(57)【要約】本発明は、複数の分光システムおよび分光学的方法を使用して、病気の診断に有効な組織の特徴を測定する。好ましい実施形態では、蛍光スペクトルと、反射率スペクトルと、散乱光スペクトルとの組合せを測定しかつ処理して、組織の生化学的、構造的および形態学的状態を得る。本発明の方法およびシステムは、体内および体外から、組織内の癌の早期検出を行なうのに特に有効に使用できる。
2004518124.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光および組織からの複数の波長の反射光を収集しかつ収集された光を検出する光収集システムを設け、
検出された光からの波長の関数として蛍光表現および散乱光表現を形成し、
蛍光表現および散乱光表現がなされた組織層の特徴を決定する段階を有することを特徴とする、スペクトルデータを分析して組織層の構造を測定する方法。
【請求項２】
前記蛍光表現を用いて組織の１つ以上の成分を決定する段階を更に有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記散乱光表現を用いて組織内の構造のサイズを決定する段階を更に有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記検出された光の周期的成分を測定して散乱光表現を形成することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
拡散反射光スペクトルおよび光散乱スペクトルを分析する段階を更に有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
反射光標準および蛍光標準を用いて較正する段階を更に有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
異なる散乱サイズをもつルックアップテーブルを創出する段階を更に有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記蛍光スペクトルを補正して固有蛍光スペクトルを得る段階を更に有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記光散乱スペクトルを変形させかつスペクトル成分を除去して組織成分のサイズ分布を決定する段階を更に有することを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項１０】
識別分析を行なって組織を診断する段階を更に有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
複数の散乱係数値を複数の異なる領域に区分する段階を更に有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】
入射放射により測定すべく組織の対象領域を照射する放射源と、
組織からの散乱光および蛍光を複数の波長で収集する光学系と、
収集された光を検出しかつ波長の関数として蛍光データおよび散乱光データを供給する検出器システムと、
蛍光データおよび散乱光データを用いて対象領域の特徴を決定するデータプロセッサとを有することを特徴とする、組織を光学的に測定する装置。
【請求項１３】
３３０〜７００ｎｍの範囲内の光を発生する広帯域光源を更に有することを特徴とする請求項１２記載の装置。
【請求項１４】
前記光源を組織に連結する光ファイバプローブを更に有することを特徴とする請求項１２記載の装置。
【請求項１５】
前記プローブは内視鏡内に挿入できることを特徴とする請求項１２記載の装置。
【請求項１６】
高速励起エミッションマトリックス器具を更に有することを特徴とする請求項１２記載の装置。
【請求項１７】
情報を記憶して蛍光データおよび散乱光データを約２〜８秒で処理するデータプロセッサを更に有することを特徴とする請求項１２記載の装置。
【請求項１８】
蛍光スペクトルを取得し、
反射率スペクトルを取得し、
蛍光スペクトルおよび反射率スペクトルを処理して、固有蛍光スペクトルと、拡散反射率スペクトルと、光散乱スペクトルとを供給し、
固有蛍光スペクトル、拡散反射率スペクトルおよび光散乱スペクトルから、生物物理的組織特徴を決定する段階を有することを特徴とする、組織スペクトルを分析する方法。
【請求項１９】
処理ユニットに、請求項１８の方法の段階を実行させる１組の情報が記憶されていることを特徴とするコンピュータ読取り可能な媒体。
【請求項２０】
前記組織層内の構造のサイズを決定する段階を更に有することを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
前記構造は組織中の上皮細胞の核であることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記検出された反射率スペクトルの周期的成分を測定する段階を更に有することを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
反射光標準および蛍光標準を用いて較正する段階を更に有することを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
異なる散乱サイズをもつルックアップテーブルを創出する段階を更に有することを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２５】
前記蛍光スペクトルを補正して固有蛍光スペクトルを得る段階を更に有することを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２６】
前記光散乱スペクトルを変形させかつスペクトル成分を除去して組織成分のサイズ分布を決定する段階を更に有することを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２７】
識別分析を行なって組織のリアルタイム診断を行なう段階を更に有することを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２８】
複数の散乱係数値を複数の異なる領域に区分する段階を更に有することを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２９】
入射放射により測定すべき組織の対象領域を照射する放射源と、
散乱光、蛍光および組織からの反射光を複数の波長で収集する光学系と、
収集された光を検出しかつ波長の関数として蛍光スペクトル、反射率スペクトルおよび散乱光スペクトルを供給する検出器システムと、
蛍光スペクトル、反射率スペクトルおよび散乱光を用いて対象領域の特徴を決定するデータプロセッサとを有することを特徴とする、組織層中の構造を光学的に測定する装置。
【請求項３０】
３３０〜７００ｎｍの範囲内の光を発生する広帯域光源を更に有することを特徴とする請求項２９記載の装置。
【請求項３１】
前記光源を組織に連結する光ファイバプローブを更に有することを特徴とする請求項２９記載の装置。
【請求項３２】
前記プローブは内視鏡内に挿入できることを特徴とする請求項２９記載の装置。
【請求項３３】
高速励起エミッションマトリックス器具を更に有することを特徴とする請求項２９記載の装置。
【請求項３４】
情報を記憶して蛍光スペクトル、反射率スペクトルおよび散乱光スペクトルを約２〜８秒で処理するデータプロセッサを更に有することを特徴とする請求項２９記載の装置。
【請求項３５】
測定すべき物質中の対象領域上に入射放射を指向させ、
物質からの蛍光放射および反射された放射を収集し、
収集された放射から蛍光スペクトルおよび反射率スペクトルを検出し、
検出された反射率スペクトルの周期的成分を波長の関数として測定して、蛍光スペクトルおよび反射率スペクトルから、物質の複数の物理的特徴を決定する段階を有することを特徴とする、物質を光学的に測定する方法。
【請求項３６】
光ファイバプローブを用いて物質上に放射を指向させる段階を更に有することを特徴とする請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
光ファイバプローブを用いて物質から放射を収集する段階を更に有し、前記プローブは０．０５〜０．２５の範囲内の開口数をもつ光ファイバを有していることを特徴とする請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
対象領域内の核の平均核サイズを決定する段階を更に有することを特徴とする請求項３５記載の方法。
【請求項３９】
対象領域内の単位面積当りの粒子の数を測定する段階を更に有することを特徴とする請求項３５記載の方法。
【請求項４０】
入射放射により測定すべき組織の対象領域を照射する第一放射源および第二放射源と、
蛍光および組織からの反射放射を収集する光学系と、
収集された蛍光および反射放射をする検出器システムと、
波長の関数として検出放射の周期的成分を決定し、組織の物理的特徴を決定するデータプロセッサとを有することを特徴とする、組織を光学的に測定する装置。
【請求項４１】
フィルタホイールと、３３０〜７００ｎｍの範囲内の光を発生する広帯域光源とを更に有することを特徴とする請求項４０記載の装置。
【請求項４２】
前記第一放射源および第二放射源を組織の単一対象領域に連結する光ファイバプローブを更に有することを特徴とする請求項４０記載の装置。
【請求項４３】
前記データプロセッサは、検出された反射放射から散乱スペクトルを発生しかつ収集された蛍光および反射放射により変調された蛍光スペクトルを発生することを特徴とする請求項４０記載の装置。
【請求項４４】
前記プローブは内視鏡内に挿入できることを特徴とする請求項４３記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
関連出願の相互参照
本願は、係属中の２００１年１月１９日付米国特許出願第０９／７６６，８７９号の一部継続出願である。前記米国特許出願の全内容は本願に援用する。
【０００２】
（背景技術）
下部食道の腺癌は、ほぼ例外なく、バレット食道（ＢＥ）、すなわち化生円柱上皮（ｍｅｔａｐｌａｓｔｉｃ ｃｏｌｕｍｕｎａｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）が存在するという特徴をもつ患者に現われる。腺癌であると診断された患者の予後は悲しいが、疾患が異形成段階で発見されるならば、成功裏の治療の機会は高い。ＢＥに異形成がある患者のサーベイランスは、２つの点で挑戦的なことである。第一に、異形成は、日常的な内視鏡検査時には視認できない。かくして、多数のランダムな生検（バイオプシー）が必要になる。第二に、熟練した胃腸病理学者の間でも、特定検体の類別に関して観察者相互間の同意が得られ難いため、異形成の組織病理学的診断は問題がある。蛍光等の光学的技術は、ＢＥにおけるこれらの早期異形成変化を検出する内視鏡医の能力を大幅に高めている。実際に、Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）等の外因性蛍光物質およびアミノレブリン酸誘導プロトポルフィリンＩＸ型を用いる蛍光分光学の研究によれば、癌の測定した赤色蛍光と薬剤の選択的蓄積の結果としての非異形成組織との間に大きい差異があることが証明されている。初期のオートフルオロエッセンス分光学の研究は、高度異形成の検出を約束する４１０ｎｍ励起レポートで行なわれた。しかしながら、局部的な高段階病巣および低段階病巣を信頼性をもって検出することはできなかった。かくして、早期癌の検出に使用される光学的測定技術の更なる改善に対する継続的な要望が存在している。
【０００３】
（発明の開示）
本発明は、組織の状態の測定感度および測定精度を改善できる分光システムの組合せに関する。例えば、組織の一領域が正常であるか、前癌状態であるか、癌状態であるかを判断するのに、複数の異なる分光システムを使用できる。好ましい実施形態では、バレット食道（ＢＥ）を患う患者の異形成検出を遂行できる。好ましい実施形態では、蛍光分光学的手法、反射率分光学的手法および光散乱分光学的手法により、組織の生化学的、構造的および形態学的状態および病気の進行中に生じる対応変化、より詳しくは異形成に関する補完情報が得られる。好ましい実施形態では、これらの３つの分光学的手法を組合せて、組織の検出、マッピングおよび／またはイメージングを行なうシステムが開発された。より詳しくは、自動化された診断ルーチンを遂行すべくプログラムされたデータプロセッサによりスペクトルデータまたは画像データを処理する方法は、蛍光分光学的手法および光散乱分光学的手法を含む複数の異なる測定様相の結果を得るのに有効である。本発明の他の好ましい実施形態は、３モードシステムを使用して生検手順を案内する。
【０００４】
リアルタイム測定を行なうこのシステムの１つの重要性は、対象とする同一スポットすなわち領域から同時にまたはほぼ同時に光を収集（集光）できることである。例えば、収集には、測定した蛍光スペクトルおよび反射率スペクトルの収集が含まれる。検出された反射率スペクトルは、拡散性背景成分を除去すべく処理される。これが完了されたならば、次に、波長内に周期的に見られる光成分が測定される。この成分は、例えば、表皮細胞核によりミー散乱（Ｍｉｅ−ｓｃａｔｔｅｒｅｄ）される光から生じる。周期構造の振幅および周波数を分析することにより、これらの細胞核の密度およびサイズ分布を抽出できる。対象とする所与の領域を評価するのに、反射率要素、光散乱要素および蛍光要素を適正に相関付けかつ使用できるようにするには、反射率測定および蛍光測定の両方について励起を大きくオーバーラップさせるのが好ましい。反射光は、これに含まれる周期構造の使用に基いて、蛍光スペクトルの補正および光散乱スペクトルの発生の両方に使用される。本発明の装置は、両励起要素を、プローブの同じ遠位面を介して、好ましくは同じ光ファイバまたは光ファイバ集合体を介して対象領域に供給する。
【０００５】
内視鏡の生検チャネルは、測定を行なうのに使用される光ファイバによる光供給／収集システムを挿入するのに使用できる。或いは、例えば直径５ｍｍ以下の小径内視鏡に、多くの用途に適した光供給／収集システムを設けることができる。本発明のシステムの好ましい実施形態は、光の供給／収集を行なう単一ファイバシステムを使用でき、或いは中心の供給ファイバおよびこの周囲に同心状に配置された６本の収集ファイバを使用することもできる。光供給／収集プローブの近位端は、広帯域フラッシュランプおよびレーザのような単色光源の両方に光学的に連結される。選択された範囲に亘って励起波長を迅速に切換えるのに、回転フィルタまたは染料ホイール（ｄｙｅ ｗｈｅｅｌ）を使用できる。
【０００６】
反射光を使用する必要性は、測定された集積組織蛍光強度でのヘモグロビン吸収の効果を補正する必要性から生じる。蛍光分光学的手法と反射率分光学的手法との組合せは、散乱および吸収により、測定された全組織蛍光スペクトル内に導入された歪みを除去すべく適用できる。歪んでいないまたは修正された蛍光スペクトルは組織生化学の感応インジケータとして機能し、一方、反射率表示および光散乱表示は、組織構造（ｔｉｓｓｕｅ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）および表皮細胞核に関する形態情報を与える。本発明は、組織を特徴付けしかつ病巣を診断する３つの全ての分光学的手法を同時に使用できる。３つの全ての技術を組合せて使用することにより、例えば、ＢＥにおける高段階異形成だけでなく、低段階異形成の検出に関して、各技術の結果を個々に比較することに比べ、優れた結果を得ることができる。
【０００７】
好ましい実施形態では、スペクトルデータを分析して組織層の構造を測定する方法は、蛍光および組織からの複数の波長の反射光を収集しかつ収集された光を検出する光収集システムを設ける段階を有している。本発明の方法は更に、検出された光からの波長の関数として蛍光表現および散乱光表現を形成する段階を有している。また本発明の方法は、蛍光表現および散乱光表現がなされた組織層の特徴を決定する段階を有している。また本発明の方法は、散乱光表現を用いて組織層内の構造、例えば細胞の核のサイズを決定する段階を有している。好ましい実施形態では、拡散反射率スペクトルが分析される。本発明の好ましい実施形態は、異なる散乱サイズをもつルックアップテーブルを創出する段階を更に有している。蛍光表現は、補正して固有蛍光スペクトルを得ることができる。
【０００８】
本発明の好ましい実施形態では、蛍光スペクトルを取得し、反射率スペクトルを取得し、次にこれらの両者を処理して、固有蛍光スペクトルと、拡散反射率スペクトルと、光散乱スペクトルとを供給する段階を有している。また本発明の方法は、固有蛍光スペクトル、拡散反射率スペクトルおよび光散乱スペクトルから、生物物理的組織特徴を決定する段階を有している。本発明の方法には、拡散反射率スペクトルからの診断パラメータ、固有蛍光スペクトルからの診断パラメータ、および散乱光パラメータからの診断パラメータを用いて識別分析を遂行し、次に診断する段階を含めることができる。
【０００９】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明の上記および他の目的、特徴および長所は、添付図面に示す本発明の好ましい実施形態についての以下に述べる詳細な説明から明らかになるであろう。尚、全図面を通して同じ部品は同じ参照番号で示されており、また図面は必ずしも縮尺通りではなく、本発明の原理を示すため強調もなされている。
【００１０】
測定は、例えば、１９９９年１月２６日付米国特許出願第０９／２３８，６６４号（この全内容は本願に援用する）において詳細に説明されている高速の励起エミッションマトリックス（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ−ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｍａｔｒｉｘ：ＥＥＭ）装置１０を用いて行なわれる。この高速ＥＥＭシステムの励起光源には、高速回転ホイール１６に正確に取付けられた１０個の染料キュベットをポンピングする、３３７ｎｍでのエミッション窒素レーザ１２（Ｌａｓｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｉｎｃ．， Ｆｒａｎｋｌｉｎ、マサチューセッツ州、モデルＶＳＬ−３３７ＭＤ）を使用できる。この態様で、好ましい実施形態では、３３７〜６２０ｎｍの間で１１個の異なる励起波長が得られ、これらの波長は、光学系１８を用いて直径１ｍｍの光ファイバプローブ２０に連結される。反射率測定を行なうため、Ｘｅフラッシュランプ１４（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｏｐｔｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ社、Ｓｅｌｅｍ、マサチューセッツ州）からの白色光が同じプローブに連結される。或いは、膀胱内での測定を含む他の実施形態では、例えば３０８ｎｍを放出するＸｅＣｌエキシマレーザを使用できる。好ましい実施形態では、プローブ２０は、光供給ファイバ２６を包囲する６本の収集ファイバ２８で構成でき、図１に示すように、プローブの遠位端２２を透明保護シールドで覆うことができる。
【００１１】
内視鏡検査中、プローブは内視鏡のアクセサリチャネル内に挿入されかつ組織に優しく接触するように移動され、かくして一定の供給／収集ジオメトリが形成される。反射された蛍光はプローブにより収集されかつ分光器３０および検出器２２に連結される。蛍光励起波長をブロックするのに、第二同期ホイール３６が使用される。各部位からの３組のスペクトルの平均が、データ処理システム３４使用する分析に用いられる。データ取得の直後に、プローブが除去され、プローブの接触の結果として、僅かな分画（ｄｅｍａｒｃａｔｉｏｎ）が３０〜６０秒間組織上に留まる。この内視鏡的に明らかなマーカは、スペクトルが取得されたのと同じ部位から生検を採取するガイドとして使用される。生検検体は、胃腸病理学者により解釈されかつ類別される。異形成病巣が疑われる場合には、検体が再検査されかつケア基準に従って第二の胃腸病理学者により診断が確認される。データは、２６箇所の非異形成バレット食道部位（９人の患者）、７箇所の低段階異形成部位（４人の患者）および７箇所の高段階異形成部位（５人の患者）から分析された。
【００１２】
好ましい実施形態では、好ましくは１／２以下で３種類の内視鏡検査情報が取得される。１１個の異なる励起波長、反射率スペクトルおよび光散乱スペクトルでの蛍光スペクトルが得られる。各種のスペクトルは、異形成変態中に生じる生化学的および形態的変化に関する情報を供給する態様で分析できる。蛍光分光学的手法は、異形成の発生中に組織生化学に生じる変化に関する価値ある情報を供給できる。しかしながら、測定される組織蛍光スペクトルは、無関係の散乱および吸収事象により大きい歪みを受ける。これらの歪みを除去するため、対応する反射率スペクトルからの情報と組合せて、蛍光スペクトルが分析される。蛍光スペクトルおよび反射率スペクトルが、同様な歪みを受ける同じ光供給／収集ジオメトリを用いて、対象とする特定部位または領域から収集されるという事実から、この手順の成功が予測される。固有の（歪んでいない）組織蛍光を抽出することにより、組織生化学の変化は、より敏感な特定態様で隔絶される。
【００１３】
主成分の分析および論理学的回帰（ｌｏｇｉｓｔｉｃｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）は、固有蛍光のスペクトル特徴と組織病理学的診断のスペクトル特徴との相関関係を決定するのに用いられる。この比較的小さいデータ組を不偏態様で分析するため、「１つを残しておく」相互検証（”ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ” ｃｒｏｓｓ−ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）を使用できる。特に、異形成の進行中に変化するスペクトル特徴を説明する固有蛍光スペクトルの主成分が選択される。対応標点（全スペクトルへの主成分の寄与を記述する係数）を使用して、システムが、（ａ）低段階異形成および非異形成バレット食道（ＢＥ）低段階の異形成から高段階異形成を識別する能力、および（ｂ）非異形成バレット食道（ＢＥ）から低段階および高段階の異形成を識別する能力を決定できる。不偏態様でこれを達成するため、次の手段を遂行できる。特定部位からの標点が除去され、論理学的回帰を使用して、組織病理学的類別との一致を最適化する態様で残余の部位を類別する決定表面を形成する。得られる決定表面は、次に、除外部位を類別するのに使用できる。この方法は、各部位について反復される。この方法は、比較的小さいデータ組を使用して、偏りのない決定表面の性能を検証する。決定表面は、この手順中の変化が最小であり、技術の信頼性を表示する。感度値および特異性値は、分光学的類別と組織病理学的類別とを比較することにより決定できる。好ましい実施形態に従って、Ｍａｔｌａｂの統計学的ソフトウェア（ＴｈｅＭａｔｈ Ｗｏｒｋｓ， Ｉｎｃ．， Ｎａｔｉｃｋ、マサチューセッツ州）を用いて統計学的分析を行なうことができる。
【００１４】
測定された反射率スペクトルは、反射光を、組織の吸収係数（μａ（λ））および低下した散乱係数（μｓ′（λ））として表現する拡散理論に基いた表現を用いて分析できる。この分析により、収集された光が組織表面からの５００〜７００μｍの範囲内に源を発するときは、主として連結組織の構造および形態、すなわち粘膜固有層および粘膜下組織に関する情報が得られる。得られる組織散乱係数値の診断値は、固有蛍光の場合におけるように、論理学的回帰および相互検証と、組織病理学的類別とを相関付けることにより決定される。
【００１５】
検出された反射光の僅かな部分（２〜５％）は、組織により１回だけ散乱された後にプローブにより収集された光から出る。光散乱分光学的手法は、２０００年７月１８日付米国特許第６，０９１，９８４号（この全内容は本願に援用する）に詳細に開示されているので、ここでは概略的に説明する。米国を指定して１９９８年１０月９日出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ／９８／２１４５（該出願の全内容も本願に援用する）には、組織構造を測定する他の方法が開示されている。この単独で散乱される光の強度は、逆波長の周期的な成分を含んでおり、この大きさおよび周波数は、上皮細胞層の核の数およびサイズに基いている。この周期的信号は分析されて、特定部位に一致する上皮細胞核の数およびサイズを決定する。次に、論理学的回帰および相互検証を用いて、分光学的類別と組織病理学的類別とを比較する。感度および特異性を最適化するため、一実施形態では、非高段階異形成部位から高段階異形成を識別する事後確立閾値を０．３に定める。
【００１６】
最後に、３つの全ての分光学的技術からの結果が組合されて、正しく類別される部位の数を向上できる。より詳しくは、部位には、３つの分析方法のうちの少なくとも２つからの結果と一致する類別が割当てられ、この類別は組織病理学的手法に匹敵する。
【００１７】
図２Ａには、非異形成バレット食道（ＢＥ）部位（実線）からの３３７ｎｍ光で励起された典型的な蛍光スペクトルが示されている。２つの異なる組織蛍光物質の存在に帰すことができる２つのピークがある。これらの２つのピーク間の蛍光強度の低下は、ヘモグロビンが非常に効率的に光を吸収する波長範囲内に生じることに留意されたい。ヘモグロビンの吸収効果は、オキシ−ヘモグロビン吸収ピーク（図２）に一致する約４２０、５４０および５８０ｎｍで最小値を呈する対応反射率スペクトル（図２Ｂ）内に観察される。図２Ａの測定した蛍光スペクトルが本願で論じるように図２Ｂの対応反射率スペクトルと組合せて処理されるとき、特定励起波長での固有（非歪み）組織蛍光スペクトルが得られる（図２Ａ、破線）。このスペクトルは単一の幅広ピークを有することに留意されたい。
【００１８】
３３７ｎｍで励起された非異形成部位およびバレット食道（ＢＥ）部位の固有組織蛍光の例（図３Ａおよび図３Ｂ）と、３９７ｎｍで励起された非異形成部位およびバレット食道（ＢＥ）部位の固有組織蛍光の例（図３Ｃおよび図３Ｄ）との間には大きい差異が観察される。３３７ｎｍ励起では、異形成部位の腺形状は幅広でかつ非異形成から低段階異形成および高段階異形成へと進行する間にスペクトルの赤色領域に変位する。３９７ｎｍ励起では、蛍光は、異形成ＢＥ部位についてはスペクトルの赤色領域で増大する。４１２ｎｍ励起でも同様な変化が観察される。
【００１９】
これらの相違は、ＢＥでの異形成を検出するためのアルゴリズムを得るのに使用できる。より詳しくは、（ａ）異形成（低段階異形成および高段階異形成）組織から非異形成を識別し、かつ（ｂ）低段階ＢＥ上皮および高段階ＢＥ上皮から高段階異形成を識別できる感度および特異性を決定するのに、主成分分析、論理学的回帰および「１つを残しておく」相互検証が使用される。各場合において、３３７、３９７および４１２ｎｍ励起での固有蛍光スペクトルから抽出される最初の３つの主成分のうちの１つの標点が使用される（図４および図５）。選択された主成分は、観察されたスペクトルの相違を示している。この分析から、高段階異形成のある部位は、高い感度および特異性をもって、低段階異形成部位および非異形成部位から識別される（表１）。また、異形成上皮および非異形成上皮は、非常に高い感度および特異性をもって識別される。
【００２０】
表１には、バレット食道での非異形成（ＮＤＢ）、低段階（ＬＧＤ）および高段階（ＨＧＤ）組織の分光学的手法による類別の精度が示されている。
【００２１】
【表１】
2004518124.tif 000003
【００２２】
反射率スペクトルは、塊組織の散乱特性および吸収特性に関する詳細情報を得るため、数学的表現を用いて分析される。図６には、この数学的表現を用いて得られた対応適合（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｆｉｔ）を有する典型的な反射率スペクトルが示されている。
【００２３】
この分析形式は、バレット食道の組織の低下した散乱係数μｓ′（λ）は、非異形成から、低段階異形成および高段階異形成へと進行する間に徐々に変化する。例えば４００ｎｍでは、高段階異形成組織（１．３±０．２ｍｍ−１）のμｓ′（λ）が、低段階異形成組織（１．８±０．３ｍｍ−１）のμｓ′（λ）より小さく、この低段階異形成組織（１．８±０．３ｍｍ−１）のμｓ′（λ）は、更に、非異形成バレット食道（ＢＥ）組織（３±１．６ｍｍ−１）のμｓ′（λ）より小さい。また、異形成の成長中に、μｓ′（λ）の波長依存性が変化する。これらの変化を説明するため、１つの直線がμｓ′（λ）に適合され、この直線の遮断（ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ）および傾斜が診断パラメータとして使用される（図７）。論理学的回帰および「１つを残しておく」相互検証を用いて、組織病理学的手法に従って１０個の類別組織の感度および特異性が決定される。この方法により、固有蛍光スペクトルにより達成されるよりも僅かに小さい全体的感度および特異性の値が得られる（表１）。
【００２４】
反射率スペクトルは、上皮細胞核からの後方散乱の抽出および分析を可能にする態様で処理される。この分析結果は図８に示されている。図８の縦座標は、核の密集度合いを示す、１ｍｍ２当りの核数を表し、横方向座標は、１０ミクロンより大きい直径をもつ核として定義される拡大核の割合（％）を表す。非異形成試料は左下コーナに集中しており、これは、細胞核が小さくて密集していないことを示している。異形成が進行するにつれて、データ点は右上に移動し、これは、組織病理学的手法による検出結果と一致する核の拡大および密集を示している。この技術は、非異形成ＢＥ部位から異形成（低段階異形成および高段階異形成）を分離する点で優れている（表１）。
【００２５】
ＢＥでの異形成および非異形成組織を特徴付ける能力は、本発明のシステムにより同時に得られる、分光学的手法の各々により得られた情報を組合せることにより改善される。分光学的類別が３つの分析方法のうちの少なくとも２つと一致する場合には、高段階異形成は、完全な感度および特異性をもって識別されかつ異形成組織は、高い感度を維持しつつ、完全な異形成をもって非異形成組織から識別される（表１）。
【００２６】
分光学的技術は、光信号に含まれる情報を使用して、生物学的組織の状態にアクセスする。光ファイバ技術は、分光学的手法を、内視鏡によりアクセスできる広範囲の組織の診断ツールとして適用することを可能にする。本願において説明する分光学的手法の使用により、医者が、例えば口腔、頚、肺、胸および胃腸管等の多くの器官の前癌状態（異形成）および早期癌病巣の検出する能力を向上できる。用いられる技術に基いて、組織の生化学的、構造的および形態学的特徴を取得できる。異形成の進行中に生じるこれらの特徴の顕微鏡的変化は、内視鏡により視認できる肉眼で見える変化の発現前に分光学的に検出できる。また、分光学的技術は非観血的手法であり、組織を、そのありのままの状態で、かつ組織を切断しかつ化学的に処置することにより導入されるアーチファクト（人工産物）がない態様で研究できる。原則として、分光学的信号はリアルタイムで分析され、かくして、医者を、患者の成功裏の治療に必要な介入の種類に関して直ちに決定できるようにする重大な病理学的手法をもたらす生検領域に案内する。また、光により搬送されるスペクトル信号は、特に、病気の類別に関する観察者内および観察者相互の一致が非常に良くない領域の特定組織部位を評価するための目的ガイドとして使用できる。
【００２７】
蛍光分光学的手法のターゲットとして、ＮＡＤＨ、ＦＡＤ、コラーゲン。エラスチンおよびポルフィリン等の組織生化学物質がある。病巣領域に優先的に蓄積することが証明されている外因性発色団または外因的に誘発される発色団を使用することもできる。４１０ｎｍで励起される組織オート蛍光（ｔｉｓｓｕｅ ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を用いた高段階異形成の検出が行なわれている。測定された集積強度／正規化蛍光（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｉｎｔｅｎｓｉｔｙ−ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）および正常な食道組織からの平均正規化蛍光が、診断に使用された。高段階異形成組織と非異形成組織との間に優れた識別をもたらす主なスペクトル特徴は、約４７０〜４８０ｎｍの減少した蛍光の存在および高段階異形成組織のスペクトルの赤色領域内の増大した蛍光の存在である。しかしながら、この方法は、低段階異形成部位または病巣の高段階異形成部位を正しく類別することはできない。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態を示す例では、３３７〜６１０ｎｍ間の１１個の異なる励起波長での蛍光スペクトルが得られた。かくして、単一の蛍光スペクトルの代わりに、励起エミッションマトリックス（ＥＥＭ）が収集される。ＥＥＭは、組織類別が最適化される励起波長を識別するのに使用できる。また、ＥＥＭは測定された蛍光信号の起点を、より信頼性のある態様で識別することを補助できる。それにもかかわらず、図２および図３に示すように、これらの測定されたＥＥＭは組織散乱および吸収により大幅に歪んでしまうことがある。組織生化学によるアーチファクトではなく、散乱または吸収の変化により導入されるアーチファクトを除去するため、散乱および吸収事象により同様な態様で影響を受ける対応反射率スペクトルを使用できる。歪んだ測定組織蛍光スペクトルが、反射率手法を用いてひとたび整流されると、３３７ｎｍで励起された組織蛍光は、組織が非異形成から低段階異形成、更には高段階異形成へと進行するときに、非常に首尾一貫した態様で、より長い波長に拡大されかつ変位する（図３）。これらのスペクトル変化は、異形成組織の増大したＮＡＤＨレベルの存在と調和している。３９７および４１２ｎｍ励起での本発明者の発見は内因性のポルフィリンに帰する。高段階異形成部位に一致するスペクトルは、散乱および吸収の効果を補正した後でも、約４７０ｎｍで僅かに歪む。このことは、この効果が、吸収の結果というよりはむしろ生化学的変化の結果として生じるものであることを示唆するものである。
【００２９】
異形成の成長中に組織蛍光に観察される大きい変化レベルを示すため、３３７、３９７および４１２ｎｍで励起された固有蛍光スペクトルに観察される不一致の９９％に亘って記述する最初の３つの主成分のうちの１つの標点を使用できる。次に、論理学的回帰および「１つを残しておく」相互検証を用いて、感度および特異性を不偏態様で評価しかつ検証でき、これらの感度および特異性を用いて、（ａ）低段階異形成組織および非異形成組織から高段階異形成組織を識別し、かつ（ｂ）非異形成組織からの異形成（低段階および高段階異形成）を識別して、低段階異形成組織および非異形成組織から高段階異形成組織を識別でき、分光学的手法による類別は、１つを除く全てにおいて、組織病理学類別に一致している。また、非常に高い感度および特異性で、非異形成組織から異形成を識別できる。
【００３０】
反射率による分光学的手法は、測定した組織蛍光スペクトルに観察される歪みを除去するだけでなく、組織の形態学的および構造的特徴に関する非常に詳細かつ潜在的に有効な情報を提供できる。より詳しくは、図６に示すように、観察された組織反射率スペクトルは、組織散乱および吸収により決定される２つのパラメータに関して使用できる。例えば、ヘモグロビンの濃度または酸素飽和度の変化、この種類の組織からの可視スペクトルでの主吸収により、組織の吸収係数の付随的変化が生じる。連結性組織コラーゲン線維および組織散乱の主寄与子は、修正された組織散乱係数をつくる。この分析は、組織の散乱係数は異形成の成長中に大幅に減少することを示唆し、このことは、組織病理学的に観察されない変化が、侵襲が立上る前に粘膜固有層および粘膜下組織内に生じることを示唆する。最近では、システインおよびセリンプロテアーゼの増大したレベルが胃および結腸直腸の癌性および前癌性病巣に見られることが示されている。異形成の進行中の散乱係数の値の低下に関する発見は、このような酵素の存在に一致し、これは例えば、密度の小さいコラーゲンマトリックスを生じさせる。波長の関数としてのμ′（λ）の傾斜の変化は、粒子を散乱する組織の平均サイズが変化することを示唆する。細胞および上皮層の核の密集度合いは、この変化に応答する。表１に示すように、全く成功裏に組織を類別するため、組織散乱の観察された変化を使用できる。光散乱分光学的手法は、上皮細胞層の核の数およびサイズに関する情報を得るのに使用できる方法である。上皮細胞核は、反射光がプローブにより収集される前に、単独で散乱される反射光の主ターゲットである。この単独で後方散乱される光の強度および振動は、そのターゲット核の数およびサイズの特徴である。この技術は、結腸、口腔、膀胱およびバレット食道（ＢＥ）の前癌および早期癌の変化を特徴付けるのに使用される。この技術の結果は、取得されかつ蛍光分光学的手法および反射光分光学的手法と組合される情報を示すため、好ましい実施形態のデータ組に包含される。光散乱分光学的手法は、非異形成ＢＥ部位から異形成を識別する能力に関して、他の２つの方法より優れている。
【００３１】
３つの全ての技術の組合せにより、バレット食道（ＢＥ）の異形成の検出を行なう極めて感度が高い特殊ツールが得られる。この場合には、非異形成部位および低段階異形成部位からの高段階異形成の識別に関して組織病理学的手法との一致が達成される。また、全ての部位は、１つの部位を除き、異形成または非異形成として正しく類別される。各技術は。異形成の変化が生じている間に変化する組織生化学および形態学の種々の特徴を試験するので、目立つ改善が期待される。
【００３２】
西欧諸国での５大死亡原因の１つは膵臓癌であり、膵臓癌は、最初の診断後の予後（予測）は非常に困難である。これは、症状が後で現われること、および切除が適当であるのは全患者のうちの約５〜２０％に過ぎないからである。膵臓の腺癌は管状上皮から生じる。前癌段階では、管状上皮細胞は、大きい核サイズおよび密集度をもつバレット食道（ＢＥ）の形態学的変化と同様な形態学的変化を受ける。前癌状態および早期癌状態の変化の検出を可能にする幾つかの臨床条件が存在する。これらの条件として、膵管の病巣閉塞による急性膵炎または慢性膵炎、腺管内乳頭ムチン腫瘍（ＩＰＭＴ）および膵臓癌の強い家系をもつ患者がある。このセッティングでの異形成の検出は、現在、膵管の狭窄または拡張の検出および剥離細胞診に基いている。しかしながら、これらの方法は、異形成と炎症との信頼性ある識別を行なうことができず、４４．７０％という全体的に悪い感度を有している。
【００３３】
本発明は、内視鏡的逆行性膵胆管造影法（ＥＲＣＰ）の技術および膵管上皮から得たスペクトルを用いた主膵管内の３モード分光学的分析を行なう方法を有している。
【００３４】
膵臓の管腺癌の大部分の患者は、有効な治療を受けることができない手遅れの段階の癌である。極く少数の患者のみが、癌の早期異形成を検出できる時点で評価されるに過ぎない。これらには、主膵管の狭窄（ＭＰＤ）、急性膵炎を呈するＩＰＭＴ、および膵臓癌の強い家系をもつ患者の場合がある。これらの全ての場合において、異形成の存在および膵臓の長さに沿う異形成の分散は、（膵臓の一部または全部を切除すべきか否か）についての判断決定を厳しいものとする。本発明は、異形成の検出のための３モード分光学的手法を、膵管の侵襲性癌に使用することを可能にする。本発明は、患者の体外または体内検体を評価して異形成の膵臓癌の検出を行なうことができる。スペクトルは、切除の３時間以内でかつホルマリン固定前に、１ｃｍ間隔でＭＰＤから収集される。３モードスペクトル分析は、歴史的カテゴリを正確に識別する要素を評価すべく遂行できる。これらのスペクトルアルゴリズムは、上記３つの状態を評価するためＥＲＣＰを受ける患者に、その体内的に適用される。スペクトルは、管の全長に沿って、１ｃｍ間隔で体内で収集される。スペクトル信号は、臨床的状態が膵臓の外科的切除を必要とする患者間の組織と比較できる。スペクトル信号のアナトミー位置は、ＭＰＤオリフィスからの距離に従って一致させることができる。
【００３５】
本発明は、単独でまたは異常なパパニコラウスミア（Ｐａｐ ｓｍｅａｒ）の後のコルポスコーピーのときに、頚管の前侵襲病巣の検出に使用できる。また、本発明は、前侵襲病巣の治療の進行をモニタリングする非侵襲方法にも使用できる。
【００３６】
パパニコラウスミアは、頚管組織異常に用いるスクリーニングツールである。異常なパパニコラウスミアの後には、コルポスコーピー手法が日常的に行なわれる。この方法は、後で生検採取されかつ組織病理学的に検査される異常な頚管上皮の識別を行なう低倍率両眼顕微鏡を使用する。熟練した手では、コルポスコーピーの感度および特異性は、それぞれ、９４％および４８％であると見積もられる。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態は、体内の頚管上皮を評価する分光学的技術を含んでいる。３３７、３８０および４６０ｎｍで励起される組織蛍光スペクトルは、子宮膣部領域および頚管内領域内の正常部位および疑わしい部位からのコルポスコーピー手術中に取得された。疑わしい部位は生検採取されかつ組織病理学的に類別される。最初の組のスペクトルが分析され、分光学的類別と組織病理学的類別との一致を最適化させる統計学的方法が開発された。第二組のデータを類別するのにこれらの方法が先を見越して使用されると、鱗状上皮内病巣（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ：ＳＩＬ）は、組織病理学的方法と比較して８２％の感度および６８％の特異性で分光学的に識別できることが判明した。本発明は、体内アプローチでリアルタイムに頚管上皮をスペクトル分析するときの感度および特異性を改善する。本発明の方法は、３モード分光学的手法（ＴＭＳ）、および固有蛍光分光学的手法（ＩＦＳ）と、拡散反射率分光学的手法（ＤＲＳ）と、光散乱分光学的手法（ＬＳＳ）との組合せ使用を用いる。
【００３８】
本発明の方法は、３モード方法を用いて得られたスペクトルと、生検採取された上皮領域の組織学的診断とを比較することができる。この方法は、組織学的異形成を予測態様で予想するパターンを与え、かくして、医者は、頚管上皮の組織学的病巣の予測の確実性を高めることができる。これは、頚管異形成の治療の応答を決定するため、臨床的トライアルで次の患者の大きい値にすることができる。
【００３９】
スペクトルは、正常な鱗状子宮膣部および変態ゾーン内の疑わしい部位から取得される。後者は、直ちに生検採取され、次にスペクトルが取得される。データは、３４人の患者、４２個の正常な子宮膣部（生検採取されない）、１５個の良性の生検採取部位（鱗状化生として類別された１２個と、成熟した鱗状上皮として類別された３個）、および１０個の高段階鱗状上皮内病巣（ＨＩＬ）から収集された。
【００４０】
図９Ａ〜図９Ｄに示すように、幾つかの励起波長について、固有蛍光強度および／または線形状の相違が観察される。
【００４１】
固有蛍光分光学的手法の診断能力の評価についての主成分分析を用いる代わりに、静脈瘤結紮中に遂行される測定から抽出されるＮＡＤＨと、コラーゲンＥＥＭとのリニアな組合せとして分解できる。
【００４２】
図１０に示すように、良性の生検採取部位およびＨＳＩＬのコラーゲン蛍光は、正常の鱗状上皮のコラーゲン蛍光に比べて大幅に低減しているのが観察される。これらの変化は、マトリックス金属結合タンパク（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ：ＭＭＰ）の表現のレベル差およびコラーゲン分解の原因となる酵素のクラスの差異から生じる。ＭＭＰ−２のレベルおよび／またはパターンの差異は、正常の鱗状上皮と、鱗状化生と、ＳＩＬとの間に報告されている。また、図１１Ａから、ＮＡＤＨ蛍光は、良性の生検採取部位よりもＨＳＩＬの方が増大しているのが見られる。この増大は、上皮細胞数の増大および／またはこれらの代謝活性（５２）によるものと考えられる。バレット食道の場合におけるように、論理学的回帰および「１つを残しておく」相互検証を用いると、ＨＳＩＬを、８０％の感度および６７％の特異性をもつ良性の生検採取部位から識別できる。
【００４３】
図１１Ｂに示すように、散乱光中の周期的成分を用いた拡散反射率スペクトルの分析によれば、ＨＳＩＬの低下したＨＳＩＬの散乱係数は、一般に、鱗状化生および成熟した鱗状上皮の生検採取部位の散乱係数より小さい。４００ｎｍでのμｓ′（λ）を用いて論理学的回帰および相互検証を行なうときは、７／１０ＨＳＩＬ（７０％感度）および９／１５良性の生検採取部位（６０％特異性）は正しく類別される。
【００４４】
光散乱スペクトルの抽出および分析により、核サイズの変化、すなわち特定部位に一致する核サイズ母集団の標準偏差は、バレット食道の場合に考えられる拡大核の割合（％）より高い診断値を有することが判明した。診断パラメータとして論理学的回帰および相互検証に核サイズの標準偏差および単位面積当りの核数を用いると、特に図１１Ｂに示すように、ＨＳＩＬは、９０％の感度および６７％の特異性で、良性の生検部位から識別される。
【００４５】
最後に、３つの技術ＩＦＳ、ＤＲＳおよびＬＳＳは、好ましい実施形態では、３つの分析方法のうちの少なくとも２つに一致する診断に従って特定部位を類別する態様で組合される。表２に示すように、このアプローチは、いずれか１つの技術と比較して、変態ゾーン内の非ＨＳＩＬ部位からのＨＳＩＬの検出を行なう高レベルの感度および特異性（それぞれ、１００％および８０％）を達成する。
【００４６】
【表２】
2004518124.tif 000004
【００４７】
図１２は、患者の体腔内の対象領域が照射され（１０２）、かつ蛍光および反射光が検出される（１０４）構成の本発明の好ましい実施形態のプロセスシーケンスを示す。３つの要素（１０６）、（１０８）および（１１０）を使用して、構造的および生化学的情報（１１２）を発生させる。このデータは、判別分析（１１４）、重み付けされた要素（１１６）および遂行された診断（１１８）をリアルタイムで使用して分析される。これらの測定値は、非侵襲的態様で病気の類別を行なう有効情報を得る分光学的技術の能力を示す。各技術はバレット食道の異形成を検出するのに使用できるが、これらを組合せることにより、組織の生化学的および形態学的状態の包括的画像（ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｐｉｃｔｕｒｅ）の形成ができる。より詳しくは、固有組織蛍光ＥＥＭのＮＡＤＨおよびコラーゲン等の生化学的物質のＥＥＭへの分解は、組織生化学に関する詳細を与える。反射率および光散乱分光学的手法は、結合組織および上皮細胞核に関する形態学的情報を発生する。この情報には組織の切除および処理により導入されるアーチファクトがないので、異形成の進行をもたらすプロセスの理解を進めることを助けることができる。リアルタイムでのデータ分析を遂行するソフトウェアは、生検へのガイドとしてこれらの技術を適用することを可能にする。この手順を用いて対象領域をイメージングする方法は、大きい組織領域を迅速に研究することを可能にする。
【００４８】
システムの作動環境は、少なくとも１つの高速処理ユニットおよびメモリシステムを備えたデータ処理システム３４等の処理システムを有している。コンピュータプログラムの当業者の実務に従って、特記しない限り、本発明は、処理システムにより遂行される行為または作動または情報を表す符号に関連して説明する。これらの行為、作動または情報は、ときどき、「コンピュータ実行される」または「処理ユニット実行される」と呼ばれる。
【００４９】
符号で表される作動または情報には、処理ユニットによる電気信号の操作が含まれることに留意されたい。データビットを使用する電気システムは、電気信号表示の変形または減少および記憶システムのメモリでのデータビットの維持によって処理ユニットの作動および他の信号処理を再構成すなわち変えさせる。メモリ位置がデータビットであるならば、このデータビットに一致する特定の電気的、磁気的、光学的または有機的特性をもつ物理的位置が保持される。
【００５０】
データビットはまた、磁気ディスク、光ディスク、有機ディスク、および使用する処理装置が読取り可能な他の任意の揮発性または不揮発性大量記憶システムを含むコンピュータ読取り可能媒体に保持される。コンピュータ読取り可能媒体は協働しかつ相互接続されるコンピュータ読取り可能媒体を有し、該媒体は、専ら処理システムに設けるか、処理システムに対してローカルまたは遠隔に位置する多数の相互接続された処理システム間に分散配置できる。
【００５１】
図１３は、本発明に従ってデータをリアルタイムで分析することにより、組織の層の構造を測定する好ましい実施形態を示すフローチャートである。リアルタイム分析は、例えば頚の上皮組織およびＧＩ路（ＧＩ ｔｒａｃｔ）の前癌状態の診断に使用できる。この測定方法は、キャリブレーションステップ（２００）から開始する。次に、ステップ（３００）で、拡散反射率スペクトル（ＤＲＳ）が分析される。ステップ（４００）では固有蛍光スペクトル（ＩＦＳ）が分析される。この方法の次のステップは、光散乱スペクトル（ＬＳＳ）を分析するステップ（５００）を有している。方法は、次に、この３モードシステム分析の前のモードの組合せ分析を表すステップ６００に続く。
【００５２】
好ましい実施形態では、内視鏡手術中に、複数の波長、例えば３３７〜６２０ｎｍ間の１１個のレーザ励起波長での蛍光スペクトルと、１つの白色光（３５０〜７５０ｎｍ）の反射率スペクトルとが１秒以内に取得される。取得されたスペクトルは、最外組織層（該層に、ほぼ９０％の癌が発生する）に関する情報を含んでいる。
【００５３】
記録された蛍光スペクトルおよび反射率スペクトルから、３種類の分光学的情報ＩＦＳ、ＤＲＳおよびＬＳＳが抽出される。ＩＦＳとは、組織の散乱および吸収により導入される歪みがない組織の蛍光スペクトルの回収をいう。これらの歪みを除去するため、測定した蛍光スペクトルおよび反射率スペクトルが、例えば光子移動法を用いて組合される。抽出されたＩＦＳは分解されて、生化学的組織組成に関する量的情報および前癌組織に生じる変化を得る。
【００５４】
測定された反射率スペクトルは、主として、検出される前に多数回散乱される光子からなる。拡散理論に基いたモデルは、拡散的に反射される光を説明するため、従って組織の吸収および低下した散乱係数に関する情報を抽出するのに使用される。低下した散乱係数は、主として、上皮すなわち最も表面に近い組織層の構造的支持体を形成する結合組織の形態学的性質に基いて定まる。
【００５５】
ＩＦＳ、ＤＲＳおよびＬＳＳの組合せ使用は、生物物理学的組織の特徴化および前癌病巣の検出を行なうツールとして機能する。好ましい実施形態では、ＴＭＳ分析はデータ収集時から２〜８秒以内に遂行される。このＴＭＳ分析は、生検へのリアルタイムガイドを形成できる。
【００５６】
図１４は、本発明の好ましい実施形態によるキャリブレーションのステップ２００の詳細を示すものである。例えば情報と関連するスペクトルの変化を除去するためのキャリブレーション方法は、病巣組織の診断に使用されるシステムの任意のデータファイルを較正するステップ（２１０）から開始する。キャリブレーションシーケンスでの次のステップは、反射率基準を用いてシステムを較正するステップ（２２０）を有している。この基準は、反射率のＳｐｅｃｔｒａｌｏｎキャリブレーションのような白色光標準の使用を含むが、これに限定されるものではない。キャリブレーション方法（２００）は、蛍光標準を用いてシステムを較正するステップ（２３０）を有している。蛍光標準として、例えばＲｈｏｄａｍｉｎｅがあるが、これに限定されるものではない。キャリブレーション方法（２００）の次のステップは、例えば任意の背景蛍光（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を減じることにより背景蛍光を除去するステップ（２４０）を有している。機器のスペクトル応答は、ステップ（２５０）で較正される。
【００５７】
図１５は、ＤＲＳの分析を詳述する本発明の好ましい実施形態のフローチャートである。この方法は、ステップ（３１０）での、種々の直径の散乱粒子のミー散乱パラメータを記述するルックアップテーブルの創成を有している。ミー散乱を記述するルックアップテーブルを創出することにより、各反復についてのミー散乱計算の処理時間が短縮される。ステップ（３２０）は、減少した散乱係数値μｓ′（λ）を複数の異なる領域に分割する。好ましい実施形態では、５つの領域がある。異なる領域へのこの分割は、１つの最適値または全てのμｓ′（λ）値に対する万能適合（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｆｉｔ）が存在しないことの説明がつく。なぜならば、異なる領域のμｓ′（λ）には異なる値があるからである。かくして、μｓ′（λ）スペースが複数の領域に分離され、かつ各領域について最小化方法が別々に遂行される。ステップ（３３０）では、較正された反射率スペクトルが、或るモデル、例えば前掲の米国特許第６，０９１，９８４号において説明されておりかつ異なる各領域でのＺｏｎｉｏｓモデルとして後述するモデルを用いて分析される。Ｚｏｎｉｏｓモデルは、１つの層の組織構造を説明しかつモデルの結果と実際の記録からの値との最良の適合を得るための反復方法を表す。本発明の好ましい実施形態は、２層モデルのような多層組織構造を説明することを含む。Ｚｏｎｉｏｓモデルでは、光は光源により組織の表面上に当てられる。組織から反射される光は波長の関数であり、組織の吸収係数、減少された散乱係数およびプローブ等の幾つかのパラメータに基いて定められる。かくして、反射率スペクトルＲ（λ）＝Ｆ（μａ（λ）、μｓ′（λ）、ｒｃ）と表される。ここで、μａ（λ）は、光を吸収するヘモグロビンまたはベータカロチンまたはより一般的に生化学物質、μｓ′（λ）は、減少した散乱係数、およびｒｃは、プローブの有効光収集領域である。次に、ステップ（３４０）において、モデルとデータとの間の最適値が選択される。最適値は、例えばスケーリング定数、粒子サイズおよび粒子密度、ヘモグロビン濃度および所定スペース内の飽和等のパラメータの値を最適化することにより決定される。必要ならば、高ヘモグロビン濃度および／または吸収の場合に、ステップ３５０において補正が計算されかつ適用される。一般に、ヘモグロビン濃度が高い場合には、適合が良くない。好ましい実施形態において、ヘモグロビン濃度適合が所定閾値を超える場合には、適合は或る領域例えば４５０〜７００ｎｍについて遂行されるに過ぎない。また、必要ならば、ステップ（３６０）におけるように、反射率曲線の形状により示されるように適合が劣る場合にも補正が計算されかつ適用される。
【００５８】
図１６は、本発明の好ましい実施形態によるＩＦＳの分析を詳細に説明するフローチャートである。生物学的組織は、散乱光が優勢であると吸収および蛍光の効果が不可避的に混乱される混濁媒体であることに留意すべきである。吸収および散乱の相互作用により、測定された蛍光に大きい歪みを引起こす。従って、測定した組織蛍光から固有蛍光を抽出することが重要である。固有蛍光は、組織中に存在する吸収体および散乱体からの干渉を受けない、蛍光物質のみによる蛍光であると定義される。蛍光スペクトルの最大の歪みは、ヘモグロビンが強く吸収する４２０ｎｍ近くのエミッションに生じる。このような歪みの除去は、重要な診断情報を含むことが証明されている紫外励起波長にとって特に重要である。
【００５９】
ステップ（４１０）では、入力データは、Ｚｏｎｉｏｓモデルにより与えられる反射率適合からの情報を用いて分析される。入力は、μｓ′（λ）、μａ（λ）、蛍光Ｆ（λ）およびＲｏｂｓを有している。ここで、Ｒｏｂｓは、観察された白色光の反射率である。データはまた、以下にＺｈａｎｇモデルと呼ぶ光子移動理論に基いた方法を用いて分析される。Ｚｈａｎｇモデルは、「較正された分光イメージング（Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｇｒａｐｈｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ）」という名称に係る１９９５年９月２６日付米国特許第５，４５２，７２３号（該米国特許の全内容は本願に援用する）に開示されたモデルに比べて改善されている。Ｚｈａｎｇモデルは、Ｚｈａｎｇ等の論文「生物学的組織の混濁のない蛍光分光学（Ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ−ｆｒｅｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｉｓｓｕｅ）」（Ｏｐｔｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒ社発行、Ｖｏｌ．２５、第１９巻、２０００年、１０月１日）に開示されている。尚、この論文の全内容は本願に援用する。Ｚｈａｎｇモデルは、反射率および蛍光が、同じプローブを用いて所与の組織部位から収集されるときは、拡散反射光および蛍光光子が同じ経路を横行するので、吸収および散乱によって蛍光スペクトルおよび反射率スペクトルが同様に歪まされるという事実に基いている。
【００６０】
好ましい実施形態では、媒体の蛍光強度は、次式のようにモデル化される。
【００６１】
【数１】
2004518124.tif 000005
【００６２】
ここで、Ｉｘは励起強度、φｘｍは蛍光の量子効率（ここで、添字ｘおよびｍは励起周波数νｘおよびエミッション周波数νｘでの対応量の評価）、ρｎｉは蛍光速度での蛍光の逃散確率、αはμｓ／（μａ＋μｓ）でありかつ各相互作用中に吸収されない光子の一部であって、この相互作用時の光子重量低減係数であると考えることができる。従って、カッコ内の表記は、単位励起光子当りの蛍光光子を意味する。光子が第一ｉ吸収すなわち散乱ノードを横切って、伝達ロスを受けた後、その重量は、各入射励起光子についてαｘｉとなる。第（ｉ＋１）番目のノードに到達する各励起光子については、μｆｘ／（μａｘ＋μｓｘ）個の光子が蛍光により吸収される。蛍光により吸収される各光子については、φｘｍ個の蛍光光子が発生される。蛍光光子の伝搬ロスは、ファクタαｍｎ−ｉ−１により説明される。
【００６３】
同量の蛍光を有するが他の吸収体および散乱体はもたない厚さｌ（エル）の希薄で光学的に薄い（μｆｘｌ（エル）≪１）場合には、次の固有蛍光が得られる。
【００６４】
【数２】
2004518124.tif 000006
【００６５】
式（１）中の蛍光の表現は、反射率に関して次式の補助により表現できる。
【００６６】
【数３】
2004518124.tif 000007
【００６７】
ここで、Ｒは、散乱体および吸収体の均質媒体の反射率である。この結果は、式（２）と組合せることにより、固有蛍光スペクトルｆｘｍと、実験的に測定した蛍光スペクトルＦｘｍと、蛍光スペクトルＲｍとの間に下記関係を得ることができる。
【００６８】
【数４】
2004518124.tif 000008
【００６９】
ここで、Ｒｏは、吸収がなくかつε＝ｅｘｐβ−１であるときの反射率、βは、段数ｎとは独立しているが、媒体の散乱特性に依存しているパラメータ、およびμは、組織の散乱係数である。
【００７０】
式（４）は、同一プローブを用いて蛍光および反射率が測定される限り、任意の供給のプローブすなわち収集ジオメトリを保持する。すなわち、Ｒｏは波長の関数であることに留意されたい。式（４）は、実験的に測定された蛍光ＥＥＭから固有蛍光励起すなわちエミッションマトリックス（ＥＥＭ）を抽出するのに使用できる。媒体が多数の蛍光を含んでいるときに必要な１つのことは、式（１）、（２）中のμｆｘφｘｍの全ての発生を、全ての蛍光に亘るこの量の合計に置換することである。これを行うことにより、式（４）におけるものと同じ表現が得られる。
【００７１】
ステップ（４２０）では、ＩＦＳ（Ｒｏｂｓｆｉｔ（λ））が得られる。次に、ステップ（４３０）において、生化学的分解プロセスが遂行される。生化学的分解プロセスはＩＦＳに基くリニア分解プロセスにすることができ、かつスペクトルの量的測定を行なう。また、ステップ（４４０）では、主成分分析（ＰＣＡ）も行なわれる。
【００７２】
図１７Ａおよび図１７Ｂは、本発明の好ましい実施形態によるＬＳＳの分析を詳細に示すフローチャートである。この分析はステップ（５１０）から開始し、ここでは、観察された白色光反射率曲線（Ｒｏｂｓ（λ））および反射率適合曲線（Ｒｆｉｔ（λ））が円滑化される。好ましい実施形態では、移動窓平均円滑化プロセス（ｍｏｖｉｎｇ ｗｉｎｄｏｗ ａｖｅｒａｇｅ ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ）が使用される。ステップ（５２０）では、円滑化されたデータからＬＳＳスペクトルが発生され、ＬＳＳスペクトルは、観察された白色光反射率と、反射率適合との差で表される（ＬＳＳスペクトル＝Ｒｏｂｓ（λ）−Ｒｆｉｔ（λ））。ＬＳＳスペクトルは波長依存性スペクトルである。次にステップ（５３０）において、データは、波長（λ）スペースから、波数（κ）スペースへと伝送される。次に、ステップ（５４０）において第一試験が行なわれ、フーリエスペースのスペクトル中に明確なピークが存在するか否かが決定される。明確なピークが存在する場合にのみフーリエ変換が評価され、さもなくば信頼性のある診断は行なわれない。好ましい実施形態では、明確なピークの存在の試験には、例えば下記のサイン・フーリエ変換を使用できる。
【００７３】
【数５】
2004518124.tif 000009
【００７４】
明確なピークが存在する場合には、プロセスはステップ（５５０）に進み、ここでフーリエ変換（ＦＴ）が創出される。しかしながら、明確なピークが存在しない場合には、プロセスはステップ（３１０）に戻る。次にプロセスはステップ（５６０）に入り、該ステップ（５６０）は、ヘモグロビン吸収特徴が説明される第二試験すなわちチェックポイントとして機能する。二次多項式がＲｏｂｓ（λ）データに適合される。次に、適合が正確でない場合には、ステップ（５１０）、（５２０）および（５３０）が反復される。次に、フーリエ変換を行なって、ステップ（５５０）および（５６０）から得られたＦＴ（フーリエ変換）と比較する。次に、ＦＴと同じであるか否かを決定する。異なる場合には、プロセスはステップ（５７０）に進む。しかしながら、ＦＴが同じである場合には、限定的ではないが、図１５のＤＲＳ分析に関して説明したような他のヘモグロビンまたは２層モデルが使用される。
【００７５】
ステップ（５７０）では、ステップ（５５０）からのＦＴを分析しかつ顕著なピークの有無を確認することにより、第三試験すなわちチェックポイントが行なわれる。顕著なピークが存在しない場合には、多分、ヘモグロビン吸収パラメータがアーチファクトであると思われるので、プロセスはＤＲＳ分析のステップ（３１０）に戻る。顕著なピークが存在する場合には、ステップ（５７４）で高周波成分を濾過することにより、顕著なピーク以外のピークスペクトル成分が除去される。
【００７６】
データは、ステップ（５７６）で、例えば全スケーリング定数を掛けて結果を正規化することにより適当スケールに変換される。ステップ（５８０）で、核サイズ分布が決定される。この決定には、ステップ（５８２）での核サイズの拡大割合（％）の決定を含めることができる。核サイズ分布の決定には、ステップ（５８４）の核サイズ分布の幅の決定を含めることもできる。更に、核サイズ分布の決定には、ステップ（５８６）の数密度の決定を含めることもできる。
【００７７】
図１８は、本発明による３モードシステム（ＴＭＳ）分析の好ましい実施形態を示す。ＴＭＳ分析には、ステップ（６１０）のＤＲＳ分析（μａ（λ）およびμｓ′（λ））からの診断パラメータ出力の少なくとも１つの値と、ステップ（６２０）のＩＦＳ分析例えば生化学的分析（但し、これに限定されない）からの診断パラメータ出力の値と、ステップ（６３０）のＬＳＳ分析例えば核サイズ分布、サイズ変化、標準偏差および数密度の分析（但し、これに限定されない）からの診断パラメータ出力とが含まれ、ステップ（６４０）での識別分析を遂行する。好ましい実施形態では、判別分析には、各パラメータへの重みの割当て、重み付けされたパラメータの合計、および該合計と閾値との比較を含むＦｉｓｈｅｒ判別分析（但し、これらに限定されない）を含めることができる。ＴＭＳ分析の結果は、ステップ（６５０）で、ＴＭＳ診断として得られる。ＴＭＳ診断には、非異形成組織、高段階異形成組織、および異形成組織の有無に関する評価が含まれる。
【００７８】
図１９には、本発明によるＴＭＳ分析の他の好ましい実施形態が示されている。この好ましい実施形態では、分光学的手法の各様相からの診断が個々に与えられかつ全体的診断を行なう前に比較される。ステップ（６６２）で、ＤＲＳ分析からの診断パラメータ出力の値例えばμｓ′（λ）を使用して、ステップ（６６４）で、ＤＲＳ分析からの診断を行なう。例えば、傾斜／遮断データ値（ｓｌｏｐ／ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ ｄａｔａ ｖａｌｕｅｓ）が決定されかつ閾値と比較されて、組織特徴を決定する。同様に、ステップ（６７０）でのＩＦＳ分析からの診断パラメータ出力の値を用いて、ステップ（６７２）で、ＩＦＳ分析と同一基準の分析を行なう。例えば、ＩＦＳスペクトルへのＮＡＤＨおよび／またはコラーゲン、および／またはポルフィリン（但し、これらに限定されない）の寄与が閾値と比較され、ＩＦＳ分析からの診断を行なう。ステップ（６８０）でのＬＳＳ分析からの診断パラメータ出力の値は、次に、ステップ（６８２）で、ＬＳＳ分析からの診断を行なうのに使用される。ＬＳＳ分析からの診断として、例えば、拡大割合、数密度、サイズ変化、分散対密集の幅等で表される核サイズのような少なくとも１つの核サイズ特徴と、閾値との比較が含まれる。組織およびその位置に基いて、２つ以上の核サイズ特徴の組合せを対応閾値と比較し、ＬＳＳ分析からの診断を行なうことができる。
【００７９】
ステップ（６９０）で、３つの診断、より詳しくは、ＤＲＳ分析からの診断と、ＩＦＳ分析からの診断と、ＬＳＳ分析からの診断とが比較される。ステップ（６９２）でこの比較からの全体的診断が行なわれる。全体的診断は、２つの同様な個々の診断、例えばＩＦＳ分析およびＬＳＳ分析からの同様な診断から行なうこともできる。好ましい実施形態において、同様な診断の種々の順列および組合せを使用できる。
【００８０】
当業者ならば、組織の特徴を測定するための蛍光、反射率および光散乱分光学的手法のシステムに含まれる方法は、コンピュータが使用できる媒体を含むコンピュータプログラム製品に具現できることは明らかであろう。例えば、このようなコンピュータが使用できる媒体として、コンピュータ読取り可能なプログラムコードセグメントが記憶されたハードドライブデバイス、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、またはコンピュータディスケット等の読取り可能なメモリがある。また、コンピュータ読取り可能な媒体として、デジタルまたはアナログデータ信号として形成されたプログラムコードセグメントを備えた光学的、有線または無線のバスまたは通信リンク等の通信または伝送媒体がある。
【００８１】
以上、本発明を、特にその好ましい実施形態について図示しかつ説明したが、当業者ならば、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲から逸脱することなく。形状および詳細に種々の変更を施すことができることは理解されよう。
【００８２】
特許請求の範囲は、効果を述べたものでない限り、記載された順序または要素そのもに限定すべきものと理解すべきではない。従って、あらゆる実施形態は、特許請求の範囲に記載された範囲および精神内に包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明による測定を行なうシステムの好ましい実施形態を示す概略図である。
【図２Ａ】
非異形成バレット食道部位からの蛍光（３３７ｎｍ）を示すグラフであり、測定されたスペクトルが実線で、抽出された固有蛍光が破線で示されている。
【図２Ｂ】
図２Ａに示した蛍光スペクトルによる対応反射率スペクトルを示すグラフである。
【図３Ａ】
非異形成部位（実線）、低段階部位（一点鎖線）および高段階異形成バレット食道（ＢＥ）部位（破線）からの蛍光スペクトルを示すグラフであり、３３７ｎｍでの励起のための測定された固有蛍光および抽出された対応蛍光を示す。スペクトルはこれらのピーク強度に正規化されており、大きい腺形状変化に留意されたい。また、各カテゴリについての平均±標準偏差値が示されている。
【図３Ｂ】
非異形成部位（実線）、低段階部位（一点鎖線）および高段階異形成バレット食道（ＢＥ）部位（破線）からの蛍光スペクトルを示すグラフであり、３３７ｎｍでの励起のための測定された固有蛍光および抽出された対応蛍光を示す。スペクトルはこれらのピーク強度に正規化されており、大きい腺形状変化に留意されたい。また、各カテゴリについての平均±標準偏差値が示されている。
【図３Ｃ】
非異形成部位（実線）、低段階部位（一点鎖線）および高段階異形成バレット食道（ＢＥ）部位（破線）からの蛍光スペクトルを示すグラフであり、３９７ｎｍでの励起のための測定された固有蛍光および抽出された対応蛍光を示す。スペクトルはこれらのピーク強度に正規化されており、大きい腺形状変化に留意されたい。また、各カテゴリについての平均±標準偏差値が示されている。
【図３Ｄ】
非異形成部位（実線）、低段階部位（一点鎖線）および高段階異形成バレット食道（ＢＥ）部位（破線）からの蛍光スペクトルを示すグラフであり、３９７ｎｍでの励起のための測定された固有蛍光および抽出された対応蛍光を示す。スペクトルはこれらのピーク強度に正規化されており、大きい腺形状変化に留意されたい。また、各カテゴリについての平均±標準偏差値が示されている。
【図４】
非異形成部位および低段階異形成バレット食道（ＢＥ）部位（正方形）から高段階異形成部位（菱形）を識別するのに使用される３３７、３９７および４１２ｎｍ励起での固有蛍光スペクトルの分解から抽出された３つの主成分の標点を示す図面である。３３７ｎｍ励起では、固有蛍光スペクトルの４６０〜５２０ｎｍ領域で分解が行なわれた。これは、スペクトル差が最も顕著である波長範囲だからである。同様に、３９７ｎｍ励起では、６００〜６５０ｎｍ間の固有蛍光スペクトルから主成分が抽出された。ＰＣ１は第一主成分を示し、ＰＣ３は第三主成分を示している。
【図５】
非異形成バレット食道（ＢＥ）部位（正方形）から低段階および高段階異形成部位（菱形）を識別するのに使用される３３７、３９７および４１２ｎｍ励起での全固有蛍光スペクトルの分解から抽出された３つの主成分の標点を示す図面である。ＰＣ２は第二主成分を示している。
【図６】
非異形成バレット食道部位の反射率スペクトルを示すグラフであり、実線は測定データを示し、破線は組織の既知の散乱特性および吸収特性に基いた組織の投影特性を示す。
【図７】
非異形成部位（正方形）、低段階異形成部位（菱形）および高段階異形成バレット食道（ＢＥ）部位（三角形）についての波長依存性組織低減散乱係数μｓ′（λ）の傾斜および遮断を示すグラフである。各場合において、直線は反射率スペクトルから抽出したμｓ′（λ）に適合された。全てのデータ点が見られるようにするため、両対数スケールを使用している。
【図８】
光散乱モデル分析から決定されたときの拡大核（直径＞１０μｍ）の割合（％）の関数としてプロットされた１ｍｍ２当りの核の全数を示すグラフであり、非異形成バレット食道は正方形、低段階異形成は丸、高段階異形成は三角形のプロットで示されている。
【図９Ａ】
正常の鱗状上皮（実線）、良性生検部位（破線）および高段階ＳＩＬ（点線）の測定蛍光スペクトルおよび固有蛍光スペクトルを示すグラフであり、３３７ｎｍ励起で観察された線形状および強度の差を示す。
【図９Ｂ】
正常の鱗状上皮（実線）、良性生検部位（破線）および高段階ＳＩＬ（点線）の測定蛍光スペクトルおよび固有蛍光スペクトルを示すグラフであり、３３７ｎｍ励起で観察された線形状および強度の差を示す。
【図９Ｃ】
正常の鱗状上皮（実線）、良性生検部位（破線）および高段階ＳＩＬ（点線）の測定蛍光スペクトルおよび固有蛍光スペクトルを示すグラフであり、３５８ｎｍ励起で観察された固有蛍光に観察された強度差を示す。
【図９Ｄ】
正常の鱗状上皮（実線）、良性生検部位（破線）および高段階ＳＩＬ（点線）の測定蛍光スペクトルおよび固有蛍光スペクトルを示すグラフであり、３５８ｎｍ励起で観察された固有蛍光に観察された強度差を示す。
【図１０】
正常の鱗状上皮（正方形）、良性生検（丸）およびＨＳＩＬ（三角形）についてプロットした、相対コラーゲン蛍光レベルの関数としての相対ＮＡＤＨ蛍光レベルを示すグラフであり、３つの矢印は「成熟鱗状上皮」として類別された良性生検を示し、他の良性生検は「鱗状化生」として類別された。
【図１１Ａ】
良性生検採取部位および高段階異形成部位について４００ｎｍでの減少した散乱係数を示すグラフである。
【図１１Ｂ】
特定部位の核サイズ母集団の標準偏差の関数としてプロットした１ｍｍ２当りの核密集度すなわち全数を示すグラフであり、線は論理学的回帰により決定されたものである。
【図１２】
本発明の好ましい実施形態によるプロセスシーケンスを示すものである。
【図１３】
本発明による組織層中の構造を測定する好ましい実施形態を示すフローチャートである。
【図１４】
本発明の好ましい実施形態による、図１３に示したキャリブレーションのステップを詳細に示すものである。
【図１５】
本発明による拡散反射率スペクトル（ＤＲＳ）の分析を詳細に示す本発明の好ましい実施形態のフローチャートである。
【図１６】
本発明の好ましい実施形態による固有蛍光スペクトル（ＩＦＳ）の分析を詳細に示すフローチャートである。
【図１７Ａ】
本発明の好ましい実施形態による光散乱スペクトル（ＬＳＳ）の分析を詳細に示すフローチャートの前段部である。
【図１７Ｂ】
図１７Ａのフローチャートの後段部である。
【図１８】
本発明の好ましい実施形態による３モードシステムの分析を示すものである。
【図１９】
本発明による３モードシステムの他の好ましい実施形態を示すものである。
【図１】
2004518124.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2004518124.tif 000019
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【図１０】
2004518124.tif 000021
【図１１】
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【図１２】
2004518124.tif 000023
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2004518124.tif 000027
【図１７Ａ】
2004518124.tif 000028
【図１７Ｂ】
2004518124.tif 000029
【図１８】
2004518124.tif 000030
【図１９】
2004518124.tif 000031
【国際公開パンフレット】
2004518124.tif 000032
2004518124.tif 000033
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2004518124.tif 000089
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004518124.tif 000090
2004518124.tif 000091
【国際調査報告】
2004518124.tif 000092
2004518124.tif 000093
2004518124.tif 000094