(57)【要約】それぞれに第１の表面を有し、１つの分析ステーションとして構築することができる顕微鏡スライドなどの第１のプレート部材および第２のプレート部材を備えたフローセルアセンブリを提供する。第１のプレート部材と第２のプレート部材は、それぞれの第１の表面どうしを向かい合わせて重なり合う。第１の表面間にキャビティが形成され、そして、第２のプレート部材の中の複数のチャネルがそれぞれ、第２のプレート部材の他の表面から前記キャビティのそれぞれの部分へ延びる。解放可能な手段が第１のプレート部材と第２のプレート部材とを面対面の一時的な液密接触状態にし、部材間にキャビティを形成する。キャビティは、第１のプレート部材の上に分析視野を提供する。少なくとも３つの入口フローチャネルおよび少なくとも１つの出口フローチャネルがあり、これらのチャネルは全て分析視野と連絡して、入口フローチャネルと出口フローチャネルの間の視野の上に流体力学的に配置された流れを供給する。
2004502933.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれ第１の表面を有し、それぞれの第１の表面どうしを向かい合わせて重なり合う第１および第２のプレート部材と、前記第１のプレート部材の前記第１の表面と前記第２のプレート部材の前記第１の表面との間に形成されたキャビティと、前記第１のプレート部材または前記第２のプレート部材の中の複数のチャネルであって、前記チャネルが形成されたプレート部材の他の表面から前記キャビティのそれぞれの部分へそれぞれ延びているところの複数のチャネルと、そして、前記第１のプレート部材と前記第２のプレート部材とを面対面の一時的な液密接触状態に保持して、部材間に前記キャビティを形成するための解放可能な保持手段とを備えるフローセルアセンブリであって、前記キャビティが、前記第１および第２のプレート部材のうちの一方の部材上に分析視野を提供し、前記チャネルが、少なくとも３つの入口フローチャネルおよび少なくとも１つの出口フローチャネルを含み、これらのチャネルが全て分析視野と連絡して、前記入口フローチャネルと前記出口フローチャネルの間の前記視野の上に流体力学的に配置された流れを供給するフローセルアセンブリ。
【請求項２】
前記チャネルが、前記キャビティと第１または第２のプレート部材の他の表面との間をそれぞれ連絡する複数の貫通孔を有する、請求項１に記載のフローセルアセンブリ。
【請求項３】
前記貫通孔の各々が、前記第１の表面とは反対側の、前記チャネルが形成された前記プレート部材の他の表面と連絡している、請求項２に記載のフローセルアセンブリ。
【請求項４】
前記フローチャネルの各々が、前記第１の表面と隣接する、前記チャネルが形成されたプレート部材の側面と連絡している、請求項１または２に記載のフローセルアセンブリ。
【請求項５】
前記チャネルが形成された前記プレート部材の前記第１の表面が、前記キャビティの深さを決定する表面レリーフを有し、そして、前記プレート部材のうちの他の部材の第１の表面が平面である、請求項１乃至４のいずれか１つに記載のフローセルアセンブリ。
【請求項６】
前記第１および第２のプレート部材の前記第１の表面が平面であり、そして、前記キャビティの深さが、前記第１の表面間に配置されたガスケットによって決定された、請求項１から４のいずれか１つに記載のフローセルアセンブリ。
【請求項７】
前記ガスケットが、前記チャネルが形成された前記プレート部材の第１の表面に恒久的に取り付けられた、請求項６に記載のフローセル。
【請求項８】
前記ガスケットが、前記チャネルが形成されていない前記プレート部材の第１の表面に恒久的に取り付けられた、請求項６に記載のフローセル。
【請求項９】
前記キャビティの深さが５００μｍ以下である、請求項１乃至８のいずれか１つに記載のフローセルアセンブリ。
【請求項１０】
前記深さが１０から２００μｍである、請求項９に記載のフローセルアセンブリ。
【請求項１１】
前記深さが５０から１５０μｍである、請求項１０に記載のフローセルアセンブリ。
【請求項１２】
前記保持手段が、前記プレート部材の一方を支持するための底部と、前記プレート部材を他方を支持し、そして、前記プレート部材が分離されているところのローディング位置と、前記第１のプレート部材及び前記第２のプレート部材が重なり合って、前記キャビティを形成しているところの操作位置との間を移動可能なキャリッジと、そして、前記操作位置にあるときに、前記第１のプレート部材及び前記第２のプレート部材を弾力によって相互に押しつけて、前記キャビティを密封するための手段とを備えた、請求項１乃至１１のいずれか１つに記載のフローセルアセンブリ。
【請求項１３】
前記プレート部材の一方が顕微鏡スライドであり、そして、前記フローチャネルがもう前記プレート部材の他方に形成された、請求項１乃至１２のいずれか１つに記載のフローセルアセンブリ。
【請求項１４】
前記フローチャネルが形成されたプレート部材が、少なくとも３つの前記入口フローチャネルおよび少なくとも１つの前記出口フローチャネルを提供し、これらのチャネルが全て分析視野と連絡して、流体力学的に集束した第１の方向の流れを前記視野の上に提供し、そして、少なくとも３つの前記入口フローチャネルおよび少なくとも１つの前記出口フローチャネルが全て分析視野と連絡して、前記第１の方向と交差する第２の方向の流体力学的に集束した流れを前記視野の上に提供する、請求項１乃至１３のいずれか１つに記載のフローセルアセンブリ。
【請求項１５】
液体と固体表面に固定された材料との間の相互作用を観察または検出するための手段をさらに備えた、請求項１乃至１４のいずれか１つに記載のフローセルアセンブリ。
【請求項１６】
前記相互作用を観察または検出するための前記手段が、顕微鏡、クロマトグラフィ法、イムノアッセイ、蛍光検出器、放射能検出器およびこれらの組合せからなるグループから選択された、請求項１５に記載のフローセルアセンブリ。
【請求項１７】
液体と固体表面に固定された材料との間の空間的に導かれた相互作用を誘導する方法であって、第１のプレート部材及び第２のプレート部材を重なり合うように組み立ててアセンブリを形成するに先立って、請求項１乃至１６のいずれか１つに記載のフローセルアセンブリのキャビティの分析視野の中に前記材料を固定し、前記アセンブリを形成し、そして、誘導液体の緩衝流を側面に有する前記液体の流体力学的に集束した流れを、前記アセンブリのそれぞれの前記入口フローチャネルを通して、前記アセンブリの前記出口フローチャネルから外へ流し、もって、前記分析視野の所望のストリップの上を前記液体を流すステップを含む方法。
【請求項１８】
次いで、実質的に同一または異なる液体を導いて、最初の前記ストリップと実質的に同一の方向に延びる分析視野の他の所望のストリップの上に流す、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記キャビティが、少なくとも３つの前記入口フローチャネルおよび少なくとも１つの前記出口フローチャネルを提供し、これらのチャネルが全て分析視野と連絡して、流体力学的に集束した第１の方向の流れを前記視野の上に供給し、そして、少なくとも３つの前記入口フローチャネルおよび少なくとも１つの前記出口フローチャネルが全て分析視野と連絡して、前記第１の方向と交差する第２の方向の流体力学的に集束した流れを前記視野の上に供給し、そして、液体を前記第１の方向に、続いて前記第２の方向に通過させて、前記固定された材料と相互作用させる、請求項１７または請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記固定された材料が、生物細胞、生きた細胞または固定組織を含む、請求項１７乃至１９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２１】
液体と固体表面に固定された材料との間の空間的に導かれた相互作用を誘導する方法において使用される装置であって、請求項１乃至１４のいずれか１つに記載のフローセルアセンブリと、そして、前記相互作用を観察または検出するための手段とを備える装置。
【請求項２２】
前記相互作用を観察する前記手段が、顕微鏡、蛍光検出器または放射能検出器を含む、請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
検体をスクリーニングして、細胞に対するその生物活性を判定する方法であって、
ａ）固体表面に細胞を固定し、
ｂ）流体力学的に集束した流れを固定された細胞の上に提供するのに適したハウジングの中に、前記固体表面を配置し、
ｃ）前記検体を含む、流体力学的に集束した流体流を、前記固定された細胞の上に発生させ、かくして、前記検体が前記細胞と接触することを可能にし、そして、
ｄ）前記細胞に対する前記検体の生物活性の指標として、前記細胞の変化または前記細胞によって引き起こされた変化の有無を判定する
ステップを含む方法。
【請求項２４】
固定するステップが、前記細胞を固定するのに適した特性を有する固体表面を選択し、そして、前記細胞を固体表面と接触させることを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記固体表面が、コラーゲン、デキストラン、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、アルギン酸塩、寒天およびこれらの組合せを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記検体が薬剤または薬剤候補物質である、請求項２３乃至２５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２７】
前記薬剤または薬剤候補物質がタンパク質核酸または小分子である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
スクリーニングされる前記生物活性が、細胞分化、運動、アポトーシス、付着、シグナル分子のトランスロケーション、タンパク質発現および腫瘍化変換のうちの少なくとも１つである、請求項２３乃至２７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２９】
スクリーニングされる前記生物活性が、吸着、分布、代謝および排出のうちの少なくとも１つと関連づけられた、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
細胞を検体に選択的に暴露する方法であって、
ａ）固体表面に細胞を固定し、
ｂ）流体力学的に集束した流れを固定された細胞の上に供給するのに適したハウジングの中に、前記固体表面を配置し、そして、
ｃ）前記検体を含む、流体力学的に集束した流体流を、前記固定された細胞の上に発生させ、かくして、前記検体が前記細胞と接触することを可能にする
ステップを含む方法。
【請求項３１】
前記細胞が生きた細胞である、請求項２３乃至３０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞が組織の部分である、請求項２３乃至３１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞が一次細胞である、請求項２３乃至３２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３４】
前記一次細胞を哺乳動物から得る、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞が、血球、幹細胞、内皮細胞、骨細胞、肝細胞、平滑筋細胞、横紋筋細胞、心筋細胞、胃腸細胞、神経細胞および癌細胞から選択された、請求項２３乃至３４のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、流体力学的に集束した流れを表面の上に生じさせるために使用されるフローセルおよびフローセルを含む装置に関する。本発明はさらに、このようなフローセルの内部で、液体または液体中に浮遊した材料と表面との間に相互作用を生成する方法に関する。本発明はさらに、上記のシステムを使用して検体をスクリーニングする方法、および細胞を検体に選択的に暴露する方法に関する。
【０００２】
ＷＯ００／５６４４４（本明細書の出願日には未公告）に、フローセルの中の液体と固体表面との間に相互作用を生じさせる方法が開示されている。この方法では、液体が、比較的に幅の狭い流体力学的に集束して流れるように、あるいはセルの中の比較的に幅広い表面の上を帯状に流れるように拘束され、集束した流れの両側の緩衝流を調整することによって液体が、表面の上に希望通りに配置される。集束した流れまたは流れの中の材料とフローセルの中の比較的に幅の広い前記表面との間に相互作用が起こる。
【０００３】
セルはベース部分を含み、その中には、ベース部分に形成されたウェルへ／から延びるマイクロチャネルが形成されている。ウェルは、比較的に幅の広い前記表面をその底部として有する。ベース部分の上にカバーを恒久的に取り付けることによってフローセルは閉じられている。マイクロチャネルおよびウェルの高さは数十または数百ミクロン（μｍ）程度である。
【０００４】
使用時には、物質または細胞などの微小な構造を、流体力学的に集束または配置され、前記底部の所望の部分の上に導かれた液体流からそれらを捕獲することによって前記ウェルの底部の上に置く。あるいはそれらを、カバーの重なり合った部分に捕獲する。これはセルを構築した後で実施される。この文献には、フローセルの中に含まれるセルの生存力を維持するための手段は記載されていない。さらに、再使用のためにセルの内容物を一掃することは実際に実行可能なオプションでないため、フローセルは実質上再使用できない。マイクロチャネルおよびウェルが形成されたベースが使用後に廃棄されるので、これはコストの増大につながる。
【０００５】
さらに、化学分子または生化学分子と生きた細胞との間の相互作用を、生きた細胞を表面に取り付ける方法で調べたい場合には、フローセルを構築する前に細胞を取り付けることができれば好都合であろう。しかしこれは、ベース部分とカバーとが製造時に恒久的に結合されるＷＯ００／５６４４４に記載のフローセルを使用しては不可能である。
【０００６】
本発明はフローセルアセンブリを提供する。このアセンブリは、それぞれに第１の表面を有し、それぞれの第１の表面どうしを向かい合わせて重なり合う第１および第２のプレート部材と、第１のプレート部材の前記第１の表面と第２のプレート部材の前記第１の表面との間に形成されたキャビティと、前記第１のプレート部材または前記第２のプレート部材の中の複数のチャネルであって、チャネルが形成されたプレート部材の他の表面から前記キャビティのそれぞれの部分へそれぞれ延びる複数のチャネルと、前記第１のプレート部材と前記第２のプレート部材を面対面の一時的な液密接触状態に保持して部材間に前記キャビティを形成する、解放可能な保持手段とを備え、キャビティが、前記第１および第２のプレート部材のうちの一方の部材上に分析視野を提供し、前記チャネルが、少なくとも３つの入口フローチャネルおよび少なくとも１つの出口フローチャネルを含み、これらのチャネルが全て分析視野と連絡して、前記入口フローチャネルと前記出口フローチャネルの間の前記視野の上に流体力学的に集束された流れを供給する。
【０００７】
フローチャネルを全て同じプレート部材に形成して、第１のプレート部材と第２のプレート部材の両方ではなく、これらのうちのどちらかにフローチャネルが形成されるようにすることが好ましいが、例えば前記入口チャネルとは別の前記プレート部材に出口チャネルを形成することもできる。出口チャネルは、使用時に液体が受け取られ保持されるそのプレート部材に形成されたウェルまたはリザーバと連絡することができる。
【０００８】
チャネルは、前記キャビティと第１または第２のプレート部材の他の表面との間をそれぞれ連絡する複数の貫通孔を含んでいてもよい。しかしチャネルは、第１または第２のプレート部材のこの表面にあって、この表面の縁まで延びて接続を形成する溝として形成してもよい。第１のプレート部材の第１の表面と第２のプレート部材の第１の表面を合わせると、このような溝は閉じて管状チャネルを形成する。
【０００９】
チャネルは、第１または第２のプレート部材の厚さを貫通して反対側の表面まで延び、または横方向に、第１の表面に隣接したプレート部材の側面まで延びていてもよい。これは、分析視野にチャネル接続がないようにすることを助け、そのためチャネル接続が、分析視野を観察するための手段を妨害しない。
【００１０】
第１のプレート部材の第１の表面と第２のプレート部材の第１の表面の間のキャビティをさまざまな方法で形成することができる。チャネルが形成されたプレート部材はキャビティの深さを決定する表面レリーフを備えることができ、もう一方のプレート部材の第１の表面は平面としてもよい。
【００１１】
あるいは、第１のプレート部材の第１の表面および第２のプレート部材の第１の表面を平面とし、これらの表面の間にガスケットを配置してキャビティの深さを決定することもできる。この実施形態では、第１のプレート部材の表面と第２のプレート部材の表面との間の接触が直接の接触ではなくガスケットを介した接触となる。
【００１２】
ガスケットは、チャネルが形成されたプレート部材の第１の表面に恒久的に取り付けてもよい。あるいはガスケットを、もう一方のプレート部材の第１の表面に恒久的に取り付けることもできる。
【００１３】
チャネルが形成されたプレート部材を平らな第１の表面を有するように形成し、もう一方のプレート部材の第１の表面を、キャビティの深さを決定する凹部を提供する表面レリーフを有するように形成することもできる。あるいは両方のプレート部材の表面特徴の組合せによってキャビティを形成することもできる。
【００１４】
キャビティの深さは最大５００μｍ、例えば１０から２００μｍであることが好ましく、５０から１５０μｍ、例えば約１００μｍであることがより好ましい。
【００１５】
保持手段は、一方の前記プレート部材を支持する底部と、もう一方の前記プレート部材を担持したキャリッジであって、２つの前記プレート部材が分離されたローディング位置と、前記第１のプレート部材と前記第２のプレート部材が重なり合って前記キャビティを形成する操作位置との間を移動可能なキャリッジと、前記操作位置にあるときに、前記第１のプレート部材と前記第２のプレート部材を弾力によって相互に押しつけて前記キャビティを密封する手段とを備えていてもよい。
【００１６】
プレート部材をローディング位置から操作位置に移動させる底部の方向へのキャリッジの動きは、ちょうつがい式またはピボット式の動きとすることができ、あるいは、２つのプレート部材のそれぞれの第１の表面が平行に保たれるスライド式の動きとすることもできる。
【００１７】
移動させるのは、チャネルが形成されたプレート部材でも、またはもう一方のプレート部材でもよい。
【００１８】
都合のよい様式としては、一方の前記プレート部材が顕微鏡スライドであり、前記フローチャネルがもう一方の前記プレート部材に形成されることが好ましい。顕微鏡スライドは平面とし、あるいは顕微鏡スライドを、キャビティの深さを決定する表面の凹部またはウェルを有するように形成してもよい。
【００１９】
先に指摘したとおり、フローチャネルが形成されたプレート部材は、少なくとも３つの前記入口フローチャネルおよび少なくとも１つの前記出口フローチャネルを提供し、これらのチャネルが全て分析視野と連絡して、流体力学的に集束した第１の方向の流れを前記視野の上に供給する。少なくとも３つの前記入口フローチャネルおよび少なくとも１つの前記出口フローチャネルが全て分析視野と連絡して、前記第１の方向と交差する第２の方向の流体力学的に集束した流れを前記視野の上に供給することが好ましい。この目的のため、少なくとも１つの入口フローチャネルを共用し、それぞれの２つの指定された方向の流れを供給するために使用してもよい。
【００２０】
例えば、３つのコーナー、および前記３つのコーナー間の２辺の各々の中央に入口フローチャネルを有し、第４のコーナーに出口チャネルが形成された長方形の分析視野が考えられる。出口チャネルに隣接したコーナーの２つの入口チャネルは各々、流れ方向の１つについて出口チャネルとして二重になる。
【００２１】
この種のチャネル配置および他のチャネル配置がＰＣＴ／ＥＰ００／０２５７８に示されており、そこに示されているほぼ全ての配置を本発明に従って使用することができる。
【００２２】
本発明は、液体と固体表面に固定された材料との間の空間的に導かれた相互作用を誘導する方法を含む。この方法は、第１のプレート部材と第２のプレート部材を重なり合うように組み立ててアセンブリを形成する前に、これまでに説明したフローセルアセンブリのキャビティの分析視野の中に前記材料を固定すること、前記アセンブリを形成すること、および誘導液体の緩衝流を側面に有する前記液体の流体力学的に集束した流れを、前記分析視野の所望のストリップの上を前記液体が流れるように、アセンブリのそれぞれの前記入口フローチャネルを通してアセンブリの前記出口フローチャネルから外へ流すことを含む。
【００２３】
続いて、同じ液体または別の液体を、最初の前記ストリップと概ね同じ方向に延びる分析視野の他の所望のストリップの上を流れるように誘導してもよい。
【００２４】
本明細書で言う緩衝流は、誘導された液体流を機械的に緩衝する働きをするものであって、化学的な緩衝液であることも、またはそうでないこともある。
【００２５】
しかし、キャビティが横方向の流れの向きを生じさせるフローチャネルを提供する場合には、この方法は、液体を第１の方向に、続いて第２の方向に通過させて、固定された材料と相互作用させることを含んでいてもよい。
【００２６】
固定された材料は細胞を含んでいてもよく、この細胞は生きた細胞または固定組織であってもよい。しかし、全体として、ＷＯ００／５６４４４に記載された任意の目的を本明細書に記載の方法の対象としてもよい。固定される材料は、オリゴヌクレオチド、タンパク質、化学ライブラリの一般的な化合物、抗体または他の特異的な捕獲試薬であってもよい。
【００２７】
本発明は、以上のような方法で使用する装置を含む。この装置は、これまでに説明したフローセルアセンブリと、任意選択でＣＣＤカメラなどの画像記録装置を装備した顕微鏡などの、相互作用を観察しまたは検出するための手段とを備える。検出手段は、光電子増倍管などの蛍光または放射性発光を検出するための手段を含んでいてもよい。他の装置を含んでもよい。
【００２８】
本発明はさらに、検体をスクリーニングして細胞に対するその生物活性を判定する方法を提供する。この実施形態ではこの方法が、まず最初に固体表面に細胞を固定し、続いて、固体表面上に固定された細胞の上に流体力学的に集束した流れを供給するように適合されたハウジングの中に固体表面を置くことを含む。その後、検体を含む流体力学的に集束した流体流を発生させ細胞の上に導き、それによって検体が細胞と接触するようにする。次いで、細胞に対する検体の生物活性の指標として、細胞の変化または細胞によって引き起こされた変化を検出する。
【００２９】
さらに本発明は、細胞を検体に選択的に暴露する方法を提供する。この実施形態ではこの方法が、固体表面に細胞を固定すること、流体力学的に集束した流れを固定された細胞の上に供給するように適合されたハウジングの中に固体表面を置くこと、および検体を含む流体力学的に集束した流体流を固定された細胞の上に発生させ、それによって検体が細胞と接触するようにすることを含む。
【００３０】
次に、添付図面に示した好ましい実施形態を参照して本発明をより詳細に説明する。
【００３１】
多数の試料を並行して試験することを含むさまざまな検定および調査手順はかつて、検定位置がウェルのアレイによって提供されるマイクロタイタープレートを使用して実施された。最近、このようなシステムを小型化して、固体表面上の小型化されたアレイの中にそれぞれの検定位置が提供されるようにすることが提案された。多数の回路構成要素がその上に形成された半導体チップに似ていることから当技術分野ではこのような装置を、固体表面の形成に使用される材料の種類にかかわらず「チップ」と呼んでいる。この命名法に従って、後に詳細に説明するそれぞれの実施形態の、フローチャネルがその中に形成されたプレート部材を「オープンフェイスチップ（ｏｐｅｎ−ｆａｃｅｄ　ｃｈｉｐ）」（ＯＦＣ）と呼ぶことにする。後に説明するそれぞれの実施形態ではこのＯＦＣが再使用可能な構成要素であり、フローセルアセンブリのもう１つのプレート部材が使い捨て式の構成要素である。
【００３２】
図１に示すように、本発明に基づくフローセルアセンブリは、一対のばねアーム４上に支持された第１のプレート部材またはＯＦＣ２を備える。ＯＦＣは薄い正方形のプレートであり、ばねアーム４はそれぞれ、このプレートの対向する一対の辺のほぼ中間に取り付けられている。この接続では、一対のばねアーム４間に形成された軸を中心にＯＦＣ２が回転することができ、かつＯＦＣの表面に対して直角の方向にＯＦＣ２が、ばねアーム４の制御下で移動することができる。
【００３３】
ばねアーム４は、それぞれのピボットアーム６に取り付けられている。ピボットアーム６は、互いに平行を保ったまま、ブロック１０の中に形成されたピボット軸８を中心に回転するように拘束されている。ブロック１０の上面は、アセンブリの第２のプレート部材を構成する顕微鏡スライド１４を受け取る底部１２を提供する。直立した壁１６を境界とする浅いウェルが底部１２を形成し、顕微鏡スライド１４の周囲には位置調整用の小さなすき間１８が残されている。ピボットアーム６によって構成されたキャリッジを下方へ抑えつけるために２０に概略的に示すロック機構が提供されており、これによってＯＦＣ２は、ばねアーム４によって顕微鏡スライド１４の表面に押しつけられる。図２に示すようにブロック１０の側面には、調整や取外しのときに顕微鏡スライド１４の縁に触れやすいよう指溝２２がある。
【００３４】
図３および図４に示す代替配置では、ばねアーム４の代わりに、コイルばね２６を介してピボットアーム６に接続されたアーム２４が使用されている。アーム６の中にばね２６を収容するためにウェル２８がある。それぞれのウェル２８の壁の外側の部分は内側の部分よりも高くなっており、そのため図４に示すように、弛緩した位置にあるアーム４は顕微鏡スライド１４の方へ向かって下方へいくぶん傾き、アーム６が操作位置まで押し下げられ機構２０によってロックされると、アーム２４の内側の端はコイルばねの力に逆らって上方向へ偏向する。
【００３５】
操作位置では、顕微鏡スライド１４およびその上に置かれた試料に対するＯＦＣ２の位置を調整するため、アーム２４の位置を、図面の平面内で横方向に、または図面の平面から離れる方向にある程度移動させることができる。
【００３６】
図５に、ＯＦＣ２を担持するキャリッジの動きがピボット式ではなくスライド式である代替実施形態を示す。一対のアーム３０がブロック１０のそれぞれの側面に沿って下に延び、ブロック１０の側面に設けられた溝３２の中でスライドする。一対のアーム３０間には、ＯＦＣ２の対向する辺にピボット式に接続された一対の板ばね部材３２によって橋が形成されている。
【００３７】
それぞれの板ばねはＬ字形の断面を有し、それぞれのスライドアーム３０に小ねじ３４で固定されている。ブロック１０の表面に支持された顕微鏡スライド１４の上にＯＦＣをロックするために、偏心カム／ピン型の機構３６が提供されている。
【００３８】
これまでに説明した実施形態で示したように一対のばねの間でＯＦＣを回転させるのは、ＯＦＣの表面を横断して適用される圧力を均等にするためである。
【００３９】
残りの図に、ＯＦＣ自体の構造を詳細に示す。これらの実施形態では、ＯＦＣと顕微鏡スライドの間にキャビティが形成される。キャビティ自体は、顕微鏡スライドの上面またはＯＦＣの下面、あるいはその両方の表面特徴によって作り出すことができ、あるいはＯＦＣと顕微鏡スライドの間にガスケットの形態の第３の構成要素を配置してキャビティを作り出すこともできる。ＯＦＣは一般にガラスから、またはより好ましくは透明なプラスチックから製作することができ、あるいは後に説明するようにこれらの両方を組み合わせて製作することもできる。ＯＦＣと顕微鏡スライドの間の十分な密封は、ガスケットの使用によって、または単にこれらの構成要素の平面を十分に平らにすることによって得ることができる。以下では、ガスケットの形状、ガスケットの有無、ガラスインサートを有するプラスチックＯＦＣの使用、成形中にフローチャネルを作り出すためのリブまたはコアの使用、ＯＦＣまたは顕微鏡スライドに必要なキャビティを形成するための表面の凹部の提供などのさまざまな構造上の特徴を、さまざまな好ましい実施形態について説明する。ただしこれらの特徴は一般に、さまざまな多くの組合せで使用することができることを理解されたい。
【００４０】
図７に示すとおりＯＦＣは中央開口を有するプラスチックフレーム４０を備える。この中央開口に、超音波溶接、接着または他の液密接続によって密封されたガラス窓４２が押圧嵌合されている。フレーム４０の対向する側縁には、先に説明した支持ばねに接続するための穴４４がある。ガラス窓４２の縁から内側へチャネル４６、４８、５０、５２が延びており、これらのチャネルはその内側端のところで、ガラス窓の下面に浅い長方形のウェルを提供する正方形の表面レリーフ５４の領域に開いている。チューブ５６への接続を容易にするためにチャネル４６から５２の外側端は徐々に広がっている。チューブ５６は、プラスチックフレーム４０の中の断面が円形のチャネル５８の中を通ってガラス窓に達している。操作位置で使用する際には図８に示すように、ＯＦＣが、顕微鏡スライド１４と面−面接触するように置かれ、その結果、顕微鏡スライド１４上の分析視野全体を覆うキャビティが、ガラス窓４２の表面レリーフ５４によって生み出される。チャネル４６および５０によって緩衝流の入口が提供され、入口４８によって被誘導流の入口が提供され、チャネル５２によって共通の出口が提供される。入口４６および５０を通して導入される緩衝流の相対的な重みに従って、入口４８から出口５２へ誘導される液体流をＰＣＴ／ＥＰ００／０２５７８に詳細に記載されているように、分析視野を横切る数本の細いストリップのうちの所望の任意の１本のストリップの上に導いてもよい。
【００４１】
図９に示すように、キャビティの深さをガスケット６０によって形成することもできる。ガスケット６０は中央開口６２を有し、ＯＦＣ２と顕微鏡スライド１４の間に配置され、このどちらかと恒久的に一体化することができる。この実施形態ではＯＦＣのプラスチックフレーム４０の中に、このプラスチックフレームの下面に開いたチャネル６４が成形されている（図１０）。この溝には、必要な液体接続を達成するためにチューブ６６が受け取られ、プラスチックフレームの下面は接着剤６８で平らにされる。この装置で調査する細胞は顕微鏡スライド１４上の７０に置かれている。
【００４２】
上で説明した構造の利点は、バイパスの問題を回避し、ガラスインサートとプラスチックハウジングの両方を密封するために１つのシールが液体チャネルを分離するその連続性である。他の利点は、ガラス構造の深さが１通りだけでよいことである。しかしガスケットを使用すると、測定チャンバの深さの精度が不足し、チャンバの壁がいくぶん不規則になる場合がある。ガラスインサートとプラスチックハウジングの間の接続が数百ｋＰａの流体に対して不透過性であることが求められる場合もある。しかしこれは、組み立てた後にこれらの部品を、プラスチックハウジングの超音波変形を使用して一緒にプレスすることによって、または接着剤によって、あるいは液密アセンブリを形成する他の技法によって達成することができる。組み立てられたユニットの平坦さは、ＯＦＣの下面のラッピングおよび研磨によって高めることができる。
【００４３】
開いた溝を使用してチューブを受け取るチャネルを形成すると、成形操作のためこのツールにリブを使用することが可能になり、かつ、例えば直径約０．４ｍｍにもなる可能性があるコアを使用する必要性が回避され、これによってツールのロバストネスが向上する。
【００４４】
図１１に示した代替実施形態ではキャビティの高さが、ガスケットによってではなしにガラスインサートのエッチング深さによって形成される。ガスケット７２も使用されるが、それはプラスチックフレーム４０の環状部分７４の外側にあり、ガスケットの厚さをキャビティの高さと一致させる必要はない。キャビティ内のさまざまなチューブ接続を分離するガスケットがないので、スライドと接触する領域のフレームの部分７４およびガラスインサートの平坦度は精密に制御されなければならない。しかし液体チャネル間の圧力差はほとんどない。キャビティと周囲との間の圧力差のほうがはるかに大きく、これはガスケット７２によって処理される。
【００４５】
チューブ６６を受け取る図１１のチャネルは、その一部分がフレーム４０の底面の開いた溝として形成され、フレームの環状部分７４を通過する部分が管状成形物として形成されており、これが図１２および１３に示されている。
【００４６】
顕微鏡、光電子増倍管などの検出手段がＤに示されている。
【００４７】
図１４から１６に、顕微鏡スライド１４に形成されたウェル８０によってキャビティの深さが生み出される他の変形形態を示す。プラスチックフレーム４０の溝８４の中にＯリング８２が配置されている。ウェル８０を使用すると、試料を置く必要がある顕微鏡スライド上の位置が使用者にとって明白となるが、液体チャネルとキャビティとを適切に位置合せするためにＯＦＣと顕微鏡スライドとを正確に位置合せする必要があるという対応する欠点もある。
【００４８】
図１５および１６に、フレーム４０がチューブ６６を受け取る２つの代替配置を示す。図１５ではフレームが、チューブ６６が受け入れられる開いた溝を有するように成形されており、フレームの下面が先に説明したように接着剤で平らにされている。図１６ではフレームが、チューブ６６を受け取る孔を有するように成形されている。原理的にはこのほうが好ましいが、チューブ６６の底部とフレーム４０の下面との間の余裕が小さいことを考えると精度の高い成形が必要となる。
【００４９】
図１７に示した実施形態ではこの後者の問題が回避されている。この実施形態では、チューブ６６がキャビティからだいぶ上のほうへ移動しており、キャビティが、ガラス窓インサートを含まないプラスチック製のワンピースＯＦＣによって形成されている。顕微鏡スライド表面に対する密封はＯリング８２によって達成されている。キャビティの高さは、ＯＦＣの下面に成形された凹部８０の深さによって形成される。この実施形態は、ガラス窓を使用する他の実施形態と同じ測定チャンバの圧力および温度要求には応えることができず、さらに、ＯＦＣの厚さが厚くなることから試料と測定機器との間の距離も大きくなる。この構造は一般に、測定機器と試料の間の距離が０．８ｍｍよりも大きくてもよい場合に適当である。このようなワンピースＯＦＣに適した材料は例えば、優れた光学特性を有するＰＭＭＡ（ポリメタクリル酸メチル）である。他の適当な材料には、ＳＡＮ（ポリ（スチレン−ｃｏ−アクリロニトリル）、ＰＳ（ポリスチレン）、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ＰＣ（ポリカーボネート）などがある。
【００５０】
他の実施形態のフレーム４０に対しても同様の材料を使用することができるが、その場合には、使用する材料が透明である必要はなく、その代わりに耐熱性など他の特性に基づいて選択してもよい。
【００５１】
記載の装置内の液体の流れは、ポンプを使用して液体をフローチャネルに沿って押し出しまたは吸引することを含む多くの方法で生じさせることができる。ＷＯ００／５６４４４に記載されているように電気泳動法および電気浸透法を使用することもできる。
【００５２】
過去の提案と比べると、以上に説明した実施形態はさまざまな利点を提供する。装置に必要な複雑な複数のマイクロフルーディック（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ）構造が、使い捨てではない再使用可能な構造として統合される。これは、１回の装置使用にかかるコストを引き下げるのに貢献する。
【００５３】
装置の消耗部品（顕微鏡スライド）は単純かつ安価であり、これを、このタイプの装置で使用する標準様式として確立することができる。装置を使用するたびに複雑な毛管取付け手順を事前に実施する必要がない。これは毛管が本質的に恒久的に取り付けられているためである。試料を受け取るこの構成部品の開いた面は、オリゴヌクレオチドアレイなどの試薬パターンまたは研究用の生物細胞の配置を比較的に簡単かつ安価にする。組織全体の切片を試料領域に置くことができる。試薬のアレイを配置する場合には、当技術分野で周知の「スポッティング」技法など、オリゴヌクレオチドアレイなどのアレイを配置する周知の技法を使用して実施することができる。
【００５４】
本明細書に記載のフローセルアセンブリを、細胞ベースの検定とともに使用するように適合させることができる。細胞ベースの検定とは、細胞、特に生きた細胞に対する検体の影響を判定する重要な手段のことを表す。例えば、本発明の方法では、無傷の生きた細胞に対して潜在的な新薬を検定することができ、それによって、死んだ細胞を組み込んだ従来の検定およびアフィニティ検定などの分子検定に比べて改良された薬力学的および薬物動態学的モデル化を提供する。
【００５５】
本発明はさらに、選択した検体に関して細胞をスクリーニングする方法、ならびに細胞を検体に選択的に暴露する方法を提供する。これらの方法はともに、ａ）固体表面に細胞を固定すること、ｂ）流体力学的に集束した流れを固定された細胞の上に供給するように適合されたハウジングの中に、固体表面を置くこと、およびｃ）検体を含む流体力学的に集束した流体流を固定された細胞の上に発生させ、それによって検体が細胞と接触するようにすることを含む。細胞をスクリーニングする方法はさらに、細胞に対する検体の生物活性の指標として、細胞の変化、例えば細胞の形態の変化、あるいは細胞によって引き起こされた変化、例えばタンパク質の発現の如何を判定することを含む。
【００５６】
流体力学的に集束した流れは、検体を含む流体流の方向を決定することの他に、細胞の生存力を持続させるための培地を含むことが好ましい。ただし培地は、細胞が生き続けることを保証するものではないことに留意されたい。とはいえ生きた細胞のほうが好ましい。したがって例えば、有毒な検体がない場合に、生きた細胞を生存可能な状態に保つ培地を使用してもよい。例えば毒性調査の際に有毒な検体をフローセルに導入する場合には、培地の存在にもかかわらず細胞死が起こる可能性がある。
【００５７】
それぞれの特定の細胞に対して適当な培地は当業者に周知であり、それらは例えばミズーリ州Ｓｔ．ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ社から市販されている。このような培地は一般に、塩類、アミノ酸、ビタミン、栄養素および細胞の健康を維持するのに必要な他の物質の混合物を含む。培地に含めることができる好ましい塩類には、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、ＭｇＣｌ２およびこれらの組合せが含まれる。ただしこれらに限定されるわけではない。好ましいアミノ酸は天然のＬアミノ酸、特にアルギニン、システイン、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンおよびこれらの組合せである。細胞培養で好ましいビタミンには例えば、ビオチン、コリン、葉酸塩、ニコチンアミド、パントテン酸塩、ピリドキサル、チアミン、リボフラビンおよびこれらの組合せが含まれる。グルコースおよび／または血清、例えばウマ血清または仔ウシ血清も培地の好ましい構成要素である。細菌の成長を抑えるために、任意選択で、ペニシリン、ストレプトマイシンなどの抗生物質を添加することもできる。培地は、特定の細胞タイプに特異的な１種または数種のタンパク質成長因子を含むことが好ましい。例えば多くの神経細胞は、それらの生存力を維持するために極微量の神経発育因子（ＮＧＦ）を必要とする。同様に、検定に肝細胞が含まれるときには培地が肝細胞成長因子（ＨＧＦ）を含むことが好ましい。所与のタイプの細胞に対して適当な培地の決定に際して当業者は、これらの因子および他の因子をごく普通に検討する。培地は、一方または両方の誘導流の中に含まれてもよく、さらに任意選択で、検体を含む流体流に含まれてもよい。
【００５８】
本発明の方法では、真核細胞と原核細胞の両方を含むほぼ全てのタイプの細胞を使用することができる。ただし細胞は、哺乳動物、例えばヒトから得た一次細胞であることが好ましい。好ましい細胞タイプは、血球、幹細胞、内皮細胞、骨細胞、肝細胞、平滑筋細胞、横紋筋細胞、心筋細胞、胃腸細胞、神経細胞および癌細胞からなるグループから選択される。
【００５９】
検定に使用する固体表面は、細胞を容易に固定できるかどうかに基づいて選択する。このような固体表面には例えば、コラーゲンから誘導された表面、デキストラン、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、アルギン酸塩、寒天およびこれらの組合せが含まれる。この基板は、全体を上記の材料から構成し、または適当な方法で部分的または完全にコーティングした別の材料から構成してもよい。適当な材料を用いて部分的にコーティングする固体表面は、あるパターン、例えばレーン、千鳥格子、斑点などのパターンにコーティングして、固体表面の特定の位置に細胞を空間的に配置できるようにしてもよい。
【００６０】
細胞は、当業者に周知の従来の技法を使用して固体表面に固定してもよい。例えば、単に固体表面を細胞と接触させることによって固定してもよい。任意選択で遠心機を使用することもできる。固体表面に細胞を固定するのに必要な力は一般に約２００×ｇから約５００×ｇである。また、問題の細胞を含む組織試料の固定化は、まず最初に比較的に大きな組織切片を例えば約−１５℃〜約−２０℃で凍結させることによって実施してもよい。その後、ナイフ、ミクロトームまたは同種の切断装置を使用して凍結した組織を複数の切片にスライスする。次に１枚の組織切片を固体表面、例えばガラススライドの上に置き、この切片を固体表面で「融解」させ、これによって組織中の細胞を固体表面に固定する。当業者ならば、同様に使用可能な他の固定化技法を認識するであろう。
【００６１】
問題の細胞または問題の細胞を含む組織を固定した後、検体を含む流体力学的に集束した流体流を発生させる。流体力学的に集束した流れは先に説明したとおりに発生させる。すなわち、その両側に位置する入口からの流量を制御し、これによって検体を含む中央の流れを集束させる「誘導流」を生じさせることによって流体力学的に集束した流れを発生させる。このようにして検体を関心の１つまたは複数の細胞と接触させる。
【００６２】
先に述べたとおり、本発明の方法は、特定のタイプの細胞に対する検体の生物活性をスクリーニングする方法を提供する。検体の生物活性は、細胞の変化、例えば細胞の形状の変化、あるいは細胞によって引き起こされた変化、例えばタンパク質の発現の如何を判定することによって検出してもよい。一般に、このような変化を観察しまたは検出する手段が使用される。このような手段には例えば、顕微鏡、クロマトグラフィ法、イムノアッセイ、蛍光検出器、放射能検出器の使用、およびこれらの組合せが含まれる。
【００６３】
理解されることだが、異なる検定は異なるタイプの生物活性の検出を必要とする。いくつかのケースでは、細胞を直接に観察することによって検体の特定の生物活性を決定してもよい。例えば、検体の毒性検定は例えば細胞死の検出を含む。検体の有糸分裂活性を調べる検定では新しい細胞の存在を検出する。他のいくつかの検定では、細胞によって引き起こされた変化を検出することが好ましい。例えば、検体に応答して細胞が排出した物質を検出するために流出した材料を検定することによって、生物活性を判定してもよい。
【００６４】
このように、本明細書に記載の細胞ベースの検定は、検体、例えば薬剤または薬剤候補物質を、いくつかの生物活性に関してスクリーニングするのに有用である。スクリーニングすることができる生物活性の例には、細胞分化、運動（ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎ）、毒性、アポトーシス、付着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）、シグナル分子のトランスロケーション、タンパク質発現および腫瘍化変換が含まれる。ただしこれらに限定されるわけではない。さらに本発明の方法は、検体の吸着、分布、代謝および／または排出特性のスクリーニングを可能にする。
【００６５】
本発明をその好ましい特定の実施形態に関して説明してきたが、以上の説明および以下の実施例は本発明の範囲を例示しようとするものであって、本発明の範囲を限定しようとするものではないことを理解されたい。本発明が属する技術分野の熟練者には、本発明の範囲に含まれるその他の態様、利点および変更が明白であろう。
【００６６】
本明細書に記載した全ての特許、特許出願および公告はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６７】
（実験）
以下の実施例では、使用する数値（例えば量、温度など）に関して正確さが保証されるよう努めたが、いくらかの実験誤差および偏差は考慮されなければならない。特に指摘しない限り温度の単位は℃、圧力は海面気圧またはほぼ海面気圧である。特に指摘しない限り試薬は全て市販のものを使用した。
【００６８】
実施例１
哺乳動物の生きた皮膚の組織の小さな試料を約−１５℃で凍結させ、この凍結した組織をミクロトームを使用してスライスする。その後、１枚の凍結組織切片をガラス製の顕微鏡スライドの上に置く。このように準備したスライドを直ちに、流体力学的に集束した流れを供給するのに適したハウジングの中に置き、哺乳動物の細胞を維持するのに適した培地の流れを発生させる。簡単には培地は次のものを含む：それぞれ約０．１から約０．２ｍＭの全ての天然Ｌアミノ酸；約１μＭのビタミン、例えばビオチン、コリン、葉酸塩、ニコチンアミド、パントテン酸塩、ピリドキサル、チアミンおよびリボフラビン；塩類、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２；グルコース；および全体積の約１０パーセントを構成する量の全血清、例えばウマ血清または仔ウシ血清。培地のｐＨは約７．４であり、培地は約３７℃に維持する。
【００６９】
培地を含む流れをチャンバ内に確立した後、両側に２つの誘導流が流れている単一の流れの中に検体を導入する。次いでこの２つの誘導流を制御して、流体力学的に集束した流れが供給されるようにする。例えば、検体を含む流れの左側の誘導流の流量を増大させると、検体を含む流れは右側へ導かれる。誘導流を変更することによって、検体を含む流れをスライドの事実上すべての部分に到達させることができる。このようにして検体を含む流体を流体力学的に集束させ、検体が上皮細胞と接触するようにする。
【００７０】
この実験の検体は、局所的な抗真菌活性を示すことが以前に示されている薬剤候補物質である。１週間のあいだ検体と接触させた後に上皮細胞を顕微鏡で観察する。上皮細胞は健康であることが認められる。提案の局所抗真菌薬候補物質は上皮細胞に損傷を与えないと結論される。
【００７１】
実施例２
哺乳動物の肝臓から得た肝細胞を使用し、肝細胞に適した培地を使用し、高血圧症の治療で使用される薬剤を検体として、実施例１を実施する。この検定は、薬剤の代謝を試験するために実施する。チャンバからの全流出物を集め、これを、高速液体クロマトグラフィ／質量分析技法を使用して検定する。元々の薬剤に対応する１つのピークとグルクロニド抱合体に対応するもう１つのピークの２つのピークが観察される。この抗高血圧症薬は肝細胞によって代謝されると結論される。
【００７２】
実施例３
哺乳動物の膵臓から得たβ細胞を使用し、膵細胞に適した培地を使用し、インスリン産生活性を有すると考えられている薬剤候補物質を検体として、実施例１を実施する。この検定は、この薬剤候補物質が膵臓のβ細胞のインスリン産生を刺激することができるかどうかを試験するために実施する。チャンバからの全流出物を集め、これを、高速液体クロマトグラフィ／質量分析技法を使用して検定する。流出物の中にインスリンが検出される。この薬剤候補物質は、膵臓のβ細胞からのインスリンの排出を刺激すると結論される。
【００７３】
実施例４
哺乳動物から得た内皮細胞を使用し、内皮細胞に適した培地を使用し、新規の合成ヌクレオチドを検体として、実施例１を実施する。ヌクレオチドは、検体流に導入する前に放射性同位元素３２Ｐを使用して標識しておく。この検定は、このヌクレオチドが内皮細胞のＤＮＡに組み込まれるどうかを試験するために実施する。放射能検出器を使用して、ヌクレオチドが細胞に組み込まれたかどうかを判定する。細胞内で放射能が検出される。放射性信号の位置を決定するために追加実験を実施する。信号は核から発せられる。この新規の合成ヌクレオチドは内皮細胞のＤＮＡに組み込まれると結論される。
【００７４】
図面を参照して以上に説明した実施形態には、本発明の範囲に含まれる多くの変形および変更を加えることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
第１の実施形態に基づくフローセルアセンブリの側面図である。
【図２】
図１の線Ａ−Ａで切った断面図である。
【図３】
ローディング位置にある諸構成要素を示す好ましい第２の実施形態の断面図である。
【図４】
操作位置にある諸構成要素を示す、図３と同様の断面図である。
【図５】
他の好ましい実施形態を示す、図１と同様の側面図である。
【図６】
図５の実施形態の中央の領域の平面図である。
【図７】
上記の任意の実施形態で使用される第１のプレート部材を下から見た図である。
【図８】
図７の実施形態の側面図である。
【図９】
本発明に基づくフローセルアセンブリの例示的な一実施形態のキャビティの側断面図である。
【図１０】
図９を矢印「Ｂ」の方向へ見た図である。
【図１１】
本発明のフローセルアセンブリの好ましい代替実施形態の側断面図である。
【図１２】
図１１の実施形態を矢印「Ｃ」の方向へ見た側面図である。
【図１３】
図１１の線Ｄ−Ｄで切った断面図である。
【図１４】
本発明のフローセルアセンブリの例示的な他の実施形態の側断面図である。
【図１５】
図１４の線Ｅ−Ｅで切った断面図である。
【図１６】
図１４の実施形態の変更を示す、図１４の線Ｅ−Ｅで切った断面図である。
【図１７】
本発明の他の実施形態のキャビティの側断面図である。
【国際公開パンフレット】
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2004502933.tif 000004
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2004502933.tif 000044
2004502933.tif 000045
【国際調査報告】
2004502933.tif 000046
2004502933.tif 000047
2004502933.tif 000048