(57)【要約】本発明は、ニトリラーゼ触媒を使用して、対応するニトリルからカルボン酸を調製するための改良された方法に関する。より詳細には本発明は、アルギン酸塩中に固定化され、グルタルアルデヒドおよびポリエチレンイミンと架橋されたニトリラーゼ活性を有する酵素触媒を使用して、水溶液中で２−メチルグルタロニトリルを４−シアノペンタン酸に転換する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ニトリラーゼ活性によって特徴付けられる酵素触媒をアルギン酸塩中に固定化する工程と、
ｂ）第１の安定剤、次に第２の安定剤をそれぞれ固定化酵素触媒を架橋するのに十分な量と時間で、工程ａ）の固定化酵素触媒に添加する工程と、
ｃ）工程ｂ）の生成物を適切な水性反応混合物中でニトリルに接触させる工程と、
ｄ）工程ｃ）で生成したカルボン酸を塩または酸の形態で単離する工程と
を含むカルボン酸を製造する方法であって、
第２の安定剤が第１の安定剤以外であるならば、第１の安定剤および第２の安定剤がグルタルアルデヒドおよびポリエチレンイミンからなる群よりそれぞれ選択されることを特徴とする方法。
【請求項２】
工程ｃ）のニトリルが２−メチルグルタロニトリルであり、工程ｃ）の水性反応混合物が反応過程中、２０：１を超えるＮＨ４＋：Ｃａ２＋比を有し、工程ｄ）で単離されるカルボン酸が４−シアノペンタン酸であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素触媒がアシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）、アシドボラックス・ファシリス  ７２−ＰＦ−１５（ＡＴＣＣ  ５５７４７）、アシドボラックス・ファシリス  ７２−ＰＦ−１７（ＡＴＣＣ  ５５７４５）、エシェリキア・コリ  ＳＳ１００１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７７）、またはエシェリキア・コリ  ＳＷ９１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７５）であり、細胞全体または透過性処理微生物細胞の形態であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素触媒がアシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）であり、酵素触媒のニトリルヒドラターゼ活性が、アルギン酸塩中での固定化前に熱によって不活性化されないことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
アルギン酸塩がアルギン酸カルシウムであることを特徴とする請求項１および２に記載の方法。
【請求項６】
反応過程において、工程ｃ）の水性反応混合物が少なくとも２００：１のＮＨ４＋：Ｃａ２＋比、および少なくとも２ｍＭのカルシウムイオン濃度を有することを特徴とする請求項１および２に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）酵素触媒をアシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）、アシドボラックス・ファシリス  ７２−ＰＦ−１５（ＡＴＣＣ  ５５７４７）、アシドボラックス・ファシリス  ７２−ＰＦ−１７（ＡＴＣＣ  ５５７４５）、エシェリキア・コリ  ＳＳ１００１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７７）、およびエシェリキア・コリ  ＳＷ９１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７５）からなる群より選択される細胞全体または透過性処理微生物細胞の形態で、アルギン酸カルシウム中に固定化する工程と、
（ｂ）第１の安定剤、次に第２の安定剤をそれぞれ固定化酵素触媒を架橋するのに十分な量と時間で、工程ａ）の固定化酵素触媒に添加する工程と、
（ｃ）工程ｂ）の生成物を反応過程中、２０：１を超えるＮＨ４＋：Ｃａ２＋比を有する適切な水性反応混合物中で２−メチルグルタロニトリルに接触させる工程と、
（ｄ）工程ｃ）で生成した４−シアノペンタン酸を塩または酸の形態で単離する工程と
を含む、４−シアノペンタン酸を製造する方法であって、
第２の安定剤が第１の安定剤以外であるならば、第１の安定剤および第２の安定剤がグルタルアルデヒドおよびポリエチレンイミンからなる群よりそれぞれ選択されることを特徴とする方法。
【請求項８】
前記酵素触媒がアシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）であり、前記酵素触媒のニトリルヒドラターゼ活性が、アルギン酸塩中での固定化前に熱によって不活性化されていないことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｃ）および（ｄ）を反復する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１または８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニトリラーゼ活性を有する酵素触媒を使用して、ニトリルを対応するカルボン酸に転換する改良された方法に関する。より詳細には、本発明は、脂肪族ニトリラーゼ（ＥＣ  ３．５．５．７）活性を有する酵素触媒を使用して、水溶液中で２−メチルグルタロニトリルを４−シアノペンタン酸のアンモニウム塩に転換する。
【背景技術】
【０００２】
ニトリラーゼ酵素は水溶液中で、アミドの中間体形成なしにニトリルを対応するカルボン酸アンモニウム塩に直接的に転換する。ニトリラーゼは、多様な微生物中で同定されており、例えば（非特許文献１）；（非特許文献２）は、脂肪族ニトリルの対応するカルボン酸アンモニウム塩への加水分解を触媒する、ロドコッカス・ロドキュラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）  Ｋ２２から単離される脂肪族ニトリラーゼについて記載している。アルカリゲネス・ファカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）  １６５０の立体特異性ニトリラーゼは、キラルカルボン酸の製造においてラセミ体ニトリルを分解するのに使用されており、ニトリラーゼをコード化する遺伝子はクローン化され発現されている（特許文献１）。脂肪族、芳香族、および複素環式ニトリルの加水分解を触媒するニトリラーゼは、高温細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｌｌｉｄｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  Ｄａｃ５２１から単離されている（非特許文献３）。ロドコッカス・ロドキュラス  ＮＣＩＭＢ  ４０７５７またはＮＣＩＭＢ  ４０８３３からのニトリラーゼは、アクリロニトリルをアクリル酸アンモニウムに転換するのに使用されている（特許文献２）。様々な脂肪族α，ω−ジニトリルを対応するω−シアノカルボン酸アンモニウム塩またはジカルボン酸ジアンモニウム塩のどちらかに転換できるニトリラーゼが、コマモナス・テストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）から単離されている（特許文献３；非特許文献４）。アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）  ７２Ｗのニトリラーゼ活性による、脂肪族α，ω−ジニトリルの対応するω−シアノカルボン酸アンモニウム塩への位置選択的加水分解についても報告されている（非特許文献５）。
【０００３】
水溶液中で脂肪族ニトリルを対応するカルボン酸アンモニウム塩に転換するのに、ニトリルヒドラターゼとアミダーゼの２つの酵素の組み合わせも使用できる。ここでは脂肪族ニトリルは、最初にニトリルヒドラターゼによってアミドに転換され、次にアミドはアミダーゼによって引き続き対応するカルボン酸アンモニウム塩に転換される。ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、Ｂａｃｔｅｒｉｄｉｕｍ、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）をはじめとする多種多様の細菌属が、多様な範囲のニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性を有することが知られている。（非特許文献６）は、最近ニトリル分解微生物のニトリラーゼとニトリルヒドラターゼ／アミダーゼ酵素系の双方をレビューした。
【０００４】
２−メチルグルタロニトリルは、生体触媒を使用してω−シアノカルボン酸アンモニウム塩（すなわち４−シアノペンタン酸のアンモニウム塩）に位置選択的に転換できる脂肪族α，ω−ジニトリルの一例である。生体触媒による４−シアノペンタン酸の調製については、（特許文献４）およびその分割特許（特許文献５）、（特許文献６）、（特許文献７）、（特許文献８）、（特許文献９）、および（特許文献１０）で既に記載されている。これらの特許は、脂肪族ニトリラーゼ（ＥＣ  ３．５．５．７）活性、あるいはニトリルヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．８４）およびアミダーゼ（ＥＣ  ３．５．１．４）活性の組み合わせを有する触媒を使用して、水溶液中で脂肪族α，ω−ジニトリルをω−シアノカルボン酸のアンモニウム塩に転換する方法に関する。脂肪族α，ω−ジニトリルがω−炭素原子で非対称に置換されている場合、ニトリラーゼは９８％を超える位置選択性で、ω−ニトリル基の加水分解からもたらされるω−シアノカルボン酸アンモニウム塩を生じる。（特許文献４）は、アシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗを酵素触媒として使用する前に１０〜１２０分間の熱処理（３５〜７０℃）に曝す、水溶液中で２−メチルグルタロニトリルを４−シアノペンタン酸に転換する方法を具体的に開示する。この熱処理は望ましくない非位置選択的ニトリルヒドラターゼ活性を破壊しながら、望ましい位置選択的脂肪族ニトリラーゼ（ＥＣ  ３．５．５．７）活性を選択するのに重要であった。次に４−シアノペンタン酸は、１，５−ジメチル−２−ピペリドンの商業的調製のための一段階化学法で、基質としての機能を果たすことができる。１，５−ジメチル−２−ピペリドンには、電子部品クリーニング、フォトレジスト除去、工業的脱脂および金属クリーニング、樹脂クリーンアップ、インク調合物、工業的接着剤をはじめとする工業用溶剤としての、ポリマーと化学薬品のための反応溶剤しての多くの用途がある。
【０００５】
商業規模用途では、生体触媒である固定化微生物細胞を使用することは、固定化されない細胞の使用と比較して、多くの既知の経済上の利点を有する。利点のいくつかは、それらを繰り返し使用する能力、それらの分離の容易さ、および連続反応におけるそれらの使用である。ポリマーマトリックス内への細胞包含によって、生成物および基質の高い拡散を保ちながら、生細胞または代謝的不活性細胞の取り込みが可能になる。固定化のための典型的なマトリックスの例は、アルギン酸ナトリウム（非特許文献７）またはカラゲナン（非特許文献８）である。取り込み方法は比較的単純で、ゲル材料は無毒で低価格である。
【０００６】
固定化細胞の「任意の」安定性は、細胞と、グルタルアルデヒドおよびポリエチレンイミンまたはヘキサメチレンジアミンなどの多官能性試薬とを共有結合的に架橋する架橋剤による、細胞ビーズの引き続く処理によってさらに増大できる。一例では、Ｌ−アスパラギン酸製造のためにκカラゲナン中に固定化されたＥ．ｃｏｌｉ細胞（非特許文献９）に関する安定性が研究された。架橋処理として使用された最適化濃度のヘキサメチレンジアミンおよびグルタルアルデヒドによって、固定化細胞の半減期は、未処理の固定化細胞の５倍以上に顕著に延長した。
【０００７】
さらにＢｉｒｎｂａｕｍら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３：３９３〜４００（１９８１））は、アルギン酸カルシウム固定化細胞の物理的安定性を増大する方法を開示している。１つの安定化方法では、ポリエチレンイミン処理（２４時間）を使用し、グルタルアルデヒド架橋（１〜５分間）が続く。ビーズ安定性は、固定化細胞を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液内で１０日間培養して検査された。固定化細胞からの細胞放出がわずかなことが観察されたことで、ビーズの完全性の改良が実証される。同時に全体的な触媒活性は、このプロトコルによって有害に影響された。Ｂｉｒｎｂａｕｍは、この影響がおそらくグルタルアルデヒドの毒性によるものであると提案した。
【０００８】
最後に、微生物細胞全体または微生物細胞材料を直接的に固定化するため、ポリエチレンイミンおよびグルタルアルデヒドを添加する好ましい順序は、グルタルアルデヒドに対する固定化酵素活性の感受性に左右されると理解されている。（特許文献１１）は、グルタルアルデヒド感受性酵素（チオール酵素、あるいはＳＨ基が酵素分子の活性部位にある、またはその非常に近くにあるものなど）が、グルタルアルデヒドなどのチオール反応性作用物質によって不活性化されることを開示する。これらのタイプの酵素触媒では、発明は、起こり得る酵素活性損失を打ち消すために、微生物細胞材料を最初にポリエチレンイミンで処理して、グルタルアルデヒドを同時にまたは引き続いて添加することが必要である。対照的に（特許文献１２）は、酵素がグルタルアルデヒド感受性でない微生物を固定化する場合、ポリエチレンイミンの前にグルタルアルデヒドを導入することが望ましいことを教示する。この場合、得られる固定化細胞は、グルタルアルデヒド添加前のポリエチレンイミン前処理で固定化した細胞よりも、容易に水性媒体から回収される。どちらの場合でも微生物細胞は、ポリエチレンイミンおよびグルタルアルデヒドによる処理前に、ゲルまたはポリマーマトリックス内に取り込まれない。
【０００９】
【特許文献１】
ＷＯ  ００／２３５７７明細書
【特許文献２】
米国特許第５，９９８，１８０号明細書
【特許文献３】
ＣＡ  ２，１０３，６１６明細書
【特許文献４】
米国特許第５，８１４，５０８号明細書
【特許文献５】
米国特許第５，８５８，７３６号明細書
【特許文献６】
米国特許第５，９０８，９５４号明細書
【特許文献７】
米国特許第５，９２２，５８９号明細書
【特許文献８】
米国特許第５，９３６，１１４号明細書
【特許文献９】
米国特許第６，０７７，９５５号明細書
【特許文献１０】
米国特許第６，０６６，４９０号明細書
【特許文献１１】
米国特許第４，２８８，５５２号明細書
【特許文献１２】
米国特許第４，３５５，１０５号明細書
【非特許文献１】
ＫｏｂａｙａｓｈｉらＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４６：５５８７〜５５９０（１９９０）
【非特許文献２】
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７２：４８０７〜４８１５（１９９０）
【非特許文献３】
Ａｌｍａｔａｗａｈら、Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ３：２８３〜２９１（１９９９）
【非特許文献４】
Ｓ．Ｌｅｖｙ−Ｓｃｈｉｌら、Ｇｅｎｅ  １６１：１５−２０（１９９５）
【非特許文献５】
Ｇａｖａｇａｎら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６３：４７９２−４８０１（１９９８）
【非特許文献６】
Ｃｏｗａｎら（Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ  ２：２０７〜２１６（１９９８））
【非特許文献７】
Ｂｕｃｋｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３５：１７５〜１８９（１９８７）
【非特許文献８】
Ｃｈｉｂａｔａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３５：１８９〜１９８（１９８７）
【非特許文献９】
Ｃｈｉｂａｔａ，Ｉ．Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ；Ｖｅｎｋａｔｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｋ．，Ｅｄ．；ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  １０６；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，１９７９，ｐｐ１８７〜２０１
【非特許文献１０】
Ｆｅｌｉｘ，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１１：２５９〜２７８（１９９１）
【非特許文献１１】
Ｆｅｌｉｘ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：２１１〜２３４（１９８２）
【非特許文献１２】
Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．およびＶｏｒｌｏｐ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＦｏｃｕｓＩ；Ｆｉｎｎ，Ｒ．Ｆ．，Ｅｄ．；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：ＮｅｗＹｏｒｋ；１９９８，ｐｐ３２５〜３３６
【非特許文献１３】
Ｓｍｉｄｓｒｏｄら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８，７１〜７８（１９９０）
【非特許文献１４】
Ｇａｖａｇａｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５２：６５４〜６５９（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって解決すべき問題は、ニトリルを対応するカルボン酸アンモニウム塩に転換するための触媒として使用すると、高い比活性および長期の物理的完全性を有する、固定化細胞触媒を製造する経済的な方法の開発である。より具体的には、より高い収率とより高い濃度の４−シアノペンタン酸を生じ、使用が以前開示されているものよりも便利な酵素触媒を使用する方法によって、技術は進歩するであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
出願人らの発明は、ａ）ニトリラーゼ活性によって特徴付けられる触媒酵素をアルギン酸塩中に固定化する工程と、ｂ）第１の安定剤、次に第２の安定剤をそれぞれ固定化酵素触媒を架橋するのに十分な量と時間で、工程ａ）の固定化酵素触媒に添加する工程と、ｃ）工程ｂ）の生成物を適切な水性反応混合物中でニトリルに接触させる工程と、ｄ）工程ｃ）で生成したカルボン酸を塩または酸の形態で単離する工程とを含む、カルボン酸を製造する方法であって、第２の安定剤が第１の安定剤以外であるならば、第１の安定剤および第２の安定剤がグルタルアルデヒドおよびポリエチレンイミンからなる群よりそれぞれ選択される方法である。任意に工程ｃ）およびｄ）を繰り返しても良い。発明の好ましい実施態様としては、工程ｃ）のニトリルが２−メチルグルタロニトリルであるもの、工程ｃ）の水性反応混合物が反応過程で２０：１を超える（より好ましくは２００：１を超え、最も好ましくは７５０：１を超える）ＮＨ４＋：Ｃａ２＋比を有するもの、工程ｄ）で単離されるカルボン酸が４−シアノペンタン酸であるものが挙げられる。
【００１２】
好ましい酵素触媒は、アシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）、アシドボラックス・ファシリス  ７２−ＰＦ−１５（ＡＴＣＣ  ５５７４７）、アシドボラックス・ファシリス  ７２−ＰＦ−１７（ＡＴＣＣ５５７４５）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＳＳ１００１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７７）、またはエシェリキア・コリ  ＳＷ９１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７５）であり、酵素触媒は細胞全体または透過性処理微生物細胞の形態である。酵素触媒がアシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）である場合、アルギン酸塩中で固定化する前に、熱処理によって酵素触媒のニトリルヒドラターゼ活性を不活性化する必要はない。
【００１３】
（微生物の寄託の簡単な説明）
出願人らはブダペスト条約の取り決めの元に、以下の微生物の寄託を行った。
【００１４】
【表１】
2004531243.tif 000002
【００１５】
ここでの用法では、「ＡＴＣＣ」とは、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−１１０９，Ｕ．Ｓ．Ａ．にあるＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙを指す。「ＡＴＣＣ  Ｎｏ．」とは、ＡＴＣＣに寄託された培養株の受け入れ番号である。列挙した寄託株は、表示国際保管所に少なくとも３０年保持され、それを開示する特許の付与時に一般に公開される。寄託株の可用性は、政府の行為によって付与される特許権を失効させる、対象発明の実施免許を意味するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、ニトリラーゼ活性を有する酵素触媒を使用して、ニトリルを対応するカルボン酸アンモニウム塩に転換する、改良された方法に関する。より詳細には本発明は、脂肪族ニトリラーゼ（ＥＣ  ３．５．５．７）活性を有する酵素触媒を使用して、水溶液中で２−メチルグルタロニトリルを４−シアノペンタン酸のアンモニウム塩に転換する。出願人らは、ニトリラーゼ活性を有する酵素触媒をアルギン酸カルシウム中に固定化し、グルタルアルデヒドおよびポリエチレンイミンと架橋した後に得られる触媒を使用して、架橋された固定化酵素触媒の物理的完全性の迅速な損失の帰結が予期される条件下において、少なくとも１．５０Ｍの濃度で４−シアノペンタン酸アンモニウム塩を製造することが可能であることをここで開示する。ＰＥＩ添加に先立つ固定化細胞のグルタルアルデヒド処理が、測定可能なニトリラーゼ活性の損失なしに実施できること、あるいはアンモニウム／カルシウムイオン比が２０：１の比率を超えないことが推奨されている場合に、少なくとも７５０：１で反応させることが、触媒ビーズの物理的完全性に影響しないことは予想外であった。酵素触媒は物理的完全性の損失なしに、多数の連続リサイクル反応で再利用された。
【００１７】
出願人らは（カラゲナンを使用して調製された対応する酵素触媒とは対照的に）、グルタルアルデヒド／ポリエチレンイミン−架橋アルギン酸塩−固定化酵素触媒のニトリラーゼ活性が、触媒ビーズ中の乾燥細胞重量の濃度増大と共に増大することをさらに開示する。アルギン酸塩−固定化酵素触媒の使用は、カラゲナン固定化酵素触媒と比較すると、触媒使用量を基準にした全体的な生成物収率を増大させて有利である。
【００１８】
出願人らは、酵素触媒アシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗを固定化する場合、細胞をアルギン酸塩内に固定化して、得られる酵素触媒を安定剤グルタルアルデヒドとポリエチレンイミンに架橋する際、望ましくないニトリルヒドラターゼ活性を不活性化するのに通常必要な熱処理が必要でないことをさらに開示する。特にニトリラーゼがグルタルアルデヒドによって不活性化できることは既知であり、固定化手順が測定可能なニトリラーゼ活性損失を生じることなく、望ましくないニトリルヒドラターゼ活性を選択的かつ完全に不活性化することは予想外であった。
【００１９】
ここで開示される方法の改良は、既知の方法と比較して、以前得られたよりも高い濃度でより高い生成物収率（触媒重量あたりの生成物重量を基準にして）をもたらす。クレーム方法の生成物は、農業および製薬産業で高価値なポリマー、溶剤（例えば１，５−ジメチル−２−ピペリドン）、および化学物質の前駆物質として有用である。
【００２０】
本願明細書では、特に断りのない限り以下の略語と定義が適用される。
「グルタルアルデヒド」は、ＧＡと略する。
「ポリエチレンイミン」は、ＰＥＩと略する。
「２−メチルグルタロニトリル」は、２−ＭＧＮと略する。
「４−シアノペンタン酸」は、４−ＣＰＡと略する。
【００２１】
「酵素触媒」とは、ニトリラーゼ活性によって特徴付けられる触媒を指す。触媒は、微生物細胞全体または透過性処理微生物細胞（群）の形態であっても良い。
【００２２】
「水性反応混合物」は、水、濃度が少なくとも２ｍＭのカルシウム塩、任意に反応の初期ｐＨを５〜１０、好ましくは６〜８に保てる緩衝液を含有する水性混合物を指すために使用される。
【００２３】
「水性生成物混合物」は、対応する工程段階からもたらされる生成物を含有する水性混合物を指すために使用される。
【００２４】
２−メチルグルタロニトリル（２−ＭＧＮ）を４−シアノペンタン酸（４−ＣＰＡ）アンモニウム塩に転換する方法の顕著な改良をここで開示する。具体的には本発明の顕著な改良は、１）好ましくはアシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗに由来するニトリラーゼ活性によって特徴付けられる酵素触媒をアルギン酸塩中に固定化する工程と、２）グルタルアルデヒドおよびポリエチレンイミンを（好ましくはこのこの順で）固定化酵素触媒に、各安定剤の架橋を達成するのに適切な量で十分な時間をかけて順次に添加する工程と、３）適切な水性反応混合物中で２−ＭＧＮと架橋された固定化酵素触媒とを接触させる工程と、４）４−ＣＰＡを酸またはアンモニウム塩として単離する工程と、５）次に架橋された固定化酵素触媒を少なくとも１回リサイクルする工程と含む方法によってもたらされる。本発明の利点は、ニトリルを対応するカルボン酸アンモニウム塩に転換するために、ニトリラーゼ活性によって特徴付けられるその他の酵素触媒（例えばロドコッカス・ロドキュラス、アルカリゲネス・ファカリス、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｌｌｉｄｕｓ、コマモナス・テストステロニ、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐ．、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、およびＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）を使用する際にも実現化できる。
【００２５】
（酵素触媒固定化）
酵素触媒を固定化するための方法は、２つの異なるポリマーマトリックス、ナトリウムアルギン酸塩、およびΚ−カラゲナンを使用して開発された。細胞全体または透過性処理微生物細胞の形態の酵素触媒は、アルギン酸塩またはカラゲナン中に固定化でき、透過性処理の方法は当業者には周知であり、凍結融解、あるいは有機溶剤または洗剤による処理（非特許文献１０）；（非特許文献１１）が挙げられるが、これに限定されるものではない。アルギン酸塩中の細胞固定化は、固定化が５℃程度の低い温度で実施できることから有利である。対照的にカラゲナン固定化は、典型的に４５〜５０℃の温度を必要とし、これはニトリラーゼの不活性化をもたらすことができる。
【００２６】
グルタルアルデヒド（ＧＡ）およびリエチレンイミン（ＰＥＩ）処理を固定化プロトコルに加えて、触媒リサイクルによる多数回の連続反応に適するように、ビーズの機械的安定性をさらに増大させた。アルギン酸塩ビーズ酵素触媒を架橋するために添加されるＧＡおよびＰＥＩの量は、それぞれ触媒ビーズ中に存在する乾燥細胞重量あたり２５重量％から、触媒ビーズ中に存在する乾燥細胞重量あたり２重量％の範囲であり、触媒ビーズに添加されるＧＡとＰＥＩとの比は３：１〜１：３の範囲である。２つの架橋安定剤は、最初にＧＡ次にＰＥＩ、あるいは最初にＰＥＩ次にＧＡのどちらかの順で固定化酵素触媒に添加される。２つの架橋安定剤の好ましい添加順序は、最初にＧＡ次にＰＥＩである。第２の安定剤の添加は、第１の安定剤を架橋させるのに十分な時間遅らされる。固定化酵素触媒のＧＡ架橋時間は、５分〜２時間、好ましくは３０分〜１時間の範囲である。固定化酵素触媒のＰＥＩ架橋時間は、３０分〜２４時間、好ましくは１時間〜１２時間の範囲である。
【００２７】
グルタルアルデヒドがアシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗニトリラーゼ酵素を不活性化する（実施例１）ことが知られていたため、ＧＡ／ＰＥＩの組み合わせが特定のニトリラーゼ活性への損害なしに、固定化細胞触媒を成功裏に安定化させることは知られておらず予想外であった。（非特許文献６）では、ニトリラーゼ酵素が、活性化されたチオール残基によるニトリル炭素への求核攻撃によって作用することが開示されており、（特許文献１１）は、チオール−酵素などのグルタルアルデヒド感受性酵素がグルタルアルデヒドによって不活性化されることを記載している。
【００２８】
カルシウム架橋アルギン酸塩は、高濃度のその他のカチオン存在下で安定でないことが報告されている。具体的には、２０：１または２５：１のアンモニウム／カルシウムイオン比を上回ることは奨励されていない（非特許文献１２）；（非特許文献１３）。Ｋｌｅｉｎらは、高比率のＬ−グルロン酸を有するアルギン酸塩に対しては、電解質（Ｎａ＋、Ｋ＋、ＮＨ４＋、Ｍｇ２＋のモル濃度合計）とＣａ２＋との比率が２０：１より高くなってはならないと述べている。本出願では、グルタルアルデヒドおよびポリエチレンイミンとの架橋後、アルギン酸塩は（高比率のＬ−グルロン酸を含有する）酵素触媒をゲル化し、少なくとも１９５回の連続バッチ反応でリサイクルして高濃度の４−シアノペンタン酸アンモニウム塩を製造する際に、それらの物理的完全性を保つ。最小カルシウムイオン濃度２ｍＭを含有するこれらの反応では、アンモニウムイオンとカルシウムイオンの比は、典型的に少なくとも７５０：１（実施例４参照）である。反応は、アンモニウムイオンとカルシウムイオンの比が２００：１、７５０：１、および９５０：１で実施された。これらの結果は確かに予見できないものだった。
【００２９】
商業的方法を実施する際、ここで触媒の酵素活性／重量として定義される比活性が高いことが望ましい。本出願では、アルギン酸塩ビーズ中の乾燥細胞重量の増大する濃度と共に、ニトリラーゼ比活性が増大したが、カラゲナンビーズ中では増大しなかった。カラゲナンビーズでは、乾燥細胞重量の５０％の増大により、３０℃での小さな活性増大（７％）、あるいは３５℃でのわずかな比活性減少のどちらかがあった（実施例４参照）。
【００３０】
（グルタルアルデヒド／ポリエチレンイミン架橋アルギン酸塩中のアシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）固定化）
微生物アシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）は、脂肪族ニトリルまたはジニトリルに曝された土壌サンプルから予め単離されている（特許文献４およびその分割特許特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、および特許文献１０）。（特許文献４を本願明細書に援用する。）アシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗを微生物の全細胞触媒として、非対称に置換されたα−ａｌｋｙｌ−α，ω−ジニトリルの加水分解のために使用すると、所望のω−シアノカルボン酸に加えて、対応するジカルボン酸モノアミドおよびジカルボン酸が生じる。この全細胞触媒の望ましくない非位置選択的ニトリルヒドラターゼ活性は、望ましくないジカルボン酸モノアミドを生じて、それはアミダーゼによって対応するジカルボン酸にさらに転換された。アシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗのニトリラーゼ活性によって特徴付けられるが、アシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗのニトリルヒドラターゼ活性を示さないアシドボラックス・ファシリス  ７２−ＰＦ−１５、アシドボラックス・ファシリス  ７２−ＰＦ−１７、エシェリキア・コリ  ＳＳ１００１、およびエシェリキア・コリ  ＳＷ９１などの酵素触媒は、望ましくないジカルボン酸モノアミドおよびジカルボン酸副産物を生じない。
【００３１】
適切な緩衝液中でアシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）懸濁液を３５〜７０℃に短時間加熱することで、望ましいニトリラーゼ活性に影響せずに、望ましくないニトリルヒドラターゼ活性が不活性化されることが分かった。したがって極めて高い位置選択性で２−メチルグルタロニトリル（２−ＭＧＮ）を４−シアノペンタン酸（４−ＣＰＡ）アンモニウム塩に加水分解するための以前の方法では、アシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗの懸濁液を３５〜７０℃で熱処理して望まれないニトリルヒドラターゼ活性を不活性化し、望まれない副産物２−メチルグルタル酸の生成を除外することが必要であった（非特許文献１４）；特許文献４）。熱処理はニトリラーゼ活性の損失を生じることなく、固定化細胞触媒を調製するのに日常的に使用された。
【００３２】
４−シアノペンタン酸商業的製造のための本発明は、アルギン酸塩中の非熱処理アシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ細胞を固定化することで望まれないニトリルヒドラターゼ活性のおよそ９０％を除去するという、さらなる利点を提供する。引き続くアルギン酸塩固定化アシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ細胞のグルタルアルデヒド（ＧＡ）またはグルタルアルデヒドおよびポリエチレンイミン（ＧＡ／ＰＥＩ）架橋は、触媒による望ましくない副産物（２−メチルグルタル酸）の生成率を、熱処理されて検出可能なニトリルヒドラターゼ活性を持たない細胞で観察された率にまで、さらに低下させる（実施例１０参照）。（特許文献４）でこれまで必要であった熱処理工程がもはや必要なくなったので、出願人らの開示は意外であり予想外であった。アルギン酸塩中でのアシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ細胞の固定化とそれに続くＧＡまたはＧＡ／ＰＥＩ架橋が、望ましいニトリラーゼ活性の測定可能な損失を同時に引き起こすことなく、望ましくないニトリルヒドラターゼ活性を選択的かつ完全に不活性化することは知られていなかった。ニトリラーゼがグルタルアルデヒドによって不活性化されることが知られていたので、結果は特に予想外であった。
【００３３】
（２−メチルグルタロニトリルの加水分解：）
加水分解反応の温度を選択して、反応速度と酵素触媒活性の安定性の双方を最適化した。反応温度は、懸濁液の氷点のすぐ上（約０℃）から６０℃の範囲でも良く、好ましい反応温度範囲は５℃〜３５℃である。固定化酵素触媒懸濁液は、触媒を蒸留水中、または反応の初期ｐＨを５．０〜１０．０、好ましくは６．０〜８．０に保つ緩衝液中に懸濁して調製しても良い。反応が進行すると、ジニトリルの対応するニトリル官能性からのカルボン酸アンモニウム塩形成のために、反応混合物のｐＨは変化するかもしれない。反応は、ｐＨ調節なしにジニトリルが完全に転換するまで実施でき、あるいは反応の経過に伴って適切な酸または塩基を添加して、所望のｐＨを保つことができる。塩化カルシウムまたは酢酸カルシウムをはじめとするが、これに限定されるものではないカルシウム塩を少なくとも２ｍＭの濃度で加水分解反応に添加して、架橋された固定化酵素触媒の物理的完全性を保つ。
【００３４】
４−シアノペンタン酸はまた、（触媒の除去後）に濃ＨＣｌによって反応混合物のｐＨを２．０〜２．５に調節し、得られる溶液を塩化ナトリウムで飽和して、４−シアノペンタン酸を適切な有機溶剤（酢酸エチル、エチルエーテル、またはジクロロメタンなど）で抽出して、生成物混合物から単離しても良い。次に有機抽出物を一緒にして適切な乾燥剤（例えば硫酸マグネシウム）と共に撹拌して濾過し、溶剤を（例えばロータリー蒸発によって）除去して、所望の生成物を高収率および高純度（典型的に純度９８〜９９％）で製造する。所望するならば、生成物を再結晶または蒸留によってさらに精製できる。代案としては、１，５−ジメチル−２−ピペリドンの調製と同様に、４−シアノペンタン酸アンモニウム塩を引き続く反応で直接的に使用しても良い（特許文献４およびその分割特許特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、および特許文献）。
【００３５】
（実施例）
発明をさらに例証する制限を意図しない以下の実施例では、２−メチルグルタロニトリルの％回収率、および微生物の加水分解反応中に形成する加水分解生成物４−シアノペンタン酸および２−メチルグルタル酸の％収率は、（特に断りのない限り）反応混合物中に存在する２−メチルグルタロニトリルの初期量を基準とし、屈折率検出器およびＳｕｐｅｌｃｏｓｉｌ  ＬＣ−１８−ＤＢカラム（１５ｃｍ×４．６ｍＭ径）、および１０ｍＭの酢酸、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、および７．５％（ｖ／ｖ）のメタノール／水混液から構成される溶出剤を使用して、ＨＰＬＣによって求められる。
【００３６】
略語の意味は次の通り。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日数を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｄｃｗ」は乾燥細胞重量を意味する。
【実施例１】
【００３７】
（グルタルアルデヒドによるアシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗニトリラーゼ酵素の不活性化）
実施例１は、グルタルアルデヒドがニトリラーゼ活性に有害であることを例証する。
【００３８】
アシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）のニトリラーゼを細胞抽出物から単離し、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅイオン交換媒体に通過させ、続いてＨｉｌｏａｄ  １６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム上でゲル濾過して、＞９０％純度に精製した。１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中の５ｍＭベンゾニトリル溶液の２４５ｎｍにおける吸収増大によって示される、ベンゾニトリルの安息香酸への転換率を測定することで、ニトリラーゼ活性を精製中にモニターした。精製した酵素のニトリラーゼ活性は、２５．７Ｕ／ｍｇタンパクであった。グルタルアルデヒド（０．１０Ｍ）の存在下で酵素アッセイを実施すると、ニトリラーゼ比活性は６．６５Ｕ／ｍｇに減少し、７４％の酵素活性損失であった。
【実施例２】
【００３９】
（アルギン酸カルシウム中のアシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ細胞固定化）
実施例２は、非架橋アルギン酸カルシウムおよびＧＡ／ＰＥＩ架橋アルギン酸カルシウム、双方の中でのアシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）細胞の固定化を例証する。
【００４０】
２２．９ｇの蒸留脱イオン水を含有する磁気撹拌棒を装着した１００ｍＬメディアボトルに、５０℃で１．１０ｇのＦＭＣ  ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ  Ｐｒｏｔａｎａｌ（登録商標）ＬＦ  １０／６０アルギン酸塩を迅速に撹拌しながらゆっくり添加した。混合物を迅速に撹拌しながら、アルギン酸塩が完全に溶解するまで７５〜８０℃に加熱し、得られた溶液を水浴中で２５℃に冷却した。０．１５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（総容量１６ｍＬ、ｐＨ７．０）中のアシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ懸濁液（５０％湿潤細胞重量、１１．５％乾燥細胞重量）を５０℃に１５分間加熱して次に２５℃に冷却し、２５℃で撹拌しながらアルギン酸塩溶液に添加した。細胞／アルギン酸塩混合物をシリンジで滴下して、２１３ｍＬの０．２０Ｍ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）に２５℃で撹拌しながら添加した。２時間の撹拌後、得られたビーズから緩衝液をデカントし、８４ｍＬの０．２０Ｍ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に２５℃で再懸濁した。撹拌しながら０．８８ｇの水中の２５重量％グルタルアルデヒド（ＧＡ）を添加し、ビーズを２５℃で１．０時間混合した。次に懸濁液に、３．５ｇの水中の１２．５重量％のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（ＢＡＳＦ  Ｌｕｐａｓｏｌ（登録商標）ＰＲ９７１Ｌ、平均分子量約７５０，０００）を添加して、ビーズを２５℃でさらに１時間混合した。次に架橋したビーズを２５℃で８４ｍＬの０．２０Ｍ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）で２回洗浄し、この同一緩衝液中に５℃で保存した。
【００４１】
０．２０Ｍ酢酸カルシウム緩衝液中のビーズ懸濁液にＧＡとＰＥＩを添加しなかったこと以外は、上述の方法で非架橋ビーズを調製した。
【実施例３】
【００４２】
（４−シアノペンタン酸製造における非架橋およびＧＡ／ＰＥＩ架橋アシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ細胞／アルギン酸塩ビーズ触媒の比較）
実施例３は、連続バッチ反応においてＧＡ／ＰＥＩ架橋触媒ビーズが、非架橋ビーズよりも高い収率の４−シアノペンタン酸を生じることを例証する。
【００４３】
別個の１２５ｍＬジャケット付き反応容器（再循環温度浴中で３０℃に温度調節された）の中に、実施例２で記載されたように調製された１６．５ｇの非架橋またはＧＡ／ＰＥＩ架橋アシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ細胞／アルギン酸塩ビーズのどちらかを入れた。各反応容器に６８．２５ｍＬの蒸留脱イオン水、１．０ｍＬの０．５０Ｍ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０、反応混合物中の最終カルシウムイオン濃度５．０ｍＭ）、および１４．２５ｍＬ（１３．５４ｇ、１．２５Ｍ）の２−メチグルタロニトリルを添加し、混合物を３０℃で撹拌した。反応混合物のサンプル（０．１００ｍＬ）を０．４００ｍＬの水と混合し、次に０．３６０ｍＬの希釈サンプルを０．０４０ｍｌの水中の０．７５ＭのＮ−メチルプロピオンアミド（ＨＰＬＣ外部標準）および０．０２０ｍｌの６．０ＮのＨＣｌと混合した。得られた各容器内の混合物を濾過し（０．２２μｍ）、濾液をＨＰＬＣによって２−メチルグルラトニトリル、４−シアノペンタン酸、および２−メチルグルタル酸について分析した。非架橋およびＧＡ／ＰＥＩ架橋アシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ細胞／アルギン酸塩ビーズによる４−シアノペンタン酸の生成速度は、それぞれ１９３ｍＭ／時間および１９８ｍＭ／時間であった。２−メチルグルタロニトリルの完全な転換時に、４−シアノペンタン酸アンモニウム塩および２−メチルグルタル酸ジアンモニウム塩の収率は、どちらの反応容器でも典型的にそれぞれ９８．５％および１．５％の収率であった。
【００４４】
反応終了時に生成混合物を触媒ビーズからデカントした。上述の条件下で、これらのビーズをさらに１１回の連続バッチ反応で再利用した。表１に示すように、非架橋およびＧＡ／ＰＥＩ架橋アシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ細胞／アルギン酸塩ビーズによる、反応１２での４−シアノペンタン酸の生成速度は、それぞれ６４ｍＭ／時間および１１８ｍＭ／時間であった。１１回のリサイクル反応の各セット完了時に、４−シアノペンタン酸最終濃度は少なくとも１，５５０ｍＭであった。
【００４５】
【表２】
2004531243.tif 000003
【実施例４】
【００４６】
（４−シアノペンタン酸製造のためのＧＡ／ＰＥＩ架橋アシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ細胞／アルギン酸塩ビーズ触媒に対するカルシウムイオン濃度の効果）
実施例４は、高濃度アンモニウムイオン存在下でＧＡ／ＰＥＩ架橋アルギン酸塩ビーズ触媒が安定化できることを例証する。この発見は先行技術（非特許文献１２）に反している。
【００４７】
各３個の１２５ｍＬジャケット付き反応容器（再循環温度浴中で３０℃に温度調節された）の中に、実施例２で記載されたように調製された１６．５ｇのＧＡ／ＰＥＩ架橋アシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ細胞／アルギン酸塩ビーズを入れた。各反応容器に６８．２５ｍｌの蒸留脱イオン水および１４．２５ｍＬ（１３．５４ｇ、１．２５Ｍ）の２−メチグルタロニトリルを入れた。これらの３つの反応混合物の１つに、３つの反応混合物中の最終カルシウムイオン濃度が、それぞれ５．０ｍＭ、２．０ｍＭ、または０ｍＭになるように、ａ）１．０ｍｌの０．５０Ｍ酢酸カルシウム（ｐＨ７．０）、ｂ）０．２０Ｍ酢酸カルシウム（ｐＨ７．０）、またはｃ）蒸留水を添加した。混合物を３０℃で撹拌した。反応混合物のサンプル（０．１００ｍ）を０．４００ｍｌの水と混合し、次に０．３６０ｍｌの希釈サンプルを０．０４０ｍｌの水中の０．７５ＭのＮ−メチルプロピオンアミド（ＨＰＬＣ外部標準）および０．０２０ｍｌの６．０ＮのＨＣｌと混合した。得られた混合物を濾過し（０．２２μｍ）、濾液をＨＰＬＣによって２−メチルグルラトニトリル、４−シアノペンタン酸、および２−メチルグルタル酸について分析した。５ｍＭ、２ｍＭ、または０ｍＭのカルシウムイオンを含有する反応中の４−シアノペンタン酸生成速度は、それぞれ２３６ｍＭ／時間、２３３ｍＭ／時間、および２３２ｍＭ／時間であった。
【００４８】
２−メチルグルタロニトリルの完全な転換後、生成物混合物を触媒ビーズからデカントした。触媒重量を測定し、上述したような条件下で、触媒をさらに１０回の連続バッチ反応で再利用した。リサイクル反応の各セットにおける２−メチルグルタロニトリルの完全な転換時に、４−シアノペンタン酸の最終濃度は、前の反応から残留する反応ヒール（触媒と生成物の混合物）のために、少なくとも１，５５０ｍＭであった。反応の各セットにおける回収された触媒重量を表２に列挙した。
【００４９】
【表３】
2004531243.tif 000004
【００５０】
３つの反応混合物中の酢酸カルシウム濃度が、それぞれ２．０ｍＭ、１．０ｍＭ、および０．５ｍＭであったこと以外は、上述の３回の反応のセットを繰り返した。触媒リサイクルによるさらに１０回の反応後、０．５ｍＭの酢酸カルシウムを含有する反応中の触媒ビーズは粉々になり、反応混合物は顕著な量の粒子状物質を含有した。１．０ｍＭの酢酸カルシウムを含有する反応中の触媒ビーズは、触媒リサイクルによる１２回目の反応で破損し始め、１８回目の反応後に触媒は粉々になり、反応混合物は顕著な量の粒子状物質を含有した。２．０ｍＭの酢酸カルシウムを含有する反応中の触媒ビーズは、触媒リサイクルによる６０回に及ぶ連続反応後も粉々にならず、反応混合物中に粒子状物質の顕著な生成はなかった。
【実施例５】
【００５１】
（カラゲナン中のＥ．ｃｏｌｉ形質転換体ＳＳ１００１細胞固定化）
実施例５は、カラゲナン中のＥ．ｃｏｌｉ形質転換体ＳＳ１００１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７７）細胞の固定化を例証する。
【００５２】
２５０ｍＬメディアボトル（磁気撹拌棒を装着し５０℃の６４．１２ｇの蒸留脱イオン水を含有する）中に、３．３８ｇのＦＭＣ  ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ  ＩＳＡＧＥＬ（登録商標）ＲＧ３００カラゲナンを迅速に撹拌しなからゆっくり添加した。混合物を迅速に撹拌しながら、カラゲナンが完全に溶解するまで７５〜８０℃に加熱し、得られた溶液を温度調節された水浴中で５５〜５６℃（ゲル化温度およそ５２℃）に冷却した。０．３５Ｍのリン酸水素ナトリウム緩衝液（総容量４５ｍＬ、ｐＨ７．３）中のＥ．ｃｏｌｉ形質転換体ＳＳ１００１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７７）の懸濁液（１２．５％乾燥細胞重量）を５０℃に１２分間加熱し、次に５５〜５６℃で撹拌しながらカラゲナン溶液に添加した。細胞／カラゲナン混合物を５０℃でオーバーヘッド撹拌機を使用して撹拌しながら、直ちに４５０ｍｌの大豆油にゆっくりと添加した。油中に所望のサイズの細胞／カラゲナン液滴が生じた後に撹拌速度を調節し、油の温度を３５℃に低下させて液滴をゲル化させ、得られたビーズから油をデカントし、０．１０Ｍの重炭酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．３）で洗浄した。ビーズの２０ｇの部分を４８．８ｍｌの０．１０Ｍ重炭酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．３）に再懸濁し、０．２５ｇの水中の２５重量％グルタルアルデヒドを添加し、ビーズを２５℃で１．０時間混合した。次に混合物に１．０ｇの水中の１２．５重量％ポリエチレンイミン（ＢＡＳＦ  Ｌｕｐａｓｏｌ（登録商標）ＰＲ９７１Ｌ、平均分子量約７５０，０００）を添加し、ビーズを２５℃でさらに１時間混合した。次に架橋したビーズを２５℃で５０ｍｌの０．３０Ｍ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ７．３）で洗浄し、この同一緩衝液中に５℃で保存した。
【実施例６】
【００５３】
（４−シアノペンタン酸製造における非架橋およびＧＡ／ＰＥＩ架橋Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＳ１００１／カラゲナンビーズ触媒の比較）
実施例６は、連続バッチ反応においてＧＡ／ＰＥＩ架橋カラゲナンビーズ触媒が、非架橋ビーズよりも高い速度で４−シアノペンタン酸を生じることを例証する。
【００５４】
別個の１２５ｍＬジャケット付き反応容器（再循環温度浴中で３０℃に温度調節された）の中に、実施例６で記載されたように調製された１２．３７５ｇの非架橋またはＧＡ／ＰＥＩ架橋Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＳ１００１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７７）／カラゲナンビーズのどちらかを入れた。各反応容器に、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を含有する５１．９ｍｌの蒸留脱イオン水、および１０．７１ｍＬ（１０．１７ｇ、１．２５Ｍ）の２−メチグルタロニトリルを添加し、各混合物を３０℃で撹拌した。反応混合物のサンプル（０．１００ｍＬ）を０．４００ｍｌの水と混合し、次に０．３６０ｍｌの希釈サンプルを０．０４０ｍｌの水中の０．７５ＭのＮ−メチルプロピオンアミド（ＨＰＬＣ外部標準）および０．０２０ｍｌの６．０ＮのＨＣｌと混合した。得られる混合物を濾過し（０．２２μｍ）、濾液をＨＰＬＣで２−メチルグルラトニトリル、４−シアノペンタン酸、および２−メチルグルタル酸について分析した。非架橋およびＧＡ／ＰＥＩ架橋アシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ細胞／アルギン酸塩ビーズによる４−シアノペンタン酸の生成速度は、それぞれ２５４ｍＭ／時間および３１０ｍＭ／時間であった。２−メチルグルタロニトリルの完全な転換時に、４−シアノペンタン酸アンモニウム塩および２−メチルグルタル酸ジアンモニウム塩の収率は、どちらの反応容器でもそれぞれ９８．８％および１．２％の収率であった。
【００５５】
反応終了時に生成混合物を触媒ビーズからデカントした。上述したように、触媒ビーズをさらに１１回の連続バッチ反応で再利用した。表３は、非架橋およびＧＡ／ＰＥＩ架橋Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＳ１００１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１７７）／カラゲナンビーズによる、反応４での４−シアノペンタン酸の生成速度がそれぞれ１２０ｍＭ／時間および２９０ｍＭ／時間であったことを示す。
【００５６】
【表４】
2004531243.tif 000005
【実施例７】
【００５７】
（カラゲナン中のアシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ細胞の固定化）
実施例７は、カラゲナン中のアシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）細胞の固定化を例証する。
【００５８】
２５０ｍＬメディアボトル（磁気撹拌棒を装着し５０℃の６４．１２ｇの蒸留脱イオン水を含有する）中に、３．３８ｇのＦＭＣ  ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ  ＩＳＡＧＥＬ（登録商標）ＲＧ３００カラゲナンを迅速に撹拌しながらゆっくり添加した。混合物を迅速に撹拌しながらカラゲナンが完全に溶解するまで７５〜８０℃に加熱し、得られた溶液を温度調節された水浴中で５５〜５６℃に冷却した（ゲル化温度およそ５２℃）。０．３５Ｍリン酸水素ナトリウム緩衝液（総容量４５ｍＬ、ｐＨ７．３）中のアシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ細胞の懸濁液（１２．５％乾燥細胞重量）を５０℃に６０分間加熱して、次にカラゲナン溶液に５５〜５６℃で撹拌しながら添加した。細胞／カラゲナン混合物を５０℃でオーバーヘッド撹拌機を使用して撹拌しながら、直ちに４５０ｍｌの大豆油にゆっくりと添加した。油中に所望のサイズの細胞／カラゲナン液滴が生じた後に撹拌速度を調節し、油の温度を３５℃に低下させて液滴をゲル化させ、得られたビーズから油をデカントし、０．１０Ｍ重炭酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．３）で洗浄した。ビーズの２０ｇの部分を４８．８ｍｌの０．１０Ｍ重炭酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．３）に再懸濁し、０．２５ｇの水中の２５重量％グルタルアルデヒドを添加し、ビーズを２５℃で１．０時間混合した。次に混合物に１．０ｇの水中の１２．５重量％ポリエチレンイミン（ＢＡＳＦ  Ｌｕｐａｓｏｌ（登録商標）ＰＲ９７１Ｌ、平均分子量約７５０，０００）を添加し、ビーズを２５℃でさらに１時間混合した。次に架橋したビーズを２５℃で５０ｍｌの０．３０Ｍ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ７．３）で洗浄し、この同一緩衝液中に５℃で保存した。
【００５９】
グルタルアルデヒド無添加の非架橋ビーズも０．３０Ｍ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ７．３）で２５℃で洗浄し、この同一緩衝液中に５℃で保存した。
【実施例８】
【００６０】
（４−シアノペンタン酸製造における非架橋およびＧＡ／ＰＥＩ架橋アシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ／カラゲナンビーズ触媒の比較）
実施例８は、連続バッチ反応においてＧＡ／ＰＥＩ架橋カラゲナンビーズ触媒が、非架橋ビーズよりも高い速度で４−シアノペンタン酸を生じることを例証する。
【００６１】
別個の１２５ｍＬジャケット付き反応容器（再循環温度浴中で３０℃に温度調節された）の中に、実施例７で記載されたように調製された１６．５ｇの非架橋またはＧＡ／ＰＥＩ架橋アシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ／カラゲナンビーズのどちらかを入れた。各反応容器に、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を含有する７２．１ｍｌの蒸留脱イオン水、および１１．４０ｍＬ（１０．８３ｇ、１．０Ｍ）の２−メチルグルタロニトリルを添加し、混合物を３０℃で撹拌した。反応混合物のサンプル（０．１００ｍＬ）を０．４００ｍｌの水と混合し、次に０．３６０ｍｌの希釈サンプルを０．０４０ｍｌの水中の０．７５ＭのＮ−メチルプロピオンアミド（ＨＰＬＣ外部標準）および０．０２０ｍｌの６．０ＮのＨＣｌと混合した。得られる混合物を濾過し（０．２２μｍ）、濾液をＨＰＬＣによって２−メチルグルラトニトリル、４−シアノペンタン酸、および２−メチルグルタル酸について分析した。非架橋およびＧＡ／ＰＥＩ架橋アシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ／アルギン酸塩ビーズによる４−シアノペンタン酸の生成速度は、それぞれ２６６ｍＭ／時間および２３５ｍＭ／時間であった。２−メチルグルタロニトリルの完全な転換時に、４−シアノペンタン酸アンモニウム塩および２−メチルグルタル酸ジアンモニウム塩の収率は、どちらの反応容器でもそれぞれ９８．５％および１．５％収率であった。
【００６２】
反応終了時に生成混合物を触媒ビーズからデカントした。上述したように、触媒ビーズをさらに９回の連続バッチ反応で再利用した。表４は非架橋およびＧＡ／ＰＥＩ架橋アシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ／カラゲナンビーズによる、反応９での４−シアノペンタン酸の生成速度が、それぞれ１４４ｍＭ／時間および２００ｍＭ／時間であったことを示す。
【００６３】
【表５】
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【実施例９】
【００６４】
（４−シアノペンタン酸製造のための触媒としてのＧＡ／ＰＥＩ架橋アルギン酸塩またはカラゲナンビーズ中に固定化されたアシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ細胞の比較）
実施例９は、乾燥細胞重量の増大する濃度と共に、アルギン酸塩ビーズ触媒ではニトリラーゼの比活性が増大するが、カラゲナンビーズ触媒では増大しないことを例証する。
【００６５】
別個の１２５ｍＬジャケット付き反応容器に、ａ）１６．５ｇの固定化アシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ触媒ビーズおよび６８．２５ｇの蒸留脱イオン水、あるいはｂ）２２ｇの固定化アシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ触媒ビーズおよび６２．７５ｇの蒸留脱イオン水のどちらかを入れた。触媒をＧＡ／ＰＥＩ架橋アシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ細胞／アルギン酸塩ビーズ（実施例２で記載された手順に従って調製された）またはＧＡ／ＰＥＩ架橋アシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ細胞／カラゲナンビーズ（実施例５で記載された手順に従って調製された）のどちらかから選択した。触媒ビーズは、５％乾燥細胞重量（ｄｃｗ）または７．５％のｄｃｗのアシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ細胞のどちらかで調製された。７．５％ｄｃｗの触媒ビーズでは、完全に架橋された触媒を生じるために、ビーズを架橋するのに使用されるＧＡおよびＰＥＩの量は２倍になった。各反応容器に１．０ｍｌの０．２０Ｍ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）および１４．２５ｍＬ（１３．５４ｇ、１．２５Ｍ）の２−メチグルタロニトリルを直ちに添加して、再循環温度浴で温度を保ちながら、各反応混合物を３０℃または３５℃のどちらかで撹拌した。反応混合物のサンプル（０．１００ｍＬ）を０．４００ｍｌの水と混合し、次に０．３６０ｍｌの希釈サンプルを０．０４０ｍｌの水中の０．７５ＭのＮ−メチルプロピオンアミド（ＨＰＬＣ外部標準）および０．０２０ｍｌの６．０ＮのＨＣｌと混合した。得られる混合物を濾過し（０．２２μｍ）、濾液をＨＰＬＣによって２−メチルグルラトニトリル、４−シアノペンタン酸、および２−メチルグルタル酸について分析した。表５は、同一反応条件下で２つの触媒で実施された反応中での４−シアノペンタン酸の製造について、反応速度および触媒比活性を列挙する。
【００６６】
【表６】
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【実施例１０】
【００６７】
（４−シアノペンタン酸（アンモニウム塩）の調製）
実施例１０は、アルギン酸塩中にアシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗを固定化することで、望まれないニトリルヒドラターゼ活性のおよそ９０％が除去されることを例証する。さらにＧＡまたはＧＡ／ＰＥＩは、追加的な望まれないニトリルヒドラターゼ活性を除去する。４−シアノペンタン酸を調製するための先行技術は、望まれないニトリルヒドラターゼ活性を除去するための細胞の熱処理工程を必要とする（特許文献４およびその分割特許、上述）。
【００６８】
アルギン酸塩溶液との混合前に、アシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）細胞懸濁液を５０℃で１５分熱処理しなかったこと以外は、実施例２の手順を繰り返して、３つの別個のアシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ／アルギン酸塩ビーズ触媒を製造した。細胞のニトリラーゼおよびニトリルヒドラターゼ／アミダーゼ活性は、固定化前に０．３Ｍの２−メチルグルタロニトリルを使用して２５℃でアッセイし、２−メチルグルタル酸（２−ＭＧＡ、細胞のニトリルヒドラターゼ／アミダーゼ活性の生成物）の生成速度は、４−シアノペンタン酸（４−ＣＰＡ）生成速度の３４％であった。実施例２で記載されたようにして調製され加熱された細胞懸濁液では、２−メチルグルタル酸の生成速度は、典型的に４−シアノペンタン酸生成速度の１．５％であった。調製された３つの触媒セットで、１）アシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ／アルギン酸塩ビーズの１つめのセットはＧＡまたはＰＥＩのどちらによっても架橋せず、２）２つめはＧＡのみで架橋し、３）３つめはのＧＡとＰＥＩの双方で架橋した。
【００６９】
別個の１２５ｍＬジャケット付き反応容器（再循環温度浴中で３５℃に温度調節された）の中に、１６．５ｇの上述したように調製された３つの触媒の１つを入れた。次に各反応容器に６８．２５ｍｌの蒸留脱イオン水、１．０ｍｌの０．２０Ｍ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０、反応混合物中の最終カルシウムイオン濃度２．０ｍＭ）、および１４．２５ｍＬ（１３．５４ｇ、１．２５Ｍ）の２−メチルグルタロニトリルを添加して、混合物を３５℃で撹拌した。反応混合物のサンプル（０．１００ｍＬ）を０．４００ｍｌの水と混合し、次に０．３６０ｍｌの希釈サンプルを０．０４０ｍｌの水中の０．７５ＭのＮ−メチルプロピオンアミド（ＨＰＬＣ外部標準）、および０．０２０ｍｌの６．０ＮのＨＣｌと混合した。得られた混合物を濾過して（０．２２μｍ）、各濾液をＨＰＬＣによって２−メチルグルラトニトリル、４−シアノペンタン酸、および２−メチルグルタル酸について分析した。ＧＡまたはＰＥＩのどちらによっても架橋されないアシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ／アルギン酸塩ビーズによる２−メチルグルタル酸の生成速度は、４−シアノペンタン酸生成速度の３．６％であり、３４％の低下であった（表６）。ＧＡのみによって架橋されたアシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ／アルギン酸塩ビーズは、４−シアノペンタン酸生成速度の１．７％である２−メチルグルタル酸生成速度を有し、ＧＡおよびＰＥＩ双方によって架橋されたアシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ／アルギン酸塩ビーズは、４−シアノペンタン酸生成速度の１．５％である２−メチルグルタル酸生成速度を有した。
【００７０】
【表７】
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【実施例１１】
【００７１】
（４−シアノペンタン酸製造のためのＧＡ／ＰＥＩ架橋Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＳＳ１００１／アルギン酸塩ビーズ触媒）
反応混合物中に２ｍＭの酢酸カルシウムを使用して、４−シアノペンタン酸製造のために、ＧＡ／ＰＥＩ架橋エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）  ７２Ｗ  ＳＳ１００１／アルギン酸塩を使用して、ＧＡ／ＰＥＩ架橋アシドボラックス・ファシリス  ７２Ｗ  ＳＳ１００１ビーズ触媒を使用した実施例３の反応を繰り返した。
【００７２】
１９５回の連続触媒リサイクル後、反応速度は初期反応速度の６７％で、触媒ビーズの物理的完全性の顕著な損失はなかった。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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