(57)【要約】本発明は、改善された安定性及び／又は性能を有する変種ＥＧＩＩＩセルラーゼに関する。変種セルラーゼは感受性残基に置換を有することにより安定性及び／又は性能を改善する。
2004512827.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
界面活性剤のストレス及び／又は温度のストレスに感受性の残基において置換を含む、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩセルラーゼ由来の変種ＥＧＩＩＩセルラーゼ。
【請求項２】
ＥＧＩＩＩ中の残基Ｗ７，Ｇ３１，Ａ３５，Ｈ４５，Ｓ６３，Ｓ７７，Ｍ７９，Ｈ１０８，Ｔ１４５，Ｙ１４７，Ｍ１５４，Ｑ１６２，Ｔ１６３，Ｎ１６７，Ｎ１７４，及び／又はＶ１９２の一つ又は複数に対応する位置において置換又は欠失を含む、請求項１記載のセルラーゼ。
【請求項３】
ＥＧＩＩＩ中の残基Ｗ７Ｙ，Ｇ３１Ｑ，Ａ３５Ｖ，Ｈ４５Ｑ，Ｓ６３Ｖ，Ｓ７７Ｇ，Ｍ７９Ｉ，Ｈ１０８Ｒ，Ｔ１４５Ｅ，Ｙ１４７Ｗ，Ｍ１５４Ｎ，Ｑ１６２Ｐ，Ｔ１６３Ｓ，Ｎ１６７Ｓ，Ｎ１７４Ｄ，及び／又はＶ１９２Ｌの一つ又は複数に対応する位置において置換又は欠失を含む、請求項１記載のセルラーゼ。
【請求項４】
請求項１記載のセルラーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項５記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項６】
請求項６記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項７】
工程：
（ａ）セルラーゼを生成するのに適した条件下で適当な培養培地中で請求項７記載の宿主細胞を培養し；そして
（ｂ）生成されたセルラーゼを得ること
を含む、改善された安定性及び／又は性能を有する変種ＥＧＩＩＩセルラーゼを生成する方法。
【請求項８】
界面活性剤及び／又は温度に感受性の残基において置換を含むセルラーゼ及び界面活性剤を含む洗浄剤組成物。
【請求項９】
変種ＥＧＩＩＩセルラーゼがＥＧＩＩＩ中の残基Ｗ７，Ｇ３１，Ａ３５，Ｈ４５，Ｓ６３，Ｓ７７，Ｍ７９，Ｈ１０８，Ｔ１４５，Ｙ１４７，Ｍ１５４，Ｑ１６２，Ｔ１６３，Ｎ１６７，Ｎ１７４，及び／又はＶ１９２の一つ又は複数に対応する位置において置換又は欠失を含む、請求項９記載の洗浄剤。
【請求項１０】
変種ＥＧＩＩＩセルラーゼがＥＧＩＩＩ中の残基Ｗ７Ｙ，Ｇ３１Ｑ，Ａ３５Ｖ，Ｈ４５Ｑ，Ｓ６３Ｖ，Ｓ７７Ｇ，Ｍ７９Ｉ，Ｈ１０８Ｒ，Ｔ１４５Ｅ，Ｙ１４７Ｗ，Ｍ１５４Ｎ，Ｑ１６２Ｐ，Ｔ１６３Ｓ，Ｎ１６７Ｓ，Ｎ１７４Ｄ，及び／又はＶ１９２Ｌの一つ又は複数に対応する位置において置換又は欠失を含む、請求項１０記載の洗浄剤。
【請求項１１】
洗浄剤がランドリー用洗浄剤である、請求項９記載の洗浄剤。
【請求項１２】
洗浄剤が皿洗い用洗浄剤である、請求項９記載の洗浄剤。
【請求項１３】
セルロース含有織物の処理における、請求項１記載の変種ＥＧＩＩＩセルラーゼの使用。
【請求項１４】
飼料付加物としての、請求項１記載の変種ＥＧＩＩＩセルラーゼの使用。
【請求項１５】
ウッドパルプ処理における、請求項１５記載の変種ＥＧＩＩＩセルラーゼの使用。
【請求項１６】
バイオマスからグルコースへの還元における、ウッドパルプ処理における、請求項１５記載の変種ＥＧＩＩＩセルラーゼの使用。
【請求項１７】
インディゴ染色されたデニムのストーンウオッシングにおける、請求項１５記載の変種ＥＧＩＩＩセルラーゼの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
政府後援の研究及び開発
適用外。
【０００２】
発明の背景
セルラーゼは、セルロース中のβ−Ｄ−グルコシド結合の加水分解が可能な酵素である。セルロース分解酵素は伝統的に３つの主要なクラスに分類されてきた：エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ又はセロビオヒドラーゼ及びβ−グルコシダーゼであり（Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，（１９８７），ＴＩＢＴＥＣＨ　５，２５５−２６１）；多数の細菌、酵母及び真菌により製造されることが知られている。
【０００３】
セルラーゼはウッドパルプ及び動物用飼料を分解するのに用いられるが、セルラーゼは主に織物の処理、例えば泥又は灰色傾向の除去の補助のための洗浄剤組成物において（例えば、大英帝国出願番号２，０７５，０２８、２，０９５，２７５及び２，０９４，８２６を参照）又は織物の感触及び外観を改良するための販売前の織物の処理にいおいて使用される。即ち、大英帝国出願番号１，３５８，５９９は、コットンを含む織物のざらつきを軽減するために洗浄剤中のセルラーゼの使用を例示する。
【０００４】
セルラーゼは、織物の色をより活気あるものにすることにより使用された織物を改良するために織物の処理においても使用されてきた（Ｔｈｅ　Ｓｈｉｚｕｏｋａ　Ｐｒｅｆｅｃｔｕｒａｌ　Ｈａｍａｍａｔｓｕ　Ｔｅｘｔｉｌｅ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｒｅｐｏｒｔ　２４：５４−６１（１９８６））。コットンを含む織物の繰り返しの洗浄は織物に灰色傾向をもたらすが、破壊されて不規則になった繊維によると信じられ、ときどき機械の作用による「毛玉（ｐｉｌｌｓ）」と呼ばれる。この灰色傾向は色付きの織物において特に目立つ。結果として、織物の不規則な上部層を除去して即ち織物の全体の外観を改良することにおけるセルラーゼの能力は価値がある。
【０００５】
多くの工業上のプロセスにおけるその有用性のため、ひとつ又は複数の特定の応用に関して特に有効な性能特性を有する特定のセルラーゼ組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）又は成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）を研究する分野において時代の風潮があった。セルラーゼの可能な源として、実務家は真菌及び細菌に焦点を合わせた。例えば、特定の真菌、例えばＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種（特に、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）により生産されるセルラーゼは大いに注目されたが、何故ならばセルロースの結晶形態を分解することができる完全なセルラーゼが発酵の手法により大量に容易に提供されるからである。この特定のセルロース複合体を広く分析することにより、その特定の成分の性質及びそれらの成分が工業上のプロセスにおいて機能する能力を測定した（Ｗｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ．，”Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，１６０，２５，ｐａｇｅｓ　２３４，及び次参照（１９８８））。米国特許番号５，４７５，１０１（Ｗａｒｄ　ｅｔ　ａｌ．）は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ由来のエンドグルカナーゼＩＩＩ（ＥＧＩＩＩ）と呼ばれる一つの特に有用な酵素の精製及び分子クローニングを開示する。
【０００６】
ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１４９５３は、各２０ヌクレアーゼ有する一連のＤＮＡ配列の何れか一つを含む核酸によりコードされるエンドグルカナーゼを開示する。
【０００７】
Ｏｏｉ，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１８：２１７−２２２（１９９０）は、アミノ酸ストリングスＮＮＬＷＧ，ＥＬＭＩＷ及びＧＴＥＰＦＴを含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓにより生産されるエンドグルカナーゼＥＦ１−ＣＭＣをコードするｃＤＮＡ配列を開示する。Ｓａｋａｍｏｔｏ，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２７：４３５−４３９（１９９５）は、アミノ酸ストリングスＥＬＭＩＷ及びＧＴＥＰＦＴを含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｋａｗａｃｈｉｉ由来のエンドグルカナーゼＣＭＣａｓｅ−１をコードするｃＤＮＡ配列を開示する。Ｗａｒｄ，ｅｔ　ａｌ．，は、アミノ酸ストリングスＮＮＬＷＧ，ＥＬＭＩＷ及びＧＴＥＰＦＴを有するＥＧＩＩＩの配列を開示する。さらに、２つのセルラーゼ配列、一方がＥｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖａｒａそしてＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ　ｍａｒｉｎｕｓが、Ｓａａｒｉｌａｈｔｉ，ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ　９０：９−１４（１９９０）及びＨｒｅｇｇｖｉｄｓｓｏｎ，ｅｔ　ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．６２：３０４７−３０４９（１９９６）に開示されており、アミノ酸ストリングＥＬＭＩＷを含む。
【０００８】
上記のエリアの幾つか又は全てにおいて応用性を有する多くのセルラーゼ組成物に関する業界の知見に拘わらず、セルラーゼが有用な応用において存在する条件下で改良された安定性を有する新規のセルラーゼ組成物、例えば家庭の洗浄剤及びランドリーの洗浄剤及び織物処理用の組成物に関する継続する要求が存在する。
【０００９】
発明の概要
変種（ｖａｒｉａｎｔ）のＥＧＩＩＩセルラーゼが提供されるが、上記セルラーゼは温度のストレスに対して感受性の残基において置換を有し、そして上記変種ＥＧＩＩＩセルラーゼはＴ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩセルラーゼに由来する。好ましい態様において、上記変種は、残基Ｗ７，Ｇ３１，Ａ３５，Ｈ４５，Ｓ６３，Ｓ７７，Ｍ７９，Ｈ１０８，Ｔ１４５，Ｙ１４７，Ｍ１５４，Ｑ１６２，Ｔ１６３，Ｎ１６７，Ｎ１７４，及び／又はＶ１９２の一つ又は複数に対応する位置において置換又は欠失を含む。より好ましい態様において、上記変種は、残基Ｗ７Ｙ，Ｇ３１Ｑ，Ａ３５Ｖ，Ｈ４５Ｑ，Ｓ６３Ｖ，Ｓ７７Ｇ，Ｍ７９Ｉ，Ｈ１０８Ｒ，Ｔ１４５Ｅ，Ｙ１４７Ｗ，Ｍ１５４Ｎ，Ｑ１６２Ｐ，Ｔ１６３Ｓ，Ｎ１６７Ｓ，Ｎ１７４Ｄ，及び／又はＶ１９２Ｌの一つ又は複数に対応する位置において置換又は欠失を含む。
【００１０】
この発明の別の態様において、変種ＥＧＩＩＩセルラーゼをコードするＤＮＡが提供される。この態様において、ＤＮＡはベクター中にある。この態様の好ましい側面において、ベクターは宿主細胞を形質転換するために使用される。
【００１１】
さらに別の態様において、改良された安定性及び／又は性能を有する変種ＥＧＩＩＩセルラーゼを生産する方法が提供される。当該方法は、セルラーゼを生産するために適した条件下で適当な培養培地中で宿主細胞を培養し、そして生産されたセルラーゼを得る工程を含む。さらに別の態様において、界面活性剤及び変種ＥＧＩＩＩセルラーゼを含む洗浄剤組成物が提供されるが、但し、セルラーゼは温度に感受性の残基において置換を含む。好ましい態様において、変種ＥＧＩＩＩセルラーゼは、残基Ｗ７，Ｇ３１，Ａ３５，Ｈ４５，Ｓ６３，Ｓ７７，Ｍ７９，Ｈ１０８，Ｔ１４５，Ｙ１４７，Ｍ１５４，Ｑ１６２，Ｔ１６３，Ｎ１６７，Ｎ１７４，及び／又はＶ１９２の一つ又は複数に対応する位置において置換又は欠失を含む。より好ましい態様において、変種ＥＧＩＩＩセルラーゼは、残基Ｗ７Ｙ，Ｇ３１Ｑ，Ａ３５Ｖ，Ｈ４５Ｑ，Ｓ６３Ｖ，Ｓ７７Ｇ，Ｍ７９Ｉ，Ｈ１０８Ｒ，Ｔ１４５Ｅ，Ｙ１４７Ｗ，Ｍ１５４Ｎ，Ｑ１６２Ｐ，Ｔ１６３Ｓ，Ｎ１６７Ｓ，Ｎ１７４Ｄ，及び／又はＶ１９２Ｌの一つ又は複数に対応する位置において置換又は欠失を含む。この態様の別の側面において、洗浄剤はランドリー又は家庭用の洗浄剤である。
【００１２】
別の態様において、セルロースを含む織物、特にストーンウオッシングインディゴ染色デニムの処理において、上記変種ＥＧＩＩＩセルラーゼを使用する。この態様の別の側面において、この発明のセルラーゼは飼料添加物として、ウッドパルプの処理において、バイオマスのグルコースへの還元において使用される。
【００１３】
発明の詳細な説明
出願人は、前に、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ由来のＥＧＩＩＩに有意な相同性を有するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ由来の新規なセルラーゼを単離した（共にそれらの全体を引用により編入する、１９９８年６月２４日に出願された米国特許出願０９／１０４，３０８及び１９９９年５月２８日に出願されてＧＣＩドケット番号ＧＣ５４０−２を付与された米国特許出願）。このセルラーゼの分析は、有意な相同性にも拘わらず、２つのセルラーゼの間に性能に関する実質的な相異が存在するという発見をもたらした。事実、相同な酵素は、温度のストレスの条件下又は界面活性剤の存在下では顕著に減じられた性能を有する。これは、ＥＧＩＩＩの安定性及び／又は性能に対して有意な影響を有する蛋白質の部分又はエリアに非相同の位置が位置することを示す。即ち、出願人は、１１ＡＧ８から残基を補充する（ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ）ことにより、異なる位置の一つ又は複数においてＥＧＩＩＩ内で残基を最適化することにより、ＥＧＩＩＩの性能を最適化することが可能であることを発見した。
【００１４】
従って、本発明は、例えば、界面活性剤又は温度のストレスの存在下で改良された性能を有する変種ＥＧＩＩＩセルラーゼに関する。当該変種は、安定性及び／又は性能に必須であると本明細書において同定された一つ又は複数の残基の、改良された安定性及び／又は性能を酵素に付与する残基による置換により特徴付けられる。好ましくは、しかし必然ではなく、感受性の残基を、その位置の野生型（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ　ＥＧＩＩＩ）残基に比較して、改良された酸化性、アルカリ性又は熱安定性を有して且つＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓの１１ＡＧ８内に存在する残基に置換する。適切な置換は安定性を修飾する如何なる置換であってもよく、特に好ましい置換は、改良された安定性を提供する置換であり、そしてもっとも好ましくは、電荷、極性及び／又はサイズに関して保存された修飾を提供する置換である。非限定例として、特に価値のある置換は、ロイシンをイソロイシンに修飾する置換、イソロイシンをロイシンに修飾する置換、トリプトファンをチロシンに修飾する置換、スレオニンをアスパラギンに修飾する置換、アラニンをグリシンに修飾する置換、セリンをアスパラギンに修飾する置換、グリシンをプロリンに修飾する置換及びアスパラギンをスレオニンに修飾する置換を含む。
定義
明細書内では、特定の用語を以下のように定義して、特許請求の範囲の発明の性質を明らかにする。
【００１５】
「セルラーゼ」は、当業界においてよく分類されているカテゴリーの酵素であり、セルロースポリマーを短いロ−オリゴサッカライドオリゴマー、セロビオース及び／又はグルコースに加水分解できる酵素を含む。セロビオース酵素の共通の例は、セロビオヒドロラーゼ類及びエンドグルカナーゼ類であり、そしてセルロース分解性生物の多くの種から得ることができ、特に真菌及び細菌を含む。
【００１６】
「ＥＧＩＩＩセルラーゼ」は、米国特許第５，４７５，１０１号及びＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｓｅｃｏｎｄ　ＴＲＩＣＥＬ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　Ｒｅｅｓｅｉ　Ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ　Ａｎｄ　Ｏｔｈｅｒ　Ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ，Ｓｕｏｍｉｎｅｎ　＆　Ｒｅｉｎｉｋａｉｎｅｎ　ｅｄｓ．，Ｅｓｐｏｏ　Ｆｉｎｌａｎｄ（１９９３），ｐｐ．１５３−１５８（Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．８）に記載されたエンドグルカナーゼ成分を意味する。本明細書において議論されるとおり、ＥＧＩＩＩはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ（ｒｅｅｓｅｉ）に由来し、そして約５．８の至適ｐＨ、約７．４の等電点（ｐＩ）及び約２５ｋＤの分子量により特徴付けられる。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ由来のＥＧＩＩと一般に呼ばれる酵素は、文献において数人の著者らにより名称ＥＧＩＩＩと呼ばれたが、その酵素は分子量、ｐＩ及び至適ｐＨに関して本明細書中のＥＧＩＩＩと定義した酵素とは実質的に異なる。
【００１７】
「セルロース含有織物（ｆａｂｒｉｃ）」は、セルロースを含むコットン又は非コットン又はセルロースブレンドを含むコットン又は非コットンから作成された、あらゆる縫われたか又は縫われていない織物、編み糸又は繊維製品を意味し、天然セルロース誘導体及び人工セルロース誘導体（例えば、黄麻、亜麻、ラミー、レーヨン及びライオセル（ｌｙｏｃｅｌｌ））を含む。人工のセルロース含有織物の項に含まれるのは再生織物であり、当業界においてはレーヨンとしてよく知られている。他の人工セルロース含有織物は、化学修飾されたセルロース織物（例えば、アセテートにより誘導したセルロース）及び溶剤で紡いだ（ｓｏｌｖｅｎｔ−ｓｐｕｎ）セルロース織物（例えば、ライオセル）を含む。セルロース含有織物に特別に含まれるのは、そのような材料から作成されたあらゆる編み糸又は繊維製品である。セルロース含有織物は、合成繊維のような材料及びウール及びシルクのような天然セルロース誘導繊維とのブレンドにしばしば取り込まれる。
【００１８】
ＥＧＩＩＩに存在する残基に「対応する」又は「均等な」Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ由来のＥＧＩＩＩ相同物中の残基は、一次配列相同性、三次構造相同性（例えば、結晶構造又はコンピューターモデリングにより示される）又は機能均等性により示される、ＥＧＩＩＩ中のその均等な位置に存在する残基を意味する。
【００１９】
「均等な残基」は、ｘ線結晶解析によりその三次構造が決定された前駆体プロテアーゼに関する三次構造のレベルにおいて相同性を決定することにより定義してもよい。均等な残基はＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ及びＴ．ｒｅｅｓｅｉからのＥＧＩＩＩ相同物の特定のアミノ酸残基の主鎖の２つ又は複数の原子の原子配位結合（Ｎ上のＮ、ＣＡ上のＣＡ、Ｃ上のＣ、Ｏ上のＯ）が整列化後に０．１３ｎｍ及び好ましくは０．１ｎｍの範囲であるものとして定義される。整列化は、最良のモデルが並べられて配置されることにより、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩに対して問題のＥＧＩＩＩ相同物の非水素蛋白質原子の原子配位結合の最大のオーバーラップを提供した後に達成される。最良のモデルはもっとも高い解析において実験上異なるデータに関するもっとも低いＲ因子を利用可能にさせる結晶解析モデルである。
【００２０】
【数１】
2004512827.tif 000003
【００２１】
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩの特定の残基に機能上類似する均等な残基は、それらがＴ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩの特定の残基に対して定義され且つ原因とされるような様式にて蛋白質の構造、基質結合又は触媒性を変更するか又は修飾するか、又は一因となるコンフォメーションを採用してよい、セルラーゼのアミノ酸として定義される。さらに、それらは、与えられた残基の主鎖原子が相同の位置を占めることに基づいて均等の基準を満たさないかもしれないが、残基の側鎖原子の少なくとも２つの原子配位結合がＴ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩの対応する側鎖原子の０．１３ｎｍに位置する範囲に類似の位置を占めるセルラーゼの残基（ｘ線結晶解析により得られた三次構造に関して）である。Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩの三次元構造の配位結合を上記概要のとおりに用いることにより、三次構造のレベルにて均等な残基を決定することができる。Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩの結晶構造は、Ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｆｏｕｒｔｅｅｎｔｈ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ．Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．２０００年８月５−９日に存在し、その開示は全体を引用により編入する。ファミリー１２のグリコシルヒドロラーゼの相同メンバーである、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓのＣｅｌｌ　Ｂの配位結合は、Ｓｕｌｚｅｎｂａｃｈｅｒ，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３６：６０３２（１９９７）及びＳｕｌｚｅｎｂａｃｈｅｒ，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３８：４８２６（１９９９）に提供される。
【００２２】
「コットン含有織物」は、純粋なコットンまたはコットンブレンドから作られた、縫われたか又は縫われていない織物、編み糸又は繊維製品を意味し、コットンを織り込まれた織物、コットンニット、コットンデニム、コットン編み糸、未加工のコットン等を含む。コットンブレンドを用いる場合、織物中のコットンの量は、好ましくは、コットンの重量あたり少なくとも約３５％である。ブレンドとして用いる場合、織物中に用いられる相手の材料は一つ又は複数の非コットン繊維を含むことができ、セルロース誘導体又は合成繊維、例えばポリアミド繊維（例えば、ナイロン６及びナイロン６６）、アクリル繊維（例えば、ポリアクリロニトリル繊維）、及びポリエステル繊維（例えば、ポリエチレンテレフタレート）、ポリビニルアルコール（例えば、ビニロン）、塩化ポリビニル繊維、ポリビニリデンクロリド繊維、ポリウレタン繊維、ポリウレア繊維及びアラミド繊維を含む。
【００２３】
「洗浄剤組成物」は、汚れたセルロース含有織物の洗濯のための洗浄媒質中での使用のために意図される混合物を意味する。本発明のコンテクストにおいては、そのような組成物は、セルラーゼ及び界面活性剤に加えて、追加の加水分解酵素、研摩剤、漂白剤、漂白活性化剤、青み剤及び蛍光染料、ケーキング阻害剤、マスキング剤、セルラーゼ活性化剤、酸化防止剤、及び可溶化剤を含んでよい。そのような組成物は、汚れた衣服を洗濯するために一般的に使用されて、ストーンウオッシング組成物とは対照的に製造工程において使用されない。セルラーゼを含む洗浄剤組成物は、例えば米国特許第５，２９０，４７４号及びＥＰ公開番号２７１　００４に記載されており、引用により本明細書に編入される。
【００２４】
「ＤＮＡベクター」は、上で記載されたＥＧＩＩＩ又は変種をコードする一つ又は複数のＤＮＡ断片又はＤＮＡ変種断片を含むヌクレオチド配列を意味し、ＥＧＩＩＩの発現を誘導するために適切な宿主細胞を形質転換することに際して使用され得る。
【００２５】
「発現ベクター」は、適切な宿主において上記ＤＮＡの発現を作用させ得る適切な制御配列に作動可能なように連結させたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を意味する。そのような制御配列は、転写を作用させるためのプロモーター、転写を制御するための追加のオペレーター配列、ｍＲＮＡ上の適切なリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の停止を制御する配列を含んでよい。別の細胞種が別の発現ベクターと共に使用されるのが好ましい。Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて使用されるベクターのための好ましいプロモーターはＡｐｒＥプロモーターであり；Ｅ．ｃｏｌｉにおいて使用される好ましいプロモーターはＬａｃプロモーターであり、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて使用される好ましいプロモーターはＰＧＫ１であり、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒにおいて使用される好ましいプロモーターはｇｌａＡであり、そしてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ（ｒｅｅｓｅｉ）のための好ましいプロモーターはｃｂｈＩである。ベクターはプラスミド、ファージ又は単純に有力なゲノミック挿入物であってよい。適切な宿主細胞を形質転換したら、ベクターを宿主のゲノムと独立に複製させて機能させてよく、あるいは適切な条件下でゲノム自体に組み込んでよい。本明細書においては、プラスミド及びベクターを時々交換可能に使用する。しかしながら、発明は、均等な機能を担う発現ベクターの他の形態を含むことを意図し、そして当業界にて公知であるか又は公知になる。即ち、様々な宿主／発現ベクターの組み合わせをこの発明のＤＮＡ配列を発現させるために用いてよい。有用な発現ベクターは、例えば、染色体のセグメント、非染色体及び合成ＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０の様々な公知の誘導体及び公知の細菌プラスミド、例えばｃｏｌ　Ｅ１，ｐＣＲ１，ｐＢＲ３２２，ｐＭｂ９，ｐＵＣ１９及びそれらの誘導体を含むＥ．ｃｏｌｉ由来のプラスミド、ホストレンジの広いプラスミド、例えばＲＰ４，ファージＤＮＡ、例えばファージλの多数の誘導体、例えばＮＭ９８９及び他のＤＮＡファージ、例えばＭ１３繊維状一本鎖ＤＮＡファージ、酵母プラスミド例えば２μプラスミド又はそれらの誘導体、真核生物において有用なベクター、例えば動物細胞において有用なベクター及びプラスミドＤＮＡとファージのＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、例えばファージＤＮＡ又は他の発現制御配列を用いるように修飾されたプラスミドからなってよい。本発明の発現ベクターを用いる発現技術は当業界公知であり、そして一般的には、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載される。しばしば、発明のＤＮＡ配列を含むそのような発現ベクターは、組み込み事象を通して特定の種のゲノムに直接挿入することにより単細胞生物を形質転換する（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔ　＆　Ｌａｓｕｒｅ，ＭＯＲＥ　ＧＥＮＥ　ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ　ＩＮ　ＦＵＮＧＩ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．７０−７６（１９９１）及び真菌宿主��おける標的化ゲノミック挿入を記載するその中で引用された文献を参照、引用により本明細書に編入される）。
【００２６】
「機能的に結合させた」は、制御領域、例えばプロモーター、ターミネーター、分泌シグナル又は増強領域が構造遺伝子に連結されてその遺伝子の発現を制御することを意味する。
【００２７】
「宿主株」又は「宿主細胞」は、本発明によるＤＮＡを含む発現ベクターに適した宿主を意味する。本発明において有用な宿主細胞は一般的に原核生物宿主及び真核生物宿主であり、発現を達成できるあらゆる形質転換可能な微生物を含む。特定すれば、宿主株は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ，Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ（ｒ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒであってよい。宿主細胞は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築されたベクターにより形質転換されるか又はトランスフェクトされる。そのような形質転換された宿主細胞はスオレニン（ｓｗｏｌｌｅｎｉｎ）及びその変種（変異体）をコードして所望の生成物を発現する両複製ベクターを複製することができる。本発明による好ましい態様において、「宿主細胞」は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の細胞から創製された細胞及びプロトプラストの両方を意味す。
【００２８】
「ストーンウオッシング」は、振動させ、そしてカスケードさせる条件、例えばデニムに対して「ストーンウオッシュ」された外観を付与するために回転ドラム洗濯機中でセルラーゼ溶液によりセルラーゼ含有織物を処理することを意味する。本発明によるセルラーゼ溶液は、そのような当業界で認識された方法においての石の使用を完全か又は一部、機能上置き換えることになる。デニムに対してストーンウオッシュされた外観を付与する方法は、米国特許第４，８３２，８６４号に記載されており、その全体を引用により本明細書に編入する。一般に、ストーンウオッシング技術はインディゴ染色したコットンデニムに適用されてきた。
【００２９】
「ストーンウオッシング組成物」は、セロース含有織物をストーンウオッシュすることにおける使用のための製剤を意味する。ストーンウオッシング組成物は消費者への売買のための公開の前に、即ち製造プロセスの間に、セルロース含有織物を修飾するために使用する。対照的に、洗浄剤組成物は汚れた衣服の洗濯を意図している。
【００３０】
「シグナル配列」は、細胞外への蛋白質の成熟形態の分泌を促進する蛋白質のＮ−末端部分に結合したアミノ酸の配列を意味する。シグナル配列のこの定義は機能性配列である。成熟形態の細胞外蛋白質は分泌プロセスの間に分断されるシグナル配列を欠く。
【００３１】
「界面活性剤」は、界面活性の特性を有すると当業界において一般的に認識されたあらゆる化合物を意味する。即ち、例えば、界面活性剤は、アニオン性、カチオン性、及び非イオン性界面活性剤、例えば洗浄剤において共通に見いだされる界面活性剤を含む。カチオン性界面活性剤及び長鎖脂肪酸塩は、飽和又は未飽和の脂肪酸塩、アルキル又はアルケニルエーテルカルボキシル酸塩、α−スルフォ脂肪酸塩又はエステル、アミノ酸タイプの界面活性剤、リン酸エステル界面活性剤、３から４のアルキル置換基及び１までのフェニル置換されたアルキル置換基を有するものを含む第四級アンモニウム塩を含む。カチオン界面活性剤及び長鎖脂肪酸塩の例は、英国特許出願第２　０９４　８２６Ａ号に開示されており、その開示は引用により本明細書に編入される。上記組成物は約１から約２０重量パーセントのそのようなカチオン界面活性剤及び長鎖脂肪酸塩を含んでよい。
【００３２】
アニオン界面活性剤は、直鎖又は分枝したアルキルベンゼンスルフォネート；直鎖又は分枝したアルキル基又はアルケニルエーテル基を有するアルキル又はアルケニルエーテルスルフォネート；アルキル又はアルケニルスルフォネート；オレフィンスルフォネート；及びアルカンスフェロプラストを含む。アニオン界面活性剤の適当なカウンターイオンは、アルカリ金属イオン、例えばナトリウム及びカリウム、アルカリ土類金属イオン、例えばカルシウム及びマグネシウム；アンモニウムイオン；及び炭素数２又は３の１から３のアルカノール基を有するアルカノールアミンを含む。両性の界面活性剤は、第四級アンモニウムスルフォン酸塩及びベタインタイプの両性界面活性剤を含む。そのような両性界面活性剤は同じ分子内に陽性電荷した基及び陰性電荷した基の両方を有する。非イオン性界面活性剤は、ポリオキシアルキレンエーテル、並びに高脂肪酸アルカノールアミド又はそのアルキレンオキシド付加物、脂肪酸グリセリンモノエステル等を含んでよい。この発明における使用のための界面活性剤の例は、英国特許出願番号第２　０９４　８２６Ａ号に開示されており、その開示は引用により本明細書に編入される。そのような界面活性剤の混合物も使用できる。
【００３３】
「変種（ｖａｒｉａｎｔ）」は、Ｃ−末端及びＮ−末端のいずれか又は両方への一つ又は複数のアミノ酸の追加、アミノ酸配列中の一つ又は複数の異なる部位における一つ又は複数のアミノ酸の置換、蛋白質の一方又は両方の末端か又はアミノ酸配列中の一つ又は複数の部位における一つ又は複数のアミノ酸の欠失、又はアミノ酸配列中の一つ又は複数の部位における一つ又は複数のアミノ酸の挿入により、前駆体蛋白質（例えば、天然蛋白質）から誘導される蛋白質を意味する。酵素の変種の調製は、好ましくは、天然蛋白質をコードするＤＮＡ配列を修飾し、そのＤＮＡ配列による適当な宿主の形質転換、及び修飾されたＤＮＡ配列の発現による変種酵素の形成により達成する。発明の変種は、前駆体アミノ酸配列との比較の上で変更されたアミノ酸配列を含むペプチドを含み（例えば、野生型又は天然の状態の酵素）、そのペプチドは前駆体酵素の特徴的な酵素の性質は保持するが、いくつかの特定の側面において変更された特性を有する。例えば，ＥＧＩＩＩ変種は増加した至適ｐＨ又は増加した温度安定性又は酸化安定性を有してよいが、セルロース溶解活性は保持する。本発明による変種は、発現されたセルラーゼ誘導体の機能活性が保持されたセルラーゼ誘導体をコードするＤＮＡ断片に由来してよいことが意図される。例えば、セルラーゼをコードするＤＮＡ断片は、コードされたセルラーゼの機能活性が保持されるように、５’又は３’の何れかにおいてセルラーゼＤＮＡ配列に連結したヒンジ又はリンカーをコードするＤＮＡ配列又はその一部をさらに含んでよい。
アミノ酸配列の整列化
この発明の変種ＥＧＩＩＩは前駆体ＥＧＩＩＩのアミノ酸配列由来のアミノ酸配列を有する。ＥＧＩＩＩ変種のアミノ酸配列は、前駆体アミノ酸配列の一つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は挿入により前駆体ＥＧＩＩＩアミノ酸配列とは異なる。好ましい態様において、前駆体ＥＧＩＩＩはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩである。Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩの成熟アミノ酸配列を図１に示す（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１）。即ち、この発明は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩ中に置いて特に同定された残基に均等な位置においてアミノ酸残基を含み並びにＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓのＥＧＩＩＩ相同体において同定された残基に均等な少なくとも一つの残基を含む、ＥＧＩＩＩ変種に向けられる。ＥＧＩＩＩ相同体の残基（アミノ酸）は、それがＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩ中の特定の残基又はその残基の一部に相同であるか（即ち、一次構造及び三次構造の何れかにおいて位置が対応する）又は機能上類似であるなら（即ち、化学的又は構造的に化合、反応又は相互作用するための同じか又は類似の機能性能力を有する）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩの残基に均等である。本明細書において、ナンバリングは図２に示された成熟ＥＧＩＩＩアミノ酸配列のそれに対応することが意図される（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３２）。前駆体ＥＧＩＩＩ内の位置に加えて、前駆体ＥＧＩＩＩが温度のストレス又は界面活性剤のストレス下にあるときに、不安定性の原因であるアミノ酸位置に対応する前駆体ＥＧＩＩＩ内の特定の残基が本明細書において置換又は欠失のために同定される。アミノ酸の位置の番号（例えば、＋５１）は、図１に表した成熟Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩ配列に与えられた番号を意味する（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１）。
【００３４】
この発明の前駆体ＥＧＩＩＩは天然に生じるセルラーゼ及び組換えセルラーゼを含む（本明細書にて定義されたとおり）。前駆体ＥＧＩＩＩをコードするＤＮＡは、前駆体セルラーゼ酵素それ自体の操作よりも修飾することを意図する。前駆体ＤＮＡ配列のそのような修飾の適当な方法は、本明細書そして権利者が同じ米国特許第４，７６０，０２５号及び第５，１８５，２５８号に開示された方法を含む。
【００３５】
相同性を測定するためのアミノ酸配列の整列化は、好ましくは「配列比較計算式」により決定される。比較のための配列の最適な整列化は、例えば、Ｓｍｉｔｈ　＆　Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性計算式によるか、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ　＆　Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３）１９７０）の相同性整列化計算式によるか、Ｐｅａｒｓｏｎ　＆　Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によるか、これらの計算式のコンピューター化の実行によるか（ウイスコンシンジェネティックスソフトパッケージ、ジェネティックスコンピューターグループ、５７５サイエンス　Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、又は可視点検により行うことができる。
【００３６】
配列類似性を決定するために適した計算式の例はＢＬＡＳＴ計算式であり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載される。ＢＬＡＳＴ計算式のを実行するためのソフトウエアは、バイオテクノロジー情報国立センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に利用可能である。この計算式は、データベース配列中の同じ長さの言葉と整列化したときに、いくつかの陽性評価された閾値スコアに適合するか又は満足する質問配列中の長さＷの短い言葉を同定することにより、高いスコアの配列対（ＨＳＰｓ）を最初に同定することを含む。これらの初期の隣接する言葉のヒットはそれらを含む長いＨＳＰｓを発見するための開始ポイントとして作用する。言葉のヒットは、蓄積する整列化のスコアが増加し得る限り、２つの配列の各々が比較される両方向に沿って伸長する。言葉のヒットの伸長は、蓄積する整列化スコアが達成された最大値からの量Ｘにより低下する場合；蓄積スコアがゼロ又はそれ以下になる場合；又は何れかの配列の末端が延びる（ｒｅａｃｈｅｄ）場合に停止する。ＢＬＡＳＴ計算式のパラメーターＷ，Ｔ及びＸは整列化の感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは欠点としてワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ＆２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ　＆　Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，ＰｒｏｃＮａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：１０９１５（１９８９）を参照）整列化（Ｂ）５０、気体（Ｅ）１０、Ｍ’５，Ｎ’−４、及び両鎖の比較を用いる。
【００３７】
ＢＬＡＳＴ計算式は次に、２つの配列間の類似性の統計分析を実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ　＆　Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴ計算式により提供される類似性の一つの測定は最少合計確率（Ｐ（Ｎ））であり２つのヌクレオチド又は間の配列の間の適合が偶然起こる確率の指標を提供する。例えば、プロテアーゼアミノ酸配列に対する試験アミノ酸配列の比較における最少合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、そしてもっとも好ましくは約０．００１未満ならば、アミノ酸配列はプロテアーゼに類似であると考えられる。
【００３８】
ＥＧＩＩＩセルラーゼの安定性を修飾するための追加の特定の戦略を以下に提供する。
（１）主鎖の未フォールディングのエントロピーの増加は酵素に対して安定性を導入するかもしれない。例えば、αヘリックスのＮ末端及びループ構造におけるリバースターンの２位へのプロリン残基の導入は未フォールディングのエントロピーを増加させることにより当該蛋白質の安定性を顕著に増加させるかもしれない（Ｗａｔａｎａｂｅ，ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２６：２７７−２８３（１９９４）を参照）。類似して、グリシン残基はβ炭素を含まず、即ち、多くの他の残基よりも顕著に大きなバックボーンのコンフォメーションの自由度を有する。これは、その結果の弱い安定性を伴う高い柔軟性を導くかもしれない。グリシンの好ましくはアラニンへの置換は、柔軟性を低下させるか又は安定性を改善するかもしれない。さらに、外部のループを短くすることにより、安定性を改善する可能性があるかもしれない。高度に好熱性の生産蛋白質がそれらの中温性相同物よりも短い外部ループを有することが観察された（例えば、Ｒｕｓｓｅｌ，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：３７０−３７４（１９９５）を参照）。ジスルフィド結合の導入は、互いの関係する異なる三次構造を安定化するのにも有用かもしれない。即ち、存在するシステインに接近可能な残基におけるシステインの導入又はジスルフィド結合を形成できるシステインの対の導入は、ＥＧＩＩＩ変種の安定性を変更するかもしれない。
（２）側鎖の疎水性を増加させることによる内部の空洞の減少は、酵素の安定性を変化させるかもしれない。内部の空洞の数及び容積を減少させることは、疎水性相互作用を最大にしてパッキングの欠点を減少させることにより酵素の安定性を増加させる（例えば、Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１３９−１６０（１９９３）；Ｂｕｒｌｅｙ，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９：２３−２９（１９８５）；Ｚｕｂｅｒ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２９：１７１−１７９（１９８８）；Ｋｅｌｌｉｓ，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３３３：７８４−７８６（１９８８）を参照）。好熱性生物からのマルチマー蛋白質は、それらの中温性相当物よりも高い表面相補性の、より疎水性のサブユニット界面をしばしば有する（Ｒｕｓｓｅｌ，ｅｔ　ａｌ．，前記）。この原理は、モノマー蛋白質のドメイン界面に適用可能であると信じられる。疎水性を増加させることにより安定性を改善するかもしれない特定の置換は、リシンからアルギニン、セリンからアラニン、及びスレオニンからアラニンを含む（Ｒｕｓｓｅｌ，ｅｔ　ａｌ．，前記）。アラニン又はプロリンへの置換による修飾は、結果物の空洞の減少、良好なパッキング及び増加した疎水性を伴って側鎖サイズを増加させるかもしれない。空洞のサイズを減少させ、疎水性を増加させ、そして相補性を改善するための置換は、ＥＧＩＩＩのドメイン間の界面が酵素の安定性を改善するかもしれない。特に、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン及びイソロイシンの何れかから選択される異なる残基によるこれらの位置の特定の残基の修飾は性能を改善するかもしれない。
（３）堅い二次構造、即ちαヘリックス及びβターンの変化の均衡は、安定性を改善するかもしれない。例えば、ヘリックスＮ−末端上の部分的な陽性電荷をアスパラギン酸上の陰性電荷により中和することは構造の安定性を改善するかもしれない（例えば、Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５５：１７８−１８３（１９９２）を参照）。同様に、ヘリックスＣ−末端上の部分的な陰性電荷の陽性電荷による中和は構造の安定性を改善するかもしれない。βターン中のペプチドのＮ−末端との相互作用から陽性電荷を除去することは三次構造安定性を授与するのに有効であるべきである。非陽性電荷残基による置換はターン中に存在するアミド窒素との相互作用から好ましくない陽性電荷を除去することができた。
（４）三次構造を安定化させるための塩ブリッジ及び水素結合の導入は有効かもしれない。例えば、イオン対の相互作用、即ちアスパラギン酸又はグルタミン酸とリシン、アルギニン又はヒスチジンの間の相互作用は強い安定化作用を導入するかもしれず、そして熱安定性における結果としての改善を伴って別の三次構造を結合するのに使用されるかもしれない。さらに、荷電残基／非荷電残基水素結合の数、及び水素結合の数の増加は一般的に、熱安定性を改善するかもしれない（例えば、Ｔａｎｎｅｒ，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３５：２５９７−２６０９を参照）。アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸又はグルタミンによる置換は、バックボーンのアミドによる水素結合を導入するかもしれない。アルギニンによる置換は、塩のブリッジを改善してバックボーンのカルボニルにＨ−結合を導入するかもしれない。
（５）一般的に熱不安定性残基を避けることは熱安定性を増加させるかもしれない。例えば、アスパラギン及びグルタミンは脱アミド化に感受性であり、そしてシステインは高温で酸化感受性である。感受性の位置におけるこれらの残基の数の減少は改善された熱安定性をもたらすかもしれない（Ｒｕｓｓｅｌ，ｅｔ　ａｌ．，前記）。グルタミン及びシステイン以外の何れかの残基による置換又は欠失は熱安定性残基の回避により安定性を増加させるかもしれない。
（６）修飾された安定性をＥＧＩＩＩ変種に授与するリガンドの結合の安定化及び脱安定化。例えば、この発明のＥＧＩＩＩ変種を使用するマトリックスの成分は、ＥＧＩＩＩ変種の特定の界面活性剤／熱感受性部位に結合するかもしれない。置換を通して上記部位を修飾することにより、成分の変種への結合が強化されるか又は減じられるかもしれない。例えば、ＥＧＩＩＩの結合の割れ目の中の非芳香性残基をフェニルアラニン又はチロシンにより置換することにより、セルロース基質の相互作用がベンゼン環に好ましく相互作用するかもしれない芳香性側鎖安定化を導入して、ＥＧＩＩＩ変種の安定性を増加させてよい。
（８）界面活性剤／熱感受性リガンドの何れかの電気陰性度を増加させることは、界面活性剤ストレス又は熱ストレス下で安定性を改善するかもしれない。例えば、フェニルアラニン又はチロシンによる置換は、溶剤からの遮蔽を改善してＤ残基の電気陰性度を増加させるかもしれない。
変種ＥＧＩＩＩ
本発明は、変種ＥＧＩＩＩの発現、生成及び／又は単離及び使用に関する。これらの酵素は、以下に記載される方法に従い同定及び単離された遺伝子を利用する組換え方法により調製するのが好ましい。しかしながら、本発明における使用のための酵素は他の当業界で認識される手段、例えば天然単離物からの精製により得てよい。
【００３９】
ＥＧＩＩＩをコードするＤＮＡ配列を単離するために使用できる技術は当業界において公知であり、限定ではないが、相同のＤＮＡプローブを用いてスクリーニングするｃＤＮＡライブラリー及び／又はゲノミックライブラリー及び活性アッセイ又はＥＧＩＩＩに対する抗体を用いてスクリーニングする発現を含む。これらの方法の何れかは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ　ａｌ．においてか又はＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ　ａｌ．，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８７）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）に見いだすことができる。
【００４０】
ＥＧＩＩＩの単離及びクローン化の後に、当業界において公知の他の方法、例えば、部位特異的変異導入を用いることにより、発現されたＥＧＩＩＩ変種内の置換されたアミノ酸に対応する置換、付加又は欠失を作成する。再び、部位特異的変異導入及びＤＮＡレベルにおいて発現蛋白質にアミノ酸の変化を取り入れる方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ　ａｌ．及びＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ　ａｌに見いだすことができる。
【００４１】
ＥＧＩＩＩ変種をコードするＤＮＡ配列をＤＮＡ構築物中にクローン化した後に、当該ＤＮＡを用いて微生物を形質転換する。本発明により変種ＥＧＩＩＩを発現するために形質転換される微生物は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種由来の株を含むのが有利かもしれない。即ち、本発明により変種ＥＧＩＩＩセルラーゼを調製するための好ましい様式は、変種ＥＧＩＩＩの全て又は一部をコードするＤＮＡの断片を少なくとも含むＤＮＡ構築物により、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の宿主細胞を形質転換することを含む。当該ＤＮＡ構築物は一般にプロモーターに機能するように連結されることになる。形質転換された宿主細胞は、次に所望の蛋白質を発現させる条件下で生育させる。次に、所望の蛋白質生成物を実質均一になるまで精製する。
【００４２】
しかしながら、変種ＥＧＩＩＩをコードする所定のＤＮＡのための最良の発現媒体はＴ．ｒｅｅｓｅｉとは異なるかもしれないのが事実かもしれない。即ち、変種ＥＧＩＩＩに関する源の生物に系統発生上類似性をもつ形質転換宿主中で蛋白質を発現させるのがもっとも有利になるといって差し支えない。別の態様において、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒを発現媒体として使用することができる。Ａ．ｎｉｇｅｒによる形質転換技術の記載に関しては、ＷＯ　９８／３１８２１を参照されたく、その開示はその全体を引用することにより編入される。
【００４３】
従って、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の発現系の本記載は、例示の目的のためのみに提供されて且つ発明の変種ＥＧＩＩＩを発現するための一つのオプションとして提供される。当業者は、しかしながら、適切なら別の宿主細胞内で変種ＥＧＩＩＩをコードするＤＮＡを発現させる傾向であってよく、そして最適な発現宿主を決定することにおいて変種ＥＧＩＩＩの源を考慮するべきであることが認識されるべきである。さらに、当業者は、当業界において利用可能な手段を利用する日常的技術を通して特定の遺伝子のための最良の発現系を選択することができるようになる。
【００４４】
一つの態様において、株は過剰発現された蛋白質を得るための有用な株であるＴ．ｒｅｅｓｅｉ（ｒｅｅｓｅｉ）を含む。例えば、Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ，ｅｔ　ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４６−５３（１９８４）により記載されたＲＬ−Ｐ３７は上昇量のセルラーゼ酵素を分泌することが知られている。ＲＬ−Ｐ３７の機能上の均等物は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ（ｒｅｅｓｅｉ）株ＲＵＴ−Ｃ３０（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．５６７６５）及び株ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．２６９２１）を含む。これらの株は変種ＥＧＩＩＩを過剰発現するためにも有用なはずである。
【００４５】
潜在的に有害な天然のセルロース溶解活性の不在下で変種ＥＧＩＩＩを得ることが望まれる場合、変種ＥＧＩＩＩをコードするＤＮＡ断片を含むＤＮＡ構築物又はプラスミドの導入前に欠損させた一つ又は複数のセルラーゼ遺伝子を有していたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ宿主細胞株を得るために有用である。そのような株は、引用により編入される、米国特許第５，２４６，８５３号及びＷＯ　９２／０６２０９に開示された方法により調製してよい。一つ又は複数のセルラーゼ遺伝子を欠落している宿主微生物中で変種ＥＧＩＩＩを発現させることにより、同定及び次の精製の手法を単純化させる。クローン化されたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種からの何れの遺伝子も欠損させることができ、例えば、ｃｂｈ１，ｃｂｈ２，及びｅｇｌ３遺伝子並びにＥＧＩＩＩ及び／又はＥＧＶ蛋白質をコードするものである（例えば、それぞれ、米国特許第５，４７５，１０１号及びＷＯ　９４／２８１１７）。
【００４６】
遺伝子の欠損は、欠損されるか又は破壊されるべき所望の遺伝子の形態を当業界公知の方法によりプラスミドに挿入することにより達成してよい。欠損したプラスミドは次に適当な制限酵素部位において所望の遺伝子コーディング領域内部で切断されて、そして遺伝子コーディング配列又はその一部を選択マーカーで置き換える。欠損させるか又は破壊する遺伝子の位置の周辺のＤＮＡ配列は、好ましくは約０．５から２．０ｋｂであり、選択可能なマーカー遺伝子の何れかのサイド上に保持される。適当な欠損プラスミドはその中に存在する唯一の制限酵素部位を有することにより、欠損遺伝子を含む断片、周辺ＤＮＡ配列、及び選択可能なマーカー遺伝子が単一の直鎖片として除去されることを可能にさせる。
【００４７】
選択可能なマーカーは、形質転換された微生物の欠損を可能にさせるように選択されなければならない。選択された微生物において発現されるあらゆる選択可能なマーカー遺伝子が適することになる。例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種に関しては、選択可能なマーカーは形質転換体において選択可能なマーカーの存在がその特性に顕著に影響しないように選択される。そのような選択可能なマーカーはアッセイ可能な生成物をコードする遺伝子であってよい。例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の遺伝子の機能性コピーを使用してよく、宿主内で欠損しているなら、栄養要求性表現型を表す宿主株をもたらす。
【００４８】
好ましい態様において、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種のｐｙｒ４−誘導株は機能性ｐｙｒ４遺伝子により形質転換されて、即ち、形質転換のための選択可能なマーカーを提供する。ｐｙｒ４−誘導株は、フルオロオロティック酸（ＦＯＡ）に耐性のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の株の選択により得てよい。ｐｙｒ４遺伝子はオロチジン−５’−モノホスフェートデカルボキシラーゼをコードし、ウリジンの生合成に必要な酵素である。完全なｐｙｒ４遺伝子を含む株はウリジン欠損培地中で生育するが、フルオロオロティック酸には感受性である。機能性のオロチジンモノホスフェートデカルボキシラーゼ酵素を欠くｐｙｒ４−誘導株を選択して、ＦＯＡ耐性に関して選択することにより、生育のためにウリジンを要求することは可能である。ＦＯＡ選択技術を用いることにより、機能性オロテートピロホスホリボシルトランスフェラーゼを欠くウリジン要求株を得ることも可能である。この酵素をコードする遺伝子の機能するコピーによりこれらの細胞を形質転換することができる（Ｂｅｒｇｅｓ　＆　Ｂａｒｒｅａｕ，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１９：３５９−３６５（１９９１））。誘導株の選択は上で言及されたＦＯＡ耐性技術を用いて容易に実施され、即ち、ｐｙｒ４遺伝子は選択可能なマーカーとして好ましく用いられる。
【００４９】
一つ又は複数のセルラーゼ遺伝子を発現することに関する能力を欠如させるためにｐｙｒ４−Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種を形質転換するため、破壊されたか又は欠損させたセルラーゼ遺伝子を含む単一のＤＮＡ断片を次に欠損プラスミドから単離して、適当なｐｙｒ−Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ宿主を形質転換するのに用いた。次に、ｐｙｒ４遺伝子産物を発現させて即ち宿主株のウリジン栄養要求性を相補するそれらの能力に基づいて、形質転換体を同定及び選択する。サザンブロット分析を次に結果の形質転換体に実施することにより、欠損させた遺伝子のゲノミックコピーのコード領域の一部又は全てをｐｙｒ４選択可能マーカーにより置き換える二重クロスオーバー組み込み事象を確認（ｉｄｅｎｔｉｆｙ）及び確証（ｃｏｎｆｉｒｍ）する。
【００５０】
上記の特定のプラスミドベクターはｐｙｒ−形質転換体の製造に関するが、本発明はこれらのベクターに限定されない。様々な遺伝子を上記技術を用いてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種において欠損及び置換させることができる。さらに、何れかの利用可能な選択可能なマーカーを上記のとおりに用いることができる。事実、クローン化されて即ち同定された何れのＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の遺伝子も上記の戦略を用いてゲノムから欠損させることができる。
【００５１】
上記のとおり、用いられた宿主株は、非機能性遺伝子又は選択された選択可能なマーカーに相当する遺伝子を欠くか又は有するＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の誘導体である。例えば、ｐｙｒ４の選択可能マーカーを選択したら、次に、特定のｐｙｒ４−誘導株を形質転換法においてレシピエントとして用い。同様に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓの遺伝子ａｍｄＳ，ａｒｇＳ，ａｒｇＢ，ｔｒｐＣ，ｎｉａＤに均等なＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種遺伝子を含む選択可能なマーカーを用いてよい。対応するレシピエント株は、よって、誘導株、例えばそれぞれａｒｇＢ−，ｔｒｐＣ−，ｎｉａＤ−でなければならない。
【００５２】
次に、適当な微生物への挿入のために、変種ＥＧＩＩＩセルラーゼをコードするＤＮＡを調製する。本発明によれば、変種ＥＧＩＩＩセルラーゼをコードするＤＮＡは、機能するセルロース溶解活性を有する蛋白質をコードするのに必要なＤＮＡを含む。変種ＥＧＩＩＩセルラーゼ又は誘導体をコードするＤＮＡ変種断片は、真菌のプロモーター配列、例えばｃｂｈ１又はｅｇｌ１遺伝子のプロモーターに機能するように連結されてよい。
【００５３】
変種ＥＧＩＩＩをコードするＤＮＡの一つより多いコピーを株の中で組換えることにより過剰発現を促進することも意図される。変種ＥＧＩＩＩをコードするＤＮＡは、セルラーゼをコードするＤＮＡを有する発現ベクターの構築により製造してよい。変種ＥＧＩＩＩセルラーゼをコードする挿入されたＤＮＡ断片を有する発現ベクターは、所定の宿主生物内で自律複製可能であるか、又は宿主のＤＮＡに組み込み可能であるあらゆるベクターであってよく、典型的にはプラスミドである。好ましい態様において、遺伝子発現を得るための２種類の発現ベクターが意図される。第１は、プロモーター、遺伝子コード領域、及びターミネーター配列の全てが発現される遺伝子起源である、ＤＮＡ配列を含む。遺伝子の末端削除は、不所望のＤＮＡ配列（例えば、望まないドメインをコードする配列）を欠損させることにより、それ自身の転写及び翻訳制御配列の制御下で発現されるドメインを残すことが望まれる場合に、得てよい。選択可能なマーカーも当該ベクター上に含まれることにより、新規の遺伝子配列の複数コピーの宿主への組み込みのための選択を可能にさせる。
【００５４】
第２の種類の発現ベクターは予め集合させ、そして高いレベルの転写に必要な配列及び選択可能なマーカーを含む。遺伝子又はその一部のコード領域をこの一般的な目的の発現ベクターに発現カセットプロモーター及びターミネーター配列の転写制御下に挿入できることが意図される。例えば、ｐＴＥＸはそのような一般的な目的の発現ベクターである。遺伝子又はその一部は強いｃｈｂ１プロモーターの下流に挿入することができる。
【００５５】
上記ベクター中では、本発明の変種ＥＧＩＩＩセルラーゼをコードするＤＮＡを転写及び翻訳配列、即ち適当なプロモーター配列及びシグナル配列に作動可能なように構造遺伝子とインフレームにて連結させるべきである。プロモーターは、宿主細胞中で転写活性を示す如何なるＤＮＡ配列でもよく、そして宿主細胞に対して同種又は異種の何れかの蛋白質をコードする遺伝子に由来してよい。上記シグナルペプチドは、変種ＥＧＩＩＩセルラーゼ又はその誘導体の細胞外生産を提供する。シグナル配列をコードするＤＮＡ配列は発現される遺伝子に天然では付随しているのが好ましいが、しかしながら、あらゆる適当な源、例えばＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ由来のエキソセロビオヒドラーゼ又はエンドグルカナーゼからのシグナル配列が本発明において意図される。
【００５６】
本発明の変種ＥＧＩＩＩセルラーゼをコードするＤＮＡ配列のプロモーターとの連結及び適当なベクターへの挿入に用いられる手法は、当業界においてよく知られている。
【００５７】
上記のＤＮＡベクター又は構築物は、公知の技術、例えば形質転換、トランスフェクション、マイクロインジェクション、マイクロポレーション、バイオリスティック砲撃等により宿主細胞に導入してよい。
【００５８】
好ましい形質転換技術において、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種内のＤＮＡへの細胞壁の透過性が極めて低いことを考慮しなければならない。従って、所望のＤＮＡ配列、遺伝子又は遺伝子断片の取り込みはせいぜい最少である。形質転換プロセスの前に、誘導株（即ち、使用した選択可能なマーカーに相当する機能性遺伝子を欠く）内のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の細胞壁の透過性を増加させるための多数の方法が存在する。
【００５９】
形質転換のためにＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種を製造するために本発明において好ましい方法は、真菌の菌糸体からのプロトプラストの調製を含む。菌糸体は出芽した生長性胞子から得ることができる。菌糸体を、細胞壁を消化する酵素により処理することにより、プロトプラストをもたらす。次に、プロトプラストを懸濁媒質中で浸透圧スタビライザーの存在により保護する。これらのスタビライザーはソルビトール、マニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウム等を含む。通常、これらのスタビライザーの濃度は０．８Ｍと１．２Ｍの間で変動する。懸濁媒質中で約１．２Ｍのソルビトール溶液を用いることが好ましい。
【００６０】
宿主Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種株へのＤＮＡの取り込みはカルシウムイオン濃度に依存する。通常、約１０ｍＭ　ＣａＣｌ２と５０ｍＭ　ＣａＣｌ２の間が取り込み溶液において用いられる。取り込み溶液におけるカルシウムイオンに関する要求のほかにも、通常含まれる他のアイテムは緩衝系、例えばＴＥバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４；１ｍＭ　ＥＤＴＡ）又は１０ｍＭ　ＭＯＰＳ，ｐＨ６．０バッファー（モルフォリンプロパンスルフォニック酸）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ポリエチレングリコールは細胞膜を融合させて、即ち媒質の含有物がＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の細胞質へ送達されることを許容して、そしてプラスミドＤＮＡが核に移送されると信じられる。この融合は、宿主染色体へ優しく（ｔｅｎｄｅｒｌｙ）組み込まれたプラスミドＤＮＡの複数コピーをしばしば残す。
【００６１】
通常、１０８から１０９／ｍＬ、好ましくは２ｘ１０８／ｍＬの密度にて透過性処理に供されたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種のプロトプラスト又は細胞を含む懸濁液を形質転換に用いる。適当な溶液（例えば、１．２Ｍソルビトール；５０ｍＭ　ＣａＣｌ２）中のこれらのプロトプラスト又は細胞の１００μＬ容量を所望のＤＮＡと混合する。通常、高濃度のＰＥＧを取り込み溶液に加える。０．１から１容量の２５％　ＰＥＧ　４０００をプロトプラスト懸濁液に加えることができる。しかしながら、プロトプラスト懸濁液に約０．２５容量を加えるのが好ましい。付加物、例えばジメチルスルフォキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウム等も取り込み溶液に加えて、形質転換を補助してよい。
【００６２】
通常、上記混合物を１０分から３０分の間０℃においてインキュベートする。追加のＰＥＧを次に混合物に加えることにより、所望の遺伝子又はＤＮＡ配列のとりこみをさらに増強する。２５％　ＰＥＧ４０００を通常は形質転換混合物の容量の５から１５倍の容量にて加える；しかしながら、より高いか又はより低い容量が適当かもしれない。２５％　ＰＥＧ４０００は形質転換混合物の容量の約１０倍が好ましい。ＰＥＧを加えた後に、形質転換混合物を次に室温においてソルビトールとＣａＣｌ２溶液の添加前にインキュベートする。プロトプラスト懸濁液を次にさらに加えることにより生育培地のアリコートを溶解する。この生育培地は形質転換体の生育のみを許容する。所望の形質転換体を生育させるのに適した如何なる生育培地も本発明において使用できる。しかしながら、Ｐｙｒ＋形質転換体が選択されるなら、ウリジンを含まない生育培地を用いることが好ましい。次のコロニーをウリジン枯渇生育培地上に移して精製する。
【００６３】
この段階において、ウリジンを欠く固形培養培地上でのそれらの早い生育及び不規則な輪郭よりむしろスムーズな環状コロニーの形成により、安定な形質転換体を不安定な形質転換体から識別してよい。さらに、いくつかの場合、安定性に関するさらなる試験を、固形の非選択培地上で形質転換体を生育させ（即ちウリジンを含む）、この培養培地から胞子を回収し、そしてウリジンを欠く選択培地上でのちに出芽及び生育するこれらの胞子のパーセンテージを測定することにより行ってよい。
【００６４】
上記の方法の特定の態様において、変種ＥＧＩＩＩセルラーゼ又はその誘導体は、新規な変種ＥＧＩＩＩセルラーゼ又はその誘導体の適切な後翻訳プロセスの結果として、液体培地中で生育させた後に宿主細胞から活性形態で回収される。
【００６５】
発現された変種ＥＧＩＩＩセルラーゼは、遠心分離、濾過及び塩、例えば硫酸アンモニウムによる上清又は濾過物中の蛋白質の沈殿により培地からの細胞の分離を含む慣用技術により培地か回収してよい。さらに、クロマトグラフィー手法、例えばイオン好感クロマトグラフィー又は親和性クロマトグラフィーを使用してよい。抗体（ポリクローナル又はモノクローナル）を天然の精製された変種ＥＧＩＩＩセルラーゼに対して生じさせてよく、あるいは合成ペプチドを変種ＥＧＩＩＩセルラーゼ分子の一部から製造して、ポリクローナル抗体を生じさせるために用いてよい。
この発明のＥＧＩＩＩ変種を含む組成物
本発明による織物の処理は、セルラーゼを含む織物の加工又は洗浄を意図する。そのような処理は、限定ではないが、ストーンウオッシング、セルロース含有織物の手ざわり、質感及び／又は外観を修飾すること又はセルロース含有織物の製造、洗濯／修理の間に使用される他の技術を含む。さらに、この発明のコンテクスト内での処理は、セルロース編み糸又は繊維製品からの「未成熟な」又は「死んだ」コットンの除去を意図する。未成熟なコットンは成熟コットンよりも顕著に無定形であり、そして例えば平行でない乾燥により存在する場合に質の低い織物をもたらす。本発明において意図される組成物は、さらに、よごして製造されたセルロース含有織物の洗浄における使用のためのセルラーゼ成分を含む。例えば、セルラーゼは洗濯ランドリーのための界面活性剤組成物中で使用してよい。本発明により有用な界面活性剤組成物は、特定の製剤、例えば、洗浄前の、前以て浸す、そしてホームユースの色再生組成物を含む。本明細書において記載されるそのような処理組成物は、希釈を必要とする濃縮物の形態又は希釈溶液の形態又はセルロース含有織物に直接適用できる形態であってよい。織物のセルラーゼ処理の一般的な処理技術は、例えば、ＥＰ公開番号２２０　０１６及びＧＢ出願番号Ｎｏｓ．１，３６８，５９９号及び２，０９５，２７５号に記載される。
【００６６】
本発明によるセルロース溶解物質の処理は、さらに、動物用飼料、パルプ及び／又は紙、当業界公知の食品及び穀類の処理を意図する。例えば、セルラーゼは動物飼料の有用性を高め、ウッドパルプの排水性（ｄｒａｉｎａｂｉｌｉｔｙ）を改善し、食品を増強し、そして穀類の湿潤製粉プロセス又は乾燥製粉プロセスの間に穀類中の繊維を減少させることが知られている。
【００６７】
本発明による処理は、有効量のセルラーゼ並びに他の任意の成分、例えばバッファー、界面活性剤、及び／又は研磨剤を包含する成分を含む水性溶液を含む。有効量のセルラーゼ酵素組成物はその意図される目的のために十分なセルラーゼ酵素の濃度である。即ち、例えば、本発明によるストーンウオッシング組成物中の「有効量の」セルラーゼは、例えば使い古されて色あせた外観を縫い目の中及び織物パネル中に生じさせる所望の効果を提供することになる量である。同様に、セルロース含有織物の質感及び／又は外観を改善することを意図した組成物中の「有効な量の」セルラーゼは、質感における測定可能な改善、例えば織物のスムーズさを改善すること、又は外観を改善すること、例えば織物の外観において鋭さを低下させる傾向がある毛玉（ｐｉｌｌｓ）及び原繊維（ｆｉｂｒｉｌｓ）を除去する量である。用いられるセルラーゼの量は、用いられる装置、用いられるプロセスパラメーター（セルラーゼ処理溶液の温度、セルラーゼ溶液への暴露時間等）、及びセルラーゼの活性（例えば、活性の低いセルラーゼ組成物に比較してより活性の高いセルラーゼ組成物を用いる場合、特定の溶液が低濃度のセルラーゼに必要となる）にも依存する。織物が処理される水性処理溶液中のセルラーゼの正確な濃度は、上記因子並びに所望の結果に基づいて当業者により容易に決定することができる。ストーンウオッシングプロセスにおいては、セルラーゼを約０．５から５，０００ｐｐｍ、もっとも好ましくは約１０から２００ｐｐｍ全蛋白質の濃度にて水性処理溶液中に存在させることが一般的には好ましかった。セルロース含有織物の質感及び／又は外観の改善のための組成物においては、約０．１から２０００ｐｐｍ、もっとも好ましくは約０．５から２００ｐｐｍ全蛋白質の濃度にてセルラーゼが水性処理溶液中に存在することが一般的に好ましいとされてきた。
【００６８】
好ましい処理態様において、バッファーは、用いられたセルラーゼが活性を呈し、そして今度は用いられたセルラーゼの性質に依存する範囲内で溶液のｐＨを保持するのにバッファーの濃度が十分であるように、処理用組成物中に存在するように用いる。用いられるバッファーの正確な濃度は、当業者が容易に参酌できるいくつかの因子に依存することになる。例えば、好ましい態様において、バッファー、並びにバッファー濃度は、最適なセルラーゼ活性に必要なｐＨ範囲内で最終セルラーゼ溶液のｐＨを維持するように選択される。発明のセルラーゼの最適なｐＨ範囲の測定はよく知られた技術に従い確かめることができる。上記セルラーゼの活性範囲内のｐＨにおける適切なバッファーは、当業者によく知られている。
【００６９】
セルラーゼ及びバッファーに加えて、処理組成物は任意に界面活性剤を含んでよい。適当な界面活性剤は、上記セルラーゼ及び織物に適合可能な何れの界面活性剤も含み、例えばアニオン性、非イオン性及び両性の界面活性剤を含む。本明細書中の使用のための適当なアニオン性界面活性剤は、直鎖又は分枝のアルキルベンゼンスルフォネート；直鎖又は分枝アルキル基又はアルケニル基を有するアルキル又はアルケニルエーテルスルフェート；アルキル又はアルケニルエーテルスルフェート；オレフィンスルフォネート；アルカンスルフォネート等を含む。アニオン性界面活性剤のための適当なカウンターイオンは、アルカリ金属イオン、例えばナトリウム及びカリウム；アルカリ土類金属イオン、例えばカルシウム及びマグネシウム；アンモニウムイオン；及び炭素数２又は３の１から３のアルカノール基を有するアルカノールアミンを含む。両性界面活性剤は、第四級スルホン酸アンモニウム、及びベタインタイプの両性界面活性剤を含む。そのような両性界面活性剤は、同じ分子中に陽性荷電基と陰性荷電基の両方を有する。非イオン性界面活性剤は一般的に、ポリオキシアルキレンエータル、並びに高脂肪酸アルカノールアミド又はそのアルキレンオキシド付加物、及び脂肪酸グリセリンモノエステルを含む。界面活性剤の混合物は、当業者に知られている様式にて用いられることもできる。
【００７０】
濃縮されたセルラーゼ組成物は本明細書に記載される方法における使用のために調製することができる。そのような濃縮物は、濃縮された量の上記セルラーゼ組成物、バッファー及び界面活性剤を、好ましくは水性溶液中に含む。そうして製剤化された場合、セルラーゼ濃縮物を水により希釈することにより、必要な濃度の各成分を有するセルラーゼ調製物を迅速かつ正確に調製することができる。水性濃縮物を製剤化する場合、これらの濃縮物を希釈することにより、上で示された通りに必要な濃度の成分をセルラーゼ溶液中にて達することができる。容易に明白なとおり、そのようなセルラーゼ濃縮物はセルラーゼ溶液の容易な製剤化を許容し、並びにそれが使用されることになる位置への上記組成物の便利な運搬を許容する。処理用濃縮物は当業界において認識された形態、例えば液体、エマルジョン、ゲル又はペーストであり得る。そのような形態は当業者によく知られている。
【００７１】
固形のセルラーゼ濃縮物を使用する場合、セルラーゼ組成物は顆粒、粉末、塊又は固形ディスクであってよい。顆粒を製剤化することにより、洗浄媒質への顆粒の溶解速度を減じる物質を含ませることができる。そのような物質及び顆粒は、米国特許第５，２５４，２８３号に記載されており、その全体を引用により本明細書に編入する。
【００７２】
他の物質も所望であれば本発明のセルラーゼ組成物と共にか又は代わりに用いることができ、石、軽石、充填剤、溶剤、酵素活性化剤、及び抗−再貯蔵剤（ａｎｔｉ−ｒｅｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）を含み、上記組成物の最後の用途に依存する。
【００７３】
例示の目的で、ストーンウオッシング法を詳細に記載するが、しかし、記載されたパラメーターは、他の応用のために、例えば織物の質感及び／又は外観の改善のために当業者により容易に修飾される。セルロース含有織物を有効量のセルラーゼを含むセルラーゼ含有ストーンウオッシング組成物と接触させるが、処理された組成物とストーンウオッシング組成物とを混ぜ合わせて、そして即ちセルラーゼ酵素を織物に近接させることによる。次に、セルラーゼを含む水性溶液と織物を撹拌する。処理組成物が水性溶液ならば、織物は直接上記溶液中に浸してよい。同様に、ストーンウオッシング組成物が濃縮物であれば、当該濃縮物をセルラーゼ含有織物を含む水浴中に希釈する。ストーンウオッシング組成物が固体の形態、例えば洗濯前のゲル又は固形スティックの形態の場合、ストーンウオッシング組成物を直接に織物又は洗浄液体にかけることにより当該組成物を接触させてよい。
【００７４】
セルラーゼ含有織物にストーンウオッシュの外観を授与させるような酵素の作用を可能にさせる条件下で、セルラーゼ含有織物をストーンウオッシング溶液とインキュベートさせる。例えば、ストーンウオッシングの間、ｐＨ，液体比率、温度及び反応時間を調節することにより、ストーンウオッシング組成物が作用する条件を最適にしてよい。「有効な条件」は必然的に、セルラーゼ酵素が、セルラーゼ含有織物と有効に反応すること、この場合にはストーンウオッシング効果を生じさせることを可能にさせるｐＨ，液体比率、及び温度を意味する。しかしながら、そのような条件は、当業者により容易に確かめられ得る。本発明のストーンウオッシング組成物に有効な反応条件は、対応する従来技術のセルラーゼ組成物により用いられた公知の方法に実質類似である。従って、本発明に従いストーンウオッシング組成物を使用するための条件を最大にすることは当業者の範囲内である。
【００７５】
ストーンウオッシングの間の液体の比率、即ち織物の重量に対する、ウオッシング組成物溶液（即ち、洗浄液体）の重量比率は、本明細書で用いる場合、一般的に、デニムの織物において所望のストーンウオッシュ効果を達成するのに十分な量であり、使用されるプロセスに依存する。好ましくは、液体の比率は約４：１から約５０：１、より好ましくは約５：１から約２０：１、そしてもっとも好ましくは約１０：１から約１５：１である。
【００７６】
本発明のストーンウオッシング組成物によるストーンウオッシュの間の反応温度は２つの競合因子により支配される。第１に、高い温度は、増強された反応キネティックス、即ち速い反応に一般的には対応し、低温において必要な反応時間に比較して反応時間の減少を可能にさせる。従って、セルラーゼは所定の反応温度を越えて活性を損失する蛋白質であって、その温度は使用されるセルラーゼの性質に依存する。即ち、反応温度があまりに高くなるまで許容すればセルロース溶解活性はセルラーゼの変性の結果として損失する。当業界におけるセルラーゼ使用のための標準温度は一般的に３５℃から６５℃の範囲内であり、その条件は発明のセルラーゼに適していると予測されるはずでもあるから、最適な温度条件は、使用される特定のセルラーゼに関してよく知られた技術に従い確認するべきである。
【００７７】
反応時間はストーンウオッシングが起こる特定の条件に依存することになる。例えば、セルラーゼのｐＨ，温度及び濃度はすべて最適反応時間に影響することになる。一般的に、反応時間は約５分から約５時間、好ましくは約１０分から約３時間、そしてより好ましくは約２０分から約１時間である。
【００７８】
本発明のまた別の好ましい態様によると、発明のセルラーゼは洗浄剤組成物中に用いてよい。本発明による洗浄剤組成物は前洗浄剤組成物、前浸潤組成物として、又は通常の洗浄又はリンスサイクルの間の洗浄のために有用である。好ましくは、本発明の洗浄剤組成物は、有効量のセルラーゼ、界面活性剤を含み、そして任意に以下に記載される他の成分を含む。
【００７９】
この発明の洗浄剤組成物の中に用いられる有効量のセルラーゼは、例えば、毛玉除去、軟化、抗−毛玉化、表面繊維除去、抗−灰色化及び洗浄を含む、セルラーゼ含有織物上でセルラーゼにより生じることが知られている所望の効果を授与するのに十分な量である。好ましくは、上記洗浄剤組成物中のセルラーゼは約１０ｐｐｍから約２０，０００ｐｐｍの洗浄剤の濃度にて用いられる。
【００８０】
洗浄剤組成物中に用いられるセルラーゼ酵素の濃度は、洗浄媒質への希釈に際してセルラーゼ酵素の濃度が約０．０１から約１０００ｐｐｍ、好ましくは約０．０２ｐｐｍから約５００ｐｐｍ、そしてもっとも好ましくは約０．５ｐｐｍから約２５０ｐｐｍ全蛋白質の範囲にあるように、選択されるのが好ましい。洗浄剤組成物中に用いられるセルラーゼ酵素の量は、洗浄剤が水への添加により希釈されて洗浄溶液を形成する程度に依存する。
【００８１】
本発明の洗浄剤組成物は、当業界において認識されている形態、例えば液体中、顆粒中、エマルジョン中、ゲル中、又はペースト中であってよい。そのような形態は当業者によく知られている。固形の洗浄剤組成物を用いる場合、セルラーゼは顆粒として用いるのが好ましい。好ましくは、顆粒を製剤化することにより、セルラーゼ保護剤を追加して含ませることができる。顆粒を製剤化することにより、洗浄媒質への顆粒の溶解速度を低下させるための物質を含ませることができる。そのような物質及び顆粒は米国特許第５，２５４，２８３号に記載されており、その全体を引用により本明細書に編入する。
【００８２】
この発明の洗浄剤組成物は表面活性化剤、例えば界面活性剤を用い、洗浄剤組成物中でのそれらの使用に関してよく知られた、アニオン性、非イオン性及び量性界面活性剤を含む。
【００８３】
本発明及びその利点をさらに例示するために、以下の特定の実施例を本発明を例示するために提供されるという理解のもとに提供するが、如何なる様式においてもその範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００８４】
実施例
実施例１：ＥＧＩＩＩ変種の温度安定性
部位特異的変異導入を実施することにより、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩにアミノ酸の置換を取り込んだ。ＥＧＩＩＩに置換されたアミノ酸はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　１１ＡＧ８相同体中で相同の位置にあるものであった。
【００８５】
以下のプライマーを用いることにより、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉからのＥｒｗｉｎｉａ及びＨ．ｇｒｉｓｅａからのＥｒｗｉｎｉａ様セルラーゼにおいてシステインの置換を生じさせた。ＰＣＲをよく知られた技術に従い実施した。
【００８６】
【表１】
2004512827.tif 000004
【００８７】
簡単に云うと、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩをコードするＤＮＡをｃＤＮＡクローンから（Ｗａｒｄ，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．ｏｆ　ｔｈｅ　Ｔｒｉｃｅｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　”Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ．”Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ　１９９３　Ｅｄ．Ｓｏｕｍｉｎｅｎ，Ｐ．ａｎｄ　Ｒｅｉｎｉｋａｎｅｎ，Ｔ．Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ．８，ｐｐ１５３−１５８；米国特許第５，４７５，１０１号）、ｅｇｌ３遺伝子の５’末端にＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（最初のＡＴＧコドンのすぐ上流）及び３’末端にＸｂａＩ部位を導入した（「停止」コドンのすぐ下流）ＰＣＲプライマーを用いて、増幅した。増幅した断片を次にＢｇｌＩＩ及びＸｂａＩにより消化することにより、ＢｇｌＩＩ及びＸｂａＩにより消化したｐＵＣ１９に連結した。
【００８８】
変種はこのプロトプラスト中においてＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）変異導入法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて作成した。変種遺伝子を次にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの発現ベクターｐＰＧＰＴ−ｐｙｒＧにサブクローン化した。これは、ＰＧＰＴ−ｐｙｒＧの変種であり（Ｂｅｒｋａ　ａｎｄ　Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｄｖ．７：１２７（１９８９））、必須でないＤＮＡが切り出してある。変種遺伝子を有するベクターにより次にＡ．ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ：ａｗａｍｏｒを形質転換して、その結果の株を撹拌フラスコ培養にて成育させた（ＷＯ　９８／３１８２１）。
【００８９】
ＥＧＩＩＩ変種を次にこれらの培養物の細胞不含上清からカラムクロマトグラフィーにより精製した。簡単に云えば、１０ｍｇのＥＧＩＩＩあたり、約１ｍＬのＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｕｔｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（高速流）樹脂を０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む使い捨てドリップカラムに負荷した。当該カラムを次に０．０５ＭのＢｉｓ　Ｔｒｉｓ　Ｐｒｏｐａｎｅ及び０．０５Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ８により平衡化した。
【００９０】
ＥＧＩＩＩ様セルラーゼを含む上清を一晩０．１８ｍｇ／ｍＬのエンドグルカナーゼＨにより３７℃において処理した。硫酸アンモニウムを処理上清に約０．５Ｍの最終濃度まで加えた。遠心分離後に、上清を上記カラムに負荷した。当該カラムを次に３容量の平衡化バッファーにより洗浄して、次に２ｘ１容量の０．０５Ｍ　Ｂｉｓ　Ｔｒｉｓ　Ｐｒｏｐａｎｅ及び０．０５Ｍ酢酸アンモニウムによりｐＨ８にて溶出した。フロースルーの各容量を別々の画分として回収したところ、ＥＧＩＩＩ様セルラーゼは第２の画分に出現した。
【００９１】
平衡ＣＤ実験を、Ａｖｉｖにより供給された５位の熱電気セルホルダーを備えたＡｖｉｖ　６２ＤＳ又は６２ＡＤＳ分光光度計により実施した。バッファー条件は酢酸によりｐＨ８．０に調節された５０ｍＭ　ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン及び５０ｍＭ酢酸アンモニウムであった。各実験に関する最終蛋白質濃度は、５−３０ｍＭの範囲であった。データを０．１ｃｍのパスの長さのセルに回収した。
【００９２】
スペクトルを２６５〜２１０ｎｍにおいて回収した。熱変性は２１７ｎｍにおいて３０から９０℃において実施して、データを２℃おきに回収した。各温度における平衡時間は０．１分であり、そしてデータはサンプルあたり４秒間回収した。
【００９３】
ｐＨ８．０サンプルの残りを５ｘ４００ｕＬアリコートに分割した。２つのサンプルを酢酸によｐＨ５から７に調節して、２つのその他を水酸化ナトリウムによりｐＨ９及び１０に調節した。全５サンプルの熱変性は上記のとおりに同時に実施した。融点を、Ｌｕｏ，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３４：１０６６９及びＧｌｏｓｓ，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３６：５６１２の方法により測定した。
【００９４】
【表２】
2004512827.tif 000005
表２から認識し得るとおり、幾つかの変異は熱安定性において有意な増加を誘導した。例えば、３５位のアラニンのバリンへの変化は融点を約７．４℃上昇させた。
実施例３：ＥＧＩＩＩ様セルラーゼの比活性
比活性をアッセイするため、ＮＰＣの加水分解アッセイを用いた。マイクロタイタープレート中で、１００μｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５及び２０μｌの２５ｍｇ／ｍＬ　ｏ−ＮＰＣ（ｏ−ニトロフェニルｏ−Ｄ−セロビオシド（シグマＮ　４７６４））をアッセイバッファー中で加えた。プレートを１０分間４０℃においてインキュベートした。
【００９５】
平衡化したら、１０μｌのＥＧＩＩＩ様セルラーゼを加えて、プレートを４０℃においてさらに１０分間インキュベートした。加水分解を消滅させて反応を停止するため、７０μＬの０．２Ｍグリシン、ｐＨ１０．０を加えた。次に、プレートをマイクロタイターリーダー中で４１０ｎｍにおいて読んだ。規準として、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩの１０μＬの０．１ｍｇ／ｍｌ溶液は約０．３付近のＯＤを提供した。
【００９６】
ＥＧＩＩＩ様セルラーゼの濃度を２８０ｎｍにおける吸光により測定したが、減衰定数はＰａｃｅ，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏ．Ｓｃｉ．４：２４１１（１９９５）に記載されたＥｄｅｌｈｏｃｈの方法により実験上測定された７８７１１　Ｍ−１ｃｍ−１又は３．３５２ｇ／Ｌ−１であった。
【００９７】
【表３】
2004512827.tif 000006
表３から認識し得るとおり、ＥＧＩＩＩ由来の変種ＥＧＩＩＩセルラーゼを安定化させた変異は活性を保持する傾向である。３１位のグルタミンへの変更は、顕著に熱安定性を低下させ、活性も低下させた。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩのアミノ酸配列を示す（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１）。
【図２】
図２は、イントロンを除いたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩのＤＮＡ配列を示す（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３２）。
【図３】
図３は、２０のＥＧＩＩＩ様セルラーゼの完全長のＥＧＩＩＩの整列化における整列化を示し、一次配列モデリングに基づいた均等残基を示し、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３３），Ｈｙｐｏｃｒｅａ　ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３５），Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｋａｗａｃｈｉｉ（１）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３６），Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｋａｗａｃｈｉｉ（２）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３７），Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３８），Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｇｒｉｓｅａ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３９），Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｉｎｓｏｌｅｎｓ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０）、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ　ｂｒａｓｉｌｌｉｅｎｓｅ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４１），Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｅｑｕｉｓｅｔｉ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４２），Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｊａｖａｎｉｃｕｍ（１）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４３），Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｊａｖａｎｉｃｕｍ（２）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４４），Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ　ｒｏｓｅｕｍ（１）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４５），Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ　ｒｏｓｅｕｍ（２）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４６），Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ　ｒｏｓｅｕｍ（３）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４７），Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ　ｒｏｓｅｕｍ（４）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４８），Ｍｅｍｎｏｎｉｅｌｌａ　ｅｃｈｉｎａｔａ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４９），Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ　ｄｅｓｅｒｔｏｒｕ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５０），Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ　１１ＡＧ８（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５１），Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ　ＣｅｌＢ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２），Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ　ｍａｒｉｎｕｓ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５３）、及びＥｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖａｒａ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５４）を含む。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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