(57)【要約】３−チオール化７−アミノセファロスポラン酸誘導体を製造するための酵素による方法であって、式（Ｉ）の３−チオール化セファロスポリンＣ【化１９】2004537985.tif 000034を酵素によって転換させて、式（Ｉ）の３−チオール化−グルタリル−７−ＡＣＡ【化２０】2004537985.tif 000035を生成させ、式（ＩＩ）の化合物を酵素によって転換させて、式（ＩＩＩ）の３−チオール化−７−ＡＣＡ【化２１】2004537985.tif 000036を生成させることから成り、前記各式において、Ｒが少なくとも一つの窒素原子を含む複素環基であり、Ｒ1とＲ2とが両方とも水素原子であるかまたはこれらの一つが水素原子であり他がアシルドナーである、ことを特徴とする方法。
2004537985.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−チオール化７−アミノセファロスポラン酸誘導体を製造するための酵素による方法であって、
式Ｉの３−チオール化セファロスポリンＣ
【化１】
2004537985.tif 000028
を酵素によって転換させて、式ＩＩの３−チオール化−グルタリル−７−ＡＣＡ
【化２】
2004537985.tif 000029
を生成させ、式ＩＩの化合物を酵素によって転換させて、式ＩＩＩの３−チオール化−
７−ＡＣＡ
【化３】
2004537985.tif 000030
を生成させることから成り、
前記各式において、Ｒが少なくとも一つの窒素原子を含む複素環基であり、Ｒ1とＲ2とが両方とも水素原子であるかまたはこれらの一つが水素原子であり他がアシルドナーである、
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
式Ｉの３−チオール化セファロスポリンＣが、式ＩＩの３−チオール化−グルタ
リル−７−ＡＣＡに、
式Ｉの化合物を、分子酸素の存在下で、固定化Ｄ−アミノ酸オキシダーゼと反
応させ、
前記支持された酵素を水性反応混合物から分離し、
過酸化水素を加えて、３−チオール化−α−ケトアジピルセファロスポラン酸を式ＩＩの化合物に転換させる
ことによって、転換されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
式Ｉの化合物が、約２ｂａｒの絶対圧、ｐＨ６．０〜８．０、温度２０〜３０℃で、０．５〜３時間にわたって、固定化Ｄ−アミノ酸オキシダーゼと反応させられることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
支持された触媒を塩濃厚溶液で洗浄し、このようにして生成される溶液に好ましくは３０〜５０ｐｐｍに相当する量の過酸化水素を加える工程を含むことを特徴とする請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
溶液から、過剰な過酸化水素を、好ましくは溶液に触媒を加えることによって除去する工程を含むことを特徴とする請求項１から４の中のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
過剰な過酸化水素が溶液にカタラーゼを加えることによって除去されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
式ＩＩの化合物が、式ＩＩの化合物を固定化グルタリル−７−ＡＣＡアシラーゼと
接触させることによって、式ＩＩＩの化合物に転換させられることを特徴とする請求
項１から６の中のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
式ＩＩの化合物から式ＩＩＩの化合物を生成させる反応が、不活性雰囲気中、周囲圧
、ｐＨ６．０〜８．５、温度２０〜３５℃で、０．５〜３時間にわたって実施されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
式ＩＩＩの化合物が、反応媒質を酸性化することによって沈殿させられ、そのよう
にして生成される沈殿が次に洗浄され乾燥されることを特徴とする請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
酵素が、適当な架橋剤により適当な固体担体に固定化されることを特徴とする請求項１から９の中のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
酵素が、生体触媒として使用するのに適した寸法の結晶の形であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
酵素を基質水溶液中に分散維持させて実施されることを特徴とする請求項１から１１のうちのいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
一つのカラム内で実施されることを特徴とする請求項１から１２の中のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
再使用のために酵素を回収する工程を含む請求項１から１３の中のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５】
式ＩＩＩの化合物の結晶化が酸性ｐＨで実施されることを特徴とする請求項１から
１４の中のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
式ＩＩＩの３チオール化−７−ＡＣＡを生成させるための、式Ｉの３チオール化セ
ファロスポリンＣの酵素による転換が、一つの容器で実施されることを特徴とする請求項１から１５の中のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１７】
Ｒが、少なくとも一つの窒素原子と随意の一つのイオウまたは酸素原子とを含む複素環基であることを特徴とする請求項１から１６のうちのいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
Ｒが、チエニル、ジアゾリル、テトラゾリル、チアゾリル、トリアジニル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、またはこれらの誘導体、好ましくは５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル、１−メチル−１Ｈ−テトラゾル−５−イル、もしくは１，２，５，６−テトラヒドロ−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−トリアジン−３−イルから成るグループの一つ以上から選択される複素環基であることを特徴とする請求項１から１７の中のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
式Ｉの化合物が固体の形または該化合物の非毒性塩の形であることを特徴とす
る請求項１から１８の中のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０】
請求項１から１９の中のいずれか１つに記載の方法によって製造されることを特徴とする式ＩＩＩの３−チオール化−７−ＡＣＡ。
【請求項２１】
請求項１から２０で定める式ＩＩＩの化合物を生成させてから酵素処理することか
ら成る、セファロスポリンＣ抗生物質とその誘導体とを製造する方法。
【請求項２２】
抗生物質が、セファゾリン、セファゼドン、セフォペラゾン、セファマンドール、セファトリアジン、セフォティアム、またはセフトリアクソンであることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の３−チオール化７アミノセファロスポラン酸誘導体を製造するための酵素による方法であって、
セファロスポリンＣを、一般式ＩＶ
Ｒ−ＳＨ                （ＩＶ）
のチオール化合物と反応させて、式Ｉの化合物を生成させ、
式Ｉの化合物の生成のあと、過剰な式ＩＶのチオールを除去する、
各工程を含み、
式ＩＶにおいて、Ｒが少なくとも一つの窒素原子を含む複素環基である、
ことを特徴とする方法。
【請求項２４】
過剰なチオールが陰イオン交換樹脂による吸着によって除去されることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
陰イオン交換樹脂が、架橋アクリルコポリマー構造を有する微孔質樹脂であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
陰イオン交換樹脂が、８％の架橋結合を含むチアルキルベンジルアンモニウム官能基を有することを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記樹脂がクロリド、ヒドロキシ、ホスフェート、またはアセテートサイクル（ｔｈｅ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ，ｈｙｄｒｏｘｙ，ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｏｒ  ａｃｅｔａｔｅ  ｃｙｃｌｅ）内にあることを特徴とする請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
過剰なチオールが結晶化によって除去されることを特徴とする請求項２３から２７の中のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２９】
結晶化が酸性ｐＨのもとで実施されることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
過剰なチオールが、結晶化とそれに続く陰イオン交換樹脂による吸着とによって除去されることを特徴とする請求項２３から２９の中のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３１】
セファロスポリンＣが水性媒質中にあることを特徴とする請求項２３から２９の中のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３２】
セファロスポリンＣがセファロスポリンＣの濃厚溶液の形であることを特徴とする請求項２３から２９の中のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３３】
反応が、ｐＨ５．５〜８．０、温度６０〜８０℃で、１〜１２時間にわたって、実施されることを特徴とする請求項２３から３２の中のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３４】
反応が、ｐＨ約６．０、温度約６５℃で、実施されることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
チオール化合物が、１〜５ｍｏｌ／（１ｍｏｌのセファロスポリンＣ）の量だけ存在することを特徴とする請求項２３から３４の中のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３６】
Ｒが、少なくとも一つの窒素原子と随意のイオウまたは酸素原子とを含む複素環基であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項３７】
Ｒが、チエニル、ジアゾリル、チアゾリル、テトラゾリル、チアジアゾリル、トリアジニル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、またはこれらの誘導体、好ましくは５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル、１−メチル−テトラゾル−５−イル、もしくは１，２，５，６−テトラヒドロ−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−トリアジン−３−イルの一つ以上から選択される複素環基であることを特徴とする請求項２３から３６の中のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３８】
式Ｉの化合物が固体の形または該化合物の非毒性塩の形であることを特徴とす
る請求項２３から３７の中のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３９】
請求項１から３８の中のいずれか１つに記載の方法によって得られる、式
【化４】
2004537985.tif 000031
を有し、Ｒが少なくとも一つの窒素原子を含む複素環基である、
ことを特徴とする化合物。
【請求項４０】
式
【化５】
2004537985.tif 000032
すなわち、式Ｉにおいて、Ｒが５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル
であること、
を有することを特徴とする化合物。
【請求項４１】
式
【化６】
2004537985.tif 000033
すなわち、式Ｉにおいて、Ｒが１，２，５，６−テトラヒドロ−２−メチル−５，
６−ジオキソ−１，２，４−トリアジン−３−イルであること、
を有することを特徴とする化合物。
【請求項４２】
請求項１から４１で定める式Ｉの化合物を生成させてから式Ｉの化合物を酵素処理することから成る、セファロスポリンＣ抗生物質とその誘導体とを製造する方法。
【請求項４３】
抗生物質が、セファゾリン、セファゼドン、セフォペラゾン、セファマンドール、セファトリアジン、セフォティアム、およびセフトリアクソンであることを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−ラクタム抗生物質の製造に使用される３−セファロスポリンＣ誘導体を製造する方法に関する。より詳しくは、本発明は、３−アセトキシ−メチル−７−アミノ−セフ−３−エム−カルボン酸の３−チオール化誘導体を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療用に使用されるセファロスポリンはすべて半合成のものであり、いろいろな前駆物質を使用して、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ  の発酵肉汁から得られる物質の基本β−ラクタム構造を改変することにより、または、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの発酵肉汁から得られる生成物から、化学的成分置換の後、製造される。
【０００３】
一般に、セファロスポリンＣ［３−アセトキシメチル−７−（Ｄ−５−アミノ−５−カルボキシペンタンアミド（ｃａｒｂｏｘｙ  ｐｅｎｔａｎａｍｉｄｏ））−セフ−３−エム−４−カルボン酸］が、β−ラクタム環のアミノアジピン側鎖を除去することにより、３−アセトキシメチル−７−アミノ−セフ−３−エム−カルボン酸（普通、７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）と呼ばれる）に転換される。７−ＡＣＡは、生成され、結晶化されてから、後続の７および３位の修飾のための出発原料として使用される。７−ＡＣＡは、現在、生物薬剤学産業で関心を持たれている重要な多くの半合成セファロスポリン抗生物質の合成に使用される基本構成ブロックとなっている。
【０００４】
３−チオメチルセファロスポリンＣ誘導体が、ＵＳ  ３，２７８，５３１号、ＵＳ  ３，５１６，９９７号、ＵＳ  ３，６４７，７８８号、ＧＢ  １，４００，８０４号、ＧＢ  １，５６５，０５３号、およびＧＢ  １，５６６，５１５号の明細書に開示されている。少数例の３´−チオメチルグルタリル７−ＡＣＡ誘導体が、ＷＯ−Ａ−９５３５０２０号およびＥＰ  ０８４６６９５号の明細書に記載されている。
【０００５】
７−ＡＣＡは、工業的な規模で化学的にまたは酵素によって得ることができるので、複素環チオールとの反応のための中間体としてもっとも広く使用されている。これは、いくつかの特許明細書、たとえばＵＳ  ３，５０２，６６５号、ＵＳ  ３，９５４，７４５号、ＵＳ  ３，５１６，９９７号、ＵＳ  ３，９７９，３８３号、ＵＳ  ４，１１５，６４５号、ＵＳ  ４，３１７，９０７号、ＵＳ  ５，３８７，６７９号、ＪＰ  ５５，１３９，３２７号、ＥＰ  ０１６７６５１号、およびＷＯ−Ａ−９３０２０８５号の明細書に開示されている。
【０００６】
ＵＳ  ５，３８７，６７９号の明細書には、アセトン水溶液中、重炭酸ナトリウムの存在下、ｐＨ６〜７での、７−アミノセファロスポラン酸と２−メルカプト−５−メチル−１，３，４−チアジアゾール（ＭＭＴＤ）との反応が記載されている。約６０〜６５％の収率が達成されている。
【０００７】
ＵＳ  ４，３１７，９０７号の場合、無水媒質中での前記反応の収率が、酢酸またはニトロメタノールを溶剤として使用し、三フッ化ホウ素または三フッ化ホウ素エーテレート（ｂｏｒｏｎ  ｔｒｉｆｌｕｏｒｉｄｅ  ｅｔｈｅｒａｔｅ）の存在下で、約８６％に向上している。しかし、未反応７−ＡＣＡおよび分解生成物を含んでいるため、純度は低く、最大で８０％である。ＷＯ−Ａ−９３０２０８５号の場合、ジアルキルカーボネートトリフルオリド複合体と脂肪酸との存在下でのジアルキルカーボネートの使用により、収率が最大８９％まで向上している。しかし、ＷＯ−Ａ−９３０２０８５号は、毒性で非常に高価なガスたとえばＢＦ3の使用、およびホウ化物とフルオロボライドとを含む排出液の取り扱いに伴う問題を抱えている。
【０００８】
セファロスポリンＣの脱アシル、すなわち７´側鎖（７´−ｌａｔｅｒａｌ  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）の脱離は、通常、化学的に、たとえばギ酸にニトロシルクロリドを溶解させたものを使用し、アセトニトリルの存在下で、実施する（ＵＳ  ３，３６７，９３３号）。もう一つの脱アシルの方法は、アミノペンタン側鎖（ａｍｉｎｏｐｅｎｔｅａｎｏｉｃ  ｃｈａｉｎ）カルボキシル基の保護、−５５℃での五塩化リンとの反応、それに続く、水とメタノールとの混合物による低温での加水分解、を含む（ＢＥ  ７１８，８２４号）。
【０００９】
これらの公知の方法は、一般に、低温で実施する必要があり、また高価で毒性の溶剤または試薬の使用が必要であり、したがってこれらの方法は環境に対して深刻な影響を及ぼしうる。さらに、β−ラクタム核の化学的不安定性と、環の３および７位の基の反応性とのため、特別の反応条件を使用しなければならず、したがって工業的な規模でのこのプロセスの実施は複雑になる。
【００１０】
７−ＡＣＡにいたる化学的方法の欠点を克服するために、代替法として、セファロスポリンＣの酵素による開裂が提案されている。セファロスポリンＣの７−アミノアジピン側鎖の直接的一工程除去が、特異性のセファロスポリンアシラーゼの使用によって可能である（ＦＲ  ２，２４１，５５７号、ＵＳ  ４，７７４，１７９号、ＥＰ  ２８３，２４８号、ＷＯ−Ａ−９５１２６８０号、ＷＯ−Ａ−９６１６１７４号）。しかし、これらの方法は、ＵＳ  ５，２９６，３５８号明細書に述べられているように、再現性がないことが多く、また低収率と長い反応時間という特性を有する。この方法（セファスポリンＣの７−ＡＣＡへの一工程での転換）の工業的応用はいまのところまだ報告されていない（Ｐａｒｍａｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，１，１９９８）。
【００１１】
他方、セファロスポリンＣを二つの酵素工程によって７−ＡＣＡに転換する方法は、工業的な見地から重要である。第一段階は、いろいろな供給源（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、ＧＢ  １，２７２，７６９号；Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、ＥＰ  ０，５１７，２００号；またはＦｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｒｉ  Ｍ−０７１８，ＥＰ  ０，３６４，２７５号）からのＤ−アミノ酸オキシダーゼ（Ｅ．Ｃ．  １．４．３．３、以下「ＤＡＡＯ」と略記する。）を使用することから成る。ＤＡＡＯは、分子酸素の存在下で、セファロスポリンＣのＤ−５−アミド−カルボキシペンタノイル側鎖を酸化して、７β−（５−カルボキシ−５−オキソペント−アミド）−セフ−３−エム−カルボン酸（または、α−ケトアジピル−７−アミノセファロスポラン酸、以下ではα−ケトアジピル−７−ＡＣＡと略記する。）と過酸化水素とを生成する。この過酸化水素は、α−ケトアジピル−７−ＡＣＡから化学的にカルボキシル基を除去して７β−（４−カルボキシブタンアミド）−セフ−３−エム−４−カルボン酸（または、グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸、以下ではＧＬ−７−ＡＣＡと略記する）にする。
【００１２】
第二段階においては、ＧＬ−７−ＡＣＡに対して特異性のあるアシラーゼすなわちグルタリル−７−アシラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．３）が使用される。このアシラーゼは、たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて過剰に発現したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓタイプの微生物のアシラーゼ（ＵＳ  ３，９６０，６６２号、ＥＰ  ０４９６９９３号）であり、ＧＬ−７−ＡＣＡからアシル基を除去して、７−ＡＣＡにする。
【００１３】
この二工程の、７−ＡＣＡを得るための酵素による方法は、すでに工業的規模で使用されている（Ｃｏｎｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．４６，５１０，１９９５）。
【００１４】
３´−複素環チオメチルセファロスポラン酸誘導体を製造するための環境にやさしい代替法が、ＥＰ  ０８４６６９５号の明細書に開示されている。水性媒質中でのグルタリル−７−ＡＣＡの３位の化学的求核置換のあと、グルタリル−７−ＡＣＡアシラーゼ酵素を使用することにより、３´グルタリル−７−ＡＣＡ−誘導体の酵素転換がなされる。この誘導体の量は約６５％であり、また環境に対する影響はない。この手順は酵素−化学−酵素（ＥＣＥ）法と名づけることができる。というのは、分離されたＧＬ−７−ＡＣＡが可溶化セファロスポリンＣのバイオ転換によって得られ、次にＧＬ−７−ＡＣＡが複素環チオールと反応し、最後に３−複素環チオ誘導体がＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼによって酵素処理されるからである。ＷＯ−Ａ−９５３５０２０号の明細書に記載されているように、この方法の問題点は、ＧＬ−７−ＡＣＡの分離が必要であるということであり、ＧＬ−７−ＡＣＡは水溶性が大きいため、この方法には技術的な困難が伴い、また費用がかかる。
【００１５】
もう一つの問題は酵素がわずか２、３サイクルしか再使用できないということである。実際、５−メルカプトトリアゾールとＭＭＴＤに関して、３サイクル以下しか記載されておらず、その場合のＭＭＴＤの残留量は、結晶化後、２．８ｍｇ／ｍｌである。例として使用されている他の二つのチオールは、溶液中に残留するチオール量が大きいため、１サイクルしか使用されていない。これは、５−メルカプト−１−メチルテトラゾール（ＭＭＴＺ）または２，５−ジヒドロ−３−メルカプト−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−トリアジン（ＴＴＺ）の場合であり、これらは非常に水に溶けやすく、ｐＨを低下させても除去することができない。チオールのこの有害な効果は、すでに、セファゾリンの酵素による合成における、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＣＦＣ−０４０１７からのペニシリンＧアミダーゼに対するＭＭＴＤに関して報告されている（Ｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．６９，１，１９９８）。この妨害効果を克服するために、ＭＭＴＤ／７−ＡＣＡモル比を１．２：１に減少させて酵素の寿命が延びるようにしている。この小さなモル比のため、３−チオ誘導体の収率が低下し、また、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ−グルタリル−７−ＡＣＡアシラーゼと、複素環チオールとの化学反応とを使用する酵素−酵素−化学プロセス（ＥＥＣ）が提案されている、３−修飾セファロスポリンの化学−酵素合成に関する他の公表された方法（Ｊｉｓｔｉｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２，９０９９，１９９７）の使用が避けられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、３−セファロスポリンＣ誘導体の製造のための改良された方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明によれば、
３−チオール化７−アミノセファロスポラン酸誘導体を製造するための酵素による方法であって、
式Ｉの３−チオール化セファロスポリンＣ
【化７】
2004537985.tif 000003
を酵素によって転換させて、式ＩＩの３−チオール化−グルタリル−７−ＡＣＡ
【化８】
2004537985.tif 000004
を生成させ、式ＩＩの化合物を酵素によって転換させて、式ＩＩＩの３−チオール化−
７−ＡＣＡ
【化９】
2004537985.tif 000005
を生成させることから成り、
前記各式において、Ｒが少なくとも一つの窒素原子を含む複素環基であり、Ｒ1とＲ2とが両方とも水素原子であるかまたはこれらの一つが水素原子であり他がアシルドナーである、
ことを特徴とする方法、
が提供される。
【００１８】
好ましくは、式Ｉの３−チオール化セファロスポリンＣは、式ＩＩの３−チオール化−グルタリル−７−ＡＣＡに、
式Ｉの化合物を、分子酸素の存在下で、固定化Ｄ−アミノ酸オキシダーゼと反
応させ、
前記支持された酵素を水性反応混合物から分離し、
過酸化水素を加えて、３−チオール化−α−ケトアジピルセファロスポラン酸を式ＩＩの化合物に転換させる
ことによって、転換される。
【００１９】
本発明の一つの実施態様においては、式Ｉの化合物が、約２ｂａｒの絶対圧、
ｐＨ６．０〜８．０、温度２０〜３０℃で、０．５〜３時間にわたって、固定化Ｄ−アミノ酸オキシダーゼと反応させられる。
【００２０】
好ましくは、本発明の方法は、支持された触媒を塩濃厚溶液で洗浄し、このようにして生成される溶液に好ましくは３０〜５０ｐｐｍに相当する量の過酸化水素を加える工程を含む。
【００２１】
もっとも好ましくは、本発明の方法は、溶液から、過剰な過酸化水素を、好ましくは溶液に触媒を加えることによって除去する工程を含む。
【００２２】
本発明の一つの実施態様においては、過剰な過酸化水素が溶液にカタラーゼを加えることによって除去される。好ましくは、式ＩＩの化合物が、式ＩＩの化合物を固定化グルタリル−７−ＡＣＡアシラーゼと接触させることによって、式ＩＩＩの化合物に転換させられる。もっとも好ましくは、式ＩＩの化合物から式ＩＩＩの化合物を生成させる反応は、不活性雰囲気中、周囲圧、ｐＨ６．０〜８．５、温度２０〜３５℃で、０．５〜３時間にわたって実施される。
【００２３】
本発明の一つの実施態様においては、式ＩＩＩの化合物が、反応媒質を酸性化することによって沈殿させられ、そのようにして生成される沈殿がそのあと洗浄され乾燥される。
【００２４】
本発明のもう一つの実施態様においては、酵素が、適当な架橋剤により適当な固体担体に固定化される。好ましくは、酵素は、生体触媒として使用するのに適した寸法の結晶の形である。もっとも好ましくは、この酵素による方法は、酵素を基質水溶液中に分散維持させて実施される。
【００２５】
本発明の一つの実施態様においては、酵素による方法が、一つのカラム内で実施される。
【００２６】
好ましくは、本発明の方法は、再使用のために酵素を回収する工程を含む。
【００２７】
本発明の一つの実施態様においては、式ＩＩＩの化合物の結晶化が酸性ｐＨで実施される。
【００２８】
本発明の一つの視点においては、式ＩＩＩの３チオール化−７−ＡＣＡを生成させるための、式Ｉの３チオール化セファロスポリンＣの酵素による転換が、一つの工程で実施される本発明の方法が提供される。
【００２９】
本発明の一つの実施態様においては、式Ｉの化合物が固体の形または該化合物の非毒性塩の形である。非毒性塩は、人に対して非毒性の、セファロスポリンＣの結晶化で使用される陽イオンを含むことができ、たとえば亜鉛塩とすることができる。
【００３０】
また、本発明は、式ＩＩＩの化合物を生成させてから酵素処理することから成る、セファロスポリンＣ抗生物質とその誘導体とを製造する方法をも提供する。好ましくは、この抗生物質は、セファゾリン、セファゼドン、セフォペラゾン、セファマンドール、セファトリアジン、セフォティアム、またはセフトリアクソンの一つ以上から選択される。
【００３１】
本発明の一つの実施態様によれば、
３−チオール化７アミノセファロスポラン酸誘導体を製造するための酵素による方法であって、
セファロスポリンＣを、一般式ＩＶ
Ｒ−ＳＨ                （ＩＶ）
のチオール化合物と反応させて、式Ｉの化合物を生成させ、
式Ｉの化合物の生成のあと、過剰な式ＩＶのチオールを除去する、
各工程を含み、
式ＩＶにおいて、Ｒが少なくとも一つの窒素原子を含む複素環基である、
ことを特徴とする方法、
が提供される。
【００３２】
好ましくは、過剰なチオールは陰イオン交換樹脂による吸着によって除去される。もっとも好ましくは、陰イオン交換樹脂は、架橋アクリルコポリマー構造を有する微孔質樹脂である。好ましくは、陰イオン交換樹脂は、８％の架橋結合を含むチアルキルベンジルアンモニウム官能基を有する。前記樹脂は、クロリド、ヒドロキシ、ホスフェート、またはアセテートサイクル（ｃｙｃｌｅ）内にあることができる。
【００３３】
本発明の一つの実施態様においては、過剰なチオールが結晶化によって除去される。好ましくは、この結晶化は酸性ｐＨのもとで実施される。もっとも好ましくは、過剰なチオールは、結晶化とそれに続く陰イオン交換樹脂による吸着とによって除去される。
【００３４】
本発明の一つの実施態様においては、セファロスポリンＣは水性媒質中にある。
【００３５】
本発明のもう一つの実施態様においては、セファロスポリンＣは、固体セファロスポリンＣから得られるか、または直接もしくは精製セファロスポリンＣ肉汁から得られるセファロスポリンＣの濃厚溶液の形である。セファロスポリンＣは、セファロスポリンＣの濃厚溶液またはセファロスポリンＣの濃厚肉汁の形とすることができる。
【００３６】
本発明の一つの実施態様においては、反応プロセスが、ｐＨ５．５〜８．０、温度６０〜８０℃で、１〜１２時間にわたって、実施される。好ましくは、この反応は、ｐＨ約６．０、温度約６５℃で、実施される。もっとも好ましくは、チオール化合物が、１〜５ｍｏｌ／（１ｍｏｌのセファロスポリンＣ）の量だけ存在する。
【００３７】
Ｒは、少なくとも一つの窒素原子と随意のイオウまたは酸素原子とを含む複素環基とすることができる。好ましくは、Ｒは、チエニル、ジアゾリル、テトラゾリル、チアゾリル、トリアジニル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、またはこれらの誘導体、好ましくは５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル、１−メチル−１Ｈ−テトラゾル−５−イル、もしくは１，２，５，６−テトラヒドロ−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−トリアジン−３−イルの一つ以上から選択される複素環基である。
【００３８】
本発明の一つの実施態様においては、式Ｉの化合物は固体の形または該化合物の非毒性塩の形である。
【００３９】
本発明は、
本発明の方法によって得られる、式
【化１０】
2004537985.tif 000006
を有し、Ｒが少なくとも一つの窒素原子を含む複素環基である、
ことを特徴とする化合物、
を提供する。
【００４０】
また、本発明は、
式
【化１１】
2004537985.tif 000007
を有し、式Ｉにおいて、Ｒが５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イルであることを特徴とする化合物、
をも提供する。
【００４１】
本発明は、
式
【化１２】
2004537985.tif 000008
を有し、式Ｉにおいて、Ｒが１，２，５，６−テトラヒドロ−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−トリアジン−３−イルであることを特徴とする化合物、
を提供する。
【００４２】
また、本発明は、上で定義した式Ｉの化合物を生成させてから式Ｉの化合物を酵素処理することから成る、セファロスポリンＣ抗生物質とその誘導体とを製造する方法、をも提供する。好ましくは、抗生物質は、セファゾリン、セファゼドン、セフォペラゾン、セァマンドール、セファトリアジン、セフォティアム、およびセフトリアクソンの一つ以上から選択される。
【００４３】
ここでの発見によれば、まず、溶液中で、セファロスポリンＣを、７位の側鎖を酵素によって除去する前に、複素環チオールと反応させる化学−酵素−酵素プロセス（ＣＥＥ）により、３−セファロスポリンＣ誘導体を製造する改良された方法が提供される。
【００４４】
本発明の方法は、下記のように表すことができる。
【００４５】
第一段階：Ｏ2存在下の固定化Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ
【化１３】
2004537985.tif 000009
【００４６】
第二段階：固定化グルタリル−７−ＡＣＡ−アシラーゼ
【化１４】
2004537985.tif 000010
【００４７】
前記式において、Ｒは、少なくとも一つの窒素原子を含み、イオウまたは酸素を有するかまたは有しない複素環基、たとえば、チエニル、ジアゾリル、トリアジニル、トリアゾリル、テトラゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、チアトリアゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、または、前記複素環構造の置換に使用できる任意の可能な部位において置換したこれらの誘導体である。
【００４８】
化合物Ｉの３−チオール化グルタリル−７−ＡＣＡ（化合物ＩＩ）への酵素による転換は、ｐＨ約６．５〜８．０好ましくはｐＨ７．０の水溶液中で実施される。これにより、８よりも大のｐＨレベルでのセファロスポラン化合物の不安定性の増大の問題が避けられる。反応温度は、１５〜３５℃とすることができ、通常は２０℃に固定される。３−チオール化セファロスポリンＣ誘導体の濃度は、３５〜１５０ｍＭの範囲で変えることができる。
【００４９】
分子酸素は、酸化脱アミノ反応のための補基質として作用する。分子酸素は、適当な機械的撹拌下で、底部ディフューザーから、０．０１〜１ｖｏｌ／（溶液単位ｖｏｌ）／ｍｉｎ、好ましくは０．１ｖｖｍの流量で、反応溶液内にスパージする。当業者には明らかなように、撹拌速度は、広範囲の設計パラメータと反応特性とに応じて、変えることができる。通常、撹拌は２０〜５００ｒｐｍの範囲でなされるであろう。バイオリアクターのこの構造は、適当な酸素の移動が起こりにくく、したがって３−チオール化グルタリル−７−ＡＣＡの最終収率が低下する、固定化結晶酵素を含むパーコレーション塔（ｐｅｒｃｏｌａｔｉｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ）の場合に好ましい。
【００５０】
完全な転換に必要な時間は、作業条件に応じて０．５〜３時間の程度であるが、一般に約１時間である。
【００５１】
式Ｉの化合物から式ＩＩの化合物への転換率は大きく、通常、約９８％で、生成物収率は９５％である。反応の終了時にも、反応溶液はまだある程度の未分解の式ＩＶの中間体化合物を含んでおり、これは外部過酸化水素の使用により式ＩＩの化合物に転換される。さらに、式ＩＩの化合物の一部は酵素が固定化されている樹脂に結合して残留しうる。
【００５２】
これらの起こりうる損失の影響を小さくするために、反応器溶液を過圧下で保持タンクに排出し、酵素を、ｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸塩緩衝液で洗浄する。同様の特性を有する他の緩衝剤溶液も使用することができる。この緩衝剤洗浄液を反応溶液と混合し、そのようにして得られる混合物を過酸化水素で滴定し、約２５℃で３０〜５０分かけて、３０〜５０ｐｐｍの溶液最終濃度とし、好ましくは３０分かけて３５ｐｐｍとする。
【００５３】
過剰なＨ2Ｏ2を除去してから、適当な酵素たとえばカタラーゼ、適当な還元剤たとえばピルビン酸、アルカリ性硫酸塩、または可溶もしくは固定化した形の他の適当な触媒による次の工程に進む。本発明においては、Ｈ2Ｏ2の酵素による除去が、最終生成物の品質と純度を保持するために好ましい。
【００５４】
前記処理によって、最終化合物（ＩＩ）収率は９７〜９８％となった。これは、非修飾セファロスポリンＣのグルタリル−７−ＡＣＡへの転換に関して、ＥＰ  ０４９６９９３号明細書に記載されているものよりも３％大きい。
【００５５】
Ｈ2Ｏ2滴定後の最終溶液を、濃厚有機または無機塩基たとえばアンモニアによってｐＨ約７．５〜８．５好ましくはｐＨ８．０に調節してから、適当な湿式固定化（ｗｅｔ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｅｄ）または結晶性グルタリル−７−ＡＣＡアシラーゼ製剤を装填した第二のバイオリアクターに移す。市販の製剤、たとえば Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ が市販しているものが、この目的に適している。ｐＨは、ｐＨ約８．０に固定した自動滴定器を使用して、前記のものと同じ有機または無機塩基を反応に供給することによって、一定に保つ。作業温度は、約１５〜２５℃好ましくは２０℃とすることができる。転換時間は、作業条件に応じて、０．５〜２時間であるが、通常は約１時間である。酵素製剤の微生物汚染を避けるために、窒素流を、穏やかな撹拌をしながら、底部ディフューザーから約０．０１ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｍｉｎの流速で流す。
【００５６】
３−チオール化グルタリル−７−ＡＣＡ誘導体の９７％以上の転換、またはアンモニウム消費速度の初期消費速度の２％への低下によって、反応が完了したものとみなし、この完了後、溶液をろ過して、グルタリル−７−ＡＣＡアシラーゼが固定化されている樹脂を、好ましくは１００ｍＭのｐＨ７．０リン酸塩緩衝液で洗浄する。
【００５７】
二つの酵素段階の終了のあと、３−チオール化−７−ＡＣＡ（化合物ＩＩＩ）の収率は、約９４％である。この化合物を、最終溶液から、無機酸たとえば塩酸、硫酸、もしくはリン酸、またはこれらの酸のいずれかを適当な有機溶剤といろいろな比率で混合したものを使用し、最終生成物の等電点に応じた酸性ｐＨ１．７〜約５．５での結晶化により、採取する。
【００５８】
本発明の方法は、新しいものであり、良好な生成物総収率、より良い品質（色と純度に関して）、簡単な分離、工程の連続操業、および化学反応後に複素環チオールが残存することによる失活を防止することによる酵素の再使用、を可能にする。
【００５９】
本発明による方法は、まず溶液中のセファロスポリンＣを複素環チオールと反応させることにより、３−複素環チオール化−７−アミノセファロスポラン酸を得るための公知の三段階法を非常に大きく改良するものである。この最初の反応は、発酵肉汁から直接に得られるセファロスポリンＣの溶液に関して実施できて便利である。したがって、この方法では、セファロスポリンＣを金属塩として結晶化させる必要がなく、同時に、有機溶剤の使用と回収との必要もなくなる。さらに、この方法はセファロスポリンＣの回収プロセス全体における収量損失を小さくする。３置換誘導体は親物質（ｐａｒｅｎｔ）のセファロスポリンＣに比して溶液中で安定であり、発酵総収率が効率的にさらに増大する。
【００６０】
過剰なチオールの高度に選択的な除去により、式Ｉの化合物を、非常に低濃度（＜０．２ｍｇ／ｍｌ）の複素環チオールの存在下で、非常に高純度で製造することが可能になる。この方法は、いくつかの重要な利点を有する。この方法は、式Ｉの化合物を、酵素の失活なしで、酵素によるプロセスのための基質として使用することを可能にする。したがって、酵素を繰返し使用することができる。さらに、この方法は、毒性試薬の使用を必要とせず、また中間体の分離を必要とせず、したがって連続プロセスが可能である。
【００６１】
強陰イオン交換体Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４００（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ製）による高度に選択的な除去手順を使用し、この手順により、式Ｉの化合物が、非常に低濃度（＜０．２ｍｇ／ｍｌ）の複素環チオールの存在下で得られる。
【００６２】
３´位の求核置換反応が、複素環チオールと任意の非毒性セファロスポリンＣ塩とを水に溶解させた水性媒質中で、水溶性塩を形成する塩基性化合物たとえばアルカリ金属水酸化物、水酸化アンモニウム、または好ましくはアルカリ金属炭酸塩もしくは重炭酸塩を添加することにより、実施される。一般に、前記のようにして生成される塩のほかに、任意の市販のセファロスポリンＣ塩と複素環チオールとを、本発明の方法で、方法の基本構成を変えることなく使用することができる。
【００６３】
複素環チオールとセファロスポリンＣとを別々の反応容器内でまたは一緒に溶解させたあと、両反応物を同じ反応器内で混合するが、その前または後に、溶液をｐＨ値５．５〜８．０で約６０〜８０℃の温度に加熱する。
【００６４】
反応が開始したら、温度とｐＨをそれぞれ好ましくは約６５℃と６．０に、約１〜４時間にわたって維持する。
【００６５】
複素環チオール／セファロスポリンＣのモル比は、反応の収率に関して重要な変数であり、使用するそれぞれの複素環チオールに対して最適化しなければならない。このモル比は、１．０〜４．０であり、好ましくは約４である。
【００６６】
ここでの観察によれば、これらのモル比において、セファロスポリンＣは、チオールを含まないセファロスポリンＣ溶液の場合に比して、きわめて安定で、少ししかβ−ラクタム環分解を起こさない。チオールを含まない場合、セファロスポリンＣは、８０℃で、４０分以内に完全に分解する。
【００６７】
セファロスポリンＣの濃度が初期量の２％を下回ったら、反応混合物を、強鉱酸たとえばハロゲン化水素または酸素酸による、ｐＨの３．０〜５．５好ましくは約５．２への酸性化ありまたはなしで、約２〜１０℃の温度に冷却する。
【００６８】
この酸性化工程により、場合によっては、複素環チオールの結晶化が起こり、新たな反応のための再使用の可能性も与えられる。
【００６９】
酸性化工程ありまたはなしの反応後に得られる溶液に対して、後続の、クロマトグラフィーによる精製が行われる。いろいろな樹脂といろいろなタイプのクロマトグラフィーとが、工業的規模で使用できる。
【００７０】
吸着、親水性−疎水性相互作用、陽イオン交換、および陰イオン交換にもとづいて、四種類の樹脂に分けて、いくつかの樹脂を試験した。吸着に関して試験したすべての樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−７６１、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ７ＨＰ、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  １６ＨＰ、およびＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−４）は、同様の結果を与え、溶出液は２２〜３８％の複素環チオールを含んでいた。疎水性−親水性相互作用樹脂Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０は、チオールを保持していなかった（＜５％）。同様な状況は、陽イオン交換体ＡｍｂｅｒｌｉｔｅR  ＩＲＣ−５０、ＩＲ−１２０、およびＩＲ−２００に関しても見られた。しかし、陰イオン交換体は、弱陰イオン交換体（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−９３）の場合、５７〜６０％複素環チオールの最高の結合能力を有することがわかった。
【００７１】
ここでの観察によれば、８％の架橋結合を含むトリアルキルベンジルアンモニウム官能基を有する強微孔質（ゲルタイプＩ）陰イオン（塩基性）交換樹脂Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４００が、最高の複素環チオール（９２〜９８％）結合と３´位複素環チオメチルセファロスポリンＣ誘導体の小さな結合（２〜１５％、第一サイクルでは１５％よりも小で、その後のサイクルでは５％よりも小）を与えた。
【００７２】
そのような微孔質樹脂はいくつかの利点を与える。これらの樹脂は、あまり壊れやすくなく、取扱いにそれほど注意する必要がなく、大きな負荷特性を有する。これらの樹脂は不連続気孔を有しないので、溶質イオンは、粒子を通って拡散して交換部位と相互作用する。前記樹脂の総交換能力は、１．４ｍｅｑ／ｍｌの程度である。
【００７３】
ここでの驚くべき発見によれば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４００は、セファロスポリンＣの３−複素環チオメチル誘導体に対しては、グルタリル−７−ＡＣＡおよび７−ＡＣＡの同じ誘導体に対してよりも、小さな結合能力を有する。実際、ＭＭＴＤによって製造されたグルタリル−７−ＡＣＡの３−複素環チオメチル誘導体は、カラムに７６．３％のレベルで結合した。同じ結果は、ＭＭＴＤによる、７−ＡＣＡの３−複素環チオメチル誘導体の場合にも見られ、この誘導体は、カラムに９２．７％のレベルで結合した。これら三つの同類β−ラクタム化合物に対するＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４００の予想外の挙動は、グルタリル−７−ＡＣＡおよび７−ＡＣＡと異なり、セファロスポリンＣの側鎖の５位にイオン化可能なアミノ基が存在することによると考えられる。
【００７４】
本発明の方法による複素環チオールの除去は、カラムからの溶出液を修飾セファロスポリンＣの分離なしで酵素処理に使用することができるため、工業的規模の場合に特に有利であり、このやり方は、不純物がカラムに束縛されていてβ−ラクタム誘導体が水によって簡単に溶出する場合、セファロスポリン中間体の分野に対して新しいコンセプトをもたらすものである。
【００７５】
β−ラクタム誘導体が溶出された（＜５％が束縛されて残留している）ならば、一般に、カラムを、いろいろな量の有機溶剤好ましくは１０〜２０％のアセトニトリルを含む強鉱酸たとえばハロゲン化水素の１．５Ｎ溶液によって再生させる。溶出液のチオール濃度が０．２ｍｇ／ｍｌよりも大きい場合、３Ｎ  ＨＣｌと４０％のアセトニトリルとによる強力な再生を実施することができる。あるいは、ＮａＯＨ溶液とＨＣｌ溶液とを順次に使用して再生を実施することができる。
【００７６】
複素環チオールの溶出後、このチオールを濃縮して再使用する。次のサイクルの前に、カラムを脱イオン水ですすいで、過剰な再生剤を除去する。最初の層体積のすすぎは、再生に使用する流量で実施すべきである。残りは吸着流量で実施する。
【００７７】
３−チオール化誘導体（ＴＸＣ）は、非修飾セファロスポリンＣに比して、非常に良い基質であることがわかった。したがって、本発明の方法は、セファロスポリンＣ誘導体の製造のための改良された経済的な方法を提供するものである。
【００７８】
本発明の方法の第二の重要な視点は、酵素を、固体担体上で固定化するかまたは大きな安定化結晶の形にして、再使用できる形で使用することである。この要件は、工程が工業的な規模で実施されるようにするのに重要である。
【００７９】
本発明のもう一つの重要な利点は、過剰なチオールの除去と回収とのあと、化学物質溶液を第一の酵素反応器に移送し、また該反応器から第二の酵素反応器に移送することが容易である、ということである。このことにより、工程を、セファロスポリンＣ濃厚液または用意したバッチ溶液から、非修飾７−ＡＣＡに比して結晶化が容易な３−チオール化−７−ＡＣＡ誘導体までの単一の液体流によって連続的に実施することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８０】
下記の実施形態は、本発明の説明を意図するものであるが、一般性に関して本発明を限定するものではない。
【００８１】
実施例１〜５は、セファロスポリンＣからの、式Ｉの３−チオール化−７−Ａ
ＣＡ誘導体の製造を示す。
【００８２】
実施例６〜１０は、式Ｉの３−チオール化−グルタリル−７−ＡＣＡ誘導体の
生成を経由する、式ＩＩＩの３−チオール化−７−ＡＣＡ誘導体の製造を示す。
【実施例１】
【００８３】
７−β−（５−アミノ−カルボキシペンタンアミド）−３−（５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル チオメチル）−３−セフェム−４−カルボン酸（ＴＤＣ）の製造
【００８４】
６００ｍｌの脱イオン水を入れたガラス内張り反応器に、３１．７３ｇ（０．２４ｍｏｌ）の２−メルカプト−５−メチル−１，３，４−チアジアゾール（ＭＭＴＤ）を加え、撹拌しながら、この反応器を約６５℃の温度に加熱した。混合物のｐＨを、約１０ｇの炭酸ナトリウムの添加により、約６．０に調節した。
【００８５】
別のガラス内張りフラスコで、３３．２３ｇのナトリウムセファロスポリンＣ（７５％遊離酸、０．０６ｍｏｌ）を２００ｍｌの水に溶解させることによって、ナトリウムセファロスポリンＣの濃厚溶液（ＨＰＬＣによる純度９８％）を作った。ＭＭＴＤが溶解してから、このセファロスポリンＣ濃厚溶液を加えて、混合物を約６５℃で２４０分撹拌した。このとき、セファロスポリンＣ濃度が２％よりも低くなるまで、反応速度を制御した。下記の反応速度が観察された。
【００８６】
【表１】
2004537985.tif 000011
【００８７】
次に、反応混合物を約４℃に冷却した。この温度で、過剰なＭＭＴＤの結晶化が開始した。撹拌（１５０ｒｐｍ）しながら、３７％の塩酸（ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  ａｃｉｄ）により、ｐＨを５．２まで酸性化し、結晶化を完了させるために、ゆっくりと撹拌（５０ｒｐｍ）しながら、６０分放置した。
【００８８】
沈殿したＭＭＴＤをろ過し、減圧下、３５℃で乾燥した。２３ｇの回収ＭＭＴＤが得られ（ＨＰＬＣによる純度９９％）、回収率は約９５％であった。
【００８９】
０．０４２ｍｏｌのＴＤＣとＭＭＴＤ０．０１６ｍｏｌとを含むろ液（８２５ｍｌ）のｐＨを、３Ｍのアンモニアによって７．２５に調節し、２０ｍｌ／ｍｉｎの流量の脱イオン水で覆われた、クロリドサイクル内にあるＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４００カラム（層体積＝１８０ｍｌ）に投入した。投入のあと、投入ＴＤＣの９７％（ＨＰＬＣによる純度９４％）が回収されるまで、カラムを脱イオン水（約１００ｍｌ）で洗浄した。流出液のｐＨは、約５．４であり、３Ｍのアンモニアにより中和して７．０にした。残留ＭＭＴＤは０．０００９ｍｏｌ（＜０．２ｍｇ／ｍｌ）であり、これは、ｐＨの減少による結晶化後の残留ＭＭＴＤの６％よりも少ない。この低レベルのＭＭＴＤ（化学反応後のもとのＭＭＴＤの１％よりも小）により、ＴＤＣの酵素処理が可能になる。
【００９０】
一般に、カラムは１０％のアセトニトリルを含む１ｌの１．５Ｍ ＨＣｌで再生してから、２ｌの脱イオン水で洗浄してすすぎ、過剰な再生がなされないようにした。必要であれば（ＭＭＴＤ＞０．２ｍｇ／ｍｌ）、樹脂を、４０％のアセトニトリルを含む、１ｌの３Ｍ ＨＣｌを用いて強再生することができる。
【００９１】
ｐＨ５．０のＴＤＣ溶液の特性をさらに調べるために、該溶液を、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−２吸着カラムに投入し、該カラムを水で洗浄した。洗浄後、樹脂に水による溶出処理を行い、２５ｍｌの部分をいくつか保存した。
【００９２】
９８．５％ＴＤＣ（ＨＰＬＣによる）を含む画分を、凍結乾燥し、分析して下記の結果を得た。
【００９３】
生成物Ｃ17Ｈ20Ｎ5Ｏ6Ｓ3・２Ｈ2Ｏ（ＴＤＣ）の元素分析結果
計算：Ｃ ３７．４２、Ｈ ４．４３、Ｎ １２．８４、Ｓ １７．６３
実験：Ｃ ３７．２７、Ｈ ４．３、Ｎ １３．１１、Ｓ １７．５１
【００９４】
【化１５】
2004537985.tif 000012
【実施例２】
【００９５】
比較例：いろいろなカラムにおける、７−β−（５−アミノ−５−カルボキシペンタンアミド）−３−（５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル チオメチル）−３−セフェム−４−カルボン酸の製造
【００９６】
ＴＤＣ誘導体を実施例１のようにして製造し、該誘導体を含むろ液を、いろいろなタイプの樹脂に投入した。
【００９７】
カラム使用の第一サイクルにおける１００ｍｌの水での洗浄後、下記のデータが得られた。
【００９８】
【表２】
2004537985.tif 000013
【００９９】
Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４００が最善の結果を与えた。ＴＤＣの大量の溶出が見られ、ＭＭＴＤの溶出は少ない。他の陰イオン交換カラムを使用すると、ＭＭＴＤも大量に溶出する。他の陰イオン交換体は、チオールとＴＤＣ双方の大量の結合を示した。
【実施例３】
【０１００】
Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４００に対するＴＤＣの特異性
【０１０１】
グルタリル−７−ＡＣＡと７−ＡＣＡとを出発原料として使用し、実施例１のようにして、グルタリル−７−ＡＣＡ誘導体（ＴＤＧ）と７−ＡＣＡ誘導体（７−ＴＤＡ）を製造した。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４００のろ液から下記のデータが得られた。
【０１０２】
【表３】
2004537985.tif 000014
【０１０３】
ＴＤＣの場合と異なり、ＴＤＧとＴＤＡは、ＭＭＴＤと同様に、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４００に結合したままになると思われる。
【実施例４】
【０１０４】
７−β−（５−アミノ−５−カルボキシペンタンアミド）−３−［（１−メチル−１Ｈ−テトラゾル−５−イル）−チオメチル］−セファロスポラン酸（ＴＺＣ）の製造
【０１０５】
６００ｍｌの脱イオン水を入れたガラス内張り反応器に、２８．１６ｇ（０．２４ｍｏｌ）の５−メルカプト−１−メチルテトラゾール（ＭＭＴＺ）を加え、撹拌しながら、この反応器を約７０℃の温度に加熱した。混合物のｐＨを、約１２ｇの炭酸ナトリウムの添加により、約５．７〜５．８に調節した。
【０１０６】
別のガラス内張りフラスコで、３３．２３ｇのナトリウムセファロスポリンＣ（７５％遊離酸、０．０６ｍｏｌ、ＨＰＬＣによる純度９８％）を２００ｍｌの水に溶解させることによって、ナトリウムセファロスポリンＣの濃厚溶液を作った。ＭＭＴＺが溶解してから、このセファロスポリンＣ濃厚溶液を加えて、混合物を約７０℃で１２０分撹拌した。このとき、セファロスポリンＣ濃度が３％よりも低くなるまで、反応速度を制御した。
【０１０７】
【表４】
2004537985.tif 000015
【０１０８】
反応混合物を約４℃に冷却したが、ｐＨを低下させた場合でも、過剰なＭＭＴＺの結晶化は開始しなかった。ＭＭＴＺからのＴＺＣ誘導体０．０４ｍｏｌとＭＭＴＺ０．１９ｍｏｌとを含む溶液のｐＨを、３Ｍのアンモニアによって７．２５に調節し、２０ｍｌ／ｍｉｎの流量の脱イオン水で覆われた、クロリドサイクル内にあるＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４００カラム（層体積＝１５０ｍｌ）に投入した。カラムの第一パスのあと、残留ＭＭＴＺは初期値の１３％よりも多かった（０．０３２ｍｏｌ）。
【０１０９】
そのため、流出液を、上記と同じ条件の別のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４００（層体積＝６０ｍｌ）カラムに投入し、ＭＭＴＺの濃度を低下させた。
【０１１０】
投入のあと、投入ＴＺＣの９７％（ＨＰＬＣによる純度８７％）が回収されるまで、カラムを脱イオン水（約９０ｍｌ）で洗浄した。流出液のｐＨは、約５．４であり、３Ｍのアンモニアにより中和して７．０にした。残留ＭＭＴＺの濃度は０．００１３ｍｏｌであり、これは、化学反応後のもとのＭＭＴＺの１％よりも少ない。ＭＭＴＺのこの低レベルのため、酵素の失活なしで前記誘導体を酵素処理することが可能になる。
【０１１１】
カラムを１０％のアセトニトリルを含む１ｌの１．５Ｍ ＨＣｌで再生してから、２ｌの脱イオン水で洗浄してすすぎ、過剰な再生がなされないようにした。
【実施例５】
【０１１２】
７−β−（５−アミノ−５−カルボキシペンタンアミド）−３−［（１，２，５，６−テトラヒドロ−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−トリアジン−３−イル）−チオメチル］−セファロスポラン酸（ＴＴＣ）の製造
【０１１３】
６００ｍｌの脱イオン水を入れたガラス内張り反応器に、３７．９６ｇ（０．２４ｍｏｌ）の２，５−ジヒドロ−３−メルカプト−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−トリアジン（以下、ＴＴＺと略記する）を加え、撹拌しながら、この反応器を約７５℃の温度に加熱した。混合物のｐＨを、約１２ｇの炭酸ナトリウムの添加により、約６．７に調節した。
【０１１４】
別のガラス内張りフラスコで、３３．２３ｇのナトリウムセファロスポリンＣ（７５％遊離酸、０．０６ｍｏｌ、ＨＰＬＣによる純度９８％）を２００ｍｌの水に溶解させることによって、ナトリウムセファロスポリンＣの濃厚溶液を作った。ＴＴＺが溶解してから、このセファロスポリンＣ濃厚溶液を加えて、混合物を約７５℃で７５分撹拌した。このとき、セファロスポリンＣ濃度が２％よりも低くなるまで、反応速度を制御した。
【０１１５】
【表５】
2004537985.tif 000016
【０１１６】
反応混合物を約４℃に冷却したが、ｐＨを低下させた場合でも、過剰なＴＴＺの結晶化は開始しなかった。０．０３６ｍｏｌのＴＴＣと０．１９ｍｏｌのＴＴＺとを含む溶液のｐＨを、３Ｍのアンモニアによって７．２５に調節し、２０ｍｌ／ｍｉｎの流量の脱イオン水で覆われた、クロリドサイクル内にあるＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４００カラム（層体積＝２０９ｍｌ）に投入した。第一カラム後、残留ＴＴＺは０．０１５ｍｏｌであった。
【０１１７】
そのため、流出液を、上記と同じ条件の別のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４００カラム（層体積同じ）に投入し、ＴＴＺの濃度を低下させた。
【０１１８】
投入のあと、投入ＴＴＣの６０％（ＨＰＬＣによる純度９０％）が回収されるまで、カラムを脱イオン水（約１２０ｍｌ）で洗浄した。流出液のｐＨは、約５．４であり、３Ｍのアンモニアにより中和して７．０にした。残留ＴＴＺの濃度は０．０００９６ｍｏｌであり、これは、化学反応後のもとのＴＴＺの１％よりも少ない。ＴＴＺのこのレベルのため、酵素の失活なしで誘導体を酵素処理することが可能になる。
【０１１９】
カラムを１０％のアセトニトリルを含む１ｌの１．５Ｍ ＨＣｌで再生してから、２ｌの脱イオン水で洗浄してすすぎ、過剰な再生がなされないようにした。
【実施例６】
【０１２０】
７−アミノ−３−［（５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）−チオメチル］−セファロスポラン酸（ＴＤＡ）の製造
【０１２１】
実施例１の強陰イオン交換体Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（スペイン国登録商標） ＩＲＡ−４００からのろ液（９２５ｍｌ）を、３ＭのアンモニアによってｐＨ７．０に調節した。このろ液は、０．０４１ｍｏｌの７β−（５−アミノ−５−カルボキシペンタアミド−３−［（５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）−チオメチル］−セファロスポラン酸（以下ＴＤＣと略記、純度９４．４％（ＨＰＬＣ））と、０．２ｍｇ／ｍｌよりも少ない２−メルカプト−５−メチル−１，３，４−チアジアゾール（ＭＭＴＤ）とを含む。
【０１２２】
このＴＤＣ溶液を、国際公開ＷＯ−Ａ−９５１６７７３号の明細書に記載されているようにして製造された、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社が市販している、湿式固定化Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを、８２．５ｇ（３０．３  Ｒｏｃｈｅ単位／ｇ）を入れた１．５ｌの撹拌反応器に投入した。
【０１２３】
転換は、２０℃、４００ｒｐｍで、底部ディフューザーから絶対圧２ｂａｒの流量０．１ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｍｉｎの酸素流を送りながら、実施した。ｐＨを、自動滴定器により、３Ｍのアンモニアで、７．０になるように滴定した。
【０１２４】
転換を、逆相カラムＮｕｃｌｅｏｓｉｌ  １２０  ３−Ｃ１８  １２５×８×４ｍｍによるＨＰＬＣによって制御した。移動相は、１ｍｌ／ｍｉｎの、４％のアセトニトリルを含むｐＨ５．５の２０ｍＭ酢酸アンモニウム（ａｃｅｔａｔｅ  ａｍｍｏｎｉｕｍ）であり、また２６０ｎｍの検出器を使用する。７．０分で、ＴＤＣが現れ、８．５分で、α−ケトアジピル中間体、１１．５分で、ＴＤＧ（３−チオール化グルタリル−７−ＡＣＡ）が現れた。
【０１２５】
反応混合物から酵素以外の代表サンプルを採取した。得られた結果を下記の表に示す。
【０１２６】
【表６】
2004537985.tif 000017
【０１２７】
ＴＤＣの転換率が９８％よりも大きくなったとき、反応を停止させ、反応溶液をろ過除去した。残留生体触媒を、ｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸塩緩衝液１００ｍｌで洗浄した。この洗浄液をはじめのろ液に加えた。
【０１２８】
残留α−ケトアジピル−チオール化誘導体（ＴＤＫ）をＴＤＧに転換するために、得られた溶液を、２５℃で、３０分間、１Ｍの過酸化水素で、３５ｐｐｍになるまで滴定した。この転換を、ＴＤＧの生成が最大になるまで（前記表参照）、ＨＰＬＣによって制御した。処理後の純度は、ＴＤＧが９２．６５％、他のβ−ラクタムが７．３４％であった。
【０１２９】
残留過酸化水素を、５分間かけて、１０μｌの可溶性Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍカタラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社が市販しているもの、６５０ｋＵ）を添加することにより、除去した。
【０１３０】
得られたＴＤＧ溶液を、３Ｍのアンモニアによって、ｐＨ８．０に調節し、５７．０８ｇ（８７．６Ｒｏｃｈｅ単位／ｇ）の、湿式固定化グルタリル−７−ＡＣＡアシラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社が市販しているもの）を入れた１．５ｌの撹拌反応器に移した。転換は、２０℃、２５０ｒｐｍで、底部ディフューザーから周囲圧の流量０．０１ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｍｉｎの窒素流を送りながら、実施した。ｐＨ値を、自動滴定器により、３Ｍのアンモニアで、８．０になるように滴定した。この転換を、Ｄ−ＡＡＯ反応の場合と同じ条件でＨＰＬＣによって制御した。生成物７−アミノ−３−［（５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）−チオメチル］−セファロスポラン酸（以下、ＴＤＡと略記する）の保持時間は、７．２分であった。
【０１３１】
反応混合物から代表サンプルを採取した。得られた結果を下記の表に示す。
【０１３２】
【表７】
2004537985.tif 000018
【０１３３】
ＴＤＧの転換率が９７％よりも大きくなったとき、反応を停止させ、反応溶液をろ過除去した。残留酵素を、ｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸塩緩衝液１００ｍｌで洗浄し、残留触媒が再使用できるようにした。この洗浄液を、ＴＤＡを含むろ液に加え、１０℃に冷却した。ｐＨを、濃硫酸によって５．２に調節し、６０分間、ゆっくりと撹拌しながら、結晶化が起こるようにした。
【０１３４】
沈殿をろ過してから、順次に、２５０ｍｌの５０％アセトン／水と１００ｍｌのアセトンで洗浄し、ふたたびろ過してから、３５℃、減圧下で乾燥し、実質的に純粋の７−アミノ−３−［（メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）−チオメチル］−セファロスポラン酸１３．９１ｇ（Ｋ．Ｆ．１．８１％）を得た。この生成物は、ＨＰＬＣ純度９８．２％と４２０ｎｍにおける透過率８７（２％ＮａＨＣＯ3に１％含まれる溶液として決定；１ｃｍセル）とを有する。
【０１３５】
このＣＥＥプロセスにおける、出発セファロスポリンＣ溶液（遊離酸の活性グラム数（ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｇｒａｍｓ）２４．９２）からＴＤＡへの総収率は、６４．６％であった。
【０１３６】
【化１６】
2004537985.tif 000019
【０１３７】
元素分析：
Ｃ11Ｈ12Ｎ4Ｓ3Ｏ3に関する計算値：Ｃ  ３８．３６％、Ｈ  ３．５１％、Ｓ  ２７．９３％、Ｎ  １６．２７％。実験値：Ｃ  ３８．３５％、Ｈ  ３．４％、Ｓ  ２８．００％、Ｎ  １６．０４％。
【実施例７】
【０１３８】
酵素の再使用における、ＴＤＣ溶液中に存在する複素環チオールの影響
【０１３９】
ＴＤＣの二段階酵素処理における残留複素環チオールの失活効果を調べるために、ＴＤＣを、強陰イオン交換体Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＡ−４００によるクロマトグラフィーでの複素環チオールの除去ありまたはなしで使用した。結晶化工程後のＭＭＴＤの濃度は、２．５６ｍｇ／ｍｌであった。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＡ−４００強陰イオン交換体によるクロマトグラフィー工程後、ＭＭＴＤの量は０．２ｍｇ／ｍｌよりも少なく、この数値ははじめに使用したＭＭＴＤの１％よりも少ない。
【０１４０】
下記の表は、クロマトグラフィー工程がない場合にＤ−アミノ酸オキシダーゼ時間の長さは４サイクル後に二倍になるが、痕跡量のＭＭＴＤしか含まないＴＤＣの場合、１２サイクル後にも同じままである（およそ１００分）、ということを示している。
【０１４１】
【表８】
2004537985.tif 000020
【０１４２】
第二の酵素グルタリル−７−ＡＣＡ−アシラーゼの場合には、第一の反応後に生成および添加される過酸化水素が痕跡量のＭＭＴＤを破壊し、酵素の触媒活性が保持され、反応時間が約５０分となる、と考えられる。
【実施例８】
【０１４３】
７−アミノ−３−［（１−メチル−１Ｈ−テトラゾル−５−イル）−チオメチル］−セファロスポラン酸（ＴＺＡ）の合成
【０１４４】
実施例４の強陰イオン交換体Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（スペイン国登録商標） ＩＲＡ−４００からのろ液（１０００ｍｌ）を、３ＭのアンモニアによってｐＨ７．２５に調節した。このろ液は、純度９１．３％（ＨＰＬＣ）の、０．０３９ｍｏｌの７−（５´−アミドアジパミド）−３−［（１−メチル−１Ｈ−テトラゾル−５−イル）−チオメチル］−セファロスポラン酸（ＴＺＣ）と、０．２ｍｇ／ｍｌよりも少ない５−メルカプト−１−メチルテトラゾール（ＭＭＴＺ）とを含む。
【０１４５】
このＴＺＣ溶液を、国際公開ＷＯ−Ａ−９５１６７７３号の明細書に記載されているようにして製造された、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社が市販している、湿式固定化Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを、８２．５ｇ（３０．３  Ｒｏｃｈｅ単位／ｇ）入れた１．５ｌの撹拌反応器に投入した。
【０１４６】
転換は、２０℃、４００ｒｐｍで、底部ディフューザーから絶対圧２ｂａｒの流量０．１ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｍｉｎの酸素流を送りながら、実施した。ｐＨを、自動滴定器により、３Ｍのアンモニアで、７．２５になるように滴定した。
【０１４７】
転換を、逆相カラムＮｕｃｌｅｏｓｉｌ  １２０  ３−Ｃ１８  １２５×８×４ｍｍによるＨＰＬＣによって制御した。移動相は、１ｍｌ／ｍｉｎの、４％のアセトニトリルを含むｐＨ５．５の２０ｍＭ酢酸アンモニウムであり、また２６０ｎｍの検出器を使用する。３．０分で、ＴＺＣが現れ、３．６分で、α−ケトアジピル中間体、４．６分で、ＴＺＧ（３−チオール化グルタリル−７−ＡＣＡ）が現れた。
【０１４８】
反応混合物から酵素以外の代表サンプルを採取した。得られた結果を下記の表に示す。
【０１４９】
【表９】
2004537985.tif 000021
【０１５０】
ＴＺＣの転換率が９９％よりも大きくなったとき、反応を停止させ、反応溶液をろ過除去した。残留生体触媒を、ｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸塩緩衝液１００ｍｌで洗浄した。この洗浄液をはじめのろ液に加えた。
【０１５１】
残留α−ケトアジピル−チオール化誘導体（ＴＺＫ）をＴＺＧに転換するために、得られた溶液を、２５℃で、３０分間、１Ｍの過酸化水素で、３５ｐｐｍになるまで滴定した。この転換を、ＨＰＬＣによって制御した（前記表参照）。処理後の純度は、ＴＺＧが８９．４５％、他のβ−ラクタムが１０．５５％であった。
【０１５２】
残留過酸化水素を、５分間かけて、１０μｌの可溶性Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍカタラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社が市販しているもの、６５０ｋＵ）を添加することにより、除去した。
【０１５３】
得られたＴＺＧ溶液を、３Ｍのアンモニアによって、ｐＨ８．０に調節し、５７．０８ｇ（８７．６Ｒｏｃｈｅ単位／ｇ）の、湿式固定化グルタリル−７−ＡＣＡアシラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社が市販しているもの）を入れた１．５ｌの撹拌反応器に移した。転換は、２０℃、２５０ｒｐｍで、底部ディフューザーから周囲圧の流量０．０１ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｍｉｎの窒素流を送りながら、実施した。ｐＨ値を、自動滴定器により、アンモニアで、８．０になるように滴定した。この転換を、Ｄ−ＡＡＯ反応の場合と同じ条件でＨＰＬＣによって制御した。生成物７−アミノ−３−［（５−メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）−チオメチル］−セファロスポラン酸（以下、ＴＺＡと略記する）の保持時間は、３．２分であった。
【０１５４】
反応混合物から代表サンプルを採取した。得られた結果を下記の表に示す。
【０１５５】
【表１０】
2004537985.tif 000022
【０１５６】
ＴＺＧの転換率が９９％よりも大きくなったとき、反応を停止させ、反応溶液をろ過除去した。残留酵素を、ｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸塩緩衝液１００ｍｌで洗浄し、残留触媒が再使用できるようにした。この洗浄液を、ＴＺＡを含むろ液に加え、１０℃に冷却した。ｐＨを、濃硫酸によって５．２に調節し、６０分間、ゆっくりと撹拌しながら、結晶化が起こるようにした。
【０１５７】
沈殿をろ過してから、順次に、２５０ｍｌの５０％アセトン／水と１００ｍｌのアセトンで洗浄し、ふたたびろ過してから、３５℃、減圧下で乾燥し、実質的に純粋の７−アミノ−３−［（メチル−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）−チオメチル］−セファロスポラン酸９．９４ｇ（Ｋ．Ｆ．１．４％）を得た。この生成物は、ＨＰＬＣ純度９６．６０％を有する。
【０１５８】
このＥＣＣプロセスにおける、出発セファロスポリンＣ溶液（遊離酸の活性グラム数２４．９２）からＴＺＡへの総収率は、４８．０５％であった。
【０１５９】
【化１７】
2004537985.tif 000023
【実施例９】
【０１６０】
酵素の再使用における、ＴＺＣ溶液に存在する複素環チオールの影響
【０１６１】
ＴＺＣの二段階酵素処理における残留複素環チオールの失活効果を調べるために、ＴＺＣを、強陰イオン交換体Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＡ−４００によるクロマトグラフィーでの複素環チオールの除去ありまたはなしで使用した。化学反応工程後のＭＭＴＺの濃度は、２７．６ｍｇ／ｍｌであった。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（スペイン国登録商標）ＩＲＡ−４００強陰イオン交換体によるクロマトグラフィー工程後、ＭＭＴＺの量は０．２ｍｇ／ｍｌよりも少なく、この数値は使用ＭＭＴＺの１％よりも少ない。
【０１６２】
下記の表は、二つのクロマトグラフィー工程がない場合にＤ−アミノ酸オキシダーゼ反応の長さは２サイクル目に少し増大するが、グルタリル−７−ＡＣＡアシラーゼの場合には非常に強い影響が見られ、第二反応の第二サイクルを終了させることはできなかった。
【０１６３】
【表１１】
2004537985.tif 000024
【０１６４】
しかし、どちらの酵素の場合にも、クロマトグラフィー工程ありの場合のサイクル時間は、上記表に示す５サイクルにおいて、大体同じままである。これは、酵素の安定性のためには、チオール除去が必要であることをはっきりと示している。
【実施例１０】
【０１６５】
７−アミノ−３−［（１，２，５，６−テトラヒドロ−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−トリアジン−３−イル）−チオメチル］−セファロスポラン酸（ＴＴＡ）の製造
【０１６６】
実施例５の強陰イオン交換体Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標） ＩＲＡ−４００からのろ液（１０００ｍｌ）を、３ＭのアンモニアによってｐＨ７．２５に調節した。このろ液は、純度８８％（ＨＰＬＣ）の、０．０３２ｍｏｌの７β−（５−アミノ５−カルボキシペンタアミド）−３−［（１，２，５，６−テトラヒドロ−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−トリアジン−３−イル）−チオメチル］−セファロスポラン酸（以下、ＴＴＣと略記する）と、０．２ｍｇ／ｍｌよりも少ない２，５−ジヒドロ−３−メルカプト−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−トリアジン（ＴＴＺ）とを含む。
【０１６７】
このＴＴＣ溶液を、ＷＯ９５／１６７７３号明細書に記載されているようにして製造された、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社が市販している、湿式固定化Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを、８２．５ｇ（３０．３  Ｒｏｃｈｅ単位／ｇ）入れた１．５ｌの撹拌反応器に投入した。
【０１６８】
転換は、２０℃、４００ｒｐｍで、底部ディフューザーから絶対圧２ｂａｒの流量０．１ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｍｉｎの酸素流を送りながら、実施した。ｐＨを、自動滴定器により、３Ｍのアンモニアで、７．２５になるように滴定した。
【０１６９】
転換を、逆相カラムＮｕｃｌｅｏｓｉｌ  １００−５  Ｃ１８  ２５０×８×４．６ｍｍによるＨＰＬＣによって制御した。移動相は、１ｍｌ／ｍｉｎの、１０ｍＭの硫酸水素テトラブチルアンモニウムと１５ｍＭのリン酸二水素ナトリウムとを含む２５％のメタノールであり、また２６０ｎｍの検出器を使用する。４．３分で、ＴＴＣが現れ、６．８分で、α−ケトアジピル中間体、８．２分で、３−チオール化グルタリル−７−ＡＣＡ（ＴＴＧ）が現れた。
【０１７０】
反応混合物から酵素以外の代表サンプルを採取した。得られた結果を下記の表に示す。
【０１７１】
【表１２】
2004537985.tif 000025
【０１７２】
ＴＴＣの転換率が９７％よりも大きくなったとき、反応を停止させ、反応溶液をろ過除去した。残留生体触媒を、ｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸塩緩衝液１００ｍｌで洗浄した。この洗浄液をはじめのろ液に加えた。
【０１７３】
残留α−ケトアジピル−チオール化誘導体（ＴＴＫ）をＴＴＧに転換するために、得られた溶液を、２５℃で、３０分間、１Ｍの過酸化水素で、３５ｐｐｍになるまで滴定した。この転換を、ＨＰＬＣによって制御した（前記表参照）。処理後の純度は、ＴＴＧが８０．７７％、他のβ−ラクタムが１９．２３％であった。
【０１７４】
残留過酸化水素を、５分間かけて、１０μｌの可溶性Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍカタラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社が市販しているもの、６５０ｋＵ）を添加することにより、除去した。
【０１７５】
得られたＴＴＧ溶液を、３Ｍのアンモニアによって、ｐＨ８．０に調節し、５７．０８ｇ（８７．６Ｒｏｃｈｅ単位／ｇ）の、湿式固定化グルタリル−７−ＡＣＡアシラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社が市販しているもの）を入れた１．５ｌの撹拌反応器に移した。転換は、２０℃、２５０ｒｐｍで、底部ディフューザーから周囲圧の流量０．０１ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｍｉｎの窒素流を送りながら、実施した。ｐＨ値を、自動滴定器により、アンモニアで、８．０になるように滴定した。
【０１７６】
この転換を、Ｄ−ＡＡＯ反応の場合と同じ条件でＨＰＬＣによって制御した。生成物７−（５´−アミドアジパミド）−３−［（１，２，５，６−テトラヒドロ−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−トリアジン−３−イル）−チオメチル］−セファロスポラン酸（ＴＴＡ）の保持時間は、５．２分であった。
【０１７７】
反応混合物から代表サンプルを採取した。得られた結果を下記の表に示す。
【０１７８】
【表１３】
2004537985.tif 000026
【０１７９】
ＴＴＧの転換率が９９％よりも大きくなったとき、反応を停止させ、反応溶液をろ過除去した。残留酵素を、ｐＨ７．０のリン酸塩緩衝液１００ｍｌで洗浄し、残留触媒が再使用できるようにした。この洗浄液を、ＴＴＡを含むろ液に加え、１０℃に冷却した。ｐＨを、濃塩酸によって４．２に調節し、６０分間、ゆっくりと撹拌しながら、結晶化が起こるようにした。
【０１８０】
沈殿をろ過してから、順次に、２５０ｍｌの５０％アセトン／水と１００ｍｌのアセトンで洗浄し、ふたたびろ過してから、４０℃、減圧下で乾燥し、実質的に純粋の７−（５´−アミドアジパミド）−３−［（１，２，５，６−テトラヒドロ−２−メチル−５，６−ジオキソ−１，２，４−チアジン−３−イル）−チオメチル］−セファロスポラン酸８．５３ｇ（Ｋ．Ｆ．５．９５％）を得た。この生成物は、ＨＰＬＣ純度９８．２８％を有する。
【０１８１】
このＥＣＣプロセスにおける、出発セファロスポリンＣ溶液（遊離酸の活性グラム数２４．９２）からＴＴＡへの総収率は、４０．０１％であった。
【０１８２】
【化１８】
2004537985.tif 000027
【０１８３】
本発明は、前記実施形態に限定されるものではなく、細部においては変更することができる。
【国際公開パンフレット】
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2004537985.tif 000038
2004537985.tif 000039
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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