(57)【要約】本発明は、核酸配列のメチル化プロファイルの確定および対応する対照配列と比較した場合の標的核酸配列中の１以上の塩基の変化の判定のための改善された方法を提供する。これらの方法は、ＰＣＲなどの公知の増幅技法と併合できる一段法である。本発明はまた、メチル化プロファイルによる、または１以上の塩基の突然変異のための核酸配列の変化の判定方法を提供する。
2004512050.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列のメチル化プロファイルを確定するための方法であって、
（ａ）核酸配列を亜硫酸水素で処理して、その核酸配列内の非メチル化シトシンをウラシルに変換して、変換型核酸配列を作製すること；
（ｂ）処理した核酸配列を、上記の変換型核酸配列に対してのみ特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅すること、但し、その増幅条件には、増幅された核酸におけるシグナル物質の取込みが含まれ、そのシグナル物質は二本鎖核酸と一本鎖核酸とを区別できるようにするものである；
（ｃ）温度変化により起こる核酸の二本鎖と一本鎖とのトランジションの際のシグナル物質の量を検出すること；
（ｄ）その温度変化の際に検出されたシグナル物質の量を測定することにより、その標的核酸配列のメチル化プロファイルを確定すること；
を含む上記方法。
【請求項２】
標的核酸配列が動物由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的核酸配列がヒト由来である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
標的核酸が腫瘍細胞由来である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
標的核酸配列が植物または原核生物由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
シグナル物質が蛍光団である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
亜硫酸水素が亜硫酸水素ナトリウムである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
疾病症状に関連する核酸メチル化プロファイルの存在の判定方法であって、試験核酸を予め候補疾患細胞から得ておくこと、ならびに
（ａ）核酸配列を亜硫酸水素で処理して、核酸配列内の非メチル化シトシンをウラシルに変換して、変換型核酸分子を作製するステップ；
（ｂ）処理した核酸配列を、その変換型核酸配列に対してのみ特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅するステップ、但し、その増幅条件は増幅された核酸におけるシグナル物質の取込みを含み、そのシグナル物質は二本鎖核酸と一本鎖核酸とを区別できるようにするものである；
（ｃ）温度変化により生じる核酸の二本鎖と一本鎖とのトランジションの際のシグナル物質の量を検出するステップ；そして
（ｄ）その温度変化の際のシグナル物質の量を測定し、その結果を非疾患細胞由来の対照核酸を用いて得られるものと比較することにより、上記の標的核酸配列のメチル化プロファイルを確定するステップ；
を含む、上記方法。
【請求項９】
疾病症状が、癌、遺伝的障害、代謝性疾患および年齢関連障害からなる群から選ばれる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
疾病症状が癌である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
シグナル物質が蛍光団である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
亜硫酸水素が亜硫酸水素ナトリウムである、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
核酸のトランジションが温度の上昇により起こる二本鎖から一本鎖へのものである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
標的核酸が、対照低温解離ドメインおよび高温解離ドメイン（ＧＣクランプ）を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
対照解離ドメインおよび高温解離ドメイン（ＧＣクランプ）がオリゴヌクレオチドプライマーにより標的核酸に取り込まれている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
標的核酸配列内の１以上の塩基の突然変異の検出方法であって、
（ａ）上記核酸配列に、対照低温解離ドメインおよび高温解離ドメイン（ＧＣクランプ）を組み込むステップ；
（ｂ）対照低温解離ドメインおよびＧＣクランプが組み込まれている核酸配列を、オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅するステップ；
（ｃ）増幅した核酸を、二本鎖核酸配列と一本鎖核酸配列とを識別するシグナル物質と共に提供するステップ；
（ｄ）温度の上昇により起こる核酸の二本鎖から一本鎖へのトランジションの際の上記のシグナル物質のシグナルの変化を検出するステップ；そして
（ｅ）標的核酸配列内の１以上の塩基の突然変異の存在を、その解離ピークを、同等の条件下で試験した対照核酸配列のものと比較することにより判定するステップ；
を含む、上記方法。
【請求項１７】
オリゴヌクレオチドプライマーによる増幅ステップの際に、対照低温解離ドメインおよび高温解離ドメイン（ＧＣクランプ）が変換型核酸配列に導入される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
シグナル物質が二本鎖核酸に特異的に結合する化合物である、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
試験核酸および対照核酸が動物細胞に由来する、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
動物細胞がヒト細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
試験核酸配列が腫瘍細胞に由来し、対照核酸配列がそれ対応する正常細胞に由来する、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
試験核酸および対照核酸が植物細胞に由来する、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキットであって、変換型核酸配列に特異的なプライマーを含む上記キット。
【請求項２４】
請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキットであって、標的核酸配列に特異的なプライマーを含む上記キット。
【請求項２５】
プライマーが低温解離ドメインおよび／またはＧＣクランプを含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
更に、その表面にプライマーが固定されている固相支持体を含む、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、改善された核酸の増幅およびプロファイリングに関連する物質および方法に関する。限定するものではないが、特に、例えば蛍光解離曲線分析による試験管内（ｉｎ−ｔｕｂｅ）ＤＮＡメチル化プロファイリングに関する。
【０００２】
発明の背景
５−メチルシトシン（ｍ５Ｃ）は、ＣｐＧジヌクレオチドの形態で存在し、脊椎動物のゲノム内で最も豊富な共有結合的に修飾されている塩基である。ＣｐＧジヌクレオチドの密度が高い領域、いわゆる「ＣｐＧアイランド」は、ゲノム全体にわたって散在しており、通常は遺伝子のプロモーター領域に位置している。プロモーターのＣｐＧアイランドのメチル化は、ヒストンの脱アセチル化および転写サイレンシングと関わっており（１）、正常な胚の発達、ゲノムインプリンティングおよびＸ染色体の不活性化に不可欠である。近年、腫瘍抑制遺伝子内のＣｐＧアイランドの体細胞性ｄｅ ｎｏｖｏメチル化は腫瘍発生に関与しており、インプリント遺伝子の異常なメチル化は幾つかのヒトの遺伝性疾患に関わっている（１〜３）。正常なプロセスにおいても疾患に関連するプロセスにおいてもＤＮＡメチル化が中心的役割を担っていることから、生物学的および臨床的な検体において正常および異常なメチル化パターンを検出し特性決定するための種々の方法が得られている。
【０００３】
標準的なＰＣＲおよびクローニング法において、ゲノムＤＮＡにおけるｍ５Ｃおよび他の共有結合的塩基修飾についての情報は失われる。したがって、特定の遺伝子においてｍ５Ｃを検出およびマッピングするための現行のＰＣＲ法は、増幅の前に、ゲノムＤＮＡをメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼまたは亜硫酸水素ナトリウムで処理することに基づいている。亜硫酸水素は、非メチル化シトシンをウラシルへと変換し、一方、メチル化シトシンは不活性のままである（４）。特定の標的配列は、続いて、亜硫酸水素で変換されたＤＮＡに特異的なプライマーを用いて増幅し、そのｍ５Ｃ含量について調べることができる。亜硫酸水素法の中でも極めて有効なものは、実質的にあらゆるＤＮＡ伸長鎖において特定のＣｐＧ部位にｍ５Ｃが存在することを呈示するゲノムシークエンシングである（５）。亜硫酸水素で変換されたＤＮＡを鋳型として用いるもっと簡単な方法としては、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）（６）、メチル化感受性一塩基プライマー伸長（７）および制限エンドヌクレアーゼの使用に基づく方法（８；９）が挙げられる。
【０００４】
上記の方法には明らかな利点があるが、それらの方法は全て、最初のＰＣＲ増幅とその後の生成物分析（通常はゲル電気泳動による）からなる２段階の手順を必要とする。更に、それらは、ゲノムシークエンシングを除いて、設定毎に１箇所または数箇所のＣｐＧ部位の分析に限定される。
【０００５】
発明の概要
本明細書において、本発明は、異常ＤＮＡメチル化を検出するための新規な試験管内ＰＣＲアッセイを記載するものであり、このアッセイは、シグナル検出装置（例えばフルオリメーター（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ）（ライトサイクラー）（１０）を備えるサーマルサイクラーを用い、亜硫酸水素処理の後でのメチル化対立遺伝子と非メチル化対立遺伝子との解離温度（Ｔｍ）の差を利用するものである。
【０００６】
したがって、本発明は、標的核酸配列についてのメチル化プロファイルを確定するための方法であって、
（ａ）核酸配列を亜硫酸水素（好ましくは亜硫酸水素ナトリウム）で処理して、その核酸配列内の非メチル化シトシンをウラシルに変換して、変換型核酸配列を作製すること；
（ｂ）処理した核酸配列を、上記の変換型核酸配列に対してのみ特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅すること、但し、その増幅条件には、増幅された核酸におけるシグナル物質の取込みが含まれ、そのシグナル物質は二本鎖核酸と一本鎖核酸とを区別できるようにするものである；
（ｃ）温度変化により起こる二本鎖と一本鎖との間での核酸の変換（トランジション）の際にそのシグナル物質の量を検出すること；
（ｄ）その温度変化の際に検出されたシグナル物質の量を測定することにより、標的核酸配列のメチル化プロファイルを確定すること；
を含む上記方法を提供する。
【０００７】
本発明の１つの好ましい実施形態において、核酸のトランジションとは、温度の上昇により起こる二本鎖から一本鎖になることである。あるいはまた、シグナルの変化は、温度の低下によって起こる一本鎖から二本鎖へのトランジションの際に検出してもよい。
【０００８】
標的核酸配列は、動物、植物または真核生物に由来するいずれの核酸配列であってもよい。好ましくは、標的核酸配列はヒト由来のものである。
【０００９】
最も都合が良いのは、シグナル物質が、光量計を用いて検出可能な色素（例えば蛍光色素）であることである。好ましい検出方法は、フルオリメーター（１０）の使用である。ＤＮＡの解離曲線は、ある温度変化の際に二本鎖ＤＮＡに結合している蛍光色素（例えばＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ）の蛍光を測定することにより得られる。温度変化は、直線状でもよいし、あるいは道理上可能な限り直線状に近いものであってもよい。
【００１０】
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉは本発明における好ましい発蛍光団であるが、当業者であれば、他の発蛍光団も同様に使用可能であることが理解されよう。そうした発蛍光団の例としては、アクリジンオレンジ、ヨウ化プロピジウム、臭化エチジウム、ミトラマイシン、クロモマイシン、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ（ヘキスト）Ｈ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｈ３３３４２、ＤＡＰＩ（４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール）、ＴＯＰＲＯ、ＴＯＴＯ、ＹＯＰＲＯ、ＹＯＹＯおよびＰｉｃｏｇｒｅｅｎが挙げられる。
【００１１】
あるいはまた、シグナル物質の検出は、適切なシグナル物質を使用する紫外線またはエネルギーの伝達機構を用いて達成できる。シグナル物質は、実際には、組み合せて使用される２種類の色素から成るものとすることができる。例えば、ヌクレオチドを色素標識して、その色素がそのＤＮＡに共有結合的に結合しているようにすることが可能である。一本鎖核酸と二本鎖核酸との識別を可能にする二色素系を作製してもよい。
【００１２】
上記で述べたように、本発明は、シグナル検出装置を備えたサーマルサイクラーを用いて実施できる。しかし、この方法は、標準的なＰＣＲ装置をサンプルの加熱およびシグナルの検出を可能にするもう１つの装置と組み合せて使用して実施することも可能である。そのようなもう１つの装置の一例は、Ｄａｓｈ−ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＨｙｂｒｉｄ）である。このもう１つの装置は、本発明を実施するためのキットの一部として提供してもよい（後記を参照）。
【００１３】
メチル化プロファイルの確定は、対照との比較により達成できる。例えば、試験する標的核酸が腫瘍（例えばメラノーマ）に由来するものである場合、対照は正常なメラノサイトに由来する核酸配列とすることが好都合であると考えられる。
【００１４】
本発明の第２の態様において、本発明者らは、上記で記載した解離曲線分析を、一塩基突然変異を試験管内検出するためのＰＣＲと組み合わせることを可能にする方法を提供する。
【００１５】
理論的および実験的な研究から、ＤＮＡが、各工程が「解離ドメイン（ｍｅｌｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）」と呼ばれる個々のセグメントの解離を意味する一連の工程で解離することが示された。
【００１６】
一塩基置換または他のタイプの突然変異はそのドメインのＴｍを変化させることができ、その変化は０．５℃以下である。解離特性の差異に基づく突然変異の解析は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）により達成でき、この場合、変性剤の勾配の増大がゲル内での温度勾配をシミュレートする（ＡｂｒａｍｓおよびＳｔａｎｔｏｎ， １９９２）。温度を非常に正確に段階的に上昇させるための機器を用いて、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒら（１９８３）は、一塩基置換により相違しているＤＮＡ断片同士が、ＵＶ吸光度測定値により判定した場合に、異なるＴｍを示すことを示した。近年、微量フルオリメーターと急速温度サイクラーとを兼ね備えた機器が利用できるようになった。これらの機器を用いれば、解離曲線は、ＰＣＲの直後に、直線的に温度を変化させている際に二本鎖ＤＮＡ色素の蛍光を測定することによって得ることができる。これは、配列相同性のない無関係なＰＣＲ産物同士を識別するのに用いられている（Ｒｉｒｉｅら， １９９７）。しかし、これらの微量フルオリメーターを備えたサーマルサイクラーを用いることによる小さな突然変異の検出は、次の幾つかの理由により、非常に困難になる。
【００１７】
１）幾つかの突然変異では、溶液中にホモ二本鎖およびヘテロ二本鎖が存在していても、正味のＴｍは変化しない。
【００１８】
２）塩および色素の濃度は、ＰＣＲ産物の解離ピークの幅および絶対的位置に有意に影響を及ぼす可能性がある。
【００１９】
３）急速な温度の変化および比較的厳密性に欠ける温度の調節は、絶対的なＴｍに影響を及ぼし、試験管間の有意なバラツキの原因となる可能性がある。
【００２０】
したがって、１つの塩基の変化によるＴｍの僅かな変化の検出は、適切な内部対照を添加することによってのみ達成可能である。
【００２１】
この本発明の第２の態様の原理は、Ｔｍについての内部対照がＰＣＲ産物自体の内部に含まれることである。図５Ａに、Ｎ−ｒａｓ原癌遺伝子の第２エキソンの解離マップを示す。図５Ｂに、対照低温解離ドメイン（「ａ」）および高温解離ドメイン（「ＧＣクランプ」）（「ｃ」）を人為的に付加した後の同じ領域の解離マップを示す。これらの人為的なドメインはＰＣＲプライマーにより容易に取り込まれる。ＧＣクランプは、新しい最高温解離ドメインを導入し、鎖同士を保持するための「ハンドル」として作用する。対照ドメインは、対象の配列を含むドメインのＴｍよりも２〜３℃低いＴｍを有する。この対照ドメインの解離ピークの高さおよび幅、その解離ピークの下の面積、ならびにその解離ピークのＴｍが対照パラメーターとして用いられる。したがって、本発明の第２の態様は、標的核酸配列内の１以上の塩基の突然変異の検出方法であって、
（ａ）核酸配列に、対照低温解離ドメインおよび高温解離ドメイン（ＧＣクランプ）を組み込むステップ；
（ｂ）対照低温解離ドメインおよびＧＣクランプが組み込まれた核酸配列を、オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅するステップ；
（ｃ）増幅した線状核酸を、二本鎖核酸配列と一本鎖核酸配列とを識別するシグナル物質と共に提供するステップ；
（ｄ）温度の上昇により起こる核酸の二本鎖から一本鎖へのトランジションの際の、上記のシグナル物質のシグナルの変化を検出するステップ；そして
（ｅ）標的核酸配列内の１以上の塩基の突然変異の存在を、その解離ピークを、同等の条件下で試験した対照核酸配列のものと比較することにより判定するステップ；
を含んでなる、上記方法を提供する。
【００２２】
対照低温解離ドメインおよびＧＣクランプは、ＰＣＲ増幅工程の一部として組み込まれることが好ましい。好ましくは、これらの配列を含み、したがって得られるＰＣＲ二本鎖増幅産物がこれら２つのドメインならびに標的核酸配列（中温の解離ドメイン）を含むＰＣＲプライマーが提供される。
【００２３】
標的核酸配列が、対照の核酸配列と比較して１以上の突然変異（相違）を含むか否かを判定するために、本発明のこの第２の態様の方法は、同等の（好ましくは同一の）条件下で双方の配列（標的および対照）について行う。例えば、標的核酸配列は腫瘍細胞（例えばメラノーマ細胞）に由来するものとすることができ、対照はそれに対応する正常な細胞（例えばメラノサイト）に由来するものとすることができる。この例において、この方法の工程（ｅ）に従って行われる判定は、標的核酸配列の中間解離ドメインおよび低解離ドメインと対照核酸配列の中間解離ドメインおよび低解離ドメインとの比較である。示されている実施例の詳細な説明を参照されたい。
【００２４】
上記で述べたように、シグナル物質は、二本鎖核酸には特異的に結合するが一本鎖核酸には結合しないシグナルとすることができる。したがって、核酸配列が加熱されて鎖が変性すると、シグナルは消失し始め、変化が測定できる。あるいはまた、複数のシグナルを用いることも可能であり、この場合、シグナルタイプの変化は、二本鎖核酸配列と一本鎖核酸配列との違いを同定する。
【００２５】
本発明の全ての態様は、核酸のメチル化プロファイルに関連する疾患状態の診断を支援するために使用できる。例えば、哺乳動物細胞に関しては、発達および細胞分化の異常が、核酸のメチル化レベルと関連する場合が多い。したがって、本発明は、これらのレベルまたはレベルの差を測定しモニターできる迅速かつ効率的な方法を提供する。同様に、植物の育種では、植物ＤＮＡのメチル化レベルの変化を知ることが重要である場合が多い。更に、本発明は、疾患の診断で使用するための、核酸のメチル化プロファイルのデータベースを提供するのに使用できる。本発明のこれらのデータベースまたは方法は、医療目的の治療方法において医療従事者を支援するのに使用できる。
【００２６】
本発明の更に別の態様において、上記に記載した本発明の方法を実施するための研究用ツールまたはキットが提供される。このツールまたはキットは、異なる病理を判定するように設計された数種の核酸プライマーを含むことができる。キットは、核酸配列のメチル化プロファイルまたは数を測定するための複数のプライマーが固定されている固相支持体を含んでなるチップまたはビーズの形態を取ることができる。また、キットは、好ましくは、ＰＣＲ反応を実施するのに必要な成分ならびに検出用化合物（例えば発蛍光団）も含む（上記を参照のこと）。キットはまた、本発明の第１または第２の態様による方法を行うための成文化された指示書も含むことができる。
【００２７】
したがって、本発明には、医療目的の研究診断および治療の分野において多くの用途がある。本発明の方法は、新規および既知の遺伝子を異常なＤＮＡメチル化または突然変異のパターンについて調べるための研究用ツールとして使用できる。これらの方法は、既知／新規の遺伝子と遺伝的疾患もしくは病理との新規な相関関係を同定するためのスクリーニングアッセイとして使用できる。
【００２８】
本発明の最も重要な使用の１つは、診断の分野においてである。例えば、上記の方法は、異なる癌タイプ、遺伝的障害、代謝性疾患、または年齢に関連する病理などの他の病理と関連する特定のメチル化パターンを同定するのに使用できる。そのような方法から得られる結果は、患者に必要な治療のタイプを確定する上で医療従事者を支援する。更に、上記の方法は、化学療法に対する腫瘍の応答性を予測できる特定のメチル化パターンを同定するのに使用できる（例えばＭａｎｅｌ Ｅｓｔｅｌｌｅｌら， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ． Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， 第３４３巻， Ｎｏ．１９， ２０００を参照）。
【００２９】
図面の説明
各図面の簡単な説明は後述する。
【００３０】
本発明の態様を、例として添付の図面を参照しながらここに更に詳細に説明するが、それらは一例であって、限定しようとするものではない。本発明の更なる態様は、当業者には明らかであろう。本明細書中で引用される全ての文献は参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【００３１】
詳細な説明
非メチル化シトシンを亜硫酸水素ナトリウムでウラシルへと変換し、続いてウラシルをチミンへとＰＣＲにより変換した後では、メチル化対立遺伝子および非メチル化対立遺伝子は、それらのＧＣ含量が異なるために熱安定性が違っていると予測される（Ｇｕｌｄｂｅｒｇら， １９９８）。ＴｍがＧＣ含量に依存性であることの主な理由は、Ｇ：Ｃ塩基対が３つの水素結合を含み、Ａ：Ｔ塩基対（２つの水素結合しか含まない）よりも安定なことである。図１に、どのようにして増幅産物のＴｍが元のＤＮＡサンプル中のメチル化対立遺伝子と非メチル化対立遺伝子との比較によって測定されるのかを概略的に示す。全ての対立遺伝子が完全にｍ５Ｃを含んでいない場合は、全てのシトシンはチミンへと変換され、Ｔｍが比較的低いＰＣＲ産物が生じる（図１Ａ）。これに対して、全ての対立遺伝子が全てのＣｐＧジヌクレオチドにおいてｍ５Ｃを含んでいる場合は、ＰＣＲ産物のＴｍはそれより有意に高い（図１Ｂ）。ＤＮＡサンプルがメチル化されていないか完全にメチル化されている対立遺伝子の混合物を含んでいる場合、増幅によって、それぞれ低いＴｍおよび高いＴｍを有する２種の異なるＰＣＲ産物が生じる（図１Ｃ）。最後に、標的配列がメチル化「モザイク現象」を示す場合、すなわち同一サンプル中の個々の対立遺伝子間でｍ５Ｃの数が異なっている場合、ＰＣＲ産物は異なるＴｍを有する分子のプールとなり、全体として中間のＴｍを示す（図１Ｄ）。
【００３２】
Ｔｍの差を最適に解析できるためには、ＤＮＡ配列の解離特性を考慮することが重要である。後記で記載するように、ＤＮＡ配列のＴｍは、単にＡ：Ｔ塩基対およびＧ：Ｃ塩基対の含量の関数ではない。
【００３３】
ＤＮＡ解離理論
６０℃以下の温度に保たれた水溶液中で、ＤＮＡは、向かい合う鎖の塩基対間での水素結合および同一鎖上の隣接塩基間のスタッキング相互作用（ｓｔａｃｋｉｎｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）により保持された二本鎖のらせん構造をとる。温度を急激に上昇させると、二本の鎖は離れ、一本鎖のランダムコイル構造をとる。このらせん鎖からランダム鎖へのトランジションは「ＤＮＡ解離」と呼ばれ、化学的変性剤によっても誘導できる。ＤＮＡらせんを保持する力としては塩基対合とスタッキング相互作用の両者が含まれ、ＤＮＡ分子の解離温度（Ｔｍ）は、ＧＣ含量によってではなく、配列全体により決定される。
【００３４】
ＤＮＡ分子を段階的な加熱に供すると、その分子は一連の工程で解離し、その各々の工程は「解離ドメイン」と呼ばれる個々のセグメントの解離に相当する（ＡｂｒａｍｓおよびＳｔａｎｔｏｎ， １９９２）。１つのＤＮＡ分子は数個の解離ドメインを含むことができ、それぞれ２５〜３００個の連続する塩基対からなり、一般に６０〜９０℃の範囲のＴｍを有する。各ドメインは、紫外線吸光度により測定した特異なハイパークロミシティプロファイルでピークをもたらし得る（２０）。最も低い温度で解離するドメインは「最低解離ドメイン（ｌｏｗｅｓｔ−ｍｅｌｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）」と呼び、最も安定なドメインは「最高解離ドメイン（ｈｉｇｈｅｓｔ−ｍｅｌｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）」と呼ぶ。
【００３５】
ＤＮＡ解離特性（解離マップ）の理論的予測
Ｌｅｏｎａｒｄ Ｌｅｒｍａｎの研究室で作成されたＭＥＬＴ８４およびＭＥＬＴ９４プログラム（Ｌｅｒｍａｎ ＬＳ． Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ Ｋ： Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｌｔｉｎｇ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＤＮＡ解離のコンピューターによるシミュレーションおよび変性勾配ゲル電気泳動へのその応用）． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １９８７； １５５： ４８２−５０１；およびＬｅｒｍａｎ ＬＳ， Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ Ｋ． Ｆｒｉｐｐ Ｂ， Ｓａｕｅｒ Ｐ， Ｄｒｅｓｓｅｌｈａｕｓ Ｃ． ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｏｓｐ／ｗｗｗ／ｍｅｌｔ．ｈｔｍ）により、既知のＤＮＡ配列についての解離マップ（すなわち、配列の各塩基対がらせん構造と解離している構造との間で５０：５０の平衡になっている中間温度のプロット）が得られる。これらのプログラムは、ＤＮＡ解離のためのＰｏｌａｎｄアルゴリズムのＦｉｘｍａｎ−Ｆｒｉｅｒｅ変法を用いるものである。ＤＮＡ断片の各解離ドメインは一本の横線として現れ、通常は両側で隣接するドメインとはっきり区切られている。ＭＥＬＴプログラムの修正バージョンは市販されているが（例えばＢｉｏ−Ｒａｄ社製のＭａｃＭＥＬＴＴＭプログラム）、鎖解離速度（生体分子の解離；後記を参照）を算出するための機能は備えていないことがある。ＭＥＬＴプログラムは、ＤＮＡ分子のドメインパターンを予測するには非常に有用であるが、Ｔｍの予測には有用ではない（ＡｂｒａｍｓおよびＳｔａｎｔｏｎ， １９９２）。
【００３６】
一分子ＤＮＡ解離 対 二分子ＤＮＡ解離
ＭＥＬＴプログラムを用いて作製した解離マップは、一分子成分のＤＮＡ解離のみを表わすので、無制限に高いＤＮＡ濃度でのみ適合する。実験上適切な濃度では、二分子成分のＤＮＡ解離が重要となり、解離マップにより示されるように、最高ドメインの解離より低い温度においてＤＮＡ鎖の完全な解離が起こる。鎖解離速度は、所与温度における解離平衡定数により求められ、ＭＥＬＴプログラムを用いて見積もることが可能である。鎖解離温度は、ＧＣクランプが結合することにより上昇し得る（Ｍｙｅｒｓら， １９８５）。
【００３７】
断片の設計
メチル化含量の差異を解析するためには、最適なＰＣＲ増幅および増幅産物の最適な解離挙動が確実になるようにプライマー対を慎重に設計しなければならない。実験を設計するときに従わなければならない厳密な規定はなく、メチル化状態の違いは最適ではない条件下でも検出可能であるが、最適に解析を実行するには次のガイドラインが推奨される：
Ｉ．メチル化配列と非メチル化配列とのＴｍの差が、解離曲線分析による解析を可能にするのに十分高いものであることを確実にする；
ＩＩ．（非メチル化配列およびメチル化配列の双方について）分析しようとする配列全体が１つの低解離ドメイン内に含まれることを確実にする；
ＩＩＩ．鎖解離温度が対象の解離ドメインの解離温度よりも高いことを確実にする；
ＩＶ．プライマーが、亜硫酸水素塩で完全に変換されたＤＮＡのみを増幅し、メチル化対立遺伝子と非メチル化対立遺伝子とを区別しないことを確実にする；
Ｖ．プライマーが、メチル化対立遺伝子と非メチル化対立遺伝子とを増幅レベルで区別しないことを確実にする。
【００３８】
ポイントＩについて　増幅された配列のＴｍは、元の鋳型内のメチル化部位の数と広く相関関係をとる。ｍ５Ｃが１個違うだけでＴｍは異なりうるが（後記を参照）、装置固有のバラツキが制約となる。理想的には、標的配列内のＣｐＧ部位（または他のメチル化シトシン）の数は、比較的大きな温度変化率においてさえも解離ピーク同士が重ならないようにするのに十分多いものでなければならない。
【００３９】
ポイントＩＩについて　ＰＣＲ産物中の複数の解離ドメインは、それに対応する数の解離ピークをもたらす。但し、これは、鎖解離が無視できるほど小さい場合である（これは読取りに有意に悪影響を及ぼす可能性がある）。更に、特定のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態の変化は、そのＣｐＧが存在する解離ドメインのＴｍに対してのみ影響を及ぼす。好ましくは、標的領域の全てのＣｐＧ部位が増幅産物の１つの低解離ドメイン内に含まれるべきである。解離プロファイルの調整は、ＰＣＲによるＧＣクランプ化によって効率的に達成できる（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄら， １９８９）。
【００４０】
ポイントＩＩＩについて　鎖解離が有意なものになると如何に読取りが有意に悪影響を受け得るのか、そしてＧＣクランプの長さを長くすることにより如何に鎖解離温度が上昇し得るのか、についての一例を後記に示す。
【００４１】
ポイントＩＶについて　プライマーの設計については、通常はＣｌａｒｋらにより提供されたガイドライン（Ｃｌａｒｋら， １９９４）に従うべきである。好ましくは、プライマーは、ＤＮＡ領域が完全にＣｐＧジヌクレオチドを含まないように設計されるべきであり、鋳型のＧＣ含量が少ないために比較的長いもの（典型的には２５〜３０ｂｐ）とすべきであり、限られた範囲の内部相補性および限られた範囲のプライマー対同士の相補性を示すべきである。特にＣｐＧアイランドにおいては、ＣｐＧを含まない領域を見い出して同定することは不可能であろう。この場合、プライマーはＣｐＧを極力含まないようにしなければならず、メチル化配列および非メチル化配列の双方に対するミスマッチはＣｐＧジヌクレオチドのＣ残基において組み込まれていなければならない（Ｃｌａｒｋら， １９９４）。増幅産物の純度は、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲにより向上できる（Ｃｌａｒｋら， １９９４）。
【００４２】
ポイントＶについて　非メチル化ＤＮＡ配列とメチル化ＤＮＡ配列とは、亜硫酸水素処理した後のＧＣ含量が異なる。したがって、亜硫酸水素処理したＤＮＡの分析に付き物の落とし穴は、これら２種類の配列が等しい効率で増幅されず、有意な偏りを生じることである（Ｗａｒｎｅｃｋｅら， １９９７）。現在、そのようなＰＣＲにおける偏りを防止するのに利用できる一般的法則は存在しないので、メチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡの双方を（好ましくは１：１の割合で）含むサンプルを分析にすることによって実験的に排除すべきである。
【００４３】
ＧＣクランプ化についての要件
上記のように、１分子成分および２分子成分のＤＮＡ解離は共に、実験上適切なＤＮＡ濃度において有意なものになる。如何にしてこのことが解離転移に影響し得るのかについての一例を、ＭＤＲ１遺伝子の１０７ｂｐ領域について示す（図６Ａ）。解離マップ内の実線は、完全にメチル化されている構造（ＣｐＧジヌクレオチド内の全てのシトシンがメチル化されているもの）の上部ＤＮＡ鎖についての１分子成分のＤＮＡ解離を表わす。解離マップ内の破線は、ＭＥＬＴ９４により算出した場合の計算上の鎖解離定数が１０−６Ｍである等価温度（すなわち、鎖解離が起こると予測される温度）を示す。理論と実験データとの相関性は十分に文献記載されている（Ｍｙｅｒｓら， １９８５）。この解離マップの２つの特徴は重要である。まず第１に、この１０７ｂｐ断片は、約９℃だけ違っている２つの主要な解離ドメインを有する。第２に、鎖解離は、低解離ドメインのＴｍより高いが高解離ドメインのＴｍよりは低い温度で起こっている。したがって、高解離ドメインは、低解離ドメインが解離している間は二本鎖構造を取り続けているはずであるが、鎖解離はわずかに高い温度（１℃未満）で起こっている。これらの温度推移の各々が１つの解離ピークを生じるので、この断片の解離分析によって、Ｔｍがわずかに異なる２つの解離ピークからなる複合的なプロファイルが得られる。これには２つの欠点がある。まず第１は、データの判読が非常に難しくなることであり、第２には、高解離ドメインにおけるメチル化含量の差異が解析されないままになる可能性があることである（Ｍｙｅｒｓら， １９８５；ＡｂｒａｍｓおよびＳｔａｎｔｏｎ， １９９２）。
【００４４】
対象とする配列へのＧＣクランプのＰＣＲによる結合は、２つの目的に役立つ（これは図６Ｂに例示されている）。まず第１に、ＧＣクランプ化を用いて、（非メチル化配列およびメチル化配列の双方について）対象とする配列全体を１つの低解離ドメインへと変換できる。第２に、それを用いて、鎖解離温度を、対象とする配列を含む解離ドメインのＴｍよりずっと高く上昇させることができる。幾つかの増幅配列では、鎖解離が起こる温度は、１分子性解離が起こる温度よりも低くなることがある。そのような場合、ＧＣクランプ化は必要ないと思われる。
【００４５】
材料および方法
ＤＮＡサンプル
健常な個体およびアンジェルマン症候群もしくはプラダー−ウイリー症候群に罹患している患者からの末梢血、または急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に罹患している患者からの骨髄から単核細胞を得た。皮膚悪性メラノーマは、手術直後に液体窒素中で瞬間凍結し、使用まで−８０℃で保存した。ゲノムＤＮＡは、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ ＤＮＡ単離キット（Ｇｅｎｅｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて単離した。白血病細胞系ＭＯＬＴ−４およびＨＬ−６０からのＤＮＡを、それぞれｐ１５Ｉｎｋ４ｂメチル化についてのポジティブ対照およびネガティブ対照とした（１１）。普遍的メチル化ＤＮＡは、製造元の指示書に従って正常な末梢血の単核細胞から単離されたゲノムＤＮＡをＳｓｓＩメチルトランスフェラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理することにより作製した。インフォームドコンセントを行った後で血液および骨髄のサンプルを得て、全ての手順は１９７５年のヘルシンキ宣言の現行バージョンに従った。
【００４６】
亜硫酸水素ナトリウムによる変換
ゲノムＤＮＡを、本質的に先に記載されているようにして亜硫酸水素ナトリウムで処理した（１２、参照により本明細書に組み入れられる）。簡単に説明すると、約２μｇのＤＮＡを、０．３Ｍ ＮａＯＨ中で３７℃にて１５分間変性した後、亜硫酸水素ナトリウムを最終濃度３．１Ｍで、そしてヒドロキノンを最終濃度２．５ｍＭで添加した。５５℃で１６時間インキュベートした後、そのＤＮＡサンプルをＧｅｎｅＣｌｅａｎ ＩＩキット（Ｂｉｏ １０１ Ｉｎｃ．）を用いて回収し、０．３Ｍ ＮａＯＨ中で脱スルホン化し、エタノール沈殿させた。ＤＮＡをＴＥに再懸濁し、直ちに使用するか、あるいは使用まで−８０℃で保存した。
【００４７】
プライマーの設計およびＰＣＲ増幅
解離マップは、ＭＥＬＴ９４プログラム（１３）を用いて作製した。亜硫酸水素塩で変換したアンチセンス鎖ＤＮＡに特異的なプライマーを選択して、低分子量リボ核タンパク質関連ポリペプチドＮ遺伝子（ＳＮＰＲＮ）プロモーターのＣｐＧアイランドの一領域（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＬ３２７０２、１５３〜３０５番目の塩基）を増幅した。この領域は、アンジェルマン症候群およびプラダー−ウイリー症候群において特異にメチル化されていることが知られている領域（１４）の内部にある。プライマーはＳＮＲＰＮ−Ａ ［ＣＧＧＧＣＧＧＧＧＧ］−ＣＡＴＡＣＴＣＡＡＡＣＴＡＡＡＡＴＡＴＡＴＡＣＴＡＡＡＣＣＴＡＣＣおよびＳＮＲＰＮ−Ｂ ［ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＣＣＧＣＧＣＣＣＧＴＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＣＧ］−ＡＧＡＧＡＡＧＴＴＡＴＴＧＧＴＡＴＡＧＴＴＧＡＴＴＴＴＧＴＴとした。ＡＰＣプロモーター１ＡのＣｐＧアイランドのセンス鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＵ０２５０９）を増幅するためのプライマーは、［ＣＧＣＣ］ＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＧＴＧＴＴＴＴＡＴＴ（ＡＰＣ−ＭＣ−Ａ）およびＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＣＣＧＣＧＣＣＣＧＴＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＣＧ］−ＣＣＡＴＴＣＴＡＴＣＴＣＣＡＡＴＡＡＣＡＣＣＣＴＡＡ（ＡＰＣ−ＭＣ−Ｂ）とした。カッコ内のヌクレオチドはＧＣクランプを示す。Ｐ１５Ｉｎｋ４ｂプロモーターのＣｐＧアイランドを増幅するためのプライマーは、先に記載されているとおりとした（１１）。ＰＣＲは、１００〜２００ｎｇの亜硫酸水素処理したＤＮＡ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、０．４μＭの各プライマーおよび１ＵのＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を含む最終容量２５μｌで行った。ＰＣＲは、ブロックサーモサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて、ホットスタートで開始し、続いて９４℃で３０秒、５５℃で３０秒および７２℃で３０秒を３９サイクル行い、７２℃で５分の最終伸長を行った。ＰＣＲ産物を、２〜３％のアガロースゲル（ＦＭＣ）での電気泳動により調べた。
【００４８】
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）での増幅では、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉキット（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用した。増幅の前に、２μｌの１０×ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを０．１６μｌのＴａｑＳｔａｒｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と混合し、室温で５分間インキュベートした。ＰＣＲを、２μｌの１０×ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、３ｍＭのＭｇＣｌ２（最終濃度）、２００ｎｇの亜硫酸水素処理したＤＮＡおよび０．５μＭの各プライマーを含む２０μｌの反応物中で行った。ＰＣＲは、９５℃で１分間インキュベートして開始してＴａｑＳｔａｒｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙを変性させ、続いて９５℃で５秒、５５℃で１０秒および７２℃で１５秒を４０〜５０サイクル行った。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの蛍光は、各サイクル毎に１回測定して、鋳型の増幅をモニターした。
【００４９】
解離曲線および解離ピークの作製
ＤＮＡ解離曲線は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒで、７０℃から１００℃まで０．１℃／秒で直線的に温度変化させた間でのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの蛍光（Ｆ）を測定することにより得た。蛍光データは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒソフトウエア（バージョン３．３９）を用いて、蛍光／温度の負の導関数対温度（−ｄＦ／ｄＴ対Ｔ）でプロットすることにより、解離ピークに変換した。ブロックサーモサイクラーで作製したＰＣＲ産物については、５μｌのＰＣＲ産物を１０ Ｌの１．５×ＰＣＲ緩衝液および５μｌのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）の１：５，０００希釈液、５μｌのＰｉｃｏｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）の１：１，２５０希釈液もしくは５μｌの臭化エチジウム（Ｓｉｇｍａ）の１：１，２５０希釈液と混合した後で、解離曲線分析を行った。特に指示しない限り、解離曲線分析は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの存在下で行った。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒで作製したＰＣＲ産物については、解離曲線分析は、増幅の直後に行った。
【００５０】
結果
ＤＮＡメチル化プロファイリングについての解離曲線分析の基本原理
二本鎖ＤＮＡ分子を段階的加熱に供すると、一連の工程（各工程がいわゆる「解離ドメイン」と呼ばれる個々のセグメントの解離に相当する）で解離する。一般に、解離ドメインのＴｍは、ＧＣ含量が高いほど増大する。亜硫酸水素ナトリウムにより非メチル化シトシンからウラシルへと変換し、続いてＰＣＲによりウラシルをチミンへと変化した後では、メチル化対立遺伝子と非メチル化対立遺伝子は、それらのＧＣ含量の違いによって熱安定性が違っていると予測される（１５）。
【００５１】
図１に、どのようにして増幅産物のＴｍが元のＤＮＡサンプル中のメチル化対立遺伝子と非メチル化対立遺伝子との比較によって求められるのかを概略的に示す。全ての対立遺伝子が完全にｍ５Ｃを含んでいない場合は、全てのシトシンはチミンへと変換されて、比較的Ｔｍが低いＰＣＲ産物を生じる（図１Ａ）。これに対して、全ての対立遺伝子が全てのＣｐＧジヌクレオチドにおいてｍ５Ｃを含んでいる場合は、ＰＣＲ産物のＴｍはそれよりも有意に高い（図１Ｂ）。ＤＮＡサンプルがメチル化されていないまたは完全にメチル化されている対立遺伝子の混合物を含む場合は、増幅によって、それぞれ低いＴｍおよび高いＴｍを有する２種の異なるＰＣＲ産物が生じる（図１Ｃ）。最後に、標的配列がメチル化「モザイク現象」（すなわち、ｍ５Ｃの数が同一サンプル中のそれぞれの対立遺伝子間で異なる）を示す場合は、ＰＣＲ産物は異なるＴｍを有する分子のプールとなり、その結果、全体として中間のＴｍを示す（図１Ｄ）。
【００５２】
ＳＮＲＰＮ遺伝子の試験管内解離曲線分析
低分子量リボ核タンパク質関連ポリペプチドＮ（ＳＮＲＰＮ）をコードする遺伝子は、ＤＮＡメチル化の異なる対立遺伝子コンステレーション（ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｉｏｎｓ）の解離プロファイルを調べるのには都合の良いモデルである。ＳＮＲＰＮは、１５ｑ１１−ｑ１３染色体のインプリント調節領域に位置し、そのプロモーターは通常、母系染色体上では完全に（全てのＣｐＧジヌクレオチドの９６％を超える）メチル化されており、父系染色体上では完全にメチル化を欠如している（１４）。プラダー−ウイリー症候群およびアンジェルマン症候群の２種の遺伝性発達障害は、このＳＮＲＰＮ領域の大きな欠失、片親性ダイソミーまたはインプリント突然変異により引き起こされる。正常な個体はメチル化ＳＮＲＰＮ対立遺伝子および非メチル化ＳＮＲＰＮ対立遺伝子の双方を有するが、プラダー−ウイリー症候群に罹患している患者はメチル化対立遺伝子しか有さず、アンジェルマン症候群に罹患している患者は非メチル化対立遺伝子しか有しない（１６）。
【００５３】
図２Ａに、１１のＣｐＧジヌクレオチドを含むＳＮＲＰＮのＣｐＧアイランドの１５３ｂｐのゲノムＤＮＡ領域の解離マップを示す。この領域は、６７％のＧＣ含量を有し、推定される最大Ｔｍは８５℃である。亜硫酸水素ナトリウムで処理し、続いてＰＣＲを行ったところ、元の鋳型のｍ５Ｃ含量により求めたＧＣ含量およびＴｍを有する２種の異なる非相補的鎖が形成される。アンチセンス鎖では、完全メチル化配列は、３３％のＧＣ含量および７０℃の最大Ｔｍを有するが、非メチル化配列は２６％のＧＣ含量および６６℃の最大Ｔｍを有する（図２Ａ）。
【００５４】
正常な個体、プラダー−ウイリー症候群に罹患している患者およびアンジェルマン症候群に罹患している患者からのＤＮＡサンプルを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、続いてＳＮＰＲＮプロモーターのＣｐＧアイランドを、亜硫酸水素処理したＤＮＡには特異的であるがメチル化対立遺伝子と非メチル化対立遺伝子とを区別しないプライマーを用いて増幅しＧＣクランプ化した。メチル化ＳＮＰＲＮ対立遺伝子または非メチル化ＳＮＰＲＮ対立遺伝子に由来する増幅産物の解離マップを図２Ｂに示す。非メチル化ＳＮＲＰＮ領域を含むＧＣクランプ化配列は、推定Ｔｍが６４．９℃である低温解離ドメインを有するが、完全メチル化配列では、このドメインのＴｍは６８．３℃である（図２Ｂ）。慣用のＰＣＲにより、全てのサンプルは予想どおりの長さの産物を生じ、意図しない産物は生じなかった（図示せず）。
【００５５】
３種のＰＣＲ産物の解離分析から、二本鎖ＤＮＡ色素ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの蛍光（Ｆ）の単相性または二相性の低下が示された（図３Ａ）。解離曲線を、蛍光の負の導関数を温度対温度（−ｄＦ／ｄＴ対Ｔ）でプロットすることにより解離ピークに変換すると、それら３種のサンプルは容易に区別できるようになった（図３Ｂ）。アンジェルマン症候群に罹患している患者からの亜硫酸水素処理したＤＮＡでは、見掛けのＴｍが７７．４℃である単一の解離ピークが観察され、一方、プラダー−ウイリー症候群に罹患している患者からのＤＮＡでは、見掛けのＴｍが８０．３℃である単一のピークが得られた。正常な個体からのＤＮＡでは、見掛けのＴｍがそれぞれ７７．３℃および８０．３℃である２つの解離ピークが観察された（図３Ｂ）。
【００５６】
この方法の再現性を調べるために、本発明者らは、ＳＮＲＰＮモデルを使用して、試験管間（ｉｎｔｅｒ−ｔｕｂｅ）およびサンプル間（ｉｎｔｅｒ−ｓａｍｐｌｅ）でのバラツキを調べた。正常な個体のＤＮＡから作製した同一のＳＮＲＰＮ ＰＣＲ産物を７つの個々のガラスキャピラリーに分配したところ、Ｔｍは非メチル化のピークおよびメチル化のピークの双方について約０．３℃ずつ違っていた。同じＤＮＡ鋳型を７種の独立した反応物中で増幅して解離曲線分析に供した場合、Ｔｍのバラツキは約０．４℃であった。４人の異なる個体からのＤＮＡを用いて更にもう１回一連の実験を行った場合は、Ｔｍのバラツキは０．６℃未満であり、平均Ｔｍはいろいろな日数について行った実験間で変わらなかった。これらのデータから、固定したアッセイ条件下では解離ピークのデータは再現性が高いこと、およびＴｍのほんの僅かなバラツキは、少なくとも一部は、サンプルの円形コンベア（ｃａｒｏｕｓｓｅｌ）の温度の差が原因である可能性があることが示唆され、これはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒシステムの技術仕様書（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒオペレータマニュアル、バージョン３．０）と一致する。最初の加熱および解離プロファイルの前の再アニーリングは、おそらく増幅されたＤＮＡと過剰なプライマーとのヘテロ二本鎖および／またはハイブリッドが形成されるためである（データは示さず）。
【００５７】
不均一メチル化パターンの試験管内検出
解離曲線分析による不均一（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ）メチル化パターンの解析の実現可能性を調べるために、本発明者らは、ｐ１５Ｉｎｋ４ｂ腫瘍抑制遺伝子のプロモーターＣｐＧアイランドを調べたところ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に罹患している患者の間で、メチル化密度の個体内および個体間での高程度のバラツキを示した（１１；１７）。ＡＭＬ患者および対照細胞系からの亜硫酸水素処理したＤＮＡを、２７のＣｐＧジヌクレオチドを含むｐ１５Ｉｎｋ４ｂの領域に隣接するプライマー（１１）を用いて増幅しＧＣクランプ化した。図５に示すように、非メチル化細胞系ＨＬ−６０からのＤＮＡは、見掛けのＴｍが８１．３℃である解離ピークを示し、一方、メチル化ＭＯＬＴ−４細胞系からのＤＮＡでは、見掛けのＴｍが８８．９℃のピークが観察された。不均一にメチル化されているｐ１５Ｉｎｋ４ｂ対立遺伝子を高比率で含むことが先に示されている２種のＡＭＬサンプルからのＤＮＡ（１１）では、解離転移は広がる傾向があり、解離ピークはそれぞれ８４．４℃および８６．２℃のＴｍを有していた。したがって、理論に従えば（図１Ｄ）、不均一にメチル化されているＤＮＡを含むサンプルは、それに対応する非メチル化配列と完全メチル化配列との間の解離ピークのＴｍ値を示す。
【００５８】
解離曲線の取得をＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒでの市販のキットの成分を用いるＰＣＲと組み合わせた場合、ＨＬ−６０およびＭＯＬＴ−４のｐ１５Ｉｎｋ４ｂ解離ピークプロファイルは、ブロックサーモサイクラーで作製したＰＣＲ産物を用いて得られたものとほぼ同じであった（データは示さず）。しかし、解離ピークは有意にシフトしており（ＨＬ−６０ではＴｍ＝８３．６℃、ＭＯＬＴ−４ではＴｍ＝９２．４℃）、これはおそらく、ＭｇＣｌ２の濃度が違うこと、およびｄＴＴＰのｄＵＴＰによる置換による可能性がある。
【００５９】
実施例
このセクションには、本発明の各種態様の実施例が含まれる。実験的な実施例は、次のように５つのカテゴリーに分類されている。メチル化ＤＮＡ配列と非メチル化ＤＮＡ配列とを識別するための「基本的」アッセイの実施例（Ａ）；ヒト遺伝性疾患において異常なＤＮＡメチル化を検出するための実施例（Ｂ）；ヒト腫瘍において異常なメチル化を検出するための実施例（Ｃ）；ｍ５Ｃの数の僅かな差異を検出するための実施例（Ｄ）；異なる二本鎖ＤＮＡ結合色素を用いて異常なメチル化を検出するための実施例（Ｅ）。
【００６０】
Ａ．解離曲線分析によるＤＮＡメチル化の解析
以下の２つの実施例は、ＰＣＲ解離曲線分析によるヒト遺伝子における特異なＤＮＡメチル化の解析を示す。標準的な手順は、次のものを含むものとした：
Ｉ．ゲノムＤＮＡの単離
ＩＩ．ゲノムＤＮＡの亜硫酸水素ナトリウムによる処理
ＩＩＩ．ブロックサーマルサイクラーでのＰＣＲ産物の作製
ＩＶ．アガロースゲル電気泳動による増幅産物の分析
Ｖ．ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒシステムを用いた二本鎖ＤＮＡ結合蛍光色素ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの存在下での解離曲線分析。
【００６１】
両方の場合において、ＰＣＲ増幅およびＧＣクランプ化のためのオリゴヌクレオチドプライマーは、セクション５．４に記載されている一般原理に基づいて選んだ。ｉｎ ｖｉｔｒｏでＳｓｓＩメチルトランスフェラーゼで処理したＤＮＡを、メチル化対立遺伝子のポジティブ対照として用いた（下記のポイントＶＩを参照）。
【００６２】
ＨＩＣ１
ＨＩＣ１遺伝子（アクセッションＮｏ． ＮＭ ００６４９７）のメチル化状態を調べるために、亜硫酸水素処理したＤＮＡの上部鎖の１１７ｂｐ領域（７６位〜１９２位）を増幅するためのプライマーを作製した。プライマー結合部位には二重線がひいてある。５’末端プライマーは４０ｂｐのＧＣクランプを用いて伸長し、３’末端プライマーは９ｂｐのＧＣクランプを用いて伸長した（カッコ内に示す）。プライマー結合部位間の領域は、９つのＣｐＧジヌクレオチド部位（一本線を引いてある）を含む。最終増幅産物は１６６ｂｐである。
【００６３】
５’［ｃｇｃｃｃｇｃｃｇｃｇｃｃｃｃｇｃｇｃｃｃｇｔｃｃｃｇｃｃｇｃｃｃｃｃｇｃｃｃｇ］ａｔａａｔｔａｇＣＧｔａｔｔａａｇｇｇｔｔｔｔｔｔｇｔｇＣＧａＣＧｔｇａｔｔａｔＣＧｔｇｇｔｇｔａｇａａＣＧｔｔｔｔｔｔｔｔＣＧＣＧＣＧｔａｔａａｇａａＣＧｔｇｔｔｇｇＣＧｇｔ　ｔａｇｔａｇＣＧｔｔｔａｔｔｔｔａａｇｔｔｔｔｔｇｇｔｇｇ［ｇｃｃｇｃｃｃｇｃ］３’
ＭＥＬＴ９４アルゴリズムを用いて作製した解離マップによれば、低解離ドメインは、メチル化配列については７０．９℃および非メチル化配列については６６．８℃のＴｍを有する。ＳｓｓＩでメチル化したＤＮＡおよび正常な末梢血リンパ球からのＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、上記のプライマー対を用いて増幅した。双方のＤＮＡサンプルは、予想どおりの長さの産物を生じ、非特異的な産物は生じなかった。ＰＣＲ産物をＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉと混合し、解離分析に供した。蛍光／温度の負の導関数対温度（−ｄＦ／ｄＴ対Ｔ）でプロットすることにより解離曲線を解離ピークに変換したところ、正常なリンパ球からの亜硫酸水素処理したＤＮＡでは見掛けのＴｍが８２．６３℃である単一のピークが観察され、亜硫酸水素処理したＳｓｓＩメチル化ＤＮＡでは見掛けのＴｍが８４．９７℃である単一のピークが観察された（図７）。
【００６４】
ＤＡＰＫ
ＤＡＰ−キナーゼ（ＤＡＰＫ）遺伝子（アクセッションＮｏ． Ｘ７６１０４）のメチル化状態を調べるために、亜硫酸水素処理したＤＮＡの上部鎖の１０３ｂｐ領域（１７位〜１１９位）を増幅するためのプライマーを作製した。プライマー結合部位には二重線がひいてある。５’末端プライマーは４０ｂｐのＧＣクランプを用いて伸長し、３’末端プライマーは５ｂｐのＧＣクランプを用いて伸長した（カッコ内に示す）。プライマー結合部位間の領域は、６つのＣｐＧジヌクレオチド部位（一本線を引いてある）を含む。最終増幅産物は１４８ｂｐである。
【００６５】
５’［ｃｇｃｃｃｇｃｃｇｃｇｃｃｃｃｇｃｇｃｃｃｇｔｃｃｃｇｃｃｇｃｃｃｃｃｇｃｃｃｇ］ＣｇａｇｔｔａａＣＧｔＣＧｇｇｇａｔｔｔｔｇｔｔｔｔｔｔｔｔａＣＧｇａｇｇｇｇａｔｔＣＧｇｔａａｔｔＣＧｔａｇＣＧｇｔａｇｇｇｔｔｔｇｇｇｇｔＣＧｇＣＧｔｔｔｇｇｇａｇｇｇａｔｔｔｇＣＧｔｔｔｔｔｔａｔｔｔ［ｃｃｇｃｃ］−３’
ＭＥＬＴ９４アルゴリズムを用いて作製した解離マップによれば、低温解離ドメインは、メチル化配列については７３．５℃および非メチル化配列については６８．５℃のＴｍを有する。ＳｓｓＩでメチル化したＤＮＡおよび正常な末梢血リンパ球からのＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、上記のプライマー対を用いて増幅した。双方のＤＮＡサンプルは、予想どおりの長さの産物を生じ、非特異的な産物は生じなかった。ＰＣＲ産物をＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉと混合し、解離分析に供した。蛍光／温度の負の導関数対温度（−ｄＦ／ｄＴ対Ｔ）でプロットすることにより解離曲線を解離ピークに変換したところ、正常なリンパ球からの亜硫酸水素処理したＤＮＡでは見掛けのＴｍが８４．６３℃である単一のピークが観察され、亜硫酸水素処理したＳｓｓＩメチル化ＤＮＡでは見掛けのＴｍが８７．８４℃である単一の解離ピークが観察された（図８）。
【００６６】
Ｂ．ヒト遺伝性障害（プラダー−ウイリー症候群およびアンジェルマン症候群）における異常ＤＮＡメチル化の検出
低分子量リボ核タンパク質関連ポリペプチドＮ（ＳＮＲＰＮ）をコードする遺伝子は、１５ｑ１１−ｑ１３染色体のインプリント調節領域内に位置し、そのプロモーターは通常、母系染色体上では完全に（全てのＣｐＧジヌクレオチドの９６％を超える）メチル化されており、父系染色体上では完全にメチル化が欠如している（Ｚｅｓｃｈｎｉｇｋら， １９９７）。プラダー−ウイリー症候群およびアンジェルマン症候群の２種の遺伝性発達障害は、このＳＮＲＰＮ領域の大きな欠失、片親性ダイソミーまたはインプリント突然変異により引き起こされる。正常な個体はメチル化ＳＮＲＰＮ対立遺伝子および非メチル化ＳＮＲＰＮ対立遺伝子の双方を有するが、プラダー−ウイリー症候群に罹患している患者はメチル化対立遺伝子しか有さず、アンジェルマン症候群に罹患している患者は非メチル化対立遺伝子しか有しない（Ｎｉｃｈｏｌｌｓら， １９９８）。
【００６７】
ＳＮＲＰＮ遺伝子（受託番号Ｌ３２７０２）のメチル化状態を調べるために、亜硫酸水素処理したＤＮＡの下部鎖の１５３ｂｐ領域（ｐｏｓ． １５３〜３０５）を増幅するためのプライマーを作製した。プライマー結合部位には二重線がひいてある。５’末端プライマーは１０ｂｐのＧＣクランプを用いて伸長し、３’末端プライマーは４０ｐｂのＧＣクランプを用いて伸長した（カッコ内に示す）。プライマー結合部位間の領域は、１１のＣｐＧジヌクレオチド部位（一本線を引いてある）を含む。最終増幅産物は２０３ｐｂである。
【００６８】
Ｐｏｓ．１５３
３’［ｃｇｃｃｃｇｃｃｇｃ］ｇｔａｔｇａｇｔｔｔＧＣｔｔｔｔａｔａｔａｔＧＣｔｔｔｇｇａｔｇＧＣｇａｔｇａｔｇｔｔＧＣｔｔａｇａｔｔＧＣｇｔｔｔｔａｔｔｔｔＧＣｔｇＧＣｇＧＣｔｔｔｔａｔｇｇａｔｔＧＣｇｔａｇａｔａｇａｔｔｔｔｔｔＧＣｔａｇｔｔａｔｔＧＣＧＣｔａｔｔｔｔＧＣｔｔｇｔｔｔｔａｇｔｔｇａｔａｔｇＧＣｔａｔｔｇａａｇａｇａ［ｃｇｃｃｃｇｃｃｇｃｇｃｃｃｃｇｃｇｃｃｃｇｔｃｃｃｇｃｃｇｃｃｃｃｃｇｃｃｃｇ］５’　Ｐｏｓ．３０５
ＭＥＬＴ９４アルゴリズムを用いて作製した解離マップによれば、低解離ドメインは、メチル化配列については６８．３℃および非メチル化配列については６４．９℃のＴｍを有する。見掛け上は健常な個体、プラダー−ウイリー症候群に罹患している患者およびアンジェルマン症候群に罹患している患者からのＤＮＡサンプルを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、上記のプライマー対（セクションＡに記載されている条件）を用いて増幅した。全てのＤＮＡサンプルは、予想どおりの長さの産物を生じ、非特異的な産物は生じなかった。ＰＣＲ産物をＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉと混合し、解離分析に供した。蛍光の負の導関数を温度対温度（−ｄＦ／ｄＴ対Ｔ）でプロットすることにより解離曲線を解離ピークに変換したところ、見掛けのＴｍがそれぞれ７７．３℃および８０．３℃である２つの解離ピークが観察された（図３Ａ）。アンジェルマン症候群に罹患している患者からの亜硫酸水素処理したＤＮＡでは、見掛けのＴｍが７７．４℃である単一の解離ピークが観察され、一方、プラダー−ウイリー症候群に罹患している患者からのＤＮＡでは見掛けのＴｍが８０．３℃である単一のピークが観察された（図３Ｂ）。
【００６９】
Ｃ．固形腫瘍（悪性メラノーマ）におけるＡＰＣプロモーターのメチル化の検出
大腸腺腫症遺伝子（ＡＰＣ）は、家族性および散発性の癌に関連する腫瘍抑制遺伝子である。生殖細胞系ＡＰＣ突然変異は、家族性大腸腺腫症（ＦＡＰ）の原因であり、突然変異または異常なプロモーターメチル化によるＡＰＣの体性不活性化は、散発性の結腸直腸癌、胃癌、乳癌および肺癌において実証されている。ＡＰＣの機能不全は、β−カテニンの細胞内蓄積を引き起こす。
【００７０】
ＡＰＣプロモーターメチル化がメラノーマ細胞におけるβ−カテニンの異常蓄積に関与するか否かを調べるために、ＡＰＣプロモーター１Ａのメチル化状態を、悪性メラノーマに罹患している患者からの原発性および転移性腫瘍における解離曲線分析により分析した。メラノーマ検体からのＤＮＡを、亜硫酸水素ナトリウムで処理し、プライマーＡＰＣ−ＭＣ−ＡおよびＡＰＣ−ＭＣ−Ｂを用いて増幅した。正常なメラノサイトからの亜硫酸水素処理したＤＮＡを、非メチル化ＡＰＣ対立遺伝子のポジティブ対照とし、１４のｍ５Ｃを提示するクローン（上記を参照）をメチル化ＡＰＣ対立遺伝子のポジティブ対照とした。その後の解離曲線分析の例を図９に示す。幾つかのメラノーマサンプルは２つの明確な解離ピークを示し（図９Ｃ〜Ｆ）、それぞれ非メチル化ＡＰＣ対立遺伝子および完全メチル化ＡＰＣ対立遺伝子のピークに該当する。２つのピークの高さはサンプル間で異なっており、これはおそらく、メチル化ＡＰＣ対立遺伝子と非メチル化ＡＰＣ対立遺伝子との割合が異なることを反映していると思われる。これらのサンプル中でのメチル化ＡＰＣ対立遺伝子の存在は、メチル化特異的ＰＣＲ分析により確認した（未公表のデータ）。これらのデータから、解離曲線分析が固形腫瘍（かなりの量の正常な非癌性組織を含む）においてＤＮＡメチル化を検出するのに使用できることを実証される。
【００７１】
Ｄ．ｍ５Ｃ含量の些少の差の解析
ｍ５Ｃが１つだけ異なる２種の対立遺伝子は、亜硫酸水素で処理した後で１つの塩基対（Ａ：Ｔ対Ｇ：Ｃ）が違ってくる。理論上、このＧＣ含量の差異はＴｍを変化させ、その大きさは標的配列の長さおよび配列内でのその塩基の違いの正確な位置に依存する。本発明の感度を調べるために、異なる数のｍ５Ｃを保有する対立遺伝子に対応する個々にクローニングしたＰＣＲ産物を分析した。メラノーマ細胞系（ＦＭ９１）からの亜硫酸水素処理ＤＮＡから作製したＰＣＲ産物の３つのクローン（これらは異なるＡＰＣプロモーター１Ａのメチル化を示す（未公表のデータ）を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒでプライマーＡＰＣ−ＭＣ−ＡおよびＡＰＣ−ＭＣ−Ｂを用いて増幅した。これらのプライマーは、ＡＰＣプロモーター１Ａ内に１５のＣｐＧ部位を含む２４０ｂｐのＰＣＲ産物を産生する。同じプライマーを用いて、正常なメラノサイト（ＡＰＣプロモーター１Ａメチル化の証拠を何も示さない（未公表のデータ））からの亜硫酸水素処理ＤＮＡを増幅した。増幅産物の解離曲線分析から、全てのサンプルについての１つの解離ピークが明らかになった（図１０）。見掛けのＴｍは、非メチル化対照（メラノーマ細胞）では８３．７℃、６つのｍ５Ｃを提示するクローンでは８４．７℃、８つのｍ５Ｃを提示するクローンでは８５．３℃、１４のｍ５Ｃを提示するクローンでは８６．４℃であった。これらのデータから、わずかなｍ５Ｃ含量の違いであっても解離曲線分析によって解析できることが実証される。
【００７２】
Ｅ．別の二本鎖ＤＮＡ特異的色素
多数の蛍光色素が、二本鎖ＤＮＡに結合すると、それらの蛍光特性を変化させる。臭化エチジウムは、二本鎖ＤＮＡに結合した後に３０倍増大する適度な特有の蛍光を有する。それよりも新規な生成色素（例えばＰｉｃｏＧｒｅｅｎおよびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ）は、溶液中で遊離している時は本質的に非蛍光性であるが、二本鎖ＤＮＡに結合すると高度に蛍光性となる。
【００７３】
解離曲線分析によるＤＮＡメチル化の解析における各種の二本鎖ＤＮＡ特異的色素の適用可能性を調べるために、ＳｓｓＩでメチル化したＤＮＡおよび正常な末梢血リンパ球からのＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、プライマーＡＰＣ−ＭＣ−ＡおよびＡＰＣ−ＭＣ−Ｂを用いて増幅して、ＡＰＣプロモーター１Ａ内に１５のＣｐＧ部位を含むＰＣＲ産物を得た。５μｌのＰＣＲ産物を、１０μｌの１．５×ＰＣＲ緩衝液および５μｌのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの１：５，０００希釈液、５μｌのＰｉｃｏＧｒｅｅｎの１：１，２５０希釈液もしくは５μｌの臭化エチジウムの１：１，２５０希釈液物と混合した。ＤＮＡ解離曲線は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒにて、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎおよび臭化エチジウムの蛍光をそれぞれ測定し、続いて蛍光の負の導関数を温度対温度（−ｄＦ／ｄＴ対Ｔ）でプロットすることにより解離ピークに変換することによって得た。図１１に示すように、３種の色素は全て、メチル化ＡＰＣ対立遺伝子および非メチル化対立遺伝子の解析を可能にしたが、臭化エチジウムを用いて得られたピーク（図１１Ａ）はＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（図１１Ｂ）またはＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（図１１Ｃ）を用いて得られたものよりも明確ではなかった。非メチル化ＡＰＣ対立遺伝子についての見掛けのＴｍは、臭化エチジウムでは８４．４２℃、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎでは８４．８８℃、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉでは８４．９５℃であった。これに対応するメチル化ＡＰＣ対立遺伝子についてのＴｍは８７．８３℃、８７．３９℃、８７．４９℃であった。これらのデータから、各種の二本鎖ＤＮＡ特異的色素が解離曲線分析によるＤＮＡメチル化の解析に使用できることが実証される。
【００７４】
可能な装置の例
図１２に、ＰＣＲ産物が固定されているスライドガラスフォーマット上で解離アッセイを行うための装置を示す。チャンバーは温度制御されており、ＰＣＲ産物の解離温度は、それらが固定されている位置で蛍光シグナルを検出することにより測定できる。ＣＣＤカメラを使用すれば、複数のシグナルを同時に観察することができる。この図中で使用されるナンバリングシステムは次のとおりである：１．スライド、２．反応チャンバー、３．サンプル容器、４．チャンバーの蓋、５．シリンジポンプへのチューブ、６．加熱要素、７．ペルチェ要素、８．加熱シンク、９．放射状仕切体（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｅｒ）、１０．ＣＣＤカメラ、１１．反射光学系、１２．フィルター（発光波長用）、１３．フィルター（活性化波長用）、１４．集光光学系、および１５．光源。
【００７５】
上記で述べたように、本発明は、予め調製されているキットを用いて行うことができる。このキットは、本発明の第１または第２の態様の方法を実施するのに必要な種々の要素を含み得る。これらの要素としては、本発明の第１の態様における変換型の標的核酸または本発明の第２の態様における試験核酸および対照核酸のための特異的プライマーが挙げられる。本発明の１つの実施形態において、これらのプライマーの１つは、チップなどの固相支持体上に固定することができる。この実施形態を説明する２つの実施例を以下に示す。
【００７６】
１．上記で記載したようなプライマーを用いた増幅は、固相上に固定された１つのプライマーおよび溶液の形態の第２のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用い、緩衝液にシグナル物質を添加して行うことができる。好ましくは、図１２に示すような装置のセットアップを使用する。固相表面上の異なる位置に、違った標的核酸配列に特異的な異なるプライマーを固定することができるので、異なる既知のＰＣＲ産物が別々の既知の位置で合成される。シグナル物質はここでもまた、二本鎖核酸と一本鎖核酸とを区別できるようにするものである。取り込まれたシグナル物質の量は減少するが、ＤＮＡは解離し、これは固相の大部分について同時に測定される。表面は温度制御することができ、温度が上昇すると、蛍光シグナルは固相表面上の各スポットでＤＮＡの解離の関数として低下する。
【００７７】
２．第２の実施例では、この方法を、測定に関しては上記に記載されているのと同様にして行うが、ＰＣＲ産物の固定は別のやり方で行う。この方法を用いると、１つ以上のサンプルからの多数の異なるＰＣＲ産物がそれぞれ２つのプライマーを用いて作製される。各々の対のプライマーの少なくとも一方は、それが固相表面上に結合するように（例えばチオールもしくはアミノ修飾を用いて）修飾され、それは市販されている。他の特異的結合メンバーは当業者には公知であり、例えばビオチン／アビジン、抗体／抗原または酵素／リガンドが挙げられる。市販されており当業者には公知であるチップスポット装置を用いて、これらのＰＣＲ産物が表面に固定される。続いて、上記で記載したような測定を行う。
【００７８】
考察
本発明者らは、蛍光解離曲線分析が、異常ＤＮＡメチル化パターンの検出のためのＰＣＲと完全に併合できる、迅速で費用対効果の高い方法であることを示した。サンプルＤＮＡの亜硫酸水素による変換を行ってしまえば、サンプルのスクリーニングは、標準的なＰＣＲ試薬を用いることにより、４５分以内に完了することができる。手作業によりＰＣＲ産物を移す必要がないのでＰＣＲによるコンタミネーションが有意に低減することを考慮すると、この方法は、従来のゲルを用いるメチル化アッセイの魅力的な別法となる。
【００７９】
解離曲線分析によるメチル化解析を成功させるためには、ＰＣＲプライマーを適切に設計することが重要である。まず第１に、プライマーは、メチル化対立遺伝子と非メチル化対立遺伝子とをヌクレオチドレベル（１８）でも増幅レベル（１９）でも区別してはならない。第２に、ＰＣＲ産物内に複数の解離ドメインが存在すると、それに対応する数の解離ピークが生じるので（２０）、特定のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態の変化は、そのＣｐＧが存在する解離ドメインのＴｍに対してのみ影響を及ぼす。好ましくは、標的領域の全てのＣｐＧ部位が増幅産物の１つの低解離ドメインに含まれるべきである。解離プロファイルの調節は、幾つかの利用可能なコンピューターアルゴリズムの中の１つをＰＣＲによるＧＣクランプ化と組み合せて用いることにより容易に達成できる（２１）。この研究において用いられるＭＥＬＴ９４アルゴリズムは、実験値よりも有意に低い理論上のＴｍ値を与えるが、ＤＮＡ分子のドメイン構造を予測する上では非常に正確である（未公表のデータ）。
【００８０】
温度変化率ならびに塩および色素の濃度は、ＰＣＲ産物の解離ピークの幅および絶対的位置に大きな影響を及ぼす可能性があり（２０；２２；２３）、再現性のある結果を得るためには適切に調節されなければならない。ルーチンなハイスループットの用途では、温度変化率は、速度と解像度との最良の兼ね合いとして選べばよいと思われる。変化率が大き過ぎると、ピークが広くなり、メチル化対立遺伝子と非メチル化対立遺伝子とを区別しにくくなることがある。ヒトＳＮＲＰＮ遺伝子について図３に示すように、０．１℃／秒の変化率で１１のＣｐＧ部位を含む領域の単一対立遺伝子メチル化を分析すると、通常は、重なり合うが区別可能であり約３℃のＴｍ差を有する２つの解離ピークが生じる。この変化率では、解離曲線分析は４分以内に完了できる。温度変化率を下げること、標的配列内のＣｐＧ部位の数を増やすこと、または解離分析の際の温度調節の精度を高めることにより、重なり合わない解離ピークを得ることが可能である。
【００８１】
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉまたは他のＰＣＲに適合する二本鎖ＤＮＡ特異的色素の使用による解離曲線分析に特有の可能性のある落とし穴は、目的のＰＣＲ産物と意図しない産物（プライマー二量体など）との区別が不可能である場合があることである。したがって、例えば「ホットスタート」および「タッチダウン」の工程を組み入れることによって意図しない配列の不注意な増幅を完全に防止するＰＣＲプロトコールを開発する必要がある。可能性のあるもう１つの意図しない産物の発生原因は、ＰＣＲの間に伸長しつつあるプライマーが別の鋳型へジャンプする「ジャンピングＰＣＲ」（２４）である。鋳型ＤＮＡがメチル化対立遺伝子および非メチル化対立遺伝子の双方を含む場合、早まって終結してしまった産物が、配列相同性が高いために、逆のタイプの鋳型を伸長させることがあり、これにより、混成のメチル化パターンおよび中間のＴｍを有するキメラ分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ形成が起こる可能性がある。
【００８２】
本発明の方法の最も強力な特徴の１つは、不均一なメチル化パターンを解析できることである。ＡＭＬに罹患している患者からの骨髄サンプルの先の研究から、幾つかの腫瘍抑制遺伝子のプロモーター配列内のｍ５Ｃの含量および分布が、同一患者からの各種の細胞間で有意に相違することが実証されている（１１；１７；２５；２６）。更に、非癌性組織におけるプロモーターＣｐＧアイランドの不均一メチル化は、プロラクチンおよび成長ホルモンをコードする遺伝子について実証されており（２７）、この現象が生物学的プロセスでは、従来評価されていたものよりもずっとよく見られることが示唆される。ｐ１５Ｉｎｋ４ｂ遺伝子プロモーターについて図４に示されているように、不均一にメチル化されているＡＭＬサンプルは、解離分析により、非メチル化対立遺伝子のＴｍと完全メチル化対立遺伝子のＴｍとの間の全てひっくるめたＴｍを有する広い解離ピークによって容易に識別できる。解離曲線分析は個々の対立遺伝子もしくは個々のＣｐＧのメチル化状態についての情報は提供しないが、特定の遺伝子および遺伝子座における全体的なメチル化状態についてサンプルを迅速にスクリーニングするのには非常に有用である。
【００８３】
近年、ＭＳＰとリアルタイム定量ＰＣＲとを組み合せたメチル化方法が開発された（２８；２９）。慣用のＭＳＰと比較したリアルタイムＭＳＰの重要な利点は、試験管内フォーマットおよびその定量範囲である。この方法の欠点は、それが高価なハイブリダイゼーションプローブを必要とすること、各設定毎に標準曲線を作製しなければならないこと、不均一なメチル化が検出できない可能性があること、およびメチル化対立遺伝子および非メチル化対立遺伝子の分析を別々の試験管内で行わなければならないことである。一方、解離曲線分析は、高価な試薬を必要とせず、不均一なメチル化を解析し、１つの反応でメチル化対立遺伝子および非メチル化対立遺伝子を半定量的な様式で検出する。
【００８４】
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本発明の第２の態様に関連する参考文献
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Ｒｉｒｉｅ， Ｋ．Ｍ．， Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ， Ｒ．Ｐ．，およびＷｉｔｔｗｅｒ， Ｃ．Ｔ． （１９９７）． Ｐｒｏｄｕｃｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ポリメラーゼ連鎖反応の間のＤＮＡ解離曲線の分析による産物の識別）． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４５， １５４−１６０
Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ， Ｆ．， Ｋｏｌｂ， Ａ．，およびＢｕｃ， Ｈ． （１９８２）． Ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｃｈａｎｇｅ ｔｈｅ ｔｈｅｒｍａｌ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ａ ｓｈｏｒｔ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｌａｃｔｏｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｌｅｍｅｎｔｓ（点突然変異はラクトース調節エレメントを含む短鎖ＤＮＡ断片の熱変性プロフィールを変化させる）． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙ（実験と理論の比較）． ＥＭＢＯ Ｊ． １， ９９−１０５
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＤＮＡメチル化パターンを解析するための解離曲線分析の原理を示す。
【図２】
図２は、（Ａ）未処理のゲノムＤＮＡ（曲線「ａ」）および亜硫酸水素ナトリウムで処理した後のＤＮＡ（曲線「ｂ」、メチル化下部鎖；曲線「ｃ」、非メチル化下部鎖）におけるＳＮＲＰＮプロモーターの１５３ｂｐ領域のコンピューター処理した解離マップ、（Ｂ）２０３ｂｐのＧＣクランプ化ＳＮＲＰＮ ＰＣＲ産物（曲線「ｄ」、メチル化されたもの；曲線「ｅ」、メチル化されていないもの）について算出した解離マップを示す。
【図３】
図３は、ＳＮＲＰＮ遺伝子についての蛍光解離曲線（Ａ）および解離ピーク（Ｂ）を示す。亜硫酸水素処理したＤＮＡは、プラダー−ウイリー（Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ）症候群に罹患している患者（曲線「ａ」）、正常な個体（曲線「ｂ」）およびアンジェルマン（Ａｎｇｅｌｍａｎ）症候群に罹患している患者（曲線「ｃ」）から増幅した。解離曲線のための蛍光データは、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの存在下でＰＣＲ産物を７０℃から９８℃まで０．１℃／秒の変化率で加熱することにより得た。解離ピークは、蛍光の負の導関数を温度対温度（−ｄＦ／ｄＴ対Ｔ）でプロットすることにより得た。
【図４】
図４は、ｐ１５Ｉｎｋ４ｂ遺伝子についての蛍光解離ピークを示す。亜硫酸水素処理したＤＮＡは、２種の対照細胞系ＨＬ−６０（メチル化されていないもの、曲線「ａ」）およびＭＯＬＴ−４（完全にメチル化されているもの、曲線「ｂ」）ならびにＡＭＬに罹患している患者からの骨髄細胞（曲線「ｃ」および「ｄ」）から増幅した。
【図５】
図５は、本発明の第２の態様に関連する。図５Ａは、Ｎ−ｒａｓ原癌遺伝子の第２エキソンの解離マップを示す。図５Ｂは、対照低温解離ドメイン（「ａ」）および高温解離ドメイン（「ＧＣクランプ」）（「ｃ」）を人為的に付加した後の同じ領域の解離マップを示す。
【図６】
図６は、ＭＤＲ１遺伝子の１０７ｂｐ領域の解離転移を示す（図６Ａ）。解離マップ内の実線は、完全にメチル化されている形態（ＣｐＧジヌクレオチド中の全てのシトシンがメチル化されているもの）の上部ＤＮＡ鎖についてのＤＮＡ解離の一分子成分を表わす。解離マップ内の破線は、ＭＥＬＴ９４により算出した場合の計算上の鎖解離定数が１０−６Ｍである等価温度（すなわち、鎖の解離が起こると予測される温度）を示す。関心の持たれる配列へのＧＣクランプのＰＣＲによる結合は、図６Ｂに示す。
【図７】
図７は、ＨＩＣ１遺伝子についての蛍光解離ピークを示す。Ｓｓｓ Ｉ処理したＤＮＡ（曲線「Ｍ」）および正常なリンパ球からのＤＮＡ（曲線「Ｕ」）を亜硫酸水素ナトリウムで処理し、ＰＣＴ増幅した。ＰＣＲ産物をＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉと混合し、解離分析に供した。
【図８】
図８は、ＤＡＰＫ遺伝子についての蛍光解離ピークを示す。Ｓｓｓ Ｉ処理したＤＮＡ（曲線「Ｍ」）および正常なリンパ球からのＤＮＡ（曲線「Ｕ」）を亜硫酸水素ナトリウムで処理し、ＰＣＴ増幅した。ＰＣＲ産物をＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉと混合し、解離分析に供した。
【図９】
図９は、ＡＰＣ遺伝子のプロモーター１Ａについての蛍光解離ピークを示す。正常なメラノサイト（Ａ）およびメラノーマの生検（Ｂ〜Ｆ）からの亜硫酸水素処理したＤＮＡを増幅し、解離曲線分析に供した。
【図１０】
図１０は、ＡＰＣ遺伝子のプロモーター１Ａについての蛍光解離ピークを示す。正常なメラノサイトからの亜硫酸水素処理ＤＮＡ（メチル化されていないもの、曲線「０」）および６つ、８つおよび１４のメチル化ＣｐＧ部位を提示するプラスミドＤＮＡ（曲線「６」、「８」および「１４」）を増幅し、解離曲線分析に供した。
【図１１】
図１１は、ＡＰＣ遺伝子のプロモーター１Ａについての蛍光解離ピークを示す。正常なメラノサイトからの亜硫酸水素処理ＤＮＡ（「非メチル化ＡＰＣ」）および１４のメチル化ＣｐＧ部位を提示するプラスミドＤＮＡ（「メチル化ＡＰＣ」）を増幅し、臭化エチジウム（Ａ）、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（Ｂ）またはＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｃ）の存在下での解離曲線分析に供した。
【図１２】
図１２は、ＰＣＲ産物を固定したスライドガラスフォーマット上で解離アッセイを行うための装置を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004512050.tif 000089
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