(57)【要約】組換えプロセスが提供され、それによって、さらなる遺伝子が、ＰＨＡを生成するように遺伝的に操作されたＥ．Ｃｏｌｉに導入され、その結果、改善された株は、ジオールからＰＨＡホモポリマーおよびコポリマーを直接生成する。好ましい実施形態において、４−ヒドロキシブチレートモノマーを含むＰＨＡが、１，４−ブタンジオールから直接生成され；５−ヒドロキシバレレートを含むＰＨＡが、１，５−ペンタンジオールから生成され；６−ヒドロキシヘキサノエート（６ＨＨ）を含むＰＨＡが、１，３−プロパンジオールから生成され；３−ヒドロキシプロピオネートを含むＰＨＡが、１，３−プロパンジオールから生成され；２−ヒドロキシプロピオネートを含むＰＨＡが、１，３−プロパンジオールから生成され；２−ヒドロキシプロピオネート（ラクテート）を含むＰＨＡが、１，２−プロパンジオール（プロピレングリコール）から生成される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヒドロキシアルカノエートを生成するための方法であって、該方法は、
ジオールオキシドレダクターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼおよびＰＨＡシンターゼからなる群より選択される酵素を発現する、遺伝的に操作された生物を提供する工程、
該生物によって発現される酵素によってヒドロキシアルカノエートモノマーに変換され得るジオールを提供する工程、および
該ヒドロキシアルカノエートモノマーが重合されてポリヒドロキシアルカノエートを形成する条件下で、該生物を培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記ジオールが、１，６−ヘキサジオールであり、かつ前記ヒドロキシアルカノエートモノマーが、６−ヒドロキシヘキサノエートである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ジオールが、１，５−ペンタンジオールであり、かつ前記ヒドロキシアルカノエートモノマーが、５−ヒドロキシバレレートである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ジオールが、１，４−ブタンジオールであり、かつ前記ヒドロキシアルカノエートモノマーが、４−ヒドロキシブチレートである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ジオールが、１，３−プロパンジオールであり、かつ前記ヒドロキシアルカノエートモノマーが、３−ヒドロキシプロピオネートである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ジオールが、１，２−エタンジオールであり、かつ前記ヒドロキシアルカノエートモノマーが、２−ヒドロキシエタノエートである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ジオールが、１，２−プロパンジオールであり、かつ前記ヒドロキシアルカノエートモノマーが、２−ヒドロキシプロピオネートである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法における使用のために、遺伝学的に操作された生物であって、ａｌｄＨ遺伝子およびｄｈａＴ遺伝子を発現する生物を含む、生物。
【請求項９】
前記生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ　ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｓｐｐ．、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｌａｔｕｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐｐ．およびＣｏｍａｍｏｎａｓ　ｓｐｐ．からなる群より選択される、請求項８に記載の生物。
【請求項１０】
ポリヒドロキシアルカノエートを作製するためのシステムであって、該システムは、ジオールオキシドレダクターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼおよびＰＨＡシンターゼからなる群より選択される酵素を発現するように遺伝的に操作された生物を含み、
ここで、該生物は、ジオールを、重合されてポリヒドロキシアルカノエートを形成するヒドロキシアルカノエートモノマーに変換し得る、システム。
【請求項１１】
ポリヒドロキシアルカノエートコポリマーを含む組成物であって、該組成物は、
２−ヒドロキシプロピオネートもしくは２−ヒドロキシエタノエートまたはこれら両方、ならびに
少なくとも３００，０００の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する、３−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシプロピオネート、２−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシバレレート、５−ヒドロキシバレレート、６−ヒドロキシヘキサノエート、および３−ヒドロキシヘキサノエートからなる群より選択される、少なくとも１つのコモノマーを含む、組成物。
【請求項１２】
前記コモノマーが、３−ヒドロキシブチレートである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記コモノマーが、４−ヒドロキシブチレートである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記コモノマーが、３−ヒドロキシプロピオネートである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記コモノマーが、２−ヒドロキシブチレートである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記コモノマーが、４−ヒドロキシバレレートである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記コモノマーが、５−ヒドロキシバレレートである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記コモノマーが、６−ヒドロキシヘキサノエートである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記コモノマーが、３−ヒドロキシヘキサノエートである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２０】
ジオールオキシドレダクターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼおよびＰＨＡシンターゼからなる群より選択される酵素を発現するように遺伝的に操作された生物体を用いて、ポリヒドロキシアルカノエートを作製するための生物学的システムを改善するための方法であって、該生物体は、ジオールを、重合されてポリヒドロキシアルカノエートを形成するヒドロキシアルカノエートモノマーに変換し得、該方法は、
ｉ）特定の宿主に変異を導入する工程、および
ｉｉ）選択されたジオールからＰＨＡを合成する増大した能力について、生成された変異体のプールをスクリーニングする工程、
によって酵素活性が増大された変異体について選択する工程を包含する、方法。
【請求項２１】
ジオールオキシドレダクターゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡフラグメントであって、発現された酵素が、ジオールから、３−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシプロピオネート、２−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシバレレート、５−ヒドロキシバレレート、６−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシヘキサノエート、２−ヒドロキシプロピオネートおよび２−ヒドロキシエタノエートからなる群より選択されるヒドロキシアルカノエートモノマーを生成し得る、ＤＮＡフラグメント。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
２０００年７月２１日出願の米国仮出願番号６０／２１９，９９５号に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、一般的には、細菌の遺伝子工学によるポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の生成の分野にある。
【０００３】
モノマー４−ヒドロキシブチレート（４ＨＢ）を含むＰＨＡポリマー（例えば、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ４ＨＢ））（Ｄｏｉ、１９９５、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．９８：５８５〜９９））の合成、または４−ヒドロキシバレレートと４−ヒドロキシヘキサノートとを含む、ＰＨＡポリエステルの合成が、例えば、Ｖａｌｅｎｔｉｎら、１９９２、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：５０７〜１４およびＶａｌｅｎｔｉｎら、１９９４、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：７１０〜１６に記載されている。例えば、ＰＨＢ４ＨＢの生成は、グルコースと４ＨＢとをか、またはグルコースと、４−ヒドロキシブチレートへと変換される基質とを、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ　ｅｕｔｒｏｐｈａへと（Ｋｕｎｉｏｋａら、１９８８、Ｐｏｌｙｍ．Ｃｏｍｍｕｎ，２９：１７４；Ｄｏｉら、１９９０、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．１２：１０６；Ｎａｋａｍｕｒａら、１９９２、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　２５：４２３）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｌａｔｕｓへと（Ｈｉｒａｍｉｔｓｕら、１９９３、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５：４６１）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ（Ｋｉｍｕｒａら、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１４：４４５）へと、およびＣｏｍａｍｏｎａｓ　ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓへと（ＳａｉｔｏおよびＤｏｉ、１９９４、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．１６：１８）供給することによって達成された。４ＨＢへと変換される基質としては、１，４−ブタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、１，８−オクタンジオール、１，１０−デカンジオール、１，１２−ドデカンジオールおよびγ−ブチロラクトンが挙げられる。これらのＰＨＢ４ＨＢコポリマーは、一定範囲のポリマー特性を提供する、一定範囲のモノマー組成物を用いて生成され得る。特に、４ＨＢの量が１５重量％を超えると、融解温度（Ｔｍ）が１３０℃未満に減少し、そして分解するまでの伸長（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｂｒｅａｋ）が、４００％を超える（Ｓａｉｔｏら、１９９６、Ｐｏｌｙｍ．Ｉｎｔ．３９：１６９）。
【０００４】
しかし、生物学的系によって、４ＨＢを含むＰＨＡを生成するための、より費用効果が高い方法を開発することが、非常に有利である。ＰＨＡの経済的な生成のために、いくつかの要因が、重要であり、その要因としては、基質の費用、発酵時間、および下流処理の効率が挙げられる。野生型ＰＨＡ生成細菌の一般的特徴は、その増殖速度が低いこと、それらの細菌を破壊することがしばしば困難であること、および遺伝子操作に対するそれらの細菌の利用し易さが制限されていることである。従って、ＰＨＡ生成の経済性を改善するトランスジェニック生物を開発することが、望ましい。
【０００５】
組換えＥ．ｃｏｌｉにおけるコポリマーＰＨＢ４ＨＢの生成が、記載されている（例えば、ＨｕｉｓｍａｎらによるＰＣＴ　ＷＯ　００／０１１１８８；ＨｅｉｎらによるＰＣＴ　ＷＯ　９８／３９４５３）。組換えＥ．ｃｏｌｉにおいて生成された、生物学的に生成された一定範囲の新規な４ＨＢポリマーが、ＳｋｒａｌｙおよびＰｅｏｐｌｅｓ（例えば、ＰＣＴ　ＷＯ　９９／６１６２４）によって記載されている。これらの研究において、参考文献Ｈｕｉｓｍａｎのみが、１，４−ブタンジオールからの小量の４ＨＢコモノマーの組み込みを示した。４ＨＢモノマーの供給源として１，４−ブタンジオールを使用して、一定範囲の４ＨＢコポリマーおよびポリ４ＨＢホモポリマーを生成することができる遺伝子操作された系を開発することが、非常に有利である。
【０００６】
従って、種々の単純な糖および単純なアルコールを基質として使用して、ＰＨＡ（例えば、４ＨＢモノマーを含むＰＨＡ）を生成するための改善された組換え系および方法を提供することが、本発明の１つの目的である。
【０００７】
（発明の要旨）
ＰＨＡを生成するように遺伝子操作されたＥ．ｃｏｌｉ中にさらなる遺伝子を導入して、その改良菌株が、ジオールから直接ＰＨＡホモポリマーおよびＰＨＡコポリマーを生成するようにする、組換えプロセスが、提供される。好ましい実施形態において、４−ヒドロキシブチレート（４ＨＢ）モノマーを含むＰＨＡが、１，４−ブタンジオールから直接生成され；５−ヒドロキシバレレート（６ＨＶ）を含むＰＨＡが、１，５−ペンタンジオールから生成され；６−ヒドロキシヘキサノエート（６ＨＨ）を含むＰＨＡが、１，６−ヘキサンジオールから生成され；３−ヒドロキシプロピオネート（３ＨＰ）を含むＰＨＡが、１，３−プロパンジオール（プロピレングリコールともいう）から生成され；２−ヒドロキシプロピオネート（２ＨＰ、ラクテート）を含むＰＨＡが、１，２−プロパンジオール（プロピレングリコール）から生成され；２−ヒドロキシエタノエート（２ＨＥ、グリコレート）を含むＰＨＡが、１，２−エタンジオール（エチレングリコール）から生成される。これらの同じ酵素活性をコードする遺伝子が野生型ＰＨＡ生成株に導入されるか、またはその遺伝子の発現が野生型ＰＨＡ生成株において増幅されて、ジオールおよび他のアルコール供給原料から直接ＰＨＡホモポリマーおよびＰＨＡコポリマーを生成することが、改善され得る。このＰＨＡポリマーは、容易に回収され、そしてポリマーとしてか、または一定範囲の化学物質中間体のための出発物質として、産業上有用である。
【０００８】
（発明の簡単な説明）
ＰＨＡを生成するように遺伝子操作された微生物中にさらなる遺伝子を導入して、その改良菌株が、単純なアルコール基質および単純な糖基質から直接、ＰＨＡホモポリマーおよびＰＨＡコポリマーを生成するようにする、プロセスが提供される。これらのプロセスは、生成生物として組換え細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）に、そしてＰＨＡ生成微生物（例えば、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ　ｅｕｔｒｏｐｈａまたはＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｌａｔｕｓ）由来のＰＨＡ生合成遺伝子に基づくが、今や、他の多くのＰＨＡ遺伝子供給源が公知である（ＭａｄｉｓｏｎおよびＨｕｉｓｍａｎ、１９９９、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．＆　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　６３：２１〜５３）。組換えＥ．ｃｏｌｉは、野生型ＰＨＡ生成生物を超える多くの利点を有し、その利点としては、遺伝子操作の容易さ、ゲノム配列を完全に利用できること、速い増殖速度、増殖基質の自由度および溶菌のし易さが、挙げられる。
【０００９】
（操作される生物）
１つの実施形態において、図１に示される経路全体についての遺伝子が、生成生物中に導入される。天然にてＰＨＡを生成しないすべての生物（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）が、使用され得る。多数の組換えＥ．ｃｏｌｉ　ＰＨＢ生成系が、記載されている（ＭａｄｉｓｏｎおよびＨｕｉｓｍａｎ、１９９９、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　＆　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　６３：２１〜５３）。ジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子およびアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、この宿主中に導入される。１，４−ブタンジオールの場合、そのジオールオキシドレダクターゼが、この基質を４−ヒドロキシブチルアルデヒドへと変換し、その後これが、アルデヒドデヒドロゲナーゼによって４−ヒドロキシブチレートへと変換される。１，３−プロパンジオールの場合、そのジオールオキシドレダクターゼが、この基質を３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドへと変換し、その後これが、アルデヒドデヒドロゲナーゼによって３−ヒドロキシプロピオネートへと変換される。他のジオールも、同様の様式で処理され得る。いくつかの場合において、そのジオール供給原料よりも炭素が２つ短いヒドロキシ酸をＰＨＡに組み込むことが、生じ得る。これは、脂肪酸異化のβ酸化経路と似た内因性異化に起因する。例えば、４ＨＢ単位、または４ＨＢ単位と６ＨＨ単位の両方が、１，６−ヘキサンジオールを供給した結果として、ポリマー中で生成され得る。必要に応じて、内因性アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは内因性アシル−ＣｏＡシンテターゼが、補酵素Ａによるヒドロキシ酸の活性化を促進するように含められ得る。その後、活性化したモノマーは、生成宿主中に存在する適切なＰＨＡシンターゼの作用によって、ＰＨＡ中に組み込まれ得る。この酵素活性は、１つ以上のモノマー型を含むポリマーの生成宿主における合成系を提供し、そのモノマー型は、ジオール供給原料に依存する。
【００１０】
しばしば、上記のようなモノマーと３ＨＢとを含む、コポリマーを合成することが、非常に有用である。この場合、その生成宿主は、β−ケトチオラーゼ遺伝子およびアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子もまた含み、これらの遺伝子の生成物は、アセチル−ＣｏＡを３ＨＢ−ＣｏＡへと変換する。アセチル−ＣｏＡは、ジオールに由来し得るし、または別の炭素供給源（例えば、糖）に由来し得る。３ＨＢ−ＣｏＡとヒドロキシアシル−ＣｏＡ（例えば、上記のもの）との両方が、種々のＰＨＡシンターゼ（例えば、その組換え宿主において発現されるもの）によって受容され得、従って、ＰＨＢのコポリマーが、その組換え宿主によって合成される。所望のＰＨＡ組成物が何であっても、そのジオールは、増殖の間にかまたは個々の増殖相の後のいずれかにて、単独にかまたは少なくとも１つの他の供給原料（例えば、糖）と組み合わせてかのいずれかで細胞に供給され得、そしてＰＨＡが、その細胞中に蓄積される。
【００１１】
別の実施形態において、図１に示される経路のうちの少なくとも一部を天然にて含む組換え生物が、使用され得る。この実施形態において、上記の活性（ジオールオキシドレダクターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアシル−ＣｏＡシンテターゼ、β−ケトチオラーゼ、ＰＨＡシンターゼ、およびアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ）のうちの１つ以上が、その宿主の内因性機構に由来し得る。例えば、ジオールオキシドレダクターゼとアルデヒドデヒドロゲナーゼのみが、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ（天然のＰＨＡ生成生物）において発現されて、そのＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａが１，４−ブタンジオールを４ＨＢへと変換する能力を増強し得、そしてこの宿主が、必要な代謝段階の残りを達成する天然の能力が、頼みにされ得る。天然の多くのＰＨＡ生成生物が、当業者に周知である（Ｂｒａｕｎｅｇｇら、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６５：１２７〜６１）。その宿主がＰＨＡを生成することができない場合、ＰＨＡシンターゼまたはＰＨＢ生合成経路全体と、必要に応じて外因性アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは外因性アシル−ＣｏＡシンテターゼとが導入され、この生物がＰＨＡ生成することができるようなり得る。これを行うための技術は、当該分野において周知である（例えば、Ｄｅｎｎｉｓら、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６４：１７７〜８６）。ここでまた、そのジオールは、増殖の間にかまたは個々の増殖相の後のいずれかに、単独でかまたは少なくとも１つの他の供給原料（例えば、糖）と組み合わせてかのいずれかで細胞に供給され得、そしてＰＨＡがその細胞中に蓄積される。
【００１２】
ジオール供給原料を用いるＰＨＡ生成を実施することは、本実施例において記載される細菌に限定されない。同じ遺伝子が、真核生物細胞（酵母細胞および培養植物細胞を含むが、これらに限定されない）中へと導入され得る。
【００１３】
（基質の利用のための遺伝子）
本明細書中に記載の使用に適切な組換えＰＨＡ産生株を開発するための遺伝子および技術は、一般に、当業者に公知である（Ｍａｄｉｓｏｎ　＆　Ｈｕｉｓｍａｎ、１９９９、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ、６３：２１−５３；ＰＣＴ　ＷＯ９９／１４３１３）。ジオールおよび糖のような供給材料からＰＨＡ産生を行うために必要な遺伝子の全ては、クローニングされており、そして遺伝子操作可能な形態で入手可能であるので、プラスミドに保持された遺伝子および組み込まれた遺伝子の任意の組み合わせが使用され得、そして従って、この経路の実行は、本明細書中に概要が示されているスキームに限定されない。多くの異なる実行が、当業者に明らかである。
【００１４】
１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．２０２）は、いくつかの種の細菌において見出される。しばしば、これは、グリセロール存在下の嫌気条件下で誘導される（Ｆｏｒａｇｅ　＆　Ｆｏｓｔｅｒ、１９８２、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４９：４１３−４１９）。この酵素は、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドおよび他のヒドロキシアルデヒドが、対応するジオールから可逆的形成するのを触媒する。生理学的に、そのアルデヒドが、ＮＡＤＨを消費して電子受容体として必要とされる場合に、この酵素は、ジオール形成において主に使用されると考えられる（Ｊｏｈｎｓｏｎ　＆　Ｌｉｎ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：２０５０−５４）。１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼを含む生物は、代表的に、グリセロールを１，３−プロパンジオールに変換し得るが、類似の活性が、他の生物において見出される。グリセロールを１，３−プロパンジオールに変換する能力が示されている細菌種としては、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｓｔｒｅｅｋｓｔｒａら、１９８７、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４７：２６８−７５）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｏｘｙｔｏｃａ（Ｈｏｍａｎｎら、１９９０、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：１２１−２６）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ（同書）およびＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ（Ｂｏｅｎｉｇｋら、１９９３、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：４５３−５７）が挙げられるが、他の多くの例が、一般的に公知である。
【００１５】
アルデヒドデヒドロゲナーゼは、生物学的系において極めて一般的である。相同性についてのＥ．ｃｏｌｉゲノムデータベースの探索は、この生物が単独で、少なくとも７つのこのタイプの推定酵素を含むことを示す。これらは、非常に多くかつ多様であるので、これら全てを分類する試みでさえ複雑である（例えば、Ｖａｓｉｌｉｏｕら、１９９９、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　９：４２１−３４）。これらの酵素のタイプおよび生理学的役割の全ての考察は、本考察の範囲を超える。代謝工学における使用のための適切なアルデヒドデヒドロゲナーゼの選択は、いくつかの候補の基質特異性の評価後に行われるべきである。Ｂａｌｄｏｍａ　＆　Ａｇｕｉｌａｒ（１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１３９９１−６）に記載のアッセイのような酵素アッセイが、このような診断に有用である。
【００１６】
アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ　２．８．３．ｘ）およびアシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ　６．２．１．ｘ）の両方は、補酵素Ａと有機酸とのチオエステルの形成を触媒する。アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（例えば、ＯｒｆＺ（ＨｂｃＴとも呼ばれる）（ＳｏｅｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、１９９６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１７８：８７１−８０））は、ドナー（例えば、アセチル−ＣｏＡ）から遊離の有機酸（例えば、脂肪酸）へＣｏＡ部分を転移する。アシル−ＣｏＡシンテターゼ（例えば、ＡｌｋＫ（ｖａｎ　Ｂｅｉｌｅｎら、１９９２、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：３１２１−３６）は、遊離の有機酸と遊離の補酵素Ａを連結し、ＡＴＰから反応のためのエネルギーを誘導し、そしてＡＭＰおよびピロリン酸を副生成物として生じる。
【００１７】
（経路中の酵素の改善）
本明細書中に記載されるジオール−ＰＨＡ経路における酵素の比活性または基質特異性を改善することは、有利であり得る。例えば、特定のジオールが、特定の生物において受容可能な速度でＰＨＡへと変換されないかもしれない。この性質を改善することは、一般的に、変異誘発およびスクリーニングを包含し；改善されるべきＤＮＡ配列が、１回以上の変異誘発に供され、その後、なされた改善を評価される。
【００１８】
当業者に公知な種々の方法（例えば、エラープローンＰＣＲまたはカセット変異誘発、細菌変異誘発遺伝子株を通す継代、化学的変異原による処理）のいずれかを使用して、変異誘発が実施され得、そのような方法は、例えば、Ｃａｄｗｅｌｌら、１９９２、ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　２：２８〜３３；Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、１９９３、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：３８５８〜６２；Ｈｅｒｍｅｓら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：６９６〜７００；Ｈｏら、１９８９、Ｇｅｎｅ　７７：５１〜５９；Ｋｅｌｌｏｇら、１９８１、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１４：１１３３〜３５；Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら、１９９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：５３〜５７；Ｓｔｅｍｍｅｒ、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ　３７０：３８９〜９１；およびＳｔｅｍｍｅｒ、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：１０７４７〜５１に記載されるものである。
【００１９】
改善されたジオール−ＰＨＡ経路についてのスクリーニングは、上記のようにして生成された変異体の集団を、その経路に関連するいくつかの特性が改善した細胞を容易に選択し得るような様式で、培養する工程を包含する。１つの実施形態は、目的のジオールに対する増殖の改善についての選択である。特定のジオールの取り込みまたは利用が欠損した生物は、唯一の炭素源としてそのジオールを用いては十分に増殖しない。変異体のプールが、問題の生物の増殖に必要な他の全ての栄養素とともに、唯一の炭素源としてジオールを含む、液体培地中または寒天プレート上に、接種され得、そして増殖可能な細胞が、容易に単離され得る。別の実施形態は、そのジオールの存在下で培養された場合に、ポリマーを生成することができる細胞を選択することである。生物が、そのジオールを、後に重合され得るモノマー前駆体へと有意な速度で変換することができない場合、（添加されるすべての複合補充物（例えば、酵母抽出物）に含まれる炭素以外の）唯一の炭素原としてそのジオールを含む寒天上に、その生物をプレーティングすると、ＰＨＡをほとんど含まないかまたはＰＨＡ含量がない、細胞を生じる。そのようなプレート上の変異体のプールを培養することにより、そのジオールを重合可能な中間体へと変換する能力を得た株が、同定され得る。これらの細胞は、非ＰＨＡ生成細胞よりも不透明でありかつ白色に見える。あるいは、別の炭素原（例えば、グルコース）が、スクリーニングされるべき細胞がその炭素原からポリマーを合成できない場合には、添加され得る。プレートはまた、そのプレートが存在する条件において増殖できない菌株を排除するために役立ち得；例えば、変異誘発を介して、ジオールからＰＨＡを生成する能力を得たが産業上重要な特徴（例えば、最小グルコース培地上で増殖する能力）を失った細胞は、ジオールとグルコースとを含むプレート上では、特にその細胞がそのジオールを唯一の炭素原として増殖できない場合は、増殖しない。この場合はジオールからＰＨＡを生成し得かつ最小グルコース上で増殖し得る細胞のみが、不透明なコロニーとして出現する。ＰＨＡは、細胞（特にプレート上の細胞）中に、未処理のコロニーの可視的スクリーニングより感度の良い方法（例えば、（例えば、Ｓｐｉｅｋｅｒｍａｎｎら、１９９９、Ａｒｃｈ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７１：７３〜８０におけるような）ナイルレッドによる染色）によって、可視化され得る。上記のような方法は、このジオール−ＰＨＡ経路をさらに最適化するために、数回反復され得る。スクリーニング方法は、上記の局面によって例示されるが、これらの局面に限定されず、そして他の有用なスクリーニング手順が、当業者に明らかである。
【００２０】
（発現の調節）
上記の実施形態のいずれかにおいて、ジオールオキシドレダクターゼとアルデヒドデヒドロゲナーゼとの発現を制御することによってか、またはジオールの利用性を制御することによって、生成されるポリマーの組成を制御することが可能である。ジオールオキシドレダクターゼとアルデヒドデヒドロゲナーゼとの活性が高いほど、その活性の結果として、別の要因（例えば、基質利用性またはこれらの下流の酵素活性）が制限的になるまで、活性化されたモノマーがより多く誘導される。種々の生物における遺伝子発現（従って酵素活性）を調節する方法は、当業者に周知である。培養される細胞に供給されるジオールの速度は、発酵および細胞培養における当業者に周知の種々の技術によって、制御され得る。
【００２１】
いくつかの微生物の場合、これらの遺伝子のいくつかまたは全てが、宿主染色体に組み込まれ得、そしていくつかまたは全てが、プラスミドに提供され得る。いくつかの場合、適合性のプラスミド系（例えば、その経路のいくつかの段階が、１つのプラスミドにコードされ、そして他の段階が、第２のプラスミドにコードされる）が、使用され得る。これらの２つのアプローチの組み合わせもまた、使用され得る。
【００２２】
（基質）
上記に考察されるように、本明細書中に記載の系の状況下でＰＨＡを生成するために使用され得る基質としては、アルコール、好ましくは、ジオールが挙げられる。適切なジオールの例としては、１，６−ヘキサンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−エタンジオールおよび１，２−プロパンジオールが挙げられる。
【００２３】
これらのジオールは、多くの場合において、高濃度においてさえ、多くの微生物に対して非毒性である。これらは、有機酸（これらは、しばしば、多くの微生物に対して低濃度で毒性となる）と比較して、発酵のための優れた供給材料であり得る。多くのジオールは、容易に入手可能であり、比較的安価である。例えば、１，４−ブタンジオールは、１９９５年に約１０億ポンドの世界的需要があった。そしてこれは、そして合成ポリマー生産に非常に広範に使用されている（Ｍｏｒｇａｎ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＆　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、３　Ｍａｒｃｈ　１９９７、１６６−８頁）。
【００２４】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照して、さらに理解される。
【００２５】
（実施例１：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＡｌｄＨの酵素アッセイ）
他のアルデヒドデヒドロゲナーゼとのその相同性に基づいて、ａｌｄＨ遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムからのＰＣＲによってクローン化した。プラスミドｐＭＳ３３は、ｔｒｃプロモーターの制御下にあるａｌｄＨを含む。Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５αを、ネガティブコントロールとしてｐＭＳ３３またはｐＦＳ１４を用いて形質転換した。プラスミドｐＦＳ１４は、ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ（１９９６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：８７１−８０）に記載されるように、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｋｌｕｙｖｅｒｉ　４ｈｂＤ（４ＨＢデヒドロゲナーゼ）遺伝子を含む。
【００２６】
ＤＨ５α／ｐＭＳ３３およびＤＨ５α／ｐＦＳ１４を、３７℃にて、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ；Ｄｉｆｃｏ；Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ．）ブロス中で振盪しながら、０．５の吸光度（６００ｎｍ）まで増殖させ、そして引き続いて、１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて誘導した。インキュベーションを３時間続けた後、細胞を遠心分離（２０００ｇ、１０分）によって培地から取り出し、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）で洗浄し、再度、再度遠心分離し、そして細胞ペレットのサイズにほぼ等しい容量の０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）中に再懸濁した。各サンプルを、３ｍＬのアリコートのマイクロチップを用いて、氷上で２分間（各々、１秒間隔の７０％サイクルで）超音波処理した（ＸＬソニケーター、Ｈｅａｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）。溶解物を、１４，０００ｇにて１０分間マイクロ遠心分離でスピンし、そして上清を、収集し、そして粗細胞抽出物と命名した。
【００２７】
酵素アッセイを、１００ｍＭ　ナトリウムグリシン（ｐＨ９．５）、１ｍＭ　３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３ＨＰＡ）、１ｍＭ　ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋、６ｍＭ　ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、および２０〜１００μｇの総タンパク質を含む一定容量の粗細胞抽出物を含む、１ｍＬの総容量で行った。ベースラインを、３ＨＰＡを添加する（このことにより反応を開始する）前に確立した。ＤＨ５α／ｐＦＳ１４抽出物により得られた活性は、ＮＡＤ＋を用いた場合、０．００Ｕ／ｍｇ、およびＮＡＤＰ＋を用いた場合０．０３Ｕ／ｍｇであった。ＤＨ５α／ｐＭＳ３３抽出物により得られた活性は、ＮＡＤ＋を用いた場合、１．８９Ｕ／ｍｇ、およびＮＡＤＰ＋を用いた場合０．３２Ｕ／ｍｇであった。従って、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＡｌｄＨタンパク質を発現する細胞は、補助因子として、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋のいずれかを用いて、３ＨＰＡを３−ヒドロキシプロピオン酸へと転換する能力を得る。
【００２８】
（ｐＦＳ１４の構築）
４ｈｂＤ遺伝子を、テンプレートとして、プラスミドｐＣＫ３（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ，１９９６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：８７１−８０）を用いるＰＣＲによりクローン化した。以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた：
【００２９】
【化１】
2004512825.tif 000002
得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩを用いて消化し、そしてプラスミドｐＴｒｃＮ（これは、同じ酵素を用いて消化されている）に連結した。ｐＴｒｃＮは、ｐＴｒｃ９９ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の誘導体であり；ｐＴｒｃＮを区別する改変は、ＮｃｏＩを用いる消化、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼを用いる処理、および自己連結による、ＮｃｏＩ制限部位の除去である。
【００３０】
（ｐＭＳ３３の構築）
他のアルデヒドデヒドロゲナーゼとのその相同性に基づいて、ａｌｄＨ遺伝子を以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＥ．ｃｏｌｉゲノムからＰＣＲによりクローン化した：
【００３１】
【化２】
2004512825.tif 000003
得られたＰＣＲ産物をＡｃｃ６５ＩおよびＮｏｔＩを用いて消化し、そしてｐＳＥ３８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）（これは、同じ酵素を用いて消化されている）に連結して、ｐＭＳ３３を形成した。
【００３２】
（実施例２：唯一の炭素供給源として１，４−ブタンジオールを用いる、Ｅｃｏｌｉの増殖）
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＬＳ５２１８（株ＣＧＳＣ６９６６として、Ｙａｌｅ　Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ，Ｃｏｎｎ．から入手した）を、２つのプラスミド（ｐＦＳ７６またはｐＦＳ７７）のいずれかを用いて形質転換した。ｐＦＳ７６は、Ｖａｌｅｎｔｉｎら（１９９５，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２７：４３−６０）に記載されるように、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ　ｅｕｔｒｏｐｈａ由来の４ＨＢデヒドロゲナーゼ（ｇｂｄ）遺伝子を含む。プラスミドｐＦＳ７７は、単一のオペロンに配置された、ｇｂｄ遺伝子、ならびにＥ．ｃｏｌｉアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄＨ）遺伝子、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）遺伝子を含む。両方のプラスミドは、遺伝子の転写のためのｔｒｃプロモーターを含む。
【００３３】
ＬＳ５２１８／ｐＦＳ７６およびＬＳ５２１８／ｐＦＳ７７を、４ＨＢ（ナトリウム塩として、４−ヒドロキシブチレート）または１，４−ブタンジオールのいずれかを５ｇ／Ｌ含む、最少培地プレート上に画線した。このプレート培地はまた、１リットルあたり以下のものを含んでいた：１５ｇ寒天；１ｍｍｏｌ　ＭｇＳＯ４；１０ｍｇチアミン；２５．５ｍｍｏｌ　Ｎａ２ＨＰＯ４；３３．３ｍｍｏｌ　Ｋ２ＨＰＯ４；２７．２ｍｍｏｌ　ＫＨ２ＰＯ４；２．７８ｍｇ　ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１．９８ｍｇ　ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；２．８１ｍｇ　ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；０．１７ｍｇ　ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；１．６７ｍｇ　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；０．２９ｍｇ　ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１００μｇアンピシリン；および０．１ｍｍｏｌ　ＩＰＴＧ。これらのプレートを３７℃で一晩インキュベートした。両方の株を、４ＨＢプレートで増殖したが、ＬＳ５２１８／ｐＦＳ７７のみが、１，４−ブタノールプレート上で増殖した。従って、ｇｂｄ遺伝子、ａｌｄＨ遺伝子、およびｄｈａＴ遺伝子からなる経路が、唯一の炭素供給源として、１，４−ブタンジオールを用いるＥ．ｃｏｌｉ　ＬＳ５２１８の増殖に十分であることが示された。
【００３４】
（ｐＦＳ７６の構築）
ｇｂｄ遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ　Ｈ１６（株ＡＴＣＣ１７６９９として、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．，から入手した）のゲノムからＰＣＲにより増幅した：
【００３５】
【化３】
2004512825.tif 000004
得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩを用いて消化し、そしてｐＳＥ３８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）（これは、同じ酵素を用いて消化されている）に連結して、ｐＦＳ７６を形成した。
【００３６】
（ｐＦＳ７７の構築）
ａｌｄＨ−ｄｈａＴ領域を、ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いる消化により、ｐＭＳ５９から取り出した。プラスミドｐＦＳ７６を、ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化した。ＮｈｅＩおよびＳｐｅＩは、適合性の接着末端を形成する。ｐＭＳ５９由来のａｌｄＨ−ｄｈａＴフラグメントおよびｐＦＳ７６の大きなフラグメントを、共に連結してｐＦＳ７７を得た。ｐＦＳ７７は、ｇｂｄ遺伝子、ａｌｄＨ遺伝子、およびｄｈａＴ遺伝子（全ての遺伝子がｔｒｃプロモーターの制御下にある）を含んでいた。
【００３７】
（実施例３：１，４−ブタンジオールからのポリ（４ＨＢ）の生成）
Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ株ＬＳ５２１８（ＣＧＳＣ６９６６）を、２つのプラスミド（ｐＦＳ３０またはｐＭＳ６０）のいずれかを用いて形質転換した。ｐＦＳ３０は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ　ｅｕｔｒｏｐｈａ　ＰＨＡシンターゼ（ｐｈａＣ）遺伝子およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｋｌｕｙｖｅｒｉ　４ＨＢ−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ｈｂｃＴ）遺伝子（両方ともｔｒｃプロモーターの制御下にある）を含む。ｐＭＳ６０は、ａｌｄＨ遺伝子およびｄｈａＴ遺伝子に加えて、ｐＦＳ３０の２つの遺伝子（全ての遺伝子がｔｒｃプロモーターの制御下にある）を含む。この実験の目的は、ａｌｄＨ遺伝子およびｄｈａＴ遺伝子の添加が、ＰＨＡポリマーにおける１，４−ブタンジオールの４ＨＢへの転換に役立つか否かを決定することであった。
【００３８】
各株を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを補充したＬＢブロス中で、３７℃にて一晩、２５０ｒｐｍで振盪しながら増殖させた。次いで、細胞を、遠心分離（２０００ｇ、１０分）により培地から取出し、そして１リットルあたり以下のものを含む培地の１００ｍＬに再懸濁した：２．５ｇ　ＬＢ粉末；５０ｍｍｏｌリン酸カルシウム、ｐＨ７．０；２ｇ　グルコース；５ｇ　１，４−ブタンジオール；１００μｇアンピシリン；および０．１ｍｍｏｌ　ＩＰＴＧ。これらのインキュベーションは、３０℃にて２５０ｒｐｍで振盪しながら、２５時間であった。フラスコの容量の４分の１に由来する細胞を、上記のように遠心分離し、水で洗浄し、再び遠心分離し、そして凍結乾燥した。各フラスコに由来する凍結乾燥した細胞集団の約２０ｍｇを同時抽出、および（容量で）９０％１−ブタノールおよび１０％濃塩酸を含む混合物の２ｍＬ（内部標準として添加した２ｍｇ／ｍＬの安息香酸を有する）中で、１１０℃にて３時間のブタノール分解に供した。得られた混合物の水溶性成分を、３ｍＬの水を用いる抽出により取出した。有機相（２ｍＬ／分の総流速にて１：５０の分割比で１μＬ）を、以下の温度プロフィール：８０℃、２分；１０℃／１分、２５０℃まで；２５０℃、２分を用いてＳＰＢ−１石英ガラスキャピラリーＧＣカラム（３０ｍ；０．３２ｍｍ　ＩＤ；０．２５μｍフィルム；Ｓｕｐｅｌｃｏ；Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ）で分析した。ポリマー中の４−ヒドロキシブチレート単位の存在について試験するために用いた標準は、γ−ブチロラクトン（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．；Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）であった。
【００３９】
株ＬＳ５２１８／ｐＦＳ３０は、３．９の吸光度（６００ｎｍ）に達し、そして乾燥細胞重量の３．３％までポリ−４ＨＢを蓄積したが、株ＬＳ５２１８／ｐＭＳ６０は、６．５の吸光度（６００ｎｍ）に達し、そして乾燥細胞重量の１２．３％までポリ−４ＨＢを蓄積した。従って、ａｌｄＨ遺伝子およびｄｈａＴ遺伝子の発現は、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＬＳ５２１８の、１，４−ブタンジオールからポリ−４ＨＢを合成する能力を増大させるのに十分である。
【００４０】
（ｐＦＳ１６の構築）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｋｌｕｙｖｅｒｉ　ｏｒｆＺ（ｈｂｃＴともよばれる）ＰＣＲ産物をｐＴｒｃＮに連結することにより、プラスミドｐＦＳ１６を構築した。このｏｒｆＺ遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてプラスミドｐＣＫ３からＰＣＲにより増幅した（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ，１９９６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：８７１−８０）：
【００４１】
【化４】
2004512825.tif 000005
得られたＰＣＲ産物をＡｖｒＩＩおよびＳａｌＩで消化し、ＸｂａＩ（これは、ＡｖｒＩＩと適合する）およびＳａｌＩで消化したｐＴｒｃＮに連結して、ｐＦＳ１６を形成した。
【００４２】
（ｐＳＦ３０の構築）
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ　ｅｕｔｒｏｐｈａ　ＰＨＡシンターゼ（ｐｈａＣ）遺伝子を付加することにより、ｐＦＳ１６からプラスミドｐＦＳ３０を得た。プラスミドｐＡｅＴ４１４を、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａプロモーターおよび構造性ｐｈａＣ遺伝子が１つのフラグメントに存在するように、ＸｍａＩおよびＳｔｕＩで消化した。ｐＦＳ１６をＢａｍＨＩで切断し、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで処理して、平滑末端を作製し、次いでＸｍａＩで消化した。このようにして得た２つのＤＮＡフラグメントをともに連結して、ｐＦＳ３０を形成した。
【００４３】
（ｐＭＳ５９の構築）
ＳｐｅＩおよびＢｇｌＩＩで消化することにより、ｐＭＳ３３からａｌｄＨ遺伝子を除去した。プラスミドｐＴＣ４２（Ｓｋｒａｌｙら、１９９８，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：９８−１０５）（これは、ｔｒｃプロモーターの制御下にあるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　ｄｈａＴ遺伝子を含む）を、ＮｈｅＩおよびＢｇｌＩＩで消化した。ＳｐｅＩおよびＮｈｅＩは、適合性の粘着末端を生成する。ｐＭＳ３３のａｌｄＨ含有フラグメントおよびｐＴＣ４２の大きなフラグメントをともに連結して、ｐＭＳ５９を形成した。
【００４４】
（ｐＭＳ６０の構築）
ａｌｄＨ−ｄｈａＴ領域を、ＳｐｅＩで消化し、続いてＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで処理し、続いてＭｆｅＩで消化することにより、ｐＭＳ５９から単離した。このフラグメントは、１つの平滑末端と１つの粘着末端を有し、ＥｃｏＲＩが生成する粘着末端と適合する。ｐＦＳ３０をＸｍａＩで消化し、続いて、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで処理し、続いてＥｃｏＲＩで消化した。ｐＦＳ３０の大きなフラグメントおよびｐＭＳ５９のａｌｄＨ−ｄｈａＴ含有フラグメントをともに連結して、ｐＭＳ６０を得た。
【００４５】
（実施例４：グルコースおよび１，４−ブタンジオールからのポリ（３ＨＢ−コ−４ＨＢ）の合成）
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＢＸ１４９３は、ポリ（３ＨＢ−コ−４ＨＢ）生成株であり、その染色体に、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ　ｏｒｆＺ（ｈｂｃＴともよばれる）遺伝子（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ，１９９６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：８７１−８０）が組み込まれている。この株は、ＭＢＸ１３３５（ＰＨＢ生成株であり、その染色体にｐｈａＡ、ｐｈａＢおよびｐｈａＣ遺伝子が組み込まれている）から生成された。ＭＢＸ１３３５は、それ自体、株ＬＳ５２１８にｐｈａＡ、ｐｈａＢおよびｐｈａＣ遺伝子のバクテリオファージＰ１での形質導入によるＭＢＸ８２０（ＭｅｔａｂｏｌｉｘによるＰＣＴ　ＷＯ００／０１１１８８を参照のこと）から得られた。
【００４６】
株ＭＢＸ１４９３を、別々の手順を用いて以下の４つのプラスミドで形質転換した：ｐＴｒｃＮ、ｐＴＣ４２、ｐＭＳ３３およびｐＭＳ５９。これらのプラスミドは、それぞれ、ｔｒｃプロモーターの制御下にある以下の遺伝子を含む：なし、ｄｈａＴのみ、ａｌｄＨのみ、ａｌｄＨおよびｄｈａＴ両方。これらの株の各々を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを補充した３ｍＬのＬＢ中で、３７℃で振盪しながら一晩増殖させた。これらの培養物各１ｍＬの容量を、１Ｌあたり以下を含む培地５０ｍＬへの接種物として用いた：１ｍｍｏｌのＭｇＳＯ４；１０ｍｇのチアミン；２５．５ｍｍｏｌのＮａ２ＨＰＯ４；３３．３ｍｍｏｌのＫ２ＨＰＯ４；２７．２ｍｍｏｌのＫＨ２ＰＯ４；２．７８ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１．９８ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；２．８１ｍｇのＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；０．１７ｍｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；１．６７ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；０．２９ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１０ｇのグルコース；５ｇの４−ヒドロキシブチレートまたは１０ｇの１，４−ブタンジオール；１００μｇのアンピシリン；２５μｇのクロラムフェニコール；および０．０１ｍｍｏｌのＩＰＴＧ。これらの培養物を、２５０ｒｐｍで３０℃で８８時間振盪しながらインキュベートした。細胞を遠心分離（２０００ｇ，１０分間）により、この培地から除去し、これらを凍結乾燥し、ＰＨＡ含有量およびＧＣ組成について分析した。表１は、これらの株により生成されたポリマーの組成およびこの培養物の最終的な光学密度（６００ｎｍ）を示す。
【００４７】
表１に示されるように、４ＨＢを供給された場合、全ての株が有意な％の４ＨＢを有するコポリマーを生成する。しかし、１，４−ブタンジオールを供給した場合、ｐＭＳ５９含有細胞（すなわち、ａｌｄＨとｄｈａＴの両方を発現する細胞）のみが、ポリマーへの有意なレベルの４ＨＢ取り込みを達成した。従って、ａｌｄＨ−ｄｈａＴ経路により、１，４−ブタンジオールから４ＨＢへの変換が可能になるが、細胞の状態（ｃｅｌｌ　ｈｅａｌｔｈ）も、４ＨＢのＰＨＡへの引き続く取り込みも有意には妨げないことが示された。
【００４８】
【表１】
2004512825.tif 000006
（実施例５：１，３−プロパンジオールからのポリ（３ＨＰ）の生成）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ株ＬＳ５２１８（ＣＧＳＣ　６９６６）を、２つのプラスミド（ｐＦＳ３０またはｐＭＳ６０）のいずれかで形質転換した。この実験の目的は、ａｌｄＨ遺伝子およびｄｈａＴ遺伝子の付加が１，３−プロパンジオールの３ＨＰへの変換に有益か否かを決定することである。
【００４９】
各株を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを補充したＬＢブロス中、２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩増殖させた。次いで、この細胞を遠心分離（２０００ｒｐｍ、１０分）により培地から除去し、１Ｌあたり以下を含有する培地５０ｍＬに再懸濁した：２．５ｇのＬＢ粉末；５０ｍｍｏｌのリン酸カリウム（ｐＨ７．０）；５ｇのグルコース；０ｇまたは１０ｇの１，３−プロパンジオール；１００μｇのアンピシリン；および０．１ｍｍｏｌのＩＰＴＧ。これらのインキュベーションは、２５０ｒｐｍで２５時間振盪しながら３０℃であった。これらの細胞を、上記のように遠心分離により培地から除去し、水で洗浄し、再び遠心分離し、凍結乾燥し、ＰＨＡ含有量およびＧＣ組成について分析した。ポリマー中の３−ヒドロキシプロピオネートユニットの存在について試験するために用いた標準物質は、β−プロピオラクトン（ＡＬｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．；Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）であった。
【００５０】
１，３−プロパンジオール添加なしのフラスコ中では、ＰＨＰ形成は検出されなかった；株ＬＳ５２１８／ｐＦＳ３０およびＬＳ５２１８／ｐＭＳ６０は、それぞれ、４．６および８．２の光学密度（６００ｎｍ）に達した。１，３−プロパンジオールを添加したフラスコ中では、株ＬＳ５２１８／ｐＦＳ３０は５．２の光学密度（６００ｎｍ）に達し、検出可能なレベルまでポリ−３ＨＰを蓄積しなかったが、株ＬＳ５２１８／ｐＭＳ６０は、６．６の光学密度（６００ｎｍ）に足し、乾燥細胞重量の５．０％までポリ−３ＨＰを蓄積した。従って、ａｌｄＨ遺伝子およびｄｈａＴ遺伝子の発現は、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＬＳ５２１８が１，３−プロパンジオールからポリ−３ＨＰを合成する能力を増大させるに十分である。
【００５１】
（実施例６：グルコースおよび１，３−プロパンジオールからのポリ（３−ＨＢ−コ−３ＨＰ）の合成）
株ＭＢＸ１４９３を別々の手順で以下の４つのプラスミドで形質転換した：ｐＴｒｃＮ、ｐＴＣ４２、ｐＭＳ３３およびｐＭＳ５９。これらの株の各々を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを補充した１００ｍＬのＬＢ中で、３７℃で一晩振盪しながら増殖させた。これらの細胞を各フラスコからデカントし、残りの液体を維持した、次いで、各フラスコに、１Ｌあたり以下を含む培地８０ｍＬを添加した：６．２５ｇのＬＢ粉末；１ｍｍｏｌのＭｇＳＯ４；１０ｍｇのチアミン；２５．５ｍｍｏｌのＮａ２ＨＰＯ４；３３．３ｎｍｏｌのＫ２ＨＰＯ４；２７．２ｍｍｏｌのＫＨ２ＰＯ４；２．７８ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１．９８ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；２．８１ｍｇのＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；０．１７ｍｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；１．６７ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；０．２９ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１０ｇのグルコース；１００μｇのアンピシリン；２５μｇのクロラムフェニコール；および０．０１ｍｍｏｌのＩＰＴＧ。これらの培養物を、２５０ｒｐｍで７時間振盪しながら３７℃でインキュベートした。次いで、この培地において、ＬＢが１２．５ｇ／Ｌに増加し、グルコースが１００ｇ／Ｌに増加し、ＩＰＴＧが０．２５ｍＭに増加し、１，３−プロパンジオールが５０ｇ／Ｌで添加された以外は、上記と同じ培地２０ｍＬを各フラスコに添加した。従って、この段階で添加した最終濃度は、２．５ｇ／ＬのＬＢ、２０ｇ／Ｌのグルコース、１０ｇ／Ｌの１，３−プロパンジオール、および０．０５ｍＭのＩＰＴＧであった。これらのフラスコを、２５０ｒｐｍで振盪しながら２４時間３０℃でインキュベートした。次いで、細胞を、遠心分離（２０００ｇ，１０分間）によりこの培地から除去し、これらを凍結乾燥し、ＰＨＡ含有量およびＧＣ組成について分析した。表２は、これらの株により生成されたポリマーの組成およびこの培養物の最終的な光学密度（６００ｎｍ）を示す。
【００５２】
１，３−プロパンジオールの非存在下では、各株は、ＰＨＢのみを合成した。１，３−プロパンジオールが供給された場合、ｐＭＳ５９含有細胞（すなわち、ａｌｄＨとｄｈａＴの両方を発現する細胞）のみが、ポリマーへの有意なレベルの３ＨＰの取り込みを達成した。ｐＭＳ３３、またはａｌｄＨ単独を含む細胞は、３ＨＰ取り込みを達成したが、ごくわずかであった。従って、ａｌｄＨ−ｄｈａＴ経路により、１，３−プロパンジオールから３ＨＰへの変換が可能になることが示された。ｄｈａＴ遺伝子（ｐＴＣ４２およびｐＭＳ５９）を含む細胞は、１，３−プロパンジオールが存在する場合に、全体としてあまり多くのポリマーを作らず、このことは、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの毒性に起因する可能性が最も高い。ａｌｄＨ　対　ｄｈａＴの発現の比が増大および／または１，３−プロパンジオール濃度が減少すると、この現象は抑えられるはずである。
【００５３】
【表２】
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（実施例７：１，４−ブタンジオールからのポリ（４ＨＢ）合成のための、アシル−ＣｏＡシンテターゼの使用）
Ｔｎ１０由来のテトラサイクリン耐性マーカーと共に、オペロンとしてその染色体中に組み込まれたａｌｄＨ遺伝子およびｄｈａＨ遺伝子を有する株ＭＢＸ１６６８を、２つのプラスミド（ｐＦＳ７３またはｐＭＳ９２）のいずれかで形質転換した。プラスミドｐＦＳ７３は、アンピシリン耐性マーカーがｐＡＣＹＣ１７７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０６４０２）由来のカナマイシン耐性マーカーで置換されている点を除いて、先の実施例に記載されたｐＦＳ３０と同じである。プラスミドｐＭＳ９２は、ｐＦＳ７３に由来し、そのｏｒｆＺ遺伝子は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ由来のａｌｋＫ遺伝子で置換されている（ｖａｎ　Ｂｅｉｌｅｎら、１９９２、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：３１２１−３６）。これらの株の各々を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを補充した３ｍＬのＬＢ中で、３７℃で一晩振とうしながら増殖させた。１ミリリットルの各培養物を、２００ｍＬの角瓶に接種材料として添加した。各瓶は、１リットルあたり、０．１ｇのカザミノ酸；５ｍｍｏｌのＭｇＳＯ４；１０ｍｇのチアミン；２５．５ｍｍｏｌのＮａ２ＨＰＯ４；３３．３ｍｍｏｌのＫ２ＨＰＯ４；２７．２ｍｍｏｌのＫＨ２ＰＯ４；２．７８ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１．９８ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；２．８１ｍｇのＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；０．１７ｍｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；１．６７ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；０．２９ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１０ｇのグルコース；１０ｇの１，４−ブタンジオール；５０μｇのカナマイシン；および１０μｇのテトラサイクリンを含む培地の５０ｍＬを保持した。これらの培養物を、２５０ｒｐｍで振とうしながら、３０℃で４８時間インキュベートした。次いで、細胞を、遠心分離（２０００ｇ、１０分間）によってこの培地から回収し、そしてこれらを凍結乾燥し、そしてＰＨＡ含量およびＧＣ組成について分析した。ｐＦＳ７３保有の株ＭＢＸ１６６８は、乾燥重量で５．８％のポリ（４ＨＢ）を含み、一方、ｐＭＳ９２保有の株ＭＢＸ１６６８は、乾燥重量で２７．７％のポリ（４ＨＢ）を含んだ。従って、このａｌｋＫ遺伝子は、受容可能であり、そしてこのよりよい場合において、ジオールからのＰＨＡ合成におけるｏｒｆＺ遺伝子の代用になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、１つの実施形態において使用される、１，４−ブタンジオールから４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの経路を示す。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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