(57)【要約】本発明は、輸送タンパク質、特に多種薬物抵抗性関連タンパク質（ＭＲＰ）の活性を測定する簡易な定量的蛍光アッセイ方法に関する。本発明の方法は、透過性支持体上に集密して生育した興味ある輸送タンパク質を発現する分極した細胞のウェル封入培養物で行われ、前記集密細胞培養物は、ウェルの分離した頂端と側底部の区画を形成する。細胞を、一区画の蛍光化合物の細胞透過性非蛍光誘導体（例えばカルセインＡＭ）と接触させ、一定時間のインキュベーション後、反対側の区画から採取したサンプルで検出された蛍光強度によって、細胞で発現された興味ある輸送タンパク質の活性が示される。また、本発明は、興味ある輸送タンパク質の抑制因子及び活性化因子を定性及び定量的に測定する方法、及び分極した細胞における興味ある形質膜結合輸送タンパク質の側底部及び／又は頂端の局在性を評価する方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分極した細胞の側底部又は頂端の形質膜のいずれかに局在する、興味のある輸送タンパク質の活性及び／又は量を測定する方法であって、以下の工程、
（ａ）　透過性支持体上で生育した前記興味のある輸送タンパク質を発現する分極した細胞のウェル封入集密培養物を供給し、前記培養物の前記細胞間の密着結合の形成を確実にし、それによって、前記集密細胞培養物の両側面に分かれた側底部及び頂端の区画を形成する工程、
（ｂ）　前記区画の一つに、蛍光化合物の細胞透過性非蛍光誘導体を添加する工程であって、前記区画の一つが、前記興味のある輸送タンパク質が局在する前記分極した細胞の形質膜の反対側であり、前記誘導体が、細胞内の酵素によって切断され得、前記興味のある輸送タンパク質の基質である蛍光化合物を形成する工程、
（ｃ）　前記非蛍光誘導体の存在下で前記細胞をインキュベートする工程、
（ｄ）　前記非蛍光誘導体が添加される一つの区画の反対側の区画から採取されたサンプルの蛍光強度を測定する工程であって、前記強度が、前記興味のある輸送タンパク質の存在及び活性を示す工程、及び任意に、
（ｅ）　工程（ｄ）で測定された蛍光強度の値に基づいて、かつあらかじめ確立されたキャリブレーションカーブ及び／又は経験的相関に基づいて、前記細胞に存在する前記興味のある輸送タンパク質の活性及び／又は量の測定を計算する工程、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
分極した細胞の側底部又は頂端の形質膜のいずれかに局在する興味のある輸送タンパク質の活性を抑制又は向上させる、興味のあるテスト化合物の能力を測定する方法であって、以下の工程、
（ａ）　透過性支持体上で生育した前記興味のある輸送タンパク質を発現する分極した細胞のウェル封入集密培養物を供給し、前記培養物の前記細胞間の密着結合の形成を確実にし、それによって、前記集密細胞培養物の両側面に分かれた側底部及び頂端の区画を形成する工程、
（ｂ）　前記区画の一つに、蛍光化合物の細胞透過性非蛍光誘導体を添加する工程であって、前記区画の一つが、前記興味のある輸送タンパク質が局在する前記分極した細胞の形質膜の反対側であり、前記誘導体が、細胞内の酵素によって切断され得、前記興味のある輸送タンパク質の基質である蛍光化合物を形成する工程、
（ｃ）　前記非蛍光誘導体の存在下で前記細胞をインキュベートする工程、
（ｄ）　前記非蛍光誘導体が添加される区画の反対側の区画から採取されたサンプルの蛍光強度を測定する工程であって、前記強度が、前記興味のある輸送タンパク質の存在及び活性を示す工程、及び任意に、
（ｅ）　工程（ｄ）で測定された蛍光強度の値に基づいて、かつあらかじめ確立されたキャリブレーションカーブ及び／又は経験的相関に基づいて、前記細胞に存在する前記興味のある輸送タンパク質の活性の測定を計算する工程、
（ｆ）　工程（ａ）で供給された同一の分極した細胞培養物又はそれと本質的に同一の分極した細胞培養物を使用して、工程（ｂ）−（ｅ）を繰り返し、一方、前記興味のあるテスト化合物又は前記細胞内で前記興味のあるテスト化合物から生成された興味のある代謝生成物を、繰り返し行われる工程（ｃ）における前記興味のある輸送タンパク質と接触させることを確実にする工程、及び
（ｇ）　工程（ｄ）及び繰り返し行われた工程（ｄ）で測定された蛍光強度の値を比較する工程、及び／又は工程（ｅ）及び繰り返し行われた工程（ｅ）で計算された活性値を比較する工程、及び前記興味のあるテスト化合物が、前記興味のある輸送タンパク質の活性を抑制又は向上させるかどうかを判定する工程、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項３】
分極した細胞において興味のある形質膜結合輸送タンパク質の側底部及び／又は頂端の局在性を評価する方法であって、以下の工程、
（ａ）　透過性支持体上で生育した前記興味のある輸送タンパク質を発現する分極した細胞のウェル封入集密培養物を供給し、前記培養物の前記細胞間の密着結合の形成を確実にし、それによって、前記集密細胞培養物の両側面に分かれた側底部及び頂端の区画を形成する工程、
（ｂ）　前記頂端及び側底部の区画の両方に、蛍光化合物の細胞透過性非蛍光誘導体を添加する工程であって、前記誘導体が、細胞内の酵素によって切断され得、前記興味のある輸送タンパク質の基質である蛍光化合物を形成する工程、
（ｃ）　前記非蛍光誘導体の存在下で前記細胞をインキュベートする工程、
（ｄ）　両方の区画から採取したサンプルの蛍光強度を測定する工程、
（ｅ）　異なる区画で測定された蛍光強度の値を比較する工程であって、前記比較が、前記興味のある輸送タンパク質の頂端及び／又は側底部の局在を示す工程、及び任意に、
（ｆ）　工程（ｄ）で測定された蛍光強度の値に基づいて、かつあらかじめ確立されたキャリブレーションカーブ及び／又は経験的相関に基づいて、前記細胞に存在する前記興味のある輸送タンパク質のパーセントの頂端及び／又は側底部の局在を計算する工程、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項４】
前記蛍光化合物が、カルセインであって、かつ前記蛍光化合物の非蛍光誘導体が、カルセインの細胞透過性非蛍光誘導体、有利にはカルセインＡＭである、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記分極した細胞が、腎臓細胞であって、有利にはＭＤＣＫ　ＩＩ細胞である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ｃ）のインキュベーションが、約３７℃で約３０分間行われる、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記興味のある輸送タンパク質が、ＡＢＣ輸送体スーパーファミリーのメンバーである、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記興味のある輸送タンパク質が、多種薬物輸送体又は多種薬物輸送体関連タンパク質である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記興味のある輸送タンパク質が、ＭＲＰ１又はＭＰＲである、請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、興味のある輸送タンパク質、特に、多種薬物抵抗性関連タンパク質（ＭＲＰ）の活性を測定する、簡易な定量的蛍光アッセイに関する。
本発明の方法は、透過性支持体上に集密して（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）生育した興味のある輸送タンパク質を発現する分極した細胞のウェル封入培養物で行われ、前記集密細胞培養物は、ウェルの分離した頂端（ａｐｉｃａｌ）の及び側底部（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ）の区画を形成する。細胞を、一区画の蛍光化合物の細胞透過性非蛍光誘導体（例えば、カルセインＡＭ）と接触させ、一定時間のインキュベーション後、反対側の区画から採取されたサンプルで検出された蛍光強度によって、細胞に発現した興味のある輸送タンパク質の活性が示される。
また、本発明は、興味のある輸送タンパク質の抑制因子及び活性化因子の定性及び定量的測定方法、及び分極した細胞の興味のある形質膜結合輸送タンパク質の側底部及び／又は頂端の局在性を評価する方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】
多種薬物抵抗性タンパク質（ＭＤＲ）及び多種薬物抵抗性関連タンパク質、即ちＭＲＰ１及びＭＲＰ２は、ＡＢＣ輸送体スーパーファミリーのメンバーであり、悪性腫瘍に多種薬物抵抗性を生じさせることができる。今までに、少なくとも６種類のＭＲＰ様タンパク質が同定されている。これらのタンパク質の生理学的役割は、毒剤の排除から多様な分泌機能の範囲に渡るであろう。ＭＲＰ１は、様々な組織に広く発現され、一方ＭＲＰ２は、肝細胞及び腎臓の近位尿細管の上皮細胞に優勢に発現する。従って、このような輸送タンパク質を効果的に抑制する新規化合物の同定は、主要な関心事であり、薬物抵抗性タイプの悪性疾患に対してより効果的な化学療法的治療方法を作り上げようと試みられている。また、前記輸送タンパク質の活性化因子の同定は、それらの活性の向上が幾つかの望ましくない生理学的状態の除去を助けるであろうという他の適用に興味をもたれているかもしれない。
ＭＲＰ１は、マイナスにチャージした蛍光化合物、例えば、カルセイン遊離酸を、細胞から追い出すことが以前から明らかにされている（Ｆｅｌｌｅｒら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．３６８、３８５−３８８（１９９５）；Ｈｏｌｌｏら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．３８３、９９−１０４（１９９６））。我々は、この色素は、ＭＲＰ２によっても細胞から迅速に排出されることを近頃発見した。また、このタンパク質ファミリーの他のメンバーがこの化合物を輸送することも可能である。分極した細胞での、これらのタンパク質の分布は、均一ではない。ＭＲＰ１の発現は、側底部表面に限定され、一方ＭＲＰ２は、頂端膜に唯一発現される。
この特徴により、透過性の固体支持体（例えば、多孔性膜）上で生育した分極した細胞の集密培養物で行われる、いわゆる有向（ｖｅｃｔｏｒｉａｌ）輸送アッセイにおいて、これら及び他の同様なタンパク質の機能の評価が可能となる。従来説明されていた有向輸送アッセイ（Ｅｖｅｒｓ，Ｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７、１２１１−１２１８（１９９６））は、ＭＲＰ１及びＭＲＰ２のような輸送タンパク質の局在性と活性を実験的に調査するのに好適であると考えられるが、検出のためにもっぱら放射性標識された基質を使用する一連の欠点を持ち、当然、特別の実験室安全装置及び規制の適用が必要となる。別の欠点は、前述の有向輸送アッセイでは、興味のある細胞内輸送タンパク質の活性を評価するのに使用される一定の標識基質が、使用される集密培養物の細胞が接触している密着結合を通過するかもしれず、従って、輸送されることなく、反対側の区画に到着できるということであり、その結果、興味のある輸送タンパク質の活性の正確な測定に好適な定量的アッセイを開発するのが非常に複雑になる。
【０００３】
従って、本発明の目的は、前述の方法よりもずっと簡単に行え、かつ自動化される簡易な定性及び定量的有向輸送アッセイ方法を提供することにあり、また、細胞貫通放出（分極した細胞の密着結合を通り抜け、それにより、細胞による取り込み及び排出を避けるという輸送ではない）を測定するだけで定量的になされる。本発明の別の目的は、興味のある輸送タンパク質の抑制因子及び活性化因子を同定するアッセイ方法、また側底部及び／又は頂端の形質膜の興味のある輸送タンパク質の局在性を迅速にかつ簡単に評価するアッセイ方法を提供する。
カルセインは、周知の蛍光基質であり（モレキュラープローブス社、ＵＳＡから市販されている）、前記化合物の非蛍光アセトキシメチルエステル誘導体（カルセインＡＭ）は、その疎水性の性質のため、細胞透過性であることが知られる。我々は、ＭＤＲ１、又は細胞からカルセインＡＭを追い出すことができるがカルセイン自体は追い出さない他の輸送タンパク質の活性を評価するのにカルセインＡＭを使用する、既に開発された異なるアッセイの組み合わせ方を持っている（米国特許第５，８７２，０１４号明細書；欧州特許第０，７８４，６９９号明細書）。我々は、カルセイン及びカルセインＡＭ（及び同様の性質の他の化合物）を、ＭＲＰ１、ＭＲＰ２及び細胞からカルセインを効果的に追い出す同様の輸送タンパク質の活性を評価するアッセイ方法を作り上げるのにも使用できることを認識している。
【０００４】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は、透過性支持体（例えば多孔性膜又はコラーゲンマトリックス）上に（形成された密着結合で）密集して生育した興味のある輸送タンパク質を発現し、それによってウェルの分離した頂端と側底部の区画を形成する、分極した細胞のウェル封入培養物で行われる。細胞培養物を、１つの区画で蛍光化合物の細胞透過性非蛍光誘導体（例えばカルセインＡＭ）に接触させ、次にその誘導体が、細胞内に取り込まれて切断され、蛍光化合物（例えばカルセイン）が生成され、その蛍光化合物は、興味のある膜結合輸送タンパク質の基質になる。次に、反対側の区画から採取されたサンプルで検出される蛍光強度によって、細胞から前記蛍光化合物を排出する興味のある膜結合輸送タンパク質の実際の活性が示される（図１参照のこと）。コントロール実験は、ＭＲＰを発現しない同様の培養物で行うことができる。また、本発明は、興味のある輸送タンパク質の局在性、抑制因子及び／又は活性化因子の定性及び定量的測定方法に関する。ある化合物と興味のある輸送タンパク質間の相互作用を測定するために、本発明の方法は、試験される化合物の存在下で行われる。答える問題によって、調べた化合物をセル培養物の頂端又は側底部又は両側いずれかに添加することができる。
【０００５】
従って、本発明は、分極した細胞の側底部又は頂端の形質膜のいずれかに局在する、興味のある輸送タンパク質の活性及び／又は量を測定する方法を提供し、以下の工程、
（ａ）　透過性支持体上で生育した前記興味のある輸送タンパク質を発現する分極した細胞のウェル封入集密培養物を供給し、前記培養物の前記細胞間の密着結合の形成を確実にし、それによって、前記集密細胞培養物の両側面に分かれた側底部及び頂端の区画を形成する工程、
（ｂ）　前記区画の一つに、蛍光化合物の細胞透過性非蛍光誘導体を添加する工程であって、前記区画の一つが、前記興味のある輸送タンパク質が局在する前記分極した細胞の形質膜の反対側であり、前記誘導体が、細胞内の酵素によって切断され得、前記興味のある輸送タンパク質の基質である蛍光化合物を形成する工程、
（ｃ）　前記非蛍光誘導体の存在下で前記細胞をインキュベートする工程、
（ｄ）　前記非蛍光誘導体が添加される区画の反対側の区画から採取されたサンプルの蛍光強度を測定する工程であって、前記強度が、前記興味のある輸送タンパク質の存在及び活性を示す工程、及び任意に、
（ｅ）　工程（ｄ）で測定された蛍光強度の値に基づいて、かつあらかじめ確立されたキャリブレーションカーブ及び／又は経験的相関に基づいて、前記細胞に存在する前記興味のある輸送タンパク質の活性及び／又は量の測定を計算する工程、
を含む。
【０００６】
また、本発明は、分極した細胞の側底部又は頂端の形質膜のいずれかに局在する興味のある輸送タンパク質の活性を抑制又は向上させる、興味のあるテスト化合物の能力を測定する方法を提供し、以下の工程、
（ａ）　透過性支持体上で生育した前記興味のある輸送タンパク質を発現する分極した細胞のウェル封入集密培養物を供給し、前記培養物の前記細胞間の密着結合の形成を確実にし、それによって、前記集密細胞培養物の両側面に分かれた側底部及び頂端の区画を形成する工程、
（ｂ）　前記区画の一つに、蛍光化合物の細胞透過性非蛍光誘導体を添加する工程であって、前記区画の一つが、前記興味のある輸送タンパク質が局在する前記分極した細胞の形質膜の反対側であり、前記誘導体が、細胞内の酵素によって切断され得、前記興味のある輸送タンパク質の基質である蛍光化合物を形成する工程、
（ｃ）　前記非蛍光誘導体の存在下で前記細胞をインキュベートする工程、
（ｄ）　前記非蛍光誘導体が添加される区画の反対側の区画から採取されたサンプルの蛍光強度を測定する工程であって、前記強度が、前記興味のある輸送タンパク質の存在及び活性を示す工程、及び任意に、
（ｅ）　工程（ｄ）で測定された蛍光強度の値に基づいて、かつあらかじめ確立されたキャリブレーションカーブ及び／又は経験的相関に基づいて、前記細胞に存在する前記興味のある輸送タンパク質の活性の測定を計算する工程、
（ｆ）　工程（ａ）で供給された同一の分極した細胞培養物又はそれと本質的に同一の分極した細胞培養物を使用して、工程（ｂ）−（ｅ）を繰り返し、一方、前記興味のあるテスト化合物又は前記細胞内で前記興味のあるテスト化合物から生成された興味のある代謝生成物を、繰り返し行われる工程（ｃ）における前記興味のある輸送タンパク質と接触させることを確実にする工程、及び
（ｇ）　工程（ｄ）及び繰り返し行われた工程（ｄ）で測定された蛍光強度の値を比較する工程、及び／又は工程（ｅ）及び繰り返し行われた工程（ｅ）で計算された活性値を比較する工程、及び前記興味のあるテスト化合物が、前記興味のある輸送タンパク質の活性を抑制又は向上させるかどうかを判定する工程、
を含む。
【０００７】
更に、本発明は、分極した細胞の興味のある形質膜結合輸送タンパク質の側底部及び／又は頂端の局在を評価する方法に関し、以下の工程、
（ａ）　透過性支持体上で生育した前記興味のある輸送タンパク質を発現する分極した細胞のウェル封入集密培養物を供給し、前記培養物の前記細胞間の密着結合の形成を確実にし、それによって、前記集密細胞培養物の両側面に分かれた側底部及び頂端の区画を形成する工程、
（ｂ）　前記頂端及び側底部の区画の両方に、蛍光化合物の細胞透過性非蛍光誘導体を添加する工程であって、前記誘導体が、細胞内の酵素によって切断され得、前記興味のある輸送タンパク質の基質である蛍光化合物を形成する工程、
（ｃ）　前記非蛍光誘導体の存在下で前記細胞をインキュベートする工程、
（ｄ）　両方の区画から採取したサンプルの蛍光強度を測定する工程、
（ｅ）　異なる区画で測定された蛍光強度の値を比較する工程であって、前記比較が、前記興味のある輸送タンパク質の頂端及び／又は側底部の局在を示す工程、及び任意に、
（ｆ）　工程（ｄ）で測定された蛍光強度の値に基づいて、かつあらかじめ確立されたキャリブレーションカーブ及び／又は経験的相関に基づいて、前記細胞に存在する前記興味のある輸送タンパク質のパーセントの頂端及び／又は側底部の局在を計算する工程、
を含む。
【０００８】
本発明の方法に使用される前記蛍光化合物は、カルセインが有利であり、前記蛍光化合物の非蛍光誘導体は、カルセインの細胞透過性非蛍光誘導体、有利にはカルセインＡＭである。
本発明の方法は、有利には、分極した腎臓細胞で、より有利には、ＭＤＣＫ　ＩＩ細胞で行い、約３７℃で約３０分間インキュベーションする。
本発明の幾つかの有利な態様は、以下に示す実験例によって更に説明され、また、付加したクレームよって定義される本発明の範囲について制限するものではない。
【０００９】
【実施例】
例１　有向カルセイン輸送のＭＲＰ２基質の抑制効果
分極したイヌの腎臓細胞（ＭＤＣＫ　ＩＩ）及びヒトＭＲＰ２を安定して発現するＭＤＣＫ　ＩＩ由来の培養細胞株を、トランスウェル−コル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ−Ｃｏｌ）膜支持体（孔径４□ｍ）に播き、培養物を、１０％ＦＢＳ及び抗生物質を含むＤ−ＭＥＭ培地で７日間維持した。培養物を洗浄後、２００μｌ及び４００μｌのリンガー緩衝液を上方及び下方の区画に、それぞれ添加した。細胞を、指示されたように試験した薬物で５分間、相互にプレインキュベートした。次に、細胞を、側底部側（下方のチャンバー）で、５μｌのカルセインＡＭに３７℃で３０分間暴露した。１００μｌのサンプルを、頂端の区画（上方のチャンバー）から採取し、その蛍光を測定した。図２において、左のカラムは、親細胞での結果を示し、一方右のカラムは、ＭＲＰ２を発現した細胞で得られた結果を示す。黒ベタのバーは、薬物の不存在下で測定された任意の単位での蛍光を描き、白抜き及び灰色のバーは、それぞれ、２５μＭベンズブロマロン及び１ｍＭプロベネシドの存在下で得られた結果を示す。
【００１０】
例２　ＭＤＣＫ　ＩＩ細胞単層によるカルセインの放出
分極した細胞をマイクロポーラスポリカーボネートフィルター（孔径３□ｍ、直径２４．５ｍｍ）に播き、毎日培地交換して３日間培養した。実験は、細胞層の頂端又は基底側のいずれかで培地を交換することにより開始した。カルセインの放出を、カルセインＡＭ（１□Ｍ）を含むＨＢＳＳで室温で、単層をインキュベートすることによって測定した。各区画のサンプル（２００ｍｌ）を指示した時点で採取した。８００ｍｌのＨＢＳＳを添加し、蛍光を測定した。放出されたカルセインの量を、遊離カルセインで作成されたキャリブレーションカーブを使って計算した。結果を図３に示す。
上に示したように、本発明の有利な態様を通じて、本発明の方法は、興味のある輸送タンパク質のようなＭＲＰの活性の簡易な定性及び定量評価、前記輸送タンパク質の抑制因子及び活性化因子の同定、及び側底部及び／又は頂端の形質膜のこのようなタンパク質の局在性を迅速に簡単に評価するのに好適である。当業者は、前述の本発明の方法の様々な変更、改良が、ここで説明されたものに、代わりの解釈を等価に適用することによって作り上げられ、しかしながら、このような変化及び改良は、本発明の最初の精神から逸脱することなく、従って、付随するクレームによって定義される本発明の範囲内にあることを確実に理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明の輸送測定アッセイのスキームである。（省略：Ｃは、蛍光化合物、Ｃ−ＡＭは、Ｃの非蛍光誘導体である。）
【図２】
本発明のアッセイによって測定した、有向細胞貫通カルセイン輸送の２種類のＭＲＰ２基質の抑制効果を示す。
【図３】
ＭＤＣＫ　ＩＩ細胞単層による、カルセイン放出を示す。カルセインＡＭを、頂端及び側底部の培地の両方に添加し、培地に現れたカルセインの量を測定した。サンプルを、１及び２時間で採取した。四角：頂端の区画に放出。丸：側底部の区画に放出。
【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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2004502433.tif 000017
2004502433.tif 000018
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004502433.tif 000019
2004502433.tif 000020
【国際調査報告】
2004502433.tif 000021
2004502433.tif 000022
2004502433.tif 000023