(57)【要約】本発明は、Ｂ７様（Ｂ７−Ｌ）ポリペプチドおよびこれをコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、Ｂ７−Ｌポリペプチドを産生するための選択的結合因子、ベクター、宿主細胞、および方法を提供する。本発明はさらに、Ｂ７−Ｌポリペプチドに関連する疾患、障害、および状態の診断、処置、改善、および／または予防のための薬学的組成物および方法を提供する。Ｂ７−Ｌアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドもまた、提供される。本発明はまた、本明細書中に示されるような単離された核酸分子を含む発現ベクター、本明細書中に示されるような組換え核酸分子を含む組換え宿主細胞、およびＢ７−Ｌポリペプチドを産生する方法を提供し、この方法は、この宿主細胞を培養する工程、および必要に応じてそのように産生されたポリペプチドを単離する工程を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１または配列番号１３のいずれかに示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のいずれかの相補体に、中程度または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；および
（ｄ）（ａ）または（ｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドに少なくとも約７０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該コードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１または配列番号１３のいずれかに示されるヌクレオチド配列、あるいは（ａ）の、対立遺伝子改変体またはスプライス改変体をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１または配列番号１３のいずれかのヌクレオチド配列、（ａ）、あるいは（ｂ）の領域であって、ここで、該ポリペプチドフラグメントは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるコードされたポリペプチドの活性を有するか、あるいは抗原性である、ヌクレオチド配列の領域；
（ｄ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１または配列番号１３のいずれかのヌクレオチド配列、あるいは（ａ）〜（ｃ）いずれかの領域；
（ｅ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｄ）のいずれかの相補体にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｆ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項３】
単離された核酸分子であって、以下；
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該コードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該コードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該コードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該コードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮、およびＮ末端短縮からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該コードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む（ａ）〜（ｅ）のいずれかのヌクレオチド配列；
（ｇ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｆ）のいずれかの相補体にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項４】
請求項１、請求項２または請求項３のいずれかに記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６】
真核生物細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
原核生物細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項８】
Ｂ７−Ｌポリペプチドを産生するプロセスであって、該ポリペプチドを発現するために適切な条件下で請求項５に記載の宿主細胞を培養する工程、および必要に応じて、該培養物から該ポリペプチドを単離する工程を包含する、プロセス。
【請求項９】
請求項８に記載のプロセスによって産生される、ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項８に記載のプロセスであって、ここで、前記核酸分子が、前記Ｂ７−ＬポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結された、ネイティブなＢ７−Ｌポリペプチドに対するプロモーターＤＮＡ以外のプロモーターＤＮＡを含む、プロセス。
【請求項１１】
請求項２に記載の単離された核酸分子であって、ここで、同一性パーセントは、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔ、およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムからなる群より選択されるコンピュータープログラムを用いて決定される、単離された核酸分子。
【請求項１２】
化合物がＢ７−Ｌポリペプチド活性またはＢ７−Ｌポリペプチド産生を阻害するか否かを決定するためのプロセスであって、請求項５、請求項６、または請求項７のいずれかに記載の細胞を該化合物に曝露する工程、および該細胞におけるＢ７−Ｌポリペプチド活性またはＢ７−Ｌポリペプチド産生を測定する工程を包含する、プロセス。
【請求項１３】
単離されたポリペプチドであって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかのオルソログに対するアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列であって、ここで、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基を含む配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、ここで、該フラグメントは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有するか、あるいは抗原性である、フラグメント；ならびに
（ｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるアミノ酸配列、（ａ）または（ｃ）の、対立遺伝子改変体またはスプライス改変体のアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；ならびに
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮、およびＮ末端短縮からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１、請求項２、または請求項３のいずれかに記載の核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１４に記載の単離されたポリペプチドであって、ここで、同一性パーセントは、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔ、およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムからなる群より選択されるコンピュータープログラムを用いて決定される、単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１３、請求項１４、または請求項１５のいずれかに記載のポリペプチドに特異的に結合する、選択的結合因子またはそのフラグメント。
【請求項１９】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそのフラグメントに特異的に結合する、請求項１８に記載の選択的結合因子またはそのフラグメント。
【請求項２０】
抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２１】
ヒト化抗体である、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２２】
ヒト抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２３】
ポリクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２４】
モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２５】
キメラ抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２６】
ＣＤＲ接続抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２７】
抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２８】
可変領域フラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２９】
ＦａｂフラグメントまたはＦａｂ’フラグメントである、請求項２８に記載の可変領域フラグメント。
【請求項３０】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異性を有する少なくとも１つの相補性決定領域を含む、選択的結合因子またはそのフラグメント。
【請求項３１】
検出可能標識に結合される、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項３２】
Ｂ７−Ｌポリペプチドの生物学的活性を拮抗する、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項３３】
Ｂ７−Ｌポリペプチド関連の疾患、状態、または障害を、処置、予防、または改善するための方法であって、請求項１８に記載の選択的結合因子の有効量を患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３４】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドで動物を免疫することによって産生される、選択的結合因子。
【請求項３５】
請求項１、請求項２、または請求項３のいずれかに記載のポリペプチドに結合し得る選択的結合因子を産生する、ハイブリドーマ。
【請求項３６】
請求項１８に記載の抗Ｂ７−Ｌ抗体またはフラグメントを用いて、Ｂ７−Ｌポリペプチドの量を検出または定量する方法。
【請求項３７】
請求項１３、請求項１４、または請求項１５のいずれかに記載のポリペプチド、および薬学的に受容可能な処方剤を含む、組成物。
【請求項３８】
前記薬学的に受容可能な処方剤が、キャリア、アジュバント、溶解剤、安定剤、または抗酸化剤である、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
請求項１３、請求項１４、または請求項１５のいずれかに記載のポリペプチドの誘導体を含む、ポリペプチド。
【請求項４０】
水溶性ポリマーを用いて共有結合的に改変された、請求項３９に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
請求項４０に記載のポリペプチドであって、ここで、前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、およびポリビニルアルコールからなる群より選択される、ポリペプチド。
【請求項４２】
請求項１、請求項２、または請求項３のいずれかに記載の核酸分子および薬学的に受容可能な処方剤を含む、組成物。
【請求項４３】
前記核酸分子が、ウイルスベクター中に含まれる、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
請求項１、請求項２、または請求項３のいずれかに記載の核酸分子を含む、ウイルスベクター。
【請求項４５】
異種アミノ酸配列に融合された、請求項１３、請求項１４、または請求項１５のいずれかに記載のポリペプチドを含む、融合ポリペプチド。
【請求項４６】
前記異種アミノ酸配列が、ＩｇＧ定常ドメインまたはそのフラグメントである、請求項４５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４７】
医学的状態を処置、予防、または改善するための方法であって、請求項１３、請求項１４、もしくは請求項１５のいずれかに記載のポリペプチド、または請求項１、請求項２、もしくは請求項３のいずれかに記載の核酸によってコードされるポリペプチドを患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４８】
被験体において病的状態または病的状態に対する感受性を診断する方法であって、以下：
（ａ）サンプル中の、請求項１３、請求項１４、もしくは請求項１５のいずれかに記載のポリペプチド、または請求項１、請求項２、もしくは請求項３のいずれかに記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドの、発現の存在または発現量を決定する工程；および
（ｂ）該ポリペプチドの発現の存在または発現量に基づいて、病的状態または病的状態に対する感受性を診断する工程、
を包含する、方法。
【請求項４９】
デバイスであって、以下：
（ａ）移植に適した膜；および
（ｂ）該膜内にカプセル化された細胞であって、該細胞は、請求項１３、請求項１４、または請求項１５のいずれかに記載のタンパク質を分泌する、細胞；を備え、
該膜は、該タンパク質に対して透過性であり、そして該細胞に有害な物質に対して不透過性である、デバイス。
【請求項５０】
Ｂ７−Ｌポリペプチドに結合する化合物を同定する方法であって、以下：
（ａ）請求項１３、請求項１４、もしくは請求項１５のいずれかに記載のポリペプチドを、化合物と接触させる工程；および
（ｂ）該化合物に対する該Ｂ７−Ｌポリペプチドの結合の程度を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５１】
前記化合物に結合した場合に、前記ポリペプチドの活性を決定する工程をさらに包含する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
動物においてポリペプチドのレベルを調節する方法であって、請求項１、請求項２、または請求項３のいずれかに記載の核酸分子を該動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項５３】
請求項１、請求項２、または請求項３のいずれかに記載の核酸分子を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項５４】
化合物がＢ７−Ｌポリペプチド活性またはＢ７−Ｌポリペプチド産生を阻害するか否かを決定するためのプロセスであって、請求項５３に記載のトランスジェニック哺乳動物を該化合物に曝露する工程、および該哺乳動物におけるＢ７−Ｌポリペプチド活性またはＢ７−Ｌポリペプチド産生を測定する工程を包含する、プロセス。
【請求項５５】
固体支持体に結合される請求項１、請求項２または請求項３のいずれかに記載の、核酸分子。
【請求項５６】
核酸分子のアレイであって、該アレイが、請求項１、請求項２または請求項３のいずれかに記載の少なくとも１つの核酸分子を含む、アレイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、２０００年６月２８日に出願された米国暫定特許番号第６０／２１４，５１２号および２０００年１１月２８日に出願された、米国特許第０９／７２９，２６４号から優先権の利益を主張する（これらのそれぞれの開示は、本明細書中に参考として明白に援用される）
（発明の分野）
本発明は、Ｂ７様（Ｂ７−Ｌ）ポリペプチドおよびこれをコードする核酸分子に関する。本発明はまた、Ｂ７−Ｌポリペプチドを産生するための、選択的結合因子、ベクター、宿主細胞および方法に関する。本発明はさらに、Ｂ７−Ｌポリペプチドと関連する疾患、障害、および状態の、診断、処置、改善、および／または予防のための薬学的組成物および方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
核酸分子の同定、クローニング、発現、および操作における技術進歩ならびにヒトゲノムの解読は、新規治療薬の発見を大いに加速した。現在、高速核酸配列決定技術は、前例のない速度で配列情報を作製し得、そしてコンピュータ分析と結合されて、ゲノムの一部および全体への重複配列の組み立てならびにポリペプチドコード領域の同定を可能にする。既知アミノ酸配列のデータベース編集物に対する推定アミノ酸配列の比較は、以前に同定された配列および／または構造の目印に対する相同性の程度を決定することを可能にする。核酸分子のポリペプチドコード領域のクローニングおよび発現は、構造分析および機能分析のためのポリペプチド産物を提供する。核酸分子およびコードされるポリペプチドの操作は、治療剤として使用するための生成物に対して有利な特性を与え得る。
【０００３】
過去１０年間にわたるゲノム研究における有意な技術進歩にも関わらず、ヒトゲノムに基づく新規治療剤の開発に対する可能性は、未だ大部分理解されていない。潜在的に有利なポリペプチド治療剤をコードする多くの遺伝子またはこれらがコードするポリペプチド（これらは、治療分子に対して「標的」としてはたらき得る）は、未だ同定されていない。従って、診断的な利点または治療的な利点を有する、新規ポリペプチドおよびこれらをコードする核酸分子を同定することが、本発明の目的である。
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、新規Ｂ７−Ｌの核酸分子およびコードされるポリペプチドに関する。
【０００５】
本発明は、以下：
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１または配列番号１３のいずれかに示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のいずれかの相補体に、中程度または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；および
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。
【０００６】
本発明はまた、以下：
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドに少なくとも約７０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１または配列番号１３のいずれかに示されるヌクレオチド配列、または（ａ）の、対立遺伝子改変体またはスプライス改変体をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１または配列番号１３のいずれかのヌクレオチド配列、（ａ）、または（ｂ）の領域であって、ここで、このポリペプチドフラグメントは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有するか、あるいは抗原性である、ヌクレオチド配列の領域；
（ｄ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１または配列番号１３のいずれかのヌクレオチド配列あるいは（ａ）〜（ｃ）のいずれかの領域；
（ｅ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｄ）のいずれかの相補体にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｆ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。
【０００７】
本発明はさらに、以下；
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮、およびＮ末端短縮からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む（ａ）〜（ｅ）のいずれかのヌクレオチド配列；
（ｇ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｆ）のいずれかの相補体にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。
【０００８】
本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるようなアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【０００９】
本発明はまた、以下：
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかのオルソログに対するアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基を含む配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、ここで、このフラグメントは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有するか、あるいは抗原性である、フラグメント；ならびに
（ｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるアミノ酸配列、（ａ）または（ｂ）のいずれかの、対立遺伝子改変体またはスプライス改変体のアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを提供する。
【００１０】
本発明は、さらに、以下：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；ならびに
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮、およびＮ末端短縮からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを提供する。
【００１１】
Ｂ７−Ｌアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドもまた、提供される。
【００１２】
本発明はまた、本明細書中に示されるような単離された核酸分子を含む発現ベクター、本明細書中に示されるような組換え核酸分子を含む組換え宿主細胞、およびＢ７−Ｌポリペプチドを産生する方法を提供し、この方法は、この宿主細胞を培養する工程、および必要に応じてそのように産生されたポリペプチドを単離する工程を包含する。
【００１３】
Ｂ７−Ｌポリペプチドをコードする核酸分子を含むトランスジェニック非ヒト動物もまた、本発明に含まれる。Ｂ７−Ｌ核酸分子は、Ｂ７−Ｌポリペプチドの発現およびＢ７−Ｌポリペプチドの増加したレベル（これは、増加した循環レベルを含み得る）を可能にする様式で、動物中に導入される。あるいは、Ｂ７−Ｌ核酸分子は、内因性Ｂ７−Ｌポリペプチドの発現を阻害する（すなわち、Ｂ７−Ｌポリペプチド遺伝子ノックアウトを保有するトランスジェニック動物を作製する）様式で動物に導入される。このトランスジェニック非ヒト動物は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはげっ歯類（例えば、ラットまたはマウス）である。
【００１４】
本発明のＢ７−Ｌポリペプチドの誘導体もまた、提供される。
【００１５】
本発明のＢ７−Ｌポリペプチドを特異的に結合し得る選択的結合因子（例えば、抗体およびペプチド）が、さらに提供される。このような抗体およびペプチドは、アゴニストであってもアンタゴニストであってもよい。
【００１６】
本発明のヌクレオチド、ポリペプチド、もしくは選択的結合因子と、１つ以上の薬学的に受容可能な処方剤とを含む、薬学的組成物もまた、本発明によって包含される。この薬学的組成物は、治療有効量の本発明のヌクレオチドまたはポリペプチドを提供するために使用される。本発明はまた、このポリペプチド、核酸分子、および選択的結合因子を使用する方法に関する。
【００１７】
本発明のＢ７−ＬポリペプチドおよびＢ７−Ｌ核酸分子は、疾患および障害（本明細書中に列挙されるものを含む）を処置、予防、改善、および／または検出するために使用され得る。
【００１８】
本発明はまた、Ｂ７−Ｌポリペプチドに結合する試験分子を同定するために、試験分子をアッセイする方法を提供する。この方法は、Ｂ７−Ｌポリペプチドを試験分子と接触させて、このポリペプチドへのこの試験分子の結合の程度を決定する工程を包含する。この方法はさらに、このような試験分子が、Ｂ７−Ｌポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを決定する工程を包含する。本発明はさらに、Ｂ７−Ｌポリペプチドの発現またはＢ７−Ｌポリペプチドの活性に対する分子の影響を試験する方法を提供する。
【００１９】
Ｂ７−Ｌポリペプチドの発現を調整する方法およびＢ７−Ｌポリペプチドのレベルを調節する（すなわち、増加または減少させる）方法もまた、本発明によって包含される。１つの方法は、Ｂ７−Ｌポリペプチドをコードする核酸分子を動物に投与する工程を包含する。別の方法において、Ｂ７−Ｌポリペプチドの発現を調整または調節するエレメントを含む核酸分子が、投与され得る。これらの方法の例としては、本明細書中にさらに記載されるような、遺伝子治療、細胞治療、およびアンチセンス治療が挙げられる。
【００２０】
本発明の別の局面において、このＢ７−Ｌポリペプチドは、そのレセプター（「Ｂ７−Ｌポリペプチドレセプター」）を同定するために使用され得る。種々の形態の「発現クローニング」が、タンパク質リガンドについてのレセプターをクローニングするために広く使用されている。例えば、ＳｉｍｏｎｓｅｎおよびＬｏｄｉｓｈ，１９９４，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１５：４３７−４１およびＴａｒｔａｇｌｉａら，１９９５，Ｃｅｌｌ　８３：１２６３−７１を参照のこと。Ｂ７−Ｌポリペプチドレセプターの単離は、Ｂ７−Ｌポリペプチドのシグナル伝達経路の新規のアゴニストおよびアンタゴニストを同定または開発するために有用である。このようなアゴニストおよびアンタゴニストとしては、可溶性Ｂ７−Ｌポリペプチドレセプター、抗Ｂ７−Ｌポリペプチドレセプター選択的結合因子（例えば、抗体およびその誘導体）、低分子、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられ、これらのうちのいずれかが、１つ以上の疾患または障害（本明細書中に開示されるものを含む）を処置するために使用され得る。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で使用される節の表題は、組織的な目的のみのためであり、そして記載される主題を限定するようには解釈されるべきではない。本願において引用される全ての参考文献は、明確に本明細書中に参考として援用される。
【００２２】
（定義）
用語「Ｂ７−Ｌ遺伝子」または「Ｂ７−Ｌ核酸分子」または「Ｂ７−Ｌポリヌクレオチド」とは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１３のいずれかに示されるヌクレオチド配列、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および本明細書中で定義される核酸分子を含むかまたはこれらからなる、核酸分子をいう。
【００２３】
用語「Ｂ７−Ｌポリペプチド対立遺伝子改変体」とは、生物または生物の集団の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子の、天然に存在する可能ないくつかの代替形態のうちの１つをいう。
【００２４】
用語「Ｂ７−Ｌポリペプチドスプライス改変体」とは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４のいずれかに示されるＢ７−Ｌポリペプチドアミノ酸配列のＲＮＡ転写物中のイントロン配列の選択的プロセシングによって生成される、核酸分子（通常はＲＮＡ）をいう。
【００２５】
用語「単離された核酸分子」とは、（１）総核酸が供給源細胞から単離される場合に、ともに天然で見出されるタンパク質、脂質、糖質、または他の物質のうち少なくとも約５０パーセントから分離された、本発明の核酸分子、（２）「単離された核酸分子」が天然で連結しているポリヌクレオチドの全てまたは一部に連結していない、本発明の核酸分子、（３）天然では連結しないポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、本発明の核酸分子、または（４）より大きなポリヌクレオチド配列の一部として天然には存在しない、本発明の核酸分子をいう。好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、いかなる他の夾雑核酸分子、または天然の環境において見出される他の夾雑物（これらは、ポリペプチド産生における使用、または治療的使用、診断的使用、予防的使用、もしくは研究的使用を妨げる）も実質的には含まない。
【００２６】
用語「核酸配列」または「核酸分子」は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列をいう。この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのうちのいずれかから形成される分子を含み、この塩基アナログは、例えば、以下であるがこれらに限定されない：４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニル−シトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシ−メチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソ−ペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチル−グアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ−メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン（ｂｅｔａ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボニル−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリン。
【００２７】
用語「ベクター」は、宿主細胞にコード情報を移すために使用される任意の分子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）をいうために使用される。
【００２８】
用語「発現ベクター」は、宿主細胞の形質転換に適切であり、かつ挿入された異種核酸配列の発現を、指向および／または制御する核酸配列を含む、ベクターをいう。発現としては、転写、翻訳、およびＲＮＡスプライシング（イントロンが存在する場合）のようなプロセスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
用語「作動可能に連結された（されている）」は、隣接配列の配置方法をいうために本明細書中に使用される。ここで、このように記載される隣接配列は、その通常の機能を実行するように構成されるかまたは組み立てられる。従って、コード配列に作動可能に連結された隣接配列は、そのコード配列の複製、転写および／または翻訳をもたらすことができ得る。例えば、プロモーターがコード配列の転写を指向し得る場合、このコード配列は、このプロモーターに作動可能に連結されている。隣接配列は、それが正確に機能する限り、コード配列と連続している必要はない。従って、例えば、翻訳されないが転写される介在配列が、プロモーター配列とこのコード配列との間に存在し得、そして、このプロモーター配列はなお、このコード配列に「作動可能に連結されている」とみなされ得る。
【００３０】
用語「宿主細胞」は、核酸配列で形質転換されたかまたは形質転換され得、次いで目的の選択された遺伝子を発現し得る、細胞をいうために用いられる。この用語は、この選択された遺伝子が存在する限り、子孫が形態学または遺伝的構成においてもとの親と同一であってもなくても、この親細胞の子孫を含む。
【００３１】
用語「Ｂ７−Ｌポリペプチド」とは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび関連ポリペプチドをいう。関連ポリペプチドとしては、以下が挙げられる：Ｂ７−Ｌポリペプチドフラグメント、Ｂ７−Ｌポリペプチドオルソログ、Ｂ７−Ｌポリペプチド改変体、およびＢ７−Ｌポリペプチド誘導体であって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するもの。Ｂ７−Ｌポリペプチドは、本明細書中に定義されるように、成熟ポリペプチドであり得、そしてそれらが調製される方法に依存して、アミノ末端メチオニン残基を有しても有さなくてもよい。
【００３２】
用語「Ｂ７−Ｌポリペプチドフラグメント」とは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドのアミノ末端（リーダー配列を有するかまたは有さない）の短縮および／またはカルボキシル末端の短縮を含むポリペプチドをいう。用語「Ｂ７−Ｌポリペプチドフラグメント」とはまた、Ｂ７−Ｌポリペプチドオルソログ、Ｂ７−Ｌポリペプチド誘導体、またはＢ７−Ｌポリペプチド改変体のアミノ末端および／またはカルボキシル末端の短縮物をいうか、あるいはＢ７−Ｌポリペプチド対立遺伝子改変体またはＢ７−Ｌポリペプチドスプライス改変体によってコードされるポリペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシル末端の短縮物をいう。Ｂ７−Ｌポリペプチドフラグメントは、選択的ＲＮＡスプライシングから生じ得るか、またはインビボプロテアーゼ活性から生じ得る。Ｂ７−Ｌポリペプチドの膜結合形態もまた、本発明によって意図される。好ましい実施形態において、短縮および／または欠失は、約１０アミノ酸、または約２０アミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または１００アミノ酸より多いアミノ酸を含む。このように産生されたポリペプチドフラグメントは、約２５個連続するアミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１５０アミノ酸、または約２００アミノ酸を含む。このようなＢ７−Ｌポリペプチドフラグメントは、必要に応じて、アミノ末端メチオニン残基を含み得る。このようなフラグメントは、例えば、Ｂ７−Ｌポリペプチドに対する抗体を生成するために用いられ得ることが理解される。
【００３３】
用語「Ｂ７−Ｌポリペプチドオルソログ」とは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４のいずれかに示されるＢ７−Ｌポリペプチドアミノ酸配列に対応する、別の種由来のポリペプチドをいう。例えば、マウスおよびヒトのＢ７−Ｌポリペプチドは、互いにオルソログであるとみなされる。
【００３４】
用語「Ｂ７−Ｌポリペプチド改変体」とは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４のいずれかに示されるＢ７−Ｌポリペプチドアミノ酸配列（リーダー配列を有するか、または有さない）に比べて、１つ以上のアミノ酸配列の置換、欠失（例えば、内部欠失および／もしくはＢ７−Ｌポリペプチドフラグメント）、ならびに／または付加（例えば、内部付加および／もしくはＢ７−Ｌ融合ポリペプチド）を有するアミノ酸配列を含む、Ｂ７−Ｌポリペプチドをいう。改変体は、天然に存在し得る（例えば、Ｂ７−Ｌポリペプチド対立遺伝子改変体、Ｂ７−Ｌポリペプチドオルソログ、およびＢ７−Ｌスプライス改変体）か、または人工的に構築され得る。このようなＢ７−Ｌポリペプチド改変体は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１３のいずれかに示されるＤＮＡ配列からしかるべく変動するＤＮＡ配列を有する対応する核酸分子から調製され得る。好ましい実施形態において、この改変体は、１〜３個、または１〜５個、または１〜１０個、または１〜１５個、または１〜２０個、または１〜２５個、または１〜５０個、または１〜７５個、または１〜１００個、または１００個よりも多いアミノ酸の置換、挿入、付加および／もしくは欠失を有し、ここでその置換は、保存的であっても、または非保存的であってもよいし、あるいはその組み合わせであってもよい。
【００３５】
用語「Ｂ７−Ｌポリペプチド誘導体」とは、化学的に改変された、本明細書中に定義されるような、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチド、Ｂ７−Ｌポリペプチドフラグメント、Ｂ７−Ｌポリペプチドオルソログ、またはＢ７−Ｌポリペプチド改変体をいう。用語「Ｂ７−Ｌポリペプチド誘導体」とはまた、化学的に改変された、本明細書中に定義されるような、Ｂ７−Ｌポリペプチド対立遺伝子改変体またはＢ７−Ｌポリペプチドスプライス改変体によってコードされるポリペプチドをいう。
【００３６】
用語「成熟Ｂ７−Ｌポリペプチド」とは、リーダー配列を欠くＢ７−Ｌポリペプチドをいう。成熟Ｂ７−Ｌポリペプチドはまた、アミノ末端（リーダー配列を有するか、または有さない）および／またはカルボキシル末端のタンパク質分解性プロセシング、より大きい前駆体からのより小さいポリペプチドの切断、Ｎ結合型グリコシル化および／またはＯ結合型グリコシル化などのような、他の改変を含み得る。
【００３７】
用語「Ｂ７−Ｌ融合ポリペプチド」とは、本明細書中に定義されるような、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチド、Ｂ７−Ｌポリペプチドフラグメント、Ｂ７−Ｌポリペプチドオルソログ、Ｂ７−Ｌポリペプチド改変体、またはＢ７−Ｌ誘導体の、アミノ末端またはカルボキシル末端での１つ以上のアミノ酸（例えば、異種タンパク質または異種ペプチド）の融合体をいう。用語「Ｂ７−Ｌ融合ポリペプチド」とはまた、本明細書中に定義されるような、Ｂ７−Ｌポリペプチド対立遺伝子改変体またはＢ７−Ｌポリペプチドスプライス改変体によってコードされるポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端での、１つ以上のアミノ酸の融合体をいう。
【００３８】
用語「生物学的に活性なＢ７−Ｌポリペプチド」とは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも１つの活性の特徴を有する、Ｂ７−Ｌポリペプチドをいう。さらに、Ｂ７−Ｌポリペプチドは、免疫原として活性であり得る；すなわち、このＢ７−Ｌポリペプチドは、抗体が惹起され得る少なくとも１つのエピトープを含む。
【００３９】
用語「単離されたポリペプチド」とは、以下のような本発明のポリペプチドをいう：（１）供給源細胞から単離された場合に、共に天然に見出されるポリヌクレオチド、脂質、糖質、または他の材料の、少なくとも約５０％から分離されたポリペプチド、（２）その「単離されたポリペプチド」が天然において結合されているポリペプチドの全体または一部分に（共有結合性の相互作用または非共有結合性の相互作用によって）結合されていないポリペプチド、（３）天然において結合されないポリペプチドに（共有結合性の相互作用または非共有結合性の相互作用によって）作動可能に連結されているポリペプチド、あるいは（４）天然に存在しないポリペプチド。好ましくは、この単離されたポリペプチドは、その治療用途、診断用途、予防用途または研究用途を妨害する、その天然の環境において見出されるいかなる他の夾雑ポリペプチドまたは他の夾雑物をも実質的に含まない。
【００４０】
用語「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、当該分野で公知のように、２つ以上のポリペプチド分子、または２つ以上の核酸分子の配列間の、これらの配列を比較することによって決定される、関係をいう。当該分野では、「同一性」はまた、核酸分子またはポリペプチドの配列関連性の程度（場合によっては、２つ以上のヌクレオチド配列または２つ以上のアミノ酸配列のストリングの間の一致により決定されるような）を意味する。「同一性」は、特定の数学的モデルまたはコンピュータープログラム（すなわち、アルゴリズム）によって扱われるギャップアライメント（もし存在するならば）を有する、２つ以上の配列のうちの短い方の間の同一適合のパーセントを測定する。
【００４１】
用語「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」は、関連する概念であるが、「同一性」とは対照的に、「類似性」とは、同一適合および保存的置換適合の両方を含む関連性の尺度をいう。２つのポリペプチド配列が、例えば、１０／２０の同一のアミノ酸を有し、そして残りが全て非保存的置換であるならば、同一性パーセントおよび類似性パーセントは、両方とも５０％である。同じ例で、保存的置換が存在するさらに５つの位置が存在するならば、同一性パーセントは、５０％のままであるが、類似性パーセントは７５％（１５／２０）である。従って、保存的置換が存在する場合、２つのポリペプチドの間の類似性パーセントは、これらの２つのポリペプチドの間の同一性パーセントよりも高い。
【００４２】
用語「天然に存在する」または「ネイティブ」は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などのような生物学的材料に関して使用される場合、天然に見出されかつ人工的に操作されていない材料をいう。同様に、「天然に存在しない」または「非ネイティブ」は、本明細書中において使用される場合、天然には見出されないか、または人工的に構造改変されたかもしくは合成された、材料をいう。
【００４３】
用語「有効量」および「治療的に有効な量」とは、各々、本明細書中に示されるＢ７−Ｌポリペプチドの１つ以上の生物学的活性の観察可能なレベルを支持するために使用されるＢ７−ＬポリペプチドまたはＢ７−Ｌ核酸分子の量をいう。
【００４４】
本明細書中に使用される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」または「生理学的に受容可能なキャリア」とは、薬学的組成物としてのＢ７−Ｌポリペプチド、Ｂ７−Ｌ核酸分子、またはＢ７−Ｌ選択的結合因子の送達を、達成するかまたは増強するのに適切な、１つ以上の処方材料をいう。
【００４５】
用語「抗原」とは、選択的結合因子（例えば、抗体）により結合され得る分子または分子の一部であって、そしてさらに、その抗原のエピトープに結合し得る抗体を産生するために動物において用いられ得る、分子または分子の一部をいう。抗原は、１つ以上のエピトープを有し得る。
【００４６】
用語「選択的結合因子」とは、Ｂ７−Ｌポリペプチドに対して特異性を有する分子をいう。本明細書中にて使用される場合、用語「特異的」および「特異性」とは、ヒトＢ７−Ｌポリペプチドに結合するがヒト非Ｂ７−Ｌポリペプチドに結合しない、選択的結合因子の能力をいう。しかし、その選択的結合因子が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４のいずれかに示されるようなポリペプチドのオルソログ（すなわち、その種間のバージョン（例えば、マウスＢ７−ＬポリペプチドおよびラットＢ７−Ｌポリペプチド））もまた結合し得ることが、理解される。
【００４７】
用語「形質導入」は、１つの細菌から別の細胞への（通常、ファージによる）遺伝子の移入をいうために使用される。「形質導入」はまた、レトロウイルスによる真核生物細胞の配列の捕捉および移入をいう。
【００４８】
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡまたは外因性ＤＮＡの取り込みをいうために使用される。そして、細胞は、その外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されている場合、「トランスフェクト」されている。多数のトランスフェクション技術が、当該分野で周知であり、そして、本明細書中に開示される。例えば、Ｇｒａｈａｍら、１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１９８９）；Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８６）；およびＣｈｕら、１９８１，Ｇｅｎｅ　１３：１９７を参照のこと。このような技術は、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入するために使用され得る。
【００４９】
用語「形質転換」は、本明細書中に使用される場合、細胞の遺伝的特徴における変化をいい、そして細胞は、新しいＤＮＡを含むように改変されている場合、形質転換されている。例えば、細胞は、そのネイティブな状態から遺伝的に改変された場合、形質転換されている。トランスフェクションまたは形質導入に続いて、その形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体へ物理的に組み込むことによってその細胞のＤＮＡと組み換わり得るか、複製されないエピソームエレメントとして一過性に維持され得るか、またはプラスミドとして独立して複製し得る。細胞は、そのＤＮＡが細胞の分裂と共に複製される場合、安定に形質転換されているとみなされる。
【００５０】
（核酸分子および／またはポリペプチドの関連性）
関連する核酸分子が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１３のいずれかの核酸分子の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体を含み、そして上記のヌクレオチド配列のいずれかと相補的である配列を含むことが、理解される。関連する核酸分子はまた、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドと比較して、１つ以上のアミノ酸残基の置換、改変、付加、および／または欠失を含むかまたはこれらから本質的になる、ポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む。このような関連するＢ７−Ｌポリペプチドは、例えば、１つ以上のＮ結合型グリコシル化部位もしくはＯ結合型グリコシル化部位の付加および／または欠失、あるいは１つ以上のシステイン残基の付加および／または欠失を含み得る。
【００５１】
関連する核酸分子はまた、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４のいずれかのＢ７−Ｌポリペプチドの、少なくとも約２５個連続したアミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１５０アミノ酸、または約２００アミノ酸、または約２００個より多いアミノ酸残基のポリペプチドをコードする、Ｂ７−Ｌ核酸分子のフラグメントを含む。
【００５２】
さらに、関連するＢ７−Ｌ核酸分子としてはまた、本明細書中に定義されるような中程度にストリンジェントな条件または高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、もしくは配列番号１３のいずれかのＢ７−Ｌ核酸分子の完全な相補配列、または配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、もしくは配列番号１４のいずれかに示されるようなアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする分子の完全な相補配列、または本明細書中に定義されるような核酸フラグメントの完全な相補配列、または本明細書中に定義されるようなポリペプチドをコードする核酸フラグメントの完全な相補配列、とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む分子が挙げられる。ハイブリダイゼーションプローブは、関連する配列に関して、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡライブラリー、または合成ＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために、本明細書中に提供されるＢ７−Ｌ配列を用いて調製され得る。既知の配列と有意な同一性を示すＢ７−ＬポリペプチドのＤＮＡ配列および／またはアミノ酸配列の領域は、本明細書中に記載されるような配列アラインメントアルゴリズムを用いて容易に決定され、そしてこれらの領域は、スクリーニングのためのプローブを設計するために使用され得る。
【００５３】
用語「高度にストリンジェントな条件」は、配列が高度に相補的であるＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そして有意にミスマッチしているＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された、条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の濃度によって、決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、６５〜６８℃での、０．０１５Ｍ　塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ　クエン酸ナトリウムであるか、または４２℃での、０．０１５Ｍ　塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ　クエン酸ナトリウム、および５０％　ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ　＆　Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｉｍｉｔｅｄ）を参照のこと。
【００５４】
よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）もまた、使用し得る−しかし、ハイブリダイゼーションの速度は、影響される。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少させる目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。例は、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニル−ピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４（ＳＤＳ））、フィコール、デンハルト溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）、および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨとは無関係である。Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｉｍｉｔｅｄ）を参照のこと。
【００５５】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さ、および塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、これらの変数を適応させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にするように、当業者によって調整され得る。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る：
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致に対して約１℃ずつ減少する。
【００５６】
用語「中程度にストリンジェントな条件」は、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりもより大きい程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、５０〜６５℃での、０．０１５Ｍ　塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ　クエン酸ナトリウムであるか、または３７〜５０℃での、０．０１５Ｍ　塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ　クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミドである。例として、０．０１５Ｍ　ナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな条件」は、約２１％の不一致を許容する。
【００５７】
「高度にストリンジェントな条件」と「中程度にストリンジェントな条件」との間に完全な区別は存在しないことが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍ　ナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）で洗浄する場合、これは、約６％の不一致を許容する。より遠く関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るし、またはイオン強度を上昇させ得る。
【００５８】
約２０ｎｔまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１Ｍ　ＮａＣｌ＊における融解温度の適切な概算値は、以下によって提供される：
Ｔｍ＝１つのＡ−Ｔ塩基対につき２℃＋１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃
＊６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである。Ｓｕｇｇｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｕｓｉｎｇ　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｇｅｎｅｓ、６８３（ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）１９８１）を参照のこと。
【００５９】
オリゴヌクレオチドに対して高いストリンジェンシーの洗浄条件は、通常、６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいて、このオリゴヌクレオチドのＴｍの０〜５℃下の温度である。
【００６０】
別の実施形態において、関連する核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１３のいずれかに示されるようなヌクレオチド配列と少なくとも約７０パーセント同一であるヌクレオチド配列を含むかまたはこれからなるか、あるいは配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドと少なくとも約７０パーセント同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかまたはこれから本質的になる。好ましい実施形態において、このヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１３のいずれかに示されるヌクレオチド配列と、約７５パーセント、または約８０パーセント、または約８５パーセント、または約９０パーセント、または約９５パーセント、９６パーセント、９７パーセント、９８パーセントまたは９９パーセント同一であるか、あるいは、このヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチド配列と、約７５パーセント、または約８０パーセント、または約８５パーセント、または約９０パーセント、または約９５パーセント、９６パーセント、９７パーセント、９８パーセントまたは９９パーセント同一であるポリペプチドをコードする。関連する核酸分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４のいずれかに示されるポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチドをコードする。
【００６１】
核酸配列における差異は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４のいずれかのアミノ酸配列に対するアミノ酸配列の保存的改変および／または非保存的改変を生じ得る。
【００６２】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４のいずれかのアミノ酸配列に対する保存的改変（およびコードヌクレオチドに対する対応する改変）は、Ｂ７−Ｌポリペプチドに類似した機能的特徴および化学的特徴を有するポリペプチドを生成する。対照的に、Ｂ７−Ｌポリペプチドの機能的特徴および／または化学的特徴における実質的な改変は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４のいずれかのアミノ酸配列において置換を選択することによって達成され得、これらの置換は、（ａ）置換領域における分子骨格の構造（例えば、シートコンフォメーションまたはらせんコンフォメーション）、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、あるいは（ｃ）側鎖の大きさを、維持することに対するその影響において有意に異なる。
【００６３】
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置におけるアミノ酸残基の極性または電荷にほとんど影響がないかまたは全く影響がないような、ネイティブなアミノ酸残基の非ネイティブな残基による置換を含み得る。さらに、ポリペプチド中の任意のネイティブな残基はまた、「アラニンスキャニング変異誘発」に関して以前に記載されたように、アラニンで置換され得る。
【００６４】
保存的アミノ酸置換はまた、天然に存在しないアミノ酸残基を含み、これらの残基は、生物系における合成によるよりむしろ化学的ペプチド合成によって代表的に組み込まれる。これらは、ペプチド模倣物、およびアミノ酸部分の他の逆転形態または反転形態を含む。
【００６５】
天然に存在する残基は、共通の側鎖の特性に基づいてクラスに分けられ得る：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の方向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００６６】
例えば、非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを、別のクラス由来のメンバーへと交換することを含み得る。このような置換された残基は、非ヒトＢ７−Ｌポリペプチドと相同であるヒトＢ７−Ｌポリペプチドの領域、またはこの分子の非相同領域に、導入され得る。
【００６７】
このような変更を作製する場合、アミノ酸のハイドロパシー指標が、考慮され得る。各アミノ酸は、その疎水性特徴および荷電特徴に基づいてハイドロパシー指標が割り当てられている。これらのハイドロパシー指標は、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）およびアルギニン（−４．５）である。
【００６８】
タンパク質に対して相互作用的な生物学的機能を付与することにおけるハイドロパシーアミノ酸指標の重要性は、当該分野において一般的に理解されている（Ｋｙｔｅら、１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−３１）。特定のアミノ酸が類似のハイドロパシー指標またはハイドロパシースコアを有する他のアミノ酸で置換され得、そして依然として類似の生物学的活性を維持し得ることが、公知である。ハイドロパシー指標に基づいて変化を起こす際に、ハイドロパシー指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、そして±０．５以内であるものが、なおより特に好ましい。
【００６９】
類似のアミノ酸の置換が親水性に基づいて効果的になされ得る（特に、これによって作製された生物学的機能的に等価なタンパク質またはペプチドが、この場合においてと同様に、免疫学的実施形態における使用に関して考慮される場合）こともまた、当該分野において理解されている。その隣接するアミノ酸の親水性によって支配される、タンパク質の最も大きな局所的平均親水性は、その免疫原性および抗原性に、すなわち、そのタンパク質の生物学的特性に、相関する。
【００７０】
以下の親水性の値が、これらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。類似の親水性の値に基づいて変化を行う際に、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、そして±０．５以内であるものが、なおより特に好ましい。一次アミノ酸配列から、エピトープを、親水性に基づいて同定もし得る。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」とも呼ばれる。
【００７１】
所望のアミノ酸置換（保存的であれ非保存的であれ）は、当業者によって、そのような置換が所望される時点で決定され得る。例えば、アミノ酸置換を使用して、Ｂ７−Ｌポリペプチドの重要な残基を同定し得るか、または本明細書中に記載されるＢ７−Ｌポリペプチドの親和性を増加もしくは減少させ得る。例示的なアミノ酸置換は、表Ｉに記載される。
【００７２】
（表１）
（アミノ酸置換）
【００７３】
【表１】
2004501625.tif 000002
当業者は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに記載されるようなポリペプチドの適切な改変体を、周知の技術を使用して、決定し得る。生物学的活性を破壊することなく変化され得る分子の適切な領域を同定するために、当業者は、活性のために重要であるとは考えられない領域を標的化し得る。例えば、同じ種由来かまたは他の種由来の、類似の活性を有する類似のポリペプチドが既知である場合には、当業者は、Ｂ７−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列を、このような類似のポリペプチドと比較し得る。このような比較を用いて、類似のポリペプチド間で保存される分子の残基および部分を同定し得る。このような類似のポリペプチドに対して保存されていない、Ｂ７−Ｌ分子の領域における変化が、Ｂ７−Ｌポリペプチドの生物学的活性および／または構造にさほど不利に影響を与えるようではないことが、理解される。当業者は、比較的保存された領域においてさえ、化学的に類似のアミノ酸を、活性を維持ながら天然に存在する残基と置換し得ることもまた理解する（保存的アミノ酸残基置換）。従って、生物学的活性または構造のために重要であり得る領域でさえ、生物学的活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に不利に影響を与えることなく、保存的アミノ酸置換に供され得る。
【００７４】
さらに、当業者は、活性または構造のために重要である、類似のポリペプチドにおける残基を同定する、構造−機能研究を再調査し得る。このような比較の観点において、類似のポリペプチドにおける活性または構造のために重要なアミノ酸残基に対応するＢ７−Ｌポリペプチドにおける、アミノ酸残基の重要性を予測し得る。当業者は、Ｂ７−Ｌポリペプチドのこのような予測された重要なアミノ酸残基に対する化学的に類似のアミノ酸置換を、選択し得る。
【００７５】
当業者はまた、類似のポリペプチドにおける三次元構造に関して、三次元構造およびアミノ酸配列を分析し得る。このような情報の観点において、当業者は、Ｂ７−Ｌポリペプチドのアミノ酸残基のアライメントを、その三次元構造に関して予測し得る。当業者は、そのタンパク質の表面に存在すると予測されるアミノ酸残基に対する急激な変化を起こさないように、選択し得る。なぜなら、このような残基は、他の分子との重要な相互作用に関与し得るからである。さらに、当業者は、単一のアミノ酸置換を各アミノ酸残基に含む、試験改変体を生成し得る。これらの改変体は、当業者に公知の活性アッセイを使用して、スクリーニングされ得る。このような改変体は、適切な改変体に関する情報を集めるために使用され得る。例えば、特定のアミノ酸残基に対する変化が活性の破壊を生じるか、活性を所望でなく減少するか、または不適切な活性を生ずることを発見した場合には、このような変化を有する改変体は、回避される。換言すれば、このような慣用的な実験から集めた情報に基づいて、当業者は、さらなる置換が、単独でかまたは他の変異と組み合わせてかのいずれかで回避されるべきであるアミノ酸を、容易に決定し得る。
【００７６】
多数の科学刊行物が、二次構造の推定に充てられてきた。Ｍｏｕｌｔ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：４２２−２７；Ｃｈｏｕら、１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１３：２２２−４５；Ｃｈｏｕら、１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１１３：２１１−２２；Ｃｈｏｕら、１９７８，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５−４８；Ｃｈｏｕら、１９７８，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６；およびＣｈｏｕら、１９７９，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７−８４を参照のこと。さらに、コンピュータープログラムが、二次構造の推定を補助するために、現在利用可能である。二次構造を推定する１つの方法は、相同性モデリングに基づく。例えば、３０％より大きな配列同一性または４０％より大きな類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は、しばしば、類似の構造トポロジーを有する。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の近年の成長は、二次構造（ポリペプチドまたはタンパク質の構造内の可能な数の折り畳みを含む）の増強された予測不可能性を提供してきた。Ｈｏｌｍら、１９９９，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２７：２４４−４７を参照のこと。所定のポリペプチドまたはタンパク質において制限された数の折り畳みが存在すること、および一旦、重要な数の構造が解析されると、構造推定は劇的により正確となることが、示唆されてきた（Ｂｒｅｎｎｅｒら、１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３６９−７６）。
【００７７】
二次構造を推定するさらなる方法は、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３７７−８７；Ｓｉｐｐｌら、１９９６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　４：１５−１９）、「プロフィール分析」（Ｂｏｗｉｅら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４−７０；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：１４６−５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：４３５５−５８）、および「進化学的連鎖」（Ｈｏｌｍら、前出、およびＢｒｅｎｎｅｒら、前出を参照のこと）を包含する。
【００７８】
好ましいＢ７−Ｌポリペプチド改変体としては、グリコシル化部位の数および／または型が配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに記載のアミノ酸配列と比較して変化している、グリコシル化改変体が挙げられる。１つの実施形態において、Ｂ７−Ｌポリペプチド改変体は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに記載のアミノ酸配列より多いかまたはより少ない数のＮ連結グリコシル化部位を含む。Ｎ連結グリコシル化部位は、配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒによって特徴付けられ、ここで、Ｘと印されるアミノ酸残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸残基であり得る。この配列を作製するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ連結炭水化物鎖の付加のための潜在的な新たな部位を提供する。あるいは、この配列を排除する置換は、存在するＮ連結炭水化物鎖を除去する。１つ以上のＮ連結グリコシル化部位（代表的に、天然に存在するグリコシル化部位）が排除され、そして１つ以上の新たなＮ連結部位が作製される、Ｎ連結炭水化物鎖の再配列もまた、提供される。さらなる好ましいＢ７−Ｌ改変体としては、１つ以上のシステイン残基が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに記載のアミノ酸配列と比較して欠失しているか、または別のアミノ酸（例えば、セリン）で置換されている、システイン改変体が挙げられる。システイン改変体は、Ｂ７−Ｌポリペプチドが、例えば、不溶性の封入体の単離の後に、生物学的に活性なコンフォメーションにリフォールディングされなければならない場合に、有用である。システイン改変体は、一般に、ネイティブタンパク質より少ないシステイン残基を有し、そして代表的には、同数のシステイン残基を有し、対合していないシステインから生じる相互作用を最小にする。
【００７９】
他の実施形態において、関連する核酸分子は、少なくとも１つのアミノ酸挿入を有し、そしてここで、ポリペプチドが配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに記載のようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、またはこの配列からなるか、あるいは少なくとも１つのアミノ酸欠失を有し、そしてここで、ポリペプチドが配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに記載のようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、またはこの配列からなる。関連する核酸分子はまた、ポリペプチドがカルボキシル末端および／またはアミノ末端の短縮を有し、そしてさらにここで、このポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに記載のようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、またはこの配列からなる。関連する核酸分子はまた、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、カルボキシル末端短縮、およびアミノ末端短縮からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有し、そしてここで、ポリペプチドが配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに記載のようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、またはこの配列からなる。
【００８０】
さらに、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは他のＢ７−Ｌポリペプチドは、同種ポリペプチドに融合されてホモダイマーを形成し得るか、あるいは異種ポリペプチドに融合されてヘテロダイマーを形成し得る。異種のペプチドおよびポリペプチドとしては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：Ｂ７−Ｌ融合ポリペプチドの検出および／または単離を可能にするエピトープ；膜貫通レセプタータンパク質またはその部分（例えば、細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン）；膜貫通レセプタータンパク質に結合する、リガンドまたはその部分；触媒的に活性である、酵素またはその部分；オリゴマー化を促進するポリペプチドまたはペプチド（例えば、ロイシンジッパードメイン）；安定性を増加させるポリペプチドまたはペプチド（例えば、免疫グロブリン定常領域）；ならびに配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに記載のようなアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは他のＢ７−Ｌポリペプチドとは異なる治療活性を有するポリペプチド。
【００８１】
融合は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは他のＢ７−Ｌポリペプチドの、アミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて、なされ得る。融合は、リンカーもアダプター分子も用いずに直接であっても、リンカーもしくはアダプター分子を介してであってもよい。リンカーまたはアダプター分子は、１つ以上のアミノ酸残基、代表的には、約２０〜約５０アミノ酸残基であり得る。リンカーまたはアダプター分子はまた、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼまたはプロテアーゼに対する切断部位を有して設計されて、融合した部分の分離を可能にし得る。一旦構築されると、融合ポリペプチドは、本明細書中に記載の方法に従って誘導体化され得ることが、理解される。
【００８２】
本発明のさらなる実施形態において、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは他のＢ７−Ｌポリペプチドは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域の１つ以上のドメインに融合する。抗体は、以下の２つの機能的に独立した部分を含む：抗原を結合する「Ｆａｂ」として公知の可変ドメイン、ならびに相補的活性化および食作用細胞による攻撃のようなエフェクター機能に関与する、「Ｆｃ」として公知の定常ドメイン。Ｆｃは、長い血清半減期を有し、一方でＦａｂは、短寿命である。Ｃａｐｏｎら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ　３３７：５２５−３１。治療タンパク質と一緒に構築される場合には、Ｆｃドメインは、より長い半減期を提供し得るか、またはＦｃレセプター結合、プロテインＡ結合、相補体固定のような機能、および、おそらく胎盤移入のような機能でさえも、組み込み得る。同書。表ＩＩは、当該分野において公知の特定のＦｃ融合物の使用を要約する。
【００８３】
【表２】
2004501625.tif 000003
一例において、ヒトＩｇＧのヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域は、当業者に公知の方法を使用して、Ｂ７−Ｌポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて、融合され得る。別の例において、ヒトＩｇＧのヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域は、Ｂ７−Ｌポリペプチドフラグメント（例えば、Ｂ７−Ｌポリペプチドの推定細胞外部分）のアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて、融合され得る。
【００８４】
得られるＢ７−Ｌ融合ポリペプチドは、プロテインＡアフィニティーカラムの使用によって、精製され得る。Ｆｃ領域に融合したペプチドおよびタンパク質は、融合していない対応物より実質的に長いインビボでの半減期を示すことが見出された。また、Ｆｃ領域への融合は、融合ポリペプチドの二量化／多量体化を可能にする。Ｆｃ領域は、天然に存在するＦｃ領域であり得るか、または治療の質、循環時間、もしくは減少した凝集のような特定の質を改善するよう変更され得る。
【００８５】
関連する核酸分子およびポリペプチドの同一性および類似性は、公知の方法によって容易に計算される。このような方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａ．Ｍ．Ｌｅｓｋ編、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ　１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｄ．Ｗ．Ｓｍｉｔｈ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄａｔａ（Ｐａｒｔ　１，Ａ．Ｍ．ＧｒｉｆｆｉｎおよびＨ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｎ編、Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ　１９９４）；Ｇ．ｖｏｎ　Ｈｅｉｎｌｅ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　１９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐｒｉｍｅｒ（Ｍ．ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＪ．Ｄｅｖｅｒｅｕｘ編、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ　１９９１）；ならびにＣａｒｉｌｌｏら、１９８８，ＳＩＡＭ　Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈ．，４８：１０７３に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
同一性および／または類似性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間での最大の適合を与えるように、設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公共に利用可能なコンピュータープログラムにおいて記載されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための、好ましいコンピュータープログラム方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０）を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＢＬＡＳＴ　Ｍａｎｕａｌ（ＮＣＢ　ＮＬＭ　ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、前出）から公共に利用可能である。周知のＳｍｉｔｈ　Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用され得る。
【００８７】
２つのアミノ酸配列を整列させるための特定のアライメントスキームは、これら２つの配列の短い領域のみの適合を生じ得、そしてこの小さな整列領域は、２つの全長配列間に有意な関連がない場合でさえも、非常に高い配列同一性を有し得る。従って、好ましい実施形態において、選択された整列方法（ＧＡＰプログラム）は、特許請求されるポリペプチドの少なくとも５０個連続するアミノ酸にわたる整列を生じる。
【００８８】
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、配列同一性パーセントが決定されるべき２つのポリペプチドが、それらのそれぞれのアミノ酸の最適な適合（アルゴリズムによって決定されるような「適合したスパン」）のために、整列される。ギャップオープニングペナルティー（ｇａｐ　ｏｐｅｎｉｎｇ　ｐｅｎａｌｔｙ）（これは、平均対角の３倍として計算される：「平均対角」とは、使用される比較行列（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｍａｔｒｉｘ）の対角の平均である；「対角」とは、特定の比較行列によって各完全なアミノ酸適合に対して割り当てられたスコアまたは数である）およびギャップエクステンションペナルティー（ｇａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｐｅｎａｌｔｙ）（これは通常、キャップオープニングペナルティーの０．１倍である）、ならびにＰＡＭ　２５０またはＢＬＯＳＵＭ　６２のような比較行列が、このアルゴリズムと共に使用される。標準的な比較行列もまた、このアルゴリズムによって使用される（Ｄａｙｈｏｆｆら、５　Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（補遺３　１９７８）（ＰＡＭ２５０比較行列）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８９：１０９１５−１９（ＢＬＯＳＵＭ　６２比較行列）を参照のこと）。
【００８９】
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータは、以下を含む：
Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−５３；
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ　６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、前出）；
Ｇａｐ　Ｐｅｎａｌｔｙ：１２
Ｇａｐ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｅｎａｌｔｙ：４
Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ　ｏｆ　Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ：０
このＧＡＰプログラムは、上記パラメータを用いて有用である。上記パラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを用いるポリペプチド比較（末端ギャップに対してはペナルティーがないこととともに）のためのデフォルトパラメータである。
【００９０】
核酸分子配列比較のための好ましいパラメータは、以下を含む：
Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｗｕｎｓｃｈ，前出；
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｍａｔｒｉｘ：ｍａｔｃｈｅｓ＝＋１０，ｍｉｓｍａｔｃｈ＝０
Ｇａｐ　Ｐｅｎａｌｔｙ：５０
Ｇａｐ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｅｎａｌｔｙ：３
このＧＡＰプログラムはまた、上記パラメータを用いて有用である。上記パラメータは、核酸分子比較のためのデフォルトパラメータである。
【００９１】
Ｐｒｏｇｒａｍ　Ｍａｎｕａｌ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｐａｃｋａｇｅ，第９版、９月、１９９７に記載されるものを含む、他の例示的なａｌｇｏｒｉｔｈｍ、ｇａｐ　ｏｐｅｎｉｎｇ　ｐｅｎａｌｔｙ、ｇａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｐｅｎａｌｔｙ、ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｍａｔｒｉｘ、およびｔｈｒｅｓｈｏｌｄ　ｏｆ　ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙが使用され得る。なされるべき特定の選択は、当業者に明らかであり、そしてなされるべき特定の比較（例えば、ＤＮＡ対ＤＮＡ、タンパク質対タンパク質、タンパク質対ＤＮＡ）；ならびにさらに、その比較が所定の対の配列間（この場合には、ＧＡＰまたはＢｅｓｔＦｉｔが一般的に好ましい）であるか、１つの配列と大きなデータベースの配列との間（この場合には、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＡが好ましい）であるかに依存する。
【００９２】
（核酸分子）
Ｂ７−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子は、種々の様式（化学合成、ｃＤＮＡもしくはゲノムのライブラリーのスクリーニング、発現ライブラリースクリーニング、および／またはｃＤＮＡのＰＣＲ増幅が挙げられるが、これらに限定されない）において容易に得られ得る。
【００９３】
本明細書中において使用される組換えＤＮＡ方法は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９）および／またはＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｉｎｃ．およびＷｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ　１９９４）に記載されるものである。本発明は、本明細書中に記載される核酸分子、およびこのような分子を得るための方法を提供する。
【００９４】
Ｂ７−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子が１つの種から同定された場合には、この遺伝子の全てまたは一部を、同じ種由来のオーソログまたは関連する遺伝子を同定するためのプローブとして使用し得る。このプローブまたはプライマーを使用して、Ｂ７−Ｌポリペプチドを発現すると考えられる種々の組織供給源由来のｃＤＮＡをスクリーニングし得る。さらに、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１または配列番号１３のいずれかに記載されるような配列を有する核酸分子の部分または全てを使用して、ゲノムライブラリーをスクリーニングし、Ｂ７−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を同定および単離し得る。代表的に、中程度または高いストリンジェンシーの条件が、スクリーニングのために使用されて、このスクリーニングから得られる偽陽性の数を最小にする。
【００９５】
Ｂ７−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子もまた、発現されたタンパク質の特性に基づいて陽性クローンの検出を使用する発現クローニングによって、同定され得る。代表的に、核酸ライブラリーは、抗体または他の結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）を、宿主細胞表面において発現および提示されたクローンタンパク質に結合させることによって、スクリーニングされる。抗体または結合パートナーは、所望のクローンを発現する細胞を同定するために、検出可能な標識で改変される。
【００９６】
以下に記載される説明に従って実施される組換え発現技術に従って、これらのポリヌクレオチドを産生し得、そしてコードされたポリペプチドを発現し得る。例えば、Ｂ７−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列を適切なベクターに挿入することによって、当業者は、多量の所望のヌクレオチド配列を容易に生成し得る。次いで、これらの配列を使用して、検出プローブまたは増幅プライマーを生成し得る。あるいは、Ｂ７−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、発現ベクターに挿入し得る。発現ベクターを適切な宿主に導入することによって、コードされたＢ７−Ｌポリペプチドが、多量に生成され得る。
【００９７】
適切な核酸配列を得るための別の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。この方法において、ｃＤＮＡは、酵素逆転写酵素を使用して、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡまたは全ＲＮＡから調製される。次いで、２つのプライマー（代表的には、Ｂ７−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの２つの別個の領域に対して相補的である）が、ＴａｑポリメラーゼのようなポリメラーゼとともにこのｃＤＮＡに付加され、そしてこのポリメラーゼが、これら２つのプライマー間のｃＤＮＡの領域を増幅する。
【００９８】
Ｂ７−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を調製する別の手段は、Ｅｎｇｅｌｓら、１９８９，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．２８：７１６−３４によって記載されるもののような、当業者に周知の方法を使用する、化学合成である。これらの方法としては、とりわけ、核酸合成のためのリン酸トリエステル方法、ホスホラミダイト方法、およびＨ−ホスホネート方法が挙げられる。このような化学合成のために好ましい方法は、標準的なホスホラミダイト化学を使用する、ポリマーにより支持される合成である。代表的に、Ｂ７−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、数百ヌクレオチド長である。約１００ヌクレオチドより長い核酸は、これらの方法を使用して、いくつかのフラグメントとして合成され得る。次いで、これらのフラグメントが一緒に連結されて、Ｂ７−Ｌ遺伝子の全長ヌクレオチド配列を形成し得る。通常、このポリペプチドのアミノ末端をコードするＤＮＡフラグメントは、ＡＴＧを有し、これは、メチオニン残基をコードする。このメチオニンは、宿主細胞において産生されたポリペプチドがその細胞から分泌されるよう設計されるか否かに依存して、Ｂ７−Ｌポリペプチドの成熟形態で存在してもしなくてもよい。当業者に公知の他の方法が、同様に使用され得る。
【００９９】
特定の実施形態において、核酸改変体は、所定の宿主細胞におけるＢ７−Ｌポリペプチドの最適な発現のために変更されたコドンを含む。特定のコドン変更は、発現のために選択されるＢ７−Ｌポリペプチドおよび宿主細胞に依存する。このような「コドン最適化」は、種々の方法によって（例えば、所定の宿主細胞において高度に発現される遺伝子における使用に好ましいコドンを選択することによって）実施され得る。高度に発現された細菌遺伝子のコドン優先性のための「Ｅｃｏ＿ｈｉｇｈ．Ｃｏｄ」のようなコドン度数表を組み込むコンピュータアルゴリズムが使用され得、そしてＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｐａｃｋａｇｅ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　９．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって提供される。他の有用なコドン度数表としては、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｌｏｗ．ｃｏｄ」、「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｍａｉｚｅ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、および「Ｙｅａｓｔ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ．」が挙げられる。
【０１００】
いくつかの場合において、Ｂ７−Ｌポリペプチド改変体をコードする核酸分子を調製することが所望であり得る。改変体をコードする核酸分子は、プライマーが所望の点変異を有する、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ増幅、または他の適切な方法を使用して生成され得る（変異誘発技術の記載に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、およびＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）。Ｅｎｇｅｌｓら、前出によって記載される方法を使用する化学合成もまた、このような改変体を調製するために使用され得る。当業者に公知の他の方法が、同様に使用され得る。
【０１０１】
（ベクターおよび宿主細胞）
Ｂ７−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を、標準的な連結技術を使用して適切な発現ベクターに挿入する。ベクターは、代表的に、使用される特定の宿主細胞において機能的であるように選択される（すなわち、ベクターは、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が生じ得るように、宿主細胞機構と適合性である）。Ｂ７−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子は、原核生物宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫（バキュロウイルス系）宿主細胞および／または真核生物宿主細胞において増幅／発現され得る。宿主細胞の選択は、Ｂ７−Ｌポリペプチドが翻訳後修飾（例えば、グリコシル化および／またはホスホリル化）されるか否かに一部依存する。そうである場合、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、または哺乳動物宿主細胞が好ましい。発現ベクターの総説については、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，第１８５巻（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，編，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　１９９０）を参照のこと。
【０１０２】
代表的に、任意の宿主細胞に使用される発現ベクターは、プラスミド維持のためならびに外因性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含む。このような配列（集合的に、「隣接配列」と呼ばれる）は、特定の実施形態において、代表的に、以下のヌクレオチド配列の１つ以上を含む：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含む完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択マーカーエレメント。これらの配列のそれぞれが、以下に議論される。
【０１０３】
必要に応じて、ベクターは、「タグ」コード配列（すなわち、Ｂ７−Ｌポリペプチドコード配列の５’末端または３’末端に配置されるオリゴヌクレオチド分子）を含み得；オリゴヌクレオチド配列は、ｐｏｌｙＨｉｓ（例えば、ｈｅｘａＨｉｓ）、別の「タグ」（例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ（赤血球凝集素インフルエンザウイルス））または市販の抗体が存在するｍｙｃをコードする。このタグは、代表的には、ポリペプチドの発現の際にポリペプチドに融合され、宿主細胞からの、Ｂ７−Ｌポリペプチドのアフィニティー精製のための手段として役立ち得る。アフィニティー精製は、例えば、アフィニティーマトリクスとしてタグに対して抗体を使用するカラムクロマトグラフィーによって達成され得る。必要に応じて、タグは、続いて、切断のために特定のペプチダーゼを使用するような種々の手段によって、精製されたＢ７−Ｌポリペプチドから除去される。
【０１０４】
隣接配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または系統由来）であり得るか、異種（すなわち、宿主細胞種または系統以外の種由来）であり得るか、ハイブリッド（すなわち、１つより多くの供給源由来の隣接配列の組み合わせ）であり得るか、または合成であり得るか、あるいは隣接配列は、Ｂ７−Ｌポリペプチド発現を調節するために正常に機能するネイティブな配列であり得る。このように、隣接配列の供給源は、任意の原核生物または真核生物、任意の脊椎生物または無脊椎生物、あるいは任意の植物であり得、但し、隣接配列は、宿主細胞の機構において機能的であり、そして宿主細胞の機構によって活性化され得る。
【０１０５】
本発明のベクターに有用な隣接配列は、当該分野において周知である任意のいくつかの方法によって得られ得る。代表的には、Ｂ７−Ｌ遺伝子隣接配列以外の、本明細書中で有用な隣接配列は、マッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定されており、従って、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して、適切な組織供給源から単離され得る。いくつかの場合において、隣接配列の全長ヌクレオチド配列は公知であり得る。ここで、この隣接配列は、核酸合成またはクローニングのために本明細書中で記載される方法を使用して合成され得る。
【０１０６】
隣接配列の全てまたは一部のみが公知である場合、ＰＣＲを使用して、そして／あるいは適切なオリゴヌクレオチドおよび／または同じ種もしくは別の種由来の隣接配列フラグメントを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得る。隣接配列が公知でない場合、隣接配列を含むＤＮＡのフラグメントは、例えば、コード配列または別の遺伝子さえも含み得るＤＮＡの大きな片から単離され得る。単離は、適切なＤＮＡフラグメントを生成するための制限エンドヌクレアーゼ消化、続くアガロースゲル精製を使用する単離、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）、または当業者に公知の他の方法によって達成され得る。この目的を達成するための適切な酵素の選択は、当業者に容易に明らかである。
【０１０７】
複製起点は、代表的に、市販の原核生物発現ベクターの一部であり、そして、この起点は、宿主細胞においてベクターの増幅に役立つ。特定のコピー数に対するベクターの増幅は、いくつかの場合において、Ｂ７−Ｌポリペプチドの最適な発現に重要であり得る。選択されたベクターが複製起点部位を含まない場合、公知の配列に基づいて化学的に合成され得、そしてベクターに連結され得る。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）からの複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に適切であり、そして種々の起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶもしくはＢＰＶのようなパピローマウイルス）は、哺乳動物細胞においてベクターのクローニングのために有用である。一般的に、複製起点の成分は、哺乳動物発現ベクターを必要としない（例えば、ＳＶ４０起点は、ただそれが初期プロモーターを含むので、しばしば、使用される）。
【０１０８】
転写終結配列は、代表的にポリペプチドコード領域の末端の３’側に配置され、そして転写を終結させるのに役立つ。通常、原核生物細胞における転写終結配列は、Ｇ−Ｃリッチフラグメント、続いてポリ−Ｔ配列である。この配列は、ライブラリーから容易にクローン化されるか、またはベクターの一部として市販で購入さえされる一方で、これはまた、本明細書中に記載のような核酸合成のための方法を使用して容易に合成され得る。
【０１０９】
選択マーカー遺伝子エレメントは、選択培養培地において増殖される宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。代表的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物宿主細胞に対して、抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシン）に対する耐性を与えるか；（ｂ）細胞の自己栄養欠損を補うか；あるいは（ｃ）複合培地から入手可能でない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞における選択のために使用され得る。
【０１１０】
他の選択遺伝子は、発現される遺伝子を増幅するために使用され得る。増幅は、増殖に重要なタンパク質の産生のために、より大きく要求される遺伝子が、組換え細胞の連続的な生成の染色体内でタンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に対する適切な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼが挙げられる。哺乳動物細胞形質転換体は、選択圧下に置かれ、ここで、形質転換体のみが、ベクターに存在する選択遺伝子の効力によって生存するように独特に適合される。選択圧は、培地中の選択因子の濃度が連続的に変化し、それによって選択遺伝子とＢ７−ＬポリペプチドをコードするＤＮＡとの両方の増幅を導く条件下で、形質転換された細胞を培養することによって課される。結果として、増加した量のＢ７−Ｌポリペプチドが、増幅されたＤＮＡから合成される。
【０１１１】
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、そしてＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（原核性物）またはＫｏｚａｋ配列（真核生物）によって特徴付けられる。このエレメントは、代表的に、発現されるＢ７−Ｌポリペプチドのプロモーターの３’側およびコード配列の５’側に配置される。Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列は、可変であるが、代表的には、ポリプリン（すなわち、高いＡ−Ｇ含有量を有する）である。多くのＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列は、同定されており、これらの各々が、本明細書中に記載の方法を使用して容易に合成され得、そして原核生物ベクターにおいて使用され得る。
【０１１２】
リーダー配列、またはシグナル配列は、宿主細胞からＢ７−Ｌポリペプチドを指向させるために使用され得る。代表的には、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、Ｂ７−Ｌ核酸分子のコード領域に位置するか、または直接Ｂ７−Ｌポリペプチドコード領域の５’末端に位置する。多くのシグナル配列が同定されており、そして、選択された宿主細胞において機能性である任意のシグナル配列が、Ｂ７−Ｌ核酸分子と共に使用され得る。従って、シグナル配列は、Ｂ７−Ｌ核酸分子に対して同種（天然）または異種であり得る。さらに、シグナル配列は、本明細書中に記載される方法を使用して化学的に合成され得る。大部分において、シグナルペプチドの存在によって宿主細胞からのＢ７−Ｌポリペプチドの分泌は、分泌されたＢ７−Ｌポリペプチドからのシグナルペプチドの除去を生じる。シグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、またはベクターに挿入されたＢ７−Ｌ核酸分子の一部であり得る。
【０１１３】
Ｂ７−Ｌポリペプチドコード領域に結合されたネイティブなＢ７−Ｌポリペプチドシグナル配列をコードするヌクレオチド配列またはＢ７−Ｌポリペプチドコード領域に結合された異種シグナル配列をコードするヌクレオチド配列のいずれかの使用が本発明の範囲内に含まれる。選択された異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され、そしてプロセスされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものでなければならない。ネイティブなＢ７−Ｌポリペプチドシグナル配列を認識せず、プロセスしない原核生物宿主細胞について、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。酵母分泌について、ネイティブなＢ７−Ｌポリペプチドシグナル配列は、酵母インベルターゼ、α因子、または酸ホスファターゼリーダーによって置換され得る。哺乳動物細胞発現において、ネイティブなシグナル配列が満足であるが、他の哺乳動物シグナル配列が適切であり得る。
【０１１４】
グリコシル化が真核生物宿主細胞発現系において望ましいような、いくつかの場合において、グリコシル化または収量を改善するために種々のシグナルペプチド（ｐｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）が操作され得る。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更し得るかまたはプロ配列（ｐｒｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を加え得、これはまた、グリコシル化に影響し得る。最終タンパク質産物は、１位に（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）、発現に付随して１つ以上のさらなるアミノ酸を有し得、これは、完全に除去されないかもしれない。例えば、最終タンパク質産物は、アミノ末端に結合される、ペプチダーゼ切断部位において見出される１つまたは２つのアミノ酸残基を有し得る。あるいは、いくつかの酵素切断部位の使用は、酵素が成熟ポリペプチド内のこのような領域で切断される場合、所望のＢ７−Ｌポリペプチドのわずかに短縮した形態を生じ得る。
【０１１５】
多くの場合において、核酸分子の転写は、ベクター内の１つ以上のイントロンの存在によって増加される；これは、ポリペプチドが真核生物宿主細胞（特に、哺乳動物宿主細胞）において産生される場合、特に当てはまる。使用されるイントロンは、特に使用される遺伝子が全長ゲノム配列またはそのフラグメントである場合、Ｂ７−Ｌ遺伝子内に天然に存在し得る。イントロンが（大部分のｃＤＮＡについて）遺伝子内に天然に存在しない場合、イントロンは、別の供給源から得られ得る。隣接配列およびＢ７−Ｌ遺伝子に関するイントロンの位置は、イントロンが効果的に転写されなければならないので、一般的に重要である。従って、Ｂ７−Ｌ　ｃＤＮＡ分子が転写される場合、イントロンの好ましい位置は、転写開始部位の３’側で、そしてｐｏｌｙ−Ａ転写終止配列の５’側である。好ましくは、イントロンは、コード配列を妨害しないように、ｃＤＮＡの１つの側面または他の側面（すなわち、５’側または３’側）に配置される。任意の供給源（ウイルス、原核生物および真核生物（植物または動物）を含む）由来の任意のイントロンを使用して本発明を実行し得るが、但し、このイントロンは、挿入される宿主細胞に適合性である。合成イントロンもまたここに含まれる。必要に応じて、１つより多くのイントロンがベクター内で使用され得る。
【０１１６】
本発明の発現ベクターおよびクローニングベクターは、代表的には、宿主生物によって認識され、Ｂ７−Ｌポリペプチドをコードする分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する構造遺伝子（一般的に、約１００ｂｐ〜１０００ｂｐ）の開始コドンに対して上流（すなわち、５’側）に配置される非転写配列である。プロモーターは、通常、２つのクラス（誘導プロモーターおよび構成プロモーター）の１つにグループ化される。誘導プロモーターは、培養条件におけるいくらかの変化（例えば、栄養分の存在または非存在、あるいは温度の変化）に応答してそれらの制御下で、ＤＮＡからの転写の増加したレベルを開始する。他方、構成プロモーターは、連続的な遺伝子産物の産生を開始する；すなわち、遺伝子発現に対して遺伝子をほとんど制御しないかまたは制御しない。多数のプロモーター（種々の潜在的な宿主細胞によって認識される）が周知である。適切なプロモーターは、供給源のＤＮＡからプロモーターを制限酵素消化によって取り出し、そして所望のプロモーター配列をベクターに挿入することによって、Ｂ７−ＬポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結される。ネイティブなＢ７−Ｌプロモーター配列は、Ｂ７−Ｌ核酸分子の増幅および／または発現を指向するために使用され得る。しかし、ネイティブなプロモーターと比較して、より大きい転写および発現タンパク質のより高い産生が可能であり、そして使用のために選択された宿主細胞系と適合性である場合、異種プロモーターが好ましい。
【０１１７】
原核性物宿主との使用に適切なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼ；トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系；およびハイブリッドプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター）が挙げられる。他の公知の細菌プロモーターもまた、適切である。これらの配列は、公開されており、その結果、当業者は、任意の有用な制限部位を供給するのに必要とされるようなリンカーまたはアダプターを使用して、所望のＤＮＡ配列にそれらの配列を連結し得る。
【０１１８】
酵母宿主との使用に適切なプロモーターもまた、当該分野において周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと共に有利に使用される。哺乳動物宿主細胞との使用に適切なプロモーターは周知であり、そしてこれらとしては、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ２）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、そして最も好ましくは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。他の適切な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター（例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーター）が挙げられる。
【０１１９】
Ｂ７−Ｌ遺伝子発現を制御する際の目的のプロモーターであり得るさらなるプロモーターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ　２９０：３０４−１０）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復において得られるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０、Ｃｅｌｌ、２２：７８７−９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７８：１４４４−４５）；メタロチオニン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ２９６：３９−４２）；βラクタマーゼプロモーターのような原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３１）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０：２１−２５）。以下の動物転写制御領域もまた目的の領域であり、これらは、組織特異性を示し、そしてトランスジェニック動物において利用されている：膵臓腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら、１９８４、Ｃｅｌｌ、３８：６３９−４６；Ｏｒｎｉｔｚら、１９８６、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９８７、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，７：４２５−５１５）；膵臓β細胞中で活性化されるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ　３１５：１１５−１２２）；リンパ系細胞中で活性化される免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４、Ｃｅｌｌ　３８：６４７−５８；Ａｄａｍｅｓら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１８：５３３−３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１４３６−４４）；精巣細胞、胸部細胞、リンパ系細胞および肥胖細胞において活性化されるマウス乳腺癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら、１９８６、Ｃｅｌｌ　４５：４８５−９５）；肝臓において活性化されるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−７６）；肝臓において活性化されるαフェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：１６３９−４８；Ｈａｍｍｅｒら、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３５：５３−５８）；肝臓において活性化されるα１アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）；骨髄性細胞において活性化されるβグロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ　３１５：３３８−４０；Ｋｏｌｌｉａｓら、１９８６、Ｃｅｌｌ　４６：８９−９４）；脳中の稀突起膠細胞において活性化されるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７、Ｃｅｌｌ　４８：７０３−１２）；骨格筋において活性化されるミオシン軽鎖−��遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ　３１４：２８３−８６）；および視床下部において活性化される性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３４：１３７２−７８）。
【０１２０】
エンハンサー配列は、高等真核生物により本発明のＢ７−ＬポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を増加するためにベクターへ挿入され得る。エンハンサーは、ＤＮＡのシス作用性エレメントであり、通常約１０〜３００ｂｐ長であり、これは、プロモーターに対して作用し、その転写を増加させる。エンハンサーは、比較的配向性でありそして位置依存性である。エンハンサーは、転写ユニットに対して５’および３’を見出されている。哺乳動物遺伝子から利用可能ないくつかのエンハンサー配列（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン）が公知である。しかし、典型的に、ウイルス由来のエンハンサーが使用される。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化についての例示的なエンハンサーエレメントである。エンハンサーは、Ｂ７−Ｌ核酸分子に対して５’位または３’位でベクターに接合され得るが、エンハンサーは、典型的には、プロモーターから５’部位に配置される。
【０１２１】
本発明の発現ベクターは、市販のベクターのような出発ベクターから構成され得る。このようなベクターは、全ての所望の隣接配列を含んでも含まなくてもよい。本明細書中に記載される所望の隣接配列のうちの１以上がベクター中にまだ存在しない場合、これらは、個々に入手され、そしてベクターへ連結され得る。それぞれの隣接配列を得るために使用される方法は、当業者に周知である。
【０１２２】
本発明を実施するために好ましいベクターは、細菌宿主細胞、昆虫宿主細胞および哺乳動物宿主細胞と適合するベクターである。このようなベクターとしては、特に、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＥＴ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−α（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１４３６３）およびｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）が挙げられる。
【０１２３】
さらなる適切なベクターとしては、コスミドベクター、プラスミドベクターまたは改変ベクターが挙げられるがこれらに限定されない。しかし、このベクター系が選択された宿主細胞と適合しなければならないことが理解される。このようなベクターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：例えば、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（高コピー数ＣｏｌＥ１ベースのファージミド；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ　ＣＡ）のようなプラスミド；クローンニングＴａｑ−増幅されるＰＣＲ産物について設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えば、ＴＯＰＯＴＭ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）ＫｉｔおよびＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ならびに哺乳動物ベクター、酵母ベクターおよびウイルスベクター（例えば、バキュロウイルス発現系（ｐＢａｃＰＡＫプラスミド誘導体；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））。
【０１２４】
ベクターが構築され、そしてＢ７−Ｌポリペプチドをコードする核酸分子がベクターの適切な部位に挿入された後、完成されたベクターは、増幅および／またはポリペプチド発現のために適切な宿主細胞へ挿入され得る。選択された宿主細胞へのＢ７−Ｌポリペプチドについての発現ベクターの形質転換は、周知の方法（例えば、トランスフェクション、感染、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクチン、ＤＥＡＥ−デキストラン法または、他の公知の技術のような方法）により達成され得る。選択された方法は、部分的に、使用される宿主細胞の型に依存する。これらの方法および他の適切な方法は、当業者に周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載される。
【０１２５】
宿主細胞は、原核細胞宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核細胞宿主細胞（酵母細胞、昆虫細胞、または脊椎動物細胞）であり得る。適切な条件下で培養された場合、宿主細胞は、Ｂ７−Ｌポリペプチドを合成し、このポリペプチドは引き続き培養培地から収集され得るか（宿主細胞がＢ７−Ｌポリペプチドを培地へ分泌する場合）、またはＢ７−Ｌポリペプチドを産生する宿主細胞から直接収集される（分泌されない場合）。適切な宿主細胞の選択が、ウイルス因子（例えば、所望の発現レベル、活性にとって所望であるかまたは必要であるポリペプチド改変（例えば、グリコシル化またはリン酸化）および生物学的に活性な分子への折り畳みの簡便性）に依存する。
【０１２６】
適切な宿主細胞の多くは、当該分野で公知であり、そして、多くは、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから入手可能である。例としては、哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＨＯ　ＤＨＦＲ（−）細胞（Ｕｒｌａｕｂら、１９８０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：４２１６−２０）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞もしくは２９３Ｔ細胞、または３Ｔ３細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。適切な哺乳動物宿主細胞の選択ならびに形質転換、培養、増幅、スクリーニング、産物産生および精製のための方法は、当該分野で公知である。他の適切な哺乳動物細胞株は、サルＣＯＳ−１およびＣＯＳ−７細胞株ならびにＣＶ−１細胞株である。さらなる例示的な哺乳宿主細胞としては、形質転換された細胞株を含む、霊長類細胞株およびげっ歯類細胞株が挙げられる。正常な二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養に由来する細胞株、ならびに一次外植片もまた適切である。候補細胞は、選択遺伝子において遺伝子型的に欠損していてもよいし、または優性に作用する選択遺伝子を含んでいてもよい。他の適切な哺乳動物細胞株としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃもしくはＮＩＨマウスに由来するマウス神経芽細胞種Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ−９２９細胞、３Ｔ３株またはＨａＫハムスター細胞株、ＢＨＫハムスター細胞株またはＨａＫハムスター細胞株。各々これらの細胞株は、公知であり、そしてタンパク質発現の分野の当業者にとって利用可能である。
【０１２７】
本発明に適切な宿主細胞として同様に有用であるのは、細菌細胞である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの種々の株（例えば、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＤＨ１０、およびＭＣ１０６１）が、バイオテクノロジーの分野において宿主細胞として周知である。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐｐ．、他のＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐｐ．などの種々の株もまた、本方法において使用され得る。
【０１２８】
当業者に公知の酵母細胞の多くの株もまた、本発明のポリペプチドの発現のための宿主細胞として利用可能である。好ましい酵母株としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｉｖｉｓａｅおよびＰｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。
【０１２９】
さらに、所望される場合、昆虫細胞系が、本発明の方法において利用され得る。このような系は、例えば、Ｋｉｔｔｓら（１９９３、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４：８１０−１７）；Ｌｕｃｋｌｏｗ（１９９３、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：５６４−７２）；およびＬｕｃｋｌｏｗら（１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４５６６−７９）に記載される。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ−９およびＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【０１３０】
グリコシル化Ｂ７−Ｌポリペプチドを発現するためのトランスジェニック動物もまた使用し得る。例えば、トランスジェニック乳汁産生動物（例えば、ウシまたはヤギ）を使用し得、そしてその動物の乳汁中の本発明のグリコシル化ポリペプチドを入手し得る。Ｂ７−Ｌポリペプチドを産生するための植物もまた使用し得るが、一般的に、植物中で生じるグリコシル化は、哺乳動物細胞にて産生されるものと異なり、そしてヒト治療用途に適切でないグリコシル化生成物を生じ得る。
【０１３１】
（ポリペプチド産生）
Ｂ７−Ｌポリペプチド発現ベクターを含む宿主細胞が、当業者に周知の標準的培地を使用して培養され得る。この培地は、通常、その細胞の増殖および生存に必要な栄養素すべてを含む。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を培養するのに適切な培地は、例えば、Ｌｕｒｉａ　Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）および／またはＴｅｒｒｉｆｉｃ　Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）が挙げられる。真核生物細胞を培養するのに適切な培地としては、Ｒｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｍｅｄｉｕｍ　１６４０（ＲＰＭＩ　１６４０）、Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、および／またはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）が挙げられ、これらすべては、培養される特定の細胞株のために必要な血清および／または増殖因子として補充され得る。昆虫培養に適切な培地は、必要な場合には酵母融解物（ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）、ラクトアルブミン加水分解物および／またはウシ胎仔血清を補充した、Ｇｒａｃｅ培地である。
【０１３２】
代表的には、トランスフェクトされた細胞または形質転換細胞の選択的増殖に有用な抗生物質または他の化合物が、この培地に補充物として添加される。使用される化合物は、宿主細胞を形質転換したプラスミド上に存在する選択マーカーエレメントにより決定される。例えば、その選択マーカーエレメントがカナマイシン耐性である場合、培養培地に添加される化合物は、カナマイシンである。選択的増殖のための他の化合物としては、アンピシリン、テトラサイクリンおよびネオマイシンが挙げられる。
【０１３３】
宿主細胞により産生されるＢ７−Ｌポリペプチドの量は、当該分野で公知の標準的方法を使用して評価され得る。このような方法としては、限定はしないが、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離、免疫沈降、および／または活性アッセイ（例えば、ＤＮＡ結合ゲルシフトアッセイ）が挙げられる。
【０１３４】
Ｂ７−Ｌポリペプチドが宿主細胞から分泌されるように設計された場合、ポリペプチドの大部分は、細胞培養培地にて見出され得る。しかし、Ｂ７−Ｌポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合、Ｂ７−Ｌポリペプチドは細胞質および／または核（真核生物宿主細胞について）あるいは細胞質ゾル（グラム陰性細菌宿主細胞）に存在する。
【０１３５】
宿主細胞の細胞質および／または核（真核生物宿主細胞について）あるいは細胞質ゾル（細菌宿主細胞）に存在するＢ７−Ｌポリペプチドに関して、細胞内物質（グラム陰性細菌について封入体を含む）が、当業者に公知の任意の標準的技術を使用して宿主細胞から抽出され得る。例えば、宿主細胞は、フレンチプレス、ホモジナイゼーション、および／または超音波処理、それに続く遠心分離によって、ペリプラズム／細胞質の中身を放出するように溶解され得る。
【０１３６】
Ｂ７−Ｌポリペプチドが細胞質ゾルにおいて封入体を形成した場合、その封入体は、しばしば、内側細胞膜および／または外側細胞膜に結合し得、従って、遠心分離後に、主にペレット物質中に見出される。次いで、このペレット物質は、極端なｐＨ状態で処理され得るか、またはカオトロピック剤（例えば、界面活性剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素、または尿素誘導体）を還元剤（例えば、ジチオスレイトール（アルカリ性ｐＨ）もしくはトリスカルボキシエチルホスフィン（酸性ｐＨ））の存在下で用いて処理され得て、封入体を遊離、破壊および可溶化し得る。可溶化されたＢ７−Ｌポリペプチドは、次いで、ゲル電気泳動、免疫沈降などを使用して分析され得る。Ｂ７−Ｌポリペプチドを単離することが所望される場合、単離は、本明細書中に記載される方法およびＭａｒｓｔｏｎら（１９９０、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１８２：２６４−７５）に記載される方法のような、標準的方法を使用して達成され得る。
【０１３７】
いくつかの場合において、Ｂ７−Ｌポリペプチドは、単離の際に生物学的に活性でないかもしれない。そのポリペプチドを「リフォールディング」またはその３次構造に変換してジスルフィド結合を産生するための種々の方法が、生物学的活性を回復するために使用され得る。このような方法は、可溶化されたポリペプチドを通常は７を超えるｐＨに、特定の濃度のカオトロープの存在下で曝すことを包含する。カオトロープの選択は、封入体可溶化のために使用される選択に非常に類似するが、通常このカオトロープは、より低い濃度で使用されそして可溶化に使用されるカオトロープと必ずしも同じではない。ほとんどの場合、リフォールディング／酸化溶液はまた、還元剤を含むかまたは還元剤およびその酸化形態を特定の比で含んで、特定の酸化還元ポテンシャルを生じ、それによりそのタンパク質のシステイン架橋の形成を生じるようなジスルフィドシャッフリングを可能にする。一般的に使用される酸化還元カップルのいくつかとしては、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化銅、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、および２−２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）が挙げられる。多くの場合において、共溶媒が、使用され得るかまたはリフォールディングの効率を高めるために必要であり得、そしてこの目的に使用されるより一般的な試薬としては、グリセロール、種々の分子量のポリエチレングリコール、アルギニンなどが挙げられる。
【０１３８】
封入体が、Ｂ７−Ｌポリペプチドの発現の際に有意な程度まで形成されない場合は、そのポリペプチドは、主に、細胞ホモジネートの遠心分離後に上清中に見出される。そのポリペプチドは、本明細書中に記載されるような方法を使用して、上清からさらに単離され得る。
【０１３９】
溶液からのＢ７−Ｌポリペプチドの精製は、種々の技術を使用して達成され得る。そのポリペプチドがそのカルボキシル末端もしくはアミノ末端のいずれかに、ヘキサヒスチジンのようなタグを含む（Ｂ７−Ｌポリペプチド／ヘキサＨｉｓ）かまたはＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏ．、Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）もしくはｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のような他の小さいペプチドを含むように合成されている場合、そのポリペプチドは、アフィニティーカラム（カラムマトリックスはそのタグに高い親和性を有する）にその溶液を通すことによって、１工程で精製され得る。
【０１４０】
例えば、ポリヒスチジンはニッケルに大きな親和性および特異性で結合する。従ってニッケルのアフィニティーカラム（例えば、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ニッケルカラム）が、Ｂ７−Ｌポリペプチド／ポリＨｉｓの精製に使用され得る。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、１０．１１．８節（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｉｎｃ．およびＷｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ、１９９３を参照のこと。
【０１４１】
さらに、Ｂ７−Ｌポリペプチドは、Ｂ７−Ｌポリペプチドを特異的に認識し得そして結合し得るモノクローナル抗体の使用を介して、精製され得る。
【０１４２】
精製に適切な他の手順としては、限定はしないが、アフィニティークロマトグラフィー、イムノアフィニティー、クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、電気泳動（ネイティブゲル電気泳動を含む）と続くゲル溶出、ならびに調製的等電点電気泳動（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」マシーン／技術、Ｈｏｅｆｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）が挙げられる。いくつかの場合、２つ以上の精製技術が、純度の増加を達成するために組み合わされ得る。
【０１４３】
Ｂ７−Ｌポリペプチドもまた、当該分野で公知の技術を使用して化学合成法（例えば、固相ペプチド合成）により調製され得、その公知技術は、たとえば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、１９６３、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：５１３２；ならびにＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．１９８４）に示される技術である。このようなポリペプチドは、アミノ末端にメチオニンを含んで合成され得るし、または含まずに合成され得る。化学合成されたＢ７−Ｌポリペプチドは、これらの参考文献に示される方法を使用して、ジスルフィド架橋を形成するように酸化され得る。化学合成されたＢ７−Ｌポリペプチドは、組換え産生されるかもしくは天然の供給源から精製された対応するＢ７−Ｌポリペプチドに匹敵する生物学的活性を有すると予測され、従って、組換えＢ７−Ｌポリペプチドもしくは天然のＢ７−Ｌポリペプチドと互換可能に使用され得る。
【０１４４】
Ｂ７−Ｌポリペプチドを得るための別の手段は、そのＢ７−Ｌポリペプチドが天然で見出される生物学的サンプル（例えば、供給源組織および／または流体）からの精製を介する。このような精製は、上記のようなタンパク質精製のための方法を使用して実行され得る。精製の間のＢ７−Ｌポリペプチドの存在は、例えば、組換え産生されたＢ７−Ｌポリペプチドもしくはそのペプチドフラグメントに対して調製された抗体を使用して、モニターされ得る。
【０１４５】
核酸およびポリペプチドを産生するためのさらなる多数の方法が、当該分野で公知であり、そしてその方法は、Ｂ７−Ｌポリペプチドに対する特異性を有するポリペプチドを産生するために使用され得る。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：１２２９７−３０３を参照のこと。これは、ｍＲＮＡとそのコードされるペプチドとの間の融合タンパク質の産生を記載する。また、Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９９、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：２６８−７３も参照のこと。さらに、米国特許第５，８２４，４６９号は、特定の生物学的機能を実行し得るオリゴヌクレオチドを得る方法を記載する。この手順は、各々が５’ランダム配列、所定の中心配列、および３’ランダム配列を有する、オリゴヌクレオチドの不均質プールを産生することを包含する。生じた不均質プールは、所望の生物学的機能を示さない細胞集団に導入される。次いで、この細胞の部分集団が、所定の生物学的機能を示す部分集団についてスクリーニングされる。この部分集団から、所望の生物学的機能を実行し得るオリゴヌクレオチドが、単離される。
【０１４６】
米国特許第５，７６３，１９２号；同第５，８１４，４７６号；同第５，７２３，３２３号；および同第５，８１７，４８３号は、ペプチドもしくはポリペプチドを産生するためのプロセスを記載する。これは、確率的（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ）遺伝子もしくはそのフラグメントを産生すること、次いでこれらの遺伝子を、その確率的遺伝子によりコードされる１つ以上のタンパク質を産生する宿主細胞に導入することによって、なされる。次いで、この宿主細胞は、所望の活性を有するペプチドもしくはポリペプチドを産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。
【０１４７】
ペプチドもしくはポリペプチドを産生するための別の方法は、「Ｒａｎｄｏｍ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」（ＲＡＧＥ−ＧＤ）として公知である、Ａｔｈｅｒｓｙｓ，Ｉｎｃ．により出願されたＰＣＴ／ＵＳ９８／２００９４（ＷＯ９９／１５６５０）に記載され、このプロセスは、インサイチュ組換え方法による内因性遺伝子発現の活性化もしくは遺伝子の過剰発現を包含する。例えば、内因性遺伝子の発現は、非相同組換えもしくは非正統的（ｉｌｌｅｇｉｔｉｍａｔｅ）組換えによってその遺伝子の発現を活性化し得る標的細胞に調節配列を組み込むことによって、活性化もしくは増加される。標的ＤＮＡは、まず、放射線に供され、そして遺伝子プロモーターが挿入される。このプロモーターは、最終的には遺伝子の前の途切れ目に位置し、その遺伝子の転写を開始する。これは、所望のペプチドもしくはポリペプチドの発現を生じる。
【０１４８】
これらの方法がまた、包括的Ｂ７−Ｌポリペプチド発現ライブラリーを生じるために使用され得、このライブラリーが続いて種々のアッセイ（例えば、生化学的アッセイ、細胞アッセイ、および生物全体アッセイ（例えば、植物、マウスなど））における高スループット表現型スクリーニングに使用され得ることが、理解される。
【０１４９】
（合成）
本明細書中に記載される核酸およびポリペプチド分子が、組換え手段および他の手段によって産生され得ることが、当業者によって理解される。
【０１５０】
（選択的結合因子）
用語「選択的結合因子」は、１つ以上のＢ７−Ｌポリペプチドに対して特異性を有する分子をいう。適切な選択的結合因子としては、抗体およびその誘導体、ポリペプチド、ならびに低分子が挙げられるが、これらに限定されない。適切な選択的結合因子は、当該分野で公知の方法を使用して調製され得る。本発明の例示的なＢ７−Ｌポリペプチド選択的結合因子は、Ｂ７−Ｌポリペプチドの特定の部分を結合し得、それによって、Ｂ７−Ｌポリペプチドレセプターへのこのポリペプチドの結合を阻害する。
【０１５１】
Ｂ７−Ｌポリペプチドを結合する選択的結合因子（例えば、抗体および抗体フラグメント）は、本発明の範囲内にある。抗体は、ポリクローナル（単一特異的なポリクローナルを含む）抗体；モノクローナル抗体（ＭＡｂ）；組換え抗体；キメラ抗体；ヒト化抗体（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフト化抗体）；ヒト抗体；単鎖抗体；および／または二特異性抗体；ならびにそれらのフラグメント；改変体；または誘導体であり得る。抗体フラグメントは、Ｂ７−Ｌポリペプチドのエピトープに結合する抗体の部分を含む。このようなフラグメントの例としては、全長抗体の酵素的切断によって生成される、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）フラグメントが挙げられる。他の結合フラグメントとしては、組換えＤＮＡ技術（例えば、抗体可変領域をコードする核酸配列を含む組換えプラスミドの発現）によって生成されるフラグメントが挙げられる。
【０１５２】
Ｂ７−Ｌポリペプチドに対するポリクローナル抗体は、一般に、Ｂ７−Ｌポリペプチドおよびアジュバントの複数回の皮下注射または腹腔内注射によって、動物（例えば、ウサギまたはマウス）において産生される。Ｂ７−Ｌポリペプチドを、キャリアタンパク質に結合体化することが有用であり得、このキャリアタンパク質は、免疫される種において免疫原性である（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清、アルブミン、ウシサイログロブリンまたはダイズトリプシンインヒビター）。また、凝集因子（例えば、ミョウバン）も、免疫応答を増強するために使用される。免疫後、動物を採血し、そして血清を、抗Ｂ７−Ｌ抗体力価についてアッセイする。
【０１５３】
Ｂ７−Ｌポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、培養物中の継代細胞株による抗体分子の産生を提供する、任意の方法を使用して産生される。モノクローナル抗体を調製するための適切な方法の例としては、Ｋｏｈｌｅｒら、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５−９７のハイブリドーマ法、およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ、１９８４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、１９８７）が挙げられる。Ｂ７−Ｌポリペプチドと反応性のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた、本発明によって提供される。
【０１５４】
本発明のモノクローナル抗体は、治療剤としての使用のために改変され得る。１つの実施形態は、「キメラ」抗体であり、ここで、重鎖（Ｈ）および／または軽鎖（Ｌ）の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と、同一であるかまたは相同であり、鎖の残りの部分は、別の種に由来するかまたは別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と、同一であるかまたは相同である。このような抗体のフラグメントもまた、それらが、所望の生物学的活性を示す限り、含まれる。米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、８１：６８５１−５５を参照のこと。
【０１５５】
別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で周知である。米国特許第５，５８５，０８９号および同第５，６９３，７６２号を参照のこと。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト供給源由来のそのヒト化抗体に１以上のアミノ酸残基が導入されている。ヒト化は、例えば、齧歯目の相補性決定領域の少なくとも一部を、ヒト抗体の対応する領域で置換することによる、当該分野で記載される方法（Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ　３２１：５２２−２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ　３３２：３２３−２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：１５３４−３６）によって、行われ得る。
【０１５６】
Ｂ７−Ｌポリペプチドを結合するヒト抗体もまた、本発明に含まれる。このような抗体は、必要に応じてキャリアに結合体化されたＢ７−Ｌポリペプチド抗原（すなわち、少なくとも６個連続するアミノ酸を有する）で免疫することによって産生される内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体のレパートリーを産生し得る、トランスジェニック動物（例えば、マウス）を使用する。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：２５５１−５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ　３６２：２５５−５８；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、１９９３、Ｙｅａｒ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏ．７：３３を参照のこと。１つの方法において、このようなトランスジェニック動物は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をその中でコードする内因性遺伝子座を不活化し、ヒト重鎖および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を、そのゲノム内に導入することによって産生される。次いで、部分的に改変された動物（完全ではない補体の改変を有する）を交雑育種して、所望の免疫系の改変の全てを有する動物を得る。免疫原を投与した場合、これらのトランスジェニック動物は、これらの抗原に免疫特異的な可変領域を含む、（例えば、マウスよりもむしろ）ヒトのアミノ酸配列を有する抗体を産生する。ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８およびＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９２６を参照のこと。さらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９１／２４５、およびＰＣＴ／ＧＢ８９／０１２０７、ならびに欧州特許第５４６０７３Ｂ１号および同第５４６０７３Ａ１号に記載される。ヒト抗体はまた、本明細書中に記載されるような、宿主細胞における組換えＤＮＡの発現またはハイブリドーマ細胞における発現によって産生され得る。
【０１５７】
代替的な実施形態において、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーにおいて生成され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１）。これらのプロセスは、糸状バクテリオファージの表面上での抗体レパートリーのディスプレイ、引き続いて、選択された抗原に対するそれらの結合によるファージの選択によって免疫選択を模倣する。１つのこのような技術は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１７３６４（これは、このようなアプローチを用いたＭＰＬ−レセプターおよびｍｓｋ−レセプターに対する高親和性でかつ機能的アゴニスト抗体の単離を記載する）に記載される。
【０１５８】
キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、およびヒト化抗体は、代表的には、組換え方法により生成される。これらの抗体をコードする核酸は、宿主細胞に導入され、そして本明細書中に記載される材料および方法を用いて発現される。好ましい実施形態において、抗体は、哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）において発現される。モノクローナル（例えば、ヒト）抗体は、宿主細胞における組換えＤＮＡの発現によるか、または本明細書中に記載のハイブリドーマ細胞における発現により生成され得る。
【０１５９】
本発明の抗Ｂ７−Ｌ抗体は、Ｂ７−Ｌポリペプチドの検出および定量について、任意の公知のアッセイ方法（例えば、競合結合アッセイ、直接的サンドイッチアッセイおよび間接的サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイ（Ｓｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４７−１５８（ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８７））において用いられ得る。抗体は、使用されるアッセイ方法に適切な親和性でＢ７−Ｌポリペプチドを結合する。
【０１６０】
診断適用に関しては、特定の実施形態において、抗Ｂ７−Ｌ抗体は、検出可能な部分で標識され得る。この検出可能な部分は、直接的または間接的のいずれかで検出可能なシグナルを生じ得る任意の部分である。例えば、検出可能な部分は、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、または６７Ｇａ）；蛍光化合物もしくは化学発光化合物（例えば、フルオロセインイソチオシアネート、ローダミンもしくはルシフェリン）；または酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたは西洋ワサビベルオキシダーゼ）（Ｂａｙｅｒら、１９９０、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１８４：１３８−１６３）であり得る。
【０１６１】
競合結合アッセイは、限定された量の抗Ｂ７−Ｌ抗体との結合について試験サンプル分析物（Ｂ７−Ｌポリペプチド）と競合する標識された標準物質（例えば、Ｂ７−Ｌポリペプチドまたはその免疫学的に反応性の部分）の能力に依存する。試験サンプル中のＢ７−Ｌポリペプチドの量は、この抗体に結合する標準物質の量に逆比例する。結合する標準物質の量の測定を容易にするために、この抗体は、代表的には、競合の前または後に不溶化され、その結果、この抗体に結合する標準物質および分析物は、結合しないままの標準物質および分析物から簡単に分離され得る。
【０１６２】
サンドイッチアッセイは、代表的には、２つの抗体（各々、検出され、そして／または定量されるタンパク質の異なる免疫原性部分（すなわち、エピトープ）に結合し得る）の使用を含む。サンドイッチアッセイにおいて、この試験サンプル分析物は、代表的には、固体支持体に固定化された第１の抗体に結合され、その後第２の抗体がこの分析物に結合し、このようにして不溶性の３部分で構成される複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照のこと。第２の抗体は、それ自体検出可能な部分で標識され得るか（直接サンドイッチアッセイ）、または検出可能な部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定され得る（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１つの型は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）であり、この場合、この検出可能な部分は酵素である。
【０１６３】
選択的結合因子（抗Ｂ７−Ｌ抗体を含む）はまた、インビボ画像化のために有用である。検出可能な部分で標識された抗体は、動物に（好ましくは、血流に）投与され得、そして宿主における標識化抗体の存在および位置がアッセイされる。この抗体は、動物において（核磁気共鳴、放射線学または当該分野で公知の他の検出手段のいずれかで）検出可能な任意の部分で標識され得る。
【０１６４】
本発明の選択的結合因子（抗体を含む）は、治療剤として使用され得る。これらの治療剤は、一般に、それらがＢ７−Ｌポリペプチドの生物学的活性の少なくとも１つを増強または減少するかのいずれかであるという点で、それぞれ、アゴニストまたはアンタゴニストである。１つの実施形態において、本発明のアンタゴニスト抗体は、Ｂ７−Ｌポリペプチドに特異的に結合し得、そしてＢ７−Ｌポリペプチドの機能的活性をインビボまたはインビトロで阻害または排除し得る抗体またはその結合フラグメントである。好ましい実施形態において、選択的結合因子（例えば、アンタゴニスト抗体）は、Ｂ７−Ｌポリペプチドの機能的活性を少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約８０％阻害する。別の実施形態において、この選択的結合因子は、Ｂ７−Ｌポリペプチド結合パートナー（リガンドまたはレセプター）と相互作用し得、それによりインビトロまたはインビボでＢ７−Ｌポリペプチド活性を阻害または排除し得る抗Ｂ７−Ｌペプチド抗体であり得る。選択的結合因子（アゴニスト抗Ｂ７−Ｌポリペプチド抗体およびアンタゴニスト抗Ｂ７−Ｌポリペプチド抗体を含む）は、当該分野で周知のスクリーニングアッセイにより同定される。
【０１６５】
本発明はまた、Ｂ７−Ｌ選択的結合因子（例えば、抗体）および生物学的サンプルにおいてＢ７−Ｌポリペプチドレベルを検出するに有用な他の試薬を含むキットに関する。このような試薬としては、以下が挙げられ得る：検出可能な標識、ブロッキング血清、陽性コントロールサンプルおよび陰性コントロールサンプル、ならびに検出試薬。
【０１６６】
（マイクロアレイ）
ＤＮＡマイクロアレイ技術が、本発明に従って利用され得ることが理解される。ＤＮＡマイクロアレイは、固体支持体（例えば、ガラス）上に配置された、核酸の微小の高密度アレイである。このアレイ内の各セルまたはエレメントは、単一核酸種の多くのコピーを有し、この核酸種は、相補的な核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）に対するハイブリダイゼーションのための標的として作用する。ＤＮＡマイクロアレイ技術を使用する発現プロファイリングにおいて、最初に、ｍＲＮＡが、細胞または組織サンプルから抽出され、次いで、蛍光標識されたｃＤＮＡに酵素的に変換される。この材料を、マイクロアレイにハイブリダイズさせ、そして未結合ｃＤＮＡを洗浄により除去する。次いで、アレイ上に提示される別々の遺伝子の発現を、各標的核酸分子に特異的に結合された標識ｃＤＮＡの量を定量することによって可視化する。このようにして、数千の遺伝子の発現を、生物学的材料の単一のサンプルから、高スループットの並行様式で定量し得る。
【０１６７】
この高スループット発現プロファイリングは、本発明のＢ７−Ｌ分子に関する広範な適用を有する。これらの適用としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：治療用標的としてのＢ７−Ｌ疾患関連遺伝子の同定および確証；関連するＢ７−Ｌ分子およびそのインヒビターの分子毒性研究；集団の層別化および臨床試験用の代理マーカーの作製；ならびに高スループットスクリーニングにおける選択的な化合物の同定を補助することによるＢ７−Ｌポリペプチド関連低分子薬物発見の増大。
【０１６８】
（化学的誘導体）
Ｂ７−Ｌポリペプチドの化学的改変誘導体は、本明細書に記載される開示を与えられると、当業者によって調製され得る。Ｂ７−Ｌポリペプチド誘導体は、ポリペプチドに天然に結合する分子の型または場所のいずれかが異なる様式で改変される。誘導体は、１つ以上の天然に結合する化学基の欠失によって形成される分子を含み得る。配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド、または他のＢ７−Ｌポリペプチドは、１つ以上のポリマーの共有結合によって改変され得る。例えば、選択されたポリマーは、典型的には、水溶性であり、その結果、結合されるタンパク質は、水性環境（例えば、生理学的環境）において沈殿しない。ポリマーの混合物は、適切なポリマーの範囲内に含まれる。好ましくは、最終生成物の調製物の治療的使用のために、このポリマーは、薬学的に受容可能である。
【０１６９】
ポリマーは、各々、任意の分子量のポリマーであり得、そして分枝しても分枝しなくてもよい。ポリマーは、各々、代表的に、約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａの間の平均分子量を有する（用語「約」とは、水溶性ポリマーの調製物において、ある分子は、示された分子量よりも大きく、ある分子は、示された分子量より小さいことを示す）。各ポリマーの平均分子量は、好ましくは約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａの間、より好ましくは、約１２ｋＤａ〜約４０ｋＤａの間、そして最も好ましくは、約２０ｋＤａ〜約３５ｋＤａの間である。
【０１７０】
適切な水溶性ポリマーまたはそれらの混合物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｎ結合型炭水化物またはＯ結合型炭水化物、糖類、ホスフェート、炭水化物、糖類、ホスフェート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（モノ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールを含む、タンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの形態を含む）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン（例えば、低分子量（例えば、約６ｋＤ）のデキストラン）、セルロース、他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコール。共有結合的に結合したＢ７−Ｌポリペプチドマルチマーを調製するために使用され得る、二官能性架橋分子もまた、本発明に含まれる。
【０１７１】
一般に、化学誘導体化は、タンパク質を活性化ポリマー分子と反応させるために使用される任意の適切な条件下で行われ得る。ポリペプチドの化学誘導体を調製するための方法は、一般に、以下の工程を包含する：（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４のアミノ酸配列を含むポリペプチドあるいは他のＢ７−Ｌポリペプチドが、１つ以上のポリマー分子に結合されるような条件下で、ポリペプチドを、活性化したポリマー分子（例えば、ポリマー分子の反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）と反応させる工程、および（ｂ）反応生成物を得る工程。最適な反応条件は、公知のパラメータおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、ポリマー分子　対　タンパク質の比が大きいほど、結合されるポリマー分子の割合は大きくなる。１つの実施形態において、Ｂ７−Ｌポリペプチド誘導体は、そのアミノ末端で単一のポリマー分子部分を有し得る。例えば、米国特許第５，２３４，７８４号を参照のこと。
【０１７２】
ポリペプチドのペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、当該分野で公知の任意のペグ化反応を使用して特異的に実施され得る。このような反応は、例えば、以下の参考文献に記載されている：Ｆｒａｎｃｉｓら、１９９２、Ｆｏｃｕｓ　ｏｎ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ　３：４−１０；欧州特許第０１５４３１６号および同第０４０１３８４号；ならびに米国特許第４，１７９，３３７号。例えば、ペグ化は、本明細書中に記載されるように、反応性ポリエチレングリコール分子（または、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施され得る。アシル化反応に関して、選択されたポリマーは、単一の反応性エステル基を有するべきである。還元的アルキル化に関して、選択されたポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。反応性アルデヒドは、例えば、水安定性のポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドであるか、またはそれらのモノＣ１〜Ｃ１０アルコキシ誘導体またはモノＣ１〜Ｃ１０アリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。
【０１７３】
別の実施形態において、Ｂ７−Ｌポリペプチドは、ビオチンに化学的に結合し得る。次いで、ビオチン／Ｂ７−Ｌポリペプチド分子は、アビジンに結合し得、その結果、四価のアビジン／ビオチン／Ｂ７−Ｌポリペプチド分子を生じる。Ｂ７−Ｌポリペプチドはまた、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）またはトリニトロフェノール（ＴＮＰ）と共有結合し得、その結果、抗ＤＮＰ−ＩｇＭまたは抗ＴＮＰ−ＩｇＭと沈降される結合体が生じて、１０の価数を有する十量化結合体を形成する。
【０１７４】
一般に、本発明のＢ７−Ｌポリペプチド誘導体の投与によって緩和または調節され得る状態としては、Ｂ７−Ｌポリペプチドについて本明細書中で記載される状態が挙げられる。しかし、本明細書中に開示されるＢ７−Ｌポリペプチド誘導体は、非誘導体化分子と比較して、さらなる活性、増強または減少された生物学的活性、または他の特徴（例えば、増加または減少された半減期）を有し得る。
【０１７５】
（遺伝子操作した非ヒト動物）
ネイティブＢ７−Ｌポリペプチドをコードする遺伝子が破壊（すなわち、「ノックアウト」）されて、その結果、このＢ７−Ｌポリペプチドの発現レベルが、有意に減少されているかまたは完全に消失されている、非ヒト動物（例えば、マウス、ラットまたは他の齧歯目、ウサギ、ヤギまたはヒツジ、あるいは他の家畜動物）も、本発明の範囲内にさらに含まれる。このような動物は、米国特許第５，５５７，０３２号に記載されるような技術および方法を使用して調製され得る。
【０１７６】
本発明はさらに、その動物についてネイティブな形態のＢ７−Ｌ遺伝子または異種Ｂ７−Ｌ遺伝子のいずれかが、その動物によって過剰発現されている（それによって「トランスジェニック」動物が作製される）非ヒト動物（例えば、マウス、ラットまたは他の齧歯目、ウサギ、ヤギまたはヒツジ、あるいは他の家畜動物）を包含する。このようなトランスジェニック動物は、米国特許第５，４８９，７４３号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２８１２２に記載のような、周知の方法を使用して調製され得る。
【０１７７】
本発明はさらに、本発明の１以上のＢ７−Ｌポリペプチドに対するプロモーターが、活性化または不活性化されて（例えば、相同組換え法を使用することによって）１以上のネイティブＢ７−Ｌポリペプチドの発現レベルが変更されている非ヒト動物を包含する。
【０１７８】
これらの非ヒト動物は、薬物候補スクリーニングに使用され得る。このようなスクリーニングにおいて、動物に対する薬物候補の影響が測定され得る。例えば、薬物候補は、Ｂ７−Ｌ遺伝子の発現を減少または増加し得る。特定の実施形態において、産生されるＢ７−Ｌポリペプチドの量は、薬物候補への動物の曝露後に測定され得る。さらに、特定の実施形態において、動物に対する薬物候補の実際の影響を検出し得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、疾患または病理学的状態を生じ得るか、またはそれらに関連し得る。このような場合において、遺伝子の発現を減少する薬物候補の能力または病理学的状態を防止または阻止する能力を試験し得る。他の例において、特定の代謝産物（例えば、ポリペプチドのフラグメント）の産生が、疾患または病理学的状態を生じ得るか、またはそれらに関連し得る。このような場合において、このような代謝産物の産生を減少する薬物候補の能力または病理学的状態を防止または阻止する能力を試験し得る。
【０１７９】
（Ｂ７−Ｌポリペプチド活性の他のモジュレーターについてのアッセイ）
いくつかの状況において、Ｂ７−Ｌポリペプチドの活性のモジュレーター（すなわち、アゴニストまたはアンタゴニスト）である分子を同定することが所望され得る。Ｂ７−Ｌポリペプチドを調節する天然または合成の分子は、１つ以上のスクリーニングアッセイ（例えば、本明細書において記載されるようなもの）を用いて同定され得る。そのような分子は、エキソビボ様式もしくは注射によってインビボ様式で、または経口送達、移植デバイスなどによって投与され得る。
【０１８０】
「試験分子」とは、Ｂ７−Ｌポリペプチドの活性を調節（すなわち、増加または減少）させる能力について評価される状態にある分子をいう。最も一般的には、試験分子は、Ｂ７−Ｌポリペプチドと直接相互作用する。しかし、試験分子はまた、例えば、Ｂ７−Ｌ遺伝子発現に影響を与えることにより、またはＢ７−Ｌポリペプチド結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）に結合することにより、Ｂ７−Ｌポリペプチド活性を間接的に調節し得ることも意図される。１つの実施形態において、試験分子は、少なくとも約１０−６Ｍ、好ましくは約１０−８Ｍ、より好ましくは約１０−９Ｍ、そしてさらにより好ましくは約１０−１０Ｍの親和性定数でＢ７−Ｌポリペプチドに結合する。
【０１８１】
Ｂ７−Ｌポリペプチドと相互作用する化合物を同定するための方法は、本発明に包含される。特定の実施形態において、Ｂ７−Ｌポリペプチドは、試験分子と、その試験分子のＢ７−Ｌポリペプチドとの相互作用を可能にする条件下で、インキュベートされ、そしてその相互作用の程度が測定される。この試験分子は、実質的に精製された形態で、または粗混合物中でスクリーニングされ得る。
【０１８２】
特定の実施形態において、Ｂ７−Ｌポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストは、Ｂ７−Ｌポリペプチドと相互作用してその活性を調節するタンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質または低分子量分子であり得る。Ｂ７−Ｌポリペプチド発現を調節する分子としては、Ｂ７−Ｌポリペプチドをコードする核酸に相補的であるか、またはＢ７−Ｌポリペプチドの発現を指向もしくは制御する核酸配列に相補的であり、かつ発現のアンチセンスモジュレーターとして作用する核酸が挙げられる。
【０１８３】
一旦、試験分子が、Ｂ７−Ｌポリペプチドと相互作用すると同定されると、この分子はさらに、Ｂ７−Ｌポリペプチドの活性を増大または減少させるその能力について評価され得る。Ｂ７−Ｌポリペプチドと試験分子との相互作用の測定は、いくつかの形式で行われ得、これには、細胞ベースの結合アッセイ、膜結合アッセイ、溶液相アッセイおよび免疫アッセイが含まれる。一般的に、試験分子は、特定の時間にわたって、Ｂ７−Ｌポリペプチドとインキュベートされ、そしてＢ７−Ｌポリペプチド活性は、生物学的活性を測定するための１つ以上のアッセイにより決定される。
【０１８４】
試験分子のＢ７−Ｌポリペプチドとの相互作用はまた、免疫アッセイにおいて、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用して直接的にアッセイされ得る。あるいは、本明細書中に記載されるエピトープタグを含有するＢ７−Ｌポリペプチドの改変形態は、溶液中および免疫アッセイにおいて使用され得る。
【０１８５】
結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）との相互作用を介してＢ７−Ｌポリペプチドが生物学的活性を示す事象において、種々のインビトロアッセイは、対応する結合パートナー（例えば、選択的結合因子、レセプターまたはリガンド）へのＢ７−Ｌポリペプチドの結合を測定するために使用され得る。これらのアッセイは、Ｂ７−Ｌポリペプチドのその結合パートナーへの結合の速度および／または程度を増加または減少するこれらの能力について試験分子をスクリーニングするために使用され得る。１つのアッセイにおいて、Ｂ７−Ｌポリペプチドは、マイクロタイタープレートのウェル中に固定される。次いで、放射標識されたＢ７−Ｌポリペプチド結合パートナー（例えば、ヨウ素化されたＢ７−Ｌポリペプチド結合パートナー）、および試験分子は、ウェルに（いずれかの順番で）一つずつか、または同時にかのいずれかで添加され得る。インキュベーション後、ウェルを洗浄し、そして、Ｂ７−Ｌポリペプチドに結合した結合パートナーの程度を決定するために、放射能についてシンチレーションカウンターを使用して計数し得る。典型的には、分子は、ある濃度範囲にわたって試験され、そして、試験アッセイの１つ以上の要素を欠く一連のコントロールウェルは、これらの結果の評価における正確さのために使用され得る。本方法の代替は、タンパク質の「位置」を反転する工程（すなわち、マイクロタイタープレートのウェルにＢ７−Ｌポリペプチド結合パートナーを固定する工程）、試験分子および放射標識されたＢ７−Ｌポリペプチドをインキュベートする工程、ならびにＢ７−Ｌポリペプチド結合の程度を決定する工程を包含する。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１８章（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｉｎｃ．およびＷｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ　１９９５）を参照のこと。
【０１８６】
放射標識の代替として、Ｂ７−Ｌポリペプチドまたはその結合パートナーは、ビオチンと結合体化され得、次いで、ビオチン化タンパク質の存在は、比色的に（ｃｏｌｏｒｏｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）またはストレプトアビジンの蛍光タグ化によって検出され得る酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ））に連結されたストレプトアビジンを使用して検出され得る。Ｂ７−ＬポリペプチドまたはＢ７−Ｌポリペプチド結合パートナーに対する抗体、およびビオチンに結合体化された抗体もまた、そしてＡＰまたはＨＲＰと連結された酵素連結ストレプトアビジンとの複合体のインキュベーション後の検出の目的のために使用され得る。
【０１８７】
Ｂ７−ＬポリペプチドまたはＢ７−Ｌポリペプチド結合パートナーはまた、アガロースビーズ、アクリルビーズまたは他の型のこのような不活性な固相基質への接着によって固定され得る。基質−タンパク質複合体は、相補的タンパク質および試験化合物を含む溶液中に配置され得る。インキュベーション後、ビーズは、遠心分離によって沈殿され得、そしてＢ７−Ｌポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合の量は、本明細書中に記載される方法を使用して評価され得る。あるいは、基質−タンパク質複合体は、カラムに固定され得、そして試験分子および相補的タンパク質は、このカラムを通過する。次いで、Ｂ７−Ｌポリペプチドとその結合パートナーとの間の複合体の形成は、本明細書中に記載の技術のいずれか（例えば、放射標識、抗体結合）を使用して評価され得る。
【０１８８】
Ｂ７−Ｌポリペプチド結合タンパク質とＢ７−Ｌポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少させる試験分子を同定するために有用な、別のインビトロアッセイは、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のような表面プラズモン共鳴検出器システムである。ＢＩＡｃｏｒｅシステムを、製造業者に特定されるように利用する。このアッセイは、Ｂ７−ＬポリペプチドまたはＢ７−Ｌポリペプチド結合パートナーのいずれかの、検出器中に位置するデキストランコートされたセンサーチップへの共有結合を本質的に含む。次いで、試験化合物および他の相補的タンパク質は、同時にかまたは連続的にかのいずれかで、センサーチップを含むチャンバー中に注入され得る。結合する相補的タンパク質の量は、センサーチップのデキストランコートされた側に物理的に結合する分子量における変化に基づいて評価され得、そして分子量における変化は、検出器システムによって測定される。
【０１８９】
いくつかの場合において、Ｂ７−ＬポリペプチドとＢ７−Ｌポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少させる能力について、２つ以上の試験化合物を一緒に評価することが所望され得る。これらの場合において、本明細書中に示されるアッセイは、このようなさらなる試験化合物の添加（第一の試験化合物と同時にか、または第一の試験化合物に引き続いてかのいずれか）によって容易に改変され得る。このアッセイにおける残りの工程は、本明細書中に示される。
【０１９０】
本明細書中に記載されるもののようなインビトロアッセイは、Ｂ７−ＬポリペプチドとＢ７−Ｌポリペプチド結合パートナーとの間の複合体形成に対する影響について、多数の化合物をスクリーニングするために有利に使用され得る。これらのアッセイは、ファージディスプレイライブラリー、合成ペプチドライブラリー、および化学合成ライブラリーにおいて作製される化合物をスクリーニングするために自動化され得る。
【０１９１】
Ｂ７−ＬポリペプチドとＢ７−Ｌポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少させる化合物はまた、Ｂ７−ＬポリペプチドまたはＢ７−Ｌポリペプチド結合パートナーのいずれかを発現する細胞および細胞株を使用する細胞培養物においてスクリーニングされ得る。細胞および細胞株は、任意の哺乳動物から取得され得るが、好ましくは、ヒトもしくは他の霊長類、イヌ、またはげっ歯類の供給源由来である。Ｂ７−Ｌポリペプチドの、Ｂ７−Ｌポリペプチド結合パートナーを発現する細胞への表面での結合は、試験分子の存在または非存在下で評価され、そして結合の程度は、例えば、Ｂ７−Ｌポリペプチド結合パートナーに対するビオチン化抗体を使用するフローサイトメトリーによって決定され得る。細胞培養アッセイは、本明細書中に記載されるタンパク質結合アッセイにおいてポジティブにスコアリングされる化合物をさらに評価するために有利に使用され得る。
【０１９２】
細胞培養物はまた、薬物候補の影響をスクリーニングするために使用され得る。例えば、薬物候補は、Ｂ７−Ｌ遺伝子の発現を減少または増加させ得る。特定の実施形態において、Ｂ７−Ｌポリペプチドまたは生成されるＢ７−Ｌポリペプチドフラグメントの量は、細胞培養物を薬物候補に暴露した後に測定され得る。特定の実施形態において、細胞培養物に対する薬物候補の実際の影響を検出し得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、細胞培養物に対する特定の影響を有し得る。このような場合において、この遺伝子の発現を増加または減少させる薬物候補の能力、あるいは細胞培養物に対する特定の影響を予防または阻害する薬物候補の能力を試験し得る。他の例において、特定の代謝産物（例えば、ポリペプチドのフラグメント）の産生は、疾患または病理学的状態を生じ得るか、あるいは疾患または病理学的状態に関し得る。このような場合において、細胞培養物中のこのような代謝産物の生成を減少させる薬物候補の能力を試験し得る。
【０１９３】
（タンパク質の内部移行）
ｔａｔタンパク質配列（ＨＩＶ由来）は、細胞にタンパク質を内部移行させるために使用され得る。例えば、Ｆａｌｗｅｌｌら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：６６４−６８を参照のこと。例えば、ＨＩＶ　ｔａｔタンパク質の１１アミノ酸配列（Ｙ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ：配列番号１６）（「タンパク質形質導入ドメイン」、またはＴＡＴ　ＰＤＴと呼ばれる）は、細胞の細胞質膜および核膜を横切る送達を媒介するとして記載されている。Ｓｃｈｗａｒｚｅら、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８５：１５６９−７２；およびＮａｇａｈａｒａら、１９９８、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：１４４９−５２を参照のこと。これらの手順において、腹腔内投与後に組織を貫通するＦＩＴＣ構築物（ＦＩＴＣ標識されたＧ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ；配列番号１７）が調製され、そしてこれらの構築物の細胞への結合は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析によって検出される。ｔａｔ−β−ｇａｌ融合タンパク質で処理された細胞は、β−ｇａｌ活性を示す。注入に続いて、このような構築物は、多くの組織（肝臓組織、腎臓組織、肺組織、心臓組織、および脳組織を含む）において検出され得る。このような構築物の発現は、細胞への侵入のためにある程度のアンフォールディングを受け；そしてそれ自体、細胞への侵入後に再折り畳みを必要とし得ると考えられる。
【０１９４】
従って、ｔａｔタンパク質配列が所望のポリペプチドを細胞内へ内部移行するために使用され得ることは明白である。例えば、ｔａｔタンパク質配列を使用して、Ｂ７−Ｌアンタゴニスト（例えば、抗Ｂ７−Ｌ選択的結合因子、低分子、可溶性レセプター、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、細胞内へ投与されてＢ７−Ｌ分子の活性を阻害し得る。本明細書中で使用される場合、用語「Ｂ７−Ｌ分子」は、本明細書中で定義されるようなＢ７−Ｌ核酸分子およびＢ７−Ｌポリペプチドの両方をいう。所望の場合、Ｂ７−Ｌタンパク質自体はまた、これらの手順を使用して細胞内部に投与され得る。Ｓｔｒａｕｓ、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８５：１４６６−６７もまた参照のこと。
【０１９５】
（Ｂ７−Ｌポリペプチドを使用する細胞供給源の同定）
本発明の特定の実施形態に従って、Ｂ７−Ｌポリペプチドに関連する特定の細胞型の供給源を決定し得ることは有用であり得る。例えば、適切な治療を選択する際の補助として疾患または病理学的状態の起源を決定することは、有用であり得る。特定の実施形態において、Ｂ７−Ｌポリペプチドをコードする核酸をプローブとして使用して、このようなプローブを用いて細胞の核酸をスクリーニングすることによって、本明細書中に記載される細胞を同定し得る。他の実施形態において、抗Ｂ７−Ｌポリペプチド抗体を使用して、細胞中のＢ７−Ｌポリペプチドの存在について試験し得、従って、このような細胞が、本明細書中に記載される型の細胞であるか否かを決定し得る。
【０１９６】
（Ｂ７−Ｌポリペプチド組成物および投与）
治療的組成物は、本発明の範囲内である。このようなＢ７−Ｌポリペプチドの薬学的組成物は、Ｂ７−ＬポリペプチドまたはＢ７−Ｌ核酸分子の治療有効量を、投与形態の適切さのために選択される薬学的または生理学的に受容可能な処方剤との混合物で含み得る。薬学的組成物は、１つ以上のＢ７−Ｌポリペプチド選択的結合因子の治療有効量を、投与形態の適切さのために選択される薬学的または生理学的に受容可能な処方剤との混合物で含み得る。
【０１９７】
受容可能な処方物材料は、好ましくは、使用される投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性である。
【０１９８】
この薬学的組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、におい、無菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着または浸透を改変、維持または保存するための処方材料を含み得る。適切な処方材料としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン）、抗菌剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ　ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｓｕｌｆｉｔｅ））、緩衝剤（例えば、ホウ酸塩、炭酸水素塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、または他の有機酸）、バルキング剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）、キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）、充填剤、単糖類、二糖類、および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）、着色剤、香味剤および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）、保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素）、溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール）、糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、懸濁剤、界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート（例えば、ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ　２０またはｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ　８０）；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロールまたはチロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ））、安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）、張度増強剤（例えば、ハロゲン化アルカリ金属（好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）、またはマンニトール、ソルビトール）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的なアジュバント。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ、編、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ　１９９０）を参照のこと。
【０１９９】
最適な薬学的組成物は、当業者によって、例えば、意図される投与経路、送達形式、および所望の投薬量に依存して決定される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前出を参照のこと。このような組成物は、Ｂ７−Ｌ分子の、物理的な状態、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボクリアランスの速度に影響し得る。
【０２００】
薬学的組成物における主要なビヒクルまたはキャリアは、本来水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、注入のための適切なビヒクルまたはキャリアは、水、生理食塩水溶液、または人工脳脊髄液であり得、おそらく非経口投与のための組成物において一般的な他の材料で補充され得る。中性の緩衝化生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。他の例示的な薬学的組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸塩緩衝液を含み、これはさらに、ソルビトールまたは適切な置換物を含み得る。本発明の１つの実施形態において、Ｂ７−Ｌポリペプチド組成物は、所望の程度の純度を有する選択された組成物を、最適な処方剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前出）と混合することによって、凍結乾燥ケークまたは水溶液の形態で、保存のために調製され得る。さらに、Ｂ７−Ｌポリペプチド産物は、スクロースのような適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として処方され得る。
【０２０１】
このＢ７−Ｌポリペプチドの薬学的組成物は、非経口送達のために選択され得る。あるいは、これらの組成物は、吸入または消化管を介する送達（例えば、経口的）のために、選択され得る。このような薬学的に受容可能な組成物の調製は、当該分野の技術内である。
【０２０２】
処方成分は、投与の部位に受容可能な濃度で存在する。例えば、緩衝液は、生理学的ｐＨまたは僅かに低いｐＨ（典型的に、約５〜約８のｐＨ範囲内）にこの組成物を維持するために使用される。
【０２０３】
非経口投与が意図される場合、本発明における使用のための治療的組成物は、薬学的に受容可能なビヒクル中に所望のＢ７−Ｌ分子を含む、発熱物質を含まない非経口的に受容可能な水溶液の形態であり得る。非経口注入のために特に適切なビヒクルは、滅菌蒸留水であり、ここで、Ｂ７−Ｌ分子が、滅菌の等張溶液として処方され、適切に保存される。なお別の調製物は、所望の分子と、薬剤（例えば、注入可能なミクロスフィア、生体侵食（ｂｉｏ−ｅｒｏｄｉｂｌｅ）粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソーム）との処方物を含み、これは、次いで蓄積注射を介して送達され得る産物の制御放出または持続放出を提供する。ヒアルロン酸もまた、使用され得、そしてこれは、循環において、維持された持続時間を助長する効果を有し得る。所望の分子の導入のための他の適切な手段としては、移植可能な薬物送達デバイスが挙げられる。
【０２０４】
１つの実施形態において、薬学的組成物は、吸入のために処方され得る。例えば、Ｂ７−Ｌポリペプチドは、吸入のための乾燥粉末として処方され得る。Ｂ７−Ｌポリペプチドまたは核酸分子の吸入溶液はまた、エアロゾル送達のための噴霧剤と共に処方され得る。なお別の実施形態において、溶液は、噴霧され得る。肺投与が、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２００６９にさらに記載され、これは化学的に改変されたタンパク質の肺送達を記載する。
【０２０５】
特定の処方物が、経口投与され得ることがまた意図される。本発明の１つの実施形態において、この様式で投与されるＢ７−Ｌポリペプチドは、固体投薬形態（例えば、錠剤およびカプセル）の調合において慣用的に使用されるキャリアを用いてか、または用いずに処方され得る。例えば、カプセルは、バイオアベイラビリティーが最大化され、そして全身前分解が最小化される場合、胃腸管内の点で処方物の活性部分を放出するように設計され得る。さらなる薬剤が、Ｂ７−Ｌポリペプチドの吸収を促進するために含まれ得る。希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合因子もまた、使用され得る。
【０２０６】
別の薬学的組成物は、錠剤の製造に適切な非毒性賦形剤との混合物中に、有効量のＢ７−Ｌポリペプチドを含み得る。錠剤を滅菌水または別の適切なビヒクルに溶解させることによって、溶液が、単位用量形態で調製され得る。適切な賦形剤としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：不活性な希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウム、ラクトース、あるいはリン酸カルシウム）；または結合因子（例えば、デンプン、ゼラチンまたはアカシア）；あるいは潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク）。
【０２０７】
さらなるＢ７−Ｌポリペプチドの薬学的組成物は、当業者に明らかであり、持続送達処方物または制御送達処方物中にＢ７−Ｌポリペプチドを含む処方物が挙げられる。種々の他の持続送達手段または制御送達手段（例えば、リポソームキャリア、生体侵食微粒子あるいは多孔性ビーズおよび蓄積注射）を処方するための技術もまた、当業者に公知である。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９（これは、薬学的組成物の送達のための多孔性ポリマー性微粒子の制御放出を記載する）を参照のこと。
【０２０８】
徐放性調製物のさらなる例としては、成形された物品の形態（例えば、フィルム、またはマイクロカプセル）の半透過性ポリマーマトリックスが挙げられる。徐放性マトリックスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許第０５８４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ　２２：５４７−５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら，前出）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３９８８号）が挙げられる。徐放性組成物はまた、リポソームを含み得、これは、当該分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製され得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：３６８８−９２；および欧州特許第０３６６７６号、同第０８８０４６号、および同第１４３９４９号を参照のこと。
【０２０９】
インビボ投与のために使用されるＢ７−Ｌの薬学的組成物は、代表的に滅菌でなければならない。このことは、滅菌濾過膜を介する濾過によって達成され得る。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥および再構成の前、またはその後のいずれかに実施され得る。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥された形態または溶液で保存され得る。さらに、非経口組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器（例えば、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアル）内に配置される。
【０２１０】
一旦、薬学的組成物が処方されると、それは、滅菌バイアル中に溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、または脱水粉末または凍結乾燥粉末として保存され得る。このような処方物は、すぐに使用できる形態または投与の前に再構成を必要とする形態（凍結乾燥された形態）のいずれかで保存され得る。
【０２１１】
特定の実施形態において、本発明は、単一用量投与単位を生成するためのキットに関する。このキットは、各々、乾燥タンパク質を有する第一の容器および水性処方物を有する第二の容器の両方を含み得る。また、本発明の範囲内には、単一および多チャンバーの予め充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジおよび分散シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含むキットが含まれる。
【０２１２】
治療的に使用されるＢ７−Ｌの薬学的組成物の有効量は、例えば、治療の内容および目的に依存する。従って、当業者は、処置のための適切な投薬レベルが、送達される分子、Ｂ７−Ｌ分子が使用されている適応、投与の経路、および患者のサイズ（体重、体表面、または器官の大きさ）および状態（年齢および一般的な健康）に、部分的に依存して変化することを理解する。従って、臨床医は、最適な治療効果を得るために、投薬量を力価決定し（ｔｉｔｅｒ）、そして投与経路を改変し得る。代表的な投薬量は、上記の因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上までの範囲であり得る。他の実施形態において、投薬量は、０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまで；または１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまで；または５μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり得る。
【０２１３】
投薬の頻度は、使用される処方物中でのＢ７−Ｌ分子の薬物動態学的パラメータに依存する。典型的に、臨床医は、所望の効果を達成する投薬量に達するまで組成物を投与する。従って、組成物は、ある時間にわたって単一用量として、２以上の用量（これは、同量の所望の分子を含んでも、含まなくてもよい）として、あるいは移植デバイスまたはカテーテルを介する連続的な注入として、投与され得る。適切な投薬量のさらなる改良は、当業者によって慣用的になされ、そして彼らによって慣用的に実施される課題の範囲内である。適切な投薬量は、適切な用量−応答データの使用を介して確認され得る。
【０２１４】
薬学的組成物の投与の経路は、以下のような公知の方法と一致する：例えば、経口的に；静脈内、腹腔内、脳内（実質内の）、脳室内、筋内、眼内、動脈内、門脈内、または病巣内の経路による注入を介する方法；徐放系による方法；または移植デバイスによる方法。所望される場合、これらの組成物は、ボーラス注射によって投与され得るか、または注入によって連続的に投与され得るか、または移植デバイスによって投与され得る。
【０２１５】
あるいはまたはさらに、この組成物は、その上に所望の分子が吸着されるかまたはカプセル化される膜、スポンジ、または他の適切な材料の移植を介して局所的に投与され得る。移植デバイスが使用される場合、このデバイスは、任意の適切な組織または器官中に移植され得、そして所望の分子の送達は、拡散、時限放出ボーラスまたは連続的な投与を介してであり得る。
【０２１６】
いくつかの場合において、エキソビボ様式で、Ｂ７−Ｌポリペプチドの薬学的組成物を使用することが所望され得る。このような例において、患者から取り出された細胞、組織、または器官は、Ｂ７−Ｌポリペプチドの薬学的組成物に曝露され、その後これらの細胞、組織、または器官が引き続いて患者に移植して戻される。
【０２１７】
他の場合において、Ｂ７−Ｌポリペプチドは、本明細書中に記載されるような方法を使用して、Ｂ７−Ｌポリペプチドを発現および分泌するように遺伝的に操作された特定の細胞を移植することによって送達され得る。このような細胞は、動物細胞またはヒト細胞であり得、そして自己、異種、または外因性の細胞であり得る。必要に応じて、これらの細胞は、不死化され得る。免疫学的応答の機会を減少させるために、これらの細胞は、周囲の組織の浸潤を回避するために、カプセル化され得る。カプセル化材料は、典型的に、生体適合性の半浸透性ポリマー性包囲物または膜であり、これらは、タンパク質産物の放出を可能にするが、患者の免疫系または周囲の組織からの他の有害な因子による細胞の破壊を防止する。
【０２１８】
本明細書中において議論されるように、単離された細胞集団（例えば、幹細胞、リンパ球、赤血球、軟骨細胞、ニューロンなど）を１つ以上のＢ７−Ｌポリペプチドで処理することが、望ましくあり得る。このことは、細胞膜に対して透過性の形態である場合には、単離された細胞をこのポリペプチドに直接曝露することによって達成され得る。
【０２１９】
本発明のさらなる実施形態は、治療的ポリペプチドのインビトロ産生ならびに遺伝子治療または細胞治療による治療的ポリペプチドの産生および送達の両方のための、細胞および方法（例えば、相同組換えおよび／または他の組換え産生方法）に関する。相同組換えおよび他の組換えの方法を使用して、通常は転写的にサイレントなＢ７−Ｌ遺伝子（すなわち、過少発現される遺伝子）を含む細胞を改変し得、これによって、治療有効量のＢ７−Ｌポリペプチドを発現する細胞を生成し得る。
【０２２０】
相同組換えは、もともとは、遺伝子を標的化して転写的に活性な遺伝子における変異を誘導または修正するために開発された技術である。Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，１９８９，Ｐｒｏｇ．ｉｎ　Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．＆　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６：３０１。基本的な技術が、特定の変異を哺乳動物ゲノムの特定の領域に導入するため（Ｔｈｏｍａｓら、１９８６，Ｃｅｌｌ　４４：４１９−２８；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，１９８７，Ｃｅｌｌ　５１：５０３−１２；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８５８３−８７）、または欠損遺伝子内の特定の変異を修正するため（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、１９８７，Ｎａｔｕｒｅ　３３０：５７６−７８）の方法として、開発された。例示的な相同組換え技術は、米国特許第５，２７２，０７１号；欧州特許第９１９３０５１号および同第５０５５００号；ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７６４２、ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ　９１／０９９５５）に記載されている。
【０２２１】
相同組換えによって、ゲノムに挿入されるべきＤＮＡ配列は、それを標的化ＤＮＡに付着させることによって、目的の遺伝子の特定の領域に指向され得る。この標的化ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの領域に相補的（相同）であるヌクレオチド配列である。ゲノムの特定の領域に対して相補的な標的化ＤＮＡの小さな断片は、ＤＮＡ複製プロセスの間に、親鎖と接触される。これは、細胞に挿入されてハイブリダイズしたＤＮＡの一般的な特性であり、そして従って、共有される相同領域を介して、内因性ＤＮＡの他の断片と組み換わる。この相補鎖が、変異または異なる配列またはさらなるヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに付着される場合には、これはまた、この組換えの結果として新たに合成された鎖に組み込まれる。校正機能の結果として、ＤＮＡの新たな配列がテンプレートとして働くことが可能である。従って、移入されたＤＮＡは、ゲノムに組み込まれる。
【０２２２】
Ｂ７−Ｌポリペプチドと相互作用し得るかまたはその発現を制御し得るＤＮＡの領域（例えば、隣接配列）が、標的化ＤＮＡのこれらの断片に付着する。例えば、プロモーター／エンハンサーエレメント、サプレッサー、または外因性転写調節エレメントが、意図される宿主細胞のゲノムに、所望のＢ７−ＬポリペプチドをコードするＤＮＡの近位に、このＤＮＡの転写に影響を与えるに十分な配向で、挿入される。制御エレメントは、この宿主細胞ゲノムに存在するＤＮＡの部分を制御する。従って、所望のＢ７−Ｌポリペプチドの発現は、Ｂ７−Ｌ遺伝子自体をコードするＤＮＡのトランスフェクションによってではなく、むしろ、Ｂ７−Ｌ遺伝子の転写のための認識可能なシグナルを有する内因性遺伝子配列を提供するＤＮＡ調節セグメントと結合した標的化ＤＮＡ（目的の内因性遺伝子と相同の領域を含む）の使用によって、達成され得る。
【０２２３】
例示的な方法において、細胞における所望の標的遺伝子（すなわち、所望の内因性細胞遺伝子）の発現は、予め選択された部位における細胞ゲノムへの相同組換えを介して、少なくとも調節配列、エキソン、およびスプライスドナー部位を含むＤＮＡの導入によって、変更される。これらの構成成分は、新たな転写単位の生成を実際に生じるような様式で、染色体（ゲノム）ＤＮＡに導入される（ここで、このＤＮＡ構築物に存在する調節配列、エキソン、およびスプライスドナー部位は、内因性遺伝子に作動可能に連結する）。染色体ＤＮＡへのこれらの構成成分の導入の結果として、所望の内因性遺伝子の発現が変化する。
【０２２４】
本明細書中で記載されるように、変化された遺伝子発現は、得られたままの細胞において通常はサイレントな（発現されていない）遺伝子を活性化させること（または発現させること）、ならびに得られたままの細胞において生理学的に有意なレベルでは発現されない遺伝子の発現を増加させることを包含する。この実施形態はさらに、調節または誘導のパターンを変化させる工程を包含し、その結果、これは、得られたままの細胞において生じる調節または誘導のパターンとは異なり、そして得られたままの細胞において発現される遺伝子の発現を減少（排除を含む）させる。
【０２２５】
細胞の内在性Ｂ７−Ｌ遺伝子からのＢ７−Ｌポリペプチドの産生を増加するかまたはこれを引き起こすために相同定組換えが使用され得る１つの方法は、最初に、相同性組換えを使用して、部位特異的組換え系由来の組換え配列（例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ、ＦＬＰ／ＦＲＴ）（Ｓａｕｅｒ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５：５２１−２７；Ｓａｕｅｒ，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２２５：８９０−９００）を、細胞の内在性ゲノムＢ７−Ｌポリペプチドコード領域の上流（すなわち、５’）に配置する工程を包含する。ゲノムＢ７−Ｌポリペプチドコード領域のすぐ上流に配置された部位に対して相同な組換え部位を含むプラスミドは、適切なリコンビナーゼ酵素と共に、改変された細胞株に導入される。このリコンビナーゼによって、プラスミドを、このプラスミドの組換え部位を介して、この細胞株のゲノムＢ７−Ｌポリペプチドコード領域のすぐ上流に位置する組換え部位に組込み得る（ＢａｕｂｏｎｉｓおよびＳａｕｅｒ、１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２１：２０２５−２９；Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１：１３５１−５５）。転写を増加させることが知られている任意の隣接配列（例えば、エンハンサー／プロモーター、イントロン、翻訳エンハンサー）は、このプラスミド中に適切に配置される場合、細胞の内在性Ｂ７−Ｌ遺伝子からの新たなまたは増加したＢ７−Ｌポリペプチド産生を生じる、新たなまたは改変された転写単位を作製するような様式で組み込む。
【０２２６】
部位特異的組換え配列が細胞の内在性ゲノムＢ７−Ｌポリペプチドコード領域のすぐ上流に配置された細胞株を使用するためのさらなる方法は、細胞株のゲノムの他の場所に第２の組換え部位を導入するために相同性組換えを使用することである。適切なリコンビナーゼ酵素は、次いで、二組換え部位細胞株に導入され、組換え事象（欠失、転化、および転移）を生じ（Ｓａｕｅｒ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５：５２１−２７；Ｓａｕｅｒ，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２２５：８９０−９００）、これは、細胞の内在性Ｂ７−Ｌ遺伝子からの新規なまたは増加したＢ７−Ｌポリペプチド産生を生じる、新しいかまたは改変された転写単位を作製する。
【０２２７】
細胞の内在性Ｂ７−Ｌ遺伝子からのＢ７−Ｌポリペプチドの発現を増加するかまたは引き起こすためのさらなるアプローチは、細胞の内在性Ｂ７−Ｌ遺伝子からの新たなまたは増加したＢ７−Ｌポリペプチドの産生を生じる様式で、遺伝子（例えば、転写因子）の発現を増加するかまたは引き起こし、そして／または遺伝子（例えば、転写リプレッサー）の発現を減少させる工程を包含する。この方法は、天然に存在しないポリペプチド（例えば、転写因子ドメインに融合した部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド）を、細胞の内在性Ｂ７−Ｌ遺伝子からの新たなまたは増加したＢ７−Ｌポリペプチドの産生が起こるように、細胞に導入する工程を包含する。
【０２２８】
本発明はさらに、標的遺伝子の発現を変化させる方法において有用なＤＮＡ構築物に関する。特定の実施形態において、例示的なＤＮＡ構築物は、以下を含む：（ａ）１つ以上の標的化配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン、および（ｄ）不対スプライスドナー部位。ＤＮＡ構築物中の標的化配列は、エレメント（ａ）〜（ｄ）の細胞中の標的遺伝子への組込みを指向し、その結果、これらのエレメント（ｂ）〜（ｄ）は、内在性標的遺伝子の配列に作動可能に連結される。別の実施形態において、このＤＮＡ構築物は、以下を含む：（ａ）１つ以上の標的化配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン、（ｄ）スプライスドナー部位、（ｅ）イントロン、および（ｆ）スプライスアクセプター部位。ここで、この標的化配列は、エレメント（ａ）〜（ｆ）の組込みを指向し、その結果、これらのエレメント（ｂ）〜（ｆ）は、内在性遺伝子に作動可能に連結される。標的化配列は、相同性組換えが生じる細胞染色体ＤＮＡの予め選択された部位に対して相同である。この構築物において、エキソンは、一般的に、制御配列の３’側であり、そしてスプライスドナー部位は、このエキソンの３’側である。
【０２２９】
特定の遺伝子の配列（例えば、本明細書中で記載されるＢ７−Ｌポリペプチドの核酸配列）が既知である場合、遺伝子の選択された領域に対して相補的なＤＮＡの部分は、合成され得るか、またはそうでなければ、例えば、目的の領域に結合している特定の認識部位におけるネイティブのＤＮＡの適切な制限によって得られ得る。この部分は、細胞に挿入される際に、標的化配列として働き、そしてそのゲノム内の相同性領域にハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションが、ＤＮＡ複製の間に生じる場合、このＤＮＡの部分、およびそれに結合した任意のさらなる配列は、Ｏｋａｚａｋｉフラグメントとして作用し、そしてＤＮＡの新たに合成された娘鎖に組み込まれる。従って、本発明は、Ｂ７−Ｌポリペプチドをコードするヌクレオチドを含み、このヌクレオチドは、標的化配列として使用され得る。
【０２３０】
Ｂ７−Ｌポリペプチド細胞治療（例えば、Ｂ７−Ｌポリペプチドを産生する細胞の移植）もまた意図される。この実施形態は、生物学的に活性な形態のＢ７−Ｌポリペプチドを合成および分泌し得る細胞を移植する工程を包含する。このようなＢ７−Ｌポリペプチド産生細胞は、Ｂ７−Ｌポリペプチドの天然のプロデューサーである細胞であり得るか、またはＢ７−Ｌポリペプチドを産生する能力が、所望のＢ７−Ｌポリペプチドをコードする遺伝子またはＢ７−Ｌポリペプチドの発現を増強する遺伝子で形質転換することによって増強された、組換え細胞であり得る。このような改変は、遺伝子を送達し、かつその発現および分泌を促進するために適切なベクターによって達成され得る。Ｂ７−Ｌポリペプチドを投与されている患者における、異種のポリペプチドの投与によって生じ得るような、強力な免疫学的反応を最小化するために、Ｂ７−Ｌポリペプチドを産生する天然の細胞が、ヒト起源でありかつヒトＢ７−Ｌポリペプチドを産生することが好ましい。同様に、Ｂ７−Ｌポリペプチドを産生する組換え細胞が、ヒトＢ７−Ｌポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換されることが好ましい。
【０２３１】
移植された細胞は、周辺組織の浸透を回避するようにカプセル化され得る。ヒト細胞または非ヒト動物細胞は、生体適合性の半透性ポリマー封入物または膜（これらは、Ｂ７−Ｌポリペプチドの放出を可能にするが、患者の免疫系または周辺組織からの他の有害な因子による細胞の崩壊を防止する）で患者に移植され得る。あるいは、Ｂ７−Ｌポリペプチドをエキソビボで産生するように形質転換された患者自身の細胞が、このようなカプセル化なしで、患者に直接移植され得る。
【０２３２】
生きた細胞をカプセル化するための技術は当該分野で公知であり、そしてカプセル化された細胞の調製およびそれらの患者への移植は、慣用的に達成され得る。例えば、Ｂａｅｔｇｅら（ＰＣＴ公開ＷＯ９５／０５４５２およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２９９）は、生物学的に活性な分子の効果的な送達のために遺伝子操作された細胞を含む膜カプセルを記載する。このカプセルは、生体適合性であり、そして容易に取り出し可能である。このカプセルは、哺乳動物宿主に移植される際に、インビボで下方制御に供されないプロモーターに作動可能に連結された生物学的に活性な分子をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトされた細胞をカプセル化する。このデバイスは、生きた細胞由来の分子のレシピエント内の特定の部位への送達を提供する。さらに、米国特許第４，８９２，５３８号；同第５，０１１，４７２号；および同第５，１０６，６２７号を参照のこと。生きた細胞をカプセル化するための系は、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１０４２５（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）に記載される。ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１０４７０（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）；Ｗｉｎｎら、１９９１，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１３：３２２−２９；Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、１９９１，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１１：２６９−７５；およびＴｒｅｓｃｏら、１９９２，ＡＳＡＩＯ　３８：１７−２３もまた参照のこと。
【０２３３】
Ｂ７−Ｌポリペプチドのインビボおよびインビトロの遺伝子治療送達もまた想定される。遺伝子治療技術の一例は、構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結されて「遺伝子治療ＤＮＡ構築物」を形成し得るＢ７−ＬポリペプチドをコードするＢ７−Ｌ遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび／または合成ＤＮＡのいずれか）を使用することである。このプロモーターは、内在性Ｂ７−Ｌ遺伝子に対して同種または異種であり得るが、ただし、これは、構築物が挿入される細胞または組織型において活性である。遺伝子治療ＤＮＡ構築物の他の成分は、必要に応じて、部位特異的組込みのために設計されるＤＮＡ分子（例えば、相同組換えのために有用な内在性配列）、組織特異的プロモーター、エンハンサーまたはサイレンサー、親細胞を超える選択的利点を提供し得るＤＮＡ分子、形質転換された細胞を同定するための標識として有用なＤＮＡ分子、ネガティブ選択系、細胞特異的結合因子（例えば、細胞標的化のための）、細胞特異的内部移行因子、ベクターからの発現を増大する転写因子、およびベクターの産生を可能にする因子を含み得る。
【０２３４】
次いで、遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを使用して（エキソビボまたはインビボのいずれかで）細胞に導入され得る。遺伝子治療ＤＮＡ構築物を導入するための１つの方法は、本明細書中に記載されるようなウイルスベクターによる。特定のベクター（例えば、レトロウイルスベクター）は、ＤＮＡ構築物を細胞の染色体ＤＮＡに送達し、そしてこの遺伝子は、染色体ＤＮＡに組み込まれ得る。他のベクターは、エピソームとして機能し、そして遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、細胞質に残る。
【０２３５】
なお他の実施形態において、調節エレメントが、標的細胞におけるＢ７−Ｌ遺伝子の制御された発現のために含まれ得る。このようなエレメントは、適切なエフェクターに応答して変化する。このようにして、治療的ポリペプチドは、所望の場合に発現され得る。１つの従来の制御手段は、低分子結合ドメインおよび生物学的プロセスを開始し得るドメインを含むキメラタンパク質（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質または転写活性化タンパク質）を二量体化する低分子二量体化剤またはラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）の使用を包含する（ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４１８６５、ＷＯ９７／３１８９８およびＷＯ９７／３１８９９を参照のこと）。タンパク質の二量体化は、導入遺伝子の転写を開始するために使用され得る。
【０２３６】
代替の調節技術は、目的の遺伝子から発現されたタンパク質を、凝集体またはクラスターとして細胞の内側に貯蔵する方法を使用する。目的の遺伝子は、小胞体における凝集タンパク質の保持を生じる、条件的凝集ドメインを含む融合タンパク質として発現される。貯蔵されたタンパク質は安定であり、そして細胞の内側で不活性である。しかし、このタンパク質は、条件的凝集ドメインを除去する薬物（例えば、低分子リガンド）を投与することによって放出され得、それにより、凝集体またはクラスターを特異的に分解し、その結果、このタンパク質は細胞から分泌され得る。Ａｒｉｄｏｒら、２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８７：８１６−１７およびＲｉｖｅｒａら、２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８７：８２６−３０を参照のこと。
【０２３７】
他の適切な制御手段または遺伝子スイッチとしては、本明細書中で記載される系が挙げられるが、これらに限定されない。ミフェプリストン（ＲＵ４８６）は、プロゲステロンアンタゴニストとして使用される。改変されたプロゲステロンレセプターリガンド結合ドメインのプロゲステロンアンタゴニストへの結合は、２つの転写因子の二量体を形成することによって、転写を活性化し、次いで、核に至り、ＤＮＡに結合する。このリガンド結合ドメインは、天然のリガンドに結合するレセプターの能力を排除するように改変される。改変されたステロイドホルモンレセプター系はさらに、米国特許第５，３６４，７９１号、ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０９１１およびＷＯ９７／１０３３７に記載される。
【０２３８】
なお別の制御系は、エクジソンレセプター（細胞質レセプター）に結合し、そしてこれを活性化するエクジソン（ショウジョウバエステロイドホルモン）を使用する。次いで、このレセプターは核に転移し、特定のＤＮＡ応答エレメント（エクジソン応答性遺伝子由来のプロモーター）に結合する。エクジソンレセプターは、転写を開始するためのトランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、およびリガンド結合ドメインを含む。エクジソン系はさらに、米国特許第５，５１４，５７８号ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９７／３８１１７、ＷＯ９６／３７６０９、およびＷＯ９３／０３１６２に記載される。
【０２３９】
別の制御手段は、陽性テトラサイクリン制御可能トランス活性化因子を使用する。この系は、転写を活性化するポリペプチドに連結された変異ｔｅｔリプレッサータンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（逆テトラサイクリン調節トランス活性化因子タンパク質を生じる、変異ｔｅｔＲ−４アミノ酸の変化、すなわち、これは、テトラサイクリンの存在下でｔｅｔオペレーターに結合する）を含む。このような系は、米国特許第５，４６４，７５８号、同第５，６５０，２９８号、および同第５，６５４，１６８号に記載される。
【０２４０】
さらなる発現制御系および核酸構築物は、Ｉｎｎｏｖｉｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．への米国特許第５，７４１，６７９号および同第５，８３４，１８６号に記載されている。
【０２４１】
インビボ遺伝子治療は、Ｂ７−Ｌポリペプチドをコードする遺伝子を、Ｂ７−Ｌ核酸分子の局所的注射を介してかまたは他の適切なウイルス送達ベクターもしくは非ウイルス送達ベクターによって、細胞に導入することにより達成され得る。Ｈｅｆｔｉ，１９９４，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２５：１４１８−３５。例えば、Ｂ７−Ｌポリペプチドをコードする核酸分子は、標的化された細胞への送達のために、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに含まれ得る（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／３４６７０；およびＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７１７８を参照のこと）。組換えＡＡＶゲノムは、代表的に、機能的プロモーターおよびポリアデニル化配列に作動可能に連結されたＢ７−ＬポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に隣接する、ＡＡＶ逆方向末端反復を含む。
【０２４２】
代替の適切なウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、肝炎ウイルスベクター、パルボウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、コロナウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、およびパピローマウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。米国特許第５，６７２，３４４号は、組換え神経栄養性ＨＳＶ−１ベクターを含む、インビボウイルス媒介遺伝子移入系を記載する。米国特許第５，３９９，３４６号は、治療タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを挿入するようインビトロで処理されたヒト細胞の送達による、患者に治療タンパク質を提供するためのプロセスの例を、提供する。遺伝子治療技術の実施のさらなる方法および材料は、米国特許第５，６３１，２３６号（アデノウイルスベクターを含む）；米国特許第５，６７２，５１０号（レトロウイルスベクターを含む）；および米国特許第５，６３５，３９９号（サイトカインを発現するレトロウイルスベクターを含む）に記載されている。
【０２４３】
非ウイルス送達方法としては、リポソーム媒介移入、裸のＤＮＡ送達（直接注入）、レセプター媒介移入（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、および微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃）が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子治療の材料および方法としてはまた、誘導性プロモーター、組織特異的エンハンサー−プロモーター、部位特異的組み込みのために設計されたＤＮＡ配列、親細胞より優れた選択的利点を提供し得るＤＮＡ配列、形質転換された細胞を同定するための標識、ネガティブ選択系および発現制御系（安全性の尺度）、細胞特異的結合因子（細胞標的化のため）、細胞特異的インターナリゼーション因子、およびベクターによる発現を増強するための転写因子、ならびにベクター作製の方法が挙げられ得る。遺伝子治療技術の実施のための、このようなさらなる方法および材料は、米国特許第４，９７０，１５４号（エレクトロポレーション技術を含む）、米国特許第５，６７９，５５９号（遺伝子送達のためのリポタンパク質含有系を記載する）、米国特許第５，６７６，９５４号（リポソームキャリアを含む）、米国特許第５，５９３，８７５号（リン酸カルシウムトランスフェクションのための方法を記載する）、米国特許第４，９４５，０５０号（生物学的に活性な粒子が、細胞において、この粒子がこの細胞の表面を貫通しそしてこの細胞の内側に取り込まれる速度で推進されるプロセス、を記載する）、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４０９５８（核リガンドを含む）に記載されている。
【０２４４】
Ｂ７−Ｌ遺伝子治療または細胞治療が、同じまたは異なる細胞における１つ以上のさらなるポリペプチドの送達をさらに含み得ることがまた意図される。このような細胞は、患者に別々に導入され得るか、またはこれらの細胞は、単一の移植可能なデバイス（例えば、上記のカプセル化膜）内に含まれ得るか、または細胞は、ウイルスベクターによって別々に改変され得る。
【０２４５】
遺伝子治療を介して細胞における内因性Ｂ７−Ｌポリペプチド発現を増加させるための手段は、１つ以上のエンハンサーエレメントをＢ７−Ｌポリペプチドプロモーターに挿入することであり、ここで、このエンハンサーエレメントは、Ｂ７−Ｌ遺伝子の転写活性を増加させるよう作用し得る。使用されるエンハンサーエレメントは、遺伝子を活性化することが所望される組織に基づいて選択される；この組織においてプロモーター活性化を与えることが公知であるエンハンサーエレメントが、選択される。例えば、Ｂ７−Ｌポリペプチドをコードする遺伝子がＴ細胞において「オンにされる」場合には、ｌｃｋプロモーターエンハンサーエレメントが使用され得る。ここで、付加される転写エレメントの機能性部分は、標準的なクローニング技術を使用して、Ｂ７−Ｌポリペプチドプロモーターを含むＤＮＡのフラグメントに挿入され得る（そして必要に応じて、ベクターおよび／または５’および／または３’隣接配列に挿入され得る）。次いで、この構築物（「相同組換え構築物」として公知）が、エキソビボでかまたはインビボでのいずれかで、所望の細胞に導入され得る。
【０２４６】
遺伝子治療はまた、内因性プロモーターのヌクレオチド配列を改変することによって、Ｂ７−Ｌポリペプチド発現を減少させるために、使用され得る。このような改変は、代表的に、相同組換え法を介して達成される。例えば、不活化について選択されたＢ７−Ｌ遺伝子のプロモーターの全てまたは一部を含むＤＮＡ分子は、転写を調節するプロモーター片を除去および／または置換するように、操作され得る。例えば、プロモーターの転写アクチベーターのＴＡＴＡボックスおよび／または結合部位が、標準的な分子生物学の技術を使用して、欠失され得る；このような欠失は、プロモーター活性を阻害し得、これによって、対応するＢ７−Ｌ遺伝子の転写を抑制する。プロモーターにおけるＴＡＴＡボックスまたは転写アクチベーター結合部位の欠失は、（調節されるＢ７−Ｌ遺伝子と同じ種かまたは関連する種由来の）Ｂ７−Ｌポリペプチドプロモーターの全てまたは関連する部分を含むＤＮＡ構築物を生成することによって達成され得、ここで、１つ以上のＴＡＴＡボックスおよび／または転写アクチベーター結合部位のヌクレオチドが、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入を介して変異される。その結果、ＴＡＴＡボックスおよび／またはアクチベーター結合部位は、活性が減少されているか、または完全に不活性にされている。この構築物はまた、代表的に、その改変されたプロモーターセグメントに隣接するネイティブな（内因性の）５’および３’ＤＮＡ配列に対応する、少なくとも約５００塩基のＤＮＡを含む。この構築物は、直接的にかまたは本明細書中に記載されるようなウイルスベクターを介して、適切な細胞に（エキソビボでかまたはインビボでかのいずれかで）導入され得る。代表的に、細胞のゲノムＤＮＡへのこの構築物の組み込みは、相同組換えを介し、ここで、このプロモーター構築物における５’および３’ＤＮＡ配列は、ハイブリダイゼーションを介するその内因性染色体ＤＮＡへの改変されたプロモーター領域の組み込みを補助するよう作用し得る。
【０２４７】
（治療的使用）
Ｂ７−Ｌ核酸分子、ポリペプチド、ならびにそれらのアゴニストおよびアンタゴニストは、本明細書中に引用される疾患、障害または状態を含む、多くの疾患、障害または状態を処置、診断、改善または予防するために使用され得る。
【０２４８】
Ｂ７−Ｌポリペプチドアゴニストおよびアンタゴニストとしては、Ｂ７−Ｌポリペプチド活性を調節し、そしてＢ７−Ｌポリペプチドの成熟形態の少なくとも１つの活性を増加または減少する、アゴニスト分子およびアンタゴニスト分子が挙げられる。アゴニストまたはアンタゴニストは、Ｂ７−Ｌポリペプチドと相互作用し、それによってそのＢ７−Ｌの活性を調節する、補因子（例えば、タンパク質、ペプチド、糖質、脂質または低分子量分子）であり得る。潜在的なポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニストとしては、Ｂ７−Ｌポリペプチドの可溶性形態または膜結合形態のいずれかと反応する抗体が挙げられ、これらの形態は、Ｂ７−Ｌタンパク質の細胞外ドメインの全てまたは一部を含む。Ｂ７−Ｌポリペプチド発現を調節する分子としては、代表的に、発現のアンチセンス調節因子として作用し得る、Ｂ７−Ｌポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。
【０２４９】
本発明のＢ７−Ｌポリペプチド（Ｂ７−Ｌ＿Ｌｍ３；配列番号１４）を発現するトランスジェニックマウスは、精嚢同形成を示した。従って、本発明のＢ７−Ｌ核酸、ポリペプチド、ならびにそのアゴニストおよびアンタゴニストは、生殖障害および増殖性障害の処置において有用であり得る。
【０２５０】
例えば、延長または増大したＴ細胞の活性化を生じる抗体、細胞外ドメインを含む可溶性タンパク質、およびＢ７−Ｌポリペプチド発現の他のレギュレーターは、腫瘍に対する免疫応答を増大するために有用であり得る。Ｂ７−Ｌポリペプチドは、Ｂ７−Ｌポリペプチドを過剰発現するトランスジェニックマウスにおける精嚢の過形成の観察に基づいて、癌細胞の増殖および維持における役割を果たし得る。従って、Ｂ７−Ｌポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストは、癌の診断または処置について有用であり得る。このような癌の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：精嚢癌、肺癌、脳癌、乳癌、造血系の癌、前立腺癌、卵巣癌、および精巣癌。他の癌は、本発明の範囲内に含まれる。
【０２５１】
本発明のＢ７−Ｌポリペプチド遺伝子を使用する遺伝子治療は、癌の免疫療法処置において有用であり得る。癌細胞に導入される場合、Ｂ７−Ｌポリペプチド遺伝子は、動物に導入して戻される場合に免疫系のＴ細胞によって認識され得る抗原提示細胞へと、これらの細胞を形質転換し得る。この形質転換された腫瘍細胞の、Ｔ細胞による認識は、Ｂ７−Ｌ発現腫瘍細胞およびＢ７−Ｌポリペプチドを発現しない腫瘍細胞の両方の根絶を生じ得る。この免疫療法アプローチは、種々の白血病、肉腫、黒色腫、腺癌、乳癌、前立腺腫瘍、肺癌、結腸癌、または他の腫瘍の処置に有用であり得る。本発明は、種々の腫瘍への応答においてＴ細胞活性化を増大する様式と同様の様式で、Ｂ７−Ｌポリペプチド遺伝子を使用することを含む。
【０２５２】
Ｂ７−Ｌポリペプチド経路はまた、多くの他の臨床設定（同種移植、対宿主性移植片病、Ｔ細胞依存性Ｂ細胞媒介疾患、および自己免疫疾患を含む）における細胞傷害性Ｔ−リンパ球（ＣＴＬ）応答を調節するために操作され得る。
【０２５３】
対宿主性移植片病−「人工的な」免疫障害−は、例えば、Ｂ７−Ｌポリペプチドアンタゴニストを使用する抗体産生の阻害から恩恵を受ける。本発明のＢ７−Ｌ分子はまた、慢性免疫細胞機能障害に関連する疾患に関連する症状を緩和するため、または自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス、慢性間接リウマチ、多発性硬化症、糖尿病、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、および乾癬）を処置するために使用され得る。さらに、慢性炎症性疾患（例えば、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎）、グレーヴズ病、橋本甲状腺炎、および真性糖尿病もまた、本発明のＢ７−Ｌ分子を使用して処置され得る。Ｂ７−Ｌポリペプチドのアンタゴニストはまた、輸血に起因するトキシックショック症候群またはアロ感作を緩和するために有用であり得る。
【０２５４】
本発明のＢ７−Ｌ分子は、骨髄移植および器官移植についての免疫抑制剤として、または移植編の生存を延長するために有用であり得る。このようなアンタゴニストは、既存の処置を超える有意な利点を提供し得る。骨髄移植および器官移植の治療は、宿主による外来の細胞または組織のＴ細胞媒介拒絶について対処しなければならない。Ｔ細胞媒介拒絶を阻害するための本治療レジメンは、薬物（シクロスポリンまたはＦＫ５０６）での処置を含む。このような薬物は効果的であるが、患者は、重篤な副作用（肝毒性、腎毒性、神経毒性を含む）を受け得る。シクロスポリン／ＦＫ５０６クラスの治療の標的は、カルシニュリン、偏在性発現を有するホスファターゼである。Ｂ７−Ｌポリペプチドまたはタンパク質のインヒビターは、本免疫療法剤が使用される場合に、観察される重篤な副作用が少なくあり得る。
【０２５５】
Ｂ７−Ｌポリペプチドは、Ｂ７−Ｌポリペプチドを過剰発現するトランスジェニックマウスにおける精嚢の過形成の観察に基づいて、細胞の不適切な増殖における役割を果たし得る。従って、本発明のＢ７−Ｌ分子は、異常な細胞増殖に関連する疾患の診断または処置について有用であり得る。このような疾患の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：動脈硬化および脈管再狭窄。細胞の不適切な増殖によって影響される他の疾患は、本発明の範囲内に含まれる。
【０２５６】
Ｂ７−Ｌポリペプチドは、Ｂ７−Ｌポリペプチドを過剰発現するトランスジェニックマウスにおける精嚢の過形成の観察に基づいて、生殖系における役割を果たし得る。従って、本発明のＢ７−Ｌ分子は、生殖障害の診断または処置について有用であり得る。このような疾患の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：不妊症、流産、早期分娩および早期産、ならびに子宮内膜症。他の生殖系疾患は、本発明の範囲内に含まれる。
【０２５７】
効果的かつ特異的な抗体応答を誘発することによって、多くのワクチンが作用する。いくつかのワクチン（特に、腸の微生物（例えば、Ａ型肝炎ウイルスおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ）に対するワクチン）は、短期的な抗体応答を誘発する。ワクチンの有効性を増大するために、この応答を増強および延長することが望ましい。従って、可溶性Ｂ７−Ｌポリペプチドは、ワクチンアジュバントとして貢献し得る。
【０２５８】
抗ウイルス応答はまた、Ｂ７−Ｌポリペプチド経路のアクチベーターまたはアゴニストによって増大され得る。Ｂ７−ＬポリペプチドまたはＢ７−Ｌポリペプチド／Ｆｃ融合物による細胞の免疫機能の増大はまた、ウイルスに感染した細胞を除去する際に有利であり得る。相補的様式において、Ｂ７−ＬポリペプチドまたはＢ７−Ｌポリペプチド／Ｆｃ融合物はまた、抗体媒介応答を増大することによって、体液性免疫機能に対する影響を有し得、そしてこれは身体からの遊離ウイルスの清浄化を助けるように機能する。
【０２５９】
さらに、抗体産生の阻害によって改善される多くの臨床条件がある。過敏症は、拡大したかまたは不適切な、通常は有利な免疫応答であり、そしてこれは炎症性反応および組織損傷を導く。抗体媒介される過敏性反応は、Ｂ７−Ｌポリペプチド活性のインヒビターによるアンタゴニスト作用に対して特に感受性であり得る。アレルギー、枯草熱、ぜん息、および急性浮腫は、過敏性型反応を引き起こし、そしてこれらの反応は、Ｂ７−Ｌポリペプチド活性のタンパク質インヒビター、抗体インヒビター、または低分子インヒビターによって抑制され得る。
【０２６０】
抗体媒介過敏性反応を引き起こす疾患（全身性エリテマトーデス、関節炎（例えば、慢性間接リウマチ、反応性関節炎、および乾癬性関節炎）、腎症（例えば、糸球体腎炎、膜様（ｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ）、膜性増殖性（ｍｅｓａｎｇｉｏｃａｐｉｌｌａｒｙ）、巣状分節状（ｆｏｃａｌ　ｓｅｇｍｅｎｔａｌ）、巣状壊死性（ｆｏｃａｌ　ｎｅｃｒｏｔｉｚｉｎｇ）、半月形、および増殖性管状疾患（ｔｕｂｕｌｏｐａｔｈｉｅｓ））、皮膚障害（例えば、天疱瘡および類天疱瘡、結節性紅斑）、内分泌障害（例えば、グレーヴズ病、橋本甲状腺炎、および真性糖尿病）、種々の肺疾患（ｐｎｅｕｍｏｐａｔｈｉｅｓ）（特に、外因性肺胞炎）、種々の血管症、ＩｇＡの異常な産生を伴う腔（ｃｏｅｌｉａｃ）疾患、多くの貧血および血小板減少、ギヤン‐バレー症候群、ならびに重症筋無力症が挙げられる）は、Ｂ７−Ｌポリペプチドアンタゴニストを用いて処置され得る。
【０２６１】
さらに、リンパ増殖障害（例えば、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、およびクリオグロブリン血症）は、Ｂ７−Ｌポリペプチド活性のタンパク質アンタゴニスト、抗体アンタゴニスト、または低分子アンタゴニストによって阻害され得る。
【０２６２】
Ｂ７−Ｌ核酸、ポリペプチド、アゴニストおよびアンタゴニストは、処置される徴候に適切である場合、サイトカイン、増殖因子、抗生物質、抗炎症剤および／または化学療法剤と組み合わせて使用され得る。
【０２６３】
Ｂ７−ＬポリペプチドまたはＢ７−Ｌポリペプチドレセプターの望ましくないレベルによって引き起こされるかまたはこれらによって媒介される他の疾患または障害は、本発明の範囲内に含まれる。望ましくないレベルは、Ｂ７−Ｌポリペプチドの過剰なレベルおよびＢ７−Ｌポリペプチドの正常以下のレベルを含む。
【０２６４】
（Ｂ７−Ｌ核酸およびＢ７−Ｌポリペプチドの使用）
本発明の核酸分子（それ自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードしない核酸分子を含む）を使用して、Ｂ７−Ｌ遺伝子および関連する遺伝子の染色体上の位置をマッピングし得る。マッピングは、当該分野で公知の技術（例えば、ＰＣＲ増幅およびインサイチュハイブリダイゼーション）により行われ得る。
【０２６５】
Ｂ７−Ｌ核酸分子（それ自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードしない核酸分子を含む）は、哺乳動物組織または体液サンプル中のＢ７−Ｌ核酸分子の存在について、定性的または定量的のいずれかで試験するための、診断アッセイにおけるハイブリダイゼーションプローブとして有用であり得る。
【０２６６】
他の方法はまた、１つ以上のＢ７−Ｌポリペプチドの活性を阻害することが所望される場合に使用され得る。このような阻害は、発現制御配列（三重らせん形成）またはＢ７−Ｌ　ｍＲＮＡに相補的でありかつこれらにハイブリダイズする核酸分子によりもたらされ得る。例えば、アンチセンスＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子（これらは、Ｂ７−Ｌ遺伝子の少なくとも一部に相補的である配列を有する）が、細胞中に導入され得る。アンチセンスプローブは、本明細書中に開示されるＢ７−Ｌ遺伝子の配列を使用して、利用可能な技術により設計され得る。代表的には、このようなアンチセンス分子の各々は、選択された各Ｂ７−Ｌ遺伝子の開始部位（５’末端）に相補的である。このアンチセンス分子が、次いで、対応するＢ７−Ｌ　ｍＲＮＡにハイブリダイズする場合、このｍＲＮＡの翻訳は、妨げられるかまたは減少される。アンチセンスインヒビターは、細胞または生物体におけるＢ７−Ｌポリペプチドの減少または非存在に関連する情報を提供する。
【０２６７】
あるいは、遺伝子治療を使用して、１つ以上のＢ７−Ｌポリペプチドのドミナントネガティブインヒビターを作製し得る。この状況において、各選択されたＢ７−Ｌポリペプチドの変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡが調製され得、そして本明細書中に記載されるウイルス方法または非ウイルス方法のいずれかを使用して患者の細胞中に導入され得る。このような変異体の各々は、代表的に、その生物学的役割において内因性ポリペプチドと競合するように設計される。
【０２６８】
さらに、Ｂ７−Ｌポリペプチドは、生物学的に活性であっても活性でなくても、免疫原として使用され得、すなわち、これらのポリペプチドは、抗体が惹起され得る、少なくとも１つのエピトープを含有する。Ｂ７−Ｌポリペプチドに結合する選択的結合因子（本明細書中に記載されるような）は、インビボおよびインビトロでの診断目的のために使用され得、これらの目的としては、体液サンプルまたは細胞サンプル中のＢ７−Ｌポリペプチドの存在を検出するための標識された形態での使用を含むが、これに限定されない。これらの抗体もまた、本明細書中に列挙される疾患および障害を含む、多数の疾患および障害を、予防、処置または診断するために使用され得る。これらの抗体は、Ｂ７−Ｌポリペプチドの少なくとも１つの活性特徴を減少またはブロックするようにＢ７−Ｌポリペプチドに結合し得るか、またはポリペプチドに結合してＢ７−Ｌポリペプチドの少なくとも１つの活性特徴を増加し得る（Ｂ７−Ｌポリペプチドの薬物動態を増加させることによるものを含む）。
【０２６９】
本発明のＢ７−Ｌポリペプチドは、発現クローニングストラテジーを使用して、Ｂ７−Ｌポリペプチドレセプターをクローニングするために使用され得る。放射性標識（１２５ヨウ素）したＢ７−Ｌポリペプチドまたはアフィニティ／活性−タグ化Ｂ７−Ｌポリペプチド（例えば、Ｆｃ融合体またはアルカリホスファターゼ融合体）を結合アッセイにおいて使用して、Ｂ７−Ｌポリペプチドレセプターを発現する細胞型、細胞株または組織を同定し得る。このような細胞または組織から単離されたＲＮＡを、ｃＤＮＡに変換し、哺乳動物発現ベクターにクローニングし、そして哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳまたは２９３細胞）にトランスフェクトして発現ライブラリーを作製し得る。次いで、放射性標識化またはタグ化Ｂ７−Ｌポリペプチドを、アフィニティリガンドとして使用して、Ｂ７−Ｌポリペプチドレセプターを表面に発現する、このライブラリー中の細胞のサブセットを同定および単離し得る。次いで、ＤＮＡを、これらの細胞から単離しそして哺乳動物細胞にトランスフェクトして、二次発現ライブラリー（ここで、Ｂ７−Ｌポリペプチドレセプターを発現する細胞の画分は、元のライブラリーよりも何倍も高い）を作製し得る。この富化プロセスは、Ｂ７−Ｌポリペプチドレセプターを含む単一の組換えクローンが単離されるまで、繰り返し反復され得る。Ｂ７−Ｌポリペプチドレセプターの単離は、Ｂ７−Ｌポリペプチドシグナル伝達経路の新規なアゴニストおよびアンタゴニストを同定または開発するために有用である。このようなアゴニストおよびアンタゴニストとしては、可溶性のＢ７−Ｌポリペプチドレセプター、抗Ｂ７−Ｌポリペプチドレセプター抗体、低分子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられ、これらは、本明細書中に記載される１つ以上の疾患または障害を、処置、予防、または診断するために使用され得る。
【０２７０】
本発明のマウスおよびヒトのＢ７−Ｌ核酸はまた、対応する染色体Ｂ７−Ｌポリペプチド遺伝子を単離するための有用なツールである。例えば、Ｂ７−Ｌ配列を含むマウス染色体ＤＮＡは、ノックアウトマウスを構築するために使用され得、これによってＢ７−Ｌポリペプチドについてのインビボでの役割の試験が可能になる。ヒトＢ７−ＬゲノムＤＮＡは、遺伝的組織変性疾患を同定するために使用され得る。
【０２７１】
以下の実施例は、例示目的のみが意図され、そしていかようにも本発明の範囲を限定するようには解釈されるべきではない。
【０２７２】
（実施例１：Ｂ７−Ｌ　ｍＲＮＡの発現）
Ｂ７−Ｌ　ｍＲＮＡの発現を、ノーザンブロット分析によって試験する。複数のヒト組織のノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ヒトＢ７−ＬポリペプチドｃＤＮＡクローンから単離した適切な制限フラグメントを用いてプローブする。このプローブを、標準的な技術を使用して３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識する。
【０２７３】
ノーザンブロットを、ハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＣ、５０％脱イオン化ホルムアミド、５×デンハート溶液、０．５％　ＳＤＳ、および１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ）中、４２℃で２時間プレハイブリダイズし、次いで５ｎｇ／ｍｌの標識されたプローブを含む新鮮なハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩ハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後、濾過物を、２×ＳＳＣおよび０．１％　ＳＤＳ中、室温で１０分間、２回洗浄し、次いで０．１×ＳＳＣおよび０．１％　ＳＤＳ中、６５℃で３０分間、２回洗浄する。次いで、このブロットを、オートラジオグラフィーに曝露する。
【０２７４】
Ｂ７−Ｌ　ｍＲＮＡの発現を、インサイチュハイブリダイゼーションによって局在化する。正常の胚および成体マウスの組織パネルを、４％パラホルムアルデヒド中に固定し、パラフィン中に包埋し、そして５μｍで切り出す。切り出した組織を、０．２ＭのＨＣｌ中に透過させ、プロテイナーゼＫで消化し、そしてトリエタノールアミンおよび無水酢酸を用いてアセチル化する。切片を、ハイブリダイゼーション溶液（３００ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１×デンハート溶液、０．２％　ＳＤＳ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、０．２５ｍｇ／ｍｌ　ｔＲＮＡ、２５μｇ／ｍｌ　ポリＡ、２５μｇ／ｍｌ　ポリＣおよび５０％ホルムアルデヒド）中、６０℃で１時間プレハイブリダイズし、次いで、１０％デキストランおよびヒトＢ７−Ｌ遺伝子に相補的な２×１０４ｃｐｍ／μｌの３３Ｐ−標識されたアンチセンスリボプローブを含む同じ溶液中、６０℃で一晩ハイブリダイズする。このリボプローブを、標準的技術を使用して、ヒトＢ７−Ｌ　ｃＤＮＡ配列を含むクローンのインビトロ転写によって得る。
【０２７５】
ハイブリダイゼーション後、切片を、ハイブリダイゼーション溶液中でリンスし、ＲＮａｓｅＡで処理してハイブリダイズしていないプローブを消化し、次いで０．１×ＳＳＣ中で５５℃で３０分間洗浄する。次いで、切片をＮＴＢ−２エマルジョン（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に浸し、４℃に３週間曝し、発色させ、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色する。組織形態学およびハイブリダイゼーションシグナルを、脳（矢状断面１つおよび冠状断面２つ）、胃腸管（食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、近位結腸、および遠位結腸）、下垂体、肝臓、肺、心臓、脾臓、胸腺、リンパ節、腎臓、副腎、膀胱、膵臓、唾液腺、雄性および雌性生殖器（雌性の卵巣、卵管、および子宮；ならびに雄性の精巣、精巣上体、前立腺、精嚢および輸精管）、ＢＡＴおよびＷＡＴ（皮下、腎臓周囲）、骨（大腿）、皮膚、乳房、および骨格筋についての暗視野かつ標準のイルミネーションによって同時に分析する。
【０２７６】
（実施例２：Ｂ７−Ｌポリペプチドの産生）
（Ａ．細菌におけるＢ７−Ｌポリペプチドの発現）
ＰＣＲを用いて、Ｂ７−ＬポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列を増幅する。このＰＣＲには、この配列の５’および３’末端に対応するプライマーを用いる。増幅したＤＮＡ産物を改変して、発現ベクター内への挿入を可能にするために制限酵素部位を含むようにし得る。ＰＣＲ産物をゲル精製し、そして標準的組み換えＤＮＡ方法論を用いて発現ベクター中に挿入する。ｌｕｘプロモーターおよびカナマイシン耐性をコードする遺伝子を含むｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣ番号９８１１３）のような代表的ベクターを、挿入したＤＮＡの方向性クローニングのために、ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩを用いて消化する。連結した混合物を、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ宿主株中に形質転換し、そして形質転換体をカナマイシン耐性について選択する。選択したコロニー由来のプラスミドＤＮＡを、単離し、そしてＤＮＡ配列決定に供してインサート（挿入物）の存在を確認する。
【０２７７】
形質転換した宿主細胞を、導入前に、３０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する２×ＹＴ培地中で３０℃でインキュベートする。最終濃度３０ｎｇ／ｍＬへのＮ−（３−オキソヘキサノイル）−ｄｌ−ホモセリンラクトンの添加、それに続く３０℃かまたは３７℃での６時間のインキュベーションによって、遺伝子発現を誘導する。Ｂ７−Ｌポリペプチドの発現を、培養物の遠心分離、細菌ペレットの再懸濁および溶解、ならびに、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による宿主細胞タンパク質の分析によって評価する。
【０２７８】
Ｂ７−Ｌポリペプチドを含有する封入体を、以下の通り精製する。細菌細胞を遠心分離によってペレット化し、そして水中に再懸濁する。この細胞懸濁液を超音波処理によって溶解し、そして１９５，０００×ｇでの５〜１０分間の遠心分離によってペレット化する。この上清を廃棄し、そしてペレットを洗浄してホモジナイザーに移す。このペレットを、均一に懸濁されるまで、５ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ溶液（７５％液体Ｐｅｒｃｏｌｌおよび０．１５Ｍ　ＮａＣｌ）中にホモジナイズし、次いで希釈して２１，６００×ｇで３０分間遠心分離する。封入体を含む勾配画分を回収してプールする。単離した封入体をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０２７９】
Ｅ．ｃｏｌｉが産生したＢ７−Ｌポリペプチドに相当する、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上の単一のバンドを、ゲルから切り出し、そしてＮ末端アミノ酸配列を、本質的にＭａｔｓｕｄａｉｒａら、１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１０〜３５に記載のように決定する。
【０２８０】
（Ｂ．哺乳動物細胞におけるＢ７−Ｌポリペプチドの発現）
ＰＣＲを用いて、Ｂ７−ＬポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列を増幅する。このＰＣＲには、この配列の５’および３’末端に対応するプライマーを用いる。増幅したＤＮＡ産物を改変して、発現ベクター内への挿入を可能にするために制限酵素部位を含むようにし得る。ＰＣＲ産物をゲル精製し、そして標準的組み換えＤＮＡ方法論を用いて発現ベクター中に挿入する。エプスタイン−バーウイルス複製起点を含む例示的な発現ベクターであるｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、２９３−ＥＢＮＡ−１細胞におけるＢ７−Ｌポリペプチドの発現のために用い得る。増幅およびゲル精製したＰＣＲ産物を、ｐＣＥＰ４ベクターに連結し、そしてリポフェクションによって２９３−ＥＢＮＡ細胞中に導入する。トランスフェクトした細胞を、１００μｇ／ｍＬのハイグロマイシン中で選択し、そして得られた薬物耐性培養物をコンフルエンスになるまで増殖させる。次いで、この細胞を無血清培地中で７２時間培養する。馴化培地を取り出し、Ｂ７−Ｌポリペプチド発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０２８１】
Ｂ７−Ｌポリペプチド発現は、銀染色によって検出され得る。あるいは、Ｂ７−Ｌポリペプチドを、ペプチドタグに対する抗体を用いてウエスタンブロット分析によって検出可能である、エピトープタグ（例えば、ＩｇＧ定常ドメインまたはＦＬＡＧエピトープ）を有する融合タンパク質として生成する。
【０２８２】
Ｂ７−Ｌポリペプチドを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから切り出し得るか、またはＢ７−Ｌ融合タンパク質を、エピトープタグに対するアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、そして本明細書に記載のようなＮ末端アミノ酸配列分析に供する。
【０２８３】
（Ｃ．哺乳動物細胞におけるＢ７−Ｌポリペプチドの発現および精製）
リポフェクションまたはリン酸カルシウムプロトコールのいずれかを用いて、２９３　ＥＢＮＡ細胞またはＣＨＯ細胞中に、Ｂ７−Ｌポリペプチド発現構築物を導入する。
【０２８４】
生成されるＢ７−Ｌポリペプチドに対する機能的研究を行うため、ハイグロマイシン選択２９３　ＥＢＮＡクローンのプールから大量の馴化培地を生成する。この細胞を５００ｃｍ　Ｎｕｎｃ　Ｔｒｉｐｌｅ　Ｆｌａｓｋｓ中で、８０％コンフルエンスになるまで培養し、その後、培地を回収する１週間前に無血清培地に切り換える。馴化培地を回収し、そして精製まで−２０℃に凍結する。
【０２８５】
馴化培地を下記のとおり、アフィニティークロマトグラフィーによって精製する。この培地を解凍し、次いで０．２μｍフィルターに通す。プロテインＧカラムをＰＢＳでｐＨ７．０に平衡化し、次いで濾過した培地をロードした。このカラムをＡ２８０の吸収がベースラインに達するまでＰＢＳで洗浄する。０．１Ｍ　グリシン−ＨＣｌを用いてｐＨ２．７で、Ｂ７−Ｌポリペプチドをカラムから溶出し、直ちに１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを用いてｐＨ８．５で中和する。Ｂ７−Ｌポリペプチドを含有する画分をプールし、ＰＢＳ中で透析し、そして−７０℃で貯蔵した。
【０２８６】
ヒトＢ７−Ｌポリペプチド−Ｆｃ融合ポリペプチドの第Ｘａ因子切断について、アフィニティークロマトグラフィー精製したタンパク質を、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＣａＣｌ２中でｐＨ８．０で透析する。制限プロテアーゼ第Ｘａ因子を、透析したタンパク質に１／１００（ｗ／ｗ）で添加し、そしてこのサンプルを室温で一晩消化する。
【０２８７】
（実施例３：抗Ｂ７−Ｌポリペプチド抗体の産生）
Ｂ７−Ｌポリペプチドに対する抗体を、生物学的合成または化学的合成によって生成した、精製タンパク質またはＢ７−Ｌペプチドを用いて免疫することによって獲得し得る。抗体を生成するための適切な手順は、ＨｕｄｓｏｎおよびＢａｙ、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第二版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｉｌｉｃａｔｉｏｎ）に記載の手順を含む。
【０２８８】
抗体生成のための１つの手順において、動物（代表的には、マウスまたはウサギ）に、Ｂ７−Ｌ抗原（例えば、Ｂ７−Ｌポリペプチド）を注射し、そして、ハイブリドーマ産生のため、ＥＬＩＳＡによって決定した十分な血清力価レベルを有する動物を、選択する。免疫した動物の脾臓を回収し、そして単一細胞懸濁液として調製し、これから脾臓細胞を回収する。脾臓細胞をマウスミエローマ細胞（例えば、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞）に融合し、ＤＭＥＭ（２００Ｕ／ｍＬペニシリン、２００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン、および４ｍＭグルタミン含有）中でまずインキュベートし、次いで、ＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）中でインキュベートする。選択後、組織培養上清を各融合ウェルから取り出し、そしてＥＬＩＳＡによって、抗Ｂ７−Ｌ抗体産生について試験する。
【０２８９】
抗Ｂ７−Ｌ抗体を得るため、別の手順をまた、使用し得る。この手順は例えば、ヒト抗体の生成のためのヒトＩｇ遺伝子座を保有するトランスジェニックマウスの免疫、および合成抗体ライブラリー（例えば、抗体可変ドメインの変異誘発によって生成されるライブラリーなど）のスクリーニングである。
【０２９０】
（実施例４：トランスジェニックマウスにおけるＢ７−Ｌポリペプチドの発現）
Ｂ７−Ｌポリペプチドの生物学的活性を評価するため、肝臓特異的ＡｐｏＥプロモーターの制御下でＢ７−Ｌポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質をコードする構築物を調製する。この構築物の送達により、Ｂ７−Ｌポリペプチドの機能に関する情報を与える病理的変化を生じることが期待される。同様に、βアクチンプロモーターの制御下で全長Ｂ７−Ｌポリペプチドを含む構築物を調製する。この構築物の送達により、遍在性発現を生じることが期待される。
【０２９１】
これらの構築物を生成するために、ＰＣＲを用いて、Ｂ７−ＬポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列を増幅する。このＰＣＲには、所望の配列の５’および３’末端に対応するプライマーを用いる。そしてこの配列は、発現ベクター内への増幅産物の挿入を可能にするために制限酵素部位を組み込む。増幅後、ＰＣＲ産物をゲル精製し、適切な制限酵素で消化し、そして標準的組み換えＤＮＡ技術を用いて発現ベクター中に連結する。例えば、増幅したＢ７−Ｌポリペプチド配列を、Ｇｒａｈａｍら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１７：２７２〜７４およびＲａｙら，１９９１　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．５：２２６５〜７３に記載のように、ヒトβアクチンプロモーターの制御下で発現ベクター中にクローニングし得る。
【０２９２】
連結後、反応混合物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主株をエレクトロポレーションによって形質転換し、そして形質転換体を、薬物耐性で選択する。選択したコロニー由来のプラスミドＤＮＡを単離して、ＤＮＡ配列決定に供し、適切なインサートの存在および変異が存在しないことを確認する。Ｂ７−Ｌポリペプチド発現ベクターを、２回のＣｓＣｌ密度勾配遠心分離を通じて精製し、適切な制限酵素で切断し、そして、Ｂ７−Ｌポリペプチド導入遺伝子を含有する直線フラグメントを、ゲル電気泳動によって精製する。精製したフラグメントを、５ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）および０．２ｍＭ　ＥＤＴＡ中で、２ｍｇ／ｍＬの濃度で、再懸濁する。
【０２９３】
ＢＤＦ１×ＢＤＦ１交配マウス由来の単一細胞胚を、記載（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／２３６１４）のように注射する。胚を、ＣＯ２インキュベーター中で一晩培養し、そして１５〜２０の２細胞胚を偽妊娠ＣＤ１雌性マウスの卵管に移す。マイクロインジェクションした胚の着床から得た子孫を、以下のように、ゲノムＤＮＡサンプル中に取り込まれた導入遺伝子のＰＣＲ増幅でスクリーニングする。耳切片を２０ｍＬの耳緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％　ＳＤＳ、および５００ｍｇ／ｍＬ　プロテイナーゼＫ）中で、５５℃で一晩消化する。次いで、このサンプルを２００ｍＬのＴＥで希釈し、そして２ｍＬの耳サンプルを、適切なプライマーを用いるＰＣＲ反応中で用いる。
【０２９４】
８週齢で、トランスジェニック創始動物およびコントロール動物を、剖検および病理分析のため、屠殺する。脾臓の一部を取り出し、そしてＴｏｔａｌ　ＲＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、脾臓から、総細胞ＲＮＡを単離し、そして導入遺伝子発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって決定する。脾臓から回収したＲＮＡを、以下のように、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＰｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いてｃＤＮＡに変換する。適切なプライマー（発現ベクター中のＢ７−Ｌポリペプチド導入遺伝子の３’側に位置する）を用いて、導入遺伝子転写物からｃＤＮＡ合成をプライムする。トランスジェニック創始動物およびコントロール由来の１０ｍｇの総脾臓ＲＮＡを、１ｍＭのプライマーとともに、１０分間７０℃でインキュベートし、そして氷上に置く。次いで、反応物に、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ　ＫＣｌ、２．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．１ｍＭ　ＤＴＴ、および２００ＵのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ逆転写酵素を補充する。４２℃で５０分間のインキュベーション後、７２℃で１５分間加熱することによって反応を停止し、２ＵのＲＮａｓｅ　Ｈを用いて２０分間３７℃で消化する。次いで、サンプルをＢ７−Ｌポリペプチドに特異的なプライマーを用いるＰＣＲによって増幅する。
【０２９５】
（実施例５：トランスジェニックマウスにおけるＢ７−Ｌポリペプチドの生物学的活性）
安楽死の前に、トランスジェニック動物を計量し、イソフルオロラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）によって麻酔し、そして心臓穿刺によって採血する。サンプルを、血液学および血清化学分析に供する。Ｘ線撮影を、最終的な放血後に行う。肉眼での解剖の際に、主な内臓器官を、重量分析に供する。
【０２９６】
肉眼での解剖後、組織（すなわち、肝臓、脾臓、膵臓、胃、胃腸管全体、腎臓、生殖器官、皮膚および乳腺、骨、脳、心臓、肺、胸腺、気管、食道、甲状腺、副腎、膀胱、リンパ節および骨格筋）を取出し、そして１０％緩衝化Ｚｎ−ホルマリン中で組織学的検査のために固定する。固定後、組織をパラフィンブロック中で処理し、そして３ｍｍの切片を得る。全ての切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、次いで組織学的分析に供する。
【０２９７】
トランスジェニックマウスおよびコントロールマウスの両方の脾臓、リンパ節およびパイアー斑を、以下の通りにＢ細胞特異的抗体およびＴ細胞特異的抗体を用いた免疫組織学的分析に供する。ホルマリンで固定したパラフィン包埋切片を脱パラフィン処理し、そして脱イオン水中で水和する。切片を３％過酸化水素でクエンチし、タンパク質　Ｂｌｏｃｋ（Ｌｉｐｓｈａｗ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）でブロックし、そしてラットモノクローナル抗マウスＢ２２０およびＣＤ３（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）中でインキュベートする。抗体結合を、色素原（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）としてＤＡＢ（ＢｉｏＴｅｋ，Ｓａｎｔａ　Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を用いて、ビオチン化ウサギ抗ラット免疫グロブリンおよびペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジン（ＢｉｏＧｅｎｅｘ，Ｓａｎ　Ｒａｍｏｎ，ＣＡ）によって検出する。切片を、ヘマトキシリンで対比染色する。
【０２９８】
剖検後、トランスジェニック動物およびコントロールの同腹仔由来の脾臓および胸腺のＭＬＮおよび切片を取出す。シリンジの平らな末端を用いて１００ｍｍナイロン性細胞ストレーナー（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ　Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）の底に対してこの組織を穏やかに粉砕することによって単細胞懸濁物を調製する。細胞を２回洗浄し、計数し、次いで各組織由来の約１×１０６細胞を、２０μＬ容量において０．５μｇ　ＣＤ１６／３２（ＦｃγＩＩＩ／ＩＩ）Ｆｃブロックで１０分間インキュベートする。次いで、サンプルを、ＦＩＴＣまたはＰＥに結合体化した、ＣＤ９０．２に対するモノクローナル抗体（Ｔｈｙ−１．２）、ＣＤ４５Ｒに対するモノクローナル抗体（Ｂ２２０）、ＣＤ１１ｂに対するモノクローナル抗体（Ｍａｃ−１）、Ｇｒ−１に対するモノクローナル抗体、ＣＤ４に対するモノクローナル抗体またはＣＤ８に対するモノクローナル抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の０．５μｇ抗体を用いて、１００μＬ容量のＰＢＳ（Ｃａ＋およびＭｇ＋を欠く）、０．１％ウシ血清アルブミンおよび０．０１％アジ化ナトリウム中で２〜８℃で３０分間染色する。抗体結合後、細胞を洗浄し、次いでＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフローサイトメトリーによって分析する。
【０２９９】
本発明を好ましい実施形態に関して記載してきたが、改変および修飾が当業者に思い浮かぶことが理解される。それゆえ、添付の特許請求の範囲が、本願発明の範囲内に入る全てのこのような均等な改変物を包含することが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａ〜１Ｂは、ヒトＢ７−Ｌポリペプチド（Ｂ７−Ｌ　ｈ１；配列番号２）をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｂは、ヒトＢ７−Ｌポリペプチド（Ｂ７−Ｌ　ｈ２；配列番号４）をコードするヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、ヒトＢ７−Ｌポリペプチド（Ｂ７−Ｌ　ｈ３；配列番号６）をコードするヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、ヒトＢ７−Ｌポリペプチド（Ｂ７−Ｌ　ｈ４；配列番号８）をコードするヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、マウスＢ７−Ｌポリペプチド（Ｂ７−Ｌ　ｍ１；配列番号１０）をコードするヌクレオチド配列（配列番号９）を示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、マウスＢ７−Ｌポリペプチド（Ｂ７−Ｌ　ｍ２；配列番号１２）をコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｂは、マウスＢ７−Ｌポリペプチド（Ｂ７−Ｌ　ｍ３；配列番号１４）をコードするヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す。
【図８】図８は、マウスＢ７−Ｌポリペプチド（上側の配列；配列番号１０）およびラットＢ７−１（下側の配列；配列番号１５）のアミノ酸配列のアライアメントを示す。
【図９】図９は、ヒトＢ７−Ｌポリペプチド（上側の配列；配列番号２）およびマウスＢ７−Ｌ（下側の配列；配列番号１０）のアミノ酸配列のアライアメントを示す。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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