(57)【要約】ＣＤ３抗原複合体の構成部分の産生を認識または干渉する、抗体または機能的な抗体の断片が脱免疫化される。本開示による抗体は、ＣＤ３抗原複合体を認識するかもしくはＣＤ３抗原複合体の構成部分の細胞―表面発現に干渉する。抗ＣＤ３抗体もまた脱免疫化される（すなわち、所定の種に対して非免疫原性にされるかもしくは免疫原性を低くされる）。特に有用な実施形態において、始めにタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部を決定し、次いでアミノ酸配列中で所定の種のＨＬＡタンパク質に結合し得る一以上の潜在的なＴ細胞についてのエピトープ（「Ｔ細胞エピトープ」）を同定することによって、脱免疫化が達成される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱免疫化抗ＣＤ３抗体。
【請求項２】
配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７からなる群から選択される配列を含む、脱免疫化抗ＣＤ３抗体重鎖可変領域。
【請求項３】
配列番号１９および２０からなる群から選択される配列を含む、脱免疫化抗ＣＤ３抗体軽鎖可変領域。
【請求項４】
抗ＣＤ３抗体を選択する工程；ならびに
該抗ＣＤ３抗体を所定の種に対して免疫原性を低くする工程、
を含包する、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記抗ＣＤ３抗体を前記所定の種に対して免疫原性を低くする工程は、
（ａ）該抗体のアミノ酸配列の少なくとも一部を決定する工程；
（ｂ）該アミノ酸配列中で該所定の種の内在性タンパク質の中に見出される一以上の潜在的なＴ細胞のエピトープ（「Ｔ細胞エピトープ」）を同定する工程；
（ｃ）該アミノ酸配列を改変して、工程（ｂ）で同定された該Ｔ細胞エピトープのうち少なくとも一つを除去し、それにより該所定の種の免疫システムにさらされたときに、該抗体もしくはその一部分の免疫原性を減少させる工程、
を含包する、方法。
【請求項６】
（ａ）少なくとも一部が脱免疫化された抗ＣＤ３抗体をコードする配列を含むＤＮＡ配列を有する発現ベクターを産生する工程、
（ｂ）該ベクターで宿主細胞をトランスフェクトする工程、
（ｃ）該トランスフェクトされた細胞株を培養して脱免疫化抗ＣＤ３抗体分子を産生する工程、
を含包する、方法。
【請求項７】
脱免疫化抗ＣＤ３抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項８】
請求項７に記載の組成物であって、前記脱免疫化抗ＣＤ３抗体は、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７からなる群から選択される配列を含む重鎖可変領域を含む、組成物。
【請求項９】
請求項７に記載の組成物であって、前記脱免疫化抗ＣＤ３抗体は、配列番号１９および２０からなる群から選択される配列を含む重軽鎖可変領域を含む、組成物。
【請求項１０】
抗ＣＤ３抗体を投与する工程を含包する方法であって、該ＣＤ３抗体は、一以上のヒトＩｇＧ２抗体に由来する第一の部分と、一以上のヒトＩｇＧ４抗体に由来する第二の部分を有する操作された重鎖不可変領域を含み、少なくとも該抗体の一部が脱免疫化される、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、少なくとも前記抗体の軽鎖可変領域が脱免疫化される、方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法であって、少なくとも前記抗体の重鎖可変領域が脱免疫化される、方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の方法であって、前記抗体の軽鎖及び重鎖可変領域が脱免疫化される、方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載の方法であって、前記抗ＣＤ３抗体が配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７からなる群から選択される配列を含む重鎖可変領域を含む、方法。
【請求項１５】
請求項１０に記載の方法であって、前記抗ＣＤ３抗体が配列番号１９および２０からなる群から選択される配列を含む重鎖可変領域を含む、方法。
【請求項１６】
請求項１０に記載の方法であって、前記抗ＣＤ３抗体の少なくとも一部が
（ａ）該抗体のアミノ酸配列の少なくとも一部を決定する工程；
（ｂ）該アミノ酸配列中で所定の種の内在性タンパク質の中に見出される一以上の潜在的なＴ細胞のエピトープ（「Ｔ細胞エピトープ」）を同定する工程；
（ｃ）該アミノ酸配列を改変して、工程（ｂ）で同定された該Ｔ細胞エピトープのうち少なくとも一つを除去し、それにより該所定の種の免疫システムにさらされたときに、該抗体もしくはその一部分の免疫原性を減少させる工程、
によって、該抗体もしくはその一部を該所定の種に対して非免疫原性にするか、または、免疫原性を低くする工程を含包するプロセスによって脱免疫化される、方法。
【請求項１７】
脱免疫化抗ＣＤ３抗体をコードする、核酸。
【請求項１８】
請求項１７に記載の核酸であって、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７からなる群から選択される配列を含む抗体重鎖可変領域をコードする、核酸。
【請求項１９】
請求項１７に記載の核酸であって、配列番号１９および２０からなる群から選択される配列を含む抗体軽鎖可変領域をコードする、核酸。
【請求項２０】
請求項１７から１９のいずれかに記載の核酸によってコードされる抗ＣＤ３抗体と薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
この出願は米国仮特許出願第６０／４７５，１５５号（２００３年６月２日出願）の利益を主張し、この開示全体が本明細書中に参考として援用される。
（１．技術分野）
本開示は、遺伝子操作された抗体の分野に関連する。より具体的には本開示は、ＨＬＡタンパク質との結合を除去し、それによって潜在的に免疫原性が低くなるように、構造的に変化された抗ＣＤ３抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
（２．関連技術の背景）
抗体はＢリンパ球によって産生され、感染を防御する。抗体の基本的な構造は、ジスルフィド結合によって連結された二つの同じ軽鎖ポリペプチドと二つの同じ重鎖ポリペプチドからなる。各々の鎖のアミノ末端に位置する一番目のドメインはアミノ酸配列の中で非常に可変的であり、個人個人に見出される抗体結合の特異性に広い分布範囲をもたらす。これらは、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）として公知である。各鎖のその他のドメインは比較的アミノ酸配列において不変であり、重鎖定常領域（ＣＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）として公知である。
【０００３】
抗原と抗体との反応は、多重結合および水素結合、静電気力、ファンデルワールス力といった引き合う力が形成されることによって発生する。これらは共に、抗体に抗原を結合させるための重要な結合エネルギーを作り上げる。抗体結合親和力と抗体結合力は、抗体の生理学的特性および病理学的特性に影響すると知られている。
【０００４】
遺伝子操作技術の出現は、アイソタイプに依存して様々な程度のエフェクター機能を表す、無限の量の同じ型の抗体（モノクローナル抗体）を産生する様々な手段を導いた。例えば、あるマウスアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２）およびヒトアイソタイプ（特にＩｇＧ１）は、効果的に単球、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞といった細胞のＦｃ受容体に結合することができ、それによりサイトカインを放出するため該細胞を活性化させる。そのような抗体アイソタイプは、補体を活性化させるのにも強力であり、局所的もしくは全身的な炎症の結果を生じる。抗ＣＤ３マウス抗体ＯＫＴ３は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）に結び付く、大量のサイトカインを放出する原因になると観察された１つの抗体である。ヒトＣＤ３抗原は、代表的にはＣＤ３抗原複合体としていわれるＴ細胞の表面のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と非共有的に会合する、不変の少なくとも４つのポリペプチド鎖からなる。このＣＤ３抗原複合体は、抗原がＴ細胞受容体に結合するに際しＴ細胞の活性化の重要な役割を担っている。ある抗ＣＤ３抗体は抗原―ＴＣＲライゲーションがなくてもＴ細胞を活性化し得るが、そのような活性化も、Ｔ細胞の上でＣＤ３複合体を架橋させるために、ｍＡｂのＦｃ部分と付随細胞のＦｃ受容体の相互作用に依存している。抗ＣＤ３により媒介されるＴ細胞活性化におけるＦｃ相互作用の重要性は、ＯＫＴ３のような「分裂促進物質のような」抗ＣＤ３抗体が、プラスチック（これはＣＤ３を架橋させる）に結合されるか、またはＦｃ受容体保有細胞に結合されるのでない限り、Ｔ細胞をインビトロで増殖するように刺激しないという観察によって説明される。
【０００５】
上記Ｔ細胞受容体複合体のＣＤ３εシグナル伝達分子に対する抗体は、強力な免疫抑制因子であると判明した。例えば、ＯＫＴ３は、Ｔ細胞受容体―ＣＤ３エプシロン鎖のエピトープを認識し、激しい同種移植片拒絶の処置の免疫抑制体として世界中の多くの国々においての使用の承認を受けている、マウスｌｇＧ２ａ／ｋＭＡｂである。ＯＫＴ３のＣＤ３への結合は、ＴｃＲ複合体の全てのコーティングおよび／もしくは転形（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）という結果になり、このコーティングおよび／もしくは転形（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）は、ＴｃＲ遮断を媒介し、同種抗原と細胞媒介性細胞傷害性が阻害される一つの仕組みであり得る。
【０００６】
上記マウスＯＫＴ３抗体は、１９８５年の承認以来治療に使われている。しかしながら、このＭＡｂは、本来マウスであるという視点から、主に抗イディオタイプ成分が原因で、重大なヒトの抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答が起こる。この応答により、この抗体の投与の可能性は、厳しく制限される。個体からのＴ細胞が投与された抗体への免疫応答をしたときに、ＨＡＭＡ応答が始まる。それから、このＴ細胞は特定の「抗抗体」抗体を作り出すためＢ細胞を補充する。それゆえ、ＨＡＭＡ応答は、マウス抗体に対してＢ細胞によって作り出された抗体に媒介されるが、始めに起こるＴ細胞の応答に依存している。明らかに、この非常に有用な抗体の適切なヒト化もしくは他のＤＮＡ組み換え操作によってこのＨＡＭＡ応答を縮小もしくは撤廃することが大いに望ましく、それゆえ、その使用分野も拡大することになる。
【０００７】
いくつかの技術が上記ＨＡＭＡ問題に対処するために使われ、それゆえ、ヒトにおける治療用のマウス由来のモノクローナル抗体の使用を可能にしている。これらの方法論の共通の局面は、一般にげっ歯動物が起源であり、ヒト抗体タンパク質に存在する配列と同一の配列の重大な路を持つ、治療用抗体への導入であった。そのような変更はまた、抗体―抗原結合相互作用を維持するのに重要とされる場所における、特定の一つのアミノ酸残基の変更と通常連動されている。抗体に関しては、別の種の抗体分子の間の非常に高い程度の構造的（および機能的）保存によって、このプロセスは可能となっている。しかしながら、治療用のタンパク質の宿主種（例えば、ヒト）の中に構造的ホモログが存在していない、潜在的に治療用のタンパク質に関しては、そのようなプロセスは適用可能ではない。
【０００８】
ヒト化された抗体という用語は、非ヒト種からの抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる抗原結合部位の一定の構成部分を有する分子を、記載する。それに対し、抗原結合部位の他の領域（フレームワーク領域と呼ばれる）はヒト抗体に由来する。抗原結合部位は、ヒト定常ドメインに融合された完全な非ヒト可変領域も含み得る（「キメラ」抗体）。抗体の主要な機能はその標的抗原に結合することなので、抗原特異性と抗原親和性が維持されるように抗体の元の特徴が保存されることが大切である。しかしながら、不運にも、非ヒト抗体のヒト化は、例えば抗原結合性のような抗体−抗原相互作用に予想不可能な影響を与える。これは、治療目的の実施に際し、一回の投与につきより多くのヒト化された抗体を必要としていることを意味し、より高額な処置の費用と潜在的に不利な事象が起こる危険がより多くなるという結果となる。そして、完全なヒト抗体とヒト化された抗体の両方が、免疫応答を引き起こし得るか、もしくは一定の個体に投与される場合に免疫原性となり得る。
【０００９】
別の方法によれば、始めにタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部を決定し、次いで所定の種由来のＴ細胞が応答し得る一以上の潜在的なエピトープをそのアミノ酸配列中に同定することによって、その所定の種に対して、抗体は非免疫原性にされるか免疫原性をより低くされる。次に、上記抗体のアミノ酸配列が改変されて、上記同定されたＴ細胞エピトープの少なくとも一つを除去し、上記所定の種の免疫系にさらされた場合の上記タンパク質もしくはその一部の免疫原性を減少する。可溶性抗原を認識し結合し得る抗体と違い、Ｔ細胞は樹状細胞およびマクロファージのような特殊化した抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活動を通して、その抗原標的に出会わなければならない。ＡＰＣは、外部の抗原を取り込み、次いでこのペプチドはＨＬＡタンパク質へと複合体化され上記ＡＰＣの表面で発現される。Ｔ細胞はＨＬＡに関連して「提示される」抗原フラグメントのみを認識できる。「脱免疫化」と称され、そして本明細書において記述された方法において、ＨＬＡ分子に効果的に結合すると予想される抗体配列中のアミノ酸は、ＨＬＡにもはや結合せず、それゆえＴ細胞応答をもはや刺激し得ないように変化される。抗原へのＴ細胞の反応の欠如は、ＨＡＭＡ応答の減少もしくは除去となる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（要旨）
本開示による抗体は、ＣＤ３抗原複合体を認識するかもしくはＣＤ３抗原複合体の構成部分の細胞―表面発現に干渉する。抗ＣＤ３抗体もまた脱免疫化される（すなわち、所定の種に対して非免疫原性にされるかもしくは免疫原性を低くされること）。特に有用な実施形態において、始めにタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部を決定し、次いでアミノ酸配列中で所定の種のＨＬＡタンパク質に結合し得る一以上の潜在的なＴ細胞についてのエピトープ（「Ｔ細胞エピトープ」）を同定することによって、脱免疫化が達成される。次に、抗体のアミノ酸配列を改変して、同定されたＴ細胞エピトープの少なくとも一つを除去し、所定の種の免疫系にさらされた場合に、タンパク質もしくはその一部の免疫原性を減少させる。
【００１１】
別の局面から、本開示は以下の工程を含包する抗体産生のためのプロセスに関する；（ａ）少なくとも一部が脱免疫化された抗ＣＤ３抗体をコードする配列を含むＤＮＡ配列を有する発現ベクターを産生する工程；（ｂ）上記ベクターで宿主細胞をトランスフェクトする工程；そして、（ｃ）操作された抗体分子を産生するためトランスフェクトされた細胞株を培養する工程。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（好適な実施形態の詳細な説明）
脱免疫化抗ＣＤ３抗体が説明されている。用語「抗ＣＤ３抗体」は、ＣＤ３抗原複合体を認識するかまたはＣＤ３抗原複合体の一部の細胞表面発現に干渉する、任意の抗体もしくは機能的抗体断片を意味する。抗ＣＤ３抗体は、組み換え型であり得るかまたは天然であり得る。抗ＣＤ３抗体は、ヒト、非ヒト、キメラまたはヒト化されたものであり得る。抗ＣＤ３抗体は当業者の間で公知であり、例えば以下において説明される抗体が挙げられる；米国特許第５，５２７，７１３号、発明の名称「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ  ｕｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ  ｗｈｉｃｈ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ＴＣＲ／ＣＤ３  ａｎｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｗｈｉｃｈ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ａｎ  ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ」；米国特許第６，３５２，６９４号、発明の名称「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ  ｕｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ  ｗｈｉｃｈ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ＴＣＲ／ＣＤ３  ａｎｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｗｈｉｃｈ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ａｎ  ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ」；米国特許第６，４０６，６９６号、発明の名称「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ＣＤ３  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」；米国特許第６，１４３，２９７号、発明の名称「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ＣＤ３  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」；米国特許第６，１１３，９０１号、発明の名称「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｏｒ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ＣＤ３  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」；米国特許第６，４９１，９１６号、発明の名称「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」；米国特許第５，９２９，２１２号、発明の名称「ＣＤ３  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ」；米国特許第５，８３４，５９７号、発明の名称「Ｍｕｔａｔｅｄ  ｎｏｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｌｇＧ２  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉ  ＣＤ３  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ」；米国特許第５，５２７，７１３号、発明の名称「Ａｎｔｉ−ＣＤ３  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｍｉｎｏｄｅｘｔｒａｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ」；米国特許第５，３１６，７６３号、発明の名称「Ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ  ａｎｔｉ−ＣＤ３  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｔｏ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎ  ｖ���ｖｏ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」；米国特許第５，８２１，３３７号、発明の名称「Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｖａｒｉａｎｔｓ」。これらの特許のそれぞれは、その全体が本明細書中において参考として援用される。
【００１３】
上記抗ＣＤ３抗体は脱免疫化される。脱免疫化は、所定の種に対し上記抗ＣＤ３抗体を非免疫原性にするかまたは免疫原性をより低くする。脱免疫化は抗ＣＤ３抗体への構造的変化を通して達成され得る。当業者に公知のいかなる脱免疫化技術も使われ得る。抗体を脱免疫化するための一つの適切な技術が、例えば、本明細書においてその全体が参考として援用される、２０００年６月１５日に公開されたＷＯ００／３４３１７に記載されている。まとめとして、そこで記載された一般的な方法の中の代表的なプロトコルは、次の工程を含む；
１．抗体またはその一部のアミノ酸配列を決定する工程（もし一部だけの改変が必要とされる場合）；
２．ＭＨＣ分子へのペプチドの結合の決定、治療用タンパク質を受け入れる種由来のＴ細胞受容体へのペプチド：ＨＬＡ複合体の結合の決定、治療用タンパク質を受け入れる種のＨＬＡ分子を持つトランスジェニック動物を使い抗体もしくはその一部を試験すること、または、治療用タンパク質を受け入れる種由来の免疫系細胞で再形成されたそのようなトランスジェニック動物を試験することを含む任意の方法によって抗体のアミノ酸配列中の潜在的なＴ細胞エピトープを同定する、工程；
３．改変された抗体を産生する遺伝子操作方法または他の方法によって、抗体を変化させて、一以上の潜在的Ｔ細胞エピトープを除去し、およびそのような変化した抗体を試験するため産生する工程；
４．必要に応じて工程３の中で、抗体を変化させて、一以上の潜在的なＢ細胞エピトープを除去する工程；
５．一以上の潜在的なＴ細胞エピトープ（および必要に応じてＢ細胞エピトープ）が除去されている変化した抗体を試験して、その望まれた活性の全部もしくは一部を保持しているが一以上のＴ細胞エピトープを喪失している、改変された抗体を同定する工程。
本明細書における潜在的なＴ細胞エピトープは、特定ペプチド配列として規定され、この特定ペプチド配列はＨＬＡクラスＩＩ分子（もしくは非ヒト種の中で同等のもの）に相応な効率で結合すると予測されるかまたは結合し、またはペプチド：ＨＬＡ複合体形態で治療用タンパク質を受け入れる種由来のＴ細胞受容体に強力に結合し、または前回もしくは他の研究から治療用抗体を受け入れる種由来の抗原提示細胞に存在するＨＬＡクラスＩＩ分子の提示を経由してＴ細胞を刺激する能力を示す。
【００１４】
この脱免疫化方法は、外来のタンパク質への効果的なＴ細胞依存の免疫応答が免疫系の細胞アーム（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｒｍ）の活性化を必要とすることを、認識する。そのような応答は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による治療用の（外来の）タンパク質（つまり、治療用抗体）の取り込みを必要とする。一度そのような細胞の中に入ると、タンパク質はプロセスされ、そのタンパク質のフラグメントは、ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成し、および、その細胞表面に提示される。もしそのような複合体がＴ細胞由来のＴ細胞受容体の結合によって認識されれば、そのような細胞は一定の条件において活性化され、刺激性サイトカインを産生し得る。そのサイトカインは、Ｂ細胞の成熟した抗体産生細胞への分化を引き出す。さらに、そのようなＴ細胞応答はまた炎症および可能性としてアレルギー反応のような患者にその他の有害な影響も媒介し得る。
【００１５】
抗ＣＤ３抗体全部またはその一部分だけ（例えば、その抗ＣＤ３抗体の可変部分）が脱免疫化され得る。抗ＣＤ３抗体の一部だけの脱免疫化は抗ＣＤ３抗体がキメラ抗体（例えば、ヒト定常領域のもの）である場合に特に有用である。
【００１６】
本明細書で使用される用語「抗体」は全体のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、単鎖抗体および他の機能的抗体フラグメントを含む。全体の、モノクローナル抗体が好ましい。
【００１７】
一般に、本明細書によって開示された抗体の構成は、遺伝子工学技術を利用した認識された操作を使用することによって達成される。例えば、ＤＮＡを分離する技術、ＤＮＡを発現するためのベクターを作り、選択する技術、核酸を精製し分析する技術、組み換えベクターＤＮＡを作製するための特異的方法（例えば、ＰＣＲ法）、制限酵素でＤＮＡを切断するための特異的方法、ＤＮＡを連結する特異的方法、ＤＮＡ（ベクターＤＮＡを含む）を安定したまたは一時的な手段で宿主細胞へ導入する特異的方法、選択培地もしくは非選択培地で宿主細胞を培養し、ＤＮＡを発現する細胞を選択し維持する特異的方法が、一般に当該分野で公知である。
【００１８】
本明細書において開示されたモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５、１９７５）もしくは当該分野で周知の他の組み換えＤＮＡ方法を使用して誘導され得る。ハイブリドーマ法において、マウスまたは他の適切な宿主動物は、リンパ球による抗体の産生を惹起するタンパク質で免疫化される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化され得る。抗原に応答して産生されたリンパ球は、次いで、ポリエチレングリコールのような適切な融合剤を使用して骨髄腫細胞に融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，５９−１０３、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）。そのハイブリドーマ細胞は、次いで、融合していない親骨髄腫細胞の増殖もしくは生存を抑制する一以上の物質を好ましくは含む、適切な培地に接種され増殖する。好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した抗体の産生を支持し、かつＨＡＴ培地（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，カタログ番号Ｈ−０２６２）のような選択培地に対して感受性でないものである。これらの中で、好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫細胞（例えば、ｔｈｅ  Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡから入手できるＭＯＰＣ−２１マウス腫瘍およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、およびｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．ＵＳＡから入手できるＳＰ−２０細胞，ＮＳ０細胞もしくはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞に由来するマウス骨髄腫細胞）である。
【００１９】
上記ハイブリドーマ細胞は、選択培地（例えば、ＨＡＴ）で増殖し、そして、生存している細胞は、増殖し、そして抗原に対するモノクローナル抗体の産生について試験される。ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降反応、放射免疫測定（ＲＩＡ），フローサイトメトリーもしくは酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）のようなアッセイによって決定され得る。
【００２０】
望まれた特異性、親和性および／もしくは活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、そのクローンは、限界希釈手順によってサブクローンされ得、標準的な方法（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，５９−１０３、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）により増殖し得る。さらに、上記ハイブリドーマ細胞は、動物の腹水腫瘍としてインビボで増殖し得る。上記サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析もしくはアフィニティクロマトグラフィのような、慣習的な免疫グロブリン精製手順によって、培地、腹水もしくは血清から適切に分離される。上記モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣習的な方法を使用して（例えば、そのモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され、塩基配列が決定される。そのハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立ち得る。一度単離されると、そのＤＮＡは、発現ベクターへ中に配置され得、その発現ベクターは、次いでトランスフェクトされなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞（例えば、Ｅ．  ｃｏｌｉ細胞もしくは哺乳動物細胞）へトランスフェクトされ、組み換え宿主細胞の中におけるモノクローナル抗体の合成が得られる。
【００２１】
抗体もしくは抗体フラグメントもまた、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載された技術を使用して作り出された抗体ファージライブラリーから分離され得る。他の刊行物は、鎖シャッフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３，１９９２），ならびに、非常に大きいファージライブラリーを構築する戦略として感染とインビボ組み換えとの組み合わせ（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、２１：２２６５−２２６６，１９９３）を記載している。それゆえ、これらの技術は、抗原特異モノクローナル抗体と単離するための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の実行可能な別の方法である。
【００２２】
別の局面において、本開示は、組み換え発現ベクターを提供し、そのベクターは脱免疫化抗ＣＤ３抗体を産生するために必要な合成核酸フラグメント、ゲノム核酸フラグメントもしくはｃＤＮＡ由来核酸フラグメントを含む。本開示に従う任意の脱免疫化抗ＣＤ３抗体をコードするヌクレオチド配列が、適切なベクターへ挿入され得る。そのベクターは、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含む。任意の適切な宿主細胞ベクターが、脱免疫化抗ＣＤ３抗体をコードするＤＮＡ配列の発現のため使用され得る。細菌系（例えば、Ｅ．  ｃｏｌｉ）および他の微生物系が、使用され得る。真核生物（例えば、哺乳動物）宿主細胞発現系もまた、使用され得、本開示の抗体が得られ得る。適切な哺乳動物宿主細胞としては、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  Ｃ  Ｒ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２  １３６−１４５）；ならびに骨髄腫細胞株もしくはハイブリドーマ細胞株（例えば、ＮＳＯ細胞；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１６９−１７５．１９９２）が挙げられる。
【００２３】
上記脱免疫化抗ＣＤ３抗体もまた、治療剤と共に与えられ、別々に投与される組成物として使用され得る。診断目的で、その抗体は、標識されるかもしくは標識されないかのいずれかであり得る。非標識抗体は、他の標識抗体（第二の抗体）と組み合わせて使用され得、その標識抗体は、脱免疫化抗ＣＤ３抗体（例えば、ヒト免疫グロブリン定常領域に特異な抗体）と反応する。あるいは、その脱免疫化抗体は、直接に標識され得る。幅広い種類の標識（例えば、放射性核種、蛍光剤（ｆｌｕｏｒｓ）、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、リガンド（特に、ハプテン）等）が使用され得る。いくつかの種類の免疫測定法が、利用可能であり、当業者に周知である。
【００２４】
この脱免疫化抗ＣＤ３抗体は、薬学的キャリアを含む組成物として患者に投与され得る。薬学的キャリアは、患者に抗体を送ることに適した、任意の適合した非毒性物質であり得る。無菌の水、アルコール、脂肪、ロウおよび不活性固体が、そのキャリアに含まれ得る。薬学的に受け入れられたアジュバント（例えば、緩衝剤、分散剤）もまた、その薬剤組成物に組み込まれ得る。
【００２５】
上記抗体構成物は、多様な方法で患者に投与され得る。好ましくは、上記薬学的組成物は、非経口的に（例えば、皮下に、筋肉内にもしくは静脈内に）投与され得る。それゆえ、非経口的投与のための組成物は、受容可能なキャリア（好ましくは、水性キャリア）中に溶解している抗体、抗体フラグメントもしくはその混液の溶液を含有し得る。種々の水性キャリア（例えば、水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン等）が、使用され得る。これらの溶液は、無菌であり、一般的に粒子状の物質が存在しない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌され得る。上記組成物は、生理的な条件（例えば、ｐＨ調製剤および緩衝剤、毒性調節剤等（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等））に近づけるために必要とされる薬学的に受容可能な二次的な物質を含み得る。これらの処方物中の抗体もしくは抗体フラグメントの濃度は、広く変動し得（例えば、約０．５重量％未満から、通常約１重量％もしくは少なくとも約１重量％から多くとも１５重量％もしくは２０重量％まで）、そして、選択された特定の投与様式に従って、主として流体の量、粘性等に基づいて選択される。
【００２６】
被験体に投与するために必要な、非経口的に投与され得る組成物および調製物を調製するための実際の方法は、周知であるか、または当業者に明らかであり、そして、例えば、本明細書中に参考として援用されているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１７版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ（１９８５）により詳細に記載されている。
【００２７】
以下の実施例は、本発明を説明することを意図し、本発明を制限するものではない。これらは、使用され得る代表的な実施例であるが、当業者に公知の他の手順が、代替的に使用され得る。
【実施例】
【００２８】
（実施例１）
（脱免疫化キメラ抗ＣＤ３抗体）
脱免疫化キメラ抗ＣＤ３抗体を調製した。選択した可変領域は、公知のマウス抗ヒトＣＤ３抗体ＯＫＴ３由来のものであった。上記可変領域を、免疫性を失わせ、そして操作されたヒト定常領域に結合させて、脱免疫化キメラ抗ＣＤ３抗体を調製した。脱免疫化キメラ抗ＣＤ３抗体を調製し、試験するために使用した手順を、以下に記載する。
【００２９】
マウスＯＫＴ３重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、重複する４０マーオリゴヌクレオチドおよびポリメラーゼ連鎖反応を使用した、遺伝子合成によって合成的に構築した。この抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列は、既に決定され、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに寄託されている（受託番号は、それぞれＡ２２２６１およびＡ２２２５９；図１を参照のこと）。マウス免疫グロブリンプロモーターおよびイントロンと共にマウスシグナル配列を含む配列を、５’末端に付加し、そしてスプライスドナー部位を含む配列を、ＰＣＲによって３’末端に付加し、ＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩのフラグメントとして重鎖可変領域および軽鎖可変領域に対する発現カセット（図２を参照のこと）を形成した。上記発現カセットの全体の配列が正確であることを確認した。上記マウスＯＫＴ３重鎖発現カセットおよびマウスＯＫＴ３軽鎖発現カセットの完全なＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ図３および図４に示す。重鎖定常領域を、ヒトＩｇＧ２部分およびヒトＩｇＧ４部分を含むように操作した（「ＨｕＧ２Ｇ４定常領域」）。この定常領域を、以下のように調製した：始めに、ヒトＩｇＧ４由来の部分（ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の一部）をコードするゲノムＤＮＡを、細菌キャリアプラスミドｐＢＲ３２２中に挿入した。そのプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ種（ＡＴＣＣ  ３７０１７；Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．ら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３，１５４）に由来するものであった。上記ＩｇＧ４由来の挿入部分は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩを用いて制限消化を行なうことによって上記プラスミドから放出させた。上記挿入部分を、ゲル精製し、切断し、そしてさらなる制限分析に供し、ヒトＩｇＧ４ゲノムＤＮＡの公開された配列を確認した。その個々のゲノムＩｇＧ４挿入部分（ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩ制限フラグメント；Ｓｍａｌ部位は、各挿入部分の翻訳終止部位の３’の約３０ｂｐの３’非翻訳領域の中にある）を、次いで発現カセットＡＰＥＸ−１へのライゲーションによってサブクローニングし、ＡＰＥＸ−１  ３Ｆ４  ＶＨ  ＨｕＧａｍｍａ４（図５を参照のこと）を産生した。ＤＮＡ配列分析を実行し、ヒトＩｇＧ４の所望の領域の正確な配列を確認した。
【００３０】
上記の手順もまた、ｐＢＲ３２２細菌プラスミドを用いて実行した。そのプラスミドは、ヒトＩｇＧ２  ＣＨ１、ＣＨ２のヒンジ領域および第一の部分をコードするゲノムＤＮＡを保有していた。これらの領域を、ＰｍｌｌＩおよびＢｓｔ  ＥＩＩで切断し、そしてＡＰＥＸ−１  ３Ｆ４  ＶＨ  ＨｕＧａｍｍａ４へとサブクローニングし、対応しているＩｇＧ４由来の配列を置換した。得られたキメラＩｇＧ２／ＩｇＧ４ヒト定常領域の配列を、図６（ＡＰＥＸ−１  ３Ｆ４  ＶＨ  Ｇ２／Ｇ４）に示す。
【００３１】
（改変されたＧ２Ｇ４定常領域の構築）
上記ＨｕＧ２Ｇ４定常領域を、以下のように重鎖発現ベクターへの挿入のために改変した：
ＨｕＩｇＧ４定常領域の５’末端（５’末端におけるＢａｍＨ１部位を有するネイティブＨｕＩｇＧ４  ５’イントロン配列）からコード領域の開始部分までを、反応１において増幅する。Ｈｕ  Ｇ２Ｇ４コード配列（イントロンを含む）（ＣＨ１領域の開始からＣＨ３領域の末端まで）を、反応２においてＡＰＥＸ−１  ３Ｆ４  ＶＨ  Ｈｕ  Ｇ２／Ｇ４ベクターから増幅する。ＣＨ３コード領域の末端からのネイティブＨｕＩｇＧ４  ３’配列の３’末端を、Ｂａｍ  Ｈ１部位のすぐ内側のＢｇｌ  ＩＩ部位およびＢｇｌ  ＩＩ部位のすぐ内側のＥｃｏ  Ｒ１部位を用いて、３’Ｂａｍ  ＨＩ部位を導入するよう設計された３’プライマーを使用して、反応３において増幅する。これら三つの反応（これらは重複する）の生成物を、５’プライマーおよび３’プライマーを使用して、四番目のＰＣＲ反応において結合する。上記結合された生成物を、ｐＵＣ１９のＢａｍ  Ｈ１部位にクローニングし、そして改変されたＨｕＧ２Ｇ４フラグメントのＤＮＡ配列を確認する。上記Ｇ２Ｇ４遺伝子を、Ｂｇｌ  ＩＩおよびＢａｍ  ＨＩで切断し、５’末端にＢａｍ  ＨＩ、そして３’末端にＢｇｌ  ＩＩを有するフラグメントを生じる。これを、Ｂａｍ  ＨＩで切断した重鎖発現ベクターへとクローニングする。正確な方向に定常領域が挿入されたクローン（５’末端に再形成されたＢａｍ  ＨＩ部位、３’末端にハイブリッドＢａｍ  ＨＩ／Ｂｇｌ  ＩＩ部位）を、選択する（図７）。Ｂａｍ  ＨＩからＢｇｌ  ＩＩまでのフラグメントの完全な配列を、図８に示す。抗体可変領域を、直接Ｈｉｎｄ  ＩＩＩからＢａｍ  ＨＩのフラグメントとしてクローニングし得る。
プライマー（配列番号７７〜８３）
【００３２】
【化１】
2006526414.tif 000002
軽鎖定常領域は、ヒトκ定常領域であった。これを、図９に示されるように発現ベクターｐＳＶ  ｈｙｇ  ＨｕＣｋの中に含める。
【００３３】
マウス抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３の可変領域のアミノ酸配列を、２００２年９月６日に公開されたＷＯ０２／０６９２３２に詳細に説明されるペプチドスレディングソフトウェア、および他のインシリコ技術を使用して、潜在的なＴ細胞エピトープ（ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチド）を分析した。脱免疫化配列を設計し、可能な限り保存的アミノ酸に変化を加えることによって、潜在的なＴ細胞エピトープを除去した。Ｔ細胞エピトープを除去するように設計された代替的な置換への抗体結合の影響を試験するために、図１０および図１１に示されるように、脱免疫化重鎖可変領域および軽鎖可変領域のいくつかのバージョンを構築した。
【００３４】
マウスＯＫＴ３重鎖可変領域カセットおよびマウスＯＫＴ３軽鎖可変領域カセットを、突然変異誘発性のオリゴヌクレオチドプライマー（図１２を参照のこと）を用いた重複ＰＣＲ法を使用して突然変異誘発することによって、設計された脱免疫化配列の構築のためのテンプレートとして使用した。ベクターＶＨ−ＰＣＲ１およびＶＫ−ＰＣＲ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８）を、リーダーシグナルペプチド配列、リーダーイントロンおよびマウス免疫グロブリンプロモーターを含む５’隣接配列、ならびにスプライス部位およびイントロン配列を含む３’隣接配列を導入するためのテンプレートとして使用した。変更させる領域を包囲する突然変異誘発性のプライマー対の組を合成し、それによって、標的ＤＮＡ配列を、一組のフラグメントとして増幅する。
【００３５】
近接するオリゴを、配列が少なくとも１５ｂｐ重複するよう設計した。これらの数は、突然変異させる部位の数に依存する。
【００３６】
各プライマー対のＰＣＲ増幅を、以下の試薬を使用して設定した：
１μＬ  テンプレートＤＮＡ
１μＬ（２５ｐｍｏｌ）  フォワードプライマー
１μＬ（２５ｐｍｏｌ）  リバースプライマー
１μＬ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ
５μＬ  １０×Ｐｆｕポリメラーゼ緩衝液
０．５μＬ（１単位）  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ
５０μＬまでのＨ２Ｏ。
【００３７】
酵素を除いた全ての試薬を、０．５ｍｌの薄壁ＰＣＲ管の中で混ぜ、ＰＣＲブロックの上で９４℃まで熱した。上記Ｐｆｕ酵素を添加し、次いでサンプルをサイクルした：９４℃／２分と、９４℃／３０秒、５０℃／３０秒、７５℃／１分（必要とされる伸長の長さに依存する）の１５〜２０サイクル、そして、最後に７５℃／５分。アニーリング温度は、オリゴのＴｍによって、５０℃より低くても高くてもよい。
【００３８】
５μＬの各反応を、アガロースゲルの上で泳動し、ＰＣＲにより予想される大きさの生成物を生じたことを点検した。そうでない場合、上記アニーリング温度を５℃低くし、そして／またはＰＣＲのサイクル数を増やし、そして／またはＭｇＣｌ２の濃度を５ｍＭまで増加させた。主なＰＣＲが複数のバンドを生じた場合は、正確な大きさのバンドをゲル精製した。
【００３９】
上記生成物を、二回目のラウンドの５’プライマーおよび３’プライマーのみを使用して、二回目のＰＣＲにおいて連結した。この配列は、元のテンプレートには存在せず、それゆえ突然変異が生じたＤＮＡのみをこの段階で増幅し得る。二回目の連結ＰＣＲのためのテンプレートは、一回目のラウンドで生成されたフラグメントであった。これらの量を、およそ等量を添加するように調節した。二回目のラウンドのＰＣＲのための試薬は、以下のものであった：
一回目のＰＣＲの生成物
２μＬ（５０ｐｍｏｌ）  ５’二回目のラウンドのプライマー
２μＬ（５０ｐｍｏｌ）  ３’二回目のラウンドのプライマー
１μＬ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ
５μＬ  １０×Ｐｆｕポリメラーゼ緩衝液
０．５μＬ（１単位）  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ
５０μＬまでのＨ２Ｏ。
【００４０】
酵素を除いた全ての試薬を、０．５ｍｌの薄壁ＰＣＲ管の中で混ぜ、ＰＣＲブロックの上で９４℃まで熱した。上記Ｐｆｕ酵素を添加し、次いでサンプルをサイクルした：９４℃／２分、９４℃／３０秒、５０℃／３０秒、７５℃／１分（必要とされる伸長の長さに依存する）の１５サイクル、７５℃／５分で終了した。
【００４１】
５μＬの各反応を、アガロースゲルの上で泳動し、ＰＣＲにより予想される大きさの生成物が生じたことを点検した（ＶＨ発現カセットに対しては約８２０ｂｐ、およびＶＫ発現カセットに対しては６５０ｂｐ）。そうでない場合、上記アニーリング温度を５℃低くし、そして／またはＰＣＲのサイクル数を増やして、二回目のラウンドのＰＣＲを繰り返した。
【００４２】
上記生成物の残りを、フェノール／クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈殿し、必要とされる酵素（発現カセットに対しては通常、Ｈｉｎｄ１１１およびＢａｍＨ１）によって消化し、そして１．５％の低融点アガロースゲルの上にロードした。正確な大きさのＤＮＡバンドを切り出し、そして精製した。
【００４３】
生成された、脱免疫化ＶＨ発現カセットおよびＶκ発現カセット（図２）を、ベクターｐＵＣ１９へクローニングし、そして各脱免疫化ＶＨおよびＶκに関して全体のＤＮＡ配列が正確であることを確認した。一例として、脱免疫化ＯＫＴ３  ＶＨおよびＶκ１の発現カセットであるＯＫＴ３  ＤＩＶ  Ｈ  Ｖ１（バージョン１）およびＯＫＴ３  ＤＩＶＫ  Ｖ１（バージョン１）のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ図１３および図１４に示す。
【００４４】
脱免疫化重鎖および軽鎖Ｖ領域遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩ発現カセットとしてベクターｐＵＣ１９から切断した。これらを、発現ベクターｐＳＶｇｐｔ  ＨｕＧ２Ｇ４およびｐＳＶｈｙｇ  ＨｕＣｋ（それぞれ、図７および図９）に移転した。これらのベクターは、以前に記載した、それぞれ、ＨｕＧ２Ｇ４もしくはヒトκ定常領域、および哺乳動物細胞の選択マーカーを含む。ＤＮＡ配列を、発現ベクターの脱免疫化ＶＨおよびＶκとして正確であることを確認した。
【００４５】
元のマウスＯＫＴ３重鎖可変領域カセットおよび軽鎖可変領域カセットもまた、上記のように発現ベクターｐＳＶｇｐｔ  ＨｕＧ２Ｇ４およびｐＳＶｈｙｇ  ＨｕＣｋに移転し、ヒト定常領域Ｇ２／Ｇ４構築物に結合したマウス可変領域遺伝子を有するキメラ抗体を産生した。キメラ抗体が、同じエフェクター機能を有し、そして同じ二次的検出試薬を脱免疫化抗体に関して使用することから、このキメラ抗体を、脱免疫化抗体との結合実験のためのコントロールに対応するアイソタイプとして使用した。
【００４６】
抗体発現のための宿主細胞株は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｐｏｒｔｏｎ  ＵＫ（ＥＣＡＣＣ番号８５１１０５０３）から得たＮＳＯ（マウス骨髄腫を産生する非免疫グロブリン）であった。重鎖発現ベクターおよび軽鎖発現ベクターを、エレクトロポレーションによってＮＳＯ細胞に同時にトランスフェクトした。上記トランスフェクションを、以下のように達成した：トランスフェクトされるＤＮＡを、直線的に並べ、効率を向上させた。それぞれ約３ｍｇのプラスミドｐＳＶｇｐｔ  ＨｕＧ２／Ｇ４のＰｖｕＩ消化物および６ｍｇのｐＳＶ  ｈｙｇ  ＨＵＣＫのＰｖｕＩ消化物を調製した。上記消化されたＤＮＡを、エタノール沈殿し、５０ｍｌのｄＨ２Ｏに溶解した。レシピエントのＮＳＯ細胞を、半集密的な７５ｃｍ２フラスコから再懸濁し、そして１０００ｒｐｍで５分間の遠心沈殿法によって集めた。その上清を除去した。上記細胞を、０．５ｍｌのＤＭＥＭに再懸濁し、そしてＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）へ移した。上記ＤＮＡを、緩やかにピペッティングすることによって上記細胞と混合し、そして氷の上に５分間静置した。上記キュベットを、Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒの電極の間に挿入し、１７０Ｖ、９６０ｍＦの単一パルスを加えた。次いで上記キュベットを、２０分間氷に戻した。上記細胞懸濁液を、２０ｍｌのＤＭＥＭを含む７５ｃｍ２フラスコに移し、１〜２日間回復させた。細胞を集め、そして８０ｍｌの選択ＤＭＥＭのなかに再懸濁し、２００μＬのアリコートを９６ウェルプレートの各ウェルへ添加した。選択ＤＭＥＭは、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清、２５０μｇ／ｍｌのキサンチン、０．８μｇ／ｍｌマイコフェノール酸で補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）である。選択の開始から約１０日後、コロニーを裸眼で見ることができた。各ウェルから２０μＬの培地を、ヒト抗体の存在についてアッセイした。抗体の産生のレベルおよびウェル中の細胞数に基づいて、ウェルを増やすために選択した。指定されたウェルから細胞を再懸濁するために、Ｇｉｌｓｏｎ  Ｐ２００ピペット（黄色いチップを用いる）の先端を、表面に沿ってこすり、そして培地を、１．５ｍＬの新鮮な選択ＤＭＥＭを含む２４ウェルの組織培養プレートのウェルへ移した。細胞を、２５ｃｍ２、そして液体窒素ストックをし、そして抗体の精製および試験のための培地を提供するためにより大きな組織培養フラスコで増やした。
【００４７】
７つの脱免疫化重鎖遺伝子の各々（図１０）を、２つの脱免疫化軽鎖遺伝子（図１１）の各々と対にし、合計１４の脱免疫化ＯＫＴ３抗体を産生させた。キメラ重鎖ベクターおよびキメラ軽鎖ベクターを、同時にトランスフェクトさせキメラ抗体を産生した。ｇｐｔ遺伝子を発現するコロニーを、選択ＤＭＥＭを使用して選択した。トランスフェクトされた細胞クローンを、以下のようにヒトＩｇＧについてのＥＬＩＳＡにより、ヒト抗体の産生についてスクリーニングした：ＥＬＩＳＡプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｉｍｍｕｌｏｎ２）を、炭酸塩／重炭酸イオンコーティング緩衝液ｐＨ９．６（Ｓｉｇｍａ  カタログ：Ｃ−３０４１）に１：１０００で希釈したヒツジ抗ヒトκ抗体（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  カタログ番号：ＡＵ０１５）で１ウェルあたり１００μＬでコーティングした。サンプルを、一晩４℃でインキュベートした。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ＲＴＭ）を含むＰＢＳ溶液で３回洗浄した後、トランスフェクト体を９６ウェルプレートにプレートし、１ウェルあたりＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）溶液を７５μＬ含むアッセイプレートに移すことにより、各ウェルから２５μＬの培養培地のサンプルを使用して、スクリーニングを実行した。２４ウェルプレートを使用してトランスフェクトされた細胞を培養した場合、１２．５μＬを第一のウェルに８７．５μＬまで添加し、そして倍加希釈系列を上記プレートに設置した。全てのアッセイに関して、空のウェルに、ＰＢＳＴのみを入れた。上記サンプルを、一時間室温でインキュベートし、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液で３回洗浄した。二次的抗体（ペルオキシダーゼが結合したヒツジ抗ヒトＩｇＧγ鎖特異的試薬（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅカタログ番号：ＡＰ００４））を、１ウェルあたり１００μＬの量でＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液中に１：１０００の割合で添加した。サンプルを、再び一時間室温でインキュベートし、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液で３回洗浄した。有色の基質を調製するために、一錠（２０ｍｇ）のＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン）（Ｓｉｇｍａカタログ番号：Ｐ−７２８８）を、４５ｍｌの水および５ｍｌの１０×ペルオキシダーゼ緩衝液（Ｓｉｇｍａリン酸クエン酸緩衝液錠剤ｐＨ５．０（カタログ番号：Ｐ−４８０９）を含む１０×ペルオキシダーゼ緩衝液を作製する）の中で溶解し、そして１０ｍＬの３０％（ｗ／ｗ）過酸化水素（Ｓｉｇｍａカタログ番号：Ｈ−１１０９）を、使用の直前に添加した。上記基質を、１ウェルあたり１００μＬ添加し、そして５分間もしくは必要な時間室温でインキュベートした。色が現れた場合、上記工程を２５μＬの１２．５％硫酸を添加することによって停止した。結果を、４９２ｎｍで読み取った。使用した標準抗体は、ヒトＩｇＧ１／ｋ精製骨髄腫タンパク質（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅカタログ番号：ＢＰ０７８）であった。
【００４８】
抗体を分泌する細胞株を、増やし、そして最も産生量の多いものを選択した。脱免疫化抗体およびキメラ抗体を、Ｐｒｏｓｅｐ（登録商標）‐Ａ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｌｔｄ，Ｄｕｒｈａｍ，ＵＫ）を使用して以下のように精製した：抗体を産生するＮＳＯトランスフェクトーマ細胞株を、Ｎｕｎｃ三層フラスコ（各フラスコは、２５０ｍｌ（合計１Ｌの体積））中のＤＭＥＭ５％のＦＣＳで１０〜１４日間飽和状態近くまで増殖した。条件培地を集め、ベンチ遠心分離機で３０００ｒｐｍにて５分間回転し、細胞を除去した。１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐＨ８（Ｓｉｇｍａ  カタログ：Ｔ３０３８）の１０分の１の体積を、細胞上清に添加し、これを０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐＨ８にした。０．５ｍｌのＰｒｏｓｅｐ  Ａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  カタログ：１１３１１１８２４）を添加し、そして一晩室温で撹拌した。Ｐｒｏｓｅｐ  Ａを、３０００ｒｐｍで五分間回転することによって集め、Ｂｉｏｒａｄ  Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐカラム（カタログ：７３１−１５５０）に充填した。上記カラムを、１０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、次いで０．１ＭのグリシンｐＨ３．０で１ｍｌの画分中に溶出した。各画分を、１００μＬの１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐＨ８（Ｓｉｇｍａ：上記）の中へ集めた。各画分の吸光度を、２８０ｎｍで測定した。抗体を含む画分を集め、そしてＰＢＳに対し一晩室温で透析した。この調整物を、０．２ミクロンの注射器フィルターを通してろ過することによって滅菌し、そしてＡ２８０を測定した。その濃度を、ヒトＩｇＧ１ｋのためにＥＬＩＳＡによって決定した。
【００４９】
（脱免疫化抗体のＣＤ３を発現する細胞への結合の評価）
脱免疫化される間に誘導された突然変異が抗体特異性または抗体親和性に影響を与え得ることが可能であるので、各脱免疫化抗体を、Ｔ細胞の上のＣＤ３分子に結合する能力に関して評価した。ＨＰＢ−ＡＬＬ（ヒト抹消血急性リンパ球白血病）株の細胞を、ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｔｏｈｏｋｕ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｊａｐａｎから得た。Ｊｕｒｋａｔ細胞株およびＪ．ＲＴ３細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから得た。細胞を、３７℃で空気中５％ＣＯ２を含む加湿されたチャンバー内で、２×１０５〜２×１０６細胞／ｍｌで１０％の熱により活性化したウシ胎仔血清（Ａｔｌａｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、０．０１Ｍへぺス（Ｓｉｇｍａ）、０．２ｍＭ  １−グルタミンおよび５×１０−５Ｍ  ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０（Ｃｅｌｌｇｒｏ）中で培養した。ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞は、それらの細胞表面に高いレベルのＴＣＲ／ＣＤ３複合体を保有するのに対し、Ｊ．ＲＴ３細胞は、ＣＤ３を発現しないＪｕｒｋａｔ株の改変体である。マウスＯＫＴ３抗体、キメラＯＫＴ３抗体および脱免疫化ＯＫＴ３  Ｇ２／Ｇ４抗体の調製物を、免疫細胞化学およびフローサイトメトリーによって三つ全ての株の細胞への結合を評価した。簡潔に、１０６個の細胞を、９６−ウェルプレートの個々のウェルの中に配置し、そして１μｇの各試験抗体または適切なヒトアイソタイプコントロールもしくはマウスアイソタイプコントロールと２０分間４℃で、反応させた。上記細胞を、次いで３回２％のウシ胎仔血清（Ａｔｌａｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を含有するＰＢＳで洗浄し、その後キメラ抗体と脱免疫化抗体およびＧ２／Ｇ４アイソタイプコントロールの検出のためにフィコエリトリンが接合された二次抗体（Ｒ−ＰＥ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ純粋Ｆ（ａｂ）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｍａｉｎｅ）、ならびに、マウスＯＫＴ３およびマウスＩｇＧ２ａアイソタイプコントロールの検出のために、Ｒ−ＰＥと接合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））と、４℃で、２０分間反応させた。上記細胞を、ＰＢＳ−ＦＢＳで上記のように３回洗浄し、次いでフローサイトミーター（ＦＡＣｓ  Ｃａｌｉｂｕｒ，  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）での分析のためにＰＢＳに再懸濁した。
【００５０】
キメラＯＫＴ３  ＨｕＧ２／Ｇ４κ抗体およびマウスＯＫＴ３抗体の両方は、ＣＤ３を発現するが、ＣＤ３陰性細胞株Ｊ．ＲＴ３への結合を示さないＪｕｒｋａｔ細胞およびＨＰＢ−Ａｌｌ細胞へ同等に結合した。対応するマウスアイソタイプコントロールおよびヒトアイソタイプコントロールは、どの細胞型にも結合を示さなかった（図１５）。
【００５１】
脱免疫化ＯＫＴ３抗体を発現するＮＳＯ細胞株からの調製した培地もまた、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞およびＪ．ＲＴ３細胞を使用して、フローサイトメトリー結合アッセイで試験した。上記調製した培地中の抗体の濃度を、以前に記載されたＥＬＩＳＡ手順を使用して、ヒトＩｇＧに対するＥＬＩＳＡにより決定した。免疫細胞化学およびフローサイトメトリー手順を上記のように実行した。脱免疫化ＯＫＴ３軽鎖バージョン１と結合した脱免疫化重鎖の７つのバージョンについての結果を、図１６に示す。脱免疫化ＯＫＴ３軽鎖バージョン２と結合した脱免疫化重鎖についての結果を、図１７に示す。脱免疫化多数のＯＫＴ３抗体は、マウス抗体およびキメラ抗体に観察された結合と同等のＨＰＢ−ＡＬＬ細胞への結合を示した。しかし、いくつかの脱免疫化抗体（例えば、クローン２４Ｃ１２、４８Ｇ３および５５Ｂ２由来の抗体）は、有意により低いレベルのＨＰＢ−ＡＬＬ細胞への結合を示した。所定の抗体のＨＰＢ−ＡＬＬ細胞へ結合する能力は、κ軽鎖の特定のバージョンの使用と関連がなかった。；すなわち、両方の突然変異したκ鎖は、いくつかの、しかし全てではない、突然変異したＶＨ領域と結合して、このアッセイで同程度の結合を示した。
【００５２】
（マウスＯＫＴ３抗体、キメラＯＫＴ３抗体および脱免疫化ＯＫＴ３抗体の結合を比較する競合アッセイ）
種々の脱免疫化抗体の間をより区別するため、およびＯＫＴ３の結合親和性と関連した上記抗体のＯＫＴ３の結合親和性を決定するために、競合結合アッセイを実行した。ＣＤ３は、タンパク質の細胞‐表面複合体の一部であるので、親和性を、ＢＩＡＣＯＲＥ分析で測定し得ず、しかしその代わりにフローサイトメトリーで測定した。マウスＯＫＴ３を、製造業者により提供されたプロトコルに従って、Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（カタログ番号２１３３５）からのＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣビオチンを使用してビオチン化した。使用するビオチン化されたＯＫＴ３の量を、抗体の量を減少させながらＨＰＢ−ＡＬＬ細胞を滴定することにより決定した。適切な飽和以下の濃度を、１０６個の細胞あたりの１０ｎｇのビオチン化された抗体であると決定した。次いで、この濃度を、全ての実験において使用した。二次検出試薬は、アビジン−ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ２０５０）であった。１００ｐｇから１μｇまでの試験（脱免疫化したかもしくはキメラ）抗体の希釈による競合を、試験した。その結果を、最大限の蛍光活性のパーセント阻害（ブロッキング抗体の非存在下でビオチン化されたマウスＯＫＴ３の結合によって決定された）として表し、そして図１８、図１９、図２０および図２１に示す。
【００５３】
上記結果は、キメラＯＫＴ３抗体および六つの脱免疫化抗体（ＯＫＴ３  ＤＩＶＨｖ５からＤＩＶＧｖ７／ＤＩＶＫｖ１およびＯＫＴ３  ＤＩＶＨ５からＤＩＶＨ７／ＤＩＶＫ２）は、ビオチン化されたマウスＯＫＴ３抗体の結合と、マウス抗体自体と同じくらい効率的にか、もしくはマウス抗体の２倍から３倍の範囲で競合し得る。
【００５４】
本明細書全体を通して、種々の出版物および特許開示が参照される。上記教示およびその開示は、その全体が、本明細書中で本発明が属する分野の状態をより十分に記載する本出願に参考として援用される。
【００５５】
本発明の好ましい実施形態および他の実施形態が、本明細書中で記載されたが、さらなる実施形態は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲から逸脱しないことが、当業者によって理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１Ａ−１】図１Ａと１Ｂとは、ＯＫＴ３重鎖可変領域（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ａ２２２６１）および軽鎖可変領域（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ａ２２２５９）の完全なヌクレオチド配列およびとアミノ酸配列をそれぞれ、示す。
【図１Ａ−２】図１Ａと１Ｂとは、ＯＫＴ３重鎖可変領域（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ａ２２２６１）および軽鎖可変領域（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ａ２２２５９）の完全なヌクレオチド配列およびとアミノ酸配列をそれぞれ、示す。
【図１Ｂ−１】図１Ａと１Ｂとは、ＯＫＴ３重鎖可変領域（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ａ２２２６１）および軽鎖可変領域（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ａ２２２５９）の完全なヌクレオチド配列およびとアミノ酸配列をそれぞれ、示す。
【図１Ｂ−２】図１Ａと１Ｂとは、ＯＫＴ３重鎖可変領域（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ａ２２２６１）および軽鎖可変領域（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ａ２２２５９）の完全なヌクレオチド配列およびとアミノ酸配列をそれぞれ、示す。
【図２】図２は、上記重鎖領域と軽鎖領域のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨ１フラグメントまでの発現カセットを模式的に示す。
【図３−１】図３は、マウス免疫グロブリンプロモーター、５’末端にイントロンを有するマウスシグナル配列および３’末端にスプライスドナー部位（Ｂａｍ  ＨＩ）を含む、マウスＯＫＴ３重鎖可変領域の完全なヌクレオチド配列（配列番号１）ならびにアミノ酸配列を示す。制限酵素部位が示されている。
【図３−２】図３は、マウス免疫グロブリンプロモーター、５’末端にイントロンを有するマウスシグナル配列および３’末端にスプライスドナー部位（Ｂａｍ  ＨＩ）を含む、マウスＯＫＴ３重鎖可変領域の完全なヌクレオチド配列（配列番号１）ならびにアミノ酸配列を示す。制限酵素部位が示されている。
【図３−３】図３は、マウス免疫グロブリンプロモーター、５’末端にイントロンを有するマウスシグナル配列および３’末端にスプライスドナー部位（Ｂａｍ  ＨＩ）を含む、マウスＯＫＴ３重鎖可変領域の完全なヌクレオチド配列（配列番号１）ならびにアミノ酸配列を示す。制限酵素部位が示されている。
【図４−１】図４は、マウス免疫グロブリンプロモーター、５’末端にイントロンを有するマウスシグナル配列および３’末端にスプライスドナー部位（Ｂａｍ  ＨＩ）を含む、マウスＯＫＴ３軽鎖可変領域の完全なヌクレオチド配列（配列番号３）ならびにアミノ酸配列を示す。制限酵素部位が示されている。
【図４−２】図４は、マウス免疫グロブリンプロモーター、５’末端にイントロンを有するマウスシグナル配列および３’末端にスプライスドナー部位（Ｂａｍ  ＨＩ）を含む、マウスＯＫＴ３軽鎖可変領域の完全なヌクレオチド配列（配列番号３）ならびにアミノ酸配列を示す。制限酵素部位が示されている。
【図５Ａ】図５Ａは、ベクターＡＰＥＸ―１  ３Ｆ４ＶＨＨｕＧａｍｍａ４の図解的地図を示す。
【図５Ｂ−１】図５Ｂは、ベクターの完全なヌクレオチド配列（配列番号５）を示し、無関係なＶＨ領域（３Ｆ４ＶＨと標識されている）に隣接するｈＩｇＧ４挿入部分のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す。シグナル配列領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の位置が、示されている。
【図５Ｂ−２】図５Ｂは、ベクターの完全なヌクレオチド配列（配列番号５）を示し、無関係なＶＨ領域（３Ｆ４ＶＨと標識されている）に隣接するｈＩｇＧ４挿入部分のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す。シグナル配列領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の位置が、示されている。
【図５Ｂ−３】図５Ｂは、ベクターの完全なヌクレオチド配列（配列番号５）を示し、無関係なＶＨ領域（３Ｆ４ＶＨと標識されている）に隣接するｈＩｇＧ４挿入部分のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す。シグナル配列領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の位置が、示されている。
【図６Ａ】図６Ａは、ベクターＡＰＥＸ―１  ３Ｆ４ＶＨＨｕＧ２／Ｇ４の図解的地図を示す。
【図６Ｂ−１】図６Ｂは、ベクターのヌクレオチド配列（配列番号７）ならびに上記Ｇ２／Ｇ４挿入部分のアミノ酸配列および核酸配列を示し、シグナル配列領域、無関係なＶｈ領域（本明細書において３Ｆ４Ｖｈと標識されている）、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の位置を示す。
【図６Ｂ−２】図６Ｂは、ベクターのヌクレオチド配列（配列番号７）ならびに上記Ｇ２／Ｇ４挿入部分のアミノ酸配列および核酸配列を示し、シグナル配列領域、無関係なＶｈ領域（本明細書において３Ｆ４Ｖｈと標識されている）、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の位置を示す。
【図６Ｂ−３】図６Ｂは、ベクターのヌクレオチド配列（配列番号７）ならびに上記Ｇ２／Ｇ４挿入部分のアミノ酸配列および核酸配列を示し、シグナル配列領域、無関係なＶｈ領域（本明細書において３Ｆ４Ｖｈと標識されている）、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の位置を示す。
【図６Ｂ−４】図６Ｂは、ベクターのヌクレオチド配列（配列番号７）ならびに上記Ｇ２／Ｇ４挿入部分のアミノ酸配列および核酸配列を示し、シグナル配列領域、無関係なＶｈ領域（本明細書において３Ｆ４Ｖｈと標識されている）、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の位置を示す。
【図７】図７は、重鎖発現ベクターｐＳＶｇｐｔＨｕＧ２／Ｇ４の図解的地図を示す。
【図８】図８は、ＡＰＥＸ―１  ３Ｆ４ＶＨＨｕＧ２／Ｇ４ベクターから切断され、そして５’末端におけるＢａｍ  ＨＩ部位およびネイティブヒトＩｇＧ４由来５’非翻訳イントロン配列の付加、ならびに３’末端におけるＢｇｌ  ＩＩ部位および天然ヒトＩｇＧ４由来３’非翻訳配列の付加によって、クローニングベクターＰＵＣ１９への挿入のために改変された、ＨｕＧ２／Ｇ４フラグメントの完全なヌクレオチド配列（配列番号９）を示す。
【図９】図９は、発現ベクターｐＳＶｇｐｔＨｕＣｋの図解的地図を示し、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域の位置を示す。
【図１０−１】図１０は、マウスＯＫＴ３可変重鎖のアミノ酸配列（配列番号１０）および、実施例において構築された脱免疫化重鎖可変領域のいくつかのアミノ酸配列（配列番号１１−１７）を示す。
【図１０−２】図１０は、マウスＯＫＴ３可変重鎖のアミノ酸配列（配列番号１０）および、実施例において構築された脱免疫化重鎖可変領域のいくつかのアミノ酸配列（配列番号１１−１７）を示す。
【図１１】図１１は、マウスＯＫＴ３可変軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１８）および、実施例において構築された２つの脱免疫化軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１９と２０）を示す。
【図１２】図１２は、重複ＰＣＲ法を使用して突然変異誘発することによって設計された脱免疫化配列を構築するために使用された、突然変異誘発性のオリゴヌクレオチドプライマーを示す。
【図１３−１】図１３は、脱免疫化ＶＨ発現カセットＯＫＴ３ＤＩＶＨＶ１の核酸配列（配列番号２１）およびアミノ酸配列を示す。
【図１３−２】図１３は、脱免疫化ＶＨ発現カセットＯＫＴ３ＤＩＶＨＶ１の核酸配列（配列番号２１）およびアミノ酸配列を示す。
【図１３−３】図１３は、脱免疫化ＶＨ発現カセットＯＫＴ３ＤＩＶＨＶ１の核酸配列（配列番号２１）およびアミノ酸配列を示す。
【図１４−１】図１４は、脱免疫化ＶＫ発現カセットＯＫＴ３ＤＩＶＫＶ１の核酸配列（配列番号２３）およびアミノ酸配列を示す。
【図１４−２】図１４は、脱免疫化Ｖｋ発現カセットＯＫＴ３ＤＩＶＫＶ１の核酸配列（配列番号２３）およびアミノ酸配列を示す。
【図１５】図１５は、マウスＯＫＴ３およびキメラＯＫＴ３の、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＪＲＴ３細胞およびＨＰＢ−ＡＬＬ細胞への結合を示す。
【図１６】図１６は、脱免疫化抗ＣＤ３抗体のＨＰＢ−ＡＬＬ細胞およびＪＲＴ３細胞への結合を示す表である。
【図１７】図１７は、脱免疫化抗ＣＤ３抗体のＨＰＢ−ＡＬＬ細胞およびＪＲＴ３細胞への結合を示す表である。
【図１８】図１８は、キメラＯＫＴ３の親和性およびマウスＯＫＴ３の親和性とを比較した、脱免疫化抗体の親和性を測定する競合アッセイの結果を示す。
【図１９】図１９は、キメラＯＫＴ３の親和性およびマウスＯＫＴ３の親和性とを比較した、脱免疫化抗体の親和性を測定する競合アッセイの結果を示す。
【図２０】図２０は、キメラＯＫＴ３の親和性およびマウスＯＫＴ３の親和性とを比較した、脱免疫化抗体の親和性を測定する競合アッセイの結果を示す。
【図２１】図２１は、キメラＯＫＴ３の親和性およびマウスＯＫＴ３の親和性とを比較した、脱免疫化抗体の親和性を測定する競合アッセイの結果を示す。
【図２２】図２２は、マウスＯＫＴ３と比較した、脱免疫化抗体のＩＣ５０をまとめた表である。
【図１Ａ−１】
2006526414.tif 000003
【図１Ａ−２】
2006526414.tif 000004
【図１Ｂ−１】
2006526414.tif 000005
【図１Ｂ−２】
2006526414.tif 000006
【図２】
2006526414.tif 000007
【図３−１】
2006526414.tif 000008
【図３−２】
2006526414.tif 000009
【図３−３】
2006526414.tif 000010
【図４−１】
2006526414.tif 000011
【図４−２】
2006526414.tif 000012
【図５Ａ】
2006526414.tif 000013
【図５Ｂ−１】
2006526414.tif 000014
【図５Ｂ−２】
2006526414.tif 000015
【図５Ｂ−３】
2006526414.tif 000016
【図６Ａ】
2006526414.tif 000017
【図６Ｂ−１】
2006526414.tif 000018
【図６Ｂ−２】
2006526414.tif 000019
【図６Ｂ−３】
2006526414.tif 000020
【図６Ｂ−４】
2006526414.tif 000021
【図７】
2006526414.tif 000022
【図８】
2006526414.tif 000023
【図９】
2006526414.tif 000024
【図１０−１】
2006526414.tif 000025
【図１０−２】
2006526414.tif 000026
【図１１】
2006526414.tif 000027
【図１２】
2006526414.tif 000028
【図１３−１】
2006526414.tif 000029
【図１３−２】
2006526414.tif 000030
【図１３−３】
2006526414.tif 000031
【図１４−１】
2006526414.tif 000032
【図１４−２】
2006526414.tif 000033
【図１５】
2006526414.tif 000034
【図１６】
2006526414.tif 000035
【図１７】
2006526414.tif 000036
【図１８】
2006526414.tif 000037
【図１９】
2006526414.tif 000038
【図２０】
2006526414.tif 000039
【図２１】
2006526414.tif 000040
【図２２】
2006526414.tif 000041
【配列表】
2006526414000001.app
【国際調査報告】
2006526414.tif 000042
2006526414.tif 000043
2006526414.tif 000044