(57)【要約】本発明は、増殖因子関連ポリペプチドを使用する哺乳動物の胃腸管における炎症状態を処置するための方法に基づく。線維芽細胞増殖因子−ＣＸ（ＦＧＦ−ＣＸ）ポリヌクレオチド配列およびこのような核酸配列にコードされるＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、あるいはその改変体、フラグメント、およびホモログが、本発明において特許請求される。同様に、ＦＣＴＲＸポリヌクレオチド配列およびこのような核酸配列にコードされるＦＣＴＲＸポリペプチド、あるいはその改変体、フラグメント、およびホモログが、単独または組み合わせて使用される方法がまた、本発明において特許請求される。ＦＣＴＲＸとは、それぞれＦＣＴＲ１、ＦＣＴＲ２、ＦＣＴＲ３、ＦＣＴＲ４、ＦＣＴＲ５およびＦＣＴＲ６として示される、任意の６つの改変体ＦＣＴＲＸ配列を集合的にいう。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の集団の増殖を促進する方法であって、該方法は、以下：
少なくとも１つのポリペプチドを含有する組成物と少なくとも１つの細胞を接触させる工程であって、ここで、該ポリペプチドは、ＦＧＦＣＸポリペプチド、ＦＣＴＲＸポリペプチド、およびＦＧＦＣＸポリペプチドとＦＣＴＲＸポリペプチドとの組み合わせからなる群より選択される、工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記ポリペプチドがＦＧＦＣＸポリペプチドを含み、ここで、該ＦＧＦＣＸポリペプチドが以下：
ａ）配列番号２；
ｂ）配列番号２の改変体であって、配列番号２において提供される１５％までの残基が保存的アミノ酸置換に従って変化している、改変体；
ｃ）配列番号２の欠失変異体；または
ｄ）配列番号２の欠失変異体の改変体であって、該欠失変異体において提供される１５％までの残基が保存的アミノ酸置換に従って変化している、改変体；
を含む、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記ポリペプチドがＦＣＴＲＸポリペプチドを含み、ここで、該ＦＣＴＲＸポリペプチドが以下：
ａ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４からなる群より選択される配列；
ｂ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４からなる群より選択される配列の改変体であって、配列番号２において提供される１５％までの残基が保存的アミノ酸置換に従って変化している、改変体；
ｃ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４からなる群より選択される配列の欠失変異体；または
ｄ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４からなる群より選択される配列の欠失変異体の改変体であって、該欠失変異体において提供される１５％までの残基が保存的アミノ酸置換に従って変化している、改変体；
ｅ）ＦＣＴＲＸポリペプチドのｐ３５形態；
ｆ）ＦＣＴＲＸポリペプチドのｐ３５形態の改変体であって、該欠失改変体において提供される１５％までの残基が保存的アミノ酸置換に従って変化している、改変体；
を含む、方法。
【請求項６】
被験体における炎症性病理を処置する方法であって、該方法は、以下；
ポリペプチドを含有する組成物を被験体に投与する工程であって、該ポリペプチドは、ＦＧＦＣＸポリペプチドもしくはＦＣＴＲＸポリペプチドまたはＦＧＦＣＸポリペプチドおよびＦＣＴＲＸポリペプチドの組み合わせを含む、工程
を包含する、方法。
【請求項７】
前記被験体が哺乳動物である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記被験体がヒトである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
請求項６に記載の方法であって、該ポリペプチドはＦＧＦＣＸポリペプチド含み、ここで、該ＦＧＦＣＸポリペプチドが以下：
ａ）配列番号２；
ｂ）配列番号２の改変体であって、配列番号２において提供される１５％までの残基が保存的アミノ酸置換に従って変化している、改変体；
ｃ）配列番号２の欠失変異体；または
ｄ）配列番号２の欠失変異体の改変体であって、該欠失改変体において提供される１５％までの残基が保存的アミノ酸置換に従って変化している、改変体；
を含む、方法。
【請求項１０】
請求項６に記載の方法であって、該ポリペプチドはＦＣＴＲＸポリペプチドを含み、ここで、該ＦＣＴＲＸポリペプチドが以下：
ａ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４からなる群より選択される配列；
ｂ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４からなる群より選択される配列の改変体であって、配列番号２において提供される１５％までの残基が保存的アミノ酸置換に従って変化している、改変体；
ｃ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４からなる群より選択される配列の欠失変異体；
ｄ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４からなる群より選択される配列の欠失変異体の改変体であって、該欠失変異体において提供される１５％までの残基が保存的アミノ酸置換に従って変化している、改変体；
ｅ）ＦＣＴＲＸポリペプチドのｐ３５形態；または
ｆ）ＦＣＴＲＸポリペプチドのｐ３５形態の改変体であって、該欠失変異体において提供される１５％までの残基が保存的アミノ酸置換に従って変化している、改変体；
を含む、方法。
【請求項１１】
前記炎症性病理が炎症性腸疾患である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記炎症性病理が結腸にて生じる炎症性状態である、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記炎症性病理が小腸にて生じる炎症性状態である、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記炎症性病理がクローン病である、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが静脈内で前記被験体に投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが皮下で前記被験体に投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項１７】
被験体における炎症性病理の発症を遅延させる方法であって、該方法は、ポリペプチドを含有する組成物を該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該ポリペプチドは、ＦＧＦＣＸポリペプチドもしくはＦＣＴＲＸポリペプチドまたはＦＧＦＣＸポリペプチドとＦＣＴＲＸポリペプチドとの組み合わせを含む、方法。
【請求項１８】
前記被験体が哺乳動物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記被験体がヒトである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１７に記載の方法であって、前記ポリペプチドがＦＧＦＣＸポリペプチドを含み、ここで、該ＦＧＦＣＸポリペプチドが以下：
ａ）配列番号２；
ｂ）配列番号２の改変体であって、配列番号２において提供される１５％までの残基が保存的アミノ酸置換に従って変化している、改変体；
ｃ）配列番号２の欠失変異体；または
ｄ）配列番号２の欠失変異体の改変体であって、該欠失変異体において提供される１５％までの残基が保存的アミノ酸置換に従って変化している、改変体；
を含む、方法。
【請求項２１】
請求項１７に記載の方法であって、ここで、前記ポリペプチドがＦＣＴＲＸポリペプチドを含み、ここで、該ＦＣＴＲＸポリペプチドが以下：
ａ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４からなる群より選択される配列；
ｂ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４からなる群より選択される配列の改変体であって、配列番号２において提供される１５％までの残基が保存的アミノ酸置換に従って変化している、改変体；
ｃ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４からなる群より選択される配列の欠失変異体；または
ｄ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４からなる群より選択される配列の欠失変異体の改変体であって、該欠失変異体において提供される１５％までの残基が保存的アミノ酸置換に従って変化している、改変体；
ｅ）ＦＣＴＲＸポリペプチドのｐ３５形態；または
ｆ）ＦＣＴＲＸポリペプチドのｐ３５形態の改変体であって、該欠失改変体において提供される１５％までの残基が保存的アミノ酸置換に従って変化している、改変体；
を含む、方法。
【請求項２２】
前記炎症性病理が炎症性腸疾患である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記炎症性病理が結腸にて生じる炎症性状態である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記炎症性病理が小腸にて生じる炎症性状態である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記炎症性病理がクローン病である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが静脈内で前記被験体に投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリペプチドが皮下で前記被験体に投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
被験体において炎症性病理から改善する方法であって、該方法は、ポリペプチドを含有する組成物を該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該ポリペプチドは、ＦＧＦＣＸポリペプチドもしくはＦＣＴＲＸポリペプチドまたはＦＧＦＣＸポリペプチドとＦＣＴＲＸポリペプチドとの組み合わせを含む、方法。
【請求項２９】
前記被験体が哺乳動物である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記被験体がヒトである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２８に記載の方法であって、前記ポリペプチドがＦＧＦＣＸポリペプチドを含み、ここで、該ＦＧＦＣＸポリペプチドが以下：
ａ）配列番号２；
ｂ）配列番号２の改変体であって、配列番号２において提供される１５％までの残基が保存的アミノ酸置換に従って変化している、改変体；
ｃ）配列番号２の欠失変異体；または
ｄ）配列番号２の欠失変異体の改変体であって、該欠失変異体において提供される１５％までの残基が保存的アミノ酸置換に従って変化している、改変体；
を含む、方法。
【請求項３２】
請求項２８に記載の方法であって、ここで、前記ポリペプチドがＦＣＴＲＸポリペプチドを含み、ここで、該ＦＣＴＲＸポリペプチドが以下：
ａ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４からなる群より選択される配列；
ｂ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４からなる群より選択される配列の改変体であって、配列番号２において提供される１５％までの残基が保存的アミノ酸置換に従って変化している、改変体；
ｃ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４からなる群より選択される配列の欠失変異体；または
ｄ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４からなる群より選択される配列の欠失変異体の改変体であって、該欠失変異体において提供される１５％までの残基が保存的アミノ酸置換に従って変化している、改変体；
ｅ）ＦＣＴＲＸポリペプチドのｐ３５形態；または
ｆ）ＦＣＴＲＸポリペプチドのｐ３５形態の改変体であって、該欠失改変体において提供される１５％までの残基が保存的アミノ酸置換に従って変化している、改変体；
を含む、方法。
【請求項３３】
前記炎症性病理が炎症性腸疾患である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記炎症性病理が結腸にて生じる炎症性状態である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記炎症性病理が小腸にて生じる炎症性状態である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記炎症性病理がクローン病である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記ポリペプチドが静脈内で前記被験体に投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
前記ポリペプチドが皮下で前記被験体に投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
薬学的組成物を調製するための方法であって、該組成物は、炎症性疾患を処置するのに十分な少なくとも１つのポリペプチドを薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含有し、ここで、該ポリペプチドはＦＧＦＣＸポリペプチド、ＦＣＴＲＸポリペプチドおよびＦＧＦＣＸポリペプチドとＦＣＴＲＸポリペプチドとの組み合わせからなる群より選択される、方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法であって、ここで、前記炎症性病理が、炎症性腸疾患、結腸で生じる炎症性状態、小腸にて生じる炎症性状態、またはクローン病である、方法。
【請求項４１】
前記薬学的組成物が被験体への静脈内投与に適切である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ポリペプチドが被験体への皮下投与に適切である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記ポリペプチドがＦＧＦＣＸポリペプチドとＦＣＴＲＸポリペプチドとの組み合わせを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
請求項３９に記載の方法であって、前記ポリペプチドがＦＧＦＣＸポリペプチドを含み、ここで、該ＦＧＦＣＸポリペプチドが以下：
ａ）配列番号２；
ｂ）配列番号２の改変体であって、配列番号２において提供される１５％までの残基が保存的アミノ酸置換に従って変化している、改変体；
ｃ）配列番号２の欠失変異体；または
ｄ）配列番号２の欠失変異体の改変体であって、該欠失変異体において提供される１５％までの残基が保存的アミノ酸置換に従って変化している、改変体；
を含む、方法。
【請求項４５】
請求項３９に記載の方法であって、ここで、前記ポリペプチドがＦＣＴＲＸポリペプチドを含み、ここで、該ＦＣＴＲＸポリペプチドが以下：
ａ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４からなる群より選択される配列；
ｂ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４からなる群より選択される配列の改変体であって、配列番号２において提供される１５％までの残基が保存的アミノ酸置換に従って変化している、改変体；
ｃ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４からなる群より選択される配列の欠失変異体；
ｄ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４からなる群より選択される配列の欠失変異体の改変体であって、該欠失変異体において提供される１５％までの残基が保存的アミノ酸置換に従って変化している、改変体；
ｅ）ＦＣＴＲＸポリペプチドのｐ３５形態；または
ｆ）ＦＣＴＲＸポリペプチドのｐ３５形態の改変体であって、該欠失改変体において提供される１５％までの残基が保存的アミノ酸置換に従って変化している、改変体；
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、増殖因子関連ポリペプチドを使用する、哺乳動物の腸管の炎症状態を処置する方法に関する。より詳細には、本発明の方法において使用されるポリペプチドは、線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーおよび血小板由来増殖因子ファミリーのメンバーに関する。
【０００２】
（発明の背景）
炎症性腸疾患は、以下の２つの別個のサブセットを含む：潰瘍性大腸炎およびクローン病。１９９９年には、約１７０万人が、この消耗性疾患を有すると診断された。既存の治療剤は、疾患を低減し、そして手術を予防するに成功していないので、ＩＢＤの満足な処置は、いまだ満たされていない医療上の要求である。全ての潰瘍性大腸炎患者の４０％までが手術を受け、この手術としては、代表的に、大腸の一部の除去または人工肛門形成術が挙げられる。このような手術は、クローン病について治療的ではない。なぜなら、全ての患者の７５％が、その生涯で少なくとも１回の手術を受け、これらの患者の９０％までがさらなる手術を必要とするからである。結果として、炎症性腸疾患を首尾よく処置し得る治療剤は、浸襲性手術手順に伴う数百万ドルの健康管理システムのコストを潜在的に節約しつつ、患者の生活の質を改善する有利な効果を有する。
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は、増殖因子関連ポリペプチドを使用する、哺乳動物の腸管の炎症状態を処置する方法に基づく。線維芽細胞増殖因子−ＣＸ（ＦＧＦ−ＣＸ）ポリヌクレオチド配列およびこのような核酸配列によってコードされるＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、またはこれらの改変体、フラグメントおよびホモログを使用する方法が、本発明において特許請求される。同様に、ＦＣＴＲＸポリヌクレオチド配列およびこのような核酸配列によってコードされるＦＣＴＲＸポリペプチド、またはこれらの改変体、フラグメントおよびホモログを、単独または組み合わせて使用する方法もまた、本発明において特許請求される。ＦＣＴＲＸは、集合的に、６つの改変体ＦＣＴＲＸ配列（ＦＣＴＲ１、ＦＣＴＲ２、ＦＣＴＲ３、ＦＣＴＲ４、ＦＣＴＲ５およびＦＣＴＲ６と称される）のいずれかをいう。
【０００４】
１つの局面において、本発明は、細胞が、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドまたはＦＣＴＲＸポリペプチドを含む組成物、あるいはＦＧＦ−ＣＸポリペプチドおよびＦＣＴＲＸポリペプチドを含む組成物と接触して配置される、細胞集団の増殖を促進する方法を提供する。別の局面において、本発明は、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドまたはＦＣＴＲＸポリペプチドの組成物が被験体に投与される、被験体における炎症性病理を処置する方法を提供する。なお別の局面において、本発明は、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドまたはＦＣＴＲＸポリペプチドを含む組成物、あるいはＦＧＦ−ＣＸポリペプチドおよびＦＣＴＲＸポリペプチドを含む組成物が被験体に投与される、被験体における炎症性病理の発症を遅延させる方法を提供する。さらなる局面において、本発明は、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドまたはＦＣＴＲＸポリペプチドを含む組成物、あるいはＦＧＦ−ＣＸポリペプチドおよびＦＣＴＲＸポリペプチドを含む組成物が被験体に投与される、被験体における炎症性病理を改善する方法を提供する。
【０００５】
１つの実施形態において、この被験体は、哺乳動物である。別の実施形態において、この被験体は、ヒトである。なお別の実施形態において、この炎症性病理は、炎症性腸疾患、結腸で生じる炎症状態、小腸で生じる炎症状態、またはクローン病である。なお別の実施形態において、このＦＧＦ−ＣＸポリペプチドは、配列番号２またはその改変体、欠失変異体もしくは欠失変異体の改変体によって与えられ、ここで、いずれかの改変体の残基の１５％までが、保存的アミノ酸置換に従って変化される。なおさらに別の実施形態において、ＦＣＴＲＸポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２および１４、またはその改変体、欠失変異体、欠失変異体の改変体、ｐ３５形態もしくはｐ３５形態の改変体のいずれか１つによって与えられ、ここで、任意の改変体の残基の１５％までが、保存的アミノ酸置換に従って変化される。なおさらなる実施形態において、このポリペプチド組成物は、静脈内または皮下に投与される。
【０００６】
本発明はさらに、炎症性病理を処置するに有効なポリペプチドが、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わされる、薬学的組成物を調製する方法を提供する。
【０００７】
１つの実施形態において、この薬学的組成物は、被験体に静脈内または皮下での投与に適切である。別の実施形態において、このポリペプチドは、ＦＧＦ−ＣＸである。なお別の実施形態において、このＦＧＦ−ＣＸポリペプチドは、配列番号２またはその改変体、欠失変異体もしくは欠失変異体の改変体によって与えられ、ここで、いずれかの改変体の残基の１５％までが、保存的アミノ酸置換に従って変化される。さらなる実施形態において、このポリペプチドは、ＦＣＴＲＸである。なおさらなる実施形態において、このＦＣＴＲＸポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２および１４、またはその改変体、欠失変異体、欠失変異体の改変体、ｐ３５形態もしくはｐ３５形態の改変体のいずれか１つによって与えられ、ここで、任意の改変体の残基の１５％までが、保存的アミノ酸置換に従って変化される。なおさらなる実施形態において、この炎症性病理は、炎症性腸疾患、結腸で生じる炎症状態、小腸で生じる炎症状態、またはクローン病である。
【０００８】
本発明において意図される障害としては、例えば、胃腸管の炎症状態（炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎およびクローン病）が挙げられるが、これらに限定されない）、成長および増殖疾患（例えば、癌、新脈管形成、アテローム硬化症斑、コラーゲン形成、軟骨形成および骨形成）、心血管疾患および線維症疾患、ならびに糖尿病性潰瘍のような病理が挙げられる。さらに、ＦＣＴＲＸ核酸およびそれらがコードするポリペプチドは、遺伝子治療を介した動脈瘤の予防および創傷閉鎖の加速のために、治療的に有用である。さらに、ＦＤＴＲＸ核酸およびそれらがコードするポリペプチドは、細胞増殖、創傷治癒、血管新生および組織増殖を刺激するため、ならびに類似の組織再生の要求のために利用され得る。より詳細には、ＦＣＴＲＸ核酸またはポリペプチドは、貧血および白血球減少症、腸管感受性および禿頭症の治療において有用であり得る。このような状態の処置は、例えば、放射線治療または化学療法を受けた患者において示され得、ここで、処置は、任意の過剰増殖副作用を最小化する。
【０００９】
他に規定されない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において記載される方法および材料に類似または等価の方法および材料は、本発明の実施または試験において用いられ得るが、ここで、好ましい方法および材料が記載されている。本明細書において引用されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾する場合、定義を含む本願明細書が支配する。さらに、本発明の材料、方法および実施例は、例示のためのみであり、限定を意図しない。本発明の特徴および利点は、以下の詳細な説明および上記の特許請求の範囲から明らかである。
【００１０】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および上記の特許請求の範囲から明らかである。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、一部、線維芽細胞増殖因子（「ＦＧＦ」）ファミリーのメンバーであるポリペプチドをコードする、新規ＦＧＦ−ＣＸ核酸配列の発見に関する。本明細書中で使用される場合、名称「ＦＧＦ−ＣＸ」は、核酸、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチドならびにこれらのいずれかの改変体、誘導体およびフラグメント、そしてこれらのクラスの化合物のいずれかに免疫特異的に結合する抗体に関する。本発明の開示において、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドは、内部登録番号ＡＢ０２０８５８、ＣＧ５３１３５−０１およびＣＧ５３１３５−０２によって、代替的に同定される。
【００１２】
本発明はさらに、骨形態形成タンパク質タンパク質−１（「ＢＭＰ−１」）、血管内皮増殖因子（「ＶＥＧＦ−Ｅ」）および血小板由来増殖因子（「ＰＤＧＦ」）に関するポリペプチドをコードする核酸の発見に基づく。これらの配列は、集合的に、「ＦＣＴＲＸ核酸」または「ＦＣＴＲＸポリヌクレオチド」と称され、そして対応するコードされるポリペプチドは、「ＦＣＴＲＸポリペプチド」または「ＦＣＴＲＸタンパク質」と称される。他に示さない限り、「ＦＣＴＲＸ」は、本明細書中に開示される新規配列のいずれかをいうように意味される。さらに、本発明のポリペプチドおよび核酸は、代替的に、本明細書中で集合的に「ＰＤＧＦ  Ｄ」と称される。なぜなら、これらは、これまで未知であったＰＤＧＦ（すなわち、ＰＤＧＦ  Ａ、ＰＤＧＦ  ＢおよびＰＤＧＦ  Ｃとは異なるＰＤＧＦ）を示すとみなされるからである。さらに、「ＰＤＧＦＸＸ」または「ＰＤＧＦ  ＸＸ」に対して参照がなされる場合（ここで、「Ｘ」は、Ａ、Ｂ、ＣまたはＤのいすれかである）、これは、特定のＰＤＧＦのホモダイマーをいうように意味される。あるいは、「ＰＤＧＦＸＹ」に対して参照がなされる場合（ここで、ＸおよびＹは、Ａ、Ｂ、ＣまたはＤのいずれかであり、そして「Ｘ」は「Ｙ」とは異なる）、これは、ＰＤＧＦのヘテロダイマーをいうように意味される。
【００１３】
ＰＤＧＦ  Ｄは、高分子量の潜在形態（ｐ８５と称される）および低分子量の活性形態（ｐ３５と称される）を有することが、本明細書中で示される。本発明の開示において、ＦＣＴＲＸポリペプチドまたはＰＤＧＦ  Ｄポリペプチドは、識別子３０６６４１８８およびその改変体（例えば、３０６６４１８８．０．９９または３０６６４１８８．０．３３１）ならびにＣＧ５２０５３およびその改変体（例えば、ＣＧ５２０５３−０１およびＣＧ５２０５３−０２）によって、代替的に称される。
【００１４】
（炎症性腸疾患）
炎症性腸疾患（「ＩＢＤ」）とは、胃腸管に関与する慢性の炎症性障害の群をいう。ＩＢＤは、空置術により広く診断されるが、正確な診断を可能にする、ＩＢＤ関連の特徴的な特徴が存在する。
【００１５】
慢性ＩＢＤは、２つの主な群（すなわち、潰瘍性大腸炎（「ＵＣ」）およびクローン病（「ＣＤ」））に区分される。ＩＢＤは、臨床的に、種々の臨床的症状を有する腸区画の、再発性の炎症関与によって特徴付けられる。代表的に、ＵＣは、直腸を罹患させ、近位に拡張して、結腸の一部または全てを巻き込む。病変は、結腸の粘膜または粘膜下の層に限定され、より深い層は、劇症疾患において以外は、罹患されない。症状としては、直腸の出血、粘液含有の下痢、異常な疼痛および体重減少が挙げられる。ＣＤは、ＵＣとは対照的に、小腸および大腸の両方において腸壁の全層を罹患させる。ＵＣの臨床的症状は、罹患する領域によって異なる。一般に、熱、倦怠感、体重減少、異常な疼痛および痙攣は、ＣＤの一般的な症状である。全層の腸病変は、腸の穿孔および局所的膿瘍、腹および骨盤の器官の連結部におけるフィステル、ならびに閉塞を有する腸壁の線維症に進行し得る。
【００１６】
ＵＣの病因もＣＤの病因も未知のままである。しかし、免疫系の異常、遺伝的素因、環境因子および心理的因子を含む因子の組み合わせは、この疾患の結果を決定する際に重要であり得る。
【００１７】
ヨーロッパおよび米国において、ＣＤの発生率および罹患率は、それぞれ、人口１００，０００人あたり、１〜６症例および１０〜１００症例である。ＵＣについて、発生率および罹患率は、１００，０００人当たり、それぞれ、２〜１０症例および３５〜１００症例である。この疾患に罹るのは、男性よりも女性がわずかに優る。ＵＣおよびＣＤは、主に、１５歳と３５歳の間の個体を罹患させる。
【００１８】
（炎症性腸疾患についての治療的選択肢）
ＩＢＤについての治療の選択は、薬物および患者の特徴を支配する薬動力学的な考慮に依存する。臨床的回復（炎症症状の軽減）および粘膜治癒は、処置される必要がある２つの致命的な局面である。多くの現行の薬物の選択は、症状の軽減および粘膜治癒の間の乏しい相関を有する。従って、回復を維持し得、そして治癒を達成し得る薬剤は、ＩＢＤの管理において、特に目的とされる。過去数十年、いくつかの薬物は、ＩＢＤの処置において使用されてきた。これらには、従来のサリチレート、抗生物質およびコルチコステロイド、ならびに免疫調節剤および生物学的応答改変剤が挙げられる。
【００１９】
（５−アミノサリチレート（５−ＡＳＡ））
５−ＡＳＡ（スルファサラジンおよびサルファ非含有薬剤）は、抗体分泌およびリンパ球機能をダウンレギュレートすることによって免疫応答を変更し、好中球およびマクロファージの走化性を阻害し、そして熱ショックタンパク質の発現を増強することによって腸の上皮を保護することが公知である。さらに、これらは、アラキドン酸代謝のシクロオキシゲナーゼおよび５−リポオキシゲナーゼ経路（これは、走化性物質の放出を阻害し得る）を阻害する（Ｇｒｉｓｈａｍ，Ｍ．Ｂ．Ｌａｎｃｅｔ、１９９４、３４４：８５９−８６１）。５−ＡＳＡは、弱い〜中程度のＵＣの状態に有効な治療剤である。しかし、５−ＡＳＡは、悪心、アレルギー反応および可逆的精子減少症が挙げられ得る副作用に起因して、ＩＢＤについて選択される薬物ではない。
【００２０】
（抗生物質）
歴史的に、抗生物質様のメトロニダゾルおよびキノロンが、ＣＤを処置するために使用されてきたが、状態を改善するにおけるその有効性は、十分報告されていない。これらの薬剤の推定される効果は、ＩＢＤに伴う細菌微生物叢の変更におけるものであり得る。抗生物質は、ＩＢＤについてあまり有効でないだけでなく、副作用（食欲不振、悪心、発疹）にもまた関連し、従って、ＩＢＤについて選択される処置ではないかもしれない。
【００２１】
（コルチコステロイド）
コルチコステロイドは、ＩＢＤについての、最も古い非特異的であるが有効な治療レジメンである。コルチコステロイドは、免疫学的応答および炎症応答の両方を調節し、そして一連の白血球機能（例えば、接着、走化性、食作用、アラキドン酸代謝およびエイコサノイド産生）を阻害する。ＣＤおよびＵＣの短期処置におけるこれらの使用が示されているが、維持治療におけるこれらの効力は、満足できない（Ｍｕｎｋｈｏｌｍら、Ｇｕｔ、１９９４、３５：３６０−３６２）。この薬剤の既知の有害な副作用に伴う、維持治療におけるコルチコステロイドの失敗は、ＩＢＤについての処置におけるその使用を限定する。
【００２２】
（免疫調節剤）
チオプリン薬剤である６−メルカプトプリン（６−ｍｅｒｃａｐｔｏｐｔｉｎｅ）（「６−ＭＰ」）およびアザチオプリン（「ＡＺＡ」）は、ステロイド節約剤として、ＣＤおよびＵＣの処置において使用されてきた（Ｐｅａｒｓｏｎら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍａｄｉｃｉｎｅ、１９９５、１２３：１３２０１４２）。これらの薬物に伴う副作用（例えば、白血球減少症、血小板減少症）は、患者の遺伝的素因によってさらに関与される（Ｙａｔｅｓら、Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１９９７、１２６：６０８−６１４）。さらなる副作用（例えば、膵炎、肝炎、悪心および発疹）もまた報告されている。
【００２３】
メトトレキサートは、ステロイド依存性ＣＤにおいて有効であるが、ＵＣにおいては有効でないことが示されている。メトトレキサートの副作用としては、骨髄抑制、間質性肺炎および神経障害が挙げられる。
【００２４】
シクロスポリンは、ＣＤおよびＵＣの両方の処置において有効である。シクロスポリンは、コルチコステロイドに耐性または非耐性の、活動性ＣＤまたはＵＣを有する患者において有効であることが特に示されてきた（Ｌｉｃｈｔｉｇｅｒら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９４、３３０：１８４１−１８４５）。シクロスポリンの副作用としては、腎機能における可逆的または不可逆的疾患、高血圧、振せんおよび痙攣が挙げられる。
【００２５】
（生物学的応答改変剤）
薬剤Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ（ＴＮＦ−αに対するキメラモノクローナルＩｇＧ１抗体）は、ＣＤの処置において有効に使用されてきた。これは、維持治療およびフィステルの治癒において有効であるが（Ｐｒｅｓｅｎｔら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９９、３４０：１３９８−１４０５）、副作用としては、遅延型過敏性反応およびリンパ増殖障害が挙げられる。
【００２６】
（線維芽細胞増殖因子）
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の群のサイトカインは、少なくとも２１のメンバーを含み、多様な細胞機能（例えば、増殖、生存、アポトーシス、運動性および分化）を調節する。これらの分子は、細胞表面チロシンキナーゼＦＧＦレセプター（ＦＧＦＲ）との高親和性相互作用を介してシグナルを伝達する。ＦＧＦレセプターは、組織培養物中のほとんどの型の細胞上で発現される。リガンド結合の際のＦＧＦレセプターモノマーの二量体化は、キナーゼドメインの活性化のために必要であることが報告されており、レセプターのトランスリン酸化を導く。ＦＧＦレセプター−１（ＦＧＦＲ−１）（これは、４つのＦＧＦレセプターの中で最も広い発現パターンを示す）は、少なくとも７つのチロシンリン酸化部位を含む。多数のシグナル伝達分子は、これらのリン酸化部位に対する異なる親和性での結合によって、影響を受ける。
【００２７】
正常な増殖および発生に関与することに加えて、既知のＦＧＦはまた、癌を含む病理学的状態の生成にも関与する。ＦＧＦは、腫瘍細胞の増殖を直接増強することによって、悪性に寄与し得る。例えば、同じ細胞におけるＦＧＦとＦＧＦＲとの同時発現を介したオートクライン増殖刺激は、細胞の形質転換を導くと報告されている。
【００２８】
以前に記載された多数のＦＧＦファミリーメンバーは、多様な細胞機能（例えば、増殖、生存、アポトーシス、運動性および分化）を調節する（ＳｚｅｂｅｎｙｉおよびＦａｌｌｏｎ（１９９９）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１８５、４５−１０６）。これらの分子は、細胞表面チロシンキナーゼＦＧＦレセプター（ＦＧＦＲ）との高親和性相互作用を介して細胞内にシグナルを伝達し、これらのＦＧＦＲのうち４つがこれまで同定されている（Ｘｕら、（１９９９）Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．２９６、３３−４３；ＫｌｉｎｔおよびＣｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ（１９９９）Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．４、１６５−１７７）。これらのＦＧＦレセプターは、組織培養物中のほとんどの型の細胞上で発現される。リガンド結合の際のＦＧＦレセプターモノマーの二量体化は、キナーゼドメインの活性化のために必要であることが報告されており、レセプターのトランスリン酸化を導く。ＦＧＦレセプター−１（ＦＧＦＲ−１）（これは、４つのＦＧＦレセプターの中で最も広い発現パターンを示す）は、少なくとも７つのチロシンリン酸化部位を含む。多数のシグナル伝達分子は、これらのリン酸化部位に対する異なる親和性での結合によって、影響を受ける。
【００２９】
ＦＧＦはまた、低親和性ではあるが、ほとんどの細胞表面および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）上に存在する硫酸ヘパリンプロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に対しても結合する。ＦＧＦとＨＳＰＧとの間の相互作用は、ＦＧＦ／ＦＧＦＲ相互作用を安定化させ、ＦＧＦを隔離し、そしてこれらを分解から保護するように作用する（ＳｚｅｂｅｎｙｉおよびＦａｌｌｏｎ（１９９９））。増殖促進能に起因して、ＦＧＦファミリーの１メンバーであるＦＧＦ−７は、現在、化学療法誘導性の粘膜炎の処置について、現在臨床試験中である（Ｄａｎｉｌｅｎｋｏ（１９９９）Ｔａｘｉｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．２７、６４−７１）。
【００３０】
正常な増殖および発生に関与することに加えて、既知のＦＧＦはまた、癌を含む病理学的状態の生成にも関与する（ＢａｓｉｌｉｃｏおよびＭｏｓｃａｔｅｌｌｉ（１９９２）Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９、１１５−１６５）。ＦＧＦは、腫瘍細胞の増殖を直接増強することによって、悪性に寄与し得る。例えば、同じ細胞におけるＦＧＦとＦＧＦＲとの同時発現を介したオートクライン増殖刺激は、細胞の形質転換を導くと報告されている（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ−Ｙｏｓｈｉｔｏｍｉら、（１９９７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７１，４４２−４５０）。同様に、変異または再編成を介したＦＧＦＲの構成的活性化は、制御されない増殖を導く（Ｌｏｒｅｎｚｉら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３、８９５６−８９６１；Ｌｉら、（１９９７）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４、１３９７−１４０６）。さらに、いくつかのＦＧＦは、脈管形成性である（Ｇｅｒｗｉｎｓら、（２０００）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３４、１８５−１９４）。このようなＦＧＦは、腫瘍増殖を支持するために必要な血液供給の発達を容易にすることによって、腫瘍形成プロセスに寄与し得る。少なくとも１つのＦＧＦが、現在、がん治療のための潜在的な標的として調査されていることは、驚くに値しない（Ｇａｓｐａｒｉｎｉ（１９９９）Ｄｒｕｇｓ  ５８、１７−３８）。
【００３１】
出生時および成体のマウスの脳におけるＦＧＦおよびＦＧＦレセプターの発現が、試験されている。ＦＧＦ−４以外の全てのＦＧＦ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡが、これらの組織において検出される。ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５およびＦＧＦ−８遺伝子は、出生後の段階よりも、後期胚段階においてより高い発現を実証し、このことは、これらのメンバーが、脳の発達の後期段階に関与することを示唆する。対照的に、ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−５の発現は、出生後に増加した。特に、出生時のマウスにおけるＦＧＦ−６の発現は、中枢神経系および骨格筋に限定され、胚における発達中の大脳において強力なシグナルが存在するが、５日齢の新生仔においては小脳において強力なシグナルが存在する。ＦＧＦレセプター（ＦＧＦＲ）−４（ＦＧＦ−６の同族パートナー）は、類似の時空間的発現を実証し、このことは、ＦＧＦ−６およびＦＧＦＲ−４が、リガンド−レセプター系として、神経系の成熟において重要な役割を果たすことを示唆する。Ｏｚａｗａらによると、これらの結果は、種々のＦＧＦおよびＦＧＦレセプターが、脳の種々の発達プロセス（例えば、神経前駆細胞の増殖および移動、ニューロンおよびグリアの分化、神経突起伸長ならびにシナプス形成）の調節に関与することを強力に示唆する。
【００３２】
別のＦＧＦファミリーメンバーであるグリア活性化因子（「ＧＡＦ」）は、ヒトグリオーム細胞株の培養物上清から精製されたヘパリン結合増殖因子である。Ｍｉｙａｍｏｔｏら、１９９３、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３（７）：４２５１−４２５９を参照のこと。ＧＡＦは、他の既知の増殖因子とは僅かに異なる活性のスペクトルを示し、ＦＧＦ−９と称される。ヒトＦＧＦ−９  ｃＤＮＡは、２０８アミノ酸のポリペプチドをコードする。ＦＧＦファミリーの他のメンバーに対する配列類似性は、約３０％であると推定された。他のファミリーメンバーにおいて見出された２つのシステイン残基および他のコンセンサス配列もまた、ＦＧＦ−９配列において十分保存されていた。ＦＧＦ−９は、酸性ＦＧＦおよび塩基性ＦＧＦにおけるような、代表的なシグナル配列をＮ末端に有さないことが見出された。
【００３３】
酸性ＦＧＦおよび塩基性ＦＧＦは、従来の様式で細胞から分泌されないことが公知である。しかし、ＦＧＦ−９は、代表的なシグナル配列を欠くにもかかわらず、ｃＤＮＡトランスフェクトＣＯＳ細胞から効率的に分泌されることが見出された。これは、細胞の培養培地中で排他的に検出され得る。分泌されたタンパク質は、ｃＤＮＡ配列によって予測された配列に関して、開始メチオニン以外は、Ｎ末端でアミノ酸残基を欠かなかった。ラットＦＧＦ−９  ｃＤＮＡもまたクローニングされ、そして構造分析によって、ＦＧＦ−９遺伝子が高度に保存されていることが示された。
【００３４】
（血小板由来増殖因子）
種々の組織に影響を及ぼすポリペプチド増殖因子が、記載されている。これらの増殖因子は、骨形成プロテイン−１（「ＢＭＰ−１」）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、および血小板由来増殖因子（「ＰＤＧＦ」）である。
【００３５】
複数の効果が、ＢＭＰ−１に起因している。例えば、ＢＭＰ−１は、インビボで軟骨の形成を誘導し得る。ＢＭＰ−１はまた、精製されたプロコラーゲンＣプロテイナーゼ（「ＰＣＰ」）、軟骨形成および骨形成のために必要であることが報告されている、分泌されたカルシウム依存性メタロプロテアーゼと同一である。ＢＭＰ−１は、プロコラーゲンＩ、プロコラーゲンＩＩおよびプロコラーゲンＩＩＩのＣ末端プロペプチドを切断し、そしてその活性は、プロコラーゲンＣエンドペプチダーゼエンハンサータンパク質によって増加される。
【００３６】
血管内皮増殖因子（「ＶＥＧＦ」）ポリペプチドは、主に血管内皮細胞のマイトジェンとして作用することが報告されている。血管内皮細胞についての特異性は、他のポリペプチドマイトジェン（例えば、塩基性線維芽細胞成長因子および血小板由来増殖因子）由来のＶＥＧＦポリペプチド（これは、細胞型のより広範な範囲において活性である）と対照的である。
【００３７】
ＶＥＧＦはまた、腫瘍脈管形成に影響を及ぼすことが報告されている。例えば、ＶＥＧＦは、伸長、網様構造形成、ならびに酸素および栄養分の乏しい培地中の非増殖内皮細胞の分枝形成を刺激することが示されている。
【００３８】
血小板由来増殖因子（「ＰＤＧＦ」）ファミリーは、現在、少なくとも３種の別個の遺伝子（ＰＤＧＦ  Ａ、ＰＤＧＦ  ＢおよびＰＤＧＦ  Ｃ）からなり、これらの遺伝子は、選択的に、２つのＰＤＧＦＲによってシグナルを発生して、多様な細胞機能を調節する。ＰＤＧＦ  Ａ、ＰＤＧＦ  ＢおよびＰＤＧＦ  Ｃは溶液中で二量体化して、ホモ二量体およびヘテロ二量体を形成する。
【００３９】
ＰＤＧＦ  ＡおよびＰＤＧＦ  ＢサブユニットをコードするＲＮＡの発現は、アテローム性動脈硬化症に関与する血管組織において報告されている。ＰＤＧＦ  ＡおよびＰＤＧＦ  Ｂ  ｍＲＮＡは、それそれ、アテローム性動脈硬化症のプラークの、間葉に出現する内膜細胞および内皮細胞に存在することが報告されている。さらに、ＰＤＧＦレセプターｍＲＮＡはまた、プラーク内膜細胞中に主に局在化されている。
【００４０】
ＰＤＧＦ  Ｂは、サルの肉腫ウイルスの形質転換遺伝子（ｖ−ｓｉｓ）に関連する。ＰＤＧＦ  Ｂはまた、間葉起源の細胞についてのマイトジェンであることが報告されている。ＰＤＧＦ  Ｂは、さらに、神経膠芽細胞中に特徴的に見出される内皮細胞の病理学的増殖における自己分泌増殖刺激に関連している。ＰＤＧＦはまた、細胞増殖を促進し、アポトーシスを阻害することが報告されている。
【００４１】
（ＦＧＦ−ＣＸ）
本発明は、新規のヒトＦＧＦおよびその対応するｃＤＮＡに関する。この遺伝子のタンパク質産生は、増殖刺激性特性および増殖促進特性を示すことが示されている。
【００４２】
繊維芽細胞成長因子−ＣＸ（「ＦＧＦ−ＣＸ」、ＡＢ０２０８５８とも呼ばれる）のヌクレオチド配列および翻訳されたポリペプチド配列を、表１に示す（実施例１を参照のこと：１９９９年７月２７日に出願された米国特許出願第６０／１４５，８９９号、２０００年１月３１日に出願された米国特許出願第０９／４９４５８５号、および２０００年７月３日に出願された米国特許出願第０９／６０９５４３号（これらの全てが本明細書中で参考として援用される）の開示もまた参照のこと）。開始コドンおよび終止コドンを太字において示す。
【００４３】
【表１】
2004537267.tif 000002
2004537267.tif 000003
繊維芽細胞成長因子−２０Ｘ（ＦＧＦ−ＣＸ）と表わされた新規の繊維芽細胞成長因子をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）は、本発明に含まれる（表１；配列番号１を参照のこと）。このコーディング配列を、ヒトゲノムＤＮＡ配列において同定した。開示されるＤＮＡ配列は、２１１アミノ酸残基を有すると予測されるポリペプチドをコードする６３３塩基を有する（表１；配列番号２）。表１および配列番号２に示される配列に基づく、ＦＧＦ−ＣＸの予測される分子量は、２３４９８．４Ｄａである。
【００４４】
ＦＧＦ−ＣＸ核酸該列を、ＢＬＡＳＴＮ検索において問い合わせヌクレオチド配列として使用して、関連する核酸配列を同定した。ＦＧＦ−ＣＸヌクレオチド配列は、マウスの繊維芽細胞成長因子９（「ＦＧＦ−９」）に対して高い類似性（５４３塩基中３９２塩基（すなわち、７２％）の同一性；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｓ８２０２３）を有し、かつ、神経膠活性化因子（ＧＡＰ）をコードするヒトＤＮＡに対して高い類似性（５５４塩基中３８５塩基（すなわち、６９％）の同一性；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｅ０５８２２、ＦＧＦ−９ともまた呼ばれる）を有する。さらに、ＦＧＦ−ＣＸは、Ｎａｒｕｏら、日本国特許ＪＰ  １９９３３０１８９３、表題「Ｇｌｉａ−Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ  Ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」によって開示されたＧＡＦ配列（配列番号５）に匹敵する同一性の程度（４２４塩基中３１１塩基（すなわち７３％）の同一性）を有することが見出された。
【００４５】
ゲノム採掘（ｍｉｎｉｎｇ）によって同定されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が正確であったことを確証するために、ＰＣＲ増幅を使用して推定ゲノムクローンに対応するｃＤＮＡを得た。得られた産物のヌクレオチド配列は、推定遺伝子のヌクレオチド配列と正確に一致する（実施例２を参照のこと）。
【００４６】
ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質は、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ＦＧＦ−２０Ｘ（本明細書中で、ＸＦＧＦ−ＣＸまたはＸＦＧＦ−２０Ｘと表わされる）、ならびにヒトＦＧＦ−９およびヒトＦＧＦ−１６と最も密接に関連している（それぞれ、８０％、７０％および６４％アミノ酸同一性）。ＸＦＧＦ−ＣＸとの高い相同性に基づいて、本発明の開示において同定された遺伝子は、そのヒトオルトログを表わすと考えられ、本明細書中でＦＧＦ−ＣＸと命名される。
【００４７】
配列番号２のポリペプチドのＢＬＡＳＴＰ分析は、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド配列（配列番号２）の最初の２０８アミノ酸が、ヒトＦＧＦ−９と整列することを示す。例えば、神経膠活性化因子前駆体（ＧＡＦ）についての、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ登録番号Ｐ３１３７１（繊維芽細胞成長因子−９）；Ｍｉｙａｍｏｔｏら、１９９３  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：４２５１〜４２５９；およびＮａｒｕｏら、１９９３  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２８５７〜２８６４を参照のこと。ＢＬＡＳＴＸ分析は、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド（配列番号２）の最初の２０８アミノ酸が、マウスＦＧＦ−９配列およびラットＦＧＦ−９配列と整列することを示す。例えば、神経膠活性化因子前駆体（ＧＡＦ）についての、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ登録番号Ｐ５４１３０（繊維芽細胞成長因子−９）；マウスＦＧＦ−９についての、Ｓａｎｔｏｓ−Ｏｃａｍｐｏら、１９９６  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１７２６〜１７３１；および、神経膠活性化因子前駆体（ＧＡＦ）についての、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ登録番号Ｐ３６３６４（繊維芽細胞成長因子−９）（ＦＧＦ−９）、ラットＦＧＦ−９についての、Ｍｉｙａｍｏｔｏ，１９９３  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：４２５１〜４２５９を参照のこと。
【００４８】
全長ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド（配列番号２）もまた、ＢＬＡＳＴＸによって、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ＸＦＧＦ−ＣＸと整列された（例えば、Ｋｏｇａら、１９９９  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２６１（３）：７５６〜７６５を参照のこと）。ＦＧＦ−ＣＸが、２１１残基中１７０残基（８０％）の同一な残基を有し、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ＸＦＧＦ−ＣＸと比較して、２１１残基中１８９残基（８９％）のポジティブな残基を有することが見出された。ＸＦＧＦ−ＣＸオープンリーディングフレームの推定の２０８アミノ酸配列は、ＦＧＦファミリーに特徴的なモチーフを含む。ＸＦＧＦ−ＣＸは、ＸＦＧＦ−９に対して７３．１％の全体的な類似性を有するが、そのアミノ末端領域においてＸＦＧＦ−９とは異なる（３３．３％の類似性）。これは、種々の哺乳動物ＦＧＦ−９配列およびＦＧＦ−１６配列（ヒトを含む）に対して、現在開示されている配列番号２について見られる類似性と似ている（上記を参照のこと）。
【００４９】
ＦＧＦ−ＣＸは、その最も密接したいくつかのヒトファミリーメンバー（例えば、ＦＧＦ−９およびＦＧＦ−１６）についてまさに見出されるように、ＰＳＯＲＴ（Ｎａｋａｉ  ＆  Ｋａｎｅｈｉｓａ（１９９２）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １４，８９７〜９１１）およびＳＩＧＮＡＬＰ（Ｎｉｅｌｓｅｎら、（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０，１〜６）コンピューターアルゴリズムによって予測されるように、古典的なアミノ末端シグナル配列を欠失している。それにもかかわらず、ＦＧＦ−９とＦＧＦ−１６の両方が、分泌される（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ−Ｙｏｓｈｉｔｏｍｉら、（１９９７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７１，４４２〜４５０；Ｍｉｙａｋｅら、（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｏｍｍ．２４３，１４８〜１５２；Ｍｉｙａｋａｗａら、（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，２９３５２〜２９３５７；Ｒｅｖｅｓｔら、（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，８０８３〜８０９０）。ＦＧＦ−ＣＸがまた分泌されるか否かを決定するために、全長ＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードするｃＤＮＡを、哺乳動物発現ベクター（ｐＦＧＦ−ＣＸと表わされる）中にサブクローン化した。ヒト胚性腎臓２９３細胞をこのベクターによってトランスフェクトした際に発現されるタンパク質は、条件培地中において見出され、Ｃ末端Ｖ５エピトープに対する抗体によって検出されるバンドを示し、約２７ｋＤａのウェスタンブロットにおける見かけの分子量を有する（図４）。発現されたタンパク質のさらなる部分は、硫酸ヘパリンプロテオグリカン（ＨＳＰＧ）との相互作用を阻害する物質で処置することによって、２９３細胞における腐骨形成から遊離される。この様式において遊離されたタンパク質はまた、類似のウェスタンブロットパターンを示す（図４）。このタンパク質が、Ｉｇ  Ｋａｐｐａシグナル配列を組み込んだ組換えプラスミドからのＨＥＫ２９３細胞において発現される場合、バンドは、約３４ｋＤａの見かけの分子量を有するようにウェスタンブロットによって検出される（図１、実施例４）。
【００５０】
（ＦＣＴＲ１）
本発明のポリヌクレオチドは、ＦＣＴＲ１の核酸配列（クローン３０６６４１８８．０．９９とも呼ばれる）を含む。ＦＣＴＲ１は、１８２８ヌクレオチド長である。ＦＣＴＲ１のヌクレオチド配列（３０６６４１８８．０．９９またはＰＤＧＦＤとも呼ばれる）を、表２において報告する（配列番号３）。下垂体組織由来のＲＮＡから本来得られるクローンは、ヒト子宮微小血管内皮細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ヒト赤白血細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、甲状腺、小腸、リンパ球、副腎および唾液腺由来のＲＮＡにおいても存在する。開始部位の上流および終止コドンの下流の非翻訳領域を、下線で示し、開始コドンおよび停止コドンを、太字で示す。
【００５１】
【表２】
2004537267.tif 000004
2004537267.tif 000005
2004537267.tif 000006
配列番号３のヌクレオチド１８２〜１２９２は、分泌されたタンパク質に特徴的な配列を含む３７０アミノ酸のタンパク質（配列番号４）をコードする。コードされるタンパク質（これは、本明細書中で、「ＦＣＴＲ１タンパク質」「３０６６４１８８．０．９９タンパク質」「３０６６４１８８．０．９９」、「ＰＤＧＦＤ」または「ヒトＰＤＧＦＤ」とも呼ばれる）の配列を、表２に示す。３０６６４１８８．０．９９タンパク質の推定分子量は、４２８４７．８ダルトンであり、７．８８のｐＩを有する。
【００５２】
ＢＬＡＳＴＮ分析およびＢＬＡＳＴＰ分析は、３０６６４１８８．０．９９ポリペプチドが、ヒト血管内皮増殖因子Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）および他の脊椎動物種由来のＶＥＧＦ−Ｅに対する類似性を有することを示す。例えば、ヒト分泌性増殖因子様タンパク質（ＶＥＧＦ−Ｅまたはフォロテイン（ｆａｌｌｏｔｅｉｎ）；登録番号：ＡＡＦ０００４９（これは、ヌクレオチド配列について、ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＦ０９１４３４を参照する））に対して４４％の同一性が存在する。３０６６４１８８．０．９９ポリペプチドのアミノ酸配列の、ＶＥＧＦ−Ｅの配列との整列を、図１に示す。ＢＬＡＳＴＰ分析はまた、ＦＣＴＲ１が、ヒトＰＤＧＦ  Ｃ、ヒトＰＤＧＦ  Ｂ、およびヒトＰＤＧＦ  Ａに関連することを示す（それぞれ、４２％、２７％、および２５％の全体のアミノ酸同一性）。
【００５３】
ＰＦＡＭ分析およびＰＲＯＳＩＴＥ分析は、３０６６４１８８．０．９９ポリペプチドのアミノ酸配列が、ＰＤＧＦドメイン（ａａ２７２〜３６２）およびＮ連結グリコシル化部位（残基２７６）を含むことを示す。
【００５４】
３０６６４１８８．０．９９ポリペプチドのアミノ酸配列は、８２３残基のポリペプチドである、ヒトプロコラーゲンＣエンドペプチダーゼ（骨形成タンパク質−１；ＢＭＰ−１；ＰＩＲ番号：Ａ５８７８８）の配列に対する類似性を示す。３０６６４１８８．０．９９ポリペプチドの残基５４〜１６９は、ＢＭＰ−１ポリペプチドの３つのセグメントにわたって３０〜４１％の同一性を示す。３０６６４１８８．０．９９ポリペプチドはまた、同一性の類似の程度が、７０７残基タンパク質である、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ（ＡＣＣ  ＮＯ：Ｐ９８０７０）由来のＢＭＰ−１に対してであることを示している。後者のタンパク質は、軟骨形成および骨形成を促進する際に亜鉛プロテアーゼとして作用し得る（Ｗｏｚｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１５２８−３４，１９８８）。
【００５５】
３０６６４１８８．０．９９ポリペプチドはまた、他の増殖因子にも関連する。例えば、このポリペプチドは、ニワトリの脊髄由来増殖因子（ＴＲＥＭＢＬＮＥＷ−ＡＣＣ：ＢＡＢ０３２６５）に対して４２％の同一性および５９％の類似性を示し、ヒト分泌性増殖因子様タンパク質フォロテイン（ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９ＵＬ２２）に対して４２％の同一性および５９％の類似性を示し、ヒト血小板由来増殖因子Ｃ（ＴＲＥＭＢＬＮＥＷ−ＡＣＣ：ＡＡＦ８０５９７）に対して４２％の同一性および３９％の類似性を有し、マウスフォロテイン（ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９ＱＹ７１）に対して３９％の同一性および５９％の類似性を示す。
【００５６】
上で議論された相同性は、３０６６４１８８．０．９９ポリペプチドを、ＢＭＰ−１／ＶＥＧＦ−Ｅ／ＰＤＧＦタンパク質ファミリーのメンバーとして同定する。ＢＭＰ−１タンパク質は、ＥＧＦ様ドメイン、３つのＣＵＢドメイン、およびＰＤＧＦ／ＶＥＧＦドメインを含む。ＢＭＰ−１タンパク質はまた、アスタシンサブファミリーのメンバーである。
【００５７】
ＳｉｇｎａｌＰ分析およびＰＳＯＲＴ分析は、３０６６４１８８．０．９９についてのアミノ酸配列が、２３位と２４位との間に切断部位を有する、切断可能なアミノ末端シグナルペプチド（ＴＳＡ−ＴＰ）を含むことを予測する。このタンパク質は、細胞の外側に分泌され、局在化される可能性が高い。ＩｎｔｅｒＰｒｏソフトウェアプログラムは、残基５３〜残基１６７の３０６６４１８８．０．９９におけるＣＵＢドメイン、残基２７２〜３０６および残基３５０〜３６２の長さにわたるＰＤＧＦドメイン、ならびに残基３０２〜残基３６５のメタロチオネインドメインの存在を予測する。本発明のＦＣＴＲ１ポリペプチドは、これらのドメインの１つ、２つ、３つもしくは４つ、またはそれらの組み合わせを有するポリペプチドを含む。
【００５８】
本発明のＦＣＴＲ１ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸２４〜３７０を含むＦＣＴＲ１ポリペプチドの成熟形態を含む。これらの配列はまた、クローン３０６６４１８８．０．ｍ９９（以下により詳細に記載される）によってコードされる構築物においてコードされる。アミノ酸配列２４７〜３７０、２４７〜３３８もしくは３３９〜３７０を含むＦＣＴＲＸポリペプチドフラグメントまたはそれらの改変体形態をコードする核酸もまた、本発明の範囲内である。いくつかの実施形態において、このフラグメントは、細胞増殖を刺激する。ＦＣＴＲＸポリペプチドフラグメント、またはこれらの核酸によってコードされる、それらの改変体、ホモログもしくはアナログもまた、本発明の範囲内である。
【００５９】
（ＦＣＴＲ２核酸およびポリペプチド）
本発明のポリヌクレオチドは、ＦＣＴＲ２（クローン３０６６４１８８．０．３３１とも呼ばれる）の核酸配列を含む。ＦＣＴＲ２は、１５８７ヌクレオチド長であり、そして、これは本来、下垂体組織由来のＲＮＡから単離された。ＦＣＴＲ２のヌクレオチド配列を、表３に示す（配列番号５）。開始部位の上流および停止コドン下流の非翻訳領域を、下線で示し、開始コドンおよび停止コドンを、太字において示す。
【００６０】
【表３】
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2004537267.tif 000008
クローン３０６６４１８８．０．３３１は、ヌクレオチド５４０〜９３６のオープンリーディングフレームを含む。このオープンリーディングフレームは、１３２アミノ酸のポリペプチド（配列番号６）をコードする。コードされたポリペプチドは、本明細書中で「３０６６４１８８．０．３３１タンパク質」または「３０６６４１８８．０．３３１ポリペプチド」と呼ばれる。３０６６４１８８．０．３３１核酸配列の推定アミノ酸配列を、表３に示す（配列番号６）。
【００６１】
クローン３０６６４１８８．０．３３１のヌクレオチド５０〜１４７２は、クローン３０６６４１８８．０．９９のヌクレオチド４０６〜１８２８に対して１００％同一である。クローン３０６６４１８８．０．３３１タンパク質の１３２アミノ酸は、３０６６４１８８．０．９９のタンパク質配列のカルボキシ末端に対して１００％同一である。従って、クローン３０６６４１８８．０．９９および３０６６４１８８．０．３３１の核酸は、共通遺伝子のスプライス改変体として関連する。
【００６２】
３０６６４１８８．０．３３１タンパク質は、ヒト増殖因子ＦＩＧＦ（ｃ−ｆｏｓ由来増殖因子；ｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ４３９１５）、血小板由来増殖因子／血管内皮増殖因子（ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦ）ファミリーのメンバー、およびラット血管内皮増殖因子Ｄ（ｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ３５２５１）に対する類似性を示す。
【００６３】
（ＦＣＴＲ３核酸およびポリペプチド）
本発明に従う、ＦＣＴＲ３（本明細書中で、ＰＤＧＦＤ、マウスＰＤＧＦＤまたはｍＰＤＧＦＤとも呼ばれる）核酸およびポリペプチドは、表４に示される核酸配列およびコードされるポリペプチド配列（配列番号７および配列番号８）を含む。開始コドンおよび停止コドンを、太字で示す。ＦＣＴＲ３核酸配列を、マウス脳ライブラリーから同定した。推定オープンリーディングフレームは、３７０アミノ酸長分泌タンパク質をコードする。ＦＣＴＲ３は、４２，８０８ダルトンの予測分子量および７．５３のｐＩを有する。ＰＦＡＭおよびＰＲＯＳＩＴＥを使用するタンパク質構造分析は、ＦＣＴＲ３ポリペプチド配列内のコアＰＤＧＦドメインを同定した。
【００６４】
【表４】
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（ＦＣＴＲ４核酸およびポリペプチド）
本発明に従う、ＦＣＴＲ４（本明細書中で、ＰＤＧＦＤ、マウスＰＤＧＦＤまたはｍＰＤＧＦＤとも呼ばれる）核酸およびポリペプチドは、表５に示される核酸配列およびコードされるポリペプチド配列（配列番号９および配列番号１０）を含む。開始コドンおよび停止コドンを、太字で示す。ＦＣＴＲ４核酸配列を、マウス脳ライブラリーから同定し、これは、ＦＣＴＲ３のスプライス改変体である。ＦＣＴＲ４は、ＦＣＴＲ３との比較において、内部停止コドンを有する。表８を参照のこと。しかしながら、ＦＣＴＲ３とは異なり、ＦＣＴＲ４は、ＰＤＧＦ様ドメインの有意な部分を欠失している。表９を参照のこと。
【００６５】
【表５】
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（ＦＣＴＲ５核酸およびポリペプチド）
本発明に従う、ＦＣＴＲ５（本明細書中で、ＰＤＧＦＤ、ヒトＰＤＧＦＤ、ｈＰＤＧＦＤまたはクローンｐＣＲ２．１−Ｓ８５２＿２Ｂとも呼ばれる）核酸およびポリペプチドは、ＦＣＴＲ５の核酸配列およびコードされるポリペプチド配列を含み、これらは、表６に示される（配列番号１１および配列番号１２）。ＦＣＴＲ５核酸配列を、ＦＣＴＲ１のスプライス改変体として同定した。
【００６６】
ＦＣＴＲ１と同様に、タンパク質構造分析プログラムＰＳＯＲＴ、ＰＦＡＭおよびＰＲＯＳＩＴＥは、ＦＣＴＲ５が、特徴的なシグナルペプチド（ａａ１〜２３）、ＰＤＧＦドメイン（ａａ２７２〜３６２）およびＮ連結グリコシル化部位（残基２７６）を含むことを予測した。ＢＬＡＳＴＰ分析は、ヒトＦＣＴＲ５が、ヒトＰＤＧＦ  Ｃ、ヒトＰＤＧＦ  Ｂ、およびヒトＰＤＧＦ  Ａに最も密接に関連していることを明らかにした（それぞれ、４２％、２７％および２５％の全アミノ酸同一性）。
【００６７】
【表６】
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（ＦＣＴＲ６核酸およびポリペプチド）
本発明に従う、ＦＣＴＲ６（本明細書中で、ＰＤＧＦＤ、ヒトＰＤＧＦＤまたはｈＰＤＧＦＤとも呼ばれる）核酸およびポリペプチドは、ＦＣＴＲ６の核酸配列およびコードされるポリペプチド配列を含み、これらは、表７に示される（配列番号１３および配列番号１４）。ＦＣＴＲ６配列（クローンｐＣＲ２．１−Ｓ８６９＿４Ｂとも呼ばれる）を、ＦＣＴＲ１のスプライス改変体として同定した。
【００６８】
ＦＣＴＲ６は、全長遺伝子（ＦＣＴＲ１）の５’末端の多くを含むが、コーディング配列の最も３’末端にて、潜在的な非コンセンサススプライス部位にスプライシングされる。このスプライシングは、停止コドンを、このスプライス部位のすぐ下流に導入する。このスプライス改変体は、３０６６４１８８．０．９９のインタクトなＣＵＢドメインを含むが、ＰＤＧＦドメインを欠失しており、これは、この分子の潜在的な調節機能を示す。
【００６９】
しかしながら、ＦＣＴＲ１と同様に、タンパク質構造分析プログラムＰＳＯＲＴ、ＰＦＡＭおよびＰＲＯＳＩＴＥは、ＦＣＴＲ６が、特徴的なシグナルペプチド（ａａ１〜２３）、ＣＵＢドメイン（ａａ５３〜１６７）およびＮ連結グリコシル化部位（残基２７６）を含むことを予測した。ＢＬＡＳＴＰ分析は、ヒトＦＣＴＲ５が、ヒトＰＤＧＦ  Ｃ、ヒトＰＤＧＦ  Ｂ、およびヒトＰＤＧＦ  Ａに最も密接に関連していることを明らかにした（それぞれ、４２％、２７％および２５％の全アミノ酸同一性）。
【００７０】
【表７】
2004537267.tif 000013
（ＦＣＴＲＸ配列）
種々のＦＣＴＲＸ核酸およびポリペプチドは、関連出願ＵＳＳＮ  ６０／１５８，０８３（１９９９年１０月７日出願）；ＵＳＳＮ  ６０／１５９，２３１（１９９９年１０月１３日出願）；ＵＳＳＮ  ６０／１７４，４８５（２０００年１月４日出願）；ＵＳＳＮ  ６０／１８６，７０７（２０００年３月３日出願）；ＵＳＳＮ  ６０／１８８，２５０（２０００年３月１０日出願）；ＵＳＳＮ  ６０／２２３，８７９（２０００年８月８日出願）；ＵＳＳＮ  ６０／２３４，０８２（２０００年９月２０日出願）；ＵＳＳＮ  ０９／６８５，３３０（２０００年１０月５日出願）；ＰＣＴ出願ＵＳ００／２７６７１（２０００年１０月６日出願）；ＵＳＳＮ  ０９／６８８，３１２（２０００年１０月１３日出願）；ＵＳＳＮ  ０９／７１５，３３２（２０００年１１月１６日出願）；およびＵＳＳＮ  ０９／７７５，４８２（２００１年２月２日出願）に開示される。これらの出願の各々が、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【００７１】
ＦＣＴＲＸアミノ酸配列改変体を、ＣｌｕｓｔａｌＷソフトウェアを用いて分析した。得られた配列アラインメントを、表８に示す。
【００７２】
【表８】
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ＦＣＴＲ１、ＦＣＴＲ３、ＦＣＴＲ４およびＦＣＴＲ６の核酸は、表９に示されるヌクレオチド残基にわたって、互いに整列する。
【００７３】
【表９】
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ＦＣＴＲ１、ＦＣＴＲ３、ＦＣＴＲ４およびＦＣＴＲ６のアミノ酸は、表１０に示されるように、互いに整列する。
【００７４】
【表１０】
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2004537267.tif 000022
ＦＣＴＲ２およびＦＣＴＲ５の核酸は、表１１に示されるヌクレオチド残基にわたって、互いに整列する。
【００７５】
【表１１】
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ＦＣＴＲ２およびＦＣＴＲ５のアミノ酸は、表１２に示されるように、互いに整列する。
【００７６】
【表１２】
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前述のＢＭＰ−１  ＶＥＧＦ−ＥポリペプチドおよびＰＤＧＦポリペプチドに対する開示されたＦＣＴＲＸポリペプチドの類似性は、本発明のＦＣＴＲＸ核酸およびＦＣＴＲＸポリペプチドの機能の類似性を示す。これらの有用性は、以下に詳細に記載される。
【００７７】
ＦＣＴＲＸ核酸およびＦＣＴＲＸポリペプチドは、ＢＭＰ−１がまた、インビボで軟骨の形成を誘導し得るように（Ｗｏｚｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１５２８〜１５３４（１９８８））、軟骨の形成を誘導するために使用され得る。
【００７８】
ＦＣＴＲＸ核酸およびＦＣＴＲＸポリペプチドについてのさらなる使用は、コラーゲン形成の調節における使用である。組み換え発現されたＢＭＰ１および精製されたプロコラーゲンＣプロテイナーゼ（ＰＣＰ）（これは、カルシウムを必要とし、軟骨形成および骨形成にとって必要とされる分泌メタロプロテアーゼである）は実際、同一である。例えば、Ｋｅｓｓｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１：３６０〜６２（１９９６）を参照のこと。ＢＭＰ−１は、プロコラーゲンＩ、プロコラーゲンＩＩ、プロコラーゲンＩＩＩのＣ末端のポリペプチドを切断し、そして、これらの活性は、プロコラーゲンＣエンドペプチダーゼエンハンサータンパク質によって増大される。ＦＣＴＲＸ核酸およびＦＣＴＲＸポリペプチドは、コラーゲン調節経路において類似の役割を担い得る。
【００７９】
ＦＣＴＲＸポリペプチドが、炎症性腸疾患の２つの動物モデルにおいて炎症性応答の程度を軽減または改善する能力を有することが、以下の実施例において示される。
【００８０】
ＦＣＴＲＸポリペプチドとＰＤＧＦポリペプチドとの間の類似性は、ＦＣＴＲＸ核酸およびそれらのコードされるポリペプチドが種々の治療適用および診断適用において使用され得ることを示唆する。例えば、ＦＣＴＲＸ核酸およびそれらのコードされるポリペプチドは、癌、心臓血管疾患および繊維症疾患および糖尿病性潰瘍を処置するために使用され得る。さらに、ＦＣＴＲＸ核酸およびそれらのコードされるポリペプチドは、遺伝子療法による動脈瘤の予防および創傷閉鎖の加速のために、治療学的に有用である。さらに、ＦＣＴＲＸ核酸およびそれらのコードされるポリペプチドは、細胞増殖を刺激するために使用され得る。
【００８１】
ＦＣＴＲＸ核酸または遺伝子産物（例えば、配列番号４または配列番号６をコードする核酸）は、創傷治癒、血管新生および組織増殖、および類似の組織再生の必要性を促進する際の治療剤として有用である。より詳細には、ＦＣＴＲＸ核酸またはポリペプチドは、虚血および白血球減少症、胃腸管過敏症および禿頭症の処置において有用であり得る。このような状態の処置は、例えば、放射線療法または化学療法を受けている患者において示され得る。このような場合、ＦＣＴＸ核酸またはポリペプチド（例えば、配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいはこれらのポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、配列番号３または配列番号５））の投与は、任意の増殖性副作用が最小化されるように、用量が制御されることが意図される。
【００８２】
本発明はまた、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチド、成熟ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチドの改変体、成熟および成熟改変体のＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチドのフラグメント、ならびにこれらのポリペプチドおよびフラグメントをコードする核酸を含み得る。本明細書中において使用される場合、本発明において開示されるＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態は、天然に存在するポリペプチドまたは前駆体形態またはプロタンパク質の産物である。天然に存在するポリペプチド、前駆体、またはプロタンパク質としては、非制限的な例として、対応する遺伝子によってコードされる全長遺伝子産物が挙げられる。いくつかの実施形態において、成熟形態は、本明細書中に記載されるオープンリーディングフレームによってコードされる、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチド、前駆体、またはプロタンパク質を含む。産物「成熟」形態が生じ得、例えば、１つ以上の天然に存在するプロセシング工程が細胞または宿主細胞内（ここにおいて、遺伝子産物が生じる）で起こり得る場合に、その工程の結果として生じる。
【００８３】
ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態を生じるこのようなプロセシング工程の例としては、オープンリーディングフレームの開始コドンによってコードされるＮ末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドもしくはリーダー配列のタンパク質分解性の切断が挙げられる。従って、残基１〜Ｎ（ここで、残基１は、Ｎ末端メチオニンである）を有するＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態は、Ｎ末端のメチオニンの除去後、残りの残基２〜Ｎを有する。あるいは、残基１〜Ｎを有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態（ここで、残基１〜残基ＭまでのＮ末端シグナル配列が切断される）は、残りの残基Ｍ＋１〜残基Ｎまでの残基を有する。さらに、「成熟」タンパク質またはフラグメントは、初期メチオニンの除去またはシグナルペプチドの除去ではなく、切断事象から生じ得る。さらに本明細書中で使用される場合、「成熟」形態のＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチドまたはタンパク質は、タンパク質分解切断事象ではなく、翻訳後修飾の工程から生じ得る。このようなさらなるプロセスとしては、非限定的な例として、グリコシル化、ミリスチル化またはリン酸化が挙げられる。一般的に、成熟ポリペプチドまたはタンパク質は、これらのプロセスの１つのみの操作から生じ得るか、またはそれらのいずれかの組み合わせから生じ得る。
【００８４】
本明細書中で使用される場合、「同一な」残基は、等価なヌクレオチド塩基または２つの配列のアラインメントにおけるアミノ酸残基が同じ残基である２つの配列間の比較におけるこれらの残基に対応する。１つのアラインメント中の２つの配列間の比較が、比較における等価な位置における残基が、以下に規定される同じアミノ酸または保存されたアミノ酸のいずれかであることを示す場合に、残基は、「類似」または「ポジティブ」として代替的に記載される。
【００８５】
ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ核酸、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチドまたはその一部をコードする単離された核酸、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチド、これらの核酸を含むベクター、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ核酸で形質転換された宿主細胞、抗ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ抗体、ならびに薬学的組成物は、本発明の範囲内に含まれる。ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチドを作製する方法、ならびにこれらの化合物を使用する、スクリーニング方法、診断方法、処置方法、ならびにＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチド活性を調節する化合物をスクリーニングする方法もまた、開示される。ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ核酸およびポリペプチド、ならびに本明細書中で開示されるＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ抗体、治療剤および薬学的組成物は、炎症性状態および組織増殖に関連した障害を処置する際に特に有用である。
【００８６】
（ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ核酸およびポリペプチド）
本発明のＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ核酸およびポリペプチドの概要を、表１３において提供する。
【００８７】
（表１３．本発明の核酸およびタンパク質の概要）
【００８８】
【表１３】
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本発明の１つの局面は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性な部分をコードする単離された核酸分子に関する。ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸコード核酸（例えば、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ  ｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分な核酸フラグメント、ならびにＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ核酸分子の増幅および／または突然変異のためのＰＣＲプライマーとして使用するのに十分なフラグメントもまた、本発明に含まれる。本明細書中で使用される場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを使用して作製されるＤＮＡまたはＲＮＡのアナログ、ならびにそれらの誘導体、フラグメントおよびホモログを含むことを意図する。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００８９】
ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ核酸分子は、成熟ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチドをコードし得る。本明細書中において使用される場合、本発明において開示されるポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態は、天然に存在するポリペプチドまたは前駆体形態またはプロタンパク質の産物である。天然に存在するポリペプチド、前駆体、またはプロタンパク質としては、非制限的な例として、対応する遺伝子によってコードされる全長遺伝子産物が挙げられる。あるいは、これは、本明細書中に記載されるＯＲＦによってコードされる、ポリペプチド、前駆体、またはプロタンパク質として定義され得る。産物「成熟」形態が生じ、さらに非制限的な例として、１つ以上の天然に存在するプロセシング工程が細胞または宿主細胞内（ここにおいて、遺伝子産物が生じる）で起こり得る場合に、その工程の結果として生じる。ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態を生じるこのようなプロセシング工程の例としては、ＯＲＦの開始コドンによってコードされるＮ末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドもしくはリーダー配列のタンパク質分解性の切断が挙げられる。従って、残基１〜Ｎ（ここで、残基１は、Ｎ末端メチオニンである）を有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態は、Ｎ末端のメチオニンの除去後、残りの残基２〜Ｎを有する。あるいは、残基１〜Ｎを有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態（ここで、残基１〜残基ＭまでのＮ末端シグナル配列が切断される）は、残りの残基Ｍ＋１〜残基Ｎまでの残基を有する。本明細書中でさらに使用される場合、「成熟」形態のポリペプチドまたはタンパク質は、タンパク質分解事象ではなく、翻訳後修飾の工程から生じ得る。このようなさらなるプロセスとしては、非限定的な例として、グリコシル化、ミリスチル化またはリン酸化が挙げられる。一般的に、成熟ポリペプチドまたはタンパク質は、これらのプロセスの１つのみの操作から生じ得るか、またはそれらのいずれかの組み合わせから生じ得る。
【００９０】
用語「プローブ」とは、本明細書中で使用される場合、種々の長さの核酸配列をいい、好ましくは、用途に依存して、少なくとも約１０ヌクレオチド（ｎｔ）、１００ｎｔ、または例えば、約６，０００ｎｔほどの大きさの間である。プローブは、同一、類似または相補的な核酸配列の検出において使用される長いプローブは、一般的には、天然供給源または組換え供給源から得られ、非常に特異的であり、そして短いオリゴマープローブよりもはるかに遅くハイブリダイズする。プローブは、一本鎖または二本鎖であり得、そしてＰＣＲ、メンブレンベースのハイブリダイゼーション技術またはＥＬＩＳＡのような技術において特異性を有するように設計される。
【００９１】
用語「単離された」核酸分子は、本明細書中で使用される場合、この核酸の天然の供給源中に存在するその他の核酸分子とは異なるものである。好ましくは、「単離された」核酸は、この核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中でこの核酸に天然に隣接する配列（すなわち、この核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、種々の実施形態において、単離されたＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ核酸分子は、この核酸が由来する細胞／組織（例えば、脳、心臓、肝臓、膵臓など）のゲノムＤＮＡ中でこの核酸に天然で隣接する、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含み得る。さらに、「単離された」核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）は、組換え技術により産生される場合、その他の細胞物質または培養培地を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合、化学物質前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に含まないものであり得る。
【００９２】
本発明の核酸分子（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３のヌクレオチド配列を有する核酸分子、または前に言及されたこれらのヌクレオチド配列の相補体）は、標準的な分子生物学的技術および本明細書で提供される配列情報を用いて単離され得る。ハイブリダイゼーションプローブとして、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３の核酸配列の全部または一部を使用して、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ分子は、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌら、（編）、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３に記載されるように）を用いて単離され得る。
【００９３】
本発明の核酸は、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って、テンプレートとしてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいはゲノムＤＮＡ、および適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅され得る。このように増幅された核酸は、適切なベクター中にクローン化され、そしてＤＮＡ配列分析により特徴付けられ得る。さらに、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術、例えば、自動化ＤＮＡ合成機を用いることにより調製され得る。
【００９４】
用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で用いられる場合、一連の連結されたヌクレオチド残基をいい、このオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応で用いられるに十分な数のヌクレオチド塩基を有する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム配列もしくはｃＤＮＡ配列に基づき得るか、またはそれから設計され得、そして特定の細胞もしくは組織において、同一、類似もしくは相補的ＤＮＡｍもしくはＲＮＡを増幅し、確認し、もしくはその存在を示すために用いられる。オリゴヌクレオチドは、約１０ｎｔ、５０ｎｔ、または１００ｎｔの長さ、好ましくは約１５ｎｔ〜３０ｎｔの長さを有する核酸配列の部分を含む。本発明の１つの実施形態において、１００ｎｔより少ない長さの核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、さらに、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３の少なくとも６個連続するヌクレオチド、またはその相補体を含む。オリゴヌクレオチドは、化学合成され得、そしてプローブとしても用いられ得る。
【００９５】
別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３に示されるヌクレオチド配列またはこのヌクレオチド配列の一部分（例えば、プローブまたはプライマーとして使用され得るフラグメント、あるいはＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードするフラグメント）の相補体である核酸分子を含む。配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３に示されるヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３に示されるヌクレオチド配列に十分相補的である核酸分子であり、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３に示される核酸配列に対しミスマッチがほとんどまたは全くなく水素結合し得、それによって安定な二本鎖を形成する。
【００９６】
用語「相補的」は、本明細書で使用される場合、核酸分子のヌクレオチド単位間のＷａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成をいい、そして用語「結合」は、２つのポリペプチドもしくは化合物または関連ポリペプチドもしくは化合物またはその組み合わせ間の物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合は、イオン性、非イオン性、ファンデルワールス性、疎水性相互作用などを含む。物理的相互作用は直接的であるかまたは間接的であり得る。間接的相互作用は、別のポリペプチドまたは化合物を介するか、またはその効果に起因し得る。直接的結合は、別のポリペプチドもしくは化合物を介して、またはその効果に起因して生じない、他の実質的な化学的中間体がない相互作用をいう。
【００９７】
本明細書中に提供されるフラグメントは、少なくとも６個の（連続する）核酸配列または少なくとも４個の（連続する）アミノ酸配列（それぞれ、核酸の場合には、特異的ハイブリダイゼーションを可能にし、またはアミノ酸の場合には、エピトープの特異的な認識を可能にするに十分な長さ）の配列として定義され、そして全長配列未満のせいぜいいくらかの部分である。フラグメントは、選択された核酸配列またはアミノ酸配列の任意の連続する部分に由来し得る。誘導体は、直接的にかまたは改変もしくは部分的置換によってかのいずれかでネイティブな化合物から形成される核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、ネイティブな化合物に類似する構造を有する（しかし、同一ではない）が、特定の成分または側鎖に関してそれとは異なる核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、合成物であり得るか、または進化的に異なる起源に由来し得、そして野生型と比較して、類似の代謝活性または反対の代謝活性を有し得る。ホモログは、異なる種由来の特定の遺伝子の核酸配列またはアミノ酸配列である。
【００９８】
誘導体およびアナログは、以下に記載のように、誘導体またはアナログが、修飾された核酸またはアミノ酸を含む場合、全長、または全長以外のものであり得る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体またはアナログとしては、種々の実施形態において、同一の大きさの核酸またはアミノ酸配列にわたって、または整列した配列と比較した場合（この整列は、当該分野で公知であるコンピューター相同性プログラムによって実施される）、少なくとも約７０％、８０％、もしくは９５％の同一性（好ましい同一性は、８０〜９５％）で、本発明の核酸もしくはタンパク質に実質的に相同であるか、あるいはそのコードする核酸がストリンジェントな条件下で、中程度にストリンジェントな条件下で、または低いストリンジェント条件下で上記のタンパク質をコードする配列の相補体にハイブリダイズし得る、領域を含む分子が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３、および以下を参照のこと。
【００９９】
「相同な核酸配列」もしくは「相同なアミノ酸配列」、またはその改変体とは、上記で議論したように、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルにおける相同性によって特徴付けられる配列をいう。相同なヌクレオチド配列は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチドのアイソフォームをコードする配列をコードする。アイソフォームは、例えば、ＲＮＡの選択的スプライシングの結果として、同じ生体の異なる組織において発現され得る。あるいは、アイソフォームは、異なる遺伝子によってコードされ得る。本発明において、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の種（脊椎動物が挙げられるが、これに限定されず、従って、例えば、カエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよび他の生体が挙げられ得る）のＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。相同なヌクレオチド配列はまた、天然に生じる対立遺伝子改変体および本明細書に記載されるヌクレオチド配列の改変体が挙げられるが、これらに限定されない。しかし、相同なヌクレオチド配列は、ヒトＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質をコードする正確なヌクレオチド配列を含まない。相同な核酸配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３の保存的アミノ酸置換（以下を参照のこと）、ならびにＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの生物学的活性を有するポリペプチドをコードするこれらの核酸配列を含む。ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の種々の生物学的活性は、以下に記載されている。
【０１００】
「同一な」残基は、本明細書中で使用される場合、等価なヌクレオチド塩基または２つの配列のアラインメントにおけるアミノ酸残基が同じ残基である２つの配列間の比較におけるこれらの残基に対応する。１つのアラインメント中の２つの配列間の比較が、比較における等価な位置における残基が、以下に規定される同じアミノ酸または保存されたアミノ酸のいずれかであることを示す場合に、残基は、「類似」または「ポジティブ」として代替的に記載される。
【０１０１】
ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチドは、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ核酸のオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）によってコードされる。ＯＲＦは、ポリペプチドに潜在的に翻訳され得るヌクレオチド配列に対応する。ＯＲＦを含む核酸の伸長は、終止コドンまで連続している。全長タンパク質に対するコーディング配列を示すＯＲＦは、ＡＴＧ「開始」コドンで始まり、３つの「終止」コドン（すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）のうちの１つで終結する。本発明の目的のために、ＯＲＦは、開始コドン、終止コドン、またはそれらの両方を有するかまたは有さない、コーディング配列の任意の部分であり得る。本物の（ｂｏｎａ  ｆｉｄｅ）細胞タンパク質をコードするための良好な候補物として考慮されるＯＲＦに関して、最小サイズの必要条件（例えば、５０アミノ酸以上のタンパク質をコードするＤＮＡの伸長）が、しばしば設定される。
【０１０２】
ヒトＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子のクローニングから決定されたヌクレオチド配列は、他の細胞型（例えば、他の組織由来）におけるＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸホモログ、ならびに他の脊椎動物由来のＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸホモログを同定および／またはクローニングする際の使用のために設計されるプローブおよびプライマーの作製を可能にする。このプローブ／プライマーは、代表的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチドは、代表的には、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３；または配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；あるいは配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３の天然に存在する改変体の少なくとも約１２個、約２５個、約５０個、約１００個、約１５０個、約２００個、約２５０個、約３００個、約３５０個または約４００個の連続するセンス鎖ヌクレオチド配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
【０１０３】
ヒトＦＧＦ−ＣＸヌクレオチド配列および／またはヒトＦＣＴＲＸヌクレオチド配列に基づくプローブは、同じタンパク質または相同なタンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出するために用いられ得る。種々の実施形態において、このプローブは、これらに結合する標識基をさらに含み得る（例えば、標識基は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る）。このようなプローブは、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質を誤って発現する細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として、例えば、被験体からの細胞のサンプルにおけるＦＧＦ−ＣＸコード核酸および／またはＦＣＴＲＸコード核酸のレベルを測定する（例えば、ＦＧＦ−ＣＸｍＲＮＡレベルおよび／またはＦＣＴＲＸ  ｍＲＮＡレベルを検出するか、ゲノムＦＧＦ−ＣＸ遺伝子および／またはゲノムＦＣＴＲＸ遺伝子が変異しているか、または欠失しているか否かを決定する）ことにより用いられ得る。
【０１０４】
「ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチドの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」とは、用量依存性であってもそうでなくても、特定の生物学的アッセイにおいて測定される、本発明のポリペプチドの活性に類似するが、この活性に必ずしも同一ではない活性を示すポリペプチド（成熟形態を含む）をいう。「ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントは、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの生物学的活性（ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質の生物学的活性は以下に記載される）を有するポリペプチドをコードする配列番号１、３、５、７、９、１１および１３の一部分を単離し、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質のコードされた部分を（例えば、インビトロでの組換え発現により）発現し、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのコードされた部分の活性を評価することにより、調製され得る。
【０１０５】
（ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの核酸およびポリペプチドの改変体）
本発明はさらに、遺伝コードの縮重に起因して、配列番号１、３、５、７、９、１１および１３に示されるヌクレオチド配列とは異なり、従って、配列番号１、３、５、７、９、１１および１３に示されるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質と同じＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質をコードする核酸分子を包含する。別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【０１０６】
配列番号１、３、５、７、９、１１および１３に示されるヒトＦＧＦ−ＣＸヌクレオチド配列および／またはヒトＦＣＴＲＸヌクレオチド配列に加えて、このＦＧＦ−ＣＸポリペプチドおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチドのアミノ酸配列における変化を導くＤＮＡ配列多型が、集団（例えば、ヒト集団）内に存在し得ることが、当業者によって理解される。ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子および／またはＦＣＴＲＸ遺伝子中のこのような遺伝的多型は、天然の対立遺伝子のバリエーションに起因して、集団内の個体間に存在し得る。本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質、好ましくは脊椎動物のＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子をいう。このような天然の対立遺伝子のバリエーションは、代表的には、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子および／またはＦＣＴＲＸ遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％の分散を生じ得る。天然の対立遺伝子バリエーションの結果であり、かつこのＦＧＦ−ＣＸポリペプチドおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチドの機能的活性を変化させない、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチド内の任意および全てのこのようなヌクレオチドのバリエーションならびに得られるアミノ酸多型は、本発明の範囲内であると意図される。
【０１０７】
さらに、他の種由来のＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質をコードし、従って、ヒトの配列番号１、３、５、７、９、１１および１３とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあることが意図される。本発明のＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのｃＤＮＡの天然の対立遺伝子改変体およびホモログに対応する核酸分子は、本明細書中に開示されるヒトＦＧＦ−ＣＸ核酸および／またはＦＣＴＲＸ核酸に対するその相同性に基づいて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標準的なハイブリダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡまたはその一部を用いて単離され得る。
【０１０８】
従って、別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも６ヌクレオチド長であり、そしてストリンジェント条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１および１３のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズする。別の実施形態では、この核酸は、少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、または２０００以上のヌクレオチド長である。なお別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、コード領域にハイブリダイズする。本明細書中で用いられる場合、用語「ストリンジェント条件下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄に関して、互いに少なくとも６０％相同なヌクレオチド配列が代表的には互いにハイブリダイズしたまま残る条件を記載することを意図する。
【０１０９】
ホモログ（すなわち、ヒト以外の種由来のＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質をコードする核酸）または他の関連配列（例えば、パラログ）は、特定のヒト配列の全てまたは一部をプローブとし、核酸ハイブリダイゼーションおよびクローニングに関して当該分野で周知の方法を使用して、低い、中程度の、または高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションによって入手され得る。
【０１１０】
本明細書で用いられる場合、語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、その条件下で、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが、その標的配列にハイブリダイズするが、その他の配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる状況で異なる。より長い配列は、より短い配列より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで、特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。このＴｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下）温度である。標的配列は一般に過剰で存在するので、Ｔｍでは、５０％のプローブが平衡状態で占有されている。代表的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオンより低く、代表的には約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン（またはその他の塩）であり、そして温度が、短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ）については、少なくとも約３０℃、そしてより長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドについては、少なくとも約６０℃であるような条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような、不安定化剤の添加で達成され得る。
【０１１１】
ストリンジェント条件は、当業者に公知であり、そしてＡｕｓｕｂｅｌら（編），ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出され得る。好ましくは、この条件は、互いに少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％または約９９％相同な配列が、代表的には互いにハイブリダイズしたまま残るような条件である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％  ＢＳＡ、および５００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中での６５℃でのハイブリダイゼーションであり、これは続いて、０．２×ＳＳＣ、０．０１％  ＢＳＡ中での５０℃での１回以上の洗浄を行う。ストリンジェント条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１および１３の配列にハイブリダイズする、本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書中で使用される場合、「天然に存在する」核酸分子とは、天然に存在する（例えば、天然のタンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有する、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子をいう。
【０１１２】
第２の実施形態では、配列番号１、３、５、７、９、１１および１３のヌクレオチド配列、またはそれらのフラグメント、アナログもしくは誘導体を含む核酸分子に、中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列が提供される。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、５５℃での６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％  ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中でのハイブリダイゼーション、続いて１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中での３７℃での１回以上の洗浄である。用いられ得る中程度のストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹおよびＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照のこと。
【０１１３】
第３の実施形態では、配列番号１、３、５、７、９、１１および１３のヌクレオチド配列、またはそれらのフラグメント、アナログもしくは誘導体を含む核酸分子に、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る核酸が提供される。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％  ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（重量／容量）デキストラン硫酸中での４０℃でのハイブリダイゼーション、続いて２×ＳＳＣ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１％  ＳＤＳ中での５０℃での１回以上の洗浄である。用いられ得る低ストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である（例えば、種交差ハイブリダイゼーションについて用いられるような条件）。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹならびにＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：６７８９−６７９２を参照のこと。
【０１１４】
（保存的変異）
集団中に存在し得る、ＦＧＦ−ＣＸ配列および／またはＦＣＴＲＸ配列の天然に存在する対立遺伝子改変体に加えて、配列番号１、３、５、７、９、１１および１３のヌクレオチド配列への変異によって変化が導入され得、それによって、このＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質の機能的能力を変更することなく、コードされるＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質のアミノ酸配列に変化がもたらされることを、当業者はさらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基にてアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換は、配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４の配列において行われ得る。「非必須」アミノ酸残基は、その生物学的活性を変更することなく、このＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質の野生型配列から変更され得る残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、このような生物学的活性に必要とされる。例えば、本発明のＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質の間で保存されているアミノ酸残基は、特に変更を受け入れ難いと予測される。保存的置換がなされ得るアミノ酸は、当該分野で周知である。
【０１１５】
本発明の別の局面は、活性に必須ではないアミノ酸残基における変化を含む、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４のアミノ酸配列とは異なるが、生物学的活性をなお保持する。１つの実施形態では、単離された核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、このタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４のアミノ酸配列に少なくとも約４５％相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、この核酸分子によってコードされるタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４に対して少なくとも約６０％相同であり；より好ましくは配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４に対して少なくとも約７０％相同であり；なおより好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４に対してして少なくとも約８０％相同であり；なおより好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４に対して少なくとも約９０％相同であり；そして最も好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４に対して少なくとも約９５％相同である。
【０１１６】
配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４のタンパク質に相同なＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質をコードする単離された核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１および１３のヌクレオチド配列に１以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより作製され得、その結果、１以上のアミノ酸の置換、付加または欠失が、このコードされるタンパク質に導入される。
【０１１７】
変異は、標準技術（例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）によって配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４に導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、１以上の推定非必須アミノ酸残基にて作製される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される、アミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーとしては、以下が挙げられる：塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アルパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）。従って、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質中の推定非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖のファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形態では、変異は、ＦＧＦ−ＣＸコード配列および／またはＦＣＴＲＸコード配列の全てまたは一部に沿って（例えば、飽和変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって）ランダムに導入され得、そして得られる変異体は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの生物学的活性についてスクリーニングされて、活性を維持する変異体を同定し得る。配列番号１、３、５、７、９、１１および１３の変異誘発に続いて、コードされるタンパク質は、当該分野で公知の任意の組換え技術によって発現され得、そしてこのタンパク質の活性が決定され得る。
【０１１８】
アミノ酸ファミリーの関連性はまた、側鎖の相互作用に基づいて決定され得る。置換されたアミノ酸は、完全に保存された「強い」残基または完全に保存された「弱い」残基であり得る。保存されたアミノ酸残基の「強い」群は、以下の群のいずれかであり得る：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷ（ここで、一文字アミノ酸コードは、互いに置換され得るこれらのアミノ酸残基によりグループ化される）。同様に、保存された残基の「弱い」群は、以下のいずれか１つであり得る：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＶＬＩＭ、ＨＦＹ（ここで、各群内の文字は、一文字アミノ酸コードを表す）。
【０１１９】
１つの実施形態では、変異体ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質は、以下についてアッセイされ得る：（ｉ）他のＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質、他の細胞表面タンパク質、または生物学的に活性なそれらの部分と、タンパク質：タンパク質相互作用を形成する能力、（ｉｉ）変異体ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質と、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのリガンドとの間の複合体形成；または（ｉｉｉ）変異体ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質が細胞内標的タンパク質またはその生物学的に活性な部分に結合する能力；（例えば、アビジンタンパク質）。
【０１２０】
なお別の実施形態において、変異体ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質は、特定の生物学的機能を調節する能力（例えば、インスリン放出の調節）についてアッセイされ得る。
【０１２１】
（アンチセンス核酸）
本発明の別の局面は、配列番号１、３、５、７、９、１１および１３またはそのフラグメント、アナログもしくは誘導体のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズし得るかまたは相補的である、単離されたアンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的である（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるかまたはｍＲＮＡ配列に相補的である）ヌクレオチド配列を含む。特定の局面では、少なくとも約１０、約２５、約５０、約１００、約２５０もしくは約５００ヌクレオチドまたはＦＧＦ−ＣＸコード鎖および／またはＦＣＴＲＸコード鎖の全体、またはそれらの一部のみに相補的な配列を含む、アンチセンス核酸分子が提供される。配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは１４のＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質のフラグメント、ホモログ、誘導体およびアナログをコードする核酸分子、または配列番号１、３、５、７、９、１１および１３のＦＧＦ−ＣＸ核酸配列および／またはＦＣＴＲＸ核酸配列に相補的なアンチセンス核酸がさらに提供される。
【０１２２】
１つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。用語「コード領域」とは、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含む、ヌクレオチド配列の領域をいう。別の実施形態では、このアンチセンス核酸分子は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。用語「非コード領域」とは、コード領域に隣接する、アミノ酸に翻訳されない、５’配列および３’配列をいう（すなわち、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域ともいわれる）。
【０１２３】
本明細書中に開示されるＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質をコードするコード鎖配列を考慮すれば、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎの塩基対形成の規則に従って設計され得る。アンチセンス核酸分子は、ＦＧＦ−ＣＸ  ｍＲＮＡおよび／またはＦＣＴＲＸ  ｍＲＮＡのコード領域全体に相補的であり得るが、より好ましくは、ＦＧＦ−ＣＸ  ｍＲＮＡおよび／またはＦＣＴＲＸ  ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部にのみアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＦＧＦ−ＣＸ  ｍＲＮＡおよび／またはＦＣＴＲＸ  ｍＲＮＡの翻訳開始部位を取り囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５または約５０ヌクレオチドの長さであり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用いて、化学的合成または酵素連結反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、またはこの分子の生物学的安定性を増大させるように、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計された種々に改変されたヌクレオチドを用いて化学的に合成され得る（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが用いられ得る）。
【０１２４】
アンチセンス核酸を作製するために用いられ得る改変されたヌクレオチドの例としては以下が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、５−メチルウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、２，６−ジアミノプリン、（ａｃｐ３）ｗおよび３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル。あるいは、このアンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされた発現ベクターを用いて生物学的に生成され得る（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、以下の小節にさらに記載されるように、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である）。
【０１２５】
本発明のアンチセンス核酸分子は、代表的には被験体に投与されるか、またはインサイチュで生成され、その結果それらは、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、またはそれに結合し、それによってこのタンパク質の発現を阻害する（例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって）。このハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によってか、または例えばＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの主溝における特異的相互作用を介してであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位での直接的注射が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的化するように改変され得、次いで全身に投与され得る。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子は、選択された細胞表面上に発現されたレセプターまたは抗原にそれらが特異的に結合するように改変され得る（例えば、そのアンチセンス核酸分子を細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結することによって）。このアンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に記載されるベクターを用いて細胞に送達され得る。十分な核酸分子を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ  ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれているベクター構築物が、好ましい。
【０１２６】
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、ここで、通常のβ−ユニットとは対照的に、これらの鎖は、互いに平行に延びる（例えば、Ｇａｕｌｔｉｅｒら，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１を参照のこと）。このアンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（例えば、Ｉｎｏｕｅら，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１〜６１４８を参照のこと）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（例えば、Ｉｎｏｕｅら，１９８７，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７〜３３０を参照のこと）を含み得る。
【０１２７】
（リボザイムおよびＰＮＡ部分）
核酸の改変としては、非制限的な例として、改変塩基、および糖リン酸骨格が改変または誘導体化された核酸が挙げられる。これらの改変は、少なくとも一部は、改変された核酸の化学的安定性を増強するために実施され、その結果、それらは、例えば、被験体での治療的適用におけるアンチセンス結合核酸として使用され得る。
【０１２８】
１つの実施形態において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を切断し得るリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子であり、これらは、その一本鎖核酸に対して相補領域を有する。従って、リボザイム（例えば、ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ  １９８８．Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１に記載されるハンマーヘッド型リボザイム）を使用して、ＦＧＦ−ＣＸ  ｍＲＮＡ転写物および／またはＦＣＴＲＸ  ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによってＦＧＦ−ＣＸ  ｍＲＮＡおよび／またはＦＣＴＲＸ  ｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＦＧＦ−ＣＸをコードする核酸および／またはＦＣＴＲＸをコードする核酸に特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示されるＦＧＦ−ＣＸ  ｃＤＮＡおよび／またはＦＣＴＲＸ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１、３、５、７、９、１１および１３）に基づいて設計され得る。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、ＦＧＦ−ＣＸをコードするｍＲＮＡおよび／またはＦＣＴＲＸをコードするｍＲＮＡ内で切断されるヌクレオチド配列に相補的である、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）Ｌ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体が構築され得る。例えば、Ｃｅｃｈらの米国特許第４，９８７，０７１号およびＣｅｃｈらの米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。ＦＧＦ−ＣＸ  ｍＲＮＡおよび／またはＦＣＴＲＸ  ｍＲＮＡをまた使用して、ＲＮＡ分子のプールから、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択し得る。例えば、Ｂａｒｔｅｌら、（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１〜１４１８を参照のこと。
【０１２９】
あるいは、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子発現および／またはＦＣＴＲＸ遺伝子発現は、ＦＧＦ−ＣＸ核酸および／またはＦＣＴＲＸ核酸の調節領域（例えば、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化し、標的細胞中でＦＧＦ−ＣＸ遺伝子および／またはＦＣＴＲＸ遺伝子の転写を妨害する三重らせん構造を形成することによって阻害され得る。例えば、Ｈｅｌｅｎｅ，１９９１．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．６：５６９〜８４；Ｈｅｌｅｎｅら．１９９２．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６；Ｍａｈｅｒ，１９９２．Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １４：８０７−１５を参照のこと。
【０１３０】
種々の実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸ核酸および／またはＦＣＴＲＸ核酸は、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格で改変され、例えば、その分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは可溶性を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を改変して、ペプチド核酸を生成し得る（例えば、Ｈｙｒｕｐら，１９９６．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４：５−２３を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格が偽ペプチド骨格によって置換され、そして４つの天然の核酸塩基のみが保持されている核酸模倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）をいう。ＰＮＡの中性の骨格は、低いイオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐら，１９９６．前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら，１９９６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１４６７０−１４６７５において記載されるような標準的固相ペプチド合成プロトコルを用いて行われ得る。
【０１３１】
ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのＰＮＡは、治療的適用および診断的適用において使用され得る。例えば、ＰＮＡは、例えば転写または翻訳の停止を誘導することまたは複製を阻害することによる、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンスまたは抗遺伝子（ａｎｔｉｇｅｎｅ）剤として使用され得る。ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのＰＮＡはまた、例えばＰＮＡ指向性ＰＣＲクランピング（ｃｌａｍｐｉｎｇ）による遺伝子における一塩基対変異の分析において；他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）と組み合わせて使用される場合の人工制限酵素として（Ｈｙｒｕｐら，１９９６．前出を参照のこと）；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのプローブもしくはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐら，１９９６，前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら，１９９６，前出を参照のこと）、使用され得る。
【０１３２】
別の実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのＰＮＡは、例えば、それらの安定性または細胞性取り込みを増強するために、ＰＮＡに親油基または他のヘルパー基を結合することによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、またはリポソームもしくは当該分野において公知の薬物送達の他の技術の使用によって改変され得る。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組合せ得る、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのＰＮＡ−ＤＮＡキメラが生成され得る。ＰＮＡ部分が高い結合親和性および特異性を提供する一方で、そのようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮａｓｅ  ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用するのを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基のスタッキング、核酸塩基間の結合数および方向を考慮して選択される適切な長さのリンカーを使用して連結され得る（Ｈｙｒｕｐら，１９９６，前出を参照のこと）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐら，１９９６，前出およびＦｉｎｎら，１９９６，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２４：３３５７−３３６３において記載されるように行われ得る。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホルアミダイトカップリング化学を用いて固体支持体上で合成され得、そして改変されたヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイト）が、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間に使用され得る（例えば、Ｍａｇら，１９８９，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １７：５９７３〜５９８８を参照のこと）。次いで、ＰＮＡモノマーが段階様式でカップリングされ、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する（例えば、Ｆｉｎｎら，１９９６，前出を参照のこと）。あるいは、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを用いて、キメラ分子が合成され得る。例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅｎら，１９７５、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９〜１１１２４を参照のこと。
【０１３３】
他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、以下のような他の付属の基を含み得る：ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的化するため）、または細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８〜６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）、もしくは血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）を横切る輸送を容易にする因子。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８〜９７６を参照のこと）、またはインターカレート剤（例えば、Ｚｏｎ，１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９を参照のこと）で改変され得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤など）に結合され得る。
【０１３４】
（ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチド）
本発明に従うポリペプチドは、その配列が配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４に提供されるＦＧＦ−ＣＸポリペプチドおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明はまた、なおそのＦＧＦ−ＣＸおよび／もしくはＦＣＴＲＸの活性ならびに生理学的機能を維持するタンパク質、またはその機能的フラグメントをコードする一方で、その任意の残基が配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４に示される対応する残基から変化し得る、変異体または改変体タンパク質を含む。
【０１３５】
一般に、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ様機能を保持するＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ改変体は、配列中の特定位置の残基が他のアミノ酸により置換され、そしてさらに、親タンパク質の２つの残基間にさらなる残基を挿入する可能性、および親配列から１つ以上の残基を欠失する可能性を含む任意の改変体を含む。任意のアミノ酸置換、挿入または欠失が、本発明に包含される。好適な状況では、この置換は、上記で規定されるような保存的置換である。
【０１３６】
本発明の１つの局面は、単離されたＦＧＦ−ＣＸおよび／もしくはＦＣＴＲＸタンパク質、ならびにその生物学的に活性な部分、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに関する。抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体および／または抗ＦＣＴＲＸ抗体を惹起するための免疫原としての使用のために適切なポリペプチドフラグメントもまた提供される。１つの実施形態において、ネイティブなＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を用いる適切な精製スキームによって、細胞または組織供給源から単離され得る。別の実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって産生される。組換え発現に代わるものとして、ＦＧＦ−ＣＸおよび／もしくはＦＣＴＲＸタンパク質またはポリペプチドが、標準的なペプチド合成技術を用いて化学合成され得る。
【０１３７】
「単離された」または「精製された」ポリペプチドまたはタンパク質あるいはこれらの生物学的に活性な部分は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／もしくはＦＣＴＲＸタンパク質の由来する細胞または組織供給源由来の細胞性物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学合成される場合に化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質が単離または組換え産生される細胞の細胞性成分から、このタンパク質が分離されているＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態において、用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、非ＦＧＦ−ＣＸおよび／または非ＦＣＴＲＸタンパク質（本明細書中において「夾雑タンパク質」ともいわれる）を（乾燥重量にて）約３０％未満、より好ましくは非ＦＧＦ−ＣＸおよび／または非ＦＣＴＲＸタンパク質の約２０％未満、なおより好ましくは非ＦＧＦ−ＣＸおよび／または非ＦＣＴＲＸタンパク質の約１０％未満、そして最も好ましくは非ＦＧＦ−ＣＸおよび／または非ＦＣＴＲＸタンパク質の約５％未満を有する、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の調製物を含む。ＦＧＦ−ＣＸおよび／もしくはＦＣＴＲＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え産生される場合、好ましくは、調製物はまた培養培地を実質的に含まない、すなわち、培養培地は、そのＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質調製物の容量の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは約５％未満に相当する。
【０１３８】
用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、タンパク質が、そのタンパク質の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離されるＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態において、用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、化学前駆体または非ＦＧＦ−ＣＸおよび／もしくは非ＦＣＴＲＸの化学物質の約３０％未満（乾燥重量にて）、より好ましくは化学前駆体または非ＦＧＦ−ＣＸおよび／もしくは非ＦＣＴＲＸ化学物質の約２０％未満、なおより好ましくは化学前駆体または非ＦＧＦ−ＣＸおよび／もしくは非ＦＣＴＲＸ化学物質の約１０％未満、そして最も好ましくは化学前駆体または非ＦＧＦ−ＣＸおよび／もしくは非ＦＣＴＲＸ化学物質の約５％未満を有する、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の調製物を含む。
【０１３９】
ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質より少ないアミノ酸を含み、そしてＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の少なくとも１つの活性を示す、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４に示されるアミノ酸配列）に十分に相同なアミノ酸配列、またはＦＧＦ−ＣＸおよび／もしくはＦＣＴＲＸタンパク質のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。代表的には、生物学的に活性な部分は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、長さが１０、２５、５０、１００またはそれより多いアミノ酸残基であるポリペプチドであり得る。
【０１４０】
さらに、タンパク質の他の領域が欠失している他の生物学的に活性な部分は、組換え技術によって調製され得、そしてネイティブなＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の機能的活性のうちの１つ以上について評価され得る。
【０１４１】
１つの実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４に示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４に実質的に相同であり、そして以下に詳細に記載されるように、天然の対立遺伝子改変または変異誘発に起因してアミノ酸配列が異なるが、配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４のタンパク質の機能的活性を保持する。従って、別の実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４のアミノ酸配列に少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列を含み、そして配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４のＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の機能的活性を保持するタンパク質である。
【０１４２】
（２つ以上の配列間の相同性の決定）
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の相同性の百分率を決定するために、配列は、至適な比較の目的のために整列される（例えば、ギャップは、第２のアミノ酸または核酸配列との最適な整列のために、第１のアミノ酸または核酸配列の配列中に導入され得る）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められる場合、分子は、その位置で相同である（すなわち、本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性」と等価である）。
【０１４３】
核酸配列の相同性は、２つの配列間の同一性の程度として決定され得る。相同性は、当該分野において公知のコンピュータープログラム（例えば、ＧＣＧプログラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰソフトウェア）を用いて決定され得る。ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８：４４３〜４５３を参照のこと。核酸配列比較のための以下の設定（ＧＡＰ作製ペナルティー、５．０、およびＧＡＰ伸長ペナルティー、０．３）を用いてＧＣＧ  ＧＡＰソフトウェアを使用すると、上記で言及される類似の核酸配列のコード領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１および１３に示されるＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード）部分と、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性の程度を示す。
【０１４４】
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が、特定の比較領域にわたって、残基毎を基準として同一である程度をいう。用語「配列同一性のパーセンテージ」は、以下により算出される：この比較領域にわたって最適に整列された２つの配列を比較すること、両方の配列において同一の核酸塩基（例えば、核酸の場合にはＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を導くこと、この一致した位置の数を、比較領域の内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算すること、およびその結果を１００で乗算して、配列同一性のパーセンテージを導くこと。用語「実質的な同一性」は、本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、ここで、このポリヌクレオチドは、比較領域にわたり参照配列と比較して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、そして頻繁には９０〜９５％の配列同一性、より通常には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【０１４５】
（キメラタンパク質および融合タンパク質）
本発明はまた、ＦＧＦ−ＣＸおよび／もしくはＦＣＴＲＸキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書中で使用される場合、ＦＧＦ−ＣＸおよび／もしくはＦＣＴＲＸ「キメラタンパク質」またはＦＧＦ−ＣＸおよび／もしくはＦＣＴＲＸ「融合タンパク質」は、非ＦＧＦ−ＣＸおよび／または非ＦＣＴＲＸポリペプチドに作動可能に連結された、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチドを含む。「ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチド」は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質（配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいうが、「非ＦＧＦ−ＣＸおよび／または非ＦＣＴＲＸポリペプチド」は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質に対して実質的に相同ではないタンパク質（例えば、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質とは異なり、かつ同一かまたは異なる生物体に由来するタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ融合タンパク質において、このＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチドは、ＦＧＦ−ＣＸおよび／もしくはＦＣＴＲＸタンパク質のすべてまたは一部分に対応し得る。１つの実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ融合タンパク質は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。別の実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ融合タンパク質は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。なお別の実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ融合タンパク質は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の少なくとも３つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結された」は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチドならびに非ＦＧＦ−ＣＸおよび／または非ＦＣＴＲＸポリペプチドが、インフレームで互いに融合されることを示すことが意図される。非ＦＧＦ−ＣＸおよび／または非ＦＣＴＲＸポリペプチドは、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【０１４６】
１つの実施形態において、融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＧＳＴ−ＦＣＴＲＸ融合タンパク質であり、ここではＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ配列が、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合される。このような融合タンパク質は、組換えＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチドの精製を容易にし得る。
【０１４７】
別の実施形態において、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含むＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質である。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、ＦＧＦ−ＣＸおよび／もしくはＦＣＴＲＸの発現ならびに／または分泌は、異種シグナル配列の使用を介して増加され得る。
【０１４８】
なお別の実施形態において、融合タンパク質は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ−免疫グロブリン融合タンパク質であり、ここで、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ配列が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合される。本発明のＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、薬学的組成物中に取り込まれ、そして被験体に投与されて、細胞の表面上でＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸリガントとＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質との間の相互作用を阻害し、それによってインビボのＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ媒介シグナル伝達を抑制し得る。ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を用いて、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ同族リガンドの生体利用性に影響を与え得る。ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸリガンド／ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ相互作用の阻害は、増殖障害および分化障害の両方の処置、および細胞生存を調節（例えば、促進または阻害）するために、治療的に有用であり得る。さらに、本発明のＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、被験体中で抗ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ抗体を産生するための免疫原として用いられ、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸリガンドを精製し、そしてＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸリガンドとのＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの相互作用を阻害する分子を同定するスクリーニングアッセイで用いられ得る。
【０１４９】
本発明のＦＧＦ−ＣＸおよび／もしくはＦＣＴＲＸのキメラまたは融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術により産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、従来の技術に従って、例えば、連結のための平滑末端または粘着（ｓｔａｇｇｅｒ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じて粘着（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）末端のフィルイン、所望しない連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を採用することにより、インフレームで一緒に連結する。別の実施形態において、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来技術により合成し得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、キメラ遺伝子配列を生成するために次いでアニールおよび再増幅され得る、２つの連続遺伝子フラグメント間の相補的オーバハングを生じるアンカープライマーを用いて実施し得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）。さらに、融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をすでにコードした多くの発現ベクターが市販されている。ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸをコードする核酸は、この融合部分がＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質にインフレームで連結されるように、このような発現ベクター中にクローン化され得る。
【０１５０】
（ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸアゴニストならびにＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸアンタゴニスト）
本発明はまた、ＦＧＦ−ＣＸおよび／もしくはＦＣＴＲＸアゴニスト（すなわち、模倣物）として、またはＦＧＦ−ＣＸおよび／もしくはＦＣＴＲＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の改変体に関する。ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の改変体（例えば、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の離散した点変異または短縮型）が、変異誘発により生成され得る。ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質のアゴニストは、天然に存在する形態のＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質と実質的に同じ生物学的活性、またはその生物学的活性のサブセットを保持し得る。ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質のアンタゴニストは、天然に存在する形態のＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の１つ以上の活性を、例えば、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質を含む細胞性シグナル伝達カスケードの下流または上流のメンバーに競合的に結合することにより阻害し得る。従って、特定の生物学的効果が、限られた機能の改変体を用いた処理により誘発され得る。１つの実施形態において、このタンパク質の天然に存在する形態の生物学活性のサブセットを有する改変体を用いた被験体の処置は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の天然に存在する形態を用いた処置に対して、被験体においてより少ない副作用を有する。
【０１５１】
ＦＧＦ−ＣＸおよび／もしくはＦＣＴＲＸアゴニスト（すなわち、模倣物）、またはＦＧＦ−ＣＸおよび／もしくはＦＣＴＲＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の改変体は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／もしくはＦＣＴＲＸタンパク質のアゴニストまたはアンタゴニスト活性についてＦＧＦ−ＣＸおよび／もしくはＦＣＴＲＸタンパク質の変異体（例えば短縮型変異体）のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより同定され得る。１つの実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ改変体の多彩なライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発により生成され、そして多彩な遺伝子ライブラリーによりコードされる。ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ改変体の多彩なライブラリーは、例えば、潜在的なＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、あるいは、その中にＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ配列のセットを含む（例えば、ファージディスプレイのための）より大きな融合タンパク質のセットとして発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、遺伝子配列に酵素的に連結することによって、作製され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ改変体のライブラリーを産生するために用いられ得る種々の方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学的合成は、自動化ＤＮＡ合成機中で実施され得、次いでこの合成遺伝子は、適切な発現ベクター中に連結される。遺伝子の縮重セットの使用は、１つの混合物において、潜在的なＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ配列の所望のセットをコードする配列のすべての供給を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当該分野において周知である。例えば、Ｎａｒａｎｇ，１９８３．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら，１９８４．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら，１９８４．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅら，１９８３．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと。
【０１５２】
（ポリペプチドライブラリー）
さらに、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーを用いて、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の改変体のスクリーニングならびに引き続く選択のためのＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸフラグメントの多彩な集団を生成し得る。１つの実施形態において、コード配列フラグメントのライブラリーは、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを、１分子あたり約１つのみのニックが生じる条件下で、ヌクレアーゼで処理すること、二本鎖ＤＮＡを変性させること、異なるニック産物からのセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成するためにこのＤＮＡを再生すること、Ｓ１ヌクレアーゼを用いた処理により再形成された二重鎖から一本鎖部分を除去すること、および得られるフラグメントライブラリーを発現ベクター中に連結することにより生成し得る。この方法によって、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の種々のサイズのＮ末端ならびに内部フラグメントをコードする発現ライブラリーが派生され得る。
【０１５３】
点変異または短縮により作成されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された性質を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための種々の技術が当該分野で公知である。このような技術を、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質のコンビナトリアル変異誘発により生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、高スループット分析に従う最も広く用いられる技術は、代表的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター中にクローニングすること、得られるベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、およびこのコンビナトリアル遺伝子を、所望の活性の検出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下で発現することを含む。ライブラリー中の機能的変異体の頻度を増大させる新規技術であるリクルーシブアンサンブル変異誘発（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）を、スクリーニングアッセイと組み合わせて用い、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ改変体を同定し得る。例えば、ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ，１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら，１９９３．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６：３２７−３３１を参照のこと。
【０１５４】
（抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体および／または抗ＦＣＴＲＸ抗体）
ＦＧＦ−ＣＸおよび／もしくはＦＣＴＲＸタンパク質、またはＦＧＦ−ＣＸおよび／もしくはＦＣＴＲＸタンパク質のフラグメントに対する抗体がまた本発明に含まれる。用語「抗体」とは、本明細書中で使用される場合、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原に特異的に結合（抗原と免疫反応する）抗原結合部位を含む分子）をいう。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げられるがこれらに限定されない。一般に、ヒトから得た抗体分子は、この分子に存在する重鎖の性質が互いに異なるクラスであるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのいずれかに関する。特定のクラスは、同様にサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など）を有する。さらに、ヒトにおいては、軽鎖は、κ鎖またはλ鎖であり得る。抗体に対する本明細書における言及は、ヒト抗体種のこのようなクラス、サブクラス、およびタイプの全てに対する言及を包含する。
【０１５５】
本発明の単離されたＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ関連タンパク質は、抗原、またはその部分もしくはフラグメントとして役立つように意図され得、さらに、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製のための標準的な技術を用いて、抗原に免疫特異的に結合する抗体を産生するための免疫原として用いられ得る。完全長のタンパク質が用いられ得るか、あるいは、本発明は、免疫原としての使用のための抗原の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。抗原性ペプチドフラグメントは、完全長のタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも６アミノ酸残基を含み、そしてこのペプチドに対して惹起された抗体が完全長のタンパク質またはエピトープを含む任意のフラグメントと特異的な免疫複合体を形成するように、そのエピトープを含む。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基、または少なくとも１５アミノ酸残基、または少なくとも２０アミノ酸残基、または少なくとも３０アミノ酸残基を含む。抗原性ペプチドによって包含される好ましいエピトープは、その表面に位置するタンパク質の領域である；一般的に、これらは、親水性領域である。
【０１５６】
本発明の特定の実施形態において、抗原性ペプチドに含まれる少なくとも１つのエピトープは、タンパク質の表面上に位置するＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ関連タンパク質の領域、例えば、親水性領域である。ヒトのＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ関連タンパク質配列の疎水性分析は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ関連タンパク質のどの領域が特に親水性であり、従って、抗体産生を標的するための有用な表面残基をコードしそうであるかを示す。抗体産生を標的する手段として、親水性および疎水性の領域を示すヒドロパシープロットを、例えば、フーリエ変換を伴うかまたは伴わないかのいずれかの、Ｋｙｔｅ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ法またはＨｏｐｐ  Ｗｏｏｄｓ法を含む、当該分野で周知の任意の方法により生成し得る（例えば、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：３８２４−３８２８；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ  １９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１４２を参照のこと（これらの各々は、本明細書中にその全体が参考として援用される））。抗原性タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログ内の１つ以上のドメインに対して特異的な抗体はまた、本明細書中で提供される。
【０１５７】
本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）は、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の産生における免疫原として利用され得る。
【０１５８】
当該分野において公知の種々の手順が、本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオルソログに対して指向されるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の産生のために使用され得る（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。これらの抗体のうちのいくつかは、以下で考察される。
【０１５９】
（ポリクローナル抗体）
ポリクローナル抗体の産生のために、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の動物）は、ネイティブなタンパク質、その合成改変体、または上記の誘導体を用いる１以上の注射によって免疫され得る。適切な免疫原性調製物は、例えば、天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質を提示する化学的に合成されたポリペプチド、または組換え的に発現される免疫原性タンパク質を含み得る。さらに、このタンパク質は、免疫されている哺乳動物において免疫原性であることが知られている第２のタンパク質に結合体化され得る。このような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、およびダイズトリプシンインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。この調製物はさらに、アジュバントを含み得る。種々のアジュバントが免疫学的応答を増加させるために使用され、このようなアジュバントとしては、フロイントのアジュバント（完全および不完全）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、ジニトロフェノールなど）、ヒトにおいて使用可能なアジュバント（例えば、Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−ＧｕｅｒｉｎおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、または類似の免疫刺激剤が挙げられるが、これらに限定されない。使用され得るアジュバントのさらなる例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコレート）が挙げられる。
【０１６０】
免疫原性タンパク質に対して指向されるポリクローナル抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離され得、そして周知の技術（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧを用いるアフィニティークロマトグラフィー（これは、主に免疫血清のＩｇＧ画分を提供する））によってさらに精製され得る。続いて、または代替的に、求められる免疫グロブリンの標的である特定の抗原、またはそのエピトープが、カラムに固定され、免疫アフィニティークロマトグラフィーによって免疫特異的抗体を精製し得る。免疫グロブリンの精製は、例えば、Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ＰＡより発行）、第１４巻、第８号（２０００年４月１７日）、２５〜２８頁）によって考察される。
【０１６１】
（モノクローナル抗体）
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」は、独特の軽鎖遺伝子産物および独特の重鎖遺伝子産物から構成される唯一の分子種の抗体分子を含む抗体分子の集団をいう。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、その集団のすべての分子に同一である。従って、ＭＡｂは、抗原への独特の結合親和性によって特徴付けられる抗原の特定のエピトープと免疫反応可能な抗原結合部位を含む。
【０１６２】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ方法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載されるような方法）を使用して調製され得る。ハイブリドーマ方法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物は、免疫因子で代表的に免疫され、その免疫因子に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生し得るリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。
【０１６３】
免疫因子としては、代表的に、タンパク質抗原、そのフラグメントまたはその融合タンパク質が挙げられる。一般的には、以下のいずれかである：ヒト起源の細胞が望まれる場合は、末梢血リンパ球が使用され、または非ヒト哺乳動物供給源が望まれる場合は、脾臓細胞もしくはリンパ節細胞が使用される。次いで、適切な融合因子（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して、リンパ球を不死化細胞株に融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）第５９−１０３頁）。不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、融合されていない不死化細胞の増殖または生存を阻害する１以上の物質を含む好ましくは適切な培養培地中で培養され得る。例えば、親の細胞が酵素、ヒポキサンチングアニンンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、代表的にヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、それらの物質はＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる。
【０１６４】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合する細胞株であり、それらは選択された抗体産生細胞による安定な高レベルの抗体の発現を支持し、そして培地（例えば、ＨＡＴ培地）に敏感である。より好ましい不死化細胞株はマウス骨髄腫株であり、それらを、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａおよびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから得ることが可能である。ヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８７）第５１−６３頁）。
【０１６５】
次いで、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって決定されるか、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノソルベント（ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂｅｎｔ）検定法（ＥＬＩＳＡ））によって決定される。このような技術およびアッセイは、当該分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード分析によって決定され得る。好ましくは、標的抗原に対する高い程度の特異性および高結合親和性を有する抗体が単離される。
【０１６６】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、限界希釈手順によって、クローンをサブクローニングし得、そして標準方法によって増殖し得る。例えば、この目的のための適切な培養培地としては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭｅｄｉｕｍおよびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物内において腹水としてインビボで増殖され得る。
【０１６７】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィー）によって、培養培地または腹水から、単離または精製され得る。
【０１６８】
モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される方法）によって作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され得、そして配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離されると、そのＤＮＡは、発現ベクター内に配置され得、次いでそれらは、宿主細胞（例えば、トランスフェクトしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞）内にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞でのモノクローナル抗体の合成を得る。ＤＮＡはまた、例えば、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖およびヒト軽鎖の定常ドメインについてのコード配列を置換すること（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８１２−１３（１９９４））によってか、あるいは非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列の全てまたは一部を免疫グロブリンのコード配列に共有結合的に連結することによって改変され得る。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換され得るか、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換され得、キメラ二価の抗体を作製する。
【０１６９】
（ヒト化抗体）
本発明のタンパク質抗原に対する抗体は、さらにヒト化抗体またはヒト抗体を含み得る。これらの抗体は、投与された免疫グロブリンに対するヒトによる免疫応答を引き起こさない、ヒトへの投与に適する。抗体のヒト化形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合部分配列）であり、それらは主にヒト免疫グロブリンの配列から構成され、そして非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含む。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列についてのげっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列の置換によって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らの方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って、実施され得る。（米国特許第５，２２５，５３９号もまた参照のこと。）いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖ骨格（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエントの抗体においても、移入されたＣＤＲまたは骨格配列においても見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの可変領域の実質的に全て、および代表的には２つの可変領域を含む。これらの領域内で、すべてのまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンの領域に対応し、そしてすべてまたは実質的にすべての骨格領域はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の領域である。ヒト化抗体は好ましくはまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、代表的には、ヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を含む（Ｊｏｎｅｓら、１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２））。
【０１７０】
（ヒト抗体）
完全なヒト抗体は、ＣＤＲを含む軽鎖および重鎖の両方の全体配列がヒト遺伝子から本質的に生じる抗体分子に基本的に関連する。このような抗体を、本明細書中で「ヒト抗体」、または「完全なヒト抗体」と呼ぶ。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術によって調製され得る；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２を参照のこと）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，第７７−９６頁を参照のこと）。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実施において使用され得、そしてヒトハイブリドーマを用いることによってか（Ｃｏｔｅら、１９８３．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：２０２６−２０３０を参照のこと）、またはインビトロでのエプスタイン−バーウイルスを用いてヒトＢ細胞を形質転換することによって（Ｃｏｌｅら、１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，第７７−９６頁を参照のこと）産生され得る。
【０１７１】
さらに、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））を含む、さらなる技術を用いて産生され得る。同様に、ヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が、部分的または完全に不活化されているマウス）内に導入することによって、ヒト抗体は作製され得る。チャレンジの際に、ヒト抗体産生が観察され、このことは、遺伝子再配列、アセンブリー、および抗体レパートリーを含むすべての点において、ヒトにおいて観察されたものに密接に類似する。このアプローチは、例えば、以下に記載される：米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、およびＭａｒｋｓら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０、７７９−７８３（１９９２））；Ｌｏｎｂｅｒｇら（Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８５６−８５９（１９９４））；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ３６８、８１２−１３（１９９４））；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４、８４５−５１（１９９６））；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４、８２６（１９９６））；ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３  ６５−９３（１９９５））。
【０１７２】
ヒト抗体は、抗原によるチャレンジに応答した動物の内因性抗体よりも完全なヒト抗体を産生するように改変されたトランスジェニック非ヒト動物を用いて、さらに産生され得る（ＰＣＴ公開  ＷＯ９４／０２６０２を参照のこと）。非ヒト宿主における重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免疫グロブリンをコードする内因性遺伝子は、無能になっており、そしてヒト重鎖免疫グロブリンおよびヒト軽鎖免疫グロブリンをコードする活性な座位は、宿主のゲノムに挿入される。ヒト遺伝子は、例えば、必須のヒトＤＮＡセグメントを含む酵母人工染色体を用いて組み込まれる。次いで、所望の改変全てを提供する動物は、完全ではない改変の相補体を含む中間トランスジェニック動物を交配させることによって子孫として得られる。このような非ヒト動物の好ましい実施形態はマウスであり、そしてＰＣＴ公開  ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０９６に開示されるように、ＸｅｎｏｍｏｕｓｅＴＭと呼ばれる。この動物は、完全なヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産生する。この抗体は、対象の免疫原による免疫後の動物から（例えば、ポリクローナル抗体の調製）、あるいは動物由来の不死化されたＢ細胞から（例えば、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ）、直接得ることが可能である。さらに、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子は、抗体を直接得るために回収され、そして発現され得るか、または抗体のアナログ（例えば、単鎖Ｆｖ分子）を得るために、さらに改変され得る。
【０１７３】
内因性免疫グロブリン重鎖の発現を欠く非ヒト宿主（マウスとして例証される）を作製するための方法の例は、米国特許第５，９３９，５９８号に開示される。この非ヒト宿主は、以下の工程を包含する方法によって獲得され得る：胚性幹細胞における少なくとも１つの内因性重鎖座位由来のＪセグメント遺伝子を欠失して、座位の再配列を防止する工程、そして再配列された免疫グロブリン重鎖座位の転写物の形成を防止する工程であり、ここで欠失は、選択マーカーをコードする遺伝子を含む標的ベクターによってもたらされる；およびトランスジェニックマウス（その体細胞および生殖細胞は、選択マーカーをコードする遺伝子を含む）を、胚性幹細胞から作製する工程。
【０１７４】
対象の抗体（例えば、ヒト抗体）を産生するための方法は、米国特許第５，９１６，７７１号に開示される。その方法は以下の工程を包含する：重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、培養中の１つの哺乳動物宿主細胞に導入する工程、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、別の哺乳動物宿主細胞に導入する工程、および２つの細胞を融合してハイブリッド細胞を形成する工程。このハイブリッド細胞は、重鎖および軽鎖を含む抗体を発現する。
【０１７５】
この手順のさらなる改良において、免疫原上の臨床的に関連するエピトープを同定するための方法、および関連するエピトープに高い親和性で免疫特異的に結合する抗体を選択するための相関性のある方法は、ＰＣＴ公開  ＷＯ９９／５３０４９に開示される。
【０１７６】
（Ｆａｂフラグメントおよび単鎖抗体）
本発明に従って、本発明の抗原性タンパク質に特異的な単鎖抗体の産生のための技術が、適用され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。さらに、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築のための方法が適用され得（例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１を参照のこと）、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ有効な同定を可能にする。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含む抗体フラグメントは、以下を含む当該分野で公知の技術によって産生され得るが、これらの技術に限定されない：（ｉ）抗体分子のペプシン消化によって産生されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって産生されたＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤を用いた抗体分子の処理によって産生されたＦａｂフラグメント、および（ｉｖ）Ｆｖフラグメント。
【０１７７】
（二重特異的抗体）
二重特異的抗体は、モノクローナル抗体（好ましくはヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体）であって、これは少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する。この場合において、結合特異性の１つは、本発明の抗原性タンパク質に対してである。その第２の結合標的は、任意の他の抗原であり、そして有利には細胞表面タンパク質あるいはレセプターまたはレセプターサブユニットである。
【０１７８】
二重特異的抗体を作製するための方法は、当該分野で公知である。伝統的に、二重特異的抗体の組換え生成は、２つの免疫グロブリンの重鎖対／軽鎖対の同時発現に基づき、ここでこの２つの重鎖は異なる特異性を有する（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせに起因して、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の潜在的混合物を作製し、このうち１つのみが正確な二重特異的構造を有する。この正確な分子の精製は、通常アフィニティークロマトグラフィー工程によって達成される。同様の手順は、１９９３年５月１３日公開されたＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９１  ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５−３６５９において開示される。
【０１７９】
所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインは、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合され得る。この融合は、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常ドメインを有し、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の少なくとも一部分を含む。この融合物の少なくとも１つの中に存在する、軽鎖結合のために必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。この免疫グロブリン重鎖融合体、および所望の場合、この免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別々の発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主生物体に同時トランスフェクトされる。二重特異的抗体の作製のさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
【０１８０】
ＷＯ９６／２７０１１に記載される別のアプローチに従って、抗体分子対の間の界面は、組換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーのパーセンテージを最大化するように操作され得る。この好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子の界面からの１つ以上の小さなアミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換される。大きな側鎖に同一または類似サイズの代償的な「キャビティ」は、大きなアミノ酸側鎖を小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置換することによって、第２の抗体分子の界面上に生成される。このことは、他の不必要な最終生成物（例えば、ホモダイマー）よりも、ヘテロダイマーの収量を増加させるための機構を提供する。
【０１８１】
二重特異的抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異的抗体）として調製され得る。抗体フラグメントから二重特異的抗体を作製するための技術は、文献において記載されている。例えば、二重特異的抗体は、化学結合を用いて調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体がタンパク分解的に切断されてＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成する手順を記載する。これらのフラグメントは、ビシナルジチオールを安定化し、そして分子間のジスルフィド形成を阻止するために、ジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウム塩の存在下で還元される。次いで、この作製されたＦａｂ’フラグメントは、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つは、メルカプトエチルアミンでの還元によってＦａｂ’−チオールに再変換され、そしてこれは等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合されて二重特異的抗体を形成する。生成された二重特異的抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用され得る。
【０１８２】
さらに、Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され得、そして化学的にカップリングされて二重特異的抗体を形成する。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全なヒト化二重特異的抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の生成を記載する。各Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから別々に分泌され、そしてインビトロでの指向された化学的カップリングに供され、二重特異的抗体を形成する。従って、形成されたこの二重特異的抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合し得、そしてヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解性活性を誘発し得る。
【０１８３】
組換え細胞培養物から直接二重特異的抗体フラグメントを作製し、そして単離するための種々の技術がまた記載されている。例えば、二重特異的抗体は、ロイシンジッパーを用いて産生される。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合される。この抗体ホモダイマーは、ヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、次いで再酸化されて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた、抗体ホモダイマーの産生のために利用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）に記載されるこの「ディアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）」技術は、二重特異的抗体フラグメントを作製するための代替的な機構を提供している。このフラグメントは、短すぎて同じ鎖上の２つのドメインの間を対にできないリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、１つのフラグメントのＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的なＶＬドメインおよびＶＨドメインと対にさせられ、これによって２つの抗原結合部位が形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用によって二重特異的抗体フラグメントを作製するための別のストラテジーもまた、報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。
【０１８４】
２つを超える結合価を有する抗体が企図される。例えば、三重特異的抗体が調製され得る。Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０１８５】
例示的な二重特異的抗体は、２つの異なるエピトープに結合し得、このうち少なくとも１つは、本発明のタンパク質抗原中に起源を有する。あるいは、免疫グロブリン分子の抗抗原性アームは、Ｔ細胞レセプター分子のような白血球上の誘発分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、またはＢ７）、あるいはＩｇＧに対するＦｃレセプター（ＦｃγＲ）（例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６））に結合するアームに、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞性防御機構に焦点を合わせるように結合され得る。二重特異的抗体はまた、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞傷害性因子に指向するために使用され得る。これらの抗体は、抗原結合アームと、細胞傷害性因子または放射性核種キレーター（例えば、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、またはＴＥＴＡ）に結合するアームとを保有する。目的の別の二重特異的抗体は、本明細書中に記載のタンパク質抗原に結合し、そしてさらに組織因子（ＴＦ）に結合する。
【０１８６】
（ヘテロ接合体抗体）
ヘテロ接合体抗体はまた、本発明の範囲内である。ヘテロ接合体抗体は、２つの共有結合した抗体から構成される。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不必要な細胞に標的化するために（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置のために（ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９）提案されている。この抗体（架橋剤を含む抗体を含む）は、インビトロで、合成タンパク質化学において公知の方法を使用して調製され得ることが企図される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応もちいて、またはチオエーテル結合の形成によって構築され得る。この目的のための適切な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデート、ならびに例えば米国特許第４，６７６，９８０号において開示される試薬が挙げられる。
【０１８７】
（エフェクター機能の操作）
本発明の抗体を、エフェクター機能について、例えば癌の処置における抗体の効力を増大するように改変することが望ましくあり得る。例えば、システイン残基は、Ｆｃ領域に導入され得、これによってこの領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にする。従って、作製されるこのホモダイマー抗体は、改良されたインターナリゼーションの可能性および／または増加した補体媒介細胞死滅、ならびに抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照のこと。増大した抗腫瘍活性を有するホモダイマー抗体はまた、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されるように、ヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製され得る。あるいは、二重のＦｃ領域を有する抗体が操作され得、これによって増大した補体溶解およびＡＤＣＣの可能性を有し得る。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，３：２１９−２３０（１９８９）を参照のこと。
【０１８８】
（免疫結合体）
本発明はまた、細胞傷害性薬剤（例えば、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素学的に活性な毒素、あるいはそれらのフラグメント）、または放射性同位体（すなわち、放射性結合体））に結合した抗体を含む免疫結合体に関する。
【０１８９】
このような免疫結合体の生成において有用な化学療法剤は、上記に記載されている。使用され得る酵素学的に活性な毒素およびそれらのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａインヒビター、カーシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、マイトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、およびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）が挙げられる。種々の放射性核種は、放射性結合抗体の作製のために利用可能である。その例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅが挙げられる。
【０１９０】
抗体および細胞傷害性薬剤の結合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング因子（例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデート  ＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ））、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン））を用いて作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製され得る。炭素−１４−標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への結合体化のための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。
【０１９１】
別の実施形態において、腫瘍の前標的化における利用のために、この抗体は、「レセプター」（例えば、ストレプトアビジン）に結合体化され得、ここで抗体−レセプター結合体は患者に投与され、続いて除去剤を用いて結合していない結合体が循環から除去され、次いで細胞傷害性因子に次々に結合する「リガンド」（例えば、アビジン）が投与される。
【０１９２】
１つの実施形態において、所望の特異性を保有する抗体のスクリーニングのための方法としては、当該分野内で公知の酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）および他の免疫学的に媒介された技術が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の特定のドメインに対して特異的である抗体の選択は、このようなドメインを所有しているＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質のフラグメントに結合するハイブリドーマの生成により容易にされる。従って、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質、あるいはそれらの誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログ内の所望のドメインに特異的である抗体がまた、本明細書で提供される。
【０１９３】
抗ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ抗体は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の局在化および／または定量化に関する当該分野で公知の方法において使用され得る（例えば、適切な生理学的サンプル中のＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質のレベルを測定する使用のために、診断方法での使用のために、タンパク質の画像化における使用のためになど）。所定の実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログについての抗体（抗体由来の結合ドメインを含む）は、薬理学的に活性な化合物（本明細書中、以降「治療剤」という）として利用される。
【０１９４】
抗ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、標準的技術（例えばアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降）によって、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチドを単離するために使用され得る。抗ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ抗体は、細胞からの天然のＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチドの精製、ならびに宿主細胞において発現された、組換え的に産生されたＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸポリペプチドの精製を容易にし得る。さらに、抗ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ抗体が、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質（例えば、細胞の溶解物または細胞上清における）を検出するために用いられて、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の発現の量およびパターンを評価し得る。抗ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ抗体は、例えば、所定の治療レジメンの有効性を決定するために、臨床試験手順の一部として、組織におけるタンパク質レベルを診断的にモニターするために使用され得る。検出は、抗体を検出可能物質に結合させる（すなわち、物理的に連結する）ことにより容易にされ得る。検出可能物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌａｍｉｎｅ）フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられる；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられる；そして、適切な放射性物質の例としては１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０１９５】
（ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ組換え発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明の別の局面は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログをコードする核酸を含む、ベクター、好ましくは、発現ベクターに関する。本明細書において使用する場合、用語「ベクター」は、連結された別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。１つの型のベクターは、「プラスミド」である。これはさらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、ウイルス性ベクターであり、ここでは、さらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノムに連結され得る。特定のベクターは、ベクターが導入される宿主細胞中で自律複製し得る（例えば、細菌性の複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、そして、これにより宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指示し得る。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に用いられる形態のベクターであるので、交換可能に使用され得る。しかし、本発明は、等価の機能を果たす、ウイルス性ベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）のような、このような他の形態の発現ベクターを含むことを意図する。
【０１９６】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態の本発明の核酸を含む。これは、組換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結されている、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択された１つ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結する」とは、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロの転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入される場合は、宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で調節配列に連結されることを意味することを意図する。
【０１９７】
用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節配列は、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示する配列、および特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を指示する配列（例えば、組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどのような因子に依存し得ることが当業者に理解される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され得、それにより、本明細書に記載される核酸によってコードされるタンパク質またはペプチド（融合タンパク質またはペプチドを含む）（例えば、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の変異形態、融合タンパク質など）を産生し得る。
【０１９８】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞における、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質発現のために設計され得る。例えば、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）にさらに考察されている。あるいは、組換え型発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写および翻訳され得る。
【０１９９】
原核生物におけるタンパク質の発現は、最も頻繁には、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて実施される。融合ベクターは、そこにコードされるタンパク質に、通常、組換えタンパク質のアミノ末端に、多数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、代表的には、以下の３つの目的のために役立つ：（ｉ）組換えタンパク質の発現を増加させるため；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解性を増加させるため；および（ｉｉｉ）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製の際に補助するため。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解の切断部位が、融合部分と組換えタンパク質との結合部に導入されて、融合タンパク質の精製の後に融合部分から組換えタンパク質を分離することを可能とする。このような酵素、およびその同族（ｃｏｇｎａｔｅ）の認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが挙げられる。代表的な融合発現ベクターとしては、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的の組換えタンパク質に融合する、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
【０２００】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ  １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。
【０２０１】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大化するための１つのストラテジーは、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力を欠損した宿主細菌中でタンパク質を発現させることである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８を参照のこと。別のストラテジーは、各アミノ酸についての個々のコドンが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用されるコドンであるように、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変更することである（例えば、Ｗａｄａら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８を参照のこと）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的なＤＮＡ合成技術によって実行され得る。
【０２０２】
別の実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【０２０３】
あるいは、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞中で発現され得る。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）中でのタンパク質の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）が挙げられる。
【０２０４】
なお別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルスの調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０に由来する。原核生物細胞および真核生物細胞の両方のために適切な他の発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章および第１７章を参照のこと。
【０２０５】
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型中で優先的に核酸の発現を指示し得る（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現する）。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的なプロモーターの非限定的な例には、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、Ｔ細胞レセプターの特定のプロモーターにおいて（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９−７３３）および免疫グロブリンの特定のプロモーターにおいて（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）、ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発達的に調節されるプロモーターもまた含まれる（例えば、マウスｈｏｘプロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７−５４６））。
【０２０６】
本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、そのＤＮＡ分子は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ  ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写によって）を可能にする様式で調節配列に作動可能に連結される。種々の細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の持続的な発現を指示する、アンチセンス方向でクローニングされた核酸に作動可能に連結された調節配列（例えば、ウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサー）が選択され得るか、または、アンチセンスＲＮＡの構成的発現、組織特異的発現、または細胞型特異的発現を指示する調節配列が、選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化されたウイルスの形態であり得、ここではアンチセンス核酸は、高効率調節領域の制御下で産生され、その活性は、ベクターが導入される細胞型によって決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の考察については、例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１巻（１）１９８６を参照のこと。
【０２０７】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現べクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で、交換可能に使用される。このような用語は、特定の被験細胞をいうのみでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫をもいうことが理解される。変異または環境の影響のいずれかに起因して、特定の改変は次の世代において生じ得るので、このような子孫は、実際には、親の細胞と同一でないかもしれないが、なお、本明細書中で使用される場合のこの用語の範囲内に含まれる。
【０２０８】
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）において発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０２０９】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術を介して原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来性の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するために当該分野で容認されている種々の技術をいうことを意図し、これらには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）および他の実験室マニュアルに見出され得る。
【０２１０】
安定な哺乳動物細胞のトランスフェクションのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞のほんの一部のみが外来ＤＮＡをそのゲノムに組み込み得ることが知られている。これらの要素を同定および選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が、一般的には目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。種々の選択マーカーには、薬物（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキサート）に対する耐性を付与するものが含まれる。選択マーカーをコードする核酸は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸをコードするベクターと同じベクター上で宿主細胞に導入され得るか、あるいは別々のベクター上で導入され得る。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定され得る（例えば、選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）。
【０２１１】
本発明の宿主細胞（例えば、培養中の原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞）は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質を産生（すなわち、発現）するために使用され得る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質を産生するための方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質が産生されるような適切な培地中で、本発明の宿主細胞（ここに、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を培養する工程を包含する。別の実施形態において、この方法はさらに、培地または宿主細胞からＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質を単離する工程を包含する。
【０２１２】
（トランスジェニックＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ動物）
本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。例えば、１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質コード配列が導入された、受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、このような宿主細胞は、外因性のＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ配列がゲノムに導入された非ヒトトランスジェニック動物、または内因性のＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ配列が変更された相同組換え動物を作製するために使用され得る。このような動物は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の機能および／または活性を研究するため、ならびにＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質活性のモジュレーターを同定および／または評価するために有用である。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」とは、非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは、ラットまたはマウスのような齧歯類であり、ここで、その動物の１つ以上の細胞が、導入遺伝子を含む。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。導入遺伝子は、細胞（この細胞からトランスジェニック動物を発生させた）のゲノムに組み込まれかつ成熟動物のゲノムに残存し、それによって、トランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織においてコードされた遺伝子産物の発現を指示する、外因性のＤＮＡである。本明細書中で使用される場合、「相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）組換え動物」とは、非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはマウスであり、ここで内因性のＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子は、内因性の遺伝子と、その動物の発生の前にその動物の細胞（例えば、その動物の胚細胞）に導入された外因性のＤＮＡ分子との間の相同組換えによって変更されている。
【０２１３】
本発明のトランスジェニック動物は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸをコードする核酸を、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって、受精卵母細胞の雄性前核に導入すること、およびその卵母細胞を偽妊娠雌性養育動物（ｆｏｓｔｅｒ  ａｎｉｍａｌ）中で発達させることを可能にすることによって作製され得る。配列番号１、３、５、７、９、１１および１３のヒトのＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ  ｃＤＮＡ配列は、非ヒト動物のゲノムに導入遺伝子として導入され得る。あるいは、ヒトのＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子の非ヒトホモログ（例えば、マウスのＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子）は、ヒトのＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ  ｃＤＮＡ（上記にさらに記載された）に対するハイブリダイゼーションに基づいて単離され得、そして導入遺伝子として使用され得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた導入遺伝子中に含まれ得、その導入遺伝子の発現の効率を増大させ得る。組織特異的調節配列（単数または複数）は、特定の細胞に対して、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の発現を指示するように、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ導入遺伝子に作動可能に連結され得る。胚の操作およびマイクロインジェクションを介するトランスジェニック動物（特に、マウスのような動物）を作製するための方法は、当該分野で慣習的になっており、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号；同第４，８７０，００９号；および同第４，８７３，１９１号；ならびにＨｏｇａｎ  １９８６、ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ  ＴＨＥ  ＭＯＵＳＥ  ＥＭＢＲＹＯ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。同様の方法が、他のトランスジェニック動物の作製のために使用される。トランスジェニック創始（ｆｏｕｎｄｅｒ）動物は、そのゲノムにおけるＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ導入遺伝子の存在および／またはその動物の組織もしくは細胞中のＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ  ｍＲＮＡの発現に基づいて同定され得る。次いで、トランスジェニック創始動物は、導入遺伝子を有するさらなる動物を育種するために使用され得る。さらに、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質をコードする導入遺伝子を有するトランスジェニック動物は、さらに、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物に交雑され得る。
【０２１４】
相同組換え動物を作製するために、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子の少なくとも一部を含むベクターを調製する。ここで、この遺伝子は、欠失、付加、または置換が導入され、それによってそのＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子が変更されている（例えば、機能的に破壊されている）。ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子は、ヒト遺伝子（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１および１３のｃＤＮＡ）であり得るが、より好ましくは、ヒトのＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子の非ヒトホモログである。例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１および１３のヒトのＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子のマウスホモログは、マウスゲノムにおける内因性のＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子を変更するのに適切な相同組換えベクターを構築するために使用され得る。１つの実施形態において、そのベクターは、相同組換えに際して、その内因性のＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子が、機能的に破壊されるように設計される（すなわち、機能的タンパク質をもはやコードしない；「ノックアウト」ベクターともいわれる）。
【０２１５】
あるいは、このベクターは、相同組換えに際して、内因性ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子が変異されるか、あるいはさもなければ、変更されるが、なお機能性タンパク質をコードするように、設計され得る（例えば、上流の調節領域が変更され、それによって内因性ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の発現を変更し得る）。相同組換えベクターにおいて、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子の変更された部分は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子のさらなる核酸によって、その５’末端および３’末端で隣接されることにより、相同組換えが、ベクターによって保有される外因性ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子と胚性幹細胞中の内因性ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子との間で起こることを可能にする。さらなる隣接するＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ核酸は、内因性遺伝子との首尾よい相同組換えのために十分な長さである。典型的に、数キロベースの隣接ＤＮＡ（５’末端および３’末端の両方における）が、ベクターに含まれる。例えば、相同組換えベクターの説明について、Ｔｈｏｍａｓら（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：５０３を参照のこと。次いで、このベクターは、（例えば、エレクトロポレーションによって）胚性幹細胞株に導入され、そして導入されたＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子が内因性ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子と相同組換えした細胞が、選択される。例えば、Ｌｉら（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６９：９１５を参照のこと。
【０２１６】
次いで、選択された細胞が、動物（例えば、マウス）の胚盤胞へ注入され、凝集キメラを形成する。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ（１９８７）のＴＥＲＡＴＯＣＡＲＣＩＮＯＭＡＳ  ＡＮＤ  ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ、１１３頁〜１５２頁を参照のこと。次いで、キメラ胚が、適切な偽妊娠雌性養育動物に移植され得、そしてその胚は分娩に到る。その生殖細胞中に相同組換えされたＤＮＡを保有する子孫が、動物を育種するために使用され得、ここでこの動物の全ての細胞は、導入遺伝子の生殖系列伝達によって、相同組換えされたＤＮＡを含む。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築するための方法が、さらに以下に記載される；Ｂｒａｄｌｅｙ（１９９１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：８２３−８２９；ＰＣＴ国際公開番号：ＷＯ９０／１１３５４；ＷＯ９１／０１１４０；ＷＯ９２／０９６８；およびＷＯ９３／０４１６９。
【０２１７】
別の実施形態において、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択された系を含む非ヒトトランスジェニック動物が産生され得る。このような系の１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の説明については、例えば、Ｌａｋｓｏら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６２３２−６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である。Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１−１３５５を参照のこと。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が導入遺伝子の発現を調節するために使用される場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要となる。このような動物は、例えば、２つのトランスジェニック動物（一方は選択されたタンパク質をコードした導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコードした導入遺伝子を含む）を交配することによる「二重の」トランスジェニック動物の構築によって提供され得る。
【０２１８】
本明細書中に記載される非ヒトトランスジェニック動物のクローンがまた、Ｗｉｌｍｕｔら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０−８１３に記載される方法に従って、産生され得る。簡単には、トランスジェニック動物からの細胞（例えば、体細胞）が単離され得、そして増殖サイクル（ｇｒｏｗｔｈ  ｃｙｃｌｅ）から出て、Ｇ０期に入るように誘導され得る。次いで、静止性細胞が、例えば、電気パルスの使用により、その静止性細胞が単離されたのと同種の動物から除核された卵母細胞へ融合され得る。次いで、この再構築された卵母細胞は培養され、これにより、これは桑実胚または未分化胚芽細胞に発達し、次いで、偽妊娠雌性養育動物に移される。この雌性養育動物から産まれた子孫は、その細胞（例えば、その体細胞）が単離された動物のクローンである。
【０２１９】
（薬学的組成物）
本発明のＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ核酸分子、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質、および抗ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ抗体（これはまた、本明細書中で、「活性化合物」とも呼ばれる）、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、アナログ、およびホモログが、投与に適した薬学的組成物に組み込まれ得る。このような組成物は、典型的に、核酸分子、タンパク質または抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的な投与に適合性の任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤（ｄｅｌａｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）などを含むことが意図される。適切なキャリアは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（当該分野の標準的参考文献であって、本明細書中に参考として援用される）の最新版に記載される。このようなキャリアまたは希釈剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、フィンガー（ｆｉｎｇｅｒ）溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油）もまた、使用され得る。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物におけるその使用が意図される。補助的な活性化合物もまた、組成物へ組み込まれ得る。
【０２２０】
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように処方される。投与経路の例には、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下）投与、経口（例えば、吸入）投与、経皮（すなわち、局所的）投与、経粘膜（ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ）投与、および直腸投与が挙げられる。非経口適用、皮内適用または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような、滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような、抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムのような、抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような、キレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような、張度の調整のための薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調整され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または多用量のバイアル中に入れられ得る。
【０２２１】
注入用途に適した薬学的組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散物、および滅菌注入可能溶液または分散物の即座の調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与において、適切なキャリアには、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、無菌でなければならず、そして容易な注入性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性であるべきである。これは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして、細菌および真菌のような微生物の汚染行為に対して保護されなければならない。このキャリアは、例えば、以下を含む溶媒または分散媒であり得る：水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）ならびにそれらの適切な混合物。適切な流動性が、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散物の場合には、要求される粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトール）、塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注入可能組成物の吸収期間の延長は、組成物に吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含ませることによってもたらされ得る。
【０２２２】
滅菌注射可能溶液は、必要量の活性化合物（例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／もしくはＦＣＴＲＸタンパク質または抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体および／もしくはＦＣＴＲＸ抗体）を、適切な溶媒中で、上記で列挙される成分の１つまたは組み合わせと共に組み込み、必要な場合、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般的に、分散剤は、活性化合物を、基本（ｂａｓｉｃ）の分散媒と上記で列挙される成分から必要とされる他の成分とを含む滅菌ビヒクル中へ組み込むことによって調製される。滅菌注射可能液剤の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、予め滅菌濾過されたその溶液から活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を得る。
【０２２３】
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤中に圧縮され得る。経口治療投与の目的のために、この活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得、そして錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、うがい薬としての使用のために流体キャリアを使用して調製され得、ここで、この流体キャリア中のこの化合物は、経口的に適用され、そして音を立てられ（ｓｗｉｓｈ）、そして吐き出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント物質が、この組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などが、任意の以下の成分または同様の性質を有する化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶セルロース、ガムトラガントまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、またはコーンスターチ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステロテス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ））；潤滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；あるいは香味剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバー）。
【０２２４】
吸入による投与について、この化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のような気体）を含む圧縮容器またはディスペンサー、あるいは噴霧器から、エアロゾル噴霧の形態で送達される。
【０２２５】
全身的投与はまた、経粘膜手段または経皮手段により得る。経粘膜投与または経皮投与について、浸透される障壁に適切な浸透剤が、処方物において使用される。このような浸透剤は、一般的に、当該分野で公知であり、そして、例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻噴霧または坐剤の使用によって達成され得る。経皮投与については、この活性化合物は、当該分野で一般的に公知である軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリーム剤へ処方される。
【０２２６】
この化合物はまた、直腸送達のための坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤基剤と共に）または貯留（ｒｅｎｔｅｎｔｉｏｎ）浣腸の形態で調製され得る。
【０２２７】
１つの実施形態において、この活性化合物は、身体からの迅速な排出に対してこの化合物を保護するキャリアを用いて調製され（例えば、制御放出処方物）、これには、移植片およびマイクロカプセル化された送達系が挙げられる。酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような、生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。このような処方物の調製方法は、当業者に明らかである。これらの物質はまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手され得る。リポソーム懸濁剤（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体によって感染細胞へ標的化されたリポソームを含む）がまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０２２８】
投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、経口組成物または非経口組成物を投薬単位形態で処方することが、特に有益である。本明細書で使用される投薬単位形態は、処置される被験体に対する単位投薬量として適切な物理的に別々の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと共に、所望の治療的効果を生じるように計算された、所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態についての詳細は、活性化合物の固有の特徴、および達成される特定の治療効果、ならびにこのような個体の処置のための活性化合物を調合する分野に固有の制限によって決定されるか、あるいはこれらに直接依存する。
【０２２９】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、例えば静脈内注射、局所投与（例えば、米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）によって、または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）によって被験体に送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物として、受容可能な希釈剤中の遺伝子治療ベクターが挙げられ得るか、または遺伝子送達ビヒクルが組み込まれた除放性マトリックスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞からインタクトで産生され得る場合（例えば、レトロウイルスベクター）、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１以上の細胞を含み得る。
【０２３０】
薬学的組成物は、投与のための使用説明書と共に、容器、包装、またはディスペンサーに含まれ得る。
【０２３１】
（スクリーニング方法および検出方法）
本発明の単離された核酸分子は、以下にさらに説明されるように、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質を発現するため（例えば、遺伝子治療適用において宿主細胞中の組換え発現ベクターを介して）、ＦＧＦ−ＣＸ  ｍＲＮＡおよび／またはＦＣＴＲＸ  ｍＲＮＡ（例えば、生物学的サンプルにおいて）あるいはＦＧＦ−ＣＸ遺伝子および／またはＦＣＴＲＸ遺伝子における遺伝子損傷を検出するため、ならびにＦＧＦ−ＣＸ活性および／またはＦＣＴＲＸ活性を調節するために使用され得る。さらに、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質の活性または発現を調節する薬物または化合物をスクリーニングするために、ならびにＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質の不十分な産生もしくは過剰な産生によって、あるいはＦＧＦ−ＣＸ野生型タンパク質および／またはＦＣＴＲＸ野生型タンパク質と比較して減少した活性もしくは異常な活性を有するＦＧＦ−ＣＸタンパク質形態および／またはＦＣＴＲＸタンパク質形態の産生によって特徴付けられる障害（例えば、糖尿病（インスリン放出を調節する）；肥満（脂質に結合し、運搬する）；肥満と関連する代謝障害、代謝症候群Ｘおよび拒食症ならびに慢性疾患および種々のガンと関連する消耗病、ならびに感染症（抗微生物活性を保有する）ならびに種々の異脂肪血症）を処置するために使用され得る。さらに、本発明の抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体および／または抗ＦＣＴＲＸ抗体が、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質を検出および単離するため、ならびにＦＧＦ−ＣＸ活性および／またはＦＣＴＲＸ活性を調節するために使用され得る。さらなる局面において、本発明は、ポジティブおよびネガティブの両方の様式において食欲、栄養の吸収、および代謝基質の処分に影響を及ぼす方法において使用され得る。
【０２３２】
本発明は、さらに、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイによって同定される新規の薬剤、および上記のような処置のためのそれらの使用に関する。
【０２３３】
（スクリーニングアッセイ）
本発明は、調節因子、すなわち、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質に結合するか、または例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質発現および／またはＦＣＴＲＸタンパク質発現あるいはＦＧＦ−ＣＸタンパク質活性および／またはＦＣＴＲＸタンパク質活性に対して刺激効果または阻害効果を有する、候補または試験化合物または薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または他の薬物）を同定するための方法（本明細書中において「スクリーニングアッセイ」とも称される）を提供する。本発明はまた、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイにおいて同定された化合物を含む。
【０２３４】
１実施形態において、本発明は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのタンパク質またはポリペプチド、あるいはその生物学的に活性な部分の膜結合形態に結合するか、またはその膜結合形態の活性を調節する、候補化合物もしくは試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを使用して得られ得、これには、以下が挙げられる：生物学的ライブラリー；空間的に位置付け可能な並行固相もしくは溶液相ライブラリー；逆重畳を要する合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である（例えば、Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １２：１４５を参照のこと）。
【０２３５】
本明細書中で使用される場合、「低分子」とは、約５ｋＤ未満の分子量、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物をいうことを意味する。低分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、炭水化物、脂質または他の有機分子もしくは無機分子であり得る。化学的および／または生物学的混合物（例えば、真菌、細菌または藻類抽出物）のライブラリーは、当該分野で公知であり、そして本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングされ得る。
【０２３６】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば以下に見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３。
【０２３７】
化合物のライブラリーは、溶液中に（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２〜４２１）、あるいはビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５〜５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第５，２３３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６３７８〜６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１〜３１０；Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２３３，４０９号）に存在し得る。
【０２３８】
１つの実施形態において、アッセイは細胞ベースのアッセイであり、ここで、膜結合形態のＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質、あるいはその生物学的に活性な部分を細胞表面上に発現する細胞が、試験化合物と接触され、そしてこの試験化合物が、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質に結合する能力が、決定される。例えば、細胞は、哺乳動物起源または酵母細胞であり得る。試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質に結合する能力の決定は、例えば、その試験化合物を放射性同位体または酵素標識と連結させることによって達成され、その結果、この試験化合物のＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質あるいはその生物学的に活性な部分に対する結合が、複合体におけるその標識化合物を検出することによって決定され得る。例えば、試験化合物は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで直接的または間接的のいずれかで標識され得、そしてその放射性同位体が、放射線放射の直接の計数により、またはシンチレーション計数により、検出され得る。あるいは、試験化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素標識され得、そしてこの酵素標識が、適切な基質の生成物への転換を決定することにより、検出され得る。１つの実施形態において、このアッセイは、膜結合形態のＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質、あるいはその生物学的に活性な部分をその細胞表面上に発現する細胞と、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸと結合する既知の化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物に試験化合物を接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、この試験化合物が、既知の化合物と比較して、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質あるいはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を決定する工程を包含する。
【０２３９】
別の実施形態において、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、これは、膜結合形態のＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質あるいはその生物学的に活性な部分を細胞表面上で発現する細胞を、試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物が、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質あるいはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。試験化合物が、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質あるいはその生物学的に活性な部分の活性を調節する能力の決定は、例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質が、ＦＧＦ−ＣＸ標的分子および／またはＦＣＴＲＸ標的分子に結合またはこれら標的分子と相互作用する能力を決定することによって達成され得る。本明細書中において使用される場合、「標的分子」とは、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質が天然に結合または相互作用する分子であり、例えば、ＦＧＦ−ＣＸ相互作用タンパク質および／またはＦＣＴＲＸ相互作用タンパク質を発現する細胞の表面上の分子、第二の細胞の表面上の分子、細胞外環境中の分子、細胞膜の内面と会合する分子、または細胞質分子である。ＦＧＦ−ＣＸ標的分子および／またはＦＣＴＲＸ標的分子は、非ＦＧＦ−ＣＸ分子および／またはＦＣＴＲＸ分子あるいは本発明のＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのタンパク質またはポリペプチドであり得る。１つの実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸ標的分子および／またはＦＣＴＲＸ標的分子は、シグナル伝達経路の構成要素であり、これは、細胞膜を通って細胞内への細胞外シグナル（例えば、化合物が膜結合ＦＧＦ−ＣＸ分子および／またはＦＣＴＲＸ分子に結合することにより発生するシグナル）の伝達を促進する。その標的は、例えば、触媒活性を有する第二の細胞内タンパク質、または下流シグナル伝達分子のＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸとの会合を容易にするタンパク質であり得る。
【０２４０】
ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質がＦＧＦ−ＣＸ標的分子および／またはＦＣＴＲＸ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相互作用する能力の決定は、直接的結合を決定するための上記方法の１つにより達成され得る。１つの実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質がＦＧＦ−ＣＸ標的分子および／またはＦＣＴＲＸ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相互作用する能力の決定は、その標的分子の活性を決定することにより達成され得る。例えば、この標的分子の活性は、その標的の細胞性セカンドメッセンジャー（すなわち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など）の誘導を検出すること、適切な基質に対する標的の触媒活性／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする核酸に作動可能に連結されたＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ応答性調節エレメントを含む）の誘導を検出すること、または細胞応答（例えば、細胞生存度、細胞分化、または細胞増殖）を検出することにより、決定され得る。
【０２４１】
なお別の実施形態において、本発明のアッセイは、無細胞アッセイであり、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質あるいはその生物学的に活性な部分を試験化合物に接触させる工程、ならびにその試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質あるいはその生物学的に活性な部分と結合する能力を決定する工程を包含する。試験化合物の、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質への結合は、上記のように、直接的または間接的にのいずれかで決定され得る。１つのこのような実施形態において、このアッセイは、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質あるいはその生物学的に活性な部分を、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸを結合する既知の化合物に接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物に接触させる工程、ならびにその試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、この試験化合物が、既知の化合物と比較して、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ、またはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を決定する工程を包含する。
【０２４２】
なお別の実施形態において、アッセイは、無細胞アッセイであり、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質あるいはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させる工程、ならびにその試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質あるいはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。試験化合物がＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの活性を調節する能力の決定は、例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質が、ＦＧＦ−ＣＸ標的分子および／またはＦＣＴＲＸ標的分子に結合する能力を、直接的結合の決定のための上記方法の１つによって決定することにより達成され得る。代替の実施形態において、試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質の活性を調節する能力の決定は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質が、ＦＧＦ−ＣＸ標的分子および／またはＦＣＴＲＸ標的分子をさらに調節する能力を決定することにより達成され得る。例えば、この標的分子の適切な基質に対する触媒活性／酵素活性は、上記のように決定され得る。
【０２４３】
さらに別の実施形態において、無細胞アッセイは、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質あるいはその生物学的に活性な部分を、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質を結合する既知の化合物に接触させてアッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質と相互作用する能力の決定は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質が、ＦＧＦ−ＣＸ標的分子および／またはＦＣＴＲＸ標的分子と優先的に結合するか、またはその標的分子の活性を優先的に調節する能力を決定する工程を包含する。
【０２４４】
本発明の無細胞アッセイは、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質の、可溶形態または膜結合形態の両方の使用に適している。膜結合形態のＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質を含む無細胞アッセイの場合、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質の膜結合形態が溶液中で維持されるように、可溶化剤を利用することが所望され得る。このような可溶化剤の例には、非イオン性界面活性剤が挙げられ、例えば、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ（Ｉｓｏｔｒｉｄｅｃｙｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｅｔｈｅｒ）ｎ）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンミニオール−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−１−ｐｒｏｐａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳ）、または３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンミニオール−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳＯ）である。
【０２４５】
本発明の上記アッセイ方法の１つより多い実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質またはその標的分子のいずれかを固定して、そのタンパク質の一方または両方の非複合形態と複合形態との分離を促進し、そしてそのアッセイの自動化に適合させることが、所望され得る。試験化合物の、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質への結合、または候補化合物の存在下および非存在下での、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質の標的分子との相互作用は、これらの反応物を収容するために適切な任意の容器内で、達成され得る。このような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。１実施形態において、そのタンパク質の一方または両方がマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加した融合タンパク質が、提供され得る。例えば、ＧＳＴ−ＦＧＦ−ＣＸ融合タンパク質および／またはＦＣＴＲＸ融合タンパク質またはＧＳＴ標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され得、次いでこれらは、試験化合物と合わせられるか、あるいは試験化合物および未吸着標的タンパク質またはＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／もしくはＦＣＴＲＸタンパク質のいずれかと合わせられ、そしてこの混合物が、複合体形成を誘導する条件下（例えば、塩およびｐＨに関して生理学的条件）でインキュベートされる。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、結合していないあらゆる成分を除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定し、例えば上記のように、複合体を直接的または間接的のいずれかで決定する。あるいは、複合体がマトリックスから解離され得、そしてＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質の結合レベルまたは活性レベルを、標準的な技術を使用して決定し得る。
【０２４６】
タンパク質をマトリックスに固定するための他の技術もまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質あるいはその標的分子のいずれかが、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を利用して、固定され得る。ビオチン化ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはビオチン化ＦＣＴＲＸタンパク質あるいは標的分子は、当該分野において周知の技術を使用して、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製され得（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）、そしてストレプトアビジンでコーティングした９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定され得る。あるいは、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質あるいは標的分子と反応性であるがＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質のその標的分子への結合を妨害しない抗体が、そのプレートのウェルに誘導体化され得、そして結合していない標的またはＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質が、抗体結合によってウェル内に捕捉され得る。このような複合体を検出するための方法には、ＧＳＴ固定複合体に関して上述した方法に加えて、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質あるいは標的分子と反応性の抗体を使用する、複合体の免疫検出、ならびにＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質あるいは標的分子に関する酵素活性の検出に基づく酵素結合アッセイが挙げられる。
【０２４７】
別の実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質の発現のモジュレーターは、細胞を候補化合物と接触させ、そして細胞中のＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を決定する方法において同定される。候補化合物の存在下でのＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、候補化合物の非存在下でのＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較される。次いで、候補化合物は、この比較に基づいて、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のモジュレーターとして同定され得る。例えば、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の非存在下より、その存在下における方が大きい（すなわち、統計的に有意に大きい）場合、この候補化合物は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の刺激物質として同定される。あるいは、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の非存在下よりその存在下の方が少ない（統計的に有意に少ない）場合、この候補化合物は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のインヒビターとして同定される。細胞中のＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するために本明細書中に記載の方法によって決定され得る。
【０２４８】
本発明のなお別の局面において、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質は、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおいて「ベイト（ｂａｉｔ）タンパク質」として使用されて（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら、１９９３  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら、１９９３  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら、１９９３  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ  ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ（「ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ結合タンパク質」または「ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ−ｂｐ」）に結合するか、またはこれと相互作用し、そしてＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ活性を調節する他のタンパク質を同定し得る。このようなＦＧＦ−ＣＸ結合タンパク質および／またはＦＣＴＲＸ結合タンパク質はまた、例えば、ＦＧＦ−ＣＸ経路および／またはＦＣＴＲＸ経路の上流または下流エレメントとしてＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質によるシグナル伝達に関与する可能性がある。
【０２４９】
ツーハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインからなる、大部分の転写因子のモジュール的性質に基づく。簡潔には、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。一方の構築物においては、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸをコードする遺伝子が既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他方の構築物においては、ＤＮＡ配列のライブラリー由来の、未同定タンパク質（「プレイ（ｐｒｅｙ）」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列が、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「ベイト」および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用して、ＦＧＦ−ＣＸ依存性複合体および／またはＦＣＴＲＸ依存性複合体を形成し得る場合、この転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、非常に近くにある。近位にあることにより、転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写が可能となる。レポーター遺伝子の発現が検出され得、そして機能的転写因子を含む細胞コロニーが、単離され得、そしてＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸと相互作用するタンパク質をコードするクローニングされた遺伝子を得るために使用され得る。
【０２５０】
本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイにより同定される新規な薬剤および本明細書中に記載されるような処置のためのこの薬剤の使用に関する。
【０２５１】
（検出アッセイ）
本明細書中で同定されるｃＤＮＡ配列の一部またはフラグメント（および対応する完全な遺伝子配列）は、ポリヌクレオチド試薬として多くの方法で使用され得る。例えば、これらの配列は、（ｉ）染色体上にそれぞれの遺伝子をマッピングし得；従って遺伝病と関連する遺伝子領域を位置決定するため；（ｉｉ）微量の生物学的サンプルから個体を同定するため（組織型決定）；および（ｉｉｉ）生物学的サンプルの法医学的識別を補助するために使用され得るが、これに限定されない。これらの適用は、以下の節において記載される。
【０２５２】
（染色体マッピング）
一旦遺伝子の配列（または配列の一部分）が単離されると、この配列を用いて染色体上にこの遺伝子の位置をマッピングし得る。このプロセスは、染色体マッピングとよばれる。従って、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ配列の一部またはフラグメント、配列番号１、３、５、７、９、１１、および１３、またはそれらのフラグメントもしくは誘導体を用いて、それぞれ、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子の位置を染色体上にマッピングし得る。ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ配列を染色体にマッピングすることは、これらの配列と、疾患と関連する遺伝子とを相関付ける際の重要な第一工程である。
【０２５３】
簡潔には、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ配列からＰＣＲプライマー（好ましくは、１５〜２５ｂｐの長さ）を調製することにより染色体にマッピングされ得る。ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ配列のコンピューター分析を用いて、ゲノムＤＮＡにおける１つを超えるエクソンにまたがず、それにより増幅プロセスを複雑にしないプライマーを迅速に選択し得る。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用され得る。ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ配列に対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを生じる。
【０２５４】
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳動物由来の体細胞（例えば、ヒトおよびマウス細胞）を融合することにより調製される。ヒトおよびマウス細胞のハイブリッドが増殖および分裂するにつれ、それらは、無作為な順序で徐々にヒト染色体を失うが、マウス染色体を維持する。特定の酵素を欠損しているので、マウス細胞は増殖できないがヒト細胞は増殖し得る培地を使用することにより、必要な酵素をコードする遺伝子を含む１つのヒト染色体が維持される。種々の培地を使用することによって、ハイブリッド細胞株のパネルが確立され得る。パネルにおける各細胞株は、単一のヒト染色体または少数のヒト染色体いずれかと、マウス染色体の完全なセットとを含み、これにより、個々の遺伝子を特定のヒト染色体に容易にマッピングすることが可能になる（例えば、Ｄ’Ｅｕｓｔａｃｈｉｏら（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２０：９１９−９２４を参照のこと）。ヒト染色体のフラグメントのみを含む体細胞ハイブリッドはまた、転座および欠失を伴うヒト染色体を使用することにより生成され得る。
【０２５５】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に特定の配列を割り当てるためには迅速な手順である。１つのサーマルサイクラーを用いて一日に３つ以上の配列が割り当てられ得る。ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ配列を使用して、オリゴヌクレオチドプライマーを設計すると、下位位置決定（ｓｕｂ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、特定の染色体由来のフラグメントのパネルを用いて達成され得る。
【０２５６】
中期染色体スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）に対するＤＮＡ配列の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）をさらに使用して、一工程で正確な染色体位置を提供し得る。染色体スプレッドは、コルセミド（有糸分裂紡錘体を破壊する）のような化学物質により分裂が中期においてブロックされた細胞を使用して作製され得る。この染色体は、トリプシンで短時間処理され得、次いで、ギムザ染色され得る。薄いバンドおよび濃いバンドのパターンが各染色体で現れ、その結果、この染色体は、個々に同定され得る。ＦＩＳＨ技術は、５００または６００塩基ほどの短さのＤＮＡ配列を用いて使用され得る。しかし、１，０００塩基より大きなクローンは、簡単な検出に十分なシグナル強度で、独特の染色体位置に結合する可能性がより高い。好ましくは、１，０００塩基、そしてより好ましくは、２，０００塩基が妥当な時間量で良好な結果を得るために十分である。この技術の総説については、Ｖｅｒｍａら、ＨＵＭＡＮ  ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥＳ：Ａ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  ＢＡＳＩＣ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８８）を参照のこと。
【０２５７】
染色体マッピングの薬剤が、単一の染色体またはその染色体上の単一の部位を印付けするために個々に使用され得るか、または薬剤のパネルが、複数の部位および／または複数の染色体を印付けするために使用され得る。遺伝子の非コード領域に対応する薬剤は、実際に、マッピング目的のために好ましい。コード配列は、遺伝子ファミリー内に保存されている可能性がより高く、従って、染色体マッピングの間における交叉ハイブリダイゼーションの機会を増大させる。
【０２５８】
一旦配列が正確な染色体位置にマッピングされると、その配列の染色体上の物理的位置は、遺伝子マップデータと相関し得る。このようなデータは、例えば、ＭｃＫｕｓｉｃｋ，ＭＥＮＤＥＬＩＡＮ  ＩＮＨＥＲＩＴＡＮＣＥ  ＩＮ  ＭＡＮ（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｗｅｌｃｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙを通じてオンラインで入手可能）において見いだされる。次いで、同じ染色体領域にマッピングされる遺伝子と疾患との間の関係は、例えば、Ｅｇｅｌａｎｄら、１９８７．Ｎａｔｕｒｅ，３２５：７８３−７８７に記載される連鎖分析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）によって同定され得る。
【０２５９】
さらに、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子と関連する疾患に罹患した個体と、この疾患に罹患していない個体との間のＤＮＡ配列における差異が決定され得る。罹患した個体のいくらかまたは全てにおいて変異が認められるが、非罹患個体のいずれにおいても認められない場合、この変異は特定の疾患の候補薬剤である可能性が高い。罹患個体と非罹患個体の比較は、一般に、染色体における構造的変化（例えば、染色体スプレッドから可視であるか、またはそのＤＮＡ配列に基づいたＰＣＲを用いて検出可能である、欠失または転座）を最初に探すことを包含する。最終的に、いくらかの個体に由来する遺伝子の完全な配列決定を行って、変異の存在を確認し得、そして多型と変異を区別し得る。
【０２６０】
（組織型決定（ｔｉｓｓｕｅ  ｔｙｐｉｎｇ））
本発明のＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ配列はまた、わずかな生物学的サンプルから個体を同定するために使用され得る。この技術において、個体のゲノムＤＮＡは、１つ以上の制限酵素で消化され、そして同定のために独特のバンドを生成するためにサザンブロット上でプローブされる。本発明の配列は、ＲＦＬＰ（米国特許第５，２７２，０５７号に記載の「制限断片長多型」）のためのさらなるＤＮＡマーカーとして有用である。
【０２６１】
さらに、本発明の配列を用いて、個体のゲノムの選択された部分について実際の塩基ごとにＤＮＡ配列を決定する代替的技術を提供し得る。従って、本明細書中に記載のＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ配列を用いて、配列の５’末端および３’末端から２つのＰＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これらのプライマーを使用して、個体のＤＮＡを増幅し得、そして引き続いて、そのＤＮＡを配列決定し得る。
【０２６２】
このように調製された個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、各個体が、対立遺伝子差異に起因するこのようなＤＮＡ配列の独特のセットを有するので、唯一の個体同定を提供し得る。本発明の配列は、個体由来および組織由来の配列のこのような同定を得るために使用され得る。本発明のＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ配列は、ヒトゲノムの部分を独特に表す。対立遺伝子変異は、これらの配列のコード領域においてある程度生じ、そして非コード領域においてより大きな程度に生じる。個々のヒト間での対立遺伝子変異は、各５００塩基につき約１回の頻度で生じると見積もられる。対立遺伝子変異の大半は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を含む一塩基多型（ＳＮＰ）に起因する。
【０２６３】
本明細書中に記載の配列の各々は、ある程度、標準物質（これに対して個体由来のＤＮＡが同定の目的で比較され得る）として使用され得る。より多くの多型が非コード領域で生じるので、個体を区別するために、それほど多くの配列は必要ではない。非コード配列は、おそらく１０〜１，０００プライマーのパネルを用いて決定的な個体同定を不自由なく提供し得る。これらのプライマーは、各々が１００塩基の増幅された非コード配列を生じる。推定コード配列（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１および１３における配列）が使用される場合、決定的な個体同定のためのプライマーのより適切な数は、５００〜２，０００である。
【０２６４】
（予測医療）
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノム（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）およびモニタリング臨床試験が、予後（予測）の目的に使用され、これによって個体を予防的に処置する、予測医療の分野に関する。従って、本発明の１つの局面は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質および／または核酸の発現、ならびにＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの活性を、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織）の関連で決定するための診断アッセイに関し、これによって、個体が、ＦＧＦ−ＣＸの異常な発現または活性、ＦＣＴＲＸの異常な発現または活性、あるいはその両方に関連する疾患または障害に罹患しているかどうか、あるいはそれらの障害を発症するリスクがあるかどうかを決定する。障害は、例えば、消化管における炎症性状態の病理を含み、この病理としては、限定しないが、以下が挙げられる：潰瘍性大腸炎およびクローン病のような炎症性腸疾患、癌のような成長および増殖性の疾患、脈管形成、アテローム性動脈硬化症プラーク、コラーゲン形成、軟骨形成および骨形成、心血管疾患および線維性疾患ならびに糖尿病性潰瘍。さらに、ＦＣＴＲＸ核酸およびそれらにコードされるポリペプチドは、本発明の動脈瘤および遺伝子治療を介する創傷閉鎖の促進のために、治療的に有用である。さらに、ＦＣＴＲＸ核酸およびそれらにコードされるポリペプチドは、細胞増殖、創傷治癒、新血管形成および組織増殖、ならびに類似の組織再生の需要を刺激するために利用され得る。より詳細には、ＦＣＴＲＸ核酸またはポリペプチドは、貧血および白血球減少症、腸管過敏症および禿頭症の処置において有用であり得る。このような状態の処置は、例えば、放射線または化学療法を受けた患者において示され得、ここで処置は、すべての過剰増殖性の副作用を最小にする。
【０２６５】
本発明はまた、個体が、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのタンパク質、核酸の発現または活性と関連した障害を発症するリスクがあるかどうかを決定するための予後的（または予測的）アッセイを提供する。例えば、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの遺伝子における変異が、生物学的サンプルにおいてアッセイされ得る。このようなアッセイは、予後的または予測的な目的に使用され得、これによってＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのタンパク質、核酸の発現または生物学的活性によって特徴付けられるかまたはそれらに関連した障害の発病前に個体を予防的に処置する。
【０２６６】
本発明の別の局面は、個体におけるＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのタンパク質、核酸の発現または活性を決定するための方法を提供し、これによって、その個体についての適切な治療的または予防的薬剤（本明細書において「薬理ゲノム学的」とよばれる）を選択する。薬理ゲノム学は、個体の遺伝子型（例えば、特定の薬剤に対して応答する個体の能力を決定するために試験された個体の遺伝子型）に基づいた、個体の治療的または予防的処置のための薬剤（例えば、薬物）の選択を可能にする。
【０２６７】
本発明のなお別の局面は、臨床試験におけるＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの発現または活性に対する薬剤（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることに関する。
【０２６８】
これらおよび他の薬剤は、以下の節でさらに詳細に記載される。
【０２６９】
（診断アッセイ）
生物学的サンプルにおけるＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの存在または非存在を検出するための例示的な方法は、試験被験体から生物学的サンプルを得る工程、およびその生物学的サンプルをＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのタンパク質あるいはＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出し得る化合物もしくは薬剤とを接触させ、その結果、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの存在が、その生物学的サンプルにおいて検出される、工程を包含する。ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するための薬剤は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ  ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る、標識された核酸プローブである。この核酸プローブは、例えば、全長のＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの核酸（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１および１３の核酸またはそれらの一部）（例えば、少なくとも、１５、３０、５０、１００、２５０もしくは５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件下でＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするに十分である核酸）であり得る。本発明の診断アッセイにおける使用のための他の適切なプローブは本明細書において記載されている。
【０２７０】
ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのタンパク質を検出するための薬剤は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのタンパク質に結合し得る抗体であり、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナルであり得るか、またはより好ましくはモノクローナル抗体であり得る。インタクトな抗体またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が使用され得る。用語「標識（された）」とは、プローブまたは抗体に関して、検出可能な物質をそのプローブもしくは抗体にカップリングさせる（すなわち、物理的に連結する）ことによってそのプローブまたは抗体を直接標識すること、ならびに、直接標識された別の薬剤との反応性によってそのプローブもしくは抗体を間接的に標識することを包含することが意図される。間接的な標識の例としては、蛍光標識された二次抗体を用いた一次抗体の検出、および蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて検出され得るようにビオチンでＤＮＡプローブを末端標識することが挙げられる。用語「生物学的サンプル」とは、被験体から単離された、組織、細胞および生物学的流体ならびに被験体に存在する組織、細胞および流体を含むことが意図される。すなわち、本発明の検出方法を用いて、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを、生物学的サンプル中で、インビトロおよびインビボで検出し得る。例えば、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのタンパク質の検出のためのインビトロ技術としては、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光が挙げられる。ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのタンパク質の検出のためのインビボ技術としては、標識された抗ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ抗体を被験体に導入することが挙げられる。例えば、その抗体は、放射性マーカーを用いて標識され得る。被験体におけるその放射性マーカーの存在および位置は、標準的な画像化技術によって検出され得る。
【０２７１】
１つの実施形態において、この生物学的サンプルは、その試験被験体からのタンパク質分子を含む。あるいは、その生物学的サンプルは、その試験被験体からのｍＲＮＡ分子またはその試験被験体からのゲノムＤＮＡ分子を含み得る。好ましい生物学的サンプルは、被験体から従来の手段によって単離された末梢血白血球サンプルである。
【０２７２】
別の実施形態において、本発明の方法はさらに、コントロール被験体からコントロール生物学的サンプルを得る工程、そのコントロールサンプルを、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出し得る化合物もしくは薬剤と接触させ、その結果、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在がその生物学的サンプルにおいて検出される、工程、およびそのコントロールサンプルにおけるＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在と、その試験サンプルにおけるＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在とを比較する工程を包含する。
【０２７３】
本発明はまた、生物学的サンプルにおけるＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの存在を検出するためのキットを包含する。例えば、このキットは、以下を備え得る：生物学的サンプルにおいてＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのタンパク質またはｍＲＮＡを検出し得る、標識された化合物もしくは薬剤；そのサンプルにおいてＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの量を決定するための手段；およびそのサンプルにおいて、標準と、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの量とを比較するための手段。この化合物または薬剤は、適切な容器内に包装され得る。このキットは、さらに、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのタンパク質または核酸を検出するためにキットを用いるための指示書を備え得る。
【０２７４】
（予後アッセイ）
本明細書において記載された診断方法をさらに利用して、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの異常発現または異常活性に関連した疾患または障害を有するか、またはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。例えば、本明細書に記載されるアッセイ（例えば、上述の診断アッセイまたは下記のアッセイ）を利用して、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのタンパク質、核酸の発現または活性に関連する障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。あるいは、この予後アッセイを利用して、疾患または障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。従って、本発明は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの異常発現または異常活性に関連する疾患または障害を同定するための方法を提供し、ここで、試験サンプルは、被験体から得られ、そしてＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのタンパク質または核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）が検出され、ここで、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのタンパク質または核酸の存在は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの異常発現または異常活性に関連する疾患または障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体についての診断指標である。本明細書において使用される場合「試験サンプル」とは、目的の被験体から得られた生物学的サンプルをいう。例えば、試験サンプルは、生物学的流体（例えば、血清）、細胞サンプル、または組織であり得る。
【０２７５】
さらに、本明細書に記載される予後アッセイを使用して、被験体に薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の薬物候補）を投与してＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの異常発現または異常活性に関連する疾患または障害を処置し得るか否かを、決定し得る。例えば、このような方法を使用して、被験体が障害のための薬剤で有効に処置され得るか否かを決定し得る。従って、本発明は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの異常発現または異常活性に関連する障害についての薬剤を用いて、被験体が有効に処置され得るか否かを決定するための方法を提供する。ここで、試験サンプルが得られ、そしてＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのタンパク質または核酸が検出される（例えば、ここで、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのタンパク質または核酸の存在は、この薬剤が投与されてＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの異常発現または異常活性に関連する障害が処置され得る被験体についての、診断指標である）。
【０２７６】
本発明の方法はまた、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子における遺伝的損傷を検出し、それによって、その損傷遺伝子を有する被験体が異常な細胞増殖および／または分化によって特徴付けられる障害についての危険性を有するか否かを決定するためにも使用され得る。種々の実施形態において、この方法は、その被験体からの細胞のサンプルにおいて、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質をコードする遺伝子の統合性に影響を与える少なくとも１つの変更によって特徴付けられる遺伝的損傷の存在または非存在、あるいはＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子の誤発現を検出する工程を包含する。例えば、そのような遺伝的損傷は、以下の少なくとも１つの存在を確認することによって検出され得る：（ｉ）ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子からの１つ以上のヌクレオチドの欠失；（ｉｉ）ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの付加；（ｉｉｉ）ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの置換、（ｉｖ）ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子の染色体再配置；（ｖ）ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルにおける変更、（ｖｉ）ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子の異常改変（例えば、ゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常改変）、（ｖｉｉ）ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、（ｖｉｉｉ）ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の非野生型レベル、（ｉｘ）ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子の対立遺伝子の欠失、ならびに（ｘ）ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸタンパク質の不適切な翻訳後修飾。本明細書において記載されるように、当該分野において、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子における損傷を検出するために使用され得る、多数の公知のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的サンプルは、従来手段によって被験体から単離される末梢血白血球サンプルである。しかし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプルが使用され得、これには、例えば、頬粘膜細胞が挙げられる。
【０２７７】
特定の実施形態において、損傷の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を参照のこと）（例えば、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ  ＰＣＲ）、あるいは、連結連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら、１９８８．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら、１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３６０−３６４を参照のこと）におけるプローブ／プライマーの使用を包含し、後者は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子における点変異を検出するために特に有用であり得る（Ａｂｒａｖａｙａら、１９９５．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：６７５−６８２を参照のこと）。この方法は、患者から細胞のサンプルを収集する工程、核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたはその両方）をそのサンプルの細胞から単離する工程、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの遺伝子に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーとその核酸サンプルとを、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で接触させる工程、ならびに増幅産物の存在もしくは非存在を検出する工程、またはその増幅産物のサイズを検出する工程およびその長さをコントロールサンプルと比較する工程を包含し得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書中に記載される変異を検出するために使用される技術のいずれかとともに予備的増幅工程として使用されることが望ましくあり得ることが予想される。
【０２７８】
代替的な増幅方法としては、以下が挙げられる：当業者に周知な技術を用いた、その増幅された分子の検出の前の、自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８を参照のこと）、転写増幅系（Ｋｗｏｈら、１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７を参照のこと）、Ｑβレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８８．ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７を参照のこと）、または他の任意の核酸増幅方法。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に極少数で存在する場合に、そのような核酸分子の検出のために特に有用である。
【０２７９】
代替の実施形態において、サンプル細胞からのＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子における変異は、制限酵素切断パターンにおける変更によって同定され得る。例えば、サンプルおよびコントロールのＤＮＡが単離され、増幅され（必要に応じて）、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて消化され、そしてフラグメント長の大きさがゲル電気泳動によって決定され、そして比較される。サンプルＤＮＡとコントロールＤＮＡとの間のフラグメント長の大きさにおける差異は、そのサンプルＤＮＡにおける変異を示す。さらに、配列特異的なリボザイムの使用（例えば、米国特許第５，４９３，５３１号を参照のこと）を使用して、リボザイム切断部位の発生または喪失によって特異的な変異の存在についてスコア付けし得る。
【０２８０】
他の実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸにおける遺伝子変異は、サンプル核酸およびコントロール核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイに対してハイブリダイズさせることによって同定され得る（例えば、Ｃｒｏｎｉｎら、１９９６．Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｌら、１９９６．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：７５３−７５９を参照のこと）。例えば、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸにおける遺伝子変異は、Ｃｒｏｎｉｎら（前出）に記載されるように光生成ＤＮＡプローブを含む二次元アレイにおいて同定され得る。手短には、プローブの第一ハイブリダイゼーションアレイを用いて、サンプルおよびコントロールにおける長いストレッチのＤＮＡにわたって走査し、連続的に重複するプローブの線形アレイを作成することによって、その配列間の塩基変化を同定し得る。この工程は、点変異の同定を可能にする。この工程に第二のハイブリダイゼーションアレイが続き、これは、検出される全ての改変体または変異体に相補的な、より小さな特化されたプローブアレイを用いることによって、特定の変異を特徴付けることを可能にする。各変異アレイは、一方が野生型遺伝子に対して相補的であり、そして他方が変異遺伝子に対して相補である並行プローブセットから構成される。
【０２８１】
なお別の実施形態において、当該分野で公知の種々の配列決定反応のいずれかを使用して、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子を直接配列決定し得、そしてサンプルＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ配列と対応する野生型（コントロール）配列とを比較することによって、変異を検出し得る。配列決定反応の例としては、ＭａｘｉｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ、１９７７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５６０またはＳａｎｇｅｒ、１９７７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３によって開発された技術に基づくものが挙げられる。診断アッセイを実施する場合、種々の自動化配列決定手順のいずれかを利用し得ることもまた意図され（例えば、Ｎａｅｖｅら、１９９５．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９：４４８を参照のこと）、これらには、質量分析法による配列決定法（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ  ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら、１９９６．Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎら、１９９３．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８．：１４７−１５９を参照のこと）が含まれる。
【０２８２】
ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子における変異を検出するための他の方法としては、切断剤からの保護を使用して、ＲＮＡ／ＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡのヘテロ二重鎖に基づくミスマッチ塩基を検出する方法が挙げられる（例えば、Ｍｙｅｒｓら、１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２を参照のこと）。一般に、「ミスマッチ切断」の当該分野の技術は、野生型のＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ配列を含む（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織サンプルから得られた潜在的な変異体ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることによって形成されるヘテロ二重鎖を提供する工程によって始まる。この二本鎖の二重鎖を、二重鎖の一本鎖領域（例えば、そのコントロール鎖とサンプル鎖との間の塩基対ミスマッチに起因して存在するもの）を切断する薬剤を用いて処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を、ＲＮａｓｅを用いて処理し得、そしてＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、そのミスマッチ領域を酵素的に消化することに対して、Ｓ１ヌクレアーゼを用いて処理し得る。他の実施形態において、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡのいずれかの二重鎖を、ミスマッチ領域を消化するために、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム、およびピペリジンを用いて処理し得る。そのミスマッチ領域の消化後、次いで、得られた物質を変性ポリアクリルアミドゲル上で、大きさにより分離して、変異の部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら、１９８８．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａら、１９９２．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５を参照のこと。１つの実施形態において、コントロールのＤＮＡまたはＲＮＡは、検出のために標識され得る。
【０２８３】
なお別の実施形態において、ミスマッチ切断反応は、二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチ塩基対を認識する１つ以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を、細胞のサンプルから得られたＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ  ｃＤＮＡにおける点変異を検出およびマッピングするために規定された系において使用する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチでＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチでＴを切断する（例えば、Ｈｓｕら、１９９４．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １５：１６５７〜１６６２を参照のこと）。例示的な実施形態に従って、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ配列（例えば、野生型ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ配列）に基づくプローブは、試験細胞由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物にハイブリダイズされる。二重鎖は、ＤＮＡミスマッチ修復酵素を用いて処理され、そしてその切断産物（もしあれば）は、電気泳動プロトコルなどから検出され得る。例えば、米国特許第５，４５９，０３９号を参照のこと。
【０２８４】
他の実施形態において、電気泳動の移動度における変化は、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子および／またはＦＣＴＲＸ遺伝子における変異を同定するために使用される。例えば、一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）は、変異体と野生型核酸との間の電気泳動の移動度における差異を検出するために使用され得る（例えば、Ｏｒｉｔａら、１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：８６：２７６６；Ｃｏｔｔｏｎ、１９９３．Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５〜１４４；Ｈａｙａｓｈｉ、１９９２．Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３〜７９を参照のこと）。サンプルおよびコントロールのＦＧＦ−ＣＸ核酸および／またはＦＣＴＲＸ核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントは、変性され、そして再生される。一本鎖核酸の二次構造は、配列に従って変化し、電気泳動の移動度において得られる変化は、１つの塩基変化の検出さえも可能にする。ＤＮＡフラグメントは、標識され得るか、または標識されたプローブを用いて検出され得る。アッセイの感度は、（ＤＮＡよりもむしろ）二次構造が配列中の変化に対してより感受的であるＲＮＡを使用することによって増強され得る。１つの実施形態において、本発明の方法は、ヘテロ二重鎖分析を利用して、電気泳動の移動度における変化に基づいて二本鎖のヘテロ二重鎖分子を分離する。例えば、Ｋｅｅｎら、１９９１．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．７：５を参照のこと。
【０２８５】
なお別の実施形態において、一定勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミドゲルにおける変異体または野生型フラグメントの移動は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使用してアッセイされる。例えば、Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：４９５を参照のこと。ＤＧＧＥが分析の方法として使用される場合、ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲにより約４０ｂｐの高融点ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプを付加することによって、完全には変性されないことを確実するように改変される。さらなる実施形態において、温度勾配は、コントロールＤＮＡおよびサンプルＤＮＡの移動度における差異を同定するために、変性剤勾配の代わりに使用される。例えば、ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ、１９８７．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２７５３を参照のこと。
【０２８６】
点変異を検出するための他の技術の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、既知の変異が中心的に配置されるように調製され得、次いで、完全なマッチが見出される場合にのみハイブリダイゼーションを許容する条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズされ得る。例えば、Ｓａｉｋｉら、１９８６．Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３；Ｓａｉｋｉら、１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６２３０を参照のこと。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ膜に付着され、そして標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズされる場合に、ＰＣＲ増幅された標的ＤＮＡまたは多くの異なる変異にハイブリダイズされる。
【０２８７】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術は、本発明と合わせて使用され得る。特異的増幅についてのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中心において（その結果、増幅は、差次的ハイブリダイゼーションに依存する）（例えば、Ｇｉｂｂｓら、１９８９．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２４３７〜２４４８を参照のこと）か、あるいは適切な条件下でミスマッチが妨げられ得るかまたはポリメラーゼ伸長を減少し得る、１つのプライマーの３’の最末端で、目的の変異を保有し得る（例えば、Ｐｒｏｓｓｎｅｒ、１９９３．Ｔｉｂｔｅｃｈ．１１：２３８を参照のこと）。変異領域に新規な制限部位を導入することは、切断に基づく検出を行うために望ましくあり得る。例えば、Ｇａｓｐａｒｉｎｉら、１９９２．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  ６：１を参照のこと。特定の実施形態において、増幅はまた、増幅用Ｔａｑリガーゼを使用して実施され得ることが予測される。例えば、Ｂａｒａｎｙ、１９９１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８９を参照のこと。このような場合において、連結は、５’配列の３’末端に完全なマッチが存在する場合にのみ生じ、増幅の存在または非存在を探索することによって、特定の部位における既知の変異の存在を検出することを可能にする。
【０２８８】
本明細書中に記載される方法は、例えば、本明細書中に記載れる少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含む、予めパッケージングされた診断キットを利用することによって実施され得、これは、例えば、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子および／またはＦＣＴＲＸ遺伝子に関連する疾患または疾病の症状または家族病歴を示す患者を診断するための臨床的設定において簡便に使用され得る。
【０２８９】
さらに、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸが発現される任意の細胞型または組織（好ましくは、末梢血白血球）は、本明細書中に記載される予後アッセイにおいて利用され得る。しかし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプル（例えば、頬粘膜細胞を含む）が、使用され得る。
【０２９０】
（薬理ゲノム学（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ））
本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定されるような、ＦＣＦ−ＣＸ活性および／またはＦＣＴＲＸ活性（例えば、ＦＣＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子発現）に対する刺激効果または阻害効果を有する薬剤またはモジュレーターは、障害を（予防的または治療的に）処置するために個体に投与され得る。これらの障害として、以下のような病理状態が挙げられる：胃腸管における炎症状態、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸結腸炎およびクローン病）を含むがこれらに限定されない、成長疾患および増殖性疾患（例えば、癌、新脈管形成、アテローム性動脈硬化性斑、コラーゲン形成、軟骨形成および骨形成）、心臓血管疾患および線維症疾患ならびに糖尿病性潰瘍。さらに、ＦＣＴＲＸ核酸およびそれにコードされるポリペプチドは、動脈瘤の予防および遺伝子治療の際の創傷閉鎖の促進のために治療上有用である。さらに、ＦＣＴＲＸ核酸およびそれにコードされるポリペプチドは、細胞増殖、創傷治癒、新生血管形成および組織の増殖ならびに必要な類似の組織再生を刺激するために利用され得る。さらに具体的には、ＦＣＴＲＸ核酸およびＦＣＴＲＸポリペプチドは、貧血および白血球減少症、腸管感受性ならびに禿頭症の処置において有用であり得る。このような状態の処置は、例えば、放射線治療や化学療法を受けた患者において、必要とされ得、ここで、この処置は、いかなる過剰増殖副作用も最小化し得る。
【０２９１】
このような処置と合わせて、個体の薬理ゲノム学（すなわち、個体の遺伝子型と外来化合物または薬物に対するその個体の応答との間の関係についての研究）が、考慮され得る。治療剤の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血中濃度との間の関係を変化させることによって、重篤な毒性または治療の失敗を導き得る。従って、個体の薬理ゲノム学は、個体の遺伝子型の考慮に基づく予防的または治療的処置のために有効な薬剤（例えば、薬物）の選択を可能にする。このような薬理ゲノム学は、さらに、適切な投薬量および治療剤レジメンを決定するために使用され得る。従って、個体におけるＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質の活性、ＦＧＦ−ＣＸ核酸および／またはＦＣＴＲＸ核酸の発現、あるいはＦＧＦ−ＣＸ遺伝子および／またはＦＣＴＲＸ遺伝子の変異含量が決定されて、それによって個体の治療的または予防的処置のために適切な薬剤を選択し得る。
【０２９２】
薬理ゲノム学は、罹患した人おける変更された薬物の性質および異常な作用に起因する、薬物に応答する臨床的に有意な遺伝的変化を扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ、１９９６、．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２３：９８３〜９８５；Ｌｉｎｄｅｒ、１９９７．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４３：２５４〜２６６を参照のこと。一般に、２つの型の薬理ゲノム学状態が、区別され得る。薬物が身体に作用する方法を変更する１つの因子として伝達される遺伝的状態（変更された薬物作用）、または身体が薬物に作用する方法を変更する１つの因子として伝達される遺伝的状態（変更された薬物代謝）。これらの薬理ゲノム学状態は、稀な欠損としてか、または多型としてのいずれかで生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）欠損は、一般的な遺伝性酵素病であり、この主な臨床的合併症は、酸化剤薬物（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取およびソラマメの摂食後の溶血である。
【０２９３】
例示的な実施形態として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および持続期間の両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）ならびにシトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多型の発見は、なぜ幾人かの患者が予期される薬物効果を得ないのか、またはなぜ標準的かつ安全な用量の薬物を摂取した後に過大な薬物応答および深刻な毒性を示すのかに関しての説明を提供した。これらの多型は、集団において２つの表現型（高い代謝能を持つ人（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＥＭ）および低い代謝能を持つ人（ｐｏｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＰＭ））で表現される。ＰＭの有病率は、異なる集団の間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型であり、そしていくらかの変異がＰＭにおいて同定されており、この全ては機能的ＣＹＰ２Ｄ６の非存在を導く。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低い代謝能を持つ人は、彼らが標準的な用量を受ける場合に、かなり頻繁に、過大な薬物応答および副作用を経験する。代謝産物が活性な治療的部分である場合、コデインのＣＹＰ２Ｄ６形成代謝産物であるモルヒネによって媒介されるコデインの鎮痛効果について実証されるように、ＰＭは治療的応答を示さない。他の極端なものは、標準的な用量に応答しない、いわゆる超迅速な代謝能を持つ人（Ｕｌｔｒａ−ｒａｐｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）である。最近、超迅速な代謝の基礎となる分子は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に起因していることが同定されている。
【０２９４】
従って、個体におけるＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質の活性、ＦＧＦ−ＣＸ核酸および／またはＦＣＴＲＸ核酸の発現、あるいはＦＧＦ−ＣＸ遺伝子および／またはＦＣＴＲＸ遺伝子の変異含量を決定して、それによって、その個体の治療的または予防的処置のために適切な薬剤を選択し得る。さらに、薬理ゲノム学の研究を使用して、個体の薬物応答性の表現型の同定に対して薬物代謝酵素をコードする多型対立遺伝子の遺伝子型決定を適用し得る。この知見は、投薬または薬物の選択に適用される場合、有害な反応または治療の失敗を回避し得、従って、被験体をＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの調節因子（例えば、本明細書中に記載される例示的なスクリーニングアッセイの１つによって同定される調節因子）を用いて処置する場合に治療的効率または予防的効率を増強し得る。
【０２９５】
（臨床試験中の効果のモニタリング）
ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの発現または活性に対する薬剤（例えば、薬物、化合物）の影響（例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調節する能力）をモニタリングすることは、基本的な薬物スクリーニングのみならず、臨床試験にも適用され得る。例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイによって決定される、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの遺伝子発現を増加するための、タンパク質レベルを増加するための、またはＦＧＦ−ＣＸ活性および／またはＦＣＴＲＸ活性をアップレギュレートするための薬剤の効力は、減少されたＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの遺伝子発現、タンパク質レベル、またはダウンレギュレートされたＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの活性を示す被験体の臨床試験においてモニターされ得る。あるいは、スクリーニングアッセイによって決定される、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの遺伝子発現を減少するための、タンパク質レベルを減少するための、またはＦＧＦ−ＣＸ活性および／またはＦＣＴＲＸ活性をダウンレギュレートするための薬剤の効力は、増加されたＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ遺伝子発現、タンパク質レベル、またはアップレギュレートされたＦＧＦ−ＣＸ活性および／またはＦＣＴＲＸ活性を示す被験体の臨床試験においてモニターされ得る。このような臨床試験において、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ、ならびに好ましくは、例えば、細胞増殖または免疫障害に関与するような他の遺伝子の発現または活性が、「リードアウト（読み出し）（ｒｅａｄ  ｏｕｔ）」、すなわち、特定の細胞の免疫応答性のマーカーとして使用され得る。
【０２９６】
例として、そしてこれらに限定されないが、ＦＧＦ−ＣＸ活性および／またはＦＣＴＲＸ活性を調節する薬剤（例えば、化合物、薬物または低分子）（例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイにおいて同定される）を用いる処置によって、細胞内で調節される遺伝子（ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸを含む）が、同定され得る。従って、細胞増殖障害に対する薬剤の効果を研究するために、例えば、臨床試験において、細胞が単離され得、そしてＲＮＡが調製され得、そしてＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸならびにこの障害に関与する他の遺伝子の発現のレベルについて分析され得る。遺伝子発現のレベル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、本明細書中に記載されるように、ノーザンブロット分析もしくはＲＴ−ＰＣＲによってか、あるいは産生されるタンパク質の量を測定すること（本明細書中に記載されるような方法の１つによるかによって）、あるいはＦＧＦ−ＣＸおよび／もしくはＦＣＴＲＸまたは他の遺伝子の活性のレベルを測定することによって、定量され得る。この様式で、この遺伝子発現パターンは、この薬剤に対する細胞の生理学的応答の指標であるマーカーとして作用し得る。従って、この応答状態は、この薬剤を用いる個体の処置の前、および処置の間の種々の時点で、決定され得る。
【０２９７】
１つの実施形態において、本発明は、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、低分子、または本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される他の薬物候補物）を用いる被験体の処置の効力をモニタリングするための方法を提供し、これは、以下の工程を包含する：（ｉ）薬剤の投与の前に、被験体から投与前サンプルを得る工程；（ｉｉ）この投与前サンプルにおいて、ＦＧＦ−ＣＸおよび／もしくはＦＣＴＲＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出する工程；（ｉｉｉ）この被験体から１つ以上の投与後サンプルを得る工程；（ｉｖ）この投与後サンプルにおいて、ＦＧＦ−ＣＸおよび／もしくはＦＣＴＲＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出する工程；（ｖ）この投与前サンプルにおけるＦＧＦ−ＣＸおよび／もしくはＦＣＴＲＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを、この投与後サンプル（単数または複数）におけるＦＧＦ−ＣＸおよび／もしくはＦＣＴＲＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルと比較する工程；ならびに（ｖｉ）従って、この被験体に対する薬剤の投与を変更する工程。例えば、この薬剤の増加した投与は、検出されるよりも高いレベルにＦＧＦ−ＣＸおよび／もしくはＦＣＴＲＸの発現または活性を増加させることが（すなわち、この薬剤の効力を増加させること）望ましくあり得る。あるいは、この薬剤の減少した投与は、検出されるよりも低いレベルにＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの発現または活性を減少させることが（すなわち、この薬剤の効力を減少させること）望ましくあり得る。
【０２９８】
（処置方法）
本発明は、異常なＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの発現または活性に関連する障害の危険性のある（またはこれらの障害に対して感受性である）か、またはこの障害を有する被験体を処置する予防的および治療的の両方の方法を提供する。このような障害としては、以下が挙げられる：心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、先天性心欠損症、大動脈狭窄症、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損症、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満症、移植、副腎脳白質ジストロフィー、先天性副腎過形成、前立腺癌、新形成；腺癌、リンパ腫、子宮癌、受胎能、血友病、凝固能亢進、特発性血小板減少性紫斑病、免疫不全症、対宿主性移植片病、ＡＩＤＳ、気管支炎ぜん息、クーロン病；多発性硬化症、オールブライト遺伝性骨形成異常症の処置、ならびに他の疾患、障害および状態など。
【０２９９】
これらの処置方法は、以下により詳細に記載される。
【０３００】
（疾患および障害）
（その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）増加したレベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を拮抗する（すなわち、低減または阻害する）治療剤を用いて処置され得る。活性を拮抗する治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）上記ペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；（ｉｉ）上記ペプチドに対する抗体；（ｉｉｉ）上記ペプチドをコードする核酸；（ｉｖ）相同組換えによって上記ペプチドの内因性機能を「ノックアウトする」ために利用される、アンチセンス核酸および「機能不全性」である（すなわち、上記ペプチドに対するコード配列のコード配列内の異種挿入に起因する）核酸の投与、（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８〜１２９２を参照のこと）；または（ｖ）上記ペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を変化させる、調節因子（すなわち、インヒビター、アゴニストおよびアンタゴニスト（本発明のさらなるペプチド模倣物または本発明のペプチドに対して特異的な抗体を含む））。
【０３０１】
（その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）減少したレベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を増加させる（すなわち、活性に対するアゴニストである）治療剤を用いて処置され得る。活性をアップレギュレートする治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：上記ペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；あるいはバイオアベイラビリティーを増加させるアゴニスト。
【０３０２】
増加したレベルまたは減少したレベルは、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することによって、容易に検出され得る。この定量は、患者の組織サンプルを（例えば、生検組織から）入手し、そしてそのサンプルを、その発現したペプチド（または上記ペプチドのｍＲＮＡ）のＲＮＡまたはペプチドのレベル、構造および／または活性をインビトロでアッセイすることによる。当該分野において周知の方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：イムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット分析、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動と、それに続く免疫沈降、免疫細胞化学などによる）および／またはｍＲＮＡの発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼーションなど）。
【０３０３】
（予防的方法）
１つの局面において、本発明は、被験体において異常なＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの発現または活性と関連する疾患または状態を、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの発現または少なくとも１つのＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸ活性を調節する薬剤をこの被験体に投与することによって予防するための方法を提供する。異常なＦＧＦ−ＣＸ活性および／またはＦＣＴＲＸの発現または活性によって引き起こされるかまたはこれらに起因する、疾患にかかる危険がある被験体は、例えば、本明細書中に記載の診断アッセイまたは予後アッセイのいずれか、またはそれらの組み合わせによって、同定され得る。予防薬剤の投与は、疾患または障害が予防されるか、あるいはその進行を遅らせられるように、このＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの異常の特徴である症状の発現の前に行い得る。このＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの異常の型に依存して、例えば、ＦＧＦ−ＣＸアゴニスト薬剤および／またはＦＣＴＲＸアゴニスト薬剤またはＦＧＦ−ＣＸアンタゴニスト薬剤および／またはＦＣＴＲＸアンタゴニスト薬剤が、その被験体を処置するために使用され得る。その適切な薬剤は、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイに基づいて決定され得る。本発明の予防方法は、以下の小節において、さらに議論される。
【０３０４】
（治療方法）
本発明の別の局面は、治療目的のためにＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの発現または活性を調節する方法に関する。本発明の調節方法は、細胞を、その細胞に関するＦＧＦ−ＣＸタンパク質活性および／またはＦＣＴＲＸタンパク質活性の活性のうちの１つ以上を調節する薬剤と接触させる工程を包含する。ＦＧＦ−ＣＸタンパク質活性および／またはＦＣＴＲＸのタンパク質活性を調節する薬剤は、核酸またはタンパク質、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質の天然に存在する同族リガンド、ペプチド、ＦＧＦ−ＣＸペプチド模倣物および／またはＦＣＴＲＸペプチド模倣物、または他の低分子のような、本明細書中に記載されるような薬剤であり得る。１つの実施形態において、この薬剤は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのタンパク質活性のうちの１つ以上を刺激する。このような刺激薬剤の例としては、活性なＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質、およびその細胞に導入されたＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸをコードする核酸分子が挙げられる。別の実施形態において、この薬剤は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質活性および／またはＦＣＴＲＸのタンパク質活性のうちの１つ以上を阻害する。このような阻害薬剤の例としては、アンチセンスＦＧＦ−ＣＸ核酸分子および／またはアンチセンスＦＣＴＲＸ核酸分子、および抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体および／または抗ＦＣＴＲＸ抗体が挙げられる。これらの調節方法は、インビトロで（例えば、その薬剤とともにその細胞を培養することによって）、あるいはインビボで（例えば、被験体にその薬剤を投与することによって）実施され得る。このように、本発明は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのタンパク質または核酸分子の異常な発現または異常な活性によって特徴付けられる、疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの発現または活性を調節する（例えば、アップレギュレートまたはダウンレギュレートする）薬剤（例えば、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイによって同定される薬剤）あるいはそのような薬剤の組み合わせを投与する工程を包含する。別の実施形態において、この方法は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸのタンパク質または核酸分子を、低減したかまたは異常なＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの発現または活性を補償するための治療として、投与する工程を包含する。
【０３０５】
ＦＧＦ−ＣＸ活性および／またはＦＣＴＲＸ活性の刺激は、ＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸが異常にダウンレギュレートされている状況、および／またはＦＧＦ−ＣＸ活性および／またはＦＣＴＲＸ活性の増加が有益な効果を有するようである状況において、望ましい。このような状況の１つの例は、被験体が、異常な細胞増殖および／または細胞分化によって特徴付けられる障害（例えば、癌または免疫関連）を有する場合である。このような状況の別の例は、被験体が妊娠性疾患（例えば、予かん前症（ｐｒｅｃｌａｍｐｓｉａ））を有する場合である。
【０３０６】
（治療剤の生物学的効果の決定）
本発明の種々の実施形態において、適切なインビトロまたはインビボアッセイを行って、特定の治療剤の効果およびその投与が罹患組織の処置を示すか否かを決定する。
【０３０７】
種々の特定の実施形態において、インビトロアッセイが患者の障害に関与する代表的な細胞型を用いて行われ、所定の治療剤がこの細胞型に対して所望の効果を発揮するか否かを決定し得る。治療において使用する化合物は、ヒト被験体において試験する前に、適切な動物モデル系において試験され得る。これらの動物モデル系としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなど。同様に、インビボ試験については、当該分野で公知の任意の動物モデル系が、ヒト被験体に対する投与の前に使用され得る。
【０３０８】
（本発明の組成物の予防的用途および治療的用途）
本発明のＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの核酸およびタンパク質は、以下を含むが、これらに限定されない種々の障害に関連する潜在的な予防的適用および治療的適用に有用である：炎症性腸疾患、およびＦＧＦ−ＣＸ、ＦＣＴＲＸ、あるいはＦＧＦ−ＣＸおよび／またはＦＣＴＲＸの両方と関連する障害。
【０３０９】
例えば、本発明のＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に有用であり得、そして、これらのタンパク質は、それを必要とする患者に投与された場合に、有用であり得る。非限定的な例示の目的で、本発明の組成物は、以下に罹患している患者の処置について有効性を有する：胃腸管における炎症状態（炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸結腸炎およびクローン病）を含むが、これらに限定されない）、成長疾患および増殖性疾患（例えば、癌、新脈管形成、アテローム性動脈硬化性斑、コラーゲン形成、軟骨形成および骨形成）、心臓血管疾患および線維症疾患ならびに糖尿病性潰瘍。さらに、ＦＣＴＲＸ核酸およびそれにコードされるポリペプチドは、動脈瘤の予防および遺伝子治療を介する創傷閉鎖の促進のために治療上有用である。さらに、ＦＣＴＲＸ核酸およびそれにコードされるポリペプチドは、細胞増殖、創傷治癒、新生血管形成および組織の増殖、ならびに必要な類似の組織再生を刺激するために利用され得る。より具体的には、ＦＣＴＲＸ核酸およびＦＣＴＲＸポリペプチドは、貧血および白血球減少症、腸管感受性ならびに禿頭症の処置において有用であり得る。このような状態の処置は、例えば、放射線治療や化学療法を受けた患者において、必要とされ得、ここで、この処置は、いかなる過剰増殖副作用も最小化し得る。
【０３１０】
ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質をコードする新規の核酸、および本発明のＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／またはＦＣＴＲＸタンパク質の両方、あるいはそれらの核酸フラグメントもしくはタンパク質フラグメント、アナログ、ホモログまたは誘導体もまた、診断適用において有用であり得、ここで、その核酸またはタンパク質の存在または量が、評価される。さらなる用途は、抗菌分子（すなわち、いくつかのペプチドは、抗菌特性を有することが見出されている）としての用途であり得る。これらの材料は、治療的または診断的な方法における用途に関する本発明の新規の物質に免疫特異的に結合する抗体の生成においてさらに有用である。
【０３１１】
（実施例）
ＦＧＦ−ＣＸおよびＦＣＴＲＸの両方が、培養物中の種々の哺乳動物細胞の成長および増殖を誘導するいくつかの実施例を、以下に示す。さらに、これらのタンパク質が、炎症性腸疾患の処置、改善または発症の遅延のために有用であることを、炎症性腸疾患の動物モデルにおいて実証する。「処置」とは、本発明で使用されるタンパク質を、治療上有効な効果を提供する目的で、炎症性腸疾患のような病理状態にある被験体に投与することを意味する。炎症性腸疾患のような病理状態を「改善する」とは、ａ）病理状態がより重篤になりつつある被験体において、病理状態の１つ以上の症状が、より重篤になるのを停止し、そして安定するかまたは改善すること；あるいはｂ）病理状態が安定状態にあると考えられる被験体において、病理状態の１つ以上の症状が、改善するかまたは重篤度が低くなることを意味する。炎症性腸疾患のような病理状態の「発症を遅延させる」とは、本発明で使用されるＦＧＦ−ＣＸタンパク質およびＦＣＴＲＸタンパク質のような治療薬剤の予防用量または投薬レジメンの投与が、炎症性腸疾患のような病理状態の１つ以上の症状の発生の遅延、または悪化の遅延を生じることを意味する。このような遅延とは、不確定期間（その症状が本質的に決して現われないかまたは悪化しない）か、あるいはより限定される期間（その治療薬剤を投与することのない、本方法において想定される組成物によって処置されない患者の経験に基づいて予測されるよりも遅い時期において、その症状が発生するかまたは悪化する）であり得る。
【０３１２】
３つの実施例において以下に報告された実験の結果は、ＤＳＳを７日間経口投与することによって炎症性腸疾患が誘導されたマウスにおいて、このＤＳＳに対する曝露の過程において使用された増殖因子の同時処置が、未処置のＤＳＳコントロールと比較して有意な治療上の効果を導くことを示す。
【０３１３】
さらなる実施例は、クローン病で生じる変化と類似する大きさとかつ組織病理学的な腸の変化を生じる、インドメタシンを用いて処置されたラットについての結果を報告する。インドメタシン処置されたラットへのＣＧ５３１３５（０．２ｍｇ／ｋｇ  ｉｖ）投与は、体重損失、小腸の重量、好中球の絶対数ならびに空腸壊死および炎症性スコアの有意な減少を生じる。
【０３１４】
（実施例１．ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の同定）
ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子を、照会（ｑｕｅｒｙ）として、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ＦＧＦ−ＣＸ（Ｋｏｇａ，Ｃ．，Ａｄａｔｉ，Ｎ．，Ｎａｋａｔａ，Ｋ．，Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ，Ｋ．，Ｆｕｒｕｈａｔａ，Ｙ．，Ｓａｔａ，Ｓ．，Ｔｅｉ，Ｈ．，Ｓａｋａｔｉ，Ｙ．，Ｋｕｒｏｋａｗａ，Ｔ．，Ｓｈｉｏｋａｗａ，Ｋ．＆Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｋ．Ｋ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２６１，７５６−７６５；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０１２６１５）を用いた、ＧｅｎｂａｎｋヒトゲノムＤＮＡ配列のＴＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｇｉｓｈ，Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０）の検索に従って、同定した。この検索は、第８染色体の高度に相同な遺伝子座（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０２０８５８）を同定した。イントロン／エクソンの境界は、標準のコンセンサススプライシングパラメータ（Ｍｏｕｎｔ，Ｓ．Ｍ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１，１６９０−１６９２）を、公知のＦＧＦから誘導した相同性と共に使用して推定された。ＦＧＦ−ＣＸ開始コドンは、ＡＢ０２０８５８配列のｂｐ１６２１４に局在し、このエクソンの残りの３’部分は、ｂｐ１５９３０まで続く。ＦＧＦ−ＣＸの５’ＵＴＲは、公的ＥＳＴを使用して、開始コドンのさらに６０６ｂｐ上流に及んだ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡ２３２７２９，ＡＡ２３６５２２，ＡＩ２７２８７６およびＡＩ２７２８７８）。遺伝子座ＡＢ０２０８５８に関連する場合、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の残りの構造は、以下のとおりである：イントロン１（ｂｐ１５９２９−９９４２）；エクソン２（ｂｐ９９４１−９８３８）；イントロン２（ｂｐ９８３７−７５００）；エクソン３（ｂｐ７４９９で開始する）。
【０３１５】
前述のパラグラフにおける手順によって発見された遺伝子は、３つのエクソンおよび２つのイントロンを含む。ＤＮＡ配列は、開始メチオニンの１１７ｂｐ上流のインフレーム終始コドンを有する、２１１アミノ酸残基のＯＲＦを予想する（表１を参照のこと）。遺伝子が見出されたＤＮＡセグメントは、染色体８ｐ２１．３〜８ｐ２２に位置し、この位置は、放射線ハイブリッド分析によって確認された。
【０３１６】
（実施例２．ＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードする配列の分子クローニング）  オリゴヌクレオチドプライマーを、オープンリーディングフレームを示し、全長ＦＧＦ−ＣＸをコードする、ＤＮＡセグメントのＰＣＲによる増幅のために設計した。順方向プライマーは、ＢｇｌＩＩ制限部位（ＡＧＡＴＣＴ）およびコンセンサスＫｏｚａｋ配列（ＣＣＡＣＣ）を含む。逆方向プライマーは、さらなるサブクローニングの目的のためにインフレームのＸｈｏＩ制限部位を含む。順方向プライマーと逆方向プライマーの両方は、５’クランプ配列（ＣＴＣＧＴＣ）を含む。プライマーの配列は、以下のとおりである：
【０３１７】
【化１】
2004537267.tif 000027
ＰＣＲ反応を、５０μｌ容積中で、合計５ｎｇのヒト前立腺ｃＤＮＡテンプレート、各々１μＭのＰＧＦ−ＣＸ−順方向プライマーおよびＦＧＦ−ＣＸ−逆方向プライマー、５μｍｏｌのｄＮＴＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  ＣＡ）ならびに１μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＨＦ２ポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、実行した。以下のＰＣＲ反応条件を使用した：
ａ）９６℃  ３分間
ｂ）９６℃  ３０秒間  変性
ｃ）７０℃  ３０秒間、プライマーアニーリング。この温度を、１℃／サイクルで、徐々に減少した。
【０３１８】
ｄ）７２℃  １分間  伸長
工程（ｂ）〜（ｄ）を１０回繰り返す
ｅ）９６℃  ３０秒間  変性
ｆ）６０℃  ３０秒間  アニーリング
ｇ）７２℃  １分間  伸長
工程（ｅ）〜（ｇ）を２５回繰り返す
ｈ）７２℃  ５分間  最終伸長
伸長された大きさが、約６４０ｂｐである単一のＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動後にクローニングし、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結した（。クローニングされたインサートを、ベクター特異的なＭ１３順方向プライマー（−４０）およびＭ１３逆方向プライマーを使用して、配列決定を行った。これにより、ヌクレオチド配列は、表１の配列（配列番号１）に１００％同一であり、上流のＢｇｌＩＩクローニング部位と下流のＸｈｏＩクローニング部位の間に直接挿入されることが立証された。クローニングされた配列は、予想されたＦＧＦ−ＣＸ全長タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを構成する。このクローンは、ＴＡ−ＡＢ０２０８５−Ｓ２７４−Ｆ１９と呼ばれる。
【０３１９】
（実施例３．哺乳動物発現ベクターｐＣＥＰ４／Ｓｅｃの調製）
オリゴヌクレオチドプライマーｐＳｅｃ−Ｖ５−Ｈｉｓ順方向
【０３２０】
【化２】
2004537267.tif 000028
およびｐＳｅｃ−Ｖ５−Ｈｉｓ逆方向
【０３２１】
【化３】
2004537267.tif 000029
を、Ｖ５およびＨｉｓ６を含むｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）発現ベクターから、フラグメントを増幅するために設計した。ＰＣＲ産物をＸｈｏＩおよびＡｐａＩで消化し、Ｉｇκリーダー配列を有するＸｈｏＩ／ＡｐａＩ消化ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）へ連結した。結果として得られる、インフレームのＩｇκリーダーおよびＶ５−Ｈｉｓ６を含む、ベクター（ｐＳｅｃＶ５Ｈｉｓ）の正しい構造は、ＤＮＡ配列の分析によって検証された。正しいフレームに上記エレメントを保持するフラグメントを提供するために、ベクターｐＳｅｃＶ５ＨｉｓをＰｍｅＩおよびＮｈｅＩで消化した。このＰｍｅＩ−ＮｈｅＩフラグメントを、ＢａｍＨＩ／ＫｌｅｎｏｗおよびＮｈｅＩ処理ベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結した。結果として得られるベクターを、ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃと命名した。このベクターは、インフレームのＩｇκリーダー、目的のクローンを挿入するための部位、ならびにＰＣＭＶおよび／またはＰＴ７プロモーターの制御下にあるＶ５エピトープおよび６×Ｈｉｓを含む。ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃは、Ｉｇκ鎖シグナルペプチドに続くマルチクローニング部位に、任意のタンパク質を融合することによって、異種のタンパク質の発現および分泌を可能にする発現ベクターである。発現タンパクの検出および精製は、Ｃ末端のＶ５エピトープタグおよび６×Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の存在によって補助される。
【０３２２】
（実施例４．ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞中でのＦＧＦ−ＣＸの発現）
ＦＧＦ−ＣＸ配列を含むＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、ＴＡ−ＡＢ０２０８５−Ｓ２７４−Ｆ１９（実施例２）から単離し、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ消化ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃにサブクローニングし、発現ベクターｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−ＦＧＦ−ＣＸを作製した。ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−ＦＧＦ−ＣＸベクターを、製造業者の使用説明書（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）に従って、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓ試薬を使用して、２９３細胞にトランスフェクトした。細胞ペレットおよび上清を、トランスフェクション後７２時間で回収し、抗Ｖ５抗体を用いたウエスタンブロッティング（還元条件）によってＦＧＦ−ＣＸ発現について試験した。図１は、ＦＧＦ−ＣＸが、２９３細胞によって分泌される、約３４ｋＤａタンパク質の見かけの分子量（Ｍｒ）を有するポリペプチドとして発現されることを示す。さらに、約３１ｋＤａに少数のバンドが観測される。
【０３２３】
（実施例５．Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＦＧＦ−ＣＸの発現）
ベクターｐＲＳＥＴＡ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）を、ＸｈｏＩおよびＮｃｏＩ制限酵素で消化した。以下の配列のオリゴヌクレオチドリンカー：
【０３２４】
【化４】
2004537267.tif 000030
を、摂氏３７度でアニールし、ＸｈｏＩ−ＮｃｏＩ処理ｐＲＳＥＴＡに連結した。結果として得られるベクターを、制限分析および配列決定によって確認し、ｐＥＴＭＹと命名した。ＦＧＦ−ＣＸ（実施例２を参照のこと）をコードする配列のＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で消化されたベクターｐＥＴＭＹに連結した。この発現ベクターを、ｐＥＴＭＹ−ＦＧＦ−ＣＸと命名する。このベクター上で、ｈＦＧＦ−ＣＸを、そのＮ末端で、６×ＨｉｓタグおよびＴ７エピトープに融合した。次いで、プラスミドｐＥＴＭＹ−ＦＧＦ−ＣＸを、Ｅ．ｃｏｌｉ発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３、ｐＬｙｓ）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にトランスフェクトし、タンパク質ＦＧＦ−ＣＸの発現を、製造業者の使用説明書に従って誘導した。誘導後、全細胞を回収し、タンパク質を、抗ＨｉｓＧｌｙ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用するウエスタンブロッティングによって、分析した。図２は、ＦＧＦ−ＣＸが、見かけの分子量Ｍｒ約３２ｋＤａのタンパク質として発現されたことを示す。
【０３２５】
（実施例６．クローニングされたシグナルペプチドを有する組換えＦＧＦ−ＣＸタンパク質の発現とシグナルペプチドを有さない組換えＦＧＦ−ＣＸタンパク質の発現との比較）
（ａ）シグナルペプチドを有さない発現）
発明の詳細な説明に記載されるように、ＦＧＦ−ＣＸは、見たところ標準的なアミノ末端シグナルペプチドを欠損する。ＦＧＦ−ＣＸが、哺乳動物細胞から分泌されるかどうかを決定するために、ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントとして得られる、全長ＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードするｃＤＮＡを、ＴＡ−ＡＢ０２０８５−Ｓ２７４−Ｆ１９からＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ消化ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした（実施例２）。これが、ｐＦＧＦ−ＣＸと表される哺乳動物発現ベクターを提供した。この構築物は、Ｖ５エピトープタグおよびポリヒスチジンタグをこのタンパク質のカルボキシ末端に組み込み、それぞれその同定および精製を補助し、そして、約２７ｋＤａのポリペプチドを作製するはずである。２９３ヒト胎児腎臓細胞への一時的なトランスフェクションに続いて、馴化培地を、トランスフェクション後４８時間で回収した。
【０３２６】
ＦＧＦ−ＣＸの馴化培地への分泌に加えて、ＦＧＦ−ＣＸが、細胞ペレット／ＥＣＭと結合することも見出される（データは示さず）。ＦＧＦが、細胞表面上および細胞外マトリクス（ＥＣＭ）中に存在するヘパリンスルフェートプロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に結合することが公知であるので、本発明者らは、ＦＧＦ−ＣＸが、この方法で分離された可能性を調査した。このために、ＦＧＦ−ＣＸ感染化細胞を、１００μＭスラミンを含む０．５ｍｌのＤＭＥＭ（増殖因子とＨＳＰＧとの間の低親和性相互作用を破壊すると知られている化合物（Ｌａ  Ｒｏｃｃａ，Ｒ．Ｖ．，Ｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ａ．＆Ｍｙｅｒｓ，Ｃ．Ｅ．（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ２，１０６−１１５））での、４℃、３０分間の処理によって抽出した。次いで、スラミン抽出化馴化培地を、遠心分離（５分間；２０００×ｇ）で回収し、清浄化した。
【０３２７】
次いで、馴化培地およびスラニン抽出物を、等量の２×ゲル負荷緩衝液と混合した。サンプルを１０分間煮沸し、４％〜２０％勾配のポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ、Ｄａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって還元条件下で分離し、そして、ニトロセルロースフィルター（Ｎｏｖｅｘ）に移した。ウェスタン分析を、標準的な手順に従ってＨＲＰ結合抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＥＣＬ検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて実行した。
【０３２８】
予想されたＭｒを有する１つのバンドを、ｐＦＧＦ−ＣＸでトランスフェクトされた２９３細胞からの馴化培地において同定した（図３、パネルＡ、レーン１）。コントロールベクターでトランスフェクトされた細胞からの馴化培地は、抗体と反応しなかった（図３、パネルＡ、レーン５）。スラミン処理後、有意量のＦＧＦ−ＣＸが、実際に細胞表面／ＥＣＭから遊離し得ることが見出され、このことは、ＨＳＰＧがこのタンパク質の分離において役割を果たす可能性があることを示す（図３、パネルＡ、レーン２）。これらの結果は、ＦＧＦ−ＣＸが標準的なシグナルペプチドを有さずに分泌され得ることを示す。
【０３２９】
組換えＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、ＤＮＡ合成および細胞増殖を刺激（ＦＧＦ−ＣＸの細胞表面レセプターへの高親和性の結合を介して媒介され、そしてＨＳＰＧとの低親和性の相互作用を介して調整され得る効果）する。スラミン抽出データは、ＦＧＦ−ＣＸが細胞表面および／またはＥＣＭ上に存在するＨＳＰＧに結合することを示唆する。
【０３３０】
（ｂ）シグナルペプチドを有する発現）
タンパク質分泌を増加する目的で、構築物（ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−ＦＧＦ−ＣＸ）を作製し、その中で、ＦＧＦ−ＣＸ  ｃＤＮＡを、Ｉｇκ遺伝子由来の切断可能なアミノ末端分泌シグナル配列とインフレームで融合した。結果として得られるタンパク質は、ｐＦＧＦ−ＣＸについて上記に記載されるように、カルボキシ末端Ｖ５およびポリヒスチジンタグもまた含んだ。２９３細胞へのトランスフェクションに続いて、約３１ｋＤａの予想されるＭｒを有するタンパク質産物を得、スラミンは、有意量の、分離されたＦＧＦ−ＣＸタンパク質を遊離すると再度見出された（図３、パネルＡ、レーン３および４）。予想されるように、ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−ＦＧＦ−ＣＸは、ｐＦＧＦ−ＣＸよりもより多くの可溶ＦＧＦ−ＣＸを生成した。
【０３３１】
２９３細胞についての上記記載の結果に類似する結果をまた、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用して得た（図３、パネルＢ）。
【０３３２】
（実施例７．ＦＧＦ−ＣＸの発現）
ＦＧＦ−ＣＸを、実施例５に本質的に記載されるように発現した。このタンパク質を、Ｎｉ２＋親和性クロマトグラフィーを使用して精製し、還元条件および非還元条件下の両方でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、そしてＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅで染色した。この結果を図４に示す。両方の条件下で、タンパク質は、約２９ｋＤａから約３０ｋＤａの見かけの分子量で移動することが見られる。
【０３３３】
（実施例８．組換えＦＧＦ−ＣＸによるブロモデオキシウリジン取り込みの刺激）
ＢｒｄＵの取り込みに対する用量応答実験を、ヒト腎臓癌細胞（７８６−０；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を使用して実行した。２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造業者のプロトコルに従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用してトランスフェクトした。細胞をトランスフェクション後５時間で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で補充した。ＢｒｄＵアッセイおよび増殖アッセイ（実施例１０）のためのタンパク質を作製するために、細胞を洗浄し、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、トランスフェクション後１８時間培養した。４８時間後、この培地を捨て、細胞単層を、０．５ｍｌ  ＤＭＥＭ中の１００μＭスラミン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と共に、４℃で３０分間インキュベーションした。次いで、スラミン抽出馴化培地を除去し、遠心分離（５分間；２０００×ｇ）で清浄化し、そして、カルボキシ末端ポリヒスチジンタグを利用して、製造業者の使用説明書（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）に従って、ＴＡＬＯＮ金属親和性クロマトグラフィーにかけた。保持される融合タンパク質を、カラムをイミダゾールで洗浄することによって遊離した。
【０３３４】
コントロールタンパク質を作製するために、２９３−ＥＢＮＡ細胞をｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクトし、上記で概略が述べられる精製手順にかけた。
【０３３５】
組換えＦＧＦ−ＣＸを、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）組み込みアッセイにおいて、ＤＮＡ合成を誘導するその能力について試験した。７８６−０細胞を９６ウェルプレートで約１００％コンフルエンスまで培養し、ＤＭＥＭで洗浄し、そして２４時間、ＤＭＥＭで血清欠乏した。そして、組換えＦＧＦ−ＣＸまたはコントロールタンパク質を、１８時間の間細胞に加えた。ＢｒｄＵアッセイを、製造業者の仕様書（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に従って、５時間のＢｒｄＵ取り込み時間を用いて実行した。
【０３３６】
この結果を図５に示し、そこでは、ＦＧＦ−ＣＸを「２０８５８」と表す。ＦＧＦ−ＣＸは、腎臓癌細胞の増殖を、コントロールに対して４倍以上刺激し、半有効用量は約２．５ｎｇ／ｍＬである。
【０３３７】
（実施例９．ＦＧＦ−ＣＸのレセプター結合特異性）
ＦＧＦ−ＣＸのレセプター結合特異性を決定するために、本発明者らは、組換えＦＧＦ−ＣＸによるＮＩＨ  ３Ｔ３におけるＤＮＡ合成の誘導に対する可溶性ＦＧＦレセプター（ＦＧＦＲ）の効果を試験した。現在までに、４つのレセプターが同定された（Ｋｌｉｎｔ  ＰおよびＣｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ  Ｌ．Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１６５−１７７，１９９９；Ｘｕ  Ｘら  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．，２９６：３３−４３，１９９９）。ＦＧＦＲ１β（ＩＩＩｃ）、ＦＧＦＲ２α（ＩＩＩｂ）、ＦＧＦＲ２β（ＩＩＩｂ）、ＦＧＦＲ２α（ＩＩＩｃ）、ＦＧＦＲ３α（ＩＩＩｃ）およびＦＧＦＲ４、に対する可溶性レセプターを使用した。これらのＦＧＦＲの各々の可溶性形態は、ＦＧＦ−ＣＸの生物学的活性を、特異的に阻害し得ることが見出された（図６を参照のこと）。完全な阻害またはほぼ完全な阻害は、可溶性ＦＧＦＲ２α（ＩＩＩｂ）、ＦＧＦＲ２β（ＩＩＩｂ）、ＦＧＦＲ２α（ＩＩＩｃ）、およびＦＧＦＲ３α（ＩＩＩｃ）を使用して得られ、ここで、部分的な阻害を、可溶性ＦＧＦＲ１β（ＩＩＩｃ）およびＦＧＦＲ４を使用して達成した。どの可溶性レセプター試薬も、ＰＤＧＦ−ＢＢによるＤＮＡ合成の誘導に介入せず、このことにより、これらの特異性が示される。各々の可溶性レセプター試薬の完全性は、ａＦＧＦ（酸性ＦＧＦ）（分析中のＦＧＦＲの全てと相互作用することが知られている因子）によるＤＮＡ合成の誘導を阻害するその能力を示すことによって実証された。
【０３３８】
（実施例１０．Ｎ末端欠失形態のＦＧＦ−ＣＸのクローニングおよび発現）
プラスミドｐＥＴ２４ａ−ＦＧＦ２０Ｘ−ｄｅｌ５４コドンを有するＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、３７℃でＬＢ培地中で増殖した。このプラスミドは、位置５５で開始するＦＧＦ−ＣＸのＣ末端部分をコードする。細胞密度が０．６ＯＤに達した場合、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるように加えた。次いで、誘導された培養液を、３７℃でさらに４時間インキュベーションした。細胞を４℃で１５分間、３０００×ｇでの遠心分離によって回収し、ＰＢＳ中に懸濁し、次いで、微小流動化器に２回通し破砕した。可溶性タンパク質および不溶性タンパク質を分離するために、溶解物を、４℃で２０分間、１００００×ｇでの遠心分離にかけた。不溶性画分（ペレット）を、１Ｍ  Ｌ−アルギニンを含むＰＢＳで抽出した。次いで、残存する不溶性材料を遠心分離によって除去し、そのアルギニン抽出物の可溶性画分を、０．２ミクロンの低タンパク質結合性膜を通して濾過し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。この結果を図７に示し、これは、生成物が、約２０ｋＤａの見かけの分子量を有するポリペプチド（矢印を参照のこと）であることを示す。発現されたポリペプチドのＮ末端配列決定によって、配列ＡＱＬＡＨＬＨＧＩＬＲＲＲＱＬを提供し、この配列は、ＦＧＦ−ＣＸの残基５４〜６４と１００％同一である（表１、配列番号２）。
【０３３９】
（実施例１１．短縮型のＦＧＦ−ＣＸに対する応答におけるＮＩＨ  ３Ｔ３細胞へのブロモデオキシウリジンの組み込みの刺激）
（ｄ１−２３）ＦＧＦ−ＣＸといわれるＦＧＦ−ＣＸの残基２４〜２１１を発現するベクターを調製した。表１および配列番号２を参照のこと。この短縮型を取り込むベクターを使用して得られる馴化培地で処理したＮＩＨ  ３Ｔ３細胞によるＢｒｄＵの取り込みを、全長ＦＧＦ−ＣＸをコードするベクターを使用する馴化培地での処理に応じた取り込みと比較した。この実験を実施例８に記載されるように実施した。
【０３４０】
この結果を図８に示す。（ｄ１−２３）ＦＧＦ−ＣＸは、試験された最低濃度（１０ｎｇ／ｍＬ）で高い活性を保持することが観察された。この濃度で、全長ＦＧＦ−ＣＸの活性はかなり落ち、コントロールのレベルに近づく。（ｄ１−２３）ＦＧＦ−ＣＸは、全長ＦＧＦ−ＣＸよりも、少なくとも５倍高い活性であり得ることが見積もられる。
【０３４１】
（実施例１２．クローン３０６６４１８８．０．９９からの成熟ＦＣＴＲ１型（３０６６４１８８．０．ｍ９９）ポリペプチドの分子クローニング）
表２のアミノ酸配列の残基２４〜３７０（配列番号４）をコードする、クローン３０６６４１８８．０．９９の成熟型をクローニングした。このフラグメントは、３０６６４１８８．０．ｍ９９と称され、残基２３と２４の間で切断されると予想されるシグナルペプチドが除去された後に残るポリペプチド配列に対応する。以下のオリゴヌクレオチドプライマーを、予想される３０６６４１８８．０．９９の成熟型のＰＣＲ増幅に設計した：
【０３４２】
【化５】
2004537267.tif 000031
順方向プライマーは、インフレームのＥｃｏＲＩ制限部位を含み、逆方向プライマーは、ＸｈｏＩ制限部位を含む。ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩフラグメントは、ｐＥＴ２８ａ  Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターおよびｐＭｅｌＶ５Ｈｉｓバキュロウイルス発現ベクターと適合性である。
【０３４３】
ＰＣＲ反応を、５ｎｇのヒト脾臓およびヒト胎児肺ｃＤＮＡテンプレートを使用して設定した。反応混合液は、５０μｌ容積中に、各々１μＭの３０６６４１８８Ｅｃｏ順方向プライマーおよび３０６６４１８８Ｘｈｏ逆方向プライマー、５μｍｏｌのｄＮＴＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  ＣＡ）ならびに１μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＨＦ２ポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  ＣＡ）を含んだ。以下の反応条件を使用した：
ａ）９６℃  ３分間
ｂ）９６℃  ３０秒間  変性
ｃ）７０℃  ３０秒間、プライマーアニーリング。この温度を、１℃／サイクルで、徐々に減少した。
【０３４４】
ｄ）７２℃  １分間  伸長
工程（ｂ）〜（ｄ）を１０回繰り返す
ｅ）９６℃  ３０秒間  変性
ｆ）６０℃  ３０秒間  アニーリング
ｇ）７２℃  １分間  伸長
工程（ｅ）〜（ｇ）を２５回繰り返す
ｈ）７２℃  ５分間  最終伸長
１０４１ｂｐ有すると予想される増幅産物を、両サンプルにおいて、アガロースゲル電気泳動によって検出した。このフラグメントを、アガロースゲルから精製し、ｐＣＲ２．１ベクターに連結した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）。クローニングされたインサートを、Ｍ１３順方向プライマー、Ｍ１３逆方向プライマーおよび以下の遺伝子特異的プライマーを使用して配列決定した：
【０３４５】
【化６】
2004537267.tif 000032
このクローン化されたインサートは、３０６６４１８８．０．９９の予想される成熟型をコードするオープンリーディングフレームとして実証された。３０６６４１８８−Ｓ３１１ａと呼ばれる胎児肺由来の構築物を、発現ベクターへのさらなるサブクローニングに使用した（以下を参照のこと）。制限部位内の３０６６４１８８−Ｓ１１ａのヌクレオチド配列は、３０６６４１８８．０．９９のＯＲＦ中の対応するフラグメントと１００％同一であることが見出された（表２、配列番号４）。
【０３４６】
（実施例１３．Ｅ．ｃｏｌｉにおける３０６６４１８８．ｍ９９ポリペプチドの発現）
ベクターｐＲＳＥＴＡ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、ＸｈｏＩおよびＮｃｏＩ制限酵素で消化した。オリゴヌクレオチドリンカー：
【０３４７】
【化７】
2004537267.tif 000033
を、摂氏３７度でアニーリングし、ＸｈｏＩ−ＮｃｏＩ処理ｐＲＳＥＴＡに連結した。結果として得られるベクターを、制限分析および配列決定によって確認し、ｐＥＴＭＹと命名した。３０６６４１８８配列（実施例１２）を含むＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ消化ｐＥＴＭＹに連結した。結果として得られる発現ベクターを、ｐＥＴＭＹ−３０６６４１８８と命名した。このベクターにおいて、３０６６４１８８を、そのＮ末端でＴ７エピトープおよび６×Ｈｉｓタグと融合した。次いで、プラスミドｐＥＴＭＹ−３０６６４１８８をＥ．ｃｏｌｉ発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３，ｐＬｙｓ）（Ｎｏｖｅｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にトランスフェクトし、このタンパク質の発現を、製造業者の使用説明書に従って誘導した。誘導後、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を回収し、タンパク質を抗Ｈｉｓ６Ｇｌｙ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、ウエスタンブロッティングによって分析した。図９は、本明細書中で３０６６４１８８．ｍ９９と称される結果として得られるポリペプチドが、見かけ分子量４０ｋＤａのタンパク質として発現されたことを示す。これは、３０６６４１８８．ｍ９９配列に対して予想される分子量を近似する。
【０３４８】
（実施例１４．ヒト胎児腎臓２９３細胞における３０６６４１８８．ｍ９９ポリペプチドの発現）
３０６６４１８８．ｍ９９配列を含むＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、３０６６４１８８ーＳ３１１ａ（実施例１２）から単離し、ベクターｐＥ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にサブクローニングして、プラスミドｐＥＴ２８ａ−３０６６４１８８を得た。その後、ｐＥＴ２８ａ−３０６６４１８８を、ＢａｍＨＩ制限酵素で一部消化し、次いでＸｈｏＩで完全に消化した。１．１ｋｂのフラグメントを、単離し、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ消化ｐＣＥＰ／Ｓｅｃに連結して（実施例３）、発現ベクターｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−３０６６４１８８．ｍ９９を作製した。ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−３０６６４１８８．ｍ９９ベクターを、製造業者の使用説明書に従って、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓ試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用して、ヒト胎児腎臓２９３細胞（ＡＴＣＣ番号．ＣＲＬ−１５７３、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）にトランスフェクトした。細胞ペレットおよび上清をトランスフェクション後７２時間で回収し、抗Ｖ５抗体を使用して、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動のウエスタンブロッティングによって、３０６６４１８８．ｍ９９タンパク質の発現について試験した。図１０は、３０６６４１８８．ｍ９９が、２９３細胞によって分泌される、見かけの分子量が５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、および９８ｋＤａの３つの不連続のタンパク質のバンドとして発現されることを示す。この５０ｋＤａのバンドは、３０６６４１８８．ｍ９９の単量体グリコシル化形態に対して予想される大きさで移動し、９８ｋＤａのバンドは、単量体形態の二量体と一致する大きさで移動した。
【０３４９】
（実施例１５．３０６６４１８８．ｍ９９タンパク質の発現および精製）
ＨＥＫ２９３細胞を、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／１０％ウシ胎児血清培地中で、９０％コンフルエンスまで増殖した。細胞を、製造業者の仕様書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用して、ｐＣＥＰ４ｓｅｃまたはｐＣＥＰ４ｓｅｃ／３０６６４１８８．ｍ９９でトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、ＤＭＥＭで２日間インキュベートし、馴化培地を細胞上清の回収によって調製した。馴化培地をＴａｌｏｎ金属親和性クロマトグラフィー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）によって濃縮した。簡単に言えば、７ｍｌの馴化培地を、スピンカラム中で、１ｍｌのＴａｌｏｎ金属親和性樹脂とインキュベートした。このスピンカラムを、１ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した。次いで、このカラムを０．６５ｍｌのＰＢＳ／０．５Ｍイミダゾール（ｐＨ８．０）で２回溶出し、溶出液をプールした、イミダゾールを、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ遠心分離フィルターデバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して、ＰＢＳへの緩衝液交換透析によって除去した。濃縮された遺伝子産物を４℃で保存した。
【０３５０】
得られた精製されたタンパク質を、還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そして酵素標識を用いて検出される抗Ｖ５抗体を用いて検証した。２つの別々のトランスフェクション物および精製物の電気泳動の結果を、ゲルに示す。これらは、生成物が、Ｖ５含有ポリペプチドの混合物であることを示す。最大のものは、約５０ｋＤａの見かけの分子量を有する（図１１、パネルＢ）。プログラムＰｒｏＳｉｔｅは、成熟タンパク質における１つのＮ−グリコシル化部位を予想する。グリコシル化は、見出される見かけの分子量を説明し得る。従って、この５０ｋＤａのバンドは、全長遺伝子産物について予想される長さと一致する。約２０〜２５ｋＤａの見かけの分子量を優位に有する他のバンドもまた、生じる。これらは、２９３細胞の細胞内かまたはこの細胞からの分泌後の細胞外のいずれかで生じるタンパク質分解の結果であると推定される。別の電気泳動（示されていない）において、約６ｋＤａ〜約１４ｋＤａにわたる幅広いバンドは、約７〜８ｋＤａおよび約１０ｋＤａの２つのバンドに分離される。
【０３５１】
（実施例１６．クローン３０６６４１８８．０．ｍ９９タンパク質は、細胞のＤＮＡ合成を誘導する）
ヒトＣＣＤ−１０７０線維芽細胞（ＡＴＣＣ  番号ＣＲＬ−２０９１，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）またはマウスのＮＩＨ  ３Ｔ３（ＡＴＣＣ  番号ＣＲＬ−１６５８，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）線維芽細胞を、１０％ウシ胎仔血清または１０％仔ウシ血清をそれぞれ補填したＤＭＥＭ中で培養した。線維芽細胞を、１０％ＣＯ２／空気中で３７℃でコンフルエンスまで増殖させた。次いで、細胞をＤＭＥＭ中で２４時間飢餓させた。ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ（実施例３）の豊富な順化培地またはｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ／３０６６４１８８．ｍ９９（実施例１４）の豊富な順化培地を１８時間加えた（１０μＬ／１００μＬの培地）。次いで、ＢｒｄＵ（１０μＭ）を、添加し、そして細胞と共に５時間インキュベートした。ＢｒｄＵ組込みを、製造者の仕様書（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に従って、比色イムノアッセイによってアッセイした。
【０３５２】
図１２は、３０６６４１８８．ｍ９９が、コントロールの順化培地を用いて処理された細胞または未処理の細胞と比較して、いずれかの細胞型において、ＢｒｄＵ取込みにおける約４倍〜５倍の増加を誘導したことを実証する。観察される増殖性の増加は、血小板由来ＦＣＴＲＸ（ＰＤＧＦ）処理、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）処理、または血清処理によって、誘導されるＢｒｄＵ取込みにおける増加と類似していた。さらに、３０６６４１８８．ｍ９９部分精製順化培地は、ヒトＭＧ−６３上皮細胞またはＣＣＤ１１０６ケラチノサイトにおいてＢｒｄＵの取込みを誘導しない（データは示されていない）。これらの結果は、３０６６４１８８が、ヒト線維芽細胞およびマウス線維芽細胞におけるＤＮＡ合成を選択的に誘導するが、上皮細胞株におけるＤＮＡ合成を誘導しないことを示唆する。
【０３５３】
別々の実験において、ＣＣＤ−１０７０細胞およびＭＧ−６３骨肉腫細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−１４２７）を、以下の用量依存様式で各々ＢｒｄＵを取り込んだｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ／３０６６４１８８を用いて処理した：完全な効果（コントロールを超えて約２．５倍〜３倍増加する）を提供する１μｇ／ｍＬ、半分よりもわずかに少ない効果を提供する１００ｎｇ／ｍＬ、および組込みのコントロールレベル前後を提供する１０および１ｎｇ／ｍＬ。さらに、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞の用量応答は、ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ／３０６６４１８８．Ｍ９９の１０ｎｇ／ｍＬの用量と５０ｎｇ／ｍＬの用量との間で５０％の応答が生じることを示す（図１３）。
【０３５４】
ＮＩＨ／３Ｔ３細胞およびＣＣＤ１０７０細胞の両方を用いるさらなる用量滴定実験において、最大半減の効果が、２５ｎｇ／ｍＬ以下で生じた。
【０３５５】
（実施例１７．３０６６４１８８．ｍ９９によるＮＩＨ  ３Ｔ３細胞の増殖の誘導）
マウスＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞を、４０％のコンフルーエンシーでプレートし、そして１０％ウシ胎仔血清または１０％子ウシ血清を補填したＤＭＥＭ中で２４時間培養した。この培養培地を取り出し、そして等容量のｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ（実施例３）またはｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ／３０６６４１８８．ｍ９９．ｍ９９（実施例１４）の順化培地で置換した。４８時間後、細胞をＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  １００を用いて撮影した。細胞数を、トリプシン処理の後にＣｏｕｌｔｅｒ  Ｚ１  粒子カウンターを用いて計数することによって、測定した。
【０３５６】
３０６６４１８８でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３腎臓上皮細胞由来の順化培地を用いるＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞の処理は、２日間に渡って６〜８倍の細胞数の増加を生じた（図１４）。ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃベクター単独でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞由来のコントロールの順化培地を用いて処理した細胞は、ほとんどまたは全く増殖を示さなかった（図１４）。
【０３５７】
３０６６４１８８．ｍ９９順化培地が、細胞の形質転換に特徴的な表現型の変化を誘導し得るか否かを決定するために、３０６６４１８８順化培地または偽（ｍｏｃｋ）順化培地のいずれかで処理された細胞を、光学顕微鏡によって検査した。図１５は、３０６６４１８８．ｍ９９で処理されたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞が、細胞数および屈折特性における著しい増加を示したが、コントロールの処理されたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞は増加を示さなかったことを示す。増殖の接触阻害の損失が明らかとなった。コンフルーエントなＮＩＨ  ３Ｔ３細胞の敷石状外観の特徴を失い、そして密度非依存性増殖が、明らかとなった。後者をまた、わずかな収縮に起因するＮＩＨ  ３Ｔ３細胞のより丸みを帯びた外観によって示唆した。ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ／３０６６４１８８．ｍ９９．ｍ９９のトランスフェクションはまた、２〜５日の培養の形質転換の潜在能力と同じ能力を示した。しかし、７〜１０日の培養後、形態学的に形質転換された表現型が、戻ったように見えた。
【０３５８】
（実施例１８．３０６６４１８８タンパク質によるヒト初代の骨芽細胞の増殖の誘導）
実施例１７に記載されるものと類似の実験において、ヒト初代の骨芽細胞（ＮＨｏｓｔ；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）もまた、３倍〜４倍までの細胞数における用量依存性増加をする（図１６）。図１６における５０％の応答を誘導するために必要な容量は、１００ｎｇ／ｍＬ未満のｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ／３０６６４１８８．ｍ９９．である。さらに、３０６６４１８８遺伝子産物を含む部分精製された順化培地と接触させたＪｕｒｋａｔ細胞は、偽トランスフェクションに由来する培地と比較して２倍のＢｒｄＵ取り込みを示した、その一方で、増殖促進活性を有すると考えられる１３の他のＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ遺伝子産物と接触させた同じ細胞は、なんの効果も誘導しなかった。
【０３５９】
要約において、３０６６４１８８タンパク質が、ＤＮＡ合成（実施例１６）、細胞増殖（実施例１６および１７）、および形態学的形質転換（実施例１７）を誘導するという観察は、３０６６４１８８タンパク質が、増殖促進特性および刺激特性を保有することを示す。
【０３６０】
（実施例１９．３０６６４１８８．ｍ９９タンパク質のインタクトな産物および切断化産物の精製）
特定の実験において、ベクターｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ／３０６６４１８８．ｍ９９を用いた処理が、ＤＮＡ合成または細胞増殖を生じないことを観察した。さらなる実験において、３０６６４１８８．ｍ９９を用いて調整された培地を、血清の存在下で増殖させたＨＥＫ  ２９３細胞から得た（実施例１５〜１７）。この３０６６４１８８．ｍ９９遺伝子産物を、カチオン交換クロマトグラフィー、次いでニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。このタンパク質産物を、非還元条件および還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動し、そしてクーマシー染色によって現像した。この結果を、図１７、パネルＡおよびＢに示す。血清の存在下において、非還元条件下で、３０６６４１８８．ｍ９９遺伝子産物は、約３５ｋＤａのタンパク質として現れた（図１７、パネルＢ）。しかし、還元条件下で電気泳動する場合、このポリペプチドは、３つの分解されたバンドとして現れる。２つのバンドの見かけの分子量は、２２〜２５ｋＤａ（バンドＩ）、約１６ｋＤａ（バンドＩＩ）および約５〜６ｋＤａ（バンドＩＩＩ）であった。これらのフラグメントのＮ末端アミノ酸分析は、バンドＩおよびバンドＩＩの両方が、残基２４７と２４８との間の切断から生じたと考えられることを示し、その結果このペプチド産物は、３０６６４１８８．０．９９アミノ酸配列（表２、配列番号４）の残基２４８で始まり、そしてバンドＩＩＩは、残基３３９で始まる。これらの結果は、バンドＩＩおよびＩＩＩのフラグメントを提供するバンドＩに対応するポリペプチドの切断と一致する。非還元条件下で観察される３５ｋＤａのバンドは、バンドＩ、および／または還元条件下で観察されるバンドＩＩおよびＩＩＩから構成される結合したポリペプチドから構成される二量体であり得る。
【０３６１】
アミノ末端分析は、上記の手順に従って単離される血清の存在下で増殖したｐＣＥＰ４ｓｅｃ／３０６６４１８８．ｍ９９トランスフェクト化２９３細胞に由来する遺伝子産物が、全長タンパク質のカルボキシ末端フラグメントであることを示す。非還元条件下で見出される３５ｋＤａのバンドは、以下でｐ３５と呼ぶ。これらの結果を、実施例２１に示す。
【０３６２】
２９３細胞を、血清の非存在下で培養し、そして前節に記載されるのと同じ単離手段および検出手段を行う場合、異なる遺伝子産物が観察される。非還元条件下で、バンドを、約８５ｋＤａで見出した（図１７、パネルＡ）。このタンパク質を、以下でｐ８５と呼ぶ。還元条件下で観察される対応する遺伝子産物の主用なバンドは、約５３〜５４ｋＤａで見出される。この遺伝子産物のＮ末端アミノ酸分析は、ｐＣＥＰ４ｓｅｃ／３０６６４１８８．ｍ９９において用いられるマルチクローニング部位でアミノ酸を提供する（実施例１４）。マルチクローニング部位の上流でクローニングされたＩｇκリーダー配列に対応する残基は、存在しない。これらの結果は、血清の非存在下で得られる遺伝子産物が、ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ／３０６６４１８８．ｍ９９においてコードされる全長アミノ酸配列を表すことを示す。このｐ８５ポリペプチドは、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて観察される５０ｋＤａの二量体であると考えられる。これらの結果は、実施例２１に展開される。
【０３６３】
（実施例２０．３０６６４１８８．ｍ９９タンパク質のインタクトなフラグメントおよび切断化フラグメントの活性）
精製したｐ８５  ＦＣＴＲＸタンパク質およびｐ３５  ＦＣＴＲＸタンパク質を、ある濃度の範囲においてＮＩＨ  ３Ｔ３細胞に別々に適用した。ＢｒｄＵの組込みを、実施例に８に記載されるように評価した。この結果を図１８に示す。ｐ８５が、使用される最も高い濃度（バー４〜１０）でのレベルを除いてコントロールレベルと差異のない増殖促進活性を有することが見られる。その一方で、ｐ３５は、非画分化ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ／３０６６４１８８．ｍ９９順化培地（バー１１〜１７）を超えない場合、少なくとも活性であった。最大ＤＮＡ合成の５０％を与えるｐ３５の濃度は、２０ｎｇ／ｍＬと５０ｎｇ／ｍＬとの間にある。
【０３６４】
これらの結果は、インタクトな３０６６４１８８．ｍ９９由来のｐ３５フラグメントは、増殖促進活性を有するが、インタクトな二量体形態の．ｍ９９タンパク質ｐ８５は、増殖促進活性を有さないことを示す。
【０３６５】
（実施例２１．組換えＰＤＧＦ  ＤＤ．の精製）
ＰＤＧＦＤの遺伝子産物を、１Ｌの攪拌フラスコ中の多孔性ミクロキャリア（Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒｅ−ＧＬ，Ｈｙｃｌｏｎｅ；Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）上で増殖させたＨＥＫ２９３細胞において発現させた。実施例２および４で述べたように、組換えＰＤＧＦ  Ｄ遺伝子は、３’末端に６×Ｈｉｓ融合物を含む。細胞を、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の存在下または非存在下で１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において増殖させた。順化培地を遠心分離（４℃で、４０００×ｇで１５分間）収集し、そして２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸塩（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＰＯＲＯＳ  ＨＳ５０カラム（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｅｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）にロードした。平衡緩衝液を用いて洗浄した後、結合したタンパク質を、ＮａＣｌ段階勾配（０．２５Ｍ、０．５Ｍ、１．０Ｍおよび２．０Ｍ）を用いて溶出した。ＰＤＧＦ  ＤＤ  ｐ３５（１．０Ｍ  ＮａＣｌ段階溶出物）またはｐ８５（０．５Ｍ  ＮａＣｌ段階溶出物）を含む画分（実施例１９を参照のこと）を、プールし、そして０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む等容量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ８．０）を用いて希釈し、ついで、硫酸ニッケルで予め荷電したＰＯＲＯＳ  ＭＣ２０カラム（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にロードした。ＰＢＳ／０．５Ｍ  ＮａＣｌを用いた洗浄後、結合したタンパク質を、直線勾配のイミダゾール（０〜０．５Ｍ）を用いて溶出した。ＰＤＧＦ  ＤＤ（ＰＤＧＦＤのホモ二量体）を含む画分（１００〜１５０ｍＭイミダゾール）をプールし、そして１０００容量の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５０ｍＭ  ＮａＣｌに対して二回透析した。このタンパク質の純度を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシン勾配ゲル；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）分析によって９５％よりも高いと見積もった（例えば、図１７を含む実施例１９の結果を参照のこと）。
【０３６６】
（ＰＤＧＦ  Ｄ．の生化学的特性）ＰＤＧＦ  Ｄの遺伝子産物の生化学的特性を試験するために、ＰＤＧＦ  Ｄタンパク質をコードするｃＤＮＡを、哺乳動物発現ベクター、ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−３０６６４１８８ｍ９９中にサブクローン化した（実施例１４）。この構築物は、その同定および精製を助けるタンパク質のＣＯＯＨ末端中のエピトープタグ（Ｖ５）およびポリヒスチジンタグを組み込む（発現ベクターｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−３０６６４１８８ｍ９９；実施例１４）。
【０３６７】
２９３ＨＥＫ細胞へのトランスフェクションおよび無血清培地における増殖の後、約４９ｋＤａの見かけの分子量（ｐ４９種）を有する分泌ポリペプチドを、還元条件下でウェスタンブロット分析によって同定した（図１９、パネルＡ、レーン２）。ｐ４９の見かけの分子量が約４３ｋＤａの期待値よりも大きいという事実は、グリコシル化に貢献し得る。反対に、ＦＢＳの存在下でＰＤＧＦ  Ｄトランスフェクト化細胞を増殖させる場合、２０ｋＤのタンパク質を分泌した（図１９、パネルＡ、レーン３）。偽トランスフェクトした細胞由来の順化培地は、抗Ｖ５抗体と反応しなかった（図１９、パネルＡ、レーン１）。
【０３６８】
さらに、ＰＤＧＦ  Ｄを、ＦＢＳの存在下または非存在下で発現し、そして９５％よりも高い均一性に精製した。図１９  パネルＢ（レーン２）に示されるように、無血清条件下でのＰＤＧＦ  Ｄの発現は、ゲルをクマシーブルーを用いて染色する場合、還元条件下で、予想される４９ｋＤの遺伝子産物の検出を生じる。ｐ４９二量体ｐ８５種に対応する約８４ｋＤａの見かけの分子量を有するポリペプチド種が、非還元条件下で見られた（図１９、パネルＢ、レーン１）。ＰＤＧＦ  ＤＤを血清含有順化培地から精製し、そして非還元条件下で電気泳動する場合、約３５ｋＤａの見かけの分子量を有する種（ｐ３５）を、観察した（図１９、パネルＢ、レーン３）。還元条件下で、クマシーブルーを用いて可視化した場合、ｐ３５が、３つのバンドを生成することを見出し、これらは、約２０、１４、および６ｋＤａの見かけの分子量を伴って移動する（図１９、パネルＢ、レーン４）。
【０３６９】
ｐ３５のアミノ末端配列分析は、Ａｒｇ２４７（Ｒ２４７）またはＡｒｇ２４９（Ｒ２４９）の後のタンパク質分解切断を実証した（図２０）。図２０のパネルＡに示されるように、２つのペプチドを見出し、１つは、ＧｌｙＡｒｇ（ＧＲＳＹＨＤＲ．．．；下線を付されたＧＲ残基とともに示される）で始まり、そして２つめは、３番目の残基、Ｓｅｒ（ＳＹＨＤＲ．．．）で始まる。これらのペプチドの比を、ＳＹＨＤＲ：ＧＲＳＹＨＤＲ＝４：１であると見出した。図２０（パネルＢおよびＣ）を生じる更なる配列決定は、さらなるプロセスが、クマシーブルー染色で見られるが、抗Ｖ５ウェスタンでは見られない残りのポリペプチド（すなわち、示される１６ｋＤａおよび６ｋＤａの種）を生成することを示す。これらを、一緒に結合してｐ３５を提供する。
【０３７０】
この実施例において示される結果は、ＰＤＧＦ  Ｄ遺伝子産物が、ホロタンパク質形態（ｐ８５）およびＣ末端フラグメント（ｐ３５）の両方における二量体であることを示す。ｐ８５形態は、ｐ３５形態を提供するＦＢＳの存在下でプロセス化されると考えられる。これらの二量体形態を、ＰＤＧＦ  ＤＤと命名する。
【０３７１】
（実施例２２．ウシ胎仔血清および仔ウシ血清存在下での３０６６４１８８遺伝子産物のプロセシング）
３０６６４１８８遺伝子産物を、漸増濃度の仔ウシ血清（図２１、パネルＡ）またはウシ胎仔血清（パネルＢ）の存在下でインキュベートした。この結果は、仔ウシ血清（パネルＡ）ではなくウシ胎仔血清（パネルＢ）のみが、ｐ３５を提供する３０６６４１８８遺伝子産物のｐ８５形態をプロセスすることを実証した。
【０３７２】
（実施例２３．増殖因子による肺動脈平滑筋細胞の増殖の刺激）
この実施例は、肺動脈平滑筋細胞の増殖を刺激するＰＤＧＦ  ＤＤの能力を実証する。
【０３７３】
３０６６４１８８のｐ３５二量体、ＰＤＧＦ  ＡＡまたはＰＤＧＦ  ＢＢを、６ウェルプレート中で約３５％コンフルエンスになるまで培養した後、種々の濃度で肺動脈平滑筋細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）に添加し、ＤＭＥＭで洗浄し、そして一晩飢餓させた。１８時間後、ＢｒｄＵを添加し、そして５時間後、細胞をＢｒｄＵ指向ＥＬＩＳＡを用いてＢｒｄＵ取込みについて分析した。
【０３７４】
この結果を、図２２に示す。ｐ３５二量体を用いた処理によって達成される最大の効果は、ＰＤＧＦ  ＡＡおよびＰＤＧＦ  ＢＢの両方によって与えられる効果を超過することが見られた。ｐ３５二量体およびＰＤＧＦ  ＢＢの効果が、ＰＤＧＦ  ＡＡを用いて得られる効果よりも密接に互いに類似していることが見られた。ＢｒｄＵ取込みによって決定されるように、１２．５ｎｇ／ｍＬ未満で得られる最大効果の５０％で、試験された３つの増殖因子全てのｐ３５二量体は、平滑筋細胞において最も高い増殖を誘導した。
【０３７５】
（実施例２４．種々の増殖促進処理に対する肺動脈平滑筋細胞の増殖）
この実施例は、肺動脈平滑筋細胞の増殖を刺激するＰＤＧＦ  ＤＤの能力を実証する。
【０３７６】
肺動脈平滑筋細胞を、６ウェルプレート中で、約３５％コンフルーエンシーまで培養し、ＤＭＥＭを用いて洗浄し、そして一晩飢餓させた。次いで、細胞を組換え３０６６４１８８、既知のＰＤＧＦ（２００ｎｇ／ｍｌ）または１０％ＦＢＳを補填したＤＭＥＭを用いて３日間栄養を与えた。培養溶液を、取り出し、そしてさらに２〜３日間同じ培地と置換した。平滑筋細胞増殖アッセイを定量するために、細胞を、トリプシン処理し、そしてＢｅｃｋｅｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｚ１シリーズカウンターを用いて計数した（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）。
【０３７７】
これらの結果を、図２３に示す。ＰＤＧＦが、細胞数のわずかな増加を生じることが見られ、その一方で、３０６６４１８８を用いる処理は、コントロールと比較してＰＤＧＦを用いて観察される約二倍の効果を提供する。１０％ＦＢＳでの処理を用いたポジティブコントロールは、非常に明白な効果を与える。３０６６４１８８およびＰＤＧＦ  ＢＢを用いた平滑筋細胞の処理は、血清で観察される平らなクラブ型の表現型に対して、細長い二極の紡錘体型の表現型を導いた。
【０３７８】
３０６６４１８８は、肺動脈平滑筋細胞増殖の効果的な刺激物であり、そして３０６６４１８８が創傷治癒、組織修復、および軟骨の修復における治療的用途を有することを示唆する。さらに、３０６６４１８８に対して指向される抗体は、患者の脈管系の再狭窄を阻害または予防する際の治療的用途を有し得る。
【０３７９】
（実施例２５．種々の増殖促進処理に対する伏在静脈細胞の増殖）
この実施例は、伏在静脈細胞における増殖を刺激するＰＤＧＦ  ＤＤの能力を例示する。伏在静脈細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）を実施例２４に記載されるように処理および分析した。この結果（示されていない）は、ＰＤＧＦが、３０６６４１８８での処理よりも細胞数のわずかに少ない増加を生じることを示し、これはコントロールで見られる細胞数の約５倍までの増殖を提供する。１０％ＦＢＳでの処理を使用する陽性コントロールは、非常に明白な効果を与えた。３０６６４１８８は、伏在静脈細胞増殖の効果的な刺激物であり、そして３０６６４１８８および３０６６４１８８抗体が、創傷治癒、組織修復および軟骨修復における治療的用途を有することを示唆する。さらに、３０６６４１８８に対して指向される抗体は、患者の脈管系の再狭窄を阻害または予防する際の治療的用途を有し得る。
【０３８０】
（実施例２６．炎症性腸疾患についてのマウスモデル）
炎症性腸疾患について広く認識されるマウスモデルは、硫酸デキストランのナトリウム形態を投与したマウスである。
【０３８１】
（材料および方法）
大腸炎研究計画。６〜８週齢の約２０ｇの体重の正常な雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｓ）を、フィルタートップを有するポリカーボネートケージ中に、ケージあたり３〜５匹の動物を収容し、そして食物（Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄマウス固形飼料）およびリビタム（ｌｉｂｉｔｕｍ）を添加した水道水を与えた。マウスを、６日間（１日〜７日）順応させ、次いで５％硫酸デキストランナトリウム（ＤＳＳ）を含むリビタム（ｌｉｂｉｔｕｍ）を添加した水または、リビタム（ｌｉｂｉｔｕｍ）を添加したコントロールの水を７日間（０日〜６日）経口的（ｐｏ）に与えた。ＤＳＳ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇａｒｄｅｎａ  ＣＡ）を水道水で５％溶液として作製し；ＤＳＳを、１日おきに作製し、そして４℃で保存した。マウスを４つの処置群に分けた（表１４）。０日目に、ビヒクル（リン酸緩衝生理食塩水中の１Ｍ  Ｌ−アルギニン）またはタンパク質（ＣＧ５３１３５またはＣＧ５２０５３、５ｍｇ／ｋｇ）を用いた毎日の腹腔内（ｉｐ）処置を開始し、そして６日まで毎朝続けた。７日において、マウスを、ＣＯ２への曝露によって屠殺した。
【０３８２】
【表１４】
2004537267.tif 000034
2004537267.tif 000035
タンパク質産生。ＣＧ５２０５３についてのｃＤＮＡを同定し、そしてｐＣＥＰ４／Ｓｅｃベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にクローン化し、そしてヒト胎児の腎細胞（ＨＥＫ２９３）中へトランスフェクトした。トランスフェクト化細胞を、ハイグロマイシンＢを用いて選択し、次いで１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を用いて１０Ｌのバイオリアクター中でスケールアップした。ＣＧ５２０５３タンパク質を、イオン交換クロマトグラフィーおよび金属アフィニティークロマトグラフィーによって培養培地から精製した。最終的な精製ＣＧ５２０５３を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で希釈した。
【０３８３】
ＣＧ５３１３５についてのｃＤＮＡを同定し、そしてｐＲＳＥＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化して実施例５に記載されるベクターｐＥＴＭＹ−ＦＧＦ−ＣＸを提供した。この構築物の遺伝子産物は、ポリペプチドのＮ末端の（Ｈｉｓ）６−（エンテロキナーゼ切断部位）−（マルチクローニング部位）を組み込んでいるポリペプチドを提供し；さらに、この構築物において、ＦＧＦ−ＣＸ配列は、表１（配列番号２）の２位のＡｌａで開始する（配列番号２）。このベクターをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ中に形質転換した。このＥ．ｃｏｌｉ細胞を、１０Ｌのスケールまで増殖させ、そしてＣＥ６ファージを用いて感染させて組換えＣＧ５３１５３を産生した。この組換えタンパク質を、マイクロフリューダイザーにおいてＥ．ｃｏｌｉ細胞を破壊し、そして１Ｍ  Ｌ−アルギニン溶液を用いて溶出し、次いで、複数の金属アフィニティークロマトグラフィー工程によって、精製した。最終的な精製タンパク質を、１Ｍ  Ｌ−アルギニンを含むリン酸生理食塩水中で透析した。タンパク質の精製度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって測定し、そして同一性を、ウェスタンブロット分析によって確認した。タンパク質の活性を、５時間の組込み時間およびＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を用いてＢｒｄＵ取込みアッセイ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）によって測定した。
【０３８４】
体重を、毎日および７日の終わりに測定した。剖検で測定されるさらなるパラメータとしては、結腸の長さ、結腸の重さおよび脾臓の重さが挙げられる。結腸および脾臓を、組織病理学的な評価のためにホルマリン中に収集した。
【０３８５】
結腸内容物を、以下の基準に従って剖検時に記録した：
０＝正常〜半固体の糞便、血液は観察されない
１＝正常〜半固体の糞便、血液を帯びている
２＝明確な血液の証拠を有する半固体〜流体の糞便
３＝血性の流体
（病理学的方法）
遠位端から約１ｃｍ離れた３つの区分（このモデルにおいて最も激しく影響される範囲）および近位端から約１ｃｍ離れた３つの区分（余り激しく影響されない範囲）を、パラフィン包埋のために処理し、切片化し、そして病理学的評価のためにヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色した。
【０３８６】
それぞれの切片について、粘膜下の浮腫を、筋肉の粘膜から外側の筋肉層の内部境界までの距離を測定することによって定量した。炎症（泡沫状マクロファージ、リンパ球およびＰＭＮ浸潤）を、以下に従って重症度のスコアを割り当てた：
正常＝０
最小＝１
温和な＝２
中程度の＝３
著しい＝４
激しい＝５
脾臓のリンパ球萎縮をまた、上記の基準によってスコアリングした。
【０３８７】
上皮細胞の損失／損傷を反映するパラメータを、スコアリング方法に関する範囲％を用いて個々にスコアリングした。
【０３８８】
何もない＝０
１〜１０％の粘膜が影響される＝１
１１〜２５％の粘膜が影響される＝２
２６〜５０％の粘膜が影響される＝３
５１〜７５％の粘膜が影響される＝４
７６〜１００％の粘膜が影響される＝５
関与％を用いてスコアリングされたパラメータとしては；
結腸腺上皮損失−これは、陰窩の上皮および残りの腺上皮の損失を誘導し、そして陰窩損傷スコアと同等とみなす。
【０３８９】
結腸侵食−これは、上皮表面の損失を反映し、そして一般的に粘膜の出血と関連する（出血の反映は、臨床的剖検で見られる）。
【０３９０】
各動物に対して、３つの近位（あまり激しくない病変）および３つの遠位（最も激しい病変）範囲をスコアリングし、そしてそれぞれの領域についてのスコアの平均を決定した。群の平均および疾患コントロールからの阻害％を決定した。この方法で行うことによって、（種々の切片からのスコアを合計するよりもむしろ）個々のパラメータについての平均±ＳＥパラメータ（３つの切片によって表される）が観察され得、そして線引きされる重症度と同等視され得る。例として、腺上皮損失についての平均が４である場合、５１〜７５％の粘膜が上皮を欠くことがわかる。
【０３９１】
３つの重要なスコアリングしたパラメータ（炎症、腺上皮の損失、侵食）を、最終的に合計して組織病理学的スコアの合計に達し、このスコアの合計は、全ての損傷を示し、そして最大スコア１５を有する。
【０３９２】
近位＋遠位の合計したスコアの１つの最終的な合計を行い、全体の総結腸重症度スコアを反映させた。
【０３９３】
統計学。  それぞれの処置群についての平均および標準誤差（ＳＥ）を、スコアされた各パラメータについて測定し；このデータを、ｐ＜０．０５の有意水準を用いる両側ステューデント検定を用いて疾患コントロール（群２）についてのデータと比較した。
【０３９４】
（結果）
（生息期間、剖検および器官重量）
ＤＳＳ＋ビヒクルコントロールマウス４を除く全ての動物が、研究の終わりまで生存した。マウス４は、７日目の剖検の朝死亡していることが発見された。
【０３９５】
体重におけるＤＳＳ処置に関連した変化は、全てのＤＳＳ処置マウスにおいて３日目まで存在した。研究の終わりに、ＤＳＳ＋ビヒクルコントロールは、２５％の体重の減少を有した（図２４、２５および２６）。体重減少を誘導したＤＳＳにおける有意で有益な効果を、ＦＧＦ−ＣＸ（ＡＢ０２０８５８といわれる）を与えられたマウスにおいて観察した（図２５および２６）。
【０３９６】
血液性の下痢の臨床的証拠が、動物１を除く全てのＤＳＳ＋ビヒクル動物において明白であった。剖検で全てのＤＳＳコントロールは、結腸中に血液または血液を帯びた流体を有していた。反対に、ＡＢ０２０８５８で処置したマウスは一般に半固体の糞便および血液のわずかな形跡を有していた。類似の知見が、３０６６４１８８で処置したマウスにおいても生じた。
【０３９７】
結腸出血を反映する結腸内容物のスコアは、ＡＢ０２０８５８を用いて処置したマウス（９３％）および３０６６４１８８を用いて処置したマウス（７９％）において劇的に減少した（図３４）。
【０３９８】
脾臓の絶対重量（図２７および２８）は、ビヒクルを用いて処置したマウスにおいて約３０％減少した。ＡＢ０２０８５８を用いた処置は、脾臓重量においてＤＳＳ誘導性損失の５５％の減少を生じた。３０６６４１８８を用いた処置は、脾臓の重量損失を６２％まで減少した。
【０３９９】
結腸の絶対重量（図２９および３０）は、ビヒクルを用いて処置したマウスにおいて約２６％減少した。ＡＢ０２０８５８を用いた処理は、結腸重量におけるＤＳＳ誘導性変化のわずかだが、有意な減少を生じた。３０６６４１８８を用いた処置は、結腸重量の減少を逆転した（図３０および３１）。
【０４００】
結腸の絶対長さ（図３２および３３）は、ＤＳＳ＋ビヒクルを用いて処置したマウスにおいて約４０％減少した。ＡＢ０２０８５８を用いた処置は、結腸の長さにおいてＤＳＳ誘導性変化の有意な減少（４０％）を生じた。３０６６４１８８を用いた処置は、結腸の長さ損失を３６％減少した。
【０４０１】
（組織病理学的知見）
組織病理学を、結腸の全長において実施した。病変は、予測していたように、近位の結腸に対して遠位の結腸においてより大きかった。処置の効果の定量は、第１に、この位置における病理学的変化の阻害に基づく。遠位の結腸における結腸浮腫は、ＡＢ０２０８５８を用いた処置によって７６％阻害され、その一方で、３０６６４１８８を用いた処置は、浮腫を阻害しなかった（図３５）。
【０４０２】
遠位の結腸における結腸の炎症は、ＡＢ０２０８５８を用いた処置によって５５％阻害され、そして３０６６４１８８を用いる処置によって４１％阻害された（図３６）。
【０４０３】
上皮損失スコアによって測定されたような、結腸の上皮の保護（腺の陰窩および残部の両方）は、ＡＢ０２０８５８を与えられたマウスの５７％、および３０６６４１８８を用いて処置されたマウスの４１％であった（図３７）。遠位の結腸における粘膜上皮の保護のさらなる証拠は、侵食／潰瘍形成を導く上皮の損失の表面の程度の評価において明白であった。結腸侵食スコアによって示されるように、ＡＢ０２０８５８処置は、侵食性の病変の８４％の阻害を与え、そして３０６６４１８８処置は、７４％の阻害を生じた（図３８）。
【０４０４】
炎症、腺上皮損傷および侵食についての重要な病理組織のスコアを合計するとは（図３９）、保護効果全体が、ＡＢ０２０８５８を用いた処置から生じることを見出した。この効果は病理学の６６％の阻害を提供する。３０６６４１８８を用いる処置は、全てのスコアの５３％の阻害を生じた。総組織学的スコアのわずかだが有意な阻害（３３〜３７％）は、近位の結腸について明白であった。結腸全体についての結果を、図４０に示す。
【０４０５】
脾臓重量の減少は、ほとんど、脾臓のリンパの萎縮の結果であった。両方のタンパク質を用いる処置は、このパラメータを同様に阻害した（図４１）。
【０４０６】
（考察および結論）
マウスが５％  ＤＳＳに７日間曝露されるこの炎症性腸疾患モデルにおいて、ほとんどの動物は、特徴的な、陰窩および結腸腺上皮の喪失、ならびに顕著な出血を生じるびらん／潰瘍に関連する重篤な遠位結腸炎症／浮腫を発症する。近位結腸における病変は、より穏やかであるが，特徴は類似する。
【０４０７】
ＡＢ０２０８５８（５ｍｇ／ｋｇ、毎日、ｄ０〜６）での同時処置は、臨床的利点（体重減少の減少）およびこのモデルの一般的特徴である出血性の下痢の発症に対する保護を生じた。ストレスをかけた、不健康なＤＳＳ処置マウスは、脾臓リンパ萎縮症を有する。このパラメータ（体重変化および組織学的変化によって反映される）もまた、ＡＢ０２０８５８による処置によって恩恵を受けた。
【０４０８】
結腸の短縮（炎症および粘膜組織喪失に起因する）は、ＡＢ０２０８５８による処置によって、４０％阻害された。この巨視的観察は、陰窩、結腸腺および表面上皮における粘膜上皮保護の組織学的観察によって、強力に支持された（図４２および４３を参照のこと）。図４２において、元の画像において４００倍で見ると、正常な結腸粘膜は、均一な腺構造を有し、粘膜下の浮腫を有さない（左上）。疾患コントロールは、粘膜腺および表面上皮を有さず、重篤に炎症した粘膜固有層の血管が、内腔に曝され、出血を生じる（右上）。ＣＧ５３１３５での処置は、粘膜の完全性を保護し、そして上皮喪失の減少、および粘膜固有層における炎症の減少を生じる（左下）。ＣＧ５２０５３での処置は、ＣＧ５３１３５での処置よりも低い程度までであるが、上皮喪失および粘膜炎症を減少させる（右下）。図３４において、元の画像において５０倍で見ると、正常なコントロールは、均一な腺構造を有し、粘膜下の浮腫を有さない、正常な結腸粘膜を示す（左上）。ＤＳＳ誘導された結腸炎は、腺構造の喪失および外側の筋肉層から粘膜を分離する浮腫を生じる（右上）。ＣＧ５３１３５での処置は、ＤＳＳによって誘導される重篤な粘膜変化および粘膜下の浮腫を阻害する（左下）。ＣＧ５２０５３での処置は、炎症および腺構造の喪失のいくらかの阻害を生じるが、粘膜下の浮腫の阻害は生じない（右下）。粘膜保護の組織学的証拠は、非常に僅かの出血性の下痢しか生じないという劇的な剖検観察を確認する。
【０４０９】
本実施例において報告される実験結果は、７日間のＤＳＳ経口投与によって炎症性腸疾患が誘導されるマウスにおいて、ＤＳＳへの曝露の過程の間に本明細書中で使用される増殖因子での同時処置が、未処置のＤＳＳコントロールと比較して、有意な治療的利点を生じたことを示す。
【０４１０】
（実施例２７．硫酸デキストラン誘導された結腸炎を有するメスＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスに対する、ＡＢ０２０８５８の用量応答性効果）
本実施例において報告される実験は、実施例２６において使用されたマウスとは異なる系統のマウスを使用する、炎症性腸疾患の動物モデルにおける、用量力価決定実験の結果を報告する。
【０４１１】
（導入および一般的方法）
（結腸炎研究設計）６〜８週齢、体重約２０ｇの正常なメスＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｓ）を、４日間（−４日目〜−１日目）馴化させ、次いで、５％硫酸デキストランナトリウム（ＤＳＳ）を含有する水を経口的に（ｐｏ）任意に、またはコントロールの水を任意に、７日間（０日目〜６日目）与えた。ＤＳＳ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇａｒｄｅｎａ  ＣＡ）を、水道水中５％溶液として作製した；ＤＳＳを、一日おきに作製し、４℃で保存した。マウスを、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇのＱＤ用量、ならびに１用量当たり５ｍｇ／ｋｇのＢＩＤ用量レジメンを含む、８つの処置群に分割した（表１５）。０日目に、ビヒクル（リン酸緩化生理食塩水中１Ｍ  Ｌ−アルギニン）またはビヒクル中のＣＧ５３１３５タンパク質を用いる毎日の腹腔内（ｉｐ）処置を開始し、そして６日目まで継続した。７日目に、マウスを、ＣＯ２で屠殺した。
【０４１２】
【表１５】
2004537267.tif 000036
（タンパク質生成）ＣＧ５３１３５タンパク質を、実施例２６に記載のように、Ｅ．ｃｏｌｉ中で生成した。この組換えタンパク質を、微小流動化装置中でのＥ．ｃｏｌｉ細胞（１Ｍ  Ｌ−アルギニン溶液中に再懸濁）の破壊、その後の複数の金属クロマトグラフィー工程によって、精製した。最終精製タンパク質を、１Ｍ  Ｌ−アルギニン含有リン酸緩衝化生理食塩水中に透析した。
【０４１３】
結腸含量を、実施例１に記載のようにスコアした。
【０４１４】
（病理学的方法）
結腸の遠位３分の１（このモデルにおいて最も重篤に罹患した領域）から等距離離れた３つの切片を、パラフィン包埋のために処理し、切片化し、そして病理学的評価のためにヘマトキシリンおよびエオシンによって染色した。
【０４１５】
各切片について、スコアリングを、実施例２６に記載のように行った。
【０４１６】
脾臓リンパ萎縮症もまた、上記の基準によってスコアリングした。
【０４１７】
上皮細胞喪失／損傷を、実施例２６に記載のようにスコアリングした。
【０４１８】
関与％を使用してスコアリングされたパラメータを含めた：
結腸腺上皮喪失−これは、陰窩上皮および残存腺上皮の喪失を含み、そして陰窩損傷スコアと同等である。
【０４１９】
結腸びらん−これは、表面上皮の喪失を反映し、そして一般に、（臨床的および剖検で見られる出血を反映する）粘膜出血を伴った。
【０４２０】
各動物について、３つの遠位（最も重篤な病変）領域をスコアリングした。スコアリングおよび分析を、実施例２６に記載のように行った。
【０４２１】
（生存期、剖検および器官重量の結果）
４匹の動物が、研究過程の間に死亡した（７日目にビヒクルコントロール群２の番号１０、６日目に群６（０．３ｍｇ／ｋｇ）の番号３、７日目にビヒクルコントロールＢＩＤ群８の番号５、および６日目に群７（５ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ）の番号６）。
【０４２２】
ＤＳＳ処置関連の体重変化は、５日目までに全ての処置マウスにおいて明らかであり、そして最終的にはビヒクルで処置した動物においては最も重篤であった（図４４）。研究終了時に、ＤＳＳ＋ビヒクルコントロールは、２８％の体重減少を有した。ＤＳＳ誘導性の体重減少に対する有意な有益な効果は、全ての用量でＡＢ０２０８５８でＱＤ処置されたマウスにおいて見られた（図４５）。
【０４２３】
出血性の下痢の臨床的証拠は、全てのＤＳＳ＋ビヒクル動物において明らかであった。剖検時点で、全てのＤＳＳコントロールは、結腸中に、血液またはうっすら血液の混じった液体を有した。対照的に、１０ｍｇ／ｋｇのＡＢ０２０８５８でＱＤ処置したマウスは、一般に、半固体の糞便を有し、より少ない血液しか有さなかった（番号５のマウス以外）。臨床的利点もまた明らかであったが、３ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇの用量をＱＤ投与したマウスにおいてはあまり目立たず、そして０．３ｍｇ／ｋｇで処置したマウスにおいては存在しなかった（図４６）。５ｍｇ／ｋｇでＢＩＤ処置したマウスは、最も目立つ臨床的利点（６８％阻害）を有し、これらのマウスは臨床的に、最も良好な全体的改善を有した。
【０４２４】
結腸の絶対長さ（図４７および４８）は、ビヒクルで処置したマウスにおいて４１％減少した。１０ｍｇ／ｋｇのＡＢ０２０８５８でのＱＤ処置は、結腸の長さのＤＳＳ誘導性の変化の有意な（２１％）阻害を生じた。５ｍｇ／ｋｇのＡＢ０２０８５８でのＢＩＤ処置は、結腸の長さの減少を、３６％低減した。
【０４２５】
結腸の絶対重量（図４９および５０）は、ビヒクル中のＤＳＳで処置したマウスにおいて約２６％減少した。１０ｍｇ／ｋｇのＡＢ０２０８５８によるＱＤ処置または５ｍｇ／ｋｇのＡＢ０２０８５８によるＢＩＤ処置は、結腸重量のＤＳＳ誘導性の変化の有意な減少を生じた。
【０４２６】
脾臓の絶対重量（図５１）は、（髄外の極度の出血に起因して）ＤＳＳ＋ビヒクル処置したマウスにおいて約４０％増加した。脾臓重量は、正常動物に対して全てのＤＳＳ処置動物において有意に大きかった。
【０４２７】
（組織病理学的知見）
結腸の炎症、腺喪失、びらんおよび総組織病理学的スコアの有意な減少が、ＡＢ０２０８５８（１０ｍｇ／ｋｇ）でＱＤ処置したマウスおよびＡＢ０２０８５８（５ｍｇ／ｋｇ）でＢＩＤ処置したマウスにおいて生じ、そしてその大きさはほぼ等しかった（図５２、５３、５４および５５）。
【０４２８】
脾臓リンパ萎縮症（ストレスの指標）は、これらの同じ動物において、ぞれぞれ、４７％および４６％阻害された（図５６）。脾臓の髄外出血の誘導の阻害は、ＱＤ処置したマウスに対してＢＩＤ処置したマウスにおいてより高く、全ての処置群において生じた（図５７）。
【０４２９】
（考察および結論）
本実施例において報告された実験は、（Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いた）実施例２６のマウスとは異なる系統のマウスを使用する、ＡＢ０２０２５８の投与についての用量応答性の情報を提供する。これらの結果は、ＡＢ０２０２５８の同時投与が、ＤＳＳ誘導性の炎症性腸疾患のマーカーの出現を、（特に、使用した最も高い用量で）阻害するに有効であることを示す。
【０４３０】
（実施例２８．ＣＧ５３１３５の皮下投与）
さらなる実験を実行し、ここで、マウスをまた、ＣＧ５３１３５を用いて皮下的に処置した。実施例２６および２７の結果とまとめたこれらの研究は、５ｍｇ／ｋｇのｉｐ用量もしくは１０ｍｇ／ｋｇのｉｐ用量、または５ｍｇ／ｋｇのｓｃ用量もしくは１ｍｇ／ｋｇのｓｃ用量のＣＧ５３１３５の予防的投与が、結腸炎のマウスモデルにおいて硫酸デキストランナトリウムによって誘導される粘膜損傷の程度および重篤度を有意に減少させたことを示す。
【０４３１】
（実施例２９．インドメタシン処置ラットに対するＣＧ５３１３５投与の効果）
インドメタシンでのラットの処置は、クローン病において生じる変化と類似した巨視的および組織病理学的な腸の変化を生じる。本実施例において提供される実験は、インドメタシン誘導性の腸損傷のラットモデルを処置する際における、ＣＧ５３１３５の効力について報告する。腸損傷の代替のモデルにおけるこのタンパク質の効力は、炎症性腸疾患の処置におけるＣＧ５３１３５の治療的能力に対する支持を追加する。
【０４３２】
（材料および方法）
（タンパク質の産生）ＣＧ５３１３５タンパク質の調製は、実施例２６における記載と同じであった。
【０４３３】
（研究計画）  体重１７５〜２００ｇの雌性Ｌｅｗｉｓラット（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を８日間馴化させた（−８日目〜−１日目）。ラットを、以下の８つの処置群に分割した：ＣＧ５３１３５を与えられる４群（３群はｉｖ投与され、１群はｓｃ投与される）、正常モデルおよび疾患モデルに対する２つのｉｖコントロール、ならびに正常モデルおよび疾患モデルに対する２つのｓｃコントロール。−１日目に、ＣＧ５３１３５またはビヒクルでの処置を開始し、そして４日目まで継続した。ＣＧ５３１３５を、５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇもしくは０．２ｍｇ／ｋｇの用量でｉｖ（尾静脈）注射するか、または１ｍｇ／ｋｇでｓｃ注射した；ビヒクルコントロールに、ＢＳＡ（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬ＋１Ｍ  Ｌ−アルギニン（ａｇｒｉｎｉｎｅ））を注射した。０日目および１日目に、ラットを、クローン病において生じる変化と類似する、巨視的および組織病理学的な腸の変化を誘導させるために、インドメタシン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；７．５ｍｇ／ｋｇ用量）で処置した。インドメタシンを、５％炭酸水素ナトリウム中で調製した。５日目に、腸および脾臓内で増殖している細胞をパルス標識するために、剖検の１時間前にラットに、５０ｍｇ／ｋｇの５−ブロモー２’デオキシウリジン（ＢｒｄＵ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の単回ｉｐ用量を注射した。停止の後に、病変の危険にさらされる領域内の空腸の１０ｃｍの切片を秤量し、巨視的病理学的スコアを与え、次いで組織病理学的な評価ならびに壊死および炎症のスコアリングのためにホルマリン中に収集した。血液をＣＢＣ分析のために収集した。
【０４３４】
（病理のマーカーの観察および分析）
（巨視的観察）  体重を、０日目始めて毎日測定した。剖検で、肝臓の重量および脾臓の重量を測定し、そして病変の危険のある領域における空腸の１０ｃｍの切片を秤量し、巨視的病理についてスコアリングし、そして組織病理学的な評価ならびに壊死および炎症のスコアリングのためにホルマリン中に収集した。インドメタシン誘導性損傷についての危険のある領域を、以下の基準に従って剖検で記録した：
０＝正常
１＝腸の腸間膜／腸間膜縁の最小限の肥厚
２＝腸の腸間膜／腸間膜縁の軽度から中程度の肥厚だが癒着はない
３＝容易に分離される１以上の限局的な癒着を有する中程度の肥厚
４＝１〜多数の分離しがたい癒着を有する顕著な肥厚
５＝死をもたらす重篤な腸の病変
（組織病理学）  インドメタシン誘導性病変に対する危険のある秤量された１０ｃｍの小腸の領域から採取された（ほぼ均一に間隔を空けられた）５つの切片を、組織病理学的な評価のために、１０％の中性に緩衝化したホルマリン中に固定化し、パラフィン包埋のために処理し、５μｍに切り出し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。壊死を、上皮細胞の損失をスコアリングするための実施例２６に記載される方法と同じ方法で、罹患した切片の面積パーセントに従ってスコアリングした。
【０４３５】
炎症を、以下の基準に従って記録した：
０＝なし
１＝腸間膜および筋肉または病変における最小限の炎症
２＝腸間膜および筋肉または病変における軽い炎症
３＝腸間膜および筋肉または病変における中程度の炎症
４＝病変における顕著な炎症
５＝病変における重篤な炎症
炎症および壊死の平均を各動物に対して決定し、次いで各群の平均を算出した。
【０４３６】
（統計）  各処置群に対する平均および標準誤差（ＳＥ）を、スコアリングした各パラメータについて決定した；このデータを、ｐ＜０．０５の有意性での両側（２−ｔａｉｌｅｄ）のスチューデントｔ検定を用いて、疾患コントロールに対するデータと比較した。
【０４３７】
（結果）
インドメタシンで処置した全ての動物において、体重損失を観察した。体重損失におけるわずかだが有意な減少を、疾患コントロール（ｉｖ）と比較して、ＣＧ５３１３５（０．２ｍｇ／ｋｇ  ｉｖ）で処置した動物において観察した。他の用量のＣＧ５３１３５（ｉｖ投与経路およびｓｃ投与経路の両方）は、減少したが統計的に有意でない、インドメタシン誘導性の体重損失を与えた（図５８）。
【０４３８】
剖検で、各動物由来の危険のある領域の空腸の１０ｃｍの切片を秤量した。インドメタシン処置は、正常なｉｖコントロールおよびｓｃコントロールと比較して小腸の重量の上昇を生じ、腸管損傷のこのモデルに関する浮腫および炎症と一致した。ＣＧ５３１３５（１ｍｇ／ｋｇまたは０．２ｍｇ／ｋｇ  ｉｖ）での処置は、疾患のコントロール比較して、小腸の重量の有意な減少を生じた（図５９）。小腸の臨床スコアにおけるわずかな減少を観察し、最大の利点は、１．０ｍｇ／ｋｇのｉｖ用量（３８％）および０．２ｍｇ／ｋｇのｉｖ用量（２５％）で生じたが；これらの利点は、統計的に有意ではなかった。相対的な脾臓の重量および肝臓の重量は、インドメタシンで処置した動物において増加した。ＣＧ５３１３５の投与は、これらの重量において中程度のさらなる増加を生じた（データを示さず）。
【０４３９】
（血液学）  ラットに対するインドメタシンの２用量の投与は、増加した好中球およびリンパ球の結果として、総白血球数を増加させた。赤血球数、ヘマトクリット、およびヘモグロビン濃度の減少もまた観察した。ＣＧ５３１３５（５ｍｇ／ｋｇおよび０．２ｍｇ／ｋｇ  ｉｖ）での処置は、疾患コントロールと比較して、絶対的な好中球数の有意な減少を生じた（図６０）。ヘモグロビン濃度は、正常なコントロールと比較して、インドメタシンコントロールにおいて減少し、さらにＣＧ５３１３５で処置したラットにおいてわずかに減少した（データを示さず）。
【０４４０】
（組織病理学）  腸の５切片の評価およびスコアリングを、各動物について実施した。腸に対する防御効果の組織学的な証拠を、ＣＧ５３１３５（０．２ｍｇ／ｋｇ  ｉｖ）で処置した動物においてのみ観察した。空腸の壊死における５３％の減少および炎症スコアにおける３８％の減少を、疾患のコントロールｉｖと比較して、０．２ｍｇ／ｋｇ  ｉｖ  ＣＧ５３１３５用量について観察した（図６１）。罹患した小腸の顕微鏡写真を、正常コントロールおよび疾患コントロール、ならびに０．２ｍｇ／ｋｇ  ＣＧ５３１３５で処置したラットについて、図６２に示す。パネルＡは、ビヒクル（ＢＳＡ）でｉｖ処置した正常コントロール動物由来の小腸を示す。正常な絨毛構造および腸間膜（矢印）が明らかである。パネルＢは、ビヒクル（ＢＳＡ）とともにインドメタシンでｉｖ処置したラット由来の小腸の顕微鏡写真を示す。腸間膜の癒着に関する領域ほとんどにわたって広がる病巣粘膜の壊死が明らかである（例えば、右上の腸壁および右下の腸壁のアスタリスクを参照のこと）。顕著な炎症性細胞の浸潤巣が、腸間膜に存在する（矢印）。パネルＣは、インドメタシンで処置したラットをさらにＣＧ５３１３５（０．２ｍｇ／ｋｇ  ｉｖ）で処置した小腸の画像を示す。パネルＢに示される疾患コントロールと対照的に、明白な壊死は存在しない。筋肉層への減弱した絨毛および細胞性の浸潤の病巣領域が存在する（例えば、腸壁の右上、右および右下の３つのアスタリスクを参照のこと）。腸間膜（矢印）は、炎症性細胞により浸潤されている。図６２の顕微鏡写真は、さらに０．２ｍｇ／ｋｇ  ｉｖ  ＣＧ５３１３５の防御効果についての支持を提供する。
【０４４１】
ＢｒｄＵ標識化を、剖検の１時間前に５０ｍｇ／ｋｇの注射によって実施した。正常なコントロール動物由来の小腸において、正常なパターンの陰窩標識が、１００倍にて観察される（図６３、パネルＡ）。疾患モデルにおけるＢｒｄＵの取り込みは、壊死の粘膜領域の上皮細胞において減少したかまたは存在しなかったが、線維芽細胞標識が顕著な隣接（ｓｕｂａｊａｃｅｎｔ）する炎症組織では増加した（図６３、パネルＢ、５０倍で可視化した）。病巣粘膜の壊死（矢印）は、ＢｒｄＵの免疫染色が存在しないこと、ならびに炎症性細胞の重篤な浸潤および繊維芽細胞の増殖によって示される。インドメタシン＋ＣＧ５３１３５  ０．２ｍｇ／ｋｇ  ｉｖで処置されたラット由来の小腸は、陰窩標識が存在しないが、比較的インタクトな粘膜を示す（図６３中の矢印、パネルＣ、５０倍で可視化した）。隣接する平滑筋および腸間膜は、疾患コントロールにおいて観察されるものと比較して、炎症性細胞で中程度にしか浸潤されない（パネルＢ）。粘膜完全性の保存を生じたＣＧ５３１３５で処置した特定の動物において、増加された陰窩標識もまた観察され；これは、正常なコントロールにおいて見られる傾向である。
【０４４２】
本実施例における実験の結果を、以下のように要約し得る。インドメタシンでのラットの処置は、巨視的および組織病理学的な腸の変化を生じ、この変化は、クローン病において生じる変化と同様である。インドメタシンで処置したラットに対するＣＧ５３１３５（０．２ｍｇ／ｋｇ  ｉｖ）の投与は、体重損失、小腸の重量、絶対的な好中球数、ならびに空腸の壊死および炎症スコアにおける顕著な減少を生じた。高用量のＣＧ５３１３５（５．１ｍｇ／ｋｇ  ｉｖおよび１ｍｇ／ｋｇ  ｓｃ）は、効力が低かった。剖検１時間前にＢｒｄＵを注射した動物から収集された組織の形態学的な外観は、本腸管損傷モデルにおける、ＣＧ５３１３５の有益な効果が標的細胞上に対する増殖性効果よりも粘膜の防御の結果であることを示唆した。
【０４４３】
（等価物）
本発明の特定の実施形態について上記の詳細な記載から、核酸、ポリペプチド、抗体、検出および処置に関する、特定の新規な組成物および方法が記載されていることは明らかであるはずである。これらの特定の実施形態が本明細書に詳細に開示されているが、これは、例示のみの目的のために例としてなされ、そして添付される特許請求の範囲の範囲に関して制限することを意図しない。特に、種々の置換、変更、および改変が、特許請求の範囲によって規定される本発明の意図および範囲から逸脱することなく、本発明の分野における当業者に対して慣用的な事項としてなされ得ることが、本発明者によって企図される。実際、本明細書中に記載されることに加えて、本発明の種々の改変が、先行する記載および付随する図面から当業者に対して明らかとなる。このような改変は、添付された特許請求の範囲の範囲内に含まれることが企図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、２９３細胞によって分泌されたＦＧＦ−ＣＸタンパク質のウェスタン分析を示す。
【図２】
図２は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中に発現されたＦＧＦ−ＣＸタンパク質のウェスタン分析を示す。
【図３】
図３は、ＦＧＦ−ＣＸのウェスタン分析を示す。示された構築物を用いて一過性トランスフェクトされた２９３細胞（パネルＡ）またはＮＩＨ３Ｔ３細胞（パネルＢ）由来のサンプルを、抗−Ｖ５抗体を用いて、ウェスタン分析によって調べた。ＣＭは馴化された培地である。ＳＥは、スラミン抽出され、馴化された培地である。分子量マーカーを左に示す。
【図４】
図４は、還元条件または非還元条件下で調製された精製ＦＧＦ−ＣＸサンプルの、クマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像を示す。
【図５】
図５は、７８６０ヒト腎臓癌腫細胞を用いて実施された用量滴定増殖実験の結果を示す。この実験において、種々の量のＦＧＦ−ＣＸ（図５に２０８５８として示す）によって誘導されたブロモデオキシウリジンの取り込みを測定した。
【図６】
図６は、ＦＧＦ−ＣＸのレセプター結合特異性を評価する実験の結果を示す。ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を、血清飢餓状態にし、示された増殖因子（四角＝ＰＤＧＦ−ＢＢ；三角＝ａＦＧＦ；丸＝ＦＧＦ−ＣＸ）を単独でか、または示された可溶性ＦＧＦＲと一緒にインキュベートし、そしてＢｒｄＵ取り込みアッセイによって分析した。実験を、三回実施し、そして増殖因子のみを受けた細胞に対する、ＢｒｄＵの取り込みにおけるＢｒｄＵ増加％として表す。
【図７】
図７は、プラスミドｐＥＴ２４ａ−ＦＧＦ２０Ｘ−ｄｅｌ５４−コドンが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１株（ＤＥ３）において発現された場合に得られるアルギニン上清の、クマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像を示す。
【図８】
図８は、ＤＮＡ合成に対するその効果によって表された短縮形態の組換えＦＧＦ−ＣＸ（図中の（ｄ１−２３）ＦＧＦ２０によって示される）の生物学的活性を、全長ＦＧＦ−ＣＸ（図に示されるＦＧＦ２０）の生物学的活性と比較して表す。ＮＩＨ  ３Ｔ３マウス線維芽細胞を、血清飢餓させ、示される因子と共に１８時間インキュベートし、そしてＢｒｄＵ取り込みアッセイによって分析した。
【図９】
図９は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞において発現された３０６６４１８８．ｍ９９タンパク質のウェスタンブロットを示す。
【図１０】
図１０は、ヒト２９３細胞によって分泌された３０６６４１８８．ｍ９９タンパク質のウェスタンブロットの表示である。
【図１１】
図１１パネルＡは、クローン３０６６４１８８．０．９９の成熟形態のタンパク質の組換え産生、精製、および見かけの分子量についての概略の、図示的表示である。パネルＢは、３０６６４１８８．０．ｍ９９ポリペプチドの発現を示す、２種類のウェスタンブロット分析の表示を含む。
【図１２】
図１２は、種々の処理に応じた、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞およびＣＣＤ−１０７０細胞へのＢｒｄＵの取り込みを示すグラフである。
【図１３】
図１３は、種々の処理に応じた、ＮＩＨ  ３Ｔ３  ５−２４細胞の増殖を示すグラフである。
【図１４】
図１４は、模擬（ｍｏｃｋ）の処理または３０６６４１８８に曝されたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞の細胞数を示すグラフである。
【図１５】
図１５は、ｐＣＥＰ４ｓｅｃ  ＣＭタンパク質または３０６６４１８８タンパク質を用いた処理に応じた、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞の細胞密度および細胞形態を示す顕微鏡写真の描写である。
【図１６】
図１６は、種々の処理に応じた、ＮＨｏｓｔ骨芽細胞の細胞数の変化を示す顕微鏡写真の描写である。
【図１７】
図１７のパネルＡは、血清の非存在下で培養されたＨＥＫ２９３細胞によって発現された３０６６４１８８．ｍ９９のウェスタンブロットの表示である。図１７のパネルＢは、血清存在下で培養されたＨＥＫ２９３細胞によって発現された３０６６４１８８．ｍ９９タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥでの表示である。
【図１８】
図１８は、３０６６４１８８．ｍ９９タンパク質のｐ８５フラグメント（バー４〜１０）およびｐ３５フラグメント（バー１１〜１７）によって刺激されたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞への、ＢｒｄＵ取り込みの用量滴定の表示である。
【図１９】
図１９は、ＰＤＧＦ  ＤのウェスタンブロットおよびＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析の表示である。パネルＡにおいて、ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ（レーン１）またはｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−ＰＤＧＦ  Ｄ（レーン２およびレーン３）で一過性トランスフェクトされ、そしてＦＢＳの存在下（レーン３）または非存在下（レーン１および２）で培養されたＨＥＫ  ２９３細胞の馴化された培地由来のサンプルを、還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続く抗Ｖ５抗体を用いたイムノブロット分析によって調べた。パネルＢにおいて、ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−ＰＤＧＦ  Ｄでトランスフェクトされ、ＦＢＳの存在下（レーン３および４）または非存在下（レーン１および２）で培養されたＨＥＫ  ２９３細胞由来の精製ＰＤＧＦ−Ｄを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し、そしてクマシーブルーで染色した。サンプルを、ＤＴＴを用いてか（＋）または用いずに（−）処理した。分子量マーカーを左に示す。
【図２０】
図２０は、ｐ３５より得られ、そしてＮ末端配列決定によって同定されたフラグメントの表示である。各々のパネルにおいて、上の黒色の配列は、クローンより予想される配列であり、そして下の灰色の配列は、Ｎ末端配列決定によって提供された配列である。斜線の影は、ｐ３５の２つのフラグメントを示す。平衡線の影は、Ｖ５エピトープを示し、そして垂線の影は、６Ｈｉｓタグを示し、それらの両方は、ベクターｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−３０６６４１８８（実施例３）を起源とする。パネルＡにおいて、２つの配列が同定され、１つは、ＧｌｙＡｒｇ（これらの２つの残基は、下線で示される）で始まり、第２のものは、３番目の残基Ｓｅｒで始まった。
【図２１】
図２１は、胎仔ウシ血清（パネルＢ）および仔ウシ血清（パネルＡ）存在下での３０６６４１８８遺伝子産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥの描写である。各々のパネルのレーン１およびレーン２は、各々、単独または血清の存在下での真性の３０６６４１８８ｐ３５を示す。各々のパネルにおけるレーン３は、血清の非存在下でのｐ８５を示し、そしてレーン４〜６は、増加する濃度の各々の血清の存在下でのｐ８５を示す。
【図２２】
図２２は、増殖因子による、肺動脈平滑筋細胞の増殖の刺激の描写である。平滑筋細胞を、示された濃度で精製ｐ３５  ＰＤＧＦ  ＤＤ、ＰＤＧＦ  ＡＡまたはＰＤＧＦ  ＢＢを用いて処理し、そしてＤＮＡに取り込まれたＢｒｄＵの量を測定した。
【図２３】
図２３は、種々の処理に応じた、肺動脈平滑筋細胞の増殖を示す図である。
【図２４】
図２４は、種々の処理後０日目および６日目でのマウスの平均体重を表す棒グラフを示す。
【図２５】
図２５は、種々の処理後０日目と６日目との間のマウスの平均体重の変化を表す棒グラフを示す。
【図２６】
図２６は、種々の処理後０日目と６日目との間のマウスの平均体重の変化％を表す棒グラフを示す。
【図２７】
図２７は、種々の処理後０日目と６日目との間のマウスの脾臓の平均重量の変化を表す棒グラフを示す。
【図２８】
図２８は、種々の処理後０日目と６日目との間のマウスの脾臓の平均重量の変化を表す棒グラフを示す。
【図２９】
図２９は、種々の処理後０日目と６日目との間のマウスの結腸の平均重量の変化を表す棒グラフを示す。
【図３０】
図３０は、種々の処理後０日目と６日目との間のマウスの結腸の平均重量の変化を表す棒グラフを示す。
【図３１】
図３１は、種々の処理後０日目と６日目との間のマウスの結腸の平均重量の変化％を表す棒グラフを示す。
【図３２】
図３２は、種々の処理後０日目と６日目との間のマウスの結腸の平均長の変化を表す棒グラフを示す。
【図３３】
図３３は、種々の処理後０日目と６日目との間のマウスの結腸の平均長の変化％を表す棒グラフを示す。
【図３４】
図３４は、種々の処理後のマウスにおける結腸血液内容物の平均スコアを表すグラフを示す。
【図３５】
図３５は、種々の処理後のマウスにおける結腸水腫の平均スコアを表すグラフを示す。
【図３６】
図３６は、種々の処理後のマウスにおける結腸炎症の平均スコアを表す棒グラフを示す。
【図３７】
図３７は、種々の処理後のマウスにおける結腸上皮の損失の平均スコアを表す棒グラフを示す。
【図３８】
図３８は、種々の処理後のマウスにおける結腸侵食内容物の平均スコアを表す棒グラフを示す。
【図３９】
図３９は、種々の処理後のマウスにおける組織病理学的スコアの合計を表す棒グラフを示す。
【図４０】
図４０は、種々の処理後のマウスにおける組織病理学的スコアの差異を表す棒グラフを示す。
【図４１】
図４１は、種々の処理後のマウスにおける脾リンパ萎縮の平均スコアを表す棒グラフを示す。
【図４２】
図４２は、マウス結腸断面の元の画像の４００倍の顕微鏡写真を示す。パネルＡ、ＤＳＳおよびビヒクル；パネルＢ、ＤＳＳおよびＡＢ０２０８５８；パネルＣ、正常なマウス。
【図４３】
図４３は、マウス結腸断面の元の画像の５０倍の顕微鏡写真を示す。パネルＡ、ＤＳＳおよびビヒクル；パネルＢ、ＤＳＳおよびＡＢ０２０８５８；パネルＣ、正常なマウス。
【図４４】
図４４は、種々の用量のＡＢ０２０２５８を用いてマウスを処理したときから０日目の平均体重の変化を示す。
【図４５】
図４５は、種々の用量のＡＢ０２０２５８を用いてマウスを処理したときから０日目の平均体重の変化％を示す。
【図４６】
図４６は、種々の用量のＡＢ０２０２５８を用いてマウスを処理したときの、結腸血液内容物の平均スコアを示す。
【図４７】
図４７は、種々の用量のＡＢ０２０２５８を用いてマウスを処理したときの、平均の結腸の長さを示す。
【図４８】
図４８は、種々の用量のＡＢ０２０２５８を用いてマウスを処理したときの、結腸の平均の長さを正常時の％として示す。
【図４９】
図４９は、種々の用量のＡＢ０２０２５８を用いてマウスを処理したときの、結腸の平均重量を示す。
【図５０】
図５０は、種々の用量のＡＢ０２０２５８を用いてマウスを処理したときの、結腸の平均重量を正常時の％として示す。
【図５１】
図５１は、種々の用量のＡＢ０２０２５８を用いてマウスを処理したときの、脾臓の平均重量を示す。
【図５２】
図５２は、種々の用量のＡＢ０２０２５８を用いてマウスを処理したときの、遠位の結腸の炎症の平均スコアを示す。
【図５３】
図５３は、種々の用量のＡＢ０２０２５８を用いてマウスを処理したときの、遠位の結腸腺の損失の平均スコアを示す。
【図５４】
図５４は、種々の用量のＡＢ０２０２５８を用いてマウスを処理したときの、遠位の結腸の侵食の平均スコアを示す。
【図５５】
図５５は、種々の用量のＡＢ０２０２５８を用いてマウスを処理したときの、組織病理学的スコアの合計の平均を示す。
【図５６】
図５６は、種々の用量のＡＢ０２０２５８を用いてマウスを処理したときの、脾リンパ萎縮の平均スコアを示す。
【図５７】
図５７は、種々の用量のＡＢ０２０２５８を用いてマウスを処理したときの、脾臓の髄外造血の平均スコアを示す。
【図５８】
図５８は、インドメタシン処理したラットにおける体重の損失に対する、ＣＧ５３１３５処理の効果を示す。０日〜５日の体重変化をグラムで示す。
【図５９】
図５９は、インドメタシン処理したラットにおける小腸重量に対する、ＣＧ５３１３５処理の効果を示す。
【図６０】
図６０は、インドメタシン処理したラットにおける純粋な好中球数およびリンパ球数に対する、ＣＧ５３１３５処理の効果を示す。血液を、５日目に剖検で収集し、そして細胞数を測定した。
【図６１】
図６１は、インドメタシン処理したラットにおける組織病理学的スコアに対する、ＣＧ５３１３５処理の効果を示す。罹患した腸の５つの切片を、本方法に記載されるように、壊死および炎症について評価およびスコア付けした。
【図６２】
図６２は、腸構造に対するＣＧ５３１３５の保護効果を示す画像を示す。パネルＡ：ビヒクル（ＢＳＡ）を用いて静脈処理された正常なコントロール動物からの小腸。パネルＢ：インドメタシン処理され、ビヒクル（ＢＳＡ）を用いてさらに静脈処理されたラットからの小腸。パネルＣ：インドメタシン処理され、ＣＧ５３１３５（０．２ｍｇ／ｋｇ静脈）を用いてさらに処理されたラットからの小腸。切片をＨ＆Ｅで染色し、そして２５倍の倍率で可視化した。図６２は、インドメタシン処理されたラットにおける腸構造に対するＣＧ５３１３５の保護効果を示す。パネルＡ、正常なコントロール；パネルＢ、疾患コントロール（インドメタシン処理）；パネルＣ、０．２ｍｇ／ｋｇのＣＧ５３１３５を用いて静脈処理された疾患モデル動物。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された切片の顕微鏡写真を、２５倍の倍率で得た。
【図６３】
図６３は、腸におけるＢｒｄＵ標識に対するＣＧ５３１３５処理の効果を示す。ＢｒｄＵ取り込みを、イムノペルオキシダーゼ染色によって検出した。パネルＡ：正常なコントロール動物からの小腸（１００倍）。パネルＢ：インドメタシンおよびビヒクル（ＢＳＡ）で処理された動物からの小腸（５０倍）。パネルＣ：インドメタシンおよびＣＧ５３１３５（０．２ｍｇ／ｋｇ  静脈）で処理されたラットからの小腸（５０倍）。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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