。
【００７４】
通常、デサチュラーゼ活性は、形質転換生物もしくはそれに由来する細胞を培養し、それを好適な緩衝液もしくは溶媒中で消化させ、消化物を脂肪酸もしくはアシル-CoA脂肪酸ならびに適切であればNADHもしくはNADPHなどの共同因子または酸素と接触させ、得られた脱飽和脂肪酸もしくはアシル-CoA脂肪酸を検出することで検出することが可能である。その脂肪酸またはアシル-CoA脂肪酸は好ましくは、生物またはそれに由来の細胞自体が脂肪酸またはアシル-CoA脂肪酸を合成することができる場合、形質転換生物自体を起源とする。しかしながらそうではない場合、脂肪酸またはアシル-CoA脂肪酸を加えることもできる。
【００７５】
デサチュラーゼまたはコンジュガーゼによって修飾された脂肪酸またはアシル-CoA脂肪酸を、インキュベーション混合物から例えば酢酸エチルなどの溶媒を用いて抽出した後に、当業者が習熟している一般的な方法によって検出することができる。高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、ガスクロマトグラフィー（GC）、薄層クロマトグラフィー（TLC）などの分離方法ならびに質量分析（MSまたはMALDI)、UVスペクトル分析またはオートラジオグラフィーなどの検出方法をそれに関して用いることができる。好ましくはその検出は、実施例３、４および５に記載の方法に従ってガスクロマトグラフィーを用いて行う。
【００７６】
デサチュラーゼまたはコンジュガーゼを組換え発現することができる形質転換生物またはそれに由来の細胞は、総数の細胞を小群に分け、適切であれば別個にそれらの小群を培養し、個々の小群のデサチュラーゼもしくはコンジュガーゼ活性を測定することで単離することができる。機能的に活性な形でデサチュラーゼまたはコンジュガーゼタンパク質を組換え発現する細胞型を含む小群は、高いデサチュラーゼ活性またはコンジュガーゼ活性を有する。この小群をさらに細分化し、デサチュラーゼもしくはコンジュガーゼをコードする特異的cDNAを有するベクターのみを含む培養物となるまでその手順を繰り返す。
【００７７】
デサチュラーゼまたはコンジュガーゼをコードする核酸を含むベクターは、形質転換生物または細胞から回収することができる。それは例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって行うことができる。そのためには、デサチュラーゼまたはコンジュガーゼcDNA挿入物に隣接するベクター配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。その文脈においては、デサチュラーゼまたはコンジュガーゼ核酸配列につての知見は必要ない。別法として、宿主ゲノムに組み込まれていない場合、ベクターを細胞から回収し、大腸菌に形質転換し、増殖させ、配列決定して、デサチュラーゼまたはコンジュガーゼをコードする核酸配列を得ることができる。上記の方法によれば、デサチュラーゼまたはコンジュガーゼ核酸配列も、その配列順序についての知見がなくとも、PCRによって単離ベクターから単離することができる。さらに、有向クローニングを可能とするリンカーを、PCR反応後にアンプリコンに加えることができる。しかしながらクローニングは、当業者が習熟している方法での平滑末端連結またはT-突出連結によって行うこともできる。そこで、PCRによって選択的に増幅されたデサチュラーゼまたはコンジュガーゼcDNAも、事前に配列を解明せずに、デサチュラーゼまたはコンジュガーゼを発現するトランスジェニック生物を生じる上で好適なベクターに直接クローニングすることができる。このクローニング手順は、例えば当業者が習熟している技術を用いる平滑末端クローニング法として行うことができる。それについては、上記で引用した一般的な組換え法およびクローニング法を用いる。
【００７８】
上記の発現クローニング方法は、特別に好ましくは酵母サッカロミセス−セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）で行うことができる。そのためには、組換え発現すべきcDNAを相同組換えによって、形成されている組み込みプラットホームに組み込む系を用いることも可能である（Lagarde D ら. (2000) Applied および Environmental Microbiology  66(1): 64-72）。
【００７９】
別法として、前記発現クローニング方法を、前記の非増幅発現ライブラリを用いてin vitroで行うこともできる。好適な系については報告があり、市販されている。言及することができる例には、「TNT（商標）結合網状赤血球溶解物系」（プロメガ（(Promega）；プロメガノート番号67, 1998, p. 02）がある。キルシュナー（Kirschner）らは、生存細胞を必要としないin vitro手法（IVEC＝「in vitro発現クローニング」）を開発している（US5,654,150；King RW ら. (1997) Science 277, 973）。その系は、特に酵素およびキナーゼに対して良好に適用されている。キルシュナー（Kirschner）らは、キナーゼ基質およびプロテアーゼを同定している（Lustig KD ら. (1997) Meth Enzymol 283:83; Stukenberg PT ら. (1997) Curr Biol 7:338; Kothakota S ら. (1997) Science 278:294）。「in vitro発現クローニング」（IVEC）では、発現ライブラリの小さい部分を用いる。各場合で約50〜100cDNAクローンのこれらの部分は、プラスミドに存在し、網状赤血球溶解物に基づく結合in vitro転写／翻訳系によって、それらの相当するタンパク質に翻訳される。そのためには、オリゴ(dT)-プライミングされたcDNAライブラリを上記の方法で構築し、T3、T7またはSP6プロモータを用いて高コピー発現プラスミドにクローニングする。次に、そのプラスミドライブラリを大腸菌に形質転換する。各場合で、約50〜100個の独立の形質転換体を、相当する選択抗生物質の入った寒天平板でコロニーの大きさが約1mmとなるまで培養し、回収し、蓄積する。その細菌蓄積物の一部からプラスミドDNAを単離する。鋳型として用いられるこのプラスミドDNAを、網状赤血球系に直接点転写し、翻訳する。この手順の詳細は例えば、製造者のハンドブックに記載されている（TNT（商標）Coupled Reticulocyte Lysate Systems Technical Bulletin #TB126, Promega Corporation)。ライブラリ中の全長cDNAクローンの数に応じて、個々の混合物当たりで約30〜50のタンパク質を合成する。製造されたタンパク質について、それらのデサチュラーゼまたはコンジュガーゼ活性の分析を行う。デサチュラーゼまたはコンジュガーゼ活性が高い個々の混合物をさらに細分化する。個々の混合物を細分化することで、デサチュラーゼまたはコンジュガーゼをコードするcDNAが得られる。デサチュラーゼまたはコンジュガーゼをコードする核酸は、その取得物に存在するベクターからPCRによって増幅することができ、適切であれば配列の知見および分析なしに上記の方法に従って用いてデサチュラーゼまたはコンジュガーゼを組換え発現する生物を得ることができる。
【００８０】
ウサギ網状赤血球抽出物に対する代替品として、小麦麦芽抽出物を用いて、組換え転写／翻訳法に用いることもできる（例えば、ClontechからのTNT（商標）小麦麦芽抽出物系を使用）。
【００８１】
さらに別の有利な利用分野では、cDNAをレトロウィルスベクターにクローニングすることもできる。それによって、細胞の非常に効率的な形質転換が可能である。レトロウィルス発現ベクターおよび発現系については報告があり（Kitamura T, International Journal of  Hematology 1998, 67:351-359）、市販されている（例えば、Clontechから；New Retroviral & ClonCapture Expression Libraries; CLONTECHniques October 1998, XIII(4):22-23）。最初に、パッケージング細胞系でトランスフェクションを行う（例えば：ClontechからのEcoPack（商標）-293またはRetroPack（商標）PT67細胞系）。このようにして得られたウィルスを用いて、対象となる標的細胞系をトランスフェクションし、所望の活性について選択することができる。次に、昆虫を得て、例えばPCRによって分析することができる。さらにそれを、事前に配列解析を行うことなく好適な発現ベクターに直接クローニングすることができ、その発現ベクターを用いて、デサチュラーゼまたはコンジュガーゼを組換え発現することができる生物を得ることができる。
【００８２】
トランス位での脱飽和に特異的となるような突然変異誘発を介して、既知のシス−デサチュラーゼを修飾することで、E10-またはE11-デサチュラーゼを得ることができる。そのためには例えば、シス−デサチュラーゼをコードする下記の核酸配列が出発の配列として働くことができ、それについて突然変異誘発を行うことができる。
【００８３】
ｉ）配列番号７を有するアメリカタバコガからのZ11-デサチュラーゼをコードする核酸配列；
ii）配列番号９を有するイラクサギンウワバからのZ11-デサチュラーゼをコードする核酸配列
iii）配列番号11を有するアルギロテニア・ベルチナナ（Argyrotaenia velutinana）からのZ11-デサチュラーゼをコードする核酸配列；または
iv）配列番号13を有するプラノトルトリクス・オクト（Planotortrix octo）からのZ10-デサチュラーゼをコードする核酸配列。
【００８４】
さらに、E11-デサチュラーゼは、鎖が長い脂肪酸ほど効率よく変換できるような形での突然変異誘発によって修飾することができる。以下に、使用可能な開始配列の例を示す。
【００８５】
ａ）配列番号１を有するエピフィアス・ポストビッタナ（Epiphyas postvittana）からのE11-デサチュラーゼをコードする核酸配列；
ｂ）配列番号３を有するヨーロッパアワノメイガからのE11-デサチュラーゼをコードする核酸配列、または
ｃ）配列番号５を有するアワノメイガからのE11-デサチュラーゼをコードする核酸配列。
【００８６】
突然変異誘発によって、上記のデサチュラーゼによって二重結合が導入される位置に対する特異性を変えることも想到され得る。
【００８７】
突然変異誘発によるデサチュラーゼの基質特異性などの特性を変える方法は公知である（Cahoon ら. (1997) Proc Nat Acad Sci USA 94:4872-4877; WO 98/06735）。さらに好適な方法が、例えばリポキシゲナーゼ類などの脂質代謝の他の酵素について報告されており、それを同様に用いることができる（Hornung ら. (2000) Biochem Soc Trans 28:825-826; Schwarz ら. (2001) J Biol Chem 276:773-779）。
【００８８】
本発明による方法で使用されるデサチュラーゼ／コンジュガーゼをコードする核酸配列は、cDNA取得物または個々の上記の鱗翅目のライブラリからの好適な変性オリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ廉な反応によって単離することもできる。好ましく用いられるものには、配列番号15および16によって記載されるオリゴヌクレオチドプライマーペアまたは配列番号17および18によって記載されるオリゴヌクレオチドプライマーペアがある。
【００８９】
本発明による方法で用いられる鱗翅目からの脂肪酸デサチュラーゼの核酸配列は好ましくは、下記のものを含む。
【００９０】
ａ）そのセンス鎖における配列番号15または17によって記載される配列モチーフ；あるいは
ｂ）そのアンチセンス鎖における配列番号16または18によって記載される配列モチーフ。
【００９１】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明による方法で使用される鱗翅目からの脂肪酸デサチュラーゼのタンパク質配列は好ましくは、配列番号２、４、６、８、10、12もしくは14によって記載されるいずれかの脂肪酸デサチュラーゼと少なくとも65％、好ましくは少なくとも70％、特別に好ましくは少なくとも80％、非常に好ましくは少なくとも90％の相同性を有し、適宜かつ好ましくは、デサチュラーゼまたはコンジュガーゼの好ましい必須特性のうちの少なくとも一つを有する。
【００９２】
これらのタンパク質は、上記デサチュラーゼ核酸配列のいずれかの自然もしくは人工的突然変異および他の動物もしくは植物の属および種からのそれらの同族体をも含むことができる。突然変異には、１以上のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、反転または挿入が含まれる。例えば転位および転換などの挿入、欠失または置換が好適である場合、in vitro突然変異誘発、プライマー修復、制限または連結などの自体が公知の方法を用いることができる。例えば平滑末端における突出の制限、噛み戻し（chewing-back）または充填などの手法を行うことで、断片の相補末端を連結に備えることができる。特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて、同様の結果を得ることもできる。
【００９３】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明による方法で使用される鱗翅目からの脂肪酸デサチュラーゼをコードする核酸配列は好ましくは、配列番号１、３、５、７、９、11もしくは13によって記載されるいずれかの核酸配列と少なくとも65％、好ましくは少なくとも70％、特別に好ましくは少なくとも80％、非常に好ましくは少なくとも90％の相同性を有し、適宜かつ好ましくは、デサチュラーゼまたはコンジュガーゼの好ましい必須特性のうちの少なくとも一つを有する。
【００９４】
２つの核酸またはポリペプチド間の相同性は、それぞれ全配列長にわたる核酸配列の同一性を意味するものと理解され、それは下記のパラメータを設定するプログラムアルゴリズムGAPを利用したアラインメントによって計算される（Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA)。
【００９５】
ギャップウェイト：12、長さウェイト：４
平均マッチ：2.912、平均ミスマッチ：-2.003。
【００９６】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明による方法で使用される鱗翅目からの脂肪酸デサチュラーゼをコードする核酸配列は好ましくは、標準的な条件下で、デサチュラーゼをコードする上記のいずれかの核酸配列、好ましくは配列番号１、３、５、７、９、11または13に示した配列とハイブリダイズする。
【００９７】
「標準的なハイブリダイゼーション条件」という用語は、広い意味で理解されるべきであり、ストリンジェント、あるいはややストリンジェントさの低いハイブリダイゼーション条件を指す。そのようなハイブリダイゼーション条件は特に、サムブロックらの著作（Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T ら., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57)または他の著作（Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6）に記載されている。例えば、洗浄段階中の条件は、低ストリンジェントのもの（50℃で約2XSSC）および高ストリンジェントのもの（50℃、好ましくは65℃で約0.2XSSC）によって区切られる条件の範囲から選択することができる（20XSSC：0.3Mクエン酸ナトリウム、3MNaCl、pH7.0）。さらに、洗浄時段階中の温度は、約22℃の室温での低ストリンジェント条件から、約65℃の高ストリンジェント条件に上昇し得る。塩濃度および温度という２つのパラメータを同時に変化させることができるか、あるいはその２つのパラメータのうちの一方を一定に保ち、他方のみを変動させることができる。例えばホルムアミドまたはSDSなどの変性剤を、ハイブリダイゼーション反応時に用いることもできる。50％ホルムアミド存在下で、ハイブリダイゼーション反応は好ましくは約42℃で行う。ハイブリダイゼーションおよび洗浄段階についての条件の例をいくつか、以下で詳細に説明する。
【００９８】
（１）例えば下記のハイブリダイゼーション条件：
ａ）65℃で4XSSC、
ｂ）45℃で6XSSC、
ｃ）68℃で6XSSC、100μｇ／mlの変性魚精子DNA、
ｄ）42℃で4XSSC、50％ホルムアミド、
ｅ）50℃で2Xまたは4XSSC（低ストリンジェント条件）、あるいは
ｆ）42℃で2Xまたは4XSSC、30〜40％ホルムアミド（低ストリンジェント条件）。
【００９９】
（２）例えば、下記での洗浄段階：
ａ）65℃で0.1XSSC、または
ｂ）68℃で0.1XSSC、0.5％SDS、または
ｃ）42℃で0.1XSSC、0.5％SDS、50％ホルムアミド、または
ｄ）42℃で0.2XSSC、0.1％SDS、または
ｅ）65℃で2XSSC（低ストリンジェント条件）。
【０１００】
本発明に関して「核酸配列」とは、例えばゲノムもしくは相補DNA（cDNA）配列またはRNA配列、ならびにそれらの半合成もしくは全合成類縁体を指す。それらの配列は、直鎖または環状の形状で存在するか、過剰染色体で存在するか、あるいはゲノムに組み込まれて存在することができる。本発明による発現カセットまたは核酸のヌクレオチド配列は、合成的に形成することができるか、あるいは天然に得ることができるか、あるいは合成および天然のDNA構成要素の混合物を含み、各種生物の各種異種遺伝子断片からなることができる。さらに、所望の必須特性を有する限りにおいて、人工核酸配列が好適である。例えば、形質転換される植物が好むコドンを有する合成ヌクレオチド配列を得ることができる。植物が好むこれらのコドンは、最も高いタンパク質頻度を有するコドンからのコドン使用に基づいて通常の方法で決定することができる。特に好適なものは、宿主植物特異的コドン使用に従ったポリペプチド配列の逆翻訳（backtranslation）によって得られたコードヌクレオチド配列である。望ましくない植物調節機序を回避するため、例えば鱗翅目昆虫からのデサチュラーゼのアミノ酸配列から出発し、植物コドン使用を検討して、DNA断片を逆翻訳し、その結果を利用して植物での使用に至適化された完全な外因性デサチュラーゼ配列を得ることが可能である。
【０１０１】
上記の全てのヌクレオチド配列は、例えば、二重らせんの個々の重なる相補的核酸単位の断片濃縮などによって、ヌクレオチド単位から自体公知の方法で化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドは、例えばホスホアミダイト法によって自体公知の方法で化学的に合成することができる（Voet, Voet, 第2版, Wiley Press New York, pages 896-897）。核酸構築物を得る場合、正しい読み取り方向および正しい読み取り枠を有するヌクレオチド配列が得られるように各種DNA断片を操作することができる。アダプターまたはリンカーをその断片に付加させて、核酸断片を互いに連結することができる。合成オリゴヌクレオチドの付加とDNAポリメラーゼのクレノウ断片を用いたギャップの充填、連結反応および一般的なクローニング方法については、サムブルックらの著作に記載されている（Sambrook ら. (1989). Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
【０１０２】
例えば核酸配列、発現カセット、ベクターまたは生物について言及する場合に、「トランスジェニック」／「組換え」とは、組換え法によって生じた全ての構築、あるいはその使用を指し、
ａ）デサチュラーゼをコードする核酸配列、または
ｂ）デサチュラーゼをコードする核酸配列に機能的に（operably）連結されたプロモーターなどの遺伝子制御配列、または
ｃ）（ａ）および（ｂ）
はそれらの天然の遺伝子環境にないか、あるいは組換え法によって修飾されており、その修飾は例えば１以上のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、反転または挿入の形態を取る。天然遺伝子環境という用語は、起源の生物での天然の染色体座、あるいはゲノムライブラリでの存在を指す。ゲノムライブラリの場合、核酸配列の天然遺伝子環境は好ましくは、少なくとも部分的に保持されている。その環境は、核酸配列の少なくとも片側に隣接し、少なくとも50bp、好ましくは少なくとも500bp、特別に好ましくは少なくとも1000bp、非常に好ましくは少なくとも5000bpの配列長さを有する。天然発現カセット−例えばデサチュラーゼをコードする遺伝子配列とそのプロモーターとの天然の組合せ−は、後者を例えば突然変異誘発などの非天然の合成（「人工」）法によって修飾した場合、組換え発現カセットになる。そのような方法については報告がある（US5,565,350；WO 00/15815；上記のものも参照）。
【０１０３】
組換え発現とは、核酸配列を発現する上での組換え発現カセットの使用を指す。
【０１０４】
本発明はさらに、デサチュラーゼコード核酸配列を有する組換え発現カセットならびにその発現カセットを包含するベクターに関するものでもある。
【０１０５】
前記組換え発現カセットにおいて、デサチュラーゼコード核酸分子は好ましくは、好ましくは植物、植物体、ソウ類、酵母または真菌での前記デサチュラーゼの組換え発現（転写および／または翻訳）を確実に行う少なくとも一つの遺伝子制御要素（例えばプロモーター）と機能的に連結されている。組換え発現カセットを植物に直接導入し、デサチュラーゼを植物で発現する場合、植物特異的遺伝子制御要素（例えばプロモーター）が好ましい。しかしながらデサチュラーゼは、他の生物やin vitroでも発現可能である。その場合、好ましい原核生物または真核生物の遺伝子制御要素（例えばプロモーター）は、製造のために各場合で選択された生物での発現を可能とするもの全てである。
【０１０６】
従って本発明はさらに、植物、植物体、ソウ類、酵母または真菌で機能性であるプロモーターの制御下で鱗翅目昆虫からの脂肪酸デサチュラーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列を有する組換え発現カセットに関するものである。好ましくは、発現カセットに存在する核酸配列が、下記からなる群から選択される少なくとも１個の配列を包含するポリペプチドをコードする。
【０１０７】
ａ）配列番号２、４、６、８、10、12、14または22に示したアミノ酸配列、および
ｂ）配列番号２、４、６、８、10、12、14または22に示したアミノ酸配列の一つと少なくとも65％の相同性を有するアミノ酸配列、および
ｃ）配列番号２、４、６、８、10、12、14または22に示した配列の少なくとも20個の連続アミノ酸配列の断片を包含するアミノ酸配列。
【０１０８】
脂肪酸デサチュラーゼは特別に好ましくは、本文脈において、配列番号22に示したアミノ酸配列によって記載されたものである。
【０１０９】
本発明はさらに、少なくとも１個の本発明による発現カセットを含む組換え発現ベクターならびに少なくとも１個の本発明による組換え発現カセットまたは本発明による組換え発現ベクターのうちの１個を含むトランスジェニック生物に関する。好ましくは前記トランスジェニック生物は植物であり、特別に好ましくは例えばヒマワリ、ゴマ、紅花、オリーブの木、ダイズ、亜麻仁、落花生、ヒマシ油植物、ギネアアブラヤシ、トウモロコシ、小麦、カカオ木およびナッツ類などのオイル製造に使用される植物から選択される。
【０１１０】
機能的連結は、例えば発現されるべきデサチュラーゼ核酸配列を有するプロモーターの順次配置、ならびに適切な場合には、例えば前記核酸配列が組換え発現される際に調節要素がその機能を果たすことができるような形でのターミネータ配列などのさらなる調節要素を意味するものと理解される。それに関しては、化学的意味での直接連結は必ずしも必要ではない。例えばエンハンサー配列などの遺伝子制御配列は、さらに除去される位置から、あるいは他のDNA分子からの標的配列上でその機能を発揮することもできる。好ましい配置は、組換え発現されるべき核酸配列が、プロモーターとして作用する配列の後に位置することで、その２つの配列が互いに共有結合的に連結されているようなものである。プロモーター配列と組換え発現されるべき核酸配列との間の距離は、好ましくは200塩基対未満、特に好ましくは100塩基対未満、非常に好ましくは50塩基対未満である。
【０１１１】
機能的連結およびトランスジェニック発現カセットのいずれも、文献（例えば、Maniatis T, Fritsch EF および Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY); Silhavy TJ, Berman ML und Enquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY); Ausubel FM ら. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. および Wiley Interscience; Gelvin ら. (1990) In: Plant Molecular Biology Manual）に記載されている従来の組換え技術およびクローニング技術によって製造することができる。しかしながら、例えば制限酵素またはシグナルペプチドの特異的開裂部位を有するリンカーとして働くさらなる配列を、これら２つの配列の間に配置することもできる。さらに、配列の挿入によって、融合タンパク質の発現が生じる可能性がある。好ましくは、発現すべき核酸配列に連結されたプロモーターからなる組換え発現カセットは、ベクター組み込み型であることができ、例えば形質転換によって植物ゲノムに挿入することができる。
【０１１２】
しかしながら、トランスジェニック発現カセットは、デサチュラーゼをコードする核酸配列が内因性プロモーターの後に、その後者がデサチュラーゼ発現を制御するような形で配置された構築物を意味するものとも理解される。挿入によって生じる内因性プロモーターおよびデサチュラーゼ核酸配列の融合が、本発明に関しての組換え発現カセットである。
【０１１３】
植物特異的プロモーターは、植物もしくは植物部分、植物細胞、植物組織または植物培養物における遺伝子、特に外来遺伝子の発現を支配することができるプロモーターを意味するものと理解される。この文脈では、発現は例えば、構成的、誘導性または発達依存的であり得る。下記のものが好ましい。
【０１１４】
ａ）構成プロモーター
好ましいベクターは、植物での構成的発現を可能とするものである（Benfey ら. (1989) EMBO J.8, 2195-2002）。「構成」プロモーターとは、植物発達のかなりの期間にわたり、好ましくは植物発達の全期間にわたり、非常に多くの数の、好ましくは全ての組織において発現を確実に行うプロモーターを指す。植物プロモーターまたは植物ウィルスを起源とするプロモーターが特別に好ましく用いられる。CaMV（カリフラワーモザイクウイルス）35S転写物のプロモーター（Franck ら. (1980) Cell 21:285-294; Odell ら. (1985) Nature 313:810-812; Shewmaker ら. (1985) Virology 140:281-288; Gardner ら. (1986) Plant Mol Biol 6:221- 228）または19SCaMVプロモーター（US5,352,605; WO 84/02913; Benfey ら. (1989) EMBO J 8:2195-2202）が特に好ましい。別の好適な構成プロモーターは、ルビスコ小サブユニット（SSU）プロモーター（US4,962,028）、レグミンＢプロモーター（GenBank Acc. No. X03677）、アグロバクテリウムからのノパリンシンターゼのプロモーター、TR二重プロモーター、アグロバクテリウムからのOCS（オクトピンシンターゼ）プロモーター、ユビキチンプロモーター（Holtorf S ら. (1995) Plant Mol Biol 29:637-649）、ユビキチン１プロモーター（Christensen ら. (1992) Plant Mol Biol 18:675-689; Bruce ら. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:9692-9696）、Smasプロモーター、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（US5,683,439）、空胞ATPaseサブユニットのプロモーターまたは小麦からのプロリン豊富タンパク質のプロモーター（WO 91/13991）、植物での構成的発現が当業者には公知である遺伝子のさらに別のプロモーターである。
【０１１５】
ｂ）組織特異的プロモーター
さらに好ましいものは、葯、子房、花、葉、茎、根および種子に対して特異性を有するプロモーターである。
【０１１６】
種子特異的プロモーター
例えば、ファゼオリンプロモーター（US 5,504,200; Bustos MM ら. (1989) Plant Cell 1(9):839-53）、25アルブミン遺伝子プロモーター（Joseffson LG ら. (1987) J Biol Chem 262:12196-12201）、レグミンプロモーター（Shirsat A ら. (1989) Mol Gen Genet 215(2):326-331）、USP（未知種子タンパク質）プロモーター（Baumlein H ら. (1991) Mol Gen Genet 225(3):459-67）、ナピン遺伝子プロモーター（US5,608,152; Stalberg K ら. (1996) L Planta 199:515-519）、ショ糖結合タンパク質のプロモーター（WO 00/26388）もしくはレグミンB4プロモーター（LeB4; Baumlein H ら. (1991) Mol Gen Genet 225: 121-128; Baumlein ら. (1992) Plant Journal 2(2):233-9; Fiedler U ら. (1995) Biotechnology (NY) 13(10):1090f）、シロイヌナズナ・オレオシンプロモーター（WO 98/45461）、ならびにアブラナBce4プロモーター（WO 91/13980）。さらに別の好適な種子特異的プロモーターは、高分子量のグルテニン（HMWG）、グリアジン、枝分れ酵素、ADPグルコースロホスファターゼ（AGPase）またはデンプンシンターゼをコードする遺伝子のものである。さらに好ましいプロモーターは、トウモロコシ、大麦、小麦、ライ麦、米などの単子葉植物での種子特異的発現を可能とするものである。lpt2またはlpt1遺伝子のプロモーター（WO 95/15389、WO 95/23230）あるいはWO 99/16890に記載のプロモーター（ホルデイン遺伝子、グルテリン遺伝子、オリジン（oryzin）遺伝子、プロラミン遺伝子、グリアジン遺伝子、グルテリン遺伝子、ゼイン遺伝子、カシリン（casirin）遺伝子またはセカリン遺伝子のプロモーター）が有利に使用可能である。
【０１１７】
塊茎、貯蔵根または根特異的プロモーター
例えばクラスＩパタチンプロモーター（B33）およびジャガイモからのカテプシンＤ阻害薬のプロモーターなど。
【０１１８】
葉特異的プロモーター
ジャガイモ細胞質ゾルFBPaseのプロモーター（WO 97/05900）、ルビスコ（リブロース-1,5-ビスホスフェートカルボキシラーゼ）のSSUプロモーター（小サブユニット）、あるいはジャガイモST-LSIプロモーター（Stockhaus ら. (1989) EMBO J 8:2445-2451）など。
【０１１９】
花特異的プロモーター
例えば、フィトエンシンターゼプロモーター（WO 92/16635）またはP-rr遺伝子のプロモーター（WO 98/22593）など。
【０１２０】
葯特異的プロモーター
5126プロモーター（US 5,689,049、US 5,689,051）、glob-lプロモーターおよびg-ゼインプロモーターなど。
【０１２１】
ｃ）化学誘導性プロモーター
組換え発現カセットは、植物における外因性遺伝子の発現を特定の時点で制御することができる化学誘導性プロモーターを含むこともできる（総説：Gatz ら. (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48:89-108）。例えばPRP1プロモーター（Ward ら. (1993) Plant Mol Biol 22:361-366）、サリチル酸誘導プロモーター（WO 95/19443）、ベンゼンスルホンアミド誘導プロモーター（EP0388186）、テトラサイクリン誘導プロモーター（Gatz ら. (1992) Plant J 2:397-404）、アブシジン酸誘導プロモーター（EP0335528）またはエタノールもしくはシクロヘキサノン誘導プロモーター（WO 93/21334）などのそのようなプロモーターを同様に用いることができる。
【０１２２】
ｄ）ストレスまたは病原体誘導性プロモーター
好ましい他のプロモーターは、例えばPRP1遺伝子の病原体誘導性プロモーター（Ward ら. (1993) Plant Mol Biol  22:361-366）、トマトからの熱誘導hsp70またはhsp80プロモーター（US5,187,267）、ジャガイモからの低温誘導α−アミラーゼプロモーター（WO 96/12814）、光誘導PPDKプロモーターあるいは創傷誘導pinIIプロモーター（EP375091）などの生物性または非生物性のストレスによって誘導されるものである。
【０１２３】
病原体誘導性プロモーターには、例えばPRタンパク質、SARタンパク質、b-1,3-グルカナーゼ、キチナーゼなどの遺伝子のような病原体攻撃の結果として誘導される遺伝子のプロモーターが包含される（例えば、Redolfi ら. (1983) Neth J Plant Pathol 89:245-254; Uknes, ら. (1992) The Plant Cell 4:645-656; Van Loon (1985) Plant Mol Viral 4:111-116; Marineau ら. (1987) Plant Mol Biol 9:335-342; Matton ら. (1987) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-342; Somssich ら. (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83:2427-2430; Somssich ら. (1988) Mol Gen Genetics 2:93-98; Chen ら. (1996) Plant J 10:955-966; Zhang および Sing (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:2507-2511; Warner、ら. (1993) Plant J 3:191-201; Siebertz ら. (1989) Plant Cell 1:961-968(1989)）。
【０１２４】
pinII遺伝子（Ryan (1990) Ann Rev Phytopath 28:425-449; Duan ら. (1996) Nat Biotech 14:494-498）、wun1およびwun2遺伝子（US5,428,148）、win1およびwin2遺伝子（Stanford ら. (1989) Mol Gen Genet 215:200-208）、システミン（McGurl ら. (1992) Science 225:1570-1573）、WIP1遺伝子（Rohmeier ら. (1993) Plant Mol Biol 22:783-792; Eckelkamp ら. (1993) FEBS Letters 323:73-76）、MPI遺伝子（Corderok ら. (1994) The Plant J 6(2):141-150）などのプロモーターのような創傷誘導性プロモーターも含まれる。
【０１２５】
ｅ）発達依存性プロモーター
他の好適なプロモーターは例えば、トマトからの果実成熟特異的プロモーター（WO 94/21794、EP 409 625）のような果実成熟特異的プロモーターである。一部の組織は発達の機能として自然に形成されることから、発達依存性プロモーターには、組織特異的プロモーターの一部が含まれる。
【０１２６】
植物での発現に好適な他のプロモーターが報告されている（Rogers ら. (1987) Meth in Enzymol 153:253-277; Schardl ら. (1987) Gene 61:1-11; Berger ら. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:8402-8406）。構成プロモーターおよび種子特異的プロモーターが特に好ましい。
【０１２７】
さらに、別の植物または他の生物、例えば大腸菌での発現を可能とする別のプロモーターを、発現すべき核酸配列と機能的に連結させることができる。好適な植物プロモーターは、基本的に全ての上記プロモーターである。
【０１２８】
本発明による組換え発現カセットまたはベクターに存在する核酸配列は、プロモーター以外の別の遺伝子制御配列と機能的に連結することができる。遺伝子制御配列という用語は、広い意味で理解されるべきものであり、本発明による発現カセットの確立または機能に影響を与える全ての配列を指す。遺伝子制御配列は、例えば原核生物または真核生物における転写および翻訳を変えるものである。本発明による組換え発現カセットは好ましくは、各場合で組換え発現されるべき核酸配列の５’上流の胚表皮および／または花に対する特異性を有するプロモーター、そして別の遺伝子制御配列として３’下流のターミネーター配列、そして適切であれば、各場合で組換え発現されるべき核酸配列と機能的に連結された別の一般的な調節要素を含む。
【０１２９】
遺伝子制御配列は、発現制御特性を変えることができる別のプロモーター、プロモーター要素または最小プロモーターも含む。そこで、遺伝子制御配列は例えば、ある種のストレス因子にさらに依存する組織特異的発現を生じる可能性がある。そのような要素は例えば、水ストレス、アブシジン酸（Lam E および Chua NH, J Biol Chem 1991; 266(26): 17131-17135）および熱ストレス（Schoffl F ら. (1989) Mol Gen Genetics 217(2-3):246-53）について報告されている。
【０１３０】
別の有利な制御配列は例えば、グラム陽性プロモーターamyおよびSPO2、ならびに酵母もしくは真菌プロモーターADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADHにおけるものである。
【０１３１】
基本的に、上記のような調節配列を有する全ての天然プロモーターを、本発明による方法に用いることができる。さらに、合成プロモーターを有利に使用することもできる。
【０１３２】
遺伝子制御配列はさらに、例えばアクチン−１イントロンあるいはAdh1-Sイントロン１、２および６などの遺伝子の５’−非翻訳領域、イントロンまたは非コード３’−領域をも含むものである（一般的な文献として、The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling  Walbot 編, Springer, New York (1994)を参照）。これらが遺伝子発現の調節において重要な役割を果たすことが示されている。そうして、５’−非翻訳配列が異種遺伝子の一時的発現を促進し得ることが明らかになっている。例として言及することができる翻訳エンハンサーは、タバコモザイクウィルス５’リーダー配列（Gallie ら. (1987) Nucl Acids Res 15:8693-8711）などである。それらは、組織特異性をさらに促進し得る（Rouster J ら. (1998) Plant J 15:435-440）。
【０１３３】
組換え発現カセットは有利には、プロモーターと機能的に連結されたエンハンサー配列と称されるもの１以上を有することができ、それによって核酸配列の組換え発現の増加が可能となる。別の調節要素またはターミネーターなどの別の有利な配列を、組換え発現すべき核酸配列の３’末端に挿入することもできる。組換え発現すべき核酸配列の１以上のコピーが遺伝子構築物に存在していても良い。
【０１３４】
制御配列として好適なポリアデニル化シグナルは、植物ポリアデニル化シグナル、好ましくは実質的にアグロバクテリウム・ツメファシエンスT-DNAポリアデニル化シグナルに相当するもの、特にはTiプラスミドpTiACHSの遺伝子３のT-DNA（オクトピンシンターゼ）（Gielen ら. (1984) EMBO J 3:835 et seq.）またはその機能的等価物である。特に好適なターミネーター配列の例には、OCS（オクトピンシンターゼ）ターミネーターおよびNOS（ノパリンシンターゼ）ターミネーターがある。
【０１３５】
制御配列はさらに、宿主生物のゲノムへの相同的組換えもしくは挿入、あるいはゲノムの除去を可能とするものと理解される。cre／lox法などの方法によって、組換え発現カセットの宿主生物ゲノムからの組織特異的で、恐らくは誘導性の除去を行うことができる（Sauer B (1998) Methods. 14(4):381-92）。この場合、ある種の隣接配列を標的遺伝子に付加させ（lox配列）、それによって後にcreリコンビナーゼによる除去を行うことができる。
【０１３６】
組換え発現カセットおよびそれに由来する組換えベクターは、別の機能性要素を含むことができる。機能性要素という用語は広い意味で理解されるべきものであり、本発明による組換え発現カセット、ベクターまたはトランスジェニック生物の発生、複製または機能に対して効果を有する全ての要素を指す。言及することができる例には下記のものがあるが、これらに限定されるものではない。
【０１３７】
ａ）2-デオキシグルコース-6-ホスフェート（WO 98/45456）、抗生物質または殺生物剤、好ましくは除草剤、例えばカナマイシン、G418、ブレオマイシン、ハイグロマイシンまたはホスフィノトリシンなどの代謝阻害薬に対する耐性を与える選択マーカー。特に好ましい選択マーカーは、除草剤に対する耐性を与えるものである。例を挙げれば、ホスフィノトリシンおよびアセチルトランスフェラーゼ（PAT）をコードし、グルタミンシンターゼ阻害薬を失活させるDNA配列（barおよびpat遺伝子）；グリホセート（N-(ホスホノメチル)グリシン）に対する耐性を与える5-エノールピルビルシキメート-3-ホスフェートシンターゼ遺伝子（EPSPシンターゼ遺伝子）；グリホセート分解酵素（グリホセートオキシドレダクターゼ）をコードするgox遺伝子；deh遺伝子（ダラポンを失活させるでハロゲナーゼをコードする）；スルホニル尿素およびイミダゾリノン不活性化性アセト乳酸シンターゼ；ブロモキシニルを分解するニトリラーゼ酵素をコードするbxn遺伝子；抗生物質であるアクチノマイシンに対する耐性を与えるaasa遺伝子；ストレプトマイシンに対する耐性を可能とするストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ（SPT）遺伝子；カナマイシンもしくはゲネチシジン（geneticidin）に対する耐性を与えるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（NPTII）遺伝子；ハイグロマイシンに対する耐性を与えるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（HPT）遺伝子；スルホニル尿素系除草剤に対する耐性を与えるアセト乳酸シンターゼ遺伝子（ALS）（例えば、S4および／またはHra突然変異を有する突然変異ALS変異体）があり得る。
【０１３８】
ｂ）容易に定量可能なタンパク質をコードし、色または酵素活性によって形質転換効率または発現の部位もしくは時期の評価を可能とするレポーター遺伝子。この文脈で非常に好ましいものは、「緑色蛍光タンパク質」（GFP）（Sheen ら.(1995) Plant Journal 8(5):777-784); Haseloff ら. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(6):2122-2127; Reichel ら. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(12):5888-5893; Tian ら. (1997) Plant Cell Rep 16:267-271; WO 97/41228; Chui WL ら. (1996) Curr Biol 6:325-330; Leffel SM ら. (1997) Biotechniques. 23(5):912-8）、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ（Ow ら. (1986) Science 234:856-859; Millar ら. (1992) Plant Mol Biol Rep 10:324-414）、エクオリン遺伝子（Prasher ら. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126(3):1259-1268）、β−ガラクトシダーゼ、ｒ座位遺伝子（植物組織におけるアントシアニン色素（赤色着色）の産生を調節することで、別の補助剤や発色基質を加えることなくプロモーター活性の直接分析を可能とするタンパク質をコードするもの；Dellaporta ら., In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts、18th Stadler Genetics Symposium, 11:263-282, 1998）、β−グルクロニダーゼ（Jefferson ら.(1987) EMBO J 6:3901-3907）などのレポーター遺伝子（Schenborn E、Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1):29-44）である。
【０１３９】
ｃ）例えば大腸菌での本発明による組換え発現カセットまたはベクターの複製を可能とする複製起点。言及することができる例には、ORI（DNA複製の起点）、pBR322oriまたはP15Aori（Sambrook ら.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harborm, NY, 1989）がある。
【０１４０】
ｄ）例えばT-DNAの右または左境界またはvir領域などのアグロバクテリウム介在植物形質転換に必要な要素。
【０１４１】
良好に相同的組換えを受けた細胞あるいは良好に形質転換を受けた細胞を選択するには、さらに、殺生物剤（例：除草剤）、2-デオキシグルコース-6-ホスフェート（WO98/45456）などの代謝阻害薬または良好に組換えを受けた細胞に対する抗生物質に対する耐性を与える選択可能なマーカーを導入する必要がある。選択マーカーによって、非形質転換細胞から形質転換細胞を選択することができる（McCormick ら. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84）。
【０１４２】
例を挙げると、本発明による組換え発現カセットは下記の構造を有することができるが、それに限定されるものではない。
【０１４３】
ａ）5’-植物特異的プロモーター／デサチュラーゼ／ターミネーター-3’。
【０１４４】
本発明による組換え発現カセットは好ましくは下記の構造を有する。
【０１４５】
ａ）5’-35Sプロモーター／デサチュラーゼ／OCSターミネーター-3’、または
ｂ）5’-レグミンＢプロモーター／デサチュラーゼ／NOSターミネーター-3’。
【０１４６】
上記例ａ）またはｂ）のうちの複数との共形質転換が、本発明による有利なCLA生合成プロセスには有利であり得る。さらに、それぞれが上記組換え発現カセットの組合せを含む１以上のベクターを用いた形質転換が有利であり得る。
【０１４７】
さらに、前記組換え発現カセットは、組換え発現によって脂肪酸生合成の増加が生じる核酸配列を含むことができる（以下、proOILと称する）。さらに組換え発現されるこのproOIL核酸配列は、例えばアセチル-CoAカルボキシラーゼ（ACCase）、グリセリン-3-ホスフェートアシルトランスフェラーゼ（GPAT）、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（LPAT）、ジアシルグリセリンアシルトランスフェラーゼ（DAGAT）およびリン脂質：ジアシルグリセリン−アシルトランスフェラーゼ（PDAT）をコードする核酸（これらに限定されるものではない）から選択することができる。
【０１４８】
proOIL核酸配列はまた、組換え発現によって、やはり脂肪酸産生の増加を生じるアンチセンス−RNAまたは二本鎖RNAを生じる核酸も含む。
【０１４９】
好ましい例には、下記の組換え発現カセットを含むベクターがある。
【０１５０】
ａ）5’-35Sプロモーター／デサチュラーゼ／OCSターミネーター／レグミンＢプロモーター／proOIL／NOSターミネーター-3’；
ｂ）5’-35Sプロモーター／pro-デサチュラーゼもしくはコンジュガーゼ／OCSターミネーター／レグミンＢプロモーター／proOIL／NOSターミネーター-3’。
【０１５１】
構築物ａ）およびｂ）によって、デサチュラーゼおよび脂肪酸生合成を増加させるproOIL配列を有する植物の同時形質転換が可能となる。
【０１５２】
上記の組換え技術およびクローニング技術を用いて、本発明によるデサチュラーゼまたはproOIL核酸あるいは組換え発現カセットを、例えば大腸菌での増殖を可能とする好適なベクターにクローニングすることができる。好適なクローニングベクターは、特にpBR332、pUCシリーズ、M13mpシリーズおよびpACYC184である。特に好適なものは、大腸菌とアグロバクテリウムの両方での複製が可能なバイナリーベクターである。
【０１５３】
本発明によるデサチュラーゼまたはproOIL核酸あるいは組換え発現カセットは好ましくは、好適な形質転換ベクターに挿入される。好適なベクターは、特に「Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, (CRC Press), chapter 6/7, p. 71-119 (1993)」に記載されている。形質転換例および形質転換プロセスについては、下記で説明する。
【０１５４】
本発明はさらに、少なくとも一つの本発明による組換え発現カセットまたは本発明によるベクターで形質転換されたトランスジェニック生物、ならびにそのような生物に由来する細胞、細胞培養物、組織、部分（例えば、植物の場合には葉、根など）または増殖材料に関するものである。
【０１５５】
生物、出発生物または宿主生物という用語は、例えば微生物または植物などの原核生物または真核生物を意味するものと理解される。
【０１５６】
好ましい微生物は、細菌、酵母、ソウ類または真菌である。
【０１５７】
好ましい細菌は、エシェリキア属、コリネバクテリウム属、バチルス属、クロストリジウム属、プロイオニバクテリウム属（Proionibacterium）、ブチリビブリオ属、ユーバクテリウム属、乳酸桿菌属、エルウイニア属、アグロバクテリウム属、フラボバクテリウム属、アルカリゲネス属、フェオダクチラム属、コルピジウム属、モルティエラ属、ハエカビ属、ムコール属、クリプレコジニウム属（Crypthecodinium）からの細菌あるいはクロオコッカス属などの青緑色細菌である。
【０１５８】
特に好ましいものは、植物に感染する能力があることから、本発明による構築物を転移させることができる微生物である。好ましい微生物は、アグロバクテリウム属のもの、特にはアグロバクテリウム-ツメファシエンス種のものである。
【０１５９】
好ましい酵母は、カンジダ、サッカロミセス、ハンゼヌラまたはピチアである。特に好ましい酵母は、脂肪酸／脂肪酸誘導体が合計で細胞乾燥重の少なくとも20％、好ましくは40％、特別に好ましくは60％の量となるもの、特にはクリプトコッカス・カルバタス（Cryptococcus curvatus）（Ratledge (1989) Biotechnology of oils and fats. In: Microbiol lipids Vol.2 Academic Press, London, pp. 567-668）などの酵母である。
【０１６０】
好ましい真菌は、アスペルギルス、トリコデルマ、アシュビア、アカパンカビ、フザリウム、ビューベリア（Beauveria）、フィトフトラ・インフェスタンスあるいは文献（Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995), page 15, 表６）に記載の別の真菌である。特に好ましいものは、脂肪酸／脂肪酸誘導体が合計で細胞乾燥重の少なくとも10％、好ましくは20％の量となる真菌、特にはムコール・シルシネロイデス（Mucor circinelloides）およびモルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）（Wynn ら. (2001) Microbiology 147: 2857-2864）である。
【０１６１】
好ましいトランスジェニック生物は、特には植物である。「植物」という用語は、光合成を行うことができる生物ならびにそれに由来する細胞、組織、部分もしくは増殖材料（種子または果実など）を包含する。本発明に関しては、植物界の高等植物および下等植物の全ての属および種が含まれる。一年生、多年生、単子葉および双子葉植物および裸子植物が好ましい。成熟植物、種子、若枝および幼苗、ならびにそれらに由来する部分、増殖材料（例：塊茎、種子または果実）、植物器官、組織、原形質体、培養カルスおよび細胞培養物などの他の培養物などがある。「成熟植物」とは、幼苗段階を超えたあらゆる発達段階の植物を指す。幼苗という用語は、早期発達段階での若い未成熟植物を指す。
【０１６２】
「植物」には、全ての一年生および多年生の単子葉または双子葉植物が包含され、カボチャ属、バラ属、ブドウ属、クルミ属、イチゴ属、ミヤコグサ属、ウマゴヤシ属、イガマメ属、ジャジクソウ属、トリゴネラ属（Trigonella）、ビグナ属（Vigna）、カンキツ類、リナム属、ゼラニウム属、イモノキ属、ダウカス属（Daucus）、アラビドプシス属（Arabidopsis）、アブラナ属、ラファヌス属（Raphanus）、シナピス属（Sinapis）、ロウトウ属、トウガラシ属、チョウセンアサガオ属、ヒヨス属、リコペルシコン属（Lycopersicon）、タバコ属、ナス属、ペチュニア属、ジギタリス属、マジョラナ属（Majorana）、チコリウム属（Cichorium）、ヒマワリ属、ラクツカ属（Lactuca）、ブロムグラス属、アスパラガス属、キンギョソウ属、ヘメリカリス属（Hemericallis）、アフリカウンラン属、テンジクアオイ属、パニクム属、チカラシバ属、キンポウゲ属、セネシオ属、サルメンバナ属、キュウリ属、ブロワアリア属（Browaalia）、ダイズ属、エンドウ属、インゲンマメ属、ライグラス属、オリザ属（Oryza）、トウモロコシ属、カラスムギ属、ホルデウム属（Hordeum）、セカーレ属（Secale）、コムギ属、モロコシ属、ハリモミ属およびポプラ属のものなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【０１６３】
好ましい植物は、ヒユ科、キク科、アブラナ科、ナデシコ科、アカザ科、キク科、十字科植物、ウリ科、シソ科、マメ科、パピリオノイデア科（Papilionoideae）、ユリ科、アマ科、アオイ科、バラ科、アカネ科、ユキノシタ科、ゴマノハグサ科、ナス科、アオギリ科、テトラゴニアセア科（Tetragoniaceae）、ツバキ科、セリ科の植物科からのものである。
【０１６４】
好ましい単子葉植物は、例えばアルファルファ、米、トウモロコシ、小麦あるいは大麦、粟およびモロコシ、ライ麦、ライ小麦またはカラス麦などの他の穀類などのイネ科、ならびにサトウキビ、そして全ての牧草類などの単子葉作物植物から選択される。
【０１６５】
本発明は、非常に好ましくは双子葉植物に適用される。好ましい双子葉植物は、特には例えば下記のものなどの双子葉作物植物から選択される。
【０１６６】
−ヒマワリ、マリーゴールドまたはカレンデュラおよびその他などのキク科；
−キク科、特にはラクツカ属（Lactuca）、さらにはsativa種（レタス）など；
−十字科植物、特にはアブラナ属、さらにはセイヨウアブラナ種（アブラナ）、カンペストリス種（campestris）（砂糖大根）、オレラセア・cv・タスチエ種（oleracea cv Tastie）（キャベツ）、オレラセア・cv・スノーボールＹ種（oleracea cv Snowball Y）（カリフラワー）およびオレラセア・cv・エンペラー種（oleracea cv Emperor）（ブロコリー）および他のキャベツ種；ならびにアラビドプシス属、さらにはシロイヌナズナ種、ならびにタガラシ類またはカノーラなど；
−メロン、カボチャ／スカッシュまたはズッキーニなどのウリ科；
−マメ科、特にはダイズ属、さらにはマックス（大豆）、大豆ならびにアルファルファ、エンドウ豆、インゲンまたは落花生などの種；
−アカネ科、好ましくは例えばアラビカコーヒーノキまたはリベリアコーヒーノキ（コーヒーの木）などのラミイダエ（Lamiidae）亜綱；
−ナス科、特にはトマト属（さらにはトマト種（トマト））、ナス属（さらにはジャガイモ種（ジャガイモ）およびナス種（ナス）ならびにタバコもしくはパプリカなど；
−アオギリ科、好ましくは例えばチョコレートノキ（カカオ木）などのビワモドキ亜綱；
−ツバキ科、好ましくは例えばカメリア・シネンシスまたはチャ（茶の木）などのビワモドキ亜綱；
−セリ科、特にはダウクス属（Daucus）（さらには人参種（人参））およびアピウム属（Apium）（さらにはグラベオレンス・ズルス種（graveolens dulce）（セロリ））など；ならびにトウガラシ属（さらにはアヌム属（annum）（コショウ））など；
ならびにアマニ、大豆、綿、大麻、亜麻、キウリ、ほうれん草、人参、砂糖大根および各種の木、ナッツおよびブドウの木類、特にはバナナおよびキウイフルーツ。
【０１６７】
さらには、観賞用の木、花、切り花、低木または芝生に有用な観賞植物も含まれる。例として挙げることができる植物には、被子植物；例えばゼニゴケ類（ゼニゴケ）およびスギゴケ類（スギゴケ）などのコケ植物類；シダ類、トクサおよびヒカゲノカズラ類などのシダ植物類；針葉樹、ソテツ類、イチョウおよびグネタタエ（Gnetatae）などの裸子植物類；バラなどのバラ科、シャクナゲ属およびアゼリアなどのツツジ科、ポインセチア類およびヘンヨウボク属などのトウダイグサ科、ナデシコ類などのナデシコ科、ペチュニア類などのナス科、セントポーリアなどのイワタバコ科、ホウセンカ類などのツリフネソウ科、ラン類などのラン科、グラジオラス、アヤメ、フリージアおよびクロッカスなどのアヤメ科、マリーゴールドなどのキク科、ゼラニウムなどのフウロソウ科、ドラセナなどのユリ科、イチジク属などのクワ科、フィロデンドロンなどのサトイモ科という科ならびに多くの他のものなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【０１６８】
さらに本発明に関する植物は、例えばソウ類、シアノバクテリウムおよびスギゴケ類などの光合成活性であることができる別の生物である。好ましいソウ類は、例えばヘマトコッカス属、フェオダクチラム・トリコルナツム（Phaedactylum tricornatum）属、ボルボックス属またはドウナリエラ属からのソウ類などの緑ソウ類である。クロオコッカス科が特に好ましい。
【０１６９】
最も好ましいものは、例えばアブラナ、ヒマワリ、ゴマ、紅花（ベニバナ）、オリーブの木、大豆、アマニ、落花生、トウゴマ、ギネアアブラヤシ、トウモロコシ、小麦、カカオ木あるいは例えばクルミ、ココナッツもしくはアーモンドなどの各種ナッツ類などのオイル製造に好適な植物である。最も好ましいものはさらには、シロイヌナズナ、棉、亜麻およびアマニである。
【０１７０】
好ましいソウ類は、例えばヘマトコッカス属、フェオダクチラム・トリコルナツム（Phaedactylum tricornatum）属、ボルボックス属またはドウナリエラ属のソウ類などの緑ソウ類である。好ましいと言える他のものには、渦鞭毛ソウ類などの原生動物がある。
【０１７１】
上記生物の中で好ましいものは特には、ムコール・シルシネロイデス、モルティエレラ・アルピナ、ピチウム・インシジオサム（Pythium insidiosum）などの真菌、サッカロミセス・セレビシエまたはクリプトコッカス・カルバタスなどの酵母、あるいは大豆、アマニ、アブラナ、ココナッツ、ギネアアブラヤシ、紅花、トウゴマ、落花生、カカオ木またはヒマワリなどの植物、特に好ましくは大豆、アブラナ、ヒマワリ、ムコール・シルシネロイデス、モルティエレラ・アルピナ、ピチウム・インシジオサム、クリプトコッカス・カルバタスまたはサッカロミセス・セレビシエなどの、かなりの量で天然で油を合成する能力を有するものである。
【０１７２】
広範囲の油蓄積性の生物が、カイルらの著作にさらに挙げられている（Kyle および Ratledge (1992) Industrial applications of Single Cell Oils, American Oil Chemists’ Society Champaign, Illinois）。
【０１７３】
宿主生物に応じて、これらの方法で使用される生物は、当業者には公知の方法で成長または培養される。概して微生物は、通常は糖類の形での炭素源、通常は酵母抽出物または硫酸アンモニウムのような塩などの有機窒素源の形での窒素源、鉄塩、マンガン塩、マグネシウム塩などの微量元素、ならびに適切な場合にはビタミン類を含む液体培地で、０℃〜100℃、好ましくは10℃〜60℃の温度で、酸素なしで増殖させる。このプロセスの際、液体栄養培地のpH値は一定に保っても良い。すなわち、培養中に調節してもしなくても良い。培養は、バッチ式、半バッチ式または連続式で行うことができる。栄養素は、発酵開始時に提供するか、あるいは半連続的または連続的に供給することができる。
【０１７４】
本発明による組換え発現カセットは有利には、組換え発現カセットが存在するベクターを用いることによって、生物に、あるいは生物の細胞、組織、器官、部分または種子（好ましくは、植物または植物の細胞、組織、器官、部分または種子に）に導入することができる。組換え発現カセットは、好適な制限開裂部位を介してベクター（例えばプラスミド）に導入することができる。得られるプラスミドを、最初に大腸菌に導入する。正しく形質転換された大腸菌を選択、増殖し、当業者が習熟してる方法によって組換えプラスミドを得る。制限分析および配列決定を用いて、クローニング段階の検証を行うことができる。
【０１７５】
本発明による発現カセットは有利には、ベクターを用いて細胞、好ましくは植物細胞に導入することができる。ベクターの例には、プラスミド、コスミド、ファージ、ウィルスまたはアグロバクテリウムがある。好ましい実施形態では発現カセットは、プラスミドベクターによって導入される。好ましいベクターは、発現カセットの宿主ゲノムへの安定な組み込みを可能とするものである。
【０１７６】
形質転換生物（または形質転換細胞もしくは組織）の形成には、対象とするDNA、RNAまたはタンパク質を対象とする宿主細胞に導入する必要がある。
【０１７７】
形質転換（または形質導入もしくはトランスフェクション）と称されるこの手順には、多くの方法が使用可能である（Keown ら. (1990) Methods in Enzymology 185:527-537）。そこで例えば、DNAまたはRNAは、マイクロインジェクションまたはDNAコーティング微粒子による衝撃によって直接導入することができる。さらに細胞は、例えばポリエチレングリコールを用いて化学的に浸透性とすることで、DNAが拡散によって細胞に進入できるようにすることができる。DNAはまた、ミニ細胞、細胞、リソソームまたはリポソームなどの他のDNA含有単位との原形質体融合によって導入することもできる。別の好適なDNA導入方法は、電気パルスによって細胞を逆浸透性とするエレクトロポレーションがある。そのような方法は文献に記載されている（Bilang ら. (1991) Gene 100:247-250; Scheid ら. (1991) Mol Gen Genet 228:104-112; Guerche ら. (1987) Plant Science 52:111-116; Neuhause ら. (1987) Theor Appl Genet 75:30-36; Klein ら. (1987) Nature 327:70-73 ; Howell ら. (1980) Science 208:1265 ; Horsch ら.(1985) Science 227:1229-1231 ; DeBlock ら. (1989) Plant Physiology 91:694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach および Weissbach編) Academic Press Inc. (1988); および Methods in Plant Molecular Biology (Schuler および Zielinski編) Academic Press Inc. (1989)）。
【０１７８】
デサチュラーゼまたはコンジュガーゼを、非常に広範囲の生物、好ましくは植物の組換え修飾に用いて、それが前記２種のCLA異性体などの脂質由来の１以上の産生物のデノボ産生体となるようにすることができる。最初に、形質転換段階後に植物を再生し、次に常法に従って培養または増殖させる。
【０１７９】
クローニングベクターおよび繊毛虫類およびソウ類の遺伝子操作方法は当業者には公知である（WO 98/01572; Falciatore ら. (1999) Marine Biotechnology 1(3):239-251; Dunahay ら. (1995) J Phycol 31:10004-1012）。
【０１８０】
植物のゲノムに遺伝子を導入し、植物組織もしくは植物細胞から植物を再生するための各種の方法およびベクターが知られている（Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press、Boca Raton、Florida)、chapter 6/7、pp. 71-119 (1993);  White FF (1993) Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants、Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press,  15-38; Jenes B ら. (1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press, S.128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225; Halford NG, Shewry PR (2000) Br Med Bull 56(1):62-73）。それには例えば、上記のものなどがある。植物では、植物組織もしくは植物細胞からの植物の形質転換および再生について説明した方法を、一時的または安定な形質転換に利用する。好適な方法は特には、ポリエチレングリコール誘導DNA取り込み、粒子衝撃法と称される遺伝子銃を用いるバイオリスティック（biolistic）法、エレクトロポレーション、DNA含有溶液中での乾燥胚芽のインキュベーションならびにマイクロインジェクションによる原形質体形質転換である。これらの「直接」形質転換法の場合、使用されるプラスミドは特定の必要条件を満足する必要はない。pUCシリーズ、pBR322、M13mpシリーズ、pACYC184などからのものなどの簡単なプラスミドを用いることが可能である。形質転換細胞から完全な植物を再生させるには、プラスミドは別の選択可能なマーカー遺伝子を含むものでなければならない。
【０１８１】
これらの「直接」形質転換法に加えて、形質転換はアグロバクテリウム−ツメファシエンスまたはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）による細菌感染によって行うこともできる。これらの菌株は、アグロバクテリウムによる感染後に植物に転移されたプラスミド（それぞれTiおよびRiプラスミド）を含む。T-DNA（転移DNA）と称されるこのプラスミドの一部を、植物細胞のゲノムに組み込む。別法として、アグロバクテリウムも植物にバイナリーベクター（ミニ−Tiプラスミド）を転移させることができ、それらのベクターは植物のゲノムに組み込まれる。アグロバクテリウム介在形質転換は双子葉植物の二倍体植物細胞に最も適しており、直接形質転換法はあらゆる細胞種に適している。アグロバクテリウム介在形質転換の方法については、例えばホルシュらの報告（Horsch RB ら. (1985) Science 225:1229f）に記載されている。アグロバクテリウムを用いる場合、発現カセットを特異的プラスミドに、すなわちシャトルベクター（中間ベクター）またはバイナリーベクターのいずれかに組み込む。形質転換にTiまたはRiプラスミドを用いる場合、少なくともTiまたはRiプラスミドT-DNAの右側境界（しかしこの場合は、右および左の境界）が、隣接領域として挿入される発現カセットに連結される。
【０１８２】
バイナリーベクターは好ましくは、アグロバクテリウムを用いた形質転換に使用される。バイナリーベクターは、大腸菌およびアグロバクテリウムの両方の複製を行うことができる。一般にそれは、選択マーカー遺伝子および右および左のT-DNA境界配列が隣接するリンカーもしくはポリリンカーを含む。それは、アグロバクテリウムに直接形質転換することができる（Holsters ら. (1978) Mol Gen Genet 163:181-187）。例えばカナマイシンに対する耐性を与えるnptII遺伝子である選択マーカー遺伝子によって、形質転換アグロバクテリウムの選択を行うことができる。この場合に宿主生物として働くアグロバクテリウムは、すでにvir領域を有するプラスミドを含むものでなければならない。後者は、T-DNAを植物細胞に転移する上で必要である。このようにして形質転換されたアグロバクテリウムを、植物細胞の形質転換に用いることができる。植物細胞の形質転換におけるT-DNAの使用についてはかなり研究が行われており、報告されている（EP 120 516; Hoekema、In: The Binary Plant Vector System、Offsetdrukkerij Kanters B.V.、Alblasserdam、Chapter V; An ら. (1985) EMBO J 4:277-287）。各種バイナリーベクターが知られており、その一部は市販されていて、例えばpBI101.2またはpBIN19（Clontech Laboratories, Inc. USA; Bevan ら.(1984) Nucl Acids Res 12:8711）、pBinAr、pPZP200あるいはpPTVがある。
【０１８３】
そのようなベクターで形質転換されたアグロバクテリウムは次に、公知の方法で植物、特には例えばアブラナなどの作物植物の形質転換に用いることができ、それは例えば、アグロバクテリウム溶液に乱切葉または葉断片を浸し、次にそれを好適な培地で培養することで行う。アグロバクテリウムによる植物の形質転換については報告がある（White FF, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization,  edited by S.D. Kung および R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15 - 38; Jenes B ら.(1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by S.D. Kung および R. Wu, Academic Press, pp.128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205- 225）。上記の組み込まれた本発明によるデサチュラーゼまたはコンジュガーゼ、プロ−デサチュラーゼまたはコンジュガーゼあるいはproOIL核酸または組換え発現カセットまたはベクターを含むトランスジェニック植物は、前記乱切葉または葉断片の形質転換細胞から公知の方法で再生することができる。
【０１８４】
選択可能なマーカーが挿入DNAの一部である場合に、安定に形質転換された細胞、すなわち宿主細胞のDNAに組み込まれた挿入DNAを有する細胞を非形質転換細胞から選択することができる。例を挙げると、抗生物質または除草剤（カナマイシン、G418、ブレオマイシン、ハイグロマイシンまたはホスフィノトリシンなど）に対する耐性を与えることができる遺伝子は、マーカーとして作用することができる（上記参照）。そのようなマーカー遺伝子を発現する形質転換細胞は、非形質転換野生型を殺す濃度のそのような抗生物質または除草剤の存在下で生存することができる。例は上記で挙げてあり、好ましくは除草剤であるホスフィノトリシンに対する耐性を与えるbar遺伝子（Rathore KS ら. (1993) Plant Mol Biol 21(5):871-884)、カナマイシンに対する耐性を与えるnptII遺伝子、ハイグロマイシンに対する耐性を与えるhpt遺伝子、または除草剤であるグリホセートに対する耐性を与えるEPSP遺伝子を有する。この選択マーカーによって、非形質転換細胞からの形質転換細胞の選択を行うことができる（McCormick ら. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84）。得られる植物は、通常の方法で育種およびハイブリダイズすることができる。好ましくは２世代以上を生長させて、ゲノム組み込みが安定で遺伝性となるようにすべきである。
【０１８５】
形質転換植物細胞が形成されたら、当業者が習熟している方法を用いて完全な植物を得ることができる。培養カルスが原料の一例である。公知の方法で、まだ分化していない細胞バイオマスとしてのそれにおいて、若枝および根の発達を誘発することができる。得られる幼苗を移植し、生長させることができる。好適な方法が報告されている（Fennell ら. (1992) Plant Cell Rep. 11: 567-570; Stoeger ら (1995) Plant Cell Rep. 14:273-278; Jahne ら. (1994) Theor Appl Genet 89:525-533）。
【０１８６】
組換え発現核酸の発現効率は、例えば上記の選択方法のいずれかを用いる若枝分裂組織増殖によってin vitroで求めることができる。さらに、デサチュラーゼまたはproOIL核酸配列の発現の性質およびレベルにおける変化ならびにCLAおよび／または脂肪酸生合成速度に対するそれらの効果を、試験植物を用いて温室実験で調べることができる。
【０１８７】
非形質転換野生型と比較してCLA産生が改善したトランスジェニック生物をなるべく選択する。本発明に関して、改善されたCLA産生とは、例えば非遺伝子組換え開始生物と比較してトランスジェニック生物において、CLA、そのエステル（例えば、CoAエステルまたはグリセリドエステル）の群からの少なくとも１個の化合物に関して人工的に得られた生合成率上昇能力を意味する。この文脈において、トランスジェニック生物でのCLA産生は、非遺伝子組換え生物と比較して、好ましくは10％、特別に好ましくは50％、非常に好ましくは100％増加する。改善されたとは、開始生物と比較して、CLA混合物の質的組成が有利に変わること、すなわち(9Z,11E)-CLAおよび／または(10E,12Z)-CLAの含有率が上昇することを指すこともある。
【０１８８】
さらに本発明によれば、細胞、細胞培養物、部分（例えば、トランスジェニック植物の場合には根、葉など）、ならびに上記トランスジェニック生物に由来する種子もしくは果実などのトランスジェニック増殖物がある。
【０１８９】
本発明はさらに、遊離脂肪酸、特にCLAなどの食品もしくは飼料、化粧品またはファインケミカルの製造における、上記の本発明によるトランスジェニック生物の使用、ならびに細胞、細胞培養物、部分（例えば、トランスジェニック植物の場合には根、葉など）ならびにそれに由来する種子もしくは果実などのトランスジェニック増殖物の使用に関する。特に好ましいものは、CLA含有脂質、好ましくはトリグリセリド類の製造における使用である。
【０１９０】
ヒトおよび動物が消費することができる本発明の遺伝子組換え植物はまた、例えば直接、あるいは自体公知の方法に従って食品または飼料として用いることができる。
【０１９１】
生物の培養を行った後、通常の方法で脂質を得る。そのためには、最初に生物を収穫後に消化するか、あるいは直接使用することができる。その脂質は有利には、ヘキサンなどの非極性溶媒またはエタノール、イソプロパノールまたはヘキサン／イソプロパノール、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールなどの混合物のような好適な溶媒で、０℃〜80℃、好ましくは20℃〜50℃の温度で抽出する。通常は、バイオマスを過剰の溶媒で、例えばバイオマスに対して１：４過剰の溶媒で抽出する。次に、溶媒を例えば蒸留によって除去する。抽出は、超臨界CO2で行うこともできる。抽出後、バイオマスの残りを、例えば濾過によって除去することができる。
【０１９２】
次に、このようにして得られる粗オイルを、例えばアセトンもしくはクロロホルムなどの極性溶媒で処理し、次に濾過もしくは遠心して曇りを除去することでさらに精製することができる。カラムでのさらなる精製も可能である。
【０１９３】
トリグリセリドから遊離脂肪酸を得るには、後者を通常の方法で加水分解する。
【０１９４】
本発明はさらに、不飽和脂肪酸、好ましくはCLAの含有量が増加した植物油、脂肪酸混合物および／またはトリグリセリド混合物であって、本発明による上記方法によって製造されたもの、ならびに食品、動物飼料、化粧品または医薬品の製造におけるその使用に関する。そのためには、それを食品、動物飼料、化粧品または医薬品に一般的な量で加える。
【０１９５】
配列
１．配列番号１：エピフィアス・ポストビッタナからのアシル-CoA E11-デサチュラーゼをコードする核酸配列。
【０１９６】
２．配列番号２：エピフィアス・ポストビッタナからのアシル-CoA E11-デサチュラーゼをコードするタンパク質配列。
【０１９７】
３．配列番号３：ヨーロッパアワノメイガからのアシル-CoA Z/E11-デサチュラーゼをコードする核酸配列。
【０１９８】
４．配列番号４：ヨーロッパアワノメイガからのアシル-CoA Z/E11-デサチュラーゼをコードするタンパク質配列
５．配列番号５：アワノメイガからのアシル-CoA Z/E11-デサチュラーゼをコードする核酸配列。
【０１９９】
６．配列番号６：アワノメイガからのアシル-CoA Z/E11-デサチュラーゼをコードするタンパク質配列。
【０２００】
７．配列番号７：アメリカタバコガからのアシル-CoA Δ11-デサチュラーゼをコードする核酸配列。
【０２０１】
８．配列番号８：アメリカタバコガからのアシル-CoA Δ11-デサチュラーゼをコードするタンパク質配列。
【０２０２】
９．配列番号９：イラクサギンウワバからのアシル-CoA Δ11-デサチュラーゼをコードする核酸配列。
【０２０３】
10．配列番号10：イラクサギンウワバからのアシル-CoA Δ11-デサチュラーゼをコードするタンパク質配列。
【０２０４】
11．配列番号11：アルギロテニア・ベルチナナからのアシル-CoA Δ11-デサチュラーゼをコードする核酸配列。
【０２０５】
12．配列番号12：アルギロテニア・ベルチナナからのアシル-CoA Δ11-デサチュラーゼをコードするタンパク質配列。
【０２０６】
13．配列番号13：プラノトルトリクス・オクトからのアシル-CoA Z10-デサチュラーゼをコードする核酸配列。
【０２０７】
14．配列番号14：プラノトルトリクス・オクトからのアシル-CoA Z10-デサチュラーゼをコードするタンパク質配列。
【０２０８】
15．配列番号15：5’-ATYACHGCCGGKKMYCAYMG-3’。
【０２０９】
16．配列番号16：5’-GGRAABDYGTGRTGGWAGTT-3’。
【０２１０】
17．配列番号17：5’-CCCCAYCRNCTSTGGWCNCA-3’。
【０２１１】
18．配列番号18：5’-CCCTCTAGARTGRRWARTTRTGRWA-3’。
【０２１２】
19．配列番号19：5’-TAATACGACTCACTATAG-3’。
【０２１３】
20．配列番号20：5’-ACATAACTAATTACATGAT-3’。
【０２１４】
21．配列番号21：ワタアカミムシガからのアシル-CoA Z/E11-デサチュラーゼをコードする核酸配列。
【０２１５】
22．配列番号22：ワタアカミムシガからのアシル-CoA Z/E11-デサチュラーゼをコードするタンパク質配列。
【実施例】
【０２１６】
添付の図面を参照しながら、下記の実施例を用いて、本発明をさらに詳細に説明する。使用した略称は下記の意味を有する。
【０２１７】
一般法
例えば制限開裂、アガロースゲル電気泳動、DNA断片の精製、核酸のニトロセルロースおよびナイロン膜への移動、DNA断片の連結、大腸菌細胞の形質転換、細菌培養および組換えDNAの配列解析などの本発明に関して行われるクローニング段階は、文献（Sambrook ら. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6）に記載の方法に従って行う。オリゴヌクレオチドは、例えばホスホアミダイト法を用いて公知の方法で化学的に合成することができる（Voet, Voet, 第2版, Wiley Press New York, pp.896-897）。例えば制限開裂、アガロースゲル電気泳動、DNA断片の精製、核酸のニトロセルロースおよびナイロン膜への移動、DNA断片の連結、大腸菌細胞の形質転換、細菌培養、ファージの増殖および組換えDNAの配列解析などの本発明中に行われるクローニング段階は、文献（Sambrook ら. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6）に記載の方法に従って行った。組換えDNA分子は、サンガーらの方法（Sanger ら. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74:5463-5467）に従って、リコール（Licor）からのレーザー蛍光DNA配列決定装置（MWG Biotech, Ebersbachが販売）を用いて配列決定した。
【０２１８】
実施例１：鱗翅目昆虫の飼育
昆虫を、テラリウム内の好適な宿主植物上で飼育する。生長条件は、27℃、日−夜リズム：明14時間、暗10時間とする。昆虫および幼虫を、週２回新鮮な植物に移す。蛹を集め、成虫が孵化するまで雄と雌を別々にテラリウムで飼育する。昆虫の孵化から約１〜２日後、フェロモン腺を分離することができる。
【０２１９】
実施例２：縮重プライマーによるデサチュラーゼまたはコンジュガーゼcDNAの単離
蛾成虫の腹部からフェロモン腺を分離し、例えば製造者の指示に従ってTRIzol（Gibco/BRL）によって総RNAを単離するまで液体N2中で冷凍する。経験的に、新鮮組織約30mgから総RNA約60〜80μｇが単離可能であることが明らかになっている。総RNA約５μｇを用いて、オリゴ(dT)プライマーによって第一鎖cDNAを製造する。それは例えば、製造者の指示に従ってスマート・レース（SMART RACE）cDNA増幅キット（Clontech）を用いて行うことができる。この１本鎖cDNAは、デサチュラーゼ／コンジュガーゼcDNAの中心領域が増幅されるPCRについての鋳型として働く。２つの縮重プライマーを、鱗翅目からのデサチュラーゼ／コンジュガーゼの保存中心領域を増幅することができるように設計し、下記のPCRプロトコールで用いる。
【０２２０】
５μＬ：希１本鎖cDNA；
0.2mM：dATP、dTTP、dGTP、dCTP；
0.5μＭ：５’プライマー（配列番号８）；
0.5μＭ：３’プライマー（配列番号９）；
10μＬ：5Xアドバンテージ（Advantage）２反応緩衝液（Clontech）；
１μＬ：50Xアドバンテージ２DNAポリメラーゼ混合物（Clontech）；
H2O：50μＬまで。
【０２２１】
別法として、配列番号10および配列番号11を有する縮重プライマーを、中心デサチュラーゼ領域の増幅のためのプライマー対として用いる。
【０２２２】
下記のサイクル条件下でPCRを行った。
【０２２３】
１段階：94℃（５分）；
35サイクル：94℃（30秒）、56℃（30秒）、72℃（３分）；
１段階：72℃（10分）；
待機位置：４℃。
【０２２４】
PCR産物を、例えば直線化TOPO TA PCR 2.1ベクター（Invitrogen）に直接連結し、次にコンピテント大腸菌TOP10細胞（Invitrogen）に形質転換する。陽性コロニーを再度増幅し、プラスミドDNAを精製し（Qiagenプラスミド・ミニ・キット）、次に配列決定する。
【０２２５】
得られる配列情報により、遺伝子特異プライマーを誘導し、５’領域および３’領域の増幅を行うことができる（スマート・レース（SMART RACE）cDNA増幅キット（Clontech））。再度それらのPCR産物をTOPO TA PCR 2.1ベクター（Invitrogen）に連結し、次にコンピテントTOP10細胞（Invitrogen）に形質転換する。陽性コロニーを再度増幅し、プラスミドDNAを精製し（Qiagenプラスミド・ミニ・キット）、次に配列決定する。
【０２２６】
このようにして得られた断片から出発して、デサチュラーゼ／コンジュガーゼの完全配列を標準的なクローニング技術を用いて合わせ、特性決定のために、例えば酵母での発現用にpYES2ベクター（Invitrogen）に転移させることができる。サッカロミセスINVSc1（Invitrogen）を、PEG／酢酸リチウムプロトコールの変法（Ausubel ら. (1996) Current Protocols in Molecular Biology.  John Wiley および Sons, New York）によって、相当するpYES2発現ベクターで形質転換する。２％グルコースを含むCMdum寒天平板での選択後、４種のpYES2DESAT形質転換体（pYES2DESATa〜d）および１種のpYES2形質転換体を選択して、さらなる培養および機能発現に用いる。
【０２２７】
実施例３：酵母でのデサチュラーゼ／コンジュガーゼの機能的発現
前培養：２％（重量／体積比）ラフィノースを補給したCMdum液体培地20mLを、トランスジェニック酵母クローン（pYES2DESATa〜d、pYES2）に接種し、600nmでの光学密度（OD600）が1.5〜２に達するまで、30℃、200rpmで３日間培養した。
【０２２８】
主培養：発現のため、２％ラフィノースおよび１％（体積比）テルギトールNP-40を補給したCMdum液体培地20mLを、ステアリン酸、パルミチン酸またはミリスチン酸などの相当する基質とともに濃縮して、最終濃度0.003％（重量／体積比）とした。培地に、OD600が0.05となるまで前培養液を接種した。２％（重量／体積比）ガラクトースを用いて、OD6000.2で16時間発現を誘発し、その後に培養液のOD600は0.8〜1.2に達した。
【０２２９】
脂肪酸分析：総脂肪酸を酵母培養液から抽出し、ガスクロマトグラフィーによって分析した。そのために、培養液5mLの細胞を遠心（1000×ｇ、10分間、４℃）によって回収し、100mM  NaHCO3（pH8.0）で１回洗浄して、培地および脂肪酸の残りを除去した。脂肪酸メチルエステル（FAMES）を得るため、細胞堆積物を液体N2中で衝撃凍結し、N2ガス下30℃で凍結乾燥した。ペレットを１％ナトリウムメトキシドのメタノール溶液中で均質化し、ホモジネートを室温で20分間インキュベートする。次に、等容量の1M  NaClおよびｎ−ヘプタンを加え、サンプルを混合し、混合物をGC管に移し入れる。水素炎イオン化検出器を搭載したヒューレット・パッカード（Hewlett Packard）6890ガスクロマトグラフィー装置のDB-waxキャピラリーカラム（30ｍ、0.25mm、0.25μｍ；Agilent J & W）から、サンプルを分離する。オーブン温度を20℃／分の速度で60℃（保持５分間）から200℃まで（保持20分間）プログラムし、最終的に20℃／分の速度で250℃とした（保持30分間）。用いたキャリアガスは窒素であった（1.6mL／分）。脂肪酸を、FAME標準（SIGMA）の保持時間と比較することで同定した。それについては、次の脂肪酸、すなわちc9-16:1、t9-16:1、18:0、c9-18:1、t9-18:1、c11-18:1、t11-18:1、c9,c12-18:2、t9,t12-18:2、c9,t11-18:2、t10,c12-18:2が標準として好ましく用いられる（標準の命名法は、脂肪酸に従来用いられる命名法に相当するものであり、最初に脂肪酸の二重結合の配置（ｃ＝シスまたはｔ＝トランス）および位置または鎖長を示す）。
【０２３０】
他の各種脂肪酸（例えば、ラウリン酸、トランス−バクセン酸、シス−バクセン酸、E10-オクタデセン酸またはZ10-オクタデセン酸）を用いたさらなる飼育実験を行って、このデサチュラーゼ／コンジュガーゼの基質選択性を詳細に検証することができる。
【０２３１】
実施例４：サッカロミセス・セレビシエでの鱗翅目からのデサチュラーゼ／コンジュガーゼの発現クローニング
ａ）cDNAライブラリの作製
蛾成虫の腹部からフェロモン腺を分離し、例えば製造者の指示に従ってTRIzol（Gibco/BRL）によって総RNAを単離するまで液体N2中で冷凍する。経験的に、新鮮組織約30mgから総RNA約60〜80μｇが単離可能であることが明らかになっている。総RNA約５μｇを用いて、cDNAライブラリを得る。それは例えば、スマートcDNAライブラリ構築キット（Clontech）を用いて行うことができる。単離した二本鎖cDNAを最終的に、直線化pYES2（Invitrogen）酵母発現ベクターに連結する。そのためには、最初にpTriplEx2ベクター（Clontech）の多重クローニング部位をpYES2に挿入する。その二本鎖cDNAをSfilAおよびSfilBで消化させ、次に組み換えされたベクターに直接クローニングする。
【０２３２】
ｂ）酵母の形質転換
製造者の指示に従ってサッカロミセス・セレビシエ・イージー・コンプ（EASY COMP）形質転換キット（Invitrogen）を用いて、プラスミドDNA約1.5μｇをINVSc1（Invitrogen）に形質転換する。２つの50μＬバッチを、大型で正方形のシャーレ（245×245mm）中の選択培地上で平板培養し、30℃で３日間インキュベートする。
【０２３３】
ｃ）マイクロタイタープレートでの酵母培養
個々のコロニーを、ピック・ロボター（Pick Roboter）を用いてマイクロタイタープレート（MTP）に移す。培地［１×CSM-Ura；１×YNB（アミノ酸および糖を含まない）；0.5％ラフィノース；５％グリセリン；40mg／Ｌ硫酸アデニン；0.5％硫酸アンモニウム］200μＬ中、30℃および毎分250回転で72時間の前培養を行う。前培養液から平均容量を加えることで主培養液でのOD600を0.2に調節する。培地［１×CSM-Ura；１×YNB（アミノ酸および糖を含まない）；0.5％ラフィノース；２％ガラクトース；0.2％テルギトールNP-40；40mg／Ｌ硫酸アデニン；0.5％硫酸アンモニウム；0.3mM脂肪酸基質］1mL中、16℃および毎分250回転で、OD600が３〜４に達するまで２〜３週間にわたって主培養を行う。
【０２３４】
ｄ）脂肪酸分析
酵母細胞を沈降させ（1000×ｇ、10分間、４℃）、次の処理を行うまで-80℃で保存する。脂肪酸メチルエステル（FAMES）を得るため、細胞堆積物を液体N2中で衝撃凍結し、N2ガス下30℃で凍結乾燥した。ペレットを１％ナトリウムメトキシドのメタノール溶液中で均質化し、室温で20分間インキュベートする。次に、等容量の1M  NaClおよびｎ−ヘプタンを加え、サンプルを混合し、上清をGC管に移し入れる。水素炎イオン化検出器を搭載したヒューレット・パッカード（Hewlett Packard）6890ガスクロマトグラフィー装置のDB-waxキャピラリーカラム（30ｍ、0.25mm、0.25μｍ；Agilent J & W）で、サンプルを分離する。オーブン温度を20℃／分の速度で60℃（保持５分間）から200℃まで（保持20分間）プログラムし、最終的に20℃／分の速度で250℃とした（保持30分間）。用いたキャリアガスは窒素であった（1.6mL／分）。脂肪酸を、FAME標準（SIGMA）の保持時間と比較することで同定した。実施例３に挙げたものと同じ標準を用いる。他の各種脂肪酸（例えば、ラウリン酸、トランス−バクセン酸、シス−バクセン酸、E10-オクタデセン酸またはZ10-オクタデセン酸）を用いたさらなる飼育実験を行って、このデサチュラーゼ／コンジュガーゼの基質選択性を詳細に検証することができる。
【０２３５】
ｅ）陽性酵母のプラスミド製造
試験で陽性であった個々のクローンを再度、最少培地［１×CSM-Ura；１×YNB（AA、糖類を含まない）；２％グルコース；40mg／Ｌ硫酸アデニン］10mL中、28℃で24時間培養し、OD600が３を超えた時点で遠心によって沈降させる。酵母ペレットをSCE緩衝液［1.2Mソルビトール；0.1Mクエン酸ナトリウム（pH7.0）；10mM  EDTA；1mg／mLリチカーゼ（Lytikase）］400μＬ中、37℃で20分間インキュベートする。次に、STE緩衝液［２％SDS；50mM  Tris／HCl（pH8.0）；10mM  EDTA］400μＬを細胞溶解物に加え、混合物を室温で10分間インキュベートする。細胞タンパク質を沈殿させるため、5M酢酸ナトリウム200μＬを加え、混合物を氷上に30分間置く。遠心後、上清を移し、2.5倍容量のエタノールで沈殿させる。沈降したペレットを70％エタノールで洗浄し、最後に無菌水に取る。適切であれば、デサチュラーゼ／コンジュガーゼの配列を、ベクター特異的プライマー（配列番号12および13）を用いる配列決定によって確認することができる。
【０２３６】
実施例５：植物脂肪酸生合成の操作
ａ）トランスジェニック植物での鱗翅目からのデサチュラーゼ／コンジュガーゼを発現するDNA構築物の形成
鱗翅目からのデサチュラーゼ／コンジュガーゼを発現するトランスジェニックのシロイヌナズナまたはセイヨウアブラナ植物を形成するためのキメラDNA構築物を得るため、ベクターpBinAR（Hofgen および Willmitzer (1990) Plant Sci 66:221-230）を用いる。このベクターは、CaMV（カリフラワーモザイクウィルス）35Sプロモーター（Franck ら. (1980) Cell 21(1):285-294）およびオクトピンシンターゼ遺伝子（Gielen ら. (1984) EMBO J 3:835-846）の終止シグナルを含む。デサチュラーゼ／コンジュガーゼをこのベクターにクローニングした後、トランスジェニックのシロイヌナズナまたはセイヨウアブラナ植物を形成する。
【０２３７】
ｂ）トランスジェニックシロイヌナズナ植物の形成
野生型のシロイヌナズナ植物（コロンビア）を、真空浸透法の変法（Clough S および Bent A (1998) Plant J 16(6):735-43; Bechtold N ら. (1993) in: Planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. CRAcad Sci Paris 1144(2):204-212）に基づいて、アグロバクテリウム−ツメファシエンス株（GV3101 [pMP90]）で形質変換する。用いたアグロバクテリウム−ツメファシエンス細胞は、以前にプラスミドで形質転換したものであった。
【０２３８】
一次形質転換体の種子を、抗生物質に対する耐性に基づいて選択する。抗生物質に対する耐性を有する幼苗を土壌に植え、完全発達植物として生化学的分析を行う。
【０２３９】
ｃ）トランスジェニックセイヨウアブラナ植物の形成
トランスジェニックアブラナ植物を、使用される培地および緩衝液の組成についても説明しているベードらのプロトコール（Bade JB および Damm B, Gene Transfer to Plants, Potrykus I および Spangenberg G (編) Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38）に従って形成する。
【０２４０】
アグロバクテリウム−ツメファシエンス株GV3101[pMP90]を用いて形質転換を行う。プラスミドpBinAR-TkTP／VitE-ATをその形質転換に用いる。セイヨウアブラナ（var. Westar）の種子を70％エタノール（体積比）で表面滅菌し、水中にて55℃で10分間洗浄し、濃度１％の次亜塩素酸溶液(25体積％Teepol、0.1体積％Tween20）中で20分間インキュベートし、無菌水で各回20分ずつ６回洗浄する。種子を濾紙上で３日間乾燥させ、種子10〜15個を発芽培地15mLの入ったガラス製フラスコで発芽させる。幼苗（大きさ約10cm）数本から根および頂部を除去し、残っている胚軸をカットして長さ約6mmの片とする。そうして得られた約600個の外植片を基本培地50mLで30分間洗浄し、300mLフラスコに移し入れる。カルス誘導培地100mLを加えた後、培養液を100rpmで24時間インキュベートする。
【０２４１】
アグロバクテリウム株の終夜培養を、カナマイシン（20mg／Ｌ）を補給したＬ培地で29℃にて行い、この培養液2mLをカナマイシンを含まないＬ培地50mL中で、OD600が0.4〜0.5に達するまで29℃で４時間インキュベートする。培養液を2000rpmで25分間ペレット化した後、細胞ペレットを基本培地25mLに再懸濁させる。さらに基本培地を加えることで、溶液中の細菌の濃度を、OD600が0.3となるようにする。
【０２４２】
カルス誘導培地を無菌ピペットを用いてアブラナ外植片から除去し、アグロバクテリウム溶液50mLを加え、培養液を注意深く混合し、20分間インキュベートする。アグロバクテリウム懸濁液を除去し、アブラナ外植片をカルス誘導培地50mLを用いて１分間洗浄し、次にカルス誘導培地100mLを加える。軌道振盪機で100rpmにて24時間にわたり共培養を行う。カルス誘導培地を抜くことで共培養を停止し、外植片を100rpmにて洗浄培地で、それぞれ25mLでの洗浄を１分間を２回、それぞれ100mLで60分間を２回行う。外植片とともに洗浄培地を15cmシャーレに移し、培地を無菌ピペットを用いて除去する。
【０２４３】
再生のため、外植片20〜30個のバッチを、カナマイシンを補給した若枝誘導培地25mLの入った90mmシャーレに移し入れる。そのシャーレをロイコポール（Leukopor）２層で満たし、明16時間／暗８時間の光期間で25℃および2000ルクスでのインキュベーションを行う。12日ごとに、発達カルスを若枝誘導培地の入った新鮮なシャーレに移し入れる。完全植物再生のためのその後の段階は全て、ベードらの著作（Bade, J.B および Damm, B., Gene Transfer to Plants, Potrykus I および Spangenberg G (編) Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38）に記載の方法に従って行う。
【０２４４】
ｄ）トランスジェニック植物における脂肪酸パターンの分析
トランスジェニック植物の種子を１％ナトリウムメトキシドのメタノール溶液中で直接均質化し、ホモジネートを室温で20分間インキュベートする。次に、等容量の1M  NaClおよびｎ−ヘプタンを加え、サンプルを混合し、上清をGC管に移し入れる。サンプルを、水素炎イオン化検出器を搭載したヒューレット・パッカード（Hewlett Packard）6890ガスクロマトグラフィー装置のDB-waxキャピラリーカラム（30ｍ、0.25mm、0.25μｍ；Agilent J & W）で分離する。オーブン温度を20℃／分の速度で60℃（保持５分間）から200℃まで（保持20分間）プログラムし、最終的に20℃／分の速度で250℃とした（保持30分間）。用いたキャリアガスは窒素であった（1.6mL／分）。脂肪酸を、FAME標準（SIGMA）の保持時間と比較することで同定した。実施例３に挙げたものと同じ標準を用いる。
【０２４５】
実施例６：鱗翅目ワタアカミムシガからのデサチュラーゼの酵母における機能的発現
ワタアカミムシガの腺材料から単離したデサチュラーゼ（配列番号21および22）を、BamHIおよびEcoRIによって酵母発現ベクターpYES2（Invitrogen）にクローニングした。得られた構築物をpYES2::DesPgosと称した。pYES2::DesPgosおよび対照pYES2の両方を、S.c.イージー・コンプ形質転換キット（Invitrogen）を用いて酵母細胞（サッカロミセス・セレビシエINVSc1［MAT、his3-1、leu2、trp1-289、ura3-52］；Invitrogen）に形質転換した。これらの酵母細胞にはさらに、セイヨウアブラナアセチル-CoAシンターゼを発現するための構築物pESC::ACSを含有させた。pYES2::DesPgosと対照pYES2の両方の１個のコロニーを選択培地上に分離し、前培養培地（1★CSM-Leu／-Ura；1★YNB w/o AA；0.5％ラフィノース；５％グリセリンおよび0.5％硫酸アンモニウム）50mL中にて30℃および毎分200回転で２日間増殖させて、前培養液を得た。これらの前培養液から、各場合で酵母ではOD0.06を有する３つの主培養液にpYES2::DesPgosを接種し、酵母でOD0.1を有するものにはpYES2を接種し、いずれも16℃および30℃で行った。主培養液培地（1★CSM-Leu／-Ura；1★YNB w/o AA；0.5％ラフィノース；２％ガラクトース；0.2％テルギトールNP-40および0.5％硫酸アンモニウム）を0.3Mステアリン酸で処理した。16℃で４日および30℃で２日後、主培養液をOD1.2に調節し、10mLを室温および17500gで30分間遠心した。ペレットをH2Oに再懸濁させ、90℃で10分間加熱し、再度同じ条件下で沈降させた。ペレットをH2Oで洗浄し、沈降させ、液体窒素（N2）で衝撃凍結し、次にN2下で凍結乾燥した。脂質を抽出し、脂肪酸メチルエステル（FAME）を製造するために、ペレットを１％ナトリウムメトキシド300μＬ中で均質化し、室温で20分間インキュベートした。次に、1M  NaClおよびｎ−ヘプタンをそれぞれ300μＬ加え、サンプルを混合し、上清をGC管に移し入れた。サンプルを、水素炎イオン化検出器を搭載したヒューレット・パッカード（Hewlett Packard）6890ガスクロマトグラフィー装置のDB-waxキャピラリーカラム（30ｍ、0.25mm、0.25μｍ；Agilent J & W）で分離した。オーブン温度を20℃／分の速度で60℃（保持５分間）から200℃まで（保持20分間）プログラムし、最終的に20℃／分の速度で250℃とした（保持30分間）。用いたキャリアガスは窒素であった（1.6mL／分）。脂肪酸を、FAME標準（SIGMA）の保持時間と比較することで同定した。
【０２４６】
表１には、16℃での対照pYES2と比較したpYES2::DesPgosからの脂質のFAMEの相対的分布を示してある。ワタアカミムシガ・デサチュラーゼの発現によって、C16:1D11、C18:1D11およびC18:1D13というモノ不飽和脂肪酸の蓄積が生じることがわかる。さらに、ワタアカミムシガ・デサチュラーゼの異種発現によって(9Z,11E)-CLAが形成される。
【０２４７】
表２には、30℃での対照pYES2と比較したpYES2::DesPgosの脂質のFAMEの相対的分布を示してある。30℃での発現結果は、16℃でのものと類似している。酵母でのワタアカミムシガ・デサチュラーゼの発現によって、モノ不飽和脂肪酸C16:1D11、C18:1D11およびC18:1D13の蓄積が生じる。さらに、ワタアカミムシガ・デサチュラーゼの異種発現によって、(9Z,11E)-CLAが形成される。
【０２４８】
表１：16℃でのスタフィロコッカス−セレビシエにおけるワタアカミムシガ・デサチュラーゼの異種発現。値は、総脂肪酸スペクトラムにおける個々の脂肪酸の相対量を表す。
【表１】
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【０２４９】
表２：30℃でのスタフィロコッカス−セレビシエにおけるワタアカミムシガ・デサチュラーゼの異種発現。値は、総脂肪酸スペクトラムにおける個々の脂肪酸の相対量を表す。
【表２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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