(57)【要約】本発明は、細胞傷害性Ｔ細胞応答および／または体液性免疫応答を刺激するサイトカインまたはその他の分子と組み合わせて、自己樹状細胞と自己非樹状細胞の融合により形成された融合細胞を治療有効量で投与することにより、癌および感染症を治療または予防するための方法および組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌および感染症からなる群より選択される哺乳動物における病状を治療または予防する方法であって、このような治療または予防を必要とする哺乳動物に、細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激する分子と組み合わせて、上記哺乳動物と同じクラスＩ ＭＨＣハプロタイプを有する自己非樹状細胞と、樹状細胞と、の融合により形成された融合細胞を含む組成物を治療有効量で投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項２】
癌および感染症からなる群より選択される哺乳動物における病状を治療する方法であって、このような治療を必要とする哺乳動物に、細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激する分子と組み合わせて、自己非樹状細胞と、上記哺乳動物と同じクラスＩ ＭＨＣハプロタイプを有する樹状細胞と、の融合により形成された融合細胞を治療有効量で投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項３】
細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激する分子がサイトカインである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激する分子がＩＬ−１２である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
樹状細胞がヒト血液単球から得られる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
非樹状細胞が前記哺乳動物から得られた腫瘍細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
非樹状細胞が、前記融合細胞を投与しようとする哺乳動物から得られた腫瘍細胞に由来する腫瘍細胞系である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
非樹状細胞が、腫瘍特異的抗原の抗原性を呈示する１以上の抗原で形質転換された組換え細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
非樹状細胞が、感染因子の抗原の抗原性を呈示する１以上の抗原で形質転換された組換え細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
前記哺乳動物が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウス、およびラットからなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
前記癌が、腎細胞癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨形成肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢腺癌、髄様癌、気管支癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮癌、胎生期癌、ウィルムス腫、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、グリオーマ、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、欠突起グリオーマ、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽腫、白血病、急性リンパ性白血病、急性髄膜性白血病、慢性白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、およびＨ鎖病からなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
前記病原体が、Ｂ型肝炎ウイルス、パルボウイルス、サイトメガロウイルス、パポバウイルス、ポリオーマウイルス、およびＳＶ４０、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびエプスタイン−バーウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）、ヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）、ヒトＴ細胞向性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）、およびヒトＴ細胞向性ウイルスＩＩ型（ＨＴＬＶ−ＩＩ）；インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、センダイウイルス、ピコルナウイルス、コクサッキーウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、風疹ウイルス（ドイツ麻疹）およびセムリキ森林ウイルスのようなトガウイルス、アルボウイルス、ならびに、Ａ型肝炎ウイルスからなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
ヒト樹状細胞とヒト非樹状細胞との融合体を作製する方法であって、樹状細胞の集団と、該樹状細胞に自系の非樹状細胞の集団を、細胞融合を促進する条件にさらすことを含んでなる、上記方法。
【請求項１５】
融合細胞の集団を不活性化することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
細胞融合が電気融合により達成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
融合細胞の集団の不活性化が細胞にγ線を照射することにより達成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
１以上の容器に、細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激することができる分子と組み合わせて樹状細胞の集団を含むサンプル、および、癌または感染症の治療または予防にそれを使用するための説明書、を含んでなるキット。
【請求項１９】
細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激する分子がサイトカインである、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激する分子がＩＬ−１２である、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
１以上の容器に、樹状細胞の集団を含むサンプル、および、細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激することができる分子と組み合わせて、必要とする被験者に投与する目的で非樹状細胞との融合体を作製するのにそれを使用するための説明書、を含んでなるキット。
【請求項２２】
細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激する分子がサイトカインである、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激する分子がＩＬ−１２である、請求項２１に記載のキット。
【請求項２４】
電気融合に適したキュベットをさらに含む、請求項１８または２１に記載のキット。
【請求項２５】
樹状細胞が低温保存されている、請求項１８または２１に記載のキット。
【請求項２６】
一次細胞培養物から新しく単離または取得したばかりの非樹状細胞に融合された樹状細胞からなる融合細胞、および、細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激する分子を含んでなる医薬組成物。
【請求項２７】
細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激する分子がサイトカインである、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激する分子がＩＬ−１２である、請求項２６に記載のキット。
【請求項２９】
前記細胞がヒト由来である、請求項２６に記載の融合細胞。
【請求項３０】
非樹状細胞が腫瘍細胞である、請求項２６に記載の融合細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
１．序論
本発明は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答および／または体液性免疫応答を刺激するサイトカインまたはその他の分子と組み合わせて、自己樹状細胞と自己非樹状細胞の融合により形成された、治療有効量の融合細胞を投与することにより、癌および感染症を治療および予防するための方法および組成物に関する。
【０００２】
２．発明の背景
癌および／または感染症を治療または予防するのに有効な免疫治療用組成物の開発に大きな関心が寄せられている。このような免疫療法の成功には、非常に強力で、かつ、標的腫瘍または感染細胞に極めて特異的な免疫応答を誘発することができる組成物の開発が求められるであろう。
【０００３】
２．１　免疫応答
免疫系の細胞は、２つの主要な分化系統であるリンパ系統と骨髄系統を介して多能性幹細胞から発生する。リンパ系統は、Ｔ細胞やＢ細胞のようなリンパ球、ならびに、ナチュラルキラー細胞を生産するのに対し、骨髄系は、単球、マクロファージ、および好中球、ならびに、樹状細胞、血小板、およびマスト細胞などの他のアクセサリー細胞を生産する。リンパ系統のＴ細胞には２つの主要なタイプ：細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）とヘルパーＴ細胞があり、これらは胸腺において成熟して選択を受ける細胞であり、２つの表面マーカー、例えば、ＣＤ８（ＣＴＬ）またはＣＤ４（ヘルパーＴ細胞）のいずれかの存在により区別される。
【０００４】
リンパ球は循環して、脾臓やリンパ節などの二次リンパ器官中に捕獲される傾向がある侵入外来病原体および抗原を探索する。抗原は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって末梢中に取り込まれ、二次器官へと移動する。Ｔ細胞およびＡＰＣ間の相互作用により、複数のエフェクター経路（例えば、Ｂ細胞の活性化や抗体生産、ならびに、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ８＋ＣＴＬ）の活性化およびサイトカインのＴ細胞生産の刺激など）が誘発される。
【０００５】
ＣＴＬは次に、同じクラスＩ ＭＨＣ分子および、それらの活性化を初めに誘発した同じ抗原を保有する標的細胞を死滅させる。ＣＤ８＋ＣＴＬは、癌および病原体への抵抗、ならびに、同種移植片の拒絶において重要である（Ｔｅｒｓｔａｐｐｅｎら， １９９２， Ｂｌｏｏｄ ７９：６６６−６７７）。
【０００６】
抗原は、その起原が細胞内か細胞外かによって、２つの異なる経路によりプロセシングされる。細胞内または内在性タンパク質抗原は、腫瘍細胞を含む大部分の細胞型において発現されるクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子によりＣＤ８＋ＣＴＬに提示される。これに対し、細胞外抗原決定基は、例えば、クラスＩＩ ＭＨＣ分子によりＣＤ４＋「ヘルパー」Ｔ細胞に、樹状細胞やマクロファージのような「専門化」または「特殊化」ＡＰＣの細胞表面上で提示される（概要については、Ｗ．Ｅ． Ｐａｕｌ編、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， １９８４参照）。
【０００７】
クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子は、知られている最も多くの多型タンパク質である。ＭＨＣ分子のさらに高度の均質性は、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子の組合せによって生成され、ＭＨＣハプロタイプとして知られる。ヒトでは、単一の染色体に位置する３つの異なる遺伝子座である、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＣがクラスＩ分子をコードする。Ｔ細胞受容体は、抗原ペプチドとＭＨＣ分子の多型部分とからなる複合体に特異的に結合するため、Ｔ細胞は、異なる遺伝子型のＭＨＣ分子と出会う場合には応答が弱い。この特異性によって、ＭＨＣ拘束Ｔ細胞認識およびＴ細胞細胞傷害性の現象が生じる。
【０００８】
リンパ球は、末梢中を循環し、相応のシグナルと出会うとリンパ器官において「初回感作」される（ＢｒｅｔｓｃｈｅｒおよびＣｏｈｎ， １９７０， Ｓｃｉｅｎｃｅ １６９： １０４２−１０４９）。最初のシグナルは、Ｔ細胞受容体がＡＰＣの表面上のクラスＩ ＭＨＣにより提示される抗原ペプチドをとらえた後、このＴ細胞受容体を介して受け取られる。第２のシグナルは、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞または樹状細胞により生産されるインターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターフェロン−γ、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、およびインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）などの分泌化学シグナルまたはサイトカインにより提供されるか、または、Ｂ７（抗原提示細胞膜上に存在し、ヘルパーＴ細胞の細胞表面上の共受容体（ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）により認識される分子であり、ＩｇスーパーファミリーのメンバーでＣＤ２８と呼ばれる）のような原形質膜に結合した共刺激分子により提供される。インターフェロン−γおよびＩＬ−１２は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の発生を促進するＴＨ１として知られるヘルパーＴ細胞サブタイプに関連し、また、ＩＬ−４は、Ｂ細胞の発生および活性化を促進して抗体を産生するＴＨ２として知られるＴヘルパー細胞サブタイプに関連する。
【０００９】
抗原提示の間の抗原特異的相互作用に加えて、抗原非特異的な接着機構も機能する。これらは、Ｔリンパ球とＡＰＣとの結合を安定化させる。ＩＣＡＭ−１／ＣＤ５４、ＬＦＡ−３／ＣＤ５８、およびＢ７など、ＡＰＣ上の受容体分子は、Ｔ細胞上の対応する共受容体と結合する。
【００１０】
こうして、両方のシグナルを受けるヘルパーＴ細胞は活性化されて増殖し、多種多様なインターロイキンを分泌する。また、両シグナルを受けるＣＴＬは活性化されて標的細胞を死滅させる。しかし、共刺激（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）の不在下で最初のシグナルを受けるＴ細胞は、アネルギー状態となり、免疫寛容をもたらす（Ｌａｍｂら、１９８３， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １５７：１４３４−１４４７； Ｍｕｅｌｌｅｒら、１９８９， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｏｌ． ７：４４５−４８０；Ｓｃｈｗａｒｔｚ， １９９２， Ｃｅｌｌ ７１：１０６５−１０６８；ＭｕｅｌｌｅｒおよびＪｅｎｋｉｎｓ， １９９５， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７：３７５−３８１）。
【００１１】
２．２　癌に対する免疫療法
細胞傷害性Ｔ細胞応答は、抗原腫瘍細胞の増殖制御のための最も重要な宿主応答である（Ａｎｉｃｈｉｍｉら、１９８７， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ８：３８５−３８９）。実験動物腫瘍および自発的ヒト腫瘍に関する研究から、多くの腫瘍が、免疫応答を誘発し得る抗原を発現することがわかった。腫瘍に特有の抗原もあれば、腫瘍および正常細胞の両方に認められる抗原もある。複数の要因が、腫瘍の免疫原性に影響をあたえるが、例えば、関与する発癌因子の特定のタイプ、ならびに、宿主の免疫能および潜伏期間が挙げられる（Ｏｌｄら、１９６２， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １０１：８０−１０６；Ｂａｒｔｌｅｔｔ， １９７２， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ． Ｉｎｓｔ． ４９：４９３−５０４）。Ｔ細胞媒介免疫は、ウイルスおよび化学薬品により誘発された腫瘍の拒絶に決定的な重要性を持つことが明らかにされた（Ｋｌｅｉｎら、１９６０， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０：１５６１−１５７２；Ｔｅｂｅｔｈｉａら、１９７４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３：１４１７−１４２３）。
【００１２】
腫瘍の養子免疫療法は、抗腫瘍活性を有する免疫細胞を直接または間接のいずれかで、腫瘍担持宿主に投与することからなり、該細胞が樹立された腫瘍の退縮を起こすことを目的とする治療法を意味する。腫瘍細胞または腫瘍抗原を含む樹立された腫瘍、ならびに、自発的腫瘍を担持する宿主の免疫感作は、腫瘍がすでに免疫抑制応答を誘発した可能性があるため、無効であることが多い（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ， １９８７， 第１４章、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， 第６版、Ｓｔｉｔｅｓ， ＳｔｏｂｏおよびＷｅｌｌｓ編， ＡｐｐｌｅｔｏｎおよびＬａｎｇｅ、ｐｐ． １８６−１９６；Ｂｒｕｇｇｅｎ， １９９３）。従って、免疫療法の前に、腫瘍担持宿主において腫瘍塊を退縮させ、すべてのＴ細胞を消失させる必要があった（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、１９８３、ｐｐ．３０１−３３５、“Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”， Ｈｅｒｂｅｒｍａｎｎ ＲＲ， Ｍａｒｔｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ編）。
【００１３】
進行した腫瘍を担持する宿主を、腫瘍特異的同系Ｔ細胞の導入により治療することができるモデル動物が開発されている（Ｍｕｌｅら、１９８４， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２５：１４８７−１４８９）。米国立癌研究所（ＮＣＩ）の研究者らは、末梢血液リンパ球または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、すなわち、皮下リンパ節の生検由来のＴ細胞培養物の自家再注入を用いて、数種のヒト癌を治療している（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， Ｓ．Ａ． 米国特許第４，６９０，９１４号、１９８７年９月１日発行；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、１９８８， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３１９：１６７６−１６８０）。例えば、ＩＬ−２の存在下でｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させたＴＩＬを、養子的に癌患者に導入すると、転移性黒色腫を有する選択患者において腫瘍退縮が起こった。ＩＬ−２で増殖させた黒色腫ＴＩＬは、ＣＤ３＋活性化Ｔリンパ球として同定されており、これらは、主として、ユニークなｉｎ ｖｉｔｒｏ抗腫瘍特性を有するＣＤ８＋細胞である。多くの長期黒色腫ＴＩＬ培養物は、特定のクラスＩ ＭＨＣおよびＴ細胞抗原受容体に依存する様式で自己腫瘍を溶解する（Ｔｏｐａｌｉａｎら、１９８９， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４２：３７１４）。
【００１４】
これらのヒト癌治療法の応用は、患者に存在する特定セットの腫瘍反応性リンパ球を単離し、これらの細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた後、複数回の注入により宿主に戻すことを含んでなる。ＩＬ−２の存在下で増殖させたＴ細胞は、生存のために、ＩＬ−２に依存することから、細胞導入後のＩＬ−２の注入により、Ｔ細胞の生存を引き延ばし、培養したＴ細胞の治療効果を高めることができる（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、１９８７， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３１６：８８９−８９７）。しかし、高用量のＩＬ−２および活性化リンパ球治療の毒性は相当あり、例えば、高熱、低血圧、毛細血管漏出症候群による内皮壁への損傷、ならびに、不整脈および心筋梗塞などの様々な有害な心臓症状が挙げられる（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、１９８８， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３１９：１６７６−１６８０）。さらに、ＴＩＬの産生に求められる高度の専門技術、必要な材料の量、ならびに、重度の有害な副作用のために、これらの技法の使用は専門化された治療センターに制限されている。
【００１５】
クラスＩ ＭＨＣ−ペプチド複合体に特異的なＣＴＬは癌およびウイルス感染の治療に用いることができ、ｉｎ ｖｉｖｏ初回感作の必要性なしに、ｉｎ ｖｉｔｒｏでそれらを生産する方法が探求されてきた。このような方法として、適当な抗原でパルスした樹状細胞（Ｉｎａｂａら、１９８７， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６６：１８２−１９４； Ｍａｃａｔｏｎｉａら、１９８９， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６９：１２５５−１２６４；Ｄｅ Ｂｒｕｉｊｎら、１９９２， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２２：３０１３−３０２０）、ペプチドをロードしたＲＭＡ−Ｓ細胞（多数の「エンプティー（ｅｍｐｔｙ）」細胞表面クラスＩ ＭＨＣ分子を発現する突然変異型細胞）（Ｄｅ Ｂｒｕｉｊｎら、１９９１， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｎｏｌ． ２１：２９６３−２９７０；Ｄｅ Ｂｒｕｉｊｎら、１９９２， 前掲；Ｈｏｕｂｉｅｒｓら、１９９３， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２６：２０７２−２０７７）およびマクロファージにより貧食されたペプチドをロードしたビーズ（Ｄｅ Ｂｒｕｉｊｎら、１９９５， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｎｏｌ． ２５， １２７４−１２８５）の使用が挙げられる。
【００１６】
腫瘍細胞とＢ細胞または樹状細胞との融合体は、モデル動物において抗腫瘍免疫応答を誘発することがすでに証明されている（Ｇｕｏら、１９９４， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６３：５１８−５２０；ＳｔｕｈｌｅｒおよびＷａｌｄｅｎ， １９９４， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｔｏｔｈｅｒ． １９９４， ３９：３４２−３４５；Ｇｏｎｇら、１９９７， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ３：５５８−５６１；Ｃｅｌｌｕｚｚｉ， １９９８， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０：３０８１−３０８５；Ｇｏｎｇ， ＰＣＴ公開ＷＯ９８／４６７８５、１９９８年１０月２３日付）。特に、腫瘍細胞と抗原提示細胞のハイブリッドによる免疫感作は、多様なモデルげっ歯類において防御免疫をもたらすことが明らかにされている。
【００１７】
しかし、現在の治療は、防御免疫を刺激するが、樹立された疾患をすでに有する患者を常に効果的に治療するとは限らない。すなわち、疾患を有する患者に融合細胞を投与しても、疾患を排除するのに十分な免疫応答を常に刺激するわけではない。従って、治療する、例えば、患者に存在する疾患（例えば、癌または感染症）の退縮を引き起こすのに用いることができる治療用組成物が求められている。
【００１８】
参考文献の引用または考察は、それらが本発明の従来技術であることの容認として解釈されるべきでない。
【００１９】
３．発明の概要
本発明は、ＣＴＬおよび／または体液性免疫応答を刺激する分子と組み合わせて、自己樹状細胞と自己非樹状細胞との融合により形成された融合細胞を用いて、癌および感染症を治療する方法に関する。本発明は、一部には、自己樹状細胞（ＤＣ）と自己腫瘍細胞との融合細胞が、ＣＴＬおよび／または体液性免疫応答を刺激する分子と組み合わせて投与されると、癌に対して増強された免疫応答を引き出すという発見および証明に基づいている。このような融合細胞は、ＤＣの強力な免疫刺激効果と、腫瘍細胞の特異的抗原性とを組み合わせることによって、特異的かつ強力な免疫応答を誘発するが、この応答は、免疫賦活因子、例えば、ＣＴＬおよび／または体液性応答を刺激するサイトカインの共投与によりさらに増強される。
【００２０】
本発明は、自己樹状細胞と自己非樹状細胞とからなる融合細胞と、ＣＴＬおよび／または体液性応答を刺激するサイトカインまたはその他の分子との共投与を提供し、これによって、治療処置の有効性が有意に増強される。
【００２１】
好ましい実施形態では、本発明は、癌および感染症からなる群より選択される哺乳動物における病状を治療する方法であって、このような治療を必要とする哺乳動物に、ＣＴＬおよび／または体液性免疫応答を刺激する分子と組み合わせて、自己樹状細胞と自己非樹状細胞との融合により形成された融合細胞の治療有効量を投与することを含んでなる方法を提供する。
【００２２】
別の実施形態では、ＣＴＬおよび／または体液性免疫応答の共刺激物質（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）は、該刺激物質をコードする遺伝物質で上記融合細胞をトランスフェクトすることにより提供される。
【００２３】
別の実施形態では、上記非樹状細胞は、哺乳動物から得られた腫瘍細胞である。別の実施形態では、上記非樹状細胞は、上記融合細胞を投与しようとする哺乳動物から得られた原発性腫瘍細胞由来の腫瘍細胞系である。
【００２４】
別の実施形態では、上記非樹状細胞は、腫瘍特異的抗原の抗原性を示す１以上の抗原で形質転換された組換え細胞である。
【００２５】
別の実施形態では、上記非樹状細胞は、病原体の抗原の抗原性を示す１以上の抗原で形質転換された組換え細胞である。
【００２６】
別の実施形態では、上記哺乳動物はヒトである。
【００２７】
別の実施形態では、上記哺乳動物はヒト以外、例えば非ヒト霊長類であり、または非ヒト哺乳動物は、ウシ、ウマ、ブタなどの家畜、またはネコもしくはイヌのようなペットである。
【００２８】
好ましい実施形態では、免疫応答刺激分子はインターロイキン１２（ＩＬ−１２）である。別の実施形態では、免疫応答刺激分子はＩＬ−１５である。別の実施形態では、免疫刺激分子はＩＬ−１８である。別の実施形態では、免疫刺激分子はＩＦＮ−γである。それ以外のサイトカインとして、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターフェロンα（ＩＦＮα）、インターフェロンβ（ＩＦＮβ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、ならびに、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）。
【００２９】
さらに別の実施形態では、免疫刺激または誘発分子は、抗ＩＬ−４抗体であり、該抗体は、ＴＨ２細胞の形成を阻害することにより、細胞傷害性Ｔ細胞、すなわち、ＴＨ１細胞に向けてＴ細胞発生を偏らせ、このようにしてＣＴＬ応答を促進する。
【００３０】
一実施形態では、ＣＴＬおよび／または体液性免疫応答刺激または誘発分子は、例えば、様々なアッセイ（限定するものではないが、５１Ｃｒ放出アッセイや、活性化ＣＴＬによるＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の分泌の測定など）で測定されるような、Ｔ細胞を刺激する分子の能力により決定される免疫応答を誘発する分子である。
【００３１】
別の実施形態では、ＣＴＬおよび／または体液性免疫応答は、免疫応答を誘発するサイトカインおよび／または分子の組合せにより刺激または誘発される。
【００３２】
別の実施形態では、ＣＴＬおよび／または体液性免疫応答刺激分子は、サイトカイン受容体の下流にあるシグナル伝達因子、例えば、ＳＴＡＴ４を活性化する。
【００３３】
別の実施形態では、サイトカインはヒトサイトカインである。
【００３４】
別の実施形態では、上記癌は、腎細胞癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨形成肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢腺癌、髄様癌、気管支癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮癌、胎生期癌、ウィルムス腫、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、グリオーマ、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、欠突起グリオーマ、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽腫、白血病、急性リンパ性白血病、急性髄膜性白血病、慢性白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、およびＨ鎖病からなる群より選択される。
【００３５】
別の実施形態では、樹状細胞と非樹状細胞との融合体を作製する方法であって：（ａ）哺乳動物由来の自己樹状細胞の集団および自己非樹状細胞の集団を、細胞融合を促進する条件に付した後、（ｂ）融合細胞の集団を不活性化することからなる方法を提供する。別の実施形態では、細胞融合は電気融合により達成される。別の実施形態では、融合細胞の集団の不活性化は細胞にγ線を照射することにより達成される。好ましい実施形態では、本発明は、ヒト樹状細胞と、該樹状細胞に自系の非樹状細胞との融合体を作製する方法を提供する。非樹状細胞は、被験者から新しく単離してもよいし、あるいは、一次細胞培養物または樹立細胞系から取得することもできる。
【００３６】
別の実施形態では、本発明は、非樹状細胞と融合させた樹状細胞からなる融合細胞を提供する。好ましい実施形態では、樹状および非樹状細胞のいずれもヒト由来である。本発明はまた、少なくとも１０％〜１５％の細胞が融合している、好ましくは、１５％〜２０％の細胞が融合している、融合細胞の集団も包含する。
【００３７】
本明細書で用いる場合、サイトカインなどの化合物は、融合細胞のような別の化合物と「共投与する」または「組み合わせる」といわれるが、この場合、両化合物の生理学的作用または両化合物の上昇した血清濃度は同時に測定することが可能である。内因的生産のレベルを高める化合物については、内因的に生産されたサイトカインおよびその他の投与物質（すなわち、融合細胞）の血清濃度も、両者を「共投与する」または「組み合わせる」とき、同時に測定することができる。従って、化合物は、個別のもしくは混合した組成物として同時に投与してもよいし、あるいは、それらのレベルの上昇が投与中の任意の時点で同時に測定することができれば、逐次的に投与してもよい。
【００３８】
別途記載のない限り、「組合せ療法」および「組合せ治療」という用語は、被験者由来の融合細胞と、ＣＴＬ応答および／または体液性免疫応答を刺激する分子の共投与を含んでなり、疾患状態を軽減させる治療計画を表すために本明細書中で用いる。疾患状態の軽減は、例えば、患者における腫瘍塊の縮小、腫瘍細胞数の減少、または肝炎やヒト免疫不全ウイルスに感染した患者でのウイルス量の減少の証明により測定することができる。
【００３９】
別の実施形態では、本発明は、１以上の容器に、樹状細胞の集団を含むサンプル、および、癌または感染症の治療または予防にそれを使用するための説明書を含んでなるキットを提供する。別の実施形態では、上記キットは、電気融合に適したキュベットをさらに含む。別の実施形態では、上記樹状細胞は低温保存されている。
【００４０】
４．図面の説明
図１Ａ〜Ｃ．　ＦＣのＦＡＣＳ分析である。（Ａ）ＤＣをＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８０抗体で染色した。合計３４％のＤＣが抗ＣＤ８０モノクローナル抗体で染色された。（Ｂ）ＰＫＨ２６をグリオーマ細胞に組み込んだ。グリオーマ細胞の９５％以上がＰＫＨ２６について陽性であった。（Ｃ）ＰＫＨ２６をグリオーマ細胞に組み込んだ後、ＤＣとグリオーマ細胞を融合させた。ＤＣをＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８０モノクローナル抗体で染色した。細胞の合計３９．９％がＰＫＨ２６およびＣＤ８０の両方について陽性であったが、これは、ほとんどのＤＣがグリオーマ細胞と融合されたことを示す。
【００４１】
図２Ａ〜Ｂ．　ＦＣによる免疫感作の抗腫瘍作用。（Ａ）ＦＣ（▲）、ＤＣ（▲）、または対照としての照射済親細胞（●）を０および７日目に同系マウスに皮下注射した（各グループにおいてｎ＝１１）。１４日目に、１×１０６個の親細胞を側腹部に皮下接種した。接種した腫瘍細胞は、照射済親細胞を注射したすべてのマウスにおいて、２週間以内に大きな腫瘍を発生させた。対照的に、ＦＣで免疫感作したマウスで６週間以内に死亡したものは一匹もなかった。ＤＣで免疫感作した１１匹のマウスのうち６匹が触知可能な腫瘍を発生し、これが後に成長したが、ＦＣで免疫感作した１１匹のマウスのうち、触知可能な腫瘍を発生したものは一匹もなかった。（Ｂ）０および７日目にＦＣを免疫感作した後、脳（生後１４日）の右前葉に１×１０４個の腫瘍細胞を定位接種した。ＦＣで免疫感作したマウスの半数が７０日以上生存した（▲；各グループでｎ＝２０；ｐ＜０．００１）（図２Ｂ）。対照マウスはすべて６週間以内に死亡した（●）。
【００４２】
図３．　ＦＣおよびｒＩＬ−１２で処理した後のマウスの生存。脳（生後０日）の右前葉に親細胞（１×１０４個）を定位接種した。５および１２日目に、３×１０５個のＦＣを皮下接種した。数匹のマウスには、０．５ｐｇ／１００μｌのｒｍＩＬ−１２、または１００μｌの食塩水を、５日目から２週間にわたって１日おきに腹腔内注射し、７０日間観察した。ＦＣだけのワクチン接種では、腫瘍担持マウスの生存は延びなかった（▲；ｐ＞０．０５）のに対し、ＦＣおよびｒＩＬ−１２両方のワクチン接種では、対照（△；ｐ＝０．０１）と比較して生存が長くなった。ＦＣおよびｒＩＬ−１２で処理した１０匹のマウスのうち５匹は、７０日以上生存した。
【００４３】
図４．　腫瘍担持マウス由来の脾細胞の細胞傷害性。未処理マウス（●）、ｒＩＬ−１２だけを注射したマウス（△）、ＤＣを２回注射したマウス（生後０および７日；▲）、ＦＣで１回（生後０日；○）または２回（生後０および７日；■）免疫感作したマウス、ならびに、ｒＩＬ−１２およびＦＣで２回免疫感作したマウス（生後０および７日；□）から、２８日目にＳＰＣを分離した。免疫感作したマウス（特に、ｒＩＬ−１２を注射し、かつＦＣで２回免疫感作したマウス）由来の腫瘍細胞に対するＣＴＬ活性は、対照およびその他と比較して著しく高かった。処理マウス由来のＹａｃ−１細胞に対する抗腫瘍活性は、対照と比較して高かったが、それほど顕著ではなかった（データは示していない）。
【００４４】
図５．　ＦＣによるワクチン接種およびＴ細胞サブセットの枯渇後の樹立皮下腫瘍の退縮。グリオーマ細胞およびＦＣの注射を受けたマウスに、抗ＣＤ４（△）、抗ＣＤ８（▲）、抗アシアロＧＭ１（○）、または対照ラットＩｇＧ（■）を投与することにより、リンパ球サブセットを枯渇させた。０および７日目に、ＦＣを側腹部に皮下接種した。次に、１４日目に、反対側の側腹部に親細胞を接種した。７、１０、１４および１７日目に、ｍＡｂを腹腔内注射した。抗腫瘍作用は、ＣＤ８＋Ｔ細胞（▲）を枯渇させたマウスで低下した（各グループでｎ＝４）。ＦＣが賦与した防御は、ＣＤ４＋ＴおよびＮＫ細胞の枯渇によって破壊されなかった。対照マウスには、ＦＣを接種しなかった（○）。データは、平均＋ＳＤを示す。
【００４５】
図６Ａ〜Ｄ．　発生した脳腫瘍の免疫蛍光分析。非ワクチン接種マウスの腫瘍には、少数のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞しか存在しなかった（図６Ａ、Ｂ）。対照的に、ワクチン接種したマウスの腫瘍には、多数のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞が存在した（図６Ｃ、Ｄ）。浸潤ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、ほとんど同じであった。ＳＲ−Ｂ１０．Ａ細胞はＧＦＡＰについて陽性であった。
【００４６】
図７．　ＰＥＧ処理細胞のうち、ＦＩＴＣ（緑色）およびＰＫＨ−２６（赤色）で染色された融合細胞。
【００４７】
図８．　ＦＡＣＳ分析。ＰＫＨ−２ＧＬおよびＰＫＨ−２６の両方で染色された細胞（ＤＣとＢＮＬ細胞の融合体であると考えられる）を、高前方散乱と高側方散乱を含む細胞散布図の上方領域に示す。高および中前方散乱および低側方散乱の細胞画分は、多数の非融合ＢＮＬ細胞を含み、低前方散乱および低側方散乱の細胞画分は、非融合ＤＣと非融合ＢＮＬ細胞を含んでいた。散布図全体を占める二重陽性細胞の領域の幅から判断すると、非付着細胞の約３０％が融合体であった。
【００４８】
図９．　散布図にゲートさせ（ｇａｔｅｄ）、抗原発現について調べた、ＰＫＨ−２ＧＬおよびＰＫＨ−２６の両方について陽性の細胞画分のＦＡＣＳ分析。ＤＣ上に存在する、Ｉ−Ａｄ／Ｉ−Ｅｄ（ＭＨＣクラスＩＩ）、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ５４分子が融合体により発現された。
【００４９】
図１０．　走査型電子顕微鏡検査では、ＢＮＬ細胞が平滑な細胞表面上に短い突起を発現するのに対し、ＤＣは多数の長い樹状突起を有する。非付着融合細胞は大きく、楕円状をして、短い樹状突起を有する。
【００５０】
図１１．　ＤＣ／ＢＮＬ融合体でマウスにワクチン接種すると、ＢＡＬＢ／ｃマウスに接種したＢＮＬ細胞によるチャレンジの拒絶が起こった。対照的に、ＤＣだけまたは照射済ＢＮＬ細胞だけの注射では、腫瘍の発生および成長を防止することができなかった。
【００５１】
図１２．　ＣＴＬのクロム５１放出アッセイ。ＢＮＬ腫瘍に対するＤＣ／ＢＮＬ融合細胞だけによる処理の効果は顕著ではなかった。しかし、ＤＣ／ＢＮＬ融合体の注射に続いてＩＬ−１２を投与すると、顕著な抗腫瘍作用を誘発した。
【００５２】
図１３．　ＣＤ／ＢＮＬ融合体で処理したマウス由来の脾細胞を用いて、ＢＮＬ細胞に対する顕著な細胞溶解活性が認められた。黒塗りの棒はＢＮＬ細胞であり、斜線の棒はＣ２６細胞である。
【００５３】
図１４．　ＩＬ−１２と組み合わせて、ＣＤ／ＢＮＬ融合体で処理したマウス由来の脾細胞は、ＣＤ／ＢＮＬ融合体だけで処理したものと比較して、高い細胞溶解活性を示した。
【００５４】
図１５．　ＣＤ４に対する抗体で処理した脾細胞の細胞溶解活性は有意に低下したが、ＣＤ８に対する抗体で処理したものは、イソタイプが同じ抗体であるラットＩｇＧ２ａで処理したものとほぼ同じ溶解活性を示した。
【００５５】
５．発明の開示
本発明は、自己樹状細胞と自己非樹状細胞との融合により調製される、癌および感染症の治療用組成物に関する方法および組成物を提供する。次に、細胞傷害性Ｔリンパ球応答（ＣＴＬ）を刺激する分子の治療有効量と組み合わせて、上記融合細胞を、それが必要な被験者に投与する。好ましい実施形態では、本発明は、ＩＬ−１２と組み合わせて、治療に有効な量の融合細胞を含んでなる、癌および感染症治療のための方法および組成物に関する。
【００５６】
本明細書に記載した方法を用いて、自己樹状細胞を、癌抗原のような目的の抗原を含む非樹状細胞と融合させることができる。こうして得られた樹状細胞と非樹状細胞のハイブリッドは、癌または感染症のような抗原が関係する疾患状態に対する強力な組成物として使用することが可能である。この手法は、多くの癌のケースのように、特定の抗原が容易に同定できない場合に特に有利である。ヒト癌の治療のためには、例えば、非樹状細胞を患者の腫瘍から直接得ることができる。このようにして調製された融合細胞組成物は、治療すべき個々の腫瘍に対して高度に特異的である。
【００５７】
このような免疫治療用組成物に関する組成物および方法を以下に記載する。特に、５．１節、５．２節および５．３節では、それぞれ、本発明で用いる非樹状細胞、樹状細胞、および融合細胞、ならびに、それらの単離、調製、および／または作製方法を説明する。このような組成物を用いて、治療または予防することができる標的癌および感染症は、以下の５．４節および５．５節に記載する。５．６節は、癌および感染症に対する治療用組成物としてのこれら融合細胞に関する方法および使用を説明する。
【００５８】
５．１　非樹状細胞
本発明の非樹状細胞は、融合細胞−サイトカイン組成物で使用される、目的の抗原を担持するどのような細胞でもよい。このような非樹状細胞は、癌患者の腫瘍または感染症に感染した被験者など、様々な所望の被検体から単離することができる。非樹状細胞は、樹立細胞系または一次細胞培養物に由来するものでもよい。非樹状細胞の単離および調製方法について、以下に詳しく説明する。
【００５９】
非樹状細胞の供給源は、上記抗原が関係する疾患の種類に応じて、選択することができる。好ましくは、非樹状細胞は、治療対象の被験者に由来するものである。すなわち、用いる細胞は、最終標的細胞（例えば、阻害するのが望ましい、意図するレシピエントの腫瘍細胞）の細胞からｉｎ ｖｉｖｏで得られる。このようにして、全癌細胞またはその他の非樹状細胞を本発明の方法で用いることができるため、本発明の方法を実施する前に、これらの抗原を単離し、その正体を特徴付けしたり、知る必要はない。そして、細胞上に存在する少なくとも１つの抗原が標的細胞に特異的な抗原であるかぎり、また、非樹状細胞が治療対象の哺乳動物と同じクラスＩ ＭＨＣハプロタイプを有するかぎり、どのような非樹状細胞を用いてもよい。
【００６０】
癌の治療または予防の場合には、非樹状細胞が癌細胞である。この実施形態では、本発明は、癌細胞により発現される抗原、例えば、腫瘍特異的抗原および腫瘍関連抗原を発現し、このような癌細胞に対して免疫応答を誘発することができる融合細胞を提供する。本発明の一実施形態では、複数の部位に転移した癌を含む癌から単離した組織または細胞を非樹状細胞の調製に用いることができる。例えば、血液、リンパまたはその他の体液中を循環する白血病細胞を用いることができ、固形腫瘍組織（例えば、生検からの一次組織）を用いることができる。本発明の方法で治療可能な癌の例を下記の５．５節、５．６節に記載する。
【００６１】
好ましい実施形態では、腫瘍細胞は新しく単離したものではなく、その代わり、培養下で樹状細胞と融合させるべき腫瘍細胞を選択することによって、融合させるべき細胞の健康な非癌性または非感染細胞による汚染を防止または制限することが意図される。
【００６２】
好ましい実施形態では、本発明の非樹状細胞は、ハイブリッド細胞組成物のレシピエントとなる哺乳動物から外科手術により摘出した腫瘍から単離することができる。使用に先立って、固形癌細胞または塊状癌細胞を標準的技法により単細胞懸濁体へと、好ましくは機械的に、分散させる必要がある。限定するものではないが、コロゲナーゼやＤＮアーゼなどの酵素を用いて、癌細胞を分散させることができる。さらに別の好ましい実施形態では、本発明の非樹状細胞は、一次細胞培養物、すなわち、生体から取得した最初の細胞の培養物である。典型的には、約１×１０６〜１×１０９個の非樹状細胞を融合細胞の形成に用いる。
【００６３】
一実施形態では、約１×１０６〜１×１０９個の非樹状細胞を融合細胞の形成に用いる。別の実施形態では、５×１０７〜２×１０８個の細胞を用いる。さらに別の実施形態では、５×１０７個の非樹状細胞を用いる。
【００６４】
また、細胞系の細胞が、非樹状細胞上の目的の抗原と同じ抗原決定基を有するのであれば、癌または感染細胞もしくは組織に由来する細胞系を非樹状細胞として用いることもできる。ヒト由来の癌もしくは感染組織、細胞または細胞系が好ましい。
【００６５】
別の実施形態では、癌細胞である好適な非樹状細胞を調製するために、好ましくは、阻害しようとする癌と同じ細胞型の非癌性細胞を、レシピエントから、あるいは、あまり好ましくないが、意図するレシピエントと少なくとも１つのＭＨＣ対立遺伝子を共有するその他の個体から、単離した後、特定のもしくは類似した癌または形質転換状態を引き起こす因子で処理することができる。このような因子として、限定するものではないが、放射線、化学的発癌物質、およびウイルスが挙げられる。標準的技法を用いて、細胞を処理し、そのようにして調製した癌細胞または形質転換細胞を増殖させることができる。
【００６６】
別の実施形態では、感染症の治療および予防のために、病原体、特に、ウイルス、細菌、寄生体、または原生動物のような細胞内病原体の抗原性を有する抗原を用いることができる。一実施形態では、例えば、病原体に感染した細胞を用いる。別の実施形態では、病原体の抗原性を有する抗原を発現するように組換えにより作製した細胞を用いる。本発明の方法で治療または予防することができる感染症例の一覧を以下の５．６節に示す。
【００６７】
あるいは、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原または病原体の抗原をコードする遺伝子が利用可能であれば、意図するレシピエントからの好適な細胞型の正常細胞を用いることができる。場合によっては、当業者には理解されるように、この方法でレシピエントの細胞に２以上の抗原を発現させることができ、Ａｕｓｕｂｅｌら（編、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ニューヨーク）に記載されているものなど、公知の技法を用いて、レシピエントの細胞における抗原遺伝子の形質転換またはトランスフェクションおよびその後の組換え発現を実施することが可能である。レシピエントと共通の１以上のＭＨＣ分子を担持するこれらの非樹状細胞は、本発明の融合細胞の形成方法で使用するのに適している。
【００６８】
融合細胞の調製に用いる非樹状細胞および標的腫瘍または病原体感染細胞が、哺乳動物に免疫応答を誘発するためには、少なくとも１つの共通のＭＨＣ対立遺伝子を含んでいなければならない。非樹状細胞は意図するレシピエントに由来するもの（すなわち、自己であるもの）が最も好ましい。あまり好ましくはないが、非樹状細胞は非自己であるが、レシピエントの癌細胞と少なくとも１つのＭＨＣ対立遺伝子を共有するものである。非樹状細胞が同じまたは同系の個体から得られる場合には、このような細胞はすべて同じクラスＩ ＭＨＣハプロタイプを有することになる。これらの細胞すべてが同じ被験者に由来するわけではない場合には、ＭＨＣハプロタイプは、血清学試験やＭＨＣ遺伝子座のＤＮＡ分析など、当業者にはよく知られた標準的ＨＬＡタイピング技法により決定することができる。ＭＨＣハロタイプの決定は、本発明の融合細胞の調製方法を実施する前に着手する必要はない。
【００６９】
癌細胞または感染症細胞の抗原性を有する抗原を含む細胞などの非樹状細胞は、当業者には公知のどのような方法によっても同定および単離することができる。例えば、癌または感染細胞は、形態学、酵素アッセイ、増殖アッセイにより、または発癌性ウイルスの存在により同定することができる。目的の抗原の特徴がわかれば、非樹状細胞はまた、当業者には公知の生化学または免疫学的方法により同定または単離することが可能である。例えば、癌細胞または感染細胞は、手術、内視鏡検査、その他の生検技法、アフィニティークロマトグラフィー、および蛍光活性化セルソーティング（例えば、細胞により発現された抗原に対する蛍光標識抗体を使用）により単離することができる。
【００７０】
非樹状細胞のクローン集団または均質集団または精製集団を用いなければならないという要件はない。混合物中の大部分の細胞が標的とすべき腫瘍細胞上に存在する抗原を含んでいれば、細胞の混合物を用いることができる。特定の実施形態では、非樹状細胞および／または樹状細胞を精製する。
【００７１】
５．２　樹状細胞
樹状細胞は、被験者の血液もしくは骨髄、または二次リンパ器官、例えば、限定するものではないが、脾臓、リンパ節、腸のパイアー斑、および骨髄などから、当技術分野では公知のどのような方法でも、単離または調製することができる。好ましくは、本発明の方法で用いられるＤＣは、（最終的に分化した）樹状細胞である。樹状細胞の供給源は、好ましくは、ヒト血液単球である。
【００７２】
このような供給源から得られる免疫細胞は、典型的には、分化および成熟の様々な段階の再循環するリンパ球およびマクロファージを主に含んでいる。樹状細胞調製物は、標準的技法（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ７．３２．１−７．３２．１６， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９７参照）により富化することができる。一実施形態では、例えば、Ｔ細胞および付着細胞を枯渇させた後、密度勾配遠心分離を実施することによりＤＣを富化する。随意に、蛍光標識細胞を選別するか、または抗ＣＤ８３モノクローナル抗体磁気ビーズを用いることによって、ＤＣをさらに精製してもよい。
【００７３】
あるいはまた、血液サンプルまたは骨髄中に存在するＤＣ前駆細胞を、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）やインターロイキン−４（ＩＬ−４）のようなサイトカインで処理することにより、ＤＣの比較的均質な集団を高収率で取得することができる。そのような条件下で、単球は、細胞増殖せずに、樹状細胞に分化する。ＴＮＦαのような因子でさらに処理すると、ＤＣの最終的分化が刺激される。
【００７４】
例として、限定するものではないが、下記のようにして血液単球から樹状細胞を取得することができる。すなわち、末梢血単球を標準的方法（例えば、Ｓａｌｌｕｓｔｏら、１９９４， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７９：１１０９−１１１８参照）により取得する。フィコール−パック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）密度勾配遠心分離およびプラスチック付着を用いて、白血球搬出パックまたはバッフィーコート調製により健康な提供者から白血球を収集する。成熟したＤＣを所望する場合には、下記のプロトコルを用いてＤＣを培養することができる。細胞をプラスチック皿に３７℃で４時間付着させる。非付着細胞を除去した後、０．１μｇ／ｍｌの顆粒球−単球コロニー刺激因子と０．０５μｇ／ｍｌのインターロイキン−４を含む培地において、付着単球を７日間培養する。樹状細胞を調製するために、腫瘍壊死因子−αを５日目に添加し、７日目に細胞を収集する。
【００７５】
このようにして取得した樹状細胞は、特徴として、細胞表面マーカーＣＤ８３を発現する。加えて、このような細胞は、特徴として、高レベルのＭＨＣクラスＩＩ分子、ならびに、細胞表面マーカーＣＤ１α、ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＣＤ５４、およびＣＤ８０を発現するが、ＣＤ１４は発現しない。その他の細胞表面マーカーとして、Ｔ細胞マーカーＣＤ２およびＣＤ５、Ｂ細胞マーカーＣＤ７および骨髄性細胞マーカーＣＤ１３、ＣＤ３２（ＦｃγＲ ＩＩ）、ＣＤ３３、ＣＤ３６、およびＣＤ６３、ならびに、多数の白血球関連抗原が挙げられる。
【００７６】
随意に、形態学的観察および免疫化学的染色などの標準的技法を用いて、樹状細胞の存在を確認することができる。例えば、樹状細胞の純度は、上に挙げた特徴的細胞表面マーカー、例えば、ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１α、ＣＤ４０、および／またはＣＤ５４のうちの１以上に対する蛍光色素標識抗体を用いたフローサイトメトリーにより評価することができる。また、この技法を用いて、未熟なうちは存在するがＤＣには存在しないＣＤ１４に対する蛍光色素標識抗体を用いて、ＤＣと未熟なＤＣを識別することができる。
【００７７】
５．３　融合細胞の作製
下記のようにして、非樹状細胞を自己ＤＣに融合させることができる。融合の前に、細胞を滅菌洗浄する。癌または感染症の治療を目的とする哺乳動物への注射に適した融合細胞の混合物が得られる技法であれば、どのような細胞融合法によっても融合を達成することができる。好ましくは、電気融合を用いる。電気融合法は当技術分野ではよく知られている（ＳｔｕｈｌｅｒおよびＷａｌｄｅｎ， １９９４， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ３９：３４２−３４５；Ｃｈａｎｇら（編）、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９２参照）。
【００７８】
好ましい実施形態では、下記のプロトコルを用いる。第１の段階で、約５×１０７個の腫瘍細胞と約５×１０７個の樹状細胞（ＤＣ）を０．３Ｍグルコース中に懸濁させた後、電気融合キュベットに移す。このサンプルを誘電泳動により整列させ、細胞サンプルに１００Ｖ／ｃｍで５〜１０秒間パルスすることによって細胞−細胞コンジュゲートを形成する。随意に、電気穿孔キュベットの１面に１滴の誘電ワックスを塗って電界を「不均質化」させ、こうして、細胞を最も高い電界強度の領域に向けることによって、整列を最適化してもよい。第２段階では、融合パルスをかける。電気融合には各種パラメーターを用いることができる。例えば、一実施形態では、融合パルスは単一パルスから三重パルスまでのものでよい。別の実施形態では、電気融合は約２５μＦで、５００〜１，５００Ｖ／ｃｍ、好ましくは１，２００Ｖ／ｃｍを用いて行う。
【００７９】
別の実施形態では、下記プロトコルを用いる。第１に、骨髄を単離し、赤血球を塩化アンモニウムで溶解させる（Ｓｉｇｍａ、ミズリー州セントルイス）。リンパ球、顆粒球およびＤＣを骨髄細胞から枯渇させ、残った細胞を２４ウェル培養プレート（１×１０６細胞／ウェル）においてＲＰＭＩ １６４０培地で平板培養するが、その際、上記培地には、５％熱不活性化ＦＢＳ、５０μＭの２−メルカプトエタノール、２ｍＭグルタメート、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｐｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０ｎｇ／ｍｌ組換えマウス顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州サンホセ）および３０Ｕ／ｍｌ組換えマウスインターロイキン−４（ＩＬ−４；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を補充する。第２に、培養５日目に、非付着細胞とゆるく付着している細胞を収集し、１００ｍｍペトリ皿（１×１０６細胞／ｍｉ；１０ｍｌ／皿）上で再培養する。次に、ＲＰＭＩ培地中のＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を細胞に添加し、１×１０６個のＤＣを３×１０６個の照射済（５０Ｇｙ、Ｈｉｔａｃｈｉ ＭＢＲ−１５２０Ｒ、線量：１．１ Ｇｙ／分）ＳＲ−Ｂ１０．Ａ細胞と混合する。４８時間後、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ；Ｓｉｇｍａ）の５０％溶液５００μｌを６０秒にわたり滴下しながら添加することにより、融合を開始する。無血清ＲＰＭＩ培地の段階的添加により融合を停止させる。１００ｍｍペトリ皿においてＲＰＭＩ培地中ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下に融合細胞を４８時間平板培養する。
【００８０】
別の実施形態では、樹状細胞と非樹状細胞を前記のように融合させる。次に、融合細胞を、ＣＴＬおよび／または体液性免疫応答を刺激する分子をコードする遺伝物質でトランスフェクトする。好ましい実施形態では、上記遺伝物質は、ＩＬ−１２をコードするｍＲＮＡである。トランスフェクションの好ましい方法として、電気穿孔またはカチオン性ポリマーがある。
【００８１】
抗原細胞と樹状細胞の集団内での融合細胞形成の程度は、当技術分野では公知の多数の診断技法により決定することができる。一実施形態では、例えば、ＤＣおよび腫瘍細胞を赤色および緑色細胞内蛍光染料でそれぞれ標識した後、二色の発光によりハイブリッドを識別する。腫瘍を含まないＤＣ、およびＤＣを含まない腫瘍細胞のサンプル、ならびに、電気融合に付していない腫瘍＋ＤＣ混合物を陰性対照として用いることができる。
【００８２】
患者に融合細胞−サイトカイン組成物を導入する前に、例えば、照射により、融合細胞を不活性化し、腫瘍が増殖するのを防止する。好ましくは、細胞を２００Ｇγで照射し、これ以上の選択なしに、注射する。一実施形態では、この方法で調製された融合細胞は、全細胞集団の約１０および２０％を占める。さらに別の実施形態では、この方法で調製された融合細胞は、全細胞集団の約５〜５０％を占める。
【００８３】
５．３．１　組換え細胞
別の実施形態では、樹状細胞を癌細胞または感染細胞に融合するのではなく、非樹状細胞を、癌または病原体の既知抗原をコードする遺伝子でトランスフェクトする。例えば、自己または同種異系の非樹状細胞を単離し、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎に発現した主要抗原などの遺伝子をコードするベクターでトランスフェクトする。次に、非樹状細胞を、組換え抗原を発現するものについて選択し、それらを、ＣＴＬおよび／または体液性免疫応答を刺激または誘導するサイトカインまたは分子と組み合わせて、それを必要とする患者に投与する。
【００８４】
遺伝子導入または遺伝子治療による遺伝子の組換え発現は、被験者への核酸の投与を意味する。核酸は、直接、またはそのコードされたタンパク質を介して間接的に、被験者における治療効果を媒介する。本発明は遺伝子治療法を提供するが、この方法では、治療価値（好ましくはヒトに対して）を有するタンパク質をコードする遺伝物質、例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡを本発明の方法に従って融合細胞に導入し、これにより、核酸が融合細胞により発現可能になるようにした後、組換え融合細胞を被験者に投与する。
【００８５】
本発明の組換え融合細胞は、当技術分野で利用可能などのような遺伝子治療法においても用いることができる。従って、細胞に導入される核酸は、任意の所望のタンパク質、例えば、抗原タンパク質もしくはその一部、またはＣＴＬおよび／または体液性免疫応答を刺激するタンパク質をコードすることができる。以下の説明は、このような方法の例示を意図するものである。当業者には、例示する方法が、遺伝子治療の利用可能な方法のほんの一例を示すにすぎないことは容易に理解されよう。
【００８６】
遺伝子治療の方法について詳しくは、Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ， １９９９， Ｊ． Ｒｅｃｅｐｔ． Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ． Ｒｅｓ． １９：６７３−６８６；ＲｏｂｂｉｎｓおよびＧｈｉｖｉｚｚａｎｉ， １９９８， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． ８０：３５−４７；Ｐｅｌｅｇｒｉｎら、１９９８， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９：２１６５−２１７５；ＨａｒｖｅｙおよびＣａｓｋｅｙ， １９９８， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２：５１２−５１８；ＧｕｎｔａｋａおよびＳｗａｍｙｎａｔｈａｎ， １９９８， Ｉｎｄｉａｎ Ｊ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． ３６：５３９−５３５；ＤｅｓｎｉｃｋおよびＳｃｈｕｃｈｍａｎ， １９９８， Ａｃｔａ Ｐａｅｄｉａｔｒ． Ｊｐｎ． ４０：１９１−２０３；Ｖｏｓ， １９９８， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖ． ８：３５１−３５９；ＴａｒａｈｏｖｓｋｙおよびＩｖａｎｉｔｓｋｙ， １９９８， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （Ｍｏｓｃ）６３：６０７−６１８；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、１９９８， Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ２：１０２３−１０２８；Ｖｉｌｅら、１９９８， Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． Ｔｏｄａｙ ４：８４−９２；ＢｒａｎｃｈおよびＫｌｏｔｍａｎ， １９９８， Ｅｘｐ． Ｎｅｐｈｒｏｌ． ６：７８−８３；Ａｓｃｅｎｚｉｏｎｉら、１９９７， Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ． １１８：１３５−１４２；ＣｈａｎおよびＧｌａｚｅｒ， １９９７， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ７５：２６７−２８２を参照。用いることができる組換えＤＮＡ技法の当技術分野でよく知られている方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９３， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ， １９９０， Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹに記載されている。
【００８７】
遺伝子治療で組換え細胞を用いる実施形態では、患者において発現を所望する遺伝子を融合細胞に導入して、それが細胞により発現可能になるようにした後、治療効果を得るために組換え細胞をｉｎ ｖｉｖｏで投与する。
【００８８】
本発明の開示内容を考慮すれば当業者には理解されるように、組換え融合細胞はどのような遺伝子治療の好適な方法にも用いることができる。患者に投与した組換え操作細胞によって得られる作用は、例えば、患者において予め選択した遺伝子の活性化または阻害、例えば、ＩＬ−２の活性化を引き起こし、従って、患者を苦しめる病状の改善につながる。
【００８９】
所望の遺伝子は、トランスフェクションにより、電気穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような方法で融合細胞に導入される。通常、導入方法として、選択マーカーを含むベクターの導入がある。次に、細胞を選択下に置くことにより、選択マーカーとさらには導入遺伝子を含むベクターを取り込んで、これを発現している細胞を単離する。その後、これらの細胞を患者に送達する。
【００９０】
この実施形態では、所望の遺伝子を、得られた組換え細胞をｉｎ ｖｉｖｏで投与する前に、融合細胞に導入する。このような導入は、あらゆる公知の方法によって実施することができ、このような方法として、限定するものではないが、トランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、遺伝子配列を含むウイルスまたはバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子導入、マイクロセル媒介遺伝子導入、スフェロプラスト融合などが挙げられる。細胞への外来遺伝子の導入については、多数の技法が知られており（例えば、ＬｏｅｆｆｌｅｒおよびＢｅｈｒ， １９９３， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２１７：５９９−６１８；Ｃｏｈｅｎら、１９９３， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２１７：６１８−６４４；Ｃｌｉｎｅ， １９８５， Ｐｈａｒｍａｃ． Ｔｈｅｒ． ２９：６９−９２参照）、受容細胞の必要な発生および生理機能が破壊されない限り、本発明に従って用いることができる。この技法により、遺伝子の細胞への安定した導入が可能になり、その結果、遺伝子は細胞により発現可能となり、好ましくはその細胞子孫により遺伝可能かつ発現可能となる。
【００９１】
遺伝子治療を実施する一般的方法の１つは、レトロウイルスベクターを利用することからなる（Ｍｉｌｌｅｒら、１９９３， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２１７：５８１−５９９）。レトロウイルスベクターは、所定の遺伝子の発現を行うために該遺伝子を組み込むように修飾されているレトロウイルスである。レトロウイルスの天然に存在するＤＮＡ配列の多くは、レトロウイルスベクターにおいて不可欠ではないことがわかっている。必要なのは、レトロウイルスの天然に存在するＤＮＡ配列の小さなサブセットだけである。一般に、レトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのパッケージングおよび組込みに必要なシス作用配列の全部を含んでいなければならない。これらのシス作用配列は下記のものである：
ａ）ベクターの各末端にある長末端反復配列（ＬＴＲ）、またはその部分；
ｂ）−鎖および＋鎖ＤＮＡ合成のためのプライマー結合部位；
ｃ）ビリオンへのゲノムＲＮＡの組込みに必要なパッケージングシグナル。
【００９２】
遺伝子治療に用いるべき遺伝子はベクターにクローニングされるが、これは、ベクターの細胞への感染または送達による遺伝子の細胞への送達を促進する。
【００９３】
レトロウイルスベクターについてさらに詳しくは、Ｂｏｅｓｅｎら、１９９４， Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２にみいだすことができ、ここでは、化学療法に対してより抵抗性の幹細胞を作製する目的でｍｄｒ１遺伝子を造血幹細胞に送達するためのレトロウイルスベクターの使用について記載している。遺伝子治療でのレトロウイルスベクターの使用を示すその他の参照文献に下記のものがある：Ｃｌｏｗｅｓら、１９９４， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９３：６４４−６５１；Ｋｉｅｍら、１９９４， Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７３；ＳａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ， １９９３， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２９−１４１；ならびに、ＧｒｏｓｓｍａｎおよびＷｉｌｓｏｎ， １９９３， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． ＧｅｎｅｔｉｃｓおよびＤｅｖｅｌ． ３：１１０−１１４。
【００９４】
アデノウイルスを用いて、肝臓、中枢神経系、内皮および筋肉由来の非樹状細胞に遺伝子を送達することができる。アデノウイルスは、非分裂細胞を感染させることができる利点を有する。ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ， １９９３， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：４９９−５０３は、アデノウイルスに基づく遺伝子治療についての論評を提供する。遺伝子治療におけるアデノウイルスのその他の使用例は、下記の文献にみいだすことができる：Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２， Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５；およびＭａｓｔｒａｎｇｅｌｉら、１９９３， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９１：２２５−２３４。
【００９５】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を遺伝子治療で用いることが提案されている（Ｗａｌｓｈら、１９９３， Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． ２０４：２８９−３００）。また、アルファウイルスを遺伝子治療で用いることも提案されている（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ， １９９９， Ｊ． Ｒｅｃｅｐｔ． Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ． Ｒｅｓ． １９：６７３−６８６）。
【００９６】
遺伝子治療における遺伝子送達のその他の方法としては、哺乳動物人工染色体（Ｖｏｓ， １９９８， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖ． ８：３５１−３５９）；リポソーム（ＴａｒａｈｏｖｓｋｙおよびＩｖａｎｉｓｔｓｋｙ， １９９８， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ）６３：６０７−６１８）；リボザイム（ＢｒａｎｃｈおよびＫｌｏｔｍａｎ， １９９８， Ｅｘｐ． Ｎｅｐｈｒｏｌ． ６：７８−８３）；および三重らせんＤＮＡ（ＣｈａｎおよびＧｌａｚｅｒ， １９９７， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ７５：２６７−２８２）が挙げられる。
【００９７】
所望の遺伝子は、細胞内に導入し、発現のために相同的組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ， １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５；Ｚｉｊｌｓｔｒａら、１９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８）。
【００９８】
特定の実施形態では、遺伝子治療の目的で導入される細胞において組換え的に発現される所望の遺伝子は、コード領域に機能的に連結された誘導プロモーターを含んでいることから、適切な転写の誘導物質の存在または不在を調節することによって、組換え遺伝子の発現が制御可能になる。
【００９９】
好ましい実施形態では、細胞において組換え的に発現される所望の遺伝子は、その機能が本発明の方法に従って細胞運命の変化を誘発するものであろうとなかろうと、Ｃｒｅ部位によって挟まれている。遺伝子機能がもはや必要とされない場合、組換え遺伝子を含む細胞をＬｏｘタンパク質にさらすが、これは、例えば、誘導もしくは組織特異的プロモーターに機能的に結合したＬｏｘコード配列を含む核酸を供給することにより、または核局在化シグナルに機能的に結合したＬｏｘタンパク質を供給することにより実施する。Ｌｏｘリコンビナーゼは、Ｃｒｅ配列を組み換え（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８４， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １７８：４８１−４８６）、この過程で介在配列を切り出す働きをするが、該配列は、この実施形態によれば、所望の遺伝子の核酸を含む。この方法を用いて、組換え遺伝子発現を操作することに成功している（Ｆｕｋｕｓｈｉｇｅら、１９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：７９０５−７９０９）。あるいは、ＦＬＰ／ＦＲＴ組換え系を用いて、部位特異的組換えを介して遺伝子の存在および発現を制御することができる（ＢｒａｎｄおよびＰｅｒｒｉｍｏｎ， １９９３， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１８：４０１−４１５）。
【０１００】
本発明の好ましい形態では、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎主要抗原をコードする核酸を用いた遺伝子治療が、ウイルス性肝炎の治療に向けられている。
【０１０１】
５．４　免疫細胞活性化分子
本発明は、第１に、樹状および非樹状細胞の融合から得られる融合細胞と、第２に、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を刺激または誘発することができるサイトカインまたはその他の分子とを含んでなる組成物を提供する。
【０１０２】
ＩＬ−１２は、免疫応答におけるエフェクター細胞の移動および適正な選択を調節する上で主要な役割を果たす。ＩＬ−１２遺伝子産物は、Ｔヘルパー細胞のＴＨ１サブセットのほうへ免疫応答をシフトさせ、ＣＴＬ活性を強力に刺激する。好ましい実施形態では、ＣＴＬ刺激分子がＩＬ−１２である。高用量のＩＬ−１２は、全身投与すると毒性を呈するため、局部的に投与するのが好ましい。その他の投与方法については、以下の５．７．１節に記載する。
【０１０３】
ＩＬ−１２受容体β２（ＩＬ−１２Ｒ−β２）の発現は、ＩＬ−１２応答性を維持し、かつＴＨ１系統拘束（ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）を制御するのに必要である。さらに、ＩＬ−１２シグナル伝達により、ＳＴＡＴ４活性化（すなわち、ＳＴＡＴ４のリン酸化の増加により測定される）とインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）産生が起こる。従って、一実施形態では、本発明は、ＩＬ−１２ではなく、ＳＴＡＴ４を活性化することができる分子、例えば、コンビナトリアルケミストリーの使用により同定されるＳＴＡＴ４の小分子アクチベーターの使用を意図している。
【０１０４】
別の実施形態では、免疫刺激分子はＩＬ−１８である。別の実施形態では、免疫刺激分子はＩＬ−１５である。さらに別の実施形態では、免疫刺激分子はインターフェロンγである。
【０１０５】
別の実施形態では、治療しようとする被験者に、ＣＴＬおよび／または体液性免疫応答を刺激または誘発する、本明細書で記載した分子またはサイトカインの任意の組合せを投与する。
【０１０６】
あまり好ましくない実施形態では、細胞傷害性Ｔ細胞プール、すなわち、ＴＨ１細胞サブ集団を増加するため、抗ＩＬ−４抗体を投与することにより、Ｔヘルパー細胞のＴＨ２細胞へのシフトを阻害し、これによって、Ｔヘルパー細胞のＴＨ１サブセットへの選択圧を生成することができる。さらに、ＩＬ−１２の投与と同時に抗ＩＬ−４抗体を投与することにより、ＴＨ１細胞に分化するようにＴＨ細胞を誘導することができる。分化の後、細胞を洗浄し、例えば、緩衝食塩水に再懸濁させた後、好ましくは静脈内投与により、患者に再導入する。
【０１０７】
本発明はまた、前述したインターロイキンの変異体に関係する。このような変異体は、アゴニスト（擬似物）として機能して、ＣＴＬおよび／または体液性免疫応答を促進することができる改変アミノ酸配列を有する。変異体は、突然変異誘発（例えば、個別の点突然変異）またはトランケーションにより作製することができる。アゴニストは、天然に存在する形態のタンパク質と実質的に同じ（またはサブセットの）生物活性を保持することができる。タンパク質のアンタゴニストは、例えば、目的のタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流または上流メンバーと競合的に結合することにより、天然に存在する形態のタンパク質の１以上の活性を阻害することができる。従って、機能が限られている変異体を用いて治療することにより、特定の生物学的効果を誘発することができる。天然に存在する形態のタンパク質の生物活性のサブセットを有する変異体による被験者の治療では、天然に存在する形態のタンパク質による治療と比較して、被験者に対する副作用が少ない。
【０１０８】
ＣＴＬおよび／または体液性免疫応答を刺激することができる分子の変異体は、突然変異体（例えば、トランケーション突然変異体）のコンビナトリアルライブラリーをアゴニスト活性についてスクリーニングすることにより同定することができる。一実施形態では、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発により、変異体の多彩なライブラリーを作製し、該ライブラリーを多彩な遺伝子ライブラリーによってコードさせる。例えば、遺伝子配列に合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素で連結して変異体の多彩なライブラリーを作製することができ、その結果、可能性のあるタンパク質配列の縮重セットが個々のポリペプチドとして、あるいは、より大きな融合タンパク質として（例えば、ファージディスプレイのために）発現可能になる。縮重オリゴヌクレオチド配列から可能性のあるＩＬ−１２変異体のライブラリーを作製するのに用いられる方法は多々ある。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ， １９８３， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら、１９８４， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら、１９８４， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８：１０５６；Ｉｋｅら、１９８３， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， １１：４７７）。
【０１０９】
さらに、ＣＴＬおよび／または体液性免疫応答を促進することができるインターロイキンのコード配列の断片のライブラリーを用いて、変異体のスクリーニングおよびその後の選択のためのポリペプチドの多彩な集団を作製することができる。例えば、コード配列断片のライブラリーを作製するには、１分子当たり約１回だけニッキングが起こる条件下でヌクレアーゼにより目的のコード配列の二本鎖ＰＣＲ断片を処理し、二重鎖ＤＮＡを変性した後、該ＤＮＡを再生して、異なるニック産物由来のセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼで処理することにより再生した二本鎖から一本鎖部分を除去し、得られた断片ライブラリーを発現ベクターに連結させる。この方法により、目的のタンパク質のＮ末端および様々な大きさの内部断片をコードする発現ライブラリーを誘導することが可能である。
【０１１０】
点突然変異またはトランケーションにより作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための技法、また、所定の性質を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための技法は当技術分野でいくつか知られている。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、ハイスループット分析に適応可能な、最も広範に用いられる技法は、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングし、得られたベクターのライブラリーにより適切な細胞を形質転換し、所望の活性の検出が遺伝子（その産物が検出された）をコードするベクターの単離を促進する条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。ライブラリーにおける機能的突然変異体の頻度を高める技法である帰納的集合突然変異誘発（ＲＥＭ）を、スクリーニングアッセイと組み合わせて用いることにより、ＣＴＬおよび／または体液性免疫応答を促進しうるインターロイキンの変異体を同定することができる（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら、１９９３， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ６（３）：３２７−３３１）。
【０１１１】
５．５　免疫応答を測定するアッセイ
融合細胞−サイトカイン組成物は、当技術分野で公知のいずれかの方法を用いて、免疫原性についてアッセイすることができる。例えば、限定するものではないが、以下に記載する方法の１つを用いることができる。
【０１１２】
ＥＬＩＳＡを含むがこれに限らない標準検出アッセイを用いて体液性免疫応答を測定することにより、非治療被験者の抗体量に対する、治療被験者の血清中の標的抗原を認識する抗体の相対量を決定することができる。ＣＴＬ応答は本明細書に記載したクロム放出アッセイなどの標準イムノアッセイを用いて測定することが可能である。さらに具体的には、刺激物質の不在下でのＣＴＬ活性に対する、刺激物質投与後の測定可能なＣＴＬ活性の差異によりＣＴＬ応答を決定する。
【０１１３】
５．５．１　ＭＬＴＣアッセイ
ＭＬＴＣアッセイを用いて、融合細胞−サイトカイン組成物の免疫原性を試験することができる。例えば、１×１０７個の融合細胞をγ線照射した後、Ｔリンパ球と混合する。様々な間隔をおいて、４時間の５１Ｃｒ放出アッセイ（Ｐａｌｌａｄｉｎｏら、１９８７， Ｃｅｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４７：５０７４−５０７９）でＴリンパ球の細胞傷害性について試験する。このアッセイでは、混合したリンパ球培養物を標的細胞懸濁体に添加して、様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比（通常１：１〜４０：１）を得る。標的細胞を予め標識するために、５００μＣｉの５１Ｃｒ／ｍｌを含む培地中で１×１０６個の標的細胞を３７℃で１時間インキュベートする。標識後、これらの細胞を３時間洗浄する。各アッセイ点（Ｅ：Ｔ比）を３回繰り返して実施し、適当な対照を含めることにより、自発的５１Ｃｒ放出（アッセイにリンパ球は一切添加していない）および１００％放出（細胞を界面活性剤で溶解する）を測定する。細胞混合物を４時間インキュベートした後、２００ｇで５分間遠心分離することにより細胞をペレット化する。上清に放出された５１Ｃｒの量をガンマカウンターで測定する。細胞傷害性パーセントは、試験サンプル中のｃｐｍから自発的放出ｃｐｍを差し引いた値を、総界面活性剤放出ｃｐｍから自発的放出ｃｐｍを差し引いた値で割ることにより求められる。
【０１１４】
ＭＨＣクラスＩカスケードを遮断するために、Ｋ−４４ハイブリドーマ細胞（抗ＭＨＣクラスＩハイブリドーマ）由来の濃厚なハイブリドーマ上清を試験サンプルに添加して最終濃度を１２．５％とした。
【０１１５】
５．５．２　抗体応答アッセイ
本発明の一実施形態では、ワクチン接種に応答して産生された抗体を、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）のような抗体応答アッセイで測定することによって、融合細胞の免疫原性を確認する。このようなアッセイ法は当技術分野でよく知られている（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｉｇａｎら（編）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９９７のセクション２．１を参照）。この実施形態の一様式では、マイクロタイタープレート（９６ウェルＩｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅ ＩＩ、Ｎｕｎｃ）に、ＰＢＳ中の組成物として用いられる精製癌細胞または感染細胞の０．７５μｇ／ｍｌ溶液を５０μｌ／ウェルで、４℃にて１６時間、さらに２０℃で１時間コーティングする。ウェルを空にし、１ウェルにつき２００μｌのＰＢＳ−Ｔ−ＢＳＡ（０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ ２０および１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ）を用いて２０℃で１時間ブロックした後、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄する。ワクチン接種した動物（モデルマウスまたはヒト患者など）に由来する５０μｌ／ウェルの血漿またはＣＳＦを２０℃で１時間加えた後、プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄する。次に、ＰＢＳ−Ｔ−ＢＳＡ中で１：１，５００に希釈した５０μｌ／ウェルのヒツジ抗マウスまたは抗ヒト免疫グロブリン（適宜、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートさせたもの）と共に２０℃にて１時間インキュベートし、（ＰＢＳ−Ｔでさらに３回洗浄後）５０μｌのｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）−Ｈ２Ｏ２基質溶液と共にインキュベートすることにより抗原抗体活性を熱量測定により測定する。５分後、１５０μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止し、標準的技法を用いて、４９２ｎｍ（標準６２０ｎｍ）で光度計により吸光度を測定する。
【０１１６】
５．５．３　サイトカイン検出アッセイ
融合細胞−サイトカイン組成物に対するＣＤ４＋Ｔ細胞増殖応答は、特定のサイトカインのレベルの検出および定量により測定することができる。一実施形態では、例えば、細胞内サイトカインをＩＦＮ−γ検出アッセイで測定することにより、融合細胞−サイトカイン組成物の免疫原性を試験することが可能である。この方法の例では、融合細胞−サイトカイン組成物で治療した患者からの末梢血単核細胞を、ムチンペプチド抗原またはＨｅｒ２／ｎｅｕ由来エピトープなどのペプチド抗原で刺激する。次に、フローサイトメトリーにより検出可能なＴ細胞特異的な標識抗体、例えば、ＦＩＴＣ−コンジュゲート抗ＣＤ８およびＰｅｒＣＰ−標識抗ＣＤ４抗体により細胞を染色する。洗浄後、細胞を固定し、透過性にした後、ヒトＩＦＮ−γと反応性の色素標識抗体（ＰＥ−抗ＩＦＮ−γ）と反応させる。標準的技法を用いてサンプルをフローサイトメトリーにより分析する。
【０１１７】
これ以外にも、フィルターイムノアッセイ、酵素結合イムノスポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを用いて、Ｔ細胞を取り巻く特定のサイトカインを検出することができる。一実施形態では、例えば、ニトロセルロース支持マイクロタイタープレートに精製サイトカイン特異的一次抗体、すなわち、抗ＩＦＮ−γをコーティングした後、プレートをブロッキングすることにより他のタンパク質の非特異的結合によるバックグランドを排除する。次に、融合細胞−サイトカイン組成物を接種した患者から得た、サイトカイン分泌細胞を含有する単核血液細胞のサンプルをマイクロタイタープレートのウェル上に稀釈する。標識した、例えばビオチン標識した、二次抗サイトカイン抗体を添加する。その後、抗体サイトカイン複合体を酵素−コンジュゲートストレプトアビジンにより検出することができる。サイトカイン分泌細胞は、目視、顕微鏡、または電子的検出法により「斑点」として見える。
【０１１８】
５．５．４．四量体染色アッセイ
別の実施形態では、「四量体染色」アッセイ（Ａｌｔｍａｎら、１９９６， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９４−９６）を用いて、抗原特異的Ｔ細胞を同定することができる。例えば、一実施形態では、腫瘍特異的抗原のような特定のペプチド抗原を含むＭＨＣ分子を多量体化することにより可溶性ペプチド四量体を作製した後、例えば、ストレプトアビジンとの複合体を形成させて標識する。続いて、融合細胞組成物で治療した患者由来のＴ細胞の集団と、上記ＭＨＣ複合体を混合する。次に、ビオチンを用いて、目的の抗原、すなわち、腫瘍特異的抗原を発現するＴ細胞を染色する。
【０１１９】
細胞傷害性Ｔ細胞は、ＣＤ８陽性の免疫細胞であり、標的細胞の抗原をプロセッシングして展示している抗原提示細胞（ＡＰＣ）により活性化されている。抗原提示は、Ｂ−７／ＣＴＬＡ−４およびＣＤ４０などの共刺激分子の活性化と一緒に、Ｔ細胞の初回感作を達成することにより、該抗原を発現する細胞をターゲッティングして破壊する。
【０１２０】
細胞傷害性Ｔ細胞は、ＴＮＦ−β、パーフォリンおよびＩＬ−２を分泌するほかに、ＣＤ８を発現するものとして一般に特徴づけられている。細胞傷害性Ｔ細胞応答は、様々なアッセイで測定することができ、このようなアッセイとして、限定するものではないが、本明細書の実施例で説明するように、非治療被験者由来のＴ細胞と比較した、治療被験者由来のＴ細胞を用いた５１Ｃｒ放出アッセイにおける標的細胞溶解の増加、ならびに、非治療被験者と比較した、治療被験者におけるＩＦＮ−γおよびＩＬ−２のレベルの増加を測定することが挙げられる。
【０１２１】
５．６　標的となる癌
本発明の融合細胞を用いて、治療または予防することができる癌および腫瘍形成疾患として、限定するものではないが、下記のものを挙げることができる：ヒト肉腫および癌、例えば、腎細胞癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨形成肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢腺癌、髄様癌、気管支癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮癌、胎生期癌、ウィルムス腫、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、グリオーマ、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、欠突起グリオーマ、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽腫、白血病；例えば、急性リンパ性白血病および急性髄膜性白血病（骨髄芽性、前骨髄性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄単球性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病）；ならびに、真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、およびＨ鎖病。
【０１２２】
５．７　標的となる感染症
本発明の融合細胞を用いて、治療または予防することができる感染症として、ウイルス、細菌、原生動物、および細胞内寄生体のような細胞内病原体によって引き起こされるものがある。ウイルスとしては、限定するものではないが、Ｂ型肝炎ウイルス；アデノ随伴ウイルスおよびサイトメガロウイルスのようなパルボウイルス；パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、およびＳＶ４０のようなパポバウイルス；アデノウイルス；単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ−Ｉ）、単純ヘルペスＩＩ型（ＨＳＶ−ＩＩ）、およびエプスタウン−バーウイルスのようなヘルペスウイルス；痘瘡（ｓｍａｌｌｐｏｘ）およびワクシニアウイルスのようなポックスウイルス；限定するものではないが、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）、およびヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）、ヒトＴ細胞向性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）、およびヒトＴ細胞向性ウイルスＩＩ型（ＨＴＬＶ−ＩＩ）などのＲＮＡウイルス；インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、センダイウイルス、ポリオウイルスのようなピコルナウイルス、コクサッキーウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、風疹ウイルス（ドイツ麻疹（Ｇｅｒｍａｎ ｍｅａｓｌｅｓ））およびセムリキ森林ウイルスのようなトガウイルス、アルボウイルス、ならびにＡ型肝炎ウイルスによって引き起こされるものなどのウイルス性疾患が挙げられる。
【０１２３】
別の実施形態では、細菌感染を治療または予防することができ、限定するものではないが、下記のものを含む病原性細菌によって引き起こされる疾患が挙げられる：化膿連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、淋菌、髄膜菌、ジフテリア菌、ボツリヌス菌、ウェルチ菌（Ｃ． ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌、インフルエンザ菌、肺炎桿菌、臭鼻菌、鼻硬腫菌、黄色ブドウ球菌、コレラ菌、大腸菌、緑膿菌、Ｃｌａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ（Ｖｉｂｒｉｏ）ｆｅｔｕｓ、Ｃｌａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、ペスト菌、偽結核エルジニア菌、志賀赤痢菌、フレクスナー赤痢菌、ソンネ赤痢菌、ネズミチフス菌、チフス菌、梅毒トレポネーマ、フランベジアトレポネーマ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｃａｒａｔｅｎｅｕｍ、ヴァンサンスピロヘータ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、黄疸出血性レプトスピラ、ヒト結核菌、トキソプラズマ、ニューモシティスカリニ、野兎病菌、ウシ流産菌、ブタ流産菌、マルタ熱菌、マイコプラズマ属種、発疹チフスリケッチア、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ（Ｏ． ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）、クラミジミア属種、およびヘリコバクターピロリなど。
【０１２４】
別の好ましい実施形態では、前記方法を用いて、Ｅｎｔｏｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、口腔トリコモナス、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｈｏｍｉｎｉｓ（Ｐ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、膣トリコモナス、ガンビアトリパノソーマ、ローデシアトリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、ドノバンリーシュマニア、熱帯リーシュマニア、ブラジルリーシュマニア、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｐｎｕｅｍｏｎｉａ、三日熱マラリア原虫、熱帯熱マラリア原虫、および四日熱マラリア原虫などの病原性原生動物により引き起こされる感染を治療または予防することができる。
【０１２５】
５．８　医薬製剤および投与方法
本発明の組成物製剤は、ＣＴＬおよび／または体液性免疫応答を刺激することができる分子（例えば、サイトカイン）と一緒に投与される、有効な免疫感作量の融合細胞を含んでなる。
【０１２６】
融合細胞−サイトカイン組成物の好適な製剤には、好ましくは液体溶液としての、注射可能な製剤が含まれる。
【０１２７】
多数の方法を用いて、本発明の組成物製剤を導入することができ、これらは、限定するものではないが、皮下注射、リンパ内、皮内、筋内、静脈内、および乱刺法（例えば、二又針を用いて、皮膚最上層を引っ掻く）が挙げられる。好ましくは、融合細胞−サイトカイン組成物を皮内注射する。
【０１２８】
さらに、所望であれば、組成物製剤は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および／または組成物の有効性を高める化合物などの補助物質を少量含んでいてもよい。補助物質の有効性は、融合細胞に対する抗体の誘導を測定することにより確認することができる。
【０１２９】
組成物が投与される哺乳動物は、好ましくはヒトであるが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽（例えば、ニワトリ）、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウスおよびラットでもよい。
【０１３０】
５．９　有効量
治療に有効な量の組成物を患者に投与することにより、癌または感染症を治療または予防することができる。治療に有効な量とは、このような疾患または障害の症状を改善する、例えば、腫瘍を退縮させるのに十分な量の融合細胞を意味する。本発明の組成物の有効な量（免疫感作量）は、モデル動物実験系より得られる用量応答曲線から推定することができる。組成物製剤で用いるべき融合細胞の正確な用量は、治療しようとする障害の具体的種類に応じて変わる。例えば、腫瘍を治療する場合には、腫瘍の侵攻性が用量を考慮する上で重要な考慮事項となる。その他の考慮すべき重要な事項は、投与経路と患者の素質である。従って、正確な用量は医師の判断に従うと同時に、各患者の状況、例えば標準的臨床技法に基づく患者の免疫状態、に応じて決定すべきである。
【０１３１】
好ましい実施形態では、例えば、ヒト腫瘍を治療するために、自己ＤＣに融合させた腫瘍細胞により形成された融合細胞−サイトカイン組成物を、腫瘍から離れた部位、好ましくは、リンパ組織付近に投与する。組成物の投与は、１回の投与につき約１×１０８個の細胞を用いて、適当な間隔を置いて、例えば、３〜６ヶ月置きに、繰り返すことができる。
【０１３２】
本発明は従って、哺乳動物を免疫感作する方法、または哺乳動物の癌もしくは感染症を治療または予防する方法であって、治療に有効な量の本発明の融合細胞−サイトカイン組成物を哺乳動物に投与することを含んでなる方法を提供する。
【０１３３】
５．１０　キット
本発明はさらに、本発明の方法に従って免疫治療薬の送達を容易にするキットを提供する。本明細書に記載されるキットは、例えば、癌または感染症の症状を呈する患者を治療する臨床環境において、好適に使用することができる。一実施形態では、例えば、１以上の容器内に、ａ）樹状細胞の集団のサンプル、およびｂ）癌または感染症の治療または防御方法でそれを使用するための説明書を含んでなるキットが提供される。投与の前に諸成分を混合することができるように、無菌希釈剤のアンプルを提供してもよい。別の実施形態では、キットは電気融合に適したキュベットをさらに含む。一実施形態では、樹状細胞が低温保存される。
【０１３４】
６．実施例：脳腫瘍に対する樹状細胞およびグリオーマ細胞によるワクチン接種　本実施例では、免疫学的に特別な部位である脳の腫瘍に対する、グリオーマ細胞と融合させた樹状細胞の治療目的での使用を検討した。融合細胞（ＦＣ）で事前に免疫感作すると、グリオーマ細胞でチャレンジしたとき側腹部または脳における腫瘍形成が阻止された。ＣＤ８＋細胞を枯渇させたマウスで研究を実施すると、効力が低下した。治療モデルでは、脳での腫瘍発生後、ＦＣを皮下注射した。ＦＣだけを投与した場合は、脳腫瘍担持マウスの生存への効果が制限された。しかし、重要なことは、ＦＣおよび組換えＩＬ−１２（ｒＩＬ−１２）の投与は、脳腫瘍を有するマウスの生存を著しく引き延ばしたことである。免疫感作したマウス由来のグリオーマ細胞に対するＣＴＬ活性も、ＦＣまたはｒＩＬ−１２だけで得られたものと比較して、ＦＣとｒＩＬ−１２の共投与によって刺激された。これらのデータは、融合細胞に基づくワクチン療法とｒＩＬ−１２とを組み合わせることの治療効力を支持するものである。
【０１３５】
６．１　材料と方法
細胞系、薬剤および動物
マウスグリオーマ細胞系、ＳＲ−Ｂ１０．Ａを、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を補足したＤＭＥＭ（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ、Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）中で単層培養物として維持した。ＲＩＫＥＮ ＣＥＬＬ ＢＡＮＫ（Ｔｓｕｋｕｂａ， Ｊａｐａｎ）から取得したＹａｃ−１細胞を、１０％のＦＢＳ含有のＲＰＭＩ Ｉ６４Ｏ（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ）中で維持した。
【０１３６】
組換えマウスＩＬ−１２（ｒｍＩＬ−１２）は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）の好意により提供された。
【０１３７】
Ｓａｎｋｙｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｃ．（Ｓｈｉｚｕｏｋａ， Ｊａｐａｎ）から購入した雌Ｂ１０．Ａマウスを特定の無病原体室において２５±３℃で維持した。マウスは８週齢で用いた。
【０１３８】
樹状細胞と腫瘍細胞との融合
Ｂ１０．Ａマウスの長骨から骨髄を洗い流し、赤血球を塩化アンモニウムで溶解させた（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）。リンパ球、顆粒球およびＤＣを骨髄細胞から枯渇させ、５％の熱不活性化ＦＢＳ、５０μＭの２−メルカプトエタノール、２ｍＭグルタメート、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｐｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０ｎｇ／ｍｌ組換えマウス顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）および３０Ｕ／ｍｌ組換えマウスインターロイキン−４（ＩＬ−４；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ）を補足したＲＰＭＩ １６４０培地中、２４ウェル培養プレートにおいて細胞を平板培養した（１×１０６細胞／ウエル）。培養５日目に、付着していない細胞と弱く付着している細胞を収集し、１００ｍｍペトリ皿（１×１０６細胞／ｍｉ；１０ｍｌ／皿）上で再度平板培養した。ＲＰＭＩ培地中のＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を細胞に添加し、１×１０６個のＤＣを３×１０６個の照射済（５０Ｇｙ、Ｈｉｔａｃｈｉ ＭＢＲ−１５２０Ｒ、線量率：１．１Ｇｙ／分）ＳＲ−Ｂ１０．Ａ細胞と混合した。４８時間後、５００μｌのポリエチレングリコール（ＰＥＧ；Ｓｉｇｍａ）５０％溶液を６０秒滴下添加することによって融合を開始した。無血清ＲＰＭＩ培地の段階的添加により融合を停止した。ＲＰＭＩ培地中のＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で、１００ｍｍペトリ皿においてＦＣを４８時間平板培養した。
【０１３９】
フローサイトメトリー
腫瘍細胞（３×１０６）を回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ）で２回洗浄した。ＰＫＨ２６（２μｌ；Ｓｉｇｍａ）を腫瘍細胞に添加し、混合物を室温で５分（ｍｍ）維持した。次に、５００μｌのＦＢＳを添加して、反応を停止した。ＰＢＳを用いて、細胞を２回洗浄し、５００μｌのＰＢＳに再懸濁させた。ＤＣおよびＦＣの単一細胞懸濁液を調製し、洗浄してから、バッファー（ＰＢＳ中の１％のＢＳＡ、０．１％のアジ化ナトリウム）に再懸濁させて、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ８０モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）で４℃にて３０分染色した。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）を用いて、染色した細胞を分析した。
【０１４０】
動物モデル
ＦＣをＰＢＳで２回洗浄した後、１×１０６ｍｌの密度でＰＢＳ中に懸濁させる。ＦＣ（３×１０５）を、０および７日目にＢ１０．Ａマウスの側腹部に皮下（ｓ．ｃ．）接種した。次に、１４日目に、腫瘍細胞（１×１０６）をマウスの反対側の側腹部に皮下接種した。脳腫瘍モデルでは、１×１０４個のＳＲ−Ｂ１０．Ａ腫瘍細胞を、ＦＣで免疫感作後の１４日目に、同系マウスの脳の右前頭葉に定位接種した。
【０１４１】
治療モデルでは、１×１０４個の腫瘍細胞を脳（０日目）に定位接種した後、５および１２日目にＦＣ（３×１０５）を皮下注射した。特定の実験では、ｒｍＩＬ−１２を腹腔内に（ｉ．ｐ．）注射した。死亡したマウスに対して剖検を実施した。
【０１４２】
細胞溶解活性のアッセイ
活性化脾細胞（ＳＰＣ）の細胞溶解活性を、５１Ｃｒ放出アッセイによりｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。個々のマウス由来のＳＰＣの単一細胞懸濁液を洗浄した後、６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ， Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ， ＮＪ）において、１×１０７／ｍｌの密度で１０％のＦＣＳ−ＲＰＭＩ中に再懸濁させた（０日目）。付着細胞を除去した後、一日おきに、１０Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２を培養物に添加した。培養開始から４日後、細胞を回収し、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性を測定した。５１Ｃｒと共に３７℃で９０分（ｍｍ）インキュベートすることにより、標的細胞を標識した後、エフェクターリンパ球と４時間共培養した。エフェクター：標的の比は１０：１〜８０：１の範囲であった。測定はすべて３回反復で行い、式：（実験的ｃｐｍ−自発的ｃｐｍ／最大ｃｐｍ−自発的ｃｐｍ）×１００％を用いて、溶解率を算出した。
【０１４３】
抗体アブレーション（ａｂｌａｔｉｏｎ）研究
すでに記載されている（Ｋｉｋｕｃｈｉら、１９９９， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ， ８０：４２５−４３０）ように、Ｔ細胞サブセットのｉｎ ｖｉｖｏアブレーションを実施した。簡単に言えば、０日目および７日目のＢ１０．Ａマウスの側腹部に、３×１０５個のＦＣを皮下接種した。次に、１４日目に、反対側の側腹部に、腫瘍細胞（１×１０６）を接種した。７、１０、１４および１７日目に、ラットモノクローナル抗体である、抗ｍＣＤ４（ＡＴＣＣハイブリドーマＧＫ１．５）、抗ｍＣＤ８（ＡＴＣＣハイブリドーマ５６．６．７３）、抗アシアロＧＭＩ（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）または正常なラットＩｇＧを腹腔内注射した（１回の注射につき０．５ｍｇ／マウス）。
【０１４４】
免疫蛍光染色
脳（０日目）に腫瘍細胞（１×１０４）を定位接種した後、ＦＣ（３×１０５）、または対照として照射済グリオーマ細胞（３×１０５）を皮下注射した。１７日目にマウスを屠殺した後、固定バッファー（ＰＢＳ中に１％のパラホルムアルデヒドおよび０．１％のグルタルアルデヒド）において脳を１０分固定させた。第１抗体である抗グリア線維性酸性タンパク質（抗ＧＦＡＰ；Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ）と一緒に、切片（厚さ６μｍ）を４℃で一晩インキュベートした。ＦＩＴＣ−コンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ）を用いて、室温での２時間のインキュベーションにより、一次抗体を検出した。次に、抗ＣＤ４−ＰＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）または抗ＣＤ８−ＰＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）抗体と一緒に、切片を４℃で一晩インキュベートした。
【０１４５】
データ解析
算出した腫瘍サイズを、２サンプルｔ検定を用いて比較した。カプラン−メイヤー累積ハザードプロット（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ｈａｚａｒｄ ｐｌｏｔｓ）およびウイルコクソン（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）分析の作成により、生存を評価した。差はｐ＜０．０５で有意とみなした。
【０１４６】
６．２　結果
ＰＫＨ２６をグリオーマ細胞に組み込んだ後、ＤＣとグリオーマ細胞を融合させた。ＤＣは、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８０モノクローナル抗体により染色された。図１Ａは、３４％のＤＣが抗ＣＤ８０モノクローナル抗体により染色されたことを示す。９５％を上回るグリオーマ細胞は、ＰＫＨ２６（図１Ｂ）について陽性であった。二重陽性細胞の百分率（３９．９％、図１Ｃ）は、ＣＤ８０−陽性ＤＣ％とほぼ同じであり、１０％のＦＣがＰＫＨ２６−陰性であったが、これはほとんどのＤＣがグリオーマ細胞と融合したことを示唆している。
【０１４７】
皮下グリオーマに対するＦＣによる事前の免疫感作の抗腫瘍効果を調べた。ＦＣ、ＤＣ、または対照として照射済親細胞（１×１０６）を、０日目および７日目の同系マウス（各グループで、ｎ＝１１）に皮下注射した。１４日目に、反対側の側腹部に、１×１０６個の親細胞を皮下接種した。２週間以内に、照射済親細胞を注射したマウスのすべてに、接種した腫瘍細胞が大きな腫瘍を発生させた。これらのマウスは６週間以内にすべて死亡した。対照的に、ＦＣで免疫感作したマウスは一匹も６週間以内に死亡しなかった。ＤＣで免疫感作した１１匹のうち６匹が腫瘍を発生したのに対し、ＦＣで免疫感作した１１匹のうち、触知可能な腫瘍を発生したマウスは一匹もいなかった（図２Ａ）。
【０１４８】
本発明者らはまた、脳のグリオーマに対するＦＣでの事前の免疫感作の抗腫瘍効果も調べた。０日目および７日目にＦＣで免疫感作した後、脳の右前頭葉に、１×１０４個の腫瘍細胞を定位接種した（１４日目）。これらのマウスを７０日間観察した。ＦＣで免疫感作したマウスの半数は、７０日より長く生存した（各グループで、ｎ＝２０；ｐ＜０．０１）（図２Ｂ）。対照マウスは６週間以内にすべて死亡した。全マウスに対して、剖検を実施した。死亡したマウスには大きな腫瘍が発生していたが、生存したマウスにはなかった。これらの知見から、ＦＣによる免疫感作が、側腹部と脳において、グリオーマ細胞腫瘍の発生を阻止することが示される。
【０１４９】
実験治療モデルとして、脳腫瘍発生後にＦＣを注射した。同系マウス（０日目）の脳の右前頭葉に、腫瘍細胞（１×１０４）を定位接種した。５および１２日目に、３×１０５個のＦＣを皮下接種した。ＦＣのワクチン接種は腫瘍担持マウス（各々、ｎ＝１５；図３）の生存を引き延ばしたが、差は有意ではなかった（ｐ＞０．０５）。ＤＣだけの接種は生存に何の効果も及ぼさなかった（データは示していない）。本発明者らは次に、ＦＣとｒｍＩＬ−１２を組み合わせた治療の抗腫瘍効果を分析した。同系マウス（０日目）の脳に、腫瘍細胞（１×１０４）を定位接種した。５および１２日目に、３×１０５個のＦＣを皮下接種した。５日目に開始して２週間にわたって、０．５μｇ／１００μｌのｒｍＩＬ−１２または１００μｌの生理食塩水を１日おきに全マウスに腹腔内注射した（マウス１匹当たり合計３．５μｇ）。ＦＣおよびｒＩＬ−１２の両方をワクチン接種すると、対照（ｐ＝０．０１；図３）と比較して、生存が延びた。ＦＣおよびｒＩＬ−１２で治療した１０匹のマウスのうち５匹は７０日以上生存した。対照とｒｍＩＬ−１２だけ、またはＤＣとｒｍＩＬ−１２の両方で治療したマウスとの間の生存率の差は、統計的には有意でなかった（データは示していない）。これらの結果から、ｒｍＩＬ−１２がＦＣ組成物の抗腫瘍効果を増強することが示される。
【０１５０】
５１Ｃｒ放出アッセイによりＣＴＬ活性を分析した。ＦＣ（０日目および／または７日目）および／またはｒＩＬ−１２（７日目に開始して１０日間にわたって１日おきに；マウス１匹当たり合計２．５ｐｇ）での免疫感作後、未処理マウスと、ＦＣで１回または２回免疫感作したマウス由来の脾細胞（ＳＰＣ）を分離した。図４から、免疫感作したマウス、特にｒＩＬ−１２を注射し、かつＦＣで２回免疫感作したマウスからの腫瘍細胞に対するＣＴＬ活性は、対照およびその他のマウスと比較して、顕著に増加したこと、ならびに、処理マウス由来のＹａｃ−１細胞に対する抗腫瘍活性は有意に増加しなかった（データは示していない）ことが示される。これらの結果は、ＦＣのワクチン接種が抗腫瘍活性を誘導したこと、および処理マウス由来のＳＰＣの細胞溶解活性が腫瘍特異的であったことを示唆している。
【０１５１】
さらに、グリオーマ細胞およびＦＣの注射を受けたマウスに、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗アシアロＧＭＩ、または対照ラットｌｇＧを投与することにより、リンパ球サブセットを枯渇させた。０および７日目に、ＦＣを側腹部に皮下接種した。続いて１４日目に、親細胞を反対側の側腹部に接種した。ｍＡｂを７、１０、１４および１７日目に腹腔内注射した。ＣＤ８＋Ｔ細胞が枯渇したマウス（各グループで、ｎ＝４；図５）では、抗腫瘍効果が低下した。ＦＣにより賦与される防御は、ＣＤ４＋ＴまたはＮＫ細胞枯渇により喪失されなかった。これらの結果から、このモデルにおいてＦＣの抗腫瘍効果には、ＣＤ８＋Ｔ細胞を必要とすることが示される。
【０１５２】
実験治療モデルでは、本発明者らはＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞が脳腫瘍に浸潤しているかどうかを分析した。脳腫瘍の免疫蛍光分析から、非ワクチン接種マウス（図６Ａ、Ｂ）の腫瘍には、ごく少数のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞しか存在しないことが示された。対照的に、ワクチン接種マウス（図６Ｃ、Ｄ）の腫瘍には、多数のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞が検出可能であった。すでに報告されているように、ＳＲ−Ｂ１０．Ａ細胞はＧＦＡＰについて陽性であった（１０）。
【０１５３】
６．３　考察
遺伝子工学的に作製したグリオーマ細胞をグリオーマに対するワクチン接種用のＡＰＣとして用いることができるが、この抗腫瘍効果は、マウスモデルにおける樹立した脳腫瘍を根絶するには不十分である（Ａｏｋｉら、１９９２， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ８９：３８５０−４）；Ｗａｋｉｍｏｔｏ， Ｈ．ら、１９９６， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ５６：１８２８−３３）。従って、ＤＣに基づく組成物は、脳腫瘍の治療に用いることができる有望な方法である。ＤＣは抗原を取り込む能力を喪失する。従って、ＤＣを使用するには、ＴＡＡをＤＣに組み込む効率的な方法が必要である。これまで、抗腫瘍免疫の誘導のためにＤＣを用いたいくつかの方法が研究されてきた：腫瘍細胞から抽出したタンパク質またはペプチドでパルスしたＤＣ（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら、１９９６；Ｎａｉｒら、１９９７， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ， ７０：７０６−１５；Ｔｊａｎｄｒａｗａｎら、１９９８， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ， ２１：１４９−５７）、ＴＡＡをコードする遺伝子によりトランスフェクトしたＱＣ（Ｔｕｔｉｎｇら、１９９８， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １６０：１１３９−４７）、腫瘍細胞と一緒に培養したＤＣ（ＣｅｌｌｕｚｉおよびＦａｌｏ， １９９８）および腫瘍細胞と融合させたＤＣ（Ｇｏｎｇら、１９９７， Ｎａｔ Ｍｅｄ， ３：５５８−６１；Ｇｏｎｇら、１９９８， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ９５：６２７９−８３；Ｌｅｓｐａｇｎａｒｄら、１９９８， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ， ７６：２５０−８；Ｗａｎｇら、１９９８， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １６１：５５１６−２４）。１）ＦＣを用いて、未知ＴＡＡに対する抗腫瘍免疫を誘導することができること、２）グリオーマの一般的ＴＡＡは同定されていないこと、ならびに、３）ＦＣの抗腫瘍効果は、ＤＣと腫瘍細胞の混合物より一層完全な治癒をもたらすことから、ＦＣには、悪性グリオーマに対する可能性のある治療法としての利点がありうる。
【０１５４】
マウス皮下腫瘍モデルにおける腫瘍細胞に対するＦＣの効果はすでに報告されていた（Ｇｏｎｇら、１９９７， Ｎａｔ Ｍｅｄ， ３：５５８−６１）が、脳における効果はまだ不明確のままである。本発明者らの脳腫瘍モデルでは、ＦＣの全身ワクチン接種により、腫瘍細胞は拒絶に対して感受性が高くなるため、全身免疫の確立および生存の延長がもたらされる。中枢神経系（ＣＮＳ）は、一般に、リンパ排液がないこと、ならびに、脳血管内皮細胞間の緊密な結合が細胞および抗体の通過の物理的障壁を形成している血液−脳関門の性質のために、免疫学的に特別な部位と考えられている（Ｃｓｅｒｒ， Ｈ． Ｆ． およびＫｎｏｐｆ， Ｐ． Ｍ．， １９９２， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ， １３：５０７−１２）。しかし、本研究により、ＦＣの全身ワクチン接種を用いて、樹立した脳腫瘍を治療できることが示される。従って、脳は完全に免疫的に特別なわけではない可能性があり、または、あるいは特定の腫瘍の免疫系に対する障壁が乗り越えられる可能性があるために、全身と局部（ｆｏｃａｌ）免疫との間のクロストークが起こり得る。
【０１５５】
本研究では、ＦＣだけのワクチン接種で、脳腫瘍を有するマウスの生存が延びた。このため、本発明者らは、刺激性サイトカインと一緒にＦＣを注射することにより、免疫感作治療計画および方法を改善することができると推論した。実際に、ｒｍＩＬ−１２の投与により、マウスグリオーマに対するＦＣの抗腫瘍効果が増強された。ＩＬ−１２は、もともとナチュラルキラー細胞刺激因子または細胞傷害性リンパ球成熟因子と呼ばれ、ＮＫ／リンホカイン−活性化キラー（ＬＡＫ）細胞の溶解活性を増強し、特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を促進し、活性化Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増殖因子として作用し、Ｔ細胞およびＮＫ細胞からＩＦＮ−γの産生を誘導すると共に、血管形成阻害物質として作用する（Ｂｒｕｎｄａ， Ｍ． Ｊ．， １９９４， Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ， ５５：２８０−８）。ＩＬ−１２は、悪性疾患の治療で免疫調節物質として使用される可能性があり、特定のマウス腫瘍の増殖を有意に遅延させることが示されているが（Ｇａｔｅｌｙら、１９９４， Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ６：１５７−６７）；Ｎａｓｔａｌａら、１９９４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ， １５３：１６９７−７０６）、ｒｍＩＬ−１２の全身投与は、脳腫瘍を有するマウスの生存を延ばさなかった（Ｋｉｋｕｃｈｉら、１９９９， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ， ８０：４２５−４３０）。このことは、ＦＣとｒｍＩＬ−１２を組み合わせた治療の抗腫瘍効果が相乗的であることを示している。対照マウス由来の脳腫瘍にはリンパ球がほとんど存在しなかった。しかし、重要なことには、ＦＣで免疫感作すると、リンパ球浸潤が実質的に増加した。さらに、腫瘍部位では、腫瘍由来の免疫抑制因子（例えば、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、プロスタグランジンＥ２）の濃度が高いと考えられるが、これは、脳腫瘍を治癒するには、さらに強力なＣＴＬが必要でありうることを示す。
【０１５６】
ＤＣは、ＭＨＣ拘束的に、ＣＤ４＋Ｔ細胞を特定の抗原に対し感作させることができる。細胞傷害性Ｔリンパ球および抗原非特異的エフェクター免疫応答の両方のプライミングにおいて、ＣＤ４＋Ｔ細胞は重要であり、このことは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方が、抗腫瘍免疫に同等に重要であることを意味する。以前の報告によれば、ＤＣおよびＭＣ３８と融合した細胞の抗腫瘍効果は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を介して媒介された（Ｇｏｎｇら、１９９７， Ｎａｔ Ｍｅｄ， ３：５５８−６１）。しかし、本発明者らの研究結果から、ＦＣの抗腫瘍効果には、ＣＤ８＋Ｔ細胞が必要であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞の役割はそれほど明白ではないことが示された。Ｏｋａｄａら（１９９８， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ， ７８：１９６−２０１）によれば、脳腫瘍モデルにおけるペプチドパルスＤＣの抗腫瘍効果には、ＣＤ８＋Ｔ細胞だけが必要であると報告されていた（Ｏｋａｄａら、１９９８， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ， ７８：１９６−２０１）。従って、ＤＣの抗腫瘍効果を媒介する細胞型は普遍的ではなく、実験モデルに依存しうる。組織病理学による知見から、脳腫瘍には、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方が存在することが示された。ＣＴＬは、ＦＣのワクチン接種を開始する前にすでにプライミングされていたと、推測することができる。すなわち、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＦＣによる免疫感作の前にＣＴＬのプライミングをすでに終了しており、プレＣＴＬ（プライミングされたＣＴＬ）はＦＣによって刺激されるために、活性化ＣＴＬの誘導および抗腫瘍活性の獲得が達成された。
【０１５７】
結論として、本発明者らのデータから、ＦＣおよびｒＩＬ−１２のワクチン接種を用いて、マウスモデルにおける悪性グリオーマを治療できることが示唆される。本研究では、本発明者らはＤＣを樹立腫瘍細胞系と融合させた。しかし、臨床用途では、ＤＣを、摘出した腫瘍物質または一次培養細胞と融合させなければならない。将来の研究では、ＤＣおよび一次培養ヒトグリオーマ細胞と融合させた細胞の抗腫瘍活性の特性付けに焦点が絞られるであろう。
【０１５８】
７．実施例：インターロイキン１２と組み合わせた腫瘍細胞−樹状細胞ハイブリッドによる治療
肝細胞癌（ＨＣＣ）は、世界、特にアジアおよびアフリカ諸国において最も一般的な癌の一つである。この疾患は他所（ａ）では稀であったが、近年の報告によれば、ＨＣＣは現在西側諸国で増加傾向にあることが示されている（Ｅｌ−Ｓｅｌａｇら、１９９９， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３４０：７４５−７５０）。疫学的および推測的研究により、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）および／またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染とＨＣＣとの間の強い病因学的関連が示されている（Ｉｋｅｄａら、１９９３， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， １８：４７−５；Ｏｂａｔａら、１９８０， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ２５：７４１−７４７；Ｓａｉｔｏら、１９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：６５４７−６５４９）。日本では、ＨＣＣ患者の約７６％が慢性ＨＣＶ感染を有し、７８％が肝硬変を有していた（Ｌｉｖｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ ｏｆ Ｊａｐａｎ， １９９８）。同時に存在する肝硬変により機能予備力が低下するため、腫瘍の外科的切除が制限されていた。その結果、治療には、癌化学療法、トランスカテーテル動脈塞栓形成、トランスカテーテル動脈化学療法、経皮エタノール注射および経皮マイクロ波凝固療法が含まれていた。しかし、これらの療法後の再発率は高く（Ｌｉｖｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ ｏｆ Ｊａｐａｎ， １９９８；Ｔａｒａｏら、Ｃａｎｃｅｒ， ７９：６８８−６９４）、これは恐らく、不十分な治療効果と、硬変肝におけるＨＣＣの多中心性（ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｉｃ）発生によるものであろう。
【０１５９】
本研究で、本発明者らは、ＨＣＣ細胞の接種前に、ＨＣＣ細胞と融合させたＤＣのワクチン接種により、ＨＣＣ腫瘍の増殖が阻止されることを示す。加えて、ＤＣ／ＨＣＣによる樹立ＨＣＣ腫瘍の治療には、ＩＬ−１２の共投与が必要である。重要なことには、ＩＬ−１２もまた、融合細胞に基づく免疫療法の効果を高めることができる。
【０１６０】
７．１　材料および方法
マウス、腫瘍細胞系、サイトカインおよび抗体
雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（８〜１０週齢）をＮｉｐｐｏｎ ＳＬＯ（Ｓｈｉｚｕｏｋａ， Ｊａｐａｎ）から購入した。マウスＨＣＣ細胞系であるＢＮＬは、Ｓ． Ｋｕｒｉｙａｍａ博士（Ｎａｒａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎａｎ．， Ｊａｐａｎ）の好意により提供された。Ｃ２６、ＢＡＬＢ／ｃマウスの結腸癌細胞系は、Ｔｙｕｇａｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｔｏｋｙｏ）から提供された。マウス組換えＩＬ−１２（ｍｒＩＬ−１２）は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）の好意により提供された。ヒト組換えＩＬ−２（ｈｒＩＬ−２）は、Ｓｈｉｏｎｏｇｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｔｏｋｙｏ）の好意により提供された。マウスＣＤ４、ＣＤ８、Ｈ−２ＫｄおよびＩ−Ａｄ／Ｉ−Ｅｄに対するラットモノクローナル抗体は、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）から購入した。
【０１６１】
ＤＣの調製
Ｉｎａｂａらにより記載された方法（Ｉｎａｂａら、１９９２， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７６：１６９３−１７０２）に改変を加えて、ＤＣを調製した。簡単に言えば、雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（８〜１０週齢）の大腿および脛骨から骨髄細胞を取得した。０．８３％の塩化アンモニウム溶液を用いた処理により、赤血球を溶解した。ヒトγ−グロブリン（Ｃａｐｐｅｌ、Ａｕｒｏｒａ， ＯＨ）でコーティングしたプレート上で、これらの細胞を３７℃で１時間インキュベートした（Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、１９９７， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ， １５：１４４−１５３）。非付着細胞を回収し、１０ｎｇ／ｍｌマウス組換え顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＰ）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）と６０Ｕ／ｍｍの組換えマウスＩＬ−４（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）とを含む培地中の２４ウェルプレート（１０５細胞／ｍｌ／ウェル）上で培養した。５日間の培養後、非付着または付着の弱い細胞を適度なピペッティングで回収し、１００−ｎｕｎペトリ皿に移した。一晩培養した後、多数のＤＣを含む浮遊細胞を回収した。このようにして得られた細胞は、樹状の特徴と、ＭＨＣクラス１、クラスＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ５４の細胞表面発現を呈示したが、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ４ＳＲの発現は呈示しなかった。
【０１６２】
ＤＣとＢＮＬ細胞との融合
ＤＣおよびＢＮＬ細胞の融合は、Ｇｏｎｇらの方法（Ｇｏｎｇら、１９９７， Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， ３：５５８−５６１）を改変して実施した。簡単に言えば、ＢＮＬ細胞を３５Ｇｙで照射し、１：３（ＢＬＮ：ＤＣ）の比でＤＣと混合した後、遠心分離した。細胞ペレットを５０％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ １４６０， Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）で、３７℃にて１分処理した後、ＰＥＧ溶液を温かいＲＰＭＩ １６４０培地で稀釈した。ＰＥＧ処理した細胞を、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を含む培地中で、３７℃にて一晩培養した。
【０１６３】
細胞のＦＡＣＳ分析
細胞融合の効率を決定するために、ＢＮＬ細胞をＰＫＨ−２６（赤色蛍光）で染色し、ＤＣをＰＫＨ−２ＧＬ（緑色蛍光）で染色した。蛍光色素で染色した細胞をＰＥＧで処理し、上記と同様に一晩培養した。これらの融合体をＩ−Ａｄ／Ｉ−Ｅｄ、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ５４に対するモノクローナル抗体とコンジュゲートしたフィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｉｎ）（ＰＥ）またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）でも染色した。ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）で蛍光プロフィールを作製した。Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウエアパッケージ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）を用いて、ヒストグラムおよび密度プロットを作製した。
【０１６４】
走査型電子顕微鏡検査
０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．４）中の１．２％のグルタルアルデヒドで細胞を固定した。固定した細胞を、０．１％のポリ−Ｌ−リシンで事前にコーティングしたスライドに付着させ、エタノールの濃度を上昇させながら脱水させ、酢酸イソアミルで処理した後、液体ＣＯ２で臨界点乾燥させた。被検体を、真空蒸着して鉄スパッターした金でコーティングした後、１０ｋＶの加速電圧で、ＪＳＭ−３５走査型電子顕微鏡（Ｊａｐａｎ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）により観察した。
【０１６５】
マウスへの融合体の注射およびＩＬ−１２の投与
腫瘍の予防研究では、ＤＣ／ＢＮＬ融合体をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に懸濁させ、２週間の間隔を置いて、２回マウスの尾静脈に注射した（４×１０５細胞／マウス）。２回目の免疫感作から１週間後、１０６個のＢＮＬ細胞の皮下注射により腫瘍チャレンジを実施した。腫瘍サイズ（≧３ｍｍを陽性とスコアする）の測定により、腫瘍の成長についてマウスを毎週モニタリングした。対照マウスには、ＤＣ／ＢＮＬ融合体の代わりに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、照射済ＢＮＬ細胞（１０５／マウス）、ＤＣ（３×１０５／マウス）、または照射済ＢＮＬ細胞とＤＣとの混合物（４×１０５／マウス、ＤＣ：ＢＮＬ比は３：１）を投与し、融合体を投与したマウスと同様に、腫瘍の発生について検討した。各グループは１０匹のマウスから構成された。
【０１６６】
処理研究では、マウスを４つのグループに区分した。各グループ１０匹のマウスは、皮下接種したＢＮＬ細胞を有していた。グループＡでは、ＢＮＬ細胞の接種後３日目および１０日目に、ＤＣ／ＢＮＬ融合体を皮下注射した。０．３％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ中に溶解させたＩＬ−１２を、１回目の融合体の接種から２、４および６日後、ならびに、２回目の接種から３および５日後に腹腔内注射した。グループＢのマウスは、ＩＬ−１２を投与しない以外は、グループＡのマウスと同様に処理した。グループＣのマウスは、融合体を投与しない以外は、グループＡのマウスと同様に処理した。グループＤのマウスは、ＩＬ−１２と融合体のいずれも投与しない以外は、グループＡのマウスと同様に処理した。
【０１６７】
ＢＮＬ細胞に対する脾細胞の溶解活性のアッセイ
スチール製のメッシュで脾臓を穏やかに破砕した後、低張処理により赤血球を枯渇させることにより、脾細胞を取得した。５０Ｕ／ｍｌのヒト組換えＩＬ−２を含む１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補足したＲＰＭＩ−１６４０培地中で、マウス由来の脾細胞を４日培養した。ＢＮＬ細胞（１０４細胞／ウェル）を５１Ｃｒで標識した後、２００μｌの容量における表示したエフェクター標的比で、脾細胞（エフェクター細胞）とともに１０％の熱不活性化ＦＣＳを補足したＲＰＭＩ−１６４０培地において、３７℃で４時間インキュベートするが、これは９６マルチウェルプレートにおいて３重で実施した。インキュベーション後、１００μｌの上清を回収し、特異的５１Ｃｒ放出％を下記の式で計算した：５１Ｃｒ放出％＝１００×（ｃｐｍ実験−ｃｐｍ自発的放出）／（ｃｐｍ最大放出−ｃｐｍ自発的放出）（式中、最大放出は、０．３３Ｎ ＨＣｌと一緒にインキュベートした標的細胞から得られたものであり、自発的放出は、エフェクター細胞なしでインキュベートした標的細胞から得られたものであった）。マウスＣＤ４、ＣＤ８、Ｈ−２Ｋｄ、Ｉ−Ａｄ／Ｉ−Ｅｄに対するラットモノクローナル抗体による溶解活性の阻害を評価するため、４時間のインキュベーション中、５０μｇ／ｍｌの各抗体を培養物に添加した。
【０１６８】
免疫組織化学的研究
免疫蛍光染色は、直接免疫蛍光により実施した。腫瘍組織の凍結切片を作製し、アセトンで室温にて１０分固定した。ＰＢＳで洗浄した後、切片をＰＢＳ中の１０％の標準ヤギ血清で、室温にて２０分、次に、ダークボックスにおいて、ＰＢＳ中の１０％の標準ヤギ血清においてＰＥもしくはＦＩＴＣ標識抗体とともに、室温にて２〜３時間インキュベートした。切片をＰＢＳで洗浄し、マウントした後、蛍光顕微鏡下で観察した。
【０１６９】
７．２　結果
ＤＣとＢＮＬ細胞との融合体の特徴付け
ＤＣおよびＢＮＬ細胞を混合し、ＰＥＧで処理した後、一晩インキュベートした。ＰＥＧで処理した細胞から得た非付着および付着細胞は、位相差顕微鏡下で、それぞれ樹状細胞の特徴および上皮細胞の特徴を呈示した。非付着細胞は、ＦＡＣＳ分析により、ＤＣマーカーである、Ｉ−Ａｄ（ＭＨＣクラスＩＩ）およびＣＤ１１ｃを発現した（データは示していない）。付着細胞が、Ｉ−ＡｄおよびＣＤ１１ｃ発現に陰性であるという知見は、ＢＮＬ細胞が付着細胞分画中に存在することを示していた。
【０１７０】
ＰＥＧ処理前に、ＣＤ１１ｃに対するＦＩＴＣコンジュゲート抗体でＤＣを処理し、ＢＮＬ細胞をＰＫＨ−２６で染色した。これらの細胞をＰＥＧ処理により融合させてから、蛍光顕微鏡下で観察した。ＦＩＴＣ（緑色）およびＰＫＨ−２６（赤色）の両方で染色された細胞がＰＥＧ処理細胞中に観察された（図７）。融合効率を測定するために、ＤＣおよびＢＮＬ細胞を蛍光色素であるＰＫＨ−２ＧＬおよびＰＫＨ−２６でそれぞれ染色した後、ＰＥＧで処理した。ＦＡＣＳ分析により、ＰＫＨ−２ＧＬおよびＰＫＨ−２６の両方で染色された細胞（ＤＣおよびＢＮＬ細胞の融合体であると考えられた）が、高前方（ｈｉｇｈ ｆｏｒｗａｒｄ）散乱および高側方（ｈｉｇｈ ｓｉｄｅ）散乱を有する細胞散布図の上方領域に示される。高および中前方散乱および低側方散乱の細胞分画は、多数の非融合ＢＮＬ細胞を含み、低前方散乱および低側方散乱の細胞分画は、非融合ＤＣおよび非融合ＢＮＬ細胞を含んでいた（図８）。散布図全体を占める二重陽性細胞の領域の幅から判断されるように、非付着細胞の約３０％が融合体であった。
【０１７１】
融合体の表現型をＦＡＣＳにより分析した。ＰＫＨ−２ＧＬおよびＰＫＨ−２６の両方について陽性の細胞分画を散布図でゲート（ｇａｔｅ）し、抗原発現について調べた。ＤＣ上に見出されるＩ−Ａｄ／Ｉ−Ｅｄ（ＭＨＣクラスＩＩ）、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ５４分子は融合体により発現された（図９）。
【０１７２】
加えて、走査型電子顕微鏡により、ＢＮＬ細胞が平滑な細胞表面上に短い突起を発現するのに対し、ＤＣは多数の長い樹状突起を有した。非付着融合細胞は大きく、卵形で、短い樹状突起を有していた（図１０）。
【０１７３】
腫瘍の発生予防に対するＤＣ／ＢＮＬ融合体によるワクチン接種の効果
ＤＣ／ＢＮＬ融合体をワクチン接種することにより、ＢＡＬＢ／ｃマウスに接種したＢＮＬ細胞によるチャレンジの拒絶が起こった。対照的に、ＤＣだけまたは照射済ＢＮＬ細胞だけを注射した場合には、腫瘍の発生および成長を阻止することができなかった（図１１）。ＤＣおよびＢＮＬ細胞（融合体を作製するのに用いられる細胞に対応する数）の混合物の注射は、一時的に腫瘍成長を阻止したが、４週間後、腫瘍は対照に匹敵する速度で成長した。Ｃ２６結腸癌細胞が、ＤＣ／ＢＮＬ融合体の事前の注射により拒絶されなかったという知見は、ＤＣ／ＢＮＬ融合体によって誘導された免疫がＢＮＬ細胞に特異的であったということを示していた（データは示していない）。
【０１７４】
予め樹立させたＢＮＬ腫瘍の治療へのＤＣ／ＢＮＬ融合体を用いたワクチン接種の効果
ＢＮＬ細胞（１０６／マウス）をＤＣ／ＢＮＬ融合体による治療の３日前に接種した。ＢＮＬ腫瘍に対するＤＣ／ＢＮＬ融合細胞だけによる治療の効果は、有意ではなかった（図１２）。加えて、ＩＬ−１２（２００ｎｇ／マウス、腹腔内）だけの全身投与では、ＢＮＬ細胞の成長に対して何ら有意な治療効果がなかった（その際、腫瘍は、接種後７週間以内に全マウスで観察された）。しかし、ＤＣ／ＢＮＬ融合体の注射後、ＩＬ−１２を投与すると、有意な抗腫瘍効果を誘発した。７匹のマウスのうち４匹がＢＮＬ腫瘍発生を示さなかった。従って、ＢＮＬ細胞接種から７週間後の腫瘍発生率は、４３％（３／７）であった。このプロトコルでＩＬ−１２の用量を増加または減少しても、抗腫瘍効果は改善しなかった。
【０１７５】
ＤＣ／ＢＮＬ融合体およびＩＬ−１２で処理したマウスにおける脾細胞のＢＮＬ細胞に対する溶解活性
ＤＣ／ＢＮＬ融合体で処理したマウスに由来する脾細胞を用いて、ＢＮＬ細胞に対する有意な細胞溶解活性が観察された（図１３）。ＤＣ／ＢＮＬ融合体およびＩＬ−１２の両方で処理したマウス由来の脾細胞は、ＤＣ／ＢＮＬ融合体だけで処理したマウスに由来する脾細胞よりも、ＢＮＬ細胞に対する強い細胞溶解活性を示した。対照的に、Ｃ２６結腸癌細胞に対する細胞溶解活性はまったく確認されなかった（図１４）。
【０１７６】
融合体のワクチン接種により誘導されたエフェクター細胞の同定
ＤＣ／ＢＮＬ融合体で免疫感作したマウス由来の脾細胞を、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｈ−２ＫｄおよびＩ−Ａｄ／Ｉ−Ｅｄに対する抗体の存在下で、ＢＮＬ細胞に対する溶解活性について調べた。ＣＤ４に対する抗体で処理した脾細胞の溶解活性は有意に低下したが、ＣＤ８に対する抗体で処理したものは、イソタイプが同じ抗体のラットＩｇＧ２ａで処理したものとほぼ同じ溶解活性を示した（図１５Ａ）。融合体で処理したマウス由来の脾細胞の溶解活性は、ＢＮＬ細胞をＨ−２Ｋｄではなく、Ｉ−Ａｄ／Ｉ−Ｅｄに対する抗体で処理した場合、有意に阻害された。これらの結果から、ＤＣ／ＢＮＬ融合体での免疫感作により誘導されたエフェクター細胞がＣＤ４＋ＣＴＬであり、細胞傷害性はＭＨＣクラスＩＩ依存性であることが示唆される。
【０１７７】
融合体処理マウスにおいて成長するＢＮＬ腫瘍に関する免疫組織化学的研究
ＤＣ／ＢＮＬ融合体を事前に注射したにもかかわらず、成長したＢＮＬ腫瘍を免疫組織化学により、ＣＤ４＋細胞の浸潤、ならびにＩ−Ａｄ／Ｉ−Ｅｄの発現およびＩＣＡＭ−１の発現について調べた。この研究では、ＤＣ／ＢＮＬ融合体を２週間間隔で２回皮下注射した。融合体の２回目の注射から７日後、ＢＮＬ細胞（１０９／マウス）を皮下接種した。
【０１７８】
小さな腫瘍が現れたとき、いくつかのマウスを２００ｎｇのＩＬ−１２で週３回処理した。３回目のＩＬ−１２投与から１日後、腫瘍を切除した。ＩＬ−１２を投与した融合体処理マウスに形成された腫瘍において、ＣＤ４＋細胞が検出可能であった。対照的に、融合体だけで処理したマウスに形成された腫瘍には、ＣＤ４＋細胞はほとんど認められなかった。ＩＬ−１２の投与を受けたマウスに形成されたＢＮＬ腫瘍には、Ｉ−Ａｄ／Ｉ−Ｅｄ分子が、より豊富に発現していた。
【０１７９】
また、ＣＤ５４（細胞間接着分子１：ＩＣＡＭ−１）も、ＩＬ−１２で処理したマウスにおけるＢＮＬ腫瘍細胞上に、より高いレベルで発現していた。これらの結果から、ＤＣ／ＢＮＬ融合体での免疫感作により誘導されたＢＮＬ細胞と反応性の主要エフェクター細胞はＣＤ４＋ＣＴＬであったことが示唆される。さらに、ＩＬ−１２による処理で、ＭＨＣクラスＩＩおよびＩＣＡＭ−１分子の増強した発現により、ＣＤ４＋ＣＴＬに対する腫瘍細胞の感受性が誘導される。
【０１８０】
７．３　考察
ＤＣは、ナイーブＴ細胞に腫瘍抗原を提示し、これら抗原に対して該Ｔ細胞をプライミングすることができる強力な抗原提示細胞である（Ｇｒａｂｂｅら、１９９５， Ｉｍｍｕｎｏｌｏ． Ｔｏｄａｙ， １６：１１７−１２１；Ｓｈｕｒｉｎ， Ｍ． Ｒ．， １９９６， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ４３：１５８−１６４）。癌免疫療法の現在の焦点は、免疫療法剤としてのＤＣの利用である。ＤＣは、外因性抗原をプロセシングし、ＣＤ４＋Ｔ細胞だけではなく、ＣＤ８＋Ｔ細胞にも提示することができるため、腫瘍溶解物で、または腫瘍細胞表面上にＭＨＣ分子に関連して担持される抗原ペプチドでＤＣをローディングすることにより誘導される抗腫瘍免疫は、有望な抗腫瘍ストラテジーになり得る（Ｐａｇｌｉａら、１９９６， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８３：３１７−３２２；Ｍａｙｏｒｄｏｍｏら、１９９５， Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， １：１２９７−１３０２；Ｃｅｌｌｕｚｚｉら、１９９６， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８３：２８３−２８７， Ｚｉｖｏｇｅｌら、１９９６， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８３：８７−９７；Ｎｅｓｔｌｅら、１９９８， Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， ４：３２８−３３２；Ｐｏｒｇａｄｏｒら、１９９５， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８２：２５５−２６０）。
【０１８１】
腫瘍細胞と融合させたＤＣは、抗腫瘍免疫を誘導することが報告されている（Ｇｏｎｇら、１９９７， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ３：５５８−５６１）。この設定では、融合細胞は、腫瘍細胞の抗原エピトープを保有すると同時に、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子、補助的刺激分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６）および細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の発現を保持することから、該融合細胞は、腫瘍抗原の抗原エピトープをナイーブＴ細胞に提示し、該Ｔ細胞をこれら抗原に対してプライミングする。
【０１８２】
自己ＤＣと腫瘍細胞とを融合させることにより、ＭＨＣ拘束、腫瘍抗原のユニークな突然変異（Ｒｏｂｂｉｎｓら、１９９６， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８３：１１８５−１１９２；Ｂｒａｎｄｌｅら、１９９６， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８３：２５０１−２５０８）、ならびに、腫瘍特異的エピトープの多様性などの抗腫瘍免疫の誘導に対する障害を克服することができる。さらに、ＭＨＣ分子に対するパルスした抗原ペプチドの低い親和性（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、１９９８， Ｎａｔｕｒｅ， ３９２：２４５−２５２）およびペプチドをパルスしたＭＨＣクラスＩ分子の短い寿命（Ｃｅｌｌａら、１９９７， Ｎａｔｕｒｅ， ３８８：７８２−７９２）などのペプチドをパルスしたＤＣの問題は、融合体に基づく免疫感作では問題ではない。加えて、細胞融合に必要なＢＮＬ細胞の数は、ＤＣの１／２〜１／３である。必要な腫瘍細胞が少数であることは、融合体に基づく免疫療法の臨床用途では有利である。腫瘍生検で得ることができる腫瘍細胞は、ＤＣの融合相手の供給源として十分でありうる。
【０１８３】
ＤＣ／癌細胞融合体の臨床応用のために、ＰＥＧによる処理および癌細胞の排除によるＤＣおよび腫瘍細胞の融合効力の評価が重要である。非付着細胞は、ＤＣマーカーであるＩ−ＡｄおよびＣＤ１１ｃを示したが、付着細胞は示さなかった。このことは、非付着細胞分画が融合細胞およびＤＣを含むこと、ならびに、ほとんどの付着細胞が、ＤＣと融合していないＢＮＬ細胞であったことを示していた。非付着細胞分画では、位相差顕微鏡検査および走査電子顕微鏡検査により、ＤＣより大きい多樹状細胞（ｍｕｌｔｉ−ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）が示された。二色ＦＡＣＳ分析により、ＰＥＧ処理非付着細胞の約３０％が、ＰＫＨ−２ＧＬおよびＰＫＨ−２６の両方に陽性であることが示された。両方の蛍光色素で陽性の細胞は、抗原提示に必要なＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ５４分子を発現していた。従って、融合体は、ＤＣ能力により、ＢＮＬ腫瘍抗原をナイーブＴ細胞に提示することができると考えることができる。ＤＣ／ＢＮＬによるＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫感作は、ＢＮＬ細胞によるチャレンジに対する防御に関連していた。さらに、免疫感作したマウス由来の脾細胞は、ＢＮＬ細胞に対する有意な溶解活性を示した。対照的に、脾細胞が、Ｃ２６マウス結腸癌細胞に対する溶解活性を呈示しないという知見から、抗腫瘍免疫がＢＮＬ細胞に特異的であることが示される。ＰＥＧで処理しなかったＤＣおよびＢＮＬ細胞の混合物で免疫感作したマウスは、ＤＣ／ＢＮＬ融合細胞よりも、ＢＮＬ細胞チャレンジに対し弱い防御を呈示した。Ｃｅｌｌｕｚｚｉ， Ｃ．Ｍ．およびＦａｌｏ， Ｌ．Ｊ．（１９９８， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ， １６０， ３０８１−５）によれば、ＤＣ／Ｂ１６黒色腫細胞融合体と、ＤＣおよびＢ１６黒色腫細胞の混合物との間に抗腫瘍免疫の差異を認められなかった。この矛盾は、ＢＮＬ ＨＣＣ細胞とＢ１６黒色腫細胞との間の抗原性の差異によるものと思われる。
【０１８４】
ＩＬ−１２は、もともと細胞傷害性リンパ球成熟因子（ＣＬＭＦ）（Ｓｔｅｒｎら、１９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：６８０８−６８１２）またはナチュラルキラー細胞刺激因子（ＮＫＳＦ）（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、１９８９， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７０：８２７−８４５）と呼ばれるヘテロ二量体（ｐ３５／ｐ４０）のサイトカインである。ＩＬ−１２は、ＴＨ１細胞に対するナイーブ前駆体の分化に基本的役割を果たし、抗腫瘍免疫を誘導する（Ｔａｈａｒａら、１９９５， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ２：９６−１０６；Ｄｕｓｔｉｎら、１９８６， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３７：２４５−２５４；Ｓｃｈｍｉｔｔら、１９９４， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２４：７９３−７９８）。高レベルのＩＬ−１２を産生する樹状細胞は、ナイーブヘルパーＴ細胞を駆動し、ＴＨ１に分化させる（Ｍａｃａｔｏｎｉａら、１９９５， Ｊ． Ｉｍｍｎｏｌ．， １５４：５０７１−５０７９）。ＩＬ−１２と組み合わせてＤＣ／ＢＮＬ融合体で処理したマウス由来の脾細胞は、ＤＣ／ＢＮＬ融合体だけで処理したものよりも、ＢＮＬ細胞に対し優れた細胞溶解活性を示した（図１４）。特定の抗原により刺激され、かつＣＤ８０およびＣＤ８６を通じて共刺激されたヘルパーＴリンパ球は、ＩＬ−１２受容体を発現する（Ｉｇａｒａｓｈｉら、１９９８， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６０：１６３８−１６４６）。腫瘍ペプチドをパルスしたＤＣでの免疫感作、ならびに、ＩＬ−１２の全身投与により、有効な抗腫瘍免疫が誘発される（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら、１９９６， Ａｎａｌ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ７９５：２８４−２９３）。ＩＬ−１２により誘導されるＩＦＮ−γは、プロテオソームの機能、ならびに、ＤＣ（Ｇｒｉｆｆｉｎら、１９９８， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８７：９７−１０４）および恐らくは融合細胞による抗原提示の効力を増強する。本研究では、ＩＬ−１２だけを全身投与しても、予め樹立させたＢＮＬ腫瘍に対する効果はなかった。ＩＬ−１２での治療によるＣＴＬまたはＮＫ細胞の非特異的活性化は、殺腫瘍活性を誘導するには明らかに不十分である。また、本研究から、ＤＣ／腫瘍細胞融合体での免疫感作による特異的ＣＴＬの誘導、ならびに、ＩＬ−１２により誘導されたＣＴＬの活性化によって、有効かつ腫瘍特異的抗腫瘍免疫が生じることが示される。さらに、ＤＣ腫瘍細胞融合体は、Ｔｈ１状態を誘導するのに十分なＩＬ−１２を産生することができないと考えられる。ナイーブＴヘルパー細胞に特定の抗原を提示するＤＣから産生および放出されたＩＬ−１２は、Ｔｈ１細胞を活性化する（Ｍａｃａｔｏｎｉａら、１９９５， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５４：５０７１−５０７９）。ＩＬ−１２を産生するＤＣの能力が、細胞融合体により減弱される場合、融合体で免疫感作した宿主へのＩＬ−１２の全身投与は、Ｔｈ１細胞の発生および特異的ＣＴＬの生成に寄与すると考えられる。別の可能性として、融合体による抗原提示が、Ｔｈ２応答およびＩＬ−１０（ＩＬ−１２産生の阻害物質）の分泌を誘導すると考えられる（Ｈｉｎｏら、１９９６， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２６：６２３−６２８）。また、ＩＬ−１２の全身投与は、Ｔｈ２応答を阻害し、殺腫瘍ＣＴＬを生成することもできた。
【０１８５】
融合体で処理したマウス由来の脾細胞の細胞溶解活性は、ＣＤ４に対する抗体による該脾細胞の処理、ならびに、Ｉ−Ａｄ／Ｉ−Ｅｄに対する抗体による標的細胞の処理によって阻害された。これらの知見は、ＢＮＬ特異的エフェクター細胞がＣＤ４＋ＣＴＬであり、細胞傷害性がＭＨＣクラスＩＩに依存することを示唆している（Ｓｈｉｎｏｈａｒａ Ｎ．， １９８７， Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １０７：３９５−４０７；Ｏｚｄｅｍｉｒｌｉら、１９９２， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４９：１８８９−１８８５；Ｙａｓｕｋａｗａら、１９９３， Ｂｌｏｏｄ， ８１：１５２７−１５３４）。ＤＣは、特定の腫瘍抗原をＣＤ８＋ＣＴＬに提示するため、殺腫瘍活性は、ＭＨＣクラスＩ依存性である（Ｐｏｒｇａｄｏｒら、１９９５， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８２：２５５−２６０）。ＣＤ４＋ＣＴＬは一般的ではないが、ＣＤ４＋ＣＴＬはＣＤ８＋ＣＴＬとほぼ同じように機能する（Ｙａｓｕｋａｗａら、１９９３， Ｂｌｏｏｄ， ８１：１５２７−１５３４）。この研究では、細胞溶解活性は、ＣＤ８に対する抗体によるエフェクター細胞の処理でも、ＭＨＣクラスＩに対する抗体による標的細胞の処理のいずれによっても阻害されなかった。ｉｎ ｖｉｖｏでのＢＮＬ腫瘍上のＭＨＣクラスＩＩ（Ｉ−Ａｄ／Ｉ−Ｅｄ）分子の発現は、ＢＮＬ担持マウスをＩＬ−１２で処理したとき、大幅に増強された。この応答は、インターフェロン−γ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）またはインターロイキン−１の誘導によるものと考えられる（Ｇａｔｅｌｙら、１９９４， Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ６：１５７−１６７；Ｎａｓｔａｌａら、１９９４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５３：１６９７−１７０６）。ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現が増強されると、ＢＮＬ腫瘍抗原由来の抗原ペプチドのＣＤ４＋ＣＴＬに対する曝露が増加する。さらに、ＢＮＬ腫瘍組織によるＩＣＡＭ−１の発現は、ＩＬ−１２での腫瘍担持マウスの処理によりさらに増強された。この効果も、ＩＬ−１２により直接または間接的に誘導されたＩＦＮ−γまたはＩＬ−１の効果によるものであろう（Ｄｕｓｔｉｎら、１９８６， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３７：２４５−２５４）。これらの結果から、ＣＴＬは、ＩＬ−１２処理によって、より効率的に腫瘍の内皮細胞に付着し、腫瘍組織中に移動することができるため、樹立した病変に対する抗腫瘍活性が増強することが示唆される。
【０１８６】
多中心性ＨＣＣの発生および頻発する再発は、ウイルスにより誘導される硬変を有する患者には深刻な問題である。従って、ＨＣＣの発生を予防する方法が必要である。小さなＨＣＣは、超音波検査法により検出し、経皮エタノール注射療法または外科的切除によって治療することができる。新たなＨＣＣの発生を予防し、残留する微小転移巣を治療するために、生検または切除で取得した腫瘍細胞をＤＣと融合させることができる。従って、本実施例に示したように、ＩＬ−１２投与と組み合わせた自己ＤＣと腫瘍細胞との融合体による免疫感作は、ＨＣＣの治療に有望な方法である。
【０１８７】
本発明は、記載された特定の実施形態によって範囲を制限されることはなく、これらの実施形態は、本発明の個々の態様をそれぞれ例示しようとするものであり、機能的に同等の方法および構成要素は本発明の範囲内にある。実際に、本明細書に示しかつ説明したものに加えて、以上の説明および添付の図面から、本発明の様々な改変が当業者には明らかとなるであろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【０１８８】
本明細書に引用した参照文献はすべて、あらゆる目的のためにその全体が本明細書に参照として組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＦＣのＦＡＣＳ分析を示した図である。
【図２】
ＦＣによる免疫感作の抗腫瘍効果を示した図である。
【図３】
ＦＣおよびｒＩＬ−１２で処理した後のマウスの生存を示した図である。
【図４】
腫瘍担持マウス由来の脾細胞の細胞傷害性を示した図である。
【図５】
ＦＣによるワクチン接種およびＴ細胞サブセットの枯渇後の樹立皮下腫瘍の退縮を示した図である。
【図６】
発生した脳腫瘍の免疫蛍光分析を示した図である。
【図７】
ＰＥＧ処理細胞のうち、ＦＩＴＣ（緑色）とＰＫＨ−２６（赤色）の両方で染色された融合細胞を示した図である。
【図８】
ＦＡＣＳ分析。ＰＫＨ−２ＧＬとＰＫＨ−２６の両方で染色された細胞（ＤＣとＢＮＬ細胞の融合体であると考えられる）を、高前方散乱と高側方散乱を含む細胞散布図の上方領域に示す。
【図９】
散布図にゲートさせ（ｇａｔｅｄ）、抗原発現について調べた、ＰＫＨ−２ＧＬとＰＫＨ−２６の両方について陽性の細胞画分のＦＡＣＳ分析を示した図である。
【図１０】
走査型電子顕微鏡によるＢＮＬ細胞、ＤＣおよび非付着融合細胞の写真を示した図である。
【図１１】
ＤＣ／ＢＮＬ融合体によるマウスのワクチン接種が、ＢＡＬＢ／ｃマウスに接種したＢＮＬ細胞によるチャレンジの拒絶をもちらすことを示した図である。
【図１２】
ＣＴＬのクロム５１放出アッセイを示した図である。
【図１３】
ＣＤ／ＢＮＬ融合体で処理したマウス由来の脾細胞を用いた、ＢＮＬ細胞に対する顕著な細胞溶解活性を示した図である。
【図１４】
ＩＬ−１２と組み合わせて、ＣＤ／ＢＮＬ融合体で処理したマウス由来の脾細胞の、ＣＤ／ＢＮＬ融合体だけで処理したものと比較した、細胞溶解活性を示した図である。
【図１５】
ＣＤ４に対する抗体で処理した脾細胞の細胞溶解活性は有意に低下したが、ＣＤ８に対する抗体で処理したものは、イソタイプが同じ抗体であるラットＩｇＧ２ａで処理したものとほぼ同じ溶解活性を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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