(57)【要約】本発明は、ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合を特異的に遮断し、細胞におけるＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーの発現を減ずる化合物、並びにこのような化合物を含む薬剤組成物、及びＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合を遮断する化合物をスクリーニング及び／又は同定する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合を特異的に遮断し、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーの細胞における発現を減ずる化合物。
【請求項２】
前記化合物が核酸を含むことを特徴とする、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
化合物がＤＮＡを含むことを特徴とする、請求項１又は２記載の化合物。
【請求項４】
化合物がＲＮＡを含むことを特徴とする、請求項１又は２記載の化合物。
【請求項５】
化合物がＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバー又はその誘導体のコード領域の少なくとも一部を含有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
化合物が配列番号：１における配列のヌクレオチド４６６〜６１８又はその誘導体を含有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
化合物が配列番号：１における配列のヌクレオチド４６６〜６１５又はその誘導体を含有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
化合物が、−２８．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、好ましくは−２９．７ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下のエネルギーを有する、三叉ステム−ループ構造を含む二次構造を有する核酸を含有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の化合物。
【請求項９】
化合物が核酸であり、前記核酸が細胞内で該核酸からのＲＮＡ分子の転写をもたらす調節配列を含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の化合物。
【請求項１０】
化合物が核酸であり、前記核酸が細胞内での該核酸からのポリペプチド又はタンパク質の翻訳をもたらす調節配列を含有しないことを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の化合物。
【請求項１１】
前記化合物がタンパク質を含むことを特徴とする、請求項１記載の化合物。
【請求項１２】
前記タンパク質が、ＥＬＡＶタンパク質スーパーファミリーのメンバーの誘導体であることを特徴とする、請求項１１記載の化合物。
【請求項１３】
前記タンパク質が、ＥＬＡＶ、ＨｕＲ、ＨｕＢ、ＨｕＣ、ＨｕＤ、ＨｕＤｐｒｏ、ＨｕＤｍｅｘ、Ｈｅｌ−Ｎ２及びＨｕＣアイソフォーム、Ｒｅｌ−Ｎ１並びにこれらのタンパク質の天然生成同族体から成るタンパク質群から選択されることを特徴とする、請求項１２記載の化合物。
【請求項１４】
前記タンパク質が、ＨｕＲに対するタンパク質リガンドの誘導体であることを特徴とする、請求項１１記載の化合物。
【請求項１５】
前記タンパク質が、ＳＥＴα、ＳＥＴβ、ｐｐ３２及びＡＰＲＩＬ並びにこれらのタンパク質の天然生成同族体から成るタンパク質群から選択されることを特徴とする、請求項１４記載の化合物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物を含む薬剤組成物。
【請求項１７】
ＤＣの直接又は間接関与を伴う疾患の治療又は予防用の薬剤組成物を調製するための請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項１８】
前記疾患が、細胞傷害性Ｔ細胞及びヘルパーＴ細胞の増殖、分化及び／又は活性化、ヘルパーＴ細胞のＴｈ１細胞又はＴｈ２細胞への分化、Ｂ細胞の増殖、刺激及び／又は分化に関与する疾患から成る群から選択されることを特徴とする、請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
前記疾患が、アレルギー、喘息、例えば重症筋無力症、多発性硬化症及び全身性紅斑性狼瘡のような自己免疫症候群、例えば乾癬のような皮膚疾患、慢性関節リウマチ及びＡＩＤＳから成る群から選択されることを特徴とする、請求項１７記載の使用。
【請求項２０】
組織又は器官の移植片の拒絶の治療又は予防用の薬剤組成物を調製するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項２１】
請求項４〜１０のいずれかに記載のリボ核酸をコードする核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項２２】
請求項２１記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項２３】
免疫応答を調節することによる、ＤＣの直接又は間接関与を伴う障害、疾患及び症候群の治療及び予防用の薬剤を調製するための、請求項４〜１０のいずれかに記載のリボ核酸をコードする発現ベクターの使用。
【請求項２４】
請求項１１〜１５のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項２５】
請求項２４記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項２６】
免疫応答を調節することによる、ＤＣの直接又は間接関与を伴う障害、疾患及び症候群の治療及び予防用の薬剤を調製するための、請求項１１〜１５のいずれかに記載のタンパク質をコードする発現ベクターの使用。
【請求項２７】
ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合を遮断する化合物をスクリーニング及び／又は同定する方法であって、（ａ）ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバー又はその誘導体のコード領域の少なくとも一部を含有する核酸分子、及び（ｂ）ＥＬＡＶタンパク質スーパーファミリーのメンバー又はその誘導体を含む反応において、該成分を相互作用させるために充分な条件下で１種類以上の化合物をインキュベートする工程と、該化合物が核酸分子と、ＥＬＡＶタンパク質スーパーファミリーのメンバーとの間の結合を遮断するかどうかを判定する工程とを含む上記方法。
【請求項２８】
ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーがＣＤ８３であることを特徴とする、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
ＥＬＡＶタンパク質スーパーファミリーの該メンバーが、ＥＬＡＶ、ＨｕＲ、ＨｕＢ、ＨｕＣ、ＨｕＤ、ＨｕＤｐｒｏ、ＨｕＤｍｅｘ、Ｈｅｌ−Ｎ２及びＨｕＣアイソフォーム、Ｒｅｌ−Ｎ１並びにこれらのタンパク質の天然生成同族体から成る群から選択されることを特徴とする、請求項２７又は２８記載の方法。
【請求項３０】
前記方法が、ＲＮＡゲルシフト・アッセイ、フィルター結合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ相互作用分析、シンチレーション・プロキシミティ・アッセイ、ＲＮＡｓｅ・プロテクション・アッセイ、細胞に基づくＲＮＡ結合アッセイ、酵母３−ハイブリッド・アッセイ及びレポーター遺伝子アッセイから成る群から選択されるアッセイとして行なわれることを特徴とする、請求項２７〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
（ａ）ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバー又はその誘導体のコード領域の少なくとも一部を含有する核酸分子、及び（ｂ）ＥＬＡＶタンパク質スーパーファミリーのメンバー又はその誘導体を含む反応において、該成分を相互作用させるために充分な条件下でインキュベートしたときに、ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合を遮断する化合物の、ＤＣの直接又は間接関与を伴う疾患の治療又は予防用薬剤組成物を調製するための使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
哺乳動物の免疫系は、非常に多数の異種抗原と反応する能力を有さなければならない。リンパ球は抗原を認識して、特異的な適応免疫応答を誘起するので、リンパ球は免疫系の重要なエレメントを構成する。リンパ球は２つの一般的なクラスの細胞、抗体を発現することができるＢリンパ球及び、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞とＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞とに細分されうるＴリンパ球に分割することができる。Ｔリンパ球のこれらのサブグループの両方ともが、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）として知られる表面タンパク質に結合した抗原を認識することができる。ＭＨＣの認識はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、即ち、Ｔ細胞の細胞膜に固定されたタンパク質複合体を介して行なわれる。ＣＤ８＋Ｔ細胞はＭＨＣクラスＩ抗原と細胞傷害性Ｔ細胞との相互作用を排他的に媒介し；ＣＤ４＋Ｔ細胞受容体はＭＨＣクラスＩＩ抗原とヘルパーＴ細胞との相互作用を排他的に媒介する。
【０００２】
免疫応答の誘発はＴ細胞のみから排他的には進行せず；むしろ、Ｔ細胞と、いわゆる抗原提示細胞（ＡＰＣｓ、補助細胞としても知られる）及びそれらの表面マーカー（例えば、ＭＨＣＩＩ）との相互作用を通して進行する。
【０００３】
これらの補助細胞は、“シンプル”ＡＰＣｓ（これの機能は抗原を提示することである）と“プロフェッショナル”ＡＰＣｓ（抗原提示の他に、リンパ球の刺激における補助機能をも有する）とに細分されうる。ＡＰＣｓ自体は、抗原特異性を有さないが、Ｔ細胞に対して抗原を提示することによって“自然のアジュバント（ｎａｔｕｒｅ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ）”として役立つ。単核食細胞の他に、樹状細胞（ＤＣ）がＡＰＣタイプのメンバーである。実際に、ＤＣｓは現在知られる最も強力なＡＰＣであり、これらは、ナイーブＴ細胞を刺激することもできる唯一のＡＰＣである。
【０００４】
それらの異なる特性及び機能の結果として、２タイプの樹状細胞が現在までに分類されている：即ち、リンパ節、脾臓及び粘膜関連リンパ組織中に存在する濾胞樹状細胞（リンパ関連（ｌｙｍｐｈｏｉｄ−ｒｅｌａｔｅｄ）ＤＣｓとしても知られる）、並びに大抵の器官の間質腔中、リンパ節及び脾臓のＴ細胞富化領域中に見出され、皮膚全体に分布して、この場合にはランゲルハンス細胞として知られる相互連結樹状細胞（骨髄球由来細胞としても知られる）。
【０００５】
未成熟樹状細胞、即ち、Ｔ細胞を刺激することが完全にはできないＤＣｓは、抗原を取り込み、それらをプロセシングして、ＭＨＣ−ペプチド複合体にする機能を有する。例えばＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子）及びＣＤ４０Ｌのような刺激物は樹状細胞の成熟を誘導し、ＭＨＣクラスＩ分子及びＭＨＣクラスＩＩ分子の大規模な（ｍａｓｓｉｖｅ）ｄｅ  ｎｏｖｏ合成並びに、例えば内部器官の間質腔から血液を介して脾臓及び肝臓のリンパ節中へのＤＣの移行をもたらす。さらに、副刺激剤（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）分子（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６）及び接着分子（例えば、ＬＦＡ３）の発現増強が、第２リンパ組織への移行段階中に生じる。成熟ＤＣは、これらのＴ細胞に対するＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩの関連の中で（ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｘｔ ｏｆ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｏｒ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｔｏ ｔｈｅｓｅ Ｔ ｃｅｌｌ）ペプチド抗原を提示することによって、第２リンパ組織のＴ細胞富化領域に到着次第、Ｔリンパ球を刺激する。
【０００６】
条件に依存して、ＤＣｓは多様なＴ細胞の活性化を刺激することができ、該Ｔ細胞は次に免疫系の差別的応答（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）をもたらすことができる。例えば、ＭＨＣクラスＩを発現するＤＣｓは、細胞傷害性Ｔ細胞を増殖させることができ、ＭＨＣクラスＩＩを発現するＤＣｓは、ヘルパーＴ細胞と相互作用することができる。これらのＴ細胞は、成熟ＤＣｓとそれらが産生するＩＬ−１２との存在下で、成熟して、インターフェロン−γを産生するＴｈ１細胞になる。インターフェロン−γ及びＩＬ−１２は一緒に、キラー細胞へのＴ細胞の文化を促進するのに役立つ。ＩＬ−４の存在下で、ＤＣｓはＴ細胞から、ＩＬ−５及びＩＬ−４を分泌するＴｈ２細胞への分化を誘導し、該ＩＬ−５及びＩＬ−４は次に好酸球を活性化し、Ｂ細胞が抗体を産生するのを補助する（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊ．ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ３９２：２４５−２５２）。
【０００７】
ＤＣｓはさらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでいわゆる混合白血球反応（ＭＬＲ）、同種Ｔ細胞活性化及び移植片拒絶のモデルを誘導することができる。
【０００８】
成熟ＤＣは、他のもの（例えば、ＭＨＣ  Ｉ及びＩＩ、ＣＤ８０／８６、ＣＤ４０）の中でも特に、マーカー分子ＣＤ８３をそれらの表面上に発現する（Ｚｈｏｕ，Ｌ．−Ｊ．ａｎｄ  Ｔｅｄｄｅｒ，Ｔ．Ｆ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１５４：３８２１−３８３５）。これは、現在知られている、成熟ＤＣの最良のマーカーである。
【０００９】
ＣＤ８３、即ち、Ｉｇタンパク質スーパーファミリーからの分子は、膜貫通ドメイン、３９アミノ酸細胞質内ドメイン及び、成熟ＤＣの細胞表面上に非常に強く発現されるＩｇ様（Ｖ型）細胞外ドメインを有する、２０５アミノ酸から成る一本鎖４３ｋＤａ糖タンパク質である。ＣＤ８３タンパク質の細胞外ドメインは典型的なＩｇ様ドメインとは、それが少なくとも２つのエキソンによってコードされることで異なる：１つのエキソンはＩｇ様ドメインの半分のみをコードし、他方のエキソンは膜スパンニング・ドメイン（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｐａｎｎｉｎｇ ｄｍａｉｎ）をコードする（Ｚｈｏｕ，Ｌ．−Ｊ．，Ｓｃｈｗａｒｔｉｎｇ，Ｒ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｈ．Ｍ．及びＴｅｄｄｅｒ，Ｔ．Ｆ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１４９：７３５−７４２参照）。
【００１０】
ＣＤ８３をコードするｃＤＮＡは、６１８ｂｐオープンリーディングフレームを含有する（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号Ｚ１１６９７及びＺｈｏｕ，Ｌ．−Ｊ．等，上記文献（１９９５）参照）。
【００１１】
ＣＤ８３の正確な機能はまだ判明されないが、ＣＤ８３ｍＲＮＡの核外移行（ｎｕｃｌｅａｒ ｅｘｐｏｒｔ）を妨害することによる成熟ＤＣ上のＣＤ８３細胞表面発現の阻害が、Ｔ細胞を刺激するこれらの細胞の能力を明らかに減少させることは実証されている（Ｋｒｕｓｅ，Ｍ．等（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：１５８１−１５８９）。したがって、ＣＤ８３はＤＣ機能のために必要であるように思われる。
【００１２】
それゆえ、ＣＤ８３発現に関する薬理学的介入は、例えば一次免疫応答の開始、自己免疫疾患、アレルギー及び移植片拒絶に関与する免疫系機能を妨害する機会を提供することができる。
【００１３】
細胞におけるタンパク質発現の調節、即ち、翻訳機構への成熟ｍＲＮＡの利用可能性は、例えば、細胞内の、ポリアデニル化、キャッピング、スプライシング、輸送及び局在化のような、種々な転写後ＲＮＡプロセシング工程並びにｍＲＮＡ安定性の制御によって明らかに影響される。ＲＮＡ−タンパク質相互作用は、転写後遺伝子発現の調節に重要な役割を果たす。
【００１４】
このようなタンパク質の１つは、タンパク質ＥＬＡＶ（胚性致死異常ビジョン（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｌｅｔｈａｌ Ａｂｎｏｒｍａｌ Ｖｉｓｉｏｎ））、即ち、ミバエ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおいて最初に特徴付けられた、神経系の発達及び維持のために重要であるタンパク質である。ＥＬＡＶ遺伝子における欠失突然変異はしばしば、異常な又は欠損（ｍｉｓｓｉｎｇ）神経発達の結果として、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属に致命的な効果を及ぼす（Ａｎｔｉｃ，Ｄ．ａｎｄ  Ｋｅｅｎｓ，Ｊ．Ｄ．（１９９７）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６１：２７３−２７８；Ｋｅｅｎｅ，Ｊ．Ｄ．，（１９９９）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９６：５−７）。
【００１５】
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属ＥＬＡＶタンパク質が、タンパク質のスーパーファミリー、即ち、進化中に高度に保存されている、いわゆるＲＲＭ（ＲＮＡ認識モチーフ）スーパーファミリーに属することが判明している。このスーパーファミリーの他のメンバーは、ヒト、ラット、マウス、ニワトリ、並びにＸｅｎｏｐｕｓ及びＺｅｂｒａｆｉｓｈにおいて同定されている。このＲＲＭスーパーファミリーは、４種類の既知ヒトタンパク質｛ＨｕＡ＝ＨｕＲ（Ｍａ，Ｗ．−Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１４）：８１４４−８１５１），Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号Ｕ３８１７５；ＨｕＢ＝Ｈｅｌ−Ｎ１（Ｋｉｎｇ，Ｐ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４（４）：１９４３−１９５２，Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号Ｕ１２４３１；ＨｕＣ（Ｍａｎｌｅｙ，Ｔ．及びＦｕｒｎｅａｕｘ，Ｈ．Ｍ．によって、Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号Ｌ２６４０５で寄託）及びＨｕＤ（Ｓｚａｂｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６７（２）：３２５−３３３，Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号Ｍ６２８４３｝を包含する。Ｈｕタンパク質は全て、典型的に、３つのＲＮＡ結合ドメイン（ＲＲＭ１〜３）及びＲＲＭ２と３との間のヒンジ領域を含有する。ＨｕＲ（＝ＨｕＡ）のヒンジ領域は、ＨＮＳ（Ｈｕ核細胞質シャトリング（Ｈｕ ｎｕｃｌｅｏｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｓｈｕｔｔｌｉｎｇ））として知られるシャトリング配列（ｓｈｕｔｔｌｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含有する（Ｆａｎ，Ｘ．Ｃ．ａｎｄ  Ｓｔｅｉｔｚ，Ｊ．Ａ．（１９９８）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：１５２９３−１５２９８）。この配列は核内への移行のためのシグナル（ｓｉｇｎａｌ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｕｓ）、いわゆるＮＬＳ（核移行シグナル）並びに核外移行のためのシグナル（ｓｉｇｎａｌ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅａｒ ｅｘｐｏｒｔ）、いわゆるＮＥＳ（核外移行シグナル）を含有する。
【００１６】
ＨｕＲは全ての増殖細胞に偏在的に発現されることが判明しているが、ＨｕＢ、ＨｕＣ及びＨｕＤはニューロン特異的に発現される。
【００１７】
これらのＥＬＡＶ又はＥＬＡＶ様タンパク質の正確な機能は知られていないが、これらは、例えば、がん原タンパク質（ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）及びサイトカインをコードするような、初期応答遺伝子（ＥＲＧ）ｍＲＮＡｓグループの輸送、安定性及び翻訳の調節に関与すると思われる。したがって、ＨｕＲは、例えばＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｆｏｓ及びＧＬＵＴ１のようなｍＲＮＡｓの輸送、安定性及び翻訳の調節に関与するとみなされている。この調節は、これらのｍＲＮＡ分子内で見出される、いわゆるＡＲＥ（ＡＵ富化エレメント）（単数又は複数）に結合するＨｕＲを介して起こることが実証されている。ＡＲＥｓは、典型的にＡＵ富化バックグラウンド内にモチーフＡＵＵＵＡをしばしば有し、約５０〜１５０塩基のサイズ範囲であり、ｍＲＮＡ分子の３’非翻訳領域に存在し、ここで、これらが生じるｍＲＮＡ分子内の不安定化エレメントとして作用すると思われる配列エレメントである（Ｃｈｅｎ，Ｃ．−Ｙ．Ａ．ａｎｄ  Ｓｈｙｕ，Ａ．−Ｂ．（１９９５）ＴＩＢＳ  ２０：４６５−４７０参照）。例えば、ＨｕＲは、ＡＲＥｓ  ＡＵＵＵＡ、ＡＵＵＵＵＡ及びＡＵＵＵＵＵＡを含有する２７ヌクレオチドのｃ−ｆｏｓ  ｍＲＮＡのコア・エレメントに結合することが判明している（Ｍａ，Ｗ．−Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１４）：８１４４−８１５１）。特定ｍＲＮＡ分子のＡＲＥ（単数又は複数）へのＨｕＲタンパク質の結合がｍＲＮＡ分子を細胞酵素による分解から保護することができると考えられる。
【００１８】
本発明の目的は、ＣＤ８３発現及び／又はＤＣのＴ細胞刺激モードの誘導及び／又はいわゆる“調節細胞”の誘導を阻害することができる化合物を提供することである。
【００１９】
本発明の他の目的は、ＣＤ８３発現及び／又はＤＣのＴ細胞刺激モードの誘導及び／又はいわゆる“調節細胞”の誘導を阻害することができる化合物を含む薬剤組成物を提供することである。
【００２０】
本発明の他の目的は、ＣＤ８３発現及び／又はＤＣのＴ細胞刺激モードの誘導及び／又はいわゆる“調節細胞”の誘導を阻害することができ、それ自体で、薬剤として有用である化合物のスクリーニング及び／又は同定に有用であるアッセイを提供することである。
【００２１】
発明の概要
ＨｕＲが、成熟ＤＣマーカータンパク質ＣＤ８３をコードするｍＲＮＡ分子に特異的に結合する能力を有することが、意外にも発見されている。さらに、ＣＤ８３  ｍＲＮＡへのＨｕＲの特異的結合が、ＨｕＲと、ＣＤ８３  ｍＲＮＡ分子のコード領域の一部を含むシス活性エレメントとの間の相互作用の結果として生じること、及びこの相互作用が、ＣＤ８３  ｍＲＮＡのこの部分を含むｍＲＮＡ分子の発現増強をもたらすことが予想外に発見された。
【００２２】
それゆえ、ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと，ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の相互作用を特異的に遮断することができる化合物は、前記ｍＲＮＡの正確な細胞内輸送及び／又は安定化を妨害し、次には、前記ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現減少をもたらす。
【００２３】
本発明は、このような化合物を提供する。
【００２４】
したがって、本発明は、ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと，ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合を特異的に遮断することができ、細胞におけるタンパク質のＣＤ８３ファミリーのメンバーの発現を減じる化合物に関する。
【００２５】
ヒトＣＤ８３タンパク質をコードする核酸配列並びにＣＤ８３のアミノ酸配列は、Ｚｈｏｕ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９（２）：７３５−７４２に記載されており（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号Ｚ１１６９７）、それぞれ、配列番号：１及び配列番号：２に与えられる。
【００２６】
本明細書で定義するように、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーは、配列番号：２に示すようなヒトＣＤ８３に対して少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上のアミノ酸アイデンティティーを有し、その結果として、このＣＤ８３タンパク質のシス活性ＲＮＡ配列へのＥＬＡＶタンパク質の特異的結合を生じる、任意の天然生成タンパク質を包含する。
【００２７】
したがって、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーは、ＣＤ８３自体の他に、配列番号：３の核酸配列によってコードされ、配列番号：４に与えられるアミノ酸配列によって表されるマウスＨＢ１５タンパク質を包含する（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号ＮＭ００９８５６（Ｂｅｒｃｈｔｈｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ）。
【００２８】
ＣＤ８３タンパク質ファミリーの本発明のために好ましいメンバーは、配列番号：２に示すようなＣＤ８３タンパク質である。
【００２９】
ＨｕＲタンパク質をコードする核酸配列並びにＨｕＲのアミノ酸配列は、Ｍａ，Ｗ．−Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１４）：８１４４−８１５１（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号Ｕ３８１７５）に記載されており、配列番号：５及び配列番号：６にそれぞれ示される。
【００３０】
本明細書で定義するように、ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーは、ＨｕＲに対して９０％以上のアミノ酸アイデンティティーを有する、任意の天然生成タンパク質を包含する。したがって、ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーは、ＨｕＲ自体の他に、ＸｅｎｏｐｕｓのｅｌｒＡ遺伝子によってコードされタンパク質（Ｇｏｏｄ，Ｐ．Ｊ．（１９９５）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９２（１０）：４５５７−４５６１；Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号Ｕ１７５９６；マウスｍｅｌＧタンパク質（Ａｔａｓｏｙ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１１：３１４５−３１５６；ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号Ｕ６５７３５））、ニワトリＨｕＡタンパク質（Ｗａｋａｍａｔｓｕ，Ｙ．ａｎｄ  Ｗｅｓｔｏｎ，Ｊ．Ａ．（１９９７）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４（１７）：３４４９−３４６０；ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＡＦ１７６６７３）；ゼブラフィッシュＨｕＡタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号ＡＦ１８４２４４）及びＨｕＧタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号ＡＦ１８４２４５）を包含する。
【００３１】
ＨｕＲタンパク質ファミリーの本発明のために好ましいメンバーは、配列番号：６に示すようなＨｕＲタンパク質である。
【００３２】
本明細書で定義するように、“特異的に遮断する”なる用語は、本発明の化合物がＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の相互作用を生理的なｐＨ及び塩濃度において、好ましくはｐＨ６．０〜８．０の範囲であるｐＨ濃度及び／又は５０ｍＭ〜２５０ｍＭ、好ましくは１２５ｍＭ〜１７５ｍＭの範囲である塩濃度において中断させることができることを示すために用いられる。
【００３３】
細胞中のＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーの発現を測定するための好ましいアッセイを、実施例において提供する。このための他の有用なアッセイは、蛍光／間接免疫蛍光アッセイ、Ｗｅｓｔｅｒｎ分析、ＥＬＩＳＡ分析、免疫沈降分析、例えばクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びＧＦＰ／ＢＦＰのようなレポーター遺伝子の発現に基づく他のアッセイ、ＦＡＣＳ分析、ゲルの染色による直接タンパク質ゲル分析、及び共役ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳アッセイを包含する。
【００３４】
ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合を検出するための好ましいアッセイを実施例において提供する。このための他の有用なアッセイは、フィルター結合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ相互作用分析（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、シンチレーション・プロキシミティ・アッセイ（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ａｓｓａｙ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＲＮＡｓｅ・プロテクション・アッセイ、細胞に基づくＲＮＡ結合アッセイ（ＢＬａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）ＲＮＡ  ４：２１５−２２５参照）、酵母３−ハイブリッド・アッセイ（ｙｅａｓｔ ３−ｈｙｂｒｉｄ ａｓｓａｙ）（例えば、ＲＮＡ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｈｕｎｔｅｒ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）及び上述したような、真核細胞におけるレポーター遺伝子アッセイを包含する。
【００３５】
本発明の化合物は、ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の相互作用を遮断させる、この遮断は可逆的又は不可逆的であることができ、好ましくは、ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合の、上記アッセイの１つ以上で測定して、少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、そして最も好ましくは少なくとも９０％以上の阻害に相当する。
【００３６】
１実施態様では、本発明の化合物は、ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合を特異的に遮断し、細胞におけるＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバー発現を減ずる核酸分子を含む。
【００３７】
本発明の核酸は、塩基のアデニン、チミン、グアニン及びシトシンを含有するＤＮＡ（デオキシリボ核酸）又は塩基のアデニン、ウラシル、グアニン及びシトシンを含有するＲＮＡ（リボ核酸）又は両者の混合物の形態でありうる。
【００３８】
好ましくは、これらの化合物は、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバー又はその誘導体のコード領域の少なくとも一部を含有する核酸分子を含む。
【００３９】
本発明の核酸分子がヒトＣＤ８３タンパク質のコード領域の一部に由来する場合に、該コード領域の該一部が配列番号：１における配列のヌクレオチド４６６〜６１８又はその誘導体であることが好ましい。或いは、該コード領域の該一部は配列番号：１における配列のヌクレオチド４６６〜６１５である。
【００４０】
本発明の核酸分子がマウスＨＢ１５タンパク質のコード領域の一部に由来する場合に、該コード領域の該一部が配列番号：３における配列の約ヌクレオチド１４〜６０４であることが好ましい。或いは、該コード領域の該一部は配列番号：３における配列のヌクレオチド１４〜６０１である。
【００４１】
本発明のために用いることができる、他の天然生成核酸は、例えば、ヒトＣＤ８３コード領域又はマウスＨＢ１５コード領域の全て又は一部を、他の動物、好ましくは哺乳動物から、又は同じ生物の他の組織からの種々なソースの核酸（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ）にハイブリダイズすることによって得ることができる。
【００４２】
ハイブリダイゼーションは、相補的核酸配列（例えば、センス／アンチセンス）間の結合を意味する。当業者に知られるように、Ｔｍ（融解温度）は、配列間の結合がもはや安定でない温度を意味する。本明細書に用いる限り、“選択的ハイブリダイゼーション”は、ＣＤ８３関連ヌクレオチド配列を非関連配列から識別することができる、中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションを意味する。
【００４３】
核酸ハイブリダイゼーション反応において、特定のストリンジェントレベルに達するために用いられる条件は、ハイブリダイズされる核酸の性質に依存して、変化する。例えば、長さ、配列相補性の程度、配列組成（例えば、ＧＣ  ｖ．ＡＴ含量）、及びハイブリダイズする領域の種類（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ）を、特定のハイブリダイゼーション条件の選択において考慮することができる。さらに考慮することは、核酸の１つが例えばフィルターに固定されているかどうかである。
【００４４】
一般に、核酸ハイブリッドの安定性は、ナトリウムイオンが減少し、ハイブリダイゼーション反応の温度が上昇すると、低下する。中程度ストリンジェントハイブリダイゼーション反応の例は下記のとおりである：約３７℃又は４２℃での２ｘＳＳＣ／０．１ＳＤＳ（ハイブリダイゼーション条件）；ほぼ室温での０．５ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（低ストリンジェント洗浄条件）；約４２℃での０．５ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（中程度ストリンジェント洗浄条件）。高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件の例は次のとおりである：ほぼ室温での２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（ハイブリダイゼーション条件）；ほぼ室温での０．５ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（低ストリンジェント洗浄条件）；約４２℃での０．５ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（中程度ストリンジェント洗浄条件）；そして約６５℃での０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（高ストリンジェント条件）。
【００４５】
典型的に、洗浄条件は所望のストリンジェント度に達するように調節する。したがって、ハイブリダイゼーション・ストリンジェント度は、例えば、特定の条件において、例えば低ストリンジェント条件若しくは高ストリンジェント条件において洗浄することによって、又は各条件を、上記に列挙した順序で、例えばそれぞれ１０〜１５分間、列挙した工程のいずれか若しくは全てを反復しながら、用いることによって、測定することができる。選択的ハイブリダイゼーションのための最適条件は、関与する特定のハイブリダイゼーション反応に依存して変化し、これを経験的に決定されることができる。
【００４６】
本発明の化合物は、１つ以上のヌクレオチドが付加、欠失、置換、挿入又は反転されているが、まだ、ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合を特異的に遮断して、細胞におけるＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーの発現を減ずる、上述したような、本発明による核酸分子の各々の誘導体をも包含する。
【００４７】
本発明の核酸は、三叉ステム−ループ構造（３−ｐｒｏｎｇｅｄ ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を含む図１６に又は図１７に示した構造に対応する二次構造又は同様な二次構造を有することができ、これらの構造は、米国ウイスコンシン大学から（ｈｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｃｑ．ｃｏｍ）で入手可能なＭＦＯＬＤプログラムに従って、３７℃のフォールディング温度（ｆｏｌｄｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を用いて分析した場合に−２８．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、好ましくは−２９．７ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下のエネルギーと、３０の内部ループの最大サイズ及び３０の内部ループの最大ループサイドネス（ｌｏｏｐｓｉｄｅｎｅｓｓ）と、配列番号：１の４６６〜６１５のヌクレオチド配列に相当するヌクレオチドを有するＤＮＡ分子の形態のヌクレオチド配列とを有する。
【００４８】
本発明の核酸は、三叉ステム−ループ構造を含む図７〜９に示した構造に対応する二次構造又は同様な二次構造を有することができ、これらの構造は、米国ウイスコンシン大学から（ｈｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｃｑ．ｃｏｍ）で入手可能なＭＦＯＬＤプログラムに従って、３７℃のフォールディング温度を用いて分析した場合に−４０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、好ましくは−４１．７ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、より好ましくは−４１．８ｋｃａｌのエネルギーと、３０の内部ループの最大サイズ及び３０の内部ループの最大ループサイドネスと、配列番号：１の４１２〜６１８のヌクレオチド配列に相当するヌクレオチドを有するＤＮＡ分子の形態のヌクレオチド配列とを有する。
【００４９】
本発明による二次構造を有する他の核酸分子は、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードする天然生成ＲＮＡ又はＤＮＡ分子中の２ヌクレオチド、例えば図７〜９、１６又は１７に示したように塩基対を形成するＣＤ８３核酸配列を選択し、次に、置換ヌクレオチドが塩基対を形成するように、対をなすように（ｉｎ ｐａｉｒ−ｗｉｓｅ ｆａｓｈｉｏｎ）にこれらのヌクレオチドを置換することによって得られる。したがって、本発明のＲＮＡ分子では、対をなしたＣ−ＧヌクレオチドがＧ−Ｃ対、Ａ−Ｕ対又はＵ−Ａ対によって置換されることができ、Ｇ−Ｃ塩基対がＣ−Ｇ対、Ａ−Ｕ対又はＵ−Ａ対によって置換されることができ、Ａ−Ｕ塩基対がＵ−Ａ対、Ｃ−Ｇ対又はＧ−Ｃ対によって置換されることができ、そしてＵ−Ａ塩基対がＡ−Ｕ対、Ｃ−Ｇ対又はＧ−Ｃ対によって置換されることができる。同様に、本発明のＤＮＡ分子では、対をなしたＣ−ＧヌクレオチドがＧ−Ｃ対、Ａ−Ｔ対又はＴ−Ａ対によって置換されることができ、Ｇ−Ｃ塩基対がＣ−Ｇ対、Ａ−Ｔ対又はＴ−Ａ対によって置換されることができ、Ａ−Ｔ塩基対がＴ−Ａ対、Ｃ−Ｇ対又はＧ−Ｃ対によって置換されることができ、そしてＴ−Ａ塩基対がＡ−Ｔ対、Ｃ−Ｇ対又はＧ−Ｃ対によって置換されることができる。好ましくは、Ｃ−Ｇ塩基対はＧ−Ｃ塩基対によって置換され、Ａ−Ｔ又はＡ−Ｕ塩基対は、それぞれ、Ｔ−Ａ又はＵ−Ａ塩基対によって置換される。
【００５０】
本発明の核酸分子はそれらの長さの全体に渡って及び／又は５’及び／又は３’末端（単数又は複数）において、それらの安定性を高めるように、修飾されることができる。
【００５１】
このような修飾は、α−アノマー又は２’−Ｏ−アルキルリボシドを用いて得ることができる（Ｇ．Ｚｏｎ，（１９８８）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５（９）：５３９−５４９；Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．ａｎｄ  Ｔｏｕｌｍｅ，Ｊ．−Ｊ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０４９：９９−１２５；Ｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ａ．ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｓ．（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４８：２６５９−２６６８）。さらに、核酸のリン酸主鎖（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂａｃｋｂｏｎｅ）を当該技術分野で知られた手段によって修飾して、リン酸基の非架橋形成原子（ｎｏｎ−ｂｒｉｄｇｉｎｇ ａｔｏｍ）が硫黄原子によって置換されているホスホチオエート類似体、リン酸基の非架橋形成原子がセレン原子によって置換されている類似体、リン酸原子の非架橋形成基の両方（ｂｏｔｈ ｎｏｎ−ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｔｏｍ）が硫黄によって置換されているホスホロジチオエート類似体、リン酸基の非架橋形成原子がメチル基によって置換されているメチルホスホネート、リン酸基の非架橋形成原子が、１若しくは２個のアルキルメチル又はエチル基によって置換されたアミド基によって置換されているホスホロアミデイト、そしてリン酸基の非架橋形成原子がメチル又はエチルエステルによって置換されているホスホトリエステルを含む、本発明の核酸を作製することができる。他の安定化修飾はＦｒｅｉｅｒ，Ｓ．Ｍ．ａｎｄ  Ａｌｔｍａｎｎ，Ｋ．−Ｈ．，（１９４７）ＮＡＲ  ２５（２２）：４４２９−４４４３に記載されている。
【００５２】
さらに、本発明の核酸の修飾は、末端ステム−ループ構造を形成し、それゆえ本発明のシス活性配列の安定性を高める異種末端配列の添加を包含する。
【００５３】
その上、核酸の１つ以上の塩基を修飾塩基によって置換することができる。これらの修飾塩基は２−メチルアデニン、１−メチルグアニン、５−メチルシトシン及び５−ヒドロメチルシトシンを包含する。
【００５４】
本発明の核酸は、さらに、例えば、当該技術分野に知られた多数の既知二官能性リンカー（例えば、マレイミドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル及びＰｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  １９９９／２０００の１７３〜２１４頁に記載されている他のリンカー）を介して核酸に付着することができるタンパク質のような非核酸成分を含んで、核酸の細胞取り込みを助成することもできる。これの例はＶｉｖｅｓ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（２５）：１６０１０−１６０１７及びＢｈｏｒａｄｅ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１（３）：３０１−３０５に記載されているｔａｔ由来ポリペプチド、及びＦｉｓｃｈｅｒ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．５５（２２）：１６３−１７２及びＢｏｌｔｏｎ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２（８）：２８４７−２８５５に記載されているペネトラチンである。
【００５５】
本発明の上記核酸は、細胞における前記核酸からのポリペプチド又はタンパク質の発現を惹起する調節配列を含有しないものであることが好ましい。
【００５６】
他の実施態様では、本発明の化合物は、ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合を特異的に遮断し、細胞におけるＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーの発現を減ずるタンパク質分子を包含する。
【００５７】
したがって、本発明の化合物は、ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合を特異的に遮断し、細胞におけるＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーの発現を減ずるＥＬＡＶタンパク質スーパーファミリーのメンバーの誘導体を含む。
【００５８】
本明細書で定義する限り、“ＥＬＡＶタンパク質スーパーファミリーのメンバー”は、ＥＬＡＶ（Ｒｏｂｉｎｏｗ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１５７０−１５７２，Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号Ｍ２１１５２）；ＨｕＡ＝ＨｕＲ（Ｍａ，Ｗ．−Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１４）：８１４４−８１５１，Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号Ｕ３８１７５）；ＨｕＢ＝Ｈｅｌ−Ｎ１（Ｋｉｎｇ，Ｐ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４（４）：１９４３−１９５２，Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号Ｕ１２４３１，配列番号：２２及び２３）；ＨｕＣ（Ｍａｎｌｅｙ，Ｔ．及びＦｕｒｎｅａｕｘ，Ｈ．Ｍ．によってＧｅｎｂａｎｋ受け入れ番号Ｌ２６４０５で寄託，配列番号：２４及び２５）及びＨｕＤ（Ｓｚａｂｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６７（２）：３２５−３３３，Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号Ｍ６２８４３，配列番号：２６及び２７）の部分的アミノ酸配列を含むタンパク質並びに、代替遺伝子発現から得られる、例えば交互（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）ＲＮＡスプライシングに起因する、ＥＬＡＶ、ＨｕＡ（＝ＨｕＲ）、ＨｕＢ（＝Ｈｅｌ−Ｎ１）、ＨｕＣ及びＨｕＤ遺伝子によってコードされる天然生成タンパク質、例えばＨｕＤｐｒｏ、ＨｕＤｍｅｘ、Ｈｅｌ−Ｎ２及びＨｕＣアイソフォームを包含する（Ｌｉｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４５：５４４−５５０及びＧｏａ，Ｆ．Ｃ．（１９９４）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９１：１１２０７−１１２１１を参照のこと）。そのうえ、“ＥＬＡＶタンパク質スーパーファミリーのメンバー”は、上記タンパク質の天然生成の動物、例えばゼブラフィッシュ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号ＡＦ１８４２４５、ＡＦ１８４２４４、Ｕ６２０１８、Ｕ１７６０２、Ｕ１７６０１及びＵ１７６００）、好ましくは哺乳動物のタンパク質同族体を包含する。例えば、ラットのＲｅｌ−Ｎ１及びＲｅｌ−Ｎ２タンパク質（Ｋｉｎｇ，Ｐ．Ｈ．（１９９４）Ｇｅｎｅ１５１（１−２）：２６１−２６５）、ラット“ＨｕＤ”（タンパク質配列受け入れ番号Ｏ０９０３２）、ラットＥＬＡＶ型ＲＮＡ結合タンパク質３（タンパク質配列受け入れ番号ＮＰ ０５８８９３）、マウスＭｅｌ−Ｎ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号ＮＭ ０１０４８６）、マウス“ＨｕＲ”（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号ＮＭ ０１０４８５）、マウス“ＨｕＤ”（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号ＮＭ ０１０４８８）がこの定義に包含される。
【００５９】
本発明による、ＥＬＡＶタンパク質スーパーファミリーのメンバーの誘導体は、アミノ酸の１つ以上が付加、欠失、置換、挿入又は反転されているが、まだ、ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合を特異的に遮断することができ、細胞におけるＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーの発現を減ずる、上記で定義したＥＬＡＶタンパク質スーパーファミリーのメンバーを包含する。
【００６０】
ＥＬＡＶタンパク質スーパーファミリーのメンバーの誘導体に達するように、ＥＬＡＶタンパク質スーパーファミリーのメンバーの１つ以上のアミノ酸を置換する場合には、該１つ以上のアミノ酸を保存的に置換することが好ましい。例えば、保存的置換は、例えばＭｅｔ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＡｌａのような脂肪族アミノ酸残基が相互に置換される置換を包含する。同様に、極性アミノ酸残基は、例えば、ＬｙｓとＡｒｇ、ＧｌｕとＡｓｐ、又はＧｌｎとＡｓｎのように、相互に置換されることができる。
【００６１】
本発明によると、ＥＬＡＶタンパク質スーパーファミリーのメンバーの誘導体はさらに、それのアミノ酸の１つ以上が変化した側鎖を有する誘導体をも包含する。このような誘導体化ポリペプチドは、例えば、遊離アミノ基がアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基を形成している；遊離カルボキシ基が塩、メチル及びエチルエステルを形成している；遊離ヒドロキシル基がＯ−アシル又はＯ−アルキル誘導体を形成しているアミノ酸を含むもの、並びに天然生成アミノ酸誘導体、例えば、プロリンに関しては４−ヒドロキシプロリン、リシンに関しては５−ヒドロキシリシン、セリンに関してはホモセリン、リシンに関してはオルニチン、等を包含する。共有結合を変化させる、例えば、２つのシステイン残基の間に形成されて、環化ポリペプチドを生成するジスルフィド結合を変化させることができるアミノ酸誘導体も包含される。
【００６２】
本発明によるＥＬＡＶタンパク質スーパーファミリーのメンバーの誘導体の長さは、前記誘導体がＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合を特異的に遮断し、細胞におけるＣＤ８３タンパク質ファミリーメンバーの発現を減ずる限り、変化することができる。好ましくは、本発明によるＥＬＡＶタンパク質スーパーファミリーのメンバーの誘導体は、長さにおいて、２５０アミノ酸未満、より好ましくは２００アミノ酸及び最も好ましくは１５０アミノ酸以下である。
【００６３】
好ましくは、本発明によるＥＬＡＶタンパク質スーパーファミリーのメンバーの誘導体は、ＲＲＭ１、ＲＲＭ２及びＲＲＭ３の完全なセットを含有せず、又はＨＮＳを含めたヒンジ領域を含有しない。
【００６４】
ＨｕＲに関して、完全なＲＲＭ１領域は配列番号：６のＲＮＡ認識領域アミノ酸１９〜１００として定義される。ＨｕＲに関して、完全なＲＲＭ２領域は配列番号：６のＲＮＡ認識領域アミノ酸１０３〜１８９として定義される。ＨｕＲに関して、完全なＲＲＭ３領域は配列番号：６のＲＮＡ認識領域アミノ酸２４５〜３２６として定義される。他のＥＬＡＶ様タンパク質の対応するＲＲＭ１、ＲＲＭ２及びＲＲＭ３と、ヒンジ又はＨＮＳ領域は、上記で定義したような、ＨｕＲのＲＲＭ１、ＲＲＭ２及びＲＲＭ３領域に対するそれらの相同性に基づいて演繹されることができ、ＲＲＭ１に関しては配列番号：６のアミノ酸１９〜１００、ＲＲＭ２に関しては配列番号：６のアミノ酸１０３〜１８９、ＲＲＭ３に関しては配列番号：６のアミノ酸２４５〜３２６、そしてＨＮＳに関する配列番号：６のアミノ酸２０５〜２３７を含めて、ヒンジ領域に関しては配列番号：６のアミノ酸１９０〜２４４に対して、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の相同性を有する。
【００６５】
他の実施態様では、本発明の化合物は、ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合を特異的に遮断し、細胞におけるＣＤ８３タンパク質ファミリーメンバーの発現を減ずる、ＨｕＲに対するタンパク質リガンドの誘導体を含む。
【００６６】
本明細書で定義する限り、“ＨｕＲに対するタンパク質リガンド”とはＳＥＴα（タンパク質配列受け入れ番号Ｉ５９３７７）、ＳＥＴβ（タンパク質配列受け入れ番号Ａ４５０１８）、ｐｐ３２（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号Ｕ７３４７７）、及びＡＰＲＩＬ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号Ｙ０７９６９）並びにこれらのタンパク質の天然生成の動物同族体、好ましくは哺乳動物同族体の部分的アミノ酸配列を含むタンパク質を包含する。
【００６７】
本発明によるＨｕＲに対するタンパク質リガンドの誘導体は、１つ以上のアミノ酸が付加、欠失、置換、挿入又は反転されているが、まだ、ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合を特異的に遮断することができ、細胞におけるＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーの発現を減ずる、上記で定義したような、ＳＥＴα、ＳＥＴβ、ｐｐ３２及びＡＰＲＩＬタンパク質を包含する。
【００６８】
ＥＬＡＶタンパク質スーパーファミリーのメンバーの誘導体に達するように、ＨｕＲに対するタンパク質リガンドの１つ以上のアミノ酸を置換する場合には、該１つ以上のアミノ酸を保存的に置換することが好ましい。例えば、保存的置換は、例えばＭｅｔ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＡｌａのような脂肪族アミノ酸残基が相互に置換される置換を包含する。同様に、極性アミノ酸残基は、例えば、ＬｙｓとＡｒｇ、ＧｌｕとＡｓｐ、又はＧｌｎとＡｓｎのように、相互に置換されることができる。
【００６９】
本発明によると、ＨｕＲに対するタンパク質リガンドはさらに、それのアミノ酸の１つ以上が変化した側鎖を有するような誘導体をも包含する。このような誘導体化タンパク質は、例えば、遊離アミノ基がアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基を形成している；遊離カルボキシ基が塩、メチル及びエチルエステルを形成している；遊離ヒドロキシル基がＯ−アシル又はＯ−アルキル誘導体を形成しているアミノ酸を含むもの、並びに天然生成アミノ酸誘導体、例えば、プロリンに関しては４−ヒドロキシプロリン、リシンに関しては５−ヒドロキシリシン、セリンに関してはホモセリン、リシンに関してはオルニチン、等を包含する。共有結合を変化させる、例えば、２つのシステイン残基の間に形成されて、環化ポリペプチドを生成するジスルフィド結合を変化させることができるアミノ酸誘導体も包含される。
【００７０】
本発明によるタンパク質は、タンパク質精製の標準手法を用いて、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、サイズ排除、逆相、イムノアフィニティ等）によって得ることができる。当該技術分野において知られた、他のタンパク質精製方法も用いることができる（例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０を参照のこと）。或いは、本発明によるタンパク質は、本明細書に開示するような組換え発現方法を用いて得ることができる。例えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを製造し、ベクター中に挿入して、本明細書に記載した及びさらに当該技術分野で知られた周知方法を用いて、宿主細胞中に形質転換することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）。形質転換後に、慣用的方法に従って、タンパク質を単離して、精製することができる。例えば、発現宿主（例えば、細菌）から調製した溶菌物（ｌｙｓａｔｅ）をＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティ・クロマトグラフィー、又は他の精製手法を用いて精製することができる。ペプチド・シンセサイザー（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ；Ｍｏｄｅｌ  ４３０Ａ等）を用いる化学合成によって、実質的に純粋なタンパク質を得ることもできる。
【００７１】
本発明はまた、本発明の化合物を含む薬剤組成物にも関する。
【００７２】
さらに、本発明は、ＤＣの直接又は間接関与を伴う免疫応答を調節するための、これらの薬剤組成物の使用に関する。好ましくは、本発明の薬剤組成物はＣＤ８３又はＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーの発現を減ずることができる。
【００７３】
その上、本発明は、ＤＣの直接又は間接関与を伴う免疫応答を調節するための薬剤組成物又は薬剤の製造への本発明の化合物の使用に関する。
【００７４】
さらに、本発明は、本発明による化合物又は前記化合物を含む本発明による薬剤組成物の有効量を対象に投与する、免疫応答の調節による、ＤＣの直接又は間接関与を伴う障害、疾患及び症候群の治療又は予防方法に関する。
【００７５】
したがって、本発明の化合物を用いて、ＣＤ８３タンパク質発現及び／又はＤＣのＴ細胞刺激モードの誘導又はいわゆる“調節”Ｔ細胞の誘導を阻害して、それによって多様な障害、疾患及び症候群を治療又は予防することができる。“調節”Ｔ細胞はＩＬ−１０産生非増殖性ＣＤ２５＋Ｔ細胞として定義される。
【００７６】
例えば、本発明の化合物を用いて、例えば細胞傷害性Ｔ細胞及びヘルパーＴ細胞のような、多様なＴ細胞の増殖、分化及び／又は活性化、ヘルパーＴ細胞の、Ｔｈ１細胞又はＴｈ２細胞への分化、Ｂ細胞の増殖、刺激及び／又は分化をモジュレートして、身体がこれらのプロセスを健全な方法で調節することができないことによって惹起される障害、疾患及び症候群を治療又は予防することができる。
【００７７】
さらに、本発明の化合物を用いて、例えば移植片対宿主疾患又は宿主対移植片疾患の結果として生じる、組織及び／又は器官の移植片、特に異種の組織及び／又は器官の移植片の拒絶を治療又は予防することができる。
【００７８】
本発明の他の実施態様では、本発明の化合物を用いて、異種抗原（ｆｏｒｅｉｇｎ ａｎｔｉｇｅｎ）に対する好ましくない応答及びそれによるアレルギー及び喘息又は同様な状態を治療又は予防することができる。
【００７９】
本発明の化合物によって治療又は予防することができる、他の障害、疾患及び症候群は、例えば重症筋無力症、多発性硬化症及び全身性紅斑性狼瘡のような自己免疫症候群、例えば乾癬のような皮膚疾患、慢性関節リウマチ及びＡＩＤＳを包含する。
【００８０】
治療的又は予防的使用に関して、本発明の化合物は、治療又は予防のために、医学的適応に適当な方法で対象に、好ましくは哺乳動物に、より好ましくはヒト患者に投与される。
【００８１】
本発明による１種類以上の化合物の一定量による薬剤組成物の製造及び／又は本発明による用途におけるそれらの使用は、一般的な薬剤学テクノロジー方法を用いて、慣用的なやり方で行なわれる。このために、本発明の化合物を適当な、製薬的に受容されるアジュバント及び／又はキャリヤーと共に加工して、種々な適応及び用途の種類に適した薬剤形にする。それによって、薬剤が、それぞれの所望の放出速度、例えば迅速なフラッジング（ｑｕｉｃｋ ｆｌｏｏｄｉｎｇ）及び／又は持続若しくはデポー効果が得られるようなやり方で、薬剤を製造することができる。
【００８２】
注射及び注入が属する非経口的使用のための製剤は、上記適応症のために最も重要な、全身的に用いられる薬剤に含まれる。
【００８３】
好ましくは、注射剤は、バイアルの形態で又はいわゆるすぐ使える注射製剤として、例えば、多数回取り出し（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌｓ）用の穿孔ボトル（ｐｅｒｆｏｒａｔｉｏｎ ｂｏｔｔｌｅｓ）の他に、すぐ使える注射器又は１回使用注射器として調製される。注射製剤の投与は、皮下（ｓ．ｃ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、節間（ｉｎｔｅｒｎｏｄａｌ）（ｉ．ｎ．）又は皮内（ｉ．ｃ．）適用の形態で行なわれる。それぞれの適当な注射剤形は特に、溶液、結晶懸濁液、ナノ粒子又はコロイド分散系、例えばヒドロゾルとして製造することができる。
【００８４】
注射可能な製剤は、水性等張性希釈剤によって本発明の化合物の所望の投与量に調節することができる濃縮物として、製造することもできる。その上、これらを例えば凍結乾燥物のような粉末として製造することもでき、この粉末を次に、好ましくは、適用直前に適当な希釈剤によって溶解する又は分散させることができる。注入剤（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）は、等張性溶液、脂肪エマルジョン、リポソーム製剤、ミクロエマルジョン、及び混合ミセルに基づく、例えばリン脂質に基づく液体の形態で製剤化することもできる。注射製剤と同様に、注入製剤は、希釈する濃縮物の形態で調製することもできる。注射可能な製剤は固定療法（ｉｎ ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｔｈｅｒａｐｙ）においても外来療法（ｏｕｔ−ｐａｔｉｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ）においても連続注入剤の形態で、例えばミニ−ポンプの形態で適用されることもできる。
【００８５】
例えば注射器又はパッケージング物質のような物質、例えばプラスチック又はガラスへの本発明の化合物の吸着を減ずる目的で、非経口用薬剤形にアルブミン、血漿増量剤、界面活性化合物、有機溶媒、ｐＨに影響する化合物、錯体形成化合物又はポリマー化合物を加えることができる。
【００８６】
本発明による化合物は非経口用製剤中のナノ粒子に、例えば、ポリ（メタ）アクリレート、ポリアセテート、ポリグリコレート、ポリアミノ酸又はポリエーテルウレタンに基づく、微細に分散した粒子に結合することができる。非経口製剤は、例えば、本発明の化合物が非常に微細に分配及び／又は分散された、懸濁した形態で又は結晶懸濁液として取り込まれる多重単位法（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｕｎｉｔ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）で、又は本発明による化合物が薬剤形中に、例えば錠剤若しくはシード中に封入されてから、その後にこれらの薬剤形が移植される単一単位法（ｓｉｎｇｌｅ ｕｎｉｔ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）で、デポー製剤として構造的に修飾されることができる。しばしば、これらの移植又はデポー薬剤は単一単位薬剤形及び多重単位薬剤形で、例えば、乳酸及びグリコール酸のポリエーテルウレタン、ポリエーテルウレタン、ポリアミノ酸、ポリ（メタ）アクリル酸又は多糖類のような、いわゆる生分解性ポリマーから構成される。
【００８７】
滅菌水、例えば有機及び無機の酸若しくは塩基並びにそれらの塩のような、ｐＨ値に影響する物質、ｐＨ値を設定するためのバッファー物質、例えば塩化ナトリウム、炭酸一ナトリウム（ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、グルコース及びフルクトースのような、等張化剤（ａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｉｓｏｔｏｎｉｃｉｔｙ）、例えばポリオキシエチレンソルビタンの部分的脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標））又は例えばポリオキシエチレンの脂肪酸エステル（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標））のような界面活性剤（ｔｅｎｓｉｄｅ）及び／又は界面活性物質及び乳化剤、例えば落花生油、大豆油及びひまし油のような脂肪油、例えばエチルオレエート、イソプロピルミリステートのような合成脂肪酸エステル及び中性油（Ｍｉｇｌｙｏｌ（登録商標））並びに例えばゼラチン、デキストラン、ポリビニルピロリドンのようなポリマーアジュバント、例えばプロピレングリコール、エタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、プロピレングリコールのような、溶解度を高める有機溶媒添加剤、又は例えばシトレート及び尿素のような錯体形成化合物、例えばヒドロキシプロピルベンゾエート及びヒドロキシメチルベンゾエート、ベンジルアルコールのような保存剤、例えば亜硫酸ナトリウムのような酸化防止剤、並びに例えばＥＤＴＡのような安定剤が、非経口用製剤の製造におけるアジュバント及びキャリヤーとして適当である。
【００８８】
懸濁液では、界面活性剤及びペプタイザーからの本発明の化合物の沈降を防止して、沈殿物が振とうされうることを保証するための増粘剤、又は例えばＥＤＴＡのような錯体形成剤の添加が続けて行なわれる。これはまた、種々なポリマー剤複合体（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ａｇｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）によって、例えばポリエチレングリコール、ポリスチロール、カルボキシメチルセルロース、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）又はポリエチレングリコール・ソルビタン脂肪酸エステルによって達成することもできる。本発明による化合物は、包接化合物の形態で、例えばシクロデキストリンによって、液体製剤中に組み入れることもできる。他のアジュバントとして、分散剤も適当である。凍結乾燥物の製造のためには、例えばマンニット、デキストラン、サッカロース、ヒトアルブミン、ラクトース、ＰＶＰ又は種々なゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ）のような、ビルダーも用いることができる。
【００８９】
重要な、他の全身適用形は、錠剤、硬質若しくは軟質ゼラチンカプセル剤、被覆錠剤、粉末、ペレット、マイクロカプセル剤、長円形の圧縮錠剤（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｖｅｓ）、顆粒、チュワブル錠、トローチ剤、ガム又はサッシェ（ｓａｃｈｅｔ）としての経口投与である。これらの固体経口投与形は持続作用及び／又はデポー系として調製することもできる。これらのうちには、本発明の１種類以上の微粉状（ｍｉｃｒｏｎｉｚｅｄ）化合物の一定量を有する薬剤、例えば脂肪、ワックス様及び／又はポリマー状化合物を用いることによる、マトリックスに基づく拡散及び浸食系、又はいわゆるレザバー系が存在する。遅延剤及び／又は制御放出のための作用剤として、例えば、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリ（メタ）アクリレート誘導体（例えば、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標））、ヒドロキシプロピルメチルセルロース・フタレートのような、フィルム又はマトリックス形成物質が有機溶液中並びに水性分散液の形態に適している。これに関連して、身体中の保留時間増加が身体の粘膜との密接な接着によって達成される、いわゆるバイオ接着製剤を挙げることもできる。バイオ接着ポリマーの例はＣａｒｂｏｍｅｒｓ（登録商標）のグループである。
【００９０】
舌下適用のためには、圧縮錠剤、例えば、本発明の化合物を緩慢に放出する、適当なサイズの長円形の非崩壊性錠剤が特に適している。胃腸管の種々な区分において本発明の化合物を目標放出するために、種々な場所で放出するペレットの混合物、例えば、胃液溶解性及び小腸溶解性及び／又は胃液耐性及び大腸溶解性ペレットの混合物を用いることができる。胃腸管の種々な区分で放出するという同じ目標を、コアを含む適当に製造された積層錠剤によっても着想することができる、この積層錠剤によると、作用剤の被覆が胃液中で迅速に放出され、小腸環境において作用剤のコアが緩慢に放出される。胃腸管の種々な区分における制御放出という目標は多層状錠剤によっても達成することができる。作用剤を示差的に放出するペレット混合物を硬質ゼラチンカプセルに充填することができる。
【００９１】
粘着防止剤及び滑沢剤及び分離剤、例えば火炎分散（ｆｌａｍｅ ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ）二酸化ケイ素のような分散剤、例えば種々なデンプン種類のような崩壊剤、ＰＶＣ，造粒剤又は遅延剤としてのセルロースエステル、例えば、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）、セルロース又はＣｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）に基づいたワックス様及び／又はポリマー状化合物が、さらなるアジュバントとして、例えば錠剤のような圧縮錠剤、又は硬質及び軟質ゼラチンカプセル剤並びに被覆錠剤及び顆粒の製造に用いられる。
【００９２】
酸化防止剤、例えばサッカロース、キシリット又はマンニットのような甘味剤、マスキングフレーバー（ｍａｓｋｉｎｇ ｆｌａｖｏｒｓ）、芳香剤（ａｒｏｍａｔｉｃｓ）、保存剤、着色剤、バッファー物質、例えば微結晶セルロース、デンプンとデンプン加水分解物（例えば、Ｃｅｌｕｔａｂ（登録商標））、ラクトース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン及びリン酸二カルシウムのような直接製錠剤（ｄｉｒｅｃｔ ｔａｂｌｅｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、滑沢剤、例えばラクトース又はデンプンのような充填剤、ラクトース、種々なデンプン、例えば小麦又はトウモロコシ及び／又は米デンプン、セルロース誘導体、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、又はシリカ、タルク粉末、ステアリン酸塩、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、シリコーン処理タルク（ｓｉｌｉｃｏｎｉｚｅｄ ｔａｌｃ）、ステアリン酸、アセチルアルコール及び水和脂肪（ｈｙｄｒａｔｅｄ ｆａｔｓ）としての結合剤が用いられる。
【００９３】
これに関連して、特に、例えばＧＩＴ（胃腸治療システム）又はＯＲＯＳ（経口浸透システム）のような、浸透原理（ｏｓｍｏｔｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ）に基づいて構築された経口治療システムも挙げるべきである。
【００９４】
起沸性錠剤又はタブ（これらの両方が、水中で迅速に溶解又は懸濁する、すぐ飲めるインスタント薬剤形である）も、経口投与可能な圧縮錠剤に含まれる。経口投与可能な形態には、溶液、例えば滴剤、ジュース及び懸濁液も含まれ、これらは上記方法に従って製造することができ、安定性を高めるための保存剤、より容易に服用するための任意の芳香剤、及び識別を容易にするための着色剤、並びに酸化防止剤及び／又はビタミン類、及び例えば砂糖若しくは人工甘味剤のような甘味料をさらに含有することができる。このことは、摂取前に水によって製剤化される濃厚ジュースにも該当する。本発明の化合物の１種類以上と組み合わせたイオン交換樹脂も、液体の摂取可能形の製造のために挙げることができる。
【００９５】
特別な放出形は、例えば、体液との接触後にガスを発生するので、胃液の表面に浮遊する、錠剤又はペレットに基づく、いわゆる浮遊薬剤形の調製にある。さらに、いわゆる電子制御放出系も、本発明の化合物の放出が個々の必要性に応じて選択的に調節されることができるように製剤化することができる。
【００９６】
全身投与形及びさらに任意の局所的に有効な薬剤形の他の群は、直腸適用可能な薬剤によって表される。これらには、座薬及び浣腸製剤が存在する。浣腸製剤は、この投与形を製造するために水性溶媒によって錠剤に基づいて調製することができる。直腸カプセル剤も、ゼラチン又は他のキャリヤーに基づいて利用可能にすることができる。
【００９７】
硬化脂、例えば、Ｗｉｔｅｐｓｏｌ（登録商標）、Ｍａｓｓａ  Ｅｓｔａｒｉｎｕｍ（登録商標）、Ｎｏｖａｔａ（登録商標）、やし脂（ｃｏｃｏｎｕｔ ｆａｔ）、グリセロール−ゼラチン塊、グリセロール−ソープ−ゲル及びポリエチレングリコールが座薬基剤として適する。
【００９８】
本発明の化合物を数週間まで全身放出する長期間適用のためには、好ましくはいわゆる生分解性ポリマーに基づいて製剤化される、圧縮インプラント（ｐｒｅｓｓｅｄ ｉｍｐｌａｎｔｓ）が適する。
【００９９】
全身作用薬剤の他の重要な群として、上記直腸形と同様に、肝臓循環系及び／又は肝臓代謝を迂回することによって、それ自体崩壊する経皮系も注目されるべきである。これらのプラスターは特に、適当なアジュバント及びキャリヤーのさまざまな層及び／又は混合物に基づいて長い又は短い時間にわたって制御されたやり方で本発明の化合物を放出することができる経皮系として調製することができる。例えば溶媒及び、例えばＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）に基づいた、ポリマー成分のような、適当なアジュバント及びキャリヤーとは別に、例えばオレイン酸、Ａｚｏｎｅ（登録商標）、アジピン酸誘導体、エタノール、尿素、プロピルグリコールのような、膜浸潤増強物質及び／又は透過促進剤が、浸透の改良及び／又は促進のためにこの種類の経皮系の製造に適している。
【０１００】
局部、局所又は部位投与薬剤としては、下記：膣又は生殖器適用可能なエマルジョン、クリーム、フォーム錠剤（ｆｏａｍ ｔａｂｌｅｔ）、デポー・インプラント、卵子又は経尿道投与器溶液（ｏｖｕｌａｒ ｏｒ ｔｒａｎｓｕｒｅｔｈｒａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｉｎｓｔａｌｌａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が特定の製剤として適している。眼適用のためには、高度滅菌眼軟膏、溶液及び／又は適剤又はクリーム及びエマルジョンが適している。
【０１０１】
同じやり方で、対応する耳鼻科用適剤、軟膏又はクリームを耳への適用のために設計することができる。上記適用の両方のために、例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌｓ（登録商標）又は例えばポリビニルピロリドン及びセルロース誘導体のようなポリマー化合物に基づくゲルのような、半固体製剤の投与も可能である。
【０１０２】
皮膚又はさらに粘膜への慣習的な投与のためには、通常のエマルジョン、ゲル、軟膏、クリーム又は混合相及び／又は両親媒性エマルジョン系（油／水−水／油混合相）並びにリポソーム及びトランスファーソームを挙げることができる。適当なファンデーション（ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）を製造するためのゲルビルダーとしてのアルギン酸ナトリウム又はセルロース誘導体、例えばグアール若しくはキサンタンガム、無機ゲルビルダー、例えば水酸化アルミニウム又はベントナイト（いわゆるチキソトロープ・ゲルビルダー）、ポリアクリル酸誘導体、例えばＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）、ポリビニルピロリドン、微結晶セルロース又はカルボキシメチルセルロースが、アジュバント及び／又はキャリヤーとして適当である。さらに、両親媒性の低分子量及び高分子量化合物並びにリン脂質が適している。該ゲルは、水に基づくヒドロゲルとして又は、例えば、低分子及び高分子パラフィン炭化水素とワセリンとの混合物に基づく疎水性オルガノゲルとして存在しうる。
【０１０３】
アニオン、カチオン又は中性界面活性剤を、例えば、アルカリ化ソープ、メチルソープ、アミンソープ、スルフォン化化合物、カチオンソープ、高級脂肪アルコール、ソルビタン及びポリオキシエチレンソルビタンの部分的脂肪酸エステル、例えば、ラネッテタイプ（ｌａｎｅｔｔｅ ｔｙｐｅ）、羊毛脂、ラノリン又は他の合成製品の油／水及び／又は水／油エマルジョンの製造のために、乳化剤として用いることができる。
【０１０４】
親水性オルガノゲルは、例えば、高分子ポリエチレングリコールに基づいて製剤化することができる。これらのゲル様形はウォッシャブル（ｗａｓｈａｂｌｅ）である。ワセリン、天然又は合成ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、例えばモノ−、ジ−又はトリグリセリド、パラフィン油又は植物油、硬化ひまし油又はやし油、豚脂、例えばアクリル酸、カプリン酸、ラウリン酸及びステアリン酸に基づいた合成脂、例えばＳｏｆｔｉｓａｎ（登録商標）又はトリグリセリド混合物、例えばＭｉｇｌｙｏｌ（登録商標）を、軟膏、クリーム又はエマルジョンの製造のための脂肪及び／又は油及び／又はワックス様成分の形態の脂質として用いられる。
【０１０５】
浸透的に有効な酸及び塩基、例えば、塩酸、クエン酸、水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶液、炭酸一ナトリウム、他のバッファー系、例えば、クエン酸塩、リン酸塩、Ｔｒｉｓ−バッファー又はトリエタノールアミンが、ｐＨ値を調節するために用いられる。
【０１０６】
例えばメチル−若しくはプロピルベンゾエート（パラベン）又はソルビン酸のような保存剤を、安定性を高めるために、加えることができる。
【０１０７】
他の局所適用可能な形として、ペースト、粉末又は溶液を挙げることができる。ペーストはしばしば、非常に多量の脂肪質（ｆａｔｔｙ ｍａｔｔｅｒ）を有する親油性及び親水性補助剤をコンシステンシーを与える基剤として含有する。
【０１０８】
粉末又は局所適用可能な粉末は、例えば、小麦又は米デンプンのようなデンプン種類、火炎分散二酸化ケイ素又はシリカを含有することができ、これらはまた流動性及び潤滑性を高めるため、並びに凝集を防止するための希釈剤としても役立つ。
【０１０９】
点鼻剤又は鼻スプレーは、鼻適用可能形として役立つ。これに関連して、ネブライザー又はノーズクリーム（ｎｏｓｅ ｃｒｅａｍ）若しくは軟膏を用いることができる。
【０１１０】
さらに、鼻スプレー又は乾燥粉末製剤並びに制御投与量エアロゾルも、本発明の化合物の全身投与に適している。
【０１１１】
これらの加圧及び／又は制御投与エアロゾル及び乾燥粉末製剤は、吸入する及び／又は吹き入れる（ｉｎｓｕｆｆｉｌａｔｅ）ことができる。この種類の投与形は肺又は気管支及び喉頭への直接、部位投与のために確かに重要性を有する。したがって、該乾燥粉末組成物を本発明の化合物−軟質ペレットとして、例えばラクトース及び／又はグルコースのような、適当なキャリヤーとの本発明の化合物−ペレット混合物として、製剤化することができる。吸入又は吹き入れのために、鼻、口腔及び／又は喉頭の治療のために適した、一般的なアプリケーターが適当である。本発明の化合物は超音波噴霧吸入器（ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｎｅｂｕｌｉｚｉｎｇ ｄｅｖｉｃｅ）を用いても適用可能である。エアロゾル・スプレー製剤及び／又は制御投与エアロゾルのための噴射剤ガスとして、テトラフルオロエタン又はＨＦＣ１３４ａ及び／又はヘプタフルオロプロパン又はＨＦＣ２２７が適しているが、常圧及び室温において気体である、非フッ素化炭化水素又は他の噴射剤、例えばプロパン、ブタン又はジメチルエーテルが好まれうる。制御投与エアロゾルの代わりに、噴射剤を含まない、手動ポンプ系も使用可能である。
【０１１２】
噴射剤ガスエアロゾルはさらに、適当に、界面活性アジュバント、例えばイソプロピルミリステート、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタントリオレエート、レシチン又は大豆レシチンを含有することもできる。
【０１１３】
さらに、本発明の薬剤組成物が、ある種の動物への投与のために本発明の核酸を含む場合に、本発明の該核酸はその種に由来することが好ましい。例えば、本発明の薬剤組成物がヒトに投与される予定である場合には、該薬剤の該核酸はＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバー又はその誘導体のコード領域を含むことが好ましい。
【０１１４】
本発明の核酸は、核酸の細胞膜透過性及び／又は細胞取り込みを高める作用剤と共に投与することができる。これらの作用剤の例は、例えばＡｎｔｏｎｙ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：１０７７５−１０７８４に記載されているようなポリアミン；例えばＥｓｃｒｉｏｕ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３６８（２）：２７６−２８８に記載されているような分枝鎖ポリアミン；例えばＧｕｙ−Ｃａｆｆｅｙ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（５２）：３１３９１−３１３９６に記載されているようなポリアミノ脂質；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８４（２１）：７４１３−７４１７に記載されているようなＤＯＴＭＡ；及び例えばＢｅｎｉｍｅｔｓｋａｙａ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）ＮＡＲ２６（２３）：５３１０−５３１７に記載されているようなカチオン・ポルフィリンである。
【０１１５】
本発明による核酸分子、又は本発明によるタンパク質をコードする核酸をベクター中に挿入することができる。“ベクター”なる用語は、ポリヌクレオチドの挿入又は組み込みによって操作されうる、当該技術分野において知られたプラスミド、ウイルス又は他のビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）を意味する。このようなベクターは遺伝子操作のために用いることができる（即ち、“クローニングベクター”）、又は挿入されたポリヌクレオチドを転写若しくは翻訳するために用いることができる（“発現ベクター”）。ベクターは一般に、細胞内での増殖のために少なくとも１つの複製起源と、プロモーターを含有する。発現ベクター中に存在する、本明細書に記載した発現制御エレメントを含めた制御エレメントが、適当な転写及び翻訳を促進するために包含される（例えば、イントロンのスプライシング・シグナル、ｍＲＮＡのインフレーム翻訳（ｉｎ−ｆｌａｍｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）を可能にする遺伝子の正確なリーディングフレームの維持、及び終止コドン等）。“制御エレメント”なる用語は、その存在が発現に影響を与えうる、少なくとも１つ以上の成分を包含するように意図され、さらに、付加的な成分、例えばリーダー配列及び融合パートナー配列を包含することができる。
【０１１６】
本明細書で用いる限り、“発現制御エレメント”なる用語は、それが作用的に結合する核酸配列の発現を調節する１つ以上の核酸配列を意味する。核酸配列に作用的に結合した発現制御エレメントは転写を制御し、必要に応じて、該核酸配列の翻訳を制御する。したがって、発現制御エレメントは、必要に応じて、プロモーター、エンハンサー、転写終結因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ）、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン（例えば、ＡＴＧ）を包含することができる。“作用的に結合した”とは、上述した成分が、それらの予定された形式でそれらが機能することを可能にする関係にある、並置（ｊｕｘｔａｐｏｓｉｔｉｏｎ）を意味する。
【０１１７】
“プロモーター”とは、転写を導くために充分な最小配列を意味する。構成及び誘導の両方のプロモーターが本発明に包含される（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５３：５１６−５４４，１９８７を参照のこと）。誘導プロモーターは外部シグナル又は作用剤によって活性化される。プロモーター依存性遺伝子発現を、特定の細胞種類、組織又は生理的条件に関して制御可能にするために充分であるようなプロモーター要素も本発明に包含される；このような要素は遺伝子の５’、３’又はイントロン領域に位置することができる。本発明に有用なプロモーターはさらに条件プロモーターを包含する。“条件プロモーター”は、ある一定の条件下でのみ活性であるプロモーターである。例えば、このプロモーターは、例えば化学化合物のような特定の作用剤が存在するときに不活性になるか又は抑制される可能性がある。該作用剤がもはや存在しなくなると、転写が活性化されるか、又は抑制解除される。
【０１１８】
したがって、細菌系におけるクローニング時には、例えばＴ７等のような構成プロモーター並びに例えばバクテリオファージＸのｐ１、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）のような誘導プロモーターが用いることができる。哺乳類細胞系でのクローニング時には、例えばＳＶ４０、ＲＳＶ、ＣＭＶ（ＣＭＶ−ＩＥを包含）等のような構成プロモーター又は哺乳類細胞のゲノムに由来する誘導プロモーター（例えばメタロチオネイン・プロモーター）又は哺乳類ウイルスに由来する誘導プロモーター（例えば、マウス乳癌ウイルス長い末端反復配列（ＬＴＲ）；アデノウイルス後期プロモーター）を用いることができる。組換えＤＮＡ又は合成手法によって作製されるプロモーターも、本発明の核酸配列の転写を生じるために用いることができる。
【０１１９】
組換えウイルス又はウイルスエレメントを用いて、発現を導く哺乳類発現系を工作することができる（ｍａｙ ｂｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）。例えば、アデノウイルス発現ベクターを用いる場合には、問題の核酸をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーター及び３部構成リーダー配列（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）にライゲートすることができる。或いは、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーターを用いることができる。
【０１２０】
特に興味深いのは、染色体外エレメントとして、複製の可能性を有するウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）に基づくベクターである。染色体外ベクターがマウス細胞に侵入した直後に、該ベクターは複製して、約１００〜２００コピー／細胞になる。挿入されたｃＤＮＡの転写は宿主染色体中へのプラスミドの組み込みを必要としないので、高レベルの発現が生じる。例えばｎｅｏ遺伝子のような、プラスミドの選択マーカーを含めることによって、安定な発現のために、これらのベクターを用いることができる。或いは、宿主細胞における問題の核酸の発現を導入し、導くことができるベクターとして用いるために、レトロウイルス・ゲノムを修飾することができる。非限定的にメタロチオネインＲＡプロモーター及び熱ショックプロモーターを含めた、誘導プロモーターを用いて、高レベルの発現を達成することもできる。
【０１２１】
酵母では、構成プロモーター及び誘導プロモーターを含有する、多くのベクターを用いることができる。例えばＡＤＨ若しくはＬＥＵ２のような構成酵母プロモーター、又は例えばＧＡＬのような誘導プロモーターを用いることができる。或いは、例えば相同的組換えを介して、酵母染色体中への異種核酸配列の組み込みを促進するベクターが、当該技術分野において知られており、これを用いることができる。
【０１２２】
本発明による問題の核酸を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現のために発現ベクター中に挿入する（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳アッセイ又は商業的に入手可能なキットを用いて）ことができるか、又は原核細胞若しくは真核細胞（例えば、昆虫細胞）のいずれかにおける転写及び／又は翻訳を促進するプロモーター配列を含有する発現ベクター中に、適当な細胞中への適当な核酸の転移によって挿入することができる。ベクターを増殖させ、その核酸を転写させ、コードされたポリペプチドを発現することができる細胞を、本明細書では“宿主細胞”と呼ぶ。この用語は、対象宿主細胞の任意の子孫をも包含する。さらに、本発明による問題の核酸を、例えば体細胞遺伝子療法（ｓｏｍａｔｉｃ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）のｉｎ  ｖｉｖｏ発現のために発現ベクター中に挿入することができる。これらのベクター、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）ベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、プラスミド発現ベクターによって、本発明の核酸が、ＤＣ中へ該ベクターが感染／導入されると、発現される。
【０１２３】
宿主細胞は、非限定的に、例えば細菌のような微生物、酵母、昆虫及び哺乳類生物を包含する。例えば、問題の核酸を含有する、組換えバクテリオファージ核酸、プラスミド核酸若しくはコスミド核酸発現ベクターで形質転換された細菌；問題の核酸を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；問題の核酸を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワー・モザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコ・モザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染された、又は問題の核酸を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；問題の核酸を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；又は、問題の核酸を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）で感染された動物細胞系；或いは、安定な発現のために工作された形質転換動物細胞系。
【０１２４】
宿主細胞における本発明のポリペプチドの長期間発現のために、安定な発現が好ましい。したがって、例えば、ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを用いて、適当な制御エレメント（例えば、プロモーター／エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）によって制御される問題の核酸で、細胞を形質転換することができる。任意に、発現ベクターはさらに、選択可能な又は確認可能なマーカーをコードする核酸を含有することができる、該マーカーは選択的圧力に対する耐性を与えて、それによって細胞が該ベクターを確認して、成長させ、増殖させることを可能にする。或いは、選択可能なベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含有する第１ベクターと共に宿主細胞中に同時トランスフェクトされる第２ベクター上に存在することができる。
【０１２５】
非限定的に、単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ遺伝子、ハイポキサンチン−グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を包含する、多くの選択系を用いることができ、アデニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子をｔｋ−，ｈｇｐｒｔ又はａｐｒｔ細胞にそれぞれ用いることができる。さらに、代謝拮抗物質耐性を、メトトレキセートに対する耐性を与えるｄｈｆｒの選択の基礎として、ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ遺伝子の選択の基礎として、アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与えるネオマイシン遺伝子の選択の基礎として、そして、ヒグロマイシンに対する耐性を与えるヒグロマイシン遺伝子の選択の基礎として用いることができる。更なる選択可能な遺伝子、即ち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを用いることを可能にするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを用いることを可能にするｈｉｓＤ；そして、オルニチン（ｏｍｉｔｈｉｎｅ）カルボキシラーゼ阻害剤、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン（ｏｎｉｔｈｉｎｅ）、ＤＦＭＯに対する耐性を与えるＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）が今までに記載されている。
【０１２６】
本明細書で用いる限り、“形質転換”なる用語は、細胞に対して外因性のＤＮＡの組み込み後の該細胞における遺伝的変化（ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｈａｎｇｅ）を意味する。したがって、“形質転換細胞”とは、細胞（又はその子孫）中にＤＮＡ分子が組換えＤＮＡ手法によって導入されている細胞である。
【０１２７】
ＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者に知られた慣用的手法で行なうことができる。例えば、宿主細胞が真核細胞である場合には、ＤＮＡ形質転換方法は、例えば、リン酸カルシウム共沈、例えばミクロインジェクション（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、エレクトロポレーションのような慣用的な機械的手段、リポソーム中に入れられたプラスミドの挿入、及びウイルスベクターを包含する。さらに、真核細胞を、問題の核酸をコードするＤＮＡ配列と、例えば本明細書に記載するような、選択可能な表現型をコードする第２異種ＤＮＡ分子とによって、同時形質転換することもできる。他の方法は、例えばシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）又はウシパピローマウイルスのような真核細胞ウイルスベクターを用いて、真核細胞を一過性に感染又は形質転換させて、該タンパク質を発現させることである。
【０１２８】
本発明の化合物がＲＮＡ分子である場合には、前記ＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターによって、該ヌクレオチド配列の転写を可能にする配列を制御しながら、対象の細胞を形質転換することによって該細胞に前記ＲＮＡ分子をデリバリーすることができる。
【０１２９】
したがって、本発明は、ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合を特異的に遮断して、細胞におけるＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーの発現を減じる、本発明によるＲＮＡをコードする核酸配列を含む発現ベクターに関する。
【０１３０】
ＲＮＡ分子が細胞中でポリペプチド又はタンパク質に翻訳されないように、該発現ベクターを構築することが好ましい。
【０１３１】
その上、本発明は、上記発現ベクターによって形質転換された宿主細胞に関する。
【０１３２】
本発明はまた、ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合を特異的に遮断して、細胞におけるＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーの発現を減じる、本発明による核酸をコードする発現ベクターの、ＤＣの直接又は間接関与する障害、疾患及び症候群の、免疫応答の制御による治療及び予防のための薬剤の製造への使用に関する。
【０１３３】
さらに、本発明は、樹状細胞の直接又は間接関与する障害、疾患及び症候群の、免疫応答の調節による治療又は予防方法であって、ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合を特異的に遮断して、細胞におけるＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーの発現を減じる、本発明による核酸をコードする発現ベクターの有効量を対象に投与する上記方法に関する。
【０１３４】
本発明の化合物がタンパク質である場合には、前記タンパク質分子は、前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターによって、該ヌクレオチド配列の転写を可能にする配列を制御しながら、対象の細胞を形質転換することによって該細胞に前記タンパク質分子をデリバリーすることができる。
【０１３５】
したがって、本発明は、ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合を特異的に遮断して、細胞におけるＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーの発現を減じる、ＥＬＡＶタンパク質スーパーファミリーのメンバーの誘導体又はＨｕＲに対するリガンドの誘導体をコードする核酸配列を含む発現ベクターに関する。
【０１３６】
その上、本発明は、上記発現ベクターによって形質転換された宿主細胞に関する。
【０１３７】
本発明はまた、ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合を特異的に遮断して、細胞におけるＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーの発現を減じる、ＥＬＡＶタンパク質スーパーファミリーのメンバーの誘導体又はＨｕＲに対するリガンドの誘導体をコードする発現ベクターの、上記医学的適応症のいずれかを治療するための薬剤の製造への使用に関する。
【０１３８】
さらに、本発明は、樹状細胞の直接又は間接関与する障害、疾患及び症候群の、免疫応答の調節による治療又は予防方法であって、ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合を特異的に遮断して、細胞におけるＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーの発現を減じる、ＥＬＡＶタンパク質スーパーファミリーのメンバーの誘導体又はＨｕＲに対するリガンドをコードする発現ベクターの有効量を、対象に投与する上記方法に関する。
【０１３９】
本発明はまた、ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合を遮断する化合物をスクリーニング及び／又は同定する方法であって、（ａ）ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバー又はその誘導体のコード領域の少なくとも一部を含有する核酸分子、及び（ｂ）ＥＬＡＶタンパク質スーパーファミリーのメンバー又はその誘導体を含む反応において、該成分を相互作用させるために充分な条件下で１種類以上の化合物をインキュベートする工程と、該化合物が核酸分子と、ＥＬＡＶタンパク質スーパーファミリーのメンバーとの間の結合を遮断するかどうかを判定する工程とを含む上記方法に関する。
【０１４０】
本明細書で用いる限り、“インキュベートする（ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ）”なる用語は、上記（ａ）及び（ｂ）と、試験化合物との間の接触、結合又は相互作用を可能にする状態を意味する。“接触する（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）”なる用語は、溶液中、固相中及び細胞中を包含する。
【０１４１】
この方法に用いられる、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバー又はその誘導体のコード領域の少なくとも一部を含有する核酸分子と、ＥＬＡＶタンパク質スーパーファミリーのメンバー又はその誘導体との両方は、上記のように定義される。
【０１４２】
ある特定の化合物は、この化合物がＣＤ８３ｍＲＮＡのステム−ループ構造に対する高アフィニティ及び特異的結合を遮断するときに、該核酸分子と、ＥＬＡＶタンパク質スーパーファミリーのメンバーとの間の結合を遮断すると見なされることができる。
【０１４３】
ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合を遮断する化合物は、試験化合物の存在下及び不存在下でのＣＤ８３タンパク質ファミリーからのタンパク質の活性、又はＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーの発現を測定することによって同定される。ＣＤ８３タンパク質ファミリーからのタンパク質の活性、又はＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーの発現は、細胞を含まない系を用いて、細胞中で及び丸ごとの生物において測定することができる。例えば、実施例に記載するような電気泳動移動度シフト・アッセイ（ＥＭＳＡ）を用いて、ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合を遮断する化合物を同定することができる。細胞では、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡを発現する細胞を試験化合物で処理して、次に、前記細胞の表現型をＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーの機能的発現に関して検査することによって、ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合を遮断する化合物を同定することができる。
【０１４４】
ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合を遮断する化合物は、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバー又はその誘導体のコード領域の一部に結合したレポーター遺伝子配列を含むｍＲＮＡの発現を検出すること（即ち、実施例に記載するような機能的分析（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ））によって、同定することができる。レポーターは、ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合度に対応する検出シグナル（例えば、レポーター遺伝子によって産生される転写体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）又はタンパク質産物の量）を与える。レポーター遺伝子によって与えられる検出シグナルが試験化合物の不存在下でのシグナルに比べて減少するならば、該化合物は、ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合を“遮断する”。該シグナルが試験化合物の不存在下でのシグナルに比べて減少するならば、該化合物は、ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合を“阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）”。
【０１４５】
レポーター遺伝子によって与えられるシグナルは、例えば、ＲＮＡ、タンパク質、酵素活性等でありうる。したがって、該シグナルは、ノーザン分析、ＲＮＡドットブロット、ＥＬＩＳＡ又はＲＩＡ、ウェスターンブロット、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを単独で、又はレポーター遺伝子産物を免疫沈降させる抗体と組み合わせて包含する、当該技術分野に知られた多様な方法によって検出することができる。酵素活性又は検出シグナルを与える発現産物が好ましく、このような発現産物は、例えば、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、グリーン蛍光タンパク質及びクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼを包含する。これらの方法に用いるために考えられる細胞は、本明細書に記載する細胞、例えば、昆虫細胞、哺乳類細胞（例えば、ＣＶ−１、ＣＯＳ、ＨｅＬａ及びＬ−細胞）及び酵母細胞を包含する。
【０１４６】
ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合に影響を及ぼすことができる試験化合物は、非限定的に、核酸、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメチック（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、これらの誘導体、これらの構造類似体、又はこれらの組み合わせを含めた、バイオ分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）に見出される。試験化合物はさらに、化学化合物（例えば、ホルモンのような、５０ダルトンより大きく、５，０００ダルトン未満の分子量を有する小有機分子）を包含する。候補の有機化合物は、タンパク質又は核酸との構造相互作用、特に水素結合のために必要な官能基を含み、典型的に、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル又はカルボキシル基、好ましくは該官能化学基の少なくとも２つを包含する。候補有機化合物はしばしば、上記官能基の１つ以上によって置換される、環状炭素構造又は複素環構造及び／又は芳香族若しくはポリ芳香族構造を含む。既知の薬理学的化合物は、例えばアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等のような、指定された又はランダムな化学修飾をさらに受けて、構造類似体を製造することができる候補である。
【０１４７】
試験化合物をさらにライブラリーに含めることができ、例えば、合成又は天然化合物をコンビナトリアル・ライブラリーに含めることができる。多くのライブラリーが商業的に入手可能であるか、又は容易に製造することができる；ランダムに選ばれた（ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ）オリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現を含めた、多様な有機化合物及びバイオ分子のランダムな及び指定された合成のための手段も知られている。或いは、細菌、真菌、植物及び動物の抽出物の形態での天然化合物のライブラリーが入手可能であるか、又は容易に製造することができる。さらに、天然の又は合成的に製造されたライブラリー及び化合物を慣用的な化学的、物理的及び生化学的手段によって容易に修飾して、コンビナトリアル・ライブラリーの製造に用いることができる。このようなライブラリーは、非常に多数の異なる化合物のスクリーニングのために有用である。
【０１４８】
多様な、他の化合物をスクリーニング方法に含めることができる。これらは、塩、中性タンパク質、例えばアルブミン、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）等のような作用剤を包含し、最適のタンパク質−タンパク質、タンパク質−核酸、若しくは核酸−核酸結合若しくは相互作用を促進する、及び／又は非特異的若しくはバックグラウンド結合若しくは相互作用を減ずるために用いられる。例えば、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤等のような、アッセイの効率を改良する試薬を用いることができる。必要なモジュレーションを与える、成分の混合物を任意の順序で加える。さらに、このような試験化合物を、それらの同定又は精製を容易にするように、さらに修飾することができる。このような修飾は、当業者に周知である（例えば、ビオチン及びストレプトアビジン・コンジュゲーテッド化合物（ｂｉｏｔｉｎ ａｎｄ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ））。
【０１４９】
インキュベーションを任意の適当な温度で、典型的には４〜４０℃の温度で行なう。インキュベーション時間を最適な活性のために選択するが、迅速な高スループットのスクリーニングを促進するために選択することもできる。典型的に、０．１〜７２時間のインキュベーション時間が充分である。
【０１５０】
本発明の好ましい実施態様では、ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの結合を遮断する化合物をスクリーニング及び／又は同定する方法は、ＲＮＡゲルシフトアッセイ、フィルター結合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ相互作用分析（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、シンチレーション・プロキシミティ・アッセイ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＲＮＡｓｅ・プロテクション・アッセイ、細胞に基づくＲＮＡ結合アッセイ（Ｂｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）ＲＮＡ  ４：２１５−２２５）、酵母３−ハイブリッドアッセイ（例えば、ＲＮＡ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｈｕｎｔｅｒ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））、及び上述したような、真核細胞におけるレポーター遺伝子アッセイの形態で行なうことができる。
【０１５１】
以下では、本発明の種々な態様を、実施例によって、さらに詳しく説明する。しかし、本発明を実施例に限定されるものとして見なすべきではない。
【０１５２】
発明の詳細な説明
実施例１
ＲＮＡ移動度シフト実験は、ＲＮＡ−タンパク質相互作用を特徴付けるために非常に敏感な方法である。このために、検査すべきＲＮＡを増幅して、線状ＤＮＡ鋳型からのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を用いて放射能標識することができる。標識は一般に［α−３２Ｐ］−ＵＴＰによって行なわれる。ＲＮＡの正確なフォールディングを確実にするために、これを水浴中で８０℃に加熱して、室温に冷却する。この方法で得られたＲＮＡを次に所望のタンパク質と共にインキュベートして、その後に、ネイティブポリアクリルアミドゲル上で、即ち、非変性条件（ｎｏｎ−ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）下で分析する。
【０１５３】
ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡがＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーに特異的に結合するかどうかを試験するために、ベクター、配列番号：１のヌクレオチド１〜６１８が商業的に入手可能なベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位中に、ファージＴ７プロモーターの制御下で挿入されているｐｃＤＮＡ３−ＣＤ８３を構築した（図１）。
【０１５４】
ＲＮＡ移動度シフト実験のために放射能標識ＲＮＡを得るために、このベクター約２０μｇをＥｃｏＲＩによって線状化して、０．８％アガロースゲル上で精製した。ゲルから溶離した後に、該鋳型をフェノールによって抽出して、エタノール沈降させた。得られたＤＮＡをヌクレアーゼを含まない水２０μｌ中に１．０μｇ／ｍｌの濃度で再懸濁させた。Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造者の指示に従って用いて、［α−３２Ｐ］−ＵＴＰによって放射能標識されたＲＮＡを作製した。転写生成物を、変性ＲＮＡアガロースゲル（１．２％）上でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応の１μｌを分離して、このゲルをニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に８時間ブロットして、このニトロセルロースフィルターをＲＮＡサイズ基準を用いて写真フィルムによって検査することによって、サイズ及び純度に関して制御した（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ）。
【０１５５】
組換えＧＳＴ−ＥＬＡＶ（ＨｕＲ）融合タンパク質（ＧＳＴ：グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）をコードするプラスミドｐＧＥＸ５Ｘ−１−ＧＳＴ−ＥＬＡＶを、配列番号：５のヌクレオチド１〜９８１を商業的に入手可能なプラスミドｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ部位にクローニングすることによって構築した（図２）。
【０１５６】
組換えＧＳＴ−ＥＬＡＶ（ＨｕＲ）融合タンパク質を、プラスミドｐＧＥＸ５Ｘ−１−ＧＳＴ−ＥＬＡＶで形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から該タンパク質を単離することによって得た。単離の前日に、該細菌を５０ｍｌ前培養（ｐｒｅ−ｃｕｌｔｕｒｅ）で増殖させた。次の日に、この前培養をＬＢ培地で１：１０に希釈して、約０．５〜０．６のＯＤ６００になるまでインキュベートした。ＩＰＴＧの添加（最終濃度１ｍＭ）によって、融合タンパク質の誘導が生じた。４時間後に、該培養を氷上で冷却して、次に、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＧＳＡローターにおいて４℃、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ペレットを次に、ＰＢＳ５０ｍｌ、ＰＭＳＦ１００μｌ、ロイペプチン５０μｌ、ペプスタチン５０μｌ、アプロテイン５０μｌ及びＤＮＡｓｅＩ５０μｌを含むバッファー１０ｍｌ中に懸濁させた。１Ｍ  ＭｎＣｌ２２６μｌ、１Ｍ  ＭｇＣｌ２２６０μｌ及びリソザイム  スパチュラ先端を添加した後、該懸濁液を短時間混合して、氷上に１５分間放置した。次に、これを１０秒間３回音波処理し（２インパルス／秒／最大出力）、０．５Ｍ  ＮａＣｌの最終塩化ナトリウム濃度に調節した。細胞を完全に溶菌するため、Ｔｒｉｔｏｎ  ＴＸ−１００を１％の濃度にまで加え、該懸濁液を氷上に１０分間維持した。最後に、細胞残渣をＳｏｒｖａｌｌ  ｓｓ３４ローターにおいて４℃、１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。
【０１５７】
グルタチオン−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）７５０μｌをＰＢＳ１０ｍｌで３回洗浄した。該細菌細胞抽出の上清と該グルタチオン−セファロースとを混合し、冷蔵庫中に置かれた回転シェーカー上で１時間インキュベートした。該グルタチオン−セファロースと細胞抽出物との混合物をＢｉｏ−Ｐｒｅｐカラム（ＢｉｏＲａｄ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に載せ、それぞれ、ＰＢＳ１５ｍｌ及びＴｒｉｔｏｎ  ＴＸ−１００（２０％ストック溶液）１ｍｌから成るバッファー５ｍｌによって３回と、それぞれ、ＰＢＳ１５ｍｌ及びＰＭＳＦ５０μｌから成るバッファーによって３回洗浄した。該グルタチオン−セファロースからのＧＳＴ−ＨｕＲ融合タンパク質の溶離は、それぞれ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び１５ｍＭグルタチオンを含むバッファー１ｍｌによる５回の溶出工程で行なわれた。この溶離バッファー１ｍｌをカラムに加えて、カラムを密閉して、次に、回転プラットフォーム上で１０分間インキュベートした。次に、タンパク質溶液を一緒にして、１２時間ＰＢＳに対して透析した。
【０１５８】
次に、放射能標識ＣＤ８３ＲＮＡと、上述したようなＧＳＴ−ＥＬＡＶ（ＨｕＲ）融合タンパク質とを用いて、ＲＮＡ移動度シフト実験を行なった。約１５０〜２００ｎｇ／ｍｌの放射能標識ＣＤ８３ＲＮＡ１μｌ及びＧＳＴ−ＥＬＡＶ（ＨｕＲ）（タンパク質濃度：０．３ｍｇ／ｍｌ）１μｌを反応につき用いた。或いは、ＥＬＡＶ配列を含まないＧＳＴタンパク質を対照として用いた。該放射能標識ＣＤ８３ＲＮＡを水浴中で８０℃に加熱し、反応の直前に室温に冷却した。ＧＳＴ−ＥＬＡＶ（ＨｕＲ）融合タンパク質（又はベクターｐＧＥＸ−５Ｘ−１から直接発現されたＧＳＴ対照タンパク質）を、放射能標識ＣＤ８３ＲＮＡ１μｌ、Ｒｎａｓｉｎ（登録商標）ＲＮＡｓｅ阻害剤（ＰＢＳで５：１に希釈）１μｌ、１０ｘＰＢＳ１μｌ及びＭＳ２ＲＮＡ６μｌ又は５ｓＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（０．８μｇ／μｌ）６μｌから成る結合混合物と細心に混合して、室温において３０分間インキュベートした。負荷（ｌｏａｄｉｎｇ）を容易にし、ｐＨ８．３のＴＢＥランニングバッファーによる４％又は６％ネイティブポリアクリルアミドゲル上で生じる、ＧＳＴ−ＥＬＡＶ（ＨｕＲ）融合タンパク質とＣＤ８３ＲＮＡとの間の結合の分析を助成するために、５０％グリセリン３μｌを各反応に加えた。
【０１５９】
図３から見ることができるように、ＧＳＴ−ＥＬＡＶ（ＨｕＲ）タンパク質はＣＤ８３ＲＮＡをゲル中でより高い位置にシフトさせたが、ＣＤ８３ＲＮＡとＧＳＴタンパク質対照とを含む反応ではシフトは生じなかった。
【０１６０】
実施例２
実施例１に記載したようなＲＮＡ移動度シフトを、ＨｕＲとＣＤ８３ｍＲＮＡとの間の相互作用の特異性に関する対照として、上述したようなＧＳＴタンパク質、ＧＳＴ−Ｌ５融合タンパク質（Ｓｃｈａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ９５：１６０７−１６１２）、及び異種核リボヌクレオタンパク質ｈｎＲＮＰ  Ａ１（Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｖ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｅｌｌ  ８６：９８５−９９４）のＭ９ドメインを含むＧＳＴ−Ｍ９融合タンパク質を用いて行なった。
【０１６１】
図４に見ることができるように、ＣＤ８３ＲＮＡの移動度のシフトは、ＨｕＲ配列を含むタンパク質によってのみ観察される。
【０１６２】
実施例３
ＲＮＡ移動度シフト実験で実証された核酸−タンパク質相互作用の特異性を試験するための標準方法は、タンパク質への放射能標識ＲＮＡの結合を非標識ＲＮＡと競合させることである。このために、上述したような結合混合物を、非放射性ＣＤ８３ＲＮＡの量を高めて製造して、ＲＮＡ移動度シフト実験を上述したとおりに行なった、但し、結合混合物を各タンパク質と共に１５分間インキュベートし、次に、同量の放射能標識ＣＤ８３ＲＮＡ（１μｌ）を続けて各反応に加えて、インキュベーションをさらに１５分間続けた。
【０１６３】
この実験の結果を図５に示す。非標識ＣＤ８３ＲＮＡが遊離ＧＳＴ−ＥＬＡＶ（ＨｕＲ）タンパク質を滴定することができることが、実証された。
【０１６４】
実施例４
ＨｕＲのＣＤ８３ｍＲＮＡに対する結合が特異的であることが確認されたので、ＨｕＲが結合する、ＣＤ８３ｍＲＮＡの領域を決定し、正確に説明するために、幾つかの実験を行なった。
【０１６５】
ＨｕＲが結合する、ＣＤ８３ｍＲＮＡの領域を正確に説明するために、ＣＤ８３のコード領域又はＣＤ８３コード配列のサブフラグメントを、ファージＴ７プロモーターの制御下で、ベクターｐｃＤＮＡ３の多重クローニング部位中のＨｉｎｄＩＩＩ及び／又はＥｃｏＲＩ制限部位にクローン化した。これらのサブフラグメントは、上述したとおりの標準ＰＣＲ反応及び下記プロモーターを用いて、作製した：
【０１６６】
【化１】
2004516024.tif 000002
【０１６７】
【化２】
2004516024.tif 000003
【０１６８】
カバー加熱による熱安定性加熱ブロック（Ｇｅｎｉｕｓ  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ，Ｔｅｃｈｎｅ，ＮＪ，ＵＳＡ）において、ＰＣＲを行なった。増幅は４５サイクルで生じ、この場合、プログラムされたサイクルは次のとおりであった：第１サイクルは、９５℃で３分間の変性工程、５２℃で２分間のプライマーのハイブリダイゼーション工程、及び７２℃で６分間の合成反応で行なわれ；残りの４４サイクルは９５℃で１分間の変性工程、６５℃で１分間のプライマーのハイブリダイゼーション工程、及び７２℃で４分間の合成反応で行なわれ、それによって、その後の各合成反応の時間は１秒間だけ増加し；プログラムの最後に、合成工程は７２℃で１０分間行なわれた。
【０１６９】
得られたベクターをＥｃｏＲＩによって線状化して、放射能標識ＲＮＡを作製して、上述したようなＲＮＡ移動度シフトアッセイに用いた。
【０１７０】
結果は図６に示すが、これらの結果は、ＣＤ８３ｍＲＮＡに結合する、ＨｕＲの領域が配列番号：１のヌクレオチド４１５からヌクレオチド６１８までに見出されることを実証する。
【０１７１】
実施例５
核酸の二次構造は、米国ウイスコンシン大学のＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）のプログラムＭＦＯＬＤ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｃｑ．ｃｏｍ）を用いて、特定の温度において算出することができる。
【０１７２】
ＣＤ８３のアミノ酸１３８〜２０５をコードする、配列番号：１のヌクレオチド４１２〜６１８を含有するＤＮＡ配列を、ＭＦＯＬＤプログラムへの入力データとして用いて、対応するＲＮＡ分子の二次構造を算出した。フォールディング温度３７℃、内部ループの最大サイズ３０及び内部ループの最大ループサイドネス３０を用いた。この算出に基づく最も有望な二次構造は、即ち、ｋｃａｌ／ｍｏｌでの最大ネガティブエネルギーを有する二次構造を図７に示す（−４１．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ）；第二に最も有望な二次構造は図８に示し（−４１．７ｋｃａｌ／ｍｏｌ）及び第三に最も有望な二次構造は図９に示す（−４０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。
【０１７３】
これらの二次構造の各々は２つの明確な、認識可能なドメイン：単一ステム−ループ構造を含み、配列番号：１のヌクレオチド４１２〜ヌクレオチド４６５のＣＤ８３ＲＮＡサブフラグメントを含有する第１ドメイン（ステム−ル−プ−１）及び単一三叉ステム−ループ構造を含み、配列番号：１のヌクレオチド４６６〜ヌクレオチド６１８のＣＤ８３ＲＮＡサブフラグメントを含有する、他の第２ドメイン（ステム−ループ−２）を有する。
【０１７４】
実施例６
ＣＤ８３ｍＲＮＡ上のＨｕＲ結合ドメイン、第１ドメインをさらに特徴付けるために。
【０１７５】
ＨｕＲが結合する、ＣＤ８３ｍＲＮＡの領域を正確に説明するために、単一ステム−ループ構造を含み、配列番号：１のヌクレオチド２９５〜ヌクレオチド４６５のＣＤ８３ＲＮＡサブフラグメントを含有するドメイン  ステム−ル−プ−１と、単一三叉ステム−ループ構造を含み、配列番号：１のヌクレオチド４６６〜ヌクレオチド６１８のＣＤ８３ＲＮＡサブフラグメントを含有するステム−ループ−２ドメインとを、ファージＴ７プロモーターの制御下で、ベクターｐｃＤＮＡ３の多重クローニング部位のＨｉｎｄＩＩＩ及び／又はＥｃｏＲＩ制限部位中にクローン化した。これらのサブフラグメントは、上述したような標準ＰＣＲ反応及び下記プライマーを用いて作製した：
【０１７６】
【化３】
2004516024.tif 000004
【０１７７】
得られたベクターをＥｃｏＲＩによって線状化して、放射能標識ＲＮＡを作製して、上述したようなＲＮＡ移動度シフトアッセイに用いた。
【０１７８】
結果は図１０に示すが、これらの結果は、ＨｕＲがＣＤ８３ＲＮＡのステム−ループ−１及びステム−ループ−２ドメインの両方に結合することができることを実証する。
【０１７９】
実施例７
ＣＤ８３ｍＲＮＡへのＨｕＲの結合が生物学的に重要な効果をもたらすかどうかを判定するために、サイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ）の転写制御下で、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）をクローニングし、ＣＡＴ遺伝子の下流にＣＤ８３のコード領域を挿入し、次にポリ（Ａ）部位を挿入することによって、レポータープラスミドｐＢ１２／ＣＭＶ／ＣＡＴを構築した。ＣＡＴ遺伝子を含有するＤＮＡフラグメントを単離するために、プラスミドｐＢＣ１２／ＨＩＶ／ＣＡＴ（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６６：１〜１０）をＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩによって消化させた。プラスミドｐＢＣ１２／ＣＭＶ／β−Ｇａｌ／ＳＤ−ＳＡもＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩによって消化させた、そして、ｐＢＣ１２／ＣＭＶ／β−Ｇａｌ／ＳＤ−ＳＡのβ−ＧａｌがＣＡＴ遺伝子によって置換されるように、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩによって消化されたプラスミドｐＢＣ１２／β−Ｇａｌ／ＳＤ−ＳＡ中に、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩによって消化されたＣＡＴ遺伝子を挿入した。ＳＤ−ＳＡ領域を除去するために、このＣＡＴ含有ベクターを次にＢａｍＨＩ及びＸｍａＩによって消化させて、ＣＤ８３遺伝子の種々なサブフラグメントをこのＢａｍＨＩ及びＸｍａＩによって消化されたベクター中にクローン化した（図１１参照）。ＣＤ８３配列を含まないＣＡＴ含有ベクターも、ＢａｍＨＩ及びＸｍａＩによる消化によって生じた５’オーバーラップ末端にクレノウフラグメントを充填し、これらの末端を一緒にライゲートすることによって、幾つかの実験のためのネガティブ対照として構築した。
【０１８０】
開始コドン及び終止コドンを含まない、一連のＣＤ８３サブフラグメントを、下記プライマー又はオリゴヌクレオチドを上述したような標準ＰＣＲ反応に用いて得て、上記ｐＢＣ１２ベクターのＣＡＴ遺伝子の３’非翻訳領域のＢａｍＨＩ及びＸｍａＩ部位中にライゲートした：
【０１８１】
【化４】
2004516024.tif 000005
【０１８２】
【化５】
2004516024.tif 000006
【０１８３】
これらのベクターを次にＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１６５０）中に、ＤＥＡＥデキストラン・トランスフェクションによって一過性にトランスフェクトした。簡単に説明すると、６−穴培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡ）を０．１％ゼラチンによって室温において２０分間処理し、次に、ＰＢＳで２回洗浄した。２．５ｘ１０５ＣＯＳ細胞を培養培地（（ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）１０％ウシ胎仔血清、１％非必須アミノ酸、１％グルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む）４ｍｌ中に接種して、一晩培養した。トランスフェクトすべき全てのＤＮＡｓを０．０２５μｇ／ｍｌの最終濃度にした。滅菌Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中で、ＣＤ８３構築体を含有するＤＮＡ溶液２５μｌをｐＢＣ１２／ＣＭＶベクターと混合して、２．５〜３．０μｇ／ｍｌの最終ＤＮＡ濃度を得た。ＤＥＡＥデキストラン溶液２２５μｌ（ＰＢＳ２．２４ｍｌ中のＤＥＡＥデキストラン・ストック溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）６２．５μｌ）をＤＮＡ溶液２５μｌに加え、これを、培養培地を取り出し、細胞を３７℃ＰＢＳで２回洗浄した後のＣＯＳ細胞に直接、細心に加えた。トランスフェクション反応をインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２、８０％湿度）中で３０分間進行させた。次に、ＦＣ培地（ファンギゾン（２％）４００μｌ及びクロロキン（１００ｍＭ）２０μｌを含む上記ＤＭＥＭ培地２０ｍｌ）２．５ｍｌを各穴に加えて、細胞を３７℃、５％ＣＯ２、８０％湿度においてさらに２．５時間インキュベートした。次に、ＤＮＡ／ＦＣ培地混合物を吸引し、各穴は、上記ＤＭＥＭ培養培地９ｍｌとＤＭＳＯ１ｍｌとから成るショック培地（ｓｈｏｃｋ ｍｅｄｉｕｍ）１ｍｌを受容した。室温における２．５分間のインキュベーション後に、該ショック培地を吸引して、培養培地を補充した。インキュベーションを３７℃、５％ＣＯ２、８０％湿度において４８〜７２時間続けた。
【０１８４】
異なるトランスフェクション効率によって発生する誤った結果を排除するために、各トランスフェクションは、ベクターｐＢＣ１２／ＣＭＶ／β−Ｇａｌ／ＳＤ−ＳＡをＢａｍＨＩ及びＸｍａＩで消化させ、５’オーバーラップ末端にクレノウフラグメント（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を充填し、該ベクターを再ライゲートすることによって構築された同量の内部対照ベクターによって行なった。
【０１８５】
この方法でトランスフェクトされたＣＯＳ細胞の溶菌は、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ＧｅｒｍａｎｙのＣＡＴ  ＥＬＩＳＡキットの細胞溶菌バッファーによって、製造者の指示に従って行なった。
【０１８６】
このアッセイの評価は、ＣＡＴ  ＥＬＩＳＡ及びβ−Ｇａｌアッセイによって行なった。
【０１８７】
ＣＡＴ  ＥＬＩＳＡのために、トランスフェクト済み細胞抽出物２００μｌを用いて、３０分間後に、ＥＬＩＳＡマイクロプレート・リーダーにおいて波長４０５及び４９０ｎｍ（基準）で呈色反応の測定を行なった。
【０１８８】
β−Ｇａｌアッセイのために、トランスフェクト済み細胞抽出物２５μｌを、９６穴マイクロタイタープレート中のＷｏｒｋｉｎｇ  Ｚバッファー（Ｚバッファー１０ｍｌ（水１Ｌ中にＮａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ１６．１ｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ５．５ｇ、ＫＣｌ０．７５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．２５ｇ、ｐＨ７に）これに使用直前に１０％ＳＤＳ８μｌとβ−メルカプトエタノール２８μｌとを加える）２００μｌに加えた。次に、ＣＰＲＧ（クロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；Ｈ２Ｏ１ｍｌ中に１５ｍｇ溶解）２５ｍｌを加えて、約１０分間後に、５６０ｎｍの波長でＥＬＩＳＡリーダーを用いて測定を行なった。
【０１８９】
次の実験では、β−Ｇａｌ活性に関してＣＡＴ活性を測定する。ＣＡＴ遺伝子を含まないプラスミドによって細胞を形質転換することによって、バックグラウンド活性を測定して、これを測定値から控除して、標準化ＣＡＴ活性を得た。他に記載しない限り、実験は統計的評価のために少なくとも５回行なった。
【０１９０】
実施例８
ＣＤ８３インサートを含むレポーター構築体と含まないレポーター構築体との間に、測定ＣＡＴ活性の差異が存在するかどうかを確認するために、トランスフェクション実験を最初にＣＤ８３配列を含まないＣＡＴ含有ベクター（実施例７参照）と、配列番号：１のヌクレオチド４１２〜６１５のＣＤ８３インサートを含むＣＡＴ含有ベクターとによって行なった。
【０１９１】
配列番号：１のヌクレオチド４１２〜６１５のＣＤ８３インサートを含むベクターからのＣＡＴ活性の約１／２の減少が、ＣＤ８３配列を含まないＣＡＴ含有ベクターに比べて観察された（図１２参照）。
【０１９２】
ＣＤ８３インサートを含むＣＡＴ含有ベクターの観察されたＣＡＴ活性に対するＨｕＲの可能な効果を評価するために、ＣＯＳ細胞を、同量のプラスミドｐｃＤＮＡ−ＥＬＡＶ（ＨｕＲ）と配列番号：１のヌクレオチド４１２〜６１５のＣＤ８３インサートを含むベクターとによって同時トランスフェクトした。ベクターｐｃＤＮＡ３−ＥＬＡＶ（ＨｕＲ）は、ＣＶＭ−ＩＥプロモーターの制御下でｐｃＤＮＡ３のＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ部位にクローン化された配列番号：５に記載するようなＨｕＲのコード領域を含む。
【０１９３】
図１３から見ることができるように、配列番号：１のヌクレオチド４１２〜６１５のＣＤ８３インサートを含むベクター単独によるトランスフェクションに比べて、ＥＬＡＶ（ＨｕＲ）ベクターの同時トランスフェクションによるとＣＡＴ活性の約２倍の上昇が測定された。
【０１９４】
上記の他に、センス又はアンチセンス配向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）で配列番号：１のヌクレオチド４１２〜６１５のＣＤ８３インサートを含むＣＡＴ含有ベクターを用いた実験では、（ａ）センス配向のＣＤ８３配列を含むＣＡＴ含有ベクターは、ｐｃＤＮＡ−ＥＬＡＶ（ＨｕＲ）プラスミドでトランスフェクトされなかったＣＯＳ細胞におけるアンチセンスベクターよりも約５倍大きいＣＡＴ活性を有すること、及び（ｂ）センス配向で配列番号：１のヌクレオチド４１２〜６１５のＣＤ８３インサートを含むベクターのＣＡＴ活性が、ｐｃＤＮＡ−ＥＬＡＶ（ＨｕＲ）プラスミドとの同時トランスフェクションによって、アンチセンスベクターのＣＡＴ活性に比べて、約２倍に上昇することを実証することができた（図１４参照）。
【０１９５】
さらに、ｐｃＤＮＡ−ＥＬＡＶ（ＨｕＲ）プラスミドと共に又はなしで、配列番号：１のヌクレオチド４１２〜６１５のＣＤ８３インサートを含むＣＡＴ含有ベクター、配列番号：１のヌクレオチド４１２〜４６５のＣＤ８３インサート（ステム−ループ−１）を含むＣＡＴ含有ベクター又は配列番号：１のヌクレオチド４６６〜６１５のＣＤ８３インサート（ステム−ループ−２）を含むＣＡＴ含有ベクターを用いて、ＣＯＳ細胞を一過性にトランスフェクトする実験では、ステム−ループ−２を含む（即ち、配列番号：１のヌクレオチド４１２〜６１５又は配列番号：１のヌクレオチド４６６〜６１５を含む）ＣＡＴ含有ベクターが、ｐｃＤＮＡ−ＥＬＡＶ（ＨｕＲ）プラスミドと共にＣＯＳ細胞を同時トランスフェクトした場合には、ステム−ループ−２を含むＣＡＴ含有ベクター単独でトランスフェクトされたＣＯＳ細胞のＣＡＴ活性に比べて、約２倍大きいＣＡＴ活性をもたらすことを実証することができた（図１５参照）。
【０１９６】
配列番号：１のヌクレオチド４１２〜４６５のＣＤ８３インサート（ステム−ループ−１）を含むＣＡＴ含有ベクターでは、ＨｕＲ依存性効果を見ることはできなかった。
【０１９７】
上記結果を要約すると、ＨｕＲタンパク質は、配列番号：１のヌクレオチド４６６〜６１５のＣＤ８３タンパク質の領域をコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を含むＲＮＡ分子に特異的に結合しうることが実証された。さらに、ＨｕＲの過度発現が、配列番号：１のヌクレオチド４６６〜６１５のＣＤ８３タンパク質の領域をコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を含むｍＲＮＡ分子から発現されるタンパク質量の増加をもたらすことが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ一過性発現系において実証された。
【０１９８】
実施例１０
ＣＤ８３のアミノ酸１５６〜２０５をコードする配列番号：１のヌクレオチド４６６〜６１５を含有するＤＮＡ配列を、ＭＦＯＬＤプログラムへの入力データとして用いて、対応するＲＮＡ分子の二次構造を算出した。３７℃のフォールディング温度を用いた。この算出に基づく最も有望な二次構造、即ち、ｋｃａｌ／ｍｏｌでの最大ネガティブエネルギーを有する二次構造を図１６に示す（−２９．７ｋｃａｌ／ｍｏｌ）及び第二に最も有望な二次構造は図１７に示す（−２８．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。
【０１９９】
これらの二次構造の各々は、単一三叉ステム−ループ構造を含み、配列番号：１のヌクレオチド４６６〜ヌクレオチド６１５のＣＤ８３ＲＮＡサブフラグメントを含有するドメイン（ステム−ル−プ−２）を有する。
【０２００】
実施例１１
ＢＩＡＣｏｒｅ  Ｘ光学バイオセンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，Ｕｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いるＳｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅによって、特異的タンパク質−ＲＮＡ相互作用を検出した。
【０２０１】
用いたＲＮＡは、分子質量４８，３５０ｇ／ｍｏｌを有する、配列番号：１のヌクレオチド４６６〜６１５を含有した。
【０２０２】
問題のＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ単独又はＧＳＴ−ＥＬＡＶ（ＨｕＲ））をＣＭ５  Ｃｈｉｐ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，Ｕｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の表面に、ＢＩＡＣｏｒｅ  ＧＳＴ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，Ｕｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を製造者の指示にしたがって、少なくとも１，０００共鳴単位（ＲＵ）の変化が検出可能になるまで、用いることによって固定した。
【０２０３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡ（Ｔ７／ＳＰ６  Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ  Ｋｉｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙを用いる）１μｇを総量で８０μｌのＨＢＳ−ＥＰバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，３ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．００５％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０）中で希釈し、該チップ上に５０μｌ／分の流速度で流動させた。標準ランニングバッファーはＨＢＳ−ＥＰバッファーであった。アッセイ間に、０．５Ｍ  ＮａＣｌ３０μｌを注入して、結合分析物を除去することによって、センサー表面を再生した。
【０２０４】
ＢＩＡＥｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ３．１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，Ｕｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、ＫＤ値の測定及び結合特異性の算出を行なった。
【０２０５】
配列番号：１のヌクレオチド４６６〜６１５のＣＤ８３の一部へのＨｕＲの結合のＫＤ値は７．０〜８．０ｘ１０−６Ｍであると測定された。したがって、ＣＤ８３ｍＲＮＡのこの部分へのＨｕＲの結合が高いアフィニティで生じ、非常に特異的であることを明らかにすることができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ｐｃＤＮＡ３−ＣＤ８３ベクターのマップ。
【図２】
ｐｃＤＮＡ３−ＥＬＡＶ（ＨｕＲ）ベクターのマップ。
【図３】
ＣＤ８３ＲＮＡ（配列番号：１のヌクレオチド１〜６１８）によるＲＮＡゲル移動度シフト実験；レーンＡ：ＣＤ８３ＲＮＡ；レーンＢ：ＣＤ８３ＲＮＡ＋ＧＳＴ；レーンＣ：ＣＤ８３ＲＮＡ＋ＧＳＴ−ＥＬＡＶ（ＨｕＲ）。
【図４】
ＣＤ８３ＲＮＡ（配列番号：１のヌクレオチド１〜６１８）及び種々なタンパク質によるＲＮＡゲル移動度シフト実験；レーンＡ：ＣＤ８３ＲＮＡ、付加タンパク質含まず；レーンＢ：ＣＤ８３ＲＮＡ＋ＧＳＴ−Ｍ９；レーンＣ：ＣＤ８３ＲＮＡ＋ＧＳＴ−Ｌ５；レーンＤ：ＣＤ８３ＲＮＡ＋ＥＬＡＶ（ＨｕＲ）；レーンＥ：ＣＤ８３ＲＮＡ＋ＧＳＴ。
【図５】
増加する量の非標識ＣＤ８３ＲＮＡを用いる、ＣＤ８３ＲＮＡ（配列番号：１のヌクレオチド１〜６１８）によるＲＮＡゲル競合移動度シフト実験；レーンＡ：標識ＣＤ８３ＲＮＡ、付加非標識ＣＤ８３ＲＮＡ含まず；レーンＢ〜Ｇ：標識ＣＤ８３ＲＮＡ、増加する量の非標識ＣＤ８３ＲＮＡを含む。
【図６】
付加ＥＬＡＶ（ＨｕＲ）タンパク質を含む及び含まない、ＣＤ８３ＲＮＡ（配列番号：１のヌクレオチド１〜６１８）と、サブフラグメントとによるＲＮＡゲル移動度シフト実験；レーンＡ：ＣＤ８３ＲＮＡ；レーンＢ：ＣＤ８３ＲＮＡ＋ＧＳＴ−ＥＬＡＶ（ＨｕＲ）；レーンＣ：ＣＤ８３ＲＮＡ（配列番号：１のヌクレオチド１〜２９４）；レーンＤ：ＣＤ８３ＲＮＡ（配列番号：１のヌクレオチド１〜２９４）＋ＧＳＴ−ＥＬＡＶ（ＨｕＲ）；レーンＥ：ＣＤ８３ＲＮＡ（配列番号：１のヌクレオチド２０２〜４１４）；レーンＦ：ＣＤ８３ＲＮＡ（配列番号：１のヌクレオチド２０２〜４１４）＋ＧＳＴ−ＥＬＡＶ（ＨｕＲ）；レーンＧ：ＣＤ８３ＲＮＡ（配列番号：１のヌクレオチド２９５〜６１８）；レーンＨ：ＣＤ８３ＲＮＡ（配列番号：１のヌクレオチド２９５〜６１８）＋ＧＳＴ−ＥＬＡＶ（ＨｕＲ）。
【図７】
ＧＣＧプログラムＭＦＯＬＤを用いて３７℃で算出した、エネルギー値−４１．８ｋｃａｌ／ｍｏｌを有する、配列番号：１のヌクレオチド４１２〜６１８のＤＮＡ分子の二次構造モデル。
【図８】
ＧＣＧプログラムＭＦＯＬＤを用いて３７℃で算出した、エネルギー値−４１．７ｋｃａｌ／ｍｏｌを有する、配列番号：１のヌクレオチド４１２〜６１８のＤＮＡ分子の二次構造モデル。
【図９】
ＧＣＧプログラムＭＦＯＬＤを用いて３７℃で算出した、エネルギー値−４０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌを有する、配列番号：１のヌクレオチド４１２〜６１８のＤＮＡ分子の二次構造モデル。
【図１０】
付加ＥＬＡＶ（ＨｕＲ）タンパク質を含む及び含まない、ＣＤ８３ＲＮＡのサブフラグメントによるＲＮＡゲル移動度シフト実験；レーンＡ：ＣＤ８３ＲＮＡ（配列番号：１のヌクレオチド２９５〜４６５）；レーンＢ：ＣＤ８３ＲＮＡ（配列番号：１のヌクレオチド２９５〜４６５）＋ＧＳＴ−ＥＬＡＶ（ＨｕＲ）；レーンＣ：ＣＤ８３ＲＮＡ（配列番号：１のヌクレオチド４６６〜６１８）；レーンＤ：ＣＤ８３ＲＮＡ（配列番号：１のヌクレオチド４６６〜６１８）＋ＧＳＴ−ＥＬＡＶ（ＨｕＲ）。
【図１１】
レポーター構築体ｐＢＣ１２／ＣＭＶ／ＣＡＴのクローニング・スキーム。
【図１２】
ＣＯＳ細胞を用いる一過性トランスフェクション・アッセイにおいて測定した、配列番号：１のヌクレオチド４１２〜６１５を含有するＣＤ８３インサートを含むレポーター構築体ｐＢＣ１２／ＣＭＶ／ＣＡＴに比較した、ＣＤ８３コード配列を含有するインサートを含まないレポーター構築体ｐＢＣ１２／ＣＭＶ／ＣＡＴのＣＡＴ活性。
【図１３】
ｐｃＤＮＡ−ＥＬＡＶ（ＨｕＲ）によって同時トランスフェクトされた又はされなかったＣＯＳ細胞を用いる一過性トランスフェクション・アッセイにおいて測定した、配列番号：１のヌクレオチド４１２〜６１５を含有するＣＤ８３インサートを含むレポーター構築体ｐＢＣ１２／ＣＭＶ／ＣＡＴのＣＡＴ活性。
【図１４】
ｐｃＤＮＡ−ＥＬＡＶ（ＨｕＲ）によって同時トランスフェクトされた又はされなかった、ＥＬＡＶ（ＨｕＲ）を発現するＣＯＳ細胞を用いる一過性トランスフェクション・アッセイにおいて測定した、センス又はアンチセンス配向で配列番号：１のヌクレオチド４１２〜６１５を含有するＣＤ８３インサートを含むレポーター構築体ｐＢＣ１２／ＣＭＶ／ＣＡＴのＣＡＴ活性。
【図１５】
ｐｃＤＮＡ−ＥＬＡＶ（ＨｕＲ）によって同時トランスフェクトされた又はされなかったＣＯＳ細胞を用いる一過性トランスフェクション・アッセイにおいて測定した、配列番号：１のヌクレオチド４１２〜６１５、又は配列番号：１のヌクレオチド４１２〜４６５、又は配列番号：１のヌクレオチド４６６〜６１５を含有するＣＤ８３インサートを含むレポーター構築体ｐＢＣ１２／ＣＭＶ／ＣＡＴのＣＡＴ活性。
【図１６】
ＧＣＧプログラムＭＦＯＬＤを用いて３７℃で算出した、エネルギー値−２９．７ｋｃａｌ／ｍｏｌを有する、配列番号：１のヌクレオチド４６６〜６１５のＤＮＡ分子の二次構造モデル。
【図１７】
ＧＣＧプログラムＭＦＯＬＤを用いて３７℃で算出した、エネルギー値−２８．４ｋｃａｌ／ｍｏｌを有する、配列番号：１のヌクレオチド４６６〜６１５のＤＮＡ分子の二次構造モデル。
【図１】
2004516024.tif 000007
【図２】
2004516024.tif 000008
【図５】
2004516024.tif 000009
【図１１】
2004516024.tif 000010
【図１２】
2004516024.tif 000011
【図１３】
2004516024.tif 000012
【図１４】
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【図１５】
2004516024.tif 000014
【国際公開パンフレット】
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2004516024.tif 000016
2004516024.tif 000017
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年5月23日(2003.5.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合を特異的に遮断し、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーの細胞における発現を減ずる化合物であって、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバー又はその誘導体のコード領域の少なくとも一部を含有する核酸、ＥＬＡＶタンパク質スーパーファミリーのメンバーの誘導体であるタンパク質、又はＨｕＲに対するタンパク質リガンドの誘導体であるタンパク質を含む化合物から選択される前記化合物。
【請求項２】
化合物がＤＮＡを含むことを特徴とする、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
化合物がＲＮＡを含むことを特徴とする、請求項１記載の化合物。
【請求項４】
化合物が配列番号：１における配列のヌクレオチド４６６〜６１８又はその誘導体を含有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
化合物が配列番号：１における配列のヌクレオチド４６６〜６１５又はその誘導体を含有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
化合物が、−２８．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、好ましくは−２９．７ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下のエネルギーを有する、三叉ステム−ループ構造を含む二次構造を有する核酸を含有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
化合物が核酸であり、前記核酸が細胞内で該核酸からのＲＮＡ分子の転写をもたらす調節配列を含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
化合物が核酸であり、前記核酸が細胞内での該核酸からのポリペプチド又はタンパク質の翻訳をもたらす調節配列を含有しないことを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の化合物。
【請求項９】
前記タンパク質が、ＥＬＡＶ、ＨｕＲ、ＨｕＢ、ＨｕＣ、ＨｕＤ、ＨｕＤｐｒｏ、ＨｕＤｍｅｘ、Ｈｅｌ−Ｎ２及びＨｕＣアイソフォーム、Ｒｅｌ−Ｎ１並びにこれらのタンパク質の天然生成同族体から成るタンパク質群から選択されることを特徴とする、請求項１記載の化合物。
【請求項１０】
前記タンパク質が、ＳＥＴα、ＳＥＴβ、ｐｐ３２及びＡＰＲＩＬ並びにこれらのタンパク質の天然生成同族体から成るタンパク質群から選択されることを特徴とする、請求項１記載の化合物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の化合物を含む薬剤組成物。
【請求項１２】
細胞傷害性Ｔ細胞及びヘルパーＴ細胞の増殖、分化及び／又は活性化、ヘルパーＴ細胞のＴｈ１細胞又はＴｈ２細胞への分化、Ｂ細胞の増殖、刺激及び／又は分化に関与する疾患から成る群から選択される疾患の治療又は予防用の薬剤組成物を調製するための請求項１〜１０のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項１３】
前記疾患が、アレルギー、喘息、例えば重症筋無力症、多発性硬化症及び全身性紅斑性狼瘡のような自己免疫症候群、例えば乾癬のような皮膚疾患、慢性関節リウマチ及びＡＩＤＳから成る群から選択されることを特徴とする、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
組織又は器官の移植片の拒絶の治療又は予防用の薬剤組成物を調製するための、請求項１〜１０のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項１５】
請求項３〜８のいずれかに記載のリボ核酸をコードする核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１、９又は１０のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１５又は１６に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１８】
細胞傷害性Ｔ細胞及びヘルパーＴ細胞の増殖、分化及び／又は活性化、ヘルパーＴ細胞のＴｈ１細胞又はＴｈ２細胞への分化、Ｂ細胞の増殖、刺激及び／又は分化に関与する疾患から成る群から選択される障害、疾患及び症候群の治療又は予防用の薬剤を調製するための、請求項１５又は１６に記載の発現ベクターの使用。
【請求項１９】
前記疾患が、アレルギー、喘息、例えば重症筋無力症、多発性硬化症及び全身性紅斑性狼瘡のような自己免疫症候群、例えば乾癬のような皮膚疾患、慢性関節リウマチ及びＡＩＤＳから成る群から選択されることを特徴とする、請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
組織又は器官の移植片の拒絶の治療又は予防用の薬剤組成物を調製するための、請求項１５又は１６に記載の発現ベクターの使用。
【請求項２１】
ＨｕＲタンパク質ファミリーのメンバーと、ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡとの間の結合を遮断する化合物をスクリーニング及び／又は同定する方法であって、（ａ）ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバー又はその誘導体のコード領域の少なくとも一部を含有する核酸分子、及び（ｂ）ＥＬＡＶタンパク質スーパーファミリーのメンバー又はその誘導体を含む反応において、該成分を相互作用させるために充分な条件下で１種類以上の化合物をインキュベートする工程と、該化合物が核酸分子と、ＥＬＡＶタンパク質スーパーファミリーのメンバーとの間の結合を遮断するかどうかを判定する工程とを含む上記方法。
【請求項２２】
ＣＤ８３タンパク質ファミリーのメンバーがＣＤ８３であることを特徴とする、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
ＥＬＡＶタンパク質スーパーファミリーの該メンバーが、ＥＬＡＶ、ＨｕＲ、ＨｕＢ、ＨｕＣ、ＨｕＤ、ＨｕＤｐｒｏ、ＨｕＤｍｅｘ、Ｈｅｌ−Ｎ２及びＨｕＣアイソフォーム、Ｒｅｌ−Ｎ１並びにこれらのタンパク質の天然生成同族体から成る群から選択されることを特徴とする、請求項２１又は２２記載の方法。
【請求項２４】
前記方法が、ＲＮＡゲルシフト・アッセイ、フィルター結合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ相互作用分析、シンチレーション・プロキシミティ・アッセイ、ＲＮＡｓｅ・プロテクション・アッセイ、細胞に基づくＲＮＡ結合アッセイ、酵母３−ハイブリッド・アッセイ及びレポーター遺伝子アッセイから成る群から選択されるアッセイとして行なわれることを特徴とする、請求項２１〜２３のいずれかに記載の方法。
【国際調査報告】
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