(57)【要約】本発明は、マイトジェン情報伝達増幅経路におけるタンパク質キナーゼ、とりわけｃ−ｒａｆの少なくとも部分的配列を符号化する核酸に関連し、上記部分的配列はミトコンドリア膜においてＶＤＡＣまたはＢＡＸチャンネル、あるいは該核酸を交雑する核酸または該核酸の相同物または誘導体と相互作用をすることとし、また本発明は上記核酸によって符号化されたタンパク質またはペプチド、及びそれらの選別法にも関連する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイトジェン情報伝達増幅経路におけるタンパク質キナーゼの少なくとも１つの部分的配列であり、ポーリン経路、核酸と交雑する核酸、または核酸の相同物あるいは誘導体と相互反応する上記部分的配列を符号化する核酸。
【請求項２】
上記相互反応とはポーリン経路、とりわけＶＤＡＣ、ＢＡＸまたは細菌性ポーリン経路の透過性の低下であることを特徴とする請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
配列ｃ−ｒａｆ−１（３３８から６２７）を含んだタンパク質またはペプチド、またはこれから得られる活性フラグメント、または上記核酸と交雑する核酸を符号化することを特徴とする請求項１または２のいずれか１に記載の核酸。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１によるｃＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１に記載の核酸を含んだ孤立組み換え型ベクター。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか１に記載の核酸によって符号化されたタンパク質またはペプチド。
【請求項７】
エイズや神経変性疾患の治療、または癌細胞を含む組織や細菌性感性において形質転換していない細胞の保護のための薬剤構成を作成するために符号化された、請求項１から４のいずれか１に記載の核酸、タンパク質またはペプチドの使用法。
【請求項８】
請求項１から４のいずれか１に記載の核酸、またはＶＤＡＣ、ＢＡＸまたは細菌性経路の閉鎖を引き起こす物質を特定するための選別法において符号化されたタンパク質またはペプチドの使用法。
【請求項９】
ポーリン経路、とりわけＶＤＡＣ、ＢＡＸまたは細菌性ポーリン経路を調節する物質を特定するための、以下の工程から構成される選別法。
ａ）ポーリン、とりわけＶＤＡＣ、ＢＡＸまたは細菌性ポーリン経路、また任意的にはその定められた部分的配列のみを、とりわけｒａｆの部分的配列などの試料物質と共に培養する。
ｂ）工程ａ）の溶液を電解液に置かれた膜に接触させる。
ｃ）工程ｂ）における膜には、膜の異なる面の間における電位差がｔ＝０の期間加えられ、ｔ＝０、またはｔ＝０より定められた時間だけ後に、電位差によって生じた電流、または膜を通過した電荷を、好ましくは時間に基づいて測定する。
ｄ）工程ｃ）によって測定された数値を同様の状況、ただし非活性または活性化した状態のｒａｆ、特にｃ−ｒａｆ−１と共に培養された場合において測定された数値と比較する。
【請求項１０】
請求項７に記載の病気の治療に要する薬剤構成を作成するための、ｒａｆを活性させる物質を特定するための、以下の工程から構成される選別法。
ａ）標的細胞を予想活性成分または予想活性成分の混合物と反応させ、その標的細胞を培養する。
ｂ）定められた時間の経過後、ｒａｆタンパク質の発現または濃度を測定し、その時得られた数値を同様の状況、ただし予想活性成分が加えられていない場合において測定された数値と比較する。
ｃ）工程ｂ）においてｒａｆタンパク質の発現及び／または濃度の上昇が検知された予想活性成分または予想活性成分の混合物を選択する。
ｄ）任意的に予想活性成分の混合物を用いる場合、例えば混合物における活性成分のそれぞれの測定によって逆重畳（デコンヴォルーション）を行なう。
【請求項１１】
以下の工程から構成される、請求項７に記載の病気の治療に要する薬剤構成の作成のためのｒａｆを活性化させる物質を特定するための選別法。
ａ）標的細胞において自然に生じうるｒａｆ阻害剤、とりわけｒａｆのキナーゼドメインに結合する物質、またはｒａｆ発現が減少するよう規制する物質を特定する。
ｂ）工程ａ）において特定された物質は、任意的に隔離及び／または浄化され、予想活性成分または予想活性成分の混合物と共に結合タンパク測定法（ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）にて反応させ、物質の予想活性成分との結合能力を検証する。
ｃ）工程ｂ）において結合事象が検知された予想活性成分または予想活性成分の混合物を選択する。
ｄ）任意的に予想活性成分の混合物を用いる場合、例えば混合物における活性成分のそれぞれの測定によって逆重畳（デコンヴォルーション／ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）を行なう。
ｅ）選択された予想活性成分または選択された予想活性成分の混合物は、任意的にはｒａｆの作用を検証するために、請求項１０に記載の方法に用いられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はポーリン、とりわけＶＤＡＣ、ＢＡＸ経路または細菌性ポーリンと相互作用するタンパク質を符号化する核酸に関し、また選別法において上記核酸によって符号化された上記核酸、タンパク質またはペプチドの使用法、または薬剤構成の作成に関連する。
【背景技術】
【０００２】
ｒａｆタンパク質は、その様々なイソ型の形態ｃ−ｒａｆ、Ｂ−ｒａｆ、及びＡ−ｒａｆとして細胞の増殖及び鑑別の規制において重要な役割を担う。ｒａｆはｒａｓのエフェクタキナーゼであり、マイトジェン細胞質タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）情報伝達増幅経路（参照、Ｄａｕｍ，Ｏ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９：４７４−４７９（１９９４））における重要な要素である。ｒａｆプロト癌遺伝子は、細胞質のセリン・トレオニン特定キナーゼを符号化する、極めて保存された遺伝子である。これらのキナーゼはマイトジェン信号伝達において作用する。上記の経路は、ｒａｓ、ｒａｆ、ＭＥＫ及びＥＲＫを介してレセプタ・チロシン・キナーゼから細胞質における標的まで信号を伝達し、この作用は基本的に細胞の増植及び鑑別の規制のために行なわれる。古典的マイトジェンＭＡＰキナーゼ経路におけるｃ−ｒａｆ−１の役割については、むしろよく研究されている。ほんの一例としてＵ．Ｒ．Ｒａｐｐによる癌遺伝子ハンドブック、Ｔ．Ｃｕｒｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｄｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，オランダ、１９９８、１１５頁〜１５４頁を詳細のための参照として挙げる。ｃ−ｒａｆ−１は、人体において実質的に偏在する物質である。
【０００３】
細胞へのアポトーシス信号の伝達に伴い、ミトコンドリアにおける膜透過性に変化が生じる。これらの膜の透過性が高くなることで、アポトーシスタンパク質シトクロムＣが細胞質の中へ転座し、その結果カスパーゼと呼ばれるタンパク質分解タンパク質が活性化する。このようなタンパク質がアポトーシスにつながる。ミトコンドリア膜の透過性は、他の要素がある中で、ミトコンドリアポーリン経路ＶＤＡＣ（電圧依存性陰イオン経路）の透過性によって測定される。さらに、その透過性はＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸL、ＢＡＸ及びＢＡＫが属するタンパク質種による影響を受ける。Ｂｃｌ−２は保護的な機能を持ち、たいていＶＤＡＣに結合する。ＢＡＸとは膜内在性タンパクで、アポトーシスを促進する。ＢＡＸ及びＢｃｌ−２は異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚｅ）になることができ、ＢＡＸの超過発現はＢｃｌ−２の保護効果を過補償する。より深い考察のために、Ｚｈｏｕ，Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１１９３０−１１９３６（１９９８）及びＳｈｉｍｉｚｕ、Ｍ．、Ｎａｔｕｒｅ（Ａｓｉａ）３９９：４８３（１９９９）をほんの一例として参照に挙げる。
【０００４】
Ｂｃｌ−２種に属する要素には全て共通して、アミノ酸相同性のＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３及びＢＨ４という４つの領域が存在する。これらの領域は、異なる要素の二量化及び／または機能のために不可欠である。とりわけ、ＢＨ４の有無は抗アポトーシスまたはアポトーシス誘発の効果を奏する上で重要な働きを持つようである（参照Ｗａｎｇ、Ｈ．−Ｇ．ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ８７：６２９−６３８（１９９６））。例えば、Ｂｃｌ−２はＢＨ４を含む一方、ＢＡＸはＢＨ４を含んでいない。
【０００５】
Ｗａｎｇ、Ｈ．−Ｇ．ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ８７：６２９−６３８（１９９６）の文献から、ｒａｆ−１はＢｃｌ−２と相互に作用することが周知である。この文献によると、この反応を引き起こすためにはＢＨ４が必須であるという。ｒａｆ−１／ＢＡＸの関連性はいまだ見つかっておらず、むしろ否定されてきた。この結果が議論の主題となる。
【０００６】
様々な病気は、自然細胞死プログラミングの障害を伴う。自然細胞死の機能の低下は、例えば癌または自己免疫疾患などと関連する。これと対照的に、過多細胞死はエイズや神経変性疾患に伴って見られる。しかし、病原菌による感染は、細菌性ポーリンが細胞膜に転座され、そこに存在する標的細胞にアポトーシスを引き起こさせることで、自然細胞死の障害を伴うこともある。例えば、「Ｔｈｅ  ＥＭＢＣ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １８：３３９−３５２（１９９９）」の文献から、ポーリンＰｏｒＢは、その様々な変異体として淋菌から人工膜、及びとりわけミトコンドリア外膜などの細胞標的膜の中へと転座することが周知である。これらの考察は一般的にグラム陰性菌においても適用することができる。自然ミトコンドリアポーリンと細菌性ポーリンの関係性については、文献Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  ６８６：２０４−２１４（１９８２）において例としては大腸菌、ネズミチフス菌及び緑膿菌などのために既に説明されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、望ましくない細胞死を抑制し、とりわけエイズ、神経変性疾患や望ましくない細胞死を伴う感染病を始めとする、望ましくない細胞死を伴う疾患を治療するのに適した活性成分を提供するための技術目標に基づいている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ＶＤＡＣまたはＢＡＸ経路の膜透過性に関する様々な実験が合成膜を用いて行なわれた。この実験では、ＶＤＡＣまたはＢＡＸがｃ−ｒａｆと共に培養されると、経路は閉ざされたままであることが判った。それと対照的に、ＶＤＡＣまたはＢＡＸが非活性の形態でのｃ−ｒａｆと共に培養されると経路は開かれる。ここで発見されたｒａｆとＶＤＡＣまたはＢＡＸの相互作用は、できればＢｃｌ−２などの媒介物質によって直接的または間接的に行なわれてもよい。一方では自然ミトコンドリアポーリン、ＶＤＡＣ及び／またはＢＡＸとの、もう一方では細菌性ポーリンとの間における類似性のために、後者はｒａｆとの相互作用によって抑制または閉鎖されることもある。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、マイトジェン情報伝達増幅経路におけるタンパク質キナーゼの少なくとも部分的配列を符号化する核酸に関しており、上記部分的配列はポーリン、とりわけミトコンドリア膜におけるＶＤＡＣ、ＢＡＸ経路と、または細菌性ポーリン経路、または上記のような核酸を交雑する核酸、または上記核酸の相同物、誘導体と相互反応することとする。
【００１０】
ここで使用する核酸という語句は、とりわけＤＮＡ、ＲＮＡ及びＰＮＡを包含する。さらにこの語句には、二本鎖核酸および一本鎖核酸が含まれ、お互いに補足しあう核酸もまた包含する。本発明によると、サイレント変異（突然変異）もまた核酸である。サイレント変異とは、変異体のＶＤＡＣまたはＢＡＸとの相互作用を参照にすると、自然無変異配列（ｎａｔｕｒａｌ  ｎｏｎ−ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に比べて変異体が機能的差異へつながらない、配列における変異体である。サイレント変異は対立形質または人工変異であってもよい。また本発明には、誘導体も含まれる。そして誘導体とは、非自然化学変質（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）である。本発明による核酸を交雑する核酸は、緊縮な状況下で交雑する類のものである。一般的に逼迫（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）は、ハイブリダイゼーションの融解温度より５℃から２５℃低い温度範囲で生じる。逼迫した状況が意味するのは、少なくとも９５％、好ましくは９８％の配列アイデンティティ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）における交雑のことである。これらの意義が基づくハイブリダイゼーション法に関しては、文献「Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．、実験マニュアル、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）」及び「Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３（１９７５）」を参照に挙げる。
【００１１】
マイトジェン情報伝達増幅経路のタンパク質キナーゼとして、特にＡ−ｒａｆ、Ｂ−ｒａｆまたはｃ−ｒａｆが用いられる。本発明による核酸はｒａｆ部分的配列、すなわちキナーゼドメインＣＲ３またはそれの活性化した部分的配列や、サイレント変異及び／またはそれの誘導体のみであってもよい。ＣＲ３とは、最高６４８までの範囲のアミノ酸３０２である。この範囲においては、核酸は、例えば△ｒａｆ（２６−３０２）を符号化する核酸であってもよい。この上で重要なのは、核酸がキナーゼの活性形態またはそのキナーゼ活性部分、または相同のタンパク質またはペプチドのために符号化されることであるようだ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明による核酸を用いて、ＶＤＡＣ、ＢＡＸまたは細菌性ポーリン経路と相互作用する物質の検索を行なうことができる。一方で、間接的な相互作用が行なわれた場合には、以前相互作用のために必要と解明されたｒａｆの部分に結合する物質を検索することもできる。また一方では、上記のような核酸はより効率性の高い、同様の機能を持つ物質のためのモデルとして用いることもできる。そのため、本発明はＶＤＡＣ、ＢＡＸまたは細菌性ポーリン経路を調節する物質を特定するための、以下の工程から構成される選別法（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）にもまた関連する。
ａ）ＶＤＡＣ、ＢＡＸまたは細菌性ポーリン経路、また任意的にはその定められた部分的配列のみを、とりわけｒａｆの部分的配列などの試料物質と共に培養する。
ｂ）工程ａ）の溶液を電解液に置かれた膜に接触させる。
ｃ）工程ｂ）における膜には、膜の異なる面の間における電位差がｔ＝０の期間加えられ、ｔ＝０、またはｔ＝０より定められた時間だけ後に、電位差によって生じた電流、または膜を通過した電荷を、好ましくは時間に基づいて測定する。
ｄ）工程ｃ）によって測定された数値を同様の状況、ただし非活性または活性化した状態のｒａｆと共に培養された場合において測定された数値と比較する。
この結果として、非活性の状態のものを用いた場合には、全く阻害が起こらないか否か、また活性状態のものを用いた場合には、活性ｒａｆの方が強い度合いで阻害が起こるか否かを判断することができる。
【００１３】
本発明の核酸として好ましいのは、相互反応がＶＤＡＣ、ＢＡＸまたは細菌性ポーリン経路の透過性の低下として現れるものである。
【００１４】
核酸は、配列ｃ−ｒａｆ−１（３３８から６２７）から構成される活性タンパク質またはペプチド、またはこれから得られる活性フラグメントのために符号化を行なうか、またはこのような核酸を交雑する核酸であるか、配列ｃ−ｒａｆ−１（３３８から６２７）から構成されるタンパク質またはペプチドのために符号化を行なうか、またはこのような核酸の交雑を行なう核酸であることが好ましい。また、核酸はｃＤＮＡであってもよい。本発明の主旨を踏まえると、人間のｒａｆであることが好ましいが、研究を目的とした場合には非人間のｒａｆであってもよい。
【００１５】
さらに本発明は、本発明による核酸またはこの核酸を含んだ発現プラスミドを含んだ孤立組み換え型ベクターに関連する。ここでは安定した発現を生じさせるために、適したウィルス性タンパク質を符号化する、例えばギャグ（ｇａｇ）などのＤＮＡフラグメントが用いられてもよい（例えばｃ−ｒａｆまたはｃ−ｒａｆフラグメントを含んだ融合ギャグ（ｆｕｓｉｏｎ  ｇａｇ））。発現プラスミドによって、核酸によって符号化されたタンパク質またはペプチドを調合するために用いられる形質転換体を形成することも可能である。このために、形質転換体は従来の方法に応じて適した方法で培養される。
【００１６】
さらに本発明は本発明による核酸によって符号化されるタンパク質またはペプチドに関連する。
【００１７】
本発明の主題となるのは、とりわけ本発明による核酸の使用法、またはエイズ、神経変性疾患を治療するための薬剤構成を作成するため、あるいは癌細胞や細菌性感染を含んだ組織において形質変換していない細胞を保護するために上記核酸によって符号化されたタンパク質またはペプチドの使用法である。ここでは本発明による核酸、またはこれによって符号化されたタンパク質あるいはペプチドが、抗アポトーシスとして作用し関連する病気から引き起こされる(未発達な)細胞死を防ぐという作用が応用されている。エイズの場合には、Ｔリンパ球が保護される。また神経変性疾患の場合には、神経細胞は（再生不能な）細胞死から保護される。制御されていない状態で増殖する細胞に対して細胞毒を用いる癌治療においては、通常の健康な細胞は、細胞毒の働きによって望ましくない細胞死から保護される。
【００１８】
さらに本発明は、ｒａｆを活性化する物質を特定し、上記の病気を治療するための薬剤構成を作成するのに適した選別法に関しており、上記の物質は低分子（＜１０，０００ｄａ、より好ましくは＜５，０００ｄａ）であることが好ましい。選別法は、予想活性成分によるｒａｆの活性化を検証する方法としても理解されている。原則的には、上記のような選別法は細胞モデルにおいて直接的または間接的にｒａｆ濃度を上昇させる物質に対して行われる。この物質は、例えばｒａｆ発現が上昇するよう規制する物質である場合もある。またその反対に、ｒａｆ発現またはｒａｆそのものを阻害する物質である場合もある。上記の選別法は、詳細には以下のように構成される。ｒａｆ活性物質を特定するための選別法は以下の工程からなる。
ａ）標的細胞を予想活性成分または予想活性成分の混合物と反応させ、その標的細胞を培養する。
ｂ）定められた時間の経過後、ｒａｆタンパク質の発現または濃度を測定し、その時得られた数値を同様の状況、ただし予想活性成分が加えられていない場合において測定された数値と比較する。
ｃ）工程ｂ）においてｒａｆタンパク質の発現及び／または濃度の上昇が検知された予想活性成分または予想活性成分の混合物を選択する。
ｄ）任意的に予想活性成分の混合物を用いる場合、例えば混合物における活性成分のそれぞれの測定によって逆重畳（デコンヴォルーション）を行なう。
しかしまた、ｒａｆ活性物質を特定するための選別法は以下の工程も含んでなることも可能である。
ａ）標的細胞において自然に生じうるｒａｆ阻害剤、とりわけｒａｆのキナーゼドメインに結合する物質、またはｒａｆ発現が減少するよう規制する物質を特定する。
ｂ）工程ａ）において特定された物質は、任意的に隔離及び／または浄化され、予想活性成分または予想活性成分の混合物と共に結合タンパク測定法（ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）にて反応させ、物質の予想活性成分との結合能力を検証する。
ｃ）工程ｂ）において結合事象が検知された予想活性成分または予想活性成分の混合物を選択する。
ｄ）任意的に予想活性成分の混合物を用いる場合、例えば混合物における活性成分のそれぞれの測定によって逆重畳（デコンヴォルーション／ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）を行なう。
ｅ）選択された予想活性成分または選択された予想活性成分の混合物は、任意的にはｒａｆの作用を検証するために、請求項１０に記載の方法に用いられる。
原則的には、ｒａｆ濃度を測定するための全ての方法及び／または当業者に周知である全ての結合タンパク測定法を用いてよいとする。ｒａｆ特定法に関して言えば、発現したｒａｆが計測によって容易に検知ができ、また標的細胞には生来存在しないリポーター類を持つように、用いられる標的細胞に遺伝子操作がなされているとより適切である。
【００１９】
さらに付け加えると、参照の文献でも示されるように、ｒａｆを阻害することよって一方では癌細胞における自然細胞死の防護につながる（すなわちｒａｆの欠乏による）ことが特筆される。ＶＤＡＣ及び／またはＢＡＸ経路は閉鎖されておらず、アポトーシスが生じる。その範囲において、例えば癌細胞などの細胞において自然アポトーシスが起こらない病気を治療するためのｒａｆの阻害剤を少なくとも１つ含んだ薬剤構成もまた本発明の範囲の対象とする。
【００２０】
本発明における請求項のうち１つの範疇に関して付された説明は、他の請求項の範疇においても同様に適用される。最後に、本発明は治癒方法にも関連しており、例を挙げると擬古的には医薬品の投与や、遺伝子治療的には本発明による１つまたは複数の物質を標的細胞に接触するか、あるいは標的細胞において生成し、その発現が励起または増幅することによる治癒方法に関する。
【００２１】
（配列資料）
ＢＡＸの配列は、www.ncbi.nlm.nih.gov.よりアクセス番号Ｌ２２４７３にて周知となり、また入手可能である。ＢＣＬ−２の配列は、www.ncbi.nlm.nih.gov.よりアクセス番号Ｍ１３９９５にて周知となり、また入手可能である。ＶＤＡＣの配列は、www.ncbi.nlm.nih.gov.よりアクセス番号ＮＭ００３３７４にて周知となり、また入手可能である。ｃ−ｒａｆの配列は、www.ncbi.nlm.nih.gov.よりアクセス番号Ｘ０３４８４にて周知となり、また入手可能である。Ａ−ｒａｆの配列は、www.ncbi.nlm.nih.gov．よりアクセス番号Ｘ０４７９０にて周知となり、また入手可能である。Ｂ−ｒａｆの配列は、www.ncbi.nlm.nih.gov．よりアクセス番号Ｍ９５７１２にて周知となり、また入手可能である。
【実施例１】
【００２２】
（プラスミドの製剤）
ＣＯＯＨ終末膜貫通領域が欠乏しているタンパク質（△ＴＭ）を符号化するＢＡＸ及びＢＣＬ−２  ｃＤＮＡｓが用いられる。ＢＡＸに関してはＢＡＸ△Ｃ１９、すなわちアミノ酸１７２−１９１が欠乏しているものが使用される。ＢＣＬ−２に関してはＢＣＬ−２△Ｃ２１、すなわちアミノ酸２１９−２３９が欠乏しているものが使用される。ＢＣＬ−２△ＴＭを符号化するｃＤＮＡは、ベクターｐＪＧ４−５からのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩと共に消化されることで取り除かれ、ｐＧＥＸ−４ＴｌにおけるＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩの部位内で繁殖される。ＢＣＬ−２△ＴＭを符号化するｃＤＮＡは、（Ｊ．Ｒｅｅｄから得られた）ｐＧＥＸ−４Ｔｌプラスミドにおいて発現される。ＧＳＴ−ｃ−ｒａｆＹＹ３４０／３４１ＤＤ及びＧＳＴ−ｃ−ｒａｆＬ３７５Ｗは、Ｓｆ９昆虫細胞における発現のためにｐＦａｓｔＢａｃバキュロ・ウィルスにて繁殖される。
【実施例２】
【００２３】
（組み換え型タンパク質の発現及び浄化）
大腸菌ＢＬ２１  ＤＥ３（ｐＬｙｓＳ）は、ＢＡＸ△ＴＭまたはＢＣＬ−２△ＴＭ構造と共に変換され、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンと共に３７℃で一晩繁殖される。それぞれのベクターの１コロニーは、０．６のＯＤ（６００ｎｍ）数値を出すように０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｘＹ−ＴＧ溶剤にて３７℃で培養される。０．１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）にて２５℃で１６時間培養されることによって、タンパク質の発現は誘発される。４０００ｒｐｍにて４℃の温度で３０分間遠心分離することで細胞を採取し、溶解緩衝液（トリス  ５０ｍＭ  ｐＨ８、ＮａＣｌ  １００ｍＭ、ＥＤＴＡ  １ｍＭ、ベンズアミジン  １ｍＭ、フェニルメチルスルホニルフッ化物  １ｍＭ、ロイペプチン  １０μｇ／ｍｌ、アプロチニン  １０μｇ／ｍｌ、β−メルカプトエタノール  １０ｍＭ）にて再び浮かべられる。細胞のホモジェネートは、１ｍｇのリゾチームが含まれた液体窒素の中で冷凍され、超音波処方がなされる前にまた解凍される。２８０００ｇにて４℃の温度で３０分間遠心分離にかけられた後、上清はグルタチオン・セファローゼ球（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｂｅａｄｓ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共に４℃の温度で２時間培養される。球はトリトン−Ｘ１００（０．１％）及びＮａＣｌ（２０ｍＭ）を含んだ溶解緩衝液で洗浄され、トロンビンを含んだ緩衝液（トリス  ５０ｍＭ  ｐＨ８、β−メルカプトエタノール  ２０ｍＭ）の中で一晩培養される（Ｓｉｇｍａ）。更に分割ＢＡＸ△ＴＭ及びＢＣＬ−２△ＴＭは、陰イオン交換カラムリソースＱ（ａｎｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｏｌｕｍｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ）にて浄化され（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ａｍｅｒｓｈａｍ）、タンパク質はＮａＣｌ勾配（ＮａＣｌ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）（０−０．５Ｍ）と共に溶離される。
【００２４】
ＧＳＴ−Ｃ−ｒａｆタンパク質を得るために、Ｓｆ９昆虫細胞はバキュロ・ウィルスに感染され、細胞ペレットは冷凍され、−７０℃の温度に保たれる。ペレットは再び溶解緩衝液（トリス  ２５ｍＭ  ｐＨ７．６、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、Ｎａ4Ｐ2Ｏ7  １０ｍＭ、β−グリセロホスファート  ２５ｍＭ、グリセロール  １０％、ＮＰ−４０  ０．７５％、ロイペプチン  １０μｇ／ｍｌ、アプロチニン  １０μｇ／ｍｌ、ベンズアミジン  １ｍＭ、フェニルメチルスルホニルフッ化物  １ｍＭ）に浮かべられ、４℃の温度で４０分間均質化及び培養される。細胞残屑は１５０００ｇにて４℃の温度で３０分間遠心分離にかけることで取り除かれる。上清はグルタチオン・セファローゼ球（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｂｅａｄｓ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共に４℃の温度で二時間培養される。球は一度目には溶解緩衝液で洗浄され、二度目にはＮａＣｌ（５００ｍＭ）を含んだ溶解緩衝液で洗浄される。ＧＳＴ融合タンパク質は、２０ｍＭのグルタチオンを含んだ緩衝液（トリス  ５０ｍＭ  ｐＨ８、アプロチニン、ロイペプチン、ベンズアミジン）で溶離される。
【００２５】
ＶＤＡＣタンパク質は、変性／復元状態にあるラットの肝臓から浄化される。
【実施例３】
【００２６】
（脂質二重層における実験の施行）
経路形成タンパク質は、人工脂質二重層に再構成される。この実験上の構造は、５ｍｌの体積を有する水性ＫＣｌ緩衝液（０．３Ｍ）を収容するための２つの区分室を備えたテフロン（登録商標）試験槽を有し、上記の区分室は０．２ｍｍ2の断面を持つ円形の孔によって繋がっている。膜はｎデカンにおいて、１％（ｗ／ｖ）のジフィタノイルオスファティジルコリン（ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎ）（ＤｉｐｈＰＣ、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）溶液から生成される。二重層構造は、反射光に関して光学的に黒くなることから探知可能となる。
【００２７】
ＢＡＸ△ＴＭ、ＢＣＬ−２△ＴＭまたはＶＤＡＣタンパク質が、両方の区分室に収容されたＫＣｌ緩衝液に加えられる。形成された孔または経路における単チャンネル伝導性（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｎｎｅｌ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ）は、区分室の緩衝液に塩橋がそれぞれ差し込まれた状態の１つのＡｇ／ＡｇＣｌ電極の導入によって定膜電位（２０ｍｖ）が施された後に測定される。測定された電流値は電流増幅器によって増幅され、時間の機能として記録される。
【００２８】
ＢＡＸ△ＴＭ、ＢＣＬ−２△ＴＭまたはＶＤＡＣ経路に対するＣ−Ｒａｆキナーゼの効果を検査するために、チャンネル形成タンパク質（ＢＡＸ△ＴＭ：２．４μｇ、ＢＣＬ−２△ＴＭ：１．８μｇ）がＡＴＰ（０．１ｍＭ）が存在する状況で、ＧＳＴ−ｃ−ｒａｆＹＹ３４０／３４１ＤＤ（ｃ−ｒａｆの活性した形態）、ＧＳＴ−ｃ−ｒａｆＫ３７５Ｗ（ｃ−ｒａｆの非活性の状態）、またはＧＳＴのみと共に３０℃の温度で３０分間、キナーゼ緩衝液（Ｈｅｐｅｓ  ２５ｍＭ  ｐＨ  ７．４、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、β−グリセロホスファート  ２５ｍＭ、ＤＴＴ  １ｍＭ、ＭｇＣｌ2 １０ｍＭ）にて培養される。区分室におけるＫＣｌ緩衝液のＤｉｐｈＰＣ膜の両面に試料が施され、単チャンネル形態（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｎｎｅｌ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）が測定される。制御測定によると、ＧＳＴ−ｃ−ＲａｆＹＹ３４０／３４１ＤＤ、ＧＳＴ−ｃ−ｒａｆＫ３７５Ｗ、またはＧＳＴは、それぞれのみでは人工二重層膜において経路は形成されなかったことが判った。
【実施例４】
【００２９】
（結果）
図１ａ、ｂには、実施例３に記載した実験規定における透過性測定の結果が、ＶＤＡＣ／ＧＳＴ−ｃ−ｒａｆＬ３７５Ｗを（ａ）、ＢＡＸ△ＴＭ／ＧＳＴ−ｃ−ｒａｆ３７５Ｗを（ｂ）として示されている。阻害が生じていないことから、経路が形成されていることが判る。
【００３０】
これと対照的に、図１ａ、ｂに基づいた非活性の形態の代わりにｃ−ｒａｆの活性した形態であるＧＳＴ−ｃ−ｒａｆＸＸ３４０／３４１ＤＤを使用すると、経路形成においてかなりの阻害となることが図２ａ、ｂから見受けられる。これは、本発明による活性ｃ−ｒａｆタンパク質とＶＤＡＣまたはＢＡＸ△ＴＭとの間で生じる相互作用に基づくものである。
【００３１】
活性した形態のｃ−ｒａｆを用いて、ＢＣＬ−２△ＴＭに対する潜在的影響がさらに実験された。この結果は図３にて図示されている。ｃ−ｒａｆがどのような場合においても経路形成を阻害しない形でＢＣＬ−２と相互作用していることから、経路形成が行なわれていることが明白に見受けられる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図面１ａ、１ｂ：  ＧＳＴ−ｃ−ｒａｆＬ３７５Ｗ（ａ）と共に培養された後のＶＤＡＣ（ａ）及びＢＡＸ△ＴＭ（ｂ）経路の透過性を表す。
【図２】図面２ａ、２ｂ：  ＧＳＴ−ｃ−ｒａｆＹＹ３４０／３４１ＤＤと共に培養された後のＶＤＡＣ（ａ）及びＢＡＸ△ＴＭ（ｂ）経路の透過性を表す。
【図３】図面３：  ＧＳＴ−ｃ−ｒａｆＹＹ３４０／３４１ＤＤと共に培養された後のＢＣＬ２△ＴＭ経路の透過性を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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