(57)【要約】多孔性の吸水性のフリースが、架橋可能な生体適合性かつ生分解性のマクロマーから作成される。マクロマーの溶液を凍結させ、凍結乾燥によって真空乾燥させる。次いで、凍結乾燥によって形成された「フリース」を、例えば熱および／または架橋開始剤によって架橋する。得られる架橋された材料は、高度に吸水性であり、少なくとも凍結乾燥前のサイズへと容易に膨張するが、ゲルのマクロ多孔性および微孔性は保持している。フリースの多孔度および強度は、初期重合体濃度および架橋の程度によって調節され得る。フリース材料は、医学および組織工学における適用のため、種々の態様において使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体適合性生分解性フリースを作成する方法であって、
a．各々が生分解性領域および架橋可能成分を形成する一つまたは複数の成分を含む、二つまたはそれ以上の領域によって囲まれた重合体親水性領域を含む、架橋可能合成マクロマーを含む溶液を提供する段階；
b．所望の形で溶液を凍結させる段階；
c．溶液を真空乾燥させる段階；ならびに
d．フリースを作製するため、架橋可能マクロマーを架橋させる段階
を含む方法。
【請求項２】
真空乾燥工程が架橋工程の前に実行される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
真空乾燥工程が架橋工程の後に実行される、請求項1記載の方法。
【請求項４】
マクロマー溶液が、重合を引き起こす材料、および生物活性剤のうちの少なくとも一つをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
生物活性剤が、抗生物質、成長調節分子、止血剤、抗体、抗原、トランスフェクション・ベクター、発現ベクター、麻酔薬、および抗不整脈剤からなる群より選択される、請求項4記載の方法。
【請求項６】
架橋が、電離放射線、非電離放射線、熱、開始剤の添加、および架橋化学物質またはイオンの添加のうちの少なくとも一つの使用により実行される、請求項1記載の方法。
【請求項７】
架橋が、フリーラジカル重合反応によって実行される、請求項1記載の方法。
【請求項８】
架橋されたマクロマーのすすぎをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
すすぎの後に、架橋されたマクロマーを細断する工程をさらに含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
フリース粒子を形成するために、架橋されたマクロマーを細断する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
凍結工程および真空乾燥工程のうちの少なくとも一つの後に、架橋されたマクロマーを細断する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
支持材料がフリースに取り込まれる、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
支持材料の取り込みが凍結工程中に起こる、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
請求項10の方法によって作製された、生体適合性生分解性フリース粒子。
【請求項１５】
水溶液によるフリース粒子の加湿をさらに含む、請求項10記載の方法
【請求項１６】
加湿フリース粒子へ、細胞、重合を引き起こす材料、および生物活性剤のうちの少なくとも一つを添加する段階をさらに含む、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
請求項1記載の方法によって作製された、生体適合性生分解性フリース。
【請求項１８】
請求項10記載の方法によって作製された、生体適合性生分解性フリース粒子。
【請求項１９】
請求項16記載の方法によって作製された、生体適合性生分解性フリース粒子。
【請求項２０】
架橋された合成マクロマーを含み、かつマクロ多孔性である生体適合性生分解性フリースであって、合成マクロマーのうちの少なくとも一つが、各々が生分解性領域および架橋可能成分を形成する一つまたは複数の成分を含む、二つまたはそれ以上の領域によって囲まれた重合体親水性領域を含むフリース。
【請求項２１】
細胞、重合を引き起こす材料、および生物活性剤のうちの少なくとも一つをさらに含む、請求項20記載のフリース。
【請求項２２】
フリース粒子の形態で存在する、請求項20記載のフリース。
【請求項２３】
フリース粒子の形態で存在する、請求項21記載のフリース。
【請求項２４】
炭酸エステルおよびヒドロキシ酸の単量体およびオリゴマーからなる群より選択される生分解性結合を含む、ジアクリレート化ポリエチレンオキシドを含む、請求項20記載のフリース。
【請求項２５】
細胞、重合を引き起こす材料、および生物活性剤のうちの少なくとも一つをさらに含む、請求項24記載のフリース。
【請求項２６】
フリース粒子の形態で存在する、請求項24記載のフリース。
【請求項２７】
フリース粒子の形態で存在する、請求項25記載のフリース。
【請求項２８】
異なる組成の領域を少なくとも二つ有する、請求項20記載のフリース。
【請求項２９】
架橋可能マクロマーが水溶性である、請求項1記載のフリース。
【請求項３０】
凍結工程の前に泡が溶液に取り込まれる、請求項1記載のフリース。
【請求項３１】
請求項19記載の生体適合性フリース粒子および水溶液を含むスラリー。
【請求項３２】
水溶液が、細胞、重合を引き起こす材料、および生物活性剤のうちの少なくとも一つを含む、請求項31記載のスラリー。
【請求項３３】
請求項23記載の生体適合性フリース粒子および水溶液を含むスラリー。
【請求項３４】
水溶液が、細胞、重合を引き起こす材料、および生物活性剤のうちの少なくとも一つを含む、請求項33記載のスラリー。
【請求項３５】
請求項27記載の生体適合性フリース粒子および水溶液を含むスラリー。
【請求項３６】
水溶液が、細胞、重合を引き起こす材料、および生物活性剤のうちの少なくとも一つを含む、請求項35記載のスラリー。
【請求項３７】
請求項31記載のスラリーを創傷または欠損に適用することにより、創傷または欠損を治療する方法。
【請求項３８】
請求項33記載のスラリーを創傷または欠損に適用することにより、創傷または欠損を治療する方法。
【請求項３９】
請求項35記載のスラリーを創傷または欠損に適用することにより、創傷または欠損を治療する方法。
【請求項４０】
スラリーが生細胞を含む、請求項38記載の方法。
【請求項４１】
欠損が軟骨欠損であり、かつ生細胞が軟骨細胞である、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
軟骨欠損の外縁にプライマー溶液を適用する段階、およびスラリーを欠損へ密封するため、プライマー処理された欠損領域に密封剤を適用する段階をさらに含む、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
密封剤が生分解性重合可能マクロマーとして適用され、その後マクロマーが重合される、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
軟骨欠損の外縁にプライマー溶液を適用する段階、密封剤で軟骨欠損を覆うため、プライマー処理された欠損領域に密封剤を適用する段階、および次に密封剤と欠損との間にスラリーを適用する段階をさらに含む、請求項41記載の方法。
【請求項４５】
密封剤が生分解性重合可能マクロマーとして適用され、その後マクロマーが重合される、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
重合が、電離放射線、非電離放射線、熱、開始剤の添加、および架橋化学物質またはイオンの添加のうちの少なくとも一つの使用により実行される、請求項43記載の方法。
【請求項４７】
治療が、止血、大気からの保護、乾燥からの保護、および創傷への細胞または生物活性剤の送達のうちの少なくとも一つを含む、請求項38記載の方法。
【請求項４８】
薬物送達のための、請求項20記載の生体適合性生分解性フリースの使用。
【請求項４９】
組織癒着を防止するための、請求項20記載の生体適合性生分解性フリースの使用。
【請求項５０】
細胞を培養するための、請求項20記載の生体適合性生分解性フリースの使用、およびその後の、細胞を含むフリースの欠損への移植。
【請求項５１】
組織工学用の基体を提供するための、請求項20記載の生体適合性生分解性フリースの使用。
【請求項５２】
軟骨細胞、心筋細胞、および幹細胞からなる群より選択される細胞を含む、水溶液および請求項27記載の生体適合性フリース粒子を含むスラリーを、創傷または欠損に適用することにより、創傷または欠損を治療する方法。
【請求項５３】
幹細胞が間葉幹細胞である、請求項52記載記載の方法。
【請求項５４】
軟骨細胞、心筋細胞、および幹細胞からなる群より選択される細胞を含む、水溶液および請求項27記載の生体適合性フリース粒子を含むスラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
1．発明の領域
本発明は、一般に、医学的適用および組織工学にとって有用な重合体材料の領域にある。
【背景技術】
【０００２】
2．関連技術の説明
多孔性材料は、医学およびバイオテクノロジーにおける多数の用途を有している。一般に、使用される材料は、約1ミクロン未満の孔を有している微孔性、またはミクロンからミリメートルの範囲の孔を有しているマクロ多孔性のいずれかである。微孔性材料は、一般にゲルであるか、または泡状物質もしくは微孔性膜である場合もある。孔サイズのため、細胞は微孔性基質に浸透することができない。これは、ろ過および組織上の障壁の形成のようないくつかの適用にとっては利点であるが、細胞の培養または固定化においては不利である。
【０００３】
マクロ多孔性材料は、典型的には、発泡ゼラチン（例えば、「GelFoam」；Abbott）のようなより粗いオープンセル型であるか、またはフィラメントの架橋凝集物もしくは不織凝集物により作製されている（例えば、ガーゼ）。そのような技術は、乳酸、グリコール酸、および共重合体のような生分解性材料で（から）マクロ多孔性構造を作製するために使用されている。マクロ多孔性培地は、細胞の進入または付着を可能にするが、通常、ゲルの親水性および生体適合性は欠いている。
【０００４】
一つの医学的適用において、局部的な組織損傷を修復するための細胞の、より簡便な送達法の開発に、大きな関心が持たれている。膝関節軟骨の欠損という特定の例において、そのような欠損は、骨関節炎へと進行し、膝全置換を必要とする可能性がある。自家軟骨細胞移植（ACI）は、深い膝軟骨欠損を有する人々を治療するために使用されている。ACIは、関節鏡検査中に、傷害を負った膝の影響を受けていない領域から健康な軟骨細胞を得る段階を含む。次いで、軟骨細胞が単離され培養される。次いで、培養された軟骨細胞が、欠損領域に注入される。欠損は、近位内側脛骨から採取される縫合された骨膜弁で覆われる。その手法には、極めて多くの時間がかかり、欠損領域へと軟骨細胞を密封するために十分に骨膜弁が縫合されることが必要とされる。M.Brittbergら、New England J.of Med.331,889（1994）を参照されたい。吸収可能支持基質に保持された軟骨細胞の使用（B.Gianettiら、国際公開公報第00/09179号）；低密度に播かれた軟骨細胞の使用（T.Gagneら、国際公開公報第98/55594号）；組織前駆細胞を含有しているヒドロゲル支持体の使用（C.Vacantiらの米国特許第6,027,744号）；コラーゲン基質中に播かれた軟骨細胞（D.Grandeらの米国特許第4,846,835号）；繊維状重合体基質中に播かれた軟骨細胞（J.Vacantiらの米国特許第5,041,138号）；およびその他の様々な支持体に播かれた軟骨細胞（米国特許第5,326,357号；第6,206,931号；第5,837,278号；第5,709,854号；およびPCT出願国際公開公報第01/08610号）などによる、軟骨修復手法の改良が開示されている。しかしながら、適用の容易さ、および組織損傷の修復における有効性を増加させるため、軟骨修復手法を改良する必要が存在する。
【０００５】
従って、本発明の目的は、マクロ多孔性、およびゲル様微孔性を組み合わせた特性を有する材料を提供することである。
【０００６】
医学およびバイオテクノロジーにおけるこれらの材料の使用を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【０００７】
身体の創傷および欠損、特に膝関節軟骨の欠損の修復を促進するための、これらの材料の使用を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
ゲルを形成させるために通常使用される架橋可能重合体材料が、ゲル特性およびマクロ多孔性の両方を有するマクロ多孔性材料を形成させるために使用され得ることが発見された。その方法は、単純であり、かつ再現性があり、そして得られるフリースの多孔度および膨張特性の調節を可能にする。その最も単純な態様において、ゲルは、架橋可能重合体を（架橋することなく）水に溶解させること；水溶液を凍結させること；乾燥多孔性フリースを形成させるため、溶液を凍結乾燥させること；およびフリース状態で重合体を架橋することにより、形成される。フリースは、乾燥状態が維持された場合には特に、室温において長期間、安定であるが、選択的に生細胞を含有してもよい水または生物学的液体の存在下では、急速に再水和する。凍結状態での架橋；凍結乾燥前に予備凍結させられた層に、選択的に異なる材料を含有している連続的な層を添加することによる、多層を有するフリースの作製；薬物、増殖因子、および止血剤のような生理活性材料、ならびに細胞の取り込み；ならびに変動する生分解性の程度の提供を含む、手法に対するいくつかの変更が可能である。
【０００９】
本発明のその他の目的および特徴は、以下の詳細な説明より明白となる。
【００１０】
現在好ましい態様の詳細な説明
フリースを形成する材料
本明細書において使用されるように、フリースとは、水の存在下で膨張する、マクロ多孔性および水和時の微孔性の両方を有している多孔性材料である。フリースは、生体適合性、生分解性、および水溶液を吸収する能力という特性を有する架橋された材料である。フリースは、架橋可能重合体分子（マクロマー）を架橋することによって形成される。好ましい態様において、材料は組織に適用されるか、または組織修復のための支持体を形成させるために使用される。組成物は、生物活性材料を含む、その他の薬剤および生細胞をさらに含有してもよい。
【００１１】
架橋可能材料
本明細書において使用されるように、「架橋する」とは、任意の物理的または化学的な手段によって構造を形成させる、より小さな実体の接合をさすよう、総称的に定義される。特記しない限り、「重合する」という用語は、「架橋する」の機能的等価物である。
【００１２】
Hubbellらの米国特許第5,410,016号には、架橋されたゲルを形成させるための光重合へと続く、組織への生分解性マクロマーの適用が記載されている。Hubbellらによって記載された光重合可能ゲルに加え、表面上に薬物送達デポまたは障壁を形成させるための系には、Dunnらの米国特許第4,938,763号、Cohnらの米国特許第5,100,992号および第4,826,945号、De Lucaらの米国特許第4,741,872号および第5,160,745号、Suggsらの米国特許第5,527,864号、Nowinskiらの米国特許第4,511,478号、ならびにDombの米国特許第4,888,413号に記載された重合体が含まれる。フリーラジカル開始重合により共有結合的に架橋されるこれらの材料は、好ましい材料である。しかしながら、ポリイソシアネート、またはスクシンイミデートのような架橋性求核基の、ポリアミンとの反応のような、その他のメカニズムにより架橋する材料、または低分子量の反応性単量体を含む材料も、生体適合性であり無毒であるならば、適当である可能性がある。ヒドロゲルを形成させるために架橋可能なマクロ単量体（「マクロマー」）には、ブロック共重合体が含まれ得る。マクロマーは、水溶液から急速に架橋され得る。マクロマーは、有利なことに、熱可逆性ゲル化により架橋されることができ、溶液状態、ゲル状態、または固体状態から架橋され得る。特に、凍結状態または凍結乾燥状態において架橋され得る材料が、好ましい。
【００１３】
好ましくは、マクロマーは、溶媒に可溶性であり、溶液状態から架橋される。一つの局面において、架橋可能マクロマーは、所望のフリースを形成させるために十分な濃度で溶媒に溶解可能である。溶媒は、好ましくは少なくとも約50％、より好ましくは90％〜100％水である。しかしながら、溶媒は、凍結され、その後凍結乾燥によって除去され得るという制限を条件として、任意の程度に非水性液体を含有していてもよい。例えば、例えば低級アルコール、アセトン、DMF、DMSO、ピロリドン、および低毒性のその他の水混和性液体を含む水混和性液体が、最大約90％、凍結される溶液に含まれ得る。得られる凍結乾燥生成物が適切な特性を有しているのであれば、非水混和性液体も、溶媒の成分として使用され得る。加工のため、不揮発性液体の使用は、最小限に抑えることが望ましい。水溶液は、緩衝液、ならびに重合の開始剤、電子転移試薬、生物活性材料、ならびに細胞培養のためのコロイドおよび栄養素（これらに制限はされない）のような、その他の材料を含有していてもよい。
【００１４】
架橋可能基
単量体またはマクロマーは、好ましくは、凍結状態または凍結乾燥状態において共有結合を形成することができる架橋可能基を含む。これらの架橋可能基は、ゲルを形成させるためのマクロマーの架橋を許容する。マクロマーは、選択的に、マクロマーの熱可逆性相互作用またはイオン相互作用によるゲルであってもよい。当技術分野において既知の化学的またはイオン的に架橋可能な基が、架橋可能性を提供するために、マクロマー中に提供されてもよい。一つの好ましい態様において、架橋可能基は、好ましくは光開始剤を用いて、フリーラジカル開始、最も好ましくはペルオキシゲン（peroxygens）、または可視もしくは長波長紫外線により発生したものによって重合可能なものである。好ましい架橋可能基は、不飽和基、特に、ビニル基、アリル基、シナメート、アクリレート、ジアクリレート、オリゴアクリレート、メタクリレート、ジメタクリレート、オリゴメタクリレート、アクリル（メタクリル）アミド、ヒドロキシエチルメタクリレートを含むアクリル酸エステルを含むエチレン性基、およびその他の生物学的に許容されるフリーラジカル重合可能基であるが、これらに制限はされない。これらの基は、化学的もしくは熱的な手段によっても、または化学的手段、熱的手段、および光開始手段の任意の組み合わせによっても架橋され得る。
【００１５】
使用され得るその他の架橋化学には、例えば、アミンもしくはアルコールの、イソシアネートもしくはイソチオシアネートとの反応、またはアミンもしくはチオールの、アルデヒド、活性化エステル、エチレン性基、ハロゲン化アルキルのような求電子炭素中心、エポキシド、オキシラン、もしくは環式イミンとの反応が含まれ、ここでアミンもしくはチオールのいずれか、またはその他の反応体、または両方が、マクロマーへと共有結合で付加され得る。単量体の混合物からの共重合体も企図される。スルホン酸基またはカルボン酸基が、単量体に含有されていてもよい。
【００１６】
好ましくは、重合したマクロマーの架橋を確実にすることにより、粘着性ヒドロゲルの形成を許容するため、マクロマーの少なくとも一部は、架橋剤である、即ち、複数個の架橋可能反応基を有すると考えられる。マクロマーの最大100％が、複数個の反応基を有し得る。典型的には、合成中のその割合は、約50％〜95％、例えば60％〜80％であると考えられる。その割合は、1個の活性基のみを含有している共単量体（co-monomer）の添加によって減少し得る。架橋剤濃度の下限は、特定のマクロマーの特性および全マクロマー濃度に依存すると考えられるが、反応基の全モル濃度の少なくとも約2％であろう。より好ましくは、架橋剤濃度は、少なくとも10％であり、30％〜90％のようなより高い濃度が、多くの薬物の拡散の最大の遅滞にとって最適であると考えられる。選択的に、架橋機能の少なくとも一部が、低分子量架橋剤によって提供されてもよい。
【００１７】
反応基が、1個の他の基（例えばイソシアネート）とのみ反応する場合には、反応分子の少なくとも一部、例えば少なくとも約1％、好ましくは2％以上、より典型的には5％以上、選択的に最大100％が、架橋を提供するための反応基を3個またはそれ以上含有していなければならない。エポキシドの第一級アミンとの反応のようないくつかの化学においては、一方の基がモノ反応性（この例においては、エポキシド）であり、他方が多官能性（この場合、少なくとも2個のエポキシドと反応することができるアミン）であろう。そのような反応においては、必要とされる量の架橋が供給され得るいくつかの方式が存在するが、最小要件は何らかのトリエポキシドまたは何らかの二量体第一級アミンである。適当な混合物の選択は、当技術分野において既知である。
【００１８】
生細胞、または巨大分子のような生物活性剤を送達する場合には、より高い範囲のポリ官能性マクロマー（即ち、複数個の反応基を有している）が好ましい。大部分の適用において好ましいように、ゲルを生分解性とする場合には、分子中の架橋反応基が、生分解性結合によって相互に隔離されているべきである。分解可能重合体ブロックのような、インビボ条件下で生分解性であることが既知の任意の結合が、適当であり得る。化学的開始剤および／または光活性開始剤によるフリーラジカル重合によって架橋された、エチレン性不飽和基の使用が、架橋可能基として好ましい。
【００１９】
マクロマーは、マクロマーのゲル化またはイオン架橋を選択的に許容する、マクロマーへと共有結合的に付加された、イオン性の電荷を有する成分を含んでいてもよい。
【００２０】
親水性領域
マクロマーは、吸水性ゲル構造を形成するための有意な親水性を有している。マクロマーの少なくとも一部、好ましくはマクロマーの大部分が、親水性ドメインを含有している。マクロマーの中の親水性ドメインとは、マクロマーへと取り込まれるのではなく独立した分子として調製された場合に水溶性であると考えられる、マクロマーの親水性基、ブロック、または領域である。親水性基は、水への分散性または可溶性のため、およびゲル化後の、または乾燥後の再水和時のゲルによる水の保持のために必要である。マクロマーの親水性基は、好ましくは、大部分または全体が合成材料で作製される。調節された組成および結合を有する合成材料は、より一貫した分解および放出の特性のため、天然材料よりも典型的に好ましい。
【００２１】
有用な合成材料の例には、ポリ（エチレングリコール）（または同義のポリ（エチレンオキシド）またはポリオキシエチレン）、ポリ（プロピレングリコール）、部分的にまたは完全に加水分解されたポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド）-コ-ポリ（プロピレンオキシド）ブロック共重合体（ポロキサマー（poloxamers）およびメロキサポール（meroxapols））、ならびにポロキサミン（poloxamines）から調製されたものが含まれる。好ましくは水溶性重合体ブロックは、ポリ（エチレンオキシド）から作製される。好ましくは、マクロマーの少なくとも50％が、合成材料で形成されている。
【００２２】
マクロマーの親水性基は、天然材料に由来してもよい。有用な天然材料および修飾型天然材料には、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシアルキル化セルロース、例えばヒドロキシエチルセルロースおよびメチルヒドロキシプロピルセルロース、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖または炭水化物、例えばフィコール（Ficoll）（商標）ポリショ糖、ヒアルロン酸およびその誘導体、デキストラン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、またはアルギネート、ならびにタンパク質、例えばゼラチン、コラーゲン、アルブミン、またはオボアルブミンが含まれる。好ましくは、天然材料の割合は、約50％パーセントを超えない。
【００２３】
本明細書において使用されるように、親水性ドメインを含有しているマクロマーのような水溶性材料とは、水溶液へと少なくとも1重量％、溶解可能なものである。
【００２４】
生分解性ドメイン
当技術分野において利用可能な分子に由来する、生分解性の結合、または重合体もしくは共重合体のセグメントが、マクロマーに取り込まれ得る。生分解性領域とは、インビボ条件下で自然に加水分解可能なものである。いくつかの態様において、生分解性および疎水性または親水性のような異なる特性が、マクロマーの同じ領域内に存在してもよい。
【００２５】
有用な加水分解可能基には、グリコリド、ラクチド、ε-カプロラクトン、およびその他のヒドロキシ酸に由来する重合体単位、オリゴマー単位、および単量体単位、ならびに無毒であるかまたは体内に正常な代謝物として存在する材料を与える、その他の生物学的に分解可能な重合体が含まれる。好ましいポリ（α-ヒドロキシ酸）は、ポリ（グリコール酸）、ポリ（DL-乳酸）、およびポリ（L-乳酸）である。その他の有用な材料には、ポリ（アミノ酸）、ポリカーボネート（特に、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリジオキサノン、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ホスファジン）、およびポリ（ホスホエステル）を含むアルキルポリカーボネート）が含まれる。例えばポリ（ε-カプロラクトン）、ポリ（δ-カプロラクトン）、ポリ（δ-バレロラクトン）、およびポリ（γ-ブチロラクトン）のようなポリラクトンも、有用である。これらの分解可能結合基の混合物が使用されてもよい。生分解性領域は、1から実質的に水溶性でない生成物を与えると考えられる値までの範囲の重合度を有し得る。従って、単量体領域、二量体領域、三量体領域、オリゴマー領域、および重合体領域が、マクロマーに含まれ得る。
【００２６】
生分解性領域は、エステル結合、アミド結合、ペプチド結合、炭酸エステル結合、尿素結合、無水物結合、オルトエステル結合、ホスファジン結合、およびホスホエステル結合のような生分解感受性の結合を使用して、重合体または単量体から構築され得る。重合体の分解に必要とされる時間は、適切な単量体を選択することにより調整され得る。結晶度の違いも、分解速度を改変させる。比較的結晶性または疎水性の重合体について、実際の量の損失は、断片化によって起こり得るか、またはオリゴマー断片が水溶性となるほど十分に小さくなった時点で開始し得る。従って、初期の重合体の分子量および構造は、分解速度に影響を及ぼすであろう。
【００２７】
凍結および溶媒除去
本発明のフリースは、反応性材料の溶液を凍結させること、および次いで凍結乾燥フリースを作製するため、凍結させられた溶液を真空乾燥させることにより調製される。架橋は、凍結状態の時点、凍結乾燥状態の時点、および水溶液による再構成中を含む、凍結後の任意の時点で提供され得る。反応性材料は、凍結後に添加され得る。
【００２８】
初期溶液を凍結させる温度は、様々であり得る。従来のフリーザーの温度、約-20℃は、便利である。しかしながら、凍結させられた溶液が凍結乾燥中に凍結したままである限り、それよりも低いまたは高い凍結温度も選択され得る。非水性溶媒が凍結混合物中に存在する場合には、凍結乾燥による溶媒の除去の差違に起因する、可能性のある効果に、相当の注意を払わなければならない。
【００２９】
実施例において示されるように、凍結状態または真空乾燥状態でフリースを部分的にのみ架橋させ、後の段階で架橋を完成させることが可能である。形成されたフリースが細断され得ること、および細断された材料であっても再生時に凝集塊を形成し得ることも証明される。これは、少なくともいくつかの目的にとっては、乾燥または真空乾燥の間にフリースの材料形態が保存される必要がないことを暗示している。従って、凍結状態での乾燥へと続く小滴の凍結も、有用な材料を与えると予想される。凍結乾燥は、低温の乾燥ガスへのそのような粒子の浮遊によって加速され得る。溶媒除去は、水の、超臨界二酸化炭素のような超臨界流体での置換、特に中間の溶媒交換によっても加速され得る。
【００３０】
さらに、凍結工程中の泡の取り込みによって、多孔性を増強するため、空気またはその他のガスが基質へと取り込まれ得る。例えば、従来の任意の方法によってマクロマー溶液中に気泡を形成させ、溶液を直ちに凍結させることができる。泡発生のための方法には、泡立て（whipping）、ガスの注入、インサイチューのガスの生成（例えば、炭酸塩の酸との混合、またはイソシアネートからのウレタン結合の形成、または過酸化物に対する金属の作用）、および高圧でのガス溶解の後の減圧が含まれる。
【００３１】
架橋
前記のように、重合体は、可溶状態、凍結状態、または乾燥状態において架橋され得る任意の重合体であり得る。溶液が少なくとも凍結されるまで、好ましくは凍結され凍結乾燥されるまで、実質的に起こらないよう調節され得る限り、架橋の型は重要ではなく、共有結合性、イオン性、水素結合性、または疎水性（ファンデルワールス）であり得る。単純のために好ましいのは、活性化を必要とする反応基を有している重合体である。エチレン性不飽和基のようなフリーラジカル重合可能基は、特に、実施例において示されるように、使用が単純で、かつ容易である。別のアプローチとして、凍結によって不可逆的に凝集する重合体も、有用であり得る。特に、タンパク質が、そのような方法において有用であり得る。下記実施例において使用されている好ましい型の重合体は、重合体に共有結合的に付加されたエチレン性基を有する、およそ2000〜約1,000,000ダルトンの範囲の分子量を有する重合体である。
【００３２】
最も広範囲の架橋法は、凍結乾燥状態において見い出される。この状態において、化学的反応基は、開始剤、熱、光、または共反応体の供給によって活性化され得る。凍結乾燥フリースを著しく膨張させない溶媒に溶解している場合には特に、二官能性架橋剤または多官能性架橋剤を含む架橋のための試薬が、マクロマー溶液へと導入され得る。反応剤は、スプレーとして、適用可能であれば液体状態で、またはガスもしく溶媒に含まれて適用されてもよい。イオン架橋可能重合体は、フリース状態となった後に、適切なイオンを含有している溶液で処理され得る。
【００３３】
特に単純な架橋法は、乾燥後のフリースの一部であるか、またはフリースと付随している材料を、初期溶液中に提供することである。次いで、それは、架橋後処理を最小限に抑えるかまたは不要にする、熱または光の供給のような単純な方法により活性化され得る。例えば、下記実施例においては、過酸化スクシノイル（succinoyl peroxide）が、凍結させられる溶液に含まれている。それは、不揮発性であるため、凍結乾燥材料へと接着し、熱によって容易に活性化され、重合体に付加されたエチレン性不飽和基を架橋する。
【００３４】
架橋は、真空乾燥前の凍結状態で実行されてもよい。多くの材料が、例えば電離放射線により架橋され得る。フリーラジカル重合可能または架橋可能な材料は、比較的低い線量およびエネルギーの放射線、ならびに紫外光によって活性化され架橋され得る。凍結溶液に光開始剤が含まれ、そして選択的に電子転移剤が含まれている場合には、UV光、可視光、および赤外光が使用され得る。凍結により変性するタンパク質のようないくつかの材料は、付加的な架橋を必要とせず、付加的な反応なしに、凍結乾燥されるか、またはいくつかの場合には乾燥され得る。
【００３５】
生分解性
多くの使用において、フリースは、生分解性であることが好ましい、即ち代謝もしくは排泄されるほど十分に小さい構成成分、または哺乳類生物もしくは生組織に通常存在する条件の下で、フリースから、特にフリース内のゲル相からの材料の脱出を可能にするほど十分に崩壊すると考えられる構成成分へと、体内で、または使用中に、自然に崩壊することが好ましい。
【００３６】
典型的には、重合体は、使用環境、特に体内で、予測可能な速度で分解する重合体へ、重合体のサブユニットを連結させるか、または反応基を連結させる結合を含有している。前述のように、適当な生分解性結合は、乳酸、グリコール酸、ラクチド、グリコリド、ラクトンのようなヒドロキシ置換脂肪族カルボン酸、例えば、これらに制限はされないが、カプロラクトン、ジオキサノン、および環式カーボネートであり得る。分解時間は、ヒドロキシル置換の位置（アルファ位が最も速い）、局所的疎水性、および結合における局所的立体障害により調節され得る。その他の適当な不安定結合には、これらに制限はされないが、無水物、オルト炭酸エステル、オルトエステル、アセタール、ホスファジンおよびホスホエステル、ならびにアミノ酸のペプチド結合が含まれる。
【００３７】
フリースは、完全に生分解性であり得る。それは、複数の分解速度を有する生分解性材料で作成され得る。それは、分解可能成分が、材料の安定構造を残して、ある程度の期間で溶解するよう、生分解性材料および非生分解性材料の混合物で作成されていてもよい。生分解性を有しないフリースが作成されてもよく、それは、最終用途がそれを許容する場合には、好ましい。
【００３８】
生体適合性
本発明の材料および装置に関して、生体適合性とは、組織に適用されたフリースに対する重度の、長期的な、または段階的に増大する生物学的応答の刺激が存在しないことであり、手術または生物への外来物質の移植に典型的に伴う穏和な炎症とは区別される。生体適合性は、移植後の様々な時点での移植物部位の組織学的検査によって決定され得る。不充分な生体適合性の一つの徴候は、部位における重度の、慢性の、非分解性の貪食応答であり得る。不充分な生体適合性のもう一つの徴候は、部位における組織の壊死または退行であり得る。好ましい態様において、生体適合性材料は、繊維症または炎症を最小限に誘発するか、またはそれらを誘発しない。これは、好ましくは、ヒドロゲル組成物の選択によって、特に約3ヶ月未満、好ましくは約2週間未満、より好ましくは3〜10日以内にインビボのヒドロゲルの分解をもたらすようなヒドロゲル成分の使用によって達成され得る。そのような分解速度は、生体適合性材料が使用される医学的適用に依存して変動し得る。
【００３９】
添加剤および賦形剤
初期溶液、従って形成されるフリースは、意図された使用における最終生成物において有用であると考えられる任意の添加物または賦形剤をさらに含み得る。それらには、生物活性剤、生物学的に由来する材料、細胞、緩衝液、塩、浸透圧調節剤、保存剤、可塑剤、皮膚軟化剤、開始剤、重合推進剤、および、最終生成物中に少なくとも初期には存在すると考えられる重合反応に参加しない重合体が含まれるが、これらに制限はされない。これらの材料のうちの任意のものが、加工中にそれらを保護するため、またはフリースからのそれらの放出速度を調節するため、封入、固定化、コーティング、またはその他の処理を受け得る。粒子材料は、特に、ミリメートル、マルチミクロン（multimicron）、ミクロン、またはミクロン以下のサイズ範囲で便利に測定される特徴的な寸法を有するサイズを含む、適切なサイズへと粉砕され得る。
【００４０】
生物活性剤は、生物の生理学または構造に影響を及ぼすことができる、極めて多様な物質のうちの任意のものであり得る。化学的には、主要なクラスは、有機低分子、無機化合物、および重合体材料であって、その重合体は少なくとも、タンパク質、多糖、脂質、核酸、および合成重合体、ならびにこれらの共重合体および抱合体を含む。これらの材料は、当技術分野において既知の任意の機能を有し得る。特定の機能には、抗生物質、成長調節分子、構造誘導材料、止血剤、水和したフリースへの細胞の付着または脱離を制御する材料、抗体、抗原、トランスフェクション・ベクターおよび発現ベクターおよびその他の核酸構築物、麻酔薬、ならびに抗不整脈剤が含まれる。
【００４１】
作製されたフリースは、いくつかの有利な特性を有している。顕著な特徴は、低濃度マクロマー溶液から作成されたフリースによって示される「粘着性」である。湿気にさらされた際、これらのフリースは、特に組織表面を含む表面へと強く接着する。被験組織には、皮膚、粘膜、内臓表面、および創傷が含まれる。粘着性の程度は、濃度依存性であり、最初の溶液の中のマクロマー溶液が減少するにつれ減少する。しかしながら、ヒドロゲルが、そのような低い濃度においてたとえ形成される場合、フリースは、等濃度のヒドロゲルよりもはるかに粘着性である。フリースは極めて粘着性であり得るため、加湿後にフリースを取り扱わなければならない場合には、非粘着性の裏打ちを提供することが有用であろう。
【００４２】
第二の有利な特性は、水和および膨張の急速さである。マクロマーの凍結乾燥調製物を含む凍結乾燥材料は、再水和および再溶解が遅い場合がある。しかしながら、フリースは、低濃度のマクロマーから作成された場合、数秒以内に水和する。フリースは生物学的組織に適用されることが意図されるため、溶媒が再水和のために使用される場合、それらは、好ましくは実質的または完全に水溶液である。
【００４３】
第三の有利な特性は、様々な製造手法から得られる柔軟性および引張り強さである。特に、引張り強さは、マクロマー濃度が減少しても急激には低下せず、顕著にマクロマーの分子量の関数でもない。フリースの強さは、氷晶間で形成された濃縮重合体のドメイン同士の相互作用に由来し得ると思われる。さらに、乾燥フリースの柔軟性の有意な違いが、下記のような手法の詳細に依存して見出される。
【００４４】
フリースの使用
フリースは、単独で、または活性剤、生細胞、もしくはその他の添加物と組み合わされて、多様な医学的目的のうちの任意のものに使用され得る。下記の使用は、フリースの潜在的な適用の非網羅的な例示である。下記実施例に記載された材料のような、生分解性かつ高度に生体適合性である材料が想定される。いくつかの適用においては、材料は、その表面へ細胞を誘引するべきである。
【００４５】
創傷治療：フリースは、好ましくはトロンビンのような止血剤と組み合わされて、出血を止めるために使用され得る。本明細書において使用されるように、止血材料とは、血漿流の停止を含み得る、血流を止める特性を有している。止血剤または止血材料は、いくつかのメカニズムのうちの任意のものによって機能し得る。それは特に、深い創傷、広範囲の創傷、または熱傷において、吸収特性、非刺激性、および潜在的な生分解性が貴重である、創傷包帯剤として使用され得る。創傷包帯剤は、選択的に裏打ちにより補強され、抗生物質、成長因子、または創傷治癒において有用なその他の材料を含有していてもよい。止血剤または包帯として、フリースは、創傷の中に残存してもよい（フリースは、創傷内で調節された様式で分解するであろう）。フリースは、湿潤組織へと強く接着するため、単にパッケージから取り出し、創傷部位へと適用することにより、これらの機能のために使用され得る。フリースは、有意に長い時間にわたり、頬膜のような粘膜へと接着するであろう。前述のように、体液の存在下で、約1秒後には、それは、組織またはそれ自体へと接着するであろう。従ってそれは、織物、選択的には生分解性織物のようなマクロ多孔性基体に、架橋可能重合体溶液を含浸させ、複合材料を凍結および凍結乾燥に供し、その後、重合体を架橋することにより、自己接着性包帯としても使用され得る。（これは、実施例に例示される。）
【００４６】
接着剤および障壁：フリースは、組織に付着するため、組織を他の組織へ、または装置を組織へ付着させるために使用され得る。単独で、または（ヒアルロン酸のような）放出可能な薬物または重合体と共に、組織癒着の形成の防止のために使用するのにも適している。この使用において、フリースは、癒着の発生または再発が予想される部位に置かれる。任意の適用において、それは、巨視的な1個以上の片として置かれてもよいし、または乾燥粉末として噴霧もしくは沈着させられてもよい。
【００４７】
薬物送達：フリースは、薬物およびその他の生物学的に機能性の材料の送達のための、組織への接着において有用である。活性材料は、製造時にフリースに取り込まれ得る。活性材料が加工に対して抵抗性である場合には、それは、フリースが溶液または粉末として組織に適用される直前にフリースへと適用され得る。それは、薬物の局所送達にとって特に有用である。
【００４８】
細胞培養および組織工学：フリースのマクロ孔は、哺乳動物細胞を収容するのに十分に大きいため、フリースは、細胞を培養するための基体として使用され得る。特に、適切な因子がフリースまたは培養培地に提供された場合、細胞は、フリースの中で増殖し、そして適用可能な場合には、分化することができる。従って、水和時に所望の形に戻るよう、フリースを製作し；増殖培地中の細胞をそれに含浸させるかまたは接着させ；選択的に、取り込まれていない細胞を除去し；そして、所望の密度の細胞で充填されるまで、複合材を培養することが可能である。これは、軟骨の修復において使用され得る。それは、臓器置換のための足場を提供するため、または組織部位に容積を提供するためにも、使用され得る。異なる組成の多数の層を一層ずつ凍結させることができるため、または予備凍結させられた形状を、異なる組成の重合体溶液でコーティングすることができるため、差別的な細胞の増殖または分化が、そのような装置において提供され得る。さらに、この使用、またはその他の使用のため、フリースは、その調製中における、分解可能または生体適合性繊維のような補強材料の取り込みによって、膨張容積に関して（それにより形状に関して）制限され得る。
【００４９】
フリース材料を使用して、修復および／または再構築され得る組織の例には、神経組織、皮膚、血管組織、心臓組織、心膜組織、筋肉組織、眼組織、歯周根組織、結合組織、例えば軟骨、腱、半月板、および靭帯、臓器組織、例えば腎臓組織および肝臓組織、腺組織、例えば膵臓組織、乳房組織、および副腎組織、泌尿器組織、例えば膀胱組織および尿管組織、ならびに消化組織、例えば腸組織が含まれる。
【００５０】
組織工学のための生細胞の送達のための材料
フリース材料は、細断またはその他の方法によって、粒子を作製するために加工され得る。水溶液による加湿の際、粒子はスラリーを形成する。例えば軟骨または心臓組織のような組織の修復のための組織工学の手段としての、欠損への生細胞の送達を補助するため、例えば軟骨細胞、心筋細胞、または間葉幹細胞のような幹細胞などの生細胞が、スラリー材料に添加され得る。
【００５１】
細胞注入のための基質としてのフリースの使用
フリースは、例えば軟骨欠損のような欠損に置かれ、膜または密封剤またはその他の手段の使用により適所に留置され得る。次いで、生細胞が、膜または密封剤を通してフリース層に注入され、そのフリース層は、生細胞を吸収し、細胞がフリース層に分散することを可能にして、組織修復を可能にするため効率的に生細胞を欠損内に送達し、かつ保持すると考えられる。
【００５２】
本発明は、以下の非制限的な実施例を参照することによって、さらに理解されるであろう。
【００５３】
以下の材料が実施例において使用される：
PEGに基づく反応性マクロマーが、全ての研究において使用された。これらの材料は、「FOCALSEAL（商標）」なる商標の下で、Genzyme Biosurgery,One Kendall Square,Cambridge,MA 02139より入手可能である。4つの形態：FOCALSEAL（商標）-S、FOCALSEAL（商標）-L、FOCALSEAL（商標）-MおよびFOCALSEAL（商標）-プライマー（Primer）が存在する。全てが、加水分解可能な（生分解性）結合によって連結された単量体が部分的に鎖状につながれ、光重合可能アクリレート基で各末端がキャッピングされたPEGのコアからなる。これらは、コアPEGの分子量、PEG分子の数、ならびに生分解性単量体の数および組成に基づき異なっている。FOCALSEAL（商標）-Sは、分子量19,400±4000ダルトンを有するPEGを含んでおり；FOCALSEAL（商標）-LおよびFOCALSEAL（商標）-Mは、分子量35,000±5000ダルトンを有するPEGを含んでいる。FOCALSEAL（商標）-Sは、トリメチレンカーボネート（「TMC」）単量体を、PEG 1個当たり少なくとも6個または7個のTMC分子、典型的にはPEG 1個当たり12個〜13個のTMC分子という比率で含み、かつラクチド単量体、典型的にはPEG分子1個当たり4個のラクチド分子、最高でPEG 1個当たり5個のラクチド単量体を含んでいる。FOCALSEAL（商標）-Mは、PEGの分子量を除きFOCALSEAL（商標）-Sと同じである。FOCALSEAL（商標）-Lは、PEG 1個当たり10個未満、より典型的には7個未満のTMC分子という比率でTMC分子を含んでいる。米国特許第6,083,524号は、これらの材料の合成を詳細に記載している。
【００５４】
これらの材料は、光開始剤系を含有している溶液を調製することにより重合させられ得る。例えば、10gの水性製剤は、1gのFOCALSEAL（商標）-S、54mgのトリエタノールアミン（TEOA）、80mgのリン酸一カリウム（mono-potassium phosphate）（KPhos）（1.2重量％または19 mM）、40mgのビニルカプロラクタム（VC）（0.5重量％）、および0.4mgのエオシン-Y（10ppm〜100ppm、好ましくは30ppm〜60ppm）からなる。好ましくは、PLURONIC（商標）F127のような界面活性剤が、0重量％〜1重量％添加され、次いでt-ブチルペルオキシドが、典型的には0.0125重量％という濃度で添加される。材料の重合は、FOCALSEAL（商標）プライマーのようなプライマー溶液の添加によって促進され得る。このプライマーは、およそ3350ダルトンの分子量を有するPEG、ならびにPEG 1個当たりおよそ5分子のラクテート、グルコン酸鉄（グルコン酸Fe）、およびエオシン-Yを含有している。
【００５５】
その他の重合の様式が使用されてもよい。例えば、重合は、化学的または熱的なフリーラジカル重合、酸化還元反応、カチオン重合、および（例えばイソシアネートのような）活性基の化学反応によって開始させられ得る。ある種の特定の重合の様式が、以下の実施例に記載される。
【００５６】
実施例1．熱活性化重合を含むフリースの調製
以下のフリースを調製した：
1A：水中に5.4％（重量）の重合可能マクロマーを含有している溶液を調製した。マクロマーは、TMC（トリメチレンカーボネート）結合で部分的に鎖状につながれた分子量約35,000ダルトン（標示されている）のPEG（ポリエチレングリコール）骨格を含有していた。鎖状につながれたPEGの両端は、TMC基およびラクチド基で伸長されており、最後はアクリル酸エステルで終結していた。そのような材料の合成は、米国特許第6,083,524号および第5,410,016号（参照として本明細書に組み込まれる）に記載されている。その溶液は、溶液4.0g中に18.2mgの過酸化スクシノイル（Pfalz＆Bauer）も含有していた。次いで、4gのこの溶液を、1.5×2インチのプラスチック・ウェイト・ボート（plastic weight boat）へ、約3mmの深さまで注入し、フリーザーで約-20℃に凍結させた。凍結した溶液を、凍結乾燥機に置き、乾燥するまで約42時間凍結乾燥させた。次いで、凍結乾燥チャンバー内の温度を、10時間、約50℃にまで上昇させた。この工程の目的は、アクリレートでキャッピングされたマクロマーのフリーラジカル架橋を開始させるために、不揮発性である過酸化スクシノイルを熱活性化することであった。得られた基質は、堅固であるが柔軟であった。水中に置かれると、フリースは、ゼラチン状の不透明なゲルへとよく水和した。
【００５７】
1B：5.0％マクロマー溶液および9.28mgの過酸化スクシノイルを含有している合計4gの溶液を調製し、1.5×2インチのプラスチック・ウェイ・ボート（plastic weigh boat）へ約2.5mm〜3mmの深さまで注入し、フリーザーで約-20℃に凍結させた。凍結した溶液を凍結乾燥機に置き、乾燥するまで約42時間凍結乾燥させた。次いで、凍結乾燥チャンバー内の温度を10時間、約50℃にまで上昇させた。得られた基質は、1Aより柔軟で、極めて弾力があった。水中に置かれると、フリースは、ゼラチン状のわずかに不透明なゲルへとよく水和した。
【００５８】
1C：5.1％マクロマーを含有し、1.33mgの過酸化スクシノイルを含有している合計4gの溶液を調製し、1.5×2インチのプラスチック・ウェイ・ボートへ約3mmの深さまで注入し、フリーザーで約-20℃に凍結させた。凍結した溶液を凍結乾燥機に置き、乾燥するまで約42時間凍結乾燥させた。次いで、凍結乾燥チャンバー内の温度を10時間、約50℃にまで上昇させた。得られた基質は、1Aおよび1Bよりフレキシブルで、極めて弾力があった。水中に置かれると、フリースは、ゼラチン状の透明なゲルへとよく水和した。
【００５９】
1D：2.96％マクロマーおよび4.96mgの過酸化スクシノイルを含有している合計4gの溶液を調製し、1.5×2インチのプラスチック・ウェイ・ボートへ約3mmの深さまで注入し、フリーザーで約-20℃に凍結させた。凍結した溶液を凍結乾燥機に置き、乾燥するまで約42時間凍結乾燥させた。次いで、凍結乾燥チャンバー内の温度を10時間、約50℃にまで上昇させた。得られた基質は1A 、1B、および1Cよりフレキシブルで、極めて弾力があった。水中に置かれると、フリースは、ゼラチン状の透明なゲルへとよく水和した。
【００６０】
フリース試料は、室温で、または冷却器内で、または-20℃で、（吸湿を最小限に抑えるため）箔袋内に保管された。フリースは、容易な取り扱いにとって十分な引張り強さを有していた。ビーカー内の約100mlの水にフリース片（約1×1cm）を浸漬させると、フリースは、即座に水和し、溶液中に沈下した。1時間未満で、それは約40ml〜50mLの容積を占めるまでに膨張した。それは、極めて滑りやすく／脆弱であったため、溶液から持ち上げることはできなかったが、ビーカー内に渦を巻かせることにより、そしてゲル中に空気を捕捉させることにより観察されるような完全性を維持していた。
【００６１】
対照的に、凍結させ凍結乾燥させたが、架橋はしなかったマクロマーの溶液は、水和時に溶解して溶液を形成し、そして加熱により架橋し、フリースとしての完全性を保持または回復するにはあまりに希薄であった。
【００６２】
実施例2．多層ゲル
5.0gのt-ブチルアルコールに0.2063gの過酸化ベンゾイルを（加温しながら）溶解させることにより、開始剤のストック溶液を調製した。123.47mgの過酸化ベンゾイルおよび2.88gのt-ブチルアルコールを含有している、9.77％の濃度を有する重合体のストック溶液を調製した。開始剤の添加の後に、ストック溶液を20,000rpm〜30,000rpmでマイクロプロセッサー（Virtis）を使用して2分間完全に混合したところ、不透明な溶液が得られた。3.75×7.5インチの金属トレーを鋳型として使用した。32gのDI水を鋳型に置き、-20℃で凍結させた。これは、基質のための平らな表面、および鋳型への接着を防止する潜在的な手段を提供する。マクロマー・ストックをDI水で、a：2.9％、b：4.9％、およびc：6.5％にまで希釈することにより、基質を製作した。20gの稀釈aから開始し、溶液を鋳型に添加し、-20℃で凍結させた。この過程を、20gの溶液b、25gの溶液cを用いて繰り返し、最後に25gのストック溶液の層（9.8％マクロマー濃度）を追加した。予備凍結させた多層組立物を、凍結乾燥させ、10時間50℃に加熱したところ、架橋されたフリースが得られた。それは、全体的には実施例1A、1Bおよび1Cと類似の特性を有していたが、より柔軟であった。
【００６３】
実施例3．フリースを使用した血液の吸収
他の目的のために実行された手術の最後に、麻酔下のヘパリン処理されたウサギの腎臓をメスで穿刺し、出血させた。実施例2の材料片を出血部位へと押し込んだ。それらは、初期には血液を吸収し、後に血液は、血液で加湿されたフリースを通過した。このことから、水和した材料の孔が、赤血球の通過を可能にするほど充分に大きいことが証明された。フリースを構成している重合体は、生体適合性のために設計されたものであり、この実験において凝血を誘起しなかった。この実験は、細胞培養にとってのフリースの潜在的適性、または適当な止血材料がフリースに取り込まれるかもしくは含浸させられた場合には、止血の用途にとってのフリースの潜在的適正を証明している。
【００６４】
実施例4：フリースの組織接着
本発明の1個以上のフリース片は、湿性組織に急速に強く接着した。例えば、実施例2に記載されたようにして作成されたフリースは、湿ったまたは湿気のある手、ならびに頬膜（ならびに、湿った外科用手袋）によく接着した。接着は、フリースが乾燥するかまたは除去されるまで維持された（頬の場合、約1時間）。限定された水の供給により、膨張も同様に限定された。フリースを標準的なセロハン・テープで裏打ちし、テープを引っ張ることにより部位から取り除くことができた。これは、創傷包帯材としての潜在的な用途を証明している。生分解性フリースを使用した場合には、創傷包帯材を治癒中の創傷から取り除く必要はなくなるであろう。そのような使用においては、適当な裏打ち材料も、好ましくは、濃縮マクロマーの薄いフィルム、または吸収可能なゼラチンに基づく材料のような生分解性材料から作成されるであろう。
【００６５】
実施例5．止血表面を有する多層ゲル
5.0gのt-ブチルアルコールに0.2024gの過酸化ベンゾイルを（加温しながら）溶解させることにより、開始剤のストック溶液を調製した。4.39gのマクロマー、67.17mgの過酸化ベンゾイル、および1.44gのt-ブチルアルコールを含有している重合体のストック溶液45グラムを調製した。開始剤の添加の後、ストック溶液を20,000rpm〜30,000rpmでマイクロプロセッサー（Virtis）を使用して2分間完全に混合したところ、不透明な溶液が得られた。5×5cmのプラスチック・ウェイト・ボートを鋳型として使用した。17gのDI水を鋳型に置き、-20℃で凍結させた。マクロマー・ストックをDI水により、溶液a：1.8％、溶液b：3.6％、および溶液c：7.2％へと希釈することにより、基質を製作した。8gのストック溶液（9.75％マクロマー濃度）を鋳型に添加し、-20℃で凍結させた。その過程を、6.7gの溶液c、5.38gの溶液b、および5.38gの溶液aを用いて繰り返した。1000単位のトロンビンを含有している5gの層で、基質を完成させた。予備凍結させた多層アセンブリーを凍結乾燥させ、10時間50℃に加熱した。それを、単一の片として鋳型から取り出した。それは、全体的には実施例1Aおよび1Bのフリースと類似の特性を有していたが、より柔軟であった。
【００６６】
このフリースを、動物に対する外科的手法において試験したところ、止血特性を有するようであった。
【００６７】
実施例6．抗接着層を有する多層ゲル
実施例5を繰り返し、凍結多層基質を構築した。リン酸緩衝液（PBS）中の0.4％ヒアルロン酸（MW1,000Kダルトン〜2,000Kダルトン、Genzyme製）の5.1gの層を用いて、基質を完成させた。予備凍結多層アセンブリを凍結乾燥させ、10時間50℃に加熱した。それは、全体的には実施例1Aおよび1Bおよび1Cのフリースと類似の物理的特性を有していた。
【００６８】
実施例7．フリースへの支持体の取り込み
分解可能重合体ポリグリコリド（中程度の重量、Davis＆Geck）で作成された織材料の細長い一片に、5％単量体の薄層を含浸させ、次いで5％マクロマー水溶液の30gの凍結層の上に置いた。マクロマーは、TMC（トリメチレンカーボネート）結合で部分的に鎖状につながれた、分子量約20,000ダルトン（標示されている）のPEG（ポリエチレングリコール）骨格を含有しており、TMC基およびラクチド基で伸長され、最後はアクリル酸エステルで終結していた。溶液は、溶液30 mL当たり5.0mgの過酸化ベンゾイルを含有していた。先の実施例に記述された条件を使用して、複合材を凍結乾燥させ、架橋した。得られた材料は柔軟であり、かつ優れた引張り特性を有していた。支持されていないフリースと同様に、それは、湿性皮膚を含む湿性表面に強く接着した。この材料は、単独で、または治療用材料を含浸させて、包帯として使用され得る。
【００６９】
実施例8．光硬化フリース
10重量％の実施例7のマクロマー（「20KTLA」）、ならびに4mgのビニルカプロラクトン、0.054gのトリエタノールアミン、0.08gのリン酸カリウム、および40ppmのエオシン-Yを含有している、2グラムの溶液を調製した。その溶液を-20℃のフリーザーで凍結させた。凍結状態のマクロマーの光重合を誘導するため、1平方cm当たり約100mWの青緑色光（450nm〜550nm、キセノン光源）を使用して、40秒間それに照射した。次いで、架橋された材料を凍結乾燥させたところ、（凍結乾燥後に架橋された）実施例1Aおよび1Bと類似の特性を有するフリースが生じた。
【００７０】
実施例9．光硬化フリース
重量で200mgの実施例1のマクロマー（「35KTLA」）、ならびに2.5mgのビニルカプロラクトン、H3PO4でpH 7.0に中和された0.027gのトリエタノールアミン、および20ppmのエオシン-Yを含有している、2グラムの溶液を調製した。その溶液を-20℃のフリーザーで凍結させた。凍結状態のマクロマーの光重合を誘導するため、1平方cm当たり約100mWの青緑色光（450nm〜550nm、キセノン光源）を使用して、40秒間それに照射した。次いで、架橋された材料を凍結乾燥させたところ、（凍結乾燥後に架橋された）実施例1Aおよび1Bと類似の特性を有するフリースが生じた。
【００７１】
実施例10．光硬化フリース
重量で258mgの実施例1のマクロマー（「35KTLA」）を含有している、2グラムの溶液を調製した。その溶液は、1.31mgのビニルカプロラクトン、H3PO4でpH 7.0に中和された0.143gのトリエタノールアミン、および15ppmのエオシン-Yを含有していた。その溶液を-20℃のフリーザーで凍結させた。凍結状態のマクロマーの光重合を誘導するため、1平方cm当たり約100mWの青緑色光（450nm〜550nm、キセノン光源）を使用して、80秒間それに照射した。次いで、架橋された材料を凍結乾燥させたところ、（凍結乾燥後に架橋された）実施例1Cおよび1Dと類似の特性を有するフリースが生じた。
【００７２】
実施例11．光硬化フリースからのスラリー調製
前記のような重合可能FOCALSEAL-S マクロマー（10重量％）のストック溶液を緩衝液で希釈することにより、3.12％（重量）の溶液を調製した。3.12％溶液の製剤10.0gは、3.12gのストック溶液、332.0mgのN-ビニル-カプロラクタム、6.55gの緩衝液（0.035gのトリエタノールアミン、0.052gの一塩基性リン酸カリウム（Monobasic-Potassium Phosphate）、1.25μLのt-ブチルヒドロキシド（70％水溶液）、および0.26mgのエオシン-Yを含有している）を含有していた。この製剤0.6g〜0.8gを使用してゲルを調製し、室温でマクロマーの光重合を誘導するため、1平方cm当たり約100mWの青緑色光（450nm〜550nm、キセノン光源）を使用して、80秒間照射した。ゲルを、室温のDI水200 mLに置き、およそ60分間浸水させた。容器を傾け、ゲルから水を捨てた。新鮮な200mLのDI水を再び添加し、ゲルをさらに35分間浸水させた。粗い焼結ガラス漏斗を使用してゲルを収集し、次いでおよそ100mLのDI水を含有している250mLの細長いビーカーへとゲルを移した。超微細刃（ultra fine blade）（#255193）を有するVirtisマイクロプロセッサーを使用して、30,000rpmで60秒間、ゲルを細断した。中サイズの焼結ガラス・フィルターを使用して、ゲル粒子を収集した。その後、およそ30 mLのゲル粒子／水懸濁液を、凍結乾燥させた。
【００７３】
まず、1mg〜2mgの重合体を使用して、わずか1〜2滴のDI水による加湿により、スラリーとしての適性に関して構築物を評価した。スポンジ様の軟度を有する構築物が、全部で169mg得られた。次いで、ヤギのモデルにおける評価のため、乾燥してふわふわとした構築物を、PSペトリ皿を使用して、およそ9mg〜11mgの少量へと分割し、二重（タイベック（tyvek））バッグに入れ、EtOを使用して殺菌した。
【００７４】
実施例12．光硬化フリースからのスラリー調製
実施例11に記載されたストック溶液を、緩衝液で希釈することにより、5.0％（重量）の溶液を調製した。5.0％溶液の製剤10.00gは：5.01gのストック溶液（10％濃度）、280.0mgのN-ビニル-カプロラクタム、4.71gの緩衝液（0.025gのトリエタノールアミン、0.037gの一塩基性リン酸カリウム、0.089μLのt-ブチルヒドロキシド（70％水溶液）、および0.19mgのエオシン-Yを含有している）を含有していた。この製剤0.5g〜0.8gを使用してゲルを調製し、室温でマクロマーの光重合を誘導するため、1平方cm当たり約100mWの青緑色光（450nm〜550nm、キセノン光源）を使用して、80秒間照射した。ゲルを、室温のDI水200 mL中に置き、およそ30分間浸水させた。容器を傾け、ゲルから水を捨てた。新鮮な200mLのDI水を再び添加し、ゲルをさらに45分間浸水させた。ゲルを、粗い焼結ガラス漏斗を使用して収集し、次いでおよそ100mLのDI水を含有している250mLの細長いビーカーへとゲルを移した。ゲルを、超微細刃（#255193）を有するVirtisマイクロプロセッサーを使用して、30,000rpmで90秒間、細断した。比較的大きなゲル画分が観察された場合には、細断をさらに60秒間続行した。ゲル粒子を中サイズの焼結ガラス・フィルターを使用して収集した。その後、ゲル粒子／水懸濁液を凍結乾燥させた。幾分顆粒状であるがふわふわとした材料が、全部で155mg得られた。
【００７５】
1mg〜2mgの重合体を使用し、わずか1滴〜2滴のDI水による加湿により、スラリーとしての適性に関して構築物を評価した。構築物は、実施例11において調製されたスラリーと比較して、より粗い粒子を示した。
【００７６】
実施例13．ヒアルロン酸（HA）含有フリースからのスラリー調製
実施例11に記載されたストック溶液およびヒアルロン酸（HA、MW 1,500kDa）を緩衝液で希釈することにより、3.0％（重量）の溶液を調製した。
【００７７】
3.0％溶液の製剤20.045gは：6.012gのストック溶液（10％濃度）、659.8mgのN-ビニル-カプロラクタム、1.4387gの緩衝液（0.07769gのトリエタノールアミン、0.1151gの一塩基性リン酸カリウム、2.73μLのt-ブチルヒドロキシド（70％水溶液）、および0.58mgのエオシン-Yを含有している）、8.0128gのセプラコート（Sepracoat）（0.4％ HA）、および3.9215gの水を含有していた。テフロン鋳型（直径1.5cm、深さ0.4mm〜0.8mm）でゲルを調製し；次いで、室温でマクロマーの光重合を誘導するため、1平方cm当たり約100mWの青緑色光（450nm〜550nm、キセノン光源）を使用して、80秒間照射した。脱水和を防止するための照射の後、ゲルを室温のDI水500 mLに置いた。ゲルを2時間かけてDI水3×500mLで洗浄した。容器を傾け、ゲルから水を捨て、次いで約150mLのDI水を含有している250mLの細長いビーカーへと移した。超微細刃（#255193）を有するVirtisマイクロプロセッサーを使用して、30,000rpmで60秒間、ゲルを細断した。細断された材料を室温で1時間維持し、次いで2×50mLの円錐チューブへと移し、2500rpmで14分間遠心分離した。ゲルのペレットから水を除去した。洗浄／遠心分離を繰り返した。その後、ゲル粒子／水懸濁液を凍結乾燥させた。乾燥粒子材料が、全部で568mg得られた。
【００７８】
実施例14．アクリレート-PEG-RGD含有光硬化フリースからのスラリー調製
実施例11に記載されたストック溶液を緩衝液で希釈し、アクリレート化PEG-RGDペプチド（acrylated PEG-RGD peptide）（RGDペプチドは、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸配列を含有している）を添加することにより、2.76％（重量）の溶液を調製した。21.762gの製剤は：5.9964gのストック溶液（10％濃度）、683.8mgのN-ビニル-カプロラクタム、1.4101gの緩衝液（0.0756gのトリエタノールアミン、0.112gの一塩基性リン酸カリウム、2.7μLのt-ブチルヒドロキシド（70％水溶液）、および0.56mgのエオシン-Yを含有している）、13.336gの水、0.2509のアクリレート化PEG-RGD（アクリレート化PEG-NHS［Shearwater Polymers］のRGDペプチド［Sigma Chemicals］とのカップリングにより調製されたアクリレート化PEG-RGD）を含有していた。ゲルを、テフロン鋳型（直径1.5cm、深さ0.4mm〜0.8mm）で調製し；次いで、室温でマクロマーの光重合を誘導するため、1平方cm当たり約100mWの青緑色光（450nm〜550nm、キセノン光源）を使用して、80秒間照射した。脱水和を防止するための照射の後、ゲルを室温のDI水500 mL中に置いた。ゲル・バッチを2時間かけてDI水3×500mLで洗浄した。容器を傾け、ゲルから水を捨て、次いでおよそ150mLのDI水を含有している250mLの細長いビーカーへと移した。超微細刃（#255193）を有するVirtisマイクロプロセッサーを使用して、30,000rpmで60秒間、ゲルを細断した。細断された材料を室温で1時間維持し、次いで2×50mLの円錐チューブへと移し、2500rpmで14分間遠心分離した。ゲルのペレットから水を除去した。洗浄／遠心分離サイクルを繰り返した。その後、ゲル粒子／水懸濁液を凍結乾燥させた。乾燥スラリー材料が、全部で564mg得られた。
【００７９】
実施例15．TGF-β含有光硬化フリースからのスラリー調製
実施例11に記載されたストック溶液を緩衝液で希釈し、TGF-βを添加することにより、2.79％（重量）の溶液を調製した。
【００８０】
2.79％溶液の製剤21.762gは：6.033gのストック溶液（10％濃度）、660.2mgのN-ビニル-カプロラクタム、1.4154gの緩衝液（0.0764gのトリエタノールアミン、0.113gの一塩基性リン酸カリウム、2.7μLのt-ブチルヒドロキシド（70％水溶液）、および0.57mgのエオシン-Yを含有している）、13.310gの水、0.1685gのTGF-βを含有していた。テフロン鋳型（直径1.5cm、深さ0.4mm〜0.8mm）でゲルを調製し；次いで、室温でマクロマーの光重合を誘導するため、1平方cm当たり約100mWの青緑色光（450nm〜550nm、キセノン光源）を使用して、80秒間照射した。脱水和を防止するための照射の後、室温のDI水500 mLにゲルを置いた。ゲルのまとまりを2時間かけてDI水3×500mLで洗浄した。容器を傾け、ゲルから水を捨て、次いでおよそ150mLのDI水を含有している250mLの細長いビーカーへと移した。超微細刃（#255193）を有するVirtisマイクロプロセッサーを使用して、30,000rpmで60秒間、ゲルを細断した。細断された材料を室温で1時間維持し、次いで2×50mLの円錐チューブへと移し、2500rpmで14分間遠心分離した。ゲルのペレットから水を除去した。洗浄／遠心分離サイクルを繰り返した。その後、ゲル粒子／水懸濁液を凍結乾燥させた。乾燥粒子材料が、全部で564mg得られた。
【００８１】
実施例16.酸化還元硬化を使用した細断されたフリースの調製
0.748g（DI水中）の実施例1のマクロマー（「35KTLA」）を含有している二つの別々の5.0gの溶液を調製した。溶液＃1には、0.0989gのグルコン酸鉄を添加した。溶液＃2には、0.00978gのt-ブチルペルオキシドを添加した。スクリュー型混合糸（mixing thread）を含有している予備成形改変デリバリー・チップ（pre-molded modified delivery tip）が取り付けられた、静止混合のための二重シリンジ・システム（各1.0mL）を利用することにより、ゲルを調製した。シリンジの内容物を混合すると、ゲルが形成された。そのようにして調製されたゲルを、DI水約150mL中に置き、より小さな切片へと手動で切断した。Virtisマイクロプロセッサーおよび回転刃（spinning blade）#307686を使用して、5分間かけて、ゲルをより小さな断片へと切断した。次いで、これを、5分〜10分間、ブレード#225185、マイクロ微細アダプター（micro fine adapter）に交換し、次いで10分間、超微細刃#255193に交換した。100,000MWカットオフの膜を有するフィルターを使用して、断片を収集した。ゲル断片を凍結乾燥させた。得られた材料は、弱い構造を有する綿様であった。
【００８２】
実施例17．酸化還元硬化を使用したフリース調製
二つの成分を混合する前に酸化還元溶液#2に0.0986gのリン酸緩衝液pH7.5を添加したことを除き、実施例16と同様にして、ゲル調製およびゲルの加工、および断片化を実施した。加工され、その後凍結乾燥させられた基質を乾燥させたところ、ガーゼ様の特性を有する、より薄いフィルムが生じた。
【００８３】
実施例18．ゲル断片を使用したフリース調製
実施例17からのゲル断片を使用してフリースを製作し、次いで-20℃のフリーザーに置いた。実施例16からのゲル断片を第二層として使用し、凍結させ、次いで実施例17からのゲル断片を重層した。凍結させた基質を、凍結乾燥させたところ、柔軟な特性を有する単一の基質が得られた。
【００８４】
実施例19．フリースを使用した血液の吸収
他の目的のために実行された手術の最後に、麻酔下のヘパリン処理されたウサギの腎臓をメスで穿刺し、出血させた。3×0.8cm×およそ2mm〜4mm厚さの実施例18の材料の断片を、出血部位へと押し込んだ。断片は、一時には血液を突破させることなしに吸収した。第二の試みにおいては、血液の突破を止めるため、断片の厚さを2倍にした。このことから、水和した材料の孔が、赤血球の通過を可能にするほど十分に大きいこと、およびこの製剤を用いた止血における使用の可能性が存在することが証明された。
【００８５】
実施例20：生細胞の支持体のためのフリースの使用
約250万個の細胞を含有している培養軟骨細胞のペレットを、約5mlの増殖培地に再懸濁させた。実施例8のフリースの円盤（直径約0.6cm）を、ペトリ皿の底に置き、細胞懸濁物をフリース上に徐々に添加した。1分未満で、フリースは膨張し全溶液を吸い込んだ。細胞の表面への分離は視覚的には観察され得ず、細胞は、膨張したフリースの孔および割れ目に接着したと考えられる。
【００８６】
実施例21：マクロマー・ゲル中に気泡を有するフリースの調製
実施例8のものと本質的に同一の製剤を、重合前に凍結させ、さらに微粒子化（高剪断混合）手法によって空気を取り込ませた。得られたフリースはふわふわとしており、繊維構造を有し、急速に（1分未満で）再水和した。組織への接着は、実施例1よりも低かったが、それは、より高いマクロマー濃度のためと推測される。
【００８７】
実施例22：スラリー調製物中の生細胞の生存率
実施例11に記載された方法によって作成されたフリース粒子材料10mgを、ミリポア（millipore）フィルター上に置き、それを、24穴プレートに置く（フィルターはゲルを保持する）。
【００８８】
生細胞を添加する前に、材料の予備加湿のため、23ml/mg、または材料10mg当たり約230μlの培地（ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM））によるフリース粒子材料の予備加湿を行う。フリース粒子材料と培地との混合物を、約30分〜45分間放置する。これは、材料が、スラリーの妥当な軟度のゲルを形成することを可能にする。細胞を導入する前のフリース粒子材料の予備加湿は、脱水による細胞死を回避するために好ましい。
【００８９】
スラリーに生軟骨細胞を添加するため、細胞をトリプシン処理し、ペレット化し、次いで極めて少量の培地、即ち50μlに再懸濁させ、スラリー中に穏和に分散させる。培地は、10％（V/V）ウシ胎仔血清が追加されたダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、または別の合成培地のいずれかであり得る。細胞へ栄養を供給するため、約0.4mlの培地を、フィルターの外部の周辺に置いた。
【００９０】
37℃加湿インキュベーター内に2時間〜3時間プレートを置く。ゲルに約0.4mlの培地を添加する。ゲルを分散させないよう極めて穏和に培地を添加する。
【００９１】
前記の生細胞を含むスラリーの生存率アッセイ法
24時間目のスラリー調製物  細胞生存率98％
72時間目のスラリー調製物  細胞生存率84％
【００９２】
実施例23．スラリー調製物を使用した軟骨修復
ヤギの膝の局所的な全層性（full-thickness）軟骨欠損への、スラリー中の軟骨細胞の送達の実行可能性を決定するため、試験を実施した。
【００９３】
材料および方法：
細胞調製：
ヤギの遠位大腿骨の外側滑車稜（trochlear ridge）の非体重負荷部分から、関節軟骨を採集した。採集された軟骨をDMEMですすぎ、37℃／5％C02でおよそ1時間0.25％プロテアーゼの中に置いた。1時間後、プロテアーゼを除去し、軟骨をハムF12培地で2回洗浄し、0.1％コラゲナーゼを37℃／5％CO2で一夜組織に添加する。10％ウシ胎仔血清（FBS）によりコラゲナーゼを反応停止させ、試料を1000rpmで5分間回転する。細胞ペレットを、完全培地（10％FBS/DMEM）に再懸濁させる。細胞を計数し、20 mlの完全培地を含むT75フラスコへと播く。
【００９４】
90％コンフルエントになるまで細胞を培養物中で増幅し、トリプシン処理し、計数し、ペレット化し、DME/10％FBSに再懸濁させる。全細胞数に応じて、アンプル1個当たり5×105〜5×106で細胞を凍結させる。アンプルを、N2界面に一晩置き、翌日ジャクージ（Jacuzzi）に置く。細胞は、移植時まで保管される。
【００９５】
移植時には、トリプシン-EDTAにより培養プレートから細胞を解離させ、計数し、100μl当たり3000万個の濃度で無血清培地（DME）に懸濁させる。細胞懸濁物を各動物のための手術室において無血清培地100μlで希釈し、細胞懸濁物の一部分をフリース粒子と混合し、スラリーを形成させた。フリース粒子は、実施例11に記載されるようして調製された。
【００９６】
移植手術：
各ヤギの各膝の膝蓋骨の外側面の中心に、直径6mmの全層性軟骨欠損を作出した。材料を欠損間隙へと挿入するため、前記のようなグルコン酸鉄を含有しているプライマー溶液を、ブラシを使用して欠損表面（軟骨壁および底表面）に適用した。各欠損に、全深さの1/3まで、生細胞を含有しているスラリー材料を充填した。調製された全材料のうちの少ない割合のみを使用した。スラリーを軟骨-骨界面の欠損の角へと押し込み、滑らかな表面を形成させるために欠損の底へと軽く押した。細胞複合材の一部分を、細胞生存率に関して評価した。スラリーをFocalSeal-S密封剤（先行技術参照）で覆い、欠損を完全に充填し、密封剤を、青緑色域の可視波長を送達する、Focal,Inc.により供給された光源および光棒を使用して光重合させた。全部で80秒の光重合のサイクルを2回使用した。各関節を閉鎖し、2回目の移植の完了後に動物は回復した。
【００９７】
剖検および組織学的評価：
1匹の動物は、移植後3日目に、もう1匹は4週目に屠殺した。関節を調査し、滑液、滑膜、膝蓋骨欠損、滑車、半月板、および脂肪体を、各関節から採集した。3日目に屠殺された動物においては、各欠損内の修復組織を凍結切片化のために取り出した。4週間目に屠殺された動物においては、欠損を10％中性緩衝ホルマリンで固定し、プラスチック包埋し、連続切片化し、トルイジンブルーまたはヘマトキシリンおよびエオシン染色により染色した。両方の動物からの残りの組織は、全て、10％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、5μm切片へと切り分け、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。4週間時点の関節に由来する滑液は、遠心分離し、容器を傾け上清を取り出し、-80℃で凍結させ、右後膝関節に由来する液から滑液スミアを作成した。
【００９８】
結果：
手術：
各動物からの細胞複合材の1個の調製物からのアリコートを、移植時に生存率に関して試験した。アッセイ法は、細胞を材料に懸濁させた後、およそ1時間〜2時間目に実行した。細胞は、両方の被験調製物において生存可能であったが；1個の調製物における生存率は、自家軟骨細胞移植（ACI）細胞懸濁物にとって許容される生存率である70％を下回っていた。移植物の低い細胞生存率は、実施例22に記載されたような予備加湿工程の省略のためである可能性がある。
【００９９】
細胞複合材は、移植が容易であり、完全な移植に、ACIの場合の30分〜45分と比較して、数分しか要しなかった。スラリー材料は、欠損の軟骨表面および骨表面の不規則性によく適合した。
【０１００】
3日目の剖検：
いずれの関節においても、滑液は、わずかに赤みがかっており、正常な粘性を有していた。関節包は赤くなっていた。全体として、関節切開後3日間の関節は正常に見えた。
【０１０１】
左膝蓋骨の欠損は、肉眼的には、欠損深さの20％まで、柔軟な半透明の材料（それらのうちの一部は、従属部分にヒドロゲルの様相を有していた）で充填されていた。隣接軟骨壁の欠損への傾斜が相当量存在し、手術時に存在していた、欠損と通じているグレード4の病巣からの、原線維からなる端部が欠損へと膨張し、欠損内の組織充填の一部を担っていた。（修復組織除去後の）膝蓋骨欠損の組織学は、通常は無細胞である材料へ浸潤した、中程度の数の好中球を示し、その材料は、好酸性かつ原繊維性に見え、小さく明瞭な空間が、原繊維を隔離していた。生細胞の添加前の、フリース粒子の予備加湿の省略によって、予想されたように、明白な生存軟骨細胞は、欠損内に残存している少量の材料には存在しなかった。好中球性炎症を説明する細菌またはその他の病原体は、切片に存在しなかった。連続切片を通して、かつ一方の側から他方の側までの、隣接軟骨壁の変性の程度は、軽度から重度まで様々であった。
【０１０２】
右膝蓋骨の欠損は、肉眼的には欠損の深さの60％〜70％まで充填されており、移植物は無傷に見えた。欠損の端部は、裂け目がなく、きれいであると記載された。移植物除去後の欠損に対しては、組織学的分析は実施しなかった。
【０１０３】
ゲル材料の除去は、各欠損から修復組織の大部分を除去するようであった。収集された試料は、基底縁にフィルム様残留物を含有している重合ヒドロゲル表層であった。両方の欠損における除去された修復組織に対する組織学は、個々の細胞から小さな細胞クラスタまでが、FOCALSEAL材料中に極めて均一に散在しており、基底縁に沿って存在することを示した。細胞は、内因性基質にはほとんど乃至全く埋め込まれていないようであった。左欠損の組織の細胞生存率は15.6％、右欠損は18.9％であり、やはり、フリース粒子の予備加湿の省略が、生細胞の脱水を引き起こした可能性がある。
【０１０４】
I．4週間目の剖検
左膝蓋大腿関節の欠損は、肉眼的には、深さの50％まで、欠損端部に主として接続されていた白い肉芽組織で充填されていた。組織学的評価は、修復組織全体に繊維芽細胞が存在することを明らかにし、修復組織は、大量のヒドロゲルを含有しているようであった。右膝蓋大腿関節の欠損は、肉眼的には、深さの80％まで、滑らかなオフホワイトの組織で充填され、不均一な表面を有し、黄色のフィルムで覆われていた。組織学的評価は、修復組織中に好中球およびマクロファージが存在することを示した。炎症の病因は、明らかではなかった。
【０１０５】
要約すると、スラリー系は、欠損へと送達され、3日目および4週間目の時点で保持されていた。移植物は、4個の欠損全てに、少なくとも部分的には保持されていた。3日目の1個の欠損は、肉眼的には20％しか充填されておらず、このことから、一部の移植物の損失が示唆されるが；存在していた組織は、いくつかの生存細胞を含有していた。この欠損は、柔らかで不規則な端部を有しており、グレード4の病巣と通じていた。当研究所における以前の研究は、このレベルの変性を有する組織に骨膜グラフトを保持することが困難であることを示しており、従って、移植物のたとえ部分的な保持でも、肯定的である。
【０１０６】
移植後3日目の修復／複合材移植組織内には、生存細胞が証明された。生存細胞の割合は低かったが、スラリー粒子の予備加湿が行われておらず、細胞が脱水を起こした可能性が高く、そして細胞濃度は細胞の生存および増殖にとって最適ではなかった可能性がある。
【０１０７】
細胞複合材の送達は、ACIを使用した細胞送達よりも少ない時間を要し、ACIより細胞損失のリスクが低いという付加的な利点を有していた。この系の送達の結果として軟骨生成組織は産生されなかったが、スラリー条件は最適化されておらず、使用されたモデルは、軟骨修復のモデルとして保証されたものではなく、ACIを使用した場合には修復をもたらさなかった可能性がある。それにもかかわらず、本発明の系は、生存細胞の送達をもたらし、4個の欠損のうちの3個においては移植物が完全に保持され、有意に損なわれた端部を有する1個の欠損においては部分的に保持された。4週間目の時点では、両方の欠損に、修復組織の初期の徴候が認められた。複合材は、欠損に隣接している軟骨に侵入することなく、急速に送達されることができた。
【０１０８】
本発明は、実施例としてのみ提示された前記の態様によって制限されず、添付の特許請求の範囲によって定義される保護の範囲内で、様々な方式で改変され得る。
【０１０９】
従って、好ましい態様に適用されるような、本発明の基本的な新規の特質が示され記載されたが、例示された装置の形式および詳細、ならびにそれらの操作の様々な省略および置換および変化が、本発明の趣旨を逸脱することなく、当業者により作成され得ることが理解されよう。例えば、同じ結果を達成するための、実質的に同じ方法で実質的に同じ機能を発揮する、要素および／または方法工程の全ての組み合わせが、明らかに本発明の範囲内に含まれるものとする。さらに、本発明の任意の開示された形式または態様と関連して示されかつ／または記載された、構造および／または要素および／または方法工程は、一般的な設計選択の問題として、開示されるか、または記載されるか、または示唆される、その他の任意の形式または態様に取り込まれ得ることを認識すべきである。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲によって示されたようにのみ制限されるものとする。本明細書において引用された参照は、全て参照として完全に組み入れられる。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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