(57)【要約】ＨＳＶ感染の診断および処置のための化合物および方法が提供される。この化合物は、ＨＳＶポリペプチドの少なくとも１つの抗原性部分を含むポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む。このようなポリペプチドまたはＤＮＡ配列を含む薬学的組成物おおよびワクチンもまた、このようなポリペプチドに対して指向される抗体と共に提供される。このようなポリペプチドおよび／またＤＮＡ配列、ならびに患者および生物学的サンプルにおけるＨＳＶ感染を検出するための適切な検出試薬を含む診断キットもまた、提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともＨＳＶ抗原の免疫原性部分を含む単離されたポリペプチドであって、ここで、該抗原は、配列番号２〜３、５〜７、１０〜１２、１４〜１５、１７〜１８、２０〜２３、２５〜２６、３９〜４１、４５〜４７、５０〜５１、および５４〜５５のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１、４、８〜９、１３、１６、１９、２４、３４〜３８、４８〜４９、および５２〜５３のいずれか１つに記載される配列を含む、請求項２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
少なくともＨＳＶ　ＵＬ４６抗原の免疫原性部分を含む単離されたポリペプチドであって、ここで、該抗原は、配列番号１５に記載されるアミノ酸配列を含み、そしてここで、該免疫原性部分は、配列番号２７〜３３および５９〜６２からなる群より選択される、単離されたポリペプチド。
【請求項５】
少なくともＨＳＶ　ＵＬ１５抗原の免疫原性部分を含む単離されたポリペプチドであって、ここで、該抗原は、配列番号２６に記載されるアミノ酸配列を含み、そしてここで、該免疫原性部分は、配列番号５６〜５７からなる群より選択される、単離されたポリペプチド。
【請求項６】
少なくともＨＳＶ　ＵＳ３抗原の免疫原性部分を含む単離されたポリペプチドであって、ここで、該抗原は、配列番号１２に記載されるアミノ酸配列を含み、そしてここで、該免疫原性部分は、配列番号６３を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項７】
少なくともＨＳＶ　ＵＳ８Ａ抗原の免疫原性部分を含む単離されたポリペプチドであって、ここで、該抗原は、配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含み、そしてここで、該免疫原性部分は、配列番号６４を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項８】
請求項１に記載のポリペプチドおよび融合パートナーを含む、融合タンパク質。
【請求項９】
前記融合パートナーが、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされた宿主細胞中で、該融合タンパク質の発現を増大する発現エンハンサーを含む、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記融合パートナーが、請求項１に記載のポリペプチド内には存在しないＴヘルパーエピトープを含む、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記融合パートナーが、親和性タグを含む、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
請求項８に記載の融合タンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、あるいはそれらの抗体結合フラグメント。
【請求項１４】
請求項１に記載のポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および生理学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項１５】
請求項１に記載のポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および免疫賦活剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１６】
前記免疫賦活剤が、モノホスホリルリピドＡ、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート、サポニン、またはこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
患者における免疫応答を刺激するための方法であって、患者に、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１８】
患者におけるＨＳＶ感染を検出するための方法であって、以下：
（ａ）該患者から生物学的サンプルを得る工程；
（ｂ）該サンプルを、請求項１に記載のポリペプチドと接触させる工程；および
（ｃ）該ポリペプチドに結合する抗体の存在を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
前記生物学的サンプルが、全血、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、および尿からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
生物学的サンプル中のＨＳＶ感染を検出するための方法であって、以下：
（ａ）該生物学的サンプルを、請求項１に記載のポリペプチドに結合し得る結合剤と接触させる工程；および
（ｂ）該サンプル中で、該結合剤と結合するポリペプチドを検出する工程、
を包含し、これによって該生物学的サンプル中のＨＳＶ感染を検出する、方法。
【請求項２１】
前記結合剤が、モノクローナル抗体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記結合剤が、ポリクローナル抗体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記生物学的サンプルが、全血、痰、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、および尿からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
診断キットであって、以下：
（ａ）請求項１に記載のポリペプチド；
（ｂ）請求項８に記載の融合タンパク質；
（ｃ）請求項１３に記載の少なくとも１つの抗体、またはその抗原結合フラグメント；および
（ｄ）検出試薬、
からなる群より選択される成分を含む、診断キット。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが、固体支持体上に固定されている、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記検出試薬が、結合剤に結合体化したレポーター基を含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２７】
前記結合剤が、抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡおよびレクチンからなる群より選択される、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記レポーター基が、放射性同位体、蛍光基、発光基、酵素、ビオチンおよび色素粒子からなる群より選択される、請求項２６に記載のキット。
【請求項２９】
患者におけるＨＳＶ感染を処置するための方法であって、以下の工程：
（ａ）該患者から末梢血細胞を得る工程；
（ｂ）Ｔ細胞が増殖するように、該細胞を、少なくとも１つの請求項１に記載のポリペプチドの存在下でインキュベートする工程；および
（ｃ）該患者に該増殖したＴ細胞を投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項３０】
前記Ｔ細胞をインキュベートする工程が、１回以上繰り返される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記工程（ａ）が、前記末梢血細胞からＴ細胞を分離する工程をさらに包含し、そして前記工程（ｂ）においてインキュベートされる前記細胞がＴ細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記工程（ａ）が、前記末梢血細胞からＣＤ４＋細胞またはＣＤ８＋　Ｔ細胞を分離する工程をさらに包含し、そして前記工程（ｂ）において増殖される前記細胞が、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋　Ｔ細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記工程（ａ）が、前記末梢血細胞からγ／δ　Ｔリンパ球を分離する工程をさらに包含し、そして前記工程（ｂ）において増殖される前記細胞が、γ／δ　Ｔリンパ球である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記工程（ｂ）が、前記ポリペプチドの存在下で増殖した１つ以上のＴ細胞をクローニングする工程をさらに包含する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
患者におけるＨＳＶ感染を処置するための薬学的組成物であって、生理学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、請求項１に記載のポリペプチドの存在下で増殖したＴ細胞を含む、薬学的組成物。
【請求項３６】
患者におけるＨＳＶ感染を処置するための方法であって、以下の工程：
（ａ）少なくとも１つの請求項１に記載のポリペプチドの存在下で、抗原提示細胞をインキュベートする工程；
（ｂ）該患者に、該インキュベートした抗原提示細胞を投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項３７】
前記抗原提示細胞が、樹状細胞、マクロファージ細胞、Ｂ細胞、線維芽細胞、単球細胞、および幹細胞からなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
患者におけるＨＳＶ感染を処置するための薬学的組成物であって、生理学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、請求項１に記載のポリペプチドの存在下でインキュベートされた抗原提示細胞を含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、一般に、ＨＳＶ感染の検出および処置に関する。特に、本発明は、ＨＳＶ抗原を含むポリペプチド、ＨＳＶ抗原をコードするＤＮＡならびにＨＳＶ感染の診断および処置のためのこのような組成物に使用に関連する。
【０００２】
（発明の背景）
ヘルペスウイルスは、１型（ＨＳＶ−１）および２型（ＨＳＶ−２）と命名される２つの密接に関連する改変体を含む、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）を含む。ＨＳＶは、ヒトにおける生殖感染の一般的な原因であり、６００，０００の新患の推定年間発生率であり、そして１０００〜２０００万人の個体が症候性慢性再発性疾患を体験する。無症候性潜在性感染の割合は、なおより高い。例えば、型特異的な血清学的アッセイを使用して、アトランタの健康管理機関クリニックに通院する女性の３５％の非選択集団は、ＨＳＶ２型（ＨＳＶ−２）に対する抗体を有する。抗ウイルス剤（例えば、アシクロビル）の連続的な投与は、急性のＨＳＶ疾患の重篤度を改善し、そして再発性発症の頻度および持続時間を減少するが、このような化学療法介入は、潜伏の確立の中断も、潜伏ウイルスの状態の変更もしない。結果として、再発性疾患パターンは、薬剤処置の中止によって迅速に再確立される。
【０００３】
単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）の少なくとも１つの株のゲノムは、特徴付けられている。これは、約１５０ｋｂであり、そして約８５の既知の遺伝子をコードする。これらのそれぞれは、５０〜１０００アミノ酸長の範囲のタンパク質をコードする。しかし、ウイルス感染に対して効果的なＴ細胞免疫応答を誘起し得る免疫原性部分、特に免疫原性エピトープは未知である。
【０００４】
従って、ＨＳＶ感染に対する効果的な免疫応答を誘起し得るＨＳＶポリペプチドの免疫原性部分、好ましくは、エピトープを同定することが医療的および科学的に必要である。このような情報は、ＨＳＶ感染を実質的に予防するためのより安全でありかつさらに効果的な予防的薬学的組成物、例えば、ワクチン組成物、および感染が、既に起きている場合、疾患と戦う治療的な成物を導く。本発明は、これらの必要性および他の必要性を満たす。
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、ＨＳＶ感染の診断および治療のための組成物および方法を提供する。１つの局面において、本発明は、ＨＳＶ抗原の免疫原性部分あるいはこのような抗原の改変体または生物学機能の等価物を含むポリペプチドを提供する。特定の好ましい部分および他の改変体は、免疫原性であり、その結果抗原特異的な抗血清に反応する部分または改変体の能力は、実質的に減少していない。特定の実施形態において、ポリペプチドは、以下からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む：（ａ）配列番号１、４、８〜９、１３、１６、１９、２４、３５〜３８、４８〜４９および５２〜５３のいずれか１つの配列；（ｂ）それらの配列の相補体、および（ｃ）中程度のストリンジェント条件下で、（ａ）または（ｂ）の配列にハイブリダイズする配列。特定の実施形態において、本発明ポリペプチドは、その改変体および生物的な機能等価物を含む、配列番号２、３、５、６、７、１０〜１２、１４〜１５、１７〜１８、２０〜２３、２５〜３３、３９〜４７、５０〜５１および５４〜６４のいずれか１つに示されるいくつかまたは全てのアミノ酸配列を含む、ＨＳＶタンパク質の少なくとも部分、好ましくは、少なくとも免疫原性部分を含む。
【０００６】
本発明はさらに、上記のようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその部分（例えば、ＨＳＶタンパク質の少なくとも１５連続アミノ酸残基をコードする部分）、そのようなポリヌクレオチドを含む発現ベクター、およびそのような発現ベクターを用いて形質転換されたかまたはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【０００７】
関連する局面において、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、１つ以上のこれらのポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターおよびこのような発現ベクターで形質転換されるかまたはトランスフェクトされた宿主細胞もまた、提供される。
【０００８】
別の局面において、本発明は、薬学的組成物およびそのワクチンとしての使用のための、例えば、生理学的に受容可能なキャリアまたは免疫賦活剤との組み合わせた１つ以上のＨＳＶポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。
【０００９】
本発明は、（ａ）ＨＳＶタンパク質に特異的に結合する抗体（ポリクローナルおよびモノクローナルのいずれかまたはその抗原結合フラグメント）および（ｂ）生理学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物をさらに提供する。
【００１０】
他の局面において、本発明は、本明細書中に開示される１つ以上のＨＳＶポリペプチドまたはその部分あるいはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子および生理学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。本発明はまた、予防目的および治療目的のために、本明細書中に定義されるような、１つ以上の開示されるポリペプチドおよび免疫賦活剤を含むワクチンならびにこのようなポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列および免疫賦活剤を含むワクチンを提供する。
【００１１】
なお別の局面において、患者に有効量の１つ以上の上記に薬学的組成物またはワクチンを投与することを含む、患者において予防的な免疫を誘導するための方法が、提供される。患者の処置における使用のために同定されるポリペプチドのいずれかは、ヘルペス感染を処置するために使用される薬学的薬剤（例えば、Ｚｏｖｉｒａｘ（登録商標）（アシクロビル）、Ｖａｌｔｒｅｘ（登録商標）（バラシクロビルおよびＦａｍｖｉｒ（登録商標）（ファムシクロビル）であるがこれらに限定されない）と共に使用され得る。
【００１２】
なおさらなる局面において、患者におけるＨＳＶ感染の影響を処置、実質的に予防または改善のための方法が提供され、この方法は、その患者から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得る工程、そのＰＢＭＣを本発明のポリペプチド（もしくはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）とインキュベートして、インキュベートされたＴ細胞を提供する工程、およびこのインキュベートされたＴ細胞をその患者に投与する工程、を含む。本発明はさらに、抗原提示細胞を本発明のポリペプチド（もしくはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）とインキュベートして、インキュベートされた抗原提示細胞を提供する工程、およびこのインキュベートされた抗原提示細胞をその患者に投与する工程、を包含する、ＨＳＶ感染の処置のための方法を提供する。増殖した細胞は、必要ではないが、患者に投与される前にクローニングされ得る。特定の実施形態において、この抗原提示細胞は、樹状細胞、マクロファージ、単球、Ｂ細胞および線維芽細胞からなる群から選択される。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドとインキュベートされたＴ細胞または抗原提示細胞を含むＨＳＶ感染の処置のための組成物もまた提供される。関連する局面において、以下を含む、ワクチンが、提供される：（ａ）上記のようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞および（ｂ）免疫賦活剤。
【００１３】
別の局面において、本発明は、生物学的サンプルからＨＳＶ感染した細胞を除去し、この方法は、ＨＳＶタンパク質と特異的に反応するＴ細胞に生物学的サンプルを接触させる工程を包含する方法をさらに提供する。ここで、接触の工程は、サンプルからタンパク質を発現する細胞の除去を可能にする条件かつ十分な時間において実施される。
【００１４】
関連する局面において、上記されるように処理される生物学的サンプルを患者に投与する工程を包含する、患者におけるＨＳＶ感染の発生を阻害する方法が、提供される。本発明のさらなる局面において、方法および診断キットは、患者におけるＨＳＶ感染を検出するために提供される。１つの実施形態において、この方法は以下を包含する：（ａ）生物学的サンプルと本明細書中に開示されるポリペプチドまたは融合タンパク質の少なくとも１つを接触させる工程；および（ｂ）ポリペプチドまたは融合タンパク質に結合する結合剤の存在をサンプルを検出し、それによって、生物学的サンプル中でＨＳＶ感染を検出する工程。適切な生物学的サンプルとしては、以下が挙げられる：全血、痰、血清、血漿、唾液、脳脊髄液および尿。１つの実施形態において、診断キットは、検出試薬と組み合わせにおいて、本明細書中に開示される１つ以上のポリペプチドまたは融合タンパク質を含む。なお別の実施形態において、診断キットは、本発明のポリペプチドに結合するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかを含む。
【００１５】
本発明はまた、以下を包含するＨＳＶ感染を検出するための方法を提供する：（ａ）患者から生物学的サンプルを得る工程；（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応において少なくとも２つのオリゴヌクレオチドとサンプルを接触される工程であってこのオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つは、本明細書中で開示されポリヌクレオチドに特異的である、工程；および（ｃ）オリゴヌクレオチドプライマーの存在下において増幅されるポリヌクレオチド配列をサンプルから検出する工程。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列またはそれとハイブリダイズする配列の約１０個の連続したヌクレオチドを含む。
【００１６】
さらなる局面において、本発明は、以下を包含する、患者におけるＨＳＶ感染を検出するための方法を提供する：（ａ）患者から生物学的サンプルを得る工程；（ｂ）本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブとサンプルを接触させる工程；および（ｃ）オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズするポリヌクレオチド配列をサンプル中から検出する工程。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列またはそれとハイブリダイズする配列の少なくとも約１５個の連続したヌクレオチドを含む。
【００１７】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明を参照して明らかになる。本明細書中に開示されるすべての参考文献は、各々が個別に援用されるように、そのすべてが本明細書中で参考として援用される。
【００１８】
（配列識別子）
配列番号１は、ＨＳＶ２Ｉ＿ＵＬ３９ｆｒａｇＨ１２Ａ１２と命名される単離されたクローンのポリヌクレオチド配列を示す。
【００１９】
配列番号２は、配列番号１のポリヌクレオチド内にコードされるオープンリーディングフレームの、Ｈ１２Ａ１２ｏｒｆｌ．ｐｒｏと命名されるアミノ酸配列を示す。
【００２０】
配列番号３は、全長ＨＳＶ−２  ＵＬ３９タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００２１】
配列番号４は、ＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＳ８ＡｆｒａｇＤ６．Ｂ＿Ｂ１１＿Ｔ７Ｔｒｃ．ｓｅｑと命名される単離されたクローンのポリヌクレオチド配列を示す。
【００２２】
配列番号５は、配列番号４のポリヌクレオチド内にコードされるオープンリーディングフレームの、Ｄ６Ｂｏｒｆｌ．ｐｒｏと命名されるアミノ酸配列を示す。
【００２３】
配列番号６は、配列番号４のポリヌクレオチド内にコードされるオープンリーディングフレームの、Ｄ６Ｂｏｒｆ２．ｐｒｏと命名されるアミノ酸配列を示す。
【００２４】
配列番号７は、全長ＨＳＶ−２  ＵＳ８Ａタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００２５】
配列番号８は、ＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＳ４ｆｒａｇＦｌＯＢ３＿Ｔ７Ｔｒｃ．ｓｅｑと命名される単離されたクローンのポリヌクレオチド配列を示す。
【００２６】
配列番号９は、ＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＳ３ｆｒａｇＦ１０Ｂ３＿Ｔ７Ｐ．ｓｅｑと命名される単離されたクローンのポリヌクレオチド配列を示す。
【００２７】
配列番号１０は、配列番号８のポリヌクレオチド内にコードされるオープンリーディングフレームの、Ｆ１０Ｂ３ｏｒｆ２．ｐｒｏと命名されるアミノ酸配列を示す。
【００２８】
配列番号１１は、配列番号９のポリヌクレオチド内にコードされるオープンリーディングフレームの、８Ｆ１０Ｂ３ｏｒｆｌ．ｐｒｏと命名されるアミノ酸配列を示す。
【００２９】
配列番号１２は、全長ＨＳＶ−２  ＵＳ３タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００３０】
配列番号１３は、ＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＬ４６ｆｒａｇＦ１１Ｆ５＿Ｔ７Ｔｒｃ．ｓｅｑと命名される単離されたクローンのポリヌクレオチド配列を示す。
【００３１】
配列番号１４は、配列番号１３のポリヌクレオチド内にコードされるオープンリーディングフレームの、Ｆ１１Ｆ５ｏｒｆｌ．ｐｒｏと命名されるアミノ酸配列を示す。
【００３２】
配列番号１５は、全長ＨＳＶ−２  ＵＬ４６タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００３３】
配列番号１６は、ＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＬ２７ｆｒａｇＨ２Ｃ７＿Ｔ７Ｔｒｃ．ｓｅｑと命名される単離されたクローンのポリヌクレオチド配列を示す。
【００３４】
配列番号１７は、配列番号１６のポリヌクレオチド内にコードされるオープンリーディングフレームの、Ｈ２Ｃ７ｏｒｆｌ．ｐｒｏと命名されるアミノ酸配列を示す。
【００３５】
配列番号１８は、全長ＨＳＶ−２  ＵＬ２７タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００３６】
配列番号１９は、ＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＬ１８ｆｒａｇＦ１０Ａ１＿ｒｃ．ｓｅｑと命名される単離されたクローンのポリヌクレオチド配列を示す。
【００３７】
配列番号２０は、配列番号１９のポリヌクレオチド内にコードされるオープンリーディングフレームの、Ｆ１０ＡＩｏｒｆ３．ｐｒｏと命名されるアミノ酸配列を示す。
【００３８】
配列番号２１は、配列番号１９のポリヌクレオチド内にコードされるオープンリーディングフレームの、Ｆ１０ＡＩｏｒｆ２．ｐｒｏと命名されるアミノ酸配列を示す。
【００３９】
配列番号２２は、配列番号１９のポリヌクレオチド内にコードされるオープンリーディングフレームの、Ｆ１０ＡＩｏｒｆｌ．ｐｒｏと命名されるアミノ酸配列を示す。
【００４０】
配列番号２３は、全長ＨＳＶ−２  ＵＬ１８タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００４１】
配列番号２４は、ＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＬ１５ｆｒａｇＦ１０Ａ１２＿ｒｃ．ｓｅｑと命名される単離されたクローンのポリヌクレオチド配列を示す。
【００４２】
配列番号２５は、配列番号２４のポリヌクレオチド内にコードされるオープンリーディングフレームの、Ｆ１０Ａ１２ｏｒｆｌ．ｐｒｏと命名されるアミノ酸配列を示す。
【００４３】
配列番号２６は、全長ＨＳＶ−２  ＵＬ１５タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００４４】
配列番号２７は、ＨＳＶＩＩ  ＵＬ４６遺伝子の免疫原性部分由来の１５マーのポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００４５】
配列番号２８は、ＨＳＶＩＩ  ＵＬ４６遺伝子の免疫原性部分由来の１５マーのポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００４６】
配列番号２９は、ＨＳＶＩＩ  ＵＬ４６遺伝子の免疫原性部分由来の１５マーのポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００４７】
配列番号３０は、ＨＳＶＩＩ  ＵＬ４６遺伝子の免疫原性部分由来の１５マーのポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００４８】
配列番号３１は、ＨＳＶＩＩ  ＵＬ４６遺伝子の免疫原性部分由来の１５マーのポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００４９】
配列番号３２は、ＨＳＶＩＩ  ＵＬ１８遺伝子の免疫原性部分由来の１５マーのポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００５０】
配列番号３３は、ＨＳＶＩＩ  ＵＬ１８遺伝子の免疫原性部分由来の１５マーのポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００５１】
配列番号３４は、ＲＬ２＿Ｅ９Ａ４＿５＿ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ．ｓｅｑと命名される単離されたクローンのヌクレオチド配列を示す。
【００５２】
配列番号３５は、全長ＨＳＶ−２  ＲＬ２７遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【００５３】
配列番号３６は、ＵＬ２３＿２２＿Ｃ１２Ａ１２＿ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ．ｓｅｑと命名される単離されたクローンのヌクレオチド配列を示す。
【００５４】
配列番号３７は、全長ＨＳＶ−２  ＵＬ２３タンパク質のヌクレオチド配列を示す。
【００５５】
配列番号３８は、全長ＨＳＶ−２  ＵＬ２２タンパク質のヌクレオチド配列を示す。
【００５６】
配列番号３９は、配列番号３７のポリヌクレオチドによってコードされるオープンリーディングフレームの、ＨＳＶ−２＿ＵＬ２３と命名されるアミノ酸配列を示す。
【００５７】
配列番号４０は、配列番号３６のポリヌクレオチド内にコードされるオープンリーディングフレームの、ＨＳＶ２＿ＵＬ２３と命名されるアミノ酸配列を示す。
【００５８】
配列番号４１は、配列番号３６のポリヌクレオチド内にコードされるオープンリーディングフレームの、ＨＳＶ２＿ＵＬ２２と命名されるアミノ酸配列を示す。
【００５９】
配列番号４２は、ＨＳＶＩＩ  ＵＬ２３遺伝子の免疫原性部分由来の１５マーのポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００６０】
配列番号４３は、ＨＳＶＩＩ  ＵＬ２３遺伝子の免疫原性部分由来の１５マーのポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００６１】
配列番号４４は、ＨＳＶＩＩ  ＵＬ２３遺伝子の免疫原性部分由来の１５マーのポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００６２】
配列番号４５は、配列番号３８のポリヌクレオチドによってコードされるオープンリーディングフレームの、ＨＳＶ２＿ＵＬ２２と命名されるアミノ酸配列を示す。
【００６３】
配列番号４６は、配列番号３４のポリヌクレオチドによってコードされるオープンリーディングフレームの、ＲＬ２＿Ｅ９Ａ４＿５＿ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ．ｓｅｑと命名されるアミノ酸配列を示す。
【００６４】
配列番号４７は、配列番号３５のポリヌクレオチドによってコードされるオープンリーディングフレームの、ＨＳＶ２＿ＲＬ２と命名されるアミノ酸配列を示す。
【００６５】
配列番号４８は、Ｇ１０＿ＵＬ３７ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ．ｓｅｑと命名される単離されたクローンのポリヌクレオチド配列を示す。
【００６６】
配列番号４９は、全長ＨＳＶ−２  ＵＬ３７遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【００６７】
配列番号５０は、配列番号４８のポリヌクレオチドによってコードされるオープンリーディングフレームの、ＨＳＶ２＿ＵＬ３７と命名されるアミノ酸配列を示し、そして
配列番号５１は、配列番号４９のポリヌクレオチドによってコードされるオープンリーディングフレームの、ＨＳＶ２＿ＵＬ３７と命名されるアミノ酸配列を示す
配列番号５２は、クローンＵＬ４６ｆｒａｇＦＩＩＦ５の挿入物に由来するＤＮＡ配列を示す。
【００６８】
配列番号５３は、クローンＧ１０の挿入物に由来するＤＮＡ配列を示す。
【００６９】
配列番号５４は、クローンＵＬ４６ｆｒａｇＦＩＩＦ５の挿入物に由来するアミノ酸配列を示す。
【００７０】
配列番号５５は、クローンＧ１０の挿入物に由来するアミノ酸配列である。
【００７１】
配列番号５６は、ＨＳＶ−２遺伝子ＵＬ１５のペプチド番号２３（アミノ酸６８８〜７０２）のアミノ酸配列である。
【００７２】
配列番号５７は、ＨＳＶ−２遺伝子ＵＬ１５のペプチド番号３０（アミノ酸７１６〜７３０）のアミノ酸配列である。
【００７３】
配列番号５８は、ＨＳＶ−２遺伝子ＵＬ２３のペプチド番号７（アミノ酸２６５〜２７９）のアミノ酸配列である。
【００７４】
配列番号５９は、ＨＳＶ−２遺伝子ＵＬ４６のペプチド番号２（アミノ酸６２１〜６３５）のアミノ酸配列である。
【００７５】
配列番号６０は、ＨＳＶ−２遺伝子ＵＬ４６のペプチド番号８（アミノ酸６４５〜６５９）のアミノ酸配列である。
【００７６】
配列番号６１は、ＨＳＶ−２遺伝子ＵＬ４６のペプチド番号９（アミノ酸６４９〜６６３）のアミノ酸配列である。
【００７７】
配列番号６２は、ＨＳＶ−２遺伝子ＵＬ４６のペプチド番号１１（アミノ酸６５７〜６７１）のアミノ酸配列である。
【００７８】
配列番号６３は、ＨＳＶ−２遺伝子ＵＳ３のペプチド番号３３（アミノ酸２６２〜２７６）のアミノ酸配列である。
【００７９】
配列番号６４は、ＨＳＶ−２遺伝子ＵＳ８Ａのペプチド番号５（アミノ酸９９〜１１３）のアミノ酸配列である。
【００８０】
（例示的な実施形態の説明）
上記されるように、本発明は、一般に、組成物ならびに方法、特にＨＳＶ感染の治療および診断において組成物を作製および使用するための方法に関する。本明細書中に記載される特定の例示的な組成物は、ＨＳＶポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、抗体のような結合剤、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、および／または免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞）を含む。特定のＨＳＶタンパク質およびその免疫原性部分は、ＨＳＶに感染した患者の抗血清に検出可能（例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットのような免疫アッセイにおいて）に反応するＨＳＶポリペプチドを含む。
【００８１】
従って、本発明は、例示的なポリヌクレオチド組成物、例示的なポリペプチド組成物、このポリヌクレオチドおよびポリペプチド組成物の免疫原性部分、このようなポリペプチドに結合し得る抗体組成物ならびにこのような組成物を使用する多数のさらなる実施形態（例えば、ヒトＨＳＶ感染の検出、診断および／または治療において）を提供する。
【００８２】
（ポリヌクレオチド組成物）
本明細書中で使用される場合、用語「ＤＮＡセグメント」および「ポリヌクレオチド」は、特定の種の全ゲノムＤＮＡを含まない単離されたＤＮＡ分子をいう。従って、ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、ＤＮＡセグメントが得られる種の全ゲノムＤＮＡから実質的に単離されたか、またはこのゲノムＤＮＡから精製された、１つ以上のコード配列を含むＤＮＡセグメントをいう。ＤＮＡセグメントおよびこのようなセグメントのより小さなフラグメント、そしてまた、組換えベクター（例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド、ファージ、ウイルスなどを含む）が、用語「ＤＮＡセグメント」および「ポリヌクレオチド」内に含まれる。
【００８３】
当業者に理解されるように、本発明のＤＮＡセグメントは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどを発現するか、または発現し得るように適応されたゲノム配列、ゲノム外配列およびプラスミドにコードされる配列、ならびにより小さな操作された遺伝子セグメントを含み得る。このようなセグメントは、自然に単離され得るか、または人の手によって合成的に改変され得る。
【００８４】
本明細書中で使用される場合、「単離された」は、ポリヌクレオチドが、実質的に他のコード配列から離れており、そしてＤＮＡセグメントが無関係のコードＤＮＡ（例えば、大きな染色体フラグメントまたは他の機能的遺伝子あるいはポリペプチドコード領域）の大部分を含まないことを意味する。当然のことながら、これは、最初に単離され、そして人の手によってセグメントに加えられた後に遺伝子またはコード領域を除外しないＤＮＡセグメントをいう。
【００８５】
当業者に認識されるように、ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードもしくはアンチセンス）または二本鎖であり得、そしてＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成）またはＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子は、ＨｎＲＮＡ分子（これはイントロンを含み、そしてＤＮＡ分子に１対１の様式で対応する）、およびｍＲＮＡ分子（これは、イントロンを含まない）を含む。さらなるコード配列または非コード配列は、本発明のポリヌクレオチド内に存在し得るがその必要はなく、そしてポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持材料に連結され得るがその必要はない。
【００８６】
ポリヌクレオチドは、ネイティブの配列（すなわち、ＨＳＶタンパク質をコードする内因性配列またはその部分）を含み得るか、あるいはこのような配列の改変体、または生物学的もしくは抗原性の機能的均等物を含み得る。ポリヌクレオチド改変体は、以下にさらに記載されるように、好ましくはネイティブのＨＳＶタンパク質と比較して、コードされたポリペプチドの免疫原性が減少しないように、１つ以上の置換、付加、欠失、および／または挿入を含み得る。コードされたポリペプチドの免疫原性の効果は、一般に、本明細書中に記載されるように評価され得る。用語「改変体」はまた、異種間の起源の相同な遺伝子を含む。
【００８７】
ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を比較する場合、２つの配列におけるヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が、以下に記載されるように最大一致についてアライメントされる場合に同じときに、２つの配列が「同一」であるといわれる。２つの配列の間の比較は、代表的には、配列類似性の局所領域を同定および比較するために、比較ウインドウ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）にわたって配列を比較することによって行われる。本明細書中で使用される場合、「比較ウインドウ」は、少なくとも約２０、通常は３０〜約７５、４０〜約５０の連続した位置のセグメントをいい、ここで、２つの配列が最適に整列された後に、配列が連続した位置の同じ数の参照配列と比較され得る。
【００８８】
比較のための配列の最適なアライメントは、生命情報科学ソフトウエアのＬａｓｅｒｇｅｎｅスイート（ｓｕｉｔｅ）におけるＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、デフォルトパラメーターで行われ得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載のいくつかのアライメントスキームを統合する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ  Ｖｏｌ．５，Ｓｕｐｐｌ．３，ｐｐ．３４５−３５８におけるＤａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．；Ｈｅｉｎ  Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ  ｐｐ．６２６−６４５  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１８３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．（１９７１）Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ  １１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．Ｎｅｓ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６−７３０。
【００８９】
あるいは、比較のための配列の最適なアライメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ２：４８２の局所同定アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の同定アライメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化した実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または検査によって行われ得る。
【００９０】
配列同一性および配列類似性の割合を決定するために適切なアルゴリズムの１つの好ましい例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これはそれぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載される。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドについての配列同一性の割合を決定するために、例えば、本明細書中に記載のパラメータを使用して使用され得る。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウエアは、米国バイオテクノロジー情報センターを通して公に利用可能である。１つの例示的な例において、累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（一致する残基の対についての報酬スコア（ｒｅｗａｒｄ  ｓｃｏｒｅ）；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して算出され得る。アミノ酸配列について、スコア行列は、累積スコアを算出するために使用され得る。各方向におけるワードヒットの伸長は、以下の場合に停止する：累積アライメントスコアが、その最大到達値から量Ｘだけ低下した場合；累積スコアが、１以上の負のスコアの残基アライメントの累積に起因してゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。このＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アライメントの検出感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、ワード長さ（Ｗ）１１、および期待値（Ｅ）１０をデフォルトとして使用し、そしてＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照のこと）は、５０の（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較をアライメントする。
【００９１】
好ましくは、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０位置の比較ウインドウにわたる２つの最適にアライメントした配列を比較することによって決定され、ここで比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の部分は、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、２つの配列の最適なアライメントについて２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。このパーセンテージは、両方の配列で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して一致する位置の数を得、この一致する位置の数を参照配列における位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算し、そしてこの結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。
【００９２】
従って、本発明は、本明細書中に開示される配列に実質的に同一性を有するポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列（例えば、本明細書中に記載される方法（例えば、以下に記載するような標準的パラメータを使用するＢＬＡＳＴ解析）を使用して本発明のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列と比較して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を含む配列）を含む。当業者は、これらの値が、コドンの縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置などを考慮することによって、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために、適切に調整され得ることを認識する。
【００９３】
さらなる実施形態において、本発明は、本明細書中に記載の配列の１つ以上に同一であるかまたは相補的な配列の種々の長さの連続したストレッチを含む単離されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドを提供する。例えば、本発明に開示される配列の１つ以上の、少なくとも約１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００または１０００以上、ならびにその間の全ての中間の長さの連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが、本発明によって提供される。本発明の状況において、「中間の長さ」が、示される値の間の任意の長さ（例えば、１６、１７、１８、１９など；２１、２２、２３など；３０、３１、３２など；５０、５１、５２、５３など；１００、１０１、１０２、１０３など；１５０、１５１、１５２、１５３など；２００〜５００；５００〜１，０００などの間の全ての整数を含む）を意味することが容易に理解される。
【００９４】
本発明のポリヌクレオチド、またはそのフラグメントは、そのコード配列自体の長さに関わらず、他のＤＮＡ配列（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、マルチクローニング部位、他のコードセグメントなど）と組合わされ得、その結果、その全体の長さは、相当変化し得る。従って、ほとんど任意の長さの核酸フラグメントが使用され得ることが意図され、その全長は、好ましくは意図した組換えＤＮＡプロトコルにおける調製および使用の容易さによって制限される。例えば、約１０，０００、約５０００、約３０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０の塩基対長など（全ての中間の長さを含む）の全長を有する例示的なＤＮＡセグメントが、本発明の多くの実行において有用であることが意図される。
【００９５】
他の実施形態において、本発明は、中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書中で提供されるポリヌクレオチド配列またはそのフラグメント、あるいはその相補配列にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドに関する。ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学の分野において周知である。例示の目的で、本発明のポリヌクレオチドの、他のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを試験するために適切な中程度にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での予洗；５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣで一晩のハイブリダイゼーション；続いて０．１％  ＳＤＳを含む２×、０．５×、および０．２×ＳＳＣで各２０分、６５℃で２回の洗浄を含む。
【００９６】
さらに、遺伝コードの縮重の結果として、本明細書中に記載されるようなポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが、当業者に理解される。これらのポリヌクレオチドのうちいくつかは、任意のネイティブな遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドンの用法における差異に起因して変化するポリヌクレオチドは、本発明によって詳細に意図される。さらに、本明細書中で提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、１以上の変異（例えば、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換）の結果として変化する内因性遺伝子である。得られたｍＲＮＡおよびタンパク質は、変化した構造または機能を有し得るが、必ずしもそれらを有するに及ばない。対立遺伝子は、標準的な技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較）を用いて、同定され得る。
【００９７】
（プローブおよびプライマー）
本発明の他の実施形態において、本明細書中で提供されるポリヌクレオチド配列は、核酸のハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして、有利に使用され得る。従って、本明細書中で開示される１５ヌクレオチド長の連続した配列と同じ配列か、またはこの連続した配列に相補的な配列を有する、少なくとも約１５ヌクレオチド長の連続した配列の配列領域を含む核酸セグメントが、特定の有用性を見出すことが意図される。より長い連続した同一または相補的な配列（例えば、約２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００（全ての中間長さを含む）および全長配列までの配列）はまた、特定の実施形態において使用される。
【００９８】
このような核酸プローブの、目的の配列に特異的にハイブリダイズする能力は、所定のサンプルにおける相補配列の存在を検出における使用を可能にする。しかし、他の用途（例えば、変異体種プライマーの調製のための配列情報の使用、または他の遺伝的構築物の調製における使用のためのプライマーの使用）もまた想定される。
【００９９】
１０〜１４、１５〜２０、３０、５０、または１００〜２００ヌクレオチド程度（同様に中間長さを含む）の連続したヌクレオチドストレッチを含む配列領域を有し、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列に同一または相補的なポリヌクレオチド分子は、例えばサザンブロッティングまたはノーザンブロッティングにおける使用のためのハイブリダイゼーションプローブとして特に意図される。これは、遺伝子産物またはそのフラグメントの、多様な細胞型およびまた種々の細菌細胞の両方における分析を可能とする。フラグメントの全サイズ、ならびに相補的ストレッチのサイズは、究極的には、特定の核酸セグメントの意図される用途または適用に依存する。より短いフラグメントは、一般にハイブリダイゼーション実施形態における用途を見出し、ここで連続した相補領域の長さが変化され得る（例えば、約１５ヌクレオチドと約１００ヌクレオチドとの間）が、検出を望む相補配列の長さに従って、より長い連続した相補ストレッチが使用され得る。
【０１００】
約１５〜２５ヌクレオチド長のハイブリダイゼーションプローブの使用は、安定および選択的の両方の二重鎖分子の形成を可能にする。しかし、１５塩基長より長いストレッチの連続した相補配列を有する分子は、ハイブリッドの安定性および選択性を増加するために一般に好ましく、それによって、得られる特異的ハイブリッド分子の質および程度が改善する。１５〜２５の連続したヌクレオチド、または望まれる場合にはより長い遺伝子相補的ストレッチを有する核酸分子を設計するのが一般には好ましい。
【０１０１】
ハイブリダイゼーションプローブは、本明細書中で開示された任意の配列の任意の一部分から選択され得る。必要とされる全てのことは、本明細書中で開示される配列に示された配列、すなわち、プローブまたはプライマーとして使用することを所望する、約１５〜２５ヌクレオチド長から全長配列長以下の、この配列の任意の連続した一部分を精査することである。プローブおよびプライマーの選択は、種々の因子によって支配される。例えば、全長配列の末端周辺から使用することを所望し得る。
【０１０２】
小さなポリヌクレオチドセグメントまたはフラグメントは、通常自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して行われるように、例えば化学的手段によってフラグメントを直接合成することによって、容易に調製され得る。また、フラグメントは、核酸複製技術（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号（本明細書中に参考として援用される）のＰＣＲＴＭ技術）の適用によって、組換え産物のために選択配列を組換えベクターに導入することによって、および一般に分子生物学の分野の当業者に公知の他の組換えＤＮＡ技術によって、得られ得る。
【０１０３】
本発明のヌクレオチド配列は、目的の完全遺伝子または遺伝子フラグメントの相補的ストレッチと、二重鎖分子を選択的に形成するその能力のために使用され得る。想定される適用に依存して、代表的には、標的配列に対するプローブの選択性の種々の程度に達するために、ハイブリダイゼーションの種々の条件を使用することが望ましい。高い選択性を必要とする適用について、代表的には、ハイブリッドを形成するための比較的ストリンジェントな条件を使用することが望ましい。例えば、比較的低い塩、および／または高温の条件（例えば、約５０℃〜約７０℃で、約０．０２Ｍ〜約０．１５Ｍの塩の塩濃度によって提供されるような）が選択される。このような選択条件は、存在する場合、プローブとテンプレートまたは標的鎖との間のミスマッチにわずかに許容性であり、そして関連する配列の単離のために特に適切である。
【０１０４】
当然のことながら、いくつかの適用（例えば、潜在的なテンプレートにハイブリダイズする変異体プライマー鎖を使用する、変異体の調製が望ましい場合）について、低ストリンジェント（減少したストリンジェンシー）のハイブリダイゼーション条件は、ヘテロ二重鎖を形成するために代表的に必要とされる。これらの状況において、約２０℃〜約５５℃の温度範囲で約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍの塩の条件のような塩条件を使用することが望ましくあり得る。これによって、交差ハイブリダイズ種は、コントロールハイブリダイゼーションに関して、陽性ハイブリダイズシグナルとして容易に同定され得る。任意の場合において、ホルムアミド（これは、上昇した温度と同じ様式で、ハイブリッド二重鎖を不安定化するように作用する）の増加した量の添加によって、条件がよりストリンジェントになり得ることが一般に理解される。従って、ハイブリダイゼーション条件は、容易に操作され得、そして一般に、所望の結果に依存する最良の方法である。
【０１０５】
（ポリヌクレオチドの同定および特徴づけ）
ポリヌクレオチドは、種々の十分に確立された技術のいずれかを使用して、同定、調製および／または操作され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、以下により詳細に記載されるように、ｃＤＮＡのマイクロアレイをＨＳＶに関連する発現（すなわち、本明細書中で提供される代表的なアッセイを使用して決定する場合、正常な組織における発現よりも、患部である組織での少なくとも２倍高い発現）についてスクリーニングすることによって、同定され得る。このようなスクリーニングは、例えば、製造者の指示に従ってＳｙｎｔｅｎｉマイクロアレイ（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して（そして本質的にＳｃｈｅｎａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９３：１０６１４−１０６１９，１９９６およびＨｅｌｌｅｒら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９４：２１５０−２１５５，１９９７に記載されるように）、行われ得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるタンパク質を発現する細胞から調製されるｃＤＮＡから増幅され得る。このようなポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して増幅され得る。このアプローチのために、配列特異的プライマーが、本明細書中で提供される配列に基づいて設計され得、そして購入または合成され得る。
【０１０６】
本発明のポリヌクレオチドの増幅した部分を使用して、適切なライブラリー（例えば、ＨＳＶｃＤＮＡライブラリー）から周知の技術を使用して全長遺伝子を単離し得る。このような技術において、増幅に適した１以上のポリヌクレオチドプローブまたはプライマーを使用して、ライブラリー（ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリー）をスクリーニングする。好ましくは、ライブラリーはより大きな分子を含むようにサイズが選択される。無作為に刺激されたライブラリー（ｒａｎｄｏｍ　ｐｒｉｍｅｄ　ｌｉｂｒａｒｙ）もまた、遺伝子の５’領域および上流領域の同定ために好まくあり得る。ゲノムライブラリーは、イントロンを得ることおよび５’配列を伸長させることについて好ましい。
【０１０７】
ハイブリダイゼーション技術に関して、部分配列は、周知の技術を使用して標識（例えば、ニックトランスレーションまたは３２Ｐでの末端標識）され得る。次いで、細菌ライブラリーまたはバクテリオファージライブラリーは、一般に、標識プローブと、変性した細菌コロニー（またはファージプラークを含む菌叢）を含むフィルターとをハイブリダイズすることによってスクリーニングされる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。ハイブリダイズするコロニーまたはプラークを選択し、そして拡大する。そしてそのＤＮＡをさらなる分析のために単離する。ｃＤＮＡクローンを、さらなる付加配列の量を決定するために、例えば、部分配列由来のプライマーおよびそのベクター由来のプライマーを使用するＰＣＲによって分析し得る。制限地図および部分配列を作成して、１以上の重複クローンを同定し得る。次いで、標準的な技術（これは、一連の欠失クローンを作製することを包含し得る）を使用して完全配列を決定し得る。次いで、得られた重複配列を１つの連続配列にアセンブルし得る。周知の技術を使用して、適切なフラグメントを連結することにより全長ｃＤＮＡ分子を生成し得る。
【０１０８】
あるいは、部分ｃＤＮＡ配列からの全長コード配列を得るための多くの増幅技術が存在する。このような技術において、増幅は、一般的に、ＰＣＲを介して行われる。種々の市販キットのいずれかを使用して増幅工程を行い得る。例えば、当該分野で周知のソフトウエアを使用してプライマーを設計し得る。プライマーは、好ましくは、長さが２２〜３０ヌクレオチドであり、少なくとも５０％のＧＣ含有量を有し、そして標的配列に約６８℃〜７２℃の温度でアニールする。増幅した領域は、上記に記載されるように配列決定され得、そして重複配列を連続する配列へと構築する。
【０１０９】
このような増幅技術の１つは、インバースＰＣＲである（Ｔｒｉｇｌｉａら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１６：８１８６，１９８８を参照のこと）。この技術は、制限酵素を使用して、その遺伝子の既知の領域内のフラグメントを生成する。次いで、このフラグメントを分子内連結により環状化し、そして既知の領域に由来する多岐したプライマーを用いたＰＣＲのための鋳型として使用する。代替のアプローチにおいて、部分配列に隣接した配列を、リンカー配列に対するプライマーおよび既知の領域に特異的なプライマーを使用する増幅により取り出し得る。この増幅した配列を、代表的に、同じリンカープライマーおよび既知の領域に特異的な第２のプライマーを使用する２回目の増幅に供する。既知の配列から反対方向に伸長を開始する２つのプライマーを使用するこの手順についての改変は、ＷＯ　９６／３８５９１に記載される。そのような別の技術は、「迅速なｃＤＮＡ末端の増幅」またはＲＡＣＥとして公知である。この技術は、公知配列の５’および３’である配列を同定するために、内側プライマーおよび外側プライマー（これは、ポリＡ領域またはベクター配列にハイブリダイズする）の使用を含む。さらなる技術としては、キャプチャーＰＣＲ（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍら，ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｐｐｌｉｃ．１：１１１−１９，１９９１）およびウォーキングＰＣＲ（Ｐａｒｋｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９：３０５５−６０，１９９１）が挙げられる。増幅を利用する他の方法もまた使用して、全長ｃＤＮＡ配列を入手し得る。
【０１１０】
特定の場合において、発現配列タグ（ＥＳＴ）データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋより入手可能のもの）に提供される配列の分析により、全長ｃＤＮＡ配列を入手することが可能である。重複ＥＳＴの検索は、一般に、周知のプログラム（例えば、ＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴ検索）を使用して行われ得、そしてこのようなＥＳＴを使用して連続した全長配列を生成し得る。全長ＤＮＡ配列はまた、ゲノムフラグメントの分析により入手され得る。
【０１１１】
（宿主細胞におけるポリヌクレオチド発現）
本発明の他の実施形態において、本発明のポリペプチドまたはその融合タンパク質もしくは機能的等価物をコードするポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントは、適切な宿主細胞におけるポリペプチドの発現に方向付けるように組換えＤＮＡ分子において使用され得る。遺伝コードの先天的な縮重に起因して、実質的に同じか、または機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が産生され得、そしてこれらの配列を使用して所定のポリペプチドをクローン化し、そして発現させ得る。
【０１１２】
当業者によって理解されるように、いくつかの場合において、天然に存在しないコドンを所有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を作製することが有利であり得る。例えば、特定の原核生物宿主または真核生物宿主に好まれるコドンは、タンパク質発現の速度を増加させるためか、または所望の特性（例えば、天然に存在する配列から生成される転写物の半減期よりも長い半減期）を有する組換えＲＮＡ転写物を産生するように選択され得る。
【０１１３】
さらに、本発明のポリヌクレオチド配列は、種々の理由（遺伝子産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を変更する改変が挙げられるが、それらに限定されない）のためにポリペプチドコード配列を変更するために、当該分野において一般的に公知の方法を使用して操作され得る。例えば、無作為切断によるＤＮＡシャッフリングならびに遺伝子フラグメントおよび合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再アセンブリを使用して、ヌクレオチド配列を操作し得る。さらに、部位指向性変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を使用して、新たな制限部位を挿入し得るか、グリコシル化パターンを改変し得るか、コドン優先（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を変化させ得るか、スプライス改変体を作製し得るか、または変異を導入など行い得る。
【０１１４】
本発明の別の実施形態において、天然の核酸配列、改変された核酸配列、または組換え核酸配列は、融合タンパク質をコードする異種配列に連結され得る。例えば、ポリペプチド活性のインヒビターについてペプチドライブラリーをスクリーニングするために、市販の抗体により認識され得るキメラタンパク質をコードすることが有用であり得る。融合タンパク質はまた、ポリペプチドコード配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含むように操作され得、その結果そのポリペプチドは、異種部分から切断され得、そして精製されて取り出され得る。
【０１１５】
所望のポリペプチドをコードする配列が、当該分野において周知の化学的方法を使用して、全体または部分的に合成され得る（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．ら、（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２１５〜２２３、Ｈｏｒｍ，Ｔら、（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２２５〜２３２を参照のこと）。あるいは、タンパク質自体は、ポリペプチドまたはその一部のアミノ酸配列を合成するための化学的方法を使用して産生され得る。例えば、ペプチド合成は、種々の固相技術を使用して実施され得（Ｒｏｂｅｒｇｅ，Ｊ．Ｙら、（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６９：２０２〜２０４）、そして自動化合成は、例えば、ＡＢＩ　４３１Ａ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して達成され得る。
【０１１６】
新たに合成されたペプチドは、分取高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ＷＨ　Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）または当該分野において利用可能な他の同等技術により実質的に精製され得る。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定（例えば、エドマン分解手順）により確認され得る。さらに、ポリペプチドまたはその任意の部分のアミノ酸配列は、直接合成の間改変されて、そして／または化学的方法を使用して、他のタンパク質もしくはその任意の部分に由来する配列と組み合わせられて、改変体ポリペプチドを産生し得る。
【０１１７】
所望のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または機能的等価物は、適切な発現ベクター（すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含むベクター）内に挿入され得る。当業者に周知である方法を使用して、目的のポリペプチドをコードする配列および適切な転写制御エレメントおよび翻訳制御エレメントを含む発現ベクターを構築し得る。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。そのような技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．，およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ．Ｎ．Ｙ．に記載される。
【０１１８】
種々の発現ベクター／宿主系が、ポリヌクレオチド配列を含み、そして発現させるように利用され得る。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：微生物（例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌）；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；または動物細胞系。
【０１１９】
発現ベクター内に存在する「制御エレメント」または「調節配列」は、転写および翻訳を実行するように宿主細胞タンパク質と相互作用する、そのベクターの非翻訳領域（エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域）である。そのようなエレメントは、その長さおよび特異性を変更し得る。利用されるベクター系および宿主に依存して、多数の適切な転写エレメントおよび翻訳エレメント（構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む）が使用され得る。例えば、細菌系においてクローニングする場合、誘導性プロモーター（例えば、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）などのハイブリッドｌａｃＺプロモーターが使用され得る。哺乳動物細胞系において、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターが、一般的に好ましい。ポリペプチドをコードする配列の複数のコピーを含む細胞株を生成することが必要とされる場合、ＳＶ４０またはＥＢＶベースのベクターが、適切な選択マーカーと共に都合良く使用され得る。
【０１２０】
細菌系において、多数の発現ベクターが、発現されるポリペプチドに対して意図される使用に依存して選択され得る。例えば、抗体の誘導のために大量に必要とされる場合、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を方向づけるベクターが使用され得る。そのようなベクターとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：多機能性Ｅ．ｃｏｌｉクローニングベクターおよび発現ベクター（例えば、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ここでは目的のポリペプチドをコードする配列が、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔおよびそれに引続く７残基についての配列とインフレームでベクター内に連結され得、その結果、ハイブリッドタンパク質が産生される）；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ　Ｈｅｅｋｅ，Ｇ．およびＳ．Ｍ．Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９）など。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）はまた、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般的に、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、そしてグルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、次に遊離のグルタチオンの存在下において溶出させることによって、溶解した細胞から容易に精製され得る。そのような系において作製されたタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、または第ＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され得、その結果、クローン化された目的のポリペプチドが、随意にＧＳＴ部分から放出され得る。
【０１２１】
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えば、α因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨ）を含む多数のベクターが使用され得る。概説については、Ａｕｓｕｂｅｌら、（前出）およびＧｒａｎｔら、（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４を参照のこと。
【０１２２】
植物発現ベクターを使用する場合において、ポリペプチドをコードする配列の発現は、任意の多数のプロモーターにより駆動され得る。例えば、ウイルスプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターおよび１９Ｓプロモーター）を、単独でか、またはＴＭＶ由来のωリーダー配列と組み合わせて使用し得る（Ｔａｋａｍａｔｓｕ，Ｎ．（１９８７）ＥＭＢＯ　Ｊ．６：３０７−３１１）。あるいは、植物プロモーター（例えば、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットまたは熱ショックプロモーター）を使用し得る（Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇ．ら、（１９８４）ＥＭＢＯ　Ｊ．３：１６７１−１６８０；Ｂｒｏｇｌｉｅ，Ｒ．ら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２４：８３８−８４３；およびＷｉｎｔｅｒ，Ｊら、（１９９１）Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ　Ｄｉｆｆｅｒ．１７：８５−１０５）。これらの構築物は、直接的なＤＮＡ形質転換または病原体媒介性トランスフェクションによって植物細胞内に導入され得る。このような技術は、多数の一般的に入手可能な概説に記載されている（例えば、Ｈｏｂｂｓ，Ｓ．またはＭｕｒｒｙ，Ｌ．Ｅ．ＭｃＧｒａｗ　Ｈｉｌｌ　Ｙｅａｒｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）ＭｃＧｒａｗ　Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；１９１−１９６頁を参照のこと）。
【０１２３】
昆虫系はまた、目的のポリペプチドを発現させるために使用され得る。例えば、このような１つの系において、オートグラファカリフォルニア核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｌａｒｖａｅにおいて外来遺伝子を発現させるためのベクターとして使用される。ポリペプチドをコードする配列は、ウイルスの非必須領域内（例えば、ポリへドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）遺伝子）にクローン化され、そしてポリへドリンプロモーターの制御下に置かれ得る。ポリペプチドコード配列の首尾良い挿入は、ポリへドリン遺伝子を不活性化し、そして外殻タンパク質を欠損している組換えウイルスを産生する。次いで、この組換えウイルスを使用して、例えば、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｌａｒｖａｅに感染させ得、そして目的のポリペプチドが発現され得る（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｅ．Ｋ．ら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：３２２４−３２２７）。
【０１２４】
哺乳動物宿主細胞において、多数のウイルスベースの発現系が一般的に利用可能である。例えば、アデノウイルスが、発現ベクターとして使用される場合において、目的のポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーターおよび３部からなるリーダー配列から構成されるアデノウイルス転写／翻訳複合体内に連結され得る。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域における挿入を使用して、感染した宿主細胞においてポリペプチドを発現し得る、生存可能ウイルスを入手し得る（Ｌｏｇａｎ，Ｊ．およびＳｈｅｎｋ，Ｔ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３６５５−３６５９）。さらに、転写エンハンサー（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー）を使用して、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させ得る。
【０１２５】
特定の開始シグナルはまた、目的のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために使用され得る。このようなシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。ポリペプチドをコードする配列、その開始コドンおよび上流配列が適切な発現ベクター内に挿入されている場合において、さらなる転写制御シグナルまたは翻訳制御シグナルは必要とされなくとも良い。しかし、コード配列のみ、またはその一部のみが挿入されている場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが提供されるべきである。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために正確なリーディングフレーム内にあるべきである。外因性翻訳エレメントおよび開始コドンは、種々の起源（天然および合成の両方）に由来し得る。発現の効率は、使用される特定の細胞系に適切なエンハンサー（例えば、文献（Ｓｃｈａｒｆ，Ｄ．ら、（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ　Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５−１６２）に記載されるエンハンサー）の封入によって増大され得る。
【０１２６】
さらに、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の様式において発現されたタンパク質をプロセシングするその能力について選択され得る。ポリペプチドのこのような改変としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）およびアシル化が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングはまた、正確な挿入、折り畳みおよび／または機能を促進するために使用され得る。異なる宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３およびＷＩ３８）（これらは、このような翻訳後活性についての特定の細胞機構（ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）および特徴的機構（ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ）を有する）は、外来タンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするように選択され得る。
【０１２７】
組換えタンパク質の長期間の高収率の産生のために、安定な発現が一般的に好ましい。例えば、目的のポリヌクレオチドを安定に発現する細胞株が、ウイルス複製起点および／または内因性発現エレメントならびに同じかもしくは別個のベクター上の選択マーカー遺伝子を含み得る、発現ベクターを使用して形質転換され得る。このベクターの導入後、細胞は、それらが選択培地に切換えられる前に、富化（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）培地において１〜２日間の増殖され得る。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を与えることであり、そしてその存在は、導入された配列を首尾良く発現する細胞の増殖および回収を可能とする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適切な組織培養技術を使用して、増殖され得る。
【０１２８】
多数の選択系を使用して、形質転換細胞株を回収し得る。これらの選択系としては、それぞれ、ｔｋ．ｓｕｐ．−細胞またはａｐｒｔ．ｓｕｐ−細胞において使用され得る、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら、（１９７７）Ｃｅｌｌ　１１：２２３−３２）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，Ｉ．ら、（１９９０）Ｃｅｌｌ　２２：８１７−２３）遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。また、代謝拮抗剤耐性、抗生物質耐性または除草剤耐性は、選択のための基礎として使用され得る；例えば、ｄｈｆｒ（これは、メトトレキセートに対する耐性を与える（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら、（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７：３５６７−７０））；ｎｐｔ（これは、アミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を与える（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，Ｆ．ら、（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１−１４）；ならびにａｌｓまたはｐａｔ（これらは、それぞれ、クロルスルフロンおよびホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を与える（Ｍｕｒｒｙ、前出））。さらなる選択遺伝子、例えば、ｔｒｐＢ（これは、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にする）またはｈｉｓＤ（これは、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にする）（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｃ．およびＲ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８０４７−５１）が記載されている。近年、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質のＧＵＳ、ならびにルシフェラーゼおよびその基質のルシフェリンのようなマーカーを用いる、可視マーカーの使用の人気が高くなっており、形質転換体を同定するためのみならず、特定のベクター系に起因し得る一過性のタンパク質発現または安定なタンパク質発現の量を定量するためにもまた広範に使用されている（Ｒｈｏｄｅｓ，Ｃ．Ａ．ら、（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：１２１−１３１）。
【０１２９】
マーカー遺伝子発現の存在／非存在は、目的の遺伝子もまた存在するということを示唆しているが、その存在および発現は、確認されることを必要とし得る。例えば、ポリヌクレオチドをコードする配列が、マーカー遺伝子配列内に挿入される場合、配列を含む組換え細胞は、マーカー遺伝子機能の非存在により同定され得る。あるいは、マーカー遺伝子は、単一のプロモーターの制御下にポリペプチドコード配列と直列に配置され得る。誘導または選択に応じたマーカー遺伝子の発現は、通常、その直列遺伝子の発現も同様に示す。
【０１３０】
あるいは、所望のポリヌクレオチド配列を含み、かつ発現する宿主細胞は、当業者に公知の種々の手順によって同定され得る。これらの手順としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：核酸またはタンパク質の検出および／または定量化のための膜ベースの技術、溶液ベースの技術、またはチップベースの技術を含む、ＤＮＡ−ＤＮＡもしくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション技術およびタンパク質バイオアッセイ技術またはイムノアッセイ技術。
【０１３１】
ポリヌクレオチドにコードされる産物に特異的なポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体のいずれかを使用して、この産物の発現を検出および測定するための種々のプロトコルは、当該分野において公知である。例としては、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。所定のポリペプチド上の２つの非干渉性エピトープに対して反応性であるモノクローナル抗体を利用する２つの部位の、モノクローナルベースのイムノアッセイが、いくつかの適用のために好まれ得るが、競合的結合アッセイもまた、利用され得る。これらのアッセイおよび他のアッセイが他の場所に記載される（Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｒ．ら、（１９９０；Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，ＡＰＳ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ　Ｐａｕｌ．Ｍｉｎｎ．）およびＭａｄｄｏｘ，Ｄ．Ｅ．ら、（１９８３；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１−１２１６）。
【０１３２】
広範に種々の標識技術および結合技術は、当業者に公知であり、そして種々の核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにおいて使用され得る。ポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識されたハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを作製するための手段としては、オリゴ標識（ｏｌｉｇｏｌａｂｅｌｉｎｇ）、ニックトランスレーション、末端標識または標識されたヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅が挙げられる。あるいは、ｍＲＮＡプローブの産生のために、配列またはその任意の部分が、ベクター内にクローン化され得る。このようなベクターは、当該分野において公知であり、市販されており、そして適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６）および標識されたヌクレオチドを添加することにより、ＲＮＡプローブをインビトロで合成するために使用され得る。これらの手順は、種々の市販キットを使用して実施され得る。使用され得る適切なレポーター分子または標識としては、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、または色素形成剤ならびに基質、コファクター、インヒビター、磁気粒子などが挙げられる。
【０１３３】
目的のポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、発現および細胞培養物からのタンパク質の回収に適した条件下において培養され得る。組換え細胞により産生されたタンパク質は、使用された配列および／またはベクターに依存して、細胞内に分泌または含まれ得る。当業者によって理解されるように、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核生物細胞膜または真核生物細胞膜を介して、コードされたポリペプチドの分泌を方向付けるシグナル配列を含むように設計され得る。他の組換え構築物を使用して、目的のポリペプチドをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合させ得る。このような精製促進ドメインとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：固定された金属上での精製を可能にする金属キレート化ペプチド（例えば、ヒスチジン−トリプトファンモジュール）、固定された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ　Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）において利用されるドメイン。精製ドメインとコードされるポリペプチドとの間に切断可能なリンカー配列（例えば、第ＸＡ因子またはエンテロキナーゼに対して特異的な配列（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．））の封入を使用して、精製を促進させ得る。このような発現ベクターの１つは、目的のポリペプチドを含む融合タンパク質およびチオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位の前に６つのヒスチジン残基をコードする核酸の発現を提供する。ヒスチジン残基は、Ｐｏｒａｔｈ，Ｊら、（１９９２、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３−２８１）に記載されるように、ＩＭＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）上での精製を促進する一方で、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質から所望のポリペプチドを精製するための手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターの考察は、Ｋｒｏｌｌ，Ｄ．Ｊ．ら、（１９９３；ＤＮＡ　Ｃｅｌｌ　Ｂｏｉｌ，１２：４４１−４５３）において提供される。
【０１３４】
組換え産生方法に加えて、本発明のポリペプチドおよびそのフラグメントは、固相技術（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　Ｊ．（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）を使用する、直接的なペプチド合成によって産生され得る。タンパク質合成は、手動の技術を使用してか、または自動化によって実施され得る。自動化合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４３１Ａペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）を使用して達成され得る。あるいは、種々のフラグメントは、別々に化学的に合成されて、そして全長分子を生成するために化学的方法を使用して組み合わせられ得る。
【０１３５】
（部位特異的変異誘発）
部位特異的変異誘発は、個々のペプチド、または生物学的機能の等価なポリペプチドをコードする基礎を成すポリヌクレオチドの特異的変異誘発を通じて、それらを調製する上で有用な技術である。当業者に周知の技術は、例えば、１つ以上の前述の考察を取り入れながら、１つ以上のヌクレオチド配列変化をＤＮＡ内に導入することによって配列改変体を調製し、そして試験する迅速な能力をさらに提供する。部位特異的変異誘発は、所望の変異のＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列ならびに十分な数の隣接ヌクレオチドの使用を介して変異体の産生を可能にし、横断される欠失結合部の両側に安定な二重鎖を形成するために、十分なサイズのプライマー配列および配列複雑性を提供する。変異は、ポリヌクレオチド自体の特性を改善するか、変更するか、減少させるか、修飾するか、さもなくば変化させるため、そして／またはコードされたポリペプチドの特性、活性、組成、安定性または一次配列を変更するために、選択されたポリヌクレオチド配列において使用され得る。
【０１３６】
本発明の特定の実施形態において、本発明者らは、コードされたポリペプチドの１つ以上の特性（例えば、ポリペプチドワクチンの抗原性）を変更するような開示されたポリヌクレオチド配列の変異誘発を意図する。部位特異的変異誘発の技術は、当該分野に周知であり、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの両方の改変体を作製するために広範に使用される。例えば、部位特異的変異誘発は、しばしば、ＤＮＡ分子の特定部分を変更するために使用される。このような実施形態において、代表的に約１４〜約２５ヌクレオチド長程度から成るプライマーが使用され、配列の両側の結合部における約５残基〜約１０残基が変更される。
【０１３７】
当業者によって理解されるように、部位特異的変異誘発技術は、しばしば、一本鎖形態および二本鎖形態の両方で存在するファージベクターを使用する。部位指向性変異誘発において有用である代表的なベクターとしては、例えば、Ｍ１３ファージのようなベクターが挙げられる。これらのファージは、容易に商業的に入手可能であり、そしてそれらの使用は、一般的に当業者に周知である。二本鎖プラスミドもまた、目的の遺伝子をプラスミドからファージに移入する工程を取り除く部位指向性変異誘発において慣用的に使用される。
【０１３８】
一般的に、本発明に従う部位特異的変異誘発は、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列をその配列中に含む、一本鎖ベクターを最初に入手する工程またはその配列を含む二本鎖ベクターの２本の鎖を融解して分ける工程によって実行される。所望の変異した配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマーは、一般的に、合成的に調製される。次いで、このプライマーは、一本鎖ベクターとアニーリングされ、そして変異を保有する鎖の合成を完了するために、ＤＮＡ重合酵素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩ　Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）に供される。このようにヘテロ二重鎖が形成され、ここで一方の鎖が変異を有さない本来の鎖をコードし、そして第２の鎖は所望の変異を保有する。次いで、このヘテロ二重鎖ベクターは、適切な細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）を形質転換するために使用され、そして、変異した配列の配置（ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を保有する組換えベクターを含むクローンが選択される。
【０１３９】
部位特異的変異誘発を使用する、選択されたペプチドコードＤＮＡセグメントの配列改変体の調製は、潜在的に有用な種を生成する手段を提供し、そしてこれは、限定を意味するものではない。なぜなら、ペプチドの配列改変体およびそれらをコードするＤＮＡ配列が入手され得る他の方法が存在するからである。例えば、所望のペプチド配列をコードする組換えベクターは、変異誘発剤（例えば、ヒドロキシルアミン）で処理されて、配列改変体を入手し得る。これらの方法およびプロトコルに関する具体的な詳細は、Ｍａｌｏｙら、１９９４；Ｓｅｇａｌ、１９７６；ＰｒｏｋｏｐおよびＢａｊｐａｉ、１９９１；Ｋｕｂｙ、１９９４；およびＭａｎｉａｔｉｓら、１９８２（各々がその目的のために本明細書中に参考として援用される）の教示において見出され得る。
【０１４０】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発手順」とは、鋳型依存的プロセスおよびベクター媒介増殖をいい、これは、その初期の濃度と比較して、特定の核酸分子の濃度の増加を生じるか、または検出可能なシグナルの濃度の増加（例えば、増幅）を生じる。本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発手順」は、プライマー分子の鋳型依存的な伸長を含むプロセスをいうことが意図される。用語鋳型依存的プロセスとは、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子の核酸合成をいい、ここで新規に合成された核酸の鎖の配列は、相補的塩基対形成の周知の規則によって指示され得る（例えば、Ｗａｔｓｏｎ、１９８７を参照のこと）。代表的には、ベクター媒介方法論は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターへの核酸フラグメントの導入、ベクターのクローン増幅、および増幅した核酸フラグメントの回収を包含する。これらの方法論の例は、具体的にその全体が参考として本明細書中に援用される、米国特許第４，２３７，２２４号によって提供される。
【０１４１】
（ポリヌクレオチド増幅技術）
多数の鋳型依存性プロセスが、サンプル中に存在する目的の標的配列を増幅するために利用可能である。最もよく知られた増幅方法の１つは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲＴＭ）であり、これは、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号に詳細に記載され、これらの各々はその全体が本明細書中に参考として援用される。手短に言えば、ＰＣＲＴＭにおいては、標的配列の反対の相補鎖上の領域に対して相補的な２つのプライマー配列が調製される。過剰のデオキシヌクレオシド三リン酸を、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）とともに反応混合液に添加する。標的配列がサンプル中に存在する場合、プライマーはその標的に結合し、そしてポリメラーゼが、ヌクレオチドを付加することによって標的配列に沿ってプライマーを伸長させる。反応混合物の温度を上昇および下降させることによって、伸長したプライマーは、標的から解離して反応生成物を形成し、過剰のプライマーは標的および反応生成物に結合し、そしてこのプロセスが反復される。好ましくは、逆転写およびＰＣＲＴＭ増幅手順が、増幅されたｍＲＮＡの量を定量するために実行され得る。ポリメラーゼ連鎖反応方法論は、当該分野で周知である。
【０１４２】
増幅のための別の方法は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲともいわれる）であり、欧州特許出願公開番号３２０，３０８（その全体が特に本明細書中に参考として援用される）において開示されている。ＬＣＲにおいては、２つの相補的プローブ対が調製され、そして標的配列の存在下では、各対がその標的の反対の相補鎖に結合し、その結果、それらは接触する。リガーゼの存在下では、これらの２つのプローブ対は、連結して１つの単位を形成する。温度のサイクリングによって、ＰＣＲＴＭにおけるのと同様に、結合した連結単位は標的から解離し、次いで過剰のプローブ対の連結のために「標的配列」として働く。米国特許第４，８８３，７５０号（その全体が参考として本明細書中に援用される）は、標的配列に対するプローブ対の結合のためのＬＣＲに類似する増幅の代替方法を記載する。
【０１４３】
Ｑβレプリカーゼ（ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０に記載され、その全体が参考として本明細書中に援用される）もまた、本発明におけるなお別の増幅方法として使用され得る。この方法において、標的の配列に相補的な領域を有するＲＮＡの複製配列が、ＲＮＡポリメラーゼの存在下でサンプルに添加される。このポリメラーゼは複製配列をコピーし、次いで検出され得る。
【０１４４】
制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼを使用して、制限部位の一方の鎖におけるヌクレオチド５’−［α−チオ］三リン酸を含む標的分子の増幅を達成する等温増幅方法（Ｗａｌｋｅｒら、１９９２、その全体が参考として本明細書中に援用される）もまた、本発明における核酸の増幅において有用であり得る。
【０１４５】
鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ　Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）は、複数のラウンドの鎖置換および合成（すなわち、ニックトランスレーション）を含む核酸の等温増幅を実行する別の方法である。同様の方法（修復鎖反応（Ｒｅｐａｉｒ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＲＣＲ）と呼ばれる）は、本発明において有用であり得る別の増幅方法であり、そして増幅のために標的化される領域全体にわたっていくつかのプローブをアニーリングする工程、続いて４塩基のうちの２塩基のみが存在する修復反応を包含する。他の２塩基は、容易な検出のためのビオチン化誘導体として添加され得る。同様のアプローチが、ＳＤＡにおいて使用される。
【０１４６】
配列はまた、周期的プローブ反応（ｃｙｃｌｉｃ　ｐｒｏｂｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＣＰＲ）を使用して検出され得る。ＣＰＲにおいて、非標的ＤＮＡの３’配列および５’配列ならびに標的タンパク質特異的ＲＮＡの内部または「中間」配列を有するプローブは、サンプル中に存在するＤＮＡにハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションにおいて、反応物はＲＮａｓｅＨで処理され、そしてプローブの生成物は、消化後に遊離されるシグナルを生成することによって識別される産物として同定される。最初の鋳型は、別のサイクリングプローブにアニーリングされ、そして反応が反復される。従って、ＣＰＲは、標的遺伝子特異的な発現した核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションによって生成されるシグナルを増幅する工程を包含する。
【０１４７】
英国特許出願番号２　２０２　３２８号およびＰＣＴ国際特許出願公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５（これらの各々はその全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されるなお他の増幅方法は、本発明に従って使用され得る。前者の出願において、「改変された」プライマーが、ＰＣＲ様の鋳型および酵素依存性合成において使用される。このプライマーは、捕捉部分（例えば、ビオチン）および／または検出体部分（例えば、酵素）で標識することによって改変され得る。後者の出願において、過剰な標識プローブがサンプルに添加される。標的配列の存在下において、プローブが結合し、そして触媒的に切断される。切断後、標的配列は、過剰のプローブによって結合されるためにインタクトで遊離される。標識プローブの切断は、標的配列の存在を示す。
【０１４８】
他の核酸増幅手順として、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）（Ｋｗｏｈら、１９８９；ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ　８８／１０３１５（その全体が本明細書中に参考として援用される））が挙げられ、これには、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）および３ＳＲが含まれる。ＮＡＳＢＡにおいて、核酸は、標準的なフェノール／クロロホルム抽出、サンプルの熱変性、溶解緩衝液を用いる処理、ならびにＤＮＡもしくはＲＮＡの単離のためのミニスピンカラムまたはＲＮＡの塩化グアニジウム抽出によって増幅のために調製され得る。これらの増幅技術は、標的配列に特異的な配列を有するプライマーをアニーリングさせる工程を包含する。重合後、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドはＲＮａｓｅＨで消化され、一方、二本鎖ＤＮＡ分子は再度熱変性される。いずれの場合においても、一本鎖ＤＮＡは、第２の標的特異的プライマーの添加によって完全に二本鎖にされ、その後重合する。次いで、二本鎖ＤＮＡ分子は、ポリメラーゼ（例えば、Ｔ７またはＳＰ６）によって複数回転写される。等温サイクル反応において、ＲＮＡはＤＮＡに逆転写され、そして再度ポリメラーゼ（例えば、Ｔ７またはＳＰ６）を用いて転写される。得られる生成物は、短縮型または完全型のいずれであっても、標的特異的配列を示す。
【０１４９】
欧州特許出願公開番号３２９，８２２（その全体が本明細書中に参考として援用される）は、一本鎖ＲＮＡ（「ｓｓＲＮＡ」）、ｓｓＤＮＡ、および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）をサイクル合成する工程を包含する核酸増殖プロセスを開示し、これらは、本発明に従って使用され得る。ｓｓＲＮＡは、第１のプライマーオリゴヌクレオチドのための最初の鋳型であり、逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）によって伸長される。次いで、ＲＮＡは、得られるＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖からリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかと二重鎖を形成したＲＮＡに特異的なＲＮａｓｅ）の作用によって除去される。得られたｓｓＤＮＡは、第２のプライマーのための第２の鋳型であり、これはまた、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼによって例示される）の５’からその鋳型に対するその相同性までの配列を含む。次いで、このプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩの大「Ｋｌｅｎｏｗ」フラグメントによって例示される）によって伸長させられ、プライマー間に最初のＲＮＡの配列と同一の配列を有し、そして一方の端にプロモーター配列をさらに有する、二本鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ」）分子として得られる。このプロモーター配列は、ＤＮＡの多くのＲＮＡコピーを作製するために適切なＲＮＡポリメラーゼによって使用され得る。次いで、これらのコピーはサイクルに再び入り、非常に迅速な増幅をもたらし得る。酵素の適切な選択を用いて、この増殖は、各サイクルで酵素の添加なしに等温で行われ得る。このプロセスの循環的な性質のために、開始の配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの形態であるように選択され得る。
【０１５０】
ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ　８９／０６７００（その全体が本明細書中で参考として援用される）は、プロモーター／プライマー配列の標的一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）へのハイブリダイゼーション、続くこの配列の多くのＲＮＡコピーの転写に基づく核酸配列増幅スキームを開示する。このスキームは、循環性ではない；すなわち、新しい鋳型は、得られたＲＮＡ転写物から産生されない。他の増幅方法には、「ＲＡＣＥ」（Ｆｒｏｈｍａｎ、１９９０）および「ワンサイド（ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ）ＰＣＲ（Ｏｈａｒａ、１９８９）」が挙げられ、これらは当業者に周知である。
【０１５１】
得られた「ジオリゴヌクレオチド」の配列を有する核酸の存在下で２つの（または２より多い）オリゴヌクレオチドを連結し、それによってジオリゴヌクレオチドを増殖することに基づく方法（ＷｕおよびＤｅａｎ、１９９６、その全体が参考として本明細書中に援用される）もまた、本発明のＤＮＡ配列の増幅において使用され得る。
【０１５２】
（生物学的機能的等価物）
改変および変化が、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造においてなされ得、そしてなお、所望の特性を有するポリペプチドをコードする機能的分子を入手し得る。上述のように、特定のポリヌクレオチド配列に１つ以上の変異を導入することがしばしば所望される。特定の状況において、得られるコードされたポリペプチド配列はこの変異によって変更されるか、または他の場合において、このポリペプチドの配列は、コードするポリヌクレオチドにおける１つ以上の変異によっては変化しない。
【０１５３】
等価物または改善された第２世代の分子さえも作製するためにポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることが所望される場合、このアミノ酸の変化は、表１に従ってＤＮＡ配列をコードする１つ以上のコドンを変化させることによって達成され得る。
【０１５４】
例えば、特定のアミノ酸は、例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上のの結合部位のような構造を有するタンパク質構造中の他のアミノ酸に、感知可能な相互作用的結合能の損失なしで、置換され得る。タンパク質の相互作用的な能力および性質がタンパク質の生物学的機能的活性を規定するので、特定のアミノ酸配列置換は、タンパク質配列、および当然ながら、その根底にあるＤＮＡコード配列においてなされ得、そしてそれにも関わらず、同様の特性を有するタンパク質が入手される。従って、種々の変化が、ペプチドの生物学的有用性または活性の感知可能な損失を伴わずに、開示された組成物のペプチド配列またはそのペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列においてなされ得ることが意図される。
【０１５５】
【表１】
2004501663.tif 000002
このような変化を作製する際に、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮され得る。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際の疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、一般的に当該分野において理解されている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２、本明細書中に参考として援用される）。アミノ酸の相対的な疎水性親水性的性質は、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、これが次に、他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）とのそのタンパク質の相互作用を規定することが受け入れられている。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて疎水性親水性指標を割り当てられている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）。これらの値は以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【０１５６】
特定のアミノ酸が類似の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換され得、そしてなお類似の生物学的活性を有するタンパク質を生じる（すなわち、生物学的に機能的に等価なタンパク質をなお入手する）ことが、当該分野において公知である。このような変化を作製する際に、その疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、その疎水性親水性指標が±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そしてその疎水性親水性指標が±０．５以内であるアミノ酸の置換がなおより特に好ましい。同様なアミノ酸の置換が、親水性に基づいて有効になされ得ることもまた、当該分野で理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号（その全体が本明細書中に参考として詳細に援用される）は、そのタンパク質の最大局所的平均親水性が、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるので、そのタンパク質の生物学的特性と相関することを言及している。
【０１５７】
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられた：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸は、類似の親水性の値を有する別のアミノ酸に置換され得、そしてなお、生物学的な等価物（特に、免疫学的に等価なタンパク質）を得ることが理解される。このような変化において、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、その親水性値が±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そしてその親水性値が±０．５以内であるアミノ酸の置換がなおより特に好ましい。
【０１５８】
上記で概説したように、従って、アミノ酸置換は、一般的にアミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性（例えば、その疎水性、親水性、電荷、大きさ、など）に基づく。前述の種々の特徴を考慮する典型的な置換は当業者に周知であり、そして以下を含む：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン。
【０１５９】
さらに、任意のポリヌクレオチドが、インビボでの安定性を増加させるためにさらに改変され得る。可能性のある改変として以下が挙げられるがこれらに限定されない：５’末端および／または３’末端での隣接配列の付加；骨格におけるホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチルの使用；ならびに／あるいは従来とは異なる塩基（例えば、イノシン、キューオシン、およびワイブトシン、ならびにアデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンのアセチル、メチル、チオ、および他の修飾形態）の含有。
【０１６０】
（インビボポリヌクレオチド送達技術）
さらなる実施形態において、本発明の１以上のポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物は、インビボで細胞に導入される。これは、種々のまたは周知のアプローチのいずれかを用いて達成され得、これらのいくつかは、例示の目的で以下に概説される。
【０１６１】
（１．アデノウイルス）
１以上の核酸配列のインビボ送達のための好ましい方法の１つは、アデノウイルス発現ベクターの使用を包含する。「アデノウイルス発現ベクター」は、（ａ）この構築物のパッケージングを支持するため、および（ｂ）センス方向またはアンチセンス方向でその中にクローニングされたポリヌクレオチドを発現するため、に十分なアデノウイルス配列を含む構築物を含むことを意味する。当然のことながら、アンチセンス構築物の文脈において、発現は、遺伝子産物が合成されることを必要としない。
【０１６２】
発現ベクターは、一般的にアデノウイルスの遺伝子操作された形態を含む。アデノウイルスの遺伝的構成の知見（３６ｋｂ、線状、二本鎖ＤＮＡウイルス）は、７ｋｂまでの外来性配列でアデノウイルスＤＮＡの大きな断片を置換することを可能にする（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２）。レトロウイルスとは対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染は、染色体への組込みを生じない。なぜなら、アデノウイルスＤＮＡは、潜在的な遺伝毒性を有さないエピソーム性様式で複製し得るからである。また、アデノウイルスは構造的に安定であり、そして大規模な増幅後にゲノム再構成は検出されなかった。アデノウイルスは、細胞の細胞周期段階に関わりなく、実質的にすべての上皮細胞に感染し得る。今日まで、アデノウイルス感染は、穏やかな疾患（例えば、ヒトの急性呼吸器疾患）にのみに関連しているらしい。
【０１６３】
アデノウイルスは、その中程度のサイズのゲノム、操作の容易さ、高い力価、広範な標的−細胞範囲、および高い感染力のため、遺伝子移入ベクターとしての使用のために特に適している。ウイルスゲノムの両端は１００〜２００塩基対の逆方向反復（ＩＴＲ）を含み、これらは、ウイルスＤＮＡ複製およびパッケージングに必要なシスエレメントである。ゲノムの初期（Ｅ）領域および後期（Ｌ）領域は、異なる転写単位を含み、これは、ウイルスＤＮＡ複製の開始によって分裂する。Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよびいくつかの細胞遺伝子の転写の調節の原因であるタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質の合成を生じる。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現、および宿主細胞シャットオフに関与する（Ｒｅｎａｎ、１９９０）。後期遺伝子の産物（ウイルスキャプシドタンパク質の大多数を含む）は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）によって与えられる単一の一次転写物の有意なプロセシング後にのみ発現される。ＭＬＰ（１６．８　ｍ．ｕ．に位置する）は、感染の後期の間に特に効率的であり、そしてこのプロモーターに由来するすべてのｍＲＮＡは、５’−３成分リーダー（ＴＰＬ）配列（この配列は、ＲＮＡを翻訳のために好ましいｍＲＮＡにする）を有する。
【０１６４】
現在の系では、組換えアデノウイルスが、シャトルベクターとプロウイルスベクターとの間の相同組換えから生成する。２つのプロウイルスベクター間の可能な組換えに起因して、野生型アデノウイルスは、このプロセスから生成され得る。従って、個々のプラークからウイルスの単一クローンを単離すること、およびそのゲノム構造を調べることが重要である。
【０１６５】
複製欠損である現在のアデノウイルスベクターの生成および増殖は、特有のペルパー細胞株（２９３と称される）に依存し、そのヘルパー細胞株は、Ａｄ５ＤＮＡフラグメントによりヒト胚性腎臓細胞から形質転換され、そしてＥ１タンパク質を構成的に発現する（Ｇｒａｈａｍら、１９７７）。Ｅ３領域は、アデノウイルスゲノムから不必要であるので（ＪｏｎｅｓおよびＳｈｅｎｋ、１９７８）、２９３細胞の補助のよって、現在のアデノウイルスベクターは、Ｅ１もしくはＤ３のいずれかまたはその両方の領域に、外来ＤＮＡを保有する（ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ、１９９１）。本質的には、アデノウイルスは、ＤＮＡより約２ｋＢ多い容量を仮定すると、野生型ゲノムの約１０５％をパッケージし得る（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら、１９８７）。Ｅ１およびＥ３領域で交換可能である約５．５ｋＢのＤＮＡと組合わせると、現在のアデノウイルスベクターの最大容量は、７．５ｋＢより低いか、またはベクターの全長の約１５％である。アデノウイルスのウイルス性のゲノムの８０％より多くは、ベクター骨格内にあり、そしてベクター保有（ｂｏｒｎｅ）細胞毒性の供給源である。また、Ｅ１欠失ウイルスの複製欠損は、不完全である。例えば、ウイルス遺伝子発現のリーク（ｌｅａｋａｇｅ）は、高い多重感染（ＭＯＩ）で、現在利用可能なベクターで観察された（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、１９９３）。
【０１６６】
ヘルパー細胞株は、ヒト細胞（例えば、ヒト胚性腎臓細胞、筋細胞、造血細胞または他のヒト胚性間葉細胞または上皮細胞）に由来し得る。あるいは、ヘルパーＴ細胞は、ヒトアデノウイルス許容性である他の哺乳動物種の細胞に由来し得る。このような細胞としては、例えば、Ｖｅｒｏ細胞または他のサル胚性間葉細胞または上皮細胞が挙げられる。上記のように、現在、好ましいヘルパー細胞株は、２９３である。
【０１６７】
最近、Ｒａｃｈｅｒら（１９９５）は、２９３細胞の培養およびアデノウイルスの増殖についての改良方法を開示した。１つのフォーマットにおいて、天然の細胞の凝集物は、１００〜２００ｍｌの培地を含む１リットルのシリコン処理した攪拌フラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｇｅ、ＵＫ）内に、個々の細胞を接種することによって増殖する。４０ｒｐｍでの攪拌後、細胞生存度を、トリパンブルーで評価する。別のフォーマットにおいて、Ｆｉｂｒａ−Ｃｅｌマイクロキャリア（Ｂｉｂｂｙ　Ｓｔｅｒｌｉｎ、Ｓｔｏｎｅ，ＵＫ）（５ｇ／ｌ）を、以下のように使用する。５ｍｌの培地に再懸濁された細胞接種物を、２５０ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中のキャリア（５０ｍｌ）に添加し、そして時々攪拌しながら、１〜４時間、静止させておく。次いで培地を、５０ｍｌの新鮮な培地で置換し、そして振盪を開始する。ウイルス産生のために、細胞を、約８０％のコンフルーエンスまで増殖させ、その後、培地を置換し（最終容量の２５％まで）、そしてアデノウイルスを０．０５のＭＯＩで添加する。培養物を、一晩静止させ、その後容量を１００％まで増やし、そしてさらに７２時間の振盪を開始する。
【０１６８】
アデノウイルスベクターは、複製欠損または少なくとも条件付で欠損であるという必要性以外に、アデノウイルスベクターの特性は、本発明の実施の成功に重要でないと考えられる。アデノウイルスは、４２の異なる公知の血清型またはサブグループＡ〜Ｆのいずれかのアデノウイルスであり得る。サブグループＣのアデノウイルス５型は、本発明において使用するための条件付複製欠損アデノウイルスベクターを得るために好ましい開始物質である。なぜならアデノウイルス５型は、大量の生化学的情報および遺伝学的情報が公知であるヒトアデノウイルスであり、そしてそれは、ベクターとしてアデノウイルスを使用するほとんどの構築物に歴史的に使用されてきたからである。
【０１６９】
上記のように、本発明による代表的なベクターは、複製欠損であり、そしてアデノウイルスＥ１領域を有さない。従って、目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを、Ｅ１コード配列が除去された位置に導入することが最も簡便である。しかし、アデノウイルス配列内の構築物の挿入の位置は、本発明に重要ではない。目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドはまた、Ｋａｒｌｓｓｏｎら（１９８６）に記載されるように、Ｅ３置換ベクターに、欠失したＥ３領域の代わりに挿入され得るか、またはヘルパー細胞株またはヘルパーウイルスがＥ４欠損を補足するＥ４領域に挿入され得る。
【０１７０】
アデノウイルスは、容易に増殖し、かつ容易に操作され、そしてインビトロおよびインビボでの広い宿主範囲を示す。この群のウイルスは、高い力価（例えば、１０９〜１０１１プラーク形成ユニット／ｍｌ）で得られ得、そしてそれらは非常に感染性である。アデノウイルスの生活環は、宿主細胞ゲノムへの組込みを必要としない。アデノウイルスベクターによって送達された外来遺伝子は、エピソーム性であり、従って、宿主細胞に対して低い遺伝毒性を有する。副作用は、野生型アデノウイルスでのワクチン接種の研究において報告されていない（Ｃｏｕｃｈら、１９６３；Ｔｏｐら、１９７１）。このことは、インビボ遺伝子トランスファーベクターとしてのそれらの安全かつ治療的な可能性を示す。
【０１７１】
アデノウイルスベクターを、真核生物遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏら、１９９１；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘら、１９９２）およびワクチンの開発（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２；ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ，１９９２）に使用した。最近、動物研究は、組換えアデノウイルスが、遺伝子療法に使用され得ることを示唆した（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−ＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、１９９１；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、１９９０；Ｒｉｃｈら、１９９３）。異なる組織に組換えアデノウイルスを投与する際の研究としては、気管点滴注入法（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔら、１９９３）、末梢静脈内注射（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ、１９９３）および脳における定位接種法（Ｌｅ　Ｇａｌ　Ｌａ　Ｓａｌｌｅら、１９９３）が挙げられる。
【０１７２】
（２．レトロウイルス）
レトロウイルスは、逆転写のプロセスによって感染された細胞においてそれらのＲＮＡを２本鎖ＤＮＡに転換する能力によって特徴付けられる一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。次いで、生じるＤＮＡを、プロウイルスとして細胞染色体に安定に組み込み、そしてウイルスタンパク質を合成させる。この組込みは、レシピエント細胞およびその子孫におけるウイルス遺伝子配列の保持を生じる。レトロウイルスゲノムは、カプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をそれぞれコードする３つの遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を含む。ｇａｇ遺伝子の上流に見出された配列は、ビリオンへのゲノムのパッケージングのためのシグナルを含む。２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列は、ウイルスゲノムの５’および３’末端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列を含み、そしてまた宿主細胞ゲノムへの組込みに必要とされる（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０）。
【０１７３】
レトロウイルスベクターを構築するために、１つ以上の目的のオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列をコードする核酸が、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入され、複製欠損であるウイルスを作製する。ビリオンを作製するために、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲ成分およびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株が構築される（Ｍａｎｎら、１９８３）。レトロウイルスＬＴＲ配列およびパッケージング配列と一緒にｃＤＮＡを含む組換えプラスミドがこの細胞株に（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）導入される場合、パッケージング配列は、ウイルス粒子にパッケージングされる組換えプラスミドのＲＮＡの転写を可能にし、次いで培養培地に分泌される（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，１９８８；Ｔｅｍｉｎ，１９８６；Ｍａｎｎら、１９８３）。次いで、この組換えレトロウイルスを含む培地は、収集され、必要に応じて、濃縮され、そして遺伝子移入のために使用される。レトロウイルスベクターは、広範な細胞型に感染し得る。しかし、組み込みおよび安定な発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄら、１９７５）。
【０１７４】
レトロウイルスベクターの特異的な標的化を可能にするように設計された新規なアプローチが最近、ラクトース残基のウイルスエンベロープへの化学的な付加によるレトロウイルスの化学的な改変に基づいて、開発された。この改変は、シアログリコタンパク質レセプターを介する肝細胞の特異的な感染を可能にし得る。
【０１７５】
組換えレトロウイルスの標的化のための異なるアプローチが、設計され、この方法においては、レトロウイルスエンベロープタンパク質に対するビオチン化抗体および特定の細胞レセプターに対するビオチン化抗体が使用された。この抗体は、ストレプトアビジンを使用することによってビオチン成分を介して結合された（Ｒｏｕｘら、１９８９）。主な組織適合性複合体の、クラスＩ型抗原およびクラスＩＩ型抗原に対する抗体を使用して、著者らは、インビトロでエコトロピックウイルスを伴なった細胞表面抗原を保持する種々のヒト細胞の感染を実証した（Ｒｏｕｘら、１９８９）。
【０１７６】
（３．アデノ随伴ウイルス）
ＡＡＶ（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｓｋａ，１９８４）は、パルボウイルス（ｐａｒｏｖｉｒｕｓ）であり、アデノウイルスのストックの汚染物質として発見された。ＡＡＶは、いかなる疾患にも関連していない偏在する（抗体は、アメリカ人の集団の８５％に存在する）ウイルスである。ＡＡＶはまた、ＡＡＶの複製がヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）の存在に依存するので、デペンドウイルスとして分類される。５つの血清型が単離されている。そのうち、ＡＡＶ−２は、最も特徴付けされている。ＡＡＶは、キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３にキャプシド形成され、直径２０ｎｍ〜２４ｎｍの正二十面体のビリオンを形成する、一本鎖の線状ＤＮＡを有する（ＭｕｚｙｃｚｋａおよびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，１９８８）。
【０１７７】
このＡＡＶ　ＤＮＡは、約４．７キロ塩基長である。このＤＮＡは、２つのオープンリーディングフレームを含み、そして２つのＩＴＲに隣接される（図２）。ＡＡＶゲノム中には、２つの主な遺伝子（ｒｅｐおよびｃａｐ）が存在する。ｒｅｐ遺伝子は、ウイルスの複製を担うタンパク質をコードし、これに対し、ｃａｐは、キャプシドタンパク質ＶＰ１−３をコードする。各々のＩＴＲは、Ｔ形状のヘアピン構造を形成する。これらの末端繰り返しは、染色体組み込みのために必須のＡＡＶのｃｉｓ成分のみである。従って、このＡＡＶは、送達のための遺伝子のカセットによって、全てのウイルスコード配列が除去および置換されたベクターとして使用され得る。それらの地図位置に従って、３つのウイルスプロモーターが同定され、そしてｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と称されている。ｐ５およびｐ１９からの転写はｒｅｐタンパク質の産生を生じ、そしてｐ４０からの転写はキャプシドタンパク質を産生する（ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ，１９８４）。
【０１７８】
発現ベクターとしてｒＡＡＶを使用する可能性を研究するために研究者を駆り立てるいくつかの要因が存在する。１つは、宿主染色体に組み込むために遺伝子を送達する必要性が、驚くべきことに少ないことである。１４５ｂｐのＩＴＲ（ＡＡＶゲノムのわずか６％である）を有することが必要である。これは、４．５ｋｂのＤＮＡ挿入物を作製する余地をベクター残す。これは、ＡＡＶが大きな遺伝子を送達するのを妨げ得る、能力を保有するが、本発明のアンチセンス構築物を送達するのに十分に適している。
【０１７９】
ＡＡＶはまた、その安全性に起因して、送達ビヒクルの優れた選択である。相対的に複雑なレスキュー機構が存在する：野生型のアデノウイルス遺伝子だけでなく、ＡＡＶ遺伝子もｒＡＡＶを動員する必要がある。同様に、ＡＡＶは、病原性ではなく、そしていかなる疾患にも関連しない。ウイルスコード配列の除去は、ウイルス遺伝子発現に対する免疫反応を最小化し、従って、ｒＡＡＶは、炎症応答を生じない。
【０１８０】
（４．発現構築物としての他のウイルスベクター）
他のウイルスベクターを、宿主細胞へのオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列の送達のための本発明における発現構築物として用いてもよい。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８）、レンチウイルス、ポリオウイルス、およびヘルペスウイルスのようなウイルス由来のベクターを用いてもよい。これらは、種々の哺乳動物細胞に、いくつかの魅力のある特性を提供する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，１９８９；Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０）。
【０１８１】
Ｂ型ヘルペス欠損ウイルスの最近の認識によると、新しい見識は、異なるウイルス配列の構造−機能の関連性を与えた。インビトロでの研究は、このウイルスが、そのゲノムの８０％までの欠失にもかかわらず、ヘルパー依存パッケージングおよび逆転写についての能力を保持し得ることを示した（Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０）。このことは、ゲノムの大部分が外来の遺伝物質と交換され得ることを示唆した。肝臓向性（ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｓｍ）および持続（組込み）は、肝臓指向性遺伝子移入についての特に魅力的な特性であった。Ｃｈａｎｇら、（１９９１）は、ポリメラーゼコード配列、表面コード配列、および前表面（ｐｒｅ−ｓｕｒｆａｃｅ）コード配列に代えて、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子をアヒルＢ型肝炎ウイルスゲノムに導入した。これを、野生型ウイルスと共に、トリ肝炎細胞株へと、同時トランスフェクトした。高力価の組換えウイルスを含む培養培地を用いて、初代仔ガモ肝細胞を感染させた。安定なＣＡＴ遺伝子発現を、トランスフェクション後の少なくとも２４日間検出した（Ｃｈａｎｇら、１９９１）。
【０１８２】
（５．非ウイルスベクター）
本発明のオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列の発現をもたらすために、発現構築物は、細胞に送達されなければならない。この送達は、細胞株を形質転換するための実験手順の際のように、インビトロで達成され得るか、または特定の疾患状態の処置の際のように、インビボもしくはエキソビボで達成され得る。上記のように、送達のための１つの好ましい機構は、ウイルス感染を介する機構であり、ここで、発現構築物は、感染性ウイルス粒子の中にカプセル化される。
【０１８３】
一旦、発現構築物が、細胞の中に送達されると、所望のオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列をコードする核酸は、異なる部位に配置され、そして異なる部位で発現し得る。特定の実施形態では、この構築物をコードする核酸は、細胞のゲノムの中に安定に組込まれ得る。この組込みは、相同組換え（遺伝子置換）を介する特定の位置および特定の配向であってもよいし、またはこれは無作為な非特異的な位置に組込まれてもよい（遺伝子増強）。なおさらなる実施形態では、核酸は、ＤＮＡの別個のエピソームセグメントとして、細胞の中で安定に維持され得る。このような核酸セグメント、または「エピソーム」は、宿主細胞周期から独立して、または宿主細胞周期に同調して維持および複製させるのに十分な配列をコードする。どのように発現構築物を細胞に送達させ、そして細胞の中のどこで核酸を維持するかは、用いられる発現構築物の型に依存する。
【０１８４】
本発明の特定の実施形態では、１つ以上のオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列を含む発現構築物は、単に、裸の組換えＤＮＡまたはプラスミドから構成されてもよい。この構築物の移入は、細胞膜を物理的または化学的に透過化処理する、上記の方法のいずれかにより行われ得る。このことは、特に、インビトロでの移入に適用可能であるが、これはインビボでの使用でも同様に適用され得る。Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、（１９８４）は、ポリオーマウイルスＤＮＡを、成体および新生仔マウスの肝臓および腎臓に、リン酸カルシウム沈殿物の形態で首尾良く注入した。これは、能動的ウイルス複製および急性感染を実証した。ＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙおよびＲｅｓｈｅｆ（１９８６）はまた、沈降リン酸カルシウムプラスミドの直接的腹腔内注入が、トランスフェクトした遺伝子の発現を生じることを実証した。目的の遺伝子をコードするＤＮＡはまた、インビボで同じ様式で移入され得、遺伝子産物を発現することが想定される。
【０１８５】
細胞の中に裸のＤＮＡ発現構築物を移入するための本発明の別の実施形態では、粒子子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）を包含し得る。この方法は、ＤＮＡをコーティングした微粒子を、この粒子が細胞膜を貫き、そして細胞を殺すことなく細胞に侵入することが可能な高速まで加速させる能力に依存する（Ｋｌｅｉｎら、１９８７）。小さな粒子を加速させるためのいくつかの装置が、開発されている。このような装置の１つは、高電圧放電に依存して電流を発生させ、これは、次いで原動力を提供する（Ｙａｎｇら、１９９０）。用いられる微粒子は、タングステンビーズまたは金ビーズのような生物学的に不活性な物質からなっている。
【０１８６】
ラットおよびマウスの肝臓組織、皮膚組織、および筋肉組織を含む選択された器官は、インビボでボンバードされた（Ｙａｎｇら、１９９０；Ｚｅｌｅｎｉｎら、１９９１）。このことは、銃と標的器官との間の任意の介在組織を除去する（すなわち、エキソビボ処置）ための、組織または細胞の外科的露出を必要とし得る。また、特定の遺伝子をコードするＤＮＡは、この方法を介して送達され、そしてなお本発明に含まれ得る。
【０１８７】
（アンチセンスオリゴヌクレオチド）
遺伝子情報の流れの最終的結果は、タンパク質の合成である。ＤＮＡは、ポリメラーゼによってメッセンジャーＲＮＡへと転写され、そしてリボソーム上で翻訳されて、フォールディングされた機能性タンパク質が生じる。従って、この経路に沿って、タンパク質合成が阻害され得るいくつかの段階が存在する。本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするネイティブのＤＮＡセグメントは、すべての哺乳動物ＤＮＡ鎖のように、水素結合により結合された２つの鎖（センス鎖およびアンチセンス鎖）を有する。ポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡは、センスＤＮＡ鎖と同じヌクレオチド配列を有するが、ただし、そのＤＮＡのチミジンがウリジンに置き換わっている。従って、合成アンチセンスヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡに結合し、そしてそのｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の発現を阻害する。
【０１８８】
従って、アンチセンスオリゴヌクレオチドにｍＲＮＡを標的とさせることは、タンパク質合成を妨げるための１つの機構であり、結果的に、強力かつ標的化された治療アプローチを示す。例えば、ポリガラクツロナーゼ（ｐｏｌｙｇａｌａｃｔａｕｒｏｎａｓｅ）の合成および２型ムスカリンアセチルコリンレセプターは、そのそれぞれのｍＲＮＡ配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される（米国特許第５，７３９，１１９号および米国特許第５，７５９，８２９号（各々その全体が、本明細書中に詳細に参考として援用される））。さらに、アンチセンス阻害の例が、核タンパク質サイクリン、多剤耐性遺伝子（ＭＤＧ１）、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、ＳＴＫ−１、線条体ＧＡＢＡＡレセプターおよびヒトＥＧＦを用いて示されている（Ｊａｓｋｕｌｓｋｉら、１９８８；ＶａｓａｎｔｈａｋｕｍａｒおよびＡｈｍｅｄ、１９８９；Ｐｅｒｉｓら、１９９８；米国特許第５，８０１，１５４号；同第５，７８９，５７３号；同第５，７１８，７０９号および同第５，６１０，２８８号（各々その全体が、本明細書中に詳細に参考として援用される））。種々の異常な細胞増殖（例えば、癌）を阻害しそして処置するために使用され得る、アンチセンス構築物もまた、記載されている（米国特許第５，７４７，４７０号；同第５，５９１，３１７号および同第５，７８３，６８３号（各々その全体が、本明細書中に詳細に参考として援用される））。
【０１８９】
従って、例示的実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列に特異的に結合し得る任意の配列もしくはその相補体のすべてまたは一部を含む、オリゴヌクレオチド配列を提供する。１つの実施形態において、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはその誘導体を含む。別の実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはその誘導体を含む。第３の実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート改変骨格を含む、改変ＤＮＡである。第４の実施形態において、そのオリゴヌクレオチド配列は、ペプチド核酸またはその誘導体を含む。各場合において、好ましい組成物は、本明細書中に開示されるポリヌクレオチドのうちの１つ以上の部分に相補的な、より好ましくは実質的に相補的な、そしてさらにより好ましくは完全に相補的な、配列領域を含む。
【０１９０】
所定の遺伝子配列に特異的なアンチセンス組成物の選択は、選択された標的配列（すなわち、これらの例示的例においては、ラット配列およびヒト配列）の分析ならびに二次構造、Ｔｍ、結合エネルギー、相対的安定性の決定に基づき、そしてアンチセンス組成物は、二量体、ヘアピン、または宿主細胞において標的ｍＲＮＡへの特異的結合を減少もしくは妨げる他の二次構造をそれらが形成できない相対的能力に基づいて選択された。
【０１９１】
ｍＲＮＡの非常に好ましい標的領域は、ＡＵＧ翻訳開始コドンの領域またはその付近の領域、およびｍＲＮＡの５’領域と実質的に相補的な配列である。これらの二次構造分析および標的部位選択の考慮は、ＯＬＩＧＯプライマー分析ソフトウェアのバージョン４（Ｒｙｃｈｌｉｋ、１９９７）およびＢＬＡＳＴＮ　２．０．５アルゴリズムソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）を使用して実施された。
【０１９２】
短いペプチドベクター（ＭＰＧ（２７残基）と称する）を使用するアンチセンス送達法の使用もまた意図される。このＭＰＧペプチドは、ＨＩＶ　ｇｐ４１の融合配列由来の疎水性ドメインと、ＳＶ４０　Ｔ抗原の核局在化配列由来の親水性ドメインとを含む（Ｍｏｒｒｉｓら、１９９７）。このＭＰＧペプチドのいくつかの分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドをコートし、そして比較的高効率（９０％）で１時間未満で培養哺乳動物細胞へと送達され得ることが示された。さらに、ＭＰＧとの相互作用は、ヌクレアーゼに対するそのオリゴヌクレオチドの安定性および原形質膜を横切る能力の両方を強力に増加させる（Ｍｏｒｒｉｓら、１９９７）。
【０１９３】
（リボザイム）
タンパク質が伝統的に、核酸の触媒のために使用されているが、別の種類の高分子が、この試みにおいて有用であるとして出現した。リボザイムは、部位特異的様式で核酸を切断するＲＮＡ−タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を保有する特異的触媒ドメインを有する（ＫｉｍおよびＣｅｃｈ、１９８７；Ｇｅｒｌａｃｈら、１９８７；ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｓｏｎｓ、１９８７）。例えば、多数のリボザイムが、高い程度の特異性でホスホエステル転移反応を促進し、しばしば、オリゴヌクレオチド基質中の数個のホスホエステルのうちの１つだけを切断する（Ｃｅｃｈら、１９８１；ＭｉｃｈｅｌおよびＷｅｓｔｈｏｆ、１９９０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−ＨｕｒｅｋおよびＳｈｕｂ、１９９２）。この特異性は、この基質が、化学反応の前にリボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）との特異的塩基対形成相互作用を介して結合するという要件に帰せられている。
【０１９４】
リボザイム触媒は、主に、核酸を含む配列特異的切断／連結反応の一部として観察されている（Ｊｏｙｃｅ、１９８９；Ｃｅｃｈら、１９８１）。例えば、米国特許第５，３５４，８５５号（詳細に本明細書中に参考として援用される）は、特定のリボザイムが、配列特異性が既知のリボヌクレアーゼの配列特異性よりも高くかつＤＮＡ制限酵素の配列特異性に近い、エンドヌクレアーゼとして作用し得ることを報告している。従って、遺伝子発現の配列特異的リボザイム媒介性阻害は、治療適用に特に適切であり得る（Ｓｃａｎｌｏｎら、１９９１；Ｓａｒｖｅｒら、１９９０）。最近、リボザイムが適用されたいくつかの細胞株においてそのリボザイムが遺伝子変化を惹起したこと；その変化した遺伝子がオンコジーンであるＨ−ｒａｓ、ｃ−ｆｏｓおよびＨＩＶの遺伝子を含んだことが、報告された。この研究のほどんどは、特定のリボザイムにより切断される特定の変異体コドンに基づく、標的ｍＲＮＡの改変を含んだ。
【０１９５】
天然に存在する酵素的ＲＮＡの６つの基本的変種が、現在公知である。各々が、生理学的条件下で、トランスで、ＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解を触媒し得（従って、他のＲＮＡ分子を切断し得）る。一般に、酵素的核酸は、まず、標的ＲＮＡへの結合によって作用する。このような結合は、標的ＲＮＡを切断するように作用する分子の酵素的部分に近接して保持される、酵素的核酸の標的結合部分を介して生じる。従って、その酵素的核酸はまず、標的ＲＮＡを認識し、次いで相補的塩基対形成を介してその標的ＲＮＡに結合し、そして一旦正確な部位に結合すると、その標的ＲＮＡを酵素的に切断するように作用する。このような標的ＲＮＡの戦略的切断は、コードされるタンパク質を直接合成する能力を破壊する。酵素的核酸がそのＲＮＡ標的に結合しそして切断した後、その酵素的核酸は、別の標的を探索するためにそのＲＮＡから離れ、そして繰り返し、新しい標的に結合しそして切断し得る。
【０１９６】
リボザイムの酵素特性は、多くの技術（例えば、アンチセンス技術（ここで、核酸分子は、翻訳を阻害するために核酸標的に簡単に結合する））に対して有利である。なぜなら、治療的処置に影響を与えるのに必要であるリボザイムの濃度は、アンチセンスオリゴヌクレオチの濃度よりも低いからである。この利点は、酵素学的に作用するリボザイムの能力に影響を与える。従って、単一のリボザイム分子は、標的ＲＮＡの多くの分子を切断し得る。さらに、このリボザイムは、高度に選択的なインヒビターであり、この阻害の特異性は、標的ＲＮＡに結合する塩基対形成の機構に依存するだけでなく、標的ＲＮＡの切断の機構にも依存する。切断部位付近の１個のミスマッチまたは塩基置換により、リボザイムの触媒活性が完全になくなり得る。アンチセンス分子内の同様のミスマッチでは、それらの作用は妨げられない（Ｗｏｏｌｆら、１９９２）。従って、リボザイムの作用の特異性は、同じＲＮＡ部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用の特異性よりも高い。
【０１９７】
この酵素学的核酸分子は、ハンマーヘッドモチーフ、ヘアピンモチーフ、δ型肝炎ウイルスモチーフ、Ｉ群イントロンモチーフまたはＲＮａｓｅＰ　ＲＮＡモチーフ（ＲＮＡ誘導配列に関連する）あるいはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ＶＳ　ＲＮＡモチーフにおいて形成され得る。ハンマーヘッドモチーフの例は、Ｒｏｓｓｉら（１９９２）に記載される。ヘアピンモチーフの例は、Ｈａｍｐｅｌら（欧州特許出願公開番号ＥＰ　０３６０２５７）、ＨａｍｐｅｌおよびＴｒｉｔｚ（１９８９）、Ｈａｍｐｅｌら（１９９０）および米国特許第５，６３１，３５９号（本明細書中で詳細に参考として援用される）に記載される。δ型肝炎ウイルスモチーフの例は、ＰｅｒｒｏｔｔａおよびＢｅｅｎ（１９９２）に記載される；ＲＮａｓｅＰモチーフの例は、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａら（１９８３）に記載される；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ＶＳ　ＲＮＡリボザイムモチーフは、Ｃｏｌｌｉｎｓ（ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ，１９９０；ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ，１９９１；ＣｏｌｌｉｎｓおよびＯｌｉｖｅ，１９９３）に記載される；そしてＩ群イントロンの例は、米国特許第４，９８７，０７１号に記載される（本明細書中で詳細に参考として援用される）。本発明の酵素学的核酸分子において重要であることは、１以上の標的遺伝子ＲＮＡ領域に相補的である特定の基質結合部位を有すること、およびこの分子にＲＮＡ切断活性を付与する基質結合部位内にヌクレオチド配列を有することまたはこの基質結合部位を取り囲むヌクレオチド配列を有することだけである。従って、リボザイム構築物は、本明細書中に記載される特定のモチーフに限定する必要はない。
【０１９８】
特定の実施形態において、所望の標的のＲＮＡ（例えば、本明細書中において開示される配列の１つ）に対して高度の特異性を示す、酵素学的切断試薬を産生することが重要であり得る。好ましくは、この酵素学的核酸分子は、標的ｍＲＮＡの高度に保存された配列領域に対して標的化される。このような酵素学的核酸分子は、必要とされる場合、特定の細胞に外因的に送達され得る。あるいは、このリボザイムは、特定の細胞に送達されるＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターから発現され得る。
【０１９９】
小さな酵素学的核酸モチーフ（例えば、ハンマーヘッド構造またはヘアピン構造のモチーフ）はまた、外因的送達のために使用され得る。これらの分子の単純な構造は、酵素学的核酸がｍＲＮＡ構造の標的化領域に浸潤する能力を増大させる。あるいは、触媒ＲＮＡ分子は、真核生物のプロモータにより細胞内で発現され得る（例えば、Ｓｃａｎｌｏｎら、１９９１；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔら、１９９２；Ｄｒｏｐｕｌｉｃら、１９９２；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅら、１９９１；Ｏｊｗａｎｇら、１９９２；Ｃｈｅｎら、１９９２；Ｓａｒｖｅｒら、１９９０）。当業者は、任意のリボザイムが、適切なＤＮＡベクター由来の真核生物細胞において発現され得ることを理解する。このようなリボザイムの活性は、第二リボザイムによる第一転写物からの解放によって増強され得る（国際特許出願公開番号ＷＯ　９３／２３５６９、および国際特許出願公開番号ＷＯ　９４／０２５９５（これらの両方は、参考として本明細書によって援用される）；Ｏｈｋａｗａら、１９９２；Ｔａｉｒａら、１９９１；ならびにＶｅｎｔｕｒａら、１９９３）。
【０２００】
リボザイムは、直接的に添加されるか、またはリポザイム内にパッケージングされたカチオン性脂質と共に複合体化され（脂質複合体）、さもなければ、標的細胞に送達され得る。ＲＮＡまたはＲＮＡ複合体は、生体高分子中に取り込んだ状態または取り込んでない状態で、注射、エアロゾル吸入、注入ポンプまたはステントを介して、関連する組織（エキソビボ、またはインビボ）に局所的に投与され得る。
【０２０１】
リボザイムは、国際特許出願公開番号ＷＯ　９３／２３５６９および国際特許出願公開番号ＷＯ　９４／０２５９５（各々は、本明細書中で参考として詳細に援用される）に記載されるように設計され得、そして記載されるようにインビトロおよびインビボにおいて試験するために合成され得る。このようなリボザイムはまた、送達するために最適化され得る。特定の例が提供されるが、当業者は、他の種において等価なＲＮＡ標的が、必要な場合に利用され得ることを理解する。
【０２０２】
ハンマーヘッドリボザイムまたはヘアピンリボザイムを、コンピュータフォールディング（Ｊａｅｇｅｒら、１９８９）によって個々に分析し、リボザイム配列が、適切な２次構造に折り畳まれたかどうかを評価し得る。結合アーム（ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｒｍ）と触媒中心との間で好ましくない分子内相互作用を有するこれらのリボザイムは、考慮から外される。種々の結合アームの長さが、活性を最適化するために選択され得る。一般に、各アームにおいて少なくとも５個以上の塩基が標的ＲＮＡに結合するか、さもなくばこの標的ＲＮＡと相互作用し得る。
【０２０３】
ハンマーヘッドモチーフまたはヘアピンモチーフのリボザイムは、ｍＲＮＡメッセージの種々の部位に対してアニールするように設計され得、そして化学的に合成され得る。使用される合成の方法は、Ｕｓｍａｎら（１９８７）およびＳｃａｒｉｎｇｅら、（１９９０）に記載されるように通常のＲＮＡ合成のための手順に従い、そして一般的な核酸保護基および連結基（例えば、５’末端においてジメトキシトリチルおよび３’末端においてホスホルアミダイト）が使用される。平均的、段階的な連結収率は、代表的に、９８％より高い。ヘアピンリボザイムは、２個の部分で合成され得、そして活性リボザイムを再構築するためにアニールされ得る（ＣｈｏｗｒｉｒａおよびＢｕｒｋｅ、１９９２）。リボザイムは、大規模に改変され得、ヌクレアーゼ耐性基を用いて改変すること（例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−ｏ−メチル、２’−Ｈ（概説のために、例えばＵｓｍａｎおよびＣｅｄｅｒｇｒｅｎ、１９９２を参照のこと））によって安定性が増大され得る。リボザイムは、一般的な方法を使用するゲル電気泳動または高圧液体クロマトグラフィーによって精製され得、そして水中に再懸濁され得る。
【０２０４】
リボザイムの活性は、リボザイムの結合アームの長さを変更することにより、または血清リボヌクレアーゼによる分解を防ぐ改変（例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ　９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔら、１９９０；Ｐｉｅｋｅｎら、１９９１；ＵｓｍａｎおよびＣｅｄｅｒｇｒｅｎ、１９９２；国際特許出願公開番号ＷＯ　９３／１５１８７；国際特許出願公開番号ＷＯ　９１／０３１６２；欧州特許出願公開番号９２１１０２９８．４；米国特許第５，３３４，７１１号；および国際特許出願公開番号ＷＯ　９４／１３６８８（これには、酵素学的ＲＮＡ分子の糖部分に対して成され得る、種々の化学的修飾が記載される）を参照のこと）、細胞中でのリボザイムの有効性を増強する改変、ならびにＲＮＡの合成時間を短縮および化学的必要性を低下させるための幹（ｓｔｅｍ）ＩＩ塩基の除去によって、リボザイムを化学的に合成することによって最適化され得る。
【０２０５】
Ｓｕｌｌｉｖａｎら（国際特許出願公開番号ＷＯ　９４／０２５９５）は、酵素学的ＲＮＡ分子の送達のための一般的な方法を記載する。リボザイムは、当業者に公知の種々の方法によって細胞に投与され得、これらには、リポソームへのカプセル化、イオン導入法、あるいは、例えば、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセルおよび生体接着性ミクロスフィアのような他のビヒクルへの取り込みによるもの、が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの指針のために、リボザイムは、エキソビボで細胞または組織に、上記のビヒクルを使用してか、または使用せずに直接送達され得る。あるいは、ＲＮＡ／ビヒクルの組合せは、直接的な吸入、直接的な注射、またはカテーテル、注入ポンプまたはステントの使用により、局所的に送達され得る。他の送達経路としては、血管内注射、筋内注射、皮下注射または関節注射、エアロゾル吸入、経口送達（錠形態または丸薬形態）、局所送達、全身送達、眼送達、腹腔内送達および／またはくも膜下送達が挙げられるが、これらに限定されない。リボザイム送達および投与のより詳細な記載は、国際特許出願公開番号ＷＯ　９４／０２５９５および国際特許出願公開番号ＷＯ　９３／２３５６９（各々は、本明細書中で参考として詳細に援用される）に提供される。
【０２０６】
高濃度のリボザイムを細胞内に蓄積する別の手段は、リボザイムコード配列をＤＮＡ発現ベクターに組み込むことである。リボザイム配列の転写は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ　Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ　ＩＩ）、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ　ＩＩＩ）のためのプロモーターにより駆動される。ｐｏｌ　ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ　ＩＩＩプロモーターからの転写物は、全ての細胞内で高レベルで発現される；所定の細胞型における所定のｐｏｌ　ＩＩプロモーターのレベルは、近くに存在する遺伝子調節配列（エンハンサー、サイレンサーなど）の性質に依存する。原核生物のＲＮＡポリメラーゼプロモーターもまた使用され得るが、但し、原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素は、適切な細胞において発現される（Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ、１９９０；ＧａｏおよびＨｕａｎｇ、１９９３；Ｌｉｅｂｅｒら、１９９３；Ｚｈｏｕら、１９９０）。このようなプロモーターから発現するリボザイムは、哺乳動物細胞において機能し得る（例えば、Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｒら、１９９２；Ｏｊｗａｎｇら、１９９２；Ｃｈｅｎら、１９９２；Ｙｕら、１９９３；Ｌ’Ｈｕｉｌｌｉｅｒら、１９９２；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚら、１９９３）。このような転写ユニットは、哺乳動物細胞内への導入のための種々のベクター（プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（例えば、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ベクター）、またはウイルスＲＮＡベクター（例えば、レトロウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター）が挙げられるがこれらに限定されない）に組み込まれ得る。
【０２０７】
リボザイムを診断道具として使用して、疾患細胞内の遺伝的変動および変異を試験し得る。これらをまた使用して、標的ＲＮＡ分子のレベルを評価し得る。リボザイム活性と標的ＲＮＡの構造との間の緊密な関係は、標的ＲＮＡの塩基対形成および３次元構造を変える分子の任意の領域における変異の検出を可能にする。複数のリボザイムを使用することにより、インビトロならびに細胞および組織でのＲＮＡの構造および機構に対して重要であるヌクレオチドの変化をマップし得る。リボザイムを用いる標的ＲＮＡの切断を使用して、遺伝子発現を阻害し得、そして疾患の進行における特定の遺伝子産物の役割（必須性）を規定し得る。この様式で、他の遺伝子標的が、その疾患の重要な媒介物として、規定され得る。これらの研究は、併用治療の可能性（例えば、異なる遺伝子を標的とする複数のリボザイム、公知の低分子インヒビターに結合したリボザイム、あるいはリボザイムおよび／または他の化学的分子もしくは生物学的分子と組み合わせた間欠性処置）を提供することにより、疾患の進行のより良好な処置をもたらす。リボザイムの他のインビトロでの他の使用は、当該分野で周知であり、そしてＩＬ−５に関連する状態に関するｍＲＮＡの存在の検出を含む。このようなＲＮＡは、標準的な方法を使用してリボザイムと共に処置した後に、切断産物の存在を決定することによって検出される。
【０２０８】
（ペプチド核酸）
特定の実施形態において、本発明者は、本発明の方法の実施において、ペプチド核酸（ＰＮＡ）の使用を考慮した。ＰＮＡは、核酸塩基が、偽ペプチド骨格に結合されたＤＮＡ模倣物である（ＧｏｏｄおよびＮｉｅｌｓｅｎ、１９９７）。ＰＮＡは、ＲＮＡまたはＤＮＡを伝統的に使用した複数の方法において利用され得る。時々、ＰＮＡ配列は、対応するＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列よりも技術的により良く実施され、そしてＲＮＡにもＤＮＡにも固有でない有用性を有する。産生方法、使用の特徴付け、および使用方法を含むＰＮＡの総説は、Ｃｏｒｅｙ（１９９７）によって提供され、そして本明細書中で参考として援用される。このように、特定の実施形態において、ＡＣＥ　ｍＲＮＡ配列の１以上の部分に相補的であるＰＮＡ配列を調製し得、そしてこのようなＰＮＡ組成物は、ＡＣＥ−特異的ｍＲＮＡの翻訳を調節、変更、減少、または低下させるために使用され得、これにより、このようなＰＮＡ組成物が投与される宿主細胞においてＡＣＥ活性のレベルを変更する。
【０２０９】
ＰＮＡは、正常なＤＮＡのホスホジエステル骨格を置換する２−アミノエチル−グリシン連結を有する（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１；Ｈａｎｖｅｙら、１９９２；ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ，１９９６；Ｎｅｉｌｓｅｎ、１９９６）。この化学は、３つの重要な結果を有する。第１に、ＤＮＡまたはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドと比較して、ＰＮＡは、中性の分子であり；第２に、ＰＮＡは、アキラル（立体選択的な合成を開発する必要がない）であり；そして第３に、ＰＮＡ合成は、標準的なＢｏｃプロトコル（Ｄｕｅｈｏｌｍら、１９９４）またはＦｍｏｃプロトコル（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９５）を、固相ペプチド合成に使用する。一方、改良型Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法を含む他の方法が使用される（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、１９９５）。
【０２１０】
ＰＮＡモノマーまたは既製のオリゴマーは、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）から市販されている。ＢｏｃプロトコルまたはＦｍｏｃプロトコルのいずれかによるＰＮＡの合成は、手動プロトコルまたは自動プロトコルを使用して簡単に実施される（Ｎｏｒｔｏｎら、１９９５）。この手動プロトコールは、それ自体で、化学的に修飾されたＰＮＡの産生または密接に関係するＰＮＡのファミリーの同時合成を導く。
【０２１１】
ペプチドの合成に関して、特定のＰＮＡ合成の成功は、選択した配列の特性に依存する。例えば、理論上、ＰＮＡは、ヌクレオチド塩基の任意の組合せを取り込み得るが、隣接するプリンの存在は、産生の際に、１以上の残基の欠失を導き得る。この困難性を見越して、隣接するプリンを有するＰＮＡを産生する際に、非効率的に加えられているようである残基の連結を繰り返すべきであることを提案する。この後、ペプチド合成の間に観測されるのと類似する産物の収率および純度を提供する逆相高圧液体クロマトグラフィーによってＰＮＡを精製するべきである（Ｎｏｒｔｏｎら、１９９５）。
【０２１２】
所与の適用のためのＰＮＡの修飾が、固相合成の間にアミノ酸を連結することによって、または露出されたＮ末端アミンにカルボン酸基を含む化合物を付加することによって達成され得る。あるいは、ＰＮＡは、導入されたリジンまたはシステインに連結することによって合成した後に修飾され得る。ＰＮＡが修飾され得る簡便さにより、より良い溶解度または特定の機能的必要性の最適化を容易にする。一旦合成されると、ＰＮＡおよびそれらの誘導体の同定は、質量分析器によって確認され得る。いくつかの研究が、ＰＮＡの修飾物を作製および利用した（Ｎｏｒｔｏｎら、１９９５；Ｈａａｉｍａら、１９９６；Ｓｔｅｔｓｅｎｋｏら、１９９６；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、１９９５；Ｕｌｍａｎｎら、１９９６；Ｋｏｃｈら、１９９５；Ｏｒｕｍら、１９９５；Ｆｏｏｔｅｒら、１９９６；Ｇｒｉｆｆｉｔｈら、１９９５；Ｋｒｅｍｓｋｙら、１９９６；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら、１９９５；Ｂｏｆｆａら、１９９５；Ｌａｎｄｓｄｏｒｐら、１９９６；Ｇａｍｂａｃｏｒｔｉ−Ｐａｓｓｅｒｉｎｉら、１９９６；Ａｒｍｉｔａｇｅら、１９９７；Ｓｅｅｇｅｒら、１９９７；Ｒｕｓｋｏｗｓｋｉら、１９９７）。米国特許第５，７００，９２２号は、ＰＮＡ−ＤＮＡ−ＰＮＡキメラ分子および診断におけるその分子の使用、生物中で修飾するタンパク質、ならびに治療に対して影響を受け易い状態の処置について議論する。
【０２１３】
負に荷電した連結を含有するＤＮＡおよびＲＮＡと対照的に、ＰＮＡ骨格は、中性である。この劇的な変更にも係らず、ＰＮＡは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対形成によって相補的なＤＮＡおよびＲＮＡを認識し（Ｅｇｈｏｌｍら、１９９３）、Ｎｉｅｌｓｅｎら（１９９１）による初期のモデリングを確証する。ＰＮＡは、３’〜５’の極性を欠き、そして平行様式または逆平行様式のいずれかで結合し得るが、逆平行様式が好ましい（Ｅｇｈｏｌｍら、１９９３）。
【０２１４】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドとＤＮＡおよびＲＮＡとのハイブリダイゼーションは、負に荷電した相補鎖のリン酸骨格の間の静電気的な反発によって不安定化される。対照的に、ＰＮＡ−ＤＮＡまたはＰＮＡ−ＲＮＡの二重鎖において電荷の反発がないことにより、融解温度（Ｔｍ）が上昇し、そして一価のカチオンまたは二価のカチオンの濃度へのＴｍの依存度が減少する（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１）。ハイブリダイゼーションの増加した速度および親和性は重要である。なぜならば、これらは、緩和した二重鎖ＤＮＡ内の相補配列の鎖侵入を実施するようなＰＮＡの驚くべき能力の原因となるからである。さらに、逆方向反復での効果的なハイブリダイゼーションは、ＰＮＡが、二重鎖ＤＮＡ内で効果的に二次構造を認識し得ることを示唆する。増強した認識はまた、表面上に固定化されたＰＮＡで生じ、Ｗａｎｇらは、支持体に結合したＰＮＡが、ハイブリダイゼーション事象を検出するために使用され得ることを示した（Ｗａｎｇら、１９９６）。
【０２１５】
相補的な配列に対するＰＮＡの強固な結合がまた、類似の（同じではない）配列との結合を増加し、ＰＮＡ認識の配列特異性を減少させることが予期され得る。しかし、ＤＮＡハイブリダイゼーションに関して、選択的認識は、オリゴマー長およびインキュベーション温度を平均化することにより達成され得る。さらに、ＰＮＡの選択的ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションよりも低い塩基ミスマッチを許容するＰＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションによって促進される。例えば、１６ｂｐのＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖内での１個のミスマッチは、１５℃までＴｍを低下させ得る（Ｅｇｈｏｌｍら、１９９３）。高いレベルの識別は、点変異の分析に対して、数種のＰＮＡに基づく戦略の開発を可能にする（Ｗａｎｇら、１９９６；Ｃａｒｌｓｓｏｎら、１９９６；Ｔｈｉｅｄｅら、１９９６；ＷｅｂｂおよびＨｕｒｓｋａｉｎｅｎ、１９９６；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、１９９６）。
【０２１６】
高い親和性結合は、ＰＮＡに対する分子認識および新規適用の開発のための明確な利点を提供する。例えば、１１〜１３個のヌクレオチドＰＮＡは、テロメアーゼ（本質的なＲＮＡ鋳型を使用するテロメア末端を伸長するリボヌクレオ−タンパク質）の活性を阻害するが、類似のＤＮＡオリゴマーは、阻害しない（Ｎｏｒｔｏｎら、１９９６）。
【０２１７】
中性ＰＮＡは、類似のＤＮＡオリゴマーよりもより疎水性であり、そしてこのことは、特に、ＰＮＡが高いプリン含有量を有する場合、または二次構造を形成するような能力を有する場合に、このＰＮＡを中性のｐＨで溶解するのをより困難にし得る。これらの溶解度は、１以上の正の電荷をＰＮＡ末端に付与することによって増加され得る（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１）。
【０２１８】
Ａｌｌｆｒｅｙおよび共同実験者による発見は、鎖の侵入が染色体ＤＮＡ内の配列において自然に起こることを示唆している（Ｂｏｆｆａら、１９９５；Ｂｏｆｆａら、１９９６）。これらの研究は、ヌクレオチドＣＡＧの三塩基反復に対してＰＮＡを標的化し、そして転写性活性ＤＮＡを精製（Ｂｏｆｆａら、１９９５）し、そして転写を阻害（Ｂｏｆｆａら、１９９６）するためのこの認識を使用した。この結果は、ＰＮＡが細胞内に送達され得た場合、このＰＮＡが遺伝子発現の一般的な配列特異的調節因子となる能力を有することを示唆する。ＰＮＡのアンチセンスおよび抗遺伝子試薬としての使用に関する研究および総説には、Ｎｉｅｌｓｅｎら（１９９３ｂ）、Ｈａｎｖｅｙら（１９９２）、およびＧｏｏｄおよびＮｉｅｌｓｅｎ（１９９７）が挙げられる。Ｋｏｐｐｅｌｈｕｓら（１９９７）は、ＨＩＶ−１の逆転写を阻害するためにＰＮＡを使用して、ＰＮＡが抗ウイルス治療に使用され得ることを示した。
【０２１９】
ＰＮＡのアンチセンス結合特性を特徴づけする方法は、Ｒｏｓｅ（１９９３）およびＪｅｎｓｅｎら（１９９７）において議論される。Ｒｏｓｅは、キャピラリーゲル電気泳動を使用して、相対的な結合速度論および化学量論を測定することで、ＰＮＡのそれらの相補的オリゴヌクレオチドとの結合を決定する。同じタイプの測定が、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ技術を使用してＪｅｎｓｅｎらによって成された。
【０２２０】
ＰＮＡの他の適用には、ＤＮＡ鎖の侵入（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１）、アンチセンス阻害（Ｈａｎｖｅｙら、１９９２）、変異分析（Ｏｒｕｍら、１９９３）、転写の増強（Ｍｏｌｌｅｇａａｒｄら、１９９４）、核酸の精製（Ｏｒｕｍら、１９９５）、転写活性遺伝子の単離（Ｂｏｆｆａら、１９９５）、転写因子結合の阻害（Ｖｉｃｋｅｒｓら、１９９５）、ゲノムの切断（Ｖｅｓｅｌｋｏｖら、１９９６）、バイオセンサー（Ｗａｎｇら、１９９６）、インサイチュハイブリダイゼーション（Ｔｈｉｓｔｅｄら、１９９６）、およびサザンブロッティングの代替（Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ、１９９６）における使用が挙げられる。
【０２２１】
（ポリペプチド組成物）
他の局面において、本発明は、ポリペプチド組成物を提供する。一般に、本発明のポリペプチドは、ＨＳＶ由来の単離されたポリペプチド（もしくはエピトープ、改変体、またはその活性フラグメント）である。好ましくは、ポリペプチドには、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列または本明細書に開示されるポリヌクレオチド配列に対して中程度または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列によってコードされるポリペプチドである。あるいは、ポリペプチドは、本明細書中に開示されるアミノ酸配列由来の連続アミノ酸配列を含むポリペプチド、または本明細書中に開示される全体のアミノ酸配列を含むポリペプチドとして規定され得る。
【０２２２】
本発明において、ポリペプチド組成物はまた、本発明のポリペプチドに対して生成される抗体および／またはＴ細胞に対して免疫学的に反応性である１つ以上のポリペプチド（特に本明細書中において開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその活性フラグメント、またはその改変体もしくはこれらの生物学的機能等価物））を含むことが理解される。
【０２２３】
同様に、本発明のポリペプチド組成物は、１以上の連続核酸配列あるいは中程度〜高いストリンジェンシーの条件下でこれらの配列の１以上とハイブリダイズする１以上の核酸配列によってコードされる本明細書中で開示されるアミノ酸配列に含まれる１以上のポリペプチド配列、またはそれらの活性なフラグメントもしくは改変体と免疫学的に反応性である抗体またはＴ細胞を惹起し得る１以上のポリペプチドを含むことが理解される。特に例示的なポリペプチドは、配列番号２、５、６、９、１０、１１、１４、１７、２０、２１、２２および２５に開示されるアミノ酸配列を含む。
【０２２４】
本明細書中で使用される場合、ポリペプチドの活性なフラグメントは、慣用的な技術（例えば、変異誘発）または付加、欠失もしくは置換によって改変されるポリペプチドの全体または一部を含むが、この活性なフラグメントは、本明細書中に記載されるポリペプチドと実質的に同じ構造、機能、抗原性などを示す。
【０２２５】
特定の例示的な実施形態において、本発明のポリペプチドは、本細書中に記載されるような、ＨＳＶ抗原の少なくとも１つの免疫原性部分またはその改変体もしくはその生物学的に機能的な等価物を含む。本明細書中に記載されるようなポリペプチドは、任意の長さのものであり得る。ネイティブなタンパク質に由来するさらなる配列および／または異種配列が存在し得、そしてこのような配列は、さらなる免疫原性特性または抗原性特性を保持し得る（保持しなくてもよい）。
【０２２６】
本明細書中で使用される場合、「免疫原性部分」は、Ｂ細胞表面抗原レセプターおよび／またはＴ細胞表面抗原レセプターによって認識される（すなわち、特異的に結合される）タンパク質の部分である。このような免疫原性部分は、一般に、ＨＳＶタンパク質またはその改変体の、少なくとも５アミノ酸残基、より好ましくは、少なくとも１０アミノ酸残基、なおより好ましくは、少なくとも２０アミノ酸残基を含む。特定の好ましい免疫原性部分は、Ｎ末端リーダー配列および／または膜貫通ドメインが欠失されたペプチドを含む。他の好ましい免疫原性部分は、成熟タンパク質と比較して、小さいＮ末端欠失および／またはＣ末端欠失（例えば、１〜３０アミノ酸、好ましくは５〜１５アミノ酸）を含み得る。
【０２２７】
免疫原性部分は、一般に、Ｐａｕｌ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版、２４３−２４７（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ，１９９３）およびそこに引用される参考文献に要約されるような周知の技術を使用して、同定され得る。このような技術は、抗原特異的な抗体、抗血清および／あるいはＴ細胞株またはＴ細胞クローンと反応する能力についてポリペプチドをスクリーニングする工程を含む。本明細書中で使用される場合、抗血清および抗体は、それらが抗原に特異的に結合する（すなわち、これらが、ＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイにおいてそのタンパク質と反応し、無関係なタンパク質とは検出可能に反応しない）場合、「抗原特異的」である。このような抗血清および抗体は、本明細書中に記載されるように、そして周知の技術を使用して調製され得る。ネイティブのＨＳＶタンパク質の免疫原性部分は、（例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴ細胞反応性アッセイにおいて）その全長ポリペプチドの反応性よりも実質的に小さくないレベルで、このような抗血清および／またはＴ細胞と反応する部分である。このような免疫原性部分は、このようなアッセイにおいて、その全長ポリペプチドの反応性と類似またはそれより大きいレベルで反応し得る。このようなスクリーニングは、一般的に、当業者に周知の方法（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８に記載のような技術）を使用して行われる。例えば、ポリペプチドを固体支持体に固定し、そして患者の血清と接触させて、その血清中の抗体をその固定されたポリペプチドに結合させ得る。次いで、結合されなかった血清を除去し、そして結合された抗体を、例えば、１２５Ｉ標識化プロテインＡを使用して検出し得る。
【０２２８】
上記のように、組成物は、ネイティブのＨＳＶタンパク質の改変体を含み得る。本明細書中で使用される場合、ポリペプチド「改変体」は、ネイティブのＨＳＶタンパク質と、そのポリペプチドの免疫原性が、実質的には減少されないように１以上の置換、欠失、付加および／または挿入において異なる、ポリペプチドである。言い換えると、抗原特異的な抗血清と反応する改変体の能力は、そのネイティブタンパク質と比較して、増強されても、または変化されなくてもよく、あるいは、そのネイティブタンパク質と比較して、５０％未満だけ、そしてより好ましくは、２０％未満だけ減少されてもよい。このような改変体は、一般に、本明細書中に記載のように、上記ポリペプチド配列の１つを改変し、この改変ポリペプチドの抗原特異的な抗体または抗血清との反応性を評価することによって同定され得る。好ましい改変体としては、１つ以上の部分（例えば、Ｎ末端リーダー配列または膜貫通ドメイン）が取り除かれた改変体が挙げられる。他の好ましい改変体としては、小さな部分（例えば、１〜３０アミノ酸、好ましくは５〜１５アミノ酸）が、成熟タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端から取り除かれた改変体が挙げられる。
【０２２９】
本発明によって包含されるポリペプチド改変体は、本明細書中に開示されるポリペプチドに対する、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％またはそれ以上の同一性（上記のように決定された）を示すポリペプチド改変体を含む。
【０２３０】
好ましくは、改変体は、保存的置換を含む。「保存的置換」は、あるアミノ酸が、類似の特性を有する別のアミノ酸で置換され、その結果、ペプチド化学の当業者は、そのポリペプチドの二次構造および疎水性親水性性質が、実質的に変化されないことを予測する置換である。アミノ酸置換は、一般に、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性性質の類似性に基づいてなされ得る。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸；正に荷電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニン；および類似の親水性値を有する非荷電の極性頭部基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。保存的変化を示し得る他のグループのアミノ酸としては、以下：（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが挙げられる。改変体はまた、またはあるいは改変体は、非保存的変化を有し得る。好ましい実施形態において、改変体ポリペプチドは、５アミノ酸以下の置換、欠失または付加によって、ネイティブの配列とは異なる。改変体はまた（またはあるいは改変体は）、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造および疎水性親水性性質に最小限の影響しか有さないアミノ酸の欠失または付加によって、改変され得る。
【０２３１】
上記のように、ポリペプチドは、タンパク質のＮ末端にシグナル（または、リーダー）配列を含み得、これは、翻訳と同時に、または翻訳後に、そのタンパク質の移動を指向する。このポリペプチドはまた、このポリペプチドの合成、精製または同定を容易にするために、またはこのポリペプチドの固体支持体への結合を増強するために、リンカー配列または他の配列（例えば、ポリＨｉｓ）に結合体化され得る。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域に結合体化され得る。
【０２３２】
ポリペプチドは、任意の種々の周知の技術を使用して調製され得る。上記のようなＤＮＡ配列によってコードされる組換えポリペプチドは、当業者に公知の任意の種々の発現ベクターを使用して、ＤＮＡ配列から容易に調製され得る。発現は、組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、任意の適切な宿主細胞において達成され得る。適切な宿主細胞としては、原核生物、酵母ならびに高等真核生物の細胞（例えば、哺乳動物細胞および植物細胞）が挙げられる。好ましくは、使用される宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母または哺乳動物細胞株（例えば、ＣＯＳまたはＣＨＯ）である。組換えタンパク質または組換えポリペプチドを培養培地中に分泌する適切な宿主／ベクター系からの上清は、市販のフィルターを使用して、最初に濃縮され得る。濃縮後、この濃縮物を、適切な精製マトリックス（例えば、アフィニティーマトリックスまたはイオン交換樹脂）に適用し得る。最終的に、１以上の逆相ＨＰＬＣ工程を使用して、組換えポリペプチドをさらに精製し得る。
【０２３３】
約１００アミノ酸未満、そして一般に、約５０アミノ酸未満のアミノ酸を有する部分および他の改変体もまた、当業者に周知の技術を使用して、合成手段によって生成され得る。例えば、このようなポリペプチドは、任意の市販の固相技術（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成法（ここで、アミノ酸が連続的に付加されて、アミノ酸鎖を成長させる））を使用して、合成され得る。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１４６、１９６３を参照のこと。ポリペプチドの自動合成のための装置は、Ｐｅｒｋｉｎ　ＥＬｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）のような供給者から市販され、そして製造業者の説明書に従って操作され得る。
【０２３４】
ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、本明細書中に記載の複数のポリペプチドを含むか、または本明細書に記載の少なくとも１つのポリペプチドおよび関連しない配列（例えば、公知のタンパク質）を含む融合タンパク質であり得る。例えば、融合パートナーは、Ｔヘルパーエピトープ（免疫学的融合パートナー）、好ましくはヒトによって認識されるＴヘルパーエピトープを提供する際に補助し得るか、またはネイティブの組換えタンパク質より高い収量でタンパク質（発現エンハンサー）を発現する際に補助し得る。特定の好ましい融合パートナーは、免疫学的融合パートナーおよび発現増強融合パートナーの両方である。他の融合パートナーは、タンパク質の溶解性を増加するように、またはタンパク質が所望の細胞内コンパートメントに標的化されることを可能にするように選択され得る。なおさらなる融合パートナーとしては、親和性タグ（これは、タンパク質の精製を容易にする）が挙げられる。
【０２３５】
融合タンパク質は、一般に、標準的な技術（化学的結合体化を含む）を使用して調製され得る。好ましくは、融合タンパク質は、発現系において、組換えタンパク質として発現され、非融合タンパク質と比較して、増加した産生レベルを可能にする。手短に言うと、このポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列を、別々に組み立て得、そして適切な発現ベクターに連結し得る。１つのポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端は、ペプチドリンカーを用いてかまたは用いずに、第２のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’末端に、これらの配列のリーディングフレームが同じ相にあるように連結される。このことが、両方の成分ポリペプチドの生物学的活性を保持する単一の融合タンパク質への翻訳を可能にする。
【０２３６】
ペプチドリンカー配列は、各ポリペプチドがその二次構造および三次構造へと折り畳まれるのを保証するために十分な距離で第一および第二のポリペプチド成分を隔てるために用いられ得る。このようなペプチドリンカー配列は、当該分野で周知の標準的な技術を用いて融合タンパク質中に組み込まれる。適切なペプチドリンカー配列は、以下の因子に基づいて選択され得る：（１）フレキシブルな伸長したコンホメーションを採る能力；（２）第一および第二のポリペプチド上の機能的なエピトープと相互作用し得る二次構造を採ることができないこと；および（３）ポリペプチドの機能的なエピトープと反応し得る疎水性または荷電した残基の欠如。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ残基、Ａｓｎ残基およびＳｅｒ残基を含む。ＴｈｒおよびＡｌａのような中性に近い他のアミノ酸もまた、リンカー配列中に用いられ得る。リンカーとして有用に用いられ得るアミノ酸配列としては、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ　４０：３９−４６、１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８３：８２５８−８２６２、１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されるアミノ酸配列が挙げられる。リンカー配列は、一般的に１〜約５０アミノ酸長であり得る。リンカー配列は、第一および第二のポリペプチドが、機能的ドメインを分離し、かつ立体構造の干渉を防ぐために用いられ得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有する場合、必要とされない。
【０２３７】
連結されたＤＮＡ配列は、適切な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結される。ＤＮＡの発現を担う調節エレメントは、第一のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’側にのみ位置する。同様に、翻訳を終了するために必要とされる停止コドンおよび転写終結シグナルは、第二のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’側にのみ存在する。
【０２３８】
融合タンパク質もまた提供される。このようなタンパク質は、本明細書中に記載されるようなポリペプチドを、無関係の免疫原性タンパク質とともに含む。好ましくは、免疫原性タンパク質は、リコール（ｒｅｃａｌｌ）応答を惹起し得る。このようなタンパク質の例としては、破傷風タンパク質、結核タンパク質および肝炎タンパク質が挙げられる（例えば、Ｓｔｏｕｔｅら、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３６：８６−９１（１９９７）を参照のこと）。
【０２３９】
好ましい実施形態において、免疫学的融合パートナーは、グラム陰性細菌、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ｂの表面タンパク質である、プロテインＤ（ＷＯ　９１／１８９２６）に由来する。好ましくは、プロテインＤ誘導体は、タンパク質のほぼ最初の３分の１（例えば、最初のＮ末端１００〜１１０アミノ酸）を含み、そしてプロテインＤ誘導体は、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）され得る。特定の好ましい実施形態において、リポプロテインＤ融合パートナーの最初の１０９残基は、さらなる外因性Ｔ細胞エピトープを有するポリペプチドを提供するように、そしてＥ．ｃｏｌｉ中の発現レベルを増加する（従って、発現エンハンサーとして機能する）ように、Ｎ末端に含まれる。脂質テールは、抗原提示細胞への抗原の最適な提示を保証する。他の融合パートナーとしては、インフルエンザウイルス由来の非構造タンパク質、ＮＳ１（血球凝集素）が挙げ荒れる。代表的に、Ｎ末端の８１アミノ酸が用いられるが、Ｔヘルパーエピトープを含む異なるフラグメントが用いられてもよい。
【０２４０】
別の実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＲａ１２ポリヌクレオチドは、本発明のＨＳＶポリヌクレオチドの少なくとも１つの免疫原性部分に連結される。Ｒａ１２組成物および異種ポリヌクレオチド配列の発現を増強する際のＲａ１２を使用するための方法は、米国特許出願番号６０／１５８，５８５に記載され、この開示は本明細書中でその全体が参考として援用される。簡潔には、Ｒａ１２は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ＭＴＢ３２Ａ核酸の部分配列であるポリヌクレオチド領域をいう。ＭＴＢ３２Ａは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの病原性株および非病原性株の遺伝子によってコードされる３２ＫＤの分子量のセリンプロテアーゼである。ＭＴＶ３２Ａのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、開示されている（本明細書中で参考として援用される、米国特許出願番号６０／１５８，５８５；Ｓｋｅｉｌｙら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ．（１９９９）６７：３９９８−４００７もまた参照のこと）。ＭＴＢ３２Ａコード配列のＲａ１２　Ｃ末端フラグメントは、それ自体高レベルで発現し、そして精製プロセスを通じて可溶性タンパク質のままである。さらに、融合ポリペプチド中のＲａ１２ポリペプチドフラグメントの存在は、Ｒａ１２と融合した異種抗原性ＨＳＶポリペプチドの免疫原性を増強し得る。１つの実施形態において、ＨＳＶ抗原と共に融合ポリペプチド中に存在するＲａ１２ポリペプチド配列は、ＭＴＢ３２Ａのアミノ酸残基１９２〜３２３のいくらかまたは全てを含む。
【０２４１】
別の実施形態において、免疫学的融合パートナーは、ＬＹＴＡとして公知のタンパク質、またはその部分（好ましくはＣ末端部分）である。ＬＹＴＡは、アミダーゼＬＹＴＡ（ＬｙｔＡ遺伝子によりコードされる；Ｇｅｎｅ　４３：２６５−２９２、１９８６）として公知のＮ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼを合成するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する。ＬＹＴＡは、ペプチドグリカン骨格中の特定の結合を特異的に分解する自己溶解素である。ＬＹＴＡタンパク質のＣ末端ドメインは、コリンまたはいくつかのコリンアナログ（例えば、ＤＥＡＥ）に対する親和性を担う。この特性は、融合タンパク質の発現のために有用なＥ．ｃｏｌｉ　Ｃ−ＬＹＴＡ発現プラスミドの開発のために開発された。アミノ末端でＣ−ＬＹＴＡフラグメントを含むハイブリッドタンパク質の精製が、記載されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１０：７９５−７９８、１９９２を参照のこと）。好ましい実施形態において、ＬＹＴＡの反復部分は、融合タンパク質に組み込まれ得る。反復部分は、残基１７８で開始するＣ末端領域中に見出される。特に好ましい反復部分は、残基１８８〜３０５を組み込む。
【０２４２】
一般に、本明細書に記載されるようなポリペプチド（融合タンパク質を含む）およびポリヌクレオチドが単離される。「単離された」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、その元来の環境から取り出されたものである。例えば、天然に存在するタンパク質は、それが天然の系において共存する物質のいくつかまたは全てから分離されている場合、単離されている。好ましくは、このようなポリペプチドは、少なくとも約９０％純粋、より好ましくは少なくとも約９５％純粋、そして最も好ましくは少なくとも約９９％純粋である。ポリヌクレオチドは、例えば、それが天然の環境の一部でないベクターにクローニングされる場合、単離されているとみなされる。
【０２４３】
（結合剤）
本発明は、さらにＨＳＶタンパク質に特異的に結合する薬剤（例えば、抗体およびその抗原結合フラグメント）をさらに提供する。本明細書において用いる場合、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＨＳＶタンパク質と検出可能レベルで反応し（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて）、そして類似の条件下で無関係のタンパク質とは検出可能に反応しない場合、ＨＳＶタンパク質に「特異的に結合する」といわれる。本明細書において用いる場合、「結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、複合体が形成されるような２つの別々の分子間の非共有結合をいう。結合する能力は、例えば、複合体の形成についての結合定数を決定することにより評価され得る。結合定数は、複合体の濃度を成分濃度の積で割って得られる値である。一般に、２つの化合物は、複合体形成の結合定数が約１０３Ｌ／ｍｏｌを超える場合、本発明の文脈中で「結合している」といわれる。結合定数は、当該分野で周知の方法を用いて決定され得る。
【０２４４】
結合剤は、本明細書中において提供される代表的アッセイを用いて、ＨＳＶ感染を有する患者と有さない患者の間をさらに区別し得る。例えば、好ましくは、ＨＳＶタンパク質に結合する抗体または他の結合剤は、疾患を有する少なくとも約２０％の患者においては感染の存在を示すシグナルを生成し、そしてＨＳＶ感染を有さない少なくとも約９０％の個体においては疾患の存在しないことを示すネガティブなシグナルを生成する。結合剤がこの要件を満たすか否かを決定するために、（標準的な臨床試験を用いて決定されるような）ＨＳＶを有する患者およびＨＳＶを有さない患者由来の生物学的サンプル（例えば、血液、血清、痰、尿、および／または生検）は、この結合剤に結合するポリペプチドの存在について、本明細書に記載のようにアッセイされ得る。疾患を有する統計的に有意な数のサンプルおよび疾患を有さない統計的に有意な数のサンプルをアッセイすべきであることが明白である。それぞれの結合剤は、上記の基準を満たすべきである；しかし、当業者は、結合剤が感受性を改善する組み合わせで用いられ得ることを認識する。
【０２４５】
上記の要件を満たす任意の薬剤が結合剤であり得る。例えば、結合剤はリボソーム（ペプチド成分を伴うかまたは伴わない）、ＲＮＡ分子またはポリペプチドであり得る。好ましい実施形態において、結合剤は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。抗体は、当業者に公知の任意の種々の技術のいずれかにより調製され得る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照のこと。一般的に、抗体は、細胞培養技術（本明細書中に記載のモノクローナル抗体の産生を含む）により、または組換え抗体の産生を可能にするための適切な細菌細胞宿主または哺乳動物細胞宿主への抗体遺伝子のトランスフェクションを介して、産生され得る。１つの技術では、このポリペプチドを含む免疫原は、任意の広範な種々の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、またはヤギ）にまず注射される。この工程で、本発明のポリペプチドは、改変なしの免疫原として働き得る。あるいは、特に、相対的に短いポリペプチドについて、このポリペプチドがキャリアタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン）に連結される場合、優れた免疫応答が惹起され得る。この免疫原は、好ましくは所定のスケジュール（１回以上のブースター免疫を組み込む）に従って、動物宿主に注射され、そしてこれらの動物は、定期的に採血される。次いで、このポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体は、例えば、適切な固体支持体に結合しているポリペプチドを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより、このような抗血清から精製され得る。
【０２４６】
目的の抗原性ポリペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体は、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９、１９７６の技術、ならびにその改良型を使用して調製され得る。手短には、これらの方法は、所望の特異性（すなわち、目的のポリペプチドとの反応性）を有する抗体を産生し得る不死化細胞株の調製を包含する。このような細胞株は、例えば、上記のように、免疫された動物から得られた脾臓細胞から産生され得る。次いで、脾臓細胞は、例えば、ミエローマ細胞融合パートナー（好ましくは、免疫された動物と同系のもの）との融合によって不死化される。種々の融合技術が使用され得る。例えば、脾臓細胞およびミエローマ細胞は、非イオン性界面活性剤と数分間組み合わせられ得、次いで、ハイブリッド細胞の増殖を支持するが、ミエローマ細胞の増殖を支持しない選択培地上で低密度でプレートされ得る。好ましい選択技術は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を使用する。十分な時間（通常約１〜２週間）後、ハイブリッドのコロニーが観察される。シングルコロニーが選択され、そしてそれらの培養上清が、ポリペプチドに対する結合活性について試験される。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい。
【０２４７】
モノクローナル抗体を、増殖しているハイブリドーマコロニーの上清から単離し得る。さらに、種々の技術（例えば、適切な脊椎動物宿主（例えば、マウス）の腹膜腔へのハイブリドーマ細胞株の注射）が、収量を増化するために利用され得る。次いで、モノクローナル抗体を、腹水または血液から収集し得る。夾雑物を、通常の技術（例えば、クロマトグラフィー、ゲルろ過、沈殿、および抽出）によって抗体から除去し得る。本発明のポリペプチドを、例えば、アフィニティークロマトグラフィー工程における精製プロセスにおいて使用し得る。
【０２４８】
特定の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントの使用が好まれ得る。このようなフラグメントとしては、標準的な技術を使用して調製され得るＦａｂフラグメントが挙げられる。手短には、免疫グロブリンを、プロテインＡビーズカラムでのアフィニティークロマトグラフィー（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８）によってウサギ血清から精製し得、そしてパパインによって消化して、ＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントを産生し得る。ＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントは、プロテインＡビーズカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによって分離され得る。
【０２４９】
本発明のモノクローナル抗体は、１つ以上の治療薬剤に結合され得る。これに関して適切な薬剤としては、放射性核種、分化誘導剤、薬物、毒素、およびこれらの誘導体が挙げられる。好ましい放射性核種としては、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、および２１２Ｂｉが挙げられる。好ましい薬物としては、メトトレキサート、ならびにピリミジンアナログおよびプリンアナログが挙げられる。好ましい分化誘導剤としては、ホルボールエステルおよび酪酸が挙げられる。好ましい毒素としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素、Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素、およびアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が挙げられる。
【０２５０】
治療剤は、直接的または間接的に（例えば、リンカー基を介して）のいずれかで、適切なモノクローナル抗体と結合（例えば、共有結合によって）され得る。薬剤と抗体との間の直接的な反応は、各々が互いに反応し得る置換基を有する場合に可能である。例えば、一方の求核基（例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基）は、他方のカルボニル含有基（例えば、無水物もしくは酸ハロゲン化物）または良好な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含むアルキル基と反応し得る。
【０２５１】
あるいは、リンカー基を介して治療剤と抗体と結合させることが所望され得る。リンカー基は、結合能力の妨害を回避するために抗体を薬剤から隔てるためのスペーサーとして機能し得る。リンカー基はまた、薬剤または抗体上の置換基の化学的反応性を増加させるために働き得、従って結合効率を増大させる。化学的反応性の増大はまた、さもなければ可能ではない、薬剤または薬剤上の官能基の使用を容易にし得る。
【０２５２】
種々の二官能性または多官能性試薬、ホモ官能性とヘテロ官能性との両方（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬのカタログ中に記載されるもの）が、リンカー基として使用され得ることが当業者には明らかである。結合は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、または酸化された炭水化物残基を通してもたらされ得る。このような方法論を記載する多数の参考文献（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらに対する米国特許第４，６７１，９５８号）が存在する。
【０２５３】
本発明の免疫結合体の抗体部分がないときに治療剤がより強力である場合、細胞中への内部移行の間、またはその際に切断可能なリンカー基を使用することが所望であり得る。多数の異なる切断可能なリンカー基が記載されてきた。これらのリンカー基からの薬剤の細胞内放出についての機構は、ジスルフィド結合の還元（例えば、Ｓｐｉｔｌｅｒらへの米国特許第４，４８９，７１０号）、感光性結合の照射（例えば、Ｓｅｎｔｅｒらへの米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解（例えば、Ｋｏｈｎらへの米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体媒介性加水分解（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらへの米国特許第４，６７１，９５８号）、および酸触媒加水分解（例えば、Ｂｌａｔｔｌｅｒらへの米国特許第４，５６９，７８９号）による切断を含む。
【０２５４】
１つより多い薬剤を抗体に結合させることが所望され得る。１つの実施形態において、複数の薬剤の分子が１つの抗体分子に結合される。別の実施形態において、１つより型の多い薬剤が１つの抗体に結合され得る。特定の実施形態に関わらず、１つより多い薬剤との免疫結合体は、種々の方法で調製され得る。例えば、１つより多い薬剤が、抗体分子に直接的に結合され得るか、または付着のための複数の部位を提供するリンカーが使用され得る。あるいは、キャリアが使用され得る。
【０２５５】
キャリアは、種々の方法（直接的にまたはリンカー基を介するかのいずれかの共有結合を含む）で薬剤を保有し得る。適切なキャリアとしては、アルブミンのようなタンパク質（例えば、Ｋａｔｏらへの米国特許第４，５０７，２３４号）、ペプチド、およびアミノデキストランのような多糖（例えば、Ｓｈｉｈらへの米国特許第４，６９９，７８４号）が挙げられる。キャリアはまた、例えばリポソーム小胞内に、非共有結合によって、またはカプセル化によって、薬剤を保有し得る（例えば、米国特許第４，４２９，００８号および同第４，８７３，０８８号）。放射性核種薬剤に特異的なキャリアとしては、放射性ハロゲン化された低分子およびキレート化合物が挙げられる。例えば、米国特許第４，７３５，７９２号は、代表的な放射性ハロゲン化低分子およびそれらの合成を開示する。放射性核種キレートは、金属、または金属酸化物、放射性核種を結合するためのドナー原子として窒素原子および硫黄原子を含むキレート化合物を含むキレート化合物から形成され得る。例えば、Ｄａｖｉｓｏｎらへの米国特許第４，６７３，５６２号は、代表的なキレート化合物およびそれらの合成を開示する。
【０２５６】
抗体および免疫結合体の投与の種々の経路が使用され得る。代表的には、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与などである。抗体／免疫結合体の正確な用量は、使用される抗体、抗原密度、および抗体のクリアランス速度に依存して変化することが明らかである。
【０２５７】
（Ｔ細胞）
免疫療法組成物はまた、あるいは、ＨＳＶタンパク質に特異的なＴ細胞を含み得る。このような細胞は、一般的に標準的手順を使用して、インビトロまたはエキソビボで調製され得る。例えば、Ｔ細胞は、市販の細胞分離システム（例えば、ＩｓｏｌｅｘＴＭシステム（Ｎｅｘｅｌｌ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ；米国特許第５，２４０，８５６号；米国特許第５，２１５，９２６号；ＷＯ８９／０６２８０；ＷＯ９１／１６１１６およびＷＯ９２／０７２４３もまた参照のこと）から入手可能）を使用して、患者の骨髄、末梢血あるいは骨髄または末梢血の画分中から単離され得る。あるいは、Ｔ細胞は、関連または無関連のヒト、非ヒト哺乳動物、細胞株または培養物から誘導され得る。
【０２５８】
Ｔ細胞は、ＨＳＶポリペプチド、ＨＳＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはこのようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて刺激され得る。このような刺激は、このポリペプチドに特異的であるＴ細胞の生成を可能にする条件下および十分な時間、行われる。特定の実施形態において、ＨＳＶポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、送達ビヒクル（例えば、ミクロスフェア）中に存在して、特定のＴ細胞の生成を容易にする。
【０２５９】
Ｔ細胞は、このＴ細胞が、特異的に増殖するか、サイトカインを分泌するか、またはこのポリペプチドで被覆されるか、もしくはこのポリペプチドをコードする遺伝子を発現する標的細胞を殺傷する場合に、ＨＳＶポリペプチドに特異的であるとみなされる。Ｔ細胞特異性は、種々の標準的技術のいずれかを使用して評価され得る。例えば、クロム放出アッセイまたは増殖アッセイにおいて、ネガティブコントロールと比較して、溶解および／または増殖における２倍を超える増加の刺激指標は、Ｔ細胞特異性を示す。このようなアッセイは、例えば、Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５４：１０６５−１０７０，１９９４に記載されるように、実行され得る。あるいは、Ｔ細胞の増殖の検出は、種々の公知の技術によって達成され得る。例えば、Ｔ細胞増殖は、ＤＮＡ合成の速度の増加を測定することによって検出され得る（例えば、トリチウム化チミジンでＴ細胞の培養物をパルス標識し、そしてＤＮＡに取り込まれたトリチウム化チミジンの量を測定することによって）。３〜７日間のＨＳＶポリペプチド（１００ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは、２００ｎｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ）との接触は、Ｔ細胞の増殖において少なくとも２倍の増加を生じる。２〜３時間の上記のような接触は、標準的なサイトカインアッセイを使用して測定されるように（ここで、サイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＦＮ−γ）放出のレベルの２倍の増加が、Ｔ細胞の活性化を示す）、Ｔ細胞の活性化を生じるべきである（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｒｅｅｎｅ　１９９８）を参照のこと）。ＨＳＶポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現ＡＰＣに応答して活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋であり得る。ＨＳＶポリペプチド特異的Ｔ細胞は、標準的な技術を使用して拡大され得る。好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、患者、関連するドナーまたは無関連のドナーに由来し、そして刺激および拡大後にその患者に投与される。
【０２６０】
治療目的で、ＨＳＶポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはＡＰＣに応答して増殖するＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、インビトロまたはインビボのいずれかで大量に拡大され得る。このようなＴ細胞のインビトロでの増殖は、種々の方法で達成され得る。例えば、Ｔ細胞は、Ｔ細胞増殖因子（例えば、インターロイキン−２）の添加を伴うか、または伴わずに、ＨＳＶポリペプチド、またはこのようなポリペプチドの免疫原性部分に対応する短いペプチドに対して再曝露され得、そして／またはＨＳＶポリペプチドを合成する刺激細胞に対して再曝露され得る。あるいは、ＨＳＶポリペプチドの存在下で増殖する１つ以上のＴ細胞は、クローニングによって数の上で拡大され得る。細胞をクローニングするための方法は、当該分野で周知であり、そしてこれらとしては、限界希釈が挙げられる。
【０２６１】
（薬学的組成物）
さらなる実施形態において、本発明は、細胞または動物への投与のための、単独でかまたは治療の１つ以上の他の様相と組合わせてかのいずれかでの、薬学的に受容可能な溶液中の本明細書中に開示される１つ以上のポリヌクレオチド、ポリペプチド、Ｔ細胞および／または抗体組成物の処方物に関する。
【０２６２】
所望される場合、本明細書中に開示されるようなポリペプチドを発現する核酸セグメント、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＰＮＡ組成物は、他の薬剤（例えば、他のタンパク質もしくはポリペプチドもしくは種々の薬学的に活性な薬剤など）と組合わせても同様に投与され得ることが、理解される。事実、さらなる薬剤が標的細胞または宿主細胞と接触した際に有意な有害な影響をもたらさないとすれば、さらに含まれ得る他の成分に実質的に制限はない。従って、この組成物は、特定の例において必要とされる種々の他の薬剤と共に送達され得る。このような組成物は、宿主細胞または他の生物学的供給源から精製され得るか、あるいは、本明細書中に記載されるように化学的に合成され得る。同様に、このような組成物はさらに、置換または誘導体化されたＲＮＡ組成物またはＤＮＡ組成物を含み得る。
【０２６３】
薬学的に受容可能な賦形剤およびキャリア溶液の処方は、様々の処置レジメンにおいて本明細書中で記載される特定の組成物を使用するための適切な投薬レジメンおよび処置レジメン（例えば、経口、非経口、静脈内、鼻腔内、および筋肉内の投与および処方物を含む）の開発と同様に、当業者に周知である。
【０２６４】
（１．経口送達）
特定の用途において、本明細書中で開示される薬学的組成物は、経口投与によって動物に送達され得る。このように、これらの組成物は、不活性希釈剤と共にかまたは同化可能食用キャリアと共に処方され得るか、あるいはこれらの組成物は、硬質または軟質殻ゼラチンカプセルに入れられ得るか、あるいはこれらの組成物は錠剤に圧縮され得るか、あるいはこれらの組成物は食餌の食品に直接組み込まれ得る。
【０２６５】
活性化合物は、さらに賦形剤に組み込まれ得、そして経口摂取錠剤、経頬粘膜錠剤、トローチ、カプセル剤、エリキシル、懸濁液、シロップ、カシェ剤などの形態で使用される（例えば、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら、１９９７；Ｈｗａｎｇら、１９９８；米国特許第５，６４１，５１５号；米国特許第５，５８０，５７９号および米国特許第５，７９２，４５１号（これらの各々は、その全体が本明細書中で詳細に参考として援用される））。錠剤、トローチ、丸剤、カプセル剤などはまた、以下を含み得、結合剤（例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、リン酸二カルシウム）；崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ポテトデンプン、アルギン酸など）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）；および甘味料（例えば、スクロース、ラクトースまたはサッカリン）または香料（例えば、ペパーミント、ウインターグリーン油、またはチェリー香料）が添加され得る。投薬単位形態がカプセルである場合、これは上記の形態の材料に加えて液体キャリアを含み得る。様々な他の材料が、コーティングとして存在し得るか、またはそうでなければ物理的形態の投薬単位を改変し得る。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤は、セラック、糖またはその両方でコーティングされ得る。エリキシルのシロップは、香味料メチルとして活性なスクロース化合物、防腐剤としてプロピルパラベン、チェリー香料またはオレンジ香料のような染料および香料を含み得る。もちろん、任意の投薬単位形態を調製する際に使用される任意の材料は、薬学的に純粋でありかつ用いられる量で実質的に非毒性でなければならない。さらに、活性化合物が、徐放性の調製物および処方物に組み込まれ得る。
【０２６６】
代表的に、これらの処方物は、少なくとも約０．１％またはそれよりも多い活性化合物を含み得るが、活性成分の割合は、もちろん、変化し得、そして好都合に、全処方物の重量または体積の約１または２％と、約６０％または７０％以上のとの間であり得る。当然、薬学的に有用な組成物の各々の中の活性化合物の量は、適切な投薬量が、化合物の任意の所定の単位用量において得られるような様式で、調製され得る。溶解度、バイオアベイラビリティー、生物学的半減期、投与の経路、製品の有効期限のような因子、および他の薬理学的考慮が、このような薬学的処方物を調製する分野の当業者によって意図され、そして、そういうものとして種々の投薬量および処置レジメンが、所望され得る。
【０２６７】
経口投与について、本発明の組成物は、うがい薬、歯みがき剤、バッカル錠、経口スプレー、または舌下経口投与処方物の形態で、１つ以上の賦形剤と混合され得る。例えば、適切な溶媒（例えば、ホウ酸ナトリウム溶液（Ｄｏｂｅｌｌ溶液））中に必要な量で活性成分を組み込むうがい薬が、調製され得る。あるいは、活性成分は、経口溶液（例えば、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび炭酸水素カリウムを含む溶液）に組み込まれ得るか、または歯みがき剤に分散され得るか、または治療的有効量で、水、結合剤、研磨剤、香料、発泡剤、および湿潤剤を含み得る組成物に添加され得る。あるいは、これらの組成物は、舌下に置かれ得るか、そうでなければ口の中で溶解され得る錠剤形態または溶液形態に成形され得る。
【０２６８】
（２．注射送達）
特定の状況において、本明細書中で開示される薬学的組成物を、米国特許第５，５４３，１５８号；米国特許第５，６４１，５１５号および米国特許第５，３９９，３６３号（各々が、本明細書中でその全体が参考として詳細に援用される）において記載されるように、非経口送達、静脈内送達、筋肉内送達またはさらに腹腔内送達することが所望される。遊離塩基または薬学的に受容可能な塩としての活性化合物の溶液は、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合された水中で調製され得る。分散物もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、ならびにオイル中で調製され得る。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために防腐剤を含む。
【０２６９】
注入用途のために適切な例示的な薬学的形態として、滅菌水性液剤または分散物および滅菌注射用液剤または分散物の即時調製のための滅菌散剤が挙げられる（米国特許第５，４６６，４６８号（本明細書中にその全体が参考として詳細に援用される））。全ての場合において、その形態は、滅菌でなけらばならず、そして容易に注射することができる程度に、流動性でなければならない。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保存されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および／もしくは植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散物の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、そして／または界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン（ｐａｒａｂｅｎ）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によって促進され得る。多くの場合において、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含めることが、望ましい。注射可能な組成物の長期にわたる吸収は、組成物中での吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の使用によって、もたらされ得る。
【０２７０】
例えば、水溶液での非経口投与のために、必要ならばその溶液は、適切に緩衝化されるべきであり、そして液体希釈剤が、最初に、十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされる。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与に適切である。これに関連して、使用され得る滅菌水性媒体は、本開示の観点から当業者に公知である。例えば、一投与量は、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解され得、そして１０００ｍｌの皮下注入流体に添加され得るか、または注入予定部位で注入され得るかのいずれかである（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照のこと）。投薬量におけるいくらかの変化が、処置される被験体の状態に依存して必然的に生じる。投与に責任のあるヒトは、任意の事象において、個々の被験体について適切な用量を決定する。さらに、ヒト投与について、調製物は、ＦＤＡ　Ｏｆｆｉｃｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ　ｓｔａｎｄａｒｄｓによって要求されるような、無菌性、発熱性、ならびに一般的な安全性標準および純度標準を満たさなければならない。
【０２７１】
滅菌注射溶液は、上に列挙された種々の他の成分を含む適切な溶媒中に要求された量で活性な化合物を組み込み、必要ならば、続いてろか滅菌することによって調製される。一般に、分散物は、基本分散媒体、および上に列挙されたものに由来する要求された他の成分を含む滅菌ビヒクルに種々の滅菌活性成分を組み込むことによって、調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合において、調製の好ましい方法は、活性成分の粉末、および以前に滅菌ろ過したその溶液から任意のさらなる所望の成分を生じる減圧乾燥技術および凍結乾燥技術である。
【０２７２】
本明細書中で開示される組成物は、中性形態または塩形態で処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）が挙げられ、そしてこれらの塩は、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸とともに形成される。遊離カルボキシル基とともに形成される塩もまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄）、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導され得る。処方の際に、溶液は、投薬処方物と適合する様式でかつ治療的に有効な量で投与される。これらの処方物は、注射溶液、薬物放出カプセルなどのような種々の投薬形態で容易に投与される。
【０２７３】
本明細書中で使用される場合、「キャリア」は、任意および全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収を遅延させる薬剤、緩衝液、キャリア溶液、懸濁液、コロイドなどを含み得る。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性成分と不適合である場合を除いては、治療組成物におけるその使用が、企図される。補助的活性成分もまた、これらの組成物に組み込まれ得る。
【０２７４】
句「薬学的に受容可能な」とは、ヒトに投与される場合に、アレルギー反応または類似の厄介な反応を生成しない分子実体および組成物をいう。活性成分としてのタンパク質を含む水性組成物の調製は、当該分野で十分に理解されている。代表的には、このような組成物は、注射剤として、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、調製される；注射の前の液体中の溶液または懸濁液に適切な固体形態もまた、調製され得る。これらの調製物はまた、乳化され得る。
【０２７５】
（３．経鼻送達）
特定の実施形態において、薬学的組成物は、鼻腔内スプレー、吸入、および／または他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達され得る。遺伝子、核酸およびペプチド組成物を、経鼻エアロゾルスプレーを介して肺に直接送達するための方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号および米国特許第５，８０４，２１２号（各々が、本明細書中にその全体が参考として詳細に援用される）に記載されている。同様に、鼻腔内微粒子樹脂（Ｔａｋｅｎａｇａら、１９９８）およびリゾホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号（本明細書中にその全体が参考として詳細に援用される））を使用する薬物の送達はまた、薬学分野で周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態での経粘膜薬物送達は、米国特許第５，７８０，０４５号（本明細書中にその全体が参考として詳細に援用される）に記載される。
【０２７６】
（４．リポソーム送達、ナノカプセル送達、および微粒子媒介送達）
特定の実施形態において、本発明は、適切な宿主細胞への本発明の組成物の導入のためにの、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、マイクロスフィア、脂質粒子、小胞などを意図する。特に、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、またはナノ粒子などのいずれかにカプセル化して送達するために処方され得る。
【０２７７】
このような処方物は、本明細書中に開示される核酸または構築物の薬学的に受容可能な処方物の導入のために好ましくあり得る。リポソームの形成および使用は一般に、当業者に公知である（例えば、Ｃｏｕｖｒｅｕｒら、１９７７；Ｃｏｕｖｒｅｕｒ，１９８８；Ｌａｓｉｃ，１９９８を参照のこと；これは、細胞内細菌感染および疾患のための標的抗生物質治療におけるリポソームおよびナノカプセルの使用を記載する）。近年、改善された血清安定性および循環半減期を有するリポソームが開発された（ＧａｂｉｚｏｎおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，１９８８；ＡｌｌｅｎおよびＣｈｏｕｎ，１９８７；米国特許第５，７４１，５１６号（本明細書中にその全体が参考として詳細に援用される））。さらに、潜在的な薬物キャリアとしてのリポソーム調製物およびリポソーム様調製物の種々の方法が、総説されている（Ｔａｋａｋｕｒａ，１９９８；Ｃｈａｎｄｒａｎら、１９９７；Ｍａｒｇａｌｉｔ，１９９５；米国特許第５，５６７，４３４号；米国特許第５，５５２，１５７号；米国特許第５，５６５，２１３号；米国特許第５，７３８，８６８号および米国特許第５，７９５，５８７号（各々が、その全体が本明細書中で参考として詳細に援用される））。
【０２７８】
リポソームは、Ｔ細胞懸濁液、初代肝細胞培養物およびＰＣ１２細胞を含む他の手順によるトランスフェクションが通常困難である多くの細胞型とともに、首尾よく使用されている（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら、１９９０；Ｍｕｌｌｅｒら、１９９０）。さらに、リポソームは、ウイルスベースの送達系に典型的なＤＮＡ長の制限がない。リポソームは、遺伝子、薬物（ＨｅａｔｈおよびＭａｒｔｉｎ，１９８６；Ｈｅａｔｈら、１９８６；Ｂａｌａｚｓｏｖｉｔｓら、１９８９；ＦｒｅｓｔａおよびＰｕｇｌｉｓｉ，１９９６）、放射線治療剤（Ｐｉｋｕｌら、１９８７）、酵素（Ｉｍａｉｚｕｍｉら、１９９０ａ；Ｉｍａｉｚｕｍｉら、１９００ｂ）、ウイルス（ＦａｌｌｅｒおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８４）、転写因子およびアロステリックエフェクター（ＮｉｃｏｌａｕおよびＧｅｒｓｏｎｄｅ，１９７９）を、種々の培養細胞株および動物に導入するために効果的に使用されている。リポソーム媒介薬物送達の効力を試験するいくつかの成功した臨床試験が完了している（ＬｏｐｅｚＢｅｒｅｓｔｅｉｎら、１９８５ａ；１９８５ｂ；Ｃｏｕｎｅ，１９８８；Ｓｃｕｌｉｅｒら、１９８８）。さらに、いくつかの研究によって、リポソームの使用は、全身送達後の、自己免疫応答、毒性または性腺局在にも関連しないことが示唆される（ＭｏｒｉおよびＦｕｋａｔｓｕ，１９９２）。
【０２７９】
リポソームは、水性媒体中に分散したリン脂質から形成され、そして多層同心性二重層小胞（多層小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自発的に形成する。ＭＬＶは一般に、２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、２００〜５００Åの範囲の直径を有し、コア中に水溶液を含む小さな単層小胞（ＳＵＶ）の形成を生じる。
【０２８０】
リポソームは、細胞膜に類似点を有し、ペプチド組成物のためのキャリアとして本発明と組み合わせての使用を意図されている。これらは、広範に適切である。なぜなら、水可溶性物質および脂質可溶性物質の両方は、それぞれすなわち水性空間および二重層自体に包括され得るからである。薬物保有リポソームは、リポソーム処方物を選択的に改変することによる活性薬剤の部位特異的送達のためにさらに使用され得る。
【０２８１】
Ｃｏｕｖｒｅｕｒら（１９７７；１９８８）の教示に加えて、以下の情報が、リポソーム処方物の生成において利用され得る。リン脂質は、水中に分散される場合、脂質対水のモル比に依存して、リポソーム以外の種々の構造を形成し得る。低比率において、リポソームは、好ましい構造である。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度および二価陽イオンの存在に依存する。リポソームは、イオン物質および極性物質に対する低い透過性を示し得るが、高温度において、これらの透過性を顕著に変更する相転移を起こす。この相転移は、密接充填した順序付けられた構造（ゲル状態として知られている）から緩く充填したより順序付けられていない構造（流体状態として知られている）への変化を含む。これは、特徴的な相転移温度で生じ、そしてイオン、糖および薬物に対する透過性の増加を生じる。
【０２８２】
温度に加えて、タンパク質への曝露は、リポソームの透過性を変更し得る。特定の可溶性タンパク質（例えば、チトクロームｃ）は、二重層に結合し、変形し、そして透過し、それにより、透過性における変化を生じる。コレステロールは、リン脂質をより密に充填することによって、タンパク質のこの透過を明らかに阻害する。抗生物質およびインヒビター送達のための最も有用なリポソーム処方物は、コレステロールを含むことが意図される。
【０２８３】
溶質を捕捉する能力は、異なる型のリポソーム間で変化する。例えば、ＭＬＶは、捕捉溶質において中程度に効率的であるが、ＳＵＶは、極端に非効率的である。ＳＵＶは、サイズ分布における同質性および再現性の利点を提供するが、サイズと捕捉効率との間の妥協が、大きな単層小胞（ＬＵＶ）によって提供される。これらは、エーテルエバポレーションによって調製され、そしてＭＬＶよりも溶質の包括において３〜４倍効率的である。
【０２８４】
リポソーム特徴に加えて、化合物を包括する際の重要な決定因子は、化合物自体の生理化学的特質である。極性化合物は、水性空間に捕捉され、そして非極性化合物は、小胞の脂質二重層に結合する。極性化合物は、透過を介してかまたは二重層が破壊される場合に放出されるが、非極性化合物は、二重層が温度またはリポタンパク質への曝露によって破壊されない限り、二重層と結合したままである。両方の型は、相転移温度で最大流出速度を示す。
【０２８５】
リポソームは、４つの異なる機構を介して細胞と相互作用する：マクロファージおよび好中球のような細網内皮系の食細胞によるエンドサイトーシス；非特異的な弱い疎水性の力または静電気力によってか、または細胞表面成分との特異的な相互作用によってかのいずれかによる細胞表面への接着；細胞質へのリポソーム内容分の同時放出を伴う、原形質膜へのリポソームの脂質二重層の挿入による形質細胞膜との融合；およびリポソーム内容分のいずれの会合も伴わない、細胞膜または亜細胞膜へのリポソーム脂質の移行（または逆の場合も同じである）。どの機構が有効であるかを決定することはしばしば困難であり、そして１つ以上が同時に作用し得る。
【０２８６】
静脈内注射されたリポソームの運命および処分は、これらの物理的特性（例えば、サイズ、流動性、および表面電荷）に依存する。これらは、数時間または数日間、組織に存続し得（これらの組成に依存する）、そして血液中の半減期は、数分から数時間の範囲である。より大きいリポソーム（例えば、ＭＬＶおよびＬＵＶ）は、細網内皮系の食細胞によって迅速に取り込まれるが、循環系の生理は、多数の部位におけるこのような大きい種の出ていくことを制限する。これらは、大きい開口部または孔が毛細血管内皮において存在する場所（例えば、肝臓または脾臓の洞様毛細血管）のみに存在し得る。従って、これらの器官は、取り込みの優勢である部分である。他方、ＳＵＶは、広範な組織分布を示すが、肝臓および脾臓いおいてなお高度に隔離されている。一般に、このインビボ挙動は、これらの大きいサイズにアクセス可能なこれらの器官および組織のみにリポソームの潜在的な標的化を制限する。これらとしては、血液、肝臓、脾臓、骨髄、およびリンパ様器官が挙げられる。
【０２８７】
標的化は一般に、本発明の観点における制限ではない。しかし、特定の標的化が所望される場合、これが達成される方法が利用可能である。リポソーム表面に結合し、そして抗体およびその薬物内容物を、特定の細胞型表面上に位置する特異的な抗原性レセプターに指向する抗体が、使用され得る。炭水化物決定因子（細胞−細胞の認識、相互作用および接着において役割を果たす糖タンパク質または糖脂質細胞表面成分）はまた、特定の細胞型にリポソームを指向する際に可能性を有するので、認識部位として使用され得る。たいていは、リポソーム調製物の静脈内注射が使用されることが意図されるが、投与の他の経路もまた考えうる。
【０２８８】
あるいは、本発明は、本発明の組成物の薬学的に受容可能なナノカプセル処方物を提供する。ナノカプセルは一般に、化合物を安定かつ再現可能な様式で補足し得る（Ｈｅｎｒｙ−Ｍｉｃｈｅｌｌａｎｄら、１９８７；Ｑｕｉｎｔａｎａｒ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏら、１９９８；Ｄｏｕｇｌａｓら、１９８７）。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を回避するために、このような超微粒子（約０．１μｍのサイズ）は、インビボで分解され得るポリマーを使用して設計されるべきである。これらの要求を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノカプセルは、本発明における使用について意図される。このような粒子は、Ｃｏｕｖｒｅｕｒら、１９８０；１９８８；ｚｕｒ　Ｍｕｈｌｅｎら、１９９８；Ｚａｍｂａｕｘら、１９９８；Ｚａｍｂａｕｘら、１９９８；Ｐｉｎｔｏ−Ａｌｐｈａｎｄｒｙら、１９９５および米国特許第５，１４５，６８４号（これらは、本明細書中でその全体が参考として詳細に援用される）に記載されるようにして容易に作製され得る。
【０２８９】
（ワクチン）
本発明の特定の好ましい実施形態において、ワクチンが提供される。ワクチンは一般に、免疫刺激剤と組み合わせて、上に議論されるようなもののような、１つ以上の薬学的組成物を含む。免疫刺激剤は、外因性抗原に対する免疫応答（抗体および／または細胞媒介性）を強化または増強する任意の物質であり得る。免疫刺激剤の例としては、アジュバント、生分解性微粒子（例えば、ポリ乳酸ガラクチド（ｇａｌａｃｔｉｄｅ））およびリポソーム（化合物が組み込まれる；例えば、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，米国特許第４，２３５，８７７号）が挙げられる。ワクチン調製物は一般に、例えば、Ｍ．Ｆ．ＰｏｗｅｌｌおよびＭ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ編、「Ｖａｃｃｉｎｅ　Ｄｅｓｉｇｎ（ｔｈｅ　ｓｕｂｕｎｉｔ　ａｎｄ　ａｄｊｖａｎｔ　ａｐｐｒｏａｃｈ）」、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ（ＮＹ，１９９５）において記載される。本発明の範囲内の薬学的組成物およびワクチンはまた、他の化合物を含み得、これらは、生物学的に活性または不活性であり得る。例えば、他のＨＳＶ抗原の１つ以上の免疫原性部分は、組成物またはワクチン中で、融合ポリペプチドに組み込まれてか、または別々の化合物としてかのいずれかで存在し得る。
【０２９０】
例示的ワクチンは、上記のようなポリペプチドのうちの１つ以上をコードするＤＮＡを、そのポリペプチドがインサイチュで生成されるように含み得る。上記のように、そのＤＮＡは、当業者に公知の種々の送達系（核酸発現系、細菌発現系およびウイルス発現系を含む）のいずれかに存在し得る。多数の遺伝子送達技術が当該分野で周知であり、例えば、Ｒｏｌｌａｎｄ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ　Ｃａｒｒｉｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　１５：１４３〜１９８、１９９８およびその中に引用される参考文献により記載される技術である。適切な核酸発現系は、患者における発現に必要なＤＮＡ配列（例えば、適切なプロモーターおよび終止シグナル（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ　ｓｉｇｎａｌ））を含む。細菌送達系は、その細胞表面上にそのポリペプチドの免疫原性部分を発現するかまたはそのようなエピトープを分泌する細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｒｉｎ）の投与を包含する。好ましい実施形態において、そのＤＮＡは、ウイルス発現系（例えば、ワクシニアウイルスまたは他のポックスウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルス）を使用して導入され得、このウイルス発現系は、非病原性（欠損）複製コンピテントウイルスの使用を含み得る。適切な系は、例えば、以下に開示される：Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：３１７〜３２１、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６〜１０３、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ　８：１７〜２１、１９９０；米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号および同第５，０１７，４８７号；ＷＯ８９／０１９７３；米国特許第４，７７７，１２７号；ＧＢ　２，２００，６５１：ＥＰ　０，３４５，２４２号；ＷＯ　９１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：６１６〜６２７、１９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２：４３１〜４３４、１９９１；Ｋｏｌｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：２１５〜２１９、１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：１１４９８〜１１５０２、１９９３；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　８８：２８３８〜２８４８、１９９３；ならびにＧｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３：１２０２〜１２０７、１９９３。このような発現系にＤＮＡを組み込む技術は、当業者に周知である。このＤＮＡはまた、例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５９：１７４５〜１７４９、１９９３に記載されそしてＣｏｈｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５９：１６９１〜１６９２、１９９３により概説されるように、「裸」でもあり得る。裸のＤＮＡの取り込みは、生分解性ビーズ（これは、細胞に効率的に輸送される）上にそのＤＮＡをコーティングすることによって増加され得る。ワクチンがポリヌクレオチドおよびポリペプチド成分の両方を含み得ることは、明らかである。このようなワクチンは、増強された免疫応答を提供し得る。
【０２９１】
ワクチンが、本明細書中で提供されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの薬学的に受容可能な塩を含み得ることは、明らかである。このような塩は、薬学的に受容可能な非毒性塩基（有機塩基（例えば、一級アミンの塩、二級アミンの塩および三級アミンの塩、ならびに塩基性アミノ酸の塩）ならびに無機塩基（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩）を含む）から調製され得る。
【０２９２】
当業者に公知の任意の適切なキャリアが、本発明のワクチン組成物にて使用され得るが、キャリアの型は、投与様式に依存して変化する。本発明の組成物は、任意の適切な投与様式（例えば、局所投与、経口投与、経鼻投与、静脈内投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、皮下投与、または筋肉内投与を含む）のために処方され得る。非経口投与（例えば、皮下注射）のために、そのキャリアは、好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ろう、または緩衝剤を含む。経口投与のために、上記のキャリアのいずれか、または固体キャリア（例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、ショ糖、および炭酸マグネシウム）が使用され得る。生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリラクテート、ポリグリコレート）もまた、本発明の薬学的組成物のためのキャリアとして使用され得る。適切な生分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号；同第５，０７５，１０９号；同第５，９２８，６４７号；同第５，８１１，１２８号；同第５，８２０，８８３号；同第５，８５３，７６３号；同第５，８１４，３４４号および同第５，９４２，２５２号に開示される。改変Ｂ型肝炎コアタンパク質キャリア系（例えば、ＷＯ／９９　４０９３４およびそこで引用される参考文献（これらの全ては参考として本明細書中に参照される）に記載される系）もまた、適切である。米国特許第５，９２８，６４７号に記載される微粒子−タンパク質複合体を含むキャリアもまた使用され得、このようなキャリアは、宿主においてクラスＩ拘束細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導し得る。
【０２９３】
このような組成物はまた、緩衝剤（例えば、中性の緩衝化生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水）、糖質（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸（例えば、グリシン）、抗酸化剤、静菌剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、処方物をレシピエントの血液に対して等張性、低張性または弱く高張性にする溶質、懸濁剤、濃化剤および／または保存剤を含み得る。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥物として処方され得る。化合物はまた、周知の技術を使用してリポソーム内にカプセル化され得る。
【０２９４】
種々の任意の免疫刺激剤が、本発明のワクチンにおいて使用され得る。例えば、アジュバントが含まれ得る。ほとんどのアジュバントは、抗原を迅速な異化作用から保護するように設計された物質（例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油）および免疫応答の刺激物（例えば、リピドＡ、Ｂｏｒｔａｄｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来のタンパク質またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のタンパク質）を含む。適切なアジュバントは、例えば、フロイント不完全アジュバントおよびフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）；Ｍｅｒｃｋ　Ａｄｊｕｖａｎｔ　６５（Ｍｅｒｃｋ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、Ｒａｈｗａｙ、ＮＪ）；ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ　Ｂｅｅｃｈａｍ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）；アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウム；カルシウム塩、鉄塩または亜鉛塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁物；アシル化糖；カチオン誘導体化多糖またはアニオン誘導体化多糖；ポリフォスファーゼン；生分解性ミクロスフェア；モノホスホリルリピドＡおよびクイル　Ａ（ｑｕｉｌ　Ａ）として市販されている。サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、あるいはインターロイキン−２、インターロイキン−７、またはインターロイキン−１２）もまた、アジュバントとして使用され得る。
【０２９５】
本明細書中に提供されるワクチンにおいて、そのアジュバント組成物は、好ましくは、主にＴｈ１型の免疫応答を誘導するように設計される。高レベルのＴｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は、投与される抗原に対する細胞媒介性免疫応答の誘導を支持する傾向がある。対照的に、高レベルのＴｈ２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）は、体液性免疫応答の誘導を支持する傾向がある。本明細書中に提供されるようなワクチンの適用の後、患者は、Ｔｈ１型応答およびＴｈ２型応答を含む免疫応答を支持する。応答が主にＴｈ１型である好ましい実施形態において、Ｔｈ１型サイトカインのレベルは、Ｔｈ２型サイトカインのレベルより高い程度まで増加する。これらのサイトカインのレベルは、標準的アッセイを使用して容易に評価され得る。サイトカインのファミリーの概説については、ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１４５〜１７３、１９８９を参照のこと。
【０２９６】
主なＴｈ１型応答を惹起する際の使用に好ましいアジュバントとしては、例えば、モノホスホリルリピドＡ（好ましくは３−Ｏ−脱アシルモノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ））とアルミニウム塩との組み合わせが挙げられる。ＭＰＬアジュバントは、Ｃｏｒｉｘａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ；米国特許第４，４３６，７２７号；同第４，８７７，６１１号；同第４，８６６，０３４号および同第４，９１２，０９４号を参照のこと）から入手可能である。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（そのＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されていない）もまた、主なＴｈ１応答を誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えば、ＷＯ　９６／０２５５５、ＷＯ　９９／３３４８８ならびに米国特許第６，００８，２００号および同第５，８５６，４６２号に記載されている。免疫刺激性ＤＮＡ配列もまた、例えば、Ｓａｔｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７３：３５２、１９９６により記載されている。別の好ましいアジュバントは、サポニン（好ましくはＱＳ２１（Ａｑｕｉｌａ　Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　Ｉｎｃ．、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）であり、これは、単独でも他のアジュバントと組み合わせても使用され得る。例えば、増強された系は、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体との組み合わせ（例えば、ＷＯ　９４／００１５３に記載されるような、ＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの組み合わせ）またはＷＯ　９６／３３７３９に記載されるような、ＱＳ２１がコレステロールでクエンチされている反応生成が低い（ｌｅｓｓ　ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）組成物を含む。他の好ましい処方物は、水中油型エマルジョンおよびトコフェロールを含む。水中油型エマルジョン中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを含む、特に強力なアジュバント処方物が、ＷＯ　９５／１７２１０に記載されている。
【０２９７】
他の好ましいアジュバントとしては、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　７２０（Ｓｅｐｐｉｃ、フランス）、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）、ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）、ＳＢＡＳシリーズのアジュバント（例えば、ＳＢＡＳ−２またはＳＢＡＳ−４（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ　Ｂｅｅｃｈａｍ、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、ベルギーから入手可能）、Ｄｅｔｏｘ（Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）、ＲＣ−５２９（Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）、ならびに他のアミノアルキルグルコサミニド４−ホスフェート（ＡＧＰ）（例えば、係属中の米国特許出願第０８／８５３，８２６号および同第０９／０７４，７２０号（その開示は、全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されるもの）が挙げられる。他の好ましいアジュバントは、ＷＯ　９９／５２５４９Ａ１に記載されるような、ポリオキシエチレンエーテルを含む。
【０２９８】
本明細書中に提供される任意のワクチンは、抗原、免疫応答エンハンサーおよび適切なキャリアもしくは賦形剤の組み合わせを生じる、周知の方法を使用して調製され得る。本明細書中に記載される組成物は、徐放性処方物（すなわち、投与後に化合物のゆっくりした放出をもたらす、カプセル、スポンジまたはゲル（例えば、多糖から構成される）のような処方物）の一部として投与され得る。このような処方物は、一般的に、周知の技術（例えば、Ｃｏｏｍｂｅｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ　１４：１４２９〜１４３８、１９９６を参照のこと）を使用して調製され得、そしてたとえば、経口投与、直腸投与もしくは皮下移植または所望の標的部位への移植により投与され得る。徐放性処方物は、キャリアマトリックス中に分散されており、そして／または速度制御膜により囲まれた貯蔵物中に含まれる、ポリペプチド、ポリヌクレオチドもしくは抗体を含み得る。
【０２９９】
このような処方物内での使用のためのキャリアは、生体適合性であり、そしてまた、生分解性であり得；好ましくはその処方物は、比較的一定なレベルの活性成分放出を提供する。このようなキャリアとしては、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリアクリレート、ラテックス、デンプン、セルロース、デキストランなどの微粒子が挙げられる。他の遅延性放出キャリアとしては、超分子バイオベクター（ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｖｅｃｔｏｒ）が挙げられ、これは、非液体親水性コア（例えば、架橋した多糖またはオリゴ糖）と、必要に応じて両親媒性化合物（例えば、リン脂質）を含む外層とを含む（例えば、米国特許第５，１５１，２５４号およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／２００７８、ＷＯ／９４／２３７０１およびＷＯ　９６／０６６３８を参照のこと）。徐放性処方物中に含まれる活性化合物の量は、移植部位、放出の速度および予想持続期間、ならびに処置もしくは予防される状態の性質に依存する。
【０３００】
種々の任意の送達ビヒクルが、ＨＳＶ感染細胞を標的とする抗原特異的免疫応答の生成を促進するために、薬学的組成物およびワクチンにて使用され得る。送達ビヒクルとしては、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、単球、ならびに有効なＡＰＣであるように操作され得る他の細胞）が挙げられる。このような細胞は、抗原を提示する能力を増大させるように、Ｔ細胞応答の活性化および／もしくは維持を改善するように、それ自体が抗ＨＳＶ効果を有するように、そして／または受容物と免疫学的に適合性（すなわち、一致したＨＬＡハロタイプ）であるように、遺伝子改変され得るが、その必要はない。ＡＰＣは、一般的には、種々の生物学的流体ならびに器官のいずれかから単離され得、そして自系細胞でも、同種異系細胞でも、同系細胞でも、または異種細胞でもよい。
【０３０１】
本発明の特定の好ましい実施形態は、抗原提示細胞として、樹状細胞またはその前駆体を使用する。樹状細胞は、非常に強力なＡＰＣであり（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ　３９２：２４５〜２５１、１９９８）、そして、予防的免疫または治療的免疫を惹起するための生理学的アジュバントとして有効であることが示されている（ＴｉｍｍｅｒｍａｎおよびＬｅｖｙ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ，Ｍｅｄ．５０：５０７〜５２９、１９９９を参照のこと）。一般的には、樹状細胞は、その代表的形状（インサイチュで星状であり、顕著な細胞質突起（樹状突起）がインビトロで見える）、高効率に抗原を取り込み、プロセッシングして提示する能力、ならびに未刺激Ｔ細胞応答を活性化する能力に基づいて同定され得る。樹状細胞は、当然、インビボでもエキソビボでも樹状細胞上に通常は見出されない特定の細胞表面レセプターもしくはリガンドを発現するように操作され得、そしてそのような改変樹状細胞が、本発明により意図される。樹状細胞の代替物として、分泌小胞抗原ロード樹状細胞（ｓｅｃｒｅｔｅｄ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ　ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｏａｄｅｄ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ）（エキソソームと呼ばれる）が、ワクチンで使用され得る（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．４：５９４〜６００、１９９８を参照のこと）。
【０３０２】
樹状細胞および前駆体が、末梢血、骨髄、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血、あるいは他の適切な任意の組織もしくは流体から入手され得る。例えば、樹状細胞は、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３および／またはＴＮＦα）の組み合わせを末梢血から収集した単球の培養物に添加することによって、エキソビボで分化され得る。あるいは、末梢血、臍帯血または骨髄から収集したＣＤ３４陽性細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガンドおよび／または樹状細胞の分化、成熟および増殖を誘導する他の化合物の組み合わせを、培養培地に添加することによって、樹状細胞へと分化し得る。
【０３０３】
樹状細胞は、「未熟」細胞および「成熟」細胞として簡便に分類されており、これにより、簡単な方法によって２つの十分に特徴づけられた表現型間を区別することが可能である。しかし、この命名法は、可能なすべての分化の中間段階を排除すると解釈されるべきではない。未熟樹状細胞は、抗原取り込みおよびプロセッシングについて高い能力を有するＡＰＣとして特徴付けられ、これはＦｃγレセプターおよびマンノースレセプターの高発現と相関する。成熟表現型は、代表的には、これらのマーカーのより低い発現により、しかしＴ細胞活性化の原因である細胞表面分子（例えば、クラスＩ　ＭＨＣおよびクラスＩＩ　ＭＨＣ、接着分子（例えば、ＣＤ５４およびＣＤ１１）ならびに同時刺激性分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６および４−１ＢＢ））の高発現により、特徴付けられる。
【０３０４】
ＡＰＣは、一般的には、ＨＳＶタンパク質（あるいはその一部もしくは他の改変体）をコードするポリヌクレオチドで、そのＨＳＶポリペプチドまたはその免疫原性部分が細胞表面上で発現されるように、トランスフェクトされ得る。このようなトランスフェクションは、エキソビボで生じ得、次いで、このようなトランスフェクトされた細胞を含む組成物またはワクチンは、本明細書中に記載されるような治療目的のために使用され得る。あるいは、樹状細胞または他の抗原提示細胞を標的とする遺伝子送達ビヒクルが患者に投与され得、インビボで生じるトランスフェクションをもたらす。例えば、樹状細胞のインビボおよびエキソビボでのトランスフェクションは、一般的には、当該分野で公知の任意の方法（例えば、ＷＯ　９７／２４４４７に記載される方法、あるいはＭａｈｖｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　７５：４５６〜４６０、１９９７により記載される遺伝子銃アプローチ）を使用して実施され得る。樹状細胞の抗原ローディングは、樹状細胞または前駆細胞をＨＳＶポリペプチド、ＤＮＡ（裸またはプラスミドベクター内）もしくはＲＮＡとともに、または抗原を発現する組換え細菌もしくは組換えウイルス（例えば、ワクシニアウイルスベクター、鶏痘ウイルスベクター、アデノウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクター）とともに、インキュベートすることによって達成され得る。ローディングの前に、そのポリペプチドは、Ｔ細胞の補助を提供する免疫学的パートナー（例えば、キャリア分子）に共有結合により結合体化され得る。あるいは、樹状細胞は、非結合体化免疫学的パートナーを用いて、別々にかまたはそのポリペプチドの存在下で、パルスされ得る。
【０３０５】
ワクチンおよび薬学的組成物は、単位用量容器または複数用量容器（例えば、シールされたアンプルまたはバイアル）にて提示され得る。このような容器は、好ましくは、使用するまで処方物の滅菌性を保存するために密封シールされる。一般的には、処方物は、油状ビヒクルまたは水性ビヒクル中の懸濁物、溶液またはエマルジョンとして保存され得る。あるいは、ワクチンまたは薬学的組成物は、滅菌した液体キャリアを使用直前に添加することのみ必要な、凍結乾燥状態で保存され得る。
【０３０６】
（免疫治療適用）
本発明のさらなる局面において、本明細書中に記載される組成物は、ＨＳＶ感染の免疫治療に使用され得る。このような方法において、薬学的組成物およびワクチンは代表的には、患者に投与される。本明細書中で使用される場合、「患者」とは、任意の温血動物（好ましくはヒト）をいう。上記の薬学的組成物およびワクチンは、ＨＳＶによる感染を予防的に阻害するかもしくはＨＳＶによる感染の程度を改善するため、またはすでにＨＳＶに感染した患者を処置するために使用され得る。投与は、適切な任意の方法（静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、皮下経路、鼻内経路、皮内経路、肛門経路、膣経路、局所経路および経口経路による投与を含む）によってであり得る。
【０３０７】
特定の実施形態において、免疫療法は、能動免疫療法であり得、この能動免疫療法において、処置は、免疫応答改変剤（例えば、本明細書中に提供されるようなポリペプチドおよびポリヌクレオチド）の投与による、ＨＳＶ感染に対して反応する内因性宿主免疫系のインビボ刺激に依存する。
【０３０８】
他の実施形態において、免疫療法は受動免疫療法であり得、この受動免疫療法において、処置は、治療的効果を直接または間接に媒介し得そしてインタクトな宿主免疫系に必ずしも依存しないＨＳＶ免疫反応性が確立された因子（例えば、エフェクター細胞または抗体）の送達を含む。エフェクター細胞の例としては、上記のようなＴ細胞、Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球およびＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球）、キラー細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞およびリンホカイン活性化キラー細胞）、Ｂ細胞および本明細書中に提供されるポリペプチドを発現する抗原提示細胞（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）が挙げられる。本明細書中に列挙されるポリペプチドに特異的なＴ細胞レセプターおよび抗体レセプターは、クローニングされ得、発現され得、そして養子免疫療法のために他のベクターもしくはエフェクター細胞に移入され得る。本明細書中に提供されるポリペプチドはまた、抗体または抗イディオタイプ抗体（上記および米国特許第４，９１８，１６４号に記載されるような）を受動免疫療法のために生成するために使用され得る。
【０３０９】
エフェクター細胞は、一般的には、本明細書中に記載されるように、インビトロでの増殖による養子免疫療法に十分な量で得られ得る。インビボで抗原認識を保持しつつ、１個の抗原特異的エフェクター細胞を数十億個へと数を増やすための培養条件は、当該分野で周知である。このようなインビトロ培養条件は、代表的には、しばしばサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）および分裂中でないフィーダー細胞の存在下で、抗原による間欠性刺激を使用する。上記のように、本明細書中に提供されるような免疫反応性ポリペプチドは、免疫療法のために十分な数の細胞を生成するために、抗原特異的Ｔ細胞培養物を迅速に増殖させるために使用され得る。詳細には、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球、線維芽細胞および／またはＢ細胞）が、当該分野で周知の標準的技術を使用して、免疫反応性ポリペプチドでパルスされ得るか、または１つ以上のポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得る。例えば、抗原提示細胞が、組換えウイルスまたは他の発現系における発現を増加させるために適切なプロモーターを有するポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得る。治療における使用のための培養エフェクター細胞は、インビボで増殖し得、そして広範に分布し得、そして長期に生存し得なければならない。研究により、培養エフェクター細胞が、インビボで増殖するように、そしてかなりの数で長期間生存するように、ＩＬ−２を補充した抗原による反復刺激によって誘導され得ることが示された（例えば、Ｃｈｅｅｖｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　１５７：１７７、１９９７を参照のこと）。
【０３１０】
あるいは、本明細書中に列挙されるポリペプチドを発現するベクターは、患者から採取された抗原提示細胞に導入され得、そして同じ患者に移植し戻すためにエキソビボでクローン増殖され得る。トランスフェクトされた細胞は、当該分野で公知の任意の手段を使用して、好ましくは滅菌形態で、静脈投与、腔内投与、または腹腔内投与によって、その患者に再導入され得る。
【０３１１】
本明細書中に記載される治療組成物の投与の経路および頻度、ならびに投与量は、個体間で変化するが、標準的技術を使用して容易に確立され得る。１つの実施形態において、１と約１０との間の用量が、５２週間にわたって投与され得る。別の実施形態において、約６用量が、１ヶ月間隔で投与され、そしてブースターワクチン接種が、代表的にその後定期的に与えられる。代替プロトコルが、個々の患者に適切であり得る。
【０３１２】
適切な用量は、上記のように投与される場合、抗ＨＳＶ免疫応答を促進し得、かつ好ましくは基礎（すなわち、未処置）レベルを少なくとも１０〜５０％超える、化合物の量である。このような応答は、例えば、患者における抗ＨＳＶ抗体を測定することによって、モニターされ得る。このようなワクチンはまた、ワクチン接種されていない患者と比較した場合、ワクチン接種された患者において改善された臨床成果（例えば、より頻繁な完全または部分的な寛解、あるいは疾患を伴わないより長期の生存）をもたらす免疫応答を生じ得る。一般的に、１つ以上のポリペプチドを含む薬学的組成物およびワクチンについて、１用量中に存在する各ポリペプチドの量は、宿主１ｋｇあたり約２５μｇ〜５ｍｇの範囲である。適切な用量の大きさは、患者の大きさとともに変化するが、代表的には、約０．１ｍＬ〜約５ｍＬの範囲である。
【０３１３】
一般的に、適切な投薬量および処置レジメンは、治療的利益および／または予防的利益を提供するために十分な量で活性化合物を提供する。このような応答は、未処置の患者と比較した場合に、処置された患者において、改善された臨床成果（例えば、より頻繁な完全または部分的な寛解、あるいは疾患を伴なわないより長い生存）を確立することによってモニターされ得る。ＨＳＶタンパク質に対する既存の免疫応答の増加は、一般的に、改善された臨床的成果に相関し得る。このような免疫応答は、一般的に、標準的な増殖アッセイ、細胞傷害性アッセイまたはサイトカインアッセイを用いて評価され得、これらのアッセイは、処置の前および後に患者から得たサンプルを用いて実行され得る。
【０３１４】
（ＨＳＶの検出および診断）
一般的に、ＨＳＶは、この患者から得た生物学的サンプル（例えば、血液、血清、痰、尿および／または他の適切な組織）中の１以上のＨＳＶタンパク質および／または、このようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在に基づいてその患者において検出され得る。言いかえると、このようなタンパク質は、患者におけるＨＳＶの存在または不在を示すマーカーとして使用され得る。本明細書中で提供される結合剤は、一般的に、この生物学的サンプルにおいてこの因子に結合する抗原のレベルの検出を可能にする。ポリヌクレオチドプライマーおよびプローブは、ＨＳＶタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを検出するために使用され得、これはまた、ＨＳＶ感染の存在または不在を示す。
【０３１５】
サンプルにおけるポリペプチドマーカーを検出するために結合剤を使用する、当業者に公知の種々のアッセイ形式が存在する。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照のこと。一般的に、患者におけるＨＳＶの存在または不在は、患者から得た生物学的サンプルを結合剤と接触させ、そしてこの結合剤に結合するポリペプチドのレベルをサンプルにおいて検出することによって決定され得る。
【０３１６】
好ましい実施形態において、アッセイは、ポリペプチドに結合して残りのサンプルからそれを取り出すために、固体支持体に固定化された結合剤の使用を含む。次いで、結合したポリペプチドは、レポーター基を含みかつ結合剤／ポリペプチド複合体に特異的に結合する検出試薬を使用して検出され得る。このような検出試薬は、例えば、ポリペプチドに特異的に結合する結合剤あるいはこの結合剤に特異的に結合する抗体または他の因子（例えば、抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡまたはレクチン）を含み得る。あるいは、競合アッセイが、利用され得、このアッセイにおいて、ポリペプチドは、レポーター基で標識され、そしてサンプルとの結合剤のインキュベーション後に、固定化された結合剤に結合させる。サンプルの成分が、結合剤への標識されたポリペプチドの結合を阻害する程度は、固定化された結合剤とのそのサンプルの反応性を示す。このようなアッセイにおける使用に適切なポリペプチドは、上記のような、全長ＨＳＶタンパク質および結合剤が結合するその一部分を含む。
【０３１７】
固体支持体は、タンパク質が付着され得る、当業者に公知な任意の材料であり得る。例えば、固体支持体は、マイクロタイタープレート中の試験ウェルまたはニトロセルロース膜もしくは他の適切な膜であり得る。あるいは、この支持体は、ガラス、ファイバーガラス、ラテックスまたはプラスチック材料（例えば、ポリスチレンもしくはポリ塩化ビニル）のようなビーズあるいはディスクであり得る。この支持体はまた、例えば、米国特許第５，３５９，６８１号に開示されるもののような、磁気粒子または光ファイバーセンサーであり得る。結合剤は、当業者に公知の種々の技術を使用して固体支持体上に固定化され得、これは、特許および科学文献において詳細に記載されている。本発明の文脈において、用語「固定化」は、吸着のような非共有結合的会合および共有結合的付着（これは、この因子と支持体上の官能基との間の直接的結合であり得るか、または架橋剤による結合であり得る）の両方をいう。マイクロタイタープレートにおけるウェルまたは膜に対する吸着による固定化が、好ましい。このような場合において、吸着は、適切な緩衝液中で、適切な長さの時間の間、結合剤と固体支持体とを接触することによって達成され得る。接触時間は、温度とともに変化するが、代表的には約１時間と約１日との間である。一般に、プラスチックマイクロタイタープレート（例えば、ポリスチレンまたはポリビニルクロリド）のウェルと約１０ｎｇ〜約１０μｇの範囲、および好ましくは約１００ｎｇ〜約１μｇの範囲の量の結合剤とを接触させることは、適切な量の結合剤を固定化するために十分である。
【０３１８】
固体支持体に対する結合剤の共有結合的付着は、一般的に、この支持体および結合剤上の官能基（例えば、ヒドロキシル基またはアミノ基）の両方と反応する二官能性試薬を、この支持体とまず反応させることによって達成され得る。例えば、この結合剤を、ベンゾキノンを使用するか、または結合パートナーのアミンおよび活性な水素と支持体のアルデヒド基との縮合によって、適切なポリマーコーティングを有する支持体に対して共有結合的に付着し得る（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃａｔａｌｏｇ　ａｎｄ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９１、Ａ１２〜Ａ１３を参照のこと）。
【０３１９】
特定の実施形態において、このアッセイは、２抗体サンドイッチアッセイである。本アッセイは、最初に、固体支持体（一般に、マイクロタイタープレートのウェル）上で固定化されている抗体をサンプルに接触させて、その結果、サンプル内のポリペプチドを固定化抗体に結合させることによって実施され得る。次いで、非結合サンプルは固定化ポリペプチド−抗体複合体から除去され、そして検出試薬（好ましくは、そのポリペプチド上の異なる部位に結合し得る第２の抗体（レポーター基を含む））が添加される。次いで、固体支持体に結合したままである検出試薬の量が、特定のレポーター基に関して適切な方法を用いて決定される。
【０３２０】
より詳細には、一旦抗体が上記のように支持体上に固定化されると、支持体上の残りのタンパク質結合部位は、典型的にはブロックされる。任意の適切なブロック剤（例えば、ウシ血清アルブミンまたはＴｗｅｅｎ２０ＴＭ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））は、当業者に公知である。固定化抗体は次いで、サンプルとインキュベートされ、そしてポリペプチドをこの抗体に結合させる。インキュベーションの前に、このサンプルは適切な希釈液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））で希釈され得る。概して、適切な接触時間（すなわち、インキュベーション時間）は、ＨＳＶ感染を有する個体から得られたサンプル内のポリペプチドの存在を検出するのに十分な時間である。好ましくは、この接触時間は、結合ポリペプチドと非結合ポリペプチドとの間の平衡で達成されるレベルの少なくとも約９５％の結合レベルを達成するのに十分な時間である。当業者は、ある時間にわたって起こる結合レベルをアッセイすることによって、平衡に達するまでに必要な時間が容易に決定され得ることを認識する。室温では、一般に、約３０分間のインキュベーション時間で十分である。
【０３２１】
次いで、非結合サンプルが、適切な緩衝液（例えば、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭを含むＰＢＳ）を用いて固体支持体を洗浄することによって除去され得る。レポーター基を含む第２の抗体が次いで、固体支持体に添加され得る。好ましいレポーター基は、上記の基を含む。
【０３２２】
次いで、検出試薬が、結合されたポリペプチドを検出するのに十分な量の時間、固定化抗体−ポリペプチド複合体とインキュベートされる。適切な量の時間は、一般に、ある時間にわたって起こる結合のレベルをアッセイすることによって決定され得る。次いで、非結合の検出試薬は除去され、そして結合した検出試薬は、レポーター基を用いて検出される。レポーター基を検出するために使用される方法は、レポーター基の性質に依存する。放射性基について、一般的には、シンチレーション計数法またはオートラジオグラフィー法が適切である。分光法は、色素、発光基および蛍光基を検出するために使用され得る。ビチオンは、異なるレポーター基（一般に、放射性もしくは蛍光基または酵素）に結合されたアビジンを使用して検出され得る。酵素レポーター基は、一般に、基質の添加（一般には、特定の時間の間）、続いて反応産物の分光分析または他の分析により検出され得る。
【０３２３】
ＨＳＶの存在または非存在を決定するために、固体支持体に結合したままのレポーター基から検出されるシグナルが、一般に、所定のカットオフ値と対応するシグナルと比較される。１つの実施形態において、ＨＳＶの検出のためのカットオフ値は、固定化抗体を、ＨＳＶを有さない患者由来のサンプルとインキュベートした際に得られる平均シグナルである。代替の実施形態において、このカットオフ値は、Ｓａｃｋｅｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｂａｓｉｃ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｆｏｒ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌｉｔｔｌｅ　Ｂｒｏｗｎ　ａｎｄ　Ｃｏ．，１９８５，１０６〜７頁の方法に従って、レシーバーオペレーターカーブ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ　Ｏｐｅｒａｔｏｒ　Ｃａｒｖｅ）を使用して決定される。簡単に言うと、この実施形態において、このカットオフ値は、診断試験結果についての各可能なカットオフ値に対応する真の陽性割合（すなわち、感度）および偽陽性割合（１００％−特異性）の対のプロットから決定され得る。プロット上の上方左手角に最も近いカットオフ値（すなわち、最大領域を囲む値）が、最も正確なカットオフ値であり、そして本方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生ずるサンプルが陽性と見なされ得る。あるいは、カットオフ値は、偽陽性割合を最小にするためにプロットに沿って左へシフトされ得るか、または偽陰性割合を最小にするために右へシフトされ得る。概して、この方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生ずるサンプルが、陽性と見なされる。
【０３２４】
関連の実施形態において、このアッセイは、フロースルー試験形式またはストリップ試験形式で実行される（ここで、結合剤は、ニトロセルロースのような膜上で固定化される）。フロースルー試験では、サンプル内のポリペプチドは、サンプルが膜を通過するにつれて固定化結合剤に結合する。次いで、第２の標識化された結合剤が、この第２の結合剤を含む溶液がその膜を介して流れるにつれて、結合剤−ポリペプチド複合体と結合する。次いで、結合した第２の結合剤の検出は、上記のように実行され得る。ストリップ試験形式では、結合剤が結合される膜の一端を、サンプルを含む溶液中に浸す。このサンプルは、膜に沿って、第２の結合剤を含む領域を通って、そして固定化結合剤の領域まで移動する。固定化抗体の領域での第２の結合剤の濃度が、ＨＳＶの存在を示す。代表的には、その部位での第２の結合剤の濃度は、視覚的に読みとられ得るパターン（例えば、線）を生成する。このようなパターンが存在しないことは陰性の結果を示す。概して、この膜上に固定化される結合剤の量は、生物学的サンプルが、上記の形式において、２抗体サンドイッチアッセイにおいて陽性シグナルを生じるのに十分であるレベルのポリペプチドを含む場合、視覚的に識別可能なパターンを生じるように選択される。このようなアッセイにおける使用に好ましい結合剤は、抗体およびその抗原結合フラグメントである。好ましくは、膜上に固定化される抗体の量は、約２５ｎｇ〜約１μｇの範囲であり、そしてより好ましくは、約５０ｎｇ〜約５００ｎｇの範囲である。このような試験は、代表的には、非常に少ない量の生物学的サンプルを用いて実行され得る。
【０３２５】
もちろん、本発明のＨＳＶタンパク質または結合剤との使用に適する多数の他のアッセイ手順が存在する。上記の記載は、例示のみを意図する。例えば、上記手順が、ＨＳＶポリペプチドを使用するために容易に改変されて、生物学的サンプル中のこのようなポリペプチドに結合する抗体を検出し得ることが当業者に明かである。このようなタンパク質特異的抗体の検出は、ＨＳＶ感染の同定を可能にし得る。
【０３２６】
ＨＳＶ感染もまた、あるいはＨＳＶ感染が、生物学的サンプル中のＨＳＶタンパク質と特異的に反応するＴ細胞の存在に基づいて検出され得る。特定の方法では、患者から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む生物学的サンプルは、ＨＳＶポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはこのようなポリペプチドの少なくとも免疫原性部分を発現するＡＰＣとともにインキュベートされ、そしてＴ細胞の特異的活性化の存在または非存在が検出される。適切な生物学的サンプルとしては、単離されたＴ細胞が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｔ細胞は、慣用技術によって（例えば、末梢血リンパ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離法によって）患者から単離され得る。Ｔ細胞は、約２〜９日間（代表的に４日間）、３７℃にてポリペプチド（例えば、５〜２５μｇ／ｍｌ）とともにインビトロでインキュベートされ得る。Ｔ細胞サンプルの別のアリコートを、コントロールとして役立てるために、ＨＳＶポリペプチドの非存在下でインキュベートすることが所望され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞に関して、活性化は好ましくは、Ｔ細胞の増殖を評価することによって検出される。ＣＤ８＋Ｔ細胞に関しては、活性化は好ましくは、細胞溶解活性を評価することによって検出される。疾患のない患者におけるよりも少なくとも２倍高い増殖レベルおよび／または少なくとも２０％高い細胞溶解活性レベルは、患者におけるＨＳＶの存在を示す。
【０３２７】
上記のように、ＨＳＶ感染はまた、あるいはＨＳＶ感染は、生物学的サンプル中のＨＳＶタンパク質をコードするｍＲＮＡレベルに基づいて検出され得る。例えば、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイにおいて用いて、生物学的サンプルに由来するＨＳＶ　ｃＤＮＡの一部を増幅し得、ここで、オリゴヌクレオチドプライマーのうちの少なくとも１つは、ＨＳＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的である（すなわち、ハイブリダイズする）。次いで、増幅されたｃＤＮＡが、当該分野で周知の技術（例えば、ゲル電気泳動）を用いて分離され、そして検出される。同様に、ＨＳＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いて、生物学的サンプル中のこのＨＳＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在を検出し得る。
【０３２８】
アッセイ条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするために、オリゴヌクレオチドのプライマーおよびプローブは、少なくとも１０ヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの長さの、ＨＳＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部に対して少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、そしてより好ましくは少なくとも約９０％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を含むべきである。好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、上記に規定されるような、中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする。本明細書中に記載される診断方法において有用に用いられ得るオリゴヌクレオチドのプライマーおよび／またはプローブは、好ましくは、少なくとも１０〜４０ヌクレオチドの長さである。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは、本明細書中に開示される配列を有するＤＮＡ分子の少なくとも１０連続ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む。ＰＣＲに基づくアッセイおよびハイブリダイゼーションアッセイの両方についての技術は、当該分野で周知である（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１：２６３，１９８７；Ｅｒｌｉｃｈ編，ＰＣＲ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。
【０３２９】
１つの好ましいアッセイは、ＲＴ−ＰＣＲを用い、ここで、ＰＣＲは、逆転写と組み合わせて適用される。代表的に、ＲＮＡは生物学的サンプル（例えば、生検組織）から抽出され、そして逆転写されてｃＤＮＡ分子を生成する。少なくとも１つの特異的プライマーを用いるＰＣＲ増幅は、ｃＤＮＡ分子を生成し、このｃＤＮＡ分子は、例えば、ゲル電気泳動を用いて分離および可視化され得る。増幅は、試験患者およびＨＳＶに感染していない個体から採取された生物学的サンプルについて行われ得る。増幅反応は、例えば、２桁の大きさに及ぶいくつかのｃＤＮＡ希釈物について行われ得る。
【０３３０】
上記のように、感度を改善するために、複数のＨＳＶタンパク質マーカーは、所定のサンプル内でアッセイされ得る。異なるＨＳＶポリペプチドに特異的な結合剤が単一のアッセイにおいて組み合わせられ得ることは明らかである。さらに、複数のプライマーまたはプローブが同時に用いられ得る。ＨＳＶタンパク質マーカーの選択は、最適な感度をもたらす組み合わせを決定する慣用実験に基づき得る。さらに、または代替として、本明細書中に提供されるＨＳＶタンパク質についてのアッセイは、他の公知のＨＳＶ抗原に対するアッセイと組み合わせられ得る。
【０３３１】
本発明はさらに、上記の診断方法および／または治療方法のうちのいずれかにおいて使用するためのキットを提供する。このようなキットは代表的に、診断アッセイおよび／または治療アッセイを行うのに必要な２以上の構成要素を備え、そしてこのキットの使用のための取扱説明書をさらに含む。構成要素は、化合物、試薬、容器および／または器具であり得る。例えば、診断キット内の１つの容器は、ＨＳＶタンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含み得る。このような抗体またはフラグメントは、上記のように支持体材料に付着されて提供され得る。１以上のさらなる容器は、アッセイにおいて使用される要素（例えば、試薬または緩衝液）を封入し得る。このようなキットはまた、あるいはこのようなキットは、抗体結合の直接的または間接的な検出に適切なレポーター基を含む上記のような検出試薬を備え得る。
【０３３２】
あるいは、キットは、生物学的サンプル中のＨＳＶタンパク質をコードするｍＲＮＡレベルを検出するように設計され得る。このようなキットは一般に、ＨＳＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする、上記のような、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドのプローブまたはプライマーを備える。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いられ得る。このようなキット内に存在し得るさらなる構成要素としては、ＨＳＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドの検出を容易にする、第２のオリゴヌクレオチドおよび／または診断試薬もしくは容器が挙げられる。
【０３３３】
以下の実施例は、例示のために提供され、そして限定のためではない。
【０３３４】
（実施例１）
（ＨＳＶ−２抗原の同定）
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を説明し、これらを作製および使用する際に当業者を補助するために提示される。これらの実施例は、その他に、本発明の範囲を制限することをいかなるようにも意図しない。
【０３３５】
（ＨＳＶ−２陽性ドナーの供給源）：リンパ球を以下の２つの型のドナーから得た：グループＡ）未知の臨床的状態を有するセロポジティブドナー、およびグループＢ）十分に特徴付けられた臨床的状態（ウイルス散布性および肛門性器病変再発）を有するセロポジティブドナー。
【０３３６】
グループＡ：血液サンプル（５０ｍｌ）を、１３人の潜在的ドナーから得た。ＨＳＶ感染の病歴に関する情報は、要求されなかった。ウェスタンブロットによって、血液を、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２に対する血清抗体についてスクリーニングした。ＰＢＭＣをまた、ＨＳＶ−１溶解物抗原およびＨＳＶ−２溶解物抗原（ＡＢＩ；Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ）に対する特異的増殖性Ｔ細胞応答についてスクリーニングした。３人のドナー（ＡＤ１０４、ＡＤ１１６、およびＡＤ１２０）が、ＨＳＶ−２血清抗体およびＨＳＶ−２抗原に応答して特異的に増殖したそれらのＰＢＭＣについて、陽性であった。白血球搬出ＰＢＭＣを、これらのドナーから収集し、そして液体窒素中で凍結保存した。
【０３３７】
グループＢ：肛門性器病変生検（ｂｉｏｐｉｓｉｅｓ）を、ドナーＤＫ２１３１８およびＪＲ５０３２から得た。病変生検リンパ球を、５０μＭアシクロビルの存在下で、ＩＬ−２およびＰＨＡとともにインビトロで増殖させ、続いて、液体窒素中で凍結保存した。代表的に、５×１０６個〜５×１０７個のリンパ球を、二週間後に得る。自己ＰＢＭＣもまた、ＤＫ２３１８およびＪＲ５０３２の血液から収集し、そして液体窒素中で凍結保存した。
【０３３８】
（ＣＤ４＋Ｔ細胞株の作製）：凍結保存したＰＢＭＣまたは病変生検リンパ球を解凍し、ＲＰＭＩ　１６４０＋１０％ヒト血清＋１０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ−７中の１μｇ／ｍｌ　ＨＳＶ−２抗原（ＡＢＩ）を用いてインビトロで刺激した。照射された自己ＰＢＭＣを、病変生検リンパ球のみについて、抗原提示細胞として添加した。組換えＩＬ−２（１ｎｇ／ｍｌ）を１日目および４日目に添加した。７日目に細胞を収集し、洗浄し、そしてＩＬ−２およびＩＬ−７を含む新鮮な培地中に置き換えた。組換えＩＬ−２を１０日目に再び添加した。培養の１４日目に、Ｔ細胞を収集し、洗浄し、そしてＨＳＶ−２抗原および照射された自己ＰＢＭＣを用いてインビトロで同じ方法で再刺激した。Ｔ細胞株を、二次刺激の１１〜１２日目に、液体窒素中で、１×１０７細胞／バイアルで凍結保存した。解凍後、凍結保存したＴ細胞は、インビトロでＨＳＶ−２抗原に対して、特異的に増殖する能力を保持した。続いて、これらのＴ細胞を使用して、以下に記載のように、Ｅ．ｃｏｌｉ中で調製されるＨＳＶ−２遺伝子フラグメント発現クローニングライブラリーをスクリーニングした。
【０３３９】
（ＨＳＶ−２（３３３）ＤＮＡの調製）：ＨＳＶ−２株３３３ウイルスを、２００ｍｌ／ボトルのＭｅｄｉｕｍ１９９（Ｇｉｂｃｏ）＋５％ＦＣＳのローラーボトル中で培養されたベロ細胞において増殖させた。ベロ細胞をＡＴＣＣ（カタログ番号ＣＣＬ−８１）から得たアフリカ緑サル線維芽細胞様細胞に形質転換させる。コンフルエンスに近いベロ細胞（１０個のローラーボトル）を、５０ｍｌ／ボトルのＭｅｄｉｕｍ１９９＋５％ＦＣＳ中で、０．０１のＭＯＩで、ＨＳＶ−２株３３３ウイルスに感染させた。細胞および培地をローラーボトルから収集し、そして細胞をペレット化した。上清を氷上で保存し、そして細胞ペレットを新鮮なＭｅｄｉｕｍ１９９＋１％ＦＣＳ中に再懸濁させ、６サイクルの凍結／解凍によって溶解させた。溶解物中の細胞細片をペレット化し、そして上清を保存された培養上清とともにプールした。ウイルスを、超遠心分離（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）（１２，０００ｇ、２時間、４℃）によってプールされた上清からペレット化し、そして２ｍｌの新鮮なＭｅｄｉｕｍ１９９＋１％ＦＣＳ中に再懸濁させた。ウイルスを、以前に記載されるように、超遠心分離（１９，０００ｇ、２時間、４℃）によって５〜１５％線形Ｆｉｃｏｌｌ勾配でさらに精製した（第１０章：Ｈｅｒｐｅｓ　ｓｉｍｐｌｅｘ　ｖｉｒｕｓ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９３）；著者：Ｆ．Ｊ．ＲｉｘｏｎおよびＪ．ＭｃＣｌａｕｇｈｌａｎ，編者：Ａ．Ｊ．ＤａｖｉｓｏｎおよびＲ．Ｍ．Ｅｌｌｉｏｔｔ；出版社：Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）。ＨＳＶ−２ウイルス含有バンドを、Ｍｅｄｉｕｍ１９９で１０倍に希釈した勾配から抽出し、そしてウイルスを、超遠心分離（１９，０００ｇ、４時間、４℃）によってペレット化した。ウイルスペレットを回収し、１０ｍｌのＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液中に再懸濁させた。インタクトなビリオンを、ＤＮＡｓｅおよびＲＮＡｓｅで処理して、細胞性ＤＮＡおよび細胞性ＲＮＡを除去した。次いで、酵素をＥＤＴＡの添加および６５℃でのインキュベーションによって不活化した。ＤＮＡを、ＥＤＴＡの存在下でＳＤＳを用いてウイルス粒子を溶解し、続いて、フェノール／クロロホルムで抽出してゲノムウイルスＤＮＡを精製することによって、勾配精製されたウイルスから調製した。ＨＳＶ−２　ＤＮＡをＥｔＯＨを用いて沈殿させ、そしてＤＮＡペレットを乾燥させ、そして１ｍｌのＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩衝液中に再懸濁させた。ＤＮＡの濃度および純度を、ＵＶ分光光度計でのＯＤ２６０およびＯＤ２８０を読むことによって決定した。この方法で調製されたゲノムＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＨＳＶ−２ゲノムフラグメント発現ライブラリーの構築のために使用した。
【０３４０】
（ｐＥＴ１７ｂベクターにおけるＨＳＶ−２ＤＮＡフラグメントライブラリーの構築）：ＨＳＶ２−Ｉライブラリーを、以下のように構築した。ＤＮＡフラグメントを、Ｆｉｓｈｅｒ「６０ＳｏｎｉｃＤｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ」（Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて１５％出力で４秒間、ゲノムＨＳＶ−２　ＤＮＡを超音波処理することによって作製した。次いで、超音波処理したＤＮＡを沈殿させ、ペレット化し、そして１１μＬ　ＴＥ緩衝液中で再懸濁させた。ＤＮＡフラグメントのおよそのサイズを、１μＬのフラグメント化ＨＳＶ−２ゲノムＤＮＡ　対　１．５μｇの非超音波処理物質のアガロースゲル電気泳動によって測定した。ゲルの臭化エチジウム染色後に視覚化したときに、ＤＮＡフラグメントの平均サイズが、約５００ｂｐであることを決定した。不完全なＤＮＡフラグメント末端を、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼを使用して、満たした（平滑末端化した）。次いで、ＥｃｏＲ１アダプターを、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを使用して、ＤＮＡフラグメントの平滑末端に連結した。次いで、ＤＮＡを、Ｔ４　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｋｉｎａｓｅを使用してキナーゼ処理し、手動で充填したＳ−４００ＨＲ　Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（Ｓｉｇｍａ）のカラムを使用して精製し、そして、ｐＥＴ１７ｂ発現ベクターに連結した。ＨＳＶ２−ＩＩライブラリーを類似の様式で構築した。このライブラリーにおける挿入物の平均サイズは、約１０００ｂｐであることを決定した。
【０３４１】
（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＨＳＶ−２フラグメント発現ライブラリーの作製）ＨＳＶ２−Ｉライブラリーを、グリセロールストックの調製およびＨＳＶ−２　ＤＮＡ挿入物提示の試験のために、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換した。大量のＨＳＶ−２／ｐＥＴ１７ｂライブラリーＤＮＡを調製するために、ＤＮＡを、ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ　ＤＨ１０Ｂ　Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｇｉｂｃｏ）に形質転換した。形質転換された細菌を、３枚のＬＢ／アンピシリンプレート（約７５０ＣＦＵ／プレート）上で増殖させ、小さなサブセットのコロニーを、ＤＮＡ挿入物の配列決定のために選び、そして各プレート由来の残りの細菌を、プラスミドＤＮＡの調製のためにプールとして収集した。これらのプールをＨＳＶ−２　Ｐｏｏｌ９、１０および１１と名付けた。これらの細菌プールの一部のグリセロールストックを−８０℃で保存した。プラスミドをプールの残りから精製した。３つのプールのそれぞれ由来の等しい量のプラスミドＤＮＡを合わせて、単一のプールのプラスミドＤＮＡを作製した。プールされたＤＮＡの形質転換効率を、ＪＭ１０９（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細菌を使用して実験的に決定した。次いで、ＪＭ１０９（ＤＥ３）細菌を、１プレート当たり１５コロニー形成単位（ＣＦＵ）を生じることが予期された、一定量の最終プールのライブラリーＤＮＡで形質転換した。次いで、形質転換された細菌を、１００枚のＬＢ／アンピシリンプレート上にプレートした。２０ＣＦＵ（平均）を、１００枚のプレートのそれぞれにおいて実際に観測した；従って、このＨＳＶ−２ライブラリーのプールサイズは、約２０クローン／プレートであった。細菌コロニーを、約８００μｌ／プレートのＬＢ＋２０％グリセロール中に、それぞれのプレートからプールとして収集した。各プールを、４つの９６ウェルのＵ底プレートに等しく分配し（２００μｌ／ウェル）、そしてこれらの「マスターストック」プレートを、−８０℃で保存した。従って、このＨＳＶ−２遺伝子フラグメントライブラリー（本明細書中において以降、ＨＳＶ２Ｉと呼ぶ）のサイズは、２０コロニー／プールの９６プールであった。プラスミドＤＮＡを、２０の無作為に選択されたコロニーから調製し、そして挿入物を配列決定した。約１５％（３／２０）がＨＳＶ−２　ＤＮＡを挿入物として含み、８０％（１６／２０）が、非ＨＳＶ−２　ＤＮＡ（Ｅ．ｃｏｌｉまたはベロ細胞のＤＮＡ）を含み、そして５％（１／２０）が、挿入ＤＮＡを含まなかった。ＨＳＶ２−ＩＩ　ＤＮＡライブラリーを、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換し、そして類似した方法で、無作為にコロニーを分析した。ライブラリーＨＳＶ２−ＩＩの構築における関連した差は、実験的評価のためのＪＭ１０９（ＤＥ３）細菌へのプールおよび形質転換のための大量のプラスミドの調製のためにエレクトロポレーションを使用する代わりに、ＮｏｖａＢｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉへのＨＳＶ−２／ｐＥＴ１７ｂ連結産物の形質転換を含んだ。さらに、プラスミドＤＮＡを、平均１６０コロニー／プレートの１０のプールから調製した。これらの１０のプラスミドプールを、以前のように、ＪＭ１０９（ＤＥ３）への形質転換のために、１つのプールに、等しい様式（分��光度計の読みに基づいて規格化された）で合わせ、先のように、グリセロールストックプールに収集するために、平均２０コロニー（クローン）／プレートを得た。約２５％が、ＨＳＶ−２ＤＮＡを挿入物として含み、残りの７５％が、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＮＡを挿入物として含んだ。
【０３４２】
（ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を用いるスクリーニングのための、ＨＳＶ−２フラグメント発現ライブラリーの誘導）マスターＨＳＶ２Ｉライブラリー９６ウェルプレートのうちの１つを、室温で解凍した。アリコート（２０μＬ）を、各ウェルから、１８０μＬ／ウェルのＬＢ培地＋アンピシリンを含む新しい９６ウェルプレートに移した。細菌を１晩増殖させ、次いで、４０μｌを、１６０μＬの２×ＹＴ培地＋アンピシリンを含む２つの新たな９６ウェルプレートに移した。細菌を、３７℃で１時間１５分間増殖させた。次いで、タンパク質発現を、２００ｍＭまでのＩＰＴＧの添加によって誘導した。細菌をさらに３時間培養した。これらのプレートの１つを使用して、細菌数／ウェルを規格化するために、分光光度計の読みを得た。第２に、規格化されたプレートを使用して、細菌をペレット化した後にＣＤ４＋Ｔ細胞を用いてスクリーニングし（約２×１０７／ウェル）、上清を除いた。ＨＳＶ２−ＩＩライブラリーを増殖させ、そして類似の様式で誘導した。
【０３４３】
（自己樹状ＡＰＣの調製）：樹状細胞（ＤＣ）を、ＲＰＭＩ　１６４０＋１０％のＦＣＳ：ＨＳの１：１混合物＋１０ｎｇ／ｍｌ　ＧＭ−ＣＳＦ＋１０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ−４中で、６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ３５０６）のプラスチック接着ドナー細胞（１×１０８ＰＢＭＣ由来）を３７℃で培養することによって作製した。非接着ＤＣを培養の第６日目にプレートから収集し、そして３３００Ｒａｄで照射した。次いで、ＤＣを平底９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ３５９６）中で１×１０４／ウェルでプレートし、そして３７℃で１晩培養した。次の日に、細菌ペレットを２００μｌ　ＲＰＭＩ　１６４０＋１０％ＦＣＳ中で抗生物質なしで再懸濁し、そして１０μｌ／ウェルを、１９０μｌの抗生物質なしの同じ培地中にＤＣを含むウェルに移すことによって、ＤＣを、誘導したＨＳＶ２−ＩライブラリープールまたはＨＳＶ２−ＩＩライブラリープールでパルスした。ＤＣおよび細菌を、９０分間３７℃で同時培養した。次いで、ＤＣを洗浄し、１０μｌ／ウェル　ＲＰＭＩ　１６４０＋１０％ＨＳ＋Ｌ−ｇｌｕｔ．＋５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン抗生物質中に再懸濁させた。
【０３４４】
（応答（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）Ｔ細胞の調製）：凍結保存したＣＤ４＋Ｔ細胞株を、使用の５日前に解凍し、そしてＲＰＭＩ　１６４０＋１０％ＨＳ＋１ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ−７中で、３７℃で培養した。２日後、培地を、ＩＬ−２およびＩＬ−７を含まない新鮮な培地と置き換えた。
【０３４５】
（ＨＳＶ２ライブラリーの一次スクリーニング）：Ｔ細胞を、新鮮なＲＰＭＩ　１６４０＋１０％ＨＳ中に再懸濁させ、そして２×１０４／ウェルで、Ｅ．ｃｌｉパルス自己ＤＣを含むプレートに添加した。３日後、１００μｌ／ウェルの上清を取り出し、そして新たな９６ウェルプレートに移した。続いて、上清の半分をＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γ含量について試験し、そして残りを−２０℃で保存した。次いで、Ｔ細胞を３７℃で８時間、１μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）でパルスした。次いで、３Ｈパルス細胞を、ＵｎｉＦｉｌｔｅｒ　ＧＦ／Ｃプレート（Ｐａｃｋａｒｄ；Ｄｏｗｎｅｒｓ　Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）上に収集し、続いて、［３Ｈ］を取り込むＣＰＭを、シンチレーションカウンター（Ｔｏｐ−Ｃｏｕｎｔ；Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して測定した。ＥＬＩＳＡアッセイを、ヒトＩＦＮ−ｇについての標準的なサイトカイン−捕捉ＥＬＩＳＡプロトコールに続いて、細胞上清で行った。
【０３４６】
Ｄ１０４由来のＴ細胞を用いたＨＳＶ２−Ｉライブラリーのスクリーニングから、ウェルＨＳＶ２Ｉ　Ｈ１０およびＨＳＶ２Ｉ　Ｈ１２（ＣＰＭレベルとＩＦＮ−ｇレベルの両方が、バックグラウンドより有意に上であった）を、陽性として記録した。
【０３４７】
（陽性ＨＳＶ２Ｉライブラリープールの分解）：最初のＣＤ４＋Ｔ細胞スクリーニング実験由来の陽性ウェル（ＨＳＶ２Ｉ　Ｈ１０およびＨＳＶ２Ｉ　Ｈ１２）を、再び、マスターグリセロールストックプレートから増殖させた。各プール由来の４８のサブクローンを無作為に選択し、増殖させ、そして以前に記載のようにＩＰＴＧ誘導した。サブクローンを、上記のように、ＡＤ１０４　ＣＤ４＋Ｔ細胞株に対してスクリーニングした。ＨＳＶ２Ｉ　Ｈ１２プール分解由来のクローン（ＨＳＶ２Ｉ　Ｈ１２Ａ１２）を陽性と記録した。この陽性の結果を、第２のＡＤ１０４　ＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイで検証した。
【０３４８】
（ＣＤ４＋　Ｔ細胞抗原としてのＵＬ３９の同定）：陽性クローン（ＨＳＶ２Ｉ＿Ｈ１２Ａ１２）を、サブクローニングし、そして１０クローンをＥｃｏＲＩ　ＮＢ＃６７５　ｐｇ．３４を用いる制限消化分析のために選択した。１０の全てのクローンは、同じサイズ（約９００ｂｐ長）のＤＮＡ挿入物を含んだ。これらのクローンのうち３つ（ＨＳＶ２Ｉ＿Ｈ１２Ａ１２＿１，７，および８）を、配列決定のために選択し、そしてその全てが、挿入物の５’および３’末端の両方に同一な挿入配列を含んだ。挿入物のＤＮＡ配列は、配列番号１に示され、そして配列番号２に示されるオープンリーディングフレームを含む。この挿入配列を、ＨＳＶ−２菌株ＨＧ５２（ＮＣＢＩ部位、登録＃Ｚ８６０９９）の完全ゲノム配列と比較し、そしてこの配列が、ＵＬ３９（ａ．ｋ．ａ．ＩＣＰ６）（ＨＳＶリボヌクレオチドレダクターゼの大サブユニット（１４０ｋＤ））（この配列は、配列番号３に示される）に対する高い相同性を有することを決定した。配列番号１に示されるこの挿入配列は、ＵＬ３９オープンリーディングフレーム（３，４３２ｂｐ）のヌクレオチド８７６〜１６９０にまたがり、そして配列番号２に示されるアミノ酸配列（これは、ＵＬ３９（全長＝１１４３ａａ）のアミノ酸２９２〜５６３に対して高い相同性を有する）をコードする。
【０３４９】
（ＣＤ４＋　Ｔ細胞抗原としての、ＵＳ８Ａ、ＵＳ３／ＵＳ４、ＵＬ１５、ＵＬ１８、ＵＬ２７およびＵＬ４６の同定）：Ｔ細胞抗原としてのＵＬ３９の同定について上記した様式と本質的に同一の様式で、さらなるＨＳＶ２遺伝子フラグメント発現クローニングライブラリー（ＨＳＶ２−ＩＩといわれる）を調製し、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてドナーＴ細胞を用いてスクリーニングした。
【０３５０】
ドナーＡＤ１１６由来のＴ細胞を用いるＨＳＶ２−ＩＩライブラリーのスクリーニングは、クローンＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＳ８ＡｆｒａｇＤ６．Ｂ＿Ｂ１１＿Ｔ７Ｔｒｃ．ｓｅｑを同定し、配列番号４に示される挿入配列を有することが決定され、配列番号５および６に示されるアミノ酸配列を有するオープンリーディングフレームをコードし、配列番号５の配列は、ＨＳＶ２　ＵＳ８Ａタンパク質と高い相同性を有し、この配列は配列番号７に示される。
【０３５１】
さらに、ドナーＡＤ１０４由来のＴ細胞を用いるＨＳＶ２−ＩＩライブラリーのスクリーニングは、以下のクローン挿入物を同定した：
配列番号８、これは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する潜在的オープンリーディングフレームを含むクローンＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＳ３／ＵＳ４ｆｒａｇＦ１０Ｂ３＿Ｔ７Ｔｒｃ．ｓｅｑに対応する；
配列番号９、これは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有するオープンリーディングフレームを含むクローンＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＳ３／ＵＳ４ｆｒａｇＦ１０Ｂ３＿Ｔ７Ｐ．ｓｅｑに対応し、そしてＨＳＶ−２　ＵＳ３タンパク質（配列番号１２）と高い相同性を共有する；
配列番号１３、これは、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するオープンリーディングフレームを含むクローンＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＬ４６ｆｒａｇＦ１１Ｆ５＿Ｔ７Ｔｒｃ．ｓｅｑに対応し、そしてＨＳＶ−２　ＵＬ４６タンパク質（配列番号１５）と高い相同性を共有する；
配列番号１６、これは、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有するオープンリーディングフレームを含むクローンＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＬ２７ｆｒａｇ−Ｈ２Ｃ７＿Ｔ７Ｔｒｃ．ｓｅｑに対応し、そしてＨＳＶ−２　ＵＬ２７タンパク質（配列番号１８）と高い相同性を共有する；
配列番号１９、これは、配列番号２０、２１および２２に示されるアミノ酸配列を有するオープンリーディングフレームを含むクローンＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＬ１８ｆｒａｇＦ１０Ａ１＿ｒｃ．ｓｅｑに対応し、配列番号２２は、ＨＳＶ−２　ＵＬ１８タンパク質（配列番号２３）と高い相同性を共有する；ならびに
配列番号２４、これは、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を有するオープンリーディングフレームを含むクローンＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＬ１５ｆｒａｇＦ１０Ａ１２＿ｒｃ．ｓｅｑに対応し、そしてＨＳＶ−２　ＵＬ１５タンパク質（配列番号２６）と高い相同性を共有する。
【０３５２】
（実施例２）
（ＨＳＶ−２抗原の同定）
ＡＤ１０４由来のＣＤ４＋　Ｔ細胞が、実施例１に詳細に記載されるようなクローンＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＬ４６ｆｒａｇＦ１１Ｆ５＿Ｔ７Ｔｒｃ．ｓｅｑ（配列番号１３）およびＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＬ１８ｆｒｇａＦ１０Ａ１＿ｒｃ．ｓｅｑ（配列番号１９）由来の挿入物を認識することを見出した。これらのクローン由来の配列は、ＨＳＶ２−Ｉ遺伝子（それぞれ、ＵＬ４６（配列番号１５）およびＵＬ１８（配列番号２３））と高い相同性を共有する。したがって、これらのＴ細胞によって認識されるエピトープをさらに特徴付けるために、重複する１５マーのペプチドを、ＵＬ１８およびＵＬ４６のクローン挿入フラグメントを横切って作製した。ＡＤ１０４のＣＤ４＋　Ｔ細胞によるペプチド認識を、４８時間のＩＦＮ−ｇ　ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて試験した。ＥＬＩＳＰＯＴＳを、９６ウェルのＥＬＩＳＰＯＴプレートにおけるウェル当たり、１×１０４の自己ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞（ＬＣＬ）またはＤＣを添加することによって実施した。ＡＤ１０４株由来の２×１０４のＡＤ１０４　ＣＤ４＋　Ｔ細胞を、５μｇ／ｍｌのＨＳＶ２ペプチドと共に１ウェル毎に添加した。ＡＤ１０４　ＣＤ４＋　Ｔ細胞は、ＵＬ１８のペプチド２０および２１（配列番号３２および３３）、ならびにＵＬ４６のペプチド１、４、９、１０、および２０（配列番号２７〜３１）を認識した。
【０３５３】
（実施例３）
（ＨＳＶ−２抗原の同定）
ＣＤ４＋　Ｔ細胞株を、ＤＫ２３１８およびＪＲ５０３２の病変生検から作製した。このＣＤ４＋リンパ球を、実施例１に記載したような照射した自己ＰＢＭＣおよびＨＳＶ２抗原でインビトロで２回刺激した。この株を、実施例１に記載されるようなその抗原特異性について試験し、そして凍結保存した。このＣＤ４＋　Ｔ細胞株を、実施例１で作製したＨＳＶ２−ＩＩ発現クローニングライブラリーに対してスクリーニングした。
【０３５４】
ＤＫ２３１８が、クローンＣ１２およびＧ１０と反応することを示した。クローンＣ１２は、配列番号３６に示される挿入配列を有することを決定した。この挿入物は、２つのＨＳＶ−ＩＩ遺伝子のフラグメント（ＵＬ２３のヌクレオチド７２３〜１３１１およびＵＬ２２のヌクレオチド１−８５２）と配列相同性を有することを見出した。これらの配列は、配列番号４０に示されるＵＬ２３のアミノ酸２４１〜３７６、および配列番号４１に示されるアミノ酸１〜２８４に対応する。配列番号３６のＤＮＡ配列を、Ｇｅｎｂａｎｋを含む公共データベースに対して検索し、そして、それぞれ配列番号３７および３８に示されるＨＳＶ２遺伝子ＵＬ２３およびＵＬ２２に対して高い配列相同性を有することを示した。配列番号３７および３８によってコードされるタンパク質配列は、配列番号３９および４５に示される。クローンＧ１０は、以下が決定された：配列番号４８に示される挿入配列を有すること、配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有するオープンリーディングフレームをコードすること、配列番号４８の配列が、ＨＳＶ２　ＵＬ３７（この配列は配列番号４９に示される）と高い配列相同性を有すること、配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有するオープンリーディングフレームをコードすること。ＤＫ２３１８のＣＤ４＋　Ｔ細胞株を、ＵＬ２３タンパク質を覆う重複する１５マーに対してスクリーニングした。ＤＫ２３１８のＣＤ４株は、３つのＵＬ２３特異的ペプチド（配列番号４１〜４３）に対して反応することが示され、これはＵＬ２３が標的であることを示唆する。
【０３５５】
ＪＲ５０３２から作製されたＣＤ４＋　Ｔ細胞株は、以下が見出された：配列番号３４に示される挿入配列を含むクローンＥ９と反応すること、配列番号４６に示されるアミノ酸配列を有するオープンリーディングフレームをコードすること、配列番号３４が、ＨＳＶ２　ＲＬ２（また、ＩＣＰ０といわれる）（この配列は配列番号３５に示される）と高い配列相同性を有すること、配列番号４７に示されるアミノ酸配列を有するオープンリーディングフレームをコードすること。
【０３５６】
（実施例４）
（ＣＤ４クローンＦ１１Ｆ５およびＧ１０Ａ９の特徴付け）
実施例２および３は、ドナーＡＤ１０４およびＤＫ２３１３からのＣＤ４　Ｔ細胞株の作製を記載し、これらを、ＨＳＶ−２　３３３菌株を使用して作製されるｃＤＮＡライブラリーに対してスクリーニングした。ＡＤ１０４は、クローンＨＳＶ２ＩＩ＿ＵＬ４６ｆｒａｇＦ１１Ｆ５に対して反応することが見出された。この挿入物を、配列番号１３に開示される配列を使用して、部分的に配列決定した。この挿入物の全長配列決定は、この配列が、ＨＳＶ−２　３３３菌株由来のＵＬ４６のフラグメントをコードすることを明らかにした。この挿入物由来のＤＮＡおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５２および５４に開示される。
【０３５７】
ＤＫ２３１２は、クローンＧ１０に対して反応することが見出された。この挿入物を、部分的に配列決定し、そしてこの配列を配列番号４８に開示した。全長配列決定は、この配列が、ＨＳＶ−２　３３３菌株由来のＵＬ３７のフラグメントをコードすることを明らかにした。この挿入物由来のＤＮＡおよびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号５３および５５に開示する。
【０３５８】
（実施例５）
（ＨＳＶ−２由来のＣＤ８特異的免疫反応性ペプチドの同定）
末梢血単核細胞を、正常なドナーＡＤ１０４、ＡＤ１１６、ＡＤ１２０、およびＤ４７７から得た。これらのドナーは、低分解能ＤＮＡ分類方法論を使用してＨＬＡ分類し、そしてこの結果を表２に示す。
【０３５９】
（表２）
【０３６０】
【表２】
2004501663.tif 000003
ＨＳＶ−２のどのエピトープが免疫反応性であるかを決定するために、合成ペプチドを合成した。これらのペプチドは、１１アミノ酸だけ重複する１５アミノ酸長であった。これらのペプチドを、以下のＨＳＶ−２遺伝子の以下の領域を横切って合成した：ＵＬ１５（ａａ６００〜７３４）、ＵＬ１８（ａａ１〜１１０）、ＵＬ２３（ａａ２４１〜３７６）、ＵＬ４６（ａａ６１７〜７２２）、ＵＳ３（ａａ１２５〜２７６）、およびＵＳ８Ａ（ａａ８３〜１４６）。
【０３６１】
ＣＤ８＋　Ｔ細胞を、ネガティブ選択を使用して、上記のドナーの各々のＰＢＭＣから精製した。次いで、この精製したＣＤ８＋　Ｔ細胞を、ＨＳＶ−２特異的ペプチドに対するそれらの反応性について試験した。２×１０５のＣＤ８＋　Ｔ細胞、１×１０４の自己樹状細胞および１０μｇ／ｍｌのペプチドプールを含む共培養（平均で、１０ペプチド／プールを含む）を、抗ヒトＩＦＮ−γ抗体（１Ｄ１Ｋ：ｍＡｂＴｅｃｈ）で予めコーティングした９６ウェルのＥＬＩＳＰＯＴプレート中で確立した。２４時間後、このＥＬＩＳＰＯＴプレートを、当業者に周知の標準的プロトコルを使用して展開させた。次いで、ウェル当たりのスポットの数を、自動化ビデオ顕微鏡（ｖｉｄｅｏ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）ＥＬＩＳＰＯＴプレートリーダーを使用して計数した。次いで、ペプチドプールに対する陽性応答を示すドナー由来のＣＤ８＋　Ｔ細胞を、第２のＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、このプール中の個々のペプチドに対して引き続き試験した。ペプチド反応性の結果を、表３に示す。
【０３６２】
（表３）
【０３６３】
【表３】
2004501663.tif 000004
当業者は、前述の説明に開示された概念および特定の実施形態が、本発明と同じ目的を実施するために他の実施形態を改変または設計するための基礎として、容易に利用され得ることを理解する。当業者はまた、このような等価な実施形態が、添付の特許請求の範囲に示される本発明の精神および範囲から逸脱しないことを理解する。
【国際公開パンフレット】
2004501663.tif 000005
2004501663.tif 000006
2004501663.tif 000007
2004501663.tif 000008
2004501663.tif 000009
2004501663.tif 000010
2004501663.tif 000011
2004501663.tif 000012
2004501663.tif 000013
2004501663.tif 000014
2004501663.tif 000015
2004501663.tif 000016
2004501663.tif 000017
2004501663.tif 000018
2004501663.tif 000019
2004501663.tif 000020
2004501663.tif 000021
2004501663.tif 000022
2004501663.tif 000023
2004501663.tif 000024
2004501663.tif 000025
2004501663.tif 000026
2004501663.tif 000027
2004501663.tif 000028
2004501663.tif 000029
2004501663.tif 000030
2004501663.tif 000031
2004501663.tif 000032
2004501663.tif 000033
2004501663.tif 000034
2004501663.tif 000035
2004501663.tif 000036
2004501663.tif 000037
2004501663.tif 000038
2004501663.tif 000039
2004501663.tif 000040
2004501663.tif 000041
2004501663.tif 000042
2004501663.tif 000043
2004501663.tif 000044
2004501663.tif 000045
2004501663.tif 000046
2004501663.tif 000047
2004501663.tif 000048
2004501663.tif 000049
2004501663.tif 000050
2004501663.tif 000051
2004501663.tif 000052
2004501663.tif 000053
2004501663.tif 000054
2004501663.tif 000055
2004501663.tif 000056
2004501663.tif 000057
2004501663.tif 000058
2004501663.tif 000059
2004501663.tif 000060
2004501663.tif 000061
2004501663.tif 000062
2004501663.tif 000063
2004501663.tif 000064
2004501663.tif 000065
2004501663.tif 000066
2004501663.tif 000067
2004501663.tif 000068
2004501663.tif 000069
2004501663.tif 000070
2004501663.tif 000071
2004501663.tif 000072
2004501663.tif 000073
2004501663.tif 000074
2004501663.tif 000075
2004501663.tif 000076
2004501663.tif 000077
2004501663.tif 000078
2004501663.tif 000079
2004501663.tif 000080
2004501663.tif 000081
2004501663.tif 000082
2004501663.tif 000083
2004501663.tif 000084
2004501663.tif 000085
2004501663.tif 000086
2004501663.tif 000087
2004501663.tif 000088
2004501663.tif 000089
2004501663.tif 000090
2004501663.tif 000091
2004501663.tif 000092
2004501663.tif 000093
2004501663.tif 000094
2004501663.tif 000095
2004501663.tif 000096
2004501663.tif 000097
2004501663.tif 000098
2004501663.tif 000099
2004501663.tif 000100
2004501663.tif 000101
2004501663.tif 000102
2004501663.tif 000103
2004501663.tif 000104
2004501663.tif 000105
2004501663.tif 000106
2004501663.tif 000107
2004501663.tif 000108
2004501663.tif 000109
2004501663.tif 000110
2004501663.tif 000111
2004501663.tif 000112
2004501663.tif 000113
2004501663.tif 000114
2004501663.tif 000115
2004501663.tif 000116
2004501663.tif 000117
2004501663.tif 000118
2004501663.tif 000119
2004501663.tif 000120
2004501663.tif 000121
2004501663.tif 000122
2004501663.tif 000123
2004501663.tif 000124
2004501663.tif 000125
2004501663.tif 000126
2004501663.tif 000127
2004501663.tif 000128
2004501663.tif 000129
2004501663.tif 000130
2004501663.tif 000131
2004501663.tif 000132
2004501663.tif 000133
2004501663.tif 000134
2004501663.tif 000135
2004501663.tif 000136
2004501663.tif 000137
2004501663.tif 000138
2004501663.tif 000139
2004501663.tif 000140
2004501663.tif 000141
2004501663.tif 000142
2004501663.tif 000143
2004501663.tif 000144
2004501663.tif 000145
2004501663.tif 000146
2004501663.tif 000147
2004501663.tif 000148
2004501663.tif 000149
2004501663.tif 000150
2004501663.tif 000151
2004501663.tif 000152
2004501663.tif 000153
2004501663.tif 000154
2004501663.tif 000155
2004501663.tif 000156
2004501663.tif 000157
2004501663.tif 000158
2004501663.tif 000159
2004501663.tif 000160
2004501663.tif 000161
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004501663.tif 000162
【国際調査報告】
2004501663.tif 000163
2004501663.tif 000164
2004501663.tif 000165
2004501663.tif 000166
2004501663.tif 000167
2004501663.tif 000168