(57)【要約】この発明は、プロテインキナーゼAアンカー蛋白をコードする核酸配列、融合蛋白における該核酸配列の使用、プロテインキナーゼAアンカー蛋白とプロテインキナーゼAの調節サブユニットとの相互作用、および細胞透過性物質を識別する方法に関する。
2006515743.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)配列番号1のヌクレオチド配列を含む核酸分子、
b)a)のヌクレオチド配列と機能的に類似となるのに十分な相同性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子、
c)遺伝暗号の結果としてa)またはb)のヌクレオチド配列に縮重する核酸分子、および
d)欠失、付加、置換、転位、反転および/または挿入によって改変されており、かつa)からc)までのヌクレオチド配列と機能的に類似している、a)〜c)のヌクレオチド配列に対応する核酸分子
を含む群から選択される単離核酸分子。
【請求項２】
b)に記載のヌクレオチド配列が、a)に記載のヌクレオチド配列の1つと少なくとも80%、好ましくは90%の相同性を有することを特徴とする、請求項1に記載の核酸分子。
【請求項３】
ゲノムDNA、cDNAおよび/またはRNAであることを特徴とする、請求項1または2に記載の核酸分子。
【請求項４】
請求項1から3のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項５】
請求項4に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
請求項1から3のいずれか一項に記載の核酸分子によりコードされるポリペプチド。
【請求項７】
請求項1から3の一項いずれかに記載の核酸分子、請求項4に記載のベクター、請求項5に記載の宿主細胞および/または請求項6に記載のポリペプチドに対する認識分子。
【請求項８】
抗体、抗体断片および/またはアンチセンス構築物、特にRNA干渉分子であることを特徴とする、請求項7に記載の認識分子。
【請求項９】
請求項1から3のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項4に記載のベクター、請求項5に記載の宿主細胞、請求項6に記載のポリペプチド、および/または請求項7もしくは8に記載の認識分子を、場合により製薬的に許容可能な担体と共に含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１０】
場合により製薬的に許容可能な担体と共に含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項4に記載のベクター、請求項5に記載の宿主細胞、請求項6に記載のポリペプチド、および/または請求項7もしくは8に記載の認識分子、ならびに/あるいは請求項9に記載の医薬組成物を含むことを特徴とする、キット。
【請求項１１】
a)(i)請求項1〜3のいずれか一項に記載の核酸分子および第1のマーカーを含む第1のベクター、ならびに(ii)プロテインキナーゼの調節サブユニットをコードする第2の核酸分子および第2のマーカーを含む第2のベクターを用意するステップ、
b)第1および第2のマーカーを細胞中に導入し、該細胞をトランスフェクションするステップ、
c)蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の測定を実施し、AKAP-PKA相互作用を検出するステップ、
を含む、AKAP-PKA相互作用の検出方法。
【請求項１２】
AKAPと、RIIα、RIIβ、RIαおよび/またはRIβとの相互作用を検出することを特徴とする、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
調査すべき阻害剤を添加しておよび添加せずに前記方法を実施し、これによって該AKAPおよび/またはPKAの阻害剤について指示を得るような仕方で、KAPおよび/またはPKAの阻害剤を識別することを特徴とする、請求項11または12に記載の方法。
【請求項１４】
調査すべき膜透過性分子と膜透過性AKAP-PKA阻害剤との複合体を生成し、該複合体または該分子を用いておよび用いないでAKAP-PKA相互作用を検出するような仕方で、膜透過性分子を識別することを特徴とする、請求項11から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項1から3のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項4に記載のベクター、請求項5に記載の宿主細胞、請求項6に記載のポリペプチド、請求項7もしくは9に記載の認識分子、請求項9に記載の医薬組成物、請求項10に記載のキット、および/または、請求項11から14のいずれか一項に記載の方法の、AKAP-PKA相互作用の検出またはAKAPおよび/もしくはPKAの阻害剤の検出ならびに/あるいは膜透過性ペプチドの検出のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテインキナーゼAアンカー蛋白をコードする核酸配列、融合蛋白における該核酸配列の使用、およびプロテインキナーゼAアンカー蛋白のプロテインキナーゼAの調節サブユニットとの相互作用の決定方法、ならびに細胞透過性物質の識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホルモンおよび神経伝達物質の生物学的活性は、エフェクター蛋白のリン酸化状態を改変するシグナルカスケードの活性化により媒介される。この可逆的過程には2種の酵素、プロテインキナーゼおよびホスホプロテインホスファターゼが関与している。リン酸化は、ATPの末端リン酸基の特定のセリンまたはスレオニン残基への転移を触媒するキナーゼを介して起こり、脱リン酸化は、ホスホプロテインホスファターゼによって媒介される。この酵素活性の制御および調節機構の１つは、基質近傍にあるアンカー蛋白との会合を介した該酵素のコンパートメンテーションである。プロテインキナーゼA(PKA)は基質特異性の広い多機能キナーゼの一種であり、いわゆる「プロテインキナーゼAアンカー蛋白」(AKAP)により細胞下の構造体に固定される。
【０００３】
収縮、分泌、物質代謝、遺伝子転写、細胞の増殖および分裂などの多くの本質的な細胞過程において、G蛋白共役型受容体への細胞外シグナルの伝達、G蛋白Gs、アデニルシクラーゼの活性化および第二メッセンジャーの環状アデノシン一リン酸(cAMP)の形成が生じる。cAMPの作用はcAMP依存性PKAにより媒介される。
【０００４】
PKAのサブユニットは、ヒトでは様々な染色体上にある7種の異なる遺伝子によりコードされている。3種の遺伝子は触媒サブユニットCα、Cβ、Cγのアイソフォームをコードし、4種の遺伝子は調節サブユニットRIα、RIβ、RIIαおよびRIIβのアイソフォームをコードしている。
【０００５】
調節サブユニットは様々な発現パターンを示す。RIαおよびRIIαは組織中に普遍的に見られるが、調節サブユニットRIβは主に脳内に見出される。
【０００６】
RIIサブユニットの細胞内コンパートメントとの会合は、AKAPを介して媒介される。このアンカー蛋白は、PKAホロ酵素のI型またはII型調節サブユニット(それぞれRIまたはRII)との相互作用を特徴とする、機能的に関連する一群の分子である。第1のアンカー蛋白は、cAMP-セファロース上でのRサブユニットのアフィニティークロマトグラフィーによる精製で単離される。この会合蛋白は、ニトロセルロース膜上に移した後でさえもRII構造を示した。現AKAP検出法(RIIオーバーレイ)もこの観察に基づいている。それは、一次抗体の代わりに放射標識RIIサブユニットをプローブとして用いる改良型ウェスタンブロットである。
【０００７】
RI-AKAP相互作用の機能的重要性に関しては、あまり知られていない。RIαは主に細胞質ゾル中に認められるが、in vivoでの固定が様々な研究により認められている。その場合、RIIサブユニットの統計的固定に対するRIαサブユニットの動的固定が、細胞にとって決定的に重要と思われる。赤血球および活性化Tリンパ球の形質膜とのRIサブユニットの会合も報告された。I型PKAによるT細胞増殖のcAMP媒介阻害では、該酵素の局在が恐らくAKAPによってやはり決定されると思われる。骨格筋組織中にII型調節サブユニットを発現しないノックアウトマウスでは、RIαサブユニットはカルシウムチャンネル会合性AKAPに結合し、PKAの触媒サブユニットの適正な利用性により正常なcAMP依存チャンネル伝導性を得ている。
【０００８】
in vivoでは更に、細胞内の触媒サブユニットがRIIサブユニットと優先的に会合すること、および遊離触媒サブユニットの量が遊離RIIサブユニットの量より多いとき、I型PKAホロ酵素を形成することが示されている。
【０００９】
PKA固定における特異性は、固定ドメインに反してAKAPの構造中にも配列中にも保存されていない構造モチーフである標的ドメインにより発揮される。このように、AKAPは、細胞内の構造要素に蛋白-蛋白相互作用によって固定されるし、および膜に蛋白-脂質相互作用によって固定化される。
【００１０】
文献には、様々な細胞コンパートメント、例えばセントロソーム、ミトコンドリア、小胞体およびゴルジ体、形質膜および核膜、ならびに小胞と会合する各種AKAPが記載されている。
【００１１】
正確な固定機構は、これまでのところ2、3のAKAPについてしか知られていない。心筋特異的アンカー蛋白は、3個のスペクトリン様反復配列を有する領域を介して心筋細胞の核周辺膜に固定される。AKAP15/18のアイソフォーム2種は、脂質修飾(ミリストイル化およびパルミトイル化)により形質膜に固定される。AKAP79の標的ドメイン中の多塩基性の3領域は、後シナプス内膜における該蛋白の局在化(PSD、後シナプス密度)に関与している。
【００１２】
AKAPは、第一にPKAとの相互作用を介して特徴付けられた。しかし該蛋白のいくつかはまた、シグナル伝達に関与する他の酵素に結合できる。逆反応を触媒する酵素、例えばキナーゼおよびホスファターゼの同時固定によって、足場形成蛋白とも呼ばれるこれらのAKAPは、シグナル複合体全体を特定の基質の近傍に局在化し、それにより細胞外シグナルに対する細胞応答の特異性および調節に寄与することができる。AKAP79は、複数の酵素との相互作用を検出することのできた最初のAKAPであった。この蛋白はプロテインキナーゼA、プロテインキナーゼCおよびプロテインホスファターゼカルシニューリン(PP2B)に結合し、そのとき結合状態の各酵素を阻害する。個々の各酵素の活性化にとって様々なシグナルが不可欠なので、cAMP、カルシウム、リン脂質などの異なる第二メッセンジャーがこの場所に集まることができる。その他の例には、PKAおよびプロテインホスファターゼPP1をペルオキシソームに局在化するAKAP220、およびPKAの他に同様にプロテインホスファターゼPP1を結合するAKAP Yotiaoが挙げられる。AKAP CG-NAPは、PKAおよびプロテインホスファターゼPP1を結合するだけでなく、Rho依存性キナーゼPKN(NGF(神経成長因子)活性化プロテインキナーゼ)およびプロテインホスファターゼPP2Aもまた結合する。
【００１３】
従来技術で、水チャンネルや心臓などの異なる組織に存在するか、または機能が認められていないAKAP18γが知られている。相互作用、例えばPKAとの相互作用を可視化するのに未だ成功していない既知のAKAPもある。相互作用を自ら分析することができずに、特定の結果に基づいて推定されているにちがいないということが刊行物、例えばB.Klussmann等(1999)を通して知られているに過ぎない。
【００１４】
他の蛋白もAKAPと会合することができ、そこで細胞骨格結合性ERMファミリーの一員であるエズリンと、ラジキシンと、AKAPと識別されたモエシンは、上皮細胞の頂端側細胞膜におけるナトリウム-プロトン輸送の調節に関与する蛋白(EBP50/NHERF)に結合する。AKAPは、特定のチャンネルサブユニットの近傍にプロテインキナーゼおよびホスファターゼを局在させることにより、イオンチャンネルの伝導性のモジュレーションを媒介するが、該サブユニットはリン酸化および脱リン酸化により恐らく調節されている。
【００１５】
NMDA受容体の活性は、プロテインホスファターゼPP1も結合するAKAP Yotiaoによりモジュレートされる。結合状態で活性なホスファターゼは、PKAがcAMPにより活性化され、イオンチャンネルまたは結合蛋白をリン酸化し、その結果チャンネル伝導性が急上昇するまで、NMDA受容体のチャンネル伝導性を制限する。更に、PKAとAKAPとの相互作用を阻害するミリストイル化Ht31ペプチドは、ジャーカットT細胞中でのインターロイキン2の転写のcAMP依存性阻害を無効にすること、およびS-Ht31ペプチドは精子の運動性を抑制することを解明することができた。
【００１６】
すい臓のβ細胞およびRINm5F細胞(ラットのクローンβ細胞系)におけるホルモンGLP-1(グルカゴン様ペプチド)媒介インスリン分泌などの必須で複雑な生物学的過程においても、AKAPが関与している。GLP-1によるPKAの活性化でL型カルシウムチャンネルがリン酸化され、分泌顆粒からのインスリンのエキソサイトーシスを促進する。PKA固定のHt31ペプチド仲介阻害で、インスリン分泌の明白な減少が起こる。その際、cAMP産生もPKAの触媒サブユニットの活性も、該ペプチドの影響を受けなかった。更に、野生型AKAP18αを発現しなかった対照細胞と比較して、RINm5F細胞中でのAKAP18αの発現後、インスリン分泌の増加をGLP-1の適用後に検出することができた。
【００１７】
新規な蛋白がAKAPであるという証拠は、これまで共沈法によりもたらされた。そのために、候補蛋白を発現する細胞または組織から免疫沈降を起こすために、該蛋白に対する抗体を作製した。次いで、調節および/または触媒PKAサブユニットの沈殿中の存在を、ウェスタンブロットにより調べた。PKAサブユニットの沈殿中での存在により、候補蛋白がAKAPとしてin vivoで作用していることが支持される。反対に、PKAサブユニットが免疫沈降を起こし、次いでAKAPを沈殿中に検出する証拠ももたらすことができる。
【００１８】
しかし、この実験的評価からAKAP-PKA複合体の細胞内部位またはin vivo状態を推定することはできない。相互作用の時間的かつ空間的な解答を分析することも不可能である。その上、特異的なAKAP阻害剤または活性化剤を識別することは、目下のところ既知の方法では不可能である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
したがって、本発明の目的は、AKAPとPKAとのin vivoでの相互作用を検出し、その相互作用の細胞内局在を推定できる方法に利用でき、更に膜透過性物質、特にペプチドを検出できる方法に利用できる、構造体をコードする新規な核酸配列を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、以下のものを含む群から選択される単離核酸配列を提供することにより、この技術的課題を解決する。
【００２１】
a)配列番号1またはその相補ヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、
b)a)に記載のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、
c)a)またはb)に相当するヌクレオチド配列と類似の機能を有するのに十分な相同性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子、
d)遺伝暗号の結果として、a)〜c)に記載のヌクレオチド配列に縮重する核酸分子、および
e)欠失、付加、置換、転位、反転および/または挿入により改変されおり、かつ、a)からd)に記載のヌクレオチド配列と機能的に類似する、a)〜d)のヌクレオチド配列に対応する核酸分子。
【００２２】
ハイブリダイゼーションの条件は、既知の核酸分子、特に既知のスプライシング変異体をコードするような核酸分子を用いるハイブリダイゼーションを除外するように選択する。
【発明の効果】
【００２３】
AKAP-PKA複合体を細胞内コンパートメントに割り付けることができ、かつ、その文脈中のAKAPという用語を新規なスプライシング変異体と関係づける、AKAPとPKAサブユニットとのin vivoでの相互作用を検出するために、本発明の核酸配列を用いることができることは、驚くべきことであった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明においては、前記核酸配列またはその核酸配列とハイブリダイズする配列との機能的な類似は、コードされた相同構造体が、PKAサブユニットとの相互作用において、in vivo状態および細胞内局在の推定ならびに特異的AKAP阻害剤の識別を可能にする特徴を示すことを意味する。より詳しくは、類似機能とは、コードされた分子が、新規なスプライシング変異体AKAP18δと類似の挙動を示すことを意味する。
【００２５】
この新規なスプライシング変異体を用いて、例えば既知のスプライシング変異体AKAP18γでは解決できなかった課題が解決されうる。既知のAKAP18γと本発明のAKAP18δとの差は、核酸レベルで約20%ある。
【００２６】
プロテインキナーゼAアンカー蛋白AKAPγおよび本発明のAKAP18δは、AKAP18遺伝子の異なるスプライシング変異体である。AKAP18δは、AKAP18γと比較して、エキソンによってコードされるN末端のアミノ酸を27個余分に有している。AKAP18δはアミノ酸353個からなり、AKAP18γはアミノ酸226個からなる。重複配列領域では、両蛋白間に75%の同一性がある。
【００２７】
この差により、既知および新規の該分子間に明白な機能的差異が生じる。したがって、例えばAKAP18δは、AKAP18γとは対照的に、必須機能を推定することができるように水チャンネル含有小胞に位置している。その上、AKAP18γが心臓内に全く発現しないのに対して、AKAPδは、心臓内のCa2+チャンネルに局在し、そこで重要な機能を示している。それに伴い、AKAP18の既知スプライシング変異体と本発明の新規のスプライシング変異体との間には明白な差異がある。新規な該スプライシング変異体は、新規な驚くべき効果を生じる。したがって、例えばAKAP18δを用いると、PKAとの相互作用を特に良好で効果的に可視化することができる。既知のAKAP18γおよび本発明のAKAP18δが構造的に類似しているが、新規な該分子は、本発明の解決手段として既知の該分子より適当である。このような両分子間に生じる構造的差異は、上記の技術課題の解決に重要な特性に本質的に影響しない程小さく、したがって無視し得ることを、当業者であれば、一般的な知識またはある種の開示に基づくことなく容認できよう。しかし反対に、AKAP18δとAKAP18γとの間には、共通の特徴と共に構造的にも機能的にも明白な差異があることも事実である。このことは、例えば、AKAP18δが身体の一定領域、例えば心臓のCa2+チャンネル中に発現するのに対し、既知の該化合物はそこでは発現しないという事実にみることができる。
【００２８】
本発明の有利な更なる実施形態では、核酸分子は、本発明の核酸分子と少なくとも80%、好ましくは90%の相同性を有する。
【００２９】
本発明の好ましい更なる実施形態では、核酸分子はゲノムDNAおよび/またはRNAであり、特に好ましくは核酸分子はcDNAである。
【００３０】
本発明は、少なくとも本発明の核酸分子を含むベクターにも関する。本発明は、更に該ベクターを含む宿主細胞にも関する。特に好ましくは、本発明は、本発明の核酸分子によりコードされるポリペプチドにも関する。このようなポリペプチドは、好ましくはAKAP18の新規なスプライシング変異体(AKAP18δ)である。
【００３１】
本発明は、本発明の核酸分子によりコードされるポリペプチドまたは蛋白にも関する。
【００３２】
本発明は、前記核酸分子、ベクター、宿主細胞および/またはポリペプチドに対する認識分子にも関する。本発明における識別物質は、核酸分子もしくは配列、ベクター、宿主細胞および/またはポリペプチド、あるいはその断片などの前記構造体と相互作用することができる分子、特に該構造体の検出を可能とするように相互作用する分子である。識別物質は、特に、前記の核酸分子またはポリペプチドに結合する特異的な核酸分子、例えばアンチセンス構築物、cDNAまたはmRNA分子、あるいはそれらの断片とし得るが、抗体、蛍光マーカー、標識した炭水化物または脂質であってもよい。認識物質は、蛋白または核酸あるいは抗体ではなく、それらに対する抗体であることも可能である。認識物質は、このような場合、特に二次抗体であってもよい。
【００３３】
本発明の特定の実施形態では、認識物質は、抗体、抗体断片および/またはアンチセンス構築体、特にRNA干渉分子である。
【００３４】
本発明における抗体は、本発明のポリペプチド、特にAKAP18δと特異的に結合する。該抗体は、修飾された抗体であってもよい(例えば、オリゴマー、還元型、酸化型および標識された抗体)。本明細書に用いる抗体という用語は、完全な分子、ならびに該ポリペプチドの特定のエピトープ決定基を結合できるFab、F(ab')2、Fvなどの抗体断片も含む。該断片では、抗原または受容体への抗体の選択的結合能が部分的に保持されており、該断片は以下のように定義される。
【００３５】
(1) Fabは、抗体分子の一価の抗原結合性断片を含み、酵素パパインでの抗体全体の分解により生成し、無傷の軽鎖と重鎖の一部を保持する断片。
【００３６】
(2) 抗体分子のFab'断片は、ペプシンでの抗体全体の処理および後続の還元により得られ、無傷の軽鎖と重鎖の一部を保持する。抗体分子1個につきFab'断片2個が保持されている。
【００３７】
(3) F(ab')2は、後続の還元をせずに、酵素ペプシンでの抗体全体の処理により得られる抗体の断片。F(ab')2は、Fab'断片2個がジスルフィド結合2個で保持されている二量体である。
【００３８】
(4) Fvは、遺伝子工学的に改変された断片と定義され、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含み、鎖2本の形態で発現する断片。
【００３９】
(5) 単鎖抗体(「SCA」)は、遺伝子工学的に改変された分子と定義され、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含み、両領域が適当なポリペプチドリンカーで結合されて遺伝子的に融合した単鎖分子を形成している分子。
【００４０】
本明細書に用いるエピトープという用語は、ポリペプチド、特にAKAP18δ上の任意の抗原決定基を意味する。抗原決定基は、通常、アミノ酸や糖の側鎖などの分子の化学活性な表面基からなり、三次元構造の特定の特性と特異的電荷の特性とを有する。
【００４１】
本発明は、ワクチン、あるいは核酸分子、ベクター、宿主細胞、ポリペプチドおよび/または認識分子を、場合により製薬的に許容可能な担体と共に含む医薬組成物にも関する。製薬的に許容可能な担体には、それ自体既知の薬剤用アジュバントおよび/または添加剤が含まれる。当業者にはそれ自体既知の添加剤および賦形剤には、リポソームならびに遺伝子工学において既知の構造体と溶液および/または緩衝剤混合物、あるいは生薬領域からの他の物質も含まれる。
【００４２】
更に本発明は、核酸分子、ベクター、宿主細胞、ポリペプチド、認識分子、および/または医薬組成物を含むキットに関する。例えば診断キット、または特にAKAP阻害剤またはAKAP-PKA相互作用を検出するための検出キットとして、該キットを使用することができる。
【００４３】
本発明は、AKAP-PKA相互作用を検出する方法にも関しており、その方法は、
a)(i)AKAP、特にAKAP18δ、および(ii)第1のマーカー、特に蛍光性蛋白、をコードする本発明の核酸分子を含む第1のベクター、特にプラスミドを用意するステップと、
b)(i)プロテインキナーゼの調節サブユニット、好ましくはRIIα、RIIβ、RIαまたはRIβ、および(ii)第2のマーカー、特に蛍光性蛋白、をコードする第2の核酸分子を含む第2のベクター、特にプラスミドを用意するステップと、
c)形質移入する細胞中への第1および第2のベクターを導入するステップと、
d)AKAP-PKA相互作用を検出する蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の測定を実施するステップ
を含む。
【００４４】
本発明の方法によって、AKAP-PKA相互作用、好ましくはAKAP18との、特に好ましくはAKAP18δとのPKAの相互作用を生細胞中で可視化し、それによりAKAP-PKA複合体を細胞コンパートメントに割り付けることが、驚くべきことに可能となる。
【００４５】
本発明の方法の第1ステップでは、2種のベクターまたはプラスミドを用意するが、例えば第1のプラスミドは、AKAP18δをコードする本発明の核酸分子、およびマーカー、好ましくは蛍光性蛋白をコードする少なくとも1つのさらなる核酸分子を含む。第2のプラスミドも、同様に少なくとも2つの核酸分子を含み、第1の核酸分子はプロテインキナーゼの調節サブユニット、好ましくはRIIαをコードし、他の核酸分子は第2のマーカー、特に第2の蛍光性蛋白をコードする。より詳しくは、第1および第2の蛍光性蛋白は、相互に空間的に十分近接して蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を起こせるように、特に選択することができる。従って、第1の蛍光性蛋白は例えばシアン蛍光性蛋白(CFP)、第2の蛍光性蛋白は黄色蛍光性蛋白(YFP)とすることができる。例えば蛍光共鳴エネルギー移動などの蛍光マーカー間の測定可能な相互作用を実現するために、あるいは、生じた蛍光共鳴エネルギー移動を、少なくとも2種のマーカー分子、特に蛍光マーカーの相互作用の検出を可能とするように、改変すること、例えば阻害することのために、多種の分子を使用できることは、当業者にとっては当然知られていることである。その上、特にプラスミドである第1および第2のベクターが、標識として測定で検出できる少なくとも1つの構造を有することは必須である。マーカーまたは標識という用語は、本発明では、検出可能で好ましくは定量可能なシグナルの発生に使用でき、かつ特に核酸または蛋白またはその断片に結合するか、または有効に結合することを含む、あらゆる構造または方法に関する。マーカーまたは標識は、より具体的には、蛍光により検出可能なシグナルを発生することができる。本発明の教示に関連して、相互作用および相互作用の改変、例えば阻害などは、好ましくはFRET測定方式で検出される。少なくとも2種の生体成分、特に2種の蛋白、より好ましくは、プロテインキナーゼ好ましくはPKAと、プロテインキナーゼAアンカー蛋白好ましくはAKAP18δとの相互作用を検出できるように、蛍光もしくは蛍光共鳴エネルギー移動プロセスに関連してシグナルを発生、阻害または改変すること、あるいは、放射活性、熱量測定、重量測定、X線回折もしくは吸収、磁気、または酵素活性を利用して個々に測定されるシグナルを発生させることは、当然ながら可能である。本発明におけるプローブとは、例えば核酸またはアミノ酸配列であって、その一端もしくは両端または中間に少なくとも1つの標識を有するものであり、該標識は好ましくは蛍光を生成可能にする色素もしくはマーカー、または蛍光消光性の色素もしくはマーカーである。したがって、本発明におけるプローブは、検出可能なシグナルを改変する、特に阻害することのできる少なくとも1つの標識を有する核酸またはアミノ酸配列であってもよい。このようなプローブは、例えばマーカーまたは色素、例えばレポーター色素の蛍光に、2分子間の相互作用と関連付けて、測定可能なシグナル変化を起こすことができるように影響する、例えば消光構造であってもよい。したがって、蛍光生成可能な構造と消光可能な構造とが、例えばプロテインキナーゼAアンカー蛋白とプロテインキナーゼとの相互作用時に、両者間の相互作用に必要な空間的接近をしている場合、蛍光色素との相互作用の結果、蛍光シグナルもエネルギー移動シグナルも検出できないように、例えば該消光構造を設計することができる。このような系では、標識構造間の相互作用が存在する限り蛍光シグナルまたは未改変の蛍光シグナルが検出可能であろう。したがって、消光、蛍光共鳴エネルギー移動シグナルまたは単なる蛍光という用語は、蛍光分子と他の蛍光分子または消光分子とが空間的に近接している場合、該分子の1つの励起で励起状態のエネルギーの大部分を、発光せずに消光分子に移動させるか、あるいは測定可能な発光を該系に与えるような構造または方法に関する。消光物質に移動したエネルギーは、例えば発光せずに失われるか、または蛍光分子のものとは異なる放出波長で放出されることもある。即ち、2種の蛋白またはそれらをコードする核酸、特にプロテインキナーゼAおよびプロテインキナーゼAアンカー蛋白が関係するようなものの間の相互作用は、発光によってまたは消光物質への無発光エネルギー移動によって検出できる。
【００４６】
特定のプローブのために適当な蛍光物質-消光物質対を選択するための実用的教示は、文献中で入手でき、以下の参考文献に例示されている:Pesce et al., Ed., Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970)。文献中には、蛍光物質-消光物質対を選択するために蛍光分子および発色分子ならびに関連するそれらの光学特性の詳細な一覧を示す参考文献も含まれる:例えば、Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd ed., (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Colour and Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, Ed., Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992)を参照されたい。更に、文献中には、オリゴヌクレオチドに結合できる一般的な反応基に対して、蛍光分子および消光分子を誘導体化するための詳細な教示も見られる。米国特許第3996345号、米国特許第4351760号を参照されたい。
【００４７】
例示的な蛍光物質-消光物質対は、キサンチン色素、例えばフルオレセインおよびローダミン色素などから選択できる。このような化合物の多数の適切な形態が市販されており、オリゴヌクレオチドに結合するための結合部位または結合性官能基として使用できる置換基をフェニル基上に有している。他の一群の蛍光化合物は、αまたはβ位にアミノ基を有するナフチルアミンである。このようなナフチルアミノ化合物は、1-ジメチルアミノナフチル-5-スルホン酸、1-アニリノ-8-ナフタレンスルホン酸および2-p-トルイジニル-6-ナフタレンスルホン酸を含む。他の色素には、3-フェニル-7-イソシアナートクマリン、9-イソチオシアナートアクリジンオレンジなどのアクリジン、N-(p-(2-ベンゾキサゾリル)-フェニル)-マレイミド、ベンゾキシジアゾール、スチルベン、ピレンが含まれる。好ましい蛍光体は、更にSYBRグリーン、Hex、TET、VIC、JOE、NED、Redmondレッド、Alexaレッド、カスケードブルー、Yakimaイエロー、Cy3、Cy3.5、Tamra/Cy3、テキサスレッド、ROX、Cy5、Cy5.5、カルボキシローダミン、LC705および/またはLC640である。消光物質としては、例えば更にTamra、ローダミン、BHQ1〜3、Dansyl、Dabcyl、エレ(Elle)クエンチャーおよび/またはメチルオレンジを指定できる。核酸プローブの副溝結合物質との複合化も有利なことがある。このような構造体は、例えばKutyavin et al., 2000, Nucleic Acids Researchに記載されており、本明細書中に参照により取り入れる。
【００４８】
本発明によれば、消光過程または蛍光放出を改変する過程には2通りあり、1つは衝突過程による動的な蛍光消滅であり、また他の1つは、蛍光団、即ちマーカーまたはプローブと消光分子またはプローブ消光物質との間での複合体形成による静的な蛍光消光である。したがって、消光により、標識プローブの蛍光励起で検出できる量子収率が低下する。しかし、例えば特定の核酸断片上で、非常に高い濃度で存在するプローブが、いわゆる自己消光、即ち、運動中の個々の分子が妨害されて、(高いプローブ濃度の結果)消光作用が同様に現れる現象を起こし易くなることも、例えば可能である。
【００４９】
このことから、本発明において、例えば個別に生成した蛍光シグナル、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)、および消光したシグナルを用いてAKAP-PKAを検出することができ、好ましいシグナルはFRETシグナルである。FRETシグナルは、特に蛍光物質のCFPやYFPの使用により得られる。
【００５０】
用意した両プラスミドを用いて、細胞のトランスフェクションがなされる。本発明において、トランスフェクションは、化学的、物理的および/または生物学的トランスフェクション法で行うことができる。化学的トランスフェクションは、例えばDEAEデキストラン、デンドリマー、またはリン酸カルシウムの使用により行うことができる。物理的トランスフェクションでは、細胞がトランスフェクション用プラスミド-DNAを取り込むように、例えば細胞膜をエレクトロポレーションで改変することが可能である。他の物理的トランスフェクション法は、例えば微量注射、または例えば金粒子を用いた衝撃によるDNAの導入である。生物学的トランスフェクション法は、例えば受容体媒介トランスフェクション、ウィルス成分で補助された受容体媒介トランスフェクションおよびリポフェクションである。当業者にとっては、様々なトランスフェクション法は既知である。トランスフェクションに適した細胞は、原核細胞、真核細胞のいずれでもよく、例えば細菌、酵母、昆虫、植物または哺乳動物の各細胞、あるいはトランスジェニック動物や植物などの生物であってもよい。真核細胞系で好ましいものには、哺乳動物細胞系のNS0、SP2/0、CHO-K1、CHO-dhfr-、COS-1、COS-7、K562、Percy6、または好ましくはHEK293細胞、好ましくはCD8細胞、LCCPK1、HeLa細胞、MDCK2細胞、MCF7、線維芽細胞、MCF7、NIH3T3がある。
【００５１】
当業者には既知の条件下で、細胞を両プラスミドで同時にトランスフェクションした後、AKAPおよび第1の蛍光蛋白、ならびにプロテインキナーゼの調節サブユニットおよび第2の蛍光蛋白で構成された2つの融合蛋白が発現される。発現した融合蛋白同士が相互作用する限り、蛍光蛋白同士の相互作用に基づいて、前者の相互作用を特に細胞などの生物中で蛍光共鳴エネルギー移動法を用いて検出できる。蛍光共鳴エネルギー移動法は、2つの融合蛋白が相互に極近くに存在する場合だけ実現する、第1の蛍光蛋白から第2の蛍光蛋白へのエネルギー移動に基づいている。融合蛋白同士は、AKAP蛋白がプロテインキナーゼの調節サブユニットに直接結合する場合に特に、このように接近する。この場合に蛍光共鳴エネルギー移動を検出することができる。
【００５２】
この系は、AKAPと調節サブユニット、好ましくは、PKAのRIIαであるがRIIβ、RIαおよびβでもよいサブユニットとの相互作用を阻害する物質の識別にも利用できる。
【００５３】
本発明の方法の提供により、当業者であればその方法を随意に改変することができる。より詳しくは、特定の分子がAKAPとPKA、特にAKAP18δとRIIαとの相互作用に影響するか否かを調べることも可能である。このため、本発明の方法は、例えばある時は調査すべき分子の存在下で、別の時は不在下で実施し、調査すべき分子がある場合と、ない場合に行った方法同士を比較して該分子の阻害特性について指示を得ることもできる。例えばFRETシグナルが該分子の存在下で測定されなければ、該分子はAKAPとPKAとの相互作用を阻害することが示される。
【００５４】
該分子がFRET自体を抑制する可能性を、どんな対照試験をすれば除外できるかということは、当業者には既知のことである。その上、該分子がAKAP、PKAサブユニットまたはそれらの特定の相互作用に影響するか否か、特に阻害するか否かを、どうすれば検出できるかということも、当業者には既知のことである。
【００５５】
特異的なAKAP阻害を識別することにより、治療上の大きな可能性が得られる。AKAP-PKA相互作用は様々なエキソサイトティックな過程において重要であり、その調節ができないと尿崩症、糖尿病、高血圧、胃潰瘍、甲状腺疾患などを発症する。心不全ではイオンチャンネル、リアノジン受容体(カルシウムチャンネル)のPKA媒介過リン酸化が起こる。特定のAKAPを特異的に阻害する物質は、この疾患の薬剤として使用することができる。
【００５６】
本方法は、ペプチドの膜透過性を調べるのに特に適している。これまで、ペプチドの膜透過を直接検出または定量する手段がなかった。これは、特に調査すべき分子、特にペプチドと、S-Ht31またはペプチドHt31との混合物から結合体が生成されることによって達成できる。それは、各AKAPの各RII結合ドメインに対してのみ可能である。
【００５７】
本発明の特定の実施形態では、細胞を膜透過性ペプチドと接触させる。その場合、例えば蛍光共鳴エネルギー移動の測定を、ある場合には膜透過性ペプチドを添加し、別の場合には添加せずに実施することが可能であり、それにより、膜透過性ペプチドがAKAP-PKA相互作用を改変、特に阻止するか否かを検出できる。測定中の蛍光共鳴エネルギー移動の連続的減少は、膜透過性ペプチドの存在下での、例えば、AKAPとプロテインキナーゼの調節サブユニットとの相互作用の阻害を示している。更に、AKAPとPKAとの相互作用を阻害する既知の膜透過性ペプチドを用いることも可能であり、その膜透過性ペプチドにおいて、例えばアミノ酸の欠失や置換などのある種の改変を調べることにより、AKAP-PKA相互作用を抑制または促進するには、膜透過性ペプチド中のどのアミノ酸が必須であるかについて指示を得ることも可能である。
【００５８】
本発明の態様は、生細胞中でのAKAP-PKA相互作用を可視化すること、およびAKAP-PKA複合体を細胞コンパートメントに割り付けることにある。
【００５９】
更に、本方法の応用範囲は極めて広い。本方法は、AKAP-PKA相互作用に影響する物質を識別および定量分析するハイスループット法を実現する。その上で、ペプチドの膜透過能を決定することができる。
【００６０】
本発明はまた、本発明の核酸、ベクター、宿主細胞、ポリペプチド、認識分子、医薬組成物、キット、ならびに/あるいは本発明方法の、AKAP-PKA相互作用、AKAPおよび/またはPKA阻害および/または膜透過性ペプチドの検出への使用にも関する。本発明の前記構造および方法を提供することによって、当業者は基礎研究および臨床の多領域でこれを使用することができる。例えば、ある分子がAKAPまたはPKAの阻害剤であるか否かを調べることができる。更に、ある分子がAKAPおよびPKAの相互作用を改変するか否かを調べることもできる。更に、ある分子、特にペプチドが膜透過性であるか否かを検出することもできる。
【００６１】
以下に、本発明を実施例を参照しながら、より詳細に説明する。ただし本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６２】
先ず、プロテインキナーゼAアンカー蛋白(AKAP)AKAP18の新規なスプライシング変異体のcDNAを同定し、単離した(図1)。この変異体をAKAP18δと呼ぶ。このAKAP18δ-cDNAを市販のベクターpECFP(BD Biosciences, Clontech, Heidelberg)中にクローニングした。教授K. Tasken博士(オスロ大学)により恵与された、ヒトプロテインキナーゼAの調節サブユニットRIIαのcDNAを、市販のベクターpEYFP(BD Biosciences, Clontech, Heidelberg) 中にクローニングした。HEK293真核細胞(GBF, Braunschweig)に該プラスミド類を同時にトランスフェクションした。
【００６３】
発現した各融合蛋白AKAP18δ-CFPとRIIα-YFPとの相互作用を、HEK293細胞中で蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)法により測定した(図3に概略図)。FRETシグナルは、両蛋白が相互に直接近接して存在する場合(<10nm)だけ実現するCFPからYFPへのエネルギー移動により生じる。CFPおよびYFPは、AKAP18δがRIIαサブユニットに直接結合する場合にのみ、このように接近する。この場合にFRETを検出することができる。AKAP18δとRIIαとの相互作用の特異性は、AKAPとRIIサブユニットとの相互作用を妨げる膜透過性ペプチドS-Ht31の存在下でFRETを測定することにより、立証することができる。測定中のFRETシグナルの連続的減少は、AKAP18δとRIIαとの相互作用の阻害を示している。
【００６４】
ペプチドS-Ht31の配列は、AKAP Ht31のPKA結合ドメイン(RII結合ドメイン)の配列に相当する。それは両親媒性ヘリックスを形成し、PKA調節サブユニットに競合的に結合する。AKAP18δとの相互作用は、それにより阻害される。該ペプチドは、N末端のステアリン酸残基との結合によって膜透過性を得る(Klussmann et al. J. Biol. Chem. 274, 4934-4938, 1999)。ステアリン酸残基をもたず、そのため膜透過性のない同じアミノ酸配列のペプチド(Ht31)は、その系でFRETシグナルを変化させない。同様に、プロリン2個の挿入によって両親媒性ヘリックスが妨害されるステアリン酸結合S-Ht31ペプチドも、FRETシグナルを変化させない。
【００６５】
新たに同定されたAKAPの特性決定のひとつとして、AKAP即ちPKA相互作用の相手としてin vivoで作用することの証明がある。本発明の方法により、AKAP18δとPKAのRIIαサブユニットとの相互作用を生細胞内で検出することが可能である。そのため、本方法は、AKAP18δがAKAPとしてin vivoで作用することを実証するのに適している。同時に、この系ではAKAP18δ-RIIα複合体の細胞内局在化を推定することが可能である。
【００６６】
AKAPは、これまで特異的な相互作用性物質によってその機能を操作することのできなかった50種以上の蛋白のファミリーである。AKAP18δとRIIαとの結合を阻害するために用いられたペプチドS-Ht31(上記参照)は、AKAP機能に影響する唯一の既知物質である。それはAKAP-PKA相互作用を阻害するが、各AKAPとPKA調節サブユニット全てとの結合を解除する。この開発系を用いて、膜透過性ペプチド、ならびにAKAP18δとRIIαとの相互作用を特異的に阻害する低分子量の非ペプチド物質が、FRET測定を用いる特定のハイスループット調査によってで同定される。
【００６７】
融合蛋白AKAP18δ-CFPおよびRIIα-YFPをコードするプラスミドの作製
本発明者らが同定したAKAP18δ-cDNA(図1の配列AKAP18δ)のコード領域は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅した。それぞれEcoRIまたはBamHIの制限酵素切断部位を有する、配列5' CTC GAG CTC AAG CTT CGA ATT CTG ATG GAG CGC CCC GCC GCG GG 3'の順方向プライマー(AKAP18δ中の位置:bp 57-76)および配列5' GGC GAC CGG TGG ATC CCG GGC CCG GTT GTT ATC ACT GCC ATC GCC 3'の逆方向プライマー(AKAP18δ中の位置:bp 1095-1118)をそのために用いた。ポリメラーゼとしてAdvantage cDNA polymeraseミックスを製造業者の指示通りに用いた。必要な10×PCR緩衝液をAdvantage cDNA polymeraseミックスと共に供給した。各ヌクレオチドdATP、dCTP、dGTPおよびdTTPは、dNTPミックスとしてPCR混合物中にピペットで加えた(反応バッチは下記を参照のこと)。
【００６８】
RIIαをコードするcDNAは、PCRによってプラスミドから増幅した。それぞれXhoIまたはBamHIの制限酵素切断部位を有する、配列5' TCA GAT CTC GAG CTC AAG CTT CGA ATT CTG ATG AGC CAC ATC CAG ATC CCG 3'の順方向プライマー(RIIα中の位置:bp 190-210)および配列5' GAC CGG TGG ATC CCG GGC CTG CCC GAG GTT GCC CAG AT 3'の逆方向プライマー(RIIα中の位置:bp 1382-1401)を、このために用いた。ポリメラーゼとしてAdvantage cDNA polymeraseミックスを再び用いた。同様に、上記の10×PCR緩衝液およびdNTPミックスを用いた。
【００６９】
AKAP18δおよびRIIαのPCR増幅反応のバッチは、以下のとおりであった。
【００７０】
DNA                                            5μl
dNTPミックス(10μM)                             1μl
順方向プライマー(10μM)                         1μl
逆方向プライマー(10μM)                         1μl
Advantage cDNA polymeraseミックス(5単位/μl)     0.2μl
H2O                                            41.8μl
全体積                                         50μl
反応条件：
1サイクル     95℃、5分
30サイクル    94℃、30秒
58℃、30秒
72℃、2分
1サイクル     72℃、10分
4℃, ∞
得られたAKAP18δ cDNA増幅産物(配列長:1061bp)は、制限酵素EcoRIおよびBamHIで処理し、得られたRIIα cDNA増幅産物(配列長:1211bp)は、制限酵素XhoIおよびBamHIで処理した。次いで、各バッチをアガロースゲル中で分離し、AKAP18δおよびRIIα増幅産物をジーンクリーン法によりゲルから溶離した。
【００７１】
AKAP18δ cDNAは、制限酵素EcoRIおよびBamHIで切断され、シアン蛍光蛋白(CFP)をコードするプラスミド(pECFP, BD Biosciences)中に単一クローン化した。RIIα-cDNAは、制限酵素EcoRIおよびBamHIで切断され、黄色蛍光蛋白(YFP)をコードするプラスミド(pEYFP, BD Biosciences)中に単一クローン化した。したがって、得られたプラスミドは、それぞれ融合蛋白AKAP18δ-CFPまたはRIIα-YFPをコードする。大腸菌(JM109株)を該プラスミドDNAで形質転換した。細菌中で増殖させたプラスミドDNAを、製造業者の指示(Qiagen, Hilden)通りにQiagen-Midi-Plasmid調製法により単離し、トランスフェクションによってHEK293細胞中に導入した(下記参照)。
【００７２】
HEK293細胞(GBF, Braunschweig)を10%ウシ胎児血清(FCS)を含むダルベッコの最少イーグル培地(DMEM)中、ポリリジンをコートした30mm小カバーグラス上で培養し、集密度を40〜60%とした。リポフェクタミン法(Gibco Invitrogen, Karlsruhe)によりAKAP18δ-CFPおよびRIIα-YFPのプラスミド(DNA当たり1〜2μg)で、該細胞を一時的にトランスフェクションした(プラスミドDNAの比は、AKAP18δ-CFP:RIIα-YFPが1:4)。
【００７３】
蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の測定
HEK293細胞を、RIIα-YFPおよびAKAP18δ-CFPをコードする各プラスミドで一時的に同時トランスフェクションした。FRET測定は、表面蛍光顕微鏡(Axiovert 200M, Carl Zeiss, Jena,ドイツ)でトランスフェクションしてから24〜48時間後に行った。データはOpenlab 2.25ソフトウェア(Improvision, Coventry イギリス)により保存した。蛍光は、CFPについて425、YFPについて488nmの波長で励起された。発光した蛍光は、CFPについて480/30、YFPについて535/26nmの波長で測定した。CFPからYFPへのFRETは、CFPの波長425nmでの励起およびYFPの波長535/26nmでの発光の測定により決定した。非特異的なバックグランド蛍光を細胞のない領域で決定し、それを差し引いた。顕微鏡への設定に変化はなかったので、535/480>0.6を全実験においてFRETシグナル陽性とした。
【００７４】
FRET実験では、CFPの励起時にはYFPも励起される結果生じる偽陽性シグナルを除外しなければならない。その上、CFP発光はTFP発光の範囲でも起こる。真の陽性FRETシグナルを検出するために、対照実験をアクセプター漂白法(アクセプター漂白後のドナー再生)によって行う。この実験は、倒立表面蛍光顕微鏡(Axiovert 100, Carl Zeiss, Jena, ドイツ)で行った。この場合、425nmの励起時に480/30および535/26nmの発光を12ビットCCDカメラ(Imago, TILL-Photonics, Martinsried,ドイツ)で記録する。基準シグナルの決定後に波長488nmでのYFPの強い励起が起こり、その結果YFP発光シグナルが消失する(アクセプター漂白)。波長480/30nmで決定されるCFPの発光は、FRETが中断されるので直ちに増加する(ドナー再生)。このような系では、光源のエネルギー量が十分ではないので、波長488nmでの強い励起を多数回受けることにより、YFPを漂白しなければならなかった。したがって、漂白およびYFP発光シグナルの消失は逐次に起こる。それによって、波長480/30nmで決定されるCFPの発光は、1段だけではなくて継続的に増加する。したがって、CFP発光の増加は、アクセプター漂白の開始から約120秒間にわたり測定される。
【００７５】
更にFRETの特異性を調べ、RIIα-YFPとAKAP18δ-CFPとの相互作用をモジュレートする膜透過性物質を同定するために、同時トランスフェクションされたHEK293細胞が適しているか否かを試験するために、AKAP-RII相互作用を一般に阻害する膜透過性ペプチドS-Ht31(100μM)と該細胞とのインキュベーションを行った。対照として、AKAP-RII相互作用に影響のないペプチドS-Ht31-P(Klussmann et al., J. Biol. Chem. 274, 4934-4938, 1999)と該細胞とのインキュベーションを行った。FRET測定は、10分間隔で計90分にわたり行った。
【００７６】
結果
AKAP18δとPKAのRIIα調節サブユニットとの相互作用を直接検出するために、AKAP18δ-CFPとRIIα-YFPをコードする各プラスミドでHEK293をin vivoで同時にトランスフェクションした。図2は同一細胞内での両蛋白の同時発現を証明している。RIIα-YFPの発現は、488nmでの励起および535/26nmでの発光蛍光の測定により検出し(図2A)、AKAP18δ-CFPの発現は、425nmでの蛍光の励起および480/30nmでの発光蛍光の測定により検出した(図2B)。両融合蛋白はサイトゾル中に拡散した分布を示した。次いで、FRET測定を同一細胞で行った。そのためにドナーCFPは波長425nmで励起される。適当なアクセプターが直接近接して(距離<10nm)、ドナーの励起がアクセプターYFPへの部分的なエネルギー移動を起こし、YFPは波長545nmで蛍光を発する(図3の概略図)。それに従ってFRET検出のためにHEK293細胞(CFP)が波長425nmで励起され、YFPの発光を波長535/26nmで測定した。図2Cは、表示したYFP発光の図2Aと類似の分布を示す。こうしてCFPからYFPへのエネルギー移動が起こった。図1Dは、この細胞におけるFRETシグナルの比535/480の計算値が、約1.2〜1.5である色素コードによる表示を示す。
【００７７】
測定したFRETシグナルの特異性は、アクセプター漂白法により調査した。図4Aは、YFPおよびCFPから発光した蛍光の動力学を示す。比F/Fmaxが時間(秒単位の時間)の関数として示されている。FmaxはそれぞれYFPまたはCFPの最大発光量に相当する。アクセプター漂白の前は、YFPのF/Fmaxは約1であり、CFPのそれは約0.92である。約40秒後にアクセプター漂白を開始すると、YFPの発光シグナルが激減する。CFPのF/Fmaxは約0.91から約1に増加する。約10%のCFP発光の増加から、FRET効率は約10%となる。回帰分析(図4B)により、この観察が確認される。このデータは、AKAP18δとRIIαとの直接の相互作用を示している。
【００７８】
AKAP18δとRIIαとの相互作用の、およびそれによるFRETの特異性を更に調べるだけでなく、同時トランスフェクションされたHEK293細胞が、AKAP18δとRIIαとの相互作用をモジュレートする膜透過性物質の同定に適するか否かを試験するためにも、膜透過性ペプチドS-Ht31の存在下でFRET測定を行った。このペプチドは、AKAPとPKA調節サブユニットとの相互作用を一般に阻害する(Klussmann et al., J. Biol. Chem. 274, 4934-4938, 1999; 図5AとBの概略図を参照されたい)。図6Aは、HEK293細胞2個でのAKAP18δからRIIαへの色素コードによるFRETシグナル(比535/480)を示す。S-Ht31の添加前は(時点0分)、比535/480は約1.3となった。比535/480の減少(赤の薄まり)は、CFPとYFPとの相互作用の減少と直接相関している。S-Ht31の添加(時点0後に100μM)により、比535/480nmが80分以内に50%超減少することが示されている。その比の平均値は約0.35となった。図6Bは、AKAP-RII相互作用に全く影響しない有効でない対照ペプチドS-Ht31-Pとインキュベーションをした細胞を示す。この場合、色素コードによるFRETシグナルは殆ど変化しない。図6Cは、図6AおよびBから得られたデータのまとめを示す。FRETシグナルの経時的な変化(%)を示している。このグラフは、S-Ht31またはS-Ht31-Pの存在下で細胞で観察されたFRETシグナルの変化を示す。
【００７９】
これらの結果は、AKAP18δ-CFPとRIIα-YFPとを同時発現するHEK293細胞は、AKAPとRIIαとの相互作用を阻害する膜透過性物質の同定に適した系を表すことを示している。
【００８０】
AKAPは、保存された構造モチーフ(両親媒性ヘリックス)を介してPKA調節サブユニットと結合する。そのため、この系における各AKAPとPKA調節サブユニットとの相互作用をFRETによって決定できる。これが可能なことは、各AKAP-PKA相互作用に対する特異的な膜透過性阻害剤の探索に、この系が有用であることを示している。
【００８１】
AKAP18δおよびAKAP18γの異なる一次構造から、細胞内および組織特異的分布が異なり、そのために機能が異なっている。したがって、例えばAKAP18γはマウス卵母細胞の核内に存在し、遺伝子転写に寄与するものと思われる(Brown等、2003年)。その上、AKAP18γは、より詳細な同定がされていないラット腎細胞のサイトゾル画分および粒子画分中に見出された。細胞型(1種または複数)の同定は、腎臓全体のホモジェネートを使用する実験では不可能であった。該ホモジェネートの超遠心後の上清および沈殿を、例えばTrotter等(1999年)等によって表示されたように、サイトゾル画分および粒子画分と表示した。本発明者等によって、AKAP18γは、ラット腎の尿収集細管の主細胞のサイトゾルならびに核の中に生じるということを示すことができた。主細胞では抗利尿ホルモンのアルギニンバソプレッシン(AVP)が、細胞内小胞から形質膜の尿側部位へ水チャンネルアクアポリン-2(AQP2)を再分布することにより、水の再吸収を調節する(Klussmann等、2000年)。主細胞でのAKAP18γの機能は不明である。AKAP18δは、AKAP18γと同様に腎臓主細胞のサイトゾルおよび核の中に局在するが、AKAP18γと異なり細胞内小胞内にAQP2と共に局在する(図7)。小胞はRIIβ-PKA調節サブユニットも含んでいるが、他の細胞小器官に通常または専ら存在する蛋白を全く含まない(図7)。したがって、AKAP18δは小胞にPKAを固定できるが、その機能は既知のAKAP18γからは推定できない。更に、腎臓主細胞中へのバソプレッシン媒介による水の再吸収に、本発明のAKAP18δが直接関与していることを、例えばFRET実験により示すことができた。この場合、CD8細胞がモデル系として使用された(Valenti等、1996年)。その細胞は、ラットのAQP2を安定に発現する、ウサギ腎臓由来の樹立細胞系である。フォルスコリン(アデニル酸シクラーゼの直接的活性化剤、バソプレッシン受容体の活性化の省略)による細胞の刺激は、バソプレッシンによる本来の主細胞の刺激と同様に、頂端側形質膜中へのAQP2の転位を起こす。更に以下に詳述するように、本発明のAKAP18δ CFPとRIIα YFPの各構築物でCD8細胞の同時トランス
フェクションを行った。フォルスコリンによる細胞の刺激によって、頂端側形質膜へのAQP2の転位だけでなく、AKAPとPKAとの解離も誘発した(図8)。解離の分子機構は、AKAPのPKA結合部位におけるPKAリン酸化コンセンサス配列のリン酸化に基づいている。次いで、このリン酸化は、静電反発によりPKAのAKAP18δへの結合を妨害する。
【００８２】
既知および新規のスプライシング変異体の間の構造および機能に関するこのような一般的差異の他に、明らかに器官特異的な差異も示すことができた。既知のスプライシング変異体と異なり、AKAP18δは、心筋細胞中のCa2+チャンネルおよび受容体へPKAを固定する。
【００８３】
心筋の収縮は、心筋細胞内のサイトゾルCa2+の増加により引起される (Berridge等、2003年;図9)。活動電位が細胞に達し、形質膜に局在するチャンネルが開放された後、Ca2+はL型Ca2+チャンネルを通って外部から細胞内に入る。流入したCa2+は、筋小胞体(SR)のリアノジンR2受容体(RyR2)に結合し、それを活性化し、SRからRyR2を介してサイトゾル中へCa2+の排出を引き起こす。サイトゾルCa2+は、多数の中間段階を経て細胞骨格と、それにより心筋細胞とを収縮させる。Ca2+-ATPアーゼのSERCA2aは、Ca2+をサイトゾルからSR中に逆流させるこにより、収縮の終結に実際に関与している。SERCA2aは、蛋白ホスホランバン(PLN)の結合により阻害される。サイトゾルCa2+の増加と共に、SERCA2aからのPLNの解離によってその阻害が停止される。
【００８４】
心筋細胞の収縮強度と、それによる心筋全体の収縮強度は、サイトゾル中のCa2+量によりモジュレートされる。心筋細胞内Ca2+量の生理的モジュレーターは、例えば、心筋細胞表面上のβ受容体に結合するアドレナリンである。この受容体への結合に続いてPKAの活性化が起こり、それがL型Ca2+チャンネル、RyR2、PLNおよび細胞骨格蛋白トロポニンCのリン酸化を起こす。L型Ca2+チャンネルおよびRyR2のリン酸化は、Ca2+伝導性を増強し、それによりサイトゾルのCa2+濃度を高める。リン酸化トロポニンCは細胞骨格の収縮性を強化する。PLBのリン酸化は、SERCA2aからのその解離を起こし、それによりCa2+のサイトゾルからSR中への逆輸送を増強する。それによって、次の心筋収縮のために、より多くのCa2+がサイトゾル中に自由に流入することができる。例えば高血圧の治療に投与される所謂βブロッカーは、β受容体の遮断によってこのようなリン酸化能を阻止し、それにより心臓収縮性および心拍数を低下させる。
【００８５】
したがって、本発明のウェスタンブロット検査で、AKAP18δが心臓内で発現するのに対し、AKAP18γは発現しないを示した。したがって、抗AKAP18δ抗体を用いる免疫蛍光法顕微鏡検査(図10)によって、AKAP18δがRyR2、SERCA2aおよびPLNと共に局在することが示される。更に、AKAP18δは、PKAのRIIαおよびβ調節サブユニットと共に心臓細胞内に局在する。そのために、AKAP18δは、PKAをRyR2、SERCA2aおよびPLNの特定の近傍に固定し、それらのリン酸化を可能にすることを示した。
【００８６】
AKAP15とも称するAKAP18αは、AKAP18遺伝子の他のスプライシング変異体である。その相当する蛋白はアミノ酸81個からなる。それは、PKAのL型Ca2+チャンネルへの固定により、ウサギ骨格筋中でL型Ca2+チャンネルのリン酸化を可能にする(Hulme等、2002年)。
【００８７】
上記のことから、AKAP18γおよびAKAP18δは、一次構造、細胞下局在、組織特異的分布および機能が明確に異なると結論できる。
【００８８】
図7:AQP2、PKAならびにAKAP18δおよび/または55kDa AKAPが同じ細胞内小胞上に存在する。ラット腎臓の内部髄質をホモジェネートし、核および細胞屑を遠心分離で除去した。親和性精製し、Eupergit C1Zメタクリレートマトリックスに結合した抗AKAP18δ抗体(AKAP18ABビーズ)と、核除去後の上清をインキュベーションした。飽和していない結合部位は、グリシンとのインキュベーションにより遮断された。対照としてビーズにグリシンの層だけを形成した(グリシンビーズ)。本発明者らの生化学分析によれば、抗AKAP18δ抗体は、主細胞の粒子画分中でAKAP18δおよび55kDa AKAPを認識することが示されている。該抗体は、主細胞の可溶性画分および核の中でAKAP18γを検出した。グリコシル化(g)および非グリコシル化(ng)AQP2、RIIβ PKA調節サブユニット、ならびに対照として、形質膜(非グリコシル化AQP4、AQP4-ng)、小胞体(カルネキシン)、ミトコンドリア(シトクロムcオキシダーゼのサブユニットIV、COX IV)および細胞骨格(チューブリン)の各マーカーが、市販抗体を用いたウェスタンブロットにより検出された。
【００８９】
図8:AKAP18δは、腎臓主細胞の頂端側形質膜へのAQP2の転位を起こすシグナルカスケードにおいて作用する。A:RIIα-YFPおよびAKAP18δ-CFPをコードする各プラスミドで、CD8細胞の同時トランスフェクションを行った。FRETは、フォルスコリン(100μM)による細胞の刺激の前後に測定した。ここには、2種の融合蛋白を同時発現する代表的な細胞2個を示している。FRETは、フォルスコリンの添加前(0秒)と、95および600秒後(95秒および600秒)に測定した。FRETシグナル(比535/480nm)は偽色素にコードされている。B: FRETシグナルに対するフォルスコリンの作用の定量分析(n=6の細胞)。尺度、20μm。
【００９０】
図9:心臓におけるカルシウムシグナル(Berridge等、2003年より)。局所的Ca2+シグナルは、収縮と恐らく遺伝子転写とを担っている(Ca2+、赤丸)。Ca2+シグナル(Ca2+シグナル伝達)は、T管中のL型Ca2+チャンネル近傍での増幅から始まる。心臓細胞の形質膜および筋小胞体膜(SR)が近接する心臓内の領域をT管と称する。形質膜(T管膜)の脱分極はサイトゾルCa2+のパルス状局所増加を起こし、次いでそのCa2+がリアノジンR2受容体2(RyR2)に拡散し、RyR2を活性化する。次いで、RyR2を介してCa2+がSRからサイトゾル(細胞質)中に達し、収縮を誘発するまでそこから拡散する。Ca2+が、Na+/Ca2+交換(NCX)により細胞外にくみ出されるか、またはSERCAを介してSR中にくみ戻されるときに、収縮は終了する。Ca2+の一部はミトコンドリアに達し、そこで、収縮や転写のためにATPを用意する代謝過程を刺激する。SRでは、Ca2+はT管に局在する目標のSR膜に達し(トンネル効果)、次の心拍のために再び遊離される。Ca2+の循環は、サイクリックAMP(cAMP)などの第2メッセンジャーによりモジュレートされる。サイクリックAMPは、ホスホランバン(PLN)の阻害作用を終結させる。他の第2メッセンジャーであるADPリボース(cADPR)はSERCAを活性化することにより、SR中の遊離Ca2+量を増加させる。
【００９１】
図10:ラット心臓細胞中のAKAP18δ、リアノジンR2受容体2(RyR2)、SERCA2aおよびホスホランバン(PLN)、PKAのRIIαおよびβ調節サブユニットの局在。ラットの心臓から5μmの切片を作製した。本発明者らが作製し、特性決定をした抗AKAP18δ抗体(Henn等の準備中の原稿)およびCy3結合二次抗体を用いて、AKAP18δを検出した。図中に記した蛋白の同時検出を、市販抗体およびCy5結合二次抗体を用いて行った。Cy3およびCy5蛍光シグナル(それぞれ緑色および赤色)は、レーザー走査顕微鏡(LSM 510, Zeiss, Jena)で作製した。AKAP18δと他の1つの蛋白との共局在化は、重ね合わせ図(オーバーレイ)の黄色染色に認められる。
【００９２】
本明細書に記載した参考文献を下記に列挙する。
【００９３】
2006515743.tif 000003
2006515743.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１Ａ】AKAP18δのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す。
【図１Ｂ】AKAP18δ、γおよびβ、mAKAP18α、hAKAP18αのアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図２】AKAP18δ-CFPとRIIα-YFPとの相互作用を示す。
【図３】AKAP18δ-CFPとRIIα-YFPとの間の蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を示す。
【図４Ａ】FRET動力学を示す。
【図４Ｂ】アクセプターYFP(RIIα-YFP)の漂白がドナーCFP(AKAP18δ-CFP)による発光蛍光の増加を起こすことを示す。
【図５Ａ】ペプチドS-Ht31によるAKAP18δ-CFPとRIIα-YFPとの相互作用の阻止を示す。
【図５Ｂ】S-Ht31によるAKAP18δ-CFPとRIIα-YFPとの相互作用の阻止の結果を示す。
【図６Ａ】ペプチドS-Ht31によるAKAP18δ-CFPとRIIα-YFPとの相互作用の阻害、すなわちFRETシグナルの減少を示す。
【図６Ｂ】ペプチドS-Ht31-PはAKAP18δ-CFPとRIIα-YFPとの相互作用を阻止しない、すなわちFRETシグナルの減少がないことを示す。
【図６Ｃ】ペプチドS-Ht31およびS-Ht31-Pの存在下、HEK293細胞中でのAKAP18δ-CFPおよびRIIα-YFPからのFRETシグナル(比535/480)の変化を示す。
【図７】AQP2、PKAならびにAKAP18δおよび/または55kDa AKAPが同じ細胞内小胞上に存在することを示す。
【図８】AKAP18δが腎臓主細胞の頂端側形質膜へのAQP2の転位を起こすシグナルカスケードにおいて作用することを示す。A:RIIα-YFPおよびAKAP18δ-CFPをコードする各プラスミドによるCD8細胞の同時トランスフェクション。B: FRETシグナルに対するフォルスコリンの作用の定量分析。
【図９】心臓におけるカルシウムシグナルを示す。
【図１０Ａ−Ｃ】ラット心臓細胞中のAKAP18δ、リアノジンR2受容体2(RyR2)、SERCA2aおよびホスホランバン(PLN)の局在を示す。
【図１０Ｄ−Ｆ】ラット心臓細胞中のAKAP18δ、ならびにPKAのRIIαおよびβ調節サブユニットの局在を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ−Ｃ】
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【図１０Ｄ−Ｆ】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年5月9日(2005.5.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)配列番号1のヌクレオチド配列を含む核酸分子、
b)a)のヌクレオチド配列と機能的に類似となるのに十分な相同性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子、
c)遺伝暗号の結果としてa)またはb)のヌクレオチド配列に縮重する核酸分子、および
d)欠失、付加、置換、転位、反転および/または挿入によって改変されており、かつa)からc)までのヌクレオチド配列と機能的に類似している、a)〜c)のヌクレオチド配列に対応する核酸分子
を含む群から選択される単離核酸分子。
【請求項２】
b)に記載のヌクレオチド配列が、a)に記載のヌクレオチド配列の1つと少なくとも80%、好ましくは90%の相同性を有することを特徴とする、請求項1に記載の核酸分子。
【請求項３】
ゲノムDNA、cDNAおよび/またはRNAであることを特徴とする、請求項1または2に記載の核酸分子。
【請求項４】
請求項1から3のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項５】
請求項4に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
請求項1から3のいずれか一項に記載の核酸分子によりコードされるポリペプチド。
【請求項７】
請求項1から3のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項4に記載のベクター、請求項5に記載の宿主細胞、または請求項6に記載のポリペプチドを、場合により製薬的に許容可能な担体と共に含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項８】
場合により製薬的に許容可能な担体と共に含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項4に記載のベクター、請求項5に記載の宿主細胞、または請求項6に記載のポリペプチド、ならびに/あるいは請求項７に記載の医薬組成物を含むことを特徴とする、キット。
【請求項９】
a)(i)請求項1〜3のいずれか一項に記載の核酸分子および第1のマーカーを含む第1のベクター、ならびに(ii)プロテインキナーゼの調節サブユニットをコードする第2の核酸分子および第2のマーカーを含む第2のベクターを用意するステップ、
b)第1および第2のマーカーを細胞中に導入し、該細胞をトランスフェクションするステップ、
c)蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の測定を実施し、AKAP-PKA相互作用を検出するステップ、
を含む、AKAP-PKA相互作用の検出方法。
【請求項１０】
AKAPと、RIIα、RIIβ、RIαおよび/またはRIβとの相互作用を検出することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
調査すべき阻害剤を添加しておよび添加せずに前記方法を実施し、これによって該AKAPおよび/またはPKAの阻害剤について指示を得るような仕方で、KAPおよび/またはPKAの阻害剤を識別することを特徴とする、請求項９または10に記載の方法。
【請求項１２】
調査すべき膜透過性分子と膜透過性AKAP-PKA阻害剤との複合体を生成し、該複合体または該分子を用いておよび用いないでAKAP-PKA相互作用を検出するような仕方で、膜透過性分子を識別することを特徴とする、請求項９から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項1から3のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項4に記載のベクター、請求項5に記載の宿主細胞、請求項6に記載のポリペプチド、請求項７に記載の医薬組成物、請求項８に記載のキット、および/または、請求項９から12のいずれか一項に記載の方法の、AKAP-PKA相互作用の検出またはAKAPおよび/もしくはPKAの阻害剤の検出ならびに/あるいは膜透過性ペプチドの検出のための使用。
【国際調査報告】
2006515743.tif 000021
2006515743.tif 000022
2006515743.tif 000023
2006515743.tif 000024