(57)【要約】有効量の血管内皮成長因子受容体アンタゴニストによりヒト患者を処理することを含んで成る、ヒト患者における血管内皮成長因子のリガンドにより刺激される皮固形腫瘍細胞の成長を阻害する方法が言及される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類における血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）のリガンドにより刺激される非固形腫瘍細胞を阻害する方法であって、有効量のＶＥＧＦＲアンタゴニストにより前記哺乳類を処理することを含んで成る方法。
【請求項２】
前記ＶＥＧＦＲがＫＤＲである請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＶＥＧＦＲがｆｌｋ−１である請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ＶＥＧＦＲがｆｌｔ−１である請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記哺乳類が、ヒトである請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記アンタゴニストが、生物学的分子である請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記生物学的分子が、ＶＥＧＦＲに対して特異的なモノクローナル抗体、又はその超可変領域を含んで成るフラグメントである請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が、
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１；
配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２；及び
配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３
を含んで成る少なくとも１つの可変Ｈ鎖フラグメント、並びに
配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１；
配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２；及び
配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３
を含んで成る少なくとも１つの可変Ｌ鎖フラグメント、
を含んで成る請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記抗体が、
配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの可変Ｈ鎖フラグメント；及び
配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの可変Ｌ鎖フラグメント；
を含んで成る請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記モノクローナル抗体が、キメラ化されるか又はヒト化される請求項７記載の方法。
【請求項１１】
前記アンタゴニストが、小分子である請求項１記載の方法。
【請求項１２】
照射、化学療法又はその組み合わせにより前記非固形腫瘍細胞を処理することをさらに含んで成る請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記腫瘍細胞が、造血構造に影響を及ぼす請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記腫瘍細胞が、骨髄細胞である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記腫瘍細胞が、白血病である請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記白血病が、急性単球性白血病（ＡＭＬ）、慢性単球性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、赤血球性白血病又は単球性白血病である請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍細胞が、多発性骨髄腫である請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
前記腫瘍細胞が、リンパ系細胞である請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
前記リンパ系が、ホジキン病又は非ホジキン病に関連する請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
哺乳類における血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）のリガンドにより刺激される非固形腫瘍細胞を阻害する方法であって、有効量のＶＥＧＦＲアンタゴニスト及び照射の組合せにより前記哺乳類を処理することを含んで成る方法。
【請求項２１】
前記哺乳類が、ヒトである請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記アンタゴニストが、照射の前に投与される請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記アンタゴニストが、照射の間に投与される請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
前記アンタゴニストが、照射の後に投与される請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
前記アンタゴニストが、照射の前及び間に投与される請求項２０記載の方法。
【請求項２６】
前記アンタゴニストが、照射の間及び後に投与される請求項２０記載の方法。
【請求項２７】
前記アンタゴニストが、照射の前及び後に投与される請求項２０記載の方法。
【請求項２８】
前記アンタゴニストが、照射の前、間及び後に投与される請求項２０記載の方法。
【請求項２９】
前記照射源が、哺乳類の外部にある請求項２０記載の方法。
【請求項３０】
前記照射源が、哺乳類の内部にある請求項２０記載の方法。
【請求項３１】
前記アンタゴニストが、モノクローナル抗体である請求項２０記載の方法。
【請求項３２】
前記腫瘍細胞が、造血構造に影響を及ぼす請求項２０記載の方法。
【請求項３３】
哺乳類における血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）のリガンドにより刺激される非固形腫瘍細胞を阻害する方法であって、有効量のＶＥＧＦＲアンタゴニスト及び化学療法剤より前記哺乳類を処理することを含んで成る方法。
【請求項３４】
前記アンタゴニストが、化学療法剤による処理の前に投与される請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記アンタゴニストが、化学療法剤による処理の間に投与される請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
前記アンタゴニストが、化学療法剤による処理の後に投与される請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
前記アンタゴニストが、化学療法剤による処理の前及び間に投与される請求項３３記載の方法。
【請求項３８】
前記アンタゴニストが、化学療法剤による処理の間及び後に投与される請求項３３記載の方法。
【請求項３９】
前記アンタゴニストが、化学療法剤による処理の前及び後に投与される請求項３３記載の方法。
【請求項４０】
前記アンタゴニストが、化学療法剤による処理の前、間及び後に投与される請求項３３記載の方法。
【請求項４１】
前記化学療法剤が、シスプラチン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、メクロレタミン、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン、エトポシド、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、アルデスレウキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラトリビン、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イフォスファミド、インターフェロンα、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトーテン、ベガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブリマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、タキソール及びそれらの組合せから成る群から選択される請求項３３記載の方法。
【請求項４２】
前記化学療法剤が、シスプラチン、ドキソルビシン、タキソール及びそれらの組合せから成る群から選択される請求項３３記載の方法。
【請求項４３】
前記腫瘍細胞が、造血構造に影響を及ぼす請求項３３記載の方法。
【請求項４４】
前記アンタゴニストが、モノクローナル抗体である請求項３３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景：
癌は、アメリカ合衆国においては、心臓発作に続く死の第２の主要原因である。２つの破壊的疾病の処理における新規治療の開発において重要な進展が存在する。その進展の大部分は、正常細胞及び癌細胞の両者における細胞増殖の良好な理解による。
正常細胞は、それらのそれぞれのリガンドによる成長因子受容体の高度に調節された活性化により増殖する。そのような受容体の例は、成長因子受容体チロシンキナーゼである。
【０００２】
癌細胞もまた、成長因子受容体の活性化により増殖するが、しかし正常な増殖の注意した制御を失う。この制御の喪失は、多くの因子、例えば成長因子及び／又は受容体の過剰発現、及び成長因子により調節される生化学経路の自立的活性化により引き起こされ得る。
腫瘍形成に関与するいくつかの例は、血管内成長因子（ＶＥＧＦＲ）、血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦＲ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦＲ）、神経の成長因子（ＮＧＦＲ）及び線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）のための受容体である。
【０００３】
胚成長の間、造血及び初期内内皮細胞（血管芽細胞）は、血管芽細胞として知られる通常の前駆体細胞に起因する。この通常の起源が与えられる場合、いくつかのシグナル化経路が、造血細胞及び血管細胞の両者により共有される。１つのそのような経路は、ＶＥＧＦＲシグナル化経路である。ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）は、Ｓｈｉｂｕｙａ Ｍ．など．， ｏｎｃｏｇｅｎｅ ５： ５１９−５２４ （１９９０） （ＶＥＧＦＲ−１） により配列決定されたＦＬＴ−１；１９９２年２月２０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ９２／０１３００号、及びＴｅｒｍａｎなど．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６： １６７７−１６８３ （１９９１） に記載されるＫＤＲ；及びＭａｔｔｈｅｗｓ Ｗ． など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８： ９０２６−９０３０ （１９９１） （ＫＤＲ及びＦＬＫ−１は集合的には、ＶＥＧＦＲ−２として言及される） により配列決定されたＦＬＫ−１を包含する。
【０００４】
特にとらわれない限り又は他方では、明確に言及されない限り、本明細書は、ＶＥＧＦ受容体の習慣的な文献命名法に従うであろ。ＫＤＲは、ＶＥＧＦＲ−２のヒト形として言及されるであろ。ＦＬＫ−１はＶＥＧＦＲ２のネズミ相同体として言及される。ＦＬＴ−１は、ＫＤＲ／ＦＬＫ−１受容体とは異なるが、しかしそれに関連している。
ＶＥＧＦＲは、内皮に対して増殖及び移動効果を発揮する、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を包含するいくつかの可溶性因子に結合する。ＶＥＧＦＲ−２は、内皮細胞により独占的に発現されると思われる。しかしながら、最近、ＶＥＧＦＲ２は、多能性造血幹細胞上に存在することが知られている（１）。いくつかの研究は、一定の白血病細胞がまた、ＶＥＧＦＲ−２を発現したことを示している（２）。
【０００５】
ＶＥＧＦの種々の生物学的効果を仲介する２種の主要なシグナル化チロシンキナーゼ受容体は、ＶＥＧＦＲ−２及びＶＥＧＦＲ−１である。ＶＥＧＦへのＶＥＧＦＲ−１の結合親和性は、１０−７０ｐＭのＫｄ値を伴なって、非常に高いが（５）、ほとんどの研究は、ＶＥＧＦＲ−２が内皮細胞増殖及び分化のための細胞シグナルを伝達するための決定的な受容体であることを示している（６）。ＶＥＧＦＲ−１は、血管再造形のためにより重要であると思われる。血管形式及び血管芽形成の調節におけるＶＥＧＦ受容体の相対的有意性は、ＶＥＧＦＲ−２及びＶＥＧＦＲ−１遺伝子が相同組換えによりネズミ胚幹細胞における破壊された研究において確立されている。ＶＥＧＦＲ−２を欠失するネズミは、血管形成、血管芽形成及び造血において劇的な欠点を有した（７）。対照的に、ＶＥＧＦＲ−１ノックアウトマウスは異常血管チャネルを成長せしめ、このことは、内皮細胞−細胞又は細胞−マトリックス相互作用の調節においてこの受容体のための役割を示唆する。
【０００６】
ＢＥＧＦＲ−２シグナル化の破壊を通しての血管芽形成の阻害は、固形腫瘍の増殖及び転移の阻害をもたらす。例えば、ネズミＶＥＧＦＲ−２に対する中和モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）は、ネズミモデルにおいて腫瘍増殖及び転移を阻害した（９，１０）。さらに、グリア芽腫増殖は、ＶＥＧＦＲ−２に対して優性−陰性のマウスにおいて阻害された（１１）。腫瘍増殖のそのような阻害は、血管芽形成の阻害を引き起こし、腫瘍の血液供給を効果的に制限する。
【０００７】
白血病は、それらの成熟及び分化の異なった段階で造血幹細胞に起因する。急性白血病は自己再生を受ける能力を有する未成熟造血幹細胞に起因するが、ところが一定の低攻撃性白血病、例えば慢性白血病はより成熟傾向の造血前駆細胞に起因すると思われることが現在十分に確立されている。
いずれにせよ、白血病細胞は独立した血液供給を必要としない。従って、白血病及び他の非固形腫瘍は、上記の従来の技術処理に対して敏感でない。
【０００８】
いくつかの研究は、ＶＥＧＦがすべての確立された白血病細胞系、及び新しく単離されたヒト白血病、例えば十分に研究されたＨＬ−６０白血病細胞系によりほとんど不変的に発現されることを示している（２，３）。ＲＴ−ＰＣＲを用いれば、いくつかの研究は、ＶＥＧＦＲ−２及びＶＥＧＦＲ−１が一定のヒト白血病により単に発現されることを示している（２，３）。しかしながら、それらの研究は、ＶＥＧＦの発現がいずれかの同目的の表面ＶＥＧＦＲ−２／ＶＥＧＦＲ−１発現又は機能的応答に関連するがどうかを示していない。
現在の癌処理は伝統てきには、化学療法又は放射線治療を包含する。しかしながら、そのような処理は、特に長期にわたっては、必ずしも効果的ではない。
従って、非固形腫瘍を処理するための新規方法の必要性がある。そのような方法を提供することが、本発明の目的である。
【０００９】
発明の要約：
当業者に明らかであるようなこの及び他の目的は、哺乳類におけるＶＥＧＦＲのリガンドにより刺激される非固形腫瘍の増殖を阻害する方法を提供することによって達成されて来た。この方法は、有効量のＶＥＧＲアンタゴニストにより哺乳類を処理することを含んで成る。
もう１つの態様においては、本発明の方法は、有効量のＶＥＧＦＲアンタゴニスト及び化学療法剤の組合せによりヒト患者を処理することを含んで成る。
さらにもう１つの態様においては、本発明の方法は、有効量のＶＥＧＦＲアンタゴニスト及び照射の組み合わせによりヒト患者を処理することを含んで成る。
【００１０】
発明の特定の記載：
本発明は、ヒト患者における非固形腫瘍、特に非固形悪性腫瘍を処理するための改良された方法を提供する。
【００１１】
非固形腫瘍細胞：
非固形腫瘍細胞は、免疫系の成分を包含する造血構造に影響を及ぼす腫瘍を包含する。非固形腫瘍のいくつかの例は、白血病、多発生骨髄腫及びリンパ腫を包含する。それらの腫瘍細胞は一般的に、骨髄及び末梢循環において出現する。
本発明に従って処理され得るタイプの非固形腫瘍は、ＶＥＧＦＲのリガンドにより刺激されるいずれかの非固形腫瘍である。受容体のＶＥＧＦＲファミリーは、例えばＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ， ｆｌｋ−１）及びＶＥＧＦＲ−１（ｆｌｔ−１）を包含する。ＶＥＧＦＲを刺激するリガンドのいくつかの例は、ＶＥＧＦを包含する。
【００１２】
非固形腫瘍のいくつかの例は、白血病、多発生骨髄腫及びリンパ腫を包含する。白血病のいくつかの例は、急性単球性白血病（ＡＭＬ）、慢性単球性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、赤血球性白血病又は単球性白血病を包含する。リンパ腫のいくつかの例は、ホジキン病及び非ホジキン病に関連するリンパ腫を包含する。
非固形腫瘍は、正常なレベルでＶＥＧＦＲを発現することができるか、又はそれらは、例えば正常レベルよりも少なくとも１０，１００又は１０００倍高いレベルでＶＥＧＦＲを過剰発現することができる。
【００１３】
ＶＥＧＦＲアンタゴニスト：
本発明の非固形腫瘍は、ＶＥＧＦＲアンタゴニストにより処理される。本明細書の目的のためには、ＶＥＧＦＲアンタゴニストは、ＶＥＧＦＲリガンドによるＶＥＧＦＲの刺激を阻害するいずれかの分子である。そのような刺激の阻害は、ＶＥＧＦＲを発現する細胞の増殖を阻害する。
【００１４】
阻害の特定の機構は、本発明において作動する通りには包含されない。それにもかかわらず、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼは一般的に、リン酸化現象により活性化される。従って、本発明のアンタゴニストは一般的に、ＶＥＧＦＲのリン酸化を阻害する。従って、リン酸化アッセイは、本発明において有用なアンタゴニストの生成において有用である。
【００１５】
非固形腫瘍の増殖は、癌の進行（すなわち、非固形腫瘍の増殖、侵襲性、転移）及び／又は再発）を妨げるか又は軽減するために、患者において十分に阻害される。本発明のＶＥＧＦＲアンタゴニストは、細胞増殖抑制性であり、すなわち非固形腫瘍の増殖を阻害する。好ましくは、ＥＲＧＲアンタゴニストは細胞溶解性であり、すなわち腫瘍を破壊する。
【００１６】
ＶＥＧＦＲアンタゴニストは、生物学的分子又は小分子を包含する。生物学的分子は、４５０以上の分子量を有する、単糖、アミノ酸及びヌクレオチドのすべての脂質及びポリマーを包含する。従って、生物学的分子は、例えばオリゴ糖及び多糖；オリゴペプチド、ポリペプチド、ペプチド及びタンパク質；及びオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドを包含する。オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡを包含する。
【００１７】
生物学的分子はさらに、上記分子のいずれかの誘導体を包含する。例えば、生物学的分子の誘導体は、オリゴペプチド、ポリペプチド、ペプチド及びタンパク質の脂質及びグリコシル化誘導体を包含する。生物学的分子の誘導体はさらに、オリゴ糖及び多糖の脂質誘導体、例えばリポ多糖類を包含する。
最も典型的には、生物学的分子は、抗体、又は抗体の機能的同等物である。抗体の機能的同等物は、抗体のそれらの同等物に比較できる結合特性を有し、そしてＶＥＧＦＲを発現する細胞の増殖を阻害する。そのような機能的同等物は、例えばキメラ化された、ヒト適合された及び一本鎖の抗体及びそのフラグメントを包含する。
【００１８】
抗体の機能的同等物は好ましくは、キメラ化された又はヒト適合された抗体である。キメラ化された抗体は、非ヒト抗体の可変領域及びヒト抗体の不変領域を含んで成る。ヒト適合された抗体は、非ヒト抗体の超可変領域（ＣＤＲ）を含んで成る。ヒト適合された抗体の超可変領域以外の可変領域、たとえば骨格可変領域、及び不変領域は、ヒト抗体のそれらである。
本出願のためには、非ヒト抗体の適切な可変及び超可変領域は、モノクローナル抗体が製造されるいずれかの非ヒト哺乳類により生成される抗体から誘導され得る。ヒト以外の哺乳類の適切な例は、例えばウサギ、ラット、マウス、ウマ、ヤギ又は霊長類を包含する。マウスが好ましい。
【００１９】
機能的同等物はさらに、完全な抗体のそれらと同じか又はそれに比較できる結合特性を有する抗体のフラグメントを包含する。抗体の適切なフラグメントは、ＶＥＧＦＲのような受容体を発現する細胞の増殖を阻害するために、ＶＥＧＦＲに対して特異的に及び十分な親和性を伴なって、結合する超可変（すなわち、相補性決定）領域の十分な部分を含んで成るいずれかのフラグメントを包含する。
そのようなフラグメントは、例えばＦａｂフラグメント又はＦ（ａｂ’）２フラグメントの１又は両者を含むことができる。好ましくは、抗体フラグメントは、完全な抗体のすべての６個の相補性決定領域を含むが、但しそのような領域のすべてよりも少ない、例えば３，４又は５個のＣＤＲを含む機能フラグメントもまた包含される。
【００２０】
好ましいフラグメントは、一本鎖抗体又はＦｖフラグメントである。一本鎖抗体は、相互連結リンカーにより又はそれを伴わないで、Ｌ鎖の化変領域に連結される抗体のＨ鎖の可変領域を少なくとも含んで成るポリペプチドである。従って、Ｆｖフラグメントは、完全な抗体結合部位を含んで成る。それらの鎖は、細菌又は真核細胞において生成され得る。
抗体及び機能的同等物は、免疫グルブリンのいずれかの種類、例えばＩｇＧ， ＩｇＭ， ＩｇＡ， ＩｇＤ又はＩｇＥ， 及びそれらのサブクラスのメンバーであり得る。好ましい抗体は、ＩｇＧ１サブクラスのメンバーである。機能的同等物はまた、上記種類及びサブクラスのいずれかの組合せの同等物であり得る。
【００２１】
抗体は、当業界において良く知られている方法により所望の受容体から製造され得る。受容体は、市販されており、又は良く知られている方法により単離され得る。例えば、ＫＤＲを単離し、そして精製するための方法は、ＰＣＴ／ＵＳ９２／０１３００号に見出される。ｆｌｋ−１を単離し、そして精製するための方法は、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ｓｃｉ． ８８： ９０２６−３０ （１９９１） に見出される。ｆｌｔ−１を単離し、そして精製するための方法は、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ５：５１９−２４に見出される。
【００２２】
モノクローナル抗体の製造方法は、Ｋａｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｉｎ Ｎａｔｕｒｅ ２５６， ４９５−４９７ （１９７） 及びＣａｍｐｂｅｌｌ ｉｎ “Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｏｄｅｎｔ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ” ｉｎ Ｂｕｒｄｏｎなど．， Ｅｄｓ， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ １３， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ （１９８５） により記載される免疫学的方法を包含する。Ｈｕｓｅなど．， ｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６， １２７５−１２８１ （１９８９） により記載される組換えＤＮＡ方法もまた適切である。
【００２３】
手短には、モノクローナル抗体を生成するためには、宿主哺乳類は、上記のようにして、受容体、又は受容体フラグメントにより接触され、そして次に、追加免疫化される。有用であるためには、受容体フラグメントは、検出される分子のエピトープを定義するために十分なアミノ酸残基を含むべきである。フラグメントが免疫原であるのに短過ぎる場合、それはキャリヤー分子に接合され得る。いくつかの適切なキャリヤー分子は、カサガイヘモアニン及びウシ血清アルブミンを含む。接合は、当業界において知られている方法により行なわれ得る。１つのそのような方法は、キャリヤー分子上のシステイン残基とフラグメントのシステイン残基とを結合することである。
【００２４】
脾臓を、最終追加免疫の数日後、接種された哺乳類から採取した。脾臓からの細胞懸濁液が腫瘍細胞により融合される。抗体を発現するその得られるハイブリドーマ細胞が、単離され、増殖され、そして培養物において維持される。
実質的にヒトである抗体は、トランスジェニック哺乳類、特にヒト抗体を発現するよう遺伝的に修飾されたトランスジェニックマウスにおいて生成され得る。例えば、キメラ抗体を製造するための方法は、Ｂｏｓｓ （Ｃｅｌｌｔｅｃｈ） 及びＣａｂｉｌｌｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）によるアメリカ特許に記載されるそれらの方法を包含する。それぞれ、アメリカ特許第４，８１６，３９７号及び第４，８１６，５６７号を参照のこと。ヒト適合された抗体の製造方法は、例えばアメリカ特許第５，２２５，５３９号（Ｗｉｎｔｅｒ）に記載される。
【００２５】
抗体のヒト適合化のための好ましい方法は、ＣＤＲ−移植と呼ばれる。ＣＤＲ移植においては、抗体への結合に直接的に関与するマウス抗体の領域、相補性決定領域又はＣＤＲが、“再形状化されたヒト”可変領域を創造するためにヒト可変領域中に移植される。次に、それらの十分にヒト適合された可変領域が、完全な“十分にヒト適合された”抗体を創造するために、ヒト不変領域に連結される。
抗原に十分に結合する、十分にヒト適合された抗体を創造するためには、再形状化されたヒト可変領域を注意して企画することが好都合である。ＣＤＲが移植されるであろうヒト可変領域は注意して選択されるべきであり、そしてヒト可変領域の骨格領域（ＦＲ）内の決定的な位置で数個のアミノ酸変化を製造することが通常必要である。
【００２６】
例えば、再形状化されたヒト可変領域は、選択されたヒトＬ鎖の可変領域のＦＲにおける１０個までのアミノ酸変化、及び選択されたヒトＨ鎖可変領域のＦＥにおける１２個のアミノ酸変化を包含することができる。それらの再形状化されたヒトＨ及びＬ鎖可変領域遺伝子をコードするＤＮＡ配列は、ヒトＨ鎖及びＬ鎖不変領域遺伝子、好ましくはそれぞれγ１及びκをコードするＤＮＡ配列に連結される。次に、再形状化されたヒト適合された抗体は、哺乳類細胞において発現され、そしてその標的物についてのその親和性がその対応するネズミ抗体及びキメラ抗体のその親和性と比較される。
【００２７】
置換されるべきヒト適合された抗体の残基を選択し、そして置換を製造するための方法は、当業界においてよく知られている。例えば、Ｃｏなど．， Ｎａｔｕｒｅ ３５１， ５０１−５０２ （１９９２）； Ｑｕｅｅｎなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８６， １００２９−１００３０ （１９８９） 及びＲｏｄｒｉｇｕｅｓなど．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ７， ４５−５０ （１９９２） を参照のこと。２２５抗−ＥＧＦＲモノクローナル抗体をヒト適合化し、そして再形状化するための方法は、Ｃｏｌｄｓｔｅｉｎなど． ＰＣＴ出願ＷＯ９６／４０２１０号に記載される。この方法は、他の成長因子受容体チロシンキナーゼに対する抗体のヒト適合化及び再形状化に適合され得る。
【００２８】
一本鎖抗体を製造するための方法はまた、当業界において知られている。いくつかの適切な例は、Ｗｅｌｓなど． ヨーロッパ特許出願第５０２８１２号及びＩｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ６０， １３７−１４４ （１９９５） に記載されるそれらの例を包含する。一本鎖抗体はまた、ファージ表示ライブラリーにより調製され得る。下記を参照のこと。
上記機能的同等物を生成するための他の方法は、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／２１３１９号、ヨーロッパ特許出願第２３９４００号、ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０９６２２号、ヨーロッパ特許出願第３３８７４５号、アメリカ特許第５，６５８，５７０号、アメリカ特許第５，６９３，７８０号及びヨーロッパ特許出願第３３２４２４号に開示される。
【００２９】
好ましいＶＥＧＦＲ抗体は、Ｈ及びＬ鎖超可変領域のアミノ酸及びヌクレオチド配列が下記に示されているネズミ抗体から誘導される、キメラ化され、ヒト適合され、そして一本鎖の抗体である。キメラ化された抗体及び一本鎖抗体は、標準の方法、例えば下記の方法に従って製造され得る。ヒト適合された抗体は、引例により本明細書に組み込まれる。ＰＣＴ出願ＷＯ９６／４６２１０号の例ＩＶに記載される方法に従って調製され得る。
Ｌ及びＨ鎖の超可変（ＣＤＲ）領域の配列が下記で再生される。ヌクレオチド配列は、アミノ酸下に示される。
【００３０】
Ｈ鎖超可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１：
配列番号１：
Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｈｉｓ
配列番号９：
ｇｇｃｔｔｃａａｃａ ｔｔａａａｇａｃｔｔ ｃｔａｔａｔｇｃａｃ
【００３１】
ＣＤＲ２：
配列番号２：
Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｇｌｙ
配列番号１０：
ｔｇｇａｔｔｇａｔｃ ｃｔｇａｇａａｔｇｇ ｔｇａｔｔｃｔｇａｔ ｔａｔｇｃｃｃｃｇａ ａｇｔｔｃｃａｇｇｇ ｃ
【００３２】
ＣＤＲ３：
配列番号３：
Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｙｒ
配列番号１１：
ｔａｃｔａｔｇｇｔｇ ａｃｔａｃｇａａｇｇ ｃｔａｃ
【００３３】
Ｌ鎖超可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１：
配列番号４：
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｈｉｓ
配列番号１２：
ａｇｔｇｃｃａｇｃｔ ｃａａｇｔｇｔａａｇ ｔｔａｃａｔｇｃａｃ
【００３４】
ＣＤＲ２：
配列番号５：
Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｓｅｒ
配列番号１３：
ａｇｃａｃａｔｃｃａ ａｃｃｔｇｇｃｔｔｃ ｔ
【００３５】
ＣＤＲ３：
配列番号６：
Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｔｈｒ
配列番号１４：
ｃａｇｃａａａｇｇａ ｇｔａｇｔｔａｃｃｃ ａｔｔｃａｃｇ
完全なＬ及びＨ鎖の配列は下記に再生される。ヌクレオチド配列は、アミノ酸配列の下に示される。
【００３６】
Ｈ鎖：
配列番号７：
【化１】
2004501070.tif 000002
【００３７】
配列番号１５：
【化２】
2004501070.tif 000003
【００３８】
Ｌ鎖：
配列番号８：
【化３】
2004501070.tif 000004
【００３９】
配列番号１６：
【化４】
2004501070.tif 000005
【００４０】
アンタゴニストとして有用な生物学的分子の他の例は、可溶性受容体を包含する（Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ２４１： １， １６１−１７０； Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９２： ２３， １０４５７−６１）。
【００４１】
上記に論じられる生物学的分子の他に、本発明において有用なアンタゴニストはまた、小分子であり得る。生物学的分子ではないいずれかの分子は、小分子であると本明細書において考慮される。小分子のいくつかの例は、有機化合物、有機金属化合物、有機及び有機金属化合物の塩、サッカリド、アミノ酸及びヌクレオチドを包含する。小分子は他方では、４５０よりも高くないそれらの分子量を除いて、生物学的分子として考慮される分子を包含する。従って、小分子は、４５０又はそれ以下の分子量を有する、脂質、オリゴ糖、オリゴペプチド及びオリゴヌクレオチド、及びそれらの誘導体であり得る。
【００４２】
小分子は、いずれの分子量でも有することが強調される。それらは典型的には、４５０以下の分子量を有するので、それらは単に、小分子と呼ばれる。小分子は、現在見出される化合物、及び合成化合物を包含する。好ましくは、小分子は、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼを発現する非固形腫瘍細胞の増殖を阻害する。
ＶＥＧＦＲ分子として有用な小分子のいくつかの例は、Ｈｅｎｎｅｑｕｉｎなど． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４２， ５３６９−５３８９ （１９９９） により記載される、キナゾリン、キノリン及びシンノリンを包含する。また、Ａｎｎｉｅなど．， ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ １７， Ａ４１ （１９８９） も参照のこと。
【００４３】
ＶＥＧＦＲアンタゴニストの投与：
本発明は、有効量のＶＥＧＦＲアンタゴニストのヒト患者への投与を包含する。ＶＥＧＦＲアンタゴニストの投与は、非経口及び腸内経路による全身性を包含する種々の手段で達成され得る。例えば、本発明のＶＥＧＦＲアンタゴニストは、供給の好ましい経路である静脈内（例えば、静脈注射）投与され得る。静脈内投与は、ＶＥＧＦＲアンタゴニストと、当業者により理解されるように、適切な医薬キャリヤー（ビークル）又は賦形剤とを接触せしめることによって達成され得る。
本発明のＶＥＧＦＲアンタゴニストは、有効量でヒト患者に投与される場合、非固形腫瘍細胞の増殖を有意に阻害する。本明細書において使用される場合、有効量とは、非固形腫瘍の増殖を阻害する特定化された結果を達成するのに効果的な量である。
【００４４】
最適用量のＶＥＧＦＲアンタゴニストが、多くのパラメーター、例えば年齢、性別、体重、処理される病状の重症度、投与されるアンタゴニスト及び投与の経路に基づいて、医師により投与され得る。一般的に、標的受容体の飽和を可能にする血清濃度のアンタゴニストが所望される。ポリペプチド及び抗体の場合、例えば約０．１ｎＭ以上の濃度が通常十分である。例えば、１００ｍｇ／ｍ２の抗体の用量が、約８日間、約２０ｍＭの血清濃度を提供する。
おおまかなガイドラインとして、抗体の用量は、１０−３００ ｍｇ／ｍ２の量で毎週与えられ得る。同等の用量の抗体フラグメントが、受容体の飽和を可能にする濃度以上の血清レベル維持するために、より頻繁な間隔で使用されるべきである。
【００４５】
組合せ療法：
１つの好ましい態様においては、非固形腫瘍は、有効量の上記のようなＶＥＧＦＲアンタゴニスト及び化学療法剤、照射又はその組合せにより処理され得る。
化学療法剤の例は、アルキル化剤、例えば窒素マスタード、エチレンイミン化合物及びアルキルスルホネート；抗代謝物、例えば葉酸、ピリン又はピリミジンアンタゴニスト；有糸分裂インヒビター、例えばビンカアルカロイド、及びポドフィロトキシンの誘導体；細胞毒性抗生物質；及びＤＮＡ発現に損傷を与えるか又はそれを妨げる化合物を包含する。
【００４６】
化学療法剤の特定の例は、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（窒素マスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウのルビシン、プロカルバジン、ミトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテレ）、アルデスレウキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラトリビン、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イフォスファミド、インターフェロンα、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトーテン、ベガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブリマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、タキソール及びそれらの組合せを包含する。
【００４７】
化学療法剤の投与は、上記のように、非経口及び腸内経路による全身性を包含する種々の手段で達成され得る。
さらにもう１つの態様においては、非固形腫瘍は、照射と組合して、有効量のＶＥＧＦＲアンタゴニストにより処理され得る。照射の源は、処理される患者の外部又は内部のいずれかに存在することができる。前記源が患者の外部である場合、治療は外部放射線治療（ＥＢＲＴ）として知られている。前期照射源が患者の内部である場合、処理は近接照射療法（ＢＴ）と呼ばれる。
【００４８】
照射は、この目的のために製造された標準の装置、例えばＡＥＣＬ Ｔｈｅｒａｔｒｏｎ 及びＶａｒｉａｎ Ｃｌｉｎａｃを用いて、良く知られている標準の技法に従って投与される。照射の用量は、当業界において良く知られているような多くの要因に依存する。そのような要因は、処理される器官、偶然に悪影響を及ぼす照射の経路における健康な器官、放射線療法に対する患者の耐性、及び処理に必要な身体の面積を包含する。用量は典型的なには、１〜１００Ｇｙ、及びより特定には、２〜８０Ｇｙであろう。報告されているいくつかの用量は、脊髄に関して３５Ｇｙ、腎臓に関して１５Ｇｙ，肝臓に関して２０Ｇｙ及び前立腺に関して６５−８０Ｇｙを包含する。しかしながら、本発明はいずれの特定の用量に制限されるものではないことが、強調されるべきである。用量は、所定の状況における特定の要因、例えば上記要因に従って、処理を行う医師により決定されるであろう。
【００４９】
外部照射源と患者への侵入の点との間の距離は、殺害標的細胞と免疫化副作用との間の許容できるバランスを示すいずれかの距離であり得る。典型的には、外部照射源は、患者への侵入の点から７０〜１００ｃｍである。
【００５０】
近接照射療法は一般的には、患者に照射源を配置することによって行なわれる。典型的には、照射源は、処理される組織から約０〜３ｃｍの位置に配置される。既知の技法は、間隔性、腔内及び表面近接照射療法を包含する。放射性腫は、永久的に又は一時的に移植され得る。永久移植に使用されて来たいくつかの典型的な放射性原子は、ヨー素−１２５及びラドンを包含する。一時的移植に使用されて来たいくつかの典型的な放射性原子は、ラジウム、セシウム−１３７及びイリジウム−１９２を包含する。近接照射療法に使用されて来たいくつかの追加の放射性原子は、アメリシウム−２４１及び金−１９８を包含する。
【００５１】
近接照射療法のための照射の用量は、外部放射線療法について上記で言及された用量と同じであり得る。外部放射線療法の用量を決定することに関して上記で言及された要因の他に、使用される放射性原子の性質は、近接照射療法の用量を決定することにも考慮される。
【００５２】
好ましい態様においては、ヒト患者における非固形腫瘍がＶＥＧＦＲアンタゴニスト及び化学療法剤又は照射、又はその組み合わせにより処理される場合、相乗性が存在する。換言すれば、ＶＥＧＦＲアンタゴニストによる腫瘍増殖の阻害は、化学療法剤又は照射、又はその組み合わせにより組み合わされる場合、増強される。相乗性は、単独でのＶＥＧＦＲアンタゴニスト、化学療剤又は照射による処理から予測されるよりも、組合された処理による非固形腫瘍増殖の高い阻害性により示され得る。好ましくは、相乗性は、暖解がＶＥＧＦＲアンタゴニスト、化学療法剤又は照射のみによる処理から予測されない癌の暖解により示される。
【００５３】
ＶＥＧＦＲアンタゴニストは、化学療法剤又は照射方法の開始の前、間又は後、及びそのいずれかの組み合わせ、すなわち化学療法剤及び／又は照射療法の開始の前及び間、前及び後、間及び後又は前、間及び後に投与される。例えば、ＶＥＧＦＲアンタゴニストが抗体である場合、それは典型的には、照射療法及び／又は化学療法剤の開始の前、１〜３０日、好ましくは３〜２０日、より好ましくは５〜１２日間、投与される。
【００５４】
下記例は、一定サブクラスの白血病がインビボ及びインビトロで、ＢＥＧＦを生成するのみならず、また機能的ＶＥＧＦＲ−２も発現し、白血球細胞増殖及び移動を増強するオートクラインループの生成をもたらすことを示している。実験された新しく単離された急性骨髄芽球性白血病（ＡＭＬ）の約５０％が、ＶＥＧＦＲ−２のためのｍＲＮＡ及びタンパク質を発現した。ＶＥＧＦ１６５は、ＶＥＧＦＲ−２のリン酸化を誘発し、そして白血病細胞の増殖を高めた。ＶＥＧＦ１６５はまた、白血病細胞によるメタルプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）の発現を誘発し、そして再構成された基底膜を通してのそれらの移動を促進した。
【００５５】
ＶＥＧＦＲ−２に対する中和性ＭｏＡｂ、及びＶＥＧＦＲ−２の特定の合成インヒビターは、白血病細胞のＶＥＧＦ１６５−介在性増殖、及びＶＥＧＦ−誘発された白血病細胞移動を阻止した。免疫無防備状態のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス中へのヒト白血病の異種移植は、血漿においてネズミＶＥＧＦではなく、ヒトＶＥＧＦの有意な上昇、及び２週以内での接触されたマウスの死をもたらした。ヒトＶＥＧＦＲ−２を通してのシグナル化を選択的に阻止するヒト得意的な中和モノクローナル抗体の注入は、異種移植されたヒト白血病の増殖を阻害し、そして実験の期間を通してマウスの生存性を高めた。
【００５６】
実施例
すべての化学薬品及び試薬は、特にことわらない限り、Ｓｉｇｍａから得られた。
例１．ＶＥＧＦＲの阻害、一次ＡＭＬサンプルの採取及びＦｉｃｏｌｌグラジエントによる単核細胞の単離
白血病患者（急性白血病を有するものとして診断された）からの末梢血液サンプルを、静脈切開により採血し、ハンクス緩衝溶液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）において１／２に希釈し、そして５ｍｌのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ （Ｆｉｃｏｌｌ， Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， ＮＹ） 上に積層した。個々のサンプルを、４０００ｒｐｍでの３０分間、回転せしめ、そして間期の単核細胞を、新しい管中に集め、そして２５００ｒｐｍで５分間、ハンクス溶液により２度、洗浄した。得られる細胞ペレットを、最終的に、ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳにおいて再懸濁した。
【００５７】
細胞培養物
この研究に使用される３種のＡＭＬ細胞系、すなわちＨＬ−６０（プロ−骨髄単球）、ＨＥＬ（巨核球）及びＫ５６２（赤血球）を、１０％ＦＣＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）及びＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（０．２５μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩにおいて培養した。ＶＥＧＦ及び／又は抗体／タンパク質キナーゼインヒビターとのインキュベーションの前、細胞を、ＲＰＭＩのみにおいて１６時間〜一晩、血清飢餓状態においた。
【００５８】
末梢血液からの単核細胞の採取及び単離の後、一次白血病細胞を、ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳにおいて一晩、培養し、組織培養フラスコに容易に付着する、単球／マクロファージによる可能な汚染を排除した。懸濁液に残存する細胞は、主に白血病芽細胞から成る。続いて、それらの白血病細胞を、もう１つのフラスコに移し、そしてＶＥＧＦ及び／ＶＥＧＦ及び／又は抗―ＶＥＧＦＲ抗体の添加の前、１６時間〜一晩、上記のようにして血清フリーの遊離ＲＰＭＩにおいて血清飢餓状態においた。
【００５９】
増殖実験のために、細胞を、血清フリーＲＰＭＩにおいて、１×１０５個の細胞／ウェルの細胞密度で、６個のウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において培養した。細胞を処理し（１０−５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ）又は処理せず（培地のみ）、そして５００ｎｇ〜１μ／ｍｌの、ＫＤＲ／ＶＥＧＦＲ−２に対する免疫中和ＭｏＡｂ、すなわちＩＭＣ−１Ｃ１１（１２）、又はＦＬＴ−１／ＮＶＧＦＲ−１に対するＭｏＡｂ，すなわちクローン６．１２（両者とも、ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ からの）の存在又は不存下で培養した。
【００６０】
白血病細胞系に対するＶＥＧＦのミトゲン効果がＮＥＧＦＲ−２を通して介在されたことを確認するために、ＶＥＧＦＲ−２に対して高い親和性を有する合成タンパク質キナーゼインヒビター（ＡＧ１４３３， ＩＣ５０：９．３μＭ， Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）をまた、製造業者により推薦されるようにして、１０μＭの濃度で使用した。２４， ４８及び９６時間後、生存細胞（トリパンブルー排除により決定される場合）を、血球計を用いて三重反復して計数した。個々の実験条件を、三重反復して行い、そして白血病細胞系を３度、反復した。
【００６１】
ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成及びＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを、製造業者の説明書に従って、ＴＲＩ−試薬を用いて抽出した。続いて、ｃＤＮＡを、Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｇｏキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ） を用いて、全ＲＮＡから合成し、そしてＰＣＲを、ＰＣＲ熱サイクラー（ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｈｉｇｈ Ｐｏｉｎｔ， ＮＣ）を用いて行った。ＫＤＲ， ＦＬＴ−１及びβ−アクチンを増幅するために使用されるＰＣＲプログラムは、９４℃での５分、６０℃での４５秒及び７２℃での４５秒のプレーサイクルから成った。
【００６２】
この初期サイクルに続いて、反応を、９４℃での１分、６５℃での４５秒及び７２℃での２分のサイクルを３５回続け、そして７２℃で７分間で終結した。プライマー配列は、次の通りであった：β−アクチン前方向プライマー：ｔｃａｔｇｔｔｔｇａｇａｃｃｔｔｃａａ（配列番号１７）；β−アクチン逆方向プライマー：ｇｔｃｔｔｔｇｃｇｇａｔｇｔｃｃａｃｇ（配列番号１８）（β−アクチンＰＣＲ生成物：５１３ｂｐ）；ＶＥＧＦＲ−２前方向プライマー：ｇｔｇａｃｃａａｃａｔｇｇａｇｔｃｇｔｇ（配列番号１９）；ＶＥＧＦＲ−２逆方向プライマー：ｃｃａｇａｇａｔｔｃｃａｔｇｃｃａｃｔｔ（配列番号２０）（ＶＥＧＦＲ−２　ＰＣＲ生成物：６６０ｂｐ）；ＶＥＧＦＲ−１前方向プライマー：ａｔｔｇｔｇａｔｔｔｔｇｇｃｃｔｔｇｃ （配列番号２１）；ＶＥＧＦＲ−１）逆方向プライマー：ｃａｇｇｃｔｃａｔｇａａｃｔｔｇａａａｇｃ （配列番号２２）（ＶＥＧＦＲ−１ＰＣＲ生成物５５０ｂｐ）。内皮細胞ｃＤＮＡを、３組のプライマーのための陽性対照として使用した。
【００６３】
タンパク質抽出及びウェスターンブロット
リン酸化されたＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２）を、３７℃で１０分間、２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ＭＮ）と共に細胞インキュベーションした後、ウェスターンブロットにより検出した。この短時間の刺激の後、一次白血病細胞及び細胞系からの全タンパク質抽出物を、プロテアーゼインヒビター（１ｍｇ／ｍｌのアプロチニン、１０ｍｇ／ｍｌのロイペチン、１ｍＭのβ−グリセロホスフェート、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム及び１ｍＭのＰＭＳＦ） の存在下で、冷ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのトリス、５ｍＭのＥＤＴＡ， １％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４， ０．４％のカコジル酸ナトリウム及び１５０ｍＭのＮａＣｌ）において細胞を溶解することによって得た。
【００６４】
胚線維芽細胞（ＭＲＣ５細胞系）を、負の対照として使用した。細胞残骸を除去するために遠心分離した後、上清液（最少５００ｎｇの合計タンパク質）を、プロテイン−Ｇアガロースビーズ及び抗−ホスホチロシン抗体（Ｓａｎｔｏ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＣＡ） により、４℃で一晩、免疫沈殿せしめ、リン酸化されたタンパク質を沈殿せしめた。それらを、充填緩衝液に再懸濁し、そして還元条件（β−メルカプトエタノール）下で、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ−アクリルアミドゲル電気泳動（７．５％ゲル）にゆだねた。続いてタンパク質を、従来のプロトコールに従って、ニトロセルロース膜上にブロットした。
【００６５】
最終的に、ブロットを１％ＢＳＡ／ＰＢＳ−１％Ｔｗｅｅｎ−２０ において、室温（ＲＴ）で１時間、ブロックし、続いて、一次及び二次抗体と共にインキュベートした。ウサギポリクローナル抗−ＶＥＧＦＲ−２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＣＡ）及びヤギモノクローナル抗−ＶＥＧＦＲ−１（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ＭＮ）抗体を、１μｇ／ｍｌの濃度で使用し、そして二次抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（ＶＥＧＦＲ−２のための）又は抗−ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ（ＶＥＧＦＲ−１のための）を、１：６０００　で使用した。ＥＣＬ化学ルミネセンス検出システム及びＥＣＬフィルス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を用いて、ニトロセルロースブロット上でのタンパク質の存在を可視化した。
【００６６】
ゼラチン分解ザイモグラフィー
白血病細胞系及び一次細胞培養物からの上清液を、ＶＥＧＦ１６５を含むか又はそれを含まない血清フリー培地における一晩のインキュベーションの後、集め、そしてそれらのメタロプロテアーゼ活性を、前に記載したようにしてゲル分解ザイモグラフィーにより測定した（１３）。手短には、細胞培養上清液を、ゼラチン−アガロースビーズにより処理し、ゼラチナーゼを濃縮し、そして１％のゼラチンを含むＳＤＳ−Ｐａｇｅ−アクリルアミドゲルを通して処理した。
【００６７】
続いて、ゲルを、２．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００において、ＲＴで１時間インキュベートし、蒸留水（ＤＷ）によりすすぎ、そして３７℃で１８時間、低塩コラゲナーゼ緩衝液（５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．６、０．２ＭのＮａＣｌ， ５ｍＭのＣａＣｌ２及び０．２％（ｖ／ｖ）のＢｒｉｊ−３５）に配置した。ゲル分解活性のバンドを、０．２％クーマシーブルー溶液１０ｍｌ及び１９０ｍｌのデステイン（ＤＷ、メタノール及び氷酢酸、６：３：１）によりゲルをＲＴで３０−６０分間、染色した後に可視化した。個々の実験に関しては、細胞を個々のウェル中に配置し、そして実験を反復して行った。Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ４．０ ソフトウェアアプリケーション及びＵｍａｘ Ａｓｔｒａ スキャナーを用いて、ゲルを走査し、そしてゲル分解バンドの強さを、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ １．５８を用いて評価した。
【００６８】
移動実験
新しく単離された白血病細胞及び細胞系を、血清フリーＲＰＭＩに再懸濁し、そして１０６細胞／ｍｌの原液を調製した。前に記載されたトランスウェル移動技法の変性されたバージョン（１４）を使用した。手短には、ＬＣアリコート（１００μｌ）を、８μｍの多孔性トランスウェル挿入体に添加し、２５μｇの成長因子−消耗されたＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｂｅｃｋｔｏｎ ａｎｄ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）により被覆し、そして２４ウェルプレートのウェル中に配置した。低い方の区画は、２００ｎｇ／ｍｌ のＶＥＧＦ１６０（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ＭＮ）と共に又はそれを伴なわないで、血清フリーＲＰＭＩを含んだ。移動を阻止するためには、個々の条件を、別々のアリコートにおいて調製し、そして１μｇ／ｍｌのＩＭＣ−１Ｃ１１， 抗−ＶＥＧＦＲ−１（クローン６．１２）中和ＭｏＡｂ， １０μＭのＡＧ１４３３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， ＣＡ）又は広範囲のＭＭＰインヒビター、５， １０−フェナントロリン（１μＭ）と共にインキュベートした。
【００６９】
この研究に使用される抗体及びチロシンキナーゼインヒビターは、ＶＥＧＦ誘発された内皮細胞増殖及び受容体リン酸化を阻止することがこれまで示されている（１２， １５， １６）。移動を、３７℃及び５％ＣＯ２下で， １４−１８時間、行った。移動された細胞を、下方区画から集め、８０００ｒｐｍで回転沈降せしめ、そして血球計を用いて計数した。肝臓細胞のみが、トリパンブルー排除により決定される場合、定量化において考慮された。実験を三重反復して行い、そして結果は、ＶＥＧＦに反応して移動される細胞の数として示される。
【００７０】
免疫組織化学による異所的に移植された白血病（緑色腫）上でのＫＤＲ／ＶＥＧＦＲ−２、ＦＬＴ−１／ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦの検出
パラフィン−埋封された緑色腫断片を、従来のプロトコールに従って、ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２のために免疫組織化学的に染色した。使用される抗体は次のものであった：３００ｎｇ／ｍｌで使用される、ＶＥＧＦＲ−２、すなわちクローン６．６４（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）に対するマウスＭｏＡｂ；２００ｎｇ／ｍｌで使用される、ＶＥＧＦＲ−１（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対するウサギポリクローナル抗体；２００ｎｇ／ｍｌで使用されるｖＷＦポリクローナル抗体；２００ｎｇ／ｍｌで使用されるＶＥＧＦポリクローナル抗体（ＢｉｏＧｅｎｅｘ， Ａｂ Ｎｏ． ３６０ｐ）。ペルオキシダーゼによりラベルされた第２抗体マウス（及びウサギ免疫グロブリンに対する）を、１／６０００希釈度で使用した。断片をヘマトキシリン／エオシンにより対比染色し、そして光顕微鏡下で観察した。
【００７１】
ＨＬ−６０細胞によるインビボ実験
年齢及び性別適合された非肥満性糖尿病性免疫無防備状態マウス（ＮＯＤ−ＳＣＩＤ）を、すべての実験に使用した。ＨＬ−６０細胞（１×１０６／マウス）を、１０匹のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに静脈内（ｉ．ｖ．）注射し、そして注射の３日後、マウスを、５匹のマウスの２つのグループに分けた。１つのグループを、４００μｇのＩＭＣ−１Ｃ１１（１２）により週３度、腹膜内処理し、そして対照グループを、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ（抗体のための希釈対照）により、実験の間、注入した。
【００７２】
マウス血漿におけるＶＥＧＦレベルの定量
それぞれ、ヒト及びネズミＶＥＧＦに対して特異的な２種のＥＬＩＳＡキット（両者ともＲ ＆ Ｄシステムからの）を用いて、ＨＬ−６０細胞により注射されたマウスの血漿におけるＶＥＧＦ濃度を決定した。血漿サンプルを、白血病細胞の注射の後、異なった時点で集め、そしてさらに希釈しないで使用した。個々のアンプルを三重反復してアッセイし、そして測定を２種の別々の実験において行った。両アッセイは、７．５ｐｇ／ｍｌの感受性限界を有し、そして製造業者の説明書に従って進行せしめた。
【００７３】
ヒト緑色腫はＶＥＧＦ， ＶＥＧＦＲ−２及びＶＥＧＦＲ−１を発現する
ヒト白血病は、骨髄及び末梢循環に局在するだけでなく、また組織にも転移し、そして緑色腫として言及される固形塊状物を形成する。
ＶＥＧＦＲ−１又はＶＥＧＦＲ−２に対して特異的な抗体によりヒト緑色腫の免疫組織化学的染色は、血管の内皮内層の染色の他に、それらの受容体はまた、１つのサブセットの白血病細胞により発現されたことを示した（図１Ｃ及びＤ）。染色は細胞膜に局在し、そして陽性細胞は断片じゅうに散在するように見えた（図１Ｃ及びＤ）。
【００７４】
全体的には、分析される断片において、ＶＥＧＦＲ−１陽性部分によりより一層ＶＥＧＦＲ−２陽性部分が存在した。それらの受容体は、腫瘍の異なった部分において主に検出され、このことは、ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２の染色パターンが、異なった細胞集団を同定できることを示唆する。さらに、分析される断片においては、白血病細胞がまた、ＶＥＧＦを染色し（図１、Ｅ及びＦ）、このことは、ＶＥＧＦとその受容体との間のオートクラインループが緑色腫の形成にも寄与することを示唆する。
【００７５】
一次白血病及び白血病細胞系はＶＥＧＦを生成し、そしてＶＥＧＦＲ−２を発現する
３種の白血病細胞及び１０種の一次急性白血病（末梢血液サンプルから単離された）を、ＶＥＧＦの生成及びＶＥＧＦＲ−２の発現について、ＥＬＩＳＡ及びＲＴ−ＰＣＲにより分析した。
分析された白血病細胞系のうち、ＨＬ−６０及びＨＥＬはｍＲＮＡレベルでＶＥＧＦＲ−２を発現し、そしてＫ５６２細胞は陰性であった（図２Ａ）。一次白血病サンプルのＲＴ−ＰＣＲ分析は、１０種の一次ＡＭＬサンプルのうち５種（全５０％）がＶＥＧＦＲ−２を発現したことを示した。ＶＥＧＦＲ−１をまた、ＶＥＧＦＲ−２陽性白血病に対して、ＲＴ−ＰＣＲにより検出した。さらに、すべてのＶＥＧＦＲ−２陽性白血病細胞系はＶＥＧＦをインビトロで生成した。従って、ＶＥＧＦ−生成白血病細胞上での機能的受容体の存在は、細胞移植及び生存を支持するオートクラインループを創造することができる。
【００７６】
ＶＥＧＦ１６５は白血病細胞に対してＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２リン酸化を誘発する
ＶＥＧＦ１６５は、白血病細胞系及び一次白血病に対するＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２リン酸化の用量依存性上昇を誘発したが、しかし線維芽細胞又はＶＥＧＦＲ陰性白血病細胞上ではそうではなかった（図２Ｂ）。ＶＥＧＦの不在下で、白血病細胞は基線のＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２リン酸化を有し（図２Ｂ）、これは、同じ細胞によるＶＥＧＦの生成及びその受容体の発現のためであり得る。
【００７７】
ＶＥＧＦ１６５がサブセットの白血病に対するその受容体のリン酸化を誘発する観察は、それがまた、それらの細胞上で表現型変化を誘発することができることを示唆する。従って、白血病細胞に対するＶＥＧＦ１６５の効果を、表現型変化、例えば高められた増殖、マトリックス−メタロプロティナーゼ（ＭＭＰ）生成及び再構成された基底膜を通しての移動を見ることによって、さらに調べた。抗−ＶＥＧＦＲ ＭｏＡｂ及び特定のキナーゼインヒビター、すなわちＡＧ１４３３を用いて、ＶＥＧＦ１６５がＶＥＧＦＲ−２を通して白血病細胞に対するその効果を誘発するかどうかを調べた。
【００７８】
ＶＥＧＦは白血病細胞増殖、すなわちＶＥＧＦＲ−２を通して介在する効果を誘発する
ＶＥＧＦ１６５は、用量依存性態様において、ＶＥＧＦＲ−２−陽性白血病及び白血病細胞系の増殖の増強を誘発した（図３）。この効果は、１μｇ／ｍｌで使用されるＩＭＣ−１Ｃ１１と共に前記細胞をインキュベートすることによって阻止され得た（図３、★、ｐ＜０．０５）。白血病細胞に対するＶＥＧＦ１６５のミトゲン効果は、ＶＥＧＦＲ−１に対する中和ＭｏＡｂがＶＥＧＦ１６５−誘発された白血病細胞増殖に対して効果を有さないので、この受容体を通して主に介在すると思われる。重要なことには、ＶＥＧＦ１６５に対して応答しなかった白血病細胞、例えばＫ５６２細胞系及び一次サンプル６， ７， ８， ９及び１０に基づいてのＩＭＣ−１Ｃ１１とのインキュベーションは、ＶＥＧＦ−誘発された細胞増殖に対して効果を有さなかった（図３）。
【００７９】
タンパク質キナーゼインヒビターＡＧ１４３３を用いての実験は、ＶＥＧＦ１６５−誘発された白血病細胞がＶＥＧＦＲ−２を通して主に増殖したことを確証した（図４）。ＡＧ１４３３は、７２時間、ＶＥＧＦ１６５−誘発された白血病細胞増殖を有意に阻止した（★★， ｐ＜０．０５， 図４）。中和ＭｏＡｂに関しては、ＶＥＧＦ１６５の存在又は不在下でのＡＧ１４３３と、Ｋ５６２細胞、ＶＥＧＦＲ−２陰性白血病又は線維芽細胞（示されている）とのインキュベーションは、細胞増殖に対して効果を有さなかった（図４）。
【００８０】
それらの結果は、ＶＥＧＦ１６５がサブセットの白血病細胞系及び一次白血病に対して細胞増殖を誘発することを示す。この効果は、ＶＥＧＦＲ−２に対するＭｏＡｂにより及びこの受容体のために高い親和性を有する合成タンパク質キナーゼインヒビターにより阻止され得る。これは、内皮細胞について報告されるように、白血病細胞に対して、ＶＥＧＦ１６５がＶＥＧＦＲ−２を通してそのマイトゲン変換することを示唆する。
【００８１】
ＶＥＧＦは白血病細胞によりＭＭＰ分泌／生成を誘発する
ＶＥＧＦ１６５は、平滑筋細胞によるＭＭＰ生成を誘発し、この効果は通常、より侵入性の表現型の獲得と相互関係する（１７）。本発明者は、ＶＥＧＦ１６５が白血病細胞に対する類似する効果を誘発するかどうかを調べた。
【００８２】
刺激を伴なわないでは、血清フリー条件下で、個々のサンプルにより上清液中に開放されるＭＭＰのレベルは変化した（図５）。白血病細胞によるＭＭＰ生成は、より侵入性表現型を有する白血病サブタイプ及び副集団を同定することができることが示唆される。調査された一次白血病及び／又は細胞系に基づいて、骨髄−単球性サブタイプ（図５に示される：ＨＬ−６０細胞、サンプルに２及び３）は、より高いレベルの基本的ＭＭＰ生成及び開放性を一貫して示している。
【００８３】
ＭＭＰ−生成白血病に基づけば、ＶＥＧＦ１６５とのインキュベーションは、デンシトメトリーにより測定される場合、１８時間にわたって白血病細胞によるＭＭＰ−９分泌を有意に高めた（図５Ａ及びＢ）。一次白血病に基づけば、ＭＭＰ−９は培養上清液中に開放される主用ＭＭＰであり、そしてＭＭＰ−２はほとんどの場合において不在であった（図５）。白血病細胞により生成されるＴＩＭＰ−１のレベルは、ウェスターンブロットにより決定される場合、ＶＥＧＦ１６５による刺激の後、マイナーな変動のみを示した。
【００８４】
ＶＥＧＦはマトリゲル被覆されたトランスウェルを通しての白血病細胞移動、すなわちＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２を通して介在される効果を誘発する
本発明者は、白血病細胞によるＭＭＰ生成におけるＶＥＧＦ１６５−誘発された上昇性が、より侵入性の表現型の獲得に影響を及ぼすかどうかを調査した。トランスウェル挿入体が薄層のマトリゲルにより被覆されている移動システム、すなわち基底膜を通しての侵入のモデルを用いて示された。ＶＥＧＦ１６５は、用量依存性態様で、ＨＬ−６０細胞及びＶＥＧＦＲ−２＋１次白血病の白血病細胞移動を誘発した（図６）。この工程は、ＶＥＧＦ−誘発された細胞移動が合成ＭＭＰインヒビター、５，１０−フェナントロリン（図６）及び組換えヒトＴＩＭＰ−１の使用により阻止されるので、ＭＭＰ生成及び活性化を必要とする。
【００８５】
残る細胞系及びＶＥＧＦＲ−２陰性一次白血病は、裸（被覆されていない）のトランスウェルを通してさえ、ＶＥＧＦに対して応答して移動しなかった。これは、ＭＭＰを分泌するそれらの細胞の低められた能力と相互関係するが、しかしまた、それらの細胞、すなわちＶＥＧＦＲ−１に基づく低められたレベルのＶＥＧＦＲ発現のためでもあり得る。
【００８６】
上記に示されるように、白血病細胞に対するＶＥＧＦ１６５のミトゲン効果は、ＶＥＧＦＲ−２を通して介在された。しかしながら、この研究に使用される移動システムにおいては、ＩＭＣ−１Ｃ１１（１μｇ／ｍｌでの）とＨＬ−６０細胞とのインキュベーションは、マトリゲルを通してＶＥＧＦ１６５−誘発された移動を単に部分的に（４０％）、阻害することができた（図６）。対照的に、同じ濃度で使用される、ＶＥＧＦＲ−１に対するＭｏＡｂは、ＨＬ−６０細胞移動を有意に阻害し（６０−７０％）（図６、★、ｐ＜０．０５）、このことは、それらの細胞に基づいて、ＶＥＧＦ１６５が両受容体との相互作用によりＭＭＰ活性化及び細胞移動を誘発できることを示唆する。
【００８７】
この可能性を確証すれば、ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２　ＭｏＡｂの組合せとＨＬ−６０細胞とのインキュベーションは、いずれかの単独での抗体よりも、より効果的に（７０−８０％）、ＶＥＧＦ１６５−誘発された移動を阻止した（図６）。それにもかかわらず、ＶＥＧＦＲ−２特異的チロシンキナーゼインヒビターＡＧ１４３３とＨＬ−６０細胞とのインキュベーションは、ＶＥＧＦ１６５−誘発された移動を有意に阻止した（７０％）（図７、★、ｐ＜０．０５）。一緒に考えると、それらの結果は、ＨＬ−６０細胞に基づいて、ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２とＶＥＧＦ１６５との相互作用は細胞移動及び侵入を誘発する必要があるが、しかしこの工程のための個々の受容体の正確な寄与はさらなる調査を必要とする。
【００８８】
一次白血病に基づけば、抗−ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２　ＭｃＡｂの両者は、全体的に、比較できる移動−阻止効果を示した（図６）。しかしながら、ＨＬ−６０細胞に関しては、抗−ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２ ＭｃＡｂの組合せと一次白血病とのインキュベーションは、いずれかの抗体単独でよりもより効果的であり、ＶＥＧＦ１６５−誘発された移動を８０％阻止した（図６）。最終的に、ＶＥＧＦ１６５に応答しての白血病細胞の移動は、試験されるいずれかの細胞において抗−ＭＭＰ−２抗体により阻止されないが、しかし細胞がＭＭＰ−９−中和抗体と共にインキュベートされる場合、有意に低められ、このことは、ＭＭＰ−９がこの移動工程に関与する主要プロテアーゼであり得ることを示唆する。
【００８９】
上記で言及されたように、この研究に使用される移動アッセイは、活性ＭＭＰ分泌及び活性化、並びにＶＥＧＦ１６５に応答しての細胞走化性を必要とする。さらに、抗体及びタンパク質キナーゼインヒビター研究は、ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２を通してのＶＥＧＦ１６５誘発されたシグナル化が、基底膜を細胞が移動し、そして侵入するために必要であることを示唆する。これは、ＶＥＧＦＲ−１が単球移動（１８）及びまた、平滑筋細胞によるＭＭＰ生成（１７）を介在することが示されているので、驚くべきことではない。
【００９０】
一緒に考慮すると、それらの結果は、ＶＥＧＦ１６５が、高められた増殖、基底膜を通してのＭＭＰ生成及び移動により決定されるように、サブセットの白血病細胞に対してより侵入性の表現型を誘発することを示す。それらの効果は、特に移動及びＭＭＰ活性化のためには、ＶＥＧＦＲ−１を通してのシグナル化がまた必要とされるが、ＶＥＧＦＲ−２を通して主に介在される。
【００９１】
ＨＬ−６０細胞はインビボでＶＥＧＦを開放する
ＨＬ−６０細胞がインビトロでプログラム量でＶＥＧＦを放すことは、現在十分に確立されている。ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスを用いて、本発明者は、それらの細胞がインビボでＶＥＧＦを放すかどうかを調査した。図８Ａに示されるように、ヒトＶＥＧＦ血漿レベルは、白血病細胞注入の後、有意に上昇し、これは、循環白血病細胞の上昇、及びマウス生存性の対応する低下と相互関係している（図８Ｂ）。重要なことには、ネズミＶＥＧＦ血漿レベルは、実験を通して、非常に低く存続した（アッセイ検出レベルで又はそれ以下で、図８Ａ）。それらの結果は、白血病細胞増殖及び生存性の維持においてオートクラインＶＥＧＦのための役割を支持する。
【００９２】
抗−ヒトＶＥＧＦＲ−２／ＫＤＲ ｍｏＡｂ （ＩＭＣ−１Ｃ１１） はインビボで白血病増殖を阻止する
いずれの処理も不在下で、１×１０６個のＨＬ−６０細胞により注射（ｉ．ｖ．）されたマウスは、わずか１４−１８日（ｎ＝８）、生存し、これはそれらの白血病細胞の攻撃的な性質を強調する。ＩＭＣ−１Ｃ１１を用いて、本発明者は、白血病由来のＶＥＧＦが、ＶＥＧＦＲ−２とのオークライン相互作用を通して白血病細胞増殖を維持するかどうかを調査した。図８Ｂに示されるように、ＩＭＣ−１Ｃ１１により処理されたマウスは、実験の期間じゅう生存した（＞８０日、図８Ｂ、＜０．００５）。
【００９３】
重要なことには、それらの研究に使用される抗体がヒトＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ）に対して特異的であり、そしてネズミｆｌｋ−１と交差反応しないことが、最近確認されている（Ｌｕなど．， 提供されている）。また、上記で言及されるように、全体のマウス生存性の低下と相互関係する対照（処理されていない）マウスにおけるヒトＶＥＧＦ血漿レベルの上昇が存在した（図８Ａ及びＢ）。
【００９４】
それらのインビボ結果は、白血病細胞増殖の調節においてＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ−２の役割を確証し、そしてＶＥＧＦ受容体に対する抗体がサブセットの白血病の処理のための新規治療アプローチを提供することを示唆している。
【００９５】
抗−ヒトＶＥＧＦＲ−２／ＫＤＲ ｍｏＡｂは肝臓及び脾臓転移の形成を阻止する
処理の開始の１４日後、ＨＬ−６０−注射されたＰＢＳ−処理されたマウスからの肝臓及び脾臓の組織学的分析は、両器官において白血病浸潤物（緑色腫）の存在を表した（図９Ｂ及びＤ）。肝臓断片は、活性細胞増殖の徴候と共に、白血病細胞により侵入されたいくつかの領域を有した（図９Ｂ）。さらに、それらのマウスの脾臓の赤色脾髄領域が白血病細胞により大部分、置換された（図９７）。対照的に、中和ＭｏＡｂ ＩＭＣ−１Ｃ１１により処理されたマウスは、正常な肝臓及び脾臓組織学を有した（図９Ａ及びＣ）。処理されたマウスにおいては、肝臓において白血病浸潤物の証拠は存在せず（図９Ａ）、そして脾臓は、アポプトシスの証拠を伴なって、正常に見えた（図９Ｃ）。それらの結果は、ヒトＶＥＧＦＲ−２に対するｍｏＡｂが、接種されたマウスにおいてＨＬ−６０細胞の増殖及び侵入を阻止したことを示す。
【００９６】
例１の解釈
インビボでの白血病細胞の調節におけるＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ−２オートクラインループの役割を定義するために、本発明者は、ヒト白血病細胞系ＨＬ−６０が免疫欠損マウス中に移植されている、十分に確立された異種移植モデルを使用した（１９−２１）。ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス中への百万個のＨＬ−６０細胞の注入は、骨髄、脾臓、肝臓及び末梢循環における白血病緑色腫の移植及び形成をもたらす。本発明者は、ＨＬ−６０細胞が、ヒト特異的ＨＬＩＳＡにより決定される場合、ＨＬ−６０異種移植されたマウスの血漿において高レベルで検出され得るヒトＶＥＧＦを生成することを示す（図８Ａ）。ヒトＶＥＧＦの上昇するレベルが、血漿サンプルにおいて検出され、そしてＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいて増殖されるＨＬ−６０細胞として時間と共に高められた。対照的に、生成されるネズミＶＥＧＦの血漿レベルは無意味であり、そしてＨＬ−６０増殖の間、上昇しなかった（図８Ａ）。
【００９７】
いずれの介在も不在下で、ＨＬ−６０異種移植されたＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスは、接種の１４日以内に緑色腫の転移性増殖に負ける。しかしながら、ヒトＶＥＧＦＲ−２のＶＥＧＦ結合ドメインに対して特異的なＭｏＡｂの注入は、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおけるＨＬ−６０ヒト白血病の増殖の阻害、及び実験期間を通してのそれらの長期の生存性をもたらした（＞８０日、図８Ｂ）。肝臓及び脾臓の組織学的試験は、ＶＥＧＦＲ−２に対するＭｏＡｂによる処理が脾臓及び脾臓内での白血病浸潤物及び緑色腫の増殖も阻害することを示した（図９）。
【００９８】
それらのデータは、内因的に生成される、ＨＬ−６０によるヒトＶＥＧＦがオートクラインループを生成するヒトＶＥＧＦＲ−２との相互作用を通してそれらの白血病細胞の増殖を促進し、従って、インビトロデータを確証することを強く示唆する。集合的には、それらのデータは、血管及び造血系内でのＶＥＧＦＲシグナル化の形成性、及び一定のサブセットのＶＥＧＦＲ−２＋急性白血病の増殖を支持するそれらの可能性を示す。
【００９９】
ヒトにおいては、急性白血病は、前駆体細胞型、及びそれらが起因する幹細胞の分化状態に基づいて分類される（Ｍ１〜Ｍ７）。大部分の白血病は、骨髄及び末梢循環にほとんど局在化する、骨髄性前駆体（Ｍ１， Ｍ２， Ｍ３， Ｍ４， Ｍ５）の悪性変換によるものである。しかしながら、白血病細胞は、種々の組織を挿入する能力を時おり獲得し、緑色腫として言及される大きな腫瘍塊状物の形成のための適所を設定する。血管形式に類似する、緑色腫の形成が白血病細胞の連続的な侵入、増殖及び安定化を必要とする場合、緑色腫を形成する能力を有する白血病細胞がまた、ＶＥＧＦＲを発現することは驚くべきことではない。
【０１００】
例えば、ＨＬ−６０細胞は、皮下移植される場合、転移し、そして固形の血管形成された腫瘍を形成する能力を有する１つの白血病モデルを表す。従って、緑色腫を形成することが運命づけられている白血病は、ＭＭＰの発現をアップレギュレートし、そして組織中への侵入を促進するためにＶＥＧＦＲを使用することができる。続いて、ＶＥＧＦＲ−２の発現は、白血病細胞増殖を促進することができる。対向調節因子の不在下で、白血病は増殖し続けることができる。
【０１０１】
本発明者のインビボデータに基づけば、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス中に異種移植されたＨｌ−６０細胞の増殖は、ＶＥＧＦＲ−２に対するヒト特異的中和ＭｏＡｂにより阻害され、このことは、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ−２により生成されるオートクラインループが、パラクラインループの他に、白血病細胞増殖を介在することを示唆する（図１０）。
【０１０２】
例ＩＩ．一本鎖抗体の生成：
細胞系及びタンパク質
一次培養されたＨＵＶＥＣを、ＥＢＭ−２培地において、３７℃で５％ＣＯ２下で維持した。細胞を、すべてのアッセイのために継代２〜５間で使用した。ＶＥＧＦ１６５タンパク質を、バキュロウィルスにおいて発現し、そして精製した。ＫＤＲの細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡを、ヒト胎児腎臓ｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより単離し、そしてベクターＡＰ−ＴａｇのＢｇｌ ＩＩ及びＢｓｐＥＩ部位中にサブクローン化した。
【０１０３】
このプラスミドにおいては、ＫＤＲ細胞外ドメインのためのｃＤＮＡを、ヒト胎盤ＡＰのためのｃＤＮＡと整合して、融合せしめた。プラスミドを、ネオマイシン発現ベクターｐＳＶ−Ｎｅｏと共に、ＮＩＨ３Ｔ３細胞中にエレクトロポレートし、そして安定した細胞クローンを、Ｇ４１８により選択した。その可溶性融合タンパク質ＫＤＲ−ＡＰを、ＡＰに対する固定されたモノクローナル抗体を用いて、親和性クロマトグラフィーにより細胞培養上清液から精製した。
【０１０４】
マウス免疫化及び一本鎖抗体ファージ表示ライブラリーの構成
雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスに、２００μｌのＲＩＢＩアジュバントシステム中、１０μｇのＫＤＲ−ＡＰの２回の腹膜内（ｉ．ｐ．）注射、続いて、ＲＩＢＩアジュバントを含まない１回のｉ．ｐ．注射を、２ヶ月間にわたって与えた。マウスにまた、最初の免疫化の時点で、２００μｌのＲＩＢＩ中、１０μｇのＫＤＲ−ＡＰの皮下（ｓ．ｃ．）注射を与えた。マウスを、安楽死の３日前、２０μｇのＫＤＲ−ＡＰによりｉ．ｐ．追加免疫化した。ドナーマウスからの脾臓を除去し、そして細胞を単離した。ＲＮＡを抽出し、そしてｍＲＮＡを、脾臓細胞の全ＲＮＡから精製した。ｓｃＦｖファージ表示ライブラリーを、糸状ファージＭ１３の表面上に表示されるｍＲＮＡを用いて構成した。
【０１０５】
糸状ファージ表面上でのｓｃＦｖの表示においては、抗体ＶＨ及びＶＬドメインを、１５個のアミノ酸の長さのリンカー（ＧＧＧＧＳ）３ （配列番号２３）により一緒に連結し、そしてファージタンパク質ＩＩＩのＮ−末端に融合せしめた。続いてアンバーコドン（ＴＡＧ）を伴なう、１５個のアミノ酸の長さのＥ標識を、検出及び他の分析目的のためにＶＬのＣ−末端とプロテインＩＩＩとの間に挿入した。Ｅ標識とプロテインＩＩＩとの間に位置するアンバーコドンは、サプレッサー宿主（例えば、ＴＧＩ細胞）中に形質転換される場合、表面表示形式でのｓｃＦｖの製造、及び非サプレッサー宿主（例えば、ＨＢ２１５細胞）中に形質転換される場合、可溶性形式でのｓｃＦｖの構成を可能にする。
【０１０６】
アセンブルされたｓｃＦｃ ＤＮＡを、ｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅベクター中に連結した。形質転換されたＴＧ１細胞を、ＺＹＴＡＧプレート上に配置し、そしてインキュベートした。コロニーを１０ｍｌの２ＹＴ培地から剥離し、５０％グリセロール５ｍｌと共に混合し、そしてライブラリー原液として−７０℃で貯蔵した。
【０１０７】
バイオパンニング
ライブラリー原液を対数相まで増植し、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージにより救援し、そして２ＹＴＡＫ培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２ＹＴ）において３０℃で一晩、増幅した。ファージ調製物を、４％ＰＥＧ／０．５ＭのＮａＣｌにおいて沈殿せしめ、５００μｇ／ｍｌのＡＰタンパク質を含む、３％脱脂乳／ＰＢＳに再懸濁し、そして３７℃で１時間インキュベートし、ファージ表示抗−ＡＰ ｓｃＦｖを捕獲し、そして他の非特異的結合を阻止した。
【０１０８】
ＫＤＲ−ＡＰ（１０μｇ／ｍｌ）により被覆されたＭａｘｉｓｏｒｐ Ｓｔａｒ管（Ｎｕｎｃ， Ｄｅｎｍａｒｋ）をまず、３％脱脂乳／ＰＢＳにより３７℃で１時間、阻止し、そして次に、ファージ調製物と共に室温で１時間インキュベートした。管を、ＰＢＳＴにより１０回、続いてＰＢＳ（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）により１０回、洗浄した。結合されたファージを、１００ｍＭのトリエチルアミンの新しく調製された溶液１ｍｌにより、室温で１０分間、溶出した。溶出されたファージを、１０ｍｌの中間対数相ＴＧ１細胞と共に３７℃で３０分間、振盪しながらインキュベートした。次に、感染されたＴＧ１細胞を、２ＹＴＡＧプレートにプレートし、そして３０℃で一晩インキュベートした。
【０１０９】
第３回目のパンニングの後、スクリーンされたクローンの９９％（１８５／１８６）のクローンが、特異的ＫＤＲ結合体であることが見出された。しかしながら、それらの結合のわずか１５個（８％）が、固定されたＶＥＧＦへのＫＤＲ結合を阻止することができた。それらの１５個のクローンのＤＮＡ ＢｓｔＮ Ｉフィンガープリントは、２種の異なった消化パターンの存在を示し；そして２１個のランダムに採取されたＶＥＧＦ非ブロッカーは４種の異なったパターンを生成した。
【０１１０】
すべての消化パターンがまた、第２回目のパンニングの後、同定されたクローンにも見られた。個々の消化パターンの代表的なクローンを、第２回目のパンニングの後に回収されたクローンから採取し、そしてＤＮＡ配列決定にゆだねた。列決定された１５個のクローンのうち、２個のユニークＶＥＧＦブロッカー及び３個の非ブロッカーを同定した。ＫＤＲに結合も又ＫＤＲへのＶＥＧＦ結合も遮断しない１つのｓｃＦｖ， ｐ２Ａ７を、すべての研究のための負の対照として選択した。
【０１１１】
ファージＥＬＩＳＡ
個々のＴＧ１クローンを、９６ウェルプレートにおいて３７℃で増殖し、そして上記のようにしてＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージにより助けた。増殖されたファージ調製物を、ＲＴで１時間、１／６体積の１８％脱脂乳／ＰＢＳにより阻止し、そしてＫＤＲ−ＡＰ又はＡＰ（１μｇ／ｍｌ×１００μｌ）により被覆されたＭａｘｉ−ｓｏｒｐ９６−ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）に添加した。室温で１時間のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳＴにより３度、洗浄し、そしてウサギ抗−Ｍ１３ファージＡｂ−ＨＲＰ接合体と共にインキュベートした。プレートを５度、洗浄し、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質を添加し、そして４５０ｎｍでのＯＤを、マイクロプレートリーダーを用いて読み取り、そしてｓｃＦｖ抗体を同定し、そして配列決定した。
【０１１２】
可溶性ｓｃＦｖの調製
個々のクローンのファージを用いて、非サプレッサーＥ．コリ宿主ＨＢ２１５１を感染せしめ、そしてその感染体を２ＹＴＡＧ−Ｎプレート上で選択した。ＨＢ２１５１細胞におけるｓｃＦｖの発現を、１ｍＭのイソプロピル−１−チオ−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシドを含む２ＹＴＡ培地において細胞を３０℃で培養することによって誘発した。細胞のペリプラズム抽出物を、２０％（ｗ／ｖ）のスクロース、２００ｍＭのＮａＣｌ， １ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１ｍＭのＰＭＳＦを含む２５ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）に細胞ペレットを再懸濁することによって調製し、続いて、４℃で軽く振盪しながら１時間インキュベートした。１５，０００ｒｐｍでの１５分間の遠心分離の後、可溶性ｓｃＦｖを、ＲＰＡＳ精製モデル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、親和性クロマトグラフィーにより上清液から、精製した。
【０１１３】
例ＩＩＩ．アッセイ：
定量的ＫＤＲ結合アッセイ
２種のアッセイを、ＫＤＲへの精製された可溶性ｓｖＦｖの結合を定量的に試験するために使用した。
２種のＶＥＧＦブロッカー、すなわちｐ１Ｃ１１及びｐＩＦ１２、１つの非ブロッカー、優性クローンｐ２Ａ６及び非結合体ｐ２Ａ７を包含する４種の異なったクローンを、非サプレッサー宿主Ｅ．コリＨＢ２１５１細胞を用いて、振盪フラスコにおいて発現した。ｐ１Ｃ１１は、図１１に示されるＨ鎖及びＬ鎖配列を有する。可溶性ｓｃＦｖを、抗−Ｅ−標識親和性クロマトグラフィーのより、Ｅ．コリのペリプラズミック抽出物から精製した。それらのクローンの精製されたｓｃＦｖの収率は、１００〜４００μｇ／Ｌの培養物の範囲であった。
【０１１４】
直接的な結合アッセイにおいては、種々の量の可溶性ｓｃＦｖを、ＫＤＲ−被覆された９６−ウェルＭａｘｉ−ｓｏｒｐマイクロタイタープレートに添加し、そして室温で１時間インキュベートし、この後、プレートをＰＢＳＴにより３度、洗浄した。次に、プレートを、１００μｌのマウス抗−Ｅ標識抗体と共に室温で１時間インキュベートし、続いて、１００ｐｌのウサギ抗−マウス抗体−ＨＲＰ接合体と共にインキュベートした。プレートを、ファージＥＬＩＳＡについて上記に記載される方法に従って、洗浄し、そして進行せしめた。
【０１１５】
もう１つのアッセイ、すなわち競争ＶＥＧＦブロックアッセイにおいては、種々の量の可溶性ｓｃＦｖを、固定された量のＫＤＲ−ＡＰ（５０ｎｇ）と共に混合し、そして室温で１時間インキュベートした。次に、その混合物を、ＶＥＧＦ１６５（２００ｎｇ／ウェル）により被覆された９６−ウェルマイクロタイタープレートに移し、そして室温でさらに２時間インキュベートし、その後、プレートを５度、洗浄し、そしてＡＰのための基質を添加し、結合されたＫＤＲ−ＡＰ分子を定量化した。ＩＣ５０、すなわちＶＥＧＦへのＫＤＲ結合の５０％阻害のために必要とされるｓｃＦｖ濃度を、計算した。
【０１１６】
ｐ２Ａ６を除くクローンｐ１Ｃ１１及びｐ１Ｆ１２はまた、固定されたＶＥＧＦへのＫＤＲ結合を阻止する。クローンｐ１Ｃ１１， すなわち個々の回のパンニングの後の優性クローンは、最高のＫＤＲ結合能力及びＫＤＲへのＶＥＧＦ結合の最高の阻止能力を示した（表１）。ＫＤＲへの最大結合の５０％の結合、及びＶＥＧＦへのＫＤＲ結合の５０％の阻害のために必要とされるクローンｐ１Ｃ１１の抗体濃度はそれぞれ、０．３ｎＭ及び３ｎＭであった（表１を参照のこと）。ＦＡＣＳ分析は、ｐ１Ｃ１１， ｐ１Ｆ１２及びｐ２Ａ６がまた、ＨＵＶＥＣ上での細胞表面発現受容体に結合することができたことを示した。
【０１１７】
可溶性ｓｃＦｖのＢＬＡコアー分析
ＫＤＲへの可溶性ｓｃＦｖの結合運動学を、ＢＬＡコアーバイオセンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）を用いて測定した。ＫＤＲ−ＡＰ融合タンパク質を、センサーチップ上に固定し、そして可溶性ｓｖＦｖを、６２．５ｎＭ〜１０００ｎＭの範囲の濃度で注入した。センサーグラムを個々の濃度で得、そしてプログラムＢＩＡ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ２．０を用いて評価し、速度定数ｋｎｏ及びｋｏｆｆを決定した。Ｋｄを、速度定数ｋｏｆｆ／ｋｎｏの割合から計算した。
【０１１８】
表１は、ＢＩＡｃｏｒｅ装置上での表面プラスモン共鳴の結果を示す。ＶＥＧＦ−ブロッキングｓｃＦｖ， ｐ１Ｃ１１及びｐ１Ｆ１２は、それぞれ２．１及び５．９ｎＭのＫｄを有する、固定されたＫＤＲに結合した。非ブロッキングｓｃＦｖ， ｐ２６Ａは、主により早い解離速度のために、最良の結合体ｐ１Ｃ１１よりも約６倍弱い親和性（Ｋｄ， １１．２ｎＭ）を有するＫＤＲに結合した。予測されるように、ｐ２Ａ７は、ＢＩＡｃｏｒｅ上の固定されたＫＤＲに結合しなかった。
【０１１９】
リン酸化アッセイ
リン酸化アッセイを、前に記載されたプロトコールに従って、初期継代ＨＵＶＥＣにより行った。手短には、ＨＵＶＥＣを、０．５％ウシ血清アルブミンにより補充された血清フリーのＥＢＭ−２塩基培地において、５μｇ／ｍｌでのｓｃＦｖ抗体の存在又は不在下で１０分間インキュベートし、続いて室温でさらに１５分間、２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５により刺激した。細胞を溶解し、そしてＫＤＲ受容体を、ウサギ抗−ＫＤＲポリクローナル抗体（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）に結合されるプロテインＡセファロースビーズにより、細胞溶解物から免疫沈殿せしめた。
【０１２０】
ビーズを洗浄し、ＳＤＳ充填後緩衝液と共に混合し、そして上清液をウェスターンブロット分析にゆだねた。ＫＤＲリン酸化を検出するために、ブロットを、抗−ホスホチロシンＭａｂ， ４Ｇ１０によりプローブした。ＭＡＰキナーゼ活性アッセイのために、細胞溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、続いて、ホスホ−特異的ＭＡＰキナーゼ抗体を用いてウェスターンブロット分析にゆだねた。すべてのシグナルを、ＥＣＬを用いて検出した。
【０１２１】
結果は、非ブロッキングｓｃＦｖ ｐ２Ａ６とは異なって、ＶＥＧＦ−ブロッキングｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１１が、ＶＥＧＦにより刺激されたＫＤＲ受容体リン酸化を阻害することができたことを示した。さらに、ｐ１Ｃ１１はまた、ＭＡＰキナーゼｐ４４／ｐ４２のＶＥＧＦ−刺激された活性化を効果的に阻害した。対照的に、ｐ１Ｃ１１もＩＭＣ−２Ａ６も、ＭＡＰキナーゼｐ４４／ｐ４２のＰＧＦ−刺激された活性化を阻害しなかった。
【０１２２】
抗−ミトゲンアッセイ
ＨＵＶＥＣ（５×１０３個の細胞／ウェル）を、ＶＥＧＦ， ｂＦＧＦ又はＥＧＦを有さない２００μｌのＥＢＭ−２培地を含む９６−ウェル組織培養プレート上にプレートし、そして３７℃で７２時間インキュベートした。種々の量の抗体を、二重ウェルに添加し、３７℃で１時間、プレインキュベートし、その後、ＶＥＧＦ１６５を、１６ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。１８時間のインキュベーションの後、０．２５μＣｉの［３Ｈ］−ＴｄＲ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を個々のウェルに添加し、そしてさらに４時間インキュベートした。細胞を氷上に置き、血清含有培地により２度、洗浄し、続いて、４℃で１０％ＴＣＡと共にインキュベートした。次に、細胞を水により１度洗浄し、そして２５μｌの２％ＳＤＳに溶解した。シンチレーション流体（１５０μｌ／ウェル）を添加し、そして放射能を組み込まれたＤＮＡを、シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃｈ， Ｍｏｄｅｌ １４５０ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒ）上で決定した。
【０１２３】
ＨＵＶＥＣ上でのＶＥＧＦ−刺激されたミトゲン活性を阻止するｓｃＦｖ抗体の能力が、図３に示される。ＶＥＧＦ−ブロッキングｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１１が、約５ｎＭのＥＣ５０、すなわちＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ−刺激された有糸分裂誘発を５０％阻害する抗体濃度を有するＨＵＶＥＣにおいてＶＥＧＦ誘発されたＤＮＡ合成を強く阻害した。非ブロッキングｓｖＦｖ ｐ２Ａ６は、ＶＥＧＦのミトゲン活性に対する阻害効果を示さなかった。ｐ１Ｃ１１もｐ２Ａ６も、ＨＵＶＥにおけるｂＦＧＦ−誘発されたＤＮＡ合成を阻害しなかった。
【０１２４】
例ＩＶ．キメラ抗体の生成：
細胞系及びタンパク質
一次培養されたヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、ＥＢＭ−２培地において、３７℃で、５％ＣＯ２下で維持した。２〜５間の継代の細胞を、すべてのアッセイのために使用した。ＶＥＧＦ１６５及びＫＤＲ−アルカリホスファターゼ融合タンパク質（ＫＤＲ−ＡＰ）を、それぞれ、バキュロウィルス及びＮＩＨ ３Ｔ３細胞において発現し、そして上記方法に従って精製した。抗−ＫＤＲ ｓｅＦｖ ｐ１Ｃ１１及びｓｃＦｖ ｐ２Ａ６， ＫＤＲに結合するが、しかしＫＤＲ−ＶＥＧＦ相互作用を阻止しない抗体を、上記のようにして、ＫＤＲにより免疫化されたマウスから構成されたファージ表示ライブラリーから単離した。Ｃ２２５は、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体に対して向けられたキメラＩｇ抗体である。
【０１２５】
ｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１１の可変ドメインのクローニング
ｐ１Ｃ１１のＬ鎖（ＶＬ）及びＨ鎖（ＶＨ）の可変ドメインを、それぞれプライマー１及び２、並びにプライマー３及び４を用いて、ＰＣＲによりｓｃＦｖ発現ベクターからクローン化した。哺乳類細胞におけるタンパク質分泌のためのリーダーペプチド配列を、それぞれ、プライマー５及び２、並びにプライマー５及び４を用いて、ＰＣＲにより、ＶＬ及びＶＨの５’に付加した。
【０１２６】
【化５】
2004501070.tif 000006
【０１２７】
キメラｐ１Ｃ１１ ＩｇＧのための発現ベクターの構成
キメラＩｇＧ Ｌ鎖及びＨ鎖の発現のための別々のベクターを構成した。クローン化されたＶＬ遺伝子を、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＢａｍ ＨＩにより消化し、そしてヒトκＬ鎖不変領域（ＣＬ）を含むベクターｐＫＮ１００中に連結し、キメラｐ１Ｃ１１ Ｌ鎖、ＩＭＣ−１Ｃ１１−Ｌのための発現ベクターを創造した。クローン化されたＶＨ遺伝子を、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＢａｍ ＨＩにより消化し、そしてヒトＩｇＧ（γ）Ｈ鎖不変ドメイン（ＣＨ）を含むベクターｐＧＩＤ１０５中に連結し、キメラｐ１Ｃ１１ Ｈ鎖、ＩＭＣ−１Ｃ１１−Ｈのための発現ベクターを創造した。両構造体を、制限酵素消化により試験し、そしてデオキシヌクレオチド配列決定により確かめた。
【０１２８】
図４に見られるように、ＶＨ及びＶＬドメインの両者を、市販のリーダーペプチド配列をコードする遺伝子セグメントにそれらの５’末端上で正確に融合せしめた。ＶＨ及びＶＬドメインを、Ｈｉｒｄ ＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位を通して、ヒトγＩ不変領域遺伝子のｃＤＮＡバージョンを含む発現ベクターｐＧ１Ｄ１０５、及びヒトκ鎖不変領域遺伝子のｃＤＮＡバージョンを含むｐＫＮ１００中にそれぞれ連結した。個々の場合、発現はＨＣＭＶｉプロモーターの制御下にあり、そして人工的な終結配列により終結される。Ｋａｂａｔなどの超可変配列定義に従って定義される、Ｌ及びＨ鎖相補的決定領域（ＣＤＲ）残基は、下線が引かれ、そしてそれぞれＨ３に対するＣＤＲ−Ｈ１及びＬ３に対するＣＤＲ−Ｌ１がラベルされる。
【０１２９】
ＩｇＧの発現及び精製
ＣＯＳ細胞を、過渡的ＩｇＧ発現のために等量のＩＭＣ−１Ｃ１１−Ｌ及びＩＭＣ−１Ｃ１１−Ｈプラスミドにより同時トランスフェクトした。１５０ｍｍの培養皿におけるＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳにおいて増殖された、ほぼ集密性のＣＯＳ細胞を、４０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）を含むＤＭＥＭ２０ｍｌにより１度すすぎ、続いて、４ｍｌのＤＭＥＭ／ＤＥＡＥデキストラン／ＤＮＡ混合物（４０ｍＭのトリス、０．４ｍｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ）、及び２０μｇの個々のＩＭＣ−１Ｃ１１−Ｌ及びＩＭＣ−１Ｃ１１−Ｈプラスミドを含むＤＭＥＭ）と共に３７℃で４．５時間インキュベートした。
【０１３０】
細胞を、１００ｎＭのクロロキン（Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ／２％ＦＣＳ４ｍｌと共に３７℃で１時間インキュベートし、続いて、１．５ｍｌの２０％グリセロール／ＰＢＳと共に室温で１分間インキュベートした。細胞をＤＭＥＭ／５％ＦＣＳにより２度、洗浄し、そして同じ培地２０ｍｌにおいて３７℃で一晩インキュベートした。細胞培養培地を、細胞をプレーンのＤＭＥＭにより２度、洗浄した後、血清フリーのＤＭＥＭ／ＨＥＰＥＳに変えた。細胞培養上清液を、トランスフェクションの後、４８及び１２０時間で収集した。
【０１３１】
キメラＩｇＧを、製造業者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により記載されるプロトコールに従って、プロテインＧカラムを用いての親和性クロマトグラフィーにより、プールされた上清液から精製した。ＩｇＧ−含有画分をプールし、緩衝液をＰＢＳに交換し、そしてＣｅｎｔｒｉｃｏｎ １０濃縮機（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｏｒｐ．， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ） を用いて濃縮した。ＩｇＧの純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。精製された抗体の濃度を、捕獲剤としてのヤギ抗−ヒトｙ鎖特異的抗体及び検出剤としてのＨＲＰ−接合されたヤギ抗−ヒトκ鎖抗体を用いて、ＥＬＩＳＡにより決定した。標準曲線を、臨床学的品種の抗体Ｃ２２５を用いて校正した。
【０１３２】
プロテインＧによる親和性精製の後、約１５０ｋＤの単一のタンパク質バンドが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて見られた。ＨＲＰ−接合された抗−ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体を用いてのウェスターンプロット分析は、精製されたタンパク質におけるヒトＩｇＧ Ｆｃ部分の存在を確証した。
ＥＬＩＳＡの結果は、ＩＭＣ−１Ｃ１１が親ｓｃＦｖよりも固定されたＫＤＲに対してより効果的に結合することを示す。
【０１３３】
例Ｖ．アッセイ及び分析：
ＦＡＣＳ分析
初期継代ＨＵＶＥＣ細胞を、成長因子−消耗されたＥＢＭ−２培地において一晩、培養し、ＫＤＲの発現を誘発した。細胞を収穫し、そしてＰＢＳにより３度、洗浄し、ＩＭＣ−ｐ１Ｃ１１ ＩｇＧ（５μｇ／ｍｌ）と共に４℃で１時間インキュベートし、続いてＦＩＴＣによりラベルされた抗−ヒトＦｃ抗体（Ｃａｐｐｅｒ， Ｏｒｇａｎｏｎ ｔｅｋｎｉｋａ Ｃｏｒｐ．， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ， ＰＡ）と共にさらに６０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、そして流動細胞計測機（Ｍｏｄｅｌ ＥＰＩＣＳ（商標）， Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐ．，Ｅｄｉｓｏｎ， ＮＪ）により分析した。親ｓｃＦｖ　ｐ１Ｃ１１に関して前に見られるように、ＩＭＣ−１Ｃ１１は、初期継代ＨＵＶＥＣ上に発現されるＫＤＲに対して特異的に結合する。
【０１３４】
定量ＫＤＲ結合アッセイ
種々の量の抗体を、ＫＤＲ−被覆された９６ウェルＭａｘｉ−ｓｏｒｐマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ． Ｄａｎｍａｒｋ）に添加し、そして室温で１時間インキュベートし、その後、プレートを、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳにより３度、洗浄した。次に、プレートをｓｃＦｖのためのマウス抗−Ｅ標識抗体−ＨＲＰ接合体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）１００μｌ、又はキメラＩｇＧのための抗−ヒトＩｇＧ　Ｆｃ特異的抗体−ＨＲＰ接合体（Ｃａｐｐｅｌ， Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｃｏｒｐ．）１００μｌと共にＲＴで１時間インキュベートした。プレートを５度、洗浄し、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を添加し、そして４５０ｎｍでのＯＤをマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）を用いて読み取った。ＩＭＣ−１Ｃ１１は、親ｓｃＦｖよりも、固定されたＫＤＲ受容体により効果的に結合する。
【０１３５】
ＢＩＡｃｏｒｅ分析
ＫＤＲに対する抗体の結合運動学を、ＢＬＡｃｏｒｅバイオセンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）を用いて測定した。ＫＤＲ−ＡＰ融合タンパク質を、センサーチップ上に固定し、そしてＶＥＧＦに対する抗体を、２５ｎＭ〜２００ｎＭの範囲の濃度で注入した。センサーグラムを個々の濃度で得、そしてプログラムＢＩＡ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ２．０を用いて評価し、速度定数ｋｎｏ及びｋｏｆｆを決定した。Ｋｄを、速度定数ｋｏｆｆ／ｋｎｏの割合から計算した。
【０１３６】
ＢＩＡｃｏｒｅ分析は、ＩＭＣ−１Ｃ１１が、親ｓｃＦｖよりも高い親和性を伴なってＫＤＲに結合することを示す（表２）。ＩＭＣ−１Ｃ１１のＫｄは、ｓｖＦｖについての２．１ｎＭに比較して、０．８２ｎＭである。ＩＭＣ−１Ｃ１１の高められた親和性は、主に二価キメラＩｇＧの遅い解離速度（ｋｏｆｆ）のためである。ＫＤＲへの結合のためのＩＭＣ−１Ｃ１１の親和性が、ＢＩＡｃｏｒｅ分析において決定される場合、０．９３ｎＭである、ＫＤＲへの結合のための天然のリガンドＶＥＧＦの親和性に類似する（表２）。
【０１３７】
競争ＶＥＧＦ結合アッセイ
第１のアッセイにおいては、種々の量の抗体を、固定された量のＫＤＲ−ＡＰ（５０ｎｇ）と共に混合し、そして室温で１時間インキュベートした。次に、この混合物を、ＶＥＧＦ１６５（２００ｎｇ／ウェル）により被覆された９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、そして室温でさらに２時間インキュベートし、その後、プレートを５度、洗浄し、そしてＡＰのための基質（ｐ−ニトロフェニルホスフェート、Ｓｉｇｍａ）を添加し、結合されたＫＤＲ−ＡＰ分子を定量化した。ＥＣ５０、すなわちＶＥＧＦへのＫＤＲ結合の５０％阻害のために必要とされる抗体濃度を計算した。
【０１３８】
ＩＭＣ−１Ｃ１１は、用量依存性態様で、固定されたＶＥＧＦへの結合からＫＤＲ受容体を阻止する。キメラ抗体は、ｓｃＦｖに関する２．０ｎＭのＩＣ５０に比較して、０．８ｎＭのＩＣ５０（すなわち、ＶＥＧＦへのＫＤＲ結合５０％を阻害するために必要とされる抗体濃度）を伴なって、ＶＥＧＦ−ＫＤＲ相互作用を阻止することにおいてより効果的である。対照ｓｃＦｃ ｐ２Ａ６はまた、ＫＤＲを結合するが、しかしＶＥＧＦ−ＫＤＲ相互作用を阻止しない。
【０１３９】
第２のアッセイにおいては、種々の量のＩＭＣ−１Ｃ１１の抗体又は冷ＶＥＧＦ１６５タンパク質を、固定された量の１２５ＩラベルされたＶＥＧＦ１６５と共に混合し、そしてＫＤＲ受容体により被覆された９６ウェルマイクロタイタープレートに添加した。プレートを室温で２時間インキュベートし、５度、洗浄し、そして固定されたＤＫＲ受容体に結合される、ラベルされたＶＥＧＦ１６５の量を計数した。固定されたＫＤＲ受容体へのラベルされたＶＥＧＦの結合を５０％阻止するために必要とされるＩＭＣ−１Ｃ１１及び冷ＶＥＧＦ１６５の濃度を決定した。
【０１４０】
ＩＭＣ−１Ｃ１１は、用量を依存態様で、固定されたＫＤＲ受容体への結合に関して、１２５ＩラベルされたＶＥＧＦと効果的に競争する。予測されるように、Ｃ２２５、すなわちＥＧＦ受容体に対して向けれたキメラ抗体は、ＫＤＲ受容体に結合せず、又はＶＥＧＦ−ＫＤＲ相互作用を阻止しない。
【０１４１】
リン酸化アッセイ
ほぼ集密性のＨＵＶＥＣ細胞を、実験の前、成長因子消耗されたＥＢＭ−２倍地において２４〜４８時間、増殖した。５０ｎＭのオルトバナジン酸ナトリウムにより３０分間、前処理した後、細胞を、抗体の存在又は不在下で１５分間インキュベートし、続いて２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５又は１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦにより室温でさらに１５分間、刺激した。次に、細胞を、溶解緩衝液（５０ｎＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ， １％ＮＰ−４０、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．２５％ナトリウムデオキシコレート、１ｍＭのＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌのロイペプチン、１μｇ／ｍｌのペプスタチン、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、ｐＨ７．５）に溶解し、そしてその細胞溶解物を、ＫＤＲ及びＭＡＰキナーゼリン酸化アッセイのために使用した。
【０１４２】
ＫＤＲ受容体を、抗−ＫＤＲ抗体、すなわちＭｏｂ４．１３（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に結合されたプロテインＡセファロースビーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．， ＣＡ）により細胞溶解物から免疫沈殿せしめた。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、そしてウェルターンブロット分析にゆだねた。ＫＤＲリン酸化を検出するために、ブロットを、抗ホスホチロシンＭａｂ、すなわちＰＹＺＯ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ａｕｒｏｒａ， ＯＨ）によりプローブした。
【０１４３】
ＭＡＰキナーゼ活性アッセイのために、細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、続いて、ホスホ−特異的ＭＡＰキナーゼ抗体（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）を用いてウェルターンブロット分析した。すべてのシグナルを、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ）を用いて検出した。両アッセイにおいては、ブロットをポリクローナル抗−ＫＤＲ抗体（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により再プローブし、等量のタンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの個々のレーンに負荷されたことを確かめた。
【０１４４】
ＩＭＣ−１Ｃ１１は、ＫＤＲ受容体のＶＥＧＦ−刺激されたリン酸化及びｐ４４／ｐ４２ ＭＡＰキナーゼの活性化を効果的に阻害する。対照的に、Ｃ２２５は、ＫＤＲ受容体及びＭＡＰキナーゼのＶＥＧＦ−刺激された活性化のいずれの阻害も示さない。ＩＭＣ−１Ｃ１１もＣ２２５も単独で、ＫＤＲ受容体及びｐ４４／ｐ４２ ＭＡＰキナーゼの活性に対していずれの効果も有さない。ｓｃＦｖ　ｐ１Ｃ１１に関して前に見出されたように、ＩＭＣ−１Ｃ１１は、ｐ４４／ｐ４２ ＭＡＰ−キナーゼのＦＧＦ−刺激された活性化を阻害しない。さらに、ｓｃＦｖ ｐ２Ａ６もｐ２Ａ６のキメラＩｇＧ形（ｃ−ｐ２Ａ６）も、ＫＤＲ受容体及びＭＡＰキナーゼのＶＥＧＦ−刺激された活性化を阻害しない。
【０１４５】
抗−ミトゲンアッセイ
ヒト内皮細胞のＶＥＧＦ−刺激された有糸分裂誘発に対する抗−ＫＤＲ抗体の効果を、ＨＵＶＥＣを用いて、［３Ｈ］−ＴｄＲ ＤＮＡ組み込みアッセイにより決定した。ＨＵＶＥＣ（５×１０３個の細胞／ウェル）を、ＶＥＧＦ， ｂＦＧＦ又はＥＧＦを含まないＥＢＭ−２培地２００μｌを有する９６−ウェル組織培養プレート中にプレートし、そして３７℃で７２時間インキュベートした。種々の量の抗体を二重ウェルに添加し、そして３７℃で１時間、プレインキュベートし、その後、ＶＥＧＦ１６５を添加し、１６ｎｇ／ｍｌの最終濃度にした。１８時間のインキュベーションの後、０．２５μＣｉの［３Ｈ］−ＴｄＲを個々のウェルに添加し、そしてさらに４時間インキュベートした。ＤＮＡに組み込まれた放射能を、シンチレーションカウンターにより決定した。
【０１４６】
ＩＭＣ−１Ｃ１１及びｓｃＦＶ ｐ１Ｃ１１の両者は、ＶＥＧＦにより刺激されたＨＵＶＥＣの有糸分裂誘発を効果的に阻害する。ＩＭＣ−１Ｃ１１は、親ｓｃＦｖよりも、ＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ−誘発された有糸分裂誘発のより強いインヒビターである。ＨＵＶＥＣのＥＧＦ−誘発された有糸分裂誘発の５０％を阻害するのに必要とされる抗体濃度は、それぞれＩＭＣ−１Ｃ１１に関して０．８ｎＭ及びｓｃＦｖに関して６ｎＭである。予測されるように、ｓｃＦｖ ｐ２Ａ６は、ＶＥＧＦ−刺激された内皮細胞増殖に対していずれの阻害効果も示さない。
【０１４７】
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９．Ｓｋｏｂｅ， Ｍ．， Ｒｏｃｋｗｅｌｌ， Ｐ．， Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ， Ｎ．， Ｖｏｓｓｅｌｅｒ， Ｓ．， Ｆｕｓｅｎｉｇ， Ｎ．Ｅ． （１９９７） Ｎａｔ Ｍｅｄ ３（１１）， １２２２−７．
１０．Ｐｒｅｗｅｔｔ， Ｍ．， Ｈｕｂｅｒ， Ｊ．， Ｌｉ， Ｙ．， Ｓａｎｔｉａｇｏ， Ａ．， Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ， Ｗ．， Ｋｉｎｇ， Ｋ．， Ｏｖｅｒｈｏｌｓｅｒ， Ｊ．， Ｈｏｏｐｅｒ， Ａ．， Ｐｙｔｏｗｓｋｉ， Ｂ．， Ｗｉｔｔｅ， Ｌ．， Ｂｏｈｌｅｎ， Ｐ．， ａｎｄ Ｈｉｃｋｌｉｎ， Ｄ． Ｊ． （１９９９） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５９ （２０）， ５２０９−１８．
【０１４９】
１１．Ｍｉｌｌａｕｅｒ， Ｂ．， Ｓｈａｗｖｅｒ， Ｌ． Ｋ．， Ｐｌａｔｅ， Ｋ． Ｈ．， Ｒｉｓａｕ， Ｗ．， ａｎｄ Ｕｌｌｒｉｃｈ， Ａ． （１９９４） Ｎａｔｕｒｅ ３６７ （６４６３）， ５７６−９．
１２．Ｚｈｕ， Ｚ．， Ｌｕ， Ｄ．， Ｋｏｔａｎｉｄｅｓ， Ｈ．， Ｓａｎｔｉａｇｏ． Ａ．， Ｊｉｍｅｎｅｚ， Ｘ．， Ｓｉｍｃｏｘ， Ｔ．， Ｈｉｃｋｌｉｎ， Ｄ． Ｊ．， Ｂｏｈｌｅｎ， Ｐ．， ａｎｄ Ｗｉｔｔｅ， Ｌ． （１９９９） Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ １３６ （２）， ２０３−１３
１３．Ｌｅｂｅｒ， Ｔ． Ｍ．， ａｎｄ Ｂａｌｋｗｉｌｌ， Ｆ． Ｒ． （１９９７） Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２４９ （１）， ２４−８．
１４．Ｈａｍａｄａ， Ｔ．， Ｍｏｈｌｅ， Ｒ．， Ｈｅｓｓｅｌｇｅｓｓｅｒ， Ｊ．， Ｈｏｘｉｅ， Ｊ．， Ｎａｃｈｍａｎ， Ｒ． Ｌ．， Ｍｏｏｒｅ， Ｍ．Ａ．Ｓ．， ａｎｄ Ｒａｆｉｉ， Ｓ． （１９９８） Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８８， ５３９−５４８．
１５．Ｓｔｒａｗｎ， Ｌ． Ｍ．， ＭｃＭａｈｏｎ， Ｇ．， Ａｐｐ， Ｈ．， Ｓｃｈｒｅｃｋ， Ｒ．， Ｋｕｃｈｌｅｒ， Ｗ． Ｒ．， Ｌｏｎｇｈｉ， Ｍ． Ｐ．， Ｈｕｉ， Ｔ． Ｈ．， Ｔａｎｇ， Ｃ．， Ｌｅｖｉｔｚｋｉ， Ａ．， Ｇａｚｉｔ， Ａ．， Ｃｈｅｎ， Ｉ．， Ｋｅｒｉ， Ｇ．， Ｏｒｆｉ， Ｌ．， Ｒｉｓａｕ， Ｗ．， Ｆｌａｍｍｅ， Ｌ， Ｕｌｌｒｉｃｈ， Ａ．， Ｈｉｒｔｈ， Ｋ． Ｐ．， ａｎｄ Ｓｈａｗｖｅｒ， Ｌ． ｋ． （１９９６） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５６ （１５）， ３５４０−５．
【０１５０】
１６． Ｚｈｕ， Ｚ．， Ｒｏｃｋｗｅｌｌ， Ｐ．， Ｌｕ， Ｄ．， Ｋｏｔａｎｉｄｅｓ， ｈ．， Ｐｙｔｏｗｓｋｉ， Ｂ．， Ｈｉｃｋｌｉｎ， Ｄ． Ｊ．， Ｂｏｈｌｅｎ， Ｐ．， ａｎｄ Ｗｉｔｔｅ， Ｌ． （１９９８） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５８ （１５）， ３２０９−１４．
１７．Ｗａｎｇ， Ｈ．， ａｎｄ Ｋｅｉｓｅｒ， Ｊ． Ａ． （１９９８） Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ８３ （８）， ８３２−４０
１８．Ｂａｒｌｅｏｎ， Ｂ．， Ｓｏｚｚａｎｉ， Ｓ．， Ｚｈｏｕ， Ｄ．， Ｗｅｉｃｈ， Ｈ． Ａ．， Ｍａｎｔｏｖａｎｉ， Ａ．， ａｎｄ Ｍａｒｍｅ， Ｄ． （１９９６） Ｂｌｏｏｄ ８７ （８）， ３３３６−４３．
１９．Ｃｌｕｔｔｅｒｂｕｃｋ， Ｒ． Ｄ．， Ｍｉｌｌａｒ， Ｂ． Ｃ．， Ｐｏｗｌｅｓ， Ｒ． Ｌ．， Ｎｅｗｍａｎ， Ａ．， Ｃａｔｏｖｓｋｙ， Ｄ．， Ｊａｒｍａｎ， Ｍ．， ａｎｄ Ｍｉｌｌａｒ， Ｊ． Ｌ． （１９９８） Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ １０２ （２）， ５２２−７．
２０．Ｔｅｒｐｓｔｒａ， Ｗ．， Ｐｒｉｎｓ， Ａ．， Ｖｉｓｓｅｒ， Ｔ．， Ｗｏｇｎｕｍ， Ｂ．， Ｗａｇｅｍａｋｅｒ， Ｇ．， Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇ， Ｂ．， ａｎｄ Ｗｉｅｌｅｎｇａ， ｊ． （１９９５） Ｌｅｕｋｅｍｉａ ９ （９）， １５７３−７．
【０１５１】
２１．Ｍａｃｈａｄｏ， Ｅ． Ａ．， Ｇｅｒａｒｄ， Ｄ． Ａ．， Ｌｏｚｚｉｏ， Ｃ． Ｂ．， Ｌｏｚｚｉｏ， Ｂ． Ｂ．， Ｍｉｔｃｈｅｌｌ， Ｊ． Ｒ．， ａｎｄ Ｇｏｌｄｅ， Ｄ． Ｗ． （１９８４） Ｂｌｏｏｄ ６３ （５）， １０１５−２２．
２２．Ｓｏｋｅｒ， Ｓ．， Ｔａｋａｓｈｉｍａ， Ｓ．， Ｍｉａｏ， Ｈ． Ｑ．， Ｎｅｕｆｅｌｄ， Ｇ．， ａｎｄ Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ， Ｍ． （１９９８） Ｃｅｌｌ ９２ （６）， ７３５−４５．
２３．Ｓａｌｖｅｎ， Ｐ．， Ｍａｎｐａａ， Ｈ．， Ｏｒｐａｎａ， Ａ．， Ａｌｉｔａｌｏ， Ｋ．， ａｎｄ Ｊｏｅｎｓｕｕ， Ｈ． （１９９７） Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ３ （５）， ６４７−５１．
２４．Ｏｂｅｒｍａｉｒ， Ａ．， Ｔｅｍｐｆｅｒ， Ｃ．， Ｈｅｆｌｅｒ， Ｌ．， Ｐｒｅｙｅｒ， Ｏ．， Ｋａｉｄｅｒ， Ａ．， Ｚｅｉｌｌｉｎｇｅｒ， Ｒ．， Ｌｅｏｄｏｌｔｅｒ， Ｓ．， ａｎｄ Ｋａｉｎｚ， Ｃ． （１９９８） Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ７７ （１１）， １８７０−４．
２５．Ｋｒａｎｚ， Ａ．， Ｍａｔｔｆｅｌｄｔ， Ｔ．， ａｎｄ Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ， Ｊ． （１９９９） Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８４ （３）， ２９３−８．
【０１５２】
２６．Ａｂｕ−Ｊａｗｄｅｈ， Ｇ． Ｍ．， Ｆａｉｘ， Ｊ． Ｄ．， Ｎｉｌｏｆｆ， Ｊ．， Ｔｏｇｎａｚｚｉ， Ｋ．， Ｍａｎｓｅａｕ， Ｅ．， Ｄｖｏｒａｋ， Ｈ． Ｆ．， ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ， Ｌ． Ｆ． （１９９６） Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ ７４ （６）， １１０５−１５．
２７．Ｆｅｒｒｃｒ， Ｆ． Ａ．， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｌ． Ｊ．， Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ， Ｒ．， Ｋｏｗａｌｃｚｙｋ， Ｐ．， Ｌａｕｄｏｎｅ， Ｖ． Ｐ．， Ａｌｖｅｒｔｓｅｎ， Ｐ． Ｃ．， ａｎｄ Ｋｒｅｕｔｚｅｒ， Ｄ． Ｌ． （１９９９） Ｕｒｏｌｏｇｙ ５４ （３）， ５６７−７２．
２８．Ｆｏｌｋｍａｎ， Ｊ． （１９９７） Ｅｘｓ ７９， １−８．
２９．Ｐｅｒｅｚ−Ａｔａｙｄｅ， Ａ． Ｒ．， Ｓｅｌｌａｎ， Ｓ． Ｅ．， Ｔｅｄｒｏｗ， Ｕ．， Ｃｏｎｎｏｒｓ， Ｅ．， ａｎｄ Ｆｏｌｋｍａｎ， Ｊ． （１９９７） Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５０ （３）， ８１５−２１．
３０．Ｆｉｅｌｄｅｒ， Ｗ．， Ｇｒａｅｖｅｎ， Ｕ．， Ｅｒｇｕｎ， Ｓ．， Ｖｅｒａｇｏ， Ｓ．， Ｋｉｌｉｃ， Ｎ．， Ｓｔｏｃｋｓｃｈｌａｄｅｒ， Ｍ．， ａｎｄ Ｈｏｓｓｆｅｌｄ， Ｄ． Ｋ． （１９９７） Ｌｅｕｋｅｍｉａ １１ （８）， １２３４−７．
【０１５３】
【表１】
2004501070.tif 000007
【０１５４】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１．ヒト緑色腫はＦＬＴ−１／ＶＥＧＦＲ−１及びＫＤＲ／ＶＥＧＦＲ−２を発現する。ヒト緑色腫からの断片は、方法セクションに記載のように、免疫組織化学により染色された。Ａ：小さな非特異的染色を示す対照ＩｇＧ（倍率：４００倍）；Ｂ：特定の血管染色を示す第ＶＩＩＩ因子染色（倍率：１００倍）；Ｃ：白血病細胞部分上のＫＤＲ／ＶＥＧＦＲ−２染色（倍率：４００倍）；Ｄ：サブセットの白血病細胞上にも検出されるＦＬＴ−１／ＶＥＧＦＲ−１発現（倍率：４００倍）。Ｅ及びＦ：特定の白血病細胞（Ｅ）及び陽性対照としての血管周囲細胞（白色の矢印、Ｆ）染色を示すＶＥＧＦ発現（倍率：４００倍）。それらの結果は、４種の異なったサンプルの代表である。
【図２Ａ】
図２Ａ．白血病細胞によるＶＥＧＦＲ−２発現。細胞系ＨＬ−６０及びＨＥＬ（及び５種の一次白血病）は、ＲＴ−ＰＣＲにより検出される場合、ＫＤＲ／ＶＥＧＦＲ−２を発現した。Ｋ５６２細胞はＫＤＲ陰性であった。β−アクチンは内部対処として使用された。
【図２Ｂ】
図２Ｂ．ＶＥＧＦ１６５は、ＶＥＧＦＲ−２−陽性白血病細胞系に対する用量依存性ＶＥＧＦＲ−２リン酸化を誘発した。ＨＬ−６０及びＨＥＬ細胞からの全細胞溶解物が、抗−ホスホチロシン抗体により免疫沈殿され、そして続いて、方法セクションに記載のようにして、ＶＥＧＦＲ−１（ＦＬＴ−１）又はＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ）に対する抗体を用いて、ウェスターンブロットにより分析された。線維芽細胞は負の対照として使用され、そしてＶＥＧＦＲ−１又はＶＥＧＦＲ−２リン酸化の徴候を示さなかった。３種の別々の実験の代表である。
【図３】
図３．ＶＥＧＦ１６５は、サブセットの白血病の増殖は、すなわちＫＤＲ／ＶＥＧＦＲ−２を通して介在される効果を誘発した。ＶＥＧＦ１６５は、すべてのＫＤＲ／ＶＥＧＦＲ−２＋白血病の増殖の有意（★、ｐ＜０．００３）な上昇性を誘発した（２種の細胞系及び２種の一次白血病が示される）。この効果は、方法セクションに記載のように、ＫＤＲ／ＶＥＧＦＲ−２に対する中和ＭｏＡｂにより阻止され得た（★★、ｐ＜０．０４）。示される結果は、３種の別々の実験の代表である。
【図４】
図４．ＫＤＲ／ＶＥＧＦＲ−２に関して高い親和性を有するチロシンキナーゼインヒビターは、ＶＥＧＦ１６５−誘発された白血病細胞増殖を阻止した。チロシンキナーゼＡＧ１４３３は、白血病細胞増殖を有意に（★、ｐ＜０．０５）阻止し、このことは、白血病細胞に対して、ＶＥＧＦ１６５のミトゲン効果がＫＤＲ／ＶＥＧＦＲ−２を通して主に介在されることを確証する。それらの結果は、２種の別々の実験の代表である。
【図５】
図５．ＶＥＧＦ１６５は白血病細胞によるＭＭＰ分泌を誘発する。Ａ：２４時間のＶＥＧＦ１６５刺激によるか又はそれによらない、白血病細胞上清液のザイモグラフ分析。Ｂ：培養上清液上に検出されるゲル分解活性の定量化。ＶＥＧＦ１６５と共に白血病細胞の２４時間のインキュベーションは、ザイモグラフィーにより検出されるように、上清液中に開放されるＭＭＰのレベルに対する有意（ｐ＜０．０５）な効果を有した。結果は、３種の独立した実験の代表である。
【図６】
図６．ＶＥＧＦ１６５は、用量依存性態様で（５０〜２００ｎｇ／ｍｌ）、マトリゲル−被覆されたトランスウェルを通しての白血病細胞移動、すなわち、ＫＤＲ／ＶＥＧＦＲ−２及びＦＬＴ−１／ＶＥＧＦＲ−１を通して介在される工程を誘発する。２００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５に応答して、マトリゲル−被覆されたトランスウェルを通してのＨＬ−６０細胞及び４種の一次白血病の移動が示される。この工程は、合成ＭＭＰｉの効果により示されるように、ＭＭＰ活性を必要とする。ＫＤＲ／ＶＥＧＦＲ−２に対するＭｏＡｂは白血病細胞移動を部分的に阻止するが、しかし細胞とＦＬＴ−１／ＶＥＧＦＲ−１及びＫＤＲ／ＶＥＧＦＲ−２ ＭｏＡｂとのインキュベーションは、いずれかの単独での抗体よりもより効果的であった（★★、ｐ＜０．０５）。それらの結果は、３種の独立した実験の代表である。
【図７】
図７．ＶＥＧＦ１６５−誘発されたＨＬ−６０細胞移動は、ＡＧ１４３３により阻止される。合成タンパク質キナーゼインヒビターＡＧ１４３３（１０μＭで使用される）は、ＶＥＧＦ１６５−誘発されたＨＬ−６０細胞移動を阻止した（★、ｐ＜０．０４）。それらの結果は、２種の異なった実験の代表であり、そして個々の条件は三重反復して行われた。
【図８】
図８．ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス中へのＨＬ−６０注射は、マウス血漿において、高いレベルのヒト（但し、マウスでない）ＶＥＧＦを誘発する。マウスに、１×１０６個のＨＬ−６０細胞を注射し（ｉ．ｖ．）、そしてヒト（Ａ）及びネズミＶＥＧＦ（Ｂ）血漿レベルを、注射の後、異なった時点でＥＬＩＳＡにより測定した。示される結果は、２種の別々の実験の代表である。Ｂ：ＨＬ−６０注射（ｉ．ｖ．）の後のマウス生存率（％）。マウスに、１×１０６個の細胞をｉ．ｖ．注射し、そして白血病細胞の注射の３日後、４００μｇのＩＭＣ−１Ｃ１１（ヒトＶＥＧＦＲ−２／ＫＤＲに対する中和ＭｏＡｂ）ｎ＝５又はＰＢＳ／ＢＳＡ（ｎ＝８）により、週３度、ｉ．ｐ．処理した。１匹のマウスを、組織学的分析のために殺害した。結果は、２種の別々の実験の代表である。
【図９】
図９．ＨＬ−６０注射されたマウスからの肝臓（Ａ， Ｂ）及び脾臓（Ｃ， Ｄ）の組織学。処理されていない（対照）マウスは、肝臓（白色及び赤色の矢印、Ｂ）及び脾臓（Ｄ）における転移疾患の証拠を有した。対照的に、ＩＭＣ−１Ｃ１１により処理されたマウスは、肝臓（Ａ）において白血病細胞の証拠を示さず、そして脾臓は、正常な組織学を除いて、アポプトシスの証拠を有した（青色矢印、Ｃ）。
【図１０】
図１０．ＶＥＧＦＲ−２陽性白血病に対して、ＶＥＧＦは、パラクライン（骨髄内皮細胞塊状物の上昇）及びオートクライン（白血病細胞増殖の直接的な刺激）機構を通して白血病細胞増殖を支持することができる。ヒトＶＥＧＦＲ−２に対する抗体（矢印）は、白血病由来のヒトＶＥＧＦにより誘発されたオートクラインループを阻止することができる。
【図１１】
図１１．ｐ１Ｃ１１のヌクレオチド及びアミノ酸配列。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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