(57)【要約】分子内ペプチド結合を持たず、ＲＧＤペプチドを模倣可能であり、ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＡＳＰモチーフ「アルギニン−グリシン−アスパラギン酸」（これはインビボおよびインビトロにおいて細胞接着の強い阻害剤である。）を含有する、一般式Ｉの分子。インビトロ実験により、この分子がＲＡＳＭＣ接着、増殖および移動の効率的阻害剤であることが示された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式で表される構造を有する非ペプチドＲＧＤ類似体分子。
【化１】
2004527488.tif 000012
（式中、Ｒは以下の化学式から選択される。）
【化２】
2004527488.tif 000013
【請求項２】
下記の構造を有する非ペプチドＲＧＤ類似体分子。
【化３】
2004527488.tif 000014
【請求項３】
血管疾患の治療のために使用される薬理的化合物の調製のための、請求項１記載の非ペプチド分子の使用法。
【請求項４】
一次腫瘍増殖および転移の阻害のための、請求項１記載の非ペプチド分子の使用法。
【請求項５】
インテグリン媒介疾患の阻害のために使用される薬理的化合物の調製のための、請求項１記載の非ペプチド分子の使用法。
【請求項６】
細胞増殖および移動、ならびに転移部位に向かう腫瘍細胞の移動の阻害のために使用される薬理的化合物の調製のための、請求項１記載の非ペプチド分子の使用法。
【請求項７】
腫瘍および血管疾患の治療における補助剤として使用される薬理的化合物の調製のための、請求項１記載の非ペプチド分子の使用法。
【請求項８】
ＲＧＤ蛋白質媒介疾患の治療のために使用される薬理的化合物の調製のための、請求項１記載の非ペプチド分子の使用法。
【請求項９】
ＲＧＤモチーフ結合活性に関連する疾患の治療のために使用される薬理的化合物の調製のための、請求項１記載の非ペプチド分子の使用法。
【請求項１０】
生物適合性および治療効率を高めるための、合成および／または生物学的マトリックスに対する請求項１の非ペプチド分子の使用法。
【請求項１１】
免疫応答を変更可能な薬理的化合物の調製のための、請求項１のペプチド分子の使用法。
【請求項１２】
血栓現象の治療のために使用される薬理的化合物の調製のための、請求項１記載の非ペプチド分子の使用法。
【請求項１３】
アポトーシスを誘導するために使用される薬理的化合物の調製のための、請求項１記載の非ペプチド分子の使用法。
【請求項１４】
血管疾患の治療のために使用される薬理的化合物の調製のための、請求項２記載の非ペプチド分子の使用法。
【請求項１５】
一次腫瘍増殖および転移の阻害のための、請求項２記載の非ペプチド分子の使用法。
【請求項１６】
インテグリン媒介疾患の阻害のために使用される薬理的化合物の調製のための、請求項２記載の非ペプチド分子の使用法。
【請求項１７】
細胞増殖および移動、ならびに転移部位に向かう腫瘍細胞の移動の阻害のために使用される薬理的化合物の調製のための、請求項２記載の非ペプチド分子の使用法。
【請求項１８】
腫瘍および血管疾患の治療における補助剤として使用される薬理的化合物の調製のための、請求項２記載の非ペプチド分子の使用法。
【請求項１９】
ＲＧＤ蛋白質媒介疾患の治療のために使用される薬理的化合物の調製のための、請求項２記載の非ペプチド分子の使用法。
【請求項２０】
ＲＧＤモチーフ結合活性に関連する疾患の治療のために使用される薬理的化合物の調製のための、請求項２記載の非ペプチド分子の使用法。
【請求項２１】
生物適合性および治療効率を高めるための、合成および／または生物学的マトリックスに対する請求項２の非ペプチド分子の使用法。
【請求項２２】
免疫応答を変更可能な薬理的化合物の調製のための、請求項２のペプチド分子の使用法。
【請求項２３】
血栓現象の治療のために使用される薬理的化合物の調製のための、請求項２記載の非ペプチド分子の使用法。
【請求項２４】
アポトーシスを誘導するために使用される薬理的化合物の調製のための、請求項２記載の非ペプチド分子の使用法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、生物学的活性を有するペプチドを模倣可能な新規な合成分子、すなわちペプチド様分子あるいはペプチド模擬分子、の同定に関する。特に、本発明は、分子内ペプチド結合を持たず、かつＲＧＤモチーフを模倣可能な新規な分子の同定に関する。実際、ＲＧＤモチーフが、インビボおよびインビトロにおいて、分子接着の強力な阻害剤であることが知られている。
【０００２】
ラット平滑筋細胞（ＲＡＳＭＣ）におけるインビトロ実験により、これらの新規なペプチド様分子がＲＡＳＭＣ増殖および移動の有効な阻害剤であり（細胞移動および増殖の変更が、高い社会的インパクトを有するアテローム性動脈硬化および再狭窄等多くの血管障害において生じる）、潜在的な転移性部位へ向かう腫瘍細胞移動の阻害剤として使用可能であるかもしれないことが示された。
【０００３】
適切なペプチド結合の欠損により前記分子はインビボ蛋白質分解性分解に対する感度が低下する。蛋白質分解性分解がインビトロ活性を有するペプチド分子のインビボ生物学的効果を通常減少または遮断する分解機構であることは周知である。
【０００４】
したがって、本発明の目的である、ペプチド模擬分子が潜在的により安定であり、かつ結果的に設計に使用される対応鋳型ペプチドよりもより高いインビボ活性を示すことである。
【０００５】
血管疾患が西欧諸国における疾病率および死亡率の主な原因の一つを表す。虚血性疾患は主にアテローム性動脈硬化症、血栓現象、および血管形成後の再狭窄等の他の現象を原因とする。さらに、血管変更は固形腫瘍増殖の間の新血管形成をもたらす。この理由のために、血管細胞および血管壁の増殖を制御する際の分子活性が多くの社会的関連性疾患にける潜在的な利益を求めて盛んに研究される。
【０００６】
脈管形成が血管細胞の細胞外マトリックスへの接着に依存し、かつαｖβ３という蛋白質がこのプロセスに必要であることが示された（ブルックス等、サイエンス、１９９４年、２６４巻、５６９〜５７１頁）。
【０００７】
結果的に、インテグリン阻害剤であるＡＲＧ−ＧＬＹ−ＡＳＰモチーフ「アルギニン−グリシン−アスパラギン酸」（ＲＧＤモチーフ）含有ペプチドが抗脈管形成特性（フリードランダー等、サイエンス、１９９５年、２７０巻、１５００〜１５０２頁；ウッダード等、ジェイ．セルサイエンス(J. Cell Sci.)１９９８年、１９３０〜１９３５年）および抗腫瘍活性（ハムメス等、ナットメディシン（Nat.Medicine）１９９６年、２巻、５２９〜５３３頁；キャロン等、キャンサーレス（Cancer Res.）１９９８年、１９３０〜１９３５頁）および抗転移活性（フジイ等、オンコロジイレス（Oncology Res.） １９９６年、８巻、３３３〜３４２頁）を発揮し得る。
【０００８】
さらに、ＲＧＤ含有蛋白質およびＲＧＤ含有短ペプチドが血液凝固、細胞増殖、細胞移動、細胞外マトリックスへの接着を調節することが示された（Ｒｏｕｓｌｈｔｉ等、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．１９９６年、１２巻、６９７〜７１５頁；Ｏｊｉｍａｅｔ等、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｅｃｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９７年、３巻、３３７〜３６０頁；Ｗａｎｇ等、Ｃｕｒｒ．ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０００年、７巻、７４〜８０頁）。
【０００９】
さらに、ＲＧＤ類似体が異なる実験条件下でアポトーシスを誘導することが示された（Ｍｏｄｌｉｃｈ等、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９６年、７４巻、７７１〜７８０頁；Ｙｅｈ等、Ｂｌｏｏｄ，１９９８年、９２巻、３２６８〜３２７６頁；Ｂｕｃｋｌｅｙ等、ネイチャー１９９９年、３９７巻、５３４〜５３９頁）。
【００１０】
これらのデータを考慮すると、ＲＧＤ類似体ペプチドは腫瘍細胞および活発に増殖する血管細胞のアポトーシスを効率的に誘導可能である。
【００１１】
親全体の蛋白質と比較してこれらの小さいペプチドの制限されたインビボ副作用および合成コストの比較によって、小さい生物学的活性ペプチドの使用が現在盛んに研究されている。あいにく、小さいペプチドは普通不安定分子であり、これらはプロテアーゼにより分解可能であり、かつこれらは免疫系による非自己として認識可能であり、したがって、生物学的効果の喪失を急速に排除される。したがって、異化作用を減少し結果的にインビトロおよびインビボにおける活性を高めるために、本発明では、特異的蛋白質の活性部位を確認した後、以下の段階は前記活性部位を模倣するが異なる化学的特徴（すわなち、ペプチド結合または抗原性活性）を有する分子の同定にある。
【００１２】
今日、ＲＧＤ含有ペプチドについて盛んに研究されている。その理由は、上記のように、これらがインビトロおよびインビボでインテグリン媒介疾患の阻害剤として強い活性を示すからである。
【００１３】
ＲＧＤペプチドの非ペプチド類似体を、インビボでより安定であり、蛋白質分解性部位が無く、インビボでより遅い異化的分解を受ける分子を得るために設計する（Ｗａｎｇ等、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２０００年、７巻、７４〜８０頁；Ｈｏｒｔｏｎ等、Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．、１９９９年、７巻、１７８〜１８４頁）。前記ペプチド様分子はペプチド模倣物と言われる。これは、これらがオリジナル化合物を模倣するが、ペプチド結合がなく、プロテアーゼによる分解を回避して、結果的にインビボでより安定であるためである。
【００１４】
これらの新規なアプローチ（ペプチド模倣物）の使用により、研究の分野が新しく広がり、市場で利用可能な新規な化合物によって支持される。異なる分子において類似の形すなわち三次元構造および類似の電気分布を検出できる特異的なソフトウェアを使用することにより、ペプチド模倣分子の構造に対するアミノ酸への代替物として使用されるのに最適なビルディングブロックを確認できる。
【００１５】
本発明の目的は、ＲＧＤモチーフを模倣可能であり、細胞接着、移動および増殖を阻害可能である合成非ペプチド分子の新規なファミリーである。前記分子のファミリーは対応する鋳型と比較してインビトロで少なくとも等しいかまたはより活性であり、かつ潜在的にインビボでより安定である。
【００１６】
本発明では、第１段階において、ペプチド分子が、以下の段階でペプチド模倣物またはペプチド様分子を設計するために鋳型として選択された。この目的のために、細胞間のおよび細胞と細胞外マトリックス間の接着の変更として、幾つかの生物学的機能に伴われるＲＧＤ含有ペプチド（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）を選択した。したがって、前記ポリペプチドの三次元構造を得た。
【００１７】
結果的に、前記鋳型のＲＧＤに類似したモチーフを含み、潜在的に生物学的活性を有するが、インビボで蛋白質分解性分解に低感度であるためにペプチド結合が無い、同じファミリーに属する合成分子を設計した。
【００１８】
前記設計段階の後、前記ファミリーのより興味ある分子、すなわち製造が最も容易であり、前記鋳型に高類似を示す分子を合成してインビトロで試験した。
【００１９】
【化１】
2004527488.tif 000002
【００２０】
分子内ペプチド結合がない前記ＲＧＤ類似分子を平滑筋ラット細胞で試験し、細胞外マトリックスへの細胞接着を強く阻害し、かつＰＤＧＦ誘導（血小板由来成長因子）細胞移動および増殖を阻害する能力を示した。
【００２１】
これらのデータは、この新規な分子が、アテローム動脈硬化および再狭窄等の幾つかの血管疾患において生じる血管細胞の異常な移動および増殖の阻害剤並びに潜在的転移性部位に向かう腫瘍細胞の移動阻害剤として使用され得ることを示す。
【００２２】
ＲＧＤペプチド模倣物の設計
前記観察にしたがって、ＲＧＤ含有ペプチドを鋳型として選択し、ペプチド模倣分子を設計した。
【００２３】
この選択は、文献において利用可能なＲＧＤ含有ペプチドの生物学的活性についての報告を注意深く考慮して、かつ既知の構造的コンフォメーションの同定のための有益かつ特異的なデータベース（ＰＤＢデータベース）を使用して行った。
【００２４】
シミュレーションにおいて使用される鋳型ペプチドにおけるＲＧＤモチーフの三次元コンフォメーションを同定した後、類似分子の設計プロセスを実施して、同じファミリーに属し、同じ特徴を示す分子を得た。
【００２５】
同じファミリーに属する分子を以下に示す。
【００２６】
【化２】
2004527488.tif 000003
【００２７】
【化３】
2004527488.tif 000004
【００２８】
【化４】
2004527488.tif 000005
【００２９】
【化５】
2004527488.tif 000006
【００３０】
【化６】
2004527488.tif 000007
【００３１】
【化７】
2004527488.tif 000008
【００３２】
【化８】
2004527488.tif 000009
【００３３】
【化９】
2004527488.tif 000010
【００３４】
同じファミリーに属する全分子間で、分子ｎｒ．６を合成し、以降、非ペプチドＲＧＤ類似体分子という。
【００３５】
【化１０】
2004527488.tif 000011
【００３６】
分子ファミリーの機能的特徴を確認するインビトロ実験を前記分子について実施した。
【００３７】
ＲＧＤ類似体活性インビトロ試験
この試験のために、成体雄ウィスターラットから得た、ラット血管平滑筋細胞（ＲＡＳＭＣ）一次培養を周知の手順にしたがって使用した（Ｆａｃｃｈｉａｎｏ等、２０００年、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１３（１６）２８５５〜６３）。
【００３８】
接着アッセイ
接着アッセイを９６ウェルプレート上で行い、５０マイクロリットルのビトロネクチン含有溶液を用いて活性化した（２０マイクロリットル／ミリリットル）。非特異的部位の飽和をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ダルベッコ変法イーグル培地、ＤＭＥＭ中、５ｍｇ／ｍｌ）で１時間、３７℃にてインキュベートして得た。その後、ウェルをＤＭＥＭで１回洗浄して、３０．０００細胞／ウェルを、試験する分子の存在または不存在下に分配した。１時間３７℃にてインキュベートした後、ビトロネクチンマトリックスに細胞を接着させるために、ウェルを２回ＰＢＳで洗浄し、細胞をＰＢＳ中ホルムアルデヒド４％を用いて室温で１０分間固定した。ＰＢＳを用いてさらに洗浄した後、細胞をトルイジンブルーで１０分間室温にて染色した（ホルムアルデヒド４％中、０．５％）。細胞内に吸収された染色を３０分間ＳＤＳ１％で抽出し、波長５９５ナノメーターでＥＬＩＳＡライダーを定量した。
【００３９】
移動アッセイ
移動アッセイを周知の標準手順（Ｆａｃｃｈｉａｎｏ等、２０００年、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１３（１６）２８５５〜６３）に従って変法ボイデンチャンバー（Ｃｏｓｔａｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｔｒａｔｉｏｎ）内で実施した。ラット血管平滑筋細胞（ＲＡＳＭＣ）を前記ボイデン装置の上方チャンバーに入れた。使用した化学誘引物質はヒト組換え血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）（Ｒ＆Ｄシステム）であった。これは、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）に対して説明された最も強力な化学誘引物質である。これを、ＤＭＥＭ−０．１％ＢＳＡに１０ｎｇ／ｍｌで溶解し、ボイデン装置の下方チャンバーに入れた。フィルタの底面に移動した細胞を４００Ｘの倍率で計数した。各フィルタについて１５視野をカウントし、視野当たりの平均細胞数を計算した。実験は二重に少なくとも４回行った。実験結果は、非処理細胞に比較して、処理分子の異なる移動能力を示す。
【００４０】
増殖アッセイ
増殖アッセイを以下の標準手順（Ｆａｃｃｈｉａｎｏ等、２０００年、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１３（１６）２８５５〜６３）にしたがって、６ウェルプレート（１×１０５細胞／プレート）上で、２４時間、１０％胎児性ウシ血清（ＦＣＳ）で補強したＤＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ２中で行った。培地をＤＭＥＭ−０．１％ＢＳＡを含有する飢餓性培地で２４時間置き換えた。次に、飢餓培地を、０．１％ＢＳＡ単独またはＰＤＧＦ−ＢＢを含む０．１％ＢＳＡ培地含有の新しい培地で、ＲＧＤ類似体存在または非存在下で置き換えた。各アッセイを異なる時間間隔で行い、細胞をハーベストし、血球計で計数した。
【００４１】
３種のアッセイの結果を図１、２、３に示す。
結果は、投与量に依存して、かつ鋳型分子（これらの実験においてポジティブコントロールとして使用した、ＲＧＤＳペプチド）に類似した方式で、ＲＧＤ類似体がビトロネクチンへのＲＡＳＭＣ接着を阻害することを示す（図１）、そして、ＰＤＧＦ−ＢＢへ向かうＲＡＳＭＣ移動を阻害することを示す（図２）。
【００４２】
増殖実験は、１００ナノグラム／ｍｌ濃度における、非ペプチドＲＧＤ類似体、およびポジティブコントロールＲＧＤＳの著しい抗増殖効果を示す。両分子は、ＰＤＧＦ−ＢＢの不存在下で細胞に添加した場合、毒性効果を示めさない（図３）。
【００４３】
得られた結果は以下のことを示す。
１．前記新規合成分子および説明した他の全非ペプチドＲＧＤ類似体は、鋳型ＲＧＤＳの活性を完全に模倣し、ＲＧＤペプチドを模倣可能な分子ファミリーを構築する目的を達成することを示した。
２．前記新規合成分子および説明した他の全非ペプチドＲＧＤ類似体は、実施したアッセイにおいて、非特異的細胞毒性効果を示さなかった。
３．前記新規合成分子および説明した他の全非ペプチドＲＧＤ類似体は、ＲＡＳＭＣの接着、移動および増殖を強く阻害し、これらの分子がさらにインビボで研究するための良好な候補であることを示す。実際、前記分子は化学的特徴が都合よく、鋳型ＲＧＤＳより良好なインビボにおける作用が期待される。
【００４４】
ＲＧＤＳはインビボで強い生物学的活性を持つことが知られている。非ペプチドＲＧＤ類似体が一次腫瘍増殖および転移の阻害剤として、血管疾患の治療に使用できることは明らかである。したがって、溶液中に分散された、または合成および／または生物学的マトリックス上で固定した前記分子の使用を仮定できる。特に、第１の場合、これらの分子は、細胞接着、移動及び増殖を阻害可能である。第２の場合、これらの分子は細胞接着を刺激することが可能である。したがって、前記分子は、移植（トランスプラント）および／または移植（グラフト）において、特に虚血性または心臓血管疾患のための血管または心臓弁移植の場合に使用される、合成および／または生物学的材料の生物学的適合性を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】（既知の活性を有するポジティブコントロールとして使用した）ＲＧＤＳおよび非ペプチドＲＧＤ類似体により誘導した、ビトロネクチンへのＲＡＳＭＣ接着の投与量依存性阻害を比較する。
【図２】ＲＧＤＳおよび非ペプチドＲＧＤ類似体により誘導された、ＰＤＧＦ−ＢＢ勾配に向かうＲＡＳＭＣ移動の投与量依存性阻害を比較する。
【図３】ＲＧＤＳおよび非ペプチドＲＧＤ類似体（１００ｎｇ／ｍｌ）により誘導された、ＰＤＧＦ−ＢＢ（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いて４８時間刺激したＲＡＳＭＣ増殖の投与量依存性阻害を比較する。
【図１】
2004527488.tif 000015
【図２】
2004527488.tif 000016
【図３】
2004527488.tif 000017
【国際公開パンフレット】
2004527488.tif 000018
2004527488.tif 000019
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2004527488.tif 000038
2004527488.tif 000039
2004527488.tif 000040
【国際調査報告】
2004527488.tif 000041
2004527488.tif 000042
2004527488.tif 000043