(57)【要約】本発明は、放射性リガンド化合物である［３５Ｓ］−放射性標識（＋）−Ｎ−［１−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−ヒドロキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４−ピペリジン］−６−イル］メタンスルホンアミドに関する。ＩＫｒチャンネルに結合し抗不整脈活性を有しうる化合物の同定方法も、本発明の範囲内である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
【化１】
2004512268.tif 000022
である式Ｉの放射性リガンド化合物またはその医薬上許容される塩。
【請求項２】
５００Ｃｉ／ｍｍｏｌより大きな比放射能を有する、請求項１記載の式Ｉの放射性リガンド化合物。
【請求項３】
約９００Ｃｉ／ｍｍｏｌ〜約１４９８Ｃｉ／ｍｍｏｌの範囲の比放射能を有する、請求項１記載の式Ｉの放射性リガンド化合物。
【請求項４】
イオンチャンネルをＩＫｒチャンネルとして特徴づける方法であって、該イオンチャンネルを請求項１記載の放射性リガンド化合物と接触させ、該放射性リガンド化合物が該イオンチャンネルに結合するか否かを判定することを含んでなる方法。
【請求項５】
化合物の活性をＩＫｒチャンネルブロッカーとして特徴づけるための方法であって、請求項１記載の放射性リガンド化合物の存在下、試験化合物を、該ＩＫｒチャンネルを含有する膜と接触させ、該試験化合物が該ＩＫｒチャンネル含有膜への該放射性リガンド化合物の結合に影響を及ぼすか否かをモニターすることを含んでなる方法。
【請求項６】
該ＩＫｒチャンネルを含有する膜が、ＥＲＧ遺伝子でトランスフェクトされた細胞系に由来する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
該細胞系がＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
該ＥＲＧ遺伝子がヒト、イヌまたは霊長類のものである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
式Ｉの放射性リガンド化合物が約９００Ｃｉ／ｍｍｏｌ〜約１４９８Ｃｉ／ｍｍｏｌの範囲の比放射能を有する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
式Ｉの放射性リガンド化合物である［３５Ｓ］−放射性標識（＋）−Ｎ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−ヒドロキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］メタンスルホンアミドを使用して、ＩＫｒチャンネルを含有する膜への試験化合物の結合を評価するための方法であって、
１）溶媒中の、５以上の異なる濃度の該試験化合物の溶液、対照ビヒクルの溶液および（＋）−Ｎ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−ヒドロキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］メタンスルホンアミド（式ＩＩの化合物）の溶液を調製する工程、
２）式Ｉの放射性リガンド化合物を、アッセイバッファーで希釈された該ＩＫｒチャンネルを含有する膜と混合して、既知濃度の膜／放射性リガンド混合物を形成させる工程、
３）ある量の既知濃度の該膜／放射性リガンド混合物を、工程１で列挙した試験化合物、対照ビヒクルまたは式ＩＩの化合物の溶液と共に、約４℃〜約３７℃の温度範囲で、規定の時間にわたりインキュベートして、該試験化合物、該対照ビヒクルまたは式ＩＩの化合物と該放射性リガンドが結合した膜との混合物を得る工程（ここで、該ＩＫｒチャンネルを含有する膜の最終濃度は予め定められている）、
４）該試験化合物、該対照ビヒクルまたは式ＩＩの化合物および該放射性リガンドが結合した膜を該インキュベート混合物から単離する工程、
５）該試験化合物、該対照ビヒクルまたは式ＩＩの化合物および該放射性リガンドが結合した単離された膜の放射能を測定する工程、
６）工程１に列挙した各濃度の試験化合物、対照ビヒクルの溶液および式ＩＩの化合物の溶液で、工程３〜５を繰返す工程、及び、
７）１）各濃度の該試験化合物及び該放射性リガンドが結合した膜、２）該対照ビヒクル及び該放射性リガンドが結合した膜、ならびに３）式ＩＩの化合物及び該放射性リガンドが結合した膜の測定放射能に対応するＩＣ５０を計算する工程：
を含んでなる方法。
【請求項１１】
該ＩＫｒチャンネルを含有する膜が、ＥＲＧ遺伝子でトランスフェクトされた細胞系に由来する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該細胞系がＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
該ＥＲＧ遺伝子がヒト、イヌまたは霊長類のものである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
工程１において、該試験化合物の溶液を７つの異なる濃度で調製する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
工程３のインキュベーションの時間が約３０分間〜１時間である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
工程３のインキュベーションの温度が室温（２５℃）である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
工程４において、試験化合物または放射性リガンドが結合した膜を、ユニフィルター（Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ）、シンチレーション・プロキシミティー・アッセイ（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ　Ａｓｓａｙ）（ＳＰＡ）ビーズまたはフラッシュプレート（Ｆｌａｓｈｐｌａｔｅ）で単離する、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
該ＩＫｒチャンネルを含有する膜が、ヒトＥＲＧ遺伝子でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞系に由来する、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
式Ｉの放射性リガンド化合物が約９００Ｃｉ／ｍｍｏｌ〜約１４９８Ｃｉ／ｍｍｏｌの範囲の比放射能を有する、請求項８記載の方法。
【請求項２０】
式Ｉの放射性リガンドである［３５Ｓ］−放射性標識（＋）−Ｎ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−ヒドロキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］メタンスルホンアミドを使用して、該ＩＫｒチャンネルを含有する膜への試験化合物の結合を評価するための方法であって、
１）４μｌの、５以上の異なる濃度にてアッセイバッファーで１００倍希釈されたジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の該試験化合物、ＤＭＳＯである対照ビヒクルおよび（＋）−Ｎ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−ヒドロキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］メタンスルホンアミド（式ＩＩの化合物）のＤＭＳＯ溶液を含有するアッセイウェルを調製する工程、
２）アッセイバッファーで希釈された該ＩＫｒチャンネルを含有する膜に、式Ｉの放射性リガンド化合物を５０ｐＭで加えて、膜／放射性リガンド混合物を形成させる工程、
３）４００μｌの該５０ｐＭ膜／放射性リガンド混合物を含有する各アッセイウェルを室温（２５℃）で約７５分間〜約９０分間にわたりインキュベートして、各濃度の該試験化合物、該ＤＭＳＯ対照ビヒクルまたは式ＩＩの化合物および該放射性リガンドが結合した膜を含有するアッセイウェルを得る工程（ここで、該ＩＫｒチャンネルを含有する膜の最終濃度は１１μｇ／ｍｌである）、
４）そのインキュベートしたアッセイウェルを０．１％ＢＳＡ予浸フィルターで濾過して、各濃度の該試験化合物、該ＤＭＳＯ対照ビヒクルまたは式ＩＩの化合物および該放射性リガンドが結合した膜を該フィルターで単離する工程、
５）各濃度の該試験化合物、該ＤＭＳＯ対照ビヒクルまたは式ＩＩの化合物および該放射性リガンドが結合した膜を含有するフィルターのそれぞれを５００μｌの氷冷洗浄バッファーで約５回洗浄する工程、
６）各濃度の該試験化合物、該ＤＭＳＯ対照ビヒクルまたは式ＩＩの化合物および該放射性リガンドが結合した膜を含有する該洗浄したフィルターを換気フード中で室温で乾燥させる工程、
７）各濃度の該試験化合物、該ＤＭＳＯ対照ビヒクルまたは式ＩＩの化合物および該放射性リガンドが結合した膜を含有する該乾燥したフィルターに、５０μｌのマイクロシント（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ）−２０マイクロシンチレートを加える工程、
８）各濃度の該試験化合物、該ＤＭＳＯ対照ビヒクルまたは式ＩＩの化合物および該放射性リガンドが結合した膜を含有する該マイクロシンチレーション処理フィルターのマイクロシンチレーション計数を１分間にわたり測定する工程、及び、
９）１）各濃度の該試験化合物及び該放射性リガンドが結合した膜を含有する該マイクロシンチレーション処理フィルター、２）該対照ビヒクル及び該放射性リガンドが結合した膜を含有する該マイクロシンチレーション処理フィルター、ならびに３）式ＩＩの化合物及び該放射性リガンドが結合した膜を含有する該マイクロシンチレーション処理フィルターの該測定マイクロシンチレーション計数に対応するＩＣ５０を計算する工程：
を含んでなる方法。
【請求項２１】
該ＩＫｒチャンネルを含有する膜が、ＥＲＧ遺伝子でトランスフェクトされた細胞系に由来する、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
該細胞系がＨＥＫ２９３細胞である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該ＥＲＧ遺伝子がヒトまたはイヌのものである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
工程１において該試験化合物の溶液を７つの異なる濃度で調製する、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
該ＩＫｒチャンネルを含有する膜が、ヒトＥＲＧ遺伝子でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞系に由来する、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
式Ｉの放射性リガンド化合物が約９００Ｃｉ／ｍｍｏｌ〜約１４９８Ｃｉ／ｍｍｏｌの範囲の比放射能を有する、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
工程４において、試験化合物または放射性リガンドが結合した膜をユニフィルター（Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ）で濾過する、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
【化２】
2004512268.tif 000023
の製造方法であって、
（１）アルコール
【化３】
2004512268.tif 000024
を２，６−ルチジンおよびｔ−ブチルジメチルシリルトリフラートと反応させてｔ−ブチルジメチルシリル保護ヒドロキシル化合物
【化４】
2004512268.tif 000025
を得る工程、
（２）水素化ナトリウムで処理し次いで２−トリメチルシリルエタンスルホニルクロリドで処理することにより、該ｔ−ブチルジメチルシリル保護ヒドロキシル化合物をアルキル化してジ置換スルホンアミド化合物
【化５】
2004512268.tif 000026
を得る工程、
（３）該ジスルホンアミドをＣ１−Ｃ８−アルカンチオラートで処理して、以下のスルホンアミドの混合物
【化６】
2004512268.tif 000027
を得る工程、
（４）クロマトグラフィーを用いて該スルホンアミド混合物を分離して、無極性溶媒系で溶出する無極性スルホンアミド
【化７】
2004512268.tif 000028
を単離し、ついで極性溶媒系を用いて極性異性体
【化８】
2004512268.tif 000029
を溶出除去する工程、
（５）有機塩基中でフッ化物化合物を使用し、約２４時間〜約４８時間加熱して、該無極性異性体
【化９】
2004512268.tif 000030
を脱スルホン化して、遊離アルコール−アミン
【化１０】
2004512268.tif 000031
を得る工程、
（６）該遊離アルコール−アミン
【化１１】
2004512268.tif 000032
を有機溶媒中でトリメチルシリルイミダゾールと反応させて所望のトリメチルシリルオキシ化合物を得る工程：
を含んでなる製造方法。
【請求項２９】
工程２におけるアルキル化を２４時間まで室温で攪拌して行う、請求項２８記載の製造方法。
【請求項３０】
工程３におけるＣ１−Ｃ８−アルカンチオラートがナトリウムメタンチオラート、ナトリウムエタンチオラート、ナトリウムプロパンチオラートまたはナトリウム２−メチルプロパンチオラートである、請求項２９記載の製造方法。
【請求項３１】
工程３における脱スルホン化反応を２４時間未満にわたり行う、請求項３０記載の製造方法。
【請求項３２】
工程４におけるスルホンアミド混合物の分離を、酢酸エチルおよびヘキサンから酢酸エチルおよびメタノールへの溶媒系でフラッシュクロマトグラフィーを用いて行う、請求項３１記載の製造方法。
【請求項３３】
工程４におけるスルホンアミド混合物の分離を、１：１　酢酸エチル：ヘキサンの無極性溶媒系から９９：１　酢酸エチル：メタノールの極性溶媒系でフラッシュクロマトグラフィーを用いて行う、請求項３２記載の製造方法。
【請求項３４】
工程５の脱スルホン化で使用するフッ化物化合物が、フッ化セシウムおよびテトラブチルアンモニウムフルオリドから選ばれる、請求項３３記載の製造方法。
【請求項３５】
工程５の脱スルホン化で使用する有機溶媒が、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドおよびＮ−メチルピロリジノンから選ばれる、請求項３４記載の製造方法。
【請求項３６】
工程６における有機溶媒がアセトニトリル、テトラヒドロフランまたはエーテルである、請求項３５記載の製造方法。
【請求項３７】
式Ｉ
【化１２】
2004512268.tif 000033
の放射性リガンド化合物の製造方法であって、
（ａ）アミン
【化１３】
2004512268.tif 000034
を有機塩基の存在下で［３５Ｓ］−メタンスルホニルクロリドと反応させて、シリル保護［３５Ｓ］−メタンスルホンアミド体を形成させる工程、及び、
（ｂ）該シリル保護［３５Ｓ］−メタンスルホンアミド体のシリル保護基をトリフルオロ酢酸で除去して、式Ｉの放射性リガンド化合物を得る工程：
を含んでなる製造方法。
【請求項３８】
該有機塩基が、トリエチルアミン、トリメチルアミンおよびジイソプロピルエチルアミンから選ばれる、請求項３７記載の製造方法。
【請求項３９】
該有機塩基がトリエチルアミンである、請求項３８記載の製造方法。
【請求項４０】
【化１４】
2004512268.tif 000035
である化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、潜在的クラスＩＩＩ抗不整脈化合物をスクリーニングするための有用な物質である放射性リガンド化合物、およびこの放射性リガンド化合物を使用するこのＩＫｒ活性に関するスクリーニング方法を提供する。過去に、モルモット筋細胞においてＥＲＧ（ｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅ）に結合しうる［３Ｈ］−放射性リガンドを使用して、同様の結合アッセイが行われたり、あるいは無傷細胞上でパッチクランプ法が行われた。Ｇｅｏｎｚｏｎ，Ｒら　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｃａｒｄｉｏｌ．３０，ｐ．１６９１−１７０１（１９９８）；Ｃｈａｄｗｉｃｋ，Ｃ．Ｃ．ら　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　７２，ｐ．７０７−７１４（１９９３）；Ｄｕｆｆ，Ｈ．Ｊ．ら　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　７７，ｐ．７１８−７２５（１９９５）；およびＦｉｓｅｔ，Ｃ．ら　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｃａｒｄｉｏｌ．２８，ｐ．１８５−１０９６（１９９６）を参照されたい。
【０００２】
本発明は、従来法より優れたいくつかの利点をもたらす。［３５Ｓ］標識放射性リガンドの使用は、［３５Ｓ］が［３Ｈ］より高いエネルギーおよび比放射能を有する放射性同位体であるため、より少量の放射性リガンドおよびヒトＥＲＧ（ｈＥＲＧとも称される）チャンネルの使用により科学者がアッセイ条件を改良することが可能となり、より高感度なアッセイが可能になるという利点をもたらす。また、本結合アッセイは、無傷動物細胞におけるＥＲＧではなくｈＥＲＧを発現する細胞からの膜を該イオンチャンネル源として使用して開発されたものである。したがって、このアッセイにおけるヒトＥＲＧの使用は、該動物ＥＲＧより適切な結合アッセイを研究者にもたらすであろう。
【０００３】
また、膜は、無傷細胞より使いやすいイオンチャンネル源である。大量の膜を予め製造し、凍結保存し、そしてアッセイ当日に解凍しうるため、より大きなスループットが可能である。また、イオンチャンネルの膜源は、その細胞外および細胞内の両方の露出部位を有し、無傷細胞の生理学の変化に左右されることなく全ての可能な結合部位が露出されうる。［３５Ｓ］に基づく結合アッセイの最後の利点として、ホールセルパッチクランプアッセイより遥かに高いスループットで、それを実施しうることが挙げられる。したがって、本発明は、広範囲に基づくスクリーニングに、より適している。このアッセイは、長いＱＴの活性が望ましくない研究プログラムにおけるカウンタースクリーニングとして用いられる。
【０００４】
米国特許第５，６３３，２４７号は、未標識化合物（非放射性リガンドとも称される）であるＮ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−ヒドロキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］メタンスルホンアミドを開示し、特許請求している。
【０００５】
（発明の概要）
本発明は、放射性リガンド化合物である［３５Ｓ］−放射性標識（＋）−Ｎ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−ヒドロキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］メタンスルホンアミド（式Ｉ）またはその医薬上許容される塩、水和物もしくは溶媒和物に関する。ＩＫｒチャンネルに結合する化合物の同定方法も、本発明の範囲内である。
【０００６】
（発明の詳細な説明）
式Ｉ
【化１５】
2004512268.tif 000002
の放射性リガンド化合物またはその医薬上許容される塩、水和物もしくは溶媒和物。式Ｉの放射性リガンド化合物は、［３５Ｓ］−放射性標識（＋）−Ｎ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−ヒドロキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］メタンスルホンアミドとも称される。式ＩＩの化合物は、未標識化合物である（＋）−Ｎ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−ヒドロキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］メタンスルホンアミドである。
【０００７】
本発明の実施形態は、約５００Ｃｉ／ｍｍｏｌより大きな比放射能、好ましくは、約９００Ｃｉ／ｍｍｏｌ〜約１４９８Ｃｉ／ｍｍｏｌの範囲の比放射能を有する式Ｉの放射性リガンド化合物を含む。
【０００８】
イオンチャンネルをＩＫｒチャンネルとして特徴づける方法は、該イオンチャンネルを、放射性リガンド化合物である［３５Ｓ］−放射性標識（＋）−Ｎ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−ヒドロキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］メタンスルホンアミドと接触させ、該放射性リガンド化合物が該イオンチャンネルに結合するか否かを判定することを含む。
【０００９】
化合物の活性をＩＫｒチャンネルブロッカーとして特徴づけるための方法は、放射性リガンド化合物である［３５Ｓ］−放射性標識（＋）−Ｎ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−ヒドロキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］メタンスルホンアミドの存在下、該試験化合物を、該ＩＫｒチャンネルを含有する膜と接触させ、該試験化合物が該ＩＫｒチャンネル含有膜への該放射性リガンド化合物の結合に影響を及ぼすか否かをモニターすることを含む。該ＩＫｒチャンネルを含有する膜は、ＥＲＧ遺伝子で安定にトランスフェクトされ、該ＩＫｒチャンネルタンパク質を発現しうる適当な細胞系に由来し、その代表例としては、ヒト、イヌまたは霊長類ＥＲＧ遺伝子で安定にトランスフェクトされており、該ＩＫｒチャンネルタンパク質を発現しうるＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ−１５７３，Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ　２０１１０）またはＣＨＯ細胞が挙げられる。該ヒトＥＲＧ遺伝子は、Ｔ．Ｉｔｏｈら，Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１０２（４），ｐｐ４３５−４３９（１９９８）およびＭ．Ｄ．Ａｄａｍｓら，Ｎａｔｕｒｅ　３７７：３−１７４（１９９５）に開示されている。本方法において有用な放射性リガンド化合物は、５００Ｃｉ／ｍｍｏｌより大きな比放射能、好ましくは、約９００Ｃｉ／ｍｍｏｌ〜約１４９８Ｃｉ／ｍｍｏｌの範囲の比放射能を有する。
【００１０】
式Ｉの放射性リガンドである［３５Ｓ］−放射性標識（＋）−Ｎ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−ヒドロキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］メタンスルホンアミドを使用して、該ＩＫｒチャンネルを含有する膜への試験化合物の結合を評価するための方法は、
１）溶媒中の、５以上の異なる濃度の該試験化合物の溶液、対照ビヒクルの溶液および（＋）−Ｎ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−ヒドロキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］メタンスルホンアミド（式ＩＩの化合物）の溶液を調製する工程、
２）式Ｉの放射性リガンド化合物を、アッセイバッファーで希釈された該ＩＫｒチャンネルを含有する膜と混合して、既知濃度の膜／放射性リガンド混合物を形成させる工程、
３）ある量の既知濃度の該膜／放射性リガンド混合物を、工程１で列挙した試験化合物、対照ビヒクルまたは式ＩＩの化合物の溶液と共に、約４℃〜約３７℃の温度範囲で、規定の時間にわたりインキュベートして、該試験化合物、該対照ビヒクルまたは式ＩＩの化合物と該放射性リガンドが結合した膜との混合物を得る工程（ここで、該ＩＫｒチャンネルを含有する膜の最終濃度は予め定められている）、
４）該試験化合物、該対照ビヒクルまたは式ＩＩの化合物および該放射性リガンドが結合した膜を該インキュベート混合物から単離する工程、
５）該試験化合物、該対照ビヒクルまたは式ＩＩの化合物および該放射性リガンドが結合した単離された膜の放射能を測定する工程、
６）工程１に列挙した各濃度の試験化合物、対照ビヒクルの溶液および式ＩＩの化合物の溶液で、工程３〜５を繰返す工程、及び、
７）１）各濃度の該試験化合物及び該放射性リガンドが結合した膜、２）該対照ビヒクル及び該放射性リガンドが結合した膜、ならびに３）式ＩＩの化合物及び該放射性リガンドが結合した膜の測定放射能に対応するＩＣ５０を計算する工程を含む。
【００１１】
該ＩＫｒチャンネルとの化合物の相互作用の効力またはＩＣ５０は、溶媒ビヒクル（１００％　対照）の存在下、１μＭの式ＩＩ化合物（最終的な非特異的結合）の存在下、および該試験化合物の７つの異なる濃度のそれぞれにおける、該膜に結合した［３５Ｓ］放射性リガンド計数を比較することにより求められる。試験する異なる濃度の数は、７より多くても少なくてもよい。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、水またはバッファーのような溶媒中の該試験化合物の１００μＭ溶液を調製し、試験化合物の該ストック１００μＭ溶液の対数（１０倍）希釈、５倍希釈または３倍希釈により７つの濃度の該試験化合物を調製する。対照値に対する割合（％）を各条件に関して求め、非線形４パラメーター回帰プロットを作成し、このプロットの変曲点またはＩＣ５０を求める。この値は、該化合物の該ＥＲＧチャンネルとの相互作用のアフィニティーの尺度として示される。該データが該４パラメーター式に適切にフィットしない場合には、最大もしくは最小結合またはそれらの両方を固定し、それぞれ３または２パラメーターフィットを用いて該変曲点を得る。
【００１２】
該膜結合放射性リガンドは、例えばユニフィルター（Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ）（Ｐａｃｋａｒｄ）を使用する該遊離放射性リガンドからの濾過により又はシンチレーション・プロキシミティー・アッセイ（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ　Ａｓｓａｙ）（ＳＰＡ）ビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）もしくはフラッシュプレート（Ｆｌａｓｈｐｌａｔｅ）（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む別の技術を用いることにより単離した後にモニターする。後者の２つの技術の利用は、該膜、放射性リガンドおよび化合物をＳＰＡビーズと共に標準的なアッセイプレート内で又はフラッシュプレート（Ｆｌａｓｈｐｌａｔｅ）内でインキュベートすることを必要とする。
【００１３】
式Ｉの放射性リガンドである［３５Ｓ］−放射性標識（＋）−Ｎ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−ヒドロキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］メタンスルホンアミドを使用して、該ＩＫｒチャンネルを含有する膜への試験化合物の結合を評価するための方法は、
１）４μｌの、５以上の異なる濃度にてアッセイバッファーで１００倍希釈されたジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の該試験化合物、ＤＭＳＯである対照ビヒクルおよび（＋）−Ｎ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−ヒドロキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］メタンスルホンアミド（式ＩＩの化合物）のＤＭＳＯ溶液を含有するアッセイウェルを調製する工程、
２）５０ｐＭの式Ｉの放射性リガンド化合物を、アッセイバッファーで希釈された該ＩＫｒチャンネルを含有する膜に加えて、膜／放射性リガンド混合物を形成させる工程、
３）４００μｌの該５０ｐＭ膜／放射性リガンド混合物を含有する各アッセイウェルを室温（２５℃）で約７５分間〜約９０分間にわたりインキュベートして、各濃度の該試験化合物、該ＤＭＳＯ対照ビヒクルまたは式ＩＩの化合物および該放射性リガンドが結合した膜を含有するアッセイウェルを得る工程（ここで、該ＩＫｒチャンネルを含有する膜の最終濃度は１１μｇ／ｍｌである）、
４）そのインキュベートしたアッセイウェルを０．１％ＢＳＡ予浸フィルターで濾過して、各濃度の該試験化合物、該ＤＭＳＯ対照ビヒクルまたは式ＩＩの化合物および該放射性リガンドが結合した膜を該フィルターで単離する工程、
５）各濃度の該試験化合物、該ＤＭＳＯ対照ビヒクルまたは式ＩＩの化合物および該放射性リガンドが結合した膜を含有するフィルターのそれぞれを５００μｌの氷冷洗浄バッファーで約５回洗浄する工程、
６）各濃度の該試験化合物、該ＤＭＳＯ対照ビヒクルまたは式ＩＩの化合物および該放射性リガンドが結合した膜を含有する該洗浄したフィルターを換気フード（ｆｕｍｅ　ｈｏｏｄ）中で室温で乾燥させる工程、
７）各濃度の該試験化合物、該ＤＭＳＯ対照ビヒクルまたは式ＩＩの化合物および該放射性リガンドが結合した膜を含有する該乾燥したフィルターに、５０μｌのマイクロシント（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ）−２０マイクロシンチレートを加える工程、
８）各濃度の該試験化合物、該ＤＭＳＯ対照ビヒクルまたは式ＩＩの化合物および該放射性リガンドが結合した膜を含有する該マイクロシンチレーション処理フィルターのマイクロシンチレーション計数を１分間にわたり測定する工程、及び、
９）１）各濃度の該試験化合物及び該放射性リガンドが結合した膜を含有する該マイクロシンチレーション処理フィルター、２）該対照ビヒクル及び該放射性リガンドが結合した膜を含有する該マイクロシンチレーション処理フィルター、ならびに３）式ＩＩの化合物及び該放射性リガンドが結合した膜を含有する該マイクロシンチレーション処理フィルター、の該測定マイクロシンチレーション計数に対応するＩＣ５０を計算する工程を含む。
【００１４】
該ＩＫｒチャンネルを含有する膜が、該ＥＲＧ遺伝子でトランスフェクトされた細胞系に由来する前記方法においては、該細胞系はＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞であり、好ましくはＨＥＫ２９３細胞であり、該ＥＲＧ遺伝子はヒト、イヌまたは霊長類のものであり、好ましくはヒトまたはイヌのものである。
【００１５】
前記方法においては、該試験化合物の溶液を工程１において７つの異なる濃度（希釈度）で調製する。
【００１６】
前記方法においては、式Ｉの放射性リガンド化合物は、５００より大きな比放射能、好ましくは約９００Ｃｉ／ｍｍｏｌ〜約１４９８Ｃｉ／ｍｍｏｌの範囲の比放射能を有する。前記方法においては、各濃度の該試験化合物、該ＤＭＳＯ対照ビヒクルまたは式ＩＩの化合物および該放射性リガンドに結合した膜を工程４においてユニフィルター（Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ）（Ｐａｒｋａｒｄ）で濾過する。
【００１７】
本発明の実施態様の１つは、式Ｉの放射性リガンド化合物の製造における鍵中間体
【化１６】
2004512268.tif 000003
の製造方法であって、
（１）アルコール
【化１７】
2004512268.tif 000004
を２，６−ルチジンおよびｔ−ブチルジメチルシリルトリフラートと反応させてｔ−ブチルジメチルシリル保護ヒドロキシル化合物
【化１８】
2004512268.tif 000005
を得る工程、
（２）水素化ナトリウムで処理し次いで２−トリメチルシリルエタンスルホニルクロリドで処理することにより、該ｔ−ブチルジメチルシリル保護ヒドロキシル化合物をアルキル化してジ置換スルホンアミド化合物
【化１９】
2004512268.tif 000006
を得る工程、
（３）該ジスルホンアミドをＣ１−Ｃ８−アルカンチオラートで処理して、以下のスルホンアミドの混合物
【化２０】
2004512268.tif 000007
を得る工程、
（４）クロマトグラフィーを用いて該スルホンアミド混合物を分離して、無極性溶媒系で溶出する無極性スルホンアミド
【化２１】
2004512268.tif 000008
を単離し、ついで極性溶媒系を用いて極性異性体
【化２２】
2004512268.tif 000009
を溶出除去する工程、
（５）有機溶媒中のフッ化物化合物を使用し、約２４時間〜約４８時間加熱して、該無極性異性体
【化２３】
2004512268.tif 000010
を脱スルホン化して、遊離アルコール−アミン
【化２４】
2004512268.tif 000011
を得る工程、
（６）該遊離アルコール−アミン
【化２５】
2004512268.tif 000012
を有機溶媒中でトリメチルシリルイミダゾールと反応させて所望のトリメチルシリルオキシ化合物を得る工程を含んでなる製造方法である。
【００１８】
前記の製造方法の出発物質（式ＩＩの化合物とも称される）は、米国特許第５，６３３，２４７号、第５，２０６，２４０号、第５，４８４，９２３号および第５，４６４，７６２号に記載されている。また、この出発物質の合成におけるテトラヒドロナフタレン中間体の不斉合成が、１９９６年１月１０日付け公開の英国特許公開第２，２９０，７９０号に記載されている。前記の製造方法の工程２のアルキル化においては、室温で２４時間まで、好ましくは１８時間にわたり攪拌を行う。前記の製造方法において、工程３で使用するＣ１−Ｃ８−アルカンチオラートとしては、分枝または直鎖状アルカンチオラート、例えばナトリウムまたはカリウムヘキサンチオラート、ナトリウムまたはカリウムブタンチオラート、ナトリウムまたはカリウム２−メチルペンタンチオラート、ナトリウムまたはカリウム２−メチルプロパンチオラート、ナトリウムまたはカリウムメタンチオラート、ナトリウムまたはカリウムエタンチオラート、好ましくはナトリウム２−メチルプロパンチオラートが挙げられる。前記の製造方法において、工程３における脱スルホン化反応は、２４時間未満、好ましくは約３０分間〜１時間行う。前記の製造方法において、工程４におけるスルホンアミド混合物の分離は、酢酸エチルおよびヘキサンから酢酸エチルおよびメタノールへの溶媒系、好ましくは、１：１　酢酸エチル：ヘキサンの無極性溶媒系および９９：１　酢酸エチル：メタノールの極性溶媒系でフラッシュクロマトグラフィーを用いて行う。前記の製造方法において、工程５の脱スルホン化で使用するフッ化物化合物は、フッ化セシウム（ＣｓＦ）およびテトラブチルアンモニウムフルオリドから選ばれ、好ましくはＣｓＦである。前記の製造方法において、工程５の脱スルホン化で使用する有機溶媒は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシドおよびＮ−メチルピロリジノンから選ばれ、好ましくはＤＭＦである。前記の製造方法において、工程６における有機溶媒としては、アセトニトリル、テトラヒドロフランまたはエーテル、好ましくはアセトニトリルが挙げられる。
【００１９】
本発明の実施態様の１つは、式Ｉ
【化２６】
2004512268.tif 000013
の放射性リガンド化合物の製造方法であって、
（ａ）アミン
【化２７】
2004512268.tif 000014
を有機塩基の存在下で［３５Ｓ］−メタンスルホニルクロリドと反応させて、シリル保護［３５Ｓ］−メタンスルホンアミド体を形成させる工程、及び、
（ｂ）該シリル保護［３５Ｓ］−メタンスルホンアミド体のシリル保護基をトリフルオロ酢酸で除去して、式Ｉの放射性リガンド化合物を得る工程を含んでなる製造方法である。
【００２０】
該製造方法においては、トリエチルアミン、トリメチルアミンおよびジイソプロピルエチルアミンのような有機塩基、好ましくはトリエチルアミンを使用する。該製造方法は、好ましくは、無水条件下、室温で約２時間行う。
【００２１】
また、アミン化合物
【化２８】
2004512268.tif 000015
である、式Ｉの放射性リガンド化合物の合成の鍵中間体も、本発明の範囲内である。
【００２２】
放射性リガンド化合物である［３５Ｓ］−放射性標識（＋）−Ｎ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−ヒドロキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］メタンスルホンアミドは、以下の合成経路を用いて製造する。スキーム１および２は、Ｎ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−ヒドロキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］メタンスルホンアミドからＮ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−トリメチルシリルオキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］アミンを製造するための工程を示す。スキーム３は、［３５Ｓ］−亜硫酸ナトリウムを使用して［３５Ｓ］−メタンスルホン酸ナトリウムを製造し、次いでそれを対応スルホニルクロリドに変換する放射性標識メタンスルホニル　クロリドの製造、および該放射性標識メタンスルホニルクロリドでの該アミンのスルホニル化、およびそれに続く該トリメチルシリル保護基の除去を示す。
【００２３】
【化２９】
2004512268.tif 000016
【００２４】
【化３０】
2004512268.tif 000017
【００２５】
【化３１】
2004512268.tif 000018
【００２６】
以下の実施例は本発明を例示するものであり、それ自体が本明細書に添付の特許請求の範囲に記載の発明を限定するとみなされるべきではない。
【００２７】
実施例１
【化３２】
2004512268.tif 000019
Ｎ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−トリメチルシリルオキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］アミン
工程Ａ：　Ｎ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］メタンスルホンアミド
アルゴン下のＮ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−ヒドロキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］メタンスルホンアミド（５．０ｇｍ，１０．７ｍｍｏｌ）の−２０℃のジクロロメタン（５０ｍＬ）溶液に、２，６−ルチジン（３．７４ｍＬ，３２．１ｍｍｏｌ）、ついでｔ−ブチルジメチルシリルトリフラート（６．４６ｍＬ，２６．８ｍｍｏｌ）を加えた。該反応混合物を反応完了まで３時間にわたり０℃で攪拌した。該反応物を真空中で濃縮し、メタノールで希釈し、１Ｎ水酸化ナトリウム（１１０ｍＬ）をゆっくりと加えた。該混合物を３０分間攪拌し、酢酸エチル（２×２００ｍＬ）で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、真空中で濃縮して油（９ｇｍ）を得た。９５／５　ジクロロメタン／アセトン、ついで９０／１０／３　ジクロロメタン／アセトン／メタノールを使用するフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、濃縮後、Ｎ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−ｔ−ブチルジメチルシリルヒドロキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］メタンスルホンアミド（５．５ｇｍ，８８％）を白色固体として得た。ＭＳ　ｍ／ｚ　５８２（Ｍ＋）。
【００２８】
工程Ｂ：　Ｎ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］トリメチルシリルエタンスルホンアミドの製造
アルゴン下のＮ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］メタンスルホンアミド（２．５ｇｍ，４．３０ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液に、水素化ナトリウム（６０％分散液，０．５０ｇｍ，１３．０ｍｍｏｌ）を加えた。該混合物を３０分間攪拌し、−２０℃に冷却し、トリメチルシリルエタンスルホニルクロリド（２．５ｍＬ，１２．４ｍｍｏｌ）を加えた。該反応物を１８時間攪拌し、ついでナトリウム２−メチルプロパンチオラート（５．０ｇｍ，４４．０ｍｍｏｌ）を一度に加えた。該反応物を３０分間攪拌し、水（２００ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（４００ｍＬ）で抽出した。該有機抽出物をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空中で濃縮して油を得、１／１　酢酸エチル／ヘキサンを使用するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、Ｎ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］トリメチルシリルエタンスルホンアミド（１．４３ｇｍ，５０％）を得、ついで９９／１　酢酸エチル／メタノールを使用してＮ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−ｔ−ブチル−ジメチルシリルオキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］メタンスルホンアミド（１．１ｇｍ，４４％）を得た。ＭＳ　ｍ／ｚ　６６８（Ｍ＋）。
【００２９】
工程Ｃ：　Ｎ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−ヒドロキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］アミンの製造
アルゴン下のジメチルホルムアミド（５ｍＬ）中のＮ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］トリメチルシリルエタンスルホンアミド（０．５０ｇｍ，０．７５ｍｍｏｌ）の混合物に、フッ化セシウム（０．３４ｇｍ，２．２５ｍｍｏｌ）を加え、該混合物を９５℃まで３０時間にわたり加熱した。該反応物を冷却し、１０％炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で抽出した。該有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空中で濃縮して油を得、９０／１０　ジクロロメタン／メタノールを使用するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、Ｎ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−ヒドロキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］アミン（０．２１８ｇｍ，８０％）を泡状物として得た。ＭＳ　ｍ／ｚ　３９０（Ｍ＋），１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤＣＬ３）δ１．４−２．２（９Ｈ，ｍ），２．６−３．２（９Ｈ，ｍ），３．４（２Ｈ，ｂｒ　ｓ），４．８２（１Ｈ，ｂｒ　ｔ），６．６０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．３および２．８Ｈｚ），６．７１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），６．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ），７．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ）、７．３７（２Ｈ，ｍ）。
【００３０】
工程Ｄ：　Ｎ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−トリメチルシリルオキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］アミンの製造
アルゴン下のＮ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−ヒドロキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］アミン（５０ｍｇ，０．１２８ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液に、トリメチルシリルイミダゾール（０．３６ｇｍ，２．５ｍｍｏｌ）を加え、該反応物を１．５時間にわたり６０℃に加温した。該反応物を真空中で濃縮し、９５／５／０．１　ジクロロメタン／メタノール／トリエチルアミンを使用するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、Ｎ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−トリメチルシリルオキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］アミンを泡状物（５８ｍｇ，９８％）として得た。ＭＳ　ｍ／ｚ　４６２（Ｍ＋），１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤＣＬ３）δ０．０９（９Ｈ，ｓ），１．４−２．１（８Ｈ，ｍ），２．４−２．９（９Ｈ，ｍ），３．２（２Ｈ，ｂｒ　ｓ），４．６５（１Ｈ，ｔ），６．４１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚおよび３．３Ｈｚ），６．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ），６．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），７．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），７．２２（２Ｈ，ｍ）。
【００３１】
実施例２
【化３３】
2004512268.tif 000020
［３５Ｓ］−Ｎ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−ヒドロキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］メタンスルホンアミド
工程Ａ：　［３５Ｓ］−メタンスルホン酸ナトリウム
［３５Ｓ］−亜硫酸ナトリウム（１Ｃｉ／ｍｍｏｌ，１０ｍＭ　ＤＴＴおよび１ｍＭ　ＥＤＴＡの存在下の１００μＬの０．１Ｎ　ＮａＯＨ溶液中、２１５μＣｉ）（生成した［３５Ｓ］二酸化硫黄を水酸化ナトリウム溶液中に捕捉しながら銅表面上で［３５Ｓ］硫酸を還元することにより得ることができる）の溶液に２５μＬのヨウ化メチルを加え、該反応物を室温で２０分間攪拌した。ＨＰＬＣ（ＡｓｔｅｃシクロボンドＩカラム、１ｍＬ／分、２０分間にわたる１０ｍＭ　硝酸溶液から１８０ｍＭ　硝酸溶液への勾配）による放射能の分析は、［３５Ｓ］−メタンスルホン酸への完全な変換を示した。該溶液を、ほぼ乾固状態になるまで窒素下で濃縮し、５００μＬのＤＩ水を加え、該溶液を窒素で脱気した。得られた［３５Ｓ］−メタンスルホン酸ナトリウム（１７７μＣｉ）の溶液を０℃で保存した。
【００３２】
工程Ｂ：　［３５Ｓ］−メタンスルホニルクロリド
［３５Ｓ］−メタンスルホン酸溶液（２．０８ｇの０．１Ｎ　水酸化ナトリウム中、３．３７ｍＣｉ、比放射能＝１３４２Ｃｉ／ｍｍｏｌ、約９０％ＲＣＰ、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒから入手）を、乾固するまで５０℃で窒素気流下で吹き飛ばした。得られた残渣に、ジクロロメタン（１ｍＬ）、ついでオキサリルクロリド（１００μＬ，０．５４ｍｍｏｌ）を加えた。激しいガス発生が約１．５時間にわたり生じ、その時点で、追加的なオキサリルクロリド（２０μＬ）の添加は可視反応を引き起こさなかった。ジクロロメタン（２０μＬ）中のジメチルホルムアミドの１０％溶液を加えると、黄緑色に変色した。オキサリルクロリド（２０μＬ，０．７６１ｍｍｏｌ（合計））の添加は可視反応を引き起こさなかった。該反応混合物を０℃で１２時間攪拌した。該混合物を室温に加温し、ジクロロメタン（３ｍＬ）で希釈し、計数し（２．３７ｍＣｉ）、５％炭酸水素ナトリウム溶液（２×１ｍＬ）、ついで２％亜硫酸水素ナトリウム溶液（１ｍＬ）で洗浄した。該ジクロロメタン溶液を硫酸ナトリウムで乾燥させ、デシケーター内で乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中、−７８℃で保存した。ＨＰＬＣ：Ｚｏｒｂａｘ　ＳＢ−Ｃ８　４．８×２５０ｍｍ分析用カラム、３０分間で８０％水（０．１％　トリフルオロ酢酸を含有）：２０％アセトニトリルから２０％水（０．１％　トリフルオロ酢酸を含有）：８０％アセトニトリルまで、ＵＶ＝２５４ｎｍ、流速＝１ｍｌ／分、［３５Ｓ］−メタンスルホニルクロリドの保持時間（Ｒｔ）＝９．２分間。得られた溶液を計数することによる放射能の測定は、１．７５ｍＣｉ（収率約５８％）が存在することを示した。該［３５Ｓ］−メタンスルホニルクロリドの製造に関する詳細は、“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　Ｈｉｇｈ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　Ｓｕｌｆｕｒ−３５　Ｌａｂｅｌｌｅｄ　Ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ　Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ　Ｔｈａｔ　Ａｌｌｏｗｅｄ　ｔｈｅ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｎｅｗ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ．”　Ｄｅａｎ，Ｄ．Ｃ．，Ｎａｒｇｕｎｄ，Ｒ．Ｐ．，Ｍｅｌｉｌｌｏ，Ｄ．Ｇ．，Ｐｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．，Ｐａｔｃｈｅｔｔ，Ａ．Ａ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｇ，Ｃｈａｕｎｇ，Ｌ．Ｐ．，Ｅｌｌｓｗｏｒｔｈ，Ｒ．Ｌ．，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｐ．，Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｐｌｏｅｇ，Ｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９６，３９，１７６７に記載されている。
【００３３】
工程Ｃ：　［３５Ｓ］−Ｎ−［１’−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２（Ｒ）−ナフタレニル）−３，４−ジヒドロ−４（Ｒ）−ヒドロキシスピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−６−イル］メタンスルホンアミドの製造
ＣＨ２Ｃｌ２中の［３５Ｓ］−メタンスルホニルクロリドのストック溶液（無水硫酸ナトリウムで新たに乾燥されたもの）から、２５ｍＣｉの［３５Ｓ］−メタンスルホニルクロリドを２５ｍｌナシ型フラスコ内に移し、過剰の溶媒を大気圧、６０〜６４℃で蒸留した。溶液の容積が約１００〜２００μｌになったら、該蒸留を止めた。該フラスコを加熱浴から取り外し、少し冷却した。ついでこの溶液を、３０μｌの無水ＣＨ２Ｃｌ２中の実施例１、工程Ｄのアミン生成物（〜５ｍｇ、該［３５Ｓ］−メタンスルホニルクロリドに対して〜５０００倍過剰）を含有する溶液に、鈍端シリンジを介して移した。該蒸留フラスコを無水ＣＨ２Ｃｌ２（２×５０μｌ）で洗浄し、合わせた有機溶媒を該反応混合物に移した。この溶液に、１０μｌの無水トリエチルアミン（活性化モレキュラーシーブ４Ａ下で保存したもの）を加えた。該反応混合物を室温で２時間攪拌した。ＨＰＬＣ溶離液中に該反応溶液のアリコート（＜０．１μＬ）をクエンチすることにより、該反応混合物をＨＰＬＣ分析によりアッセイした（ＨＰＬＣ系：Ｚｏｒｂａｘ−ＳＢ−Ｃ８　４．５×２５０ｍｍ分析用カラム、３０分間の７０％水（０．１％　ＨＣｌＯ４を含有）：３０％アセトニトリルから１０分間かけて１００％ＭｅＣＮへ、ついで１０分間維持、ＵＶ＝２３０ｎｍ、流速＝１ｍｌ／分、［３５Ｓ］ＭｅＳＯ３ＨのＲｔ＝３．１分、アミンのＲｔ＝５．１分、［３５Ｓ］スルホンアミドのＲｔは１０．１分、〜５０％　［３５Ｓ］ＭｅＳＯ３Ｈ、４５％の放射化学的収率）。
【００３４】
該反応物を２００μｌの水および１０μｌのトリフルオロ酢酸（Ｏ−トリメチルシリル基を脱保護するため）で希釈した。室温で３０分間攪拌した後、該反応混合物を５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、激しく攪拌した。該ジクロロメタン層を分離し、飽和炭酸水素ナトリウム（２×２ｍｌ）で洗浄した。該水層をＣＨ２Ｃｌ２（２×１０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下でロータリーエバポレーターを使用して蒸発乾固した。得られた残渣をアセトニトリル：水（２：１　ｖ：ｖ）の混合物に溶解し、分取ＨＰＬＣ（Ｚｏｒｂａｘ−ＳＢ−Ｃ８　９．４×２５０ｍｍ　セミ分取カラム、０．１％ＨＣｌＯ４を含有する７５％水：２５％アセトニトリル、ＵＶ＝２３０ｎｍ、流速＝３ｍｌ／分、ＭＫ−０４９９のＲＴ＝１４．９分間）を用いて精製した。該生成物含有画分を合わせ、飽和炭酸水素ナトリウムで中和した。ポリプロピレン容器中の窒素下での濃縮により、アセトニトリルを除去し、得られた溶液をＳｅｐ−Ｐａｋ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｃ−１８）カートリッジに通した。該カートリッジを水（１０ｍｌ）で洗浄し、ついで該生成物をメタノール（２×５ｍｌ）で溶出した。該メタノール画分を集め、それが１１．５ｍＣｉの全活性を有することを確認した。
【００３５】
このバッチは、２．３分で１．３％の放射化学的不純物度を、６．７分で１．１％の不純物度を示した。したがって、このバッチを、前記と同じ条件を用いるＺｏｒＢａｘ−ＳＢフェニルセミ分取カラムを使用して再精製し、ついでＳｅｐ−Ｐａｋ精製を行った。得られた全活性は８．８３２ｍＣｉであり、放射化学的純度は＞９９％であった。式Ｉの化合物は１３６８Ｃｉ／ｍｍｏｌの比放射能を有する。
【００３６】
実施例３
［３５Ｓ］ＭＫ４９９はＨＥＫ２９３細胞膜におけるｈＥＲＧ　Ｋ＋チャンネルに結合する
工程Ａ：　材料
Ａ．バッファー：
【表１】
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【００３７】
Ｂ．膜：
ｈＥＲＧを構成的に発現するヒト胎児腎細胞を回収し、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓおよび１ｍＭのＥＤＴＡを含有（ｐＨ７．４））中でホモジナイズし、４５，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離する。該ペレットをＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーに再懸濁し、再ホモジナイズし、前記のとおりに遠心分離する。最後に、該ペレットをＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーに再懸濁し、アリコート化し、−７０℃で保存する。膜を実験当日に手短にホモジナイズし、各アリコートを１回だけ使用する。
【００３８】
Ｃ．放射性リガンド：
５０ｐＭの最終濃度の式Ｉ
【００３９】
Ｄ．非特異的置換体：
式ＩＩ；１μＭ ）
【００４０】
Ｅ．細胞：
細胞は、ｈＥＲＧ　ｃＤＮＡで安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３である。Ｚ．Ｚｈｏｕら　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　７４　ｐｐ．２３０−２４１（１９９８）を参照されたい。細胞は凍結培地中に存在する。細胞を、アール（Ｅａｒｌｅ）塩、非必須アミノ酸（０．１ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリン（５０単位／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、ジェネティシン（Ｇ４１８，Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ，０．４ｍｇ／ｍｌ）およびウシ胎仔血清（１０％）で補足された最小必須培地（ＭＥＭ）中で培養すべきである。
【００４１】
工程Ｂ：　結合アッセイ
ヒトＥＲＧ（ｈＥＲＧ）膜をアッセイバッファー中に希釈し、最終濃度５０ｐＭまで放射性リガンドと混合し、４００μｌの膜／リガンド混合物をウェルごとに、４μｌの１００×ストックの試験薬または１００％ＤＭＳＯ（最大結合）または式ＩＩの化合物の１００μＭ溶液（非特異的結合）を含有する９６ウェルアッセイブロック（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｔ．＃３９５７）に加える。該アッセイにおける最終膜タンパク質濃度は１１μｇ／ｍｌである。この混合物を室温で７５分間インキュベートし、ついで、０．１％ＢＳＡ中に予浸されたＧＦ／Ｂユニフィルター（Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ）（Ｐａｃｋａｒｄ）で濾過し、５×５００μｌの氷冷洗浄バッファーで洗浄する。該フィルターを換気フードの内部で室温で乾燥させ、５０μｌのマイクロシント（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ）−２０を各ウェルに加え、ユニフィルター（Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ）をトップカウント（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ）（Ｐａｃｋａｒｄ）中で１分間計数する。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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