(57)【要約】本発明は、モノネガウイルス目のウイルスにおいてプロモーターから遠位に位置する遺伝子の発現量を増大させる方法ならびにこうした方法によって構築される組換えウイルスを提供するものである。更に、モノネガウイルス目のウイルスを弱毒化する方法、及びワクチンとして有用な弱毒化ウイルスを構築スル方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノネガウイルス目のウイルスのプロモーターから遠位に位置する遺伝子の発現量を増大させるための方法であって、
前記プロモーターから遠位に位置する遺伝子を野性型ウイルスの３’末端側のプロモーターの近位の部位に近づく方向に移動させることによって前記ウイルスの遺伝子の順序を再編成する工程を含む方法。
【請求項２】
前記遠位遺伝子は表面糖タンパク質の遺伝子である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記モノネガウイルス目のウイルスはラブドウイルスである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ラブドウイルスは、狂犬病ウイルス及び水疱性口内炎ウイルスからなる群から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記モノネガウイルス目のウイルスはパラミクソウイルスである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記パラミクソウイルスは、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、及び呼吸系発疹ウイルスからなる群から選択される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記呼吸系発疹ウイルスは、ヒト呼吸系発疹ウイルス及びウシ呼吸系発疹ウイルスからなる群から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記モノネガウイルス目のウイルスはフィロウイルスである請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記フィロウイルスはエボラウイルス及びマールブルグウイルスからなる群から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ゲノムが再編成されたモノネガウイルス目の組換えウイルスであって、前記ゲノムは前記ウイルスのプロモーターの遠位の遺伝子を野性型ウイルスの３’末端側のプロモーターの近位の部位に近づく方向に移動させることによって再編成される組換えウイルス。
【請求項１１】
前記プロモーターの遠位の遺伝子は表面糖タンパク質である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記モノネガウイルス目のウイルスはラブドウイルスである請求項１０に記載の組換えウイルス。
【請求項１３】
前記ラブドウイルスは、狂犬病ウイルス及び水疱性口内炎ウイルスからなる群から選択される請求項１２に記載の組換えウイルス。
【請求項１４】
前記モノネガウイルス目のウイルスはパラミクソウイルスである請求項１０に記載の組換えウイルス。
【請求項１５】
前記パラミクソウイルスは、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、及び呼吸系発疹ウイルスからなる群から選択される請求項１４に記載の組換えウイルス。
【請求項１６】
前記呼吸系発疹ウイルスは、ヒト呼吸系発疹ウイルス及びウシ呼吸系発疹ウイルスからなる群から選択される請求項１５に記載の組換えウイルス。
【請求項１７】
前記モノネガウイルス目のウイルスはフィロウイルスである請求項１０に記載の組換えウイルス。
【請求項１８】
前記フィロウイルスはエボラウイルス及びマールブルグウイルスからなる群から選択される請求項１７に記載の組換えウイルス。
【請求項１９】
防御的免疫応答を加速かつ増強させる処置を必要とする患者において当該免疫応答を加速かつ増強させるための方法であって、
請求項１０に記載の組換えウイルスの薬学的な有効量を前記患者に投与する工程を含む方法。
【請求項２０】
モノネガウイルス目のウイルスを弱毒化するための方法であって、
所定の遺伝子を野性型ウイルスにおける位置から遠くに移動させることによって遺伝子の順序を再編成する工程を含む方法。
【請求項２１】
モノネガウイルス目のウイルスを弱毒化するための方法であって、
野性型ウイルスにおける３’末端側のプロモーターの近位の部位から遠ざかる方向に所定の遺伝子を移動させることによって前記ウイルスの遺伝子順序を再編成する工程であって、前記所定の遺伝子はゲノムの複製に不可欠な律速因子である工程を含む方法。
【請求項２２】
前記不可欠律速因子はヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記不可欠律速因子の遺伝子は前記ウイルスの遺伝子順序において最後から２番目の位置に配される請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
請求項２１の方法に基づいて弱毒化されたウイルス。
【請求項２５】
ワクチンとして有用なモノネガウイルス目の弱毒化ウイルスを構築するための方法であって、
野性型ウイルスにおける３’末端側のプロモーターの近位の部位から遠ざかる方向に所定の遺伝子を移動させることによって前記ウイルスの遺伝子順序を再編成する工程であって、前記所定の遺伝子はゲノムの複製に不可欠な律速因子である工程と、
免疫応答誘導抗原をコードした遺伝子を前記ウイルスの遺伝子順序の３’末端に最も近い位置に配することによりワクチン用の弱毒化ウイルスを構築する工程とを含む方法。
【請求項２６】
前記不可欠律速因子はヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記不可欠律速因子の遺伝子は前記ウイルスの遺伝子順序において最後から２番目の位置に配される請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
免疫応答誘導抗原をコードした前記遺伝子は、付着用糖タンパク質（Ｇ）遺伝子、融合遺伝子、またはヘマグルチニン／ノイラミニダーゼ遺伝子からなる群から選択される請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
請求項２５の方法に基づいて弱毒化されたウイルス。
【請求項３０】
前記モノネガウイルス目のウイルスはラブドウイルスである請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記ラブドウイルスは狂犬病ウイルスまたは水疱性口内炎ウイルスである請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記モノネガウイルス目のウイルスはパラミクソウイルスである請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記パラミクソウイルスは、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、及び呼吸系発疹ウイルスからなる群から選択される請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記呼吸系発疹ウイルスは、ヒト呼吸系発疹ウイルス及びウシ呼吸系発疹ウイルスからなる群から選択される請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記モノネガウイルス目のウイルスはフィロウイルスである請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
前記フィロウイルスはエボラウイルス及びマールブルグウイルスからなる群から選択される請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ワクチンとして有用な前記弱毒化ウイルスは、該ウイルスの致死量と防御反応誘導量が約１０００倍異なるように弱毒化されている請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願情報
本願は２０００年６月２３日出願の米国特許出願第０９／６０２，２８８号の一部継続出願であり、米国特許法１２０条に基づき当該出願の出願日にその出願日を遡及するものである。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は一般的には分子ウイルス学及びワクチン学の分野に関するものである。より詳細には本発明は、遺伝子の再編成によるマイナス鎖ＲＮＡウイルスの弱毒化ならびに当該ウイルスの使用方法に関するものである。
【０００３】
関連技術の説明
モノネガウイルス目は、ラブドウイルス科、パラミクソウイルス科、フィロウイルス科、及びボルナウイルス科の４科よりなる。これらの科に属するウイルスは非分節型のマイナス鎖の一本鎖ＲＮＡを有し、魚類、植物、動物において様々な重要な疾患の原因となっている（Ｗａｇｎｅｒ， １９９６）。これらのウイルスによってコードされる遺伝子の発現は、３’末端側の１個のプロモーターに対するゲノム上の遺伝子の順序によって転写レベルで制御されている。モノネガウイルス目のウイルスは遺伝子の発現を制御する優れて単純な手段を有している。このウイルス目が有する直線状の一本鎖ＲＮＡゲノムは５〜１０個の遺伝子をコードし、その順序はこのウイルス目のすべてのウイルスにおいてよく保存されている。ウイルスゲノムの転写はウイルスがコードするＲＮＡ依存型ＲＮＡポリメラーゼによって行われる。この直線状ゲノム上にあるＲＮＡポリメラーゼの進入部位は１個だけであるにも関わらずウイルスの各ｍＲＮＡは等モル量で生成するわけではない。
【０００４】
個々の遺伝子の発現レベルがゲノム上の遺伝子の直線的順序によって制御されていることを示す証拠が示されている。転写はゲノムの３’末端の１個のポリメラーゼ進入部位にて開始され、常にプロセッシブである（Ｂａｌｌ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ， １９７６）。モノシストロニックなｍＲＮＡとしての個々の遺伝子の発現レベルは、ポリメラーゼが３’から５’方向にゲノム上を移動する際の各遺伝子間の接合部におけるポリメラーゼの解離（約３０％の頻度）によって制御されている（Ｉｖｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｒｏｓｅ， １９８１）。このような転写のメカニズムにより、ゲノムの３’末端からの遺伝子の距離が大きくなるにしたがって転写産物の量は順次少なくなる。このため、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質のようにウイルスが複製を行う際に化学量論的な量が必要とされる遺伝子産物は常に３’末端またはその近傍にコードされており、その発現モル量は最大である（Ｖｉｌｌａｒｒｅａｌ ｅｔ ａｌ．， １９７６， Ｂａｌｌ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ， １９７６）。また、ＲＮＡポリメラーゼのように酵素的な量を必要とする遺伝子産物は３’末端から最も遠い位置にコードされている。モノネガウイルス目のすべてのウイルスでは、ポリメラーゼ遺伝子が最も５’末端側の遺伝子であり、その発現量は最も少ない。ウイルスの複製が最適に行われるためにはタンパク質のモル比は正確でなければならない。複製が支障なく行われるには、各タンパク質が通常ゲノムから発現されるものに近いモル比で発現される必要がある（Ｐａｔｔｎａｉｋ ａｎｄ Ｗｅｒｔｚ， １９９０）。
【０００５】
モノネガウイルス目のウイルスでは相同的な遺伝子組換えは起こらない（Ｐｒｉｎｇｌｅ， １９８７）。したがって、ゲノムの一部が欠損した欠陥干渉ウイルス粒子以外には、遺伝子の全体が再編成された変異体は自然界では観察されていない。
【０００６】
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）はラブドウイルス科の典型的なウイルスである。このウイルスの１１キロベースのゲノムは、ウイルスの５種類の構造タンパク質すなわち、複製されたＲＮＡを封入するために化学量論的な量を要するヌクレオカプシドタンパク質であるＮ、ＲＮＡ依存型ＲＮＡポリメラーゼであるＬの補因子である燐タンパク質Ｐ、基質タンパク質であるＭ、及び、付着用の糖タンパク質であるＧをコードしている。ゲノム内の遺伝子の順序は３’−Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｇ−Ｌ−５’であり、３’末端側の１個のプロモーターから必ず順に発現することがこれまでの研究によって示されている。各遺伝子接合部における減衰によって、プロモーターから遠い位置にある遺伝子と比較して最も３’末端側に位置する遺伝子の転写産物がより多くなる（Ｉｖｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｒｏｓｅ， １９８１）。
【０００７】
自然界ではＶＳＶは様々な動物に感染するが、その内、ウマ、ウシ、ブタが経済的に最も重要である。感染によって口、蹄、乳頭の周辺に病変を生ずる。この疾患は生命に関わることは稀であるが、食肉や乳の生産が低下するうえに検疫や予防ワクチン接種のコストがかかる。ＶＳＶには主にインディアナ（Ｉｎｄ）とニュージャージー（ＮＪ）の２種類の血清型がある。これらのウイルスは中南米諸国に固有であるが、米国内においても流行が見られる。最近の米国内での流行は１９９７年にウマで発生したものであり、血清型がＩｎｄのものであるが、それ以前の１９９５年及び１９８２〜１９８３年に起きた例では血清型はＮＪであった。これらのウイルスが容易に感染すること、及び、この病気の症状がウシやブタにおける口蹄疫ウイルスによる症状に類似していることから、ＶＳＶは畜産業における病原体として関心を集めている。
【０００８】
病気の症状を発現することなく複製によって防御的体液性免疫ならびに細胞性免疫を引き起こすことが可能な生きた弱毒化ウイルスは、天然痘、黄熱病、及びポリオなどのウイルスに対して有効なワクチンであることが示されている。しかしながら弱毒化のプロセスは多分に経験的なものであり、ワクチンの幅広い使用を可能とするうえで必要な再現性を有するものではなかった。ＲＮＡウイルスの場合、ＲＮＡ依存型ＲＮＡポリメラーゼの高いエラー発生率、プルーフリードが行われないこと、及び、ＲＮＡウイルス群のｑｕａｓｉｓｐｅｃｉｅｓとしての性質（Ｄｏｍｉｎｇｏ ｅｔ ａｌ．， １９９６）といった更なる考慮条件が、この医学的に重要な大きな病原体群に対する生きた弱毒化ウイルスの使用を困難なものとしている。これは、ワクチンウイルスが限られた数の１塩基変異に基づいたものである場合、病原性ウイルスへの復帰変異が問題となることから特にそうである。例えば、わずか数回の復帰変異によって３型サビンポリオウイルスワクチン株は病原性を回復する（Ｗｉｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。
【０００９】
従来技術は、モノネガウイルス目のウイルスを弱毒化し、モノネガウイルス目のウイルスにおいてプロモーターから遠くに位置する遺伝子の発現を増大させる有効な手段を欠くことから充分なものとはいえなかった。本発明は当該技術分野におけるこのような以前からの要請に応えたものである。
【００１０】
発明の概要
モノネガウイルス目に属する非分節型のマイナス鎖ＲＮＡウイルスにはヒトの病原体として重要なものが幾つか存在する。これらのウイルスの遺伝子の順序はよく保存されており、遺伝子の発現の相対的レベルの主たる決定要因となっている。ウイルスゲノム上に１個だけ存在するプロモーター部位に近い遺伝子は、より遠くに位置する遺伝子よりも高レベルで転写される。典型的な水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の感染性ｃＤＮＡクローンを操作して、ウイルスのヌクレオチド配列の他の部分は変化させずに５個のウイルス遺伝子の内の４個の順序を並べ替えた。１群のｃＤＮＡクローンにおいて、燐タンパク質Ｐ、基質タンパク質Ｍ、及び糖タンパク質Ｇをコードした中央の３個の遺伝子を、可能な６つの順序のすべてに並べ替えた。別の群では、ヌクレオカプシドタンパク質Ｎの遺伝子を、野生株におけるプロモーターに最も近い位置から遠位へと移動させて、第２、第３、または第４番目の位置に配した。最後の構成では、主要表面抗原及び中和抗体をコードしたＧタンパク質遺伝子を発現量が最大となるプロモーターの隣接位置に配した。以上の再編成ｃＤＮＡ群のそれぞれから感染性ウイルスを回収し、細胞培養中での遺伝子の発現レベル及び増殖能、ならびにホスト動物におけるウイルスの免疫原性及び病原性について調べた。再編成によって、コードされたタンパク質の発現レベルは変化し、ウイルスは培養細胞及び動物のいずれにおいても異なる程度で弱毒化された。Ｇタンパク質の発現量の増大によってウイルスを接種したマウスにおける免疫応答が増強、促進された。モノネガウイルス目では相同組換えが起こらないことから遺伝子再編成は不可逆的であり、こうした遺伝子再編成によって、この種のウイルスに対し、病原性回復がないように弱毒化された生ワクチンを開発するための合理的手法が与えられるものである。
【００１１】
本発明の一実施形態では、モノネガウイルス目のウイルスのプロモーターから遠位に位置する遺伝子の発現量を増大させるための方法であって、プロモーターから遠位に位置する遺伝子を野性型ウイルスの３’末端側のプロモーターの近位の部位に近づく方向に移動させることによってウイルスの遺伝子の順序を再編成する工程を含む方法が提供される。
【００１２】
本発明の別の一実施形態では、ゲノムが再編成されたモノネガウイルス目の組換えウイルスであって、ウイルスのプロモーターの遠位の遺伝子を野性型ウイルスの３’末端側のプロモーターの近位の部位に近づく方向に移動させることによってゲノムが再編成される組換えウイルスが提供される。こうした組換えウイルスを利用して防御的免疫応答を加速かつ増強することが可能である。
【００１３】
本発明の更に別の一実施形態では、所定の遺伝子をその野性型ウイルスにおける位置から遠ざかる方向に移動させることによってウイルスの遺伝子順序を再編成するか、もしくは、不可欠律速因子の遺伝子を野性型ウイルスにおける３’末端側のプロモーターの近位の部位から遠ざかる方向に移動させることによってウイルスの遺伝子順序を再編成することによりモノネガウイルス目のウイルスを弱毒化する方法が提供される。
【００１４】
本発明の更に別の一実施形態では、ワクチンとして有用な弱毒化ウイルスを構築するための方法であって、野性型ウイルスにおける３’末端側のプロモーターの近位の部位から遠ざかる方向に所定の遺伝子を移動させることによって当該ウイルスの遺伝子順序を再編成する工程であって、当該所定の遺伝子はゲノムの複製に不可欠な律速因子である工程と、免疫応答誘導抗原をコードした遺伝子をウイルスの遺伝子順序の３’末端に最も近い位置に配する工程とを含む方法が提供される。
【００１５】
本発明の他または更なる態様、特徴、ならびに利点は、開示の目的で示される現時点における発明の好適な実施形態の説明より明らかとなろう。
【００１６】
発明の上記に述べた特徴、利点及び目的ならびに自明となる他の目的を実現し、これらの詳細な理解を可能とすべく、上記に概略述べた発明を付属の図面に示される発明の特定の実施形態に基づいてより詳細に説明する。これらの図面は本明細書の一部をなすものであるが、図面はあくまで発明の好適な実施形態を説明するためのものであって発明の範囲を限定するものではない点は注意を要する。
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムへの特定の変異の導入によってヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質の遺伝子をゲノム上の後続の位置に転座させることが可能であることを示すとともに、プロモーターに対する遺伝子の位置によって発現レベルが決定されることを直接証明したものである。Ｎタンパク質の合成レベルによってＲＮＡの複製レベルは制御される。このことに一致して、本発明は、Ｎ２、Ｎ３及びＮ４ウイルスに感染した細胞内でのＮのｍＲＮＡならびにタンパク質合成のレベルが低減するにしたがってゲノムＲＮＡの複製レベルもまた低下することを証明するものである。このことに対応して、細胞培養中での感染性ウイルスの産生量もＮ４ウイルスでは最大で１０４のオーダーで漸減した。最後の点として、複製能の低下にともなって、Ｎ２、Ｎ３、及びＮ４ウイルスのＩＮ接種後のマウスに対する致死率は、野生型のウイルスと比較してそれぞれ約１０１、１０２、１０３のオーダーで低下した。ウイルスの天然のホストにおいても複製及び防御に関して同様の結果が観察された。
【００１８】
これらのデータは、複製に不可欠な１個の遺伝子をウイルスのゲノムに沿って後続の位置へと転座させることにより、動物モデル及び天然ホストにおいてウイルスの細胞培養中での増殖能及び致死率が段階的に低下したことを示すものである。しかしながら、マウス及び天然ホストにおいてこれらのウイルスが防御的免疫応答反応を引き起こす能力が病原性の低下にともなって変化することはなかった。したがって、これらのウイルスはいずれも野生型の遺伝子の全体を有し、そのレベルは低下してはいるもののいずれも複製能を有することから、複製のレベルはホストの防御反応を誘導するには充分であった。すなわち、致死量と防御応答を誘導する量とが重なっている野生型の場合と異なり、遺伝子を再編成したウイルスの一部では防御反応を誘導する量と致死量との間には１０００倍の開きがあった。総括するとこれらのデータによって、非分節型のマイナス鎖ＲＮＡウイルスを予測可能かつ漸減的に弱毒化するための手段であって、充分な免疫応答を誘導するだけの複製能は失わずに発病は防止する最適な弱毒化レベルを決定することを可能ならしめる手段が示唆されるものである。
【００１９】
更に本発明によれば、例えば付着用の糖タンパク質をコードするＧ遺伝子のような、プロモーターから最も遠くに位置する遺伝子をプロモーターに最も近い位置に移動させることによってその発現量を増大させることが可能であることが示される。感染の際のＧタンパク質の産生量の増大によって、より顕著な防御的免疫応答反応が引き起こされることを示すため、ＶＳＶのゲノムの感染性のｃＤＮＡクローンに変異を導入して糖タンパク質の遺伝子が遺伝子の順序における通常の第４番目の位置から第１番目の位置に移動した２種類の新規なウイルスを得た。第１のウイルスでは遺伝子の順序は３’−Ｇ−Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｌ−５’（Ｇ１Ｎ２）であり、第２のウイルスでは遺伝子の順序は３’−Ｇ−Ｐ−Ｍ−Ｌ−Ｎ−５’（Ｇ１Ｎ４）であった。これらのウイルスのｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏにおける特徴を調べ、遺伝子の順序が３’−Ｐ−Ｍ−Ｇ−Ｎ−Ｌ−５’（Ｇ３Ｎ４）及び３’−Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｇ−Ｌ−５’（Ｎ１Ｇ４）（後者は野生型の遺伝子順序）であるウイルスの特徴と比較を行った。細胞培養中におけるこれらのウイルスの複製量、マウスにおける致死率、動態及び抗体産生、ならびにＶＳＶの致死量投与によるチャレンジに対するウイルスの防御能において差異が認められた。
【００２０】
モノネガウイルス目では相同組換えが起こらないことが観察されていることから遺伝子再編成は不可逆的であると予想され、したがって本発明によって、非分節型のマイナス鎖ＲＮＡウイルスに対する安定的に弱毒化された生ワクチンを開発するための合理的な代替手法が提供されるものである。更に、ゲノムの構成ならびに遺伝子の発現制御の類似性に基づけば、弱毒化ウイルスを生成するためのこの手法は、狂犬病ウイルスなどのラブドウイルス科、麻疹、流行性耳下腺炎、呼吸系発疹ウイルス及びパラインフルエンザウイルスＩ〜ＩＶなどのパラミクソウイルス科、ならびにエボラウイルスやマールブルグウイルスなどのフィロウイルス科のモノネガウイルス目に属するすべての科のウイルスに対して適用可能である。これらは現在知られているウイルス病原体のなかでも大きな問題となっているものの一部を代表するものである。
【００２１】
本発明の一実施形態では、モノネガウイルス目に属するウイルスにおいてプロモーターから遠位に位置する遺伝子の発現量を増大させる方法であって、プロモーターから遠位に位置する当該遺伝子を野生型における３’末端側のプロモーターの近位の部位に近づく方向に移動させることによって当該ウイルスの遺伝子の順序を再編成する工程からなる方法が提供される。当該遠位遺伝子は表面糖タンパク質をコードしたものであることが好ましい。水疱性口内炎ウイルスでは、表面糖タンパク質をコードする遠位遺伝子として付着用糖タンパク質Ｇが挙げられる。呼吸器系発疹ウイルスでは、表面糖タンパク質をコードする最遠位遺伝子の一例として付着用糖タンパク質（Ｇ）遺伝子と呼ばれる遺伝子がある。また、表面糖タンパク質をコードする最遠位遺伝子の別の一例として、呼吸器系発疹ウイルス融合（Ｆ）タンパク質遺伝子が挙げられる。麻疹ウイルスでは、表面糖タンパク質をコードする最遠位遺伝子はＨ（ヘマグルチニン）遺伝子と呼ばれる遺伝子である。流行性耳下腺炎及びパラインフルエンザウイルスでは、表面糖タンパク質をコードする最遠位遺伝子はＨＮ（ヘマグルチニン／ノイラミニダーゼ）遺伝子と呼ばれる遺伝子である。当業者であれば、本発明の方法の実施に際して、モノネガウイルス目のそれぞれの特定のウイルスについて表面糖タンパク質をコードするいずれの最遠位遺伝子を操作すべきかは容易に理解できよう。
【００２２】
本発明の別の一実施形態では、再編成されたゲノムを有するモノネガウイルス目の組換えウイルスであって、当該ウイルスのプロモーターから遠位に位置する遺伝子を野性型における３’末端側のプロモーターの近位の部位に近づく方向に移動させることによってゲノムが再編成されている組換えウイルスが提供される。こうした組換えウイルスは防御的免疫応答反応を促進、増強するために使用することが可能である。
【００２３】
本発明の更なる別の一実施形態では、モノネガウイルス目のウイルスを弱毒化するための方法であって、所定の遺伝子をその野性型における位置から遠ざかる方向に移動させることによってウイルスの遺伝子の順序を再編成するか、または、不可欠律速因子の遺伝子をその野性型における３’末端側のプロモーターに最も近い部位から遠ざかる方向に移動させることによってウイルスの遺伝子の順序を再編成することによってモノネガウイルス目のウイルスを弱毒化する方法が提供される。好ましくは当該遺伝子はウイルスの遺伝子の順序において最後から２番目の位置に配される。更に、ゲノム複製の不可欠律速因子としての前記遺伝子はヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子であることが好ましい。モノネガウイルス目に属するウイルスの代表例としては、狂犬病ウイルスや水疱性口内炎ウイルスなどのラブドウイルス、麻疹、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザウイルスや呼吸器系発疹ウイルス（ヒト及びウシの）などのパラミクソウイルス、及びエボラウイルスやマールブルグウイルスなどのフィロウイルスが挙げられる。本発明は本方法に基づいて弱毒化されたウイルスをも含むものである。
【００２４】
本発明の更なる別の一実施形態では、ワクチンとして有用な弱毒化ウイルスを構築するための方法であって、ゲノム複製の不可欠律速因子である所定の遺伝子をその野性型における３’末端側のプロモーターに最も近い部位から遠ざかる方向に移動させることによって当該ウイルスの遺伝子の順序を再編成する工程と、免疫応答誘導抗原をコードする遺伝子をウイルスの遺伝子順序の３’末端に最も近い位置に配する工程とからなる方法が提供される。好ましくは、不可欠律速因子の遺伝子はヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子であり、該遺伝子は当該ウイルスの遺伝子の順序において最後から２番目に配される。更に好ましくは、免疫応答誘導抗原をコードする遺伝子は付着用糖タンパク質（Ｇ）遺伝子、融合遺伝子またはヘマグルチニン／ノイラミニダーゼ遺伝子である。当業者であれば適当な免疫応答誘導抗原に容易に置換することが可能である。本発明は本方法に基づいて弱毒化されたウイルスをも含むものである。
【００２５】
本発明に基づけば、当該技術分野における通常の技術の範囲内で、従来の分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡ技術を使用することが可能である。こうした技術はすべて文献に述べられているものである。例として、Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” （１９８２）； ”ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，” Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ （Ｄ．Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ． １９８５）； ”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ” （Ｍ．Ｊ． Ｇａｉｔ ｅｄ． １９８４）； ”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ” ［Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ． （１９８５）］； ”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ” ［Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ． （１９８４）］；  ”Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ” ［Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｄ． （１９８６）］； ”Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ” ［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， （１９８６）］； Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ， ”Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ” （１９８４）を参照。したがって本明細書中で触れる場合、以下の用語は下記に述べる定義を有するものである。
【００２６】
本明細書で用いる「弱毒化」なる語は、転写の早期停止を含む、特定の遺伝子の発現を調節するために用いられる遺伝子機構、または、免疫学的に病原微生物の病原性を失わせるプロセスとして定義される。
【００２７】
本明細書で用いる「致死量」なる語は、ホストを死に至らしめるうえで必要とされるウイルス接種物の量として定義される。
【００２８】
本明細書で用いる「防御反応誘導量」なる語は、ホストを死に至らしめることなくウイルスに対して充分な免疫応答反応を引き起こすウイルス接種物の量として定義される。
【００２９】
本明細書で用いる「再編成」なる語は、ウイルスゲノム内の遺伝子及び遺伝子間領域は野性型に維持したままで３’末端に対する遺伝子の順序のみが改変されるように遺伝子の順序を変更することとして定義される。
【００３０】
本明細書で用いる「マイナス鎖ＲＮＡウイルス」なる語は、ゲノムがＲＮＡ分子のマイナス鎖であるようなＲＮＡウイルスの一分類として定義される。
【００３１】
以下の実施例は本発明の異なる実施形態を説明するためのものであって、本発明の範囲をいかなる意味においても限定することを目的としたものではない。
【００３２】
実施例１
ウイルス及び細胞
ここで使用するｃＤＮＡクローンの最初のテンプレートの多くは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のインディアナ血清型のＳａｎＪｕａｎ単離物によって与えられたものであるが、Ｇタンパク質をコードする遺伝子はＶＳＶインディアナのＯｒｓａｙ単離物からもともと得られたものである（Ｗｈｅｌａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。ベビーハムスターの腎（ＢＨＫ−２１）細胞を用いてｃＤＮＡからウイルスを回収し、１段増殖実験ならびにＲＮＡやタンパク質の放射性同位体による標識を行った。プラークアッセイにはアフリカミドリザルの腎細胞（ＢＣＳ−１及びＢＳＣ−４０）またはＶｅｒｏ−７６細胞系を使用した。
【００３３】
実施例２
プラスミドの構築及び感染性ウイルスの回収
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の５個の遺伝子のそれぞれは、１８個のヌクレオチドからなる共通の配列によって挟まれている。このため、個々のクローン分子を構築し、これから各々の遺伝子を正確に包含したＤＮＡフラグメントを適当な制限エンドヌクレアーゼによる消化によって切り出すことが可能である。認識配列から離れた部位を切断する制限エンドヌクレアーゼを使用して、保存されたシストロン間領域の共通の４個のヌクレオチド（ＡＣＡＧ）に対応した粘着末端を有する遺伝子セグメントを形成した。これにより、５個の遺伝子のそれぞれを包含したＤＮＡセグメントを所望の任意の順序に並べ替えることによって、遺伝子が再編成されている以外は野性型ＶＳＶのヌクレオチド配列に正確に一致したヌクレオチド配列を有する１群のＤＮＡプラスミドを得た。遺伝子が再編成されたウイルスゲノムであるＮ１（ｗｔ）、ＧＭＰ、ＭＧＰ、ＰＧＭ、ＧＰＭ、ＭＰＧ、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｇ１Ｎ２及びＧ１Ｎ４を構築するための工程を図２、３及び４に示した。Ｐ遺伝子の下流の遺伝子間領域の１個のヌクレオチドを除いてゲノムに他の改変は行わなかった。この３’−ＣＡ−５’から３’−ＧＡ−５’への改変によって転写はほとんど影響されない。
【００３４】
遺伝子が再編成されたｃＤＮＡクローンから感染性ウイルスを回収するため、ＢＨＫ−２１細胞に、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ（ｖＴＦ７−３）を発現する組換えワクシニアウイルスを感染させた（Ｆｕｅｒｓｔ， ｅｔ ａｌ．， １９８６）。この１時間後、遺伝子再編成したＶＳＶｃＤＮＡを、抗ゲノムＲＮＡの封入及び複製に必要とされるＮ、Ｐ、及びＬタンパク質を発現する３種類のプラスミドとともに細胞にトランスフェクトした（Ｗｈｅｌａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。感染性ウイルスを上清培地から収穫し、ＤＩ粒子の形成を避けるため低感染多重度（ＭＯＩ）で、またワクシニアウイルスの複製を抑制するためにシトシンアラビノシド（２５μｇ／ｍｌ）の存在下でＢＨＫ−２１細胞内で増幅した。上清培地を０．２μＭフィルターで濾過し、ウイルスを１５〜４５％ショ糖速度勾配にかけてバンドに分離して残留するｖＴＦ７−３ワクシニアウイルスから分離した。回収したウイルスの遺伝子の順序は、逆転写及びＰＣＲによってゲノムの再編成された部分を増幅した後、制限酵素分析を行って確認した（図５）。
【００３５】
実施例３
１サイクルウイルス複製
１０６個のＢＨＫ−２１、ＢＳＣ−４０、またはＢＳＣ−１細胞の単層培養に各ウイルスを接種時感染多重度が３となるように感染させた。１時間の吸着の後、接種物を除去し、培養を２度洗い、新鮮な培地を加えて３１℃〜３７℃で培養した。３６時間にわたり、示された時間間隔で試料を収穫し、コンフルエンスに達したＢＳＣ−４０細胞またはＶｅｒｏ−７６細胞の単層においてプラークアッセイを行ってウイルスの複製量を定量した。
【００３６】
実施例４
ウイルスＲＮＡ及びタンパク質合成の分析
コンフルエンスに達したＢＨＫ−２１細胞の単層培養に、細胞当たりの接種時感染多重度が５ＰＦＵとなるように個々のウイルスを感染させ、１時間の吸着時間をおいた。ウイルスＲＮＡの合成を分析するため、感染の１．５時間後に培養を３０分間アクチノマイシンＤ（５μｇ／ｍｌ）にて処理し、次いで［３Ｈ］−ウリジン（３０μＣｉ／ｍｌ）を添加して２〜４時間標識した。細胞を収穫し、細胞質の抽出物を調製し、１．７５％アガロース−尿素ゲル上でＲＮＡを分析した（Ｐａｔｔｎａｉｋ ａｎｄ Ｗｅｒｔｚ， １９９０）。感染の４時間後に、メチオニン無添加の培地中で３０分間培養した後、［３５Ｓ］−メチオニン（４０μＣｉ／ｍｌ）を加えて３０分間標識することによってタンパク質合成を分析した。既述の方法によって細胞質の抽出物を調製し、１０％ポリアクリルアミドゲル上でタンパク質を分析した（Ｐａｔｔｎａｉｋ ａｎｄ Ｗｅｒｔｚ， １９９０）。個々のＲＮＡまたはタンパク質は、ホーテック社製スキャンマスター３（Ｈｏｗｔｅｋ  Ｓｃａｎｍａｓｔｅｒ３）をＰｄｉ  Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェアとともに使用してオートラジオグラフに濃度計分析を行って定量し、その後モル比を計算した。
【００３７】
または、各変異ウイルスによるウイルスタンパク合成を、ＭＯＩが５０となるようにウイルスに感染させたＢＨＫ−２１細胞に、感染の３時間後にアクチノマイシンＤ（５μｇ／ｍｌ）を加えて測定した。感染の５時間後に細胞を洗い、メチオニン無添加培地中で３０分間培養した。次いで細胞を［３５Ｓ］−メチオニン（３０μＣｉ／ｍｌ、比放射能１０ｍＣｉ／ｍｌ）に１時間曝露した。細胞の単層をゲルローディングバッファー中に直接収穫し、毎分当たりのカウント数（ｃｐｍ）が等しくなるように基準化した後、アクリルアミドに対するビスアクリルアミドの比が小さい１０％ポリアクリルアミド上でウイルスタンパク質を分離してＰタンパク質とＮタンパク質を分離した。ウイルスタンパク質はＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒを用いて定量し、モル比を算出した。
【００３８】
成熟したウイルス粒子中の各タンパク質の量を評価するため、ＢＨＫ−２１細胞にＭＯＩが５となるようにウイルスを感染させた。２時間後に細胞を洗い、メチオニン無添加培地中で３０分間培養した。放射性同位体標識していないメチオニンを通常の培地液位の１０％まで加え、細胞を［３５Ｓ］−メチオニン（５０μＣｉ／ｍｌ、比放射能１０．２ｍＣｉ／ｍｌ）で一晩標識した。上清液を回収し、細胞の破片を遠心により除去し、１０％ショ糖溶液を加えて遠心してウイルスを回収した。ｃｐｍを基準化した後、ウイルスのペレットをゲルローディングバッファー中に再懸濁し、ウイルス粒子タンパク質を１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ウイルス粒子タンパク質はＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒを用いて定量し、モル比を算出した。
【００３９】
実施例５
マウスにおける病原性
Ｔａｃｏｎｉｃ　Ｆａｒｍ社より得た３〜４週齢の雄性Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒ系マウスにおいて各ウイルスの致死率を測定した。軽度の麻酔（ケタミン／キシラジン）下の５〜６頭の動物からなる複数の群に、希釈液（ＰＢＳ）または１０倍毎の濃度に連続希釈した各ウイルスを、容量３０μｌで頭蓋内経路または容量１５μｌで鼻腔内経路にて接種した。または、６頭のマウスからなる複数の群にケタミン／キシラジンにて軽度の麻酔を施し、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に１０倍毎の濃度に連続希釈した各ウイルスを１０μｌづつ鼻腔内接種した。コントロール動物には同量のＤＭＥＭを与えた。動物を毎日観察し、Ｒｅｅｄ及びＭｕｅｎｃｈ（１９３８）の方法により各ウイルスについて５０％致死量（ＬＤ５０）を算出した。
【００４０】
実施例６
マウスの防御反応
希釈液を接種したか、または致死的でない量の各ウイルスを鼻腔内接種したマウスのコントロール群の尾の血液を血清中和抗体の産生について監視した。接種１４日後にマウスに上記の要領で軽度の麻酔を施し、１．３ｘ１０６ＰＦＵの野性型ウイルス（Ｎ１で示される）を１５μＬ鼻腔内投与することによりチャレンジ試験を行った。チャレンジした動物を２１日間にわたって観察した。
【００４１】
実施例７
モノネガウイルスの遺伝子を再編成するための一般的手法
ウイルスのゲノムに他の変異を一切導入することなく水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の遺伝子を再編成するため、認識配列の外側を切断する制限酵素の認識部位によって挟まれたＮ、Ｐ、Ｍ、及びＧ遺伝子の個別のｃＤＮＡクローンをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって構築した。Ｐ、Ｍ、及びＧ遺伝子ではＢｓｐＭ１部位をフランキング配列として用いたが、Ｎ遺伝子ではフランキング配列としてＢｓａ１部位を用いた（Ｎは内部にＢｓｐＭ１部位を有するため）。エンドヌクレアーゼによる消化後に残る塩基４個分の粘着末端が、ＶＳＶの各ｍＲＮＡの開始部分に見られる保存領域５’ＡＡＣＡＧ・・・３’（配列番号：１４）のＡＣＡＧ配列（配列番号：１３）に対応するように制限部位が位置するようＰＣＲプライマーを設計した（図３Ａも参照）。例えば、
５’・・・ＡＣＣＴＧＣＡＣＴＡＡＣＡＧ・・・ＡＡＡＡＡＡＡＣＴＡＡＣＡＧＡＧＡＴＧＣＡＧＧＴ・・・３’（配列番号：１）
では、プラスのセンス鎖として表されるＶＳＶ配列は斜体で、ＢｓｐＭ１の認識部位は太字で、ＢｓｐＭ１による消化後に残る塩基４個分の粘着末端は下線で示してある。このようにして、上記４個の遺伝子をそれぞれの遺伝子間接合部とともに、適当な粘着末端を有する個別のＤＮＡフラグメント上に配置した（図３Ａ及び３Ｂ）。意図的に組み込まれた野性型配列との唯一の相違点は、野性型配列では５’−ＧＴ−３’となっているＰ遺伝子の下流の接合部を含め、すべての接合部において、遺伝子間の転写されない２個のヌクレオチドを５’−ＣＴ−３’とした点である。この突然変異は明らかにサイレントである（Ｂａｒｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。ＰＣＲの際に生ずる偽性突然変異の影響を避けるため、クローニングした遺伝子の両末端の配列を決定し、その内側を感染性クローンから得た対応するＤＮＡフラグメントで置き換えた。
【００４２】
遺伝子を再編成した完全長クローンを再構築するには更に２種類の開始プラスミドを必要とする。一つはバクテリオファージＴ７のプロモーターの後にＶＳＶのリーダー配列をつないだものであり、５’・・・ＧＡＡＡＣＴＴＴＡＡＣＡＧＴＡＡＴＧＣＡＧＧＴ・・・３’（配列番号：２）として表されるＮ遺伝子の開始部分の５’（Ａ）ＡＣＡＧ（配列番号：１４）内を切断するように固有のＢｓｐＭ１部位が配置されている。もう一つのプラスミドは、Ｌ遺伝子の最初の４２０個のヌクレオチドを有し、５’・・・ＡＣＣＴＧＣＡＣＴＡＡＣＡＧＣＡＡＴＣＡＴＧ・・・３’（配列番号：３）として表されるＬ遺伝子の開始部分の同じ配列内を切断するように固有のＢｓｐＭ１部位が配置されている。これらのプラスミドの固有のＢｓｐＭ１部位に、Ｎ、Ｐ、Ｍ、及びＧ遺伝子フラグメントを一方向にライゲートしていくことにより、ウイルスゲノムを３’末端または５’末端から段階的に再構築した。各遺伝子の挿入によって野性型の遺伝子間接合部が再形成され、次の遺伝子を連結するための固有のＢｓｐＭ１部位が形成される。
【００４３】
プラスミド構築の最後の工程は、Ｌ遺伝子の残りの６ｋｂ、ウイルスゲノムの５’末端、ならびに、複製可能な転写産物の細胞内合成に必要なリボザイム及びＴ７ターミネーターを有する感染性クローンから得たＤＮＡフラグメントを付加することである（Ｐａｔｔｎａｉｋ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。この手法は遺伝子間接合部に保存配列を有するすべてのモノネガウイルスに用いることが可能である。このようにして並べ替えられた遺伝子の順序を図１に示した。このクローニング法を実証し、個々の遺伝子が機能性タンパク質をコードしていることを確認する目的で、遺伝子を再編成したｃＤＮＡクローンと並行して野性型のゲノムを有するプラスミドを構築した。このプラスミドから得られたウイルスを野性型（Ｎ１、図１参照）として使用した。いずれの場合も、２３個のヌクレオチドからなる遺伝子間保存領域は遺伝子間で維持された。
【００４４】
実施例８
中央の３個の遺伝子の並べ替えによるウイルスの作成
モノネガウイルス目に属するウイルスのすべてでゲノムがよく保存されていること、及び、ウイルスの複製にはＶＳＶヌクレオカプシド（Ｎ）、タンパク質、燐タンパク質（Ｐ）、及びＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質が正確なモル比で必要とされるという知見に基づけば、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のゲノムのｃＤＮＡの最初の再編成は保存的なものである。最も３’末端側の遺伝子であるＮ及び最も５’末端側の遺伝子であるＬは、初期には元々の位置に保たれ、ＶＳＶの中央の３個の遺伝子であるＰ、Ｍ、及びＧ遺伝子がすべての可能な組合わせで並べ替えられて図１に示されるような６個のゲノムの順序が得られる（Ｎ１（ｗｔ）、ＧＭＰ、ＭＧＰ、ＰＧＭ、ＧＰＭ及びＭＰＧ）。上記の要領で野性型の遺伝子の順序であるＮ１を得てｃＤＮＡの要素がすべて機能することを示した。それぞれのｃＤＮＡは、正確な５’及び３’末端を有するＲＮＡを生成するように設計された専用のＴ７発現プラスミドに組み込んだ（Ｐａｔｔｎａｉｋ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。
【００４５】
Ｔ７ポリメラーゼを発現するワクシニアウイルス（Ｆｕｅｒｓｔ ｅｔ ａｌ．， １９８６）を感染させたＢＨＫ細胞に、再編成された６種類のｃＤＮＡのそれぞれを、このｃＤＮＡクローンから転写されるＲＮＡを封入するとともに上記に述べたような機能性のリボヌクレオカプシドを形成するために必要なＶＳＶのＮ、Ｐ、及びＬタンパク質をコードした（Ｗｈｅｌａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５）ｃＤＮＡクローンとともにトランスフェクトすることによって、再編成されたｃＤＮＡが機能性のＲＮＡゲノムを生成することを証明した。６種類のｃＤＮＡ構築体のすべてから異なる効率でウイルスが得られた。これを０．２μｍフィルターで濾過してＲＮＡウイルスを生成する際のｃＤＮＡの転写に必要とされるＴ７ポリメラーゼを発現させるために使用した組換えワクシニアウイルスを除去した後、シトシンアラビノシド（２５μｇ／ｍｌ）の存在下で増幅した。
【００４６】
実施例９
回収されたＲＮＡウイルスの遺伝子の順序はウイルスを生成したｃＤＮＡの遺伝子順序を反映している
細胞培養中で３代の継代後に回収したウイルスの遺伝子順序を、逆転写及びＰＣＲによってウイルスゲノムの再編成部分を含む４．１ｋｂのフラグメントを増幅し、ＰＣＲ産物の制限酵素解析を行うことにより決定した。Ｎ及びＬ遺伝子内に位置するプライマーを用いてＰＣＲを行った。それぞれＰ、Ｍ、またはＧ遺伝子を特異的に切断する制限エンドヌクレアーゼＡｃｃＩ、ＢｇｌＩ、またはＰｓｔＩによる切断後の消化産物の大きさは予想と完全に一致していた（図５Ａ及び５Ｂ）。このデータは回収されたウイルスの遺伝子順序がウイルスが由来するｃＤＮＡクローンに一致することを示すものである。変異体間で野性型の遺伝子順序の再出現を示す証拠は得られなかった。
【００４７】
実施例１０
ウイルスＲＮＡ及びタンパク質の合成
次に回収したウイルスを遺伝子の発現レベルについて調べた。変異体ウイルスによるウイルスＲＮＡ及びタンパク質の合成を、感染細胞の代謝に［３Ｈ］ウリジンまたは［３５Ｓ］メチオニンを取込ませ、放射線同位体標識された産物をゲル電気泳動によって分析して調べた。野性型及び各変異体を感染させた細胞中で同じウイルスＲＮＡ、すなわち１１．１６ｋｂのゲノムＲＮＡ及びＬ、Ｇ、Ｎ、Ｐ及びＭ遺伝子を表すｍＲＮＡが作られていた（図６）。最後の２つのＲＮＡは大きさが似通っており、電気泳動において同じ速度で移動した。変異体ウイルスを感染させた細胞において新規ＲＮＡまたは異常ＲＮＡは観察されず、ウイルス調製物中にはＤＩ粒子が存在しないことが示された（図６）。更に、ＲＮＡの発現パターンのこうした類似性は、転写の際の遺伝子間接合部にまたがったウイルスポリメラーゼの挙動がこれらの位置における局所的配列要素によってのみ決定され、検出可能な長期の影響を及ぼさないという考え方を支持するものである。こうしたＲＮＡ発現パターンに基づけば、変異体ウイルスが産生するウイルスタンパク質は野性型の感染によって産生されるウイルスタンパク質に質的にも類似していた（図７）。
【００４８】
野性型及び変異体ウイルスを感染させた細胞におけるＲＮＡ及びタンパク質の発現プロファイルは質的には類似していたものの、異なるＲＮＡ及びタンパク質の相対レベルを測定した結果、変異体ウイルスでは野性型ともまた互いとも異なるモル比で遺伝子が発現していることが判明した（図８）。変異体ウイルスのそれぞれについて各タンパク質の発現量をプロモーターに最も近いＮ遺伝子の発現量に対して基準化することによって、特定の遺伝子の相対的発現レベルは主としてゲノム内におけるその遺伝子の位置、すなわちプロモーターからの距離によって決まることが示された。これは正に段階的転写減衰のモデルによって予測されたとおりであった。このことは、野性型（ＰＭＧ）が発現するタンパク質のモル比を、内側の遺伝子の順序を逆転させた変異体（ＧＭＰ）と比較することによって明確に示される（図８）。ｍＲＮＡのプロファイルの同様な定量分析はＭとＰのｍＲＮＡの分離が不完全である（図６）ことにより困難であったが、Ｌ、Ｇ、及びＮのｍＲＮＡレベルの測定によって、ウイルスゲノムの３’末端に対する特定の遺伝子の近接度がその遺伝子の転写レベルの決定要因であるという結論が裏付けられた。例えばＧのｍＲＮＡの相対量における差異はＧ遺伝子の位置を反映している（図６）。更にＲＮＡプロファイルによって、１１．１ｋｂのゲノムＲＮＡとアンチゲノムＲＮＡの量により表されるＲＮＡの複製レベルが変異体間で大幅に異なることが示された（図６）。
【００４９】
実施例１１
中央の３個の遺伝子が再編成されたウイルスの複製
プラーク形成ならびに単周期増殖の条件下で複製を行う能力について前記の変異体ウイルス同士を比較した。これらのウイルスの中にはＭＧＰやＭＰＧのようにこのアッセイではＮ１野性型（ＰＭＧ）との区別がつかなかったものもあるが、ＧＭＰ、ＧＰＭ、及びＰＧＭのように野性型と比較して大幅に小さなプラークをＢＳＣ−１細胞の単層上で形成したものもある（表１）。更に、野性型ウイルス及び他の変異体のプラークが依然成長している２４時間後においてＧＭＰのプラークは成長を停止した（表１）。ＢＳＣ−１細胞での単周期増殖においてもＧＭＰ、ＧＰＭ、及びＰＧＭの複製能が低下していることが証明された（図９）。感染１７時間後に変異体の３つの別個のプラークについて収率の平均値をとって野性型に対するパーセンテージとして表すと次のようであった。すなわちＭＧＰでは１０７％、ＭＰＧでは５１％、ＧＭＰでは２３％、ＰＧＭでは２１％、及びＧＰＭでは１．６％（表２）であった。
【００５０】
【表１】
2004501639.tif 000002
実施例１２
中央の３個の遺伝子が再編成されたウイルスの病原性
野性型ＶＳＶをマウスの脳内もしくは鼻腔内に接種すると致死性の脳炎を発症する。１９３８年にＳａｂｉｎとＯｌｉｔｓｋｙによって、ＶＳＶ脳炎に対するマウスの神経病理学及び比較感受性と、週齢及び接種経路との相関が最初に述べられて以来、ＶＳＶ及びその突然変異体の致死性を比較するための手軽な高感度の小型動物モデルとして若いマウスが用いられてきた（Ｓａｖｉｎ ａｎｄ Ｏｌｉｔｓｋｙ， １９３８； Ｗａｇｎｅｒ， １９７４）。したがってここでもマウスにおける変異体ウイルスの病因論を調べた。
【００５１】
３〜４週齢のマウスに野性型ＶＳＶを鼻腔内投与すると、脳炎、麻痺を起こし７〜１１日後に死に至る（Ｓａｖｉｎ ａｎｄ Ｏｌｉｔｓｋｙ， １９３８）。この場合のＬＤ５０量は約１０ＰＦＵである。複数のマウス群に、１回投与量当たり０．１〜１，０００ＰＦＵとなるように１０倍毎の連続希釈液を鼻腔内接種して毎日２回観察することにより変異体ウイルスの病原性を比較した。ウイルスの遺伝子順序を、図５Ａ及び５Ｂに示した方法によって接種マウスの死後まもなく脳から回収したウイルスによって確認した。いずれの場合にも回収されたウイルスの遺伝子順序は接種ウイルスの遺伝子順序と一致していた（データは示されていない）。
【００５２】
変異体ウイルスのＬＤ５０量は野性型と同様であり、ＧＰＭ、ＧＭＰ、及びＭＧＰウイルスでは若干多く（１．５〜２倍）の量を要した（表２）。これらの実験を３回繰り返し、このうちの代表的な実験の結果によってマウス１頭当たり１００ＰＦＵを投与した場合の病態の発現時間及び死亡時間を示した（図１０）。野性型を感染させた動物では移植後６日目に最初に病態の発現が見られ、急速に麻痺が起こり、２週間以内に死亡した。組換え体であるＧＭＰ及びＭＧＰでは再現可能な実験において病態の進行は早く、野性型に感染した動物よりも２４〜３６時間早く症状が現れたのに対し、ＭＰＧ及びＧＰＭによる感染では死亡に至る時刻は２４〜３６時間遅れた（図１０）。一般に野性型ＶＳＶによる感染の特徴である麻痺症状は変異体ウイルスではそれほど著明ではなく、一部のＭタンパク質の突然変異体によって引き起こされるような持続性の神経系疾患（Ｂａｒｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７）の徴候は見られなかった。
【００５３】
変異体ウイルスの細胞培養の表現型からはマウスにおける病原性を予見し得なかった（表２）。細胞培養中での複製能が最も低下していた３種類の組換え体（ＧＭＰ、ＰＧＭ、及びＧＰＭ）のうち、１種（ＧＰＭ）は野性型の２倍のウイルスをＬＤ５０として要し、マウスの死亡時刻が若干遅れたのに対して、ＧＭＰでは症状の発現及び死亡が早まり、ＰＧＭでは野性型との差異は見られなかった。このように細胞培養中でのウイルスの挙動と動物体内での性質との間に相関が見られないのは、異なる動物ウイルスでよく見られる現象であるが、ウイルス間の唯一の相違点が各ウイルスが発現する野性型タンパク質の相対レベルであったことを考えると興味深い点である。
【００５４】
【表２】
2004501639.tif 000003
実施例１３
Ｎ遺伝子を再編成したウイルス
感染性ウイルスが回収されたことを考えると、内側の３個の遺伝子の再編成に対してＶＳＶは比較的許容性を有するものと思われる。そこでヌクレオカプシドタンパク質であるＮの遺伝子の位置を変化させて更なる再編成を行った。Ｎタンパク質は、ＲＮＡ複製の際に新生ゲノムＲＮＡを封入するために化学論的な量を要する（Ｐａｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８４）。ＲＮＡの複製はＮタンパク質の定常的な合成に依存しており、Ｎタンパク質の合成を阻害すると複製は停止する。したがって、Ｎ遺伝子を最もプロモーターに近い部位から段階的に遠ざけていくことによってＮタンパク質の合成レベルが低下する（したがってＮ遺伝子の発現レベルが低下する）と、ゲノムの複製レベルも低下することになる。そこで、ＮのｍＲＮＡの合成量が最大となる３’末端側に最も近い位置から図１に示すような内側の一連の位置へとＮ遺伝子を移動させてｃＤＮＡレベルでＶＳＶのゲノムを改変することによりＮ２（ＰＮＭＧＬ）、Ｎ３（ＰＭＮＧＬ）、及びＮ４（ＰＭＧＮＬ）を作成した。Ｎ１は野性型の配列に一致している。Ｇ遺伝子を順序の中で最後から２番目の位置より移動させ、Ｎ遺伝子の手前に配した第４及び第５の変異も作成した（図１）。これにより、Ｇ１Ｎ２（ＧＮＰＭＬ）ならびにＧ１Ｎ４（ＧＰＭＮＬ）が得られ、ＧとＮ遺伝子の位置が入れ替わっている。
【００５５】
Ｎ１〜Ｎ４及びＧ１Ｎ２及びＧ１Ｎ４のｃＤＮＡを上記の要領で細胞にトランスフェクトして生育可能なウイルスを生ずる能力について分析した。Ｎ２、Ｎ３及びＧ１Ｎ２からはウイルスは比較的容易に得られた。Ｎ４及びＧ１Ｎ４からは標準的なトランスフェクション条件を用いて３７℃にて繰り返しトランスフェクションを行ってもウイルスは得られなかった。トランスフェクション及びその後の継代の温度を３１℃に低下させることによりＮ４及びＧ１Ｎ４に対応するウイルスが得られた。
【００５６】
実施例１４
Ｎ遺伝子を再編成したウイルスによるＲＮＡ合成
ゲノム上でＮ遺伝子を順次下流に移動させると複製及びＮのｍＲＮＡ合成レベルは大きく変化した。ＮのｍＲＮＡの合成レベルは、Ｎ２、Ｎ３及びＮ４ウイルスにおいてＮ遺伝子をプロモーターから遠ざかる方向に順次移動させることにより野性型のレベルから大幅に低下した（それぞれ野性型の３６％、６％及び３％。図１１）。これに符合するように、遺伝子順序の中でＧ遺伝子の位置がプロモーターに１つ近づき、代わりにＮ遺伝子が最後から２番目の位置に配されたＮ４ウイルスではＧのｍＲＮＡの量の増加が観察された（図１１）。Ｎ２、Ｎ３及びＮ４のゲノムＲＮＡの複製量は、野性型に対して減少し（それぞれ５０％、２８％、及び４％。図１１）、これにともなってＮ遺伝子の発現が低下した。これはＮタンパク質の合成が複製の律速段階となっている場合に予想されるとおりである。Ｎ遺伝子が段階的にプロモーターから遠ざかるにしたがって更に全体の転写レベルも低下したが、これは恐らくゲノムのテンプレートの数が減少したことの副次的な効果であると考えられる。
【００５７】
実施例１５
Ｎ遺伝子を再編成したウイルスのタンパク質合成
遺伝子を再編成したウイルスを感染させた細胞では５種類のＶＳＶタンパク質のすべてが発現しており、これらはすべて野性型ウイルスのタンパク質とともに拡散していた。しかしながら、Ｎタンパク質の合成はその遺伝子が３’末端側の位置から遠ざかるにつれて低下した。図１２に示したデータは、野性型ウイルスＮ１における、Ｎ遺伝子の３’末端からの距離にともなうタンパク質のモル量の変化の仕方を示したものである。Ｎ遺伝子が転座した場合、図１２のデータによれば、Ｎ遺伝子が遺伝子順序の中の第１番目から、第２番目、第３番目、または第４番目へと移動されるのにしたがって燐タンパク質Ｐに対するＮタンパク質のモル比が減少している。これらの結果は、ＶＳＶにおける遺伝子の発現の分析に基づくこれまでの予測、ならびに転写が順序だって行われることを証明するものである。更にこれらのデータは、特定の遺伝子の位置がその発現レベルを決定することを直接的に証明するものである。単離されたＮ１〜Ｎ４の成熟ウイルス粒子におけるタンパク質のレベルを調べたところ、成熟したウイルス粒子内の各タンパク質の相対モル比は野性型ウイルスにおけるモル比とほぼ同じに保たれていることが示された。しかしながらＮ２〜４の感染によって生成されるウイルスの全体量は減少しており、ゲノムＲＮＡの複製レベルの低下と相関が見られた。
【００５８】
実施例１６
Ｎ遺伝子が再編成されたウイルスの複製能
Ｎ遺伝子が再編成されたウイルスは、Ｎ遺伝子が通常のプロモーターに最も近い位置から下流へと移動させられるにしたがって複製能力が段階的に低下した。増殖能力は１段増殖曲線によって分析した。Ｎ２及びＧ１Ｎ２は３７℃でウイルスの収率が約１５倍低下した。野性型ウイルスと比較してＮ３では５０倍、Ｎ４では２０，０００倍増殖能が低下した（図１３）。３１℃でのウイルスの増殖能を比較したところ同様の段階的低下が見られたが、３７℃におけるほどその効果は著明ではなかった。全体としてこの温度は増殖にとってより寛容的である（図１３、ｉｎｓｅｔ）。３１℃ではＮ４の複製能は野性型と比較して約１００倍低下した。３１℃及び３７℃における、細胞当たりのＰＦＵで表した各ウイルスのバーストサイズは、Ｎ遺伝子がゲノムの下流の連続した各位置に移動させられるのにしたがって細胞当たりの収率が段階的に低下したことを示している（図１３）。更に、各ウイルスの相対的なプラークのサイズにも変化が見られた。Ｎ４のプラークを野性型のプラークと比較した（感染４２時間後では、直径３ｍｍに対し＜０．５ｍｍ）。これらのデータは、Ｎ２、Ｎ３、及びＮ４の遺伝子は野性型であったものの、これらの遺伝子の再編成及びその後のタンパク質のモル比の改変によってウイルスの複製過程のいずれかの段階が部分的に温度感受性となったことを示すものである。
【００５９】
実施例１７
Ｎ遺伝子が再編成されたウイルスの致死性
マウスにおけるＶＳＶの増殖、神経病理学、及び野性型の温度感受性またはプラークサイズ可変型ウイルスの脳内または鼻腔内接種による脳炎に対する感受性についてはこれまでに詳しく述べられている（Ｓａｂｉｎ ａｎｄ Ｏｌｉｔｓｋｙ， １９３７； Ｓｈｅｃｈｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９６７； Ｗａｇｎｅｒ， １９７４； Ｙｏｕｎｇｎｅｒ ａｎｄ Ｗｅｒｔｚ， １９６８）。脳内または鼻腔内接種経路によるＮ２、Ｎ３及びＮ４ウイルスのマウスに対する致死性を野性型ウイルスＮ１と比較した。各経路で致死量（ＬＤ５０）を与えるのに必要なウイルスの量を表３に示した。脳内接種では各ウイルスのＬＤ５０量は１〜５ＰＦＵであったが、Ｎ４ウイルスでは死に至るまでの平均時間は約２倍の長さであった。これらのデータは、遺伝子を再編成したウイルスを直接脳内に注入することでホストの防御システムの大半を回避させるとやがては致死性の脳炎を発症することを示すものである。
【００６０】
これに対し、鼻腔内接種では致死量を与えるのに必要なウイルスの量は大きく異なった（表３）。野性型ウイルスの鼻腔内投与によるＬＤ５０量が約１０ＰＦＵであったのに対し、Ｎ２、Ｎ３、及びＮ４ウイルスでは段階的に値は大きくなった。野性型のＬＤ５０である３０，０００ＰＦＵに対し、Ｎ２は２０倍のウイルスを要し、Ｎ３は５００倍のウイルスを要し、Ｎ４は３０００倍のウイルスを要した。病態（毛羽だった毛皮、嗜眠、後肢麻痺）の発現までの時間及び死亡率は、野性型と比較してＮ２、Ｎ３、及びＮ４ウイルスの感染により段階的に増大し（図１４）、致死率は投与量に応じて変化した（表３）。これらのデータは、周辺経路から投与される場合、細胞培養において観察されるウイルス複製の段階的な低減とマウスにおける致死率の低下との間に相関が見られることを示すものである。
【００６１】
【表３】
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実施例１８
野性型ウイルスによるチャレンジに対するＮ遺伝子が再編成されたウイルスの防御能力
上記ウイルスのすべてのものが脳内接種した場合に致死性を有したことは、最も弱毒化されたウイルスであってもマウスの体内で複製可能であることを示している。このことと、鼻腔内投与後に見られた弱毒化とを併せ考えると、弱毒化されたウイルスによっても防御的免疫応答反応を引き起こせる可能性が示される。この可能性を確かめるため、野性型Ｎ１または変異体ウイルスＮ２，Ｎ３、Ｎ４の１０倍毎の連続希釈液を鼻腔内接種してマウスを免疫した。１４日後に生存した動物に１．３ｘ１０６ＰＦＵの野性型ウイルスを鼻腔内接種してチャレンジを行った。このチャレンジ後に生存した動物の比率と免疫化のウイルス投与量の間には相関が見られ、これまでの研究（Ｗａｇｎｅｒ， １９７４）と一致した。Ｎ２、Ｎ３、及びＮ４ウイルスでは、１００％の生存率を与える最低投与量はマウス１頭当たり３００ＰＦＵであった。３０ＰＦＵでは生存率は８０〜９０％であり、３〜６ＰＦＵでは生存率は４５〜８５％であり、マウス１頭当たり３〜６ＰＦＵ未満の投与量では同じ週齢の免疫化を行わないコントロールとの有意な差は見られなかった（図１５、パネルＡの破線）。野性型ウイルスでは、致死量と防御反応誘導量は近い値であったが、一般に３〜６ＰＦＵのウイルス投与後に生存した動物の８０〜８５％で防御反応が誘導された。
【００６２】
１４日目のチャレンジに先立って血清抗体を測定したところ、マウスにおける病原性が弱毒化されているにも関わらず、Ｎ２、Ｎ３、及びＮ４ウイルスで免疫した動物の血清中に存在する中和抗体のレベルは、３〜６ＰＦＵの野性型ウイルスの接種後に生存した動物で見られたレベルよりも高く、また一般に投与量依存的に高くなったことが示された（図１５Ｂ）。野性型ウイルスの致死性のため、高投与量での抗体価を直接比較することはできなかったが、Ｎ１〜Ｎ４ウイルスを接種した後、１ｘ１０６ＰＦＵの野性型ウイルスでチャレンジした動物における中和抗体価は１：６２５〜１：３１２５の範囲であった。これらのデータは、Ｎ遺伝子を再編成したウイルスは、動物体内における複製能及び致死性が低下しているにも関わらず、野性型ウイルスによる場合に劣らない防御応答反応を引き起こしたことを示すものである。
【００６３】
実施例１９
最適なワクチン用ウイルスを得るための遺伝子の編成
本発明は、モノネガウイルス目における遺伝子発現のレベルが遺伝子の順序によって決定されることを示すものである。更にこれらのデータは、重要なヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子をその通常の位置である３’のプロモーターに最も近い位置から遠ざかる方向に移動させることによって、連続的により高度に弱毒化されたウイルスを得るための手段が与えられることを示すものである。弱毒化の程度はＮ遺伝子が遺伝子の順序において最後から２番目に配される場合に最大となる。最も３’末端に近い遺伝子において発現レベルは最大となる。したがって、弱毒化されているとともに防御反応に関与する抗原を高レベルで発現するワクチン用ベクターを構築するうえで理想的な配列は、Ｎ４（３’−ＰＭＧＮＬ−５’）またはＧ１Ｎ２（３’−ＧＮＰＭＬ−５’）またはＧ１Ｎ４（３’−ＧＰＭＮＬ−５’）の組合わせである。これらの構築体のうち、Ｎ４は弱毒化の程度が最大であり、Ｇ１Ｎ４は免疫応答に重要な付着用糖タンパク質の発現レベルが最大である。この基準に基づけば、Ｇ１Ｎ４（３’−ＧＰＭＮＬ−５’）は弱毒化の程度が最大であり、かつＧタンパク質を最も高いレベルで発現することになる。
【００６４】
実施例２０
位置による発現レベルの調節が可能な更なる外来遺伝子を発現することが可能なワクチン用ベクター
ＶＳＶのゲノムには更なる外来遺伝子を組み込んで発現させることが可能であり、その場合、外来遺伝子は遺伝子間領域に挿入し、保存された遺伝子開始領域、遺伝子終端領域、及び遺伝子間領域は維持するようにする（図１６）（Ｓｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。更に、ＶＳＶゲノムに挿入される外来遺伝子の発現レベルをゲノム内の遺伝子の挿入位置によって調節することが可能である。ＶＳＶ遺伝子の保存された開始領域と終端領域とで挟み込んだバクテリオファージΦＸ１７４のゲノムの６６０個のヌクレオチドからなる配列を、保存された遺伝子間配列は維持するようにしてＶＳＶゲノムの完全長ｃＤＮＡの一連の遺伝子接合部のそれぞれに挿入した。これらの構築体の遺伝子順序は、Ｉが挿入された外来遺伝子を示すものとして、それぞれ、ＮＩＰ（３’−ＮＩＰＭＧＬ−５’）、ＰＩＭ（３’−ＮＰＩＭＧＬ−５’）、ＭＩＧ（３’−ＮＰＭＩＧＬ−５’）、またはＧＩＬ（３’−ＮＰＭＧＩＬ−５’）である。これらのｃＤＮＡのそれぞれを上記の要領でトランスフェクトすることによりウイルスを得た。
【００６５】
ゲノム内の各位置に外来遺伝子配列が挿入されたウイルスのそれぞれをＢＨＫ−２１細胞に感染させ、アクチノマイシンＤの存在下で［３Ｈ］−ウリジンにて代謝標識することによりＲＮＡの合成を分析した。回収されたウイルスのすべてにおいてＶＳＶのゲノムＲＮＡと５種類のＶＳＶ特異的ＲＮＡが発現されていた（図１６）。更に挿入された外来遺伝物質から予測される大きさのｍＲＮＡの合成が４つのケースのすべてで観察された。外来遺伝子の発現レベルはゲノムの３’末端からの遺伝子の挿入位置とともに変化した。発現レベルが最も高かったのはＮＩＰにおいてであり、次いでＰＩＭ、ＭＩＧ、及びＧＩＬの順であった（図１６）。したがって、これらのデータは、ＶＳＶのゲノムへの外来遺伝子の挿入が可能であり、この外来遺伝子は保存されたＶＳＶ遺伝子の開始及び停止シグナルによって挟み込まれている場合に発現させることが可能であることを示している。最も重要な点としては、このデータは外来遺伝子の発現レベルをゲノムへの遺伝子への遺伝子を挿入位置によって調節可能であることを示すものである。
【００６６】
外来遺伝子を発現している各ウイルスの増殖能を分析することによって、外来遺伝子の挿入位置がウイルスの増殖に影響するか否かを判定した。野性型ウイルスと比較してＮＩＰではウイルスの収量は１０分の１に減少したのに対し、ＰＩＭ、ＭＩＧ、及びＧＩＬはいずれも野性型ウイルスに匹敵する程度で複製した。したがって、これらのデータは、外来遺伝子の挿入が可能であること、外来遺伝子の挿入はウイルスにとって致死的ではないこと、及び、外来遺伝子の挿入はその挿入位置によってウイルスの複製を減衰させることが可能であることを示すものである。
【００６７】
実施例２１
血清抗体レベル及び中和価の決定
ウイルスの接種後、２〜４頭からなる動物群から１週間おきに血液を採取した。血清をプールし、５７℃に４０分加熱して補体を不活性化した。ＶＳＶ野性型（Ｎ１Ｇ４）を感染させた細胞単層と感染させていないＢＨＫ−２１細胞を洗剤緩衝液（１％　ＮＰ４０、０．４％　デオキシコール酸ナトリウム、６６ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．４）中で溶解し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）において抗原として使用した。試料を連続希釈し、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合させたヤギα−マウスＩｇを用いて検出した。４５０ｎｍの吸光度（ＯＤ）を読み取り、吸光度と血清希釈度をプロットしたグラフで線形回帰分析を行って抗体価を算出した。滴定終点（ｌｏｇ１０）は免疫前試料の１．５倍のＯＤと推定された。チャレンジを行った日の血清中の中和抗体価をＶｅｒｏ７６細胞を用いた標準的プラーク減少法によって求め、５０％中和度を与える希釈度の逆数として表した。
【００６８】
実施例２２
野性型によるチャレンジからのマウスの防御
ＤＭＥＭに各ウイルスを１〜１０，０００プラーク形成単位（ＰＦＵ）加えたものを鼻腔内接種してマウスを免役した。各変異体ウイルスの非致死量を接種したマウス群に、接種の２１日後、５．４ｘ１０６ＰＦＵの野性型ウイルスＮ１Ｇ４を鼻腔内接種してチャレンジを行った。チャレンジを行った動物とコントロールをその後２１日間にわたって監視した。１週間おきに尾から血液を採取して血清抗体価を調べた。
【００６９】
実施例２３
Ｎ及びＧ遺伝子が再編成されたウイルスの生成及び回収
本発明の実験では、Ｇ遺伝子を遺伝子順序における本来の第４番目の位置から最もプロモーターに近い第１番目の位置に移動させてその発現量を増大させたｃＤＮＡクローンを作成した。Ｇ遺伝子を遺伝子順序の第１番目に移動させ、残りの４個の遺伝子の順序はそのままとして順序を３’−ＧＮＰＭＮ−５’（Ｇ１Ｎ２）としたものと、Ｇ遺伝子とＮ遺伝子の位置を入れ替えて順序を３’−ＧＰＭＮＬ−５’（Ｇ１Ｎ４）としたものの２種類の新規な遺伝子再編成体を作成した（図１７）。これらのｃＤＮＡを細胞にトランスフェクトしたところ、いずれの場合にもウイルスが回収された。回収されたウイルスは、再編成された遺伝子順序内でのＮ及びＧ遺伝子の位置に基づいてＧ１Ｎ２及びＧ１Ｎ４として表した。これらのウイルスの性質を、同様の遺伝子再編成過程によって野性型の遺伝子順序（Ｎ１Ｇ４）としたｃＤＮＡクローンから得られるウイルス、及び遺伝子順序が３’−ＰＭＧＮＬ−５’（Ｇ３Ｎ４）であるウイルスとの比較を行って調べた。
【００７０】
実施例２４
Ｎ及びＧ遺伝子が再編成されたウイルスにおけるタンパク質発現に対する遺伝子再編成の影響
ＢＨＫ−２１細胞にゲノムを再編成したウイルスを感染させ、感染５時間後に［３５Ｓ］メチオニンで１時間標識することでウイルスタンパク質の合成の相対レベルを調べた。細胞の全タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離してオートラジオグラフィにより可視化した。図１８Ａに典型的なゲルの一例を示した。野性型ＶＳＶ及び遺伝子再編成した変異体を感染させた場合、ホストのタンパク質合成は急速に阻害され、ウイルス由来のＮ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬタンパク質が直接検出された。野性型（Ｎ１Ｇ４）を感染させた細胞（図１８、レーン１）の合成速度と比較して、Ｇ１Ｎ２及びＧ１Ｎ４ウイルスを感染させた細胞では他のウイルスタンパク質に対するＧタンパク質の合成速度が大幅に増大した（図１８、レーン２及び４）。
【００７１】
各タンパク質を燐光発光法によって定量した。１時間の標識時間の間に合成されたＧタンパク質のモル比率は、野性型ウイルスを感染させた細胞と比較してＧ１Ｎ２を感染させた細胞では２．３倍高く、Ｇ１Ｎ４細胞を感染させた細胞では１．７倍高かった。同様にＮ遺伝子がプロモーターに最も近い位置からＧ１Ｎ２、Ｇ３Ｎ４、及びＧ１Ｎ４ウイルスにおけるより遠くの位置へと転座することによりＮタンパク質の合成速度は低下した（図１８Ｃ）。このようにタンパク質合成速度の相対速度が変化した結果、各ウイルスタンパク質のモル比、特に最適なＲＮＡ複製が行われるうえで重要であることが知られているＰに対するＮの比（Ｐａｔｔｎａｉｋ ａｎｄ Ｗｅｒｔｚ， １９９０）は各変異体ウイルスに感染した細胞で異なった（図１８Ｃ）。
【００７２】
更に精製したウイルス粒子中のタンパク質含量を調べることにより細胞内でのタンパク質合成における変化がタンパク質のウイルス粒子へのアセンブリ過程に影響するか否かを調べた。［３５Ｓ］−メチオニンにて一晩標識した各ウイルスをＢＨＫ−２１細胞に感染させ、上清からウイルスを収穫し、１０％ショ糖にて遠心して細胞の破砕片より分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりウイルスタンパク質を分析したところ（図１８Ｂ）、相対的なタンパク質含量に全体としての差異は見られなかった。燐光発光法による定量によって、感染細胞ではタンパク質合成の相対レベルは変化していたものの、野性型または他の遺伝子再編成ウイルスにおけるよりもＧタンパク質のレベルが１．６倍高かったＧ１Ｎ２ウイルスを例外として、ウイルス粒子中の各タンパク質の量は野性型と同様であることが確認された（図１８Ｄ）。
【００７３】
実施例２５
Ｎ及びＧ遺伝子が再編成されたウイルスの複製
１段増殖条件下での遺伝子再編成ウイルスの複製能を、感染多重度（ＭＯＩ）が３となるようにＢＨＫ−２１培養細胞にウイルスを感染させた後、３７℃にて培養して調べた。異なる時間に上清を回収し、プラークアッセイによってウイルス収量を測定した。プロモーターに最も近い位置から遠ざかる方向にＮ遺伝子を転座させると、第１番目の位置から遠位へと遺伝子が移動させられるにしたがって複製量は段階的に低減した。Ｎ遺伝子の第２番目の位置への移動（Ｇ１Ｎ２）により、複製量は３分の１に減少したのに対し、Ｎ遺伝子を第４番目の位置に移動（Ｇ３Ｎ４）させると複製量は１，０００分の１にまで低下した（図１９）。これに対し、Ｎ遺伝子が第４番目の位置にある２種類のウイルス（Ｇ３Ｎ４とＧ１Ｎ４）では１段増殖条件下での複製量が大きく異なったが、これは最適な複製が行われるうえで重要なＮ：Ｐのモル比がＧ１Ｎ４ではＧ３Ｎ４よりも安定していたことに恐らくよるものと考えられる。感染５時間後に細胞内のタンパク質合成速度を測定したところ、Ｇ１Ｎ４（３’−ＧＰＭＮＬ−５’）に感染した細胞ではＮ：Ｐのモル比は１：１．６であったのに対し、Ｇ３Ｎ４（３’−ＰＭＧＮＬ−５’）に感染した細胞ではＮ：Ｐのモル比は１：１．８であった（図１８Ｃ）。野性型に感染した細胞（Ｎ１Ｇ４）におけるＮ：Ｐの比が１：０．７であり、Ｇ１Ｎ２に感染した細胞では１：０．８であることに示されるように、ウイルスの複製には１：０．５〜１：１のＮ：Ｐのモル比が最適である。野性型ウイルス及びＧ１Ｎ２ではいずれも遺伝子順序においてＮ遺伝子の直後にＰ遺伝子が位置している（図１７）。Ｎに対するＰの量が多すぎても少なすぎても複製量は大幅に低下する。Ｇ３Ｎ４に感染した細胞ではＮが律速因子となっているばかりでなくＮ：Ｐのモル比が最適値の２倍以上となっている。Ｇ３Ｎ４及びＧ１Ｎ４の複製速度は野性型及びＧ１Ｎ２に比較して遅くなっている。Ｎ１Ｇ４及びＧ１Ｎ２では１段増殖は感染１２時間後に完了したのに対し、Ｇ３Ｎ４及びＧ１Ｎ４では感染２４時間後であった。Ｇ１Ｎ２では野性型ウイルスと比較して複製の遅れは見られなかったことから、感染細胞における過剰量のＧの存在が複製のこうした遅れの原因であるとは考えにくい。
【００７４】
実施例２６
Ｎ及びＧ遺伝子が再編成されたウイルスの致死性
若いマウスは、ＶＳＶ及びその突然変異体によって引き起こされる神経疾患の研究のための好感度の動物モデルを与えるものであり（Ｓａｂｉｎ ａｎｄ Ｏｌｉｔｓｋｙ， １９３８； Ｗａｇｎｅｒ， １９７４）、鼻腔内経路からマウスに野性型ＶＳＶを接種すると致死性の脳炎を発症する。遺伝子を再編成した変異体ウイルスを３〜４週齢のＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒ系マウスに鼻腔内接種し、その病原性を野性型ウイルスと比較した。各ウイルスについてＬＤ５０を与える投与量を表４に示した。
【００７５】
【表４】
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ウイルスはいずれも充分量を投与した場合にマウスに対する致死性を示したが、これらの実験で投与したＧ３Ｎ４の量は以前に見られたＬＤ５０に達しなかった。一般にはＮ遺伝子の位置、Ｎ：Ｐの比、及びウイルス複製のレベルが致死性の主要な決定因子であった。Ｎ遺伝子がプロモーターから遠ざかる方向に移動させられたウイルスではＬＤ５０となる投与量は大幅に大きくなった。これらの結果は、Ｎ遺伝子が順次移動させられたＮ１〜Ｎ４ウイルスにおけるこれまでの観察結果を裏付けるものである。しかしながら、ここに示す結果は、第４番目の位置にＮ遺伝子が配されたウイルス（Ｇ３Ｎ４及びＧ１Ｎ４）では、Ｇ遺伝子の位置によっても複製能及びＬＤ５０値の両方が影響されることを示すものである。
【００７６】
ここに示すＬＤ５０値はＶｅｒｏ−７細胞での力価で表したものであり、ＢＳＣ−４０細胞における力価よりも約１０倍高い値である。細胞系を変更したのは、ＶＳＶの遺伝子順序の並べ替えが変異体ウイルスのインターフェロン系との相互作用に影響するおそれがあるためである。ＢＳＣ−４０細胞は感染後にもインターフェロンを産生するのに対してＶｅｒｏ細胞はインターフェロンを産生しない。したがってＶｅｒｏ細胞への変更によってインターフェロン誘導性またはインターフェロン感受性における差の問題を回避することが可能である。
【００７７】
病態の最初の症状（背骨が曲がった姿勢、及び後肢の麻痺）はＮ１Ｇ４及びＧ１Ｎ２の両方において接種５日後に現れたが、Ｎ１Ｇ４を接種した動物では最初の死亡例がこれよりも早期に見られた（図２０）。第４番目の位置にＮ遺伝子が配されたウイルスでは症状の発現はより緩慢であり、マウス１頭当たり１，０００ＰＦＵの投与量では先に観察されたとおりＧ３Ｎ４による死亡も病態の発現も見られなかった。非顕性の病態の徴候を検出するため、これらのマウス群の体重を実験期間の全体を通じて毎日計測した（図２１）が、症状が見られたマウスは例外なく体重が減少し死亡したのに対して、症状が見られなかったマウスでは非接種のコントロール動物群と比較して体重差は認められなかった（図２１）。同様な結果がウイルスを接種したマウスを野性型ウイルスでチャレンジした後にも見られ、症状が現れた動物はいずれも後に死亡し、症状が現れなかった動物ではやはり体重の減少は認められなかった。
【００７８】
実施例２７
再編成されたＮ及びＧ遺伝子を有するウイルスを接種したマウスの血清抗体
Ｇ遺伝子が再編成されたウイルスの接種が体液性免疫応答に与える影響を評価するため、各変異体ウイルスの１０倍毎の連続希釈液をマウスに鼻腔内接種した。毎週尾から採血してＥＬＩＳＡにより血清の抗体レベルを求めた。この実験では接種後のマウスの生存が前提条件であるのでＬＤ５０以下の投与量のみを用いた。Ｇ遺伝子の転座によって抗体の応答反応の反応速度及び程度が変化した（図２２）。野性型ウイルスを接種したマウスでは２１日以内に辛うじて検出可能なレベルの抗体が産生されたのに対して、１００ＰＦＵのＧ１Ｎ２を接種した動物では１４日目までに有意な抗体価の抗体が産生され、Ｇ１Ｎ４を接種した動物では接種７日後までに有意な抗体価の抗体が産生された。このような加速、増強された免疫応答は、１００ＰＦＵのウイルスを接種したマウスを比較することによって最も明らかとなる（図２２）。これらの結果は、Ｇ遺伝子を第１番目の位置から第４番目の位置に転座させることによってＶＳＶに対する体液性免疫応答が増強されることを示すものである。Ｇ１Ｎ４を接種したマウスではＧ３Ｎ４を接種したマウスと比較して早期かつ高レベルの抗体の産生が見られた。このことは更に、Ｇ遺伝子を遺伝子順序の第１番目の位置に配することでＶＳＶの免疫原性が高められるという観察を裏付けるものである。
【００７９】
接種２１日後にマウスを５．４ｘ１０６ＰＦＵの野性型ＶＳＶでチャレンジした。Ｎ１Ｇ４またはＧ１Ｎ２を接種した動物では抗体価の速やかな上昇が見られたが、Ｇ３Ｎ４またはＧ１Ｎ４を接種したマウスでチャレンジを行う以前に既に高値であった抗体価が更に上昇することはなかった。
【００８０】
実施例２８
再編成されたＮ及びＧ遺伝子を有するウイルスの接種後の中和抗体価
チャレンジの時点における血清中の中和抗体のレベルを測定した。マウス及びウシでは中和抗体はＶＳＶ感染に対する防御反応における重要な要素である。チャレンジの当日にマウスから採血し、Ｖｅｒｏ−７６細胞を用いて標準的なプラーク減少法を行い、野性型ＶＳＶを中和する能力について血清試料を検定した。プラーク数が５０％に減少した最も高い希釈度の逆数を計算して各血清の中和価を求めた。
【００８１】
これらのゲノムが再編成されたウイルスはいずれもマウスにおいて血清中和抗体を誘導した（図２３Ａ）。Ｎ１Ｇ４またはＧ１Ｎ２を１または１０ＰＦＵ／マウスの投与量で接種した場合にはいずれも中和抗体は検出されなかったが、いずれのウイルスも１００ＰＦＵの投与量では検出可能な抗体価の抗体を誘導し、Ｇ１Ｎ２に対する応答は野性型ウイルスと比較して１０倍高かった。したがって、細胞培養中では野性型ウイルスはＧ１Ｎ２の２〜３倍の量で複製することから、Ｎ１Ｇ４及びＧ１Ｎ２では中和抗体のレベルと細胞培養中でのウイルスの複製量に相関は見られなかった（図１９）。Ｇ３Ｎ４及びＧ１Ｎ４ではその複製能が大幅に低下しているにも関わらずこれに対する応答において野性型ウイルスと比較して約１０倍高い抗体価の抗体が誘導されたが、このこともこの結論を裏打ちするものである。
【００８２】
以上まとめると、野性型ウイルス（Ｎ１Ｇ４）と比較して、Ｇ遺伝子が過剰発現し、Ｎ遺伝子の発現が低下したウイルスの鼻腔内接種により感染細胞の中和抗体の産生量は増大した。過剰発現するＧ遺伝子と発現が低下したＮ遺伝子との組み合わせによって、こうした高い免疫原性とウイルスの弱毒化が組み合わされるため、投与量を大きくして誘導される中和抗体の抗体価を高めることが可能である。更に、これらのウイルスでは致死性が低下していることから１００倍の量のウイルスを支障なく投与することが可能であり、こうした条件下ではこれらのウイルスは野性型ウイルスに対する応答によって誘導される量の最大で１００倍の中和抗体を誘導することが可能である。
【００８３】
実施例２９
野性型ウイルスによるチャレンジからのマウスの防御
以上の結果は、病原性を呈さない程度の投与量でＧタンパク質を過剰発現するウイルスをマウスに投与することによって著明な体液性免疫応答を誘導することが可能であることを示すものである。遺伝子を再編成したこれらのウイルスによる免疫化によってＶＳＶ疾患に対する防御反応が与えられるか否かを検討するため、各遺伝子再編成ウイルスの接種後に生存した動物に２１日後に５．４ｘ１０６ＰＦＵの野性型ウイルスでチャレンジを行った。この投与量はウイルスを接種していない同じ週齢のコントロール動物群の８３％を死に至らしめる量である。
【００８４】
ゲノム再編成ウイルスのいずれによっても接種物の量に応じてレベルの異なる防御反応が与えられた（図２３）。Ｎ１Ｇ４及びＧ１Ｎ２によって誘導される防御反応のレベルは同程度であり、先に述べたようにこれらのウイルスの複製及び致死性のレベルが同等であることを反映している（図１９及び表４）。同様にＧ１Ｎ４によって与えられた防御反応はＧ３Ｎ４によるものと同様であった。いずれのウイルスによっても接種２１日後までにマウス１頭当たり１，０００ＰＦＵの投与量により著明な免疫応答が誘導された。こうした完全な防御反応の誘導量がＬＤ５０値の２０〜１００分の１であったことは重要である。このことは、ＶＳＶの表現型を系統的に改変して弱毒化生ワクチンに求められる性質を最適化するうえで遺伝子の再編成が有効な方法であるという結論を支持するものである。　【００８５】
考察
本発明はマイナス鎖ＲＮＡウイルスにおける遺伝子の順序が遺伝子の発現レベルを決定することを証明するものである。この遺伝子の順序は並べ替えることが可能であり、再編成された各ウイルス遺伝子の発現レベルは３’末端側の転写プロモーターに対する各遺伝子の位置を反映したものとなる。Ｎ（ヌクレオカプシド）遺伝子などのウイルスの複製に不可欠な１個の遺伝子をウイルスゲノムの下流方向に向かって異なる位置に順次並べ替えることによって細胞培養におけるウイルスの増殖能及びマウスに対するウイルスの致死性を段階的に変化させることが可能である。すなわち、上記のデータはこれらのウイルスを段階的に弱毒化するための一手段を示したものである。Ｎ４（３’−ＰＭＧＮＬ−５’）のような弱毒化ウイルスでは、ウイルスの致死量と防御反応誘導量は１，０００倍以上も異なっているが、これは弱毒化ワクチンの候補として望ましい特性である。
【００８６】
更に本発明は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムに外来遺伝子を挿入し、この外来遺伝子を発現する感染性ウイルスを得ることが可能であることを証明するものである。外来遺伝子の発現レベルは３’末端に対するゲノム内の遺伝子の挿入位置によって調節することが可能である。これらのウイルスが外来物質を取り込む能力は、これらのウイルスが螺旋状のリボヌクレオカプシドを有することにより、ゲノムのサイズが大きくなるにしたがってヌクレオカプシド及びウイルスが大型化することに起因するものと考えられる。これまでのところ挿入可能な外来物質の量の限界は見出されていない。
【００８７】
本発明の方法を利用してワクチン用の弱毒化ウイルスを開発することが可能であるが、この方法はゲノムの構成及び遺伝子発現の調節機序の類似性に基づけば、モノネガウイルス目に属するすべてのウイルスに適用可能である。モノネガウイルス目には、狂犬病ウイルスなどのラブドウイルス科、麻疹ウイルス、パラインフルエンザウイルスや呼吸系発疹ウイルスなどのパラミクソウイルス科、及びエボラウイルスやマールブルグウイルスなどのフィロウイルス科が含まれる。
【００８８】
モノネガウイルスのｃＤＮＡクローンから感染性のウイルスが再生されることによりウイルスゲノムを実験的に操作することが可能である。これらのウイルスの遺伝子の発現は、ウイルスのゲノムの３’末端に位置する１個のプロモーターに対する遺伝子の順序によって転写レベルで調節することが可能である。ゲノムに他の変異を導入することなく遺伝子の順序を並べ替える方法が開発された。こうした遺伝子の再編成によってウイルスの各タンパク質の相対的合成量が予測どおりに変化し、多様な表現型を有する感染性ウイルスが生成された。本研究では、ウイルスの主要な中和エピトープをコードするＧタンパク質遺伝子を遺伝子の順序においてプロモーターから最も離れた位置から第１番目の位置に移動させた結果を調べた。Ｇタンパク質の遺伝子を第４番目から第１番目の位置に移動させた場合、ウイルスを感染させた細胞内でＧタンパク質の発現量は大幅に増大した。しかし精製したウイルス粒子の内容物にはウイルスの遺伝子順序の変化による影響はほとんど見られなかった。
【００８９】
これらのウイルスによるＧ遺伝子の過剰発現によってウイルスが動物に引き起こす体液性免疫応答に変化が生ずるか否かを調べることが可能である。図２２のデータは、Ｇ遺伝子がプロモーターに最も近い位置に移動させられたウイルスを感染させた動物では、１００ＰＦＵの接種物の接種により、野性型ウイルスと比較してより短時間でより高レベルの抗体が産生されたことを示している。Ｎ１Ｇ４の野性型ウイルス及びＧ１Ｎ２ウイルスでは１００ＰＦＵよりも高い投与量はウイルスの致死性のために検定できなかった。１００ＰＦＵの投与量で比較した場合、Ｇ１Ｎ２、Ｇ３Ｎ４、及びＧ１Ｎ４ウイルスはいずれも野性型ウイルスと比較してより短時間により高い抗体価の抗体の産生を誘導した。Ｇ１Ｎ４及びＧ３Ｎ４ウイルスでは致死性が低下していることから大量投与が可能であり、その場合、抗体レベルは低量投与の場合よりも一層速やかに増大した。
【００９０】
Ｇ遺伝子がプロモーターに最も近い位置に移動させられた３種類のウイルスのすべてがマウスの体液性免疫応答を増強させたことは、この系における防御免疫反応を理解するうえで示唆を与えるものである。免疫応答の誘導に最も関連が深い、細胞内での各変異体接種ウイルスの複製の相対レベルは不明であるが、こうした複製レベルは細胞培養中での複製の相対レベルを少なくとも性質の面において反映している可能性が高いものと考えられる。もしそうであるとすると、Ｇ１Ｎ２、Ｇ３Ｎ４、及びＧ１Ｎ４は最初の一回の複製においてのみ接種されたマウスの体内でＧタンパク質を高レベルで発現していることになる。その後は、野性型ウイルスのより強力な複製能によって野性型ウイルスの弱いＧタンパク質合成は補償される。ところがマウス１頭当たり１００ＰＦＵの同量接種では、野性型を接種した動物と比較して各変異体ウイルスによって増強された体液性免疫応答が速やかに誘導された。感染細胞内でのＧタンパク質合成速度の若干の増加が、ウイルスの複製能が大幅に減衰されているにも関わらず免疫応答に著明な影響を与える点は注目に値する。
【００９１】
これらの結果は、体液性免疫応答の反応速度及び反応の程度は感染のかなり早期に確立されることを示している。免疫応答の程度が不可変的に確立される短い時間枠が存在するか、あるいは、ＶＳＶ感染に対する免疫応答が集合的な免疫原性負荷によってではなく、感染細胞１個当たりのＧタンパク質合成のレベルによって決定されていることが考えられる。カナリア痘ウイルスベクターをウイルスが複製できない条件下で用いたワクチンの効果によっても同様の結論が示される。複製能を大きく減衰させたベクターによる抗原の強力な合成は、更なる応用が期待される効果的なワクチン策と考えられる。
【００９２】
ゲノムＲＮＡの複製には化学量論的な量のＮタンパク質を必要とすることから、Ｎ遺伝子の位置及びＮタンパク質の発現レベルと複製の効率とは相関していると考えられる。野性型ウイルスＮ１Ｇ４が最も高いウイルス価で複製し、次いでＧ１Ｎ２及びＧ１Ｎ４ウイルスの順でＧ３Ｎ４ウイルスの複製能が最も低かった。Ｇ１Ｎ４ウイルスとＧ３Ｎ４ウイルスではいずれも第４番目の位置にＮ遺伝子があるにも関わらずＧ１Ｎ４ウイルスの複製能はＧ３Ｎ４よりも大幅に高かった。これらのウイルスではいずれも複製速度は遅く、Ｎタンパク質の供給によって子孫ウイルスの生成が律速されると仮定した場合に予想されるとおりであった。
【００９３】
Ｎタンパク質とＰタンパク質の相対レベルは、Ｎタンパク質の絶対量とならんで、効率的な複製が行われるうえで重要であることが知られている。Ｐタンパク質の機能の１つは、Ｎタンパク質によって新たに複製されたＲＮＡが封入されるようにＮタンパク質を可溶状態に維持することであるが、このことに一致して、Ｇ１Ｎ２ウイルスではＮタンパク質の発現が低下している（図１８Ａ及び１８Ｃ）が、Ｎ及びＰ遺伝子の相対的な順序は野性型のＮ１Ｇ４ウイルスと同じである（図１７）。したがってＧ１Ｎ２はＮタンパク質とＰタンパク質を、それぞれ１：０．８及び１：０．７と野性型とほぼ同じ相対速度で発現する。このことに一致して、Ｇ１Ｎ２ウイルスの複製能は野性型ウイルスよりも若干低いだけであった。更に、Ｇ１Ｎ４及びＧ３Ｎ４ウイルスではいずれもＮ遺伝子が第４番目の位置にあるにも関わらず、Ｇ１Ｎ４の複製能はＧ３Ｎ４に比して大幅に高かった（図１９）。これらのウイルスのいずれにおいてもＮタンパク質とＰタンパク質の合成速度の比は野性型と大きく異なっていた。これに対し、Ｐ遺伝子が第１番目の位置にあるＧ３Ｎ４ウイルスでは感染細胞におけるＰに対するＮの比が１：１．８であったのに対して、Ｐ遺伝子が第２番目の位置にあるＧ１Ｎ４に感染した細胞ではＮ：Ｐの比は１：１．６であり、野性型により近かった。これら２種類のウイルスのウイルスはＧタンパク質の発現速度においても異なっており、またＧタンパク質のレベルが高いことによってＧ１Ｎ４ウイルスの再生に有利に働いている可能性がある。
【００９４】
遺伝子が再編成されたウイルスにおける致死性の低下も、マウスにおける致死性の低下と複製能の低下には相関が見られるという観察にやはり符合するものである。上記に述べたように複製能の低下はＮタンパク質の過剰発現レベル、及びＰに対するＮの比に関連している。明らかなことであるが、Ｇ遺伝子を第１番目の位置に移動させるすべての遺伝子再編成ではＮ遺伝子がその野性型における位置から移動させられるためにＮタンパク質の発現量が低減する。これによって更に、問題となる遺伝子再編成によって互いに対する位置が変化する遺伝子からのタンパク質のモル比は変化する。いずれのタイプの変化によっても複製効率及び致死率が変化することが予想される。表４のデータは、最も複製能が高い野性型及びＧ１Ｎ２ウイルスではＬＤ５０量としてわずか５０〜１００ＰＦＵを要するだけなのに対して、Ｇ１Ｎ４及びＧ３Ｎ４ウイルスでは致死量を与えるのにそれぞれその２００〜１０００倍を要したことを示している。
【００９５】
ここに示したデータは、遺伝子の再編成によってウイルスの表現型の２つの重要な性質、すなわち致死率と中和抗体の刺激の操作が可能となることを示している。Ｎタンパク質の発現量を低下させ、Ｎ：Ｐの比を変化させることによって複製能及び動物での致死率を低下させることが可能であり、Ｇタンパク質の発現量を増大させることによって抗体合成の反応速度及びレベルを変化させることが可能である。
【００９６】
これらの結果は、遺伝子再編成を利用することにより新規で有用な表現型を有するウイルスの作成が可能であることを示すものである。この方法によれば、表現型を段階的に変化させて所望のレベルでウイルスを弱毒化したり、特定の遺伝子の発現を変化させることが可能となる。この方法は、弱毒化及び免疫原性のレベルを個別かつ系統的に調節することを可能にするものであり、弱毒化生ワクチンの候補を作成、操作するうえで正に必要なものである。モノネガウイルス目に属するすべてのウイルスは、３’末端側の１個のプロモーターから必ず順次転写が行われることによる遺伝子発現を調節するための共通の機構を有するため、この方法をモノネガウイルス目の他のウイルスに適用することも可能である。更にモノネガウイルス目のウイルスでは相同組換えが起こらないために遺伝子の順序についてなされた改変は自然のプロセスによって逆戻りすることはない。ＶＳＶに複数の外来遺伝子を発現させ、１実験では対応する病原体からマウスを防御した。ＶＳＶのこうした性質のため、このウイルスは将来的にＶＳＶ自体または他の病原体を対象としたワクチンを製造するための優れた候補といえる。天然のホストの体内におけるＧ１Ｎ２、Ｇ３Ｎ４、及びＧ１Ｎ４ウイルスの病原性及び免疫原性を評価するための研究が現在行われている。
【００９７】
実施例３０
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）における遺伝子の再編成により天然のホストにおける臨床的疾患が消失する
ＶＳＶに対するサブユニットワクチンまたはＤＮＡワクチンの開発に努力が向けられてきたが限られた成功しか収めていない。生きた野外株による免疫化が緊急時にのみ試みられたことがある。しかしながら、弱毒化した生ワクチンは別のラブドウイルスである狂犬病ウイルスに対して用いられて成功を収めているにも関わらずＶＳＶに対して使用されてこなかった。現時点ではＶＳＶ感染に対する有効なワクチンは存在しない。
【００９８】
ＶＳＶが複製し、疾患を引き起こし、ＶＳＶの３種類のホストの１つであるブタにおいて防御的免疫応答を誘導する能力に対してＶＳＶの遺伝子の再編成が与える影響を下記の例において調べた。その結果、ヌクレオカプシドタンパク質の遺伝子を単一の転写プロモーターから遠ざかる方向に移動させることによってウイルスが疾患を引き起こす能力が減衰され、最終的には失われることが示された。この変化を表面糖タンパク質の遺伝子の転位と組み合わせることにより、野性型ＶＳＶによるチャレンジにおいて防御反応を誘導するワクチンが得られた。ウイルスの性質を段階的に操作する遺伝子再編成は、このクラスのウイルスに対する弱毒化生ワクチンを製造するための新規な方法を与えるものである。
【００９９】
地域の養豚業者より入手した２０頭の雌のヨークシャー種のブタ（８〜１０週齢で２５〜３０ｋｇのもの）を４頭づつ５個のグループにランダムに分け、各群をプラム島動物疾病センター（Ｐｌｕｍ　Ｉｓｌａｎｄ　Ａｎｉｍａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｅｎｔｅｒ）にてバイオセーフティレベル３（ＢＬ−３）の隔離条件下にて隔離室に収容した。血清中和抗体検定を行ったところ動物はすべてＶＳＶ陰性であった。動物の温度及び挙動を連日監視し、ウイルス単離及び抗体価測定用の試料を下記に示す時間間隔で採取した。採取は、防護服及び携帯型ＨＥＰＡレスピレータを着用した人員により行い、各隔離室に入室する度にレスピレータを交換した。
【０１００】
再編成ゲノムとして、３’−Ｇ−Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｌ−５’（Ｇ１Ｎ２）、３’−Ｐ−Ｍ−Ｇ−Ｎ−Ｌ−５’（Ｇ３Ｎ４）、及び３’−Ｇ−Ｐ−Ｍ−Ｎ−Ｌ−５’（Ｇ１Ｎ４）を有するウイルスを上記に述べた要領でＶＳＶ−ＩＮの感染性ｃＤＮＡクローンから誘導した。３７℃にてトランスフェクトした細胞からＮ１Ｇ４（ＷＴ）及びＧ１Ｎ２ウイルスが回収され、Ｇ３Ｎ４及びＧ１Ｎ４ウイルスは３１℃にてトランスフェクトした細胞のみから回収された。これまでに報告されているように、Ｎ遺伝子がプロモーターから離れた位置に移動させられたウイルスは、遺伝子の順序に応じて程度の異なる温度感受性を示す。細胞培養中におけるこれらのウイルスに対する操作は特に断らない限りすべてそれぞれの温度にて行った。
【０１０１】
キシラジン−ケタミン−テラゾールにて鎮静させた動物の吻部の表皮を、二重先端皮膚検査アプリケータ（Ｄｕｏｔｉｐ−Ｔｅｓｔ；リンカーン・ダイアグノスティックス社（Ｌｉｎｃｏｒｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ディケーター、イリノイ州）にて２０回穿針し、１００μｌのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に加えた２．５ｘ１０７ＰＦＵのウイルスを乱刺部分に置いた。次いで接種物の下部領域を乱刺法を繰り返し行って再感作し、接種物がその部位に導入されるまで動物を静止状態に拘束した。コントロール動物は同様の処理を行って１００μｌのＤＭＥＭのみを投与した。接種後のウイルス調製物はすべて最初のウイルス価の４倍以内に収まっていた。改変咽頭またはプロバングスクレーパを用いて咽喉頭粘液（ＯＰＦ）を接種前後の異なる時間に採取した。接種前後の異なる時間に綿棒による鼻粘液試料及び血清試料を採取した。更にすべての病変部の綿棒採取物も採取し、ウイルス単離により検査した。綿棒採取物及びＯＰＦ試料は抗生物質含有ＤＭＥＭ中に採取した。
【０１０２】
最初の接種の３６日後に、上記の要領で吻部表皮の乱刺及び接種を行って、これらのブタに１頭当たり４．２ｘ１０７ＰＦＵのＮ１Ｇ４でチャレンジを行った。動物の温度ならびに挙動を連日監視し、ＯＰＦ、鼻、及び血清試料を上記の要領で採取した。
【０１０３】
鼻綿棒採取物、ＯＰＦ、及び病変部の綿棒採取物の試料を遠心して清澄とした後に９６穴プレート中ＢＨＫ−２１細胞の単層上に接種してウイルスの存在について分析した。上清を連続希釈して４セットのウェルの細胞に添加した。Ｎ１Ｇ４及びＧ１Ｎ２を接種した動物から得た試料は３７℃で３日間インキュベートし、Ｇ１Ｎ４及びＧ３Ｎ４から得た試料は３１℃で４日間インキュベートした。
【０１０４】
血清を採取し、５６℃で３０分間加熱して不活化した。血清の２倍毎の連続希釈液を１ｍｌ当たり５０％の組織培養感染量のＮ１Ｇ４とともに３７℃で１時間インキュベートした。９６穴プレートを用いた４セットのアッセイにおいて試料をＢＨＫ−２１細胞に添加し、３７℃で３日間インキュベートし、１０％ホルムアルデヒドにて固定した後、クリスタルバイオレットにて染色した。野性型のＮ１Ｇ４ＶＳＶのＣＰＥを１００％阻害する希釈度の逆数を記録した。
【０１０５】
細胞変性効果について陽性を示した培養ウェルを回収し、ＶＳＶ特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによってウイルス単離物を同定した。ＶＳＶプライマーは再編成したウイルスゲノム同士の区別が可能であるようなものを設計した。プライマーは、標的遺伝子（Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、またはＬ）、ヌクレオチドの位置、及びセンス鎖（順方向（ｆ）または逆方向（ｒ））から命名し、野性型の順序ではＮ−１３１４ｆ／Ｐ−１９５６ｒ及びＭ−２８４４ｆ／Ｇ−３１９８ｒであり、Ｇ１Ｎ２ではＧ−４２８４ｆ／Ｎ−１２１ｒ及びＭ−２８４４ｆ／Ｌ４９２５ｒであり、Ｇ３Ｎ４ではＧ−４２８４ｆ／Ｎ−１２１ｒ及びＮ−１３１４ｆ／Ｌ−４９２５ｒであり、Ｇ１Ｎ４ではＧ４２８４ｆ／Ｐ−１９５６ｒであった。
【０１０６】
異なるウイルスの接種により引き起こされた疾患の程度は、病変部のサイズ及び位置に基づいた臨床評点システムを用いて病変部の形成を評価することで判定した。０点は視認できる病変が認められなかった場合、１点は接種部位に直径２ｃｍ未満の病変が生じた場合、２点は接種部位に直径２ｃｍよりも大きい病変を生ずるかまたは複数の病変を生じた場合、３点は非接種部位に２ｃｍ未満の病変が生じた場合、４点は非接種部位に２ｃｍよりも大きい病変を生ずるかまたは複数の病変を生じた場合を示す。１頭の動物において１種類よりも多い病変を生じた場合には得点が４点を上回る場合もある。
【０１０７】
実施例３１
ブタにおける遺伝子操作ウイルスの病原性
図２４に示されるように、Ｎ遺伝子が遺伝子の順序における第１番目から第２番目または第４番目に移動させられ、Ｇ遺伝子が遺伝子の順序における第４番目から第１番目または第３番目に移動させられたウイルスの、ＶＳＶの天然のホストであるブタにおける病原性を、野性型の遺伝子順序を有するウイルスの病原性と比較した。各群４頭からなる若い雌のヨークシャー種のブタの群に、吻部の乱刺によって、Ｎ１Ｇ４（ＷＴ）、Ｇ１Ｎ２、Ｇ３Ｎ４またはＧ１Ｎ４のウイルスの内の１種類を１頭当たり２．５ｘ１０７ＰＦＵ皮内接種した。第５の群には培地のみを接種し、擬似感染コントロール群とした。ＢＬ−３条件下で各群を別々の隔離室で飼育し、ＶＳＶ感染に特徴的な水疱性病変部の形成ならびに直腸温度について毎日監視した。
【０１０８】
接種後２日目までに野性型であるＮ１Ｇ４ウイルスを接種したすべての動物の接種部位に直径２ｃｍ未満の水疱が生じた。その後、Ｎ１Ｇ４を接種した動物では接種３〜４日後までに病変部のサイズは直径２ｃｍを上回り、更に複数の病変部を生じた。接種３日後に吻部に生じたこうした病変部の一例を図２４Ａに示した。異なる４種のウイルスの内の１種類を接種した各ブタの臨床評点の経時的変化を図２５に示した。この臨床評点は生じた病変部のサイズ、個数、及び分布を上述の要領で判定して求めた。Ｎ１Ｇ４を接種した４頭のブタの内、３頭では病変の発生は吻部に限局した（図２４Ａ及び２５Ａ）。これに対し、Ｎ１Ｇ４を接種をしたブタの１頭では、蹄に水疱を生じ、別の１頭は舌に水疱を生じて、その臨床評点は６点と高くなった。一般にこれらの病変部のサイズ、分布、及び重篤度はＶＳＶ−ＩＮの野外単離ウイルスによって生ずる病変部との区別が困難であった。以上の実験で使用した、本発明者等のｃＤＮＡクローンから得たＮ１Ｇ４の野性型ＶＳＶ−ＩＮによって、この遺伝子組換えウイルスが回収後に細胞培養中で多数回にわたって継代され、動物を介して継代されることがなかったにも関わらず、ＶＳＶ−ＩＮの野外単離ウイルスと同様の臨床的病態が引き起こされたことは注目に値する。
【０１０９】
Ｇ１Ｎ２ウイルスの接種によって２日目までにすべてのブタの接種部位に小疱（＜２ｃｍ）が形成された（図２４Ｂ及び２５Ｂ）。しかし、野性型Ｎ１Ｇ４ウイルスによる病態と比較して、Ｇ１Ｎ２を接種したブタに見られた水疱は時間とともにサイズが大きくなることはなく、多数の病変部を生じることもなかった。更に、Ｇ１Ｎ２を接種した動物で見られた病変は接種部位に限局していた。Ｎ１Ｇ４を接種した動物及びＧ１Ｎ２を接種した動物ではいずれも２日目に病変が生じ始めた。Ｎ１Ｇ４野性型ウイルスを接種した動物では９日目まで病変部は視認可能であり、その後感染組織の治癒が明らかに認められた。これに対してＧ１Ｎ２に感染した動物では病変は６日目までに完全に治癒した。全体として、Ｇ１Ｎ２の感染による臨床的所見は野性型ウイルスによるものよりも軽度であり、Ｇ１Ｎ２ウイルスが部分的に弱毒化されていることを示すものである。
【０１１０】
野性型またはＧ１Ｎ２を接種した動物で観察された結果と比較して、Ｇ３Ｎ４またはＧ１Ｎ４を接種した動物では水疱は観察されず（図２４及び２５、Ｃ及びＤ）、これらのウイルスが高度に弱毒化されていることが示された。いずれの動物においても直腸温度の毎日の変化は観察されなかった（データは示していない）。このことは発熱を引き起こすことが稀な野外単離ＶＳＶウイルスの皮内接種の場合に見られた結果と一致する。ＤＭＥＭのみを接種した擬似接種動物では接種による有害な反応は何ら見られなかった（データは示していない）。
【０１１１】
以上まとめると、Ｎ遺伝子が第１番目の位置にある野性型ウイルスであるＮ１Ｇ４はＶＳＶのインディアナ野外単離ウイルスにおいて見られるものと同様の疾患を引き起こしたのに対し、Ｎ遺伝子が第２番目の位置にあるＧ１Ｎ２では臨床的症状は軽減していた。Ｎ遺伝子が第４番目の位置にあるウイルスであるＧ１Ｎ４またはＧ３Ｎ４では検出可能な疾患は見られなかった。以上の結果より、Ｎ遺伝子をプロモーターから遠ざかる方向に後続の位置へと転座させることによって臨床的疾患が段階的に軽減されることが示された。
【０１１２】
実施例３２
ブタへの接種後のウイルスの単離
投与後のウイルスの複製能を調べるため、信頼度の高い感染の指標である鼻綿棒接種物及びＯＰＦを上記の要領でウイルスについて検定した。感染後１〜６日目にはＮ１Ｇ４（ＷＴ）を接種したすべての動物から得た鼻綿棒採取物及びＯＰＦ試料からウイルスが得られた（図２６）。Ｇ１Ｎ２を接種したすべての動物からも感染後１日目からウイルスが回収されたが、７日目の１試料を例外として、５日目以降Ｇ１Ｎ２ウイルスは単離されなかった。鼻採取物ならびにＯＰＦ試料以外にも、Ｎ１Ｇ４を接種したすべての動物で接種領域から得た綿棒採取物から最大６日間にわたってウイルスが確認された。これに対し、Ｇ１Ｎ２の接種群では、１頭の吻部からウイルスが単離されず、残りの動物においても３〜４日後に吻部からウイルスが検出されなくなり、やはりこのウイルスの弱毒化表現型が示された。
【０１１３】
Ｎ１Ｇ４及びＧ１Ｎ２が同様な試料から比較的容易に検出されたのに対し、Ｇ３Ｎ４またはＧ１Ｎ４を接種した動物から得たＯＰＦや鼻採取物試料からウイルスは回収されなかった（図２６）。更に吻部の接種領域からの綿棒採取物からもＧ３Ｎ４またはＧ１Ｎ４は確認されなかった（データは示していない）。以上のデータはこれらのウイルスではブタにおける複製能が大幅に減衰されていることを示すものである。
【０１１４】
Ｎ１Ｇ４及びＧ１Ｎ２に感染した動物から得られたウイルスがｉｎ　ｖｉｖｏでの継代後に遺伝的に安定しているか否かを試験するため、選択されたウイルス陽性培養からウイルスＲＮＡを抽出し、各ウイルスに固有の遺伝子末端部及び遺伝子接合領域を特定のプライマーの組を用いたＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。得られたＰＣＲ産物の関連する遺伝子接合部の配列を決定した。遺伝子の順序、遺伝子末端部や遺伝子間接合部の配列に変化は見られず（データは示していない）、再編成された遺伝子順序が天然のホスト体内でのウイルスの複製の際に安定していることが示された。
【０１１５】
実施例３３
遺伝子再編成ウイルスを接種したブタにおける体液性免疫応答
野性型ウイルス及び遺伝子再編成ウイルスが体液性免疫応答を刺激する能力を、接種後の異なる時間に血清中に存在する中和抗体のレベルを判定することにより測定した。Ｎ１Ｇ４（ＷＴ）を接種した動物の血清中の中和抗体のレベルは２．５〜４．０ｌｏｇ１０の範囲であり、接種７日後までの平均の抗体価は２．９ｌｏｇ１０であった。このような中和抗体のレベルはその後４週間の観察期間を通じて維持された。Ｇ１Ｎ２を接種した動物では同様の高い抗体価を示し、７日目の平均は２．９ｌｏｇ１０であり、抗体価は実験期間の全体を通じて高値を維持した（図２７Ｂ）。Ｇ３Ｎ４を接種した動物では中和抗体価の平均値は２．９ｌｏｇ１０へと上昇した。この値は、Ｎ１Ｇ４またはＧ１Ｎ２の接種後に見られる抗体価よりも１０倍低い値であるが、Ｇ３Ｎ４ウイルスが、鼻綿棒採取物またはＯＰＦ試料中に検出可能なレベルの複製ウイルスが見られない状態での１回の接種によって体液性免疫応答を刺激する能力を有することを示すものである（図２７Ｃ）。
【０１１６】
Ｇ１Ｎ４ウイルスを接種した動物では、バックグラウンドレベル上にようやく検出可能な極めて低い抗体価の上昇を示し、時間とともにこれらの抗体価が大きく上昇することはなかった（図２７Ｄ）。このような低い応答反応のため、この群の動物には、２８日目にブタ１頭当たり５．７ｘ１０７ＰＦＵのＧ１Ｎ４ウイルスを再接種した。これらの動物では臨床的症状はまったく見られなかった。７日後に血清を採取したところ、４頭の動物すべてにおいて抗体価は３．３ｌｏｇ１０と急激な上昇を示した（図２７Ｄ）。このデータは、これらの動物では複製能を有するウイルスは検出されなかったものの、Ｎ１Ｇ４野性型による免疫化の７日後に見られる免疫応答よりも顕著な免疫応答が追加免疫の７日後に誘導されるように初回抗原刺激されたことを示すものである。
【０１１７】
実施例３４
遺伝子の順序が再編成されたウイルスは、野性型ウイルスによるチャレンジに対する防御能を天然のホストに与える
遺伝子再編成ウイルスのワクチンとしての能力を評価するため、ウイルスを接種したすべての動物群と擬似接種を行ったコントロール群に、各ウイルスの初回接種の３６日後とＧ１Ｎ４群では第２回目の接種の７日後に、ブタ１頭当たり４．２ｘ１０７ＰＦＵの野性型Ｎ１Ｇ４ウイルスでチャレンジを行った。チャレンジの経路は初回接種と同様、吻部の表皮の乱刺によった。動物を臨床的症状について観察し、上記に述べた要領で採点した。更に、鼻綿棒採取物及びＯＰＦ試料をチャレンジ後の第１週目に毎日採取し、ウイルスの存在について検定した。
【０１１８】
チャレンジ後、Ｎ１Ｇ４、Ｇ１Ｎ２、またはＧ１Ｎ４接種群の動物のいずれにも病変は検出されず、これらの動物が臨床的な病態から完全に防御されたことが示された（図２８Ａ、Ｂ、及びＤ）。Ｇ３Ｎ４を接種した動物では部分的な防御反応が見られ、２頭の動物においてチャレンジ後２日目から４日目に視認可能な病変部が出現した。この内、一方のケースでは病変部は小さく（＜２ｃｍ）、他方では２ｃｍよりも大きかった。いずれのケースにおいても病変は接種部位にのみ見られ、５日目までに完全に治癒した（図２８Ｃ）。
【０１１９】
これに対し、ワクチン接種しなかったコントロール群ではチャレンジ後１日目及び２日目からすべての動物において病変が発生し、５日目まで残存した（図２８Ｅ）。いずれの場合にも病変部は初期には小さかった（＜２ｃｍ）が、２ｃｍよりも大きく発達した。４頭の動物の内、３頭において接種部位以外の部位に病変が見られ、２例において舌に病変が見られ、別の１例において蹄の蹄冠帯に病変が現れた。
【０１２０】
ワクチンを接種しないコントロール動物群にチャレンジを行ったものでは、すべての動物で鼻綿棒採取物またはＯＰＦから１日目から５日目までウイルスが回収され、臨床データが正しいことが確認された（図２９）。Ｇ３Ｎ４を接種した動物の内、チャレンジ後に吻部に病変を生じた２頭の鼻綿棒接種物から１〜３日目にウイルスが回収された。Ｇ３Ｎ４を接種した動物の内、病変を生じなかったものからはチャレンジ後にウイルスは回収されなかった（図２９）。Ｇ３Ｎ４により免疫化された２頭からチャレンジ後に回収されたウイルスがチャレンジ用のＮ１Ｇ４ウイルスであるか、あるいは免疫化に用いたＧ３Ｎ４の遺伝子型を有するかを判定するため、組織培養試料からウイルスＲＮＡを抽出し、遺伝子間接合部をＲＴ−ＰＣＲで分析した後、配列を分析した。いずれの動物においても、回収されたウイルスはチャレンジ用のＮ１Ｇ４ウイルスであった（データは示していない）。
【０１２１】
Ｎ１Ｇ４にて免疫化した動物群の内、臨床的所見の見られない１頭の鼻綿棒採取物からチャレンジ後１日目の１時点においてウイルスが培養された（図２９）。これが導入されたチャレンジ用ウイルスであるか、あるいはチャレンジウイルスが複製したものであるかを知ることは困難である。
【０１２２】
以上のデータは、臨床的症状に対する防御能と中和抗体価との強い相関を示すものである。Ｇ３Ｎ４で免疫化した動物の内、チャレンジ後に疾患が見られなかった２頭では、チャレンジ前に高い抗体価を示した（２．１及び２．３ｌｏｇ１０）。
【０１２３】
チャレンジの当日、その３、５及び７日後にすべての動物の中和抗体価を分析した。Ｎ１Ｇ４により免疫化した動物の抗体価はチャレンジ時に既に高値であったが、ほぼその値に保たれ、若干の上昇を示した（図３０Ａ）。Ｇ１Ｎ２にて最初に免疫化した動物では、チャレンジの５〜７日後までにＮ１Ｇ４の場合に見られた抗体価に近い値へと、約１０倍の抗体価の上昇を示した（図３０Ｂ）。Ｇ３Ｎ４により免疫化した動物ではチャレンジ時の抗体価は最も低かった（１．９ｌｏｇ１０）が、チャレンジ後３〜５日間で野性型の場合に見られた値に匹敵する値にまでほぼ１００倍の抗体価の上昇を示した（図３０Ｃ）。Ｇ１Ｎ４により免疫化した動物では、２８日目の抗体価が低値であったためにチャレンジの７日前に２度目の免疫化を行ったが、チャレンジ後には追加免疫による高い抗体価を維持し、更なる抗体価の上昇は見られなかった（図３０Ｄ）。
【０１２４】
考察
以上に示したデータは、ＶＳＶのヌクレオカプシド遺伝子をプロモーターから遠ざかる方向の後続位置へと移動させてその発現をダウンレギュレートすることにより、天然のホストにおける臨床疾患が系統的かつ段階的に軽減されることを示すものである。これは、マイナス鎖ＲＮＡウイルスによって引き起こされる臨床疾患の段階的操作を可能とする方法の最初の報告例である。
【０１２５】
驚くべきことに、本明細書に開示されるｃＤＮＡクローンから得られるＶＳＶ−ＩＮは、野外単離ウイルスによる感染において見られる症状と同等の臨床疾患を家畜用ブタに引き起こした。これは、ｃＤＮＡクローンから得たＶＳＶを利用して天然ホストの体内で臨床疾患が誘発された最初の例である。更に、このｃＤＮＡクローンの複数の遺伝子を再編成してＮ遺伝子をプロモーターから遠ざかる方向の第２の位置へと動かす（Ｇ１Ｎ２）ことで感染ブタにおける臨床病変の程度が軽減された（図２４〜２５）。ウイルスが吻部、鼻腔、及びＯＰＦの綿棒採取物から回収される時間の長さがＮ１Ｇ４ウイルスの場合よりも短いことから（図２６）、ブタにおけるこのウイルスの複製能も若干減衰したものと考えられる。また、Ｇ１Ｎ２ウイルスでもＧ遺伝子がプロモーターの近くに移動させられている。Ｇ１Ｎ２ウイルスに感染したブタにおける免疫応答は野性型の場合に見られるものとほぼ同等であった。これらの発見は、このようなウイルスの発病能力の低下はＮ遺伝子の発現の低下とウイルスの複製能の低下によるものであることを示すものである。Ｇ遺伝子を更に移動させれば、複製能の低下を補償して野性型ウイルスの接種後に得られるのと同等の中和抗体レベルが実現された可能性がある。
【０１２６】
Ｎ遺伝子をプロモーターから更に離れた第４番目の位置に移動させることによりＧ３Ｎ４及びＧ１Ｎ４ウイルスが得られるが、これらのウイルスはいずれも天然ホストに臨床疾患を引き起こさなかった。接種後に吻部、鼻、及びＯＰＦ試料からウイルスが検出されなかったことから、これらのウイルスもブタにおける複製能が低下していると考えられる。このことに一致して、これらのウイルスの１回接種に対する免疫応答では、Ｎ１Ｇ４やＧ１Ｎ２の場合と比較して中和抗体応答は低かった（図２７）。しかしながら、ブタにおける複製能が著明に低下しているにも関わらず、これらのウイルスは依然免疫応答を誘導する能力を有した。Ｇ３Ｎ４ウイルスでは接種後の抗体レベルは中程度の上昇を示した。更に、３６日目に行った野性型によるチャレンジに際して、Ｇ３Ｎ４を接種した動物では早くも５日後に応答が見られ、抗体価は１００倍に上昇した。同様にＧ１Ｎ４ウイルスでは初回接種後に誘導された抗体価は低かったものの、２８日目にＧ１Ｎ４の２回目の追加接種を行うと、野性型ウイルスを初回接種の７日後に接種した場合と同等かもしくはこれを上回る急激な応答が見られた（図２７）。
【０１２７】
Ｎ１Ｇ４、Ｇ１Ｎ２を１回接種したか、もしくはＧ１Ｎ４を２回接種した動物のいずれにおいても野性型ウイルスによるチャレンジ後に臨床疾患は認められなかった。これら３つの動物群における中和抗体価はチャレンジ当日にはすべて高値であり（図２７）、その値は家畜用ブタにＶＳＶの野外単離物を各種経路より接種した後に報告された中和抗体価と同等かもしくはこれを上回った。Ｇ３Ｎ４により免疫化した４頭の動物の内、２頭でチャレンジに対する防御反応が見られた。チャレンジ前の抗体価はこれらの動物で最も高いことが判明した。以上のデータは中和抗体価と臨床疾患に対する防御反応の強い相関を示すものである。同様な知見が、ＶＳＶ−Ｇを発現する組換えワクシニアウイルスを用いてウシを免疫した場合にも報告されている。
【０１２８】
更にこれらのデータは、Ｇ１Ｎ２ウイルスではその発病能力が低下しているにも関わらず、１回のみの接種によって野性型ウイルスと同等の強力な防御免疫応答反応を誘導することが可能であることを示すものである。天然のホストの体内では完全に減衰される第４番目の位置にＮ遺伝子を有するウイルスでは、１回の接種後の免疫応答は低かったものの、Ｇ１Ｎ４を更にもう１回接種すると野性型ウイルスによって誘導される免疫応答と同等の免疫応答が誘導された。したがってこれらのデータは、遺伝子の再編成によって発病能力を低下させる一方で、臨床疾患を引き起こすことなく防御免疫応答を誘導するうえで充分な複製能を有するウイルスを作成することが可能であることを示すものである。
【０１２９】
水疱性口内炎は報告義務のある疾病であるため、すべての弱毒化生ワクチンは家畜に対するその使用が認可されるためには安全かつ有効性を有するものでなければならないのは無論のこと、野外株との区別が可能なものである必要がある。ここに開示されるデータによれば、ゲノムが再編成されたウイルスは、遺伝子間領域のＲＴ−ＰＣＲによって容易に野外株との区別が可能であることが示された。更に、ｃＤＮＡから得たウイルスを使用することによって、特定の抗原決定因子を欠失させるなどの血清学的検査において利用可能な特定の変化をゲノムに導入してワクチン接種した動物と自然感染した動物とを区別することが可能である。以上まとめると上記に示したデータによって、非分節型のマイナス鎖ＲＮＡウイルスに対する安定的に弱毒化された生ワクチンを開発するための合理的な代替策が遺伝子再編成によって提供されることが示された。
【０１３０】
本明細書中、以下の文献を引用した。
【０１３１】
Ｂａｌｌ， Ｌ． Ａ． １９９２． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６， ２３３５−２３４５．
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Ｐｅｌｕｓｏ， Ｒ． Ｗ．， ａｎｄ Ｓ． Ａ． Ｍｏｙｅｒ． １９８８． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６２， ３６９−３７６．
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本明細書で触れた特許または刊行物はいずれも本発明が関連するところの技術分野における当業者の水準を示すものである。これらの特許ならびに刊行物は、恰も個々の刊行物を詳細かつ個別に援用するのと同様に本明細書において援用するものである。
【０１３２】
当業者であれば、上記に述べた、もしくは発明本来の目的を達成し、その役割ならびに利点を実現すべく本発明がよく適合している点は直ちに了承されよう。本明細書に述べた実施例、方法、手順、処理、分子、及び／または特定の化合物は現時点における好適な実施形態の代表的なものであり、あくまで例示的のものであって、発明の範囲を何ら限定するものではない。当業者であれば本発明の改変ならびに発明の他の使用法が想到されようが、それらは特許請求の範囲において定義される発明の精神に包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
遺伝子を再編成したＶＳＶのゲノムの遺伝子順序を示す図
【図２】
再編成したＶＳＶゲノムのｃＤＮＡを作成するための段階的手順を示す図
【図３】
（Ａ）遺伝子順序を再編成するためのｃＤＮＡ単位を作成するために使用される制限酵素の切断特異性を示す図。ＰＣＲにより、ＢｓｐＭＩまたはＢｓａＩ部位がＶＳＶのＰ、Ｍ、及びＧ遺伝子の両端、Ｎ遺伝子の３’末端、及びＬ遺伝子の５’末端に配され、粘着末端が遺伝子間接合部の保存された４個のヌクレオチドに対応している。（Ｂ）遺伝子順序を再編成するためにクローニングされたＶＳＶゲノムのフラグメントを示す図
【図４】
遺伝子を再編成したゲノムであるＮ２、Ｎ３、Ｎ４及びＧ１Ｎ２を構築するための方法を示す図
【図５】
（Ａ）ＮまたはＬ遺伝子にそれぞれアニールするＰＣＲプライマーの位置（矢線にて示してある）、制限酵素の切断部位、及び予想されるフラグメントのサイズを示したＶＳＶゲノムの概略図。（Ｂ）ＧＭＰ、ＭＧＰ、ＰＧＭ、ＰＭＧ、ＧＰＭ、及びＭＰＧ（レーン１〜６にそれぞれ対応）ウイルスから得たウイルスＲＮＡのｃＤＮＡの各酵素による消化後の産物を示す図。エチジウムブロマイドの存在下、１％アガロースゲル上でフラグメントを分析した。レーンＭ＝図に示したサイズを有するマーカーＤＮＡフラグメント
【図６】
野性型及び各変異体ウイルスを感染させたＢＨＫ−２１細胞内で合成されたウイルスＲＮＡを示す図。ウイルスＲＮＡは［３Ｈ］−ウリジンで標識し、アガロース−尿素ゲル上での電気泳動により分離して蛍光間接撮影法により検出した。各感染性ウイルスをレーンの上に示し、同定されたウイルスＲＮＡを左に示してある
【図７】
野性型及び各変異体ウイルスを感染させたＢＨＫ−２１細胞内で合成されたウイルスタンパク質を示す図。ウイルスタンパク質は［３５Ｓ］−メチオニンで標識し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により分離してオートラジオグラフィーにより検出した。各感染性ウイルスをレーンの上に示し、同定されたウイルスタンパク質を左に示してある。Ｕｎｉｎｆは感染していない細胞を示す
【図８】
野性型及び各変異体ウイルスを感染させたＢＨＫ−２１細胞内で合成されたウイルスタンパク質のモル比を示す図。タンパク質は標識後、図７に示すようにＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、燐光発光法により定量した。各タンパク質をそれぞれのメチオニン含有量（Ｎ−１４、Ｐ−５、Ｍ−１１、Ｇ−１０、Ｌ−６０）について基準化した後、モル比を求めた
【図９】
ＢＳＣ−１細胞中での野性型ＶＳＶ及び遺伝子再編成した変異体ウイルスの１段増殖曲線を示す図。３７℃で独立した３つの１段増殖実験を行って各時点におけるウイルス価を重複して測定し、結果を平均した
【図１０】
マウスへの鼻腔内接種後の野性型（ｗｔ）及び変異体ウイルスの病原性を示す図。１００ＰＦＵの各変異体ウイルスを鼻腔内接種した動物における、罹病率（グレーの棒グラフ）及び死亡率（黒塗りの棒グラフ）の経時変化を示した。図に示した時間帯以降に更なる変化は見られなかった
【図１１】
遺伝子再編成ウイルスとしてＮ１（ｗｔ）、Ｎ２、Ｎ３、及びＮ４を感染させたＢＨＫ−２１細胞内で合成されたウイルス特異的ＲＮＡを示す図。感染、標識、及び分析の条件は図６で述べたものと同様である
【図１２】
遺伝子再編成ウイルスＮ１（ｗｔ）、Ｎ２、Ｎ３、及びＮ４による感染後にＢＨＫ−２１細胞内で合成されたＶＳＶ特異的タンパク質のモル比。タンパク質は図７に述べたのと同様に分析し、モル比は図８で述べたのと同様に計算した
【図１３】
ＢＨＫ細胞内での１段増殖によりＮ遺伝子を転座させた各ウイルスの複製能を示す図
【図１４】
マウスに対するＮ１（ｗｔ）、Ｎ２、Ｎ３、及びＮ４ウイルスの相対致死率を示す図
【図１５】
Ｎ１（ｗｔ）、Ｎ２、Ｎ３、及びＮ４ウイルスに対する抗体産生量及び各ウイルスに対する致死性チャレンジに対する防御応答能の比較図
【図１６】
ＶＳＶの各遺伝子間接合部に外来遺伝子（Ｉ）を挿入したウイルスを感染させたＢＨＫ−２１細胞内で合成されたウイルス特異的ＲＮＡを示す図。標識時間が感染の２〜４．５時間後であった点を除き、感染、標識及び分析の条件は図６で述べたものと同様である
【図１７】
変異体ウイルスであるＮ１Ｇ４（野性型）、Ｇ１Ｎ２、Ｇ３Ｎ４、及びＧ１Ｎ４の遺伝子の順序を示す図
【図１８】
各変異体ウイルスを感染させたＢＨＫ−２１細胞内でのウイルスタンパク質の合成を示す図。（Ａ）ＢＨＫ−２１細胞にＭＯＩが５０となるように感染させ、３７℃で５時間培養した後、アクチノマイシンＤ（５μｇ／ｍｌ）の存在下で最後の２時間培養した。次いで感染細胞を３０分間メチオニン枯渇状態におき、［３５Ｓ］−メチオニン（３０μＣｉ／ｍｌ）を含む培地に１時間曝露した。感染細胞の全タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。（Ｂ）ＭＯＩが５となるようにウイルスに感染させたＢＨＫ−２１細胞の上清液からウイルス粒子を単離し、感染の２．５〜１２時間後に［３５Ｓ］−メチオニン（５０μＣｉ／ｍｌ）に曝露した。ウイルス粒子を１０％ショ糖にて遠心して単離し、そのタンパク質含量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより求めた。図１８（Ａ）及び（Ｂ）に示したウイルスタンパク質は燐光発光法により定量し、感染ＢＨＫ−２１細胞における各ウイルスタンパク質のモル比率（図１８（Ｃ））、または単離されたウイルス粒子における各タンパク質のモル比率（図１８（Ｄ））として表した。独立した２つの実験の結果を平均したデータを示した。レーン：１、Ｎ１Ｇ４（ｗｔ）；２、Ｇ１Ｎ２；３、Ｇ３Ｎ４；４、Ｇ１Ｎ４；５、非感染細胞
【図１９】
１段増殖分析の結果を示す図。３７℃でのＢＨＫ−２１細胞内での１段増殖によって各ウイルスの複製能を検定した。細胞は感染多重度が３となるようにウイルスに感染させ、上清培地の試料を図に示した時間に回収した。試料はＶｅｒｏ−７６細胞を用いたプラークアッセイにより重複して滴定した。細胞当たりの平均のウイルス収率を感染２４時間後に求めた（ｉｎｓｅｔ）
【図２０】
マウスにおける病原性を示す図。ウイルスは６頭のマウスからなる複数の動物群に１頭当たり１，０００ＰＦＵの投与量を鼻腔内投与し、罹病率及び死亡率について連日監視した。１２日目以降に更なる変化は見られなかった
【図２１】
遺伝子再編成ウイルスを接種したマウスの平均体重を示す図。６頭のマウスからなる複数の動物群に、１頭当たり１０，０００〜１ＰＦＵとなるように、Ｎ１Ｇ４（ｗｔ）、Ｇ１Ｎ２、Ｇ３Ｎ４、及びＧ１Ｎ４の１０倍毎の連続希釈液を鼻腔内接種した。コントロールマウス群には培地のみを接種した。縦方向の破線は５．４ｘ１０６ＰＦＵ／マウスの野性型ウイルスによるチャレンジを行った日を示す。各動物群について生存したすべての動物の総体重を測定して平均体重を求めた。↓、１０，０００ＰＦＵ；　、１，０００ＰＦＵ；□、１００ＰＦＵ；＜、１０ＰＦＵ；＜、１ＰＦＵ；＋、培地
【図２２】
各遺伝子再編成ウイルス及び野性型ウイルスの接種に対する抗体産生の速度を示す図。６頭のマウスからなる複数の動物群に１頭当たり１０，０００〜１ＰＦＵとなるように、Ｎ１Ｇ４（ｗｔ）、Ｇ１Ｎ２、Ｇ３Ｎ４、及びＧ１Ｎ４の１０倍毎の連続希釈液を鼻腔内接種した。コントロールマウス群には培地のみを接種した。縦方向の破線は５．４ｘ１０６ＰＦＵ／マウスの野性型ウイルスによるチャレンジを行った日を示す。１週間おきに２〜４頭の動物の尾から採血し血清を得た。血清をプールし、ＶＳＶによって上昇した抗体レベルを、洗剤で溶解したＶＳＶ感染細胞抗原を用いたＥＬＩＳＡによって求めた。抗体レベルは抗体価の自然対数で表した。↓、１０，０００ＰＦＵ；　、１，０００ＰＦＵ；□、１００ＰＦＵ；＜、１０ＰＦＵ；＜、１ＰＦＵ；＋、培地
【図２３】
６頭のマウスからなる複数の動物群に１頭当たり１０，０００〜１ＰＦＵとなるように、Ｎ１Ｇ４（ｗｔ）、Ｇ１Ｎ２、Ｇ３Ｎ４、及びＧ１Ｎ４の１０倍毎の連続希釈液を鼻腔内接種した場合の図。コントロールマウス群には培地のみを接種した。プラーク減少法によりチャレンジ当日のマウスの血清試料中の中和抗体のレベルを判定した（図２３（Ａ））。中和抗体のレベルは、Ｖｅｒｏ−７６細胞において野性型ウイルスのプラーク数を５０％減少させた最も高い希釈度の逆数として表した。＊は、１ＰＦＵまたは１０ＰＦＵのＮ１Ｇ４またはＧ１Ｎ２ウイルスを接種した動物から得た血清の中和抗体レベルがバックグラウンドレベルであったことを示す。更に５．４ｘ１０６ＰＦＵのＮ１Ｇ４ウイルスの鼻腔内接種によるチャレンジ後に生存する能力についてマウスを検定した（図２３（Ｂ））。破線は、チャレンジの２１日後における、ワクチン接種していない同じ週齢のコントロール動物群のこの量での致死率（８３％）を示す
【図２４】
遺伝子順序を各パネルの下に示されるように再編成した遺伝子操作ＶＳＶを３日前に接種したブタの吻部を示す図（「ｌｅ」及び「ｔｒ」は３’末端側のリーダー配列と５’末端側のトレーラー配列を示す）。ブタには麻酔を施して２．５ｘ１０７ＰＦＵの各ウイルスを接種した。Ｎ１Ｇ４（ｗｔ）、Ｇ１Ｎ２、Ｇ３Ｎ４、及びＧ１Ｎ４を動物に感染させた（図２４Ａ〜２４Ｄにそれぞれ示されている）
【図２５】
遺伝子再編成ウイルスの接種後、各群４頭の動物の各々について判定した臨床評点を示す図。２．５ｘ１０７ＰＦＵのウイルスをブタに接種した後、病変部の形成を連日評価した。臨床評点は生じた病変部のサイズ及び位置に基づいて判定した。各符号は個別の動物を表す
【図２６】
遺伝子再編成ウイルスの接種後のブタからのウイルスの単離状況を示す図。２．５ｘ１０７ＰＦＵのウイルスをブタに接種し、鼻及びプロバング綿棒採取物を図に示すように採取した。試料を滴定し、Ｎ１Ｇ４（ＷＴ）及びＧ１Ｎ２については３７℃で３日間、Ｇ３Ｎ４及びＧ１Ｎ４については３１℃で４日間、ＢＨＫ−２１細胞で培養することによりウイルスを回収した。それぞれの升目は個別の動物を表し、各試料がウイルスのＣＰＥについて陽性（■）または陰性（　）であったかを示している。ウイルスの存在及び遺伝子順序はＲＴ−ＰＣＲにより確認した
【図２７】
遺伝子再編成ウイルスの接種後の血清中の中和抗体価を示す図。２．５ｘ１０７ＰＦＵのウイルスをブタに接種した。７日おきに血清を採取し、中和抗体のレベルを求めた。Ｇ１Ｎ４を接種した動物では２８日目に５．７ｘ１０７ＰＦＵのウイルスで追加免疫を行った。各棒グラフは各動物群の平均値及び値域を示す。破線はアッセイの感度限界を示す
【図２８】
Ｎ１Ｇ４（ＷＴ）ウイルスによるチャレンジ後のブタにおける臨床評点を示す。ブタには麻酔を施し、各ウイルスの初回投与の３６日後に４．２ｘ１０７ＰＦＵの野性型ウイルスによるチャレンジを行った。病変の形成を連日監視した。臨床評点は生じた病変部のサイズ及び位置に基づいて判定した。各符号は個別の動物を表す
【図２９】
Ｎ１Ｇ４（ＷＴ）ウイルスによるチャレンジ後のブタからのウイルスの単離状況を示す図。チャレンジウイルスの接種後、図に示した各時点に鼻及びプロバング綿棒採取物を採取した。試料は後述の要領で滴定した。それぞれの升目は個別の動物を表し、各試料がウイルスのＣＰＥについて陽性（■）または陰性（　）であったかを示している。ウイルスの存在及び遺伝子順序はＲＴ−ＰＣＲにより確認した
【図３０】
Ｎ１Ｇ４（ＷＴ）ウイルスによるチャレンジ後の血清中の中和抗体価を示す図。チャレンジウイルスの接種後、図に示した各時点に血清を採取し、エンドポイントアッセイによって中和抗体のレベルを求めた。各棒グラフは各動物群の平均値及び値域を示す。破線はアッセイの感度限界を示す
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図６】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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