(57)【要約】本発明は、救出イヌジステンパーウイルスにより、セグメント化されていない負方向一本鎖ＲＮＡウイルスを組換え生産する方法およびそれから形成される免疫原性組成物に関する。付加的な具体例は、イヌジステンパーウイルスを弱毒化および／または感染性ウイルスとして生産する方法に関する。組換えウイルスはｃＤＮＡクローンから調製することができ、従って、ゲノム内に定義された変化、例えば、ヌクレオチド／ポリヌクレオチドの欠失、挿入、置換および再配列を有するウイルスを得ることができる。
2004501646.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えイヌジステンパーウイルスを生産する方法であって、少なくとも１個の宿主細胞中で、（ｉ）イヌジステンパーウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列またはその変異型ポリヌクレオチド配列を含有する単離された核酸分子を含有する転写ベクターと、（ｉｉ）カプシドへの被包、転写および複製に必要なトランス作用タンパク（Ｎ、ＰおよびＬ）をコードするポリヌクレオチド配列を含有するさらに１個の単離された核酸分子を含有する少なくとも１種の発現ベクターとを含有する救出組成物の、媒体中における、該ベクターの同時発現および組換えウイルスの生産を可能にするのに十分な条件下でのトランスフェクションまたは形質転換を行うことからなる方法。
【請求項２】
さらに組換えウイルスを収穫することを包含する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
イヌジステンパーウイルスのゲノムまたはアンチゲノムをコードする単離された核酸分子が１個より多くのゲノムまたはアンチゲノム源のキメラである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
イヌジステンパーウイルスのゲノムまたはアンチゲノムをコードする単離された核酸分子が配列番号１、２または３のポリヌクレオチド配列を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
イヌジステンパーウイルスのゲノムまたはアンチゲノムをコードする単離された核酸分子が弱毒化ウイルスまたは該ウイルスの感染型をコードする、請求項１記載の方法。
【請求項６】
イヌジステンパーウイルスのゲノムまたはアンチゲノムをコードする単離された核酸分子が該ウイルスの感染型をコードする、請求項１記載の方法。
【請求項７】
イヌジステンパーウイルスのゲノムまたはアンチゲノムをコードする単離された核酸分子が弱毒化ウイルスをコードする、請求項１記載の方法。
【請求項８】
イヌジステンパーウイルスのゲノムまたはアンチゲノムをコードする単離された核酸分子が感染性の弱毒化ウイルスをコードする、請求項１記載の方法。
【請求項９】
宿主細胞が真核細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
宿主細胞が脊椎動物細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
宿主細胞が鳥類細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
宿主細胞がヒト細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
宿主細胞がヒト胚細胞由来である、請求項９記載の方法。
【請求項１４】
宿主細胞がヒト胚腎臓細胞、ヒト肺癌およびヒト子宮頸癌、または動物腎臓細胞由来である、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
請求項１記載の方法から調製される組換えイヌジステンパーウイルス。
【請求項１６】
（ｉ）請求項１記載の方法から調製された組換えイヌジステンパーウイルスと、（ｉｉ）医薬上許容される担体とからなる医薬組成物。
【請求項１７】
さらに転写ベクターがＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
単離された組換え生産されたイヌジステンパーウイルスと、生理学的に許容される担体とからなる免疫原性組成物。
【請求項１９】
動物またはヒトを免疫化してイヌジステンパーウイルスに対する保護を誘発する方法であって、該動物またはヒトに請求項１８の免疫原性組成物を投与することからなる方法。
【請求項２０】
イヌジステンパーウイルスのゲノムまたはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含有する核酸分子。
【請求項２１】
配列番号１のアンチゲノムメッセージ方向である正鎖のイヌジステンパーウイルス配列を含有する請求項２０記載の核酸分子。
【請求項２２】
イヌジステンパーウイルスの１個またはそれ以上のタンパクをコードするポリヌクレオチド配列を含有する核酸分子。
【請求項２３】
前記ポリヌクレオチド配列がさらに１個もしくはそれ以上の異種ヌクレオチド配列または１個もしくはそれ以上の異種遺伝子を含有する請求項２０、２１または２２記載の核酸分子。
【請求項２４】
イヌジステンパーウイルスのゲノムまたはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含有するプラスミド。
【請求項２５】
イヌジステンパーウイルスの１個またはそれ以上のタンパクをコードするポリヌクレオチド配列を含有するプラスミド。
【請求項２６】
ポリヌクレオチド配列がさらに１個もしくはそれ以上の異種ヌクレオチド配列または１個もしくはそれ以上の異種遺伝子を含有する、請求項２４記載のプラスミド。
【請求項２７】
前記ポリヌクレオチド配列がさらに１個もしくはそれ以上の異種ヌクレオチド配列または１個もしくはそれ以上の異種遺伝子を含有する、請求項２５記載のプラスミド。
【請求項２８】
請求項２４〜２７記載の少なくとも１個のプラスミドで形質転換された宿主細胞。
【請求項２９】
単離された組換え生産されたイヌジステンパーウイルスと、生理学的に許容される担体とからなる組成物であって、イヌジステンパーウイルスが少なくとも１個の異種ポリヌクレオチドを発現する、組成物。
【請求項３０】
イヌジステンパーウイルスが抗原をコードする少なくとも１個の異種ポリヌクレオチドを発現する、請求項１８記載の免疫原性組成物。
【請求項３１】
さらにイヌジステンパーウイルス以外の病原体に対する少なくとも１個の抗原を含有する、請求項１８記載の免疫原性組成物。
【請求項３２】
少なくとも１個の抗原が弱毒化ＲＮＡウイルスである、請求項３１記載の免疫原性組成物。
【請求項３３】
さらにイヌに感染する病原体に対する少なくとも１個の抗原を含有する、請求項１８記載の免疫原性組成物。
【請求項３４】
少なくとも１個の抗原が、狂犬病ウイルス、イヌパルボウイルス、イヌパルボウイルス２、イヌコロナウイルス、イヌアデノウイルス１型、イヌアデノウイルス２型およびイヌパラインフルエンザウイルスからなる群から選択される１種またはそれ以上のウイルスに対する抗原である、請求項３１記載の免疫原性組成物。
【請求項３５】
さらにヒトに感染する病原体に対する少なくとも１個の抗原を含有する、請求項１８記載の免疫原性組成物。
【請求項３６】
イヌウイルス以外の病原体の少なくとも１個の抗原が組換え生産されたイヌジステンパーウイルスから発現される、請求項３１記載の免疫原性組成物。
【請求項３７】
少なくとも１個の抗原が１個またはそれ以上のイヌパルボウイルスに対する抗原である、請求項３１記載の免疫原性組成物。
【請求項３８】
組換えイヌジステンパーウイルスのｃＤＮＡクローンの配列を含有するヌクレオチド配列。
【請求項３９】
異種ヌクレオチド配列が単一の転写単位としてイヌジステンパーウイルスゲノム配列内に挿入される、請求項２６記載のプラスミド。
【請求項４０】
異種ヌクレオチド配列が１個またはそれ以上のモノシストロニックな転写単位としてイヌジステンパーウイルスゲノム配列内に挿入される、請求項２６記載のプラスミド。
【請求項４１】
異種ヌクレオチド配列が、１個またはそれ以上のリボソームエントリー部位を含有しうる、少なくとも１個のポリシストロニック転写単位としてイヌジステンパーウイルスゲノム配列内に挿入される、請求項２６記載のプラスミド。
【請求項４２】
請求項２８記載の宿主細胞により産生された単離された組換え生産されたイヌジステンパーウイルスと、生理学的に許容される担体とからなる組成物。
【請求項４３】
図６（配列番号２）または図７（配列番号３）の組換えイヌジステンパーウイルスのｃＤＮＡクローンのポリヌクレオチド配列を含有するヌクレオチド配列。
【請求項４４】
動物がイヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびウマからなる群から選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項４５】
動物またはヒトを免疫化してイヌジステンパーウイルスに対する保護を誘発する方法であって、該動物またはヒトに請求項１８、３０〜３７記載の免疫原性組成物を投与することからなる方法。
【請求項４６】
イヌジステンパーウイルスのゲノムまたはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列またはその変異型ポリヌクレオチド配列がイヌジステンパーウイルスの野生型ヌクレオチドの少なくとも１個の突然変異を含有し、かかる突然変異がモノネガウイルス目に属する別の非セグメント化負方向一本鎖ＲＮＡウイルスのコードまたは非コード領域における公知の弱毒化突然変異に対応する、請求項１記載の方法。
【請求項４７】
イヌジステンパーウイルスのゲノムまたはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列またはその変異型ポリヌクレオチド配列が組換え生産されたウイルス複製欠陥を与える少なくとも１個の突然変異を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項４８】
ＲＮＡウイルスがＰＩＶ、ＲＳＶ、流行性耳下腺炎および麻疹から選択される、請求項４６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、イヌジステンパーウイルス、すなわち非セグメント化負方向一本鎖ＲＮＡウイルスを組換え生産する方法およびそれから形成される免疫原性組成物に関する。付加的な具体例は、イヌジステンパーウイルスを弱毒化および／または感染性ウイルスとして生産する方法に関する。組換えウイルスはｃＤＮＡクローンから調製することができ、従って、ゲノム内に定義された変化を有するウイルスを得ることができる。また、本発明は、それから形成された組換えウイルスを、外来遺伝子情報、例えば、外来遺伝子を発現するベクターとして、多くの応用、例えば、イヌジステンパー以外の病原体に対する免疫原性または医薬組成物、遺伝子治療および細胞ターゲティングに使用することに関する。
【０００２】
（背景技術）
被包された負方向一本鎖ＲＮＡウイルスは、独特に組織され、発現される。負方向一本鎖ウイルスのゲノムＲＮＡは、ヌクレオカプシドの内容物における２つの鋳型機能を果たす：メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の合成用鋳型として、および、アンチゲノム（＋）鎖の合成用鋳型として。負方向一本鎖ＲＮＡウイルスは、それら自体のＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼをコードし、パッケージする。メッセンジャーＲＮＡは、いったんウイルスが感染した細胞の細胞質に入ったら、合成されるだけである。ウイルスの複製は、ｍＲＮＡの合成後に起こり、ウイルスタンパクの連続合成を必要とする。新しく合成されたアンチゲノム（＋）鎖は、（−）鎖ゲノムＲＮＡのさらなるコピーを生成する鋳型として役立つ。
【０００３】
イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）は、麻疹ウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）属のメンバーである（３０）。このグループの他のメンバー、例えば、麻疹ウイルス、牛疫ウイルスおよび小反芻動物病ウイルスと同様に、ＣＤＶは約１６キロ塩基の一本鎖負方向ゲノムを含有する被包されたＲＮＡウイルスである（４、１８、２５）。ゲノムは、感染細胞中の８個の公知のウイルスポリペプチドをコードする６個の重複していない遺伝子領域、組織された３’−Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｆ−Ｈ−Ｌ−５’を含有する。ウイルスポリペプチドとしては、ウイルスゲノムＲＮＡをカプシドに被包するヌクレオカプシドタンパク（Ｎ）；ビリオンの構造成分であるマトリックスタンパク（Ｍ）；融合（Ｆ）および血球凝集素（Ｈ）エンベロープ糖タンパク；触媒ポリメラーゼサブユニット（Ｌ）；Ｐ遺伝子によりコードされる３つのタンパクが挙げられる。Ｐ遺伝子は、下流の翻訳開始コドンからアクセスする別のリーディングフレーム（Ｃ）またはｍＲＮＡの編集により生成するフレームシフト（Ｖ）を利用することにより、リンタンパク（Ｐ）ポリメラーゼサブユニットおよび非構造タンパク（ＣおよびＶ）をコードする。
【０００４】
ＣＤＶは、イヌの疾患を引き起こすので最も良く知られている（４、１８）。ウイルスは一般的に煙霧により広がり、最初の感染は上部気道上皮で起こる。次いで、感染はリンパ系組織に広がり、ウイルスの免疫抑制ならびにさらにウイルスの多くに臓器および細胞タイプへの伝播を起こす。一部の動物はこの疾患から回復するが、数日から数週間以内に、比較的多数が中枢神経系の活性な感染を起こし、神経症状を表す進行性脱髄疾患に至る。この疾患は、ヒト脱髄障害のモデルとして研究されている（５２、５７）。
【０００５】
典型的にはイヌの感染に関連するが、向上した検出技術を用いた最近の研究は、ＣＤＶが幅広い宿主の範囲に感染することが示されている（４、１１、１８、５２）。家庭で飼育されているイヌおよび野犬、キツネ、オオカミおよびコヨーテを含めて、すべてのイヌ科動物が感染しやすい。また、ＣＤＶは、アフリカおよび米国の動物におけるライオンおよびトラを含む大型ネコ科動物の死亡に関連している。また、アシカ科・アザラシ科の動物におけるＣＤＶ発生が報告されており、このウイルスはミンク、白イタチおよびアライグマの疾患を起こすことが知られている。ＣＤＶは、パジェット病および多発性硬化症などのヒト疾患の原因であると見なされてさえいる（１４、１９、２８）。この比較的幅広い宿主の範囲は、麻疹ウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）属の中では、このグループの他のメンバーが限定された宿主範囲を示すことから、むしろ独特である。
【０００６】
生弱毒化ＣＤＶワクチンは、家庭で飼育されているイヌの集団の疾患を制御するのに有効であるが、さらなるワクチン研究の必要性が存在する。３つの普及しているワクチンは、すべての感染しやすい動物集団に用いることはできない（４、１８、５２）。白イタチ、キツネ、大型ネコ動物の一部、レッサーパンダおよびアフリカの野生のイヌは、ワクチン株により引き起こされる疾患に感染しやすく、このことは、動物園およびサファリ・パークについて、それらの動物をＣＤＶ感染から保護しようと試みる特別の問題を生じる。加えて、ＣＤＶの大型宿主範囲は、さらなる新しい宿主への適応だけでなく抗原変異のかなりの可能性が存在しうることを示唆している。かくして、より幅広い範囲の動物に投与するのが安全なワクチンは価値があり、これらのワクチンが将来の抗原変異を考慮して容易に操作しうるのであれば有益である。
【０００７】
新しいＣＤＶワクチンが研究されつつある。例えば、ＣＤＶ糖タンパクを発現する組換えワクシニアウイルスまたはカナリア痘ウイルスに基づくワクチンがイヌおよび白イタチで試験されており（３４、５１）、これらのワクチンは成功裏に保護免疫応答を誘発する。しかし、この免疫応答の期間が従来の生ＣＤＶワクチンにより誘発される応答と同じであるかどうかはまだ調べられていない（４）。ＣＤＶ糖タンパクに基づくＤＮＡワクチンがマウスで試験されている。免疫化されたマウスは、ＣＤＶの神経毒性株による大脳内への攻撃誘発に耐えたが、一部のマウスは感染から完全には保護されていなかった（４８）。これらの技術を試験することに加えて、生弱毒化ＣＤＶワクチンにおいて、幅広い範囲の宿主でのそれらの安全性を増強するための改良を試みることが望ましい。家庭で飼育されているイヌの集団におけるジステンパーを制御する際の現在の生弱毒化ＣＤＶワクチンの立証されている成功（４、１８、５２）は、修飾および改良された生弱毒化ＣＤＶ株が依然としてワクチン開発の重要な選択肢の１つでありうることを示唆している。
【０００８】
生弱毒化ＣＤＶワクチンのさらなる発達を容易にする１つの重要な技術は、クローン化ＤＮＡから非セグメント化負鎖ＲＮＡウイルスの回収を可能にするｃＤＮＡ救出（ｒｅｓｃｕｅ）技術である（１０、３１、４０、４２）。それが最初に報告されて（３８、４４）以来、この技術は、様々な負鎖ウイルスにおいて、弱毒化株を誘導し、遺伝分析を行い、かつ外来遺伝子を挿入する頻度を増大させるのに用いられている（１０、３１、４０、４２）。簡単には、この技術は、負鎖ＲＮＡウイルスの救出を、たとえこれらのウイルスのゲノムＲＮＡが感染性でなくても、可能にする。救出は、ウイルスのゲノムｃＤＮＡを、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する感染細胞におけるウイルスゲノムの正確なコピーを生成させるように設計されたプラスミドベクターにクローン化することにより達成される。このプラスミドは、一般的には、正ゲノム鎖の５’末端にあるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよび３’末端にあるリボザイム配列が隣接するｃＤＮＡを含有する。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始がウイルスゲノムの５’末端を形成するのに対し、主要なＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ誘導転写物のリボザイム開裂は３’末端を形成する。プラスミドからのゲノムの細胞内合成に加えて、Ｎ、ＰおよびＬ遺伝子を含有するＴ７発現ベクターは、ウイルス救出の開始に必要なトランス作用因子の最小補体を与えるように細胞内に導入される。ゲノムｃＤＮＡクローンとＮ、ＰおよびＬの発現プラスミドとが同時トランスフェクトされた細胞の少ない割合は、ゲノム転写物をＮタンパクでパッケージして、ヌクレオカプシド粒子を形成する。次いで、ヌクレオカプシド粒子は、ＰおよびＬタンパクからなるウイルスポリメラーゼの基質として作用する。この工程の後、ウイルスの複製サイクルを開始することができる。
【０００９】
ポリメラーゼ複合体は、ゲノムの３’末端におけるシス作用性シグナル、特にプロモーター領域を関与させることにより、転写および複製を作動させ、達成する。次いで、ウイルス遺伝子は、ゲノム鋳型から一方向にその３’末端から５’末端に転写される。一般的には、上流の遺伝子（例えば、核タンパク遺伝子（Ｎ））に対して下流の遺伝子（例えば、ポリメラーゼ遺伝子（Ｌ））から作成されるｍＲＮＡは少ない。それゆえ、常にゲノムの３’末端に対する遺伝子の位置に従ってｍＲＮＡ発生量の勾配が存在する。
【００１０】
かかる非セグメント化ＲＮＡウイルスの分子遺伝分析は、裸のゲノムＲＮＡまたはトランスフェクトされたプラスミドから細胞内で産生されたＲＮＡが感染性でないので、困難であることが示されてきた。現在では、いくつかの組換え非セグメント化負鎖ＲＮＡウイルスの単離を可能にする方法を記載する刊行物が存在する（シュネル（Ｓｃｈｎｅｌｌ）ら、１９９４年）。これらの方法を、ここでは「救出」と呼ぶ。これらの様々な負鎖ウイルスを救出するための技術は共通のテーマに従う；しかし、各ウイルスは成功した救出用の独特の必要成分を有する（４１、４３、４４、６３、６４、６５、６６、６７、６８、７０および７３）。ゲノムｃＤＮＡプラスミドのトラスフェクション後に、ゲノムＲＮＡの正確なコピーがファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびベクターにコードされたリボザイム配列（ＲＮＡを３’末端から開裂する）の共同作用により産生される。このＲＮＡが、同時トランスフェクトされた発現プラスミドにより最初に供給されるウイルスタンパクによりパッケージされ、複製される。イヌジステンパーウイルスの場合、救出の方法は、まだ確立する必要があり、従って、イヌジステンパー救出の方法を考案する必要がある。イヌジステンパーウイルス用の救出方法は、他のＲＮＡウイルスに関する研究に比べて、イヌジステンパーウイルスの生物学の関する広範囲な研究が存在しないことにより複雑である。特に、ＣＤＶミニレプリコンの研究は発表されておらず、ミニレプリコン系は本質的にウイルス救出方法を開発する出発点を与える。かくして、救出系、例えば、Ｎ、ＰおよびＬタンパク発現クローンまたは全長ゲノムｃＤＮＡ配列を確立するのに利用可能な試薬はない。さらに、有効なミニレプリコン発現に必要な細胞培養条件およびトランスフェクション条件は、ＣＤＶでは未知である。これらの変量の十分な理解は、いかなる組換えウイルスの成功した救出にとっても重要である。また、イヌジステンパーウイルスの一部の株は、組織培養系では十分に増殖しない。修正されたゲノム配列（ジーンバンク受託番号ＡＦ０１４９５３）（出典を示すことにより本明細書の一部をなす）が１９９８年以来利用可能であるという事実にもかかわらず、ミニレプリコンまたはウイルス救出系は報告されていない。
【００１１】
イヌジステンパーウイルスの成功したｃＤＮＡ救出には、多数の分子イベントがトランスフェクション後に起こらなければならない：例えば、１）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによるゲノムまたはアンチゲノムＲＮＡの正確な全長合成およびリボザイム配列による３’末端プロセッシング；２）複製を開始するのに適当なレベルでのウイルスＮ、ＰおよびＬタンパクの合成；３）ゲノムＲＮＡのトランスフェクション的に活性な、かつ複製に適格な核カプシド構造体へのデノボ・パッケージ化；および４）複製を進行させるのに十分なレベルでの新しく形成された核カプシドからのウイルス遺伝子の発現。
【００１２】
本発明は、組換え生産されたイヌジステンパーウイルスの救出方法を提供する。救出されたイヌジステンパーウイルスは、多数の用途、例えば、変異ウイルスの調製ならびに免疫原性および医薬組成物の調製だけでなく、抗体生成、診断、予防および治療への応用、細胞ターゲティングを有する。
【００１３】
（発明の開示）
本発明は、組換えイヌジステンパーウイルスを生産する方法であって、少なくとも１個の宿主細胞中で、（ｉ）イヌジステンパーウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列またはその変異型ポリヌクレオチド配列を含有する単離された核酸分子を含有する転写ベクターと、（ｉｉ）カプシドへの被包、転写および複製に必要なトランス作用タンパク（Ｎ、ＰおよびＬ）をコードするポリヌクレオチド配列を含有するさらに１個に単離された核酸分子を含有する少なくとも１種の発現ベクターとを含有する救出組成物の、媒体中における、該ベクターの同時発現および組換えウイルスの生産を可能にするのに十分な条件下でのトランスフェクションまたは形質転換を行うことからなる方法を提供する。次いで、組換えウイルスは収穫される。
【００１４】
付加的な具体例は、ｍＲＮＡ転写により、イヌジステンパーウイルスの以下のタンパク：Ｎ、Ｐ、Ｍ Ｆ、Ｈ、ＬならびにＰ、ＣおよびＶタンパク（上記のイヌジステンパーウイルスのＰ遺伝子から生成される）のうちの１個もしくはそれ以上、またはその任意の組合せを発現するヌクレオチド配列に関する。関連する具体例は、かかるヌクレオチド配列を含有する核酸分子に関する。本発明の好ましい具体例は、ジーンバンクに寄託されているイヌジステンパーウイルスのヌクレオチド配列（受託番号ＡＦ０１４９５３−配列番号１）を採用する。さらなる具体例は、これらのヌクレオチド、上記イヌジステンパーウイルスタンパクおよびその変異体のアミノ酸配列に関する。
【００１５】
本発明のタンパクおよびヌクレオチド配列は、イヌジステンパーウイルス用の診断、予防および治療の用途を有する。これらの配列は、カプシドへの被包、複製または増幅により、正常なウイルス発達を干渉または混乱させる化合物のスクリーニング系を設計するのに用いることができる。また、ヌクレオチド配列は、外来遺伝子を発現させるのに用いる場合には、イヌジステンパーウイルスおよび／または他の病原体の免疫原性組成物に用いることができる。
【００１６】
好ましい具体例では、感染性の組換えウイルスは、イヌジステンパーウイルスによる感染および／または他の病原体による感染を治療または予防する免疫原性組成物および方法（この方法はかかる組成物を採用する）に用いるために生産される。
【００１７】
別の具体例では、本発明は、弱毒化、感染性または両方である組換えイヌジステンパーウイルスを生成する方法を提供する。組換えウイルスはｃＤＮＡクローンから調製され、従って、ゲノム内に定義された変化を有するウイルスを得ることができる。さらなる具体例は、外来遺伝子を発現するためにここで採用されたゲノム配列を採用する。我々はここにイヌジステンパーウイルスのオンデルシュテプール（Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ）株の全ｃＤＮＡクローンの完全なクローニングおよび配列決定を報告するので、この配列は本発明の具体例でもある。
【００１８】
また、それから形成された組換えウイルスを、外来遺伝子情報、例えば、外来遺伝子を発現するベクターとして、多くの応用、例えば、イヌジステンパー以外の病原体に対する免疫原性または医薬組成物、遺伝子治療および細胞ターゲティングに使用することに関する。
【００１９】
イヌジステンパーウイルスの成功した救出が技術および可能な処理を進歩させるのに非常に重要である説得力のある理由がいくつか存在する。組換えＣＤＶを生成する能力は、改良された免疫原性組成物の開発を容易にする。組換えＣＤＶを生成する能力はＣＤＶベクターの開発を容易にする。加えて、ＣＤＶベースの免疫原性および医薬組成物ならびにＣＤＶベースのウイルスベクターに対するアプローチを研究する利用可能な動物モデルが存在する。天然の宿主、すなわちイヌおよび白イタチは、天然の宿主生物におけるＣＤＶ弱毒化の遺伝的基礎を研究する実験モデルとして用いることができる。組換えＣＤＶの別の利点は、それが神経向性ウイルスであるので、組換えウイルスを生成する能力が神経向性の遺伝的分析を可能にすることである。また、ＣＤＶは急性および持続感染を確立するので、持続感染の遺伝的分析を研究することができる。これに応じて、組換えＣＤＶは、次いで、中枢神経系のヒト脱髄疾患に特徴的な症状と同様の症状を確立するウイルスの能力を細かく分析するのに用いることができる。
【００２０】
特定の具体例は、イヌジステンパーウイルスのオンデルシュテプール（Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ）（１７）の実験室に適合した株を採用する。実験室に適合した株をイヌジステンパーウイルスの救出用の初期モデルとして用いることには、いくつかの利点が存在する。まず、実験室に適合した株は、培養された細胞中でよく増殖する。この特徴は、組換え体の成功した救出を促進することに役立つ。第２に、実験室に適合した株は、ワクチン生産用に適する細胞系、例えば、ヴェロ（Ｖｅｒｏ）細胞中でよく増殖することができる。第３に、実験室に適合した株は、イヌで安全に用いられているワクチンウイルス（オンデルシュテプール（Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ））に密接に関係しており、従って、組換え体ウイルスが弱毒化表現型を有する可能性を与える。第４に、実験室に適合した組換え体ウイルスがさらなる弱毒化を必要とするのであれば、オンデルシュテプール（Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ）株のゲノムは、弱毒化する突然変異を同定するのに容易に特徴付けることができる。第５に、実験室に適合した株は、培養した細胞中で増殖する能力を有する。この様相は、全体的に動物モデル系に頼るよりはむしろインビトロでの必要な初期の研究を可能にする。
【００２１】
ここで詳細に考察される上記の具体例および付加的な具体例は、本発明の目的を表す。
【００２２】
（発明を実施するための形態）
上記したように、本発明は、組換えイヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）を生産する方法に関する。当該分野におけるかかる方法は、「救出」または逆遺伝学方法と呼ばれている。様々な非セグメント化負鎖ウイルスのためのいくつかの救出方法が開示されている（４０、４１、４３、４４、６３、６４、６５、６６、６７、６８および７０を参照）。救出に関するさらなる刊行物としては、麻疹ウイルスおよびパラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）の他のウイルスに関する公開国際特許出願第ＷＯ９７／０６２７０号およびＲＳＶ救出に関する公開国際特許出願第ＷＯ９７／１２０３２号が挙げられる。
【００２３】
本発明のさらなる具体例は、イヌジステンパーウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムまたはそのタンパクをコードするポリヌクレオチド配列ならびにかかる配列の変異体を採用する救出方法および組成物に関する。これらの変異体配列は、好ましくは、高いストリンジェントな条件下で、１個またはそれ以上のイヌジステンパータンパクをコードするポリヌクレオチド、例えば、ジーンバンク受託番号ＡＦ０１４９５３または配列番号１（図６）のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする。高いストリンジェントなサザンハイブリダイゼーション条件を定義する目的では、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９年）の第３８７〜３８９頁（これは出典を示すことにより本明細書の一部をなす）を便宜的に参照することができる。そこでは、第１１節の洗浄工程が高いストリンジェンシーであると考えられる。また、本発明は、ポリヌクレオチド配列がヌクレオチドトリプレットの第３のヌクレオチドの変化により参照配列と異なる保存的変異体に関する。好ましくは、これらの保存的変異体は、イヌジステンパーウイルス参照ポリヌクレオチド配列に対する生物学的な等価物として機能する。
【００２４】
また、本発明は、かかるポリヌクレオチドの１個またはそれ以上を含有する核酸分子に関する。上記したように、所定のヌクレオチド組換え配列は、イヌジステンパーウイルスの変異株のゲノムの１個またはそれ以上を含有しうる。特定の具体例は、配列番号１のヌクレオチド配列または転写された場合にはイヌジステンパータンパク（Ｎ、Ｐ−Ｐ／Ｃ／Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨおよびＬ）の１個またはそれ以上を発現するヌクレオチド配列を採用する。
【００２５】
さらなる具体例は、翻訳された配列がジーンバンクＡＦ０１４９５３中にあり、また、その断片または変異体に対するものである、イヌジステンパーウイルスタンパク（Ｎ、Ｐ−Ｐ／Ｃ／Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨおよびＬ）のアミノ酸配列を採用する。好ましくは、これらの断片および変異体アミノ酸ならびにイヌジステンパーウイルスタンパクを発現する変異体ヌクレオチド配列は生物学的な等価物である。すなわち、それらは、弱毒化、感染性または両方にかかわらず、所望の組換えイヌジステンパーウイルスを得るために実質的に同じタンパクの機能を保持している。かかる変異体アミノ酸配列は、本発明のポリヌクレオチド配列によりコードされる。かかる変異体アミノ酸配列は、イヌジステンパーウイルスタンパクのアミノ酸配列に対して、約７０％〜約８０％、好ましくは約９０％の総類似性を有しうる。変異体ヌクレオチド配列は、転写された場合に、イヌジステンパーウイルスタンパクのアミノ酸配列またはイヌジステンパーウイルスタンパクの変異体アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、約７０％〜約８０％、好ましくは約９０％の総類似性を有しうる。イヌジステンパーウイルスタンパクＮ、Ｐ−Ｐ／Ｃ／Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨおよびＬの例示的なヌクレオチド配列は、翻訳された配列がジーンバンクＡＦ０１４９５３中にあるように記載されている（これらの配列は本明細書の一部をなす）。
【００２６】
生物学的な等価物は、ヌクレオチド配列またはタンパク配列の変異体を生成することにより得ることができる。変異体は、鋳型配列の挿入、置換、欠失または再配列とすることができる。イヌジステンパーポリヌクレオチド配列の変異体は、従来の方法、例えば、ＰＣＲ突然変異誘発法、アミノ酸（アラニン）スクリーニング、および部位特異的突然変異誘発法などにより生成することができる。変異体の表現型は、イヌジステンパーウイルスを救出する能力を妨害する能力を評価すべきであれば、所望の組換えイヌジステンパーウイルスが得られるか、あるいは所望の生物学的効果が得られるかを評価する変異体を用いた救出を行うことにより評価することができる。また、変異体は、所望の使用が免疫原性組成物であれば、抗原性について評価することができる。
【００２７】
アミノ酸変化は、ヌクレオチド配列のコドンを変化させることにより得ればよい。かかる変化は、アミノ酸配列中のあるアミノ酸を他のアミノ酸に置換することに基づいて得ることができることは公知である。例えば、代替アミノ酸の置換により、小さい構造変化をタンパクに与えうる。このことは、イヌジステンパーウイルスの他のタンパクに結合または相互作用する低下した能力をもたらしうる。さらなる変化は、組換えイヌジステンパーウイルスの弱毒化のレベルを変化させうる。
【００２８】
カイト（Ｋｙｔｅ）およびドゥーリトル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）（６９）により考察されたように、ポリペプチドに相互作用する生物学的機能を与える際にアミノ酸のハイドロパシー指数を用いることができる。ここで、いくつかのアミノ酸が同様のハイドロパシー指数を有する他のアミノ酸で置換し、依然として同様の生物学的活性を有しうることが見出された。あるいは、特に生成すべきポリペプチドにおける所望の生物学的機能が免疫原性の具体例における使用を意図される場合には、親水性に基づいて、類似のアミノ酸の置換を行ってもよい。例えば、米国特許第４，５５４，１０１号（これは出典を示すことにより本明細書の一部をなす）を参照。これは、その隣接するアミノ酸の親水性により支配される「タンパク」の最大の局所的な平均親水性がその免疫原性と相関することを述べている。従って、各アミノ酸に指定された親水性に基づいて置換を行うことができることが知られている。
【００２９】
各アミノ酸に値を指定する親水性指数またはハイドロパシー指数のいずれかを用いる際には、これらの値が±２である（±１が特に好ましく、±０．５以内のものが最も好ましい置換である）アミノ酸の置換を導入することが好ましい。
【００３０】
本発明のヌクレオチド配列によりコードされるイヌジステンパーウイルスタンパクの好ましい特徴としては、以下の１個またはそれ以上が挙げられる：（ａ）膜タンパクまたは膜に直接関連するタンパクである；（ｂ）ＳＤＳアクリルアミド（１０％）ゲルを用いてタンパクとして分離することができる；および（ｃ）他の適当なイヌジステンパーウイルスタンパクの存在下で所望の組換えイヌジステンパーウイルスの救出生産に寄与する際にその生物学的機能を保持していること。
【００３１】
上記のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を手中にすれば、次いで、イヌジステンパーウイルスを救出することを進めることができる。イヌジステンパー救出は、救出組成物を用いて、培地中で、少なくとも１個の宿主細胞のトランスフェクションまたは形質転換を行うことにより達成される。救出組成物は、（ｉ）イヌジステンパーウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードする少なくとも１個のポリヌクレオチド配列を含有する転写ベクターと、（ｉｉ）カプシドへの被包、転写および複製に必要なトランス作用タンパクをコードする１個またはそれ以上の単離された核酸分子を含有する少なくとも１種の発現ベクターとを、該ベクターの同時発現および組換えウイルスの生産を可能にするのに十分な条件下で含有する。アンチゲノムとは、後代ゲノムの合成用の鋳型として役立つ単離された正メッセージ方向ポリヌクレオチド配列を意味する。好ましくは、ポリヌクレオチド配列は、転写複製ヌクレオカプシドを生成するのに必要なタンパクをコードする補足配列の正方向転写物とハイブリダイズする可能性を最少限にするために、転写により、複製中間ＲＮＡまたはアンチゲノムに対応するイヌジステンパーゲノムの正方向版が与えられるように構築されるｃＤＮＡである。転写ベクターは、イヌジステンパーウイルス発現において調節の役割を有する遺伝要素または要素類、例えば、プロモーター、イヌジステンパーウイルスＲＮＡに転写される構造遺伝子またはコード配列、および適当な転写開始および終結配列などの集合を含有する作動可能なように連結された転写ユニットからなる。
【００３２】
転写ベクターは、ＲＮＡ複製が可能であるヌクレオカプシドを生産するのに必要であり、また、ＲＮＡ複製および転写の両方に適する後代ヌクレオカプシドを与えるイヌジステンパーウイルスタンパクＮ、ＰおよびＬと同時発現される。Ｎ、ＰおよびＬタンパクは必要なタンパクをコードする１個もしくはそれ以上の発現ベクター（例えば、プラスミド）から生成されるが、これらの必要なタンパクの１個、または１個もしくはそれ以上は、これらのウイルス特異的な遺伝子および遺伝子産物を安定な形質転換体として含有し、発現するように作出された選択的な宿主細胞内で生産されうる。好ましい具体例では、Ｎ、ＰおよびＬタンパクは、発現ベクターから発現される。より好ましくは、Ｎ、ＰおよびＬタンパクは、各々、別々の発現ベクター、例えば、プラスミドなどから発現される。後者の場合、感染または形質転換の間に与えられる各々のタンパクの相対的な量をより容易に制御することができる。付加的なイヌジステンパーウイルスタンパクは、Ｎ、ＰまたはＬを発現するプラスミドから発現されうるが、付加的なタンパクは付加的なプラスミドを用いることにより発現させることができる。
【００３３】
Ｎ、ＰおよびＬの量は、それらの発現に対する宿主細胞の許容度に依存して変化するが、Ｎ、ＰおよびＬを発現するプラスミドは、細胞内でＮ、ＰおよびＬの有効なモル比を達成するように調節される。有効なモル比は、所望の組換えイヌジステンパーウイルスの成功した救出を与えるのに十分なＮ、ＰおよびＬの比率である。これらの比率は、ミニレプリコン（ＣＡＴ／レポーター）アッセイで観察される発現プラスミドの比率に基づいて得ることができる。ある具体例では、トランスフェクトプラスミドｐＣＤＶＮ：ｐＣＤＶＰの分子比は約５：１未満であり、ｐＣＤＶＰ：ｐＣＤＶＬは約１５：１未満である。好ましくは、ｐＣＤＶＮ：ｐＣＤＶＰの分子比は約３：１〜約１：３であり、ｐＣＤＶＰ：ｐＣＤＶＬは約１０：１〜約１：５である。より好ましくは、ｐＣＤＶＮ：ｐＣＤＶＰの比率は約２：１であり、ｐＣＤＶＰ：ｐＣＤＶＬは約８：１〜約１：１である。ｐＣＤＶＮ：ｐＣＤＶＰの最も好ましい比率は約１．２：１であり、ｐＣＤＶＰ：ｐＣＤＶＬは約５：１である。
【００３４】
イヌジステンパーウイルス発現プラスミドｐＣＤＶＮ、ｐＣＤＶＰおよびｐＣＤＶＬと共にゲノムｃＤＮＡプラスミドをトランスフェクトまたは形質転換した後、ゲノムＲＮＡの正確なコピーは、ファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼと、ＲＮＡを開裂して３’末端を形成するベクターにコードされたリボザイム配列との共同作用により生成される。このＲＮＡは、同時トランスフェクトされた発現プラスミドにより最初に供給されたウイルスタンパクにより、パッケージされ、複製される。イヌジステンパーウイルス救出の場合には、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する起源がＮ、ＰおよびＬの起源と共に宿主細胞（または細胞系）に加えられる。イヌジステンパーウイルス救出は、この細胞系を、適当に位置付けられたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有するイヌジステンパーウイルスゲノムｃＤＮＡクローンと、イヌジステンパーウイルスタンパクＮ、ＰおよびＬをコードする発現プラスミドとで同時トランスフェクトすることにより達成される。
【００３５】
イヌジステンパーウイルスの救出には、所望のウイルスゲノムのクローン化されたＤＮＡ等価物が、適当なＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）と、適当な転写ベクター（例えば、細菌プラスミド）に挿入される自己開裂リボザイム配列（例えば、デルタ肝炎リボザイム）との間に配置される。この転写ベクターは、容易に操作可能なＤＮＡ鋳型を与える。このＤＮＡ鋳型から、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ）は、正確なまたはほとんど正確な５’および３’末端を有するウイルスアンチゲノム（またはゲノム）の一本鎖ＲＮＡコピーを転写する。ウイルスゲノムＤＮＡコピーならびに隣接するプロモーターおよびリボザイム配列の配向は、アンチゲノムまたはゲノムＲＮＡ等価物が転写されるかどうかを決定する。
【００３６】
従って、救出方法においては、救出組成物が採用される。救出組成物は、特定の必要性または応用に望まれるように変化させることができる。救出組成物の一例は、（ｉ）イヌジステンパーウイルスのゲノムまたはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含有する単離された核酸分子を含有する転写ベクターと、（ｉｉ）カプシドへの被包、転写および複製に必要なトランス作用タンパクをコードする少なくとも１個の単離された核酸分子を含有する少なくとも１種の発現ベクターを含有する。転写および発現ベクターは、宿主細胞における救出組成物のトランスフェクションがこれらベクターの同時発現および組換えイヌジステンパーウイルスの生産をもたらすように選択される。
【００３７】
上記したように、単離された核酸分子は、イヌジステンパーウイルスの少なくとも１個のゲノムまたはアンチゲノムをコードする配列を含有する。単離された核酸分子は、ゲノム、アンチゲノムまたはその修飾版をコードするポリヌクレオチド配列を含有しうる。ある具体例では、ポリヌクレオチドは、作動可能なように連結されたプロモーター、所望のゲノムまたはアンチゲノム、自己開裂リボザイム配列および転写ターミネーターをコードする。
【００３８】
本発明の好ましい具体例では、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの挿入、再配列、欠失または置換により、野生型イヌジステンパーウイルスから修飾されているゲノムまたはアンチゲノムをコードする。救出から複製するウイルスを得る能力は、天然のゲノムおよびアンチゲノムをコードするポリヌクレオチドがますます修飾されるにつれて減少しうると思われる。ゲノムまたはアンチゲノム配列は、イヌジステンパーウイルスのいかなる株のものからも誘導することができる。また、ポリヌクレオチド配列は、１個またはそれ以上の異種起源由来のゲノムまたはアンチゲノムを組換え的に組み合わせることから形成されたキメラゲノムをコードしうる。
【００３９】
本発明の方法により形成された組換えウイルスは、診断リサーチ研究におけるツールとして、または、治療もしくは予防の免疫原性および医薬組成物として、採用することができるので、ポリヌクレオチドはイヌジステンパーの野生型またはいかなる修飾型もコードしうる。多くの具体例では、ポリヌクレオチドは弱毒化感染性型のイヌジステンパーウイルスをコードする。弱毒化型のウイルスは、１個またはそれ以上の遺伝子のコード領域内、ならびに、１個またはそれ以上の非コード領域内、すなわちゲノムの遺伝子間領域内に起こる突然変異から生じうる。いくつかの弱毒化突然変異は、上でさらに詳細に考察されている。例えば、弱毒化型は、公開国際特許出願第ＷＯ９８／１３５０１号に記載されているように、３’ゲノムプロモーター領域内に少なくとも１個の弱毒化突然変異を有し、かつＲＮＡポリメラーゼ遺伝子内に少なくとも１個の弱毒化突然変異を有するイヌジステンパーウイルスのゲノムまたはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチドとすることができる。
【００４０】
また、ポリヌクレオチドの修飾型は欠損ウイルスをコードしうる。欠損ウイルスは、組換え生産されたウイルスが複製能力を有しないようにＣＤＶをコードするポリヌクレオチドに変化を含有する。突然変異は、ウイルスの複製に必須なタンパクをコードする１個またはそれ以上の遺伝子に起こることが多い。複製を得るためには、欠損ウイルスは、ウイルスに欠損を与えるように変更されているヌクレオチド配列の非修飾型（非変化型）を含有する宿主細胞で補足しなければならない。かかる宿主細胞および細胞系は、補足細胞または補足細胞系と呼ばれる。複製能力を有しないウイルスを発生させるために、欠損細胞は、好ましくは補足細胞系で増殖させる。
【００４１】
また、本発明は、ＣＤＶポリヌクレオチド配列の非感染性改変に関する。ＣＤＶの場合、感染性ウイルスの生産に関与するが、ウイルスゲノムの複製を防止するのに関与しない遺伝子、すなわちヌクレオチド配列を改変させることが望まれうる。これらの改変およびそれらを含有するＣＤＶポリヌクレオチドは、「非感染性改変および非感染性ＣＤＶポリヌクレオチド」と呼ばれる。適当な改変は、複製欠損であろうと非感染性であろうと、意図された用途、例えば、イヌまたはウマの細胞に対してヒトの細胞における複製の欠損などにより変化しうる。
【００４２】
改変された配列は、補足することにより、欠損または非感染性の組換え生産されたウイルスに与えうる。また、かかる補足された組換えウイルスは、医薬用途、例えば、遺伝子治療のための遺伝子送達などや、免疫原性組成物の一部として用いうる。
【００４３】
上記したような所望のイヌジステンパーゲノムおよびアンチゲノムの修飾型をコードするポリヌクレオチド配列に加えて、ポリヌクレオチド配列は、１個もしくはそれ以上の異種遺伝子または所望の異種ヌクレオチド配列と共に所望のゲノムまたはアンチゲノムもコードしうる。異種とは、挿入される遺伝子またはヌクレオチド配列がＣＤＶの受容株に存在しないか、あるいは該遺伝子またはヌクレオチド配列がＣＤＶポリヌクレオチド配列に挿入される様式で正常に存在しないことを意味する。これらの変異体は、選択された異種ヌクレオチド配列を、イヌジステンパーのゲノムまたはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列に導入することにより調製される。所望の異種配列は、イヌジステンパーポリヌクレオチド配列の非本質的または非コード領域内に挿入するか、あるいは非コード領域とコード領域との間に挿入するか、あるいはこのポリヌクレオチド配列のいずれかの末端に挿入することができる。別の具体例では、所望の異種配列は、非コード領域内にまたは非本質的な遺伝子のコード領域に代えて挿入される。
挿入の位置は、イヌジステンパーウイルスの勾配発現特性を利用することができる（２５）。様々なレベルの外来抗原発現は、イヌジステンパーウイルスの天然の３’側から５’側に減少する勾配を利用する様々なゲノム位置に外来遺伝子を挿入することにより、このタイプの救出系で容易に調べられる。
【００４４】
異種ヌクレオチド配列（例えば、遺伝子）は、望まれるように変化させることができる。所望の組換えウイルスの用途に依存して、異種ヌクレオチド配列は、補助因子、サイトカイン（例えば、インターロイキン）、Ｔヘルパーエピトープ、制限マーカー、アジュバント、または異なる微生物病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌または寄生虫）のタンパク、特に保護免疫応答を誘発することができるタンパクをコードしうる。所望のイヌジステンパーウイルスまたはミニレプリコンウイルスベクターを救出する可能性を最大限にするために、補助因子、サイトカイン（例えば、インターロイキン）、Ｔヘルパーエピトープ、制限マーカー、アジュバント、または異なる微生物病原体（例えば、ウイルス、細菌または真菌）の免疫原性部分をコードする異種配列を選択することが望ましい。例えば、いくつかの具体例では、異種遺伝子は、組換えウイルスまたはそれから発現される抗原の予防的または治療的な特性を向上させるように選択されるサイトカイン、例えば、インターロイキン−１２をコードする。
【００４５】
本発明で用いるための抗原は、所望の表示に有用な抗原から選択しうる。抗原は、本発明の組成物に加えられるか、あるいは述べたように、組換え生産されたイヌジステンパーウイルスから異種配列として発現させうる。１種またはそれ以上の病原体、例えば、ウイルス、細菌または真菌に対して有用な抗原を選択しうる。可能性のある病原体目標の詳細なリストを以下に示す。
【００４６】
かかるウイルスの例としては、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス１〜３型、単純ヘルペスウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、カリシウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、アデノウイルス、狂犬病ウイルス、牛疫ウイルス、コロナウイルス、パルボウイルス、伝染性鼻気管炎ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、鳥類伝染性ファブリーキウス嚢病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、マレック病ウイルス、ブタ呼吸器および生殖症候群ウイルス、ウマ動脈炎ウイルスおよび様々な脳炎ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
かかる細菌の例としては、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（分類可能なものと分類可能でないものの両方）、ヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ）、モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、無乳症連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、大便連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア・シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ブタコレラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・アビウム−マイコバクテリウム・イントラセルラーエ複合体（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ−Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、レプトスピラ・インテロガン（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、パスツレラ・ヘモリティカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、アクチノバシラス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびマイコプラズマ・ガリセプチカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
かかる真菌の例としては、アスペルギルス菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓ）、ブラストマイセス菌（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ菌（Ｃａｎｄｉｄａ）、コクシジオイデス菌（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ）、クリプトコッカス菌（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびヒストプラスマ菌（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）が挙げられるが、これらの限定されない。
【００４９】
かかる寄生虫としては、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）、回虫属（Ａｓｃａｒｉｓ）、鞭虫属（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ）、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）、住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、トリコモナス属（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）およびニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
他のタイプの異種配列は、病的な細胞（例えば、癌細胞または腫瘍細胞、アレルゲンアミロイドペプチド、タンパクまたは他の巨大分子成分に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない）を除去または減少させるのに有用な１個またはそれ以上のペプチドまたはポリペプチドをコードしうる。
【００５１】
かかる癌細胞または腫瘍細胞の例としては、前立腺特異的な抗原、癌胎児性抗原、ＭＵＣ−１、Ｈｅｒ２、ＣＡ−１２５およびＭＡＧＥ−３が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
かかるアレルゲンの例としては、米国特許第５，８３０，８７７号および公開国際特許出願第ＷＯ９９／５１２５９号（これらは出典を示すことにより本明細書の一部をなす）に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されず、また、花粉、昆虫の毒、動物のふけ、カビの胞子および薬物（例えば、ペニシリン）が挙げられる。かかる成分は、アレルギー反応の公知の原因であるＩｇＥ抗体の産生を妨害する。
【００５３】
アミロイドペプチドタンパク（ＡＰＰ）は、アルツハイマー病、アミロイドーシスまたはアミロイド生成性疾患と様々に呼ばれる疾患に関与している。β−アミロイドペプチド（Ａβペプチドとも呼ばれる）は、ＡＰＰの４２アミノ酸断片であり、βおよびγセクレターゼ酵素によるＡＰＰのプロセッシングにより生成され、以下の配列を有する：
Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ ＶａｌＰｈｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｍｅｔ ＶａｌＧｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｌａ。
【００５４】
一部の患者では、アミロイド沈着は、凝集したＡβペプチドの形態を取る。驚くべきことに、現在、単離されたＡβペプチドの投与が脊椎動物宿主におけるアミロイド沈着のＡβペプチド成分に対する免疫応答を誘発することが見出されている（公開国際特許出願第ＷＯ９９／２７９４４号を参照）。かかるＡβペプチドは無関係な部分にも結び付けられている。かくして、本発明の異種ヌクレオチド配列は、このＡβペプチド、ならびにＡβペプチドの断片およびＡβペプチドまたはその断片に対する抗体の発現を包含する。Ａβペプチドの１つのかかる断片は、以下の配列を有する２８アミノ酸ペプチドである（米国特許第４，６６６，８２９号に開示されているように）：
Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｌｙｓ
Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ。
【００５５】
異種配列を発現させることにより、組換え形態のイヌジステンパーウイルスは、変化したＲＮＡ、アミノ酸配列、ポリペプチドおよびタンパクの形態で、変化した有効成分の送達のための発現ベクターと同様に、動物またはヒトに用いることができる。組換えイヌジステンパーウイルスは、ウイルス転写プロモーターの制御下で、１個またはそれ以上の異種遺伝子（および３、４または５個の遺伝子さえ）を発現するように用いることができる。別の具体例では、付加的な異種核酸配列は、単一の特別な転写単位として発現される７〜１０ｋｂまでの単一配列でありうる。好ましくは、６つの規則（参考文献６）に従う。いくつかの好ましい具体例では、この配列は４〜６ｋｂまででありうる。付加的なモノシストロニック転写単位およびポリシストロニック転写単位の形態で異種遺伝子情報を挿入してもよい。付加的なモノシストロニック転写単位およびポリシストロニック転写単位の使用は、より多くの遺伝子情報の挿入を可能にするはずである。好ましい具体例では、異種ヌクレオチド配列は、イヌジステンパーウイルスゲノム配列内に、１個またはそれ以上のリボソーム導入部位を含有しうる少なくとも１個のポリシストロニック転写単位として挿入される。
【００５６】
あるいは好ましい具体例では、異種ヌクレオチド配列は、ポリタンパクおよび該ポリタンパクを開裂させてポリタンパクの個々のポリペプチドを生成する十分な数のプロテアーゼをコードする。
【００５７】
異種ヌクレオチド配列は、イヌジステンパーウイルスの感染の正常な経路を利用するように選択することができる。イヌジステンパーウイルスは、気道を通じて体内に侵入し、様々な組織および細胞、例えば、唾液腺、リンパ系組織、乳腺、精巣および脳細胞にさえ感染することができる。また、異種遺伝子は遺伝子治療または特定細胞のターゲティングに用いることができる作用物質を提供するのに用いてもよい。イヌジステンパー感染の正常な経路の間に曝露される正常な細胞を単に利用する代わりとして、異種遺伝子または断片は、異なる病原体由来の別のタンパクまたはアミノ酸配列をコードしていてもよい。この異なる病原体は、組換えイヌジステンパーウイルスの一部として採用した場合には、組換えイヌジステンパーウイルスをイヌジステンパーウイルスの正常な経路にない細胞または組織に向かわせる。このようにして、組換えイヌジステンパーウイルスは、多種多様な外来遺伝子の送達用および従って多数のタイプの抗原の送達用のベクターになる。我々の例は、組換えイヌジステンパーウイルスが発現ベクターと用いることができることを示している。組換えイヌジステンパーウイルス発現ベクターは、１種またはそれ以上の抗原を送達するのに用いうる。様々な病原菌由来の抗原（１、７）を所望の応用に選択しうる。以下の病原体のいずれかに対して有用な抗原を選択することができる。
【００５８】
2004501646.tif 000003
【００５９】
2004501646.tif 000004
【００６０】
好ましい具体例では、獣医学への応用のための抗原は、狂犬病ウイルス、イヌパルボウイルス（重篤な胃腸病）、イヌパルボウイルス２（重篤な胃腸炎）、イヌコロナウイルス（胃腸炎）、イヌアデノウイルス１型（感染性肝炎）およびイヌアデノウイルス２型（犬小屋咳）、イヌパラインフルエンザウイルス（気管気管支炎、犬小屋咳）、および多数の他の動物の病原体に対して用いるために選択される。
【００６１】
我々の研究の結果は、ＣＤＶの分子遺伝子操作が実行可能であること、および将来の弱毒化ＣＤＶ株およびＣＤＶ発現ベクターの合理的な設計がｃＤＮＡ救出技術を用いてアプローチ可能であることを示している。
【００６２】
ｒＣＤＶの救出は、イヌジステンパーウイルスに対するより安全で生弱毒化免疫原性組成物の開発を遂行する１つの道を提供する。さらなる弱毒化ウイルスは、それが犬の免疫化に有効なままであり、かつ大型のネコ科動物、小型の肉食動物およびアシカ科・アザラシ科の動物などの他の動物に用いるのに有効であるならば、理想的である。弱毒化イヌジステンパーウイルスを採用する具体例の場合、従来の手段を用いて、例えば、化学的な突然変異誘発物質が加えられている細胞培養物中におけるウイルス増殖の間に化学的突然変異誘発などの弱毒化突然変異を導入した後、温度感受性および／または低温適応性の突然変異体を選択するために最適状態に及ばない温度における継代に付されたウイルスを選択し、細胞培養物中に小さいプラークを生成する突然変異ウイルスを同定し、かつ宿主範囲の突然変異について選択するために異種宿主によって継代することにより、修飾されたウイルスを生成する。弱毒化突然変異を導入する別の手段は、特定部位の突然変異誘発を用いた所定の突然変異を行わせることからなる。１個またはそれ以上の突然変異を導入しうる。次いで、これらのウイルスは、動物モデルにおけるそれらの生物学的活性の弱毒化についてスクリーニングされる。弱毒化イヌジステンパーウイルスは、弱毒化突然変異の部位を位置決定するためにヌクレオチドの配列決定に付す。
【００６３】
この目的を達成する別のアプローチは、合理的なワクチン設計法を用いることである。イヌジステンパーウイルスで試験することができる弱毒化アミノ酸置換およびシス作用シグナル変化を同定することに役立つ数多くの研究が存在する。例えば、ヒトパラインフルエンザウイルス３型および呼吸器合胞体ウイルスの組換え株の研究は、ＣＤＶにおいて良好な相関を有しうる数多くの弱毒化突然変異を同定している。これらとしては、Ｌタンパクにおけるアミノ酸置換（４９、５０、６０）、ならびに、リーダーのシス作用配列における、およびＧＥ／ＧＳシグナルにおける突然変異（２１、５０、５９）が挙げられる。加えて、麻疹ウイルスワクチンのゲノム配列が調べられ、野生型の単離物と比較されている。ある程度の弱毒化を示す、ＣまたはＶタンパク発現の欠損したウイルスの例が存在する（１２、１３、１５、２２、３１、３７、５３、５６）。具体的には、ＣＤＶゲノムに、モノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の別の非セグメント化負方向一本鎖ＲＮＡウイルス、好ましくはパラミクソウイルス科（Ｆａｍｉｌｙ Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ＰＩＶ、ＲＳＶ、流行性耳下腺炎および麻疹）のウイルスのコードまたは非コード領域における弱毒化突然変異に対応する１個またはそれ以上の突然変異を挿入することができる。他のウイルスに対する様々な突然変異は公知であり、生成され続けている。モノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）のウイルスに対する弱毒化として同定されている突然変異としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：麻疹ウイルス３’ゲノムプロモーター＋ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（ＷＯ９８／１３５０１）、麻疹ウイルスＮ、ＰおよびＣ遺伝子、ならびにＦ遺伝子末端シグナル（ＷＯ９９／４９０１７）、呼吸器合胞体ウイルス３’ゲノムプロモーター＋ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（ＷＯ９８／１３５０１）、呼吸器合胞体ウイルスＭ遺伝子末端シグナル（ＷＯ９９／４９０１７）、呼吸器合胞体ウイルスＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（米国特許第５，９９３，８２４号）、呼吸器合胞体ウイルスＮおよびＦ遺伝子（ＷＯ００／６１６１１）およびパラインフルエンザウイルス３型３’ゲノムプロモーター＋ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（ＷＯ９８／１３５０１）。いったん突然変異がＣＤＶゲノムで行われたら、組換え生産された組換えウイルスに本発明の方法を用いることができる。さらに、遺伝子不活性化アプローチが有用でありうる。最後に、免疫原性および医薬組成物に用いるためのイヌジステンパーウイルスのより安全なより弱毒化された株を開発するために、新規な遺伝子シャッフリングアプローチ（３、５８）を利用することが可能でありうる。
【００６４】
救出された組換えイヌジステンパーウイウスは、まずインビトロ手段、例えば、配列の同定、配列タグの確認、および抗体ベースのアッセイにより、その所望の表現型（温度感受性、低温適応性、プラーク形態学、ならびに転写および複製の弱化）について試験される。救出されたウイルスの弱毒化表現型が存在すれば、適当な動物モデルまたは標的動物を用いて、攻撃誘発実験を行うことができる。これらの動物は、まず、弱毒化され組換え生産されたウイルスで免疫化され、次いで、このウイルスの野生型で攻撃誘発される。組換え生産されたＣＤＶの弱毒化のレベルは、弱毒化ウイルスの毒性を野生型ＣＤＶまたは他の標準（例えば、許容される弱毒化形態のＣＤＶ）のそれと比較することにより確立される。好ましくは、この比較は、弱毒化組換えウイルスが野生型に対する毒性の実質的な低下を示すことを確立する。弱毒化組換えウイルスの毒性のレベルは、ヒトを治療するのに、または、選択された部類の非ヒト動物を治療するのに組換えウイルスを用いることを可能にするに十分であるべきである。
【００６５】
発現ベクターの選択、ならびにカプシドへの被包、転写および複製に必要なトランス作用タンパクをコードする単離された核酸分子は、所望のウイルスの選択に依存して変化させることができる。発現ベクターは、宿主細胞における転写ベクターとのそれらの同時発現と、選択された条件下における組換えウイルスの生産とを可能にするために調製される。
【００６６】
イヌジステンパー救出は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼがウイルスゲノムｃＤＮＡ含有転写ベクターからのアンチゲノム（またはゲノム）一本鎖ＲＮＡの転写を導くために存在する適当な細胞環境を包含する。同時転写的またはその直後のいずれかに、このウイルスアンチゲノム（またはゲノム）ＲＮＡ転写物は、核カプシドタンパクにより機能性鋳型にカプシド被包され、必要なウイルス特異的トランス作用タンパクをコードする同時トランスフェクトされた発現プラスミドから同時に生産された必要なポリメラーゼ成分により拘束される。これらのイベントおよび過程は、ウイルスｍＲＮＡの予め必要な転写、新しいゲノムの複製および増幅、ならびにそれにより、新規なウイルス後代の生産、すなわち救出に至る。
【００６７】
本発明の救出方法では、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、組換えワクシニアウイルスにより与えることができる。しかし、この系は、救出されたウイルスがワクシニアウイルスから、物理的もしくは生化学的な手段により、または、ポックスウイルスにとっては良好な宿主ではない細胞または組織で繰り返し継代することにより、分離される必要がある。この必要条件は、哺乳動物細胞中で増殖しないワクシニアウイルスの宿主細胞限定株（例えば、ＭＶＡ−Ｔ７）として用いることにより回避される。バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する２つの組換えＭＶＡが報告されている。ＭＶＡ／Ｔ７組換えウイルスは、７．５Ｋの弱い早期／後期プロモーター（サター（Ｓｕｔｔｅｒ）ら、１９９５年）または１１Ｋの強い後期プロモーター（７４）のいずれかの調節下にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの１つの組み込まれたコピーを含有する。
【００６８】
救出組成物のトランスフェクションに採用される宿主細胞または細胞系は、救出用に選択された条件に基づいて幅広く変化させることができる。宿主細胞は、所望の組換えイヌジステンパーウイルスを生産するように救出組成物のベクターの同時発現を可能にする条件下で培養される。かかる宿主細胞は、多種多様な細胞、例えば、真核細胞、好ましくは脊椎動物細胞などから選択することができる。鳥類細胞を用いてもよいが、所望の宿主細胞が他の細胞から誘導することができるなら、ヒト細胞（例えば、ヒト胎児腎臓細胞）さえ用いてもよい。宿主細胞の例は、ヒト２９３細胞、Ａ５４９細胞（肺癌）およびＨｅｐ２細胞（子宮頸癌）である。ヴェロ（Ｖｅｒｏ）細胞（サル腎臓細胞）、ならびに多くの他のタイプの細胞を宿主細胞として用いることもできる。適当な宿主細胞の他の例は、（１）ヒト二倍体一次細胞系：例えば、ＷＩ−３８およびＭＲＣ５細胞；（２）サル二倍体細胞系：例えば、ＦＲｈＬ−赤毛猿胎児肺細胞；（３）準一次連続継代細胞系：例えば、ＡＧＭＫ−アフリカサバンナモンキー腎臓細胞；（４）他の可能性のある細胞系、例えば、ＣＨＯ、ＭＤＣＫ（マディン（Ｍａｄｉｎ）−ダービー（Ｄａｒｂｙ）イヌ腎臓）、ＤＫ（イヌ腎臓）および一次ひな鳥胎児線維芽細胞（ＣＥＦ）。いくつかの真核細胞系はウイルスを増殖させるのに他のものより適しているが、いくつかの細胞系はいくつかのウイルスに対して全く働かない。生存可能なウイルスの救出が容易に検出しうるために、検出可能な細胞変性効果を与える細胞系が採用される。イヌジステンパーの場合、トランスフェクトされた細胞は、ウイルスが急速にヴェロ（Ｖｅｒｏ）細胞に広がり、容易に検出可能なプラークを形成するので、ヴェロ（Ｖｅｒｏ）細胞と同時培養することができる。一般的には、選択されたウイルスの増殖に許容性の宿主細胞が採用される。
【００６９】
別の好ましい具体例では、細胞によるＤＮＡ摂取を増大させるために、トランスフェクション容易化試薬を加えてもよい。これらの試薬の多くは当該分野で公知である。リポフェクトエース（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ）（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ゲーサーズバーグ）およびエフェクティーン（ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ）（キアジェン（Ｇｉａｇｅｎ）、カリフォルニア州バレンシア）が一般的な例である。リポフェクトエースおよびエフェクティーンは、いずれもカチオン性脂質である。それらは、いずれもＤＮＡをコートし、細胞によるＤＮＡ摂取を増強する。リポフェクトエースはＤＮＡを取り囲むリポソームを形成するのに対し、エフェクティーンはＤＮＡをコートするがリポソームを形成しない。
【００７０】
転写ベクターおよび発現ベクターは、宿主細胞での発現用に設計されたプラスミドベクターとすることができる。カプシドへの被包、転写および複製に必要なトランス作用タンパクをコードする少なくとも１種の単離された核酸分子を含有する発現ベクターは、同じ発現ベクターまたは少なくとも２つの異なるベクターからこれらのタンパクを発現しうる。これらのベクターは一般的には基本的な救出方法から公知であり、それらは本発明の改良された方法に用いるのに変更する必要はない。
【００７１】
本発明の方法では、救出用に標準的な温度範囲（約３２℃〜約３７℃）を採用することができる；しかし、高温での救出は、組換えＲＮＡウイルスの回収を向上させることが示されている。高温は、熱ショック温度と呼ばれている（国際特許公開番号第ＷＯ９９／６３０６４、１９９９年１２月９日付で公開；これは出典を示すことにより本明細書の一部をなす）。効果的な熱ショック温度は、組換えウイルスの回収のレベルが向上する組換えウイルスの救出を行うのに提案される標準的な温度より高い温度である。温度範囲の例示的なリストは以下のとおりである：３８℃〜約４７℃；約４２℃〜約４６℃がより好ましい。あるいは、４３℃、４４℃および４５℃の熱ショック温度が特に好ましい。
【００７２】
所望の組換えイヌジステンパーウイルスの回収のレベルを決定するために数多くの手段が採用される。ここにおける実施例に記載されているように、組換えウイルスの救出用の条件をモニターし最適化するために、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子が用いられる。レポーター遺伝子の対応する活性は、ベースラインおよび組換えウイルスの発現のレベルを確立する。他の方法は、得られた組換えウイルスのプラームの数を検出すること、および、救出されたウイルスの産生を配列決定により確認することを包含する。
【００７３】
好ましい具体例では、宿主細胞中に存在するトランスフェクトされた救出組成物はプラーク発現工程（すなわち、増幅工程）に付される。トランスフェクトされた救出組成物は、少なくとも１層のプラーク拡大細胞（ＰＥ細胞）上に移される。トランスフェクトされた細胞から組換えウイルスの回収は、イヌジステンパーウイルスまたは組換えイヌジステンパーウイルスが増強された増殖を示すプラーク拡大細胞を選択することにより向上する。好ましくは、救出組成物を含有するトランスフェクトされた細胞は、単層の実質的に密集したＰＥ細胞上に移される。救出技術（例えば、プラーク拡大）の様々な変法もまた、国際特許公開第ＷＯ９９／６３０６４号（１９９９年１２月９日付で公開）に記載されている。
【００７４】
加えて、３７℃よりむしろ３０℃〜３５℃の温度で細胞をインキュベートすることは、ミニレプリコン発現を増大させることが知られている（図３Ｂ参照）。この観察は低温でイヌジステンパーウイルス救出実験を行う実用的価値を有する。より低いインキュベーション温度はミニレプリコン活性を増大させるが、高温での一時的なインキュベーションはＣＤＶミニレプリコン活性を増大させたことが見出されている。ミニレプリコン活性に対する熱ショックの正の効果を考慮すると、熱ショック工程は、好ましく本発明の我々のイヌジステンパーウイルス救出プロトコルに組み込まれる。
【００７５】
好ましくは、救出方法はトランスフェクションの方法に対するリン酸カルシウム技術を採用する。リン酸カルシウム法は、一般的にはリポソーム法の約２倍だけトランスフェクション実験におけるＣＤＶ陽性のウェルの数を上昇させる（データは示さない）。このことは非常に弱毒化された株を単離する場合に重要となることができる。以下のことにとらわれずに、リン酸カルシウムは、リポソーム試薬より細胞膜に与える損傷が少なく、より健全な細胞膜は比較的な希な救出されたウイルスの出芽を促進する。また、リン酸カルシウム沈降法は、同じ細胞に多数の異なるプラスミドを導入するのに多少より効果的であることは事実であり得るが、実際には、ゲノムｃＤＮＡと共にＮ、ＰおよびＬ発現プラスミドの完全な組を含有するより多くの細胞を生成する。
【００７６】
好ましいウイルス救出方法は、上記の技術、例えば、プラーク発現、熱ショック、カルシウム沈降技術など（１０、３１、４０、４２）のうちのいくつか、ならびにいくつかの重要な変法、例えば、低温インキュベーションなどを包含する。
【００７７】
技術の改変された組合せは、一時的アッセイにおける遺伝子発現のレベルに影響を与える様々な変数の迅速な評価を可能にするミニレプリコンを用いることにより、救出方法を最適化するために試験することができる。例えば、救出用の様々な成分、例えば、各発現ベクター（Ｎ、ＰおよびＬ）、ならびにレプリコンベクターにおけるシス作用シグナルなどは、迅速に試験して、救出系内におけるそれらの活性を評価することができる。また、最大のミニレプリコン発現に必要とされる最適な量の発現ベクターを決定するためにミニレプリコン系を用いることもできる（図２および３を参照；データを示していない）。これらの最適化工程の各々はミニレプリコン発現の有益な増大をもたらし、一緒になって、それらは救出に有意な効果を有しうる。最適な変数および技術の２個またはそれ以上を組み合わせることにより、成功裏に救出されたウイルスの割合を実質的に向上させることができる。成功率はウェルプレートあたりの陽性ウェルの数を求めることにより測定することができる。成功率は少なくとも５０％であり、６０％より高くさえある。さらに好ましい具体例では、成功率は少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％である。これは、救出用の公開技術と比べた場合、実質的な向上である（例えば、公開国際特許出願第ＷＯ９９／６３０６４号を参照）。
【００７８】
イヌジステンパーウイルスの場合、最適化された救出法は、改変したプロトコルを用いて、トランスフェクトされた６ウェルプレートから４〜６個のＣＤＶ陽性ウェルを常に生成する。対照的に、免疫原性組成物が形成した候補株、特に望ましい弱毒化突然変異を含有するものは、非常に乏しく複製し、および／または救出するのが困難である。増大した救出効率のために選択された技術は、非セグメント化負方向一本鎖ＲＮＡウイルスの救出に適用しうる。非セグメント化負方向一本鎖ＲＮＡウイルスの現在の分類学的な分類を各々の例と共に以下に示す。
【００７９】
モノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）に属する非セグメント化負方向一本鎖ＲＮＡウイルスの分類
パラミクソウイルス科（Ｆａｍｉｌｙ Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）
パラミクソウイルス亜科（Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）
レスピロウイルス属（Ｇｅｎｕｓ Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）（以前はパラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）として知られていた）
センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ）（マウスパラインフルエンザウイルス１型（ｍｏｕｓｅ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １））
ヒトパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）１型および３型（Ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ （ＰＩＶ） ｔｙｐｅｓ １ ａｎｄ ３
ウシパラインフルエンザウイルス（ＢＰＶ）３型（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ （ＢＰＶ） ｔｙｐｅ ３）
ルブラウイルス属（Ｇｅｎｕｓ Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ）
シミアンウイルス５（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ５）（ＳＶ５）（イヌパラインフルエンザウイルス２型（Ｃａｎｉｎｅ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２））
流行性耳下腺炎ウイルス（Ｍｕｍｐｓ ｖｉｒｕｓ）
ニューカッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）（ＮＤＶ））（鳥類パラミクソウイルス１（ａｖｉａｎ Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ １））
ヒトパラインフルエンザウイルス（Ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）ＰＩＶ−型２、４ａおよび４ｂ（ＰＩＶ−ｔｙｐｅｓ ２，４ａ ａｎｄ ４ｂ）
モービリウイルス属（Ｇｅｎｕｓ Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）
麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ）（ＭＶ）
イルカモービリウイルス（Ｄｏｌｐｈｉｎ Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）
イヌジステンパーウイルス（Ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ）（ＣＤＶ）
小反芻獣疫ウイルス（Ｐｅｓｔｅ−ｄｅｓ−ｐｅｔｉｔｓ−ｒｕｍｉｎａｎｔｓ ｖｉｒｕｓ）
アザラシジステンパーウイルス（Ｐｈｏｃｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ）
牛疫ウイルス（Ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）
ニュウモウイルス亜科（Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）
ニュウモウイルス属（Ｇｅｎｕｓ Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（Ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）
ウシ呼吸器合胞体ウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）
マウスの肺炎ウイルス（Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｏｆ ｍｉｃｅ）
七面鳥鼻気管炎ウイルス（Ｔｕｒｋｅｙ ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）
ラブドウイルス科（Ｆａｍｉｌｙ Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）
リッサウイルス属（Ｇｅｎｕｓ Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ）
狂犬病ウイルス（Ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ）
ベシクロウイルス属（Ｇｅｎｕｓ Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）
水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＶＳＶ）
エファメロウイルス属（Ｇｅｎｕｓ Ｅｐｈｅｍｅｒｏｖｉｒｕｓ）
ウシ流行熱ウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ ｅｐｈｅｍｅｒａｌ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）
フィロウイルス科（Ｆａｍｉｌｙ Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）
フィロウイルス属（Ｇｅｎｕｓ Ｆｉｌｏｖｉｒｕｓ）
マールブルグウイルス（Ｍａｒｂｕｒｇ ｖｉｒｕｓ）
【００８０】
上記ウイルスのいずれかに対するウイルス救出の効率を向上するには、組換えウイルスを救出することを可能にする量を生成するために、Ｎ、ＰおよびＬ発現ベクターの量ならびに全長ｃＤＮＡのミニレプリコンの量を変化させる。その後、増大した救出効率のための以下の工程および／または技術の２つまたはそれ以上を利用することができる：（１）トランスフェクションについて細胞タイプ（好ましくは、ヴェロ（Ｖｅｒｏ）細胞、Ｈｅｐ２またはＡ５４９細胞）を選択すること；（２）トランスフェクション試薬（好ましくは、リン酸カルシウム試薬を用いて）を選択すること；プラーク発現工程を行うために最適な細胞タイプを選択すること；および（４）トランスフェクションを向上させるものについて細胞タイプを選択すること。加えて、救出効率は、以下の工程および／または技術の１つまたはそれ以上を採用することにより、さらに向上される：（１）所定の細胞タイプおよび救出系に対するインキュベーション温度を変更すること；（２）熱ショック適用のタイミングを変更すること（好ましくは、トランスフェクションの開始してから約２〜約４時間後に熱ショックを適応する）；（３）熱ショックの温度を変更すること（好ましくは、約４２〜約４４℃）；および（４）熱ショックの期間を変更すること（約２〜約３時間が好ましい）。
【００８１】
また、救出効率のさらなる増大は、適当量のＴ７ポリメラーゼ起源、例えば、ＭＶＡ／Ｔ７または組換えワクシニアウイルスを選択することにより、および／または細胞がトランスフェクションにおいてトランスフェクション試薬およびＤＮＡに曝露される時間の長さを調節することにより得られる。
【００８２】
本発明の方法から調製される組換えイヌジステンパーウイルスは、診断、予防および治療の用途に採用される。好ましくは、本発明の方法から調製される組換えウイルスは弱毒化される。弱毒化された組換えウイルスは、ヒトおよび動物宿主に感染する野生型ウイルスに比べて毒性の実質的な減少を示す。弱毒化の程度は、感染の症状が大抵の個体に生じないようなものであるが、このウイルスは感染性であるのに十分な複製能力を保持し、所望の免疫原性組成物に対して所望の免疫応答プロファイルを誘発する。弱毒化組換えウイルスは、単独で用いることができるし、疾患の予防または改善における免疫原性組成物として、医薬品、抗原、免疫化剤またはアジュバントと共に用いることができる。これらの活性剤は、従来の手段により、すなわち希釈剤または医薬上許容される担体を用いることにより、製剤化し、送達することができる。
【００８３】
本発明のさらなる具体例では、弱毒化されていないまたは弱毒化された組換え的に生産されたイヌジステンパーウイルスが、（ｉ）少なくとも１種の組換え的に生産されたイヌジステンパーウイルスおよび（ｉｉ）医薬上許容される緩衝剤または希釈剤、アジュバントまたは担体の少なくとも１種とを含有する免疫原性組成物に採用される。好ましくは、これらの組成物は、イヌジステンパーの感染を予防および／または改善する際に免疫原性組成物として治療および予防用途を有する。かかる用途では、免疫学的に有効量の少なくとも１種の本発明の組換えイヌジステンパーウイルスが、通常のイヌジステンパー感染の経過において実質的な減少を引き起こすような量で採用される。
【００８４】
かかる免疫原性組成物の製剤は、この分野の当業者に公知である。本発明の免疫原性組成物は、付加的な抗原性成分（例えば、ポリペプチドもしくはその断片または抗原もしくはその断片をコードする核酸）を含有し、好ましくは医薬上許容される担体を含有する。適当な医薬上許容される担体および／または希釈剤としては、ありとあらゆる従来の溶剤、分散媒、充填剤、固形担体、水溶液剤、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張性および吸収遅延剤などが挙げられる。「医薬上許容される担体」という用語は、それを投与される患者にアレルギー反応または他の悪影響を起こさない担体を意味する。適当な医薬上許容される担体としては、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの１種またはそれ以上、ならびにその組合せが挙げられる。医薬上許容される担体は、さらに、湿潤剤または乳化剤などの補助物質、抗原の保存寿命または有効性を高める保存剤または緩衝剤などを少量含有しうる。かかる媒体および作用物質の医薬上活性な物質への使用は、当該分野で公知である。従来の媒体または作用物質が有効成分と不適合である限りを除いて、本発明の免疫原性組成物におけるその使用が考えられる。
【００８５】
かかる免疫原性組成物の投与は、従来の有効な形態、例えば、鼻腔内、非経口的、経口的、あるいは鼻腔内、口腔内、眼、肺、膣などの粘膜表面または直腸表面に、例えば、エアロゾルスプレーなどにより塗布される局所的などによればよい。好ましい投与の手段は非経口的または鼻腔内である。
【００８６】
経口製剤は、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常採用される賦形剤を含有する。
【００８７】
本発明の免疫原性組成物はアジュバントを含有することができる。アジュバントとしては、水酸化アルミニウム；リン酸アルミニウム；スティムロン（ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭ）ＱＳ−２１（アクイラ・バイオファーマシューティカルズ，インク（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州フレーミングハム）；ＭＰＬＴＭ（３−Ｏ−デアシル化モノホスホリル脂質Ａ；ＲＩＢＩイムノケム・リサーチ（ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、モンタナ州ハミルトン）、ＩＬ−１２（ジェネティック・インスティチュート（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、マサチューセッツ州ケンブリッジ）；Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）；Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ノル−ＭＤＰと呼ばれる）；Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）；およびコレラ毒素などが挙げられるが、これらに限定されない。用いてもよいその他のものは、コレラ毒素の非毒性誘導体、例えば、そのＢサブユニット（例えば、アミノ酸２９位のグルタミン酸が別のアミノ酸、好ましくは、ヒスチジンに置き換わっている；公開特許出願第ＷＯ００／１８４３４号（これは出典を示すことにより本明細書の一部をなす）により）、および／または非イヌジステンパーポリペプチドとコレラ毒素もしくはそのＢサブユニット、プロコレラゲノイド（ｐｒｏｃｈｏｌｅｒａｇｅｎｏｉｄ）、真菌多糖類との複合体または遺伝子操作された融合である。【００８８】
本発明の組換え的に生産された弱毒化イヌジステンパーウイルスは、免疫原性組成物における単独の活性な免疫原として投与すればよい。あるいは、しかし、免疫原性組成物は、他の活性な免疫原、例えば、上記のような他の病原性種に対する他の免疫学的に活性な抗原を含有しうる。他の免疫学的に活性な抗原は、複製する病原体であっても、複製しない病原体であってもよい。他の免疫学的に活性な抗原は、様々な感染性病原体に対するものでありうる（１、７）。免疫原性組成物は、様々な動物、例えば、コンパニオン・アニマル、例えば、イヌ（犬）およびネコ（猫）、およびまた家畜、例えば、ウシ、ブタおよびウマなどを治療するのに用いてもよい。
【００８９】
本発明の重要な態様の１つは、哺乳動物の免疫応答を誘発する方法であって、該哺乳動物に本発明の免疫原性組成物を投与する工程を包含する方法に関する。免疫原性組成物は、治療した動物またはヒトにおいて免疫原性であり、かかる組成物に含有される免疫学的に有効量のポリペプチドがイヌジステンパー感染に対して所望の免疫応答をもたらすような組成物である。好ましい具体例は、動物におけるイヌジステンパー感染の治療、例えば、改善、または予防のための方法であって、動物に免疫学的に有効量の抗原性組成物を投与することからなる方法に関する。投与量は、個体の特定の条件に依存して変化させることができる。この量は、当業者に公知の手段により、通常の試験で決定することができる。動物およびヒトさえ、本発明の免疫原性組成物で治療することができる。確かに、多種多様の動物を治療しうる。治療用の動物としては、ペットのイヌなどのコンパニオン・アニマル、ならびに野生動物、例えば、キツネ、オオカミおよびコヨーテなどが挙げられる。レッサーパンダさえ、イヌジステンパーウイルスによる感染に感受性を有すると報告されているので、含まれる領域または環境における動物、例えば、動物園またはサファリパークにおける動物を治療するかもしれない。イヌジステンパーウイルスの発生は、アザラシ、ならびにミンク、白イタチおよびアライグマなどの肉食動物について報告されている。これらは、いずれも上記した治療の標的動物でありうる。
【００９０】
以下の実施例は、本発明のいくつかの具体例を例示するために含められている。しかし、当業者は、本開示内容を考慮して、開示されている特定の具体例で多くの変更を行うことができ、かつ依然として本発明の精神および範囲を逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることを十分に理解すべきである。
【００９１】
実施例
実施例１
材料および方法
細胞およびウイルス。ＨＥｐ２、Ａ５４９、ヴェロ（Ｖｅｒｏ）、Ｂ９５−８およびニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補足したダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の修正イーグル（Ｅａｇｌｅ）培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。ＨｅＬａ懸濁細胞は、５％ＦＢＳを補足した修正最少必須培地（ＳＭＥＭ）中で増殖させた。実験室に適合したオンデルシュテプール（Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ）ＣＤＶ株（１７）は、以前報告されたように（４６）、ＨｅＬａ細胞中で増殖させた。実験室に適合した第２のオンデルシュテプール（Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ）株は、チューリッヒ大学のマーチン・ビレター（Ｍａｒｔｉｎ Ｂｉｌｌｅｔｅｒ）博士から提供され、Ｂ９５−８細胞中で増殖させた。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現するように設計された組換え弱毒化ワクシニアウイルス株ＭＶＡ／Ｔ７（国立衛生研究所（メリーランド州ベセズダ）のビー・モス（Ｂ． Ｍｏｓｓ）博士から得た；ワイアット（Ｗｙａｔｔ）ら， １９９５年を参照；参考文献６１）は、ＣＥＦ細胞中で増殖させた。ＭＶＡ／Ｔ７の原株は、ＣＥＦ上で力価測定した。麻疹ウイルス（ＭＶ）の実験室に適合したエドモンズトン（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）株は、ＨｅＬａ懸濁細胞中で増殖させた（５５）。
【００９２】
組換えＤＮＡ
分子クローニング法を標準的なプロトコル（２、２６、７１）に従って行った。
１Ａ−全長ＣＤＶ ｃＤＮＡクローン
ゲノムに見出される都合のよい制限部位を活用する６個のＲＴ／ＰＣＲ断片から全長ＣＤＶ ｃＤＮＡクローンを組み立てた（図１Ａ）。ウイルスｃＤＮＡは正ゲノム鎖の５’末端に融合したＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターでクローン化され、３’末端には、デルタ型ウイルスリボザイムおよび２つのＴ７転写ターミネーターが隣接する。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、転写物の有意な部分が正ゲノム鎖における最初のＡ残基から開始するように、好ましいＴ７ポリメラーゼ転写開始部位を通常与える３つのＧ残基を除去することにより、３’末端で切り取った。
【００９３】
ＣＤＶ全長ゲノムクローンのクローニングを容易にするために、独特のＮｏｔＩおよびＮａｒＩ部位を含有するプラスミドベクターを調製した。ＣＤＶゲノムには、ＮｏｔＩおよびＮａｒＩ制限部位が存在せず、それらをベクター骨格に使用するための都合のよい部位とする。この修飾されたベクターＤＮＡはＰＣＲにより生成された。プライマーは、以前に報告された麻疹ウイルスミニレプリコンプラスミド（図１、ｐ８０２、参考文献４５）からベクター骨格を増幅するように設計した。これらのプライマーは、ベクター骨格の増幅を導き、麻疹ウイルスミニレプリコン配列を排除した。増幅ＤＮＡは、リボザイム配列に位置するＮａｒＩ部位を維持し、ＮｏｔＩ部位を生成した（図１ＡのＮｏｔＩおよびＮａｒＩ部位を参照）。また、いったん増幅ＤＮＡを連結して細菌形質転換用の増幅ベクター骨格を環化したら、プライマーはＮｏｔＩおよびＮａｒＩ部位の間にポリリンカーを生成するように設計された５’伸長部分を含有した。ポリリンカーは、ウイルスゲノムから増幅された断片のクローニングを容易にするために、ＳａｌＩ、ＮｄｅＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＢｓｉＷＩおよびＳｇｒＡ１部位を含有した（図１Ａ）。
【００９４】
全長ゲノムｃＤＮＡを上記のベクターにクローン化した（図１ａ）。完成したＣＤＶ ｃＤＮＡ配列は１５，６９０塩基であったが、６で割ることができる数であり、６の規則（ｒｕｌｅ−ｏｆ−ｓｉｘ）（６、２３）に一致した。プラスミドｐＢＳ−ｒＣＤＶ中のウイルスｃＤＮＡ（図１Ａ）は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによるＣＤＶゲノムの正方向コピーの合成を可能にするように方向付けられた。ゲノムｃＤＮＡプラスミドを調製するために、ＣＤＶゲノムの６つの断片（図１Ａ）を精製ウイルスＲＮＡ（４６）からの逆転写およびＰＣＲ増幅（ＲＴ／ＰＣＲ）後に逐次クローン化した。
【００９５】
増幅した第１ゲノムｃＤＮＡ断片は、図１ＡのＮａｒＩ／ＳｇｒＡＩ断片に等価であった（配列番号２のＣＤＶヌクレオチド１３０８９〜１５６９０）。ＣＤＶ ｃＤＮＡの３’末端を増幅するのに用いたプライマーは、ＣＤＶ末端に相補的であり、ＮａｒＩ部位にまたがるリボザイム配列を含有する伸長部分を含有した（ｃａｇｃｃｇｇｃｇｃｃａｇｃｇａｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｃｃａｔｇｃｃｇｇｃｃＡＣＣＡＧＡＣＡＡＡ ＧＣＴＧＧＧＴ、配列番号６；ＣＤＶ配列は大文字で示されている）。第２のプライマーは、ウイルスゲノムにおけるＳｇｒＡＩ部位にまたがっている（ＴＡＣＴＣＡＡＧＴＣＡＡＡＴＡＣＴＣＡＧＧＧＡＣ、配列番号７）。増幅断片をＮａｒＩおよびＳｇｒＡＩで消化し、ベクター骨格中にクローン化した。次いで、このプラスミドを用いて、ＳｇｒＡＩおよびＢｓｉＷＩ部位にまたがる次の断片にクローン化した（１０１３６〜１３０８８；プライマーＣＡＧＧＧＧＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＡＧＴＣＡＣＴＧＣ、配列番号８およびＡＣＧＡＣＣＴＴＴＣＴＧＡＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＴＣ、配列番号９）。同様に、ＢｓｉＷＩ−ＤｒａＩＩＩ断片（ヌクレオチド８６６６〜１３０１５；プライマーＡＧＡＧＧＡＧＡＣＣＡＧＴＴＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣ、配列番号１０およびＴＧＡＴＴＣＣＣＴＣＣＣＣＴＧＡＧＧＣＡＴＧＡＧＣ、配列番号１１）、ＮｄｅＩ／ＤｒａＩＩＩ断片（ヌクレオチド５８４５〜８６６５；プライマーＧＣＡＡＴＣＣＡＡＴＣＴＣＴＴＡＧＡＡＣＣＡＧＣＣ、配列番号１２およびＴＣＧＡＡＴＣＴＧＴＡＡＡＡＴＴＧＧＴＧＡＣＡＣＣ、配列番号１３）ならびにＳａｌＩ／ＮｄｅＩ断片（ヌクレオチド２９６２〜５８４４；プライマーＧＣＣＡＴＴＡＣＴＡＡＡＣＴＡＡＣＴＧ、配列番号１４およびＡＴＣＴＴＡＴＧＡＡＴＴＴＣＴＣＣＴＣＣ、配列番号１５）を増幅し、増殖ｃＤＮＡクローンに逐次加えた。最後に、Ｔ７プロモーター＋ＣＤＶヌクレオチド１〜２９６１を含有するＮｏｔＩ／ＳａｌＩ断片を増幅し（プライマーＡＴＧＧＧＴＴＴＣＡＧＣＴＧＧＡＧＧＴＣＴＣＴＣ、配列番号１６およびｃｇｇｃｇｇｃｃｇｃｇｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａ ＡＣＣＡＧＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＣＴ、配列番号１７；ＣＤＶヌクレオチドは大文字で示す）、ゲノムｃＤＮＡクローンに加えた。
【００９６】
完成したゲノムｃＤＮＡプラスミドを配列決定し、ＣＤＶゲノムコンセンサス配列と比較した。これは多分ＲＴ／ＰＣＲ増幅により導入された数多くのヌクレオチド変化を示した。タンパクコード領域におけるいくつかの塩基変化は、アミノ酸コドンの特異性に関して沈黙していた。これらの塩基置換は修復されない；それらは組換えウイルスを同定する有用な「タグ」として役立った。加えて、１個の非コード領域塩基変化もヌクレオチド６８３７におけるＭおよびＦ遺伝子の間の遺伝子間領域（Ｍ／Ｆ遺伝子間領域）に見出されており、この塩基置換は修復されなかった。コドン特異性に影響を与える塩基置換は、オリゴヌクレオチド突然変異誘発により、または、突然変異した領域を独立してＲＴ／ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片で置き換えることにより、修復された。オリゴヌクレオチド突然変異誘発は、まず塩基補正を必要とする領域をサブクローニングし、次いで、クイックチェンジ（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））またはモルフ（Ｍｏｒｐｈ）（５プライム−３プライム、インク（５ ｐｒｉｍｅ−３ ｐｒｉｍｅ， Ｉｎｃ））突然変異誘発キットのいずれかを用いて補正を行うことにより実施した。次いで、補正した断片を全長クローンに入れ戻した。修復した全長クローンの配列決定を行って、突然変異の補正を確認した。
【００９７】
１Ｂ−ＣＤＶミニレプリコン
また、全長ｃＤＮＡクローンに用いたプラスミドベクターは、ＣＤＶミニレプリコン（ＣＤＶ−ＣＡＴ）配列を含有するｐＣＤＶ−ＣＡＴを生成するためにも用いた。ＣＤＶミニレプリコンを含有する配列は、レポーター遺伝子の５’末端においてＣＤＶリーダーおよび３’末端においてＣＤＶトレーラーが隣接するＣＡＴ遺伝子を包含する（図１Ｂ）。ＣＤＶミニレプリコンは、全長クローンの反対方向にＴ７ポリメラーゼプロモーターとリボザイムとの間に挿入した。かくして、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ転写は、負方向ミニレプリコンＲＮＡの等価物を生成する。
【００９８】
ＣＤＶミニレプリコンは、上記のベクター骨格にクローン化した。クローニングに用いたミニレプリコンＤＮＡは、ＰＣＲにより調製した。５’末端においてＣＤＶリーダーおよびリボザイム配列（ＮａｒＩ部位を含む）ならびに３’末端においてＣＤＶトレーラーおよびＴ７プロモーターが隣接するＣＡＴ遺伝子（図１Ｂ）は、四ネスト化（ｆｏｕｒ ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ反応により生成した。簡単には、４つの異なる組みのプライマーを用いて、ＣＡＴ遺伝子を４回別々に増幅した。第１組のプライマーは、ＣＡＴ遺伝子特異的なプライマーの５’末端に挿入された配列によりＰＣＲ産物にリーダーおよびトレーラーの一部を加えながら、ＣＡＴ遺伝子の増幅を目的とした。次回のＰＣＲは、ＣＤＶリーダーおよびトレーラー由来の付加的な配列を加えながら、第１組のプライマーと重複したプライマーを用いた。５’伸長部分を有する重複プライマーを用いるこのスキームを、以下のリストからプライマーを用いて４回繰り返した。
【００９９】
【表１】
2004501646.tif 000005
【０１００】
【表２】
2004501646.tif 000006
【０１０１】
４回のネスト化ＰＣＲ増幅は、５’−ＮａｒＩ部位−３３ｂｐのリボザイム配列−ＣＤＶリーダー−ＣＡＴ遺伝子−ＣＤＶトレーラー−Ｔ７プロモーター−ＨｉｎｄＩＩＩ部位からなるミニレプリコン断片を生成した。４つのネスト化ＰＣＲ増幅は、以下のプライマー対を用いて行った：１回目：プライマーＡ＋Ｆ；２回目：プライマーＢ＋Ｇ；３回目：プライマーＣ＋Ｈ；４回目：プライマーＤ＋Ｉ。
【０１０２】
プライマーＦがＣＡＴ遺伝子の３’末端に２つの終止コドンを指定したことに注目しうる。一方はＣＴＡ遺伝子の終止コドンであり、他方はＣＤＶゲノムにおけるＬ遺伝子に由来した。２つの終止コドンは、ミニゲノムを６の規則（ｒｕｌｅ−ｏｆ−ｓｉｘ）（６、２３）に一致するように３個の付加的なヌクレオチド（第２の終止コドン）を導入するために単純に組み込まれた。
【０１０３】
この時点で、最初の計画は、図１ＢのＮｏｔＩ部位の位置にＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有するベクターを用いることであった。従って、上記に示したプライマーＩは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有した。ベクター中のＮｏｔＩ部位を用いる決定は、ＮｏｔＩ部位を含有するミニレプリコン断片を生成する５回目のＰＣＲをもたらした。ＮｏｔＩ部位を導入するために、ミニレプリコンＤＮＡをプライマーＥおよびＪで増幅した（ＪはＮｏｔＩ部位を含有する）。
【０１０４】
最後に、上で用いたプライマーは、ＣＤＶミニレプリコンに野生型Ｔ７プロモーター配列（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（斜体字）、配列番号２８、プライマーＨ、ＩおよびＪを参照）を組み込んでいた。トランスフェクション実験における乏しいミニレプリコン活性は、Ｔ７プロモーターの３’末端由来の３個のＧ残基（斜体字）を除去するようにミニレプリコンのさらなる改変をもたらした。Ｔ７プロモーターにおけるこれらの残基は、実際にはポリメラーゼによりコピーされ、ミニレプリコン転写物に組み込まれる。これは６の規則（ｒｕｌｅ−ｏｆ−ｓｉｘ）（６、２３）に一致しないミニレプリコンＲＮＡを生成する。Ｔ７プロモーターの切断は、プロモーター活性を減少させるが、６の規則に従うミニレプリコン転写物を生成する。改変されたミニレプリコンは、３個のＧ残基を欠く改変されたプライマーＪと共に、ＥおよびＪに類似したプライマーを用いてＰＣＲ増幅により生成させた。
【０１０５】
１Ｃ−異種核酸または遺伝子配列を発現するためのＣＤＶ構築物
ゲノムｃＤＮＡクローンを、外来遺伝子の挿入を可能にするようにＰ遺伝子とＭ遺伝子との間を改変した。改変は、ＣＤＶ配列を最少限に改変しながら、いくつかの独特の制限部位の導入を可能にするように選択された。８つのヌクレオチド置換を導入して、３つの独特の制限部位を作出した（３３３０Ｇ〜Ａ、３３３１Ｇ〜Ａ、３３３５Ｔ〜Ｃ、３３４８Ａ〜Ｇ、３３４９Ａ〜Ｇ、３３５５Ｇ〜Ｃ、３３７３Ｔ〜Ａ、および３３７７Ｔ〜Ｇ）。これらの改変は、ＣＤＶヌクレオチド３３２９位〜３３７７位の間に３つの独特の制限部位（ＡａｔＩＩ、ＦｓｅＩおよびＭｌｕＩ、図５Ａ）を作出した。９番目の塩基変化をＡａｔＩＩ部位のすぐ３’側に加えて（３３３７、Ａ〜Ｔ）、ＳａｌＩ部位をノックアウトした。ＳａｌＩ部位は、ＡａｔＩＩ部位を生成するのに用いたヌクレオチド変化により生成させた。
【０１０６】
ヌクレオチド置換は、まずＰおよびＭ遺伝子間領域を含有するプラスミドサブクローンに生成させた（ＳａｌＩ ２９６１位〜ＮｄｅＩ ５８４３位）。サブクローン由来の改変断片を、Ｐ遺伝子オープンリーディングフレームの３’側およびＰ／Ｍ遺伝子−終止／遺伝子−開始シグナルの５’側に新しい制限酵素部位を配置する全長ゲノムクローンに交換して戻した。このクローン（ｐＢＳ−ｒＣＤＶ＋）は成功裏に救出されたが、これは塩基置換がウイルスに対する顕著な悪影響を有しなかったことを示す。
【０１０７】
次いで、クローンｐＢＳ−ｒＣＤＶ＋は、外来遺伝子の挿入用ベクターとして用いた。ｐＧＬ２−ｌｕｃ由来のルシフェラーゼ遺伝子（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））はプライマー（５’末端、ＴＡＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＡＴＴＡＴＡＡＡＡＡＡＣＴＴＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＡＧＣＣＴＡＡＧＴＣＣＧＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＣＡＴ、配列番号２９；３’末端、ＴＴＴＴＡＣＧＣＧＴＴＴＡＣＡＡＴＴＴＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣ、配列番号３０）で増幅し、ルシフェラーゼ遺伝子に５’ＦｓｅＩおよび３’ＭｌｕＩ部位を導入した。また、ルシフェラーゼコドン領域のアミノ末端に特異的な５’末端プライマーは、５’伸長部分を含有していた。５’伸長部分は、ＦｓｅＩ部位に加えて、Ｐ／Ｍ遺伝子間領域由来のＧＥ／ＧＳシグナルのコピーを含んでいた（図５Ａ）。ルシフェラーゼ遺伝子を増幅するのに用いたプライマーは、それを最終的にｐＢＳ−ｒＣＤＶ＋に挿入してｐＢＳ−ｒＣＤＶ−Ｐ／ｌｕｃ／Ｍを生成させた場合に６の規則（２３）を考慮した断片を製造するように設計した（図５Ａ）。
【０１０８】
１Ｄ−発現ベクターｐＣＤＶ−Ｎ、ｐＣＤＶ−ＰおよびｐＣＤＶ−Ｌ
発現ベクターｐＣＤＶ−Ｎ、ｐＣＤＶ−ＰおよびｐＣＤＶ−Ｌは、図１Ｃに示すように、Ｎ（ヌクレオチド１０８〜１６７９）、Ｐ（１８０１〜３３２４）またはＬ（９０２９〜１５５８４）コード配列をｐＴＭ−１に基づくベクター（２９、４１）に挿入することにより調製した。このベクターは、脳心筋炎ウイルス内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）の上流にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有する。ＩＲＥＳの３’末端に位置するＮｃｏＩ部位をクローニングに用い、また、ＡＴＧ開始コドンを含有する。合成ポリアデノシンストレッチは、クローニング領域のすぐ３’側に位置し、その後にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼターミネーターが続く。Ｎ、ＰおよびＬ遺伝子挿入物は、ＰＣＲ増幅により調製した。ＮおよびＰ遺伝子は、感染細胞ＲＮＡからＲＴ／ＰＣＲにより増幅した。Ｌ遺伝子は全長ＣＤＶ ｃＤＮＡクローンからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲの間に導入された誤りは、突然変異した配列を独立したＰＣＲ増幅から生成した断片で置き換えることにより、または特定オリゴヌクレオチドの突然変異により修復した。実験室に適合したエドモンズトン（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）株（５５）由来のＭＶ Ｎ、ＰおよびＬ遺伝子を、感染細胞ＲＮＡ由来のＲＴ／ＰＣＲ増幅後のＴ７ベクターにクローン化した。
【０１０９】
１Ｅ−ＤＮＡ配列決定および配列確認
発現ベクターにクローン化した遺伝子の配列、ｐＣＤＶ−ＣＡＴの配列、および全長ゲノムクローンの配列を、色素−ターミネーター／Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼキット（ＡＢＩ）を用いたサイクル配列決定法（１６、２４）により決定した。配列決定の反応物は、ミクロスピン（ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ）Ｇ５０カラム（アマシャム−ファルマシア・バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ））で精製し、ＡＢＩ ３７７自動化シークエンサー（ＡＢＩ）で分析した。配列データは、マックベクター（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ）（オックスフォード・モレキュラー（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ））を用いたコンピューター分析により解析した。
【０１１０】
ＣＤＶオンデルシュテプール（Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ）株のゲノム配列は、増幅ＲＴ／ＰＣＲ産物（３６）から直接コンセンサス配列を生成させることにより確認した。簡単には、感染細胞由来のＲＮＡを、トリゾール試薬（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いたグアニジニウム−フェノール−クロロホルム抽出法（９）により抽出した。生成したＲＮＡを、遺伝子特異的なプライマーおよびスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＩＩ逆転写酵素（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いて逆転写した。次いで、遺伝子特異的なプライマーおよびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＡＢＩ）を用いてゲノム断片を増幅し、これらを引き続いてゲル精製した。精製ＰＣＲ断片をサイクル配列決定法に付し、上記のように解析した。
【０１１１】
救出されたＣＤＶの信頼性
組換えＣＤＶ（ｒＣＤＶ）単離物のゲノムにおける配列タグは、ＤＮＡ配列決定法により分析するか、あるいは制限酵素部位マーカーの存在について分析した。１４個のヌクレオチド位置を用いて、実験室で用いたｒＣＤＶ株とＣＤＶ株とを区別した。感染細胞ＲＮＡを上記のようなグアニジニウム−フェノール−クロロホルム抽出法により単離した。適当な配列タグを含有するゲノム領域を、タイタン（Ｔｉｔａｎ）ワン−チューブ（ｏｎｅ−ｔｕｂｅ）ＰＣＲキット（ロッシュ・モレキュラー・バイオロジー（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ））を用いたＲＴ／ＰＣＲにより増幅した。汚染したプラスミドＤＮＡの存在について試験する負の対照（−ＲＴ）は、ＲＴ工程をワン−チューブ反応系で完了した後でＲＮＡを加えることにより行った。ＰＣＲ断片を上記のように配列決定するか、あるいは増幅した断片を適当な制限酵素で消化した（図４Ｂ）。
【０１１２】
ルシフェラーゼ遺伝子（ｒＣＤＶ−Ｐ／ｌｕｃ／Ｍ）を含有するｒＣＤＶゲノムを配列分析により解析して、ルシフェラーゼ遺伝子が正しく挿入されているかを確認した。また、ｒＣＤＶ−Ｐ／ｌｕｃ／Ｍ単離物で感染させた細胞をルシフェラーゼ発現について分析した。レポーター溶解緩衝液（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）：ウィスコンシン州マジソン）を用いて感染細胞抽出物を調製し、ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の試薬およびアナリティカル・ルミネッセンス・ラボラトリーズ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）照度計（ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いてルシフェラーゼ活性について分析した。
【０１１３】
実施例２
ＣＡＴアッセイおよびウイルス救出による一時的発現分析ための一般的な方法
ミニレプリコンのトランスフェクションは、いくつかの方法で行った。ＣＤＶミニレプリコンがＲＮＡとしてトランスフェクトされる実験では、２９３細胞をリポフェクターゼ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｓｅ）（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））でトランスフェクトした。ミニレプリコンＲＮＡは、ｐＣＤＶ−ＣＡＴ ＤＮＡ（図１Ｂ）を転写鋳型として用いて、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（２）によりインビトロで調製した。ＲＮＡは、メガスクリプト（Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ）キット（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））の試薬およびプロトコルを用いて合成し、精製した。ＣＤＶ感染が相補性を与えるミニレプリコン実験（図２Ａ）では、ＲＮＡトランスフェクション混合物の成分を２つのチューブに調製した。一方のチューブは、２０μｇの精製ミニレプリコンＲＮＡおよび１００μｌの無血清オプティメム（ＯｐｔｉＭＥＭ）（ライフ・テクノロジー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を含有した。第２のチューブは、１００μｌの無血清オプティメム（ＯｐｔｉＭＥＭ）および９〜１２μｌのリポフェクターゼ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｓｅ）（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））で調製した。次いで、両方のチューブの内容物を混合し、室温で３０〜４０分間インキュベートした。トランスフェクション前に、培養培地を２９３細胞単層（６０ｍｍの皿に約８０％の集密度）から除去し、細胞を無血清オプティメム（ＯｐｔｉＭＥＭ）で１回洗浄した。次いで、この単層を細胞１個あたり約２プラーク形成単位（ｐｆｕ）の感染多重度（ｍｏｉ）で感染させるために、ＲＮＡトランスフェクション混合物を、十分なＣＤＶ（オンデルシュテプール（Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ））を含有する０．８ｍｌの無血清オプティメム（ＯｐｔｉＭＥＭ）と混合した。次いで、この１ｍｌトランスフェクション混合物を細胞単層に加え、３７℃で５時間インキュベートした。５時間インキュベートした後、２０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ １ｍｌを細胞に加え、インキュベーションを一晩続けた。７０％より多くの細胞単層が細胞融合を示したとき、トランスフェクションの約２４時間後に細胞抽出物を調製した。ＣＡＴアッセイは、基本的には上記（３５）のように行った。いくつかの実験（図３）では、Ｃ１４標識クロラムフェニコール基質を蛍光基質（２０、６２）で置き換え、アッセイを基質製造業者のプロトコル（ファースト・キャット・イエロー（ＦＡＳＴ ＣＡＴ Ｙｅｌｌｏｗ）またはファースト・キャット・グリーン（ＦＡＳＴ ＣＡＴ Ｇｒｅｅｎ）；モレキュラー・プローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））に従って修正した。蛍光ＣＡＴアッセイの産物は、フルオルイメージャー（ＦｌｏｕｒＩｍａｇｅｒ）（モレキュラー・ダイナミックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ））で分析し、イメージ・クァント（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ）ソフトウェア（モレキュラー・ダイナミックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ））を用いて定量化した。
【０１１４】
また、ＲＮＡミニゲノムは、Ｎ、ＰおよびＬ発現プラスミドで同時トランスフェクトした。トランスフェクションは、ＲＮＡを適当なプラスミドＤＮＡ（１μｇ ｐＣＤＶ−ＮおよびｐＣＤＶ−Ｐ、２００ｎｇ ｐＣＤＶ−Ｌ）、１００μｌの無血清オプティメム（ＯｐｔｉＭＥＭ）および２０μｌのリポフェクターゼ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｓｅ）（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））と組み合わせたこと以外は本質的に上記のように行った。トランスフェクションの１時間前に、２９３個の細胞単層をＭＶＡ／Ｔ７に細胞１個あたり５ｐｆｕのｍｏｉで感染させて、発現プラスミドを転写するためのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを得た。
【０１１５】
上記したトランスフェクションプロトコルは、ＤＮＡミニレプリコントランスフェクション用に修正し、ホワイトヘッド（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ）ら（５９）により報告されているものに類似したプロトコルに従った。これらの実験において、我々は２９３細胞からＨＥｐ２またはＡ５４９細胞に交換した。それらがＭＶＡ／Ｔ７感染ンの効果に対して顕著により耐性を有することを我々が見出したからである。トランスフェクションに用いた細胞は、通常約７０〜９０％の集密度である。トランスフェクション混合物は、２００μｌの無血清オプティメム（ＯｐｔｉＭＥＭ）中でミニレプリコンＤＮＡ（１０ｎｇ ｐＣＤＶ−ＣＡＴ）および発現プラスミド（４００ｎｇ ｐＣＤＶ−Ｎ、３００ｎｇ ｐＣＤＶ−Ｐ、５０〜１００ｎｇ ｐＣＤＶ−Ｌ）を組み合わせることにより調製した後、１５μｌのリポフェクターゼ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｓｅ）（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を加えた。この混合物を室温で２０〜３０分間インキュベートした。別のＭＶＡ／Ｔ７混合物を、６ウェルプレートの各ウェルを細胞１個あたり約２〜５ｐｆｕで感染させるのに十分なＭＶＡ／Ｔ７を含有する０．８ｍｌの無血清オプティメム（ＯｐｔｉＭＥＭ）を与えるのに十分な量で調製した。トランスフェクションを開始する前に、培養培地を単層から除去し、トランスフェクション混合物を８００μｌのＭＶＡ／Ｔ７混合物に加え、合わせた１ｍｌ混合物を細胞に加えた。一晩のインキュベーション後、トランスフェクション培地を、１０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭで置き換え、細胞をさらに１日インキュベートした。トランスフェクションを開始してから約４８時間後、細胞を採取し、上記のようにＣＡＴ活性の分析用に抽出物を調製した。説明文に示したように、ウイルス救出について本質的に下に記載するように、リン酸カルシウムトランスフェクション法を用いて、いくつかのミニレプリコン実験（図３Ｂ）を行った。
【０１１６】
ウイルス救出用の細胞のトランスフェクションは、主としてリン酸カルシウム法で行った。また、我々は上記のリポフェクターゼ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｓｅ）プロトコルを用いたが、熱ショック工程（３５）と組み合わせたリン酸カルシウム法がより効果的であることを見出した。６ウェルプレートのＡ５４９細胞またはＨＥｐ２単層は、トランスフェクション前に７５〜９０％集密的であった。トランスフェクションの１〜２時間前、細胞に１０％ＦＢＳを含有する４．５ｍｌのＤＭＥＭを供給し、３％ＣＯ２に設定したインキュベーターに移した。通常、このインキュベーターは、また、３７℃より３２℃に設定されていた。ミニレプリコン実験が、この低温がより高いレベルの救出を与えるらしいことを示したからである（図３Ａ）。リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿物は、まず、全長ＣＤＶプラスミド（５μｇ）を４００ｎｇ ｐＣＤＶ−Ｎ、３００ｎｇ ｐＣＤＶ−Ｐ、および１００ｎｇ ｐＣＤＶ−Ｌを組み合わせ、５ｍｌのポリプロピレンチューブ中、最終濃度を水で２２５μｌに調節することにより調製した。次いで、２５μｌの２．５Ｍ塩化カルシウムをＤＮＡ溶液に加えた。最後に、２５０μｌの２×ＢＥＳ緩衝化食塩水（５０ｍＭ ＢＥＳ［ｐＨ６．９５〜６．９８］、１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２８０ｍＭ ＮａＣｌ）を、混合物を穏やかに攪拌しながら、チューブに滴下した。沈殿物が室温で２０〜３０分間で形成した。次いで、沈殿物を培養培地に滴下した後、１〜３のｍｏｉを与えるのに十分なＭＶＡ／Ｔ７を加えた。プレートを穏やかにロックして、培地、リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿物、およびＭＶＡ／Ｔ７の均一な混合を確実にした後、細胞を３％ＣＯ２に設定したインキュベーターに戻した。トランスフェクションを開始してから３時間後、６ウェルプレートをジップ−ロック（ｚｉｐ−ｌｏｃｋ）プラスチックバッグ中に密封し、４３〜４４℃に設定した水浴に２時間沈めた。熱ショック後、細胞を３％ＣＯ２に設定した３２℃のインキュベーターに戻した。翌日、トランスフェクション培地を除去して、細胞をｈｅｐｅｓ緩衝化食塩水溶液（１０ｍＭ ｈｅｐｅｓ［ｐＨ７．０］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）で洗浄し、１０％ＦＢＳを補足した２〜３ｍｌのＤＭＥＭを供給した。細胞を３２℃でさらに２４〜４８時間インキュベートした。トランスフェクションの４８〜７２時間後に、細胞を培地中にこぞげ入れ、集密度７０〜８０％のヴェロ（Ｖｅｒｏ）細胞の単層と１０ｍｌの培地とを含有する１０ｃｍプレートに移して、同時培養（３５）を開始した。同時培養を開始してから３〜５時間後、培地を、１０％ＦＢＳを含有する１０ｍｌのＤＭＥＭで置き換えた。４〜６日後、プラークが明瞭に認められた。、細胞を培地中にこそげ込み、−８０℃で凍結することにより、後の分析のために、救出されたウイルスを採取した。
【０１１７】
実施例３
ＣＤＶミニレプリコン発現。ミニレプリコンレポーター系を用いた一時的な発現研究は、ウイルス救出系を開発するのに重要である。ミニレプリコンレポーター由来の一時的発現を分析することは、最適な条件を決定するトランスフェクションパラメーターの比較的迅速な評価を可能にし、また、Ｎ、ＰおよびＬの発現ベクターが機能タンパクの合成を導くかどうかを決定する有用なツールでもある。
【０１１８】
３．１　ウイルスによるＣＤＶミニレプリコン救出
３．１．１　このミニレプリコン実験は、ＣＤＶ−ＣＡＴミニレプリコンがウイルス相補性により救出されるその能力により機能的であるかどうか試験する。インビトロで合成したＣＤＶ−ＣＡＴミニレプリコンＲＮＡ（２０μｇ）を２９３細胞の６０ｍｍ皿にトランスフェクトした。また、細胞をほぼＣＤＶにトランスフェクションを開始したときに約２のｍｏｉで感染させた。トランスフェクションの約２４時間後、約７０％の細胞が合胞体に取り込まれたとき、細胞抽出物を調製し、ＣＡＴ活性について分析した（図２Ａ）。ＣＡＴアッセイの結果を示すオートラジオグラムを図２Ａに示す。ＣＡＴ活性は、ミニレプリコンＲＮＡでトランスフェクトしたＣＤＶ感染細胞に容易に検出された（図２Ａ、レーン２）。これはミニレプリコンが機能的であることを示す。ＲＮＡでトランスフェクトされたが、ＣＤＶに感染していない対照細胞は、検出可能なＣＡＴ活性を生じた（図２Ａ、レーン１）。これはＣＡＴ活性が明らかにミニレプリコンの複製および発現によるものであったことを示す。
【０１１９】
３．１．２　相補的なウイルスから発現されたトランス作用タンパクを与えられたときにＣＤＶミニレプリコンＲＮＡが機能的であることを確立した後、我々は、次いで、Ｎ、ＰおよびＬタンパク発現ベクター（図１Ｃ）が相補性を与える能力を試験した。従って、ミニレプリコンＲＮＡ（２０μｇ）をｐＣＤＶ−Ｎ（１μｇ）、ｐＣＤＶ−Ｐ（１μｇ）およびｐＣＤＶ−Ｌ（図２Ｂに示す量）と共に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの１時間前に、この実験に用いた２９３細胞をＭＶＡ−Ｔ７に５のｍｏｉで感染させて、プラスミドベクター由来のＮ、ＰおよびＬタンパクの発現に必要なＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを得た。感染細胞由来の抽出物のＣＡＴ活性に関する分析は、発現プラスミドが効果的に相補性を与えたことを示した（図２Ｂ）。ミニレプリコン複製および発現を示すＣＡＴ活性は、５０および１００ｎｇのｐＣＤＶ−Ｌ発現プラスミドを用いた場合に検出可能であり（図２Ｂ）、最大で１００ｎｇであった。１００ｎｇより多くのＬ発現プラスミドが抑制性である（図２Ｂ、レーン５）。期待されるように、ミニレプリコンＲＮＡだけを与えられた（図２Ｂ、レーン１）、またはＬタンパク発現ベクターを与えられていない（図２Ｂ、レーン２）、負の対照のトランスフェクションでは、ほとんどまたはまったくＣＡＴ活性は検出できなかった。
【０１２０】
３．１．３　ＣＤＶミニレプリコンＤＮＡの救出
ＲＮＡよりむしろミニレプリコンプラスミドＤＮＡは、Ｎ、ＰおよびＬの発現ベクターと共に細胞にトランスフェクトされるので、最終的なミニレプリコン実験に用いた条件は、全長ウイルスを救出するのに用いられる条件に非常によく似ている。かくして、レプリコンＲＮＡの合成は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによる細胞内転写に依存する。図３Ａの結果は、ミニレプリコン活性がミニレプリコンＤＮＡのトランスフェクション後に得ることができたことを示す。加えて、ミニレプリコン活性がある温度感受性を示しうる可能性を試験するために、我々はトランスフェクトした細胞を様々な温度でインキュベートした（図３Ａ）。６ウェルプレート中の５４９細胞を感染させ、３２℃〜３７℃にインキュベートした。プラスミドミニレプリコンｐＣＤＶ−ＣＡＴ（５０ｎｇ）を、リポソームトランスフェクション試薬を用いて、発現プラスミド（４００ｎｇ ｐＣＤＶ−Ｎ、３００ｎｇ ｐＣＤＶ−Ｐ、５０または１００ｎｇ ｐＣＤＶ−Ｌ）と共にＡ５４９に同時トランスフェクトした。同様に、麻疹ウイルスミニレプリコン（１００ｎｇ ｐＭＶ１０７−ＣＡＴ）を麻疹ウイルスタンパク発現ベクター（４００ｎｇ ｐＭＶ−Ｎ、３００ｎｇ ｐＭＶ−Ｐ、１００ｎｇ ｐＭＶ−Ｌ）と共に同時トランスフェクトした。トランスフェクションと同時に、細胞をＭＶＡ／Ｔ７に約２のｍｏｉで感染させた。細胞抽出物を感染の約４８時間後に調製し、ＣＡＴ活性を分析した。この図に示す実験では、蛍光クロラムフェニコール基質を用いてＣＡＴアッセイを行い、蛍光カメラを用いて反応生成物を定量した。図（３Ａ）の相対的なＣＡＴ活性は、レーン８に与えた値に対して表す。
【０１２１】
図３に示す結果は、明らかに、ｐＣＤＶ−Ｌ ＤＮＡが省略されている負の対照のトランスフェクション（図３Ａ、レーン１を参照）に対して有意なレベルのＣＤＶ−ＣＡＴミニレプリコン活性を示した（図３Ａ、レーン２および３を参照）。ｐＣＤＶ−Ｌベクターの非存在下で観察された低いが検出可能なバックグラウンドシグナルが存在した。これは、おそらくＣＤＶリーダー中における潜在ワクシニアウイルスプロモーターまたは細胞ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターに起因する。ＭＶリーダーおよびトレーラーの存在を除いて同一であるミニレプリコンベクターは、有意に多量のＭＶミニレプリコンを用いた場合に、ほとんど検出できないバックグラウンドを生成する（図３Ａ、レーン５、（３５、４１））。また、これらの結果は、３７℃よりむしろ３２℃におけるインキュベーションが一般的には２〜３倍高いレベルのＣＤＶ−ＣＡＴ活性を生じたことを示した。従って、３２℃の温度をウイルス救出に用いた。
【０１２２】
加えて、これらの実験（図３）は、Ａ５４９またはＨＥｐ２（図３のＡ５４９；ＨＥｐ２、データを示していない）細胞を用いて行った。我々はこれらの細胞がＭＶＡ／Ｔ７による感染に対して２９３細胞よりも耐性があることを観察したからである（図２Ｂ）。これらの実験のいくつかの場合、リポソームトランスフェクションプロトコル（図３Ａ）をリン酸カルシウム法（図３Ｂ）で置き換えた。付加的な変数を調べた。これらを以下で説明する。
【０１２３】
３．１．４　ＣＤＶミニレプリコンの熱ショック応用
「方法」に記載したリン酸カルシウム法を用いて、６ウェルプレート中におけるＡ５４９細胞を、ｐＣＤＶ−ＣＡＴミニレプリコン（１０ｎｇ）と、Ｎ（４００ｎｇ）、Ｐ（３００ｎｇ）およびＬ（５０〜１００ｎｇ）用の発現ベクターとで同時トランスフェクトした。トランスフェクションを開始してから３時間後に、細胞を４３℃で２時間移し、次いで３２℃に一晩戻した。ＣＤＶミニレプリコンの発現に対する熱ショックの効果を図３Ｂに示す。熱ショック処理は、ＣＤＶ−ＣＡＴ活性を約４〜１６倍上昇させた。これはこの処理がＣＤＶの救出に有益であるらしいことを示す。
【０１２４】
実施例４
４．１　ｒＣＤＶの救出
最大レベルのミニレプリコン活性を生じた上記のトランスフェクションおよび培養条件をＣＤＶの救出に応用した。すなわち、リン酸カルシウム法（「方法」）を用いて、Ａ５４９またはＨｅｐ２細胞を全長ｃＤＮＡプラスミドならびにｐＣＤＶ−Ｎ、ｐＣＤＶ−ＰおよびｐＣＤＶ−Ｌ発現ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションを開始してから３時間後、細胞に４３〜４４℃で２時間熱ショックを与えた後、３２℃のインキュベーターに戻した。翌日、媒体を交換し、トランスフェクトした細胞をさらに１日インキュベートした。ウイルスを生じ、少量のｒＣＤＶを増やすトランスフェクトした細胞培養物を同定するために、トランスフェクトした細胞をヴェロ（Ｖｅｒｏ）細胞の新しい単層と共に同時培養した（「方法」；参考文献３５）。３２℃での同時培養の４〜６日後に合胞体が観察された（図４Ａを参照）。
【０１２５】
大抵の実験では、我々の救出条件は、ヴェロ（Ｖｅｒｏ）細胞と同時培養した後に検出可能なトランスフェクトした６ウェルプレートから４〜６個のｒＣＤＶ陽性のウェルを生じた。我々は、また、リン酸カルシウムまたはリポソームトランスフェクション試薬を用いた場合の救出効率の限られた比較を行った。「方法」に記載したリン酸カルシウム法は、リポソーム試薬に比べて約２倍の頻度でＣＤＶ陽性のトランスフェクトをもたらした（データを示していない）。
【０１２６】
４．２　救出されたウイルスの特徴付け
ｒＣＤＶの２つの単離物に感染した細胞（ｒＣＤＶ１およびｒＣＤＶ２）またはマーチン・ビレター（Ｍａｒｔｉｎ Ｂｉｌｌｅｔｅｒ）から得たオンデルシュテプール（Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ）株（Ｏｎｄ）由来のＲＮＡを用いて、Ｐ遺伝子からＤＮＡ断片を増幅した。組換え株由来のＲＴ／ＰＣＲ増幅した断片は、ＢｓｔＢＩの制限酵素消化部位「タグ」を含有する。非組換え（Ｏｎｄ）株は、この部位を欠いている。いくつかの実験由来のＣＤＶ単離物は、組換えウイルスが救出されたことを確認するために特徴付けた。組換えＣＤＶは、ｃＤＮＡクローニングの間に導入され、修復されていないヌクレオチドの変化（配列「タグ」）を含有するはずである。例えば、Ｐ遺伝子の２つの近接して位置する塩基変化（ヌクレオチド２２９５および２２９８）が存在した。これらの塩基変化は、アミノ酸コドンの特異性に関して沈黙しているが、ＢｓｔＢＩ制限酵素消化部位を生成した。組換えｃＤＮＡにおけるこのＢｓｔＢＩタグは、汚染ウイルスの起源となる可能性のある、実験室で用いた２つのＣＤＶ株（我々の実験室に適合したオンデルシュテプール（Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ）株およびマーチン・ビレター（Ｍａｒｔｉｎ Ｂｉｌｌｅｔｅｒ）（チューリッヒ大学）により提供されたオンデルシュテプール（Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ）株）には存在しないはずである。例えば、Ｐ遺伝子の領域（位置１９７８〜２８０４）を感染細胞ＲＮＡからＲＴ／ＰＣＲにより増幅し、引き続いてＢｓｔＢＩで消化した。結果は、明らかに組換えウイルスがＢｓｔＢＩタグを含有するが、非組換え株は含有しないことを示した（図４Ｂを参照、レーン２、３、６とレーン８、９、１０を比較せよ）。組換えウイルスから誘導されたＰＣＲ産物は、ＢｓｔＢＩで開裂させ、消化に耐性を有するＤＮＡより早く移動した二重線を生じた（図４Ｂを参照）。これらの結果は、また、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を直接に配列決定することにより確認した。１１個の付加的な配列タグを同様に分析し、その結果はＣＤＶの組換え株が救出により生じつつあることを決定的に示した。配列タグの分析がトランスフェクトした細胞から引き継いだゲノムｃＤＮＡを汚染することにより複雑化する可能性は、２つの負の対照により除外することができる。ｐＣＤＶ−Ｌ発現ベクターを除いてすべてのプラスミドＤＮＡを与えられた負の対照のトランスフェクションから生じる細胞から調製されたＲＮＡは、検出可能な量のＰＣＲ産物を与えなかった（図４Ｂ、レーン１を参照）。さらに、逆転写工程を省略すれば、ＰＣＲ産物は明瞭に認められなかった（図４Ｂ、レーン３、５、７を参照）。
【０１２７】
実施例５　上記の救出方法を用いて救出されたＣＤＶからの異種遺伝子の発現
ａ）ルシフェラーゼ遺伝子の発現
ＣＤＶを可能性のあるベクターとしてさらに評価するために、ＣＤＶゲノムｃＤＮＡを修飾して外来遺伝子を受け入れた。まず、９つのヌクレオチド置換を位置３３３０と３３７３との間の領域に導入した（図５Ａ、５Ｂ）。これは、Ｐ遺伝子とＭ遺伝子との間の遺伝間領域（Ｐ／Ｍ遺伝子間領域）に３つの制限酵素部位（ＡａｔＩＩ、ＦｓｅＩおよびＭｌｕＩ）を導入した。これらの部位は、ゲノムｃＤＮＡクローンｐＢＳ−ｒＣＤＶ＋に独特である（図５Ｂ）。これらの塩基置換を含有するウイルス（ｒＣＤＶ＋）が救出された。これは、これらの修飾がウイルスの生存可能性に有意な効果を有しなかったことを示す（データを示していない）。次いで、ＦｓｅＩおよびＭｌｕＩ部位を用いて、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を挿入した。図５Ｂは、プラスミドｐＢＳ−ｒＣＤＶ＋を生成する元々のｒＣＤＶプラスミドベクター（ＰＢＳ−ｒＣＤＶ）になされたヌクレオチド置換を示す。ルシフェラーゼ遺伝子は、修飾され、プラスミドｐｒＣＤＶ−ｍｃｓに挿入した（図５Ｂ）。まず、プラスミドｐＧＬ２−対照（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マジソン）を鋳型として用いてＰＣＲを行い、コード配列を増幅することにより、ルシフェラーゼ遺伝子をクローニング用に調製した。ＰＣＲプライマー（以下のＰＣＲプライマーのリスト、プライマー１および２を参照）は、ｐｒＣＤＶ−ｍｃｓのＦｓｅＩ部位とＭｌｕＩ部位と間に増幅したレポーター遺伝子の挿入を可能にする末端の制限酵素開裂部位を含有した（図５Ｂ）。５’ＰＣＲプライマー（プライマー１）は、また、ＣＤＶ Ｐ／Ｍ遺伝子間転写制御配列の合成コピーに等価である付加的な配列を含有した。３つのプライマーを用いたルシフェラーゼコード配列のＰＣＲ増幅は、Ｐ／Ｍ遺伝子間転写制御配列、５’末端に融合したＦｓｅＩ部位、および３’末端におけるＭｌｕＩ部位を含有するルシフェラーゼ遺伝子を生じた。増幅された配列をｐＢＳ−ｒＣＤＶ−ｍｃｓにクローン化し、引き続くＤＮＡ配列分析は、ルシフェラーゼ遺伝子が正確にクローン化され、ｐＢＳ−ｒＣＤＶ−Ｐ／Ｌｕｃ／Ｍを生じたことを確認した（図５Ｃ）。
【０１２８】
ウイルスプラークは、ルシフェラーゼ遺伝子を含有するｃＤＮＡを救出実験に用いた後に検出した（図４Ａ、ｒＣＤＶ−Ｐ／Ｌｕｃ／Ｍ）。回収されたウイルス（ｒＣＤＶ−Ｐ／Ｌｕｃ／Ｍ）の単離物を、ＣＤＶ配列間の接合部分およびルシフェラーゼ遺伝子に及ぶＲＴ／ＰＣＲ増幅断片を配列決定することにより特徴付けた。これは、この遺伝子が期待されたように組換えウイルスに挿入されたことを示した（データを示していない）。
【０１２９】
ｒＣＤＶ−Ｐ／Ｌｕｃ／Ｍウイルスの５つの異なる単離物（番号１〜５）に感染した細胞から作出された抽出物を用いて、ルシフェラーゼアッセイを行った。ヴェロ（Ｖｅｒｏ）細胞を含有する６ウェルプレートの各ウェルを異なるｒＣＤＶ株に感染させ、７５％またはそれ以上の単層が細胞融合を示した感染から約４８時間後に細胞抽出物を調製した。抽出物は１０４倍に希釈し、５０μｌを分析して、以下のルシフェラーゼの表に示す結果を得た。負の対照試料を希釈せずに分析した。これらはｒＣＤＶおよびｒＣＤＶ−ｍｃｓウイルスを用いた行われた偽感染を含んでいた。ｒＣＤＶ−Ｐ／Ｌｕｃ／Ｍウイルスが救出される場合、Ｌ発現プラスミドを欠く（ｐＣＤＶ−Ｌなし）負の対照トランスフェクションは平行して行われた。この平行した偽救出由来の細胞溶解物を用いて、バックグラウンドレベルのルシフェラーゼ活性しか生じない偽感染を行った。以下のルシフェラーゼの表に示すように、独立したトランスフェクションから回収されたｒＣＤＶ−Ｐ／Ｌｕｃ／Ｍの異なる単離物に感染した細胞で比較的高レベルのルシフェラーゼ活性が観察された（表、番号１〜５を参照）。負の対照は非常に低いバックグラウンドレベルのルシフェラーゼを与えた（ｒＣＤＶ、ｒＣＤＶ＋、Ｌプラスミドなし）。
【０１３０】
【表３】
2004501646.tif 000007
【０１３１】
ｂ）イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）ＶＰ２遺伝子の発現
ＣＰＶ ＶＰ２遺伝子を含有するＣＤＶゲノムプラスミド（図５Ｄおよび以下のフローチャートを参照）を生成した。ＶＰ２遺伝子をクローニングするのに用いたＣＰＶゲノムＤＮＡは、プロテアーゼＫ消化および有機抽出法により、ＣＰＶワクチン株ＦＤ９９（これは、フォート・ドッジ・ラボラトリーズ（Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；アイオワ州フォートドッジ）のイヌワクチン・デュラミューン・マックス（ＤＵＲＡＭＵＮＥ（登録商標）ＭＡＸ）から単離されたＣＰＶ株である）から調製した。ＶＰ２コード配列は、ＣＤＶ Ｐ／Ｍ遺伝子間転写制御配列に等価な配列（プライマー３）に加えて、ＶＰ２コード配列の５’末端に相同性を有する配列を含有する５’プライマー（プライマー４）を用いたＰＣＲにより増幅した。５’および３’プライマー（プライマー３および４）は、また、上記のように、増幅したＶＰ２コード配列をプラスミドｐｒＣＤＶ−ｍｃｓに挿入するのに用いた末端の制限部位を含有した。増幅したＶＰ２ ＤＮＡをクローニングする前に、このＤＮＡの一部をＤＮＡ配列分析に直接用いた。これは、引き続くクローニング工程の間に導入される可能性のあるヌクレオチド変化を含有しないＶＰ２遺伝子用のＤＮＡ配列データを与えた。次に、ＶＰ２ ＰＣＲ産物の残りは、この遺伝子を標準的なクローニングベクター（ｐＢＳＫ（＋））にクローニングするのに用いた。次いで、クローン化されたＶＰ２遺伝子のヌクレオチド配列および結合したＣＤＶ Ｐ／Ｍ遺伝子間転写制御配列を、色素−ターミネーターサイクル配列決定法（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（カリフォルニア州フォスターシティー）のサイクル配列決定試薬）および自動化シーケンサー（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３７７（カリフォルニア州フォスターシティー）を用いたＤＮＡ配列決定により求めた後（ヌクレオチド配列、配列番号３９の図９およびアミノ酸配列、配列番号４０の図１０を参照）、それをＣＤＶゲノムＤＮＡクローン（ｐｒＣＤＶ−ｍｃｓ）中、Ｐ遺伝子とＭ遺伝子との間に移入して、プラスミドｐＢＳ−ｒＣＤＶ−ＶＰ２（図８Ｅ）を生成した。プラスミドｐＢＳ−ｒＣＤＶ−ＶＰ２を用いて、いくつかのウイルス単離物が独立したトランスフェクションから救出された。プライマー７および８（以下）を用いたを用いた逆転写およびＰＣＲ増幅（ＲＴ／ＰＣＲ）増幅によるウイルスゲノムＲＮＡの分析は、これらの株がＶＰ２遺伝子を含有しないことを示した。
【０１３２】
ｒＣＤＶ−ＶＰ２ウイルスがＶＰ２タンパクを発現することを確認するために、ポリクローナル抗体を用いることができる。ポリクローナル抗体は従来の手段で調製することができる。ＶＰ２発現は、ＶＰ２に対する反応性に関するウェスタンブロッティング（２）で決定される。簡単には、正の対照であるＣＰＶに感染させたイヌの腎臓細胞をレムリー緩衝液（バイオ−ラッド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリフォルニア州ハーキュリーズ）中で煮沸するこにより溶解させた。粗製の細胞抽出物中のタンパクを１２％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動させた後、電気泳動的にニトロセルロースメンブレンに移した。このメｍブレンをブロッキング緩衝液（リン酸緩衝食塩水＋５％粉乳（バイオ−ラッド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリフォルニア州ハーキュリーズ））で処理した後、ブロッキング緩衝液に希釈した抗ＣＰＶ抗体を含有するイヌの血清と反応させた。抗原−抗体結合は、ペルオキシダーゼ標識抗イヌ第２抗体（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス）および化学ルミネセンス基質（スーパーシグナル・ウェスト・ピコ・ケミルミネセント・サブストレート（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）、イリノイ州ロックフォード）を用いて検出した。ウェスタンブロットアッセイは、イヌ抗血清がＣＰＶにア感染した細胞由来の６５キロダルトンタンパクと特異的に反応することを示した；この６５ｋＤポリペプチドの相対的な移動度は、ＶＰ２の期待されたサイズと一致した。この方法は、この同じポリペプチド種がｒＣＤＶ−ＶＰ２株に感染させた細胞に存在することを確認するのに用いることができる。
【０１３３】
ｃ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原遺伝子ＨＢｓＡｇの発現
ｐｒＣＤＶ−ＨＢｓＡｇを用いて、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）由来の表面抗原遺伝子を含有するｒＣＤＶの単離物を救出した（図８Ｅ）。プラスミドｐＢＳ−ｒＣＤＶ−ＨＢｓＡｇを調製した。上記の実施例（ａ）および（ｂ）のように、ＨＢｓＡｇコード配列をｐｒＣＤＶ−ｍｃｓのＦｓｅＩ部位とＭｌｕＩ部位との間に挿入することにより、プラスミドｐＢＳ−ｒＣＤＶ−ＨＢｓＡｇを調製した。ＨＢｓＡｇ遺伝子は、プライマー５および６（以下を参照）を用いて、クローン化されたＨＢＶゲノム（ａｙｗ株；ジーンバンク受託番号Ｖ０１４６０；（７５））からＰＣＲにより増幅した。
【０１３４】
プラスミドｐＢＳ−ｒＣＤＶ−ＨＢｓＡｇを用いて、ＨｂｓＡｇ遺伝子を含有するＣＤＶのいくつかの独立して救出された組換え株を単離した。遺伝子特異的なプライマー（プライマー７および８）を用いたＲＴ−ＰＣＲにより、ｒＣＤＶ−ＨＢｓＡｇ単離物（ｒＣＤＶ−ＨＢｓＡｇ−１、−２および−３）由来のウイルスゲノムＲＮＡを分析して、組換え単離物がＨＢｓＡｇ遺伝子を含有することを確認した。組換えウイルスがＨＢｓＡｇ遺伝子を含有することを確認した後、ウェスタンブロット分析を行って、ＨＢｓＡｇ遺伝子が発現されることを裏付けた。図８に示すように、ウェスタンブロット分析は、２４および２７ｋＤであることを示した。ＨｂｓＡｇ株の２７ｋＤ形態は、タンパクのグリコシル化形態である（７６）。ＨＢＶ遺伝子を欠く組換えＣＤＶに感染させた細胞抽出物は、抗体（フィッツジェラルド・インダストリーズ・インターナショナル・インク（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．），マサチューセッツ州コンコード）と反応しなかった。対照として、ブロットを剥ぎ取って、抗ＣＤＶ Ｎタンパク抗体（ヴィー・エム・アール・ディー，インク（ＶＭＲＤ Ｉｎｃ．）、ワシントン州プルマン）で精査した。これは、すべての抽出物がＣＤＶに感染した細胞から調製されたことを確認した。
【０１３５】
ＰＣＲプライマーリスト
１．ルシフェラーゼ遺伝子５’末端
５’−ＴＡＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＡＴＴＡＴＡＡＡＡＡＡＣＴＴＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＡＧＣＣＴＡＡＧＴＣＣＧＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＣＡＴ−３’
（配列番号３１）
ＣＤＶ遺伝子−末端／遺伝子−開始シグナルは下線が引かれ、ＦｓｅＩ部位（ＧＧＣＣＧＧＣＣ）は斜体字で示す。コザック（Ｋｏｚａｋ）（７７）翻訳制御コンセンサス配列をルシフェラーゼＡＴＧ開始コドン（太字）の前に加えた（ＧＣＣＡＣＣ）。
２．ルシフェラーゼ３’末端
５’−ＴＴＴＴＡＣＧＣＧＴＴＴＡＣＡＡＴＴＴＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣ−３’
（配列番号３２）ＭｌｕＩ部位（ＡＣＧＣＧ）は斜体字で示す。
３．ＣＰＶ ＶＰ２ ５’末端
ＴＡＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＡＴＴＡＴＡＡＡＡＡＡＣＴＴＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＡＧＣＣＴＡＡＧＴＣＣＧＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣ（配列番号３３）
プライマー１の説明を参照。
４．ＣＰＶ ＶＰ２ ３’末端
ＴＴＴＴＡＣＧＣＧＴＴＴＡＡＴＡＴＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＧＴＧＣ（配列番号３４）
ＭｌｕＩ部位（ＡＣＧＣＧＴ）は斜体字で示す。
５．ＨＢｓＡｇ ５’末端
ＴＡＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＡＴＴＡＴＡＡＡＡＡＡＣＴＴＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＡＧＣＣＴＡＡＧＴＣＣＧＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＣＡＴＣＡＣＡＴＣＡＧＧＡＴ（配列番号３５）
プライマー１の説明を参照。
６．ＨＢｓＡｇ ３’末端
ＴＴＴＴＡＣＧＣＧＴＴＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＣＡＴＡＧＴＣＡＧＧＣＡＣＧＴＣＡＴＡＡＧＧＡＴＡＧＣＴＡＡＴＧＴＡＴＡＣＣＣＡＡＡＧＡＣＡ（配列番号３６）
ＭｌｕＩ部位（ＡＣＧＣＧ）は斜体字で示す。
７．ＦｓｅＩ部位の５’側
ＡＴＡＡＣＡＴＧＣＴＧＧＣＴＣＴＧＣＴＣ（配列番号３７）
組換えＣＤＶ株のゲノムに挿入された遺伝子のＰＣＲ分析に用いた５’プライマー。外来遺伝子の５’末端に隣接するＣＤＶ配列に特異的。
８．ＭｌｕＩ部位の３’側
ＧＣＴＡＧＴＣＡＧＧＡＧＡＡＣＣＡＴＧＴ（配列番号３８）
組換えＣＤＶ株のゲノムに挿入された遺伝子のＰＣＲ分析に用いた３’プライマー。外来遺伝子の３’末端に隣接するＣＤＶ配列に特異的。
【０１３６】
【表４】
2004501646.tif 000008
【０１３７】
以下に与えるのは参考文献（これらは本明細書の一部をなす）のリストである。　参考文献
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３２． Ｎａｇａｉ， Ｙ．， ａｎｄ Ａ． Ｋａｔｏ． １９９９． Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｓ ｃｏｍｉｎｇ ｏｆ ａｇｅ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４３： ６１３−６２４．
３３． Ｏｇｌｅｓｂｅｅ， Ｍ． Ｊ．， Ｈ． Ｋｅｎｎｅｙ， Ｔ． Ｋｅｎｎｅｙ， ａｎｄ Ｓ． Ｋｒａｋｏｗｋａ． １９９３． Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ ｇｅｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＲＮＡｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｓｔａｂｌｅ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９２： ５５６−５６７．
３４． Ｐａｒｄｏ， Ｍ． Ｃ．， Ｊ． Ｅ． Ｂａｕｍａｎ， ａｎｄ Ｍ． Ｍａｃｋｏｗｉａｋ． １９９７． Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｇｓ ａｇａｉｎｓｔ ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｂｙ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｃａｎａｒｙｐｏｘ ｖｉｒｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ ｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊ． Ｖｅｔ． Ｒｅｓ． ５８： ８３３−８３６．
３５． Ｐａｒｋｓ， Ｃ． Ｌ．， Ｒ． Ａ． Ｌｅｒｃｈ， Ｐ． Ｗａｌｐｉｔａ， Ｍ． Ｓ． Ｓｉｄｈｕ， ａｎｄ Ｓ． Ａ． Ｕｄｅｍ． １９９９． Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｃＤＮＡ ｒｅｓｃｕｅ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３： ３５６０−３５６６．
３６． Ｐａｒｋｓ， Ｃ． Ｌ．， Ｒ． Ａ． Ｌｅｒｃｈ， Ｐ． Ｗａｌｐｉｔａ， Ｈ． Ｗａｎｇ， Ｍ． Ｓ． Ｓｉｄｈｕ， ａｎｄ Ｓ． Ａ． Ｕｄｅｍ． ２０００． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｒｏｍ Ｍｅａｓｌｅｓ Ｖｉｒｕｓ Ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｌｉｎｅａｇｅ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ．
３７． Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ， Ｊ． Ｂ．， Ｄ． Ｔｈｏｍａｓ， Ｈ． Ｌｅｗｉｃｋｉ， Ｍ． Ａ． Ｂｉｌｌｅｔｅｒ， ａｎｄ Ｍ． Ｂ． Ａ． Ｏｌｄｓｔｏｎｅ． ２０００． Ｖ ａｎｄ Ｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｓ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６７： ８０−８９．
３８． Ｐａｔｔｎａｉｋ， Ａ． Ｋ．， Ｌ． Ａ． Ｂａｌｌ， Ａ． Ｗ． ＬｅＧｒｏｎｅ， ａｎｄ Ｇ． Ｗ． Ｗｅｒｔｚ． １９９２． Ｕｓｅ ｏｆ Ｔ７ ｐｈａｇｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｎｄ ｈｅｐａｔｉｔｓ ｄｅｌｔａ ｖｉｒｕｓ ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ． Ｃｅｌｌ ６９： １０１１２０．
３９． Ｐｅｋｏｓｚ， Ａ．， ａｎｄ Ｒ． Ａ． Ｌａｍｂ． １９９９． Ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ： Ｃｌｏｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃｉｒｃｌｅ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６： ８８０４−８８０６．
４０． Ｒａｄｅｃｋｅ， Ｆ．， ａｎｄ Ｍ． Ａ． Ｂｉｌｌｅｔｅｒ． １９９７． Ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｍｅｅｔｓ ｔｈｅ ｎｏｎｓｅｇｍｅｎｔｅｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ． Ｒｅｖ． Ｍｅｄ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７： ４９−６３．
４１． Ｒａｄｅｃｋｅ， Ｆ．， Ｐ． Ｓｐｉｅｌｈｏｆｅｒ， Ｈ． Ｓｃｈｍｅｉｄｅｒ， Ｋ． Ｋａｅｌｉｎ， Ｍ． Ｈｕｂｅｒ， Ｃ． Ｄｏｔｓｃｈ， Ｇ． Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ， ａｎｄ Ｍ． Ａ． Ｂｉｌｌｅｔｅｒ． １９９５． Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ ｃｌｏｎｅｄ ＤＮＡ． ＥＭＢＯ Ｊ． １４： ５７７３−５７８４．
４２． Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ａ．， ａｎｄ Ｊ． Ｋ． Ｒｏｓｅ． １９９８． Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｎｅｇａｔｉｖｅｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡｓ ： ａ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｐｐｒｏａｃｈ ｒｅｖｉｔａｌｉｚｅｓ ａ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆｉｅｌｄ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４７： １−６．
４３． Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｈ．， Ｐ． Ｓｐｉｅｌｈｏｆｅｒ， Ｋ． Ｋａｅｌｉｎ， Ｃ． Ｄｏｔｓｃｈ， Ｆ． Ｒａｄｅｋｅ， Ｇ． Ｓｕｔｔｅｒ， ａｎｄ Ｍ． Ａ． Ｂｉｌｌｅｔｅｒ． １９９７． Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｖａｃｃｉｎｉａ−Ｔ７ ｖｅｃｔｏｒ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６４： ５７−６４．
４４． Ｓｃｈｎｅｌｌ， Ｍ． Ｊ．， Ｔ． Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ， ａｎｄ Ｋ．−Ｋ． Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ． １９９４． Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ ｃｌｏｎｅｄ ｃＤＮＡ． ＥＭＢＯ Ｊ． １３： ４１９５４２０３．
４５． Ｓｉｄｈｕ， Ｍ． Ｓ．， Ｊ． Ｃｈａｎ， Ｋ． Ｋａｅｌｉｎ， Ｐ． Ｓｐｉｅｌｈｏｆｅｒ， Ｆ． Ｒａｄｅｃｋｅ， Ｈ． Ｓｃｈｎｉｅｄｅｒ， Ｍ． Ｍａｓｕｒｅｋａｒ， Ｐ． Ｃ． Ｄｏｗｌｉｎｇ， Ｍ． Ａ． Ｂｉｌｌｅｔｅｒ， ａｎｄ Ｓ． Ａ． Ｕｄｅｍ． １９９５． Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｅａｌｓｅｓ ｖｉｒｕｓ ｍｉｎｉｒｅｐｌｉｃｏｎｓ： ｍｅａｓｌｅｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ｔｅｒｍｉｎｉ ｄｉｒｅｃｔ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０８： ８００−８０７．
４６． Ｓｉｄｈｕ， Ｍ． Ｓ．， Ｗ． Ｈｕｓａｒ， Ｓ． Ｄ． Ｃｏｏｋ， Ｐ． Ｃ． Ｄｏｗｌｉｎｇ， ａｎｄ Ｓ． Ａ． Ｕｄｅｍ． １９９３． Ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｔｅｒｍｉｎａｌ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｎｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｄｉｎｇ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ： ｃｏｍｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｔｉｒｅ ＣＤＶ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９３： ６６−７２．
４７． Ｓｉｄｈｕ， Ｍ． Ｓ．， Ｊ． Ｐ． Ｍｅｎｏｎｎａ， Ｓ． Ｄ． Ｃｏｏｋ， Ｐ． Ｃ． Ｄｏｗｌｉｎｇ， ａｎｄ Ｓ． Ａ． Ｕｄｅｍ． １９９３． Ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ Ｌ ｇｅｎｅ： Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｒｅｌａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９３： ５０−６５．
４８． Ｓｉｘｔ， Ｎ．， Ａ． Ｃａｒｄｏｓｏ， Ａ． Ｖａｌｌｉｅｒ， Ｊ． Ｆａｙｏｌｌｅ， Ｒ． Ｂｕｃｋｌａｎｄ， ａｎｄ Ｔ． Ｆ． Ｗｉｌｄ． １９９８． Ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｈｕｍｏｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｇａｉｎａｓｔ ａ ｌｅｔｈａｌ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２： ８４７２−８４７６．
４９． Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓ， Ｍ． Ｈ．， Ａ． Ｐ． Ｄｕｒｂｉｎ， Ｊ． Ｍ． Ｔａｔｅｍ， Ｓ．−Ｌ． Ｗｕ， Ｍ． Ｐａｓｃｈａｌｉｓ， Ｔ． Ｔａｏ， Ｐ． Ｌ． Ｃｏｌｌｉｎｓ， ａｎｄ Ｂ． Ｒ． Ｍｕｒｐｈｙ． １９９８． Ｔｈｒｅｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐａｒｉｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ３ ｃｐ４５ ｌｉｖｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｉｔｓ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： １７６２１７６８．
５０． Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓ， Ｍ． Ｈ．， Ｓ． Ｓｕｒｍａｎ， Ｊ． Ｍ． Ｔａｔｅｍ， Ｍ． Ｐａｓｃｈａｌｉｓ， Ｓ．−Ｌ． Ｗｕ， Ｓ． Ａ． Ｕｄｅｍ， Ａ． Ｐ． Ｄｕｒｂｉｎ， Ｐ． Ｌ． Ｃｏｌｌｉｎｓ， ａｎｄ Ｂ． Ｒ． Ｍｕｒｐｈｙ． １９９９． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ， ｃｏｌｄ−ａｄａｐｔｅｄ， ａｎｄ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｆ ｌｉｖｅａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｃｏｌｄ−ｐａｓｓａｇｅ ４５ （ｃｐ４５） ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ３ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３： １３７４−１３８１．
５１． Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ， Ｃ． Ｂ．， Ｊ． Ｗｅｌｔｅｒ， Ｓ． Ｒ． Ｔｈａｋｅｒ， Ｊ． Ｔａｙｌｏｒ， Ｊ． Ｔａｒｔａｇｌｉａ， ａｎｄ Ｅ． Ｐａｏｌｅｔｔｉ． １９９７． Ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ （ＣＤＶ） ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｒｒｅｔｓ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｔｅｓｔｉｎｇ ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ： ＮＹＶＡＣ−ａｎｄ ＡＬＶＡＣ−ｂａｓｅｄ ＣＤＶ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ ｐｒｏｔｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１： １５０６−１５１３．
５２． Ｓｕｍｍｅｒｓ， Ｂ． Ａ．， ａｎｄ Ｊ． Ｇ． Ａｐｐｅｌ． １９９４． Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ． Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ２０： ５２５−５３４．
５３． Ｔｏｂｅｒ， Ｃ．， Ｍ． Ｓｅｕｆｅｒｔ， Ｈ． Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｍ． Ａ． Ｂｉｌｌｅｔｅｒ， Ｉ． Ｃ． Ｄ． Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， Ｓ． Ｎｉｅｗｉｅｓｋ， Ｔｅｒ Ｍｅｕｌｅｎ．， ａｎｄ Ｓ． Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ−Ｓｃｈａｕｌｉｅｓ． １９９８． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ Ｖ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｖｉｒａｌ ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ８１２４８１３２．
５４． Ｔｏｇｎｏｎ， Ｍ．， Ｅ． Ｍ． Ｃａｔｔｏｚｚｏ， Ｓ． Ｂｉａｎｃｈｉ， ａｎｄ Ｍ． Ｇ． Ｒｏｍａｎｅｌｌｉ． １９９６． Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ＨＳＶ−ＤＮＡ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ， ｉｎ Ｖｅｒｏ ａｎｄ ＲＳ ｃｅｌｌｓ， ｂｙ ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ． Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ １２： １９３−１９７．
５５． Ｕｄｅｍ， Ｓ． Ａ． １９８４． Ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ： ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８： １２３−１３６．
５６． Ｖａｌｓａｍａｋｉｓ， Ａ．， Ｈ． Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｐ． Ｇ． Ａｕｗａｅｒｔｅｒ， Ｈ． Ｋａｎｅｓｈｉｍａ， Ｍ． Ａ． Ｂｉｌｌｅｔｅｒ， ａｎｄ Ｄ． Ｅ． Ｇｒｉｆｆｉｎ． １９９８． Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓｅｓ ｗｉｔｈ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃ， Ｖ， ｏｒ Ｆ ｇｅｎｅ ｈａｖｅ ａｌｔｅｒｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ７７５４−７７６１．
５７． Ｖａｎｄｅｖｅｌｄｅ， Ｍ．， ａｎｄ Ａ． Ｚｕｂｒｉｇｇｅｎ． １９９５． Ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｖｅｔ． Ｍｉｃｒｏ．： ２７１−２８０．
５８． Ｗｅｒｔｚ， Ｇ． Ｗ．， Ｖ． Ｐ． Ｐｅｒｅｐｅｌｉｔｓａ， ａｎｄ Ｌ． Ａ． Ｂａｌｌ． １９９８． Ｇｅｎｅ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｌｅｔｈａｌｉｔｙ ｏｆ ａ ｎｏｎｓｅｇｍｅｎｔｅｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５： ３５０１−３５０６．
５９． Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ， Ｓ． Ｓ．， Ｃ．−Ｙ Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅ， Ｐ． Ｌ． Ｃｏｌｌｉｎｓ， ａｎｄ Ｂ． Ｒ． Ｍｕｒｐｈｙ． １９９８． Ａ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｓｔａｒｔ ｓｉｇｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｍ２ ｇｅｎｅ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｉｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｃｐｔｓ２４８／４０４ ｉｓ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４７： ２３２−２３９．
６０． Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ， Ｓ． Ｓ．， Ｃ． Ｙ． Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅ， Ｒ． Ａ． Ｋａｒｒｏｎ， Ｊ． Ｅ． Ｃｒｏｗｅ， Ｗ． Ｒ． Ｅｌｋｉｎｓ， Ｐ． Ｌ． Ｃｏｌｌｉｎｓ， ａｎｄ Ｂ． Ｒ． Ｍｕｒｐｈｙ． １９９９． Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｉｓｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ Ｌ ｇｅｎｅ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ （ＲＳＶ） ｃｐｔｓ５３０／１０３０ ｔｏ ＲＳＶ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｃｐｔｓ２４８／４０４ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｉｔｓ ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３： ８７１８７７．
６１． Ｗｙａｔｔ， Ｌ． Ｓ．， Ｂ． Ｍｏｓｓ， ａｎｄ Ｒ． Ｓ． １９９５． Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１０： ２０２−２０５．
６２． Ｙｏｕｎｇ， Ｓ． Ｌ．， Ｌ． Ｂａｒｂｅｒａ， Ａ． Ｈ． Ｋａｙｎａｒｄ， Ｒ． Ｐ． Ｈａｕｇｌａｎｄ， Ｈ． Ｃ． Ｋａｎｇ， Ｍ． Ｂｒｉｎｋｌｅｙ， ａｎｄ Ｍ． Ｈ． Ｍｅｌｎｅｒ． １９９１． Ａ ｎｏｎ ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９７： ４０１−４０７．
６３． Ｂａｒｏｎ， Ｍ． Ｄ．， ａｎｄ Ｂａｒｒｅｔｔ， Ｔ． （１９９７）． Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ｃｌｏｎｅｄ ｃＤＮＡ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ， ７１，１２６５−１２７１．
６４． Ｃｌａｒｋｅ， Ｄａｖｉｄ Ｋ．， Ｓｉｄｈｕ， Ｍｏｈｉｎｄｅｒｉｊｉｔ Ｓ．， Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｅｒｉｋ Ｊ．， ａｎｄ Ｕｄｅｍ， Ｓｔｅｐｈｅｎ Ａ． （２０００）． Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｍｕｍｐｓ Ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ｃＤＮＡ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． ７４： ４８３１−４８３８．
６５． Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｐ． Ｌ．， Ｈｉｌｌ， Ｍ． Ｇ．， Ｃａｍａｒｇｏ， Ｅ．， Ｇｒｏｓｆｉｅｌｄ， Ｈ．， Ｃｈａｎｏｃｋ， Ｒ． Ｍ．， ａｎｄ Ｍｕｒｐｈｙ， Ｂ． Ｒ． （１９９５）． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ｃｌｏｎｅｄ ｃＤＮＡ ｃｏｎｆｉｒｍｓ ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ５”ｐｒｏｘｉｍａｌ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｍ２ ｍＲＮＡ ｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２； １１５６３−１１５６７．
６６． Ｇａｒｃｉｎ， Ｄ．， Ｐｅｌｅｔ， Ｔ．， Ｃａｌａｉｎ， Ｐ．， Ｓａｋａｉ， Ｙ．， Ｓｈｉｏｄａ， Ｔ．， Ｒｏｕｘ， Ｌ．， Ｃｕｒｒａｎ， Ｊ．， Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ， Ｄ． （１９９５）． Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｓｅｎｄｉａ ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ｃＤＮＡ ：； ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｃｏｐｙｂａｃｋ ｎｏｎｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｖｉｒｕｓ． ＥＭＢＯ Ｊ． １４： ６０８７−６０９４．
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【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】図１は、ＣＤＶ救出用に調製されたプラスミドＤＮＡの組織化を示す図である。図１Ａは全長ＣＤＶクローンｐＢＳ−ｒＣＤＶの概略図である。ＣＤＶゲノムにおける遺伝子領域は、白文字および遺伝子境界を有する黒色のボックスとして描かれている。ＣＤＶリーダーおよびトレーラー配列は、ＣＤＶゲノムの末端に白色のボックスとして描かれている。ゲノムは、プラスミドベクター中で、ゲノムの５’末端に隣接するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（灰色のボックス）からの正方向ＲＮＡの合成を導くように配向している。デルタ肝炎ウイルス・リボザイム配列（図１Ａの斜線を引いたボックス；ビーン（Ｂｅｅｎ）ら、１９９７（５）を参照）および２つのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼターミネーター（灰色のボックス）は、正方向ｃＤＮＡの３’末端に隣接する。クローニングに用いた制限酵素消化部位は斜体字で示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＣＤＶミニレプリコン（ｐＣＤＶ−ＣＡＴ）を示す。ミニレプリコンは、ウイルスｃＤＮＡクローンの調製に用いた同じベクター中に調製した。１０７ヌクレオチドＣＤＶリーダーおよび１０６ヌクレオチドトレーラー（白いボックス）が隣接するＣＡＴレポーター遺伝子は、ＮｏｔＩおよびＮａｒＩ部位の間に挿入した（方法）。ミニレプリコンｃＤＮＡの配向は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ転写後の負方向ミニレプリコンＲＮＡを生じる。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＭＶＡ／Ｔ７（６１）に感染した細胞中でＮ、ＰまたはＬ遺伝子の発現を導くように調製したＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ依存プラスミドベクター（２９）を示す。ｃＤＮＡ挿入物は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ転写物の翻訳を容易にするために初期リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）の３’側にクローン化する。ひと続きの５０アデノシン残基が３’末端に位置し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼターミネーターが続く。
【図２Ａ】図２Ａは、実施例３．１．１に記載したＣＤＶ−ＣＡＴミニレプリコン発現実験を定量するために行ったＣＡＴアッセイの結果を表示するオートラジオグラムである。２Ａでは、細胞は２０μｇのミニレプリコンＲＮＡでトランスフェクトし、ＣＤＶ−ＣＡＴミニレプリコン活性はＣＤＶによる感染で駆動した。レーン１のアッセイは、ＣＤＶに感染していない負の対照に由来するものであった。レーン２は、ＣＤＶ感染による駆動される特定のミニレプリコン活性のレベルを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、実施例３．１．２に記載したＣＤＶ−ＣＡＴミニレプリコン発現実験を定量するために行ったＣＡＴアッセイの結果を表示するオートラジオグラムである。２Ｂでは、細胞はＣＤＶミニレプリコンＲＮＡ（２０μｇ）＋Ｔ７発現プラスミドｐＣＤＶ−Ｎ（１μｇ）、ｐＣＤＶ−Ｐタンパク（１μｇ）およびｐＣＤＶ−Ｌ（図に示す質量）でトランスフェクトした。負の対照はレーン１（Ｎ、ＰまたはＬ発現ベクターなし）およびレーン２（Ｌ発現ベクターなし）に示す。レーン３〜５は、増大量のＬ発現ベクターをこれらのトランスフェクションに用いたこと以外は、同じトランスフェクションに由来するものであった。
【図３Ａ】図３Ａは、実施例３．１．３に記載したｐＣＤＶ−ＣＡＴプラスミドＤＮＡのトランスフェクション後のＣＤＶ−ＣＡＴミニレプリコン活性に関するＣＡＴアッセイの結果を表示する蛍光イメージである。３Ａの結果は、ミニレプリコン活性に対するインキュベーション温度の効果を示している。図３Ａの相対的活性はレーン８に与えた値に対して表す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、実施例３．１．４に記載したｐＣＤＶ−ＣＡＴプラスミドＤＮＡのトランスフェクション後のＣＤＶ−ＣＡＴミニレプリコン活性に関するＣＡＴアッセイの結果を表示するオートラジオグラムである。図３Ｂは、ミニレプリコン発現に対するヒートショックの有益な効果を示す。３ＢのＣＡＴ活性値はレーン２に対して表す。
【図４Ａ】図４Ａは、実施例４．１に記載した組換えｒＣＤＶの救出からの２つの代表的なプラークを表す。第１（左）のプラークは、オンデルシュテプール（Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ）株のゲノムｃＤＮＡから救出されたｒＣＤＶであった（ｐＢＳ−ｒＣＤＶ）。ｒＣＤＶ−Ｐ／Ｌｕｃ／Ｍと表示した第２（右）のプラークは、図５Ａに記載したルシフェラーゼ遺伝子を含有する組換え株である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、実施例４．２に記載した上記の実験から救出された株に由来するＲＴ／ＰＣＲ増幅産物の分析からの結果を表す。レーン１〜７は、ＣＤＶゲノム上の１９７８と２６０４との間の領域から増幅されたＲＴ／ＰＣＲ反応の生成物を示す。レーン１における負の対照（−Ｌ）は、ｐＣＤＶ−ＬベクターＤＮＡを用いずに行った救出実験に由来する同時培養物から誘導されたＲＮＡを用いて得られたＲＴ／ＰＣＲ結果であった。レーン３、５および７は、ＲＴ−ＰＣＲのＲＴ工程が省略されている負の対照であった。レーン８〜１０は、レーン２、４および６におけるＤＮＡと同じ試料のＢｓｔＢＩ消化の結果を示す。ＰＣＲフラグメントの消化は約３１５塩基対の二本線を与え、未消化のフラグメントは６３０塩基対である。
【図５】図５は、６つの説明図（Ａ〜Ｆ）を含む。パート（Ａ）は、全長ｃＤＮＡクローン中に存在するＣＤＶゲノムの構造を示す。パート（Ｂ）では、この領域がプラスミドｐｒＣＤＶ−ｍｃｓ中に見出される多数のクローニング部位を生成するようにどのように変更されたかを示すために、Ｍ／Ｆ遺伝子間領域の一部が示されている（ヌクレオチド３３２０〜３３８０）。太字で示すヌクレオチドは、制限部位を生成するように変更した。パート（Ｃ〜Ｅ）は、外来遺伝子がＦｓｅＩとＭｌｕＩ部位との間のｐｒＣＤＶ−ｍｃｓにどのように挿入されたかを示す。Ｍ／Ｆ遺伝子−末端／遺伝子−開始シグナルの合成コピーは、ＰＣＲ増幅の間に外来遺伝子の５’末端に加えた。（Ｆ）において、外来遺伝子（Ｘ）のゲノム位置がＣＤＶゲノム上に示されている。命名法：ｒＣＤＶは組換えウイルス株を意味し、ｐｒＣＤＶはウイルスｃＤＮＡ配列を含有するプラスミド（ｐＢＳ−ｒＣＤＶ）を意味する。
【図６】図６は、ＣＤＶのｃＤＮＡクローンに関する全ヌクレオチド配列（配列番号２）を表す。
【図７】図７は、ＣＤＶ全長ゲノムクローンに関する全配列（ＣＤＶゲノム＋ベクター；ＣＤＶ配列２１９９〜１７８８８；全長１８８２６塩基対）（配列番号３）を表す。
【図８】図８は、実施例５（ｃ）に従って、ｒＣＤＶおよびｒＣＤＶ−ＨＢｓＡｇ株に感染した細胞からの抽出物中に見出されるタンパクのウェスタンブロット分析を表す。ｒＣＤＶ−ＨＢｓＡｇ−１、２および３は、プラスミドｐｒＣＤＶ−ＨＢｓＡｇで行った独立したトランスフェクションから単離したことに注意。
【図９】図９は、ＣＰＶ ＶＰ２コード領域のヌクレオチド配列（配列番号４）を表す。
【図１０】図１０は、ＣＰＶ ＶＰ２推定アミノ酸配列（配列番号５）を表す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図７Ａ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004501646.tif 000133
【国際調査報告】
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2004501646.tif 000135
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