(57)【要約】  骨粗鬆症におけるヒトBMP2核酸の役割が開示される。また、骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性の診断、臨床経過の予想、および処置のための、BMP2核酸の多型を使用する方法が、単独で、または他のアッセイと組み合わせて開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1のヒトBMP2遺伝子における少なくとも一つの多型を検出する工程を含み、ここでAL035668のヌクレオチド位置122247における「G」の存在；AL035668の位置118920における「G」対立遺伝子の存在；AL035668の位置167584における「T」対立遺伝子の存在；AL035668の位置138476における「G」対立遺伝子の存在；AL035668の位置167584における「T」対立遺伝子の存在；TSC0428253における「T」対立遺伝子の存在；またはTSC0293456の「G」対立遺伝子の存在が、AL035668のヌクレオチド位置122247における「T」；AL035668の位置118920における「A」対立遺伝子；AL035668の位置167584における「C」対立遺伝子；AL035668の位置138476における「A」対立遺伝子；AL035668の位置167584における「C」対立遺伝子；TSC0428253における「C」対立遺伝子；またはTSC0293456の「A」対立遺伝子の存在を有する個体と比較して、骨粗鬆症に対する罹患性の指標となる、個体における骨粗鬆症に対する罹患性を診断する方法。
【請求項２】
血液、血清、細胞および組織からなる群から選択される供給源由来の試料中の多型が検出される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
配列番号1のヒトBMP2遺伝子における少なくとも1つの多型を検出する工程を含み、ここで該多型が、AL035668の位置122247におけるTからG；AL035668の位置118920におけるAからG；AL035668の位置167584におけるCからT；AL035668の位置138476におけるAからG；AL035668の位置167584におけるCからT；TSC0428253におけるCからT；TSC0293456におけるAからGおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、個体における骨粗鬆症に対する罹患性を診断する方法。
【請求項４】
血液、血清、細胞および組織からなる群から選択される供給源由来の試料中の多型が検出される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
配列番号1を有し、AL035668の位置122247におけるTからG；AL035668の位置121366におけるCからT；AL035668の位置118920におけるAからG；AL035668の位置167584におけるCからT；AL035668の位置138476におけるAからGおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、1つ以上の核酸変化を有する核酸を含む、単離された核酸分子。
【請求項６】
アミノ酸位置37におけるアラニン、アミノ酸位置94におけるセリン、アミノ酸位置189におけるセリン、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項７】
骨粗鬆症に対する罹患性の指標である請求項６記載のポリペプチドを検出する工程を含む、骨粗鬆症に対する罹患性を診断する方法。
【請求項８】
位置37、位置94、位置1891およびそれらの組み合わせからなる群から選択される位置におけるアミノ酸の決定が、試料を、参照アミノ酸または変異体アミノ酸のいずれかに特異的な抗体と接触させる工程を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
請求項６記載のポリペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項１０】
請求項６記載の単離されたポリペプチドを、治療上有効な量個体に投与することを含む、個体における骨粗鬆症の治療方法。
【請求項１１】
a)アミノ酸位置37におけるセリン、アミノ酸位置37におけるアラニン、アミノ酸位置94におけるアラニン、アミノ酸位置94におけるセリン、アミノ酸位置189におけるアルギニン、アミノ酸位置189におけるセリン、またはそれらの組み合わせを含むBMP2タンパク質に特異的な抗体からなる群から選択される、少なくとも1つの抗体；および
b)参照BMP2タンパク質試料
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、2003年1月16日に提出された米国特許出願番号10／346,723の継続出願であり、上記出願に対して優先権を主張する。上記出願は、2001年9月13日に提出された米国特許出願番号09／952,360の一部継続出願であり、この出願もまた、国際出願番号PCT／IB01／01667の一部継続出願であり、上記国際出願に対して優先権を主張する。上記国際出願は米国を指定し、2001年9月12日に提出され、英語で公開された。上記国際出願は、2000年9月14日に提出された米国特許出願番号09／661,887の一部継続出願である。上記出願の教示全体が、引用により本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
発明の背景
骨粗鬆症は、骨密度（BMD）の低下によって定義されるように、骨量が少ないことおよび骨組織の劣化を特徴とする衰弱性疾患である。直面する微小構造の劣化の直接の結果は、骨折しやすくなること、および骨格が脆くなりやすくなることであり、これらは、最終的には、世界的な規模での高い死亡率、高い罹患率、および高額な医療費を生じる。なかでも、更年期以降の女性は、エストロゲンの不足、およびこれに対応する月経の間の骨量の減少が、骨粗鬆症性の骨折の可能性、および骨折の可能性がある部位の数の両方を増大させるので、最もリスクが高い。さらに、高齢の女性だけが人口統計学上のリスクが高いグループではない。栄養失調、無月経、または運動不足の若い女性は、若年齢で骨量の増大を阻害するリスクがある。さらに、アンドロゲンは思春期の間に骨量を増やす役割を果たしており、骨が十分に発達しなかった高齢者または性腺機能低下症の男性は、骨粗鬆症のリスクに曝される。
【０００３】
この疾患の治療法を見出すために必要なものは、骨粗鬆症を引き起こす要因が多く存在するという事実から複雑である。栄養分（特に、カルシウム、ビタミンD、およびビタミンKの摂取）、ホルモン濃度、年齢、性別、人種、体重、活動レベル、および遺伝的要素の全てが、個体間の骨密度に見られる相違の原因となる。現在、骨粗鬆症を処置するための承認されている薬剤は、骨の再吸収の阻害因子として作用し、これには、ホルモン補充療法（HRT）、選択的なエストロゲン受容体調節因子、カルシトニン、およびビスホスホネート（biophosphonate）のような方法が挙げられる。しかし、これらの処置は個々にリスクを低下させて一貫した結果を伴うものではなく、いくつかの治療薬が同時に投与された場合にBMDが改善され、他のものは、併用されても改善を示さないか、またはさらに効力を低下させる。明らかに、平均寿命が延び、骨粗鬆症に関する健康上および経済上の懸念が大きくなっているので、この晩期発症型疾患のリスクを解消する方法が非常に望まれている。この疾患またはこの疾患に対する素因の早期の診断が望まれている。
【０００４】
発明の要旨
本明細書中に記載されるように、ヒトの骨形成タンパク質2（BMP2）の核酸配列における多型が、多数の骨粗鬆症の表現型と関係していることが、ヒトの連関分析を通じて明らかにされている。具体的には、BMP2遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列内の1種以上の単一ヌクレオチド多型が、骨粗鬆症と関係していることが明らかにされている。したがって、本発明は、表2に示される少なくとも1つの変化したヌクレオチドを有している配列番号1のBMP2核酸を含む単離された核酸分子、およびそれによってコードされる遺伝子産物（本明細書中では、「変異体BMP2核酸または遺伝子」あるいは「変異体BMP2遺伝子産物」と呼ばれる）に関する。
【０００５】
多数の多型が、表2に報告されるように、BMP2核酸において観察されている。したがって、具体的な態様では、本発明の単離された核酸分子は、これらのヌクレオチド多型のうちの1つ、またはそれらの組み合わせを有することができる。これらの多型は、骨粗鬆症の存在、骨粗鬆症が存在しないこと、または骨粗鬆症の重篤度に寄与する、BMP2核酸における他の多型のグループの一部であり得る。ある態様では、核酸分子は、少なくともヌクレオチド3747位に多型を含み、遺伝子産物は、ヌクレオチド3747位に多型（アミノ酸変化はセリンからアラニン）を含む。
【０００６】
本発明により、さらに、試料中にBMP2全体またはBMP2の一部を含む核酸分子が存在するかどうかについて試料をアッセイするための方法が提供される。この方法には、上記試料を、BMP2ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号1または配列番号1の相補物であり、これは、表2に示される少なくとも1つの多型を含む）；表2に示される少なくとも1つの多型を含む配列番号2をコードするヌクレオチド配列、あるいはそれらの断片または誘導体を含む第2の核酸分子と、選択的ハイブリダイゼーションに適切な条件下で接触させる工程が含まれる。ある態様では、核酸分子は、少なくともヌクレオチド3747位に多型を含み、遺伝子産物は、ヌクレオチド3747位に多型（アミノ酸変化はセリンからアラニン）を含む。本発明により、さらに、BMP2ポリペプチド、またはその断片もしくは誘導体の発現レベルについて試料をアッセイするための方法が提供される。この方法には、BMP2ポリペプチド、その断片または誘導体の発現レベルを（直接または間接的に）検出する工程が含まれる。
【０００７】
本発明はまた、調節配列に動作可能に連結された本発明の単離された核酸分子を含むベクター、さらには、このベクターを含む組み換え宿主細胞にも関する。本発明により、また、本明細書中に記載される単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド（BMP2ポリペプチド）を調製するための方法も提供される。この方法には、本発明の組み換え宿主細胞を、上記核酸分子の発現に適切な条件下で培養する工程が含まれる。
【０００８】
本発明により、さらに、本発明の単離された核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチド（例えば、BMP2ポリペプチド）、さらにはその断片または誘導体が提供される。特定の態様では、ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列を含み、表2に示される少なくとも1つの多型を含む。別の態様では、ポリペプチドは、少なくともヌクレオチド3747位の多型を含み、これによりセリンからアラニンへのアミノ酸変化が生じる。本発明はまた、配列番号2のアミノ酸配列に対する同一性が約90％より高いアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに関し、これは、本明細書中に記載される少なくとも1つの多型を含む。別の態様では、アミノ酸配列は配列番号2のアミノ酸配列と約95％同一である。
【０００９】
本発明はまた、本発明のポリペプチドに選択的に結合する抗体またはその抗原結合断片、さらには、試料中に本発明の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチドの存在をアッセイするための方法に関する。この方法には、上記試料を、コードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体と接触させる工程が含まれる。
【００１０】
本発明は、さらに、骨粗鬆症または骨粗鬆症の素因の診断方法に関する。個体の骨粗鬆症の素因の診断方法には、BMP2中の突然変異の存在を検出する工程、さらには、BMP2ポリペプチドの種々のスプライシング変異体の存在のような、BMP2ポリペプチドの発現の変化を検出する工程が含まれる。発現の変化は、定量的、定性的であり得、また、定量的かつ定性的でもあり得る。本発明の方法は、単独で、または他のアッセイ、例えば、骨の代謝マーカーのアッセイ（例えば、骨スキャン）と組み合わせて、疾患の発症時または発症前に骨粗鬆症を正確に診断でき、したがって、骨粗鬆症の衰弱作用を低下させるかまたは最少にすることができる。
【００１１】
本発明は、さらに、1つ以上のBMP2ポリペプチドの活性または発現を変化させる（例えば、増大させるかまたは阻害する）因子を同定するためのアッセイに関する。例えば、BMP2ポリペプチドまたはその断片もしくは誘導体を含む、細胞、細胞画分、あるいは溶液が、試験される因子と接触させられ得、BMP2ポリペプチドの発現または活性のレベルが評価され得る。1つ以上のBMP2ポリペプチドの活性または発現が、同時に評価され得る（例えば、細胞、細胞画分、または溶液には、種々のスプライシング変異体のような1つ以上のタイプのBMP2ポリペプチドが含まれ得、種々のポリペプチドまたはスプライシング変異体のレベルが評価され得る）。
【００１２】
別の態様では、本発明は、1つ以上のBMP2ポリペプチドと相互作用するポリペプチドを同定するためのアッセイに関する。例えば、酵母のツーハイブリッドシステムでは、DNA結合ドメインと、さらにBMP2ポリペプチド、スプライシング変異体、またはその断片もしくは誘導体をコードする核酸を含む第1のベクターが使用され、転写活性化ドメインをコードする核酸と、さらにBMP2ポリペプチドと相互作用できる可能性があるポリペプチド、スプライシング変異体、またはその断片もしくは誘導体（例えば、BMP2ポリペプチド結合因子または受容体）をコードする核酸を含む第2のベクターが使用される。第1のベクターと第2のベクターの両方を含む酵母の適切な条件下でのインキュベーションにより、BMP2ポリペプチドまたはその断片もしくは誘導体と相互作用し、したがって、BMP2ポリペプチドの活性または発現を変化させる因子であり得るポリペプチドが同定される。
【００１３】
BMP2ポリペプチドの発現または活性を増大させるかまたは阻害する因子もまた、本発明に含まれる。BMP2および／またはポリペプチドを含む細胞、あるいはBMP2ポリペプチドを、BMP2またはポリペプチドの発現または活性を増大させるかまたは阻害する因子と接触させることにより、BMP2ポリペプチドの発現または活性を変化させる（増大させるか、または阻害する）方法も同様に、本発明に含まれる。
【００１４】
さらに、本発明は、本発明の核酸、本発明のポリペプチド、および／またはBMP2ポリペプチドの活性を変化させる因子を含む医薬組成物に関する。本発明はさらに、本発明の核酸、本発明のポリペプチド、BMP2ポリペプチドの活性を変化させる因子、あるいは、上記核酸、上記ポリペプチド、および／またはBMP2ポリペプチドの活性を変化させる上記因子を含む組成物のようなBMP2治療薬を投与することにより、骨粗鬆症を処置する方法に関する。別の態様では、BMP2治療薬は、骨粗鬆症を有していない健常な個体に由来するヒトBMP2核酸またはその遺伝子産物である。
【００１５】
さらなる態様では、本発明は、個体の骨粗鬆症に対する罹患性を診断する方法に関する。この方法には、配列番号1のヒトBMP2遺伝子中の多型を検出する工程が含まれる。ここでは、AL035668のヌクレオチド122247位の「G」の存在；AL035668の118920位の「G」対立遺伝子の存在；AL035668の167584位の「T」対立遺伝子の存在；AL035668の138476位の「G」対立遺伝子の存在；AL035668の167584位の「T」対立遺伝子の存在；TSC0428253の「T」対立遺伝子の存在；または、TSC0293456の「G」対立遺伝子の存在が、AL035668のヌクレオチド122247位に「T」；AL035668の118920位に「A」対立遺伝子；AL035668の167584位に「C」対立遺伝子；AL035668の138476位に「A」対立遺伝子；AL035668の167584位に「C」対立遺伝子；TSC0428253に「C」対立遺伝子；または、TSC0293456に「A」対立遺伝子の存在を有している個体と比較して、骨粗鬆症に対する罹患性の指標である。特定の態様では、多型は、血液、血清、細胞、および組織からなる群より選択される供給源に由来する試料において検出される。
【００１６】
別の態様では、本発明は、個体の骨粗鬆症に対する罹患性を診断する方法に関する。この方法には、配列番号1のヒトBMP2遺伝子中の多型を検出する工程が含まれる。ここでは、多型は、AL035668の122247位のTからG；AL035668の118920位のAからG；AL035668の167584位のCからT；AL035668の138476位のAからG；AL035668の167584位のCからT；TSC0428253のCからT；TSC0293456のAからG、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される。特定の態様では、多型は、血液、血清、細胞、および組織からなる群より選択される供給源に由来する試料において検出される。
【００１７】
別の態様では、本発明は、AL035668の122247位のTからG；AL035668の121366位のCからT；AL035668の118920位のAからG；AL035668の167584位のCからT；AL035668の138476位のAからG；およびそれらの組み合わせからなる群より選択される1つ以上の核酸変化を含む、配列番号1を有している核酸を含む単離された核酸分子に関する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、アミノ酸37位のアラニン、アミノ酸94位のセリン、アミノ酸189位のセリン、またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに関する。
【００１９】
さらに別の態様では、本発明は、骨粗鬆症に対する罹患性を診断する方法に関する。この方法には、骨粗鬆症に対する罹患性の指標である本明細書中に記載されるポリペプチドを検出する工程が含まれる。特定の態様では、37位、94位、1891位、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される位置のアミノ酸の決定には、試料を、対照アミノ酸または変異体アミノ酸のいずれかに特異的な抗体と接触させる工程が含まれる。別の態様では、本発明は、本明細書中に記載されるポリペプチドを含む医薬組成物に関する。別の態様では、本発明は、個体の骨粗鬆症を処置する方法に関し、この方法には、個体に対して、本明細書中に記載される単離されたポリペプチドを治療有効量で投与することが含まれる。
【００２０】
別の態様では、本発明は、a）アミノ酸37位のセリン、アミノ酸37位のアラニン、アミノ酸94位のアラニン、アミノ酸94位のセリン、アミノ酸189位のアルギニン、アミノ酸189位のセリン、またはそれらの組み合わせを含む、BMP2タンパク質に特異的な抗体からなる群より選択される少なくとも1つの抗体；およびb）対照であるBMP2タンパク質試料を含むキットに関する。
【００２１】
発明の詳細な説明
本明細書中に記載されるように、出願人らにより、種々の形態の骨粗鬆症を有している患者についてゲノム広域スキャンが完了し、骨粗鬆症と関連付けられた第20染色体上の1つの領域が同定された。今日までには、染色体のこの領域に対して何らかの関係を示しているヒトの骨粗鬆症の連関分析は、知られていない。行われた連関分析に基づいて、出願人らにより、BMP2と骨粗鬆症との間の直接的な関係が発見された。正常な個体に由来するBMP2核酸は既知であるが、BMP2と骨粗鬆症との間の関連を直接調べている研究は存在していない。さらに、骨粗鬆症と関係していることが報告されている変異体は存在していない。連関分析は、種々の骨粗鬆症の表現型、すなわち、股関節、背骨、複合型、および複合型の重症の表現型を有している患者（例えば、脊椎の圧迫骨折、股関節骨折、他の骨粗鬆症に関係している負荷の少ない骨折を有している患者）を網羅するゲノム広域スキャンに基づく。連関分析で得られたデータにより、第20染色体上の1つの領域、具体的には、BMP2遺伝子が同定された。変異体BMP2核酸は、以前には報告されたことのないヌクレオチド変化を有しており、これは、患者の集団において観察された（多型性の変化については、表2、3、および4を参照のこと）。
【００２２】
全てのヌクレオチド位置は、配列番号1に対して、またはGenBank登録番号AL035668に対して示される。ヌクレオチド3747位の多型は、対照の集団よりも骨粗鬆症の試験集団において統計学的により頻繁に現れる。
【００２３】
本発明の核酸
BMP2ヌクレオチド、その一部、および変異体
したがって、本発明は、少なくとも1つのヌクレオチド変化を有しており、骨粗鬆症の指標と関係がある、ヒトBMP2核酸を含む単離された核酸分子に関する。用語「変異体BMP2」は、本明細書中で使用される場合は、変化しているヌクレオチドを少なくとも1つ有している、第20染色体中の単離された核酸分子をいう。本発明のBMP2の変異体は、多数の骨粗鬆症の表現型に対する罹患性と関係している。本発明には、変異体BMP2ポリペプチド（例えば、配列番号2を有しているポリペプチド）をコードする断片を含む、変化を含む単離された核酸分子の一部または断片（例えば、cDNA、遺伝子、またはその断片）が含まれる。ある態様では、単離された核酸分子には、少なくともヌクレオチド3747位の多型を含むBMP2遺伝子の表2、3、および4に示される多型のいずれか1つまたはそれらの組み合わせからなる群より選択される多型が含まれる。治療目的のための特定の態様では、例えば、核酸は、健常な個体のヒトBMP2核酸を示す、配列番号1の配列を含む。
【００２４】
本発明の単離された核酸分子は、RNA（例えば、mRNA）であり得、また、cDNAおよびゲノムDNAのようなDNAでもあり得る。DNA分子は、二本鎖または一本鎖であり得；一本鎖のRNAまたはDNAは、コード鎖、すなわち「センス鎖」、または非コード鎖、すなわち、「アンチセンス」鎖のいずれかであり得る。核酸分子は、遺伝子のコード配列全体またはその一部を含むことができ、イントロンおよび非コード3'および5'配列（例えば、調節配列および他の隣接配列を含む）のような非コード配列をさらに含むこともできる。さらに、核酸分子は、マーカー配列、親和性タグ、または他の遺伝子もしくは配列（例えば、ポリペプチドの単離または精製を助けるポリペプチドをコードする配列）に融合させられ得る。このような配列として、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）融合タンパク質をコードする配列、およびインフルエンザに由来するヘマグルチニンA（HA）ポリペプチドマーカーをコードする配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
「単離された」核酸分子は、本明細書中で使用される場合は、その遺伝子またはヌクレオチド配列に通常は隣接している（ゲノム配列中で）核酸から分離され、そして／または他の転写された配列（例えば、RNAライブラリーにおいて）から完全にもしくは部分的に精製されている核酸分子である。例えば、本発明の単離された核酸は、その天然に存在している複雑な細胞環境、または組み換え技術によって生産される場合には培養培地、あるいは、化学合成される場合には化学的前駆体もしくは他の化合物に関して実質的に単離され得る。いくつかの例では、単離された材料は、組成物（例えば、他の物質を含む粗抽出物）、緩衝液システム、または試薬混合物の一部を形成する。他の状況では、材料は、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）またはHPLCのようなカラムクロマトグラフィーによって測定されるように、本質的に均質であるように精製され得る。本発明の単離された核酸分子は、存在する全ての高分子種のうちの少なくとも約50、80、または90％（モル基準で）を占め得る。ゲノムDNAに関して、用語「単離された」はまた、ゲノムDNAが天然において会合している染色体から分離されている核酸分子をも意味し得る。例えば、単離された核酸分子は、核酸分子が由来する細胞のゲノムDNAにおいて核酸分子に隣接している、約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、または0.1kb未満のヌクレオチドを含み得る。
【００２６】
核酸分子は、他のコード配列または調節配列に融合させられ得、なおも単離されているとみなされ得る。したがって、ベクター中に含まれる組み換えDNAは、本明細書中で使用される「単離された」の定義に含まれる。また、単離された核酸分子には、異種宿主細胞または異種生物中の組み換えDNA分子、さらには、溶液中の部分的または実質的に精製されたDNA分子も含まれる。「単離された」核酸分子には、また、本発明のDNA分子のインビボおよびインビトロRNA転写物も含まれる。単離された核酸分子またはヌクレオチド配列には、化学的に、または組み換え手段によって合成される、核酸分子またはヌクレオチド配列が含まれ得る。したがって、ベクター中に含まれる組み換えDNAは、本明細書中で使用される「単離された」の定義に含まれる。このような単離されたヌクレオチド配列は、例えば、コードされるポリペプチドの製造において、（例えば、他の哺乳動物種から）相同配列を単離するため、（例えば、染色体を用いるインサイチュハイブリダイゼーションによる）遺伝子マッピングのため、または組織（例えば、ヒト組織）中での遺伝子の発現を、例えば、ノーザンブロット分析もしくは他のハイブリダイゼーション技術によって検出するためのプローブとして、有用である。
【００２７】
本発明はまた、天然では必ずしも見出されないが、それにもかかわらず、BMP2ポリペプチド（例えば、配列番号2のアミノ酸配列を有しており、表2、3、および4に示される少なくとも1つの多型を含むポリペプチド）をコードする核酸分子に関する。したがって、例えば、天然に存在しているヌクレオチド配列とは異なるが、遺伝子コードの縮重により、本発明のBMP2ポリペプチドをコードする配列を含むDNA分子もまた、本発明の対象である。本発明には、また、本発明のヌクレオチド配列の変異体（例えば、BMP2ポリペプチドの一部、類似体または誘導体をコードするもの）も含まれる。このような変異体は、例えば、対立遺伝子変異体の場合には、天然に存在し得、また、例えば、種々の突然変異誘発物質および突然変異誘発性のプロセスによって誘導されるものの場合には、天然には存在し得ない。意図されるバリエーションには、1つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、および置換が含まれれるが、これらに限定されない。これらにより、付加および欠失を含む、保存的または非保存的アミノ酸変化が生じ得る。ヌクレオチド（および／または得られるアミノ酸）変化は、サイレントでも、また、保存的でもあり得る。すなわち、これらは、必ずしもBMP2ポリペプチドの特性または活性を変化させる必要はない。ある態様では、ヌクレオチド配列は、1つ以上の多型性マイクロサテライトマーカーを含む断片である。別の態様では、ヌクレオチド配列は、BMP2遺伝子中に1つ以上の単一ヌクレオチド多型を含む断片である。
【００２８】
本発明の核酸分子の他の変化としては、例えば、標識、メチル化、ヌクレオチド間修飾、例えば、電荷を有さない結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート）、電荷を有する結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート）、ペンダント部分（例えば、ポリペプチド）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレン）、キレート化剤、アルキル化剤、ならびに修飾された結合（例えば、αアノマー核酸）が挙げられ得る。水素結合および他の化学的相互作用を通じて、設計された配列に結合する能力に関して核酸分子を模倣する合成分子も含まれる。このような分子には、例えば、ペプチド結合で分子の骨格中のリン酸結合が置き換えられている分子が含まれる。
【００２９】
本発明はまた、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件（例えば、選択的ハイブリダイゼーション用の条件）下で、本明細書中に記載されるヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸分子（例えば、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズし、任意に、ポリペプチドの活性を有する核酸分子）に関する。ある態様では、本発明には、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件および洗浄条件（例えば、選択的ハイブリダイゼーション用の条件）下で、表2、3、および4に示される少なくとも1つの多型を含む配列番号1から選択されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列またはその相補物、あるいは、表2、3、および4に示される少なくとも1つの多型を含む配列番号2のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対してハイブリダイズする、本明細書中に記載される変異体が含まれる。ある態様では、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション下でハイブリダイズする変異体はBMP2の活性を有する。
【００３０】
そのような核酸分子は、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションまたは配列特異的ハイブリダイゼーション（例えば、高ストリンジェンシーの条件下での）によって検出、および／または単離され得る。「特異的ハイブリダイゼーション」は、本明細書中で使用される場合は、第1の核酸が第2の核酸以外のいずれの核酸に対してもハイブリダイズしない様式（例えば、第1の核酸が、ハイブリダイゼーションが行われる試料中の他の全ての核酸に対してよりも第2の核酸に対して高い相補性を有する場合）で、第1の核酸が第2の核酸にハイブリダイズする能力をいう。ハイブリダイゼーションについての「ストリンジェンシーの条件」は、特定の核酸の第2の核酸に対するハイブリダイゼーションを可能にするインキュベーション条件および洗浄条件、例えば、温度および緩衝液濃度の条件について言及する専門用語である。第1の核酸は、第2の核酸に対して完全に（すなわち、100％）相補的であっても、また、第1の核酸と第2の核酸は、完全には満たないある程度の相補性（例えば、70％、75％、85％、90％、95％）を共有していてもよい。例えば、特定の高ストリンジェンシーの条件は、完全に相補的な核酸を相補性の低い核酸から識別するために使用され得る。核酸のハイブリダイゼーションについての「高ストリンジェンシーの条件」、「中程度のストリンジェンシーの条件」、および「低ストリンジェンシーの条件」は、Current Protocols in Molecular Biology（Ausubel,F.M.ら, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, （1998）、その教示全体が引用により本明細書中に援用される）の2.10.1〜2.10.16ページ、および6.3.1〜6.3.6ページに説明されている。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する正確な条件は、イオン強度（例えば、0.2×SSC、0.1×SSC）、温度（例えば、室温、42℃、68℃）、およびホルムアミドのような脱安定化剤またはSDSのような変性剤の濃度だけではなく、核酸配列の長さ、塩基組成、ハイブリダイズする配列間のミスマッチの割合（％）、および他の同一ではない配列内においてその配列のサブセットが出現する頻度のような要因によっても変化する。したがって、同等の条件は、2つの核酸分子の間で同程度の同一性または類似性を維持したまま、これらのパラメーターの1つ以上を変化させることによって決定され得る。通常は、互いに少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％、あるいはそれ以上同一である配列が互いにハイブリダイズしたままである条件が使用される。ハイブリダイゼーションが生じないストリンジェンシーのレベルから、ハイブリダイゼーションが最初に観察されるレベルにまでハイブリダイゼーション条件を変化させることにより、所定の配列を、試料中の最も相補的な配列と（例えば、選択的に）ハイブリダイズさせる条件が決定され得る。
【００３１】
例示的な条件は、Krause,M.H.およびS.A.Aaronson, Methods in Enzymology, 200:546-556（1991）に記載されている。また、Ausubelら, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, （1998）：にも、中程度または低ストリンジェンシーの条件についての洗浄条件の決定が記載されている。洗浄は、通常は、その条件がハイブリッドの相補性の最低レベルを決定するように設定される工程である。一般的には、相同なハイブリダイゼーションしか生じない最も低い温度から開始して、最終的な洗浄温度がそれぞれ1℃下がると（SSC濃度を一定に保ったまま）、ハイブリダイズする配列間の最大のミスマッチの割合（％）が1％増大する。通常は、SSCの濃度を2倍にすることによって、Tmが約17℃上昇する。これらの指針を用いると、洗浄温度は、想定されるミスマッチのレベルに応じて、高ストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、または低ストリンジェンシーについて経験的に決定され得る。
【００３２】
例えば、低ストリンジェンシーの洗浄には、0.2×SSC／0.1％のSDSを含む溶液中での室温で10分間の洗浄が含まれ得る。中程度のストリンジェンシーの洗浄には、0.2×SSC／0.1％のSDSを含む予め温められた（42℃）溶液中での、42℃で15分間の洗浄が含まれ得る。そして、高ストリンジェンシーの洗浄には、0.1×SSC／0.1％のSDSを含む予め温められた（68℃）溶液中での、68℃で15分間の洗浄が含まれ得る。さらに、洗浄は、当該分野で公知であるように、所望される結果が得られるまで繰り返して、または連続して行われ得る。同等の条件は、使用される標的核酸分子とプライマーまたはプローブ（例えば、ハイブリダイズされる配列）との間で同程度の相補性を維持したまま、当該分野で公知であるように、例として挙げられる1つ以上のパラメーターを変化させることによって決定され得る。
【００３３】
2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の同一性の割合（％）は、最適な比較の目的のために配列をアラインメントすることによって決定され得る（例えば、第1の配列の配列中にギャップが導入され得る）。次いで、対応する位置のヌクレオチドまたはアミノ酸が比較され、2つの配列間の同一性の割合（％）は、これらの配列によって共有される同一の位置の数の関数（すなわち、同一性の割合（％）＝同一である位置の数／位置の総数×100）である。特定の態様では、比較の目的のためにアラインメントされる配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％である。2つの配列の実際の比較は、周知の方法によって、例えば、数学的アルゴリズムを使用して行われ得る。このような数学的アルゴリズムの限定的ではない例は、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877（1993）に記載されている。このようなアルゴリズムは、Altschulら, Nucleic Acids Res., 25:389-3402（1997）に記載されているように、NBLASTおよびXBLASTプログラム（バージョン2.0）に組み込まれている。BLASTおよびGapped BLASTプログラムが利用される場合には、それぞれのプログラム（例えば、NBLAST）についてのデフォルトパラメーターが使用され得る。ワールドワイドウェブ（World Wide Web）上のncbi.nlm.nih.govのウェブサイトを参照のこと。ある態様では、配列比較のためのパラメーターは、スコア＝100、文字長＝12に設定され得るか、または変化させることもできる（例えば、W＝5、またはW＝20）。
【００３４】
配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の限定的ではない例は、MyersおよびMiller, CABIOS（1989）のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれており、これは、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部である。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムが利用される場合は、PAM120重み残基表、12のギャップ長ペナルティー、および4のギャップペナルティーが使用され得る。配列解析のためにさらなるアルゴリズムは当該分野で公知であり、これには、TorellisおよびRobotti（1994）Comput. Appl. Biosci., 10:3-5に記載されているADVANCEおよびADAM、ならびにPearsonおよびLipman（1988）PNAS, 85:2444-8に記載されているFASTAが含まれる。
【００３５】
別の態様では、2つのアミノ酸配列の間での同一性の割合（％）は、Blossom 63マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれか、および12、10、8、6、または4のギャップ重み、および2、3、または4の長さ重みのいずれかを使用するGCGソフトウェアパッケージ（Accelrys, Cambridge, UK）のGAPプログラムを使用して行われ得る。さらに別の態様では、2つの核酸配列の間での同一性の割合（％）は、50のギャップ重みおよび3の長さ重みを使用して、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを使用して行われ得る。
【００３６】
本発明により、また、配列番号1から選択されるヌクレオチド配列を含み、表2、3、および4に示される少なくとも1つの多型を含むヌクレオチド配列、およびその相補物に対して、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする断片または部分を含む、単離された核酸分子が提供される。また、配列番号2から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、その多型変異体、またはその断片もしくは一部に対して、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする断片または部分を含む単離された核酸分子も提供される。本発明の核酸断片は、少なくとも約15、少なくとも約18、20、23、または25ヌクレオチドであり、30、40、50、100、200、またはそれ以上のヌクレオチド長であり得る。本明細書中に記載される抗原性ポリペプチドをコードするより長い断片、例えば、30以上のヌクレオチド長は、例えば、以下に記載されるような抗体の作成に、特に有用である。
【００３７】
プローブおよびプライマー
関連する局面では、本発明の核酸断片は、本明細書中に記載されるアッセイのようなアッセイにおいて、プローブまたはプライマーとして使用される。「プローブ」または「プライマー」は、核酸分子の相補鎖に対して塩基特異的様式でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。DNAおよびRNAに加えて、このようなプローブおよびプライマーとして、Nielsenら, Science, 254, 1497-1500（1991）に記載されているような、ポリペプチド核酸（PNA）が挙げられる。
【００３８】
プローブまたはプライマーには、配列番号1であって、表2、3、および4に示される少なくとも1つの多型を含むもの、およびその相補物、あるいは、配列番号2から選択されるアミノ酸配列をコードする配列、またはその多型変異体から選択される連続するヌクレオチド配列を含む核酸分子の、少なくとも約15、典型的には、約20〜25、そしてある態様では、約40、50、または75個の連続するヌクレオチドに対してハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域が含まれる。特定の態様では、プローブまたはプライマーには、100個またはそれ未満のヌクレオチドが含まれ得る。例えば、特定の態様では、6個から50個のヌクレオチド、または、例えば12個から30個のヌクレオチドが含まれる。他の態様では、プローブまたはプライマーは、連続するヌクレオチド配列に対して、または連続するヌクレオチド配列の相補物に対して、少なくとも70％同一であり、例えば、特定の態様では、少なくとも80％同一であり、他の態様では、少なくとも85％同一である、少なくとも90％同一であり、そして他の態様では、少なくとも95％同一であるか、あるいは、連続するヌクレオチド配列に対して、または連続するヌクレオチド配列の相補物に対して選択的にハイブリダイズすることさえできる。多くの場合、プローブまたはプライマーには、さらに、標識、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子が含まれる。
【００３９】
上記に記載されたような本発明の核酸分子は、標準的な分子生物学的技術および配列番号1に提供されるを配列情報使用して同定され得、単離され得る。例えば、核酸分子は、配列番号1に提供される1つ以上の配列（および、任意に、表2、3、および4に示される少なくとも1つの多型を含む）および／またはその相補物に基づいて設計された合成のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅および単離され得る。一般的には、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification（H.A.Erlich編, Freeman Press, NY, NY, 1992）；PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications（Innisら編、Academic Press, San Diego, CA, 1990）；Mattilaら, Nucleic Acids Res., 19:4967（1991）；Eckertら, PCR Methods and Applications, 1:17（1991）；PCR（McPhersonら編, IRL Press, Oxford）；および米国特許第4,683,202号を参照のこと。核酸分子は、cDNA、mRNA、またはゲノムDNAを鋳型として使用して増幅され得、適切なベクターにクローニングされ得、そしてDNA配列解析によって特徴付けられ得る。
【００４０】
他の適切な増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（LCR）（WuおよびWallace, Genomics, 4:560（1989）、Landegrenら, Science, 241:1077（1988）を参照のこと）、転写増幅（Kwohら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173（1989））、および自己維持配列の複製（Guatelliら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1874（1990））、および核酸に基づいた配列増幅法（NASBA）が挙げられる。後者の2つの増幅方法には、等温転写に基づく等温反応が含まれ、これにより、一本鎖RNA（ssRNA）と二本鎖DNA（dsDNA）の両方が、それぞれ、約30および100対1の割合で増幅産物として生じる。
【００４１】
増幅されたDNAは標識、例えば、放射標識され得、そしてヒト細胞に由来するcDNAライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用され得る。cDNAは、mRNAから誘導され得、これは、zap express（Stratagene, La Jolla, CA）、ZIPLOX（Gibco BRL, Gaithesburg, MD）、または他の適切なベクターに含まれ得る。対応するクローンが単離され得、インビボでの切り出しの後にDNAが得られ得、そしてクローニングされた挿入物が、適切な分子量のポリペプチドをコードする正確なリーディングフレームを同定するための当該分野で認識されている方法によって、いずれかの方向で、または両方の方向で配列決定され得る。例えば、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列の直接的な分析は、市販されている周知の方法を使用して行われ得る。例えば、Sambrookら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual（第2版、CSHP, New York 1989）；Zyskindら, Recombinant DNA Laboratory Manual,（Acad. Press, 1988）を参照のこと）。さらに、蛍光法もまた、核酸（Chenら, Genome Res. 9:492（1999）およびポリペプチドを分析するために利用できる。これらの方法または類似する方法を用いて、ポリペプチドおよびポリペプチドをコードするDNAが単離され得、配列決定され得、さらに特徴付けられ得る。
【００４２】
本発明のアンチセンス核酸分子は、配列番号1のヌクレオチド配列であって、表2、3、および4に示される少なくとも1つの多型を含むヌクレオチド配列、および／またはその相補物、ならびに／あるいは、配列番号1の一部であって、表2、3、および4に示される少なくとも1つの多型を含むもの、またはその相補物を使用して設計され得、そして当該分野で公知の手順を使用して、化学合成および酵素による連結反応を使用して構築され得る。例えば、アンチセンス核酸分子（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、分子の生物学的安定性を増大させるように、またはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二本鎖の物理的安定性を増大させるように設計された、自然界に存在しているヌクレオチドまたは様々に修飾されたヌクレオチドを使用して化学合成され得る。例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用され得る。あるいは、アンチセンス核酸分子は、核酸分子がアンチセンス方向でサブクローニングされている発現ベクターを使用して、生物学的に生産され得る（すなわち、挿入された核酸分子から転写されるRNAは、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である）。
【００４３】
一般的には、本発明の単離された核酸配列は、サザンゲル上の分子量マーカーとして、および関連する遺伝子位置をマッピングするために標識される染色体マーカーとして、使用され得る。核酸配列はまた、遺伝的障害（例えば、骨粗鬆症の素因、または骨粗鬆症に対する罹患性）を同定するために、患者の内因性DNA配列と比較するため、および例えば、関連するDNA配列にハイブリダイズさせ、関連するDNA配列を発見するためのプローブとして、あるいは、試料に由来する既知の配列を差し引くためにも、使用され得る。核酸配列は、さらに、遺伝子のフィンガープリントのためのプライマーを導き出すため、免疫化技術を使用して抗ポリペプチド抗体を惹起させるため、および抗DNA抗体を惹起させるかまたは免疫応答を誘発させるための抗原として、使用され得る。本明細書中で同定されるヌクレオチド配列の一部または断片（および対応する完全な遺伝子配列）は、ポリヌクレオチド試薬として多数の方法で使用され得る。例えば、これらの配列は、（i）染色体上にそれらのそれぞれの遺伝子をマッピングし；それにより遺伝的疾患に関係している遺伝子領域を決定するため；（ii）微量の生物学的試料から個体を同定する（組織分類）ために；および（iii）生物学的試料の法医学的同定を助けるために、使用され得る。さらに、本発明のヌクレオチド配列は、分析、特性決定、または治療の用途のための組み換えポリペプチドを同定し、それを発現させるために、あるいは、対応するポリペプチドが、組織分化の間に構成的に、または疾患状態のいずれかで発現される組織に対するマーカーとして、使用され得る。核酸配列は、さらに、本明細書中に記載されるスクリーニングおよび／または診断アッセイの試薬として使用され得、そして本明細書中に記載されるスクリーニングおよび／または診断アッセイでの使用のためのキットの成分（例えば、試薬キット）としても含まれ得る。
【００４４】
ベクター
本発明の別の局面は、配列番号1であって、表2、3、および4に示される少なくとも1つの多型を含むもの、およびそれらの相補物または一部からなる群より選択される核酸分子を含む核酸構築物に関する。本発明のさらに別の局面は、配列番号2のアミノ酸配列をコードする核酸分子またはその多型変異体を含む核酸構築物に関する。構築物として、その中に本発明の配列が、センスまたはアンチセンス方向で挿入されているベクター（例えば、発現ベクター）が挙げられる。本明細書中で使用される場合は、用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子をいう。ベクターの1つのタイプが「プラスミド」であり、これは、その中にさらなるDNAセグメントを連結させることができる環状の二本鎖DNAループをいう。ベクターの別のタイプはウイルスベクターであり、ここでは、さらなるDNAセグメントをウイルスゲノム内に連結させることができる。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自律複製できる（例えば、細菌の複製基点を有している細菌ベクター、および哺乳動物のエピソームベクター）。他のベクター（例えば、哺乳動物の非エピソームベクター）は、宿主細胞に導入されると、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、発現ベクターと呼ばれる特定のベクターは、それらが動作可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。一般的に、組み換えDNA技術に有用である発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。しかし、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス）のような他の形態の発現ベクターも含むように意図される。
【００４５】
本発明の組み換え発現ベクターには、宿主細胞中での核酸分子の発現に適切な形態の本発明の核酸分子が含まれ得る。これは、組み換え発現ベクターが、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択される1つ以上の調節配列を含み、これが発現させられる核酸配列に動作可能に連結されていることを意味する。組み換え発現ベクターにおいて、「動作可能にまたは作用するように連結される」により、ヌクレオチド配列を発現させる様式で（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入される場合には、宿主細胞において）、目的のヌクレオチド配列が調節配列（単数または複数）に連結されることを意味するように意図される。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むように意図される。このような調節配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA（1990）に記載されている。調節配列としては、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的な発現を指示する調節配列、および特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指示する調節配列（例えば、組織特異的調節配列）が挙げられる。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望されるポリペプチドの発現のレベルのような要因に応じて変化し得ることは、当業者に理解されるであろう。本発明の発現ベクターは宿主細胞に導入され得、それによって、本明細書中に記載される核酸分子によってコードされる、融合ポリペプチドを含むポリペプチドが生産される。
【００４６】
本発明の組み換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞、例えば、大腸菌のような細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現ベクターを使用して）、酵母細胞、または哺乳動物細胞中での本発明のポリペプチドの発現のために設計され得る。適切な宿主細胞については、Goeddel（前出）においてさらに議論されている。あるいは、組み換え発現ベクターは、例えば、T7プロモーター調節配列とT7ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写、翻訳され得る。
【００４７】
本発明の別の局面は、その中に本発明の組み換え発現ベクターが導入されている宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組み換え宿主細胞」は、本明細書中では同義的に使用される。このような用語が、特定の対象細胞だけではなく、そのような細胞の子孫または将来生じ得る子孫をもまた意味することが理解される。突然変異または環境による影響のいずれかの原因によって、特定の修飾が後世に生じ得るので、このような子孫は、実際には、親細胞と同一ではない場合があり得るが、これらもなお、本明細書中で使用されるこの用語の範囲に含まれる。
【００４８】
宿主細胞は、あらゆる原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、本発明の核酸分子は、細菌細胞（例えば、大腸菌）、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）もしくはCOS細胞）中で発現させることができる。他の適切な宿主細胞は当業者に公知である。
【００４９】
ベクターDNAは、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術によって、原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合は、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、外来核酸分子（例えば、DNA）を宿主細胞中に導入するための当該分野で認識されている種々の技術をいうように意図され、これには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、DEAE-デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための適切な方法は、Sambrookら（前出）および他の研究室マニュアルに見ることができる。
【００５０】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのためには、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、極一部の細胞だけがそれらのゲノムに外来DNAを組み込むことができることが知られている。これらの組み込み体を同定し選択するためには、通常、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性についてのもの）をコードする遺伝子が、目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。選択マーカーとしては、G418、ハイグロマイシン、およびメトトレキセートのような薬剤に対する耐性を付与する選択マーカーが挙げられ得る。選択マーカーをコードする核酸分子は、本発明の核酸分子と同じベクター上で、宿主細胞に導入することができ、また、別のベクター上で導入することもできる。導入された核酸分子で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬剤による選択（例えば、選択マーカー遺伝子が組み込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）によって同定され得る。
【００５１】
本発明の宿主細胞、例えば、培養物中の原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞は、本発明のポリペプチドを生産（すなわち、発現させる）させるために使用され得る。したがって、本発明により、さらに、本発明の宿主細胞を使用してポリペプチドを生産するための方法が提供される。ある態様では、この方法には、本発明の宿主細胞（その中に本発明のポリペプチドをコードする組み換え発現ベクターが導入されている）を、ポリペプチドが生産される適切な培養培地中で培養する工程が含まれる。別の態様では、この方法には、さらに、培地または宿主細胞からポリペプチドを単離する工程が含まれる。
【００５２】
本発明の宿主細胞はまた、ヒト以外のトランスジェニック動物を得るために使用され得る。例えば、ある態様では、本発明の宿主細胞は、その中に本発明の核酸分子（例えば、外因性BMP2遺伝子、またはBMP2ポリペプチドをコードする外因性核酸）が導入されている、受精卵母細胞または胚性幹細胞である。このような宿主細胞は、その後、その中に外因性ヌクレオチド配列がゲノムに導入されているヒト以外のトランスジェニック動物、またはその中の内因性ヌクレオチド配列が変化させられている相同組み換え動物を作成するために、使用され得る。このような動物は、ヌクレオチド配列、およびその配列によってコードされるポリペプチドの機能および／または活性を研究するため、ならびにそれらの活性についての調節因子を同定および／または評価するために有用である。本明細書中で使用される場合は、「トランスジェニック動物」はヒト以外の動物、例えば、哺乳動物であり、例えば、ラットまたはマウスのような齧歯動物であり、これらの動物の1つ以上の細胞にトランスジーンが含まれる。トランスジェニック動物の他の例としては、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ブタ、ヤギ、ニワトリ、および両生類が挙げられる。トランスジーンは、トランスジェニック動物を発生する、成体の動物のゲノムを維持している細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、トランスジェニック動物の1つ以上の細胞型または組織中でコードされる遺伝子産物の発現を指示する、外因性DNAである。本明細書中で使用される場合は、「相同組み換え動物」はヒト以外の動物、例えば、哺乳動物、例えば、マウスであり、その中の内因性遺伝子が、内因性遺伝子と動物の細胞（例えば、動物の発生前の動物の胚性細胞）に導入された外因性DNA分子との間での相同組み換えにより変化させられている。
【００５３】
胚の操作およびマイクロインジェクションによりトランスジェニック動物、特にマウスのような動物を作成するための方法は、当該分野で一般的となっており、例えば、米国特許第4,736,866号、および同第4,870,009号、米国特許第4,873,191号、ならびにHogan, Manipulating the Mouse Embryo（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986）に記載されている。相同組み換えベクターおよび相同組み換え動物を構築するための方法は、さらに、Bradley（1991）Current Opinion in Bio／Technology, 2:823-829、ならびに、PCT国際公開番号WO90／11354、同WO91／01140、同WO92／0968、および同WO93／04169に記載されている。本明細書中に記載されているヒト以外のトランスジェニック動物のクローンはまた、Wilmutら,（1997）Nature, 385:810-813、ならびに、PCT国際公開番号WO97／07668および同WO97／07669に記載されている方法にしたがって生産され得る。
【００５４】
本発明のポリペプチド
本発明は、また、単離されたBMP2ポリペプチド、例えば、タンパク質およびその変異体、ならびに本明細書中に記載されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド（例えば、他のスプライシング変異体）に関する。用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーをいい、特定の長さのものではない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質が、ポリペプチドの定義に含まれる。本明細書中で使用される場合は、ポリペプチドは、それが組み換え細胞および非組み換え細胞から単離される場合には、それが細胞性の材料を実質的に含まない場合、あるいはそれが化学合成される場合には化学的な前駆体または他の化合物を実質的に含まない場合に、「単離された」または「精製された」と言われる。しかし、ポリペプチドは、細胞中でそれとは通常は結合していない別のポリペプチドに接続させることができ、これはなおも「単離」または「精製」されている。
【００５５】
本発明のポリペプチドは、均質になるように精製され得る。しかし、ポリペプチドが均質になるまでには精製されていない調製物が有用であることが理解される。重要な特徴は、相当量の他の成分の存在下でもなお、調製物が、ポリペプチドの所望される機能を発揮することができることである。したがって、本発明には、種々の程度の純度が含まれる。ある態様では、語句「細胞性の材料を実質的に含まない」には、他のタンパク質（すなわち、混入しているタンパク質）を約30％（乾燥重量）未満、他のタンパク質を約20％未満、他のタンパク質を約10％未満、または他のタンパク質を約5％未満有しているポリペプチドの調製物が含まれる。
【００５６】
ポリペプチドが組み換えによって生産される場合は、これには、培養培地は実質的に含まれ得ない。すなわち、培養培地は、ポリペプチド調製物の容積の約20％未満、約10％未満、または約5％未満を占める。語句「化学的な前駆体または他の化合物を実質的に含まない」には、その合成に関係している化学的な前駆体または他の化合物から分離されているポリペプチドの調製物が含まれる。ある態様では、語句「化学的な前駆体または他の化合物を実質的に含まない」には、化学的な前駆体または他の化合物を約30％（乾燥重量）未満、化学的な前駆体または他の化合物を約20％未満、化学的な前駆体または他の化合物を約10％未満、化学的な前駆体または他の化合物を約5％未満有しているポリペプチドの調製物が含まれる。
【００５７】
ある態様では、ポリペプチドには、配列番号1であって、表2、3、および4に示される少なくとも1つの多型を含むもの、ならびにそれらの相補物および一部からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるアミノ酸配列が含まれる。しかし、本発明には、配列変異体も含まれる。変異体には、生物体の同じ遺伝子座にコードされる実質的に相同なポリペプチド、すなわち、対立遺伝子変異体、ならびに他のスプライシング変異体が含まれる。変異体には、また、生物体の他の遺伝子座に由来するが、配列番号1であって、表2、3、および4に示される少なくとも1つの多型を含むもの、ならびにその相補物および一部からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドに対して実質的な相同性を有しているか、あるいは、配列番号2をコードするヌクレオチド配列またはその多型変異体からなる群より選択されるヌクレオチドを含む核酸分子によってコードされるポリペプチドに対して実質的な相同性を有している、ポリペプチドも含まれる。変異体には、また、これらのポリペプチドに実質的に相同であるかまたはそれと同一であるが、別の生物体に由来するポリペプチド、すなわち、オルトログも含まれる。変異体には、また、化学合成によって生産される、これらのポリペプチドに実質的に相同であるかまたはそれと同一であるポリペプチドも含まれる。変異体には、また、組み換え方法によって生産される、これらのポリペプチドに実質的に相同であるかまたはそれと同一であるポリペプチドも含まれる。
【００５８】
本明細書中で使用される場合は、2つのポリペプチド（またはポリペプチドの領域）は、アミノ酸配列が少なくとも約45〜55％、特定の態様では、少なくとも約70〜75％、他の態様では、少なくとも約80〜85％、そして他の態様では、約90％またはそれ以上相同であるかあるいは同一である場合に、実質的に相同または同一である。実質的に相同であるアミノ酸配列は、本発明によれば、配列番号1であって、表2、3、および4に示される少なくとも1つの多型を含むもの、またはその一部に対して、上記により具体的に記載されているストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるか、あるいは、配列番号2もしくはその一部、またはその多型変異体をコードする核酸配列に対して、それについてより具体的に記載されているストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる。
【００５９】
本発明には、低い程度の同一性しか有さないが、本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチドによって果たされる同じ機能の1つ以上を果たすのに十分な類似性を有しているポリペプチドも含まれる。類似性は、保存的アミノ酸置換によって、または構造上の類似性によって決定される。このような保存的置換は、ポリペプチド中の所定のアミノ酸を類似の特性の別のアミノ酸によって置換する置換である。保存的置換は、おそらく、表現型上はサイレントである。通常は、脂肪族アミノ酸であるAla、Val、Leu、およびIleの間での1つのものの別のものでの置き換え；ヒドロキシル残基であるSerとThrの交換、酸性残基であるAspとGluの交換、アミド残基であるAsnとGlnとの間での置換、塩基性残基LysとArgの交換、および芳香族残基PheとTyrの間での置き換えが、保存的置換とみなされる。どのアミノ酸変化がおそらく表現型上サイレントであるかに関する指針は、Bowieら、Science 247:1306-1310（1990）に見出される。
【００６０】
変異体ポリペプチドは、1つ以上の置換、欠失、挿入、逆位、融合、および短縮、またはこれらのいずれかの組み合わせによってアミノ酸配列が異なり得る。さらに、変異体ポリペプチドは、完全に機能性であり得るか、また、1つ以上の活性において機能を欠失している場合もある。完全な機能を有している変異体には、通常、保存的変化または重要ではない残基もしくは重要ではない領域中の変化のみが含まれる。機能性変異体には、また、機能においては変化を生じないか重要ではない変化を生じる、類似のアミノ酸の置換も含まれ得る。あるいは、このような置換は、機能に対してある程度の正または負の影響を与え得る。非機能性変異体には、通常、1つ以上の非保存的アミノ酸置換、欠失、挿入、逆位、または短縮、あるいは重要な残基もしくは重量な領域内での置換、挿入、逆位、または欠失が含まれる。
【００６１】
機能に不可欠なアミノ酸は、当該分野で公知の方法、例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャン変異誘発（Cunninghamら、Science, 244:1081-1085（1989））によって同定され得る。後者の手順により、分子中のそれぞれの残基に単一のアラニン変異が導入される。得られる変異体分子は、その後、インビトロで生物学的活性について試験される。ポリペプチド活性に重要な部位は、構造分析によって、例えば、結晶解析、核磁気共鳴、または光親和性標識（Smithら、J. Mol. Biol., 244:899-904（1992）；de Vosら、Science, 255:306-312（1992）によっても決定され得る。
【００６２】
本発明には、また、本発明のポリペプチドのポリペプチド断片も含まれる。断片は、配列番号1を含み、表2、3、および4に示される少なくとも1つの多型を含む核酸分子、またはその一部およびその相補物によってコードされるポリペプチドから誘導され得る。しかし、本発明には、また、本明細書中に記載されるポリペプチドの変異体の断片も含まれる。本明細書中で使用される場合は、断片には、少なくとも6個の連続するアミノ酸が含まれる。有用な断片には、ポリペプチドの生物学的活性の1つ以上を保持している断片、さらには、ポリペプチド特異的抗体を作製するための免疫原として使用することができる断片が含まれる。
【００６３】
生物学的に活性な断片（例えば、6、9、12、15、16、20、30、35、36、37、38、39、40、50、100、またはそれ以上のアミノ酸の長さのペプチド）には、周知の方法を使用するポリペプチド配列の分析によって同定されているドメイン、セグメント、またはモチーフ、例えば、シグナルペプチド、細胞外ドメイン、1つ以上の膜貫通セグメントもしくはループ、リガンド結合領域、ジンクフィンガードメイン、DNA結合ドメイン、アシル化部位、グリコシル化部位、またはリン酸化部位が含まれ得る。
【００６４】
断片は、不連続（他のアミノ酸またはポリペプチドに融合されていない）であっても、また、より大きなポリペプチドの中に存在していてもよい。さらに、いくつかの断片は、単一のより大きなポリペプチド内に含まれ得る。ある態様では、宿主中での発現のために設計された断片は、ポリペプチド断片のアミノ末端に融合された異種プレ-ポリペプチドおよびプロ-ポリペプチド領域、ならびに、断片のカルボキシル末端に融合されたさらなる領域を有することができる。
【００６５】
したがって、本発明により、キメラまたは融合ポリペプチドが提供される。これらには、本発明のポリペプチドと実質的に相同ではないアミノ酸配列を有している、異種タンパク質またはポリペプチドに動作可能に連結された本発明のポリペプチドが含まれる。「動作可能に連結された」は、ポリペプチドおよび異種タンパク質がインフレームで融合されていることを示す。異種タンパク質は、ポリペプチドのN末端またはC末端に融合させることができる。ある態様では、融合ポリペプチドは、ポリペプチド自体の機能には影響を与えない。例えば、融合ポリペプチドは、GST-融合ポリペプチドであり得、その中ではポリペプチド配列はGST配列のC末端に融合されている。融合ポリペプチドの他のタイプとしては、酵素の融合ポリペプチド、例えば、β-ガラクトシダーゼ融合体、酵母のツーハイブリッドGAL融合体、ポリ-His融合体、およびIg融合体が挙げられるが、これらに限定されない。このような融合ポリペプチド、特に、ポリ-His融合体は、組み換えポリペプチドの精製を容易にすることができる。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）においては、ポリペプチドの発現および／または分泌は、異種シグナル配列を使用することにより増大させられ得る。したがって、別の態様では、融合ポリペプチドには、そのN末端に異種シグナル配列が含まれる。
【００６６】
EP-A-0,464,533には、免疫グロブリン定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質が開示されている。Fcは、治療および診断に有用であり、したがって、例えば、薬物動態特性の改善を生じる（EP-A 0,232,262）。薬剤の発見においては、例えば、ヒトタンパク質が、アンタゴニストを同定するための高スループットスクリーニングアッセイの目的のためにFc部分と融合させられている。Bennettら、J. Mol. Rec., 8:52-58（1995）およびJohansonら、J. Biol. Chem., 270, 16:9459-9471（1995）。したがって、本発明には、また、本発明のポリペプチドと、種々のサブクラス（IgG、IgM、IgA、IgE）の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々の部分を含む、可溶性の融合ポリペプチドも含まれる。
【００６７】
キメラまたは融合ポリペプチドは、標準的な組み換えDNA技術によって生産することができる。例えば、種々のポリペプチド配列をコードするDNA断片が、従来技術にしたがって互いにインフレームで連結される。別の態様では、融合遺伝子が、自動DNA合成装置を含む従来技術により合成され得る。あるいは、核酸断片のPCR増幅が、2つの連続する核酸断片の間に相補性の突出を生じるアンカープライマーを使用して行われ得、続いてアニーリングさせられて、キメラ核酸配列を生じるように再度増幅させられ得る（Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, 1992を参照のこと）。さらに、すでに融合部分（例えば、GSTタンパク質）をコードしている多くの発現ベクターが市販されている。本発明のポリペプチドをコードする核酸分子は、融合部分がポリペプチドに対してインフレームで連結されるように、そのような発現ベクターにクローニングされ得る。
【００６８】
単離されたポリペプチドは、それを自然界において発現する細胞から精製され得るか、それを発現するように変化させられている細胞（組み換え体）から精製され得るか、または公知のタンパク質合成方法を使用して合成され得る。ある態様では、ポリペプチドは、組み換えDNA技術によって生産される。例えば、ポリペプチドをコードする核酸分子は発現ベクターにクローニングされ、発現ベクターが宿主細胞に導入され、ポリペプチドが宿主細胞中で発現させられる。その後、ポリペプチドは標準的なタンパク質精製技術を使用して適切な精製図式によって細胞から単離され得る。
【００６９】
一般的には、本発明のポリペプチドは、SDS-PAGEゲル上で、または当該分野で認識されている方法を使用する分子篩ゲル濾過カラム上で、分子量マーカーとして使用され得る。本発明のポリペプチドは、抗体を惹起させるため、または免疫応答を誘発するために使用され得る。ポリペプチドはまた、生物学的な液体中のそれに結合するポリペプチドまたは分子（例えば、受容体またはリガンド）のレベルを定量的に決定するためのアッセイにおいて、試薬、例えば、標識試薬としても使用され得る。ポリペプチドは、細胞または組織についてのマーカーとしても使用され得、ここで対応するポリペプチドは、構成的に、組織の分化の間に、または疾患状態においてのいずれかで優先的に発現される。ポリペプチドは、対応する結合パートナー、例えば、受容体またはリガンドを、例えば、相互作用捕捉アッセイにおいて単離するために、および結合相互作用のペプチドまたは低分子アンタゴニストまたはアゴニストをスクリーニングするために、使用され得る。
【００７０】
本発明の抗体
遺伝子産物の1つの形態に特異的に結合するが、他の形態の遺伝子産物には結合しない、ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体もまた、提供される。多型部位（単数または複数）を含む変異体または対照遺伝子産物のいずれかの一部に結合する抗体もまた、提供される。本発明により、本発明のポリペプチドおよびポリペプチド断片、例えば、配列番号2によってコードされ、表2、3、および4に示される少なくとも1つの多型を含むアミノ酸配列、またはその一部を有しているもの、あるいは、配列番号1の全体またはその一部を含み、表2、3、および4に示される少なくとも1つの多型を含む核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を有しているものに対する抗体が提供される。用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合は、免疫グロブリン分子を意味し、免疫グロブリン分子、すなわち、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子の免疫学的に活性な部分をいう。本発明のポリペプチドに特異的に結合する分子は、そのポリペプチドまたはその断片に結合するが、試料、例えば、自然な状態で上記ポリペプチドを含む生物学的試料中の他の分子には実質的に結合しない分子である。免疫グロブリン分子の免疫学的活性のある部分の例として、ペプシンのような酵素で抗体を処理することによって作成することができる、F（ab）およびF（ab'）2断片が挙げられる。本発明により、本発明のポリペプチドに結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が提供される。用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書中で使用される場合は、本発明のポリペプチドの特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位の1種のみを含む、抗体分子の集団をいう。したがって、モノクローナル抗体組成物は、通常は、それと免疫反応する本発明の特定のポリペプチドについて、単一の結合親和性を提示する。
【００７１】
ポリクローナル抗体は、所望される免疫原、例えば、本発明のポリペプチドまたはその断片で適切な被験体を免疫化することによって、上記のように調製され得る。免疫化された被験体の抗体力価は、標準的な技術によって、例えば、固定されたポリペプチドを使用する酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を用いて、経時的にモニターされ得る。所望される場合は、ポリペプチドに対する抗体分子が哺乳動物から（例えば、血液から）単離され得、周知の技術、例えば、IgG画分を得るためのプロテインAクロマトグラフィーによってさらに精製され得る。免疫化後、適切な時間（例えば、抗体力価が最大である時）に、抗体を生産する細胞を被験体から得ることができ、これは標準的な技術、例えば、KohlerおよびMilstein（1975）Nature, 256:495-497によって最初に記載されたハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor ら、（1983）Immunol. Today, 4:72）、EBV-ハイブリドーマ技術（Coleら（1985）, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp77-96）、またはトリオーマ技術によって、モノクローナル抗体を調製するために使用され得る。ハイブリドーマを生産するための技術は周知である（一般的には、Current Protocols in Immunology（1994）Coligan ら、（編）John Wiley & Sons, Inc., New York, NYを参照のこと）。簡潔には、不死化細胞（通常は、骨髄腫細胞）が、上記のように免疫原で免疫化された哺乳動物に由来するリンパ球（通常は、脾臓細胞）に融合させられ、得られるハイブリドーマ細胞の培養上清が、本発明のポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを同定するためにスクリーニングされる。
【００７２】
リンパ球を融合させるために使用される多くの周知のプロトコールのいずれかと不死化細胞が、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を作製する目的のために利用され得る（例えば、Current Protocols in Immunology, 前出；Galfre ら、（1977）Nature, 266:55052；R.H.Kenneth, Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analysis, Plenum Publishing Corp., New York, New York（1980）；およびLerner（1981）Yale J. Biol. Med., 54:387-402を参照のこと）。さらに、それらもまた有用である、このような方法の多くのバリエーションが存在することは、当業者によって理解されるであろう。
【００７３】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製する代わりに、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、組み換えの組み合わせ免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）を上記ポリペプチドを用いてスクリーニングして、上記ポリペプチドに結合する免疫グロブリンライブラリーのメンバーを単離することによって、同定され、単離され得る。ファージディスプレイライブラリーを作成し、スクリーニングするためのキットは市販されている（例えば、Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, カタログ番号27-9400-01；およびStratagene SurfZAP（登録商標）Phage Display Kit, カタログ番号240,612）。さらに、抗体ディスプレイライブラリーを作成およびスクリーニングすることにおける使用に特に適している方法および試薬の例は、例えば、米国特許第5,223,409号；PCT国際公開番号WO92／18619；PCT国際公開番号WO91／17271；PCT国際公開番号WO92／20791；PCT国際公開番号WO92／15679；PCT国際公開番号WO93／01288；PCT国際公開番号WO92／01047；PCT国際公開番号WO92／09690；PCT国際公開番号WO90／02809；Fuchs ら、（1991）Bio／Technology, 9:1370-1372；Hay ら、（1992）Hum. Antibod. Hibridomas, 3:81-85；Huse ら、（1989）Science, 246:1275-1281;Griffiths ら、（1993）EMBO J., 12:725-734に見ることができる。
【００７４】
さらに、ヒト部分およびヒト以外の両方の部分を含む、キメラ抗体およびヒト化モノクローナル抗体のような組み換え抗体、（これは、標準的な組み換えDNA技術を使用して作成され得る）が、本発明の範囲に含まれる。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野で公知の組み換えDNA技術によって生産され得る。
【００７５】
一般的には、本発明の抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準的な技術によって、本発明のポリペプチドを単離するために使用され得る。ポリペプチド特異的抗体は、細胞からの自然界に存在しているポリペプチドの精製、および宿主細胞中で発現させられた組み換えによって生産されたポリペプチドの精製を容易にし得る。さらに、本発明のポリペプチドに特異的な抗体は、ポリペプチドの発現の量およびパターンを評価するために、ポリペプチドを検出する（例えば、細胞溶解物、細胞上清、または組織試料中で）ために使用され得る。抗体は、例えば、所定の処置レジュメの有効性を決定するために、臨床試験手順の一部として組織中のタンパク質濃度をモニターするために、診断的に使用され得る。検出は、検出可能な物質に対する抗体の結合によって容易にすることができる。検出可能な物質の例として、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生体発光物質、および放射活性物質が挙げられる。適切な酵素の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン、およびアビジン／ビオチンが挙げられる。適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド、またはフィコエリスリンが挙げられる。発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる；生体発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、適切な放射活性物質の例としては、125I、131I、35S、32P、33P、14C、または3Hが挙げられる。
【００７６】
本発明の診断およびスクリーニングアッセイ
本発明はまた、個体におけるBMP2核酸または遺伝子産物の存在に関係している骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性の診断、またはそのような診断を補助する方法にも関する。診断アッセイは、BMP2遺伝子の発現を評価するために、または本発明のBMP2ポリペプチドの活性を評価するために、設計され得る。このようなアッセイは、単独で、または他のアッセイ、例えば、骨の代謝マーカーのアッセイ（例えば、骨スキャン）と組み合わせて使用され得る。ある態様では、このアッセイは、生物学的試料（例えば、血液、血清、細胞、組織、滑液）の状況で使用され、それによって個体が骨粗鬆症に罹患しているかどうか、または骨粗鬆症を発症するリスクがある（骨粗鬆症の素因または骨粗鬆症に対する罹患性を有している）かどうかが決定される。本発明により、また、個体が骨粗鬆症を発症しやすいかどうかを決定するための予後の（すなわち、予測）アッセイも提供される。例えば、遺伝子の変化は、生物学的試料中でアッセイされ得る。このようなアッセイは、それによって骨粗鬆症に関係する症状の発症の前に個体を予防的に処置するための、予後または予測目的のために使用され得る。本発明の別の局面は、本発明の遺伝子の発現またはポリペプチドの活性に対する因子（例えば、薬剤、化合物、または他の因子）の影響をモニターするためのアッセイに、さらには、BMP2ポリペプチドに結合する因子を同定するためのアッセイに関する。これらおよび他のアッセイおよび因子は、以下のセクションにさらに詳細に記載される。
【００７７】
診断アッセイ
本明細書中に記載される核酸、ポリペプチド、および抗体は、骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性の診断方法において、さらには、骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性の診断に有用なキットにおいて使用され得る。
【００７８】
本発明のある態様では、骨粗鬆症に対する罹患性の診断は、本明細書中に記載されるようなBMP2の多型を検出することによって行われる。多型は、フレームシフトを生じる、1ヌクレオチドまたは1つより多くのヌクレオチドの挿入または欠失；コードされるアミノ酸に変化を生じる少なくとも1つのヌクレオチドの変化；早期終結コドンの作製を生じる少なくとも1つのヌクレオチドの変化；ヌクレオチドによってコードされる1つ以上のアミノ酸の欠失を生じるいくつかのヌクレオチドの欠失；遺伝子のコード配列の中断を生じる、同等ではない(unequal)組み換えまたは遺伝子の逆位によるような1つまたはいくつかのヌクレオチドの挿入；遺伝子全体または遺伝子の一部の重複；遺伝子全体または遺伝子の一部のトランスポジション；あるいは、遺伝子全体または遺伝子の一部の再配置のような、BMP2の変化であり得る。1つ以上のこのような変化が1つの遺伝子の中に存在し得る。このような配列変化により、BMP2核酸によってコードされるポリペプチドが変化させられる。例えば、核酸配列の変化によりフレームシフトが引き起こされる場合は、フレームシフトによって、コードされるアミノ酸に変化が生じ得る、および／または短縮型ポリペプチドの作製を生じる、早い位置での終結コドンの作製が生じ得る。あるいは、骨粗鬆症に対する罹患性に関係している多型は、1つ以上のヌクレオチドの同義的な変化（すなわち、BMP2遺伝子によってコードされるポリペプチドには変化を生じない変化）であり得る。このような多型は、例えば、スプライシング部位を変化させ得る、mRNAの安定性または輸送に影響を与え得る、あるいは、別の方法で遺伝子の転写または翻訳に影響を与え得る。上記の変化のいずれかを有するBMP2核酸は、本明細書中で、「変異体(variant)核酸」、または時折、「変異体(mutant)遺伝子」とも呼ばれる。
【００７９】
第１の骨粗鬆症に対する罹患性の診断方法においては、サザン分析、ノーザン分析、またはインサイチュハイブリダイゼーションのようなハイブリダイゼーション方法が使用され得る（Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel,F. ら、編、John Wiley & Sons（1999年からの全ての追補を含む）を参照のこと）。例えば、ゲノムDNA、RNA、またはcDNAの試験被験体に由来する生物学的試料（「試験試料」）は、骨粗鬆症を有していると疑われるか、骨粗鬆症に対して罹患性を有している、または骨粗鬆症の素因がある、あるいは骨粗鬆症の障害を有している個体（「試験個体」）から得られる。個体は、成人、子供、また、胎児でもあり得る。試験試料は、血液試料、羊水の試料、脳脊髄液の試料、滑液の試料、あるいは、皮膚、筋肉、頬粘膜もしくは結膜粘膜、胎盤、消化管、または他の器官に由来する組織試料のような、ゲノムDNAを含む任意の供給源に由来し得る。胎児の細胞または組織に由来するDNAの試験試料は、適切な方法によって、例えば、羊水穿刺または絨毛膜標本採取によって、得ることができる。DNA、RNA、またはcDNA試料が、次いで、BMP2中に多型が存在するかどうかを決定するために試験される。多型の存在は、ゲノムDNA、RNA、またはcDNA中の遺伝子の核酸プローブに対するハイブリダイゼーションによって示され得る。「核酸プローブ」は、本明細書中で使用される場合は、DNAプローブまたはRNAプローブであり得る。核酸プローブには、BMP2中に少なくとも1つの多型が含まれる。プローブは、上記の核酸分子（例えば、遺伝子または核酸、断片、遺伝子を含むベクターなど）のいずれかであり得る。
【００８０】
骨粗鬆症に対する罹患性を診断するために、ハイブリダイゼーション試料が、BMP2を含む試験試料を少なくとも1つの核酸プローブと接触させることによって形成される。mRNAまたはゲノムDNAを検出するためのプローブの限定的ではない例は、本明細書中に記載されるmRNAまたはゲノムDNA配列にハイブリダイズすることができる標識された核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、全長の核酸分子またはその一部であり得、例えば、少なくとも15、30、50、100、250、または500ヌクレオチドの長さの、適切なmRNAまたはゲノムDNAに対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするために十分なオリゴヌクレオチドである。例えば、核酸プローブは、配列番号1全体またはその一部であり得、これには、任意に、表2、3、および4に示される少なくとも1つの多型が含まれるか、あるいはそれらの相補物またはそれらの一部であり得る。本発明の診断アッセイでの使用に適切な他のプローブは、本明細書中に記載される。
【００８１】
ハイブリダイゼーション試料は、BMP2に対する核酸プローブの特異的ハイブリダイゼーションを行うために十分な条件下で維持される。「特異的ハイブリダイゼーション」は、本明細書中で使用される場合は、正確なハイブリダイゼーション（例えば、ミスマッチを含まない）を示す。特異的ハイブリダイゼーションは、例えば、上記のような、高ストリンジェンシーの条件または中程度のストリンジェンシーの条件下で行われ得る。ある態様では、特異的ハイブリダイゼーションのためのハイブリダイゼーション条件は、高ストリンジェンシーである。
【００８２】
特異的ハイブリダイゼーションは、存在する場合には、次いで、標準的な方法を使用して検出される。特異的ハイブリダイゼーションが核酸プローブと試験試料中のBMP2との間で生じる場合は、BMP2は多型を有しており、これは核酸プローブ中に存在する。1つ以上の核酸プローブもまた、この方法において同時に使用され得る。核酸プローブのいずれか1つの特異的ハイブリダイゼーションは、BMP2中の多型の指標であり、したがって、骨粗鬆症に対する罹患性の診断である。
【００８３】
別のハイブリダイゼーション方法では、ノーザン分析（Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel,F. ら、編、John Wiley & Sons,（前出）を参照のこと）が、骨粗鬆症に対する罹患性と関係している多型の存在を同定するために使用される。ノーザン分析については、RNAの試験試料は適切な手段によって個体から得られる。上記のような、核酸プローブの、個体に由来するRNAに対する特異的ハイブリダイゼーションは、BMP2における多型の指標であり、したがって、骨粗鬆症に対する罹患性の診断である。
【００８４】
核酸プローブの使用の代表的な例については、例えば、米国特許第5,288,611号および同第4,851,330号を参照のこと。
【００８５】
あるいは、ペプチド核酸（PNA）プローブが、上記のハイブリダイゼーション方法において核酸プローブの代わりに使用され得る。PNAは、ペプチド様の無機骨格を有しているDNA模倣物であり、例えば、メチレンカルボニルリンカーを介してグリシン窒素に結合させられた有機塩基（A、G、C、T、またはU）を有しているN-（2-アミノエチル）グリシン単位である（例えば、Nielsen,P.E.ら、Bioconjugate Chemistry, 1994, 5, American Chemical Society, p.1（1994）を参照のこと）。PNAプローブは、骨粗鬆症に対する罹患性に関係している多型を有している遺伝子に特異的にハイブリダイズするように設計され得る。PNAプローブのBMP2に対するハイブリダイゼーションは、骨粗鬆症に対する罹患性の診断である。
【００８６】
本発明のある態様では、BMP2に関係している骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性の診断は、定量的PCR（動的温度循環）を使用する発現分析によって行われ得る。ある態様では、骨粗鬆症の診断は、少なくとも1つのBMP2に関係している対立遺伝子を検出することによって、骨の代謝マーカーのアッセイ（例えば、骨スキャン）と組み合わせて行われる。この技術には、例えば、TaqMan（登録商標）（Applied Biosystems, Foster City, CA）のような市販されている技術を利用することができ、これにより、例えば、多型が同定され得る。この技術により、BMP2によってコードされるポリペプチドの発現または組成に変化が存在するかどうか、またはスプライシング変異体が存在するかどうかが評価され得る。さらに、変異体の発現は、物理的または機能的な差として定量され得る。
【００８７】
本発明の別の方法においては、遺伝子中の変異または多型によって制限部位の作成または消滅が生じる場合には、制限消化による変異の分析が、多型（単数または複数）を含む変異体遺伝子（単数または複数）を検出するために使用され得る。ゲノムDNAを含む試験試料は、個体から得られる。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、試験個体に由来するゲノムDNAの試験試料中のBMP2（および必要である場合には、隣接配列）を増幅するために使用され得る。RFLP分析が、記載されているように行われる（Current Protocols in Molecular Biology（前出）を参照のこと）。関連するDNA断片の消化パターンは、BMP2中に変異または多型が存在するかまたは存在しないかを示し、したがって、骨粗鬆症に対するこの罹患性が存在するかまたは存在しないかを示す。
【００８８】
配列解析はまた、BMP2中の特異的な多型を検出するためにも使用され得る。DNAまたはRNAの試験試料は、試験個体から得られる。PCRまたは他の適切な方法は、所望される場合には、遺伝子、および／またはその隣接配列を増幅するために使用され得る。BMP2、または遺伝子の断片、またはcDNAもしくはcDNAの断片、あるいはmRNAもしくはmRNAの断片の配列が、標準的な方法を使用して決定される。遺伝子、遺伝子断片、cDNA、cDNA断片、mRNA、またはmRNA断片の配列は、適切である場合には、遺伝子、cDNA（例えば、配列番号1であって、表2、3、および4に示される少なくとも1つの多型を含むもの）、またはmRNAの既知の核酸配列と比較される。BMP2中の特異的な多型の存在は、個体が骨粗鬆症に対して罹患性を有することを示す。
【００８９】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドもまた、BMP2中の多型の存在を検出するために、増幅されたオリゴヌクレオチドの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ASO）プローブとのドット-ブロットハイブリダイゼーションの使用を通じて使用され得る（例えば、Saiki,R. ら、（1986）Nature（London）324:163-166を参照のこと）。「対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド」（本明細書中では、「対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ」とも呼ばれる）は、およそ10〜50塩基対、またはおよそ15〜30塩基対のオリゴヌクレオチドであり、これは、BMP2に特異的にハイブリダイズし、これには骨粗鬆症に対する罹患性に関係している多型が含まれる。BMP2中の特定の多型に対して特異的な対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブは、標準的な方法を使用して調製され得る（Current Protocols in Molecular Biology（前出）を参照のこと）。骨粗鬆症に対する罹患性に関係している遺伝子における多型を同定するために、DNAの試験試料が個体から得られる。PCRが、BMP2全体またはその断片、およびその隣接配列を増幅するために使用され得る。増幅されたBMP2（またはその遺伝子の断片）を含むDNAが、標準的な方法を使用してドット-ブロットされ（Current Protocols in Molecular Biology（前出）を参照のこと）、そしてブロットがオリゴヌクレオチドプローブと接触させられる。次いで、増幅されたBMP2に対するプローブの特異的なハイブリダイゼーションの存在が検出される。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブの個体に由来するDNAに対する特異的ハイブリダイゼーションは、BMP2中の特異的な多型の指標であり、したがって、骨粗鬆症に対する罹患性の指標である。
【００９０】
対立遺伝子特異的プライマーは、多型と重複する標的DNA上の部位にハイブリダイズし、およびそれに対して完全な相補性を示すプライマーの対立遺伝子形態の増幅だけをプライムする（Gibbs,R.ら、1989. Nucleic Acids Res., 17:2437-2448）。このプライマーは、はなれた部位にハイブリダイズする第2のプライマーと組み合わせて使用される。増幅は2つのプライマーから進行して、検出可能な産物を生じ、これが特定の対立遺伝子形態が存在することを示す。対照は、通常、プライマーの第2の対を用いて行われる。この対の一方は多型部位で１塩基のミスマッチを示し、他方は離れた部位に対して完全な相補性を示す。1塩基のミスマッチは増幅を妨げ、検出可能な産物は形成されない。ミスマッチが多型とともにアラインメントされるオリゴヌクレオチドの最も3'位置に含まれる場合には、この方法は最も良好に機能する。なぜなら、この位置は、プライマーからの伸張を最も不安定化させるからである（例えば、国際公開番号WO93／22456を参照のこと）。
【００９１】
ロックト核酸（LNA）のような類似体を加えることにより、プライマーおよびプローブの大きさが、8塩基程度の小ささにまで縮小させられ得る。LNAは、フラノース環の2'および4'位置がO-メチレン（オキシ-LNA）、S-メチレン（チオ-LNA）、またはアミノメチレン（アミノ-LNA）部分を介して接続されている2環式DNA類似体の新規のクラスである。全てのこれらのLNA変異体について、相補的核酸に対する親和性が共通しており、これは、DNA類似体について報告されている最大をはるかに上回る。例えば、特定の全てのオキシ-LNA九量体は、相補的なDNAまたはRNAとの複合体の場合には、対応するDNA九量体に関してのDNAおよびRNAの両方についての28℃とは対照的に、それぞれ、64℃および74℃の融点を有することが示されている。Tmの実質的な上昇は、LNA単量体が標準的なDNAまたはRNA単量体と組み合わせて使用された場合にも得られる。プライマーおよびプローブについて、どこにLNA単量体が含まれるか（例えば、3'末端、5'末端、または中間に）に依存して、Tmはかなり上昇させられ得る。
【００９２】
別の態様では、個体に由来する標的核酸配列セグメントに相補的であるオリゴヌクレオチドプローブのアレイが、BMP2核酸における多型を同定するために使用され得る。例えば、ある態様では、オリゴヌクレオチドアレイが使用され得る。オリゴヌクレオチドアレイには、通常、種々の既知の位置の基質の表面に結合させられた複数の種々のオリゴヌクレオチドプローブが含まれる。これらのオリゴヌクレオチドアレイはまた、「Genechip（登録商標）」としても記載されており、当該分野において、例えば、米国特許第5,143,854号およびPCT国際特許公開番号WO90／15070および同92／10092に一般的に記載されている。これらのアレイは、通常、機械による合成方法、またはフォトリソグラフィー法と固相オリゴヌクレオチド合成方法の組み合わせが組み込まれている光特異的合成方法（Fodor,S. ら、1991. Science, 251:767-773;Pirrungら、米国特許第5,143,854号（PCT出願番号WO90／15070もまた参照のこと）；およびFodor,S.ら、PCT国際公開番号WO92／10092および米国特許第5,424,186号、これらのそれぞれの教示全体が引用により本明細書中に組み込まれる）を使用して、生産され得る。機械による合成方法を使用するこれらのアレイの合成のための技術は、例えば、米国特許第5,384,261号（その教示全体が引用により本明細書中に組み込まれる）に記載されている。別の例では、直線的なアレイが利用され得る。
【００９３】
一旦、オリゴヌクレオチドアレイが調製されると、目的の核酸がアレイとハイブリダイズさせられ、多型についてスキャンされる。ハイブリダイゼーションおよびスキャンは、通常、本明細書中、ならびに例えば、公開されたPCT出願番号WO92／10092および同WO95／11995、および米国特許第5,424,186号（それらの教示全体が、引用により本明細書中に組み込まれる）に記載されている方法によって行われる。簡潔にいうと、1つ以上の以前に同定された多型性マーカーを含む標的核酸配列が、周知の増幅技術、例えば、PCRによって増幅される。通常は、この技術には、標的配列の二本鎖に相補的であるプライマー配列（多型の上流と下流の両方）の使用が含まれる。非対称PCR技術もまた、使用され得る。増幅された標的には、通常、標識が組み込まれており、これは次いで、適切な条件下でアレイとハイブリダイズさせられる。アレイのハイブリダイゼーションと洗浄が完了すると、アレイは、標的配列がハイブリダイズしたアレイ上の位置を決定するためにスキャンされる。スキャンによって得られたハイブリダイゼーションデータは、通常は、アレイの位置の関数としての蛍光強度の形態である。
【００９４】
単一の検出ブロックに関して、例えば、単一の多型の検出について主に記載されているが、アレイには複数の検出ブロックが含まれ得、したがって、複数の特異的な多型を分析することができる。別のアレンジでは、検出ブロックが単一のアレイの中または複数の異なるアレイの中でグループ分けされ得、その結果、種々の最適な条件が、アレイに対する標的のハイブリダイゼーションの間に使用され得る。例えば、A-Tリッチセグメントに含まれる多型とは別の、ゲノム配列のG-Cリッチストレッチに含まれるこれらの多型の検出を提供することが、多くの場合に望まれる。これにより、それぞれの状況についてのハイブリダイゼーション条件を別々に最適化することができる。
【００９５】
多型の検出のためにオリゴヌクレオチドアレイを使用することについてのさらなる記載は、例えば、米国特許第5,858,659号および同第5,837,832号（それらの教示全体が引用により本明細書中に組み込まれる）に見出され得る。
【００９６】
他の核酸分析方法が、BMP2の多型を検出するために使用され得る。代表的な方法としては、例えば、直接的な手作業による配列決定（ChurchおよびGilbert,（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1991-1995；Sanger,F. ら、（1977）Proc. Natl. Acad. Sci., 74:5463-5467；Beavisら、米国特許第5,288,644号）；自動蛍光配列決定；一本鎖立体構造多型アッセイ（SSCP）；クランプ変性ゲル電気泳動（CDGE）；変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（DGGE）（Sheffield,V.C. ら、（19891）Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:232-236）；移動度シフト分析（Orita,M. ら、（1989）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766-2770）、制限酵素分析（Flavell ら、（1978）Cell 15:25；Geever ら、（1981）Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:5081）；ヘテロ二本鎖分析；化学的なミスマッチ切断（CMC）（Cotton ら、（1985）Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4397-4401）；RNase保護アッセイ（Myers,R.M. ら、（1985）Science 230:1242）；大腸菌（E.coli）mutSタンパク質のようなヌクレオチドのミスマッチを認識するポリペプチドの使用；ならびに対立遺伝子特異的PCRが挙げられる。
【００９７】
本発明のある態様では、BMP2核酸に関係している疾患または症状（例えば、骨粗鬆症）、あるいはBMP2核酸に関係している疾患または症状（例えば、骨粗鬆症）に対する罹患性の診断もまた、定量的PCR（動的温度循環）による発現分析によって行われ得る。ある態様では、疾患自体、例えば、骨粗鬆症の診断は、少なくとも1つのBMP2に関係している対立遺伝子を検出することにより、骨の代謝マーカーのアッセイ（例えば、骨スキャン）と組み合わせて、行われる。TaqMan（登録商標）を利用するこの技術は、多型を同定するために、および患者がホモ接合型であるかまたはヘテロ接合型であるかどうかを識別するために使用され得る。この技術により、BMP2核酸によってコードされるポリペプチドの発現または組成に変化が存在するかどうか、あるいはBMP2核酸によってコードされるスプライシング変異体が存在するかどうかが評価され得る。さらに、変異体の発現は、物理的または機能的な差として定量され得る。
【００９８】
本発明の別の態様では、骨粗鬆症に対する罹患性の診断は、また、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、ウェスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光を含む種々の方法によって、BMP2ポリペプチドの発現および／または組成を試験することにより行われ得る。個体に由来する試験試料が、BMP2によってコードされるポリペプチドの発現に変化が、および／またはBMP2によってコードされるポリペプチドの組成に変化が存在するかどうかが、評価される。BMP2によってコードされるポリペプチドの発現の変化は、例えば、定量的なポリペプチドの発現（すなわち、生産されるポリペプチドの量）の変化であり得、BMP2によってコードされるポリペプチドの組成の変化は、定性的なポリペプチドの発現の変化（例えば、変異体BMP2ポリペプチドの発現、または別のスプライシング変異体の発現）である。ある態様では、骨粗鬆症に対する罹患性の診断は、BMP2によってコードされる特定のスプライシング変異体、または特定のパターンのスプライシング変異体を検出することによって行われる。
【００９９】
このような変化（定量的および定性的）の両方ともが存在し得る。ポリペプチドの発現または組成の「変化」は、本明細書中で使用される場合は、対照試料中のBMP2によってコードされるポリペプチドの発現または組成と比較した、試験試料中の発現または組成の変化をいう。対照試料は、試験試料に対応する試料であり（例えば、同じタイプの細胞に由来する）、骨粗鬆症に罹患していない個体に由来する試料である。同様に、対照試料と比較した、試験試料中の1つ以上の異なるスプライシング変異体の存在、または試験試料中の有意に異なる量の複数の異なるスプライシング変異体の存在は、骨粗鬆症に対する罹患性の指標である。対照試料と比較した試験試料中のポリペプチドの発現または組成の変化は、骨粗鬆症に対する罹患性の指標である。BMP2によってコードされるポリペプチドの発現または組成を試験する種々の手段が使用され得、これには、分光分析、比色分析、電気泳動、等電点電気泳動、および免疫ブロッティング（Current Protocols in Molecular Biology, 特に、第10章もまた参照のこと）のような免疫アッセイ（例えば、Davidら、米国特許第4,376,110号）が含まれる。
【０１００】
例えば、ある態様では、（例えば、上記の）ポリペプチドに結合することができる抗体（例えば、検出可能な標識を有している抗体）が使用され得る。抗体は、ポリクローナルでも、モノクローナルでもよい。完全な抗体、またはその断片（例えば、FabまたはF（ab'）２）が使用され得る。用語「標識された」は、プローブまたは抗体に関して用いられる場合は、プローブまたは抗体に対して検出可能な物質を結合させる（すなわち、物理的に連結させる）ことによるプローブまたは抗体の直接的な標識、ならびに、直接標識される別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接的な標識を含むように意図される。間接的な標識の例としては、蛍光標識された二次抗体、および蛍光標識されたストレプトアビジンで検出することができるようにするためのビオチンでのDNAプローブの末端標識を使用する一次抗体の検出が含まれる。
【０１０１】
変異体BMP2によってコードされるポリペプチドに特異的に結合する上記抗体、または変異体ではない遺伝子によってコードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体を使用するウェスタンブロット分析が、多型性BMP2または変異体BMP2によってコードされるポリペプチドが試験試料中に存在すること、あるいは多型性ではない遺伝子または変異体ではない遺伝子によってコードされるポリペプチドが試験試料中には存在しないことを識別するために使用され得る。多型性遺伝子または変異体遺伝子によってコードされるポリペプチドの存在、あるいは、多型性ではない遺伝子または変異体ではない遺伝子によってコードされるポリペプチドが存在しないことは、骨粗鬆症に対する罹患性の診断である。
【０１０２】
この方法のある態様では、試験試料中のBMP2によってコードされるポリペプチドのレベルまたは量が、対照試料中のBMP2によってコードされるポリペプチドのレベルまたは量と比較される。統計学的に有意であるような、対照試料中のポリペプチドのレベルまたは量よりも多いかまたは少ない試験試料中のポリペプチドのレベルまたは量は、BMP2によってコードされるポリペプチドの発現の変化の指標であり、骨粗鬆症に対する罹患性の診断である。あるいは、試験試料中のBMP2によってコードされるポリペプチドの組成が、対照試料中のBMP2によってコードされるポリペプチドの組成と比較される。対照試料中のポリペプチドの組成と比較された試験試料中のポリペプチドの組成における差は、骨粗鬆症に対する罹患性の診断である。別の態様では、ポリペプチドのレベルまたは量および組成が、試験試料中、および対照試料中で評価され得る。対照試料と比較された、試験試料中のポリペプチドの量またはレベルの差；対照試料と比較された、試験試料中の組成の差；あるいは量またはレベルの差と組成の差の両方が、骨粗鬆症に対する罹患性の指標である。
【０１０３】
診断方法において有用なキットには、本明細書中に記載される方法のいずれかにおいて有用である成分が含まれ、これらとしては、例えば、ハイブリダイゼーションプローブ、制限酵素（例えば、RFLP解析用）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド、変化しているBMP2ポリペプチドまたは変化していない（天然の）BMP2ポリペプチド（例えば、配列番号2であって、表2、3、および4に示される少なくとも1つの多型を含むもの）に結合する抗体、BMP2を含む核酸の増幅のための手段、またはBMP2の核酸配列を分析するため、もしくはBMP2ポリペプチドのアミノ酸配列を分析するための手段などが挙げられる。さらに、キットにより、本発明の方法、例えば、骨の代謝マーカーのアッセイ（例えば、骨スキャン）と組み合わせて使用されるアッセイのための試薬が提供され得る。
【０１０４】
診断方法において有用であるキット（例えば、試薬キット）には、本明細書中に記載される方法のいずれかにおいて有用である成分が含まれ、これらとして、例えば、本明細書中に記載されるハイブリダイゼーションプローブまたはプライマー（例えば、標識されたプローブまたはプライマー）、標識された分子の検出のための試薬、制限酵素（例えば、RFLP解析用）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド、変化しているBMP2ポリペプチドまたは変化していない（天然の）BMP2ポリペプチドに結合する抗体、BMP2を含む核酸の増幅のための手段、または、本明細書中に記載されるような、BMP2核酸の核酸配列を分析するため、もしくはBMP2ポリペプチドのアミノ酸配列を分析するための手段などが挙げられる。ある態様では、骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性を診断するためのキットには、骨粗鬆症を有しているかまたは骨粗鬆症に対する罹患性がある個体において、より頻繁に存在する1つ以上の多型部位を含む、BMP2核酸中の領域の核酸増幅のためのプライマーが含まれ得る。プライマーは、骨粗鬆症の指標であるSNPに隣接している核酸の一部を使用して設計され得る。さらに、キットにより、本発明の方法、例えば、骨の代謝マーカーのアッセイ（例えば、骨スキャン）と組み合わせて使用されるアッセイのための試薬が提供され得る。
【０１０５】
本発明はさらに、BMP2中のリスクマーカー、例えばSNPを同定することにより、個体における骨粗鬆症に対する罹患性を診断および同定するための方法にも関する。ある態様では、リスクマーカーは、骨粗鬆症の有意なリスクを与えるものである。ある態様では、マーカーに関連する有意性は、オッズ比によって測定される。さらなる態様では、有意性は割合（％）によって測定される。ある態様では、有意なリスクは、少なくとも約2.2であって、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、および1.9を含むがこれらに限定されないオッズ比として測定される。さらなる態様では、少なくとも1.2のオッズ比が有意である。さらなる態様では、少なくとも約1.5のオッズ比が有意である。さらなる態様では、リスクの有意な増大は、少なくとも約1.7が有意である。さらなる態様では、リスクの有意な増大は、少なくとも約20％であり、約25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、および98％が含まれるがこれらに限定されない。さらなる態様では、リスクの有意な増大は、少なくとも約50％である。しかし、リスクが医学的に有意であるかどうかの識別はまた、特定の疾患、マーカー、そして多くの場合には環境的要因を含む種々の要因によって変化し得ることが理解される。
【０１０６】
本発明はまた、個体における骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性を診断する方法に関する。この方法には、健常な個体（対照）中でのその存在の頻度と比較して、骨粗鬆症に罹患しやすい個体（罹患）においてより頻繁に存在する、BMP2核酸と関係しているリスクマーカーをスクリーニングする工程が含まれる。ここでは、マーカーの存在は、骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性の指標である。骨粗鬆症と関係しているSNPおよび／またはマイクロサテライトマーカーの存在についての遺伝子型決定のための標準的技術、例えば、蛍光に基づく技術（Chenら, 1999. Genome Res., 9:492）、PCR、LCR、Nested PCR、および核酸増幅のための他の技術が使用され得る。ある態様では、この方法には、骨粗鬆症に関係しているBMP2核酸と関係している、特定のSNP対立遺伝子またはマイクロサテライト対立遺伝子の存在または頻度を個体において評価する工程が含まれる。ここでは、健常な対照個体と比較してマーカーが過剰であるかマーカーの頻度が高いことは、個体が骨粗鬆症を有しているか、または骨粗鬆症に対する罹患性があることの指標である。スクリーニングツールとして使用され得るSNPおよびマーカーについては、表2、3、および4を参照のこと。
【０１０７】
スクリーニングアッセイおよびそれによって同定される因子
本発明により、本発明の核酸にハイブリダイズするヌクレオチドの存在を同定するため、さらには、本発明の核酸によってコードされるポリペプチドの存在を同定するための方法（本明細書中では、「スクリーニングアッセイ」とも呼ばれる）が提供される。ある態様では、試料中の目的の核酸分子（例えば、本発明の核酸に対して有意な相同性を有する核酸）の存在（または存在しないこと）が、試料を本発明の核酸を含む核酸（例えば、配列番号1の配列を有しており、表2、3、および4に示される少なくとも1つの多型を含む核酸、またはその相補物、あるいは、配列番号2の配列を有しているアミノ酸をコードする核酸、またはそのような核酸の断片もしくは変異体）と、上記のようなストリンジェントな条件下で接触させられ、その後、ハイブリダイゼーションの存在（または存在しないこと）について試料を評価することによって、評価され得る。ある態様では、高ストリンジェンシーの条件が、選択的ハイブリダイゼーションに適切な条件である。別の態様では、目的の核酸分子を含む試料は、目的の核酸分子（例えば、変異体BMP2核酸）の一部に対して少なくとも部分的に相補的である連続するヌクレオチド配列（例えば、上記のようなプライマーまたはプローブ）を含む核酸と接触させられ、そして接触させられた試料が、ハイブリダイゼーションの有無について評価される。ある態様では、連続するヌクレオチド配列を含む核酸は、目的の核酸分子の一部に対して完全に相補的である。
【０１０８】
これらの態様のいずれにおいても、目的の核酸全体またはその一部を、ハイブリダイゼーションが行われる前に増幅することができる。
【０１０９】
別の態様では、本発明のポリペプチドまたはその断片もしくは変異体のような目的のポリペプチドの試料中での存在（または存在しないこと）は、試料を目的のポリペプチドに特異的にハイブリダイズする抗体（例えば、上記の抗体のような抗体）と接触させ、その後、目的のポリペプチドに対する抗体の結合の存在（または存在しないこと）について試料を評価することによって、評価され得る。
【０１１０】
別の態様では、本発明により、本明細書中に記載されるポリペプチドの活性を変化させる（例えば、増大させるかまたは低下させる）か、または本明細書中のポリペプチドと別の方法で相互作用する因子（例えば、融合タンパク質、ポリペプチド、ペプチド模倣物、プロドラッグ、受容体、結合因子、抗体、低分子、または他の薬物、あるいはリボザイム）を同定するための方法が提供される。例えば、そのような因子は、本明細書中に記載されるポリペプチドに結合する因子（例えば、BMP2結合因子）；例えば、本発明のポリペプチドの活性に対して刺激作用または阻害作用を有する因子；本発明のポリペプチドがBMP2結合因子（例えば、受容体または他の結合因子）と相互作用する能力を変化させる（例えば、増大させるかまたは阻害する）因子；あるいは、BMP2ポリペプチドの翻訳後プロセシングを変化させる因子（例えば、それが通常合成される場所から細胞中の別の位置、例えば、細胞表面に対してポリペプチドを向けるようにタンパク質分解によるプロセシングを変化させる因子；より多くのポリペプチドが細胞から放出されるようにタンパク質分解によるプロセシングを変化させる因子など）であり得る。
【０１１１】
ある態様では、本発明により、本明細書中に記載されるポリペプチド（またはその生物学的に活性な部分（単数または複数））に結合するか、またはポリペプチド（またはその生物学的に活性な部分（単数または複数））の活性を調節する、候補または試験因子をスクリーニングするためのアッセイが、さらには、このアッセイによって同定され得る因子が提供される。試験因子は、当該分野で公知の組み合わせライブラリー方法において多数の手法のいずれかを使用して得ることができ、組み合わせライブラリー方法として、生物学的ライブラリー；空間的に場所を特定することができる並列固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「1ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法が挙げられる。生物学的ライブラリーの手法はポリペプチドライブラリーに限られるが、他の4つの手法は、ポリペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の低分子ライブラリーに適用され得る（Lam,K.S.（1997）Anticancer Drug Des., 12:145）。
【０１１２】
ある態様では、BMP2ポリペプチド（例えば、配列番号2であって、表2、3、および4に示される少なくとも1つの多型を含むもの）、またはその活性のある断片もしくは誘導体（上記）を含むかまたは発現する、細胞、細胞溶解物、または溶液が、BMP2ポリペプチドの活性を変化させる因子を同定するために、試験される因子と接触させられ得る。あるいは、ポリペプチドは、試験される因子と直接接触させられ得る。BMP2活性のレベル（量）が評価され（例えば、BMP2活性のレベル（量）が、直接または間接的に測定され）、そして対照中の活性のレベル（すなわち、試験される因子が存在しない条件下での、BMP2ポリペプチドまたはその活性のある断片もしくは誘導体の活性のレベル）と比較される。因子の存在下での活性のレベルが、因子が存在しない条件下での活性のレベルと、統計学的に有意な量で異なる場合は、この因子はBMP2ポリペプチドの活性を変化させる因子である。対照と比較したBMP2活性のレベルの増大は、この因子がBMP2活性を増大させる因子である（BMP2活性のアゴニストである）ことを示す。同様に、対照と比較したBMP2活性のレベルの低下は、この因子がBMP2活性を阻害する因子である（BMP2活性のアンタゴニストである）ことを示す。別の態様では、試験される因子の存在下でのBMP2ポリペプチドまたはその誘導体もしくは断片の活性のレベルが、前もって確立された対照レベルと比較される。対照レベルとは統計学的に有意な量で異なる、因子の存在下での活性のレベルは、この因子がBMP2活性を変化させることを示す。
【０１１３】
本発明はまた、BMP2核酸の発現を変化させる因子（例えば、アンチセンス核酸、融合タンパク質、ポリペプチド、ペプチド模倣物、プロドラッグ、受容体、結合因子、抗体、低分子、または他の薬物、あるいはリボザイム）、遺伝子の発現（例えば、転写または翻訳）を変化させる（例えば、増大させるかまたは減少させる）因子、あるいは、別な方法で本明細書中に記載される核酸と相互作用する因子を同定するためのアッセイ、さらには、このアッセイによって同定することができる因子にも関する。例えば、BMP2ポリペプチドをコードする核酸（例えば、BMP2遺伝子）を含む溶液は、試験される因子と接触させられ得る。溶液には、例えば、核酸を含む細胞または核酸を含む細胞溶解物が含まれ得る。あるいは、溶液は、核酸の転写／翻訳に不可欠な要素を含む別の溶液であり得る。溶液には懸濁されていない細胞も、所望される場合には、使用され得る。BMP2の発現のレベルおよび／またはパターン（例えば、mRNAまたは発現されるタンパク質のレベルおよび／またはパターン、例えば、種々のスプライシング変異体のレベルおよび／またはパターン）が評価され、そして対照中の発現のレベルおよび／またはパターン（すなわち、試験される因子が存在しない条件下でのBMP2の発現のレベルおよび／またはパターン）と比較される。因子の存在下でのレベルおよび／またはパターンが、統計学的に有意な量または様式で、因子が存在しない条件下でのレベルおよび／またはパターンとは異なる場合は、この因子は、BMP2の発現を変化させる因子である。BMP2の発現の増大は、この因子がBMP2活性のアゴニストであることを示す。同様に、BMP2の発現の阻害は、この因子がBMP2活性のアンタゴニストであることを示す。別の態様では、試験される因子の存在下でのBMP2ポリペプチド（単数または複数）（例えば、種々のスプライシング変異体）のレベルおよび／またはパターンが、前もって確立されている対照レベルおよび／またはパターンと比較される。因子の存在下でのレベルおよび／またはパターンが、統計学的に有意な量または様式で対照レベルおよび／またはパターンとは異なる場合、この因子はBMP2の発現を変化させることを示す。
【０１１４】
本発明の別の態様では、BMP2核酸の発現を変化させる因子、または他の方法で本明細書中に記載される核酸と相互作用する因子が、レポーター遺伝子に動作可能に連結されたBMP2核酸のプロモーター領域をコードする核酸を含む、細胞、細胞溶解物、または溶液を使用して同定され得る。試験される因子との接触の後、レポーター遺伝子の発現のレベル（例えば、mRNAまたは発現されるタンパク質のレベル）が評価され、対照中での発現のレベル（すなわち、試験される因子が存在しない条件下でのレポーター遺伝子の発現のレベル）と比較される。因子の存在下でのレベルが、統計学的に有意な量または様式で、因子が存在しない条件下でのレベルとは異なる場合は、この因子は、BMP2遺伝子プロモーターに動作可能に連結された遺伝子の発現を変化させるその能力によって示されるように、BMP2の発現を変化させる因子である。レポーターの発現の増大は、この因子がBMP2活性のアゴニストであることを示す。同様に、レポーターの発現の阻害は、この因子がBMP2活性のアンタゴニストであることを示す。別の態様では、試験される因子の存在下でのレポーターの発現レベルが、前もって確立されている対照レベルと比較される。因子の存在下でのレベルが、統計学的に有意な量または様式で対照レベルとは異なる場合、この因子はBMP2の発現を変化させることを示す。
【０１１５】
BMP2によってコードされる種々のスプイライシング変異体の量を変化させる因子（例えば、第1のスプライシング変異体の活性を増大させ、そして第2のスプライシング変異体の活性を阻害する因子）、ならびに第1のスプライシング変異体の活性のアゴニストであり、第2のスプライシング変異体の活性のアンタゴニストである因子が、上記のこれらの方法を使用して同定され得る。
【０１１６】
本発明の他の態様では、アッセイは、BMP2結合因子に関係しているポリペプチドの活性に対する試験因子の影響を評価するために使用され得る。例えば、BMP2と相互作用する化合物（本明細書中では「BMP2結合因子」と呼ばれ、これは、BMP2と相互作用するポリペプチドまたは他の分子、例えば受容体であり得る）を発現する細胞が、試験因子の存在下でBMP2と接触させられ、BMP2とBMP2結合因子との間の相互作用を変化させる試験因子の能力が決定される。あるいは、BMP2結合因子を含む細胞溶解物または溶液が使用され得る。BMP2またはBMP2結合因子に結合する因子は、BMP2結合因子に結合する、BMP2結合因子と会合する、または別の方法でBMP2結合因子と相互作用するBMP2の能力を妨害するかまたは増強することにより、相互作用を変化させ得る。BMP2またはBMP2結合因子に結合する試験因子の能力の決定は、例えば、試験因子を放射性同位元素または酵素標識と結合させることによって行われ得、その結果、125I、35S、32P、33P、14C、または3Hで、直接的または間接的のいずれかで標識されたものを検出することによって試験因子のポリペプチドに対する結合が決定され得、そして放射性同位元素は、放射線の放射を直接カウントするかまたはシンチレーションカウンティングによって検出され得る。あるいは、試験因子は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素標識され得、酵素標識が、適切な基質の生成物への転換の測定によって検出され得る。相互作用物のいずれの標識をも伴うことなく、試験因子がポリペプチドと相互作用する能力を決定することもまた、本発明の範囲に含まれる。例えば、マイクロフィジオメーターは、試験因子、BMP2、またはBMP2結合因子のいずれをも標識することなく、試験因子のBMP2またはBMP2結合因子との相互作用を検出するために使用され得る（McConnell,H.M.ら（1992）Science, 257:1906-1912）。本明細書中で使用される場合は、「マイクロフィジオメーター」（例えば、Cytosensor（登録商標））は、光アドレス可能電位計測センサー（LAPS）を使用して、細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化速度の変化は、リガンドとポリペプチドとの間での相互作用の指標として使用され得る。既知のBMP2結合パートナーの考察については、「実施例」のセクションを参照のこと。したがって、これらの受容体は、骨粗鬆症の処置に使用するためのBMP2受容体アゴニストである化合物、または骨粗鬆症の研究のためのBMP2受容体アンタゴニストである化合物をスクリーニングするために、使用され得る。本明細書中に提供される連鎖データにより、初めて、骨粗鬆症に対するそのような矯正が提供される。薬物は、BMP2受容体の活性化を調節するように設計され得、次いで、シグナル伝達経路および下流の遺伝子の転写事象を調節するために使用され得る。
【０１１７】
本発明の別の態様では、アッセイは、本明細書中に記載される1つ以上のBMP2ポリペプチドと相互作用するポリペプチドを同定するために使用され得る。例えば、酵母のツーハイブリッドシステム（Fields,S.およびSong,O., Nature 340:245-246（1989））は、1つ以上のBMP2ポリペプチドと相互作用するポリペプチドを同定するために使用され得る。このような酵母のツーハイブリッドシステムでは、ベクターは、2つの機能性ドメイン（DNA結合ドメインと転写活性化ドメイン）を有する転写因子の可撓性に基づいて構築される。2つのドメインが分離されているが、互いに相互作用する2つの異なるタンパク質に融合されている場合には、転写活性化が行われ得、そして特異的マーカー（例えば、HisおよびAdeのような栄養マーカー、またはlacZのような着色マーカー）の転写が、相互作用と転写活性化の存在を同定するために使用され得る。例えば、本発明の方法では、ＤＮＡ結合ドメインと、さらにＢＭＰ２ポリペプチド、スプライシング変異体、またはその断片もしくは誘導体をコードする核酸を含む第1のベクターが使用され、そして転写活性化ドメインをコードする核酸と、さらにBMP2ポリペプチド、スプライシング変異体、またはその断片もしくは誘導体（例えば、BMP2ポリペプチド結合因子または受容体）と相互作用することができる可能性があるポリペプチドをコードする核酸を含む第2のベクターが使用される。第1のベクターと第2のベクターを含む酵母の適切な条件（例えば、ClontechのMatchmaker（登録商標）システムにおいて使用されるような接合条件）下でのインキュベーションにより、目的のマーカーを発現するコロニーが同定される。これらのコロニーは、BMP2ポリペプチドまたはその断片もしくは誘導体と相互作用するポリペプチド（単数または複数）を同定するために試験され得る。このようなポリペプチドは、上記のように、BMP2ポリペプチドの発現の活性を変化させる因子として有用であり得る。
【０１１８】
本発明の上記アッセイ方法の1つ以上の態様では、1つまたは両方のポリペプチドの複合体化していない形態からの複合体の形態の分離を容易にするために、さらには、アッセイを自動化を適応させるために、BMP2、BMP2結合因子、またはアッセイの他の成分のいずれかを固体支持体上に固定させることが所望され得る。試験因子の存在下および試験因子が存在しない条件下での、ポリペプチドに対する試験因子の結合、またはポリペプチドの結合因子との相互作用は、反応物を含むために適切な任意の容器内で行われ得る。このような容器の例として、マイクロタイタープレート、試験管、または微量遠心分離管が挙げられる。ある態様では、BMP2またはBMP2結合因子を、マトリックスまたは他の固体支持体に結合させることができるドメインが付加されている、融合タンパク質（例えば、GST融合タンパク質）が提供され得る。
【０１１９】
別の態様では、BMP2をコードする核酸を含む細胞、細胞溶解物、または溶液が試験因子と接触させられ、細胞、細胞溶解物、または溶液中での適切なmRNAまたはポリペプチド（例えば、スプライシング変異体（単数または複数））の発現が決定される方法において、本発明の核酸分子の発現の調節因子が決定される。試験因子の存在下での適切なmRNAまたはポリペプチド（単数または複数）の発現のレベルは、試験因子が存在しない条件下でのmRNAまたはポリペプチド（単数または複数）の発現のレベルと比較される。その後、試験因子は、この比較に基づいて発現の調節因子として同定され得る。例えば、mRNAまたはポリペプチドの発現が試験因子の存在下で、それが存在しない条件下よりも大きい（統計学的に有意に大きい）場合は、試験因子は、mRNAまたはポリペプチドの発現の刺激因子または促進因子として同定される。あるいは、mRNAまたはポリペプチドの発現が試験因子の存在下で、それが存在しない条件下よりも少ない（統計学的に有意に少ない）場合は、試験因子は、mRNAまたはポリペプチドの発現の阻害因子として同定される。細胞中でのmRNAまたはポリペプチド発現のレベルは、mRNAまたはポリペプチドを検出するための本明細書中に記載される方法によって決定され得る。
【０１２０】
本発明は、さらに、上記のスクリーニングアッセイによって同定される新規の因子に関する。したがって、本明細書中に記載されるように同定された因子を適切な動物モデルにおいてさらに使用することが、本発明の範囲内に含まれる。例えば、本明細書中に記載されるように同定された因子（例えば、調節因子、アンチセンス核酸分子、特異的抗体、またはポリペプチド結合因子である試験因子）は、そのような因子を用いた処置の有効性、毒性、または副作用を決定するために、動物モデルにおいて使用され得る。あるいは、本明細書中に記載されるように同定された因子は、そのような因子の作用機構を決定するために、動物モデルにおいて使用され得る。さらに、本発明は、上記スクリーニングアッセイによって同定された新規の因子を本明細書中に記載される処置のために使用することに関する。さらに、本明細書中に記載されるように同定された因子は、BMP2によってコードされるポリペプチドの活性を変化させるために、またはBMP2の発現を変化させるために、ポリペプチドまたは遺伝子を本明細書中に記載されるように同定された因子と接触させること（あるいは、ポリペプチドまたは遺伝子を含む細胞を同定された因子と接触させること）によって使用され得る。
【０１２１】
薬学的組成物
本発明はまた、本明細書中に記載される核酸、特に、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチドを含み；本明細書中に記載されているポリペプチド（例えば、配列番号2）を含み；かつ／または本明細書中に記載されているBMP2ポリペプチドの活性を変化させる（例えば、増大させるかまたは阻害する）因子を含む、薬学的組成物に関する。例えば、本発明のポリペプチド、タンパク質、断片、その融合タンパク質またはプロドラッグ、あるいは本発明のヌクレオチドを含むヌクレオチドまたは核酸構築物（ベクター）、あるいはBMP2ポリペプチドの活性を変化させる因子は、薬学的組成物を調製するために、生理学的に許容される担体または賦形剤とともに処方され得る。担体および組成物は無菌のものであり得る。処方は投与の様式に合わせられるべきである。
【０１２２】
適切な薬学的に許容される担体としては、水、塩溶液（例えば、NaCl）、生理食塩水、緩衝生理食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアガム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（例えば、ラクトース、アミロース、または澱粉、デキストロース）、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど、ならびに、それらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。薬学的調製物は、所望される場合には、活性のある因子と悪影響を及ぼすように反応することがない、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に作用するための塩、緩衝液、着色剤、香味剤、および／または芳香物質などの助剤と混合され得る。
【０１２３】
所望される場合には、組成物には、少量の湿潤剤または乳化剤、あるいはpH緩衝剤も含まれ得る。組成物は、溶液、懸濁液、乳状液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性処方物、または粉末であり得る。組成物は、伝統的な結合剤およびトリグリセリドのような担体を用いて、坐剤として処方され得る。経口用処方物には、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような、標準的な担体が含まれ得る。
【０１２４】
これらの組成物の導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、眼内、静脈内、皮下、局所、経口、および鼻腔内が挙げられるが、これら限定されない。他の適切な導入方法としては、遺伝子治療（下記）、再充電可能な装置または生分解性装置、粒子加速装置（「遺伝子銃」）、および徐放性重合体装置が挙げられ得る。本発明の薬学的組成物はまた、他の試薬との組み合わせ治療の一部として投与され得る。
【０１２５】
組成物は、ヒトへの投与に適合させられた薬学的組成物として、日常的な手順に従って処方され得る。例えば、静脈内投与のための組成物は、通常は、滅菌の等張性水性緩衝液中の溶液である。必要である場合には、組成物にはまた、溶解剤、および注射部位の痛みを軽くするための局所麻酔剤も含まれ得る。一般的には、成分は、別々に、または単位投与量形態で共に混合されてのいずれかで、例えば、活性のある因子の量を提示するアンプルもしくは袋のような密封された容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給される。組成物が注入によって投与される場合は、無菌の医薬品グレードの水、生理食塩水、またはデキストロース／水を含む注入ボトルに分注され得る。組成物が注射によって投与される場合は、複数の成分を投与前に混合することができるように、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０１２６】
局所適用のためには、局所適用に適合する担体を含み、そして水よりも大きい動粘性率を有している、スプレーすることができない形態、粘性から半固体または固体の形態が使用され得る。適切な処方物としては、溶液、懸濁液、乳状液、乳剤、軟膏、粉末、浣腸剤、ローション剤、ゾル、塗布薬、軟膏、エアロゾルなどが挙げられるがこれらに限定されない。これらは、所望される場合には、滅菌されるか、または助剤（例えば、防腐剤、安定剤、湿潤剤、緩衝液、または浸透圧に作用するための塩など）と混合される。因子は、化粧品処方物に混合され得る。局所適用については、有効成分が、任意に固体または液体の不活性な担体材料と組み合わせられて、スクイーズボトルにパッケージングされるか、あるいは、圧縮された揮発性の、通常は、気体状の高圧ガス、例えば、圧縮された空気と混合されている、スプレーすることができるエアロゾル調製物も適切である。
【０１２７】
本明細書中に記載される試薬は、中性の形態または塩の形態として処方され得る。薬学的に許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するもののような遊離のアミノ基を用いて形成される塩、ならびに、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインに由来するもののような遊離のカルボキシル基を用いて形成される塩などが挙げられる。
【０１２８】
因子は、治療有効量で投与される。特定の障害または症状の処置において治療上有効である因子の量は、障害または症状の性質に応じて異なり、そして標準的な臨床技術によって決定され得る。さらに、インビトロまたはインビボでのアッセイが、任意に、最適な投与量範囲の同定を助けるために使用され得る。処方物において使用される正確な用量もまた、投与経路および骨粗鬆症の症状の重篤度に応じて変化し、医師の判断とそれぞれの患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロ試験システムまたは動物モデル試験システムから導き出された用量応答曲線から推定され得る。
【０１２９】
本発明により、また、本発明の薬学的組成物の1つ以上の成分で満たされた1つ以上の容器を含む薬学的パックまたはキットも提供される。任意に、そのような容器（単数または複数）には、医薬品または生物学的な製品の製造、使用、または販売を管理する政府機関によって規定された書式の注意書きが添付され得る。この注意書きは、ヒトへの投与のための製造、使用、または販売の政府機関による承認を反映する。パックまたはキットには、投与の様式、薬剤の投与順序（例えば、別々に、連続して、または同時に）などに関する情報が表示され得る。パックまたはキットには、治療を行うことを患者に記憶させておくための手段も含まれ得る。パックまたはキットは、組み合わせ治療の単一の単位投与量であり得るか、または、複数の単位投与量でもあり得る。具体的には、因子は、個別にされ得、任意の組み合わせで互いに混合され得、1つのバイアル中にまたは錠剤中に存在させられ得る。ブリスターパックまたは他の分散手段に集められた因子が、本発明によって想像される。本発明の目的のために、単位投与量は、それぞれの試薬の個々の薬物動態によって異なり、標準的な時間経過においてFDAで承認された投与量で投与される投与量を意味するように意図される。
【０１３０】
治療方法
本発明はまた、BMP2治療剤を使用する、骨粗鬆症または骨粗鬆症に対する罹患性についての処置（予防的および／または治療的）の方法に関する。「BMP2治療剤」は、本明細書中に記載されるように、BMP2ポリペプチドの活性および／またはBMP2の発現を変化させる（例えば、増大させるかもしくは阻害する）因子（例えば、BMP2アゴニストまたはアンタゴニスト）である。
【０１３１】
BMP2治療剤は、BMP2ポリペプチドの活性または遺伝子発現を、例えば、さらなるBMP2ポリペプチドを提供することによるか、またはBMP2遺伝子の転写もしくは翻訳をアップレギュレートさせることによるか；BMP2ポリペプチドの翻訳後プロセシングを変化させることによるか；BMP2スプライシング変異体の転写を変化させることによるか；あるいはBMP2ポリペプチドの活性を妨害することによるか（例えば、BMP2ポリペプチドに結合することによる）、またはBMP2遺伝子の転写もしくは翻訳をダウンレギュレートさせることによるような種々の手段によって、変化させることができる。代表的なBMP2治療剤としては、以下が挙げられる：本明細書中に記載される核酸またはその断片もしくは誘導体、具体的には、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド、およびそのような核酸（例えば、BMP2ポリペプチドまたはその活性のある断片もしくは誘導体をコードする核酸のような、遺伝子、cDNA、および／またはmRNA、あるいは、オリゴヌクレオチド；例えば、配列番号1であって、任意に表2、3、および4に示される少なくとも1つの多型を含むもの、または、配列番号2をコードする核酸であって、任意に表2、3、および4に示される少なくとも1つの多型を含むもの、またはその断片もしくは誘導体）を含むベクター；本明細書中に記載されるポリペプチド（例えば、表2、3、および4に示される少なくとも1つの多型を含む配列番号2、および／あるいはBMP2、またはその断片もしくは誘導体によってコードされる他のスプライシング変異体）；他のポリペプチド（例えば、BMP2受容体）；BMP2R2、BMPR1A、およびBMPR1Bを含むがこれらに限定されないBMP2結合因子；ペプチド模倣物；それらの融合タンパク質またはプロドラッグ；抗体（例えば、上記のような、変異BMP2ポリペプチドに対する抗体、または非変異BMP2ポリペプチドに対する抗体、またはBMP2によってコードされる特定のスプライシング変異体に対する抗体）；リボザイム；他の低分子；ならびにBMP2遺伝子の発現またはポリペプチド活性を変化させる（例えば、増大させるかもしくは阻害する）か、またはBMP2スプライシング変異体の転写を調節する他の因子（例えば、どのスプライシング変異体が発現されるかに影響を与える因子、または発現されるそれぞれのスプライシング変異体の量に影響を与える因子）。
【０１３２】
BMP2R2、BMPR1A、およびBMPR1Bは、BMP2タンパク質に結合する細胞表面受容体である。BMP2タンパク質はこれらの受容体に結合し、次いで、特定の細胞内応答を刺激する（Fujii,M.ら, Mol. Biol. Cell, 10（11）3801-13（1999）；Massague,J., Annu. Rev. Biochem., 67:753-91（1998）；Chen,D.ら, J. Cell Biol., 142（1）:295-305（1998）；およびKirsch,T.ら, Nature Structural Biology, 7（6）:492-496（2000））。既知のBMP2の直接の阻害因子、例えば、nogginおよびchordinもまた存在している（少なくともnoggin；chordinは他のBMPの既知の阻害因子である）（Zimmerman,L.B.ら, Cell, 86:599-606（1996）；Aspenberg,P.ら, J. Bone Miner. Res., 16（3）:497-500（2001）；およびDale.,L.ら, Bioessays, 21（9）:751-60（1999））。
【０１３３】
1つより多いMP2治療剤が、所望される場合には、別の治療剤と同時に使用され得る。
【０１３４】
核酸であるBMP2治療剤は、骨粗鬆症の処置または骨粗鬆症に対する罹患性の処置において使用される。用語「処置」は、本明細書中で使用される場合は、疾患に関連する症状を緩和することだけではなく、疾患の発症を防ぐことまたは遅らせること、さらには、疾患の症状の重篤度または頻度を減少させることをもいう。治療は、個体中でのBMP2ポリペプチドの活性を変化させる（例えば、阻害するかまたは増大させる）、置き換える、または補うように設計される。例えば、BMP2治療剤は、BMP2遺伝子またはBMP2の特定のスプライシング変異体の発現または有用性をアップレギュレートまたは増大させるために、あるいは逆に、BMP2遺伝子またはBMP2の特定のスプライシング変異体の発現または有用性をダウンレギュレートまたは低下させるために、投与され得る。天然のBMP2核酸または特定のスプライシング変異体の発現または有用性のアップレギュレーションまたは増大は、欠損遺伝子または別のスプライシング変異体の発現または活性を妨害するかまたは補うことができる。天然のBMP2核酸または特定のスプライシング変異体の発現または有用性のダウンレギュレーションまたは低下は、欠損遺伝子または特定のスプライシング変異体の発現または活性を最小にすることができ、これによって、欠損遺伝子または特定のスプライシング変異体の影響を最小にすることができる。ある態様では、BMP2治療剤は、健常な遺伝子または遺伝子産物（配列番号2）であり、例えば、骨粗鬆症には関係していないBMP2核酸および遺伝子産物である。
【０１３５】
BMP2治療剤（単数または複数）は、治療有効量（例えば、疾患に関連する症状を緩和することによる、疾患の発症を妨げるかまたは遅らせることによる、および／または疾患の症状の重篤度または頻度を低下させることにもよるような、疾患を処置するために十分な量）で投与される。特定の個体の障害または症状の処置において治療上有効である量は、疾患の症状および重篤度に応じて変化し、標準的な臨床的技術によって決定され得る。さらに、インビトロまたはインビボでのアッセイが、任意に、最適な投与量範囲の同定を助けるために使用され得る。処方物中で使用される正確な用量も、また、投与経路、および疾患または障害の重篤度に応じて変化し、これは、医師の判断とそれぞれの患者の状況に従って決定されるべきである。有効量は、インビトロ試験システムまたは動物モデル試験システムから導き出された用量応答曲線から推定され得る。
【０１３６】
ある態様では、本発明の核酸（例えば、配列番号1であって、任意に表2、3、および4に示される少なくとも1つの多型を含むもののような、BMP2ポリペプチドをコードする核酸、あるいは、配列番号2をコードし、表2、3、および4に示される少なくとも1つの多型を含む核酸のような、BMP2ポリペプチド、またはそのスプライシング変異体、誘導体もしくは断片をコードする別の核酸が、単独で、または上記の薬学的組成物中のいずれかで、使用され得る。例えば、BMP2またはBMP2ポリペプチドをコードするcDNAは、それ自体、またはベクター中に含まれてのいずれかで、細胞が天然のBMP2ポリペプチドを生産するように、細胞に導入（インビトロまたはインビボのいずれかで）され得る。必要である場合には、遺伝子もしくはcDNA、または遺伝子もしくはcDNAを含むベクターで形質転換されている細胞が、疾患に罹患した個体に導入（または再導入）され得る。したがって、性質において、天然のBMP2の発現および活性が欠損している細胞、または変異体BMP2の発現および活性を有している細胞、または疾患関連BMP2スプライシング変異体の発現を有している細胞は、BMP2ポリペプチド、またはBMP2ポリペプチドの活性のある断片（またはBMP2ポリペプチドの異なる変異体）を発現するように操作され得る。ある態様では、BMP2ポリペプチドをコードする核酸、またはその活性のある断片もしくは誘導体が、ウイルスベクターのような発現ベクター中に導入され得、ベクターは、動物中の適切な細胞に導入され得る。ウイルスのおよびウイルス以外の導入システムを含む、他の遺伝子導入システムが使用され得る。あるいは、ウイルス以外の遺伝子導入方法、例えば、リン酸カルシウム共沈、機械的技術（例えば、マイクロインジェクション）；リポソームを介する膜融合体媒介性導入；または直接的なDNAの取り込みもまた、使用され得る。
【０１３７】
あるいは、本発明の別の態様では、本発明の核酸；本発明の核酸に相補的な核酸；またはそのような核酸の一部（例えば、以下に記載されるようなオリゴヌクレオチド）が、「アンチセンス」治療において使用され得る。ここでは、BMP2のmRNAおよび／またはゲノムDNAに特異的にハイブリダイズする核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）が投与されるか、またはインサイチュで作成される。mRNAおよび／またはDNAに特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸は、例えば、翻訳および／または転写を阻害することにより、BMP2ポリペプチドの発現を阻害する。アンチセンス核酸の結合は、従来の塩基対相補性により得るか、または例えば、DNA二本鎖への結合の場合には、二重ヘリックスの深いほうの溝における特異的相互作用を介するものであり得る。
【０１３８】
本発明のアンチセンス構築物は、例えば、上記のような発現プラスミドとして送達され得る。プラスミドが細胞中で転写されると、これにより、BMP2ポリペプチドをコードするmRNAおよび／またはDNAの一部に相補的なRNAが生じる。あるいは、アンチセンス構築物は、エキソビボで作成されて細胞に導入されるオリゴヌクレオチドプローブであり得る。これは、次いで、BMP2のmRNAおよび／またはゲノムDNAとハイブリダイズすることにより発現を阻害する。ある態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、内因性のヌクレアーゼ、例えば、エキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼに耐性である修飾されたオリゴヌクレオチドであり、それによりオリゴヌクレオチドプローブをインビボで安定にする。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしての使用のための例示的な核酸分子は、DNAのホスホルアミデート、ホスホチオエート、およびメチルホスホネート類似体である（米国特許第5,176,996号、同第5,264,564号、および同第5,256,775号をもまた参照のこと）。さらに、アンチセンス治療に有用なオリゴマーを構築するための一般的な手法はまた、例えば、Van der Krolら,（（1988）Biotechniques 6:958-976）；およびSteinら,（（1988）Cancer Res 48:2659-2668）にも記載されている。アンチセンスDNAに関して、翻訳開始部位、例えば、BMP2配列の−10と＋10の間の領域由来のオリゴデオキシリボヌクレオチドが利用され得る。
【０１３９】
アンチセンス治療を行うために、BMP2をコードするmRNAに相補的であるオリゴヌクレオチド（mRNA、cDNA、またはDNA）が設計される。アンチセンスオリゴヌクレオチドはBMP2 mRNA転写物に結合し、翻訳を妨げる。絶対的な相補性は必要ではない。RNAの一部に対しての配列「相補性」は、本明細書中で使用される場合は、配列が、RNAとハイブリダイズして、安定な二本鎖を形成できるための十分な相補性を有していることを示す。二本鎖のアンチセンス核酸の場合には、二本鎖DNAのうちの一方の鎖がこのようにして試験され得るか、または三本鎖の形成がアッセイされ得る。ハイブリダイズする能力は、上記に詳細に記載されるように、アンチセンス核酸の相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。一般的には、ハイブリダイズする核酸が長いほど、これにはRNAとのより多くの塩基ミスマッチが含まれ得、なおも安定な二本鎖（または場合によっては、三本鎖である場合もある）を形成することができる。当業者は、標準的な手順の使用により、容認される程度のミスマッチを確認することができる。
【０１４０】
アンチセンス治療において使用されるオリゴヌクレオチドは、DNA、RNA,またはキメラ混合物もしくは誘導体、またはそれらの修飾されたバージョン、一本鎖または二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、分子、ハイブリダイゼーションなどの安定性を改善するために、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で修飾され得る。オリゴヌクレオチドには、ペプチドのような他の付加基（例えば、インビボで宿主細胞受容体を標的化するため）、あるいは、細胞膜を通過する（例えば、Letsingerら,（1989）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556；Lemaitreら,（1987）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652；PCT国際公開番号WO88／09810）を参照のこと）、もしくは血液脳関門を通過する（例えば、PCT国際公開番号WO89／10134を参照のこと）輸送を容易にする因子、あるいはハイブリダイゼーションによって誘発される切断因子（例えば、Krolら,（1988）BioTechniques 6:958-976を参照のこと）、あるいは挿入剤（例えば、Zon,（1988）Pharm. Res. 5:539-549を参照のこと）が含まれ得る。この目的のためには、オリゴヌクレオチドを、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーションによって誘発される架橋剤、輸送因子、ハイブリダイゼーションによって誘発される切断因子）に結合させることもできる。
【０１４１】
アンチセンス分子は、インビボでBMP2を発現する細胞へと送達される。多数の方法が、アンチセンスDNAまたはRNAを細胞に送達するために使用され得る。例えば、アンチセンス分子は、組織部位に直接注入され得るか、または、所望される細胞を標的化するように設計された修飾されたアンチセンス分子（例えば、標的細胞の表面上で発現される受容体または抗原に特異的に結合するペプチドまたは抗体に連結されたアンチセンス）が、全身投与され得る。あるいは、別の態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なプロモーター（例えば、pol IIIまたはpol II）の制御下に配置されている組み換えDNA構築物が利用される。患者の中の標的細胞をトランスフェクトするためにそのような構築物を使用することにより、内因性BMP2転写物と相補的な塩基対を形成する十分な量の一本鎖RNAの転写が生じ、それによって、BMP2 mRNAの翻訳が妨げられる。例えば、ベクターは、細胞によって取り込まれて、アンチセンスRNAの転写を指示するように、インビボで導入され得る。このようなベクターはエピソームであり続けることができるか、またはそれが所望されるアンチセンスRNAを生産するように転写され得る限りは、染色体に組み込まれ得る。このようなベクターは、当該分野で標準的である上記の組み換えDNA技術方法によって構築され得る。例えば、プラスミド、コスミド、YAC、またはウイルスベクターが、組織部位に直接導入することができる組み換えDNA構築物を調製するために使用され得る。あるいは、ウイルスベクターは、投与を別の経路によって（例えば、全身的に）行うことができる場合には、所望される組織を選択的に感染させるために使用され得る。
【０１４２】
内因性BMP2の発現はまた、標的化された相同組み換えを使用して、BMP2またはそのプロモーターを不活化させるかまたは「ノックアウト」することによっても低下させられ得る（例えば、Smithiesら,（1985）Nature 317:230-234；Thomas & Capecchi（1987）Cell 51:503-512；Thompsonら,（1989）Cell 5:313-321を参照のこと）。例えば、内因性のBMP2（BMP2のコード領域または調節領域のいずれか）に相同であるDNAが隣接している変異非機能性BMP2（または完全に無関係なDNA配列）が、インビボでBMP2を発現する細胞をトランスフェクトするために、選択マーカーおよび／または陰性選択マーカーとともに、あるいはそれらを伴わずに使用され得る。DNA構築物の、標的化された相同組み換えによる挿入により、BMP2の不活化を生じる。組み換えDNA構築物は、直接投与され得るか、または上記のような適切なベクターを使用して必要とされる部位に対してインビボで標的化され得る。あるいは、非変異BMP2の発現は、同様の方法を使用して増大させられ得る。標的化された相同組み換えが、非変異機能性BMP2を含むDNA構築物（例えば、配列番号1を有している核酸）またはその一部を、上記のように、細胞中の突然変異体BMP2の代わりに挿入するために使用され得る。別の態様では、標的化された相同組み換えが、細胞中に存在するものとは異なるBMP2ポリペプチド変異体をコードする核酸を含むDNA構築物を挿入するために使用され得る。
【０１４３】
あるいは、内因性BMP2の発現は、BMP2の調節領域（すなわち、BMP2プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的であるデオキシリボヌクレオチド配列を標的化することによって減少させられて、体内の標的細胞中でのBMP2の転写を妨げる三重ヘリックス構造が形成され得る（一般的には、Helene,C.（1991）Anticancer Drug Des.,6（6）:569-84；Helene,C.ら,（1992）Ann, N.Y. Acad. Sci., 660:27-36；およびMaher,L.J.（1992）Bioassays 14（12）:807-15を参照のこと）。同様に、本明細書中に記載されるアンチセンス構築物は、BMP2タンパク質の1つの正常な生物学的活性をアンタゴナイズすることにより、インビボおよびエキソビボの組織培養物の両方において、組織の操作、例えば、組織の分化に使用され得る。さらに、アンチセンス技術（例えば、アンチセンス分子のマイクロインジェクション、またはその転写物がBMP2 mRNAもしくは遺伝子配列に対してアンチセンスであるプラスミドでのトランスフェクション）が、発生事象におけるBMP2の役割、さらには、成体組織中でのBMP2の正常な細胞性機能を研究するために使用され得る。このような技術は、細胞培養物において利用され得るが、トランスジェニック動物の作成においてもまた使用され得る。
【０１４４】
本発明のさらに別の態様では、本明細書中に記載される他のBMP2治療剤もまた、骨粗鬆症の処置または予防において使用され得る。治療剤は、上記のような組成物中で、またはそれ自体で送達され得る。これらは全身投与され得るか、または特定の組織に対して標的化され得る。治療剤は、例えば、化学合成、組み換え生産、インビボ生産（例えば、Meadeらの米国特許第4,873,316のようなトランスジェニック動物）を含む種々の手段によって生産され得、そして本明細書中に記載されている手段のような標準的な手段を使用して単離され得る。
【０１４５】
上記の処置方法の任意の組み合わせ（例えば、変異BMP2 mRNAを標的化するアンチセンス治療に関連した、非変異BMP2ポリペプチドの投与、BMP2によってコードされる第2の変異体を標的化するアンチセンス治療に関連した、BMP2によってコードされる変異体の投与）もまた、使用され得る。
【０１４６】
本発明は、以下の限定的ではない実施例によってさらに記載される。本明細書中で引用される全ての刊行物の教示は、それらの全体が引用により本明細書中に援用される。
【実施例１】
【０１４７】
骨粗鬆症に関係しているBMP2核酸の同定
表現型および家族構成
弱い衝撃での骨折（low impact fracture）を有している、および／または骨粗鬆症を処置するためのビスホスホネートを摂取している患者を、罹患しているとして自動的に処置する。骨密度（BMD）測定値が低いヒトを骨粗鬆症とみなし、彼らは骨折のリスクが実質的に高いことが示されている。BMD測定値は、股関節および背骨の両方について測定する。BMD測定したそれぞれのヒトについて、標準化したBMDスコアを計算し（集団について平均0、標準偏差1）、これを、性別、年齢、体重、およびホルモン補充療法（HRT）について調整する。組み合わせ分析のために、2つの測定値を足し算する。アイスランドおよび米国での集団のBMDデータを、標準化および調整に使用する。例えば、正のBMDスコアを有しているヒトは、彼／彼女の年齢、体重、および場合によってはHRTの平均を上回り、負のスコアを有しているヒトは平均を下回る。ほぼ正常であるとすれば、−1のスコアは、低い方から第16百分位数にほぼ対応する、などである。
【０１４８】
分析のために、本発明者らは、BMD測定値を有しているヒト、および／または重症に罹患しているヒト、ならびに本発明者らが遺伝子型を有しているヒトである、第一次のヒトの現状のリストを用いて開始する。次いで、本発明者らは、5回の減数分裂事象の限界距離を使用してこれらの第一次のヒトを関連づける家族の群を作成するために、系図学のデータベースを使用する。この手順により、全部で1215人の第一次のヒトに関して、190の可能性のある情報の群が得られた。
【０１４９】
連鎖データ
4回の全ゲノムスキャン（GWS）を、種々の骨格部位にある骨粗鬆症の表現型を使用して行った；股関節、脊椎、および複合型の表現型。全てのGWS分析は、Marshfieldマップに基づいた10cMと30cMの間の、Chr20上の20cMの領域に配置した。
【０１５０】
全ての分析を、deCODEで開発されたAllegroリンケージプログラム（Gudbjartssonら, Nature Genetics, 25:12-13, 2000年5月）を使用して行った。対立遺伝子共有分析には、GENEHUNTERのSpairsスコア機能（Kruglyakら, Am. J. Hum. Genet., 46:1347-1363, 1996）を使用する。しかし、家族間で等しく重み付けをすることと、罹患した対の間で等しく重み付けをすることとの歩み寄りである方法論を使用して、家族に重み付けをした。対立遺伝子共有LODスコアを、KongおよびCox, Am. J. Hum. Genet., 61:1179-1188（1997）に記載されている「指数モデル」を使用して計算した。
【０１５１】
股関節
使用した表現型は、年齢、性別、体重、および股関節（股関節全体）についてのHRT修正済みのBMD＜−1 SDであった。股関節骨折の症例およびビスホスホネートの使用者もまた、値が−1 SDを上回る場合でも、罹患しているとみなした。全部で346の罹患をこの分析に使用した。GWSにより、本発明者らの標準的なマーカーのセットを使用して、3.1のLODスコアが得られた。目的の領域（11cMと39cMの間）に10のさらなるマーカーを加えることにより、3.3のLODスコアが得られた。
【０１５２】
脊柱
表現型は、年齢、性別、体重、および腰椎（L2〜L4）についてのHRT修正済みのBMD＜−1 SDであった。脊椎骨の圧迫骨折の症例およびビスホスホネートの使用者も、値が−1 SDを上回る場合でも、罹患しているとみなした。全部で402の罹患したヒトをこの分析に使用した。GWSにより、標準的なマーカーのセットを使用した股関節の分析と同じ位置では、2.4のLODスコアが得られたが、さらなるマーカーのセットを用いた場合には、2.9のLODスコアが得られた。
【０１５３】
複合型
使用した表現型は、修正済みのBMDの和＜−1.5 SDであった。脊椎骨の圧迫骨折、股関節骨折、他の骨粗鬆症に関係している弱い衝撃での骨折（少なくとも2箇所の骨折）、およびビスホスホネートの使用者（得られる場合には、処置の開始前のBMD測定値を使用する）は全て罹患しているとみなす。全部で522の罹患をこの分析において使用した。GWSにより、標準的なマーカーのセットを用いた場合には、2.5のLODスコアが得られたが、この領域内でさらなるマーカーのセットを用いた場合には、3.9のLODスコアが得られた。
【０１５４】
複合型の重症
使用した表現型は、年齢、性別、体重、およびHRT修正済みのBMDの和＜−2.3 SDであった。脊椎骨の圧迫骨折、股関節骨折、他の骨粗鬆症に関係している弱い衝撃での骨折（少なくとも2箇所の骨折）、およびビスホスホネートの使用者は罹患している。この分析における罹患の数は290であった。GWSにより、標準的なセットを用いた場合には、3.8のLODスコアが得られたが、加えてさらなる10個のマーカーを使用した場合には、4.7のLODスコアが得られた。
【０１５５】
コルチコステロイドの使用者および早い閉経を迎えた女性は、全ての分析において罹患しているとして排除した。
【０１５６】
BMP2遺伝子
BMP2核酸はこの領域に存在する。マーカーD20S846（これは、最も高いLODスコアを生じる）と遺伝子の3'末端の間はわずか5kbしかない。この遺伝子は配列決定されており、エキソン／イントロン構造、プロモーター領域、および転写開始部位に関して特徴付けられている。この情報は公に入手できる。
【０１５７】
多数のヌクレオチド変化がアイスランドの集団において観察される。これらの変化は、本発明者らの知る限りでは以前には記載されていなかった（表２を参照のこと）。
【０１５８】
BMP2は、受容体BMPR-IAまたはBMPR-IB、およびBMPR-IIに結合して、受容体複合体ヘテロ二量体の形成、およびBMPR-IAまたはBMPR-IB受容体のリン酸化を導く。一旦活性化されると、これらの受容体は続いて、SMAD1、SMAD5、またはSMAD8をリン酸化し、これらは次いでSMAD4と複合体を形成し、特定の遺伝子の転写が影響を受ける核へと転位する（Massague,J.,Annu. Rev. Biochem., 67:753-791（1998）；Chen,D.ら, J. Cell Biol., 142（1）:295-305（1998）。SMAD6およびSMAD7は、BMP2受容体によるSMAD1、SMAD5、またはSMAD8の活性化を妨害することによってシグナルをブロックし、骨芽細胞の分化を阻害することが示されている（Miyazono,K., Bone, 25（1）:91-93（1999）；Fujii,M.ら, Mol. Biol. Cell, 10（11）:3801-3813（1999））。BMP2はCbfal、アルカリホスファターゼ、およびI型コラーゲン（骨芽細胞特異的タンパク質）の発現を、BMPR-IB介して刺激する（Chen,D.ら, J. Cell Biol., 142（1）:295-305（1998））。Cbfalは、オステオプロテゲリン（OPG）の発現を調節する。オステオプロテゲリンは、骨芽細胞の分化の強力な阻害因子として、したがって、骨の再吸収の強力な阻害因子として作用する、骨芽細胞によって分泌される糖タンパク質である（Thirunavukkarasu,K.ら, J. Biol. Chem.,（2000））。Cbfalは骨芽細胞の分化および骨の形成を制御する。ヒトの骨芽細胞の細胞老化の間に、Cbfal mRNAは顕著に減少（50％まで）する（Christiansen,M.ら, J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci., 55（4）:B194-200（2000））。
【０１５９】
結果および考察
連鎖分析の結果として、この分析は、この遺伝子座が複数の骨粗鬆症の表現型に関係していることを示している。さらに、ヒトBMP2核酸内での変異は、おそらく、これらの家族における表現型を説明付ける。骨粗鬆症の散発的な発生、すなわち、家族関係のない発生もまた、本明細書中に含まれる情報を使用して決定することができる。
【０１６０】
骨粗鬆症は、以下のようなBMP2核酸中での欠損によって引き起こされ得る。BMP2核酸における変化（転写変異体、スプライシング変異体、タンパク質変異体など）は、Cbfalに対する、BMPR-IBを介するその作用およびそれに続くシグナル伝達経路の減少を導くことができた。これは、より少数の、より活性の低い骨芽細胞が原因で、より少ない骨の形成を導き、そしてより少数のOPGおよびより多い破骨細胞が原因で、より多くの骨の再吸収を導く。これにより、骨組織の減少が導かれる。Cbfalレベルの有意な低下が老化している骨芽細胞に関係しているので、この作用は、年齢を重ねるほどにさらに重要となり得る。
【０１６１】
【表１】
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【０１６２】
【表２】
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【実施例２】
【０１６３】
BMP2核酸配列の直接的な配列決定により他の多型が明らかになる
さらなる遺伝的マーカーを、種々の集団においてこの領域を直接配列決定することによって、BMP2核酸において同定した。これらを、以前のSNPアップデートファイルにおける配列AL035668と比較したヌクレオチド位置とともに、表3に列挙する。
【０１６４】
【表３】
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【０１６５】
骨粗鬆症の表現型に対する種々のSNPのさらなる連鎖データを、表4に列挙する。表４には、SNPの表現型との関係についてのp値（p値）、相対的リスク（r）、罹患した個体の割合（Aff.freq.carrier）、罹患した個体の数（#aff）、対照の割合（Ctrl.freq.carrier）、対照の数（#ctrl）、対立遺伝子の同定、およびスクリーニングした表現型を列挙する。
【０１６６】
【表４】
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【０１６７】
本発明は、その好ましい態様に関して具体的に示され記載されているが、形式および詳細における種々の変更が、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、その中で行われ得ることが、当業者に理解されるであろう。
【配列表】
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【国際調査報告】
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2006515992.tif 000019
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