(57)【要約】新規なクラスの抗腫瘍化合物がアクチノマドラ属ｓｐ．に属する新規な海洋微生物である株ＰＯ１３−０４６から単離され、化合物ＩＢ−００２０８と名づけられた。式（Ｉ）又は（ＩＩ）のクラスであって、Ｒ１が、水素、アシル、アルキル、アルケニル、アリール、ベンジル、アルカリ金属及び／又は糖であり得、Ｒ２及びＲ３は、水素、アルキルであるか、Ｒ２及びＲ３が一緒に不飽和結合を形成し得る。そのような化合物は、数種の癌細胞ライン及びグラム陽性細菌に対する興味深い活性を呈した。
2004501924.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式：
【化１】
2004501924.tif 000015
（式中、Ｒ１は、同じでも異なっていてもよく、水素、アシル、アルキル、アルケニル、アリール、ベンジル、アルカリ金属及び／または糖であり得、並びにＲ２及びＲ３は、水素、アルキルであり得るか、またはＲ２及びＲ３が一緒に不飽和結合を形成し得る。）により表される化合物。
【請求項２】
式：
【化２】
2004501924.tif 000016
により表される請求項１の化合物。
【請求項３】
化合物ＩＢ−００２０８を製造するための方法であって、前記方法が、水性栄養培地中でそれを産生し得る微生物の株を培養することを含む方法。
【請求項４】
前記培養したブロスから、化合物ＩＢ−００２０８を単離及び精製することを更に含む請求項３の方法。
【請求項５】
前記ＩＢ−００２０８産生生物が、スペイン、バレンシア大学、コレクシオン　エスパニョーラ　デ　カルチボス　ティポから受託番号ＣＥＣＴ　５３１８として入手可能な実質的に純粋な培養株ＰＯ１３−０４６である請求項４の方法。
【請求項６】
海洋無脊椎動物から単離された実質的に純粋な培養株ＰＯ１３−０４６であって、テルモモノストラセアエ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）科に属し、アクチノマドラｓｐ．と分類学的に分類されてきた株。
【請求項７】
請求項１の化合物及び薬学的に許容可能な担体を含有する抗腫瘍薬学組成物。
【請求項８】
請求項２の化合物ＩＢ−００２０８及び薬学的に許容可能な担体を含有する抗腫瘍薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリシクロキサントン（ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ ｘａｎｔｈｏｎｅ）及びそれらの腫瘍に対する使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
セルビノマイシン（ｃｅｒｖｉｎｏｍｙｃｉｎｓ）（ＥＰ００２４６０９１；ＥＰ００５４８０１；Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９８２、３５、６４５−６５２；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８６、１０８、６０８８−６０８９、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９８７、４０、３０１−３０８；Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９９４、４７、３４２−３４８；ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９８６、３９、１６３６−１６３９及びＥＰ０２５９４９６）並びにシトレアミシン（ｃｉｔｒｅａｍｉｃｉｎｓ）（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９８９、４２、８４６−８５１；Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９９０、４３、５０４−５１２；ＥＰ０４０５１５１）は、天然抗生物質のファミリーの構成員であり、これらは全て、より大きいポリシクロ骨格内に組み込まれたキサントンに基くユニットを有する。
【０００３】
これらの化合物は、好気性及び嫌気性細菌及びマイコプラズマに対する強力な活性を示したが、セルビノマイシンのみが抗腫瘍活性を呈示することが記載されている（ＥＰ０２４６０９１）。
【０００４】
【化３】
2004501924.tif 000003
Ｒ＝Ｍｅ、セルビノマイシンＡ２
Ｒ＝Ｈ、１８−Ｏ−デメチル  セルビノマイシンＡ２
【０００５】
我々は、最近、シトレアミシンの抗腫瘍活性もＰＣＴ／ＧＢ０１／０２１４８に記載した。
【０００６】
【化４】
2004501924.tif 000004
2004501924.tif 000005
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
新規な抗癌薬が、多くのヒト腫瘍に対する治療のために依然として必要とされている。従って、本発明の目的は、ポリシクロキサントン構造を有する新規な抗腫瘍剤を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、治療が必要な患者に活性化合物を投与するための薬学的組成物を提供することである。
【０００９】
さらに他の目的は、適切な栄養培地中で生物学的に純粋な生体の培養を使用する制御された好気発酵によるポリシクロキサントンの製造に向けられ、また、発酵培養液からそれを回収及び濃縮するための方法を提供すること、さらには、活性化合物の最終精製に向けられている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、細菌から単離された新規化合物ＩＢ−００２０８の発見に基き見出された新規クラスの活性キサントン化合物であって、次の式：
【化５】
2004501924.tif 000006
【００１１】
を有する抗腫瘍医薬として有用なものを提供する。
【００１２】
即ち、本発明は、一般式：
【化６】
2004501924.tif 000007
【００１３】
（式中、Ｒ１は、同じでも異なっていてもよく、水素、アシル、アルキル、アルケニル、アリール、ベンジル、アルカリ金属及び／または糖であり得、Ｒ２及びＲ３は、水素、アルキルであり得るか、または一緒に不飽和結合を形成し得る。）を有する化合物を提供する。
【００１４】
本発明は、ＩＢ−００２０８を入手するプロセスを含む、そのような化合物を製造するためのプロセスも提供する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
ＩＢ−００２０８及び関連する化合物は、ヒト腫瘍、例えば、ヒト肺癌、ヒト大腸癌、ヒト黒色腫等に対する抗腫瘍活性を示す。従って、本発明には、悪性腫瘍に対して感受性があり、それらにより冒されたいずれものヒトを治療する方法が含まれる。この方法には、治療的に有効量の化合物またはその薬学的組成物を冒された個人に投与することが含まれる。
【００１６】
本発明は、活性成分として化合物ＩＢ−００２０８又はそのいずれもの誘導体、又はその薬学的に許容され得る塩を含有する薬学的処方、さらにはその製造のためのプロセスにも関する。薬学的に許容され得る担体（ｃａｒｒｉｅｒ）が使用される。
【００１７】
薬学的組成物は、典型的には、活性化合物から処方され、固形物（錠剤、丸薬、カプセル、顆粒等）又は液体（溶液、サスペンジョン又はエマルジョン）を、いずれもの担体又は他の薬学的に活性な化合物と併用して含む。
【００１８】
ＩＢ−００２０８又はその誘導体の薬学的組成物の正確な投与量は、具体的な化合物、処方、投与方法、並びに治療される宿主及び腫瘍の位置に応じて変化するであろう。
【００１９】
他の要素、例えば、体重、性、食事、投与時期、排泄の割合（ｒａｔｅ）、宿主の状態、薬剤組み合わせ、反応感度および疾病の重篤さを考慮すべきであろう。投与は、最大耐量の範囲内で、連続的に又は周期的に実行することができる。
【００２０】
アシル基は、脂肪族アシル、芳香族アシル又は混在した脂肪族／芳香族アシルであり得る。すなわち、アシル基は、例えば、式ＲＣＯ−（式中、Ｒは、アルキル基、アルケニル基、アリール基、アラルキル基又はアルキルアリール基である。）であり得る。ベンゾイルが例に含まれる。
【００２１】
アルキル基は、典型的には、１ないし１８個の炭素原子を有する。アルキル基は、好ましくは１ないし約１２個の炭素原子を有し、より好ましくは１ないし約８個の炭素原子を有し、さらにより好ましくは１ないし約６個の炭素原子を有し、最も好ましくは、１、２、３又は４個の炭素原子を有する。メチル、エチル、及びイソプロピルを含むプロピルが、本発明の化合物において特に好ましいアルキル基である。本明細書において、アルキルの用語は、別段の修飾がない限り、環状基及び非環状基の両者をいう。もっとも、環状基は、少なくとも３個の炭素環構成員を有するであろう。アルキル基は、直鎖又は分岐鎖であり得る。
【００２２】
アルケニル基は、典型的には、１ないし１８個の炭素原子を有する。本発明の化合物において好ましいアルケニル基は、１又はそれ以上の不飽和結合、及び２ないし約１２個の炭素原子を有し、より好ましくは、２ないし約８個の炭素原子を有し、更により好ましくは２ないし約６個の炭素原子を有し、さらにより好ましくは２、３又は４個の炭素原子を有する。本明細書において、アルケニルの用語は、環状基及び非環状基の両者をいう。もっとも、直鎖又は分岐非環状基が一般的にはより好ましい。
【００２３】
アリール基は、炭素環又は複素環であり得、１又はそれ以上の縮合環を有することができる。炭素環アリール基は、典型的には、フェニル又はナフチルのように、６又は１０個の炭素原子を有する。複素環アリール基は、典型的には、５ないし１２個の原子を有し、通常は、４、５、６、１０、１１又は１２個の原子を有し、これらのうち、通常、酸素、硫黄又は窒素から選択される１、２、３個又はそれ以上のヘテロ原子が存在する。本発明の化合物において好適な複素環アリール基には、８−クマリニルを含むクマリニル、８−キノリニルを含むキノリニル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジル、フリル、ピロリル、チエニル、チアゾリル、オキサゾリル、イミダゾリル、インドリル、ベンゾフラニル及びベンゾチアゾールが含まれる。
【００２４】
特筆すべきアルカリ金属には、ナトリウム又はカリウムが含まれる。
【００２５】
置換基として使用される糖は、典型的には、モノ−、ジ−、又はトリ−サッカリドであり、好ましくは、モノ−又はジ−サッカリドである。ペントース又はヘキソース化合物が好ましい。誘導体には、糖グリコシド、Ｎ−グリコシルアミン、Ｏ−アシル誘導体、Ｏ−メチル誘導体、糖アルコール、糖酸、デオキシ糖及び関連する化合物が含まれる。ＩＢ−００２０８のトリメチルデオキシピラノース  ヘキソースが例に含まれる。
【００２６】
本発明では、新規なポリシクロキサントンＩＢ−００２０８であって、微生物、好ましくはアクチノマドラ（Ａｃｔｉｏｎｏｍａｄｕｒａ）  ｓｐ．  ＰＯ１３−０４６の発酵培養液から単離されるものを説明する。アクチノマドラ  ｓｐ．ＰＯ１３−０４６の培養物は、受託番号ＣＥＣＴ  ５３１８で、スペイン、バレンシア大学、コレクシオン  エスパニョーラ  デ  カルチボス  ティポ（Ｃｏｌｅｃｃｉｏｎ Ｅｓｐａｎｏｌａ ｄｅ Ｃｕｌｔｉｖｏｓ Ｔｉｐｏ）に寄託されている。この寄託は、ブタペスト条約の規定に基いてなされており、その公衆への入手可能性の全ての制限は、本出願への特許付与後に行われるであろう。
【００２７】
上記微生物株は、ビスケイ湾（Ｂａｙ ｏｆ Ｂｉｓｃａｙ）において採取された正体不明の海洋多毛類から単離された。
【００２８】
寄託された微生物が明らかに好ましいが、本発明は、いずれの特定の株又は生体にも制限又は限定されるものではない。本発明は、他のＩＢ−００２０８産生生体、株又は変異体を本発明の範疇に含むことを意図する。
【００２９】
適切な培地内で制御された条件下に培養されるアクチノマドラ  ｓｐ．  ＰＯ１３−０４６は、抗生物質ＩＢ−００２０８を産生する。この株は、好ましくは、水性栄養培地内で、好気及び中温条件下に成長する。
【００３０】
抗生物質ＩＢ−００２０８は、好適な混合溶媒、例えば、ＣＨＣｌ３：ＣＨ３ＯＨ：Ｈ２Ｏを用いて菌糸塊から抽出することにより単離され得る。活性は、下層に濃縮される。２回の連続抽出による抽出物を合わせ、真空中で蒸発乾固させることができる。
【００３１】
粗活性抽出物からのＩＢ−００２０８の分離及び精製は、従来のクロマトグラフィー技術の適当な組み合わせを使用することにより行うことができる。
【００３２】
発酵は、分画の抗腫瘍活性により、又は濃Ｈ２ＳＯ４中のバニリンにより可視化されるＴＬＣにより、又はホトダイオードアレイ及びＭＳ検出器を用いた分析ＨＰＬＣにより誘導され得る。ＨＰＬＣ分析は、分析カラム  シンメトリー（Ｓｙｍｍｅｔｒｙ）  Ｃ１８（５μｍ）を用いて、動相として、メタノール：Ｈ２Ｏ：酢酸  ９９：１：１及び流速０．３ｍｌ／分及び３２５ｎｍでプロットすることにより室温で行われる。図９に示すように、この条件下では、ＩＢ−００２０８保持時間は、４．５分である。
【００３３】
さまざまな分光特性の詳細な分析に基くことにより、純粋な化合物をＩＢ−００２０８として同定することができる（図１ないし９に再現されるデータを参照されたい。）。
【００３４】
表１にＩＢ−００２０８データを約する。
【００３５】
【表１】
2004501924.tif 000008
【００３６】
ＩＢ−００２０８の様々な誘導体は、当技術に既知の技術を用いて調製することができる。例えば、これらの修飾は、化学的又は生物学的方法を用いて行うことができる。これらの変更には、次のものが含まれる：
アグリコン残基の調製；
既知及び新規な異なる糖の前記アグリコンへの付加；
前記アグリコンの修飾。
【００３７】
ハイドロキノン環を有する化合物は、キノン環を有する化合物から、適切な溶媒中で還元剤［例えば、ＮａＢＨ４（Ｔ．Ｒｏｓｓ  Ｋｅｌｌｙら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８９、１１１、４５２２−４５２４）、Ｎａ２Ｓ２Ｏ４（Ａ．Ｖ．Ｒａｍａ  Ｒａｏら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９１、３２、５１９９−５２０２）］を使用してキノンの還元、次いで、（Ｒ１≠Ｈの場合）適切な溶媒中でハイドロキノン環をアシル化又はアルキル化又は適切な試薬により反応させることにより調製し得る。
【００３８】
本発明の好ましい態様に言及し、次の例により、さらに説明するが、これは、本発明の理解を助け、かつ本発明を説明することのみを目的とするものであるが、本発明を限定するものと解されるべきではない。
【００３９】
【実施例】
本明細書において報告される全ての百分率は、別段の断りがない限り重量により現わされる。全ての温度は、摂氏で表現される。全てのインキュベーションは、別段の断りがない限り２８℃で行われ、フラスコは、２５０ｒｐｍで軌道振盪機内で振盪される。全ての培地及びレシピエントは殺菌され、全ての培養プロセスは無菌状態で行われる。
【００４０】
例１ないし３は、上に示される式を有する化合物ＩＢ−００２０８の調製に関し、例４は、その生物学的活性に関する。
【００４１】
例１
生産生物：
ここで使用される分類方法は、古典的アクチノマイセテ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ）分類学に通常使用され、かつ文献に報告されるものである。
【００４２】
インキュベーション後の全ての培養物を検査し、結果の報告を毎週、２１日目まで行った。必要に応じてＮａＣｌを添加した。
【００４３】
生物の説明は、以下の通り：
ＡＳＷを伴う１７２ＡＴＣＣ、Ｂｅｎｎｅｔ、ＩＳＰ６及びＩＳＰ２において、２１日後に良好な成長が観察された。コロニーは、薄茶色を有していた。ＡＳＷを伴うＩＳＰ７、Ｃｚａｐｅｋ、ＩＳＰ５及びＩＳＰ３において、成長は少なく、可溶色素は観察されなかった。空中菌糸は形成されなかった。基質菌糸（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｍｙｃｅｌｉｕｍ）は、分枝していた。基質菌糸上の分離された胞子は、発生し得る。菌糸は、長く、欠乏している。他のフォーメーション（ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）は、観察されなかった。
【００４４】
ＩＳＰ−１において、茶色の拡散性色素が形成され、さらには他の固形培地においても形成された。ＮａＣｌへの耐性は、５％を超えた。最適成長温度範囲は、２５℃と３５℃の間である。生物は、グルコース、ガラクトース、ラムノース及びキシロースを単一の炭素源として成長し得るが、フルクトース、ラフィノース、ｍ−イノシトール、蔗糖及びα−メリビオースでの成長は、ネガティブであり、マンニトール及びメレチトースにおける成長は疑問である。
【００４５】
生物の化学組成研究から、メソ−２，６−ジアミノピメリン酸がＰＯ１３−０４６株の全細胞加水分解物に存在することが分かる。
【００４６】
他の類似株とともに、ＰＯ１３−０４６の脂肪酸メチルエステル比較を表２に記載する。
【００４７】
【表２−１】
2004501924.tif 000009
【００４８】
【表２−２】
2004501924.tif 000010
【００４９】
【表２−３】
2004501924.tif 000011
【００５０】
【表２−４】
2004501924.tif 000012
【００５１】
＊　ｉ−１５：０（９．２％）、ａ−１５：０（１９．６％）、ｉ−１７：０（１．７％）及びａ−１７：０（３．２５％）は、ストレプトミセスに対して重要な脂肪酸であるが、アクチノマドラにおいては比較的重要ではない成分である。
１以前はテルモノスポラ  ホルモセンシス（Ｔｈｅｒｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｆｏｒｍｏｓｅｎｓｉｓ）であったアクチノマドラ  ホルモセンシス。
【００５２】
先の特徴に基き、培養物は、アクチノマドラ属の種であり、Ａ．ビナセア（ｖｉｎａｃｅａ）タイプ株に９４％の類似性を有することが確認された。
【００５３】
例２
ＩＢ−００２０８の発酵：
好ましい生物によるＩＢ−００２０８の産生に必要な要求される工程は、次のとおり：
保存培養：アクチノマドラ  ｓｐ．株ＰＯ１３−０４６の純粋培養ブロス全体は、２０％グリセロール中で凍結保存される。
【００５４】
接種原：凍結培養物又は十分に成長した斜面培養を使用し、２５０ｃｃ振盪フラスコへ先に説明した種培地１００ｍｌを播種する。フラスコを４８時間インキュベートし、第一段接種原として使用する。２Ｌエルレンマイヤーフラスコ中の同じ培地５００ｍｌにこの第一段接種原の１０％を播種する。フラスコを４８時間インキュベートする。
【００５５】
発酵：７５Ｌ発酵タンクに既に説明した５０Ｌの生産培地を２５Ｌの第二段接種原とともに播種する。発酵は、４００ｒｐｍの攪拌及び０．５Ｖ／Ｖ．Ｍ．の空気流と共に、９６時間行う。
【００５６】
【表３−１】
2004501924.tif 000013
【００５７】
【表３−２】
2004501924.tif 000014
【００５８】
ＩＢ−００２０８の収量は、マウス白血病Ｐ−３８８に対する全ブロスアッセイ又はＨＰＬＣによりモニターすることができる。
【００５９】
例３
ＩＢ−００２０８の単離：
収穫した全ブロスの４．５Ｌを濾過し、バイオマス及び他の固形物を分離した。菌糸塊を、ＣＨＣｌ３：ＣＨ３ＯＨ：Ｈ２Ｏ（２：１：１）の混合溶媒（１．５ｌ）で２回抽出し、活性を下層中に濃縮した。有機溶媒を濃縮し、真空中で乾燥蒸発させ、粗抽出物１．２ｇを得た。
【００６０】
ｎ−ヘキサン／酢酸エチル及び酢酸エチル／メタノール混合物を溶出溶媒として用いて、抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供した。抗腫瘍活性を有するＩＢ−００２０８を含有する画分１１０ｍｇが、酢酸エチル／メタノール  １：１により溶出した。
【００６１】
このＩＢ−００２０８を含有するフラクションの更なる精製を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより達成し、１８ｍｇの純粋化合物ＩＢ−００２０８がクロロホルム／メタノール  ９５：５により溶出した。
【００６２】
例４
マウス白血病Ｐ−３８８、ヒト肺悪性腫瘍Ａ−５４９、ヒト大腸悪性腫瘍ＨＴ−２９及びヒトメラノーマＭＥＬ−２８の細胞培養物において、ＩＢ−００２０８の抗腫瘍活性をイン・ビトロで測定した。手順は、ベルゲロン（Ｂｅｒｇｅｒｏｎ）らにより記載される方法を用いて行った。全ての４種細胞ラインについて、０．００１、０．００１、０．００１及び０．００１μｇ／ｍｌのＩＣ５０が見出された。
【００６３】
【参照文献】
本明細書において、次の参照文献が引用された：
ＡＴＣＣカタログ１９９６、
ベルゲロンら、  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１２２：８４８、１９８４、
グエラント（Ｇｕｅｒｒａｎｔ）及びモス（Ｍｏｓｓ）、  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５６：６３３，１９８４、
ハセガワら、  Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：３１９、１９８３、
シェーリング（Ｓｈｉｒｌｉｎｇ）及びゴットリーブ（Ｇｏｔｌｉｅｂ）  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６：３１３、１９６６、
バンデルオーウエラ（Ｖａｎ ｄｅｒ Ａｕｗｅｒａ）ら  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，４：２６５，１９８６、
ワクスマン（Ｗａｋｓｍａｎ）  Ｔｈｅ  Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ  ｖｏｌ．ＩＩ：３３１，１９６１
【００６４】
その好ましい態様を含めて本発明を詳細に説明してきた。しかしながら、本開示を考慮すると、本発明の範囲内で修飾及び／又は改良を行い得ることを当業者は理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、精製ＩＢ−００２０８のプロトンＮＭＲ（１Ｈ）スペクトルである。
【図２】図２は、精製ＩＢ−００２０８のカーボン−１３ＮＭＲ（１３Ｃ）スペクトルである。
【図３】図３は、精製ＩＢ−００２０８のＤＥＰＴ実験である。
【図４】図４は、精製ＩＢ−００２０８のＣＯＳＹ４５スペクトルである。
【図５】図５は、精製ＩＢ−００２０８のＨＭＱＣスペクトルである。
【図６】図６は、精製ＩＢ−００２０８のＨＭＢＣスペクトルである。
【図７】図７は、精製ＩＢ−００２０８のＩＲスペクトルである。
【図８】図８は、ＩＢ−００２０８のＨＰＬＣ／ＭＳクロマトグラム及びＥＳＩ−ＭＳスペクトルである。
【図９】図９は、精製ＩＢ−００２０８のＨＰＬＣ／ＵＶクロマトグラム及びＵＶスペクトルである。
【図１】
2004501924.tif 000017
【図２】
2004501924.tif 000018
【図３】
2004501924.tif 000019
【図４】
2004501924.tif 000020
【図５】
2004501924.tif 000021
【図６】
2004501924.tif 000022
【図７】
2004501924.tif 000023
【図８】
2004501924.tif 000024
【図９】
2004501924.tif 000025
【国際公開パンフレット】
2004501924.tif 000026
2004501924.tif 000027
2004501924.tif 000028
2004501924.tif 000029
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2004501924.tif 000052
2004501924.tif 000053
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004501924.tif 000054
2004501924.tif 000055
【国際調査報告】
2004501924.tif 000056
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