(57)【要約】本発明は、真菌特異的な標的タンパク質および核酸に結合する化合物、および標的タンパク質と結合あるいは相互作用したときに、真菌の増殖を阻害することができる化合物を検出し同定するためのスクリーニング法、培養中の真菌の増殖を妨げるかあるいは阻害する方法、哺乳動物中の真菌の増殖を妨げるかあるいは阻害する方法、およびこのような核酸および／またはタンパク質配列を使用して病原性菌類を研究する方法を提供する。真菌Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓを阻害することが特に好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
必須タンパク質との相互作用に対して抗真菌性候補化合物をスクリーニングあるいは試験する方法であって、
ａ）ＲＰＣ３４、ＰＯＰ３、ＴＦＡ２、ＮＡＢ２、ＭＰＴ１、ＭＴＲ２、ＢＯＳ１、ＰＯＬ３０、ＹＭＲ１３１Ｃ、ＳＱＴ１、ＭＴＷ１、ＴＦＢ１、ＳＰＣ９８、ＢＦＲ２、ＲＮＡ１、ＧＣＤ７、ＳＫＩ６、ＮＩＰ１、ＬＣＰ５、ＮＣＥ１０３、ＥＣＯ１、ＯＲＣ２、ＣＮＳ１、ＹＰＤ１、ＴＩＭ１０およびＳＲＢ４からなる群から選択される必須タンパク質を提供すること、
ｂ）１以上の試験化合物を提供すること、
ｃ）前記必須タンパク質と前記１以上の試験化合物を接触させること、および
ｄ）試験化合物と前記必須タンパク質の相互作用を決定することを含む方法。
【請求項２】
前記必須タンパク質が断片、機能保存型変異体、必須タンパク質の断片または活性断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
必須タンパク質の活性を調節するための抗真菌性候補化合物をスクリーニングあるいは試験する方法であって、
ａ）ＲＰＣ３４、ＰＯＰ３、ＴＦＡ２、ＮＡＢ２、ＭＰＴ１、ＭＴＲ２、ＢＯＳ１、ＰＯＬ３０、ＹＭＲ１３１Ｃ、ＳＱＴ１、ＭＴＷ１、ＴＦＢ１、ＳＰＣ９８、ＢＦＲ２、ＲＮＡ１、ＧＣＤ７、ＳＫＩ６、ＮＩＰ１、ＬＣＰ５、ＮＣＥ１０３、ＥＣＯ１、ＯＲＣ２、ＣＮＳ１、ＹＰＤ１、ＴＩＭ１０およびＳＲＢ４からなる群から選択される必須タンパク質を提供すること、
ｂ）１以上の試験化合物を提供すること、
ｃ）前記必須タンパク質と前記１以上の試験化合物を接触させること、および
ｄ）前記試験化合物の存在下で前記必須タンパク質の活性の調節を決定することを含む方法。
【請求項４】
前記必須タンパク質が断片、機能保存型変異体、必須タンパク質の断片または活性断片を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
細胞の培養物中の必須タンパク質との相互作用に対して抗真菌性候補化合物をスクリーニングあるいは試験する方法であって、
ａ）ＲＰＣ３４、ＰＯＰ３、ＴＦＡ２、ＮＡＢ２、ＭＰＴ１、ＭＴＲ２、ＢＯＳ１、ＰＯＬ３０、ＹＭＲ１３１Ｃ、ＳＱＴ１、ＭＴＷ１、ＴＦＢ１、ＳＰＣ９８、ＢＦＲ２、ＲＮＡ１、ＧＣＤ７、ＳＫＩ６、ＮＩＰ１、ＬＣＰ５、ＮＣＥ１０３、ＥＣＯ１、ＯＲＣ２、ＣＮＳ１、ＹＰＤ１、ＴＩＭ１０およびＳＲＢ４からなる群から選択される前記必須タンパク質を発現する細胞の培養物中に必須タンパク質を提供すること、
ｂ）１以上の試験化合物を提供すること、
ｃ）前記細胞の培養物と前記１以上の試験化合物と接触させること、および
ｄ）前記試験化合物と前記必須タンパク質の相互作用を決定することを含む方法。
【請求項６】
前記細胞の培養物が細菌細胞、真菌細胞、酵母菌細胞または哺乳動物細胞を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞の培養物が組み換え細胞を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記必須タンパク質の発現または機能が低下するかあるいはブロックされるとき、前記必須タンパク質を発現している真菌の増殖率が阻害される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記必須タンパク質の発現または機能が低下するかあるいはブロックされるとき、前記必須タンパク質を発現している真菌の生存能力が低下する、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記必須タンパク質が断片、機能保存型変異体、必須タンパク質の断片または活性断片を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
細胞の培養物の増殖または生存能力に及ぼす効果に対して抗真菌性候補化合物をスクリーニングあるいは試験する方法であって、
ａ）ＲＰＣ３４、ＰＯＰ３、ＴＦＡ２、ＮＡＢ２、ＭＰＴ１、ＭＴＲ２、ＢＯＳ１、ＰＯＬ３０、ＹＭＲ１３１Ｃ、ＳＱＴ１、ＭＴＷ１、ＴＦＢ１、ＳＰＣ９８、ＢＦＲ２、ＲＮＡ１、ＧＣＤ７、ＳＫＩ６、ＮＩＰ１、ＬＣＰ５、ＮＣＥ１０３、ＥＣＯ１、ＯＲＣ２、ＣＮＳ１、ＹＰＤ１、ＴＩＭ１０およびＳＲＢ４からなる群から選択される必須タンパク質を発現する細胞の培養物中に必須タンパク質を提供すること、
ｂ）１以上の試験化合物を提供すること、
ｃ）前記細胞の培養物と前記１以上の試験化合物と接触させること、および
ｄ）前記細胞の培養物の増殖または生存能力に対する効果を決定することを含む方法。
【請求項１２】
前記細胞の培養物が真菌細胞または酵母菌細胞を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞の培養物が組み換え細胞を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記必須タンパク質の発現または機能が低下するかあるいはブロックされるとき、前記必須タンパク質を発現している真菌の増殖率が阻害される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記必須タンパク質の発現または機能が低下するかあるいはブロックされるとき、前記必須タンパク質を発現している真菌の生存能力が低下する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記必須タンパク質が断片、機能保存型変異体、前記必須タンパク質の断片または活性断片を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
ヒト以外の動物中における必須タンパク質との相互作用に対して抗真菌性候補化合物をスクリーニングあるいは試験する方法であって、
ａ）ヒト以外の動物に、ＲＰＣ３４、ＰＯＰ３、ＴＦＡ２、ＮＡＢ２、ＭＰＴ１、ＭＴＲ２、ＢＯＳ１、ＰＯＬ３０、ＹＭＲ１３１Ｃ、ＳＱＴ１、ＭＴＷ１、ＴＦＢ１、ＳＰＣ９８、ＢＦＲ２、ＲＮＡ１、ＧＣＤ７、ＳＫＩ６、ＮＩＰ１、ＬＣＰ５、ＮＣＥ１０３、ＥＣＯ１、ＯＲＣ２、ＣＮＳ１、ＹＰＤ１、ＴＩＭ１０およびＳＲＢ４からなる群から選択される必須タンパク質を発現している細胞または細胞群を提供すること、
ｂ）１以上の試験化合物を提供すること、
ｃ）前記ヒト以外の動物と前記１以上の試験化合物と接触させること、および
ｄ）前記試験化合物と前記必須タンパク質の相互作用を決定することを含む方法。
【請求項１８】
前記試験化合物と前記必須タンパク質の相互作用が、前記必須タンパク質の発現または機能を低下させるかあるいは害するとき、前記必須タンパク質を発現している真菌の増殖率が阻害される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記試験化合物と前記必須タンパク質の相互作用が前記必須タンパク質の発現または機能を低下させるかあるいは害するとき、前記必須タンパク質を発現している真菌の生存能力が低下する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記必須タンパク質が断片、機能保存型変異体、必須タンパク質の断片または活性断片を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
ヒト以外の動物中で必須タンパク質を発現している細胞または細胞群の増殖または生存能力に対する、抗真菌性候補化合物の効果をスクリーニングあるいは試験する方法であって、
ａ）ヒト以外の動物に、ＲＰＣ３４、ＰＯＰ３、ＴＦＡ２、ＮＡＢ２、ＭＰＴ１、ＭＴＲ２、ＢＯＳ１、ＰＯＬ３０、ＹＭＲ１３１Ｃ、ＳＱＴ１、ＭＴＷ１、ＴＦＢ１、ＳＰＣ９８、ＢＦＲ２、ＲＮＡ１、ＧＣＤ７、ＳＫＩ６、ＮＩＰ１、ＬＣＰ５、ＮＣＥ１０３、ＥＣＯ１、ＯＲＣ２、ＣＮＳ１、ＹＰＤ１、ＴＩＭ１０およびＳＲＢ４からなる群から選択される必須タンパク質を発現している細胞または細胞群を提供すること、
ｂ）１以上の試験化合物を提供すること、
ｃ）前記試験動物と前記１以上の試験化合物と接触させること、および
ｄ）前記細胞または細胞群の増殖または生存能力に対する効果を決定することを含む方法。
【請求項２２】
前記必須タンパク質の発現または機能が低下するかあるいはブロックされるとき、前記必須タンパク質を発現している真菌の増殖率が阻害される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記必須タンパク質の発現または機能が低下するかあるいはブロックされるとき、前記必須タンパク質を発現している真菌の生存能力が低下する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記必須タンパク質が断片、機能保存型変異体、前記必須タンパク質の断片または活性断片を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
活性の調節が真菌遺伝子の転写の調節を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項２６】
前記試験化合物と前記必須タンパク質を結合させることによって、あるいは前記試験化合物の存在下における前記必須タンパク質の活性によって相互作用を評価する、請求項５に記載の方法。
【請求項２７】
前記試験化合物と前記必須タンパク質を結合させることによって、あるいは前記試験化合物の存在下における前記必須タンパク質の活性によって相互作用を評価する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
必須タンパク質との結合に対して抗真菌性候補化合物をスクリーニングあるいは試験する方法であって、
ａ）ＲＰＣ３４、ＰＯＰ３、ＴＦＡ２、ＮＡＢ２、ＭＰＴ１、ＭＴＲ２、ＢＯＳ１、ＰＯＬ３０、ＹＭＲ１３１Ｃ、ＳＱＴ１、ＭＴＷ１、ＴＦＢ１、ＳＰＣ９８、ＢＦＲ２、ＲＮＡ１、ＧＣＤ７、ＳＫＩ６、ＮＩＰ１、ＬＣＰ５、ＮＣＥ１０３、ＥＣＯ１、ＯＲＣ２、ＣＮＳ１、ＹＰＤ１、ＴＩＭ１０およびＳＲＢ４からなる群から選択される必須タンパク質を提供すること、
ｂ）１以上の試験化合物を提供すること、
ｃ）前記必須タンパク質と前記１以上の試験化合物と接触させること、および
ｄ）試験化合物と前記必須タンパク質の結合を決定することを含む方法。
【請求項２９】
必須タンパク質をコードしている遺伝子の調節転写に対して抗真菌性候補化合物をスクリーニングあるいは試験する方法であって、
ａ）ＲＰＣ３４、ＰＯＰ３、ＴＦＡ２、ＮＡＢ２、ＭＰＴ１、ＭＴＲ２、ＢＯＳ１、ＰＯＬ３０、ＹＭＲ１３１Ｃ、ＳＱＴ１、ＭＴＷ１、ＴＦＢ１、ＳＰＣ９８、ＢＦＲ２、ＲＮＡ１、ＧＣＤ７、ＳＫＩ６、ＮＩＰ１、ＬＣＰ５、ＮＣＥ１０３、ＥＣＯ１、ＯＲＣ２、ＣＮＳ１、ＹＰＤ１、ＴＩＭ１０およびＳＲＢ４からなる群から選択される必須タンパク質をコードしている遺伝子を提供すること、
ｂ）１以上の試験化合物を提供すること、
ｃ）前記遺伝子と前記１以上の試験化合物と接触させること、および
ｄ）前記試験化合物の存在下で、前記必須タンパク質の前記遺伝子の転写の調節を決定することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（優先権）
本出願は、その全容が参照によってここに組み込まれている、２０００年６月２９日に出願された仮特許出願第６０／２１５，１６４号、および２０００年８月１０日に出願された仮特許出願第６０／２２４，４５７号からの米国特許法第１１９条（３５Ｕ．Ｓ．Ｃ§１１９）の下の優先権を主張するものである。
【０００２】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓによる感染などの真菌感染の治療において使用される、抗真菌性化学物質および薬剤をスクリーニング、単離、および開発する際の真菌殺傷性の標的の使用を包含している。本発明は、真菌殺傷性の標的を決定する方法を包含している。このような真菌殺傷性標的は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから単離され、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓなどの他の真菌中に存在することが示されており、Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの両方に必須であり真菌特異的であることが示されているような核酸配列によってコードされている、核酸およびタンパク質配列によって包含される。必須である真菌特異的核酸およびタンパク質配列は、病原性菌類または真菌を研究する際に使用することもできる。
【０００３】
【従来の技術】
真菌は、その大部分が遊離生活性である、微生物の１つの明確な鋼である。真菌は、核膜、ミトコンドリアおよび小胞体を含む真核生物である。さらに真菌は非運動型であり、クロロフィルを含まず、胞子（すなわち、酵母菌、カビ、マッシュルームおよび錆菌）から増殖することはない。通常その細胞構造は、マンナン、グルカンおよびキチンの固い細胞壁、およびエルゴステロールのパーセンテージが高い細胞質膜を含む。真菌のサイズおよび形態は、ＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種のような単形性酵母菌、およびＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓのような二形性真菌から、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種のような糸状真菌までさまざまである。
【０００４】
哺乳動物の病原体であると一般的にみなされている細菌とは対照的に、真菌は植物の病原体となる傾向がある。しかしながら、皮膚糸状菌（たとえば、「水虫」の原因）の充分に認識されている群に加えて、真菌のますます多くの群が、傷ついた個体においてのみ疾患を生み出す、日和見的なヒト病原体として働くことができることが分かっている。個体群が老化し、さらに免疫が傷ついた患者、たとえば後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の患者、癌の化学療法または免疫抑制の治療（たとえば、コルチコステロイドを用いる治療）を受けている患者、臓器移植を受けている患者の数が増大する結果として、真菌感染の発生率が急速に高まっている。
【０００５】
真菌は多くの異なる組織に寄生する。大部分の感染は、皮膚、粘膜または呼吸上皮のコロニー化によって始まる。表在性真菌および皮下の病原体が、皮膚の無痛性病変を引き起こす。上皮中の機械的な破断によって、最初の表面壁の通過が行われる。大部分の真菌は好中菌によって容易に殺傷されるが、いくつかの種は食細胞による殺傷に耐性があり、通常の場合健康である個体を感染させる可能性がある。最も病毒性である真菌は全身性の感染、通常の場合健康である個体において根深い内臓感染をもたらす進行性疾患を引き起こす。（Ｓｈｅｒｒｉｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｊ．Ｒｙａｎ，ｅｄ．，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，１９９４をたとえば参照のこと）。
【０００６】
北アメリカの主要な真菌病原体は、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ種などがあるが、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種に限られない（Ｍｅｄｉｃａｌｌｙ Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ Ｆｕｎｇｉ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｖｉｓｅ Ｈ．Ｌａｒｏｎｅ，Ｅｄ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）。酵母菌Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）は、ヒトにおいて最も勢力のある真菌病原体の１つである。その酵母菌は医療システムの金銭的および理論的負担の原因であり、その調達者は、多様なスペクトルの免疫が傷つけられた宿主に日和見的に感染する酵母菌の能力のために、今日の社会で急速に増大している患者の個体群となっている。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓは呼吸管、胃腸管、および女性の生殖管中における粘膜の正常な叢のメンバーであるが、このような場所において大勢を占める可能性があり（たとえば糖尿病を有する患者、あるいはコルチコステロイドを使用する患者において、抗菌性抗生物質を用いて治療するとき）、病的な状態と関連がある可能性がある。さらに、ほぼすべてのＨＩＶ−陽性個体は、発達性の勢力のあるＡＩＤＳが発現する前に、Ｃａｎｄｉｄａによる感染で苦しむ。
【０００７】
細胞仲介の免疫がブロックされる場合は特に、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓが進行性の全身性疾患を引き起こすことがある。１９９４年、白血病で苦しんでいるか、あるいは臓器移植を受けている約３０％の患者に全身性のＣａｎｄｉｄａ感染が現れ、その３０％の患者は、感染に屈したと推定されている。
【０００８】
わずか一握りの物質が、真菌に対して活性がある。任意の病原性真菌によって引き起こされる生命を脅かす疾患に関しては、アンホテリシンＢが選択される物質である。しかしながらこの薬剤は、熱、呼吸困難および頻脈などの多数の重度の副作用と関連があり、腎性毒性のために患者の生存期間にわたって用量が制限される。併用的にしばしば使用される物質は、ヌクレオシド類似体であるフルシトシンであり、耐性が早急に現れるために、他の物質と独立にフルシトシンを使用することはできない。フルシトシンを用いる治療の厄介な影響には白血球低下症、血小板低下症、発疹、悪心、嘔吐、下痢および重度の全腸炎がある。
【０００９】
患者の生命が脅かされない状態では、ブラストミセス症、ヒストプラスマ症、またはコクシジオイデス症用の長期の治療物質として、ケトコナゾールを使用することができる。表在性の真菌感染を治療する際には、フルコナゾールにも重要な役割がある。両者の化合物は同じクラス、トリアゾール類からのものであり、細胞増殖抑制性である。耐性の出現および肝臓毒性によって、フルコナゾールおよびケトコナゾールなどの、トリアゾール類の使用が制限される。最新のトリアゾール、イトラコナゾールは、フルコナゾールと同様の薬物動態および活性のスペクトルを有する。生命を脅かす真菌感染、または根深い真菌感染用に使用することができるアゾールは存在しない。これらは、Ｃａｎｄｉｄａ種などの真菌のコロニー化を減らす際に、さらに表在性真菌症を治療するためのみに有効である。
【００１０】
細胞壁の一成分であるエルゴステロールを、直接的あるいは間接的に攻撃することによって、あらゆる主要な抗真菌物質が働く。アンホテリシンＢおよびニスタチンのような他のポリエンマクロライド化合物は、細胞膜中のエルゴステロールと相互作用し、膜の浸透性を高める孔またはチャンネルを形成する。突然変異菌株におけるアンホテリシンＢに対する耐性には、それらの細胞膜中のエルゴステロールの濃度の低下が伴う。イミダゾールおよびトリアゾールは、ミクロソームのシトクロームＰ４５０−依存性酵素系である、ステロール１４−‘’デメチラーゼを阻害する。したがってイミダゾールおよびトリアゾールは、細胞質膜に関するエルゴステロールの生合成を害し、１４−‘’メチルステロールの蓄積をもたらし、これがいくつかの膜結合酵素系を害する（Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｅｉｇｈｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９０を参照のこと）。
【００１１】
ニスタチン、アンホテリシンＢ、フルシトシンおよびさまざまなアゾールをすべて使用して、経口性および全身性Ｃａｎｄｉｄａ感染が治療されている。しかしながら、経口的に投与されるニスタチンは腸内での治療に限られ、全身性の治療には適用されず、フルシトシンに対する耐性が非常に高いので、他の薬剤と組み合わせてのみ、それが使用される。生命を脅かすいくつかの全身性の感染は、アゾールまたはアンホテリシンＢを用いる治療の影響を受けやすい。最近数年間アゾールは、このような感染を治療するために使用されている最も首尾の良い薬剤であるが、アゾールは比較的ゆっくりと働き、数ヶ月間摂取しなければならず、殺真菌性ではなく静真菌性である。このようなアゾール抗真菌物質は、アンホテリシンＢと比べて著しく低い毒性を示し、その作用機構、およびいくつかの酵素中でのシトクロームＰ４５０配合群の不活性化によって、身体のシトクロームＰ４５０酵素によって新陳代謝される他の薬剤を同時に摂取している患者における、アゾール抗真菌物質の使用が除外される。
【００１２】
アゾールを広く使用することによって、Ｃａｎｄｉｄａ感染のスペクトルの重大な変化も結果としてもたらしている。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓはかつてはＣａｎｄｉｄｏｓｉｓの一般的な原因であったが、現在これらの感染の５０％は、アゾール治療の影響を受けにくい非ａｌｂｉｃａｎｓ種によって引き起こされている。さらに、感染した患者から得られるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ単離体のパーセンテージが急激に上昇することは、アゾールに対して耐性があることが発見されている。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよび他の真菌によって引き起こされる、日和見的な感染の効果的な治療に関する早急な必要性が存在する。生命を脅かす真菌感染の大部分はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓによって引き起こされるが、前述のあまり一般的ではない他の真菌、たとえばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓによって引き起こされる感染は予後が悪い。この大部分は、感染の非常に後の段階、通常は死後まで診断がないことによるものである。したがって、新規な化合物はあらゆる病原性真菌に対して作用することができ、時間を浪費する、正確な診断を必要としないようにすることが望ましい。
【００１４】
真菌感染を治療するのに有効な方法および組成物を開発することは、製薬産業の重大な目標である。真菌特異的な薬剤を同定するために、製薬産業は大変な労力を費やしてきているが、成功は非常に限られている。エルゴステロール以外の真菌標的を害する、新しいクラスの抗真菌剤を同定することは非常に有益であると思われる。この標的は真菌特異的でなければならず、現在の治療に耐性がある生物の増殖を妨げるかあるいは阻害する際に、かつそれらを優先的に殺傷する際に有効である、薬剤の進展をもたらすはずである。
【００１５】
抗真菌剤の開発は、標的真菌に対して有効である１以上の主要な化合物が発見される前に、多数の化合物をスクリーニングすることを利用するものであることが多い。したがって、これらのスクリーニングの進展には、標的真菌の生存または増殖に必須であるタンパク質を定義すること、およびこのようなタンパク質を精製または生成する手段を発見することが重要である。したがって、薬剤介入の標的として、および、真菌の増殖を妨げるかあるいは阻害し、かつそれらを逆説的に殺傷することによって真菌感染を治療するために使用することができる、必須の真菌要素と相互作用するかあるいはそれを阻害する、有用な抗真菌剤を同定するための方法および組成物の標的として働くことができる、必須の真菌の構造的要素または機能的要素を同定することが、当分野では必要である。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を殺傷するための潜在的な標的である、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのタンパク質を決定することに基づくものである。本発明は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓから単離した相同的な標的タンパク質に結合する化合物、およびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓおよび他の真菌の増殖を阻害することができる化合物を検出し同定するためのスクリーニング法を提供する。本発明は、哺乳動物の細胞中における、このような真菌阻害物質の毒性を評価するための方法も提供する。
【００１７】
本発明は、ＤＮＡ合成、ＤＮＡ複製、ＤＮＡ転写、ｍＲＮＡの翻訳、タンパク質の転写後修飾、およびタンパク質の細胞内輸送などのプロセスに関係する標的タンパク質、ならびに正確な細胞性機能が知られていない標的タンパク質を利用する。好ましい実施形態では本発明は、図７９中に提供するそのそれぞれのアミノ酸配列によって示されるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびヒトの相同体と共に表１中に列記した、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの標的タンパク質の使用を提供する。これらのアミノ酸配列に対応する核酸配列を、図８０中に示す。
【００１８】
本発明を実施する際に使用される、それぞれのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤＮＡ配列、およびそれらの予想される標的タンパク質配列は、一般的に入手可能である。それぞれのこのようなＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝子の不可欠性は既に知られているであろうし、あるいはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中での遺伝子の働きを打ちのめす能力を分析することによって、決定および／または確認することができる。したがって本発明は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝子、およびその遺伝子によってコードされている標的タンパク質の不可欠性を、決定および／または確認する方法を提供する。より詳細には本発明は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ中の相同的な標的を決定および単離する際に使用するための、殺傷性がある標的としてのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのタンパク質を決定することを対象とする。したがってＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的は、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓおよび他の真菌の増殖を阻害することができる化合物をスクリーニングする際に、使用することができる。
【００１９】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝子の不可欠性を決定した後に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤＮＡ配列を使用して、相同的な真菌の遺伝子を単離することができる。したがって他の態様では、本発明は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に必須である標的として、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのタンパク質をコードしているＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの核酸を決定することに基づくものである。
【００２０】
他の態様では本発明は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質をコードしている核酸を発現させるのに充分な条件下で、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質をコードしている核酸を用いて形質転換した宿主細胞を培養すること、および以下に記載するアッセイ中で使用するＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質を単離することを含む、組み換え標的Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ標的タンパク質の生成を提供する。
【００２１】
Ｇｅｎｂａｎｋにおいて入手可能な知られている配列と組み合わせて、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの核酸またはタンパク質配列および／またはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの核酸またはタンパク質配列を使用する配列アラインメントを行って、異なる真菌、すなわちＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓと哺乳動物の間のあらゆる類似性または相違実証することができる。このようにして、相同的な遺伝子を単離することができる。このような分析の一例は、ＢＬＡＳＴ（商標）分析であると思われる。
【００２２】
他の実施形態様では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中の標的タンパク質は殺傷性の標的であり、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ中の相同的なタンパク質は増殖に不可欠であることを決定した後に、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのタンパク質を標的として使用して、真菌の増殖および／または感染の候補となる阻害物質を単離することができる。必須タンパク質に結合する化合物の検出および同定は、複数の候補となる阻害剤化合物の存在下で行うことができる。複数の候補となる阻害剤化合物をスクリーニングすることを含む本発明のスクリーニング法を実施する際には、１回のアッセイで一緒に、あるいは多数の同時的な個別の検出ステップを使用して別個に、多数の阻害剤化合物をスクリーニングすることができる。
【００２３】
他の態様では本発明は、真菌の標的タンパク質、特にＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質の生物学的活性を選択的に阻害する阻害剤化合物と培養物を接触させることによって、培養中の真菌、特にＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖を妨げるかあるいは阻害する方法を提供する。
【００２４】
他の態様では本発明は、哺乳動物中の真菌、特にＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖を妨げるかあるいは阻害する方法であって、真菌、特にＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質の生物学的活性を選択的に阻害する有効量の阻害剤化合物を哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。
【００２５】
他の態様では本発明は、哺乳動物中の真菌、特にＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖を妨げるかあるいは阻害する方法であって、有効量の阻害剤化合物を哺乳動物に投与することを含み、かつ阻害剤が真菌、特にＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質の生物学的活性を選択的に阻害するが、相同的な哺乳動物のタンパク質の生物学的活性は低い程度で阻害するか、あるいはまったく阻害しないことを含む方法を提供する。
【００２６】
他の態様では本発明は、真菌の増殖を妨げるかあるいは阻害する方法であって、真菌の標的タンパク質の生物学的活性を選択的に阻害する有効量の阻害剤化合物を真菌感染体に投与することを含む方法を提供する。
【００２７】
他の態様では本発明は、このような核酸および／またはタンパク質配列を使用して、病原性菌類を研究する方法を提供する。
【００２８】
本発明の他の特徴および利点は、記載、その好ましい実施形態、図面から、および特許請求の範囲から明らかであろう。
【表１】
2004511756.tif 000002
【００２９】
【発明の実施の形態】
本明細書中に引用したすべての特許出願、特許、および参照文献は、参照によってその全容をここに組み込んである。
【００３０】
本発明は、真菌、特にＣ．ａｌｂｉｃａｎｓから相同的なタンパク質を決定および／または単離する際に使用する、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから単離した必須である真菌のタンパク質を対象とする。それぞれ以下により詳細に記載した、これらの真菌タンパク質は、細胞の生存能力および／または増殖において必須の役割を果たし、真菌中に保存されている。これらの真菌タンパク質は真菌細胞の生存能力および／または増殖に必須であるので、このような標的タンパク質の生物学的活性を害する化合物は、殺真菌性および／または静真菌性を有すると思われる。異なる真菌源からの任意のこのようなタンパク質のアミノ酸配列は、対応するヒトのタンパク質よりも互いにより類似している可能性があるので、真菌のタンパク質に結合するいくつかの化合物は対応するヒトのタンパク質には結合せず、真菌細胞の増殖の特異的阻害剤であろうことが予想される。したがって本発明は、真菌に対して活性があるこれらの標的タンパク質の、阻害剤をスクリーニングするためのアッセイも対象とする。
【００３１】
一般に、本発明を実施する際に使用する核酸操作および他の関連技法は、たとえばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｂｒｅｎｔ，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｍｏｒｅ，Ｆｅｉｄｍａｎ，Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｓｔｕｈｌ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，ＮＹ１９９７）中に開示される、当分野においてよく知られている方法を使用するものである。
【００３２】
定義
１．本明細書で使用する「妨げ」および「阻害」という語は、互換的に使用することができる。本明細書で使用する「阻害」という語は、真菌の増殖であれ、ＤＮＡ転写であれ、あるいは標的タンパク質の生物学的活性に関して選択されるプロセスと関連がある他のパラメータであれ、測定するパラメータが低下することを指す。このような低下の量は、標準（コントロール）に対して測定する。細胞分裂、増殖の調節、細胞周期の調節、および他の増殖および／または代謝プロセスにおける、さまざまな真菌タンパク質の多数の相互作用のために、検出可能な阻害を生み出すのに必要とされる標的生成物の量は、使用する個々のスクリーニング・アッセイに関して変わるであろう。本明細書では「低下」は、コントロールに対して少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％の減少として定義する。
【００３３】
２．本明細書で使用する「増殖」または「繁殖」は、真菌、特にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび／またはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの正常な増殖パターン、すなわち増殖の対数期中の６０−９０分という細胞倍化時間のことを指す。豊かな培地中では、野生型Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株の倍化時間は９０分であり、一方、野生型Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの倍化時間は約６０分に近い。液体培地中の細胞の光学濃度をたどることによって、細胞の増殖を測定することができる。光学濃度の増大は増殖を示す。固体の培地プレート上での単細胞からのコロニー形成によって、増殖を測定することもできる。
【００３４】
３．本明細書で使用する「生存能力」は、増殖の停止をもたらす細胞処理の後に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞が増殖を再開する能力のことを指す。増殖の停止をもたらすこのような処理の例には、増殖に必要とされる遺伝子産物の一時的な不活性化、または抗真菌剤を用いた処理があるが、これらだけには限られない。生存能力を測定する１つの典型的手段は、増殖の停止をもたらす処理剤を取り除いた後に、細胞が固体の培地プレート上でコロニーを形成する能力を試験することによるものである。コロニーを形成できない細胞は、生存不能であるとみなされる。
【００３５】
４．本明細書で使用する「殺傷性がある」は、生存能力を急速に失わせることとして定義する。急速とは、測定半減期が少なくとも約２時間以下である、生存能力が失われている細胞の集団として定義する。
【００３６】
５．本明細書で使用する「相同的な」タンパク質は、所与のタンパク質に対して少なくとも約３０％の配列同一性または類似性、好ましくは少なくとも約４０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約５０％の配列同一性を有するタンパク質ドメインを有している、任意のタンパク質として定義する。配列類似性の程度を決定するための有用な配列比較アルゴリズムには、ＢＬＡＳＴ（商標）、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡ Ｓｔｒｉｄｅｒ、ＧＣＧパイルアップ・プログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ ｖｅｒｓｉｏｎ１０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、およびこれらのアルゴリズムと共に提供されるデフォルト・パラメータをたとえば使用する、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗなどのアラインメント・スキーム（上記のＴｈｏｍｐｓｏｎらを参照のこと）がある。充分に相同的である配列は、配列データ・バンクにおいて入手可能な標準的なソウトウェアを使用して配列を比較することによって、あるいはたとえば特定の系に関して定義される厳格な条件下でのサザン・ハイブリダイゼーションの実験中に同定することができる。（以下の「ハイブリダイゼーション」を参照のこと）
【００３７】
６．本明細書で使用する「タンパク質ドメイン」は、少なくとも約５０個のアミノ酸であるタンパク質から完全長タンパク質までの、タンパク質の領域として定義する。
【００３８】
７．本明細書で使用する「生物学的活性」は、知られているかあるいは知られていない細胞機構によって、タンパク質が細胞の増殖および／または代謝を促進するかあるいは持続させる能力のことを指す。生きている細胞中の測定する必要がない生物学的活性、タンパク質が細胞の増殖および／または代謝を促進するかあるいは持続させる能力を再現するために設計した、タンパク質および他の選択成分からなるｉｎ ｖｉｔｒｏの系を使用して、生物学的活性を評価することもできる。
【００３９】
８．本明細書で使用する「標的タンパク質」または「殺傷性タンパク質」は、たとえば増殖および／または代謝に関連がある必須タンパク質のことを指す。真菌の標的タンパク質の生物学的活性を阻害することによって、真菌の増殖を結果として阻害する。標的タンパク質は、ＤＮＡ合成、ＤＮＡ修復、転写、ｍＲＮＡの運搬、ｍＲＮＡのプロセッシング、翻訳、タンパク質の輸送、タンパク質のプロセッシング、細胞周期の調節、細胞分裂、および細胞のシグナリングだけには限らないがこれらを含むプロセスにおいて、必須の役割を果たすことができる。「標的タンパク質」という語は、断片およびポリペプチド、および当分野で知られている任意の手段、たとえば標的タンパク質中の化学的に改質されたアミノ酸残基などを使用する、アミノ酸配列の放射性標識、接合、突然変異によって改質された標的タンパク質も含む。
【００４０】
９．本明細書で使用する「菌類」または「真菌」は、胞子、吸収によって発生する栄養分を保有し、クロロフィルが欠失しており、有性的あるいは無性的に繁殖する真核生物のことを指す。
【００４１】
１０．本明細書で使用する「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのプリンおよびピリミジン含有ポリマー、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドあるいは混合ポリリボ−ポリデオキシリボヌクレオチドのことを指す。これは一本鎖および二本鎖分子、すなわちＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、および塩基をアミノ酸のバックボーンに結合させることによって形成される「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）を含む。これは修飾された塩基を含む核酸も含む。
【００４２】
１１．本明細書で使用する「単離した」核酸またはポリペプチドは、その本来の環境（たとえば、それが天然に存在する場合は自然環境）から取り除いた核酸またはポリペプチドのことを指す。単離した核酸またはポリペプチドは、それが本来結合していた細胞成分を約５０％未満、好ましくは約７５％未満、最も好ましくは約９０％未満含む。
【００４３】
１２．指定の配列「由来の」核酸またはポリペプチド配列とは、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列中において指定の配列の領域と関連がある配列のことである。核酸配列については、これはその配列と相同的であるかあるいは相補的な配列、および「配列保存型変異体」および「機能保存型変異体」を包含する。ポリペプチド配列については、これは「機能保存型変異体」を包含する。配列保存型変異体は、所与のコドン位置における１以上のヌクレオチドが変わることによって、その位置にコードされているアミノ酸の変化がもたらされることがない変異体である。機能保存型変異体は、アミノ酸が類似の物理的および／または化学的性質（たとえば、酸性、塩基性、疎水性など）を有するアミノ酸に置換されることだけには限らないが、このことを含めて元のポリペプチドの全体的な形状および機能が変わることなく、ポリペプチド中の所与のアミノ酸残基が変わっている変異体である。指定のポリペプチドの「機能保存型」変異体は、指定のポリペプチドに特異的な抗体を誘い出す能力を有する任意のポリペプチドも含む。
【００４４】
１３．核酸の少なくとも１本の鎖が、規定されたストリンジェントな条件下でもう１本の核酸の鎖とアニールすることができるとき、核酸は互いに「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションのストリンジェント度は、たとえばａ）ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄が行われる温度、およびｂ）ハイブリダイゼーションおよび洗浄溶液のイオン強度および極性（たとえば、ホルムアミド濃度）、および他のパラメータによって決定される。ハイブリダイゼーションには、２つの核酸が充分に相補的な配列を含むことが必要であるが、ハイブリダイゼーションのストリンジェント度に応じて、ミスマッチを許容することができる。核酸をハイブリダイズさせるのに適したストリンジェント度は、核酸の長さおよび相補性の程度、当分野でよく知られている変数に依存する。
【００４５】
ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドは、任意の長さであってよい。一実施形態では、このようなポリヌクレオチドは少なくとも７個、好ましくは少なくとも２５個、最も好ましくは少なくとも１００個のヌクレオチド長である。他の実施形態では、本発明の任意のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドと同じ長さである。他の核酸とハイブリダイズ可能な核酸は、本明細書において以下で「ストリンジェント度が高い」ものとして定義するハイブリダイゼーション条件下で、それらの相補体とハイブリダイズすることができる。
【００４６】
以下の組成：４×ＳＳＣ、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ（１×Ｄｅｎｈａｒｄｔは１％のＦｉｃｏｌｌ、１％のポリビニルピロリジン、１％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）；１×ＳＳＣは０．１５ＭのＮａｃｌおよび０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７からなる）を有する溶液を用いて、６時間かけて６５ＥＣでハイブリダイズすることができる核酸が結合する、支持体（ニトロセルロース・フィルタまたはナイロン膜）の予備ハイブリダイゼーション処理；
【００４７】
支持体と接触している予備ハイブリダイゼーション溶液を、以下の組成：４×ＳＳＣ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、２５ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ７、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＳＤＳ、特に放射性プローブとして核酸プローブを含み、３分間の１００ＥＣでの処理によって予め変性させた、超音波処理したサケの精液のＤＮＡ １００ｇ／ｍＬを有する緩衝溶液に取り替えること；
【００４８】
６５ＥＣでの１２時間の培養；
【００４９】
以下の溶液を用いた連続的な洗浄：（ｉ）２×ＳＳＣ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、０．５％のＳＤＳを用いた、６５ＥＣでの４５分間の４回の洗浄；（ｉｉ）０．２×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣを用いた、６５ＥＣでの４５分間の２回の洗浄；および（ｉｉｉ）０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを用いた、６５ＥＣでの４５分間の洗浄。
【００５０】
１４．本明細書で使用する「プロモーター配列」は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼを結合させ、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始させることができる、ＤＮＡの調節領域として定義する。
【００５１】
１５．本明細書で使用する「候補となる阻害剤」は、表１、および本明細書を通じて記載した任意の標的タンパク質により仲介される活性によって、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓまたは他の真菌の増殖および／または代謝を阻害する能力を有する、任意の化合物である。
【００５２】
１６．「Ａｎｙ Ｔａｒｇｅｔ Ｌｉｇａｎｄ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ」の略語、「ＡＴＬＡＳ」は、「Ｐｒｉｍａｒｙ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」という表題のセクションに記載された、スクリーニング法のことを指す。
【００５３】
標的タンパク質
本発明は、細胞の増殖および／または代謝に関連がある真菌のタンパク質、特に表１中に列記したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび／またはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの遺伝子に由来するタンパク質をコードするＤＮＡを単離すること、およびこのような真菌の遺伝子の必須性および／または殺傷性を決定することに基づくものである。これらのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの標的タンパク質および／またはそのＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの相同体を発見し特徴付けること、および真菌と哺乳動物の標的タンパク質の間の違いを明瞭にすることによって、これらのタンパク質、特にＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのタンパク質が、真菌感染を治療するための新しい方法および組成物を開発するための、重要な標的として関連付けられる。生物学的活性を選択的に害する物質は、抗真菌、特に抗Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよび関連真菌の治療法の候補であると思われる。本発明は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質の活性を選択的に害する化合物を同定するための方法も包含し、したがって有用な抗真菌剤を含むことができる。
【００５４】
抗真菌化合物は、真菌中に存在しヒト細胞中には存在しない標的に対する作用を指示することが理想的である。しかしながら、このような標的は、細胞機能にとって重要であり、進化中に保存される傾向があり、したがってヒトおよび真菌細胞中の両方に存在する。このような場合、前述のように、標的タンパク質は両方の細胞タイプ中に存在するが、この標的タンパク質のヒト相同体は、真菌の標的タンパク質とは異なるアミノ酸配列を有する。
【００５５】
標的タンパク質のヒト相同体が同定されている場合、このようなヒト配列は、それが約５０％未満、好ましくは約４０％未満、さらに好ましくは約３０％未満の配列同一性を有する場合は、真菌の配列と区別することができるとみなされる。配列類似性が低いほど、真菌の標的タンパク質に対して特異的に作用し、そのヒト相同体には作用しない化合物を同定するチャンスは高い。しかしながら、異なる真菌の相同体の間の標的タンパク質の配列類似性も、重要な要因である。たとえばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓなどの、２つの異なる真菌源由来の相同的なタンパク質が、たとえば５０％を超える、より好ましくは７０％を超える、さらに好ましくは９０％を超える高い配列類似性を示す場合、このことによって、真菌の標的タンパク質に特異的でありそのヒト相同体には特異的でない、阻害物質を同定するチャンスが高くなる。したがって、真菌とヒト標的タンパク質相同体の間の最適より高い配列類似性によって、真菌のタンパク質の生物学的活性のみを阻害する物質の発見が妨げられることはない。
【００５６】
それぞれの好ましい標的タンパク質を、以下に記載する。いくつかの標的タンパク質についての、いくつかのアッセイの非制限的な例も提供する。このようなアッセイは、たとえば潜在的に阻害性のある化合物の存在下で、標的タンパク質の生物学的活性を同定および／または測定する際に有用である。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および関連がある場合はヒト中の、それぞれの標的タンパク質のアミノ酸配列は、表１において見ることができる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および入手可能な場合はヒト相同体の間の配列同一性の測定値は、表２中に与える。
【００５７】
ＲＰＣ３４
ＲＰＣ３４（Ｃ３４）は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ複合体の必須で特異的なサブユニットである（Ｓｔｅｔｔｌｅｒ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２；２６７：２１３９０−２１３９５）。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩは、ｔＲＮＡ、５ＳｒＲＮＡ、およびいくつかの他の小さなＲＮＡの転写を担っている。３つのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ特有のサブユニット、Ｃ３４、Ｃ８２、およびＣ３１は、Ｃ３４によって転写因子ＴＦＩＩＩＢの７０ｋＤａの成分と相互作用する複合体を形成する（Ｗｅｒｎｅｒ，Ｍ． ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９３；２６８：２０７２１−２０７２４）。Ｃ３４サブユニットは、予備開始複合体によるｐｏｌ ＩＩＩ漸増の主要な決定基である。Ｃ３４とＴＦＩＩＩＢ７０の間の相互作用は、予備開始複合体の形成、および後のプロモーターの作用開始中に必須である（Ｂｒｕｎ，Ｉ．，ら、ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９７；１６：５７３０−５７４１）。ＲＰＣ３４中に温度感受性または低温感受性突然変異体を保有している菌株は、ｔＲＮＡ合成中にブロックされることが実証されている（Ｓｔｅｔｔｌｅｒ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２；２６７：２１３９０−２１３９５；Ｂｒｕｎ，Ｉ．，ら、ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９７；１６：５７３０−５７４１）。ＲＰＣ３４のＲＰＣ３９ヒト相同体は同定されている（Ｗａｎｇ，Ｚ．ａｎｄ Ｒｏｅｄｅｒ，Ｒ．Ｇｅｎ．Ｄｅｖ．，１９９７；１１：３２７−７９４９）。ＲＰＣ３４およびＲＰＣ３９は２７％が同一であり、５０％が類似である。
【００５８】
ＲＰＣ３４アッセイ：
（ａ）ＡＴＬＡＳ
（ｂ）ＲＰＣ３４の機能の不在下／これを果たすことができないと、ｔＲＮＡ合成が低下するという情報（Ｓｔｅｔｔｌｅｒ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２；２６７：２１３９０−２１３９５；Ｂｒｕｎ，Ｉ．，ら、ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９７；１６：５７３０−５７４１）を使用して、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびヒト細胞における細胞ベースのアッセイを開発した。化合物がＲｐｃ３４ｐに特異的に結合する場合、ｔＲＮＡレベルの低下は、増殖培地にその化合物を加えた後に検出することができる。ヒト細胞における類似のアッセイを、同じ原則に基づいて設計することができる。異なるタイム・ポイントで細胞に化合物を加えることによって、ｔＲＮＡのレベルをアッセイすることができる。
（ｃ）ＲＰＣ３４を含めた、精製したＲＮＡポリメラーゼＩＩＩの転写因子を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを開発し、化合物の存在／不在下でｔＲＮＡおよび５ＳｒＲＮＡレベルを評価することができる（Ｋａｓｓａｖｅｔｉｓ，Ｇ．，ら、ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９９；１８：５０４２−５０５１）。
（ｄ）ツーハイブリッド系を使用して、レポーターをベースとするアッセイを開発することができ、ＲＰＣ３４はＣ８２、Ｃ３１およびＴＦＩＩＩＢ７０と物理的に相互作用することが知られている。タンパク質の１つは転写活性化物質と融合することができ、もう１つはＤＮＡ結合タンパク質と融合することができる。２つのタンパク質が、化合物の存在または不在下で互いに相互作用する能力は、プロモーターから発現されるレポーター遺伝子の酵素活性を調べることによって測定することができる。
【００５９】
ＰＯＰ３
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰＯＰ３は、大きな前駆体ＲＮＡを成熟した機能的な形のｔＲＮＡおよびｒＲＮＡにする、翻訳後プロセッシングと関係がある。（Ｄｉｃｈｔｌ，Ｂ．ａｎｄ Ｄ．Ｔｏｌｌｅｒｖｅｙ，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９７；１６：４１７−４２９；Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，Ｊ．Ｒ．，ら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９８；１２：１６７８−１６９０）。ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡのこのプロセッシングは、ＲＮａｓｅＭＲＰおよびＲＮａｓｅＰリボ核タンパク質によってそれぞれ行われるが、２つの複合体は、広範囲のサブユニット重複部分を有することが知られている（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，Ｊ．Ｒ．，ら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９８；１２：１６７８−１６９０）。ＰＯＰ３が突然変異することによって、ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡの完全なプロセッシングの妨害を含めて、ＲＮａｓｅＭＲＰを損失したものと同一の表現型がもたらされる（Ｄｉｃｈｔｌ，Ｂ．ａｎｄ Ｄ．Ｔｏｌｌｅｒｖｅｙ，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９７；１６：４１７−４２９；Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，Ｊ．Ｒ．，ら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９８；１２：１６７８−１６９０）。ＰＯＰ３は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞が増殖するのに必須である（Ｄｉｃｈｔｌ，Ｂ．ａｎｄ Ｄ．Ｔｏｌｌｅｒｖｅｙ，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９７；１６：４１７−４２９）。
【００６０】
ＰＯＰ３アッセイ：
（ａ）ＡＴＬＡＳ：ＣａＰｏｐ３タンパク質を精製し、タンパク質を広げる高温または低ｐＨなどの環境条件で攻撃することができた。ＣａＰｏｐ３タンパク質に結合する化合物は、タンパク質の元の形状を安定させることができる。
（ｂ）他の相互作用タンパク質を使用するツーハイブリッド断絶スクリーニング： ＲＮａｓｅＭＲＰまたはＲＮａｓｅＰ複合体のいずれかの他のサブユニットの、ＣａＰｏｐ３およびＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓのオーソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）を、酵母菌ツーハイブリッド・スクリーニング用ベクター中に、１つはベイト（ｂａｉｔ）として、１つは標的として置くことができた。２つのタンパク質の近くに結合することによって、レポーター遺伝子の発現が誘導されるであろう。２つのタンパク質の結合を妨害する化合物は、レポーター遺伝子の誘導を妨げるはずであり、このような化合物をスクリーニング・フォーマット中に同定することができる。ＲＮａｓｅＭＲＰまたはＲＮａｓｅＰ複合体中のタンパク質以外の相互作用タンパク質を、このフォーマットにおいて使用することができた。
【００６１】
ＴＦＡ２
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＦＡ２は、一般的なＲＮＡポリメラーゼＩＩの転写開始因子、ＴＦＩＩＥのサブユニットである。ＴＦＡ２の遺伝子産物は、ＴＦＡ１のそれとヘテロ・テトラマーを形成し、両方の遺伝子が細胞の生存能力に必須である（Ｆｅａｖｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，２６９：２７５４９−５３）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのプロモーターから正確に開始される転写に必要な活性を有することが示されている、ＴＦＡ１およびＴＦＡ２の遺伝子は、精製されたタンパク質から同定されており、その遺伝子配列は哺乳動物のＴＦＩＩＥと充分な相同性を有する（Ｆｅａｖｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，２６９：２７５４９−５３）。ＴＦＩＩＥが遺伝子の転写を行うための要件は、プロモーターの構造に応じて変わる（Ｓａｋｕｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，２７２：１５９３６−１５９４２）。酵母菌ＧＡＬ１１の生成物が、ＴＦＩＩＥとＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の間の相互作用を高め、したがって転写効率を増大させることが示唆されている。（Ｓａｋｕｒａｕら、ＰＮＡＳ，１９９６，９３：９４８８−９４９２）。
【００６２】
ＴＦＡ２アッセイ：
（ａ）ＡＴＬＡＳ：ＣａＴＦａ２タンパク質を精製し、タンパク質を広げる高温または低ｐＨなどの環境条件で攻撃することができた。ＣａＴＦａ２タンパク質に結合する化合物は、タンパク質の元の形状を安定させることができる。
（ｂ）他の相互作用タンパク質を使用するツーハイブリッド断絶スクリーニング： ＣａＴｆａ２およびＣａＴｆａ１を、酵母菌ツーハイブリッド・スクリーニング用ベクター中に、１つはベイトとして、１つは標的として置くことができた。２つのタンパク質の近くに結合することによって、レポーター遺伝子の発現が誘導されるであろう。２つのタンパク質の結合を妨害する化合物は、レポーター遺伝子の誘導を妨げるはずであり、このような化合物をスクリーニング・フォーマット中に同定することができる。ＣａＴｆａｌｐ以外の相互作用タンパク質、注目すべきところではＣａＧａｌ１１タンパク質を、このフォーマットにおいて使用することができた。
【００６３】
ＮＡＢ２
新生ＲＮＡポリメラーゼＩＩの転写物は核のリポ核タンパク質と結合し、プレｍＲＮＡのポリアデニル化およびスプライシングなどの、その後のＲＮＡのプロセッシング反応中は結合したままであり、細胞質に移動する。Ｓａｃｃａｈｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＮＡＢ２は、ポリアデニル化されたＲＮＡとｉｎ ｖｉｖｏで結合する主要なタンパク質の１つであり、細胞の増殖には不可欠である（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｔ．，ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９３；１３：２７３０−２７４１）。ＮＡＢ２の遺伝子産物は、主に核に局在する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｔ．，ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９３；１３：２７３０−２７４１）。２つの異なるＲＮＡ結合モチーフ、さまざまな異質の核ＲＮＡ結合タンパク質中で観察されるＲＧＧボックス、およびＲＮＡポリメラーゼの最大サブユニットの亜鉛結合モチーフと関連があるＣＣＣＨモチーフ繰り返し体は、ＮＡＢ２の配列中で識別可能である（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｔ．， ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９３；１３：２７３０−２７４１）。ＮＡＢ２の遺伝子産物は、酵母菌ＫＡＰ１０４の産物、タンパク質の核膜孔中で機能することが示されているカリオフェリンをコードしている遺伝子と相互作用し、ヒトのトランスポーチン１（ｈＴＲＮ１）、酵母菌ＫＡＰ１０４のヒト相同体と相互作用することが示されている（Ａｉｔｃｈｉｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．， ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６；２７４：６２４−６２７；Ｔｒｕａｎｔ，Ｒ．，ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８；１８：１４４９−１４５８；Ｍ．Ｃ．Ｓｉｏｍｉ，ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８；１８：４１４１−４１４８）。
【００６４】
ＮＡＢ２アッセイ：
（ａ）ＡＴＬＡＳ：ＣａＮａｂ２タンパク質を精製し、タンパク質を広げる高温または低ｐＨなどの環境条件で攻撃することができた。ＣａＮａｂ２タンパク質に結合する化合物は、タンパク質の元の形状を安定させることができる。
（ｂ）他の相互作用タンパク質を使用するツーハイブリッド断絶スクリーニング：ＣａＮａｂ２およびＣａＫＡＰ１０４を、酵母菌ツーハイブリッド・スクリーニング用ベクター中に、１つはベイトとして、１つは標的として置くことができた。２つのタンパク質の近くに結合することによって、レポーター遺伝子の発現が誘導されるであろう。２つのタンパク質の結合を妨害する化合物は、レポーター遺伝子の誘導を妨げるはずであり、このような化合物をスクリーニング・フォーマット中に同定することができる。ＣａＫａｐ１０４以外の相互作用タンパク質を、このフォーマットにおいて使用することができた。
（ｃ）ＲＮＡ結合のスクリーニング：ＣａＮａｂ２タンパク質の近くのＲＮＡの結合を妨害する能力に関して、化合物をスクリーニングすることができた。ＲＮＡとＣａＮａｂ２タンパク質の結合は、さまざまな方法：１）フィルタ上での捕獲あるいは抗体による捕獲によって；２）蛍光標識したＲＮＡを使用して均質な溶液中で、蛍光性の偏りの変化を検出すること；あるいは３）ＲＮＡがタンパク質の近くに結合するとき、ゲルの移動を検出することによって評価することができた。
【００６５】
ＭＰＴ１
ＭＰＴ１は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの両方において同定されている標的である。ＭＰＴ１タンパク質は詳細には特徴付けられていない。ベイトとしてＳｃＰｒｐ９を使用して、ツーハイブリッド・スクリーニングにおいてＳｃＭＰＴ１が単離された（Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅ，Ｍ．，ら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，１９９７；１６：２７７−８２）。Ｐｒｐ９は、ＲＮＡのスプライシングと関連がある複合体のサブユニットである。ＳｃＭＰＴ１がＰｒｐ９と相互作用するであろう事実によって、ＳｃＭＰＴ１もＲＮＡのスプライシングと関連があるであろうことが示唆される。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓにおける実証データによって、ＭＰＴ１は真菌細胞の増殖および生存能力にとって重要であり、ＲＮＡのスプライシングの推定上の機能と相関関係がある可能性があることが示される。哺乳動物の相同体が提案されているが、相同性の程度は、このことを確信するには低すぎる。哺乳動物細胞中に非常に類似したタンパク質が存在しないことと併せた、真菌の増殖に関するＭＰＴ１の明らかな重要性によって、ＭＰＴ１は抗真菌剤を発見するための優れた標的となる。
【００６６】
ＭＰＴ１アッセイ：
（ａ）ＡＴＬＡＳ．（前を参照のこと）
（ｂ）細胞ベースのアッセイ：ＳｃＭＰＴ１が、異なる生物、特に真菌および哺乳動物からの機能的なＭＰＴ１の遺伝子で置き換えられると思われる（すなわち、必要なときはｃＤＮＡ由来の）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのさまざまな菌株を構築することができた。これらの細胞は、潜在的に増殖を阻害する可能性がある明確な数の混合物および化合物を含む、個別のウエル中で増殖すると思われる。前述の菌株間の化合物による阻害の程度の違いは、ＭＰＴ１のクラスの活性を優先的に阻害することによって、化合物が増殖を阻害できることを示唆している可能性がある。
（ｃ）タンパク質間相互作用に基づくアッセイ：ＭＰＴ１およびＰＲＰ９（またはＭＰＴ１と相互作用することが分かっている任意の他のタンパク質）を使用する（ｉ）ツーハイブリッド・スクリーニング（Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅ，Ｍ．，ら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，１９９７；１６：２７７−８２）；（ｉｉ）直接的な結合アッセイ：相互作用タンパク質を、検出可能なＭＰＴ１に容易に結合することができる担体上に固定することができた。阻害物質の不在下では、充分なシグナルが生じるであろう。しかしながら、この相互作用が妨害されることによって、シグナルが低下する可能性がある。ＭＰＴ１の固定、および放射性ヌクレオチドまたは蛍光性化合物などのレポーター分子で標識した、相互作用タンパク質を用いた培養によって、アッセイの方向を逆にすることもできた。
【００６７】
ＭＴＲ２
真核細胞では、ｍＲＮＡの運搬は、遺伝子の発現および調節に関する重要な細胞プロセスである。ポリ（Ａ）ＲＮＡを核中に蓄積させるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの温度感受性突然変異体を単離する試みによって、１組の遺伝子が同定された（Ｋａｄｏｗａｋｉ，Ｔ．，ら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９９４；１２６，６４９−５９）。遺伝子の１つ、ＭＴＲ２は、プラスミドＤＮＡの移動と関係がある大腸菌のタンパク質と限られた相同性を示す、２１ｋＤの核タンパク質をコードしている。（Ｋａｄｏｗａｋｉ，Ｔ．，ら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９９４；１２６，６４９−５９）Ｍｔｒ２のタンパク質は、核孔と結合するタンパク質、Ｍｅｘ６７と相互作用することができ、その相互作用はｍＲＮＡの核外輸送におそらくは不可欠であることが示されている。（Ｓａｎｔｏｓ−Ｒｏｓａ，Ｈ．，ら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９９８；１８：６８２６−３８）遺伝学的および生化学的な証拠によって、Ｍｔｒ２ｐはＮｕｐ８５ｐと相互作用することができることも示されており、Ｎｕｐ８５ｐは、Ｍｔｒ２ｐおよびＭｅｘ６７が結合する核孔複合体（ＮＰＣ）における、標的である可能性があることが示唆される。（Ｓａｎｔｏｓ−Ｒｏｓａ，Ｈ．，ら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９９８；１８：６８２６−３８）これらすべての要因を考慮して、Ｍｔｒ２のタンパク質は、酵母菌のｍＲＮＡ核外輸送機構の重要な成分であることが述べられた。（Ｓａｎｔｏｓ−Ｒｏｓａ，Ｈ．，ら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９９８；１８：６８２６−３８；Ｓｃｈｎｅｉｔｅｒ，Ｒ．， ら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ，１９９５；６：３５７−７０）
【００６８】
近年、ポリ（Ａ）ＲＮＡおよびヒトの核タンパク質と相互作用することができるＭｅｘ６７のヒト相同体、ＴＡＰが同定された。しかしながら、Ｍｔｒ２のヒト相同体はこれまで発見されていなかった。Ｋａｔａｈｉｒａら（Ｍｅｘ６７ｐによって仲介される核のｍＲＮＡ核外輸送経路は、酵母菌からヒトまで保存されている。Ｅｍｂｏ Ｊｏｕｒｎａｌ １８，２５９３−２６０９（１９９９））は、ＴＡＰと相互作用する小さなヒトのタンパク質、ｐ１５を同定した。興味深いことに、酵母菌中でＴＡＰとｐ１５が同時に発現することによって、Ｍｅｘ６７−Ｍｔｒ２複合体を機能的に補うことができ、進化において保存されたｍＲＮＡの運搬に関連がある経路の存在が示唆される。
【００６９】
ＭＴＲ２アッセイ：
（ａ）ＡＴＬＡＳ：Ｍｔｒ２タンパク質は、均質に精製することができる。精製したＭｔｒ２タンパク質を、高温または低ｐＨなどの異なる環境条件で攻撃することによって、タンパク質の形状が変わり、タンパク質が折りたたまれていない状態になるであろう。Ｍｔｒ２に結合する任意の化合物は、タンパク質を元の形状で安定させることができるであろう。ＡＴＬＡＳを使用することによって、Ｍｔｒ２に結合する化合物の同定を助けることができる。
（ｂ）Ｍｅｘ６７を用いたツーハイブリッド。Ｍｔｒ２およびＭｅｘ６７を、酵母菌中で１対の遺伝子として、その１つはベイトとして、もう１つは標的として使用することができる。Ｍｔｒ２およびＭｅｘ６７タンパク質が酵母菌中で結合することによって、検出することができるレポーター遺伝子が誘導される結果となるであろう。Ｍｔｒ２ｐとＭｅｘ６７ｐの相互作用を害する任意の化合物によって、レポーター遺伝子の誘導が妨げられることになり、したがってその化合物を同定することができる。
（ｃ）Ｎｕｐ８５ｐを用いたツーハイブリッド。Ｍｔｒ２およびＮｕｐ８５を、酵母菌中で１対の遺伝子として、その１つはベイトとして、もう１つは標的として使用することができる。Ｍｔｒ２およびＭｅｘ６７タンパク質が酵母菌中で結合することによって、検出することができるレポーター遺伝子が誘導される結果となるであろう。Ｍｔｒ２ｐとＮｕｐ８５ｐの相互作用を害する任意の化合物によって、レポーター遺伝の誘導が妨げられることになり、したがってその化合物を同定することができる。
【００７０】
ＢＯＳ１
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＢＯＳ１は、小胞体からゴルジ体への運搬において機能する必須遺伝子である。そのタンパク質は、分泌性小胞の細胞質優先タイプＩＩの内在性膜タンパク質である（Ｎｅｗｍａｎら、Ｅｍｂｏ Ｊ．，１９９２，１１：３６０９−３６１７；Ｌｉａｎら、Ｃｅｌｌ，１９９３，７３：７３５−７４５）。ＢＯＳ１が欠失することによって、小胞体からゴルジ体へのタンパク質の運搬がブロックされ、小さな小胞が蓄積する結果となる（Ｓｈｉｍら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９１，１３：５５−６４）。本来この遺伝子は、コピー数が多いＢＥＴ１のサプレッサーとして単離されたものである（Ｎｅｗｍａｎら、Ｅｍｂｏ Ｊ．，１９９２，１１：３６０９−３６１７）。ＢＯＳ１は、小胞体からゴルジ体への小胞の運搬と関連があることが知られているいくつかのタンパク質と、遺伝的および物理的相互作用を示す。ＢＥＴ１の欠失をサプレスすることに加えて、ＢＯＳ１の過剰発現は、ＳＥＣ２２およびＹＰＴ１欠失を克服することもできる（Ｎｅｗｍａｎら、Ｅｍｂｏ Ｊｏｕｒｎａｌ １１， ３６０９−１７（１９９２）。Ｂｏｓ１ｐは、Ｙｐｔ１の影響下で、Ｓｅｃ２２ｐと対になることが示されている。Ｂｏｓ１ｐ、Ｂｅｔ１ｐ、およびＳｅｃ２２ｐは、輸送小胞の連結と関連がある（Ｆｅｒｒｏ−Ｎｏｖｉｃｋら、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓ １９，２５−３３（１９９１））複合体を形成するＶ−ＳＮＡＲＥタンパク質である（Ｌｉａｎら、Ｃｅｌｌ ７３， ７３５−４５（１９９３）；Ｐｆｅｆｆｅｒ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ． Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．（２，４４１−４６１（１９９６））。ＹＰＴ１は、ＳＮＡＲＥ複合体形成に必要とされる、Ｒａｂタンパク質である（Ｓｏｇａａｒｄら、Ｃｅｌｌ ７８，９３７−４８（１９９４）；Ｌｉａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３７２，６９８−７０１（１９９４）；Ｌａｚａｒら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ ２２，４６８−４７２（１９９７））。Ｖ−ＳＮＡＲＥ類のＢｏｓ１ｐおよびＳｅｃ２２ｐは、膜融合の前に、ｔ−ＳＮＡＲＥ Ｓｅｄ５ｐと同時作用的に相互作用する（Ｓａｃｈｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２，１７１３４−８（１９９７））。
【００７１】
ＢＯＳ１アッセイ：
（ａ）ＢＯＳ１は、ＡＴＬＡＳアッセイの優れた標的である。さらに、ＢＯＳ１機能の欠陥は、再編成された運搬系（Ｌｉａｎ，Ｊ．Ｐ．，およびＦｅｒｒｏ−Ｎｏｖｉｃｋ，Ｓ．Ｂｏｓ１ｐ，Ｃｅｌｌ，１９９３； ７３：７３５−４５）または分泌されるタンパク質の小胞体からゴルジ体への非効率的な運搬を調べる（Ｓｈｉｍら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９１，１１３：５５−６４）、インベルターゼ分泌の細胞ベースのアッセイ（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｌ．Ｍ．，ら、Ｃｅｌｌ，１９８７；４８：８７５−８８５）において、評価することができた。
（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏの運搬系（Ｌｉａｎら、Ｃｅｌｌ ７３，７３５−４５（１９９３））。
（ｃ）分泌されるタンパク質の小胞体からゴルジ体への非効率的な運搬を調べる（Ｓｈｉｍら、１９９１）、インベルターゼ分泌の細胞ベースのアッセイ（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９８７）。
（ｄ）タンパク質間相互作用。ＢＯＳ１は、ツーハイブリッド分析によるアッセイ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでのタンパク質結合アッセイによって、その相互作用を調べることができる、多数のタンパク質パートナーを有する（前を参照のこと）。
【００７２】
ＰＯＬ３０
このセクションに関する参照文献は、セクションの終わりに列挙する。
【００７３】
Ｓａｃｃａｈｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰＯＬ３０は、酵母菌の増殖している細胞の核の抗原（ＰＣＮＡ）をコードしている、必須遺伝子である（Ｂａｕｅｒら、ＮＡＲ，１９９０，１８：２６１−５）。酵母菌のＰＣＮＡの構造は決定されており、ＤＮＡの二重らせんの周りにスライディング・クランプを形成する、三量体として機能しているようである（Ｋｒｉｓｈｎａら、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１９９４，２４１：２６５−８）。ＰＣＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて線状ＤＮＡ分子の端に装入することができるが、ＰＣＮＡをＤＮＡに効率よく装入するには、ＡＴＰおよびＲＦＣ１の産物が必要である（ＭｃＡｌｅａｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９６，１４２：６５−７８，Ｂｕｒｇｅｒｓら、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，２６８：１９９２３−１９９２６）。
【００７４】
ＰＣＮＡは、哺乳動物および酵母菌において、ＤＮＡ合成およびＤＮＡ修復の両方に必要とされる。ＰＣＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼ・デルタまたはイプシロンと相互作用して、ＤＮＡの連続的な複製を促進する（Ｈｏｌｍｅｓら、Ｃｅｌｌ，１９９９，９６：４１５−４２４）。ＰＣＮＡは、ＦＥＮ−１、ＲＡＤ２７の哺乳動物の相同体の産物、岡崎フラグメントのプロセッシングに必要とされるタンパク質と相互作用する（Ｉｓｈｉｍｉら、Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，１９８８，２６３：１９７２３−１９７３３；Ｌｉら、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，２７０：２２１０９−２２１１２；Ｔｕｒｃｈｉら、ＰＮＡＳ，１９９５，９１：９８０３−９８０７）。ヌクレオチドの切除修復反応および塩基の切除修復反応を再構築するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＰＣＮＡが必要とされる。（Ａｙｙａｇａｒｉら、Ｍｏｌｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９９５，１５：４４２０−０；Ｕｍａｒら、Ｃｅｌｌ，１９９６，８７：６５−７３； Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９９６，２７１：２７９８７−９０；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．，１９９４， １４：６１８７−９７；Ｎｉｃｈｏｌｓら、ＮＡＲ，１９９２ １０：２４４１−２４４６；Ｓｈｉｖｊｉら、Ｃｅｌｌ，１９９２，６９：３６７−３７４）。転写のサイレンスも、ＰＣＮＡによるものである可能性がある（Ｅｈｒｅｎｈｏｆｅｒ−Ｍｕｒｒａｙら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９９，１５３：１１７１−８２）。
【００７５】
ＰＯＬ３０アッセイ：
（ａ）ＡＴＬＡＳ：ＣａＰｏｌ３０タンパク質を精製し、タンパク質を広げる高温または低ｐＨなどの環境条件で攻撃することができた。ＣａＰｏｌ３０タンパク質に結合する化合物は、タンパク質の元の形状を安定させることができる。
（ｂ）ＣａＲａｄ２７タンパク質または他の相互作用タンパク質を使用するツーハイブリッド断絶スクリーニング：ＣａＰＯｌ３０およびＣａＲａｄ２７を、酵母菌ツーハイブリッド・スクリーニング用ベクター中に、１つはベイトとして、１つは標的として置くことができた。２つのタンパク質の近くに結合することによって、レポーター遺伝子の発現が誘導されるであろう。２つのタンパク質の結合を妨害する化合物は、レポーター遺伝子の誘導を妨げるはずであり、このような化合物をスクリーニング・フォーマット中に同定することができる。ＣａＲａｄ２７ｐ以外の相互作用タンパク質を、このフォーマットにおいて使用することができた。スクリーニングは、ベイトおよびプレイの両方として遺伝子を使用してＣａＰｏｌ３０の多量化を妨害するように設計することができる。
（ｃ）ＤＮＡ結合のスクリーニング：ＣａＰｏｌ３０タンパク質へのＤＮＡの結合を妨害する能力に関して、化合物をスクリーニングすることができた。ＤＮＡとＣａＰｏｌ３０タンパク質の結合は、さまざまな方法：１）フィルタ上での捕獲あるいは抗体による捕獲によって；２）蛍光標識したＤＮＡを使用して均質な溶液中で、蛍光性の偏りの変化を検出すること；あるいは３）ＤＮＡがタンパク質の近くに結合するとき、ゲルの移動を検出することによって評価することができた。
【００７６】
ＹＭＲ１３１Ｃ
ＹＭＲ１３１Ｃは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ中の必須遺伝子である。最も近いヒトとの整合は、ヒト網膜芽腫のタンパク質ＲＢＢＰ４との２５％の同一性である。ＹＭＲ１３１Ｃのタンパク質はＷＤ４０繰り返し体を有し、このタンパク質が他のタンパク質と物理的に相互作用することができることが示唆される。最近の報告は、このタンパク質は核孔複合体形成と関連がある可能性があることを示唆している（Ｒｏｕｔ，Ｍ．，ら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２０００；１４８：６３５−６５２）。
【００７７】
ＹＭＲ１３１Ｃアッセイ：
（ａ）ＡＴＬＡＳ
（ｂ）Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのＹＭＲ１３１Ｃを補う哺乳動物のＹＭＲ１３１Ｃ相同体が発見される場合、細胞ベースのアッセイを設定して、化合物の存在／不在下で細胞の増殖を測定し、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのＹＭＲ１３１Ｃを有する菌株とヒトのＹＭＲ１３１Ｃ相同体を比較することができるであろう。
（ｃ）ＹＭＲ１３１Ｃと物理的に相互作用するタンパク質が同定される場合、ツーハイブリッド系ベースのアッセイを進展させて、ＹＭＲ１３１Ｃと他のタンパク質の間の相互作用を調べることができる。
（ｄ）ＹＭＲ１３１Ｃが核孔における運搬に不可欠である場合、アッセイを設定して、核孔を介した運搬の効率を調べることができる。
【００７８】
ＳＱＴ１
Ｓａｃｃａｈｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＱＴ１は、４０Ｓのサブユニットと６０Ｓのサブユニットを結合させるために必要な６０Ｓのリボゾーム・サブユニットのタンパク質をコードしている、必須遺伝子である（Ｅｉｓｉｎｇｅｒら、ＭＣＢ，１７：５１４６−５１５５，１９９７）。ＳＱＴ１は、リボゾーム・タンパク質ＱＲＳ１の優勢ネガティブ切断型変異のサプレッサーとして単離された（Ｅｉｓｉｎｇｅｒら、ＭＣＢ，１７：５１３６−５１４５，１９９７； Ｅｉｓｉｎｇｅｒら、ＭＣＢ，１７： ５１４６−５１５５，１９９７）。ＳＱＴ１の機能が失われることによって、半繰り返しのポリゾームが形成される結果となり、これによって４０Ｓおよび６０Ｓのサブユニットが結合しなくなる。ＳＱＴ１は、６０Ｓのリボゾーム・サブユニット上でＱＲＳ１を組み立てるために、必要である可能性がある（Ｅｉｓｉｎｇｅｒら、ＭＣＢ，１７：５１４６−５１５５，１９９７）。タンパク質はオリゴマー複合体の一部であってよく、細胞質に局在しており、そこでリボゾームと緩く結合している（Ｅｉｓｉｎｇｅｒら、ＭＣＢ，１７：５１４６−５１５５，１９９７）。
【００７９】
ＳＱＴ１アッセイ：
（ａ）ＳＱＴ１は、ＡＴＬＡＳアッセイの優れた候補である。さらに、ポリゾームおよびリボゾーム・サブユニットの分析を、スループットが低い二次的なアッセイにおいて行うことができた。ＳＱＴ１の機能を害することによって、半繰り返しのポリゾーム輪郭が結果として生じるはずである。このタイプのアッセイは、スクロース速度勾配法（Ｅｉｓｉｎｇｅｒら、ＭＣＢ，１７：５１３６−５１４５，１９９７）による、リボゾーム・サブユニット、８０Ｓリボゾームおよびポリゾームの単離および分画を含むであろう。
（ｂ）ポリゾームおよびリボゾーム・サブユニットの分析を、スループットが低い二次的なアッセイにおいて行うことができた。ＳＱＴ１の機能を害することによって、半繰り返しのポリゾーム輪郭が結果として生じるはずである。このタイプのアッセイは、スクロース速度勾配法（Ｅｉｓｉｎｇｅｒら、１９９７ａ）による、リボゾーム・サブユニット、８０Ｓリボゾームおよびポリゾームの単離および分画を含むであろう。
【００８０】
ＭＴＷ１
ＭＴＷ１は、機能が知られていない、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ中の必須タンパク質である。Ｍｔｗ１ｐ（Ｍｉｓ１２様タンパク質）は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＭｉｓ１２ｐと３３％同一である。公表されているデータによって、染色体分離中に、動原体構造の維持および正確な紡錘体の形態形成のために、Ｓ．ｐｏｍｂｅのＭｉｓ１２ｐが必要とされることが示唆されている（Ｇｏｓｈｉｍａら、Ｇｅｎ．Ｄｅｖ．，１３：１６６４−１６７７，１９９９）。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのＭｔｗ１ｐは、ＤＮＡ結合モチーフを有していることが考えられる。真のヒト相同体は、これまでのところ同定されていない。
【００８１】
ＭＴＷ１アッセイ：
（ａ）ＡＴＬＡＳ
（ｂ）ＭＴＷ１がＤＮＡに結合する場合、ＤＮＡ結合活性に関するアッセイを設定することができる。
（ｃ）Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのＭＴＷ１を補う哺乳動物のＭＴＷ１相同体が発見される場合、細胞ベースのアッセイを設定して、化合物の存在／不在下で細胞の増殖を測定し、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのＭＴＷ１を有する菌株とヒトのＭＴＷ１相同体を比較することができる。
（ｄ）ＭＴＷ１と物理的に相互作用するタンパク質が同定される場合、ツーハイブリッド系ベースのアッセイを進展させて、ＭＴＷ１と他のタンパク質の間の相互作用を調べることができる。
【００８２】
ＴＦＢ１
ＲＮＡポリメラーゼＩＩは、プロモーター依存性転写のために、５つのさらなる一般的な転写因子を必要とし、その１つがＴＦＩＩＨである（Ｓｖｅｊｓｔｒｕｐら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６９：２８０４４−８，１９９４）。ＴＦＩＩＨは、ＤＮＡ依存性ＡＴＰａｓｅ活性成分、およびＲＮＡポリメラーゼＩＩのＣ末端繰り返しドメインを対象とするタンパク質キナーゼ活性成分を含む。ＴＦＢ１は、ＴＦＩＩＨのサブユニットの１つであり、転写とヌクレオチドの切除修復の両方に必要とされる。
【００８３】
ＴＦＢ１の遺伝子は、哺乳動物細胞および真菌細胞の両方において発見されている。しかしながら、真菌間の保存の程度は、真菌と哺乳動物の間のそれよりも高い（約４０％と２０％）。真菌細胞の生存能力に関する重要性と併せたこの違いによって、ＴＦＢ１は抗真菌剤を発見するための優れた標的となる。
【００８４】
ＴＦＢ１アッセイ：
（ａ）ＡＴＬＡＳ
（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター依存転写エッセイ
（ｃ）細胞ベースのアッセイ：ＳｃＮＩＰ１が、異なる生物、特に真菌および哺乳動物からの機能的なＴＦＢ１の遺伝子で置き換えられると思われる（すなわち、必要なときはｃＤＮＡ由来の）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのさまざまな菌株を構築することができる。これらの細胞は、潜在的に増殖を阻害する可能性がある明確な数の混合物および化合物を含む、個別のウエル中で増殖すると思われる。前述の菌株間の化合物による阻害の程度の違いは、ＴＦＢ１のクラスの活性を優先的に阻害することによって、化合物が増殖を阻害できることを示唆している可能性がある。
（ｄ）タンパク質−タンパク質／ＤＮＡ相互作用に基づくアッセイ： ＴＦＢおよびＴＦＢ１（たとえば、他のＴＦＩＩＨサブユニット）と相互作用することが分かっている任意のタンパク質（またはＤＮＡ）を使用する（ｉ）ツーハイブリッド・スクリーニング（Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅ，ら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，１６：２７７−８２，１９９７）；（ｉｉ）直接的な結合アッセイ：相互作用タンパク質またはＤＮＡを、検出可能なＴＦＢ１に容易に結合することができる担体上に固定することができる。阻害物質の不在下では、充分なシグナルが生じるであろう。しかしながら、この相互作用が妨害されることによって、シグナルが低下する。ＴＦＢ１の固定、および標識相互作用タンパク質ＤＮＡを用いた培養によって、アッセイの方向を逆にすることもできた。
【００８５】
ＳＰＣ９８
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＰＣ９８は、紡錘体の極体（ＳＰＢ）、真菌の動原体の相当物において役割を有する、必須タンパク質をコードしている。ＳＰＣ９８は、γチューブリンに関する酵母菌遺伝子、ＴＵＢ４の突然変異体の、コピー数の多いサプレッサーとして同定された。ＳＰＣ９８の条件付き突然変異は、制限的な条件に移動すると、欠陥のある分裂紡錘体と共に細胞周期の停止をもたらす（Ｇｅｉｓｓｌｅｒら、Ｅｍｂｏ Ｊｏｕｒｎａｌ，１５：３８９９−９１１，１９９６）。ＳＰＣ９８と類似した配列の領域を有する遺伝子である、ＳＰＣ９７は、ＳＰＣ９８の突然変異体の、コピー数の多いサプレッサーとして同定された（Ｋｎｏｐら、Ｅｍｂｏ Ｊｏｕｒｎａｌ，１６：１５５０−６４，１９９７）。ＳＰＣ９７およびＳＰＣ９８の産物は、γチューブリンと複合体を形成し、微小管の核形成を担うことが示されている（Ｋｎｏｐ，Ｍ．，ら、１９９７；Ｐｅｒｅｉｒａら、Ｅｍｂｏ Ｊｏｕｒｎａｌ，１８：４１８０−４１９５，１９９９；Ｃｈｅｎら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１４１：１１６９−１１７９，１９９８）。ＳＰＣ９７およびＳＰＣ９８のヒト相同体も、γチューブリンとの複合体中に存在し、同じ機能を有しているようである（Ｔａｓｓｉｎら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１４１：６８９−７０１，１９９８；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１４１：６６３−７４，１９９８）。
【００８６】
ＳＰＣ９８アッセイ：
（ａ）ＡＴＬＡＳ：ＣａＳｐｃ９８タンパク質を精製し、タンパク質を広げる高温または低ｐＨなどの環境条件で攻撃することができた。ＣａＳｐｃ９８タンパク質に結合する化合物は、タンパク質の元の形状を安定させることができる。
（ｂ）他の相互作用タンパク質を使用するツーハイブリッド断絶スクリーニング： ＣａＳｐｃ９８およびＣａＳｐｃ９７を、酵母菌ツーハイブリッド・スクリーニング用ベクター中に、１つはベイト（ｂａｉｔ）として、１つは標的として置くことができた。２つのタンパク質の近くに結合することによって、レポーター遺伝子の発現が誘導されるであろう。２つのタンパク質の結合を妨害する化合物は、レポーター遺伝子の誘導を妨げるはずであり、このような化合物をスクリーニング・フォーマット中に同定することができる。ＣａＳｐｃ９７以外の相互作用タンパク質を、このフォーマットにおいて使用することができた。
【００８７】
ＢＦＲ２
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＢＦＲ２は、ゴルジ体の構造および機能を害する真菌の代謝産物である、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（ＢＦＡ）によって誘導される増殖欠陥体の、コピー数の多いサプレッサーとして単離された必須遺伝子である（Ｃｈａｂａｎｅ他、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ，３３：２１−８，１９９８；Ｔａｋａｔｓｕｋｉら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４９：８９９−９０２，１９９５；Ｋｌａｕｓｎｅｒら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１１６：１０７１−１０８０，１９９２）。さらに、ＢＦＲ２の過剰産生は、分泌経路に関連がある４つの突然変異の増殖欠陥体を、部分的にサプレスすることが示された（Ｃｈａｂａｎｅら、１９９８）。突然変異体、ｓｅｃ１３−１、ｓｅｃ１６−１、ｓｅｃ２３−１およびｙｐｔ１−１はそれぞれ、ゴルジ体への途中の小さな小胞の出芽およびまたは結合と関連がある。したがって、ＢＦＲ２はタンパク質の運搬と関連があることが示唆された（Ｃｈａｂａｎｅら、１９９８）。
【００８８】
ＢＦＲ２アッセイ：
（ａ）ＢＦＲ２は、ＡＴＬＡＳアッセイ・フォーマットにおいてスクリーニングすることができ、
（ｂ）ＢＦＲ２の示されている機能に基づくと、ＢＦＲ２を害する化合物は、細胞のＢＦＡに対する感受性をより高めると思われる。したがって、ＢＦＡに対する細胞の感受性の増大は、二次的なスクリーニング対象として使用することができるであろう、追加的なアッセイ対象である。
【００８９】
ＲＮＡ１
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＲＮＡ１遺伝子は、Ｒｎａ１タンパク質をコードしており、これはあらゆるタイプのＲＮＡの核外輸送と関連がある（Ｓａｒｋａｒら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ，１９９８，９：３０４１−５５）。組み立てられた６０Ｓのリボゾーム・サブユニットの、核から細胞質への輸送が必要とされる（Ｈｕｒｔら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９９９，１４４：３８９−４０１）。Ｒｎａ１ｐは、タンパク質の核内への輸送において直接的な役割を果たす（Ｃｏｒｂｅｔｔら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９９５，１３０：１０１７−２６）。ＧＳＴ−Ｒｎａ１ｐは、精製されたＧｓｐ１ｐによってＧＴＰの加水分解を触媒的に刺激する（Ｃｏｒｂｅｔｔら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９９５，１３０：１０１７−２６）。ＧＳＴ−Ｒｎａ１ｐが、ｒａｓまたはＲａｂ７のＧＴＰａｓｅ活性を刺激することはない（Ｂｅｃｋｅｔら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９５，２７０：１１８６０−５）。ＲＮＡ１は、Ｓ．ｐｏｍｂｅのＲｎａ１ｐ、および哺乳動物のＲａｎ／ＴＣ４ ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質と広範囲の相同性を有する（Ｃｏｒｂｅｔｔら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９９５，１３０：１０１７−２６；Ｂｉｓｃｈｏｆｆら、ＰＮＣＡＳ ＵＳＡ，１９９５ ９２：１７４９−５３；Ｍｅｌｃｈｉｏｒら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ，１９９３，４：５６９−８１）。ｒｎａ１−１の突然変異体は、Ｓ．ｐｏｍｂｅのｒｎａ１によって補われる。これは、ロイシンが豊富な繰り返しモチーフを有するタンパク質の、スーパーファミリーのメンバーであり、このタンパク質はアミノ酸２９個までの長さであってよい（Ｍｅｌｃｈｉｏｒら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ，１９９３，４：５６９−８１；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，１９９２，２３３：３１５−８）。ｒｎａ１−１の突然変異体から作成したサイトゾル抽出物には、Ｒｎａ１ｐがまったく無く、タンパク質が核中に局在することが発見された（Ｔｒａｇｌｉｅら、ＰＮＣＡＳ ＵＳＡ，１９９６，９３：７６６７−７２）。この突然変異体は、ＲＮＡのプロセッシングおよび核からの輸送に影響を与えるが、Ｒｎａ１ｐは細胞質性である（Ｈｏｐｐｅｒら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９９０，１１１：３０９−２１）。ｒｎａ１−１の突然変異体は、非許容温度において、イントロンの無いｔＲＮＡおよびイントロン含有ｔＲＮＡを核中に蓄積させる（Ｓａｒｋａｒら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ，１９９８，９：３０４１−５５）。これによって、核から細胞質へのＲＮＡの輸送が変わること、およびＲＮＡが核周辺に蓄積することが示される（Ａｍｂｅｒｇら、ＧＡＤ，１９９２ ６：１１７３−８９）。温度感受性の突然変異体は、３５ＳのプレｒＲＮＡが蓄積している（Ｖｅｎｅｍａら、Ｙｅａｓｔ，１９９５，１１：１６２９−５０）。ｒｎａ１−１の突然変異体では核孔複合体、Ｃｓｅ１ｐ−ＧＦＰは局在しておらず、これは細胞全体に分布するようになる（Ｈｏｏｄ他、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９８，２７３：３５１４２−３５１４６）。カルボキシ末端からの１１個のアミノ酸が取り除かれるとき、タンパク質はその機能を保持する（Ｔｒａｇｌｉａら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，���９８９，９：２９８９−９９）。ｒｎａ１−１の突然変異体では、核からの小さなリボゾーム・サブユニットの輸送は、プレｒＲＮＡのプロセッシングの際に付随する二次的な欠陥と共に直接阻害される（Ｍｏｙら、ＧＡＤ，１９９９，１３：２１１８−２１３３）。
【００９０】
ＲＮＡ１アッセイ：
（ａ）ＡＴＬＡＳ
（ｂ）ＲＮＡ１の突然変異体は、イントロンの無いｔＲＮＡおよびイントロン含有ｔＲＮＡを蓄積させる（１）。この情報は、結合しＲｎａ１ｐ活性を害する化合物の存在／不在下で、このようなｔＲＮＡをアッセイする際に有用である可能性がある。
（ｃ）３５ＳプレｒＲＮＡのプロセッシングの欠陥は、ノーザン・ハイブリダイゼーションおよびプライマー伸張分析による、プレｒＲＮＡの切断部位周辺でのオリゴヌクレオチドを用いた探索によって調べることができる。
（ｄ）温度感受性の突然変異体中には、３５ＳプレｒＲＮＡが蓄積する（１１）。この影響は、細胞ベースのアッセイにおいて研究することができる。３５Ｓ標識されたプレｒＲＮＡのレベルは、化合物の存在／不在下でアッセイすることができる。
【００９１】
ＧＣＤ７
真核生物のタンパク質の翻訳は、４０Ｓのリボゾーム・サブユニットの近くに、ｍＲＮＡおよびＭｅｔ−ｔＲＮＡｉＭｅｔを得ることによって開始される。これらの変化は、開始因子（ｅＩＦ’ｓ）によって仲介されている。ｅＩＦ２は、Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｉＭｅｔおよびＧＴＰとの複合体を形成し、これは４０Ｓのリボゾームに結合する（Ｐａｖｉｔｔら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９９７，１７：１２９８−３１３）。その後ｍＲＮＡがこれらの４０Ｓのリボゾームに結合し、Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｉＭｅｔの近くのＡＵＧコドンが認識された後に、ＧＴＰの加水分解によってｅＩＦ２−ＧＤＰが切り離される。ｅＩＦ２−ＧＤＰは、グアニン・ヌクレオチド交換因子であるｅＩＦ２ＢによってｅＩＦ２−ＧＴＰに転換され、この結果として、タンパク質の翻訳を継続することができる。アミノ酸が枯渇することによって、ｅＩＦ２のリン酸化、ｅＩＦ２ＢによるｅＩＦ２−ＧＤＰのリサイクルの低下、アミノ酸生合成酵素の転写活性化物質であるＧＣＮ４の優先的な翻訳がもたらされる。ｅＩＦ２Ｂは５つのサブユニットから構成されており、ＧＣＤ７を含めたそのうちの４つは、増殖に不可欠である。ＧＣＤ７は、リン酸化ｅＩＦ２の結合部位の一部を形成し、これによってｅＩＦ２Ｂの阻害を仲介しているようである。
【００９２】
ＧＣＤ７の遺伝子は、哺乳動物細胞および真菌細胞の両方において発見されている。しかしながら、真菌間の保存の程度は、真菌と哺乳動物の間のそれよりも高い（約５０％と３５％）。真菌細胞の生存能力に関する重要性と併せたこの違いによって、ＧＣＤ７は抗真菌剤を発見するための優れた標的となる。
【００９３】
ＧＣＤ７アッセイ：
（ａ）ＡＴＬＡＳ
（ｂ）タンパク質の翻訳アッセイ（Ｃｏｌｔｈｕｒｓｔら、Ｊ Ｇｅｍ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９１，１３７：８５１−８５７）
（ｃ）細胞ベースのアッセイ：（ｉ）ＳｃＧＣＤ７が異なる生物、特に真菌および哺乳動物からの機能的なＧＣＤ７遺伝子で置き換えられる（すなわち、必要なときはｃＤＮＡ由来の）と思われる、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのさまざまな菌株を構築することができた。これらの細胞は、潜在的に増殖を阻害する可能性がある明確な数の化合物および混合物を含む個々のウエル中で増殖すると思われる。前述の菌株間の化合物による阻害の程度の違いは、ＧＣＤ７のクラスの活性を優先的に阻害することによって、化合物が増殖を阻害することができることを示唆する；（ｉｉ）阻害剤化合物の存在に依存する増殖を測定する代わりに、ＧＣＮ４の発現を標的とするより特異的なアッセイを行うことができると思われる。ＡＴを用いてヒスチジンの枯渇が誘導され、これによって増殖に必要とされるＧＣＮ４の発現が行われると思われる。あるいは、ＡＴを加える前に細胞を高密度に増殖させることができ、ＧＣＮプロモーター（および（一部の）Ｇｃｎ４ｐ）の適切なレポーター遺伝子／タンパク質への転写（または翻訳）融合によって、ＧＣＮ４の活性化を調べることができた（Ｐａｖｉｔｔら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９９７，１７：１２９８−３１３）。
（ｄ）ＧＤＰ交換アッセイ（Ｃｉｇａｎら、ＰＮＡＳ，１９９３，９０：５３５０−５３５４）：ｅＩＦ２およびｅＩＦ２Ｂは、適切な宿主から単離されると思われる。ｅＩＦ２は標識されたＧＤＰと複合体形成すると思われる。この複合体を培養することによって標識されたＧＤＰが切り離され、これが複合体から分離されると思われる。この離脱によって化合物がブロックされることにより、多量の標識体が切り離されると思われる。
（ｅ）タンパク質間相互作用ベースのアッセイ：（ｉ）ＧＣＤ７およびＧＣＤ７と相互作用することが分かっている任意のタンパク質（たとえば、他のｅＩＦ２サブユニット）を使用する、ツーハイブリッド・スクリーニング（Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，１９９７，１６：２７７−８２）；（ｉｉ）直接的な結合アッセイ。相互作用タンパク質を、検出可能なＧＣＤ７に容易に結合することができる担体に固定する。阻害物質の不在下では、多量のシグナルが生じると思われる。しかしながら、この相互作用を害することによってシグナルは低下すると思われる。ＧＣＤ７を固定すること、および標識した相互作用タンパク質と共に培養することによって、アッセイの方向を逆にすることもできると思われる。
【００９４】
ＳＫＩ６
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの大部分の菌株は、１以上のｄｓＲＮＡウイルスを保有している。酵母菌に宿るこれらのウイルスはキラー菌株と呼ばれており、ウイルスを保有していない菌株の大部分にとって致命的な毒素を分泌する。毒素の発現を抑制解除することによって、スーパーキラーの表現型がもたらされる（Ｒｉｄｌｅｙら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９８４，４：７６１−７０）。
【００９５】
ＳＫＩ６は、キラーより強力な突然変異体の表現型によって同定された、多くの遺伝子の１つである。（Ｍａｓｉｓｏｎら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９９５，１５：２７６３−７１）ＳＫＩ６は、細菌のｔＲＮＡプロセッシング酵素、ＲＮａｓｅＰＨと相同的な必須タンパク質をコードしている。（Ｌｕｓｓｉｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９７，１４７：４３５−４５０；Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、Ｃｅｌｌ，１９９７，９１：４５７−４６６）Ｂｅｎａｒｄらは、ｓｋｉ６突然変異体は、効率的なｍＲＮＡ翻訳に関するポリＡ尾部の要件を回避しており、これによってＬ−ＡウイルスのｍＲＮＡを含めて、非ポリＡｍＲＮＡがより良く翻訳されることを発見した。（Ｂｅｎａｒｄら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９９８，１８：２６８８−２６９６）その後の実験によって、ＳＫＩ６は３’−５’ｍＲＮＡの減衰に重要な役割を果たしており、このことはｓｋｉ６突然変異体がウイルスのｍＲＮＡ翻訳を抑制解除するという事実と一致することが示唆された。（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、Ｃｅｌｌ，１９９７，９１：４５７−４６６；ｖａｎＨｏｏｆら、Ｃｅｌｌ，１９９９，９９：３４７−３５０）
【００９６】
ＳＫＩ６は、リボゾームＲＮＡのプロセッシングにおいても機能する。（Ａｌｌｍａｎｇら、ＧＡＤ，１９９９，１３：２１４８−５８）ＳＫＩ６は、５．８ＳのｒＲＮＡの成熟に必要とされる３’−５’エキソリボヌクレアーゼとして機能する、エキソゾーム複合体の一部分である。（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、Ｃｅｌｌ，１９９７，９１：４５７−４６６）
【００９７】
ＳＫＩ６Ｓｋｉ６ｐは、３’−５’エキソリボヌクレアーゼ活性によってスクリーニングすることができる。ＲＮＡ基質はＰ−３２で放射性標識し、組み換え精製Ｓｋｉ６ｐと共に培養する。ＴＣＡ沈殿性である放射性標識したＲＮＡ基質の損失は、Ｓｋｉ６タンパク質の活性によるものであり、したがってＳｋｉ６ｐの阻害物質をスクリーニングすることができる。
【００９８】
（ａ）ＡＴＬＡＳ： Ｓｋｉ６タンパク質は、均質に精製することができる。精製したＳｋｉ６タンパク質を、高温または低ｐＨなどの異なる環境条件で攻撃することによってタンパク質の形状が変わり、タンパク質が折りたたまれていない状態になるであろう。Ｓｋｉ６に結合する任意の化合物は、タンパク質を元の形状に安定させることができるであろう。ＡＴＬＡＳを使用することによって、Ｓｋｉ６ｐに結合する化合物の同定を助けることができる。
【００９９】
（ｂ）ルシフェラーゼ・アッセイ： ポリＡ尾部を有するかあるいは有さないルシフェラーゼのメッセンジャーＲＮＡを調製し、エレクトロポレーションによって酵母菌にトランスフェクトすることができる。Ｓｋｉ６ｐはポリＡを有していないｍＲＮＡの翻訳を害するので、ポリＡ尾部を含むｍＲＮＡについてはルシフェラーゼ活性は高く、ポリＡ尾部を有さないｍＲＮＡについては約４０倍低いであろう。Ｓｋｉ６ｐの活性を害する化合物の存在下では、ポリＡ尾部を含むｍＲＮＡの存在下のルシフェラーゼ活性は比較的一定であるはずであるが、ポリＡ尾部の不在下の活性は約１０倍増大するはずである。
【０１００】
ＮＩＰ１
真核生物のタンパク質の翻訳は、４０Ｓのリボゾーム・サブユニットの近くに、ｍＲＮＡおよびＭｅｔ−ｔＲＮＡｉＭｅｔを得ることによって開始される（Ｈａｎａｃｈｉら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９９，２７４：８５４６−８５５３）。これらの変化は、開始因子（ｅＩＦ’ｓ）によって仲介されている。ｅＩＦ３は、約８−１０個のサブユニットから構成されており、そのうちの１つがＮＩＰ１である。ｅＩＦ３内のＮＩＰ１の特異的な酵素機能は記載されていない。しかしながら、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中においてこの遺伝子を確認することによって、このタンパク質が細胞の増殖および生存能力にとって重要であることが示される。
【０１０１】
ＮＩＰ１の遺伝子は、哺乳動物細胞および真菌細胞の両方において発見されている。しかしながら、真菌間の保存の程度は、真菌と哺乳動物の間のそれよりも高い（約４０％と２５％）。真菌細胞の生存能力に関する重要性と併せたこの違いによって、ＮＩＰ１は抗真菌剤を発見するための優れた標的となる。
【０１０２】
ＮＩＰ１アッセイ：
（ａ）ＡＴＬＡＳ
（ｂ）タンパク質の翻訳アッセイ（Ｃｏｌｔｈｕｒｓｔら、Ｊ Ｇｅｎ Ｂｉｏｌ，１９９１，１３７：８５１−８５７）
（ｃ）細胞ベースのアッセイ：ＳｃＮＩＰ１が、異なる生物、特に真菌および哺乳動物からの機能的なＮＩＰ１の遺伝子で置き換えられると思われる（すなわち、必要なときはｃＤＮＡ由来の）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのさまざまな菌株を構築することができる。これらの細胞は、潜在的に増殖を阻害する可能性がある明確な数の混合物および化合物を含む、個別のウエル中で増殖すると思われる。前述の菌株間の化合物による阻害の程度の違いは、ＮＩＰ１のクラスの活性を優先的に阻害することによって、化合物が増殖を阻害できることを示唆している。
（ｄ）タンパク質間相互作用に基づくアッセイ： ＮＩＰ１およびＮＩＰ１（たとえば、他のｅＩＦ３サブユニット）と相互作用することが分かっている任意のタンパク質）を使用する（ｉ）ツーハイブリッド・スクリーニング（Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，１９９７；１６：２７７−８２）；（ｉｉ）直接的な結合アッセイ：相互作用タンパク質を、検出可能なＮＩＰ１に容易に結合することができる担体上に固定することができる。阻害物質の不在下では、充分なシグナルが生じるであろう。しかしながら、この相互作用が妨害されることによって、シグナルが低下する。ＮＩＰ１の固定、および標識相互作用タンパク質を用いた培養によって、アッセイの方向を逆にすることもできた。
【０１０３】
ＬＣＰ５
ＬＣＰ５は、４０．８Ｋｄのタンパク質をコードしている、不可欠なＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝子である。ＬＣＰ５ｐは核に免疫局在し、プレｒＲＮＡのプロセッシングの経路における部位Ａ０〜Ａ２での初期の切断事象と関係がある（Ｗｉｅｄｅｒｋｅｈｒら、ＲＮＡ，１９９８，４：１３５７−１３７２）。欠失は１８Ｓのリボゾーム・サブユニットのレベルの低下、付随する６０Ｓのリボゾーム・サブユニットの蓄積、およびポリゾームの急激な減少をもたらす（Ｗｉｅｄｅｒｋｅｈｒら、ＲＮＡ，１９９８，４：１３５７−１３７２）。
ｌｃｐ５−１突然変異体は、アミノグリコシド抗生物質パロモミシンおよびネオマイシン、およびシクロヘキシミドに対して高い感受性を示し、このことは翻訳の欠陥を示す（Ｗｉｅｄｅｒｋｅｈｒら、ＲＮＡ，１９９８，４：１３５７−１３７２）。ｌｃｐ５−１の突然変異、またはＬｃｐ５ｐの欠失によって、１８ＳのｒＲＮＡの急激な減少、異常な２３Ｓのプレ−ｒＲＮＡ種の蓄積が示される（Ｗｉｅｄｅｒｋｅｈｒら、ＲＮＡ，１９９８，４：１３５７−１３７２）。
【０１０４】
ＬＰＣ５アッセイ：
（ａ）ＡＴＬＡＳ
（ｂ）Ｌｃｐ５の突然変異によって、部位Ａ３における優性プロセッシング、および３５ＳプレｒＲＮＡ中の部位Ａ０〜Ａ２での切断の減少が示される（Ｗｉｅｄｅｒｋｅｈｒら、ＲＮＡ，１９９８，４：１３５７−１３７２）。３５ＳプレｒＲＮＡのプロセッシングの欠陥は、ノーザン・ハイブリダイゼーションおよびプライマー伸張分析による、プレｒＲＮＡの切断部位周辺でのオリゴヌクレオチドを用いた探索によって調べることができる。
（ｃ）ＬＣＰ５特異的な化合物によってｒＲＮＡ代謝に影響を与えることができ、このことは、１８ＳのｒＲＮＡの安定状態の量が減少を示すであろう、すべてのＲＮＡを見ることによって調べることができる。（Ｗｉｅｄｅｒｋｅｈｒら、ＲＮＡ，１９９８，４：１３５７−１３７２）。
（ｄ）化合物は、アミノグリコシド抗生物質パロモミシンおよびネオマイシン、およびシクロヘキシミドの存在／不在下でアッセイすることができる。突然変異体はこれらの抗生物質に対して高い感受性を示すので（Ｗｉｅｄｅｒｋｅｈｒら、ＲＮＡ，１９９８，４：１３５７−１３７２）、相乗作用を観察することができるからである。
【０１０５】
ＮＣＥ１０３
タンパク質輸送機構の成分に関する研究において、Ｃｌｅｖｅｓら（Ｃｌｅｖｅｓら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９６，１３５（５）１０１７−２６）は、小胞体からゴルジ体区画への古典的経路とは独立して機能する、非古典的な輸送経路と関連があるＮＣＥ１０３遺伝子を発見した。（Ｃｌｅｖｅｓら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９６，１３５（５）１０１７−２６）ＮＣＥ１０３遺伝子は正常な条件下では不可欠であるようであったが、Ｇｏｔｚらによる実験によって、それは嫌気性条件下では野生型のように増殖することが示唆された。（Ｇｏｔｚら、Ｙｅａｓｔ，１９９９，１５：８５５−８６４）Ｎｃｅ１０３ｐの予想アミノ酸配列は、原核生物と真核生物の両方の炭酸脱水酵素に対して高レベルの同一性を示す。（Ｇｏｔｚら、Ｙｅａｓｔ，１９９９，１５：８５５−８６４）コピー数の多いプラスミド中での、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａの炭酸脱水酵素の遺伝子の発現によって、ｎｃｅ１０３の欠失によって引き起こされる増殖欠陥が補われる（Ｇｏｔｚら、Ｙｅａｓｔ，１９９９，１５：８５５−８６４）ｎｃｅ１０３の欠失菌株が嫌気性条件下において野生型のように増殖し、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａの炭酸脱水酵素の遺伝子によって欠失を補うことができないと仮定して、ｎｃｅ１０３は忠実な炭酸脱水酵素として機能し、好気性条件下での酸化代謝産物のいくつかの生成物に対する保護用に必要とされることが提案された。（Ｇｏｔｚら、Ｙｅａｓｔ，１９９９，１５：８５５−８６４）
【０１０６】
ＮＣＥ１０３アッセイ：
（ａ）ＡＴＬＡＳ：Ｎｃｅ１０３タンパク質は、均質に精製することができる。精製したＮｃｅ１０３タンパク質を、高温または低ｐＨなどの異なる環境条件で攻撃することによってタンパク質の形状が変わり、タンパク質が折りたたまれていない状態になるであろう。Ｎｃｅ１０３ｐに結合する任意の化合物は、タンパク質を元の形状に安定させることができるであろう。ＡＴＬＡＳを使用することによって、Ｎｃｅ１０３ｐに結合する化合物の同定を助けることができる。
【０１０７】
ＥＣＯ１
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＣＯ１（ＣＴＦ７とも呼ばれる）は、ＤＮＡ複製中に姉妹染色分体間の結合を確立するために必要とされる必須遺伝子である。この遺伝子は、後期阻害タンパク質、Ｐｄｓ１ｐの存在下で姉妹染色分体を分離させることができる、突然変異体として単離された（Ｔｏｔｈら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．，１３：３２０−３３３，１９９９；Ｓｋｉｂｂｅｎｓら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．，１３：３０７−３１９，１９９９）。このタンパク質は、姉妹染色分体の結合を確立させるためにＳ期中で不可欠であるが、その結合を維持するために有糸分裂中で不可欠であることはない（Ｓｋｉｂｂｅｎｓら、１９９９）。ＥＣＯ１の温度感受性対立遺伝子を収容している細胞は、制限的温度において、伸張した紡錘糸を有する大きな出芽細胞として主に停止する。母細胞はすべてのＤＮＡを含むことが多いなどの、ＤＮＡの分離における欠点が存在する（Ｓｋｉｂｂｅｎｓら、１９９９）。いくつかの温度感受性突然変異体は、許容温度において、より大きな染色体断片の損失を示す（Ｔｏｔｈら、１９９９；Ｓｋｉｂｂｅｎｓら、１９９９）。コピー数の多いＰＯＬ３０（ＤＮＡ複製加工因子またはＰＣＮＡ）遺伝子は、ｃｔｆ７の温度感受性および染色体の損失をサプレスすることができ、したがって、ＣＴＦ１／ＥＣＯ１は姉妹染色分体の結合の確立において機能するという仮説が、さらに支持されることになる（Ｓｋｉｂｂｅｎｓら、１９９９）。
【０１０８】
ＥＣＯ１アッセイ：
（ａ）ＥＣＯ１は、ＡＴＬＡＳフォーマットにおいてスクリーニングすることができる。染色体断片の損失は、二次的なアッセイにおいて評価することができる。このアッセイでは、レポーター染色体断片を忠実に維持することによって白いコロニーが生成する一方で、レポーター染色体が損失することによって赤い区画されたコロニーが生成する（Ｔｏｔｈら、１９９９；Ｓｋｉｂｂｅｎｓら、１９９９）。さらに、細胞のＤＮＡ含有量をフロー・サイトメトリーによって、あるいは核染色液、ＤＡＰＩで染色した細胞の顕微鏡写真において分析することができる（Ｔｏｔｈら、１９９９）。
（ｂ）染色体断片の損失。レポーター染色体断片を忠実に維持することによって白いコロニーが生成する一方で、レポーター染色体が損失することによって赤い区画されたコロニーが生成する（Ｔｏｔｈら、１９９９；Ｓｋｉｂｂｅｎｓら、１９９９）。
（ｃ）細胞のＤＮＡ含有量をフロー・サイトメトリーによって、あるいは核染色液、ＤＡＰＩで染色した細胞の顕微鏡写真において分析することができる（Ｔｏｔｈら、１９９９）。
【０１０９】
ＯＲＣ２
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＯＲＣ２は、染色体の全長にわたって分布しているＤＮＡ複製の起点において働く、６サブユニット起点の認識複合体（ＯＲＣ）の成分である（Ｂｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９２，３５７：１２８−１３４）。ＯＲＣ２は、生存能力のために必要であり、ＯＲＣ２の温度感受性突然変異により、ＤＮＡ複製の欠陥と一致して細胞周期が停止する結果となる（Ｍｉｃｋｌｅｍら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，３６６：８７−８９；Ｍ．Ｆｏｓｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３，２６２： １８３８−１８４４； Ｂｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３，２６２：１８４４−１８４９）。ＯＲＣは、ＤＮＡｓｅフットプリント法によって複製の起点に結合することが実証されており、この活性はＯＲＣ２に依存する（Ｂｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３，２６２：１８４４−１８４９；Ｌｅｅら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ，１９９３，２６２：１８４４−１８４９）。この遺伝子が、転写のサイレンス化および末端小粒のサイレンス化に必要とされることも示されている（Ｍｉｃｋｌｅｍら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，３６６：８７−８９；Ｍ．Ｆｏｓｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３，２６２： １８３８−１８４４； Ｂｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３，２６２：１８４４−１８４９）。これらは、ＯＲＣ２遺伝子産物については別の機能であるようである。なぜなら、サイレンス化の際のＯＲＣ２の役割は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＯＲＣ２の発現によって酵母菌中で補うことができるが、複製の際のその役割は補われないからである（Ｅｈｒｅｎｈｏｆｅｒ−Ｍｕｒｒａｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，２７０：１６７１−１６７４）。
【０１１０】
ＯＲＣ２アッセイ：
（ａ）ＡＴＬＡＳ：ＣａＯｒｃ２タンパク質を精製し、タンパク質を広げる高温または低ｐＨなどの環境条件で攻撃することができた。ＣａＯｒｃ２タンパク質に結合する化合物は、タンパク質の元の形状を安定させることができる。
（ｂ）他の相互作用タンパク質を使用するツーハイブリッド断絶スクリーニング：ＣａＯｒｃ２およびＯＲＣの別のメンバーのＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓのオーソログを、酵母菌ツーハイブリッド・スクリーニング用ベクター中に、１つはベイトとして、１つは標的として置くことができた。２つのタンパク質の近くに結合することによって、レポーター遺伝子の発現が誘導されるであろう。２つのタンパク質の結合を妨害する化合物は、レポーター遺伝子の誘導を妨げるはずであり、このような化合物をスクリーニング・フォーマット中に同定することができる。ＯＲＣのタンパク質以外の相互作用タンパク質を、このフォーマットにおいて使用することができた。
（ｃ）ＤＮＡ結合のスクリーニング：ＣａＯｒｃ２タンパク質へのＤＮＡの結合を妨害する能力に関して、化合物をスクリーニングすることができた。ＤＮＡとＣａＯｒｃ２タンパク質の結合は、さまざまな方法：１）フィルタ上での捕獲あるいは抗体による捕獲によって；２）蛍光標識したＤＮＡを使用して均質な溶液中で、蛍光性の偏りの変化を検出すること；あるいは３）ＤＮＡがタンパク質の近くに結合するとき、ゲルの移動を検出することによって評価することができた。これらのスクリーニングは、アッセイ中の存在するＯＲＣの他のタンパク質で実施することができる。
【０１１１】
ＣＮＳ１
Ｈｓｐ９０シャペロン複合体は、熱変性したタンパク質および失活し易いシグナル・タンパク質の両方において、活性を維持または回復する（Ｄｏｌｉｎｓｋｉら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９９８，１８：７３４４−７３５２）。Ｈｓｐ９０複合体とシグナル・タンパク質（たとえば、ホルモン受容体）の相互作用の現在のモデルでは、Ｈｓｐ９０−シグナル・タンパク質複合体のそのサブユニットへの、構築および分解を引き起こすサイクルが考えられている。タンパク質複合体の構築が完了すると、シグナルが発生する可能性がある。しかしながら、Ｈｓｐ９０の除去が起こらない場合は、シグナル・タンパク質は分解される。
【０１１２】
ＣＮＳ１はＨｓｐ９０シャペロン複合体サブユニットの１つであり、おそらくＴｅｔｒａｔｒｉｃｏペプチド繰り返し体（ＴＰＲ）ドメインを介して結合している。ＣＮＳ１の遺伝子は、哺乳動物細胞および真菌細胞の両方において発見されている。しかしながら、真菌間の保存の程度は、真菌と哺乳動物の間のそれよりも高い（約５５％と３０％）。真菌細胞の生存能力に関する重要性と併せたこの違いによって、ＣＮＳ１は抗真菌剤を発見するための優れた標的となる。
【０１１３】
ＣＮＳ１アッセイ：
（ａ）ＡＴＬＡＳ
（ｂ）細胞ベースのアッセイ：ＳｃＣＮＳ１が、異なる生物、特に真菌および哺乳動物からの機能的なＣＮＳ１の遺伝子で置き換えられると思われる（すなわち、必要なときはｃＤＮＡ由来の）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのさまざまな菌株を構築することができた。これらの細胞は、潜在的に増殖を阻害する可能性がある明確な数の混合物および化合物を含む、個別のウエル中で増殖すると思われる。前述の菌株間の化合物による阻害の程度の違いは、ＣＮＳ１のクラスの活性を優先的に阻害することによって、化合物が増殖を阻害できることを示唆している。
（ｃ）タンパク質間相互作用に基づくアッセイ： ＣＮＳ１およびＣＮＳ１（たとえば、他のＨｓｐ９０複合体サブユニット）と相互作用することが分かっている任意のタンパク質を使用する（ｉ）ツーハイブリッド・スクリーニング（Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，１９９７；１６：２７７−８２）；（ｉｉ）直接的な結合アッセイ：相互作用タンパク質を、検出可能なＣＮＳ１に容易に結合することができる担体上に固定することができる。阻害物質の不在下では、充分なシグナルが生じるであろう。しかしながら、この相互作用が妨害されることによって、シグナルが低下する。ＣＮＳ１の固定、および標識相互作用タンパク質を用いた培養によって、アッセイの方向を逆にすることもできた。
【０１１４】
ＹＰＤ１
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＹＰＤ１は、高浸透性検出ＭＡＰキナーゼ経路中の２成分調節系において機能する必須遺伝子である。タンパク質は、正常な浸透性の下でＳｌｎ１ｐからＳｓｋ１ｐへのリン酸（塩）の移動を仲介して、ＭＡＰキナーゼＳｓｋ２ｐおよびＳｓｋ２２ｐを阻害する（Ｐｏｓａｓら、Ｃｅｌｌ，８６：８６５−８７５，１９９６）。Ｙｐｄ１の致死性は、ＨＯＧ１経路が常に活性化していることによるものである（Ｐｏｓａｓら、１９９６）。Ｙｐｄ１ｐの構造は解明されており、これは中央孔を構成し活性部位残基、Ｈｉｓ６４を含む４らせんの束からなる。活性部位周辺の残基は溶媒にさらされ、リン酸（塩）移動の活性に重要である（Ｘｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２９２：１０３９−１０５０，１９９９）。
【０１１５】
ＹＰＤ１アッセイ：
（ａ）ＹＰＤ１は、ＡＴＬＡＳアッセイの優れた候補である。さらに、二次的なｉｎ ｖｉｔｒｏでのアッセイとして、Ｓｌｎ１ｐからＹｐｄ１への放射性標識したリン酸（塩）の移動を調べることができる（Ｌｉら、１９９８）
（ｂ）Ｓｌｎ１ｐからＹｐｄ１への放射性標識したリン酸（塩）の移動は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで調べることができる（Ｌｉら、ＥＭＢＯ Ｊ．，１７：６９５２−６９６２，１９９８）。
【０１１６】
ＴＩＭ１０
Ｔｉｍ１０は、ミトコンドリアのＲＮＡスプライシングおよび呼吸に欠陥があるｍｒｓ２突然変異体のサプレッサーとして、最初に単離された。（Ｊａｒｏｓｃｈら、Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，１９９７，２５５：１５７−６５）Ｔｉｍ１０は、ＴＩＭファミリーと呼ばれ、他のＴｉｍタンパク質、Ｔｉｍ９と広範囲の相同性を共有している、進化において保存されたタンパク質のグループに属する。（Ｂａｕｅｒら、ＧＥＢＳ Ｌｅｔｔ，１９９９，４６４：４１−４７）ミトコンドリアの内側膜の空間に位置しているので、Ｔｉｍ１０は、代謝担体タンパク質を、細胞質からミトコンドリアまで移動させるために機能する。Ｔｉｍ１０は可溶性タンパク質であり、これがＴｉｍ９およびＴｉｍ１２と複合体を形成して、ミトコンドリア用であり、それらを他のＴｉｍ複合体、Ｔｉｍ５４−２２−１８に移動させる前駆体タンパク質に結合する。（Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７９：３６９−３７３，１９９８：Ｓｉｒｒｅｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ，３９１：９１２−９１５，１９９８；Ａｄａｍら、Ｅｍｂｏ Ｊｏｕｒｎａｌ，１８：３１３−３１９，１９９９； Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｅｍｂｏ Ｊ．，１７：６４７７−６４８６，１９９８；Ｅｎｄｒｅｓら、Ｅｍｂｏ Ｊ．，１８：３２１４−３２２１，１９９９）。Ｔｉｍ１０はミトコンドリアの生物発生、および酵母菌細胞の生存能力に不可欠である。（Ｊａｒｏｓｃｈら、Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，１９９７，２５５：１５７−６５）Ｔｉｍ１０欠失の結果として、ミトコンドリアは形状が劇的に変わり、シトクローム複合体を組み立てることができなくなる。（Ｋｕｂｒｉｃｈら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９８，２７３：１６３７４−１６３８１）
【０１１７】
ＴＩＭ１０アッセイ：
（ａ）ＡＴＬＡＳ：Ｔｉｍ１０タンパク質は、均質に精製することができる。精製したＴｉｍ１０タンパク質を、高温または低ｐＨなどの異なる環境条件で攻撃することによってタンパク質の形状が変わり、タンパク質が折りたたまれていない状態になるであろう。Ｔｉｍ１０ｐに結合する任意の化合物は、タンパク質を元の形状に安定させることができるであろう。ＡＴＬＡＳを使用することによって、Ｔｉｍ１０ｐに結合する化合物の同定を助けることができる。
（ｂ）Ｔｉｍ９を用いたツーハイブリッド。Ｔｉｍ１０は、Ｔｉｍ９およびＴｉｍ１２と複合体を形成することが示されているが、Ｔｉｍ９ｐとのＴｉｍ１０ｐの直接的な相互作用のみが充分に述べられている。ツーハイブリッドを使用して、Ｔｉｍ１０とＴｉｍ９の相互作用を害する化合物をスクリーニングすることによって、Ｔｉｍ１０タンパク質を攻撃する化合物を同定するのを助けることになるであろう。Ｔｉｍ１０およびＴｉｍ９は、酵母菌中で１対の遺伝子として、その１つはベイトとして、もう１つは標的として使用することができる。Ｔｉｍ１０およびＴｉｍ９タンパク質が酵母菌中で結合することによって、検出することができるレポーター遺伝子が誘導される結果となるであろう。Ｔｉｍ１０タンパク質とＴｉｍ９タンパク質の結合を害する任意の化合物によって、レポーター遺伝子の誘導が妨げられ、したがってその化合物を同定することができる。
【０１１８】
ＳＲＢ４
ＳＲＢ４は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのマルチ・サブユニット複合体の必須成分である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，１９９３，７３：１３６１−７５）。当分野ではＳＲＢは、ＲＮＡポリメラーゼＢのサプレッサーを表すことが知られている。ＳＲＢ４は、大部分のプロモーターにおいて、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの転写に必要とされている（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、ＰＮＡＳ，１９９５，９２：４５８７−９０）。ＳＲＢ４は、特定の活性物質の活性化機構に応じて、いくつかの遺伝子の転写の活性化には重要ではないことが近年実証されている（Ｌｅｅら、Ｇｅｎ．Ｄｅｖ．，１９９９，１３：２９３４−９）。ＤＮＡ架橋の免疫沈降アッセイを使用して、ＴＢＰ結合の活性物質依存性の刺激にはＳｒｂ４が必要であることが示された（Ｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９９，３９９：６０５−９）。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのＳｒｂ４タンパク質はイントロンを有しており、それはそのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ相同体と約３０％の同一性を有する。ＳＲＢ４は、２０％同一である潜在的なヒトの相同体である。
【０１１９】
ＳＲＢ４アッセイ：
（ａ）ＡＴＬＡＳ
（ｂ）細胞ベースのアッセイを設定して、野生型菌株およびＳＲＢ４温度感受性菌株中の、レポーター遺伝子の転写活性化を調べることができる。
（ｃ）ツーハイブリッド系ベースのアッセイを進展させて、Ｓｒｂ４ｐと他のＳＲＢタンパク質またはＲＮＡポリメラーゼＩＩのＣＴＤの間の相互作用を調べることができる。
（ｄ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写アッセイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，１９９３，７３：１３６１−７５，Ｋｏｌｅｓｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９４，３６８：４６６−４６９）。
【０１２０】
配列同一性
前述のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ｓｃ）遺伝子とそのＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ（ｃａ）、および入手可能な場合はヒト（ｈｓ）相同体間の配列同一性の程度を、表２中に提供する。（以下参照）。多数のアラインメントをＣｌｕｓｔａｌ Ｗを使用して作成し（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、上記）、ギャップ作成ペナルティー１２およびギャップ伸張ペナルティー４を用いるＧＣＧＧＡＰプログラムを使用して、同一性のパーセンテージを計算した。配列アラインメントの結果も、表２において参照される図中に示す。
【表２】
2004511756.tif 000003
2004511756.tif 000004
【０１２１】
標的タンパク質の生成および単離
本発明は、分析において抗真菌標的として使用する、真菌標的タンパク質を生成することに基づくものである。このような生成には、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよび／またはヒトの標的タンパク質、特に表１に列記したタンパク質をコードしている配列を含むベクター、これらのベクターを含む細胞を使用すること、および細胞を培養することを含む、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよび／またはヒトの標的タンパク質の相同体を生成するための方法が必要である。
【０１２２】
さまざまな真核生物および原核生物宿主における発現に関して、プラスミドおよび真菌ベクターを含めた、多数のベクターが記載されている。このようなベクターは、クローニングまたは発現用の１以上の複製系、宿主中での選択、たとえば抗生物質耐性に関する１以上のマーカー、および１以上の発現カセットを含むことが多いであろう。配列をコードしている挿入標的タンパク質は、合成し、天然源から単離し、ハイブリッドなどとして調製することができる。コード配列の転写調節配列への連結は、知られている方法によって行うことができる。適切な宿主細胞は、エレクトロポレーション、ＣａＣｌ２仲介のＤＮＡの取り込み、真菌感染、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイルを含めた任意の適切な方法、または他の確立されている方法によって、形質転換する／トランスフェクトする／感染させることができる。
【０１２３】
非常にさまざまな宿主／発現ベクターの組み合わせが、標的タンパク質、特に表１に列記したタンパク質をコードしているＤＮＡ配列を発現させる際に使用することができる。たとえば、有用な発現ベクターは、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列の断片からなっていてよい。適切なベクターには、ＳＶ４０および知られている細菌のプラスミド、たとえば大腸菌プラスミドＣｏｌ Ｅｌ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｅ６７：３１−４０，１９８８）、ｐＭＢ９およびその誘導体、ＰＲ４などのプラスミド、ファージＤＮＡ、たとえばファージ１の多数の誘導体、たとえばＮＭ９８９、および他のファージＤＮＡ、たとえばＭ１３および糸状一本鎖ファージＤＮＡの誘導体；２ミクロンのプラスミドまたはその誘導体などの酵母菌プラスミド；昆虫または哺乳動物細胞中で有用なベクターなどの、真核生物の細胞中で有用なベクター；ファージＤＮＡまたは他の発現調節配列を使用するために改質されているプラスミドなどの、プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせから誘導されるベクターなどがある。
【０１２４】
タンパク質を発現するのに適した宿主細胞には、細菌、始原細菌、真菌、特に酵母菌、および植物および動物細胞、特に哺乳動物細胞がある。特に興味深いのは大腸菌、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｆ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、およびＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、および不朽である哺乳動物骨髄およびリンパ細胞株である。好ましい複製系にはＭ１３、ＣｏｌＥ１、ＳＶ４０、バキュロウイルス、ラムダ、アデノウイルスなどがある。多数の転写開始および停止調節領域が単離されており、さまざまな宿主中での異種タンパク質の転写および翻訳において有効であることが示されている。これらの領域、単離の方法、操作の仕方などの例は、当分野で知られている。適切な発現条件下では、組み換えによって生成された標的タンパク質の源として、宿主細胞を使用することができる。有利なことにベクターは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよび／またはヒトの標的タンパク質をコードしている部分に作用可能に連結している、プロモーター配列を含むこともできる。コードされているＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよび／またはヒトの標的タンパク質は、本明細書に開示または引用されているか、あるいはそうでなければ当業者に知られている方法を使用して、任意の適切なベクターおよび宿主細胞を使用することによって発現させることができる。ベクター／宿主の個々の選択は、本発明には決して重要ではない。
【０１２５】
本発明の目的のために、ベクター中のプロモーター配列を、転写開始部位の近くのその３’末端に結合させ、上流（５’方向）に伸張させて、バックグランドを超えた検出可能なレベルで転写を開始させるのに必要な、最小数の塩基または要素を含ませる。プロモーター配列内には、転写開始部位（たとえばヌクレアーゼＳ１を用いた地図作成によって、好都合には定義される）、およびＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見られるであろう。
【０１２６】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよび／またはヒトの標的タンパク質の発現は、当分野で知られている任意のプロモーター／エンハンサー要素によって調節することができるが、これらの調節要素は、発現用に選択される宿主中において機能的でなければならない。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよび／またはヒトの標的タンパク質の遺伝子発現を調節するために、使用することができるプロモーターには、サイトメガロウイルス直接初期プロモーター（ＣＭＶプロモーター；米国特許第５，３８５，８３９号および５，１６８，０６２号）、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫の３’長末端繰り返し体中に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０，Ｃｅｌｌ２２：７８７−７９７）、疱疹チミジンキナーゼ・プロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２，Ｎａｔｕｒｅ２９６：３９−４２）；βラクタマーゼ・プロモーターなどの原核生物の発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５）；Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ，１９８０，２４２：７４−９４の「Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ」も参照のこと；Ｇａｌ４プロモーターなどの、酵母菌または他の真菌からのプロモーター要素、ＡＤＣ（アルコール脱水素酵素）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼ・プロモーター、および組織特異性を示し、トランスジェニック動物において使用されている動物の転写調節領域：脾臓の小胞細胞中で活性があるエラスターゼＩ遺伝子の調節領域（Ｓｗｉｆｔら、１９８４，Ｃｅｌｌ３８：６３９−６４６；Ｏｒｎｉｔｚら、１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５）；脾臓β細胞中で活性があるインシュリン遺伝子の調節領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５， Ｎａｔｕｒｅ３１５：１１５−１２２）、リンパ細胞中で活性がある免疫グロブリンの遺伝子の調節領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４，Ｃｅｌｌ３８：６４７−６５８；Ａｄａｍｅｓら、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１８：５３３−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８７， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４）、精巣、胸、リンパおよび肥満細胞中で活性があるマウスの乳腫瘍ウイルス調節領域（Ｌｅｄｅｒら、１９８６，Ｃｅｌｌ４５：４８５−４９５）、肝臓中で活性があるアルブミン遺伝子の調節領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７，ＧｅｎｅｓおよびＤｅｖｅｌ．１：２６８−２７６）、肝臓中で活性があるαフェトプロテ���ン遺伝子の調節領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８；Ｈａｍｍｅｒら、１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３５：５３−５８）、肝臓中で活性があるα１−抗トリプシン遺伝子の調節領域（Ｋｅｌｓｅｙら、１９８７，ＧｅｎｅｓおよびＤｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）、骨髄細胞中で活性があるβグロビン遺伝子の調節領域（Ｍｏｇｒａｍら、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａｓら、１９８６，Ｃｅｌｌ４６：８９−９４）、脳内の希突起膠細胞中で活性があるミエリン塩基性タンパク質遺伝子の調節領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７，Ｃｅｌｌ４８：７０３−７１２）、骨格筋中で活性があるミオシン軽鎖−２遺伝子の調節領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１４：２８３−２８６）、および視床下部で活性がある生殖腺刺激性放出ホルモン遺伝子の調節領域（Ｍａｓｏｎら、１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３４：１３７２−１３７８）があるが、これらだけには限られない。
【０１２７】
野生型または変異体のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよび／またはヒトの標的タンパク質／ポリペプチドをコードしている核酸を、組み換え事象によって細胞中に導入することもできる。たとえば、このような配列を細胞中に導入し、それによって内生遺伝子またはその遺伝子と充分な同一性を有する配列の部位において、相同的な組み換えを行うことができる。非相同的な組み換え、または相同的な組み換えによる内生遺伝子の欠失などの、他の組み換えベースの方法を使用することもできる。
【０１２８】
本発明は、たとえばその配列番号によって識別される表１に示した任意のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含めた、単離および精製したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよび／またはヒトの標的タンパク質／ポリペプチド、および前述の転写および／または他の増殖調節活性を保持している断片を含めた、これらのポリペプチドの機能保存型変異体を生成することにも基づく。
【０１２９】
機能保存型変異体を含めた、本発明のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および／またはヒト由来の標的タンパク質／ポリペプチドは、野生型または突然変異体Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび／またはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞からそれぞれ、あるいはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および／またはヒト由来の標的タンパク質をコードしている配列が導入され発現している、異種の生物または細胞（細菌、真菌、昆虫、植物および哺乳動物細胞だけには限られないが、これらを含めて）から単離することができる。さらに、ポリペプチドは組み換え融合タンパク質の一部であってよい。あるいは、排他的固相合成、部分的固相法、画分濃縮または古典的な溶液合成だけには限られないが、これらを含めた工業的に利用可能な自動化された手順によって、ポリペプチドを化学的に合成することができる。
【０１３０】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および／またはヒトの標的タンパク質／ポリペプチドの「精製」は、ポリペプチドが発現されている細胞の他の成分によってブロックされることなく、その転写および／または増殖調節活性を測定することができる形で、ポリペプチドを単離することを指す。調製ディスク・ゲル電気泳動、等電点電気泳動、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過、イオン交換および分配クロマトグラフィ、および向流分配だけには限られないがこれらを含めた、ポリペプチドを精製するための方法は当分野においてよく知られている。いくつかの目的のために、ポリヒスチジン配列などだけには限られないが、精製を容易にする追加的な配列タグをタンパク質が含む組み換え系において、ポリペプチドを生成することが好ましい。したがってポリペプチドは、適切な固相マトリックス上でのクロマトグラフィによって、宿主細胞の未精製溶解物から精製することができる。あるいは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および／またはヒトの標的タンパク質に対する、あるいはこれらに由来するペプチドに対する抗体を、精製試薬として使用することができる。他の精製法も考えられる。
【０１３１】
本発明のポリヌクレオチドの発現によって得られる本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノールを用いた沈殿、酸性条件下での抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、親和クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィおよび高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）などの当業者に知られている方法によって、形質転換された細胞の培養物から精製することができる。単離または精製中にタンパク質が変性する場合、当業者によく知られている技法を使用して、タンパク質を再生することができる。
【０１３２】
単離したポリペプチドは、たとえばリン酸化、硫酸化、アシル化、または他のタンパク質改質によって改質することができる。放射性同位体および蛍光性化合物だけには限られないがこれらを含めた、検出可能なシグナル、すなわちレポーター分子を直接的あるいは間接的に提供することができる標識体を用いて、ポリペプチドを改質することもできる。
【０１３３】
標的タンパク質を対象とする抗体
本発明は、前述のように同定されるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質または断片に、高い親和度で結合する抗体も包含する。本明細書で使用するように、親和性が高い抗体には、本来のあるいは変性した、すなわち折りたたまれているかあるいは折りたたまれていない形状の、本明細書で同定される任意のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質に結合する抗体があるが、これだけには限られず、特に好ましい抗体は、以下に記載したアッセイにおいて使用する、折りたたまれていないかあるいは折りたたまれている標的タンパク質を認識する抗体である。したがって一実施形態では、本発明の抗体は、変性していない本来の形状の、折りたたまれていない形の、あるいはこの反対の標的タンパク質に関して、親和性が高い抗体調製物である抗体である。
【０１３４】
本来の形状あるいはそうではない形状のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質を特異的に認識する抗体は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質に結合するか、あるいはそうでなければその生物学的活性を阻害する、潜在的な抗真菌性化合物に関するスクリーニングにおいて有利に使用することができる。このようなスクリーニングにおいては、本来の形状のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質に特異的な抗体を使用して、潜在的な抗真菌性化合物が標的タンパク質の変性を防ぎ、したがって標的との強力な相互作用が示されるかどうかを試験することができる。
【０１３５】
潜在的な抗真菌性化合物がＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質に結合した後に、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質に、たとえば高温、ｐＨ、変性溶媒、およびたとえば尿素などの変性物質などの変性条件を施す。これらの変性条件を適用した後に、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質および潜在的な抗真菌性化合物を含むサンプルを、本来の形状あるいはそうではない形状のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質に特異的な抗体と反応させる。この抗体タイプの結合により、スクリーニング中に潜在的な抗真菌性化合物が結合することによって、標的タンパク質が変性から保護されたことが示される。したがって、本来の形状あるいはそうではない形状の標的タンパク質に特異的な本発明の抗体は、抗真菌性化合物およびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質のスクリーニングにおいて有用である。
【０１３６】
このタイプのスクリーニングの例は、それぞれ参照により本明細書に組み込んである、１９９６年１２月１７日に発行された米国特許第５，５８５，２７７号、および１９９７年１０月２１日に発行された米国特許第５，６７９，５８２号中で発見することができる。本発明の抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであってよいが、モノクローナルであることが最も好ましい。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質、またはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質のエピトープを保有するタンパク質由来の断片を用いた免疫処置によって、動物宿主中において抗体を誘導することができ、あるいは免疫細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの免疫処置によって、抗体を形成することができる。抗体を誘導するために使用する免疫原は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞から単離することができるか、組み換え系において生成することができる。適切な抗体をコードしているＤＮＡに関してプログラムされている組み換え系において、抗体を生成することもできる。あるいは、精製された重鎖および軽鎖の生化学的な再編成によって、抗体を構築することもできる。抗体にはハイブリッド抗体（すなわち、それぞれが異なる抗原を認識する、２組の重鎖／軽鎖の組み合わせを含む）、キメラ抗体（すなわち、重鎖、軽鎖、あるいはこの両方が融合タンパク質である）、一価抗体（すなわち、第２の重鎖の定常領域に結合した重鎖／軽鎖複合体からなる）がある。抗体のＦａｂ’およびＦ（ａｂ）２断片を含めた、Ｆａｂ断片も含まれる。
【０１３７】
あらゆる前述のタイプの抗体および誘導体を産生するための方法は、当分野でよく知られており、以下により詳細に記載する。たとえば、ポリクローナル抗血清を生成し加工するための技法はＭａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，１９８７，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ中に開示されている。好都合には、このような抗体は、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８中に開示されている方法および組成物、および当業者に知られている免疫およびハイブリドーマ技術を使用して作成することができる。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質に対して向けられる特異的な免疫応答を誘導するために、任意のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質から誘導される天然または合成ペプチドが使用される場合、ＫＬＨなどの適切な担体にペプチドを都合よく結合させることができ、フロイントなどの適切なアジュバントの形で投与することができる。Ｔａｍの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９８８；８５：５４０９）に従って、選択したペプチドをリシン・コア担体にしっかりと結合させることが好ましい。
【０１３８】
一実施形態では、精製した組み換えＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質を使用して、マウスに免疫性を与え、その後脾臓を取り除き、脾細胞を使用して骨髄腫細胞との細胞ハイブリッドを形成し、当分野において標準的である技法に従って抗体分泌細胞のクローンを得る。その結果生じたモノクローナル抗体を、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質に結合させるため、あるいはその生物学的活性を阻害するための本明細書に記載したアッセイなどの、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのアッセイを使用してスクリーニングする。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質に変性条件を施す前後に、標的タンパク質との結合用の抗体をスクリーニングすることによって、本来の形状のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質への結合の特異性について、抗体を試験する。
【０１３９】
折りたたまれていない形状の標的タンパク質に特異的な抗体も、以下に記載したスクリーニング法において有用である。
【０１４０】
前述の抗真菌性化合物のスクリーニングにおける使用に加えて、ＥＬＩＳＡなどに限らず免疫アッセイを使用することによって、本発明の抗標的タンパク質抗体を使用して、選択した変性していないＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質を定量化することができる。タンパク質の生物学的活性を阻害し、細胞抽出物の免疫を劣化させ、あるいは標的タンパク質の機能に関連がある他の反応を害することにより、抗体を使用して、選択したＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質の本来の機能を害することもできる。さらに、これらの抗体を使用して、異なる源からＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質を同定、単離、および精製することができ、亜細胞性および組織化学的局在性の研究、および組織、血液または血清サンプル中の抗原性のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質の存在を決定するための診断分析を行うことができる。
【０１４１】
推定される必須遺伝子の不可欠な性質を決定するための方法
さまざまな方法を使用して、遺伝子の産物が菌の生存に不可欠であるか、あるいは感染の確立または維持に不可欠であるかどうかを決定することができる。遺伝子の不可欠な性質を確認することによって、遺伝子の機能に関する追加的な情報が提供され、その産物が抗真菌性物質の当該の標的を構成する遺伝子を選択することができる。これらの方法の例を、以下に簡単に要約する。これらの方法は、それぞれ参照によりここに組み込んである、以下の書物中に記載されている：Ｇｕｔｈｒｉｅ Ｃ．ａｎｄ Ｆｉｎｋ Ｇ．Ｒ．（ｅｄｓ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９４，１９９１，「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．；Ｒｏｓｅ Ａ．Ｈ．，Ａ．Ｅ．Ｗｈｅａｌｓ ａｎｄ Ｊ．Ｓ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔｓ Ｖｏｌ．６，１９９５，「Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．；Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆら、（ｅｄｓ．），Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｗｉｌｅｙ；およびＢｒｏｗｎ Ａ．Ｊ．Ｐ ａｎｄ Ｔｕｉｔｅ Ｍ．Ｆ．（ｅｄｓ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２６，１９９８，「Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．
【０１４２】
状況に応じて、所望の結果に応じて、記載した方法の１つが使用されるであろう。特に、遺伝子を直接的に不活性化する方法、あるいは遺伝子を一時的に不活性化する方法によって行うことが可能である。以下では、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの遺伝子の不可欠性を決定するのに有用な、アッセイを例示する。
【０１４３】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの不活性化の分析
酵母菌Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいては、最も一般的に使用される方法は、酵母菌の染色体中の部位において当該の遺伝子を不活性化することを含む。遺伝マーカー（たとえば、栄養要求性または耐性マーカー用の遺伝子）を挿入することによって、野生型対立遺伝子を不活性化させる。この挿入は一般に、Ｇｕｔｈｒｉｅ Ｃ．ａｎｄ Ｆｉｎｋ Ｇ．Ｒ．（ｅｄｓ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，またはＧｕｌｔｎｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９６，２４：２５１９−２５２４に記載されたような、知られている方法によって作製した線状の欠失カセットによって、遺伝子を転換する方法により行われる。
【０１４４】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝子および／またはタンパク質が増殖および生存能力に不可欠であるかどうかを決定するための、好ましい方法、酵母菌細胞およびベクターは、現在は許可され発行を待っている、１９９７年８月２２日に出願された米国仮特許出願６０／０５６，７１９、１９９８年８月２１日に出願された米国特許出願０９／１３８，０２４、および２０００年５月１８日に出願された米国特許出願０９／５７３，３２２中に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込んである。
【０１４５】
簡潔には、その中の特定の遺伝子の発現をしっかりと調節することができるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株を生成させる。このために、当該の遺伝子の野生型対立遺伝子を、外生金属によって調節することができる対立遺伝子に置き換える。この置換は一般に、前に引用した米国特許および出願中に記載されるような、知られている方法によって作製した線状のＤＮＡ片を用いる、二重交差戦略を使用して行われる。
【０１４６】
組み換え細胞は、たとえば以下のものを含む：
（ｉ）転写のリプレッサータンパク質をコードしている第１の遺伝子であって、遺伝子の発現が金属イオン応答性要素の制御下に置かれており、金属イオンを細胞の増殖培地に加えることによってリプレッサータンパク質の発現が刺激される第１の遺伝子、
（ｉｉ）選択される標的タンパク質をコードしている第２の遺伝子であって、標的タンパク質の発現がプロモーターによって制御されており、その活性がリプレッサータンパク質によって阻害される第２の遺伝子、および
（ｉｉｉ）バイオミネラリゼーション・タンパク質をコードしている第３の遺伝子であって、不活性化されており、その不活性化によって金属イオン応答性要素の加えられる金属イオンに対する転写応答性が増大する第３の遺伝子。
【０１４７】
好ましい実施形態では、第１の遺伝子はＲＯＸ１であり、第２の遺伝子は、ＡＮＢ１プロモーターによって制御されている、本明細書に記載する標的タンパク質をコードしている遺伝子であり、第３の遺伝子はＳＬＦ１である。
【０１４８】
特に好ましい実施形態では、組み換え細胞は追加の遺伝子を含み、この細胞は、以下のものを含む：
（ｉ）転写のリプレッサータンパク質をコードしている第１の遺伝子であって、遺伝子の発現が金属イオン応答性要素の制御下に置かれており、金属イオンを細胞の増殖培地に加えることによってリプレッサータンパク質の発現が刺激される第１の遺伝子、
（ｉｉ）標的タンパク質をコードしている第２の遺伝子であって、標的タンパク質の発現がプロモーターによって制御されており、その活性がリプレッサータンパク質によって阻害される第２の遺伝子、
（ｉｉｉ）分解に関してユビキチン含有ポリペプチドを標的とするタンパク質をコードしている第３の遺伝子であって、遺伝子の発現が金属イオン応答性要素の制御下に置かれており、金属イオンを細胞の増殖培地に加えることによってユビキチン標的タンパク質の発現が刺激され、標的タンパク質の安定性がユビキチン標的タンパク質によって制御されている第３の遺伝子、および
（ｉｖ）バイオミネラリゼーション・タンパク質をコードしている第４の遺伝子であって、不活性化されており、その不活性化によって金属イオン応答性要素の加えられる金属イオンに対する転写応答性が増大する第４の遺伝子。
【０１４９】
したがって、特に好ましい実施形態では、第１の遺伝子はＲＯＸ１であり、本発明の標的タンパク質をコードしている第２の遺伝子は、ＡＮＢ１プロモーターによって制御されおり、第３の遺伝子はＵＢＲ１であり、第４の遺伝子はＳＬＦ１である。
【０１５０】
この好ましい系を使用して、標的タンパク質の遺伝子の発現を、添加金属イオンの不在下で行わせる。標的タンパク質の遺伝子の発現を低下させるかあるいは無くすことが望ましいときは、添加金属イオンの濃度に依存し、標的タンパク質の遺伝子の転写を抑制し、タンパク質の安定性を低下させる程度に、リプレッサーおよびユビキチン標的タンパク質の発現を刺激する金属イオンを培地に加える。好ましい系では、Ｒｏｘ１およびＵｂｒ１タンパク質の発現は、増殖培地に銅を加えることによって誘導され、このようにして標的タンパク質の発現を停止させる。この抑制可能な系の制御下の、標的タンパク質の遺伝子を含む遺伝子工学的に処理したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株が、銅の存在下で増殖を停止し生存能力を失う場合、この標的タンパク質は必須であり、殺傷性のある標的であることが示される。
【０１５１】
表１に記載した標的タンパク質の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの不活性化の分析は、本明細書および実施例１に記載したように行い、その結果を図２７−５２に示す。
【０１５２】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの標的タンパク質が増殖および生存能力の両方に不可欠であることがひとたび示された後に、次いでＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中の殺傷性のある標的、相同的なＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ遺伝子および／タンパク質を分析して、どちらが増殖に不可欠であり、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ中で潜在的な殺傷性のある標的として働くことができるかどうかを決定しなければならない。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの遺伝子は、相対的な配列の分析によって同定する。いくつかのタイプの分析用に（遺伝子の不活性化またはタンパク質の発現）ＤＮＡ断片が必要とされるとき、当分野でよく知られる方法（たとえば、Ｅｄｓ．Ｃ．Ｗ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ａｎｄ Ｅ．Ｆ．Ｄｖｅｋｆｌｅｒ，ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５を参照のこと）を使用して、ＰＣＲクローニングによってＤＮＡ断片を得ることが好ましい。
【０１５３】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析
特定の遺伝子またはタンパク質が増殖に不可欠であるかどうかの決定は、遺伝子またはタンパク質がＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ中で不活性であるとき、細胞が生存するかどうかを決定することによって行う。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓが複相の真菌であり、主にそのライフ・サイクル中に有性生殖期が存在しないことにより、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに適用される多数の遺伝的技法に耐性があるために、ＤＮＡ構築体を使用して、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ中の当該の遺伝子のすべて、あるいは一部分を不活性化、欠失させる。遺伝選択マーカー（たとえば、栄養要求性または耐性マーカー用の遺伝子）を挿入することによって、このような構築体により、野生型対立遺伝子の不活性化または欠失がもたらされる。この挿入は一般に、前述のＤＮＡ操作の知られている方法によって作製した線状の欠失カセットによって、遺伝子を転換する方法により行われる。
【０１５４】
一実施形態では、標的タンパク質の遺伝子がＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に不可欠であるかどうかを評価するために、図５３−７８に概略する方法に従って、プラスミドを使用して二倍体破壊株を構築することができる。二倍体破壊株を生成することができる場合、この遺伝子は必須ではないと決定される。これらの構築において使用される方法では、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの遺伝学的操作およびスクリーニングにおいて使用される一般的な技法を使用する。
【０１５５】
１つの一般的に使用されている手法は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ菌株ＣＡＩ４（ＦｏｎｚｉおよびＩｒｗｉｎ，１９９３）を使用して、同一のＨｉｓＧ配列の側面に位置するＣａＵＲＡ３遺伝子（形質転換体にウリジン原栄養性を与えることができる）を含む線状ＤＮＡ断片を用いて形質転換されている、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのウリジン栄養要求性菌株を生成させる。このＨｉｓＧ−ＣａＵＲＡ３−ＨｉｓＧカセットは、片側は当該の遺伝子の配列上流の側面に位置し、もう一方の側は遺伝子の下流の側面に位置する。
【０１５６】
原栄養性形質転換体は、当該の遺伝子の１つのコピーがＨｉｓＧ−ＣａＵＲＡ３−ＨｉｓＧカセットで置換されている。栄養要求性でありウリジンを必要とする誘導体は、ウリジンの存在下での５’フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）耐性を選択することによって、単離することができる。ＵＲＡ３遺伝子の産物は、ＦＯＡを毒性のあるフルオロウラシルに転換させる。したがって、ＦＯＡを選択することによって、２つの同一なｈｉｓＧ側面領域のシス組み換えによりＵＲＡ３遺伝子を失っている細胞を選択することができる。
【０１５７】
当該の遺伝子が増殖に不可欠であるかどうかを決定するために、第２の破壊プラスミドを使用して、遺伝子の第２のコピーを不活性化することを試みる。前述のＣａＵＲＡ３遺伝子は、形質転換体にウリジン原栄養性を与えることができ、同一のＨｉｓＧ配列の側面に位置する。このＨｉｓＧ−ＣａＵＲＡ３−ＨｉｓＧカセットは、片側は当該の遺伝子の配列上流の側面に位置し、もう一方の側は遺伝子の下流の側面に位置する。原栄養性形質転換体の生成は、当該の遺伝子の非破壊型対立遺伝子にカセットを組み込むことによって、ｈｉｓＧカセットをＣａＵＲＡ３カセットで置き換えることによって、あるいは非相同的な組み換え事象によって行うことができる。遺伝子の第２のコピーを破壊する形質転換体は、当該の遺伝子が必須ではない証拠である。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ中の遺伝子が増殖に不可欠であることを確定するためには、少なくとも約２０個の第２の形質転換体を分析しなければならない。２０個の形質転換体を分析することによって、遺伝子の第２のコピーがなお存在することが実証される場合、これはその遺伝子が不可欠であることを示す。形質転換体はすべて、サザンブロットによって分析する。Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換は、記載するように行う（Ｅｌｂｌｅ Ｒ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１９９２；１３：１８−２０）。
【０１５８】
第２の一般的に使用されている手法は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ菌株ＣＡＩ８を使用する（ＦｏｎｚｉおよびＩｒｗｉｎ，１９９３）。ＣＡＩ８は、それぞれＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのＵＲＡ３（ＣａＵＲＡ３）およびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのＡＤＥ２（ＣａＡＤＥ２）を用いる形質転換によって、ウリジンおよびアデニン原栄養性に転換することができる、ウリジンおよびアデニン栄養要求性菌株である。
【０１５９】
当該の遺伝子の第１の対立遺伝子の欠失は、１つの部位が当該の遺伝子の配列上流の側面に位置し、もう１つの部位が遺伝子の下流の側面に位置するＣａＡＤＥ２遺伝子を含む線状ＤＮＡ断片を用いて、ＣＡＩ８をアデニン原栄養性に形質転換することによって行われる。
【０１６０】
当該の遺伝子が増殖に不可欠であるかどうかを決定するために、第２の破壊プラスミドを使用して、遺伝子の第２のコピーを不活性化することを試みる。ＣａＵＲＡ３は、１つの部位が当該の遺伝子の配列上流の側面に位置し、もう１つの部位が遺伝子の下流の側面に位置する。アデニン／ウリジン原栄養性形質転換体の生成は、当該の遺伝子の非破壊型対立遺伝子をカセットに組み込むことによって、あるいは非相同的な組み換え事象によって行うことができる。遺伝子の第２のコピーを破壊する形質転換体は、当該の遺伝子が必須ではない証拠である。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ中の遺伝子が増殖に不可欠であることを確定するためには、少なくとも約２０個の第２の形質転換体を分析しなければならない。２０個の形質転換体を分析することによって、遺伝子の第２のコピーがなお存在し欠失している可能性がないことが実証される場合、これはその遺伝子が不可欠であることを示す。形質転換体はすべて、サザンブロットによって分析する。Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換は、前に記載したように行う（Ｅｌｂｌｅ，１９９２）。
【０１６１】
ＵＲＡ３は、前述のいずれかの選択可能なマーカー用に、ＣＡＩ８菌株と共に使用することができる。
【０１６２】
これらのタイプの分析手順は、前述したもの以外の調節可能なプロモーター、およびＲｏｘ１リプレッサータンパク質を用いて、当該の遺伝子を一時的に不活性化させることによって行うこともできる。これを行うために、遺伝子の本来のプロモーターを、染色体上で直接、あるいは染色体外プラスミド上で調節可能なプロモーターに置き換える。この方法において使用するための他の調節可能なプロモーターの一例は、ＣＡＬプロモーターまたはその誘導体、またはｔｅｔＯプロモーターである（Ｍｕｍｂｅｒｇら、１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：５７６７−５７６８；Ｂｅｌｌｉら、１９９８，Ｙｅａｓｔ，１４：１１２７−１１３８）。研究する遺伝子の不可欠な性質はこのようにして観察することができ、一方、使用するプロモーターは、酵母菌Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの半数体菌株において、あるいは二倍体微生物（たとえばＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ）中の第２の対立遺伝子の不活性化後に抑制される。
【０１６３】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を、このセクションおよび実施例２に記載するように、表１において同定したそれぞれの標的遺伝子について行った。その結果は図５３−７８中に示し、それぞれの図は１つ１つの標的遺伝子を示す。
【０１６４】
相同的な遺伝子を同定するための方法
種族中の知られている必須遺伝子から、多種の菌類と相同的であるかあるいは同じ機能を有する遺伝子を同定することができる。当業者に知られる方法を使用して、多種の菌類の研究対象遺伝子の相同体（いわゆる「オーソロガス」遺伝子）、または研究対象遺伝子と同じ機能を有する遺伝子を同定することができる。使用することができる方法の例を、以下に与える。これらの方法は、参照により本明細書に組み込んである以下の書物中に記載されている：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ； Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆら、ｅｄｓ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５， Ｗｉｌｅｙ；Ｇｕｔｈｒｉｅ Ｃ．ａｎｄ Ｆｉｎｋ Ｇ．Ｒ．ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９４，１９９１，「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ。
【０１６５】
このような方法には、病原性菌類のゲノム・ライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーとの相同性または遺伝子の相補性のスクリーニング、または当該のヌクレオチド配列との相同性によって選択した特異的なプライマーを使用する、このようなライブラリーＤＮＡのＰＣＲ増幅がある。
【０１６６】
前で定義した他の菌類の相同的なＤＮＡ配列を、特に当業者に知られているＰＣＲ増幅法によって単離することができる。非制限的なこのようなＰＣＲ技法は、縮重ヌクレオチド・プライマーを使用して、対応する菌類のゲノム・ライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーからの、これらの相同的なＤＮＡ配列を増幅させることによって行う。本発明の文脈において研究対象となるさまざまな種の菌類から単離したｍＲＮＡから、ｃＤＮＡを作製することもでき、これらの菌類はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、すなわちＣａｎｄｉｄａ ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｑｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉａｎｉａｅまたはＣａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓまたはＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓタイプの菌類、特にたとえばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓおよびＳｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｌも、またはＰｈｙｃｏｍｙｃｅｔｅｓまたはＥｕｍｙｃｅｔｅｓの鋼の菌類、特に亜鋼のＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｍｅｈｉａｓｃｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ（酵母菌）およびＰｌｅｃｔａｓｃａｌｅｓ、Ｇｙｍｎａｓｃａｌｅｓ（皮膚および髪の毛の真菌）も、またはＨｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓの鋼、特に亜鋼ＣｏｎｉｄｉｏｓｐｏｒａｌｅｓおよびＴｈａｌｌｏｓｐｏｒａｌｅｓ、およびこれらの中でも以下の種：Ｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、Ｅｎｄｏｍｙｃｅｓ（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｍｅｎｉｃｉｌｉｕｍ．（Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ（Ｃｔｅｎｏｍｙｃｅｓ）、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｔｏｎ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｏｎ、Ｐｉｅｄｒａｉａ、Ｈｏｒｍｏｄｅｎｄｒｏｎ、Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｏｎ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ、ＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎまたはＴｏｒｏｐｓｕｌｏｓｉｓも対象とする。
【０１６７】
したがって相同的なポリヌクレオチドは、細胞から抽出した染色体ＤＮＡの断片からクローニングおよびスクリーニングする方法などの、通常のクローニングおよびスクリーニング法を使用して得ることができる。たとえば、このような相同的なポリヌクレオチドを得るために、染色体ＤＮＡ断片のライブラリーから始めることができる。好ましくは１７個以上のヌクレオチドから構成され、配列の一部に由来する、放射性標識したオリゴヌクレオチドに対応するプローブを作製することができる。したがってプローブのＤＮＡと同一のＤＮＡを含むクローンを、ストリンジェントな条件下で識別することができる。元の配列から生じたシークエンシング・プライマーを使用して、このようにして識別した個々のクローンをシークエンシングすることにより、配列を両方向に延長させて、完全な遺伝子の配列を決定することがしたがって可能である。通常このようなシークエンシングは、プラスミドから作製した二本鎖の変性したＤＮＡを使用して、効率的に行うことができる。このような技法は、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，および前述のＳａｍｂｒｏｏｋによって記載されている。（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９），詳細にはハイブリダイゼーションによるスクリーニングおよび二本鎖の変性したＤＮＡからシークエンシングの章の１．９０および１３．７０）。
【０１６８】
ゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーは知られている方法によって作製することができ、得られるポリヌクレオチド断片は、発現ベクター、たとえばｐＲＳ４２３またはその誘導体などのベクター中に組み込み、ベクターは大腸菌中およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中の両方で使用することができる。ライブラリーのスクリーニングは、従来的な方法、細菌コロニーのレプリカ平板法によるｉｎ ｓｉｔｕでのハイブリダイゼーションによって行われるであろう。ハイブリダイゼーションの条件は、研究対象の遺伝子と多少なりとも相同的である断片が同定されるように、反応に必要とされる減密度に適合させる。他種の菌類の遺伝子も、知られているいわゆる「遺伝子相補性」法によって、同定することができる。たとえば、同定される必須遺伝子が調節可能なプロモーターの制御下に置かれているＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの菌株は、研究対象の菌類に対応するＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーの代表的なサンプルによって形質転換することができる。プロモーターが抑制されるような条件下で酵母菌を培養するとき、生存することができる唯一の酵母菌は、最初の必須遺伝子と機能的に同等である研究対象の菌類の配列を含む組み換えベクターを保有する酵母菌である。したがって研究対象の菌類中の遺伝子配列は、組み換えベクターを単離し、知られている方法によってそれをシークエンシングすることによって同定される。同様にして、いわゆる「プラスミド・シャッフル」法によって、最初の必須遺伝子を発現しなくなっており、他の菌類を起源とする機能的に同等な配列を含む酵母菌を選択することができる。
【０１６９】
このタイプの研究は、さまざまな種に関して行うことができる：必須遺伝子と機能的に同等であるかあるいは配列が相同的である遺伝子は、他の菌類、特にヒトに対して病原性であるさまざまな菌類において単離することができる。このため、特に鋼Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ、ＡｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓおよびＤｅｕｔｅｒｏｍｙｃｅｔｅｓに属する菌類を使用することができる。より詳細には菌類は、亜鋼Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．、特にＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓおよびＣａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉに属するであろう。菌類は、亜鋼Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓおよびＳｐｒｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉにも属するであろう。
【０１７０】
真菌の増殖の阻害
本発明は、本明細書で提供する標的タンパク質の生物学的活性を阻害することによって、真菌の増殖を阻害するためのいくつかの戦略を提供する。前述のように、これらの真菌の標的タンパク質は、ＤＮＡ転写、ｍＲＮＡ翻訳、ｍＲＮＡおよびタンパク質のプロセッシングおよび運搬、細胞分裂、増殖の調節、細胞周期の調節、および他のプロセスなどだけには限らないがこれらの、増殖および生存能力に関する広範囲の活動と関係がある。いくつかの標的タンパク質の正確な機能はいまだに知られていないが、本発明によって提供される標的タンパク質はすべて、真菌の増殖に関係があるという共通の特徴を有している。以下のセクションでは、それによって増殖が影響を受ける可能性がある１つの潜在的な機構として転写を例示するが、以下で詳細には記載しない他の機構を、研究用および／または本明細書に記載する方法を使用して増殖の阻害を行うために、使用することができることを理解されたい。
【０１７１】
転写
本発明は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび／またはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質を、このようなタンパク質に結合するかあるいはこれと相互作用する物質、またはこのようなタンパク質をコードしているＤＮＡ／ＲＮＡと接触させることによって、遺伝子の転写を改変する方法を提供する。これらの物質は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび／またはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質の、転写、クロマチン再編または遺伝子の転写に不可欠な他のプロセスに対する影響を変えることができる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび／またはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質に結合するかあるいはこれと相互作用する物質、またはこのようなタンパク質をコードしているＤＮＡ／ＲＮＡは、タンパク質の生物学的活性を害するかあるいは高めることができ、直接的あるいは間接的に真菌の増殖を阻害する可能性がある。
【０１７２】
たとえば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび／またはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質のＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズし、それらの翻訳または転写を完全に阻害するかあるいは低下させるアンチセンスまたは非センス・ヌクレオチド配列は、他の真菌遺伝子の転写を妨げ阻害することができる。あるいは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび／またはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質に結合するかあるいはこれと相互作用することができる化合物は、転写プロセスにおけるタンパク質の機能を妨げるか阻害することができる。これらの物質は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび／またはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質のいずれかあるいは両方と、反応性がありこれらに結合する抗体を含む。
【０１７３】
候補となる阻害剤
標的タンパク質がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中において殺傷性のある標的であり、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓを増殖させるのに不可欠であることをひとたび決定した後に、このタンパク質を殺傷性のある標的として使用して、真菌の増殖および／または感染の候補となる阻害剤を単離することができる。
【０１７４】
前述のように、本明細書で使用する「候補となる阻害剤」は、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓまたは他の真菌種において標的タンパク質の生物学的活性を阻害する可能性を有する、任意の化合物である。候補となる阻害剤化合物を、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質に対する第一次スクリーニングにおいて最初に同定する。この第一次スクリーニングは親和性ベース、機械論的（たとえばｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写アッセイ）、または細胞ベース（たとえばレポーター・アッセイ）であってよい。このようなアッセイを、以下に詳細に記載する。候補となる阻害剤は、分子の分子量およびアッセイのタイプに依存する濃度範囲において試験する。たとえば、タンパク質／タンパク質またはタンパク質／ＤＮＡ複合体形成または転写延長を阻害するために、小さな分子（以下で定義する）は、１ｐｇ−１００ｕｇ／ｍＬ、好ましくは約１００ｐｇ−２０ｕｇ／ｍＬの濃度範囲において試験することができ、大きな分子、たとえばペプチドは、１０ｎｇ−１００ｕｇ／ｍＬ、好ましくは１００ｎｇ−１０ｕｇ／ｍＬの範囲において試験することができる。
【０１７５】
Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの増殖または生存能力の阻害剤は、本明細書に記載するＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質を標的にすることができ、あるいはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質と相互作用してｉｎ ｖｉｖｏで起こる本来の生物学的相互作用を妨げる、タンパク質または核酸を標的にすることができる。本明細書に記載するように同定した阻害剤は、ある濃度においてＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの増殖または生存能力を阻害し、最も好ましくは同じ濃度において、哺乳動物、特にヒト細胞の増殖に著しく影響を与えることがない性質を有しているに違いない。
【０１７６】
候補となる阻害剤には、本明細書に記載するＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質の配列をベースとするアミノ酸配列を有する、ペプチドおよびポリペプチド阻害剤がある。たとえば、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質の断片は、野生型Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ細胞の増殖を妨げるために働くことができる。なぜならこれは、Ｃａｎｄｉｄａの増殖、たとえばクロマチン結合、細胞分裂、転写、または他の不可欠な活動に関係がある他のタンパク質に結合するＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質に関して、拮抗的阻害剤として働くことができるからである。
【０１７７】
試験する阻害剤化合物は、合成または天然化合物の大きなライブラリーからスクリーニングする。糖、ペプチド、および核酸ベースの化合物のランダムで統制された合成用に、多数の手段が現在使用されている。合成化合物のライブラリーは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ，Ｃｏｒｎｗａｌｌ，ＵＫ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、Ｂｒａｎｄｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ，ＮＭ）、およびＭｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（Ｎｅｗ Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＣＴ）から市販されている。珍しい化学的ライブラリーは、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から入手可能である。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形である天然化合物のライブラリーが、たとえばＰａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）またはＭｙｃｏＳｅａｒｃｈ（ＮＣ）から入手可能であり、これらは容易に生成することができる。さらに、天然および合成によって生成したライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的、および生化学的手段によって容易に改質される。
【０１７８】
阻害剤として有用な化合物は、多数の化学物質のクラス中において発見することができるが、これらは典型的には有機化合物であり、小さな有機化合物であることが好ましい。小さな有機化合物は、５０ダルトンを超える約２，５００ダルトン未満の、好ましくは約７５０ダルトン未満の、より好ましくは約３５０ダルトン未満の分子量を有する。例示的なクラスには複素環、ペプチド、糖、ステロイドなどがある。化合物を改質して、効率、安定性、薬剤適合性などを高めることができる。物質の構造的な同一性を使用して、追加的な物質を同定、生成、またはスクリーニングすることができる。たとえば、ペプチド物質が同定される場合、Ｄ−アミノ酸、特にＤ−アラニンなどの非天然アミノ酸を使用するなどして、アミノまたはカルボキシル末端を機能的にする、たとえばアミノ基についてはアシル化またはアルキル化、カルボキシル基についてはエステル化またはアミド化することなどにより、さまざまな方法で物質を改質してその安定性を高めることができる。安定化の他の方法は、たとえばリポソーム中などへの被包を含んでよい。
【０１７９】
第一次阻害剤スクリーニング
阻害剤をスクリーニングするための高スループット法
好ましい実施形態では、ＡＴＬＡＳとも呼ばれる、スループットの高いスクリーニング・プロトコルを使用して、多数の試験化合物がＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質に結合する能力、あるいはこれ以外は、試験化合物が標的タンパク質と相互作用する能力を調べる。高スループット・スクリーニング法は、米国特許第５，５８５，２７７号、および５，６７９，５８２号、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／５４７，８８９、および公開されているＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／１９６９８中に記載されており、本明細書に記載する標的タンパク質に結合するリガンドを同定するために使用することができる。これらの方法に従って、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質の１つのリガンド、または複数のリガンドを、リガンドが標的タンパク質の折りたたみの程度、すなわち折りたたまれている割合または折りたたまれていない割合に影響を与える能力によって同定する。可逆的であれ不可逆的であれ標的タンパク質が測定可能な程度に開くように、実験条件を選択する。これらの条件下で試験リガンドが標的タンパク質に結合する場合、試験リガンドの存在下における、折りたたまれている標的タンパク質と折りたたまれていない標的タンパク質の相対量、すなわち標的タンパク質の折りたたまれている割合または折りたたまれていない割合は異なる、すなわち試験リガンドの不在下で観察されるものよりも、高いか低いであろう。したがって、この方法は、（リガンドの不在下で）標的タンパク質が部分的にあるいは完全に開くと思われる条件下において、複数の試験リガンドの存在下および不在下で、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質を培養することを包含する。この後に、折りたたまれている標的タンパク質と折りたたまれていない標的タンパク質の絶対量または相対量、すなわち標的タンパク質の折りたたまれている割合または折りたたまれていない割合を分析する。
【０１８０】
この方法の１つの重要な特徴は、この方法が、生物学的活性または機能と密接に関係がある配列またはドメインのみだけでなく、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質の任意の配列またはドメインに結合する任意の化合物を検出するであろうことである。結合配列、領域、またはドメインは、タンパク質が折りたたまれている状態のときは標的タンパク質の表面上に存在してよく、あるいはタンパク質の内部に埋め込まれていてよい。タンパク質が部分的にあるいは完全に開いているときは、いくつかの結合部位のみがリガンド結合しやすくなる可能性がある。
【０１８１】
簡単に言うと、この方法を実施するために、１以上の試験リガンドをＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質と一緒にし、適切な条件下に、試験リガンドを結合させるのに充分な時間だけその混合物を維持する。実験条件は、経験的に決定する。試験リガンドを試験するときは、大部分のリガンドと標的タンパク質の相互作用が最後まで進行することが予想されるように、培養条件を選択する。試験リガンドは、標的タンパク質と比べてモル過剰に存在する。標的タンパク質は可溶形であってよく、あるいは固体相マトリックスに結合することができる。マトリックスは非制限的に、ビーズ、膜フィルタ、プラスチック表面、または他の適切な固形支持体を含んでよい。
【０１８２】
好ましい実施形態では、標的タンパク質への１以上の試験リガンドの結合を、タンパク質分解を使用することによって検出する。このアッセイは、折りたたまれておらず、変性しているポリペプチドが、折りたたまれているタンパク質と比べてプロテアーゼによる消化をより受けやすいことに基づく。この場合、試験リガンドと標的タンパク質の組み合わせ、および試験リガンドを含まないコントロールの組み合わせを、折りたたまれていない標的タンパク質に優先的に作用する１以上のプロテアーゼを用いて処理する。適切な時間培養した後に、無傷である、すなわちプロテアーゼによる消化を受けていない標的タンパク質のレベルを、以下に記載する方法の１つ、たとえばゲル電気泳動および／または免疫アッセイを使用して評価する。
【０１８３】
試験リガンドが標的タンパク質に結合したことを示す、２つの考えられる結果が存在する。１）著しく多い、または２）著しく少ない絶対量の無傷または分解されたタンパク質を、リガンドの不在下よりもリガンドの存在下で観察することができる。
【０１８４】
本発明を実施する際に有用であるプロテアーゼには、非制限的に、トリプシン、キモトリプシン、Ｖ８プロテアーゼ、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、サーモリシン、パパインおよびサブチリシンがある（これらはすべてＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＣＯ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから得ることができる）。本発明を実施する際に使用するための、プロテアーゼを選択する際の最も重要な基準は、選択した培養条件下においてプロテアーゼが標的タンパク質を必ず消化することができ、この活性が折りたたまれていない形のタンパク質に対して優先的に向けられることである。プロテアーゼを直接阻害する試験リガンドによって引き起こされる「偽陽性」の結果を回避するために、２つ以上のプロテアーゼ、特に酵素作用機構が異なるプロテアーゼを同時に、あるいは並行的なアッセイにおいて使用することができる。さらに、プロテアーゼの活性に必要とされる補因子を過剰に提供して、これらの因子を封鎖する可能性がある試験リガンドによる、偽陽性の結果を回避する。
【０１８５】
この方法の典型的な実施形態では、精製した標的タンパク質を最初に採取して、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ７．５、１０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、および１．０ｍＭ ＤＴＴを含む緩衝液中で約１−１００ｇ／ｍＬの最終濃度にする。たとえばプロテイナーゼＫまたはサーモリシンなどのプロテアーゼ（作用機構が異なるプロテアーゼ）を次いで別々に加えて、０．２−１０．０ｇ／ｍＬの最終濃度にする。４℃、１５℃、２５℃、および３５℃で、５分から１時間の範囲の異なる時間、好ましくは３０分、並行的な培養を行う。たとえば最終濃度１ｍＭまでの塩化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）（セリンプロテアーゼの場合）、最終濃度２０ｍＭまでのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（メテロプロテアーゼの場合）、またはヨードアセトアミド（システインプロテアーゼの場合）などの、適切なプロテアーゼ阻害剤を加えることによって、反応を停止させる。次いで培養期間の終期に反応混合物中に残っている無傷であるタンパク質の量を、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動、ＥＬＩＳＡ、あるいはニトロセルロース・フィルタへの結合を非制限的に含めた任意の方法によって評価することができる。狭い範囲の温度を使用する追加的な実験を行って、適切な条件を確立させることができることは理解されよう。このプロトコルによって、３０分の培養時間内に約７０％の標的タンパク質が消化される結果となり、高い程度でタンパク質が開いたことが示される適切な条件（たとえば、プロテアーゼ濃度および消化温度）を選択することができる。
【０１８６】
他の実施形態では、試験リガンドの存在下および不在下における、折りたたまれている標的タンパク質と折りたたまれていない標的タンパク質の相対量を、適切な表面に結合するタンパク質の相対量を測定することによって評価する。この方法は、折りたたまれていないタンパク質は表面に付着する傾向が高いことを利用するものであり、この性質は、折りたたまれていないことにより表面積が広く、疎水性残基の覆いが少ないためである。試験リガンドがＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質に結合する（すなわちリガンドである）場合、リガンドは折りたたまれている形の標的タンパク質を安定化させることができ、固体表面へのタンパク質の結合を低下させる。あるいは、リガンドは折りたたまれていない形の標的タンパク質を安定化させることができ、固体表面へのタンパク質の結合を増大させる。
【０１８７】
この目的に適した表面には、非制限的に、さまざまな処理または未処理プラスチックから構成されているミクロタイター・プレート、組織培養用またはタンパク質を高度に結合させるためのプレート、ニトロセルロース・フィルタおよびＰＶＤＦフィルタがある。
【０１８８】
他の実施形態では、試験結合体中に存在する折りたたまれている標的タンパク質および折りたたまれていない標的タンパク質を、折りたたまれていない状態または折りたたみ状態のタンパク質に特異的な抗体、すなわち変性した状態に特異的な抗体（「ＤＳ」）または元の状態に特異的な抗体（「ＮＳ」）をそれぞれ使用することによって評価する。（Ｂｒｅｙｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９；２６４（５）：１３３４８−１３３５４）ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を、前述のように作製する。その結果生じる抗体を、変性状態のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質への優先的な結合に関してスクリーニングする。これらの抗体を使用して、これらの相互作用の阻害物質に関するスクリーニングを行う。
【０１８９】
他の実施形態では、分子シャペロンを使用して、試験結合体中の折りたたまれているタンパク質および折りたたまれていないタンパク質の相対的レベルを評価する。シャペロンは、正常な生理学的機能の一部として折りたたまれていないタンパク質に結合する、知られているタンパク質を包含する。この実施形態では、試験リガンドおよびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質を含む試験結合体を、標的タンパク質とそのリガンドの結合、分子シャペロンと折りたたまれていないタンパク質の結合に適した条件下で、固形支持体、たとえばミクロタイター・プレートまたは分子シャペロンで覆われた他の適切な表面にさらす。溶液中の折りたたまれていない標的タンパク質は、リガンド安定型の折りたたまれた標的タンパク質と比べて、分子シャペロンで覆われた表面に結合する傾向が高いであろう。したがって、試験リガンドが標的タンパク質に結合する能力は、結合していない標的タンパク質の量、または分子シャペロンで覆われた表面に結合している量を決定することによって、決定することができる。あるいは、分子シャペロンへの結合に関する競合アッセイを使用することができる。
【０１９０】
前述のような高スループット・スクリーニングに関する条件をひとたび確立した後、たとえば２０〜２００Ｍの範囲の濃度で多数の試験リガンドを用いて、プロトコルを同時に繰り返す。標的タンパク質の消化度の少なくとも２倍の増大または減少を観察することによって、「ヒット」化合物、すなわち標的タンパク質に結合するリガンドが示される。好ましい条件は、この手順を使用して「ヒット」化合物として同定される試験リガンドが、０．１％と１％の間である条件である。
【０１９１】
他の実施形態では、前述の試験およびコントロール結合体を、たとえば蛍光性分子または放射性ヌクレオチドなどの、レポーター分子を含む形状感受性プローブ、すなわち折りたたみ状態、折りたたまれていない状態、または溶融した小球状態のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質に優先的に結合するか、あるいはレポーター仲介性が折りたたみ状態のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質によって決して影響されることがないプローブと接触させることができる。
【０１９２】
ファージ・ディスプレー技術のスクリーニング
前述の高スループット・スクリーニング技法に加えて、分子の同定に関する技術を、阻害剤分子の同定において使用することができる。これらの技術の１つは、ファージ・ディスプレー技術である（米国特許第５，４０３，４８４号。Ｖｉｒｕｓｅｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）。ファージ・ディスプレーによって、選択した標的に対して結合するタンパク質を同定することができる。ファージ・ディスプレーは、組み換えバクテリオファージを使用する分子スクリーニングのプロトコルである。この技術は、当該の標的分子に結合することができる適切なリガンド（この場合、候補となる阻害物質）をコードしている遺伝子を用いて、バクテリオファージを形質転換することを含む。本開示のために、標的分子はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質であってよい。形質転換されたバクテリオファージは（固形支持体に結合していることが好ましい）、候補となる阻害物質を発現し、ファージ被膜上にそれを露呈する。候補となる阻害物質を有しており、標的分子を認識する細胞またはウイルスを単離し増幅させる。次いで、首尾の良い阻害物質を特徴付ける。
【０１９３】
ファージ・ディスプレー技術には、標準的な親和性リガンドのスクリーニング技術に優る利点がある。ファージの表面には、本来存在する形状に非常に似た三次元形状のミクロタンパク質リガンドが露呈される。これによって、スクリーニング目的用の、より特異的で親和性の高い結合が可能になる。
【０１９４】
生物特異的な相互作用の分析スクリーニング
本発明の阻害物質スクリーニング・アッセイに適用することができる他の比較的新しいスクリーニング技術は、生物特異的な相互作用の分析である（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。この技術は、Ｊｏｎｓｓｏｎら、（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：５，６２０−６２７（１９９１））によって詳細に記載されている。生物特異的な相互作用の分析は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、センサ・チップ上の生物分子複合体の吸着を調べる。ＳＰＲは、センサ・チップの表面に向けられる偏光の屈折率の変化を測定する。
【０１９５】
当該の標的分子（すなわち、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質、またはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質を含むタンパク質−タンパク質またはタンパク質−ＤＮＡ複合体）に結合することができる特異的リガンド（すなわち、候補となる阻害物質）は、センサ・チップに固定する。標的分子の存在下で、固定されたリガンドへの特異的な結合が起こる。初期の固定リガンド−標的分子複合体は、偏光の屈折率の変化を引き起こし、ダイオード・アレー上で検出される。生物特異的な相互作用の分析は、以下の利点を与える；１）分子複合体形成の標識によらない研究が可能になる；２）アッセイ対象がセンサ・チップを通過するときにリアル・タイムで分子の相互作用を研究することができる；３）１０ｐｇ／ｍｍ２まで表面濃度を検出すること、２つ以上の分子の間の相互作用を検出すること；および４）完全に自動化されていること（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：５，６２０−６２７（１９９１））。
【０１９６】
転写アッセイを使用することによるスクリーニング
転写そのものおよび／または伸張に必要とされるものとして標的タンパク質が同定されている場合、本発明は、真菌の遺伝子の転写、特に標的タンパク質依存性方式でのＲＮＡポリメラーゼＩＩによる遺伝子の転写を調節する際に有用な物質を同定することを包含する。したがって、転写および／または伸張に不可欠であるものとして標的タンパク質が同定されている場合、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの増殖および生存能力の阻害物質を、前述の任意の活性の阻害を測定することによって、あるいはタンパク質／ＤＮＡ複合体の形成を、あるいは細胞がＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの阻害物質と接触しているときは胞子形成の阻害を評価することによって、スクリーニングすることもできる。
【０１９７】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写アッセイ
必須標的タンパク質が転写に必要とされるものとして同定され、前述の任意のスクリーニング法に従って同定されている場合、転写に対するその活性および影響を、タンパク質をｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写反応に加えることによって、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写アッセイを使用して、標的タンパク質仲介活性化型転写に対する影響を測定することによって確認することができる。たとえば、当該のＤＮＡ（すなわち、転写されるＤＮＡ）は、（ｉ）精製されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ、（ｉｉ）ＳＲＢタンパク質、（ｉｉｉ）転写因子ｂ、ｅ、ｇまたはａ、（ｉｖ）Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質、および（ｖ）試験する物質（リガンド）と混合することができる。この混合物を、転写を起こすのに充分な条件下に維持する。その結果生じる組み合わせを、試験混合物と呼ぶ。ＤＮＡ転写は、生成されるｍＲＮＡの量を決定することによって評価することができる。転写は、試験する物質の存在下で決定し、同一条件下で試験物質（たとえば、コントロール混合物）の不在下で起こるＤＮＡ転写と比較する。コントロール混合物中よりも、試験混合物中において（すなわち、評価する物質の存在下で）低い程度で転写が起こる場合、その物質は、好ましくは転写を阻害するような方式で、１以上のＳＲＢタンパク質、またはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質と相互作用している可能性がある。コントロール混合物中よりも、試験混合物中において高い程度で転写が起こる場合、その物質は転写を刺激するような方式で相互作用している。
【０１９８】
ＤＮＡ配列の転写、またはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質をコードしているｍＲＮＡ配列の翻訳も、阻害剤化合物によって阻害または低下させることができ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質の生成が低下するか、あるいは完全になくなる結果となる。遺伝子の転写は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質をコードしている遺伝子の転写を阻害する物質、またはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質をコードしているｍＲＮＡの翻訳を阻害する物質を有効量、細胞に導入することによって改変することができる。たとえば、標的タンパク質をコードしている遺伝子とハイブリダイズし、遺伝子の転写を阻害するアンチセンス・ヌクレオチド配列を細胞中に導入することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，ＮＹ，１９９７を参照のこと）。あるいは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質をコードしているｍＲＮＡの翻訳を阻害するであろうアンチセンス配列を、細胞中に導入することができる。
【０１９９】
二次的なスクリーニング−培養中におけるＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの増殖の阻害の測定
第一次の１回または複数回のスクリーニングにおいて推定阻害物質をひとたび同定した後に、培養におけるＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの増殖および／または生存能力に対する阻害物質の影響を決定することが望ましいであろう。培養中である真菌の増殖阻害に関する試験を行うための方法は、当分野でよく知られている。
【０２００】
このような手順の非制限的な例によって、３種の菌株：Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、およびＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓの一団に対する抗真菌活性について、候補となる阻害剤化合物を試験する。１つのこのような手順は、最小阻害濃度（ＭＩＣ）および最小真菌殺傷濃度（ＭＦＣ）を測定するための、ＮＣＣＬＳＭ２７Ａ法（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ，Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｂｒｏｔｈ Ｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ｙｅａｓｔ；ａｐｐｒｏｖｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄ，１９９７）に基づくものである。このプロトコルのこの概観は、以下の通りである。
【０２０１】
培地
１．Ｓａｂｏｕｒａｕｄデキストロース寒天培地（ＳＤＡ）：Ｂａｃｔｏネオペプトン１０ｇ；Ｂａｃｔｏデキストロース４０ｇ； Ｂａｃｔｏ寒天１５ｇ。１リットルの水に内容物を懸濁させて、攪拌しながら沸騰させて完全に溶かす。１５分間、オートクレーブで処理する。好都合なことにＳＤＡは、ＤＩＦＣＯによって粉末状混合物として販売されている（Ｃａｔ＃０１０９−１７−１）。
【０２０２】
２．ジャガイモ・デキストロース寒天培地（ＰＤＡ）： ジャガイモ抽出物４ｇ；Ｂａｃｔｏデキストロース２０ｇ； Ｂａｃｔｏ寒天１５ｇ。１リットルの水に内容物を懸濁させて、攪拌しながら沸騰させて完全に溶かす。１５分間、オートクレーブで処理する。好都合なことにＰＤＡは、ＤＩＦＣＯによって粉末状混合物として販売されている（Ｃａｔ＃００１３−１７−６）。
【０２０３】
３．ＲＰＭＩ−１６４０：粉末状培地（Ｓｉｇｍａ Ｒ−６５０４、ｗ／グルタミンおよびｗ／ｏバイカーボネート）１０．４ｇ；ＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ Ｓ−６２９７）２．０ｇ；ＭＯＰＳ緩衝液（Ｓｉｇｍａ Ｍ−６２７０）３４．５３ｇ。粉末状培地およびＮａＨＣＯ３を９００ｍｌの蒸留水に溶かす。ＭＯＰＳを加え、溶けるまで攪拌する。１ＮのＮａＯＨを使用して、ｐＨを７．０に調節する。最終体積１リットルにし、濾過滅菌し、４℃で保存する。
【０２０４】
４．１２．５％のマウス血清を含むＲＰＭＩ−１６４０：粉末状培地（Ｓｉｇｍａ Ｒ−６５０４、ｗ／グルタミンおよびｗ／ｏバイカーボネート）１０．４ｇ；ＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ Ｓ−６２９７）２．０ｇ；ＭＯＰＳ緩衝液（Ｓｉｇｍａ Ｍ−６２７０）３４．５３ｇ；マウス血清（Ｓｉｇｍａ Ｓ−７２７３）５０ｍｌ。粉末状培地およびＮａＨＣＯ３を７５０ｍｌの蒸留水に溶かす。ＭＯＰＳを加え、溶けるまで攪拌する。１ＮのＮａＯＨを使用して、ｐＨを７．０に調節し、最終体積８７５ｍｌにする。３５０ｍｌを取り除き、それにマウス血清５０ｍｌを加える。蒸留水７５ｍｌを加えて、培地の残存体積（５２５ｍｌ）を６００ｍｌにする。それぞれの溶液を濾過滅菌し、４℃で保存する。
【０２０５】
接種材料の作製
１．酵母菌：酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）を、３５℃の培養器中のＳａｂｏｕｒａｕｄデキストロース寒天培地（ＳＤＡ）プレート上で培養する。ＳＤＡプレート上の菌株は４℃で保存し、作業用ストック培養物として使用する。細胞の凍結ストックから月に一度、作業用ストック・プレートを作製する。感受性試験用の接種材料を、新鮮な２４時間培養物から作製する。５−１０のコロニーをプレートからかき取り、３ｍｌの滅菌０．８５％生理食塩水（８．５ｇ／ＮａＣｌ１リットル）中に懸濁させる。溶液の細胞密度を、６００ｎｍに設定した分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ−１２０１Ｓ ＵＶ−ＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）中の吸光度を測定することによって決定する。正確な読み取りのためには、０．１と０．４の間の吸光度値が必要とされる。
【０２０６】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、たとえば菌株ＡＴＣＣ１０２３１については、１．０ ＯＤ６００単位は１ｍｌ当たり約１０７個の細胞であり、一方Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株ＣＴＹ５５２については、１．０ ＯＤ６００単位は１ｍｌ当たり１０７個よりわずかに少ない細胞であった。適切な培地（典型的にはＲＰＭＩ−１６４０）によって、ＣａｎｄｉｄａについてはＯＤ６００＝０．０００３に、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓについてはＯＤ６００＝０．０００４に細胞懸濁液を希釈する。希釈された懸濁液は、１ｍｌ当たり約３×１０３個の細胞を含むはずである（これは接種材料濃度の２倍）。この希釈液の２つの１００ｕｌアリコートをＳＤＡプレート上に広げ、３５℃で１−２日間培養して、コロニー形成単位の正確な数を決定しなければならない。接種材料（２×）の許容範囲は、１−５×１０３ｃｆｕ／ｍｌ（１００ｕｌについて１００−５００）である。化合物を用いて接種材料を２倍に希釈した後、細胞の最終濃度は１ｍｌ当たり０．５−２．５×１０３個であろう。接種材料は４℃に保ち、数時間以内に使用しなければならない。
【０２０７】
２．糸状真菌：糸状真菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）は、３５℃の培養器中のジャガイモ・デキストロース寒天培地（ＰＤＡ）プレート上で培養しなければならない。月に一度、新鮮なプレートを凍結細胞ストックから始めなければならない。感受性試験用のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの接種材料を、３５℃で５日間培養したプレートから作製する。コロニーを５ｍｌの滅菌０．８５％生理食塩水（８．５ｇ／ＮａＣｌ１リットル）で覆い、１０−１５分間穏やかに揺らす。分生胞子を取り除くために、自動式ピペッタを使用してコロニーを軽く洗浄する。生理食塩水溶液をプレートから取り除き、重い粒子を３−５分間沈殿させる。上部の懸濁液を取り除き、１５秒間攪拌する。溶液の濁度を、６００ｎｍに設定した分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ−１２０１Ｓ ＵＶ−ＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）中の吸光度を測定することによって決定する。正確な読み取りのためには、０．１と０．４の間の吸光度値が必要とされる。
【０２０８】
適切な培地（典型的にはＲＰＭＩ−１６４０）によって、ＯＤ６００＝０．０００４に細胞懸濁液を希釈する。最終懸濁液は、１ｍｌ当たり約３×１０３個の細胞を含むはずである（これは接種材料濃度の２倍）。この希釈液の２つの１００ｕｌアリコートをＳＤＡプレート上に広げ、３５℃で１−２日間培養して、コロニー形成単位の正確な数を決定しなければならない。接種材料（２×）の許容範囲は、１−５×１０３ｃｆｕ／ｍｌ（１００ｕｌについて１００−５００）である。化合物を用いて接種材料を２倍に希釈した後、細胞の最終濃度は１ｍｌ当たり０．５−２．５×１０３個であろう。接種材料は４℃に保ち、数時間以内に使用しなければならない。
【０２０９】
化合物の調製
試験するストック溶液および濃度は、化合物ごとに変わるであろう。しかしながら一般には、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ Ｄ−８７７９）中に溶けた１２．８ｍｇ／ｍｌのストック溶液を作製すべきである。これによって、１％ＤＭＳＯを含む１２８ｕｇ／ｍｌの開始試験濃度が与えられるであろう。ストック溶液は−２０℃に保存しなければならず、抗真菌試験用の希釈液はそれぞれのアッセイ前に新鮮に作製しなければならない。
【０２１０】
活性が知られていない化合物またはＭＩＣ値が４ｕｇ／ｍｌを超える化合物については、１２８ｕｇ／ｍｌ〜０．１２５ｕｇ／ｍｌの範囲の濃度を使用すべきである。アンホテリシンＢ（Ｓｉｇｍａ Ａ２４１１）イトラコナゾール（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．ｃａｔ＃３０．２１１．４４）などの、より活性のある化合物は、より低い範囲の濃度（１６ｕｇ／ｍｌ〜０．０１６ｕｇ／ｍｌ）を必要とする。アンホテリシンＢおよびイトラコナゾールのストック溶液は、ＤＭＳＯ中に１．６ｍｇ／ｍｌで作製しなければならない。アンホテリシンＢは、約８０％アンホテリシンＢである粉末として販売されている。ストック溶液は、それに応じて作製しなければならない（１．６ｍｇ／ｍｌのアンホテリシンＢの溶液１ｍｌについて粉末２．０ｍｇ）。
【０２１１】
コントロール化合物のストック溶液（１．６ｍｇ／ｍｌ、アンホテリシンＢまたはイトラコナゾール）を、最初に培地中において３２ｕｇ／ｍｌの濃度に希釈し、一方、試験化合物のストック溶液（典型的には１２．８ｍｇ／ｍｌ）は２５６ｕｇ／ｍｌに希釈する。これら（コントロールおよび試験化合物）は両方とも、１：５０の希釈液である。３つの真菌菌株に関するアッセイでは、４０マイクロリットルのストック溶液を、室温である培地を用いて２．０ｍｌに希釈しなければならない。試験化合物のストック溶液が１２．８ｍｇ／ｍｌではない場合、適切な希釈を計算しなければならない。これらの最初の希釈液を使用して、一連の希釈液が生成されるであろう（以下参照）。細胞を化合物に加えることによって、さらなる２倍希釈液が生成されるであろう。
【０２１２】
天然産物の抽出物を、最初の培養体積に基づいて抽出物の２００倍〜２０４，８００倍の希釈範囲の濃度で試験する。抽出物は最初に１００倍に希釈しなければならず、次いで以下で指示するように一連の希釈液を作成する。
【０２１３】
アッセイの設定
抗真菌感受性試験を、ポリスチレン製である９６ウエルの平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ９０１７）中で設定しなければならない。それぞれのウエルの行２−１２に、１００マイクロリットルの培地を加える。チャンネル上にチップがない電動式マルチチャンネル（１２）ピペッタによって、この仕事が簡単になる。それぞれのウエルの行に、２００マイクロリットルの希釈した化合物を加える（アンホテリシンＢまたはイトラコナゾール・コントロールは３２ｕｇ／ｍｌ、試験化合物は２５６ｕｇ／ｍｌ、天然産物の抽出物は１００倍に希釈）。次いで手動型マルチチャンネル（８）ピペッタを使用して、一連の２倍希釈を設定する。それぞれのウエルの行１から１００マイクロリットルを取り除き、行２中の１００マイクロリットルと混合させる。これを連続的に行って（行２〜行３など）、１組の１１個の一連の希釈液を作成する（行１２は薬剤を含まないコントロール）。
【０２１４】
それぞれのウエルの２つの列に、１つの菌株の接種材料（２×）１００ｕｌを加える。プレート上の最後の２つの列（ＧおよびＨ）には、培地のみを加える。接種材料の添加は、電動式マルチチャンネル（１２）ピペッタを使用して行うことが最良である。この設定（以下参照）によって、１ｍｌ当たり５００−２５００個の開始細胞密度（ウエル当たり１００−５００個）、およびコントロール（アンホテリシンＢおよびイトラコナゾール）については１６ｕｇ／ｍｌ〜０．０１６ｕｇ／ｍｌの範囲、純粋な試験化合物については１２８ｕｇ／ｍｌ〜０．１２５ｕｇ／ｍｌの範囲の薬剤濃度、および天然産物の抽出物については２００倍〜２０４，８００倍の希釈が生み出される。
【０２１５】
それぞれの菌株の接種材料（２×）中に存在する、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を決定することは重要である。それぞれの接種材料（２×）の２つの１００ｕｌアリコートをＳＤＡプレート上に広げ、３５℃で１−２日間培養して、コロニー形成単位の正確な数を決定しなければならない。接種材料（２×）の許容範囲は、１−５×１０３ｃｆｕ／ｍｌ（１００ｕｌについて１００−５００）である。化合物を用いて接種材料を２倍に希釈した後、細胞の最終濃度は１ｍｌ当たり０．５−２．５×１０３個であろう。接種材料は暗所、３５℃の培養器中に４８時間置かなければならない。
【０２１６】
低溶解度化合物に関する改変型アッセイの設定
いくつかの化合物は、水性培地中において低濃度でもあまり溶解性がなく、化合物の沈殿から希釈産物が生じる可能性がある。このような問題を回避するために、最終濃度が１００倍である一連の２倍希釈を、同じ溶媒（典型的にはＤＭＳＯ）に溶けているストック溶液から作製する。次いでそれぞれの中間溶液を、１×接種材料に関する最終強度に希釈する。
【０２１７】
このタイプのアッセイの設定は、試験化合物が１２，８００ｕｇ／ｍｌ〜１２．５ｕｇ／ｍｌの範囲であり、コントロール化合物（アンホテリシンＢおよびイトラコナゾール）が１６００ｕｇ／ｍｌ〜１．６ｕｇ／ｍｌの範囲である、ＤＭＳＯ中に溶けた一連の１１個の２倍希釈液を作製することを含む。２マイクロリットルの希釈した化合物を、それぞれのウエルの適切な行に置く（行１には１２，８００ｕｇ／ｍｌ、行１１まで１２．５ｕｇ／ｍｌ、および行１２にはＤＭＳＯ）。それぞれのウエルの２つの列に、１つの菌株の接種材料（１×）２００ｕｌを加える。プレート上の最後の２つの列（ＧおよびＨ）には、培地のみ（２００ｕｌ）を加える。接種材料の添加は、電動式マルチチャンネル（１２）ピペッタを使用して行うことが最良である。細胞および化合物の最終濃度は、標準的なアッセイの設定に関する前述のものと同じである。このアッセイにおける接種材料は１×の濃度であり、一方で前述のアッセイの接種材料は２×濃度であることに留意されたい。１×接種材料は、等体積の培地を２×接種材料に加えることによって作成する。
【０２１８】
ＮＣＣＬＳは、アンホテリシンＢおよびイトラコナゾールを含めた不溶性化合物に関する、このタイプのアッセイの設定を使用することを勧めている。標準的なアッセイの設定を使用して、アンホテリシンＢおよびイトラコナゾールに関する妥当な一貫した結果を得ることができるが、いくつかの試験化合物は、ＤＭＳＯの一連の希釈を行うことから利点を得ることができる。化合物が有望な候補である可能性があり、標準的なアッセイで矛盾した結果が得られる場合は特に、培地の希釈によって重たい沈殿物を形成する化合物は、このアッセイ用のものであるとみなすべきである。
【０２１９】
読み取り値および結果
最小阻害濃度（ＭＩＣ）：ＭＩＣは、生物の増殖を阻害する抗真菌剤の最低濃度である。アンホテリシンＢについては、目に見える増殖を生み出さない最低の薬剤濃度がＭＩＣである。イトラコナゾール（および他のアゾール類）については、増殖コントロール（行１２）の増殖を２０％以下に低下させる最低の薬剤濃度が、ＭＩＣである。
【０２２０】
急激な終点を与える（アンホテリシンＢのような）試験化合物については、目に見える増殖を生み出さない最低の薬剤濃度がＭＩＣである。細胞増殖の阻害に対して追随的な影響をを与える（アゾール類のような）試験化合物については、増殖コントロールの増殖を２０％以下に低下させる最低の薬剤濃度（濁度を測定することによって決定される）がＭＩＣである。
【０２２１】
それぞれのウエルの濁度を、プレート・リーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｍｏｄｅｌ３５５０−ＵＶ）上において４１５ｎｍで吸光度を測定することによって決定する。細胞を含まない列（ＧおよびＨ）は、吸光度のコントロールの役割を果たす。化合物を含まない行１２は、増殖コントロールの役割を果たす。
【０２２２】
最小真菌殺傷濃度（ＭＦＣ）：ＭＦＣは、生存不能な培養物を生じさせる抗真菌剤の最低濃度である。状況に応じて、２つのわずかに異なる標準およびアッセイを適用する。しかしながら、２つの方法のそれぞれについて、ＭＩＣよりわずかに濃度が低い薬剤希釈から始め、最高の薬剤濃度まで続けることによって、培養物の生存能力を決定しなければならない。
【０２２３】
第１のより厳格な標準は、培養物が１％以下の開始培養物のコロニー形成単位を含む場合、これを生存不能であるとみなす。ミクロタイター・プレートのウエルから細胞を完全に取り除き、１．３ｍｌのＲＰＭＩ培地を含むミクロ遠心チューブ中に細胞を置くことによって、このことを決定する。これらの細胞を２分間回転させ、上澄みを注ぎ出し、残りの培地に細胞を再懸濁させ、ＳＤＡプレート上に広げる。このプレートを３５℃で１−２日間培養して、コロニーを計数する。これらの数を、アッセイの第１日目からの元のｃｆｕ数と比較する。
【０２２４】
第２のより簡単な方法は、多数のサンプルを加工処理するのにより実用的であり、これが通常使用されている方法である。細胞を再懸濁させた後にピペッティングによって、１５マイクロリットルをＳＤＡプレート上に直接点在させ、３５℃で２日間培養する。プレート上でコロニーが形成されない場合、培養物は生存不能であるとみなす。この方法は前述の方法より簡単であるが、定量性が低く、平板培養の前に細胞から化合物を洗い出すための作業は行わない。化合物が依然として充分高い濃度で存在する場合、寒天プレート上での増殖の阻害を観察することができる。
【０２２５】
コントロール化合物アンホテリシンＢは殺傷性のある薬剤であり、ＭＩＣは典型的にはＭＦＣと等しい。対照的に、イトラコナゾールは静的薬剤であり、ＭＩＣを充分に超える濃度の化合物を含むウエルから、生存能力のある細胞を回収することができる。
【０２２６】
質の調節
接種材料（２×）の細胞密度は、１×１０３ｃｆｕ／ｍｌと５×１０３ｃｆｕ／ｍｌの間（１００マイクロリットル当たり１００−５００ｃｆｕ）でなければならない。アッセイにおける開始細胞濃度は０．５×１０３ｃｆｕ／ｍｌ〜２．５×１０３ｃｆｕ／ｍｌであろう。
【０２２７】
【表３】
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【０２２８】
開始細胞濃度またはＭＩＣ値が許容できる範囲内でない場合は、問題の個々の菌株のアッセイにおけるすべての結果を無効であるとみなし、アッセイを繰り返さなければならない。
【０２２９】
二次的なスクリーニング−機構的アッセイ
本発明の好ましい阻害剤化合物は、抗真菌活性を有する化合物であるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏの機構ベースのアッセイにおいて充分な活性がある化合物をさらに開発することができると考えられる。このような二次的なアッセイを行って、これらの化合物の作用機構を決定する。このような二次的な機構的アッセイには、これらの化合物の機構的阻害活性を決定するための、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの実験、および真菌のｉｎ ｖｉｖｏでの実験がある。これらのアッセイの正確な性質は、標的に依存するであろう。
【０２３０】
標的タンパク質を阻害することによって細胞増殖を妨げる化合物を、さらに開発することができると考えられる。
【０２３１】
他種のカウンター・スクリーニング（ｃｏｕｎｔｅｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）
二次的なスクリーニング・アッセイと平行して、カウンター・スクリーニングを行って、化合物が任意のヒト相同体の活性を阻害するかどうかを決定する。カウンター・スクリーニングの正確な性質は、標的タンパク質に依存するであろう。これらのカウンター・スクリーニングは、化合物がヒト相同体に結合するかどうかを決定するための親和性アッセイ、または化合物がヒトのタンパク質の活性を阻害するかどうかを決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏまたは細胞ベースの機械論的アッセイを含んでよい。
【０２３２】
哺乳動物細胞に関する細胞毒性の研究も行って、化合物が培養中の哺乳動物細胞に対して毒性があるかどうかを決定する。ヒト相同体に結合しない、および／またはヒト相同体の活性を阻害しない化合物を、さらに開発することができると考えられるであろう。
【０２３３】
ヒト相同体を使用する転写阻害のカウンター・スクリーニング
本明細書に記載する１以上のアッセイに従って、必須標的タンパク質がＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に必要なものとして、かつＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの阻害物質として同定されているとき、タンパク質をさらに試験して、宿主生物に対するその影響を決定することができる。ヒトの治療に有用な抗真菌性化合物の開発においては、このような化合物が真菌病原体の生存能力を阻害する再に有効な物質として働き、一方でヒトの細胞系は著しく害さないことが望ましい。詳細には、前述のアッセイの任意の１つにおいて同定されたＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの阻害物質を、標的タンパク質のヒト相同体の阻害に関してカウンター・スクリーニングすることができる。
【０２３４】
利用可能な場合は、標的タンパク質をコードしているヒトの遺伝子を発現させ、公表されている方法および酵母菌の標的タンパク質相同体とのその相同性を使用して精製することができる。ヒト相同体は、ヒトの細胞培養系を使用して、前述したアッセイなどのアッセイにおいて候補となる阻害物質と接触させることができる。ヒトの治療物質としてのＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの阻害物質の有効性は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質に関する阻害レベルと比べて、そのヒト相同体に対して低レベルの阻害を示すことであると決定される。たとえば、ヒトの系における所与のヒト相同体の阻害物質による阻害の量は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質の阻害の量に関して２０％を超えないことが好ましい。
【０２３５】
このような阻害物質は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの生物学的活性を「選択的に阻害する」Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの標的タンパク質の「選択的な阻害物質」である。哺乳動物の転写または他の増殖関連の機構に対して試験化合物の影響がないことを、たとえばＭａｎｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：３８５５，１９８０中に示されるように、酵母菌の成分を類似のヒトｉｎ ｖｉｔｒｏ転写系に置換することによって試験する。
【０２３６】
１つのこのような哺乳動物の細胞毒性スクリーニング法の一例を、実施例３に記載する。
【０２３７】
化学的類似化
いくつかの化合物は細胞毒性であるが、ヒト相同体の活性は阻害しないことが判明する可能性があることに留意することが重要である。このような非標的ベースの細胞毒性を示す化合物を、さらに開発することができると依然として考えられている。化学的類似化作業を使用して、標的ベースの抗真菌活性と非標的ベースの細胞毒活性を区別することができる。
【０２３８】
抗真菌活性が向上しており細胞毒活性が低下している化合物を同定するために、化学的類似化を使用することもできる。前述の二次的なアッセイおよびカウンター・スクリーニングを、抗真菌性アッセイと平行して行って、適切な標的に対して化合物が活性状態のままである、すなわち同じ作用機構を阻害したままであることを保証する。
【０２３９】
広範囲のスペクトルの真菌種および多数の単離体に対する抗真菌性試験も、この点において行う。広範囲のスペクトルの真菌種には、既存の治療剤、たとえばアンホテリシンＢ、およびたとえばイントラコンゾールおよびフルコナゾールなどのさなざまなアゾール類に耐性がある真菌種がある。４ｕｇ／ｍｌ未満の濃度で真菌、特にＣａｎｄｉｄａおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種の増殖を阻害し、最小細胞毒性を示し、確立された作用機構を有する化合物を、さらに開発することができると考えられる。
【０２４０】
候補薬剤の前臨床開発
その後の化合物の前臨床開発には、処方、毒物学、薬物動態学、動物への効能の研究、および医用化学があるが、これらだけには限られない。望ましい性質を有する化合物を、ヒト検体の臨床試験用に選択する。
【０２４１】
調剤および薬剤調合物
治療用に使用するために、本明細書に記載した同定されている阻害物質を、薬剤として許容される／生物学的に適合性がある調合物の形で投与することができる。本発明の組成物は、個々の患者の年齢、性別、体重、種類および条件、および投与の経路などの要因を考慮して、調剤の形で、医学、獣医学、および農学の分野の当業者よく知られているに技法によって投与することができる。本発明の組成物は、単独あるいは組み合わせて投与することができ、あるいはたとえばニステイン、アンホテリシンＢ、フルシトシンおよびさなざまな抗真菌性アゾール類などの、追加的な抗真菌剤と共に同時に投与するか、あるいは順次に投与することができる。
【０２４２】
このような薬剤組成物は、特に局所性および全身性の真菌感染の治療用に使用することができ、頬に、直腸に、非経口的に、あるいは皮膚および粘膜への局所的な施用によって、あるいは静脈内または筋肉内注射によって投与することができる。これらの組成物は固体または液体であってよく、たとえば単純または被覆錠剤、カプセル、顆粒剤、座剤、注射可能な調製物、軟膏、クリーム、ゲルおよびエアロゾル調製物などの、ヒト医療において一般に使用されている任意の薬剤形であってよい。本発明の薬剤組成物は、当業者に知られている通常の方法によって調製する。活性成分は、タルク、アラビア・ゴム、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、カカオ脂などの薬剤組成物中において通常使用される補形薬、水性または非水性媒体、動物または植物起源の脂肪物質、パラフィン誘導体、グリコール、さまざまな湿潤剤、分散剤または乳化剤および防腐剤と共に、組成物中に取り込ませることができる。
【０２４３】
液体調製物は、１）溶液、懸濁液、シロップ、エリキシル剤の形での、たとえば経口、鼻、肛門、膣、経口、胃内投与などの粘膜への投与、２）たとえばクリーム、軟膏、ローションまたはスプレーの形での局所投与に有用である。さらに、滅菌溶液、懸濁液または乳濁液などの非経口、皮下、皮内、筋肉内、静脈内投与用、たとえば注射による投与用などに使用される阻害物質を含む液体薬剤調合物を、過度の実験なしで調合することができる。
【０２４４】
動物またはヒトに投与する組成物、および任意の個々の投与法用に、適切な動物モデル、たとえばマウスにおける致死用量（ＬＤ）およびＬＤ５０を決定することなどによって毒性、組成物の用量、および組成物中の成分の濃度、および抗ウイルス性および／または抗菌性応答を最大にするための投与の時間を決定することが好ましい。こうした要因は、滴定などの方法、およびたとえばＥＬＩＳＡおよび／またはＥＦＦＩＴ分析によって、抗体または抗原の血清を分析することによって、過度の実験なしで決定することができる。このような決定には、当業者、本開示および本明細書に引用した文献の知識からの過度の実験は必要とされない。
【０２４５】
調合物は、標的兆候の相対的活性および毒性、たとえば抗真菌活性、および投与の経路、個々の患者の年齢、性別、体重、種類および条件などの要因を考慮して、薬剤として有効な量および／または抗真菌的に有効な量、投与することができる。
【０２４６】
前述のように、本発明の薬剤組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、シロップ、エリキシル剤、カプセル、錠剤、クリーム、ローションなどであってよい。本発明の組成物は、滅菌水、生理食塩水、グルコースなどの、適切な担体、希釈液、または補形薬を含んでよい。さらに、本発明の組成物は凍結乾燥させることもでき、かつ／または、投与の経路および所望の調製に応じて、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバント、ゲル化または粘性向上添加剤、防腐剤、芳香剤、着色剤などの補助物質を含んでよい。参照によって本明細書に組み込んである、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ」，１７ｔｈ Ｅｄ．，１９８５などの標準的なテキストを参考にして、過度の実験なしで適切な調製物を調製することができる。
【０２４７】
投与する阻害物質の量は病原性感染の程度に従って決定されるはずであり、感染が全身性であれ局所性であれ、典型的には約１ｕｇ−１００ｍｇ／身体重量１ｋｇの範囲であろう。阻害物質がペプチドまたはポリペプチドである場合、１回の投与当たり約１００−５００ｕｇ／ｍＬの範囲でそれが投与されるであろう。阻害物質の１回の投与、または複数回、日ごと、週ごと、あるいは断続的な投与が、本発明に従って企図される。
【０２４８】
投与の経路は内科医によって選択され、局所的、経口的、経皮的、鼻に関する、直腸に関する、静脈内、筋肉内または皮下投与であってよい。
【０２４９】
以下の実施例は、本発明を非制限的に例示することを意図するものである。
【０２５０】
【実施例】
実施例１：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの不活性化分析
酵母菌のゲノムＤＮＡの作製
このプロトコルを使用して、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの培養物、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからゲノムＤＮＡを作製することができる。酵母菌ストックの培養物をグリセロールのストックからＹＰＤ（Ｂｉｏ１０１Ｃａｔ＃４００１−２４２）プレートに画線接種し、３０℃で４８時間培養する。単一の異なるコロニーを採取して、５ｍｌのＹＰＤ培地に入れ（Ｂｉｏ１０１Ｃａｔ＃４００１−０４２）、ローラ・ドラム中において３０℃で一晩培養する。この培養物１ｍｌからの細胞を、ミクロ遠心分離において５秒間回転させることによってペレット状にする。ＴＥ１ｍｌ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いて、細胞を１回洗浄し、これを再び回転させる。０．２ｍｌの抽出緩衝液（２％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００，１％ ＳＤＳ，１００ｍＭ ＮａＣｌ， １０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５，および１ｍＭ ＥＤＴＡ）中にペレットを再懸濁させ、フェノール／クロロホルム／イソアミル（２５：２４：１，ｖ：ｖ：ｖ）を０．２ｍｌ加える。酸で洗浄した４００ミクロンのガラス・ビーズを０．３ｇ加える。５分間攪拌する。ＴＥを０．２ｍｌ加え、ミクロ遠心分離において１０−１３ｋｒｐｍで１０分間回転させる。水性相を取り出して新鮮なチューブに移す。２．５倍の体積の無水エタノールを用いて沈殿させる。回転させ、４００ｕｌのＴＥおよび３ｕｌの１０ｍｇ／ｍｌであるＲＮａｓｅ Ａのストック中にペレットを再懸濁させる。３７℃で５分間培養する。４Ｍである酢酸アンモニウム１０ｕｌ、および無水エタノール１ｍｌを加える。転化するまで混合し、ミクロ遠心分離で８分間遠心分離する。ペレットを自然乾燥させ、５０ｕｌのＴＥ中に再懸濁させる。４℃で保存する。この溶液は、幾分曇った状態になる可能性がある。ＰＣＲ反応またはサザンブロットにおいて使用するために、このストックを希釈する前に、ストックのサンプルを軽く攪拌する。
【０２５１】
あるいは、酵母菌用ゲノムＤＮＡキットが、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手可能である（Ｃａｔ．＃Ｄ２００２）。このキットには、ガラス・ビーズおよびフェノール：クロロホルム混合物の使用を回避し、非常に清潔なゲノムＤＮＡが生成されるという利点があるが、これが前述の方法よりも、幾分生産性の低い方法であることが明らかになっている場合もある。
【０２５２】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形質転換
菌株を富裕な培地プレート（ＹＰＤなど）に画線接種し、３０℃で４８時間培養する。単一の異なるコロニーを採取して、２−５ｍｌのＹＰＤ培地に入れ、ローラ・ドラム上で一晩培養する。２００ｍｌのＹＰＤ中においてＡ６００＝０．２まで希釈し、Ａ６００＝０．８まで３０℃で培養する（正常な状況下で約４時間増殖させる）。培養物を４本の滅菌した５０ｍｌチューブに分ける。たとえばＢｅｃｋｍａｎＪＴ−６中において３０００ｒｐｍで５分間、中低速で遠心分離する。２０ｍｌのＨ２Ｏ中に、ペレットを再懸濁させ１つにする。再び遠心分離する。１０ｍｌのＴＥＬ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１Ｍ酢酸リチウム）中にペレットを再懸濁させる。再び遠心分離し、２ｍｌのＴＥＬ中に再懸濁させる。コンピテント細胞は、室温では４時間まで安定している。凍結ストックを作成することを望む場合、滅菌グリセロールを（５０％ストックから）加えて、最終濃度１５％にし、次いで−８０℃の冷凍室中に置くことによって凍結させる（液体窒素またはドライアイス／エタノール浴中で急速に凍結させないこと）。凍結させたコンピテント細胞は、新鮮に作成したコンピテント細胞よりも３−５倍反応能が低いと予想することができる。充分にせん断された一本鎖担体ＤＮＡ１００μｇ、および消化されたプラスミドＤＮＡ３０μｌを、清潔なエッペンドルフ・チューブに加える。コンピテント細胞１００ｍｌを加え、混合する。ＰＬＡＴＥ（４０％ＰＥＧ−３３５０ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１Ｍ酢酸リチウム）０．８ｍｌを加え、充分に混合する。３０℃で３０分間培養する。４２℃において、２０分間熱ショックを与える。ミクロ遠心分離で５秒間遠心分離し、上澄みを取り除く。ペレットを１ｍｌのＴＥで洗浄し、再び回転させ、最小体積（５０μｌ未満）で（−）ＨＩＳプレートなどの選択培地上にペレットを平板培養する。
【０２５３】
ＴＥＬおよびＰＬＡＴＥ溶液は市販されており（ＳＩＧＭＡ Ｃａｔ．Ｔ−０８０９およびＰ−８９６６）、室温では安定しているようである。研究室中で作成したＴＥＬおよびＰＬＡＴＥについては、形質転換の日にＴｒｉｓ−Ｃｌ、ＥＤＴＡ、ＰＥＧ−３３５０および酢酸リチウムの溶液ストックから作成した場合、溶液が最も良く働くことが発見されている。
【０２５４】
３０℃で４８−７２時間培養した後、特定の菌株の増殖率に応じて、個々のコロニーを滅菌した爪楊枝で同等に刺して、１つが（−）ＨＩＳであり、もう１つが（−）ＨＩＳ（＋）Ｃｕである、同様に並べた２つのプレートに移す。このようにして少なくとも１２個のコロニーを採取し、作製したプレートを３０℃で４８−７２時間培養する（ここでも、菌株の増殖率に応じて）。コロニーまたは２つのＣＵＹ１０６は、（−）ＨＩＳ（＋）Ｃｕプレート上での増殖に関する陽性コントロールとして採取すること。培養した後、増殖に関してプレートを記録する。真の銅感受性菌株の場合、（−）ＨＩＳ（＋）Ｃｕプレート上では明らかに増殖せず、（−）ＨＩＳプレート上において増殖することが明らかであろう。
【０２５５】
銅の滴定
単一コロニーを選択プレート（前を参照のこと）から採取し、ＣＭＳ培地（Ｂｉｏ１０１．Ｃａｔ．＃４５００−０２２）に移し、ローラ・ドラム中において３０℃で一晩増殖させる。Ｂｉｏ１０１ ＣＭＳを使用することは、滴定の再現性には重要であると思われる。培養物をＡ６００＝０．２まで希釈し、２ｍｌ部分を滅菌キャップをした培養チューブに等分する。５００ｍＭのストックから、硫酸銅をそれぞれのチューブに加えて、０ｕＭ（銅を含まないコントロール）、１０ｕＭ、２０ｕＭ、５０ｕＭ、１００ｕＭ、２００ｕＭ、５００ｕＭ１．０ｍＭ、１．５ｍＭおよび２．０ｍＭの最終濃度にする。１０本のチューブを、ローラ・ドラム上で３０℃で１６−２０時間培養する。それぞれのアリコートのＡ６００を測定し、その結果を半対数プロットでグラフ化する：Ｙ軸＝銅を含まないコントロールのＡ６００に正規化したサンプルのＡ６００（常数目盛り）。Ｘ軸＝ＣｕＳＯ４の濃度（対数目盛り）。
【０２５６】
銅の時間経過
単一コロニーを選択プレート（前を参照のこと）から採取し、ＣＭＳ培地（Ｂｉｏ１０１．Ｃａｔ．＃４５００−０２２）に移し、ローラ・ドラム中において３０℃で一晩増殖させる。銅の滴定の場合と同様に、Ｂｉｏ１０１ ＣＭＳを使用することは、銅の時間経過の再現性には重要であると思われる。培養物を２５ｍｌのＣＭＳ中においてＡ６００＝０．０２−０．１まで希釈する。培養物を２本の滅菌５０ｍｌチューブに均一に分け、振とう器／培養器中において３０℃で１時間増殖させる。１ｍＭの硫酸銅（５００ｍＭの滅菌ストックからのもの）を、培養物の１つに加えることによって、タイム・ポイント０を定義する。それぞれのタイム・ポイントで、１．２ｍｌのアリコートをそれぞれの培養物の分析用に採取し、その培養物をすぐに、振とうしながらの３０℃の培養に戻す。この例外はタイム・ポイント０であり、この時点では、添加銅が入っていない培養物のみを、両方の培養物を示すデータとしてアッセイする。それぞれのアリコートの一部を使用してＡ６００を測定し、一方、残りを使用して一連の１０倍希釈系にする。１００ｕｌのアリコートを、滅菌水のアリコート９００ｕｌを用いて順次に希釈する。希釈系のそれぞれのステップについて、新鮮なピペット・チップを使用し、元の培養物の１０１、１０２、１０３、１０４および１０５倍希釈液として表す。適切な希釈液をＹＰＤプレートに平板培養し、そのプレートを菌株識別名、タイム・ポイント、銅を含むか含まないか、どの希釈液を平板培養するかによって特徴付ける。プレートは３０℃に置き、平板培養した４８時間後および７２時間後に調べる。目に見えるコロニーを計数し、希釈の要因および平板培養の要因に基づいて、元の培養物の１ｍｌ当たりのコロニーに正規化する（１ｍｌではなくわずかに１００ｕｌを平板培養したため）。
【０２５７】
ＹＰＤに平板培養するための適切な希釈液
ＣＵＹ１０６、および他の銅無感反菌株については：
タイム・ポイント０では：１０３、１０４、１０５
１０時間未満のタイム・ポイントでは：１０３、１０４、１０５
１０時間を超えるタイム・ポイントでは：１０４、１０５、１０６
殺傷性が知られていない遺伝子については：
タイム・ポイント０では：１０３、１０４、１０５
１０時間未満のタイム・ポイントでは：１０１、１０３、１０５
１０時間を超えるタイム・ポイントでは：１００、１０２、１０４、１０６
【０２５８】
１００希釈ｏとは、希釈していない培養物１００μｌを平板培養することを指す。硫酸銅を含む培養物については、希釈していないサンプルをミクロ遠心分離で５秒間回転させ、ＹＰＤに平板培養する前にペレットを滅菌水に再懸濁させて、硫酸銅による汚染を回避することが勧められる。希釈系の他のすべてのサンプルについては、この余分なステップは不要であることが分かっている。生存していない極限の細胞の場合、第１の結果を確認するために、第２の時間行程が勧められる。この場合、平板培養するための適切な希釈液は、最初の実験の結果に依存するであろう。高希釈液に限ることにより静的効果をより注意深くアッセイすることができ、一方、低希釈液については後期のタイム・ポイントで、より高い真菌殺傷効果を得ることができる。培養物の濃縮が必要である場合もあることが分かっている（たとえば、１ｍｌから１００ｕｌの体積に、あるいはさらに１０ｍｌから１００ｕｌに濃縮し、測定可能な数の生きている細胞を得て、その後銅にさらす（後者の場合は、実験中に使用する体積を調節して、必要とされる大きな体積を融通することが必要である））。
【０２５９】
表１に記載した標的遺伝子に関する、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ不活性化の分析からの結果を、図２７−５３に示す。
【０２６０】
実施例２：Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換
プレート上の単一コロニーからの、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの一晩培養物１ｍｌを、３０℃で攪拌しながら、ウリジンを２０μｇ／ｍｌ補ったＹＰＤ中で増殖させる。培養物を５０ｍｌのウリジンを補ったＹＰＤに希釈させ、３０℃で攪拌しながら増殖させる。培養物のＡ５４０が２に達するとき、細胞を氷上で１０分間冷却し、次いで４℃で１０分間５０００ｒｐｍで遠心分離する。ペレットを１０ｍｌのＴＥで２回洗浄し、そのたびに再び遠心分離する。１ｍｌのＴＥＬＤ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５，０．０１Ｍ酢酸リチウム，０．０１Ｍ ＤＴＴ）中にペレットを再懸濁させる。それぞれの成分の１０×ストックから、ＴＥＬＤを新鮮にしておくことが重要である（１０×ＤＴＴは凍結保存しておかなければならない）。ミクロ遠心分離で軽く回転させる。２００μｌのＴＥＬＤにペレットを再懸濁させる。これは４回の形質転換に充分なコンピテント酵母菌である。新鮮なチューブに、コンピテント酵母菌の調製物５０μｌ、１０ｍｇ／ｍｌの担体ＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ） ５μｌ、消化およびゲル精製されたプラスミド断片１−２μｌ（１−２μｇ／ｍｌ）、ＰＥＧ溶液ＴＥＬＤ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５，０．０１Ｍ酢酸リチウム，０．０１Ｍ ＤＴＴ，４０％ＰＥＧ４０００（ＶＷＲ Ｃａｔ．＃９７２７−２））３００μｌを加える。転化するまで混合する。３０℃で３０分間培養し、次いで４２℃において２０分間熱ショックを与える。ミクロ遠心分離で１５秒間回転させる。２００μｌのＴＥにペレットを再懸濁させ、（−）ＵＲＡプレート上に広げる。
【０２６１】
実施例３：哺乳動物細胞の細胞毒性のスクリーニング
試薬
ＡＴＣＣから：オスのアフリカザルの腎臓に由来するＣＶ−１線維芽細胞の細胞系Ｃａｔ．Ｎｏ．：ＣＣＬ−７０
Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬから：
ダルベッコの改質型イーグル培地（「ＤＭＥＭ」）１×液体　Ｃａｔ．Ｎｏ．：１１９６５−０６５
フェノール・レッドを含まないダルベッコの改質型イーグル培地　Ｃａｔ．Ｎｏ．：１１０５４−０２０
ウシ胎児血清　Ｃａｔ．Ｎｏ．：２６１４０−０７９
ゲンタマイシン試薬溶液　Ｃａｔ．Ｎｏ．：１５７１０−０１５
トリプシン−ＥＤＴＡ　Ｃａｔ．Ｎｏ．：２５３００−５４
Ｓｉｇｍａから：
ＸＴＴベースの、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの毒性アッセイ用キット、　Ｃａｔ．Ｎｏ．：ＴＯＸ−２１
（ＸＴＴは２，３−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリデイン塩である）
【０２６２】
手順
１．１０％ＦＢＳおよびゲンタマイシン１０ｇ／ｍｌを補ったＤＭＥＭ培地を使用して、ＣＶ−１細胞を１：２０に分ける。
２．分割の３日後、ＣＶ−１細胞は約８０−９０％の融合状態に達しているはずである。
３．培地を吸い出し、ＰＢＳ５ｍｌを加える。
４．トリプシン３ｍｌを加え、３分間放置する。ＤＭＥＭ２ｍｌを加えて、トリプシンを不活性化させる。
５．細胞０．５ｍｌを取り出し、１０ｍｌのＤＭＥＭで希釈する。これによって、細胞濃度が０．５−１．５×１０５細胞／ｍｌの範囲になるはずである。
６．１００ｕｌの細胞懸濁液を、９６ウエル・プレートの列２−８に加える。培地は列１にのみ加える。
７．細胞を２４時間培養する。
８．試験する化合物の１：５０希釈液を１２．８ｍｇ／ｍｌの濃度で作成する。
９．行１、列４〜列８に３００ｕｌを加える。
１０．行１の列１および列２は、３００ｕｌの培地のみで満たすこと。行１の列３は、ＤＭＳＯの最終濃度が１％で始まるように、３００ｕｌの培地および２％ＤＭＳＯで満たすこと。
１１．行２、３、４、５および６を２００μｌのＤＭＥＭ培地で満たす。
１２．行１〜行６から１〜３の一連の希釈液を作成する。
１３．それぞれ異なる濃度の化合物１００μｌを取り出し、行１〜６の細胞プレートに入れ、７〜１２を再現する。
１４．細胞をさらに２４時間培養する。
１５．フェノール・レッドを含まない２５ｍｌのＤＭＥＭ培地に、５ｍｇのＸＴＴを溶かす。
１６．吸引によって化合物の溶液を取り出す。
１７．９６ウエル・プレートを３００ｕｌのＰＢＳで洗浄し、３分間放置する。
１８．１００μｌのＸＴＴ溶液を行１〜６に加え、ＤＭＥＭ培地（フェノール・レッドを含まない）を行７〜１２に加える。
１９．プレート・リーダーにおいて、Ｏ．Ｄ．４５０を測定し、Ｏ．Ｄ．６５０を引く。さらに、１時間間隔で４時間のタイム・ポイントをとる。
２０．１０％ＦＢＳおよび１０％ゲンタマイシンを補ったＤＭＥＭ培地を使用して、ＣＶ−１細胞を１：２０に分ける。
【０２６３】
ＸＴＴはミトコンドリア活性の指標であり、したがって、細胞の増殖および生存能力の妥当な指標であるとみなされる。ＯＤ６９０をＯＤ４５０から引いた後に、それぞれの化合物処理したデータ・ポイントを、化合物処理していないそれと比較するものとし、これによって増殖のパーセンテージが決定される。阻害のパーセンテージは、増殖のパーセンテージを引いたものとして定義する。阻害のパーセンテージを、化合物の濃度に対してプロットする。ＴＣ５０は、細胞増殖を５０％阻害する化合物濃度として定義する。細胞毒性アッセイからのデータおよび抗真菌アッセイの結果を使用して、治療係数（ＴＣ５０／ＭＩＣ）を計算することができる。この係数が高いほど、化合物は魅力的になる。類似化および医用化学を使用して、この係数を高めることができる。
【０２６４】
前で確認した参照文献はすべて、本発明の１以上の実施形態を実施するために重要であるであろう組成物および／または方法を、記載し、示し、これらに根拠を与え、あるいはこれらを可能にする程度に、参照によって本明細書に明白に組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【図１】本明細書に示した標的タンパク質についての、配列アラインメントおよび同一性の決定値の図である。図は、表２において同定した１つの標的タンパク質を示し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および入手可能な場合はヒト相同体からのアミノ酸配列を比較する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４；２２：４６７３−８０）を使用して、配列アラインメントを行い、同一性のパーセンテージを、ギャップ作成ペナルティー１２およびギャップ伸張ペナルティー４を用いる、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（「ＧＣＧ」）ＧＡＰプログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して決定した。
【図２】本明細書に示した標的タンパク質についての、配列アラインメントおよび同一性の決定値の図である。図は、表２において同定した１つの標的タンパク質を示し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および入手可能な場合はヒト相同体からのアミノ酸配列を比較する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４；２２：４６７３−８０）を使用して、配列アラインメントを行い、同一性のパーセンテージを、ギャップ作成ペナルティー１２およびギャップ伸張ペナルティー４を用いる、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（「ＧＣＧ」）ＧＡＰプログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して決定した。
【図３】本明細書に示した標的タンパク質についての、配列アラインメントおよび同一性の決定値の図である。図は、表２において同定した１つの標的タンパク質を示し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および入手可能な場合はヒト相同体からのアミノ酸配列を比較する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４；２２：４６７３−８０）を使用して、配列アラインメントを行い、同一性のパーセンテージを、ギャップ作成ペナルティー１２およびギャップ伸張ペナルティー４を用いる、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（「ＧＣＧ」）ＧＡＰプログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して決定した。
【図４】本明細書に示した標的タンパク質についての、配列アラインメントおよび同一性の決定値の図である。図は、表２において同定した１つの標的タンパク質を示し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および入手可能な場合はヒト相同体からのアミノ酸配列を比較する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４；２２：４６７３−８０）を使用して、配列アラインメントを行い、同一性のパーセンテージを、ギャップ作成ペナルティー１２およびギャップ伸張ペナルティー４を用いる、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（「ＧＣＧ」）ＧＡＰプログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して決定した。
【図５】本明細書に示した標的タンパク質についての、配列アラインメントおよび同一性の決定値の図である。図は、表２において同定した１つの標的タンパク質を示し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および入手可能な場合はヒト相同体からのアミノ酸配列を比較する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４；２２：４６７３−８０）を使用して、配列アラインメントを行い、同一性のパーセンテージを、ギャップ作成ペナルティー１２およびギャップ伸張ペナルティー４を用いる、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（「ＧＣＧ」）ＧＡＰプログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して決定した。
【図６】本明細書に示した標的タンパク質についての、配列アラインメントおよび同一性の決定値の図である。図は、表２において同定した１つの標的タンパク質を示し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および入手可能な場合はヒト相同体からのアミノ酸配列を比較する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４；２２：４６７３−８０）を使用して、配列アラインメントを行い、同一性のパーセンテージを、ギャップ作成ペナルティー１２およびギャップ伸張ペナルティー４を用いる、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（「ＧＣＧ」）ＧＡＰプログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して決定した。
【図７】本明細書に示した標的タンパク質についての、配列アラインメントおよび同一性の決定値の図である。図は、表２において同定した１つの標的タンパク質を示し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および入手可能な場合はヒト相同体からのアミノ酸配列を比較する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４；２２：４６７３−８０）を使用して、配列アラインメントを行い、同一性のパーセンテージを、ギャップ作成ペナルティー１２およびギャップ伸張ペナルティー４を用いる、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（「ＧＣＧ」）ＧＡＰプログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して決定した。
【図８】本明細書に示した標的タンパク質についての、配列アラインメントおよび同一性の決定値の図である。図は、表２において同定した１つの標的タンパク質を示し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および入手可能な場合はヒト相同体からのアミノ酸配列を比較する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４；２２：４６７３−８０）を使用して、配列アラインメントを行い、同一性のパーセンテージを、ギャップ作成ペナルティー１２およびギャップ伸張ペナルティー４を用いる、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（「ＧＣＧ」）ＧＡＰプログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して決定した。
【図９】本明細書に示した標的タンパク質についての、配列アラインメントおよび同一性の決定値の図である。図は、表２において同定した１つの標的タンパク質を示し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および入手可能な場合はヒト相同体からのアミノ酸配列を比較する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４；２２：４６７３−８０）を使用して、配列アラインメントを行い、同一性のパーセンテージを、ギャップ作成ペナルティー１２およびギャップ伸張ペナルティー４を用いる、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（「ＧＣＧ」）ＧＡＰプログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して決定した。
【図１０】本明細書に示した標的タンパク質についての、配列アラインメントおよび同一性の決定値の図である。図は、表２において同定した１つの標的タンパク質を示し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および入手可能な場合はヒト相同体からのアミノ酸配列を比較する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４；２２：４６７３−８０）を使用して、配列アラインメントを行い、同一性のパーセンテージを、ギャップ作成ペナルティー１２およびギャップ伸張ペナルティー４を用いる、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（「ＧＣＧ」）ＧＡＰプログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して決定した。
【図１１】本明細書に示した標的タンパク質についての、配列アラインメントおよび同一性の決定値の図である。図は、表２において同定した１つの標的タンパク質を示し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および入手可能な場合はヒト相同体からのアミノ酸配列を比較する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４；２２：４６７３−８０）を使用して、配列アラインメントを行い、同一性のパーセンテージを、ギャップ作成ペナルティー１２およびギャップ伸張ペナルティー４を用いる、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（「ＧＣＧ」）ＧＡＰプログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して決定した。
【図１２】本明細書に示した標的タンパク質についての、配列アラインメントおよび同一性の決定値の図である。図は、表２において同定した１つの標的タンパク質を示し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および入手可能な場合はヒト相同体からのアミノ酸配列を比較する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４；２２：４６７３−８０）を使用して、配列アラインメントを行い、同一性のパーセンテージを、ギャップ作成ペナルティー１２およびギャップ伸張ペナルティー４を用いる、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（「ＧＣＧ」）ＧＡＰプログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して決定した。
【図１３】本明細書に示した標的タンパク質についての、配列アラインメントおよび同一性の決定値の図である。図は、表２において同定した１つの標的タンパク質を示し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および入手可能な場合はヒト相同体からのアミノ酸配列を比較する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４；２２：４６７３−８０）を使用して、配列アラインメントを行い、同一性のパーセンテージを、ギャップ作成ペナルティー１２およびギャップ伸張ペナルティー４を用いる、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（「ＧＣＧ」）ＧＡＰプログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して決定した。
【図１４】本明細書に示した標的タンパク質についての、配列アラインメントおよび同一性の決定値の図である。図は、表２において同定した１つの標的タンパク質を示し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および入手可能な場合はヒト相同体からのアミノ酸配列を比較する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４；２２：４６７３−８０）を使用して、配列アラインメントを行い、同一性のパーセンテージを、ギャップ作成ペナルティー１２およびギャップ伸張ペナルティー４を用いる、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（「ＧＣＧ」）ＧＡＰプログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して決定した。
【図１５】本明細書に示した標的タンパク質についての、配列アラインメントおよび同一性の決定値の図である。図は、表２において同定した１つの標的タンパク質を示し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および入手可能な場合はヒト相同体からのアミノ酸配列を比較する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４；２２：４６７３−８０）を使用して、配列アラインメントを行い、同一性のパーセンテージを、ギャップ作成ペナルティー１２およびギャップ伸張ペナルティー４を用いる、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（「ＧＣＧ」）ＧＡＰプログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して決定した。
【図１６】本明細書に示した標的タンパク質についての、配列アラインメントおよび同一性の決定値の図である。図は、表２において同定した１つの標的タンパク質を示し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および入手可能な場合はヒト相同体からのアミノ酸配列を比較する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４；２２：４６７３−８０）を使用して、配列アラインメントを行い、同一性のパーセンテージを、ギャップ作成ペナルティー１２およびギャップ伸張ペナルティー４を用いる、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（「ＧＣＧ」）ＧＡＰプログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して決定した。
【図１７】本明細書に示した標的タンパク質についての、配列アラインメントおよび同一性の決定値の図である。図は、表２において同定した１つの標的タンパク質を示し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および入手可能な場合はヒト相同体からのアミノ酸配列を比較する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４；２２：４６７３−８０）を使用して、配列アラインメントを行い、同一性のパーセンテージを、ギャップ作成ペナルティー１２およびギャップ伸張ペナルティー４を用いる、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（「ＧＣＧ」）ＧＡＰプログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して決定した。
【図１８】本明細書に示した標的タンパク質についての、配列アラインメントおよび同一性の決定値の図である。図は、表２において同定した１つの標的タンパク質を示し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および入手可能な場合はヒト相同体からのアミノ酸配列を比較する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４；２２：４６７３−８０）を使用して、配列アラインメントを行い、同一性のパーセンテージを、ギャップ作成ペナルティー１２およびギャップ伸張ペナルティー４を用いる、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（「ＧＣＧ」）ＧＡＰプログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して決定した。
【図１９】本明細書に示した標的タンパク質についての、配列アラインメントおよび同一性の決定値の図である。図は、表２において同定した１つの標的タンパク質を示し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および入手可能な場合はヒト相同体からのアミノ酸配列を比較する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４；２２：４６７３−８０）を使用して、配列アラインメントを行い、同一性のパーセンテージを、ギャップ作成ペナルティー１２およびギャップ伸張ペナルティー４を用いる、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（「ＧＣＧ」）ＧＡＰプログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して決定した。
【図２０】本明細書に示した標的タンパク質についての、配列アラインメントおよび同一性の決定値の図である。図は、表２において同定した１つの標的タンパク質を示し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および入手可能な場合はヒト相同体からのアミノ酸配列を比較する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４；２２：４６７３−８０）を使用して、配列アラインメントを行い、同一性のパーセンテージを、ギャップ作成ペナルティー１２およびギャップ伸張ペナルティー４を用いる、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（「ＧＣＧ」）ＧＡＰプログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して決定した。
【図２１】本明細書に示した標的タンパク質についての、配列アラインメントおよび同一性の決定値の図である。図は、表２において同定した１つの標的タンパク質を示し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および入手可能な場合はヒト相同体からのアミノ酸配列を比較する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４；２２：４６７３−８０）を使用して、配列アラインメントを行い、同一性のパーセンテージを、ギャップ作成ペナルティー１２およびギャップ伸張ペナルティー４を用いる、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（「ＧＣＧ」）ＧＡＰプログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して決定した。
【図２２】本明細書に示した標的タンパク質についての、配列アラインメントおよび同一性の決定値の図である。図は、表２において同定した１つの標的タンパク質を示し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および入手可能な場合はヒト相同体からのアミノ酸配列を比較する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４；２２：４６７３−８０）を使用して、配列アラインメントを行い、同一性のパーセンテージを、ギャップ作成ペナルティー１２およびギャップ伸張ペナルティー４を用いる、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（「ＧＣＧ」）ＧＡＰプログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して決定した。
【図２３】本明細書に示した標的タンパク質についての、配列アラインメントおよび同一性の決定値の図である。図は、表２において同定した１つの標的タンパク質を示し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および入手可能な場合はヒト相同体からのアミノ酸配列を比較する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４；２２：４６７３−８０）を使用して、配列アラインメントを行い、同一性のパーセンテージを、ギャップ作成ペナルティー１２およびギャップ伸張ペナルティー４を用いる、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（「ＧＣＧ」）ＧＡＰプログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して決定した。
【図２４】本明細書に示した標的タンパク質についての、配列アラインメントおよび同一性の決定値の図である。図は、表２において同定した１つの標的タンパク質を示し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および入手可能な場合はヒト相同体からのアミノ酸配列を比較する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４；２２：４６７３−８０）を使用して、配列アラインメントを行い、同一性のパーセンテージを、ギャップ作成ペナルティー１２およびギャップ伸張ペナルティー４を用いる、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（「ＧＣＧ」）ＧＡＰプログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して決定した。
【図２５】本明細書に示した標的タンパク質についての、配列アラインメントおよび同一性の決定値の図である。図は、表２において同定した１つの標的タンパク質を示し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および入手可能な場合はヒト相同体からのアミノ酸配列を比較する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４；２２：４６７３−８０）を使用して、配列アラインメントを行い、同一性のパーセンテージを、ギャップ作成ペナルティー１２およびギャップ伸張ペナルティー４を用いる、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（「ＧＣＧ」）ＧＡＰプログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して決定した。
【図２６】本明細書に示した標的タンパク質についての、配列アラインメントおよび同一性の決定値の図である。図は、表２において同定した１つの標的タンパク質を示し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、および入手可能な場合はヒト相同体からのアミノ酸配列を比較する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４；２２：４６７３−８０）を使用して、配列アラインメントを行い、同一性のパーセンテージを、ギャップ作成ペナルティー１２およびギャップ伸張ペナルティー４を用いる、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（「ＧＣＧ」）ＧＡＰプログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して決定した。
【図２７】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ不活性化の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。不活性化の分析は、以下の詳細な説明および実施例１に記載するように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの標的遺伝子の発現を金属感受性要素の制御下に置くこと、および酵母菌細胞をＣｕ塩と共に培養することによって行った。
【図２８】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ不活性化の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。不活性化の分析は、以下の詳細な説明および実施例１に記載するように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの標的遺伝子の発現を金属感受性要素の制御下に置くこと、および酵母菌細胞をＣｕ塩と共に培養することによって行った。
【図２９】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ不活性化の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。不活性化の分析は、以下の詳細な説明および実施例１に記載するように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの標的遺伝子の発現を金属感受性要素の制御下に置くこと、および酵母菌細胞をＣｕ塩と共に培養することによって行った。
【図３０】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ不活性化の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。不活性化の分析は、以下の詳細な説明および実施例１に記載するように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの標的遺伝子の発現を金属感受性要素の制御下に置くこと、および酵母菌細胞をＣｕ塩と共に培養することによって行った。
【図３１】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ不活性化の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。不活性化の分析は、以下の詳細な説明および実施例１に記載するように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの標的遺伝子の発現を金属感受性要素の制御下に置くこと、および酵母菌細胞をＣｕ塩と共に培養することによって行った。
【図３２】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ不活性化の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。不活性化の分析は、以下の詳細な説明および実施例１に記載するように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの標的遺伝子の発現を金属感受性要素の制御下に置くこと、および酵母菌細胞をＣｕ塩と共に培養することによって行った。
【図３３】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ不活性化の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。不活性化の分析は、以下の詳細な説明および実施例１に記載するように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの標的遺伝子の発現を金属感受性要素の制御下に置くこと、および酵母菌細胞をＣｕ塩と共に培養することによって行った。
【図３４】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ不活性化の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。不活性化の分析は、以下の詳細な説明および実施例１に記載するように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの標的遺伝子の発現を金属感受性要素の制御下に置くこと、および酵母菌細胞をＣｕ塩と共に培養することによって行った。
【図３５】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ不活性化の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。不活性化の分析は、以下の詳細な説明および実施例１に記載するように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの標的遺伝子の発現を金属感受性要素の制御下に置くこと、および酵母菌細胞をＣｕ塩と共に培養することによって行った。
【図３６】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ不活性化の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。不活性化の分析は、以下の詳細な説明および実施例１に記載するように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの標的遺伝子の発現を金属感受性要素の制御下に置くこと、および酵母菌細胞をＣｕ塩と共に培養することによって行った。
【図３７】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ不活性化の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。不活性化の分析は、以下の詳細な説明および実施例１に記載するように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの標的遺伝子の発現を金属感受性要素の制御下に置くこと、および酵母菌細胞をＣｕ塩と共に培養することによって行った。
【図３８】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ不活性化の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。不活性化の分析は、以下の詳細な説明および実施例１に記載するように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの標的遺伝子の発現を金属感受性要素の制御下に置くこと、および酵母菌細胞をＣｕ塩と共に培養することによって行った。
【図３９】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ不活性化の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。不活性化の分析は、以下の詳細な説明および実施例１に記載するように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの標的遺伝子の発現を金属感受性要素の制御下に置くこと、および酵母菌細胞をＣｕ塩と共に培養することによって行った。
【図４０】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ不活性化の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。不活性化の分析は、以下の詳細な説明および実施例１に記載するように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの標的遺伝子の発現を金属感受性要素の制御下に置くこと、および酵母菌細胞をＣｕ塩と共に培養することによって行った。
【図４１】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ不活性化の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。不活性化の分析は、以下の詳細な説明および実施例１に記載するように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの標的遺伝子の発現を金属感受性要素の制御下に置くこと、および酵母菌細胞をＣｕ塩と共に培養することによって行った。
【図４２】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ不活性化の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。不活性化の分析は、以下の詳細な説明および実施例１に記載するように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの標的遺伝子の発現を金属感受性要素の制御下に置くこと、および酵母菌細胞をＣｕ塩と共に培養することによって行った。
【図４３】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ不活性化の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。不活性化の分析は、以下の詳細な説明および実施例１に記載するように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの標的遺伝子の発現を金属感受性要素の制御下に置くこと、および酵母菌細胞をＣｕ塩と共に培養することによって行った。
【図４４】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ不活性化の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。不活性化の分析は、以下の詳細な説明および実施例１に記載するように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの標的遺伝子の発現を金属感受性要素の制御下に置くこと、および酵母菌細胞をＣｕ塩と共に培養することによって行った。
【図４５】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ不活性化の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。不活性化の分析は、以下の詳細な説明および実施例１に記載するように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの標的遺伝子の発現を金属感受性要素の制御下に置くこと、および酵母菌細胞をＣｕ塩と共に培養することによって行った。
【図４６】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ不活性化の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。不活性化の分析は、以下の詳細な説明および実施例１に記載するように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの標的遺伝子の発現を金属感受性要素の制御下に置くこと、および酵母菌細胞をＣｕ塩と共に培養することによって行った。
【図４７】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ不活性化の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。不活性化の分析は、以下の詳細な説明および実施例１に記載するように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの標的遺伝子の発現を金属感受性要素の制御下に置くこと、および酵母菌細胞をＣｕ塩と共に培養することによって行った。
【図４８】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ不活性化の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。不活性化の分析は、以下の詳細な説明および実施例１に記載するように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの標的遺伝子の発現を金属感受性要素の制御下に置くこと、および酵母菌細胞をＣｕ塩と共に培養することによって行った。
【図４９】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ不活性化の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。不活性化の分析は、以下の詳細な説明および実施例１に記載するように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの標的遺伝子の発現を金属感受性要素の制御下に置くこと、および酵母菌細胞をＣｕ塩と共に培養することによって行った。
【図５０】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ不活性化の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。不活性化の分析は、以下の詳細な説明および実施例１に記載するように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの標的遺伝子の発現を金属感受性要素の制御下に置くこと、および酵母菌細胞をＣｕ塩と共に培養することによって行った。
【図５１】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ不活性化の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。不活性化の分析は、以下の詳細な説明および実施例１に記載するように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの標的遺伝子の発現を金属感受性要素の制御下に置くこと、および酵母菌細胞をＣｕ塩と共に培養することによって行った。
【図５２】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ不活性化の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。不活性化の分析は、以下の詳細な説明および実施例１に記載するように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの標的遺伝子の発現を金属感受性要素の制御下に置くこと、および酵母菌細胞をＣｕ塩と共に培養することによって行った。
【図５３Ａ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図５３Ｂ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図５４Ａ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図５４Ｂ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図５５Ａ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図５５Ｂ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図５６Ａ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図５６Ｂ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図５７Ａ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図５７Ｂ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図５８Ａ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図５８Ｂ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図５９Ａ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図５９Ｂ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図６０Ａ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図６０Ｂ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図６１Ａ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図６１Ｂ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図６２Ａ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図６２Ｂ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図６３Ａ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図６３Ｂ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図６４Ａ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図６４Ｂ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図６５Ａ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図６５Ｂ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図６６Ａ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図６６Ｂ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図６７Ａ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図６７Ｂ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図６８Ａ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図６８Ｂ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図６９Ａ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図６９Ｂ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図７０Ａ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図７０Ｂ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図７１Ａ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図７１Ｂ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図７２Ａ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図７２Ｂ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図７３Ａ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図７３Ｂ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図７４Ａ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図７４Ｂ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図７５Ａ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図７５Ｂ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図７６Ａ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図７６Ｂ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図７７Ａ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図７７Ｂ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図７８Ａ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図７８Ｂ】表１において同定した標的遺伝子／タンパク質の、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失の分析を示す図である。これらのデータによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖に関する、それぞれの遺伝子の不可欠性が示される。図は１つの標的タンパク質を示す。詳細な説明に記載するように欠失の分析を行い、以下の実施例２に記載するようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を行った。
【図７９】本明細書で開示し表１に示すそれぞれのタンパク質についての、アミノ酸配列を示す図である。
【図８０】図７９に開示したそれぞれのタンパク質に対応する、核酸配列を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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