(57)【要約】癌、特に前立腺癌の治療および診断のための組成物および方法が開示される。例示的な組成物は、一種以上の前立腺特異的ポリペプチド、それらの免疫原性部分、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、このようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞、およびこのようなポリペプチドを発現する細胞に特異的なＴ細胞を含有する。開示された組成物は、例えば、疾患、特に前立腺癌の診断、予防および／または処置に有用である。
2006515749.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１１３のＸ個以下のアミノ酸残基を含む単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号１０３７を含み、Ｘは、１１〜５４２からなる群より選択される、ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドであって、ここで、配列番号１０３７は、３個のクラスＩ  ＭＨＣ対立遺伝子に対する天然にプロセシングされたＴ細胞エピトープを含む配列番号１１３の１１個のアミノ酸フラグメントを含む、ポリペプチド。
【請求項３】
Ｘが、１１〜１００からなる群より選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
Ｘが、１１〜５０からなる群より選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
Ｘが、１１〜２５からなる群より選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、以下：
（ａ）配列番号１０３４〜１０３６に提供される配列；
（ｂ）配列番号１０３４〜１０３６に提供される配列の相補体；
（ｃ）配列番号１０３４〜１０３６に提供される配列の少なくとも２０個の連続する残基からなる配列；
（ｄ）高ストリンジェントな条件下で、配列番号１０３４〜１０３６に提供される配列にハイブリダイズする配列；
（ｅ）配列番号１０３４〜１０３６の配列に対して、少なくとも７５％の同一性を有する配列；
（ｆ）配列番号１０３４〜１０３６の配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有する配列；および
（ｇ）配列番号１０３４〜１０３６に提供される配列の変性改変体；および
（ｈ）請求項１に記載のポリペプチドをコードする配列
からなる群より選択される配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下
（ａ）請求項６に記載のポリヌクレオチドによってコードされる配列；および
（ｂ）請求項６に記載のポリヌクレオチドによってコードされる配列に対して、少なくとも７０％の同一性を有する配列；
（ｃ）請求項６に記載のポリヌクレオチドによってコードされる配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有する配列；
（ｄ）請求項６に記載のポリヌクレオチドによってコードされる配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸からなる配列；
（ｅ）請求項６に記載のポリヌクレオチドによってコードされる配列の少なくとも１０個の連続するアミノ酸からなる配列；
（ｆ）請求項６に記載のポリヌクレオチドによってコードされる配列の少なくとも２０個の連続するアミノ酸からなる配列；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項８】
発現制御配列に作動可能に連結した請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターで形質転換したか、またはトランスフェクトした、宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１または７に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
患者において、癌の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程；
（ａ）該患者から生物学的サンプルを入手する工程；
（ｂ）該生物学的サンプルを、請求項１または７に記載のポリペプチドまたは配列番号１０８のポリペプチドに結合する結合剤と接触させる工程；
（ｃ）該サンプル中で、該結合剤に結合する一定量のポリペプチドを検出する工程；および
（ｄ）該ポリペプチドの量を、所定のカットオフ値と比較し、そこから該患者における癌の存在を決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１２】
請求項１または７に記載のポリペプチドを少なくとも一種含む、融合タンパク質。
【請求項１３】
高ストリンジェントの条件下で、配列番号１０３４〜１０３６に列挙される配列にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
腫瘍タンパク質に特異的なＴ細胞を刺激、および／または拡大するための方法であって、該方法は、Ｔ細胞を、Ｔ細胞の刺激および／または拡大を可能にするための条件下、かつ十分な時間、以下：
（ａ）請求項１または７に記載のポリヌクレオチド；
（ｂ）請求項６に記載のポリヌクレオチド；および
（ｃ）請求項６に記載のポリヌクレオチドを発現する抗原提示細胞；
からなる群より選択される少なくとも一種の成分と接触させる工程；
を包含する方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法に従って調製されたＴ細胞を含む、単離されたＴ細胞集団。
【請求項１６】
組成物であって、生理学的に受容可能なキャリアおよび免疫賦活剤からなる群より選択される第一成分、ならびに、以下：
（ａ）請求項１または７に記載のポリペプチド；
（ｂ）請求項６に記載のポリヌクレオチド；
（ｃ）請求項１０に記載の抗体；
（ｄ）請求項１２に記載の融合タンパク質；
（ｅ）請求項１５に記載のＴ細胞集団；および
（ｆ）請求項１または７に記載のポリペプチドを発現する抗原提示細胞；
からなる群より選択される第二成分を含有する、組成物。
【請求項１７】
患者に、請求項１６に記載の組成物を投与する工程を包含する、該患者における免疫応答を刺激するための方法。
【請求項１８】
患者に、請求項１６に記載の組成物を投与する工程を包含する、該患者における前立腺癌の処置のための方法。
【請求項１９】
患者における癌の存在を決定するために方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該患者から生物学的サンプルを入手する工程；
（ｂ）該生物学的サンプルを、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチドまたは配列番号１０７に特異的なオリゴヌクレオチドと接触させる工程；
（ｃ）該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする一定量のポリヌクレオチドを、該サンプル中で検出する工程；および
（ｄ）該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする一定量のポリヌクレオチドを、所定のカットオフ値と比較し、そしてそこから該患者における癌の存在を決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項２０】
請求項１３に記載の少なくとも一種のオリゴヌクレオチドを含む、診断キット。
【請求項２１】
請求項１０に記載の少なくとも一種の抗体および検出試薬を含む診断キットであって、該検出試薬がレポーター基を含む、診断キット。
【請求項２２】
患者における前立腺癌の処置のための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）Ｔ細胞が増殖するように、該患者から単離されたＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を、以下、（ｉ）請求項１または７に記載のポリペプチド；（ｉｉ）請求項６に記載のポリヌクレオチド；および（ｉｉｉ）請求項１または７に記載のポリペプチドを発現する抗原提示細胞からなる群より選択される少なくとも一種の成分とインキュベートする工程；
（ｂ）該患者に有効量の該増殖したＴ細胞を投与する工程、
そして、それによって、該患者における癌の進行を阻害する工程；
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、一般に、前立腺癌のような癌の治療および診断に関する。本発明は、より詳細には、前立腺特異的タンパク質の少なくとも一部分を含むポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。そのようなポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、前立腺癌の診断および処置のための薬学的組成物（例えば、ワクチン）および他の組成物において有用である。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の記述）
癌は、世界中で重大な健康問題である。癌の検出および処置において、進歩が成されてきたが、予防または処置のためのワクチンまたは他の一般に成功した方法は、現在利用可能ではない。現在の治療方法は、一般的に化学療法または外科手術および放射線の組み合わせに基づいており、多くの患者において不十分であることが示され続けている。
【０００３】
前立腺癌は、男性の間の癌の最も代表的な癌の形態であって、５０歳より上の男性における発生率は、３０％と推定されている。圧倒的な臨床的な証拠は、ヒト前立腺癌が、骨に転移する傾向を有し、そして、この疾患は、男性ホルモン依存性から男性ホルモン不応性状態へ不可避的に進行し、患者の死亡率を増加させる原因となっているようである。この流行性の疾患は、現在、米国における男性の間の二番目に主要な癌による死亡の原因である。
【０００４】
この疾患のための治療についての相当量の研究に関わらず、前立腺癌は、処置することが困難なままである。一般に、処置は、外科手術および／または放射線治療に基づくが、これらの方法は、かなりの割合の場合において、有効ではない。二つのこれまでに同定された前立腺特異的タンパク質−前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）および前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）は、限られた治療可能性および診断可能性しか有さない。例えば、ＰＳＡレベルは、前立腺癌の存在と常によく関連しているわけではなく、非前立腺癌症状（良性前立腺増殖症（ＢＰＨ）を含む）の割合においてポジティブである。ＰＳＡ測定は、前立腺の体積を関連し、転移のレベルは示さない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
この疾患のための治療についての相当量の研究にかかわらず、前立腺癌は、処置することが困難なままである。従って、当該分野において、このような癌を検出しそして処置するための、改善された方法の必要性が存在する。本発明は、これらの必要性を満たし、さらに他の関連する利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の概要）
一局面において、本発明は、以下からなる群より選択される配列を含むポリヌクレオチド組成物を提供する：
（ａ）配列番号１−１１１、１１５−１７１、１７３−１７５、１７７、１７９−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２−３３５、３４０−３７５、３８１、３８２および３８４−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、５３６、５５２、５６９−５７２、５８７、５９１、５９３−６０６、６１８−７０５、７０９−７７４、７７７、７８９、８１７、８２３、８２４、８７８、８８０−８８２、８９４、８９６、９０７、９０８、９１６−９１９、９２９−９３１、９３８、９３９、９４２、９４４、９４５、９４８、９６７、９６９−９７６、９９１、９９３−１００２、１００４、１００６、１００７、１０１０、１０１３−１０１９、１０２１、１０２３−１０２７および１０３４−１０３６；
（ｂ）配列番号１−１１１、１１５−１７１、１７３−１７５、１７７、１７９−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２−３３５、３４０−３７５、３８１、３８２および３８４−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、５３６、５５２、５６９−５７２、５８７、５９１、５９３−６０６、６１８−７０５、７０９−７７４、７７７、７８９、８１７、８２３、８２４、８７８、８８０−８８２、８９４、８９６、９０７、９０８、９１６−９１９、９２９−９３１、９３８、９３９、９４２、９４４、９４５、９４８、９６７、９６９−９７６、９９１、９９３−１００２、１００４、１００６、１００７、１０１０、１０１３−１０１９、１０２１、１０２３−１０２７および１０３４−１０３６に提供される倍列の相補体；
（ｃ）の少なくとも２０個の連続した残基からなる配列配列番号１−１１１、１１５−１７１、１７３−１７５、１７７、１７９−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２−３３５、３４０−３７５、３８１、３８２および３８４−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、５３６、５５２、５６９−５７２、５８７、５９１、５９３−６０６、６１８−７０５、７０９−７７４、７７７、７８９、８１７、８２３、８２４、８７８、８８０−８８２、８９４、８９６、９０７、９０８、９１６−９１９、９２９−９３１、９３８、９３９、９４２、９４４、９４５、９４８、９６７、９６９−９７６、９９１、９９３−１００２、１００４、１００６、１００７、１０１０、１０１３−１０１９、１０２１、１０２３−１０２７および１０３４−１０３６に提供される配列；
（ｄ）配列番号１−１１１、１１５−１７１、１７３−１７５、１７７、１７９−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２−３３５、３４０−３７５、３８１、３８２および３８４−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、５３６、５５２、５６９−５７２、５８７、５９１、５９３−６０６、６１８−７０５、７０９−７７４、７７７、７８９、８１７、８２３、８２４、８７８、８８０−８８２、８９４、８９６、９０７、９０８、９１６−９１９、９２９−９３１、９３８、９３９、９４２、９４４、９４５、９４８、９６７、９６９−９７６、９９１、９９３−１００２、１００４、１００６、１００７、１０１０、１０１３−１０１９、１０２１、１０２３−１０２７および１０３４−１０３６に提供される配列にハイブリダイズする配列；
（ｅ）配列番号１−１１１、１１５−１７１、１７３−１７５、１７７、１７９−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２−３３５、３４０−３７５、３８１、３８２および３８４−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、５３６、５５２、５６９−５７２、５８７、５９１、５９３−６０６、６１８−７０５、７０９−７７４、７７７、７８９、８１７、８２３、８２４、８７８、８８０−８８２、８９４、８９６、９０７、９０８、９１６−９１９、９２９−９３１、９３８、９３９、９４２、９４４、９４５、９４８、９６７、９６９−９７６、９９１、９９３−１００２、１００４、１００６、１００７、１０１０、１０１３−１０１９、１０２１、１０２３−１０２７および１０３４−１０３６の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列；
（ｆ）配列番号１−１１１、１１５−１７１、１７３−１７５、１７７、１７９−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２−３３５、３４０−３７５、３８１、３８２および３８４−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、５３６、５５２、５６９−５７２、５８７、５９１、５９３−６０６、６１８−７０５、７０９−７７４、７７７、７８９、８１７、８２３、８２４、８７８、８８０−８８２、８９４、８９６、９０７、９０８、９１６−９１９、９２９−９３１、９３８、９３９、９４２、９４４、９４５、９４８、９６７、９６９−９７６、９９１、９９３−１００２、１００４、１００６、１００７、１０１０、１０１３−１０１９、１０２１、１０２３−１０２７および１０３４−１０３６の配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列；
（ｇ）配列番号１−１１１、１１５−１７１、１７３−１７５、１７７、１７９−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２−３３５、３４０−３７５、３８１、３８２および３８４−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、５３６、５５２、５６９−５７２、５８７、５９１、５９３−６０６、６１８−７０５、７０９−７７４、７７７、７８９、８１７、８２３、８２４、８７８、８８０−８８２、８９４、８９６、９０７、９０８、９１６−９１９、９２９−９３１、９３８、９３９、９４２、９４４、９４５、９４８、９６７、９６９−９７６、９９１、９９３−１００２、１００４、１００６、１００７、１０１０、１０１３−１０１９、１０２１、１０２３−１０２７および１０３４−１０３６に提供される配列の縮重した改変体。
【０００７】
１つの好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチド組成物は、試験された前立腺組織サンプルのうちの、少なくとも２０％、より好ましくは、少なくとも３０％、および最も好ましくは、少なくとも５０％において、他の正常組織のレベルよりも、少なくとも約２倍、より好ましくは、少なくとも約５倍、および、最も好ましくは、少なくとも約１０倍高いレベルで発現する。
【０００８】
本発明は、別の局面において、上記のポリヌクレオチド配列にコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチド組成物を提供する。
【０００９】
本発明は、さらに、以下の配列番号に列挙される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド組成物を提供する：配列番号１１２−１１４、１７２、１７６、１７８、３２７、３２９、３３１、３３６、３３９、３７６−３８０、３８３、４７７−４８３、４９６、５０４、５０５、５１９、５２０、５２２、５２５、５２７、５３２、５３４、５３７−５５１、５５３−５６８、５７３−５８６、５８８−５９０、５９２、７０６−７０８、７７５、７７６、７７８、７８０、７８１、８１１、８１４、８１８、８２６、８２７、８５３、８５５、８５８、８６０−８６２、８６６−８７７、８７９、８８３−８９３、８９５、８９７、８９８、９０９−９１５、９２０−９２８、９３２−９３４、９４０、９４１、９４３、９４６、９４７、９４９−９６６、９６８、９７７−９９０、９９２、１００３、１００５、１００８、１００９、１０１１、１０１２、１０２０、１０２２、１０２８−１０２９、１０３０−１０３３、および１０３７。
【００１０】
特定の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは免疫原性であり、すなわち、これらは、本明細書中でさらに記載のされるように、免疫応答、特に体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を誘発し得る。
【００１１】
別の例示的な実施形態において、本発明のＰ５０１Ｓ（配列番号１１３）ポリペプチドは、最小限配列番号１０３７を含むＰ５０１Ｓのフラグメントを含み、配列番号１０３７は、少なくとも３つのＩ型ＭＨＣ対立遺伝子に対する天然にプロセスされたエピトープを含むことが予想外に見出されたＰ５０１Ｓの１１アミノ酸フラグメントを示す。関連する実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１０３７を最小限含むＰ５０１Ｓのフラグメント、および少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、
１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、
２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、
３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、または５５３アミノ酸長であってかつ配列番号１０３７を含むフラグメントを含む。
【００１２】
本実施形態に従う特定の他の例示的なＰ５０１Ｓポリペプチドは、配列番号１１３の少なくとも１１−５４２アミノ酸残基、１１−１００アミノ酸残基、−５０−５０１１アミノ酸残基または１１−２５アミノ酸残基からからなり、そして、配列番号１０３７を含む。
【００１３】
本発明はさらに、開示されたポリペプチド配列および／またはポリヌクレオチド配列の、フラグメント、改変体、および／または誘導体を提供し、ここで、これらのフラグメント、改変体、および／または誘導体は好ましくは、配列番号１１２−１１４、１７２、１７６、１７８、３２７、３２９、３３１、３３６、３３９、３７６−３８０、３８３、４７７−４８３、４９６、５０４、５０５、５１９、５２０、５２２、５２５、５２７、５３２、５３４、５３７−５５１、５５３−５６８、５７３−５８６、５８８−５９０、５９２、７０６−７０８、７７５、７７６、７７８、７８０、７８１、８１１、８１４、８１８、８２６、８２７、８５３、８５５、８５８または８６０−８６２、８６６−８７７、８７９、８８３−８９３、８９５、８９７、８９８、９０９−９１５、９２０−９２８、９３２−９３４、９４０、９４１、９４３、９４６、９４７、９４９−９６６、９６８、９７７−９９０、９９２、１００３、１００５、１００８、１００９、１０１１、１０１２、１０２０、１０２２、１０２８−１０２９、および１０３０−１０３３で示されるポリペプチド配列、または１−１１１、１１５−１７１、１７３−１７５、１７７、１７９−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２−３３５、３４０−３７５、３８１、３８２および３８４−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、５３６、５５２、５６９−５７２、５８７、５９１、５９３−６０６、６１８−７０５、７０９−７７４、７７７、７８９、８１７、８２３、８２４、８７８、８８０−８８２、８９４、８９６、９０７、９０８、９１６−９１９、９２９−９３１、９３８、９３９、９４２、９４４、９４５、９４８、９６７、９６９−９７６、９９１、９９３−１００２、１００４、１００６、１００７、１０１０、１０１３−１０１９、１０２１、１０２３−１０２７、および１０３４−１０３７で示されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの免疫原性活性レベルの、少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約７０％およびより好ましくは、少なくとも約９０％である免疫原性活性のレベルを有する。
【００１４】
本発明は、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドを含む発現ベクター、およびこのような発現ベクターで、形質転換された宿主細胞またはトランスフェクトされた宿主細胞をさらに提供する。
【００１５】
他の局面において、本発明は、上記のようなポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよび生理学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。
【００１６】
本発明の関連する局面において、薬学的組成物（例えば、ワクチン組成物）が、予防用途または治療用途のために提供される。このような組成物は、一般に免疫原性である、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、および免疫賦活薬（例えば、アジュバント）を、生理学的に受容可能なキャリアとともに含む。
【００１７】
本発明はさらに、以下を含む薬学的組成物を提供する：（ａ）本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント；および（ｂ）生理学的に受容可能なキャリア。
【００１８】
さらなる局面において、本発明は、以下を含む薬学的組成物を提供する：（ａ）上記のポリペプチドを発現する抗原提示細胞および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアもしくは賦形剤。例示的な抗原提示細胞としては、樹状細胞、マクロファージ、単球、線維芽細胞およびＢ細胞が挙げられる。
【００１９】
関連する局面において、以下を含む薬学的組成物が提供される：（ａ）上記のポリペプチドを発現する抗原提示細胞および（ｂ）免疫賦活薬。
【００２０】
本発明は、他の局面で、少なくとも１つの上記のようなポリペプチドを含む融合タンパク質ならびにこのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、代表的には生理学的に受容可能なキャリアおよび／または免疫賦活薬を含む薬学的組成物（例えば、ワクチン）の形態でさらに提供する。この融合タンパク質は、本明細書中に記載のされるように、複数の免疫原性ポリペプチドおよびそれらの一部分／改変体を含み得、そしてこれらのポリペプチドの、発現、精製、および／または免疫原性を促進および／または増強する為の１つ以上のポリペプチドセグメントをさらに含み得る。
【００２１】
さらなる局面において、本発明は、患者における免疫応答、好ましくはヒト患者におけるＴ細胞応答を刺激する為の方法を提供し、この方法は本明細書に記載の薬学的組成物を投与する工程を含む。この患者は前立腺癌に罹患し得、この場合、本方法によって、この疾患についての処置が提供され、またはこのような疾患に対する危険があると考えられる患者は予防的に処置され得る。
【００２２】
さらなる局面において、本発明は、患者における癌の発達を阻害するための方法を提供し、その方法は、上に列挙した薬学的組成物を患者に投与する工程を包含する。この患者は卵巣癌に罹患し得、この場合、本方法によって、この疾患についての処置が提供され、またはこのような疾患に対して危険であると考えられる患者は予防的に処置され得る。
【００２３】
本発明は、他の局面において、生物学的サンプルから腫瘍細胞を除去するための方法をさらに提供する。この方法は、生物学サンプルと、本発明のポリペプチドに特異的に反応するＴ細胞とを接触させる工程を包含し、ここでその接触させる工程は、サンプルからそのポリペプチドを発現する細胞を除去することを可能にするための条件下およびそのための充分な時間で実施される。
【００２４】
関連する局面において、患者の癌の発達を阻害するための方法が提供され、その方法は、上記のように処理された生物学的サンプルを患者に投与する工程を包含する。
【００２５】
他の局面において、本発明のポリペプチドに対して特異的なＴ細胞を刺激および／または増殖させるための方法がさらに提供され、その方法は、Ｔ細胞を、以下の１つ以上と、Ｔ細胞の増加および／または増加を可能にするための条件下およびそのための充分な時間で、接触させる工程を包含する：（ｉ）上記のポリペプチド；（ｉｉ）そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および（ｉｉｉ）そのようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞。上記のように調製されたＴ細胞を含む、単離されたＴ細胞集団もまた、提供される。
【００２６】
さらなる局面において、本発明は、患者の癌の発達を阻害するための方法を提供し、その方法は上記のＴ細胞集団の有効量を患者に投与する工程を包含する。
【００２７】
本発明は、患者の癌の発達を阻害するための方法をさらに提供し、その方法は、以下の工程を包含する：（ａ）患者から単離されたＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を以下の１つ以上と共にインキュベートする工程：（ｉ）本明細書で開示されたポリペプチドの少なくとも免疫原性部分を含むポリペプチド；（ｉｉ）そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および（ｉｉｉ）そのようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞；ならびに（ｂ）その増殖したＴ細胞の有効量を患者に投与し、それにより患者の癌の発達を阻害する工程。増殖した細胞は、患者に投与される前にクローン化され得るが、これは必ずしも、行われるに及ばない。
【００２８】
さらなる局面において、本発明は、患者において癌（好ましくは前立腺癌）の存在または非存在を決定するための方法を提供する。この方法は、以下を包含する：（ａ）患者から得た生物学的サンプルと、上に列挙したポリペプチドに結合する結合因子とを接触させる工程；（ｂ）サンプル中で、この結合因子に結合するポリペプチドの量を検出する工程；および（ｃ）このポリペプチドの量と事前に決定していたカットオフ値とを比較し、それによって患者における癌の存在または非存在を決定する工程。好ましい実施形態において、この結合因子は、抗体であり、より好ましくはモノクロナール抗体である。
【００２９】
他の局面において、本発明はまた、患者における癌の進行をモニタリングする方法を提供する。このような方法は、以下の工程を包含する：（ａ）最初の時点で患者から得た生物学的サンプルと、上に列挙したポリペプチドプチドに結合する結合因子とを接触させる工程；（ｂ）サンプルにおいて、この結合因子に結合するポリペプチドの量を検出する工程；（ｃ）次の時点において、患者から得られた生物学的サンプルを使用し、工程（ａ）および工程（ｂ）を反復する工程；ならびに（ｄ）工程（ｃ）において検出されたポリペプチドの量と、工程（ｂ）において検出された量とを比較し、それらによって、患者における癌の進行をモニタリングする工程。
【００３０】
本発明は、他の局面において、患者の癌の存在または非存在を決定するための方法をさらに提供する。この方法は以下の工程を包含する：（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとを接触させる工程；（ｂ）そのサンプルにおいて、そのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド、好ましくはｍＲＮＡのレベルを検出する工程；ならびに（ｃ）そのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドのレベルと事前に決定されたカットオフ値とを比較して、それによって患者の癌の存在または非存在を検出する工程。特定の実施形態において、ｍＲＮＡの量は、例えば、本発明のポリヌクレオチドまたはそのようなポリヌクレオチドの相補体とハイブリダイズする、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって検出される。他の実施形態において、ｍＲＮＡの量は、本発明のポリヌクレオチドまたはそのようなポリヌクレオチドの相補体とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを使用する、ハイブリダイゼーション技術を使用して検出される。
【００３１】
関連する局面において、患者の癌の進行をモニタリングする方法が、提供され、その方法は以下の工程を包含する：（ａ）患者から得られた生物学的サンプルと、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとを接触させる工程；（ｂ）そのサンプルにおいて、そのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を検出する工程；（ｃ）次の時点において、患者から得られた生物学的サンプルを使用し、工程（ａ）および工程（ｂ）を反復する工程；ならびに（ｄ）工程（ｃ）において検出されたポリヌクレオチドの量を工程（ｂ）において検出された量と比較し、それらによって、患者における癌の進行をモニタリングする工程。
【００３２】
さらなる局面において、本発明は、上記のようなポリペプチドに結合する抗体（例えば、モノクロナール抗体）ならびにこのような抗体を含む診断キットを提供する。上記のような１つ以上のオリゴヌレクオチドプローブまたはオリゴヌレクオチドプライマーを含む診断キットがまた、提供される。
【００３３】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付する図面を参照することによって明らかになる。本明細書中で開示される全ての参考文献は、各々が個々に援用されるがごとく参考としてその全体が本明細書によって援用される。
【００３４】
（配列の識別名の簡単な説明）
配列番号１は、Ｆ１−１３に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３５】
配列番号２は、Ｆ１−１２に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【００３６】
配列番号３は、Ｆ１−１２に対する決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
【００３７】
配列番号４は、Ｆ１−１６に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【００３８】
配列番号５は、Ｈ１−１に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【００３９】
配列番号６は、Ｈ１−９に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【００４０】
配列番号７は、Ｈ１−４に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【００４１】
配列番号８は、Ｊ１−１７に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【００４２】
配列番号９は、Ｊ１−１７に対する決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
【００４３】
配列番号１０は、Ｌ１−１２に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【００４４】
配列番号１１は、Ｌ１−１２に対する決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
【００４５】
配列番号１２は、Ｎ１−１８６２に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【００４６】
配列番号１３は、Ｎ１−１８６２に対する決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
【００４７】
配列番号１４は、Ｊ１−１３に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【００４８】
配列番号１５は、Ｊ１−１３に対する決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
【００４９】
配列番号１６は、Ｊ１−１９に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【００５０】
配列番号１７は、Ｊ１−１９に対する決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
【００５１】
配列番号１８は、Ｊ１−２５に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【００５２】
配列番号１９は、Ｊ１−２５に対する決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
【００５３】
配列番号２０は、Ｊ１−２４に対する決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
【００５４】
配列番号２１は、Ｊ１−２４に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【００５５】
配列番号２２は、Ｋ１−５８に対する決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
【００５６】
配列番号２３は、Ｋ１−５８に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【００５７】
配列番号２４は、Ｋ１−６３に対する決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
【００５８】
配列番号２５は、Ｋ１−６３に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【００５９】
配列番号２６は、Ｌ１−４に対する決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
【００６０】
配列番号２７は、Ｌ１−４に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【００６１】
配列番号２８は、Ｌ１−１４に対する決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
【００６２】
配列番号２９は、Ｌ１−１４に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【００６３】
配列番号３０は、Ｊ１−１２に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【００６４】
配列番号３１は、Ｊ１−１６に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【００６５】
配列番号３２は、Ｊ１−２１に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【００６６】
配列番号３３は、Ｋ１−４８に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【００６７】
配列番号３４は、Ｋ１−５５に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【００６８】
配列番号３５は、Ｌ１−２に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【００６９】
配列番号３６は、Ｌ１−６に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【００７０】
配列番号３７は、Ｎ１−１８５８に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【００７１】
配列番号３８は、Ｎ１−１８６０に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【００７２】
配列番号３９は、Ｎ１−１８６１に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【００７３】
配列番号４０は、Ｎ１−１８６４に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【００７４】
配列番号４１は、Ｐ５に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００７５】
配列番号４２は、Ｐ８に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００７６】
配列番号４３は、Ｐ９に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００７７】
配列番号４４は、Ｐ１８に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００７８】
配列番号４５は、Ｐ２０に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００７９】
配列番号４６は、Ｐ２９に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８０】
配列番号４７は、Ｐ３０に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８１】
配列番号４８は、Ｐ３４に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８２】
配列番号４９は、Ｐ３６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８３】
配列番号５０は、Ｐ３８に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８４】
配列番号５１は、Ｐ３９に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８５】
配列番号５２は、Ｐ４２に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８６】
配列番号５３は、Ｐ４７に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８７】
配列番号５４は、Ｐ４９に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８８】
配列番号５５は、Ｐ５０に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８９】
配列番号５６は、Ｐ５３に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００９０】
配列番号５７は、Ｐ５５に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００９１】
配列番号５８は、Ｐ６０に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００９２】
配列番号５９は、Ｐ６４に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００９３】
配列番号６０は、Ｐ６５に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００９４】
配列番号６１は、Ｐ７３に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００９５】
配列番号６２は、Ｐ７５に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００９６】
配列番号６３は、Ｐ７６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００９７】
配列番号６４は、Ｐ７９に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００９８】
配列番号６５は、Ｐ８４に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００９９】
配列番号６６は、Ｐ６８に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１００】
配列番号６７は、Ｐ８０に対する決定されたｃＤＮＡ配列である（また、Ｐ７０４Ｐとも称される）。
【０１０１】
配列番号６８は、Ｐ８２に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１０２】
配列番号６９は、Ｕ１−３０６４に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１０３】
配列番号７０は、Ｕ１−３０６５に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１０４】
配列番号７１は、Ｖ１−３６９２に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１０５】
配列番号７２は、１Ａ−３９０５に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１０６】
配列番号７３は、Ｖ１−３６８６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１０７】
配列番号７４は、Ｒ１−２３３０に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１０８】
配列番号７５は、１Ｂ−３９７６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１０９】
配列番号７６は、Ｖ１−３６７９に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１１０】
配列番号７７は、１Ｇ−４７３６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１１１】
配列番号７８は、１Ｇ−４７３８に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１１２】
配列番号７９は、１Ｇ−４７４１に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１１３】
配列番号８０は、１Ｇ−４７４４に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１１４】
配列番号８１は、１Ｇ−４７３４に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１１５】
配列番号８２は、１Ｈ−４７７４に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１１６】
配列番号８３は、１Ｈ−４７８１に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１１７】
配列番号８４は、１Ｈ−４７８５に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１１８】
配列番号８５は、１Ｈ−４７８７に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１１９】
配列番号８６は、１Ｈ−４７９６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１２０】
配列番号８７は、１Ｉ−４８０７に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１２１】
配列番号８８は、１Ｉ−４８１０に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１２２】
配列番号８９は、１Ｉ−４８１１に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１２３】
配列番号９０は、１Ｊ−４８７６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１２４】
配列番号９１は、１Ｋ−４８８４に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１２５】
配列番号９２は、１Ｋ−４８９６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１２６】
配列番号９３は、１Ｇ−４７６１に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１２７】
配列番号９４は、１Ｇ−４７６２に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１２８】
配列番号９５は、１Ｈ−４７６６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１２９】
配列番号９６は、１Ｈ−４７７０に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１３０】
配列番号９７は、１Ｈ−４７７１に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１３１】
配列番号９８は、１Ｈ−４７７２に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１３２】
配列番号９９は、１Ｄ−４２９７に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１３３】
配列番号１００は、１Ｄ−４３０９に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１３４】
配列番号１０１は、１Ｄ．１−４２７８に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１３５】
配列番号１０２は、１Ｄ−４２８８に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１３６】
配列番号１０３は、１Ｄ−４２８３に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１３７】
配列番号１０４は、１Ｄ−４３０４に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１３８】
配列番号１０５は、１Ｄ−４２９６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１３９】
配列番号１０６は、１Ｄ−４２８０に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１４０】
配列番号１０７は、Ｆ１−１２に対する決定された全長ｃＤＮＡ配列である（Ｐ５０４Ｓとも称される）。
【０１４１】
配列番号１０８は、Ｆ１−１２に対するアミノ酸配列である。
【０１４２】
配列番号１０９は、Ｊ１−１７に対する決定された全長ｃＤＮＡ配列である。
【０１４３】
配列番号１１０は、Ｌ１−１２に対する決定された全長ｃＤＮＡ配列である（Ｐ５０１Ｓとも称される）。
【０１４４】
配列番号１１１は、Ｎ１−１８６２に対する決定された全長ｃＤＮＡ配列である（Ｐ５０３Ｓとも称される）。
【０１４５】
配列番号１１２は、Ｊ１−１７に対するアミノ酸配列である。
【０１４６】
配列番号１１３は、Ｌ１−１２に対するアミノ酸配列である（Ｐ５０１Ｓとも称される）。
【０１４７】
配列番号１１４は、Ｎ１−１８６２に対するアミノ酸配列である（Ｐ５０３Ｓとも称される）。
【０１４８】
配列番号１１５は、Ｐ８９に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１４９】
配列番号１１６は、Ｐ９０に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１５０】
配列番号１１７は、Ｐ９２に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１５１】
配列番号１１８は、Ｐ９５に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１５２】
配列番号１１９は、Ｐ９８に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１５３】
配列番号１２０は、Ｐ１０２に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１５４】
配列番号１２１は、Ｐ１１０に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１５５】
配列番号１２２は、Ｐ１１１に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１５６】
配列番号１２３は、Ｐ１１４に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１５７】
配列番号１２４は、Ｐ１１５に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１５８】
配列番号１２５は、Ｐ１１６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１５９】
配列番号１２６は、Ｐ１２４に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１６０】
配列番号１２７は、Ｐ１２６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１６１】
配列番号１２８は、Ｐ１３０に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１６２】
配列番号１２９は、Ｐ１３３に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１６３】
配列番号１３０は、Ｐ１３８に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１６４】
配列番号１３１は、Ｐ１４３に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１６５】
配列番号１３２は、Ｐ１５１に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１６６】
配列番号１３３は、Ｐ１５６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１６７】
配列番号１３４は、Ｐ１５７に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１６８】
配列番号１３５は、Ｐ１６６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１６９】
配列番号１３６は、Ｐ１７６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１７０】
配列番号１３７は、Ｐ１７８に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１７１】
配列番号１３８は、Ｐ１７９に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１７２】
配列番号１３９は、Ｐ１８５に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１７３】
配列番号１４０は、Ｐ１９２に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１７４】
配列番号１４１は、Ｐ２０１に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１７５】
配列番号１４２は、Ｐ２０４に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１７６】
配列番号１４３は、Ｐ２０８に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１７７】
配列番号１４４は、Ｐ２１１に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１７８】
配列番号１４５は、Ｐ２１３に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１７９】
配列番号１４６は、Ｐ２１９に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１８０】
配列番号１４７は、Ｐ２３７に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１８１】
配列番号１４８は、Ｐ２３９に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１８２】
配列番号１４９は、Ｐ２４８に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１８３】
配列番号１５０は、Ｐ２５１に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１８４】
配列番号１５１は、Ｐ２５５に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１８５】
配列番号１５２は、Ｐ２５６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１８６】
配列番号１５３は、Ｐ２５９に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１８７】
配列番号１５４は、Ｐ２６０に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１８８】
配列番号１５５は、Ｐ２６３に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１８９】
配列番号１５６は、Ｐ２６４に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１９０】
配列番号１５７は、Ｐ２６６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１９１】
配列番号１５８は、Ｐ２７０に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１９２】
配列番号１５９は、Ｐ２７２に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１９３】
配列番号１６０は、Ｐ２７８に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１９４】
配列番号１６１は、Ｐ１０５に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１９５】
配列番号１６２は、Ｐ１０７に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１９６】
配列番号１６３は、Ｐ１３７に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１９７】
配列番号１６４は、Ｐ１９４に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１９８】
配列番号１６５は、Ｐ１９５に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１９９】
配列番号１６６は、Ｐ１９６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２００】
配列番号１６７は、Ｐ２２０に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２０１】
配列番号１６８は、Ｐ２３４に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２０２】
配列番号１６９は、Ｐ２３５に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２０３】
配列番号１７０は、Ｐ２４３に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２０４】
配列番号１７１は、Ｐ７０３Ｐ−ＤＥ１に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２０５】
配列番号１７２は、Ｐ７０３Ｐ−ＤＥ１に対するアミノ酸配列である。
【０２０６】
配列番号１７３は、Ｐ７０３Ｐ−ＤＥ２に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２０７】
配列番号１７４は、Ｐ７０３Ｐ−ＤＥ６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２０８】
配列番号１７５は、Ｐ７０３Ｐ−ＤＥ１３に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２０９】
配列番号１７６は、Ｐ７０３Ｐ−ＤＥ１３に対するアミノ酸配列である。
【０２１０】
配列番号１７７は、Ｐ７０３Ｐ−ＤＥ１４に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２１１】
配列番号１７８は、Ｐ７０３Ｐ−ＤＥ１４に対するアミノ酸配列である。
【０２１２】
配列番号１７９は、１Ｇ−４７３６に対する決定された伸長ｃＤＮＡ配列である。
【０２１３】
配列番号１８０は、１Ｇ−４７３８に対する決定された伸長ｃＤＮＡ配列である。
【０２１４】
配列番号１８１は、１Ｇ−４７４１に対する決定された伸長ｃＤＮＡ配列である。
【０２１５】
配列番号１８２は、１Ｇ−４７４４に対する決定された伸長ｃＤＮＡ配列である。
【０２１６】
配列番号１８３は、１Ｈ−４７７４に対する決定された伸長ｃＤＮＡ配列である。
【０２１７】
配列番号１８４は、１Ｈ−４７８１に対する決定された伸長ｃＤＮＡ配列である。
【０２１８】
配列番号１８５は、１Ｈ−４７８５に対する決定された伸長ｃＤＮＡ配列である。
【０２１９】
配列番号１８６は、１Ｈ−４７８７に対する決定された伸長ｃＤＮＡ配列である。
【０２２０】
配列番号１８７は、１Ｈ−４７９６に対する決定された伸長ｃＤＮＡ配列である。
【０２２１】
配列番号１８８は、１Ｉ−４８０７に対する決定された伸長ｃＤＮＡ配列である。
【０２２２】
配列番号１８９は、１Ｉ−４８１０に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【０２２３】
配列番号１９０は、１Ｉ−４８１１に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【０２２４】
配列番号１９１は、１Ｊ−４８７６に対する決定された伸長ｃＤＮＡ配列である。
【０２２５】
配列番号１９２は、１Ｋ−４８８４に対する決定された伸長ｃＤＮＡ配列である。
【０２２６】
配列番号１９３は、１Ｋ−４８９６に対する決定された伸長ｃＤＮＡ配列である。
【０２２７】
配列番号１９４は、１Ｇ−４７６１に対する決定された伸長ｃＤＮＡ配列である。
【０２２８】
配列番号１９５は、１Ｇ−４７６２に対する決定された伸長ｃＤＮＡ配列である。
【０２２９】
配列番号１９６は、１Ｈ−４７６６に対する決定された伸長ｃＤＮＡ配列である。
【０２３０】
配列番号１９７は、１Ｈ−４７７０に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【０２３１】
配列番号１９８は、１Ｈ−４７７１に対する決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
【０２３２】
配列番号１９９は、１Ｈ−４７７２に対する決定された伸長ｃＤＮＡ配列である。
【０２３３】
配列番号２００は、１Ｄ−４３０９に対する決定された伸長ｃＤＮＡ配列である。
【０２３４】
配列番号２０１は、１Ｄ．１−４２７８に対する決定された伸長ｃＤＮＡ配列である。
【０２３５】
配列番号２０２は、１Ｄ−４２８８に対する決定された伸長ｃＤＮＡ配列である。
【０２３６】
配列番号２０３は、１Ｄ−４２８３に対する決定された伸長ｃＤＮＡ配列である。
【０２３７】
配列番号２０４は、１Ｄ−４３０４に対する決定された伸長ｃＤＮＡ配列である。
【０２３８】
配列番号２０５は、１Ｄ−４２９６に対する決定された伸長ｃＤＮＡ配列である。
【０２３９】
配列番号２０６は、１Ｄ−４２８０に対する決定された伸長ｃＤＮＡ配列である。
【０２４０】
配列番号２０７は、１０−ｄ８ｆｗｄに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２４１】
配列番号２０８は、１０−Ｈ１０ｃｏｎに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２４２】
配列番号２０９は、１１−Ｃ８ｒｅｖに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２４３】
配列番号２１０は、７．ｇ６ｆｗｄに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２４４】
配列番号２１１は、７．ｇ６ｒｅｖに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２４５】
配列番号２１２は、８−ｂ５ｆｗｄに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２４６】
配列番号２１３は、８−ｂ５ｒｅｖに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２４７】
配列番号２１４は、８−ｂ６ｆｗｄに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２４８】
配列番号２１５は、８−ｂ６ｒｅｖに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２４９】
配列番号２１６は、８−ｄ４ｆｗｄに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２５０】
配列番号２１７は、８−ｄ９ｒｅｖに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２５１】
配列番号２１８は、８−ｇ３ｆｗｄに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２５２】
配列番号２１９は、８−ｇ３ｒｅｖに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２５３】
配列番号２２０は、８−ｈ１１ｒｅｖに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２５４】
配列番号２２１は、ｇ−ｆ１２ｆｗｄに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２５５】
配列番号２２２は、ｇ−ｆ３ｒｅｖに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２５６】
配列番号２２３は、Ｐ５０９Ｓに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２５７】
配列番号２２４は、Ｐ５１０Ｓに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２５８】
配列番号２２５は、Ｐ７０３ＤＥ５に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２５９】
配列番号２２６は、９−Ａ１１に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２６０】
配列番号２２７は、８−Ｃ６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２６１】
配列番号２２８は、８−Ｈ７に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２６２】
配列番号２２９は、ＪＰＴＰＮ１３に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２６３】
配列番号２３０は、ＪＰＴＰＮ１４に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２６４】
配列番号２３１は、ＪＰＴＰＮ２３に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２６５】
配列番号２３２は、ＪＰＴＰＮ２４に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２６６】
配列番号２３３は、ＪＰＴＰＮ２５に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２６７】
配列番号２３４は、ＪＰＴＰＮ３０に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２６８】
配列番号２３５は、ＪＰＴＰＮ３４に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２６９】
配列番号２３６は、ＪＰＴＰＮ３５に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２７０】
配列番号２３７は、ＪＰＴＰＮ３６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２７１】
配列番号２３８は、ＪＰＴＰＮ３８に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２７２】
配列番号２３９は、ＪＰＴＰＮ３９に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２７３】
配列番号２４０は、ＪＰＴＰＮ４０に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２７４】
配列番号２４１は、ＪＰＴＰＮ４１に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２７５】
配列番号２４２は、ＪＰＴＰＮ４２に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２７６】
配列番号２４３は、ＪＰＴＰＮ４５に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２７７】
配列番号２４４は、ＪＰＴＰＮ４６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２７８】
配列番号２４５は、ＪＰＴＰＮ５１に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２７９】
配列番号２４６は、ＪＰＴＰＮ５６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２８０】
配列番号２４７は、ＪＰＴＰＮ６４に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２８１】
配列番号２４８は、ＪＰＴＰＮ６５に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２８２】
配列番号２４９は、ＪＰＴＰＮ６７に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２８３】
配列番号２５０は、ＪＰＴＰＮ７６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２８４】
配列番号２５１は、ＪＰＴＰＮ８４に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２８５】
配列番号２５２は、ＪＰＴＰＮ８５に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２８６】
配列番号２５３は、ＪＰＴＰＮ８６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２８７】
配列番号２５４は、ＪＰＴＰＮ８７に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２８８】
配列番号２５５は、ＪＰＴＰＮ８８に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２８９】
配列番号２５６は、ＪＰ１Ｆ１に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２９０】
配列番号２５７は、ＪＰ１Ｆ２に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２９１】
配列番号２５８は、ＪＰ１Ｃ２に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２９２】
配列番号２５９は、ＪＰ１Ｂ１に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２９３】
配列番号２６０は、ＪＰ１Ｂ２に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２９４】
配列番号２６１は、ＪＰ１Ｄ３に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２９５】
配列番号２６２は、ＪＰ１Ａ４に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２９６】
配列番号２６３は、ＪＰ１Ｆ５に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２９７】
配列番号２６４は、ＪＰ１Ｅ６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２９８】
配列番号２６５は、ＪＰ１Ｄ６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２９９】
配列番号２６６は、ＪＰ１Ｂ５に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３００】
配列番号２６７は、ＪＰ１Ａ６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３０１】
配列番号２６８は、ＪＰ１Ｅ８に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３０２】
配列番号２６９は、ＪＰ１Ｄ７に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３０３】
配列番号２７０は、ＪＰ１Ｄ９に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３０４】
配列番号２７１は、ＪＰ１Ｃ１０に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３０５】
配列番号２７２は、ＪＰ１Ａ９に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３０６】
配列番号２７３は、ＪＰ１Ｆ１２に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３０７】
配列番号２７４は、ＪＰ１Ｅ１２に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３０８】
配列番号２７５は、ＪＰ１Ｄ１１に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３０９】
配列番号２７６は、ＪＰ１Ｃ１１に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３１０】
配列番号２７７は、ＪＰ１Ｃ１２に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３１１】
配列番号２７８は、ＪＰ１Ｂ１２に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３１２】
配列番号２７９は、ＪＰ１Ａ１２に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３１３】
配列番号２８０は、ＪＰ８Ｇ２に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３１４】
配列番号２８１は、ＪＰ８Ｈ１に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３１５】
配列番号２８２は、ＪＰ８Ｈ２に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３１６】
配列番号２８３は、ＪＰ８Ａ３に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３１７】
配列番号２８４は、ＪＰ８Ａ４に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３１８】
配列番号２８５は、ＪＰ８Ｃ３に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３１９】
配列番号２８６は、ＪＰ８Ｇ４に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３２０】
配列番号２８７は、ＪＰ８Ｂ６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３２１】
配列番号２８８は、ＪＰ８Ｄ６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３２２】
配列番号２８９は、ＪＰ８Ｆ５に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３２３】
配列番号２９０は、ＪＰ８Ａ８に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３２４】
配列番号２９１は、ＪＰ８Ｃ７に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３２５】
配列番号２９２は、ＪＰ８Ｄ７に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３２６】
配列番号２９３は、ＪＰ８Ｄ８に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３２７】
配列番号２９４は、ＪＰ８Ｅ７に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３２８】
配列番号２９５は、ＪＰ８Ｆ８に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３２９】
配列番号２９６は、ＪＰ８Ｇ８に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３３０】
配列番号２９７は、ＪＰ８Ｂ１０に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３３１】
配列番号２９８は、ＪＰ８Ｃ１０に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３３２】
配列番号２９９は、ＪＰＴＰＮ１３に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３３３】
配列番号３００は、ＪＰ８Ｅ１０に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３３４】
配列番号３０１は、ＪＰ８Ｆ９に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３３５】
配列番号３０２は、ＪＰ８Ｈ９に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３３６】
配列番号３０３は、ＪＰ８Ｃ１２に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３３７】
配列番号３０４は、ＪＰ８Ｅ１１に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３３８】
配列番号３０５は、ＪＰ８Ｅ１２に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３３９】
配列番号３０６は、ペプチドＰＳ２＃１２に対するアミノ酸配列である。
【０３４０】
配列番号３０７は、Ｐ７１１Ｐに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３４１】
配列番号３０８は、Ｐ７１２Ｐに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３４２】
配列番号３０９は、クローン２３に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３４３】
配列番号３１０は、Ｐ７７４Ｐに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３４４】
配列番号３１１は、Ｐ７７５Ｐに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３４５】
配列番号３１２は、Ｐ７１５Ｐに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３４６】
配列番号３１３は、Ｐ７１０Ｐに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３４７】
配列番号３１４は、Ｐ７６７Ｐに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３４８】
配列番号３１５は、Ｐ７６８Ｐに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３４９】
配列番号３１６−３２５は、以前に単離された遺伝子の決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３５０】
配列番号３２６は、Ｐ７０３ＰＤＥ５に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３５１】
配列番号３２７は、Ｐ７０３ＰＤＥ５に対するアミノ酸配列である。
【０３５２】
配列番号３２８は、Ｐ７０３Ｐ６．２６に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３５３】
配列番号３２９は、Ｐ７０３Ｐ６．２６に対するアミノ酸配列である。
【０３５４】
配列番号３３０は、Ｐ７０３ＰＸ−２３に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３５５】
配列番号３３１は、Ｐ７０３ＰＸ−２３に対するアミノ酸配列である。
【０３５６】
配列番号３３２は、Ｐ５０９Ｓに対する決定された全長ｃＤＮＡ配列である。
【０３５７】
配列番号３３３は、Ｐ７０７Ｐに対する決定された伸長ｃＤＮＡ配列である（１１−Ｃ９とも称される）。
【０３５８】
配列番号３３４は、Ｐ７１４Ｐに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３５９】
配列番号３３５は、Ｐ７０５Ｐに対する決定されたｃＤＮＡ配列である（９−Ｆ３とも称される）。
【０３６０】
配列番号３３６は、Ｐ７０５Ｐに対するアミノ酸配列である。
【０３６１】
配列番号３３７は、ペプチドＰ１Ｓ＃１０のアミノ酸配列である。
【０３６２】
配列番号３３８は、ペプチドｐ５のアミノ酸配列である。
【０３６３】
配列番号３３９は、ｐ５０９Ｓのアミノ酸配列である。
【０３６４】
配列番号３４０は、Ｐ７７８Ｐに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３６５】
配列番号３４１は、Ｐ７８６Ｐに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３６６】
配列番号３４２は、Ｐ７８９Ｐに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３６７】
配列番号３４３は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＭＭ４６  ｍＲＮＡに対して相同性を示すクローンに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３６８】
配列番号３４４は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＴＮＦαに刺激されたＡＢＣタンパク質ｍＲＮＡに対して相同性を示すクローンに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３６９】
配列番号３４５は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓのＥ−カドヘリンに対するｍＲＮＡに対して相同性を示すクローンに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３７０】
配列番号３４６は、ヒトの核にコードされるミトコンドリアのセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ）に対して相同性を示すクローンに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３７１】
配列番号３４７は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓの天然の耐性関連マクロファージタンパク質２（ＭＲＡＭＰ２）に対して相同性を示すクローンに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３７２】
配列番号３４８は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓホスホグルコムターゼタンパク質（ＰＧＭＲＰ）に対して相同性を示すクローンに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３７３】
配列番号３４９は、プロテオソームサブユニットｐ４０に対するヒトｍＲＮＡに対して相同性を示すクローンに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３７４】
配列番号３５０は、Ｐ７７７Ｐに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３７５】
配列番号３５１は、Ｐ７７９Ｐに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３７６】
配列番号３５２は、Ｐ７９０Ｐに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３７７】
配列番号３５３は、Ｐ７８４Ｐに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３７８】
配列番号３５４は、Ｐ７７６Ｐに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３７９】
配列番号３５５は、Ｐ７８０Ｐに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３８０】
配列番号３５６は、Ｐ５４４Ｓに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３８１】
配列番号３５７は、Ｐ７４５Ｓに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３８２】
配列番号３５８は、Ｐ７８２Ｐに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３８３】
配列番号３５９は、Ｐ７８３Ｐに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３８４】
配列番号３６０は、未知の１７９８４に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３８５】
配列番号３６１は、Ｐ７８７Ｐに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３８６】
配列番号３６２は、Ｐ７８８Ｐに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３８７】
配列番号３６３は、未知の１７９９４に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３８８】
配列番号３６４は、Ｐ７８１Ｐに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３８９】
配列番号３６５は、Ｐ７８５Ｐに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３９０】
配列番号３６６−３７５は、Ｂ３０５Ｄのスプライス改変体に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３９１】
配列番号３７６は、配列番号３６６の配列によってコードされるアミノ酸配列である。
【０３９２】
配列番号３７７は、配列番号３７２の配列によってコードされるアミノ酸配列である。
【０３９３】
配列番号３７８は、配列番号３７３の配列によってコードされるアミノ酸配列である。
【０３９４】
配列番号３７９は、配列番号３７４の配列によってコードされるアミノ酸配列である。
【０３９５】
配列番号３８０は、配列番号３７５の配列によってコードされるアミノ酸配列である。
【０３９６】
配列番号３８１は、Ｂ７１６Ｐに対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０３９７】
配列番号３８２は、Ｐ７１１Ｐに対する決定された全長ｃＤＮＡ配列である。
【０３９８】
配列番号３８３は、Ｐ７１１Ｐに対するアミノ酸配列である。
【０３９９】
配列番号３８４は、Ｐ１０００Ｃに対するｃＤＮＡ配列である。
【０４００】
配列番号３８５は、ＣＧＩ−８２に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４０１】
配列番号３８６は、２３３２０に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４０２】
配列番号３８７は、ＣＧＩ−６９に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４０３】
配列番号３８８は、１１−Ｌ−イジトール−２−デヒドロゲナーゼに対するｃＤＮＡ配列である。
【０４０４】
配列番号３８９は、２３３７９に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４０５】
配列番号３９０は、２３３８１に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４０６】
配列番号３９１は、ＫＩＡＡ０１２２に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４０７】
配列番号３９２は、クローン２３３９９に対するｃＤＮＡ配列である（Ｐ５５４Ｓとしても既知である）。
【０４０８】
配列番号３９３は、これまでに同定された遺伝子に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４０９】
配列番号３９４は、ＨＣＬＢＰに対するｃＤＮＡ配列である。
【０４１０】
配列番号３９５は、トランスグルタミナーゼに対するｃＤＮＡ配列である。
【０４１１】
配列番号３９６は、これまでに同定された遺伝子に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４１２】
配列番号３９７は、ＰＡＰに対するｃＤＮＡ配列である。
【０４１３】
配列番号３９８は、Ｅｔｓ転写調節因子ＰＤＥＦに対するｃＤＮＡ配列である。
【０４１４】
配列番号３９９は、ｈＴＧＲに対するｃＤＮＡ配列である。
【０４１５】
配列番号４００は、ＫＩＡＡ０２９５に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４１６】
配列番号４０１は、２２５４５に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４１７】
配列番号４０２は、２２５４７に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４１８】
配列番号４０３は、２２５４８に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４１９】
配列番号４０４は、２２５５０に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４２０】
配列番号４０５は、２２５５１に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４２１】
配列番号４０６は、２２５５２に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４２２】
配列番号４０７は、２２５５３に対するｃＤＮＡ配列である（Ｐ１０２０Ｃとしても既知である）。
【０４２３】
配列番号４０８は、２２５５８に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４２４】
配列番号４０９は、２２５６２に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４２５】
配列番号４１０は、２２５６５に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４２６】
配列番号４１１は、２２５６７に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４２７】
配列番号４１２は、２２５６８に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４２８】
配列番号４１３は、２２５７０に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４２９】
配列番号４１４は、２２５７１に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４３０】
配列番号４１５は、２２５７２に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４３１】
配列番号４１６は、２２５７３に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４３２】
配列番号４１７は、２２５７３に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４３３】
配列番号４１８は、２２５７５に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４３４】
配列番号４１９は、２２５８０に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４３５】
配列番号４２０は、２２５８１に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４３６】
配列番号４２１は、２２５８２に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４３７】
配列番号４２２は、２２５８３に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４３８】
配列番号４２３は、２２５８４に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４３９】
配列番号４２４は、２２５８５に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４４０】
配列番号４２５は、２２５８６に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４４１】
配列番号４２６は、２２５８７に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４４２】
配列番号４２７は、２２５８８に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４４３】
配列番号４２８は、２２５８９に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４４４】
配列番号４２９は、２２５９０に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４４５】
配列番号４３０は、２２５９１に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４４６】
配列番号４３１は、２２５９２に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４４７】
配列番号４３２は、２２５９３に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４４８】
配列番号４３３は、２２５９４に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４４９】
配列番号４３４は、２２５９５に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４５０】
配列番号４３５は、２２５９６に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４５１】
配列番号４３６は、２２８４７に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４５２】
配列番号４３７は、２２８４８に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４５３】
配列番号４３８は、２２８４９に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４５４】
配列番号４３９は、２２８５１に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４５５】
配列番号４４０は、２２８５２に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４５６】
配列番号４４１は、２２８５３に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４５７】
配列番号４４２は、２２８５４に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４５８】
配列番号４４３は、２２８５５に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４５９】
配列番号４４４は、２２８５６に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４６０】
配列番号４４５は、２２８５７に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４６１】
配列番号４４６は、２３６０１に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４６２】
配列番号４４７は、２３６０２に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４６３】
配列番号４４８は、２３６０５に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４６４】
配列番号４４９は、２３６０６に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４６５】
配列番号４５０は、２３６１２に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４６６】
配列番号４５１は、２３６１４に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４６７】
配列番号４５２は、２３６１８に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４６８】
配列番号４５３は、２３６２２に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４６９】
配列番号４５４は、葉酸加水分解酵素に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４７０】
配列番号４５５は、ＬＩＭタンパク質に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４７１】
配列番号４５６は、既知の遺伝子に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４７２】
配列番号４５７は、既知の遺伝子に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４７３】
配列番号４５８は、これまでに同定された遺伝子に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４７４】
配列番号４５９は、２３０４５に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４７５】
配列番号４６０は、２３０３２に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４７６】
配列番号４６１は、クローン２３０５４に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４７７】
配列番号４６２−４６７は、既知の遺伝子に対するｃＤＮＡ配列である。
【０４７８】
配列番号４６８−４７１は、Ｐ７１０Ｐに対するｃＤＮＡ配列である。
【０４７９】
配列番号４７２は、Ｐ１００１Ｃに対するｃＤＮＡ配列である。
【０４８０】
配列番号４７３は、Ｐ７７５Ｐの第一スプライシング改変体に対する決定されたｃＤＮＡ配列である（２７５０５と称される）。
【０４８１】
配列番号４７４は、Ｐ７７５Ｐの第二スプライシング改変体に対する決定されたｃＤＮＡ配列である（１９９４７と称される）。
【０４８２】
配列番号４７５は、Ｐ７７５Ｐの第三スプライシング改変体に対する決定されたｃＤＮＡ配列である（１９９４１と称される）。
【０４８３】
配列番号４７６は、Ｐ７７５Ｐの第四スプライシング改変体に対する決定されたｃＤＮＡ配列である（１９９３７と称される）。
【０４８４】
配列番号４７７は、配列番号４７４の配列によってコードされる第一アミノ酸配列である。
【０４８５】
配列番号４７８は、配列番号４７４の配列によってコードされる第二アミノ酸配列である。
【０４８６】
配列番号４７９は、配列番号４７５の配列によってコードされるアミノ酸配列である。
【０４８７】
配列番号４８０は、配列番号４７３の配列によってコードされる第一アミノ酸配列である。
【０４８８】
配列番号４８１は、配列番号４７３の配列によってコードされる第二アミノ酸配列である。
【０４８９】
配列番号４８２は、配列番号４７３の配列によってコードされる第三アミノ酸配列である。
【０４９０】
配列番号４８３は、配列番号４７３の配列によってコードされる第四アミノ酸配列である。
【０４９１】
配列番号４８４は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原Ｒａ１２の最初の３０アミノ酸である。
【０４９２】
配列番号４８５は、ＰＣＲプライマーＡＷ０２５である。
【０４９３】
配列番号４８６は、ＰＣＲプライマーＡＷ００３である。
【０４９４】
配列番号４８７は、ＰＣＲプライマーＡＷ０２７である。
【０４９５】
配列番号４８８は、ＰＣＲプライマーＡＷ０２６である。
【０４９６】
配列番号４８９−５０１は、エピトープマッピング研究に使用されるペプチドである。
【０４９７】
配列番号５０２は、抗Ｐ５０３Ｓモノクローナル抗体２０Ｄ４に対する相補性決定領域の、決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４９８】
配列番号５０３は、抗Ｐ５０３Ｓモノクローナル抗体ＪＡ１に対する相補性決定領域の、決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０４９９】
配列番号５０４および配列番号５０５は、ペプチドマッピング研究に使用されるペプチドである。
【０５００】
配列番号５０６は、抗Ｐ７０３Ｐモノクローナル抗体８Ｈ２に対する相補性決定領域の、決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０５０１】
配列番号５０７は、抗Ｐ７０３Ｐモノクローナル抗体７Ｈ８に対する相補性決定領域の、決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０５０２】
配列番号５０８は、抗Ｐ７０３Ｐモノクローナル抗体２Ｄ４に対する相補性決定領域の、決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０５０３】
配列番号５０９−５２２は、エピトープマッピング研究に使用されるペプチドである。
【０５０４】
配列番号５２３は、Ｐ７０３に対する抗体を惹起するために使用されたＰ７０３Ｐの成熟形態である。
【０５０５】
配列番号５２４は、Ｐ７０３Ｐの推定全長ｃＤＮＡ配列である。
【０５０６】
配列番号５２５は、配列番号５２４によってコードされるアミノ酸配列である。
【０５０７】
配列番号５２６は、Ｐ７９０Ｐに対する全長ｃＤＮＡ配列である。
【０５０８】
配列番号５２７は、Ｐ７９０Ｐに対するアミノ酸配列である。
【０５０９】
配列番号５２８および配列番号５２９は、ＰＣＲプライマーである。
【０５１０】
配列番号５３０は、配列番号３６６のスプライス改変体のｃＤＮＡ配列である。
【０５１１】
配列番号５３１は、配列番号５３０のオープンリーディングフレームのｃＤＮＡ配列である。
【０５１２】
配列番号５３２は、配列番号５３１の配列によりコードされるアミノ酸である。
【０５１３】
配列番号５３３は、Ｐ７７５Ｐの推定ＯＲＦのＤＮＡ配列である。
【０５１４】
配列番号５３４は、配列番号５３３によりコードされるアミノ酸配列である。
【０５１５】
配列番号５３５は、Ｐ５１０Ｓに対する第一全長ｃＤＮＡ配列である。
【０５１６】
配列番号５３６は、Ｐ５１０Ｓに対する第二全長ｃＤＮＡ配列である。
【０５１７】
配列番号５３７は、配列番号５３５によりコードされるアミノ酸配列である。
【０５１８】
配列番号５３８は、配列番号５３６によりコードされるアミノ酸配列である。
【０５１９】
配列番号５３９は、ペプチドＰ５０１Ｓ−３７０である。
【０５２０】
配列番号５４０は、ペプチドＰ５０１Ｓ−３７６である。
【０５２１】
配列番号５４１−配列番号５５１は、Ｐ５０１Ｓのエピトープである。
【０５２２】
配列番号５５２は、Ｐ７１２Ｐに対する伸長ｃＤＮＡ配列である。
【０５２３】
配列番号５５３−配列番号５６８は、配列番号５５２のオープンリーディングフレームによりコードされるアミノ酸配列である。
【０５２４】
配列番号５６９は、Ｐ７７６Ｐに対する伸長ｃＤＮＡ配列である。
【０５２５】
配列番号５７０は、コンティグ６と称されるＰ７７６Ｐのスプライス改変体に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０５２６】
配列番号５７１は、コンティグ７と称されるＰ７７６Ｐのスプライス改変体に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０５２７】
配列番号５７２は、コンティグ１４と称されるＰ７７６Ｐのスプライス改変体に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０５２８】
配列番号５７３は、配列番号５７０の第一ＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列である。
【０５２９】
配列番号５７４は、配列番号５７０の第二ＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列である。
【０５３０】
配列番号５７５は、配列番号５７１のＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列である。
【０５３１】
配列番号５７６−配列番号５８６は、配列番号５６９のＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列である。
【０５３２】
配列番号５８７は、Ｐ７６７ＰおよびＰ７７７Ｐの配列のＤＮＡコンセンサス配列である。
【０５３３】
配列番号５８８−配列番号５９０は、配列番号５８７のＯＲＦによってコードされるアミノ酸配列である。
【０５３４】
配列番号５９１は、Ｐ１０２０Ｃに対する伸長ｃＤＮＡ配列である。
【０５３５】
配列番号５９２は、配列番号Ｐ１０２０Ｃの配列によってコードされるアミノ酸配列である。
【０５３６】
配列番号５９３は、５０７４８と称されるＰ７７５Ｐのスプライシング改変体である。
【０５３７】
配列番号５９４は、５０７１７と称されるＰ７７５Ｐのスプライシング改変体である。
【０５３８】
配列番号５９５は、４５９８５と称されるＰ７７５Ｐのスプライシング改変体である。
【０５３９】
配列番号５９６は、３８７６９と称されるＰ７７５Ｐのスプライシング改変体である。
【０５４０】
配列番号５９７は、３７９２２と称されるＰ７７５Ｐのスプライシング改変体である。
【０５４１】
配列番号５９８は、４９２７４と称されるＰ５１０Ｓのスプライシング改変体である。
【０５４２】
配列番号５９９は、３９４８７と称されるＰ５１０Ｓのスプライシング改変体である。
【０５４３】
配列番号６００は、５１６７．１６と称されるＰ５０４Ｓのスプライシング改変体である。
【０５４４】
配列番号６０１は、５１６７．１と称されるＰ５０４Ｓのスプライシング改変体である。
【０５４５】
配列番号６０２は、５１６３．４６と称されるＰ５０４Ｓのスプライシング改変体である。
【０５４６】
配列番号６０３は、５１６３．４２と称されるＰ５０４Ｓのスプライシング改変体である。
【０５４７】
配列番号６０４は、５１６３．３４と称されるＰ５０４Ｓのスプライシング改変体である。
【０５４８】
配列番号６０５は、５１６３．１７と称されるＰ５０４Ｓのスプライシング改変体である。
【０５４９】
配列番号６０６は、１０６４０と称されるＰ５０１Ｓのスプライシング改変体である。
【０５５０】
配列番号６０７−配列番号６１５は、ＰＣＲプライマーの配列である。
【０５５１】
配列番号６１６は、Ｐ７０３ＰおよびＰＳＡの融合物の決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０５５２】
配列番号６１７は、Ｐ７０３ＰおよびＰＳＡの融合物のアミノ酸配列である。
【０５５３】
配列番号６１８−配列番号６８９は、前立腺特異的クローンの決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０５５４】
配列番号６９０は、遺伝子ＤＤ３のｃＤＮＡ配列である。
【０５５５】
配列番号６９１−配列番号６９７は、前立腺特異的クローンの決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０５５６】
配列番号６９８は、Ｐ７１４Ｐに対する伸長ｃＤＮＡ配列である。
【０５５７】
配列番号６９９−配列番号７０１は、Ｐ７０４Ｐのスプライシング改変体に対する配列である。
【０５５８】
配列番号７０２は、Ｐ５５３Ｓ−１４と称されるＰ５５３Ｓのスプライシング改変体のｃＤＮＡ配列である。
【０５５９】
配列番号７０３は、Ｐ５５３Ｓ−１２と称されるＰ５５３Ｓのスプライシング改変体のｃＤＮＡ配列である。
【０５６０】
配列番号７０４は、Ｐ５５３Ｓ−１０と称されるＰ５５３Ｓのスプライシング改変体のｃＤＮＡ配列である。
【０５６１】
配列番号７０５は、Ｐ５５３Ｓ−６と称されるＰ５５３Ｓのスプライシング改変体のｃＤＮＡ配列である。
【０５６２】
配列番号７０６は、配列番号７０５によってコードされるアミノ酸配列である。
【０５６３】
配列番号７０７は、配列番号７０２によってコードされるアミノ酸配列である。
【０５６４】
配列番号７０８は、配列番号７０２によってコードされる第二アミノ酸配列である。
【０５６５】
配列番号７０９−配列番号７７２は、前立腺特異的クローンの決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０５６６】
配列番号７７３は、前立腺特異的トランスグルタミナーゼ遺伝子に対する第一全長ｃＤＮＡ配列である（本明細書中では、Ｐ５５８Ｓとも称される）。
【０５６７】
配列番号７７４は、前立腺特異的トランスグルタミナーゼ遺伝子に対する第二全長ｃＤＮＡ配列である。
【０５６８】
配列番号７７５は、配列番号７７３の配列によってコードされるアミノ酸配列である。
【０５６９】
配列番号７７６は、配列番号７７４の配列によってコードされるアミノ酸配列である。
【０５７０】
配列番号７７７は、Ｐ７８８Ｐに対する全長ｃＤＮＡ配列である。
【０５７１】
配列番号７７８は、配列番号７７７によってコードされるアミノ酸配列である。
【０５７２】
配列番号７７９は、Ｐ７８８Ｐの多型改変体に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０５７３】
配列番号７８０は、配列番号７７９によってコードされるアミノ酸配列である。
【０５７４】
配列番号７８１は、Ｐ７０３Ｐ由来のペプチド４のアミノ酸配列である。
【０５７５】
配列番号７８２は、Ｐ７０３Ｐ由来のペプチド４をコードするｃＤＮＡ配列である。
【０５７６】
配列番号７８３−配列番号７９８は、Ｐ７０３ＰのエピトープをコードするｃＤＮＡ配列である。
【０５７７】
配列番号７９９−配列番号８１４は、Ｐ７０３Ｐのエピトープのアミノ酸配列である。
【０５７８】
配列番号８１５および配列番号８１６は、ＰＣＲプライマーである。
【０５７９】
配列番号８１７は、Ｅ．ｃｏｌｉで発現されたＰ７８８ＰのＮ末端部分をコードするｃＤＮＡ配列である。
【０５８０】
配列番号８１８は、Ｅ．ｃｏｌｉで発現されたＰ７８８ＰのＮ末端部分のアミノ酸配列である。
【０５８１】
配列番号８１９は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原Ｒａ１２のアミノ酸配列である。
【０５８２】
配列番号８２０および配列番号８２１は、ＰＣＲプライマーである。
【０５８３】
配列番号８２２は、Ｒａ１２−Ｐ５１０Ｓ−Ｃ構築物に対するｃＤＮＡ配列である。
【０５８４】
配列番号８２３は、Ｐ５１０Ｓ−Ｃ構築物に対するｃＤＮＡ配列である。
【０５８５】
配列番号８２４は、Ｐ５１０Ｓ−Ｅ３構築物に対するｃＤＮＡ配列である。
【０５８６】
配列番号８２５は、Ｒａ１２−Ｐ５１０Ｓ−Ｃ構築物に対するアミノ酸配列である。
【０５８７】
配列番号８２６は、Ｐ５１０Ｓ−Ｃ構築物に対するアミノ酸配列である。
【０５８８】
配列番号８２７は、Ｐ５１０Ｓ−Ｅ３構築物に対するアミノ酸配列である。
【０５８９】
配列番号８２８−配列番号８３３は、ＰＣＲプライマーである。
【０５９０】
配列番号８３４は、Ｒａ１２−Ｐ７７５Ｐ−ＯＲＦ３構築物のｃＤＮＡ配列である。
【０５９１】
配列番号８３５は、Ｒａ１２−Ｐ７７５Ｐ−ＯＲＦ３構築物のアミノ酸配列である。
【０５９２】
配列番号８３６および配列番号８３７は、ＰＣＲプライマーである。
【０５９３】
配列番号８３８は、Ｐ７０３ＰＨｉｓタグ融合タンパク質に対する決定されたアミノ酸配列である。
【０５９４】
配列番号８３９は、Ｐ７０３ＰＨｉｓタグ融合タンパク質に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０５９５】
配列番号８４０および配列番号８４１は、ＰＣＲプライマーである。
【０５９６】
配列番号８４２は、Ｐ７０５ＰＨｉｓタグ融合タンパク質に対する決定されたアミノ酸配列である。
【０５９７】
配列番号８４３は、Ｐ７０５ＰＨｉｓタグ融合タンパク質に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０５９８】
配列番号８４４および配列番号８４５は、ＰＣＲプライマーである。
【０５９９】
配列番号８４６は、Ｐ７１１ＰＨｉｓタグ融合タンパク質に対する決定されたアミノ酸配列である。
【０６００】
配列番号８４７は、Ｐ７１１ＰＨｉｓタグ融合タンパク質に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０６０１】
配列番号８４８は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原Ｒａ１２のアミノ酸配列である。
【０６０２】
配列番号８４９および配列番号８５０は、ＰＣＲプライマーである。
【０６０３】
配列番号８５１は、Ｒａ１２−Ｐ５０１Ｓ−Ｅ２構築物に対する決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０６０４】
配列番号８５２は、Ｒａ１２−Ｐ５０１Ｓ−Ｅ２構築物に対する決定されたアミノ酸配列である。
【０６０５】
配列番号８５３は、Ｐ５０１Ｓのエピトープに対するアミノ酸配列である。
【０６０６】
配列番号８５４は、配列番号８５３をコードするＤＮＡ配列である。
【０６０７】
配列番号８５５は、Ｐ５０１Ｓのエピトープに対するアミノ酸配列である。
【０６０８】
配列番号８５６は、配列番号８５５をコードするＤＮＡ配列である。
【０６０９】
配列番号８５７は、エピトープマッピング研究に使用されるペプチドである。
【０６１０】
配列番号８５８は、Ｐ５０１Ｓのエピトープに対するアミノ酸配列である。
【０６１１】
配列番号８５９は、配列番号８５８をコードするＤＮＡ配列である。
【０６１２】
配列番号８６０−配列番号８６２は、Ｐ５０１ＳのＣＤ４エピトープに対するアミノ酸配列である。
【０６１３】
配列番号８６３−配列番号８６５は、配列番号８６０−配列番号８６２の配列をコードするＤＮＡ配列である。
【０６１４】
配列番号８６６−配列番号８７７は、Ｐ７０３Ｐの推定ＣＴＬエピトープに対するアミノ酸配列である。
【０６１５】
配列番号８７８は、Ｐ７８９Ｐに対する全長ｃＤＮＡ配列である。
【０６１６】
配列番号８７９は、配列番号８７８によってコードされるアミノ酸配列である。
【０６１７】
配列番号８８０は、コンティグ６と称されるＰ７７６Ｐのスプライス改変体に対する決定された全長ｃＤＮＡ配列である。
【０６１８】
配列番号８８１−配列番号８８２は、コンティグ７と称されるＰ７７６Ｐのスプライス改変体に対する決定された全長ｃＤＮＡ配列である。
【０６１９】
配列番号８８３−配列番号８８７は、配列番号８８０によってコードされるアミノ酸配列である。
【０６２０】
配列番号８８８−配列番号８９３は、コンティグ７と称されるＰ７７６Ｐのスプライス改変体によってコードされるアミノ酸配列である。
【０６２１】
配列番号８９４は、ヒト膜貫通型プロテアーゼセリン２に対する全長ｃＤＮＡ配列である。
【０６２２】
配列番号８９５は、配列番号８９４によってコードされるアミノ酸配列である。
【０６２３】
配列番号８９６は、ヒト膜貫通型プロテアーゼセリン２の最初の２０９アミノ酸をコードするｃＤＮＡ配列である。
【０６２４】
配列番号８９７は、ヒト膜貫通型プロテアーゼセリン２の最初の２０９アミノ酸である。
【０６２５】
配列番号８９８は、Ｐ５０１Ｓのペプチド２９６−３２２のアミノ酸配列である。
【０６２６】
配列番号８９９−９０２は、ＰＣＲプライマーである。
【０６２７】
配列番号９０３は、Ｐ５０１Ｓ特異的Ｔ細胞クローン４Ｅ５に対するＴ細胞レセプターのＶｂ鎖の決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０６２８】
配列番号９０４は、Ｐ５０１Ｓ特異的Ｔ細胞クローン４Ｅ５に対するＴ細胞レセプターのＶａ鎖の決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０６２９】
配列番号９０５は、配列番号９０３によってコードされるアミノ酸配列である。
【０６３０】
配列番号９０６は、配列番号９０４によってコードされるアミノ酸配列である。
【０６３１】
配列番号９０７は、終止コドンを含むＰ７６８Ｐに対する全長オープンリーディングフレームである。
【０６３２】
配列番号９０８は、終止コドンを含まないＰ７６８Ｐに対する全長オープンリーディングフレームである。
【０６３３】
配列番号９０９は、配列番号９０８によってコードされるアミノ酸配列である。
【０６３４】
配列番号９１０−配列番号９１５は、Ｐ７６８Ｐの予測されるドメインに対するアミノ酸配列である。
【０６３５】
配列番号９１６は、Ｐ８３５Ｐの全長ｃＤＮＡ配列である。
【０６３６】
配列番号９１７は、以前に同定されたクローンＦＬＪ１３５８１のｃＤＮＡ配列である。
【０６３７】
配列番号９１８は、終止コドンを含むＰ８３５Ｐに対するオープンリーディングフレームのｃＤＮＡ配列である。
【０６３８】
配列番号９１９は、終止コドンを含まないＰ８３５Ｐに対する全長オープンリーディングフレームのｃＤＮＡ配列である。
【０６３９】
配列番号９２０は、Ｐ８３５Ｐに対する全長アミノ酸配列である。
【０６４０】
配列番号９２１−配列番号９２８は、Ｐ８３５Ｐの細胞外ドメインおよび細胞内ドメインのアミノ酸配列である。
【０６４１】
配列番号９２９は、Ｐ１０００Ｃに対する全長ｃＤＮＡ配列である。
【０６４２】
配列番号９３０は、終止コドンを含むＰ１０００Ｃに対するオープンリーディングフレームのｃＤＮＡ配列である。
【０６４３】
配列番号９３１は、終止コドンを含まないＰ１０００Ｃに対するオープンリーディングフレームのｃＤＮＡ配列である。
【０６４４】
配列番号９３２は、Ｐ１０００Ｃに対する全長アミノ酸配列である。
【０６４５】
配列番号９３３は、配列番号９３２のアミノ酸１−１００である。
【０６４６】
配列番号９３４は、配列番号９３２のアミノ酸１００−４９２である。
【０６４７】
配列番号９３５−配列番号９３７は、ＰＣＲプライマーである。
【０６４８】
配列番号９３８は、発現された全長Ｐ７６７Ｐコード領域のｃＤＮＡ配列である。
【０６４９】
配列番号９３９は、発現された短縮Ｐ７６７Ｐコード領域のｃＤＮＡ配列である。
【０６５０】
配列番号９４０は、配列番号９３９によってコードされるアミノ酸配列である。
【０６５１】
配列番号９４１は、配列番号９３８によってコードされるアミノ酸配列である。
【０６５２】
配列番号９４２は、Ｐ７０３ＰのＣＤ４エピトープのＤＮＡ配列である。
【０６５３】
配列番号９４３は、Ｐ７０３ＰのＣＤ４エピトープのアミノ酸配列である。
【０６５４】
配列番号９４４および配列番号９４５は、Ｐ７８０Ｐの二つの選択的スプライシング形態のｃＤＮＡ配列である。
【０６５５】
配列番号９４６および配列番号９４７はそれぞれ、配列番号９４４および配列番号９４５によってコードされるアミノ酸配列である。
【０６５６】
配列番号９４８は、Ｐ７０５Ｐに対して回収されたｃＤＮＡ配列である。
【０６５７】
配列番号９４９−配列番号９５６は、Ｐ７９０Ｐペプチドのアミノ酸配列である。
【０６５８】
配列番号９５７−配列番号９６６は、Ｐ７７５Ｐペプチドのアミノ酸配列である。
【０６５９】
配列番号９６７は、Ｐ５５４Ｓに対する伸長ｃＤＮＡ配列である。
【０６６０】
配列番号９６８は、Ｐ５５４Ｓに対するアミノ酸配列である。
【０６６１】
配列番号９６９−配列番号９７６は、Ｐ５０１ＳのエピトープをコードするｃＤＮＡ配列である。
【０６６２】
配列番号９７７−配列番号９８４は、Ｐ５０１Ｓのエピトープのアミノ酸配列である。
【０６６３】
配列番号９８５−配列番号９８７は、Ｐ５０１Ｓのペプチドのアミノ酸配列である。
【０６６４】
配列番号９８８−配列番号９９０は、Ｐ７０３Ｐのペプチドのアミノ酸配列である。
【０６６５】
配列番号９９１は、Ｐ７０３ＰのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープをコードするｃＤＮＡである。
【０６６６】
配列番号９９２は、Ｐ７０３ＰのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ（配列番号９９１によってコードされる）のアミノ酸配列である。
【０６６７】
配列番号９９３は、Ｐ３を含むＰ７０６Ｐクローン８−Ｂ６に対するｃＤＮＡ配列を示す。
【０６６８】
配列番号９９４は、Ｐ４を含むＰ７０６Ｐクローン８−Ｂ６に対するｃＤＮＡ配列を示す。
【０６６９】
配列番号９９５は、Ｐ７０６Ｐクローン８Ｂ６．Ｐ４コンティグに対するｃＤＮＡ配列を示す。
【０６７０】
配列番号９９６は、Ｐ７０６Ｐ  ＥＳＴ  １３８６−１９０２に対するｃＤＮＡ配列を示す。
【０６７１】
配列番号９９７は、Ｐ７０６Ｐ  ＥＳＴ  ４９２７−６０８８に対するｃＤＮＡ配列を示す。
【０６７２】
配列番号９９８は、Ｐ７１３ＰクローンＰＴ４４１０Ａ４２に対するｃＤＮＡ配列を示す。
【０６７３】
配列番号９９９−配列番号１００２は、前立腺分泌タンパク質（ＰＳＰ）をコードする四つのエキソンを示す。
【０６７４】
配列番号１００３は、ＰＳＰに対する全長アミノ酸配列を示す。
【０６７５】
配列番号１００４は、クローンＰ１Ｅに対する伸長ｃＤＮＡ配列を示す。
【０６７６】
配列番号１００５は、配列番号１００４によってコードされるオープンリーディングフレームのアミノ酸配列を示す。
【０６７７】
配列番号１００６は、発現構築物Ｐ５１０．ｓｅｑのコード領域のＤＮＡ配列を示す。
【０６７８】
配列番号１００７は、発現構築物ＭＡＰＳ−Ｐ５１０Ｓ．ｓｅｑのコード領域のＤＮＡ配列を示す。
【０６７９】
配列番号１００８は、配列番号１００７のＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質配列を示す。
【０６８０】
配列番号１００９は、配列番号１００６のＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質配列を示す。
【０６８１】
配列番号１０１０は、Ｔｒｘ−Ｐ５０１Ｓ融合構築物に対するコード領域のＤＮＡ配列を示す。
【０６８２】
配列番号１０１１は、配列番号１０１０のＤＮＡ配列によってコードされるＴｒｘ−Ｐ５０１Ｓ融合タンパク質に対するアミノ酸配列を示す。
【０６８３】
配列番号１０１２は、クローン２Ｈ２−１Ａ１２によって識別される最小限のＰ５０１Ｓエピトープに対するアミノ酸配列を示す。
【０６８４】
配列番号１０１３は、クローン２Ｈ２−１Ａ１２によって識別される最小限のＰ５０１Ｓエピトープに対するＤＮＡ配列を示す。
【０６８５】
配列番号１０１４は、フォワードプライマーｈＰＡＰＦ１に対するプライマー配列に相当する。
【０６８６】
配列番号１０１５は、リバースプライマーｈＰＡＰＲＶ１に対するプライマー配列に相当する。
【０６８７】
配列番号１０１６は、フォワードプライマーＦＯＰＰ２Ｆ１に対するプライマー配列に相当する。
【０６８８】
配列番号１０１７は、リバースプライマーＦＯＰＰＦ１に対するプライマー配列に相当する。
【０６８９】
配列番号１０１８は、フォーワードプライマーＦＯＰＰ２ＲＶ１に対するプライマー配列に相当する。
【０６９０】
配列番号１０１９は、ＦＯＰＰ２と称されるＦＯＰＰおよびｈＰＡＰの融合物に対するＤＮＡ配列を示す。
【０６９１】
配列番号１０２０は、ＦＯＰＰ２と称されるＦＯＰＰおよびｈＰＡＰの融合物に対するアミノ酸配列を示す。
【０６９２】
配列番号１０２１は、クローン１Ｈ１−１Ａ６によって識別されるＰ５０１Ｓの最小限ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対するＤＮＡ配列を示す。
【０６９３】
配列番号１０２２は、クローン１Ｈ１−１Ａ６によって識別されるＰ５０１Ｓの最小限ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対するアミノ酸配列を示す。
【０６９４】
配列番号１０２３は、プライマーＰＤＭ−９３０に対する配列を示す。
【０６９５】
配列番号１０２４は、プライマーＰＤＭ−１６５に対する配列を示す。
【０６９６】
配列番号１０２５は、プライマーＰＤＭ−９２９に対する配列を示す。
【０６９７】
配列番号１０２６は、Ｐ５０１Ｓ  Ｄタンパク質をコードするＤＮＡ配列を示す（アミノ酸３１６−５５３）。
【０６９８】
配列番号１０２７は、Ｐ５０１Ｓ  Ｃタンパク質をコードするＤＮＡ配列を示す（アミノ酸２５７−５５３）。
【０６９９】
配列番号１０２８は、Ｐ５０１Ｓ  Ｄタンパク質に対応するアミノ酸配列を示す（アミノ酸３１６−５５３）。
【０７００】
配列番号１０２９は、Ｐ５０１Ｓ  Ｃタンパク質に対応するアミノ酸配列を示す（アミノ酸２５７−５５３）。
【０７０１】
配列番号１０３０は、患者血清により識別されるＰ７０３Ｐエピトープに対するアミノ酸を示す。
【０７０２】
配列番号１０３１は、患者血清により識別されるＰ７０３Ｐエピトープに対するアミノ酸を示す。
【０７０３】
配列番号１０３２は、患者血清により識別されるＰ７０３Ｐエピトープに対するアミノ酸を示す。
【０７０４】
配列番号１０３３は、患者血清により識別されるＰ７０３Ｐエピトープに対するアミノ酸を示す。
【０７０５】
配列番号１０３４は、前立腺抗原Ｐ７１２Ｐに対するさらなるＤＮＡ配列を開示する。
【０７０６】
配列番号１０３５は、前立腺抗原Ｐ７７５Ｐに対するさらなるＤＮＡ配列を開示する。
【０７０７】
配列番号１０３６は、前立腺抗原Ｐ７０４Ｐに対するさらなるＤＮＡ配列を開示する。
【０７０８】
配列番号１０３７は、少なくとも３つのＩ型対立遺伝子に対する天然にプロセスされたエピトープを含むＰ５０１Ｓ由来の１１アミノ酸フラグメントを開示する。
【０７０９】
配列番号１０３８は、配列番号１０３７をコードするポリヌクレオチド配列を開示する。
【０７１０】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に参照され、そして／または、出願データシートに列挙される米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許公開物は、その全体が、参考として、本明細書中に援用される。
【０７１１】
本発明は、一般に、組成物、ならびに癌（特に、前立腺癌）の治療および診断におけるその使用に関する。以下でさらに記載するように、本発明の例示的な組成物としては、以下を含むがこれらに限定されない：ポリペプチド、特に免疫原性ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、抗体および他の結合因子、抗原提示細胞（ＡＰＣ）ならびに免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞）。
【０７１２】
本発明の実施は、特にそれと逆であることを示さない限り、当業者の範囲であるウイルス学、免疫学、細菌学、分子生物学、および組換えＤＮＡ技術の従来の方法（これらの多くは、例示目的で以下に記載される）を使用する。このような技術は、文献によって完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  （Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照のこと。
【０７１３】
上記または下記にかかわらず、本明細書中で引用される、全ての刊行物、特許および特許出願は、全体が参考して本明細書によって援用される。
【０７１４】
本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈によって明らかに他の方法で示されていない限り、複数の参照を含む。
【０７１５】
（ポリペプチド組成物）
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、その従来の意味、すなわちアミノ酸の配列として使用される。これらのポリペプチドは、特定の長さの生成物に限定されず；従って、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質は、このポリペプチドの定義に含まれ、そしてこのような用語は、別段に示さない限り、本明細書中で交換可能に使用され得る。この用語はまた、このポリペプチドの発現後修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに天然および非天然の両方の、当該分野で公知の他の改変）を称さない。ポリペプチドは、タンパク質全体でもあり、またはその部分配列でもあり得る。本発明の状況において特定の目的のポリペプチドは、エピトープ、すなわち、ポリペプチドの免疫原特性の実質的な原因となり、かつ免疫応答を誘起し得る抗原決定基を含むアミノ酸部分配列である。
【０７１６】
本発明の特に例示的なポリペプチドとしては、配列番号１−１１１、１１５−１７１、１７３−１７５、１７７、１７９−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２−３３５、３４０−３７５、３８１、３８２および３８４−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、５３６、５５２、５６９−５７２、５８７、５９１、５９３−６０６、６１８−７０５、７０９−７７４、７７７、７８９、８１７、８２３、８２４、８７８、８８０−８８２、８９４、８９６、９０７、９０８、９１６−９１９、９２９−９３１、９３８、９３９、９４２、９４４、９４５、９４８、９６７、９６９−９７６、９９１、９９３−１００２、１００４、１００６、１００７、１０１０、１０１３−１０１９、１０２１、１０２３−１０２７および１０３４−１０３６のいずれか１つに示されたポリヌクレオチド配列、あるいは中程度にストリンジェントな条件下または高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１−１１１、１１５−１７１、１７３−１７５、１７７、１７９−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２−３３５、３４０−３７５、３８１、３８２および３８４−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、５３６、５５２、５６９−５７２、５８７、５９１、５９３−６０６、６１８−７０５、７０９−７７４、７７７、７８９、８１７、８２３、８２４、８７８、８８０−８８２、８９４、８９６、９０７、９０８、９１６−９１９、９２９−９３１、９３８、９３９、９４２、９４４、９４５、９４８、９６７、９６９−９７６、９９１、９９３−１００２、１００４、１００６、１００７、１０１０、１０１３−１０１９、１０２１、１０２３−１０２７および１０３４−１０３６のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする配列によってコードされるポリペプチドを含む。特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１１２−１１４、１７２、１７６、１７８、３２７、３２９、３３１、３３６、３３９、３７６−３８０、３８３、４７７−４８３、４９６、５０４、５０５、５１９、５２０、５２２、５２５、５２７、５３２、５３４、５３７−５５１、５５３−５６８、５７３−５８６、５８８−５９０、５９２、７０６−７０８、７７５、７７６、７７８、７８０、７８１、８１１、８１４、８１８、８２６、８２７、８５３、８５５、８５８、８６０−８６２、８６６−８７７、８７９、８８３−８９３、８９５、８９７、８９８、９０９−９１５、９２０−９２８、９３２−９３４、９４０、９４１、９４３、９４６、９４７、９４９−９６６、９６８、９７７−９９０、９９２、１００３、１００５、１００８、１００９、１０１１および１０１２、１０２０、１０２２、１０２８−１０２９、１０３０−１０３３、および１０３７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。
【０７１７】
本発明のポリペプチドは、これらの同定が少なくとも部分的には、前立腺組織サンプルにおけるこれらの発現の増大したレベルに基づくことの現れとして、本明細書中で時々、前立腺特異的タンパク質または前立腺特異的ポリペプチドとして言及される。従って、「前立腺特異的ポリペプチド」または「前立腺特異的タンパク質」は、一般に本発明のポリペプチド配列、またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をいい、これらは、本明細書中で提供された代表的なアッセイを使用して決定されるように、正常組織での発現レベルより、少なくとも２倍大きいレベル、好ましくは５倍大きいレベルで、前立腺組織サンプルに実質的に比例して（例えば、試験された前立腺組織サンプルの、好ましくは約２０％より大きく、より好ましくは約３０％より大きく、そして最も好ましくは約５０％以上）発現される。本発明の前立腺特異的ポリペプチド配列は、その腫瘍細胞での増大した発現レベルに基づき、以下にさらに記載されるように、診断マーカーならびに治療標的の両方として特定の有用性を有する。
【０７１８】
特定の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは免疫原性であり、すなわちこれらは、前立腺癌を患った患者からの抗血清および／またはＴ細胞を用いた免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡまたはＴ細胞刺激アッセイ）で検出可能に反応する。免疫原性活性についてのスクリーニングは、当業者に周知の技術を使用して実施され得る。例えば、このようなスクリーニングは、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８に記載されるスクリーニングのような方法を使用して実施され得る。１つの例示的な例において、ポリペプチドは固体支持体に固定され得、そして患者の血清と接触され得、血清中の抗体の固定されたポリペプチドへの結合を可能にする。次いで、非結合血清は除去され、そして結合した抗体は、例えば、１２５Ｉ標識プロテインＡを用いて検出され得る。
【０７１９】
当業者に認識されるように、本明細書中で開示されるポリペプチドの免疫原性部分もまた、本発明により包含される。本明細書中で用いられる場合、「免疫原性部分」は、それ自体が本発明の免疫原性ポリペプチドを認識するＢ細胞および／またはＴ細胞表面抗原レセプターと免疫学的に反応性である（すなわち、特異的に結合する）本発明の免疫原性ポリペプチドのフラグメントである。免疫原性部分は、一般に、周知の技術（例えば、Ｐａｕｌ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版、２４３−２４７（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３）およびこの文献で引用される参考文献に要約されている）を用いて同定され得る。このような技術は、抗原特異的抗体、抗血清、および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応する能力について、ポリペプチドをスクリーニングすることを包含する。本明細書中で用いられる場合、抗血清および抗体は、これらが、抗原に特異的に結合する（すなわち、これらが、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫アッセイにおいてこのタンパク質と反応し、そして無関係のタンパク質とは検出可能に反応しない）場合に、「抗原特異的」である。このような抗血清および抗体は、本明細書中に記載されるように、そして周知技術を用いて、調製され得る。
【０７２０】
１つの好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドの免疫原性部分は、（例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴ細胞反応性アッセイにおいて）全長ポリペプチドの反応性よりも実質的に低くないレベルで、抗血清および／またはＴ細胞と反応する部分である。好ましくは、免疫原性部分の免疫原性活性のレベルは、全長ポリペプチドの免疫原性の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、そしてもっとも好ましくは９０％以上である。いくつかの例において、対応する全長ポリペプチドよりも大きい免疫原性活性のレベルを有する（例えば、約１００％または１５０％もしくはそれより大きい免疫原性活性を有する）好ましい免疫原性部分が同定される。
【０７２１】
特定の他の実施形態において、例示的な免疫原性部分は、Ｎ末端リーダー配列および／または膜貫通ドメインが欠失されたペプチドを含み得る。他の例示的な免疫原性部分は、成熟タンパク質と比較して小さなＮ末端および／またはＣ末端の欠失（例えば、１〜３０アミノ酸、好ましくは５〜１５アミノ酸）を含む。
【０７２２】
別の実施形態において、本発明のポリペプチド組成物また、Ｔ細胞および／または本発明のポリペプチド（特に、本明細書中に開示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド）またはそれらのフラグメントもしくは改変体に対して生成された抗体と免疫学的に反応性である１つ以上のポリペプチドを含み得る。
【０７２３】
本発明の別の実施形態において、本明細書中に記載される１つ以上のポリペプチドと免疫学的に反応性であるＴ細胞および／または抗体を惹起し得る１つ以上のポリペプチド、または本明細書中で開示されるポリヌクレオチド配列に含まれる連続的な核酸配列によりコードされる１つ以上のポリペプチド、またはそれらの免疫原性フラグメントもしくは改変体、あるいは中程度から高度のストリンジェンシーの条件下で１つ以上のこれらの配列にハイブリダイズする１つ以上の核酸配列によりコードされる１つ以上のポリペプチドを含むポリペプチドが提供される。
【０７２４】
別の局面において、本発明は、本明細書中に示されるポリペプチド組成物（例えば、配列番号１１２−１１４、１７２、１７６、１７８、３２７、３２９、３３１、３３６、３３９、３７６−３８０、３８３、４７７−４８３、４９６、５０４、５０５、５１９、５２０、５２２、５２５、５２７、５３２、５３４、５３７−５５１、５５３−５６８、５７３−５８６、５８８−５９０、５９２、７０６−７０８、７７５、７７６、７７８、７８０、７８１、８１１、８１４、８１８、８２６、８２７、８５３、８５５、８５８、８６０−８６２、８６６−８７７、８７９、８８３−８９３、８９５、８９７、８９８、９０９−９１５、９２０−９２８、９３２−９３４、９４０、９４１、９４３、９４６、９４７、９４９−９６６、９６８、９７７−９９０、９９２、１００３、１００５、１００８、１００９、１０１１、１０１２、１０２０、１０２２、１０２８−１０２９、１０３０−１０３３、および１０３７に示されるポリペプチド、または１−１１１、１１５−１７１、１７３−１７５、１７７、１７９−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２−３３５、３４０−３７５、３８１、３８２および３８４−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、５３６、５５２、５６９−５７２、５８７、５９１、５９３−６０６、６１８−７０５、７０９−７７４、７７７、７８９、８１７、８２３、８２４、８７８、８８０−８８２、８９４、８９６、９０７、９０８、９１６−９１９、９２９−９３１、９３８、９３９、９４２、９４４、９４５、９４８、９６７、９６９−９７６、９９１、９９３−１００２、１００４、１００６、１００７、１０１０、１０１３−１０１９、１０２１、１０２３−１０２７および１０３４−１０３６の配列に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド）の少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、５０、または１００またはそれ以上（全ての中間の長さを含む）連続するアミノ酸を含むポリペプチドフラグメントを提供する。
【０７２５】
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるポリペプチド組成物の改変体を提供する。一般的に本発明により包含されるポリペプチド改変体は、代表的に、本明細書中に示されるポリペプチド配列に対して、その長さに沿って、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％またはそれ以上の同一性（以下に記載するように決定された）を示す。
【０７２６】
１つの好ましい実施形態において、本発明により提供されるポリペプチドフラグメントおよび改変体は、本明細書中に詳細に示される全長ポリペプチドと反応する抗体および／またはＴ細胞と免疫学的に反応性である。
【０７２７】
別の好ましい実施形態において、本発明により提供されるポリペプチドフラグメントおよび改変体は、本明細書中に詳細に示される全長ポリペプチド配列により示される免疫原性活性のレベルの少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％またはそれ以上の免疫原性活性のレベルを示す。
【０７２８】
ポリペプチド「改変体」は、本明細書中でこの用語が使用される場合、代表的に、本明細書中で詳細に開示されるポリペプチドと１つ以上の置換、欠失、付加、および／または挿入において異なるポリペプチドである。このような改変体は、天然に生じるか、または例えば、当該分野で周知の任意の多くの技術を用いて、本発明の１つ以上の上記のポリペプチド配列を改変し、そして、本明細書中に記載されるようなそれらの免疫学的活性を評価することにより、合成により作製され得る。
【０７２９】
例えば、本発明のポリペプチドの特定の例示的な改変体として、１つ以上の部分（例えば、Ｎ末端リーダー配列または膜貫通ドメイン）が除去された改変体が挙げられる。他の例示的な改変体として、小さな部分（例えば、１〜３０アミノ酸、好ましくは５〜１５アミノ酸）が成熟タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端から除去された改変体が挙げられる。
【０７３０】
多くの例において、改変体は、保存的置換を含む。「保存的置換」とは、アミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸で置換され、その結果、ペプチド化学の当業者がポリペプチドの二次構造および疎水的性質が実質的に変化していないことを期待するような置換である。上記のように、改変は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造においてなされ得、そしてなお所望の特性（例えば、免疫原性特性）を有する改変体または誘導体ポリペプチドをコードする機能的分子を獲得し得る。本発明のポリペプチドの等価物を（または本発明のポリペプチドの改善された免疫原性の改変体もしくは部分さえも）作製するようポリペプチドのアミノ酸配列が変更されることが所望される場合、当業者は、代表的に、表１に従ってコードＤＮＡ配列の１つ以上のコドンを変更する。
【０７３１】
例えば、特定のアミノ酸は、例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位のような構造を有するタンパク質構造中の他のアミノ酸に、感知可能な相互作用的結合能の損失なしで、置換され得る。タンパク質の相互作用的な能力および性質がタンパク質の生物学的機能的活性を規定するので、特定のアミノ酸配列置換は、タンパク質配列、および当然ながら、その根底にあるＤＮＡコード配列においてなされ得、そしてそれにも関わらず、同様の特性を有するタンパク質が入手される。従って、種々の変化が、ペプチドの生物学的有用性または活性の感知可能な損失を伴わずに、開示された組成物のペプチド配列またはそのペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列においてなされ得ることが意図される。
【０７３２】
（表１）
【０７３３】
【表１】
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このような変化を作製する際に、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮され得る。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際の疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、一般的に当該分野において理解されている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２、本明細書中に参考として援用される）。アミノ酸の相対的な疎水性親水性的性質は、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、これが次に、他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）とのそのタンパク質の相互作用を規定することが受け入れられている。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて疎水性親水性指標を割り当てられている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）。これらの値は以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【０７３４】
特定のアミノ酸が類似の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換され得、そしてなお類似の生物学的活性を有するタンパク質を生じる（すなわち、生物学的に機能的に等価なタンパク質をなお入手する）ことが、当該分野において公知である。このような変化を作製する際に、その疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、その疎水性親水性指標が±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そしてその疎水性親水性指標が±０．５以内であるアミノ酸の置換がなおより特に好ましい。同様なアミノ酸の置換が、親水性に基づいて有効になされ得ることもまた、当該分野で理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号（その全体が本明細書中に参考として詳細に援用される）は、そのタンパク質の最大局所的平均親水性が、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるので、そのタンパク質の生物学的特性と相関することを言及している。
【０７３５】
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられた：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸は、類似の親水性値を有する別のアミノ酸に置換され得、そしてなお、生物学的な等価物（特に、免疫学的に等価なタンパク質）を得ることが理解される。このような変化において、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、その親水性値が±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そしてその親水性値が±０．５以内であるアミノ酸の置換がなおより特に好ましい。
【０７３６】
従って、上記で概説したように、アミノ酸置換は、一般的にアミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性（例えば、その疎水性、親水性、電荷、大きさ、など）に基づく。前述の種々の特徴を考慮する典型的な置換は当業者に周知であり、そしてこのような置換として以下が挙げられる：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン。
【０７３７】
さらに、任意のポリヌクレオチドが、インビボでの安定性を増加させるためにさらに改変され得る。可能性のある改変として以下が挙げられるがこれらに限定されない：５’末端および／または３’末端での隣接配列の付加；骨格におけるホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチルの使用；ならびに／あるいは従来とは異なる塩基（例えば、イノシン、キューオシン、およびワイブトシン、ならびにアデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンのアセチル、メチル、チオ、および他の修飾形態）の含有。
【０７３８】
アミノ酸置換はさらに、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性特性の類似性に基づいて作製され得る。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸；正に荷電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニン；そして類似の親水性値を有する非荷電性の極性頭部を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。保存的変化を示し得るアミノ酸の他のグループとしては、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが挙げられる。改変体はまた、あるいは、非保存的変化を含み得る。好ましい実施形態において、改変体ポリペプチドは、５アミノ酸またはそれより少ないアミノ酸の置換、欠失または付加によって、ネイティブの配列とは異なる。改変体はまた（あるいは）、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造および疎水性親水性特性に対する最小の影響を有するアミノ酸の欠失または付加によって、改変され得る。
【０７３９】
上記のように、ポリペプチドは、タンパク質のＮ末端にシグナル（または、リーダー）配列を含み得、これは、翻訳と同時に、または翻訳後に、そのタンパク質の移入を指向する。このポリペプチドはまた、このポリペプチド（例えば、ポリＨｉｓ）の合成、精製または同定を容易にするために、またはこのポリペプチドの固体支持体への結合を増強するために、リンカー配列または他の配列に結合体化され得る。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域に結合体化され得る。
【０７４０】
ポリペプチド配列が比較される場合、以下に記載されるように最大の一致について整列する場合に２つの配列中のアミノ酸の配列が同じである場合、２つの配列は、「同一」であるといわれる。２つの配列間の比較は、代表的には、比較ウインドウによって配列を比較して、配列類似性の局所的領域を同定および比較することによって行われる。本明細書中で使用される「比較ウインドウ」とは、少なくとも約２０、通常は３０〜約７５、４０〜約５０の連続する位置のセグメントをいう。ここで、配列は、２つの配列が必要に応じて整列された後、参照配列の同じ数の連続する位置と比較され得る。
【０７４１】
比較のための配列の最適な整列は、生命情報科学ソフトウエアのＬａｓｅｒｇｅｎｅ  ｓｕｉｔｅにおけるＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、デフォルトパラメータを用いて行われ得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載のいくつかの整列スキームを統合する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ  第５巻，補遺３，３４５〜３５８頁におけるＤａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．；Ｈｅｉｎ  Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ  ６２６〜６４５頁  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第１８３巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．（１９７１）Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ  １１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．Ｎｅｓ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６−７３０。
【０７４２】
あるいは、比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ  ２：４８２の部分的同一性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の同一性整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化した実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または検査によって行われ得る。
【０７４３】
配列同一性および配列類似性の割合を決定するために適切なアルゴリズムの１つの好ましい例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載される。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドについての配列同一性の割合を決定するために、例えば、本明細書中に記載のパラメータを使用して使用され得る。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎを通して公に利用可能である。アミノ酸配列について、スコアリングマトリクスは、累積スコアを算出するために使用され得る。各指示におけるワードヒットの拡大は、以下の場合に停止する：累積整列スコアが、その最大到達値から量Ｘだけ低下した場合；累積スコアが、１以上の負のスコアリングの残基整列の累積に起因してゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。このＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、整列の感度および速度を決定する。
【０７４４】
好ましい１つのアプローチにおいて、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０位置の比較ウインドウにわたる２つの最適に整列した配列を比較することによって決定され、ここで比較ウインドウ中のポリペプチド配列の部分は、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、２つの配列の最適な整列について２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。このパーセンテージは、両方の配列で同一のアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して一致する位置の数を得、この一致する位置の数を参照配列における位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算し、そしてこの結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。
【０７４５】
他の例示的実施形態において、ポリペプチドは、本明細書中に記載の複数のポリペプチドを含むか、または本明細書に記載の少なくとも１つのポリペプチドおよび関連しない配列（例えば、公知の腫瘍タンパク質）を含む融合ポリペプチドであり得る。例えば、融合パートナーは、Ｔヘルパーエピトープ、好ましくはヒトによって認識されるＴヘルパーエピトープを提供する際に補助し得るか（免疫学的融合パートナー）、またはネイティブの組換えタンパク質より高い収量でタンパク質を発現する際に補助し得る（発現エンハンサー）。特定の好ましい融合パートナーは、免疫学的融合パートナーおよび発現増強融合パートナーの両方である。他の融合パートナーは、ポリペプチドの溶解性を増加するように、またはポリペプチドが所望の細胞内コンパートメントに標的化されることを可能にするように選択され得る。なおさらなる融合パートナーとしては、親和性タグ（これは、ポリペプチドの精製を容易にする）が挙げられる。
【０７４６】
融合ポリペプチドは、一般に、標準的な技術（化学的結合体化を含む）を使用して調製され得る。好ましくは、融合ポリペプチドは、発現系において、組換えポリペプチドとして発現され、非融合ポリペプチドと比較して、増加したレベルの産生を可能にする。手短に言うと、このポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列を、別々に構築し得、そして適切な発現ベクターに連結し得る。１つのポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端は、ペプチドリンカーを用いてまたは用いずに、第２のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’末端に、これらの配列のリーディングフレームが同位相にあるように連結される。このことが、両方の成分ポリペプチドの生物学的活性を保持する単一の融合ポリペプチドへの翻訳を可能にする。
【０７４７】
ペプチドリンカー配列は、各ポリペプチドがその二次構造および三次構造へと折り畳まれるのを保証するために十分な距離で第一および第二のポリペプチド構成要素を隔てるために用いられ得る。このようなペプチドリンカー配列は、当該分野で周知の標準的な技術を用いて融合ポリペプチド中に組み込まれる。適切なペプチドリンカー配列は、以下の因子に基づいて選択され得る：（１）伸長した可変コンホメーションを取る能力；（２）第一および第二のポリペプチド上の機能的なエピトープと相互作用し得る二次構造を取ることができないこと；ならびに（３）ポリペプチドの機能的なエピトープと反応し得る疎水性または荷電した残基の無いこと。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ残基を含む。ＴｈｒおよびＡｌａのような中性に近い他のアミノ酸もまた、リンカー配列に用いられ得る。リンカーとして有用に用いられ得るアミノ酸配列としては、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ  ４０：３９−４６、１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８２５８−８２６２、１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されるアミノ酸配列が挙げられる。リンカー配列は、一般的に１から約５０アミノ酸長であり得る。リンカー配列は、第一および第二のポリペプチドが、機能的ドメインを分離するため、および立体的な干渉を防ぐために用いられ得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有する場合、必要とされない。
【０７４８】
連結されたＤＮＡ配列は、適切な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結される。ＤＮＡの発現を担う調節エレメントは、第一のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’側にのみ位置する。同様に、翻訳および転写終結シグナルを終了するために必要とされる終止コドンは、第二のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’側にのみ存在する。
【０７４９】
融合ポリペプチドは、関連しない免疫原性ポリペプチドと共に、本明細書中に記載されるようなポリペプチド（例えば、リコール（ｒｅｃａｌｌ）応答を惹起し得る免疫原性ポリペプチド）を含み得る。このようなタンパク質の例としては、破傷風タンパク質、結核タンパク質および肝炎タンパク質が挙げられる（例えば、Ｓｔｏｕｔｅら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３６：８６−９１（１９９７）を参照のこと）。
【０７５０】
１つの好ましい実施形態において、免疫学的融合パートナーは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＲａ１２フラグメントのようにＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．由来である。Ｒａ１２組成物ならびに異種ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列の発現および／または免疫原性を増強する際に、Ｒａ１２を使用するための方法は、米国特許出願６０／１５８，５８５（この開示は、本明細書中でその全体が参考として援用される）に記載されている。簡単には、Ｒａ１２は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＭＴＢ３２Ａ核酸のサブ配列であるポリヌクレオチド領域をいう。ＭＴＢ３２Ａは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの毒性菌株および無毒性菌株の遺伝子によってコードされる分子量３２ＫＤのセリンプロテアーゼである。ＭＴＢ３２Ａのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が、記載されている（例えば、米国特許出願６０／１５８，５８５；また、Ｓｋｅｉｋｙら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎ．（１９９９）６７：３９９８〜４００７も参照のこと。これらは、本明細書中で参考として援用される）。ＭＴＢ３２Ａコード配列のＣ末端フラグメントは高いレベルで発現し、精製プロセス全体にわたって可溶性ポリペプチドとして残存する。さらに、Ｒａ１２は、これが融合される、異種免疫原性ポリペプチドの免疫原性を増強し得る。１つの好ましいＲａ１２融合ポリペプチドは、ＭＴＢ３２Ａのアミノ酸残基１９２〜３２３に対応する１４ＫＤのＣ末端フラグメントを含む。他の好ましいＲａ１２ポリヌクレオチドは、一般的に、Ｒａ１２ポリペプチドの一部をコードする少なくとも約１５個の連続するヌクレオチド、少なくとも約３０個のヌクレオチド、少なくとも６０個のヌクレオチド、少なくとも約１００個のヌクレオチド、少なくとも約２００個のヌクレオチド、または少なくとも約３００個のヌクレオチドを含む。Ｒａ１２ポリヌクレオチドは、ネイティブな配列（すなわち、Ｒａ１２ポリペプチドまたはその一部をコードする内因性配列）を含んでもよいし、このような配列の改変体を含んでもよい。Ｒａ１２ポリヌクレオチド改変体は、１以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含み得、その結果、コードされた融合ポリペプチドの生物学的活性が、ネイティブなＲａ１２ポリペプチドを含む融合ポリペプチドと比較して、実質的に減少していない。好ましくは、改変体は、ネイティブなＲａ１２ポリペプチドまたはその一部をコードするポリヌクレオチド配列に、少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、そして最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性を示す。
【０７５１】
好ましい他の実施形態において、免疫学的融合パートナーは、グラム陰性の細菌Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂの表面タンパク質である、プロテインＤ（ＷＯ  ９１／１８９２６）に由来する。好ましくは、プロテインＤ誘導体は、ほぼ３分の１のタンパク質（例えば、最初のＮ末端１００〜１１０アミノ酸）を含み、そしてプロテインＤ誘導体は、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）され得る。特定の好ましい実施形態において、リポプロテインＤ融合パートナーの最初の１０９残基は、さらなる外因性Ｔ細胞エピトープを有するポリペプチドを提供するように、そしてＥ．ｃｏｌｉ中の発現レベルを増加するように、Ｎ末端に含まれる（従って、発現エンハンサーとして機能する）。脂質テールは、抗原提示細胞への抗原の最適な提示を保証する。他の融合パートナーは、インフルエンザウイルス由来の非構造的タンパク質、ＮＳ１（血球凝集素）を含む。代表的に、Ｎ末端の８１アミノ酸が用いられるが、Ｔヘルパーエピトープを含む異なるフラグメントが使用され得る。
【０７５２】
別の実施形態において、免疫学的融合パートナーは、ＬＹＴＡとして公知のタンパク質、またはその部分（好ましくはＣ末端部分）である。ＬＹＴＡは、アミダーゼＬＹＴＡ（ＬｙｔＡ遺伝子によりコードされる；Ｇｅｎｅ  ４３：２６５〜２９２，１９８６）として公知のＮ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼを合成するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来である。ＬＹＴＡは、ペプチドグリカン骨格中の特定の結合を特異的に分解する自己溶解素である。ＬＹＴＡタンパク質のＣ末端ドメインは、コリンまたはいくつかのコリンアナログ（例えば、ＤＥＡＥ）に対する親和性を担う。この性質は、融合タンパク質の発現のために有用なＥ．ｃｏｌｉ  Ｃ−ＬＹＴＡ発現プラスミドの開発のために利用されてきた。アミノ末端でＣ−ＬＹＴＡフラグメントを含むハイブリッドタンパク質の精製が、記載されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７９５〜７９８，１９９２を参照のこと）。好ましい実施形態において、ＬＹＴＡの反復部分は、融合ポリペプチドに組み込まれ得る。反復部分は、残基１７８で開始するＣ末端領域中に見出される。特に好ましい反復部分は、残基１８８〜３０５を組み込む。
【０７５３】
なお別の例示的な実施形態は、融合ポリペプチド、およびそれらをコードするポリヌクレオチドを含み、ここでこの融合パートナーは、米国特許第５，６３３，２３４号に記載のようにポリペプチドをエンドソーム／リソソームコンパートメントへ指向させ得る標的化シグナルを含む。本発明の免疫原性ポリペプチドは、この標的化シグナルと融合する場合、より効率的にＭＨＣクラスＩＩ分子と結合し、これによってこのポリペプチドに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞のインビボでの増強された刺激が提供される。
【０７５４】
本発明のポリペプチドは、周知の種々の合成技術および／または組換え技術のいずれかを使用して調製される。これらの技術の後者を以下でさらに記載する。約１５０アミノ酸よりも少ないポリペプチド、部分および他の改変体は、一般的に、当業者に周知の技術を使用して、合成手段により作製され得る。例示的な１つの実施例において、このようなポリペプチドは、市販される固相技術のいずれか（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成方法）を使用して合成され、ここでアミノ酸は、成長しているアミノ酸鎖に連続的に付加される。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１４６、１９６３を参照のこと。ポリペプチドの自動化された合成のための機器が、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）などの供給業者から市販され、そして製造者の指示に従って操作され得る。
【０７５５】
一般に、本発明のポリペプチド組成物（融合ポリペプチドを含む）が単離される。「単離された」ポリペプチドは、その元来の環境から取り出されたものである。例えば、天然に存在するタンパク質またはポリペプチドは、それが天然の系において共存する物質のいくつかまたは全てから分離されている場合、単離されている。好ましくは、このようなポリペプチドは、精製され、例えば、少なくとも約９０％純粋、より好ましくは少なくとも約９５％純粋、そして最も好ましくは少なくとも約９９％純粋である。
【０７５６】
（ポリヌクレオチド組成物）
他の局面において、本発明は、ポリヌクレオチド組成物を提供する。用語「ＤＮＡ」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書中で実質的に交換可能に使用され、特定の種の全ゲノムＤＮＡを含まない単離されたＤＮＡ分子をいう。本明細書中で使用される場合、「単離された」は、ポリヌクレオチドが、他のコード配列から実質的に分離されており、そしてＤＮＡ分子が、無関係のコードＤＮＡの大部分（例えば、大きな染色体フラグメントまたは他の機能的遺伝子またはポリペプチドコード領域）を含まないことを意味する。当然のことながら、これは、もともと単離されたＤＮＡ分子をいい、後で人工的にセグメントを付加された遺伝子またはコード領域を除外しない。
【０７５７】
当業者に理解されるように、本発明のポリヌクレオチド組成物は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどを発現するか、または発現し得るように適応されたゲノム配列、ゲノム外配列およびプラスミドにコードされる配列、ならびにより小さな操作された遺伝子セグメントを含み得る。このようなセグメントは、自然に単離され得るか、または人の手によって合成的に改変され得る。
【０７５８】
当業者に認識されるように、本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖（コードもしくはアンチセンス）または二本鎖であり得、そしてＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成）またはＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子は、ＨｎＲＮＡ分子（これはイントロンを含み、そしてＤＮＡ分子に１対１の様式で対応する）、およびｍＲＮＡ分子（これは、イントロンを含まない）を含み得る。さらなるコード配列または非コード配列は、本発明のポリヌクレオチド内に存在し得るがその必要はなく、そしてポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持体材料に連結され得るがその必要はない。
【０７５９】
ポリヌクレオチドは、ネイティブの配列（すなわち、本発明のポリペプチド／タンパク質、またはその部分をコードする内因性配列）を含み得るか、あるいはこのような配列の改変体または誘導体、そして好ましくは免疫原性改変体または誘導体をコードする配列を含み得る。
【０７６０】
従って、本発明の別の局面に従い、配列番号１−１１１、１１５−１７１、１７３−１７５、１７７、１７９−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２−３３５、３４０−３７５、３８１、３８２および３８４−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、５３６、５５２、５６９−５７２、５８７、５９１、５９３−６０６、６１８−７０５、７０９−７７４、７７７、７８９、８１７、８２３、８２４、８７８、８８０−８８２、８９４、８９６、９０７、９０８、９１６−９１９、９２９−９３１、９３８、９３９、９４２、９４４、９４５、９４８、９６７、９６９−９７６、９９１、９９３−１００２、１００４、１００６、１００７、１０１０、１０１３−１０１９、１０２１、１０２３−１０２７および１０３４−１０３６のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列、配列番号１−１１１、１１５−１７１、１７３−１７５、１７７、１７９−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２−３３５、３４０−３７５、３８１、３８２および３８４−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、５３６、５５２、５６９−５７２、５８７、５９１、５９３−６０６、６１８−７０５、７０９−７７４、７７７、７８９、８１７、８２３、８２４、８７８、８８０−８８２、８９４、８９６、９０７、９０８、９１６−９１９、９２９−９３１、９３８、９３９、９４２、９４４、９４５、９４８、９６７、９６９−９７６、９９１、９９３−１００２、１００４、１００６、１００７、１０１０、１０１３−１０１９、１０２１、１０２３−１０２７および１０３４−１０３６のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列の相補体、ならびに配列番号１−１１１、１１５−１７１、１７３−１７５、１７７、１７９−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２−３３５、３４０−３７５、３８１、３８２および３８４−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、５３６、５５２、５６９−５７２、５８７、５９１、５９３−６０６、６１８−７０５、７０９−７７４、７７７、７８９、８１７、８２３、８２４、８７８、８８０−８８２、８９４、８９６、９０７、９０８、９１６−９１９、９２９−９３１、９３８、９３９、９４２、９４４、９４５、９４８、９６７、９６９−９７６、９９１、９９３−１００２、１００４、１００６、１００７、１０１０、１０１３−１０１９、１０２１、１０２３−１０２７および１０３４−１０３６のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列の縮重改変体のいくつかまたは全てを含むポリヌクレオチド組成物が提供される。特定の好ましい実施形態において、本明細書中に示されるポリヌクレオチド配列は、上記のような免疫原性ポリペプチドをコードする。
【０７６１】
他の関連する実施形態において、本発明は、本明細書中で配列番号１−１１１、１１５−１７１、１７３−１７５、１７７、１７９−３０５、３０７−３１５、３２６、３２８、３３０、３３２−３３５、３４０−３７５、３８１、３８２および３８４−４７６、５２４、５２６、５３０、５３１、５３３、５３５、５３６、５５２、５６９−５７２、５８７、５９１、５９３−６０６、６１８−７０５、７０９−７７４、７７７、７８９、８１７、８２３、８２４、８７８、８８０−８８２、８９４、８９６、９０７、９０８、９１６−９１９、９２９−９３１、９３８、９３９、９４２、９４４、９４５、９４８、９６７、９６９−９７６、９９１、９９３−１００２、１００４、１００６、１００７、１０１０、１０１３−１０１９、１０２１、１０２３−１０２７および１０３４−１０３６に開示される配列に対して実質的な同一性を有するポリヌクレオチド改変体を提供する。例えば、これらは、本明細書中で記載の方法（例えば、以下に記載のような標準的なパラメーターを使用するＢＬＡＳＴ分析）を使用して、本発明のポリヌクレオチド配列と比較して、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％より高い配列同一性を含む。当業者は、これらの値が、コドンの縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置付けなどを考慮することによって、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために、適切に調整され得ることを認識する。
【０７６２】
代表的には、ポリヌクレオチド改変体は、１つ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含み、好ましくは、その結果、改変体ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの免疫原性が、本明細書中に具体的に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドに対して実質的に減少されない。用語「改変体」はまた、異種起源の相同遺伝子を包含することが理解されるべきである。
【０７６３】
さらなる実施形態において、本発明は、本明細書中に開示された配列の１つ以上に同一であるかまたは相補的な配列の、種々の長さの連続したストレッチを含むポリヌクレオチドフラグメントを提供する。例えば、本明細書中に開示される配列の１つ以上の、少なくとも約１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００または１０００以上連続したヌクレオチド、ならびにその間の中間の長さの連続したヌクレオチドを含むかまたはこれらからなるポリヌクレオチドが、本発明によって提供される。この状況において、「中間の長さ」が、示された値の間の任意の長さ（例えば、１６、１７、１８、１９など；２１、２２、２３など；３０、３１、３２など；５０、５１、５２、５３など；１００、１０１、１０２、１０３など；１５０、１５１、１５２、１５３など；２００〜５００；５００〜１，０００などの間の全ての整数を含む）を意味することが容易に理解される。
【０７６４】
本発明の別の実施形態において、本明細書において提供されるポリヌクレオチド配列もしくはそのフラグメントまたはその相補的な配列に対して、中程度〜高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチド組成物が提供される。ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学の当該分野において周知である。例示の目的であるが、他のポリヌクレオチドと本発明のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを試験するために適切な中程度にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中の事前洗浄；５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣでの、一晩のハイブリダイゼーション；続いて、０．１％ＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣのそれぞれを用いた、６５℃で２０分間の２回の洗浄を含む。当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが、例えば、ハイブリダイゼーション溶液の塩含量および／またはハイブリダイゼーションが実施される温度を変更することによって、容易に操作され得ることを理解する。例えば、別の実施形態において、適切な高いストリンジェントのハイブリダイゼーション条件としては、ハイブリダイゼーションの温度が、例えば、６０〜６５℃または６５〜７０℃に増大される点を除いて、上記の条件が挙げられる。
【０７６５】
特定の好ましい実施形態において、上記のポリヌクレオチド（例えば、ポリヌクレオチド改変体、フラグメント、およびハイブリダイズする配列）は、本明細書中に具体的に示されるポリペプチド配列と免疫学的に交差反応するポリペプチドをコードする。他の好ましい実施形態において、このようなポリヌクレオチドは、本明細書中に具体的に示されるポリペプチド配列の免疫原性活性の、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、そしてより好ましくは少なくとも約９０％の免疫原性活性レベルを有するポリペプチドをコードする。
【０７６６】
本発明のポリヌクレオチド、またはそのフラグメントは、そのコード配列自体の長さに関わらず、他のＤＮＡ配列（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、マルチクローニング部位、他のコードセグメントなど）と組合わされ得、その結果、その全体の長さは、相当変化し得る。従って、ほとんどいずれの長さの核酸フラグメントをも使用し得ることが意図され、その全長は、好ましくは意図した組換えＤＮＡプロトコルにおける調製および使用の容易さによって制限される。例えば、約１０，０００、約５０００、約３０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０塩基対長など（全ての中間の長さを含む）の全長を有する例示的なポリヌクレオチドセグメントが、本発明の多くの実行において有用であることが意図される。
【０７６７】
ポリヌクレオチド配列を比較する場合、２つの配列におけるヌクレオチドの配列が、以下に記載されるように最大一致について整列されるのと同じ場合に、２つの配列が「同一」であるといわれる。２つの配列の間の比較は、代表的には、配列類似性の局部領域を同定および比較するために、比較ウインドウにわたって配列を比較することによって行われる。本明細書中で使用される場合、「比較ウインドウ」は、少なくとも約２０、通常は３０〜約７５、４０〜約５０連続した位置のセグメントをいい、ここで、２つの配列が最適に整列された後に、配列は、連続した位置の同じ番号の参照配列と比較され得る。
【０７６８】
比較のための配列の最適な整列は、バイオインフォマティクスソフトウエアのＬａｓｅｒｇｅｎｅ  ｓｕｉｔｅにおけるＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、デフォルトパラメーターを用いて行われ得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載のいくつかの整列スキームを統合する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ  Ｖｏｌ．５，補遺３、３４５−３５８頁におけるＤａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．；Ｈｅｉｎ  Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ  ６２６−６４５頁  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１８３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．（１９７１）Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ  １１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．Ｎｅｓ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６−７３０。
【０７６９】
あるいは、比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ  ２：４８２の局部同定アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の同定整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化した実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または検査によって行われ得る。
【０７７０】
配列同一性および配列類似性の割合を決定するために適切なアルゴリズムの１つの好ましい例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載される。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、本発明のポリヌクレオチドについての配列同一性の割合を決定するために、例えば、本明細書中に記載のパラメータを用いて使用され得る。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎを通して公に利用可能である。１つの例示的な例において、累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（一致する残基の対についての報酬スコア（ｒｅｗａｒｄ  ｓｃｏｒｅ）；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して算出され得る。各指示におけるワードヒットの拡大は、以下の場合に停止する：累積整列スコアが、その最大到達値から量Ｘだけ低下した場合；累積スコアが、１以上の負のスコアの残基整列の累積に起因してゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。このＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、整列の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、ワード長（Ｗ）１１、および期待値（Ｅ）１０をデフォルトとして使用し、そしてＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照のこと）アラインメントは、（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。
【０７７１】
好ましくは、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０の位置の比較ウインドウにわたって２つの最適に整列した配列を比較することによって決定され、ここで比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の一部は、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、２つの配列の最適な整列について２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。このパーセンテージは、両方の配列で同一の核酸塩基が生じる位置の数を決定して一致する位置の数を得、この一致する位置の数を参照配列中の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算し、そしてこの結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。
【０７７２】
遺伝コードの縮重の結果として、本明細書中に記載されるようなポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが、当業者に理解される。これらのポリヌクレオチドのうちいくつかは、任意のネイティブな遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドンの用法における差異に起因して変化するポリヌクレオチドは、本発明によって具体的に意図される。さらに、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、１以上の変異（例えば、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換）の結果として変化する内因性遺伝子である。得られたｍＲＮＡおよびタンパク質は、変化した構造または機能を有し得るが、有さなくてもよい。対立遺伝子は、標準的な技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較）を用いて、同定され得る。
【０７７３】
従って、本発明の別の実施形態において、変異誘発アプローチ（例えば、部位特異的変異誘発）は、本明細書中に記載のポリペプチドの免疫原性改変体および／または誘導体の調製のために使用される。このアプローチによって、ポリペプチド配列における特定の改変が、これらをコードする、基礎となるポリヌクレオチドの変異誘発を介してなされ得る。これらの技術は、例えば、ポリヌクレオチド中に１つ以上のヌクレオチド配列変化を導入することによって先の考慮の１つ以上を具体化する、配列改変体を調製および試験するための直接的なアプローチを提供する。
【０７７４】
部位特異的変異誘発は、所望の変異のＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列ならびに十分な数の隣接ヌクレオチドの使用を介して変異体の生成を可能にし、相対する欠失連結部の両側に安定な二重鎖を形成するために、十分なサイズのプライマー配列および配列複雑性を提供する。変異は、ポリヌクレオチド自体の特性を改善するか、変更するか、減少させるか、改変するか、さもなくば変化させるため、そして／またはコードされたポリペプチドの特性、活性、組成、安定性または一次配列を変更するために、選択されたポリヌクレオチド配列において使用され得る。
【０７７５】
本発明の特定の実施形態において、本発明者らは、コードされたポリペプチドの１つ以上の特性（例えば、ポリペプチドワクチンの免疫原性）を変更するために、開示されたポリヌクレオチド配列の変異誘発を意図する。部位特異的変異誘発の技術は、当該分野に周知であり、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの両方の改変体を作製するために広範に使用される。例えば、部位特異的変異誘発は、しばしば、ＤＮＡ分子の特定部分を変更するために使用される。このような実施形態において、代表的に約１４ヌクレオチド長〜約２５ヌクレオチド長程度の長さを含むプライマーが使用され、配列の連結部の両側にある、約５残基〜約１０残基が変更される。
【０７７６】
当業者によって理解されるように、部位特異的変異誘発技術は、しばしば、一本鎖形態および二本鎖形態の両方で存在するファージベクターを使用してきた。部位特異的変異誘発において有用である代表的なベクターとしては、例えば、Ｍ１３ファージのようなベクターが挙げられる。これらのファージは、容易に商業的に入手可能であり、そしてそれらの使用は、一般的に当業者に周知である。二本鎖プラスミドもまた、目的の遺伝子をプラスミドからファージに転移する工程を除去する部位特異的変異誘発において慣用的に使用される。
【０７７７】
一般的に、本明細書に従う部位特異的変異誘発は、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列をその配列中に含む一本鎖ベクターを最初に入手する工程、またはこの配列を含む二本鎖ベクターの２本の鎖を融解して分ける工程によって実行される。所望の変異配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマーは、一般的に、合成的に調製される。次いで、このプライマーは、一本鎖ベクターとともにアニーリングされ、そして変異を保有する鎖の合成を完了するために、ＤＮＡ重合酵素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩ  Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）に供される。このようにヘテロ二重鎖が形成され、ここで一方の鎖が変異を有さないもともとの鎖をコードし、そして２つめの鎖は所望の変異を保有する。次いで、このヘテロ二重鎖ベクターは、適切な細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）を形質転換するために使用され、そして、変異した配列配置を保有する組換えベクターを含むクローンが選択される。
【０７７８】
部位特異的変異誘発を使用する、選択されたペプチドコードＤＮＡセグメントの配列改変体の調製は、潜在的に有用な種を産生する手段を提供し、そしてこれは、限定を意味するものではない。なぜなら、ペプチドの配列改変体およびそれらをコードするＤＮＡ配列を入手し得る他の方法が存在するからである。例えば、所望のペプチド配列をコードする組換えベクターは、変異誘発剤（例えば、ヒドロキシルアミン）で処理されて、配列改変体を入手し得る。これらの方法およびプロトコルに関する具体的な詳細は、Ｍａｌｏｙら、１９９４；Ｓｅｇａｌ、１９７６；ＰｒｏｋｏｐおよびＢａｊｐａｉ、１９９１；Ｋｕｂｙ、１９９４；およびＭａｎｉａｔｉｓら、１９８２（各々がその目的のために本明細書中に参考として援用される）の教示において見出され得る。
【０７７９】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発手順」とは、鋳型依存的プロセスおよびベクター媒介性増殖をいい、これは、その初期の濃度と比較して、特定の核酸分子の濃度の増加を生じるか、または検出可能なシグナルの濃度の増加（例えば、増幅）を生じる。本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発手順」は、プライマー分子の鋳型依存的な伸長を含むプロセスをいうことが意図される。用語、鋳型依存的プロセスとは、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子の核酸合成をいい、ここで新規に合成された核酸の鎖の配列は、相補的塩基対形成の周知の規則によって指示される（例えば、Ｗａｔｓｏｎ、１９８７を参照のこと）。代表的には、ベクター媒介性の方法論は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターへの核酸フラグメントの導入、ベクターのクローン性増幅、および増幅した核酸フラグメントの回収を包含する。これらの方法論の例は、その全体が具体的に参考として本明細書中に援用される、米国特許第４，２３７，２２４号によって提供される。
【０７８０】
本発明のポリペプチド改変体の生成のための別のアプローチにおいて、米国特許第５，８３７，４５８号に記載のような、再帰的な配列組換えが使用され得る。このアプローチにおいて、組換えおよびスクリーニングまたは選択の反復性のサイクルが実施されて、例えば、増強された免疫原性活性を有する本発明の個々のポリヌクレオチド改変体を「展開させる」。
【０７８１】
本発明の他の実施形態において、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列は、核酸ハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして、有利に使用され得る。このように、本明細書中に開示される１５ヌクレオチド長の連続配列と同じ配列か、またはこれに相補的な配列を有する、少なくとも約１５の連続ヌクレオチドの配列領域を含むか、またはその領域からなる核酸セグメントが特定の有用性を見出すことが、意図される。例えば、約２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００（全ての中間の長さを含む）およびまさに全長配列までの、より長い連続した同一配列または相補的な配列がまた、特定の実施形態において使用される。
【０７８２】
このような核酸プローブが目的の配列に特異的にハイブリダイズする能力は、所定のサンプル中の相補的配列の存在を検出する際にこれらが使用されることを可能にする。しかし、他の用途（例えば、変異種プライマーまたは他の遺伝的構築物の調製の際の使用のためのプライマーを調製するための配列情報の使用）がまた意図される。
【０７８３】
１０〜１４、１５〜２０、３０、５０、または１００〜２００ヌクレオチド程度（同様に中間の長さを含む）の連続したヌクレオチドストレッチからなる配列領域を有し、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列と同一または相補的なポリヌクレオチド分子は、例えばサザンブロッティングまたはノーザンブロッティングにおける使用のためのハイブリダイゼーションプローブとして特に意図される。これは、遺伝子産物またはそのフラグメントの、多様な細胞型およびまた種々の細菌細胞の両方における分析を可能とする。フラグメントの全サイズ、ならびに相補的ストレッチのサイズは、究極的には、特定の核酸セグメントの意図される用途または適用に依存する。より小さなフラグメントは、一般にハイブリダイゼーション実施形態における用途を見出し、ここで連続した相補領域の長さが変化され得る（例えば、約１５ヌクレオチドと約１００ヌクレオチドとの間）が、検出を望む相補配列の長さに従って、より長い連続した相補ストレッチが使用され得る。
【０７８４】
約１５〜２５ヌクレオチド長のハイブリダイゼーションプローブの使用は、安定で選択的な二重鎖分子の形成を可能にする。しかし、１５塩基長より長いストレッチの連続した相補配列を有する分子が、ハイブリッドの安定性および選択性を増加するために一般に好ましく、それによって、得られる特異的ハイブリッド分子の質および程度が改善される。１５〜２５の連続したヌクレオチド、または望まれる場合にはより長い遺伝子相補的ストレッチを有する核酸分子を設計するのが一般には好ましい。
【０７８５】
ハイブリダイゼーションプローブは、本明細書中に記載される配列のいずれかの、任意の部分から選択され得る。必要とされることの全ては、本明細書中に記載の配列、あるいはプローブまたはプライマーとしての利用を望む場合は、約１５〜２５ヌクレオチド長から全長配列まで、および全長配列を含む配列の任意の連続した部分までを再検討することである。プローブおよびプライマー配列の選択は、種々の要因によって支配され得る。例えば、全配列の末端に向かってプライマーを使用することが望まれ得る。
【０７８６】
小さなポリヌクレオチドセグメントまたはフラグメントは、通常は自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して行われるので、例えば化学的手段によってフラグメントを直接合成することによって、容易に調製され得る。また、フラグメントは、核酸複製技術（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号（本明細書中に参考として援用される）のＰＣＲＴＭ技術）の適用によって、組換え産物のために選択配列を組換えベクターに導入することによって、および一般に分子生物学の分野の当業者に公知の他の組換えＤＮＡ技術によって、得られ得る。
【０７８７】
本発明のヌクレオチド配列は、目的の完全遺伝子または遺伝子フラグメントのいずれかの相補的ストレッチと、二重鎖分子を選択的に形成するその能力のために使用され得る。想定される適用に依存して、代表的には、標的配列に対するプローブの選択性の種々の程度に達するために、ハイブリダイゼーションの種々の条件を使用することが望ましい。高い選択性を必要とする適用について、代表的には、ハイブリッドを形成するための比較的ストリンジェントな条件（例えば、比較的低濃度の塩、および／または高温の条件（例えば、約５０℃〜約７０℃の温度で、約０．０２Ｍ〜約０．１５Ｍの塩の塩濃度によって提供されるような）を使用することが望ましい。このような選択条件は、存在する場合、プローブとテンプレートまたは標的鎖との間のミスマッチにわずかに許容性であり、そして関連する配列の単離のために特に適切である。
【０７８８】
当然のことながら、いくつかの適用（例えば、潜在的なテンプレートにハイブリダイズする変異体プライマー鎖を使用する、変異体の調製が望ましい場合）について、低ストリンジェント（減少したストリンジェンシー）のハイブリダイゼーション条件は、ヘテロ二重鎖を形成するために代表的に必要とされる。これらの状況において、約２０℃〜約５５℃の温度範囲で約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍの塩の条件のような塩条件を使用することが望ましくあり得る。これによって、交差ハイブリダイズ種は、コントロールハイブリダイゼーションに関して、陽性ハイブリダイズシグナルとして容易に同定され得る。任意の場合において、ホルムアミド（これは、増加した温度と同じ様式で、ハイブリッド二重鎖を不安定化するように作用する）の増加した量の添加によって、条件がよりストリンジェントになり得ることが一般に理解される。従って、ハイブリダイゼーション条件は、容易に操作され得、従って、一般に、所望の結果に依存する最良の方法である。
【０７８９】
本発明の別の実施形態に従って、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド組成物が、提供される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質合成の効果的かつ標識化インヒビターであることが実証され、疾患が、疾患に起因するタンパク質の合成を阻害することによって処置され得ることによる治療的なアプローチを結果的に提供する。タンパク質合成を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力は、よく確立されている。例えば、ポリガラクタウロナーゼ（ｐｏｌｙｇａｌａｃｔａｕｒｏｎａｓｅ）の合成およびムスカリン２型アセチルコリンレセプターは、そのそれぞれのｍＲＮＡ配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される（米国特許第５，７３９，１１９号および米国特許第５，７５９，８２９号）。さらに、アンチセンス阻害の例が、核タンパク質サイクリン、多剤耐性遺伝子（ＭＤＧ１）、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、ＳＴＫ−１、線条体ＧＡＢＡＡレセプターおよびヒトＥＧＦを用いて示されている（Ｊａｓｋｕｌｓｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８８  Ｊｕｎ  １０；２４０（４８５８）：１５４４−６；ＶａｓａｎｔｈａｋｕｍａｒおよびＡｈｍｅｄ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９８９；１（４）：２２５−３２；Ｐｅｒｉｓら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１９９８  Ｊｕｎ  １５；５７（２）３１０−２０；米国特許第５，８０１，１５４号；同第５，７８９，５７３号；同第５，７１８，７０９号および同第５，６１０，２８８号）。種々の異常な細胞増殖（例えば、癌）を阻害しそして処置するために使用され得る、アンチセンス構築物もまた、記載されている（米国特許第５，７４７，４７０号；同第５，５９１，３１７号および同第５，７８３，６８３号）。
【０７９０】
従って、特定の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列に特異的に結合し得る任意の配列もしくはその相補体のすべてまたは一部を含む、オリゴヌクレオチド配列を提供する。１つの実施形態において、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはその誘導体を含む。別の実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはその誘導体を含む。第３の実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート改変骨格を含む、改変ＤＮＡである。第４の実施形態において、そのオリゴヌクレオチド配列は、ペプチド核酸またはその誘導体を含む。各場合において、好ましい組成物は、本明細書中に開示されるポリヌクレオチドのうちの１つ以上の部分に相補的な、より好ましくは実質的に相補的な、そしてさらにより好ましくは完全に相補的な、配列領域を含む。所定の遺伝子配列に特異的なアンチセンス組成物の選択は、選択された標的配列の分析に基き、そして二次構造、Ｔｍ、結合エネルギー、および相対的安定性の決定に基く。アンチセンス組成物は、二量体、ヘアピン、または宿主細胞において標的ｍＲＮＡへの特異的結合を減少または妨げる他の二次構造をそれらが形成できない相対的能力に基づいて選択され得る。ｍＲＮＡの非常に好ましい標的領域は、ＡＵＧ翻訳開始コドンの領域またはその付近の領域、およびｍＲＮＡの５’領域と実質的に相補的な配列である。これらの二次構造分析および標的部位選択の考慮は、例えば、ＯＬＩＧＯプライマー分析ソフトウェアのｖ．４およびＢＬＡＳＴＮ  ２．０．５アルゴリズムソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７年９月１日、２５（１７）：３３８９−４０２）を使用して実施され得た。
【０７９１】
短いペプチドベクター（ＭＰＧ（２７残基）と称する）を使用するアンチセンス送達法の使用もまた意図される。このＭＰＧペプチドは、ＨＩＶ  ｇｐ４１の融合配列由来の疎水性ドメインと、ＳＶ４０  Ｔ抗原の核局在化配列由来の親水性ドメインとを含む（Ｍｏｒｒｉｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７  Ｊｕｌ  １５；２５（１４）：２７３０−６）。このＭＰＧペプチドのいくつかの分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドをコートし、そして比較的高効率（９０％）で１時間未満で培養哺乳動物細胞へと送達され得ることが示された。さらに、ＭＰＧとの相互作用は、ヌクレアーゼに対するそのオリゴヌクレオチドの安定性および形質膜を横切る能力の両方を強力に増加させる。
【０７９２】
本発明の別の実施形態に従って、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド組成物は、腫瘍ポリヌクレオチドおよび腫瘍細胞における本発明のタンパク質の発現を阻害するためのリボンザイム分子の設計および調製に使用される。リボザイムは、部位特異的様式で核酸を切断するＲＮＡ−タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を保有する特異的触媒ドメインを有する（ＫｉｍおよびＣｅｃｈ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９８７  Ｄｅｃ；８４（２４）：８７８８−９２；ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｏｎｓ、Ｃｅｌｌ．１９８７  Ａｐｒ  ２４；４９（２）２１１−２０）。例えば、多数のリボザイムが、高い程度の特異性でホスホエステル転移反応を促進し、しばしば、オリゴヌクレオチド基質中の数個のホスホエステルのうちの１つだけを切断する（Ｃｅｃｈら、Ｃｅｌｌ．１９８１  Ｄｅｃ；２７（３  Ｐｔ  ２）：４８７−９６；ＭｉｃｈｅｌおよびＷｅｓｔｈｏｆ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９０  Ｄｅｃ  ５；２１６（３）：５８５−６１０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−ＨｕｒｅｋおよびＳｈｕｂ、Ｎａｔｕｒｅ．１９９２  Ｍａｙ  １４；３５７（６３７４）：１７３−６）。この特異性は、この基質が、化学反応の前にリボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）との特異的塩基対形成相互作用を介して結合するという要件に帰せられている。
【０７９３】
天然に存在する酵素的ＲＮＡの６つの基本的変種が、現在公知である。各々が、生理学的条件下で、トランスで、ＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解を触媒し得る（従って、他のＲＮＡ分子を切断し得る）。一般に、酵素的核酸は、まず、標的ＲＮＡへの結合によって作用する。このような結合は、標的ＲＮＡを切断するように作用する分子の酵素的部分に近接して保持される、酵素的核酸の標的結合部分を介して生じる。従って、その酵素的核酸はまず、標的ＲＮＡを認識し、次いで相補的塩基対形成を介してその標的ＲＮＡに結合し、そして一旦正確な部位に結合すると、その標的ＲＮＡを酵素的に切断するように作用する。このような標的ＲＮＡの戦略的切断は、コードされるタンパク質を直接合成する標的ＲＮＡの能力を破壊する。酵素的核酸がそのＲＮＡ標的に結合しそして切断した後、その酵素的核酸は、別の標的を探索するためにそのＲＮＡから離れ、そして繰り返し、新しい標的に結合しそして切断し得る。
【０７９４】
リボザイムの酵素特性は、多くの技術（例えば、アンチセンス技術（ここで、核酸分子は、翻訳を阻害するために核酸標的に簡単に結合する））に対して有利である。なぜなら、治療的処置に影響を与えるのに必要であるリボザイムの濃度は、アンチセンスオリゴヌクレオチの濃度よりも低いからである。この利点は、酵素学的に作用するリボザイムの能力に影響を与える。従って、単一のリボザイム分子は、標的ＲＮＡの多くの分子を切断し得る。さらに、このリボザイムは、高度に選択的なインヒビターであり、この阻害の特異性は、標的ＲＮＡに結合する塩基対形成の機構に依存するだけでなく、標的ＲＮＡの切断の機構にも依存する。切断部位付近の１個のミスマッチまたは塩基置換により、リボザイムの触媒活性が完全になくなり得る。アンチセンス分子内の同様のミスマッチでは、それらの作用は妨げられない（Ｗｏｏｌｆら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９２  Ａｕｇ  １５；８９（１６）：７３０５−９）。従って、リボザイムの作用の特異性は、同じＲＮＡ部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用の特異性よりも高い。
【０７９５】
この酵素学的核酸分子は、ハンマーヘッド（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）モチーフ、ヘアピンモチーフ、δ型肝炎ウイルスモチーフ、Ｉ群イントロンモチーフまたはＲＮａｓｅＰ  ＲＮＡモチーフ（ＲＮＡ誘導配列に関連する）あるいはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ＶＳ  ＲＮＡモチーフに形成され得る。ハンマーヘッドモチーフの例は、Ｒｏｓｓｉら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９２  Ｓｅｐ  １１；２０（１７）：４５５９−６５に記載される。ヘアピンモチーフの例は、Ｈａｍｐｅｌら（欧州特許出願公開番号ＥＰ  ０３６０２５７）、ＨａｍｐｅｌおよびＴｒｉｔｚ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８９  Ｊｕｎ  １３；２８（１２）：４９２９−３３）、Ｈａｍｐｅｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９０  Ｊａｎ  ２５；１８（２）：２９９−３０４および米国特許第５，６３１，３５９号に記載される。δ型肝炎ウイルスモチーフの例は、ＰｅｒｒｏｔｔａおよびＢｅｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９２  Ｄｅｃ  １；３１（４７）：１１８４３−５２に記載される；ＲＮａｓｅＰモチーフの例は、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａら，Ｃｅｌｌ．１９８３  Ｄｅｃ；３５（３  Ｐｔ  ２）：８４９−５７に記載される；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ＶＳ  ＲＮＡリボザイムモチーフは、Ｃｏｌｌｉｎｓ（ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ，Ｃｅｌｌ．１９９０  Ｍａｙ  １８；６１（４）：６８５−９６；ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９１  Ｏｃｔ  １；８８（１９）：８８２６−３０；ＣｏｌｌｉｎｓおよびＯｌｉｖｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９３  Ｍａｒ  ２３；３２（１１）：２７９５−９）に記載される；そしてＩ群イントロンの例は、米国特許第４，９８７，０７１号に記載される。本発明の酵素学的核酸分子において重要であることは、１以上の標的遺伝子ＲＮＡ領域に相補的である特定の基質結合部位を有すること、およびこの分子にＲＮＡ切断活性を付与する、基質結合部位内のヌクレオチド配列またはこの基質結合部位の周囲のヌクレオチド配列を有することだけである。従って、リボザイム構築物は、本明細書中に記載される特定のモチーフに限定する必要はない。
【０７９６】
リボザイムは、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９３／２３５６９および国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／０２５９５（各々は、本明細書中で参考として詳細に援用される）に記載されるように設計され得、そして記載されるようにインビトロおよびインビボにおいて試験するために合成され得る。このようなリボザイムはまた、送達するために最適化され得る。特定の例が提供されるが、当業者は、他の種において等価なＲＮＡ標的が、必要な場合に利用され得ることを理解する。
【０７９７】
リボザイムの活性は、リボザイムの結合アームの長さを変更することにより、または血清リボヌクレアーゼによる分解を防ぐ改変（例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９２／０７０６５；国際特許出願公開番号ＷＯ  ９３／１５１８７；国際特許出願公開番号ＷＯ  ９１／０３１６２；欧州特許出願公開番号９２１１０２９８．４；米国特許第５，３３４，７１１号、および国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／１３６８８（これには、酵素学的ＲＮＡ分子の糖部分に対して成され得る、種々の化学的修飾が記載される）を参照のこと）、細胞中でのリボザイムの有効性を増強する改変、ならびにＲＮＡの合成時間を短縮および化学的必要性を低下させるための幹（ｓｔｅｍ）ＩＩ塩基を除去して、リボザイムを化学的に合成することによって最適化され得る。
【０７９８】
Ｓｕｌｌｉｖａｎら（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／０２５９５）は、酵素学的ＲＮＡ分子の送達のための一般的な方法を記載する。リボザイムは、当業者に公知の種々の方法によって細胞に投与され得、これらには、リポソームへのカプセル化、イオン泳動法、あるいは、他のビヒクル（例えば、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセルおよび生体接着性ミクロスフィア）への取り込みによるもの、が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの指針のために、リボザイムは、エキソビボで細胞または組織に、上記のビヒクルを使用してか、または使用せずに直接送達され得る。あるいは、ＲＮＡ／ビヒクルの組合せは、直接的な吸入、直接的な注射、またはカテーテル、注入ポンプまたはステントの使用により、局所的に送達され得る。他の送達経路としては、血管内注射、筋内注射、皮下注射または関節注射、エアロゾル吸入、経口送達（錠形態または丸薬形態）、局所送達、全身送達、眼送達、腹腔内送達および／またはくも膜下腔内送達が挙げられるが、これらに限定されない。リボザイム送達および投与のより詳細な記載は、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／０２５９５および国際特許出願公開番号ＷＯ  ９３／２３５６９（各々は、本明細書中で参考として詳細に援用される）に提供される。
【０７９９】
高濃度のリボザイムを細胞内に蓄積する別の手段は、リボザイムコード配列をＤＮＡ発現ベクターに組み込むことである。リボザイム配列の転写は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ  Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩ）、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ）のためのプロモーターにより駆動される。ｐｏｌ  ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターからの転写物は、全ての細胞内で高レベルで発現される；所定の細胞型における所定のｐｏｌ  ＩＩプロモーターのレベルは、近くに存在する遺伝子調節配列（エンハンサー、サイレンサーなど）の性質に依存する。原核生物のＲＮＡポリメラーゼプロモーターもまた使用され得るが、但し、原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素は、適切な細胞において発現される。このようなプロモーターから発現するリボザイムは、哺乳動物細胞において機能することが示された。このような転写ユニットは、哺乳動物細胞内への導入のための種々のベクター（プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（例えば、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ベクター）、またはウイルスＲＮＡベクター（例えば、レトロウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター）が挙げられるがこれらに限定されない）に組み込まれ得る。
【０８００】
本発明の別の実施形態において、ペプチド核酸（ＰＮＡ）組成物が提供される。ＰＮＡは、ＤＮＡ模倣物であり、核酸塩基は、偽ペプチド骨格に結合される（ＧｏｏｄおよびＮｉｅｌｓｅｎ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１９９７  ７（４）４３１〜３７）。ＰＮＡは、ＲＮＡまたはＤＮＡを伝統的に使用した多くの方法において利用され得る。しばしば、ＰＮＡ配列は、対応するＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列よりも技術的により良く実施され、そしてＲＮＡにもＤＮＡにも固有でない有用性を有する。産生方法、特徴、および使用方法を含むＰＮＡの総説は、Ｃｏｒｅｙ（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９７  ６月；１５（６）：２２４〜９）によって提供される。このように、特定の実施形態において、ＡＣＥ  ｍＲＮＡ配列の１以上の部分に相補的であるＰＮＡ配列を調製し得、そしてこのようなＰＮＡ組成物は、ＡＣＥ−特異的ｍＲＮＡの翻訳を調節、変更、減少、または低下させるために使用され得、これにより、このようなＰＮＡ組成物が投与された宿主細胞におけるＡＣＥ活性のレベルを変更する。
【０８０１】
ＰＮＡは、ＤＮＡの正常なホスホジエステル骨格を置換する２−アミノエチル−グリシン連結を有する（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１  １２月  ６；２５４（５０３７）：１４９７〜５００；Ｈａｎｖｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９２  １１月  ２７；２５８（５０８７）：１４８１〜５；ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．１９９６  １月；４（１）：５〜２３）。この化学は、３つの重要な結果を有する。第１に、ＤＮＡまたはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドと比較して、ＰＮＡは、中性の分子であり；第２に、ＰＮＡは、アキラル（立体選択的な合成を開発する必要を避ける）であり；そして第３に、ＰＮＡ合成は、標準的なＢｏｃプロトコルまたはＦｍｏｃプロトコルを、固相ペプチド合成に使用する。一方、改良型Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法を含む他の方法が使用されている。
【０８０２】
ＰＮＡモノマーまたは既製のオリゴマーは、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）から市販されている。ＢｏｃプロトコルまたはＦｍｏｃプロトコルのいずれかによるＰＮＡの合成は、手動プロトコルまたは自動プロトコルを使用して簡単に実施される（Ｎｏｒｔｏｎら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．１９９５  ４月；３（４）：４３７〜４５）。このマニュアルプロトコルは、それ自体で、化学的に修飾されたＰＮＡの産生または密接に関係するＰＮＡのファミリーの同時合成を導く。
【０８０３】
ペプチドの合成に関して、特定のＰＮＡ合成の成功は、選択した配列の特性に依存する。例えば、理論上、ＰＮＡは、ヌクレオチド塩基の任意の組合せを取り込み得るが、隣接するプリンの存在は、産物中に１以上の残基の欠失を導き得る。この困難性の見込みにおいて、隣接するプリンを有するＰＮＡを産生する際に、非効率的に加えられているようである残基の連結を繰り返すべきであることを提案する。この後、ペプチド合成の間に観測されるのと類似する産物の収率および純度を提供する逆相高圧液体クロマトグラフィーによってＰＮＡを精製するべきである。
【０８０４】
所与の適用のためのＰＮＡの修飾が、固相合成の間にアミノ酸を連結することによって、または露出されたＮ末端アミンにカルボン酸基を含む化合物を付加することによって達成され得る。あるいは、ＰＮＡは、導入されたリジンまたはシステインに連結することによって合成した後に修飾され得る。ＰＮＡが修飾され得る簡便さにより、より良い溶解度または特定の機能的必要条件の最適化を容易にする。一旦合成されると、ＰＮＡおよびそれらの誘導体の同定は、質量分析法によって確認され得る。いくつかの研究が、ＰＮＡの修飾物を作製および利用した（例えば、Ｎｏｒｔｏｎら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．１９９５  ４月；３（４）：４３７〜４５；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ．１９９５  ５〜６月；１（３）１７５〜８３；Ｏｒｕｍら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．１９９５  ９月；１９（３）：４７２〜８０；Ｆｏｏｔｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９６  ８月  ２０；３５（３３）：１０６７３〜９；Ｇｒｉｆｆｉｔｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９９５  ８月  １１；２３（１５）：３００３〜８；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９５  ６月  ６；９２（１２）：５５９２〜６；Ｂｏｆｆａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９５  ３月  １４；９２（６）：１９０１〜５；Ｇａｍｂａｃｏｒｔｉ−Ｐａｓｓｅｒｉｎｉら、Ｂｌｏｏｄ、１９９６  ８月  １５；８８（４）：１４１１〜７；Ａｒｍｉｔａｇｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９７  １１月  １１；９４（２３）：１２３２０〜５；Ｓｅｅｇｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９７  ９月；２３（３）：５１２〜７）。米国特許第５，７００，９２２号は、ＰＮＡ−ＤＮＡ−ＰＮＡキメラ分子および診断におけるその分子の使用、生物におけるタンパク質の調節、ならびに治療に対して影響を受け易い状態の処置について議論する。
【０８０５】
ＰＮＡのアンチセンス結合特性を特徴づけする方法は、Ｒｏｓｅ（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ、１９９３  １２月  １５；６５（２４）：３５４５〜９）およびＪｅｎｓｅｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９７  ４月  ２２；３６（１６）：５０７２〜７）において議論される。Ｒｏｓｅは、キャピラリーゲル電気泳動を使用して、相対的な結合速度論および化学量論を測定することで、ＰＮＡのそれらの相補的オリゴヌクレオチドに対する結合を決定する。同様のタイプの測定が、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ  技術を使用してＪｅｎｓｅｎらによって成された。
【０８０６】
記載され、そして当業者に明らかであるＰＮＡの他の適用には、ＤＮＡ鎖の侵入、アンチセンス阻害、変異分析、転写のエンハンサー、核酸の精製、転写活性遺伝子の単離、転写因子結合の阻害、ゲノムの切断、バイオセンサー、インサイチュハイブリダイゼーションなどにおける使用が挙げられる。
【０８０７】
（ポリヌクレオチドの同定、特徴づけおよび発現）
本発明のポリヌクレオチド組成物は、種々の十分に確立された技術のいずれかを使用して、同定、調製および／または操作され得る（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９、および他の類似の参考文献を参照のこと）。例えば、ポリヌクレオチドは、腫瘍に関連する発現（すなわち、本明細書中で提供される代表的なアッセイを使用して決定する場合、正常な組織における発現よりも、腫瘍における少なくとも２倍高い発現）についてｃＤＮＡのマイクロアレイをスクリーニングすることによって、同定され得る。このようなスクリーニングは、例えば、製造者の指示に従って、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）のマイクロアレイ技術を使用して、（そして本質的にＳｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１０６１４〜１０６１９，１９９６およびＨｅｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：２１５０〜２１５５，１９９７に記載されるように）、行われ得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるタンパク質を発現する細胞（例えば、腫瘍細胞）から調製されるｃＤＮＡから増幅され得る。
【０８０８】
多数の鋳型依存性プロセスが、サンプル中に存在する目的の標的配列を増幅するために利用可能である。最もよく知られた増幅方法の１つは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲＴＭ）であり、これは、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号に詳細に記載され、これらの各々はその全体が本明細書中に参考として援用される。手短に言えば、ＰＣＲＴＭにおいては、標的配列の向かい合った相補鎖上の領域に対して相補的な２つのプライマー配列が調製される。過剰のデオキシヌクレオシド三リン酸を、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）とともに反応混合液に添加する。標的配列がサンプル中に存在する場合、プライマーはその標的に結合し、そしてポリメラーゼは、ヌクレオチドを付加することによって標的配列に沿ってプライマーを伸長させる。反応混合液の温度を上昇および下降させることによって、伸長したプライマーは、標的から解離して反応生成物を形成し、過剰のプライマーは標的および反応生成物に結合し、そしてこのプロセスが反復される。好ましくは、逆転写およびＰＣＲＴＭ増幅手順が、増幅されたｍＲＮＡの量を定量するために実行され得る。ポリメラーゼ連鎖反応方法論は、当該分野で周知である。
【０８０９】
多くの他の鋳型依存性プロセスのいずれか（この多くは、ＰＣＲＴＭ増幅技術のバリエーションである）は、当該分野で容易に知られており、利用可能である。例示として、いくつかのこのような方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲともいわれる）（欧州特許出願公開番号３２０，３０８号、米国特許第４，８８３，７５０号において記載される）；Ｑβレプリカーゼ（ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０に記載される）；鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）および修復鎖反応（Ｒｅｐａｉｒ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＲＣＲ）が挙げられる。なお他の増幅法は、英国特許出願番号２  ２０２  ３２８号およびＰＣＴ国際特許出願公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５において記載される。他の核酸増幅手順には、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）（ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ  ８８／１０３１５）が挙げられ、これには、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）および３ＳＲが含まれる。欧州特許出願公開番号３２９，８２２は、一本鎖ＲＮＡ（「ｓｓＲＮＡ」）、ｓｓＤＮＡ、および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）をサイクル的に合成する工程を包含する核酸増殖プロセスを記載する。ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ  ８９／０６７００は、プロモーター／プライマー配列の標的一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）へのハイブリダイゼーションに基づく核酸配列増幅スキーム、引き続くこの配列の多くのＲＮＡコピーの転写を記載する。「ＲＡＣＥ」（Ｆｒｏｈｍａｎ、１９９０）および「片側（ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ）ＰＣＲ」（Ｏｈａｒａ、１９８９）のような他の増幅方法はまた、当業者に周知である。
【０８１０】
本発明のポリヌクレオチドの増幅した部分を使用して、適切なライブラリー（例えば、腫瘍ｃＤＮＡライブラリー）から周知の技術を使用して全長遺伝子を単離し得る。このような技術において、増幅に適した１以上のポリヌクレオチドプローブまたはプライマーを使用して、ライブラリー（ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリー）をスクリーニングする。好ましくは、ライブラリーはより大きな分子を含むようにサイズが選択される。無作為に準備されたライブラリー（ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｄ  ｌｉｂｒａｒｙ）もまた、遺伝子の５’領域および上流領域の同定ために好ましくあり得る。ゲノムライブラリーは、イントロンを入手することおよび５’配列を伸長させることについて好ましい。
【０８１１】
ハイブリダイゼーション技術に関して、部分配列は、周知の技術を使用して標識（例えば、ニックトランスレーションまたは３２Ｐでの末端標識）され得る。次いで、細菌ライブラリーまたはバクテリオファージライブラリーは、一般に、標識プローブと、変性した細菌コロニー（またはファージプラークを含む菌叢）を含むフィルターとをハイブリダイズすることによってスクリーニングされる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。ハイブリダイズするコロニーまたはプラークを選択し、そして増殖させる。そしてそのＤＮＡをさらなる分析のために単離する。ｃＤＮＡクローンを、付加配列の量を決定するために、例えば、部分配列由来のプライマーおよびそのベクター由来のプライマーを使用するＰＣＲによって分析し得る。制限地図および部分配列を作成して、１以上の重複クローンを同定し得る。次いで、標準的な技術（これは、一連の欠失クローンを作製することを包含し得る）を使用して完全配列を決定し得る。次いで、得られた重複配列を１つの連続配列中に構築し得る。周知の技術を使用して、適切なフラグメントに連結することにより全長ｃＤＮＡ分子を生成し得る。
【０８１２】
あるいは、上記のような増幅技術は、部分的なｃＤＮＡ配列から全長コード配列を得るために有用であり得る。このような増幅技術の１つは、インバースＰＣＲである（Ｔｒｉｇｌｉａら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８１８６，１９８８を参照のこと）。この技術は、制限酵素を使用して、その遺伝子の既知の領域内のフラグメントを生成する。次いで、このフラグメントを分子内連結により環状化し、そして既知の領域に由来する多岐したプライマーを用いたＰＣＲのための鋳型として使用する。代替のアプローチにおいて、部分配列に隣接した配列を、リンカー配列に対するプライマーおよび既知の領域に特異的なプライマーを使用する増幅により取り出し得る。この増幅した配列を、代表的に、同じリンカープライマーおよび既知の領域に特異的な第２のプライマーを使用する２回目の増幅に供する。既知の配列から反対方向に伸長を開始する２つのプライマーを使用するこの手順についての改変は、ＷＯ  ９６／３８５９１に記載される。そのような別の技術は、「迅速なｃＤＮＡ末端の増幅」またはＲＡＣＥとして公知である。この技術は、公知配列の５’および３’である配列を同定するために、内側プライマーおよび外側プライマー（これらは、ポリＡ領域またはベクター配列にハイブリダイズする）の使用を含む。さらなる技術としては、キャプチャーＰＣＲ（Ｌａｎｇｅｒｓｔｒｏｍら，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．１：１１１−１９，１９９１）およびウォーキングＰＣＲ（Ｐａｒｋｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９：３０５５−６０，１９９１）が挙げられる。増幅を利用する他の方法もまた使用して、全長ｃＤＮＡ配列を入手し得る。
【０８１３】
特定の場合において、発現配列タグ（ＥＳＴ）データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋより入手可能のもの）に提供される配列の分析により、全長ｃＤＮＡ配列を入手することが可能である。重複ＥＳＴの検索は、一般に、周知のプログラム（例えば、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ検索）を使用して行われ得、そしてこのようなＥＳＴを使用して連続した全長配列を生成し得る。全長ＤＮＡ配列はまた、ゲノムフラグメントの分析により入手され得る。
【０８１４】
本発明の他の実施形態において、本発明のポリペプチドまたはその融合タンパク質もしくは機能的等価物をコードするポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントは、適切な宿主細胞におけるポリペプチドの発現に方向付けるように組換えＤＮＡ分子において使用され得る。遺伝コードの固有の縮重に起因して、実質的に同じか、または機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が産生され得、そしてこれらの配列を使用して所定のポリペプチドをクローン化し、そして発現させ得る。
【０８１５】
当業者によって理解されるように、いくつかの場合において、天然に存在しないコドンを所有するポリペプチドコードヌクレオチド配列を作製することが有利であり得る。例えば、特定の原核生物宿主または真核生物宿主に好まれるコドンは、タンパク質発現の速度を増加させるためか、または所望の特性（例えば、天然に存在する配列から生成される転写物の半減期よりも長い半減期）を有する組換えＲＮＡ転写物を産生するように選択され得る。
【０８１６】
さらに、本発明のポリヌクレオチド配列は、種々の理由（遺伝子産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を変更する改変が挙げられるが、それらに限定されない）のためにポリペプチドコード配列を変更するために、当該分野において一般的に公知の方法を使用して操作され得る。例えば、無作為切断によるＤＮＡシャッフリングならびに遺伝子フラグメントおよび合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再アセンブリを使用して、ヌクレオチド配列を操作し得る。さらに、部位指向性変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を使用して、新たな制限部位を挿入し得るか、グリコシル化パターンを改変し得るか、コドン優先（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を変化させ得るか、スプライス改変体を作製し得るか、または変異を導入したりなどし得る。
【０８１７】
本発明の別の実施形態において、天然の核酸配列、改変された核酸配列、または組換え核酸配列は、異種配列に連結されて融合タンパク質をコードし得る。例えば、ポリペプチド活性のインヒビターについてペプチドライブラリーをスクリーニングするために、市販の抗体により認識され得るキメラタンパク質をコードすることが有用であり得る。融合タンパク質はまた、ポリペプチドコード配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含むように操作され得、その結果そのポリペプチドは、切断されて、そして異種部分から取り出されて精製され得る。
【０８１８】
所望のポリペプチドをコードする配列が、当該分野において周知の化学的方法を使用して、全体または部分的に合成され得る（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．ら、（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２１５〜２２３、Ｈｏｒｎ，Ｔ．ら、（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２２５〜２３２を参照のこと）。あるいは、タンパク質自体は、ポリペプチドまたはその一部のアミノ酸配列を合成するための化学的方法を使用して産生され得る。例えば、ペプチド合成は、種々の固相技術を使用して実施され得（Ｒｏｂｅｒｇｅ，Ｊ．Ｙ．ら、（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：２０２〜２０４）、そして自動化合成は、例えば、ＡＢＩ  ４３１Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して達成され得る。
【０８１９】
新たに合成されたペプチドは、分取用高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）または当該分野において利用可能な他の同等技術により実質的に精製され得る。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定（例えば、エドマン分解手順）により確認され得る。さらに、ポリペプチドまたはその任意の部分のアミノ酸配列は、直接合成の間改変されて、そして／または化学的方法を使用して、他のタンパク質もしくはその任意の部分に由来する配列と組み合わせられて、改変体ポリペプチドを産生し得る。
【０８２０】
所望のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または機能的等価物は、適切な発現ベクター（すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含むベクター）内に挿入され得る。当業者に周知である方法を使用して、目的のポリペプチドをコードする配列および適切な転写制御エレメントおよび翻訳制御エレメントを含む発現ベクターを構築し得る。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。そのような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．，およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．Ｎ．Ｙ．に記載される。
【０８２１】
種々の発現ベクター／宿主系が、ポリヌクレオチド配列を含み、そして発現させるように利用され得る。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：微生物（例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌）；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；あるいは動物細胞系。
【０８２２】
発現ベクター内に存在する「制御エレメント」または「調節配列」は、転写および翻訳を実行するように宿主細胞タンパク質と相互作用する、それらのベクターの非翻訳領域（エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域）である。そのようなエレメントは、その強さおよび特異性を変更し得る。利用されるベクター系および宿主に依存して、多数の適切な転写エレメントおよび翻訳エレメント（構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む）が使用され得る。例えば、細菌系においてクローニングする場合、誘導性プロモーター（例えば、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）などのハイブリッドｌａｃＺプロモーターが使用され得る。哺乳動物細胞系において、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターが、一般的に好ましい。ポリペプチドをコードする配列の複数のコピーを含む細胞株を生成することが必要とされる場合、ＳＶ４０またはＥＢＶベースのベクターが、適切な選択マーカーと共に有利に使用され得る。
【０８２３】
細菌系において、多数の発現ベクターのいずれかが、発現されるポリペプチドに対して意図される使用に依存して選択され得る。例えば、大量に必要とされる場合（例えば、抗体の誘導のために）、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を指向するベクターが使用され得る。そのようなベクターとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：多機能性Ｅ．ｃｏｌｉクローニングベクターおよび発現ベクター（例えば、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ここでは目的のポリペプチドをコードする配列が、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔおよびそれに引続く７残基についての配列とインフレームでベクター内に連結され得、その結果、ハイブリッドタンパク質が産生される）；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ，Ｇ．およびＳ．Ｍ．Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９）など。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）もまた、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般的に、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、そしてグルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、次に遊離のグルタチオンの存在下において溶出させることによって、溶解した細胞から容易に精製され得る。そのような系において作製されたタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、または第ＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され得、その結果、クローニングされた目的のポリペプチドが、随意にＧＳＴ部分から放出され得る。
【０８２４】
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えば、α因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨ）を含む多数のベクターが使用され得る。概説については、Ａｕｓｕｂｅｌら、（前出）およびＧｒａｎｔら、（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４を参照のこと。
【０８２５】
植物発現ベクターを使用する場合において、ポリペプチドをコードする配列の発現は、多数のプロモーターのいずれかにより駆動され得る。例えば、ウイルスプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターおよび１９Ｓプロモーター）は、単独でか、またはＴＭＶに由来するωリーダー配列と組み合わせて使用され得る（Ｔａｋａｍａｔｓｕ，Ｎ．（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３０７−３１１）。あるいは、植物プロモーター（例えば、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットまたは熱ショックプロモーター）を使用し得る（Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇ．ら、（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１６７１−１６８０；Ｂｒｏｇｌｉｅ，Ｒ．ら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：８３８−８４３；およびＷｉｎｔｅｒ，Ｊら、（１９９１）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．１７：８５−１０５）。これらの構築物は、直接的ＤＮＡ形質転換または病原体媒介性トランスフェクションによって植物細胞内に導入され得る。そのような技術は、多数の一般的に入手可能な概説に記載されている（例えば、Ｈｏｂｂｓ，Ｓ．またはＭｕｒｒｙ，Ｌ．Ｅ．，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  Ｙｅａｒｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；１９１−１９６頁を参照のこと）。
【０８２６】
昆虫系はまた、目的のポリペプチドを発現させるために使用され得る。例えば、そのような１つの系において、オートグラファカリフォルニア核発汗病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ）は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｌａｒｖａｅにおいて外来遺伝子を発現させるベクターとして使用される。ポリペプチドをコードする配列は、ウイルスの非必須領域内（例えば、ポリへドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）遺伝子）にクローニングされ得て、ポリへドリンプロモーターの制御下に置かれ得る。ポリペプチドコード配列の首尾良い挿入は、ポリへドリン遺伝子を不活性化し、そしてコートタンパク質を欠損している組換えウイルスを産生する。次いで、この組換えウイルスを使用して、例えば、目的のポリペプチドが発現され得る、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｌａｒｖａｅに感染させ得る（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｅ．Ｋ．ら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：３２２４−３２２７）。
【０８２７】
哺乳動物宿主細胞において、多数のウイルスベースの発現系が一般的に利用可能である。例えば、アデノウイルスが、発現ベクターとして使用される場合において、目的のポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーターおよび３部からなるリーダー配列から構成されるアデノウイルス転写／翻訳複合体内に連結され得る。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域における挿入を使用して、感染した宿主細胞においてポリペプチドを発現し得る、生存可能ウイルスを入手し得る（Ｌｏｇａｎ，Ｊ．およびＳｈｅｎｋ，Ｔ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３６５５−３６５９）。さらに、転写エンハンサー（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー）を使用して、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させ得る。
【０８２８】
特定の開始シグナルはまた、目的のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために使用され得る。そのようなシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。ポリペプチドをコードする配列、その開始コドンおよび上流配列が適切な発現ベクター内に挿入される場合において、さらなる転写制御シグナルまたは翻訳制御シグナルは必要とされなくとも良い。しかし、コード配列のみ、またはその一部のみが挿入される場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが提供されるべきである。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために正確なリーディングフレーム内にあるべきである。外因性翻訳エレメントおよび開始コドンは、種々の起源（天然および合成の両方）に由来し得る。発現の効率は、使用される特定の細胞系に適切なエンハンサー（例えば、文献（Ｓｃｈａｒｆ，Ｄ．ら、（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５−１６２）に記載されるエンハンサー）の封入によって増大され得る。
【０８２９】
さらに、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の様式において発現されたタンパク質をプロセシングするその能力について選択され得る。ポリペプチドのそのような改変としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、リピデーション（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）およびアシル化が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングはまた、正確な挿入、折り畳みおよび／または機能を促進させるために使用され得る。異なる宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３およびＷＩ３８）（これらは、そのような翻訳後活性についての特定の細胞機構（ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）および特徴的機構（ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ）を有する）は、正確な改変および外来タンパク質のプロセシングを確実にするように選択され得る。
【０８３０】
長期間の組換えタンパク質の高収率の産生のために、安定な発現が一般的に好ましい。例えば、目的のポリヌクレオチドを安定に発現する細胞株が、ウイルス複製起点および／または内因性発現エレメントならびに同じかもしくは別個のベクター上の選択マーカー遺伝子を含み得る、発現ベクターを使用して形質転換され得る。そのベクターの導入後、細胞は、それらが選択培地に切換えられる前に、富化（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）培地において１〜２日間増殖され得る。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を与えることであり、そしてその存在は、導入された配列を首尾良く発現する細胞の増殖および回収を可能とする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適切な組織培養技術を使用して、増殖され得る。
【０８３１】
多数の選択系を使用して、形質転換細胞株を回収し得る。これらの選択系としては、それぞれ、ｔｋ−細胞またはａｐｒｔ−細胞において使用され得る、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら、（１９７７）Ｃｅｌｌ  １１：２２３−３２）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，Ｉ．ら、（１９９０）Ｃｅｌｌ  ２２：８１７−２３）遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。また、代謝拮抗剤耐性、抗生物質耐性または除草剤耐性は、選択のための基礎として使用され得る；例えば、ｄｈｆｒ（これは、メトトレキセートに対する耐性を与える（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら、（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７：３５６７−７０））；ｎｐｔ（これは、アミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を与える（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，Ｆ．ら、（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１−１４））；ならびにａｌｓまたはｐａｔ（これらは、それぞれ、クロルスルフロンおよびホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を与える（Ｍｕｒｒｙ、前出））。さらなる選択遺伝子が記載されている。例えば、ｔｒｐＢ（これは、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にする）またはｈｉｓＤ（これは、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にする）（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｃ．およびＲ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８０４７−５１）。可視マーカーの使用の人気が高くなっており、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質のＧＵＳ、ならびにルシフェラーゼおよびその基質のルシフェリンのようなマーカーが、形質転換体を同定するためのみならず、特定のベクター系に起因し得る一過性のタンパク質発現または安定なタンパク質発現の量を定量するためにもまた広範に使用されている（Ｒｈｏｄｅｓ，Ｃ．Ａ．ら、（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：１２１−１３１）。
【０８３２】
マーカー遺伝子発現の存在／非存在は、目的の遺伝子もまた存在するということを示唆しているが、その存在および発現は、確認されることを必要とし得る。例えば、ポリペプチドをコードする配列が、マーカー遺伝子配列内に挿入される場合、配列を含む組換え細胞は、マーカー遺伝子機能の非存在により同定され得る。あるいは、マーカー遺伝子は、１つのプロモーターの制御下でポリペプチドコード配列と直列に配置され得る。誘導または選択に応じてのマーカー遺伝子の発現は、通常、その直列遺伝子の発現も同様に示す。
【０８３３】
あるいは、所望のポリヌクレオチド配列を含み、かつ発現する宿主細胞は、当業者に公知の種々の手順によって同定され得る。これらの手順としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：核酸またはタンパク質の検出および／または定量のための、例えば、膜ベースの技術、溶液ベースの技術、またはチップベースの技術を含む、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションもしくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびタンパク質バイオアッセイ技術またはイムノアッセイ技術。
【０８３４】
ポリヌクレオチドにコードされた産物に特異的なポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体のいずれかを使用して、ポリヌクレオチドコード化産物の発現を検出および測定するための種々のプロトコルは、当該分野において公知である。例としては、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。所定のポリペプチド上の２つの非干渉性エピトープに対して反応性であるモノクローナル抗体を利用する２つの部位の、モノクローナルベースのイムノアッセイが、いくつかの適用のために好まれ得るが、競合的結合アッセイもまた、利用され得る。これらのアッセイおよび他のアッセイは、とりわけＨａｍｐｔｏｎ，Ｒ．ら、（１９９０；Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＡＰＳ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ  Ｐａｕｌ．Ｍｉｎｎ．）およびＭａｄｄｏｘ，Ｄ．Ｅ．ら、（１９８３；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１−１２１６）に記載される。
【０８３５】
広範な種々の標識技術および結合技術は、当業者に公知であり、そして種々の核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにおいて使用され得る。ポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識されたハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを作製するための手段としては、オリゴ標識（ｏｌｉｇｏｌａｂｅｌｉｎｇ）、ニックトランスレーション、末端標識または標識されたヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅が挙げられる。あるいは、ｍＲＮＡプローブの産生のために、配列またはその任意の部分が、ベクター内にクローニングされ得る。そのようなベクターは、当該分野において公知であり、市販されており、そして適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６）および標識されたヌクレオチドを添加することにより、ＲＮＡプローブをインビトロで合成するために使用され得る。これらの手順は、種々の市販キットを使用して実施され得る。使用され得る適切なレポーター分子または標識としては、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または色素形成剤ならびに基質、コファクター（補因子）、インヒビター、磁気粒子などが挙げられる。
【０８３６】
目的のポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、発現および細胞培養からタンパク質を回収するのに適した条件下で培養され得る。組換え細胞により産生されたタンパク質は、使用された配列および／またはベクターに依存して、細胞内に分泌または含まれ得る。当業者によって理解されるように、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜または真核細胞膜を介して、コードされたポリペプチドの分泌を指向するシグナル配列を含むように設計され得る。他の組換え構築物を使用して、目的のポリペプチドをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合させ得る。そのような精製促進ドメインとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：固定された金属上での精製を可能にする金属キレート化ペプチド（例えば、ヒスチジン−トリプトファンモジュール）、固定された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）において利用されるドメイン。精製ドメインとコードされるポリペプチドとの間に切断可能なリンカー配列（例えば、第ＸＡ因子またはエンテロキナーゼに対して特異的な配列（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．））を含めることを使用して、精製を促進させ得る。そのような発現ベクターの１つは、目的のポリペプチドおよびチオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位の前に６つのヒスチジン残基をコードする核酸を含む融合タンパク質の発現を提供する。ヒスチジン残基は、Ｐｏｒａｔｈ，Ｊ．ら、（１９９２、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３−２８１）に記載されるように、ＩＭＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）上での精製を促進する一方で、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質から所望のポリペプチドを精製するための手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターの考察は、Ｋｒｏｌｌ，Ｄ．Ｊら、（１９９３；ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｏｉｌ，１２：４４１−４５３）に提供される。
【０８３７】
組換え産生方法に加えて、本発明のポリペプチドおよびそのフラグメントは、固相技術（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  Ｊ．（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）を使用する、直接的ペプチド合成によって産生され得る。タンパク質合成は、手動技術を使用してか、または自動化によって実施され得る。自動化合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、達成され得る。あるいは、種々のフラグメントは、別々に化学的に合成されて、そして全長分子を産生するために化学的方法を使用して合わせられ得る。
【０８３８】
（抗体組成物、そのフラグメントおよび他の結合因子）
別の局面に従って、本発明はさらに、本明細書中に開示される腫瘍ポリペプチド、またはその一部、改変体もしくは誘導体への免疫学的結合を示す、結合因子（例えば、抗体およびその抗原結合フラグメント）を提供する。抗体またはその抗原結合フラグメントは、それが本発明のポリペプチドと検出可能なレベルで（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて）反応し、そして類似の条件下で無関係のポリペプチドと検出可能に反応しない場合、本発明のポリペプチドに「特異的に結合する」、「免疫学的に結合する」および／または「免疫学的に反応性である」と言われる。
【０８３９】
この文脈で使用される場合、免疫学的結合は、一般に、免疫グロブリン分子と、この免疫グロブリンが特異的な抗原との間で起こるタイプの非共有結合的な相互作用をいう。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）の観点から表現され得、ここで、より小さいＫｄは、より大きな親和性を示す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該分野で周知の方法を使用して、定量され得る。１つのこのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体の形成および解離の速度を測定する工程を必要とし、ここで、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方向の速度に等しく影響を与える幾何学的パラメータに依存する。従って、「会合速度定数（ｏｎ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）」（Ｋｏｎ）および「解離速度定数（ｏｆｆ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）」（Ｋｏｆｆ）の両方が、濃度ならびに会合および解離の実際の速度を計算することによって決定され得る。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は、親和性に関係しない全てのパラメータの排除を可能にし、そして従って、解離定数Ｋｄに等しい。一般的には、Ｄａｖｉｅｓら（１９９０）  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−４７３を参照のこと。
【０８４０】
抗体の「抗原結合部位」または「結合部分」は、抗原結合に関係する免疫グロブリン分子の一部分をいう。この抗原結合部位は、重鎖（「Ｈ」）および軽鎖（「Ｌ」）のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に分岐したストレッチが、「超可変領域」といわれ、これは、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知のより保存された隣接ストレッチの間に挿入される。従って、用語「ＦＲ」は、免疫グロブリンの超可変領域の間であり、かつそれに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列をいう。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域が、３次元空間において互いに相対的に配置されて、抗原結合表面を形成する。この抗原結合表面は、結合した抗原の３次元表面に相補的であり、そして重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」といわれる。
【０８４１】
結合因子は、本明細書中に提供される代表的なアッセイを使用して、癌（例えば、前立腺癌）を有する患者と有さない患者との間をさらに区別し得る。例えば、腫瘍タンパク質に結合する抗体または他の結合因子は、好ましくは、この疾患を有する患者の少なくとも約２０％、より好ましくは患者の少なくとも約３０％において、癌の存在を示すシグナルを生成する。あるいは、または加えて、この抗体は、癌を有さない個体の少なくとも約９０％において、この疾患の非存在を示す陰性シグナルを生成する。結合因子が、この要求を満たすか否かを決定するために、癌（標準的な臨床試験によって決定されるような）を有する患者および有さない患者からの生物学的サンプル（例えば、血液、血清、痰、尿および／または腫瘍生検）が、この結合因子に結合するポリペプチドの存在について、本明細書に記載されるようにアッセイされ得る。好ましくは、疾患を有するサンプルおよび有さないサンプルの統計的に有意な数が、アッセイされる。各結合因子は、上記の基準を満足すべきである；しかし、当業者は、結合因子が、組合せて使用されて、感度を改善し得ることを認識する。
【０８４２】
上記の要求を満足する任意の薬剤が、結合因子であり得る。例えば、結合因子は、ペプチド成分を含むか含まないリボソーム、ＲＮＡ分子またはポリペプチドであり得る。好ましい実施形態において、結合因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。抗体は、当業者に公知の種々の技術のいずれかによって、調製され得る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。一般に、抗体は、細胞培養技術（本明細書に記載されるようなモノクローナル抗体の生成を含む）によって、または組換え抗体の生成を可能にするために、適切な細菌細胞宿主または哺乳動物細胞宿主への抗体遺伝子のトランスフェクションを介して、生成され得る。１つの技術において、このポリペプチドを含む免疫原が、最初に、広範な種々の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジまたはヤギ）のいずれかに注射される。この工程において、本発明のポリペプチドは、改変を有さない免疫原として機能し得る。あるいは、特に、比較的短いポリペプチドについて、優れた免疫応答が、このポリペプチドがキャリアタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン）に結合される場合に、惹起され得る。この免疫原は、好ましくは、１回以上のブースト免疫を組み込む所定のスケジュールに従って、動物宿主に注射され、そしてこれらの動物が、定期的に採血される。このポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体は、次いで、例えば、適切な固体支持体に結合されたポリペプチドを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、このような抗血清から精製され得る。
【０８４３】
目的の抗原性ポリペプチドに特定なモノクローナル抗体が、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９，１９７６の技術およびその改良型を使用して、調製され得る。簡潔には、これらの方法は、所望の特異性（すなわち、目的のポリペプチドとの反応性）を有する抗体を生成し得る不死細胞株の調製を含む。このような細胞株は、例えば、上記のように免疫された動物から得られる脾臓細胞から生成され得る。次いで、この脾臓細胞が、例えば、骨髄腫細胞融合パートナー（好ましくは、免疫された動物と同系であるもの）との融合によって不死化される。種々の融合技術が使用され得る。例えば、脾臓細胞および骨髄腫細胞は、数分間、非イオン性界面活性剤とあわされ、次いで、ハイブリッド細胞の増殖は支持するが、骨髄腫細胞の増殖は支持しない選択培地に低密度でプレートされ得る。好ましい選択技術は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を使用する。十分な時間の後、通常、約１〜２週間の後、ハイブリッドのコロニーが観察される。単一コロニーを選択し、そしてそれらの培養上清を、このポリペプチドに対する結合活性について試験する。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい。
【０８４４】
モノクローナル抗体は、増殖ハイブリドーマコロニーの上清から単離され得る。さらに、種々の技術が、収量を増加させるために使用され得、この技術は、例えば、適切な脊椎動物宿主（例えば、マウス）の腹腔へのハイブリドーマ細胞株の注入である。次いで、モノクローナル抗体が、腹水または血液から回収され得る。夾雑物が、従来の技術（例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈澱、および抽出）によって抗体から除去され得る。本発明のポリペプチドは、例えば、アフィニティートクロマトグラフィー工程における精製プロセスにおいて使用され得る。
【０８４５】
抗体分子の免疫学的結合特性を示し得る抗原結合部位を含む多くの治療的に有効な分子が、当該分野で公知である。このタンパク質分解性酵素パパインは、優先的に、ＩｇＧ分子を切断して、いくつかのフラグメントを生じさせ、これら（「Ｆ（ａｂ）フラグメント」）のうちの２つの各々は、インタクトな抗原結合部位を含む共有結合ヘテロダイマーを含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、いくつかのフラグメント（両方の抗原結合部位を含む「Ｆ（ａｂ’）２」フラグメントを含む）を提供し得る。「Ｆｖ」フラグメントは、ＩｇＭ、および稀有な場合にはＩｇＧまたはＩｇＡ免疫グロブリン分子の優先的なタンパク質分解的切断によって生成され得る。しかし、Ｆｖフラグメントは、当該分野で公知の組換え技術を使用して、より一般的に誘導される。Ｆｖフラグメントは、非共有結合的なＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーを含み、このへテロダイマーは、ネイティブな抗体分子の抗原認識能力および抗原結合能力のほとんどを保持する抗原結合部位を含む。Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２６５９−２６６２；Ｈｏｃｈｍａｎら（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １５：２７０６−２７１０；およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９：４０９１−４０９６。
【０８４６】
単鎖Ｆｖ（「ｓＦｖ」）ポリペプチドは、共有結合されたＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーであり、このヘテロダイマーは、ペプチドをコードするリンカーによって連結されたＶＨをコードする遺伝子およびＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合物から発現される。Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（１６）：５８７９−５８８３。抗体Ｖ領域からの天然に凝集する（しかし、化学的には分離された）軽鎖ポリペプチドおよび重鎖ポリペプチドを、ｓＦｖ分子に転換するための化学構造を識別するための多くの方法が記述され、このｓＦｖは、抗原結合部位の構造に実質的に類似する３次元構造に折り畳まれる。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号および同第５，１３２，４０５号（Ｈｕｓｔｏｎら）；ならびに米国特許第４，９４６，７７８号（Ｌａｄｎｅｒら）を参照のこと。
【０８４７】
上記分子の各々は、重鎖および軽鎖ＣＤＲセットを含み、各々は、ＣＤＲＳへの支持を提供し、そして互い対してＣＤＲの空間的関係を規定する重鎖および軽鎖ＦＲセットの間に挿入される。本明細書中で使用される場合、用語「ＣＤＲセット」は、重鎖または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域をいう。重鎖または軽鎖のＮ末端から進んで、これらの領域は、各々、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」および「ＣＤＲ３」と表記される。従って、抗原結合部位は、６つのＣＤＲを含み、この６つのＣＤＲは、重鎖および軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲセットを含む。単一ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）を含むポリペプチドは、本明細書中で「分子認識ユニット」といわれる。多くの抗原−抗体複合体の結晶学的分析により、ＣＤＲのアミノ酸残基は、結合した抗原との広範な接触を形成することが立証され、ここで、最も広範な抗原接触は、重鎖ＣＤＲ３とである。従って、分子認識ユニットは、主に、抗原結合部位の特異性の原因である。
【０８４８】
本明細書中で使用される場合、用語「ＦＲセット」は、重鎖または軽鎖のＶ領域のＣＤＲセットのＣＤＲを構成する、４つの隣接アミノ酸配列をいう。いくつかのＦＲ残基は、結合抗原と接触し得る；しかし、ＦＲは、主に、Ｖ領域を抗原結合部位、特にＣＤＲＳに直接隣接するＦＲ残基に折り畳む原因となる。ＦＲにおいて、特定のアミノ酸残基および特定の構造特徴が、非常に高度に保存される。この点において、全てのＶ領域配列は、約９０アミノ酸残基の内部ジスルフィドループを含む。Ｖ領域が、結合部位に折り畳まれる場合、このＣＤＲは、抗原結合表面を形成する突出したループモチーフとして表示される。正確なＣＤＲアミノ酸配列に関わらず、特定の「正準」構造に折り畳まれるＣＤＲループの形状に影響を与えるＦＲの保存された構造領域が存在することが一般的に認識される。さらに、特定のＦＲ残基は、抗体重鎖および軽鎖の相互作用を安定化する非共有結合的なドメイン間接触に関与することが知られている。
【０８４９】
非ヒト免疫ブログリン由来の抗原結合部位を含む、多くの「ヒト化」抗体分子が記載され、この抗体分子には、げっ歯類Ｖ領域およびヒト定常ドメインに融合されたそれらの会合ＣＤＲ（Ｗｉｎｔｅｒら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９；Ｌｏｂｕｇｌｉｏら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：４２２０−４２２４；Ｓｈａｗら（１９８７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４−４５３８；およびＢｒｏｗｎら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：３５７７−３５８３）、適切なヒト抗体定常ドメインとの融合の前に、ヒト支持ＦＲに移植されたげっ歯類ＣＤＲ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６；およびＪｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５）、ならびに組換えベニアリングされた（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｙ  ｖｅｎｅｅｒｅｄ）げっ歯類ＦＲによって支持されるげっ歯類ＣＤＲ（欧州特許公開番号５１９，５９６（１９９２年１２月２３日公開）を有するキメラ抗体が挙げられる。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントにおけるこれらの部分の治療的適用の持続期間および有効性を制限するげっ歯類抗ヒト抗体分子に対する所望されない免疫学的応答を最小化するように設計される。
【０８５０】
本明細書中で使用される場合、用語「ベニアリングされたＦＲ」および「組換えベニアリングされたＦＲ」は、ネイティブのＦＲポリペプチド折り畳み構造の実質的に全てを保持する抗原結合部位を含む異種分子を提供するために、例えば、げっ歯類重鎖または軽鎖のＶ領域からのＦＲ残基のヒトＦＲ残基での選択的置換をいう。ベニアリング技術は、抗原結合部位のリガンド結合特徴が、主に抗原結合表面内の重鎖および軽鎖のＣＤＲセットの構造および相対的な配置によって決定されるという理解に基づく。Ｄａｖｉｅｓら（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−４７３。従って、抗原結合特異性は、ＣＤＲ構造、互いとのそれらの相互作用、およびＶ領域ドメインの残りとのそれらの相互作用が注意深く維持されるヒト化抗体のみにおいて保存され得る。ベニアリング技術を使用することによって、外部（例えば、溶媒がアクセス可能な）ＦＲ残基（これは、免疫系に容易に遭遇する）は、ヒト残基と選択的に置換されて、弱い免疫原性ベニアリング表面または実質的に非免疫原性のベニアリング表面のいずれかを含むハイブリッド分子を提供する。
【０８５１】
ベニアリングのプロセスは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  第４版（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ，１９８７）において、Ｋａｂａｔらによって編集されたヒト抗体可変ドメインについての利用可能な配列データを使用し、Ｋａｂａｔデータベースに更新され、そして他の米国および海外のアクセス可能なデータベース（核酸およびタンパク質の両方）を使用する。Ｖ領域アミノ酸の溶媒アクセス可能性は、ヒトおよびマウス抗体フラグメントについての既知の３次元構造から推定され得る。マウス抗原結合部位をベニアリングする際に２つの一般的な工程が存在する。最初に、目的の抗体分子の可変ドメインのＦＲが、上記の供給源から得られたヒト可変ドメインの対応するＦＲ配列と比較される。次いで、最も相同的なヒトＶ領域が、対応するマウスアミノ酸と、残基ごとに比較される。ヒト対応物とは異なるマウスＦＲにおける残基は、当該分野において周知の組換え技術を使用して、ヒト部分に存在する残基によって置換される。残基スイッチングは、少なくとも部分的に露出した（溶媒アクセス可能である）部分を用いて実施されるのみであり、そしてＶ領域ドメインの三次構造に対する有意な効果を有し得るアミノ酸残基（例えば、プロリン、グリシンおよび荷電したアミノ酸）の置換において、注意がなされる。
【０８５２】
この様式において、従って、得られた「ベニヤ化された（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）」マウス抗原結合部位は、以下を保持するように設計される：マウスＣＤＲ残基、ＣＤＲに実質的に隣接する残基、埋もれたかまたはほとんど埋もれた（溶媒アクセス不能）であるとして同定された残基、重鎖ドメインと軽鎖ドメインとの間の非共有（例えば、静電気的および疎水的）接触に関与すると考えられる残基、ならびにＣＤＲループの「寄与（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）」三次構造に影響すると考えられる、ＦＲの保存された構造的領域由来の残基。次いで、これらの設計基準を用いて、マウス抗原結合部位の重鎖および軽鎖の両方のＣＤＲをヒト様ＦＲ（マウス抗体分子の抗原特異性を示す組み換えヒト抗体の発現のために、哺乳動物細胞をトランスフェクトするために用いられ得る）に結合した組み換えヌクレオチド配列を調製する。
【０８５３】
本発明の別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、１つ以上の治療薬剤に結合され得る。この点に関して適切な薬剤としては、放射性核種、分化誘導剤、薬物、毒素、およびその誘導体が挙げられる。好ましい放射性核種としては、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、および２１２Ｂｉが挙げられる。好ましい薬物としては、メトトレキセート、ならびにピリミジンアナログおよびプリンアナログが挙げられる。好ましい分化誘導剤としては、ホルボールエステルおよび酪酸が挙げられる。好ましい毒素としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素、Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素、およびアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が挙げられる。
【０８５４】
治療剤は、直接的にかまたは間接的にか（例えば、リンカー基を介して）のいずれかで、適切なモノクローナル抗体にカップリング（例えば、共有結合によって）され得る。薬剤と抗体との間の直接的な反応は、各々が互いに反応し得る置換基を有する場合に可能である。例えば、一方の求核基（例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基）は、他方のカルボニル含有基（例えば、無水物もしくは酸ハロゲン化物）または良好な遊離基（例えば、ハロゲン化物）を含むアルキル基などと反応し得る。
【０８５５】
あるいは、リンカー基を介して治療剤と抗体とをカップリングさせることが所望され得る。リンカー基は、抗体を薬剤から隔てるためのスペーサーとして機能して、結合の可能性を妨げることを回避し得る。リンカー基はまた、薬剤または抗体上の置換基の化学的反応性を増加させるために働き得、従ってカップリング効率を増大させる。化学的反応性の増大はまた、薬剤または薬剤上の官能基の使用を容易にし得、これは他の方法では可能ではない。
【０８５６】
種々の二官能性または多官能性試薬、ホモ官能性とヘテロ官能性との両方（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬのカタログ中に記載されるもの）が、リンカー基として使用され得ることが当業者には明らかである。カップリングは、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、または酸化された炭水化物残基を介してもたらされ得る。このような方法論を記載する多数の参考文献（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌの米国特許第４，６７１，９５８号）が存在する。
【０８５７】
本発明の免疫結合体の抗体部分がないときに治療剤がより強力である場合、細胞中へのインターナリゼーションの間に、またはその際に切断可能なリンカー基を使用することが望ましくあり得る。多数の異なる切断可能なリンカー基が記載されてきた。これらのリンカー基からの薬剤の細胞内放出についての機構としては、ジスルフィド結合の還元（例えば、Ｓｐｉｔｌｅｒへの米国特許第４，４８９，７１０号）、感光性（Ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ）結合の照射（例えば、Ｓｅｎｔｅｒらへの米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解（例えば、Ｋｏｈｎらへの米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体媒介性加水分解（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらへの米国特許第４，６７１，９５８号）、および酸触媒加水分解（例えば、Ｂｌａｔｔｌｅｒらへの米国特許第４，５６９，７８９号）による切断が挙げられる。
【０８５８】
１つより多い薬剤を抗体にカップリングさせることが望ましくあり得る。１つの実施形態において、薬剤の複数の分子が１つの抗体分子にカップリングされる。別の実施形態において、１つより多い型の薬剤が１つの抗体にカップリングされ得る。特定の実施形態に関わらず、１つより多い薬剤を有する免疫結合体は、種々の方法で調製され得る。例えば、１つより多い薬剤が、抗体分子に直接的に結合され得るか、または付着のための複数の部位を提供するリンカーが使用され得る。あるいは、キャリアが使用され得る。
【０８５９】
キャリアは、種々の方法（直接的にかまたはリンカー基を介するかのいずれかでの共有結合を含む）で薬剤を保有し得る。適切なキャリアとして、アルブミンのようなタンパク質（例えば、Ｋａｔｏらへの米国特許第４，５０７，２３４号）、ペプチド、およびアミノデキストランのような多糖類（例えば、Ｓｈｉｈらへの米国特許第４，６９９，７８４号）が挙げられる。キャリアはまた、例えばリポソームベシクル内に、非共有結合によってかまたはカプセル化によって、薬剤を保有し得る（例えば、米国特許第４，４２９，００８号および同第４，８７３，０８８号）。放射性核種薬剤に特異的なキャリアは、放射性ハロゲン化低分子およびキレート化合物を含む。例えば、米国特許第４，７３５，７９２号は、代表的な放射性ハロゲン化低分子およびそれらの合成を開示する。放射性核種キレートは、金属、または金属酸化物、放射性核種を結合するためのドナー原子として窒素原子および硫黄原子を含むキレート化合物から形成され得る。例えば、Ｄａｖｉｓｏｎらへの米国特許第４，６７３，５６２号は、代表的なキレート化合物およびそれらの合成を開示する。
【０８６０】
（Ｔ細胞組成物）
本発明は、別の局面において、本明細書に開示される腫瘍ポリペプチド、またはその改変体もしくは誘導体に特異的なＴ細胞を提供する。このような細胞は、一般的に標準的手順を使用して、インビトロまたはエキソビボで調製され得る。例えば、Ｔ細胞は、市販の細胞分離システム（例えば、ＩｓｏｌｅｘＴＭシステム（Ｎｅｘｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ；米国特許第５，２４０，８５６号；米国特許第５，２１５，９２６号；ＷＯ８９／０６２８０；ＷＯ９１／１６１１６およびＷＯ９２／０７２４３もまた参照のこと）から入手可能）を使用して、患者の骨髄、末梢血あるいは骨髄または末梢血の画分中から単離され得る。あるいは、Ｔ細胞は、関連または無関連のヒト、非ヒト哺乳動物、細胞株または培養物から誘導され得る。
【０８６１】
Ｔ細胞は、ポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／またはそのようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて刺激され得る。このような刺激は、目的のポリペプチドに特異的であるＴ細胞の生成を可能にする条件下および十分な時間、行われる。好ましくは、本発明の腫瘍ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、送達ビヒクル（例えば、ミクロスフェア）中に存在して、特異的Ｔ細胞の生成を容易にする。
【０８６２】
Ｔ細胞は、このＴ細胞が、特異的に増殖するか、サイトカインを分泌するか、またはこのポリペプチドで被覆されるかもしくはこのポリペプチドをコードする遺伝子を発現する標的細胞を殺傷する場合に、本発明のポリペプチドに特異的であるとみなされる。Ｔ細胞特異性は、種々の標準的技術のいずれかを使用して評価され得る。例えば、クロム放出アッセイまたは増殖アッセイにおいて、ネガティブコントロールと比較した、溶解および／または増殖における２倍を超える増加の刺激指標が、Ｔ細胞特異性を示す。このようなアッセイは、例えば、Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１０６５−１０７０，１９９４に記載されるように、実行され得る。あるいは、Ｔ細胞の増殖の検出は、種々の公知の技術によって達成され得る。例えば、Ｔ細胞増殖は、ＤＮＡ合成増加率を測定することによって検出され得る（例えば、トリチウム化チミジンでＴ細胞の培養物をパルス標識し、そしてＤＮＡに取り込まれたトリチウム化チミジンの量を測定することによって）。３〜７日間の腫瘍ポリペプチド（１００ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは、２００ｎｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ）との接触によって、代表的には、Ｔ細胞の増殖において少なくとも２倍の増加が生じる。２〜３時間の上記のような接触によって、標準的なサイトカインアッセイを使用して測定されるように、Ｔ細胞の活性化を生じるはずである。このアッセイにおいては、サイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＦＮ−γ）放出のレベルの２倍の増加が、Ｔ細胞の活性化を示す（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｒｅｅｎｅ  １９９８）を参照のこと）。腫瘍ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現ＡＰＣに応答して活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋であり得る。腫瘍ポリペプチド特異的Ｔ細胞は、標準的な技術を使用して増殖され得る。好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、患者、関連するドナーまたは無関連のドナーに由来し、そして刺激および増殖後にその患者に投与される。
【０８６３】
治療目的で、腫瘍のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはＡＰＣに応答して増殖するＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、インビトロまたはインビボのいずれかで大量に増殖され得る。このようなＴ細胞のインビトロでの増殖は、種々の方法で達成され得る。例えば、Ｔ細胞は、Ｔ細胞増殖因子（例えば、インターロイキン−２）の添加を伴うか、または伴わずに、腫瘍ポリペプチド、またはこのようなポリペプチドの免疫原性部分に対応する短いペプチド、および／または腫瘍ポリペプチドを合成する刺激細胞に対して再曝露され得る。あるいは、腫瘍ポリペプチドの存在下で増殖する１つ以上のＴ細胞は、クローニングによって大量に増殖され得る。細胞をクローニングするための方法は、当該分野で周知であり、そしてこれらとしては、限界希釈が挙げられる。
【０８６４】
（薬学的組成物）
さらなる実施形態において、本発明は、細胞または動物に、単独で、または１つ以上の他の様式の療法との組み合わせのいずれかで投与するための、薬学的に受容可能なキャリア中の、本明細書中に開示される１つ以上のポリヌクレオチド、ポリペプチド、Ｔ細胞、ＴＣＲ、および／または抗体の組成物の処方物に関する。
【０８６５】
所望ならば、本明細書に開示されるような組成物は、同様に、他の薬剤（例えば、他のタンパク質もしくはポリペプチドまたは種々の薬学的に活性な薬剤）と組み合わせて投与され得ることがまた理解される。事実、さらなる薬剤が、標的細胞または宿主組織との接触の際に、有意に有害な作用を引き起こさなければ、また含まれ得る他の成分に実質的に制限はない。従って、これらの組成物は、特定の場合に必要とされる種々の他の薬剤とともに送達され得る。このような組成物は、宿主細胞または他の生物学的供給源から精製され得るか、あるいは本明細書中に記載されるように化学的に合成され得る。同様に、このような組成物は、置換されたか、または誘導体化されたＲＮＡまたはＤＮＡ組成物をさらに含み得る。
【０８６６】
従って、本発明の別の局面では、本明細書中に記載されるような１つ以上のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、および／またはＴ細胞組成物を、生理的に受容可能なキャリアと組み合せて含む薬学的組成物が提供される。特定の好ましい実施形態において、本発明の薬学的組成物は、予防的または治療的なワクチン適用における使用のために、本発明の免疫原性ポリヌクレオチド、および／またはポリペプチド組成物を含む。ワクチン調製物は、一般的に、例えば、Ｍ．Ｆ．ＰｏｗｅｌｌおよびＭ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ編、「Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ（ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ）」、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（ＮＹ、１９９５）に記載されている。概して、このような組成物は、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド組成物を、１つ以上の免疫刺激剤と組み合せて含む。
【０８６７】
本明細書に記載の任意の薬学的組成物は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの薬学的に受容可能な塩を含み得ることが明白である。このような塩は、例えば、有機塩基（例えば、第１級、２級、および３級のアミンならびに塩基性アミノ酸の塩）および無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、およびマグネシウムの塩）を含む、薬学的に受容可能な非毒性塩基から調製され得る。
【０８６８】
別の実施形態において、本発明の例示的な免疫原性組成物（例えば、ワクチン組成物）は、上記のようなポリペプチドのうちの１つ以上をコードするＤＮＡを、そのポリペプチドがインサイチュで生成されるように含む。上記のように、このポリヌクレオチドは、当業者に公知の任意の種々の送達系で投与され得る。実際、多数の遺伝子送達技術が当該分野で周知である（例えば、Ｒｏｌｌａｎｄ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １５：１４３〜１９８、１９９８、およびその中に引用される参考文献により記載される技術）。適切なポリヌクレオチド発現系は、当然ながら、患者における発現に必要な調節ＤＮＡ調節配列（例えば、適切なプロモーターおよび終結シグナル）を含む。あるいは、細菌送達系は、その細胞表面上にそのポリペプチドの免疫原性部分を発現するかまたはそのようなエピトープを分泌する、細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｅ  Ｇｕｅｒｒｉｎ）の投与を包含する。
【０８６９】
従って、特定の実施形態において、本明細書中に記載される免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、多数の公知のウイルスに基づく系のうちのいずれかを用いて、発現のための適切な哺乳動物宿主細胞に導入される。１つの例示的な実施形態において、レトロウイルスが、遺伝子送達系のための簡便かつ有効な基盤を提供する。本発明のポリペプチドをコードする選択されたヌクレオチド配列は、当該分野で公知の技術を用いて、ベクターに挿入され得、そしてレトロウイルス粒子にパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスが、単離され、そして被験体に送達され得る。多数の例示的なレトロウイルス系が、記載されている（例えば、米国特許第５，２１９，７４０号；ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：９８０−９９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５−１４；Ｓｃａｒｐａら（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８０：８４９−８５２；Ｂｕｒｎｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：８０３３−８０３７；ならびにＢｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ（１９９３）Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１０２−１０９）。
【０８７０】
さらに、多数の例示的なアデノウイルスに基づく系もまた、記載されている。宿主ゲノムに組込むレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは、染色体外に残り、このようにして、挿入変異誘発に関連する危険性を最小化する（Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒら（１９９４）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６−６２９；ならびにＲｉｃｈら（１９９３）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：４６１−４７６）。
【０８７１】
種々のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系もまた、ポリヌクレオチド送達に関して開発されている。ＡＡＶベクターは、当該分野で周知の技術を用いて容易に構築され得る。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号；国際公開番号ＷＯ  ９２／０１０７０およびＷＯ  ９３／０３７６９；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９０（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ（１９９４）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１６５−１６９；ならびにＺｈｏｕら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７−１８７５を参照のこと。
【０８７２】
遺伝子移入による、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを送達するのに有用なさらなるウイルスベクターとしては、ポックスウイルスのファミリー（例えば、ワクシニアウイルスおよび鳥類ポックスウイルス）から誘導されるものが挙げられる。例として、新規分子を発現するワクシニアウイルスの組換え体は、以下のように構築され得る。ポリペプチドをコードするＤＮＡを最初に、ワクシニアプロモーターおよび隣接ワクシニアＤＮＡ配列（例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする配列）に隣接するように適切なベクターに挿入する。次いで、このベクターを使用して、ワクシニアで同時に感染させる細胞にトランスフェクトする。相同組換えによって、ワクシニアプロモーターおよび目的のポリペプチドをコードする遺伝子を、ウイルスゲノムに挿入する。生じるＴＫ．ｓｕｐ．（−）組換え体を、５−ブロモデオキシウリジンの存在下でこの細胞を培養し、そして５−ブロモデオキシウリジンに耐性のウイルスプラークをピックアップすることによって、選択し得る。
【０８７３】
ワクシニアに基づく感染／トランスフェクション系は、生物の宿主細胞における、本明細書中に記載される１つ以上のポリペプチドの誘導可能な一過性発現または同時発現を提供するために、好都合に使用され得る。この特定の系において、細胞を最初に、インビトロで、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードするワクシニアウイルスの組換え体で感染させる。このポリメラーゼは、それがＴ７プロモーターを保有する鋳型のみを転写する点で、鋭敏な特異性を示す。感染後、細胞を、Ｔ７プロモーターによって駆動される目的のポリヌクレオチドでトランスフェクトさせる。ワクシニアウイルスの組換え体から細胞質中で発現されるポリメラーゼは、トランスフェクトされたＤＮＡをＲＮＡに転写し、このＲＮＡは次いで、宿主翻訳機構によってポリペプチドに翻訳される。この方法は、大量のＲＮＡおよびその翻訳産物の、高レベルで一過性の細胞質産生を提供する。例えば、Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：６７４３−６７４７；Ｆｕｅｒｓｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：８１２２−８１２６を参照のこと。
【０８７４】
あるいは、アビポックスウイルス（ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）（例えば、鶏痘ウイルスおよびカナリア痘ウイルス）もまた使用されて、目的のコード配列を送達し得る。哺乳動物病原体由来の免疫原を発現する組換えアビポックスウイルスは、非鳥類種に投与された場合に、防御免疫を与えることが公知である。アビポックスベクターの使用は、ヒトおよび他の哺乳動物種において特に望ましい。なぜなら、アビポックス属のメンバーは、感受性の鳥類種においてのみ生産的に複製し得、故に、哺乳動物細胞において感染性ではないからである。組換えアビポックスウイルスを産生するための方法は、当該分野で公知であり、そしてワクシニアウイルスの産生に関して上記に記載されるように、遺伝子組換えを使用する。例えば、ＷＯ  ９１／１２８８２；ＷＯ  ８９／０３４２９；およびＷＯ  ９２／０３５４５を参照のこと。
【０８７５】
多数のアルファウイルスベクターのいずれかもまた、本発明のポリヌクレオチド組成物の送達のために使用され得、これらとしては、米国特許第５，８４３，７２３号；同第６，０１５，６８６号；同第６，００８，０３５号および同第６，０１５，６９４号に記載されるベクターが挙げられる。ベネズエラウマ脳脊髄炎（ＶＥＥ）に基づく特定のベクターもまた、使用され得、この例示的な例は、米国特許第５，５０５，９４７号および同第５，６４３，５７６号に見出され得る。
【０８７６】
さらに、分子結合体化ベクター（例えば、Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：６８６６〜６８６９およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：６０９９〜６１０３に記載のアデノウイルスキメラベクター）はまた、本発明における遺伝子送達に用いられ得る。
【０８７７】
これらおよび他の公知のウイルスベースの送達系に対するさらなる例示的情報は、例えば、以下に見出され得る：Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：３１７〜３２１、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６〜１０３、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ８：１７〜２１、１９９０；米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号および同第５，０１７，４８７号；ＷＯ８９／０１９７３；米国特許第４，７７７，１２７号；ＧＢ  ２，２００，６５１：ＥＰ  ０，３４５，２４２号；ＷＯ  ９１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６〜６２７、１９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１〜４３４、１９９１；Ｋｏｌｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２１５〜２１９、１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１４９８〜１１５０２、１９９３；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８８：２８３８〜２８４８、１９９３；ならびにＧｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３：１２０２〜１２０７、１９９３。
【０８７８】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドを標的細胞のゲノムに組み込み得る。この組み込みは、相同組み換え（遺伝子置換）を介して特定の位置および方向であり得るか、または無作為な非特異的位置に組み込まれ得る（遺伝子増大）。なおさらなる実施形態において、ポリヌクレオチドはＤＮＡの別のエピソームセグメントとして細胞において安定に維持され得る。このようなポリヌクレオチドセグメントすなわち「エピソーム」は、宿主細胞の周期に独立してまたは同調して維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする。発現構築物が細胞に送達され、そしてこの細胞中にこのポリヌクレオチドが残る様式は、使用される発現構築物のタイプに依存する。
【０８７９】
本発明の別の実施形態において、例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５〜１７４９、１９９３に記載され、そしてＣｏｈｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１６９１〜１６９２、１９９３によって概説されるように、ポリヌクレオチドは、「裸の」ＤＮＡとして投与／送達される。裸のＤＮＡの取り込みは、生分解性ビーズ（これは、細胞に効率的に輸送される）上にそのＤＮＡをコーティングすることによって増加され得る。
【０８８０】
なお別の実施形態において、本発明の組成物は、微粒子銃アプローチ（その多くが記載されている）を介して送達され得る。１つの代表的な例において、ガス駆動粒子加速（ｇａｓ−ｄｒｉｖｅｎ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）は、Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ＰＬＣ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）およびＰｏｗｄｅｒｊｅｃｔ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって製造されたデバイスのようなデバイスで達成され得る。そのいくつかの例は、米国特許第５，８４６，７９６号；同第６，０１０，４７８号；同第５，８６５，７９６号；同第５，５８４，８０７号；およびＥＰ特許番号第０５００  ７９９号に記載されている。このアプローチは、注射針のない（無注射針）（ニードルフリー）送達アプローチを提供する。ここでは、顕微鏡的な粒子（例えば、ポリヌクレオチド粒子、またはポリペプチド粒子）の乾燥粉末処方物を、手持ちデバイスによって生成されたヘリウムガスジェット内で高速に加速し、目的の標的組織内へ粒子を噴射する。
【０８８１】
関連の実施形態において、本発明の組成物のガス駆動注射針なし注入に有用であり得る他のデバイスおよび方法は、Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）によって提供されるものが挙げられ、そのいくつかの例は、米国特許第４，７９０，８２４号；同第５，０６４，４１３号；同第５，３１２，３３５号；同第５，３８３，８５１号；同第５，３９９，１６３号；同第５，５２０，６３９号；および同第５，９９３，４１２号に記載されている。
【０８８２】
別の実施形態に従って、本明細書に記載される薬学的組成物は、本発明の免疫原性ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、Ｔ細胞、ＴＣＲおよび／またはＡＰＣ組成物に加えて、１つ以上の免疫賦活剤（免疫刺激因子）を含む。免疫賦活薬とは、本質的に、外因性抗原に対する免疫応答（抗原および／または細胞媒介）を増大または増強する任意の物質をいう。免疫賦活薬の１つの好ましい型は、アジュバントを含む。多くのアジュバントは、迅速な異化作用から抗原を保護するように設計された物質（例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油）および免疫応答の刺激物質（例えば、脂質Ａ、Ｂｏｒｔａｄｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ誘導化タンパク質）を含む。特定のアジュバント、例えば、フロイント不完全アジュバントおよびフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）；Ｍｅｒｃｋ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ６５（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ）；ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）；アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウム）；カルシウム，鉄または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アセチル化糖；カチオンの誘導化多糖またはアニオンの誘導化多糖；ポリフォスファーゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ）；生分解性ミクロスフェア：モノホスホリル脂質Ａおよびモノホスホリルクイル（ｑｕｉｌ）Ａが、市販されている。サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン−２、インターロイキン−７、インターロイキン−１２および成長因子のような他のもの）はまた、アジュバントとして使用され得る。
【０８８３】
本発明の特定の実施形態において、アジュバント組成物は、Ｔｈ１型の免疫応答を優勢に誘導するものが好ましい。高レベルのＴｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は、投与される抗原に対する細胞媒介性免疫応答の誘導を支持する傾向がある。対照的に、高レベルのＴｈ２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）は、体液性免疫応答の誘導を支持する傾向がある。本明細書中に提供されるようなワクチンの適用の後、患者は、Ｔｈ１型応答およびＴｈ２型応答を含む免疫応答を支持する。応答が優勢にＴｈ１型である好ましい実施形態において、Ｔｈ１型サイトカインのレベルは、Ｔｈ２型サイトカインのレベルより高い程度まで増加する。これらのサイトカインのレベルは、標準的アッセイを使用して容易に評価され得る。サイトカインのファミリーの概説については、ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１４５〜１７３、１９８９を参照のこと。
【０８８４】
Ｔｈ１型優勢の応答を誘発するための特定の好ましいアジュバンドは、例えば、モノホスホリルリピドＡ、好ましくは３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡとアルミニウム塩との組み合わせを含む。ＭＰＬ（登録商標）アジュバンドは、Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ；例えば、米国特許第４，４３６，７２７号；同第４，８７７，６１１号；同第４，８６６，０３４号および同第４，９１２，０９４号を参照のこと）から入手可能である。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ここで、ＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されていない）はまた、Ｔｈ１優勢の応答を誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、そして例えばＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８ならびに米国特許第６，００８，２００号および同第５，８５６，４６２号に記載される。免疫賦活薬ＤＮＡ配列がまた、例えば、Ｓａｔｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：３５２，１９９６によって記載される。別の好ましいアジュバンドは、サポニン（例えば、Ｑｕｉｌ  Ａ）、またはその誘導体（ＱＳ２１およびＱＳ７（Ａｑｕｉｌａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）を含む）；Ｅｓｃｉｎ；Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ；またはＧｙｐｓｏｐｈｉｌａまたはＣｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ｑｕｉｎｏａサポニンを含む。他の好ましい処方物としては、本発明のアジュバントの組み合わせ、例えば、以下のＱＳ２１、ＱＳ７、Ｑｕｉｌ  Ａ、β−エスシン、またはジギトニンを含む群のうち少なくとも２つの組み合わせ、において１つより多いサポニンを含む。
【０８８５】
あるいは、このサポニン処方物は、キトサン、または他のポリカチオン性ポリマーからなるワクチンビヒクル、ポリラクチドおよびポリラクチド−コ−グリコチド粒子、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンベースのポリマーマトリックス、ポリサッカライドまたは化学的に改変されたポリサッカライドからなる粒子、リポソームおよび脂質ベースの粒子、グリセロールモノエステルからなる粒子、などと組み合わせられ得る。サポニンはまた、コレステロールの存在下で処方されて、リポソームまたはＩＳＣＯＭのような粒子構造を形成し得る。さらに、サポニンは、非粒子的溶液もしくは懸濁液で、または小数層リポソームもしくはＩＳＣＯＭのような粒子状構造で、ポリオキシエチレンエーテルまたはエステルと一緒に処方され得る。サポニンはまた、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）のような賦形剤と一緒に処方されて、粘度を増大され得るか、またはラクトースのような粉末賦形剤とともに乾燥粉末形態に処方され得る。
【０８８６】
１つの好ましい実施形態において、アジュバント系は、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体との組み合わせ（例えば、ＷＯ９４／００１５３に記載されるような、ＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）アジュバントとの組み合わせ、またはＷＯ９６／３３７３９に記載されるような、ＱＳ２１がコレステロールでクエンチ（ｑｕｅｎｃｈ）される、あまり反応発生的（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）でない組成物）を含む。他の好ましい処方物は、水中油型エマルジョンおよびトコフェロールを含む。水中油型エマルジョン中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）アジュバントおよびトコフェロールを含む、別の特に好ましいアジュバンド処方物は、ＷＯ９５／１７２１０に記載されている。
【０８８７】
別の強化されたアジュバント系は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドとサポニン誘導体の組み合わせを含み、特にＣｐＧとＱＳ２１の組み合わせがＷＯ００／０９１５９に開示されている。好ましくは、この処方物は、さらに、水中油型エマルジョンおよびトコフェノールを含む。
【０８８８】
本発明の薬学的組成物における使用のためのさらなる代表的アジュバンドとしては、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）、ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）、アジュバンドのＳＢＡＳシリーズ（例えば、ＳＢＡＳ−２またはＳＢＡＳ−４（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから入手可能）、Ｄｅｔｏｘ（Ｅｎｈａｎｚｙｎ（登録商標））（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）、ＲＣ−５２９（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）および他のアミノアルキルグルコサミニド４−ホスフェート（ＡＧＰ）（例えば、係続中の米国出願登録番号０８／８５３，８２６および０９／０７４，７２０（これらの開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されるアジュバント）、ならびにＷＯ  ９９／５２５４９Ａ１に記載のポリオキシエチレンエーテルアジュバントのようなアジュバントが挙げられる。
【０８８９】
他の好ましいアジュバントは、一般式（Ｉ）：ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒのアジュバント分子を含み、ここで、ｎは、１〜５０であり、Ａは、結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｒは、Ｃ１〜５０アルキルまたはフェニルＣ１〜５０アルキルである。
【０８９０】
本発明の１つの実施形態は、一般式（Ｉ）のポリオキシエチレンエーテルを含むワクチン処方物からなり、ここで、ｎは、１と５０との間、好ましくは４〜２４、最も好もしくは９であり、このＲ成分は、Ｃ１〜５０、好ましくはＣ４〜Ｃ２０アルキル、そして最も好ましくはＣ１２アルキルであり、そしてＡは、結合である。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は、０．１〜２０％の範囲、好ましくは０．１〜１０％、そして最も好ましくは０．１〜１％の範囲にあるべきである。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウロイルエーテル、ポリオキシエチレン−９−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン−８−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウロイルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウロイルエーテルおよびポリオキシエチレン−２３−ラウロイルエーテル。ポリオキシエチレンラウロイルエーテルのようなポリオキシエチレンエーテルは、Ｍｅｒｃｋインデックス（第１２版、７７１７項目）に記載される。これらのアジュバント分子は、ＷＯ９９／５２５４９に記載される。上記の一般式（Ｉ）に従うポリオキシエチレンエーテルは、所望の場合、別のアジュバントと組み合わせられ得る。例えば、好ましいアジュバントの組み合わせは、好ましくは、係属中の英国特許出願第ＧＢ９８２０９５６．２号に記載されるようなＣｐＧとの組み合わせである。
【０８９１】
本発明の別の実施形態に従って、本明細書に記載される免疫原性組成物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、単球、および有効なＡＰＣであるように操作され得る他の細胞）を介して宿主に送達される。このような細胞は、抗原を提示する能力を増大するように、Ｔ細胞応答の活性化および／または維持を改良するように、それ自体で抗腫瘍効果を有するように、そして／あるいは受け手と免疫学的に適合性（すなわち、一致するＨＬＡハプロタイプ）であるように遺伝学的に改変されてもよいが、改変される必要はない。ＡＰＣは、一般に、種々の生物学的な流体および器官（腫瘍および腫瘍周辺組織を含む）のいずれかから単離されてもよいし、そして自己細胞、同種異系細胞、同系細胞、または異種細胞であってもよい。
【０８９２】
本発明の特定の好ましい実施形態は、抗原提示細胞として、樹状細胞またはその前駆細胞を使用する。樹状細胞は、高度に強力なＡＰＣであり（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２４５−２５１、１９９８）、そして予防的または治療的な抗腫瘍免疫性を誘発するための生理学的アジュバンドとして有効であることが示されてきた（ＴｉｍｍｅｒｍａｎおよびＬｅｖｙ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５０：５０７−５２９、１９９９を参照のこと）。一般に、樹状細胞は、それらの代表的な形状（インサイチュでは星状、インビトロでは目に見える顕著な細胞質プロセス（樹枝状結晶）を有する）、高い効率で抗原を取り込み、プロセシングし、そして提示するそれらの能力、およびナイーブな（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞応答を活性化するそれらの能力に基づいて同定され得る。もちろん樹状細胞は、インビボまたはエキソビボで樹状細胞上に通常見出されない特定の細胞表面レセプターまたはリガンドを発現するように操作され得、このような改変樹状細胞は本発明によって意図される。樹状細胞の代替として、分泌小胞抗原装荷樹状細胞（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｏａｄｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）（エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）と呼ばれる）がワクチン内で使用され得る（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４：５９４−６００，１９９８を参照のこと）。
【０８９３】
樹状細胞および前駆細胞は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周辺組織浸潤細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血、または他の適切な組織もしくは流体から得られ得る。例えば、樹状細胞は、末梢血から収集された単球の培養物に、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３および／またはＴＮＦαのようなサイトカインの組み合わせを添加することによってエキソビボで分化され得る。あるいは、末梢血、臍帯血または骨髄から収集されたＣＤ３４陽性細胞は、培養培地にＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガンドおよび／または樹状細胞の分化、成熟、および増殖を誘導する他の成分を添加することによって、樹状細胞に分化され得る。
【０８９４】
樹状細胞は、「未熟」細胞および「成熟」細胞として都合良く分類され、このことは、２つの充分に特徴付けられた表現型の間を区別する単純な方法を与える。しかしこの学名は、あらゆる可能な分化の中間段階を排除するように解釈されるべきではない。未熟な樹状細胞は、抗原の取り込みおよび処理の高い能力を有するＡＰＣとして特徴付けられ、この能力は、Ｆｃγレセプターおよびマンノースレセプターの高度な発現と相関する。成熟表現型は、代表的に、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ、接着分子（例えば、ＣＤ５４およびＣＤ１１）ならびに同時刺激性分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６および４−１ＢＢ）のようなＴ細胞活性化の原因である細胞表面分子の高度な発現ではなく、これらのマーカーのより低い発現によって特徴付けられる。
【０８９５】
ＡＰＣは、一般に、本発明のポリヌクレオチド（またはその部分もしくは他の改変体）を用いてトランスフェクトされ得、その結果、コードされたポリペプチドまたはその免疫原性部分が、細胞表面上に発現される。このようなトランスフェクションはエキソビボで生じ得、次いでこのようなトランスフェクトされた細胞を含む薬学的組成物は、本明細書中に記載されるように、治療目的のために使用され得る。あるいは、樹状細胞または他の抗原提示細胞を標的とする遺伝子送達ビヒクルが、患者に投与され得、インビボで起こるトランスフェクションを生じる。樹状細胞のインビボおよびエキソビボでのトランスフェクションは、例えば、ＷＯ９７／２７４４４７に記載される方法、またはＭａｈｖｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７５：４５６−４６０、１９９７によって記載される遺伝子銃アプローチのような当該分野で公知の任意の方法を使用して一般に実施され得る。樹状細胞の抗原装荷は、樹状細胞または前駆細胞を、腫瘍ポリペプチド、ＤＮＡ（裸のもしくはプラスミドベクター中の）またはＲＮＡ；あるいは抗原発現性組換え細菌またはウイルス（例えば、牛痘、鶏痘、アデノウイルスまたはレンチウイルスのベクター）とインキュベートすることによって達成され得る。装荷の前に、ポリペプチドは、Ｔ細胞補助（例えば、キャリア分子）を提供する免疫学的パートナーに共有結合され得る。あるいは、樹状細胞は、単独でかまたはポリペプチドの存在下で、結合していない免疫学的パートナーと同調（ｐｕｌｓｅ）され得る。
【０８９６】
当業者に公知の任意の適切なキャリアが本発明の薬学的組成物において用いられ得るが、キャリアのタイプは、代表的に、投与の様式に基づいて変わる。本発明の組成物は、任意の適切な投与様式（例えば、局所投与、経口投与、鼻腔投与、経粘膜投与、静脈内投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、皮下投与および筋肉内投与を含む）のために処方され得る。
【０８９７】
このような薬学的処方物における使用のためのキャリアは、生体適合性であり、そしてまた生分解性であり得る。特定の実施形態において、好ましくは、この処方物は比較的一定レベルの活性成分の放出を提供する。しかし、他の実施形態において、投与直後のより迅速な放出速度が所望され得る。このような組成物の処方は十分に、公知の技術を使用する当業者のレベル内である。この点に関して有用な例示的なキャリアとしては、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グルコリド）、ポリアクリレート、ラテックス、デンプン、セルロース、デキストランなどのマイクロマプセルが挙げられる。他の例示的な徐放性キャリアとしては、非液性（ｎｏｎ−ｌｉｑｕｉｄ）親水性コア（例えば、架橋ポリサッカリドまたはオリゴサッカリド）を含む超分子バイオベクター、ならびに必要に応じて、両親媒性化合物を含む外部層（例えば、リン脂質）（例えば、米国特許第５，１５１，２５４号およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／２００７８、ＷＯ／９４／２３７０１およびＷＯ９６／０６６３８を参照のこと）を含む超分子バイオベクターが挙げられる。徐放性処方物内に含まれる活性化合物の量は、移植の部位、放出の速度および予期される持続期間、ならびに処置または予防されるべき状態の性質に依存する。
【０８９８】
別の例示的な実施形態において、生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ポリグリコレート）は、本発明の組成物のためのキャリアとして使用される。適切な生分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号；同第５，０７５，１０９号；同第５，９２８，６４７号；同第５，８１１，１２８号；同第５，８２０，８８３号；同第５，８５３，７６３号；同第５，８１４，３４４号；同第５，４０７，６０９号および同第５，９４２，２５２号に開示される。改変Ｂ型肝炎コアタンパク質キャリア系（例えば、ＷＯ／９９  ４０９３４およびそこで引用される参考文献に記載されるような系）もまた、多くの用途に有用である。別の例示的なキャリア送達システムは、キャリア含有粒子−タンパク質複合体（例えば、米国特許第５，９２８，６４７号に記載される複合体）を使用し、これは、宿主においてクラスＩ拘束細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導し得る。
【０８９９】
本発明の薬学的組成物はしばしば、１つ以上の、緩衝剤（例えば、中性の緩衝化生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水）；糖質（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）；マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸（例えば、グリシン）；抗酸化剤；静菌剤；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；処方物をレシピエントの血液に対して等張性、低張性または弱く高張性にする溶質；懸濁剤；濃化剤および／または保存剤を含み得る。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥物として処方され得る。
【０９００】
本明細書中に記載される薬学的組成物は、単回用量容器または多用量容器（例えば、密閉アンプルまたはバイアル）中に存在し得る。このような容器は、代表的に、使用まで処方物の無菌性および安定性を維持するために、密封される。一般に、処方物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中の、懸濁液、溶液またはエマルジョンとして保存され得る。あるいは、薬学的組成物は、使用の直前に無菌水性キャリアの添加のみを必要とする、凍結乾燥状態で保存され得る。
【０９０１】
様々な処置レジメンにおいて本明細書中で記載される特定の組成物を使用するための適切な投薬レジメンおよび処置レジメン（例えば、経口、非経口、静脈内、鼻腔内、および筋肉内の投与および処方物を含む）の開発は、当該分野で周知であり、これらのいくつかは、一般的な例示目的のために以下で簡単に考察される。
【０９０２】
特定の用途において、本明細書中で開示される薬学的組成物は、経口投与によって動物に送達され得る。このように、これらの組成物は、不活性希釈剤と共にかまたは同化可能食用キャリアと共に処方され得るか、あるいはこれらの組成物は、硬質または軟質殻ゼラチンカプセルに入れられ得るか、あるいはこれらの組成物は錠剤に圧縮され得るか、あるいはこれらの組成物は食餌の食品に直接組み込まれ得る。
【０９０３】
活性化合物は、さらに賦形剤に組み込まれ得、そして経口摂取錠剤、経頬粘膜錠剤、トローチ、カプセル剤、エリキシル、懸濁液、シロップ、カシェ剤などの形態で使用される（例えば、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９７  Ｍａｒ  ２７；３８６（６６２３）：４１０−４；Ｈｗａｎｇら、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ  １９９８；１５（３）：２４３−８４；米国特許第５，６４１，５１５号；米国特許第５，５８０，５７９号および米国特許第５，７９２，４５１号を参照のこと）。錠剤、トローチ、丸剤、カプセル剤などはまた、任意の種々のさらなる成分を含み得、例えば、結合剤（例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、リン酸二カルシウム）；崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ポテトデンプン、アルギン酸など）；潤沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）；および甘味料（例えば、スクロース、ラクトースまたはサッカリン）または香料（例えば、ペパーミント、ウインターグリーン油、またはチェリー香料）が添加され得る。投薬量単位形態がカプセル剤である場合、これは上記のタイプの材料に加えて液体キャリアを含み得る。様々な他の材料が、コーティングとして存在し得るか、またはそうでなければ物理的形態の投薬単位を改変し得る。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤は、セラック、糖またはその両方でコーティングされ得る。もちろん、任意の投薬単位形態を調製する際に使用される任意の材料は、薬学的に純粋でありかつ用いられる量で実質的に非毒性でなければならない。さらに、活性化合物が、持続性放出調製物および処方物に組み込まれ得る。
【０９０４】
代表的に、これらの処方物は、少なくとも約０．１％またはそれよりも多い活性化合物を含み得るが、活性成分の割合は、もちろん、変化し得、そして好都合に、全処方物の重量または体積の約１または２％と、約６０％または７０％以上のとの間であり得る。当然、薬学的に有用な組成物の各々の中の活性化合物の量は、適切な投薬量が、化合物の任意の所定の単位用量において得られるような様式で、調製され得る。溶解度、バイオアベイラビリティー、生物学的半減期、投与の経路、製品の有効期限のような因子、および他の薬理学的考慮が、このような薬学的処方物を調製する分野の当業者によって意図され、そして、種々の投薬量および処置レジメンはそれ自体が、所望され得る。
【０９０５】
経口投与について、本発明の処方物は、うがい薬、歯みがき剤、バッカル錠、経口スプレー、または舌下経口投与処方物の形態で、１つ以上の賦形剤と混合され得る。あるいは、活性成分は、経口溶液（例えば、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび炭酸水素カリウムを含む溶液）に組み込まれ得るか、または歯みがき剤に分散され得るか、または治療的有効量で、水、結合剤、研磨剤、香料、発泡剤、および湿潤剤を含み得る組成物に添加され得る。あるいは、これらの組成物は、舌下に置かれ得るか、そうでなければ口の中で溶解され得る錠剤形態または溶液形態に成形され得る。
【０９０６】
特定の状況において、本明細書中で開示される薬学的組成物を、非経口送達、静脈内送達、筋肉内送達またはさらに腹腔内送達することが所望される。このようなアプローチは、当業者に周知であり、これらのいくつかは例えば、例えば、米国特許第５，５４３，１５８号；米国特許第５，６４１，５１５号および米国特許第５，３９９，３６３号にさらに記載される。特定の実施形態において、遊離塩基または薬学的に受容可能な塩としての活性化合物の溶液は、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合された水中で調製され得る。分散物もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、ならびにオイル中で調製され得る。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は一般に、微生物の増殖を防止するために、防腐剤を含む。
【０９０７】
注入用途のために適切な例示的な薬学的形態として、滅菌水性液剤または分散物および滅菌注射用液剤または分散物の即時調製のための滅菌散剤が挙げられる（例えば、米国特許第５，４６６，４６８号を参照のこと）。全ての場合において、その形態は、滅菌でなけらばならず、そして容易に注射することができる程度に、流動性でなければならない。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保存されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および／もしくは植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散物の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、そして／または界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン（ｐａｒａｂｅｎ）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によって促進され得る。多くの場合において、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含めることが、望ましい。注射可能な組成物の長期にわたる吸収は、組成物中での吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の使用によって、もたらされ得る。
【０９０８】
一実施形態において、水溶液の非経口投与のために、必要ならばその溶液は、適切に緩衝化されるべきであり、そして液体希釈剤が、最初に、十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされる。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、および腹腔内投与に適切である。これに関連して、使用され得る滅菌水性媒体は、本開示の観点から当業者に公知である。例えば、一投与量は、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解され得、そして１０００ｍｌの皮下注入流体に添加され得るか、または注入予定部位で注入され得るかのいずれかである（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照のこと）。投薬量におけるいくらかの変化が、処置される被験体の状態に依存して、さらに、ヒト投与について、調製物は、もちろん、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｓｔａｎｄａｒｄｓによって要求されるような、無菌性、発熱性、ならびに一般的な安全性標準および純度標準を満たす。
【０９０９】
本発明の別の実施形態において、本明細書中で開示される組成物は、中性形態または塩形態で処方され得る。例示的な薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）が挙げられ、そしてこれらの塩は、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸とともに形成される。遊離カルボキシル基とともに形成される塩もまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄）、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導され得る。処方の際に、溶液は、投薬処方物と適合する様式でかつ治療的に有効な量で投与される。
【０９１０】
キャリアは、任意および全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収を遅延させる薬剤、緩衝液、キャリア溶液、懸濁液、コロイドなどをさらに含み得る。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性成分と不適合である場合を除いては、治療組成物におけるその使用が、企図される。補助的活性成分もまた、これらの組成物に組み込まれ得る。句「薬学的に受容可能な」とは、ヒトに投与される場合に、アレルギー反応または類似の厄介な反応を生成しない分子実体および組成物をいう。
【０９１１】
特定の実施形態において、薬学的組成物は、鼻腔内スプレー、吸入、および／または他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達され得る。遺伝子、核酸およびペプチド組成物は、経鼻エアロゾルスプレーを介して肺に直接送達するための方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号および米国特許第５，８０４，２１２号に記載されている。同様に、鼻腔内微粒子樹脂（Ｔａｋｅｎａｇａら、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １９９８  Ｍａｒ  ２；５２（１−２）：８１−７）およびリゾホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号）を使用する薬物の送達はまた、薬学分野で周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態での経粘膜薬物送達は、米国特許第５，７８０，０４５号に記載される。
【０９１２】
特定の実施形態において、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、脂質粒子、小胞などを、適切な宿主細胞／生物への本発明の組成物の導入のために使用される。特に、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、またはナノ粒子などのいずれかにカプセル化して送達するために処方され得る。あるいは、本発明の組成物は、このようなキャリアビヒクルの表面に、共有結合的または非共有結合的のいずれかで結合され得る。
【０９１３】
潜在的な薬物キャリアとしてのリポソームおよびリポソーム様調製物の形成および使用は一般に、当業者に公知である（例えば、Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９８  Ｊｕｌ；１６（７）：３０７−２１；Ｔａｋａｋｕｒａ，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ  １９９８  Ｍａｒ；５６（３）：６９１−５；Ｃｈａｎｄｒａｎら、Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ．１９９７  Ａｕｇ；３５（８）：８０１−９；Ｍａｒｇａｌｉｔ，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１９９５；１２（２−３）：２３３−６１；米国特許第５，５６７，４３４号；米国特許第５，５５２，１５７号；米国特許第５，５６５，２１３号；米国特許第５，７３８，８６８号および米国特許第５，７９５，５８７号（これらの各々は、その全体が本明細書中で参考として詳細に援用される）を参照のこと）。
【０９１４】
リポソームは、Ｔ細胞懸濁液、初代肝細胞培養物およびＰＣ１２細胞を含む他の手順によるトランスフェクションが通常困難である多くの細胞型とともに、首尾よく使用されている（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９０  Ｓｅｐ  ２５；２６５（２７）：１６３３７−４２；Ｍｕｌｌｅｒら、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９０  Ａｐｒ；９（３）：２２１−９）。さらに、リポソームは、ウイルスベースの送達系に典型的なＤＮＡ長の制限がない。リポソームは、遺伝子、種々の薬物、放射線治療剤、酵素、ウイルス、転写因子およびアロステリックエフェクターなどを、種々の培養細胞株および動物に導入するために効果的に使用されている。さらに、リポソームの使用は、全身送達後の、自己免疫応答にも受容不可能な毒性にも関連しないようである。
【０９１５】
特定の実施形態において、リポソームは、水性媒体中に分散したリン脂質から形成され、そして多層同心性二重層小胞（多層小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自発的に形成する。
【０９１６】
あるいは、他の実施形態において、本発明は、本発明の組成物の薬学的に受容可能なナノカプセル処方物を提供する。ナノカプセルは一般に、化合物を安定かつ再現可能な様式で補足し得る（例えば、Ｑｕｉｎｔａｎａｒ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏら、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｉｎｄ  Ｐｈａｒｍ．１９９８  Ｄｅｃ；２４（１２）：１１１３−２８を参照のこと）。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を回避するために、このような超微粒子（約０．１μｍのサイズ）は、インビボで分解され得るポリマーを使用して設計され得る。このような粒子は、例えば、Ｃｏｕｖｒｅｕｒら、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１９８８；５（１）：１−２０；ｚｕｒ  Ｍｕｈｌｅｎら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ．１９９８  Ｍａｒ；４５（２）：１４９−５５；Ｚａｍｂａｕｘら、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ．１９９８  Ｊａｎ  ２；５０（１−３）：３１−４０；および米国特許第５，１４５，６８４号に記載されるようにして作製され得る。
【０９１７】
（癌治療法）
本発明のさらなる局面において、本明細書に記載される薬学的組成物は、癌の処置のため、特に、前立腺癌の免疫治療のために使用され得る。このような方法において、本明細書中に記載される薬学的組成物は、患者、代表的には、温血動物、好ましくはヒトに投与される。患者は、癌に罹患していてもしていなくてもよい。従って上記薬学的組成物は、癌の進行を予防するため、または癌に罹患した患者を処置するために使用され得る。薬学的組成物およびワクチンは、原発性腫瘍の外科的除去および／または放射線治療剤もしくは従来の化学療法剤の投与のような処置の前、あるいはその後のいずれかに投与され得る。上記のように、薬学的組成物の投与は、任意の適切な方法（静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内、肛門、膣、局所的および経口経路による投与を含む）によってであり得る。
【０９１８】
特定の実施形態において、免疫療法は、能動的免疫療法であり得、この療法において処置は、免疫応答改変剤（例えば、本明細書中で提供されるポリペプチドおよびポリヌクレオチド）の投与を用いる腫瘍に対して反応する内因性宿主免疫系のインビボ刺激に依存する。
【０９１９】
他の実施形態において、免疫療法は、受動的免疫療法であり得、この療法において処置は、確立された腫瘍免疫反応性を有する因子（例えば、エフェクター細胞または抗体）（これらは、抗腫瘍効果を直接的または間接的に媒介し得、そして必ずしもインタクトな宿主免疫系に依存しない）の送達を含む。エフェクター細胞の例としては、上記のようなＴ細胞、本明細書中に提供されるポリペプチドを発現するＴリンパ球（例えば、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球およびＣＤ４＋Ｔヘルパー腫瘍浸潤性リンパ球）、キラー細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞およびリンホカイン活性化キラー細胞）、Ｂ細胞および抗原提示細胞（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）が挙げられる。本明細書中に列挙されるポリペプチドに特異的なＴ細胞レセプターおよび抗体レセプターは、養子免疫療法のために他のベクターまたはエフェクター細胞中にクローニングされ、発現され、そして移入され得る。本明細書に提供されるポリペプチドはまた、受動免疫療法のための抗体または抗イディオタイプ抗体（上記および米国特許第４，９１８，１６４号に記載される）を生成するために用いられ得る。
【０９２０】
エフェクター細胞は、一般に、本明細書中に記載されるように、インビトロでの増殖により養子免疫治療のために十分な量で得られ得る。単一の抗原特異的エフェクター細胞を、インビボでの抗原認識を保持しながら数十億まで増殖させるための培養条件は当該分野で周知である。このようなインビトロの培養条件は代表的に、しばしばサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）および分裂しない支持細胞の存在下で、抗原での間欠刺激を用いる。上で述べたように、本明細書中で提供される免疫反応性ポリペプチドは、抗原特異的Ｔ細胞培養物を急速に増殖するために用いられ、免疫治療に十分な数の細胞を生成し得る。詳細には、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球、繊維芽細胞、および／またはＢ細胞）は、当該分野で周知の標準的技術を用いて、免疫反応性ポリペプチドでパルスされ得るか、または１つ以上のポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得る。例えば、抗原提示細胞は、組換えウイルスまたは他の発現系における発現を増大するのに適切なプロモーターを有するポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得る。治療において使用するための培養されたエフェクター細胞は、インビボで増殖されかつ広範に分散され得、そして長期間生存され得なければならない。培養されたエフェクター細胞が、インビボで増殖し、そしてＩＬ−２を補充された抗原での反復刺激によって、長期間、多数生存しするように誘導され得ることが研究で示されている（例えば、Ｃｈｅｅｖｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １５７：１７７、１９９７を参照のこと）。
【０９２１】
あるいは、本明細書において列挙されるポリペプチドを発現するベクターは、患者から得られた抗原提示細胞に導入され得、そして同じ患者に戻す移植のためにエキソビボでクローン的に増殖され得る。トランスフェクトされた細胞は、当該分野で公知の任意の手段（好ましくは、静脈投与、腔内投与、腹腔内投与、または腫瘍内投与による滅菌形態）を用いて患者に再導入され得る。
【０９２２】
本明細書中に記載される治療的組成物の投与の経路および頻度、ならびに投薬量は、個々人で異なり、そして標準的技術を用いて容易に確立され得る。概して、薬学的組成物およびワクチンは、注射（例えば、皮内、筋肉内、静脈内、または皮下）により、経鼻的に（例えば、吸引により）または経口的に、投与され得る。好ましくは、５２週間にわたって１〜１０用量の間が投与され得る。好ましくは、１ヶ月の間隔で６用量が投与され、そしてブースター（追加）ワクチン接種がその後定期的に与えられ得る。交互のプロトコールが個々の患者に適切であり得る。適切な用量は、上記のように投与された場合、抗腫瘍免疫応答を促進し得、そして基底（すなわち、未処置）レベルより少なくとも１０〜５０％上である、化合物の量である。このような応答は、患者内の抗腫瘍抗体を測定することによってか、または患者の腫瘍細胞をインビトロで殺傷し得る細胞溶解性エフェクター細胞のワクチン依存性の生成によってモニターされ得る。このようなワクチンはまた、ワクチン接種されていない患者と比較すると、ワクチン接種された患者において、改善された臨床的結果（例えば、より頻繁な寛解、完全もしくは部分的に疾患を有さないか、またはより長く疾患を有さない生存）を導く免疫応答を生じ得るはずである。一般に、１つ以上のポリペプチドを含む薬学的組成物およびワクチンについて、用量中に存在する各ポリペプチドの量は、宿主の体重（ｋｇ）あたり、約２５μｇ〜５ｍｇの範囲である。適切な用量サイズは、患者の大きさで変化するが、代表的には約０．１ｍＬ〜約５ｍＬの範囲である。
【０９２３】
一般に、適切な投薬量および処置レジメンは、治療的および／または予防的利点を提供するのに十分な量の活性化合物を提供する。このような応答は、処置されていない患者と比較して、処置された患者において、改善された臨床的結果（例えば、より頻繁な寛解、完全なまたは部分的な、あるいはより長い疾患なしでの生存）を確立することによってモニターされ得る。腫瘍タンパク質に対する既存の免疫応答における増加は、一般的に、改善された臨床的結果と関連する。このような免疫応答は、一般的に、標準的な増殖アッセイ、細胞障害性アッセイまたはサイトカインアッセイを使用して評価され得、これは、処置の前または後に患者から得られるサンプルを使用して行われ得る。
【０９２４】
（癌の検出および診断組成物、方法およびキット）
一般的に、癌は、患者から得られた生物学的サンプル（例えば、血液、血清、痰、尿、および／または腫瘍生検）における１つ以上の前立腺腫瘍タンパク質および／またはこのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在に基づいて患者において検出され得る。言い換えると、このようなタンパク質は、前立腺癌のような癌の存在または非存在を示すためのマーカーとして使用され得る。さらに、このようなタンパク質は、他の癌の検出のために有用であり得る。本明細書中で提供される結合剤は、一般に、生物学的サンプル中で、この薬剤に結合する抗原のレベルの検出を可能にする。ポリヌクレオチドプライマーおよびプローブは、癌の存在または非存在もまた示す、腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを検出するために使用され得る。一般に、前立腺腫瘍の配列は、腫瘍が発生するのと同一の型の正常な組織よりも、腫瘍組織において、少なくとも３倍以上のレベルで存在するはずである。
【０９２５】
サンプル中のポリペプチドマーカーを検出するために結合剤を使用するための、当業者に公知の種々のアッセイ型式が存在する。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。一般的に、患者における癌の存在または非存在は、（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを結合剤と接触させる工程；（ｂ）結合剤に結合するポリペプチドのレベルをサンプルにおいて検出する工程；および（ｃ）ポリペプチドのレベルと所定のカットオフ値とを比較する工程によって決定され得る。
【０９２６】
好ましい実施形態において、このアッセイは、ポリペプチドに結合するためおよびサンプルの残りからポリペプチドを除くために固体支持体上に固定化された結合剤の使用を含む。次いで、結合されたポリペプチドは、レポーター基を含み、結合剤／ポリペプチド複合体に特異的に結合する検出試薬を使用して検出され得る。このような検出試薬は、例えば、ポリペプチドまたは抗体に特異的に結合する結合剤あるいは結合剤に特異的に結合する他の薬剤（例えば、抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡまたはレクチン）を含み得る。あるいは、競合アッセイが、使用され得、ここで、ポリペプチドは、レポーター基で標識され、そしてサンプルと結合剤のインキュベーション後にその固定化結合剤に結合される。サンプルの成分が、標識ポリペプチドの結合剤への結合を阻害する程度は、サンプルの固定化結合剤との反応性を示す。このようなアッセイにおける使用に適切なポリペプチドは、上記のような、全長前立腺腫瘍タンパク質および結合剤が結合するそのポリペプチド部分を含む。
【０９２７】
固体支持体は、腫瘍タンパク質が付着され得る当業者に公知の任意の材料であり得る。例えば、固体支持体は、マイクロタイタープレートにおける試験ウェルあるいはニトロセルロースまたは他の適切な膜であり得る。あるいは、その支持体は、ビーズまたはディスク（例えば、ガラス）、ファイバーグラス、ラテックス、またはプラスチック物質（例えば、ポリスチレン、またはポリ塩化ビニル）であり得る。その支持体はまた、磁気粒子または光ファイバーセンサー（例えば、米国特許第５，３５９，６８１号に記載のような）であり得る。この結合剤は、当業者に公知の種々の技術を使用して固体支持体上に固定化され得、これらは特許および科学文献に十分に記載されている。本発明の状況において、用語「固定化」とは、非共有結合的な会合（例えば、吸着）および共有結合的な付着（これは、薬剤と支持体上の官能基との間で直接結合され得るかまたは架橋剤を用いる結合であり得る）の両方をいう。マイクロタイタープレートのウェル、または膜への吸着による固定化は好ましい。このような場合、吸着は、適切な緩衝液中で固体支持体を用いて適切な時間量で結合剤に接触させることによって達成され得る。接触時間は、温度によって変化するが、代表的には、約１時間から約１日の間である。一般的には、約１０ｎｇ〜約１０μｇ、そして好ましくは約１００ｎｇ〜約１μｇの範囲の量の結合剤とプラスチックマイクロタイタープレート（例えば、ポリスチレンまたはポリ塩化ビニル）のウェルを接触させることは、適切な量の結合剤を固定化するのに十分である。
【０９２８】
固体支持体への結合剤の共有結合的付着は、一般に、支持体および結合剤上の官能基（例えば、水酸基またはアミノ基）の両方と反応する二官能性試薬と支持体を最初に反応させることによって達成され得る。例えば、この結合剤は、ベンゾキノンを用いるかまたは結合パートナー上のアミンおよび活性水素と支持体上のアルデヒド基との縮合によって、適切なポリマーコーティングを有する支持体に、共有結合的に付着され得る（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９１、Ａ１２−Ａ１３を参照のこと）。
【０９２９】
特定の実施形態において、このアッセイは、２抗体サンドイッチアッセイである。本アッセイは、最初に、固体支持体（一般に、マイクロタイタープレートのウェル）上で固定化されている抗体をサンプルに接触させて、その結果、サンプル内のポリペプチドを固定化抗体に結合させることによって実施され得る。次いで、非結合サンプルは固定化ポリペプチド−抗体複合体から除去され、そして検出試薬（好ましくは、そのポリペプチド上の異なる部位に結合し得る第２の抗体（レポーター基を含む））が添加される。次いで、固体支持体に結合したままである検出試薬の量が、特定のレポーター基に関して適切な方法を用いて決定される。
【０９３０】
より詳細には、一旦抗体が上記のように支持体上に固定化されると、支持体上の残りのタンパク質結合部位は、典型的にはブロックされる。任意の適切なブロック剤（例えば、ウシ血清アルブミンまたはＴｗｅｅｎ２０ＴＭ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））は、当業者に公知である。固定化抗体は次いで、サンプルとインキュベートされ、そしてポリペプチドをこの抗体に結合させる。インキュベーションの前に、このサンプルは適切な希釈液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））で希釈され得る。概して、適切な接触時間（すなわち、インキュベーション時間）は、前立腺癌を有する個体から得られたサンプル内のポリペプチドの存在を検出するのに十分な時間である。好ましくは、この接触時間は、結合ポリペプチドと非結合ポリペプチドとの間の平衡で達成されるものの少なくとも約９５％である結合のレベルを達成するのに十分な時間である。当業者は、ある時間にわたって起こる結合レベルをアッセイすることによって、平衡に達するまでに必要な時間が容易に決定され得ることを認識する。室温では、一般に、約３０分間のインキュベーション時間で十分である。
【０９３１】
次いで、非結合サンプルが、適切な緩衝液（例えば、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭを含むＰＢＳ）を用いて固体支持体を洗浄することによって除去される。レポーター基を含む第２の抗体が次いで、固体支持体に添加され得る。好ましいレポーター基は、上記の基を含む。
【０９３２】
次いで、検出試薬が、結合されたポリペプチドを検出するのに十分な量の時間、固定化抗体−ポリペプチド複合体とインキュベートされる。適切な量の時間は、一般に、ある時間にわたって起こる結合のレベルをアッセイすることによって決定され得る。次いで、非結合の検出試薬は除去され、そして結合した検出試薬は、レポーター基を用いて検出される。レポーター基を検出するために使用される方法は、レポーター基の性質に依存する。放射性基について、一般的には、シンチレーション計数法またはオートラジオグラフィー法が適切である。分光法は、色素、発光基および蛍光基を検出するために使用され得る。ビチオンは、異なるレポーター基（一般に、放射性もしくは蛍光基または酵素）に結合されたアビジンを使用して検出され得る。酵素レポーター基は、一般に、基質の添加（一般には、特定の時間の間）、続いて反応産物の分光分析または他の分析により検出され得る。
【０９３３】
癌（例えば、前立腺癌）の存在または非存在を決定するために、固体支持体に結合したままのレポーター基から検出されるシグナルが、一般に、所定のカットオフ値と対応するシグナルと比較される。１つの好ましい実施形態において、癌の検出のためのカットオフ値は、固定化抗体を、癌を有さない患者由来のサンプルとインキュベートした際に得られる平均シグナル値である。概して、所定のカットオフ値を３標準偏差上回るシグナルを生じるサンプルが、癌に対して陽性とみなされる。代替の好ましい実施形態において、このカットオフ値は、Ｓａｃｋｅｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，１９８５，１０６〜７頁の方法に従って、レシーバーオペレーターカーブ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｏｒ  Ｃａｒｖｅ）を使用して決定される。簡単に言うと、本実施形態において、このカットオフ値は、診断試験結果についての各可能なカットオフ値に対応する真の陽性割合（すなわち、感度）および偽陽性割合（１００％−特異性）の対のプロットから決定され得る。プロット上の上方左手角に最も近いカットオフ値（すなわち、最大領域を囲む値）が、最も正確なカットオフ値であり、そして本方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生ずるサンプルが陽性と見なされ得る。あるいは、カットオフ値は、偽陽性割合を最小にするためにプロットに沿って左へシフトされ得るか、または偽陰性割合を最小にするために右へシフトされ得る。概して、本方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生ずるサンプルが、癌に対して陽性と見なされる。
【０９３４】
関連の実施形態において、このアッセイは、フロースルー試験形式またはストリップ試験形式で実行される（ここで、結合剤は、ニトロセルロースのような膜上で固定化される）。フロースルー試験では、サンプル内のポリペプチドは、サンプルが膜を通過するにつれて固定化結合剤に結合する。次いで、第２の標識化された結合剤が、この第２の結合剤を含む溶液がその膜を介して流れるにつれて、結合剤−ポリペプチド複合体と結合する。次いで、結合した第２の結合剤の検出は、上記のように実行され得る。ストリップ試験形式では、結合剤が結合される膜の一端をサンプルを含む溶液中に浸す。このサンプルは、膜に沿って、第２の結合剤を含む領域を通って、そして固定化結合剤の領域まで移動する。固定化抗体の領域での第２の結合剤の濃度が、癌の存在を示す。代表的には、その部位での第２の結合剤の濃度は、視覚的に読みとられ得るパターン（例えば、線）を生成する。このようなパターンを示さないことは陰性の結果を示す。概して、この膜上に固定化される結合剤の量は、生物学的サンプルが、上記の形式において、２抗体サンドイッチアッセイにおいて陽性シグナルを生じるのに十分であるレベルのポリペプチドを含む場合、視覚的に識別可能なパターンを生じるように選択される。このようなアッセイにおける使用に好ましい結合剤は、抗体およびその抗原結合フラグメントである。好ましくは、膜上に固定化される抗体の量は、約２５ｎｇ〜約１μｇの範囲であり、そしてより好ましくは、約５０ｎｇ〜約５００ｎｇの範囲である。このような試験は、代表的には、非常に少ない量の生物学的サンプルを用いて実行され得る。
【０９３５】
当然のことながら、本発明の腫瘍タンパク質または結合剤との使用に適する多数の他のアッセイ手順が存在する。上記の記載は、例示であることを意図するにすぎない。例えば、上記手順が、腫瘍ポリペプチドを使用するために容易に改変され得て、生物学的サンプル内でこのようなポリペプチドに結合する抗体を検出し得ることが当業者に明かである。このような腫瘍タンパク質特異的抗体の検出は、癌の存在と相関し得る。
【０９３６】
癌もまた、あるいは癌が、生物学的サンプル中の腫瘍タンパク質と特異的に反応するＴ細胞の存在に基づいて検出され得る。特定の方法では、患者から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む生物学的サンプルは、腫瘍ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはこのようなポリペプチドの少なくとも免疫原性部分を発現するＡＰＣとともにインキュベートされ、そしてＴ細胞の特異的活性化の存在または非存在が検出される。適切な生物学的サンプルとしては、単離されたＴ細胞が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｔ細胞は、慣用技術によって（例えば、末梢血リンパ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離法によって）患者から単離され得る。Ｔ細胞は、２〜９日間（代表的に４日間）、３７℃にてポリペプチド（例えば、５〜２５μｇ／ｍｌ）とともにインビトロでインキュベートされ得る。Ｔ細胞サンプルの別のアリコートを、コントロールとして役立てるために、腫瘍ポリペプチドの非存在下でインキュベートすることが所望され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞に関して、活性化は好ましくは、Ｔ細胞の増殖を評価することによって検出される。ＣＤ８＋Ｔ細胞に関しては、活性化は好ましくは、細胞溶解活性を評価することによって検出される。疾患のない患者におけるよりも少なくとも２倍高い増殖レベルおよび／または少なくとも２０％高い細胞溶解活性レベルは、患者における癌の存在を示す。
【０９３７】
上記のように、癌もまた、あるいは癌が、生物学的サンプル中の腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡレベルに基づいて検出され得る。例えば、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイにおいて用いて、生物学的サンプルに由来する腫瘍ｃＤＮＡの一部を増幅し得、ここで、オリゴヌクレオチドプライマーのうちの少なくとも１つは、腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的である（すなわち、ハイブリダイズする）。次いで、増幅されたｃＤＮＡが、当該分野で周知の技術（例えば、ゲル電気泳動）を用いて分離され、そして検出される。同様に、腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いて、生物学的サンプル中でこの腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在を検出し得る。
【０９３８】
アッセイ条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするために、オリゴヌクレオチドのプライマーおよびプローブは、少なくとも１０ヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの長さの、本発明の腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部に対して少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、そしてより好ましくは少なくとも約９０％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を含むべきである。好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、上記に規定されるような、中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする。本明細書中に記載される診断方法において有用に用いられ得るオリゴヌクレオチドのプライマーおよび／またはプローブは、好ましくは、少なくとも１０〜４０ヌクレオチドの長さである。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは、本明細書中に開示される配列を有するＤＮＡ分子の少なくとも１０の連続するヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む。ＰＣＲに基づくアッセイおよびハイブリダイゼーションアッセイの両方についての技術は、当該分野で周知である（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１：２６３，１９８７；Ｅｒｌｉｃｈ編，ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。
【０９３９】
１つの好ましいアッセイは、ＲＴ−ＰＣＲを用い、ＲＴ−ＰＣＲでは、ＰＣＲは、逆転写と組み合わせて適用される。代表的に、ＲＮＡは生物学的サンプル（例えば、生検組織）から抽出され、そして逆転写されてｃＤＮＡ分子を生成する。少なくとも１つの特異的プライマーを用いるＰＣＲ増幅は、ｃＤＮＡ分子を生成し、このｃＤＮＡ分子は、例えば、ゲル電気泳動を用いて分離および可視化され得る。増幅は、試験患者および癌に罹患していない個体から採取された生物学的サンプルについて行われ得る。増幅反応は、２桁の大きさに及ぶいくつかのｃＤＮＡ希釈物について行われ得る。試験患者サンプルのいくつかの希釈物における発現の増加が、癌のないサンプルの同一希釈の物と比較して２倍以上である場合、これは、代表的に、陽性とみなされる。
【０９４０】
別の実施形態において、本明細書中に記載された組成物は、癌の進行についてのマーカーとして使用され得る。この実施形態において、癌の診断について上記に記載されるようなアッセイは、経時的に実行され得、そして反応性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルの変化を評価し得る。例えば、このアッセイは、６ケ月〜１年の期間、２４〜７２時間毎に実行され得、そしてその後、必要に応じて実行され得る。一般に、癌は、検出されるこのポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが経時的に増大する患者において進行している。対照的に、癌は、反応性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが一定のままであるか、または時間とともに減少するかのいずれかである場合、進行していない。
【０９４１】
特定のインビボ診断アッセイは、腫瘍上で直接実施され得る。１つのこのようなアッセイは、腫瘍細胞を結合剤と接触させる工程を包含する。次いで、結合された結合剤は、レポーター基によって直接的または間接的に検出され得る。このような結合剤はまた、組織学的な用途において使用され得る。あるいは、ポリヌクレオチドプローブは、このような用途において使用され得る。
【０９４２】
上記のように、感度を改善するために、複数の腫瘍タンパク質マーカーは、所定のサンプル内でアッセイされ得る。本明細書中に提供される種々のタンパク質に特異的な結合剤が単一のアッセイにおいて組み合わせられ得ることは明かである。さらに、複数のプライマーまたはプローブが同時に用いられ得る。腫瘍タンパク質マーカーの選択は、最適な感度をもたらす組み合わせを決定する慣用実験に基づき得る。さらに、または代替として、本明細書中に提供される腫瘍タンパク質のアッセイは、他の公知の腫瘍抗原に対するアッセイと組み合わせられ得る。
【０９４３】
本発明の他の局面において、細胞捕捉技術は、検出の前に、本明細書中に開示される種々の検出方法の感受性を改善するために使用される。
【０９４４】
例示的な細胞富化方法は、サンプル中で癌細胞を最初に富化するために、または陽性に選択するために使用され得る、特定のモノクローナル抗体で表面の細胞マーカーを被覆するか、または四量体抗体複合体である免疫磁性ビーズを使用する。種々の市販のキットが使用され得、それらとしては、Ｄｙｎｅｂｅａｄｓ（登録商標）Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）、ＳｔｅｍＳｅｐＴＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）およびＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が挙げられる。当業者は、他の容易に利用可能な方法およびキットもまた所望の細胞集団を富化するかまたは陽性に選択するために使用され得ることを理解する。
【０９４５】
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈは、正常な組織および新生物上皮組織で発現した糖タンパク質膜抗原に特異的なｍＡｂで被覆した磁性ビーズを含む。被覆されたビーズは、サンプルに添加され得、次いで、そのサンプルは、磁石に適用され、それによってビーズに結合した細胞を捕捉する。所望しない細胞は、洗い流され、磁気的に単離された細胞は、ビーズから溶出し、さらなる分析に使用される。
【０９４６】
ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐは、血液サンプル由来の細胞を直接富化するために使用され得、所望しない種々の細胞を標的とする四量体抗体の混液からなり、所望しない細胞を、サンプル中に存在し、ロゼットを形成する赤血球（ＲＢＣ）上のグリコホリンＡに架橋させる。フィコール上で遠心する場合、標的細胞ペレットは、遊離ＲＢＣと一緒に存在する。
【０９４７】
枯渇混合液（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）中の抗体の組合せは、どの細胞が除去され、そして、結果的にどの細胞が回収されるかを決定する。利用可能な抗体としては、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６、ＣＤ６６Ｂ、ＣＤ６６ｅ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩｇＥおよびＴＣＲαβが挙げられるが、これらに限定されない。さらに本発明では、前立腺腫瘍抗原に特異的なｍＡｂが開発され、類似の様式で使用され得ることが企図される。例えば、腫瘍特異的細胞表面抗原に結合するｍＡｂは、磁性ビーズに結合され得るか、または四量体抗体複合体中に処方され、そして、前立腺腫瘍細胞を富化するかまたはサンプルから転移性前立腺腫瘍細胞を陽性に選択するために使用される。
【０９４８】
一旦サンプルが、富化されるか、または陽性に選択されると、細胞はさらに分析され得る。例えば、細胞は、溶解され、ＲＮＡが単離され得る。次いで、ＲＮＡは、本明細書中に記載されるリアルタイムＰＣＲアッセイにおける前立腺腫瘍特異的プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ分析に供され得る。
【０９４９】
本発明の別の局面において、細胞捕捉技術は、リアルタイムＰＣＲと組み合わせて使用され、前立腺腫瘍抗原を発現する転移性細胞の検出のためのより感度の高い手段を提供し得る。骨髄サンプル、末梢血、生検および他のサンプルにおける前立腺癌細胞の検出は、前立腺癌患者の診断および予後診断に好ましい。
【０９５０】
本発明はさらに、上記の診断方法のうちのいずれかにおいて使用するためのキットを提供する。このようなキットは代表的に、診断アッセイを行うのに必要な２以上の構成要素を備える。構成要素は、化合物、試薬、容器および／または器具であり得る。例えば、キット内の１つの容器は、腫瘍タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含み得る。このような抗体またはフラグメントは、上記のように支持体材料に付着されて提供され得る。１以上のさらなる容器は、アッセイにおいて使用される要素（例えば、試薬または緩衝液）を封入し得る。このようなキットもまた、あるいはこのようなキットは、抗体結合の直接的または間接的な検出に適切なレポーター基を含む上記のような検出試薬を備え得る。
【０９５１】
あるいは、キットは、生物学的サンプル中の腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡレベルを検出するように設計され得る。このようなキットは一般に、腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする、上記のような、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドのプローブまたはプライマーを備える。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いられ得る。このようなキット内に存在し得るさらなる構成要素としては、腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの検出を容易にする、第２のオリゴヌクレオチドおよび／または診断試薬もしくは容器が挙げられる。
【０９５２】
以下の実施例は、例示のために提供され、そして限定のためではない。
【実施例】
【０９５３】
（実施例１）
（前立腺特異的ポリペプチドの単離および特徴付け）
本実施例は、前立腺腫瘍ｃＤＮＡライブラリーからの特定の前立腺特異的ポリペプチドの単離を記載する。
【０９５４】
ヒト前立腺腫瘍ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、製造業者のプロトコルに従って、ｃＤＮＡ合成用のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＳｙｓｔｅｍおよびＰｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇキット（ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ  ２０８９７）を用いて前立腺腫瘍ポリＡ＋  ＲＮＡから構築した。具体的には、前立腺腫瘍組織を、ポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてホモジナイズし、そして総ＲＮＡを、製造業者により指示されたようにＴｒｉｚｏｌ試薬（ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて抽出した。次いで、ポリＡ＋  ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、ＱｉａｇｅｎオリゴテックススピンカラムｍＲＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ  ９１３５５）を用いて精製した。第１鎖ｃＤＮＡを、ＮｏｔＩ／Ｏｌｉｇｏ−ｄＴ１８プライマーを用いて合成した。２本鎖ｃＤＮＡを合成し、ＥｃｏＲＩ／ＢＡＸＩアダプター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と連結し、そしてＮｏｔＩで消化した。Ｃｈｒｏｍａ  Ｓｐｉｎ−１０００カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いたサイズ分画後に、ｃＤＮＡを、ｐＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ部位に連結し、そしてエレクトロポレーションによりＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ細胞（ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換した。
【０９５５】
同じ手順を用いて、正常ヒト膵臓ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、６つの組織標本のプール（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から調製した。ｃＤＮＡライブラリーを、独立したコロニーの数、挿入物を有するクローンの百分率、平均挿入物サイズを決定することにより、および配列分析により特徴付けた。前立腺腫瘍ライブラリーは１．６４×１０７個の独立したコロニーを含み、クローンの７０％は挿入物を有し、そして平均挿入物サイズは１７４５塩基対であった。正常膵臓ｃＤＮＡライブラリーは３．３×１０６個の独立したコロニーを含み、クローンの６９％は挿入物を有し、そして平均挿入物サイズは１１２０塩基対であった。両方のライブラリーについて、配列分析は、クローンの大部分が完全長ｃＤＮＡ配列を有し、そしてｍＲＮＡから合成され、ｒＲＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡの夾雑物が最小であったことを示した。
【０９５６】
ｃＤＮＡライブラリーサブトラクションを、いくらか改変したＨａｒａら（Ｂｌｏｏｄ，８４：１８９−１９９，１９９４）の記載によって、上記の前立腺腫瘍ライブラリーおよび正常膵臓ｃＤＮＡライブラリーを用いて行った。具体的には、前立腺腫瘍特異的なサブトラクションされたｃＤＮＡライブラリーを、以下の通りに生成した。正常膵臓ｃＤＮＡライブラリー（７０μｇ）を、ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ、およびＳｆｕＩで消化し、続いてＤＮＡポリメラーゼクレノウフラグメントを用いてフィルイン反応を行った。フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈澱の後、ＤＮＡを、１００μｌのＨ２Ｏに溶解し、熱変性させ、そして１００μｌ（１００μｇ）のＰｈｏｔｏｐｒｏｂｅビオチン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）と混合した。製造業者により推奨されるように、得られた混合物を、２０分間、氷上で２７０Ｗの太陽灯を用いて照射した。さらなるＰｈｏｔｏｐｒｏｂｅビオチン（５０μｌ）を添加し、そしてビオチン化反応を繰り返した。ブタノールを用いた５回の抽出後、ＤＮＡをエタノール沈澱させ、そして２３μｌ  Ｈ２Ｏに溶解して、ドライバーＤＮＡ（ｄｒｉｖｅｒ  ＤＮＡ）を形成した。
【０９５７】
トレーサーＤＮＡ（ｔｒａｃｅｒ  ＤＮＡ）を形成するために、１０μｇの前立腺腫瘍ｃＤＮＡライブラリーを、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化し、フェノールクロロホルム抽出し、そしてＣｈｒｏｍａスピン−４００カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を通過させた。エタノール沈澱後、トレーサーＤＮＡを、５μｌのＨ２Ｏに溶解した。トレーサーＤＮＡを、１５μｌのドライバーＤＮＡおよび２０μｌの２×ハイブリダイゼーション緩衝液（１．５Ｍ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ／５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．５）／０．２％ドデシル硫酸ナトリウム）と混合し、鉱油を重層し、そして完全に熱変性させた。サンプルを６８℃の水浴にすぐに移し、そして２０時間インキュベートした（長いハイブリダイゼーション［ＬＨ］）。次いで、反応混合物をストレプトアビジン処理に供し、続いてフェノール／クロロホルム抽出に供した。このプロセスを、さらに３回繰り返した。サブトラクションされたＤＮＡを沈澱し、１２μｌのＨ２Ｏに溶解し、８μｌのドライバーＤＮＡおよび２０μｌの２×ハイブリダイゼーション緩衝液と混合し、そして６８℃で２時間のハイブリダイゼーション（短いハイブリダイゼーション［ＳＨ］）に供した。ビオチン化２本鎖ＤＮＡの除去後、サブトラクションされたｃＤＮＡを、クロラムフェニコール耐性ｐＢＣＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ  ９２０３７）のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位に連結し、そしてエレクトロポレーションによりＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ細胞に形質転換して、前立腺腫瘍特異的なサブトラクションされたｃＤＮＡライブラリーを生成した（「前立腺サブトラクション１」という）。
【０９５８】
サブトラクションされたｃＤＮＡライブラリーを分析するために、プラスミドＤＮＡを１００個の独立したクローンから調製し、サブトラクションされた前立腺腫瘍特異的ライブラリーから無作為に拾い、そして挿入物サイズに基づいて分類した。代表的なｃＤＮＡクローンを、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ３７３Ａ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いたＤＮＡ配列決定によりさらに特徴付けた。６個のｃＤＮＡクローン（以下、Ｆ１−１３、Ｆ１−１２、Ｆ１−１６、Ｈ１−１、Ｈ１−９、およびＨ１−４と呼ぶ）は、サブトラクションされた前立腺特異的ｃＤＮＡライブラリーにおいて豊富であることが示された。Ｆ１−１２について決定された３’ｃＤＮＡ配列および５’ｃＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号２および配列番号３に提示し、Ｆ１−１３、Ｆ１−１６、Ｈ１−１、Ｈ１−９、およびＨ１−４について決定された３’ｃＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号１および４〜７に提示する。
【０９５９】
単離されたクローンのｃＤＮＡ配列を、ＥＭＢＬおよびＧｅｎＢａｎｋデータベース（リリース９６）を用いて遺伝子バンクにおける既知の配列と比較した。前立腺腫瘍ｃＤＮＡクローンのうちの４個（Ｆ１−１３、Ｆ１−１６、Ｈ１−１、およびＨ１−４）は、以下の以前に同定されたタンパク質をコードすることが決定された：前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ヒト腺性カリクレイン、ヒト腫瘍発現増強型遺伝子、およびミトコンドリアシトクロムＣオキシダーゼサブユニットＩＩ。Ｈ１−９は、以前に同定されたヒト自律複製配列に同一であることが見出された。Ｆ１−１２についてのｃＤＮＡ配列と有意な相同性は見出されなかった。
【０９６０】
次の研究は、Ｆ１−１２についての完全長ｃＤＮＡ配列（Ｐ５０４Ｓとも呼ぶ）の単離を導いた。この配列を配列番号１０７に提示し、対応するアミノ酸配列を配列番号１０８に提供する。Ｐ５０４ＳのｃＤＮＡスプライス改変体を配列番号６００〜６０５に提供する。
【０９６１】
それほど豊富ではない前立腺腫瘍特異的遺伝子をクローニングするために、ｃＤＮＡライブラリーサブトラクションを、上記の前立腺腫瘍ｃＤＮＡライブラリーを、正常膵臓ｃＤＮＡライブラリー、および以前にサブトラクションされた前立腺腫瘍特異的ｃＤＮＡライブラリーにおける最も豊富な３つの遺伝子（ヒト腺性カリクレイン、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、およびミトコンドリアシトクロムＣオキシダーゼサブユニットＩＩ）でサブトラクションすることにより行った。具体的には、ｐＣＤＮＡ３．１中のヒト腺性カリクレインｃＤＮＡ、ＰＳＡ  ｃＤＮＡ、およびミトコンドリアシトクロムＣオキシダーゼサブユニットＩＩ  ｃＤＮＡの各々１μｇをドライバーＤＮＡに添加し、そしてサブトラクションを上記のように行って、第２のサブトラクションされたｃＤＮＡライブラリー（以下、「スパイク（ｓｐｉｋｅ）を用いてサブトラクションされた前立腺腫瘍特異的ｃＤＮＡライブラリー」と呼ぶ）を提供した。
【０９６２】
２２個のｃＤＮＡクローンを、スパイクを用いてサブトラクションされた前立腺腫瘍特異的ｃＤＮＡライブラリーから単離した。Ｊ１−１７、Ｌ１−１２、Ｎ１−１８６２、Ｊ１−１３、Ｊ１−１９、Ｊ１−２５、Ｊ１−２４、Ｋ１−５８、Ｋ１−６３、Ｌ１−４、およびＬ１−１４と呼ばれるクローンについて決定された３’  ｃＤＮＡ配列および５’  ｃＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号８〜９、１０〜１１、１２〜１３、１４〜１５、１６〜１７、１８〜１９、２０〜２１、２２〜２３、２４〜２５、２６〜２７、および２８〜２９に提供する。Ｊ１−１２、Ｊ１−１６、Ｊ１−２１、Ｋ１−４８、Ｋ１−５５、Ｌ１−２、Ｌ１−６、Ｎ１−１８５８、Ｎ１−１８６０、Ｎ１−１８６１、Ｎ１−１８６４と呼ばれるクローンについて決定された３’ｃＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号３０〜４０に提供する。これらの配列と上記の遺伝子バンクにおける配列との比較は、５個の最も豊富なＤＮＡ種のうちの３個（Ｊ１−１７、Ｌ１−１２、およびＮ１−１８６２；それぞれ、配列番号８〜９、１０〜１１、および１２〜１３）とは有意な相同性がないことを明らかにした。残りの２つの最も豊富な種のうち、一方（Ｊ１−１２；配列番号３０）は、以前に同定されたヒト肺サーファクタント関連タンパク質と同一であることが見出され、そして他方（Ｋ１−４８；配列番号３３）は、２−アリルプロピオニル−ＣｏＡエピメラーゼについてのＲ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｍＲＮＡといくらかの相同性を有することが決定された。スパイクを用いてサブトラクションされた前立腺腫瘍特異的ｃＤＮＡライブラリーから単離された１７個のそれほど豊富ではないｃＤＮＡクローンのうち、４個（Ｊ１−１６、Ｋ１−５５、Ｌ１−６、およびＮ１−１８６４；それぞれ、配列番号３１、３４、３６、および４０）は、以前に同定された配列と同一であることが見出され、２個（Ｊ１−２１およびＮ１−１８６０；それぞれ、配列番号３２および３８）は、非ヒト配列といくらかの相同性を示すことが見出され、そして２個（Ｌ１−２およびＮ１−１８６１；それぞれ、配列番号３５および３９）は、公知のヒト配列といくらかの相同性を示すことが見出された。ポリペプチドＪ１−１３、Ｊ１−１９、Ｊ１−２４、Ｊ１−２５、Ｋ１−５８、Ｋ１−６３、Ｌ１−４、Ｌ１−１４（それぞれ、配列番号１４〜１５、１６〜１７、２０〜２１、１８〜１９、２２〜２３、２４〜２５、２６〜２７、２８〜２９）と有意な相同性は見出されなかった。
【０９６３】
次の研究は、Ｊ１−１７、Ｌ１−１２、およびＮ１−１８６２についての完全長ｃＤＮＡ配列（それぞれ、配列番号１０９〜１１１）の単離を導いた。対応するアミノ酸配列を、配列番号１１２〜１１４に提供する。Ｌ１−１２はまた、Ｐ５０１Ｓとも呼ばれる。Ｐ５０１ＳのｃＤＮＡスプライス改変体を配列番号６０６に提供する。
【０９６４】
以下に記載のように、Ｎ１−１８６２（Ｐ５０３Ｓとも呼ぶ；配列番号１１１）は、前立腺特異的発現を示すことが見出された。免疫組織化学およびフローサイトメトリー分析が、Ｐ５０３Ｓが原形質膜会合分子であることを示した。Ｐ５０３Ｓは、アミノ酸５９〜７５、９０〜１０６、１０７〜１２３および２１８〜２３４によってコードされると推定される４つの膜貫通ドメインを含む。Ｐ５０３Ｓは、アミノ酸１〜２９において切断可能なＮ末端シグナル配列を含む。アミノ酸１〜５８をコードするＰ５０３ＳのＮ末端は内部にあり、アミノ酸７６〜８９は細胞外であり、アミノ酸１２４〜２１７は細胞外であり、そしてアミノ酸２３５〜２４１は細胞内にある。潜在的Ｎ結合型グリコシル化部位は、アミノ酸Ｎ−１４１、Ｎ１５４、Ｎ−１７８およびＮ−１８４にある。Ｐ５０３Ｓのグリコシル化は、糖残基をタンパク質から選択的にはがす酵素およびウェスタンブロット分析を用いて経験的に確認されている。Ｐ５０３Ｓは、テトラスパニン（ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ）ファミリーまたはＴＭ４ＳＦ（４回膜貫通スーパーファミリー）として集合的に公知の分子ファミリーのメンバーである。このファミリーのタンパク質は、他のファミリーメンバーと相互作用して、ホモ二量体化およびヘテロ二量体化することが示されている。さらに、このＴＭ４ＳＦファミリーのメンバーは、インテグリンとして公知のファミリーの接着分子と会合する。ＴＭ４ＳＦファミリーのメンバーは、これらの生理学的応答と関連するシグナル伝達経路を制御することによって細胞接着および細胞増殖を調節することが示されている。
【０９６５】
さらなる実験において、４個のさらなるクローンを、前立腺腫瘍ｃＤＮＡライブラリーを、３つの正常前立腺ポリＡ＋ＲＮＡのプールから調製した正常前立腺ｃＤＮＡでサブトラクションすることにより同定した（「前立腺サブトラクション２」と呼ぶ）。これらのクローンについて決定されたｃＤＮＡ配列（本明細書以下、Ｕ１−３０６４、Ｕ１−３０６５、Ｖ１−３６９２、および１Ａ−３９０５と呼ぶ）を、それぞれ、配列番号６９〜７２に提供する。決定された配列と遺伝子バンクにおける配列との比較は、Ｕ１−３０６５に対する有意な相同性を明らかにしなかった。
【０９６６】
スパイクを用いた第２のサブトラクション（「前立腺サブトラクションスパイク２」とも呼ぶ）を、スパイクを用いて前立腺腫瘍特異的ｃＤＮＡライブラリーを正常膵臓ｃＤＮＡライブラリーでサブトラクションすることにより行い、そしてＰＳＡ、Ｊ１−１７、肺サーファクタント関連タンパク質、ミトコンドリアＤＮＡ、シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩＩ、Ｎ１−１８６２、自律複製配列、Ｌ１−１２、および腫瘍発現増強型遺伝子でさらにスパイクした。４個のさらなるクローン（本明細書以下、Ｖ１−３６８６、Ｒ１−２３３０、１Ｂ−３９７６、およびＶ１−３６７９と呼ぶ）を単離した。これらのクローンに対して決定されたｃＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号７３〜７６に提供する。これらの配列と遺伝子バンクにおける配列との比較は、Ｖ１−３６８６およびＲ１−２３３０に対する有意な相同性を明らかにしなかった。
【０９６７】
上記の３つの前立腺サブトラクション（前立腺サブトラクション２、スパイクを用いてサブトラクションされた前立腺腫瘍特異的ｃＤＮＡライブラリー、および前立腺サブトラクションスパイク２）のさらなる分析は、１６個のさらなるクローン（１Ｇ−４７３６、１Ｇ−４７３８、１Ｇ−４７４１、１Ｇ−４７４４、１Ｇ−４７３４、１Ｈ−４７７４、１Ｈ−４７８１、１Ｈ−４７８５、１Ｈ−４７８７、１Ｈ−４７９６、１Ｉ−４８１０、１Ｉ−４８１１、１Ｊ−４８７６、１Ｋ−４８８４、および１Ｋ−４８９６と呼ぶ）の同定をもたらした。これらのクローンについて決定されたｃＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号７７〜９２に提供する。これらの配列と上記の遺伝子バンクにおける配列との比較は、１Ｇ−４７４１、１Ｇ−４７３４、１Ｉ−４８０７、１Ｊ−４８７６、および１Ｋ−４８９６（それぞれ、配列番号７９、８１、８７、９０、および９２）に対して有意な相同性を明らかにしなかった。単離されたクローンのさらなる分析は、１Ｇ−４７３６、１Ｇ−４７３８、１Ｇ−４７４１、１Ｇ−４７４４、１Ｈ−４７７４、１Ｈ−４７８１、１Ｈ−４７８５、１Ｈ−４７８７、１Ｈ−４７９６、１Ｉ−４８０７、１Ｊ−４８７６、１Ｋ−４８８４、および１Ｋ−４８９６（それぞれ、配列番号１７９〜１８８および１９１〜１９３に提供する）についての延長したｃＤＮＡ配列の決定、および１Ｉ−４８１０および１Ｉ−４８１１（それぞれ、配列番号１８９および１９０に提供する）に対するさらなる部分的ｃＤＮＡ配列の決定を導いた。
【０９６８】
前立腺サブトラクションスパイク２を用いたさらなる研究は、さらに３個のクローンの単離をもたらした。これらの配列を上記の通りに決定し、そして最も最近のＧｅｎＢａｎｋと比較した。３個全てのクローンは、公知の遺伝子に対して相同性を有することが見出された。これらの公知の遺伝子は、システインリッチタンパク質、ＫＩＡＡ０２４２、およびＫＩＡＡ０２８０（それぞれ、配列番号３１７、３１９、および３２０）である。Ｓｙｎｔｅｎｉマイクロアレイ（Ｓｙｎｔｅｎｉ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）によるこれらのクローンのさらなる分析は、３個全てのクローンが、大部分の前立腺腫瘍および前立腺ＢＰＨ、ならびに試験した正常前立腺組織の大多数において過剰発現するが、全ての他の正常組織においては発現が低いことを実証した。
【０９６９】
さらなるサブトラクションを、正常前立腺ｃＤＮＡライブラリーを正常膵臓ｃＤＮＡでサブトラクションすることにより行った（「前立腺サブトラクション３」と呼ぶ）。これは、１Ｇ−４７６１、１Ｇ−４７６２、１Ｈ−４７６６、１Ｈ−４７７０、１Ｈ−４７７１、および１Ｈ−４７７２として呼ばれる、６個のさらなるクローン（配列番号９３〜９８）の同定を導いた。これらの配列と遺伝子バンクにおける配列との比較は、１Ｇ−４７６１および１Ｈ−４７７１（それぞれ、配列番号９３および９７）に対する有意な相同性を明らかにしなかった。単離されたクローンのさらなる分析は、１Ｇ−４７６１、１Ｇ−４７６２、１Ｈ−４７６６、および１Ｈ−４７７２に対して延長したｃＤＮＡ配列（それぞれ、配列番号１９４〜１９６および１９９に提供する）の決定、ならびに１Ｈ−４７７０および１Ｈ−４７７１に対するさらなる部分的ｃＤＮＡ配列（それぞれ、配列番号１９７および１９８に提供する）の決定を導いた。
【０９７０】
３人の前立腺癌患者に由来するポリＡ＋ＲＮＡプールから調製された前立腺腫瘍ｃＤＮＡライブラリーの、正常膵臓ｃＤＮＡライブラリーを用いてのサブトラクション（前立腺サブトラクション４）は、８個のクローン（１Ｄ−４２９７、１Ｄ−４３０９、１Ｄ．１−４２７８、１Ｄ−４２８８、１Ｄ−４２８３、１Ｄ−４３０４、１Ｄ−４２９６、および１Ｄ−４２８０と呼ぶ）（配列番号９９〜１０７）の同定を導いた。これらの配列を、上記のｇｅｎｅ  ｂａｎｋにおける配列と比較した。１Ｄ−４２８３および１Ｄ−４３０４（それぞれ、配列番号１０３および１０４）との有意な相同性は見出されなかった。単離されたクローンのさらなる分析は、１Ｄ−４３０９、１Ｄ．１−４２７８、１Ｄ−４２８８、１Ｄ−４２８３、１Ｄ−４３０４、１Ｄ−４２９６、および１Ｄ−４２８０の延長したｃＤＮＡ配列（それぞれ、配列番号２００〜２０６に提供する）の決定を導いた。
【０９７１】
上記の前立腺サブトラクション１および前立腺サブトラクション２において単離されたｃＤＮＡクローンをコロニーＰＣＲにより増幅し、そして前立腺腫瘍、正常前立腺における、および種々の他の正常組織におけるそれらのｍＲＮＡ発現レベルを、マイクロアレイ技術（Ｓｙｎｔｅｎｉ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて決定した。簡単には、ＰＣＲ増幅産物を、アレイフォーマットにおいてスライド上にドットし、各々の産物はこのアレイにおいて独自の位置を占めた。ｍＲＮＡを、試験される組織サンプルから抽出し、逆転写し、そして蛍光標識ｃＤＮＡプローブを作製した。マイクロアレイを、標識ｃＤＮＡプローブでプローブ化し、スライドをスキャンし、そして蛍光強度を測定した。この強度は、ハイブリダイゼーション強度と相関する。２個のクローン（Ｐ５０９ＳおよびＰ５１０Ｓと呼ぶ）は、前立腺腫瘍および正常前立腺において過剰発現され、そして試験された他の全ての正常組織（肝臓、膵臓、皮膚、骨髄、脳、乳房、副腎、膀胱、精巣、唾液腺、大腸、腎臓、卵巣、肺、脊髄、骨格筋、および結腸）において低レベルで発現されることが見出された。Ｐ５０９ＳおよびＰ５１０Ｓの決定されたｃＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号２２３および２２４に提供する。これらの配列と上記のｇｅｎｅ  ｂａｎｋにおける配列との比較は、以前に同定されたＥＳＴとのいくらかの相同性を明らかにした。
【０９７２】
さらに、研究は、Ｐ５０９Ｓについての完全長ｃＤＮＡ配列の単離をもたらした。この配列は、配列番号３３２に提供され、対応するアミノ酸配列は、配列番号３３９に提供される。Ｐ５１０Ｓについての２つの改変体完全長ｃＤＮＡ配列を、配列番号５３５および配列番号５３６に提供し、対応するアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号５３７および５３８に提供する。Ｐ５１０Ｓのさらなるスプライス改変体を、配列番号５９８および配列番号５９９に提供する。
【０９７３】
Ｐ５１０Ｓは、前立腺特異的様式で発現されることが見出された。免疫組織化学およびフローサイトメトリー分析は、Ｐ５１０Ｓが原形質膜会合分子であることを示した。他の多剤耐性関連輸送体タンパク質への配列類似性に基づいて、Ｐ５１０Ｓは、ＡＴＰ結合カセットを含む、細胞表面に発現される薬物輸送体タンパク質であると推定される。Ｐ５１０Ｓは、アミノ酸１３５〜１５１、２３３〜２４９、３３０〜３４６、３５１〜３６７、７１１〜７２７、７７５〜７９１、８５０〜８６６、８６７〜８８３および９５４〜９７０によってコードされると推定される９回膜結合ドメインを含む。Ｐ５１０ＳのＣ末端は、細胞内にあると推定される。潜在的Ｎ結合型グリコシル化部位は、アミノ酸Ｎ−６５１、Ｎ−６９０、Ｎ−７４６およびＮ７５４、Ｎ７９２、Ｎ−１１７６およびＮ−１３１２にある。
【０９７４】
前立腺特異的ｃＤＮＡライブラリーの特徴付けの間に単離されたさらなる前立腺特異的クローンについての決定されたｃＤＮＡ配列は、配列番号６１８〜６８９、６９１〜６９７および７０９〜７７２に提供される。公のデータベースにおける配列とこれらの配列の比較は、これらの配列のいずれに対しても有意な相同性が存在しないことを示した。
【０９７５】
（実施例２）
（前立腺特異的ポリペプチドの組織特異性の決定）
遺伝子特異的プライマーを用いて、代表的な前立腺腫瘍ポリペプチドＦ１−１６、Ｈ１−１、Ｊ１−１７（Ｐ５０２Ｓとも呼ぶ）、Ｌ１−１２（Ｐ５０１Ｓとも呼ぶ）、Ｆ１−１２（Ｐ５０４Ｓとも呼ぶ）、およびＮ１−１８６２（Ｐ５０３Ｓとも呼ぶ）についてのｍＲＮＡ発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、種々の正常組織および腫瘍組織において調べた。
【０９７６】
簡単には、総ＲＮＡを、上記のＴｒｉｚｏｌ試薬を用いて種々の正常組織および腫瘍組織から抽出した。第１鎖合成を、４２℃で１時間、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、１〜２μｇの総ＲＮＡを用いて行った。次いで、ｃＤＮＡを、遺伝子特異的プライマーを用いるＰＣＲにより増幅した。ＲＴ−ＰＣＲの半定量性質を確実にするために、β−アクチンを、調べられた組織各々の内部コントロールとして使用した。最初に、第１鎖ｃＤＮＡの連続希釈物を調製し、そしてＲＴ−ＰＣＲアッセイを、β−アクチン特異的プライマーを用いて行った。次いで、β−アクチンテンプレートの線状範囲増幅を可能にし、そして最初のコピー数の差違を反映するのに十分感度が高い希釈物を選択した。これらの条件を用いて、β−アクチンレベルを、各組識からの各々の逆転写反応について決定した。ＤＮＡ夾雑を、ＤＮａｓｅ処理により、そして逆転写酵素を添加することなく調製された第１鎖ｃＤＮＡを用いた場合のネガティブなＰＣＲ結果を保証することにより最小にした。
【０９７７】
ｍＲＮＡ発現レベルを、４つの異なる型の腫瘍組織（２人の患者に由来する前立腺腫瘍、３人の患者に由来する乳房腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍）、および１６の異なる正常組織（前立腺、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、骨格筋、皮膚、胃、精巣、骨髄、および脳を含む）において調べた。Ｆ１−１６は、前立腺腫瘍組織、結腸腫瘍、および正常前立腺において高レベルで、ならびに正常肝臓、皮膚、および精巣において低レベルで発現されることが見出され、調べられた他の組織における発現は検出可能でなかった。Ｈ１−１は、前立腺腫瘍、肺腫瘍、乳房腫瘍、正常前立腺、正常結腸、および正常脳において高レベルで、正常肺、膵臓、骨格筋、皮膚、小腸、骨髄において非常に低いレベルで発現されることが見出され、そして試験された他の組織においては検出されなかった。詳細には、Ｊ１−１７（Ｐ５０２Ｓ）およびＬ１−１２（Ｐ５０１Ｓ）は、前立腺において特異的に過剰発現されるらしく、両方の遺伝子は、前立腺腫瘍および正常前立腺において高レベルで発現されるが、調べられた他の全ての組織において低レベルから検出不可能なレベルで発現された。Ｎ１−１８６２（Ｐ５０３Ｓ）は、前立腺腫瘍の６０％において過剰発現され、そして正常結腸および正常腎臓において検出可能であることが見出された。従って、ＲＴ−ＰＣＲ結果は、Ｆ１−１６、Ｈ１−１、Ｊ１−１７（Ｐ５０２Ｓ）、Ｎ１−１８６２（Ｐ５０３Ｓ）、およびＬ１−１２（Ｐ５０４Ｓ）が前立腺特異的であるか、または前立腺において有意に上昇したレベルで発現されるかのいずれかであることを示す。
【０９７８】
さらなるＲＴ−ＰＣＲ研究は、Ｆ１−１２が、前立腺腫瘍の６０％において過剰発現され、正常腎臓において検出可能であるが、試験された他の全ての組織において検出不可能であることを示した。同様に、Ｒ１−２３３０は、前立腺腫瘍の４０％において過剰発現され、正常腎臓および肝臓において検出可能であるが、試験された他の全ての組織において検出不可能であることが示された。Ｕ１−３０６４は、前立腺腫瘍の６０％において過剰発現され、そしてまた乳房腫瘍および結腸腫瘍において発現されることが見出されたが、正常組織において検出不可能であった。
【０９７９】
Ｒ１−２３３０、Ｕ１−３０６４、および１Ｄ−４２７９のＲＴ−ＰＣＲ特徴付けは、これらの３つの抗原が前立腺および／または前立腺腫瘍において過剰発現されることを示した。
【０９８０】
４つの前立腺腫瘍、２つの正常前立腺サンプル、２つのＢＰＨ前立腺、ならびに正常結腸、腎臓、肝臓、肺、膵臓、骨格筋、脳、胃、精巣、小腸、および骨髄を用いたノザン分析は、Ｌ１−１２（Ｐ５０１Ｓ）が前立腺腫瘍および正常前立腺において過剰発現されるが、一方、試験された他の正常組織において検出不可能であることを示した。Ｊ１−１７（Ｐ５０２Ｓ）は２つの前立腺腫瘍において検出され、そして試験された他の組織において検出されなかった。Ｎ１−１８６２（Ｐ５０３Ｓ）は、３つの前立腺腫瘍において過剰発現され、そして正常前立腺、結腸、腎臓において発現されるが、試験された他の組織において発現されないことが見出された。Ｆ１−１２（Ｐ５０４Ｓ）は、２つの前立腺腫瘍において高く発現され、そして試験された他の全ての組織において検出不可能であることが見出された。
【０９８１】
上記のマイクロアレイ技術を使用して、前立腺腫瘍、乳房腫瘍、および以下の正常組織：前立腺、肝臓、膵臓、皮膚、骨髄、脳、乳房、副腎、膀胱、精巣、唾液腺、大腸、腎臓、卵巣、肺、脊髄、骨格筋、および結腸における本明細書中に記載の代表的な抗原の発現レベルを決定した。Ｌ１−１２（Ｐ５０１Ｓ）は、正常前立腺および前立腺腫瘍において過剰発現されることが見出され、いくらかの発現が正常骨格筋において検出された。Ｊ１−１２およびＦ１−１２（Ｐ５０４Ｓ）の両方は、前立腺腫瘍において過剰発現されることが見出され、試験された他の全ての組織における発現は、低いかまたは検出不可能であった。Ｎ１−１８６２（５０３Ｓ）は、前立腺腫瘍および正常前立腺において高レベルで発現され、そして正常大腸および正常結腸において低レベルで発現されることが見出され、試験された他の全ての組織における発現は検出不可能であった。Ｒ１−２３３０は、前立腺腫瘍および正常前立腺において過剰発現され、そして試験された他の全ての組織において低レベルで発現されることが見出された。１Ｄ−４２７９は、前立腺腫瘍および正常前立腺において過剰発現され、正常脊髄において低レベルで発現され、そして試験された他の全ての組織において検出不可能であることが見出された。
【０９８２】
Ｐ５０１Ｓ（配列番号１１０）が乳房腫瘍において発現される程度を、明確に検討するための、更なるマイクロアレイ分析は、乳房腫瘍においてだけではなく、転移乳房腫瘍（３１個中２個）においても、適度の過剰発現をすること、そして正常組織では無視できる程度から低い発現をすることを示した。このデータは、Ｐ５０１Ｓが、種々の乳房腫瘍および前立腺腫瘍において、過剰発現され得るということを示唆している。
【０９８３】
Ｖａｓｍａｔｚｉｓら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：３００〜３０４，１９９８）により記述された、３２個のＥＳＴ（発現された配列タグ）の種々の腫瘍および正常組織における発現レベルを、上記のマイクロアレイ技術により試験した。これらのクローンの二つ（Ｐ１０００ＣおよびＰ１００１Ｃと呼ぶ）は、前立腺腫瘍および正常前立腺において過剰発現され、そして試験された他の全ての組織（正常大動脈、胸腺、休止ＰＢＭＣおよび活性化ＰＢＭＣ、上皮細胞、脊髄、副腎、胎児組織、皮膚、唾液腺、大腸、骨髄、肝臓、肺、樹状細胞、胃、リンパ節、脳、心臓、小腸、骨格筋、結腸ならびに腎臓）において低レベル〜検出不能なレベルで発現されていることが見出された。Ｐ１０００ＣおよびＰ１００１Ｃについて決定されたのｃＤＮＡ配列を、配列番号３８４および４７２にそれぞれ提供する。Ｐ１００１Ｃの配列は、以前単離された、ＪＭ２７タンパク質のヒトｍＲＮＡに対して、いくらかの相同性を示すことが見出された。配列番号３８４の配列の、公開データベースの配列との次の比較は、Ｐ１０００Ｃ（配列番号９２９）の全長ｃＤＮＡ配列（４９２アミノ酸配列をコードする）の同定につながった。ＰＳＯＲＴＩＩプログラムを用いたアミノ酸配列の解析は、アミノ酸８４〜１００までの、推定上の膜貫通ドメインとの同定につながった。Ｐ１０００Ｃの、終止コドンを含むオープンリーディングフレームのｃＤＮＡ配列を、配列番号９３０に提供する。そして、Ｐ１０００Ｃの、終止コドンを含まないオープンリーディングフレームのｃＤＮＡ配列を、配列番号９３１に提供する。Ｐ１０００Ｃの全長アミノ酸配列を、配列番号９３２に提供する。配列番号９３３および９３４は、それぞれＰ１０００Ｃのアミノ酸１〜１００および１００〜４９２を表す。
【０９８４】
Ｆ１−１２（Ｐ５０４Ｓとも呼ぶ；配列番号１０８）の全長ｃＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドの発現を、免疫組織化学的分析により調査した。全長Ｐ５０４Ｓタンパク質に対するウサギ抗Ｐ５０４Ｓポリクローナル抗体を、標準的技術により産生した。それに続いて、そのポリクローナル抗体の単離および特徴づけもまた、当該分野で周知の技術により実行した。免疫組織化学的分析は、上記Ｐ５０４Ｓポリヌクレオチドペプチドが、試験された前立腺癌（ｎ＝５）のサンプルにおいて１００％発現されることを示した。
【０９８５】
上記ウサギ抗Ｐ５０４Ｓポリクローナル抗体は、良性前立腺細胞を同一の細胞質顆粒染色で標識していないようであり、むしろ光核染色で標識しているようであった。正常組織の分析は、上記コードされたポリペプチドは、いくつかのヒト組織において発現が見出されるが、全ての正常ヒト組織において発現が見出されるわけではない、ということを示した。ウサギ抗Ｐ５０４Ｓポリクローナル抗体を用いた陽性細胞質染色が、正常ヒト腎臓、肝臓、脳、結腸および肺感作マクロファージにおいて見出された。一方、心臓および骨髄は陰性であった。
【０９８６】
このデータは、上記Ｐ５０４Ｓポリペプチドが前立腺癌組織に存在するということ、および良性前立腺肥厚組織と前立腺癌組織との間には、染色において定量的差異および定性的差異が存在するということを示し、このポリペプチドは、前立腺腫瘍において選択的に検出され得、それゆえ前立腺癌の診断に有用であることを示唆する。
【０９８７】
（実施例３）
（ＰＣＲに基づくサブトラクションによる前立腺特異的ポリペプチドの単離および特徴付け）
１０個の他の正常組織ｃＤＮＡ（脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、卵巣、胎盤、骨格筋、脾臓、および胸腺）でサブトラクションされ、次いで、第１回のＰＣＲ増幅に供された、正常前立腺に由来するｃＤＮＡを含むｃＤＮＡサブトラクションライブラリーをＣｌｏｎｔｅｃｈから購入した。このライブラリーを、製造者のプロトコルに従って、第２回のＰＣＲ増幅に供した。得られたｃＤＮＡフラグメントを、ベクターｐＴ７  Ｂｌｕｅ  Ｔ−ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）にサブクローニングし、そしてＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’  Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。ＤＮＡを独立したクローンから単離し、そしてＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ３７３Ａを用いて配列決定した。
【０９８８】
５９個のポジティブクローンを配列決定した。これらのクローンのＤＮＡ配列と上記のｇｅｎｅ  ｂａｎｋにおけるＤＮＡ配列との比較は、これらのクローンのうちの２５個（本明細書中以下、Ｐ５、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１８、Ｐ２０、Ｐ３０、Ｐ３４、Ｐ３６、Ｐ３８、Ｐ３９、Ｐ４２、Ｐ４９、Ｐ５０、Ｐ５３、Ｐ５５、Ｐ６０、Ｐ６４、Ｐ６５、Ｐ７３、Ｐ７５、Ｐ７６、Ｐ７９、およびＰ８４と称する）との有意な相同性を明らかにしなかった。これらのクローンの決定されたｃＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号４１〜４５、４７〜５２、および５４〜６５に提供する。Ｐ２９、Ｐ４７、Ｐ６８、Ｐ８０、およびＰ８２（それぞれ、配列番号４６、５３、および６６〜６８）は、以前に同定されたＤＮＡ配列とある程度の相同性を示すことが見出された。本発明者らの知識の及ぶ限りでは、これらの配列のいずれもが、前立腺に存在すると以前に示されていなかった。
【０９８９】
標準全長クローニング法において、配列番号６７の配列をプローブとして使用するさらなる研究は、（Ｐ７０４Ｐとしても公知である）Ｐ８０のスプライシング改変体であると思われる３つのｃＤＮＡ配列の単離をもたらした。これらの配列を、配列番号６９９〜７０１に提供する。
【０９９０】
上記のＰＣＲに基づく方法論を用いるさらなる研究は、１８０を超えるさらなるクローンの単離をもたらし、これらのうち２３個のクローンは、既知の配列との有意な相同性を示さないことが見出された。これらのクローンに対して決定されたｃＤＮＡ配列を、配列番号１１５〜１２３、１２７、１３１、１３７、１４５、１４７〜１５１、１５３、１５６〜１５８、および１６０に提供する。２３個のクローン（配列番号１２４〜１２６、１２８〜１３０、１３２〜１３６、１３８〜１４４、１４６、１５２、１５４、１５５、および１５９）は、以前に同定されたＥＳＴとのいくらかの相同性を示すことが見出された。さらなる１０個のクローン（配列番号１６１〜１７０）は、既知遺伝子とのある程度の相同性を有することが見出された。上記Ｐ２０配列を含む、より大きなｃＤＮＡクローンは、Ｐ７０３Ｐと呼ぶ遺伝子のスプライシング改変体を意味する。ＤＥ１、ＤＥ１３、およびＤＥ１４と呼ぶ改変体に対して決定されたＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号１７１、１７５、および１７７に提供し、対応するアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１７２、１７６、および１７８に提供する。広範囲のスプライスされた（Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｓｐｌｉｃｅｄ）形体のＰ７０３に対して決定されたｃＤＮＡ配列を、配列番号２２５に提供する。ＤＥ２およびＤＥ６と呼ぶスプライシング改変体のＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号１７３および１７４に提供する。
【０９９１】
腫瘍組織（前立腺（ｎ＝５）、乳房（ｎ＝２）、結腸、および肺）、正常組織（前立腺（ｎ＝５）、結腸、腎臓、肝臓、肺（ｎ＝２）、卵巣（ｎ＝２）、骨格筋、皮膚、胃、小腸、および脳）、ならびに活性化および非活性化ＰＢＭＣにおける代表的なクローンのｍＲＮＡ発現レベルを、上記のようにＲＴ−ＰＣＲにより決定した。他に示さない限り、各組識型の１サンプルにおける発現を調べた。
【０９９２】
Ｐ９は、試験された全ての正常組織（匹敵する発現を示した正常結腸を除く）と比較して、正常前立腺および前立腺腫瘍において高度に発現されることが見出された。Ｐ２０（上記Ｐ７０３Ｐ遺伝子の一部分）は、試験された１２個全ての正常組織と比較して、正常前立腺および前立腺腫瘍において高度に発現されることを見出した。肺（２個のうち１個）を除く全ての正常組織と比較して、乳房腫瘍（ｎ＝２）、結腸腫瘍、および肺腫瘍におけるＰ２０発現のあまり大きくない増加が見られた。Ｐ１８の発現の増加が、肺および胃を除く他の正常組織と比較して、正常前立腺、前立腺腫瘍、および乳房腫瘍において見出された。Ｐ５の発現のささやかな増加が、他のほとんどの正常組織と比較して、正常前立腺において観察された。しかし、いくらか上昇した発現が、正常肺およびＰＢＭＣにおいて見られた。Ｐ５の上昇した発現もまた、前立腺腫瘍（５個のうち２個）、乳房腫瘍、および１個の肺腫瘍サンプルにおいて観察された。Ｐ３０については、試験された他の１２個の正常組織のうち６個と比較して、同様の発現レベルが正常前立腺および前立腺腫瘍において見られた。増加した発現は、乳房腫瘍、１個の肺腫瘍サンプル、および１個の結腸腫瘍サンプルにおいて見られ、そしてまた正常ＰＢＭＣにおいて見られた。Ｐ２９は、正常組織の大部分と比較して、前立腺腫瘍（５個のうち５個）および正常前立腺（５個のうち５個）において過剰発現されることが見出された。しかし、Ｐ２９の実質的な発現は、正常結腸および正常肺（２個のうち２個）において観察された。Ｐ８０は、試験された他の全ての正常組織と比較して、前立腺腫瘍（５個のうち５個）および正常前立腺（５個のうち５個）において過剰発現されることを見出され、増加した発現が結腸腫瘍においても見出された。
【０９９３】
さらなる研究は、１２個のさらなるクローン（本明細書中以下、１０−ｄ８、１０−ｈ１０、１１−ｃ８、７−ｇ６、８−ｂ５、８−ｂ６、８−ｄ４、８−ｄ９、８−ｇ３、８−ｈ１１、９−ｆ１２、および９−ｆ３と呼ぶ）の単離をもたらした。１０−ｄ８、１０−ｈ１０、１１−ｃ８、８−ｂ４、８−ｄ９、８−ｈ１１、９−ｆ１２、および９−ｆ３の決定されたＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号２０７、２０８、２０９、２１６、２１７、２２０、２２１、および２２２に提供する。７−ｇ６、８−ｂ５、８−ｂ６、および８−ｇ３の決定された正方向および逆方向ＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号２１０および２１１；２１２および２１３；２１４および２１５；ならびに２１８および２１９に提供する。これらの配列とｇｅｎｅ  ｂａｎｋにおける配列との比較は、９−ｆ３の配列との有意な相同性を明らかにしなかった。クローン１０−ｄ８、１１−ｃ８、および８−ｈ１１は、以前に単離されたＥＳＴとのいくらかの相同性を示すことが見出されたが、一方、１０−ｈ１０、８−ｂ５、８−ｂ６、８−ｄ４、８−ｄ９、８−ｇ３、および９−ｆ１２は、以前に同定された遺伝子とのいくらかの相同性を示すことが見出された。７−Ｇ６および８−Ｇ３のさらなる特徴付けは、公知の遺伝子であるＰＡＰおよびＰＳＡとの同一性をそれぞれ示した。
【０９９４】
これらのクローンに関するｍＲＮＡの発現レベルを、上記のマイクロアレイ技術を用いて決定した。上記クローン７−Ｇ６、８−Ｇ３、８−Ｂ５、８−Ｂ６、８−Ｄ４、８−Ｄ９、９−Ｆ３、９−Ｆ１２、９−Ｈ３、１０−Ａ２、１０−Ａ４、１１−Ｃ９および１１−Ｆ２は、試験された他の組織での発現は低いかまたは検出不能であるにもかかわらず、前立腺腫瘍および正常前立腺において過剰発現されることが見出された。８−Ｆ１１の発現増加が、前立腺腫瘍ならびに正常な前立腺、膀胱、骨格筋および結腸において見られた。１０−Ｈ１０の発現増加が、前立な腺腫瘍ならびに正常前立腺、膀胱、肺、結腸、脳および大腸において見られた。９−Ｂ１の発現増加が、前立な腺腫瘍、乳房腫瘍、ならびに正常前立腺、唾液腺、大腸および皮膚において見られた。そして、１１−Ｃ８の発現増加が、前立腺腫瘍ならびに正常な前立腺および大腸において見られた。
【０９９５】
上記のＰＣＲに基づく正常前立腺サブトラクション由来の、さらなるｃＤＮＡのフラグメントは、マイクロアレイ技術およびＲＴ−ＰＣＲの両方により前立腺特異的であることが見出された。（９−Ａ１１と呼ぶ）このクローンの、決定されたｃＤＮＡ配列を、配列番号２２６に提供する。この配列の公開データベース中での配列との比較により、公知遺伝子ＨＯＸＢ１３と９９％の同一性があることが明らかになった。
【０９９６】
さらなる研究は、上記クローン８−Ｃ６および８−Ｈ７の単離をもたらした。これらのクローンに対して決定されたｃＤＮＡの配列を、配列番号２２７および２２８にそれぞれ提供する。これらの配列は、以前に単離されたＥＳＴとのいくらかの相同性を示すことが見出された。
【０９９７】
ＰＣＲに基づく方法論およびバイブリダイゼーションに基づく方法論を、クローンＰ２０（Ｐ７０３Ｐとも呼ぶ）の、より長いｃＤＮＡ配列を取得するために使い、そして上記遺伝子の５’末端を漸次拡張する、さらに３つのｃＤＮＡフラグメントを生産した。これらのフラグメント（Ｐ７０３ＰＤＥ５、Ｐ７０３Ｐ６．２６、およびＰ７０３ＰＸ−２３（配列番号３２６、３２８、３３０および対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３２７、３２９、３３１に提供する）と呼ぶ）は、追加の５’配列を含む。Ｐ７０３ＤＥ５を、Ｐ７０３Ｐの一部をプローブとして用いることにより、ｃＤＮＡライブラリー（番号１４１−２６）をスクリーニングすることにより回収した。Ｐ７０３Ｐ６．２６を、３つの前立腺腫瘍ｃＤＮＡの混合物から回収し、そしてＰ７０３ＰＸ＿２３を、ｃＤＮＡライブラリー（番号４３８−４８）から回収した。まとめると、更なる配列は、推定上の成熟セリンプロテアーゼの全ておよび推定上のシグナル配列の一部を含む。Ｐ７０３Ｐの全長ｃＤＮＡ配列を、配列番号５２４に提供し、そしてその対応するアミノ酸配列を配列番号５２５に提供する。
【０９９８】
コンピューターのアルゴリズムを用いて、Ｐ７０３Ｐの以下の領域は潜在的ＨＬＡ  Ａ２結合ＣＴＬエピトープを表すと予測した；配列番号５２５のアミノ酸１６４〜１７２（配列番号８６６）；配列番号５２５のアミノ酸１６０〜１６８（配列番号８６７）；配列番号５２５のアミノ酸２３９〜２４７（配列番号８６８）；配列番号５２５のアミノ酸１１８〜１２６（配列番号８６９）；配列番号５２５のアミノ酸１１２〜１２０（配列番号８７０）；配列番号５２５のアミノ酸１５５〜１６４（配列番号８７１）；配列番号５２５のアミノ酸１１７〜１２６（配列番号８７２）；配列番号５２５の１６４〜１７３（配列番号８７３）；配列番号５２５の１５４〜１６３（配列番号８７４）；配列番号５２５の１６３〜１７２（配列番号８７５）；配列番号５２５の５８〜６６（配列番号８７６）；および配列番号５２５の５９〜６７（配列番号８７７）。
【０９９９】
Ｐ７０３Ｐは、以前同定されたプロテアーゼ（例えば、トロンビン）に対していくらかの相同性を示すことが示された。そのトロンビンレセプターは、非常に転移性の乳癌細胞および乳癌生検サンプル中で優先的に発現されることが示されている。トロンビンレセプターアンチセンスｃＤＮＡの導入は、培養中で転移性乳癌細胞の湿潤を妨害することが示されている。トロンビンレセプターに対する抗体は、トロンビンレセプターの活性化およびトロンビン誘導化血小板活性化を阻害する。さらに、そのレセプターのリガンド拘束ドメインに類似するペプチドは、トロンビンによる血小板凝集を阻害する。Ｐ７０３Ｐは、癌細胞上のプロテアーゼ活性化レセプターまたは間質細胞上のプロテアーゼ活性化レセプターを通して、前立腺癌において役割を果たし得る。Ｐ７０３Ｐの潜在的トリプシン様プロテアーゼ活性化は、腫瘍摘出を促進するために癌細胞膜上のプロテアーゼ活性化レセプターを活性化し得るか、または増殖因子ならびに／もしくは腫瘍血管新生、腫瘍湿潤および腫瘍転移を促進し得る他のプロテアーゼ（例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ）を分泌するために、隣接細胞（例えば、間質細胞）上のプロテアーゼ活性化レセプターを活性化し得る。Ｐ７０３Ｐは、従って、プロテアーゼ活性化レセプターの活性化により、腫瘍の進行および／または転移を促進し得る。従って、Ｐ７０３Ｐと、受容体との相互作用を阻害するポリペプチドおよび抗体を、前立腺癌の治療において、有用に使用し得る。
【１０００】
Ｐ７０３Ｐの発現が、Ｇｌｅａｓｏｎ分類の重症度（腫瘍の病期の指標）の増加と共に増加するか否かを決定するため、Ｇｌｅａｓｏｎスコア５〜＞８の範囲の前立腺腫瘍サンプルの定量的ＰＣＲ分析を行った。Ｐ７０３Ｐの発現の平均レベルは、Ｇｌｅａｓｏｎスコアの増加と共に増加した。これは、Ｐ７０３Ｐの発現は、病気の重症度の増加と相互関係を示し得るということを示した。
【１００１】
正常組織のプールに対して取り除いた前立腺腫瘍のプールの、ＰＣＲに基づくサブトラクションライブラリー（ＪＰと呼ぶ：ＰＣＲサブトラクション）を用いたさらなる研究では、１３個の追加コロニーの単離を生じ、そのうち７個は、公知のＧｅｎＢａｎｋ配列と有意な相同性を共有しなかった。これらの７個のクローン（Ｐ７１１Ｐ，Ｐ７１２Ｐ，新規２３，Ｐ７７４Ｐ，Ｐ７７５Ｐ，Ｐ７１０ＰおよびＰ７６８Ｐ）に対して決定されたｃＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号３０７〜３１１、３１３および３１５に提供する。残り６個のクローン（配列番号３１６および３２１〜３２５）は、公知の遺伝子に対していくらかの相同性を共有することが示された。マイクロアレイ分析により、１３個のクローンは全て、正常非前立腺組織と比較して、前立腺組織（前立腺腫瘍、ＢＰＨおよび正常前立腺を含む）において３倍以上の過剰発現を示した。クローンＰ７１１Ｐ、Ｐ７１２Ｐ、新規２３およびＰ７６８Ｐは、試験されたほとんどの前立腺腫瘍およびＢＰＨ組織（ｎ＝２９）ならびに大部分の正常前立腺組織（ｎ＝４）において過剰発現を示したが、全ての正常組織においてはバックグラウンド〜低レベルの発現を示した。クローンＰ７７４Ｐ，Ｐ７７５ＰおよびＰ７１０Ｐは、比較的低い発現を示し、より少数の前立腺腫瘍サンプルおよびＢＰＨサンプルで発現を示し、正常前立腺ではネガティブ発現〜低い発現であった。
【１００２】
さらなる研究は、Ｐ７１２Ｐ（配列番号５５２）の延長ｃＤＮＡ配列の単離につながった。配列番号５５２の配列内に存在する１６個の推定オープンリーディングフレームにコードされるアミノ酸配列を、配列番号５５３〜５６８に提供する。
【１００３】
Ｐ７１１Ｐの全長ｃＤＮＡを、配列番号３０７の部分配列を用いて、前立腺ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより取得した。具体的には、直接クローン化した前立腺腫瘍ｃＤＮＡライブラリーを、標準的技術を用いて調製した。このライブラリーの１００万個のコロニーを、ＬＢ／Ａｍｐのプレートに撒いた。ナイロン膜フィルタを用いてこれらのコロニーを持ち上げ、そしてこれらのフィルターによってピックアップしたｃＤＮＡを変性させ、ＵＶ光で膜に架橋した。Ｐ７１１ＰのｃＤＮＡフラグメント（配列番号３０７）を放射線標識し、そしてこれらのフィルターと共にハイブリダイズするために使用した。ポジティブなクローンを選別し、そしてｃＤＮＡを調製し、そして自動化Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓシークエンサーを用いて配列決定した。Ｐ７１１Ｐの既定の全長配列を、配列番号３８２に提供し、対応するアミノ酸配列を配列番号３８３に提供する。
【１００４】
ＰＣＲおよびハイブリダイゼーションに基づく方法論を用いて、さらなるｃＤＮＡ配列情報を、上記の２つのクローン、１１−Ｃ９および９−Ｆ３に関して引き出した。１１−Ｃ９および９−Ｆ３は、本明細書中で後に、それぞれＰ７０７ＰおよびＰ７１４Ｐ（配列番号３３３および３３４）と呼ばれる。最も最近のＧｅｎＢａｎｋとの比較の後、Ｐ７０７Ｐは、既知の遺伝子ＨｏｘＢ１３のスプライシング改変体であることが見出された。対照的に、Ｐ７１４Ｐに対する有意な相同性を何も検出しなかった。標準全長クローニング法において、配列番号３３４の配列をプローブとして用いるさらなる研究は、Ｐ７１４Ｐの延長ｃＤＮＡ配列をもたらした。この配列を、配列番号６９８に提供する。この配列は、ヒトリボソームＬ２３Ａタンパク質をコードする遺伝子とのいくらかの相同性を示すことが見出された。
【１００５】
クローン８−Ｂ３，Ｐ８９，Ｐ９８，Ｐ１３０およびＰ２０１（１９９８年２月９日に出願された米国特許出願第０９／０２０，９５６号に開示される）は、一つの隣接配列（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）内に含まれることが見出され、Ｐ７０５Ｐ（配列番号３３５に提供されるｃＤＮＡ配列および配列番号３３６に提供されるアミノ酸配列）と呼ばれ、Ｐ７０５Ｐを、公知の遺伝子ＮＫＸ３．１のスプライシング改変体であると決定した。後の研究は、Ｐ７０５Ｐの訂正ｃＤＮＡ配列の単離につながった。この配列のコード領域を、配列番号９４８に提供する。
【１００６】
Ｐ７７５Ｐに関するさらなる研究は、全てＰ７７５Ｐ遺伝子のスプライシング改変体である４個の追加配列（配列番号４７３〜４７６）の単離を生じた。配列番号４７４の配列は、２個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有することを見出した。これらのＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列を、配列番号４７７および４７８に提供する。配列番号４７５のｃＤＮＡ配列は、配列番号４７９のアミノ酸配列をコードするＯＲＦを含有することを見出された。配列番号４７３のｃＤＮＡ配列は、４個のＯＲＦを含有することを見出された。これらのＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列を、配列番号４８０〜４８３に提供する。Ｐ７７５Ｐの追加のスプライシング改変体を、配列番号５９３〜５９７に提供する。
【１００７】
後の研究は、５個の前立腺遺伝子Ｐ７０４Ｐ，Ｐ７１２Ｐ，Ｐ７７４Ｐ，Ｐ７７５ＰおよびＢ３０５Ｄを含有する染色体２２ｑ１１．２上のゲノム領域（猫の目症候群（Ｃａｔ  Ｅｙｅ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）領域として公知である）の同定をもたらした。このゲノム領域内の、これら５個の遺伝子の各々の相対的位置を、図１０に示す。この領域は、従って、悪性腫瘍に関係し得、そして他の潜在的腫瘍遺伝子は、この領域内に含まれ得る。これらの研究はまた、Ｐ７７５Ｐ（配列番号５３３に提供する）の潜在的オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の同定につながった。Ｐ７７５Ｐは、配列番号５３４のアミノ酸配列をコードする。
【１００８】
配列番号３２５（Ｐ５５８Ｓと呼ぶ）のクローンのＧｅｎＢａｎｋ中での配列およびＧｅｎｅＳｅｑ  ＤＮＡデータベース中での配列との比較は、Ｐ５５８Ｓが前立腺特異的トランスグルタミナーゼ遺伝子（２つの形態を有することが公知である）と同一であることを示した。これらの２つの形態の全長配列を、配列番号７７３および７７４に提供し、対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号７７５および７７６に提供する。配列番号７７４のｃＤＮＡ配列は、１５塩基対の挿入断片を有し、対応するアミノ酸配列（配列番号７７６）中に５アミノ酸挿入断片を生じる。このインサートは、配列番号７７３の配列中に存在しない。
【１００９】
Ｐ７６８Ｐ（配列番号３１５）に関するさらなる研究は、推定上の全長オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の同定をもたらした。終止コドンを有するＯＲＦのそのｃＤＮＡ配列を、配列番号９０７に提供する。終止コドンを有さないＯＲＦのｃＤＮＡ配列を、配列番号９０８に提供し、対応するアミノ酸配列を配列番号９０９に提供する。この配列は、ラットのカルシウムトランスポータータンパク質との８６％の同一性を示すことが見出され、これは、Ｐ７６８Ｐが、ヒトのカルシウムトランスポータータンパク質を表し得るということを示している。Ｐ７６８Ｐ内の膜貫通ドメインの位置を、ＰＳＯＲＴＩＩコンピューターのアルゴリズムを用いて予測した。６回膜貫通ドメインを、アミノ酸位置１１８〜１３４、１７２〜１８８、２１１〜２２７、２３０〜２４６、２８２〜２９８および３４８〜３６４と予測した。配列番号９１０〜９１５のアミノ酸配列は、Ｐ７６８Ｐのアミノ酸１〜１３４、１３５〜１８８、１８９〜２２７、２２８〜２４６、２４７〜２９８および２９９〜５１１をそれぞれ表す。
【１０１０】
（実施例４）
（ポリペプチド合成）
ポリペプチドを、ＨＰＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）活性化を用いるＦＭＯＣ化学を用いて、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３０Ａペプチド合成機において合成し得る。Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ配列をペプチドのアミノ末端に接着して、共役、固定化表面への結合、またはペプチド標識の方法を提供し得る。固相支持体からのペプチドの切断を、以下の切断混合物：トリフルオロ酢酸：エタンジチオール：チオアニソール：水：フェノール（４０：１：２：２：３）を用いて行い得る。２時間にわたる切断の後、そのペプチドを、冷メチル−ｔ−ブチル−エーテル中で沈殿させ得る。次いで、そのペプチドペレットを、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水に溶解し、そしてＣ１８逆相ＨＰＬＣによる精製前に凍結乾燥し得る。水（０．１％ＴＦＡを含む）中の０％〜６０％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡを含む）勾配を使用して、そのペプチドを溶出し得る。純粋画分の凍結乾燥後、そのペプチドを、エレクトロスプレーまたは他の型の質量分析法を用いて、およびアミノ酸分析により特徴付け得る。
【１０１１】
（実施例５）
（ＰＣＲベースのサブトラクションによるプロテアーゼ特異的ポリペプチドのさらなる単離および特徴付け）
上記のように前立腺原発性腫瘍ｍＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリーを、正常前立腺由来のｃＤＮＡでサブトラクト（ｓｕｂｔｒａｃｔ）した。そのサブトラクションを、より大きなフラグメントを生成するように改変したＰＣＲベースのプロトコル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して行った。このプロトコル内で、試験二本鎖ｃＤＮＡおよびドライバ二本鎖ｃＤＮＡを、６ヌクレオチド制限部位を認識する５つの制限酵素（ＭｌｕＩ、ＭｓｃＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳａｌＩおよびＳｔｕＩ）で別々に消化した。この消化により、そのＣｌｏｎｔｅｃｈプロトコルに従ってＲｓａＩでの消化から生じた３００ｂｐの平均サイズではなく、６００ｂｐの平均ｃＤＮＡサイズが生じた。この改変は、サブトラクション効率に影響を及ぼさなかった。２つの試験集団を、次いで、異なるアダプタを用いて作製し、そのドライバライブラリーは、アダプタなしのままにした。
【１０１２】
その試験ライブラリーおよびドライバライブラリーを、次いで、過剰なドライバｃＤＮＡを用いてハイブリダイズさせた。第１のハイブリダイゼーション工程において、ドライバを、その２つの試験ｃＤＮＡ集団の各々と別々にハイブリダイズさせた。このことにより、（ａ）ハイブリダイズしていない試験ｃＤＮＡ、（ｂ）他の試験ｃＤＮＡにハイブリダイズした試験ｃＤＮＡ、（ｃ）ドライバｃＤＮＡにハイブリダイズした試験ｃＤＮＡ、および（ｄ）ハイブリダイズしていないドライバｃＤＮＡの集団が生じた。次いで、その２つの別々のハイブリダイゼーション反応物を合わせて、さらなる変性したドライバｃＤＮＡの存在下で再ハイブリダイズさせた。この第２のハイブリダイゼーション後に、（ａ）〜（ｄ）の集団に加えて、第５の集団（ｅ）を生成し、この集団において、１つのアダプタを有する試験ｃＤＮＡを、第２のアダプタを有する試験ｃＤＮＡにハイブリダイズさせた。それに応じて、第２のハイブリダイゼーション工程により、差次的に発現された配列の富化が生じた。この配列を、アダプタ特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用し得た。
【１０１３】
次いで、その末端を埋め、ＰＣＲ増幅を、アダプタ特異的プライマーを用いて行った。集団（ｅ）のみ（この集団は、ドライバｃＤＮＡにハイブリダイズしなかった試験ｃＤＮＡを含んでいた）を、指数関数的に増幅した。次いで、第２のＰＣＲ増幅工程を行って、バックグラウンドを減少させ、差次的に発現された配列をさらに富化した。
【１０１４】
このＰＣＲベースのサブトラクション技術は、差次的に発現されたｃＤＮＡを正規化して、前立腺腫瘍組織において過剰発現されたまれな転写物が、回収可能であるようにしうる。このような転写物は、伝統的なサブトラクション方法によって回収するには困難である。
【１０１５】
前立腺腫瘍において過剰発現することが公知の遺伝子に加えて、７７個のさらなるクローンを同定した。これらの部分的ｃＤＮＡの配列は、配列番号２９〜３０５において提供される。これらのクローンの大部分は、データベース配列に対して有意な相同性を有さなかった。例外は、ＪＰＴＰＮ２３（配列番号２３１；ブタバロシン（ｖａｌｏｓｉｎ）含有タンパク質に対する類似性）、ＪＰＴＰＮ３０（配列番号２３４；プロテアソームサブユニットのラットｍＲＮＡに対する類似性）、ＪＰＴＰＮ４５（配列番号２４３；ラットｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ細胞質ＮＡＤＰ依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼに対する類似性）、ＪＰＴＰＮ４６（配列番号２４４；ヒトサブクローンＨ８  ４  ｄ４  ＤＮＡ配列に対する類似性）、ＪＰ１Ｄ６（配列番号２６５；Ｇ．ｇａｌｌｕｓダイニン軽鎖−Ａに対する類似性）、ＪＰ８Ｄ６（配列番号２８８；ヒトＢＡＣクローンＲＧ０１６Ｊ０４に対する類似性）、ＪＰ８Ｆ５（配列番号２８９；ヒトサブクローンＨ８  ３  ｂ５  ＤＮＡ配列に対する類似性）、およびＪＰ８Ｅ９（配列番号２９９；ヒトＡｌｕ配列に対する類似性）であった。
【１０１６】
正常前立腺プールに対してサブトラクトした前立腺腫瘍プールからなるＰＣＲベースのサブトラクションライブラリーを使用するさらなる研究（ＰＴ−ＰＮ  ＰＣＲサブトラクションといわれる）により、３つのさらなるクローンが得られた。これらのクローンのｃＤＮＡ配列と、ＧｅｎＢａｎｋの最近公開されたものとを比較すると、その２つのクローン（Ｐ７１５ＰおよびＰ７６７Ｐ（配列番号３１２および３１４）といわれる）に対して有意な相同性はないことが明らかになった。残りのクローンを、既知の遺伝子ＫＩＡＡ００５６（配列番号３１８）に対していくらかの相同性を示すことが分かった。種々の組織におけるＲＮＡ発現レベルを測定するためにマイクロアレイ分析を使用すると、全ての３つのクローンが、前立腺腫瘍およびＢＰＨ組織において過剰発現されることが分かった。具体的には、クローンＰ７１５Ｐは、大部分の前立腺腫瘍およびＢＰＨ組織において、３倍以上過剰発現され、上昇した発現が、正常前立腺サンプルの大部分および胎児組織においてみられるが、全ての他の正常な組織における低い発現に対して逆（ｎｅｇａｔｉｖｅ）である。クローンＰ７６７Ｐは、いくつかの前立腺腫瘍およびＢＰＨ組織において過剰発現され、正常な前立腺サンプルの半分において中程度の発現レベルを有し、そして試験された全ての他の正常な組織における低い発現に対してバックグラウンドである。
【１０１７】
上記のマイクロアレイによって、ＰＴ−ＰＮ  ＰＣＲサブトラクションライブラリーおよび正常組織ｃＤＮＡのプールでサブトラクトした前立腺腫瘍に由来するｃＤＮＡを含むＤＮＡサブトラクションライブラリーのさらなる分析は、２７のさらなるクローン（配列番号３４０〜３６５および３８１）の単離をもたらした。これらのクローンは、前立腺腫瘍において過剰発現されることが決定された。配列番号３４１、３４２、３４５、３４７、３４８、３４９、３５１、３５５〜３５９、３６１、３６２および３６４のクローンもまた、正常前立腺において発現されることが分かった。種々の正常組織における全ての２６個のクローンの発現は、Ｐ５４４Ｓ（配列番号３５６）（これは、小腸において発現されることが分かった）を除いて、低いかまたは検出不能であることが分かった。２６クローンのうち、１１個（配列番号３４０〜３４９および３６２）は、以前に同定された配列に対していくらかの相同性を示すことが分かった。配列番号３５０、３５１、３５３〜３６１、および３６３〜３６５のクローンに対する有意な相同性は見いだされなかった。
【１０１８】
配列番号３６２の配列と、ＧｅｎＢａｎｋおよびＧｅｎｅＳｅｑのＤＮＡデータベースにおける配列との比較により、このクローン（Ｐ７８８Ｐといわれる）が、ＧｅｎｅＳｅｑ登録番号Ｘ２７２６２（これは、ＧｅｎｅＳｅｑタンパク質登録番号Ｙ００９３１において見いだされるタンパク質をコードする）に同一であることが示された。Ｐ７８８Ｐの全長ｃＤＮＡ配列は、配列番号７７７において示され、その対応するアミノ酸は、配列番号７７８において示される。その後、配列番号７７９の配列において見いだされない多型を含むＰ７８８Ｐの全長ｃＤＮＡ配列を、３個体に由来するいくつかのＲＮＡテンプレートから調製したｃＤＮＡからのＰＣＲ増幅によって、複数回クローニングした。Ｐ７８８Ｐのこの多型改変体のこの決定されたｃＤＮＡ配列は、配列番号７７９において提供され、その対応するアミノ酸配列は、配列番号７８０に提供される。配列番号７８０の配列は、配列番号７７８の配列とは６アミノ酸残基だけ異なる。そのＰ７８８Ｐタンパク質は、Ｃ末端部分における７つの潜在的膜貫通ドメインを有し、細胞外Ｎ末端領域を有する原形質膜タンパク質であると推定される。
【１０１９】
配列番号３５２（Ｐ７９０Ｐといわれる）のクローンに関するさらなる研究により、配列番号５２６の全長ｃＤＮＡ配列の単離がもたらされた。その対応するアミノ酸は、配列番号５２７に提供される。２つの定量的ＰＣＲ実験からのデータは、Ｐ７９０Ｐが、１５個の試験した前立腺腫瘍サンプルのうちの１１個において過剰発現され、脊髄において低いレベルで発現され、試験された全ての他の正常サンプルにおいて発現はみられなかったことを示した。さらなるＰＣＲ実験およびマイクロアレイ実験からのデータにより、正常前立腺および前立腺腫瘍において過剰発現され、他の試験された組織においてはほとんどまたは全く発現されないことが示された。Ｐ７９０Ｐは、その後、以前同定されたＧタンパク質共役前立腺組織レセプターに対して有意な相同性を示すことが分かった。
【１０２０】
配列番号３５４（Ｐ７７６Ｐといわれる）のクローンに対するさらなる研究により、配列番号５６９に提供される伸長されたｃＤＮＡ配列の単離がもたらされた。Ｐ７７６Ｐの３つのさらなるスプライス改変体のその決定されたｃＤＮＡ配列は、配列番号５７０〜５７２に提供される。配列番号５７０内に含まれる２つの推定オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、配列番号５７１内に含まれる１つの推定ＯＲＦ、配列番号５６９内に含まれる１１個の推定ＯＲＦによってコードされるアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号５７３〜５８６において提供される。さらなる研究により、配列番号５７０のクローンの全長配列（配列番号８８０に提供される）の単離がもたらされた。配列番号５７１のクローンに対する全長クローニングの取り組みにより、単一のクローンを表す２つの配列（配列番号８８１および８８２において提供される）の単離がもたらされ、その２つの配列は、１２９３位における多型的な挿入／欠失を除いて、同一である。具体的には、配列番号８８２のクローン（クローンＦ１といわれる）は、１２９３位においてＣを有する。配列番号８８１のクローン（クローンＦ２といわれる）は、１２９３位において１塩基対の欠失を有する。配列番号８８０内に位置する５個のオープンリーディングフレームによってコードされるその推定アミノ酸配列は、配列番号８８３〜８８７に提供され、配列番号８８１および８８２のクローンによってコードされるその推定アミノ酸配列は、配列番号８８８〜８９３に提供される。
【１０２１】
そのクローンＰ７６７Ｐ（配列番号３１４）およびＰ７７７Ｐ（配列番号３５０）のｃＤＮＡ配列と、ＧｅｎＢａｎｋヒトＥＳＴデータベースにおける配列とを比較すると、その２つのクローンが、共通して多くのＥＳＴ配列とマッチしたことが示され、このことは、Ｐ７６７ＰおよびＰ７７７Ｐが、同じ遺伝子を表しうることを示唆する。Ｐ７６７Ｐ、Ｐ７７７Ｐおよび複数のＥＳＴクローンのＤＮＡ配列アラインメントから得られたＤＮＡコンセンサス配列は、配列番号５８７に提供される。配列番号５８７内に位置する３つの推定ＯＲＦによってコードされるそのアミノ酸配列は、配列番号５８８〜５９０に提供される。
【１０２２】
配列番号３４２のクローン（Ｐ７８９Ｐといわれる）は、以前に同定された遺伝子に対する相同性を示すことが分かった。Ｐ７８９Ｐの全長ｃＤＮＡ配列およびその対応するアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号８７８および８７９に提供される。
【１０２３】
配列番号３５５の配列（Ｐ７８０Ｐといわれる）と、Ｇｅｎｅｓｅｑ  ＤＮＡデータベースにおける配列との比較により、Ｐ７８０Ｐが、ＧｅｎｅＳＥＱ登録番号Ｚ２９０４９およびＺ２９０５０（それぞれ、配列番号９４４および９４５）との１００％の配列同一性を共有することが明らかになった。Ｚ２９０４９およびＺ２９０５０は、Ｚ２９０４９が、Ｚ２９０５０に対して７１４ｂｐの欠失を含むという点で、互いに異なる。従って、Ｚ２９０４９およびＺ２９０５０は、遺伝子Ｐ７８０Ｐの２つの選択的スプライス形態を表すようである。Ｚ２９０４９は、３７９アミノ酸長であるタンパク質（ＧｅｎｅＳｅｑ登録番号Ｙ１５１５５；配列番号９４６）をコードする。Ｚ２９０５０は、６１７アミノ酸長であるタンパク質（ＧｅｎｅＳｅｑ登録番号Ｙ１５１５６；配列番号９４７）をコードする。これらの２つのタンパク質は、Ｙ１５１５５が、Ｙ１５１５６に対して２３８アミノ酸欠失を含むことを除いて、同一である。このアミノ酸欠失は、Ｚ２９０４９における７１４ｂｐ欠失に対応する。
【１０２４】
（実施例６）
（マウスのペプチド感作およびＣＴＬ株の増殖）
６．１．この実施例は、Ｐ５０２Ｓ遺伝子を発現する細胞に特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）細胞株の調製を例示する。
【１０２５】
ヒトＨＬＡ  Ａ２Ｋｂについての導入遺伝子を発現するマウス（Ｌ．Ｓｈｅｒｍａｎ博士，Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を、Ｔｈｅｏｂａｌｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１１９９３−１１９９７，１９９５により記載されるように、以下の改変とともに、Ｐ５０２Ｓ遺伝子（本明細書中でＪ１−１７（配列番号８）ともいわれる）に由来するＰ２Ｓ＃１２ペプチド（ＶＬＧＷＶＡＥＬ；配列番号３０６）で免疫した。マウスを、不完全フロイントアジュバント中で乳化した１００μｇのＰ２Ｓ＃１２および１２０μｇのＢ型肝炎ウイルスタンパク質に由来するＩ−Ａｂ  結合ペプチドで免疫した。３週間後、これらのマウスを屠殺し、単一の細胞懸濁液を調製した。細胞を、次いで、１０％  ＦＣＳ、２ｍＭ  グルタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、２×１０−５Ｍ  ２−メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍｌ  ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む完全培地（ＲＰＭＩ−１６４０；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中、６×１０６細胞／ｍｌで懸濁し、照射された（３０００ラド）Ｐ２Ｓ＃１２パルスした（５ｍｇ／ｍｌ  Ｐ２Ｓ＃１２および１０ｍｇ／ｍｌ  β２−ミクログロブリン）ＬＰＳ芽球（７μｇ／ｍｌ  デキストラン硫酸および２５μｇ／ｍｌ  ＬＰＳの存在下で３日間培養したＡ２トランスジェニック脾細胞）の存在下で培養した。６日後、細胞（５×１０５／ｍｌ）を、２．５×１０６／ｍｌペプチドパルスされ、照射された（２０，０００ラド）ＥＬ４Ａ２Ｋｂ細胞（Ｓｈｅｒｍａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：８１５−８１８，１９９２）および３×１０６／ｍｌ  Ａ２トランスジェニック脾臓フィーダー細胞で再刺激した。細胞を、２０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２の存在下で培養した。細胞を、その株をクローニングするための調製において、記載されるように１週間に１回のベースで再刺激し続けた。
【１０２６】
Ｐ２Ｓ＃１２株を、刺激因子としてのペプチドパルスしたＥＬ４  Ａ２Ｋｂ腫瘍細胞（１×１０４細胞／ウェル）および３０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２の存在下で増殖させたフィーダーとしてのＡ２トランスジェニック脾細胞（５×１０５細胞／ウェル）での限界希釈分析によってクローニングした。１４日目に、細胞を、上記のように再刺激した。２１日目に、増殖していたクローンを単離し、培養物中で維持した。これらのクローンのうちのいくつかは、コントロール線維芽細胞に対してよりも、Ｐ５０２Ｓで形質導入したヒト線維芽細胞（ＨＬＡ  Ａ２Ｋｂ発現）に対して有意に高い反応性（溶解）を実証した。例は、図１に提示される。
【１０２７】
このデータは、Ｐ２Ｓ＃１２が、ヒトＨＬＡ  Ａ２Ｋｂ分子の状況において発現される、Ｐ５０２Ｓタンパク質の天然にプロセシングされたエピトープを表すことを示す。
【１０２８】
６．２．この実施例は、Ｐ５０１  Ｓ遺伝子を発現する細胞に特異的なマウスＣＴＬ株およびＣＴＬクローンの増殖を例示する。
【１０２９】
この一連の実験を、上記の実験と同様に行った。マウスを、Ｐ５０１Ｓ遺伝子（本明細書中でＬ１−１２（配列番号１１０）ともいわれる）に由来する、Ｐ１Ｓ＃１０ペプチド（配列番号３３７）で免疫した。そのＰ１Ｓ＆ｎｕｍ；１０ペプチドは、公開されたＨＬＡ−Ａ２結合モチーフ（Ｐａｒｋｅｒ，ＫＣら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９５２：１６３，１９９４）によって規定される潜在的なＨＬＡ−Ａ２結合配列のためのＰ５０１Ｓの推定ポリペプチド配列の分析によって得られた。Ｐ１Ｓ＃１０ペプチドを、実施例４に記載のように合成し、Ｔ細胞ベースの競合アッセイを用いてＨＬＡ−Ａ２結合について経験的に試験した。推定Ａ２結合ペプチドを、ＨＬＡ−Ａ２制限ＣＴＬクローン（Ｄ１５０Ｍ５８）に対して、ＨＬＡ−Ａ２特異的ペプチド提示と競合するそれらの能力について試験した。このクローンは、ＨＬＡ−Ａ２結合インフルエンザマトリクスペプチドｆｌｕＭ５８に特異的である。Ｄ１５０Ｍ５８  ＣＴＬは、ペプチドｆｌｕＭ５８の自己提示に応じて、ＴＮＦを分泌する。その競合アッセイにおいて、１００〜２００μｇ／ｍｌの試験ペプチドを、ＣＴＬ上のＨＬＡ−Ａ２を結合するために、Ｄ１５０Ｍ５８  ＣＴＬの培養物に添加した。３０分後、試験ペプチド、またはコントロールペプチドとともに培養したＣＴＬを、標準的なＴＮＦバイオアッセイにおいてｆｌｕＭ５８ペプチドに対するそれらの抗原用量応答について試験した。図３に示されるように、ペプチドＰ１Ｓ＃１０は、ｆｌｕＭ５８のＨＬＡ−Ａ２制限提示と競合し、ペプチドＰ１Ｓ＃１０がＨＬＡ−Ａ２を結合することを実証した。
【１０３０】
ヒトＨＬＡ  Ａ２Ｋｂの導入遺伝子発現するマウスを、以下の改変とともにＴｈｅｏｂａｌｄら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１１９９３−１１９９７，１９９５）に記載されるように、免疫した。マウスを、不完全フロイントアジュバントで乳化した６２．５μｇのＰ１Ｓ＃１０および１２０μｇのＢ型肝炎ウイルスタンパク質由来のＩ−Ａｂ結合ペプチドで免疫した。３週間後、これらのマウスを屠殺し、単一の細胞懸濁液を、ナイロンメッシュを用いて調製した。次いで、細胞を、完全培地（上記のとおり）中で６×１０６細胞／ｍｌに懸濁し、照射し（３０００ラド）Ｐ１Ｓ＃１０パルスした（２μｇ／ｍｌ  Ｐ１Ｓ＃１０および１０ｍｇ／ｍｌ  β２−ミクログロブリン）ＬＰＳ芽球（７μｇ／ｍｌ  デキストラン硫酸および２５μｇ／ｍｌ  ＬＰＳの存在下で３日間培養したＡ２トランスジェニック脾細胞）の存在下で培養した。６日後に、細胞（５×１０５／ｍｌ）を、上記のように、２．５×１０６／ｍｌペプチドパルスした照射（２０，０００ラド）ＥＬ４Ａ２Ｋｂ細胞および３×１０６／ｍｌ  Ａ２トランスジェニック脾臓フィーダー細胞で再刺激した。細胞を、２０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２の存在下で培養した。細胞を、クローニングのための調製において、１週間に１回のベースで再刺激した。３回のインビトロ刺激の後、図４に示されるように、Ｐ１Ｓ＃１０パルスしたＪｕｒｋａｔ  Ａ２Ｋｂ標的およびＰ５０１  Ｓ形質導入Ｊｕｒｋａｔ標的を認識した１つの株を、生成した。
【１０３１】
ＡＰ１Ｓ＃１０特異的ＣＴＬ株を、刺激因子としてのペプチドパルスしたＥＬ４  Ａ２Ｋｂ腫瘍細胞（１×１０４細胞／ウェル）およびフィーダーとしての３０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２の存在下で増殖させたＡ２トランスジェニック脾細胞（５×１０５細胞／ウェル）での限界希釈分析によってクローニングした。１４日目に、細胞を、上記のように再刺激した。２１日目に、生きているクローンを単離し、培養物中で維持した。図５に示されるように、これらのクローンのうちの５つは、Ｐ５０１Ｓ形質導入したＪｕｒｋａｔ  Ａ２Ｋｂ標的に対する特異的細胞溶解反応性を示した。このデータは、Ｐ１Ｓ＃１０がヒトＨＬＡ−Ａ２．１分子の状況において発現されるＰ５０１Ｓタンパク質の天然にプロセシングされたエピトープを表すことを示す。
【１０３２】
（実施例７）
（前立腺抗原とともに裸のＤＮＡ免疫を用いるインビボでのＣＴＬの感作）
前立腺特異的抗原Ｌ１−１２（上記のとおり）もまた、Ｐ５０１Ｓといわれる。ＨＬＡ  Ａ２Ｋｂ  Ｔｇマウス（Ｌ．Ｓｈｅｒｍａｎ博士，Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡにより提供）を、筋肉内または皮内のいずれかにおいて、ベクターＶＲ１０１２における１００μｇのＰ５０１  Ｓで免疫した。そのマウスを、３回免疫し、免疫の間には２週間の間隔を空けた。最後の免疫の２週間後、免疫脾細胞を、Ｊｕｒｋａｔ  Ａ２Ｋｂ−Ｐ５０１Ｓ形質導入刺激因子細胞とともに培養した。ＣＴＬ株を、１週間に１回刺激した。インビトロ刺激の２週間後、Ｐ５０１  Ｓ形質導入標的に対するＣＴＬ活性を評価した。８匹のマウスのうちの２匹は、強い抗Ｐ５０１  Ｓ  ＣＴＬ応答を発生させた。これらの結果は、Ｐ５０１  Ｓが、少なくとも１つの天然にプロセシングされたＨＬＡ−Ａ２拘束ＣＴＬエピトープを含むことを実証する。
【１０３３】
その後の実験において、マウスを、上記のベクターＶＲ１０１２におけるＰ５０１  Ｓまたは１×１０８ｐｆｕ／動物でのＰ５０１  Ｓアデノウイルス構築物のいずれかで免疫した。３週間後、動物に、追加免疫を与え、Ｐ５０１  Ｓ単独で感作した動物に、Ｐ５０１  Ｓ単独またはＰ５０１  Ｓアデノウイルスのいずれかで追加免疫した。脾細胞を、免疫して３週間後および６週間後に採取し、照射Ｊｕｒｋａｔ  Ａ２Ｋｂ細胞と培養した（０日目）。ＣＴＬ活性を６日目にアッセイし、脾細胞を、７日目に再刺激し、第２のＣＴＬアッセイを、１３日目に行った。Ｐ５０１  ＳのＮ末端領域（配列番号１１３のアミノ酸３６〜３２５）および短縮形態のＰ５０１Ｓ（配列番号１１３のアミノ酸３４２〜５３８）に対するＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ応答を、ＥＬＩＳＡを使用してアッセイした。そのＰ５０１Ｓアデノウイルス構築物は、Ｔ細胞応答および抗体応答の両方を効率的に誘発し、Ｐ５０１  Ｓ単独により、ＣＴＬ応答が誘発されたが、抗体応答は誘発しなかった。Ｐ５０１  Ｓ単独での免疫は、Ｐ５０１Ｓアデノウイルス追加免疫との組み合わせにおいて最も有効であることが分かった。Ｐ５０１  Ｓ単独での免疫は、ペプチド３７０（ＣＬＳＨＳＶＡＷ）に応答するＴ細胞を生成した。対照的に、Ｐ５０１Ｓアデノウイルスでの免疫は、ペプチド３７０に対して弱い反応を生成したか、全く反応がなかった。これらの研究は、ＤＮＡ感作免疫、続いて、アデノウイルス追加免疫の組み合わせは、ＣＴＬ応答および抗体応答の両方を誘発するための強力なアプローチであり、異なるエピトープを認識する異なる細胞傷害性Ｔ細胞が、アデノウイルス単独での免疫に対して、Ｐ５０１  ＳまたはＰ５０１  Ｓ＋アデノウイルスで免疫した場合、誘発し得ることを示す。
【１０３４】
（実施例８）
（ヒトＴ細胞が前立腺特異的ポリペプチドを認識する能力）
この実施例は、前立腺腫瘍ポリペプチドに特異的なＴ細胞がヒト腫瘍を認識する能力を例示する。
【１０３５】
ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞を、Ｖａｎ  Ｔｓａｉら（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８：６５−７５，１９９８）のプロトコルに従って、樹状細胞を使用して、Ｐ５０２Ｓ（Ｊ１−１７ともいわれる）に由来するＰ２Ｓ−１２ペプチド（配列番号３０６）に対してインビトロで感作した。得られたＣＤ８＋  Ｔ細胞マイクロ培養物を、自己線維芽細胞またはＰ５０２Ｓ遺伝子を発現するように形質導入された線維芽細胞によって提示されるＰ２Ｓ−１２ペプチドを認識するそれらの能力について、γ−インターフェロンＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（Ｌａｌｖａｎｉら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９−８６５，１９９７を参照のこと）において試験した。簡潔には、Ｔ細胞の数を力価測定することにより、３μｇ／ｍｌ  ヒトβ２−ミクログロブリンおよび１μｇ／ｍｌ  Ｐ２Ｓ−１２ペプチドまたはコントロールＥ７５ペプチドの存在下で１０４線維芽細胞に対して二連でアッセイした。さらに、Ｔ細胞を、Ｐ５０２Ｓ遺伝子で形質導入された自己線維芽細胞またはコントロールとしてＨＥＲ−２／ｎｅｕで形質導入された線維芽細胞に対して同時にアッセイした。そのアッセイの前に、その線維芽細胞を、１０ｎｇ／ｍｌ  γ−インターフェロンで４８時間処理して、クラスＩ  ＭＨＣ発現をアップレギュレートした。マイクロプレートの１つ（＃５）は、γ−インターフェロンＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、ペプチドパルスした線維芽細胞および形質導入された線維芽細胞の両方の強い認識を示した。図２Ａは、Ｐ２Ｓ−１２ペプチド（黒棒）でパルスした（コントロールＥ７５ペプチド（白棒）でパルスしたものではなく）線維芽細胞に対するＴ細胞の数の増大とともに、γ−インターフェロンスポットの数における激しい増大が存在したことを示す。このことは、これらのＴ細胞がＰ２Ｓ−１２ペプチドを特異的に認識する能力を示す。図２Ｂに示されるように、このマイクロ培養物はまた、Ｐ５０２Ｓ遺伝子（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子ではなく）を発現するように形質導入した線維芽細胞に対するＴ細胞数の増大とともに、γ−インターフェロンスポットの数における増加を実証した。これらの結果は、Ｐ２Ｓ−１２ペプチドが、Ｐ５０２Ｓタンパク質の天然にプロセシングされたエピトープである、さらなる確認する証拠を提供する。さらに、このことはまた、ヒトＴ細胞レパートリー、このエピトープを認識し得る高親和性Ｔ細胞に存在することを実証する。これらのＴ細胞はまた、Ｐ５０２Ｓ遺伝子を発現するヒト腫瘍を認識し得るはずである。
【１０３６】
（実施例９）
（ヒト血液における前立腺抗原特異的ＣＴＬ応答の惹起およびＣＴＬエピトープの同定）
本実施例は、正常ヒトの血液において、前立腺特異的抗原Ｐ５０１Ｓが細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を惹起する能力を示し、そしてＴ細胞認識を担う重要なエピトープを規定する。そのような情報は、Ｐ５０１Ｓの免疫原性をさらに確認し、そして本明細書中に記載される多数の例示的な免疫診断実施形態および免疫治療実施形態のうちのいずれかにおけるＰ５０１Ｓの使用を確認する。
【１０３７】
自己由来樹状細胞（ＤＣ）を、正常ドナーのＰＢＭＣ由来の単球培養物から、１０％ウシ血清と５０ｎｇ／ｍｌのＧＭＣＳＦと３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４とを含むＲＰＭＩ培地において５日間増殖させることによって分化させた。培養後、ＤＣに、組換えＰ５０１Ｓ発現ワクシニアウイルスをＭ．Ｏ．Ｉ  ５で一晩感染させ、２μｇ／ｍｌのＣＤ４０リガンドを添加することによって８時間成熟させた。ウイルスを、ＵＶ照射によって不活化し、ＣＤ８＋細胞を、磁気ビーズを使用する陽性選択によって単離し、プライミング培養を、２４ウェルプレートにおいて開始した。Ｐ５０１ＳおよびＣＤ８０を発現するようにレトロウイルスで形質導入した自己由来線維芽細胞を使用する５回の刺激サイクルの後、Ｐ５０１Ｓで形質導入した自己由来線維芽細胞で刺激した場合にインターフェロンを特異的に生成するＣＤ８＋株を同定した。細胞株３Ａ−１のＰ５０１Ｓ特異的活性を、Ｐ５０１Ｓを形質導入した自己由来Ｂ−ＬＣＬにおけるさらなる刺激サイクルの後に、維持し得た。株３Ａ−１は、細胞傷害性アッセイ（５１Ｃｒ放出）およびインターフェロンγ生成（インターフェロンγ  Ｅｌｉｓｐｏｔ；上記およびＬａｌｖａｎｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９〜８６５，１９９７参照）によって測定した場合に、Ｐ５０１Ｓを発現するように形質導入された自己由来Ｂ−ＬＣＬを特異的に認識するが、ＥＧＦＰ形質導入自己由来Ｂ−ＬＣＬを特異的には認識しないことが、示された。これらのアッセイの結果を、図６Ａおよび図６Ｂに示す。
【１０３８】
前立腺抗原Ｐ５０１Ｓがヒト男性において免疫応答を惹起する能力を、以下のようにして試験した。
【１０３９】
樹状細胞（ＤＣ）を、Ｐｅｒｃｏｌ勾配とその後の差次的接着とによって単離し、１％ヒト血清と５０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦと３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４とを含むＰＲＭＩ培地の存在下で５日間培養した。培養後、ＤＣに、Ｐ５０１Ｓ発現アデノウイルスをＭＯＩ  １０で２４時間感染させ、２μｇ／ｍｌのＣＤ４０リガンドの添加によりさらに２４時間成熟させた。ＣＤ８細胞を、ＰＢＭＣから磁気ビーズを用いてＣＤ４＋集団、ＣＤ１４＋集団およびＣＤ１６＋集団を差し引くことによって、正常男性ドナーのＰＢＭＣから濃縮した。１ウェル当たり１０，０００個のＰ５０１Ｓ発現ＤＣ細胞と１００，０００個のＣＤ８＋Ｔ細胞とを含むプライミング培養を、１０％ヒト血清と５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２と１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６とを含むＰＲＭＩ中で、９６ウェルＶ底プレートにて設定した。培養物を、Ｐ５０１ＳおよびＣＤ８０を発現するようにレトロウイルスで形質導入した自己由来線維芽細胞を使用して、７日間毎に刺激し、ＩＦＮ−γで４８〜７２時間処理して、ＭＨＣクラスＩ発現をアップレギュレートした。１０μｇ／ｍｌのＩＬ−２を、刺激時、ならびに刺激後２日目および刺激後５日目に添加した。４回の刺激サイクルの後、γ−ＩＦＮ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにおいて、ＩＦＮγ処理したＰ５０１Ｓ／ＣＤ８０発現自己由来線維芽細胞に応答してＩＦＮ−γを生成するが、ＩＦＮ−γ処理したＰ７０３Ｐ／ＣＤ８０発現自己由来線維芽細胞に応答してＩＦＮ−γを生成はしない、複数のＰ５０１Ｓ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞株を同定した。最も有望な３つの株（１Ｈ１、２Ｈ２および６Ｆ１と呼んだ）を、７５，０００  ＰＢＭＣ／ウェル、１０，０００  Ｂ−ＬＣＬ／ウェル、３０ｎｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３、および５０μｇ／ｍｌ  ＩＬ−２の存在下で、０．５細胞／ウェルまたは２細胞／ウェルで９６ウェルプレート中にてクローニングして、Ｐ５０１Ｓ特異的クローンを単離した。
【１０４０】
Ｐ５０１Ｓ特異的クローンについてのクラスＩ拘束エレメントを同定するために、ＨＬＡブロック分析およびミスマッチ分析を、以下のように実施した。γ―ＩＦＮ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにおいて、Ｐ５０１Ｓで形質導入した自己由来線維芽細胞に対するクローンの特異的応答が、２５μｇ／ｍｌ  Ｗ６／３２（汎クラスＩ遮断抗体）とのプレインキュベーションによってブロックされ、６Ｆ１についてはＢＢ７．２（ＨＬＡ−Ａ２遮断抗体）とのプレインキュベーションによってブロックされ、１Ｈ１および２Ｈ２についてはＢ１．２３．２（ＨＬＡ−Ｂ／Ｃ遮断抗体）とのプレインキュベーションによってブロックされた。これらの結果は、そのクローンのＰ５０１Ｓ特異的応答が、ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子および／またはＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子もしくはＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子に拘束されることを示した。ＨＬＡミスマッチ分析のために、ＨＬＡ−Ａ−２対立遺伝子とＨＬＡＢ５１対立遺伝子とを共有する自己由来線維芽細胞（Ｄ３１０、ＨＬＡ−Ａ２、Ａ３、Ｂ４４、Ｂ５１、Ｃｗ５、Ｃｗ１４）および異種線維芽細胞（Ｄ３２６、ＨＬＡ−Ａ１、Ａ２、Ｂ８、Ｂ５１、Ｃｗ１、Ｃｗ７）に、Ｐ５０１Ｓを形質導入し、それを使用して上記クローンを刺激した。γ―ＩＦＮ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにおいて、１Ｈ１および２Ｈ２は、自己由来線維芽細胞のみを認識した。このことは、（上記の抗体遮断アッセイと合わせると）関連する対立遺伝子は、Ｂ４４、Ｃｗ５またはＣｗ１４であり、６Ｆ１が、Ｄ３１０およびＤ３２６ｎｏ両方を認識したことを示唆し、このことは、上記応答がＨＬＡ−Ａ０２０１に拘束されたことを示唆する。
【１０４１】
上記の拘束データを確認し拡張するために、Ｄ３１０からの対立遺伝子の各々を、ｐＢＩＢ発現ベクター中にクローン化し、全長Ｐ５０１ＳとともにＣｏｓ−７細胞中に同時トランスフェクトした。１Ｈ１クローンおよび２Ｈ２クローンは、Ｐ５０１ＳとＣｗ０５０１対立遺伝子とで同時トランスフェクトしたＣｏｓ−７細胞を特異的に認識し、一方、６Ｆ１クローンは、Ｐ５０１ＳとＨＬＡ−Ａ０２０１対立遺伝子とで同時トランスフェクトしたＣｏｓ−７細胞を認識した。これらの結果は、上記の対立遺伝子が、上記ＣＴＬに対してＰ５０１Ｓエピトープを提示することを担うことを示す。
【１０４２】
上記ＣＴＬにより認識されるエピトープを含むＰ５０１Ｓ部分フラグメントを同定するために、Ｐ５０１Ｓの３’短縮物を、上記対立遺伝子とともにＣｏｓ−７細胞中に同時トランスフェクトした。６Ｆ１クローンは、Ｐ５０１Ｓオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の最初の３５４ヌクレオチドに由来するエピトープを認識することが見出された。２Ｈ２クローン（２Ｈ２−１Ａ１２と呼ばれる）は、Ｐ５０１Ｓのアミノ酸４７１〜５５３において見出されるＰ５０１Ｓ配列（配列番号１１３）に由来するエピトープを認識し、１Ｈ１クローン（１ＨＩ−１Ａ６と呼ばれる）は、Ｐ５０１Ｓのアミノ酸２７８〜３５３において見出されるＰ５０１Ｓ配列（配列番号１１３）に由来するエピトープを認識した。
【１０４３】
これらのＣＴＬにより認識される最小エピトープを同定するために、それぞれ１１アミノ酸または１５アミノ酸重複する１５マーペプチドまたは１９マーエピトープを、合成し、自己由来Ｂ−ＬＣＬに対してパルスし、γ―ＩＦＮ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて上記ＣＴＬについての抗原提示細胞として使用した。１ＨＩ−１Ａ６について、配列番号１１３のアミノ酸２４６〜３２５に広がる４つの１５マー〜２１マーのプールは、上記ｃＴＬによって特異的に認識された。このプールの分解において、ペプチド２９１（アミノ酸２９１〜３１０；配列番号９８３、配列番号９７２において提供されるｃＤＮＡ配列）は、１ＨＩ−１Ａ６  ＣＴＬによって特異的に認識された。その後、Ｐ５０１Ｓのアミノ酸２９１〜３１０に由来する１０マーペプチドを合成し、上記のように試験した。ペプチド２９１、２９２、および２９３（それぞれ、配列番号９８４、９８２、および９８０；それぞれ、配列番号９７５、９７６および９７３中に提供されるｃＤＮＡ配列）は、すべて上記のＣＴＬによって特異的に認識された。これらの結果は、３つの１０マーペプチドの各々が、上記ＣＴＬによって認識される最小エピトープを含むことを示す。その後、上記３つの１０マーと、配列ＴＤＦＶＧＥＧＬ（配列番号９８１）とで共通する８マーペプチドを、合成して試験した。ペプチド力価測定アッセイにおいて、このエピトープに特異的なＣＤ８＋  Ｔ細胞は、１〜１０μｇ／ｍｌでパルスしたＡＰＣを認識した。上記８マーはまた、上記ＣＴＬによって効率的に認識された。このことは、上記ＣＴＬによって認識される天然にプロセシングされる最小ペプチドエピトープは、配列番号９８１に広がることを示す。さらなる分析によって、クローン１ＨＩ−１Ａ６についての最小エピトープは、ＹＴＤＦＶＧＥＧＬ（Ｐ５０１のアミノ酸２９２〜３００）（そのアミノ鎖配列およびＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号１０２１および１０２２において開示される）であることが示された。ペプチド力価測定アッセイによって、このエピトープに特異的なＣＤ８＋  Ｔ細胞が、０．００１６μｇ／ｍｌの上記９マーでパルスされたＡＰＣを認識したことが示された。従って、Ｐ５０１に特異的な最小のＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＹＴＤＦＶＧＥＧＬ（配列番号１０２２）である。
【１０４４】
２Ｈ２−１Ａ１２について、アミノ酸４６２〜５５３に広がる１２個の１５マーのプールで、自己由来Ｂ−ＬＣＬをパルスし、上記のように試験した。ペプチド４６２および４６５（それぞれ、配列番号９７９および９７７；それぞれ、配列番号９７１および９６９において提供されるｃＤＮＡ配列）は、両方とも、上記ＣＴＬによって特異的に認識された。これらの結果は、上記２つの１５マーペプチドの各々が、上記ＣＴＬによって認識される最小エピトープを含むことを示す。その後、１アミノ酸だけ重複する１０マーペプチド群を、上記の２つのペプチドに共通する配列から合成し、上記のように試験した。主に、ペプチド４６４（アミノ酸４６４〜４７４；配列番号９７８；配列番号９７０に提供されるｃＤＮＡ配列）ならびにペプチド４６３（アミノ酸４６３〜４７２）およびペプチド４６５（アミノ酸４６５〜４７５）は、上記ＣＴＬによって特異的に認識された。これらの結果は、配列番号９７８（Ｐ５０１Ｓのアミノ酸４６４〜４７４）の配列が、２Ｈ２−１Ａ１２  ＣＴＬによって認識される最小エピトープを含むことを示す。さらなる分析によいって、クローン２Ｈ２−１Ａ１２についての最小エピトープは、ＡＣＤＶＳＶＲＶＶ（Ｐ５０１Ｓのアミノ酸４６５〜４７３）（そのアミノ酸配列およびＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号１０１２および１０１３に開示される）であることが、示された。ペプチド４６３およびペプチド４６５の認識は、これらのペプチドにペプチド４６４が混入していることを反映するか、または上記ＣＴＬによるこれらのペプチドのさらなる二次的かつ不十分な認識を反映する。
【１０４５】
本実施例は、このように、Ｐ５０１Ｓが、ヒトＣＴＬ応答を惹起することが可能であることを確認し、この前立腺特異的抗原のＴ細胞認識を担う複数のＣＴＬエピトープを同定する。そのような情報は、Ｐ５０１Ｓを、免疫診断適用および免疫治療適用における使用のための重要な標的としてさらに確認する。
【１０４６】
（実施例１０）
（前立腺特異的抗原Ｐ７０３Ｐ内に含まれる天然にプロセシングされるＣＴＬエピトープの同定）
上記９マーペプチドのｐ５（配列番号３３８）は、Ｐ７０３Ｐ抗原（Ｐ２０とも言う）に由来した。このｐ５ペプチドは、ヒトＨＬＡ−Ａ２ドナーにおいて免疫原性であり、天然にプロセシングされるエピトープである。抗原特異的ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞を、ｐ５ペプチドでパルスした単球によってインビトロ刺激を反復した後に、プライムし得る。これらのＣＴＬは、ＥＬＩＳＰＯＴ（上記のような）およびクロム放出アッセイの両方において、ｐ５でパルスした標的細胞、およびＰ７０３Ｐを形質導入した標的細胞を、特異的に認識する。さらに、ｐ５でＨＬＡ−Ａ２Ｋｂトランスジェニックマウスを免疫すると、Ｐ７０３Ｐを発現する種々のＨＬＡ−Ａ２Ｋｂ形質導入標的細胞またはＨＬＡ−Ａ２形質導入標的細胞を認識する、ＣＴＬ株の生成がもたらされる。
【１０４７】
ｐ５が天然にプロセシングされるエピトープであることを示す初期研究を、ＨＬＡ−Ａ２Ｋｂトランスジェニックマウスを使用して行った。ＨＬＡ−Ａ２Ｋｂトランスジェニックマウスに、フロイント不完全アジュバント中１４０μｇのＢ型肝炎ウイルスコアペプチド（Ｔｈペプチド）とともに１００μｇのｐ５ペプチドを、足蹠に皮下免疫した。免疫の３週間後、免疫マウス由来の脾臓細胞に、ペプチドパルスしたＬＰＳ芽細胞を用いてインビトロで刺激した。ＣＴＬアッセイを、一次インビトロ刺激の５日後に、クロム放出アッセイにおいて評価した。コントロール抗原であるＰ７０３Ｐを発現するレトロウイルス形質導入細胞およびＨＬＡ−Ａ２Ｋｂを発現するレトロウイルス形質導入細胞を、標的として使用した。ｐ５でパルスした標的およびＰ７０３Ｐ発現標的の両方を特異的に認識するＣＴＬ株を、同定した。
【１０４８】
ヒトインビトロプライミング実験は、上記ｐ５ペプチドが、ヒトにおいて免疫原性であることを示した。樹状細胞（ＤＣ）は、１０％ウシ血清と５０ｎｇ／ｍｌヒトＧＭ−ＣＳＦと３０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−４とを含むＲＰＭＩ培地において５日間培養することによって、正常ヒトドナーのＰＢＭＣから誘導した単球培養から分化した。培養後、上記ＤＣを、１μｇ／ｍｌのｐ５ペプチドでパルスし、ＣＤ８＋  Ｔ細胞を濃縮したＰＢＭＣとともに培養した。ＣＴＬ株を、ｐ５でパルスした単球を用いて、１週間ベースで再刺激した。このＣＴＬ培養開始の５週間〜６週間後、ｐ５でパルスした標的細胞のＣＴＬ認識を、実証した。ＣＴＬは、Ｐ７０３Ｐを発現するように形質導入したヒト細胞を認識することがさらに示された。このことは、ｐ５が、天然にプロセシングされるエピトープであることを示す。
【１０４９】
ＨＬＡクラスＩＩ分子の状況で細胞表面上にあるＣＤ４  Ｔ細胞により認識されることが可能な前立腺腫瘍特異的抗原Ｐ７０３Ｐに由来するさらなるペプチドエピトープ（ペプチド４と呼ぶ）を同定する研究を、以下のように実行した。ペプチド４のアミノ酸配列は、配列番号７８１に提供され、対応するｃＤＮＡ配列は、配列番号７８２に提供される。
【１０５０】
１０アミノ酸だけ重複し、Ｐ７０３Ｐのカルボキシ末端フラグメントに由来する、１２個の１５マーペプチドを、標準的手順を使用して生成した。樹状細胞（ＤＣ）を、標準的プロトコルによってＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を使用して、正常女性ドナーのＰＢＭＣから誘導した。ＣＤ４  Ｔ細胞を、上記ＤＣと同じドナーから、ＭＡＣＳビーズおよび陰性選択を使用して、生成した。ＤＣを、上記１５マーペプチドのプールで一晩パルスした。各ペプチドは、最終濃度０．２５μｇ／ｍｌであった。パルスしたＤＣを、洗浄し、そして９６ウェルＶ底プレートの１ウェル当たり１×１０４細胞でプレートした。精製したＣＤ４  Ｔ細胞を、１×１０５／ウェルで添加した。培養物に、６０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６および１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１２を補充し、３７℃でインキュベートした。培養物を、上記のように生成して抗原提示細胞としてパルスしたＤＣを使用して、１週間ベースで上記のように再刺激し、５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−７および１０μｇ／ｍｌ  ＩＬ−２を補充した。４回のインビトロ刺激サイクルの後、９６株（各株は、１つのウェルに対応する）を、上記刺激プールに応答する特異的増殖およびサイトカイン生成について、ママグロビン（ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ）に由来する無関係ペプチドプールをコントロールとして使用して試験した。
【１０５１】
Ｐ７０３Ｐペプチドのプール＃１に応答して特異的増殖（３Ｈ増殖アッセイによって測定）およびサイトカイン生成（インターフェロンγ  ＥＬＩＳＡアッセイにより測定）を示した１つの株（Ｉ−Ｆ９と呼ぶ）を、プール＃１から同定した。この株を、上記ペプチドプールの特異的認識、上記プールおよびＨＬＡミスマッチにおける個々のペプチドの特異的認識について試験して、関連する拘束対立遺伝子を同定した。株Ｉ−Ｆ９は、ペプチドプール＃１およびペプチド４（配列番号７８１）に応答して、特異的に増殖してインターフェロンγを生成することが見出された。ペプチド４は、配列番号３２７のアミノ酸１２６〜１４０に対応する。ペプチド力価測定実験を実施して、上記特異的ペプチドについての株Ｉ−Ｆ９の感受性を評価した。この株は、０．２５ｎｇ／ｍｌ程度の低い濃度のペプチド４に特異的に応答することが見出された。このことは、このＴ細胞が、上記エピトープについて非常に感受性であり、従って、上記エピトープについて高い親和性を有する可能性があることを示す。
【１０５２】
Ｐ７０３Ｐ応答のＨＬＡ拘束を決定するために、上記Ｔ細胞を生成するために使用したドナーと部分的に適合する一群の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を生成した。このＡＰＣを、上記ペプチドでパルスし、これを株Ｉ−Ｆ９とともに増殖アッセイおよびサイトカインアッセイにおいて使用した。ＨＬＡ−ＤＲＢ０７０１対立遺伝子およびＨＬＡ−ＤＱＢ０２対立遺伝子にて上記ドナーと適合したＡＰＣは、上記Ｔ細胞に対して上記ペプチドを提示可能であった。このことは、上記Ｐ７０３Ｐ特異的応答が、これらの対立遺伝子のうちの１つに拘束されることを示す。
【１０５３】
抗体遮断アッセイを使用して、上記拘束対立遺伝子がＨＬＡ−ＤＲ０７０１またはＨＬＡ−ＤＱ０２であるか否かを決定した。抗ＨＬＡ−ＤＲ遮断抗体Ｌ２４３または無関係のアイソタイプ適合型ＩｇＧ２ａをＴ細胞に添加し、ＡＰＣ培養物を、２５０ｎｇ／ｍｌのペプチドＲＭＰＴＶＬＱＣＶＮＶＳＶＶＳ（配列番号７８１）でパルスした。標準的なインターフェロンγアッセイおよび増殖アッセイを実施した。上記コントロール抗体は、ペプチドでパルスしたＡＰＣを上記Ｔ細胞が認識する能力に対して何の影響も有さなかったが、両方のアッセイにおいて、上記抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体は、ペプチドでパルスしたＡＰＣを上記Ｔ細胞が特異的に認識する能力を完全に遮断した。
【１０５４】
上記ペプチドエピトープＲＭＰＴＶＬＱＣＶＮＶＳＶＶＳ（配列番号７８１）が天然でプロセシングされるか否かを決定するために、組換えＰ７０３Ｐタンパク質でパルスしたＡＰＣを株Ｉ−Ｆ９が認識する能力を、試験した。これらの実験のために、多数の組換えＰ７０３Ｐ供給源を使用した：Ｅ．ｃｏｌｉ由来Ｐ７０３Ｐ、Ｐｉｃｈｉａ由来Ｐ７０３Ｐおよびバキュロウイルス由来Ｐ７０３Ｐ。使用した無関係のタンパク質コントロールは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来Ｌ３Ｅ肺特異的抗原、およびバキュロウイルス由来ママグロビン（ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ）であった。インターフェロンγ  ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、株Ｉ−Ｆ９は、Ｅ．ｃｏｌｉ形態のＰ７０３ＰおよびＰｉｃｈｉａ由来組換えＰ７０３Ｐの両方を効率的に認識することが可能であり、一方、バキュロウイルス由来Ｐ７０３Ｐは、それよりも効率的ではなく認識された。その後のウェスタンブロット分析によって、上記Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐ７０３Ｐタンパク質調製物およびＰｉｃｈｉａ  Ｐ７０３Ｐタンパク質調製物は、インタクトであり、一方、上記バキュロウイルスＰ７０３Ｐ調製物は、約７５％分解されていた。従って、Ｐ７０３Ｐ由来のペプチドＲＭＰＴＶＬＱＣＶＮＶＳＶＶＳ（配列番号７８１）は、Ｐ７０３Ｐに由来し、ＨＬＡ−ＤＲＢ−０７０１の状況でＴ細胞に提示される、天然にプロセシングされるペプチドエピトープである。
【１０５５】
さらなる研究において、１０アミノ酸だけ重複し、Ｐ７０３ＰのＮ末端フラグメント（配列番号５２５のアミノ酸２７〜１５４に対応する）に由来する、２４個の１５マーペプチドを、標準的手順によって生成した。それらがＣＤ４細胞によって認識される能力を、本質的に上記に記載されるようにして決定した。ＤＣを、各ペプチドを最終濃度１０μｇ／ｍｌで含む上記ペプチドのプールで、一晩パルスした。多数の個々のＣＤ４  Ｔ細胞株（６５個／４８０個）は、上記Ｐ７０３Ｐペプチドプールに応答して、有意な増殖およびサイトカイン放出（ＩＦＮ−γ）を示したが、コントロールペプチドプールには応答しなかった。特異的活性を示したＣＤ４  Ｔ細胞株を、適切なＰ７０３Ｐペプチドプールで再刺激し、ＩＦＮ−γ放出アッセイおよび増殖アッセイにおいて、各プールの個々のペプチドに関して再アッセイし、およびペプチドプールのペプチド用量力価を測定した。
【１０５６】
試験したペプチド抗原の組全体に由来する１６個の免疫原性ペプチドが、上記Ｔ細胞によって認識された。これらのペプチドのアミノ酸配列は、配列番号７９９〜８１４に提供され、対応するｃＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号７８３〜７９８に提供される。いくつかの場合に、上記Ｔ細胞株のペプチド反応性を、１つのペプチドにマッピングし得た。しかし、いくつか反応性を、各プール中の１つよりも多くのペプチドにマッピングし得た。ペプチドに対して妥当な親和性で各ペプチドプールからの代表的に認識パターンを示したＣＤ４  Ｔ細胞株（Ｉ−１Ａ、Ｉ−６Ａ；ＩＩ−４Ｃ、ＩＩ−５Ｅ；ＩＩＩ−６Ｅ、ＩＶ−４Ｂ、ＩＶ−３Ｆ、ＩＶ−９Ｂ、ＩＶ−１０Ｆ、Ｖ−５Ｂ、Ｖ−４ＤおよびＶ−１０Ｆ）を、さらなる分析のために選択した。これらのＣＤ４  Ｔ細胞株を、適切な個々のペプチドにて再刺激し、Ｅ．ｃｏｌｉ中で生成した組換えＰ７０３Ｐタンパク質の短縮形態（配列番号５２５のアミノ酸９６〜２５４）、バキュロウイルス発現系において生成した全長Ｐ７０３Ｐ、ならびにインフルエンザウイルスＮＳ１とＥ．ｃｏｌｉにおいて生成したＰ７０３Ｐとの間の融合物のいずれかでパルスした自己由来ＤＣにて再アッセイした。試験したＴ細胞株のうち、株Ｉ−１Ａは、上記の短縮形態Ｐ７０３Ｐ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を特異的に認識したが、他の組換え形態のＰ７０３Ｐは特異的には認識しなかった。この株はまた、上記Ｔ細胞を惹起するために使用したペプチドを認識した。株２−４Ｃは、短縮形態のＰ７０３Ｐ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびバキュロウイルスにおいて生成した全長形態のＰ７０３Ｐ、ならびにペプチドを認識した。試験した残りのＴ細胞株は、ペプチド特異的だけであった（ＩＩ−５Ｅ、ＩＩ−６Ｆ、ＩＶ−４Ｂ、ＩＶ−３Ｆ、ＩＶ−９Ｂ、ＩＶ−１０Ｆ、Ｖ−５Ｂ、およびＶ−４Ｄ）か、または試験したどの抗原に対して非応答性であった（Ｖ−１０Ｆ）。これらの結果は、上記Ｔ細胞株Ｉ−１Ａにより認識されるペプチド配列ＲＰＬＬＡＮＤＬＭＬＩＫＬＤＥ（配列番号８１４；配列番号５２５のアミノ酸１１０〜１２４に対応する）、ならびに上記Ｔ細胞株ＩＩ−４Ｃにより認識されるペプチド配列ＳＶＳＥＤＴＩＲＳＩＳＩＡＳ（配列番号８１１；配列番号５２５のアミノ酸１２５〜１３９に対応する）およびＩＳＩＡＳＱＣＰＴＡＧＮＳＣＬ（配列番号８１０；配列番号５２５のアミノ酸１３５〜１４９に対応する）が、上記Ｐ７０３Ｐタンパク質の天然にプロセシングされるエピトープであり得ることを示す。
【１０５７】
さらなる研究において、１０アミノ酸だけ重複し、Ｐ７０３Ｐのアミノ酸４７〜２５４（配列番号５２５）に広がる、４０個の１５マーペプチドを、標準的手順によって生成し、それらがＣＤ４細胞によって認識される能力を、本質的に上記に記載されるように決定した。ＤＣを、以前の実験においてしようしたものとは別個のＨＬＡ  ＤＲ対立遺伝子およびＨＡＬ  ＤＱ対立遺伝子を有するドナーのＰＢＭＣから、調製した。ＤＣを、各ペプチドを最終濃度０．２５μｇ／ｍｌで含むペプチドのプールで一晩パルスした。各プールは、１０ペプチドを含んだ。上記の刺激ペプチドプールに応答して特異的増殖およびサイトカイン生成を示した（γインターフェロン  ＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定した）、１２株を同定した。これらの株を、上記ペプチドプールの特異的認識、上記プール中の個別のペプチドの特異的認識、および組換えＰ７０３Ｐタンパク質の特異的認識について、さらに試験した。株３Ａ５Ｈおよび３Ａ９Ｈは、組換えタンパク質および１つの個別のペプチドならびに上記ペプチドプールに応答して、特異的に増殖してγ―インターフェロンを生成した。上記の特異的ペプチドを負荷した標的による再刺激の後、３Ａ９Ｈのみが、全長Ｐ７０３Ｐを発現するアデノウイルスが感染した線維芽細胞の溶解物に露出された標的に対して、特異的に応答した。これらの結果は、上記株３Ａ９Ｈが、哺乳動物細胞において合成されたタンパク質に由来する抗原性ペプチドに応答し得ることを示す。上記特異的ＣＤ４株が応答したペプチドは、Ｐ７０３Ｐのアミノ酸１５５〜１７０（配列番号９４３）に対応する。このペプチドのＤＮＡ配列は、配列番号９４２に提供される。
【１０５８】
（実施例１１）
（前立腺における乳癌由来抗原の発現）
ディファレンシャルディスプレイによる乳癌からの抗原Ｂ３０５Ｄの単離が、１９９６年８月２０日出願の米国特許出願番号０８／７００，０１４に記載されている。この抗原のいくつかの異なるスプライス形態を、単離した。これらのスプライス形態の決定したｃＤＮＡ配列が、配列番号３６６〜３７５に提供され、配列番号２９２、２９８および３０１〜３０３の配列に対応するそのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２９９〜３０６に提供される。さらなる研究において、配列番号３６６のｃＤＮＡ配列のスプライス改変体を単離し、それが、８８４位にさらなるグアニン残基を含む（配列番号５３０）ことを見出した。これは、そのオープンリーディングフレームのフレームシフトをもたらす。このＯＲＦの決定したＤＮＡ配列は、配列番号５３１に提供される。このフレームシフトは、Ｂ３０５Ｄの他のアイソフォームに共通するＣ末端ドメインを含むがそのＮ末端領域が異なる、２９３アミノ酸のタンパク質配列（配列番号５３２に提供される）を生成する。
【１０５９】
種々の腫瘍組織および正常組織におけるＢ３０５Ｄの発現レベルを、リアルタイムＰＣＲおよびノーザン分析によって試験した。この結果は、Ｂ３０５Ｄが、乳癌、前立腺腫瘍、正常前立腺および正常精巣において高度に発現され、試験した他のすべての組織（結腸腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、および正常な骨髄、結腸、腎臓、肺、卵巣、皮膚、小腸、胃）においては発現が低いかまたは検出不能であることを示した。一群の前立腺腫瘍に対するリアルタイムＰＣＲを使用して、前立腺腫瘍におけるＢ３０５Ｄの発現は、グリーソンの腫瘍異型度が増加するにつれて増加することが示された。このことは、Ｂ３０５Ｄの発現は、前立腺癌が進行するにつれて増加することを示す。
【１０６０】
（実施例１２）
（前立腺特異的抗原Ｐ５０１Ｓを用いる全遺伝子プライミングおよび刺激技術を使用するヒトＣＴＬのインビトロ産生）
Ｐ５０１Ｓ−ワクシニア感染ＤＣを用いるインビトロ全遺伝子プライミング（例えば、Ｙｅｅら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５７（９）：４０７９−８６，１９９６を参照のこと）を使用して、上記のように、インターフェロン−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定されるように、Ｐ５０１Ｓ（Ｌ１−１２としても公知）で形質導入した自己線維芽細胞を特異的に認識するヒトＣＴＬ株を、誘導した。Ｐ５０１Ｓを用いて形質導入したＨＬＡミスマッチＢ−ＬＣＬ株のパネルを使用して、これらのＣＴＬ株は、ＨＬＡＢクラスＩ対立遺伝子に制限されるようであるように示された。詳細には、樹状細胞（ＤＣ）を、１０％ヒト血清、５０ｎｇ／ｍｌヒトＧＭ−ＣＳＦおよび３０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−４を含むＲＰＭＩ中で、５日間増殖させることによって、正常ヒトドナーのＰＢＭＣから誘導した単球細胞株から分化させた。培養に続いて、ＤＣを５の感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ）で組換えＰ５０１Ｓワクシニアウイルスで一晩感染させ、そして３μｇ／ｍｌ  ＣＤ４０リガンドの添加によって一晩成熟させた。ウイルスをＵＶ照射によって不活化させた。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、磁気ビーズシステムを使用して単離し、そしてプライミング培養を、標準的な培養技術を使用して開始した。培養物を、Ｐ５０１ＳおよびＣＤ５０をレトロウイルスにより形質導入した自己初代線維芽細胞を使用して、７＝１０日間毎に再刺激した。４回の刺激サイクルに続いて、Ｐ５０１ＳおよびＣＤ５０を形質導入した自己線維芽細胞で刺激した場合にインターフェロン−γを特異的に産生したＣＤ８＋Ｔ細胞株を、同定した。Ｐ５０１Ｓを形質導入したＨＬＡ−ミスマッチＢ−ＬＣＬ株のパネルを作製して、応答の制限対立遺伝子を規定した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイでインターフェロン−γを測定することによって、Ｐ５０１Ｓ特異的応答は、ＨＬＡ  Ｂ対立遺伝子によって制限されるようであることが示された。これらの結果は、Ｐ５０１Ｓに対するＣＤ８＋ＣＴＬ応答が惹起され得ることを示す。
【１０６１】
認識されるエピトープを同定するために、Ｐ５０１ＳをコードするｃＤＮＡを、種々の制限消化によって断片化し、そしてレトロウイルス発現ベクターｐＢＩＢ−ＫＳにサブクローニングした。レトロウイルス上清を、ヘルパーパッケージング株Ｐｈｏｅｎｉｘ−Ａｍｐｈｏのトランスフェクションによって作製した。次いで、上清を使用して、ＣＴＬスクリーニングのためにＪｕｒｋａｔ／Ａ２Ｋｂ細胞を形質導入した。ＣＴＬを、Ｐ５０１Ｓフラグメントの「ライブラリー」で形質導入されたこれらのＡ２Ｋｂ標的に対してＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイでスクリーニングした。初期ポジティブフラグメントＰ５０１Ｓ／Ｈ３およびＰ５０１Ｓ／Ｆ２を配列決定し、そして配列番号１１３のアミノ酸１０６〜５５３およびアミノ酸１３６〜５４７をそれぞれコードすることが見出された。ＣＴｌを刺激することができなかった、配列番号１１３のアミノ酸残基１０６〜３５１をコードするために、Ｈ３の短縮物を作製し、アミノ酸残基３５１〜５４７にエピトープを局在化した。アミノ酸１〜４７２（フラグメントＡ）およびアミノ酸１〜３５１（フラグメントＢ）をコードするさらなるフラグメントをまた構築した。フラグメントＢではなく、フラグメントＡが、ＣＴＬを刺激し、エピトープをアミノ酸残基３５１〜４７２を局在化した。この領域を表す重複する２０マーおよび１８マーのペプチドを、ＩＦＮ−γアッセイでＣＴＬに対してＪｕｒｋａｔ／Ａ２Ｋｂ細胞をパルスすることによって試験した。ペプチドＰ５０１Ｓ−３６９（２０）およびＰ５０１Ｓ−３６９（１８）のみが、ＣＴｌを刺激した。この領域を表す９マーおよび１０マーのペプチドを合成し、同様に試験した。ペプチドＰ５０１Ｓ−３７０（配列番号５３９）は、強い応答を与える最小の９マーであった。ペプチドＰ５０１Ｓ−３７６（配列番号５４０）はまた、弱い応答を与え、交差反応性エピトープを表し得る。
【１０６２】
引き続く研究において、Ｐ５０１Ｓを形質導入された初代ヒトＢ細胞が、ＭＨＣクラスＩ制限Ｐ５０１Ｓ特異的自己ＣＤ８Ｔ細胞をプライムする能力を試験した。初代Ｂ細胞を、ＣＤ４０リガンドおよびＩＬ−４で培養することによってホモ接合型ＨＬＡ−Ａ２ドナーのＰＢＭＣから誘導し、ベクターｐＢＩＢで組換えＰ５０１Ｓで高い頻度で形質導入し、そしてブラストシジン（ｂｌａｓｔｏｃｉｄｉｎ）−Ｓで選択した。インビトロプライミングのために、精製ＣＤ８＋Ｔ細胞を、９６ウェルマイクロ培養形式で、自己ＣＤ４０リガンド＋ＩＬ−４誘導、Ｐ５０１Ｓ形質導入Ｂ細胞を用いて培養した。これらのＣＴＬマイクロ培養物をＰ５０１Ｓ形質導入Ｂ細胞を用いて再刺激し、次いで、特異性についてアッセイした。この初期のスクリーニングに続いて、バックグラウンドより上の有意なシグナルを有するマイクロ培養物を、自己ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞（ＢＬＣＬ）でクローニングし、Ｐ５０１Ｓをまた形質導入した。検出のためにＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴを使用して、これらのＣＤ８  Ｔ細胞クローンのいくつかが、コントロール抗原で形質導入されたＢＬＣＬではなく、ＢＬＣＬ／Ｐ５０１Ｓに対する反応性によって実証されるように、Ｐ５０１Ｓに対して特異的であることが見出された。抗Ｐ５０１Ｓ  ＣＤ８  Ｔ細胞特異性がＨＬＡ−Ａ２制限されることがさらに実証された。最初に、抗ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃモノクローナル抗体（Ｗ６．３２）、抗ＨＬＡ−Ｂ，Ｃモノクローナル抗体（Ｂ１．２３．２）およびコントロールモノクローナル抗体を用いた抗体ブロッキング実験は、抗ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ抗体のみがＰ５０１Ｓ発現自己ＢＬＣＬの認識をブロックしたことを示した。第２に、抗Ｐ５０１Ｓ  ＣＴＬはまた、対応するＥＧＦＰ形質導入されたコントロールＢＬＣＬではなく、Ｐ５０１Ｓを形質導入された、ＨＬＡ−Ａ２マッチした異種ＢＬＣＬを認識した。
【１０６３】
Ｐ５０１Ｓの天然にプロセスされたＣＤ８クラスＩ制限ペプチドは以下のように同定した。樹状細胞（ＤＣ）を、Ｐｅｒｃｏｌ勾配、続いて差示的接着によって単離し、そして１％ヒト血清、５０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦおよび３０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４を含むＲＰＭＩ培地の存在下で５日間培養した。培養後、ＤＣを２４時間、１０のＭＯＩでＰ５０１Ｓ発現アデノウイルスで感染させ、２μｇ／ｍｌのＣＤ４０リガンドの添加によって、さらに２４時間成熟させた。ＣＤ８細胞を、磁気ビーズを用いてＰＢＭＣからＣＤ４＋集団、ＣＤ１４＋集団およびＣＤ１６＋集団を減らすことによって濃縮させた。１ウェル当たり１０，０００Ｐ５０１Ｓ発現ＤＣおよび１００．０００ＣＤ８＋Ｔ細胞を含むプライミング培養物を、１０％ヒト血清、５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１２および１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６を含むＲＰＭＩを用いて９６ウェルＶボタンプレート中にセットアップした。培養物を、Ｐ５０１ＳおよびＣＤ８０を発現するようにレトロウイルスにより形質導入した自己線維芽細胞を使用して、７日毎に刺激し、そしてＭＨＣクラスＩ発現をアップレギュレートするために、４８〜７２時間、ＩＦＮ−γで処理した。１０μ／ｍｌ  ＩＬ２を、刺激のとき、および刺激の２日後および５日後に添加した。４回の刺激サイクルに続いて、１つのＰ５０１Ｓ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞株（２Ａ２と呼ばれる）を同定し、これは、ＩＦＮ−γ処理Ｐ５０１Ｓ／ＣＤ８０発現自己線維芽細胞に応答してＩＦＮ−γを産生するが、γ−ＩＦＮ  ＥｌｉｓｐｏｔアッセイにおいてＩＦＮ−γ処理Ｐ７０３Ｐ／ＣＤ８０発現自己線維芽細胞に応答してＩＦＮ−γを産生しない。株２Ａ２を、７５，０００ＰＢＭＣ／ウェル、１０，０００Ｂ−ＬＣＬ／ウェル、３０ｎｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３および５０ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２の存在下、０．５細胞／ウェルまたは２細胞／ウェルで、９６ウェルプレートでクローニングした。形質導入された線維芽細胞に対する応答において強いＰ５０１Ｓ特異性を示した１２個のクローンを単離した。
【１０６４】
蛍光標示式細胞選別（ＦＡＣＳ）分析を、ＰｅｒｃＰ、ＦＩＴＣおよびＰＥそれぞれに結合したＣＤ３特異的抗体、ＣＤ４特異的抗体、およびＣＤ８特異的抗体を使用して、Ｐ５０１Ｓ特異的クローンで実行した。プライミング培養物でのＣＤ８富化Ｔ細胞の使用と一致して、Ｐ５４０１Ｓ特異的クローンが、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋およびＣＤ４−であることを決定した。
【１０６５】
Ｐ５０１Ｓ特異的ＣＴＬによって認識される関連Ｐ５０１Ｓエピトープを同定するために、Ｐ５０１Ｓのアミン酸配列の大部分にわたる１８〜２０マーまたは３０マーのペプチドのプールを、自己Ｂ−ＬＣＬ上に装填し、そして４Ｅ５および４Ｅ７と呼ばれる、２つのＰ５０１Ｓ特異的ＣＴＬクローンを刺激する能力について、γ−ＩＦＮ  Ｅｌｉｓｐｏｔで試験した。Ｐ５０１Ｓのアミノ酸４１１〜４８６（配列番号１１３）にわたる１８〜２０マーペプチドから構成される１つのプールは、両方のＰ５０１Ｓ特異的クローンによって認識されることが見出された。クローンによって認識される特異的な１８〜２０マーペプチドを同定するために、ポジティブプールを構成する１８〜２０マーペプチドの各々が、２つのＰ５０１Ｓ特異的ＣＴＬクローン（４Ｅ５および４Ｅ７）を刺激する能力について、γ−ＩＦＮ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにおいて個々に試験した。４Ｅ５および４Ｅ７の両方が、Ｐ５０１Ｓのアミノ酸４５３〜４７２にわたる１つの２０マーペプチド（配列番号８５３；配列番号８５４において提供されるｃＤＮＡ）を特異的に認識する。ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される最小エピトープがほとんど常に９マーペプチド配列または１０マーペプチド配列のいずれかであるので、１アミノ酸だけ異なる、配列番号８５３の配列全体にわたる１０マーペプチドを合成した。これらの１０マーペプチドのそれぞれを、２つのＰ５０１Ｓ特異的クローン（１Ｄ５および１Ｅ１２と呼ばれる）を刺激する能力について試験した。Ｐ５０１Ｓ特異的クローンを特異的に刺激する、１つの１０マーペプチド（配列番号８５５；配列番号８５６において提供されるｃＤＮＡ配列）を同定した。このエピトープは、Ｐ５０１Ｓのアミノ酸４６３〜４７２にわたる。この配列は、天然にプロセスされ得、ＣＴＬ応答が正常ＰＢＭＣにおいて同定され得るＰ５０１Ｓ由来の最小１０マーエピトープを規定する。従って、このエピトープは、ワクチン部分として、ならびに前立腺癌の治療試薬および／または診断試薬としての使用の候補である。
【１０６６】
配列番号８５５のＰ５０１Ｓ由来の配列に対するクラスＩ制限エレメントを同定するために、ＨＬＡブロッキングおよびミスマッチ分析を実行した。γ−ＩＦＮ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにおいて、Ｐ５０１Ｓ形質導入自己線維芽細胞に対する、クローン４Ａ７および４Ｅ５の特異的応答を、２５ｕｇ／ｍｌ  Ｗ６／３２（ｐａｎ−クラスＩブロッキング抗体）およびＢ１．２３．２（ＨＬＡ−Ｂ／Ｃブロッキング抗体）でプレインキュベーションしてブロックした。これらの結果は、配列番号８５５特異的応答がＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子またはＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子に制限されることを実証した。
【１０６７】
ＨＬＡミスマッチ分析について、ＨＬＡＢ５１対立遺伝子を共有する、自己Ｂ−ＬＣＬ（ＨＬＡ−Ａ１、Ａ２、Ｂ８、Ｂ５１、Ｃｗ１、Ｃｗ７）および異種Ｂ−ＬＣＬ（ＨＬＡ−Ａ２、Ａ３、Ｂ１８、Ｂ５１、Ｃｗ５、Ｃｗ１４）を、配列番号８５５の２０ｕｇ／ｍｌのペプチドと１時間パルスし、洗浄し、クローン４Ａ７および４Ｅ５を刺激する能力についてγ−ＩＦＮ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにおいて試験した。Ｂ１．２３．２（ＨＬＡ−Ｂ／Ｃブロッキング抗体）を用いる抗体ブロッキングアッセイをまた実行した。配列番号８５５特異的応答を、自己（Ｄ３２６）および異種（Ｄ１０７）Ｂ−ＬＣＬの両方を使用して検出し、さらに、応答を、２５ｕｇ／ｍｌのＢ１．２３．２  ＨＬＡ−Ｂ／Ｃブロッキング抗体を用いてプレインキュベーションしてブロックした。まとめると、これらの結果は、配列番号８５５のペプチドに対するＰ５０１Ｓ特異的応答が、ＨＬＡ−Ｂ５１クラスＩ対立遺伝子に制限されることを実証する。Ｄ３２６からのＨＬＡ−Ｂ５１対立遺伝子の分子クローニングおよび配列分析は、Ｄ３２６のＨＬＡ−Ｂ５１サブタイプがＨＬＡ−Ｂ５１０１１であることが明らかにされた。
【１０６８】
配列番号８５５の１０マーＰ５０１Ｓ由来のエピトープに基づいて、配列番号８５７および８５８の配列を用いる２つの９マーを合成し、２Ａ２由来の２つのＰ５０１Ｓ特異的ＣＴＬクローンを刺激する能力についてＥｌｉｓｐｏｔアッセイにおいて試験した。配列番号８５５の１０マーペプチド、および配列番号８５８の９マーペプチド（配列番号８５７の９マーペプチドではない）は、ＩＦＮ−γを産生するためにＰ５０１Ｓ特異的ＣＴＬを刺激し得る。これらの結果は、配列番号８５８のペプチドが、Ｐ５０１Ｓ特異的ＣＴＬによって認識される９マーＰ５０１Ｓ由来のエピトープであることを実証する。配列番号８５８のエピトープをコードするＤＮＡ配列を、配列番号８５９に提供する。
【１０６９】
配列番号８５５および８５８のＰ５０１Ｓ由来のペプチドに特異的な応答に対するクラスＩ制限対立遺伝子を同定するために、ＨＬＡ  Ｂ対立遺伝子およびＨＬＡ  Ｃ対立遺伝子のそれぞれを、インビトロプライミング実験で使用したドナーからクローニングした。配列分析は、関連対立遺伝子が、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ５１、ＨＬＡ−Ｃｗ０１およびＨＬＡ−Ｃｗ０７であったことを示した。これらの対立遺伝子のそれぞれを、発現ベクターにサブクローニングし、Ｐ５０１Ｓ遺伝子とともにＶＡ−１３細胞内に同時トランスフェクトした。次いで、トランスフェクトされたＶＡ−１３細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてＰ５０１Ｓ特異的ＣＴＬを特異的に刺激する能力について試験した。Ｐ５０１ＳおよびＨＬＡ−Ｂ５１をトランスフェクトしたＶＡ−１３細胞は、γ−ＩＦＮを分泌するために、Ｐ５０１Ｓ特異的ＣＴＬを刺激し得た。ＨＬＡ−Ｂ５１単独またはＰ５０１Ｓおよび他のＨＬＡ−対立遺伝子をトランスフェクトしたＶＡ−１３細胞は、Ｐ５０１Ｓ特異的ＣＴＬを刺激し得なかった。これらの結果は、Ｐ５０１Ｓ特異的応答に対する制限対立遺伝子が、ＨＬＡＢ５１対立遺伝子であることを実証する。配列分析は、関連する制限対立遺伝子のサブタイプがＨＬＡ−Ｂ５１０１１であることを明らかにした。
【１０７０】
Ｐ５０１Ｓ特異的ＣＴＬがＰ５０１Ｓを発現する前立腺腫瘍細胞を認識し得るか否かを決定するために、Ｐ５０１Ｓポジティブ株ＬｎＣＡＰおよびＣＲＬ２４２２（両方とも、Ｐ５０１Ｓ  ｍＲＮＡおよびタンパク質の「中程度」量を発現する）、ならびにＰＣ−３（Ｐ５０１Ｓ  ｍＲＮＡおよびタンパク質の低量を発現する）、およびＰ５０１Ｓネガティブ細胞株ＤＵ−１４５を、Ｐ５０１Ｓ特異的ＣＴＬを産生するために使用されるドナーからクローニングされたＨＬＡ−Ｂ５１０１１対立遺伝子をレトロウイルスにより形質導入された。ＨＬＡ−Ｂ５１０１１またはＥＧＦＰを形質導入され、かつ選択された腫瘍細胞を、γ−インターフェロンおよびアンドロゲン（刺激機能およびＰ５０１Ｓをそれぞれアップレギュレートするため）で処理し、そしてＰ５０１Ｓ特異的ＣＴＬクローン４Ｅ５および４Ｅ７を用いてγ−インターフェロンＥｌｉｓｐｏｔアッセイで使用した。未処理細胞をコントロールとして使用した。
【１０７１】
４Ｅ５および４Ｅ７の両方が、ＨＬＡ−Ｂ５１０１１対立遺伝子を形質導入されたＬｎＣＡＰおよびＣＲＬ２４２２を効率的かつ特異的に認識したが、ＥＧＦＰを形質導入された同じ細胞株では認識しなかった。さらに、両方のＣＴＬクローンは、ＨＬＡ−Ｂ５１０１１で形質導入されたＰＣ−３を特異的に認識するが、Ｐ５０１Ｓネガティブ腫瘍細胞株ＤＵ−１４５を認識しなかった。γ−インターフェロンまたはアンドロゲンでの処理は、腫瘍細胞を認識するＣＴＬの能力を向上しなかった。これらの結果は、インビトロ全遺伝子プライミングによって産生されるＰ５０１Ｓ特異的ＣＴＬが、Ｐ５０１Ｓを発現する前立腺腫瘍細胞を特異的かつ効率的に認識することを実証する。
【１０７２】
Ｐ５０１Ｓの天然にプロセスされたＣＤ４エピトープが、以下のように同定された。
【１０７３】
Ｐ５０１Ｓに特異的なＣＤ４細胞を、上記のように調製した。Ｐ５０１Ｓ遺伝子のアミノ末端の約５０％にわたる１６個の重複ペプチドのシリーズを合成した（配列番号１１３のアミノ酸１〜３２５）。プライミングのために、ペプチドを４つのペプチドのプールに組み合わせ、ＴＮＦ−αで２４時間、樹状細胞（ＤＣ）上に４μｇ／ｍｌでパルスした。次いで、ＤＣを洗浄し、そして９６ウェルＵ底プレート中でネガティブに選択されたＣＤ４＋Ｔ細胞を用いて混合した。培養物を、ペプチドプールを装填した新鮮なＤＣで毎週再刺激した。合計４回の刺激サイクルに続いて、細胞をさらなる週の間、静止させ、γ−ＩＦＮ  ＥＬＩＳＡおよび増殖アッセイを使用してペプチドプールでパルスしたＡＰＣに対する特異性について試験した。これらのアッセイについて、関連ペプチドプール、４ｕｇ／ｍｌまたは関連のないペプチドμｇ／ｍｌのいずれかを装填された付着単球をＡＰＣとして使用した。特異的サイトカイン分泌または増殖のいずれかを実証するＴ細胞株を、次いで、プールに存在した個々のペプチドの認識について試験した。Ｔ細胞株は、これらのプールからの個々のペプチドを認識するプールＡおよびＢから同定され得た。
【１０７４】
プールＡから、株ＡＤ９およびＡＥ１０が、ペプチド１（配列番号８６２）を特異的に認識し、そして株ＡＦ５は、ペプチド３９（配列番号８６１）を認識する。プールＢから、ペプチド５８（配列番号８６０）を認識する株ＢＣ６を同定し得る。これらの株のそれぞれを特異的ペプチドで刺激し、滴定アッセイにおけるペプチドの特異的に認識、およびＰ５０１Ｓまたは非関連抗原のいずれかを発現するアデノウイルスでのＨＥＫ２９３細胞の感染によって産生された細胞溶解物について試験した。これらのアッセイについて、ＡＰＣ接着単球を１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌまたは０．１μｇ／ｍｌの個々のＰ５０１Ｓペプチドでパルスし、ＤＣを一晩、アデノウイルス感染細胞溶解物の１：５希釈で一晩パルスした。株ＡＤ９、ＡＥ１０およびＡＦ５は、０．１ｍｇ／ｍｌでさえ関連Ｐ５０１Ｓ由来のペプチドの有意な認識を保持した。さらに、株ＡＤ９は、アデノウイルス−Ｐ５０１Ｓ感染細胞からの溶解物について有意な（８．１倍の刺激指数）比活性を実証した。これらの結果は、高い親和性のＣＤ４Ｔ細胞株が、Ｐ５０１Ｓ由来のエピトープに対して作製され得ることを実証し、そして配列番号８６２のＰ５０１Ｓ由来の配列に特異的なこれらのＴ細胞の少なくともサブセットが、ヒト細胞によって天然にプロセスされるエピトープに対して特異的であることを実証した。配列番号８６０〜８６２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号８６３〜８６５に提供される。
【１０７５】
ＡＤ９のＰ５０１Ｓ特異的活性をさらに特徴付けるために、この株を抗ＣＤ３を使用してクローニングした。Ｐ５０１Ｓ−１ペプチド（配列番号８６２）に特異的であった３つのクローン（１Ａ１、１Ａ９および１Ｆ５と呼ばれる）を同定した。Ｐ５０１Ｓ特異的応答に対するＨＬＡ制限対立遺伝子を決定するために、これらのクローンのそれぞれを、増殖およびγ−インターフェロンアッセイを使用して、クラスＩＩ抗体ブロッキングおよびＨＬＡミスマッチアッセイにおいて試験した。抗体ブロッキングアッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイを使用するγ−インターフェロン産生の測定において、ペプチドパルスされたＡＰＣを認識する３つ全てのクローンの能力は、ｐａｎ−クラスＩＩ抗体ブロッキング抗体またはＨＬＡ−ＤＲブロッキング抗体のいずれかでの同時インキュベーションによって特異的にブロックされたが、ＨＬＡ−ＤＱでも非関連抗体でもブロックしなかった。同じ細胞で同時に実施された増殖アッセイは、これらの結果を確認した。これらのデータは、クローンのＰ５０１Ｓ特異的応答が、ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子によって制限されることを示す。さらなる研究は、Ｐ５０１Ｓ特異的応答に対する制限対立遺伝子が、ＨＬＡ−ＤＲＢ１５０１であることを実証した。
【１０７６】
（実施例１３）
（マイクロアレイ分析による前立腺特異的抗原の同定）
この実施例は、前立腺腫瘍ｃＤＮＡライブラリーからの特定の前立腺特異的ポリペプチドの単離を記載する。
【１０７７】
上記のヒト前立腺腫瘍ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、マイクロアレイ分析を使用してスクリーニングして、前立腺腫瘍および／または正常前立腺組織において、非前立腺正常組織（精巣を含まない）と比較して、少なくとも３倍過剰の発現を示すクローンを同定した。３７２個のクローンを同定し、そして３１９個を首尾良く配列決定した。表ＩＩは、これらのクローンの概要を提供し、これらを配列番号３８５〜４００に示す。これらの配列のうち、配列番号３８６、３８９、３９０および３９２は、新規な遺伝子に対応し、そして配列番号３９３および３９６は、先に同定された配列に対応する。他の配列（配列番号３８５、３８７、３８８、３９１、３９４、３９５および３９７〜４００）は、表ＩＩに示されるように、公知の配列と対応する。
【１０７８】
【表２】
2006515749.tif 000004
引き続く研究は、配列番号３２９（Ｐ５５４Ｓとも呼ばれる）のクローンについての伸長されたｃＤＮＡ配列の単離を導いた。この伸長された配列は、配列番号９６７に提供され、対応するアミノ酸が配列番号９６８に提供される。
【１０７９】
ＣＧＩ−８２は、試験された他の正常組織と比較して、前立腺組織において４．０６倍過剰発現を示した。これは、４３％の前立腺腫瘍、２５％の正常前立腺において過剰発現され、試験された他の正常組織において検出されなかった。Ｌ−イジトール−２デヒドロゲナーゼは、試験された他の正常組織と比較して、前立腺組織において４．９４倍過剰発現を示した。これは、前立腺腫瘍の９０％、正常前立腺の１００％において過剰発現され、試験された他の正常組織において検出されなかった。Ｅｔｓ転写因子ＰＤＥＦは、試験された他の正常組織と比較して、前立腺組織において５．５５倍の過剰発現を示した。これは、４７％前立腺腫瘍、２５％正常前立腺において過剰発現され、試験された他の正常組織において検出されなかった。ｈＴＧＲ１は、試験された他の正常組織と比較して、前立腺組織において、９．１１倍の過剰発現を示した。これは、６３％の前立腺腫瘍において過剰発現され、正常前立腺を含む試験された正常組織において検出されなかった。ＫＩＡＡ０２９５は、試験された他の正常組織と比較して、前立腺組織において５．５９倍の過剰発現を示した。これは、４７％の前立腺腫瘍において過剰発現され、正常前立腺組織においてを含む、試験された正常組織において検出可能に低かった。前立腺酸性ホスファターゼは、試験された他の正常組織と比較して、前立腺組織において９．１４倍の過剰発現を示した。これは、６７％の前立腺腫瘍、５０％の正常組織において過剰発現され、試験された他の正常組織において検出されなかった。トランスグルタミナーゼは、試験された他の正常組織と比較して、前立腺組織において１４．８４倍の過剰発現を示した。これは、３０％の前立腺腫瘍、５０％の正常前立腺において過剰発現され、試験された他の正常組織において検出されなかった。高密度リポタンパク質結合タンパク質（ＨＤＬＢＰ）は、試験された他の正常組織と比較して、前立腺組織において２８．０６倍の過剰発現を示した。これは、９７％の前立腺腫瘍、７５％の正常前立腺において過剰発現され、試験された全ての他の正常組織において検出され得なかった。ＣＧＩ−６９は、試験された他の正常組織と比較して、前立腺組織において３．５６倍の過剰発現を示した。これは、９０％より多くの前立腺腫瘍、７５％の正常前立腺において検出される低い量の遺伝子である。正常組織におけるこの遺伝子の発現は、非常に低かった。ＫＩＡＡ０１２２は、試験された他の正常組織と比較して、前立腺組織において４．２４倍の過剰発現を示した。これは、５７％の前立腺腫瘍において過剰発現された。これは、正常前立腺組織を含む、試験された全ての正常組織において検出され得なかった。１９１４２．２ｂａｎｇｕｒは、試験された他の正常組織と比較して、前立腺組織において２３．２５倍の過剰発現を示した。これは、９７％の前立腺腫瘍、および１００％の正常前立腺において過剰発現された。これは、試験された他の正常組織において検出され得なかった。５５６６．１  Ｗａｎｇは、試験された他の正常組織と比較して、前立腺組織において３．３１倍の過剰発現を示した。これは、９７％の前立腺腫瘍、および７５％の正常前立腺において過剰発現され、正常骨髄、���臓および活性化ＰＢＭＣにおいて過剰発現された。新規なクローン２３３７９（Ｐ５５３Ｓとも呼ばれる）は、試験された他の正常組織と比較して、前立腺組織において４．８６倍の過剰発現を示した。これは、９７％の前立腺腫瘍、および７５％の正常前立腺において検出され得、試験された全ての他の正常組織において検出され得なかった。新規なクローン２３３９９は、試験された他の正常組織と比較して、前立腺組織において４．０９倍の過剰発現を示した。これは、２７％の前立腺腫瘍において過剰発現され、正常前立腺組織を含む、試験された全ての正常組織において検出され得なかった。新規なクローン２３３２０は、試験された他の正常組織と比較して、前立腺組織において３．１５倍の過剰発現を示した。これは、全ての前立腺腫瘍において、５０％の正常前立腺組織において検出され得る。これはまた、正常結腸および気管において発現された。他の正常組織は、この遺伝子を高レベルで発現しない。
【１０８０】
標準的技術を使用する、Ｐ５５３Ｓについての引き続く全長クローニング研究は、このクローンが、Ｐ５０１Ｓの不完全なスプライスされた形態であることを明らかにした。Ｐ５５３Ｓの４つのスプライス改変体についての決定されたｃＤＮＡ配列を、配列番号７０２〜７０５に提供した。配列番号７０５によってコードされるアミノ酸配列を、配列番号７０６に提供する。配列番号７０２のｃＤＮＡは、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むことが見出された。これらの２つのＯＲＦによってコードされるアミノ酸配列を、配列番号７０７および７０８に提供する。
【１０８１】
（実施例１４）
（電子サブトラクション（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）前立腺特異的抗原の同定）
本実施例は、前立腺特異的抗原を同定するための電子サブトラクションの使用を記載する。
【１０８２】
ＧｅｎＢａｎｋヒトＥＳＴデータベースに存在する潜在的な前立腺特異的遺伝子を、電子セブストラクション（Ｖａｓｍａｔｉｚｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：３００−３０４，１９９８によって記載されるのと類似する）によって同定した。種々の前立腺ライブラリーに由来するＥＳＴクローン（４３，４８２）の配列を、公的なＧｅｎＢａｎｋヒトＥＳＴデータベースから得た。各前立腺ＥＳＴ配列を、ヒトＥＳＴデータベースに対するＢＬＡＳＴＮ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）検索においてクエリー配列として使用した。同一と考慮された全ての適合（適合配列の長さ＞１００塩基対、この領域にわたる同一な適合の密度＞７０％）を、クラスター中で一緒に分類（整列）させた。２００ＥＳＴより多くを含むクラスターを、処分した。なぜなら、それらは、おそらく、リボソームタンパク質にエレメントまたは遺伝子のように、反復エレメントまたは高度に発現した遺伝子を表すからである。２つ以上のクラスターが共通のＥＳＴを共有する場合、これらのクラスターを、４，３４５前立腺スーパークラスターを生じる「スーパークラスター」に一緒に分類した。
【１０８３】
ＧｅｎＢａｎｋの公開に示される４７９ヒトｃＤＮＡライブラリーの記載を、これらのｃＤＮＡライブラリーの記載のデータベースを作成するためにダウンロードした。これらの４７９ｃＤＮＡライブラリーを、以下の３つの群に分類した：プラス（正常前立腺および前立腺腫瘍のライブラリー、および胸部細胞株ライブラリー、ここでの発現が所望された）、マイナス（他の正常成体組織由来のライブラリー、ここでの発現は所望されなかった）、および他（胎児組織、乳児組織、女性のみに見られる組織、非前立腺腫瘍、および非前立腺腫瘍ならびに前立腺細胞株以外の他の細胞株に由来するライブラリー、ここでの発現により関連性がないことを考慮した）。これらのライブラリーの概説を、表ＩＩＩに示す。
【１０８４】
（表ＩＩＩ  前立腺ｃＤＮＡライブラリーおよびＥＳＴ）
【１０８５】
【表３】
2006515749.tif 000005
各スーパークラスターを、そのスーパークラスター中のＥＳＴに関して分析した。各ＥＳＴクローンの組織供給源に注目し、そしてこのスーパークラスターを以下の４つの群に分類した：プラス群ライブラリーのみにおいて見出される１−ＥＳＴ型クローン；マイナスもしくは他の群のライブラリーにおいて発現が検出されない；プラスおよび他のライブラリーのみに由来する２−ＥＳＴ型クローン；マイナス群において発現が検出されない；プラス、マイナスおよび他の群のライブラリーに由来するが、プラス群に由来するＥＳＴの数は、マイナスもしくは他の群のいずれかよりも高い、３−ＥＳＴ型クローン；ならびにプラス、マイナスおよび他の群のライブラリーに由来するが、プラス群に由来する数が、マイナス群に由来する数よりも高い、４−ＥＳＴ型クローン。この分析により、４，３４５胸部クラスターを同定した（表ＩＶを参照のこと）。これらのクラスターより、３，１７２ＥＳＴクローンをＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．に注文し、９６ウェルプレート中の凍結グリセロールストックとして受け取った。
【１０８６】
（表ＩＶ  前立腺癌クラスターの概要）
【１０８７】
【表４】
2006515749.tif 000006
ＥＳＴクローン挿入物を、Ｓｙｎｔｅｎｉマイクロアレイ分析についてのアミノ連結ＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ分析した。１つより多いＰＣＲ産物が特定のクローンについて得られた場合、発現分析について、ＰＣＲ産物を使用しなかった。総計で、電子サブトラクション法由来の２，５２８のクローンを、マイクロアレイ分析により分析し、高レベルの腫瘍ｍＲＮＡ対正常組織ｍＲＮＡを有する電子サブトラクション乳房クローンを同定した。このようなすクリーニングを、Ｓｙｎｔｅｎｉ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）マイクロアレイを用いて、製造者の指示書に（およびＳｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：１０６１４−１０６１９，１９９６およびＨｅｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’Ｉ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：２１５０−２１５５，１９９７に実質的に記載されるとおりに）従って行なった。これらの分析において、クローンをチップ上に配列し、次いで、それを正常前立腺ｃＤＮＡおよび腫瘍前立腺ｃＤＮＡ、ならびに種々の他の正常組織から作製した蛍光プローブでプローブした。このスライドを、スキャニングし、蛍光強度を測定した。
【１０８８】
３より大きい発現比を有するクローン（すなわち、前立腺腫瘍ｍＲＮＡおよび正常前立腺ｍＲＮＡにおけるレベルが、他の正常組織ｍＲＮＡのレベルの少なくとも３倍のレベルである９を前立腺腫瘍特異的配列として同定した（表Ｖ）。これらのクローンの配列を、配列番号４０１〜４５３に提供し、特定の新規の配列を、配列番号４０７、４１３、４１６−４１９、４２２、４２６、４２７および４５０に示す。
【１０８９】
（表５  前立腺腫瘍特異的クローン）
【１０９０】
【表５−１】
2006515749.tif 000007
【１０９１】
【表５−２】
2006515749.tif 000008
配列番号４０７（またＰ１０２０Ｃとも称される）のクローンについてのさらなる研究は、配列番号５９１に提供される伸長ｃＤＮＡ配列の単離を生じた。この伸長ｃＤＮＡ配列は、配列番号５９２のアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレームを含むことが見出された。Ｐ１０２０Ｃ  ｃＤＮＡ配列およびＰ１０２０Ｃアミノ酸配列は、ヒト内生レトロウイルスＨＥＲＶ−Ｋ  ｐｏｌ遺伝子およびヒト内生レトロウイルスＨＥＲＶ−Ｋ  ｐｏｌタンパク質に対してある程度の類似性を示すことが見出された。
【１０９２】
（実施例１５）
（マイクロアレイ分析による前立腺特異的抗原のさらなる同定）
本実施例は、前立腺腫瘍ｃＤＮＡライブラリーからのさらなる前立腺特異的ポリペプチドの単離を記載する。
【１０９３】
上記のヒト前立腺腫瘍ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、マイクロアレイ分析を使用してスクリーニングし、非前立腺正常組織（精巣を含まず）と比較して、前立腺腫瘍組織および／または正常前立腺組織において少なくとも３倍の過剰発現を示すクローンを同定した。１４２個のクローンを同定し、配列決定した。これらのクローンのいくつかを配列番号４５４−４６７に示す。これらの配列の内、配列番号４５９〜４６０は、新規遺伝子を示す。他（配列版吾郷４５４−４５８および４６１−４６７）は、公知の配列に相当する。ＢＬＡＳＴプログラムを用いた配列番号４６１の決定されたｃＤＮＡ配列と、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースの配列との比較は、これまでに同定されている膜貫通プロテアーゼセリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）に対する相同性を明らかにした。このクローンに対する全長ｃＤＮＡ配列は、配列番号８９４に提供され、対応するアミノ酸配列は、配列番号８９５に提供される。ＴＭＰＲＳＳ２の最初の２０９アミノ酸をコードするｃＤＮＡ配列を配列番号８９６に提供し、最初の２０９アミノ酸を配列番号８９７に提供する。
【１０９４】
配列番号４６２の配列（Ｐ８３５Ｐとも称される）は、以前に同定されたクローンＦＬＪ１３５１８（受託番号ＡＫ０２３６４３；配列番号９１７）に相当し、これは、一体となったオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有さないことが見出された。このクローンをＧｅｎｅｓｅｑ  ＤＮＡデータベースを検索するために使用し、そして、このクローンは、以前にＧタンパク質結合レセプタータンパク質として同定された、７回膜貫通ドメインの存在によって特徴付けられるクローン（Ｇｅｎｅｓｅｑ受託番号Ａ０９３５１；アミノ酸Ｇｅｎｅｓｅｑ受入番号Ｙ９２３６５）に適合した。これらのドメイン間のフラグメントの配列は、配列番号９２１−９２９に提供され、配列番号９２１、９２３、９２５および９２７は細胞外ドメインを示し、配列番号９２２、９２４、９２６および９２８は、細胞内ドメインを示す。配列番号９２１−９２８は、Ｐ８３５Ｐのアミノ酸１−２８、５３−６１、８３−１０３、１２４−１４３、１６５−２０１、２２６−２３８、２６３−２７２および２９７−３８１をそれぞれ示す。Ｐ８３５Ｐに対する全長ｃＤＮＡ配列は、配列番号９１６に提供される。終止コドンを含む、Ｐ８３５Ｐに対するオープンリーディング配列のｃＤＮＡ配列は、配列番号９１８に提供され、終止コドンを含まないオープンリーディングフレームは、配列番号９１９に提供され、そして対応するアミノ酸配列は、配列番号９２０に提供される。
【１０９５】
（実施例１６）
（前立腺特異的抗原Ｐ７１０Ｐのさらなる特徴づけ）
本実施例は、Ｐ７１０Ｐの全長クローニングを記載する。
【１０９６】
上記前立腺ｃＤＮＡライブラリーを、上記Ｐ７１０Ｐフラグメントを用いてスクリーニングした。１００万個のコロニーをＬＢ／アンピシリンプレート上に配置した。ナイロン膜フィルターを使用してこれらのコロニーを持ち上げ、次いで、これらのフィルターにより取り上げたｃＤＮＡを変性し、ＵＶ光によってフィルターに架橋した。このＰ７１０Ｐフラグメントを、放射標識し、そのフィルターとハイブリダイズさせるために使用した。ポジティブのｃＤＮＡクローンを選択し、そのｃＤＮＡを回収し、自動Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒにより配列決定した。四つの配列を獲得し、配列番号４６８−４７１に提示した。これらの配列は、Ｐ７１０Ｐ遺伝子の代表的な異なるスプライシング改変体であるようである。それらを有するＰ７１０ＰのｃＤＮＡ配列の後の比較は、ＤＤ３遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１０３９０７およびＡＦ１０３９０８）に対する相同性を明らかにした。ＤＤ３のｃＤＮＡ配列は、配列番号６９０に提供される。
【１０９７】
（実施例１７）
（前立腺特異的抗原のタンパク質発現）
本実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉ、バキュロウイルスおよび哺乳動物細胞における前立腺特異的抗原の発現および精製を記載する。
【１０９８】
（ａ）Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰ５０１Ｓの発現）
Ｐ５０１Ｓの全長形態の発現を、ｐＥＴ１７ｂのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原Ｒａ１２（配列番号４８４）の最初の３０アミノ酸の下流のリーダー配列（配列番号１１３のアミノ酸３６−５５３）を含まないＰ５０１Ｓを最初にクローニングすることによって、試みた。特に、Ｐ５０１Ｓ  ＤＮＡを用いて、プライマーＡＷ０２５（配列番号４８５）およびＡＷ００３（配列番号４８６）を使用するＰＣＲを行った。ＡＷ０２５は、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むセンスクローニングプライマーである。ＡＷ００３は、ＥｃｏＲＩ部位を含むアンチセンスクローニングプライマーである。ＤＮＡ増幅を、５μｌの１０×Ｐｆｕ緩衝液、１μｌの２０ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μｌの、１０μＭ濃度の各ＰＣＲプライマー、４０μｌの水、１μｌのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）および１μｌの、１００ｎｇ／μｌのＤＮＡを使用して行った。９５℃での変性を３０秒間行なった後、９５℃３０秒間、６０℃１分間および７２℃３分間を１０サイクル行なった。９５℃３０秒間、６５℃１分間および７２℃３分間を１０サイクル行い、最後に１サイクルの７２℃１０分間を行なった。ＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いてＲａ１２ｍ／ｐＥＴ１７ｂにクローニングした。生じた融合構築物（Ｒａ１２−Ｐ５０１Ｓ−Ｆと称される）の配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。
【１０９９】
融合構築物を、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、ｐＬｙｓＳおよびＣｏｄｏｎＰｌｕｓ  Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、カナマイシンを含むＬＢ培養液中で一晩増殖させた。生じた培養物をＩＰＴＧを用いて誘導した。タンパク質を、ＰＶＤＦ膜に移し、５％脱脂乳（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液中）でブロックし、３回洗浄し、マウス抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で１時間インキュベートした。この膜を、３回洗浄し、ＨＲＰ−タンパク質Ａ（Ｚｙｍｅｄ）で３０分間プローブした。最後に、この膜を３回洗浄し、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で現像した。ウエスタンブロットでは、発現は、検出されなかった。同様に、Ｒａ１２−Ｐ５０１Ｓ−Ｆ融合物を、ＣＥ６ファージ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるＢＬ２１  Ｃｏｄｏｎ  Ｐｌｕｓにおける発現のために使用した場合、ウエスタンブロットでは発現は検出されなかった。
【１１００】
Ｐ５０１ＳのＮ末端フラグメント（配列番号１１３のアミノ酸３６−３２５）を、以下のように、ｐＥＴ１７ｂのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原Ｒａ１２の最初の３０アミノ酸の下流にクローニングした。Ｐ５０１Ｓ  ＤＮＡを使用して、ＡＷ０２５（配列番号４８５）およびＡＷ０２７（配列番号４８７）を用いるＰＣＲを行なった。ＡＷ０２７は、ＥｃｏＲＩ部位および終止コドンを含むアンチセンスクローニングプライマーである。ＤＮＡ増幅を、本質的に上の記載のように行なった。生じるＰＣＲ産物を、ｐＥＴ１７ｂのＲａ１２に、ＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位でクローニングした。融合構築物（Ｒａ１２−Ｐ５０１Ｓ−Ｎと称される）を、ＤＮＡ配列決定により確認した。
【１１０１】
Ｒａ１２−Ｐ５０１Ｓ−Ｎ融合構築物を、本質的に上の記載のように、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、ｐＬｙｓＥおよびＣｏｄｏｎＰｌｕｓにおける発現に使用した。ウエスタンブロット分析を使用して、タンパク質バンドが、３６ｋＤａ予測される分子量で認められた。いくつかの高分子量のバンドもまた認められ、おそらくこれは、組換えタンパク質の凝集のためである。Ｒａ１２−Ｐ５０１Ｓ−Ｆ融合物を、ＣＥ６ファージによるＢＬ２１  Ｃｏｄｏｎ  Ｐｌｕｓにおける発現のために使用した場合、ウエスタンブロットでは発現は検出されなかった。
【１１０２】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原Ｒａ１２（配列番号４８４）の最初の３０アミノ酸の下に位置するＰ５０１ＳのＣ末端部分（配列番号１１３のアミノ酸２５７−５５３）を含む融合構築物を以下のように調製した。Ｐ５０１Ｓ  ＤＮＡを使用して、プライマーＡＷ０２６（配列番号４８８）およびプライマーＡＷ００３（配列番号４８６）を用いるＰＣＲを行なった。ＡＷ０２６は、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むセンスクローニングプライマーである。ＤＮＡ増幅を、本質的に上の記載のように行なった。生じるＰＣＲ産物をｐＥＴ１７ｂのＲａ１２に、ＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。融合構築物に対する配列（Ｒａ１２−Ｐ５０１Ｓ−Ｃと称される）を確認した。
【１１０３】
Ｒａ１２−Ｐ５０１Ｓ−Ｃ融合構築物を、上記のように、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬＹｓＥ、ｐＬｙｓＳおよびＣｏｄｏｎＰｌｕｓにおける発現に使用した。少量のタンパク質をウエスタンブロットにより検出した。ある程度の分子量の凝集物もまた認められた。Ｒａ１２−Ｐ５０１Ｓ−Ｃ融合物を、ＣＥ６ファージにより誘導したＢＬ２１  Ｃｏｄｏｎ  Ｐｌｕｓにおける発現のために使用した場合、発現もまた、ウエスタンブロットにより検出された。
【１１０４】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原Ｒａ１２（配列番号８４８）の下流に位置するＰ５０１Ｓのフラグメント（配列番号１１３のアミノ酸３６−２９８）を含む融合構築物を以下のように調製した。Ｐ５０１Ｓ  ＤＮＡを使用して、プライマーＡＷ０４２（配列番号８４９）およびプライマーＡＷ０５３（配列番号８５０）を用いるＰＣＲを行なった。ＡＷ０４２は、ＥｃｏＲＩ部位を含むセンスクローニングプライマーである。ＡＷ０５３は、終止コドンおよびＸｈｏＩ部位を含むアンチセンスプライマーである。ＤＮＡ増幅を、本質的に上の記載のように行なった。生じるＰＣＲ産物をｐＥＴ１７ｂのＲａ１２に、ＥｃｏＲＩ部位およびＸｈｏＩ部位にクローニングした。生じる融合構築物（Ｒａ１２−Ｐ５０１Ｓ−Ｅ２とも称される）を、ＴＢ培地中のＢ８３４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ  Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞中に、室温で、２時間発現させた。発現したタンパク質を、封入体を洗浄することにより精製し、Ｎｉ−ＮＴＡカラムに流した。精製されたタンパク質は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  β−Ｍｅおよび５％グリセロールを含有する緩衝液中で可溶性のままであった。発現した融合タンパク質に対する決定されたｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号８５１および配列番号８５２に提供する。
【１１０５】
（バキュロウイルスでのＰ５０１Ｓの発現）
Ｂａｃ−Ｂａｃバキュロウイルス発現系（ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
、Ｉｎｃ）を使用して、昆虫細胞中でＰ５０１Ｓタンパク質を発現させた。全長Ｐ５０１Ｓ（配列番号１１３９をＰＣＲによって増幅して、ドナープラスミドｐＦａｓｔＢａｃｌのＸｂａＩ部位にクローニングした。組換えバックミドおよびバキュロウイルスを製造者の指示書に従って調製した。組換えバキュロウイルスをＳｆ９細胞中に増幅し、高力値のウイルスストック使用してＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を感染させ、組換えタンパク質を作製した。全長タンパク質の同定を、組換えタンパク質のＮ末端配列決定およびウエスタンブロット分析により確認した（図７）。特に、６ウェルプレート中の０．６百万Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞を、未処理のコントロールウイルスＢＶ／ＥＣＤ＿ＰＤ（レーン２）、種々の量もしくはＭＯＩでのＰ５０１Ｓに対する組換えバキュロウイルス（レーン４−８）のいずれかで乾癬させるか、または非感染（レーン３）のままであるかのいずれかにした。細胞溶解物を、還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、抗Ｐ５０１Ｓモノクローナル抗体Ｐ５０１Ｓ−１０Ｅ３−Ｇ４Ｄ３（以下に記載されるとおりに調製される）を用いてウエスタンブロットにより分析した。レーン１は、ビオチン化タンパク質分子量マーカー（ＢｉｏＬａｂｓ）である。
【１１０６】
昆虫細胞における組換えＰ５０１Ｓの局在化を以下のように調べた。Ｐ５０１を過剰発現する昆虫細胞を核の画分、ミトコンドリアの画分、膜の画分および細胞質ゾルの画分に分画した。各画分由来の等量のタンパク質を、Ｐ５０１Ｓに対するモノクローナル抗体を用いるウエスタンブロットにより分析した。分画のスキームに起因して、核の画分およびミトコンドリアの画分は、ある程度原形質膜成分を含む。しかし、膜画分は、基本的に、ミトコンドリアおよび核を含まない。Ｐ５０１は、膜成分を含む全ての画分に存在することが見出されているが、このことは、Ｐ５０１Ｓが組換えタンパク質を発現する昆虫細胞の原形質膜と結合され得ることを示唆している。
【１１０７】
（Ｃ）哺乳動物細胞におけるＰ５０１Ｓの発現）
全長Ｐ５０１Ｓ（５３３アミノ酸；配列番号１１３）を、種々の哺乳動物発現ベクター（これらのベクターとしては、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＶＲ１０１２（Ｖｉｃａｌ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）およびレトロウイルスベクターｐＢＭＮの改変形態（ｐＢＩＢと称される）が挙げられる）中にクローニングした。Ｐ５０１Ｓ／ｐＣＥＰ４およびＰ５０１Ｓ／ｐＶＲ１０１２の、ＨＥＫ２９３線維芽細胞内へのトランスフェクトを、Ｆｕｇｅｎｅトランスフェクション試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して実施した。要約すると、２μｌのＦｕｇｅｎｅ試薬を、１００μｌの血清を含まない培地中に希釈し、室温で５〜１０分間インキュベートした。この混合物を、１μｇのＰ５０１ＳプラスミドＤＮＡに添加し、短時間混合し、そして、室温で３０分間インキュベートした。Ｆｕｇｅｎｅ／ＤＮＡ混合物を細胞に添加し、２４〜４８時間インキュベートした。トランスフェクトしたＨＥＫ２９３線維芽細胞における組換えＰ５０１Ｓの発現を、Ｐ５０１Ｓに対するモノクローナル抗体を使用するウエスタンブロットの手段により検出した。
【１１０８】
ｐ５０１Ｓ／ｐＣＥＰ４のＣＨＯ−Ｋ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）内へのトランスフェクトを、ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒトランスフェクト試薬（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて実施した。要約すると、１５μｌのＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒを、５００μｌの血清を含まない培地中に希釈し、室温で１０分間インキュベートした。ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ／培地混合物を、５００μｌの血清を含まない培地に希釈した２μｇのプラスミドＤＮＡに添加し、短時間混合し、室温で３０分間インキュベートした。ＣＨＯ−Ｋ細胞を、ＰＢＳ中でリンスし、血清タンパク質を取り除き、ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ／ＤＮＡ混合物を添加し、５時間インキュベートした。次いで、トランスフェクトした細胞を、等量の２×培地に添加し、２４〜４８時間インキュベートした。
【１１０９】
Ｐ５０１Ｓを一過性に感染させたＣＨＯ−Ｋ細胞のＦＡＣＳ分析は、Ｐ５０１Ｓの表面での発現そ示した。発現を、以下に記載するように、Ｐ５０１Ｓペプチドに対して惹起されたウサギポリクローナル抗血清を使用して検出した。ＦａＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用してフローサイトメトリー分析を実施し、データを、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  プログラムを使用して分析した。
【１１１０】
（ｄ）バキュロウイルスにおけるＰ７０３Ｐの発現）
いくつかの隣接する制限部位と一緒に、全長Ｐ７０３Ｐ−ＤＥ５（配列番号３２６）に対するｃＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いてプラスミドｐＣＤＮＡ７０３を消化することにより得た。生じる制限フラグメント（約８００塩基対）を同じ制限酵素で消化したトランスファープラスミドｐＦａｓｔＢａｃｌＩ中にライゲーションした。挿入物の配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。組換えトランスファープラスミドｐＦＢＰ７０３を使用して、組換えバックミドＤＮＡおよびＢａｃ−Ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現系（ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するバキュロウイルスを作製した。Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞を、上記のように、組換えウイルスＢＶＰ７０３で感染させ、組換えＰ７０３Ｐタンパク質を得た。
【１１１１】
（ｅ）Ｅ，ｃｏｌｉにおけるＰ７８８Ｐの発現）
Ｃ末端６×Ｈｉｓ  Ｔａｇと融合したＰ７８８Ｐの短縮Ｎ末端部分（配列番号７７７の残基１〜６４４、Ｐ７８８Ｐ−Ｎと称される）を、以下のように、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させた。Ｐ７８８Ｐ  ｃＤＮＡを、プライマーＡＷ０８０およびＡＷ０８１（配列番号８１５および８１６）を用いて増幅させた。ＡＷ０８０は、ＮｄｅＩ部位を有するセンスクローニングプライマーである。ＡＷ０８１は、ＸｈｏＩ部位を有するアンチセンスクローニングプライマーである。ＰＣＲ増幅したＰ７８８ＰおよびベクターｐＣＲＸ１を、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化した。ベクターおよび挿入部分をライゲーションし、ＮｏｖａＢｌｕｅ細胞中に形質転換した。コロニーを、挿入部分についてランダムにスクリーニングし、次いで、配列決定した。Ｐ７８８Ｐ−Ｎクローン番号６が、設計した構築物と同一であることを確認した。発現構築物Ｐ７８８Ｐ−Ｎ番号６／ｐＣＲＸ１を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＬコンピーテント細胞中に形質転換した。インキュベーション後、大部分の細胞は、よく増殖し、３時間後、２．０より高いＯＤ６００を達成した。クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥは、約７５ｋＤａで、過剰に発現したバンドを示した。６×Ｈｉｓタグ抗体を使用するウエスタンブロット分析により、そのバンドがＰ７８８ｐ−Ｎであることを確認した。Ｐ７８８Ｐ−Ｎに対する決定したＤＮＡ配列を、配列番号８１７に提供し、対応するアミノ酸配列を、配列番号８１８に提供する。
【１１１２】
（ｆ）Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰ５１０Ｓの発現）
Ｐ５１０Ｓタンパク質は、９個の潜在的な膜貫通ドメインを有し、原形質膜に位置していると予測される。このタンパク質のＣ末端タンパク質およびＰ５１０Ｓの予測される三番目の細胞外ドメインを、以下のようにＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた。
【１１１３】
Ｒａ１２−Ｐ５０１Ｓ−Ｃと称される発現構築物を、Ｎ末端ｅｎｃに６ＨｉｓＴａｇを有し、その後ろにＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原Ｒａ１２（配列番号８１９）、次いでＰ５１０ＳのＣ末端部分（配列番号５３８のアミノ酸残基１１７６−１２６１）を有するように設計した。全長Ｐ５１０Ｓを使用して、プライマーＡＷ０５６およびプライマーＡＷ０５７（それぞれ、配列番号８２０および配列番号８２１）を用いるＰＣＲによってＰ５１０Ｓ−Ｃフラグメントを増幅した。ＡＷ０５６は、ＥｃｏＲＩ部位を有するセンスクローニングプライマーである。ＡＷ０５７は、終止コドンおよびＸｈｏＩ部位を有するアンチセンスプライマーである。増幅したＰ５０１ＳフラグメントおよびＲａ１２／ｐＣＲＸ１を、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、次いで、精製した。挿入部分およびベクターを一緒にライゲーションし、ＮｏｖａＢｌｕｅ中に形質転換した。挿入部分および配列について、コロニーをランダムにスクリーニングした。タンパク質発現に関して、その発現構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＬコンピーテント細胞中に形質転換した。発現条件を最適化するために、小規模の誘導スクリーニングを行なった。誘導後、細胞はよく増殖し、３時間後、２．０より大きいＯＤ６００ｎｍを達成した。クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥは、約３０ｋＤで、過剰に発現したバンドを示した。これは、予測された分子量より大きいが、ウエスタンブロット分析は、ポジティブであり、このことは、このバンドがＨｉｓタグ含有タンパク質であることを示している。最適化培養条件は、以下のとおりである。終夜培養物および昼間培養物（ＬＢ＋カナマイシン＋クロラムフェニコール）を、２５ｍｌの培養物対１ｌの２×ＹＴの比率で、２×ＹＴ（カナマイシンおよびクロラムフェニコールを含む）に希釈する。３７℃で、ＯＤ６００＝０．６まで増殖させる。アリコートを、Ｔ０サンプルとして取り出す。１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、３０℃で、３時間増殖させる。Ｔ３サンプルを取り出し、細胞を、遠心沈殿させ、そして、−８０℃で保存する。Ｒａ１２−Ｐ５１０Ｓ−Ｃ構築物に対する決定したｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号８２２および配列番号８２５に提供する。
【１１１４】
この発現構築物Ｐ５１０Ｓ−Ｃを、５’に加えた開始コドンおよびグリシン（ＧＧＡ）コドン、次いで、そのＰ５１０Ｓ  Ｃ末端フラグメントの後に、インフレームで、ｐＥＴ２８ｂに由来する６×ヒスチジンタグおよび終止コドンベクターがくるように設計した。このクローニングストラテジーは、Ｒａ１２−Ｐ５１０Ｓ−Ｃのためのストラテジーに類似している。但し、使用されるＰＣＲプライマーは、それぞれ、配列番号８２８および配列番号８２９に示されるプライマーであり、そして、ｐＥＴ２８ｂにおいて切断されるＮｃｏｌ／Ｘｈｏｌを使用した。配列番号８２８のプライマーは、５’Ｎｃｏｌ部位を形成し、そして、開始コドンが加えられている。配列番号８２９のアンチセンスプライマーは、Ｐ５１０Ｓ  Ｃ末端フラグメント上のＸｈｏｌ部位を形成する。配列決定によってクローンを確認した。タンパク質発現のために、その発現構築物で、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＬコンピテント細胞に形質転換を起こさせた。２．０を超えるＯＤ６００を、導入の３０時間後に得た。クマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、約１１ｋＤにおいて過剰発現バンドが示される。ウェスタンブロット分析によって、そのバンドが、５１０Ｓ−Ｃであることを確認し、Ｎ末端タンパク質の配列決定も行った。この最適化した培養条件は、以下である：一晩の培養物／日中の培養物（ＬＢ＋カナマイシン＋クロラムフェニコール）を２×ＹＴ（＋カナマイシンおよびクロラムフェニコール）に、２５ｍＬの培養物に１リットルの２×ＹＴという比で希釈して、そして、ＯＤ６００が約０．５にまで達するまで３７℃で培養する。Ｔ０サンプルとして、アリコートを採取した。１ｍＭ  ＩＰＴＧを加え、３時間に亘って３０℃で増殖させた。その細胞を遠心し沈降させて、そして、精製するまで−８０℃で貯蔵した。そのＰ５１０Ｓ−Ｃ構築物について決定したｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号８２３および配列番号８２６として示した。
【１１１５】
Ｐ５１０Ｓの予測される第３の細胞外ドメイン（Ｐ５１０Ｓ−Ｅ３；配列番号５３８残基３２８〜６７６）を、以下のようにＥ．ｃｏｌｉ中で発現した。そのＰ５１０Ｓフラグメントを、配列番号８３０および配列番号８３１に示されるプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。配列番号８３０のプライマーは、ｐＰＤＭへと連結するための使用されるＮｄｅＩ部位を有するセンスプライマーである。配列番号８３１は、ｐＰＤＭへと連結するために使用されるＸｈｏＩ部位が加えられたアンセンスプライマーである。この得られたフラグメントを、ＮｄｅＩ部位およびＸｈｏＩ部位でｐＰＤＭへとクローニングした。クローンを、配列決定によって確認した。タンパク質の発現のために、そのクローンを、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＬコンピテント細胞へといれて形質転換を起こした。導入後に、２．０を超えるＯＤ６００を、達成した。クマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、約３９ｋＤにおいて過剰発現バンドが示され、そのバンドが、５１０Ｓ−ＣであることをＮ末端タンパク質の配列決定によって確認した。この最適化した培養条件は、以下である：一晩の培養物／日中の培養物（ＬＢ＋カナマイシン＋クロラムフェニコール）を２×ＹＴ（＋カナマイシンおよびクロラムフェニコール）に、２５ｍＬの培養物に１リットルの２×ＹＴという比で希釈すること。ＯＤ６００が、０．６に等しくなるまで３７℃で増殖させた。Ｔ０サンプルとしてアリコートを取り出した。１ｍＭ  ＩＰＴＧを加えて、３時間に亘って３０℃で増殖させた。Ｔ３サンプルを取り出して、それらの細胞を遠心して沈降させて、精製するまで−８０℃で貯蔵した。Ｐ５０１Ｓ−Ｅ３について決定したｃＤＮＡおよびアミノ酸の配列を、それぞれ、配列８２４および配列番号８２７として提供した。
【１１１６】
（（ｇ）Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰ７７５Ｓの発現））
抗原Ｐ７７５Ｐは、複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。その第３のＯＲＦは、配列番号４８３のタンパク質をコードしており、このＯＲＦは、最高のｅｍｏｔｉｆスコアを含む。Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原Ｒａ１２（配列番号８１９）およびＮ末端に６×ＨｉｓＴａｇを有するＰ７７５−ＯＲＦ３を含む発現融合構築物を、以下にように調製した。Ｐ７７５Ｐ−ＯＲＦを、配列番号８３２のセンスＰＣＲプライマーおよび配列番号８３３のアンチセンスＰＣＲプライマーを使用して、増幅した。Ｐ７７５ＰおよびＲａ１２／ｐＣＲＸ１のＰＣＲ増幅フラグメントを、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩを用いて消化した。ベクターおよび挿入物を、連結して、ついで、ＮｏｖａＢｕｌｅ細胞に形質転換を起こさせた。コロニーを、挿入物について無作為にスクリーニングして、ついで、配列決定した。その所望の配列を有しているクローンを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＬコンピテント細胞に入れて形質転換させた。導入の２時間後に、その細胞密度は、ＯＤ６００が１．８となりピークに達した。クマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、約３１ｋＤで過剰発現バンドが示された。６×ＨｉｓＴａｇ抗体を使用するウェスタンブロットによって、そのバンドが、Ｒａ１２−Ｐ７７５Ｐ−ＯＲＦ３であることを確認した。この融合構築物について決定したｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号８３４および８３５として提供する。
【１１１７】
ｈ）Ｅ．ｃｏｌｉでのＰ７０３  Ｈｉｓタグ融合タンパク質の発現
Ｐ７０３Ｐのコード領域についてのｃＤＮＡを、配列番号８３６および８３７のプライマーを使用するＰＣＲによって、調製した。このＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ制限酵素で消化して、ゲル精製して、そして、Ｅｃｏ７２Ｉ制限酵素およびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化することで、Ｈｉｓタグを有する改変ｐＥＴ２８ベクターに、インフレームでクローニングした。この正確な構築物を、ＤＮＡ配列分析によって確認して、ついで、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ  Ｓ発現宿主細胞に導入して形質転換させた。この発現組換えＰ７０３Ｐについて決定したアミン酸配列およびｃＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号８３８および８３９として提供する。
【１１１８】
ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉでのＰ７０５  Ｈｉｓタグ融合タンパク質の発現
Ｐ７０５Ｐのコード領域についてのｃＤＮＡを、配列番号８４０および８４１のプライマーを使用するＰＣＲによって、調製した。このＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ制限酵素で消化して、ゲル精製して、そして、Ｅｃｏ７２Ｉ制限酵素およびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化することで、Ｈｉｓタグを有する改変ｐＥＴ２８ベクターに、インフレームでクローニングした。この正確な構築物を、ＤＮＡ配列分析によって確認して、ついで、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ  Ｓ発現宿主細胞およびＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ発現宿主細胞に導入して形質転換させた。この発現組換えＰ７０５Ｐについて決定したアミン酸配列およびｃＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号８４２および８４３として提供する。
【１１１９】
（ｊ）Ｅ．ｃｏｌｉでのＰ７１１  Ｈｉｓタグ融合タンパク質の発現）
Ｐ７１１Ｐのコード領域についてのｃＤＮＡを、配列番号８４４および８４５のプライマーを使用するＰＣＲによって、調製した。このＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ制限酵素で消化して、ゲル精製して、そして、Ｅｃｏ７２Ｉ制限酵素およびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化することで、Ｈｉｓタグを有する改変ｐＥＴ２８ベクターに、インフレームでクローニングした。この正確な構築物を、ＤＮＡ配列分析によって確認して、ついで、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ  Ｓ発現宿主細胞およびＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ発現宿主細胞に導入して形質転換させた。この発現組換えＰ７１１Ｐについて決定したアミン酸配列およびｃＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号８４６および８４７として提供する。
【１１２０】
（ｋ）Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰ７６７Ｐの発現）
Ｐ７６７Ｐの全長コード領域（配列番号５９０のアミノ酸２〜３７４）を、プライマーＰＤＭ−４６８およびＰ−４６９（それぞれ、配列番号９３５および配列番号９３６）を使用するＰＣＲによって増幅した。ＤＮＡ増幅を、１０μｌの１０×Ｐｆｕ緩衝液、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、各々２μｌの濃度１０μＭのＰＣＲプライマー、８３μｌの水、１．５μｌのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）および１μｌの１００ｎｇ／μｌ  ＤＮＡを使用して実施した。９６℃での変性を、２分間に亘って実施して、その後、２０秒間に亘る９６℃、１５秒間に亘る６６℃を４０サイクル、その後、２分間に亘る７２℃、そして、最後に、４分間に亘る７２を１サイクル行った。そのＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩで消化して、Ｅｃｏ７２ＩおよびＸｈｏＩで消化した５’末端にインフレームで、ヒスチジンタグを有した改変ｐＥＴ２８ベクターにクローニングした。この構築物が、配列分析によって正確であるかを確認して、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１  ｐＬｙｓＳ細胞およびＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ  ＲＰ細胞に導入して形質転換させた。この組換えＢ７６７Ｐタンパク質をコードするｃＤＮＡ領域を、配列番号９３８で提供して、その対応する組換えＢ７６７Ｐタンパク質を、配列番号９４１で提供する。この全長Ｐ７６７Ｐは、検出または精製にとって十分に高いレベルで発現しなかった。
【１１２１】
Ｐ７６７Ｐの短縮したコード領域（Ｂ７６７−Ｂとして参照され；配列番号５９０のアミノ酸４７〜３７４である）を、プライマーＰＤＭ−５７３およびＰＤＭ−４６９（それぞれ、配列番号９３７および９３６）および全長Ｐ７６７Ｐのための上記のＰＣＲ条件を使用して増殖した。このＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩで消化して、Ｅｃｏ７２ＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＥＴ２８改変ベクターにクローニングした。この構築物を、配列解析で正確であることを確認して、そして、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ  ＲＰ細胞に導入して形質転換させた。このタンパク質は、その封入体ペレットにおいて発現されたことを確認した。この発現したＰ７６７−Ｂタンパク質のコード領域を、配列番号９３９で提供して、その対応するアミノ酸配列を、配列番号９４０で提供する。
【１１２２】
（ｌ）哺乳動物細胞におけるＰ７６７Ｐの発現）
哺乳動物細胞における組み換えのために、全長Ｐ７６７Ｐ  ｃＤＮＡ（配列番号５８７）を、ＦＬＡＧエピトープを含むように改変された哺乳動物発現ベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。この構築物を、Ｆｕｇｅｎ６試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用してＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）に導入して形質転換させた。簡潔には、そのＨＥＫ細胞を、密度にして１００，０００細胞／ｍｌ（１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ））に、プローブプレーティングして、一晩増殖させた。その次の日に、２μｌのＦｕｇｅｎｅ６を、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ（１００μｌ）に添加して、室温で、１５分間インキュベートした。ついで、このＦｕｇｅｎｅ６／ＤＭＥＭ混合物を、１μｇのＰ７６７Ｐ／ｐＣＥＰ４  プラスミドＤＮＡに添加して、室温で１５分間に亘ってインキュベートした。ついで、このＦｕｇｅｎｅ／ＤＮＡ混合物を、そのＨＥＫ２９３細胞に添加して、７％ＣＯ２にて、４８〜７２時間に亘って３７℃でインキュベートした。ＰＢＳで細胞をリンスして、次いで、遠心分離によって、回収およびペレット化した。
【１１２３】
Ｐ７６７Ｐ発現を、抗エピトープタグ抗体を使用するウェスタンブロット分析によって、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞全体で検出した。具体的には、細胞全体の溶解物を、氷上で３０分間にわたってＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む溶解溶液中で細胞をインキュベートすることによって生成した。次いで、溶解物を、４℃で５分間にわたって５，０００ｒｐｍで遠心分離することによって清澄化した。サンプルを、βメルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥロード緩衝液で希釈して、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥをロードする前に、１０分間に亘って煮沸した。タンパク質を、ニトロセルロース上に移し、そして、抗ＦＬＡＧマウスモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）を１μｇ／ｍｌ希釈で使用して探査した。ＨＲＰ結合したロバ抗マウスＩｇを加え、その後、ＥＣＬ基質中でインキュベートして、このブロットを明らかにした。
【１１２４】
以下のように、ウサギ抗Ｐ７６７Ｐ血清を使用するフローサイトメトリーによって、Ｐ７６７Ｐが、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の表面上で発現したことを見出した。細胞を、回収して、氷冷した染色緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋アジ化物）で洗浄した。次に、それらの細胞を、希釈していない抗Ｐ７６７Ｐウサギポリクローナル血清を用いて、氷上にて、３０分間に亘り、インキュベートした。これらの細胞を、染色緩衝液で、３回洗浄して、次いで、氷上にて３０分間に亘って、１：１００希釈のヤギ抗ウサギＩｇ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣ試薬（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともにインキュベートした。３回の洗浄後に、それらの細胞は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含む染色緩衝液、つまり、透過性細胞の同定を可能にする生細胞染色液中に再懸濁して、ＦＡＣＳによって分析した。
【１１２５】
（ｍ）哺乳動物細胞におけるＰ７８８Ｐの発現）
哺乳動物細胞における組み換えのために、全長Ｐ７８８Ｐ  ｃＤＮＡを、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。この構築物を、Ｆｕｇｅｎ６試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用してＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）に導入して形質転換させた。簡潔には、そのＨＥＫ細胞を、密度にして１００，０００細胞／ｍｌ（１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ））に、プローブレーティングして、一晩増殖させた。その次の日に、２μｌのＦｕｇｅｎｅ６を、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ（１００μｌ）に添加して、室温で、１５分間インキュベートした。ついで、このＦｕｇｅｎｅ６／ＤＭＥＭ混合物を、１μｇのＰ７８８Ｐ／ｐｃＤＮＡ３．１  プラスミドＤＮＡに添加して、室温で１５分間に亘ってインキュベートした。ついで、このＦｕｇｅｎｅ／ＤＮＡ混合物を、そのＨＥＫ２９３細胞に添加して、７％ＣＯ２にて、４８〜７２時間に亘って３７℃でインキュベートした。ＰＢＳで細胞をリンスして、次いで、遠心分離によって、回収およびペレット化した。
【１１２６】
Ｐ７８８Ｐ発現を、ウサギ抗Ｐ７８８Ｐ血清をプローブとして使用するウェスタンブロット分析によって、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞全体で検出した。具体的には、細胞全体の溶解物を、氷上で３０分間にわたってＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む溶解溶液中で細胞をインキュベートすることによって生成した。次いで、溶解物を、４℃で５分間にわたって５，０００ｒｐｍで遠心分離することによって清澄化した。サンプルを、βメルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥロード緩衝液で希釈して、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥをロードする前に、１０分間に亘って煮沸した。タンパク質を、ニトロセルロース上に移し、そして、抗ＦＬＡＧマウスモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）を１μｇ／ｍｌ希釈で使用して探査した。ＨＲＰ結合したロバ抗マウスＩｇを加え、その後、ＥＣＬ基質中でインキュベートして、このブロットを明らかにした。
【１１２７】
ウサギ抗Ｐ７８８Ｐ血清を使用するフローサイトメトリーによって、Ｐ７８８Ｐ発現を、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の表面上で検出した。細胞を、回収して、氷冷した染色緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋アジ化物）で洗浄した。次に、それらの細胞を、希釈していない抗Ｐ７８８Ｐポリクローナル血清（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）を用いて、氷上にて、３０分間に亘り、インキュベートした。これらの細胞を、染色緩衝液で、３回洗浄して、次いで、氷上にて３０分間に亘って、１：１００希釈のヤギ抗ウサギＩｇ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣ試薬（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともにインキュベートした。３回の洗浄後に、それらの細胞は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含む染色緩衝液、つまり、透過性細胞の同定を可能にする生細胞染色液中に再懸濁して、フローサイトメトリーによって分析した。
【１１２８】
（実施例１８）
（前立腺特異的ポリペプチドに対する抗体の精製および特徴づけ）
（ａ）Ｐ７０３Ｐ、Ｐ５０４ＳおよびＰ５０９Ｓに対する抗体の精製および特徴づけ）
Ｐ７０３Ｐ、Ｐ５０４Ｓ、Ｐ５０９Ｓ、Ｐ５０１Ｓ、Ｐ５１０Ｓ−Ｅ３、Ｐ５１０Ｓ−Ｃ、Ｐ７０５Ｐ、全長Ｐ７０３Ｐ（Ｐ７０３ＰＦＬとして参照される）、Ｐ７１１Ｐ、Ｐ７６７Ｐ、Ｐ７８８Ｐ−Ｎ、ならびにＰ７９０ＰおよびＰ７７５Ｐのペプチドに対するポリクローナル抗体を、以下にように調製した。Ｐ７９０Ｐペプチド（Ｐ７９０Ｐ８９、Ｐ７９０Ｐ１２０、Ｐ７９０Ｐ１６３、Ｐ７９０Ｐ１８０、Ｐ７９０Ｐ２２２、Ｐ７９０Ｐ２６１、Ｐ７９０Ｐ２８７およびＰ７９０Ｐ３０７として、それぞれ参照される）のアミノ酸配列を、配列番号９４９〜９５６で提供して、Ｐ７７５Ｐのアミノ酸を、配列番号９５７〜９６６として提供した。
【１１２９】
Ｅ．ｃｏｌｉ組換え発現系において発現した前立腺腫瘍抗原の各々を、振とうインキュベーター中の、適切な抗生物質を加えたＬＢブロスで、３７℃にて一晩増殖した。次の朝に、１０ｍｌのその一晩の培養物を、２Ｌバッフル付三角フラスコ中に、適切な抗生物質を添加した２×ＹＴに加え５００ｍｌとした。その培養物の光学密度（５６０ｎｍ）が、０．４〜０．６に達したとき、それらの細胞に、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を導入した。ＩＰＴＧとインキュベートした４時間後、それらの細胞を、遠心分離によって収集した。次いで、それらの細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄して、そして、再度、遠心分離した。この上清を廃棄して、そして、その細胞を、将来の使用に備えて凍結するか、または直ちに、処理した。２０ｍｌの溶解緩衝液を、それらの細胞ペレットに加えて、ボルテックス処理した。それらのＥ．ｃｏｌｉ細胞を破砕するために、次いで、この混合物を、１６，０００ｐｓｉの圧力で、加圧型細胞破砕装置（Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓ）に流した。次いで、これらの細胞を、次いで、再度、遠心分離して、そして、その上清およびペレットを、その組換えタンパク質を分画するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。その細胞ペレットに局在するタンパク質のために、そのペレットを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１％ＣＨＡＰＳ中にて再懸濁して、その封入体ペレットを、洗浄して、そして、再度遠心分離した。この手順を、２回よりも多く繰り返した。その洗浄した封入体ペレットを、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）＋１０ｍＭイミダゾールを含有する、８Ｍ尿素または６Ｍ塩酸グアニジンのいずれかを用いて可溶化した。その可溶化させたタンパク質を、５ｍｌのニッケルキレート樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）に加え、そして、連続的に振とうしながら室温で、４５分間〜１時間に亘ってインキュベートした。インキュベート後に、その樹脂とタンパク質との混合物を、使い捨て式のカラムに通して精製し、そして、その流出液を回収した。次いで、そのカラムを、１０〜２０カラム容積の可溶化緩衝液で洗浄した。次いで、その抗原を、８Ｍ尿素、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）および３００ｍＭイミダゾールを使用してそのカラムから溶出させて、３ｍｌの画分として回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが、どれがさらなる精製を行うためにプールするかを決定するために実施した。
【１１３０】
最終的な工程として、強力なアニオン交換樹脂（例えば、ＨｉＰｒｅｐＱ（Ｂｉｏｒａｄ））を適切な緩衝液で平衡化して、そして、上記のものからプールした画分を、そのカラムにロードした。抗原の各々を、塩勾配の増大させることでそのカラムを溶出させた。そのカラムに流すにつれて、画分を回収して、そして、別のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、泳動して、そのカラムからどの画分がプールされるかを決定した。そのプールした画分を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）に対して透析した。次いで、これらのタンパク質を、０．２２ミクロンフィルターを介して濾過した後にガラス瓶にいれて、そして、その抗原を、免疫のために必要となるまで凍結した。
【１１３１】
そのＰ７９０ＰペプチドおよびＰ７７５Ｐペプチドを、合成して、ＫＬＨに結合体化して、免疫のために必要となるまで凍結した。
【１１３２】
４００マイクログラムの各前立腺抗原または各前立腺ペプチドを、１００マイクログラムのムラミルジペプチド（ｍｕｒａｍｙｌｄｉｐｅｐｔｉｄｅ；ＭＤＰ）と組みあわせて、そしてウサギに注射した。４００週間毎に、ウサギを、等量の不完全フロイントのアジュバント（ＩＦＡ）と混合した１００マイクログラムの抗原／ペプチドで追加免疫した。各追加免疫の７日後に、その動物から採血した。血清を、その血液を４℃で１２〜２４時間に亘ってインキュベートして遠心分離することによって生成した。
【１１３３】
９６ウェルプレートを、２０時間に亘って４℃にて、５０マイクロリットルの（代表的には、１μｇ／μｌの）組換えタンパク質とともにインキュベートすることによって抗原で被覆した。２５０μｌのＢＳＡブロッキング緩衝液を、それらのウェルに添加して、２時間に亘って室温でインキュベートした。プレートを、ＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎで６回洗浄した。ウサギ血清を、ＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ／０．１％  ＢＳＡで希釈した。５５μｌの希釈血清を、各ウェルに添加して、３０分間に亘って室温でインキュベートした。プレートを、上記のように洗浄して、その後、５０μｌのヤギ抗西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を、１：１００００希釈で、添加して、そして、３０分間に亘って室温でインキュベートした。プレートを、上述のように再度洗浄して、そして、１００μｌのＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質を、各ウェルに添加した。室温にて、暗所で、１５分間のインキュベーション後に、その比色的反応を、１００μｌの１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止させて、そして、４５０ｎｍで直ちに読み取った。全てのポリクローナル抗体は、適切な抗原またはペプチドに対する免疫反応性を示した。
【１１３４】
どの組織がＰ５０９Ｓを発現するかを決定するために、免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析を、様々な範囲の組織溶液で実施した。組織サンプルを、１２〜２４時間に亘ってホルマリン溶液中に固定して、パラフィン中に包埋して、その後、８ミクロンの切片にスライスした。０．１Ｍ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中の蒸気加熱式エピトープ賦活化（Ｓｔｅａｍ  ｈｅａｔ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ；ＳＨＩＥＲ）を、最適な染色条件に対して使用した。切片を、１０％血清／ＰＢＳとともに５分間に亘ってインキュベートした。一次抗体を、インキュベート濃度で２５分間に亘って、切片の各々に対して添加し、その後、抗ウサギビオチン化抗体または抗マウスビオチン化抗体のいずれかと共にてインキュベーションした。内因性ペルオキシダーゼ活性を、水素ペルオキシダーゼともに１．５分間インキュベートすることを３回繰り返すことによってブロックした。このアビジン・ビオチン不複合体／西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＡＢＣ／ＨＲＰ）系を、ＤＡＢクロモゲンとともに使用して、抗原発現を可視化した。スライドを、ヘモトキシリンで対比染色して、細胞核を可視化した。Ｐ５０９発現を、前立腺癌、ＢＰＨ、結腸および腎臓で検出したが、心臓、肺、および肝臓において検出した。
【１１３５】
ｂ）Ｐ５０１Ｓに対する抗体の精製および特徴づけ
前立腺特異的抗原Ｐ５０１ＳのＣ末端に指向されるマウスモノクローナル抗体を、以下のように調製した。
【１１３６】
Ｐ５０１Ｓの短縮型フラグメント（配列番号１１３のアミノ酸３５５〜５２６）を、生成して、そして、ｐＥＴ２８ｂベクターにクローニングして、Ｅ．ｃｏｌｉ中で、ヒスチジンタグを伴うチオレドキシン融合タンパク質として発現させた。ｔｒｘ−Ｐ５０１Ｓ融合タンパク質を、ニッケルクロマトグラフィーによって精製して、トロンビンで消化して、ｔｒｘフラグメントを取り除き、そして、酸沈降手順の後に逆相ＨＰＬＣを行うことによってさらに精製した。
【１１３７】
マウスを、短縮型Ｐ５０１Ｓタンパク質で免疫した。抗Ｐ５０１ポリクローナル血清を含む可能性のあるマウスから採取した血清を、精製Ｐ５０１Ｓタンパク質およびｔｒｘ−Ｐ５０１Ｓタンパク質を用いるＥＬＩＳＡアッセイを使用して、Ｐ５０１Ｓ特異的反応性について試験した。Ｐ５０１Ｓと特異的に反応するような血清血液（ｂｌｅｅｄ）を、Ｐ５０１Ｓ反応性についてウェスタンブロットによってスクリーニングした。Ｐ５０１Ｓ特異的抗体成分を含むマウスを殺し、そして、脾臓細胞を、使用して、抗Ｐ５０１Ｓ抗体産生ハイブリドーマを標準的な技術を用いて作製した。ハイブリドーマ上清を、はじめに、Ｐ５０１特異的反応性について、ＥＬＩＳＡによって試験して、そして、Ｐ５０１Ｓ形質導入細胞を用いた反応性のＦＡＣＳ分析によって試験した。これらの結果に基づいて、１０Ｅ３として参照されるモノクローナルハイブリドーマを、さらなるサブクローニングのために選択した。多くのサブクローンを作製し、ＥＬＩＳＡを用いてＰ５０１Ｓに対する特異的反応性について試験して、そして、ＩｇＧアイソタイプについてタイプ分類した。この分析の結果を、表Ｖに以下のように示した。試験した１６個のサブクローンのうち、モノクローナル抗体１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３を、さらなる研究のために選択した。
【１１３８】
（表ＶＩ）
（マウス抗Ｐ５０１Ｓモノクローナル抗体のアイソタイプ分析）
（ハイブリドーマ）    （アイソタイプ）  （上清での推定［Ｉｇ］（μｇ／ｍｌ））
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
４Ｄ１１                ＩｇＧ１            １４．６
１Ｇ１                  ＩｇＧ１              ０．６
４Ｆ６                  ＩｇＧ１            ７２    
４Ｈ５                  ＩｇＧ１            １３．８
４Ｈ５−Ｅ１２          ＩｇＧ１            １０．７
４Ｈ５−Ｅ１２          ＩｇＧ１              ９．２
４Ｈ５−Ｈ２−Ａ１０      ＩｇＧ１            １０
４Ｈ５−Ｈ２−Ａ３        ＩｇＧ１            １２．８
４Ｈ５−Ｈ２−Ａ１０−Ｇ６  ＩｇＧ１            １３．６
４Ｈ５−Ｈ２−Ｂ１１      ＩｇＧ１            １２．３
１０Ｅ３                ＩｇＧ２ａ            ３．４
１０Ｅ−Ｄ４            ＩｇＧ２ａ            ３．８
１０Ｅ−Ｄ４−Ｇ３      ＩｇＧ２ａ            ９．５
１０Ｅ−Ｄ４−Ｇ６      ＩｇＧ２ａ          １０．４
１０Ｅ３−Ｅ７          ＩｇＧ２ａ            ６．５
８Ｈ１２                ＩｇＧ２ａ            ０．６
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
Ｐ５０１についての１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３の特異性を、ＦＡＣＳ分析によって調べた。具体的には、細胞を、固定して（２％ホルムアルデヒドで、１０分間）、浸透化し（０．１％サポニン、１０分間）、そして、０．５〜１μｇ／ｍｌの１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３で染色して、その後、第２の、ＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗マウス抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）とともにインキュベートした。次いで、細胞を、Ｅｘｃａｌｉｂｕｒ蛍光活性化細胞分類機を利用してＦＩＴＣ蛍光について分析した。形質導入した細胞のＦＡＣＳ分析について、Ｂ−ＬＣＬを、レトロウイルスを媒介してＰ５０１Ｓを用いて掲出導入した。感染した細胞の分析について、Ｂ−ＬＣＬを、Ｐ５０１Ｓを発現するワクシニアベクター感染させた。これらのアッセイでの特異性を実証するために、様々な抗原（Ｐ７０３Ｐ）および感染していないＢ−ＬＣＬベクターで掲出導入したＢ−ＬＣＬを、利用した。１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３は、Ｐ５０１形質導入Ｂ−ＬＣＬと結合することが示され、そして、Ｐ５０１Ｓ感染Ｂ−ＬＣＬと結合するが、感染していない細胞またはＰ７０３Ｐ形質導入細胞のいずれとも結合しないことが示される。
【１１３９】
１０Ｅ−Ｇ４−Ｄ３によって認識されるエピトープが細胞の表面上または細胞内区画で見出されたかどうかを決定するために、Ｂ−ＬＣＬを、Ｐ５０１Ｓ、もしくはコントロール抗原としてＨＬＡ−Ｂ８で形質導入して、上記のように固定および透明化するか、もしくは直接、１０Ｅ−Ｇ４−Ｄ３で染色し、上記のように分析した。１０Ｅ−Ｇ４−Ｄ３によるＰ５０１Ｓの特異的な認識が、透明化を必要とすることが見出され、このことは、この抗体により認識されるエピトープが細胞内にあることを示唆する。
【１１４０】
３つの前立腺腫瘍細胞株Ｌｎｃａｐ、ＰＣ−３９およびＤＵ−１４５（それぞれ、高レベル、中レベルおよび非常に低いレベルのＰ５０１Ｓを発現することが知られている）との１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３の反応性を、細胞を透明化し、これらを上記のように処理することにより決定した。ＰＣ−３よりも高い１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３の反応性が、Ｌｎｃａｐで見られ、次に、ＰＣ−３は、ＤＵ−１４５よりも高い反応性を示した。これらの結果は、リアルタイムＰＣＲと整合し、これらの腫瘍細胞株においてこの抗体がＰ５０１Ｓを特異的に認識し、前立腺腫瘍細胞株において認識されるエピトープがまた細胞内にあることを示す。
【１１４１】
Ｐ５０１Ｓについての１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３の特異性をまた、ウェスタンブロット分析によっても示した。前立腺腫瘍細胞株Ｌｎｃａｐ、ＰＣ−３９およびＤＵ−１４５、Ｐ５０１Ｓで一過性に形質転換したＨＥＫ２９３細胞、形質転換していないＨＥＫ２９３細胞から溶解物を作製した。これらの溶解物の１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３でのウェスタンブロット分析は、Ｌｎｃａｐ、ＰＣ−３９およびＰ５０１Ｓで一過性に形質転換したＨＥＫ細胞においては４６ｋＤａの免疫反応性バンドを表したが、ＤＵ−１４５細胞または形質転換していないＨＥＫ２９３細胞においては表さなかった。Ｐ５０１Ｓ  ｍＲＮＡ発現は、これらの結果と一貫する。なぜならば、半定量的ＰＣＲ分析によって、Ｐ５０１Ｓ  ｍＲＮＡが、Ｌｎｃａｐにおいて発現され、ＰＣ−３においてわずかに少なく、しかし検出可能なレベルで発現され、そして、ＤＵ−１４５細胞においては全く発現されないことが明らかになったからである。細菌により発現され、精製された組換え型Ｐ５０１Ｓ（Ｐ５０１ＳＳｔｒ２と称する）を、１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３（２４ｋＤａ）により認識させ、これは、発現ベクターＶＲ１０１２またはｐＣＥＰ４のいずれかを用いてＨＥ２９３細胞において一過性に発現させた全長Ｐ５０１Ｓであった。予測されたＰ５０１Ｓの分子量は６０．５ｋＤａであったが、形質転換したＰ５０１Ｓおよび「ネイティブな」Ｐ５０１Ｓの両方が、その疎水性の性質に起因してわずかに下側に流れた。
【１１４２】
前立腺腫瘍および正常組織切片のパネル（前立腺、副腎、乳房、子宮頚部、結腸、十二指腸、小腸、回腸、腎臓、卵巣、膵臓、耳下腺、骨格筋、脾臓および精巣）について免疫組織化学分析を行った。組織サンプルをホルマリン溶液中で２４時間固定し、パラフィン中に包埋し、その後、１０ミクロンの切片に薄切した。組織切片を透明化し、１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３抗体と共に１時間インキュベートした。ＨＲＰ標識した抗マウス、その後の、ＤＡＢ色素原とのインキュベーションを用いて、Ｐ５０１Ｓ免疫反応性を可視化した。Ｐ５０１Ｓは、正常な前立腺および前立腺腫瘍組織の両方において高度に発現したが、試験した他の組織のいずれにおいても検出されなかったことが見出された。
【１１４３】
１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３によって認識されるエピトープを同定するために、エピトープマッピングアプローチを行なった。一連の、１３の重なった２０〜２１マー（５アミノ酸の重なり；配列番号４８９〜５０１）を合成し、これは、１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３を作製するために用いたＰ５０１Ｓのフラグメントにまたがる。平底９６ウェルマイクロタイタープレートを、３７℃にて２時間、１μｇ／ｍｌにて、ペプチドまたはマウスを免疫するために用いたＰ５０１Ｓフラグメントのいずれかでコーティングした。次いで、ウェルを吸引し、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有するリン酸緩衝化生理食塩水を用いて、室温にて２時間ブロックし、その後、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で洗浄した。精製した抗体１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３をＰＢＳＴ中の２倍希釈（１０００ｎｇ〜１６μｇ）にて添加し、室温にて３０分間インキュベートした。この後、ＰＢＳＴで６回洗浄し、引き続いて、１：２００００のＨＰＲ結合体化したロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）フラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）と共に３０分間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、テトラメチルベンジン中で１５分間インキュベートした。反応を、１Ｎ硫酸を添加して停止し、プレートをＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４５０ｎｍにて読み取った。図８に示すように、反応性は、配列番号４９６のペプチド（Ｐ５０１Ｓのアミノ酸４３９〜４５９に対応する）およびＰ５０１Ｓフラグメントで見られたが、残りのペプチドでは見られず、１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３によって認識されるエピトープが、配列番号１１３のアミノ酸４３９〜３５９に局在化することを示す。
【１１４４】
Ｐ５０１Ｓの組織特異性をさらに評価するために、全ての主要な正常器官ならびにこれらの組織に由来する新生物を含む、約４７００個の異なるヒト組織について、マルチアレイ免疫組織化学分析を行なった。６５個のこれらのヒト組織サンプルは、前立腺起源であった。直径０．６ｍｍの組織切片をホルマリン固定し、パラフィンで包埋した。サンプルを１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いてＨＩＥＲで予め処理し、１０分間ボイルした。切片を１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３で染色し、Ｐ５０１Ｓ免疫反応性をＨＲＰで可視化した。全ての６５個の前立腺組織サンプル（５個は正常、５５個は未処置の前立腺腫瘍、５個はホルモン抵抗性の前立腺腫瘍）が陽性であり、明確な核周囲の染色を示した。試験した全ての他の組織は、Ｐ５０１Ｓ発現について陰性であった。
【１１４５】
（ｃ）  Ｐ５０３Ｓに対する抗体の調製および特徴づけ）
Ｐ５０３Ｓ（配列番号１１４のアミノ酸１１３〜２４１）のフラグメントを発現させ、本質的にＰ５０１Ｓについて上記したように細菌から精製し、これを用いて、ウサギおよびマウスの両方を免疫した。マウスモノクローナル抗体を、上記のような標準的なハイブリドーマ技術を用いて単離した。ウサギモノクローナル抗体を、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｔｈｏｄ  （ＳＬＡＭ）技術を用いて、Ｉｍｍｇｅｎｉｃｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  （Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，  ＢＣ，  Ｃａｎａｄａ）において単離した。以下の表ＶＩＩは、Ｐ５０３Ｓに対して開発されたモノクローナル抗体を列挙する。
【１１４６】
【表７】
2006515749.tif 000009
ウサギモノクローナル抗体２０Ｄ４およびＪＡ１についての相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡ配列を決定し、それぞれ、配列番号５０２および５０３に提供する。
【１１４７】
抗体の各々のエピトープ結合領域をより良く規定するために、一連の重なったペプチドを作製し、これらは、配列番号１１４のアミノ酸１０９〜２１３にまたがる。これらのペプチドを用いて、以下のようにＥＬＩＳＡによって抗Ｐ５０３Ｓモノクローナル抗体をエピトープマッピングした。免疫原として採用されたＰ５０３Ｓの組換え型フラグメントを、ポジティブコントロールとして用いた。９６ウェルマイクロタイタープレートを、４℃にて一晩、２０μｇ／ウェルにて、ペプチドまたは組換え型抗原のいずれかでコーティングした。プレートを吸引し、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有するリン酸緩衝化生理食塩水を用いて、室温にて２時間ブロッキングし、次いで、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で洗浄した。ＰＢＳＴ中に希釈した精製ウサギモノクローナル抗体をウェルに添加し、室温にて３０分間インキュベートした。この後、ＰＢＳＴで６回洗浄し、１：２０００希釈のプロテインＡ−ＨＲＰ結合体と共にさらに３０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ中で６回洗浄し、テトラメチルベンジン（ＴＭＢ）基質と共にさらに１５分間インキュベートした。１Ｎ  硫酸を添加して反応を停止し、プレートを、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４５０ｎｍにて読み取った。マウスモノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡを、アッセイにおいてストレートで行なった組織培養物からの上清（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｒｕｎ  ｎｅａｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｓｓａｙ）を用いて実施した。
【１１４８】
ネガティブコントロールのＳＰ２上清を除いて、全ての抗体が、組換え型Ｐ５０３Ｓフラグメントに結合した。２０Ｄ４、ＪＡ１および１Ｄ１２は、ペプチド＃２１０１（配列番号５０４）に厳密に結合し、このペプチドは、配列番号１１４のアミノ酸１５１〜１６９に対応する。１Ｃ３は、ペプチド＃２１０２（配列番号５０５）に結合し、このペプチドは、配列番号１１４のアミノ酸１６５〜１８４に対応する。９Ｃ１２ペプチド＃２０９９（配列番号５２２）に結合し、このペプチドは、配列番号１１４のアミノ酸１２０〜１３９に対応する。他の抗体は、これらの研究において試験しなかった領域に結合する。
【１１４９】
エピトープマッピングの後に、抗体を、安定にＰ５０３Ｓを発現した細胞株についてのＦＡＣＳ分析により試験し、この抗体が、細胞表面エピトープに結合することを確認した。コントロールプラスミドで安定に形質転換された細胞を、ネガティブコントロールとして用いた。細胞を、固定せずに生きたまま染色した。０．５μｇの抗Ｐ５０１Ｓモノクローナル抗体を添加し、細胞を氷上で３０分間インキュベートし、その後、２回洗浄し、ＦＩＴＣ−標識化ヤギ抗ウサギ抗体もしくはマウス二次抗体と共に２０分間インキュベートした。２回洗浄した後、細胞を、Ｅｘｃａｌｉｂｕｒ蛍光活性化セルソーターで分析した。モノクローナル抗体１Ｃ３、１Ｄ１２、９Ｃ１２、２０Ｄ４およびＪＡ１はＰ５０３Ｓの細胞表面エピトープに結合したが、８Ｄ３は結合しなかったことが分かった。
【１１５０】
どの組織がＰ５０３Ｓを発現するかを決定するために、本質的に上記のように、正常組織のパネル（前立腺、副腎、乳房、子宮頚部、結腸、十二指腸、小腸、回腸、腎臓、卵巣、膵臓、耳下腺、骨格筋、脾臓および精巣）について免疫組織化学分析を行った。ＨＲＰ結合体化抗マウス抗体または抗ウサギ抗体の後に、ＴＭＢとのインキュベーションを用いて、Ｐ５０３Ｓ免疫反応性を可視化した。Ｐ５０３Ｓは、前立腺組織において高度に発現し、子宮頚部、直腸、回腸および腎臓においてより低いレベルの発現を伴い、そして、副腎、乳房、十二指腸、小腸、卵巣、膵臓、耳下腺、骨格筋、脾臓および精巣においては発現が観察されなかったことを見出した。
【１１５１】
ウェスタンブロット分析を用いて、抗Ｐ５０１Ｓモノクローナル抗体の特異性を特徴付けた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを細菌において発現させ、細菌から精製した組換え型（ｒｅｃ）Ｐ５０３Ｓについて、そして、全長Ｐ５０３Ｓを用いて形質転換したＨＥＫ２９３細胞からの溶解物について実施した。タンパク質をニトロセルロースに移し、次いで、１μｇ／ｍｌの抗体濃度にて抗Ｐ５０３Ｓモノクローナル抗体（２０Ｄ４、ＪＡ１、１Ｄ１２、６Ｄ１２および９Ｃ１２）の各々を用いてウェスタンブロットを行なった。タンパク質を、ヤギ抗マウスモノクローナル抗体またはプロテインＡ−セファロースのいずれかに結合体化した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いて検出した。モノクローナル抗体２０Ｄ４は、分子量約１４ｋＤａの組換え型Ｐ５０３Ｓ（アミノ酸１１３〜２４１）、および全長Ｐ５０３Ｓを用いて形質転換したＨＥＫ２９３細胞溶解物の２３．５ｋＤａ種を検出した。他の抗Ｐ５０３Ｓモノクローナル抗体は、ウェスタンブロットによって、類似の特異性を示した。
【１１５２】
（ｄ）  Ｐ７０３Ｐに対する抗体の調製および特徴づけ）
ウサギを、組換え型Ｐ７０３Ｐの短縮型（Ｐ７０３Ｐｔｒ１；配列番号１７２）または全長の成熟形態（Ｐ７０３Ｐｆｌ；配列番号５２３）のいずれかで免疫した。タンパク質を、上記のように細菌中で発現させ、細菌から精製した。アフィニティー精製ポリクローナル交代を、固体支持体に結合した免疫原Ｐ７０３Ｐｔｒ１またはＰ７０３Ｐｆｌを用いて作製した。ウサギモノクローナル抗体を、ＳＬＡＭ技術を用いて、Ｉｍｍｇｅｎｉｃｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌにおいて単離した。以下の表ＶＩＩＩは、Ｐ７０３Ｐに対して作製したポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を列挙する。
【１１５３】
【表８】
2006515749.tif 000010
ウサギモノクローナル抗体８Ｈ２、７Ｈ８および２Ｄ４についての相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡ配列を決定し、それぞれ、配列番号５０５〜５０８に提供する。
【１１５４】
上記のようにエピトープマッピング研究を実施した。モノクローナル抗体２Ｄ４および７Ｈ８は、それぞれ、配列番号５０９のペプチド（配列番号１７２のアミノ酸１４５〜１５９に対応する）、および配列番号５１０のペプチド（配列番号１７２のアミノ酸１１〜２５に対応する）に特異的に結合することが分かった。ポリクローナル抗体２５９４は、配列番号５１１〜５１４のペプチドに結合し、ポリクローナル抗体９４２７が、配列番号５１５〜５１７のペプチドに結合することが分かった。
【１１５５】
抗Ｐ７０３Ｐ抗体の特異性を、以下のようにウェスタンブロット分析により決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、（１）細菌に発現させた組換え型抗原；（２）形質転換していないか、または、全長Ｐ７０３Ｐを発現するプラスミドで形質転換したかのいずれかのＨＥＫ２９３細胞およびＬｔｋ−／−細胞の溶解物、ならびに（３）これらの細胞培養物から単離した上清。について行なった。タンパク質をニトロセルロースに移し、次いで、１μｇ／ｍｌの抗体濃度の抗Ｐ７０３Ｐポリクローナル抗体＃２５９４を用いてウェスタンブロットした。タンパク質を、抗ウサギ抗体に結合体化した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いて検出した。３５ｋＤａの免疫反応性バンドが、組換え型Ｐ７０３Ｐで観察され得た。組み換え型Ｐ７０３Ｐは、エピトープタグ化されているので、わずかに大きい分子量に流れた。全長Ｐ７０３Ｐで形質転換した細胞からの溶解物および上清において、Ｐ７０３Ｐに対応する３０ｋＤａのバンドが観察された。特異性を評価するために、コントロールプラスミドを用いて安定に形質転換したＨＥＫ２９３細胞からの溶解物をまた試験し、これらは、Ｐ７０３Ｐ発現についてネガティブであった。他の抗Ｐ７０３Ｐ抗体は、類似の結果を示した。
【１１５６】
免疫組織化学研究を、抗Ｐ７０３Ｐモノクローナル抗体を用いて、上記のように行なった。Ｐ７０３Ｐは、正常な前立腺および前立腺腫瘍組織においては発現するが、試験した全ての他の組織（乳房腫瘍、肺腫瘍および正常な腎臓）においては検出可能でないことがわかった。
【１１５７】
（ｅ）  Ｐ５０４Ｓに対する抗体の調製および特徴づけ）
本質的には、Ｐ５０１Ｓについて上述のように、全長Ｐ５０４Ｓ（配列番号１０８）を発現させ、細菌から精製し、そして、これを用いて、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｔｈｏｄ（ＳＬＡＭ）技術を使用して、Ｉｍｍｇｅｎｉｃｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）においてウサギモノクローナル抗体を惹起した。抗Ｐ５０４Ｓモノクローナル抗体１３Ｈ４は、ウェスタンブロットにより、腫瘍細胞において発現された、組換え型Ｐ５０４ＳおよびナイーブＰ５０４Ｓの両方に結合したことが示された。
【１１５８】
種々の前立腺組織におけるＰ５０４Ｓの発現を評価するための１３Ｈ４を用いる免疫組織科学研究を、上記のように実施した。６５の前立腺癌を有するラジカル前立腺切除のケース（ＰＣ）、２６の前立腺生検のケースおよび１３の良性前立腺肥大のケース（ＢＰＨ）を含む、全１０４のケースを、抗Ｐ５０４Ｓモノクローナル抗体１３Ｈ４で染色した。Ｐ５０４Ｓは、前立腺切除においてＰＣの６４／６５（９８．５％）、前立腺生検においてＰＣの２６／２６（１００％）の強い細胞質内の顆粒状の染色を示した。Ｐ５０４Ｓは、癌腫において強く拡散性に染色し（ＰＣのケースの９１．２％において４＋；５．５％において３＋；２．２％において２＋；１．１％において１＋）、そして、高いグレードの前立腺上皮内新生物（全てのケースにおいて４＋）であった。Ｐ５０４Ｓの発現は、Ｇｌｅａｓｏｎスコアでは変化しなかった。ＰＣの周囲のＮＰ／ＢＰＨのケースの１７／９１（１８．７％）およびＢＰＨのケースの２／１３（１５．４％）のみが、焦点（１＋なし、全てのケースにおいて２＋〜４＋）であり、大きな腺のＰ５０４Ｓについては弱いポジティブであった。Ｐ５０４Ｓの発現は、生検または前立腺切除のいずれかにおける小さな萎縮性腺、萎縮後（ｐｏｓｔａｔｒｏｐｈｉｃ）過形成、基底細胞過形成および遷移細胞異形成においては見出されなかった。従って、Ｐ５０４Ｓは、前立腺癌の全てのＧｌｅａｓｏｎスコアで過剰発現され（９８５％〜１００％の感度）、１９／１０４のケースにおいては、大きな正常腺においてのみ焦点的なポジティブを示す（８２．３％の特異性）ことが分かった。これらの所見は、Ｐ５０４Ｓが、前立腺癌の診断について通常用いされ得ることを示す。
【１１５９】
（実施例１９）
（前立腺特異的抗原Ｐ５０１Ｓの細胞表面発現および染色体局在の特徴づけ）
この実施例は、前立腺特異的抗原Ｐ５０１Ｓが、細胞の表面に発現されることを示す研究、ならびに、Ｐ５０１Ｓの推定染色体局在を決定するための研究を記載する。
【１１６０】
タンパク質Ｐ５０１Ｓ（配列番号１１３）は、１１の膜貫通ドメインを有すると予測される。抗Ｐ５０１Ｓモノクローナル抗体１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３（実施例１７に上記される）により認識されるエピトープが、細胞内にあるという発見に基づいて、以下の膜貫通決定基が、Ｐ５０１Ｓの細胞外ドメインの予測を可能にすることが予測された。図９は、膜貫通ドメインおよび実施例１７に記載される細胞内エピトープの予測位置を示すＰ５０１Ｓタンパク質の模式図である。下線を付した配列番号は、推定膜貫通ドメインを表し、太字の配列は、推定細胞外ドメインを表し、そして、斜体の配列は、推定細胞内ドメインを表す。太字でかつ下線を付した配列番号は、ポリクローナルウサギ血清を作製するために用いられた配列番号を表す。膜貫通ドメインの位置は、ＴｕｓｎａｄｙおよびＳｉｍｏｎ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  Ｇｏｖｅｒｎｉｎｇ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｇｒａｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｔｏｐｏｌｏｇｙ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８３：４８９−５０６，１９９８）により記載されたようなＨＨＭＴＯＰを用いて予測した。
【１１６１】
図９に基づいて、アミノ酸２７４〜２９５および３２３〜３４２に対応する膜貫通ドメインにより挟まれたＰ５０１Ｓドメインは、細胞外であることが予測される。配列番号５１８のペプチドは、Ｐ５０１Ｓのアミノ酸３０６〜３２０に対応し、推定細胞外ドメイン内にある。ヒスチジンがアスパラギンで置換されていることを除いて、配列番号５１８のペプチドと同一である、配列番号５１９のペプチドを、上記のように合成した。Ｃｙｓ−ＧｌｙをこのペプチドのＣ末端に添加して、キャリアタンパク質への結合体化を容易にした。固体支持体からのペプチドの切断は、以下の切断混合物を用いて行なった：トリフルオロ酢酸：エタンジオール：チオアニソール：フェノール（４０：１：２：２：３）。２時間切断した後、このペプチドを冷エーテル中で沈殿させた。次いで、ペプチドペレットを１０％  ｖ／ｖ酢酸中に溶解させ、凍結乾燥し、その後、Ｃ１８逆相ｈｐｌｃにより精製した。水（０．０５％ＴＦＡを含む）中５〜６０％のアセトニトリル（０．０５％  ＴＦＡを含む）を用いてペプチドを溶出した。このペプチドの純度を、ｈｐｌｃおよび質量分析により評価し、＞９５％であることを決定した。精製したペプチドを用いて、上記のようにウサギポリクローナル抗血清を作製した。
【１１６２】
Ｐ５０１Ｓの表面発現を、ＦＡＣＳ分析により試験した。細胞を、１０μｇ／ｍｌのポリクローナル抗Ｐ５０１Ｓペプチド血清で染色し、洗浄し、二次ＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇ抗体（ＩＣＮ）と共にインキュベートし、洗浄し、そして、Ｅｘｃａｌｉｂｕｒ蛍光活性化セルソーターを用いてＦＩＴＣ蛍光について分析した。形質導入した細胞のＦＡＣＳ分析について、Ｂ−ＬＣＬにレトロウイルスを用いて、Ｐ５０１Ｓを形質導入した。これらのアッセイにおける特異性を示すために、無関係の抗原（Ｐ７０３Ｐ）で形質導入したか、または、形質導入していないＢ−ＬＣＬを平行して染色した。前立腺腫瘍細胞株のＦＡＣＳ分析のために、Ｌｎｃａｐ、ＰＣ−３およびＤＵ−１４５を利用した。前立腺腫瘍細胞株を、細胞解離培地を用いて組織培養プレートから解離させ、上記のように染色した。全てのサンプルを、ＦＡＣＳ分析の前にプロピジウムヨージド（ＰＩ）で処理し、データを、ＰＩを含まない（すなわち、インタクトでかつ非浸透性の）細胞から得た。配列番号５１９のペプチドに対して作製したウサギポリクローナル血清は、Ｐ５０１Ｓを発現するように形質導入した細胞の表面を特異的に認識することが示され、このことは、ポリクローナル血清により認識されるエピトープが細胞外であることを示した。
【１１６３】
Ｐ５０１Ｓが細胞表面上で発現されるかどうかを生化学的に決定するために、Ｌｎｃａｐ細胞から周辺膜を単離し、ウェスタンブロット分析に供した。具体的には、Ｌｎｃａｐ細胞を、ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを用いて、ホモジナイゼーション緩衝液（２５０ｍＭスクロース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１つの完全プロテアーゼインヒビタータブレット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ））中で溶解させた。溶解物のサンプルを１０００ｇ、４℃にて５分間スピンダウンした。次いで、上清を、８０００ｇ、４℃にて１０分間スピンダウンした。８０００ｇスピンからの上清を回収し、１００，０００ｇのスピンダウンに、４℃にて３０分間供し、周辺膜を回収した。次いで、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、上記の条件を使用して、マウスモノクローナル抗体１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３（実施例１７に上記される）を用いるウェスタンブロットを行なった。組換え型の精製Ｐ５０１Ｓならびに、Ｐ５０１Ｓを形質導入し、Ｐ５０１Ｓを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を、Ｐ５０１Ｓ検出のためのポジティブコントロールとして含めた。ＬＣＬ細胞溶解物をネガティブコントロールとして含めた。Ｐ５０１Ｓは、Ｌｎｃａｐ総細胞溶解物中では検出できたが、８０００ｇ（細胞内膜）分画において、そしてまた、１００，０００ｇ（原形質膜）分画においては検出できなかった。これらの結果は、Ｐ５０１Ｓが、周辺膜において発現され、周辺膜に局在化することを示す。
【１１６４】
配列番号５１９のペプチドに対して作製したウサギポリクローナル抗血清が、このペプチド、ならびに、配列番号５１８の対応するネイティブなペプチドを特異的に認識するために、ＥＬＩＳＡ分析を行なった。これらの分析のために、平底９６ウェルマイクロタイタープレートを、配列番号５１９のペプチド、推定細胞外ドメインの全体にまたがる配列番号５２０のより長いペプチド、Ｐ５０１Ｓ特異的抗体１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３により認識されるエピトープを表す配列番号５２１のペプチド、または、免疫ペプチド配列を含まないＰ５０１Ｓフラグメント（配列番号１１３のアミノ酸３５５〜５２６に対応する）のいずれかを、１μｇ／ｍｌにて用いて、３７℃にて２時間コーティングした。ウェルを吸引し、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有するリン酸緩衝化生理食塩水を用いて、室温にて２時間ブロッキングし、その後、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で洗浄した。精製抗Ｐ５０１Ｓポリクローナルウサギ血清を、ＰＢＳＴ中の２倍希釈（１０００ｎｇ〜１２５μｇ）で添加し、室温にて３０分間インキュベートした。個の後、ＰＢＳＴで６回洗浄し、１：２００００のＨＲＰ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）フラグメントと共に３０分間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、テトラメチルベンジン中で１５分間インキュベートした。１Ｎ硫酸を添加することによって反応を停止し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４５０ｎｍにてプレートを読み取った。図１１に示すように、抗Ｐ５０１Ｓポリクローナルウサギ血清は、免疫化において用いられる配列番号５１９のペプチド、ならびに、配列番号５２０のより長いペプチドを特異的に認識するが、無関係のＰ５０１Ｓ由来のペプチドおよびフラグメントは認識しなかった。
【１１６５】
さらなる研究において、Ｐ５０１Ｓ配列に由来するペプチドを用いてウサギを免疫し、図９に示すように、細胞外または細胞内のいずれであるかを予測した。ポリクローナルウサギ血清を単離し、血清中のポリクローナル抗体を上記のように精製した。Ｐ５０１Ｓとの特異的な反応性を決定するために、Ｐ５０１Ｓまたは無関係の抗原Ｐ７０３Ｐで形質導入したＢ−ＬＣＬを利用して、Ｐ５０１Ｓを発現するワクシニアウイルスを感染させたＢ−ＬＣＬのＦＡＣＳ分析を用いた。表面発現について、死細胞およびインタクトでない細胞を、上記のように分析から除外した。細胞内染色のために、上記のように細胞を固定し、透明化した。配列番号５４８のペプチド（Ｐ５０１Ｓのアミノ酸１８１〜１９８に対応する）に対して作製したウサギポリクローナル抗体は、Ｐ５０１Ｓの表面エピトープを認識することが分かった。配列番号５５１のペプチド（Ｐ５０１Ｓのアミノ酸５４３〜５５３に対応する）に対して作製したウサギポリクローナル血清は、異なる実験において、インタクトな細胞もしくは透明化した細胞が、ポリクローナル血清によって認識されたので、潜在的に細胞外であるか、または細胞内であるかのいずれかであるエピトープを認識することが分かった。類似の演繹的な理論付けに基づいて、配列番号５４１〜４７、５４９および５５０の配列（それぞれ、Ｐ５０１Ｓのアミノ酸１０９〜１２２、５３９〜５５３、５０９〜５２０、３７〜５４、３４２〜３５９、２９５〜３２３、２１７〜２７４、１４３〜１６０および７５〜８８に対応する）が、抗体によって認識されるＰ５０１Ｓの潜在的な表面エピトープであると考えられ得る。
【１１６６】
さらなる研究において、マウスモノクローナル抗体を、Ｐ５０１Ｓのアミノ酸２９６〜３２２に対して惹起し、この抗体は、細胞外ドメイン内であると予測される。Ａ／ＪマウスをＰ５０１Ｓ／アデノウイルスで免疫し、その後、Ｅ．ｃｏｌｉ組換え型タンパク質（Ｐ５０１Ｎと呼ばれる）で追加免疫した。このタンパク質は、Ｐ５０１Ｓのアミノ酸２９６〜３２２を含み、ペプチド２９６〜３２２（配列番号８９８）がＫＬＨと結合している。このマウスを、脾臓Ｂ細胞融合のために引き続いて使用し、抗ペプチドハイブリドーマを作製した。得られた３つのクローン（４Ｆ４（ＩｇＧ１，κ）、４Ｇ５（ＩｇＧ２ａ，κ）および９Ｂ９（ＩｇＧ１，κ）と呼ばれる）を、抗体生成のために増やした。プロテインＡ−セファロースカラムに上清を通し、その後、０．２Ｍ  グリシン（ｐＨ２．３）を用いて抗体を溶出することによって４Ｇ５  ｍＡｂを精製た。精製した抗体を、１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）の添加によって中和し、緩衝液をＰＢＳに交換した。
【１１６７】
ＥＬＩＳＡ分析のために、９６ウェルプレートを、Ｐ５０１Ｓペプチド２９６〜３２２（Ｐ５０１−長と呼ぶ）、無関係のＰ７７５ペプチド、Ｐ５０１Ｓ−Ｎ、Ｐ５０１ＴＲ２、Ｐ５０１Ｓ−長−ＫＬＨ、Ｐ５０１Ｓペプチド３０６−３１９（Ｐ５０１−短と呼ぶ）−ＫＬＨ、または無関係のペプチド２０７３−ＫＬＨでコートした（全て２μｇ／ｍｌの濃度で、３７℃で６０分間インキュベートした）。コーティング後、プレートを５回、ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次いでＰＢＳ、０．５％  ＢＳＡ、０．４％  Ｔｗｅｅｎ２０を用いて２時間室温でブロックした。上清または精製ｍＡｂの添加後、プレートを、室温で６０分間インキュベートした。プレートを、上述のように洗浄し、そしてロバ抗マウスＩｇＨＲＰ連結二次抗体を添加して、室温で３０分間インキュベートし、その後、上述のように最終洗浄を行った。ＴＭＢペルオキシダーゼ基質を添加し、そして１５分間室温で、暗所でインキュベートした。反応を、１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４の添加により停止させ、そしてＯＤを、４５０ｎＭで読み取った。３種全てのハイブリッドクローンが、ペプチド２９６〜３２２を認識するｍＡｂ、および組換えタンパク質Ｐ５０１Ｎを分泌した。
【１１６８】
ＦＡＣＳ分析について、ＨＥＫ２９３細胞を、Ｆｕｇｅｎｅ  ６試薬を用いて、過渡的にＰ５０１Ｓ／ＶＲ１０１２発現構築物でトランスフェクトした。培養２日後、細胞を回収して洗浄し、次いで、精製４Ｇ５  ｍＡｂと共に氷上で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ、０．５％  ＢＳＡ、０．０１％  アジド中で数回の洗浄の後、ヤギ抗マウスＩｇ−ＦＩＴＣを細胞に添加し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、１％  ヨウ化プロピジウム含有の洗浄緩衝液中に再懸濁し、そしてＦＡＣＳ分析に供した。ＦＡＣＳ分析は、Ｐ５０１Ｓのアミノ酸２９６〜３２２が、細胞外ドメイン中に存在し、細胞表面発現することを確認した。
【１１６９】
Ｐ５０１Ｓの染色体位置を、ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ  ４  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｈｙｂｒｉｄパネル（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いて決定した。配列番号５２８および配列番号５２９のＰＣＲプライマーを、製造業者のプロトコールに従い、ハイブリッドパネル由来のＤＮＡプールを用いたＰＣＲにおいて使用した。３８サイクルの増幅の後、反応産物を１．２％アガロースゲル上で分離し、そして結果を、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈウェブサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃｏｎｔｉｇ／ｒｈｍａｐｐｅｒ．ｐｌ）を介して分析し、可能性のある染色体位置を決定した。このアプローチを用い、Ｐ５０１Ｓを、第１染色体の長腕に、ＷＩ−９６４１において、ｑ３２とｑ４２との間にマッピングした。第１染色体のこの領域は、遺伝性前立腺癌において、前立腺癌感受性に関連している（Ｓｍｉｔｈら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：１３７１−１３７４，１９９６およびＢｅｒｔｈｏｎら  Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６２：１４１６−１４２４，１９９８）。これらの結果は、Ｐ５０１Ｓが、前立腺癌悪性度において役割を果たすことを示唆する。
【１１７０】
（実施例２０）
（前立腺特異的抗原Ｐ５０１Ｓの発現の調節）
ステロイド（アンドロゲン）ホルモン調節は、前立腺癌における一般的な治療様式である。多くの前立腺組織特異的抗原の発現は、アンドロゲンに反応することが以前に示されている。アンドロゲン処置に対する前立腺特異的抗原Ｐ５０１Ｓの反応性を、組織培養系において以下のように試験した。
【１１７１】
前立腺腫瘍細胞株ＬＮＣａＰからの細胞を、１．５×１０６細胞／Ｔ７５フラスコ（ＲＮＡ単離のため）か、または３×１０５細胞／６ウェルプレートのウェル（ＦＡＣＳ分析のため）でプレート培養し、１０％  チャコール処理ウシ胎仔血清（ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）含有のＲＰＭＩ  １６４０培地中で一晩増殖させた。細胞培養を、１０％  チャコール処理ウシ胎仔血清含有のＲＰＭＩ  １６４０培地中でさらに７２時間、１ｎＭの合成アンドロゲンメティコートローン（Ｒ１８８１；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ）を種々の時点で加えて、継続した。次いで、細胞を、アンドロゲン添加の０、１、２、４、８、１６、２４、２８および７２時間後にＲＮＡ単離およびＦＡＣＳ分析した。ＦＡＣＳ分析を、抗Ｐ５０１Ｓ抗体１０Ｅ３−Ｇ４−Ｄ３細胞を用いて実施した。
【１１７２】
ノーザン分析について、５〜１０ｍｇの全ＲＮＡを、ホルムアルデヒド変性ゲル上で電気泳動し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に移し、架橋し、そしてメチレンブルーで染色した。次いで、このフィルターを、Ｃｈｕｒｃｈ’ｓ緩衝液（２５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、７０ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  ＳＤＳ、１％  ＢＳＡ（ｐＨ７．２））で、６５℃で１時間プレハイブリダイズさせた。Ｐ５０１Ｓ  ＤＮＡを、Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅランダムプライム化ＤＮＡラベリングキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて３２Ｐで標識した。取り込まれなかった標識を、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｓ３００−ＨＲカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて除去した。次いで、ＲＮＡフィルターを、標識化ＤＮＡを含有する新しいＣｈｕｒｃｈ’ｓ緩衝液で一晩ハイブリダイズし、１×ＳＣＰ（０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０３Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．００１Ｍ  Ｎａ２ＥＤＴＡ）、１％  サルコシル（ｓａｒｋｏｓｙｌ）（ｎ−ラウロイルサルコシン（ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ））で洗浄し、そしてＸ線フィルムに曝露した。
【１１７３】
ＦＡＣＳおよびノーザン分析の両方を用い、Ｐ５０１Ｓメッセージレベルおよびタンパク質レベルが、アンドロゲン処理に反応して増加することを見出した。
【１１７４】
（実施例２１）
（前立腺特異的抗原の融合タンパク質の調製）
本実施例は、前立腺特異的抗原Ｐ７０３Ｐと公知の前立腺抗原ＰＳＡの切断型との融合タンパク質の調製を記載する。ＰＳＡの切断型は、活性セリン部位周囲の２１アミノ酸欠失を有する。融合タンパク質についての発現構築物はまた、３’末端の、停止コドンのすぐ前に制限部位を有し、さらなる抗原についてのｃＤＮＡの付加を補助する。
【１１７５】
ＰＳＡについての全長ｃＤＮＡを、ヒト前立腺腫瘍組織由来のＲＮＡのプールからの、配列番号６０７および配列番号６０８のプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによって得、ベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ内にクローン化した。得られたｃＤＮＡをテンプレートとして使用し、２組のプライマー（配列番号６０９および配列番号６１０；ならびに配列番号６１１および配列番号６１２）を用いるＰＣＲによって、ＰＳＡの２種の異なるフラグメントを作製した。予測される大きさを有するＰＣＲ産物をテンプレートとして使用し、配列番号６１１および配列番号６１３のプライマーを有するＰＣＲ（ＰＳＡ（アミノ酸におけるΔ２０８〜２１８）を作製した）によって、切断型のＰＳＡを作製した。５’末端に６×ヒスチジンタグを有するＰ７０３Ｐの成熟型についてのｃＤＮＡを、Ｐ７０３Ｐならびに配列番号６１４および配列番号６１５のプライマーを用いるＲＣＲによって調製した。次いで、Ｐ７０３ＰのＰＳＡ短縮型との融合物についてのｃＤＮＡ（ＦＯＰＰと呼ばれる）を、改変Ｐ７０３Ｐ  ｃＤＮＡとＰＳＡｃＤＮＡの切断型とをテンプレートとして用い、そして配列番号６１４および配列番号６１５のプライマーを用いるＰＣＲによって得た。ＦＯＰＰ  ｃＤＮＡを、発現ベクターｐＣＲＸ１のＮｄｅＩ部位およびＸｈｏＩ部位内にクローン化し、そしてＤＮＡ配列決定によって確認した。融合構築物ＦＯＰＰについて決定されたｃＤＮＡ配列を、配列番号６１６で提供し、アミノ酸配列を、配列番号６１７で提供する。
【１１７６】
融合ＦＯＰＰを、１つの組換えタンパク質として、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて以下のように発現させた。発現プラスミドｐＣＲＸ１ＦＯＰＰを、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ  ＲＩＬ内に形質転換した。形質転換体は、１ｍＭ  ＩＰＴＧでの誘導の際にＦＯＰＰタンパク質を発現することが示された。対応する発現クローンの培養物を、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する２５ｍｌ  ＬＢ培養液中に植菌し、３７℃で約１のＯＤ６００になるまで増殖させ、そして４℃で一晩保存した。培養物を、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する１リットルのＴＢ  ＬＢ中に希釈し、０．４のＯＤ６００になるまで３７℃で増殖させた。ＩＰＴＧを、１ｍＭの終濃度まで添加し、そして培養物を、３０℃で３時間インキュベートした。細胞を、５，０００ＲＰＭで８分間の遠心分離によってペレット化した。タンパク質を精製するため、細胞ペレットを、２５ｍＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ  ＰＭＳＦ、完全プロテアーゼインヒビターおよび１５μｇのリゾチーム中に再懸濁した。細胞を、４℃で３０分間溶解し、数回超音波処理し、そして溶解物を、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離した。封入体を含む沈殿物を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）および１％  ＣＨＡＰＳで、２回洗浄した。封入体を、４０ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭリン酸ナトリウムおよび８Ｍ尿素中に溶解した。溶液を、室温で１時間、８ｍｌ  Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）に結合させた。混合物を、２５ｍｌカラム内に注ぎ、そして５０ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ６．３）、１００ｍＭリン酸ナトリウム、０．５％  ＤＯＣおよび８Ｍ尿素で洗浄した。結合タンパク質を、３５０ｎＭのイミダゾール、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭリン酸ナトリウムおよび８Ｍ尿素で溶出した。ＦＯＰＰタンパク質を含有する画分を合わせ、そして１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ４．６）に対して大規模に透析し、アリコートを取り、そして−７０℃で保存した。
【１１７７】
（実施例２２）
（前立腺癌患者の末梢血中の前立腺特異的抗原Ｐ５０１Ｓの実時間特徴づけ）
循環上皮細胞を、健常個体および転移性前立腺癌患者の新鮮な血液から単離し、実時間ＰＣＲ手順を用いて、ｍＲＮＡを単離してｃＤＮＡを調製した。実時間ＰＣＲを、遺伝子特異的プライマーおよびプローブの両方を用い、ＴａｑｍａｎＴＭ手順で実施して、遺伝子発現のレベルを決定した。
【１１７８】
上皮細胞を、免疫磁気ビーズ分離法（Ｄｙｎａｌ  Ａ．Ｓ．，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を用いて、血液サンプルから富化した。単離した細胞を溶解し、そして磁気ビーズを回収した。次いで、溶解物を、オリゴ（ｄＴ）２５でコートした磁気ビーズを用いて、ポリＡ＋ｍＲＮＡ単離処理した。緩衝液中でビーズを洗浄した後、ビーズ／ポリＡ＋ＲＮＡサンプルを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に懸濁し、そして逆転写に供した。生じたｃＤＮＡを、遺伝子特異的プライマーを用いて、実時間ＰＣＲに供した。また、β−アクチン含量を決定し、そして基準化のために使用した。基準サンプルの平均＋３標準偏差多いＰ５０１Ｓコピー数を有するサンプルを、ポジティブと見なした。血液サンプルにおける実時間ＰＣＲを、ＴａｑｍａｎＴＭ手順を用い、順プライマーおよび逆プライマーならびにＰ５０１Ｓ特異的プローブを用いて５０サイクルまで延長して実施した。試験した８サンプルのうち、６サンプルが、Ｐ５０１Ｓおよびβアクチンシグナルについてポジティブであった。残りの２サンプルは、検出可能なβアクチンまたはＰ５０１Ｓを有さなかった。４つの試験した基準血液サンプルにおいてＰ５０１Ｓシグナルは、観察されなかった。
【１１７９】
（実施例２３）
（ＳＣＩＤマウス経代前立腺腫瘍における前立腺特異的抗原Ｐ７０３ＰおよびＰ５０１Ｓの発現）
前立腺癌の処置における抗原の有効性を考慮する場合、アンドロゲン剥離治療の間に腫瘍における継続する抗原の存在が、重要である。テストステロンの存在下でＳＣＩＤマウスにおいて増殖した前立腺腫瘍サンプルにおける前立腺特異的抗原Ｐ７０３ＰおよびＰ５０１Ｓの存在を、以下のように評価した。
【１１８０】
骨に転移した２つの前立腺腫瘍を、患者から除去し、ＳＣＩＤマウス内に移植し、そしてテストステロンの存在下で増殖させた。腫瘍を、Ｐ７０３Ｐ、Ｐ５０１ＳおよびＰＳＡのｍＲＮＡ発現について、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎアッセイ方法により、定量的実時間ＰＣＲを用いて評価した。前立腺腫瘍におけるＰ７０３ＰおよびＰ５０１Ｓの発現をポジティブコントロールとして使用し、そして正常な腸および正常な心臓における非存在をネガティブコントロールとして使用した。両方の場合において、特異的ｍＲＮＡは、後期経代腫瘍において存在した。骨転移がテストステロンの存在下で増殖するため、このことは、これらの遺伝子の存在が、アンドロゲン剥離治療の間失われないことを暗示する。
【１１８１】
（実施例２４）
（前立腺癌患者におけるＰ５０１ＳおよびＰ７０３Ｐ特異的抗体の同定）
前立腺癌患者および健常ドナーの血清における前立腺抗原Ｐ５０１ＳまたはＰ７０３Ｐに対する特異的な抗体応答を、以下のように試験した：
血清のウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡ分析の両方を、Ｐ５０１Ｓペプチド（配列番号９８５〜９８７）およびＰ７０３ペプチド（配列番号９８８〜９９０）を用いて実施した。配列番号９８５、９８６および９８７は、Ｐ５０１Ｓのアミノ酸２３１〜２５０、２４６〜２６６および４９２〜５２１をそれぞれ表す。配列番号９８８、９８９、９９０、１０３０、１０３１、１０３２、１０３３、および１０３７は、Ｐ７０３Ｐのアミノ酸１１０〜１２４、１４０〜１５４、１９０〜２０４、６２〜７６、９１〜１０６、２００〜２１４、および２２９〜２４５を、それぞれ表す。この結果は、前立腺癌患者の幾人かは、Ｐ５０１ＳまたはＰ７０３Ｐのどちらかの同じペプチド（すなわち、共通エピトープ）を認識し、そして共通エピトープは、正常ドナー由来の血清により、認識されないか、または有意により低く認識されることを実証した。このデータは、４８人の前立腺癌患者のうち少なくとも１４人は、Ｐ５０１Ｓ特異的抗体を有し、そして４８人の癌患者のうち３人は、Ｐ７０３Ｐ特異的抗体を有し、Ｐ５０１Ｓ特異的抗体およびＰ７０３Ｐ特異的抗体の両方を有する患者はいなかったことを示した。
【１１８２】
（実施例２５）
（抗Ｐ５０３Ｓモノクローナル抗体は、インビボで腫瘍増殖を阻害する）
抗Ｐ５０３Ｓモノクローナル抗体２０Ｄ４の、マウスにおいて腫瘍形成を抑制する能力を、以下のように試験した。
【１１８３】
１０匹のＳＣＩＤマウスに、Ｐ５０３Ｓを発現するＨＥＫ２９３細胞を皮下注射した。５匹のマウスに、０日目（腫瘍細胞注射時）、５日目および９日目に１５０ｍｇの２０Ｄ４を静脈内で与えた。腫瘍の大きさを、５０日にわたって測定した。２０Ｄ４を与えなかった動物５匹のうち、３匹は、２週間後に検出可能な腫瘍を形成し、これは、研究の間中、拡大し続けた。対照的に、２０Ｄ４を与えた５匹のマウスのいずれも、腫瘍を形成しなかった。これらの結果は、抗Ｐ５０３Ｓ  Ｍａｂ  ２０Ｄ４が、インビボで強力な抗腫瘍活性を示すことを実証する。
【１１８４】
（実施例２６）
（Ｐ５０１Ｓ特異的Ｔ細胞レセプタークローンの特徴づけ）
Ｔ細胞は、限定的な寿命を有する。しかし、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）鎖のクローニングおよび引き続く伝達（ｔｒａｎｓｆｅｒ）は、Ｔ細胞特異性の無限の伝播を必然的に可能にする。腫瘍抗原ＴＣＲ鎖のクローニングは、ＴＣＲ  ＭＨＣ−拘束性対立遺伝子を共有する患者から単離されたＴ細胞内への特異性の伝達を可能にする。従って、このようなＴ細胞を増殖させ、そして抗原を発現する腫瘍を有する患者内に腫瘍抗原特異性を導入するために設定された適合伝達において使用する。前立腺特異的抗原Ｐ５０１Ｓについて特異的なＣＤ８  Ｔ細胞クローン由来のＴ細胞レセプターα鎖およびβ鎖を、以下のように単離し、そして配列決定した。
【１１８５】
ＣＴＬクローン４Ｅ５（実施例１２に記載）由来の２×１０６細胞からの総ｍＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を用いて単離し、ｃＤＮＡを合成した。このクローンにおいてＶａ配列およびＶｂ配列を決定するため、一群のＶａサブタイプおよびＶｂサブタイプに特異的なプライマーを合成し、そして各クローン由来のｃＤＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ反応において使用した。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、各クローンが、Ｖｂ７サブファミリーに対応する共通Ｖｂ配列を発現したことを実証した。さらに、クローンから生成されたｃＤＮＡを使用して、発現されたＶａ配列を、Ｖａ６であると決定した。クローン４Ｅ５から全長のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖をクローン化するため、プライマーを、ＴＣＲヌクレオチドをコードする開始部（ｉｎｉｔｉａｔｏｒ）から終止部（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）にまたがるように設計した。プライマーは、以下のようであった：ＴＣＲ  Ｖα−６  ５’（センス）：ＧＧＡＴＣＣ−−−ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ−ＡＴＧＴＣＡＣＴＴＴＣＴＡＧＣＣＴＧＣＴ（配列番号８９９）ＢａｍＨＩ部位Ｋｏｚａｋ  ＴＣＲα配列、ＴＣＲα３’（アンチセンス）：ＧＴＣＧＡＣ−−−ＴＣＡＧＣＴＧＧＡＣＣＡＣＡＧＣＣＧＣＡＧ（配列番号９００）ＳａｌＩ部位ＴＣＲα共通配列、ＴＣＲＶβ−７．５’（センス）：ＧＧＡＴＣＣ−−−ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ−−ＡＴＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＣＴＣＴ（配列番号９０１）ＢａｍＨＩ部位Ｋｏｚａｋ  ＴＣＲα配列、ＴＣＲβ３’（アンチセンス）：ＧＴＣＧＡＣ−−−ＴＣＡＧＡＡＡＴＣＣＴＴＴＣＴＣＴＴＧＡＣ（配列番号９０２）ＳａｌＩ部位ＴＣＲβ共通配列。標準的３５サイクルＲＴ−ＰＣＲ反応を、ＣＴＬクローンから合成したｃＤＮＡおよび上記のプライマーを用い、校正熱安定性ポリメラーゼＰＷＯ（Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）を使用して達成した。
【１１８６】
得られた特異的バンド（αについておよそ８５０ｂｐ、βについておよそ９５０）を、ＰＣＲ平滑ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にライゲーションし、そしてＥ．ｃｏｌｉ内に形質転換にした。全長α鎖および全長β鎖を含むプラスミドで形質転換したＥ．ｃｏｌｉを同定し、そして対応するプラスミドの大規模調製を生成した。全長ＴＣＲα鎖および全長ＴＣＲβ鎖を含むプラスミドを、配列決定に供した。配列決定反応は、全長ＴＣＲα鎖および全長ＴＣＲβ鎖の、Ｖｂ鎖およびＶａ鎖についての所定のｃＤＮＡ配列（それぞれ配列番号９０３および配列番号９０４に示す）とのクローニングを実証した。対応するアミノ酸配列を、配列番号９０５および配列番号９０６にそれぞれ示す。Ｖａ配列は、Ｖａ６．２に対して９９％（３４７／３４８）同一なヌクレオチドアラインメントを示し、Ｖｂは、Ｖｂ７に対して９９％（３３６／３３７）同一なヌクレオチドアラインメントを示した。
【１１８７】
（実施例２７）
（前立腺抗原Ｐ５０３Ｓを用いた前立腺特異的細胞の捕捉）
上述のように、Ｐ５０３Ｓは、前立腺細胞の配列上に見出される。マウスＩｇＧに特異的な二次的に被膜されたミクロスフィアビーズを、精製Ｐ５０３Ｓ特異的モノクローナル抗体１Ｄ１２と結合した。次いで、結合Ｐ５０３Ｓ抗体を、組換えＰ５０３Ｓを発現するＨＥＫ細胞を捕捉するために使用した。このことは、血液中の前立腺細胞の検出において（従って、前立腺癌の検出において）通常使用され得る前立腺特異的細胞捕捉のためのモデル系を提供する。
【１１８８】
Ｐ５０３ＳトランスフェクトＨＥＫ細胞を、回収し、適当な容量の洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．１％  ＢＳＡ、０．６％  クエン酸ナトリウム）中に再溶解し、サンプルにつき少なくとも５４細胞を得た。ビーズに関する全ての手順において、丸底Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブを使用した。ストック濃度を、以下の表ＩＸに示した。
【１１８９】
【表９】
2006515749.tif 000011
ブロックした免疫磁気ビーズを、以下のように事前洗浄した：必要な全てのビーズをプールし、そして１ｍｌの洗浄緩衝液で１回洗浄した。ビーズを、３×容量の洗浄緩衝液中１％  ＢＳＡ（ｖ／ｖ）中に再懸濁し、４℃で１５分間回転させながらインキュベートした。次いでビーズを、２×容量の洗浄緩衝液で３回洗浄し、そして元の容量に再懸濁した。未ブロック化ビーズをプールし、２×容量の洗浄緩衝液で３回洗浄し、そして元の容量に再懸濁した。
【１１９０】
一次抗体を、４℃で回転させながら、二次ビーズと共に新しいＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中で３０分間インキュベートした。約２００μｌの洗浄緩衝液を、等量混合したサンプルの総容量を増加するために添加した。抗体−ビーズ溶液を、新しいＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移し、等量の洗浄緩衝液で２回洗浄し、そして下の容量に再懸濁した。標的細胞を各サンプルに添加し、４℃で回転させながら、４５分間インキュベートした。チューブを、上清を除去した、撹拌しないよう注意を要する磁気ビーズに移し、サンプルを、１ｍｌの洗浄緩衝液で洗浄した。次いで、サンプルを、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ｍＲＮＡダイレクトマイクロキット（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲのために準備した。
【１１９１】
上皮細胞濃縮物を、磁気中に置き、そして上清を除去した。次いで、上皮濃縮ビーズを、１００μｌの溶解／結合緩衝液（Ｒｎａｓｉｎ（サンプルにつき２Ｕ／μｌ）で強化した）中に再懸濁して、使用するまで−７０℃で保存した。オリゴ（ｄＴ２５）Ｄｙｎａｂｅａｄｓを、以下のように事前洗浄した：必要な全てのビーズをプールし（２３μｌ／サンプル）、過剰量の溶解／結合緩衝液で３回洗浄し、そして元の容量に再懸濁した。溶解上清を、磁気で分離し、新しいＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移した。サンプルにつき２０μｌのオリゴ（ｄＴ２５）Ｄｙｎａｂｅａｄｓを加え、そして５分間室温で回転させた。磁気を用いて上清を分離して捨て、ｍＲＮＡをビーズにアニールしたままに残した。ビーズ／ｍＲＮＡ複合体を、緩衝液で洗浄し、そして冷Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中に再懸濁した。
【１１９２】
ＲＴ−ＰＣＲについて、ＭＰＳを用いて、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ上清を分離して捨てた。１５細胞未満を含む各サンプルにつき、以下を添加して、３０μｌの総容量を得た：１４．２５μｌ  Ｈ２Ｏ；１．５μｌ  ＢＳＡ；６μｌ  第１鎖緩衝液；０．７５ｍＬ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物；３μｌ  Ｒｎａｓｉｎ；３μｌ  ０．１Ｍ  ｄＴＴ；および１．５μｌ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ。得られた溶液を、４２℃で１時間インキュベートし、Ｈ２Ｏ中で１：５希釈し、８０℃で２分間過熱してｃＤＮＡをビーズから脱着させ、そして直ちにＭＰＳ中に置いた。ｃＤＮＡを含有する上清を、新しいチューブに移し、−２０℃で保存した。
【１１９３】
表Ｘは、ＲＴ−ＰＣＲによって決定されたＰ５０３ＳトランスフェクトＨＥＫ細胞の捕捉の百分率を示す。
【１１９４】
【表１０】
2006515749.tif 000012
（実施例２８）
（組換えＰ７０３Ｐでのマウスの免疫化）
インビボ免疫原性研究を、種々のＰ７０３Ｐ組換えタンパク質処方物を用いて実施した。具体的には、一群のマウスを、以下の表ＸＩで示すＰ７０３Ｐ処方物で免疫化し、ここで、「Ｃ’アミド化Ｐ７０３Ｐ」は、Ｃ末端でのＰ７０３Ｐアミド化を表す；「切断型Ｐ７０３Ｐ」は、Ｐ７０３Ｐの切断形態を表し、そして「ＦＯＰＰ」は、Ｐ７０３ＰとＰＳＡとの融合物を表す。
【１１９５】
【表１１】
2006515749.tif 000013
各タンパク質免疫化を、４つの部位で行った：両足蹠において皮下（ｓｑ）、および両脚において筋肉内（ｉｍ）。各免疫化を、血清＋脾臓細胞およびリンパ節（ＬＮ）細胞で３週間おきに行い、最後の免疫化の１０日後に回収した。
【１１９６】
Ｔ細胞増殖アッセイおよびインターフェロン−γアッセイを、以下のように実施した。２５０，０００個の脾臓細胞または１００，０００個のＬＮ細胞を、９６ウェルプレートにプレートし、１〜１０μｇ／ｍｌの抗原で刺激した。試験した抗原としては、上記に列挙した５つのタンパク質、バキュロウイルスで発現したＰ７０３Ｐ、ＮＳ１制御タンパク質、ＰＳＡ（ＦＯＰＰ群のみについて）、およびＰ７０３Ｐペプチドプールが挙げられる。ペプチドプールは、６〜８個のペプチドを含む各プールと１５個までのアミノ酸が重複する２０マーのペプチドからなっていた。Ｃｏｎ  Ａは、ポジティブコントロールとして使用した。増殖をアッセイするための培養の開始後４日目に、培養物を、Ｈ３−チミジンでパルスした。ＥＬＩＳＡによってＩＦＮγレベルをアッセイするために、上清もまた、４日目に抜き取った。さらに、血清をプールし、上記に列挙した組み換えタンパク質に対するＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡによってアッセイした。
【１１９７】
すべての免疫原は、免疫原に対して強力な抗体応答を誘発した。すべての場合において、これらの応答は、Ｐ７０３Ｐの他の供給源と反応する（Ｐ７０３ＰのＰｉｃｈｉａ形態およびバキュロウイルス形態との強力な反応性を含む）。ＡＳ１アジュバントは、ＭＰＬ−ＳＥよりも強力な応答を誘発した。Ｐ７０３ＰのＰｉｃｈｉａ形態およびバキュロウイルス形態に対する応答を誘発することに関して最高の免疫原は、ＦＯＰＰであったが、Ｅ．ｃｏｌｉに対して強力に反応性なＰ７０３Ｐ抗体応答を誘発するすべての免疫原が、Ｐ７０３Ｐに由来した。増殖アッセイおよびインターフェロン−γアッセイの両方において、すべての免疫原は、ほとんどの動物で、Ｐ７０３Ｐタンパク質の他の供給源にもまた反応する動物の免疫原に対して検出可能な応答を伴って、免疫原に対して極めて良好なＴ細胞応答を誘発した。再び、ＡＳ１アジュバントが、ＭＰＬ−ＳＥよりも良好なＴ細胞応答を誘発した。
【１１９８】
（実施例２９）
（免疫組織化学（ＩＨＣ）による、前立腺癌組織および正常組織におけるＰ７０３Ｐ発現の分析）
前立腺癌抗原Ｐ７０３Ｐのタンパク質発現を、一群の抗Ｐ７０３Ｐポリクローナル抗体および抗Ｐ７０３Ｐモノクローナル抗体（表ＸＩＩ参照）を使用するＩＨＣ分析によって、前立腺癌組織および前立腺正常組織において分析した。Ｐ７０３Ｐタンパク質発現を、同じＰ７０３Ｐ抗体を使用するフローサイトメトリーおよびウェスタンブロット分析によって、ＨＥＫ２９３／Ｐ７０３Ｐトランスフェクト体においても分析した。このＰ７０３Ｐ―Ｒ０８７抗体およびＰ７０３Ｐ―２０５９抗体は、フローサイトメトリーによって、ＨＥＫ２９３／Ｐ７０３Ｐトランスフェクト体を染色した。Ｐ７０３Ｐ―２５９４を、ウェスタンブロット分析のために使用した。
【１１９９】
（表ＸＩＩ）
（抗Ｐ７０３Ｐ抗体）
【１２００】
【表１２】
2006515749.tif 000014
前立腺癌抗原Ｐ７０３Ｐタンパク質の組織発現をさらに評価するために、免疫組織化学（ＩＨＣ）分析を、多様な範囲の組織切片に対して実施した。組織サンプルを、ホルマリン溶液中に１２〜２４時間固定し、パラフィン中に包埋した後に、８ミクロン切片へとスライスした。０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）における蒸気熱誘導性エピトープ回復を、最適な染色条件のために使用した。切片を、１０％  血清／ＰＢＳとともに５分間インキュベートした。一次抗体を、示した濃度にて各切片に２５分間添加し、その後、抗ウサギビオチン化抗体とともに２５分間インキュベートした。内因性ペルオキシダーゼ活性を、水素ペルオキシダーゼとの１．５分間のインキュベーションを３回行うことによってブロックした。アビジンビオチン複合体／ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＡＢＣ／ＨＲＰ）系を、ＤＡＢ色素原とともに使用して、抗原発現を可視化した。スライドガラスを、ヘマトキシリンで対比染色して、細胞核を可視化した。ウェスタンブロット分析のために、全細胞溶解物を、その細胞をＴｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００含有溶解緩衝液中に氷上で３０分間インキュベートすることによって、作製した。その後、溶解物を、４℃にて５分間、１０，０００ｒｐｍでの遠心分離によって作製した。サンプルを、β―メルカプトエタノール含有ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液で希釈し、その後、１０分間煮沸した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにローディングした。タンパク質を、ニトロセルロースに移し、１μｇ／ｍｌの精製抗Ｐ７０３Ｐウサギポリクローナル血清２５９４（ロット番号３７０−８４）またはウサギモノクローナルＰ７０３Ｐ―Ｒ０８７を使用してプロービングした。ブロットを、ＨＲＰに結合体化したヤギ抗ウサギを使用した後にＥＣＬ基質中でインキュベートすることによって、明らかにした。ＦＡＣＳ分析のために、Ｐ７０３Ｐ／ＨＥＫ２９３トランスフェクト体の単細胞懸濁物を、作製し、細胞を、透過化処理緩衝液（ＰＢＳ＋サポニン＋ＢＳＡ）中で室温にてインキュベートした。その後、その細胞を、１０μｇ／ｍｌの精製抗Ｐ７０３Ｐポリクローナル血清または抗Ｐ７０３Ｐモノクローナル抗体とともに３０分間インキュベートした。透過化処理緩衝液中で３回洗浄した後、細胞を、ヤギ抗ウサギＩｇ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の１：１００希釈物とともに、室温で３０分間インキュベートした。３回洗浄した後、その細胞を、緩衝液中に再懸濁し、ＦＡＣＳによって分析した。；
光学的ＩＨＣの結果を、全長Ｐ７０３Ｐに対する上記の熱回復し親和性精製したＡＰ−Ｐ７０３Ｐ―９２４５抗体を使用して、得た。この抗体を用いて上記手順を使用するＩＨＣ運石によって、２３個中６個の転移性前立腺癌切片において、弱い染色が示された。３３個中２４個の原発性前立腺癌切片は、この抗体で陽性染色された。さらに、染色が、悪性管、種々の前立腺腫瘍における良性（正常管）、種々の前立腺腫瘍における基底筋上皮細胞、肥満細胞、およびリポフスチン顆粒に関係して、観察された。
【１２０１】
一群の正常組織（脳、乳房、子宮、耳下腺、脾臓、肝臓、卵巣、副腎、子宮頚部、扁桃、食道、気管支、肺、腎臓、精巣、膵臓、骨格筋、結腸、小腸、皮膚、および甲状腺の切片を含む）は、すべて陰性であった。
【１２０２】
（実施例３０）
（細胞捕捉技術を使用する、末梢血における循環する前立腺腫瘍細胞の検出）
前立腺癌、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、膀胱障害および他の前立腺障害であると診断された５５人の泌尿器科の患者の末梢血を、収集し、Ｄｙｎａｌ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈキット（Ｄｙｎａｌ，Ｌａｋｅ  Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）を使用して処理した。このキットは、転移性腫瘍細胞を特異的に捕捉する上皮特異的抗体Ｂｅｒ−ＥＰ４でコートされた磁気ビーズを使用する。その後、全ＲＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して単離し、ＤＮアーゼで処理し、第一鎖ｃＤＮＡを、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｒｎａｓｅ  Ｈ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ．ＣＡ）を使用して上記の細胞捕捉画分から合成した。リアルタイムＰＣＲを実施して、前立腺腫瘍遺伝子Ｐ５０１Ｓ（本明細書中でＬ１−１２とも呼ぶ（例えば、配列番号１０））、Ｐ７０３Ｐ（例えば、配列番号５２４）、Ｐ５０３Ｓ（本明細書中ではＮ１−１８６２とも呼ぶ（例えば、配列番号１１１））、Ｐ５０４Ｓ（本明細書中でＦｌ−１２とも呼ぶ（例えば、配列番号１０７）とも呼ぶ）、Ｐ５１０Ｓ（例えば、配列番号５３５および５３６）、ならびにＰ１０２０Ｃ（２２５５３とも呼ぶ（例えば、配列番号５９１））の発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子であるアクチン、β―２−ミクログロブリン、およびサイトケラチン１９をコントロールとして使用して、評価した。
【１２０３】
Ｐ５０１Ｓの発現パターンとＰ５０４Ｓの発現パターンとを合わせることによって、本発明者らは、合わせたこの２つの遺伝子が、２４人の前立腺癌患者のうちの１０人および２５人のＢＰＨ患者のうちの４人について、膀胱障害群および他の前立腺障害群についての平均シグナルと比較して、少なくとも２倍の過剰発現したことを検出することができた。ＢＰＨおよび膀胱癌／他の前立腺障害群と比較して、少なくとも２倍の平均過剰発現がまた、遺伝子Ｐ５０１Ｓ、Ｐ５０３Ｓ、Ｐ７０３Ｐ、Ｐ５０４Ｓ、およびＰ５１０Ｓについて、上記癌の群において検出された。さらに、同じサンプルが、Ｐ５０１Ｓ、Ｐ５０４ＳおよびＰ５１０Ｓを用いて同定された。従って、細胞捕捉後の血液サンプル中における本明細書中で同定された前立腺腫瘍配列の発現分析を、例えば、患者における循環する腫瘍細胞（例えば、転移性腫瘍細胞）の検出における、診断ツールとして利用し得る。
【１２０４】
（実施例３１）
（Ｐ７０３Ｐ由来ＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープの同定）
上記Ｐ７０３Ｐタンパク質配列のアミノ酸４７〜２５４に広がる１０アミノ酸だけ重複する１５マーペプチドを、合計４０個、標準的手順によって作製した。樹状細胞（ＤＣ）は、ＧＭＣＳＦおよびＩＬ−４を使用して、標準的手順によって正常女性ドナーのＰＢＭＣから誘導した。ＣＤ４  Ｔ細胞を、ＭＡＣＳビーズおよびネガティブ選択を使用して、上記ＤＣと同じドナーから作製した。ＤＣを、上記１５マーペプチドのうちの１０個を含むプールで一晩パルスした。このプールの各ペプチドは、最終濃度０．２５μｇ／ｍｌであった。パルスしたＤＣを洗浄し、９６ウェル丸底プレート１ウェル当たり１×１０４細胞でプレートした。培養物に、６０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２を補充し、３７℃にてインキュベートした。培養物を、週１回ベースで上記のように再刺激し、ＡＰＣとして、上記のように生成してパルスし５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７および１０μｇ／ｍｌのＩＬ−２を補充したＤＣを使用して、特異的増殖について試験した。５回のインビトロ刺激サイクルの後、株（各株は、１つのウェルに対応する）を、上記刺激プールに応答する増殖およびサイトカイン生成について、上記Ｐ７０３Ｐ配列に由来する無関係ペプチドプールに応答する増殖およびサイトカイン生成に対して、アッセイした。上記刺激ペプチドプールに応答する特異的増殖（標準的トリチウム化チミジン増殖アッセイにおいて測定した）およびサイトカイン生成（γ−インターフェロンＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定した）を示した、１２個の株を同定した。これらの株を、上記ペプチドプールの特異的認識、上記プールにおける個々のペプチドの特異的認識、および組換えＰ７０３Ｐタンパク質の特異的認識について、さらに試験した。このアプローチを使用して、上記前立腺腫瘍特異的タンパク質であるＰ７０３Ｐに由来するペプチドエピトープ（これは、ＭＨＣクラスＩＩの状況におけるＣＤ４＋  Ｔ細胞により認識される）を、同定した。上記ペプチドは、配列番号５２５のＰ７０３Ｐタンパク質配列のアミノ酸１４５〜１５９に対応し、配列ＧＮＳＣＬＶＳＧＷＧＬＬＡＮＧ（配列番号９９２）を有する。このエピトープをコードするｃＤＮＡ配列が、配列番号９９１に示される。
【１２０５】
（実施例３３）
（Ｐ７０６Ｐ伸長配列の同定）
関連するクローン（例えば、配列番号４６、２１２、２１３、２１４、２１５、２８８および４１５）が、上記の実施例１において前立腺特異的発現パターンを有するものとして同定された。さらなる分析を使用して、これらのクローンの伸長配列を、以下のようにして同定した。配列特異的プライマーを使用して、前立腺腫瘍ライブラリーから生成物を増幅し、クローン８Ｂ６−Ｐ３（配列番号９９３）および８Ｂ６−Ｐ４（配列番号９９４）を同定した。両方のクローンを、適切な細胞中に形質転換し、単離し、配列決定した。得られた配列を、照会配列として使用して、Ｇｅｎｂａｎｋ配列データベースに対して検索した。この検索によって、８Ｂ６−Ｐ３および８Ｂ６−Ｐ４ならびに他の関連するＥＳＴ配列が、同じゲノム７ｑ２１  ＢＡＣクローンの構成要素であることが、明らかになった。このクローンがこのゲノム骨格に沿って近位にあることおよび類似する発現プローフィルであることに基づいて、これらの構成要素は、同じ遺伝子（本明細書中でＰ７０６Ｐと呼ぶ）の一部であると結論付けた。ノーザン分析によって、前立腺腫瘍および前立腺組織における高過剰発現が示され、脳および卵巣における発現も示された。本明細書中に開示される４つの配列（配列番号９９３〜９９７）は、上記ゲノム骨格に沿う、最も長い４つの連続するｃＤＮＡ由来配列片を示す。利用可能なＥＳＴ配列を使用してクローン８Ｂ６．Ｐ３（配列番号９９３）およびクローン８−Ｂ６．Ｐ４（配列番号９９４）を連続させると、配列番号９９５に示される伸長したＰ７０６Ｐ配列の同定が可能になった。
【１２０６】
（実施例３４）
（Ｐ７１３Ｐ伸長配列の同定）
配列番号１４６（Ｐ２１９とも呼ぶ）の同定を、上記に記載した。本実施例は、このクローンの伸長配列の同定、ならびにこの配列を含む全長ｃＤＮＡ配列およびタンパク質配列のバイオインフォーマティクス的同定を記載する。全長を実験室クローニングする努力を、ＥＳＴ検索およびアライメントで開始した。このアプローチにより同定された配列を、５’  ＲＡＣＥアッセイ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｃｈｅｎｃｈｉｋら、１９９５，１９９６も参照）を用いて確認した。このアッセイにおいて、アダプターに連結した前立腺腫瘍ｃＤＮＡのライブラリーをテンプレートとして使用して、５’アダプタープライマーおよび遺伝子特異的３’プライマーを使用して、遺伝子の望ましい５’端を増幅した。さらなる配列を、核酸ベースのスクリーニングを使用して同定した。このスクリーニングにおいて、ファジミド前立腺腫瘍ライブラリーを、プラークを増殖させ、ＤＮＡをナイロンフィルター上に移して固定し、放射性遺伝子特異的プローブでハイブリダイズすることによって、スクリーニングした。その後、このフィルターをフィルムに感光させ、放射能に感光した陽性ヒットに対応するプラークを、選択し、ＤＮＡ単離のために調製した。上記アプローチを使用して同定したＤＮＡ配列は、元のクローン配列を確認し、さらに、さらなる５’配列も得た。この伸長ｃＤＮＡ配列（本明細書中ではＰ７１３Ｐとも呼ぶ）が、配列番号９９８に示される。別の分析において、Ｐ７１３Ｐが、前立腺分泌タンパク質（ＰＳＰ）と呼ばれるタンパク質に対応することが決定された。このタンパク質の全長ｃＤＮＡ配列は、配列番号９９９に示され、これは、配列番号１０００に示されるアミノ酸配列をコードする。
【１２０７】
（実施例３５）
（Ｐ１Ｅ伸長配列の同定）
配列番号６２０、６２１および６２２（本明細書中でＰ１Ｅとも呼ばれる）に示されるｃＤＮＡ配列の同定が、上記実施例１に記載された。これらの配列は、血清学的発現クローニングの努力と、その後の同じＤＮＡ発現ライブラリーの核酸スクリーニングから得られた。発現ｃＤＮＡライブラリーを、慣用的方法論を使用して、抽出した前立腺腫瘍ｍＲＮＡから構築した。このライブラリーを、自己由来患者血清（前立腺腫瘍および患者血清は、同じ個体から得た）を用いてスクリーニングした。１０，０００ｐｆｕを、６個の大きなＬＢ寒天プレート上にプレートし、６時間増殖させた。ＩＰＴＧを注入したフィルターを適用して、発現を誘導し、これが生成したタンパク質を固定した。このフィルターを、このプレートに向け、１２時間後に取り外した。このフィルターを、ＰＢＳ、１  Ｔｗｅｅｎ中でブロックし、その後、患者の血清とともに４℃にて１２時間インキュベートした。洗浄したフィルターを、Ｉ−１２５結合体化プロテインＡにおいて室温で１時間インキュベートし、再び洗浄し、フィルムに一晩感光させた。上記自己由来血清によって認識される発現タンパク質を示す、上記フィルム上の感光スポットを、選択し、精製し、プラスミドを切り出し、そしてＤＮＡ単離とその後の配列決定のために調製した。この手順によって、クローンＰＴ４４Ａ２を同定した。
【１２０８】
プライマーを、上記ＰＴ４４Ａ２２配列から設計して、同じ発現ライブラリーをさらにスクリーニングした。プローブ標識のために、元のＰＴ４Ａ２２  ＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅を、放射性ヌクレオチドの存在下で実施した。そのプローブを、上記発現ライブラリーの１００００〜１５０００個のクローンのＤＮＡを固定したナイロンフィルターとともにインキュベートした。Ｃｈｕｒｃｈハイブリダイゼーション緩衝液中で６５℃にて２〜３時間ハイブリダイゼーションした後、フィルターを、１×ＳＣＰ、１％サルコシルの溶液中で洗浄した。フィルムを、この洗浄したフィルターに一晩感光させ、陽性シグナルを使用して、適切なクローンを選択した。これあの選択物（これは、各々約５０個のクローンを含んだ）を、上記の方法によってさらに精製し、純粋なコロニー選択物を得た。この後、これを増殖させ、プラスミドＤＮＡのために調製した。目的のクローンを含むプラスミドを、フラグメントサイズに消化し、そのインサートを、隣接するプロモータープライマーを使用して配列決定した。この手順により、クローンＰＴ４４．Ｐ２を得た。まとめると、ＰＴ４４Ａ２２とＰＴ４４．Ｐ２とは、本明細書中に配列番号１００４として開示される伸長Ｐ１Ｅ配列を構成する。この伸長Ｐ１Ｅ配列は、配列番号１００５に示されるアミノ酸配列をコードする。
【１２０９】
（実施例３６）
（Ｐ５１０Ｓの免疫組織化学分析）
前立腺特異的遺伝子Ｐ５１０Ｓの同定が、上記（例えば、実施例１）に記載される。Ｐ５１０Ｓタンパク質の発現を評価するために、免疫組織化学（ＩＨＣ）分析を、多様な範囲の組織切片に対して実施した。組織サンプルを、ホルマリン溶液中に１２〜２４時間固定し、パラフィン中に包埋した後、８ミクロンの切片にスライスした。０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）における蒸気熱誘導性エピトープ回復（ＳＨＩＥＲ）を、最適な染色条件のために使用した。切片を、１０％血清／ＰＢＳとともに５分間インキュベートした。一次抗体を、示した濃度で各切片に２５分間添加した後、抗ウサギビオチン化抗体とともに２５分間インキュベートした。内因性ペルオキシダーゼ活性を、水素ペルオキシダーゼとの１．５分間のインキュベーションを３回することによってブロックした。アビジンビオチン複合体／ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＡＢＣ／ＨＲＰ）系を、ＤＡＢ色素原とともに使用して、抗原発現を可視化した。スライドガラスを、ヘマトキシリンで対比染色して、細胞核を可視化した。
【１２１０】
このアプローチを使用して、Ｐ５１０Ｓタンパク質発現が、３２個の原発性前立腺腫瘍サンプルのうちの３１個、および１７個の骨転移サンプルのうちの８個において、検出された。いくらかの発現が、５個の正常前立腺サンプルのうちの４個および５個の精巣サンプルのうちの３個において検出された。甲状腺、脾臓、子宮、卵巣、膵臓、肺、肝臓、腎臓、心臓、胃、大腸、小腸、脳、および副腎においては、発現は検出されなかった。
【１２１１】
（実施例３７）
（前立腺抗原Ｐ５０４Ｓの診断評価）
前立腺特異的配列Ｐ５０４Ｓの同定が、上記（例えば、実施例１）に記載されている。Ｐ５０４Ｓのタンパク質発現を評価するために、免疫組織化学（ＩＨＣ）分析を、多様な範囲の組織切片に対して実施した。組織サンプルを、ホルマリン溶液中に１２〜２４時間固定し、パラフィン中に包埋した後、８ミクロンの切片にスライスした。０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）における蒸気熱誘導性エピトープ回復（ＳＨＩＥＲ）を、最適な染色条件のために使用した。切片を、１０％血清／ＰＢＳとともに５分間インキュベートした。一次抗体を、示した濃度で各切片に２５分間添加した後、抗ウサギビオチン化抗体とともに２５分間インキュベートした。内因性ペルオキシダーゼ活性を、水素ペルオキシダーゼとの１．５分間のインキュベーションを３回することによってブロックした。アビジンビオチン複合体／ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＡＢＣ／ＨＲＰ）系を、ＤＡＢ色素原とともに使用して、抗原発現を可視化した。スライドガラスを、ヘマトキシリンで対比染色して、細胞核を可視化した。
【１２１２】
（Ａ．結腸癌腫におけるＰ５０４Ｓ発現：腫瘍悪性度および患者の生存との相関）
本実施例は、正常結腸および侵襲性結腸癌腫におけるＰ５０４の免疫反応性を評価し、そしてまた、Ｐ５０４発現と腫瘍の悪性度、病期、および患者の生存との間の相関を評価する。寛容的に処理した切除した結腸癌腫（ｎ＝４４）、絨毛腺腫（Ｖ，ｎ＝４）および管状腺腫もしくは管状絨毛腺腫（ＴＡ／ＴＶＡ，ｎ＝２４）を、５μｍに切断し、ＴｅｃｈＭａｔｅ  １０００（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）自動免疫染色器をにて、アビジン／ビオチン複合体（ＡＢＣ）染色手順を使用して、Ｐ５０４を用いて免疫染色した。細胞質における陽性免疫染色を、悪性度分類した：０＝陰性染色；１＋＝３３％までの細胞が陽性；２＋＝３４〜６６％の細胞が陽性；３＋＝＞６６％の細胞が陽性。腫瘍を、Ｈ＆Ｅ染色したスライドガラスを検討して悪性度分類し、病期、位置、および経過観察を、病理報告および患者の病歴から得た。
【１２１３】
侵襲性癌腫を、１８人の男性および２６人の女性（年齢４５歳〜８７歳）から、右結腸（２３人）、横行結腸（６人）、左結腸（１４人）および未知（１人）から得た。腫瘍病期は、Ｉ（４人）、ＩＩ（１７人）、ＩＩＩ（１８人）、およびＩＶ（５人）であった。腫瘍悪性度は、グレード１（２３人）、２（９人）および３（１２人）であった。残留ポリープが、７つの癌腫において存在した。Ｐ５０４Ｓについての免疫染色は、正常結腸の表面上皮においては弱く陽性であった。癌腫において、Ｐ５０４は、０（１６人）、１＋（６人）、２＋（８人）および３＋（１４人）と悪性度評価された。上記腫瘍の表面領域と深部領域との間に、差異は存在しなかった。残留ポリープは、４症例において２＋または３＋であり、３症例において０であった。各悪性度のＰ５０４Ｓについて陽性である癌腫の割合は、腫瘍の悪性度および患者の生存と逆相関していた。Ｐ５０４Ｓ発現とＴＭＮ病期または全体的病期との間に、相関は存在しなかった。ほとんどの腺腫（３５個中２５個）は、組織学的型に関わらず、２＋または３＋であった。
【１２１４】
従って、Ｐ５０４Ｓは、腺腫および十分に分化した結腸癌腫において高度に発現され、正常結腸粘膜およびほとんど分化していない癌腫においては、弱いかまたは存在しなかった。Ｐ５０４Ｓ発現は、患者の生存と逆相関した。これらの結果を考慮すると、Ｐ５０４Ｓについての免疫染色は、結腸癌腫の診断評価における診断的有意性を備える、有用な補助物を示す。
【１２１５】
（Ｂ．前立腺の非定型腺腫様増殖におけるＰ５０４Ｓの発現）
非定型腺腫様増殖（ＡＡＨ）（腺疾患としても公知）は、異常な構造パターンであるが前立腺腺上皮において有意な細胞学的非定型性はないことによって、特徴付けられる。ＡＡＨは、前立腺癌の前駆的病変を示し得る。Ｐ５０４Ｓは、前立腺癌において高度に発現されるが、良性前立腺上皮においては発現されないことが、見出されている。本実施例において、Ｐ５０４Ｓの発現を、ＡＡＨにおいて評価した。
【１２１６】
２６個のＡＡＨ（前立腺切除：Ｎ＝１８、生検：Ｎ〜６、および経尿道切除：Ｎ＝２）、Ｇｌｅａｓｏｎスコアが２＋２＝４である１０症例の腺癌、および１０症例の良性前立腺増殖症（ＢＰＨ）を含む、合計４６症例を、Ｐ５０４Ｓおよび高分子量サイトケラチンである３４βＥ１２についての免疫組織化学によって試験した。３４βＥ１２染色によって、２６症例すべてのＡＡＨにおいて、斑状基底細胞の存在が確認された。Ｐ５０４Ｓは、すべて（１０症例中１０症例）の低悪性度癌腫および２６症例中４症例のＡＡＨ（１５％）において、強力な細胞質顆粒染色を示した。ＢＰＨも、癌腫およびＡＡＨに隣接する良性腺も、Ｐ５０４Ｓについて陽性ではなかった。拡散するＰ５０４Ｓ染色パターンが、低悪性度癌腫において見出され、一方、限局的なＰ５０４Ｓ陽性が、ＡＡＨにおいて観察された。
【１２１７】
従って、Ｐ５０４Ｓの発現は、すべての低悪性度癌腫および小さい割合のＡＡＨにおいて見出されたが、ＢＰＨにおいても他の良性腺においても見出されなかった。これらの知見は、ＡＡＨが、少なくともＰ５０４Ｓ発現に関しては、低悪性度癌ともＢＰＨとも異なる病変であることを示唆する。さらに、ＡＡＨは、前悪性病変または潜在的に前悪性の病変と見なされ得る。
【１２１８】
（Ｃ．針生検での最小前立腺癌に対する診断マーカーとしてのＰ５０４Ｓ）
針生検での最小前立腺癌（ＰＣ）の診断法を確立することは、主要な診断上の試みである。前立腺癌に特異的なマーカーは、最小疾患を検出する本発明者らの能力を増強する。ｃＤＮＡサブトラクション法およびマイクロアレイ技術によって同定したＰ５０４Ｓは、ＰＣにおいて高発現することを示したが、良性の前立腺においては高発現しなかった。本研究のねらいは、最小ＰＣを検出するための方法としてＰ５０４Ｓの発現を調べることである。
【１２１９】
５２個のＧｌｅａｓｏｎ  Ｓｃｏｒｅ６（Ｎ＝５１）または８（Ｎ＝１）の最小前立腺癌および５９個の良性前立腺を含む全１１１個の前立腺針生検を、Ｐ５０４Ｓに特異的な免疫組織化学および高分子量のサイトケラチン（３４βＥ１２）を使用して検査した。最小ＰＣを、Ｈ＆Ｅ染色で直径１ｍｍより小さい腫瘍病巣として定義する。この最小ＰＣを、全生検（Ｎ＝３５）における唯一の単一病巣として提示するか、または他の提示する癌（Ｎ＝１８）に加えて一つの針中心における一つの小さい病巣として提示する。
【１２２０】
Ｐ５０４Ｓ免疫陽性を、最小ＰＣの５１／５２例（９８％）中に見出したが、任意の良性前立腺（０／５８）または悪性の腺に隣接する良性の腺においては見出さなかった。萎縮症、基底細胞過形成および遷移性細胞異形性は全てＰ５０４Ｓについてネガティブであった。Ｐ５０４Ｓのネガティブ染色を伴うＰＣの唯一つの例は、遷移帯から得られた生検における泡沫状癌の特徴を示した。高分子量サイトケラチン（３４βＥ１２）の免疫染色は、全ての５２例の癌の病巣において基底細胞が存在しないことを確認した。
【１２２１】
限られた前立腺癌を検出するためのＰ５０４Ｓの高い特異性および感度は、臨床状況における診断値を示す。従って免疫組織化学マーカーとしてＰ５０４Ｓを使用することは、針生検での最小前立腺癌の病理診断のおける正確性を増加させ得る。
【１２２２】
（実施例３８）
（Ｐ７６７Ｐの免疫組織化学分析）
前立腺の抗原Ｐ７６７Ｐのタンパク質発現を調べるために、免疫組織化学（ＩＨＣ）分析を、多様な範囲の組織切片で実施した。組織サンプルを、１２時間〜２４時間ホルマリン溶液中で固定し、そして８ミクロンの切片に切り出す前にパラフィンに包埋した。蒸気熱は、最適な染色状態のために使用する０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液中（ｐＨ６．０）でエピトープ回復（ＳＨＩＥＲ）を誘導した。切片を、５分間１０％血清／ＰＢＳを用いてインキュベートした。一次抗体を、示した濃度で２５分間各切片に添加し、その後抗ウサギビオチン化抗体とともに２５分間インキュベートした。内因性ペルオキシダーゼ活性を、水素ペルオキシダーゼを用いて１．５分間のインキュベートを３回することによって阻害した。アビジンビオチン複合体／ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＡＢＣ／ＨＲＰ）系を、抗原発現を可視化するためにＤＡＢ色素原と共に使用した。スライドを、細胞核を可視化するためにヘマトキシリンを用いて対比染色した。このアプローチを使用して、Ｐ７６７Ｓタンパク質発現を、７／７人の前立腺癌、５／５人の正常な前立腺癌、１／１人の正常な腎臓、１／１人の小脳、０／１人の正常な肝臓、０／１人の正常な心臓、１／１人の正常な肺、１／１人の正常な結腸、１／１人の正常な扁桃体、および１／１人の正常な皮質において検出した。
【１２２３】
（実施例３９）
（ＤＮＡ免疫化および抗体生成のためのＰ５１０ＳおよびＭＡＰＳ−Ｐ５１０Ｓ構築物）
前立腺配列Ｐ５１０Ｓの同定は、上記のように同定した（例えば、実施例１）。Ｐ５１０Ｓを含むプラスミドＤＮＡを、ＰＣＲ反応において鋳型として使用して、ＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＫｏｚａｋ配列を有するＰ５１０Ｓ−ＡＷ１８６センスプライマーとＮｈｅＩ部位および終止コドンを有するＰ５１０Ｓ−ＡＷ１８７アンチセンスプライマーとを使用してＰ５１０Ｓのオープンリーディングフレームを増幅した。ＰＣＲ産物を、アガロースゲルから精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩによって消化し、そして同じ二つの制限酵素によって直線化したＪＡ４３０４ベクターへライゲーションした。このライゲーション混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉへ形質転換させ、そしていくつかのクローンを、制限酵素分析およびＤＮＡ配列決定のために無作為に選択した。Ｐ５１０Ｓ／ＪＡ４３０４第２クローンおよびＰ５１０Ｓ／ＪＡ４３０４第３クローンを、所望のＰ５１０Ｓ配列を有するように確立した。この構築物について決定したＤＮＡ配列を、配列番号１００６に示し、これは配列番号１００９のポリペプチドをコードする。
【１２２４】
ＭＡＰＳ−Ｐ５１０Ｓの構築のために、ｐＣＲＸ４ベクターを使用した。ｐＣＲＸ４は、ＭＡＰＳ融合構築物のクローニングを容易にするために作成したＪＡ４３０４ベースのＭＡＰＳ融合ベクターである。ｐＣＲＸ４において、ＭＡＰＳを、マルチクローニング部位が続くＫｏｚａｋ配列の下流にクローン化した。ＭＡＰＳ−Ｐ５１０Ｓ構築物を生成するために、ＰＣＲ反応を使用し、ＥｃｏＲＩ部位を有するＭＡＰＳ−Ｐ５１０Ｓ−ＡＷ１８４センスプライマーとＫｐｎＩ部位および停止コドンを有するＭＡＰＳ−Ｐ５１０ＳのためのＰ５１０Ｓ−ＡＷ１８５アンチセンスプライマーとを用いてＰ５１０Ｓコード領域を増幅した。ＰＣＲ生成産物を、アガロースゲルから精製し、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩを用いて消化し、そして同じ二つの制限酵素でリニア化したｐＣＲＸ４ベクターにライゲーションした。このライゲーション混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉへ形質転換し、そしていくつかのクローンを、制限酵素分析およびＤＮＡ配列決定のために無作為に選択した。ＭＡＰＳ−Ｐ５１０Ｓ／ｐＣＲＸ４第１クローンおよびＭＡＰＳ−Ｐ５１０Ｓ／ｐＣＲＸ４第３クローンを確立した。この構築物について決定したＤＮＡ配列を、配列番号１００７に示し、これは、配列番号１００８のポリペプチドをコードする。
【１２２５】
（実施例４０）
（前立腺癌患者および正常な提供者の血清におけるＰ５０１Ｓ−特異的抗体
ならびにＰ７０３Ｐ−特異的抗体の検出）
前立腺特異的抗原のＰ５０１ＳおよびＰ７０３Ｐの同定ならびに特徴付けを、上に記載し、配列番号１１３（配列番号１１０によってコードされる）および配列番号５２５（配列番号５２４によってコードされる）にそれぞれ示す例証となる形態を示す。本実施例は、前立腺癌患者の血清におけるこれらタンパク質に特異的な抗体の検出を記載する。患者の血清中の前立腺抗原−特異的抗体についての有効なタンパク質ベースのスクリーニングは、タンパク質の不安定性および／または少量のＥ．ｃｏｌｉ由来のタンパク質の混入による問題があった。しかし、組換えＰ５０１Ｓおよび組換えＰ７０３Ｐのカルボキシアミド化は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって立証したように、これらタンパク質についての改善した安定性を提供した。従って、カルボキシアミド化Ｐ５０１Ｓタンパク質およびカルボキシアミド化Ｐ７０３Ｐタンパク質を使用して５５人の前立腺癌患者および１３人の正常な男性提供者の血清中のＰ５０１Ｓ−特異的抗体およびＰ７０３Ｐ−特異的抗体について、以下のようにスクリーニングした。
【１２２６】
平底免疫プレートをインキュベートし、６００ｎｇのカルボキシアミド化Ｐ５０１Ｓタンパク質または３００ｎｇのカルボキシアミド化Ｐ７０３Ｐタンパク質を補充した５０μｌのコーティング緩衝液（０．１Ｎ炭酸塩緩衝液；ｐＨ  ９．５）を用いて室温で少なくとも３時間または４℃で一晩コーティングした。この溶液を取り除き、少なくとも１５０μｌのブロッキング緩衝液（１０％  ＮＦＤＭ（無脂肪粉ミルク）／ＰＢＳおよびＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）の１：１混合物）を各ウェルに添加し、そして室温で３時間かまたは４℃で一晩インキュベートした。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０含有ＰＢＳを用いて少なくとも３回洗浄し、そしてＰＢＳを用いて一回洗浄した後、前立腺癌患者または正常な提供者に由来する５０μｌの血清を、１０％  ＮＧＳ（正常ヤギ血清；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，番号１６２１０−０７２）含有ＰＢＳを用いて希釈し、添加し、そして室温で３時間または４℃で一晩インキュベートした。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳを用いて少なくとも３回洗浄し、そしてＰＢＳを用いて一回洗浄した後、１００μｌのＨＲＰ結合体化抗−ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．；番号７０９−０３６−１４９）（１０％ＮＦＤＭ／ＰＢＳ＋Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋの１：１混合物により８０００倍に希釈）を添加し、そして室温で３０分〜６０分間インキュベートした。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳを用いて少なくとも６回洗浄し、そしてＰＢＳを用いて一回洗浄した後、８０μｌ〜１００μｌのＴＭＢ基質溶液を添加し、そして室温でインキュベートした。１０分〜３０分間の間に基準となるＩｇＧに対する適切な着色を得た後、４０μｌ〜５０μｌ（基質の半分の容量）の０．１Ｎ硫酸溶液を、添加し酵素反応を停止した。次いで吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて決定した。
【１２２７】
このアプローチを使用して、Ｐ５０１Ｓ特異的抗体を、３２／５５人の前立腺癌患者および５／１３人の正常な提供者に検出した。Ｐ７０３特異的抗体を、２４／５５人の前立腺癌患者および０／１３人の正常な提供者に検出した。この結果は、Ｐ５０１ＳおよびＰ７０３Ｐのインビボでの免疫原性を確認する。さらに、この結果は、Ｐ５０１ＳおよびＰ７０３Ｐのカルボキシアミド化形態が、ウサギ／マウス抗体、および前立腺癌患者に由来する抗体によって認識されるエピトープを保持することを示す。
【１２２８】
（実施例４１）
（Ｐ７１１Ｐに対するモノクローナル抗体の作製）
Ｐ７１１Ｐ（配列番号３８２（配列番号３８３のタンパク質をコードする））の同定および特徴付けを、上に記載する（例えば、実施例３）。抗体作製のために使用するＰ７１１Ｐタンパク質の作製および精製のために、組換えＰ７１１Ｐタンパク質を発現するＥ．ｃｏｌｉを、振盪インキュベーターにおいて３７℃で適切な抗生物質を含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ培地中で一晩増殖させた。翌朝、１０ｍｌの一晩の培養物を、２Ｌ−バッフルＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中適切な抗生物質を加えた５００ｍｌの２×ＹＴへ添加した。培養物の吸光度（５６０ｎｍにおける）が、０．４〜０．６に達した場合、この細胞をＩＰＴＧ（１ｍＭ）を用いて誘導した。ＩＰＴＧと共に４時間インキュベーションした後、この細胞を、遠心分離により回収した。次いでこの細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水を用いて洗浄し、再び遠心分離した。この上清を捨て、細胞を後の使用にために凍結するかまたは直ちに処理した。２０ｍｌの溶解緩衝液を細胞ペレットへ添加し、そしてこの懸濁液をボルテックスした。次いでＥ．ｃｏｌｉ細胞を破壊して開くために、この混合物を１６，０００  ｐｓｉの圧力でＦｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓを通過させた。次いでこの細胞を再び遠心分離し、そして上清およびペレットを、組換えタンパク質の区画についてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって調べた。細胞ペレットへ局在化したタンパク質については、このペレットを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ８．０）、１％  ＣＨＡＰＳに再懸濁し、そして封入体ペレットを洗浄して、そして再び遠心分離した。この手順を、二回以上繰り返した。洗浄した封入体ペレットを、１０ｍＭ  イミダゾールを添加した１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ８．０）を含有する８Ｍ尿素または６ＭグアニジンＨＣｌのいずれかを用いて可溶化した。この可溶化したタンパク質を、５ｍｌのニッケル−キレート樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）に添加し、そして持続的な撹拌を伴って室温で４５分間〜１時間インキュベートした。インキュベーションした後、この樹脂およびタンパク質の混合物を、使い捨てのカラムへ通し、この流出物を回収した。次いでこのカラムを、１０〜２０カラム容量の可溶化緩衝液を用いて洗浄した。次いで抗原を、８Ｍ尿素、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ８．０）および３００ｍＭのイミダゾールを使用してカラムから溶出し、３ｍｌの画分に回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを行いさらなる精製のためにプールするための画分を決定した。
【１２２９】
最終の精製工程の際に、強アニオン交換樹脂（例えば、Ｈｉ−Ｐｒｅｐ  Ｑ（Ｂｉｏｒａｄ））を、適切な緩衝液を用いて平衡化し、上記由来のプールした画分をカラムへローディングした。各抗原を、塩勾配を増加させるにつれてカラムから溶出した。カラムを実施した、画分を回収し、そして別のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを行い、このカラムに由来するプールするための画分を決定した。プールした画分を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ８．０）に対して透析した。次いでこの物質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＨＰＬＣによって決定する純度、Ｌｏｗｒｙアッセイまたはアミノ酸分析によって決定する濃度、アミノ末端タンパク質配列によって決定される同一性およびＬｉｍｕｌｕｓ（ＬＡＬ）アッセイによって決定する内毒素レベルについて調べた。次いでタンパク質を、０．２２−ミクロンフィルターを通して濾過した後、ガラス瓶に入れ、抗原を免疫化に必要になるまで凍結した。
【１２３０】
抗−Ｐ７１１Ｐマウスモノクローナル抗体を生成するために、エマルジョンを形成するように等量の完全フロイトアジュバント（ＣＦＡ）と混合した５０μｇの組換えＰ７１１Ｐタンパク質を用いてマウスに腹腔内（ｉ．ｐ）に免疫化した。３週間おきに動物へ、エマルジョンを形成するために等量のＩＦＡと混合した５０μｇの組換えＰ７１１Ｐタンパク質を注射（ｉ．ｐ）した。４回の注射の後、脾臓を単離し、標準的なハイブリドーマ融合手順を使用して、抗−Ｐ７１１Ｐマウスモノクローナル抗体を作製した。
【１２３１】
抗−Ｐ７１１Ｐマウスモノクローナル抗体を、細菌に発現させた組換えＰ７１１Ｐタンパク質を使用してＥＬＩＳＡ分析によってスクリーニングした。ＥＬＩＳＡによる抗−Ｐ７１１Ｐマウスモノクローナル抗体の特徴付けのために、９６ウェルプレートを、４℃で２０時間、５０μｌ（代表的に約１μｇ）とともに、インキュベートすることによってＰ７１１Ｐ抗原でコーティングした。２５０μｌのＢＳＡブロッキング緩衝液を、ウェルに添加し、室温で２時間、インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ／０．０１％  ＴＷＥＥＮを用いて６回洗浄した。５０μｌのそれぞれ希釈していないモノクローナルの上清を、ウェルごとに添加し、室温で３０分間、インキュベートした。１００００分の１希釈ヤギ抗−マウスホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を５０μｌ添加し、室温で３０分間インキュベートした後、プレートを上記のように洗浄した。プレートを上記のように洗浄し、そして１００μｌのＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを各ウェルに添加した。続いて室温で、暗所にて１５分間インキュベートし、比色定量反応を、１００μｌの１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を用いて停止し、４５０ｎｍで直ちに読み取った。ウエスタンブロット分析のために、組換えＰ７１１Ｐタンパク質を、β−メルカプトエタノールを含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液を用いて希釈し、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをローティングする前に１０分間煮沸した。タンパク質を、ニトロセルロースへ転移させ、抗Ｐ７１１Ｐハイブリドーマ上清のそれぞれを用いてプローブした。抗−マウス−ＨＲＰを使用してＥＣＬ基質中でインキュベートすることによって抗−Ｐ７１１Ｐ反応バンドを視覚化した。このアプローチによって、少なくとも７個の抗−Ｐ７１１Ｐモノクローナル抗体を作製し、ＥＬＩＳＡおよび／またはウエスタン分析によって組換えＰ７１１タンパク質との反応を示した。
【１２３２】
（実施例４２）
（Ｐ５０１Ｓ−特異的Ｔ細胞によるカルバミドメチル化ＣＴＬエピトープの識別）
前立腺特異的抗原Ｐ５０１Ｓの同定および特徴付けを、上に記載し、それに対する代表的な全長ＤＮＡ配列を、配列番号１１３に示したアミノ酸配列をコードする配列番号１１０に示した。Ｐ５０１Ｓのペプチド（ペプチド３７０−３７８、アミノ酸配列ＣＬＳＨＳＶＡＶＶ）に特異的なＣＴＬを、Ｐ５０１Ｓ形質転換標的細胞の識別によって示されるように天然にプロセシングされたＰ５０１Ｓを識別するために事前に提示した。本実施例において、マウスを、Ｐ５０１Ｓ  ＤＮＡを用いて免疫化し、１４日後Ｐ５０１Ｓ−含有アデノウイルス送達ベクターを使用して第二の免疫化を行った。３５日目に脾臓細胞を回収し、放射線照射したジャーカットＡ２ｋｂ−Ｐ５０１細胞を使用して毎週インビトロで刺激した。ＣＴＬ株を、親のジャーカットＡ２Ｋｂ細胞、Ｐ５０１Ｓを用いて形質転換したジャーカットＡ２Ｋｂ細胞、ｐ３７０−３７８を用いてパルスしたジャーカットＡ２Ｋｂ細胞、またはカルボキシアミド化ｐ３７０−３７８ペプチドを用いてパルスしたジャーカットＡ２ＫｂＴ細胞に対する溶解活性についてアッセイした。このアプローチを使用して、ｐ３７０−３７８特異的Ｔ細胞が、合成非改変３７０−３７８ペプチドだけでなく、３７０−３７８のカルバミドメチル化形態も認識することを見出した。これらの結果は、天然にプロセシングされたＰ５０１、アミノ酸３７０−３７８に対応する非改変合成ペプチド、Ｐ５０１Ｓ、および改変合成ペプチド３７０−３７８の交叉認識を示すために重要である。従って、組換えＰ５０１Ｓのカルバミドメチル化は、このＣＴＬエピトープのＴ細胞の認識を損なわない。
【１２３３】
（実施例４３）
（Ｐ５０１Ｓ融合タンパク質の調製）
前立腺特異的抗原Ｐ５０１Ｓの同定および特徴付けを、上に記載し、それに対する代表的な全長ＤＮＡ配列を、配列番号１１３に示すアミノ酸配列をコードする配列番号１１０に示す。本実施例において、例証的なＰ５０１Ｓ融合構築物を作製し、そしてコードされた融合タンパク質を製造した。配列特異的プライマーを使用して、Ｐ５０１ＳのＣ末端を切断した領域（アミノ酸３４１−５２７）を、以下の条件を用いてＰＣＲ増幅した。
【１２３４】
１０μｌ  １０×Ｐｆｕ緩衝液
１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
２μｌ  １０μＭ  各オリゴ
８３μｌ  滅菌水
１．５μｌ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）
５０ｎｇ  ＤＮＡ
９６℃  ２分間
９６℃  ３０秒間      ７２℃  １分３０秒間  ×４０サイクル
７２℃  ４分間。
【１２３５】
生じたＰＣＲ産物を、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩを用いて消化し、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩを用いてまた消化した市販のベクターｐＥＴ３２（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）へクローン化した。ｐＥＴ３２ベクターは、チオレドキシンであるＴｒｘ抗原と融合したＮ末端を組込み、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質は、抗原を発現することが困難である発現を増強し得、かつ生じた融合タンパク質の可溶性をさらに増強し得る。このＴｒｘ−Ｐ５０１Ｓ融合構築物のコーディング領域についての生じたｃＤＮＡ配列を、配列番号１０１１に示す融合アミノ酸配列をコードする配列番号１０１０に示す。
【１２３６】
（実施例４４）
（Ｐ５０１Ｓ免疫原性の評価）
前立腺特異的抗原Ｐ５０１Ｓの同定および特徴付けを、上に記載し、それに対する代表的な全長ＤＮＡ配列を、配列番号１１３に示すアミノ酸配列をコードする配列番号１１０に示す。本実施例は、ＤＮＡ／アデノウイルスＰ５０１Ｓ免疫化と比較し、種々のアジュバントと組み合わせたＰ５０１Ｓタンパク質（非改変かカルボキシアミド化のいずれか）を用いたワクチン接種を評価する前臨床のインビボでの免疫原性の研究の結果を記載する。以下の実験設計を使用した。
【１２３７】
【表１３】
2006515749.tif 000015
続いてアッセイを、ＣＴＬ応答、抗体応答およびＣＤ４応答（インターフェロン−γおよび増殖）を調べるために実施した。この評価の結果は、アジュバント中に送達された非改変Ｐ５０１Ｓタンパク質およびカルボキシアミド化Ｐ５０１Ｓタンパク質の両者が、抗体応答およびＣＤ４  Ｔ細胞応答によって評価するように免疫原性であるということを示した。タンパク質投与により観察されたＣＤ４応答および抗体応答は、一般に、ＤＮＡ／アデノウイルス免疫化により観察された応答よりも強かった。ＣＴＬ応答は、続く試験したアジュバント系におけるタンパク質免疫化を検出しなかった。しかし、ＣＴＬを、Ｐ５０１Ｓアデノウイルス免疫化の後、常に検出可能であった。この抗体応答およびＣＤ４応答は、非改変Ｐ５０１Ｓおよびカルボキシアミド化により改変したＰ５０１Ｓの両方を識別した。種々のアジュバント系を用いて得られた反応の比較評価は、免疫原性の影響がほとんどないことを示した（ＡＳ７が、より強いＴｈ１応答を生じたことを除く）。
【１２３８】
（実施例４５）
（Ｐ５０１Ｓの天然にプロセシングされたＣＴＬエピトープの同定）
前立腺特異的抗原Ｐ５０１Ｓの同定および特徴付けを上に記載し、代表的な全長ＤＮＡ配列を、配列番号１１３に示すアミノ酸をコードする配列番号１１０に示す。本実施例において、天然にプロセシングされたマウスＡ２Ｋｂ  ＣＴＬエピトープを、Ｐ５０１Ｓについて同定した。このエピトープを、一連のＣ末端欠失構築物、Ｐ５０１Ｓの末端の９２個のアミノ酸を含有するＣ末端サブクローン、および目的のＰ５０１Ｓ領域に及ぶペプチドのセットを使用してマッピングした。エピトープをマッピングするために使用したＴ細胞クローンは、Ｐ５０１Ｓ  ＤＮＡ免疫化Ｃ５７ＢＬ／６  Ａ２ＫｂトランスジェニックマウスおよびＰ５０１Ｓ−アデノウイルス免疫化Ｃ５７ＢＬ／６  Ａ２Ｋｂトランスジェニックマウスに由来する脾細胞の限界希釈に由来した。３７個のＴ細胞クローンを、ＣＴＬアッセイにおいてＰ５０１Ｓ−形質転換ジャーカットＡ２Ｋｂ標的に対して反応性であるとして同定した。しかし、この株は、配列番号１１３のアミノ酸残基３７０〜３７８に対応する事前に同定された天然にプロセシングされたＰ５０１Ｓエピトープをパルスしたジャーカット  Ａ２Ｋｂ細胞に対して反応性ではなかった。この観察は、アミノ酸残基３７０〜３７８の９ｍｅｒのエピトープ以外の第二のエピトープの存在を示した。従って、このＴ細胞クローンを、Ｆｒａｇ  Ａ−Ｆｒａｇ  Ｅで表示されるＣ末端欠失構築物を用いて形質転換させたジャーカットＡ２Ｋｂ細胞を用いて試験した。Ｔ細胞クローンで、これら欠失構築物に対してＣＴＬ応答を生じるものはなく、このことはエピトープがＰ５０１ＳのＣ末端の９２個のアミノ酸（４６１−５５３）内にマッピングされるようであることを示す。６個のＴ細胞クローンを、Ｐ５０１Ｓアミノ酸残基４６２〜５５３または４６２〜５１７を発現するジャーカットＡ２Ｋｂクローンに対して反応性であること示した。マウスＥＬＩＳＰＯＴアッセイ使用して、これら形質転換した標的およびジャーカットＡ２Ｋｂ標的を、種々の２０−マーペプチド、１５−マーペプチド、１０−マーペプチドおよび９−マーペプチドによりパルスし、配列ＳＡＣＤＶＳＶＲＶを有し、かつ配列番号１１３のアミノ酸残基４６４〜４７２に対応する、天然にプロセシングされたＰ５０１Ｓについてのエピトープの同定を可能にした。
【１２３９】
（実施例４６）
（Ｐ７９０Ｐ発現の特徴づけ）
前立腺抗原Ｐ７９０Ｐの同定を上記に示した。これは、配列番号５２６で示される全長ｃＤＮＡ配列であり、配列番号５２７で示されるアミノ酸配列をコードする。哺乳動物細胞における組み換え体発現のため、Ｐ７９０Ｐを、ｐＣＥＰ４およびＶＲ１０１３（ポリリンカーで改変したＶＲ１０１２ベクター）哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした。この構築物を、リポフェクタミン２０００（Ｇｉｂｃｏ）を用いてＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）にトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３細胞は、６ウェルディッシュに、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）含有ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中３００，０００細胞／ｍｌの密度で配置し、６〜８時間インキュベートした。次いで、１μｇのＤＮＡを、１００μｌの、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭに添加し、そして３μｌのリポフェクタミン２０００を、１００μｌの、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭに添加した。両方を室温で５分間インキュベートした。リポフェクタミン／ＤＭＥＭ混合物を、ＤＮＡ／ＤＭＥＭ混合物に添加し、室温で１５分間インキュベートした。次いで、このリポフェクタミン２０００／ＤＮＡ混合物をＨＥＫ２９３細胞に添加し、３７℃で、７％ＣＯ２を用いて、４８〜７２時間インキュベートした。細胞を、回収し、遠心によってペレット化して、ＰＢＳで２回洗浄した。
【１２４０】
ウェスタンブロット分析のため、サンプルをβメルカプトエタノールを含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液中に直接的に希釈することによって、全細胞溶解物を生成し、次いでこれを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにローディングする前に、７０℃で１０分間インキュベートした。タンパク質を、ニトロセルロース上に移し、１０μｇ／ｍｌの濃度でマウス抗ＦＬＡＧ抗体（Ｋｏｄａｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｃａｔ番号；ＩＢ１３０２６）を用いて探索した。ブロットを、ヤギ抗マウスＨＲＰによって検出し、続いてＥＣＬ基質中でインキュベートした。同一のブロットを、１／１０００で抗Ｐ７９０ペプチド血清（３−１３−２００１，３８７５Ｌ）を用いて探索した。このブロットを、ヤギ抗ウサギＨＲＰによって検出し、続いてＥＣＬ基質中でインキュベートした。このアプローチを用いて、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞において、抗ＦＬＡＧポリクローナル抗体を用いて組み換えＰ７９０Ｐタンパク質の発現を検出した。
【１２４１】
（実施例４７）
（前立腺の腺腫様過形成におけるＰ５０４Ｓの発現）
この実施例は、前立腺抗原Ｐ５０４ＳおよびＰ５０４Ｓに特異的な抗体が、前立腺癌の検出、加えて前立腺癌由来の異型腺腫様過形成（ＡＡＨ）の鑑別に有用な、重要な診断試薬を、どのように表すかを記載する。前立腺のＡＡＨは、腺疾患として公知であり、前立腺の腺上皮における、顕著な細胞異型性のない、異常な構築パターンによって特徴づけられる。前立腺癌由来のＡＡＨを区別することは、しばしば困難である。加えて、ＡＡＨは、前立腺腺癌の前駆型病変である。Ｐ５０４Ｓ（配列番号１０７および１０８に開示されるＤＮＡ配列およびアミノ酸配列）は、発明者らが、以前に前立腺腺癌において高度に過剰発現されることを示したタンパク質であり、したがって、前立腺癌の優れたマーカーを表現する。
【１２４２】
本明細書において、発明者らは、免疫組織化学を使用し、多くの異なる前立腺サンプルにおけるＰ５０４Ｓの発現プロファイルを決定する。全部で８０サンプルを検査した。このサンプルは４０症例のＡＡＨ（前立腺切除：ｎ＝３０、生検：ｎ＝６、および経尿道切除：ｎ＝４）、２０症例の前立腺腺癌、ならびに２０症例の良性の前立腺過形成（ＢＰＨ）を含む。Ｐ５０４Ｓおよび基底細胞特異的マーカー３４βＥ１２についての免疫組織化学を、全サンプルで行った
３４βＥ１２染色は、ＡＡＨの４０症例全てにおいて、斑状の基底細胞の存在を確認した。Ｐ５０４Ｓ染色は、前立腺癌の２０／２０、およびＡＡＨの４０症例中６症例（１５％）において、濃い細胞質の顆粒状の染色を示した。癌に隣接するかもしくはＡＡＨに隣接するＢＰＨもしくは良性の前立腺は、Ｐ５０４Ｓについて陽性ではなかった。前立腺癌サンプルにおいて、Ｐ５０４Ｓの散在性染色パターンを見出した一方、ＡＡＨの陽性症例においては、限局性の陽性を見た。
【１２４３】
これらの所見は、前立腺腺癌からＡＡＨを区別することにおいて、３４βＥ１２およびＰ５０４Ｓを用いた組み合わせ染色が強力な診断上の価値を有することを示し、したがってさらに、例えば本明細書に記載される任意の種々の例示した診断実施例および治療実施例において、Ｐ５０４Ｓの使用が有効であることを確認する。
【１２４４】
（実施例４８）
（例証的Ｐ７０３Ｐ融合タンパク質の生成）
前立腺特異的抗原Ｐ７０３Ｐの関連する形態の同定および特徴づけを上に記載した。その一つの代表的ＤＮＡ配列は、配列番号１７１で示され、配列番号１７２でコードされるアミノ酸配列をコードする。この実施例では、例証的Ｐ７０３Ｐ有効構築体を作製し、そしてそのコードする融合タンパク質を生成した。この組み換え融合タンパク質は、例えば、前立腺癌の予防および／または処置のため、前立腺癌の検出のための診断法において使用され得、かつ／または被験体の免疫応答を誘発するために使用され得る。
【１２４５】
全長ヒトＰＡＰ  ＤＮＡを、前立腺癌組織ｃＤＮＡライブラリー（ＰＴライブラリー）から、プライマーｈＰＡＰＦ１およびｈＰＡＰＲＶ１を用いてＰＣＲによって得た。これらのプライマーの配列は、ｈＰＡＰＦ１
【１２４６】
【化１】
2006515749.tif 000016
およびｈＰＡＰＲＶ１
【１２４７】
【化２】
2006515749.tif 000017
である。
【１２４８】
次いで、ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  ＢｌｕｎｔＩＩ  ＴＯＰＯベクターにクローニングした。ｈＰＡＰを改変するため、プライマーＦＯＰＰ２Ｆ１
【１２４９】
【化３】
2006515749.tif 000018
およびＨＰＡＰＲＶ１（配列番号１０１５）によって、鋳型としてｈＰＡＰ／ＴＯＰＯ  ＢｌｕｎｔＩＩを用いて、第二のＰＣＲを行った。
【１２５０】
ＦＯＰＰ／ＰＣＲＸ１（Ｐ７０３Ｐ含有ＤＮＡ）をまた、プライマーＦＯＰＰＦ１
【１２５１】
【化４】
2006515749.tif 000019
およびＦＯＰＰ２ＲＶ１
【１２５２】
【化５】
2006515749.tif 000020
を用いて改変した。
【１２５３】
最後に、プライマーＦＯＰＰＦ１およびｈＰＡＰＲＶ１、そして鋳型として、改変されたｈＰＡＰおよびＰ７０３Ｐ  ＰＣＲ産物を用いて、ＰＣＲを行い、ＦＯＰＰ２を生成した。次いで、このＰＣＲ産物を、制限酵素切断部位ＮｄｅＩおよびＸｈｏ１で、ＰＣＲＸ１ベクターにクローニングした。次いで、ＦＯＰＰ２／ＰＣＲＸ１プラスミドを使用してＥ．ｃｏｌｉ株Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓ  Ｓを形質転換し、カナマイシンおよびクロラムフェニコール（ｃｈｌｏａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）を含有するＬＢプレートにプレートアウトした。Ｈｉｓ−タグに対する抗体によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびウェスタンブロット分析を用いて、発現がＩＰＴＧを用いて誘導される場合、形質転換体がＦＯＰＰ２タンパク質を発現していることを示した。
【１２５４】
大量のＦＯＰＰ２タンパク質を生成するため、発現クローン培養物を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（ｃｈｌｏａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）を含有する２０ｍＬのＳＴＢ中に播種し、３７℃で、ＯＤ６００を約１と読み取るまで増殖させた。次いで、この培養物を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（ｃｈｌｏａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）を含有する１リットルのＳＴＢ中に希釈し、３７℃で、ＯＤ６００を約０．４と読み取るまで増殖させた。次いで、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭまで添加し、この培養物を、３７℃で２時間インキュベートした。この細胞を、５０００ＲＰＭで８分間遠心し、ＰＢＳで洗浄し、再遠心して、−７０℃で保存した。
【１２５５】
タンパク質を精製するため、細胞ペレットを、２５ｍｌの、２ｍＭ  ＰＭＳＦおよびプロテアーゼインヒビターを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で再懸濁した。この細胞を数分超音波処理し、この溶解液を、４０００ＲＰＭで６０分間遠心した。封入対を含む沈殿物を、１％ＣＨＡＰＳを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で２回洗浄した。封入体を、４０ｍｌの結合緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭリン酸ナトリウム、および８Ｍ尿素）に溶解した。この溶液を、１０ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）と、室温で３０分間混合した。次いで、この混合物を、２５ｍｌカラムに注ぎ、５０ｍｌの洗浄緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ６．３、１００ｍＭリン酸ナトリウム、０．５％  ＤＯＣ、および８Ｍ尿素）で洗浄した。次いで、結合したタンパク質を、溶出緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、３５０ｍＭイミダゾール、１００ｍＭリン酸ナトリウム、および８Ｍ尿素）を用いて溶出した。ＦＯＰＰ２を含む画分を混合し、大容量のＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０を用いて大規模に透析し、分取し、そして−７０℃で保存した。ＦＯＰＰ２配列を確認し、そのＤＮＡおよびアミノ酸配列を、配列番号１０１９および１０２０にそれぞれ開示した。
【１２５６】
（実施例４９）
（Ｅ．Ｃｏｌｉにおける、前立腺抗原Ｐ５０１Ｓの発現）
この実施例は、例えば免疫診断用途および免疫治療用途に有用な、Ｐ５０１Ｓポリペプチドの組み換え体の生成を開示する。前立腺特異的抗原Ｐ５０１Ｓの同定および特徴づけは、上述した。その代表的な全長ＤＮＡ配列は、配列番号１１０で示され、配列番号１１３で示されるアミノ酸配列をコードする。この実施例は、Ｎ末端ヒスチジンタグおよびＴＡＴ（二連アルギニン輸送体（ｔｗｉｎ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ））シグナルペプチド融合を組み合わせたＥ．ｃｏｌｉ発現系を用いた、組み換えＰ５０１Ｓ  Ｃ（アミノ酸２５７〜５５３に対応）抗原およびＰ５０１Ｓ  Ｄ（アミノ酸３１６〜５５３に対応）抗原の発現を記載する。
【１２５７】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける、Ｐ５０１Ｓ  Ｃの発現：
Ｐ５０１Ｓ  Ｃコード領域を、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
【１２５８】
【化６】
2006515749.tif 000021
Ｅ．ｃｏｌｉにおける、Ｐ５０１Ｓ  Ｄの発現：
Ｐ５０１Ｓ  Ｄコード領域を、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
【１２５９】
【化７】
2006515749.tif 000022
以下の反応成分を用いてＰＣＲを行った：
１０×Ｐｆｕ緩衝液      １０μｌ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ      １μｌ
１０μＭの各プライマー      ２μｌ
滅菌水      ８３μｌ
Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）      １．５μｌ
ＤＮＡ      ５０ｎｇ
以下の反応条件を用いてＰＣＲ増幅を行った：
９６℃  ２分間、続いて以下：
９６℃  ２０秒間；
６７℃  １５秒間；
７２℃  ２分間、
を４０サイクル、続いて最後の伸長工程：
７２℃  ４分間。
【１２６０】
このＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化し、そしてＥｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩで、ｐＰＤＭおよびｐＴＡＴ（ＴＡＴシグナルペプチドリーダーを用いたｐＰＤＭ）中にクローニングした。配列分析を通じて構築体が適切であることを確認し、ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓ  Ｓ細胞、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓ  Ｓ細胞、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）細胞、およびＲｏｓｅｔｔａ  （ＤＥ３）ｐＬｙｓ  Ｓ細胞に形質転換して、タンパク質発現を確認した。Ｐ５０１Ｓ  Ｃ−Ｈｉｓ構築体についてのアミノ酸配列を確認した。これを配列番号１０２９に開示し、一緒に対応するＤＮＡ配列を配列番号１０２７に開示する。Ｐ５０１Ｓ  Ｄ−Ｈｉｓ構築体についてのアミノ酸配列を確認した。これを配列番号１０２８に開示し、一緒に対応するＤＮＡ配列を配列番号１０２６に開示する。これらの組み換えＰ５０１Ｓポリペプチドは、例えば、本明細書に記載されるような免疫診断実施形態および／または免疫治療実施形態に使用され得る。
【１２６１】
（実施例５０）
（悪性新生物における前立腺抗原Ｐ５０４Ｓの発現）
この実施例は、前立腺抗原Ｐ５０４ＳおよびＰ５０４Ｓに特異的な抗体が、種々の型の腫瘍の検出に有用な重要な治療試薬および診断試薬をどのように表現するのかを記載する。Ｐ５０４Ｓ（そのＤＮＡおよびアミノ酸配列は、配列番号１０７および１０８に開示される）は、発明者らが以前に、前立腺腺癌において高度に過剰発現されることを示したタンパク質であり、したがって、前立腺癌の優れたマーカーを表現する。本明細書では、免疫組織化学を使用し、類上皮成分を有する悪性新生物の５１５の症例において、Ｐ５０４Ｓの発現プロファイルを決定した。組織切片を、抗Ｐ５０４Ｓ抗体１３Ｈ４（その作製については実施例１８に記載される）で染色した。肝細胞癌の８１％（１７／２１）、結腸直腸癌の８０％（２０／２５）、腎細胞癌の７５％（１８／２４）、尿路上皮性癌の３１％（９／２９）、および胃癌の２７％（４／１５）が、Ｐ５０４Ｓについて染色陽性であった。Ｐ５０４Ｓについてほとんど染色陽性でないのは、肺癌、乳癌、膵臓癌、胆管癌、副腎癌、および唾液腺癌であった。卵巣癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、黒色腫、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、軟組織腫瘍（類上皮（ｅｐｉｔｈｅｌｏｉｄ）肉腫および滑膜肉腫を含む）、胸腺腫（ｔｈｍｏｍａ）および生殖細胞腫瘍は、Ｐ５０４Ｓについて一貫して陰性であった。
【１２６２】
これらの所見は、Ｐ５０４Ｓの過剰発現を示すさらなる腫瘍型を同定し、さらに、本明細書に記載される任意の種々の例示した診断実施例および治療実施例において、Ｐ５０４Ｓの使用が有効であることを確認する。
【１２６３】
（実施例５１）
（前立腺抗原Ｐ７０４Ｐ、Ｐ７１２ＰおよびＰ７７５Ｐについての伸長されたｃＤＮＡ配列）
この実施例は、前立腺抗原Ｐ７０４Ｐ、Ｐ７１２ＰおよびＰ７７５ＰについてのさらなるｃＤＮＡ配列を記載する。前立腺抗原Ｐ７０４Ｐ、Ｐ７１２ＰおよびＰ７７５Ｐに特異的な部分配列を、前立腺腫瘍ライブラリーに対して、コロニーハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ、加えてバイオインフォマティクス法を用いてスクリーニングし、これらの抗原各々についてのさらなる配列の同定を導いた。
【１２６４】
前立腺抗原Ｐ７０４Ｐについての配列を、既に配列番号６７、４０２、および６９９〜７０１に提供した。本明細書においては、Ｐ７０４Ｓについてのさらなる伸長されたｃＤＮＡ配列が提供され、これは、配列番号１０３６に開示される。
【１２６５】
前立腺抗原Ｐ７１２Ｐについての配列を、既に配列番号３０８、３９７、および５５２に提供した。これは、配列番号５５３〜５６８に開示される配列番号に対応する。本明細書においては、Ｐ７１２Ｓについてのさらなる伸長されたｃＤＮＡ配列が提供され、これは、配列番号１０３４に開示される。
【１２６６】
前立腺抗原Ｐ７７５Ｐについての配列を、既に配列番号３１１、４７３〜４７６、５５３および５９３〜５９７に提供した。これは、配列番号４７７〜４８３および９５７〜９６６に開示される配列番号に対応する。本明細書においては、Ｐ７１２Ｓについてのさらなる伸長されたｃＤＮＡ配列が提供され、これは、配列番号１０３５に開示される。
【１２６７】
以前に同定された、前立腺癌におけるＰ７０４Ｐ、Ｐ７１２ＰおよびＰ７７５Ｐの過剰発現を考慮すると、これらのさらなる伸長された配列はまた、前立腺癌の検出および／または治療に有用な、重要な試薬を表現する。
【１２６８】
（実施例５２）
（多エピトープワクチン免疫化のための、３つの重複するクラスＩエピトープを含むＰ５０１Ｓミニ遺伝子の同定）
前立腺特異的抗原Ｐ５０１Ｓの同定および特徴づけは、先に記載された。これは、配列番号１１０で示される代表的全長ＤＮＡ配列であり、配列番号１１３で示されるアミノ酸配列をコードする。ｃＤＮＡマイクロアレイ、定量リアルタイムＰＣＲおよび免疫組織化学分析を含むＰ５０１Ｓの大規模分析（上記実施例に記載される）は、Ｐ５０１Ｓが、正常前立腺、良性前立腺過形成、ならびに原発性および続発性前立腺腫瘍でほぼ排他的に発現されることを示した。
【１２６９】
この実施例は、少なくとも３つのクラスＩ対立遺伝子に関する天然にプロセシングされたエピトープを含む、Ｐ５０１Ｓに由来する低分子の１１アミノ酸フラグメントの同定を記載する。このペプチドは、Ｐ５０１Ｓ（配列番号１１３）のアミノ酸４６３〜４７３に対応し、配列ＡＳＡＣＤＶＳＶＲＷ（配列番号１０３７、これは配列番号１０３８に開示される対応するポリヌクレオチド配列を有する）に対応する。この配列は、先の６つの異なるＣＤ８＋  Ｔ細胞エピトープの同定に由来する配列である。実施例９は、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０５０１制限エピトープ、ＳＡＣＤＶＳＶＲＷ（配列番号９７８）およびＡＣＤＶＳＶＲＷ（配列番号１０１２）の同定を記載した。実施例１２は、ＨＬＡ−Ｂ＊５１０１１制限エピトープ、ＡＳＡＣＤＶＳＶＲＶ（配列番号８５５）およびＳＡＣＤＶＳＶＲＶ（配列番号８５８）の同定を記載した。実施例４８は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限エピトープ、ＡＳＡＣＤＶＳＶＲＶおよびＳＡＣＤＶＳＶＲＶの同定を記載した。
【１２７０】
ヒトインビボ系において同定されたＨＬＡ−Ｂ＊５１０１１エピトープおよびＨＬＡ−Ｃｗ＊０５０１エピトープの潜在的交差反応性を調べるため、ｄ３１０  Ｂ−ＬＣＬ（ＨＬＡ−Ｂ＊５１０１１対立遺伝子およびＨＬＡ−Ｃｗ＊０５０１対立遺伝子の両方を内因性に発現する）を、精製ペプチドＳＡＣＤＶＳＶＲＶ、ＳＡＣＤＶＳＶＲＷ、およびＡＣＤＶＳＶＲＷの各々でパルスし、ＨＬＡ−Ｂ＊５１０１１制限クローン２Ａ２−４Ｅ５およびＨＬＡ−Ｃｗ＊０５０１制限クローン２Ｈ２−１Ａ１２のためのＡＰＣとして用いた。２Ａ２−４Ｅ５クローンは、ＳＡＣＤＶＳＶＲＶペプチドを特異的に認識したが、ＳＡＣＤＶＳＶＲＷペプチドまたはＡＣＤＶＳＶＲＷペプチドを認識しなかった。逆に、そして既に記載されたこのクローンの高度な特異性に一致して、２Ｈ２−１Ａ１２クローンは、ＳＡＣＤＶＳＶＲＷおよびＡＣＤＶＳＶＲＷペプチドの両方を特異的に認識した。しかし、２Ｈ２−１Ａ１２は、ＳＡＣＤＶＳＶＲＶペプチドを認識しなかった。したがって、二つのクローンは、ペプチド認識の交差反応性を示さない。ＭＨＣ：ペプチドレベルで２つのクローン間に交差反応性がないことに関するさらなる証拠は、二つのクローンの各々が、相互に制限する対立遺伝子を発現するＰ５０１Ｓ発現性細胞を認識しないという事実である。実施例４５は、ＨＬＡ−Ａ２ｋｂトランスジェニックマウスを用いた、Ｐ５０１Ｓに由来するＨＬＡ−Ａ２制限エピトープの同定を記載する。このエピトープは、Ｐ５０１Ｓの残基４６４〜４７５を含む。
【１２７１】
したがって、３つの異なるクラス−Ｉ制限エピトープは、Ｐ５０１Ｓの１１アミノ酸領域からプロセシングされる。単一のＴ細胞エピトープが一つ以上のＨＬＡ対立遺伝子によってＴ細胞に提示される現象は、既に記載されている。特に、単一のＭＡＧＥ−Ａ１由来エピトープが、ＨＬＡ−Ｂ＊３５対立遺伝子およびＨＬＡ−Ａ＊１対立遺伝子によってＴ細胞に提示されることが示された（Ｌｕｉｔｅｎら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ５６：７７−８１，２０００）。Ｂ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープクラスター形成は、既に報告されている（Ｂｅｌｌｏｎｅら、１９９５）が、発明者らの知識では、これは、複数のＴ細胞エピトープが、最低限のアミノ酸配列へとクラスター形成されると同定された最初の実例である。３つのエピトープの少なくとも一つは、より低い効率でプロセシングされるように見えるという観察は、エピトープのクラスター形成が、単純に、この領域を優先的にプロセシングする機能ではないことを示唆する。この低分子アミノ酸配列への複数のＴ細胞エピトープのクラスター形成は、Ｐ５０１Ｓのこの領域が、Ｐ５０１Ｓ特異性Ｔ細胞ワクチン接種法の開発に特に有用であることを示す。
【１２７２】
以上より、本明細書において、本発明の特定の実施形態が説明目的で記載されたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の改変が行われ得ることが理解される。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲による限定を除いて、限定されない。
【図面の簡単な説明】
【１２７３】
【図１】図１は、Ｔ細胞の、コントロール線維芽細胞と比較して、代表的な前立腺特異的ポリペプチドＰ５０２Ｓを発現する線維芽細胞を死滅させる能力を示す。溶解百分率を、示したような一連のエフェクター：標的の比として示す。
【図２】図２Ａおよび図２Ｂは、Ｔ細胞の、代表的な前立腺特異的ポリペプチドＰ５０２Ｓを発現する細胞を識別する能力を示す。各場合において、γインターフェロンスポットの数を、種々の数の応答物に対して示す。図２Ａにおいて、データは、コントロールＥ７５ペプチドでパルスした線維芽細胞と比較した、Ｐ２Ｓ−１２ペプチドでパルスした線維芽細胞に対して示す。図２Ｂにおいて、データは、ＨＥＲ−２／ｎｅｕを発現する線維芽細胞と比較して、Ｐ５０２Ｓを発現する線維芽細胞に対して示す。
【図３】図３は、Ｐ５０１Ｓ由来のＰ１Ｓ＃１０ペプチドがＨＬＡ−Ａ２に結合することを示すペプチド競合結合アッセイを示す。ペプチドＰ１Ｓ＃１０は、ＴＮＦ放出バイオアッセイにおけるＣＴＬクローンＤ１５０Ｍ５８に対するｆｌｕＭ５８ペプチドの提示を制限する。
【図４】図４は、Ｐ１Ｓ＃１０免疫化マウスから産生したＴ細胞株の、ＥＧＦＰ形質転換したＪｕｒａｋａｔ  Ａ３Ｋｂと比較して、Ｐ１Ｓ＃１０パルスしたＪｕｋａｔ  Ａ２Ｋｂ標的およびＰ５０１Ｓ形質転換したＪｕｒｋａｔ  Ａ２Ｋｂ標的を特異的に溶解させる能力を示す。溶解百分率は、示されるように、エフェクターの標的に対する一連の比として示す。
【図５】図５は、Ｔ細胞クローンの、代表的な前立腺特異的ポリペプチドＰ５０１Ｓを発現するＪｕｒｋａｔＡ２Ｋｂ細胞を識別し、特異的に溶解する能力を示し、それによって、Ｐ１Ｓ＃１０ペプチドがＰ５０１Ｓポリペプチドの天然にプロセスされたエピトープであり得ることを示す。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、ＣＤ８＋細胞株（３Ａ−１）の、代表的な前立腺特異的抗原（Ｐ５０１Ｓ）に対する特異性を示すグラフである。図６Ａは、５１Ｃｒ放出アッセイの結果を示す。特異的溶解百分率は、示した一連のエフェクター：標的比として示される。図６Ｂは、示した種々のエフェクター：標的比で、Ｐ５０１Ｓで形質転換した自己Ｂ−ＬＣＬで刺激した３Ａ−１細胞によるインターフェロンγの産生を示す。
【図７】図７は、バキュロウイルスにおけるＰ５０１Ｓの発現を示すウエスタンブロットである。
【図８】図８は、Ｐ５０１についてのエピトープマッピング研究の結果を示す。
【図９】図９は、膜貫通ドメインおよび予測される細胞内ドメインおよび細胞外ドメインの位置を示すＰ５０１タンパク質の略図である。
【図１０】図１０は、染色体２２ｑ１１．２のキャットアイ症候群領域内の前立腺遺伝子Ｐ７７５Ｐ、Ｐ７０４Ｐ、Ｂ３０５Ｄ、Ｐ７１２ＰおよびＰ７７４Ｐの位置を示す遺伝子地図である。
【図１１】図１１は、Ｐ５０１Ｓに対して惹起されたウサギポリクローナル抗血清の特異性を決定するためのＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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