(57)【要約】キバナオウギ（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ）、特にキバナオウギの根から調製した、アラビノース：ガラクトースの比率が、３．５：１以下または酸修飾前の該組成物中のアラビノガラクタンタンパク質成分のアラビノース：ガラクトースの比率の８０％以下である酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物は、液体に戻して水性静脈内注射用製剤にすることができる；該組成物は、哺乳動物に静脈内投与すると、哺乳動物における造血の刺激、巨核球の増殖または成熟の誘発、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦの産生の刺激、好中球の産生または作用の刺激、好中球減少、貧血または血小板減少の治療、細胞障害性作用剤または放射線への被爆（偶発的または非治療的ならびに治療的被爆）からの回復の促進、悪液質、嘔吐または薬物禁断症状の治療、もしくはＢ型肝炎における生体応答の緩和または肝細胞の保護に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キバナオウギ（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ）、特にキバナオウギの根から調製した、アラビノース：ガラクトースの比率が、３．５：１以下または酸修飾前の該組成物中のアラビノガラクタンタンパク質成分のアラビノース：ガラクトースの比率の８０％以下である酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物。
【請求項２】
Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓが、Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ Ｂｇｅ． ｖａｒ． ｍｏｎｇｈｏｌｉｃｕｓ （Ｂｇｅ．） Ｈｓｉａｏ または Ａ． ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ （Ｆｉｓｃｈ．） Ｂｇｅ． （Ｆａｂａｃｅａｅ）である赤血球記載の酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物。
【請求項３】
中国領内蒙古自治区または中華人民共和国山西省に生育するキバナオウギ植物の根から単離される請求項１または２記載の酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物。
【請求項４】
キバナオウギ植物が、２年もののキバナオウギ植物である請求項１〜３のいずれか１つに記載の酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物。
【請求項５】
重量平均分子量が、少なくとも１００キロダルトンである請求項１〜４のいずれか１つに記載の酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物。
【請求項６】
少なくとも８０重量％の炭水化物および２重量％以下のタンパク質を含む請求項１〜５のいずれか１つに記載の酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物。
【請求項７】
アラビノース：ガラクトースの比率が３．０：１以下である請求項１〜６のいずれか１つに記載の酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物。
【請求項８】
Ｅｎｄｏｓｐｅｃｙアッセイによるエンドトキシン含量が、１．０ＥＵ／ｍｇ以下である請求項１〜７のいずれか１つに記載の酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物。
【請求項９】
液体に戻した場合のｐＨが４〜７である請求項１〜８のいずれか１つに記載の酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物。
【請求項１０】
（ａ）請求項１〜９のいずれか１つに記載の酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物；および（ｂ）水性注射用賦形剤；を含む水性注射用酸修飾アラビノガラクタンタンパク質製剤。
【請求項１１】
有効量の請求項１〜９のいずれか１つに記載の酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物または請求項１０記載の水性注射用酸修飾アラビノガラクタンタンパク質製剤を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における請求項１〜９のいずれか１つに記載の酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物の投与によって治療できる疾患の治療方法。
【請求項１２】
方法が、造血を刺激、巨核球の増殖または成熟を誘発、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦの産生を刺激、好中球の産生または作用を刺激、好中球減少、貧血または血小板減少を治療、細胞障害性作用剤または放射線への被爆（偶発的または非治療的ならびに治療的被爆）からの回復を促進、悪液質、嘔吐または薬物禁断症状を治療、ウイルス、細菌、真菌および他の感染に対する、および他の免疫抑制状態における免疫応答を回復または刺激、もしくはＢ型肝炎における肝細胞を保護する方法である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
方法が、造血を刺激、巨核球の増殖または成熟を誘発、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦの産生を刺激、好中球の産生または作用を刺激、もしくは好中球減少、貧血または血小板減少を治療する方法である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物が、ヒトである請求項１１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５】
哺乳動物が、骨髄抑制に苦しんでいる請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
骨髄抑制が、ガンの化学療法または放射線療法の結果である請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１種の他の治療薬を投与することをさらに含む請求項１１〜１６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１種の他の治療薬が、造血を刺激することができる治療薬である請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１種の他の治療薬が、エリスロポエチン、スロンボポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子またはＩＬ−３から選ばれる請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜９のいずれか１つに記載の酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物または請求項１０記載の水性注射用酸修飾アラビノガラクタンタンパク質製剤の投与によって治療できる哺乳動物の疾患の治療用医薬組成物の製造における、請求項１〜９のいずれか１つに記載の酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物または請求項１０記載の水性注射用酸修飾アラビノガラクタンタンパク質製剤の使用。
【請求項２１】
治療が、造血の刺激、巨核球の増殖または成熟の誘発、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦの産生の刺激、好中球の産生または作用の刺激、好中球減少、貧血または血小板減少の治療、細胞障害性作用剤または放射線への被爆（偶発的または非治療的ならびに治療的被爆）からの回復の促進、悪液質、嘔吐または薬物禁断症状の治療、ウイルス、細菌、真菌および他の感染に対する、および他の免疫抑制状態における免疫応答の回復または刺激、もしくはＢ型肝炎における肝細胞の保護である請求項２０記載の使用。
【請求項２２】
治療が、造血の刺激、巨核球の増殖または成熟の誘発、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦの産生の刺激、好中球の産生または作用の刺激、もしくは好中球減少、貧血または血小板減少の治療である請求項２０または２１記載の使用。
【請求項２３】
哺乳動物の疾患が、骨髄抑制を含む請求項２０〜２２のいずれか１つに記載の使用。
【請求項２４】
骨髄抑制が、ガンの化学療法または放射線療法の結果である請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
医薬組成物が、少なくとも１つの他の治療薬との共投与のために意図される請求項２０〜２４のいずれか１つに記載の使用。
【請求項２６】
少なくとも１種の他の治療薬が、造血を刺激することができる治療薬である請求項２５記載の使用。
【請求項２７】
少なくとも１種の他の治療薬が、エリスロポエチン、スロンボポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子またはＩＬ−３から選ばれる請求項２６記載の使用。
【請求項２８】
（ａ）キバナオウギから抽出したアラビノガラクタンタンパク質組成物を水性酸で処理し、該組成物のアラビノガラクタンタンパク質成分のアラビノガラクタン分枝のトランケーションを引き起こし、アラビノース：ガラクトースの比率を３．５：１以下または酸修飾前の該組成物中のアラビノガラクタンタンパク質成分のアラビノース：ガラクトースの比率の８０％以下に引き下げ；次いで
（ｂ）ステップ（ａ）からの生成物から酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物を精製すること；
を含む請求項１〜９のいずれか１つに記載の酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物の製造方法。
【請求項２９】
（ａ）キバナオウギから抽出されたアラビノガラクタンタンパク質組成物を精製し；次いで
（ｂ）ステップ（ａ）からの生成物を水性酸で処理し、該組成物のアラビノガラクタンタンパク質成分のアラビノガラクタン分枝のトランケーションを引き起こし、アラビノース：ガラクトースの比率を３．５：１以下または酸修飾前の該組成物中のアラビノガラクタンタンパク質成分のアラビノース：ガラクトースの比率の８０％以下に引き下げること；
を含む請求項１〜９のいずれか１つに記載の酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物の製造方法。
【請求項３０】
水性酸が、塩酸である請求項２８または２９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
背景技術
（技術分野）
本発明は、アラビノガラクタンに関する。さらに詳しくは、本発明は、キバナオウギ（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ）、特にキバナオウギの根から調製した、アラビノース：ガラクトースの比率が、３．５：１以下または酸修飾前の該組成物中のアラビノガラクタンタンパク質成分のアラビノース：ガラクトースの比率の８０％以下である酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物に関する。
【０００２】
（関連技術の記載）
オウギ（黄耆）（ゲンゲ属の根）は、Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ Ｂｇｅ． ｖａｒ． ｍｏｎｇｈｏｌｉｃｕｓ （Ｂｇｅ．） Ｈｓｉａｏ または Ａ． ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ （Ｆｉｓｃｈ．） Ｂｇｅ． （Ｆａｂａｃｅａｅ）の乾燥根である。オウギは、伝統的な中国医学において非常に古く、よく知られている生薬である。オウギ、中国薬局方に公式に記載されており、主として強壮薬として、および腎炎または糖尿病の治療用に用いられている。オウギは、通例、単独で、または柴華栄（シカロン：薬用植物ムラサキとセンキュウを組合せたもの）および人参養栄湯（レンシェンヤンロンタン：オウギを含む十二種類の薬草を組合せたもの）など他の漢方薬における植物とともに、抽出液または“茶”として用いられる［Ｔｈｅ ｓｅｃｔｉｏｎ ｅｎｔｉｔｌｅｄ ”Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ （Ｆｉｓｃｈ．） Ｂｇｅ．”， Ｓｅｃｔｉｏｎ ２６， ｐａｇｅｓ １９１−１９７， ｏｆ ”Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｄｒｕｇｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｏｒｉｇｉｎ”， Ｗ． Ｔａｎｇ および Ｇ． Ｅｉｓｅｎｂｒａｎｄ編， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， ベルリン， １９９２］。
【０００３】
オウギの抽出液およびアルコール沈殿抽出液から調製した溶液はまた、注射による投与も行われており、胃潰瘍および十二指腸潰瘍の使用常を改善し、慢性白血球減少症における白血球数を増加することが報告されている［Ｔｈｅ ｓｅｃｔｉｏｎ ｅｎｔｉｔｌｅｄ ”Ｈｕａｎｇｑｉ”， ｐａｇｅｓ １０４１−１０４６， ｏｆ ”Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍａｔｅｒｉａ Ｍｅｄｉｃａ”， Ｈ．−Ｍ． Ｃｈａｎｇ および Ｐ． Ｐ．−Ｈ． Ｂｕｔ編， ＷｏｒｌｄＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， シンガポール， １９８７］。オウギ抽出液の精製低分子量フラクション（たとえば、２５０００〜３５０００ＭＷ）およびオウギ含有薬用植物混合物の抽出液はまた、局所的異種対宿主性移植片反応において免疫系を回復させる活性［Ｄ．−Ｔ． Ｃｈｕら，”Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｈｅｒｂｓ． Ｉ．．．．”， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｌａｂ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２５，１１９−１２３ （１９８８）］、シクロホスファミド誘発免疫抑制を逆転させる活性［Ｄ．−Ｔ． Ｃｈｕら，”Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｈｅｒｂｓ． ＩＩ．．．．”， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｌａｂ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２５，１２５−１２９ （１９８８）］、ｒＩＬ−２によって生成したＬＡＫ細胞障害性を潜在化させる活性［Ｄ．−Ｔ． Ｃｈｕら，”Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ．”， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｌａｂ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２５， １８３−１８７ （１９８８）］、免疫抑制マウスにおいて免疫応答を強化する活性［Ｋ． Ｓ． Ｚｈａｏら， ”Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ ｅｘｔｒａｃｔｓ”， Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， ２０，２２５−２３４ （１９９０）］、単核細胞において応答を刺激する活性［Ｙ． Ｓｕｎら，”Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｈｅｒｂｓ．．．”， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ， ２，２２７−２３７ （１９８３）］およびマウスにおいて骨髄造血を刺激する活性［Ｍ． Ｒｏｕら，”Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｒａｄｉｘ ａｓｔｒａｇａｌｉ ｏｎ ｍｏｕｓｅ ｍａｒｒｏｗ ｈｅｍｏｐｏｉｅｓｉｓ”， Ｊ． Ｔｒａｄ． Ｃｈｉｎ． Ｍｅｄ．， ３ （３）， １９９−２０４ （１９８３）； Ｓ．−Ｉ． Ｍｉｕｒａら，”Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈｅｒｂａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．．．”， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ７ （１１）， ７７１−７８０ （１９８９） ；およびＹ． Ｏｈｎｉｓｈｉら， ”Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｊｕｚｅｎ−ｔａｉｈｏ−ｔｏｈ （ＴＪ−４８）．．．”， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ， １８，１８−２２ （１９９０）］も示している。
【０００４】
Ｌｉｕの米国特許第４８４３０６７号には、オウギ［Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ Ｂｇｅ．またはＡｓｔｒａｇａｌｕｓ ｇｕｍｍｉｆｅｒ Ｌａｂｉｌｌａｒｄから抽出可能であると記載されている］の多糖類およびトウキ（当帰）の多糖類を含有する医薬組成物が開示されている。オウギ多糖類は、根の粉末の水抽出およびエタノール沈殿によって抽出可能であると記載されている。Ｖｅｒｂｉｓｃａｒの米国特許第５２８６８４６７号には、“化学的およびコンほーメーション変化に対する多糖類の完全性を維持する”ために低温で調製された、植物Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｔｒａｇａｃａｎｔｈａ（ｔｒａｇａｃａｎｔｈ）由来の免疫調節性多糖類フラクションが開示されている。Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎらの米国特許第５３３６５０６号には、アラビノガラクタン（カラマツ、Ｌａｒｉｘ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓから単離されたもの）およびマンナンなどの植物多糖類を使用して、受容体媒介性エンドサイトーシスを起こす能力がある細胞受容体に対する治療薬のターゲッティングするために、治療薬との複合体を形成することが開示されている。Ａｄａｍｓらの米国特許第５１１６９６９号には、密度国バイオアベイラビリティ分離に用いるのに適していると言われる超微細アラビノガラクタン生成物が開示されている。Ｊｕｎｇらの米国特許第５４７８５７６号には、受容体媒介性エンドサイトーシスを起こす能力がある細胞受容体へ治療薬をデリバリーするのに用いるための精製アラビノガラクタン（これもＬａｒｉｘ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ由来のものである）、分解性生成物およびその修飾体が開示されている。Ｌｅｗｉｓの米国特許第５５８９５９１号には、まず低分子量カットオフ膜を通して停留液を保持し、次いで高分子量カットオフ膜を通して濾液を保持する限外濾過によって、各多糖類の不純体から調製されたアラビノガラクタン、デキストラン、マンナンおよびアラビアゴムなどのエンドトキシンを含まない多糖類が開示されている。
しかし、これらの各参考文献は、生成物中に存在する多糖類（たとえば、アラビノガラクタン）にその注意を充てており、アラビノガラクタンタンパク質を排除するように設計された技術を用いることさえもできる。
【０００５】
アラビノガラクタンタンパク質はまた、開花植物においても見出され、多くの高等植物に広く分布している。アラビノガラクタンペプチドと呼ばれることもあるアラビノガラクタンタンパク質（ＡＧＰｓ）は、高割合の炭水化物を含み、高タンパク質含量のＡＧＰｓも知られているが、通常は低タンパク質含量（１０％以下）のグリコシル化タンパク質である。植物から単離可能なヒドロキシプロリンリッチな糖タンパク質の間で、ＡＧＰｓは、その一般的に低いタンパク質含量およびβグルコシルＹａｒｉｖ試薬である１，３，５−トリス（４−β−グルコピラノシルオキシフェニルアゾ）−２，４，６−トリヒドロキシベンゼンに対するその一般的な結合能力によって特徴付けられる［Ｊ． Ｈ． Ｙａｒｉｖら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ， ８５，３８３−３８８ （１９６２）； Ｒ． Ｌ． Ａｎｄｅｒｓｏｎら， Ａｕｓｔ． Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ４，１４３−１５８ （１９７７）］。ＡＧＰｓは、乳化剤、結晶化予防剤および香味剤カプセル包入剤として食品に用いられる、アカシアの木であるＡｃａｓｉａ ｓｅｎｅｇａｌからの粘着性の滲出液であるアラビアゴムの成分である。Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｌａｔａ（ハナタバコ）， Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｐｌｕｍｂａｇｉｎａｆｏｌｉａおよびＰｙｒｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ（セイヨウナシ）からのＡＧＰ遺伝子の単離が、Ｃｈｅｎらの米国特許第５６４６０２９号に開示されている。ＡＧＰｓに関する広範囲にわたる議論が、Ｎｏｔｈｎａｇｅｌの”Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ”， Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｃｙｔｏｌｏｇｙ， １７４，１９５−２９１ （１９９７）に見られる。
本出願と通して引用されたこれらの文書および他の文書の記載内容は、全体を参考文献として本発明に援用される。
【０００６】
（発明の概要）
第１の態様において、本発明は、キバナオウギ（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ）、特にキバナオウギの根から調製した、アラビノース：ガラクトースの比率が、３．５：１以下または酸修飾前の該組成物中のアラビノガラクタンタンパク質成分のアラビノース：ガラクトースの比率の８０％以下である酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物を提供する。
【０００７】
第２の態様において、本発明は、治療上有効量の本発明の第１の態様の酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物および水性の注射可能な賦形剤を含む水性の注射可能な酸修飾アラビノガラクタンタンパク質製剤を提供する。
【０００８】
第３の態様において、本発明は、哺乳動物における造血を刺激、巨核球の増殖または成熟を誘発、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦの産生を刺激、好中球の産生または作用を刺激、好中球減少、貧血または血小板減少を治療、細胞障害性作用剤または放射線への被爆（偶発的または非治療的ならびに治療的被爆）からの回復を促進、悪液質、嘔吐または薬物禁断症状を治療、もしくはウイルス、細菌、真菌および他の感染に対する、または他の免疫抑制状態における免疫応答を回復または刺激、もしくはＢ型肝炎における肝細胞を保護するといったような本発明の第１の態様の酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物または本発明の第２の態様の酸修飾アラビノガラクタンタンパク質製剤の投与による哺乳動物の疾患状態の治療方法であって、必要に応じて、少なくとも１種の他の治療薬（造血を刺激することが可能な薬など）とともに、治療上有効量の本発明の第１の態様の酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物、特に本発明の第２の態様の水性の注射可能な酸修飾アラビノガラクタンタンパク質製剤を哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。
【０００９】
本発明の第４の態様において、本発明は、本発明の第１の態様の酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物および本発明の第２の態様の酸修飾アラビノガラクタンタンパク質製剤の製造方法を提供する。
【００１０】
（好ましい具体例の詳細な記載）
定義
「酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物」は、組成物が、３．５：１以下、好ましくは３．０：１以下のアラビノース：ガラクトースの比率を有するか、または酸修飾前の該組成物中のアラビノガラクタンタンパク質成分のアラビノース：ガラクトースの比率の８０％以下であるような条件下で酸処理を行なわれた「アラビノガラクタンタンパク質組成物」（下記に定義）である。
「アラビノガラクタンタンパク質」または「ＡＧＰ」は、一般に、βグルコシルＹａｒｉｖ試薬沈殿可能であり、炭水化物が分子量の少なくとも５０％を占め、主要な炭水化物成分がアラビノースおよびガラクトースであり、主として末端位にアラビノシル残基をもつ高度にグリコシル化されたタンパク質である。一般に、該タンパク質は、ＡＧＰｓに対するモノクローナル抗体であるＭＡＣ２０７特異的に反応する。
【００１１】
「アラビノガラクタンタンパク質組成物」は、組成物重量の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％のアラビノガラクタンタンパク質（前記と同意義）および関連アラビノガラクタンおよび他の多糖類を含む組成物である。
「哺乳動物」は、ヒトおよびコンパニオン・アニマル（ネコ、イヌなど）および農場動物（畜牛、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなど）などの非ヒト哺乳動物を含む。
「疾患」は、特に本明細書の「薬理および有用性」のセクションに挙げた疾患状態などの血液正常化効果が治療的であるような疾患状態などの医学療法に起因する不健康状態（副作用）などの動物の不健康状態を含む。
【００１２】
「医薬的に許容しうる賦形剤」は、一般的に、安全で、非毒性であり、望ましい医薬組成物の製造において有用な賦形剤を意味し、獣医用途ならびにヒトの医薬用途に容認できる賦形剤が含まれる。このような賦形剤は、固体、液体、半固体であってよく、エアロゾル組成物の場合、気体であってよい。
「治療上有効量」は、疾患を治療するために動物に投与した場合に、その疾患の治療を成し遂げるのに十分な量を意味する。
疾患を「治療すること」または「治療」は、その疾患に罹りやすいが、まだ経験していないか、または疾患の症状を表していない動物において、発症を予防すること（予防的治療）、疾患を抑制すること（その進行を遅延化するか、抑止すること）、疾患の症状または副作用からの開放を提供すること（緩和的治療を含む）および疾患を軽減すること（疾患の緩解を引き起こすこと）を含む。
【００１３】
酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物
本発明の酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物は、用語を上記で定義した、キバナオウギ（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ）、特にキバナオウギの根［Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ Ｂｇｅ． ｖａｒ． ｍｏｎｇｈｏｌｉｃｕｓ （Ｂｇｅ．） Ｈｓｉａｏ または Ａ． ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ （Ｆｉｓｃｈ．） Ｂｇｅ． （Ｆａｂａｃｅａｅ）の根が好ましい；中国領内蒙古自治区または中華人民共和国山西省に生育するキバナオウギ植物の根、特に前者が好ましい；二年もののキバナオウギ植物の根が好ましい］から単離されるアラビノガラクタンタンパク質組成物から製造される「酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物」である。該組成物は、Ａｒａ約３０〜６０モル％、詳しくは約３５〜５５％；Ｒｈａ約５〜１０％；ＧａｌＡ約５〜１５％；Ｇａｌ約２０〜３５％；およびＧｌｃ約１０％以下、特に約５％以下；Ａｒａ：Ｇａｌの比率が３．５：１以下、好ましくは３．０：１以下；灰分約２重量％以下；代表的な重金属含量約２０ｐｐｍ（重量）以下；およびヒドロキシプロリン含量約１．０％以下を含む典型的な糖組成を有する（メタノール化組成物のトリメチルシリル誘導体のＧＬＣによって決定）。該組成物は、実質的にエンドトキシンを含まず（すなわち、使用説明書にしたがってＥｎｄｏｓｐｅｃｙ［生化学工業株式会社、東京、日本］アッセイによって測定されるように、エンドトキシン含量が、１．０ＥＵ／ｍｇ以下、詳しくは０．８ＥＵ／ｍｇ以下、さらに詳しくは０．５ＥＵ／ｍｇ以下、特に詳しくは０．３ＥＵ／ｍｇ以下である）；少なくとも２００ｍｇ／ｍｌの水への溶解度をもち；水溶液のｐＨが４〜７である。便利なように、この物質を以降“ＡＭＣ”と呼ぶ。
【００１４】
該組成物の代表的な調製品においては、グリカンが、組成物の約８０重量％を構成し、残りをタンパク質および可能性として痕跡量の脂質が構成する。タンパク質コアは、ヒドロキシプロリンに富み、ヒドロキシプロリンがアミノ酸残基のほとんど２５％を構成する。酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物は、水溶液中でサイズ排除クロマトグラフィーに付すことにより、２つのサイズの種類に分けられる。組成物の約４０重量％を構成する大きいサイズの種類は、プルランサイジングスタンダードと比較して約３５０ｋＤａという分子量ピークをもち、小さいサイズの種類は、約７５ｋＤａという分子量ピークをもつ。コンピューターで計算した２つのサイズの種類の重量平均分子量は、約１２０ｋＤａ〜２６０ｋＤａであり、たとえば約２００ｋＤａの場合、計算した多分散は約１〜５、特に約１．５〜３．５である。
【００１５】
酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物の製造
酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物は、キバナオウギ（代表的には、乾燥根を刈り込み、精製水でこすり洗いし、７０％エタノールなどの消毒液で清浄化し、スライスし、次いで無菌条件下で乾燥することにより作成した清潔な乾燥根のチップまたは切片；飲用チップと呼ばれる）を、根からアラビノガラクタンタンパク質および関連多糖類の実質的な抽出を引き起こすのに必要または望ましい時間、温度、および多くの抽出サイクルにて（代表的には、１００℃にて３時間をそれぞれ３回）、熱湯（代表的には８０℃以上、特には９０℃以上、さらに特には約１００℃にて）で、必要に応じて、アルカリ金属塩、特にリン酸二水素カリウムまたはナトリウム（たとえば、ｐＨ４．５にて０．５ＭのＫＨ２ＰＯ４）などのコエキストラクタントの存在下で、抽出することによって製造される。好ましい製造においては、最初、熱い水性塩洗液（たとえば、ｐＨ４．５および１００℃にて０．５ＭのＫＨ２ＰＯ４）で飲用チップを洗浄煮沸し、洗液を捨てた後、抽出処理を行う。乾燥粉砕した根の製造に続くすべてのステップは、代表的には、滅菌した器具および試薬を用いる無菌条件下で行う。約１Ｌ／Ｋｇ“飲用チップ”の濃度まで、６０〜７０℃における減圧蒸発などによって熱湯抽出液を濃縮するか、または濃縮および限外濾過によって（１００ｋＤａ分子量カットオフ（１００ＫＭＷＣＯ）限外濾過（ＵＦ）システムを用いる限外濾過などによって）水への交換を同時に行い（抽出用水がコエキストラクタントを含む場合に好ましい）、次いで低級アルカノール（たとえば、エタノール濃度約３５％のエタノール）による沈殿などによって水溶性でない物質を除去処理する。低級アルカノール沈殿物（たとえば、３５％エタノール沈殿物）の上清をさらに、高濃度の低級アルカノール（たとえば、４０〜８０％エタノール、特に６０〜７０％エタノール）で沈殿させて、アラビノガラクタンタンパク質と関連多糖類を含む粗アラビノガラクタンタンパク質組成物を沈殿させる。沈殿を水に再溶解して、低級アルカノールの除去を助け、乾燥（代表的には、過熱を避けるために、スプレー乾燥または凍結乾燥）して、組成物アラビノガラクタンタンパク質組成物を単離する。
【００１６】
次いで適当な濃度の適当な酸で、適当な時間および適当な温度で、粗アラビノガラクタンタンパク質組成物を酸処理して、最終的な酸修アラビノガラクタンタンパク質組成物中のアラビノース：ガラクトースの比率を３．５：１以下、好ましくは３．０：１以下まで低下させるか、または酸修飾前の該組成物中のアラビノガラクタンタンパク質成分のアラビノース：ガラクトースの比率の８０％以下まで低下させる。用いた酸の性質およびその濃度ならびに加水分解のために用いた温度および時間は、比較的短時間、室温などの低温にて低濃度で用いる塩酸などの鉱酸から、長時間、高温にて高濃度で用いる酢酸などの弱有機酸まで大きく変わる；しかし、我々は、室温〜４０℃、特に約３０℃などのわずかに高温にて１〜２４時間、０．１〜１Ｍの濃度で用いるトリクロロ酢酸または好ましくは塩酸が、加水分解に適していることを見出している。酸加水分解は、ガラクトースよりはむしろアラビノースに影響を及ぼすが（それによってアラビノガラクタンタンパク質の多糖類側鎖が短くなる）、所望の精製およびアラビノース：ガラクトース比率を達成するのみならず活性な酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物の収率を低下させる過剰の加水分解を回避するのに十分な加水分解を確実にすることに注意すべきである。加水分解に続いて、酸溶液に塩基（たとえば、０．５Ｍの水酸化ナトリウムなどの水性アルカリ金属水酸化物または重炭酸ナトリウムなどの弱塩基）を加えて中和する。得られる溶液は、酸修飾アラビノガラクタンタンパク質とともに（酸修飾）関連多糖類および多量の低分子量加水分解生成物を含む。
【００１７】
キバナオウギの生原料におけるバッチごとの相異を平均化するために、生原料である“飲用チップ”および工程中の中間産物の混和により、最終産物の一貫性が達成される。
次いで限外濾過およびイオン交換クロマトグラフィーによって溶液を精製する。塩および低分子量物質をさらに除去し、溶液の量を減らすために限外濾過を行う（１００Ｋ ＭＷＣＯ ＵＦシステムなどによって）。停留液を直接乾燥して（６０〜７０℃にて真空オーブンで処理するか、またはスプレー乾燥もしくは凍結乾燥、特に溶解増進賦形剤の存在下で）、酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物を得るか、または、必要に応じて、下記の通りさらに精製する。
【００１８】
必要に応じてさらに精製するために、次いでカチオン交換カラム（２０ｍＭのＮａＯＡｃ緩衝液，ｐＨ５．２０で平衡化したＳＰセファロースカチオン交換カラムなど）を通して、限外濾過により得られた停留液を溶離し；溶出液をアニオン交換カラム（同じＮａＯＡｃ緩衝液で平衡化したＱセファロースアニオン交換カラムなど）に通して溶離する。限外濾過によって、アニオン交換カラムからの溶出液を再度脱塩し、乾燥して、酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物を得る。
【００１９】
精製ステップの順番は、変えてもよく、精製ステップ自体を変更してもよい。特に連続的イオン交換ステップクロマトグラフィーは、同じかまたは類似のイオン交換樹脂による溶液のバッチ処理に置き換えてもよく、処理した溶液から樹脂を濾過する；およびカラムまたはバッチ処理のいずれかにて、分離したアニオン交換およびカチオン交換樹脂の使用をアニオンおよびカチオン交換能の両方をもつ混合床樹脂の使用に置き換えてもよい。また、イオン交換処理を酸修飾処理の後に行う代りに、前に行ってもよい。脱塩および低分子量物質の除去のための異なるＵＦ膜の使用（より低分子量のカットオフ膜など）が可能である。工程の本質的要素は、“飲用チップ”の製造、該チップからのアラビノガラクタンタンパク質組成物の抽出およびアラビノガラクタンタンパク質組成物の酸修飾、ならびに工程中少なくとも１つの高分子量（たとえば、１００Ｋ ＭＷＣＯ）限外濾過ステップであり；精製ステップの順番や種類を変えると、酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物の収率が増加し、そのように製造される組成物の本来ものよりも製造を達成するのが容易になる。もちろん、もしアラビノガラクタンタンパク質組成物または特に該組成物の＞１００Ｋフラクションをいずれかの他の方法によって製造したとしても、組成物ｗの酸修飾を行って、酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物が得られる。
【００２０】
薬理および有用性
本発明の第１の態様である精製アラビノガラクタンタンパク質組成物または本発明の第２の態様であるアラビノガラクタンタンパク質製剤の有益な活性については、幾つかのテストを行ない、以下の有用性が導かれた。
【００２１】
化学療法を受けている患者における好中球減少の治療
１．活性化ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＧ−ＣＳＦの産生
免疫および造血システムの刺激は、多くのサイトカイン相互作用を介して起こるので、インビトロにおいてＧ−ＣＳＦの産生を誘発するＡＭＣの能力を実施例６に記載したように試験した。ＡＭＣは、ＰＨＡによる活性化後のヒトＰＢＭＣによるＧ−ＣＳＦの有意な用量依存性の放出の引き金を引いた。Ｇ−ＣＳＦは、インビトロまたはインビボで好中球の産生／または作用に影響を及ぼすことがわかっている。これらのデータは、ＡＭＣが、造血機能に関与するサイトカインの産生を介して、骨髄抑制患者において好中球の産生および血小板数の回復を刺激することを示唆する。類似しているが、やや弱い応答が、（１）“飲用チップ”の抽出、エタノール沈殿、イオン交換クロマトグラフィーによる精製およびさらなるエタノール沈殿によって製造された精製アラビノガラクタン組成物（ＰＡＧＣ）；および（２）“飲用チップ”の抽出、エタノール沈殿、イオン交換クロマトグラフィーによる精製、１００Ｋ ＭＷＣＯ ＵＦ膜によるイオン交換溶出液の限外濾過（停留液を保持）およびさらなるエタノール沈殿によって製造されたアラビノガラクタンタンパク質組成物（ＡＧＰＣ）において見られる。ＰＡＧＣは、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦの産生を刺激することが明らかにされているので、このことおよび上記結果から、ＡＭＣが同じ働きをすることが示唆される。
【００２２】
２．フルオロウラシル処置マウスにおけるＧＭ−ＣＦＣ先駆細胞の回復
ＰＡＧＣは、マウスにおいてフルオロウラシル誘発骨髄抑制からの骨髄先駆細胞（ＧＭ−ＣＦＣ）の回復を増進することが明らかにされている；したがって、上記１の結果に基いて、このアッセイにおいて、ＡＭＣが、少なくともＰＡＧＣと同程度に効力があることが予測される。
【００２３】
３．致死量に近い放射線を照射されたマウスにおける末梢白血球細胞の回復
ＢＡＬＢ／ｃマウスに致死量に近い放射線を照射し、次いで実施例７に記載のプロトコルにしたがって、生理食塩水またはＰＡＧＣ、ＡＧＰＣもしくはＡＭＣを皮下処置する。照射により、白血球の数は劇的に減少する。ＰＡＧＣ、ＡＧＰＣおよびＡＭＣによる処置は、生理食塩水処置コントロール動物に見られる総白血球数以上の値まで数を増加し、８×１０６／ｍｌ以上まで白血球数の回復率を増加する。
【００２４】
４．化学療法後の白血球数の回復
ＰＡＧＣは、ＰＡＧＣを与えられていない患者と比べてヒトのガン化学療法患者の白血球を増加することが明らかにされている。上記１および３に見られる結果ならびにＰＡＧＣとの比較に基いて、ＡＭＣが、同じ利点を示すことが予測される。
【００２５】
化学療法を受けている患者における血小板減少の治療
１．致死量に近い放射線を照射されたマウスにおける末梢血血小板数の回復
第０日に、ＢＡＬＢ／ｃマウスに致死量に近い放射線を照射し、次いで実施例７に記載のプロトコルにしたがって、生理食塩水またはＡＭＣを皮下処置する。照射により、血小板の数は劇的に減少する。５０、１００および２５０ｍｇ／ｋｇの皮下ＡＭＣ処置は、マウスの末梢血における血小板回復を増進する。これらの所見は、ＡＭＣが、血小板の成長について非常に有効な作用薬であり、血小板減少の治療に有用だとみなされるべきであることを示唆する。ＡＧＰＣおよびＰＡＧＣもまた、このアッセイで有効である。
【００２６】
２．骨髄巨核球の増殖／成熟
ＰＡＧＣは、インビトロにて骨髄巨核球の増殖および／または成熟を促進することおよび最適以下投与したＩＬ−３のの佐剤として作用することが明らかにされている；したがって、上記１の結果に基いて、このアッセイにおいて、ＡＭＣが、少なくともＰＡＧＣと同程度に効力があることが予測される。化学療法または放射線療法は、サイトカイン産生細胞などの多くの細胞および組織に損傷を与えるので、そのような治療を受けている患者は、内在性サイトカインの分泌レベルが低下している。このような内在性サイトカインレベルの低下が起こると、造血システムの正常な機能をサポートができなくなり、その結果、骨髄抑制から回復するための適切な数の造血細胞を産生することができない。ＰＡＧＣは、他の不十分なレベルの内在性サイトカインの存在下において、骨髄巨核球の増殖／成熟を正常なレベルまで増進し、末梢血血小板の回復を刺激することが明らかにされており、巨核球の増殖および／または成熟を誘発することによってそのように作用すると思われる。データから、ＡＭＣもまた、骨髄抑制から派生して起こる血小板減少の治療に有用であることがわかることが示唆される。
【００２７】
３．化学療法後の血小板数の回復
ＰＡＧＣは、ヒトのガン化学療法患者の血小板を増加することが明らかにされている。上記１の結果ならびにＰＡＧＣとの比較に基いて、ＡＭＣが、同じ利点を示すことが予測される。
【００２８】
ガン患者の生活の質の向上
ＰＡＧＣは、化学療法によって誘発される症状（倦怠および疲労、不定愁訴、発汗、息切れ、食欲不振）からの回復の速度をより速めることが明らかにされており、化学療法患者におけるカルノフスキー活動指標スコアを増加する；したがって、上記結果ならびにＰＡＧＣとの比較に基いて、ＡＭＣが、同じ利点を示すことが予測される。
【００２９】
化学療法を受けているガン患者における好中球減少の予防
ＰＡＧＣは、化学療法が誘発する好中球減少の治療に有効であることが明らかにされている。データから、ＡＭＣが、好中球減少の治療と同程度に好中球予防に有用であることが示唆される。
【００３０】
放射線療法を受けているガン患者における好中球減少の治療
先に得られたデータから、放射線療法における好中球減少の回復のためのＡＭＣの使用もまた示唆される。
【００３１】
化学療法を受けているガン患者における貧血の治療
ＢＡＬＢ／ｃマウスに致死量に近い放射線を照射し、次いで実施例６に記載のプロトコルにしたがって、生理食塩水または種々の用量のＡＭＣで処置する。照射により、赤血球の数は劇的に減少する。ＡＭＣ処置により赤血球数は増加する。これらの結果は、ＡＭＣが、赤血球先駆細胞の成長および／または動員に影響を及ぼすことを示し、放射線療法および化学療法誘発貧血におけるその有用性を示唆する。ＰＡＧＣおよびＡＧＰＣは、このモデルにおいても活性がある。
【００３２】
末梢血先駆細胞移植を受けている患者に対する末梢血先駆細胞単独またはＧ−ＣＳＦと組合せた末梢血先駆細胞の動員
ＣＤ３４抗原は、ＢＦＵ−Ｅ（バースト形成単位−赤血球）、ＧＭ−ＣＦＣ（顆粒球マクロファージコロニー形成細胞）およびＣＦＣ−Ｍｉｘ（コロニー形成細胞−混合物）細胞などのコロニー形成細胞といったような造血幹細胞および先駆細胞に存在する。ＣＤ３４＋細胞のフローサイトメトリーによるアッセイは、移植組織の便利な測定を提供する。ヒトの末梢血における造血先駆細胞の存在は、最初１９７５年に記述された。先駆体の大部分は骨髄に存在するので、これらの末梢血先駆細胞（ＰＢＰＣ）は、総数のうち少しのフラクションしか作らない。化学療法後のリバウンド中のヒトの末梢血先駆細胞の数の増加が、１９７６年に報告された。最近では、コロニー刺激因子Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦが、ＰＢＰＣの数を直接増やすことが証明されている。化学療法とコロニー刺激因子の組合せは、それぞれの方法単独で観察される増加よりも、ＰＢＰＣの数を顕著に増加する。現在は、Ｇ−ＣＦＳは、ヒトの自己移植および同種異系移植に対してＰＢＰＣを動員するために用いられている。ＰＢＰＣの移植は、慣例の骨髄移植よりも速い植え付けを導く。Ｇ−ＣＳＦ処置により生成されるＰＢＰＣの収量は、前述の化学療法または他のサイトカインのいずれかと組合せて用いた場合に、顕著に増やすことができる。ＰＡＧＣが、単剤として投与された場合にＰＢＰＣ動員を誘発し、および／またはＧ−ＣＳＦと組合せて投与された場合にＧ−ＣＳＦと相乗作用してＰＢＰＣ動員を誘発することが明らかにされている。シクロホスファミド処置マウスを用いる類似の実験において、ＣＤ３４＋Ｌｉｎ−細胞の数の増加が、ＰＡＧＣ処置されなかったマウスに見られる。上記結果およびＰＡＧＣとの比較に基いて、このアッセイにおいて、ＡＭＣが、効力があることが予測される。ＡＭＣなどのＧ−ＣＳＦと相乗作用してＰＢＰＣの収量を増加する治療薬は、非常に有用であると思われる。このタイプの相乗作用は、ドナーからＰＢＰＣを採取するのに必要なアフェレーシスの数を減らすことによって費用を減じることができる。さらに、このタイプの組合せ療法は、レシピエントがＧ−ＣＳＦ単独に対して十分に応答性でない状況または化学療法薬の使用が望ましくない状況に対して援助することができる。
【００３３】
細胞障害性薬または放射線への曝露からの治癒の促進
動物またはヒト患者が、故意に放射線または細胞障害性薬に曝露され、処置されなかった動物またはヒト患者よりも治癒が促進されることが証明された、前述のＰＡＧＣを用いた結果および実験から、ＡＭＣは、細胞障害性薬または放射線への曝露（たとえば、偶発的または非治療的曝露ならびに治療的曝露）からの回復の促進においても有用であろう。
【００３４】
悪液質の治療
化学療法および放射線療法の最も通例の副作用は、患者が食欲不振および体重減少に苦しむことである。ＰＡＧＣが、化学療法薬シクロホスファミドおよびフルオロウラシルで処置されたマウスの体重を増加することが明らかにされている。前述したように、ＰＡＧＣは、測定されるパラメーターの１つが、食欲における改善である、患者の生活の質の改善において有効であることが証明されている。マウスの実験とともに、このことは、ＰＡＧＣが、悪液質、一般的身体消耗およびガンなどの慢性疾患またはその治療によって引き起こされた栄養不良の患者を助けることができることを示唆する。上記結果ならびにＰＡＧＣとの比較に基いて、ＡＭＣが、同じ利点を示すことが予測される。
【００３５】
骨髄抑制療法を受けているガン患者における、好中球回復を増加し、Ｇ−ＣＳＦの使用を減じるためのＧ−ＣＳＦとの組合せ療法
ＰＡＧＣが、サイトカイン、特に活性化ヒト末梢血単核細胞からのＧ−ＣＳＦの産生を刺激し、放射線誘発骨髄抑制動物モデルにおけるＧＭ−ＣＦＣおよび末梢白血球数の回復を促進し、中華人民共和国での大規模臨床試験における化学療法後のガン患者の白血球数を回復させることが明らかにされている。これらの結果は、ＰＡＧＣが、多数の内在性サイトカインの産生を介して、造血システムに間接的に作用し、これらのサイトカインが、相乗的に作用して好中球回復ヲ促進することを示唆する。ＰＡＧＣが、前述のような骨髄巨核球の増殖／成熟の促進において、ＩＬ−３と相乗効果をもつことも明らかである。また、ＰＡＧＣの投与は、安全であり、骨痛、筋肉痛、頭痛、疲労、悪心、嘔吐、下痢などのＧ−ＣＳＦの使用において見られる副作用がなく十分に寛容である。このことおよび前記相乗効果から、ＰＡＧＣが、Ｇ−ＣＳＦと組合せて、内在性Ｇ−ＣＳＦの使用を減少させて、骨髄抑制療法を受けているガン患者における好中球回復を促進することができることが示唆される。上記結果ならびにＰＡＧＣとの比較に基いて、ＡＭＣが、同じ利点を示すことが予測される。
【００３６】
自己または同種異系血液先駆細胞移植にともなう高用量細胞毒性療法後の好中球回復を促進するためのＧ−ＣＳＦとの組合せ療法
（骨髄または末梢血）血液先駆細胞（ＢＰＣ）移植によって支えられた高用量化学療法および／または放射線療法は、乳がん、リンパ腫および多発性骨髄腫などの身体状態をもつ多くのガン患者の治療に用いられている。ＢＰＣ移植の結果として、より速い造血回復が得られる。感染に関連する好中球減少性熱を予防し、入院期間を短縮し、抗生物質の使用を減じるために、ＢＰＣ移植後にＧ−ＣＳＦを用いて、好中球回復促進することが多い。ＰＡＧＣが、化学療法後のガン患者の白血球数を回復させることが明らかにされている；このことは、先のセクションで要約した薬理学的効果とともに、ＰＡＧＣが、好中球回復を促進するためのＢＰＣ移植後のＧ−ＣＳＦとの組合せ療法としても有用であることを示唆する。上記結果ならびにＰＡＧＣとの比較に基いて、ＡＭＣが、同じ利点を示すことが予測される。
【００３７】
Ｂ型肝炎保菌者のための生物応答変更因子および肝細胞の保護
サイトカインは、ウイルス感染に対する防御において重要な役割を演じる。マクロファージならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球などの免疫応答に関係する細胞によって産生されるサイトカインは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染などのウイルス感染からの回復において、より直接的な役割を演じる。動物モデルおよびヒトの実験から、細胞性免疫応答が、ＨＢＶ感染および疾患の発病の消散において役割を演じることが明らかである。急性ＨＢＶ感染において、活発なポリクローナル細胞性免疫応答が重大である。初回抗原刺激し、抗原特異的細胞性免疫を維持する、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２およびＩＦＮ−γの産生によって特徴付けられる１型のサイトカイン放出は、ウイルス感染に対する防御において重要である［Ｃ． Ａ． Ｂｉｒｏｎの”Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ， ａｎｄ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ， ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ”， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ６，５３０−５３８ （１９９４）］。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞によって放出されるサイトカインもまた、ＨＢＶ複製のダウンレギュレーションにおいて重要な役割を演じる。もし急性応答における防御があるならば、ＨＢＶは慢性になる。これらの所見は、肝臓内における１型の応答または適当なサイトカインの局所的産生をブーストすることを意図する方策が、慢性ＨＢＶ感染に対する療法として有用であるかもしれないことを示唆する［Ｍ． Ｊ． Ｋｏｚｉｅｌの Ｓｅｍ． Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ， １９ （２）， １５７−１６１ （１９９９）］。ＰＡＧＣは、伝統的な中国医学植物であるＡｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ ｖａｒ． ｍｏｎｇｈｏｌｉｃｕｓ（ＡＭ）から製造され、この植物は、免疫および造血システムの刺激に歴史的に用いられている。該植物は、化学療法または放射線療法誘発骨髄抑制の症状（血小板減少および貧血ならびに好中球減少）に類似する種々の病気の患者の治療に広く用いられる。さらに、ＡＭが、インビトロで用量依存的様式にてマウス脾臓細胞増殖を刺激し、Ｓ−１８０肉腫腫瘍細胞を植え付けられた動物の脾臓細胞におけるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性を増加し、また細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性を増加することが報告されている。ＣＴＬによって産生されるサイトカインは、インビトロにおいてウイルス感染のコントロールを媒介することができ、ウイルス特異的ＣＴＬによるＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの産生は、ＣＴＬのウイルス感染除去能力を増幅することができる［Ｌ． Ｇ． Ｇｕｉｄｏｔｔｉらの”Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎｈｉｂｉｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ａ ｎｏｎｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ”， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１，７６４−３７６８ （１９９４）］。さらに、上記に示したように、ＡＭＣは、ＰＨＡによる活性化の後のヒトＰＢＭＣからのＧ−ＣＳＦの産生を刺激する。これらの実験は、ＡＭＣが、サイトカイン産生の調節を介して免疫機能に間接的に影響を及ぼすこと��示唆する。ＡＭから製造された粗抽出液は、慢性肝炎患者において上昇したＩｇＧレベルを低下させること、より低いＡＬＴ値にすること、および患者の免疫および肝機能を改善することに用いられている［Ｙ． Ｌｉｕの”Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｏｒａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ７０ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｐａｔｉｅｎｔｓ”， Ｊｉａｎｇ Ｓｕ Ｃｈｕｎｇ Ｙａｏ， １５ （１２）， ３８ （１９９４）］。さらに、先に議論したように、細分化されたＡＭが、免疫増強活性をもつことが明らかにされている。これらのことは、ＡＭＣをＢ型肝炎保菌者に対する生物応答変更因子として用いて、肝細胞を保護し得ることを示唆する。
【００３８】
Ｂ型肝炎患者のためのワクチンアジュバント
猪苓舞茸（チョレイマイタケ）（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｕｍｂｅｌｌａｔｕｓ）から製造された多糖類は、慢性Ｂ型肝炎患者の治療においてＢ型肝炎ワクチンに対するアジュバントとして用いられている。それが、統計的に有意なＢ型肝炎ウイルス抗原（ＨＢｅＡｇ）の血清陰性的転換およびＢ型肝炎ウイルスＤＮＡ（ＨＢＶ−ＤＮＡ）の消滅を行うことが明らかにされている［Ｓ． Ｍ． Ｗｕらの”Ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ”． Ｊ． Ｃｈｉｎ． Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ， １３ （３）， １８７−１８９ （１９９５）； Ｈ． Ｚ． Ｓｈｕらの”Ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗｉｔｈ ｌａｒｇｅ ｄｏｓｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ６４ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｐａｔｉｅｎｔｓ”， Ｍｅｄ． Ｊ． ＮＤＦＳＣ， ６ （４）， ２１１−２１２ （１９９６）］。ＡＭから製造された抽出液もまた、Ｂ型肝炎患者におけるＨＢｅＡｇおよび抗Ｂ型肝炎コア抗原（Ａｎｔｉ ＨＢｃ）の血清陰性変換およびＨＢＶ−ＤＮＡの消滅を行うことが報告されている［Ｃ． Ｋ． Ｌｉｕらの”Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ａｓｔｒａｇａｌｉ ｃｏｍｐｏｓｉｔａ”， Ｃｈｕｎｇ Ｋｕｏ Ｃｈｕｎｇ Ｈｓｉ Ｉ Ｃｈｉｅｈ Ｈｏ Ｔｓａ Ｃｈｉｈ， １６ （７）， ３９４−３９７ （１９９６）； Ｐ． Ｌ． Ｃｈｅｎらの”Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｆｒｏｍ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｉｎ ｔｒｅａｔｉｎｇ ３３ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ａｃｔｉｖｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｐａｔｉｅｎｔｓ”， Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ Ｃｌｉｎ． Ｒｅｍｅｄｉｅｓ， １１ （２）， ７５−７６ （１９９１）］。これらの実験および前記議論した結果は、ＡＭＣが、Ｂ型肝炎患者のためのＢ型肝炎ワクチンアジュバントとして有用であることを示唆する。
【００３９】
麻薬リハビリテーションに対する禁断症状の治療
患者が麻薬を除去される場合、彼らは、麻薬常用の禁断症状に苦しむ。伝統的中国医学用語における禁断の属性は、気（エネルギー）の欠乏の顕れである。もし、気が強化されるならばリハビリテーションがスピードアップされるという中国医師の診察に基いて、ヒトのガン化学療法試験におけるＰＡＧＣに対する指標の１つは、化学療法後のガン患者の生活の質を改善することである。生活の質は、化学療法に関連する症状の改善によって評価される；これらには、倦怠および疲労、不定愁訴、発汗、息切れおよび食欲不振が含まれる。これらの症状は、伝統的中国医学医師による麻薬禁断にも関連する「気の欠乏症候群」に対応する。このことは、ＰＡＧＣが、患者の気を強化することが可能であり、麻薬からの常用禁断を治療するための医薬的能力を有することを示唆する。上記結果ならびにＰＡＧＣとの比較に基いて、ＡＭＣが、同じ利点を示すことが予測される。
【００４０】
化学療法および放射線療法を受けているガン患者における嘔吐の予防および治療
悪心および嘔吐は、化学療法および／または放射線療法の通例の副作用である。化学療法または放射線療法における多くの改善があるけれども、多数の患者が、依然として嘔吐を経験しており、治療のこの副作用を減少するための努力を続けなければならない。これらの副作用を予防するのに利用しうる多くの制吐薬がある（セロトニン受容体アンタゴニスト、コルチコステロイドおよびドーパミン受容体アンタゴニストなど）が、それらは、それ自体の副作用をもっている。これらの薬物に関連している症状は、軽い頭痛、便秘、睡眠困難、筋肉および舌の不随意運動ならびに鎮静作用である。嘔吐の神経生理学的根拠は、未だ不完全にしか理解されていないが、嘔吐の完全なコントロールに関連する目標には、患者に都合のよい介護を提供すること、入院期間および通院状況にある時間の減少ならびに患者の生活の質を向上させる療法が含まれる。ＰＡＧＣ試験は、ＰＡＧＣが、化学療法後の患者にとって、特に患者の生活の質の改善において有益であることを証明する。研究者および患者すべてからの観察結果は、ＰＡＧＣが、患者の全体的な福利を本当に改善することができることを支持し、このことは、ＰＡＧＣが、化学療法後の嘔吐の予防および治療において役割をもつことを示唆する。上記結果ならびにＰＡＧＣとの比較に基いて、ＡＭＣが、同じ利点を示すことが予測される。
【００４１】
腎臓透析患者に対するエリスロポエチンの使用の低減化または置換
ＥＰＯＧＥＮ（エポエチンα、エリスロポエチン）は、透析を受けている慢性腎不全患者に関連する貧血に対して１９８９年に認可された。この薬品は、これらの患者に対して、より活動的で生産的な生活を導く手段を提供する。ＥＰＯＧＥＮが利用できるようになる前は、すべての透析患者の９０％が、彼らを疲労させ、消耗させ、仕事をする能力を害する貧血に苦しんでいた。現在では、透析を受けているほとんどの患者が、赤血球レベルを上昇させ、維持するために治療養生法の一部としてＥＰＯＧＥＮを受けている。臨床試験において、最も頻繁に報告されたＥＰＯＧＥＮの副作用は、高血圧、頭痛、発作、悪心／嘔吐および凝固した血管アクセスであった；もし、これらの副作用が起きたならば、ＥＰＯＧＥＮの用量を減少することが勧告される。ＡＭＣの研究は、実施例７に示すように、ＡＭＣが、致死量に近い放射線を照射されたマウスにおける末梢赤血球細胞数の回復を促進しうることを示した；ＰＡＧＣが同じ利点を示すことが明らかにされている。さらに、ＰＡＧＣが、単一剤として、またはＧ−ＣＳＦとの相乗剤として投与される場合に、正常マウスにおける循環ＢＦＵ−Ｅの数を増加し、正常およびシクロホスファミド処置マウスの両方の末梢血においてＴＥＲ−１１９＋細胞の数を増加することが明らかにされている。ＴＥＲ−１１９抗原は、初期赤血球芽細胞から成熟赤血球段階を通じて、赤血球細胞上に発現される。ＴＥＲ−１１９＋細胞数の増加は、ＰＡＧＣが、骨髄における赤血球系譜の分化、増殖および成熟ならびに末梢血へのこれらの細胞の動員を刺激しうることを示す。これらの所見はすべて、ＰＡＧＣが、実験されたマウスにおいて赤血球細胞の産生および成熟を促進しうることを示唆する。さらに、ＰＡＧＣが、ヒトの臨床試験において報告される臨床的に重大な副作用がなく、安全であることが明らかにされている。結果ならびにＰＡＧＣとの比較に基いて、腎臓透析患者における貧血の治療のためのＥＰＯＧＥＮの使用をＡＭＣが低減化または置換しうることが示唆される。
結論として、ＰＡＧＣと同様の様式で投与されたＡＭＣは、照射マウスにおいて、コントロールが改善された白血球細胞、赤血球細胞および血小板の回復を促進する；このことは、このモデルにおいてＰＡＧＣによって与えられるものと同じ利点を証明する；そして、本出願で議論された他のＰＡＧＣデータを引用すると、このことは、ＡＭＣが、ＰＡＧＣと同じ治療的利点を持ち、したがって、ＰＡＧＣと同じ有益と医薬的適応に対して適しているをことを示唆する。
【００４２】
医薬製剤および投与
一般に、本発明の第１の態様である酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物は、単一で、または少なくとも１種の他の治療薬、特に造血を刺激する能力がある治療薬とともに、静脈内注射によって、治療的有効量で投与される。治療的有効量は、疾患、その重篤度、処置される動物の年齢および相対的健康ならびに他の因子に従属して大きく変化する。造血の刺激、巨核球の増殖または成熟を誘発、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦの産生の刺激、好中球の産生または作用の刺激、好中球減少、貧血もしくや血小板減少の治療、または細胞障害性作用剤または放射線への被爆（偶発的または非治療的ならびに治療的被爆）からの回復の促進にとって、本発明の第１の態様である精製アラビノガラクタン組成物の治療上有効量は、平均体重のヒトに対し、約１０〜１０００ｍｇ／日、詳しくは、約５０〜５００ｍｇ／日、さらに詳しくは、１００〜２５０ｍｇ／日にわたる。悪液質、悪心もしくは薬物禁断症状の治療、またはＢ型肝炎における生物応答の変更もしくは肝細胞の保護にとって、類似の量が治療上有効である。当業者であれば、彼らの熟練および本明細書の記載を考慮して、過度の実験を行うことなく、与えられた疾患に対する本発明組成物の治療上有効量を決定しうるであろう。
【００４３】
一般に、本発明の第１の態様である酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物は、注射によって、医薬製剤として投与される。該製剤は、本発明の第１の態様である酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物および水性注射用賦形剤を含む。適当な水性注射用賦形剤は、当業者に公知であり、それらおよび該製剤の製剤方法は、Ａｌｆｏｎｓｏ ＡＲ： Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １７ｔｈ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ， １９８５などの標準の参考文献に見出すことができる。適当な水性注射用賦形剤として、水、生理食塩水、デキストロース水溶液などが挙げられ、必要に応じて、３〜１０％マンニトールまたは他の糖類、３〜１０％のグリシンまたは他のアミノ酸などの酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物のための溶解増進剤を含む。
【００４４】
代表的には、造血薬として投与する場合、本発明の第１の態様である酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物または本発明の第２の態様である酸修飾アラビノガラクタンタンパク質製剤は、注射（皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内など）によって、特に約１５分間などの２，３分〜１時間もしくはそれ以上にわたる継続的静脈内輸液によって投与する。本発明の酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物の量は、製剤のタイプ、単位用量のサイズ、賦形剤の種類および当業者に公知の他の因子に従属して大きく変化する。一般に、最終製剤は、０．００１重量％〜１０重量％、好ましくは、０．０１重量％〜１重量％の本発明の酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物を含み、残りは賦形剤（１種またはそれ以上）である。
本発明の第１の態様である酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物は、必要に応じて、少なくとも１種の治療される疾患状態に対する他の治療薬、特にエリスロポエチン、スロンボポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＩＬ−３などの造血を刺激する能力をもつ他の作用薬とともに投与する。
【００４５】
（実施例）
以下の非限定的実施例は、本発明を説明する。すべての酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物は、サイズ排除クロマトグラフィーによって特徴決定した。
サイズ排除クロマトグラフィー方法は、以下の通りである：
を備えたＳＣＬ−１０Ａシステムコントローラー、ＬＣ−１０ＡＤポンプ、ＤＧＵ−４Ａ脱気ユニット、ＲＩＤ−６Ａ屈折率検出器およびＳＰＤ１０ＡＶ ＵＶ検出器を備えた島津ＨＰＬＣシステム、０．２Ｎ塩化ナトリウムで平衡化したＧＳ−７０１およびＧＳ−６２０カラム（Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ、７．６×５００ｍｍ）を用いる。ロードしたサンプル量は、８０μｇ（２ｍｇ／ｍｌのサンプル水溶液４０μｌ）であり、サンプルを、１ｍｌ／分で溶離した。異なる平均分子量のプルランスタンダードを用いて較正曲線を作成し、該較正曲線から分子量を決定した。島津ＳＥＣソフトウェア・バージョン２．４を用いる統計的計算によって、サンプルの重量平均分子量（Ｍｗ＝Σ（ＡｉＭｉ）／ΣＡｉ）、数平均分子量（Ｍｎ＝ΣＡｉ／Σ（ＡｉＭｉ））および多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）を決定した。
【００４６】
本発明の酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物の糖含量および組成は、トリメチルシリルメチルグリコシド誘導体のＧＬＣ分析によって決定した。この方法においては、サンプルを最初にメタノール性ＨＣｌでメタノール化し、次いでトリメチルシリル誘導体化して、揮発性単糖類誘導体を生成した。清浄後、水素炎イオン化検出器およびＤＢ−１カラムを用いるガス液体クロマトグラフィー（ＧＬＣ）によって、誘導体を分析した。内部標準であるｍｙｏ−イノシトールを誘導体化し、組成物サンプルとともに分析して、糖含量および組成を定量した。
【００４７】
比色分析アッセイによって、ヒドロキシプロリン含量を決定した。サンプルを最初に塩酸で加水分解し、次いで次亜臭素酸ナトリウム（水酸化ナトリウム中の臭素の溶液）、塩酸およびジメチルアミノベンズアルデヒドで処理した。最終溶液の光学密度を比色計で測定し、同じ様式で作成した種々の濃度のヒドロキシプロリンから得られた較正曲線からヒドロキシプロリン含量を決定した。
【００４８】
実施例１　最終ステップとして酸処理を行う、酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物の製造
ステップＡ　“飲用チップ”の加工
汚れをいずれも除去し、次いで限外濾過水で滅菌洗浄およびこすり洗いし、７０％メタノールに一夜浸漬し、厚さ３〜５ｍｍにカッティングし、次いで６０〜７０℃の無菌オーブンで乾燥することによって、乾燥したキバナオウギの根３００ｋｇを飲用チップに加工する。これらの乾燥“飲用チップ”の乾燥損失は＜１５％である。
【００４９】
ステップＢ　粗アラビノガラクタン組成物の抽出
１００℃近くの温度にて、３０分間、ステップＡで作成した“飲用チップ”２ｋｇを１０リットルの０．５ＭのＫＨ２ＰＯ４（２５℃においてｐＨ４．５）で洗浄し、洗液を捨てる。次いで１００℃にて、それぞれ３時間ずつ、２０リットルの０．５ＭのＫＨ２ＰＯ４（２５℃においてｐＨ４．５）で１回抽出し、２０リットルのエンドトキシンを含まない水（１０Ｋ ＭＷＣＯ ＵＦシステムを通して限外濾過した脱イオン水）で２回抽出する。プールした水性抽出液を濾過または約７５００×ｇで３０分間の遠心分離により清澄化し、次いで熱アルカリでパイロジェンフリーにした１００Ｋ ＭＷＣＯポリエーテルスルホン膜を用いる限外濾過によって約１２倍に濃縮する。濃縮液に９５％エタノールを加え、室温にて１５分間攪拌しながら最終エタノール濃度３５％にして、可溶性の乏しい物質を沈殿させる。濾過または濃縮によって沈殿を除去し、上清を次のステップに用いる。十分な量の９５％エタノールを加えてエタノール濃度を７０％にして、アラビノガラクタンタンパク質を沈殿させ、濾過または約７５００×ｇの遠心分離によって回収する。沈殿は７５％エタノール中で安定であり、必要ならば、この形体で維持することができる。沈殿をＵＦ水に再溶解して濃度を約２０ｇ／Ｌにし、乾燥（スプレー乾燥、トレー乾燥または凍結乾燥）して、粗アラビノガラクタン組成物を得る。
粗アラビノガラクタン組成物は、明黄色粉末であり、２００ｍｇ／ｍｌにて水溶性であり、乾燥損失は＜１５％である。エンドトキシン含量は、＜０．３ＥＵ／ｍｇである。
【００５０】
ステップＣ　イオン交換クロマトグラフィーによる精製
ステップＢからの粗アラビノガラクタン組成物３５ｇを２０ｍＭのＮａＯＡｃ緩衝液に、ｐＨ５．２にて、濃度が約４０ｇ／Ｌになるように溶解する。溶液をＳＰセファロースカチオン交換カラム（樹脂約２０ｍｌ、同じ緩衝液で平衡化、粗ＡＧＣ１ｇ当たり）にロードし、２０ｍＭのＮａＯＡｃで溶離して、２．５〜３．０総体積（ｂｅｄ ｖｏｌｕｍｅ）の溶出液を集める。。ＳＰカラムと同じ樹脂体積を含むＱセファロースアニオン交換カラムに集めた溶出液をロードし、２０ｍＭのＮａＯＡｃで溶して、３〜３．５総体積の溶出液を集める。集めた溶出液を１００Ｋ ＭＷＣＯ ＵＦシステムで限外濾過して、脱塩し、約４０ｇ／Ｌに濃縮する。停留液は、無水エタノールを加えて沈殿させて最終エタノール濃度８０〜９０％にするか、または直接次のステップに用いる。
アラビノガラクタンタンパク質組成物は、白色粉末であり、水、生理食塩水および５％グルコースに２０ｍｇ／ｍｌで溶解し、水溶液のｐＨは４〜７である。組成物は、≦０．５ＥＵ／ｍｇのエンドトキシンおよび≦１０ｐｐｍの重金属を含む。アラビノース：ガラクトースの比率は、≧３．０：１、代表的には≧４．０：１である。組成物の重量平均分子量は、≧１００キロダルトンである。
【００５１】
ステップＤ　酸修飾および単離
ステップＣからのアラビノガラクタンタンパク質組成物の停留液を等体積の１ＭのＨＣｌと混合する。得られる溶液（０．５ＭのＨＣｌ溶液）を３０℃にて６時間インキュベートし、次いで１ＭのＮａＯＨで中和する。酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物を含む中性溶液を１００Ｋ ＭＷＣＯ Ｂｉｏｍａｘ１００膜で限外濾過して、脱塩し、エンドトキシンふりー水でチェイスし、次いで約２０ｇ／Ｌに再濃縮する。
得られる溶液を直接、または単一用量バイアルに分配した後、特にマンニトールもしくは他の糖類、グリシンもしくは他のアミノ酸または塩化ナトリウムなどの溶解増進賦形剤を添加した後に凍結乾燥する。
酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物は、白色からオフホワイトの粉末であり、アラビノース：ガラクトースの比率は、３．５：１以下；灰分は、約２％以下；重金属含量は、約２０重量ｐｐｍ以下；実質的にエンドトキシンを含まない；重量平均分子量１２０〜２６０キロダルトン；および少なくとも２００ｍｇ／ｍｌで水溶性である。
【００５２】
実施例２　最終ステップとして連続イオン交換クロマトグラフィーを行う酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物の製造
ステップＢ　粗アラビノガラクタン組成物の抽出
実施例１のステップＡで製造した“飲用チップ”１５０ｇを１００℃にて３時間還流しながら、ｐＨ４．５のエンドトキシンを含まない０．５ＭのＫＨ２ＰＯ４１．５リットルで３回抽出する。合わせた抽出液を〜２００ｍｌに濃縮し、同時に１００Ｋ ＭＷＣＯ Ｂｉｏｍａｘ１００ポリエーテルスルホンＵＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ．）を通す限外濾過によってエンドトキシンを含まない水に交換する。濃縮液に９５％エタノールを攪拌しながら加え、最終エタノール濃度３５ｖ／ｖ％にして、所望の物質を沈殿させる。エタノール懸濁液を８０００×ｇで遠心分離し、沈殿を捨てる。上清を攪拌しながら９５％エタノールでさらに希釈し、最終エタノール濃度７０ｖ／ｖ％にして、第２の沈殿形成を得る。粗アラビノガラクタンタンパク質組成物を含むこの第２沈殿を、８０００×ｇの高速遠心分離によって採取し、無菌オーブンにて６０〜７０℃で乾燥する［要すれば、中間の乾燥なしに、該沈殿をステップＣに用いることができることに留意］。
【００５３】
ステップＣ　酸修飾
ステップＢからの乾燥した粗アラビノガラクタンタンパク質組成物をエンドトキシンを含まない水に溶解して濃度４０ｍｇ／ｍｌにし、次いで等体積の１Ｍ塩酸と混合する。得られる溶液（０．５ＭＨＣｌ溶液）を３０℃で６時間インキュベートし、次いで１ＭのＮａＯＨで中和する。１００Ｋ ＭＷＣＯ Ｂｉｏｍａｘ１００膜を通す限外濾過によって酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物を含む中性溶液の脱塩および低分子量物質の除去を行い、エンドトキシンを含まない水でチェイスする。
【００５４】
ステップＤ　イオン交換クロマトグラフィーによる精製および単離
ステップＣからの停留液を２０ｍＭのＮａＯＡｃ液、ｐＨ５．２にし、次いでＳＰ−セファロースを充填したカチオン交換カラム（１．５ｃｍ×２５ｃｍ）およびＱ−セファロースを充填したアニオン交換カラム（１．５ｃｍ×２５ｃｍ）に連続的に通す。アニオン交換カラムからの溶出液は、酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物を含む。１００Ｋ ＭＷＣＯ Ｂｉｏｍａｘ１００膜を通す限外濾過によって溶出液を脱塩し、凍結乾燥によって酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物を回収する。
【００５５】
実施例３　最終ステップとしてバッチ式イオン交換を行う酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物の製造
実施例２のステップＢおよびＣの工程を用いて、酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物を含む脱塩溶液を製造する。
ステップＤ　バッチ式イオン交換による精製および単離
ステップＣからの停留液を１ｇのＩＯＮＡＣ ＮＭ−６０混合床イオン交換樹脂とともに室温にて１時間攪拌する。樹脂を濾去し、酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物を含む濾液を１００Ｋ ＭＷＣＯ Ｂｉｏｍａｘ１００膜を通す限外濾過によって溶出液を脱塩し、凍結乾燥する。
混合樹脂床を用いる代りにカチオンおよびアニオン交換樹脂を用いるステップＤからの停留液の連続的バッチ式攪拌によって、類似の結果が得られる。
【００５６】
実施例４　最終ステップとして酸処理を行い、最後から２番目のステップとしてバッチ式イオン交換を行う酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物の製造
実施例１のステップＣのイオン交換クロマトグラフィーの代りに、実施例３のステップＤに記載のバッチ式イオン交換を用いて、実施例１の工程に従う。
【００５７】
実施例５　活性化ヒト末梢血単核細胞からのサイトカインの産生
Ｂｏｙｕｍの方法［Ａ． Ｂｏｙｕｍ，”Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ．．．．”， Ｓｃａｎ． Ｊ． Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ９７，７７−８９ （１９６８）］を用いて、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を製造する。ヒト血液軟膜サンプル（約２５ｍｌ／ドナー）をスタンフォード大学メディカルセンター血液バンクから入手する。滅菌技術を用い、室温にて、カルシウムおよびマグネシウムを含まないハンクスバランス塩溶液（ＨＢＳＳ、Ｇｉｂｃｏ）を添加した総体積１００ｍｌに、各軟膜サンプルを静かに再懸濁する。次いで、５０ｍｌの三角遠心管中にて、１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．）の上に体積２５ｍｌの細胞懸濁液を重ね、Ｂｅｃｋｍａｎ ＧＰＲ ｔａｂｌｅｔｏｐ遠心機（ＧＨ−３．７ローター）にて、１５℃、３０分間、４００×ｇで管を遠心する。遠心分離に続いて、界面のＰＢＭＣ懸濁液を新たな５０ｍｌ管に移し、総体積４５ｍｌのＨＢＳＳに再懸濁し、１５℃、１０分間、３５４×ｇで遠心分離する。上清を捨て、細胞ペレットを総量４５ｍｌのＨＢＳＳに再懸濁し、１５℃、１０分間、２６５×ｇで遠心分離する。細胞ペレットを１０ｍｌびＸ−Ｖｉｖｏ組織培養培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ、ＭＤ）に再懸濁し、血球計を用いて計数する。ポリスチレン管（Ｆａｌｃｏｎ＃２０５７、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を以下の実験に用いる。ＰＢＭＣ懸濁液を４×１０６／ｍｌに希釈する；最終濃度３μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニンＰ（ＰＨＡ−Ｐ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ２７−３７０７−０１）０．５ｍｌならびに種々の濃度の本発明組成物の溶液０．５ｍｌの存在下に、１ｍｌをインキュベートする。比較測定溶液は、（１）“飲用チップ”の抽出、エタノール沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、およびさらなるエタノール沈殿によって製造された精製アラビノガラクタン組成物（ＰＡＧＣ）；または（２）“飲用チップ”の抽出、エタノール沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、１００Ｋ ＭＷＣＯ ＵＦ膜を用いるイオン交換溶出液の限外濾過（停留液を保持）、およびさらなるエタノール沈殿によって製造されたアラビノガラクタンタンパク質組成物（ＡＧＰＣ）を含む。管当たりの総体積は２ｍｌである。７％ＣＯ２のインキュベーターで３７℃にて２４時間インキュベートした後、Ｂｅｃｋｍａｎ ＧＰＲ ｔａｂｌｅｔｏｐ遠心機（ＧＨ−３．７ローター）にて、１５℃、１０分間、１６００×ｇで管を遠心し、上清を集め、アッセイを行うまで−７０℃で貯蔵する。使用説明書に従って、市販のヒトＧ−ＣＳＦ用ＥＬＩＳＡアッセイキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮまたはＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いてサイトカイン測定を行う。マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ ｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＣＡ）を用いて光学密度を測定する。マイクロプレートリーダーを提供したソフトウェアを用いて結果を計算し、上清中に産生されたＧ−ＣＳＦのｐｇ／ｍｌで表す。以下の表は、ＡＭＣが、活性化ヒトＰＢＭＣによるＧ−ＣＳＦの産生を増加し、ＰＡＧＣとＡＧＰＣ���両方よりも優れていることを示す。スチューデントｔ検定の結果は、ＡＭＣが、１０〜３００μｇ／ｍｌの濃度においてＰＡＧＣよりも優れており、１０〜１０００μｇ／ｍｌの濃度においてＡＧＰＣよりも優れていることを示す（ｐ＜０．０２）。最大の差異（ＡＭＣで誘発されるＧ−ＣＳＦ：ＰＡＧＣで誘発されるＧ−ＣＳＦの比率）は、１０μｇ／ｍｌにて生じ（４．５：１）、それは、１００μｇ／ｍｌ（２．５：１）まで明白なままである；より高濃度では差異が小さくなるのがみられるが。
【００５８】
【表１】
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【００５９】
実施例６　致死量に近い放射線を照射されたマウスにおける末梢血の回復
試験には９〜１４週齢、平均体重２０ｇの雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いる。各実験の５日前に、非酸性化飲料水にネオマイシン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ）４０ｍｇ／ｌを加える。コントロールグループまたは処置グループに１グループ当たり６匹のマウスをランダムに割り当て、第０日に５ＧｙのＸ線（２５０ＫＶＰ、１．６ｍｍ　Ａｌフィルター、Ｐｈｉｌｉｐｓ）を照射する。この用量を照射した後、末梢血白血球および血小板数は、正常マウスよりも著しく低下し、赤血球数は中程度に低下する。酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物を２５０、１００および５０ｍｇ／ｋｇにて皮下投与する。処置は、第１回目は、照射後４〜５時間に行い、それぞれ最初の５日間（第０〜第４日）、次いで続く３週間に１週当たり３回（第７〜第１０日、第１４〜第１６日および第２１〜第２３日）行う。合計１４回の酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物の投与を行う。コントロールグループには、０．１ｍｌの生理食塩水を皮下投与する。実験中、第９、１３、１６および２０日に、マウスの眼窩静脈から採血する；ＥＤＴＡ塗布管（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、ドイツ）に血液サンプルを集める；次いでＳｅｒｏｎｏ９０１０＋セルカウンター（Ｓｅｒｏｎｏ Ｂａｋｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、アレンタウン、ＰＡ）で末梢血血小板および赤血球細胞を分析する。下記表に示すように、２５０、１００および５０ｍｇ／ｋｇの酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物は、照射後のすべての時点で、照射マウスにおける赤血球細胞および血小板の回復の両方を、コントロールよりも改善して促進する。
【００６０】
【表２】
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【表３】
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【００６１】
本アッセイでは、１００および３００ｍｇ／ｋｇの用量において、ＰＡＧＣは、生理食塩水よりも統計的に有意に良好であり、１００および２５０ｍｇ／ｋｇの用量において、ＡＧＰＣは、生理食塩水よりも良好である（統計的有意性は決定せず）。
類似の実験において、酸修飾アラビノガラクタンタンパク質組成物は、生理食塩水単独よりも回復速度を劇的に増進すること（白血球数が少なくとも８×１０６／ｍｌに戻る）［ＡＭＣ処置グループの回復のための平均日数は２１日であるが、食塩水グループでは７匹のうち１匹のみが第３０日までには回復した］；およびＡＧＰＣと同程度の速度を示すＰＡＧＣ以上に回復速度を増進することが明らかであった。
【００６２】
本発明を特に好ましい態様に関連して記載したが、本明細書の記載を考慮して、特に開示された物質および技術の等価物もまた本発明に適用でき、そのような等価物が以下の特許請求の範囲内にあることを意図されることは当業者には明白であろう。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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