(57)【要約】イミダゾリンレセプター関連タンパク質１ （ＩＭＲＲＰ１）、イミダゾリンレセプター関連タンパク質１ｂ （ＩＭＲＲＰ１）と名づけた新規イミダゾリンレセプター相同体およびその誘導体について説明する。少なくとも１つのＩＭＲＲＰ１， ＩＭＲＲＰ１ｂまたはその機能的部分を含む医薬組成物をＩＭＲＲＰ１、ＩＭＲＲＰ１ｂまたはその機能的部分の製造方法に従って提供する。さらに、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、その断片、部分またはアンチセンス分子をコードする核酸配列、ならびにＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよび宿主細胞を提供する。血圧、摂食行動の誘導、青斑ニューロン発射の刺激、およびインスリン放出の刺激の調節異常、ならびにα２アドレナリンレセプター作用に非依存性のグリア繊維酸性タンパク質の発現の誘導異常に関連する障害または疾患、不快性月経前症候群、神経変性障害、例えばアルツハイマー病、オピエート依存症、モノアミン代謝回転、および痛覚、加齢、気分および卒中、唾液障害、および発育障害に関連する障害または疾患を診断するための核酸配列、ポリペプチド、ペプチドおよび抗体の使用についても説明する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３のアミノ酸配列からなる実質的に純粋なＩＭＲＲＰ１ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号４のアミノ酸配列からなる実質的に純粋なＩＭＲＲＰ１ｂポリペプチド。
【請求項３】
アミノ酸配列が保存的置換により配列番号３と異なるものである配列番号３のアミノ酸配列からなる実質的に純粋なＩＭＲＲＰ１ポリペプチド。
【請求項４】
アミノ酸配列が保存的置換により配列番号４と異なるものである配列番号４のアミノ酸配列からなる実質的に純粋なＩＭＲＲＰ１ｂポリペプチド。
【請求項５】
天然の哺乳動物のグリコシル化を含まない、請求項１または２に記載のＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂポリペプチド。
【請求項６】
請求項１記載のＩＭＲＲＰ１ポリペプチドの実質的に純粋な断片。
【請求項７】
請求項２記載のＩＭＲＲＰ１ｂポリペプチドの実質的に純粋な断片。
【請求項８】
配列番号１の核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる実質的に純粋なＩＭＲＲＰ１ポリペプチド。
【請求項９】
配列番号２の核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる実質的に純粋なＩＭＲＲＰ１ｂポリペプチド。
【請求項１０】
実質的に純粋なＩＭＲＲＰ１もしくは実質的に純粋なＩＭＲＲＰ１ｂまたはその断片および医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１または２のいずれかに記載のポリペプチドまたはその抗原決定基と特異的に結合する純粋な抗体。
【請求項１２】
配列番号３のアミノ酸配列からなるＩＭＲＲＰ１ポリペプチドまたはその断片をコードする単離された純粋なポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号４のアミノ酸配列からなるＩＭＲＲＰ１ｂポリペプチドまたはその断片をコードする単離された純粋なポリヌクレオチド。
【請求項１４】
（ａ）配列番号１、（ｂ）遺伝子コードの結果として配列番号１からの核酸配列の縮重、または（ａ）もしくは（ｂ）と相補的な核酸配列を有する核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５】
（ａ）配列番号２、（ｂ）遺伝子コードの結果として配列番号２からの核酸配列の縮重、または（ａ）もしくは（ｂ）と相補的な核酸配列を有する核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１６】
相補的核酸配列が、４２℃の５０％ホルムアミドおよび６ Ｘ ＳＳＣの中程度のストリンジェンシー条件下、および６０℃、０．５ Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄条件下で、核酸を含む変性２本鎖ポリヌクレオチドのいずれかの鎖とハイブリダイズする請求項１４または１５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１２〜１６のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１８】
可溶性ＩＭＲＲＰ１もしくは可溶性ＩＭＲＲＰ１ｂポリペプチドを発現する請求項１７記載の発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１８記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２０】
（ａ）該ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項１９の宿主細胞を培養し、
（ｂ）宿主細胞培養から該ポリペプチドを回収する工程を含むＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂポリペプチドの製造方法。
【請求項２１】
中程度〜高ストリンジェンシー条件下で配列番号１または２のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができる、１０またはそれ以上の連続塩基を含むことを特徴とする配列のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブまたはプライマー。
【請求項２２】
高ストリンジェンシー条件下で配列番号１または２のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができることを特徴とする請求項２１記載のハイブリダイゼーションプローブまたはプライマー。
【請求項２３】
（ａ）請求項２１または２２記載のオリゴヌクレオチドを生物試料の核酸物質とハイブリダイズさせてハイブリダイゼーションコンプレックスを形成させ、
（ｂ）該コンプレックスの存在が生物試料中のＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドの存在と関連するハイブリダイゼーションコンプレックスを検出する工程を含む、核酸物質を含む生物試料中のＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドの検出方法。
【請求項２４】
生物試料の核酸物質がハイブリダイズ工程前にポリメラーゼ連鎖反応により増幅される請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
（ａ）抗体と試料中のＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂポリペプチドまたはその抗原性断片との間に抗原抗体コンプレックスを形成することができる条件下で、試料をＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂポリペプチドまたはその抗原性断片に特定的な抗体と接触させ、
（ｂ）工程（ａ）で形成された抗原抗体コンプレックスを検出し、該コンプレックスの検出により試料中のＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂポリペプチドまたはその抗原性断片の存在が示されることを含む試料中のＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂポリペプチドまたはその抗原性断片の検出方法。
【請求項２６】
（ａ）被験化合物をＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂポリペプチドまたはそのリガンド結合部分と接触させ、
（ｂ）候補リガンドとしてＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂまたはそのリガンド結合部分と結合する該被験化合物を選択することを含むＩＭＲＲＰ１またはＩＭＲＲＰ１ｂポリペプチドと結合する候補リガンドの同定方法。
【請求項２７】
ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂが可溶性であるか、基質と結合するか、または細胞膜と結合している請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
該方法が競合阻害アッセイである請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
該結合が抗体を用いて検出される請求項２６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、新規イミダゾリンレセプターの核酸およびアミノ酸配列、ならびに身体的および神経学的障害の治療におけるこれら配列の使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
イミダゾリンレセプター（ＩＭＲ）サブタイプは、クロニジンおよびイミダゾリンと結合する（Ｅｓｃｒｉｂａら、１９９５）。これら化合物は、血圧、摂食行動の誘導、青斑ニューロン発射の刺激、およびインスリン放出の刺激の調節、ならびにα２アドレナリンレセプター作用に非依存性のグリア繊維酸性タンパク質の発現誘導に介在する。これらレセプターは、前記生理学的状態に介在することができる薬剤の薬理学的に重要な標的である（ＦａｒｓａｎｇおよびＫａｐｏｃｓｉ、１９９９）。
【０００３】
主にクロニジンもしくはパラアミノクロニジンにより標識される非アドレナリンレセプター部位はＩ１部位と呼ばれ、主にイダゾキサンにより標識される非アドレナリンレセプター部位はＩ２部位と呼ばれる。Ｉ１またはＩ２部位と異なるイミダゾリン部位はＩ３部位と呼ばれる。例として、インスリン分泌を増幅すると報告された膵臓中のイミダゾリンレセプターがある（Ｃｈａｎら、（１９９３） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２３０ ３７５、Ｃｈａｎら、（１９９４） Ｂｒ． Ｊ ： Ｐｈａｒｍｏｃｏｌ． １１２ １０６５）。該レセプターはエファロキサン感受性であり、ＩＩ型糖尿病の治療の標的である。該部位はインスリン分泌促進薬のアグマチン、およびクロニジン置換物質（ＣＤＳ）の粗調製物にも感受性である。
【０００４】
イミダゾリンレセプターの内因性リガンドには、ハルマン（ｈａｒｍａｎｅ）、トリプタミン、およびアグマチンがある。Ｉ１部位（例えばクロニジン、ベンゾリン、およびリルメニジン）またはＩ２部位（例えばＲＳ−４５０４１−１９０、２−ＢＦＩ、ＢＵ２２４、およびＢＵ２３９）のいずれかに選択的な多くの化合物もある。これら化合物の多くは、例えばＴｏｃｒｉｓ Ｃｏｏｋｓｏｎ、Ｉｎｃ．、ＵＳＡから市販されている。
【０００５】
Ｉ１部位選択的薬剤は高血圧の治療に有望であり、Ｉ３部位選択的薬剤は糖尿病の治療に有望であり、また、Ｉ２部位選択的薬剤はモノアミンの代謝回転に作用するのでＩ２レセプターリガンドは広範囲の脳の機能、例えば痛覚、加齢、気分および卒中（発作）に作用し得る。
【０００６】
（発明の要約）
本発明は、新規イミダゾリンレセプター相同体（ホモログ）（以後、イミダゾリンレセプター関連タンパク質１ （ＩＭＲＲＰ１）、イミダゾリンレセプター関連タンパク質ｌｂ （ＩＭＲＲＰ１ｂ）と呼ぶ）およびその誘導体に関する。
【０００７】
したがって、本発明は、図３ （配列番号３）のアミノ酸配列を有する実質的に純粋なＩＭＲＲＰ１もしくはその機能的部分、および図４ （配列番号４）のアミノ酸配列を有する実質的に純粋なＩＭＲＲＰ１ｂに関する。
【０００８】
さらに本発明は実質的に純粋な可溶性ＩＭＲＲＰ１を提供する。特定の局面において、可溶性ＩＭＲＲＰ１は図３ （配列番号３）のアミノ酸配列を含む。さらに本発明は、実質的に純粋な可溶性ＩＭＲＲＰ１ｂを提供する。特定の局面において、可溶性ＩＭＲＲＰ１は図４ （配列番号４）のアミノ酸配列を含む。
【０００９】
本発明は、少なくとも１つのＩＭＲＲＰ１、ＩＭＲＲＰ１ｂまたはその機能的部分を含む医薬組成物を提供する。
【００１０】
本発明は、ＩＭＲＲＰ１、ＩＭＲＲＰ１ｂまたはその機能的部分の製造方法も提供する。
【００１１】
本発明のある局面は、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする、単離された実質的に純粋なポリヌクレオチドに関する。特定の局面において、該ポリヌクレオチドは図１ （配列番号１）のヌクレオチド配列を含む。本発明の別の局面において、該ポリヌクレオチドはＩＭＲＲＰ１をコードするヌクレオチド配列を含む。別の局面において、該ポリヌクレオチドは図２ （配列番号２）のヌクレオチド配列を含む。別の局面において、該ポリヌクレオチドはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００１２】
本発明は、図１もしくは２ （配列番号１または２）の相補物またはその変異体を含むポリヌクレオチド配列にも関する。さらに、本発明は、ストリンジェントな条件下で、図１または２ （配列番号１または２）のポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を特徴とする。
【００１３】
さらに本発明は、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、その断片、部分もしくはアンチセンス分子をコードする核酸配列、ならびにＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよび宿主細胞に関する。
【００１４】
本発明の別の目的は、イミダゾリンレセプターをコードするポリヌクレオチド配列の製造方法を提供することである。
【００１５】
本発明の別の局面は、治療薬および診断剤として用いるイミダゾリンレセプターもしくはその抗原決定基と特異的に結合する抗体である。
【００１６】
本発明の別の局面は、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂのアゴニスト、アンタゴニスト、またはインバースアゴニストである。
【００１７】
本発明は、イミダゾリンレセプターのアゴニスト、アンタゴニスト、またはインバースアゴニストのスクリーニング方法を提供する。
【００１８】
本発明の別の目的は、血圧、摂食行動の誘導、青斑ニューロン発射の刺激、およびインスリン放出の刺激の調節異常、ならびにα２アドレナリンレセプター作用に非依存性のグリア繊維酸性タンパク質の発現の誘導異常、不快性月経前症候群、神経変性障害、例えばアルツハイマー病、オピエート依存症、モノアミン代謝回転、および痛覚、加齢、気分（ｍｏｏｄ）および卒中、唾液障害、および発育障害に関連する障害または疾患を診断するための核酸配列、ポリペプチド、ペプチドおよび抗体の使用である。
【００１９】
本発明は、血圧、摂食行動の誘導、青斑ニューロン発射の刺激、およびインスリン放出の刺激の調節異常に関連する障害の予防もしくは治療方法、ならびにα２アドレナリンレセプター作用に非依存性のグリア繊維酸性タンパク質発現の誘導異常、不快性月経前症候群、神経変性障害、例えばアルツハイマー病、オピエート依存症、モノアミン代謝回転、および痛覚、加齢、気分および卒中、唾液障害、および発育障害に関連する障害の予防または治療方法を提供する。
【００２０】
本発明は、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂの異常に関連する障害のスクリーニングおよび診断用キットを提供する。
【００２１】
（図面の簡単な説明）
本発明のこれらおよび他の目的、特徴、ならびに多くの付随する利点は、添付の図面とともに発明の詳細な説明を読めばよりよく理解されよう。
図１ＡおよびＢは、クローンＮｏ． ＦＬ１−１８ （配列番号１）由来のポリヌクレオチド配列を示す。クローンＮｏ． ＦＬ１−１８は、２０００年１１月１５日にＡＴＣＣ寄託Ｎｏ． ＰＴＡ−２６７１としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、特許寄託機関、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ． ２０１１０−２２０９に寄託された。
図２Ａ−Ｃは、クローンＮｏ． ＦＬ１−１８スプライス変異体由来のポリヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
図３はＩＭＲＲＰ１ （配列番号３）由来のポリペプチド配列を示す。
図４はＩＭＲＲＰ１ｂ （配列番号４） 由来のポリペプチド配列を示す。
図５は、ＩＭＲＲＰ１とヒトイミダゾリンレセプター受託番号ＮＰ ００９１１５の比較を示す。
図６は、ＦＬ１−１８とＩｎｃｙｔｅ ２４９９８７０との比較を示す。上段の鎖、ＦＬ１−１８； 下段の鎖、Ｉｎｃｙｔｅ ２４９９８７０。
図７ＡおよびＢは、ＦＬ１−１８スプライス変異体のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＣＧ９０４４、およびヒトイミダゾリンレセプター受託番号ＮＰ ００９１１５の比較を示す。
図８Ａ−Ｄは、ＦＬ１−１８スプライス変異体、ＦＬ１−１８、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＣＧ９０４４、およびヒトイミダゾリンレセプター受託番号ＮＰ ００９１１５の比較を示す。
図９はＩＭＲＲＰ１の発現プロフィールを示す。
図１０はＩＭＲＲＰ１の発現プロフィールを示す。
【００２２】
（発明の説明）
本明細書で用いている「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、もしくはポリヌクレオチド、およびその断片もしくは部分、および１本鎖もしくは２本鎖の、センスもしくはアンチセンス鎖を表すゲノムもしくは合成物起源のＤＮＡもしくはＲＮＡを表す。同様に、本明細書で用いている用語「アミノ酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質配列、およびその断片もしくは部分、ならびに天然もしくは合成分子を表す。
【００２３】
本明細書に記載の「アミノ酸配列」が天然のタンパク質分子のアミノ酸配列を表す場合は、「アミノ酸配列」および例えば「ポリペプチド」もしくは「タンパク質」のような用語は列挙したタンパク質分子と関連する完全な天然のアミノ酸配列に限定することを意味しない。
【００２４】
本明細書で用いている用語「ペプチド核酸」は、アミノ酸残基、例えばリジン、およびアミノ基が付加されたオリゴマーを含む分子を表す。抗遺伝子物質とも呼ばれるこれら低分子は、それら核酸の相補鎖と結合することにより転写物の伸長を止める （Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｐ． Ｅ．ら （１９９３） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．， ８： ５３−６３）。
【００２５】
本明細書で用いている用語「ＩＭＲＲＰ１およびＩＭＲＲＰ１ｂ」は、天然、合成、半合成、もしくは組換えのあらゆる供給源由来の、あらゆる種、特にウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマおよび好ましくはヒトを含む哺乳動物から得られる実質的に純粋なイミダゾリンレセプター関連タンパク質のアミノ酸配列を表す。
【００２６】
本明細書で用いている「コンセンサス」は、呼び出されない（ｕｎｃａｌｌｅｄ）塩基を決定するために再配列されるか、またはＸＬ−ＰＣＲ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、Ｃｏｎｎ．）を用いて５’および／または３’方向に伸長され再配列され、またはＧＥＬＶＩＥＷ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｓｓｅｍｂｌｙシステム（ＧＣＧ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）を用いて１またはそれ以上のＩｎｃｙｔｅクローンもしくは公衆に利用可能なクローンのオーバーラップ配列から組みたてられるか、または伸長され、組みたてられた核酸配列を表す。
【００２７】
本明細書で用いているＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂの「変異体」は、１またはそれ以上のアミノ酸が変化したアミノ酸配列を表す。該変異体は、置換アミノ酸が同様な構造特性もしくは化学特性を有する「保存的」変化、例えばグリシンのトリプトファンによる置換を有してよい。より稀に、変異体は「非保存的」変化、例えばグリシンのトリプトファンによる置換を有してよい。同様の重要でない変異には、アミノ酸の欠失もしくは挿入またはその両方を含んでいてよい。生物学的もしくは免疫学的活性をなくさずにどのアミノ酸残基を置換、挿入、もしくは欠失してよいかを決める手引きは当該分野でよく知られたコンピュータプログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを用いてみいだしてよい。
【００２８】
本明細書で用いている「欠失」は、１またはそれ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチド残基がそれぞれ欠けているアミノ酸またはヌクレオチド配列の変化を表す。
【００２９】
本明細書で用いている「挿入」または「付加」は、天然分子に比べてそれぞれ１またはそれ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチド残基の付加を生じるアミノ酸またはヌクレオチド配列の変化を表す。
【００３０】
本明細書で用いている用語「置換」は、１またはそれ以上のアミノ酸またはヌクレオチドがそれぞれ異なるアミノ酸もしくはヌクレオチドにより置き換わることを表す。
【００３１】
本明細書で用いている用語「生物学的に活性な」は、天然分子の構造的、調節的もしくは生物学的機能を有するタンパク質を表す。同様に「免疫学的に活性な」は、適切な動物または細胞に特異的免疫反応を誘導し、特異抗体と結合する天然、組換えもしくは合成イミダゾリンレセプター、またはそのあらゆるオリゴペプチドの能力を表す。
【００３２】
本明細書で用いている用語「アゴニスト」は、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂと結合すると、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂの活性の量を増大させるかもしくはその持続時間を延長する分子を表す。アゴニストには、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂと結合するタンパク質、核酸、炭水化物、有機分子、もしくはあらゆる他の分子が含まれ得る。
【００３３】
本明細書で用いている用語「アンタゴニスト」は、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂに結合するとＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂの生物学的もしくは免疫学的活性を低下させる分子を表す。アンタゴニストおよびインヒビターには、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂと結合するタンパク質、核酸、炭水化物、有機分子、もしくはあらゆる他の分子が含まれ得る。
【００３４】
本明細書で用いている用語「擬似（の）（ｍｉｍｅｔｉｃ）」は、その構造がＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂまたはその部分の構造の知識から開発され、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂの作用のすべてもしくはいくつかをもたらすことができる分子を表す。
【００３５】
本明細書で用いている用語「誘導体」は、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする核酸の化学修飾、またはコードされたＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂを表す。そのような修飾の例は、アルキル、アシルもしくはアミノ基による水素の置換であろう。核酸誘導体は、天然分子の実質的な生物学的特性を保持するポリペプチドをコードするであろう。
【００３６】
本明細書で用いている用語「実質的に純粋な」は、その天然の環境から取り出され、単離されもしくは分離される、それらが天然に結合している他の成分を少なくとも６０％含まない、好ましくは７５％含まない、最も好ましくは９０％もしくはそれ以上含まない核酸もしくはアミノ酸配列を表す。
【００３７】
本明細書で用いている用語「増幅」は、核酸配列のさらなるコピーを生成することを表し、一般的には当該分野でよく知られたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行われる （Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ、Ｄ． Ｗ．およびＧ． Ｓ． Ｄｖｅｋｓｌｅｒ （１９９５）、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， ＮＹ）。
【００３８】
本明細書で用いている用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸鎖が塩基対化により相補鎖と結合するあらゆる工程を表す。
【００３９】
本明細書で用いている用語「ハイブリダイゼーション複合体（コンプレックス）は、相補的ＧおよびＣ塩基間ならびに相補的ＡおよびＴ塩基間における水素結合の形成により２つの核酸配列間に形成される複合体を表し、これら水素結合は塩基スタッキング（ｓｔａｃｋｉｎｇ）相互作用によりさらに安定化してよい。２つの相補的核酸配列は逆平行の配置に水素結合する。ハイブリダイゼーションコンプレックスは溶液中（例えば、ＣｏｔまたはＲｏｔ分析）、または溶液中に存在する１本の核酸配列と固相支持体（例えば、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて細胞が固定される膜、フィルター、チップ、ピンもしくはガラススライド）に固定化された別の核酸配列に形成されてよい。
【００４０】
本明細書で用いている用語「相補的（な）」もしくは「相補性」は、許容される塩および温度条件下における塩基対化によるポリヌクレオチドの天然の結合を表す。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は相補的配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」と結合する。２つの１本鎖分子間の相補性は、該核酸のいくらかのみが結合する「部分的」であるか、もしくは１本鎖分子間に完全な相補性が存在するときは完全であってよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率と強度に重大な影響を持つ。これは、核酸鎖間の結合に依存する増幅反応において特に重要である。
【００４１】
本明細書で用いている用語「相同性（ホモロジー）」は、相補性の程度を表す。部分的相同性や完全な相同性（すなわち、同一性）があってよい。部分的に相補的な配列は同一配列が標的核酸とハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害するものであり、機能的用語「実質的にホモローガスな」を用いて表される。完全に相補的な配列の標的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、低ストリンジェンシー条件下のハイブリダイゼーションアッセイ（サザンもしくはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど）を用いて試験することができよう。実質的にホモローガスな配列もしくはプローブは、低ストリンジェンシー条件下で、完全にホモローガスな配列もしくはプローブの標的配列への結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）と競合し、阻害するであろう。これは、非特異的結合を許すほどに低ストリンジェンシーな条件というものではなく、低ストリンジェンシー条件は、２つの配列の互いの結合が特異的（すなわち、選択的）相互作用であることが必要である。非特異的結合がないことは、部分的な相補性も有さない（例えば、同一性が約３０％以下）第２標的配列を用いることにより試験することができ、非特異的結合が存在しなければプローブは第２の非相補的標的配列とハイブリダイズしないであろう。
【００４２】
当該分野で知られているように、低または高ストリンジェンシー条件のいずれかを含む多くの同等の条件を用いることができよう。配列の長さと性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）、標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物、溶液中に存在もしくは固定化など）、および塩および他の成分の濃度（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、および／またはポリエチレングリコールの存在の有無）といった因子を考慮し、ハイブリダイゼーション溶液を変更し、上記条件とは異なるが同等の低もしくは高ストリンジェンシー条件をもたらすことができよう。
【００４３】
本明細書で用いている用語「ストリンジェント条件」は、約Ｔｍ−５℃（プローブの融解温度ＴＭより５℃低い）からＴｍより約２０℃〜２５℃低いの範囲内で生じるストリンジェンシーである。当業者が理解するであろうように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、同一もしくは関連ポリヌクレオチド配列を同定もしくは検出するために変更してよい。
【００４４】
本明細書で用いている用語「アンチセンス」は、特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列と相補的なヌクレオチド配列を表す。用語「アンチセンス鎖」は、「センス」鎖と相補的な核酸鎖に関して用いる。アンチセンス分子は、相補鎖の合成を可能にするウイルスプロモーターと逆方向に目的とする遺伝子を連結することによる合成を含むあらゆる方法により製造してよい。細胞内に導入されたら、この転写された鎖は細胞が生成した天然配列と結合して２本鎖を形成する。次に、この２本鎖はさらなる転写もしくは翻訳をブロックする。このようにして、突然変異体表現型を生成してよい。用語「陰性（ネガティブ）」はアンチセンス鎖に関して用いられることがあり、「陽性（ポジティブ）」はセンス鎖に関して用いられることがある。
【００４５】
タンパク質に関して（「あるタンパク質の部分」というように）本明細書で用いている用語「部分」は、該タンパク質の断片を表す。該断片は４アミノ酸残基〜完全アミノ酸配列から１アミノ酸少ないものまでのサイズで変動してよい。すなわち、「配列番号３または４のアミノ酸配列の少なくとも部分を含む」タンパク質は完全長ヒトＩＭＲＲＰ１またはＩＭＲＲＰ１ｂおよびその断片を含む。
【００４６】
本明細書で用いている「形質転換」は、外来ＤＮＡがレシピエント細胞に入り、変化させる工程をいう。形質転換は、当該分野でよく知られた種々の方法を用いて天然もしくは人工的条件下で行ってよい。形質転換は、異種核酸配列を原核もしくは真核宿主細胞内に挿入ためのあらゆる知られた方法を用いてよい。該方法は、形質転換宿主細胞に基づいて選ばれ、限定されるものではないが、ウイルス感染、エレクトロポーレーション、リポフェクション、および部分衝撃が含まれてよい。そのような「形質転換」細胞には、挿入ＤＮＡを自己複製プラスミドもしくは宿主染色体の部分として複製することができる安定な形質転換細胞が含まれる。それらは、限られた時間に挿入ＤＮＡまたはＲＮＡを一時的に発現する細胞が含まれる。
【００４７】
本明細書で用いている用語「抗原決定基」は、特定抗体と接触する分子の部分を表す（すなわち、エピトープ）。タンパク質の部分もしくは断片を用いて宿主動物を免疫する場合は、該タンパク質の多くの領域が該タンパク質のある領域もしくは三次元構造に特異的に結合する抗体の産生をもたらしてよく、これら領域もしくは構造を抗原決定基という。抗原決定基は、抗体との結合において完全抗原（すなわち、免疫応答を誘導するのに用いる免疫原）と競合してよい。
【００４８】
抗体とタンパク質もしくはペプチドの相互作用に関して本明細書で用いている用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、該相互作用がタンパク質上の特定の構造（すなわち、抗原決定基もしくはエピトープ）の存在に依存する、すなわち、抗体が一般にタンパク質ではなく特定のタンパク質の構造を認識し、それと結合することを意味する。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に特異的ならば、標識「Ａ」と抗体を含む反応液中のエピトープＡ（すなわち、遊離の、非標識Ａ）を含むタンパク質の存在は、抗体と結合する標識Ａの量を減少させるであろう。
【００４９】
本明細書で用いている用語「試料」は、その最も広い意味で用いられる。ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする核酸またはその断片を含むと推測される生物学的試料は、細胞、細胞から単離した染色体（例えば、開いた有子分裂期の染色体）、ゲノムＤＮＡ（溶液中、またはサザン分析のように固体支持体に結合）、ＲＮＡ（溶液中、またはノーザン分析のように固体支持体に結合）、ｃＤＮＡ（溶液中、または固体支持体に結合）、細胞もしくは組織からの抽出物などを含んでいてよい。
【００５０】
本明細書で用いている用語「ポリペプチドの発現と関連する」は、ノーザン分析により配列番号１または２と同様であるリボ核酸の存在の検出により試料中のＩＭＲＲＰ１およびＩＭＲＲＰ１ｂをコードするｍＮＲＡの存在を示すことにより該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからの転写物の発現を示す。
【００５１】
本明細書で用いている配列番号１および２のポリヌクレオチドの「改変」には、ハイブリダイゼーションアッセイを用いて検出することができる欠失、挿入、および点突然変異を含む、ＩＭＲＲＰ１およびＩＭＲＲＰ１ｂをコードするポリヌクレオチドの配列のあらゆる改変が含まれる。この定義には、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするゲノムＤＮＡ配列に対する改変の検出（例えば、配列番号１または２とハイブリダイズすることができる制限断片長の多形性パターンの改変による）、配列番号１または２の選んだ断片がゲノムＤＮＡの試料とハイブリダイズすることができないこと（例えばアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いる）、および不適切または予期しないハイブリダイゼーション、例えば、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするポリヌクレオチド配列の正常な染色体上の座以外の座とのハイブリダイゼーション（例えば、有糸分裂期の染色体展開物に対する蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用）が含まれる。
【００５２】
本明細書で用いている用語「抗体」は、エピトープの決定基と結合することができる完全分子およびその断片、例えばＦａ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、キメラ抗体、１本鎖抗体を表す。ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂポリペプチドと結合する抗体は、完全ポリペプチド、または目的とする小ペプチドを含むかもしくは免疫抗原として用いるために組換え的に作製した断片を用いて生成することができる。動物を免疫するのに用いるポリペプチドもしくはペプチドは、ＲＮＡの転位から誘導するかもしくは化学的に合成することができ、所望により担体タンパク質と結合させることができる。ペプチドと化学的に結合する一般に用いられる担体には、ウシ血清アルブミンおよびサイログロブリンが含まれる。次に、結合ペプチドを用いて動物、例えばマウス、ラット、もしくはウサギを免疫する。
【００５３】
本明細書で用いている用語「ヒト化抗体」は、当初の結合能を保持したままでヒト抗体により厳密に似るように非抗原結合領域のアミノ酸が置換された抗体分子を表す。
【００５４】
本明細書に記載の寄託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約のもとに維持されよう。この寄託物は当業者の便宜のためだけに提供され、寄託物を３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２に基づいて要求することを承認しない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列、およびそれによりコードされたポリペプチドのアミノ酸配列は本明細書の一部を構成し、本明細書中の配列のあらゆる記載と何等かの不一致が見られる場合を調整する。寄託物の製造や販売には実施許諾が必要であり、そのような実施許諾はこれによっては与えられない。
【００５５】
本発明には、ＩＭＲＲＰ１およびＩＭＲＲＰ１ｂと呼ばれる新規ヒトイミダゾリンレセプター、ＩＭＲＲＰ１およびＩＭＲＲＰ１ｂをコードするポリヌクレオチド、ならびに異常な細胞発生、免疫応答および炎症に関連する障害、ならびに臓器および組織移植拒絶の診断、予防または治療のためのこれら組成物の使用がある。
【００５６】
ヒトイミダゾリンレセプタータンパク質配列を、Ｉｎｃｙｔｅおよび公開ドメインＥＳＴデータベースを検索するプローブとして用いた。用いた検索プログラムはギャップドＢＬＡＳＴ （Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）であった。ＢＬＡＳＴの結果からヒットした上部ＥＳＴを非冗長タンパク質および特許配列データベースについて検索し直した。この分析から、可能性のある新規イミダゾリンレセプターをコードするＥＳＴを配列相同性に基づいて同定した。Ｉｎｃｙｔｅ ＥＳＴ （クローンＩＤ： ２４９９８７０）を以後の分析の可能性ある新規イミダゾリンレセプター候補に選んだ。
【００５７】
Ｉｎｃｙｔｅクローン２４９９８７０のＤＮＡ配列からデザインしたＰＣＲプライマー対を用いて、増幅断片のアンチセンス鎖の５’末端がビオチン化されたクローン由来のＤＮＡの部分を増幅した。２本鎖ＤＮＡのこのビオチン化部分を変性させ、センス鎖に対応するＤＮＡを含む、共有結合により閉じた１本鎖環状ｃＤＮＡライブラリーの混合物とインキュベーションした。ｃＤＮＡライブラリーがＧｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得た全脳組織ライブラリーであった。ビオチン化ＤＮＡと環状ｃＤＮＡのハイブリッドをストレプトアビジン磁石ビーズ上に捕捉させた。ビオチン化ＤＮＡからの該ｃＤＮＡの熱放出により、ｃＤＮＡクローニングベクター上の配列とホモローガスなプライマーを用いて１本鎖ｃＤＮＡを２本鎖に変換した。２本鎖ｃＤＮＡをエレクトロポーレーションによりＥ． ｃｏｌｉに導入し、得られたクローンを最初のプライマー対を用いるＰＣＲでスクリーニングし、正しいｃＤＮＡクローンを同定した。ＦＬ１−１８と名づけたあるクローンを両鎖により配列決定した（図１）。クローンＦＬ１−１８の核酸配列に対応する推定アミノ酸配列を図３に示す。
【００５８】
ＦＬ１−１８ ｃＤＮＡとＩｎｃｙｔｅデータベース（クローン２４９９８７０）中にみられた部分クローンとの比較により、Ｉｎｃｙｔｅクローンのヌクレオチド１７２５位に２５塩基の小さな挿入が生じ、クローンＦＬ１−１８の３３７５位に４７塩基の挿入が生じることがわかった。（図６参照： 上段の鎖、ＦＬ１−１８； 下段の鎖、Ｉｎｃｙｔｅ ２４９９８７０。）２つのＤＮＡ配列、ＦＬ１−１８およびＩｎｃｙｔｅ２４９９８７０のアラインメントを図８に示す。
【００５９】
２つのＤＮＡ配列、ＦＬ１−１８およびＩｎｃｙｔｅ２４９９８７０の、ヒトゲノムの大まかな原案に対するアラインメントにより、２つの配列中の両挿入／欠失が挿入ＤＮＡのいずれかの側のプライスドナーおよびアクセプター配列の保存により決定される推定エクソンに対応し、１ゲノム位置（すなわち、１遺伝子）由来の転写物の異なるＲＮＡスプライス形を表すことがわかった。
【００６０】
Ｉｎｃｙｔｅクローンは５’末端の約４５０ｂｐがない。ＦＬ１−１８配列の５’末端配列をＩｎｃｙｔｅクローンのそれと結合し、ＦＬ１−１８スプライス変異体と呼ばれる新規ヌクレオチド配列を作製する。この配列の遷移により、ＦＬ１−１８中の小エクソンを欠くことにより生じるインフレームの停止が排除されるためＦＬ１−１８より長いポリペプチド鎖が生じる。最初の７１２アミノ酸は同じであるが、その後のＦＬ１−１８の残りの９７アミノ酸は異なる。Ｉｎｃｙｔｅクローンにみられた第２の交互にスプライスしたエクソンはコーディングエクソンである。したがって、これらスプライス変異体は異なる長さで恐らく異なる機能的タンパク質を生じる。
【００６１】
ある態様において、本発明は、図３に示す配列番号３のアミノ酸配列もしくは図４に示す配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。ＩＭＲＲＰ１およびＩＭＲＲＰ１ｂはヒトイミダゾリンレセプター（受託番号ＮＰ ００９１１５）と化学的および構造的相同性を共有する。ＩＭＲＲＰ１およびＩＭＲＲＰ１ｂは、受託番号ＡＡＦ５２３０５および受託番号ＡＡＦ５７５１４で特定される２つのショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）タンパク質とも化学的および構造的相同性を共有する。ＩＭＲＲＰ１は図５に示すヒトイミダゾリンレセプター（受託番号ＮＰ ００９１１５）と２６％同一である。
【００６２】
イミダゾリンレセプター相同体ＩＭＲＲＰ１の発現プロフィールは種々のヒト組織における発現を示した。イミダゾリンレセプターＩＭＲＲＰ１のクローニングに用いた同じＰＣＲプライマーを用いて定量的ＰＣＲによるｍＲＮＡの定常レベルを測定した。簡単には、第１鎖ｃＤＮＡを市販のｍＲＮＡから作製した。各アッセイに用いたｃＤＮＡの相対量を、すべての組織で等量に発現した遺伝子、サイクロフィリンのプライマー対を用いる並行実験を行うことにより決定した。サイクロフィリンプライマー対は、各試料のｃＤＮＡの量の小さな変動を検出し、これらデータをＩＭＲＲＰ１のプライマー対を用いて得られたデータの正規化に用いた。ＰＣＲデータを試験した組織間の転写物の豊富さの差の相対評価に変換し、データを図９に示す。
【００６３】
本発明はＩＭＲＲＰ１およびＩＭＲＲＰ１ｂ変異体も含む。好ましいＩＭＲＲＰ１およびＩＭＲＲＰ１ｂ変異体は、それぞれ配列番号３および４のＩＭＲＲＰ１およびＩＭＲＲＰ１ｂアミノ酸配列と少なくとも８０％、より好ましくは９０％もしくはそれ以上のアミノ酸同一性を有するものである。最も好ましいＩＭＲＲＰ１およびＩＭＲＲＰ１ｂ変異体は、それぞれ配列番号３および４と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するものである。
【００６４】
本発明は単離されたＩＭＲＲＰ１およびＩＭＲＲＰ１ｂならびにその相同体を提供する。そのようなタンパク質は内因性の夾雑物質を実質的に含まず、所望により天然パターンのグリコシル化を伴わない。本発明の範囲内にあるＩＭＲＲＰ１およびＩＭＲＲＰ１ｂレセプターの誘導体には、生物活性を保持する一次タンパク質の種々の構造形も含まれる。イオン性（ｉｏｎｉｚａｂｌｅ）アミノおよびカルボキシル基の存在により、例えばＩＭＲＲＰ１およびＩＭＲＲＰ１ｂタンパク質は、酸性塩もしくは塩基性塩の形であるか、または天然の形であってよい。個々のアミノ酸残基も酸化または還元により修飾してよい。
【００６５】
一次アミノ酸構造は、他の化学的部分、例えばグリコシル基、脂質、リン酸基、アセチル基などと共有結合的もしくは凝集的コンジュゲートを形成するか、またはアミノ酸配列の突然変異体を生じることにより修飾されてよい。共有結合誘導体は特定の官能基がアミノ酸側鎖またはＮ末端もしくはＣ末端と結合することにより生成される。
【００６６】
さらに、本発明は免疫グロブリンＦｃ領域と結合したＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂのアミノ酸配列もしくはその部分を含む融合タンパク質を含んだ。用いたＦｃ領域の部分に応じて融合タンパク質は鎖間ジスルフィド結合の形成を介して二量体として発現してよい。融合タンパク質が抗体の重鎖と軽鎖の両方を生成する場合は、４つものＩＭＲＲＰ１および／またはＩＭＲＲＰ１ｂ領域を含むタンパク質オリゴマーを形成することが可能である。
【００６７】
本発明はＩＭＲＲＰ１およびＩＭＲＲＰ１ｂをコードするポリヌクレオチドも含む。したがって、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂのアミノ酸配列をコードするあらゆる核酸配列を用いてＩＭＲＲＰ１およびＩＭＲＲＰ１ｂを発現する組換え分子を生成することができる。特定の態様において、本発明には図１および２に示す配列番号１および２の核酸配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。
【００６８】
遺伝子コードの縮重の結果、いくつかがあらゆる既知の天然遺伝子のヌクレオチド配列と最小限の相同性を保持するＩＭＲＲＰ１およびＩＭＲＲＰ１ｂをコードする多数のヌクレオチド配列が生成されてよいことを当業者は認識するであろう。すなわち、本発明は、可能なコドン選択に基づいて組み合わせを選ぶことにより作製することができる、ヌクレオチド配列のそれぞれ考えられるすべての変化を予期する。これらの組み合わせは、天然のＩＭＲＲＰ１およびＩＭＲＲＰ１ｂのヌクレオチド配列に適用される標準的トリプレット遺伝子コードに従って作製され、すべてのそのような変化は具体的に開示されているものと考えるべきである。
【００６９】
ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするヌクレオチド配列およびその変異体は、適切に選ばれたストリンジェンシー条件下でＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂの天然のコーディング配列のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができることが好ましいが、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするヌクレオチド配列もしくは実質的に異なるコドン使用を有するその誘導体を製造するのに好都合かも知れない。特定のコドンが宿主により利用される頻度に従って特定の原核性もしくは真核性宿主にペプチドの発現が生じる速度を増加させるようにコドンを選んでよい。コードされたアミノ酸配列を変化させずにＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を実質的に変化させる他の理由には、天然の配列から製造した転写物より半減期が長いなどのより望ましい特性を有するＲＮＡ転写物の製造が含まれる。
【００７０】
本発明には、完全に合成化学によりＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするＤＮＡ配列もしくはその部分およびそれらの誘導体の製造も含まれる。製造後、本願出願時に当該分野でよく知られている試薬を用いて合成配列を多くのあらゆる利用可能な発現ベクターおよび細胞系に挿入してよい。さらに、合成化学を用いてＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする配列もしくはそのあらゆる部分に突然変異を導入してよい。
【００７１】
本発明には、種々のストリンジェンシー条件下で、クレームしたヌクレオチド配列、特に配列番号１および２に示すものとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列も含まれる。ハイブリダイゼーション条件は、Ｗａｈｌ， Ｇ． Ｍ．およびＳ． Ｌ． Ｂｅｒｇｅｒ （１９８７； Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２： ３９９−４０７）およびＫｉｍｍｅｌ， Ａ． Ｒ． （１９８７ ； Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２： ５０７−５１１）に記載の核酸結合複合体もしくはプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づき、定義したストリンジェンシーで用いてよい。ある態様において、配列には、軽度にストリンジェントな条件（２Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＯＳ、１．０ｍＭ ＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０の前洗浄溶液）、および５０℃、５Ｘ ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件下で、一夜、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする配列、およびＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするものの縮重である他の配列とハイブリダイズさせることができるものが含まれる。
【００７２】
本発明に含まれるＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする別の核酸配列には、同じかまたは機能的に等価なＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするポリヌクレオチドを生じる異なるヌクレオチドの欠失、挿入もしくは置換が含まれる。コードされたタンパク質は、サイレント変化を生じ、機能的に等価なＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂを生じるアミノ酸残基の欠失、挿入もしくは置換を含んでいてもよい。ＩＭＲＲＰ１およびＩＭＲＲＰ１ｂの生物活性が保持される限り、残基の極性、荷電、溶解性、疎水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて意図的なアミノ酸置換を行ってよい。例えば、負に荷電したアミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を、正に荷電したアミノ酸はリジンおよびアルギニンを含んでよく、また、同様の疎水性値を有する非荷電の極性先端基を有するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシンおよびバリン、グリシンおよびアラニン、アスパラギンおよびグルタミン、セリンおよびトレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンを含んでいてよい。
【００７３】
本発明の範囲内には、ＩＭＲＲＰ１およびＩＭＲＲＰ１ｂをコードする遺伝子のアレルも含まれる。本明細書で用いている「アレル」または「アレル配列」は、核酸配列中の少なくとも１個の突然変異から生じることがある遺伝子の別の形である。アレルは、構造や機能が変化していても、変化していなくてもよい別のｍＲＮＡまたはポリペプチドを生じてよい。あらゆる該遺伝子は、１個または多くのアレル形を有するか、有していなくてもよい。アレルを生じる普通の突然変異変化は、一般にヌクレオチドの天然の欠失、付加、もしくは置換による。これら変化のタイプはそれぞれ単独もしくは他と組み合せて、ある配列中に１回またはそれ以上生じてよい。
【００７４】
当該分野でよく知られている一般的に利用可能なＤＮＡの配列決定法を本発明のあらゆる態様を実施するのに用いてよい。該方法では、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、ＳＥＱＵＥＮＣＥ （ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ． Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏ）、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、熱安定Ｔ７ポリメラーゼ （Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｃｈｉｃａｇｏ、Ｉ１１．）、または組換えポリメラーゼと校正エクソヌクレアーゼの組み合せ、例えばＧｉｂｃｏ ＢＲＬ （Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）から市販されているＥＬＯＮＧＡＳＥ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍのような酵素を用いてよい。好ましくは、該工程は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏ Ｌａｂ ２２００ （Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｒｅｎｏ、Ｎｅｖ．）、Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ （ＰＴＣ２００； ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、Ｍａｓｓ．）、およびＡＢＩ ３７７ ＤＮＡシーケンサー （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）のような機械を用いて自動化することが好ましい。
【００７５】
ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする核酸配列を、部分的ヌクレオチド配列を利用し、当該分野で知られた種々の方法を用いて延長して、上流配列、例えばプロモーターや調節エレメントを検出してよい。例えば、「制限部位」を用いてよいある方法、ＰＣＲでは、既知の遺伝子座と隣り合った未知の配列を回収するための普遍的プライマーを用いる（Ｓａｒｋａｒ、Ｇ． （１９９３） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． ２： ３１８−３２２）。特に、ゲノムＤＮＡは、最初、リンカー配列に対するプライマー、および既知領域に特異的なプライマーの存在下で増幅される。次に、増幅した配列を同じリンカープライマーおよび最初のものに内在する別の特異的プライマーを用いる第２回目のＰＣＲにかける。各回のＰＣＲの生成物を適切なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写し、逆転写酵素を用いてシーケンスする。
【００７６】
逆ＰＣＲを用い、既知領域に基づき分岐プライマーを用いて配列を増幅もしくは伸長させてもよい（Ｔｒｉｇｌｉａ， Ｔ．ら、（１９８８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６： ８１８６）。長さ２２−３０ヌクレオチドの、ＧＣ含有率が５０％もしくはそれ以上である約６８℃〜約７２℃の温度で標的配列とアニールするプライマーをＯＬＩＧＯ ４．０６プライマー分析ソフトウエア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ、Ｍｎ．）もしくは別の適切なプログラムを用いて設計してよい。該方法では、遺伝子の既知領域中に適切な断片を生じる種々の制限酵素を用いる。次に、該断片を分子内ライゲーションにより環化し、ＰＣＲ鋳型として用いる。
【００７７】
使用可能な別の方法にはヒトおよび酵母の人工染色体ＤＮＡ中の既知の配列と隣り合ったＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を含むキャプチャーＰＣＲがある（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ， Ｍ．ら、（１９９１） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． １： １１１−１１９）。この方法では、ＰＣＲ実施前に、複数の制限酵素消化およびライゲーションを用いてＤＮＡ分子の未知の部分中に操作した二本鎖配列を配置してもよい。
【００７８】
未知の配列を回収するのに用いることができる別の方法には、Ｐａｒｋｅｒ， Ｊ． Ｄ．ら（１９９１； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９： ３０５５−３０６０）の方法がある。さらに、ＰＣＲ、ネスト化プライマー、およびＰＲＯＭＯＴＥＲＦＩＮＤＥＲライブラリーを用いてゲノムＤＮＡを得ることができる（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）。この方法はライブラリーをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エクソン接合部をみいだすのに有用である。
【００７９】
完全長ｃＤＮＡをスクリーニングするときは、より大きなｃＤＮＡを含むようにサイズ選択したライブラリーことが好ましい。また、遺伝子の５’領域を含むより多くの配列を含むランダムプライムドライブラリーが好ましい。ランダムプライムドライブラリーの使用はオリゴｄ（Ｔ）ライブラリーが完全長ｃＤＮＡを生じない状況では特に好ましいかもしれない。ゲノムライブラリーは、５’および３’非転写制御領域中に配列を伸長させるのに有用かもしれない。
【００８０】
市販のキャピラリー電気泳動系を用いてシーケンシングまたはＰＣＲ生成物のヌクレオチド配列を確認するかまたはサイズを分析してもよい。特に、キャピラリーシーケンシングでは、電気泳動的分離に流動性ポリマー、レーザーで活性される４種の異なる蛍光染料（各ヌクレオチドについて１個）、および荷電結合装置カメラによる放射波長の検出を用いてよい。出力／光強度を適切なソフトウェア（例えば、ＧＥＮＯＴＹＰＥＲ ａｎｄ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＮＡＶＩＧＡＴＯＲ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて電気信号に変換し、サンプルのローディングからコンピューター分析までの全工程および電子データ表示をコンピューター制御することができよう。特定サンプル中に限られた量で存在するＤＮＡの小片をシーケンシングするにはキャピラリー電気泳動が特に好ましい。
【００８１】
本発明の別の態様において、融合タンパク質またはその機能的等価物をコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を組換えＤＮＡ分子に用い、適切な宿主細胞中でＩＭＲＲＰ１またはＩＭＲＲＰ１ｂを発現させてよい。該遺伝子コードの固有の縮重により、実質的に同じかまたは機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を生成し、これら配列を用いてＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをクローンし、発現させてよい。
【００８２】
当業者が理解するであろうように、非天然コドンを有するＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂコーディングヌクレオチド配列を作製するのが好都合かもしれない。例えば、特に原核性もしくは真核性宿主により好まれるコドンを選び、タンパク質の発現速度を増すか、または所望の特性、例えば天然配列から生じた転写物より長い半減期を有する組換えＲＮＡ転写物を製造することができる。
【００８３】
本発明のヌクレオチド配列は、限定されるものではないが遺伝子産物のクローニング、プロセシングおよび／または発現を修飾する変化を含む種々の理由で、ＩＭＲＲＰ１およびＩＭＲＲＰ１ｂコーディング配列を変化させるために当該分野で一般的に知られた方法を用いて操作することができる。遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのランダム断片化およびＰＣＲ再組み立てによるＤＮＡシャッフリングを用いて、ヌクレオチド配列を操作してよい。例えば、部位指向性突然変異誘発を用いて、新しい制限部位を挿入するか、グリコシル化パターンを変化させ、コドン選択を変化させ、スプライス変異体を生成し、または突然変異などを導入してよい。
【００８４】
本発明の別の態様において、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする天然、修飾もしくは組換え核酸配列をヘテロローガスな配列と連結し、融合タンパク質をコードしてよい。例えば、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂ活性のインヒビターのためにペプチドライブラリーをスクリーニングするには、市販の抗体により認識することができるキメラＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂタンパク質をコードすることが有用かもしれない。融合タンパク質を、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂコーディング配列とヘテロローガスなタンパク質配列の間に位置する開裂部位を含むように操作し、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂを開裂させてヘテロローガスな部分から精製してもよい。
【００８５】
別の態様において、当該分野でよく知られた化学的方法を用い、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする配列の全部もしくは部分を合成してよい（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｍ． Ｈ．ら、（１９８０） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ２１５−２２３、Ｈｏｒｎ， Ｔ．ら、（１９８０） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ２２５−２３２）。あるいはまた、該タンパク質それ自身をＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂのアミノ酸配列またはその部分を合成する化学的方法を用いて製造してよい。例えば、ペプチド合成は種々の固相技術を用いて実施することができ（Ｒｏｂｅｒｇｅ， Ｊ． Ｙ．ら、（１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９： ２０２−２０４）、また、自動化合成は、例えば、ＡＢＩ ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて達成することができる。
【００８６】
プレパラティブ高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｔ． （１９８３） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ． Ｙ．）、逆相高速液体クロマトグラフィー、または当該分野で知られた他の精製方法により、新たに合成したペプチドを実質的に精製してよい。合成ペプチド組成物をアミノ酸合成またはシーケンシングにより確認してよい（例えば、Ｅｄｍａｎ分解法； Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、上記参照）。さらに、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂのアミノ酸配列、またはそのあらゆる部分を直接合成中に変化させ、そして／または他のタンパク質由来の配列もしくはそのあらゆる部分を用いる化学的方法を用いて混合し、種々のポリペプチドを生成してよい。
【００８７】
生物学的に活性なＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂを発現させるには、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂまたは機能的等価物をコードするヌクレオチド配列を、適切な発現ベクター、すなわち挿入コーディング配列を転写および翻訳するのに必要なエレメントを含むベクターに挿入してよい。
【００８８】
当業者によく知られた方法を用いて、コーディング配列および適切な転写および翻訳制御エレメントを含む発現ベクターを構築してよい。これら方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換えが含まれる。そのような技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．ら、（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， Ｎ． Ｙ．、およびＡｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ．ら、（１９８９） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ． Ｙ．に記載されている。
【００８９】
ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする配列を含み、発現する種々の発現ベクター／宿主系を利用してよい。これらには、限定されるものではないが、微生物、例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌、酵母発現ベクターで形質転換した酵母、ウイルス発現ベクター（例えばバクロウイルス）を感染させた昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ、またはタバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）もしくは細菌発現系（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系、もしくは動物細胞系が含まれる。
【００９０】
「調節エレメント」または「制御配列」には、それら非翻訳領域のベクター−エンハンサー、プロモーター、転写および翻訳を実行する宿主細胞タンパク質と相互作用する５’および３’非翻訳領域がある。そのようなエレメントは強さや特異性が異なってよい。利用するベクター系および宿主に応じて、保存的および誘導性プロモーターを含むあらゆる適切な転写および翻訳エレメントを用いてよい。例えば、細菌系を用いてクローニングするときは、誘導性プロモーター、例えばＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミッド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）もしくはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｇｉｂｃｏ ＢＩＬＬ）等のハイブリッドＬａｃＺプロモーターを用いてよい。バクロウイルスポリヘドリンプロモーターを昆虫細胞中で用いてよい。植物細胞のゲノム由来のプロモーターもしくはエンハンサー（例えば、熱ショック、ＲＵＢＩＳＣＯ、および保存タンパク質遺伝子）、もしくは植物ウイルス由来のプロモーターもしくはエンハンサー（例えば、ウイルスプロモーターまたはリーダー配列）プロモーターもしくはエンハンサーをベクター中にクローンしてよい。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子もしくは哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが好ましい。ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする配列の複数のコピーを含む細胞系を作製する必要があるときは、ＳＶ４０もしくはＥＢＶに基づくベクターを適切な選択マーカーと共に用いてよい。
【００９１】
細菌系において、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂを対象とした使用に応じて多くの発現ベクターを選んでよい。例えば、抗体の誘導に多量が必要であるときは、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現をもたらすベクターを用いてよい。そのようなベクターには、限定されるものではないが、多機能性Ｅ． ｃｏｌｉクローニングおよび発現ベクター、例えば、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする配列がベクター中でβガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔおよび続く７残基の配列とインフレームに連結し、ハイブリッドタンパク質が生成されるＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＮベクター （Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ．およびＳ． Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４： ５５０３−５５０９）などが含まれる。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）を用い、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ （ＧＳＴ）との融合タンパク質として異種ポリペプチドを発現させてもよい。一般的に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、次いで遊離グルタチオン存在下で溶出することにより溶解細胞から容易に精製することができる。そのような系で生成されるタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、もしくはＸＡ因子プロテアーゼ開裂部位を含み、目的とするクローンされたポリペプチドを意のままにＧＳＴ部分から放出させることができるように設計してよい。
【００９２】
酵母、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、構成性または誘導性プロモーター、例えばα因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨを含む多くのベクターを用いてよい。総説は、Ａｕｓｕｂｅｌら（上記）、およびＧｒａｎｔら（１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３： ５１６−５４４参照。
【００９３】
植物発現ベクターを用いる場合は、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする配列の発現をあらゆる多くのプロモーターにより誘導してよい。例えば、ウイルスプロモーター、例えばＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターは単独で、またはＴＭＶ由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いてよい（Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ． （１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ． ６： ３０７−３１１）。あるいはまた、植物プロモーター、例えばＲＵＢＩＳＣＯまたは熱ショックプロモーターの小サブユニットを用いてよい（Ｃｏｒｕｚｚｉ， Ｇ．ら（１９８４） ＥＭＢＯ Ｊ． ３： １６７１−１６８０、Ｂｒｏｇｌｉｅ， Ｒ．ら、（１９８４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４： ８３８−８４３、およびＷｉｎｔｅｒ， Ｊ．ら、（１９９１） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． １７： ８５−１０５）。これら構築物は、直接ＤＮＡ形質転換または病原体介在性トランスフェクションにより植物細胞に導入することができる。そのような技術は多くの一般的に利用可能な総説に記載されている（例えば、Ｈｏｂｂｓ， Ｓ．またはＭｕｒｒｙ， Ｌ． Ｅ．、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （１９９２）中、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ． Ｙ．； １９１−１９６頁参照）。
【００９４】
昆虫系を用いてＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂを発現させてよい。例えば、あるそのような系において、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｈｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターに用いてＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞もしくはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｌａｒｖａｅ中で異種遺伝子を発現させる。ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする配列を、該ウイルスの非必須領域、例えばポリヘドリン遺伝子中にクローンし、ポリヘドリンプロモーターの制御下においてよい。ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂの挿入が成功すると、ポリヘドリン遺伝子が不活性になり、コートタンパク質を欠く組換えウイルスが生成されるであろう。次に、組換えウイルスを用い、例えば、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂを発現させるＳ． ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｌａｒｖａｅを感染させてよい（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ， Ｅ． Ｋ．ら、（１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９１： ３２２４−３２２７）。
【００９５】
哺乳動物宿主細胞には多くのウイルスベースの発現系を利用してよい。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合は、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする配列を後期プロモーターおよび３部からなる（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳コンプレックス中に連結してよい。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１もしくはＥ３領域中への挿入を用いて感染宿主細胞中でＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂを発現させることができる生ウイルスを得てよい（Ｌｏｇａｎ， Ｊ．およびＳｈｅｎｋ， Ｔ． （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１： ３６５５−３６５９）。さらに、転写エンハンサー、例えばラウス肉種ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーを用いて哺乳動物宿主細胞中の発現を増加させることができる。
【００９６】
特定の開始シグナルを用いてＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする配列のより効率的な翻訳を達成してもよい。そのようなシグナルにはＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする配列、その開始コドン、および上流配列を適切な発現ベクター中に挿入する場合は、さらなる転写もしくは翻訳制御シグナルは必要でないかもしれない。しかしながら、コーディング配列もしくはその部分を挿入する場合は、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが提供されるべきである。さらに、開始コドンは完全な挿入物の翻訳を保証するため正しいリーディングフレーム（読み取り枠）中になければならない。外因性翻訳エレメントおよび開始コドンは、天然および合成の種々の起源のものであってよい。使用する特定の細胞系に適切なエンハンサー、例えば文献（Ｓｃｈａｒｆ， Ｄ．ら、（１９９４） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０： １２５−１６２）に記載のものを含めることにより発現効率を増強してよい。
【００９７】
さらに、宿主細胞株を、挿入配列の発現を調節するかまたは所望の方法で発現タンパク質を処理する能力で選んでよい。該ポリペプチドのそのような修飾には、限定されるものではないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質付加、およびアシル化が含まれる。「プレプロ」形のタンパク質を開裂させる翻訳後プロセシングを用いて正しい挿入、ホールディング、および／または機能を促がしてもよい。そのような翻訳後活性について特異的細胞機構および特徴的メカニズムを有する種々の宿主細胞、例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、およびＷ１３８を選び、異種タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にしてよい。
【００９８】
組換えタンパク質を長期間、高収率に生成するには、安定な発現が好ましい。例えば、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂを安定に発現する細胞株を、同じかもしくは別のベクター上にウイルス起源の複製および／または内因性発現エレメントおよび選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて形質転換してよい。ベクター導入後、選択培地に交換する前に、細胞を豊富化培地中で１〜２日間増殖させてよい。選択マーカーの目的は選択に対する抵抗性を与えることであり、その存在により導入配列をうまく発現させた細胞の増殖および回収が可能となる。安定な形質転換細胞の耐性クローンは、その細胞種に適した組織培養技術を用いて増殖させてよい。
【００９９】
あらゆる選択系を用いて形質転換細胞株を回収してよい。これらには、限定されるものではないが、それぞれｔｋ−またはａｐｒｔ−細胞で用いることができる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ．ら、（１９７７） Ｃｅｌｌ １１ ： ２２３−３２）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ （Ｌｏｗｙ， Ｉ．ら、（１９８０） Ｃｅｌｌ ２２： ８１７−２３）が含まれる。また、代謝拮抗物質、抗生物質もしくは除草剤耐性、例えば、メトトレキセート耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ．ら、（１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７７： ３５６７−７０）、アミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８ （Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ， Ｆ．ら （１９８１） Ｊ． ＭｏＬ Ｂｉｏｌ． １５０： １−１４）に対する耐性を付与するｎｐｔ、およびそれぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与するａｌｓまたはｐａｔ（Ｍｕｒｒｙ、上記）を選択の基準に用いることができる。さらなる選択可能な遺伝子が記載されている。例えば、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用するのを許すｔｒｐＢ、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用するのを許すｈｉｓｄ（Ｈａｒｔｍａｎ， Ｓ． Ｃ．およびＲ． Ｃ． Ｍｕｌｌｉｇａｎ （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５： ８０４７−５１）。最近、可視的なマーカー使用の人気が高まってきており、アントシアニン、βグルクロニダーゼ、およびその基質ＧＵＳ、およびリシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンのようなマーカーは、形質転換体を同定するだけでなく、特定のベクター系に帰属する一時的もしくは安定したタンパク質発現量を定量するのにも広く利用されている（Ｒｈｏｄｅｓ， Ｃ． Ａ．ら、（１９９５） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５５： １２１−１３１）。
【０１００】
マーカー遺伝子発現の有無は、目的とする遺伝子の存在も示唆するが、その存在と発現を確認する必要があるかもしれない。例えば、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする配列をマーカー遺伝子配列内に挿入する場合は、コード配列を含む組換え細胞をマーカー遺伝子機能の欠如により同定することができる。あるいはまた、マーカー遺伝子を単一プロモーターの制御下でＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする配列と縦一列に並んで配置させることができる。誘導または選択に応じたマーカー遺伝子の発現は、通常、タンデム遺伝子の発現も示唆する。
【０１０１】
あるいはまた、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする核酸配列を含み、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂを発現する宿主細胞を、当業者に知られた種々の方法で同定してよい。これら方法には、限定されるものではないが、ＤＮＡ−ＤＮＡもしくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション、および核酸もしくはタンパク質を検出および／または同定するための、膜、溶液もしくはチップベースの技術を含むタンパク質バイオアッセイもしくはイムノアッセイ技術が含まれる。
【０１０２】
ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするポリヌクレオチドの部分もしくは断片またはプローブを用いる増幅またはＤＮＡ−ＤＮＡもしくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションにより検出することができる。核酸増幅に基づくアッセイには、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする配列に基づくオリゴヌクレオチドもしくはオリゴマーを用い、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含む形質転換体を検出することが含まれる。本明細書で用いている「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、少なくとも約１０ヌクレオチド、そして約６０ヌクレオチドもの、好ましくは約１５〜３０ヌクレオチド、より好ましくは約２０〜２５ヌクレオチドの核酸配列をいい、これらはプローブやアンプリマーとして用いることができる。
【０１０３】
該タンパク質に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いるＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂの発現を検出および測定するための種々のプロトコールが当該分野で知られている。例には、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が含まれる。ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂ上の２つの非干渉エピトープと反応するモノクローナル抗体を利用する２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが好ましいが、競合バインディングアッセイを用いてもよい。これらおよび他のアッセイは、例えばＨａｍｐｔｏｎ， Ｒ．ら、（１９９０； Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ， Ｓｔ Ｐａｕｌ， Ｍｉｎｎ．）およびＭａｄｄｏｘ， Ｄ． Ｅ．ら、（１９８３ ； Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １５８： １２１１−１２１６）に記載されている。
【０１０４】
種々の標識およびコンジュゲーション技術が当業者に知られており、それらを種々の核酸およびアミノ酸アッセイに用いてよい。ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするポリヌクレオチド関連配列を検出するための標識ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブの製造方法には、標識ヌクレオチドを用いるオリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識もしくはＰＣＲ増幅が含まれる。あるいはまた、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする配列もしくはそのあらゆる部分を、ｍＲＮＡプローブを作製するためのベクター中にクローンしてよい。そのようなベクターは当該分野で知られており、市販されており、これを用いて適切なＲＮＡポリメラーゼ、例えばＴ７、Ｔ３もしくはＳＰ６、および標識ヌクレオチドを加えてｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成してよい。これら方法は種々の市販キットを用いて行ってよい （Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ、（Ｋａｌａｍａｚｏｏ、Ｍｉｃｈ．）； Ｐｒｏｍｅｇａ （Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）； およびＵ． Ｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．、（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏ））。使用できる適切なレポーター分子もしくは標識には、放射性核種、酵素、蛍光物質、化学ルミネッセンス物質もしくは色素産生物質、ならびに基質、補助因子、インヒビター、磁性粒子などが含まれる。
【０１０５】
ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするヌクレオチド配列で形質転換した宿主細胞を、細胞培養から該タンパク質を発現および回収するのに適した条件下で培養してよい。組換え細胞が産生したタンパク質は、用いる配列および／またはベクターに応じて分泌されるかまたは細胞内に含まれていてよい。当業者が理解するであろうように、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核もしくは真核細胞膜を介してＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂを分泌させるシグナル配列を含むように設計してよい。他の組換え構築物を用いてＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を促がすポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列と結合してよい。そのような精製を促がすドメインには、限定されるものではないが、金属キレートペプチド、例えば固定化金属を用いた精製を可能にするヒスチジントリプトファンモジュール、固定化免疫グロブリンを用いた精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティ精製系に利用するドメイン（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈ．）が含まれる。精製ドメインとＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂの間に開裂可能なリンカー配列、例えば、ＸＡ因子もしくはエンテロキナーゼに特異的な配列（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）を包含させたものを用いて精製を促がしてよい。あるそのような発現ベクターは、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂとチオレドキシンもしくはエンテロキナーゼ開裂部位の前の６ヒスチジン残基をコードする核酸を含む融合タンパク質の発現をもたらす。ヒスチジン残基は、Ｐｏｒａｔｈ， Ｊ．ら（１９９２， Ｐｒｏｔ． Ｅｘｐ． Ｐｕｒｉｆ． ３： ２６３−２８１）に記載のＩＭＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー）を用いる精製を促がし、一方、エンテロキナーゼ開裂部位は該融合タンパク質からの精製手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターについてはＫｒｏｌｌ， Ｄ． Ｊ．ら、９９３； ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２： ４４１−４５３に記載されている。
【０１０６】
組換え生成に加え、固相技術を用いる直接ペプチド合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌ Ｊ． （１９６３） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５： ２１４９−２１５４）により生成してよい。タンパク質合成は手動技術を用いるかまたは自動操作により行ってよい。自動合成は例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて行うことができる。ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂの種々の断片を、別個に化学合成し、化学的方法を用いて結合して完全長分子を作製することができる。
【０１０７】
ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂとＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９ （６）， ３１９−３２９ （２０００）に開示のヒトイミダゾリンレセプターの間には化学的および構造的相同性が存在する。さらに、ＩＭＲＲＰ１およびＩＭＲＲＰ１ｂは、脳、骨髄、心臓、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、胎盤、小腸、脊髄、膵臓、精巣、および胸腺組織に発現し、その多くは血圧、摂食の誘導、青斑ニューロン発射の刺激、およびインスリン放出の刺激の調節、およびα−２アドレナリンレセプターの作用に非依存性のグリア繊維性酸性タンパク質の誘導、月経前不快気分症候群、神経変性障害、例えばアルツハイマー病、オピエート依存症、モノアミン代謝回転、および従って、痛覚、加齢、気分および卒中、唾液腺障害、および発育障害に関連する。したがって、ＩＭＲＲＰ１およびＩＭＲＲＰ１ｂは哺乳動物の生理学に重要な役割を果たす。
【０１０８】
別の態様において、上記のものを含む身体的もしくは心理学的障害を予防もしくは治療するために、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂまたはその断片もしくは誘導体を発現することができるベクターを対象に投与してもよい。
【０１０９】
別の態様において、鬱病を含む多くの神経学的状態および障害と関連した障害を治療もしくは予防するために、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂのアゴニストもしくはアンタゴニストを対象に投与してよい。ある局面において、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂに特異的な抗体を、直接アンタゴニストとして、またはＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂを発現する細胞もしくは組織に医薬物質を提示するためのターゲッティングもしくはデリバリーメカニズムとして間接的に用いてよい。
【０１１０】
別の態様において、鬱病を含む多くの神経学的状態および障害と関連した障害を治療もしくは予防するために、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするポリヌクレオチドの相補的もしくはアンチセンス配列を発現するベクターを対象に投与してよい。
【０１１１】
別の態様において、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂの発現と関連した鬱病を含む多くの神経学的状態および障害を治療するために、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするポリヌクレオチドの相補的もしくはアンチセンス配列を発現するベクターを対象に投与してよい。
【０１１２】
他の態様において、上記のあらゆる治療的タンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、アンチセンス配列、またはベクターを他の適切な治療薬と組み合わせて投与してよい。併用療法に用いる適切な薬剤の選択は、常套的な医薬的方針に従って当業者が行ってよい。治療薬の組み合わせは、上記種々の障害の治療もしくは予防に相乗的に作用するかもしれない。このアプローチを用い、より低用量の各薬剤で治療効果を達成することができ、副作用の可能性を減少させることができよう。
【０１１３】
ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂのアゴニストおよびアンタゴニストもしくはインヒビターは当該分野で一般的に知られた方法を用いて製造してよい。例えば、クローン化レセプターを哺乳動物細胞に発現させてよく、また、化合物の活性をスクリーニングすることができる。さらに、精製ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂを用いて抗体を産生するか、またはＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂと特異的に結合するものを同定するために医薬ライブラリーをスクリーニングしてよい。
【０１１４】
ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂに特異的な抗体を当該分野でよく知られた方法を用いて製造してよい。そのような抗体には、限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、１本鎖、Ｆａｂ断片、およびＦａｂ発現ライブラリーにより生じた断片が含まれよう。中和抗体（すなわち二量体形成を阻害するもの）は治療的用途に特に好ましい。
【０１１５】
抗体を製造するには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトその他を含む種々の宿主を、免疫原特性を有するＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂのあらゆる断片もしくはオリゴペプチドを注射することにより免疫してよい。宿主種に応じて、免疫応答を増大させるのに種々のアジュバントを用いてよい。そのようなアジュバントには、限定されるものでないが、ＲｉｂｉアジュバントＲ７００ （Ｒｉｂｉ， Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｍｏｎｔａｎａ）、Ｆｒｅｕｎｄ不完全アジュバント、鉱物ゲル、例えば水酸化アルミニウム、および界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールが含まれる。ヒトに用いるアジュバントでは、ＢＣＧ（ウシ型弱毒結核菌ワクチン）、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍｎが特に好ましい。
【０１１６】
ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂに対する抗体を誘導するのに用いるペプチド、断片もしくはオリゴペプチドは、少なくとも５アミノ酸、より好ましくは少なくとも１０アミノ酸からなるアミノ酸配列を有することが好ましい。それらが天然タンパク質のアミノ酸配列の部分と同一であることも好ましく、それらは小天然分子の全アミノ酸配列を含んでいてよい。ペプチド、断片もしくはオリゴペプチドは、単一エピトープもしくは抗原決定基、または複数のエピトープを含んでいてよい。ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂアミノ酸の短いストレッチを、別のタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニンのそれ、およびキメラ分子に対する抗体と融合させてよい。
【０１１７】
ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂに対するモノクローナル抗体は、培養中の連続細胞系により抗体分子を製造するためのあらゆる技術を用いて製造してよい。これらには、限定されるものではないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ．ら、（１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５−４９７； Ｋｏｚｂｏｒ， Ｄ．ら、（１９８５） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１： ３１−４２； Ｃｏｔｅ， Ｒ． Ｊ．ら、（１９８３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８０： ２０２６−２０３０； Ｃｏｌｅ， Ｓ． Ｐ．ら、（ｌ９８４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６２： １０９−１２０）が含まれる。
【０１１８】
さらに、「キメラ抗体」を製造するために開発された技術、適切な抗原特異性および生物活性を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのスプライシングを用いることができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ． Ｌ．ら、（１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１： ６８５１−６８５５； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｍ． Ｓ．ら、（１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１２： ６０４−６０８； Ｔａｋｅｄａ， Ｓ．ら、（１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１４： ４５２−４５４）。あるいはまた、１本鎖抗体を製造するために記載された技術を当該分野で知られた方法を用いて適応させ、ＩＭＲＲＰ１またはＩＭＲＲＰ１ｂ特異的１本鎖抗体を製造してよい。関連する特異性を有するが異なるイディオタイプ組成を有する抗体を、ランダムコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーからチェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）により製造してよい（Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ． Ｒ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８８： １１１２０−３）。
【０１１９】
抗体は、リンパ球ポピュレーションにおいてｉｎ ｖｉｖｏ産生を誘導するか、または組換え免疫グロブリンライブラリーもしくは文献（Ｏｒｌａｎｄｉ， Ｒ．ら、（１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８６： ３８３３−３８３７； Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ．ら、（１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３４９： ２９３−２９９）に記載の高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることにより製造してもよい。
【０１２０】
ＩＭＲＲＰ１またはＩＭＲＲＰ１ｂに対する特異的結合部位を含む抗体断片を製造してもよい。例えば、そのような断片には、限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化により製造することができるＦ（ａｂ’）２断片、およびＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することにより製造することができるＦａｂ断片が含まれる。あるいはまた、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片を速やかかつ簡単に同定することができるＦａｂ発現ライブラリーを構築してよい（Ｈｕｓｅ， Ｗ． Ｄ．ら、（１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４．１２７５−１２８１）。
【０１２１】
種々のイムノアッセイを所望の特異性を有する抗体を同定するスクリーニングに用いてよい。確立された特異性を有するポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を用いる競合バインディングアッセイもしくは免疫放射定量測定法のための多くのプロトコールが当該分野でよく知られている。そのようなイムノアッセイには、典型的にはＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂとその特異抗体との間の複合体形成の測定が含まれる。モノクローナル抗体を利用する２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが好ましいが、競合バインディングアッセイも用いてよい（Ｍａｄｄｏｘ、上記）。
【０１２２】
本発明の別の態様において、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするポリヌクレオチドもしくはその断片またはアンチセンス分子を治療目的に用いてよい。 ある局面において、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンスを、ｍＲＮＡの転写をブロックすることが望ましい状況において用いてよい。特に、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列で形質転換してよい。すなわち、アンチセンス分子を用いてＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂ活性を調節するか、または遺伝子機能の調節を達成してよい。そのような技術は当該分野でよく知られており、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする配列のコーディング領域または制御領域に沿った種々の配置からセンスまたはアンチセンスオリゴマーもしくはより大きい断片を設計することができる。
【０１２３】
レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスもしくはワクシニアウイルス由来、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、標的とする臓器、組織もしくは細胞ポピュレーションにヌクレオチド配列を供給することができる。当業者によく知られた方法を用いて、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする遺伝子のポリヌクレオチドと相補的なアンチセンス分子を発現する組換えベクターを構築することができる。この技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）およびＡｕｓｕｂｅｌら（上記）の両方に記載されている。
【０１２４】
ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするポリヌクレオチドまたはその断片を高レベルに発現する発現ベクターを用いて細胞または組織を形質転換することによりＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする遺伝子を産生することができる。そのような構築物を用いて翻訳不能なセンスもしくはアンチセンス配列を細胞内に導入してよい。該ＤＮＡ中に統合されていなくても、そのようなベクターは内因性ヌクレアーゼにより無力になるまでＲＮＡ分子を転写し続けることができよう。一時的発現は非複製ベクターを用いて１月間またはそれ以上持続し、適切な複製エレメントがベクター系の部分である場合はそれより長いことがある。
【０１２５】
上記のように、遺伝子発現の修飾は、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする遺伝子の制御領域、すなわち、プロモーター、エンハンサー、およびイントロンに対するアンチセンス分子、ＤＮＡ、ＲＮＡもしくはＰＮＡを設計することにより得ることができる。例えば出発部位から−１０位と＋１０位の間の転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、「三重ラセン」塩基ペアリング方法論を用いて阻害を達成することができる。三重ラセンペアリングは、ポリメラーゼ、転写因子、もしくは調節分子を結合するように十分開く二重ラセンの能力を阻害するので有用である。三本鎖ＤＮＡを用いる最近の治療的利点は文献 （Ｇｅｅ， Ｊ． Ｅ．ら（１９９４）、Ｈｕｂｅｒ， Ｂ． Ｅ．およびＢ． Ｌ． Ｃａｒｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ， Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｍｔ． Ｋｉｓｃｏ， Ｎ． Ｙ）中）に記載されている。転写物がリボソームに結合するのを抑制することによりｍＲＮＡの翻訳をブロックするようにアンチセンス分子を設計してもよい。
【０１２６】
酵素的ＲＮＡ分子であるリボザイムはを用いて、ＲＮＡの特異的開裂を触媒してもよい。リボザイム作用のメカニズムには、リボザイム分子の相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション、次いで内ヌクレオチド結合分解性（エンドヌクレオリティックな）開裂が含まれる。用いることができる例には、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする配列の内ヌクレオチド結合分解性開裂を特異的および効率的に触媒することができる操作されたハンマーヘッドモチーフリボザイムが含まれる。
【０１２７】
あらゆる潜在的ＲＮＡ標的内の特定のリボザイム開裂部位を、以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣを含むリボザイム開裂部位の標的分子をスキャンニングすることにより最初に確認する。確認したら、開裂部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短ＲＮＡ配列を、該オリゴヌクレオチドを操作不能にする二次的な構造的特徴について評価してよい。リボヌクレアーゼプロテクションアッセイを用い、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのし易さを試験することにより候補標的の適切さを評価してもよい。
【０１２８】
本発明のアンチセンス分子およびリボザイムは、核酸分子を合成するための当該分野で知られたあらゆる方法により製造してよい。これには、オリゴヌクレオチドを化学的に合成するための技術、例えば固相ホスホラミダイト化学合成が含まれる。あるいはまた、ＲＮＡ分子をＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ転写により生成してよい。そのようなＤＮＡ配列を、適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーター、例えばＴ７またはＳＰ６を有する種々のベクターに組み込んでよい。あるいはまた、アンチセンスＲＮＡを合成するこれらｃＤＮＡ構築物を、細胞株、細胞もしくは組織に構成的にまたは誘導可能なように導入することができる。
【０１２９】
ＲＮＡ分子を修飾し、細胞内安定性および半減期を増大してよい。可能な修飾には、限定されるものではないが、該分子のバックボーン内にホスホジエステラーゼ結合よりホスホロチオエートまたは２’ Ｏ−メチルを使用するか、または分子の５’および／または３’末端へのフランキング配列の付加が含まれる。この概念はＰＮＡの生成に固有であり、非伝統的塩基、例えばイノシン、クエオシンおよびウィブトシン、ならびに内因性エンドヌクレアーゼにより容易に認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−形および同様な修飾形を含むことによりこれら分子すべてに広げることができる。
【０１３０】
ベクターを細胞もしくは組織に導入するための多くの方法が利用可能であり、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、およびｅｘ ｖｉｖｏ（生体外）での使用に同様に適している。ｅｘ ｖｉｖｏ療法では、米国特許５，３９９，４９３および５，４３７，９９４に記載のごとく、ベクターを患者から得た幹細胞に導入し、クローン的に増殖させ同じ患者に自家移植してよい。当該分野でよく知られた方法を用いてトランスフェクションおよびリポソーム注射による供給を達成してよい。
【０１３１】
上記のあらゆる治療的方法を、そのような療法が必要なあらゆる対象、例えば、哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、乳牛、ウマ、ウサギ、サル、および最も好ましくはヒトに適用することができよう。
【０１３２】
本発明のさらなる態様は、上記のあらゆる治療効果を得るため、医薬組成物を医薬的に許容される担体とともに投与することに関する。そのような医薬組成物は、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂ、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂに対する抗体、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂの擬似物（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）、アゴニスト、アンタゴニストもしくはインヒビターからなってよい。該組成物は、単独または少なくとも１つの他の物質、例えば安定化化合物と共に投与してよく、また、これは、限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、および水を含むあらゆる無菌の生体適合性医薬的担体を用いて投与してよい。該組成物は、単独または他の物質、薬剤、ホルモンもしくは生物学的応答修飾物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）と組み合わせて投与してよい。
【０１３３】
本発明に利用する医薬組成物は、限定されるものではないが経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻内、腸内、局所、舌下、もしくは直腸手段を含むあらゆる経路により投与してよい。
【０１３４】
活性成分に加えて、これら医薬組成物は、医薬的に用いることができる製剤への活性化合物の加工を促がす賦形剤および補助剤を含む適切な医薬的に許容される担体を含んでいてよい。製剤化および投与技術に関するさらなる詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．）に記載されている。
【０１３５】
経口投与用の医薬組成物は、当該分野でよく知られた医薬的に許容される担体を用い、経口投与に適した用量に製剤化することができる。そのような担体は、医薬組成物を患者が摂取するための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、溶液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、サスペンジョン剤などとして製剤化できるようにする。
【０１３６】
経口使用のための医薬製剤は、活性化合物を固体賦形剤と混合し、所望により得られた混合物を粉砕し、所望により適切な補助剤を加えた後、顆粒混合物に加工し、錠剤または糖衣錠のコアを得ることにより得ることができよう。適切な賦形剤には、炭水化物またはタンパク質充填剤、例えば乳糖、ショ糖、マンニトールもしくはソルビトールを含む糖；トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモもしくは他の植物由来のデンプン；セルロース、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースもしくはナトリウムカルボキシメチルセルロース；アラビアゴムおよびトラガカントを含むゴム；およびタンパク質、例えばゼラチンおよびコラーゲンがある。所望により、崩壊剤もしくは可溶化剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、もしくはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを加えてよい。
【０１３７】
糖衣錠のコアは、適切なコーティング剤、例えば濃縮糖溶液とともに用いてよく、コーティング剤はアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒、もしくは溶媒混合物を含んでいてもよい。製品を識別し、または活性化合物の量、すなわち用量を特徴付けるため、錠剤または糖衣錠コーティングに染料もしくは色素を用いてよい。
【０１３８】
経口的に用いることができる医薬製剤には、ゼラチン製プッシュフィットカプセル剤、およびゼラチン製鞘状（ｓｃａｌｅｄ）軟カプセル剤、およびコーティング剤、例えばグリセロールもしくはソルビトールが含まれる。プッシュフィットカプセル剤は、充填剤または結合剤、例えば乳糖もしくはデンプン、潤滑剤、例えばタルクもしくはステアリン酸マグネシウム、および所望により安定化剤と混合した活性成分を含むことができる。軟カプセルでは、活性化合物を、安定化剤を含むかまたは含まない適切な液体、例えば脂肪油、液体もしくは液体ポリエチレングリコールに溶解または懸濁してよい。
【０１３９】
非経口投与に適した医薬製剤は、水性溶液剤、好ましくは生物学的に適合性の緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液、もしくは生理学的緩衝生理食塩水を用いて製剤化してよい。水性注射用サスペンジョン剤はサスペンジョンの粘性を増大させる基質、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストランを含んでいてよい。さらに、活性化合物のサスペンジョン剤は、適切な油状注射用サスペンジョン剤として製造してよい。適切な脂肪親和性溶媒もしくはビークルには脂肪油、例えばごま油、または合成脂肪酸エステル、例えばエチルオレエートもしくはトリグリセリド、またはリポソームが含まれる。所望により、該サスペンジョン剤は、高濃縮溶液剤を製造することができるように適切な安定化剤、もしくは該化合物の溶解性を増す薬剤を含んでいてもよい。
【０１４０】
局所または鼻内投与用の製剤には、特定のバリアーに浸透性にするのに適した浸透剤を用いる。そのような浸透剤は当該分野で一般に知られている。
【０１４１】
本発明の医薬組成物は、当該分野で知られているようにして、例えば通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠作製、糊状化（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、封入、エントラッピング、または凍結乾燥処理により製造してよい。
【０１４２】
医薬的組成物は塩として提供してよく、限定されるものではないが塩化水素酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、琥珀酸などを含む多くの酸を用いて形成することができる。塩は、対応する遊離塩基形より水性または他のプロトン性溶媒により可溶性の傾向がある。別の場合において、好ましい製剤は、以下のものすべてもしくはいくつかを含む凍結乾燥粉末であってよい：１−５０ｍＭヒスチジン、０．１％−２％ショ糖、および２−７％マンニトール（ｐＨの範囲４．５〜５．５、使用前に緩衝液と混合する）。
【０１４３】
医薬組成物を製造した後、それを適切な容器に入れ、示した条件で治療するためのラベルを貼ることができる。ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂを投与するには、そのようなラベルには投与する量、頻度、および方法が含まれよう。
【０１４４】
本発明で用いるのに適した医薬組成物には、活性成分が意図する目的を達成するのに有効な量で含まれる組成物が含まれる。有効量の決定は十分当業者の能力内である。
【０１４５】
あらゆる組成物について、医薬的に有効な用量を、例えば新生物細胞の細胞培養アッセイ、または動物モデル、通常マウス、ウサギ、イヌもしくはブタを用いて最初に見積もることができる。動物モデルを用いて適切な濃度範囲と投与経路を決定することもできよう。次に、そのような情報を用いてヒトにおける有用な用量および投与経路を決定することができる。
【０１４６】
治療的有効用量とは、症状もしくは状態を改善する活性成分、例えば、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂまたはその断片、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂの抗体、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂのアゴニスト、アンタゴニストもしくはインヒビターの量をいう。治療効率および毒性は細胞培養や実験動物を用いる標準的医薬的方法、例えばＥＤ５０ （その集団の５０％に治療的に有効な量）およびＬＤ５０ （その集団の５０％に対して致死的な用量）により決定することができよう。治療効果に対する毒性作用の用量比が治療指数であり、比、ＬＤ５０／ＥＤ５０で表すことができる。治療指数が大きい医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを用いてヒトに用いる用量範囲を決定する。そのような組成物に含まれる用量は、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内が好ましい。用量は用いる剤形、患者の感受性、および投与経路に応じてこの範囲内で変化する。
【０１４７】
実際の用量は、治療を要する対象に関連する因子に照らして医師が決定するであろう。用量および用法は、活性部分の十分なレベルをもたらすか、または所望の効果を維持するように調整される。考慮される因子には、疾患状態の重症度、対象の一般健康状態、対象の年齢、体重、および性別、食事、投与時間と頻度、薬剤の組み合わせ、反応感受性、および治療に対するトレランス／反応が含まれる。長時間作用型医薬組成物は、特定製剤の半減期とクリアランス速度に応じて、３〜４日間毎、１週間毎、または２週間に１度投与してよい。
【０１４８】
正常な用量は、投与経路に応じて０．１〜１００，０００μｇ（総用量は約１ｇまで）で変化してよい。特定の用量および送達方法に関する手引きは、文献に記載されており、一般的に当業者に利用可能である。ある態様において、約１ｎｇ／ｋｇ／日〜約１０ ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約５００ｕｇ／ｋｇ／日〜約５ｍｇ／ｋｇ／日のＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂまたはその断片の用量で生物学的効果が生じるものと予期される。当業者は、ヌクレオチドについてはタンパク質やそのインヒビターとは異なる製剤を用いるであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は特定の細胞、状態、位置などに特異的であろう。
【０１４９】
別の態様において、ＩＭＲＲＰ１またはＩＭＲＲＰ１ｂと特異的に結合する抗体を、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂの発現を特徴とする状態または疾患の診断、またはＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂ、アゴニスト、アンタゴニスト、またはインヒビターで治療している患者をモニターするためのアッセイに用いてよい。診断目的に有用な抗体は、治療薬に関する上記方法と同様にして製造してよい。ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂに関する診断的アッセイには、ヒトの体液または細胞もしくは組織の抽出物中のそれを検出するための抗体および標識を利用する方法が含まれる。該抗体は修飾するか、修飾しないで用いてよく、またそれをレポーター分子と共有結合的もしくは非共有結合的に結合することにより標識してよい。当該分野で知られた種々のレポーター分子を用いてよく、そのいくつかは先に記載している。
【０１５０】
ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂを測定するためのＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、およびＦＡＣＳを含む種々のプロトコールが当該分野で知られており、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂの発現レベル変化や異常を診断するための方法を提供する。ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂ発現の正常または標準値を、正常哺乳動物対象、好ましくはヒトから得た体液もしくは細胞抽出物をＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂに対する抗体と複合体形成に適した条件下で結合させることにより確定する。標準複合体形成量は、種々の方法、好ましくは光度測定手段により定量することができよう。生検組織から得た対象試料（コントロールおよび疾患）におけるＩＭＲＲＰ１またはＩＭＲＲＰ１ｂの発現量を標準値と比較する。標準値と対象値の偏差は疾患を診断するパラメータを確定する。
【０１５１】
本発明の別の態様において、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするポリヌクレオチドを診断目的に用いてよい。用いてよい該ポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子、ならびにＰＮＡが含まれる。該ポリヌクレオチドを用いて生検試料中のＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂの発現が疾患と相関する遺伝子の発現を検出および定量することができよう。診断的アッセイを用いて、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂの欠損、存在、および過剰発現を区別し、治療的介入時のＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂレベルの調節をモニターしてよい。
【０１５２】
ある局面において、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂもしくは密接な関連分子をコードするゲノム配列を含むポリヌクレオチド配列を検出することができるＰＣＲプローブとのハイブリダイゼーションを用いてＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする核酸配列を同定することができよう。プローブが高度に特異的な領域、例えば、５’調節領域中の１０個のユニークなヌクレオチドから作製されたか、またはあまり特異的でない領域、例えば特に３’コーディング領域から作製されたかに関わらず、該プローブの特異性およびハイブリダイゼーションまたは増幅 （最大、高、中程度、または低）のストリンジェンシーが、該プローブがＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする天然配列、アレル、もしくは関連配列のみを同定する否かを決定するであろう。
【０１５３】
プローブを関連配列の検出に用いてもよく、あらゆるＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂコーディング配列由来のヌクレオチドの少なくとも５０％を含むことが好ましい。本発明のハイブリダイゼーションプローブはＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、配列番号１または２のヌクレオチド配列由来、または天然ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂ遺伝子のプロモーター、エンハンサーエレメント、およびイントロンを含むゲノム配列由来であってもよい。
【０１５４】
ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするＤＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションプローブを製造する方法には、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂまたは誘導体をコードする核酸配列をｍＲＮＡプローブを製造するためのベクターにクローンすることが含まれる。そのようなベクターは当該分野で知られ、市販されており、これを用いて適切なＲＮＡポリメラーゼおよび適切な標識ヌクレオチドを加えることによりｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成してもよい。ハイブリダイゼーションプローブを種々のレポーター基、例えば、放射性核種、例えば３２Ｐもしくは３５Ｓ、または酵素標識、例えばアビジン／ビオチンカップリング系を介してプローブとカップリングしたアルカリホスファターゼなどで標識してよい。
【０１５５】
ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするポリヌクレオチド配列を、ＩＭＲＲＰ１およびＩＭＲＲＰ１ｂの発現と関連する障害を診断するのに用いてよい。そのような障害または状態の例には、血圧、高血圧、摂食行動の誘導、青斑ニューロン発射の刺激、およびインスリン放出の刺激の調節、ならびにα２アドレナリンレセプター作用に非依存性のグリア繊維酸性タンパク質の発現の誘導異常、不快性月経前症候群、神経変性障害、例えばアルツハイマー病、オピエート依存症、モノアミン代謝回転、および痛覚、加齢、憂鬱および卒中、唾液障害、および発育障害が含まれる。ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするポリヌクレオチド配列を、サザンもしくはノーザン分析、ドットブロット、または他の膜ベースの技術、ＰＣＲ技術、または患者の生検から得た液体もしくは組織を利用するディップスティック、ピン、ＥＬＩＳＡ、もしくはチップアッセイに用い、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂ発現の変化を検出することができよう。そのような定性法または定量法は当該分野でよく知られている。
【０１５６】
ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするヌクレオチド配列を標準的方法により標識し、ハイブリダイゼーションコンプレックスを形成するのに適した条件下で患者から得た液体もしくは組織試料に加えてよい。適切なインキュベーション時間後、試料を洗浄し、信号を定量し、標準値と比較する。生検または抽出試料中の信号の量が同等のコントロール試料のそれと有意に異なる場合は、該ヌクレオチド配列は試料中のヌクレオチド配列とハイブリダイズし、試料中のＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするヌクレオチド配列のレベル変化の存在は、関連疾患の存在を示す。そのようなアッセイを用いて動物試験、臨床試験、または個々の患者の治療のモニターにおける特定の治療的処置管理の効果を評価することもできよう。
【０１５７】
ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂの発現に関連する疾患の診断基準を得るために、正常もしくは標準的発現プロフィールを確立する。これは動物またはヒトの正常対象から得た体液もしくは細胞抽出物を、ハイブリダイゼーションもしくは増幅に適した条件下で、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする配列またはその断片と混合することにより達成することができよう。正常対象から得た値を既知量の実質的に純粋なポリヌクレオチドを用いる実験から得られる値と比較することにより標準的ハイブリダイゼーションを定量してよい。正常試料から得られる標準値を、疾患の状状がある患者由来の試料から得られる値と比較してよい。標準値と対象の値の偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０１５８】
疾患が確定され、治療プロトコールが開始したら、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に反復し、患者中の発現レベルが正常患者で観察されるものに近づき始めるかどうかを評価する。一連のアッセイから得た結果を用いて数日間〜数ヶ月間の範囲の期間にわたる治療効果を示すことができよう。
【０１５９】
ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする配列から設計したオリゴヌクレオチドのためのさらなる診断的用途にはＰＣＲの使用が含まれてよい。そのようなオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素的に作製するか、または組換え供給源から生成してよい。オリゴマーは、１つはセンス方向（５’＞３’）で、もう１つがアンチセンス（３’＞５’）である２つのヌクレオチド配列からなり、特定の遺伝子または状態を同定するための最適条件下で用いることが好ましいであろう。該２つのオリゴマー、ネスト化オリゴマーセット、またはオリゴマーの縮重プールを低ストリンジェント条件下で用い、密接に関連したＤＮＡもしくはＲＮＡ配列を検出および／または定量してよい。
【０１６０】
ＩＭＲＲＰ１またはＩＭＲＲＰ１ｂの発現を定量するのに用いることができる方法には、ヌクレオチドの放射性標識もしくはビオチン化、コントロール核酸の共増幅、および実験結果を挿入する標準曲線が含まれる（Ｍｅｌｂｙ， Ｐ． Ｃ．ら、（１９９３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １５９： ２３５−２４４ ； Ｄｕｐｌａａ， Ｃ．ら、（１９９３） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２９−２３６）。目的とするオリゴマーが種々の希釈で存在し、分光光度法もしくは比色法的反応により急速に定量できるＥＬＩＳＡ形式でアッセイすることにより複数の試料の定量速度を加速することができよう。
【０１６１】
本発明の別の態様において、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする核酸配列を用い、天然ゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することもできよう。該配列をよく知られた技術を用いて特定の染色体もしくは該染色体の特定領域にマッピングしてよい。そのような技術には、Ｐｒｉｃｅ， Ｃ． Ｍ． （１９９３） Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ． ７： １２７−１３４、およびＴｒａｓｋ， Ｂ． Ｊ． （１９９１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ７： １４９−１５４に記載の、ＦＩＳＨ、ＦＡＣＳ、または人工的染色体構築、例えば酵母人工染色体、細菌人工染色体、細菌Ｐ１構築物、または単染色体ｃＤＮＡ ライブラリーが含まれる。
【０１６２】
ＦＩＳＨ （Ｖｅｒｍａら、（１９８８） Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ． Ｙ、に記載）を他の物理的染色体マッピング技術や遺伝子マップデータと関連づけてよい。遺伝子マップデータの例は、１９９４ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ （２６５： １９８１ｆ）にみることができる。物理的染色体マップ上のＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする遺伝子の位置と特定疾患もしくは特定疾患の素因との相関は、該遺伝子病と関連するＤＮＡの領域の範囲を定める助けとなろう。本発明のヌクレオチド配列を用いて正常、キャリアー、または罹患個体間の遺伝子配列の差を検出することができよう。
【０１６３】
染色体調製物のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、および物理的マッピング技術、例えば確立された染色体マーカーを用いるリンケージ分析を用いて遺伝子マップを広げることができよう。しばしば、別の哺乳動物種、例えばマウスの染色体上に遺伝子を配置することにより、特定のヒト染色体の番号や腕が分かっていなくても関連マーカーを証明することができよう。物理的マッピングにより新しい配列を染色体腕またはその部分に割り当てることができる。これは、位置的クローニングまたは他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を捜す研究者に価値のある情報を提供する。特定のゲノム領域との遺伝的関連付けにより疾病または症候群の位置が大まかに付きとめられたら（例えば、ＡＴは１１ｑ２２−２３ （Ｇａｔｔｉ， Ｒ． Ａ．ら、（１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３６： ５７７−５８０））、その領域に対するあらゆる配列マッピングはさらに研究するための関連もしくは調節遺伝子を示すことができよう。本発明のヌクレオチド配列を用い、正常、キャリアーもしくは罹患個体における転座、逆位などによる染色体位置の違いを検出することもできよう。
【０１６４】
本発明の別の態様において、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂ、その触媒的もしくは免疫原性断片、またはオリゴヌクレオチドを用い、あらゆる種々の薬剤スクリーニング技術を用いて化合物のライブラリーをスクリーニングすることができる。そのようなスクリーニングに用いる断片は、溶液中で遊離し、固体支持体に貼りつき、細胞表面上に保持され、または細胞内に局在していてよい。ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂと被検物質の間の結合複合体形成を測定してよい。
【０１６５】
用いることができる別の薬剤スクリーニング技術は、ＰＣＴ公開公報 Ｗ０８４／０３５６４に記載のごとく、目的とするタンパク質に対する適切な結合親和性を有する化合物の高処理能力のスクリーニング法を提供する。この方法において、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂに適用するように、多数の異なる小被検化合物を固体基質、例えばプラスチックピン、またはある他の表面上で合成する。被検化合物をＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂまたはその断片と接触させ、洗浄する。次に、結合ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂを当該分野でよく知られた方法により検出する。精製ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂも上記薬剤スクリーニング技術に用いるためにプレート上に直接コートすることもできる。あるいはまた、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定することができる。
【０１６６】
別の態様において、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂと結合することができる中和抗体をＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂと結合する被検化合物と特異的に競合させる競合薬剤スクリーニングアッセイを用いてよい。このようにして、抗体を用いてＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂと１またはそれ以上の抗原決定基を共有するあらゆるペプチドの存在を検出することができる。
【０１６７】
さらなる態様において、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするヌクレオチド配列を現在開発すべきあらゆる分子生物学的技術に用いてよいが、ただし、該新規技術は、限定されるものではないがトリプレット遺伝子コードおよび特定の塩基対相互作用といった特徴を含む現在知られているヌクレオチド配列の特性に依存している。
【０１６８】
以下の実施例を本発明を説明するために提供するが、これらには本発明を限定する目的はない。本明細書に示すすべての刊行物および特許は本明細書の一部を構成する。説明した本発明の方法および系の種々の修飾および変動は、本発明の範囲と精神を離れることなく当業者に明らかであろう。本発明を特定の好ましい態様について説明してきたが、クレームした本発明がそのような特定の態様に不当に限定されるべきでないことを理解すべきである。実際に、分子生物学や関連分野において当業者に明らかな本発明の説明した実施方法の種々の修飾は特許請求の範囲の範囲内にあるものとする。
【０１６９】
（実施例）
実施例Ｉ
ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードするｃＤＮＡの単離方法
【０１７０】
ヒトイミダゾリンレセプタータンパク質配列をプローブに用いてＩｎｃｙｔｅおよび公共ドメインＥＳＴデータベースを検索した。用いた検索プログラムはギャップドＢＬＡＳＴ （Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）であった。ＢＬＡＳＴの結果から上位のＥＳＴヒットを非冗長タンパク質および特許配列データベースに対して検索し直した。この分析から、可能性がある新規イミダゾリンレセプターをコードするＥＳＴを配列ホモロジーに基づいて同定した。Ｉｎｃｙｔｅ ＥＳＴ （クローンＩＤ： ２４９９８７０）を次の分析のための可能性がある新規イミダゾリンレセプター候補に選んだ。
【０１７１】
Ｉｎｃｙｔｅクローン２４９９８７０のＤＮＡ配列から設計したＰＣＲプライマー対を用いて、増幅断片のアンチセンス鎖の５’末端がビオチン化したクローン由来のＤＮＡ片を増幅した。２本鎖ＤＮＡのこのビオチン化片を変性し、センス鎖に対応するＤＮＡを含む共有結合的に閉じた１本鎖環状ｃＤＮＡライブラリーの混合物とインキュベーションした。ｃＤＮＡライブラリーは、Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得た完全な脳組織ライブラリーであった。ビオチン化ＤＮＡと環状ｃＤＮＡのハイブリッドをストレプトアビジン磁石ビーズ上に捕捉した。ビオチン化ＤＮＡからｃＤＮＡを熱放出させ、ｃＤＮＡクローニングベクター上の配列とホモローガスなプライマーを用いて１本鎖ｃＤＮＡを２本鎖に変換した。エレクトロポーレーションにより２本鎖ｃＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉに導入し、得られたコロニーを最初のプライマー対を用いてＰＣＲによりスクリーニングし、適切なｃＤＮＡクローンを同定した。ＦＬ１−１８と名づけた１クローンを両鎖上にシーケンスした（図１）。
【０１７２】
実施例ＩＩ
ＩＭＲＲＰ１の細胞および組織分布
【０１７３】
イミダゾリンレセプターＩＭＲＲＰ１のクローニングに用いた同じＰＣＲプライマーを用いて、定量的ＰＣＲによりｍＲＮＡの定常期レベルを測定した。簡単には、第１鎖ｃＤＮＡを市販のｍＲＮＡから作製した。すべての組織中の等量に発現した遺伝子、シクロフィリンのプライマー対を用いる並行実験を行うことにより各アッセイに用いるｃＤＮＡの相対量を決定した。シクロフィリンプライマー対の各試料中のｃＤＮＡ量の小変動を検出し、これらデータを用いてＩＭＲＲＰ１のプライマー対を用いて得られたデータを正規化した。ＰＣＲデータを試験した組織間の転写存在量の差の相対評価に変換し、該データを図９に示す。
【０１７４】
実施例ＩＩＩ
ハイブリダイゼーションプローブの標識および使用
【０１７５】
配列番号１または２から得たハイブリダイゼーションプローブを用いてｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはｍＲＮＡをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識が具体的に記載されているが、本質的に同じ方法をより大きなｃＤＮＡ断片で使用する。最新のソフトウェア、例えばＯＬＩＧＯ ４．０６ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてオリゴヌクレオチドを設計し、５０ｐｍｏｌの各オリゴマーと２５０μＣｉの［γ−３２Ｐ］アデノシン三リン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ， Ｂｏｓｔｏｎ， Ｍａｓｓ．）を混合することにより標識する。ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−２５スーパーファイン樹脂カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ）を用いて標識オリゴヌクレオチドを実質的に精製する。約１０７カウント／分の各センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む部分を、以下のエンドヌクレアーゼ（Ａｓｅ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｘｂａ １、またはＰｖｕ ＩＩ： ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ）で消化したヒトゲノムＤＮＡの典型的膜ベースのハイブリダイゼーション分析に用いる。
【０１７６】
各消化物由来のＤＮＡを０．７％アガロースゲルで分画し、ナイロン膜に移す（Ｎｙｔｒａｎ Ｐｌｕｓ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄｕｒｈａｍ、Ｎ． Ｈ．）。４０℃で１６時間、ハイブリダイゼーションを行う。非特異的信号を除くため、ブロットを室温で、０．１ ｘ 生理食塩水 クエン酸ナトリウムおよび０．５％ドデシル硫酸ナトリウムまでの増加するストリンジェント条件下で順次洗浄する。ＸＯＭＡＴＡＲフィルム（Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、Ｎ． Ｙ．）を、Ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒカセット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆ．）中のブロットに数時間暴露し、ハイブリダイゼーションパターンを視覚的に比較する。
【０１７７】
実施例ＩＶ
アンチセンス分子
【０１７８】
ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする配列またはそのあらゆる部分と相補的なアンチセンス分子または核酸配列を用いて天然ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂのｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでの発現を阻害する。約２０塩基対を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を具体的に説明したが、実質的に同じ方法をより大きいｃＤＮＡ断片に用いる。図１および２に示すＩＬ−１７Ｒのコーディング配列に基づくオリゴヌクレオチドを用いて天然ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂの発現を阻害する。相補的オリゴヌクレオチドを図１または２に示すユニークな５’配列から設計し、これを用いてプロモータの上流非翻訳配列への結合を防ぐことにより転写を阻害するか、またはリボソームが結合するのを防ぐことによりＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂをコードする転写物の翻訳を阻害する。配列番号１または２の５’配列およびシグナル配列の適切な部分を用いる有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドには、図１および２に示すポリペプチドの５’コーディング配列またはシグナル配列になる領域にまたがるあらゆる１５−２０ヌクレオチドが含まれる。
【０１７９】
実施例Ｖ
ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂ特異抗体の製造
【０１８０】
ＰＡＧＥ電気泳動（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記）または他の精製技術を用いて実質的に精製されるＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂを用い、標準的プロトコールを用いてウサギを免疫し、抗体を産生する。ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）を用いて配列番号３または４由来のアミノ酸配列を分析して免疫原性が高い領域を決定し、対応するオリゴヌクレオチドを合成し、これを用いて当業者に知られた方法により抗体を上昇させる。適切なエピトープ、例えばＣ末端に近いかまたは親水性領域中のエピトープの選択は、Ａｕｓｕｂｅｌら（上記）およびその他が記載している。
【０１８１】
典型的には、オリゴペプチドは長さが１５残基であり、これをｆｍｏｃ化学を用い、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ Ｍｏｄｅｌ ４３１Ａを用いて合成し、次いでＮ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ； Ａｕｓｕｂｅｌら、上記）と反応させることによりキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｓｉ， Ｍｏ．）とカップリングさせる。フロインド完全アジュバント中のオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫する。得られる抗血清の抗ペプチド活性を、例えばウサギ抗血清を結合させ、洗浄し、放射性ヨウ化ヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させることにより試験する。
【０１８２】
実施例ＶＩ
特異抗体を用いる天然ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂの精製
【０１８３】
天然もしくは組換えＩＭＲＲＰ１またはＩＭＲＲＰ１ｂをＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂ特異抗体を用いるイムノアフィニティクロマトグラフィーにより実質的に精製する。イムノアフィニティカラムは、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂ特異抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂、例えばＣＮＲｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ）と共有結合によりカップリングさせることにより構築する。カップリング後、樹脂を製造業者の指示書に従ってブロックし、洗浄する。
【０１８４】
ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂを含む媒質をイムノアフィニティカラムに通し、カラムをＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂの選択的吸収を可能にする条件（例えば、界面活性剤存在下の高イオン強度緩衝液）下で洗浄する。カラムを、抗体とＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂの結合を妨げる条件（例えば、ｐＨ２−３の緩衝液、または高濃度のカオトロプ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）、例えば尿素もしくはチオシアネートイオン）下で溶出し、ＩＭＲＲＰ１またはＩＭＲＲＰ１ｂを回収する。
【０１８５】
実施例ＶＩＩ
ＩＭＲＲＰ１またはＩＭＲＲＰ ｌｂと相互作用する分子の同定
【０１８６】
ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂまたはその生物学的に活性な断片を１２５Ｉ Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬（Ｂｏｌｔｏｎら、（１９７３） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， １３３： ５２９）で標識する。あらかじめマルチウェルプレートのウェルに配置した候補分子を標識ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂとインキュベーションし、洗浄し、次いで標識ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂ複合体を含むあらゆるウェルをアッセイする。種々の濃度のＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂを用いて得られたデータを用い、ＩＭＲＲＰ１もしくはＩＭＲＲＰ１ｂと候補分子の親和性、結合、および数について値を計算する。
【０１８７】
実施例ＶＩＩＩ
ＩＭＭＲＰ１の発現プロファイル
【０１８８】
１２組織ＲＮＡ試料中の発現プロファイルを行い、身体中の全体的遺伝子発現パターンを示した。ＩＭＭＲＰ１ ｃＤＮＡクローンを同定するのに用いた下記にＩｎｃｙｔｅ−２４９９８７０で示す同じＰＣＲプライマー対を用い、定量的ＰＣＲによりｍＲＮＡの定常期レベルを測定した。
【０１８９】
ＩＮＣＹＴＥ−２４９９８７０−ｓ　 ＧＣＴＧＧＡＧＡＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＡ （配列番号５）
ＩＮＣＹＴＥ−２４９９８７０−ａｂ ｂＴＧＧＡＣＴＴＧＡＴＴＧＴＧＧＣＴＴＡＧＧＴＴ （配列番号６）
【０１９０】
第１鎖ｃＤＮＡを市販のｍＲＮＡ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、およびＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から作製し、ＰＥ ５７００機器 （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を用いるリアルタイム定量ＰＣＲにかけ、２本鎖に特異的なＤＮＡ結合色素であるＳＹＢＲグリーンの蛍光産生量により各サイクル中に増幅されたＤＮＡの量を検出した。融解温度を測定することにより存在する異なるＤＮＡ配列の数の目安を与える操作の終わりに熱変性プロファイルを行うことにより、その標的に対するプライマー対の特異性を立証する。ＦＧＦＲ１ΔＣＰプライマー対の場合は、均一な融点を有する１つのＤＮＡ断片のみを検出した。逆転写酵素を使用し、また使用しないで作製した第１鎖を用いてＰＣＲを行うことにより、組織発生量の評価に対する汚染ゲノムＤＮＡの寄与を制御する。すべての場合で、逆転写酵素による制御なしに増幅した物質の寄与はごくわずかであった。
【０１９１】
すべての組織に同量に発現した遺伝子、シクロフィリンのプライマー対を用いる並行実験を行うことにより、各チューブ中の用いたｃＤＮＡの量の小さな変動が測定された。これらデータを用いてＩＭＭＲＰ１プライマー対を用いて得られたデータを正規化した。ＰＣＲデータを、試験した組織における転写物発生量の差の相対評価に変換した。そのデータを図１０の棒グラフに示す。ＩＭＭＲＰ１に対応する転写物が試験したさらなるＲＮＡすべてにみいだされ、精巣で最も高い量がみられた（最初の試験パネルのものと同様）。唾液腺や胎児脳でも相対的に高い発現が観察された。
【０１９２】
必要な反応数および混合量を決定することにより定量的ＰＣＴを行った。すべての試料をトリプリケートで試験したので、各試料チューブには３．５反応分の混合物が必要である。これは下記式により決定された：２ｘ＃組織試料＋１無テンプレートコントロール＋１ピペッティングエラー用。
【０１９３】
反応混合物を下のごとく製造した。
2004512830.tif 000002
【０１９４】
混合物の部分標本１７１．５μＬを各試料チューブに加え、次いでｃＤＮＡ １μＬを加えた。各試料チューブを静かに混合し、遠沈した。部分標本３ ｘ ５０μＬを光学プレートに加え、分析した。
【０１９５】
参考文献
Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ．， Ｍａｄｄｅｎ， Ｔ． Ｌ．， Ｓｃｈａｆｆｅｒ， Ａ． Ａ．， Ｚｈａｎｇ， Ｊ．， Ｚｈａｎｇ， Ｚ．， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｗ．， およびＬｉｐｍａｎ， Ｄ． Ｌ． （１９９７）． Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ： ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ２５，３３８９−３４０２．
Ｅｓｃｒｉｂａ， Ｐ． Ｖ．， Ｏｚａｉｔａ， Ａ．， Ｍｉｒａｌｌｅｓ， Ａ．， Ｒｅｉｓ， Ｄ． Ｊ．， およびＧａｒｃｉａ−Ｓｅｖｉｌｌａ， Ｊ． Ａ． （１９９５）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ４５−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒａｔ ｂｒａｉｎ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｒａｉｎ． Ｒｅｓ． ３２，１８７−１９６．
Ｆａｒｓａｎｇ， Ｃ．， ａｎｄ Ｋａｐｏｃｓｉ， Ｊ． （１９９９）． Ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ： ｆｒｏｍ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｔｏ ａｎｔｉｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｙ （ｆａｃｔｓ ａｎｄ ｄｏｕｂｔｓ）． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｂｕｌｌ． ４９，３１７−３３１．
Ｇａｒｃｉａ−Ｓｅｖｉｌｌａ， Ｊ． Ａ．， Ｅｓｃｒｉｂａ， Ｐ． Ｖ．， ａｎｄ Ｇｕｉｍｏｎ， Ｊ． （１９９９）． Ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ． Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ２１，３９２−４０９．
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】クローンＮｏ． ＦＬ１−１８ （配列番号１）由来のポリヌクレオチド配列を示す。
【図１Ｂ】クローンＮｏ． ＦＬ１−１８ （配列番号１）由来のポリヌクレオチド配列を示す。
【図２Ａ】クローンＮｏ． ＦＬ１−１８スプライス変異体由来のポリヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【図２Ｂ】クローンＮｏ． ＦＬ１−１８スプライス変異体由来のポリヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【図２Ｃ】クローンＮｏ． ＦＬ１−１８スプライス変異体由来のポリヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【図３】ＩＭＲＲＰ１ （配列番号３）由来のポリペプチド配列を示す。
【図４】ＩＭＲＲＰ１ｂ （配列番号４） 由来のポリペプチド配列を示す。
【図５】ＩＭＲＲＰ１とヒトイミダゾリンレセプター受託番号ＮＰ ００９１１５の比較を示す。
【図６】ＦＬ１−１８とＩｎｃｙｔｅ ２４９９８７０との比較を示す。
【図７Ａ】ＦＬ１−１８スプライス変異体のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＣＧ９０４４、およびヒトイミダゾリンレセプター受託番号ＮＰ ００９１１５の比較を示す。
【図７Ｂ】ＦＬ１−１８スプライス変異体のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＣＧ９０４４、およびヒトイミダゾリンレセプター受託番号ＮＰ ００９１１５の比較を示す。
【図８Ａ】ＦＬ１−１８スプライス変異体、ＦＬ１−１８、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＣＧ９０４４、およびヒトイミダゾリンレセプター受託番号ＮＰ ００９１１５の比較を示す。
【図８Ｂ】ＦＬ１−１８スプライス変異体、ＦＬ１−１８、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＣＧ９０４４、およびヒトイミダゾリンレセプター受託番号ＮＰ ００９１１５の比較を示す。
【図８Ｃ】ＦＬ１−１８スプライス変異体、ＦＬ１−１８、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＣＧ９０４４、およびヒトイミダゾリンレセプター受託番号ＮＰ ００９１１５の比較を示す。
【図８Ｄ】ＦＬ１−１８スプライス変異体、ＦＬ１−１８、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＣＧ９０４４、およびヒトイミダゾリンレセプター受託番号ＮＰ ００９１１５の比較を示す。
【図９】ＩＭＲＲＰ１の発現プロフィールを示す。
【図１０】ＩＭＲＲＰ１の発現プロフィールを示す。
【図５】
2004512830.tif 000003
【図７Ａ】
2004512830.tif 000004
【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004512830.tif 000083
【国際調査報告】
2004512830.tif 000084
2004512830.tif 000085
2004512830.tif 000086