(57)【要約】本発明は、歯垢および歯石沈着を減少させる方法に関する。本発明は、更に歯周炎並びに口腔の歯の及び組織の他の疾患を治療する又は予防する方法に関する。更に、本発明は、かかる方法における使用に適切な組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の口腔の疾患または障害を予防する方法であって、前記口腔を効果的な量の前記口腔に存在する微生物において抗微生物効果を発揮するラクトフェリン（ＬＦ）およびグリコマクロペプチド（ＧＭＰ）の組み合わせと接触させることを含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記疾患が歯垢である方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記疾患が歯肉炎である方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記抗微生物効果が抗Actinobacilous haemophilus効果である方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記組み合わせが500ppm  ＬＦおよび500ppm  ＧＭＰである方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記組み合わせが、前記抗微生物効果が前記口腔で優勢な微生物に対するものである方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記ＬＦおよびＧＭＰの組み合わせが、500ppm  ＬＦおよび50ppm  ＧＭＰである方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記抗微生物効果が、抗Pseudomonas aeruginosa又は抗Streptococcus pyogenes効果である方法。
【請求項９】
混合物中にＬＦおよびＧＭＰを含む組成物であって、抗微生物効果を発揮する組成物。
【請求項１０】
請求項９に記載の組成物であって、前記組成物が500ppm  ＬＦおよび500ppm  ＧＭＰを含む組成物。
【請求項１１】
請求項９に記載の組成物であって、前記組成物が500ppm  ＬＦおよび50ppm  ＧＭＰを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯垢（dental plaque）および歯石（calculus）沈着を減少させる方法に関する。本発明は、更に歯周炎（periodonitis）並びに口腔の歯の及び組織の他の疾患を治療する又は予防する方法に関する。また、本発明は、かかる方法における使用に適切な組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの唾液の重要な機能は、微生物の破壊的効果から口の組織を防御することである。口腔は外来の且つ有害な細菌の侵入の主経路であり、バランスのとれた健康的なフローラを維持することが必要である。細菌の凝集、刺激、接着および成長の予防におけるバランスは、口の微生物叢の発生および組成を部分的に決定する。ある種の正常な口内フローラ細菌は、それらの集団の成長が正常な口内フローラバランスを超えた場合に病原となる可能性を有している。
【０００３】
歯垢（歯エナメル質に発生する）は、歯肉炎を発症する歯肉（gingival）組織の炎症の原因となり得る。慢性歯肉炎は、歯肉縁上歯垢（suptagingival dental plaque）の歯肉縁（gingival margin）での蓄積と関連している。歯肉炎の垢（plaque）の微生物組成における、連鎖球菌優性のフローラから病原性種のシフトが高レベルで生じる。長期にわたる歯肉炎症および病原性の口内細菌への恒常的な暴露は、歯周炎（periodontitis）の原因となり得る。口内感染の最も重篤な形態は、歯支持組織の衰退の原因となる。
【０００４】
ラクトフェリンは、鉄結合性の糖蛋白質であり、いくつかの哺乳類の外分泌性の分泌（例えば、ミルクおよび唾液）に認められる。ＬＦは２つのFe3+原子と結合し、そして細菌の本必須栄養素の利用可能性を制限し、このことによって間接的な静菌効果を生じる（Cole et al, Microbial aspects of dental curies, pp. 359-373, Information Retrieval, Washington, D.C. 1976）。ＬＦの鉄フリー形態は、グラム陰性細菌の外膜を、膜の機能および透過性を変化させることによって損傷させる。また、ＬＦはシアル酸を含有する。ヒトおよびウシのミルク（κ−カゼインのシアル酸含有断片を有する）は、抗細菌効果を、細菌細胞壁へＬＦを結合させること及び表面への微生物の接着を阻害することにより発揮する。
【０００５】
グリコマクロペプチド（ＧＭＰ）、またはκ−カゼイン・グリコマクロペプチドは、食品グレードの酵素的加水分解および分画によって調製されるペプチドである。粉末は、通常89%のＧＭＰ蛋白質を含有する。産物は、グリコシル化したＧＭＰ（通常シアル酸として知られるＮ‐アセチルノイラミン酸）および非グリコシル化ＧＭＰを含有する。シアル酸を含有している糖鎖は、細菌表面への結合に重要である（Kawasaki, Biosci. Biotech. Biochem. 56:195-198 (1992)）。これらの鎖はある種の口内細菌上の活性部位と結合するので、ＧＭＰがそれらに結合することによって作用して細菌成長を阻害し、これによって成長相数（growth phase numbers）を増加させずに維持する（Kawasaki, Biosci. Biotech. Biochem. 57:1214-1215 (1993)）。
【０００６】
本発明は、抗微生物薬剤としてのＬＦおよびＧＭＰの有効性を評価するために設定された研究の結果から生じた発明である。これらの研究で試験される細菌は、Streptococcus mutans、Streptococcus pyogenes、Actinobacillus haemophilus、およびPseudomonas aeruginosaを含む。S. mutansは、アルファ溶血性〔赤血球（RBCs）および血液寒天プレートの緑色の変色を呈するヘモグロビンの部分的な破壊〕、非運動性（nonmotile）、条件的嫌気性のグラム陽性球菌である。口内のstreptococcus種は、ヒトの口腔および上気道に見出される。これらの生物体は、スクロースを加水分解し及び歯垢を形成し、そして、結果として発酵に理想的な嫌気性の環境を作り出す。S. pyogenesは、ベータ溶血性〔RBCsおよびヘモグロビンの完全なる破壊、そして血液寒天プレート上で成長部分に透明な境界（clearing around）を生じる〕、非運動性、被包性、条件的嫌気性のグラム陽性球菌である。この種は、ストレップ咽頭（strep throat）、インペチゴ（impetigo）、中耳炎、乳様突起炎、およびこの生物体の血行性播種（hematogenic dissemination）から生じる多数の感染の原因である。それは、鼻、咽頭、および皮膚に常在し、宿主細胞に付着した際、炎症の原因となる毒素を放出する。P. aeruginosaは、好気性、高度に運動性、直線状または若干カーブしたグラム陰性桿菌である。それは、土壌および水のなかに通常存在し、そして消化、吸入により又は皮膚の開口部を介して宿主への感染経路を見出す。それは組織傷害性の酵素を分泌し、そして義歯上にバイオフィルムを形成して義歯使用者の口内感染を引き起こす。A. haemophilusは、嫌気性、非運動性のグラム陽性球菌であり、歯周炎疾患のある種の形態を有する個人に通常見出される病原体である。それは歯茎組織の腫脹および歯周炎ポケットの形成を生じさせる。それは、健康的な口内フローラで見つけられることは少ない。
【０００７】
S. mutens, S. pyogenes, A. haemophilus および P. aeruginosaはヒトの間に広く分布しているが、口内フローラにおいて数が増加すると咽頭炎（sore throats）、猩紅熱（scarlet fever）、う蝕症（dental caries）、歯肉炎（gingivitis）、および歯周炎（periodontitis）の原因となる。これらの細菌の集団が正常なフローラ量を超えた場合、それらは蛋白質を変性し、宿主の白血球、宿主の分子を殺傷し、そして血餅を溶解し始める。本発明の達成に至った研究のゴールは、ＬＦおよびＧＭＰが天然の抗微生物薬剤として口内フローラの維持に関して作用するであろう特定の濃度レベルを、同定できるかどうかを決定することであった。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、歯垢および歯石沈着を減少させる方法に関する。本発明は、更に歯周炎並びに口腔の歯の及び組織の他の疾患を治療する又は予防する方法に関する。更に、本発明は、かかる方法における使用に適切な組成物に関する。
【０００９】
本発明の対象および利点は、以下の記載を参照から明らかとなる。
【発明の詳細記載】
【００１０】
本発明は、ＬＦおよびＧＭＰが例えばA. haemophilisに対して特定の組み合わせで使用された場合に抗微生物効果を発揮するという観察に基づく。本発明を達成した研究は、ＬＦ/ＧＭＰの500 ppm/500 ppm処方がA. haemophilisに対して驚くほど効果的であることを証明している。
【００１１】
本発明は、歯垢形成および歯石沈着を阻害する方法に関する。また、本発明は、歯周炎並びに口腔の歯の及び組織の他の疾患を治療する又は予防する方法に関する。更に、本発明は、口内衛生用組成物（oral hygiene compositions）に関し、該組成物はかかる方法における使用に適切なＬＦおよびＧＭＰを含む。
【００１２】
本発明の口内衛生用組成物において、ＬＦおよびＧＭＰの混合物（A. haemophilusの場合においては好ましくは500 ppm/500 ppm ＬＦ/ＧＭＰ）は、実質的に非毒性の担体（即ち、哺乳類、特にヒトの口腔での使用に適切な担体）と共に処方することができる。製品は、口内洗浄剤（mouthwash）、口内リンス剤（mouth rinse）、歯磨き粉末、歯磨きペースト、歯磨きゲル、チューイングガム、または容易に口から除去し、使用後に廃棄することが可能な他の歯磨剤（dentifrice）の形態をとることが可能である。ＬＦおよびＧＭＰ以外の成分（口内の洗浄剤およびリンス剤、歯磨き粉、ペーストおよびゲル、並びにチューイングガムに典型的に認められる）を本発明の組成物の調製に使用でき、ルーチンの調製方法を実施することができる（例えば、ＵＳＰ  5,362,480を参照）。
【００１３】
ＬＦおよびＧＭＰは、即時調製用組成物（instant composition）中に、例えばA. haemophilisの成長を阻害するために十分な量で存在する。ＬＦおよびＧＭＰの最適量は、例えば、成長が阻害される微生物、組成物の形態（例えば、チューイングガム  対  口内洗浄剤）、および他の因子に依存して変化させることが可能である。ＬＦおよびＧＭＰの最適濃度および／またはＬＦのＧＭＰに対する比率は、当業者が容易に達成することが可能であり、例えば、以下の実施例に記載されるアッセイを用いて達成できる。
【００１４】
本発明の組成物は、任意の時間に使用できる、しかしながら、食事直後、または飲料もしくはスナックを消費した後が特に有利である。使用時間の長さは、個人の利便性に基づき使用できる、またその組成物がとる形態に関して典型的な長さで使用できる。
【００１５】
本発明は、ヒトでの使用に関する発明であるが、獣医学的な使用をも意図することが理解されるだろう。明らかに、前記組成物の許容される形態は、非ヒト動物における使用を含む場合には、より限定されるであろう。
【００１６】
上述のように、歯垢および歯石の発生の阻害は、本発明の本質的な焦点である。しかしながら、歯肉疾患を含む様々な口の傷害が本発明に基づいて治療または予防することが可能であることが理解される。これらの傷害に関連する使用に適切な組成物は、上述のように処方して使用することができる。
【００１７】
本発明のある側面は、以下の限定されることのない実施例において非常に詳細に記載されている。ＬＦおよびＧＭＰ双方が、試験された細菌（A. haemophilus、S. mutans、S. pyogenes、P. aeruginosa、および口内フローラ）の間の特定のインタラクションを生み出したことを、本発明は明瞭に証明した。このインタラクションは抗微生物効果を生じる、なぜなら細菌集団がＬＦおよびＧＭＰの存在下では減少し、それらの非存在下では増加するからである。早期の研究は、末端の糖配列（シアル酸を含有している）が阻害活性に役割を演ずることを見出した。
【００１８】
全ての試験した細菌において作用したのは、１つの濃度だけではなかった。従って、重要なことはシアル酸配列の構造だけではなく、様々な糖グループ、３次元の蛋白質構造、酸性条件（低ｐＨ）および各々の異なる株の細菌における活性結合サイトの利用可能性などの他の因子も重要である。シアル酸がＬＦおよびＧＭＰの効力を発揮させる要因であるように思われるが、シアル酸それ自身は細菌の成長を阻害しない。従って、これらの蛋白質（ＬＦおよびＧＭＰ）に、微生物の結合および成長の阻害に相乗効果を有するコンポーネントが存在する。ＬＦおよびＧＭＰのＭＩＢＣが組み合わされ且つ作用しない場合、それらはお互いに相殺（counter-acting）しているだろう。
【００１９】
ＬＦはＧＭＰ（9,000  Da）よりもかなり大きい（80,000  Da）ので、ＬＦは微生物に対するＧＭＰの結合に干渉しているのだろう。１ログの最大減少を示している細菌（S. mutans、S. pyogenes、および口内フローラ）は、ＬＦおよびＧＭＰに対してより耐性である。ＬＦおよびＧＭＰおよびこれらの細菌の外膜蛋白質の間の相互作用は特異性が低く、結合をより困難にしている。差異に関して、温度の変化もＬＦおよびＧＭＰの効率に役割を演じ、これは異なる条件下で細菌に様々な効果を有しているだろう。細菌の異なる成長フェーズに対して、異なる量のＬＦおよびＧＭＰが必要とされるだろう。例えば、高い温度（35℃）で大抵の細菌は、より急速に成長する。従って、高い混合濃度は、より効果的であろう。
【実施例】
【００２０】
＜実験の詳細＞
本研究に使用される細菌株は、Pseudomonas aeruginosa ATCC #27853、Streptococcus mutans ATCC #33535、Streptococcus pyogenes ATCC #19615、およびActinobacillus haemophilus ATCC #43717、並びに健常成人から採取した口内スワブである。細菌を、血液／ＢＴＨ培地〔ブレイン・ハート・インフュージョン・アガー（Brain Heart Infusion Agar）と共にプロテアーゼペプトン（protease peptone）、塩化ナトリウム、グルコース、リン酸二ナトリウムおよび寒天、Oxoid, Hampshire England, Sheep's Blood〕上で、5%CO2の存在下35℃で成長させた。細菌を、スワビングにより採取して２４時間後に成長プレートに播種し、そしてネフェロメーター（McFarland Turbidity Meter）を用いて0.5マクファーランド濁度標準（McFarland Turbidity Standard）が達成される懸濁液になるまでコロニーを９ｍｌ脱イオン水（ＤＩ水）中で希釈した。0.5マクファーランド値は、約1.0x108生物体に対応する。１ｍｌの適切な細菌希釈を無菌ピペットを用いて採り、そして８ｍｌの滅菌BHIブロスに導入した。（BHIブロスの調製：37 g+1,000 ml DI水、Difco Laboratories。ピペットで９ｍｌのブロスを培養液試験管にコントロールとして配置し、そして８ｍｌの試験管を濃度試験用に準備した。）
【００２１】
ウシのＬＦおよびＧＭＰ（ミルクから精製）は、DMV International Nutritionals Fraser, N.Y.から供給された。重炭酸ナトリウム（酵素グレード）を、Fisher Scientific, N.J.から購入した。使用した塩酸は０．１Ｎであった。大腸菌のＮ‐アセチルノイラミン酸（シアル酸タイプＶＩ）を、Sigma Chemical Co., St. Louis Mo.から購入した。
【００２２】
[ＬＦおよびＧＭＰアッセイ]
ＬＦおよびＧＭＰの双方を、重炭酸ナトリウムで希釈した。ＬＦおよびＧＭＰが組み合わせて使用された実験において、それらは重炭酸ナトリウムで希釈された。重炭酸ナトリウムは、ＬＦに対する実証された結合増強剤である。それはより多くの結合サイトを作出し、微生物細胞への付着を容易にし、このようにしてＬＦおよびＧＭＰをより効果的にする。0.10ｍＭ濃度の重炭酸ナトリウム（分子量84.1g）を、作出して、そしてｐＨを1N  HClを用いて5.2-5.3にした。重炭酸ナトリウムの調製例（pH 4.23）：
【００２３】
2004529950.tif 000002
【００２４】
重炭酸ナトリウム、ＬＦ、およびＧＭＰのための滅菌技術は、0.45μmフィルターを介した濾過を必要とする。ＬＦ（DMV  インターナショナル）／ＧＭＰ（DMV  インターナショナル）を、重炭酸ナトリウム溶液に、100,000ppm  ＬＦ/ＧＭＰの「母希釈（mother dilution）」を作成するために溶解した。この溶液を0.45μmフィルターを通して濾過した。様々なppm（0、25、50、75、100、200、250、400、500、750、1,000、2,000および3,000 ppm）を含有する希釈物を、100,000ppm「母希釈」を用いて、そして滅菌した0.10mM  重炭酸ナトリウムを無菌の遠心チュウブに添加して作出した。2,500ppm希釈（1,000ppm＝0.1%）を計算するための例は：
【００２５】
2004529950.tif 000003
【００２６】
ＬＦ/ＧＭＰ結合のカイネティクスを研究するため、各株の細菌を別々に無菌ピペットで採取し、そして８ｍｌ  BHIブロス試験管に入れ、ボルテックスし、そして１ｍｌのＬＦまたはＧＭＰの存在下で18-24時間35℃、5%CO2でインキュベーションした。組み合わせた手法において、0.5mlのＬＦおよびＧＭＰを1mlの播種物（inoculations）として使用した。
【００２７】
[シアル酸アッセイ]
ＧＭＰのグリコシル化分画は、シアル酸（NANA）を含有する。ＧＭＰ上に発現したトータルのNANA含量は、典型例では6.5%である。シアル酸が、微生物阻害を発揮させる要因であるかどうかを試験した。純粋なシアル酸（ロット  #117H0802）を、1,000ppmで試験した：
【００２８】
2004529950.tif 000004
【００２９】
１ｍＬの各細菌株、加えて１ｍＬのシアル酸溶液（1,000ppm）を、試験管（8mLのBHIブロスを満たした）に播種した。各試験管をボルテックスして、35℃、5%CO2で２４時間インキュベーションし、そして次にBIH寒天中に注いで播種して平板計数（plate count）を得た。
【００３０】
[生菌平板計数（Viable Plate Count）]
この技術は、播種されたブロス培養中の生（生きた）細胞の密度を決定するために使用された。この技術は、細菌サンプルをプレーティングすることと、インキュベーション後に生じたコロニーを計数することと、を含む。オリジナルのブロスの段階希釈をプレーティングの前に準備した。段階希釈は、生物体の密度を減らして計数可能なプレートを作出するために必要である。25および250の間のコロニーを含有しているプレートのみが、計数可能と考えられる。細胞密度は、CFU（コロニー形成単位）/ｍｌとして伝統的な手法で記録している。慣例により（By convention）、1.0mlをプレートに播種した際の希釈係数（DF）を、10倍大きいものとして記録している。
式：
【００３１】
2004529950.tif 000005
【００３２】
もし120コロニーがプレート（１０-5のＤＦを有する1.0mlの溶液を播種したプレート）上で計数されたならば、オリジナルの密度は以下の式で表される：
【００３３】
オリジナルの細胞密度＝120  CFU/(1.0ml)(10-5)
【００３４】
オリジナルの細胞密度＝1.2x107  CFU/ml
【００３５】
前記アッセイには、プレート注入技術（pour plate technique）の使用が要求される。前記プレート注入技術は、１工程を従来の段階希釈に付加した。１ｍｌの希釈物を、希釈栄養物（ＢＨＩ）寒天の暖かいエマルジョンに添加して、ペトリプレートに寒天オーバーレイを作出する。インキュベーション後、細菌の成長はプレート全体を覆うが、個々の細胞運動はソフト寒天オーバーレイによって制限されている。形成された各コロニーは、１つのCFUに由来すると推定される。プレートを、穏やかに混合し、裏返し、そして35℃で18-24時間インキュベーションした。
【００３６】
[通常の口内フローラの同定]
「通常の口内フローラ」からは微生物の混合物が得られる。健康的な口腔から採取されたスワブを検査することにより、最も普通の口のフローラの同定が促進された。実験を口の培養物で実施して、ＬＦおよびＧＭＰの抗微生物効果を決定した。
【００３７】
口内培養物（Oral cultures）を、ヒツジの血液を添加したBHI寒天上で、35℃、5%CO2で24時間成長させた。微生物を１０-6の係数で希釈し、そしてこの希釈物１ｍＬをBHI寒天にプレート注入した。これらのプレートをもう一回２４時間インキュベーションした。ここで、分離したコロニーを、採取し、そして純粋培養として成長させるためにBHI/血液プレート上でストリークした。プレートをストリークすることにより、混合培養サンプルにおいて微生物種の分離した成長が生じる。一度分離されれば、純粋培養を種同定のために検査できる。分離したコロニーを、グラム染色してグラム陽性およびグラム陰性の細胞を区別した。グラム染色は、鑑別染色である（２つの塩基性染料の適用の間に脱色工程が実施される）。次ぎの工程は、酵素カタラーゼを産生する生物体を同定するためのカタラーゼ検査であった。それは、カタラーゼ陽性のMicrococcaceaeおよびStaphylococciのメンバーを、カタラーゼ陰性のStreptococcaceaeから区別するために使用された。過酸化水素を細菌に添加し、そして反応（泡の形成の形跡）を観察した。
【００３８】
最終同定（last identification）の技術は、API  20  Strepキット(bioMerieux Vitek, Inc. Mo.)の使用を必要とする。API  20  Strepは、２０の生化学検査を組み合わせた標準的方法である。それにより、大抵のStreptococciの種同定が可能となる。分析プロファイル指標（Analytical Profile Index）を用いて、反応のパターンが、数でコードされ、そしてその最終の数値的プロファイルにより同定される。
【００３９】
口内培養物において、３つの分離したコロニーが、スワブした口腔から採取され、同定のため検査された。グラム染色により、全てのコロニーがグラム陽性球菌であることが示された。次の工程ではカタラーゼ検査が要求され、これはネガティブ反応を有していた。ネガティブなカタラーゼ反応は、streptococcus種を確認する反応である。API  20  Strep検査を３つ全ての純粋培養について実施して各種を同定した。数はAPI  20検査の結果である。細菌の種を分析プロファイル指標を用いて決定した。結果の数値は次のとおりである：
【００４０】
純粋培養＃１： 50-52-671=Streptococcus salivaris
【００４１】
純粋培養＃２： 50-70-771=Streptococcus salivaris
【００４２】
純粋培養＃３： 50-70-671=Streptococcus salivaris
【００４３】
＜結  果＞
[I．ＬＦおよびＧＭＰのMIBCの同定]
Ａ．  ＬＦの最小阻害濃度（MIBC)
コントロール（細菌株を播種し、ＬＦを含有しない１つのブロスチュウブ）を使用して、ＬＦの有効性を試験した。ＬＦの特定量（50、100、250、500、1,000ppmおよび3000ppm）を含有している各試験管を希釈し、そしてプレートに注いだ。プレートを35℃、5%CO2で２４時間インキュベートした後、細菌の回復カウント（recovery count）をとり、そして結果をコントロールと比較した。A. haemophilus、S. mutans、S. pyrogenesおよび口内培養物を35℃で検査した。Pseudomonas aeruginosaを、室温および35℃の双方で5%CO2で検査した。
【００４４】
この検査はP. aeruginosaが厳密には口内の病原体ではないので実施した。この細菌は様々な条件の環境に通常見出される。その細菌は前記環境下で見つけることが可能であり、口内への摂取によって口腔の炎症の原因となりえる。大抵の通常の口内細菌は、口でのみ認められ、外的な要因（outside factors）から持ち込まれることはない。従って、P. aeruginosaは、両方の温度設定において脅威（threat）である。表１は、最少阻害濃度（ＭＩＢＣ）を記載しており、細菌株のそれぞれに関して35℃で実施した。S. pyogenesおよび口内培養物は、任意の試験濃度のＬＦにより影響されなかった。他の濃度はログ減少を示さなかった、というのも35℃で２４時間インキュベートされた際、その数値がコントロールに近かったからである。
【００４５】
【表１】
2004529950.tif 000006
【００４６】
【表２】
2004529950.tif 000007
【００４７】
Ｂ．  ＧＭＰのＭＩＢＣ
同様の濃度は、ＧＭＰに関して作出された（ＬＦに関して調製されたように）。A. haemophilusおよびS. mutansは、より低いppmレベル（500ppm）でＧＭＰにより影響された。S. pyogenesおよび口内フローラは、ＧＭＰ単独の存在下で成長変化を示さなかった、それ故、効果的な濃度は見つからなかった（表３および４を参照）。Pseudomonasを23℃および35℃の双方で検査したところ、何れもログ減少を示さなかった。
【００４８】
【表３】
2004529950.tif 000008
【００４９】
【表４】
2004529950.tif 000009
【００５０】
[ＩＩ.  ＭＩＢＣに影響する因子]
Ａ．  シアル酸
ＧＭＰが低い濃度でS. mutansおよびA. haemophilusの双方に関して非常に効果的だったので、純粋なシアル酸（Ｎ‐アセチルノイラミン酸）を検査して、その単独が微生物阻害の有効性を発揮させる要因であるかを調べた。ＧＭＰにおけるシアル酸含量は、約6.5%（DMV International Nutritionals, 1999）である。従って、1,000ppmの設定濃度を、３つの口内病原体（S. murans、A. haemophilus、およびP. aeruginosa）に適用した。これはシアル酸の通常の量よりも顕著に高いものであった。この高濃度での結果が作用するものであれば、次により低いシアル酸濃度で更に検査する。シアル酸、それ自身は、この濃度で細菌成長を阻害しなかった（表５を参照）。P. aeruginosaの場合、シアル酸は細菌成長の量を１ログ増加させた。従って、ＧＭＰ’sおよびＬＦ’sの化学的組成物は、シアル酸単独では不可能な細菌の阻害に作用するものである。
【００５１】
【表５】
2004529950.tif 000010
【００５２】
Ｂ.  低ｐＨ（4.36）での重炭酸ナトリウム
この検査は、重炭酸ナトリウムが細菌成長の減少における影響因子ではないことを提示した。３つの検査した細菌（S. mutans、A. haemophilus、およびP. aeruginosa）１ｍｌをBHIブロスへ別々に播種し、そして１ｍｌの重炭酸ナトリウム（0.1N  HClを用いてpH4.36に調整した）をも添加した。低ｐＨは細菌集団に１ログ減少を生じさせてS. mutansに若干影響するが、他の２つの細菌が影響されないことをプレート注入カウントは示した（表６を参照）。ＧＭＰおよびＬＦの場合、それらは微生物成長の減少に寄与する。低ｐＨにより達成された酸条件が、それ自体では細菌集団を減少できないことを、この検査は証明した。口内フローラは、この実験では検査されなかった。
【００５３】
【表６】
2004529950.tif 000011
【００５４】
[ＩＩＩ.  ＬＦおよびＧＭＰの混合物のＭＩＢＣの同定]
本実験の目的は、ＬＦおよびＧＭＰのＭＩＢＣを組み合わせて、微生物成長のより大きなログ減少が観察されるかどうかを評価することであった。S. mutansおよびA. haemophilusの成長が、3,000ppm  ＬＦで１ログ、500ppm  ＧＭＰで１ログ減少したので、ＬＦおよびＧＭＰはこれらの濃度で検査された（共にこれらの株および口内培養物を用いて）。これらの３つの細菌培養物（A. haemophilus、S. mutansおよび口内フローラ）に対して、ＬＦおよびＧＭＰ双方のＭＩＢＣが添加された。理論的には、最終効果は、少なくとも２ログ減少を示すべきであった。驚くことに、S. mutansのみが１ログ減少を示した。他は、非常に小さな成長減少を示した（表７を参照）。
【００５５】
【表７】
2004529950.tif 000012
【００５６】
[ＩＶ.  ＬＦおよびＧＭＰ濃度の変化]
濃度変化を検査するため、ＧＭＰ濃度を一定に維持し且つ異なるＬＦ濃度を用いて、それを決定した。S. mutansおよびA. haemophilusに関して記録された効果の認められた最低濃度は、500ppm  ＧＭＰであった。コスト効率は問題なので、500ppm  ＧＭＰを一定値として使用し、ＬＦ濃度を変化させて検査した。ＬＦの変化濃度は次ぎのとおり、即ち：0、25、50、75、100、200、250、400、500、750、1000、2000および3000ppmであった。S. mutansは、１ログ減少を50ppm  ＬＦ＋500ppm  ＧＭＰの濃度の組み合わせで示した。A. haemophilusは、３ログ減少を500ppm  ＬＦ＋500ppm  ＧＭＰで示した（図１を参照）。A. haeznophilusの更なる検査（１：１比率での）は、低濃度で効果的であると証明されなかった（図２を参照）。この検査は、特定の比率よりも正確な濃度が要求されることを示した。
【００５７】
S. pyogenesおよび口内細菌を検査することはより困難であった、なぜならそれらはＬＦおよびＧＭＰの組み合わせに対してより耐性であると思われたからである。S. mutansおよびA. haemophilusと同一の組み合わせを使用した際、それらは成長減少を示さなかった。
【００５８】
P. aeruginosaを室温（23℃）および35℃で5%CO2で検査した。Pseudomonasは環境的生物体（environmental organism）であるので、両方の温度で脅威（threat）である。各設定で結果は異なっていた。P. aeruginosaはより高い温度で豊富に成長したが、この細菌に対して作用するＬＦおよびＧＭＰの組み合わせが設定内に存在した。作用する前記組み合わせは、750  ＬＦ＋500  ＧＭＰ、1,000  ＬＦ＋500  ＧＭＰ、および2,000  ＬＦ＋500  ＧＭＰである。室温で、効果的な組み合わせ濃度は、即ち：50  ＬＦ＋500  ＧＭＰおよび1,000  ＬＦ＋500  ＧＭＰであった（図３Ａを参照）。
【００５９】
変化させたＧＭＰ濃度（ＬＦ濃度を一定に維持して）が、P. aeruginosa成長に効果があるかを決定するための検査をも実施した。室温および35℃双方で検査することで、２ログ減少が室温の500  ＬＦ＋50  ＧＭＰの組み合わせ濃度で観察された（図３Ｂを参照）。この組み合わせを次に４つ全ての細菌において検査し、S. pyogenes、口内フローラ、およびP. aeruginosaに関して１ログ減少が観察された（図４を参照）。
【００６０】
[ＶＩ.  検査した全ての細菌に関する効果的な組み合わせ]
最終結果として、全ての細菌株において微生物成長を効果的に阻害する、ＬＦ/ＧＭＰの１設定濃度（一緒又は別々の何れかで）は存在しなかった。全ての細菌は、試験した濃度の少なくとも１つに応答して１ログ減少を示した（表８を参照）。最大ログ減少が、A. haemophilusおよびP. aeruginosaについて35℃、5%CO2で認められた。500ppm  ＬＦ＋500ppm  ＧＭＰの濃度で、A. haemophilusは、2.5から３ログ降下し、そして50  ＬＦ＋500  ＧＭＰでそれは1.5ログ降下した。Pseudornonasは35℃において2,000  ＬＦ＋500  ＧＭＰで２ログ降下した。室温（23℃）で、Pseudomonasは、500  ＬＦ＋50  ＧＭＰ濃度で１から1.5ログ降下した（表８および図５を参照）。
【００６１】
【表８】
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【００６２】
この研究によって、ＬＦおよびＧＭＰが何らかの抗微生物的能力を具備するとの以前の研究結果が確認された。それらは完全な阻害剤（total inhibitors）ではないが、それらはある種の生物体の増殖する能力の減少化に有効性を示している。驚くことに、ある濃度の組み合わせにおいて非常に良好な相乗効果が観察された。例えば、500/500ppm  ＬＦ/ＧＭＰの組み合わせは、A. haemophilusに対して高度に効果的であった。
【００６３】
上記の記載中に参照された全ての文献は、参照によってその全体が本明細書中に援用される。
【００６４】
当業者は、この開示を参照することによって、本発明の形態および詳細に関する様々な変更が、本発明の本来の範囲から逸脱することなく成されることを理解する。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、ＬＦ変化濃度およびＧＭＰ固定濃度の存在下、35℃、5% CO2で２４時間後のA. haemophilus および S. mutansのログ成長を示す図である。
【図２】図２は、ＬＦおよびＧＭＰの様々な１：１比率の存在下、35℃、5% CO2で２４時間後のA. haemophilusのログ成長を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂは、23℃および35℃、5% CO2で２４時間後のP. aeruginosaのログ成長を示す図である。図３Ａは様々な濃度のＬＦと500 ppm ＧＭＰとの存在下での図である。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは、23℃および35℃、5% CO2で２４時間後のP. aeruginosaのログ成長を示す図である。図３Ｂは様々な濃度のＧＭＰと500 ppm ＬＦとの存在下での図である。
【図４】図４は、35℃、5% CO2で２４時間後のA. haemophilus、S. mutans、S. pyrogens、および口内フローラのログ成長を並びに室温でのP. aeruginosaのログ成長を示す図である。
【図５】図５は、全ての試験した細菌に関するログ減少の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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