(57)【要約】本発明はにきび菌であるプロピオン酸菌属にきび菌の成長を抑制して面疱減少の効果を表すことにより、にきび予防及び治療に有効な性質を有している松花の花粉抽出物を含有する皮膚外用剤に関するものである。前記松花の花粉抽出物は皮膚外用剤の全体重量を基準として０．０５〜５０重量％の量で含まれていることが望ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
松花の花粉または松花の花粉抽出物を、にきびの予防及び治療に有効な量で含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項２】
前記皮膚外用剤は薬学的な塗布用治療剤の形態であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤。
【請求項３】
前記皮膚外用剤は化粧水、クリーム、パック、ローション、ファンデーション、サンスクリーン及びベビーパウダーから選択される化粧品の形態であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤。
【請求項４】
前記皮膚外用剤は石鹸、洗顔フォーム、ヘアーシャンプー及びボディーシャンプから選択される洗浄剤の形態であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤。
【請求項５】
前記有効量は前記皮膚外用剤の全体重量を基準として約０．０５ないし約５０重量％であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤。
【請求項６】
前記有効量は前記皮膚外用剤の全体重量を基準として約１ないし約２０重量％であることを特徴とする請求項５に記載の皮膚外用剤。
【請求項７】
前記有効量は前記皮膚外用剤の全体重量を基準として約２ないし約１０重量％であることを特徴とする請求項６に記載の皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は松花の花粉または松花の花粉抽出物を含有する皮膚外用剤に関するものであり、さらに詳細にはにきび菌に対する優れた坑菌力及び面疱の減少効果を有している松花の花粉または松花の花粉抽出物を含有する皮膚外用剤に関するものである。
【０００２】
（背景技術）
にきびは尋常性座瘡というが、成長期の皮膚特徴のひとつである。一般的ににきびの生成原因は明確にはされていないが、人によって差があり、いくつかの要因が相互作用して生成するものとして知られている。その主な要因は第一に、テストステロンの活発な皮脂の生成作用により生成された過剰の皮脂であり、第二に、過角質化された毛嚢による毛穴の閉鎖で生成された過剰の皮脂が毛嚢内に蓄積されて面疱の形成を促進し、その結果プロピオン酸菌属にきび菌が増加するようになることである。第三に、前記プロピオン酸菌属にきび菌が脂腺の肥大成長や毛嚢穴の過角質化によって生成された過剰な皮脂成分のひとつであるトリグリセリドを加水分解することである。この加水分解によって遊離脂肪酸が生成される。
【０００３】
このように生成された遊離脂肪酸は皮膚上皮覆組織に作用し、各種酵素を生成して毛嚢壁を破壊し、毛嚢周囲の結合組織に炎症を起こす。炎症の程度により、丘疹、吹出物、嚢胞、小結節が起こり、最悪の場合瘢痕にまでなる。
【０００４】
現在まで、テトラサイクリンなどの抗生物質や、プロピオン酸菌属にきび菌に対する抗菌物質等はにきびを予防及び治療するために使用されているが、それによってプロピオン酸菌属にきび菌が生成や光過敏作用等の副作用を誘発する傾向にあることが知られている。また主にはサリチル酸やレチノイン酸製剤によってケラチンが除去されてしまい、同じくベンゾイル・ペルオキシド製剤、局所用抗生物質並びに化膿菌の抑制作用のあるものも、多くの副作用を引き起こし、にきびを完治させる効能はないことも知られている。
【０００５】
サリチル酸製剤は化膿した皮膚炎に使用することはできず、皮膚発赤及び紅斑を誘発させることもありえる。ベンゾイル・ペルオキシド製剤はアレルギー性皮膚炎、及び紅斑を誘発させることがありえる。レチノイン酸製剤によって発赤、浮腫が発症し、長期間にわたる使用によって過色素沈着症が発生すると報告されている。局所用抗生物質は妊婦及び授乳婦に安全性が確立されておらず、また、抗生物質に対する過敏性患者には使用が不可能であるという短所がある。更に、最近には５α−リダクターゼの活性を抑制する物質を発見するために多くの研究がなされており、結果としていくつかの物質が開発されたが、その効果は微小で実用の面では難しいということが知られている。
【０００６】
（発明の開示）
前述した問題点を解消するために、本発明者は天然物を長期間にわたって詳細に研究した結果、松花の花粉またその抽出物がにきび治療に優れた効能をもたらし、また全く副作用を引き起こさない高い安全性を持ち合わせていることを発見した。これに対する研究を続けた結果、松花の花粉またはこれの抽出物がプロピオン酸菌属にきび菌に対して優れた坑菌力を持ち、また、面疱の減少効果及びにきびの治療に優れた効果を表すと同時に、既存のにきび治療剤の副作用や短所を改善することができることを発見した。このような発見に基づいて、本発明を完成するようになった。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、従来のにきび治療剤の副作用と短所を改善することができると同時に、プロピオン酸菌属にきび菌に対する、及び面疱減少効果のある優れた坑菌効果を有することによってにきびの予防及び治療に有効な皮膚外用剤を提供することに目的がある。
【０００８】
本発明は松花の花粉またはその花粉抽出物をにきびの予防及び治療に有効な量で含有する皮膚外用剤を提供する。前記松花の花粉またはその花粉抽出物の有効量は皮膚外用剤の全体重量を基準として約０．０５ないし約５０重量％が望ましく、さらには約１ないし約２０重量％、最も望ましくは約２ないし１０重量％である。前記松花の花粉またはその花粉抽出物を含有する皮膚外用剤は薬学的塗布用治療剤、化粧水、クリーム、パック、ローション、ファンデーション、サンスクリーン、ベビーパウダー、石鹸、洗顔フォーム、ヘアーシャンプー、ボディーシャンプの形態で使用される。
【０００９】
本発明で使用された松花の花粉は昔から中風予防、慢性下痢及びでき物と皮膚湿疹の治療に利き目があると知られており、また止血作用があって創傷治療に使用された。
【００１０】
本発明で使用される松花の花粉抽出物はプロピオン酸菌属にきび菌に対して優れた坑菌作用を表し、皮膚外用剤に適用した場合にも皮膚外用剤の物性に関係なく坑菌効果を示すことを確認した。更に、臨床実験をした結果、前記松花の花粉抽出物はにきび治療効果があり、長期間反復使用しても皮膚に対する副作用が無いことを確認した。
【００１１】
本発明で使用される松花の花粉自体またはその花粉抽出物は皮膚外用剤に適用される場合、前記外用剤の全体重量を基準として０．０５〜５０重量％の割合で含まれることが望ましい。これは０．０５％以下の量で適用する場合、にきび治療効果及び坑菌効果が微弱であるためである。その一方、５０％以上の量で適用する場合には、治療の相乗効果が微弱であるだけでなく、皮膚外用剤の安定性に劣るためである。また、さらに望ましいのは前記松花の花粉またはその花粉抽出物の含有量が１ないし２０重量％であり、最も望ましくは２ないし１０重量％であることである。
【００１２】
本発明の皮膚外用剤で使用されうる基本的な物の例としては、通常的に使われている石鹸、洗顔フォームなど人体の洗浄効果を目的とする洗浄剤、及びクリーム、ローションまたはファンデーションなどの化粧品がある。それらは液状、固体状、クリーム状及びペースト状のうちいずれも可能である。
【００１３】
（実施例）
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明の技術的な範囲が次の実施例で限定されるものではないことを明らかにしておく。
【００１４】
［実施例１］　松花の花粉抽出物のプロピオン酸菌属にきび菌に対する坑菌力評価
【００１５】
松花の花粉抽出物の坑菌力実験は、液体培地で培養されたプロピオン酸菌属にきび菌ＡＴＣＣ６９１９に特定な濃度の前記抽出物を加え、その結果もたらされる混合物を嫌気性培養槽で培養し、その後、その抽出物のプロピオン酸菌属にきび菌に対する最小増加え抑制濃度（ＭＩＣ）を測定することによって遂行された。実験過程は以下のようである。
【００１６】
１．培養方法
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（アメリカ合衆国　２０８５２　メリーランド州、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ１２３０１）より購入した代表的なにきび菌であるプロピオン酸菌属にきび菌ＡＴＣＣ６９１９を強化クロストリジウム培地で３日間３７℃で培養し、生存性が良くなるまで二次培養する。培養方法は次の通りである。
ａ）液体培養：強化クロストリジウム培地をねじ込み口金管に１０ｍｌ入れ、１２１℃で２０分間殺菌する。殺菌後すぐに、液体培地が酸素と接触することを防止するために、別に殺菌された流動パラフィンを液体培地の上に０．５ｍｌ落とす。
培地が冷めると、菌を接種し、３７℃で７２時間培養をする。
ｂ）固体培養：固体培地を菌株保存に適したものにするために、寒天を強化クロストリジウム培地に１．０％加える。その固体培地をねじ込み口金管に１０ｍｌ入れ、１２１℃で２０分間殺菌する。倍地が冷めると、白金耳で菌を接種し、３７℃で７２時間高層培養する。
ｃ）プレート培養：プレート培養用倍地は固体培養用倍地と同様に、プレートに寒天倍地を入れた後冷やす。プレート培地が完全に冷めて固まると、菌を接種し、嫌気性瓶に入れる。水を嫌気性瓶のガス発生袋に１０ｍｌ入れ、その嫌気性瓶のふたを閉じて３７℃で７２時間培養する。
【００１７】
２．松花の花粉抽出物の製造方法
ａ）松花の花粉１００ｇを抽出器に入れ、エタノールを２リットル加えよく混ぜる。その後６０℃で３日間抽出する。
ｂ）抽出後の抽出物をろ過器、ワットマンフィルターペーパーＮｏ．２でろ過し、ろ過器を通ったろ過液を取り、ろ過器に残った残留物は捨てる。
ｃ）ろ過液を濃縮フラスコに入れ、その後エタノールを全て除去するために真空濃縮する。また、残存水も濃縮の際に除去される。
ｄ）濃縮された松花の花粉抽出物液を−８０℃の急速冷凍冷蔵庫で凍らせ、粉状の松花の花粉抽出物を２０ｇ獲得するために凍結乾燥させる。
【００１８】
３．松花の花粉抽出物のプロピオン酸菌属にきび菌ＡＴＣＣ６９１９に対する抑制実験
ａ）十分二次培養されたプロピオン酸菌属にきび菌ＡＴＣＣ６９１９菌の培養液１ｍｌを９ｍｌの強化クロストリジウム培地に入れ、よく混ぜる。その際１０倍で希薄される。
ｂ）前記ａ）の方法を繰り返し、１０−１〜１０−５倍までの希薄培養液を作る。
ｃ）凍結乾燥によって得られた松花の花粉抽出物１０ｇを５０％のエタノール１０ｍｌによく溶かし、２倍ずつ希薄して各濃度別松花の花粉抽出物溶液を作る。この溶液を０．２μｍの薄膜フィルターを利用して無菌ろ過する。
ｄ）強化クロストリジウム寒天培地を殺菌した後、５０℃に冷やす。その寒天培地に、前記ｃ）の無菌ろ過した抽出物を、最終濃度が１０ｍｇ／ｍｌ〜０．１ｍｇ／ｍｌの範囲で加える。その後、それをまんべんなくよく混ぜる。
ｅ）前記Ｂ）の希薄培養液よりそれぞれ１ｍｌずつペトリ皿に分株する。各濃度別の寒天培地をペトリ皿に分株し、まんべんなくよく混ざるように振った後、定置して硬化させる。
ｆ）寒天倍地が硬化すると、嫌気性瓶に入れてガス発生袋を装置する。その寒天培地を３日間３７℃で培養させ、その結果のコロニー数を測定し、対照群と比較する。その後、松花の花粉抽出物のプロピオン酸菌属にきび菌の抑制率を計算する。コロニー数及び抑制率の結果は下記表２の通りである。
【００１９】
プロピオン酸菌属にきび菌に対する殺菌力の評価結果から、本発明の松花の花粉抽出物は下記の表１のように、約０．０１６％の非常に低い濃度で殺菌力が現れ始め、０．１％またはそれ以上の濃度で、プロピオン酸菌属にきび菌を完全に殺菌するということが発見された。したがって、前記松花の花粉抽出物はプロピオン酸菌属にきび菌に対して非常に卓越した坑菌効果を有していることを分かった。
【００２０】
（表１）　プロピオン酸菌属にきび菌ＡＴＣＣ６９１９に対する最小抑制濃度（ＭＩＣ）の測定結果
2004511524.tif 000002
【００２１】
（表２）　プロピオン酸菌属にきび菌に対する坑菌効果の実験結果
2004511524.tif 000003
【００２２】
［実施例２］　松花の花粉抽出物の面疱減少効果
【００２３】
面疱減少実験において、実験動物としてニュージーランド産白ウサギを使用した。この実験のために４ケ月齢前後の２〜３ｋｇの健康な雄ウサギを入手し、１週間の順応過程を設けた。順応した動物のうち、肉眼でみて健康な動物だけを使用した。面疱減少実験用の実験物質は松花の花粉抽出物のエキスをエタノールに溶解させて１％の溶液になるように使用した。実験方法は次の通りである。
【００２４】
面疱誘発物質であるイソプロピル・ミリステート（ＩＰＭ）を３０頭のうさぎの両耳に毎日１回１ｍｌずつ７日間塗布し、面疱を誘発させた。典型的な面疱が形成された２５頭を選りすぐり、各群当たり５頭ずつ５群で分類して実験した。
【００２５】
面疱減少効果の実験において、面疱が誘発された右耳に、前記の製造方法で作った松花の花粉抽出物の実験物質を１ｍｌ投与した。その後、投与された実験物質を綿棒で均一に塗布した。左耳には基剤で使用したエタノールを１日１回１ｍｌ投与した後に、綿棒で１０回程度均一に塗布し、右側耳と比較した。
【００２６】
面疱の治癒期間を２週間続け、実験物質を投与しながら面疱の病変の進行程度と面疱の減少効果を評価した。実験終了後、各実験群を安楽死させ、両耳を切り落とし、基底部の組織を約２．５ｃｍ×１．５ｃｍに切った。その組織を５０℃の水に２分間漬けた後、取り出す。表皮を剥離した後、スライドグラスに組織の内側面が上にくるように乗せる。乾燥させた後、立体顕微鏡で観察し、画像分析機で組織の面疱数と面積を計算した。その結果は下記の表３に示している。表３より、治療群の面疱面積が顕著に減少されたことが分かった。
【００２７】
（表３）　松花の花粉抽出物の適用２週後の面疱減少率
2004511524.tif 000004
＊面疱減少率＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×１００
【００２８】
［実施例３］　松花の花粉抽出物を含有したパック製剤のプロピオン酸菌属にきび菌に対する坑菌力
【００２９】
前述した松花の花粉抽出物をパック製剤に適用した場合のプロピオン酸菌属にきび菌に対する坑菌効果を検証するために、パック製剤を通常のパック製造方法に従って作り、にきび菌に対する坑菌効果を測定した。そのパック製剤の構成は下記表４の通りである。
【００３０】
（表４）　松花の花粉抽出物を含有したパック製剤の構成（重量％）
2004511524.tif 000005
【００３１】
上記のように製造されたパック製剤のプロピオン酸菌属にきび菌ＡＴＣＣ６９１９に対する坑菌効果を測定するために、十分に活性化され、１０倍、１００倍、１０００倍まで希薄したにきび菌の培養液それぞれ１００μｌを適当な倍地が含有されたペトリ皿に接種した。その後、その培養液を均一に塗布し、嫌気性培養器で３日間培養し、育ったコロニー（Ａ）を測定した。同時に、前記表４の各実験群の５％溶液を１００μｌ、にきび菌培養液の希薄液と共にペトリ皿に接種し、均一に塗布し、嫌気性培養器で３日間培養し、育ったコロニー（Ｂ）を測定して坑菌効果を測定した。殺菌率が９０％またはそれ以上である時に効果があるものとして判定した。殺菌率の測定は次のような式に基づいて測定した。
殺菌率＝［（Ａ−Ｂ）／Ａ］×１００
パック製剤の坑菌効果は下記表５に示した。
【００３２】
（表５）
松花の花粉抽出物を含有したパック製剤のにきび菌に対する坑菌効果
2004511524.tif 000006
【００３３】
表５より、松花の花粉抽出物を含有するパック製剤のにきび菌に対する坑菌効果が、対照群より優越であることがわかる。また、松花の花粉抽出物が５％またはそれ以上含まれているパック製剤は、９５％またはそれ以上の坑菌率を表し、１０％またはそれ以上では、９９％またはそれ以上の殺菌率を表す。よって、抽出物の濃度が増加されても坑菌効果には大きい差がなかった。
【００３４】
［実施例４］　松花の花粉抽出物を含有するにきび予防及び治療用パック製剤の面疱減少の効果
【００３５】
松花の花粉抽出物を含有するにきび予防及び治療用パック製剤の面疱減少の効果を評価するために、実験用パック製剤として、実施例３で製造した臨床実験用パック製剤を使用し、実験動物としてはニュージーランド産白ウサギを使用した。この実験のために４ケ月齢前後の２〜３ｋｇの健康な雄ウサギを入手し、１週間の順応過程を設けた。順応した動物のうち、肉眼でみて健康な動物だけを使用した。実験方法は次の通りである。
【００３６】
面疱誘発物質であるイソプロピル・ミリステート（ＩＰＭ）を３０頭のうさぎの両耳に毎日１回１ｍｌずつ７日間塗布し、面疱を誘発させた。典型的な面疱が形成された２５頭を選りすぐり、各群当たり５頭ずつ５群で分類して実験した。
【００３７】
面疱減少効果の実験において、面疱が誘発された右耳に、実施例３で作った松花の花粉抽出物が含有される各パック製剤を、毎日１回２ｇ投与した。その後、その投与されたパック製剤を綿棒で均一に塗布した。左耳には対照群である松花の花粉抽出物を含有しないパック製剤を毎日１回２ｇずつ投与した後に、綿棒で１０回程度均一に塗布して右耳と比較した。
【００３８】
面疱の治療期間を２週間続け、パック製剤は塗布後十分に洗い流すか取り除く方法で進行した。パック製剤を投与しながら面疱の病変進行程度と面疱の減少効果を評価し、実験終了後、各実験群を安楽死させ、実施例２と同様の方法で面疱の減少効果を測定した。
【００３９】
その結果、治療群の面疱面積が顕著に減少されたことが分かった。松花の花粉抽出物を含有するパック製剤の面疱の減少効果を表６に表した。
【００４０】
（表６）　松花の花粉抽出物を含有するパック製剤の面疱の減少効果
2004511524.tif 000007
＊面疱減少率＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×１００
【００４１】
［実施例５］　松花の花粉抽出物を含有するパック製剤の臨床実験
【００４２】
実施例３で製造したパック製剤を使用して、にきび予防及び治療に対する臨床実験を実施した。実験は表７での等級３〜９までに該当するにきびに悩む１０代中盤から３０代中盤の男女各３０名ずつのボランティアを対象に行い、各実験群のパック製剤は対照群を含む１０名ずつの実験群ごとに選択し、１日に１回ずつ１ヶ月間使用するようにした後、その結果を評価した。臨床実験の結果は次の表８で見られる。
【００４３】
（表７）　肉眼観察による皮膚等級の基準
2004511524.tif 000008
【００４４】
（表８）　松花の花粉抽出物を含有するパック製剤の臨床実験結果（名）
2004511524.tif 000009
上記の表８で見るように松花の花粉抽出物を含有するパック製剤（実験群１〜５）のにきび治療効果は対照群に比べて優越なものとして表れた。松花の花粉抽出物が１％含まれるパック製剤（第１試験群）の場合対照群より少しの効果が見られた。松花の花粉抽出物が５％またはそれ以上含まれるパック製剤（第２〜５実験群）は非常に優れた治療効果を見せ、副作用も全く発見されなかった。前記の臨床実験は肉眼観察によるものであった。
【００４５】
（実施例６）　松花の花粉抽出物を含有する石鹸、クリーム、化粧水、ローション、ファンデーション製剤の臨床実験のために、通常の製造方法によって表９〜１３のような構成比で皮膚外用剤を作った。
【００４６】
（表９）　松花の花粉抽出物を含有した石鹸製剤の構成
2004511524.tif 000010
【００４７】
（表１０）　松花の花粉抽出物を含有したクリーム製剤の構成
2004511524.tif 000011
【００４８】
（表１１）　松花の花粉抽出物を含有する化粧水製剤の構成
2004511524.tif 000012
【００４９】
（表１２）　松花の花粉抽出物を含有するローション製剤の構成
2004511524.tif 000013
【００５０】
（表１３）　松花の花粉抽出物を含有するファンデーション製剤の構成
2004511524.tif 000014
【００５１】
上記の構成比で作ったそれぞれの製剤を使用してにきび予防及び治療に対する臨床実験を実施した。実験は表７での等級３〜９までに該当する男女各５名のボランティアを対象に行った。ファンデーション製剤は女性にのみ使用した。石鹸、クリーム、ローション、化粧水は１日に２回ずつ１ヶ月間、ファンデーションは１日に１回ずつ１ヶ月間使用してその結果を評価した。評価方法は実験開始の前後に表７の判定基準で肉眼観察により等級をつけ、３等級以上の状態好転が表われば優秀、１〜２等級の好転は良好と判定した。結果は次の表１４で見られる。
【００５２】
（表１４）
2004511524.tif 000015
【００５３】
［実施例７］　松花の花粉自体のにきび予防及び治療効果に対する臨床実験を行うために、松花の花粉とワセリンを１対２で混合しクリーム状の製剤を作った。実験は表７での等級３〜９までに該当する男女各５名のボランティアを対象に行った。クリームは１日に１回ずつ１ヶ月間使用してその結果を評価した。松花の花粉固有の色と製剤の性状のために外出時には使用することが出来ないことから夜のみに使用した。評価方法は実験開始の前後に表７の判定基準で肉眼観察により等級をつけ、３等級以上の状態好転が表われば優秀、１〜２等級の好転は良好と判定した。結果は次の表１５で見られる。
【００５４】
（表１５）
2004511524.tif 000016
【００５５】
表１５の結果から松花の花粉自体もその製剤の性状によってにきび予防及び治療に使用することが可能であるということが判った。しかし、松花の花粉自体よりはその抽出物の適用が使用感とにきびに対する効能面において優越なものであると言える。
【００５６】
（発明の効果）
以上説明したように、本発明で使用される松花の花粉または松花の花粉抽出物はプロピオン酸菌属にきび菌に対する優秀な抗菌効果および面疱減少の効果を表し、長期間使用しても副作用が全くないものと判明した。従って、松花の花粉または松花の花粉抽出物はにきび予防及び治療のための各種皮膚外用剤の主要成分として利用することができる。
【００５７】
これまでに、本発明の優れた点について具体的に述べてきたが、一方では当該技術に熟練した者により、本発明が特有なものとは限らないと理解される恐れがある。従って、本構成の問題として、部分的な変更が施される場合もあるだろう。
【国際公開パンフレット】
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2004511524.tif 000018
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2004511524.tif 000040
2004511524.tif 000041
【国際調査報告】
2004511524.tif 000042
2004511524.tif 000043