(57)【要約】本発明は、エキソビボまたはインビボにおけるＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋細胞の増殖、ならびにこれらの活性の調節のための、組成物および方法を提供する。これらの組成物および方法は診断および治療に利用することができる。2004501165.tif 000011
2004501165.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）に優先的に結合する精製抗体であって、ＴＣＲのＣＤＲ３ループ、もしくはα−β接合（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）に優先的に結合するか；あるいはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団に優先的に結合するか、または該Ｔ細胞亜集団の増殖もしくは活性化を調節する抗体。
【請求項２】
インバリアントＴ細胞に優先的に結合して優先的に増殖させる、請求項１記載の精製抗体。
【請求項３】
Ｔ細胞亜集団のＴＣＲの抗原結合部位に優先的に結合する、請求項１記載の精製抗体。
【請求項４】
ＴＣＲに優先的に結合する精製抗体の組み合わせであって、ＴＣＲのＣＤＲ３ループもしくはα−β接合に優先的に結合するか；あるいはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団に優先的に結合するか、または該Ｔ細胞亜集団の増殖もしくは活性化を調節し、かつ以下からなる群より選択される、抗体の組み合わせ：
（ｉ）抗Ｖα２４抗体および抗ＣＤ１６１抗体；
（ｉｉ）抗Ｖα２４ 抗体および抗ＣＤ９４抗体；
（ｉｉｉ）抗Ｖβ１１ 抗体および抗ＣＤ１６１抗体；ならびに
（ｉｖ）抗Ｖβ１１抗体および抗ＣＤ９４抗体。
【請求項５】
ＴＣＲのＣＤＲ３ループもしくはα−β接合に優先的に結合するか、；あるいはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団に優先的に結合するか、または該Ｔ細胞亜集団の増殖もしくは活性化を調節する抗体の、断片または誘導体。
【請求項６】
以下を含む二機能性抗体：
（ａ）ＴＣＲのＣＤＲ３ループもしくはα−β接合に優先的に結合するか；あるいはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団に優先的に結合するか、または該Ｔ細胞亜集団の増殖もしくは活性化を調節し；第１のエピトープに結合する、第１の抗体またはその断片；ならびに
（ｂ）ＴＣＲを発現するＴ細胞上に発現されるか、または第１の抗体もしくはその断片が結合しているＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、もしくはＪαＱ＋ Ｔ細胞上に発現される、第２のエピトープに結合する第２の抗体またはその断片。
【請求項７】
ＴＣＲのＣＤＲ３ループもしくはα−β接合に優先的に結合するか；あるいはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団に優先的に結合するか、または該Ｔ細胞亜集団の増殖もしくは活性化を調節する抗体を産生する、安定なハイブリドーマ。
【請求項８】
Ｔ細胞が抗体もしくは抗体の組み合わせに特異的に結合しており、該抗体もしくは抗体の組み合わせが、ＴＣＲのＣＤＲ３ループもしくはα−β接合に優先的に結合するか；あるいは該抗体が、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団に優先的に結合するか、または該Ｔ細胞亜集団の増殖もしくは活性化を調節する、精製されたＴ細胞亜集団。
【請求項９】
ＴＣＲのＣＤＲ３ループもしくはα−β接合に優先的に結合するか；あるいはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団に優先的に結合するか、または該Ｔ細胞亜集団の増殖もしくは活性化を調節する抗体を作製する、以下の段階を含む方法：
（ａ）環状ペプチドを担体に結合させる段階；
（ｂ）結合させたペプチドで哺乳類を免疫化する段階；および
（ｃ）ＴＣＲのＣＤＲ３ループまたはα−β接合に優先的に結合するか；あるいはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団に優先的に結合するか、または該Ｔ細胞亜集団の増殖もしくは活性化を調節する抗体を、単離する段階。
【請求項１０】
ＴＣＲのＣＤＲ３ループもしくはα−β接合に優先的に結合するか、あるいはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団を優先的に結合するか、または該Ｔ細胞亜集団の増殖もしくは活性化を調節する抗体を作製する、以下の段階を含む方法：
（ａ）インバリアントＴ細胞で、ＣＤ１またはインバリアントＴ細胞欠損哺乳類を免疫化する段階；および
（ｂ）ＴＣＲのＣＤＲ３ループもしくはα−β接合に優先的に結合するか；あるいはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団に優先的に結合するか、または該Ｔ細胞亜集団の増殖もしくは活性化を調節する抗体を、単離する段階。
【請求項１１】
哺乳類がＣＤ１ｄノックアウトマウス、ＮＫ Ｔ細胞に寛容な哺乳類、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞に寛容な哺乳類、ＪαＱ＋ Ｔ細胞に寛容な哺乳類、インバリアントＴ細胞に寛容な哺乳類、インバリアントＴ細胞が除去されている哺乳類、ＴＣＲ α鎖の一部を欠く哺乳類、またはＴＣＲのβ鎖の一部を欠く哺乳類である、請求項９または１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
試料中のＮＫ ＴＣＲの量またはＮＫ Ｔ細胞の量を測定する方法であって、ＴＣＲのＣＤＲ３ループ、抗原結合部位、またはα−β接合に優先的に結合する抗体を試料に接触させる段階を含む方法。
【請求項１３】
試料中のＣＤ１ｄ反応性ＴＣＲの量またはＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞の量を測定する方法であって、ＴＣＲのＣＤＲ３ループ、抗原結合部位、またはα−β接合に優先的に結合する抗体を、試料に接触させる段階を含む方法。
【請求項１４】
試料中のＪαＱ＋ ＴＣＲの量またはＪαＱ＋ Ｔ細胞の量を測定する方法であって、ＴＣＲのＣＤＲ３ループ、抗原結合部位、またはα−β接合に優先的に結合する抗体もしくは抗体の組み合わせを、試料に接触させる段階を含む方法。
【請求項１５】
試料中のＮＫ ＴＣＲまたはＮＫ Ｔ細胞を視覚化する方法であって、ＴＣＲのＣＤＲ３ループ、抗原結合部位、またはα−β接合に優先的に結合する抗体を試料に接触させる段階を含む方法。
【請求項１６】
試料中のＣＤ１ｄ反応性ＴＣＲまたはＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞を視覚化する方法であって、ＴＣＲのＣＤＲ３ループ、抗原結合部位、またはα−β接合に優先的に結合する抗体を、試料に接触させる段階を含む方法。
【請求項１７】
試料中ＪαＱ＋ ＴＣＲまたはＪαＱ＋ Ｔ細胞を視覚化する方法であって、ＴＣＲのＣＤＲ３ループ、抗原結合部位、またはα−β接合に優先的に結合する抗体もしくは抗体の組み合わせを、試料に接触させる段階を含む方法。
【請求項１８】
自己免疫疾患、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、真核性病原体感染、アレルギー、喘息、炎症性症状、移植片対宿主病、移植拒絶、免疫不全症、自然流産、妊娠、および癌からなる群より選択される症状の被験者、または症状に対する危険性の高い被験者を診断する方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）ＴＣＲのＣＤＲ３ループもしくはα−β接合に優先的に結合する、抗体もしくは抗体の組み合わせ；あるいはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団に優先的に結合するか、または該Ｔ細胞亜集団の増殖もしくは活性化を調節する抗体を、被験者に由来する試料に接触させる段階；
（ｂ）ＴＣＲまたはＴ細胞に結合している、抗体または抗体の組み合わせの量を定量し、試料中の関心対象のＴ細胞量を決定する段階；および
（ｃ）試料中の関心対象のＴ細胞量を、症状を有すると診断された被験者、または症状がないと診断された被験者にみられる、関心対象のＴ細胞量と比較する段階。
【請求項１９】
試料中の別のＴ細胞種の量を、症状を有すると診断された被験者、または症状がないと診断された被験者にみられる別のＴ細胞種の量と比較する段階をさらに含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
哺乳類の自己免疫疾患、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、真核性病原体感染、アレルギー、喘息、炎症性症状、移植片対宿主病、移植拒絶、免疫不全症、自然流産、妊娠、もしくは癌を治療または予防する方法であって、ＴＣＲのＣＤＲ３ループもしくはα−β接合に優先的に結合するか、あるいはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団に優先的に結合するか、または該Ｔ細胞亜集団の増殖もしくは活性化を調節する抗体もしくは抗体の組み合わせを、該哺乳類に投与する段階を含む方法。
【請求項２１】
ＴＣＲのＣＤＲ３ループ、抗原結合部位、もしくはα−β接合に優先的に結合するか；またはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団の増殖を抑制する抗体もしくは抗体の組み合わせを哺乳類に投与する段階を含み、該投与はＴＣＲ、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞を発現するＴ細胞を抑制するのに十分である、哺乳類のＴ細胞の病因を抑制する方法。
【請求項２２】
抗体が毒素または放射標識に共有結合で連結されている、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
Ｔ細胞亜集団のサイズを増大させる方法であって、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、ＪαＱ＋ Ｔ細胞、および抗体に優先的に結合しているＴＣＲのＣＤＲ３ループもしくはα−β接合を発現するＴ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団に優先的に結合するか、または該Ｔ細胞亜集団の増殖もしくは活性化を調節する抗体を、Ｔ細胞を含む試料に接触させる段階を含み、該接触はＴ細胞数の増加をもたらす条件下で起こる方法。
【請求項２４】
接触によりＴ細胞数を増加させる条件下で、抗原および抗原提示細胞に試料を接触させる段階をさらに含む、請求項２３記載の方法であって；ここで該抗原がα−ガラクトシルセラミドでない方法。
【請求項２５】
抗原が、感染性病原体に由来する脂質またはグリコシル−ホスファチジルイノシトール抗原、癌性細胞に由来する抗原、または自己脂質（ｓｅｌｆ−ｌｉｐｉｄ）である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
接触によりＴ細胞数を増加させる条件下で、抗原および抗原提示細胞に試料を接触させる段階をさらに含む、請求項２３記載の方法であって；ここで該抗原がα−ガラクトシルセラミドである方法。
【請求項２７】
以下の段階を含む、Ｔ細胞亜集団のサイズを増大させる方法：
（ａ）Ｔ細胞と抗体もしくは抗体の組み合わせとの複合体の形成が可能な条件下で、ＴＣＲのＣＤＲ３ループもしくはα−β接合に優先的に結合する抗体もしくは抗体の組み合わせ、あるいはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団に優先的に結合するか、または該Ｔ細胞亜集団の増殖もしくは活性化を調節する抗体に、Ｔ細胞を含む試料を接触させる段階；
（ｂ）複合体を単離する段階；ならびに
（ｃ）Ｔ細胞数を増加させる条件下で、複合体に含まれるＴ細胞または複合体から回収されたＴ細胞を、抗原および抗原提示細胞に接触させる段階であって、ここで該抗原がα−ガラクトシルセラミドでない段階。
【請求項２８】
抗原が、感染性病原体に由来する脂質またはグリコシル−ホスファチジルイノシトール抗原、癌性細胞に由来する抗原、または自己脂質である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
以下の段階を含む、Ｔ細胞の亜集団のサイズを増大させる方法：
（ａ）Ｔ細胞と抗体もしくは抗体の組み合わせとの複合体の形成が可能な条件下で、ＴＣＲのＣＤＲ３ループもしくはα−β接合に優先的に結合する抗体もしくは抗体の組み合わせ、あるいはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団に優先的に結合するか、または該Ｔ細胞亜集団の増殖もしくは活性化を調節する抗体に、Ｔ細胞を含む試料を接触させる段階；
（ｂ）複合体を単離する段階；ならびに
（ｃ）接触によりＴ細胞の数を増加させる条件下で、複合体に含まれるＴ細胞または複合体から回収されたＴ細胞を、抗原および抗原提示細胞に接触させる段階であって、ここで該抗原がα−ガラクトシルセラミドである段階。
【請求項３０】
１つまたは複数のサイトカインに、試料または複合体を接触させる段階をさらに含む、請求項２７または２９のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
以下の段階を含む、哺乳類のＴ細胞亜集団のサイズを増大させる方法：
（ａ）哺乳類に由来するＴ細胞を含む試料を得る段階；
（ｂ）接触によりＴ細胞数を増加させる条件下で、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、ＪαＱ＋ Ｔ細胞、および抗体もしくは抗体の組み合わせに優先的に結合している、ＴＣＲのＣＤＲ３ループもしくはα−β接合を発現するＴ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団に優先的に結合するか、または該Ｔ細胞亜集団の増殖もしくは活性化を調節する抗体もしくは抗体の組み合わせに、Ｔ細胞を接触させる段階；ならびに
（ｃ）接触させたＴ細胞を哺乳類に投与する段階。
【請求項３２】
接触段階の前または接触段階の後に、Ｔ細胞を精製する段階をさらに含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
以下の段階を含む、哺乳類のＴ細胞亜集団のサイズを増大させる方法：
（ａ）哺乳類に由来するＴ細胞を含む試料を得る段階；
（ｂ）Ｔ細胞と抗体もしくは抗体の組み合わせとの複合体の形成が可能な条件下で、ＴＣＲのＣＤＲ３ループもしくはα−β接合に優先的に結合する抗体もしくは抗体の組み合わせ、あるいはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団に優先的に結合するか、または該Ｔ細胞亜集団の増殖もしくは活性化を調節する抗体に、Ｔ細胞を接触させる段階；
（ｃ）複合体を単離する段階；および
（ｄ）接触によりＴ細胞の数を増加させる条件下で、複合体中のＴ細胞または複合体から回収されたＴ細胞を、抗原および抗原提示細胞に接触させる段階であって、ここで該抗原がα−ガラクトシルセラミドでない段階；ならびに
（ｅ）接触させたＴ細胞を哺乳類に投与する段階。
【請求項３４】
抗原が、感染性病原体に由来する脂質またはグリコシル−ホスファチジルイノシトール抗原、癌性細胞に由来する抗原、または自己脂質である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
以下の段階を含む、哺乳類のＴ細胞亜集団のサイズを増大させる方法：
（ａ）哺乳類に由来するＴ細胞を含む試料を得る段階；
（ｂ）Ｔ細胞と抗体もしくは抗体の組み合わせとの複合体の形成が可能な条件下で、ＴＣＲのＣＤＲ３ループもしくはα−β接合に優先的に結合する抗体もしくは抗体の組み合わせ、あるいはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団に優先的に結合するか、または該Ｔ細胞亜集団の増殖もしくは活性化を調節する抗体に、Ｔ細胞を接触させる段階；
（ｃ）複合体を単離する段階；および
（ｄ）接触によりＴ細胞数を増加させる条件下で、複合体中のＴ細胞または複合体から回収されたＴ細胞を、抗原および抗原提示細胞に接触させる段階であって、ここで該抗原がα−ガラクトシルセラミドである段階；ならびに
（ｅ）接触させたＴ細胞を哺乳類に投与する段階。
【請求項３６】
１つまたは複数のサイトカインを哺乳類に投与する段階をさらに含む、請求項３３または３５のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
１つまたは複数のサイトカインに試料またはＴ細胞を接触させる段階であって、接触させたＴ細胞によりＴｈ１／Ｔｈ２／免疫偏向反応の比を変化させる段階をさらに含む、請求項３３または３５のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
哺乳類の自己免疫疾患、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、真核性病原体感染、アレルギー、喘息、炎症性症状、移植片対宿主病、移植拒絶、免疫不全症、自然流産、妊娠、または癌の治療または予防に用いられる、請求項３３または３５のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
試料に由来するＴ細胞亜集団を精製する方法であって、ＴＣＲのＣＤＲ３ループもしくはα−β接合に優先的に結合する抗体もしくは抗体の組み合わせ、あるいはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団に優先的に結合するか、または該Ｔ細胞亜集団の増殖もしくは活性化を調節する抗体に、試料を接触させる段階を含む方法。
【請求項４０】
抗Ｖα２４抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ１６１抗体、または抗Ｖβ１１抗体に試料を接触させる段階をさらに含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
抗体に蛍光標識が共有結合で連結されていて、複合体が該複合体の蛍光シグナルを基に単離される、請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
抗体に磁気標識が共有結合で連結されていて、複合体が該複合体の磁性を基に単離される、請求項３９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
連邦政府資金による研究に関する記述
本発明は、国立衛生研究所の助成金番号ＡＩ４２９５５による資金提供を受けた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
発明の背景
免疫系を調節することは、自己免疫疾患、感染症、アレルギー、喘息、炎症性症状、自然流産、妊娠、移植片対宿主病、および癌を含むがこれらに限定されないさまざまな疾患および障害の治療に望ましい。
【０００３】
Ｔ細胞は、感染細胞または癌性細胞の認識および破壊といった複数の細胞性免疫反応に関与するリンパ球である。サプレッサーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、およびヘルパーＴ細胞などのＴ細胞サブセットは、異なる免疫機能に関与する。サプレッサーＴ細胞は、感染解消後に免疫応答をオフとする際にはたらく。細胞傷害性Ｔ細胞、または「ナチュラルキラー」Ｔ細胞は、感染細胞または癌性細胞を破壊する。ヘルパーＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、および／または抗体産生Ｂ細胞の活性を調節するサイトカインを産生する。
【０００４】
ヘルパーＴ細胞の一つのサブセットであるＴｈ１細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞活性などの細胞性反応を促進し、また可溶性抗体が関与するＴｈ２ ヘルパーＴ細胞活性および液性免疫の両方を抑制するインターロイキン−１ （ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）、およびＩＬ−２を分泌する。抗原提示細胞を死滅させる能力、およびサイトカインが関与するエフェクター活性をもつＴｈ１細胞は激しい遅延型過敏反応に関連している。ヘルパーＴ細胞の別のサブセットであるＴｈ２細胞は、細胞性反応を抑制して液性反応を促進すると考えられている。Ｔｈ２細胞は、Ｂ細胞の発生および抗体産生を活性化するＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３を分泌する。Ｔ細胞は、ＴＧＦ−βまたはＩＬ−１０サイトカインの分泌がかかわる可能性がある持続的な免疫応答の抑制などの免疫偏向反応に関与する場合もある（Ｓｏｎｏｄａら、Ｊ． Ｅｘ． Ｍｅｄ． １９０：１２１５〜１２５５、１９９９；Ｓｔｒｅｉｌｅｉｎら、Ｈｕｍ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５２：１３８〜１４３、１９９７；Ｈｏｎｇら、Ｊ． Ｅｘ． Ｍｅｄ． １９０、１１９７〜１２００、１９９９；Ｓｔｒｅｉｌｅｉｎら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８：３５５７〜３５６０、１９９７）．
【０００５】
抗原提示細胞に結合した特定の抗原を認識するために、大半のＴ細胞は、高度に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を細胞表面に発現している。大半の一般的なＴ細胞受容体の鎖はαおよびβと呼ばれる。少数のＴ細胞亜集団に見出される第２のＴ細胞受容体はγ鎖およびδ鎖からなる。Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖、γ鎖、およびδ鎖の遺伝子群の構成は抗体遺伝子の構成に似ている。つまりＶ領域、Ｄ領域、およびＪ領域のライブラリーが存在し、各ライブラリーの個々の領域が連結されて遺伝子全体を形成する。
【０００６】
ＴＣＲ−α鎖のさまざまな配列をもつ大半のＴ細胞亜集団とは対照的に、インバリアントＴ細胞は、ヒトのＶβ１１またはマウスのＶβ８と優先的に対をなす、高度に保存されたインバリアントなＴＣＲ−α鎖、Ｖα２４−ＪαＱをヒトで、またＶα１４−Ｊα２８１をマウスで有する。この細胞はＣＤ４＋ＣＤ８−またはＣＤ４−ＣＤ８−である。インバリアントＴＣＲの存在によって、インバリアントＴ細胞は、ＣＤ１ファミリーに属すると呼ばれる非多型性ＭＨＣクラスＩ様タンパク質によって提示された、内因性または病原体に由来する脂質抗原を認識できると考えられている。ヒトには４つのＣＤ１タンパク質（ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、およびＣＤ１ｄ）があるが、マウスにはヒトＣＤ１ｄに対する相同性が高い一つの重複したＣＤ１ｄ遺伝子しかない。ヒトのＣＤ１ｄは胸腺細胞で高レベルで発現しており、Ｂ細胞および単球で低レベルで発現しており、またリンパ系および骨髄系外の一部の細胞でも発現している。
【０００７】
多くのインバリアントＴ細胞は、通常は大半がヒトのＣＤ１６１ （ＮＫＲ−Ｐ１Ａ）、およびマウスの細胞表面Ｃ型レクチン、ＮＫＲ−Ｐ１Ｃ （ＮＫ１）を含むナチュラルキラー（ＮＫ）細胞にみられる数種の細胞表面タンパク質の発現によって区別される。本明細書では「インバリアントＮＫ Ｔ細胞」と呼ぶ上記Ｔ細胞亜集団は、胸腺における成熟Ｔ細胞の大部分、マウスの肝臓における主要Ｔ細胞亜集団を、また一部のマウス系列の脾臓Ｔ細胞の最大５％を占める。
【０００８】
マウスおよびヒトのインバリアントＴ細胞は、大量の免疫調節性サイトカインＩＬ−４ （Ｔｈ２エフェクター）およびＩＦＮ−γ（Ｔｈ１エフェクター）を、抗ＣＤ３抗体またはＣＤ１ｄに反応してインビボで産生する。これらのサイトカインにより、細胞はＴｈ２応答およびＴｈ１応答の両方に関与することができる。インバリアントＴ細胞が、一部の自己免疫疾患で防御的にはたらくと考えられるＴｈ２応答の増強に果たす役割は、１型糖尿病を含むヒトおよびマウスの自己免疫疾患モデルにおける数にみられるインバリアントＴ細胞の存在の欠損によってさらに支持されている。したがって、インバリアントＴ細胞の誘導によってＴｈ１応答とＴｈ２応答のバランスが変わることは、自己免疫疾患の発症に影響する可能性がある。
【０００９】
インバリアントＴ細胞は、速やかなＴｈ１免疫応答および抗腫瘍反応も促進することができる。マウスの肝臓におけるＴ細胞の大部分を占めるインバリアントＴ細胞はＩＬ−１２によって刺激されて、活性のある細胞傷害性Ｔ細胞となって、腫瘍モデルにおける肝転移に防御的に作用する場合がある。このような結論は、インバリアントＶα１４−Ｊα２８１ ＴＣＲを発現しないＪα２８１ノックアウトマウスの作製によって遺伝的に確認されている。このノックアウトマウスでは、インバリアントＴ細胞の数が著しく減少しており、ＩＬ−１２による腫瘍拒絶に関与不能であった。また他の研究では、ＩＬ−１２の投与が、インバリアントＴ細胞を欠くＣＤ１ｄノックアウトマウスの脾臓および肝臓における初期ＩＦＮ−γ応答を誘導しなかったことが報告されている。またヒト患者で得られたデータから、進行癌患者ではインバリアントＮＫ Ｔ細胞がほとんど存在せず、Ｔｈ１様の応答が低下することが判明している。活性化されたインバリアントＴ細胞の抗腫瘍反応には、ＣＤ１ｄに特異的な細胞傷害性およびＮＫ／ＬＡＫ細胞様毒性が部分的に関与すると考えられる。サイトカイン産生、または抗原提示細胞（ＡＰＣ）との相互作用を介すると考えられるインバリアントＴ細胞の他の調節性機能も、抗腫瘍性の免疫応答に重要な役割を担っている可能性がある。
【００１０】
インバリアントＴ細胞は自然流産の原因にも影響する可能性がある。インバリアントＴ細胞に対するリガンドを投与してマウスの脱落膜のインバリアントＴ細胞を刺激すると妊娠マウスの流産が誘導された。このような流産の誘導には、インバリアントＴ細胞によるパーフォリン依存性の死滅およびＩＦＮ−γおよび腫瘍壊死因子−αの産生が必要であった。
【００１１】
インバリアントＴ細胞が主要なＣＤ１ｄ反応性亜集団であるヒト末梢血とは対照的に、ヒトおよびマウスの骨髄、ならびにヒトの肝臓には大量のＩＬ−４およびＩＦＮ−γも産生する、さまざまなＴＣＲを用いるＣＤ１ｄ反応性の非インバリアントＴ細胞が大部分を占めるＴ細胞集団が存在する。このようなＣＤ１ｄ反応性の非インバリアントＴ細胞はＮＫ Ｔ細胞または非ＮＫ Ｔ細胞であり、これらはＣＤ１ｄ反応性のインバリアントＴ細胞と同様に機能する。骨髄におけるＣＤ１ｄ反応性の非インバリアントＴ細胞は移植片対宿主病の抑制に影響すると考えられており、また両集団は移植片対白血病反応を促進すると考えられている。肝臓で上記Ｔ細胞はＣ型肝炎感染などの感染症に対して防御的にはたらく可能性があるが、そのＴｈ１応答による損傷を引き起す可能性もある。また本発明者らは、ＣＤ１ｄ反応性ＮＫ Ｔ細胞が、免疫的に隔絶された部位の一つである前眼房における抗原に対する免疫寛容に極めて重要なことを見出した（Ｓｏｎｏｄａら、前掲）。このような機構は、末梢性免疫寛容の維持にも重要であると考えられる。
【００１２】
プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、またはリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）などの寄生虫に由来するグリコシル−ホスファチジルイノシトールは、マウスのＣＤ１ｄ反応性インバリアントＶα１４ ＮＫ Ｔ細胞を刺激することが最近報告された。また抗腫瘍活性のスクリーニングの過程で海綿から単離されたα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）脂質はＣＤ１ｄ提示抗原の１つである。α−ＧａｌＣｅｒは、抗Ｖα２４ 抗体を用いた精製によってＴ細胞用が最初に濃縮される臍帯試料または末梢血試料に由来するヒトのＣＤ１ｄ反応性インバリアントＴ細胞の増殖させるために使用可能な薬剤の一例である。濃縮後のＶα２４＋細胞を、α−ＧａｌＣｅｒおよび精製抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で共に培養する。しかし臨床状況によっては、２段階の複雑なプロトコル、または条件によっては適切に作用しない可能性のある抗原提示細胞の使用を必要としないインバリアントＴ細胞を増殖させる改善された方法を用いることが望ましいと考えられる。
【００１３】
自己免疫疾患、感染症、アレルギー、喘息、炎症性症状、自然流産、妊娠、移植片対宿主病、および癌などの疾患および障害を予防および治療するために、哺乳類を対象にＴ細胞の集団、より具体的にはＴ細胞の特定の亜集団を優先的にモニタリングして変化させることが求められている。
【００１４】
発明の概要
本発明者らは、特定のＴ細胞サブグループの選択的な同定および増殖、または活性化を可能とする抗体を作製する方法を発見して実用化した。特に本発明は、特定のＴＣＲ配列を有するＴ細胞を認識して増殖させる抗体を特徴とする。このような抗体は、癌および自己免疫疾患を含むさまざまな疾患の診断、予防、安定化、および治療に使用することができる。
【００１５】
したがって一つの局面では、本発明は、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）に優先的に結合する精製抗体を特徴とする。このような抗体は、ＴＣＲのＣＤＲ３ループまたはα−β接合に優先的に結合するか、またはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団に優先的に結合するか、またはその増殖もしくは活性化を調節する（例えば上昇もしくは低下させる）。関連する局面では、本発明は、ともに優先的にＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）に結合する精製抗体の組み合わせ（例えば２つ、３つ、４つ、または５つの抗体の混合物）を特徴とする。組み合わせることで、これらの抗体はＴＣＲのＣＤＲ３ループまたはα−β接合に優先的に結合するか、またはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団の増殖または活性化を優先的に調節する。抗体の望ましい組み合わせでは以下の１組の抗体を混合する：（ｉ）抗Ｖα２４抗体と抗ＣＤ１６１抗体；（ｉｉ）抗Ｖα２４抗体と抗ＣＤ９４抗体；（ｉｉｉ）抗Ｖβ１１抗体と抗ＣＤ１６１抗体；または（ｉｖ）抗Ｖβ１１抗体と抗ＣＤ９４抗体。望ましくは、これらの抗体の組み合わせは、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞に優先的に結合するか、または優先的にその増殖もしくは活性化を調節する。
【００１６】
望ましい態様では、抗体または抗体の組み合わせは、インバリアントＴ細胞に優先的に結合する。別の望ましい態様では、抗体または抗体の組み合わせと結合しているＮＫ Ｔ細胞は、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、インバリアントＴ細胞、ＣＤ１ｄ反応性非インバリアントＴ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞である。さらに別の望ましい態様では、抗体または抗体の組み合わせは、ＴＣＲの抗原結合部位に優先的に結合する。望ましくは、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞はインバリアントＴ細胞である。望ましくは、ＴＣＲのＣＤＲ３ループ、α−β接合、または抗原結合部位は、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞上で発現されている。さらに別の望ましい態様では、抗体もしくは抗体の組み合わせは、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞上に発現されたＴＣＲのＣＤＲ３ループ、抗原結合部位、またはα−β接合に優先的に結合し、また抗体もしくは抗体の組み合わせは、結合しているＴ細胞の増殖もしくは活性化を優先的に調節する。望ましくは、抗体または抗体の組み合わせに結合するＴＣＲを発現するＴ細胞は、抗体の存在下で増殖される。別の望ましい態様では、Ｔ細胞上に発現されたＴＣＲのＣＤＲ３ループ、α−β接合、または抗原結合部位の結合は、Ｔ細胞、ＣＤＲ３ループ、α−β接合、もしくは抗原結合部位を定量するのに十分な量である。望ましい態様では、二次抗体を用いて、本発明の抗体と結合する異なるＴ細胞亜集団を区別する。一つの態様では、このような抗体は二機能性の抗体である。一つの態様では、このような抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。望ましい態様では、このような抗体は毒素、治療的に活性のある化合物、酵素、サイトカイン、放射標識、蛍光標識、磁気標識、または親和性タグに共有結合している。望ましい抗体には、マウス以外の哺乳類（ヒトなど）にみられる定常領域がある。望ましくは、このような抗体はヒト化されている。
【００１７】
関連する局面では、本発明は、ＴＣＲのＣＤＲ３ループもしくはα−β接合に優先的に結合するか、あるいはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団に優先的に結合するか、もしくはその増殖もしくは活性化を調節する抗体の断片または誘導体を提供する。望ましい断片には、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ’）２断片などがある。
【００１８】
別の局面では、本発明は、（ａ）本発明の抗体もしくは同抗体の断片、および（ｂ）ＴＣＲを発現するＴ細胞に結合する二次抗体もしくは抗体断片、または本発明の抗体または断片に結合するＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、もしくはＪαＱ＋ Ｔ細胞に結合する二次抗体もしくは抗体断片を含む、二機能性の抗体を提供する。望ましくは、このような二次抗体も本発明の抗体である。別の態様では、このような二次抗体は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ１６１抗体、抗ＣＤ２８抗体、または抗ＣＤ９４抗体である。関連する局面では、本発明はＴＣＲのＣＤＲ３ループ、もしくはα−β接合に優先的に結合する二機能性抗体、またはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団に優先的に結合するか、またはその増殖もしくは活性化を調節する二機能性抗体を特徴とする。上記局面のさまざまな態様において、このような抗体は、二機能性の抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ１６１抗体、抗Ｖα２４抗体および抗ＣＤ１６１抗体；抗Ｖα２４抗体および抗ＣＤ９４抗体；抗Ｖβ１１抗体および抗ＣＤ１６１抗体；抗Ｖβ１１抗体および抗ＣＤ９４抗体；抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ９４抗体、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体；または抗Ｖα２４抗体および抗Ｖβ１１抗体である。特定の態様では、二機能性抗体はＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞を優先的に結合するか、該細胞を増殖させるか、または活性化する。
【００１９】
さらに別の局面では、本発明は、本発明の抗体を産生する安定なハイブリドーマを提供する。
【００２０】
本発明の抗体は、Ｔ細胞亜集団の精製に使用することもできる。したがって本発明は、精製されたＴ細胞亜集団も特徴とする。亜集団に含まれるＴ細胞は、本発明の抗体または抗体の組み合わせに特異的に結合する。望ましくは、このような抗体または抗体の組み合わせは、Ｔ細胞亜集団上に発現したＴＣＲのＣＤＲ３ループ、α−β接合、または抗原結合部位に特異的に結合する。望ましい態様では、亜集団に含まれるＴ細胞はＮＫ Ｔ細胞である。望ましいＮＫ Ｔ細胞にはＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、インバリアントＴ細胞、ＣＤ１ｄ反応性非インバリアントＴ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞などがある。別の望ましい態様では、このようなＴ細胞はＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞である。さらに別の望ましい態様では、このようなＴ細胞はＪαＱ＋ Ｔ細胞である。望ましくは、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞はインバリアントＴ細胞である。
【００２１】
本発明はまた、ＴＣＲのＣＤＲ３ループもしくはα−β接合に優先的に結合する本発明の抗体、またはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団に優先的に結合するか、または該Ｔ細胞亜集団の増殖もしくは活性化を調節する、本発明の抗体を作製する方法も提供する。このような方法の一つには、（ａ）環状ペプチドと担体を結合する段階、（ｂ）結合しているペプチドで動物を免疫化する段階、および（ｃ）ＴＣＲのＣＤＲ３ループもしくはα−β接合に優先的に結合する抗体、あるいはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団に優先的に結合するか、または該Ｔ細胞亜集団の増殖もしくは活性化を調節する抗体を単離する段階が含まれる。望ましくは、段階（ｂ）は繰り返し行う。別の望ましい態様では、動物はＣＤ１またはインバリアントＴ細胞を欠く哺乳類もしくは鳥類である。
【００２２】
関連する局面では、本発明は、本発明の抗体を作製する別の方法を提供する。この方法は、（ａ）動物（例えば哺乳類もしくは鳥類）をＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞で免疫化する段階、および（ｂ）ＴＣＲのＣＤＲ３ループもしくはα−β接合に優先的に結合する抗体、またはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団に優先的に結合するか、または該Ｔ細胞亜集団の増殖もしくは活性化を調節する抗体を単離する段階が含まれる。望ましくは段階（ａ）は繰り返し行う。一つの望ましい態様では、インバリアントＴ細胞は、ＣＤ１またはインバリアントＴ細胞を欠く動物に投与される。
【００２３】
別の関連する局面では、本発明は、本発明の抗体を作製する方法を特徴とする。この方法は、（ａ）環状ペプチドと担体を結合する段階、（ｂ）結合しているペプチドで動物（例えば哺乳類もしくは鳥類）を免疫化する段階、（ｃ）ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、もしくはＪαＱ＋ Ｔ細胞で動物を免疫化する段階、および（ｄ）ＴＣＲのＣＤＲ３ループもしくはα−β接合に優先的に結合する抗体、またはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団に優先的に結合するか、または該Ｔ細胞亜集団の増殖もしくは活性化を調節する抗体を単離する段階を含む。望ましくは段階（ｂ）または（ｃ）は繰り返し行う。一つの望ましい態様では、インバリアントＴ細胞は、ＣＤ１またはインバリアントＴ細胞を欠く動物に投与される。
【００２４】
さらに別の関連する局面では、本発明は、（ａ）ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞で動物（例えば哺乳類もしくは鳥類）を免疫化する段階、（ｂ）環状ペプチドと担体を結合する段階、および（ｃ）結合させたペプチドで動物を免疫化する段階、ならびに（ｄ）ＴＣＲのＣＤＲ３ループもしくはα−β接合に優先的に結合する抗体、またはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団に優先的に結合するか、または該Ｔ細胞亜集団の増殖もしくは活性化を調節する抗体を単離する段階による、本発明の抗体を作製する方法を提供する。望ましくは段階（ａ）または段階（ｃ）は繰り返し行う。一つの望ましい態様では、インバリアントＴ細胞は、ＣＤ１またはインバリアントＴ細胞を欠く動物に投与される。
【００２５】
抗体を作製する方法の望ましい態様では、動物（例えば哺乳類もしくは鳥類）は、ＣＤ１またはインバリアントＴ細胞を欠く動物、ＣＤ１ｄノックアウトマウス、インバリアントＴ細胞が除去された動物、ＴＣＲ−α鎖の一部を欠く動物、またはＴＣＲ−β鎖の一部を欠く動物である。他の望ましい態様では、このような動物は、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、ＪαＱ＋ Ｔ細胞、インバリアントＴ細胞、またはインバリアントＴＣＲに寛容である。別の望ましい態様では、このような動物は、Ｖα１４分子またはＪα２８１分子の全体または一部を欠く。ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞の量が低下したり、または欠いている別の動物が使用されることも意図される。
【００２６】
本発明の抗体、二機能性抗体、抗体の断片、および抗体の誘導体は、診断、画像化、および治療上のさまざまな応用性を有する。
【００２７】
このような一つの局面では、本発明はＮＫ ＴＣＲの量、または試料に含まれるＮＫ Ｔ細胞の量を、本発明の抗体もしくは抗体の組み合わせを試料に接触させることで測定する方法を提供する。望ましくは抗体もしくは抗体の組み合わせは、ＴＣＲのＣＤＲ３ループ、抗原結合部位、またはα−β接合に優先的に結合する。別の態様では、このような抗体は、同じＴ細胞上に発現したＣＤ３およびＣＤ１６１の両方に結合する二機能性抗体である。
【００２８】
関連する局面では、本発明は、ＣＤ１ｄ反応性ＴＣＲの量、または試料に含まれるＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞の量を測定する方法を特徴とする。この方法には、本発明の抗体または抗体の組み合わせを試料に接触させる段階が含まれる。望ましくは抗体または抗体の組み合わせは、ＴＣＲのＣＤＲ３ループ、α−β接合、または抗原結合部位に優先的に結合する。さまざまな態様では、このような抗体は二機能性の抗Ｖα２４抗体および抗ＣＤ１６１抗体；抗Ｖα２４抗体および抗ＣＤ９４抗体；抗Ｖβ１１抗体および抗ＣＤ１６１抗体；抗Ｖβ１１抗体および抗ＣＤ９４抗体；抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ９４抗体、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体；または抗Ｖα２４抗体および抗Ｖβ１１抗体である。
【００２９】
別の関連する局面では、本発明は、本発明の抗体または抗体の組み合わせを試料に接触させることで、ＪαＱ＋ ＴＣＲの量、または試料に含まれるＪαＱ＋ Ｔ細胞の量を測定する方法を特徴とする。一つの望ましい態様では、このような抗体はＴＣＲのＣＤＲ３ループ、抗原結合部位、またはα−β接合に優先的に結合する。
【００３０】
試料に含まれるＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞の量を測定する望ましい方法では、試料は、自己免疫疾患、ウイルス感染、細菌感染、 寄生虫感染、真核性病原体感染、アレルギー、喘息、炎症性症状、移植片対宿主病、移植拒絶、免疫不全症、自然流産、妊娠、および癌からなる群より選択される症状に対する治療法を検討する臨床試験に参加していたり、治療を受けている被験者に由来する。望ましくはＴＣＲまたはＴ細胞の量を基に、自己免疫疾患、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、真核性病原体感染、アレルギー、喘息、炎症性症状、移植片対宿主病、移植拒絶、免疫不全症、自然流産、妊娠、および癌からなる群より選択される症状の、治療または予防に対する望ましい治療法が決定される。以上の局面の別の望ましい態様では、ＴＣＲまたはＴ細胞の量を基に、自己免疫疾患、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、真核性病原体感染、アレルギー、喘息、炎症性症状、移植片対宿主病、移植拒絶、免疫不全症、妊娠、および癌からなる群より選択される症状からの回復または寛解、または同症状に対する任意の治療法の有効性の判断を行う。
【００３１】
別の局面では、本発明は、本発明の抗体または抗体の組み合わせを試料に接触させる段階段階を含む、試料に含まれるＮＫ ＴＣＲまたはＮＫ Ｔ細胞を視覚化する方法を提供する。望ましくは、このような抗体または抗体の組み合わせは、ＴＣＲのＣＤＲ３ループ、抗原結合部位、またはα−β接合に優先的に結合する。別の態様では、このような抗体は、同じＴ細胞上に発現するＣＤ３およびＣＤ１６１の両方に結合する二機能性抗体である。
【００３２】
関連する局面では、本発明は、本発明の抗体または抗体の組み合わせを試料に接触させることで、試料に含まれるＣＤ１ｄ反応性ＴＣＲまたはＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞を視覚化する方法を特徴とする。一つの望ましい態様では、このような抗体または抗体の組み合わせは、ＴＣＲのＣＤＲ３ループ、抗原結合部位、またはα−β接合に優先的に結合する。望ましくは、このような抗体または抗体の組み合わせは、ＴＣＲのＣＤＲ３ループ、α−β接合、または抗原結合部位に優先的に結合する。さまざまな態様において、このような抗体は二機能性の抗Ｖα２４抗体および抗ＣＤ１６１抗体；抗Ｖα２４抗体および抗ＣＤ９４抗体；抗Ｖβ１１抗体および抗ＣＤ１６１抗体；抗Ｖβ１１抗体および抗ＣＤ９４抗体；抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ９４抗体、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８；または抗Ｖα２４抗体および抗Ｖβ１１抗体である。
【００３３】
別の関連する局面では、本発明は、試料に含まれるＪαＱ＋ ＴＣＲまたはＪαＱ＋ Ｔ細胞を視覚化する方法を提供する。このような方法は、本発明の抗体または抗体の組み合わせを試料に接触させる段階を含む。望ましくは、このような抗体または抗体の組み合わせは、ＴＣＲのＣＤＲ３ループ、抗原結合部位、またはα−β接合に優先的に結合する。
【００３４】
試料に含まれるＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞を測定または視覚化する望ましい態様では、試料はトランスジェニック動物に由来するか、または剖検組織である。望ましくは、このような抗体は、蛍光標識、放射標識、または磁気標識（例えば磁気ビーズ）と共有結合している。
【００３５】
別の局面では、本発明は、自己免疫疾患、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、真核性病原体感染、アレルギー、喘息、炎症性症状、移植片対宿主病、移植拒絶、免疫不全症、自然流産、妊娠、および癌からなる群より選択される症状に関して、危険性のある被験者を同定する方法を提供する。この方法は、（ａ）被験者に由来する試料に含まれるＴ細胞亜集団の量を定量する段階、および（ｂ）試料に含まれるＴ細胞の量を、その症状であると診断された被験者、またはその症状でないと診断された被験者におけるＴ細胞の量と比較する段階を含む。望ましくは試料に含まれるＴ細胞の量は、その症状であると診断された被験者、およびその症状でないと診断された被験者の両方におけるＴ細胞の量と比較される。一つの望ましい態様では、この方法は、試料に含まれる別のＴ細胞種の量を、対象症状であると診断された被験者、または対象症状でないと診断された被験者における別のＴ細胞種の量と比較する段階をさらに含む。望ましくは試料に含まれる別のＴ細胞種の量は、対象症状であると診断された被験者、および対象症状でないと診断された被験者の両方にみられる別のＴ細胞種の量と比較される。さまざまな態様では、試料に含まれるＴ細胞亜集団の量は、Ｔ細胞のＣＤＲ３ループ、抗原結合部位、またはα−β接合に優先的に結合する抗体もしくは抗体の組み合わせ、またはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、もしくはＪαＱ＋ Ｔ細胞に優先的に結合する抗体もしくは抗体の組み合わせなどの、本発明の抗体もしくは抗体の組み合わせを試料に接触させることで決定される。
【００３６】
関連する局面では、本発明は、自己免疫疾患、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、真核性病原体感染、アレルギー、喘息、炎症性症状、移植片対宿主病、移植拒絶、免疫不全症、自然流産、妊娠、および癌からなる群より選択される、症状を有する被験者を診断する方法または病期を決定する（ｓｔａｇｉｎｇ）方法を提供する。この方法は、（ａ）被験者に由来する試料に含まれるＴ細胞亜集団の量を定量する段階、および（ｂ）試料に含まれるＴ細胞の量を、症状を有すると診断された被験者、または症状がないと診断された被験者におけるＴ細胞の量と比較する段階を含む。望ましくは試料に含まれるＴ細胞の量は、対象症状であると診断された被験者、および対象症状でないと診断された被験者の両方におけるＴ細胞の量と比較される。一つの望ましい態様では、この方法は、試料に含まれる別のＴ細胞種の量を、対象症状であると診断された被験者、または対象症状でないと診断された被験者における他のＴ細胞種の量と比較する段階をさらに含む。望ましくは試料に含まれる別のＴ細胞種の量は、対象症状であると診断された被験者、および対象症状でないと診断された被験者の両方にみられる別のＴ細胞種の量と比較される。さまざまな態様では、試料に含まれるＴ細胞亜集団の量は、Ｔ細胞のＣＤＲ３ループ、抗原結合部位、またはα−β接合に優先的に結合するか；あるいはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞に優先的に結合する、抗体もしくは抗体の組み合わせなどの、本発明の抗体もしくは抗体の組み合わせを試料に接触させることで決定される。
【００３７】
上記の任意の局面の望ましい態様では、対象試料は末梢血、リンパ液、腹水、臍帯血、尿、便、骨髄、胆汁、または生検試料である。他の血液試料または組織試料などの、哺乳類に由来する他の任意の試料が使用されうることも意図される。
【００３８】
別の局面では、本発明は、動物の自己免疫疾患、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、真核性病原体感染、アレルギー、喘息、炎症性症状、移植片対宿主病、移植拒絶、免疫不全症、自然流産、妊娠、または癌を治療または予防する方法を特徴とする。この方法は、本発明の抗体または抗体の組み合わせを動物に投与する段階を含む。望ましくは、このような抗体もしくは抗体の組み合わせは、動物の動脈内、病巣内、経口、筋肉内、静脈内、皮下、または腹腔内に投与される。別の望ましい態様では、このような抗体または抗体の組み合わせは、薬学的に適切な担体とともに投与される。一つの望ましい態様では、サイトカインも動物に投与される。別の望ましい態様では、このような抗体と協調して作用する細胞種または他の薬剤も動物に投与される。
【００３９】
さらに別の局面では、本発明は、本発明の抗体または抗体の組み合わせを動物に投与することで、動物におけるＴ細胞の病因を抑制する方法を提供する。このような抗体または抗体の組み合わせの投与は、抗体もしくは抗体の組み合わせが結合するＴＣＲを発現するＴ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞を十分抑制する。望ましくは、このような抗体もしくは抗体の組み合わせは、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、もしくはＪαＱ＋ Ｔ細胞のＴＣＲのＣＤＲ３ループ、抗原結合部位、もしくはα−β接合に優先的に結合する。別の望ましい態様では、このような抗体もしくは抗体の組み合わせは、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団の増殖または活性化を抑制する。別の望ましい態様では、このような抗体もしくは抗体の組み合わせは、毒素、放射標識、または細胞に対する宿主の防御過程もしくは異化過程を標的とする分子に共有結合する。望ましくは、このような抗体もしくは抗体の組み合わせは、経口、筋肉内、静脈内、動脈内、病巣内、皮下、腹腔内、またはＴ細胞を抑制するのに適切な用量を提供する他の任意の経路により、動物に投与される。別の望ましい態様では、このような抗体または抗体の組み合わせは薬学的に適切な担体とともに投与される。一つの望ましい態様では、１つまたは複数のサイトカインも動物に投与される。別の態様では、Ｔ細胞の病因は、肝炎感染、ピコルナウイルス感染、ポリオ感染、またはコクサッキー感染などの、ウイルス感染に対するＴ細胞の反応である。
【００４０】
別の局面では、本発明は、本発明の抗体または抗体の組み合わせを、Ｔ細胞を有する試料に接触させることで、Ｔ細胞亜集団のサイズを増大させる方法を提供する。
【００４１】
関連する局面では、本発明は、Ｔ細胞亜集団のサイズを増大させる方法を特徴とする。この方法は、（ａ）Ｔ細胞と抗体または抗体の組み合わせとの複合体の形成が可能な条件下で、本発明の抗体または抗体の組み合わせにＴ細胞を含む試料を接触させる段階、（ｂ）複合体を単離する段階、および（ｃ）接触によりＴ細胞数を増やすことが可能な条件下で、本発明の抗体もしくは抗体の組み合わせに、複合体中のＴ細胞、もしくは複合体から回収されたＴ細胞を接触させる段階を含む。
【００４２】
別の局面では、本発明は、Ｔ細胞亜集団のサイズを増大させる方法を提供する。この方法は、（ａ）Ｔ細胞と抗体もしくは抗体の組み合わせとの複合体の形成が可能な条件下で、本発明の抗体もしくは抗体の組み合わせに、Ｔ細胞を含む試料を接触させる段階、（ｂ）複合体を単離する段階、ならびに（ｃ）接触によりＴ細胞数を増やすことが可能な条件下で、抗原および抗原提示細胞に、複合体中のＴ細胞もしくは複合体から回収されたＴ細胞を接触させる段階を含む。望ましくは、このような抗原は、感染性病原体に由来するα−ガラクトシルセラミド、脂質、もしくはグリコシル−ホスファチジルイノシトール抗原、癌性細胞に由来する抗原、または内因性供給源もしくは非生理学的供給源に由来する、自己脂質もしくは他の任意の抗原である。
【００４３】
さらに別の局面では、本発明は、Ｔ細胞亜集団のサイズを増大させる方法を特徴とする。この方法は、（ａ）Ｔ細胞を含む試料に由来するＴ細胞を精製する段階、および（ｂ）接触によりＴ細胞数を増やすことが可能な条件下で、本発明の抗体または抗体の組み合わせに精製細胞を接触させる段階を含む。
【００４４】
Ｔ細胞亜集団のサイズを増大させる方法の望ましい態様では、上記の方法は、１つもしくは複数のサイトカイン、または抗体もしくは抗体の組み合わせと協調して作用する、他の細胞を試料または複合体に接触させる段階をさらに含む。
【００４５】
別の局面では、本発明は、動物のＴ細胞亜集団のサイズを増大させる方法を提供する。この方法は、（ａ）動物のＴ細胞を含む試料を得る段階、（ｂ）接触によりＴ細胞数を増やすことが可能な条件下で、本発明の抗体または抗体の組み合わせにＴ細胞を接触させる段階、および（ｃ）接触させたＴ細胞を動物に投与する段階を含む。
【００４６】
関連する局面では、本発明は、動物のＴ細胞亜集団のサイズを増大させる方法を提供する。この発明は、（ａ）動物由来のＴ細胞を含む試料を得る段階、（ｂ）Ｔ細胞を精製する段階、（ｃ）接触によりＴ細胞数を増やすことが可能な条件下で、本発明の抗体または抗体の組み合わせにＴ細胞を接触させる段階、および（ｄ）接触させたＴ細胞を動物に投与する段階を含む。望ましくはＴ細胞の精製は、本発明の抗体または抗体の組み合わせに試料を接触させる段階を含む。望ましい態様では、Ｔ細胞の精製は、抗Ｖα２４抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ１６１抗体、または抗Ｖβ１１抗体に試料を接触させる段階を含む。Ｔ細胞に結合する別の抗体または抗体の組み合わせを用いても、細胞を精製しうることも意図される。
【００４７】
さらに別の局面では、本発明は、動物のＴ細胞亜集団サイズを増大させる方法を提供する。この方法は、（ａ）動物のＴ細胞を含む試料を得る段階、（ｂ）Ｔ細胞と抗体との複合体が形成可能な条件下で、本発明の抗体または抗体の組み合わせをＴ細胞に接触させる段階、（ｃ）複合体を単離する段階、および（ｄ）接触によりＴ細胞数を増やすことが可能な条件下で、本発明の抗体もしくは抗体の組み合わせを、複合体中のＴ細胞、もしくは複合体から回収されたＴ細胞に接触させる段階、ならびに（ｅ）接触させたＴ細胞を動物に投与する段階を含む。
【００４８】
さらに別の局面では、本発明は、動物のＴ細胞亜集団のサイズを増大させる方法を特徴とする。この方法は、（ａ）動物からＴ細胞を含む試料を得る段階、（ｂ）Ｔ細胞と抗体もしくは抗体の組み合わせとの複合体の形成が可能な条件下で、本発明の抗体もしくは抗体の組み合わせをＴ細胞に接触させる段階、（ｃ）複合体を単離する段階、および（ｄ）接触によりＴ細胞数を増やすことが可能な条件下で、複合体中のＴ細胞、または複合体から回収されたＴ細胞を、抗原および抗原提示細胞に接触させる段階、ならびに（ｅ）接触させたＴ細胞を動物に投与する段階を含む。望ましくは、このような抗原は、感染性病原体に由来するα−ガラクトシルセラミド、脂質、もしくはグリコシル−ホスファチジルイノシトール抗原、癌性細胞に由来する抗原、または内因性供給源もしくは非生理学的供給源に由来する自己脂質もしくは他の任意の抗原である。
【００４９】
動物のＴ細胞亜集団のサイズを増大させる方法の望ましい態様では、この方法は、１つまたは複数のサイトカインを動物に投与する段階も含む。望ましくはサイトカインは、接触させたＴ細胞を動物に投与する前、投与中、または投与の後に動物に投与される。望ましい態様では、このようなサイトカインは、筋肉内、静脈内、動脈内、病巣内、皮下、またはＴ細胞の活性を調製するのに適切な用量を提供するのに十分な、他の任意の経路で投与される。望ましくは、１つまたは複数のサイトカインをこのような試料またはＴ細胞に接触させる。望ましくは以上の局面の方法は、動物の自己免疫疾患、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、真核性病原体感染、アレルギー、喘息、炎症性症状、移植片対宿主病、移植拒絶、免疫不全症、自然流産、妊娠、または癌の治療または予防に用いられる。
【００５０】
別の局面では、本発明は、本発明の抗体または抗体の組み合わせを試料に接触させることによって、Ｔ細胞亜集団を試料から精製する方法を提供する。
【００５１】
関連する局面では、本発明は、試料からＴ細胞亜集団を精製する方法を提供する。この方法は、（ａ）Ｔ細胞と抗体との複合体の形成が可能な条件下で、本発明の抗体もしくは抗体の組み合わせを試料に接触させる段階、ならびに（ｂ）複合体を単離する段階を含む。望ましくは、このような試料は、抗Ｖα２４抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ１６１抗体、または抗Ｖβ１１抗体にも接触させる。別の態様では、このような試料は、関連したＴ細胞サブセットに結合する他の任意の抗体に接触させる。望ましくは、このような方法は、Ｔ細胞を複合体から回収する段階も含む。一つの望ましい態様では、このような抗体は蛍光標識に共有結合され、複合体は複合体の蛍光シグナルを基に単離される。別の望ましい態様では、このような抗体は磁気標識に共有結合され、複合体は複合体の磁性を基に単離される。
【００５２】
本発明のあらゆる局面の望ましい態様では、試料、Ｔ細胞、もしくは複合体に接触させるサイトカイン、または動物に投与されるサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−α／β、ＩＦＮ−γ、およびＧＭ−ＣＳＦからなる群より選択される。他の任意のサイトカインまたはサイトカインの組み合わせを使用しうることも意図される。望ましくは、このようなサイトカインは、接触させたＴ細胞によってＴｈ１／Ｔｈ２／免疫偏向反応の比を変化させる。望ましくは被験者または動物はヒトである。他の望ましい望ましい動物には、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、およびシチメンチョウなどの、実験用または家畜用の哺乳類および鳥類などがある。望ましい態様では、本発明の方法に関連するウイルス感染は、肝炎感染、ピコルナウイルス感染、ポリオ感染、ＨＩＶ感染、またはコクサッキー感染である。別の態様では、自己免疫疾患は１型糖尿病である。
【００５３】
本発明の各方法の望ましい態様では、抗体または抗体の組み合わせはインバリアントＴ細胞に優先的に結合する。望ましくは、Ｔ細胞亜集団、Ｔ細胞、またはＴＣＲを発現するＴ細胞は、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞である。望ましいＮＫ Ｔ細胞は、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、インバリアントＴ細胞、ＣＤ１ｄ反応性非インバリアントＴ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞である。望ましいＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞またはＪαＱ＋ Ｔ細胞は、インバリアントＴ細胞である。望ましいＪαＱ＋ Ｔ細胞は、Ｖα２４＋ＪαＱ＋ Ｔ細胞である。望ましくは抗体もしくは抗体の組み合わせは、Ｔ細胞上に発現されたＴＣＲのＣＤＲ３ループ、抗原結合部位、またはα−β接合に優先的に結合し、あるいは結合症状のＴ細胞に結合したり、またはその増殖もしくは活性化を優先的に調節する。望ましくは、このような抗体もしくは抗体の組み合わせは、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より唯一選択される１つのＴ細胞亜集団のみに優先的に結合するか、またはその増殖もしくは活性化を調節する。望ましくは、本発明の抗体もしくは抗体の組み合わせに結合したＴＣＲのＣＤＲ３ループ、抗原結合部位、またはα−β接合は、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、ＪαＱ＋ Ｔ細胞、またはインバリアントＴ細胞で発現される。他の望ましい態様では、関心対象のＴ細胞亜集団（例えばＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、ＪαＱ＋ Ｔ細胞、またはインバリアントＴ細胞）に結合するか、またはその増殖または活性化を調節する抗体は、関心対象のＴ細胞亜集団のＴＣＲの抗原結合部位に優先的に結合する。本発明の任意の局面に関連するインバリアントＴ細胞が、ＣＤ１ｄ反応性ではない可能性があることも意図される。望ましい標識抗体には、ビオチン、ＦＩＴＣ、ＰＥ、または磁気ビーズに結合する抗体などがある。
【００５４】
本発明の各局面は、本発明の抗体、二機能性抗体、抗体の断片、および抗体の誘導体に等しく適用されると理解される。本発明の各局面は、ＴＣＲのＣＤＲ３ループまたはα−β接合に優先的に結合する抗体の組み合わせにも等しく適用される。さまざまな態様では、本発明の抗体の組み合わせに含まれる抗体は、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、もしくはＪαＱ＋ Ｔ細胞、またはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、もしくはＪαＱ＋ Ｔ細胞を含む試料に、同時にまたは連続的に接触させる。別の態様では、本発明の抗体の組み合わせに含まれる抗体は、疾患または症状を治療または予防するために、動物に同時にまたは連続的に投与される。
【００５５】
本発明の各局面は、任意の抗原感作に応じて、動物（例えばヒト、他の哺乳類、および鳥類）で生じる、任意の抗原特異的な、オリゴクローナン的に（ｏｌｉｇｏｃｌｏｎａｌｌｙ）増殖したＴ細胞亜集団にも適用される。このような抗原特異的なオリゴクローナン的に増殖したＴ細胞亜集団は、複数の個体に含まれる抗原の免疫優性な成分に反応して、オリゴクローナン的に増殖したＴ細胞を含む。
【００５６】
関心対象のＴ細胞に対する抗原の提示が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を必要としないことも重要である。例えば可溶性または固定化された状態の抗原提示分子を用いて、ＡＰＣの非存在下でＴ細胞の活性化または増殖が可能な条件下で、抗原をＴ細胞、または関心対象のＴ細胞を含む試料に提示することができる。
【００５７】
「ＣＤＲ３ループ」とは、ＴＣＲ−α鎖のＶセグメントとＪセグメント間における再編成により、またはＴＣＲ−β鎖のＶセグメント、Ｄセグメント、およびＪセグメント間における再編成により生じる、接合のアミノ酸を意味する。ＣＤＲ３ループの同定は、Ｖセグメントの末端に保存されたシステインを配置することで単純化することができる。このシステインに続く最初のアミノ酸が、ＣＤＲ３ループの最初の残基である。
【００５８】
ＣＤＲ３ループの配列は、関心対象のＴＣＲのアミノ酸配列と、他のＴＣＲの一つまたは複数の配列との配列アライメントを基に、容易に同定することができる。例えば多くのＴ細胞受容体のアミノ酸配列のアライメントを含むカバト（Ｋａｂａｔ）表を用いることで、関心対象のＴＣＲ−α鎖またはＴＣＲ−β鎖に含まれるＣＤＲ３ループを同定することができる（ＪｏｈｎｓｏｎおよびＷｕ、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ． ２９ （１）：２０５〜２０６、２００１；ｈｔｔｐ：／／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ）。ＣＤＲ３ループはまた、ＣＤＲ３ループがＸ線結晶構造を基に同定された、１つまたは複数のＴＣＲとの配列アライメントを基に同定することもできる（Ｒｅｉｎｈｅｒｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６ （５４４６）：１９１３〜１９２１、１９９９）。またＣＤＲ３ループは、関心対象のＴＣＲ鎖の３次元構造を決定することで同定することができる。
【００５９】
「ＴＣＲのＣＤＲ３ループ、抗原結合部位、またはα−β接合に優先的に結合する抗体」は、ＴＣＲのＣＤＲ３ループ、抗原結合部位、もしくはα−β接合を認識して結合する抗体、またはＴ細胞上に発現されたＴＣＲのＣＤＲ３ループ、抗原結合部位、もしくはα−β接合を認識して結合し、Ｔ細胞上で発現されたＴＣＲのＣＤＲ３ループ、抗原結合部位、もしくはα−β接合を認識して結合するが、試料（例えば他のタンパク質もしくは細胞を天然の状態で含む生物試料）に含まれる他の分子を実質的に認識せず結合しない抗体を意味する。Ｔ細胞上に発現されたＴＣＲのＣＤＲ３ループ、抗原結合部位、またはα−β接合に対する抗体の結合に関して、実施例１に記載されたＥＬＩＳＡアッセイ法におけるシグナルは、Ｔ細胞ではない対照細胞、またはアミノ酸配列の同一性が、抗体に優先的に結合するＣＤＲ３ループ、α−β接合、または抗原結合部位の対応配列に対して、９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、または２０％未満のＣＤＲ３ループ、α−β接合、および抗原結合部位をもつＴＣＲを発現するＴ細胞に対する結合に比べて、望ましくは少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、または５００倍大きい。ヒト化された抗体、または他の種の状態となった抗体は、標準的な手法で作製することができる。
【００６０】
望ましくは、抗体は「精製される」。これは抗体が、天然の状態で共存する他の成分から分離されることを意味する。典型的には、抗体は、天然の状態で共存するタンパク質、抗体、および天然有機分子を重量換算で少なくとも５０％含まない場合に実質的に純粋である。望ましくは抗体は少なくとも７５％、より望ましくは少なくとも９０％、また最も望ましくは少なくとも９９％が、重量換算で純粋である。ＴＣＲのＣＤＲ３ループ、α−β接合、もしくは抗原結合部位に優先的に結合する実質的に純粋な抗体は、例えば抗体を産生するように哺乳類を免疫化する本発明の方法により、抗体を分泌するハイブリドーマを構築することにより、抗体を化学的に合成することにより、または抗体を天然供給源から分離することによって得られる。純度は、抗体の単離に関して後述する、任意の適切な方法で調べることができる。
【００６１】
「ＴＣＲのα−β接合」とは、ＴＣＲのα鎖とβ鎖の境界を意味する。この境界は、α鎖とβ鎖の可変ドメイン間の非共有結合性の相互作用を含む。望ましくはα−β接合の３次元構造、もしくはα−β接合の３次元構造のモデルを用いて、哺乳類を免疫化してＴＣＲのα−β接合に対する抗体を産生させるためのポリペプチドもしくは小分子を設計する。ＴＣＲのα鎖とβ鎖間の境界の複数の３次元構造が既に報告されており、当業者はこれを基に、ＮＫ細胞、ＣＤ１ｄ反応性細胞、ＪαＱ＋ 細胞、またはインバリアントＴ細胞によって発現された、ＴＣＲのα鎖とβ鎖の境界をモデル化することができる。例えばα鎖とβ鎖の境界のモデル構造、または実際の構造を基に、３次元構造が境界の曝露された領域に似た小分子を設計することができる。また３次元構造がＴＣＲのα−β接合の一部または全体に似たポリペプチドを設計することができる。例えば関心対象のＴＣＲのモデル構造または実際の構造を用いて、設計されたポリペプチド（例えば約１００アミノ酸のポリペプチド）に後に似せることのできるＴＣＲのα−β接合のモデル構造または実際の構造が得られる。共有結合またはリンカーを、設計ポリペプチドのドメイン間に加えることで、１本鎖のポリペプチドを作製することができる。このようなモデル化の手順には、ＭｏｌＳｃｒｉｐｔなどの任意の標準的なモデル化プログラムを使用することができる。
【００６２】
同様に、以上の方法で、対象ＴＣＲのγ−δ接合に優先的に結合する抗体を作製することができる。
【００６３】
「ＴＣＲの抗原結合部位」は、抗原に結合するＴＣＲの領域を意味する。この領域は、ＴＣＲ可変領域の曝露表面の一部を含む。例えば、このような抗原結合部位は、α鎖のＣＤＲ３ループ、β鎖のＣＤＲ３ループ、ＣＤＲ１ループの予測可能な部分、ＣＤＲ２ループの予測可能な部分、およびある程度近傍の構造表面を含む。
【００６４】
望ましくは、抗原結合部位の３次元構造、もしくは抗原結合部位の３次元構造のモデルを用いて、哺乳類を免疫化するためのポリペプチドもしくは小分子を設計し、ＴＣＲの抗原結合部位に対する抗体を作製する。ＴＣＲの抗原結合部位の複数の３次元構造が（抗原の存在下または非存在下で）既に報告されており、当業者は、これを用いて、ＮＫ細胞、ＣＤ１ｄ反応性細胞、ＪαＱ＋ 細胞、またはインバリアントＴ細胞に発現されるＴＣＲの抗原結合部位をモデル化することができる。またＣＤ１ｄのモデル構造または実際の構造を用いて、他の成分がＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞と相互作用する機構を決定することができる。抗原結合部位のモデル構造、もしくは実際の構造を基に、小分子もしくはポリペプチドを、抗原結合部位の一部または全体に似た３次元構造をもつように設計することができる。例えば対象ＴＣＲのモデル構造または実際の構造を用いることで、ＴＣＲの抗原結合部位のモデル構造または実際の構造が得られる。これは後に、設計されたポリペプチド（例えば約１００アミノ酸のポリペプチド）に似せることができる。共有結合またはリンカーを、設計されたポリペプチドのドメイン間に加えることで１本鎖のポリペプチドが得られる。このようなモデル作製の手順には、ＭｏｌＳｃｒｉｐｔなどの任意の標準的なモデル化プログラムを使用することができる。
【００６５】
「インバリアントＴ細胞」とは、ＣＤ１ｄ反応性のインバリアントＴ細胞抗原受容体を有するＴ細胞を意味する。「ヒトＣＤ１ｄ反応性インバリアントＴ細胞抗原受容体」とは、ＣＤ１ｄを認識し、Ｎ領域の多様性がほとんどないか全くなくなる、Ｖα２４とＪαＱ間の再編成から生じる、α鎖を有するＴ細胞抗原受容体を意味する（Ｋｅｎｔら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６０：１０８０〜１０８９、１９９９）。マウスでは、インバリアントＴＣＲ−α鎖は、Ｎ領域の多様性がほとんどないか全くない、Ｖα１４とＪα２８１間の再編成で生じる。このような等価の再編成は、他の哺乳類（例えばラット）および鳥類で生じることがある。ヒトのインバリアントＴＣＲ−α鎖は、Ｖβ１１と優先的に対を形成するが、他のＶβと対を形成することができる。ヒトのＣＤ１ｄ反応性インバリアントＴ細胞抗原受容体はＣＤ１ｄを認識するが、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、またはＣＤ１ｃファミリーの分子とはそれほど関連性は強くない（Ｅｘｌｅｙら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６ （１）：１０９〜１２０、１９９７）．
【００６６】
「断片」とは、本発明の抗体の対応領域と同一な連続的なアミノ酸の領域を有するポリペプチドを意味する。断片は、本明細書に記載されたアッセイ法で決定すると、エキソビボまたはインビボでＴ細胞に結合し、それを活性化し、および／または増殖させることができる。望ましくは、増殖した細胞の数、活性、または純度は、本明細書に記載されたアッセイ法で測定すると、本発明の抗体の少なくとも２０％、４０％、６０％、８０％、または９０％である。望ましくは、このような断片とＴＣＲのＣＤＲ３ループ、α−β接合、または抗原結合部位との結合は、本発明の抗体との結合の少なくとも２０％、４０％、６０％、８０％、または９０％である。
【００６７】
「誘導体」とは、化学的に修飾されるか、または遺伝子融合もしくは化学合成により修飾された、毒素、治療的に活性のある化合物、酵素、サイトカイン、放射標識、蛍光標識、または親和性タグと共有結合される、本発明の抗体または断片を意味する。共有結合で連結された官能基を、抗体もしくは断片のアミノ末端、カルボキシ末端、アミノ末端とカルボキシ末端の間、またはアミノ酸の側鎖に結合させることができる。「親和性タグ」とは、別のペプチド、タンパク質、または化合物に結合するペプチド、タンパク質、または化合物を意味する。望ましい態様では、親和性タグは、誘導体の精製または固定化に使用される。別の望ましい態様では、親和性タグまたは毒素を用いて、抗体または断片を、インビボにおいて特定の細胞、組織、または器官系に標的化する。さらに別の望ましい態様では、蛍光標識または放射標識が誘導体の画像化に使用される。さらに別の望ましい態様では、治療的に活性のある化合物または放射標識が、疾患または障害の治療または予防に用いられる。別の態様では、本発明の抗体の誘導体または断片は、上記の抗体に比べて安定性を増強したり可溶性を上昇させる。本発明の抗体、断片、または誘導体が、毒素、治療的に活性のある化合物、酵素、サイトカイン、放射標識、蛍光標識、磁気標識、または親和性タグに共有結合で連結された別の抗体に、非共有結合的に結合されうることも意図される。
【００６８】
「ヒト化」とは、抗体のアミノ酸配列を変更して、ヒトに投与された場合に、抗体および／または免疫応答が、そのヒト化抗体に対してほとんど生じなくなるようにすることを意味する。ヒト以外の哺乳類の抗体を用いる場合は、本発明の抗体を、関心対象の種のフォーマットに変換することができる。
【００６９】
「二機能性抗体」とは、別の抗体、または抗体の別の断片に共有結合で連結された、抗体または抗体の断片を含む抗体を意味する。望ましくは抗体または断片の両方が、同じＴ細胞上に発現された異なるエピトープに結合する。望ましくは、二機能性抗体に含まれる少なくとも１つの抗体は、本発明の抗体である。望ましくは、このような抗体は、ＣＤ３、ＣＤ１６１、またはＣＤ３およびＣＤ１６１の両方に結合する。別の望ましい態様では、このような抗体は、Ｖα２４、ＣＤ９４、Ｖβ１１、および抗ＣＤ２８の１つまたは複数に結合する。
【００７０】
「環状ペプチド」とは、ＴＣＲのＣＤＲ３ループの領域に少なくとも６０％、望ましくは８０％、より望ましくは９０％、また最も望ましくは１００％が同一なアミノ酸配列を有する、非線形ペプチドを意味する。一つの望ましい態様では、このペプチドのアミノ酸配列は、ヒトインバリアントＴＣＲ−αのＣＤＲ３ループに由来する
2004501165.tif 000003
（配列番号：１）、または配列番号：１の少なくとも５個、８個、１０個、もしくは１５個の連続したアミノ酸領域を含む。別の望ましい態様では、このペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：１と同一である。このペプチドは、ペプチドもしくは残基の側鎖のＮ末端のアミノ酸と、Ｃ末端のカルボキシル基もしくは残基の側鎖との間に共有結合を形成することで環状化する。例えばペプチドラクタムは、Ｎ末端のアミノ基もしくはアミノ酸側鎖のアミノ基と、Ｃ末端のカルボキシル基もしくはアミドを含む側鎖（グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、またはアスパラギンなど）との間で環状化することで形成する。他の起こりうる環状化には、システイン側鎖に含まれるチオール基と、Ｎ末端のアミノ基、Ｃ末端のカルボキシル基、または別のアミノ酸の側鎖との反応による、チオエーテルの形成が含まれる。ジスルフィドが２個のシステイン残基の間に形成されることもある。インバリアントＴＣＲまたは別のＴＣＲのα鎖もしくはβ鎖の別のループ、または曝露表面の領域に少なくとも６０％、望ましくは８０％、より望ましくは９０％、また最も望ましくは１００％同一なアミノ酸配列を有するペプチドが、別のＴＣＲに対する抗体の作製に使用される場合がある。望ましいループには、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞のα鎖もしくはβ鎖のＣＤＲ３ループなどがある。
【００７１】
「ＣＤ１ｄまたはインバリアントＴ細胞を欠く哺乳類」とは、同じ種の他の哺乳類と比較したときに、機能性のＣＤ１ｄ分子、インバリアントＴ細胞、ＴＣＲ−α鎖、またはＴＣＲ−β鎖の量が減少しているか、または全く存在しない哺乳類を意味する。このような哺乳類の望ましい例には、ＣＤ１ｄノックアウトマウス（Ｓｏｎｏｄａら、１９９９、前掲）、インバリアントＴＣＲに寛容性のない哺乳類、インバリアントＴ細胞が除去された哺乳類、ＴＣＲ−α鎖の一部を欠く哺乳類（Ｃｕｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：１６２３、１９９７）、ＶＢ８分子の一部を欠く哺乳類、またはインバリアントＮＫ Ｔ細胞、もしくは関連する亜集団が、抗体、サイトカイン、もしくは反復性抗原性刺激によって除かれた動物などがある。
【００７２】
「免疫化する」とは、担体に結合させたペプチド、インバリアントＴ細胞のいずれか、または両方を標準的な手順で動物（例えば哺乳類もしくは鳥類）に投与する段階を意味する。望ましい投与経路には、腹腔内、筋肉内、皮内、および皮下への投与がある。投与の用量および頻度は、標準的な手順で決定することができる。
【００７３】
「抗体を単離する」とは、抗血清、腹水、またはハイブリドーマ上清から抗体を精製する段階を意味する。抗体は、当業者であれば、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第２巻、ｐ． １１．１３．１〜１１．１３．３、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９５）に記載された手法などの標準的な手法で精製することができる。抗体は、望ましくはポリアクリルアミド電気泳動、カラムクロマトグラフィー、光学密度、ＨＰＬＣ分析、またはウェスタン分析で測定して、混入タンパク質の減少を検出するか、またはＥＬＩＳＡで、特定のＴ細胞亜集団に関して対マーカー結合の比活性の上昇を検出すると、出発材料の少なくとも２倍、５倍、または１０倍純粋である。
【００７４】
「接触させる」とは、試料を抗体またはサイトカインとインキュベートする段階を意味する。このような抗体またはサイトカインは、可溶性の状態であっても固定化された状態であってもよい。一つの態様では、固定化された抗体もしくはサイトカインは、ビーズもしくはプレートと緊密に結合した状態であるか、または共有結合で連結されている。望ましい態様では、接触はエキソビボまたはインビボで生じる。
【００７５】
「測定する」とは、特定のＴ細胞亜集団に属する、試料中の細胞の割合（％）を決定する段階、または本明細書に記載されたように、特定のＴ細胞亜集団に属する、試料中の細胞数を決定する段階を意味する。望ましい態様では、このようなＴ細胞は、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞である。
【００７６】
「治療または予防する」とは、本発明の抗体、または抗体とインキュベートされたＴ細胞を、本明細書に記載されるように、哺乳類に投与する段階を意味する。
【００７７】
「Ｔ細胞の病因」とは、サイトカイン産生もしくは細胞毒性などの、Ｔ細胞の活性によって生じたり悪化される疾患または障害を意味する。
【００７８】
「自己免疫疾患」とは、自己エピトープに対して免疫系応答が生じる疾患を意味する。自己免疫疾患の例には、インスリン依存性糖尿病、慢性関節リウマチ、尋常性天疱瘡、多発性硬化症、および重症筋無力症などがある。
【００７９】
「Ｔ細胞亜集団のサイズを増大させる」とは、Ｔ細胞亜集団を抗体とインキュベートすることにより、またはＴ細胞亜集団を抗原および抗原提示細胞とインキュベートすることにより、細胞の増殖を促進する段階を意味する。望ましくは、インキュベーション後に存在する、亜集団に属するＴ細胞の数は、抗体または抗原および抗原提示細胞の非存在下で、対応する対照のインキュベーション後に存在する、これらの細胞数より、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７０倍、９０倍、１５０倍、または５００倍多い。より望ましくは、インキュベーション後に存在する、亜集団に属するＴ細胞の数は、０．１〜２ μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）の存在下における、対応するインキュベーション後に存在する細胞数より、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、または５０倍多い。Ｔ細胞の総数が増加した場合に、上記割合（％）が同じまま留まるが、関連するサブセットの実際の数が上昇しうることも意図される。望ましくは、Ｔ細胞亜集団に属する細胞の割合（％）の変化は、抗体とインキュベートされていない対照試料における、Ｔ細胞亜集団に属する細胞の割合（％）における、対応する変化より少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、または５０倍大きい。別の望ましい態様では、このようなＴ細胞は、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞である。
【００８０】
「ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ 細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団の増殖または活性化を優先的に調節する」とは、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞の増殖もしくは活性化を誘導する段階、または抑制する段階を意味する。このようなＴ細胞亜集団の増殖の誘導は、Ｔ細胞亜集団のサイズの拡大の判定に関して記載されたように、測定することができる。このようなＴ細胞亜集団の増殖の抑制は、抗体を含まない対象インキュベーションと比較される、本発明の抗体とのインキュベーション後における同亜集団に属するＴ細胞の数を比較することで決定することができる。望ましくは、抗体とのインキュベーション後に存在する、同亜集団に属するＴ細胞の数は、対応する対照のインキュベーション後に存在するＴ細胞数より２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、または１００倍少ない。このようなＴ細胞増殖の抑制は、Ｔ細胞の病因の予防または治療に有用な場合がある。Ｔ細胞亜集団の活性化の誘導もしくは抑制は、Ｔ細胞亜集団のサイトカイン産生もしくは細胞毒性を測定する標準的な手順で調べることができる。望ましくは、サイトカインの産生もしくは細胞毒性の上昇または低下は、抗体の非存在下でインキュベートした対照Ｔ細胞亜集団の活性の、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７０％、９０％、または１００％である。望ましくは、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのＴ細胞亜集団のサイズまたは活性の変化は、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞以外の細胞における、対応する変化より少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７０倍、９０倍、１５０倍、または５００倍大きい。望ましい態様では、このような抗体は、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞からなる群より選択される、唯一のＴ細胞亜集団に優先的に結合するか、またはその増殖もしくは活性化を調節する。
【００８１】
「抗Ｖα２４抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ１６１抗体、抗ＣＤ９４抗体、抗ＣＤ２８抗体、または抗Ｖβ１１抗体」とは、Ｖα２４分子、ＣＤ４分子、ＣＤ８分子、ＣＤ５６分子、ＣＤ１６１分子、ＣＤ９４分子、ＣＤ２８分子、もしくはＶβ１１分子、またはこれらの分子の１つを発現する細胞を認識して結合するが、他のタンパク質もしくは細胞を天然の状態で含む試料（例えば生物学的試料）に含まれる他の分子を実質的に認識せず結合しない抗体を意味する。
【００８２】
「Ｔ細胞を含む試料を得る」とは、哺乳類に由来するＴ細胞を有する試料を除去する段階、またはこのような細胞を有し、かつ哺乳類によって産生される試料を得る段階を意味する。望ましい態様では、このような試料は末梢血である。別の態様では、このような試料は尿、胆汁、または体組織などの体液である。別の態様では、このような試料は骨髄、または臍帯試料である。
【００８３】
「Ｔ細胞を精製する」とは、天然の状態で他の細胞を含む試料からＴ細胞を単離する段階を意味する。Ｔ細胞は、本発明の抗体、または抗Ｖα２４抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ１６１抗体、もしくは抗Ｖβ１１抗体を用いて標準的な手順で精製することができる。望ましい精製法には、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、免疫沈殿、免疫親和性クロマトグラフィー、磁気ビーズ免疫親和性精製、およびプレートに結合している抗体を用いる細胞パニングなどがある。望ましくは、精製されたＴ細胞は、精製したＴ細胞と、それが属するＴ細胞亜集団用のマーカーとの結合を検出する、ＥＬＩＳＡ分析またはＦＡＣＳ解析で測定されると、元の試料の少なくとも２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または９００倍純粋である。
【００８４】
「精製されたＴ細胞亜集団」とは、天然の状態で他の細胞を含む試料から単離される、実質的に純粋なＴ細胞亜集団を意味する。精製されたＴ細胞亜集団は、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞の少なくとも１つについて濃縮される。望ましくは、このようなＴ細胞亜集団は、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞のただ１つについて濃縮される。精製されたＴ細胞亜集団は、天然の状態で認められるＴ細胞亜集団の純度より純粋である。望ましくは、精製されたＴ細胞亜集団は、その数について少なくとも１％、５％、１５％、３０％、５０％、７５％、９０％、または９９％が、天然の状態で結合している細胞を含まない。通常、Ｔ細胞亜集団と結合するこのような他の細胞は、細胞表面細胞を発現しない点、リガンドと結合しない点、またはＴ細胞亜集団の活性をもたない点が、対象亜集団に属するＴ細胞とは異なる。
【００８５】
「複合体」とは、Ｔ細胞に対する抗体の結合により、試料からの複合体の単離または分離が十分可能となる抗体に結合しているＴ細胞を意味する。
【００８６】
「複合体から細胞を回収する」とは、標準的な手順でＴ細胞と抗体を分ける段階を意味する。
【００８７】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明によって明らかになる。
【００８８】
詳細な説明
本発明者らは、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）に対する抗体を産生させる方法を開発した（図１）。本発明はまた、Ｔ細胞もしくは特定のＴ細胞亜集団の数、および／または活性の影響を受ける疾患もしくは症状の診断、画像化、および治療の応用に有用なＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞のＴＣＲに対する精製抗体を提供する。このような疾患または症状の例には、自己免疫疾患、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、真核性病原体感染、アレルギー、喘息、炎症性症状、移植片対宿主病、移植拒絶、免疫不全症、自然流産、妊娠、および癌などがある。本発明の抗体を用いるエキソビボもしくはインビボにおけるＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞の増殖は、単独で、またはサイトカインもしくは腫瘍ワクチンなどの他の治療的薬剤の投与とあわせて実施することができる。
【００８９】
α−ＧａｌＣｅｒなどの抗原を使用するのではなく、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞の増殖に用いる抗ＣＤＲ３ループのモノクローナル抗体を使用することにより、自家ＡＰＣに対する要件が排除され、それらを変動性の潜在的な原因として除き、臨床試験の手順を大いに単純化できると考えられる。またモノクローナル抗体を使用することで、複数の細胞種に由来する非特異的なポリクローナルＴ細胞の増殖に対する、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞の特異的な増殖が可能になると考えられる。
【００９０】
Ｂリンパ球およびＴリンパ球のほぼすべての個々のクローンの抗原受容体は、固有のランダムな体細胞再編成の産物である。このような再編成は一卵性双生児でも起こり、相互に異なる数百万種の受容体が生じる。これとは対照的に、本発明で使用されるＣＤ１ｄ−選択的およびＣＤ１ｄ−反応性のインバリアントＴＣＲは、固有に普遍的な標的となる。インバリアントＴＣＲ−αのＣＤＲ３ループの配列は、すべての個体で同一なので、同領域を用いて、ヒトのインバリアントＴＣＲ−α鎖を認識する新しいモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を作製することができる。このモノクローナル抗体は、正常なドナーに由来するインバリアントＴ細胞をエキソビボで優先的に同定し、それを増殖させることができる。本発明のモノクローナル抗体を用いた、本発明者らによる細胞を増殖させる方法により、バルク培養物に含まれる細胞集団サイズが約＞１０８のインバリアントＴ細胞、および１０〜２０ ｍｌの末梢血を出発材料とする＞１０７の個々のクローンが得られる。わずか数万個のインバリアントＴ細胞が、マウスを対象に実施された細胞輸送実験で機能することが報告されている（Ｓｏｎｏｄａら、前掲）。したがって、ヒトの第１相臨床試験は、約１０６個の細胞から始め、１０９個の最大細胞量を標的とするような、用量増加群（ａ ｄｏｓｅ ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ ａｒｍ）を組み入れることができる。この範囲の細胞の注入は耐容性が優れていると予測されている。例えばドナーの白血球の注入では、顕著な副作用がない１０１０の桁の未精製細胞を日常的に用いる。
【００９１】
抗腫瘍効果に加えて、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞は、細胞内病原体に対するＴｈ１防御性の免疫応答に寄与する可能性がある。例えば本発明者らは、急性の細胞変性ウイルス（脳心筋炎ウイルス、ＥＭＣＶ−Ｄ）に対する免疫応答が、ＣＤ１ｄノックアウトマウスではみられないことを見出している（Ｅｘｌｅｙら、Ｊ． Ｌｅｕｋ Ｂｉｏｌ． ６９：７１３、２００１）。この結果は、本発明の抗体をウイルス、細菌、寄生虫、真菌、原虫、または他の真核性病原体を原因とする疾患を含む、感染症の予防または治療にも使用できることを示唆している。
【００９２】
ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞は、刺激条件に依存して、Ｔｈ１応答、Ｔｈ２応答、または免疫偏向反応を増強することができるため、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞の反応は、エキソビボで増殖させたＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞の注入前、注入中、もしくは注入後におけるサイトカインのインビボにおける投与か、あるいはサイトカインの存在下におけるエキソビボにおける細胞の増殖の実施のいずれかにより、または２つの方法を組み合わせることによって調節することができる。Ｔｈ１応答へＴ細胞を向けることが公知の、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、またはＩＬ−１８などのサイトカインを用いることで、癌、感染症、アレルギー、喘息、妊娠、および炎症の予防または治療における、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞の有効性が上昇すると予測されている。または、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−α／β、ＩＦＮ−γ、およびＧＭ−ＣＳＦなどの他の任意のサイトカインを用いて、Ｔｈ２応答が防御的に作用する自己免疫疾患および移植片対宿主病を予防または治療するために、Ｔ細胞をＴｈ２応答方向に偏向させることができる。または、このようなサイトカインを用いることで、Ｔ細胞をＴｈ１応答およびＴｈ２応答から離して、妊娠維持に寄与する可能性のある免疫偏向反応に偏向させることができる。免疫偏向反応には、免疫的に隔絶された部位における応答などの、持続的な免疫応答の抑制が含まれる。ＴＧＦ−βおよびＩＬ−１０は、免疫偏向反応に関与する可能性のあるサイトカインの例である（Ｓｏｎｏｄａら、前掲）。
【００９３】
エキソビボにおけるＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞の増殖における用途に加えて、本発明の抗体をヒトなどの哺乳類に投与して、自己免疫疾患、感染症、アレルギー、喘息、炎症性症状、移植片対宿主病、移植拒絶、免疫不全症、自然流産、妊娠、または癌の予防もしくは治療に用いるＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞の数を、インビボで増やすことができる。例えばインバリアントＮＫ Ｔ細胞などの特定のＴ細胞のレベルの低下は、前立腺癌、多発性硬化症、ＨＩＶ、および１型糖尿病の患者で確認されている（実施例９、１１、および１２）。または、Ｖα２４＋ＣＤ１６１＋ Ｔ細胞数の減少は黒色腫患者で過去に報告されている（Ｋａｗａｎｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９：５１０２、１９９９）。したがってインバリアントＮＫ Ｔ細胞の機能の喪失は、進行癌における一般的な結果となる可能性がある。または、サイトカイン産生または細胞毒性などの、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞に対する結合、およびその増殖または活性を抑制する抗体を用いて、哺乳類におけるＴ細胞の病因を抑制することができる。例えばアレルギーはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞のＴｈ２応答により生じたり悪化させる場合があるので、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞の増殖またはＴｈ２応答を抑制することは、上記症状の予防または治療に有用な場合がある。同様にＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞のＴｈ１応答を低下させることは、自己免疫疾患の改善、安定化、もしくは予防、または自然流産の予防につながる場合がある。肝炎ウイルスなどの感染源によって誘導されるＴｈ１応答も、以上の細胞を抑制することで極めて小さくなる可能性のある損傷を生じる場合がある。上記細胞を抑制する抗体の例には、一価の分子もしくはＦａｂ分子、または抗体が細胞に結合することで細胞を損なう毒素もしくは放射標識を結合させた抗体などがある。このような抗体は、細胞上に発現したＴＣＲに結合して、リガンドとＴＣＲとの結合を妨げることがある。
【００９４】
本発明の抗体は、画像化における応用にも使用できる。特に本発明の抗体を蛍光または放射標識に結合させることで、インビボにおける、または生検試料、血液、および他の身体材料、もしくは体液における、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞の視覚化に使用することができる。本発明の抗体は、上記試料からＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞を精製する際にも使用することができる。本発明の抗体は、インバリアントＴ細胞ではなく、骨髄や肝臓などの複数の部位においてインバリアントＴ細胞より豊富に存在する他のＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞にも結合可能である。細胞の約０．１％がインバリアントＴ細胞である末梢血試料から、インバリアントＴ細胞を精製する際に本発明の抗体を用いて、９０％〜９５％がインバリアントＴ細胞である細胞を単離することができる。より高い純度も、複数回の精製を行うことで、または１回の精製段階に複数の抗体を用いることで達成することができる。
【００９５】
さらに高い純度またはより多い細胞数は、抗原および抗原提示細胞（ＡＰＣ）をＴ細胞に接触させることでも達成することができる。関心対象のＴ細胞に対する任意の抗原（例えばタンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物、核酸、感染性物質、または小分子）を使用することができる。ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞に対して使用可能な抗原の例には、感染性病原体に由来する脂質またはグリコシル−ホスファチジルイノシトール抗原、およびα−ＧａｌＣｅｒなどがある。他の抗原には、クラスＩまたはクラスＩＩのＭＨＣ分子によって提示されるペプチド抗原およびタンパク質抗原などがある。
【００９６】
さらに抗原は、ＡＰＣの非存在下で関心対象のＴ細胞に提示させることができる。例えばリポソームに結合させた可溶性の抗原提示分子、または固定化された状態の抗原提示分子（例えばＣＤ１ｄ、クラスＩ ＭＨＣ、またはクラスＩＩ ＭＨＣ）を用いて、ＡＰＣの非存在下で関心対象のＴ細胞の活性化または増殖が可能な条件下で、抗原（例えば脂質もしくはペプチド）をＴ細胞または関心対象のＴ細胞を含む試料に提示させることができる。使用される抗原提示分子は天然分子の場合もあれば、化学的または遺伝学的に修飾された分子の場合もある。例えば、このような分子は、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ヘキサヒスチジン、またはＦｃ領域融合タンパク質などの融合タンパク質として発現させることができる。膜結合ドメイン、膜貫通ドメイン、または疎水性領域を含む融合タンパク質として発現される抗原提示分子を脂質分子と混合することで、融合タンパク質を含むリポソームもしくはミセルを形成させることができる。表面に抗原提示細胞を有するリポソームまたはミセルは、ＡＰＣが抗原をＴ細胞に提示する能力を模倣している。または抗原提示分子は、硬質表面または半硬質表面などの固相支持体上に固定化することができる。このような支持体は、膜、フィルター、チップ、スライド、ウエハー、ファイバー、磁気ビーズまたは非磁気ビーズ、ゲル、チュービング、ストリップ、プレート、ロッド、ポリマー、粒子、微粒子、およびキャピラリを含むがこれらに限定されない、任意の多孔性または非多孔性の水に不溶性の材料でありうる。望ましいならば、このような支持体には、タンパク質を結合させるためのウェル、トレンチ、ピン、チャンネル、および孔などの、さまざまな表面形状をもたせることができる。
【００９７】
溶液、固相支持体に固定化された状態、またはリポソームもしくはミセル含まれる、いずれかの状態の抗原提示分子は、同分子が抗原と結合できる条件下で、関心対象のＴ細胞亜集団に対する抗原に接触させることができる。次にこのような抗原を関心対象のＴ細胞に相互作用させて、Ｔ細胞の増殖および／または活性化を誘導することができる。ＡＰＣの非存在下で抗原によって、関心対象のＴ細胞を増殖させるかまたは活性化させる、これらの方法は、ＡＰＣなどの余分な細胞の存在が望ましくない場合がある臨床状況で、望ましい可能性がある。
【００９８】
フローサイトメトリーによるインバリアントＴ細胞の定量に本発明の抗体を用いることは、現行の方法に勝る多くの利点がある。現行の方法には、実施例６に記載されたように、それほど特異的でない抗体を用いるフローサイトメトリー、またはＴＣＲ−α鎖をコードするｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡを合成および増幅する段階、ならびに増幅したｃＤＮＡを、インバリアントＴ細胞クローンから作られたｃＤＮＡおよび対照Ｔ細胞クローンから作られたｃＤＮＡと比較する段階を含む、ＰＣＲを利用した方法のいずれかが含まれる。フローサイトメトリー法にはインバリアントＴ細胞の総数を決定できるという利点がある。これに対しＰＣＲを利用した方法では、試料に含まれるインバリアントＴ細胞の相対頻度しか決定できない。またフローサイトメトリーでは、インバリアントＴ細胞上でどのマーカーが発現されているかを決定することができる。フローサイトメトリー法はまた、約１日を要するＰＣＲ法に比べて単純かつ迅速な方法であり、約１時間で実施することが可能であり、分子生物学的技術における熟練を必要としない。したがって本発明の抗体を用いるフローサイトメトリー法は、臨床状況によってはさらに望ましい場合がある。同様の方法で、本発明の抗体を用いることで他のＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞を定量することもできる。
【００９９】
また本発明の抗体を、疾患を有する被験者、または疾患の危険性のある被験者の診断に用いることができる。実施例６、９、および１０に記載されたように、本発明の抗体を用いることで、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞の数を定量して、このような細胞を、サイトカイン産生および細胞毒性活性の測定用に単離することができる。このようなパラメータを、被験者と、症状を有する被験者、および／または症状がない被験者との間で比較することで、症状に対する危険性、症状の存在、重症度、病期、回復度、寛解を診断することができる。
【０１００】
以下の例は、本発明を説明するためのものである。これらは本発明をいかなる様式でも制限しないことを意味する。以下の実施例に記載された方法は、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、ＪαＱ＋ Ｔ細胞、および／またはインバリアントＴ細胞に適用されうると理解すべきである。
【０１０１】
実施例１：ヒトＮＫ Ｔ細胞の抗原受容体α鎖に対する抗体の作製
ヒトのすべてのインバリアントＴＣＲ＋ Ｔ細胞には、ＣＤＲ３ループ中に同じアミノ酸配列が存在するので、この領域を用いて抗ＣＤＲ３ループ抗体を作製するためのペプチドを設計することができる。マウスおよびヒトのＣＤＲ３ループの配列はほぼ同一（
2004501165.tif 000004
それぞれ配列番号：２および３）なので、ヒトＣＤＲ３ループ配列をもつペプチドをマウスに投与すると、マウスの免疫系により自己ペプチドとして認識され、そのため抗体産生を誘導しないと考えられる。
【０１０２】
このような潜在的な問題を克服するために、インバリアントＴＣＲ＋ Ｔ細胞をもたないＣＤ１ｄノックアウトマウス（Ｓｏｎｏｄａら、前掲）を、抗ＣＤＲ３ループ抗体を産生させるための宿主として用いた。このようなマウスはインバリアントＴＣＲ−α鎖をもたないので、異物としてヒトＣＤＲ３ループの配列を含むペプチドを認識することが可能であり、そのため、このようなエピトープに対する抗体を産生する。
【０１０３】
抗体およびハイブリドーマの産生には、ヒトのインバリアントＴＣＲ−α鎖のＣＤＲ３ループの一部に対応するアミノ酸配列をもつペプチド
2004501165.tif 000005
を使用した。このペプチドを、そのＮ末端のアミノ基とＣ末端のカルボキシル基を反応させることで環状化した。この環状ペプチドにキーホールリンペットヘモシニアン担体を結合させ、ＣＤ１ｄノックアウトマウスに標準的な手法で投与した。またウシ血清アルブミンに結合させた同ペプチドを、ブースター注射として投与した。次にインバリアントＴＣＲ＋ Ｔ細胞を数匹のマウスに投与して免疫系をさらに刺激した。このマウスから採取した血清を対象に、卵白アルブミンに結合させたペプチドに結合する抗体の有無について、標準的なＥＬＩＳＡアッセイ法で調べた。ハイブリドーマは、血清陽性マウスの脾臓から標準的な手法で作製した。ＥＬＩＳＡで陽性を示したハイブリドーマのウェルをさらにＦＡＣＳで調べ、Ｖα２４ＪαＱクローンに対する抗体の結合を陰性対照と比較した。Ｖα２４ＪαＱクローンには結合したが陰性対照には結合しなかった抗体を産生する細胞をクローン化し、標準的な手法で脾臓の免疫細胞と融合させた。対象ペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの集団を、次にＥＬＩＳＡアッセイ法で同定した。続いて、無処置のＮＫ Ｔ細胞上に発現されたインバリアントＴＣＲ−α鎖を認識するクローンを選択するスクリーニングでは、ハイブリドーマの反復クローニングを行い、インバリアントＴＣＲ−α鎖を発現する細胞には結合するが陰性対照には結合しない細胞をＦＡＣＳで調べ、ペプチドに対する特異的な結合の有無をＥＬＩＳＡで確認した。ハイブリドーマのクローンを分泌するこのような安定なモノクローナル抗体は、当業者によって、臨床試験レベルの質および量をもつモノクローナル抗体試薬の作製および精製に使用することができる。
【０１０４】
２つの抗体（３Ａ６および６Ｂ１１）が、ヒトのインバリアントＴ細胞を優先的に認識することが判明した（図２）。６Ｂ１１はＩｇＧ１であり、３Ａ６はＩｇＭである。６Ｂ１１が独占的にＶα２４モノクローナル抗体でないことを示すために、ＦＡＣＳで精製されたバルクＶα２４＋ Ｔ細胞をＰＨＡを用いて増幅した。この細胞を次にＶα２４、Ｖβ１１および６Ｂ１１の各モノクローナル抗体で分析した（図３）。得られた結果は、６Ｂ１１が、Ｖβ１１モノクローナル抗体に似て、Ｖα２４＋ Ｔ細胞の一部を認識することを示している。また複数のドナーを対象に単細胞選別を行い、６Ｂ１１＋ Ｔ細胞に由来するクローンを確立した。６Ｂ１１は、ＣＤ１ｄ＋標的と同じサイトカイン応答を誘導することも判明した。
【０１０５】
ＣＤＲ３ループに反応する抗体を産生させる上記の方法は、任意のＴＣＲを対象として実施することもできる。関心対象のＴＣＲ−α鎖またはＴＣＲ−β鎖のＣＤＲ３ループの配列は、他のＴＣＲ−α鎖もしくはＴＣＲ−β鎖との配列アライメントを基に、または関心対象のＴＣＲ−α鎖もしくはＴＣＲ−β鎖の３次元構造モデル化、もしくは実験的に決定された３次元構造を基に決定することができる（ＪｏｈｎｓｏｎおよびＷｕ、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ． ２９（１）：２０５〜２０６、２００１；ｈｔｔｐ：／／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ）。上述するように、このようなＣＤＲ３ループの配列を含む環状ペプチドを、ＣＤＲ３ループに反応する抗体を産生させるための抗原ペプチドとして使用することができる。この環状ペプチドは、動物（例えば実験動物または獣医学的な関心がもたれる動物）に１回または複数回投与することができる。抗体の産生をさらに促進するために、関心対象のＴ細胞を動物に投与することもできる。抗体の産生に使用可能な哺乳類の例にはマウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、およびウシなどがある。使用可能な鳥類の例にはニワトリやシチメンチョウなどがある。このような宿主動物は野生型動物でも、抗体が産生されるＴ細胞亜集団の量が減少した動物、またはこれを欠く動物でもよい。使用可能な他の動物には、天然の動物、遺伝的修飾を受けた動物、またはＴ細胞を欠く動物の場合がある。抗体を産生させることのできる他の任意の動物も、本発明の抗体を産生させる際に使用することができる。
【０１０６】
結果として得られた抗体を、抗体産生用の宿主動物として、同じ属もしくは種の他の動物を対象とした診断または臨床における応用に用いることができる。また本発明の抗体は、宿主動物として異なる属の動物を対象とした応用に使用することができる。例えばニワトリで産生された抗体を、他のニワトリもしくは他の鳥における疾患の治療または予防に使用することができる。
【０１０７】
特定の疾患もしくは症状の治療、予防、または診断用の抗体を作製するために、疾患もしくは症状に関連するＴ細胞亜集団のＣＤＲ３ループを使用することができる（例えば表１を参照）。例えば、疾患もしくは症状のない対照被験者における、対応するＴ細胞亜集団に対して、疾患もしくは症状を有する被験者において、上昇したレベルもしくは低下したレベルで存在するか、または活性が増大もしく減少したＴ細胞亜集団を用いて、本発明の抗体を作製することができる。あるいはＴ細胞を、疾患もしくは症状を有する被験者から採取した試料（生検試料など）から単離することができる。試料に含まれるＴ細胞亜集団の特性は、さまざまなＴ細胞マーカーに反応する抗体を用いたＦＡＣＳ解析、またはＴＣＲ−α鎖もしくはＴＣＲ−β鎖の配列決定などの標準的な手法で決定することができる。単離されたＴ細胞亜集団に由来するＣＤＲ３ループは、抗体の作製に使用することができる。このような抗体を、疾患または症状を有する被験者（Ｔ細胞亜集団を単離した元の被験者、ならびに同じ症状を有する他の被験者を含む）に投与して、関連するＴ細胞の数および／または活性をインビボで調節することができる。このような抗体を用いて、関連するＴ細胞をエキソビボで増殖させた後に、増殖させたＴ細胞を被験者に再投与することもできる。
【０１０８】
本発明の抗体を、任意の抗原感作に反応して動物（例えばヒト、他の哺乳類、および鳥類）の体内で遭遇する任意の抗原に特異的な、オリゴクローナン的に増殖したＴ細胞亜集団に対するように作製することもできる。このようなＴ細胞サブセットには、複数の個体における抗原の免疫優性成分に反応してオリゴクローナン的に増殖したＴ細胞が含まれる。例えば対象抗原を動物に投与して、投与によって生じるオリゴクローナン的に増殖したＴ細胞サブセットを単離して、本明細書に記載された抗体の作製に使用することができる。
【０１０９】
【表１】記載した疾患または症状が関与する臨床応用に用いる抗体の作製に使用可能なＴ細胞受容体
2004501165.tif 000006
【０１１０】
実施例２：モノクローナル抗体によるヒトインバリアントＴ細胞の単離および増殖
図４は、プレートに結合させた６Ｂ１１モノクローナル抗体を、インバリアントＴ細胞の選択的な増殖に使用できることを示す。このように、１５人の健康なドナーに由来する２０クローンおよび１５系列を上回る、６Ｂ１１を用いた分析では全体的に一貫した結果が得られた。すなわち１００％がＶα２４＋Ｖβ１１＋ＣＤ１６１＋であり、ＣＤ１ｄ反応性が高く、ＩＬ−４を多く産生し、またＩＦＮ−γを中程度に産生した（表２）。得られた結果から、このようなモノクローナル抗体に特異性があること、および臨床試験の状況次第では望ましくない場合がある自家ＡＰＣを必要としない、より限定的かつ単色の代替法として使用できることがさらにわかる。
【０１１１】
【表２】６Ｂ１１抗体によるＴ細胞系またはＴ細胞クローンの増殖後に、インバリアントＮＫ Ｔ細胞マーカーを発現し、サイトカインを産生する細胞の割合（％）
2004501165.tif 000007
【０１１２】
モノクローナル抗体６Ｂ１１＋は単独でも使用され（２ドナー、１０クローン）、または抗Ｖα２４抗体と対として（９ドナー、８７クローン）、追加的なインバリアントＴ細胞を単細胞選別でクローン化した。すべてのクローンは、インバリアントＣＤ１ｄ拘束Ｔ細胞であることが確認された。これらのクローンはいずれも、ＴＣＲ−α鎖の配列分析の結果、インバリアントＴＣＲ−α鎖も含んでいた。またすべてのクローンがＣＤ１ｄに拘束されていた（Ｅｘｌｅｙら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６：１０９、１９９７）。一部のドナーでは、６Ｂ１１＋ Ｔ細胞およびＣＤ３＋ Ｔ細胞の数は極めて少なかった。Ｔ細胞の精製に６Ｂ１１抗体のみが使用された２人のドナーには上記集団は認められなかった。ドナーの１人は、末梢血に０．０１％のＶα２４＋Ｖβ１１＋細胞を含んでいた。このドナーの６／６ Ｖα２４＋Ｖβ１１＋ＣＤ１ｄ拘束Ｔ細胞の産生は、６Ｂ１１に特異性があることを意味する。偶然に６／６ Ｖα２４＋Ｖβ１１＋のクローンとなる確率は（１０−４）６である。図６Ａ〜６Ｃに示すように、６Ｂ１１抗体は、ＣＤ１ｄ拘束Ｔ細胞系のＩＬ−４分泌も促進する。
【０１１３】
またＦＡＣＳ選別段階、または磁気ビーズを用いた免疫親和性精製段階のいずれかで６Ｂ１１抗体を使用してから、分裂促進因子の存在下で増殖させるとインバリアントＮＫ Ｔ細胞が単離された（例えば図８、９、１０Ａ〜１０Ｈ、および１１Ａ〜１１Ｆを参照）。ＰＢＭＣ中の約０．０５％のリンパ球がインバリアントＴ細胞であるＰＢＭＣを出発材料とすると、精製および増幅された細胞の約５〜３０％がインバリアントＴ細胞であった。
【０１１４】
６Ｂ１１抗体は、さまざまな人種および年齢群の１００人以上の被験者を含む、検討されたすべてのドナーに由来するインバリアントＮＫ Ｔ細胞のクローンおよび系列を認識した（例えば図８Ｂ〜８Ｉを参照）。この抗体は、癌と診断された被験者、および癌と診断されていない被験者を含む男女被験者におけるインバリアントＮＫ Ｔ細胞も認識した。以上の結果から、６Ｂ１１抗体がインバリアントＮＫ Ｔ細胞を認識する能力が、特定の患者集団に制限されないことがわかる。
【０１１５】
６Ｂ１１抗体が、インバリアントＮＫ Ｔ細胞を増殖させる能力は、α−ＧａｌＣｅｒをパルスした自家樹状細胞がもつ同能力と同等であった。比較目的で、「ＭｏＦｌｏ」で選別したＶα２４細胞を、α−ＧａｌＣｅｒをパルスした自家樹状細胞、６Ｂ１１モノクローナル抗体、または分裂促進因子（ＰＨＡ）で、ＩＬ−２の存在下で約４週間の増幅で増殖させた。図７Ａ〜７Ｃに示したように、６Ｂ１１抗体を用いたときのインバリアントＮＫ Ｔ細胞の増殖は、α−ＧａｌＣｅｒを用いて達成された増殖と同等であった。しかし６Ｂ１１抗体を用いたときの増殖では、ＡＰＣを必要としないという利点があった。
【０１１６】
実施例３：関心対象のＴ細胞の単離および増殖の例示的な方法
関心対象のＴ細胞亜集団の精製では、正および／または負の選択段階を行うことができる。正の選択段階に使用可能な抗体の例には６Ｂ１１抗体、３Ａ６抗体、抗Ｖα２４抗体、抗Ｖβ１１抗体、および抗ＣＤ１６１抗体などがある。
【０１１７】
関心対象のＴ細胞は、一部の望ましくないＴ細胞を除いたり、または試料に含まれる他の混入物を除いたりする負の選択段階で濃縮することができる。例えば抗ＣＤ８抗体、および／または抗ＣＤ４抗体を用いて、インバリアントＮＫ Ｔ細胞に関して試料を濃縮することができる。負の選択段階は、正の選択段階の前に、正の選択段階と同時に、または正の選択段階の後に実施することができる。
【０１１８】
正および／または負の選択段階は、Ｔ細胞増殖段階の前もしくは後に実施することができる。一つの可能な方法では、関心対象のＴ細胞を最初に精製した後に優先的に増殖させる。別の可能な方法では、増殖させたＴ細胞を高容量カラムを用いて精製する（例えば１０１０個に増殖させた癌患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からは、大規模なＭｉｌｔｅｎｙｉ（ミルテニ）または他のカラムを用いた精製段階後に、１０６個のインバリアントＮＫ Ｔ細胞が得られる）。
【０１１９】
可能な正の精製段階の例には以下のような段階がある。これらの方法は、関心対象の任意のＴ細胞亜集団に反応する本発明の抗体とともに使用することができる。
【０１２０】
例示的なＦＡＣＳの手順
ＰＢＭＣまたは他の組織供給源を自家血清を用いて４℃でブロックする。インバリアントＴ細胞に反応する抗体（例えば６Ｂ１１抗体または３Ａ６抗体）を、約１〜１０ μｇの抗体／１０７〜８のＰＢＭＣの比になるように添加し、４℃で２０分間インキュベートする。この方法で使用する抗体はＦＩＴＣまたはビオチンなどの結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）で直接標識することができるほか、抗体を二次抗体で間接的に標識することができる（例えば抗ＩｇＧ−Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅまたはストレプトアビジン−Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ）。異なるフルオロフォアで標識された１つまたは複数の他の抗体も添加することができる（図７Ａ〜７Ｃおよび９）。次に細胞および抗体の溶液をＰＢＳまたは他の任意の生理的緩衝液で洗浄し、未結合状態の抗体を除去する。
【０１２１】
望ましいならば、ＦＡＣＳ細胞選別装置の設定は、正の対照抗体（例えば一般的な抗Ｔ細胞抗体）、または陰性対照抗体のいずれかを用いて調節することができる。関心対象の試料は、高速ＦＡＣＳ選別装置（例えば「ＭｏＦｌｏ」ＦＡＣＳ選別装置）を用いることで、１時間あたり約１億個の細胞の速度で分析することができる。精製されたＴ細胞は、ＰＨＡ、抗ＣＤ３抗体、６Ｂ１１抗体、３Ａ６抗体、および／またはα−ＧａｌＣｅｒ抗原刺激ＣＤ３モノクローナル抗体などの分裂促進因子の存在下で、Ｔ細胞用培地［例えば緩衝液（例えばＨｅｐｅｓ）、グルタミン、および抗生物質（例えばゲンタマイシン）を添加したＲＰＭＩ−１６４０または等価の培地を溶媒とする１０％ ウシ胎児血清、またはヒト自家血清もしくはＡＢプール血清］中で増殖させることができる（Ｅｘｌｅｙら、１９９７および１９９８、前掲；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３９１：１７７、１９９８）。このような抗体は、溶液中に存在してもプレート状に結合した状態であってもよい。放射線を照射した自家フィーダーおよびＩＬ−２ （１０〜１００ Ｕ／ｍｌ）を直ちに添加することもでき、または増殖中の任意の時点で添加することができる。ＩＬ−７ （〜１〜１０ ｎｇ／ｍｌ）、および／またはＩＬ−１５ （〜１〜１０ ｎｇ／ｍｌ）は、インバリアントＮＫ Ｔ細胞の収量を増加させることができる（例えばＷｉｌｓｏｎら、１９９８、前掲；ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｌｉｅｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４７：６１〜７２、２０００）。デキサメタゾンまたは関連する選択的な免疫抑制剤（〜１ μＭ）は、典型的なＴ細胞の成長を抑制しつつインバリアントＮＫ Ｔ細胞の成長を優先的に促進することができる（例えばＭｉｌｎｅｒら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６３ （５）：２５２２〜２５２９、１９９９）。培地は、１週間に２回程度の頻度で新鮮な培地と交換する。増殖中または増殖後（例えば増殖開始てから２〜４週後）に、Ｔ細胞の表現型をＦＡＣＳで解析することができる。この分析は６Ｂ１１抗体、抗Ｖα２４抗体、抗Ｖβ１１抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８αβ抗体、または抗ＣＤ１６１抗体を染色することで実施可能である。
【０１２２】
磁気ビーズを用いる例示的な手順
ＰＢＭＣまたは他の組織供給源を、ＰＢＳまたは他の生理的緩衝液と４℃で混合することで、１〜１０％の自家血清でブロックする。インバリアントＴ細胞（例えば６Ｂ１１抗体または３Ａ６抗体）に反応する１つまたは複数の抗体を、約１〜１０ μｇのモノクローナル抗体／１０７〜８のＰＢＭＣの比になるように添加し、４℃で２０分間インキュベーションする。この方法に使用される抗体は、ＦＩＴＣもしくはビオチンなどの結合体で直接標識することができるほか、二次抗体（例えば抗ＩｇＧ−Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅまたはストレプトアビジン−Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ）で間接的に標識することができる。異なるフルオロフォアで標識した１つまたは複数の他の抗体も添加することができる（図７Ａ〜７Ｃおよび９）。次に細胞および抗体の溶液をＰＢＳまたは他の任意の生理的緩衝液で洗浄する。１０７〜８個のＰＢＭＣあたり１０〜１００ μｌのミルテニ ＭＡＣＳ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ＃４８４、またはＭＡＣＳ Ｓｔｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ ＃４８１／などの磁気ビーズ；１０７〜８個のＰＢＭＣあたり１０５〜７個のダイナル（Ｄｙｎａｌ）抗ＩｇＧ ＃Ｍ４５０ビーズを添加し、溶液を４℃で混合する。磁石を用いてビーズを単離した後に、製造業者の推奨（例えば製品番号１３０−０４２−２０１などのミルテニ ＭＳ型分離カラム、およびＭＡＣＳマルチスタンドまたはダイナルもしくは互換性のある磁石上のチューブ内のダイナルビーズ）にしたがって洗浄する。洗浄して精製した細胞を、マルチウェルにＴ細胞培地［緩衝液（例えばＨｅｐｅｓ）、グルタミン、および抗生物質（例えばゲンタマイシン）を添加したＲＰＭＩ−１６４０または等価の培地を溶媒とする１０％ ウシ胎児血清、またはヒト自家血清もしくはＡＢプール血清］とともにプレーティングする。この細胞は、ビーズに直接結合するモノクローナル抗体を用いて、または溶液中のモノクローナル抗体を用いて増殖させることができる。追加的に、もしくは代替的に上記細胞を、ＰＨＡなどの分裂促進因子、抗ＣＤ３抗体、６Ｂ１１抗体、３Ａ６抗体、またはα−ＧａｌＣｅｒ抗原刺激性ＣＤ３モノクローナル抗体などを添加した培地を用いて増殖させることができる。この抗体は、溶液に含まれる状態か、またはプレート、ビーズ、もしくは他の固相表面に結合した状態とすることができる。上述の通り、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、およびデキサメタゾンなどの他のさまざまな試薬は、産物の収率および／または純度を改善することができる。増殖後のＴ細胞の表現型は上述の手順で分析することができる。
【０１２３】
実施例４：インバリアントＴ細胞の磁気ビーズによる精製
図１０Ａ〜１７は、このような磁気ビーズを用いた精製法で、多数の精製インバリアントＴ細胞を調製可能なことを示す。具体的には６Ｂ１１抗体を、（１）親和性精製したヤギ抗マウスＩｇＧを表面に共有結合させたダイナル超常磁性ポリスチレンビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ−４５０ヤギ抗マウス ＩｇＧ、製品番号１１０．０５）、または（２）ヤギ 抗マウスＩｇＧを結合させたミルテニ ＭＡＣＳコロイド超常磁性マイクロビーズ（製品番号４８４−０２、ミルテニ・バイオテック）のいずれかに、製造業者の指示書（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ−４５０ヤギ抗マウスＩｇＧの添付文書；ＭＡＣＳヤギ抗マウスＩｇＧマイクロビーズの指示書）にしたがって結合させた。ＰＢＭＣ細胞は、６Ｂ１１−ダイナルまたは６Ｂ１１−ミルテニビーズを用いて精製することでインバリアントＴ細胞について濃縮した。次に精製細胞を、さまざまな条件で４〜８時間かけて増殖させた。例えば、このようなＴ細胞を、図１２〜１７に示すようにＰＨＡ、６Ｂ１１抗体、ＩＬ−５、ＩＬ−７、同種ＡＰＣ、および自家ＡＰＣの１つまたは複数の存在下で増殖させた。「ＰＢＭＣ」の列は増殖前に選別されなかったＰＢＭＣ細胞を示す。「ダイナル＠４０」の列は、増殖前に６Ｂ１１−ダイナルｂｅａｄｓで精製されたＰＢＭＣ細胞を示す。「ミルテニ＠２０」の列は、増殖前に６Ｂ１１−ミルテニビーズで選別されたＰＢＭＣ細胞を示す。
【０１２４】
図１２〜１７に記載された実験では、ＩＬ−７およびＩＬ−１５を添加するとインバリアントＴ細胞の収量が増加した。検討した濃度において、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、およびデキサメタゾンはインバリアントＴ細胞の純度を上昇させなかった。６Ｂ１１を用いた増殖後にα−ＧａｌＣｅｒを用いたときの増殖ではインバリアントＴ細胞の純度は改善しなかったが、インバリアントＴ細胞の数は増加した。制限性（６Ｂ１１＋ＣＤ１６１）または（ＣＤ３＋ＣＤ１６１）のいずれもインバリアントＮＫ Ｔ細胞の収量を増加させなかった（図１２〜１７）。
【０１２５】
インバリアントＴ細胞はビオチン化６Ｂ１１でも精製された。この手順では、フィコールで精製したＰＢＬを６Ｂ１１−ビオチンとインキュベートした。次に細胞を洗浄して未結合状態の抗体を除き、ミルテニ微粒子に結合させたストレプトアビジンとインキュベートした。６Ｂ１１＋細胞は製造業者の指示書にしたがって磁気ビーズ選択法で単離した。ＩＬ−２およびＩＬ−７を併用して６Ｂ１１抗体を用いることで計６系列が得られた。６系列のうち３系列が増殖し、表面の表現型はインバリアントＶα２４＋ ＣＤ１ｄ拘束Ｔ細胞と一致していた。この系列は、増殖後に７６％〜９９％がインバリアントとなった。純粋な系列のＦＡＣＳプロファイルを図１８に示す。インバリアントＴ細胞のクローニングおよび増殖が成功したことは、６Ｂ１１をＭＡＣＳ（商標）テクノロジーとあわせて用いることで、ＦＡＣＳを利用したクローニングプロトコルおよび放射線を照射したフィーダーを必要とすることなく、ＣＤ１ｄ拘束Ｔ細胞を血液から直接単離可能なことを意味する。
【０１２６】
実施例５：ＮＫ Ｔ細胞のＴｈ１／Ｔｈ２／免疫偏向反応の比を変化させるエキソビボまたはインビボにおけるサイトカイン療法
特定の理論に本発明を制限する意図はないが、一つの作業仮説は、高レベルのＩＬ−４（他の「Ｔｈ２」サイトカインを伴うと考えられる）を産生するＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞は、Ｔｈ２免疫応答へ偏向する一方、ＩＬ−４に比べて高レベルのＩＬ−１２（活性化されたＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞によりＡＰＣから誘導される）および／またはＩＦＮ−γ（Ｔ細胞そのものから産生される）が、腫瘍もしくは感染性病原体に対する免疫応答を誘導する（または少なくとも誘導性インバリアントＴ細胞のマーカーとなる）というものである。
【０１２７】
ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、もしくはＪαＱ＋ Ｔ細胞は、Ｔｈ１−様のＮＫ、またはリンフォカインで活性化されるキラー（ＬＡＫ）様のインバリアントＴ細胞の細胞毒性、ならびにインビボにおける抗腫瘍活性もしくは抗病原体活性を増大させると考えられるＩＦＮ−γ産生に偏向する可能性がある。この方法の実行可能性は、初期のＩＬ−４によるインバリアントＴ細胞の偏向が、ＩＬ−１２のエキソビボにおける増殖によって変化して、ＩＬ−４に対して著しく高いレベルのＩＦＮ−γを生じるという所見により示されるため、これはＴｈ１により偏向されたインバリアントＴ細胞を産生するための、有望で単純な方法となる（表３）。ＩＬ−１２による培養が、インバリアントＴ細胞のＩＦＮ−γの産生を増強し、またＮＫ／ＬＡＫ様の細胞毒性を有意に増強させることを示す確証的な結果が最近報告されている（ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｌｉｅｔら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９８：５５７〜６３、１９９９）。
【０１２８】
【表３】ＩＬ−１２とインキュベートしたインバリアントＮＫ Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生の促進
2004501165.tif 000008
ＣＤ１ｄ反応性Ｖα２４＋Ｖβ１１＋ Ｔ細胞系は、ＩＬ−１２の有無にかかわらず確立され、インバリアントＮＫ Ｔ細胞を特異的に刺激する限定的なプレート結合性抗ＣＤ３抗体および過剰なＣＤ１６１抗体で促進された。
【０１２９】
したがってインバリアントＴ細胞は、本発明の抗体とのエキソビボにおける増殖中に０．３ ｎＭのＩＬ−１２中で培養することでＴｈ１表現型に再極性化される（Ｅｘｌｅｙら、前掲（１９９８））。ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、および１型ＩＮＦは、ヒトＴ細胞のＴｈ１極性化を促進することも知られている。ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、もしくはＪαＱ＋ Ｔ細胞をＴｈ１応答、Ｔｈ２応答、または免疫偏向反応に向かって偏向させる可能性のある、他のサイトカインもしくはサイトカインの組み合わせには、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−α／β、ＩＦＮ−γ、およびＧＭ−ＣＳＦなどがある。Ｔｈ２応答は、自己免疫疾患の予防または治療に望ましい場合がある。または妊娠維持に関して、サイトカインを用いてＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞をＴｈ１応答もしくはＴｈ２応答ではなく免疫偏向反応に向けさせる偏向させることができる。増殖中にＴ細胞が産生するサイトカインに結合する抗ＩＬ−４抗体または抗ＩＬ−１２抗体も、上記のＴ細胞の免疫偏向またはＴｈ２応答に有利に作用する。このようなサイトカインは、Ｔ細胞が増殖する期間を通して存在したり、Ｔ細胞増殖の最後の数日間といったＴ細胞増殖の期間の一部に対してのみ存在する可能性がある。
【０１３０】
１つまたは複数の上記サイトカインの存在下における増殖後に、Ｔ細胞の機能をＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＦＮ−γの分泌に関して検討することができる。サイトカインの追加によるＣＤ１ｄ＋ （ＣＩＲ、ＣＤ１ｄ）、「ＮＫ」標的（ＪＹ、Ｋ５６２、７２１．２２１、およびＹＡＣ−１）、またはＬＡＫ標的に対する細胞側性の制御を決定することもできる（Ｅｘｌｅｙら、前掲 （１９９７）；Ｅｘｌｅｙら、前掲、（１９９８））。
【０１３１】
または１つまたは複数のサイトカインを、エキソビボで増殖させたＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、もしくはＪαＱ＋ Ｔ細胞の再導入前、再導入中、再導入後にインビボで患者に投与して、再導入細胞をＴｈ１応答、Ｔｈ２応答、もしくは免疫偏向反応に偏向させることができる。
【０１３２】
実施例６：疾患の治療法または予防法で誘導されたインバリアントＴ細胞の数または活性の変化の決定
本発明のモノクローナル抗体を高感度で特異的な方法に用いて、疾患の治療法または予防法が、インバリアントＴ細胞の数を増加させるか、および／またはインバリアントＴ細胞に優先的に結合したり、その機能を調節するか否かの判定を行うことができる。これとは対照的に、インビボにおけるＩＬ−１２抗癌療法がインバリアントに及ぼす作用を決定する従来の分析法が、インバリアントＴ細胞の増加が検出されてないＶβ１１モノクローナル抗体を併用する場合（ｎ＝１０）において、Ｖα２４モノクローナル抗体を使用する比較的感度の低いフローサイトメトリー法で実施されている（図５）。正常なドナーにおけるインバリアントＴ細胞の数が少なく、また進行癌タンパク質でみられる数がさらに少ないことを考えれば、後述する方法を用いることで、ＩＬ−１２療法、または他の治療法がインバリアントＴ細胞に及ぼす作用をより正確に決定することができる。累積用量がインバリアントＴ細胞に及ぼす作用は、このような分析を各投与後に行うことで決定することができる。
【０１３３】
患者は、上記実験において自身の対照となることができる。約２０ ｍｌの末梢血を、治療開始前と治療中に患者から回収する。この細胞の少量のアリコート（約１０６個の細胞）を用いてＴＣＲ−α鎖をコードするｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡを合成し、またＶα２４プライマーおよびＣαプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行うことで、インバリアントＴＣＲ−α鎖を発現する細胞の出現頻度を決定することができる。集団全体におけるインバリアントＴＣＲの占める比率は、連続希釈したインバリアントＴ細胞クローンを対照Ｔ細胞クローンに較正することで決定することができる。
【０１３４】
上記のＰＣＲ分析に代わる方法として、フローサイトメトリーを用いて、インバリアントＴ細胞の出現頻度および数を決定することができる。特に癌患者でみられる数は少ないので、条件の最小数および分析回数（１００，０００回）の大きな数を各試料に使用する。標準的な方法でフルオレセインに良好に結合する抗ＣＤＲ３ループモノクローナル抗体６Ｂ１１、および／または３Ａ６を簡単な１色または２色のＦＡＣＳ解析に使用することができる。また本発明の１つまたは複数のモノクローナル抗体、および他のインバリアントＴ細胞マーカー（Ｖα２４、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１６１、Ｖβ１１）に対する抗体を用いたインバリアントＴＣＲ−α鎖の同時解析にはマルチカラーＦＡＣＳを用いることができる。治療前後の患者試料を対象に得られた上記結果を比較することで、治療がインバリアントＴ細胞数に及ぼす作用の有無を決定することができる。サイトカインの産生および活性化細胞による細胞毒性は、実施例５に記載した手順で実施することができる。上記の結果をインバリアントＴ細胞の数に対して補正することで治療前後の患者を直接比較することができる。
【０１３５】
または、定量に１回の増殖が必要な場合がある。患者の試料はモノクローナル抗体による増殖に直接使用することができるほか、増殖前に標準的な手順で高速ＦＡＣＳ選別、または磁気ビーズを用いた免疫親和性精製を行うことで、試料をインバリアントＴ細胞に関して濃縮することができる。ＦＡＣＳ選別による濃縮に関しては、抗Ｖα２４、６Ｂ１１、もしくは３Ａ６を用いた１色選別、または６Ｂ１１または３Ａ６、および抗Ｖα２４、Ｖβ１１、もしくはＣＤ１６１を用いた２色選別を実施することができる。あるいは免疫親和性精製による濃縮では、１つまたは複数の負または正の選択を実施することができる。例えばネガティブディプリーション（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）を用いて、単球および／またはＢ細胞を除去することができる。続いてＶα２４モノクローナル抗体、および／または抗ＣＤＲ３ループモノクローナル抗体を用いて正の選択を実施することができる。
【０１３６】
このような細胞は、プレートに結合させた抗ＣＤＲ３ループモノクローナル抗体（６Ｂ１１もしくは３Ａ６）、または可溶性の同抗体とともに培養することができるほか、抗原をパルスした自家ＡＰＣまたは同種ＡＰＣとともに培養することができる。Ｔ細胞の１回の増殖は、初期の割合を広く表すが、このような細胞を増殖前に約１週間かけて培養することで、休止細胞と比べて増殖に対してほとんど反応しないように活性化細胞を休止状態にすることができる。
【０１３７】
初期刺激から約３〜４週後に、細胞の一部をＶα２４、Ｖβ１１、および６Ｂ１１の各モノクローナル抗体を用いてフローサイトメトリーで解析し、インバリアントＴ細胞の占める比率を決定することができる。インバリアントＴ細胞数で補正したサイトカイン産生および細胞毒性は、治療前後の患者を対象に上述の通りに比較することができる。また初期刺激前の細胞を対象としたＰＣＲ分析またはＦＡＣＳ解析により、インバリアントＴ細胞の回収率（初期刺激後）の上昇が、エキソビボにおける刺激への反応の上昇に対する治療に起因する、インビボにおける増殖にどの程度影響するかを決定することができる。
【０１３８】
８〜１０人の患者（治療後の２つの時点の平均）を対象に実施されたこの分析では、治療がインバリアントＴ細胞の数を増加させることができるか、または同細胞の活性を調節可能か否かを適切に決定すべきである。インバリアントＴ細胞に対する正の作用が明らかにされれば、用量、スケジュール、および他の免疫機能にインバリアントＴ細胞の反応を相関させる調査を行うことができる。例えばインバリアントＴ細胞の数、および／または反応の変化は、血清ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、およびＩＬ−１５；ＩＬ−１２ならびに他のサイトカインおよびケモカイン受容体の発現；ならびにＴ細胞、骨髄系および他の細胞マーカー（Ｆａｓ、ＦａｓＬ、Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ−β、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＬＦＡ−１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１６１）の変化を含む重要な免疫パラメータに相関する場合がある。
【０１３９】
インバリアントＴ細胞の数または活性の変化をみる上記の方法は、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞にも適用することができる。このようなＴ細胞の定量に事前の濃縮段階が必要であれば、本発明の抗体を含むこのような細胞に結合する任意の抗体を初期精製段階に使用するか、または負の選択により、Ｔ細胞でない細胞、またはＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞でない細胞を除去することができる。
【０１４０】
実施例７：エキソビボで増殖させたインバリアントＴ細胞の増殖および哺乳類への再導入
哺乳類の末梢血試料（２０ ｍｌ、または白血球除去療法の産物に由来）に由来するインバリアントＴ細胞を、エキソビボにおける増殖前に、既に挙げた実施例で説明した通りにＦＡＣＳ選別または免疫親和性精製で濃縮することができるほか、本発明の抗体を用いて直接増殖させることができる。実施例５で説明したように、このような細胞をサイトカインの存在下で増殖させることで、Ｔｈ１応答、Ｔｈ２応答、または免疫偏向反応に向かって偏向させることができる。またＩＬ−２、ＩＬ−７、または分裂促進因子を添加して細胞増殖を促進することができる。必要であれば、おそらく２回目の濃縮段階後における２回目のエキソビボ増殖を、初期増殖に用いられる条件で実施して、細胞の数および純度の両方を上昇させることができる。刺激後に、このような細胞を対象に、純度ならびにサイトカイン産生および細胞毒性を上述の通りに調べることができる。複数回の刺激により、正常なドナーに由来する、長期のヒトインバリアントＴ細胞の系列およびクローンを確立可能であり、そのために同様の結果が他の患者で予測されることに留意する必要がある。望ましくは少なくとも１０６個、より望ましくは少なくとも１０８個、また最も望ましくは少なくとも１０９個のインバリアントＴ細胞が増殖後に得られる。望ましくはインバリアントＴ細胞は、Ｖα２４、Ｖβ１１、およびＣＤ１６１といったインバリアントＴ細胞マーカーの存在に基づき、少なくとも６０％、８０％、または９０％純粋であり、ＩＦＮγおよびＣＤ１ｄ＋および「ＮＫ」標的に対する細胞毒性の産生を維持している。
【０１４１】
２回目の刺激で適切な細胞数が得られない場合は、追加の刺激を行うことがある。あるいは大量の血液試料を用いることで、または白血球除去療法により最初の細胞数を増加させることができる。この場合、インバリアントＴ細胞の初回濃縮は、上述の通りにビーズに結合させたＶα２４または６Ｂ１１モノクローナル抗体を用いた正の選択で実施することができる。純度を高めるために、インバリアントＴ細胞を再注入する前にＦＡＣＳまたはビーズに結合させた抗体を用いて精製することもできる。また増殖させたポリクローナルのインバリアントＴ細胞系の細胞再注入による治療上の可能性を、増殖させたインバリアントＴ細胞のクローン、またはそのプールと比較することができる。
【０１４２】
エキソビボで増殖させたインバリアントＴ細胞の投与が、特定の投与様式、用量、もしくは投与の頻度に制限されることは意図されず、現行の様式は、自己免疫疾患、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、真核性病原体感染、アレルギー、喘息、炎症性症状、宿主対移殖片疾患、自然流産、妊娠、または癌の予防もしくは治療に適切な用量を十分もたらす筋肉内、静脈内、動脈内、病巣内、皮下、または他の任意の経路を含むすべての投与様式を対象とする。望ましくは、このような細胞は、血液試料を採取した哺乳類に再注入される。この細胞が異なる哺乳類に投与されることも意図される。このような細胞は、単回または複数回、哺乳類に投与することもできる。複数回の投与を行うときは、例えば１週〜１か月に用量を分けることができる。実施例５で説明したように、１つまたは複数のサイトカインを、細胞の投与前、投与中、投与後に投与して、Ｔｈ１応答、Ｔｈ２応答、または免疫偏向反応に向かって偏向させることもできる。任意の特定の被験者については、特定の投与方法が、組成物の投与の施行もしくは管理を行う者の必要性および専門家の判断にしたがって時間的に調節されることが重要である。またＴ細胞を、適用に応じて休止細胞または活性化細胞として再注入することができる。休止細胞はインビボにおける活性化を必要とする場合がある。
【０１４３】
実施例８：エキソビボで増殖させたＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞の増殖および哺乳類への再注入
他のＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞を、実施例７に説明された手順でエキソビボで増殖させることができる。この方法は、骨髄、肝臓、臍帯、または他の試料に由来するＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞を増殖させることで改変することができる。望ましくは試料は、末梢血と比べて多くの割合を占めるＣＤ１ｄ反応性非インバリアントＴ細胞を含む。また、（ＣＤ１ｄ、脂質、他の抗原、もしくは抗体を用いる）共刺激、または共刺激の抑制を用いて所望のＴ細胞亜集団を増殖させることができる。例えばＣＤ２８の刺激は、インバリアントＴ細胞よりＣＤ１ｄ反応性非インバリアントＴ細胞の増殖に望ましい。ＣＤ１６１による刺激をブロックする可溶性の抗ＣＤ１６１抗体も、インバリアントＴ細胞と比べてＣＤ１６１による刺激にそれほど依存しない非インバリアントＴ細胞の増殖に望ましい。プレートに結合させた抗体の量は、Ｔ細胞の増殖に対する共刺激への依存性を増大させるように減少させることもできる。
【０１４４】
また、異なるサイトカイン、またはサイトカインの組み合わせを存在させることで、所望のＴ細胞亜集団の増殖に有利な条件とすることができる。例えばＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞の増殖中にＩＬ−４、ＩＬ−７、またはＩＬ−１２とインキュベートすることができる。
【０１４５】
増殖させたＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞は、実施例７に記載した手順で哺乳類に再注入することができる。
【０１４６】
実施例９：癌患者におけるインバリアントＮＫ Ｔ細胞数の減少
詳しく後述するように、前立腺癌患者では健康な患者と比べてインバリアントＮＫ Ｔ細胞が少ない。したがって、インバリアントＮＫ Ｔ細胞の数もしくは活性を上昇させる本発明の抗体は、前立腺癌の予防、安定化、または治療する方法として使用することができる。またエキソビボで増殖させたインバリアントＮＫ Ｔ細胞を被験者に投与して、前立腺癌を予防、安定化、または治療することができる。インバリアントＮＫ Ｔ細胞は他の癌患者でも低レベルで存在する。したがって、この方法を用いて他の種類の癌を治療することができる。
【０１４７】
本試験で分析された癌患者
本試験の対象癌患者は、アンドロゲン非依存性の進行性前立腺癌患者であった（Ｃａｔａｌｏｎａ、Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３１：９９６、１９９４；ＢｕｂｌｅｙおよびＢａｌｋ、Ｈｅｍａｔｏｌ． Ｏｎｃｏｌ． Ｃｌｉｎ． Ｎｏｒｔｈ Ａｍ． １０：７１３、１９９６）。すべての患者は、過去に睾丸摘出術によるアンドロゲン除去療法、または黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニストの投与による治療を受けていた。試験時点において、すべての患者は骨髄スキャンの結果が陽性で、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のレベルが高く（＞５０ ｎｇ／ｍｌ）、進行性の転移性癌を意味していた。１人を除く患者全員が細胞傷害性の化学療法を受けていなかった。寛解期にある前立腺癌患者は、アンドロゲン除去療法で同様に治療されたが骨スキャンの結果は陰性で、ＰＳＡのレベルは安定かつ低値であった（＜１０ ｎｇ／ｍｌ）。
【０１４８】
Ｖα２４陽性Ｔ細胞のエキソビボにおける増殖に用いられる方法
試験参加に同意した健康なドナーおよび前立腺癌患者の末梢血（１０〜２０ ｍｌ）をヘパリンを含むチューブに採取した。ＰＢＭＣはＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて単離した。Ｖα２４陽性Ｔ細胞を抗Ｖα２４モノクローナル抗体（Ｃ１５）（Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｍｉａｍｉ、ＦＬ）で染色後に、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ） ＦＩＴＣ結合体（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で染色し、高速ＦＡＣＳ （Ｍｏｄｕｌａｒ Ｆｌｏｗ ＦＡＣＳ、Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）で選別した（Ｄｅｌｌａｂｏｎａら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８０：１１７１、１９９４）。自家ＰＢＭＣに放射線を照射し（５０００ ｒａｄｓ）、ＡＰＣとして使用した。ＦＡＣＳで精製したＶα２４＋細胞を最初に９６ウェル平底プレート（１ウェルあたり約２０，０００個）内で、放射線を照射した同数の自家ＰＢＭＣと、α−ＧａｌＣｅｒ （５０ ｎｇ／ｍｌ、ＫＲＮ７０００、Ｋｉｒｉｎ Ｂｒｅｗｅｒｙ Ｃｏ．、Ｇｕｎｍａ、Ｊａｐａｎ）、および組換え型ＩＬ−２ （１００ Ｕ／ｍｌ）（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）の存在下で共培養した。次に培養物を２４ウェルプレート中に移して、同じ培地を用いて徐々に増殖させた。一部の培養物には、ヒト組換え型ＩＬ−１２ （１ ｎｇ／ｍｌ）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を培養の最終週に添加した。
【０１４９】
増殖させたＴ細胞のフローサイトメトリー解析に用いられる方法
α−ＧａｌＣｅｒで増殖させた細胞の表現型解析を、培養を開始してから３〜４週後に２色または３色のフローサイトメトリーで実施した。Ｖα２４およびＶβ１１がバルクＴ細胞によって極めてまれにしか使用されないことから、過去の報告でＶα２４およびＶβ１１に対する二重染色がインバリアントＮＫ Ｔ細胞のマーカーとなることが明らかにされている（Ｄｅｌｌａｂｏｎａら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８０：１１７１、１９９４；Ｅｘｌｅｙら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６：１０９、１９９７；ＰｒｕｓｓｉｎおよびＦｏｓｔｅｒ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５９：５８６２、１９９７）。抗体は、抗Ｖα２４ ＰＥ抗体、抗Ｖβ１１ ＦＩＴＣ抗体、抗ＣＤ８β ＰＥ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）、抗ＣＤ３ Ｃｙｃｈｒｏｍｅ抗体、抗ＣＤ１６１ ＰＥ抗体、および抗ＣＤ４ Ｃｙｃｈｒｏｍｅ抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用した。文献に記載されているように（Ｅｘｌｅｙら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６：１０９、１９９７；Ｅｘｌｅｙら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８８：８６７、１９９８）、約１×１０６個の細胞を９６ウェルプレートの１ウェルあたり５０ μｌのＦＡＣＳ緩衝液（リン酸緩衝液食塩水＋１％ ウシ胎児血清および０．１％ ＮａＮ３）に懸濁した（Ｅｘｌｅｙら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６：１０９、１９９７；Ｅｘｌｅｙら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８８：８６７、１９９８）。非特異的な抗体結合は、細胞を１０％ ヒト血清と共に１５分間氷上でプレインキュベートすることでブロックした。次に抗体を細胞懸濁物に添加し、２０分間氷上でインキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳｃａｎ （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェアを用いて分析を行った。
【０１５０】
健康なドナーおよび癌患者から単離直後のＰＢＭＣに含まれるインバリアントＮＫ Ｔ細胞の分析でも、６Ｂ１１モノクローナル抗体を使用した。この実験では、細胞を６Ｂ１１−ＦＩＴＣおよび抗Ｖα２４−ＰＥ（交差競合しない）で染色し、インバリアントＴＣＲを発現するＴ細胞を検出した。癌患者ではこのような細胞の出現頻度は低いため、総細胞数１０５〜１０６を分析した。
【０１５１】
癌患者におけるインバリアントＮＫ Ｔ細胞数の減少を示す結果
健康なドナーおよび癌患者の末梢血に含まれるインバリアントＮＫ Ｔ細胞を、インバリアントＶα２４−ＪαＱ ＴＣＲに対する、Ｖα２４モノクローナル抗体およびＶβ１１モノクローナル抗体、または６Ｂ１１モノクローナル抗体を用いた２色フローサイトメトリーで定量した。健康なドナーのＶα２４＋ Ｔ細胞をα−ＧａｌＣｅｒで増殖させて得られたインバリアントＮＫ Ｔ細胞系は、Ｖα２４、Ｖβ１１、および６Ｂ１１の各モノクローナル抗体に反応した（図１９Ａおよび１９Ｄ）。Ｖβ１１が、この健康なドナー、また他の複数の健康なドナーに由来する、すべてのα−ＧａｌＣｅｒ増殖Ｖα２４＋ Ｔ細胞で本質的に発現されたという結果は、このＶβがα−ＧａｌＣｅｒ反応性インバリアントＮＫ Ｔ細胞の作製に必要であったことも意味している。
【０１５２】
Ｖα２４＋Ｖβ１１＋の二重陽性Ｔ細胞が健康なドナーの末梢血に認められた。その数はＶα２４＋６Ｂ１１＋細胞と同等であり、インバリアントＴ細胞ＮＫ Ｔ細胞であるＶα２４＋Ｖβ１１＋細胞の大半の比率に一致していた（図１９Ｂおよび１９Ｅ）。一連の健康なドナーにおけるＶα２４＋６Ｂ１１＋細胞の平均比率は０．１１％であった。少数のＶα２４＋Ｖβ１１＋ Ｔ細胞が、進行性前立腺癌患者の末梢血中に認められた（表４および５）。また調査対象の６人中５人の患者にはα２４＋Ｂ１１＋細胞は検出されなかった（図１９Ｃおよび１９Ｆ）。以上の結果から、インバリアントＮＫ Ｔ細胞が進行性前立腺癌の患者では少ないことが判明した。
【０１５３】
【表４】６Ｂ１１抗体および抗Ｖα２４抗体による染色に基づく、ＰＢＭＣに含まれるインバリアントＮＫ Ｔ細胞の数
2004501165.tif 000009
【０１５４】
【表５】Ｖα２４抗体、および抗Ｖβ１１または６Ｂ１１抗体による染色に基づく、インバリアントＴ細胞であるＶα２４＋細胞の割合（％）
2004501165.tif 000010
【０１５５】
健康なドナーに由来するインバリアントＮＫ Ｔ細胞の増殖の結果
末梢血に含まれるインバリアントＮＫ Ｔ細胞の数は少ないため、１回のエキソビボにおける増殖を行って、細胞の出現頻度および機能の評価をさらに行った。健康なドナーおよび進行性前立腺癌患者に由来するインバリアントＮＫ Ｔ細胞を、Ｖα２４に特異的なモノクローナル抗体を用いた初期ＦＡＣＳ精製と、それに続く、ＡＰＣの供給源としてのα−ＧａｌＣｅｒおよび放射線を照射した自家ＰＢＭＣを用いた３〜４週間に及ぶインビトロにおける選択的増殖によって末梢血から単離した。次にＴ細胞をＶα２４およびＶβ１１または６Ｂ１１の各モノクローナル抗体による二重染色で分析した。
【０１５６】
ＦＡＣＳで精製したＶα２４＋ Ｔ細胞を、Ｔ細胞分裂促進因子ＰＨＡによってインビトロで刺激したところ、異なるドナーでは数が変化するＶα２４＋Ｖβ１１＋ Ｔ細胞の小集団のみが得られた（図２０Ａ）。これとは対照的に、健康なドナーに由来する精製されたＶα２４＋ Ｔ細胞をα−ＧａｌＣｅｒおよび放射線を照射した自家ＰＢＭＣで刺激したところ、Ｖα２４＋Ｖβ１１＋の大集団が得られた（図２０Ｂ、全細胞の９４．４％）。一連の健康なドナーに由来する、α−ＧａｌＣｅｒで増殖させたＶα２４＋Ｖβ１１＋ Ｔ細胞の追加的な表現型分析で、主要なＣＤ４＋集団およびＣＤ４−ＣＤ８−集団の存在が明らかになり、各ドナーの大多数（＞７０％）でＣＤ１６１が発現されていることが判明した。
【０１５７】
健康なドナーに由来する、α−ＧａｌＣｅｒで増殖させたＶα２４＋Ｖβ１１＋ Ｔ細胞の評価を、ＣＤ１ｄ認識およびサイトカイン産生を対象に行った。ＣＤ１ｄ反応性インバリアントＮＫ Ｔ細胞である多くの細胞と一致して、このような細胞は、ＣＤ１ｄをトランスフェクトしたＣ１Ｒ細胞に反応して実質的な量のＩＬ−４とＩＦＮ−γの両方を産生したが、疑似トランスフェクトしたＣ１Ｒ細胞では産生は認められなかった（図２０Ｃ）。この認識にＣＤ１ｄ特異性があることは、抗ＣＤ１ｄモノクローナル抗体５１．１によってブロッキングされるが、対照の抗体に対応するアイソタイプではブロッキングされないことによってさらに証明されている。ＣＤ１ｄに対するサイトカイン応答は、これらのＴ細胞のＰＨＡによるポリクローナル刺激後に得られた応答と等価であり、大部分の細胞が実際にＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞であることが確認された。以上の応答はいずれも、健康なドナーに由来するインバリアントＮＫ Ｔ細胞クローンについて過去に得られた結果（Ｅｘｌｅｙら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６：１０９、１９９７；Ｅｘｌｅｙら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８８：８６７、１９９８）と同等であり、後者のインビトロで確立されたクローンが、インビボにおける細胞の機能状態を反映していることを示している。
【０１５８】
進行性前立腺癌患者に由来するインバリアントＮＫ Ｔ細胞の増殖の低下
進行性のアンドロゲン非依存性の前立腺癌患者に由来するインバリアントＮＫ Ｔ細胞を同様に調べた。健康なドナーに対して、アンドロゲンを除去した進行性のホルモン不応性前立腺癌の患者から回収された培養細胞の総数は減少しており、またＶα２４＋Ｖβ１１＋インバリアントＮＫ Ｔ細胞であった増殖細胞の比率に顕著な低下が認められた（図２１Ａおよび２１Ｂ。健康なドナーとアンドロゲンを除去したホルモン不応性前立腺癌患者の各インバリアントＮＫ Ｔ細胞は９８．５％と１３．６％）。α−ＧａｌＣｅｒが、アンドロゲン除去療法を受けた寛解期にある前立腺患者のＶα２４＋ Ｔ細胞を増殖させたことも示され（インバリアントＮＫ Ｔ細胞の比率は７５％）、アンドロゲン除去療法が、インバリアントＮＫ Ｔ細胞の増殖の低下を説明しないことが判明した（図２１Ｃ）。
【０１５９】
いずれも転移性癌で、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のレベルが高い進行性のアンドロゲン非依存性前立腺癌の一連の患者から得られたデータから、Ｖα２４＋Ｖβ１１＋インバリアントＮＫ Ｔ細胞の回復が顕著に低下したことが確認された（平均値は前立腺癌患者の１０％に対し、健康なドナーでは＞８０％）（図２１Ｄ）。以上の結果は、進行性前立腺癌患者の末梢血のＶα２４およびＶβ１１または６Ｂ１１染色で検出されるインバリアントＮＫ Ｔ細胞数が減少することと矛盾していなかった。インビトロ刺激中における増殖の低下またはアポトーシスの増加を含む他の因子も回収率の低さに寄与する可能性があった。これとは対照的に、アンドロゲン除去療法を受けているが寛解期にある前立腺癌患者に由来するＶα２４＋Ｖβ１１＋インバリアントＮＫ Ｔ細胞の回収率は、健康なドナーで得られた値に近い値であった（図２１Ｄ）。
【０１６０】
実施例１０：癌患者におけるインバリアントＮＫ Ｔ細胞の活性の低下
低レベルで存在することに加えて、前立腺癌患者におけるインバリアントＮＫ Ｔ細胞の活性は低かった。特にこのようなインバリアントＮＫ Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γをわずかにしか産生しなかった（Ｔｈ１エフェクター）。後述するように、ＩＬ−１２とインキュベートすると、このようなインバリアントＮＫ Ｔ細胞の活性は上昇してＩＦＮ−γを産生した。この結果は、ＩＬ−１２が癌の治療に望ましい細胞傷害活性などのＴｈ１応答方向へと、インバリアントＮＫ Ｔ細胞を偏向させる能力をもつことを支持する。
【０１６１】
サイトカイン産生およびＣＤ１ｄ反応性の測定に使用される方法
サイトカイン産生に関しては、文献に記載されているように、９６ウェルプレートに１×１０５ 個／ウェルの細胞を同数のＣＤ１ｄと共培養するか、Ｃ１Ｒ細胞を、１０％ ＦＢＳ、２０ Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２、および１ ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡを添加したＲＰＭＩ １６４０培地中で疑似トランスフェクトした（Ｅｘｌｅｙら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６：１０９、１９９７）。ＣＤ１ｄに対する細胞応答は、抗ＣＤ１ｄ抗体５１．１（１０ μｇ／ｍｌ）でブロックされた（Ｅｘｌｅｙら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６：１０９、１９９７；Ｅｘｌｅｙら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １００：３７、２０００）。上清は、ＩＬ−４の測定用およびＩＦＮ−γの測定用にそれぞれ４８時間と７２時間の時点で採取した。放出されたサイトカインの濃度は、サイトカイン標準に適合させた抗体ペアとの捕捉的ＥＬＩＳＡにより３回にわたって決定した（Ｅｎｄｏｇｅｎ、Ｉｎｃ． Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）。ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の両方に対する以上のアッセイ法の検出限界は１０〜５０ ｐｇ／ｍｌであった。
【０１６２】
癌患者に由来するインバリアントＮＫ Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生の喪失を示す結果
前立腺癌患者に由来するインバリアントＮＫ Ｔ細胞が増殖し、また同等のレベルのＩＬ−４を、健康なドナーに由来するインバリアントＮＫ Ｔ細胞として、ＣＤ１ｄをトランスフェクトした細胞に応じて産生した（図２２Ａ）。しかしＩＦＮ−γの産生は、健康なドナーに由来するインバリアントＮＫ Ｔ細胞に比べて顕著に低下していた（図２２Ｂ）。一連の進行性前立腺癌患者および健康なドナーに由来する、α−ＧａｌＣｅｒで増殖させたインバリアントＮＫ Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの産生に対するＩＬ−４を分析した結果、前立腺癌患者に由来する細胞によるＩＦＮ−γ産生が顕著に減少することが確認された（図２２Ｃ、ＩＦＮ−γについては対数スケールを使用）。ＩＬ−４に対するＩＦＮ−γの喪失は、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−４産生比を比較したときに最も明らかであり、前立腺癌と健康なドナーに由来するＮＫ Ｔ細胞系間の差は約５０倍であった（図２２Ｅ）。
【０１６３】
ＩＦＮ−γ産生の以上のような喪失が他のＴ細胞集団で一般的にみられるか否かを決定するために、進行性のアンドロゲン非依存性の前立腺癌患者、および健康なドナーに由来するバルク末梢血のＴ細胞をインビトロでＰＨＡで刺激した。その結果、前立腺癌患者に由来するバルクＴ細胞によるＩＦＮ−γの生産は損なわれておらず（図２２Ｄ）、前立腺癌患者と健康なドナーの細胞でＩＦＮ−γ／ＩＬ−４比は同等であった（図２２Ｅ）。以上をまとめると、得られたデータから、進行性の前立腺癌患者に由来するインバリアントＮＫ Ｔ細胞集団においてＩＦＮ−γ生産が優先的に失われることが判明した。
【０１６４】
インバリアントＮＫ Ｔ細胞は、ＩＬ−１２の抗腫瘍効果に寄与することがあるので、次に、このような癌患者に由来する細胞がＩＬ−１２に反応するか否かを判定した。前立腺癌患者に由来するインバリアントＮＫ Ｔ細胞を、培養の最終週にＩＬ−１２（１ ｎｇ／ｍｌ）で処理して、このサイトカインに反応するか否かを判定した。ＩＬ−１２で処理した細胞では、ＩＦＮ−γ産生の顕著な上昇が認められ、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−４産生比は健康なドナーにおける比と同等であった（図２２Ｅ、癌＋ＩＬ−１２）。
【０１６５】
実施例１１：多発性硬化症患者におけるＮＫ Ｔ細胞のレベルの低下
多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症性脱髄疾患であり、自己ミエリン関連抗原に対する自己免疫応答が関与する可能性が高い。ＭＳ患者のＮＫ Ｔ細胞が少ないか否かを判定するために、一次性進行型疾患のＭＳ患者（６人）、または再発寛解型疾患のＭＳ患者（８人）の末梢血試料に含まれるＮＫ Ｔ細胞（Ｖα２４ＪαＱ＋）の割合（％）を正常なドナー（６人）と比較した。正常なドナーのＮＫ Ｔ細胞の割合（％）は、過去の報告（０．１１４±０．０２０）と同等であったが、一次性進行型疾患のＭＳ患者のＮＫ Ｔ細胞の割合（％）は（０．０１０±０．００７）であるか、または再発寛解型疾患のＮＫ Ｔ細胞の割合（％）（０．０２７±０．０７１）は有意に低値であった。ＭＳ患者のＮＫ Ｔ細胞数が少ないことは、ＮＫ Ｔ細胞の数および／または活性の上昇が、再発寛解型のＭＳ、一次性進行型のＭＳ、または慢性進行型のＭＳなどのＭＳの治療または予防に有用な可能性があることを示唆している。またＭＳ患者の試料を、さまざまな時点で採取することで、上記ＭＳ患者の末梢に含まれるＮＫ Ｔ細胞の数が経時的に変動するか否か、また疾患症状の状態と相関するか否かを判定することができる。
【０１６６】
実施例１２：臨床コホートを調べる診断ツールとしての６Ｂ１１の用途
ＣＤ１ｄ拘束Ｔ細胞は、複数の免疫疾患に免疫調節的な役割を果たす可能性がある。高リスクの前記糖尿病およびＨＩＶ感染患者の臨床状況をモニタリングする６Ｂ１１抗体の診断上の有用性を検討するために、Ｖα２４−ＰＥ抗体を併用した６Ｂ１１−ＦＩＴＣ抗体を用いて、診断日における糖尿病患者の循環性ＣＤ１ｄ拘束Ｔ細胞、またＵＣＬＡメディカルセンターで追跡されたＨＩＶ ＭＡＣＳコホートの循環性ＣＤ１ｄ拘束Ｔ細胞の出現頻度を決定した。上述の通りにＰＢＬを染色し、ＦＡＣＳで解析した。また樹状細胞（ＤＣ）のサブタイプをＨＩＶ ＭＡＣＳコホートを対象に決定した。得られた結果を図２３および２４にまとめる。
【０１６７】
実施例１３：１型糖尿病の有無が一致しない一卵性双生児に由来するインバリアントＴ細胞における遺伝子発現
特にＴ細胞型で活性化される遺伝子のパターンを同定できれば、Ｔ細胞亜集団の機能を予測する情報が得られると思われる。例えばサイトカイン／ケモカインファミリーにおける遺伝子発現パターンの変化は、サイトカインの分泌とインビボにおけるＴ細胞の機能が関連する場合に特に重要である。後述するように、このような細胞が自己免疫および１型糖尿病に果たす役割を詳しく理解するためにＶα２４ＪαＱ Ｔ細胞の遺伝子発現パターンを決定した。この方法で、関心対象の他の任意のＴ細胞亜集団が、任意の疾患または症状の発生および／または進行に果たす役割を決定することもできる。
【０１６８】
ヒトＶα２４ＪαＱ Ｔ細胞クローンにおけるＴ細胞受容体の活性化の転写の結果を調べるために、ＤＮＡマイクロアレイにより、１型糖尿病とＩＬ−４の分泌が一致しない一卵性双生児に由来するクローンの抗ＣＤ３刺激によるｍＲＮＡ量の変化の定量が行われた（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７ （１３）：７４１１〜７４１６、２０００）。活性化により、ＩＬ−４分泌クローンにおける２２６個の転写物、およびＩＬ−４ヌルクローンにおける８６個の転写物が有意に調節された。これらの遺伝子の２８個のみが共通であった。認められた差から、糖尿病患者のＶα２４ＪαＱ Ｔ細胞の分化、ならびに骨髄系細胞の動員および活性化においてインバリアントＴ細胞が果す役割がいずれも有効でないことが示唆された。
【０１６９】
ＩＬ−４分泌の欠損は、複数の差異の結果である可能性が高いので、代表的なクローンの対を選択して、約６８００個の遺伝子（Ｕｎｉｇｅｎｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の発現をモニタリングするＤＮＡマイクロアレイを用いて詳細な解析を行った。このＤＮＡマイクロアレイは、遺伝子発現における複雑な差を調べる大規模研究に対する実用的で再現性の大きい方法である（Ｌｏｃｋｈａｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４、１６７５〜１６８０、１９９６；Ｈｏｌｓｔｅｇｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３、８３〜８７、１９９９；Ｃｈｏら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ２、６５〜７３、１９９８）。発現プロファイルは、抗ＣＤ３または対照のＩｇＧを用いた４時間の刺激によって決定した。この時間点が選択された理由は、この時間点が、１型糖尿病の有無が一致しない一卵性双生児の対に由来するクローンにおけるサイトカイン分泌を対象とした過去の分析で使用されていたためである。刺激前または刺激後の発現が検出可能な遺伝子の数は、ＩＬ−４ヌルクローンとＩＬ−４分泌クローンでほぼ同じであった（それぞれ１５２３個と１５５８個）。予想された通り、大部分の転写物の頻度に変化は認められなかった。このセットの３分の２のみ（９８８個）が２個のクローンで共通であった。抗ＣＤ３刺激後における発現が、刺激されなかった場合に対して少なくとも２倍上昇または低下することが明らかとなった遺伝子の数は、ＩＬ−４ヌルクローンで８６個（６％）、またＩＬ−４＋分泌クローンで２２６個（１５％）であった。ＩＬ−４ヌルクローンとＩＬ−４分泌クローン間の遺伝子発現の差をより詳しく分析するために、自己組織化マップ（Ｓｅｌｆ−Ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ Ｍａｐ）アルゴリズムを用いて遺伝子群を６つの異なる発現パターンに分類されている（Ｔａｍａｙｏら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６、２９０７〜２９１２、１９９９）。
【０１７０】
ＤＮＡマイクロアレイを調べたところ、抗ＣＤ３によるＶα２４ＪαＱ Ｔ細胞クローンの活性化によって、サイトカイン／ケモカインファミリーの転写物に有意な変化が生じた。このカテゴリーに含まれる遺伝子の発現にみられる顕著な差は、ＩＬ−４＋クローンとＩＬ−４−ヌルクローンの比較時に認められた（図２５Ａ）。ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、およびＧＭ−ＣＳＦにみられる転写上の変化は、それぞれＥＬＩＳＡによりタンパク質レベルで検証されている。疾患の有無について対称性がみられない双子に由来するクローンを比較すると、ＩＬ−４分泌クローンに一般的にみられる変化を含む、ＩＬ−４−ヌルクローンにおける複数の転写物に確固とした変化が認められた。また計１５２３個の転写物が有意なレベルで認められ、このうち５３５個はＩＬ−４ヌルクローンに固有のものであった。また上記クローン対は、抗ＣＤ３に反応して同等量のＩＦＮ−γを分泌した。ＣＤ１６１＋Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞のエフェクター機能のかなりの部分がサイトカイン分泌を介して生じると仮定すると、ＩＬ−４ヌルクローンは、分化した機能のすべての範囲と結びつかないであろうということは重要である。最近になって、サイトカインの活性化に反応する能力と、それに続くサイトカインを分泌する能力の両方がＮＯＤマウスのＮＫ Ｔ細胞でも損なわれていることが認められた（Ｆａｌｃｏｎｅ、Ｊ． ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９０、９６３〜９７２、１９９９）。また、このようなサイトカイン／ケモカインの組み合わせは、ＣＤ１６１＋ Ｔ細胞が未成熟な樹状細胞および単球を動員して調節している可能性があることを示唆している。
【０１７１】
ＩＬ−４＋クローンとＩＬ−４ヌルクローン比較すると、ＢＣＬｘＬ、ＩＡＰ、ＰＬＣγ１、およびｔｅｃファミリーキナーゼＩｔｋなどのＰＩ ３キナーゼ情報伝達を介して部分的に活性化される細胞生存、サイトカイン分泌、およびカルシウム流入に重要な他の遺伝子の発現に有意な差が認められた。このような転写物はＩＬ−４＋クローンに有意に多量に見出された。差は、サイトカイン分泌およびＴｈ表現型に影響する転写因子および情報伝達調節因子をコードするｍＲＮＡの発現にも認められた。これにはＧＡＴＡ３、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ４、ＪｕｎＢ、ＪｕｎＤ、およびＮＦＡＴ４などがある。特にＪｕｎＢおよびＧＡＴＡ３は、Ｔｈ２ Ｔ細胞で優先的に発現されることが最近報告された。ＧＡＴＡ３、ＪｕｎＢ、ならびにＪｕｎＤの転写活性化はＩＬ−４＋クローンで優先的に認められた。ＳＴＡＴ１ （ＩＦＮ−γ情報伝達）、ＳＴＡＴ４ （ＩＬ−１２情報伝達）、およびＣＤ１６１ （Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞の増殖およびＩＦＮ−γの分泌の補助活性化因子）の転写物は、ＩＬ−４＋クローンに対してＩＬ−４ヌルクローンで過剰に発現していた。重要な点は、部分的にＩＬ−４の転写のサプレッサーとして作用すると考えられる転写因子ＮＦＡＴ４が、ＩＬ−４＋クローンに対してＩＬ−４ヌルクローンで過剰に発現していることであった。この概念を基に、転写因子などの他の遺伝子の調節の不一致が、Ｔｈ表現型の制御に影響することが予想される。発現が複数の独立した生物学的観察に一致する、調節を受ける遺伝子のモデルを図２５Ｂに示す。
【０１７２】
活性化されたＶα２４ＪαＱ Ｔ細胞クローンの転写プロファイルから、（糖尿病でない一卵性双生児と比べて）糖尿病患者に由来するクローンにみられるＩＬ−４分泌の欠損が、遺伝子発現にみられる多数の差異の一つであることが判明した。活性化がＰＩ ３キナーゼで部分的に制御される遺伝子産物の発現に差がみられたことは重要であり、これが、完全に分化したＶα２４ＪαＱ Ｔ細胞の産生に必要であると考えられる。
【０１７３】
実施例１４：骨髄系樹状細胞上のＣＤ１ｄは、Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞のサイトカイン分泌を刺激し、同細胞の細胞溶解活性を促進する
ＤＣは、Ｔ細胞応答の開始に重要な役割を果たす抗原提示細胞に由来する骨髄の特定の集団である。ヒトでは、３個のＤＣ集団が極めて低出現頻度（０．０３〜０．３％）で末梢血中に見出されている。ヒトのＤＣには２つの骨髄系集団がある。一つはランゲルハンス細胞前駆体（Ｌｉｎ−／ＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ１ａ＋／Ｉｌ−３Ｒ−）および組織ＤＣ （Ｌｉｎ−／ＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ１ａ−／ＩＬ−３Ｒ−）であり、もうひとつは「形質細胞様」ＤＣ（ＰＤＣ）集団（Ｌｉｎ−／ＣＤ１１ｃ−／ＣＤ１ａ−／ＩＬ−３Ｒ＋）である。ＰＤＣ集団も、高内皮細静脈への回帰およびリンパ組織への移動を促進するＣＸＣＲ３およびＣＤ６２Ｌを発現する。ＰＤＣはＣＤ４０の連結を介して、またはＬＰＳに曝露されることでリンパ系で活性化され、さまざまなサイトカインを産生し、またＴ細胞の刺激能力を増強する。ＭＤＣはそれぞれ表皮または真皮、および他の組織部位のいずれかを占める。ＭＤＣは未成熟な状態にある末梢組織に存在し、抗原を容易に取り込む。そしてそれまでの間、感染または組織の損傷によってもたらされる情報を受ける。この時点で、活性化されて排出性リンパ節に移動し、同リンパ節でＩＬ−１２ｐ７０などのサイトカインを容易に産生し、未感作Ｔ細胞を活性化する。ＭＤＣ集団とＰＤＣ集団には、Ｔｈ１応答およびＴｈ２応答の発生の誘導に関して異なる役割があることが最近の研究で支持されている。マウスおよびヒトを対象とした研究では、ＭＤＣの成熟および機能の欠損が、１型糖尿病の病因に影響する可能性があることも示唆されている。
【０１７４】
骨髄系樹状細胞がＴｈ１細胞性免疫応答のプライミングにおいて重要な役割を果していることから、Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞が、その免疫調節性の作用をこれらの細胞との相互作用を介して発揮している可能性がある。この仮説を検証するために、インビボおよびインビトロでＤＣ上におけるＣＤ１ｄの発現パターンを調べ、またＶα２４ＪαＱ Ｔ細胞クローンとＤＣ細胞との相互作用の帰結を調べた。
【０１７５】
本研究に使用したＶα２４ＪαＱ Ｔ細胞クローン
Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞クローンの由来については文献に記載されている（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３９１：１７７、１９９８）。簡単に説明すると、正常なドナーの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、Ｖα２４／Ｖβ１１二重陽性細胞について単細胞選別し、次に１０％ 熱不活性化ウシ胎児血清、２ ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ Ｕ／ｍｌ ペニシリン、および１０ μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン（Ｒ１０）を含むＲＰＭＩ １６４０ （Ｓｉｇｍａ）中で、放射線を照射したフィーダーＰＢＭＣ （５０，０００ 細胞／ウェル）、放射線を照射した７２１．２２１リンパ芽球細胞（５００ 細胞／ウェル）、ＰＨＡ−Ｐ （１ μｇ／ｍＬ）、ＩＬ−２ （１０ Ｕ／ｍｌ）、およびＩＬ−７ （１０ Ｕ／ｍＬ）とともに成長させた。次に、結果として得られたクローンを、放射線を照射したフィーダーＰＢＭＣおよび抗ＣＤ３抗体の存在下で、抗ＣＤ３ 抗体によって定期的に再刺激して増殖させた。クローンがＶα２４およびＮＫＲ−Ｐ１Ａに関して陽性であることをフローサイトメトリーで確認し、配列を決定してＶα２４ＪαＱ ＣＤＲ３ ＴＣＲを有することを確認した。
【０１７６】
Ｔ細胞の転写プロファイリングに使用した方法
Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞クローンの転写解析を、アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社が開発した高密度オリゴヌクレオチドアレイを用いて実施した。簡単に説明すると、細胞を１０ μｇ／ｍＬの可溶性の抗ＣＤ３または対照となるＩｇＧで４時間かけて活性化し、その後に全ＲＮＡを単離して逆転写した。結果として得られたｃＤＮＡを、ビオチン化ヌクレオチドとともにインビトロ転写に用いて、標識されたアンチセンスＲＮＡを作製し、ＤＮＡマイクロアレイチップ（Ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ 商標、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）との間でハイブリッドを形成させた。ＰＥ−ストレプトアビジンで染色後、結合しているＲＮＡの蛍光をＧｅｎｅｃｈｉｐ Ｒｅａｄｅｒ （改変型の共焦点顕微鏡）で定量した。
【０１７７】
サイトカイン分泌および増殖のアッセイ法
Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞クローンを、プレートに結合している抗ＣＤ３抗体または対照となるアイソタイプ抗体と４時間、８時間、または２４時間刺激した（２５，０００／ウェル）。上清を回収し、定量ＥＬＩＳＡ （Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ｋｉｔｓ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）でＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、マクロファージ炎症性タンパク質−１−α （ＭＩＰ−１−α）、ＭＩＰ−１−β、ＴＮＦ−α、およびＧＭ−ＣＳＦを定量した。２４時間後に、１ μＣｉ／ウェルとなるように［３Ｈ−］チミジン（Ｄｕｐｏｎｔ ＮＥＮ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を添加し、取り込みを文献の方法で測定した（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３９１：１７７、１９９８）。制限実験も、トランスフェクトしたＣ１Ｒ細胞中のＣＤ１のアイソフォーム（ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、およびｐＳＲ−α−ｎｅｏベクターのみ）を用いて文献の方法で行った（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３９１：１７７、１９９８；Ｅｘｌｅｙら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １８６：１、１９９７）。
【０１７８】
骨髄系樹状細胞の調製
単球に由来する樹状細胞を、新鮮なＰＢＭＣから文献の方法（Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １７８：１０６７、１９９３）を応用して調製し、抗ＣＤ１４微粒子による濃縮で正の選択を製造業者のプロトコルにしたがって実施した（ミルテニ・バイオテック、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）。簡単に説明すると、同系のドナーから調製した単離直後のＰＢＭＣを、吸着および洗浄操作により単球について濃縮した。洗浄直後に、残りの単球を組換え型ヒトＩＬ−４ （ｒｈＩＬ−４；Ｇｅｎｚｙｍｅ）およびｒｈＧＭ−ＣＳＦ （１０００ Ｕ／ｍｌ）を添加したＲ１０中でそれぞれさらに７日間培養し、少なくとも９０％のＣＤ１ａ＋／ＤＲ＋／ＣＤ３−／ＣＤ１４−の非接着性の細胞集団をフローサイトメトリー解析で得た。
【０１７９】
細胞溶解アッセイ法
Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞クローンによる細胞溶解活性を、５１Ｃｒの特異的な放出を４時間かけて測定することで決定した。標的細胞を５０ μＣｉのＮａ２ ５１Ｃｒ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ、Ｎｏｒｔｈ Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ ＭＡ）で１時間かけて標識し、洗浄を２回行った。細胞溶解活性は、１ウェルあたり１０４個の標識された標的細胞を含むＵ底９６ウェルマイクロタイタープレート中で標準的なクロム遊離アッセイ法で決定した（エフェクター細胞の比は記載値を使用）。３７℃で４時間インキュベートした後に上清を回収し、γカウンター（Ｃｏｂｒａ、Ｐａｃｋａｒｄ、Ｄｏｗｎｅｒ’ｓ Ｇｒｏｖｅ ＩＬ）で計数した。特異的な溶解の割合（％）を以下の式で算出した：［（実験放出分−自然放出分）／（最大放出−自然放出］×１００。実験によっては、細胞溶解の検証を、ＥＧＴＡおよびＭｇＣｌ２の存在下（各４ ｍＭ）でカルシウムキレート条件下で行った。
【０１８０】
本研究に使用した抗体
４２．１抗ＣＤ１ｄモノクローナル抗体は、スティーブン・ポーチェリ（Ｓｔｅｖｅｎ Ｐｏｒｃｅｌｌｉ）博士（Ｂｒｉｇｈａｍ ＆ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）より供与を受けた。４２．１およびＩｇＧ１対照抗体のＦ（ａｂ’）２断片は、Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２キット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で調製した。ヒト吸着（ｈｕｍａｎ ａｄｓｏｒｂｅｄ）ヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣは、カルタグ（Ｃａｌｔａｇ）（Ｂｕｒｌｉｎｇｈａｍ、ＣＡ、ＵＳＡ）から入手した。ＦｃＲ−ブロッキング試薬（商標）のヒトＩｇＧは、ミルテニ・バイオテック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）（Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）から入手した。ＮＯＲ３．２は、バイオソース・インターナショナル（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から入手した。抗Ｖα２４、抗Ｖβ１１、抗αβＴＣＲ、および抗ＣＤ８３は、イムノテック（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）（Ｃｏｕｌｔｅｒ／Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）から入手した。抗ＣＤ１ａ、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８６、およびＨＬＡ−ＤＲは、ファーミンジェン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から入手した。抗ＣＤ３、クローンＵＣＨＴ１は、アンセル（Ａｎｃｅｌｌ）（Ｂａｙｐｏｒｔ、ＭＮ、ＵＳＡ）から、またＩｇＧ１対照はＳｉｇｍａ （Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。
【０１８１】
フローサイトメトリーの方法
染色した細胞は、ＦＡＣＳｃａｎ細胞計数器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＵＳＡ）を用いて解析し、単細胞選別は、ＭｏＦｌｏ細胞計数器（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）を用いて実施した。ＣＤ４０ＬのＣＤ１ｄの発現については、Ｔ細胞クローンを文献の方法にしたがってＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化した（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３９１：１７７、１９９８；Ｅｘｌｅｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９：１５１４０、１９９４）。
【０１８２】
ＣＤ１ｄのウェスタンブロット分析
５×１０５個のＣ１Ｒ／ＣＤ１ｄ細胞、４×１０７個の樹状細胞、および４×１０７個の対照Ｃ１Ｒ／ｎｅｏ細胞の溶解液に由来するＣＤ１ｄの免疫沈殿を、モノクローナル抗体４２．１に結合させたタンパク質Ａビーズを用いて調製した。この免疫沈殿をＳＤＳ−ＰＡＧＥ （５％〜１５％）で分離し、親和性精製したウサギ抗ＣＤ１ｄ ポリクローナル抗体をプローブを用いて選び出した（Ｅｘｌｅｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １８８：８６７、１９９８）。バンドは化学発光を基に視覚化した。
【０１８３】
免疫化学的な方法
ＮＯＲ３．２ モノクローナル抗体を用いて、固定化してパラフィンに包埋した組織中のＣＤ１ｄ発現を、免疫ペルオキシダーゼ染色（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣエリートキット、視覚化にはＮｏｖａＲｅｄ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡを使用）で決定した。染色は、ＮＯＲ３．２を１：１００の希釈率で用いて製造業者の指示書にしたがって行った。シグナルの特異性は、ＧＳＴ−ＣＤ１ｄ融合タンパク質を用いたブロッキング実験で、ＧＳＴタンパク質単独の場合と比較することで確認した。
【０１８４】
抗ＣＤ３治療によるＣＤ１ｄ拘束Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞の活性化を示す結果
Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞の転写プロファイルの詳細な分析を、高密度オリゴヌクレオチドアレイを用いて実施した。正常なドナーに由来するクローンが活性化すると、骨髄系樹状細胞の動員および分化に重要であると考えられている数多くのエフェクター分子が発現した（図２６Ａおよび２６Ｂ）。調べた１６個のケモカインのうち４個が、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βを含んでおり、マクロファージおよび未成熟な樹状細胞をインビボで動員すると考えられる。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、およびＴＮＦ−α、骨髄系樹状細胞の分化および成熟、および後の成熟にかかわるサイトカインも産生された。活性化により、検討した２６個のうち８個のサイトカインの発現も誘導された。これらのサイトカイン、ならびにＣＤ４０リガンドおよび４−１ＢＢは、調べた個々のＶα２４ＪαＱ Ｔ細胞クローンによって産生された（図２６Ａ〜２６Ｄ、２７Ａ、および２７Ｂ）。また、活性化されたＶα２４ＪαＱ Ｔ細胞は、典型的な細胞傷害性Ｔ細胞に通常関与するタンパク質であるパーフォリンおよびグランザイムＢを高レベルで発現した。したがって、この免疫調節機能はサイトカインの放出に制限されないが、細胞溶解活性にもかかわると考えられる。
【０１８５】
標的細胞上におけるＣＤ１ｄの発現によるＶα２４ＪαＱ Ｔ細胞のサイトカイン分泌および細胞溶解活性の両方の活性化
完全に自家系のＶα２４ＪαＱ Ｔ細胞とＤＣの相互作用を調べるために、新しい一連のクローンを調製した。このようなクローンを、さまざまなＣＤ１分子をトランスフェクトしたリンパ芽球Ｃ１Ｒ細胞のパネルに対するＣＤ１ｄ−特異的な反応に関して検討した。ＩＬ−４およびＩＦＮ−γに関して示されたサイトカインの放出、ならびにこれらのクローンの増殖は、ＣＤ１ｄで特異的に制限された（図２７Ａ）。活性化の誘導はＣＤ１ｄではみられたが、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、またはＣＤ１ｃではみられず、これは過去に報告された結果と一致した。またＶα２４ＪαＱ Ｔ細胞クローンは、他のＣＤ１ファミリーの分子ではなくＣＤ１ｄを発現するＣ１Ｒ細胞を特異的に溶解することが判明した（図２７Ｂ）。したがってインバリアントＴＣＲのＣＤ１ｄ−制限性の誘導は、サイトカインの分泌、およびＭＨＣクラスＩおよびペプチドエピトープで誘導される細胞傷害性Ｔ細胞に関して観察される状況に似た状況である、同時に生じる細胞溶解反応を活性化する。
【０１８６】
ＣＤ１ｄは骨髄系樹状細胞で発現される
Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞クローンによって産生されるサイトカインと細胞溶解タンパク質の組み合わせから、過去に提案されているようにＩＬ−４分泌による、単純なＴｈ２プライミング以外のエフェクターとしての役割の存在が示唆されている。以上の結果を考えれば、Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞による免疫調節には、Ｔｈ１様応答の誘導に重要な骨髄系樹状細胞との相互作用が関与する可能性がある。未成熟な樹状細胞は、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦによってインビトロで分化させた末梢血単球に由来し、後に単球の培養上清で成熟させた（Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １７８：１０６７、１９９３）。末梢血単球は、インビトロの培養物中で速やかに失われる低レベルのＣＤ１ｄを発現することが知られている。末梢単球に由来する成熟した骨髄系樹状細胞（ＤＣ１）の分析から、細胞表面におけるＣＤ１ｄの発現が再び獲得されることが判明した（図２８Ａおよび２８Ｂ）。また、活性化されたＢリンパ球およびＴ リンパ球はＣＤ１ｄを発現しなかった。免疫組織化学的分析では、ＣＤ１ｄがインビボにおいて、リンパ節の傍皮質Ｔ細胞領域にある樹状細胞上に優先的に発現されることが確認された（図２８Ｃ〜２８Ｐ）。一連の切片を免疫的に染色したところ、ＣＤ１ａおよびＳ１００も発現している樹状細胞上でＣｄ１ｄが発現されていることが確認された。ＣＤ１ｄは、濾胞性樹状細胞、または濾胞刺痛体（ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｔｉｎｇｌｅ ｂｏｄｙ）マクロファージでは発現されないことが既に判明しており、またリンパ洞の組織球にはほとんどみられなかった（ＣＤ１ｄの発現はＴ細胞依存性のリンパ領域を標的としていた）。他の状態の反応性リンパ節の他の組織球／単球集団の過程を調べたところ、結核菌（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染の乾酪性肉芽腫と、他の非マイコバクテリア性肉芽腫の両方で類上皮細胞の組織球上に顕著なＣＤ１ｄ染色が認められた。マウスのＶα１４Ｊα２８１ Ｔ細胞は、結核菌の脂質抽出物による感作後の肉芽腫形成に必要なことが明らかとなっている。また樹状細胞に極めて似ていて、その新生カウンターパートと目される複数の腫瘍、例えばランゲルハンス細胞組織球増加症および組み合った樹状細胞の腫瘍も構成的にＣＤ１ｄを発現する。したがってインビトロおよびインビボの両方において樹状細胞上でＣＤ１ｄが発現されていることは、これがＶα２４ＪαＱ Ｔ細胞の生理的標的である可能性を示唆する。
【０１８７】
Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞による骨髄系樹状細胞のＣＤ１ｄ拘束性溶解
Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞がもつ、樹状細胞との相互作用能力は、ＭＨＣハプロタイプが異なる複数の健康なドナーに由来するＤＣの細胞溶解に対する、複数のＶα２４ＪαＱ Ｔ細胞クローンを検討することで確認された（図２９Ａおよび２９Ｂ）。同種樹状細胞も自家樹状細胞も、このクローンにより溶解したことから、死滅がＭＨＣ拘束性でもアロ反応性でもないことがわかる。さらに細胞溶解は、カルシウムをキレート化すると完全に抑制され、抗ＣＤ１ｄモノクローナル抗体４２．１で顕著に阻害された（図２９Ｃ）。以上のデータは、死滅がパーフォリン／グランザイム経路を介し、ＣＤ１ｄを必要とすることを示唆している。未成熟な表現型の樹状細胞（ＣＤ８３−）と成熟した表現型の樹状細胞（ＣＤ８３＋）の比較から、Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞による認識に一貫した差がないことが判明した（図２９Ａ）。樹状細胞によってＶα２４ＪαＱ Ｔ細胞が活性化されると、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γの両方の分泌も誘導された（図２９Ｄ）。したがってＶα２４ＪαＱ Ｔ細胞を、ＣＤ１ｄを発現する樹状細胞に曝露させると、細胞溶解機能とサイトカイン放出の両方が誘導された。
【０１８８】
免疫調節のフィードバック機構
抗ＣＤ３による活性化後、Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞は、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを含む、骨髄系樹状細胞の動員および分化に重要な多様なサイトカイン、ケモカイン、および補助刺激タンパク質を分泌可能であることが明らかとなっている。以上の遺伝子産物の存在下で培養した骨髄系樹状細胞は、ＣＤ１ｄを発現し、Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞によるＣＤ１ｄ拘束性の死滅に特異的な標的となった。さらにＣＤ１ｄは、インビトロで得られた発現データを補強するように、リンパ節の傍皮質Ｔ細胞領域にある骨髄系樹状細胞上で優先的に発現されていた。
【０１８９】
ヒトの骨髄系に由来する樹状細胞（ＤＣ１）およびリンパ球系樹状細胞（ＤＣ２）は、ＣＤ４＋ Ｔヘルパー細胞の応答を調節するため、Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞によるＤＣ１の特異的な溶解は、その免疫調節機能が、ＩＬ−４分泌によって誘導されるＴｈ２の偏向に制限されないことを示唆している（Ｍａｌｄｏｎａｄｏ−Ｌｏｐｅｚら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８９：５８７、１９９９；Ｒｉｓｓｏａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：１１８３、１９９９；Ｒｅｉｄら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌ １２：１１４、２０００）。Ｔ細胞と共培養すると、ＤＣ１細胞は高レベルのＩＬ−１２を分泌し、Ｔｈ１表現型をもつＴ細胞を誘導した。ＤＣ２細胞との共培養では、顕著なＴｈ２応答が誘導された（Ｒｉｓｓｏａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：１１８３、１９９９）。したがって、Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞による骨髄系樹状細胞（ＤＣ１）の特異的な溶解は、Ｔｈ１ Ｔ細胞応答を制限する負のフィードバック機構として働く可能性がある（図３０）。
【０１９０】
過去の報告では、ＮＫ細胞に関する同様の溶解結果が示されている。活性化されたＮＫ細胞が樹状細胞を溶解したことは、Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞について提案されている機構に似た、負のフィードバック機構の存在を示唆している。またα−ＧａｌＣｅｒの投与によりＣＤ１ｄ拘束Ｔ細胞がインビボで活性化されると、マウスＮＫ細胞は著しく活性化した（Ｃａｒｎａｕｄら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６３：４６４７、１９９９）。ＮＫ細胞の活性化の機構がインビボにおける樹状細胞の調節に影響する可能性がある一方、本明細書で示された、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞とＤＣの直接的な相互作用により、上記の段階が不要になると考えられる。
【０１９１】
Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞と樹状細胞との相互作用部位は現時点で不明である。典型的なリンパ節でＶα２４ＪαＱ Ｔ細胞が少ないことは、上記相互作用がリンパ節外で生じている可能性と、リンパ節内に存在するＣＤ１ｄ陽性の樹状細胞が末梢における破壊を逃れたものであることを示唆している（Ｂｅｎｄｅｌａｃら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５：５３５、１９９７；Ｐｏｒｃｅｌｌｉら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７：２９７、１９９９）。網内系におけるＶα２４ＪαＱ Ｔ細胞の平行した組織分布と、ＣＤ１ｄのインビボにおける発現パターンは、これらの相互作用が細胞性免疫応答発生の調節に重要な役割を果していることの強力な証拠である。ＣＤ１ｄ拘束Ｔ細胞は、肝臓、腸、脾臓、リンパ節、および胸腺（Ｂｅｎｄｅｌａｃら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５：５３５、１９９７；Ｐｏｒｃｅｌｌｉら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７：２９７、１９９９）、活性抗原試料採取部位に分布しており、また専門的な抗原提示細胞によって提示されている。調節を受けていない樹状細胞は、組織特異的な自己抗原を提示することで自己免疫を開始して維持する能力をもつことが過去に報告されている。またＤＣは、ＩＩ型自己免疫性リンパ球増殖性症候群（ＡＬＰＳ ＩＩ）患者のカスパーゼ１０遺伝子におけるミスセンス変異の結果として、リンパ節のＴ細胞領域に「残存（ｌｉｎｇｅｒｅｄ）」していた。これは、この自己免疫疾患の主な所見である。ＣＤ１ｄ拘束Ｔ細胞の機能不全は、げっ歯類とヒトにおけるＴ細胞を介した自己免疫疾患の発症に明らかに相関していた。またＣＤ１ｄ拘束Ｔ細胞の活性化または直接的な移動は、自己免疫のマウスモデルで自己免疫の発生を直接抑制することが報告されている。
【０１９２】
これまでのデータを要約すると、Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞が骨髄系樹状細胞（ＤＣ１）上のＣｄ１ｄにより活性化されて、樹状細胞の動員および分化に重要なケモカインおよびサイトカインを分泌することで、樹状細胞の機能調節に重要な役割を果すことを示唆している（図３０）。このような相互作用はまた、Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞の細胞溶解機能も活性化し、樹状細胞の細胞溶解を介したＴｈ１細胞性免疫応答の負の調節を誘導する。この系は、Ｔｈ２細胞性応答の制限を担う成熟Ｔ細胞によるリンパ系樹状細胞（ＣＤ２）の負の制御に相反的な可能性がある（Ｒｉｓｓｏａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：１１８３、１９９９）。
【０１９３】
ＤＣの成熟および機能が、１型糖尿病などの自己免疫疾患に寄与する可能性がある一つの可能な機構は、調節性細胞（Ｔｈ２細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋ Ｔ細胞）の産生、またはエフェクターＴ細胞の細胞死の誘導に対する不十分な抗原提示細胞活性を含む。ＭＤＣの成熟における固有の異常は、ＮＫ Ｔ細胞の数または機能の異常に寄与する可能性がある。同様にＮＫ Ｔ細胞の欠損は、ＤＣの成熟を相反的に制限する可能性があり、このような抗原提示細胞の死滅を失敗に導くことで、持続的かつ好ましくない免疫応答が可能となる。
【０１９４】
実施例１５：インビボにおいて標的となるＴ細胞亜集団に及ぼす抗体の影響を決定する方法
任意の本発明の抗体をインビボ動物モデルで検討し、抗体の薬理学的および薬物動態学的な性質を決定することができる。例えば抗体の半減期、体内分布、および有効性を決定することができる。
【０１９５】
一つの方法では、関心対象のヒトインバリアントＴ細胞もしくは他の任意のＴ細胞集団をＳＣＩＤマウス、または免疫不全動物（マウスなど）に投与し、抗インバリアントＴ細胞抗体もしくは本発明の他の任意の抗体を動物に投与して、対象抗体が投与Ｔ細胞の活性もしくは数をインビボで調節するか否かを判定する。
【０１９６】
具体的には、百万〜千万個の関心対象のＴ細胞を含むＴ細胞の集団（例えばインバリアントＴ細胞、または他の任意のＴ細胞亜集団）を静脈内、または任意の関心対象の部位に注射する。１つもしくは複数の抗体をＴ細胞の投与前、投与中、または投与後に投与する。例えば抗体は、宿主動物において投与Ｔ細胞の寿命があるうちの任意の時点で投与することができる。Ｔ細胞を投与する部位として、約１〜１００ μｇの抗体を同じ部位に投与するか、または別の部位に投与する。検出用の標識抗体を使用する場合は、投与抗体および／またはＴ細胞の位置および量を、蛍光もしくは放射活性を基にインビボでモニタリングすることができる。さらに、組織学的測定、免疫学的測定、および／または生化学的測定を、動物の組織を対象にエキソビボで行うことができる。抗体またはＴ細胞亜集団の生物学的活性は、血清または組織試料に含まれるサイトカインの量または活性を分析することで測定することができる。また投与されたＴ細胞亜集団による、他のＴ細胞などの他の細胞の活性化を測定することができる。例えばＣＤ６９＋ Ｔ細胞の数は、抗ＣＤ６９抗体を用いたＦＡＣＳ選別で測定することができる。
【０１９７】
実施例１６：ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞のインビボにおける増殖用の抗体、またはこれらの細胞の画像化用の抗体の投与
本発明の抗体は、自己免疫疾患、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、真核性病原体感染、アレルギー、喘息、炎症性症状、移植片対宿主病、移植拒絶、免疫不全症、自然流産、妊娠、または癌の治療もしくは予防のために、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞インビボにおける増殖のためのサイトカインの投与に加えることで哺乳類に投与することができる。実施例７に記載されたように、すべての投与様式、用量、および頻度が意図される。
【０１９８】
１つまたは複数の本発明の抗体を含む薬学的組成物は、「レミントンの薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」（Ｅ．Ｗ． Ｍａｒｔｉｎ）に記載された手順で調製することができる。薬学的な安定化化合物、輸送用媒介物、または担体輸送体を使用することができる。例えばヒト血清アルブミン、または他のヒトもしくは動物のタンパク質を使用することができる。リン脂質小胞もしくはリポソーム懸濁物は、薬学的に許容される担体、または輸送用媒介物となりうる。このような組成物は当技術分野で周知の方法で調製することができる。
【０１９９】
蛍光標識または放射標識に共有結合で連結された本発明の抗体を用いて、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、もしくはＪαＱ＋ Ｔ細胞のインビボにおける分布、量、または移動を視覚化することができる。ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞の画像化により、自己免疫疾患、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、真核性病原体感染、アレルギー、喘息、炎症性症状、移植片対宿主病、移植拒絶、免疫不全症、自然流産、妊娠、または癌の危険性のある被験者、またはこれらの症状のみられる被験者を同定することができる。あるいは、同様の方法で、上記疾患に対する治療がＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性Ｔ細胞、またはＪαＱ＋ Ｔ細胞に及ぼす作用を決定することができる。
【０２００】
他の態様
前述の記述から、さまざまな用途および条件に適合するように本明細書に記載された発明に変更および修正がなされることが明らかになる。このような態様も、特許請求の範囲内にある。
【０２０１】
本明細書で言及されたすべての刊行物は、個々の刊行物が、参照として組み入れられると特に個別に指定されたのと同じ程度に、参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ反応性インバリアントＴ細胞、ＣＤ１ｄ反応性非インバリアントＴ細胞、およびＪαＱ＋ Ｔ細胞間の関係を示す略図である。
【図２】図２Ａは、対照のＴ細胞クローンを、抗ＣＤＲ３ループモノクローナル抗体（３Ａ６もしくは６Ｂ１１）、または６Ｂ１１アイソタイプ（ＩｇＧ１）の適合させた対照で染色した結果を示すヒストグラムである。図２Ｂは、インバリアントＮＫ Ｔ細胞クローンの対応する染色を示すストグラムである。
【図３Ａおよび３Ｂ】６Ｂ１１モノクローナル抗体によるＶα２４＋ Ｔ細胞の認識のＦＡＣＳ解析を示すドットプロットである。ＦＡＣＳで精製したＶα２４＋ Ｔ細胞をＰＨＡで２週間エキソビボで増殖させ、Ｖα２４−ＰＥおよびＶβ１１−ＦＩＴＣモノクローナル抗体（図３Ａ）またはＶα２４−ＰＥおよび６Ｂ１１−ＦＩＴＣモノクローナル抗体（図３Ｂ）を用いて分析した。
【図４Ａおよび４Ｂ】それぞれ、６Ｂ１１抗ＣＤＲ３ループモノクローナル抗体が結合したプレート、またはＰＨＡと共に３週間培養したＶα２４で選別した細胞の増殖を示すグラフである。
【図５Ａおよび５Ｂ】それぞれＩＬ−１２の処置前または処置中における患者のインバリアントＮＫ Ｔ細胞のＦＡＣＳ解析を示すグラフである。進行腎細胞癌患者の末梢血を、ＩＬ−１２処置の直前、および最初の６週間後の時点でＣＤ３＋Ｖα２４＋細胞について分析した。処置後に有意な上昇のない、Ｖα２４＋細胞の同等の低い比率が、すべての場合（ｎ＝１０）に認められた。
【図６Ａ〜６Ｃ】それぞれバルク末梢血単核球細胞、Ｖα２４＋ 細胞、およびポリクローナル（「ポリ」）インバリアントＴ細胞によるＩＬ−４産生を示すグラフである。これらの細胞をα−ＧａｌＣｅｒで増殖させた後に、緩衝液、プレートに結合させた６Ｂ１１抗体で刺激するか、Ｈｅｌａ／ＣＤ１ｄ形質移入体と共培養するか、またはＰＨＡで刺激した。分泌されたＩＬ−４の量を標準的なＥＬＩＳＡ分析で決定した。
【図７Ａ〜７Ｃ】同じ健康なドナーの試料に由来する、６Ｂ１１およびα−ＧａｌＣｅｒによる、表現型的および機能的に同一なインバリアントＮＫ Ｔ細胞の増殖が同等であることを示すグラフである。「ＭｏＦｌｏ」で選別したＶα２４細胞を、α−ＧａｌＣｅｒをパルスした自家樹状細胞、６Ｂ１１モノクローナル抗体、または分裂促進因子（ＰＨＡ）で、約４週間ＩＬ−２のみで増殖させた。
【図８Ａ】末梢血試料に由来するバルクＴ細胞が３Ａ６抗体で認識されることを示すグラフである。
【図８Ｄ】６Ｂ１１抗体、３Ａ６抗体、または対照抗体で分析したリンパ球のゲーティングを示す細胞の前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）のグラフである。
【図８Ｂ、８Ｃ、および８Ｅ〜８Ｉ】インバリアントＮＫ Ｔ細胞クローンおよび系列が、３Ａ６抗体、６Ｂ１１抗体、またはアイソタイプの対照抗体で認識されることを示すグラフである。以上のインバリアントＮＫ Ｔ細胞のクローンおよび系列は、抗Ｖα２４モノクローナル抗体を用いて精製後に、α−ＧａｌＣｅｒを用いて増殖させた。図８Ｂ〜８Ｉでは同じ「ＭＴ」細胞系を分析した。３Ａ６抗体または６Ｂ１１抗体、および抗ｍＩｇ−ＦＩＴＣを用いた間接的（１色）ＦＡＣＳ解析で、純粋なヒトインバリアントＮＫ Ｔ細胞クローンおよび細胞系が、対照Ｔ細胞と比べて特異的に認識されることがわかる。
【図９】健康なドナーの全末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に由来するインバリアントＮＫ Ｔ細胞系のＦＡＣＳ解析を示すグラフである。このような細胞をＭｏＦｌｏ ＦＡＣＳで６Ｂ１１−ＦＩＴＣとともに選別し、約６週間増殖させた後に２色ＦＡＣＳ解析を行った。増殖後、細胞の２１％がＶα２４＋であった（増殖前は〜０．１％）。以上の結果を図１２〜１７にまとめた。
【図１０Ａ〜１０Ｈ】６Ｂ１１抗体磁気ビーズによる選別に由来する、インバリアントＮＫ Ｔ細胞系のＦＡＣＳ解析を示すグラフである。健康なドナーの全ＰＢＭＣに由来するインバリアントＮＫ Ｔ細胞を、ダイナルまたはミルテニ磁気ビーズ免疫親和性精製により、６Ｂ１１とともに全ＰＢＭＣから選別し、約６週間の増殖後に２色ＦＡＣＳ解析を行った。この結果を図１２〜１７にまとめた。
【図１１Ａ〜１１Ｆ】６Ｂ１１抗体磁気ビーズ選別に由来する、インバリアントＮＫ Ｔ細胞系のＦＡＣＳ解析を示すグラフである。健康なドナーの全ＰＢＭＣに由来するインバリアントＮＫ Ｔ細胞を、ダイナル磁気ビーズ免疫親和性精製により６Ｂ１１とともに選別し、記載の手順で全ＰＢＭＣから処理し、約６週間かけて増殖させた後に２色ＦＡＣＳ解析を行った。この結果を図１２〜１７にまとめた。
【図１２】Ｔ細胞用培地中における４〜８週間の１回の増殖の後に記載の抗体で染色されたＴ細胞の割合（％）を示す表である。「ＰＢＭＣ」カラムは、増殖前に選別されなかったＰＢＭＣ細胞を意味する。「ダイナル＠４０」カラムは、増殖前に６Ｂ１１−ダイナルビーズで精製されたＰＢＭＣ細胞を意味する。「ミルテニ＠２０」カラムは、増殖前に６Ｂ１１（２０ μｇ／ｍＬ コーティング）−ミルテニビーズを用いて選別されたＰＢＭＣ細胞を意味する。比較する目的で、選別されなかった全リューコパック（ｌｅｕｋｏｐａｋ）２１（ＬＫＰ ２１）細胞に関する、対応する結果を示す。図１２〜１７では、１０％ ＦＢＳおよび１００ Ｕ／ｍＬのヒト組換え型ＩＬ−２を添加した、ＲＰＭＩ−１６４０またはバイオウィタッカー（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）培地などの標準的なＴ細胞培地を使用した。
【図１３】６Ｂ１１−ダイナルビーズを用いた精製、およびＴ細胞用培地における４〜８週の１回の増殖の後に、記載の抗体で染色されたＴ細胞の割合（％）を示す表である。比較する目的で、選別されなかった全リューコパック １０ （ＬＫＰ １０）細胞に関する対応する結果を示す。この表に示す通り、Ｔ細胞の増殖の一部は、ＩＬ−７ （１０ ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−５ （１０ ｎｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（「Ｄｅｘ」）（１ μＭ）、および／または６Ｂ１１ 抗体（４０ μｇ／ｍＬ）を含むＴ細胞用培地（「ＴＣＭ」）の存在下で行った。表の右側に記した図の番号は、Ｔ細胞の増殖で得られた結果を示す図を意味する。
【図１４】Ｔ細胞培地中における１回の４〜８週の増殖後に、指定抗体で染色されるＴ細胞の割合（％）を示す表である。比較する目的で、選別されなかった全リューコパック １４（ＬＫＰ １４）細胞に関する対応する結果を示す。増殖前に６Ｂ１１−ダイナルビーズとともに選別された細胞の結果は、選別されなかった対照細胞と同等である。表に示す通り、Ｔ細胞増殖の一部は、上述の６Ｂ１１抗体、ＰＨＡ （１ μｇ／ｍＬ）、および／または同数の自家ＡＰＣの存在下で実施した。
【図１５】Ｔ細胞培地中における１回の４〜８週の増殖後に、指定抗体で染色されるＴ細胞の割合（％）を示す表である。増殖前に６Ｂ１１−ダイナルビーズとともに選別された細胞の結果は、選別されなかった対照細胞（ＬＫＰ １３）と同等である。Ｔ細胞増殖の一部は、上述の通り、６Ｂ１１抗体、ＰＨＡ、同種ＡＰＣ、および／または自家ＡＰＣの存在下で実施した。
【図１６】選別されなかった対照細胞（ＬＫＰ ２）と比較したときの、６Ｂ１１−ミルテニ磁気ビーズ、およびＴ細胞培地中における１回の４〜８週の増殖を用いた精製後に、指定抗体で染色されるＴ細胞の割合（％）を示す表である。以上のＴ細胞の増殖は、上述の通り、自家ＡＰＣの存在下で実施した。Ｔ細胞の増殖の１回では、１０ ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７およびＩＬ−１５も存在していた。
【図１７】６Ｂ１１−ミルテニ磁気ビーズ、およびＴ細胞培地中における１回の４〜８週の増殖を用いた精製後に、指定抗体で染色されるＴ細胞の割合（％）を示す別の表である。これらのＴ細胞の増殖は、自家ＡＰＣおよびＰＨＡの存在下で実施し、選別されなかった対照細胞（ＬＫＰ １１、１２）と比較した。Ｔ細胞の増殖中、６Ｂ１１抗体、および／またはＶα２４抗体も上述の通り、また表に示す通りに存在していた。Ｔ細胞の増殖の１回では、１０ ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７およびＩＬ−１５も存在していた。表の左側に示した図の番号は、Ｔ細胞の増殖で得られた結果を示す図を意味する。
【図１８】ビオチン化６Ｂ１１抗体およびストレプトアビジンを結合させた磁気ビーズで精製した、Ｔ細胞系のＦＡＣＳ解析を示すグラフである。
【図１９Ａ〜１９Ｅ】Ｖα２４−ＰＥ、およびＶβ１１−ＦＩＴＣ （図１９Ａ〜１９Ｃ）または６Ｂ１１−ＦＩＴＣ抗体（図１９Ｄ〜１９Ｆ）のいずれかを用いた２色フローサイトメトリーで解析した、健康なドナーの末梢血（図１９Ｂおよび１９Ｅ）、または前立腺癌患者の末梢血（図１９Ｃおよび１９Ｆ）、またはＮＫ Ｔ細胞系（図１９Ａおよび１９Ｄ）のフローサイトメトリー解析を示すグラフである。ＮＫ Ｔ細胞系は、健康なドナーに由来するＶα２４で精製した、細胞のα−ＧａｌＣｅｒによる増殖で生じた。
【図２０Ａおよび図２０Ｂ】ＰＨＡ（図２０Ａ）、もしくはα−ＧａｌＣｅｒおよび自家ＰＢＭＣフィーダー（図２０Ｂ）を用いた３週間の増殖後に、Ｖα２４で選別した細胞の、Ｖα２４−ＰＥおよびＶβ１１−ＦＩＴＣモノクローナル抗体を使用した２色フローサイトメトリー解析を示すグラフである。図２０Ｃおよび２０Ｄは、抗ＣＤ１ｄモノクローナル抗体（５１．１、１０ μｇ／ｍｌ）、またはアイソタイプの対照抗体のいずれかの存在下において、ＰＨＡで刺激されたインバリアントＮＫ Ｔ細胞系、または偽トランスフェクトした、もしくはＣＤ１ｄをトランスフェクトしたＣ１ＲヒトＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞で刺激された、それぞれＩＬ−４およびＩＦＮ−γの産生を示す棒グラフである。図２０Ａ〜２０Ｄの結果は、後述するように、複数の健康なドナーの代表である。
【図２１】図２１Ａ〜Ｃは、健康なドナーに対して、前立腺癌患者に由来するインバリアントＮＫ Ｔ細胞の増殖が低下したことを示すグラフである。健康なドナー（図２１Ａ）、進行性前立腺癌患者（図２１Ｂ）、および寛解中の前立腺癌患者（図２１Ｃ）に由来する、α−ＧａｌＣｅｒで増殖させたインバリアントＮＫ Ｔ細胞を、Ｖα２４−ＰＥおよびＶβ１１−ＦＩＴＣによる染色で分析した。図２１Ｄは、一連の（≧６）ドナーに由来する、α−ＧａｌＣｅｒによる増殖後におけるＶα２４＋Ｖβ１１＋細胞（平均および標準偏差）の割合（％）を示す棒グラフである。この結果は、図１２〜１７でもまとめられている。
【図２２Ａ〜２２Ｅ】前立腺癌患者に由来するインバリアントＮＫ Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ反応がないことを示すグラフである。図２２Ａおよび２２Ｂは、前立腺癌患者と健康なドナーに由来するインバリアントＮＫ Ｔ細胞系にそれぞれ由来する、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γの産生を示す。図２２Ｃおよび２２Ｄは、それぞれ一連の進行性前立腺癌患者（●）および健康なドナー（□）に由来する、ＣＤ１ｄで刺激したインバリアントＮＫ Ｔ細胞、およびＰＨＡで刺激したバルクＴ細胞によるサイトカイン産生の結果をまとめたグラフである。図２２Ｅは、健康なドナーおよび進行性前立腺癌患者に由来する、インバリアントＮＫ Ｔ細胞（上）、または典型的なバルクＴ細胞（下）のＩＦＮ−γ／ＩＬ−４比（平均および標準偏差）を示すグラフである。「癌＋ＩＬ−１２」は、インビトロにおいてＩＬ−１２で処理した進行性前立腺癌患者に由来する試料である。
【図２３】ＨＩＶ患者におけるＣＤ１ｄ拘束Ｔ細胞の出現頻度を決定する際の、６Ｂ１１抗体の用途を示す表である。
【図２４】糖尿病患者におけるＣＤ１ｄ拘束Ｔ細胞の出現頻度を決定する際の、６Ｂ１１抗体および抗Ｖα２４ 抗体の用途を示す表である。
【図２５Ａ】ＮＫ Ｔ細胞クローンＭＥ１０とＧＷ４とで示差的に発現される遺伝子を示す表である。１１個の遺伝子機能性カテゴリーに関する、６個の発現クラスターを構成する遺伝子を示す。個々の遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（またはＨＴ表記についてはＴＩＧＲ識別子）で示されており、それに続いて一般名および所属の特定のクラスターが示されている（行、列）。
【図２５Ｂ】不調和な（ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ）発現が観察されている細胞表現型と一致している、同定された転写物のモデルの略図である。イラストで表した絵は、転写物が明瞭に規定された細胞内における役割を有し、ＧＷ４とＭＥ１０とで不調和な発現が、確立された表現型上の差と相関する遺伝子を示す。これらの遺伝子は、ＰＩ−３キナーゼ、特に細胞生存を調節する複数の遺伝子の下流にあるか、またはカルシウムの流入およびカルシウムで調節される遺伝子転写に関して直接必要とされることで、関連している。ＧＷ４（休止、活性化）およびＭＥ１０（休止、活性化）に対する抗ＣＤ３処置によって、有意に変化したｍＲＮＡ分子／数百万個の遺伝子の平均コピー数は、それぞれＩｔｋ、（４９、１１５）および（２５、１９）；ＧＡＴＡ３、（１３、２６）および（８、１１）；Ｊｕｎ−Ｂ、（１５、１１８）および（１４、３０）；Ｊｕｎ−Ｄ、（１０７、２９１）および（６８、１３０）；ＮＦＡＴ４、（３３、３５）および（６４、２６）；ＳＴＡＴ４、（３６、２９）および（７６、３６）；１４−３−３、（２４、４５）および（８３、４１）；Ｂｃｌ−ＸＬ、（１１、５０）および（６、７）；ならびにＩＡＰ、（１４、２１１）および（１０、４１）であった。ＭＷ１０に対するＧＷ４（ＧＷ４、ＭＥ１０）に関する発現が構成的であったが、不調和であった選択された遺伝子群は、ＮＫＲ−Ｐ１Ａ、（２９、４５９）；およびＳＴＡＴ１、（２７、７９）であった。
【図２６Ａ〜２６Ｄ】活性型Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞における転写の誘導、ならびにサイトカインおよび細胞融解性酵素の放出を示すグラフである。図２６Ａおよび２６Ｂでは、Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞クローンＧＷ４ （ＩＬ−４＋）クローンとＭＥ１０ （ＩＬ−４−ヌル）クローン間における、サイトカインおよびケモカインの遺伝子の発現の変化を比較している。個々の転写物について、抗ＣＤ３で誘導されたハイブリダイゼーションの強度を示す。ＲＮＡを単離し、増幅し、かつ免疫学的関心対象の２５０個の遺伝子に対するプローブを並べたジーンチップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）とハイブリッドを形成させた。このチップは、個々の特定の転写物を検出するためのアドレス特性の数を増やすことで、定量分析用に特別設計されている。ＩｇＧ１対照による処置後の数百万個当たりの特定のｍＲＮＡのコピー数の数値を白丸（○）で示し、抗ＣＤ３処置による活性化後における対応コピー数を黒丸（●）で示す。遺伝子発現アルゴリズムで有意に異なると判定され、また少なくとも２倍変化した遺伝子を太字で表す。文字（Ａ）は、転写物が検出されなかったことを意味し、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βの転写物が、クローンＭＥ１０において抗ＣＤ３刺激で抑制されたことに留意すべきである。図２６Ｃは、定量ＥＬＩＳＡ分析に基づく、複数のＶα２４ＪαＱ Ｔ細胞クローンに由来する、上清から産生されたサイトカインの量を示すグラフである。図２６Ｄは、ＣＤ４０Ｌの発現を示すグラフである。Ｔ細胞クローンＢＷ５は、ＰＭＡ／イオノマイシン刺激により４時間にわたって活性化され、フローサイトメトリーで解析された。
【図２７Ａおよび２７Ｂ】ＣＤ１ｄによるＶα２４ＪαＱ Ｔ細胞の活性化の拘束を示す。図２７Ａは、サイトカインの放出および増殖の拘束を示す。Ｔ細胞クローンを、（ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、もしくはＣＤ１ｄを発現する）Ｃ１Ｒ形質移入体、またはプレートに結合させた抗ＣＤ３と共培養した。分泌されたＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、または増殖は、本発明に記載された手順で調べた。図２７Ｂは、細胞溶解が制限されることを示す。Ｃ１Ｒ形質移入体のパネルは、標準的な４時間の５１Ｃｒ−遊離アッセイ法で、Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞クローンによる細胞溶解に関してスクリーニングを行った。
【図２８Ａ】培養樹状細胞のフローサイトメトリー解析に基づく、骨髄系樹状細胞上におけるＣＤ１ｄ発現のグラフである。
【図２８Ｂ】樹状細胞と、（ＣＤ１ａまたはＣＤ１ｄを発現する）対照Ｃ１Ｒ形質移入細胞の免疫ブロット分析の写真である。
【図２８Ｃ〜２８Ｊ】代表的な反応性リンパ節生検（計１０回の生検）の一連の切片を免疫化学的に染色した写真である。図２８Ｃは、低出力におけるヘマトキシリン−エオシン染色の写真であり、図２８Ｄは、抗ＣＤ３染色の写真である。四角で囲んだ部分は、図２８Ｅおよび２８Ｆで高倍率で示した連続切片を、さまざまなマーカーによる染色用に採取した領域の境界を示す（図２８Ｅ、Ｓ１００；図２８Ｆ、ＣＤ１ｄ；図２８Ｇ、ＣＤ１ａ；図２８Ｈ、ＣＤ３４）。リンパ洞組織球の染色（図２８Ｉおよび２８Ｋ）、ならびに傍濾胞領域（図２８Ｌおよび２８Ｍ）：ヘマトキシリン−エオシン（図２８Ｉおよび２８Ｌ）；ＣＤ６８、マクロファージマーカー、（図２８Ｊおよび２８Ｍ）；ならびにＣＤ１ｄ（図２８Ｋおよび２８Ｎ）を示す。
【図２９Ａ〜２９Ｄ】Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞による骨髄系樹状細胞の細胞溶解の特徴を示すグラフである。図２９は、クロム遊離アッセイ法におけるＶα２４ＪαＱ Ｔ細胞クローンＧＷ４による、未成熟樹状細胞および成熟樹状細胞の同種溶解を示すグラフである。ドナーのハプロタイプは、１）クローンＧＷ４、Ａ２、Ａ２４、Ｂ８、Ｂ３８、Ｃｗ７、ＤＲ３、ＤＱ２；２）ＤＣドナーＭ、Ａ２、Ａ６８、Ｂ７、Ｂ４５、Ｃｗ６、Ｃｗ１５；３）ＤＣドナーＯ、Ａ２、Ａ２４、Ｂ４６、Ｂ６０、ＤＲ１４、ＤＲｗ５２、ＤＱ１；５）ドナーＢ、Ａ１、Ａ３、Ｂ７、Ｂ８、ＤＲＢ１＊１５０１、ＤＲＢ５＊０１０１、ＤＱＢ１＊０６０１であった。図２９Ｂと２９Ｃは、Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞クローンによる樹状細胞の自家および同種の細胞溶解のグラフである。図２９Ｄは、細胞溶解のカルシウムキレートによる抑止、および抗ＣＤ１ｄモノクローナル抗体４２．１の付加による抑制のグラフである。クローンＢＷ３およびＢＷ５を、ＥＧＴＡおよびＭｇＣｌ２ （各４ ｍＭ）、またはモノクローナル抗体４２．１もしくは対照ＩｇＧ （１００ μｇ／ｍｌ）に由来するＦ（ａｂ’）２断片の存在下または非存在下で、被験者のＢＷ ＤＣと共培養した。図２９Ｅは、Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞クローンＯＹ３およびＢＷ５と自家ＤＣとの共培養後における、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γの分泌を示す棒グラフである。
【図３０】ＣＤ１ｄ拘束Ｔ細胞と骨髄系樹状細胞との相互作用を示すモデルの略図である。インバリアントＶα２４ＪαＱ Ｔ細胞が活性化すると、骨髄系樹状細胞の動員および活性化に重要なサイトカインおよびケモカインが分泌される。また、重要な細胞表面補助刺激分子も発現される。骨髄系樹状細胞が成熟すると、ＣＤ１ｄの発現が促進され、ＣＤ１ｄ拘束Ｔ細胞が活性化される。サイトカインおよびケモカインが分泌されることに加えて、活性化されたＶα２４ＪαＱ Ｔ細胞は、パーフォリン、グランザイムＢ、およびグラニュリシン（Ｇｒａｎｕｌｙｓｉｎ）の発現を促進する。これらの分子のＣＤ１ｄに依存性の分泌により、骨髄系樹状細胞の溶解が起こる。
【図１】
2004501165.tif 000012
【図２】
2004501165.tif 000013
【図３】
2004501165.tif 000014
【図４】
2004501165.tif 000015
【図５】
2004501165.tif 000016
【図６】
2004501165.tif 000017
【図７】
2004501165.tif 000018
【図８Ａ】
2004501165.tif 000019
【図８Ｂ】
2004501165.tif 000020
【図８Ｃ】
2004501165.tif 000021
【図８Ｄ】
2004501165.tif 000022
【図８Ｅ】
2004501165.tif 000023
【図８Ｆ】
2004501165.tif 000024
【図８Ｇ】
2004501165.tif 000025
【図８Ｈ】
2004501165.tif 000026
【図８Ｉ】
2004501165.tif 000027
【図９】
2004501165.tif 000028
【図１０】
2004501165.tif 000029
【図１１】
2004501165.tif 000030
【図１２】
2004501165.tif 000031
【図１３】
2004501165.tif 000032
【図１４】
2004501165.tif 000033
【図１５】
2004501165.tif 000034
【図１６】
2004501165.tif 000035
【図１７】
2004501165.tif 000036
【図１８】
2004501165.tif 000037
【図１９】
2004501165.tif 000038
【図２０】
2004501165.tif 000039
【図２１】
2004501165.tif 000040
【図２２】
2004501165.tif 000041
【図２３】
2004501165.tif 000042
2004501165.tif 000043
2004501165.tif 000044
2004501165.tif 000045
【図２４】
2004501165.tif 000046
【図２５Ａ】
2004501165.tif 000047
2004501165.tif 000048
【図２５Ｂ】
2004501165.tif 000049
2004501165.tif 000050
【図２６Ｃ】
2004501165.tif 000051
【図２６Ｄ】
2004501165.tif 000052
【図２７】
2004501165.tif 000053
【図２８】
2004501165.tif 000054
【図２９】
2004501165.tif 000055
【図３０】
2004501165.tif 000056
【国際公開パンフレット】
2004501165.tif 000057
2004501165.tif 000058
2004501165.tif 000059
2004501165.tif 000060
2004501165.tif 000061
2004501165.tif 000062
2004501165.tif 000063
2004501165.tif 000064
2004501165.tif 000065
2004501165.tif 000066
2004501165.tif 000067
2004501165.tif 000068
2004501165.tif 000069
2004501165.tif 000070
2004501165.tif 000071
2004501165.tif 000072
2004501165.tif 000073
2004501165.tif 000074
2004501165.tif 000075
2004501165.tif 000076
2004501165.tif 000077
2004501165.tif 000078
2004501165.tif 000079
2004501165.tif 000080
2004501165.tif 000081
2004501165.tif 000082
2004501165.tif 000083
2004501165.tif 000084
2004501165.tif 000085
2004501165.tif 000086
2004501165.tif 000087
2004501165.tif 000088
2004501165.tif 000089
2004501165.tif 000090
2004501165.tif 000091
2004501165.tif 000092
2004501165.tif 000093
2004501165.tif 000094
2004501165.tif 000095
2004501165.tif 000096
2004501165.tif 000097
2004501165.tif 000098
2004501165.tif 000099
2004501165.tif 000100
2004501165.tif 000101
2004501165.tif 000102
2004501165.tif 000103
2004501165.tif 000104
2004501165.tif 000105
2004501165.tif 000106
2004501165.tif 000107
2004501165.tif 000108
2004501165.tif 000109
2004501165.tif 000110
2004501165.tif 000111
2004501165.tif 000112
2004501165.tif 000113
2004501165.tif 000114
2004501165.tif 000115
2004501165.tif 000116
2004501165.tif 000117
2004501165.tif 000118
2004501165.tif 000119
2004501165.tif 000120
2004501165.tif 000121
2004501165.tif 000122
2004501165.tif 000123
2004501165.tif 000124
2004501165.tif 000125
2004501165.tif 000126
2004501165.tif 000127
2004501165.tif 000128
2004501165.tif 000129
2004501165.tif 000130
2004501165.tif 000131
2004501165.tif 000132
2004501165.tif 000133
2004501165.tif 000134
2004501165.tif 000135
2004501165.tif 000136
2004501165.tif 000137
2004501165.tif 000138
2004501165.tif 000139
2004501165.tif 000140
2004501165.tif 000141
2004501165.tif 000142
2004501165.tif 000143
2004501165.tif 000144
2004501165.tif 000145
2004501165.tif 000146
2004501165.tif 000147
2004501165.tif 000148
2004501165.tif 000149
2004501165.tif 000150
2004501165.tif 000151
2004501165.tif 000152
2004501165.tif 000153
2004501165.tif 000154
2004501165.tif 000155
2004501165.tif 000156
2004501165.tif 000157
2004501165.tif 000158
2004501165.tif 000159
2004501165.tif 000160
2004501165.tif 000161
2004501165.tif 000162
2004501165.tif 000163
2004501165.tif 000164
2004501165.tif 000165
2004501165.tif 000166
2004501165.tif 000167
2004501165.tif 000168
2004501165.tif 000169
2004501165.tif 000170
2004501165.tif 000171
2004501165.tif 000172
2004501165.tif 000173
2004501165.tif 000174
2004501165.tif 000175
2004501165.tif 000176
2004501165.tif 000177
2004501165.tif 000178
2004501165.tif 000179
2004501165.tif 000180
2004501165.tif 000181
2004501165.tif 000182
2004501165.tif 000183
2004501165.tif 000184
2004501165.tif 000185
2004501165.tif 000186
2004501165.tif 000187
2004501165.tif 000188
2004501165.tif 000189
2004501165.tif 000190
2004501165.tif 000191
2004501165.tif 000192
2004501165.tif 000193
2004501165.tif 000194
2004501165.tif 000195
2004501165.tif 000196
2004501165.tif 000197
2004501165.tif 000198
2004501165.tif 000199
2004501165.tif 000200
2004501165.tif 000201
2004501165.tif 000202
2004501165.tif 000203
2004501165.tif 000204
2004501165.tif 000205
2004501165.tif 000206
2004501165.tif 000207
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004501165.tif 000208
2004501165.tif 000209
【国際調査報告】
2004501165.tif 000210
2004501165.tif 000211
2004501165.tif 000212
2004501165.tif 000213
2004501165.tif 000214