(57)【要約】ヌクレアーゼ、好ましくはエキソヌクレアーゼＩと、ホスファターゼ、好ましくはエビアルカリホスファターゼを含む組成物であって、該酵素は単一の組成物中で組み合わされるが、それぞれの酵素が経時的に有意な機能活性を保持している組成物である。エキソヌクレアーゼＩとエビアルカリホスファターゼを一組成物中で組み合わせることにより、残留プライマー及びヌクレオチド三リン酸を分解する増幅ＤＮＡの単純化された加工が可能になり、続くＤＮＡ解析を容易にすることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレアーゼとホスファターゼを含有する組成物であって、増幅されたデオキシリボ核酸が実質的に含まれない組成物。
【請求項２】
核酸が実質的に含まれない請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ヌクレオチド三リン酸及びプライマーが実質的に含まれない請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
有効量のエビアルカリホスファターゼを含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
有効量のエキソヌクレアーゼＩを含有する請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
上記ホスファターゼがアルカリホスファターゼである請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
上記ヌクレアーゼが一本鎖エキソヌクレアーゼである請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
有効量の緩衝剤を更に含有する請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
上記緩衝剤がＴｒｉｓ−ＨＣｌである請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
７〜８のｐＨを有する請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
有効量の還元剤を更に含有する請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
有効量のキレート剤を更に含有する請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
グリセロール、エチレングリコール及びグリシンから選択される、少なくとも２０容量パーセントの安定剤を更に含有する請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
上記ヌクレアーゼが１マイクロリットル当たり少なくとも０．１ユニットの濃度で組成物中に存在している請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
上記ホスファターゼが１マイクロリットル当たり少なくとも０．１ユニットの濃度で組成物中に存在している請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
ＰＣＲ増幅反応の産物に加えられたときに、残留プライマーを分解し、効果的なＤＮＡシークエンシングを可能にし得る請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
ＰＣＲ増幅反応の産物に加えられたときに、残留ヌクレオチド三リン酸を分解し、効果的なＤＮＡシークエンシングを可能にし得る請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
上記ヌクレアーゼと上記ホスファターゼから本質的になる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
ヌクレアーゼとホスファターゼを含有する組成物であって、該組成物を４℃で２４時間保存する場合、組成物中の上記ホスファターゼがその機能活性の少なくとも５０％を保持する組成物。
【請求項２０】
組成物を４℃で３日間保存する場合に、組成物中の上記ヌクレアーゼがその機能活性の少なくとも５０％を保持する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
物質試料中に存在する予め選択された核酸を分解する方法であって、ヌクレアーゼとホスファターゼを含有する組成物に上記試料を接触させる工程を含む方法。
【請求項２２】
上記試料が生物学的物質から単離された材料である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
上記物質試料中に存在する上記予め選択された核酸が、核酸合成反応の産物中に存在する残留物質であり、上記ヌクレアーゼと上記ホスファターゼを含有する上記組成物と上記合成反応産物を接触させる工程を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
上記組成物には、増幅されたデオキシリボ核酸が実質的に含まれない請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
上記合成反応産物が残留プライマーを含み、上記ヌクレアーゼが上記反応産物中に存在する上記残留プライマーを分解する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
上記合成反応産物が残留ヌクレオチド三リン酸を含み、上記ホスファターゼが上記反応産物中に存在する上記残留ヌクレオチド三リン酸を分解する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
上記合成反応がプライマー開始ＤＮＡ合成である請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
上記合成反応がＤＮＡ増幅反応である請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
上記合成反応がＰＣＲ増幅反応である請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
上記合成反応が等温増幅反応である請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
上記合成反応がＲＴ−ＰＣＲ増幅反応である請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この出願は２０００年３月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／１９０８１３号の利益を請求する。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、特に増幅されたＤＮＡを含むＤＮＡを加工して、限定するものではないが、ＤＮＡシークエンシング、ＳＮＰ解析、又は遺伝子発現解析のような他の操作を実施する前に、残留プライマー又は他の望まれない一本鎖ＤＮＡとヌクレオチド三リン酸を除去する分野に関する。
【０００３】
エキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）は一本鎖ＤＮＡを３’→５’方向に分解して５’モノヌクレオチドを生成する。この酵素はシークエンシングのためのＰＣＲ産物のような増幅したＤＮＡ産物を調製するのに特に有用である。該酵素は、分解させないとシークエンシング反応中に持ち越されてしまう増幅反応の残留プライマーを分解する。米国特許第５７４１６７６号及び第５７５６２８５号は一般に増幅を介したＤＮＡシークエンシング法を開示しており、その両特許を出典明示によりここに取り込む。（Ｒ．Ｌ． Ｏｌｓｅｎ等， Ｃｏｍｐ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ｖｏｌ．９９Ｂ， Ｎｏ．４， ｐｐ．７５５−７６１ （１９９１）もまた参照のこと）。
【０００４】
シークエンシング反応中に持ち越された増幅プライマーはシークエンシングプライマーとして働き、シークエンシング反応産物を産生し、よって、所望の配列を分かり難くするかその観察を妨害する二次配列のバックグラウンドをつくりだす。市販されているエキソヌクレアーゼＩの濃度と比活性（純度）の両方とも広い範囲にわたって変化しうる。一般に、酵素は１ｍｇ当たり５００００から１５００００酵素ユニットの比活性で製造され、１マイクロリットル当たり約１０ユニットの濃度で増幅ＤＮＡを加工するために提供される。比活性がより高いか低いか、濃度が高いか低い酵素は、それぞれ、より少ないか多い容量の（量の）酵素を加えるというような、応用プロトコールで適切な変更を加えることによって当該分野で用いられる。
【０００５】
市販のエキソヌクレアーゼＩの保存用緩衝液は、水中に、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；０．５ｍＭのＥＤＴＡ；５ｍＭの２−メルカプトエタノール；５０容量％のグリセロールを含むものである（主要製造提供業者は米国オハイオ州クリーブランドのＵＳＢコーポレーションである）。
【０００６】
エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）とウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）によって実証されているアルカリホスファターゼは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びリボ−及びデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ又はヌクレオチド三リン酸）の５’−リン酸残基の加水分解を触媒する。ＳＡＰは、シークエンシング反応を実施する前に熱によって直ぐに不活性化できるので、シークエンシングのために、ＰＣＲ産物のような増幅産物を調製するのに特に有用である。ＳＡＰは増幅反応からの残留ｄＮＴＰｓを分解する。残留ｄＮＴＰｓが増幅反応からシークエンシング反応へ持ち越された場合は、それらは、不確定で非再現的な形でシークエンシング反応におけるｄＮＴＰｓの濃度に加わり、よってそれを変化させる。狭い制限内の、高品質のシークエンシングにはシークエンシング反応ｄＮＴＰｓとｄｄＮＴＰｓ間の比割合が必要となるので、ｄＮＴＰｓの濃度の変化は僅かなシークエンシング反応シグナルを生じうる。
【０００７】
ＳＡＰの唯一の製造業者は広範囲の比活性と濃度を持つ酵素を製造している。その例には、４．２ユニット／μｌ〜１３．９ユニット／μｌの範囲の濃度を持ち比活性が報告されていない酵素のバッチが含まれる。比活性がより高いか低いか、濃度が高いか低い酵素は、それぞれ、より少ないか多い容量の（量の）酵素を加えるというような、応用プロトコールで適切な変更を加えることによって当該分野で用いられる。上述の分野のための好適な酵素である市販のエビアルカリホスファターゼの保存用緩衝液は、水中に、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１ｍＭのＭｇＣｌ２；０．１ｍＭのＺｎＣｌ２；５０容量％のグリセロールを含むものである（米国オハイオ州クリーブランドのＵＳＢコーポレーションから入手可能）。
【０００８】
シークエンシング又は他の解析の前に、ＥｘｏＩとＳＡＰはＰＣＲ反応産物を加工するのに用いられることがよくある。現在、各酵素は上述のようにそれ自身の保存用緩衝液に入れて提供されている。推奨されている方法では（ＵＳＢコーポレーションのプロトコール小冊子「ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｒｅ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ」を参照のこと）、各酵素調製物の１マイクロリットルが５マイクロリットルのＰＣＲ反応産物に独立に（ピペットによって）加えられる。この利用方法では、複数回のピペット操作工程が、確定的なものであれ不確定のものであれ、有意な実験誤差を次のシークエンシング測定に潜在的に持ち込みうる可能性がある。更に、ＳＡＰに対するＥｘｏＩの比は、増幅ＤＮＡの次のバッチへの不正確な相対容量の各酵素調製物の移送のために次の実験において有意に変化し得る。
【０００９】
歴史的には、固定された割合で両酵素を含有する安定な組成物は商業的には製造されていない。市販のＳＡＰ保存緩衝液中に両方が存在するＭｇＣｌ２とＺｎＣｌ２は、市販のＥｘｏＩ保存緩衝液中に存在するＥＤＴＡとは非相容性であると考えられていた。ＥＤＴＡはＭｇ２＋及びＺｎ２＋イオンと強く反応するキレート剤である。ＥＤＴＡがモル過剰になるようにして一緒に混合すると、ＥＤＴＡはＭｇ２＋及びＺｎ２＋イオンを効果的に封鎖し、これらのイオンが溶液中に存在する任意の蛋白質（群）と相互作用することを妨げる。クラスとして、アルカリホスファターゼは、構造の安定性と活性のために二価イオン、しばしばＺｎ２＋を必要とする多量体メタロ酵素（ｍｅｔａｌｌｏ−ｅｎｚｙｍｅｓ）であると考えられる。
【００１０】
従って、当該分野では単一の送達ビヒクル中に両方の酵素を含有する安定な組成物に対しての需要がある。好ましくは、かかる安定な組成物は長い半減期を持ち、各酵素はその本来の機能活性の有意な割合を時間が経過しても保有する。
【００１１】
（発明の概要）
ヌクレアーゼとホスファターゼを含有する組成物が提供される。該組成物は増幅されたデオキシリボ核酸を実質的に含まない。組成物中のホスファターゼは、組成物を４℃で２４時間保存する場合、その機能活性の少なくとも５０％を保持する。物質試料中に存在する予め選択された核酸を分解する方法もまた提供される。該方法はヌクレアーゼとホスファターゼを含有する組成物に試料を接触させる工程を含む。
【００１２】
（発明の好適な実施態様の詳細な説明）
ここで使用されるところでは、５−２５又は５から２５又は５と２５の間のような範囲が与えられる場合、これは、好ましくは少なくとも５で、別個にかつ独立して、好ましくは２５を超えないことを意味する。
【００１３】
ここで使用される場合と特許請求の範囲において、ある成分の濃度が体積／体積パーセント（％ｖ／ｖ）として付与されている場合、これは、特定の成分に対して示されたパーセントに等しい、組成物の全体積（その構成成分の全てを含む）に対する割合の体積だけ成分が存在していることを意味する。例を挙げると、５０％ｖ／ｖのグリセロールを有する組成物は、（グリセロールと存在する場合は水を含む）その成分の全てを含む組成物の全体積の半分（又は５０％）に等しいグリセロールの体積からなる。そのような組成物では、モル濃度（Ｍ）で報告されている濃度はその成分の全てを含む組成物の全体積に基づく。
【００１４】
ここで使用される場合、ヌクレアーゼ（例えばＥｘｏＩ）酵素の１ユニットは標準的な条件下で３７℃にて３０分変性されたＤＮＡからの１０ｎｍｏｌの酸可溶性ヌクレオチドの放出を触媒するのに必要なヌクレアーゼ酵素の量である。
【００１５】
ここで使用される場合、ホスファターゼ（例えばＳＡＰ）酵素の１ユニットはグリシン／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．４）中で３７℃にて１分当たり１μｍｏｌのｐ−ニトロフェニルホスフェートの加水分解を触媒するのに必要なホスファターゼ酵素の量である。
【００１６】
ここで使用される場合、「機能活性」という用語は一般には以下に記載するようなその指定された機能を実施する酵素の能力を意味する。ここで使用される場合、ヌクレアーゼ（例えばＥｘｏＩ）の機能活性は、次のシークエンシング反応又は他の用途を実質的に妨害しないように十分に低いレベルまでＰＣＲ増幅ＤＮＡの残留ＰＣＲプライマーを分解するヌクレアーゼ酵素の能力によって定性的に定義される。ヌクレアーゼの機能活性は次の方法を用いてＥｘｏＩに対して測定される。ＥｘｏＩを含む１μｌの溶液を５μｌのＰＣＲ増幅ＤＮＡに加え、混合物を３７℃にて１５分間インキュベートする。１５分間８０℃に加熱することによって反応を停止させる。処理したＤＮＡをついで標準的なシークエンシング反応、例えばＵＳＢ Ｔ７−ＳｅｑｕｅｎａｓｅＶ２．０ＰＣＲ産物シークエンシングキットにおいて鋳型として用い、シークエンシングラダーの質を調べて、増幅ＤＮＡからの残留プライマーを分解する効果を決定する。本出願のためにＵＳＢコーポレーションによって商業的に供給されたＥｘｏＩは、ＰＣＲ増幅産物の標準的なプレシークエンシング加工において５μｌの反応産物当たり０．５から２０ユニット、好ましくは１−１５ユニット、より好ましくは約１０ユニットを使用することができる。定量的には、ＥｘｏＩと本発明の他のヌクレアーゼの機能活性と半減期は次の段落に記載されるような特定の温度での特定の期間の保存後に確認される。
【００１７】
１０ユニットのＥｘｏＩ／μｌを含む元のＥｘｏＩ組成物を時間ゼロにおいて調製し、各連続する希釈中の酵素濃度が前の希釈の濃度の半分になる段階希釈を、全体で好ましくは５回の希釈プラス元の未希釈組成物となるように実施する。この結果は次の通りである：元の未希釈組成物、１／２希釈度、１／４希釈度、１／８希釈度、１／１６希釈度、及び１／３２希釈度。活性に変化がないと考えると、各希釈度（未希釈組成物から開始）におけるＥｘｏＩ組成物の１マイクロリットル当たりの酵素当量は、未希釈組成物、並びに未希釈組成物の濃度の１／２、１／４、１／８、１／１６、及び１／３２に等しい希釈度に対応して、１０ユニットＥｘｏＩ；５ユニットＥｘｏＩ；２．５ユニットＥｘｏＩ；１．２５ユニットＥｘｏＩ；０．６２５ユニットＥｘｏＩ；及び０．３１２５ユニットＥｘｏＩである。時間ゼロにおいて、１μｌの上記のものそれぞれを、シークエンシング前に分解される残留ＤＮＡプライマーを含む（ｄＮＴＰｓを実質的に分解するように前処理されたか同時処理された）コントロールＰＣＲ反応産物の別個の５μｌの試料に別個に移送し、酵素によって残留プライマーを分解させる。ついで、シークエンシングを実施して配列ラダー（この例では６）を比較する。配列ラダー又はレーンを調べる際、シークエンシングラダーが一次シークエンシングシグナルと比較して実質的に二次及び／又は複数のレーンシグナルを示す第１の希釈は、酵素活性がその希釈度で降下したことを示す。これは「降下（ｄｒｏｐ−ｏｆｆ）希釈」と呼ばれる。これは、次の時点で、酵素の半減期及び機能活性を決定するための測定スティック又はベースラインとして使用される。特定の温度での貯蔵後の幾つかの時点、例えば２４時間、２、３、５、７、１４、２１、３０、６０、９０等の日の各々において、同様な段階希釈分析が、元の保存組成物の一部について実施され、「降下希釈」が再び確認される。ある希釈度（例えば１／１６希釈度）から前の希釈度（例えば１／８希釈度）への「降下希釈」がシフトする最初の時間は、ヌクレアーゼ酵素の半減期に達した時点を示している。例えば、段階希釈分析が毎日実施され、降下希釈が１／６希釈度から１／８希釈度までシフトするのに７日かかったと仮定する。これは、７日に、酵素がその機能活性の半分を失ったことを示している。同じ結果、つまり残留プライマーの完全な又は実質的な分解を達成するのに２倍の酵素活性（１／８希釈度は１／１６希釈度の２倍の濃度である）をはじめて必要とするからである。酵素活性の２倍を必要とするので、酵素はその半減期に到達している。
【００１８】
例えば、１μｌ当たり１０ユニットのＥｘｏＩを含む元のＥｘｏＩ組成物を調製し、上記のようにして段階希釈分析を実施する。降下希釈は１／３２希釈度であると見出される。ついで、組成物を例えば１週間の期間４℃にて保存する。保存した組成物に再び段階希釈分析を施して、降下希釈が１／３２希釈度のままである。段階希釈分析を続いて２、３、４、５等の週に実施し、第５週の試験で、初めて、降下希釈が１／６希釈度であることが見出される。これは、半減期の時点に到達したことを示している。この例では、半減期の時点には第４週と第５週の間で到達することが分かる。よって、この例では、組成物中のヌクレアーゼ酵素は、組成物が４℃で４週間保存された場合にその機能活性の少なくとも５０％を保持している。
【００１９】
ここで使用される場合の、ホスファターゼ（例えばＳＡＰ）の機能活性は、次のシークエンシング反応又は他の用途を実質的に妨害しないように十分に低いレベルまでＰＣＲ増幅ＤＮＡの残留ＰＣＲヌクレオチド三リン酸を分解するホスファターゼ酵素の能力によって定性的に定義される。ホスファターゼの機能活性は次の方法を用いてＳＡＰに対して測定される。ＳＡＰを含む１μｌの溶液を５μｌのＰＣＲ増幅ＤＮＡに加え、混合物を３７℃にて１５分間インキュベートする。１５分間８０℃に加熱することによって反応を停止させる。処理したＤＮＡをついで標準的なシークエンシング反応、例えばＵＳＢ Ｔ７−ＳｅｑｕｅｎａｓｅＶ２．０ＰＣＲ産物シークエンシングキットにおいて鋳型として用い、シークエンシングラダーの質を調べて、増幅ＤＮＡからの残留ヌクレオチド三リン酸を分解する効果を決定する。ＰＣＲ増幅ＤＮＡ中の残留ヌクレオチド三リン酸が効果的に分解されない場合、ＰＣＲ反応からのヌクレオチド三リン酸がシークエンシング反応においてｄＮＴＰｓ／ｄｄＮＴＰｓの比を変え、かすかなシグナルを生じる。本出願のためにＵＳＢコーポレーションによって商業的に供給された、独立に処方されたＳＡＰは、ＰＣＲ増幅産物の標準的なプレシークエンシング加工において５μｌの反応産物当たり０．１から５ユニット、好ましくは１−３ユニット、より好ましくは約２ユニットで、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ中の残留ヌクレオチド三リン酸を分解するために使用できる。定量的には、ＳＡＰと本発明の他のホスファターゼの機能活性と半減期は、ＥｘｏＩに関して上で説明したものと同様にして断続的な段階希釈分析によって確認される。１μｌ当たり２ユニットのＳＡＰを含む元のＳＡＰ組成物を調製し、１μｌの元の未希釈のＳＡＰ組成物とその５つの段階希釈を別個に移送して、除去される残留ヌクレオチド三リン酸を有する（好ましくは残留プライマーを分解するように前処理され又は同時処理された）コントロールＰＣＲ反応産物の５μｌ試料を分離し、酵素によってヌクレオチド三リン酸を分解させる。ついで、シークエンシングを実施して配列ラダーを前のようにして比較する。配列ラダー又はレーンを調べる際、２００を越える識別可能な塩基を持つＤＮＡシークエンシングラダーの最初の５０塩基が前の希釈度におけるよりも実質的にわずかになった最初の希釈度が、その希釈度で酵素活性が降下したことを示している。これは「降下希釈」と呼ばれ、次の時点で、酵素の半減期及び機能活性を決定するための測定バー又はベースラインとして使用される。特定の温度での貯蔵後の幾つかの時点、例えば２４時間、２、３、５、６、１４、２１、３０、６０、９０等の日の各々において、同様な段階希釈分析が、元の保存組成物の一部について実施され、「降下希釈」が再び確認される。ついで、ＳＡＰに対する半減期が、ＥｘｏＩに対して上に説明したものと同様にして決定される。
【００２０】
例えば、１μｌ当たり２ユニットのＳＡＰを含む元のＳＡＰ組成物を調製し、上記のようにして段階希釈分析を実施する。時間ゼロでの降下希釈が１／３２希釈度であると見出される。ついで、組成物を例えば１週間の期間４℃にて保存する。ついで、保存した組成物に別の段階希釈分析を施して、降下希釈が１／３２希釈度のままである。段階希釈分析を続いて２、３、４、５等の週に実施し、第５週の試験で、初めて、降下希釈が１／１６希釈度であることが見出される。この例では、半減期の時点には第４週と第５週の間で到達することが分かる。よって、この例では、組成物中のホスファターゼ酵素は、組成物が４℃で４週間保存された場合にその機能活性の少なくとも５０％を保持している。
【００２１】
（好適な組成物の特性）
本発明はヌクレアーゼとホスファターゼの双方を含有する単一の組成物であって、特定の条件下、例えば−２０℃、０℃、＋４℃、又は室温（例えば＋２０℃）に保持され又は保存された場合に、各及び／又は双方の酵素の機能活性の、５０％未満、好ましくは４０％未満、好ましくは３０％未満、好ましくは２０％未満、好ましくは１０％未満が、２４時間当たり、より好ましくは１週間当たり、更により好ましくは１ヶ月当たり、最も好ましくは４ヶ月当たりに失われる組成物に関する。
【００２２】
組成物中のホスファターゼは、好ましくは、該組成物を４℃で、２４、より好ましくは３６、より好ましくは４８、より好ましくは６０、より好ましくは７２、より好ましくは９６時間保存した場合にその機能活性の少なくとも５０％を保持する。組成物中のヌクレアーゼは、好ましくは該組成物を４℃で、２、より好ましくは３、より好ましくは５、より好ましくは７、より好ましくは９、より好ましくは１２、より好ましくは１４日保存した場合にその機能活性の少なくとも５０％を保持する。本発明組成物は、好ましくは、それぞれが組成物の性能を妨害する可能性のあるデオキシリボ核酸、核酸、増幅されたＤＮＡ、ヌクレオチド三リン酸、オリゴヌクレオチド、及びプライマーを実質的に含まない。
【００２３】
好ましくは、ヌクレアーゼは熱不安定性の、好ましくは一本鎖エキソヌクレアーゼ、好ましくはエキソヌクレアーゼ７又はＲｅｃＪ、最も好ましくはＥｘｏＩであり、ホスファターゼは好ましくは熱不安定性の、好ましくは真核ホスファターゼ、好ましくはバクテリア又は動物ホスファターゼ、好ましくは哺乳動物ホスファターゼ、最も好ましくはＳＡＰである。本発明組成物は、好ましくは、２μｌの組成物のアリコートを５μｌのＰＣＲ反応産物（標準的なＰＣＲ法によって増幅されたＤＮＡ）に接触させ、残留プライマー及びヌクレオチド三リン酸が、増幅された産物の効果的なシークエンシングを可能にするレベルまで減少させることによって、効果的に不活性化され又は分解されるように、製剤される。ＥｘｏＩ、ＳＡＰ及び他の物質の量と濃度は、増幅されたＤＮＡ産物の特定の性質と量、残留プライマー及びヌクレオチド三リン酸の性質と量、加工反応の時間と温度、及び使用するシークエンシング法に応じて変わりうる。本発明の実施態様はまた所望の結果を達成するのに必要な組み合わせされた組成物を異なった容積又は割合で加えることを可能にする。更なる実施態様は、ＥｘｏＩのようなヌクレアーゼとＳＡＰのようなホスファターゼを含む組成物を脱水又は乾燥させ（又は場合によっては凍結乾燥させ）ることを可能にし、よってせいぜい１０重量％の水を含有し、これら濃縮又は乾燥形態を増幅ＤＮＡに接触させる。
【００２４】
本発明は単一の組成物中にヌクレアーゼとホスファターゼを提供する。組成物は、核酸合成反応の産物中に存在する残留物質を分解するために使用することができ、その例はこの段落に参照され、又は記載される。本方法は反応産物を組成物に接触させる（例えば混合）ことを含む。組成物は、好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡ増幅反応、好ましくはＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ増幅反応、あるいは別に等温増幅反応後に、残留プライマー及び残留ヌクレオチド三リン酸を除去又は分解するために使用することができる。組成物はまた核酸（好ましくはＤＮＡ）複製反応、例えばプライマー開始ＲＮＡ又はＤＮＡ合成を除去するために使用することができる。反応産物における残留物質のそのような分解後、除去された反応産物は、次の分析、例えばＤＮＡシークエンシング、やや好ましくはＳＮＰ（一塩基変異多型）解析（一ヌクレオチドの差異を決定する方法である）、その他の遺伝子解析（遺伝子発現を含む）又は他の核酸解析で、残留プライマー、残留オリゴヌクレオチド及び／又は残留ヌクレオチド三リン酸の除去が有用であるもの、例えば複数の塩基付加、欠失又は差異の解析において使用することができる。
【００２５】
本発明組成物はまた更なるヌクレアーゼ及び／又はホスファターゼと共に、又はこれらを伴わないで、選択性及び／又は多目的浄化（ｃｌｅａｎ−ｕｐ）組成物として作用して、増幅反応産物以外の試料、例えばバイオプシー物質、血液試料、体液のような生物学的試料、又は生物学的物質の生産に使用される中間体を浄化するために使用することができる。かかる場合、ヌクレアーゼとホスファターゼを含有する組成物は物質試料中に存在する前もって選択された核酸を分解する。試料は、生物学的物質、例えばヒトの身体から単離されたバイオプシー物質のような物質でありうる。
【００２６】
本発明の開示に関して、参照される安定性は一般に液体状態か乾燥状態の何れかに保持された組成物に関する。しかし、ＥｘｏＩとＳＡＰの組み合わせを凍結させて保存できることが理解される。この場合、十分に速やかに凍結され、十分に低温に保持される場合、ＥｘｏＩとＳＡＰの組成物は更に長期の期間、例えば少なくとも６、１２、２４、３６、６０又は１００ヶ月の間、その機能活性又は性能に潜在的に殆ど低下がないまま維持できる。好ましくは、本発明組成物は、２５℃、２０℃、１８℃、１０℃、４℃、０℃、−１０℃、−２０℃、−３０℃、−４０℃、−６０℃、−８０℃、−１００℃、−１５０℃又は−１９０℃での２４時間、又は２、３、４、５、８、１０、１５、２０、３０、４０、６０、８０、１００、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、３００、３６０、５００、１０００、１５００、２００及び／又は３０００日の間の組成物の保存後、各酵素に対するその機能活性の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０及び／又は９０％を保持する。本発明組成物は当該分野で知られているようにして包装され、保存され、運搬され、使用される。
【００２７】
（好適な組成物）
本発明組成物の唯一の必須の成分は酵素、つまりヌクレアーゼとホスファターゼである。ここに記載する他の成分は好ましいが、任意のものである。ヌクレアーゼは、上述のように、好ましくはエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）であり、ホスファターゼは好ましくはアルカリホスファターゼ、好ましくはエビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）である。酵素の組み合わせは乾燥形態又はより好ましくは液体、好ましくは水溶液として供給され得る。好適な水溶液はここに記載される。好ましさに劣るが、酵素はより濃縮された溶液、例えばここに記載の溶液よりも少なくとも２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、３０、５０、８０、１００、１５０、２００、３００、５００、８００、１０００、２０００、５０００、８０００、又は１００００倍濃縮された溶液（任意成分を含むか含まない）で提供でき、又はずっと乾固するまで濃縮されうる。希釈溶液もまた提供できる。本発明組成物において、任意の好適な又は好適さが劣る濃度又は範囲の任意の成分が、任意の好適な又は好適さが劣る濃度又は範囲の任意の他の成分又は成分群と組み合わせることができる；成分又は濃度又は範囲の全て又は任意のものが最も好ましいものであることは要求されないし必要でもない。
【００２８】
好ましくは、組成物は液体、好ましくは水性の、ヌクレアーゼとホスファターゼ（好ましくはアルカリホスファターゼ）の組み合わせ、好ましくはＥｘｏＩとＳＡＰであり、ここでＳＡＰに対するＥｘｏＩのユニット比は１：５０００から５０００：１、より好ましくは１：５００から５００：１、更により好ましくは１：５０から５０：１、最も好ましくは１：１０から１０：１であり、全蛋白濃度は、１μｇ／ｍｌから２００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１０μｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌ、更により好ましくは１００μｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは１．０ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの範囲である。かかるＥｘｏＩとＳＡＰの組み合わせでは、５μｌのＰＣＲ増幅ＤＮＡに接触されるＥｘｏＩのユニットは０．０１から１００ユニットのＥｘｏＩ、より好ましくは０．１から３０ユニットのＥｘｏＩ、更により好ましくは１から１５ユニットのＥｘｏＩ、最も好ましくは１０±４ユニットのＥｘｏＩの範囲であり、５μｌのＰＣＲ増幅反応産物はまた好ましくは０．０１から１００ユニットのＳＡＰ、より好ましくは０．１から１０ユニットのＳＡＰ、更により好ましくは０．５から５ユニットのＳＡＰ、最も好ましくは２±１ユニットのＳＡＰに接触させられる。
場合によっては、他のアルカリホスファターゼ、例えばウシ腸アルカリホスファターゼをＳＡＰの代わりに使用することができる。本発明組成物中のヌクレアーゼの濃度は１マイクロリットル当たり好ましくは少なくとも０．０１、０．１、１、２、又は５ユニットのヌクレアーゼ酵素である。本発明組成物中のホスファターゼの濃度は１マイクロリットル当たり好ましくは少なくとも０．０１、０．１、１、２、又は５ユニットのホスファターゼ酵素である。
【００２９】
本発明組成物において、好ましくはｐＨは４．０から１２．０、より好ましくはｐＨ６．０から１０．０、より好ましくは７．０から９．０、より好ましくは８未満、より好ましくは７から８、最も好ましくはｐＨ７．５±０．２又はｐＨ７．５±０．３で、好ましくは緩衝液によって制御される。本発明組成物は、場合によっては、また好ましくは、ゼロから２５０ｍＭ、より好ましくは５ｍＭから１００ｍＭ、更により好ましくは１５ｍＭから５０ｍＭ、最も好ましくは２５±５ｍＭの濃度の、好ましくはｐＨ７．５からｐＨ８．５又は上述のｐＨ範囲で、好ましくはＴｒｉｓ−ＨＣｌの、緩衝液を含んでもよい。他の緩衝液、例えば限定するものではないが、有機緩衝液、例えばＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＣＩＮＥ等々、あるいは無機緩衝液、例えばホスフェート又はアセテートを使用することができる。緩衝液又は他の薬剤を、溶液のｐＨを制御し、よって酵素の安定性を増加させるために加えることができる。
【００３０】
本発明組成物は、場合によっては、また好ましくは、還元剤、例えば限定するものではないが、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又は２−メルカプトエタノールを；好ましくはゼロから１００ｍＭ、より好ましくは０．１ｍＭから５０ｍＭ、更により好ましくは０．５から１０ｍＭ、最も好ましくは１．０±０．２ｍＭで含んでもよい。還元剤は酵素の安定性に悪影響を及ぼすかも知れない酵素の酸化を制限するために加えることができる。
【００３１】
本発明組成物は、場合によっては、また好ましくは、一価イオン、例えば限定するものではないが、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋、Ｃｌ−、Ｂｒ−又はアセテート（ＨＣＯ２−）を、ゼロから５００ｍＭ、より好ましくは０．５ｍＭから１００ｍＭ、更により好ましくは１ｍＭから５０ｍＭ、最も好ましくは１から１０ｍＭの濃度で含んでもよい。一価イオンの存在は不活性化を生じるかもしれない蛋白質の沈殿を防止することができる；キレート剤のような他の化合物の添加はしばしば微量の一価イオンの添加を生じる。
【００３２】
本発明組成物は、場合によっては、また好ましくは、錯化又はキレート剤、例えば限定するものではないが、Ｎａ２−ＥＤＴＡ又はＮａ２−ＥＧＴＡを、ゼロから１００ｍＭ、より好ましくは０．０５ｍＭから１０ｍＭ、更により好ましくは０．１から２ｍＭ、最も好ましくは０．５±０．１ｍＭの濃度で含んでもよい。キレート剤は、存在すればアミノ酸側鎖化学における所定の条件下での変化を触媒して、酵素のアミノ酸骨格を破壊し、それによって活性を低減させ得る金属イオンを封鎖するために蛋白質溶液にしばしば加えられる。
【００３３】
本発明組成物は、場合によってはアミノ酸系担体（キャリア）又は安定剤、例えば限定するものではないが、ウシ血清アルブミン及びポリエルリジンを、好ましくはゼロから１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０１から１０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．１から１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で含んでもよい。
【００３４】
本発明組成物は、場合によっては、二価イオン、例えば限定するものではないが、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋及び／又はＣａ２＋を、好ましくはゼロから２００ｍＭ、より好ましくはゼロから２０ｍＭ、より好ましくは０．０００１ｍＭから５ｍＭ、最も好ましくは０．００２から１．０ｍＭの濃度で含んでもよい。二価イオンは、ある種の蛋白質、例えばホスファターゼの効果的な酵素活性に対して好ましく又は必要とされる。微量な量の二価イオンは組成物に他の物質を添加することによって存在しうる；ＳＡＰの通常の組成物は、酵素に伴って組成物に入りうるＺｎ２＋及びＭｇ２＋の双方を含む。
【００３５】
本発明組成物は、場合によっては、洗浄剤（単独で又は組み合わせて）、例えば限定されるものではないが、酵素を安定させ又は性能を向上させるために加えられるノニオン性、イオン性又は双性イオン性洗浄剤を含んでもよい。例えば、ゼロから２０％ｖ／ｖ、より好ましくは０．０１％から５％ｖ／ｖ、最も好ましくは０．１％から１．０％ｖ／ｖでのＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００又はＴｗｅｅｎ２０である。同様に、ＳＤＳを、単独に又は他の洗浄剤と組み合わせて、ゼロから５％ｖ／ｖ、より好ましくは０．０００１％から１％ｖ／ｖ、最も好ましくは０．００５％から０．１％ｖ／ｖ加えてもよい。
【００３６】
本発明組成物は、場合によっては、性能を向上させる他の化学薬品、例えば限定するものではないが、ＤＭＳＯを、ゼロから５０％ｖ／ｖ、より好ましくは０．００１％から１０％ｖ／ｖ、最も好ましくは０．０１％から１％ｖ／ｖで含んでもよい。
【００３７】
本発明組成物は、場合によっては、デキストラン、例えばＤｅｘｔｒａｎ Ｔ−１０又はＤｅｘｔｒａｎ Ｔ５００又は他の多糖を、ゼロから５０％ｖ／ｖ、より好ましくは０．１％から１０％ｖ／ｖ、最も好ましくは１％から５％ｖ／ｖで含んでもよい。
【００３８】
本発明組成物は、場合によっては、酵素安定剤又は結氷を阻害する物質、例えば限定するものではないが、グリセロール、エチレングリコール又はグリシン、好ましくはグリセロールを、好ましくはゼロから９９％ｖ／ｖ、より好ましくは１％から７５％ｖ／ｖ、より好ましくは５％から６５％ｖ／ｖ、より好ましくは２０％から６０％ｖ／ｖ、より好ましくは３５％から５８％ｖ／ｖ、最も好ましくは５０±５％ｖ／ｖで含んでもよい。
【００３９】
本発明組成物は、場合によっては、酵素を安定化させるか、又は乾燥形態の組成物を容易にするグルコース又はマルトースのような単糖類又は二糖類を含んでもよい。単糖類又は二糖類の質量は好ましくは組成物中の蛋白質の質量の、少なくともゼロ、０．１、１、１０、１００、１０００又は１００００、あるいは１０又は１００又は１０００又は１００００倍である。
【００４０】
本発明において最も好ましい組成物は組成物Ｄ及びＥとして以下に記載される。組成物Ｄは手作業でのピペット操作に対して好ましく、組成物Ｅは自動化されたピペット操作に好ましい。組成物Ｄが使用される場合は、シークエンシングの前に残留プライマーとヌクレオチド三リン酸を効果的に分解するために５μｌのＰＣＲ反応産物と組み合わされる。組成物Ｅが用いられる場合、好ましくは５μｌの組成物Ｅが、５−２５μｌ、好ましくは５μｌのＰＣＲ反応産物と組み合わされ、シークエンシング又は他の分析の前に残留プライマーとヌクレオチド三リン酸を効果的に分解する。組成物Ｄ又はＥの何れを用いようと、１０ユニットのＥｘｏＩと２ユニットのＳＡＰを、分解する残留プライマー及び／又はヌクレオチド三リン酸を含む５μｌの産物に送達するのが好ましい。
【００４１】
本発明の更なる側面は以下に証明され、本発明は、本発明の好適な実施態様を記述する次の実施例との関連で更によく理解される。次の実施例は例証のために提供するもので、限定を意図するものではなく、任意成分の他の組み合わせと濃度を含む他のヌクレアーゼ及びホスファターゼ含有組成物が可能であり意図されることが理解されなければならない。
【００４２】
実施例
次の実験においては、５つのヌクレアーゼ／ホスファターゼ組成物を調製した。これを一般にここで組成物Ａ〜Ｅと称する。各組成物の組成と成分濃度は以下に記載する。
【００４３】
組成物Ａは、次の成分：１０ユニット／μｌのエキソヌクレアーゼＩ；２ユニット／μｌのエビアルカリホスファターゼ；２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；０．５ｍＭのＮａ２−ＥＤＴＡ；１ｍＭのＤＴＴ；５０％ｖ／ｖのグリセロールを水中にいれた水性組成物として調製した。ＥｘｏＩとＳＡＰの濃縮原液を２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；０．５ｍＭのＮａ２−ＥＤＴＡ；１ｍＭのＤＴＴ；５０％ｖ／ｖのグリセロールに対して透析した。透析後、酵素を組成物Ａに、組成物Ａの各マイクロリットルが１０ユニットのＥｘｏＩと２ユニットのＳＡＰを含むように組み合わせた。組成物を様々な時間の間、−２０℃、４℃及び＋２５℃で保存した後、表１に示されているように、酵素活性アッセイ並びに酵素機能活性を測定した。
【００４４】
組成物Ｂは、次の成分：１０ユニット／μｌのエキソヌクレアーゼＩ；２ユニット／μｌのエビアルカリホスファターゼ；２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン；１ｍＭのＤＴＴ；１ｍＭのＭｇＣｌ２；０．１ｍＭのＺｎＣｌ２；５０％ｖ／ｖのグリセロールを水中に入れた水性組成物として調製した。ＥｘｏＩとＳＡＰの濃縮原液を２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン；１ｍＭのＤＴＴ；１ｍＭのＭｇＣｌ２；０．１ｍＭのＺｎＣｌ２；５０％ｖ／ｖのグリセロールに対して透析した。透析後、酵素を組成物Ｂに、組成物Ｂの各マイクロリットルが１０ユニットのＥｘｏＩと２ユニットのＳＡＰを含むように組み合わせた。組成物を様々な時間の間、−２０℃、４℃及び＋２５℃で保存した後、表１に示されているように、酵素機能活性を測定した。
【００４５】
組成物Ｃは、次の成分：１０ユニット／μｌのエキソヌクレアーゼＩ；２ユニット／μｌのエビアルカリホスファターゼを；水中で５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３；０．５ｍＭのＮａ２−ＥＤＴＡ；１ｍＭのＤＴＴ；０．５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０；０．５％ｖ／ｖのＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、５０％ｖ／ｖのグリセロール中に処方した水性組成物として調製した。組成物は、市販の保存バッファーに入ったＥｘｏＩとＳＡＰの適量を、組成物Ｃ中に混合することにより製造した。この組成物は従って市販のＳＡＰ組成物から由来する少量のＭｇＣｌ２とＺｎＣｌ２を含んでいた。組成物を様々な時間の間、−２０℃、４℃又は２５℃で保存した後、表１に示されているように、機能活性を測定した。
【００４６】
組成物Ｄは、次の成分：５ユニット／μｌのエキソヌクレアーゼＩ；１ユニット／μｌのエビアルカリホスファターゼを；２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；０．５ｍＭのＮａ２−ＥＤＴＡ；１ｍＭのＤＴＴ；５０％ｖ／ｖのグリセロールに処方した水性組成物として調製した。この組成物は、市販の保存バッファーに入ったＥｘｏＩとＳＡＰの適量を、組成物Ｄ中に混合することにより製造した。この組成物Ｄは従って市販のＳＡＰ組成物から由来する微量のＭｇＣｌ２とＺｎＣｌ２と、ＥｘｏＩ組成物から由来する２−メルカプトエタノールを含んでいる。１０ユニットのＥｘｏＩと２ユニットのＳＡＰを移送するために、この酵素混合物の２μｌの作用容積を用いた。組成物を様々な時間の間、−８０℃、−２０℃、４℃及び２５℃で保存した後、表１に示されているように、酵素機能活性を測定した。凍結及び解凍実験も実施した。
【００４７】
組成物Ｅは、次の成分：２ユニット／μｌのエキソヌクレアーゼＩ；０．４ユニット／μｌのエビアルカリホスファターゼを；２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；０．５ｍＭのＮａ２−ＥＤＴＡ；１ｍＭのＤＴＴ；５０％ｖ／ｖのグリセロールに処方した水性組成物として調製した。この組成物は、市販の保存バッファーに入ったＥｘｏＩとＳＡＰの適量を、組成物Ｅ中に混合することにより製造した。この組成物Ｅは従って市販のＳＡＰ組成物から由来する微量のＭｇＣｌ２とＺｎＣｌ２と、ＥｘｏＩ組成物から由来する２−メルカプトエタノールを含んでいる。１０ユニットのＥｘｏＩと２ユニットのＳＡＰを移送するために、この酵素混合物に対して５μｌの作用容積が、ロボットによるピペット操作によるＰＣＲ反応混合物への添加のために簡便な容積である。組成物を様々な時間の間、−２０℃で保存した後、表１に示されているように、酵素機能活性を測定した。
【００４８】
上記ヌクレアーゼ／ホスファターゼ組成物のそれぞれの機能活性を、様々な記載温度で、上述の記載経過時間後に、以下に更に記載するようにして、決定した。各組成物の試料を適当に除去し、各連続希釈における酵素濃度が前の希釈度のものの半分になるような段階的な１：１希釈を各組成物について行った。組成物Ａ−Ｃに対して、活性の変化がないと仮定して、ＰＣＲ反応産物（酵素組成物１μｌ当たり）へ添加される容積当たりのこれらの酵素当量は：２ユニットのＳＡＰで１０ユニットのＥｘｏＩ；１ユニットのＳＡＰで５ユニットのＥｘｏＩ；０．５ユニットのＳＡＰで２．５ユニットのＥｘｏＩ；０．２５ユニットのＳＡＰで１．２５ユニットのＥｘｏＩ；０．１２５ユニットのＳＡＰで０．６２５ユニットのＥｘｏＩ；及び０．０６２５ユニットのＳＡＰで０．３１２５ユニットのＥｘｏＩであった。これらの量はよって各未希釈組成物、並びに各未希釈の組成物の濃度の１／２、１／４、１／８、１／１６、及び１／３２に希釈した希釈組成物を表すものであった。
【００４９】
これらの段階希釈によって、未処理のＥｘｏＩとＳＡＰストック酵素で作製したものとパラレルである酵素濃度が得られた。ついで、酵素希釈の性能を、ＵＳＢのＴ７−ＳｅｑｕｅｎａｓｅＶ２．０ＰＣＲ産物シークエンシングキットを用い、組成物Ａ、Ｂ及びＣに対してアッセイ当たり１μｌの希釈した組成物を；組成物Ｄに対してアッセイ当たり２μｌの希釈した組成物を；そして組成物Ｅに対してアッセイ当たり５μｌの希釈した組成物を使用して、標準的な性能アッセイによって試験した。
【００５０】
ヌクレアーゼ及びホスファターゼ酵素の機能活性は上述のようにして決定した。各組成物の半減期は、組成物中のヌクレアーゼ（ＥｘｏＩ）又はホスファターゼ（ＳＡＰ）の何れかがその半減期に達した、つまりその機能活性の少なくとも５０％を喪失した時点であった。表にした結果は以下の実施例１の表１にまとめ、更なる結果と詳しい説明は実施例２−５に記載する。
【００５１】
実施例１：−８０℃〜＋２５℃の範囲の温度における組み合わせ組成物Ａ−Ｅについての安定性のデータのまとめ
2004501611.tif 000002
表１中に示された活性半減期は、組成物中のＥｘｏＩ又はＳＡＰの何れかの機能活性が５０％減少するのを観察するのに必要であった保存期間である。
【００５２】
実施例２：組み合わせた組成物中のエキソヌクレアーゼＩ及びエビアルカリホスファターゼ酵素の−２０℃における安定性
予期しないことに、−２０℃での８週間の保存後、組成物Ａ、Ｂ及びＤは、その各コントロール酵素と比較して、エキソヌクレアーゼＩとエビアルカリホスファターゼの何れかの機能活性を有意に保持した。更に一層予期しないことに、製剤時に、ＳＡＰ機能活性の１００％を超える増加が、組成物Ａ及びＤ（該組成物は過剰なＥＤＴＡを含む）の試験において観察された。この試験では、０．２５ユニットだけの市販の製剤化ＳＡＰ（１／８希釈度）を使用して増幅ＰＣＲ ＤＮＡを反応させたときに、ＤＮＡ配列ラダーの底が僅かであった。これは、この量のＳＡＰが使用される場合は、必ずしも全ての増幅反応からの残留ｄＮＴＰｓが分解しなかったことを示している。組成物Ａ又はＤの何れかでＳＡＰをＥｘｏＩと組み合わせた場合は、０．１２５ユニットのみのＳＡＰ（１／１６希釈度）を増幅ＰＣＲ ＤＮＡ産物と反応させるために使用した場合になお強いシークエンシング反応が得られた。ＳＡＰの発表されているキャラクタライゼーション（Ｏｋｓｅｎ等， １９９１）からは、酵素が殆ど全てのその活性を失うことを予期するであろうから、この結果は特に驚くべきことである。組成物Ｂは機能活性の予期しなかった保持を示すが（表１参照）、組成物Ａ及びＤによって示された予期しない活性の増加は示さなかった。組成物Ｅはまた予期しないことに有意な活性の保持を示した（表１参照）。
【００５３】
実施例３：組み合わせた組成物中のエキソヌクレアーゼＩ及びエビアルカリホスファターゼ酵素の＋４℃における安定性
予期しないことに、＋４℃での保存後に、組成物Ａ及び組成物ＤにおいてＳＡＰのかなりの機能活性が保持され、その機能活性の５０％未満が３日で喪失した。（表１参照）。
【００５４】
実施例４：組み合わせた組成物中のエキソヌクレアーゼＩ及びエビアルカリホスファターゼ酵素の＋２５℃における安定性
予期しないことに、＋２５℃での保存後に、組成物Ａ並びに組成物ＤにおいてＳＡＰのかなりの機能活性が保持され、その元の機能活性の２５％ほどもが＋２５℃での一日の保存後に保持された。この活性の保持は、通常の市販組成物中（「Ｓｈｒｉｍｐ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ」， Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ， Ｂｉｏｔｅｃ−Ｍａｃｋｚｙｍａｌ ＡＳ， Ｔｒｏｍｓｏ， Ｎｏｒｗａｙ）に保存される場合ＳＡＰについて報告されているものよりも更に大きいように思われる。
【００５５】
実施例５：組み合わせた組成物Ｄ中のエキソヌクレアーゼＩ及びエビアルカリホスファターゼ酵素の−８０℃における安定性
−８０℃で８週間保存した後、解凍すると、組成物ＤはエキソヌクレアーゼＩもエビアルカリホスファターゼの何れの機能活性についても検出可能な喪失を示さなかった。
【００５６】
上述した最も好適な成分と成分濃度に加えて、本発明に係る組み合わせたヌクレアーゼ／ホスファターゼ組成物は、他の好ましさが劣る成分及び成分濃度を使用して調製することができる。表２は本発明組成物において使用することができる様々な成分と成分濃度をまとめている。表２において、任意の成分の任意の好適な又は好適さが少ない又はより好適な濃度又は範囲は、任意の他の成分の任意の好適な又は好適さが少ない又はより好適な濃度又は範囲と組み合わせることができる；濃度又は範囲の全て又は何れかが同じカラムから生じるということは要求されないし必要でもない。
【００５７】
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【００５８】
これまで記載した本発明の実施態様は好適な実施態様であるが、特許請求の範囲に記載した発明の範囲を逸脱しない限り、これらに変更を加えることができるものと理解されなければならない。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004501611.tif 000035