(57)【要約】チオメルサールの不在下または低レベルのチオメルサールの存在下で安定化されたヘマグルチニン抗原を含み、該ヘマグルチニンがＳＲＤアッセイにより検出可能なものである不活化インフルエンザウイルス調製物を記載する。該インフルエンザウイルス調製物は、ヘマグルチニンを安定化させるのに十分な量のミセル改変賦形剤、例えばα−トコフェロールまたはその誘導体を含みうる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオメルサールの不在下または低レベルのチオメルサールの存在下で安定化されたヘマグルチニン抗原を含む不活化インフルエンザウイルス調製物であって、該ヘマグルチニンがＳＲＤアッセイにより検出可能なものである、上記不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項２】
ミセル改変賦形剤を含む、請求項１記載の不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項３】
賦形剤が、ＨＡを安定化させるために十分な量のα−トコフェロール又はその誘導体を含む、請求項２記載の不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項４】
α−トコフェロールがα−コハク酸トコフェロールの形態である、請求項３記載の不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項５】
α−コハク酸トコフェロールが１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項４記載の不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項６】
α−コハク酸トコフェロールが１０〜５００μｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項５記載の不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項７】
賦形剤が、ＨＡを安定化させるために十分な量の正若しくは負に荷電した又は両性に荷電した両親媒性分子を含む、請求項２記載の不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項８】
荷電した両親媒性分子が、アルキル硫酸塩又はアルキル−アリール硫酸塩の形態である、請求項７記載の不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項９】
アルキル硫酸塩又はアルキル−アリール硫酸塩が１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項８記載の不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項１０】
アルキル硫酸塩又はアルキル−アリール硫酸塩が１０〜５００μｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項９記載の不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項１１】
賦形剤が、ＨＡを安定化させるために十分な量の非イオン性両親媒性分子を含む、請求項２記載の不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項１２】
非イオン性両親媒性分子が、アルキルポリグリコシド又はその誘導体の形態である、請求項１１記載の不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項１３】
アルキルポリグリコシドがＰｌａｎｔａｃａｒｅ（登録商標）である、請求項１２記載の不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項１４】
アルキルポリグリコシドが１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１２又は１３記載の不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項１５】
アルキルポリグリコシドが１０〜５００μｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１４記載の不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項１６】
非イオン性両親媒性分子が、アルキルアルコールポリアルキレンエーテル又はその誘導体の形態である、請求項１１記載の不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項１７】
アルキルアルコールポリアルキレンエーテルがラウレス−９である、請求項１６記載の不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項１８】
アルキルアルコールポリアルキレンエーテルが１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１６又は１７記載の不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項１９】
アルキルアルコールポリアルキレンエーテルが１０〜５００μｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１８記載の不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項２０】
インフルエンザウイルス抗原調製物が、ウイルス成分抗原調製物、サブユニット抗原、化学的に又はその他により不活化された全ウイルスからなる群より選択される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項２１】
インフルエンザ抗原調製物がウイルス成分抗原調製物である、請求項２０記載の不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項２２】
Ａ型株及びＢ型株ヘマグルチニンの両者を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項２３】
三価インフルエンザウイルス調製物である、請求項２２記載の不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項２４】
安定化Ｂ型株インフルエンザＨＡを含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項２５】
少なくとも１つの安定インフルエンザヘマグルチニン抗原及び安定化賦形剤を含むインフルエンザウイルス抗原調製物であって、該賦形剤が請求項１〜１９の賦形剤から選択される、上記インフルエンザウイルス抗原調製物。
【請求項２６】
少なくとも１つの安定Ｂ型株インフルエンザヘマグルチニン抗原を含む、請求項２５記載のインフルエンザウイルス抗原調製物。
【請求項２７】
賦形剤が、α−トコフェロールまたはα−コハク酸トコフェロールなどのその誘導体である、請求項２５または２６記載のインフルエンザウイルス抗原調製物。
【請求項２８】
α−トコフェロールまたはその誘導体がヘマグルチニンを安定化させるために十分な量で存在する、請求項２７記載のインフルエンザウイルス抗原調製物。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載のインフルエンザウイルス調製物を含むインフルエンザワクチン。
【請求項３０】
インフルエンザの株又は各株に対するヘマグルチニン抗原の濃度が、ＳＲＤアッセイにより検出した場合に１〜１０００μｇ／ｍｌである、請求項２９記載のインフルエンザワクチン。
【請求項３１】
さらにアジュバントを含む、請求項２９又は３０記載のインフルエンザワクチン。
【請求項３２】
安定ヘマグルチニン抗原の調製方法であって、α−トコフェロールまたはα−コハク酸トコフェロールなどのその誘導体の存在下にて抗原を精製することを含む、上記方法。
【請求項３３】
被験者におけるインフルエンザ感染症又は疾患の予防方法であって、該被験者に請求項２９〜３１のいずれか１項に記載のワクチンを投与することを含む、上記方法。
【請求項３４】
ワクチン送達が、皮内、鼻内、筋肉内、経口又は皮下送達である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
インフルエンザワクチンの製造におけるヘマグルチニン安定化剤としてのα−トコフェロール又はその誘導体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なインフルエンザウイルス抗原調製物、その調製方法、および予防または治療におけるその使用に関する。特に、本発明は、全ウイルスワクチンではなく破砕され、有機水銀性保存剤の不在下にて安定な不活化インフルエンザワクチンに関する。さらに、該ワクチンは、標準的な試験において安定なヘマグルチニンを含有する。該ワクチンは、かかるワクチンに好適な任意の経路により、例えば筋肉内、皮下、皮内または経粘膜（例えば鼻内）経路により投与することができる。
【０００２】
インフルエンザウイルスは、世界中に存在する最も遍在的なウイルスの１つであり、ヒトと家畜の両方に影響を及ぼす。インフルエンザの経済的影響は顕著である。
【０００３】
インフルエンザウイルスは、粒子サイズが直径約１２５ｎｍのＲＮＡエンベロープウイルスである。このウイルスは、基本的には、脂質二重層構造を有するウイルスエンベロープに取り囲まれた内部ヌクレオキャプシドまたは核タンパク質と会合したリボ核酸（ＲＮＡ）のコアと、外部糖タンパク質からなる。ウイルスエンベロープの内層は、主としてマトリックスタンパク質で構成され、外層は大部分が宿主由来脂質物質で構成される。表面糖タンパク質のノイラミニダーゼ（ＮＡ）およびヘマグルチニン（ＨＡ）は、粒子の表面で長さ１０〜１２ｎｍの棘のように見える。インフルエンザのサブタイプの抗原特異性を決定するのは、これらの表面タンパク質、特にヘマグルチニンである。
【０００４】
現在利用可能なインフルエンザワクチンは、不活化インフルエンザワクチンまたは生の弱毒化インフルエンザワクチンのいずれかである。不活化インフルエンザワクチンは、抗原調製物の３つの可能性ある形態、すなわち、不活化全ウイルス、脂質エンベロープを可溶化させるように精製ウイルス粒子が界面活性剤もしくは他の試薬で分割されたサブビリオン（いわゆる「ウイルス成分」ワクチン；split vaccine）、または精製ＨＡおよびＮＡ（サブユニットワクチン）から構成される。これらの不活化ワクチンは、筋肉内（ｉ．ｍ．）または鼻内（ｉ．ｎ．）経路により投与される。市販の弱毒化生ワクチンは存在しない。
【０００５】
インフルエンザワクチンは、いずれのタイプであっても、通常は三価ワクチンである。それらは、一般的には、２種のインフルエンザＡ型ウイルス株および１種のインフルエンザＢ型株に由来する抗原を含有する。多くの場合、標準的な０．５ｍｌ注射用量には、単純放射状免疫拡散法（ＳＲＤ）により測定したときに各株に由来する１５μｇのヘマグルチニン抗原成分が含まれる（Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｄら：インフルエンザヘマグルチニン抗原をアッセイするための改良された単純放射状免疫拡散法：不活化全ウイルスおよびサブユニットワクチンの効力決定のための適応化（An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen:adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines）J. Biol. Stand. 5(1977)237-247；Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｄら：インフルエンザウイルスのヘマグルチニン抗原をアッセイするための免疫電気泳動法および単純放射状拡散法に関する国際的共同研究（International collaborative study of single radial diffusion and immunoelectrophoresis technique for the assay of haemagglutinin antigen of influenza virus）J. Biol. Stand. 9(1981)317-330）。
【０００６】
各シーズンにインフルエンザワクチンに組入れられるインフルエンザウイルス株は、国立保健機関およびワクチン製造業者と共同して世界保健機構により決定される。
【０００７】
典型的なインフルエンザ流行病は、入院率または死亡率の増加により立証されるように、肺炎または下気道疾患の発生率の増加を引き起こす。高齢者または根源的慢性疾患を有する者は、そのような合併症にかなり罹患し易いと考えられるが、乳児もまた重篤な疾患にかかる可能性がある。したがって、これらの人々を特に防御する必要がある。
【０００８】
インフルエンザの毎年の流行に関連した罹患率および死亡率を抑えようとする現在の取組みは、筋肉内投与される不活化インフルエンザワクチンの使用に基づいている。呼吸器疾患およびインフルエンザ合併症を防止するそのようなワクチンの効力は、健常成人の７５％から高齢者の５０％未満までの範囲にわたる。
【０００９】
インフルエンザワクチンの効力を測定するための基準が国際的に適用される。インフルエンザに有効なワクチンに関する欧州連合公式判定基準を以下の表に示す。理論的には、欧州連合要件を満たすためには、インフルエンザワクチンは、ワクチン中に含まれるインフルエンザ株全てについて、表中の判定基準のうちの１つだけは満たさねばならない。しかしながら、実際上、特に、新しいワクチン、例えば、種々の経路により送達される新しいワクチンについては、少なくとも２つまたは３つ全ての判定基準が全株で満たされる必要があろう。いくつかの状況下では、２つの判定基準で十分なこともある。例えば、３つの判定基準のうちの２つは全ての株で満たされ、第３の判定基準は全てではなくいくつかの株（例えば、３種の株のうちの２種）で満たされる場合が許容されることもある。これらの要件は、成人集団（１８〜６０歳）と高齢者集団（＞６０歳）とでは異なる。
【００１０】
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【００１１】
＊  セロコンバージョン率は、各ワクチン株について、ワクチン接種後の血清ヘマグルチニン阻害（ＨＩ）力価が少なくとも４倍増加したワクチン被接種者の割合（％）と定義される
＊＊  コンバージョン係数は、各ワクチン株について、ワクチン接種後の血清ＨＩ幾何平均力価（ＧＭＴ）の増加倍率と定義される
＊＊＊  防御率は、（各ワクチン株について）ワクチン接種後に１：４０に等しいかまたはそれよりも大きい血清ＨＩ力価を有するワクチン被接種者の割合（％）と定義され、防御を示すものとして一般に認められている。
【００１２】
新規なインフルエンザワクチンを商業的に有用なものとするには、これらの基準を満たすことが必要なだけでなく、実際に、現在利用可能な注射ワクチンと少なくとも同程度に有効である必要があると考えられる。また、所要の抗原量および投与回数に関して商業的に利用可能であることも必要でありうる。
【００１３】
現在市販のインフルエンザワクチンは、ウイルス成分またはサブユニットの注射ワクチンのいずれかである。これらのワクチンは、一般的には有機溶媒または界面活性剤を用いて、ウイルス粒子を分割し、さまざまな程度までウイルスタンパク質を分離または精製することにより調製される。ウイルス成分ワクチンは、可溶化濃度の有機溶媒または界面活性剤を用いて感染性または不活化全インフルエンザウイルスを断片化してから、可溶化剤といくつかのまたはほとんどのウイルス脂質物質を除去することにより、調製される。ウイルス成分ワクチンは、一般的には、夾雑マトリックスタンパク質および核タンパク質ならびに時として脂質や膜エンベロープタンパク質を含有する。ウイルス成分ワクチンは、通常、ウイルス構造タンパク質のほとんどまたは全てを含有するであろうが、全ウイルスで見られる比率と必ずしも同じ比率で含有するわけではない。一方、サブユニットワクチンは、本質的には、高精製ウイルス表面タンパク質、ヘマグルチニン、およびノイラミニダーゼからなり、これらのタンパク質は、ワクチン接種時に所望のウイルス中和抗体を誘導する働きを担う表面タンパク質である。
【００１４】
現在入手可能なワクチンの多くは、劣化を防ぐために保存剤を必要とする。高頻度に使用されている保存剤は、水銀含有化合物であるチオメルサールである。水銀含有化合物の効果に関して、公衆は懸念を表明している。神経系の発達に対する低〜中程度の量の有機水銀化合物の作用を検出するための監視システムは現場にはなく、高用量の有機水銀化合物を摂取した子供の特別研究は完了するまでに数年はかかるだろう。チオメルサール含有ワクチンの潜在的な危険性について誇張する必要はないと強調する解説者もいる（Offit; P.A. JAMA Vol.283;No:16）。それでもやはり、製造プロセスにおいてチオメルサールを使用しないでワクチンを製造する別の方法を見出すことが有利であると考えられる。従って、年間基準で少なくとも特定の集団のために推奨されるインフルエンザワクチンのような特定のワクチンにおいてチオメルサール非含有のワクチンを開発することが必要とされている。
【００１５】
現在では、市販の不活化インフルエンザワクチンのために、製造／精製プロセスの過程でおよび／または最終ワクチン中に保存剤を用いることが標準的な手法となっている。保存剤は、種々の段階の精製によって微生物の増殖を阻止する必要がある。卵由来のインフルエンザワクチンに関して、典型的には、チオメルサールは未精製尿膜腔液に添加され、またウイルスの処理段階で２回目の添加が行われることもある。従って、プロセスの最後に残渣チオメルサールが存在する可能性があり、これが最終ワクチンにおいて所望の保存剤濃度に、例えば約１００μｇ／ｍｌの濃度にさらに調整されうる。
【００１６】
インフルエンザワクチンにおいてチオメルサールを保存剤として使用した場合の副作用は、安定化作用である。市販のインフルエンザワクチン中のチオメルサールは、ワクチンのＨＡ成分、特に（限定するものではないが）インフルエンザＢ型株のＨＡを安定化する機能を有する。特定のＡ型株ヘマグルチニン（例えばＨ３）もまた安定化することが必要でありうる。従って、インフルエンザワクチンからチオメルサールを除去するか、または少なくとも最終ワクチン中のチオメルサール濃度を低減させることが望ましいが、チオメルサールを使用しないとＨＡが十分に安定化しないという点で問題がある。
【００１７】
本発明においては、有機水銀化合物を含まない別の試薬を用いて不活化インフルエンザ調製物中のＨＡを安定化させることが可能であることを見出した。ＨＡは、安定化賦形剤を使用しないで同じ方法により製造された非安定化抗原調製物と比較して、標準的な定量法（特にＳＲＤ）により経時的により大量に検出可能な程度に、安定化されたままである。ＳＲＤ法は上述したように実施される。重要なことは、ＨＡは、最終インフルエンザワクチンの標準的要件である最大１２ヶ月間にわたって安定を維持するということである。
【００１８】
第１の態様において、本発明は、チオメルサールの不在下または低レベルのチオメルサールの存在下で安定化されたヘマグルチニン抗原を含む不活化インフルエンザウイルス調製物であって、該ヘマグルチニンがＳＲＤアッセイにより検出可能なものである、上記調製物を提供する。
【００１９】
低レベルのチオメルサールは、Ｂ型インフルエンザに由来するＨＡの安定性が低減し、そのためその安定化ＨＡのためには安定化賦形剤が必要とされるレベルである。低レベルのチオメルサールは一般的には５μｇ／ｍｌ以下である。
【００２０】
一般的に、安定化ＨＡとは、安定化賦形剤を使用していないで同じ方法により製造された非安定化抗原調製物と比較して、標準的な定量法（特にＳＲＤ）により経時的により大量に検出可能なＨＡを意味する。ＨＡの安定化は、ＨＡ活性が１年間にわたって実質的に一定に維持されることが好ましい。安定化により、ＨＡを含むワクチンは、好ましくは６ヶ月の保存期間後、より好ましくは１ヶ月の期間後にも許容可能な防御を与える。
【００２１】
好適には、安定化は、安定化賦形剤、好ましくはミセル改変賦形剤により実施する。ミセル改変賦形剤は、一般的には、膜タンパク質ＨＡの可溶化に使用するかまたはそれに適した個々のまたは組み合わせの界面活性剤（例えば界面活性剤Ｔｗｅｅｎ８０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００およびデオキシコール酸塩）により形成されるミセル中に組み込まれうる賦形剤である。
【００２２】
理論に拘束されることは望まないが、賦形剤は、最終調製物中の脂質、界面活性剤および／またはタンパク質との相互作用によりＨＡを安定化させるよう機能すると考えられる。賦形剤とタンパク質および脂質との混合ミセル、例えばＴｗｅｅｎおよびデオキシコール酸塩と残りの脂質および／またはＴｒｉｔｏｎＸ１００との混合ミセルを形成しうる。表面のタンパク質は、複合ミセルにより可溶化が維持されると考えられる。好ましくは、タンパク質の凝集が、好適な賦形剤を含むミセル（例えば負に荷電した界面活性剤を含むミセル）の電荷反発により限定される。
【００２３】
好適なミセル改変賦形剤としては、正、負または両性に荷電した両親媒性分子、例えばアルキル硫酸塩またはアルキル−アリール−硫酸塩；非イオン性両親媒性分子、例えばアルキルポリグリコシドもしくはその誘導体（Ｐｌａｎｔａｃａｒｅ（登録商標）（Henkel KGaAより入手可能）など）、またはアルキルアルコールポリアルキレンエーテルもしくはその誘導体（Ｌａｕｒｅｔｈ−９など）が挙げられる。
【００２４】
好ましい賦形剤は、α−トコフェロール、またはα−トコフェロール誘導体、例えばα−コハク酸トコフェロールである。本発明において使用するための他の好ましいトコフェロール誘導体としては、Ｄ−α−トコフェロール、Ｄ−δ−トコフェロール、Ｄ−γ−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールが挙げられる。使用可能なトコフェロールの好ましい誘導体としては、酢酸エステル、コハク酸エステル、リン酸エステル、ギ酸エステル、プロピオン酸エステル、ブチル酸エステル、硫酸エステルおよびグルコン酸エステルが挙げられる。α−コハク酸トコフェロールが特に好ましい。α−トコフェロールまたは誘導体は、ヘマグルチニンを安定化させるのに十分な量で存在しうる。
【００２５】
他の好適な賦形剤は、当業者に標準的な方法により同定し、例えば本明細書に記載するように安定性分析のためのＳＲＤ法を用いて試験することが可能である。
【００２６】
好ましい態様においては、本発明は、少なくとも１種の安定インフルエンザＢ型株ヘマグルチニン抗原を含むインフルエンザウイルス抗原調製物を提供する。
【００２７】
本発明は、さらなる態様において、好適なヘマグルチニン抗原を調製する方法を提供し、該方法は、安定化ミセル改変賦形剤、好ましくはα−トコフェロールまたはその誘導体（例えばα−コハク酸トコフェロール）の存在下にて抗原を精製することを含むものである。
【００２８】
さらに本発明は、本明細書に記載の抗原調製物を含むワクチン、および本発明に係るワクチンを被験体に投与することを含む、被験体におけるインフルエンザ感染または疾患の予防方法におけるかかるワクチンの使用を提供する。
【００２９】
ワクチンは、好適な任意の送達経路、例えば、皮内、粘膜（鼻内など）、経口、筋肉内、または皮下経路により投与しうる。他の送達経路は当技術分野で周知である。
【００３０】
皮内送達が好ましい。例えば、米国特許第４，８８６，４９９号、米国特許第５，１９０，５２１号、米国特許第５，３２８，４８３号、米国特許第５，５２７，２８８号、米国特許第４，２７０，５３７号、米国特許第５，０１５，２３５号、米国特許第５，１４１，４９６号、米国特許第５，４１７，６６２号に記載されているような短針デバイスなどの任意の好適なデバイスを皮内送達に使用しうる。参照により本明細書に組み入れられるものとするＷＯ９９／３４８５０号およびＥＰ１０９２４４４号に記載されているように皮膚中への針の有効侵入長を限定するデバイスおよびその機能的等価物により皮内ワクチンを投与することも可能である。同様に好適なのは、液体ジェット式注射器を用いて、または角質層を貫通し真皮に達するジェットを生成する針を用いて、真皮に液体ワクチンを送達するジェット式注射デバイスである。ジェット式注射デバイスについては、例えば、米国特許第５，４８０，３８１号、米国特許第５，５９９，３０２号、米国特許第５，３３４，１４４号、米国特許第５，９９３，４１２号、米国特許第５，６４９，９１２号、米国特許第５，５６９，１８９号、米国特許第５，７０４，９１１号、米国特許第５，３８３，８５１号、米国特許第５，８９３，３９７号、米国特許第５，４６６，２２０号、米国特許第５，３３９，１６３号、米国特許第５，３１２，３３５号、米国特許第５，５０３，６２７号、米国特許第５，０６４，４１３号、米国特許第５，５２０，６３９号、米国特許第４，５９６，５５６号、米国特許第４，７９０，８２４号、米国特許第４，９４１，８８０号、米国特許第４，９４０，４６０号、ＷＯ９７／３７７０５号、およびＷＯ９７／１３５３７号に記載されている。同様に好適なのは、皮膚の外層を通って真皮まで粉末形態のワクチンに加速度を与えるために圧縮ガスを使用するバリスティック粉末／粒子送達デバイスである。このほか、古典的なマントー式皮内投与法で従来型シリンジを使用することも可能である。しかしながら、従来型シリンジを使用するには、かなり熟練したオペレーターが必要である。したがって、かなり熟練したユーザーでなくても正確な送達を行うことのできるデバイスが好ましい。
【００３１】
従って、本発明は、被験体においてインフルエンザの感染または疾患を予防するための方法を提供する。該方法には、本発明に係るインフルエンザワクチンを被験体に皮内投与することが含まれる。
【００３２】
本発明はまた、本発明にかかるワクチンと皮内デバイス、特に例えばＷＯ９９／３４８５０号またはＥＰ１０９２４４４号に開示されたデバイスとの組み合わせにも関する。
【００３３】
また、インフルエンザワクチンの製造におけるヘマグルチニン安定化剤としてのミセル改変賦形剤、好ましくはα−トコフェロールまたはその誘導体の使用を提供する。
【００３４】
本発明は、限定するものではないが、特にＢ型株インフルエンザヘマグルチニンの安定化に適用する。
【００３５】
本発明の安定化ＨＡは、好ましくは６ヶ月、より好ましくは１２ヶ月にわたり安定である。
【００３６】
α−トコフェロールは、好ましくはエステル形態で、より好ましくはコハク酸エステルまたは酢酸エステル、最も好ましくはコハク酸エステルの形態である。
【００３７】
α−トコフェロールまたはその誘導体の濃度は、好ましくは１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌである。
【００３８】
本発明のワクチンは、一般的には、Ａ型株およびＢ型株ウイルス抗原の両方を、典型的には２つのＡ型株と１つのＢ型株の三価組成物として含む。しかしながら、二価および一価ワクチンを除外するものではない。一価ワクチンは、病気が流行している状況、例えばできる限り多くワクチンを製造し早く投与することが重要な場合には有利でありうる。
【００３９】
本発明に使用するための死滅インフルエンザ抗原調製物は、ウイルス成分抗原調製物、サブユニット抗原（組換えにより発現させるかまたは全ウイルスから調製するかいずれか）、例えばホルムアルデヒド、β−プロピオラクトンなどにより化学的に不活化させるか、またはＵＶもしくは熱不活化などの他の不活化手段により不活化させた不活化全ウイルスからなる群より選択しうる。好ましくは、抗原調製物は、ウイルス成分調製物、または全ウイルスから調製した（特に表面抗原に分割プロセスを行った後精製した）サブユニット抗原である。ウイルス成分調製物が最も好ましい。
【００４０】
インフルエンザウイルス調製物のヘマグルチニン抗原または各株の濃度は、ＳＲＤアッセイにより測定した場合に、好ましくは１ｍｌあたり１〜１０００μｇ、より好ましくは３〜３００μｇ、最も好ましくは約３０μｇである。
【００４１】
本発明に係るワクチンは、アジュバントまたは免疫刺激剤、例えば限定されるものではないが、任意の起源の解毒リピドＡおよびリピドＡの無毒誘導体、サポニンおよびＴＨ１型応答を刺激することのできる他の試薬を含有しうる。
【００４２】
腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）が免疫系に対する強力な刺激剤であることはかなり前から知られていたが、毒性作用があるため、アジュバントに使用されることはなかった。還元末端グルコサミンからコア炭水化物基およびホスフェートを除去することにより生成された無毒のＬＰＳ誘導体モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）については、Ｒｉｂｉら（1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-419）により報告されており、次の構造を有する：
【化１】
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【００４３】
ＭＰＬのさらなる解毒体は、二糖主鎖の３位からアシル鎖を除去することにより得られ、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）と呼ばれる。ＧＢ２１２２２０４Ｂに教示されている方法により、それを精製および調製することができる。この文献には、ジホスホリルリピドＡおよびその３−Ｏ−脱アシル化体の調製についても開示されている。
【００４４】
３Ｄ−ＭＰＬの好ましい形態は、直径０．２μｍ未満の小さい粒径を有するエマルジョンの形態であり、その製造方法については、ＷＯ９４／２１２９２号に開示されている。モノホスホリルリピドＡとサーファクタントとを含む水性製剤については、Ｗ０９８４３６７０Ａ２に記載されている。
【００４５】
本発明の組成物中に製剤化される細菌リポ多糖由来のアジュバントは、細菌源から精製および処理されたものであってもよいし、あるいは合成されたものであってもよい。例えば、精製モノホスホリルリピドＡについては、Ｒｉｂｉら、１９８６（前掲）に記載されており、サルモネラ・エスピーに由来する３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルまたはジホスホリルリピドＡについては、ＧＢ２２２０２１１号および米国特許第４９１２０９４号に記載されている。他の精製および合成リポ多糖についても報告されている（Hilgersら, 1986, Int. Arch. Allergy. Immunol., 79(4): 392-6；Hilgersら, 1987, Immunology, 60(1): 141-6；およびＥＰ０５４９０７４号Ｂ１）。特に好ましい細菌リポ多糖アジュバントは３Ｄ−ＭＰＬである。
【００４６】
したがって、本発明に使用しうるＬＰＳ誘導体は、ＬＰＳまたはＭＰＬまたは３Ｄ−ＭＰＬに構造が類似している免疫刺激剤である。本発明の他の態様において、ＬＰＳ誘導体は、ＭＰＬの上記構造の一部分であるアシル化単糖であってもよい。
【００４７】
サポニンについては、Lacaille-Dubois, MおよびWagner H.（1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386）に教示されている。サポニンは、植物界および海洋動物界に広く分布するステロイドまたはトリテルペンのグリコシドである。サポニンは、水に添加するとコロイド溶液を形成し、それを振盪させると泡立つこと、およびコレステロールを沈澱させることで知られている。サポニンが細胞膜近傍に存在すると、細胞膜中に細孔状構造が形成され、細胞膜が破壊される。赤血球の溶血は、この現象の一例である。この現象は、全てではなくある特定のサポニンの性質である。
【００４８】
サポニンは、全身投与に供されるワクチンのアジュバントとして知られる。アジュバントおよび個々のサポニンの溶血活性については、当技術分野で広く研究されてきた（Lacaille-DuboisおよびWagner、前掲）。例えば、Ｑｕｉｌ  Ａ（南アメリカの木キラハ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の樹皮に由来する）およびその画分については、米国特許５，０５７，５４０号および「Saponins as vaccine adjuvants」, Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996,12 (1-2): 1-55およびＥＰ０３６２２７９号Ｂ１に記載されている。Ｑｕｉｌ  Ａの一部分を含む、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）と呼ばれる粒状構造体は、溶血性であり、ワクチンの製造に使用されてきた（Morein, B., ＥＰ０１０９９４２号Ｂ１；ＷＯ９６／１１７１１号；ＷＯ９６／３３７３９号）。溶血性サポニンＱＳ２１およびＱＳ１７（Ｑｕｉｌ  ＡのＨＰＬＣ精製画分）は、強力な全身性アジュバントとして記載されており、それらの製造方法は、米国特許第５，０５７，５４０号およびＥＰ０３６２２７９号Ｂ１中に開示されている。全身性ワクチン接種の研究で使用された他のサポニンとしては、ジプソフィリア（Gypsophila）およびサポナリア（Saponaria）のような他の植物種に由来するサポニンが挙げられる（Bomfordら, Vaccine, 10(9): 572-577, 1992）。
【００４９】
強化された系には、無毒のリピドＡ誘導体とサポニン誘導体との組合せ、特に、ＷＯ９４／００１５３号に開示されているようにＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの組合せ、またはＷＯ９６／３３７３９号に開示されているようにＱＳ２１がコレステロールでクエンチされているそれほど反応原性のない組成物が含まれる。
【００５０】
水中油型エマルジョン中にＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬを含む特に強力なアジュバント製剤については、ＷＯ９５／１７２１０号に記載されている。これは好ましい製剤である。
【００５１】
したがって、本発明の一実施形態では、解毒されたリピドＡまたはリピドＡの無毒の誘導体をアジュバント添加した、より好ましくはモノホスホリルリピドＡまたはその誘導体をアジュバント添加した本発明のインフルエンザ抗原調製物を含むワクチンが提供される。
【００５２】
好ましくは、ワクチンはさらに、サポニン、より好ましくはＱＳ２１を含む。
【００５３】
好ましくは、製剤はさらに、水中油型エマルジョンを含む。本発明はまた、３Ｄ−ＭＰＬのような製薬上許容される賦形剤と共に本発明の抗原調製物を混合することを含むワクチン製剤の製造方法を提供する。
【００５４】
本発明に係るワクチンは、少なくとも１種のサーファクタント、特に非イオン性サーファクタントをさらに含んでもよい。好適な非イオン性サーファクタントは、以下からなる群より選択される：すなわち、オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、市販品のＴｒｉｔｏｎＴＭシリーズ）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（ＴｗｅｅｎＴＭシリーズ）、および一般式（Ｉ）：
（Ｉ）  ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ
〔式中、ｎは１〜５０であり、Ａは結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、ＲはＣ１〜５０アルキルまたはフェニルＣ１〜５０アルキルである。〕
で示されるポリオキシエチレンエーテルまたはエステル、ならびにこれらのうちの２種以上の組み合わせ。
【００５５】
式（Ｉ）の範囲内の好ましいサーファクタントは、ｎが４〜２４、より好ましくは６〜１２、最も好ましくは９であり、Ｒ部分がＣ１〜５０アルキル、好ましくはＣ４〜Ｃ２０アルキル、最も好ましくはＣ１２アルキルである分子である。
【００５６】
オクチルフェノキシポリオキシエタノールおよびポリオキシエチレンソルビタンエステルは、「Surfactant systems」AttwoodおよびFlorence編（1983, ChapmanおよびHall）に記載されている。また、オクチルフェノキシポリオキシエタノール（オクトキシノール類）、例えばｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ＴＭ）は、Merck Index Entry 6858（第1162頁、第１２版、Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA; ISBN 0911910-12-3）に記載されている。ポリオキシエチレンソルビタンエステル、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０ＴＭ）は、Merck Index Entry 7742（第1308頁、第１２版、Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA; ISBN 0911910-12-3）に記載されている。いずれも、上記文献に記載されている方法を用いて製造可能であるかまたはＳｉｇｍａ  Ｉｎｃ．などの供給業者から購入可能である。
【００５７】
特に好ましい非イオン性サーファクタントとしては、ＴｒｉｔｏｎＸ−４５、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１０２、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４、ＴｒｉｔｏｎＸ−１６５、ＴｒｉｔｏｎＸ−２０５、ＴｒｉｔｏｎＸ−３０５、ＴｒｉｔｏｎＮ−５７、ＴｒｉｔｏｎＮ−１０１、ＴｒｉｔｏｎＮ−１２８、Ｂｒｅｉｊ３５、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、およびポリオキシエチレン−９−ステアリルエーテル（ステアレス９）が挙げられる。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００およびラウレス９が特に好ましい。同様に特に好ましいのは、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０ＴＭ）である。
【００５８】
一般式（Ｉ）で示されるさらに適切なポリオキシエチレンエーテルは、次の群から選択される：ポリオキシエチレン−８−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【００５９】
ポリオキシエチレンラウリルエーテルに対して用いられる他の用語または名称は、ＣＡＳレジストリーに開示されている。ポリオキシエチレン−９ラウリルエーテルのＣＡＳレジストリー番号は９００２−９２−０である。ポリオキシエチレンラウリルエーテルのようなポリオキシエチレンエーテル類は、Merck Index（第１２版：entry 7717, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA; ISBN 0911910-12-3）に記載されている。ラウレス９は、エチレンオキシドをドデシルアルコールと反応させることにより生成され、平均で９個のエチレンオキシド単位を有する。
【００６０】
上記サーファクタントの異なるグループに属する２種以上の非イオン性サーファクタントが、本明細書に記載のワクチン製剤中に存在していてもよい。特に、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０ＴＭ）のようなポリオキシエチレンソルビタンエステルと、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００ＴＭのようなオクトキシノールとの組合せが好ましい。非イオン性サーファクタントのこのほかの特に好ましい組合せは、ラウレス９＋ポリオキシエチレンソルビタンエステルもしくはオクトキシノールまたはその両方を含む。
【００６１】
以上に記載したような非イオン性サーファクタントは、最終ワクチン組成物中で次のような好ましい濃度を有する：ポリオキシエチレンソルビタンエステル、例えばＴｗｅｅｎ８０ＴＭ：０．０１〜１％、最も好ましくは約０．１％（ｗ／ｖ）；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール、例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００ＴＭ、またはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の界面活性剤：０．００１〜０．１％、最も好ましくは０．００５〜０．０２％（ｗ／ｖ）；一般式（Ｉ）で示されるポリオキシエチレンエーテル、例えばラウレス９：０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％、最も好ましくは０．１〜１％または約０．５％（ｗ／ｖ）。
【００６２】
特定のワクチン製剤に関しては、他のワクチン成分が該製剤中に含まれてもよい。そのようなものとして、本発明の製剤は、胆汁酸またはその誘導体を、特に塩の形態で含有しうる。これらの例としては、コール酸の誘導体およびその塩、特に、コール酸またはコール酸誘導体のナトリウム塩が挙げられる。胆汁酸およびその誘導体の例としては、コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、および誘導体、例えば、該胆汁酸のグリコ誘導体、タウロ誘導体、アミドプロピル−１−プロパンスルホン酸誘導体、アミドプロピル−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸誘導体、またはＮ，Ｎ−ビス（３Ｄグルコノアミドプロピル）デオキシコラミドが挙げられる。特に好ましい例は、最終ワクチン用量中に存在しうるデオキシコール酸ナトリウム（ＮａＤＯＣ）である。
【００６３】
また、本発明は、本発明に係るワクチンを充填したワクチン投与デバイスを含む医薬キットを提供する。かかる投与デバイスとしては、限定するものではないが、針デバイス、液体ジェットデバイス、粉末デバイス、および噴霧デバイス（鼻内用）が挙げられる。
【００６４】
本発明に係るインフルエンザウイルス抗原調製物は、従来の発育卵法から得るかまたは組織培養を用いてウイルスを増殖させるもしくは組換えインフルエンザウイルス表面抗原を発現させる任意の新しい生成法から得ることが可能である。ウイルスを増殖するための適切な細胞培養基としては、例えば、イヌ腎臓細胞、具体例としてはＭＤＣＫまたはＭＤＣＫのクローンから得られる細胞、ＭＤＣＫ様細胞、サル腎臓細胞、具体例としてはベロ細胞などのＡＧＭＫ細胞、またはワクチンを目的としたインフルエンザウイルスの産生に適した任意の他のタイプの哺乳動物細胞が挙げられる。適切な細胞培養基としては、このほかに、ＭＲＣ−５細胞などのヒト細胞が挙げられる。適切な細胞培養基は細胞系に限定されるものではなく、例えば、ニワトリ胚繊維芽細胞のような始原細胞も含まれる。
【００６５】
インフルエンザウイルス抗原調製物は、いくつかの商業的に利用可能なプロセス、例えば、特許ＤＤ３００８３３号およびＤＤ２１１４４４号に記載されたインフルエンザ成分プロセスなどのいずれかにより生成することができる。伝統的には、インフルエンザウイルス成分は、溶媒／界面活性剤処理を用いて、例えば、トリ−ｎ−ブチルホスフェートまたはＴｗｅｅｎＴＭと組合せたジエチルエーテル（「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」分割として知られる）を用いて生産された。この方法は、依然として、いくつかの生産設備で使用されている。現在利用されている他の分割剤としては、界面活性剤またはタンパク質分解酵素または胆汁酸塩、例えば、参照により本明細書に組み入れられるものとする特許Ｄ１５５８７５号に記載されているようなデオキシコール酸ナトリウムが挙げられる。分割剤として使用することのできる界面活性剤としては、カチオン性界面活性剤、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、他のイオン性界面活性剤、例えば、ラウリルスルフェート、タウロデオキシコレート、もしくは非イオン性界面活性剤、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（例えば、Linaら, 2000, Biologicals 28, 95-103に記載の方法を用いる）およびＴｒｉｔｏｎＮ−１０１などの先に記載のもの、または任意の２種以上の界面活性剤の組合せが挙げられる。
【００６６】
ウイルス成分ワクチンの製造方法には、いくつかの異なる濾過ステップおよび／または他の分離ステップ、例えば、種々の組合せで、超遠心ステップ、限外濾過ステップ、ゾーン遠心ステップ、およびクロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー）ステップ、ならびに場合により、ホルムアルデヒドもしくはβ−プロピオラクトンまたはＵＶを用いる不活化ステップが含まれてもよいが、これらは分割の前または後に実行可能である。分割法は、バッチ法、連続法、または半連続法として実行可能である。
【００６７】
本発明に係る好ましいインフルエンザウイルス成分ワクチン抗原調製物は、製造方法で残存した残留量のＴｗｅｅｎ８０および／またはＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むが、ウイルス成分抗原の調製後に、これらを添加してもよいし、それらの濃度を調整してもよい。好ましくは、Ｔｗｅｅｎ８０とＴｒｉｔｏｎＸ−１００の両方が存在する。ワクチン用量中のこれらの非イオン性サーファクタントの最終濃度の好ましい範囲は以下のとおりである：
Ｔｗｅｅｎ８０：０．０１〜１％、好ましくは約０．１％（ｖ／ｖ）
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００：０．００１〜０．１（％ｗ／ｖ）、より好ましくは０．００５〜０．０２％（ｗ／ｖ）。
【００６８】
あるいは、本発明に係るインフルエンザウイルス抗原調製物は、生インフルエンザウイルス以外の供与源から誘導することができ、例えば、ヘマグルチニン抗原を組換え手法により生成しうる。
【００６９】
次に、以下の実施例で本発明についてさらに説明するが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【００７０】
実施例１：保存剤不含ワクチン（チオメルサール低減ワクチン）のための安定剤としてα−コハク酸トコフェロールを用いたインフルエンザウイルス抗原調製物の調製
以下の手順にしたがって、一価ウイルス成分ワクチンを調製した。
【００７１】
ウイルス接種物の調製
発育卵への接種当日に、使用するシードロットを、０．５ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンスルフェートと２５μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン（ウイルス株に応じて異なる）とを含有するリン酸緩衝食塩水と混合することにより、新鮮な接種物を調製する。ウイルス接種物を２〜８℃に保持する。
【００７２】
発育卵への接種
９〜１１日齢の発育卵をウイルス複製に使用する。卵殻を除く。０．２ｍｌのウイルス接種物を卵に接種する。適切な温度（ウイルス株に応じて異なる）で接種卵を４８〜９６時間インキュベートする。インキュベーション時間の終了時に、冷却により胚を死滅させ、卵を２〜８℃で１２〜６０時間保存する。
【００７３】
採取
冷却した発育卵から尿膜液を採取する。通常、卵１個あたり８〜１０ｍｌの粗製尿膜液を採取する。
【００７４】
尿膜液からの全ウイルスの濃縮および精製
１．清澄化
採取した尿膜液を中速度の遠心（範囲：４０００〜１４０００ｇ）により清澄化する。
【００７５】
２．吸着ステップ
ＣａＨＰＯ４ゲルを含有する清澄化ウイルスプールを得るために、ＣａＨＰＯ４の最終濃度がウイルス株に応じて１．５ｇ〜３．５ｇＣａＨＰＯ４／リットルになるように０．５ｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４溶液および０．５ｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ２溶液を添加する。
【００７６】
少なくとも８時間かけて沈降させた後、上清を除去し、ＣａＨＰＯ４の使用量に応じて０．２６ｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−Ｎａ２溶液を添加することにより、インフルエンザウイルスを含有する沈降物を再び可溶化させる。
【００７７】
３．濾過
再懸濁させた沈降物を６μｍ濾過膜で濾過する。
【００７８】
４．スクロース勾配遠心
１００μｇ／ｍｌのチオメルサールを含有する線形スクロース勾配（０〜５５％（ｗ／ｖ））で等密度遠心を行うことにより、インフルエンザウイルスを濃縮する。流速は８〜１５リットル／時である。
【００７９】
遠心終了時に、ローターの内容物を４つの異なる画分で回収する（屈折計でスクロースを測定する）：
・画分１  ５５〜５２％スクロース
・画分２  約５２〜３８％スクロース
・画分３  ３８〜２０％スクロース＊
・画分４  ２０〜０％スクロース
＊ウイルス株に応じて異なる：画分３は１５％スクロースまで低下させることができる。
【００８０】
さらなるワクチン調製では、画分２および３のみを使用する。
【００８１】
スクロース含有率を約６％未満まで低下させるために、リン酸緩衝液を用いて透析濾過することにより画分３を洗浄する。この希釈画分中に存在するインフルエンザウイルスをペレット化して可溶性夾雑物を除去する。
【００８２】
ペレットを再懸濁し、十分に混合して均質懸濁液を得る。画分２と画分３の再懸濁ペレットとをプールし、リン酸緩衝液を添加して約４０リットルの体積にする。この生成物は、一価全ウイルス濃縮物である。
【００８３】
５．デオキシコール酸ナトリウムを用いるスクロース勾配遠心
一価全インフルエンザウイルス濃縮物をＥＮＩ−ＭａｒｋＩＩ超遠心機にかける。Ｋ３ローターは、線形スクロース勾配（０〜５５％（ｗ／ｖ））を有し、該勾配上にはさらにデオキシコール酸ナトリウム勾配が設けられている。分割中に、Ｔｗｅｅｎ８０を０．１％（ｗ／ｖ）まで存在させ、Ｂ型株ウイルスについてはコハク酸トコフェロールを０．５ｍＭまで添加する。最大デオキシコール酸ナトリウム濃度は、０．７〜１．５％（ｗ／ｖ）であり、株に応じて異なる。流速は８〜１５リットル／時である。
【００８４】
遠心終了時、ローターの内容物を３つの異なる画分で回収する（屈折計でスクロースを測定する）。さらなる処理では、画分２を使用する。画分を限定するスクロース含有率（４７〜１８％）は株によって異なり、評価後に確定される。
【００８５】
６．滅菌濾過
０．２μｍ膜で終了する複数の濾過膜でウイルス成分画分を濾過する。０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および（Ｂ型株ウイルスについては）０．５ｍＭコハク酸トコフェロールを含有するリン酸緩衝液を希釈に使用する。濾過画分２の最終体積は、もとの画分体積の５倍である。
【００８６】
７．不活化
濾過された一価物質を２２±２℃で長くとも８４時間インキュベートする（ウイルス株に応じて、このインキュベーションの時間を短縮することが可能である）。次に、全タンパク質含有量を最大２５０μｇ／ｍｌまで減少させるために、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含有するリン酸緩衝生理食塩水を添加する。Ｂ型株ウイルスに関しては、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．２５ｍＭコハク酸トコフェロールを含有するリン酸緩衝化生理食塩水を希釈のために使用し、総タンパク質含量が２５０μｇ／ｍｌとなるまで低減させる。最終濃度が５０μｇ／ｍｌになるようにホルムアルデヒドを添加し、２０℃±２℃で少なくとも７２時間かけて不活化を行う。
【００８７】
８．限外濾過
２０ｋＤａ  ＭＷＣＯの酢酸セルロース膜を備えた限外濾過装置で、不活化ウイルス成分物質を少なくとも２倍濃縮する。その後、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含有するリン酸緩衝液で洗浄し、続いて、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎを含有するリン酸緩衝食塩水で洗浄する。Ｂ型株ウイルスに関しては、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．１ｍＭコハク酸トコフェロールを含有するリン酸緩衝化食塩水を洗浄に使用する。
【００８８】
９．最終滅菌濾過
限外濾過後、０．２μｍ膜で終了する複数の濾過膜で物質を濾過する。濾過膜をすすぎ、タンパク質濃度が５００μｇ／ｍｌを超えないように、必要で有れば０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および（Ｂ型株ウイルスについては）０．１ｍＭコハク酸トコフェロールを含有するリン酸緩衝化食塩水を用いて希釈する。
【００８９】
１０．保存
一価最終バルクを２〜８℃で最大１８ヶ月間保存する。
【００９０】
安定性
2004527264.tif 000005
【００９１】
実施例２：チオメルサール低減ワクチンのための安定剤としてα−コハク酸トコフェロールを用いたインフルエンザワクチンの調製
３種の株Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ＩＶＲ−１１６、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）Ｒｅｓｖｉｒ−１７、およびＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８の一価最終バルクを、実施例１に記載の方法に従って生成した。
【００９２】
プーリング
Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ＩＶＲ−１１６、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）Ｒｅｓｖｉｒ−１７についてはそれぞれ３０μｇ／ｍｌ、Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８については３９μｇ／ｍｌの最終ＨＡ濃度になるように、適切な量の一価最終バルクをプールした。Ｔｗｅｅｎ８０およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００を、それぞれ５８０μｇ／ｍｌおよび９０μｇ／ｍｌに調整した。リン酸塩緩衝食塩水を用いて最終体積を３Ｌに調整した。三価プールに、０．８μｍ酢酸セルロース膜で完了する濾過を行い、三価最終バルクを得た。少なくとも０．５ｍＬの三価最終バルクをそれぞれのシリンジに充填した。
【００９３】
2004527264.tif 000006
【００９４】
実施例３：ヘマグルチニン含量を測定するために使用したＳＲＤ法
ガラスプレート（１２．４〜１０．０ｃｍ）を、ＮＩＢＳＣにより推奨されるある濃度の抗インフルエンザＨＡ血清を含むアガロースゲルで被覆する。ゲルを設置した後、アガロースに７２サンプルウエル（直径３ｍｍ）の穴をあける。基準およびサンプルの適当な希釈液１０μｇをウエルに入れる。プレートを湿潤チャンバー中で室温（２０〜２５℃）にて２４時間インキュベートする。その後、プレートをＮａＣｌ溶液中に一晩浸積し、蒸留水で簡単に洗浄する。続いて、ゲルを圧縮して乾燥する。完全に乾燥したら、プレートをクーマシーブリリアントブルー溶液で１０分間染色し、染色した領域が明瞭に特定できる程度に可視化されるまでメタノールおよび酢酸の混合物中で２回脱染色する。プレートを乾燥した後、抗原ウエルの周囲の染色された領域の直径を直角に二方向で測定する。あるいは、表面測定装置を使用してもよい。表面に対する抗原希釈液の用量応答曲線を作成し、標準的な傾斜比定量法（Finney, D.J. (1952). Statistical Methods in Biological Assay. London: Griffin, Quoted in: Wood, JM, et al (1977). J. Biol. Standard. 5, 237-247）に従って結果を算出した。
【００９５】
実施例４：α−トコフェロールで安定化したインフルエンザワクチン（チオメルサール低減）の臨床試験
実施例２に記載のように得たシリンジを臨床試験に使用した
Ｈ３Ｎ２：Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９  ＲＥＳＶＩＲ−１７
Ｈ１Ｎ１：Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ＩＶＲ−１１６
Ｂ：Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８
2004527264.tif 000007
【００９６】
この結果は、上記ワクチンが、保存剤としてチオメルサールを含有するワクチンと等価な防御を付与する能力を有することを示す。
【００９７】
実施例５ａ：チオメルサール低減ワクチンのための安定剤としてα−コハク酸トコフェロールを用いたインフルエンザウイルス抗原調製物の調製
以下の手順にしたがって、一価ウイルス成分ワクチンを調製した。
ウイルス接種物の調製
発育卵への接種当日に、使用するシードロットを、０．５ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンスルフェートと２５μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン（ウイルス株に応じて異なる）とを含有するリン酸緩衝食塩水と混合することにより、新鮮な接種物を調製する。ウイルス接種物を２〜８℃に保持する。
【００９８】
発育卵への接種
９〜１１日齢の発育卵をウイルス複製に使用する。卵殻を除く。０．２ｍｌのウイルス接種物を卵に接種する。適切な温度（ウイルス株に応じて異なる）で接種卵を４８〜９６時間インキュベートする。インキュベーション時間の終了時に、冷却により胚を死滅させ、卵を２〜８℃で１２〜６０時間保存する。
【００９９】
採取
冷却した発育卵から尿膜液を採取する。通常、卵１個あたり８〜１０ｍｌの粗製尿膜液を採取する。
【０１００】
尿膜液からの全ウイルスの濃縮および精製
清澄化
採取した尿膜液を中速度の遠心（範囲：４０００〜１４０００ｇ）により清澄化する。
【０１０１】
沈殿ステップ
飽和硫酸アンモニウム溶液を清澄化したウイルスプールに添加し、最終硫酸アンモニウム濃度を０．５ｍｏｌ／Ｌとする。少なくとも１時間かけて沈殿させた後、沈殿物を深部濾過膜（典型的には０．５μｍ）における濾過により取り出す。
【０１０２】
濾過
清澄化した粗全ウイルスバルクを、有効な滅菌膜（典型的には０．２μｍ）で終了する濾過膜上で濾過する。
【０１０３】
限外濾過
滅菌濾過した粗一価全ウイルスバルクは、１０００ｋＤａＭＷＣＯ  ＢＩＯＭＡＸＴＭ膜を備えたカセット上で少なくとも６倍に濃縮する。濃縮した保持物をリン酸緩衝生理食塩水で少なくとも１．８回洗浄する。
【０１０４】
スクロース勾配遠心
線形スクロース勾配（０．５５％（ｗ／ｖ））で等密度遠心を行うことにより、インフルエンザウイルスを濃縮する。流速は８〜１５リットル／時である。
【０１０５】
遠心終了時に、ローターの内容物を４つの異なる画分で回収する（屈折計でスクロースを測定する）：
・画分１  ５５〜５２％スクロース
・画分２  約５２〜３８％スクロース
・画分３  ３８〜２０％スクロース＊
・画分４  ２０〜０％スクロース
＊ウイルス株に応じて異なる：画分３は１５％スクロースまで低下させることができる。
【０１０６】
さらなるワクチン調製では、画分２のみを使用するか、または画分２をさらに精製した画分３と一緒に使用する。
【０１０７】
スクロース含有率を約６％未満まで低下させるために、リン酸緩衝液を用いて透析濾過することにより画分３を洗浄する。場合によってはこのステップを省略してもよい。この希釈画分中に存在するインフルエンザウイルスをペレット化して可溶性夾雑物を除去する。
【０１０８】
ペレットを再懸濁し、十分に混合して均質懸濁液を得る。画分２と画分３の再懸濁ペレットとをプールし、リン酸緩衝液を添加して約４０リットルの体積にする。この生成物は、一価全ウイルス濃縮物である。
【０１０９】
デオキシコール酸ナトリウムを用いるスクロース勾配遠心
一価全インフルエンザウイルス濃縮物をＥＮＩ−ＭａｒｋＩＩ超遠心機にかける。Ｋ３ローターは、線形スクロース勾配（０〜５５％（ｗ／ｖ））を有し、該勾配上にはさらにデオキシコール酸ナトリウム勾配が設けられている。分割中に、Ｔｗｅｅｎ８０を０．１％（ｗ／ｖ）まで存在させ、Ｂ型株ウイルスについてはコハク酸トコフェロールを０．５ｍＭまで添加する。最大デオキシコール酸ナトリウム濃度は、０．７〜１．５％（ｗ／ｖ）であり、株に応じて異なる。流速は８〜１５リットル／時である。
【０１１０】
遠心終了時、ローターの内容物を３つの異なる画分で回収する（屈折計でスクロースを測定する）。さらなる処理では、画分２を使用する。画分を限定するスクロース含有率（４７〜１８％）は株によって異なり、評価後に確定される。
【０１１１】
滅菌濾過
０．２μｍ膜で終了する複数の濾過膜でウイルス成分画分を濾過する。０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および（Ｂ型株については）０．５ｍＭコハク酸トコフェロールを含有するリン酸緩衝液を希釈に使用する。濾過画分２の最終体積は、もとの画分体積の５倍である。
【０１１２】
不活化
濾過された一価物質を２２±２℃で長くとも８４時間インキュベートする（ウイルス株に応じて、このインキュベーションの時間を短縮することが可能である）。次に、全タンパク質含有量を最大４５０μｇ／ｍｌまで減少させるために、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含有するリン酸緩衝液を添加する。Ｂ型株に関しては、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．２５ｍＭコハク酸トコフェロールを含有するリン酸緩衝化生理食塩水を希釈のために使用し、総タンパク質含量が４５０μｇ／ｍｌとなるまで低減させる。最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるようにホルムアルデヒドを添加し、２０℃±２℃で少なくとも７２時間かけて不活化を行う。
【０１１３】
限外濾過
２０ｋＤａ  ＭＷＣＯの酢酸セルロース膜を備えた限外濾過装置で、不活化ウイルス成分物質を少なくとも２倍濃縮する。その後、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含有するリン酸緩衝液で洗浄し、続いて、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎを含有するリン酸緩衝食塩水で洗浄する。Ｂ型株ウイルスに関しては、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．１ｍＭコハク酸トコフェロールを含有するリン酸緩衝化食塩水を洗浄に使用する。
【０１１４】
最終滅菌濾過
限外濾過後、０．２μｍ膜で終了する複数の濾過膜で物質を濾過する。濾過膜をすすぎ、タンパク質濃度が５００μｇ／ｍｌを超えないように、必要で有れば０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０およびＢ型株ウイルスについては０．１ｍＭコハク酸トコフェロールを含有するリン酸緩衝化食塩水を用いて希釈する。
【０１１５】
保存
一価最終バルクを２〜８℃で最大１８ヶ月間保存する。
【０１１６】
安定性
2004527264.tif 000008
【０１１７】
実施例５ｂ：チオメルサール非含有ワクチンのための安定剤としてα−コハク酸トコフェロールを用いたインフルエンザウイルス抗原調製物の調製
実施例５ａに記載した方法の好ましい変法は以下の通りである。
【０１１８】
全ウイルスを採取した後、沈殿ステップ（硫酸アンモニウム沈殿）を行う。この後、液体を中速度の遠心分離（４０００〜１４０００ｇ）で清澄化する清澄化ステップを行う。従って、沈殿ステップと清澄化ステップの順序は実施例５ａと比べて逆の順序である。
【０１１９】
滅菌濾過、限外濾過、および超遠心分離（スクロース勾配遠心分離）ステップは、実施例５ａと同様に行う。しかしながら、超遠心分離ステップから得られた画分を再処理するステップは必要ではない。
【０１２０】
プロセスにおける残りのステップは実施例５ａに記載の通りである。
【０１２１】
従って、本実施例におけるプロセスの概要は以下の通りである：
採取
沈殿（硫酸アンモニウム）
清澄化
滅菌濾過
限外濾過
超遠心分離
分割（好ましくはデオキシコール酸ナトリウム）
滅菌濾過
不活化
限外濾過
最終滅菌濾過
【０１２２】
実施例５ａの他の好ましい別法には、最初の滅菌濾過前の前濾過ステップが含まれる。これは、滅菌フィルターではない膜を使用するが、滅菌濾過前に混入物（例えばアルブミン）を除去することが可能になる。このステップにより、収率がより良好となる。前濾過に好適な膜は、約０．８μｍ〜約１．８μｍ、好ましくは１．２μｍである。前濾過ステップは、実施例５ａまたは実施例５ｂのスキームにおいて用いることができる。
【０１２３】
実施例６：チオメルサール非含有ワクチンのための安定剤としてα−コハク酸トコフェロールを用いたインフルエンザワクチンの調製
３種の株Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ＩＶＲ−１１６、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）Ｒｅｓｖｉｒ−１７、およびＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８の一価最終バルクを、実施例５に記載の方法に従って生成した。
【０１２４】
プーリング
Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ＩＶＲ−１１６、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）Ｒｅｓｖｉｒ−１７についてはそれぞれ３０μｇ／ｍｌ、Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９７については３６μｇ／ｍｌの最終ＨＡ濃度になるように、適切な量の一価最終バルクをプールした。Ｔｗｅｅｎ８０およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００を、それぞれ５８０μｇ／ｍｌおよび９０μｇ／ｍｌに調整した。リン酸塩緩衝食塩水を用いて最終体積を３Ｌに調整した。三価プールを、０．８μｍ酢酸セルロース膜で完了する濾過を行い、三価最終バルクを得た。少なくとも０．５ｍＬの三価最終バルクをそれぞれのシリンジに充填した。
【０１２５】
2004527264.tif 000009
【０１２６】
実施例７：保存剤非含有ワクチン（チオメルサール低減ワクチン）のための安定化剤としてラウリル硫酸ナトリウムを用いたインフルエンザウイルス抗原調製物の調製
Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９の一価全ウイルス濃縮物は、実施例１に記載のように得た。
【０１２７】
デオキシコール酸ナトリウムを用いるスクロース勾配遠心
一価全インフルエンザウイルス濃縮物をＥＮＩ−ＭａｒｋＩＩ超遠心機にかける。Ｋ３ローターは、線形スクロース勾配（０．５５％（ｗ／ｖ））を有し、該勾配上にはさらにデオキシコール酸ナトリウム勾配が設けられている。分割中に、Ｔｗｅｅｎ８０を０．１％（ｗ／ｖ）まで存在させる。最大デオキシコール酸ナトリウム濃度は、０．７〜１．５％（ｗ／ｖ）であり、株に応じて異なる。流速は８〜１５リットル／時である。
【０１２８】
遠心終了時、ローターの内容物を３つの異なる画分で回収する（屈折計でスクロースを測定する）。さらなる処理では、画分２を使用する。画分を限定するスクロース含有率（４７〜１８％）は株によって異なり、評価後に確定される。
【０１２９】
滅菌濾過
画分２のサンプル１０ｍｌをさらなる処理のために取り出した。このウイルス成分画分を０．２μｍ膜で終了する複数の濾過膜で濾過する。０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．５ｍＭラウリル硫酸ナトリウムを含有するリン酸緩衝液を希釈に使用する。濾過画分２の最終体積は、もとの画分体積の５倍である。
【０１３０】
不活化
濾過された一価物質を２２±２℃で長くとも８４時間インキュベートする（ウイルス株に応じて、このインキュベーションの時間を短縮することが可能である）。次に、総タンパク質含有量を最大２５０μｇ／ｍｌまで減少させるために、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ８０および０．５ｍＭラウリル硫酸ナトリウムを含有するリン酸緩衝生理食塩水を添加する。最終濃度が５０μｇ／ｍｌになるようにホルムアルデヒドを添加し、２０℃±２℃で少なくとも７２時間かけて不活化を行う。
【０１３１】
限外濾過
２０ｋＤａ  ＭＷＣＯの酢酸セルロース膜を備えた限外濾過装置で、不活化ウイルス成分物質を少なくとも２倍濃縮する。その後、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．５ｍＭラウリル硫酸ナトリウムを含有する４倍量のリン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。
【０１３２】
最終滅菌濾過
限外濾過後、０．２μｍ膜で終了する複数の濾過膜で物質を濾過する。濾過膜をすすぎ、所要により、タンパク質濃度が１，０００μｇ／ｍｌを超えないようにかつヘマグルチニン濃度が１８０μｇ／ｍｌを超えるように、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．５ｍＭラウリル硫酸ナトリウムを含有するリン酸緩衝生理食塩水で物質を希釈する。
【０１３３】
保存
一価最終バルクを２〜８℃で保存する。
【０１３４】
2004527264.tif 000010
【０１３５】
実施例８：保存剤非含有ワクチン（チオメルサール低減ワクチン）のための安定剤としてＰｌａｎｔａｃａｒｅまたはＬａｕｒｅｔｈ−９を用いたインフルエンザウイルス抗原調製物の調製
実施例１に記載のようにしてＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８の一価全ウイルス濃縮物を得た。
【０１３６】
断片化
一価全インフルエンザウイルス濃縮物をリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）でタンパク質濃度が１，０００μｇ／ｍｌとなるよう希釈する。Ｐｌａｎｔａｃａｒｅ（登録商標）２０００ＵＰまたはＬａｕｒｅｔｈ−９のいずれかを最終濃度１％（ｗ／ｖ）となるよう添加する。この物質を３０分間穏やかに混合する。続いて、この物質をバケット中のスクロースクッション上に積層する（１５％（ｗ／ｗ））。ＢｅｃｋｍａｎスウィングアウトローターＳＷ２８において２５，０００ｒｐｍおよび２０℃にて限外濾過を２時間行った。
【０１３７】
滅菌濾過
上清をさらなる処理のために取り出した。このウイルス成分画分を０．２μｍ膜で終了する複数の濾過膜で濾過する。
【０１３８】
不活化
必要であれば、全タンパク質含有量を最大５００μｇ／ｍｌまで減少させるために、リン酸緩衝生理食塩水を添加する。最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるようにホルムアルデヒドを添加し、２０℃±２℃で少なくとも６日かけて不活化を行う。
【０１３９】
限外濾過
不活化物質中のＴｗｅｅｎ８０およびＴｒｉｔｏｎＸ１００をそれぞれ０．１５％および０．０２％に調整する。３０ｋＤａ  ＭＷＣＯの酢酸セルロース膜を備えた限外濾過装置で、不活化ウイルス成分物質を少なくとも２倍濃縮する。その後、４倍量のリン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。
【０１４０】
最終滅菌濾過
限外濾過後、０．２μｍ膜で終了する複数の濾過膜で物質を濾過する。濾過膜をすすぎ、タンパク質濃度が５００μｇ／ｍｌを超えないように、リン酸塩緩衝食塩水で物質を希釈する。
【０１４１】
保存
一価最終バルクを２〜８℃で保存する。
2004527264.tif 000011
【０１４２】
実施例９：ＩＤまたはＩＭ投与による高齢者におけるα−トコフェロール安定化インフルエンザワクチン（チオメルサール低減）の臨床試験
Ａ．インフルエンザウイルス抗原調製物の調製
以下の手順にしたがって、一価ウイルス成分ワクチンを調製した。
【０１４３】
ウイルス接種物の調製
発育卵への接種当日に、使用するシードロットを、０．５ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンスルフェートと２５μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン（ウイルス株に応じて異なる）とを含有するリン酸緩衝食塩水と混合することにより、新鮮な接種物を調製する。ウイルス接種物を２〜８℃に保持する。
【０１４４】
発育卵への接種
９〜１１日齢の発育卵をウイルス複製に使用する。卵殻を除く。０．２ｍｌのウイルス接種物を卵に接種する。適切な温度（ウイルス株に応じて異なる）で接種卵を４８〜９６時間インキュベートする。インキュベーション時間の終了時に、冷却により胚を死滅させ、卵を２〜８℃で１２〜６０時間保存する。
【０１４５】
採取
冷却した発育卵から尿膜液を採取する。通常、卵１個あたり８〜１０ｍｌの粗製尿膜液を採取する。
【０１４６】
尿膜液からの全ウイルスの濃縮および精製
１．清澄化
採取した尿膜液を中速度の遠心（範囲：４０００〜１４０００ｇ）により清澄化する。
【０１４７】
２．吸着ステップ
ＣａＨＰＯ４ゲルを含有する清澄化ウイルスプールを得るために、ＣａＨＰＯ４の最終濃度がウイルス株に応じて１．５ｇ〜３．５ｇＣａＨＰＯ４／リットルになるように０．５ｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４溶液および０．５ｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ２溶液を添加する。
【０１４８】
少なくとも８時間かけて沈降させた後、上清を除去し、ＣａＨＰＯ４の使用量に応じて０．２６ｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−Ｎａ２溶液を添加することにより、インフルエンザウイルスを含有する沈降物を再び可溶化させる。
【０１４９】
３．濾過
再懸濁させた沈降物を６μｍ濾過膜で濾過する。
【０１５０】
４．スクロース勾配遠心
１００μｇ／ｍｌのチオメルサールを含有する線形スクロース勾配（０．５５％（ｗ／ｖ））で等密度遠心を行うことにより、インフルエンザウイルスを濃縮する。流速は８〜１５リットル／時である。
【０１５１】
遠心終了時に、ローターの内容物を４つの異なる画分で回収する（屈折計でスクロースを測定する）：
・画分１  ５５〜５２％スクロース
・画分２  約５２〜３８％スクロース
・画分３  ３８〜２０％スクロース＊
・画分４  ２０〜０％スクロース
＊ウイルス株に応じて異なる：画分３は１５％スクロースまで低下させることができる。
【０１５２】
さらなるワクチン調製では、画分２および３のみを使用する。
【０１５３】
スクロース含有率を約６％未満まで低下させるために、リン酸緩衝液を用いて透析濾過することにより画分３を洗浄する。この希釈画分中に存在するインフルエンザウイルスをペレット化して可溶性夾雑物を除去する。
【０１５４】
ペレットを再懸濁し、十分に混合して均質懸濁液を得る。画分２と画分３の再懸濁ペレットとをプールし、リン酸緩衝液を添加して約４０リットル（卵１２，０００個／バッチに適した体積）の体積にする。この生成物は、一価全ウイルス濃縮物である。
【０１５５】
５．デオキシコール酸ナトリウムを用いるスクロース勾配遠心
一価全インフルエンザウイルス濃縮物をＥＮＩ−ＭａｒｋＩＩ超遠心機にかける。Ｋ３ローターは、線形スクロース勾配（０．５５％（ｗ／ｖ））を有し、該勾配上にはさらにデオキシコール酸ナトリウム勾配が設けられている。分割中に、Ｔｗｅｅｎ８０を０．１％（ｗ／ｖ）まで存在させ、Ｂ型株ウイルスに対して０．５ｍＭまでのトコフェロールスクシネートを添加する。最大デオキシコール酸ナトリウム濃度は、０．７〜１．５％（ｗ／ｖ）であり、株に応じて異なる。流速は８〜１５リットル／時である。
【０１５６】
遠心終了時、ローターの内容物を３つの異なる画分で回収する（屈折計でスクロースを測定する）。さらなる処理では、画分２を使用する。画分を限定するスクロース含有率（４７〜１８％）は株によって異なり、評価後に確定される。
【０１５７】
６．滅菌濾過
０．２μｍ膜で終了する複数の濾過膜でウイルス成分画分を濾過する。０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および（Ｂ型株ウイルスに対しては０．５ｍＭトコフェロールスクシネート）を含有するリン酸緩衝液を希釈に使用する。濾過画分２の最終体積は、もとの画分体積の５倍である。
【０１５８】
７．不活化
濾過された一価物質を２２±２℃で長くとも８４時間インキュベートする（ウイルス株に応じて、このインキュベーションの時間を短縮することが可能である）。次に、全タンパク質含有量を最大２５０μｇ／ｍｌまで減少させるために、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ８０を含有するリン酸緩衝生理食塩水を添加する。Ｂ型株ウイルスについては、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．２５ｍＭトコフェロールスクシネートを含有するリン酸緩衝食塩水を希釈に利用して、全タンパク質含有量を２５０μｇ／ｍｌまで減少させる。最終濃度が５０μｇ／ｍｌになるようにホルムアルデヒドを添加し、２０℃±２℃で少なくとも７２時間かけて不活化を行う。
【０１５９】
８．限外濾過
２０ｋＤａ  ＭＷＣＯの酢酸セルロース膜を備えた限外濾過装置で、不活化ウイルス成分物質を少なくとも２倍濃縮する。その後、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含有するリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、続いて、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎを含有するリン酸緩衝食塩水で洗浄する。Ｂ型株ウイルスについては、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．１ｍＭコハク酸トコフェロールを含有するリン酸緩衝食塩水を用いて洗浄する。
【０１６０】
９．最終滅菌濾過
限外濾過後、０．２μｍ膜で終了する複数の濾過膜で物質を濾過する。濾過膜をすすぎ、所要により、タンパク質濃度が１，０００μｇ／ｍｌを超えないようにかつヘマグルチニン濃度が１８０μｇ／ｍｌを超えるように、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および（Ｂ型株ウイルスに対しては）０．１ｍＭコハク酸トコフェロールを含有するリン酸塩緩衝食塩水で物質を希釈する。
【０１６１】
１０．保存
一価最終バルクを２〜８℃で最大１８ヶ月間保存する。
【０１６２】
Ｂ．インフルエンザワクチンの調製
３種の株Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｄｏｎｉａ／２０／９９  （Ｈ１Ｎ１）  ＩＶＲ−１１６、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９  （Ｈ３Ｎ２）  Ｒｅｓｖｉｒ−１７、およびＢ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９の一価最終バルクを、上記Ａ項に記載の方法に従って作製した。
【０１６３】
プーリング
Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ＩＶＲ−１１６、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）Ｒｅｓｖｉｒ−１７についてはそれぞれ６０μｇ／ｍｌ、Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９については６８μｇ／ｍｌの最終ＨＡ濃度になるように、適切な量の一価最終バルクをプールした。Ｔｗｅｅｎ８０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、およびコハク酸トコフェロールを、それぞれ１，０００μｇ／ｍｌ、１１０μｇ／ｍｌ、および１６０μｇ／ｍｌに調整した。リン酸塩緩衝食塩水を用いて最終体積を３Ｌに調整した。三価プールを、０．８μｍ酢酸セルロース膜で完了する濾過を行い、三価最終バルクを得た。少なくとも０．１６５ｍＬの三価最終バルクをそれぞれのシリンジに充填した。
【０１６４】
ワクチン投与
充填済みシリンジでワクチンを供給し、三角筋部に皮内投与した。皮内（ＩＤ）針は、ＥＰ１０９２４４４号に記載のものであり、適切な皮内注射が行えるように皮膚侵入リミッターを備えていた。注射部位に膨疹（丘疹）が形成されればＩＤ投与の質が良くなるので、試験者は、ワクチン接種の３０分後に被験体の膨疹の正確なサイズを測定した。
【０１６５】
単回用量（１００μｌ）は以下の成分を含んだ：
2004527264.tif 000012
【０１６６】
Ｂ  上記のワクチンを標準的な三価インフルエンザウイルス成分ワクチンＦｌｕａｒｉｘＴＭと比較した。Ｆｌｕａｒｉｘワクチンを充填済みシリンジで供給し、三角筋に筋肉内投与した。適切な皮内注射が行えるように、少なくとも２．５ｃｍ／１インチの長さの針（２３ゲージ）を使用した。
【０１６７】
単回用量（０．５ｍｌ）は以下の成分を含んだ：
2004527264.tif 000013
【０１６８】
結果
ワクチン投与時における全コホートの平均年齢は、７０．４±６．２（標準偏差（Ｓ．Ｄ．））歳であり、女性／男性の比は１．７：１であった。
【０１６９】
2004527264.tif 000014
【０１７０】
注射部位疼痛が６５名中１０名（１５．４％）のワクチン被接種者により報告されたが、これはＦｌｕａｒｉｘＴＭのＩＭ投与後のごく一般的な症状であった。ＩＤグループでは、６５名中３名（４．６％）のワクチン被接種者により疼痛が報告された。この差は統計的に有意であった（ｐ＝０．０３８；フィッシャーの精密検定）。したがって、チオメルサール低減製品のＩＤ送達が好ましい。
【０１７１】
結論
チオ低減インフルエンザワクチンの高齢者集団におけるＩＤおよびＩＭ投与の両方が１００％の血清防御を達成することができる。
【０１７２】
幾何平均力価、血清防御率、セロコンバージョン率、およびコンバージョン係数に関して、ＩＭおよびＩＤワクチン接種された個体で、ワクチン接種に対する同等の応答が見いだされた。ただし、ＩＤグループには１／２．５の抗原を接種した。
【０１７３】
２つの処置グループには、ワクチンに関連した応答型／非応答型全身症状の全体的な発生率に関して識別可能な差は見られなかった。
【０１７４】
実施例１０：チオメルサール低減インフルエンザワクチンの皮内送達
実施例９に記載したように調製した（ただし、プーリングは独立して行い、ワクチンはシリンジに充填しなかった）チオメルサール低減インフルエンザウイルス成分ワクチンの免疫原性を、標準針を用いてモルモットにＩＤ送達を行うことにより評価した。
【０１７５】
５匹からなる各グループに対し、総量２００μｌで各ＨＡ５μｇを含む不活化三価インフルエンザ全ウイルスを用いて鼻腔内投与により初回抗原刺激を行った。初回抗原刺激から２８日目に腹腔内または筋肉内経路のいずれかで動物にワクチン接種を行った。皮下投与は、０．１ｍｌ中に０．１、０．３、または１．０μｇの三価チオメルサール低減インフルエンザウイルス成分を含むものであり、これを標準針を用いてモルモットの背に投与した。筋肉内投与は、１．０μｇの三価チオメルサール低減インフルエンザウイルス成分を含むものであり、この容量０．１ｍｌをモルモットの後肢に投与した。グループは以下の通りである：
グループ１：０．１μｇの三価チオメルサール低減ウイルス成分インフルエンザ（ｓｐｌｉｔ  Ｆｌｕ）ＩＤ
グループ２：０．３μｇの三価チオメルサール低減ｓｐｌｉｔ  Ｆｌｕ  ＩＤ
グループ３：１．０μｇの三価チオメルサール低減ｓｐｌｉｔ  Ｆｌｕ  ＩＤ
グループ４：１．０μｇの三価チオメルサール低減ｓｐｌｉｔ  Ｆｌｕ  ＩＭ
【０１７６】
ワクチン接種後１４日目に動物から採血し、ワクチン接種により誘導された抗体力価を標準ヘマグルチニン阻害アッセイ（ＨＩ）を用いて評価した。結果を図１に示す。３つの株全てに対する強力なＨＩ応答がワクチン接種により誘導された。用量応答ははっきりとは認められなかったが、このことは、非常に低量のチオメルサール低減抗原であっても、ＩＤ経路により投与した場合に非常に強力なＨＩ抗体応答を誘導しうることを示唆している。ＩＤまたはＩＭワクチン接種により誘導されたＨｉ力価には有意差がなかった。従って、モルモットで得られた結果は、チオメルサール低減三価ウイルス成分インフルエンザ抗原が、ＩＭ経路と比較してＩＤ経路により送達された場合に動物におけるＨＩ抗体のレベルを同様に誘導することを実証する。
【０１７７】
実施例１１：チオメルサール低減アジュバント添加インフルエンザワクチンの皮内送達プロトコール
０日目に２００μ１中の５μｇの三価不活化インフルエンザ全ウイルスを用いてモルモットに鼻腔内抗原刺激を行った。
【０１７８】
ワクチン接種（２８日目）
プーリングステップにより得られた各抗原の最終濃度が、実施例９では６０μｇ／ｍｌであるのに対して１００μｌ中０．１μｇの用量になるよう１．０μｇ／ｍｌにしたこと以外は、実施例９に記載されているように、三価インフルエンザウイルス成分ワクチン１株あたり０．１μｇのＨＡを含有するワクチンを調製した。ツベルクリンシリンジを用いて、１００μｌのアジュバント添加またはアジュバント非添加の最終三価製剤を皮内投与した。
【０１７９】
採血（４２日目）
ＨＩアッセイにより抗体応答を測定することにより、アジュバント添加の効果を評価した（０、２８、４２日目）。
【０１８０】
ＩＤ実験は全て、標準針を用いて行った。
【０１８１】
結果
Ｇ１〜Ｇ５は、１グループあたり５匹のモルモットからなる５つのグループを表す：
Ｇ１  ウイルス成分  三価  チオメルサール低減  ０．１μｇ
Ｇ２  ウイルス成分  三価  チオ低減  ０．１μｇ＋３Ｄ−ＭＰＬ  ５０μｇ
Ｇ３  ウイルス成分  三価  チオ低減  ０．１μｇ＋３Ｄ−ＭＰＬ  １０μｇ
Ｇ４  ウイルス成分  三価  チオ低減  ０．１μｇ＋３Ｄ−ＭＰＬｉｎ  ５０μｇ＋ＱＳ２１  ５０μｇ
Ｇ５  ウイルス成分  三価  チオ低減  ０．１μｇ＋３Ｄ−ＭＰＬｉｎ  １０μｇ＋ＱＳ２１  １０μｇ
【０１８２】
注記）３Ｄ−ＭＰＬｉｎ＋ＱＳ２１は、コレステロールを含む単ラメラ小胞を備えたアジュバント製剤であって、該単ラメラ小胞は、ジオレオイルホスファチジルコリンを含む脂質二重層を有し、ＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬは、脂質二重層と会合しているかまたはその中に包埋されているものである。そのようなアジュバント製剤については、ＥＰ０８２２８３１Ｂに記載されている。その開示内容は参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０１８３】
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【０１８４】
従って、アジュバント添加またはアジュバント非添加のいずれでもチオメルサール低減三価ウイルス成分インフルエンザ抗原は強力な免疫原であり、ＩＤまたはＩＭ経路で投与されると強力なＨＩ応答を誘導しうる。これらの応答は、標準的なＦｌｕａｒｉｘ調製物により誘導される応答と少なくとも同程度の効力であると考えられる。
【０１８５】
実施例１２：ブタに皮内送達したチオメルサール含有およびチオメルサール非含有ワクチンの比較
ＩＤ経路により投与したウイルス成分インフルエンザワクチン（チオメルサール含有および非含有）の免疫原性を評価するために、初回刺激したブタモデルを使用した。集団の大部分はインフルエンザによる少なくとも１回の感染を経験しているため、インフルエンザワクチンは、既存の免疫応答を高める（追加免疫）ものである必要がある。従って、ヒトにおける状況を最良に模擬するための試みにおいて動物を免疫刺激した。
【０１８６】
この実験においては、４週令のブタを鼻内経路により免疫刺激した。それぞれ５匹の動物からなる６つのグループは以下のように免疫した：
グループ１：０日目および１４日目に三価不活化全ウイルスの２回の免疫（５０μｇ各ＨＡ）；グループ２：０日目および１４日目に三価不活化全ウイルスの２回の免疫（５０μｇ各ＨＡ）；グループ３：０日目に三価不活化全ウイルスの１回の免疫（５０μｇ各ＨＡ）；グループ４：０日目および１４日目に三価不活化全ウイルスの２回の免疫（２５μｇ各ＨＡ）；グループ５：０日目に三価不活化全ウイルスの１回の免疫（２５μｇ各ＨＡ）；グループ６：０日目および１４日目に三価不活化全ウイルスの２回の免疫（１２．５μｇ各ＨＡ）。
【０１８７】
最終免疫後２８日目に、１００μｌ中３μｇの各ＨＡ三価ウイルス成分抗原（Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ  Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｐａｎａｍａ  Ｈ３Ｎ２、およびＢ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ）をＩＤ経路により動物にワクチン接種した。グループ１には、チオメルサール保存剤を含有する標準ＦｌｕａｒｉｘＴＭをワクチン抗原として投与した。他のグループには全て保存剤非含有抗原を投与した。
【０１８８】
この実験で得られたＨＩの結果を図２に示す（種々の抗原用量で初回免疫し、３μｇの三価インフルエンザ抗原±チオメルサールを皮内経路によりワクチン接種したブタにおいて誘導された抗インフルエンザ血球凝集阻害力価）。
【０１８９】
この実験では、Ｂ型株に対して比較的低いＨＩ力価が誘導され、Ａ／Ｈ３Ｎ２に対するバックグラウンドは高い。ワクチン接種に対する応答に関して有益な効果は、初回免疫用量を低減した場合に観察された。ほぼ全ての事例において、抗原濃度または初回投与回数（５０μｇでの２回の免疫刺激）を低減することによって、ワクチン接種に対する応答が高まった。５０μｇで２回免疫刺激したグループ１および２の動物のワクチン接種に対する応答は、それほど顕著ではなかったが、保存剤非含有抗原（グループ２）がこれらの状況下で少なくともＦｌｕａｒｉｘＴＭ（グループ１）と同程度に機能したことがわかる。別の免疫刺激した動物（グループ３〜６）においてはＩＤ経路により保存剤非含有三価インフルエンザ抗原を用いたワクチン接種に対する強力な応答が明らかであり、この応答はＢ型株においても観察されたが、ＨＩ力価は低いままである。
【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１】標準ヘマグルチニン阻害アッセイ（ＨＩ）を用いて評価した、ワクチン接種により誘導された抗体力価を示す。
【図２】３μｇの三価インフルエンザ抗原±チオメルサールを皮内経路によりワクチン接種したブタにおいて誘導された抗インフルエンザ血球凝集阻害力価を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年8月11日(2003.8.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオメルサールの不在下または低レベルのチオメルサールの存在下で安定化されたヘマグルチニン抗原を含む不活化インフルエンザウイルス調製物であって、該ヘマグルチニンがＳＲＤアッセイにより検出可能なものであり、該調製物がＨＡを安定化させるために十分な量のα−コハク酸トコフェロールを含む、上記不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項２】
α−コハク酸トコフェロールが１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１記載の不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項３】
α−コハク酸トコフェロールが１０〜５００μｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項２記載の不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項４】
インフルエンザウイルス抗原調製物が、ウイルス成分抗原調製物、サブユニット抗原、化学的に又はその他により不活化された全ウイルスからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項５】
インフルエンザ抗原調製物がウイルス成分抗原調製物である、請求項４記載の不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項６】
Ａ型株及びＢ型株ヘマグルチニンの両者を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項７】
三価インフルエンザウイルス調製物である、請求項６記載の不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項８】
安定化Ｂ型株インフルエンザＨＡを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の不活化インフルエンザウイルス調製物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のインフルエンザウイルス調製物を含むインフルエンザワクチン。
【請求項１０】
インフルエンザの株又は各株に対するヘマグルチニン抗原の濃度が、ＳＲＤアッセイにより検出した場合に１〜１０００μｇ／ｍｌである、請求項９記載のインフルエンザワクチン。
【請求項１１】
さらにアジュバントを含む、請求項９又は１０記載のインフルエンザワクチン。
【請求項１２】
安定ヘマグルチニン抗原の調製方法であって、α−トコフェロールまたはα−コハク酸トコフェロールなどのその誘導体の存在下にて抗原を精製することを含む、上記方法。
【請求項１３】
被験者におけるインフルエンザ感染症又は疾患の予防方法であって、該被験者に請求項９〜１１のいずれか１項に記載のワクチンを投与することを含む、上記方法。
【請求項１４】
ワクチン送達が、皮内、鼻内、筋肉内、経口又は皮下送達である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
インフルエンザワクチンの製造におけるヘマグルチニン安定化剤としてのα−トコフェロール又はコハク酸塩の使用。
【国際調査報告】
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2004527264.tif 000074
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