(57)【要約】本発明は、α−シヌクレインの凝集（これはパーキンソン病のようなＬｅｗｙ小体病の特徴である）を測定する方法を提供する。凝集の阻害剤（マグネシウムおよびα−シヌクレイン結合タンパク質を含む）もまた開示する。この阻害剤は、Ｌｅｗｙ小体病の処置において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
作用物質（ａｇｅｎｔ）がα−シヌクレインの凝集を阻害し得るか否かを測定するための方法であって、以下：
（ａ）　外因性の鉄または銅の存在下において、α−シヌクレインを含むサンプルへ該作用物質を添加し、そして該α−シヌクレインを凝集させること；
（ｂ）　凝集されたα−シヌクレインの量（もしあるならば）を測定すること；及び
（ｃ）　工程（ｂ）からの量を該作用物質が存在しないコントロールサンプルにおいて測定される量と比較すること
を包含し、ここで、凝集されたα−シヌクレインの量における減少がある作用物質がα−シヌクレインの凝集を阻害し得ることを示す、方法。
【請求項２】
請求項１の方法であって、α−シヌクレインの凝集を助けるために、フリーラジカル発生剤（単数または複数）が工程（ａ）においてサンプルへ添加される、方法。
【請求項３】
請求項１の方法であって、工程（ａ）において外因性の鉄が添加される、方法。
【請求項４】
請求項２に記載される方法であって、前記フリーラジカル発生剤がドーパミンまたは過酸化水素である、方法。
【請求項５】
請求項１の方法であって、前記サンプルがα−シヌクレインを過剰発現する細胞から構成される、方法。
【請求項６】
請求項５の方法であって、前記細胞がニューロン起源のものである、方法。
【請求項７】
請求項１の方法であって、凝集量がタンパク質分離によって測定され、これによって凝集された材料が非凝集α−シヌクレインよりも大きい分子量を示す、方法。
【請求項８】
請求項７の方法であって、前記タンパク質分離がゲル電気泳動によって達成される、方法。
【請求項９】
請求項１の方法であって、標識化抗−α−シヌクレイン抗体を添加し且つ結合した標識を測定することによって、凝集量が測定される、方法。
【請求項１０】
請求項９の方法であって、前記標識がペルオキシダーゼである、方法。
【請求項１１】
請求項１の方法であって、凝集量がチオフラビン−Ｓへの結合によって測定される、方法。
【請求項１２】
α−シヌクレインの凝集に及ぼす物質の影響を試験するためのキットであって、凍結乾燥α−シヌクレイン、鉄または銅塩、および緩衝液を含む、キット。
【請求項１３】
請求項１２のキットであって、塩化鉄を含む、キット。
【請求項１４】
請求項１２のキットであって、フリーラジカル発生剤をさらに含む、キット。
【請求項１５】
請求項１４のキットであって、フリーラジカル発生剤が過酸化水素である、キット。
【請求項１６】
Ｌｅｗｙ小体の形成に関係する神経変性疾患を処置するための方法であって、α−シヌクレイン凝集物の形成を阻害する１つ以上の作用物質を、それを必要性とする患者に対して投与することを包含し、これによってＬｅｗｙ小体の存在が同一のままか、または減少する、方法。
【請求項１７】
請求項１６の方法であって、前記作用物質がＭｇ２＋である、方法。
【請求項１８】
請求項１７の方法であって、前記作用物質がＭｇＳＯ４である、方法。
【請求項１９】
請求項１６の方法であって、前記作用物質がα−シヌクレインに結合し、その凝集を阻害するペプチドである、方法。
【請求項２０】
請求項１９の方法であって、前記ペプチドが、α−シヌクレインのＣ末端アミノ酸１１３−１４０の任意の部分、またはＮＡＣ（非−アミロイド−βタンパク質成分）部分へ結合する、方法。
【請求項２１】
請求項２０の方法であって、前記ペプチドが以下：ＷＲＱＴＲＫＤ；　ＨＹＡＫＮＰＩ；　ＡＴＩＮＫＳＬ；　ＲＲＲＧＭＡＩ；　ＴＨＲＬＰＳＲ；　ＴＫＨＧＰＲＫ；　ＳＬＫＲＬＰＫ；　ＲＬＲＧＲＮＱ；　ＷＰＦＨＨＨＲ；　ＨＬＹＨＨＫＴ；　ＴＨＩＨＨＰＳ；およびＭＭＭＭＭＲＬから成る群より選択される、方法。
【請求項２２】
請求項２１の方法であって、前記ペプチドが以下：ＴＨＲＬＰＳＲ；　ＳＬＫＲＬＰＫ；　ＴＨＩＨＨＰＳ；およびＭＭＭＭＭＲＬから成る群より選択される、方法。
【請求項２３】
請求項２２の方法であって、前記ペプチドがＳＬＫＲＬＰＫである、方法。
【請求項２４】
請求項１６の方法であって、前記作用物質が、ペプチドと組み合わせてＭｇ２＋を含む組成物である、方法。
【請求項２５】
請求項２４の方法であって、前記作用物質が以下：ＷＲＱＴＲＫＤ；　ＨＹＡＫＮＰＩ；　ＡＴＩＮＫＳＬ；　ＲＲＲＧＭＡＩ；　ＴＨＲＬＰＳＲ；　ＴＫＨＧＰＲＫ；　ＳＬＫＲＬＰＫ；　ＲＬＲＧＲＮＱ；　ＷＰＦＨＨＨＲ；　ＨＬＹＨＨＫＴ；　ＴＨＩＨＨＰＳ；およびＭＭＭＭＭＲＬから成る群より選択される、方法。
【請求項２６】
請求項２５の方法であって、前記作用物質が以下：ＴＨＲＬＰＳＲ；　ＳＬＫＲＬＰＫ；　ＴＨＩＨＨＰＳ；およびＭＭＭＭＭＲＬから成る群より選択される、方法。
【請求項２７】
請求項２６の方法であって、前記ペプチドがＳＬＫＲＬＰＫである、方法。
【請求項２８】
請求項１６の方法であって、前記神経変性疾患がパーキンソン病、アルツハイマー病、びまん性Ｌｅｗｙ小体病、混合型ＡＤ−ＰＤ、多系統萎縮症およびハレルフォルデン−シュパッツ病である、方法。
【請求項２９】
請求項２８の方法であって、前記神経変性疾患がパーキンソン病である、方法。
【請求項３０】
α−シヌクレインの凝集の形成を阻害するための方法であって、Ｍｇ２＋を含む物質を用いてα−シヌクレインを処理することを包含する、方法。
【請求項３１】
α−シヌクレインの凝集の形成を阻害するための方法であって、α−シヌクレインに結合し且つその凝集を阻害するペプチドを用いて、該α−シヌクレインを処理することを包含する、方法。
【請求項３２】
請求項３０の方法であって、前記物質が、α−シヌクレインに結合し且つその凝集を阻害する少なくとも１つのペプチドをさらに含む、方法。
【請求項３３】
Ｍｇ２＋、およびα−シヌクレインに結合し且つその凝集を阻害する少なくとも１つのペプチドを含む、組成物。
【請求項３４】
請求項３３の組成物であって、前記ペプチドがα−シヌクレインのＣ末端またはＮＡＣ部分に結合する、組成物。
【請求項３５】
請求項３４の組成物であって、前記ペプチドが以下：ＷＲＱＴＲＫＤ；　ＨＹＡＫＮＰＩ；　ＡＴＩＮＫＳＬ；　ＲＲＲＧＭＡＩ；　ＴＨＲＬＰＳＲ；　ＴＫＨＧＰＲＫ；　ＳＬＫＲＬＰＫ；　ＲＬＲＧＲＮＱ；　ＷＰＦＨＨＨＲ；　ＨＬＹＨＨＫＴ；　ＴＨＩＨＨＰＳ；およびＭＭＭＭＭＲＬから成る群より選択される、組成物。
【請求項３６】
請求項３５の組成物であって、前記ペプチドが以下：ＴＨＲＬＰＳＲ；　ＳＬＫＲＬＰＫ；　ＴＨＩＨＨＰＳ　およびＭＭＭＭＭＲＬから成る群より選択される、組成物。
【請求項３７】
請求項３６の組成物であって、前記ペプチドがＳＬＫＲＬＰＫである、組成物。
【請求項３８】
請求項３３の組成物であって、前記Ｍｇ２＋がＭｇＳＯ４である、組成物。
【請求項３９】
α−シヌクレインに結合し且つその凝集を阻害する、ペプチド。
【請求項４０】
請求項３９のペプチドであって、前記ペプチドが以下：ＷＲＱＴＲＫＤ；　ＨＹＡＫＮＰＩ；　ＡＴＩＮＫＳＬ；　ＲＲＲＧＭＡＩ；　ＴＨＲＬＰＳＲ；　ＴＫＨＧＰＲＫ；　ＳＬＫＲＬＰＫ；　ＲＬＲＧＲＮＱ；　ＷＰＦＨＨＨＲ；　ＨＬＹＨＨＫＴ；　ＴＨＩＨＨＰＳ；およびＭＭＭＭＭＲＬから成る群より選択される配列を含む、ペプチド。
【請求項４１】
請求項４０のペプチドであって、前記ペプチドが以下：ＴＨＲＬＰＳＲ；　ＳＬＫＲＬＰＫ；　ＴＨＩＨＨＰＳ；およびＭＭＭＭＭＲＬから成る群より選択される配列を含む、ペプチド。
【請求項４２】
請求項４１のペプチドであって、配列ＳＬＫＲＬＰＫを含む、ペプチド。
【請求項４３】
請求項３９のペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項４４】
請求項４３の組成物であって、以下：ＷＲＱＴＲＫＤ；　ＨＹＡＫＮＰＩ；　ＡＴＩＮＫＳＬ；　ＲＲＲＧＭＡＩ；　ＴＨＲＬＰＳＲ；ＴＫＨＧＰＲＫ；　ＳＬＫＲＬＰＫ；　ＲＬＲＧＲＮＱ；　ＷＰＦＨＨＨＲ；　ＨＬＹＨＨＫＴ；　ＴＨＩＨＨＰＳ；およびＭＭＭＭＭＲＬから成る群より選択される配列を含むペプチドを含む、組成物。
【請求項４５】
請求項４４の組成物であって、以下：ＴＨＲＬＰＳＲ；　ＳＬＫＲＬＰＫ；　ＴＨＩＨＨＰＳ；およびＭＭＭＭＭＲＬから成る群より選択される配列を含むペプチドを含む、組成物。
【請求項４６】
請求項４５の組成物であって、配列ＳＬＫＲＬＰＫを含むペプチドを含む、組成物。
【請求項４７】
α−シヌクレインの凝集を阻害するのに有用なペプチドを同定するための方法であって、以下：
（ａ）　α−シヌクレインＣ末端またはＮＡＣ部分のペプチドを固体支持体へ結合すること；
（ｂ）　ランダムなペプチドのファージディスプレイライブラリーを添加し、α−シヌクレインとの結合を起こさせること；
（ｃ）　任意の結合されたファージを検出すること；および
（ｄ）　どのペプチドが結合されたファージ上にディスプレイされるかを決定すること、それによってこのようなペプチドがα−シヌクレインの凝集を阻害するのに有用である、
を包含する、方法。
【請求項４８】
請求項４７の方法であって、前記α−シヌクレインペプチドがα−シヌクレインのアミノ酸１２１−１３１を含む、方法。
【請求項４９】
請求項４７の方法であって、前記α−シヌクレインペプチドがα−シヌクレインのアミノ酸６１−８７を含む、方法。
【請求項５０】
請求項４７の方法であって、前記ファージディスプレイライブラリーのペプチドが７アミノ酸長である、方法。
【請求項５１】
ある作用物質がα−シヌクレインの凝集を阻害し得るか否かを測定するための方法であって、以下；
（ａ）　α−シヌクレインを蛍光標識で標識し、そしてα−シヌクレイン凝集を阻害すると推測される作用物質と標識および非標識α−シヌクレイン溶液とを混合し、そして該α−シヌクレインを凝集させること；
（ｂ）　溶液のポーラリゼーション（ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）における変化を観測することにより溶液の異方性における変化をモニターすることによって、α−シヌクレインの凝集量（もしあるならば）を測定すること；および
（ｃ）　工程（ｂ）からの量を該作用物質が存在しないコントロールサンプルにおいて測定される量と比較する工程
を包含し、ここで、ポーラリゼーションにおける変化は凝集が起こったことを示唆し、またここで、該作用物質の存在下で観測される凝集量における減少は該作用物質がα−シヌクレインの凝集を阻害し得ることを示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、仮出願シリアル番号６０／２１７，３１９（２０００年７月７日に出願された）および６０／２７９，１９９（２００１年３月２８日に出願された）に基づき、その各々の全内容は、本明細書によって参考として援用される。
【０００２】
（発明の技術分野）
本発明は、薬物スクリーニング方法およびα−シヌクレイン（α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）凝集によって引き起こされる神経組織の損傷を予防する方法に関する。これらの方法は、特に、Ｌｅｗｙ小体病および他のシヌクレイン症（ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ）の阻害剤の設計および開発において有用であり、そしてさらにこのような神経変性疾患（特にパーキンソン病）の処置において有用である。
【０００３】
（発明の背景）
パーキンソン病（ＰＤ）は、よく知られている神経変性障害であり、１８１７年にＪａｍｅｓ　Ｐａｒｋｉｎｓｏｎによって初めて記載された。この疾病の４つの主な診断的徴候は、安静時振せん、運動緩徐、筋肉硬直および体位不安定である。運動性不全のこれらの徴候は、黒質線状体系におけるドーパミン作動性ニューロンの消失が原因で生じる［Ｇｉｂｂ，Ｗら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．ａｎｄ　Ｐｓｙｃｈ．、５１：７４５−５２（１９８８）］。
【０００４】
ＰＤは、Ｌｅｗｙ小体の形成およびドーパミン作動性ニューロンの死によって特徴付けられる［Ａｄａｍｓ　Ｄ．ら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，８７４−８８０、第３版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、ＮＹ、（１９８５）］。ＰＤの神経病理学的特徴はＬｅｗｙ小体である。Ｌｅｗｙ小体は、変性するニューロン内に生じる細胞質内封入体であり、これは、放射状に（ｒａｄｉｃａｌｌｙ）方向性付けられる１０〜２０ｎｍの直径を有するフィラメントに囲まれたフィラメント状および顆粒状物質の緻密なコアから構成される［Ｇｏｅｄｅｒｔ，２０Ｍ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏ．８：６１９−３２（１９９９）］。概して、ＰＤの原因は不明であり、遺伝的性質および環境因子の相対的役割に関する活発な議論がなされてきた［Ｔａｎｎｅｒ，Ｃら、ＪＡＭＡ，２８１：３４１−６（１９９９）］。マンガンへの暴露は、鉱山労働者らにおいてパーキンソン症候群（精神分裂形成行動（ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ　ｆｏｒｍ　ｂｅｈａｖｉｏｒ）も含む）を引き起こした。いくつかの疫学研究によって、鉄への工業的暴露とＰＤの発生数との間の関連［Ｃｏｒｅｌｌ　Ｊ．Ｍら、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、８０：４６７−７２、（１９８５）］、ＰＤの発生数と血中水銀レベルとの間の関連［Ｎｇｉｍ　Ｃ．Ｈ．ら、Ｎｅｕｒｏｅｐｉ．、８（３）：１２８−１４１（１９８９）］、そしてＰＤによる死亡率と工業的プロセスに関係する鉄への近接性との関係［Ｒｙｂｉｃｋｉ　Ａ．ら、Ｍｏｖ　Ｄｉｓｏｒｄ．，．８（１）８７−９２（１９９３）］が見出された。
【０００５】
α−シヌクレインは、最初、キンカチョウの歌学習の重要な時期に、ニューロン成長に関係してアップレギュレートされるタンパク質として同定された［Ｇｅｏｒｇｅ　Ｍ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ、１５：３６１（１９９５）］。α−シヌクレインは、タンパク質シャペロン（１４−３−３）に対する重要な物理的および機能的相同性を共有する遍在性タンパク質であり、特に脳において豊富である［Ｏｓｔｒｅｒｏｖａ　Ｎ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１９：５７８２（１９９０）；Ｃｌａｙｔｏｎ　Ｄ．ら、ＴＩＮＳ　２１：２４９（１９９８）］。α−シヌクレインは、通常、セリン８７および１２９でリン酸化される［Ｏｋｏｃｈｉ　Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５：３９０（２０００）］。最近の研究によって、α−シヌクレインにおける変異が家族性ＰＤを引き起こし得ること、そしてα−シヌクレインがＬｅｗｙ小体内に蓄積することが示された。これらの発見によって、α−シヌクレインがＰＤの病態生理学に関与していることが示唆された［Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ　Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３８８：８３９（１９９７）；Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ　Ｍ．ら、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ，９５：６４６９（１９９８）；Ｊｅｎｎｅｒ　Ｐ．ら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、４４：Ｓ７２（１９９８）］。家族性ＰＤと関連するとして現在のところ同定される唯一の突然変異は、α−シヌクレイン遺伝子におけるＡ５３ＴおよびＡ３０Ｐ突然変異である［Ｇｅｄｅｒｔ，Ｍ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏ．、８：６１９−３２（１９９９）；Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ，Ａ．ら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５２：６５１−４（１９９９）；Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７６：１１９７−９（１９９７）］。しかしながら、酸化的ストレスをこの疾患の病因学に関係づける多くの状況証拠が存在している［Ｊｅｎｎｅｒ，Ｐら、Ａｎｎｕａｌ　Ｎｅｕｒｏｌ．，４４：Ｓ７２−８４（１９９８）］。
【０００６】
様々な実験的証拠は、Ｌｅｗｙ小体がα−シヌクレインと相互作用することを示唆する。例えば、免疫組織化学的な研究によって、Ｌｅｗｙ小体がα−シヌクレインおよびユビキチンについて強く染色することが示された［Ｊｅｎｎｅｒ，Ｐら、Ａｎｎｕａｌ　Ｎｅｕｒｏ．，４４：Ｓ７１−８４＿（１９９８）；Ｍａｒｋｏｐｏｕｌｏｕ，Ｋ．ら、Ａｎｎｕａｌ．Ｎｅｕｒｏｌ．、４６：３７４−８１（１９９１）；Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３８８：８３９−４０（１９９７）；およびＳｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ，Ｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｕｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：６４６９−７３（１９９８）］。組換えタンパク質を用いるｉｎ　ｖｉｔｒｏの実験によって、この突然変異（Ａ５３ＴおよびＡ３０Ｐ）が、野生型α−シヌクレインと比較して、α−シヌクレイン凝集を増大させることが示唆された［Ｃｏｎｗａｙ，Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．、４：１３１８−２０（１９９８）；Ｇｉａｓｓｏｎ，Ｂ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４：７６１９−２２（１９９９）；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｍ．ら、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．、２５　７９９：３０１−６（１９９８）］。
【０００７】
α−シヌクレイン凝集およびＬｅｗｙ小体形成に関する重要な疑問の１つは、これらのプロセスが細胞を害するか否かである。Ｌｅｗｙ小体は、フリーラジカル損傷に応答して生じる不活性なツームストーンマーカー（ｔｏｍｂｓｔｏｎｅ　ｍａｒｋｅｒｓ）であるか、あるいは細胞を害する毒性物質であるかのいずれかであり得る。両方の場合の例が文献中に存在する。凝集アミロイド−β（Ａβ）はニューロンに有毒であるが、一方リポフスチンは細胞に無害であるようにみえる［Ｂｅｈｌ，Ｃ．ら、Ｃｅｌｌ　７７：８１７−２７（１９９４）］。ハンティングトン病タンパク質は中間の状況を示す（ハンティングトン病に関係する毒性が凝集より先に起こるようにみえ、且つハンティングトン病タンパク質の凝集が保護的である可能性がある）［Ｓａｕｄｏｕ，Ｆ．ら、Ｃｅｌｌ　９５：５５−６６（１９９８）］。本発明者自身の以前の研究によって、α―シヌクレインの一過性過剰発現が種々の細胞（２つの神経細胞株（ＳＫ−Ｎ−ＳＨおよびＰＣ１２）を含む）にとって有毒であることが示された［Ｏｓｔｒｅｒｏｖａ，Ｎ．ら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１９：５７８２−９１（１９９９）］。この結果と一致して、Ｍａｓｌｉａｈおよびその共同研究者らは、最近、マウスの過剰発現するα−シヌクレインがドーパミン作動性終末の加齢−随伴性消失および運動障害（これらは、毒性の指標となり得る）を示した［Ｍａｓｌｉａｈ，Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７：１２６５−１２６９（２０００）］。これらの知見は、α−シヌクレイン凝集の割合の増加率が、ＰＤおよび他のＬｅｗｙ小体病における神経変性のメカニズムに寄与し得ることを示唆する。
【０００８】
トランスジェニック動物における最近の研究はまた、α−シヌクレインの凝集がニューロンに有害であることを示唆する。最近、野生型のヒトα−シヌクレインを発現するトランスジェニックマウスにおいてドーパミン作動性機能障害が生じることが報告された［Ｍａｓｌｉａｈ，Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７：１２６５−１２６９（２０００）］。さらに、ショウジョウバエ過剰発現α−シヌクレインが、ドーパミン作動性機能障害およびα−シヌクレイン凝集の進行と関係するドーパミン作動性ニューロン死を示すことが報告された［Ｆｅａｎｙ，ＭＢ，ら、Ｎａｔｕｒｅ　４０４：３９４−８（２０００）］。証拠は、ドーパミンを有するニューロンがα−シヌクレイン凝集を進行させ、これらの凝集の発達につれて変性することを示唆する。
【０００９】
最近、鉄および過酸化水素によって生じる酸化的ストレスが、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでα−シヌクレインのアミロイド様凝集形成を誘導することが示された［Ｈａｓｈｉｏｔｏ，Ｍ．ら、ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ，１０：７１７−２１（１９９９）；Ｐａｉｋ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３４０：８２１−８（１９９９）］。ドーパミン（これは、強力なフリーラジカル発生剤である）が黒質内の典型的な神経伝達物質であることから、酸化的ストレスはＰＤの一因であると考えられる［Ｃｈｉｕｅｈ，Ｃ．ら、Ａｄｖ．Ｎｅｕｒｏｌ．、６０：２５１−８（１９９３）；Ｊｅｎｎｅｒ，Ｐ．ら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２５　４４：Ｓ７２−８４（１９９８）］。さらに、鉄（これもまたフリーラジカルの生成を刺激する）は、年齢と共に黒質内に蓄積される［Ｊｅｎｎｅｒ，Ｐ．ら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、４４：Ｓ７２−８４（１９９８）］。鉄はヘモジデリン顆粒として細胞質内に沈着し、またパーキンソン脳の腹外側視床（ｖｅｎｔｏｒｌａｔｅｒａｌ　ｔｈａｌａｍｕｓ）、尾状およびレンズ核、ならびに黒質のニューロンおよびグリア細胞において、フェリチン顆粒で満たされたミトコンドリアが観察された［Ｅａｒｌｅ　Ｍ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２７（１）：１−１４、（１９６８）；Ａｓｅｎｊｏ　Ａ．ら、Ｒｅｖ．Ｎｅｕｏｌｏｇｉｑｕｅ、１２１（６）：５８１−９２、（１９６９）；Ｒｉｅｄｅｒｅｒ　Ｐ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５２（２）：５１５−２０（１９８９）］。このように、黒質内に存在する酸化的条件がα−シヌクレイン凝集を促進し得る。しかしながら、生きているニューロン内でこのような酸化的条件が実際にα−シヌクレイン凝集を促進するか否かは、先行技術において不明である。
【００１０】
それゆえ、Ｌｅｗｙ小体形成を阻害するであろう物質（これはＰＤのような疾患を処置するために使用され得る）が必要とされる。それと同時に、スクリーニングアッセイによるこのような物質を見つける方法もまた、当該分野において必要とされる。米国特許第６，１８４，３５１号は、α−シヌクレインを非常に高濃度で長時間継続的に振とうさせることによってシヌクレイン凝集が誘導され得ることを開示している。しかしながら、必要とされる高濃度および連続的振とうは、生理学的でもなく、スクリーニングアッセイの開発の助けにもならない。さらに、‘３５１特許に記載されるアッセイはα−シヌクレイン凝集を直接的に測定せず；むしろ可溶性の未凝集タンパク質が測定される。さらに、‘３５１アッセイは、核形成−影響物質を検出することのみに向いており、他のメカニズムによって凝集を阻害する作用物質には向けられていない。それゆえ、当該技術は、Ｌｅｗｙ小体形成の阻害に有効な薬物をスクリーニングするためのより良い方法に有用であろう。
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏもしくは生きているニューロンにおけるα−シヌクレインの凝集の阻害を導く因子を同定する方法に関する。
【００１２】
本発明の目的は、α−シヌクレインの凝集経路を阻害し得る薬学的作用物質を同定し、スクリーニングし、そしてモデリングする方法を提供することである。この薬学的作用物質は、例えば、カチオン、小分子、ペプチド、ペプチド様化合物、核酸、複合糖質（ヘパリンアナログなど）またはこれらの組み合わせである。
【００１３】
また、神経変性症状（ＰＤ、アルツハイマー病、びまん性Ｌｅｗｙ小体病、混合型ＡＤ−ＰＤ、多系統萎縮症およびハレルフォルデン−シュパッツ病など）を処置するための抗−α−シヌクレイン凝集薬をデザインし、製造し、そして使用することも、本発明の目的である。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
神経変性疾患に関わる多くの他のタンパク質と同様に、α−シヌクレインは、オリゴマー化／凝集する高い傾向を有し、Ｌｅｗｙ小体中に蓄積される大きなタンパク質フィラメントを形成する。ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、α−シヌクレインは３日間かけて凝集する傾向がある。この速度は、α−シヌクレインの変異型（Ａ５３ＴおよびＡ３０Ｐ）において２〜３倍増大される。金属イオン、酸化的ストレスおよび他の環境的ファクターもまた、凝集の速度を増大させ得る（以下を参照のこと）。本発明は、α−シヌクレインのオリゴマー化ならびにそれによるＬｅｗｙ小体形成および神経変性を阻害し得る治療剤の開発に向けられる。このような作用物質が容易に同定され得る方法もまた、本発明によって企図される。
【００１５】
従って、本発明の１つの局面は、ある作用物質が神経学的疾患（その経路の一部としてα−シヌクレインの凝集を伴う）の症状を緩和するのに有効であるか否かを測定するための方法（これは、その作用物質のα−シヌクレイン凝集を阻止する能力を測定する）に関する。１つのこのような方法は、その作用物質がα−シヌクレインの凝集経路を阻害し得るか否かを測定し、この作用物質を外因性鉄の存在下においてα−シヌクレインを含むサンプルに添加すること、α−シヌクレインを凝集させること、α−シヌクレインの凝集量（もしあるならば）を測定すること、およびこの量を作用物質が存在していないコントロールサンプルにおいて測定される量と比較することを包含する。凝集量における減少は、その作用物質がα−シヌクレインの凝集を阻害し得ること、そしてそれゆえその作用物質が疾患の処置において有効であることを示す。外因性の鉄は、凝集形成を誘導するために添加される。鉄濃度の範囲は、約０．１〜１ｍＭ、好ましくは０．１〜１ｍＭである。
【００１６】
上記のアッセイは、α−シヌクレインを含むｉｎ　ｖｉｔｒｏ、あるいは細胞培養系または動物モデルにおいて行われ得る。Ｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイについては、凝集を促進させる成分（鉄または銅の外因性源（例えば、塩またはメタロプロテイン）など）、および／またはフリーラジカル発生剤（例えば、ドーパミンおよび過酸化水素）がα−シヌクレイン溶液へ添加される。オリゴマー化を加速する傾向にある変異体α−シヌクレイン（Ａ３０ＰまたはＡ５３Ｔ）もまた使用され得る。同時に、試験される作用物質が添加され、凝集を進行させるのに十分な時間が費やされる。代表的にこれは約１２時間であるが、さらに長い時間観察してもよい。
【００１７】
任意の凝集されたα―シヌクレインを検出するいくつかの方法が存在し、本発明はこれによって制限されない。本明細書中に例示される１つの方法は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロッティングを用いる。α−シヌクレインオリゴマーは、ＳＤＳに対して安定であることが示され、それゆえオリゴマーバンディングパターンはブロット上で同定され得る。オリゴマー化の程度を測定する第２の方法は、オリゴマーをチオフラビン−Ｓで染色し、蛍光顕微鏡によってフィラメントを視覚化することである。チオフラビン−Ｓは、オリゴマー化のときに形成されるβ−プリーツシートへ結合する。
【００１８】
また、より高スループットな薬物スクリーニングに非常に有用であり得るα−シヌクレインオリゴマー化についての新規の蛍光異方性アッセイが用いられ得、これもまた、本発明の１つの主題でもある。蛍光異方性は、溶液中の蛍光団の回転拡散の指標である。小さい分子は大きな複合体より迅速に回転するので、α−シヌクレインがオリゴマー化するにつれて、結合型蛍光団の蛍光異方性は増加すると予想される。α−シヌクレインは、中性ｐＨにおいて、アミン反応性蛍光団（これは、例えばフルオレセイン、ピレンおよびダンシル誘導体から選択され得る）を用いて、Ｎ末端上で特異的に標識され得る。異方性における変化をモニターすることによって、凝集を阻害し得る化合物を容易に測定することができる。なぜなら、それらが異方性における増大を阻止することが予測されるならである。本明細書中で参考として援用されるＬａｋｏｗｉｃｚ，　Ｊｏｓｅｐｈ　Ｒ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｓｐｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、　Ｃｈａｐｔｅｒ　５、ｐｐ．１１１−１５３、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ（ＮＹ）（１９８６）を参照のこと。
【００１９】
細胞培養アッセイについては、神経芽腫細胞（ＢＥ−Ｍ１７細胞など）が使用され得る（これは、ＥＣＡＣＣから公に入手され得る）。この細胞においてα−シヌクレイン凝集を誘導するために、この細胞をα−シヌクレインもしくはその変異改変体（Ａ３０ＰまたはＡ５３Ｔ）の１つを発現するベクターでトランスフェクトし、それによってα−シヌクレインの産生をアップレギュレートする。このアップレギュレーションは凝集を誘導する効果を有し、これは別の方法では起こらない。上記のｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイと同様に、フリーラジカル発生剤を含むかあるいは含まないＦｅ２＋を細胞培養物へ添加し、１２〜９６時間にわたり、細胞内オリゴマー化について細胞をモニターする。凝集は、例えば、チオフラビン−Ｓまたは標識化抗−α−シヌクレイン抗体を用いる組織化学的染色によって検出され得る。あるいは、細胞は、収集され、溶解され、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離され、そして標識化抗−α−シヌクレイン抗体を用いてイムノブロッティングされ得る。凝集されたα−シヌクレインを検出するための他の方法としては、電子顕微鏡を用いることによる。
【００２０】
好ましくは、１つ以上のフリーラジカル発生剤（ドーパミンおよび過酸化水素など）が鉄（Ｆｅ２＋）と共に細胞培養アッセイ物へ添加される。最も好ましくは、Ｆｅ２＋および過酸化水素のみが凝集の誘導剤として添加される（Ａ５３Ｔ変異体を有する細胞を除いて、フリーラジカルは必要でない）。
【００２１】
用語「標識される（ｌａｂｅｌｌｅｄ）」は、この種の生化学的アッセイにおいて代表的に使用される任意の物質（例えば放射活性、酵素、化学発光、および蛍光標識を含む）を用いて標識することを意味する。好ましくは、標識が酵素的であり、最も好ましくは、標識がペルオキシダーゼである。
【００２２】
野生型、Ａ５３Ｔ変異体またはＡ３０Ｐ変異体α−シヌクレインを過剰発現するヒトＢＥ−Ｍ１７神経芽腫細胞を用いる細胞培養アッセイにおいて、細胞内で生じる凝集の量は、発現するα−シヌクレインの量および発現するα−シヌクレインの型に依存する（α−シヌクレイン凝集量は、Ａ５３Ｔ＞Ａ３０Ｐ＞野生型＞未トランスフェクションの順位に従う）。凝集形成を刺激することに加え、α−シヌクレインまた毒性を誘導すると考えられる。α−シヌクレインを過剰発現するＢＥ−Ｍ１７神経芽腫細胞は、鉄によって誘導される毒性に対する脆弱性（ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ）において４倍までの増加を示した。この脆弱性は、凝集に関するのと同じ順位に従う。これらのデータは、α−シヌクレインが鉄およびドーパミンと共に作用して、ＰＤにおけるＬｅｗｙ小体病理の形成およびＰＤにおける細胞死を誘導することを示唆する。
【００２３】
本発明の別の局面は、α−シヌクレイン凝集形成を阻害する方法である。とりわけ、この方法はＬｅｗｙ小体病（パーキンソン病など）の処置に関するものであり、これによりα−シヌクレイン凝集を阻害することによってＬｅｗｙ小体形成は制御される（または減少する）。すなわち、本発明は、Ｌｅｗｙ小体の形成を伴う神経変性疾患を処置するための方法を企図し、これを必要とする患者に対してα−シヌクレイン凝集の形成を阻害する１つ以上の作用物質を投与する工程を包含する（これによって、Ｌｅｗｙ小体の存在が同一のままであるか、またはより好ましくは減少される）。このような処置の詳細は、必要とされる治療薬、特定の疾患およびその進行段階、ならびに他のファクター（バイオアベイラビリティーなど）等（これらは、開業医が、用量、投与経路、および処置の長さを測定する場合に考慮し得る全てのファクターである）に依存し、また本発明はこれらによって制限されない。
【００２４】
本発明の別の局面は、Ｌｅｗｙ小体病の処置のための治療剤であり、これは本発明によって発見される。特に、本発明者らは、Ｍｇ２＋がα−シヌクレインの凝集を阻害することを見出した。とりわけ、本発明者らは、鉄およびマグネシウムの両方がα−シヌクレインに結合するが、α−シヌクレイン凝集について反対の作用を発揮することを見出した。鉄はα−シヌクレインの凝集を増大し、一方マグネシウムはα−シヌクレイン凝集を阻害する。細胞培養物における野生型α−シヌクレインの凝集を減少させることに加え、マグネシウムはまた、目に見えるニューロン封入体の形成を阻害し、神経毒性から保護する。これらのデータは、Ｌｅｗｙ小体病（ＰＤのような）の処置におけるマグネシウムについての治療的役割を暗示し、ここでその疾患の進行が少なくとも緩慢になり、そして快方に向かうかも知れない。
【００２５】
ＰＤを患う患者の脳において、鉄のレベルが上昇し、一方マグネシウムレベルが減少することが知られているが、これらの金属がＰＤの病態生理学において果たす役割は未だに解明されていない。例えば、Ｄｕｒｌａｃｈら、Ｍａｇｎｅｓ．Ｒｅｓ．　１１：２５−４２（１９９８）を参照のこと。先行技術では、脳内の鉄とマグネシウムのバランスを調節することがＬｅｗｙ小体形成または疾患の進行に影響を及ぼすということが示唆されていない。米国特許第４，９８５，２５６号；４，８３７，１６４号；およびＧｌｉｃｋの５，００４，６１５号は、痴呆における記憶を改善するためのマグネシウム投与について記載し、その中でＡＬＳ−ＰＤ（「筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｉｃ　ｌａｔｅｒａｌ　ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）およびパーキンソン症候群の複合症」）について述べている。これはグアムで認められた疾患であり、罹患した人々の脳細胞中に高レベルのアルミニウムおよび低レベルのマグネシウムを含む。しかしながら、その状態はパーキンソン病と非常に異なり、特にＬｅｗｙ小体形成に関しては、ＡＬＳ−ＰＤには存在しない。さらに、Ｇｌｉｃｋがマグネシウムの補給を提案する目的は、詳述されている痴呆（ｄｅｍｔｅｎｔｉａｓ）においてマグネシウムを標準のレベルへ上昇させることであり、α−シヌクレイン凝集には干渉していない。マグネシウムがα−シヌクレイン凝集に影響を及ぼすことを示したのは、本発明が最初である。
【００２６】
それゆえ、好ましい実施形態として、Ｍｇ２＋がＬｅｗｙ小体病の処置を必要とする動物に投与される。Ｍｇ２＋は、無毒な薬学的に許容される形態をとり得る。好ましくは、このマグネシウムは、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、塩化マグネシウム、炭酸マグネシウムまたはこれらの組み合わせとして投与される。非経口投与について、最も好ましくは硫酸マグネシウムである。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語「投与」は、哺乳動物への薬物の適用または送達をいう。この用語は、薬物の適用または送達を成し遂げる投与の任意の方法を含むことを意図されるが、関係する脳細胞へのマグネシウムを標的化する投与方法が好ましい。この用語はまた、このような投与を成し遂げるために必要な任意の方法（必要であれば、薬物が血液脳関門を通過するのを可能にする糖負荷方法（ｓｕｇａｒ　ｌｏａｄｉｎｇ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）のような）を含むよう意図される。
【００２８】
マグネシウムの用量は、例えばマグネシウム塩を用いる他の条件の処置レジメを参考にすることにより、当業者によって決定され得る。マグネシウムは、有毒なレベルが達成するように投与されるべきではない。本発明者らは、実験的に、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでα−シヌクレイン凝集を阻害するために必要とされるマグネシウムは、マグネシウムを使用する臨床（例えば、妊娠の子癇症）プロトコルで通常使用される範囲内（すなわち０．５〜２ｍＭ　ＭｇＳＯ４）である。正常な成人における血漿レベルは、１リットル当たり１．５と２ｍＥｑとの間で、これの約３分の１がタンパク質に結合される。高マグネシウム血症（これは、主として腎不全に起因している）において、過剰なマグネシウムは、中枢神経系および末梢神経筋接合部の機能低下をもたらす。プラズマレベルが１リットル当たり４ｍＥｑを越え始めると、深腱反射が減少するかまたは無くなり、このとき呼吸麻痺の危険性がある。それゆえ、本発明に従うマグネシウム塩を用いる処置において、マグネシウムレベルの適切なモニタリングを行うべきである。
【００２９】
マグネシウム塩は、長年の間ヒトにおいて治療的に使用されてきた。例えば、多くの制酸薬がマグネシウム塩から成り、特にシトレートおよびサルフェート塩である。従って、このマグネシウムが胃腸経由で投与される場合、このような塩は有用であると考えられる。非経口投与（筋肉内または静脈内）（これは、より高度な全身性レベルが達成され得るので、本発明において好ましい）について、選択される塩は硫酸マグネシウムである。このような投与は、妊娠の子癇症に関係する発作の処置において長年用いられており、この場合、体重に基づいて初期および維持用量が与えられる。妊娠中毒症の投与スケジュールに関するＦｌｏｗｅｒｓら、Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｌｎ．、１９：３１５−３２７（１９６２）を参照のこと（この内容は、本明細書中で参考として援用される）。このようなレジメは、本発明に従うＬｅｗｙ小体病の処置にもまた適用可能である（また、血漿濃度は３〜６ｍｇ％の範囲内である）。しかしながら、進行性神経変性Ｌｅｗｙ小体病（ＰＤなど）の場合、このレジメが残りの人生に及ぶかも知れない。
【００３０】
本発明はまた、Ｌｅｗｙ小体病およびシヌクレイノパシー（それらの経路に関わるα−シヌクレインを有するが、必ずしもＬｅｗｙ小体を有さない疾患）を処置するために有効な他の作用物質が、α−シヌクレインに結合し且つそれらの凝集を阻害するペプチドまたはそれらの誘導体であることを発見した。これらのペプチド（単独または組成物で）は、Ｌｅｗｙ小体病理を表す神経変性疾患を有する被験体を処置するために使用され得る。いかなる特定の理論によって結び付けられないが、α−シヌクレインへのこのペプチドの結合は、何らかの方法によって（おそらく凝集においてＦｅ２＋の役割を妨害することによって）、α−シヌクレインが凝集するのを妨げると考えられる。
【００３１】
このようなペプチドは、例えば、α−シヌクレインに結合するペプチドを表面上に発現するファージを選択するためのファージディスプレイを使用し、そしてそのペプチドが何であるかを決定することによって、見出され得る。そのペプチドまたはその物質の任意のペプチドの阻害効果は、本明細書中開示されるような、あるいは本明細書中で参考として援用される米国特許第６，１８４，３５１中で開示されるようなアッセイを用いて試験され、Ｌｅｗｙ小体病またはシヌクレイノパシーを処置するための作用物質としてのその有用性を測定し得る。このようなペプチドは、α−シヌクレインのＣ末端（およそ、アミノ酸１１３〜１４０）およびＮＡＣ部分（およそ、アミノ酸６１〜８７）へ結合する能力について選択された（これは、この領域が凝集プロセスに関与していると考えられているためである）。Ｃ末端部分へ結合するいくつかのペプチドは、以下である（全てのペプチドは、５’から３’の順番で与えられる）：（１）ＷＲＱＴＲＫＤ；（２）ＨＹＡＫＮＡＰＩ；（３）ＡＴＩＮＫＳＬ；（４）ＲＲＲＧＭＡＩ；（５）ＴＨＲＬＰＳＲ；および（６）ＴＫＨＧＰＲＫ。ＮＡＣ部分へ結合するいくつかのペプチドは、以下である：（１）ＳＬＫＲＬＰＫ；（２）ＲＬＲＧＲＮＱ；（３）ＷＰＦＨＨＨＲ；（４）ＨＬＹＨＨＫＴ；（５）ＴＨＩＨＨＰＳ；および（６）ＭＭＭＭＭＲＬ。そのタンパク質のこの一部がアルツハイマー病におけるアミロイドプラーク中で凝集することが見いだされたので、ＮＡＣ部分が選択された。特に好ましくは、より強い結合特性ゆえに、ＴＨＲＬＰＳＲ；ＳＬＫＲＬＰＫ；ＴＨＩＨＨＰＳ；およびＭＭＭＭＭＲＬである。最も好ましいのは、ＳＬＫＲＬＰＫである。
【００３２】
このペプチドは、ペプチド合成技術において周知の方法によって作製され得、また改変体もしくはアナログはまた、確立された原理に従って作製され得る。例えば、このペプチドの治療的効力を増大させ、疎水性／親水性を変化させ、または望まれない副作用を減少させることが望まれるかも知れない。例えば、特定のＬｅｗｙ小体病によって影響を受ける神経組織へ化合物を標的化するため、ペプチド構造は官能基の付加によって変化され得る。また、そのペプチドの１つ以上のアミノ酸置換がなされ得、そしてこれらは代表的に保存的置換（すなわち、もともとのアミノ酸の性質（電荷のような）などを維持する置換）を含むであろう。このような保存的置換の例は、（１）Ｍ、Ｉ、ＬおよびＶ；（２）Ｆ、ＹおよびＷ；（３）Ｋ、ＲおよびＨ；（４）ＡおよびＧ；（５）ＳおよびＴ；（６）ＱおよびＮ；ならびに（７）ＥおよびＤの間でなされるものである。ペプチドへの変化は、保存的でなくても良い；変更されるペプチドはいつも、前述したアッセイによって凝集阻害における効力を試験され得る。
【００３３】
好ましくは、そのペプチドはタンパク質分解性消化に対して耐性である。このようなペプチドは、Ｄ−アミノ酸の存在によって、または感受性の強いペプチド結合を非−加水分解型結合で置換することによって、プロテアーゼ耐性にされ得る。多くのこのような結合、およびそれらを導入する方法が、当該技術分野において知られている。それらは、−−ｐｓｉ［ＣＨ２ＮＨ］−−（還元型アミドペプチド結合）；−−ｐｓｉ［ＣＯＣＨ２］−−（ケトメチレンペプチド結合）；−−ｐｓｉ［ＣＨ（ＣＮ）ＮＨ］−−（（シアノメチレン）アミノペプチド結合）；−−ｐｓｉ［ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）］−−（ヒドロキシエチレンペプチド結合；−−ｐｓｉ［ＣＨ２Ｏ］−−（ペプチド結合）；および−−ｐｓｉ［ＣＨ２Ｓ］−−（チオメチレンペプチド結合）を含む。そのペプチドは、末端修飾（Ｃ末端でのアミドまたはＮ末端でのアセチル基のような）を用いて構築され得、これによってタンパク質分解消化に対して耐性になる。
【００３４】
非−ペプチド（擬ペプチド）アナログは、ペプチド中の１つ以上の残基が非−ペプチド部分によって置換される化合物である。この非−ペプチド部分は、そのペプチドが天然のまたはより生物活性のコンフォメーションを維持することを可能にすべきである。非ペプチド擬化合物を調製するための方法については、Ｎａｃｈｍａｎら、Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ　５７：３５９−３７０（１９９５）を参照のこと。このペプチドは、血液脳関門を通過するこれら輸送を促進する化合物へこれらを複合体化させることによって、改変され得る。例えば、このような化合物は脂肪酸、カチオン化された抗体またはアルブミン、および本明細書中で参考として援用されるＷＯ００／０９０７３に開示される両親媒性の薬物−オリゴマー複合体より選択され得る。あるいは、そのペプチドは、血液脳関門を通過する輸送を促進する化合物（単数または複数）（しかしながら、これはそのペプチドに複合体化されない）と共に投与され得る。このような化合物の例は、米国特許第５，１１２，５９６号および５，２６８，１６４号（これらは共に、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００３５】
用語「ペプチド」は、前述のペプチドおよびそれらの誘導体のいずれかを意味し、アミノ酸の数において制限されない。したがって、「ペプチド」はポリペプチドも含み得る。
【００３６】
１つ以上のペプチドを含む組成物（特に薬学的組成物）もまた、本発明の一部を成す。ペプチドの治療的有効量（疾患の進行を緩和するであろうもの）は、投与経路に依存して、任意の薬学的および／または生理学的に許容される担体（水溶液、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、充填剤、賦形剤、および他の既知物質など）と組み合わされ得る。この組成物は、所望される投与方法に適する様々な形態のいずれかに調製され得る。例えば、薬学的組成物は、錠剤、散剤、ロゼンジ、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ剤、エアロゾル（固体としてか、あるいは液体媒体中）、軟カプセル剤および硬カプセル剤、坐剤、注入可能な滅菌溶液、包装された滅菌粉末などの形態で調製され得る。同様に、担体または賦形剤は、当該技術分野において公知の時間−遅延型または時間−放出型物質（グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレート（単独またはワックスを含む）、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルメタクリレートなど）を含み得る。適切な処方は、選択される投与経路に依存する。注入については、本発明の薬剤は水溶液（好ましくは、生理学的に適合した緩衝液（ハンクス液、リンゲル液、または生理食塩水緩衝液など）中に処方され得る。経粘膜投与については、透過される関門に適切な浸透剤が処方物中に使用される。このような浸透剤は、当該技術分野において一般的に知られている。経口投与については、化合物は、活性化合物を当該技術分野において公知の薬学的に許容される担体と混合することによって、容易に処方され得る。ペプチドは、注入（例えば、ボーラス注入または連続注入）による非経口投与のために処方され得る。注入のための処方は、添加される保存剤を含む単位−投与形態で、例えば、アンプル中または複数−投与容器中に存在し得る。この組成物は、懸濁剤、油性または水性ビヒクル中の液剤または乳剤のような形態をとり得、また懸濁、安定化および／または分散剤のような処方剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ　ａｇｅｎｔ）を含み得る。処方の総合的なリストについては、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．（１９９０）（これは、その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００３７】
１つ以上のペプチドが、臨床医によって慣用的に使用され且つ個々の基準に基づいて決定される方法で、Ｌｅｗｙ小体病の処置の必要性がある哺乳動物へ投与され得る。そのペプチドは、好ましくは、注射または長時間にわたる段階的な（ｇｒａｄｕａｌ）注入によって投与され得る。使用され得る他の投与経路は、経口、静脈内、頭蓋内、腹腔内、筋肉内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔｙ）、呼吸内、皮下、経皮、またはリポソーム媒介型の送達である。特に冒される神経細胞への送達は、標的化送達方法（これは、その細胞に選択的に結合する分子への複合体化、または冒される細胞へ結合するであろう標的分子を含むリポソーム内への包囲を含む）を用いて達成され得る。標的化するためのこのような方法は、当該技術分野において周知である（例えば、本明細書中で参考として援用される米国特許第５，３９１，７２３号において）。さらに、いくつかのリポソームが市販されている。
【００３８】
好ましい実施形態において、上述したようなマグネシウム治療とこのペプチド（単数または複数）との同時投与が想定される。組合せ治療は、回復を促進し、そしてより完全なレベルの回復へ向かわせると考えられる。回復が臨床的機能のさらなる喪失のない段階へ一旦到達すると、マグネシウムの共投与によって、維持のために使用されるペプチドの用量をより少なくすることができるかも知れない。
【００３９】
治療的処置の被験体はヒト、または動物（げっ歯類、イヌ、ネコ、ショウジョウバエおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓのような）であり得る。このような動物は有用なヒトモデル系であり得る。
【００４０】
最後に、種々の物質がα−シヌクレインの凝集に及ぼす影響を試験するためのアッセイの実施における使用のためのキットもまた、企図される。この試験は、最低でも、凍結乾燥α−シヌクレイン、鉄または銅塩、および緩衝剤（ＰＢＳまたはＴｒｉｓ緩衝剤）（生理学的ｐＨにて）を含む。このキットはまた、フリーラジカル発生剤（ドーパミンまたは過酸化水素など）を含み得る。好ましくは、このキットは塩化鉄を含む。フリーラジカル発生剤については、過酸化水素が好ましい。
【００４１】
本発明は、以下に続く実施例において説明される。これらの実施例は、本発明の理解の助けとなるよう記載されており、添付される請求項に記載される本発明を何らかの方法で限定することは意図されない（また、限定するように解釈されるべきではない）。
【００４２】
以下の物質および方法は、本明細書中の実施例において使用された。
α−シヌクレインのクローニング、過剰発現、および精製：
α−シヌクレイン（野生型、Ａ５３ＴおよびＡ３０Ｐ）を、ｐｃＤＮＡ３のＮｏｔＩサイトへクローニングした。各々の構築物の配列をＤＮＡ配列決定法によって確認した。組換えタンパク質の産生について、α−シヌクレインをＰｒｏ−Ｅｘ　Ｈｉｓ６ベクター（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩサイトへ挿入した。組換えα−シヌクレインを生成するために、ＢＰｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ）試薬を使用してＩＰＴＧ誘導型細菌溶解物に由来する組換えα−シヌクレインを可溶化し、これをニッケル−アガロースアフィニティーカラムに通し、洗浄し、そして製造元（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）の指示書に従ってイミダゾールを用いて溶出した。精製の後に、Ｈｉｓ−６タグをＴＥＶプロテアーゼで開裂させ、ニッケルアガロースカラムを通すことによって取り除いた。使用される抗体としては、ポリクローナル抗−α−シヌクレイン（ＳＣ１、ヒトα−シヌクレイン（残基１１６〜１３１、配列＝ＭＰＶＤＰＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥＥ）に対して１：２０００（イムノブロッティング用）、および１：５００（免疫細胞化学法用））、モノクローナル抗−α−シヌクレイン−１（１：１０００、Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　Ｌａｂｓ）、ウサギポリクローナル抗−ユビキチン（１：１０００（イムノブロッティング用）および１：５００（免疫細胞化学用）、Ｄａｋｏ）が挙げられる。
【００４３】
ファージディスプレイ：コート上に存在し且つファージ間でランダムに異なる７アミノ酸の配列を除いて全て同じであるファージのライブラリーをインキュベートする。次いで、α−シヌクレインに特異的に結合する配列を発現するファージを単離し、クローン化し、アミノ酸配列を決定するためにＤＮＡ配列決定する。次いで、７アミノ酸ペプチドを合成し、そして直接的に試験する。
【００４４】
細胞培養：必要に応じて１０％　ＦＢＳ、非−必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよび５００μｇ／ｍｌ　Ｇ４１８を補給したＯＰＴＩＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中で細胞を増殖した。Ｇ４１８は選択のために使用した。
【００４５】
イムノブロッティング：ＳＤＳ溶解溶液（２％　ＳＤＳ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、２ｍＭ　β−グリセロールフォスフェート、１μＭ　ＡＥＢＳＦ）を用いて細胞を回収した。タンパク質の量は、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して測定された（５〜３０ｍｇ／レーンを１４％ＳＤＳポリアクリルアミド上で泳動し、ニトロセルロースへ移した（２００ｍＡｍｐ、１２時間）。次いで、そのニトロセルロースを５％ミルク／ＰＢＳ中で１時間インキュベートし、洗浄し、１°抗体中で一晩中インキュベートし、洗浄し、次いでペルオキシダーゼ結合型２°抗体中で３時間インキュベートし、そして化学発光試薬（ＮＥＮ）を用いて発色した。
【００４６】
細胞分画法：細胞分画法のために、細胞を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２５Ｍ　スクロース、および２０μｇ／ｍＬ　プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）を含む緩衝液中で回収した。細胞溶解物を音波破砕し、そして１００，０００×ｇで４℃にて１時間遠心分離した。
【００４７】
ＭＴＴおよびＬＤＨ毒性アッセイ：細胞を、１００μｌ増殖培地中に、９６ウェルディッシュに５０００細胞／ウェルでプレーティングした。ＭＴＴアッセイのために、０．５ｍｇ／ｍｌ　ＭＴＴ（ＭＴＴ、３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）を添加し、そして３７℃で３時間インキュベーションすることによって、薬理学的処理の４８時間後の生存率を分析した。次いで、溶解緩衝液（２０％ＳＤＳ　５０％Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（１００μｌ））を添加し、２４時間後、このプレートを５４０ｎｍにて読み取った。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）アッセイのために、ＭＴＳ試薬およびＣｙｔｏｘ　９６キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造元の指示書に従って用い、薬理学的処理の２４時間後の生存率を分析した。
【００４８】
チオフラビン−Ｓ　組織化学法：細胞を４％パラホルムアミド中で３０分間固定化した。２回のＰＢＳ洗浄の後、この細胞を０．５％チオフラビン−Ｓで８分間インキュベーションし、８０％エタノール中で３回洗浄し、Ｈ２Ｏ中で１回洗浄し、その後マウントした。
【００４９】
電子顕微鏡法：細胞をスクレーピングにより脱着し、スピンダウンし、そして２％グルタルアルデヒド中で２時間４℃にて固定化し、次いで１％四酸化オスミウム中で１時間４℃にて後固定した。そのサンプルを脱水し、エポキシ樹脂（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｆｏｒｔ　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）中に埋めこみ、そして顕微鏡のために７０ｎｍの切片に切断した。次いで、この切片を５％ウラニルアセテートおよびレイノルズクエン酸鉛を用いて後染色した。サンプルを、Ｈｉｔａｃｈｉ　Ｈ−６００透過型電子顕微鏡を７５ｋＶにて用いて観察した。
【００５０】
鉄染色：細胞を４％パラホルムアルデヒド中において３０分間固定化し、その後２回ＰＢＳ洗浄し、Ａｃｃｕｓｔａｉｎ（登録商標）Ｉｒｏｎ　Ｓｔａｉｎを用いて、製造元の指示書（Ｓｉｇｍａ）に従って、染色した。
【００５１】
免疫組織化学：光学顕微鏡のために、細胞を４％パラホルムアルデヒド中において固定化し、洗浄し、０．２％　Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ　１００を用いて３０分間インキュベーションすることによって透過させ、５％　乾燥ミルク／１％ヤギ血清／ＰＢＳを用いてブロックし、洗浄し、次いで１°抗体（１：５００）中で一晩中インキュベーションした。製造元の指示書（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）通りに、ＡＢＣキットおよび３’，３’−ジアミノベンジジンを用いて発色した。
実施例
実施例１．鉄およびフリーラジカルはα−シヌクレイン凝集を刺激する
α−シヌクレイン中のＡ５３ＴおよびＡ３０Ｐ突然変異がニューロンにおいてα−シヌクレインを凝集させる傾向を増大するか否かを試験するために、野生型、Ａ５３ＴまたはＡ３０Ｐ　α−シヌクレインを用いて安定にトランスフェクトしたヒトＢＥ−Ｍ１７神経芽腫細胞において、α−シヌクレイン凝集を測定した。各細胞株を、新しく調製したＦｅＣｌ２（１または１０ｍＭ）で４８時間処理し、次いで回収し、ホモジナイズし、そして膜成分および細胞質成分へ画分化した。この膜（５μｇ／レーン）および細胞質（２０μｇ／レーン）成分を、モノクローナル抗−α−シヌクレイン抗体を用いてイムノブロッティングした。
【００５２】
α−シヌクレインの凝集は膜画分において明瞭であったが、細胞質画分においては明瞭でなかった。Ａ５３Ｔ−発現細胞株のＦｅＣｌ２での処理は、濃縮用ゲル内に移動する異種の高分子量α−シヌクレイン凝集体の用量依存的な形成を誘発した。また、多くの抗−α−シヌクレイン免疫反応性が、分離ゲルの上部（４５〜２００ｋＤａの範囲内）に現れた。これらのバンドが単量体α−シヌクレイン（１９ｋＤａの質量を有する）より有意に大きいことから、これらのバンドはまた、α−シヌクレインポリマーおよび凝集体を表す可能性がある。例えば、３８および５７ｋＤａのバンドは、α−シヌクレインの２量体および３量体と一致するサイズを有する。異なる抗体（ポリクリーナル抗−α−シヌクレイン抗体）を用いて行ったイムノブロットはまた、同じ条件下で凝集体産生を示した。他の細胞株（未トランスフェクション、野生型およびＡ３０Ｐ）の処理は、試験された４８時間の枠内でα−シヌクレイン凝集体を誘導しなかった。
【００５３】
低い鉄用量にて鉄への暴露時間を延長することがα−シヌクレインの凝集に及ぼす影響を測定するために、Ａ５３Ｔまたは野生型α−シヌクレインを過剰発現するＢＥ−Ｍ１７細胞をＦｅＣｌ２へ４日間暴露した。これらの条件下では、０．３μＭと同程度低い用量のＦｅＣｌ２が、Ａ５３Ｔ　α−シヌクレインを発現する細胞中でα−シヌクレインの検出可能な凝集をもたらした。興味深いことに、これらのより長い条件はまた、野生型α−シヌクレインの凝集を誘導する。対照的に、アクチンの凝集は観察されず、このことはこの凝集がα−シヌクレインに対して選択的であることを示す。
【００５４】
ＢＥ−Ｍ１７細胞におけるα−シヌクレイン凝集のパターンがヒト脳において生じるものとどのようなものかを測定するために、ヒト皮質脳ホモジェネート（神経学的に正常なドナーに由来する）におけるα−シヌクレインの鉄暴露に対する応答をｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて行った。５００μＭ　ドーパミン、１０ｍＭ　ＦｅＣｌ２およびプロテアーゼ阻害剤（ドーパミンは、以下に記載されるように酸化剤として添加される）を用いて２４時間処理した後の皮質脳ホモジェネートの膜画分におけるα−シヌクレイン凝集のパターンは、ＢＥ−Ｍ１７細胞においてみられるものと類似していた。このことは、ＢＥ−Ｍ１７細胞およびヒト脳におけるα−シヌクレインが、鉄に応答して類似する凝集パターンを示し、そして両者ともが凝集する強い傾向を共有することを示唆する。さらに、高分子量α−シヌクレイン免疫反応性が、基本条件下において生育する細胞に由来するα−シヌクレイン細胞溶解物のイムノブロットの分離ゲル中に時々現れることを観察した。しかしながら、濃縮用ゲル中で移動する凝集体は、鉄を用いる処理後にのみ生じ、基本条件下のいずれの細胞株においても観察されなかった。このことは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて組換えα−シヌクレインを用いて行った以前の研究を支持し、α−シヌクレインの変異型がオリゴマー化する強い傾向を有していることを示唆する［Ｃｏｎｗａｙ、ＫＡら、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ、　９７：５７１−５７６（２０００）］。しかしながら、濃縮用ゲル中の凝集体の移動は、分離ゲル中における移動よりも厳しい凝集体形成のさらに厳しい試験であり得る。
【００５５】
研究は、フェントン反応を介してフリーラジカル形成を増大させることにより、鉄がタンパク質凝集を促進し得ることを示唆した［Ｗｏｌｏｚｉｎ、Ｂら、Ａｒｃｈ．　Ｎｅｕｒｏｌ．、５７：７９３−７９６（２０００）］。もしそうならば、フリーラジカル発生剤（過酸化水素またはドーパミンなど）を鉄と共に添加することが、α−シヌクレイン凝集の量を増加させるかも知れない。酸化がα−シヌクレインの鉄誘導型凝集を促進することをさらに測定するために、Ａ３０Ｐまたは野生型α−シヌクレインを過剰発現するＢＥ−Ｍ１７細胞を、１０ｍＭ　ＦｅＣｌ２および異なる濃度のドーパミン（０．５、５０、および５００μＭ）で４８時間処理した。Ａ３０Ｐまたは野生型　α−シヌクレインを発現させるために４８時間にわたって細胞を使用した（Ａ５３Ｔ　α−シヌクレインを過剰発現する細胞とは異なり、それらはこれらの条件下において凝集体を形成しないため）。予想される通り、１０ｍＭ　ＦｅＣｌ２単独で処理されたＡ３０Ｐまたは野生型α−シヌクレインを過剰発現するＢＥ−Ｍ１７細胞は、いかなる凝集も誘発しなかった。同様に、５、５０、および５００μＭドーパミン単独を用いる処理は、濃縮用ゲル内で移動する大きいα−シヌクレイン凝集体の形成を誘導しなかった。しかしながら、１０ｍＭ　ＦｅＣｌ２を５０または５００μＭ　ドーパミンと組み合わせることによって、大きいα−シヌクレイン凝集体の形成が誘導された。これらのデータによって、酸化剤と鉄との組み合わせがα−シヌクレイン凝集にさらなる影響を及ぼし得ることが示された。
【００５６】
２つの独立する実験によって、観察される凝集が、クローン細胞株の使用から生じる人工産物ではなく、むしろα−シヌクレインの一般的な特徴であることが示された。一時的にＡ５３Ｔ　α−シヌクレインｃＤＮＡでトランスフェクションされ、次いで１０ｍＭ　ＦｅＣｌ２および１００μＭ　Ｈ２Ｏ２を用いて７２時間処理されたＢＥ−Ｍ１７細胞は、安定にα−シヌクレインを過剰発現するＢＥ−Ｍ１７細胞株においてみられるものに類似する凝集体を発達させる。さらに、ラットの一次皮質ニューロンもまた凝集体を発達させる強い傾向を示し、凝集体の形成を誘導するのに０．１ｍＭ　ＦｅＣｌ２および５０μＭ　ドーパミンを用いるたった６０時間の処理を要したに過ぎなかった。従って、この凝集は、特定のクローン細胞株に対して特異的な人工産物ではなく、むしろα−シヌクレインの生物物理学的性質の結果であった。
【００５７】
実施例２：Ａ５３ＴおよびＡ３０Ｔ　α−シヌクレイン凝集体はユビキチンを含む
ＰＤにおいて、Ｌｅｗｙ小体は大量のユビキチンを含んでいることが示された［Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｄ．ら、Ｂｒａｉｎ　Ｐａｔｈ．、９：７２１−３２（１９９９）；Ｇｉｂｂ，Ｗ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．　ａｎｄ　Ｐｓｙｃｈ．、５１：７４５−５２（１９８８）］。また、ユビキチンの凝集がα−シヌクレイン凝集と共に起こるか否かを測定するために、ＦｅＣｌ２およびドーパミンで処理されたＡ３０Ｐ　α−シヌクレインを発現するＢＥ−Ｍ１７細胞から溶解物（膜画分）をとり（実施例１を参照、４８時間処理）、そして抗−ユビキチン抗体を用いてイムノブロッティングした。これらの条件下で蓄積されるユビキチン凝集体は、ユビキチンに対して強く染色した。ＦｅＣｌ２単独、ＦｅＣｌ２および過酸化水素、またはＦｅＣｌ２およびドーパミンで処理された後、Ａ５３Ｔ　α−シヌクレインまたは野生型α−シヌクレインを発現する細胞中に蓄積される凝集体は、また、ユビキチン含んでいた。凝集されるユビキチンの量は、一般的に、α−シヌクレインの量と平行する。全溶解物のイムノブロットによると、ユビキチンおよびアクチンの総量が、α−シヌクレインを過剰発現する細胞株とコントロール細胞との間で有意に異ならないことが示されたので、凝集体中のユビキチンの存在はユビキチンの発現の増大から生じるものではないと考えられた。これらのデータは、鉄処理に応答してニューロン中で形成するα−シヌクレインの凝集体がユビキチン化されることを示す。
【００５８】
実施例３．α−シヌクレイン凝集体は、チオフラビン−Ｓ組織化学法および電子顕微鏡法によって明らかにされる目に見える封入体を形成する
チオフラビン−Ｓ組織化学法および電子顕微鏡法を使用して、鉄および過酸化水素を用いる処理に応答して形成される凝集体を調べた。各株（ＢＥ−Ｍ１７：未トランスフェクション、野生型、Ａ３０ＰおよびＡ５３Ｔ　α−シヌクレイン）に由来する細胞を、１０ｍＭ　ＦｅＣｌ２、または１０ｍＭ　ＦｅＣｌ２および１００μＭ　Ｈ２Ｏ２で７２時間処理し、α−シヌクレイン陽性封入体の形成を誘導した。形成された凝集体はチオフラビン−Ｓを結合することが観察され、このことはβ−プリーツシート構造の存在を示す。チオフラビン−Ｓ−陽性凝集体のサイズおよび数は、イムノブロッティングによって示される結果に平行する。野生型、Ａ３０ＰおよびＡ５３Ｔ　α−シヌクレイン細胞株は、各々、１０ｍＭ　ＦｅＣｌ２および１００μＭ　Ｈ２Ｏ２を用いる７２時間の処理後、タンパク質凝集体の有意な蓄積を示した。対照的に、未トランスフェクション株は、チオフラビン−Ｓ−陽性凝集体の蓄積を全く見せなかった。１０ｍＭ　ＦｅＣｌ２のみを使用してこの細胞を処理した場合、チオフラビン−Ｓ陽性封入体は、Ａ５３Ｔ　α−シヌクレイン発現細胞においてのみ観察された。電子顕微鏡を使用し、この凝集体を調べた。Ａ５３Ｔ　α−シヌクレインを発現する、または空のベクターを発現する細胞を１０ｍＭ　ＦｅＣｌ２および１００μＭ　Ｈ２Ｏ２で７２時間処理し、次いで電子顕微鏡法のために調製した。細胞質封入体は、Ａ５３Ｔ−発現細胞において見られたが、ベクター−トランスフェクション細胞においては見られなかった。この封入体はフィブリル及びアモルファス材料との混合物を含んでいた。このフィブリルは、約１０ｎｍの直径および１０μｍまでの長さを有していた。１０ｍＭ　ＦｅＣｌ２および１００μＭ　Ｈ２Ｏ２を用いる処理は多くの細胞にとって有毒であったが、凝集体を含むいくつかの細胞はフィブリル沈積物および無傷なオルガネラの両方を有しており、このことは、凝集が生存細胞中で起こり得ることを示している。凝集体中のフィブリルおよびアモルファス材料の両方の存在が、α−シヌクレインを過剰発現するトランスジェニック動物において存在する凝集体中で観察された［Ｆｅａｎｙ，ＭＢら、　Ｎａｔｕｒｅ，４０４：３９４−８（２０００）；Ｍａｓｌｉａｈ，Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８７：１２６５−１２６９（２０００）］。
【００５９】
実施例４．α−シヌクレイン凝集体は、免疫組織化学によって明らかにされる目に見える封入体を形成する
免疫組織化学によって封入体形成が試験された。Ａ５３Ｔ　α−シヌクレインを発現する細胞を１０ｍＭ　ＦｅＣｌ２および１００μＭ　Ｈ２Ｏ２で７２時間処理し、固定化し、次いでユビキチンおよびα−シヌクレインに対する抗体で、ペルオキシダーゼ免疫組織化学法を用いて試験した。蛍光クロマジェン（ＦＩＴＣまたはローダミンなど）が鉄を用いる処理に起因する細胞への強い非特異的結合を示したので、ペルオキシダーゼ染色を使用した。抗−α−シヌクレインおよび抗−ユビキチン抗体を用いる免疫組織化学は、基本条件下において細胞の細胞質の全体に一様な染色を示した。１０ｍＭ　ＦｅＣｌ２および１００μＭ　Ｈ２Ｏ２を用いる７２時間の処理後には、この染色は、一様でなくなってきた。抗−α−シヌクレインで染色される細胞は、しばしば、いくつかの暗く染色された大きな反応性フォーカス（ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｆｏｃｉ）および複数の小さな点フォーカス（ｐｕｎｃｔｕａｔｅ　ｆｏｃｉ）を示した。また、ユビキチンを用いる染色は存在していたものの、細胞１個当たりのフォーカスの数がより少なかった。一次抗体の代わりに前−免疫ウサギ血清を用いて行った免疫細胞化学法は、基本または処理条件のいずれの下でも反応性を示さなかった。
【００６０】
実施例５．α−シヌクレイン凝集は生細胞中で起こる
細胞へのＦｅＣｌ２の毒性効果、そしてα−シヌクレイン凝集と細胞死との間の関係を測定するために、高濃度および低濃度のＦｅＣｌ２の存在下における凝集体形成および細胞生存率を実施した。上記のように（実施例３＆４）、１０ｍＭ　ＦｅＣｌ２および１００μＭ　Ｈ２Ｏ２を用いる７２時間の処理は、ほとんどの非−トランスフェクション細胞において、α−シヌクレイン凝集体の形成を誘導した。従って、これらの条件は、また、細胞の大部分を殺した（＞９０％細胞死）。
【００６１】
対照的に、０．３ｍＭ　ＦｅＣｌ２および１００μＭ　Ｈ２Ｏ２で９６時間処理されたＡ５３Ｔ−発現型ＢＥ−Ｍ１７細胞は、非常に少ない毒性を示し、またなおα−シヌクレイン凝集体を形成した。細胞の平行するセットを、ユビキチンおよびα−シヌクレインに対する抗体（ＳＣ１）を用いる免疫細胞化学法のために処理したか、あるいはトリパンブルー排除アッセイを用いて生存率を測定するために処理した。未処理の細胞は、ほとんど毒性を示さなかった（トリパンブルーに対して透過性である３．７±１．０％を伴った）。存在した少量の細胞死は、細胞を解離させるために使用したトリプシン処理／粉砕（ｔｒｉｔｕｒａｔｉｏｎ）工程によって引き起こされたのかも知れない。０．３ｍＭ　ＦｅＣｌ２および１００μＭ　Ｈ２Ｏ２を用いる処理はいくつかの細胞（１２．１±２．３％　トリパンブルー陽性）を殺したが、細胞の大半（８７．９％）は生存したままであった。抗α−シヌクレイン抗体を用いる免疫細胞化学法によって、２１．０±３．５％の細胞が目に見える凝集体を有することが示された。抗−ユビキチン抗体を用いる免疫細胞化学法によって、この凝集体がユビキチンを含み得、そしてこの凝集体がチオフラビン−Ｓで染色されるβ−プリーツシート構造を有する物質を含むことが示唆された。興味深いことに、また分散性チオフラビン−Ｓ反応性はこれらの細胞において明瞭であり、α−シヌクレインの分散型「マイクロ凝集体」は、また、緩やかな条件下でも形成し得ることが示唆された。
【００６２】
このように、緩やかな条件下において形成されるα−シヌクレイン凝集体は、より厳しい条件下で形成される凝集体と同様に、抗体および染色剤と反応した。さらに、α−シヌクレイン凝集体を示す細胞の割合が死の証拠を示す細胞の割合より大きかったという結果によって、α−シヌクレイン凝集体を生じる細胞の多くが生存していることを示唆する。
【００６３】
α−シヌクレインの凝集が生存細胞において起こり得るという結果は、また、α−シヌクレインの凝集が細胞死より前に起こることも示唆し得る。
【００６４】
実施例６．α−シヌクレインの過剰発現はフリーラジカル媒介型毒性を増大する
α−シヌクレイン凝集体が生存細胞において形成され得るという事実にも関わらず、α−シヌクレインの凝集が毒性の誘導における最初の段階を表しているかも知れないという可能性がある。先の結果によって、一時的に過剰発現される場合、α−シヌクレインがいくつかの細胞にとって有毒であることが示唆された。［（Ｏｓｔｒｅｒｏｖａ，Ｎ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１９：５７８２−９１（１９９９））。しかしながら、α−シヌクレインは、全ての細胞（ＢＥ−Ｍ１７細胞など）に対して急性毒性ではない。α−シヌクレインは、トランスジェニック動物における過剰発現を可能にするほど十分に耐性を有する　（Ｆｅａｎｙ，ＭＢら、Ｎａｔｕｒｅ、４０４：３９４−８（２０００）；Ｍａｓｌｉａｈ，Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８７：１２６５−１２６９（２０００））。α−シヌクレインは、基本条件下でＢＥ−Ｍ１７細胞に対して急性毒性でないが、α−シヌクレインが他の条件下（凝集体形成につながる条件など）において毒性である可能性はある。
【００６５】
α−シヌクレイン凝集を生成する条件がまた、毒性を生み出すか否かを測定するために、鉄および／または過酸化水素に対する各細胞株の脆弱性を試験した。各細胞株（未トランスフェクション、野生型、Ａ５３ＴおよびＡ３０Ｐ　α−シヌクレイン）を様々な量のＦｅＣｌ２、Ｈ２Ｏ２またはＦｅＣｌ２＋Ｈ２Ｏ２で処理し、毒性の量をＭＴＴアッセイによって測定した。全ての型のα−シヌクレインを過剰発現するＢＥ−Ｍ１７細胞は、鉄−媒介型毒性に対する脆弱性の増加を示した（図１Ａ）。Ａ５３Ｔ　α−シヌクレインの過剰発現が、毒性に及ぼす最も大きな影響を有し、ＦｅＣｌ２のＬＤ５０を７５％以上減少させた（図１Ａ）。低レベルの鉄に応答するＡ３０Ｐ−発現細胞においてみられる毒性の量は、概して、野生型α−シヌクレインで見られる毒性よりも大きかったけれども、Ａ３０Ｐまたは野生型　α−シヌクレイン構築物の過剰発現は、ＬＤ５０値を〜５０％だけ減少させた（図１Ａ）。α−シヌクレインの過剰発現が、鉄への神経芽腫細胞の脆弱性を増大させることを確かめるために、ＬＤＨアッセイを用いて鉄−誘導型毒性を試験した（図１Ｂ）。ＬＤＨアッセイによって、α−シヌクレイン構築物の過剰発現が鉄−誘導型毒性を増大させることが確認された（図１Ｂ）。
【００６６】
α−シヌクレイン（野生型、Ａ５３ＴまたはＡ３０Ｐ）を過剰発現する細胞株のＭＴＴアッセイによって、また、ＦｅＣｌ２＋Ｈ２Ｏ２を用いる処理後の毒性の増大が明らかにされた（図１Ｃ、暗灰色の棒）。興味深いことに、α−シヌクレイン（野生型、Ａ５３ＴまたはＡ３０Ｐ）の過剰発現は、Ｈ２Ｏ２単独に対する脆弱性を増大せず、また神経芽腫細胞に対する適度な保護をもたらした（図１Ｃ）。これらのデータは、野生型または変異型α−シヌクレインのいずれのレベルの増大が、選択的条件下の細胞培養物において成長するニューロンに対して毒性であり得ることを実証した。このデータは、α−シヌクレインが細胞に鉄−誘導型毒性に対する特別な脆弱性を提供することを示唆する。この鉄に対する選択的脆弱性は、α−シヌクレイン凝集体における封鎖鉄（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒ　ｉｒｏｎ）へのα−シヌクレインの傾向から生じ得る。
【００６７】
未トランスフェクションまたはＡ５３Ｔ−α−シヌクレイン発現ＢＥ−Ｍ１７細胞を、１０ｍＭ　ＦｅＣｌ２および１００μＭ　Ｈ２Ｏ２で４８時間処理し、次いで固定化し、そして鉄について染色した。Ａ５３Ｔ　α−シヌクレインを発現する細胞は、処理後、未トランスフェクション細胞よりもずっと高い鉄含量を有していた。α−シヌクレインに起因する鉄の金属イオン封鎖は、特にフリーラジカル発生剤（過酸化水素またはドーパミンなど）に暴露された細胞において、フェントン反応を介するフリーラジカル産生を増大させるであろう。しかしながら、鉄の非存在下では、フェントン反応は起こらず、α−シヌクレインは無害である。
【００６８】
実施例７．鉄はα−シヌクレインに結合する
鉄が凝集体を形成する他のタンパク質へ結合し、また鉄がパーキンソン病において蓄積することが知られていることから、鉄は、α−シヌクレインに直接的に結合する可能性がある。この仮説を確かめるために、チロシン蛍光を鉄結合の指標として使用し、鉄のα−シヌクレインとの相互作用を試験した。高用量の鉄（＞１０ｍＭ）はチロシン蛍光を消光したが、鉄を結合するタンパク質は、非常に少ない量で消光を示した（おそらく、タンパク質結合によって鉄がチロシンの近傍に保たれるので）。チロシンの蛍光を使用して金属のβ−アミロイドへの結合をモニターした［本明細書によって参考として援用されるＧａｒｚｏｎ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ　Ｗ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、９：２２４３−２２４８（１９９９）］。鉄のα−シヌクレインへの結合を分析するために類似する方法を行った。チロシンは、それぞれ２８０ｎｍで励起される場合、３１０ｎｍのピーク発光を有する蛍光発光スペクトルをもつ（図２Ａ）。鉄の結合がα−シヌクレイン内のチロシンの蛍光を減少させることが観測された。この結果は、ほぼ同用量のＦｅＣｌ２との遊離チロシンのインキュベーションが消光を全く起こさなかったので、これがα−シヌクレインへの特異的な結合に起因することを実証した。結合曲線を分析するためのＰｒｉｓｍ　ｐｒｏｇｒａｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用し、本発明者らは、そのデータがＳ字曲線（ＩＣ５０＝１７３μＭを伴う）に適合していることを観察した。ヒル係数は１．０（Ｒ２＝１．０、Ｐ＜０．０００１）であり、協同性を全く有さない鉄への１つの結合部位を示す（図２Ａ＆Ｂ）。α−シヌクレインを、また、ＣｕＣｌ２、ＺｎＣｌ２およびＭｇＣｌ２を含む他の金属への結合について試験した。α−シヌクレインのＣ−末端は７つのグルタメートおよび４つのアスパルテート（これらは共に鉄をキレートし得る）を含む領域を有するので、本発明者らは、α−シヌクレイン上の最後の２７アミノ酸を欠く欠失構築物を作製し、そしてこの構築物の結合を分析した。α−シヌクレインのＣ−末端欠失構築物ΔＣ１−１１３は、鉄結合において４倍以上の減少を示した（ＩＣ５０＝７２６μＭ（Ｐ＜０．００１）（図２Ｂ）。このことは、α−シヌクレインが鉄へ結合すること、およびこのＣ−末端構築物が鉄結合に寄与するけれども、鉄結合のために必須ではないことを示唆する。
【００６９】
実施例８．マグネシウムはシヌクレイン凝集から保護する
ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるＦｅ（ＩＩ）およびＭｇ（ＩＩ）のα−シヌクレインへの結合プロフィールをモニターするために、本発明者らは、チロシン蛍光の変化を利用した。チロシン蛍光を、タンパク質コンフォメーションまたは金属の結合における変化の指標として、使用した。２８０ｎｍでのチロシンの励起によって、単量体チロシンについては３１０ｎｍで、またチロシネートもしくは２量体チロシンについては３５０−４００ｎｍでピークに達する蛍光が誘発された。α−シヌクレインの蛍光スペクトルは、３１０および４００ｎｍでピークに達する蛍光を生じた。α−シヌクレインの２量体化が４００ｎｍでの蛍光を減少させ、且つ４００ｎｍでのピークを排除する傾向を有するので、４００ｎｍにおけるピークをα−シヌクレインの２量体化に起因する２量体チロシンの存在によって説明することはできない。さらに、α−シヌクレインのゲル電気泳動および質量分析法によって、このα−シヌクレインが単量体であることが示された。これは４００ｎｍでのピークがチロシンに起因することを示唆し、このことは、フェノール性ヒドロキシルからアスパラギン酸もしくはグルタミン酸タンパク質アクセプターへのプロトン移動の結果として生じ得る。α−シヌクレインを増大した用量のＦｅ（ＩＩ）とインキュベーションすることによって、３１０および４００ｎｍの両方においてα−シヌクレイン中のチロシンの蛍光が急速に減少する。この蛍光消光のプロットはＩＣ５０＝１７３μＭおよび０．１のヒル係数（Ｒ２＝０．１、Ｐ＜０．０００１）を伴うＳ字曲線を示し、同じ親和性を有し且つ協同性を有さない１つの結合部位または複数の結合部位を示す。チロシン蛍光は、絶対親和性（ａｂｓｏｌｕｔｅ　ａｆｆｉｎｉｔｙ）よりもコンフォメーション変化のより良い指標であるので、鉄のα−シヌクレインに対する実際の親和性は１７３μＭ以下であるかも知れない。
【００７０】
マグネシウムのα−シヌクレインへ及ぼす影響は、鉄のものと劇的に異なった。マグネシウムは４００ｎｍでの蛍光を増大させるが、３１０ｎｍでの蛍光には影響を及ぼさなかった。チロシン蛍光が、協同性結合を示す６０〜８０μＭのマグネシウムで鋭い段階的な増加を示したことから、α−シヌクレインへのマグネシウムの結合は、また、顕著であった。特に４００ｎｍにおけるチロシン蛍光の協同調節は、マグネシウムが、鉄によって誘導されるものとは異なるシヌクレインにおけるコンフォメーション変化を引き起こすことを示唆する。鉄とのマグネシウムの同時インキュベーションは、α−シヌクレインチロシン蛍光の鉄−誘導型消光を妨げず、このことは鉄およびマグネシウムがα−シヌクレイン上の異なる部位に結合することを示唆する。
【００７１】
本発明者らは、また、ヒトα−シヌクレイン中のＡ５３Ｔ変異がどのように鉄およびマグネシウムの結合に影響を与えるかを調べた。Ａ５３Ｔ突然変異は、鉄のα−シヌクレインへの見かけの親和性を変化させなかったが、マグネシウムとα−シヌクレインとの間の相互作用を消滅させた。以前の研究によって、Ａ５３Ｔ突然変異が、そのヘリックス含量を増大させることによって、α−シヌクレインのコンフォメーションを変化させることが示されている［Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７６：２０４５−７（１９９７）］。これらのコンフォメーション変化は、また、マグネシウムのα−シヌクレインへの結合を減少させるかも知れない。
【００７２】
マグネシウムおよび鉄がα−シヌクレインチロシン蛍光において反対の変化を誘導することが分かれば、マグネシウムの結合が、おそらくβ−プリーツシートの形成を妨げることによって、凝集に抵抗するコンフォメーションへα−シヌクレインを変化させ得ることが考えられる。これを試験するために、野生型組換えα−シヌクレインを０〜３ｍＭ　ＦｅＣｌ２および０または１００μＭ　ＭｇＣｌ２と共に３７℃で２４時間インキュベーションし、次いでα−シヌクレインについてイムノブロッティングし、そしてビデオデンシトメトリーによって凝集を定量した。本発明者らは、最大用量の鉄以外の全てにおいて、α−シヌクレインの高分子量凝集体の形成における顕著な減少を観察した（ｎ＝３、Ｐ＜０．０００１）。組換えα−シヌクレインの凝集を測定するためのチオフラビン−Ｓを用いる分析によっても、また、鉄によるα−シヌクレイン凝集の誘導、および類似する条件下におけるマグネシウムによる凝集の阻害が示された。独立する実験において、本発明者らは、マグネシウムが、また、α−シヌクレインの自発的な凝集を阻害することを観察した。
【００７３】
本発明者らは、チロシン蛍光を用いることによってマグネシウムとＡ５３Ｔ　α−シヌクレインとの間の相互作用を観察しなかったので、本発明者らは、組換えＡ５３Ｔ　α−シヌクレインの凝集が、また、マグネシウムに対して不感受性であるか否かを試験した。本発明者らは、組換えＡ５３Ｔ　α−シヌクレインを０〜３ｍＭ　ＦｅＣｌ２および０または１００μＭ　ＭｇＣｌ２と共に２４時間インキュベートし、次いでα−シヌクレインをイムノブロッティングし、そしてビデオデンシトメトリーによって凝集を定量した。本発明者らは、マグネシウムがＡ５３Ｔ　α−シヌクレインの鉄−誘導型凝集を阻害し得ないことを観察した。マグネシウムがＡ５３Ｔ　α−シヌクレインの凝集を阻害する能力を有さなかったことは、マグネシウムがＡ５３Ｔ　α−シヌクレインと相互作用しなかったことを示唆するチロシン蛍光データと一致する。
【００７４】
Ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて野生型α−シヌクレインの凝集を阻害するマグネシウムの能力は、これが生存ニューロンにおける凝集を阻害し得ることを示唆する。これを試験するために、本発明者らは、細胞培養物中で成長する一次皮質ニューロンにおいてα−シヌクレイン凝集を阻害するマグネシウムの能力について調べた。一次皮質ニューロンを１ｍＭ　ＦｅＣｌ２および０−１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２で３日間処理し、α−シヌクレインをイムノブロッティングし、そしてビデオデンシトメトリーによって凝集体の量を測定した。０．２〜１．５ｍＭの増加する用量のマグネシウムを用いる処理は、高分子量α−シヌクレイン凝集体の形成において、用量依存的な減少をもたらした。０．５ｍＭと同程度少量のマグネシウムは、α−シヌクレイン陽性凝集体の形成において統計的に有意な減少を生み出した。マグネシウムは、野生型α−シヌクレインを過剰発現するＢＥ−Ｍ１７神経芽腫細胞に及ぼす、同様の凝集阻害効果を発揮した。対照的に、マグネシウムは、ヒトＡ５３Ｔα−シヌクレインｃＤＮＡを発現するＢＥ−Ｍ１７細胞において、凝集体形成を阻害することができず、このことは、α−シヌクレインに結合すること（コンフォメーション変化を含む）によってマグネシウムがα−シヌクレイン凝集を阻害するという仮説と一致する。
【００７５】
本発明者らは、また、ユビキチンに対する抗体を使用して、存在する凝集体の量を調べた。前述したように、高分子量のユビキチン付加物の蓄積はα−シヌクレイン凝集体の形成と相関する。一次皮質ニューロンを前述のように処理し、そしてその凝集体を抗−α−シヌクレイン抗体で免疫沈降し、そして抗−ユビキチン抗体を用いてイムノブロッティングした。０．３ｍＭ鉄および５０μＭドーパミンで３日間処理すると、α−シヌクレインのユビキチン化における増加が観察された。しかしながら、マグネシウムを用いる細胞の処理は、０．５ｍＭと同程度低い用量で、ユビキチン免疫反応性における統計的に有意な減少を生み出す（ｎ＝３、Ｐ＜０．０００１）。従って、マグネシウムは、一次ニューロンにおけるユビキチン陽性α−シヌクレイン凝集体の形成を阻害する。
【００７６】
次に、マグネシウムが、また、野生型α−シヌクレインを安定に過剰発現するＢＥ−Ｍ１７ニューロンにおいてα−シヌクレイン−陽性封入体の形成を阻害するか否かを調べた。ニューロンを１ｍＭ　ＦｅＣｌ２および５０μＭドーパミンおよび０または１ｍＭ　ＭｇＣｌ２で３日間処理し、次いで抗−α−シヌクレインおよび抗−ユビキチン抗体を用いる免疫細胞化学法によって試験した。鉄およびドーパミンで処理されたニューロンは、豊富なα−シヌクレイン−陽性封入体を示したが、一方鉄、ドーパミンおよびマグネシウムで処理されたニューロンは、α−シヌクレイン−陽性封入体の蓄積をほとんど示さなかった。
【００７７】
α−シヌクレイン凝集のマグネシウム−誘導阻害は、また、ＭＴＴアッセイによって測定されるように、神経保護と相関する。ベクターまたは野生型α−シヌクレインで安定にトランスフェクションしたＢＥ−Ｍ１７神経芽種細胞をＦｅＣｌ２およびドーパミンおよび０または０．８ｍＭ　ＭｇＣｌ２で２日間処理し、次いでＭＴＴアッセイによって生存率を分析した（ＭＴＴアッセイのための光学密度を最適化するために、用量を選択した）。野生型α−シヌクレインを過剰発現する細胞株は、鉄／ドーパミン処理に応答する毒性の増大を示し、このことは上記の観察と矛盾しない。マグネシウムを用いる処理は、野生型細胞株における細胞生存を２．４倍増大させたが、コントロール細胞株においては、わずか１．３倍にすぎなかった（Ｆｅ２＋／ドーパミン単独で処理される細胞の間の生存と比較して）。このことは、より多くのα−シヌクレイン関連毒性を有する細胞株ほど、それに応じて、マグネシウムによるより多くの保護を有することを示唆する。
【００７８】
マグネシウムがどのように中枢神経系からのニューロンに影響を及ぼすかを、また、試験した。中枢神経の一次培養物を０．３ｍＭ　ＦｅＣｌ２および５０μＭ　ドーパミンおよび０−２ｍＭ　ＭｇＣｌ２で３日間処理した（神経突起（ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）の定量を可能にするために、比較的少ない用量の鉄を使用した）。マグネシウムによって提供される神経保護の量を定量するために、細胞生存の特徴として１００μｍより長い突起の割合を測定した。鉄およびドーパミンを用いる処理は神経突起の鈍化（ｂｌｕｎｔｉｎｇ）を誘導し、１００μｍ超の神経突起の数を約６０％減少させた（ｎ＝５、Ｐ＜０．００１）。封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓ）は、また、これらのニューロンにおいて形成された。しかしながら、鉄、ドーパミンおよび１−２ｍＭマグネシウムで処理されたニューロンは、わずか２０％の突起の消失を示したにすぎず、α−シヌクレイン−陽性封入体のいかなる形成も表さなかった。これらの結果は、以前の研究と矛盾せず、マグネシウムが細胞保護することを示唆する（Ｂｅａｌ，Ｍ．Ｆ．、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３１：１１９−３０　（１９９２））。さらに、これらの結果によって、マグネシウムが、神経細胞株における場合と同様に、中枢神経系のニューロンにおいてα−シヌクレイン凝集を防止し得ることが示された。
【００７９】
要約すると、マグネシウムは、自発的および鉄誘導型凝集の両方を阻害した（図３）。これは、α−シヌクレインへのマグネシウムの結合が、α−シヌクレインを凝集に抵抗するコンフォメーションへと変化させることのために生じたものであり得る（図３Ｂ）。
【００８０】
興味深いことに、マグネシウムがその抗−凝集効果を発揮する用量は、例えば、前−子癇症を処置するために使用される治療的用量と類似している。マグネシウムのこれら用量は、治療的に達成可能である。これは、α−シヌクレインへのマグネシウムの結合が、α−シヌクレインを凝集に抵抗するコンフォメーションへと変化させることに起因して生じたものであり得る（図３Ｂ）。
【００８１】
実施例９．抗−α−シヌクレインペプチドの同定
鉄結合を阻害し得るペプチドについて特異的に選択するために、ファージディスプレイ法を使用した（ファージディスプレイキットはＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から）。α−シヌクレインのアミノ酸１２１−１３１およびアミノ酸６１−８７に結合し且つα−シヌクレインの鉄−誘導凝集を部分的に阻害するライブラリーから、ファージを同定した。α−シヌクレイン１２１−１３１および６１−８７ペプチドを餌（ｂａｉｔ）として使用し、ペプチドを選択した。１つのこのようなペプチドは、配列ＳＬＫＲＬＰＫを有する。
【００８２】
ペプチドＳＬＫＲＬＰＫがα−シヌクレインへ結合することを実証するために、α−シヌクレインをプラスチックウェルに吸着させ、ファージを１：１０、１：１００、および１：１０００の希釈率で添加し、１時間インキュベーションし、そして５回洗浄した。ペルオキシダーゼを結合した抗−ファージ抗体を添加し、１時間インキュベーションし、５回洗浄し、そしてペルオキシダーゼ基質ＡＢＴＳを用いてシグナルを検出することによって、結合型ファージを検出した。結合型ファージは、スペクトロフォトメーターを用いて光学密度として測定される暗緑色シグナルを生じる。これらの条件を用いる場合、ＳＬＫＲＬＰＫペプチドを含むファージは、１：１０、１：１００、および１：１０００の希釈率で、それぞれ０．８８２、０．８４４および０．４８０のＯＤを与えた。対照的に、結合しない別のファージは、それぞれ０．０１９、−０．０２７、および−０．５５４のＯＤを与えた。
【００８３】
このペプチドを、また、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて鉄−誘導型α−シヌクレイン凝集を阻害する能力について試験した。デンシトメトリーの定量法によって測定される場合、１０倍過剰のペプチドは、α−シヌクレイン凝集を３８％だけ阻害し得た。この阻害のレベルは極めて顕著であり、もしこれがｉｎ　ｖｉｖｏにおける３８％減少に置き換えられるならば、これは数年以内にＰＤの進行を遅らせることができるであろう。
【００８４】
ペプチドは、配列「ＳＬＫＲＬＰＫ」を有し、またＥＬＩＳＡによってα−シヌクレインへの特に強い結合を示すファージによって発現される配列に相当する。この配列は、蛍光を付加し且つ分析を複雑にし得るチロシンまたはトリプトファンを含まない。本発明者らはα−シヌクレイン生化学についての鉄の重要性を理解する前に、このファージは生成された（従って、その結合部位は、鉄結合に対して特異的に標的化されなかった）。たとえそうであっても、１０−倍過剰のペプチドをα−シヌクレインとインキュベーションさせることによって、鉄−誘導型α−シヌクレイン凝集は３８％だけ減少する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１：α−シヌクレインは鉄依存型毒性を増大させる。
Ａ＆Ｂ．）野生型、Ａ５３ＴまたはＡ３０Ｐ　α−シヌクレインを過剰発現するＢＥ−Ｍ１７細胞を異なる用量のＦｅＣｌ２で４８時間処理し、ＭＴＴアッセイ（Ａ）またはＬＤＨアッセイ（Ｂ）を使用して生存度を測定した。
Ｃ．）野生型、Ａ５３ＴまたはＡ３０Ｐ　α−シヌクレインを過剰発現するＢＥ−Ｍ１７細胞を異なる用量のＨ２Ｏ２で４８時間処理し、ＭＴＴアッセイを用いて生存度を測定した。ＡＮＯＶＡ解析により＊ｐ＜０．００１，＋，ｐ＜０．０１。
【図２】
図２：鉄はα−シヌクレインへ結合する：
Ａ．）ＦｅＣｌ２は、α−シヌクレイン中のチロシンによる蛍光発光スペクトル（λｅｘ＝２８０ｎｍ）を消光する。高用量の鉄（＞１０ｍＭ）はチロシン蛍光を消光するだろうが、鉄に結合するタンパク質は、非常に低い用量で消光を示す（おそらく、タンパク質結合によって鉄がチロシンの近くに保たれているため）。チロシンは、それぞれ２８０ｎｍで励起されるとき、３１０ｎｍのピーク発光を伴う蛍光発光スペクトルを有する。
Ｂ．）蛍光発光に基づく、野生型およびΔＣ１−１１３　α−シヌクレインに結合する鉄についての用量応答曲線。α−シヌクレインの最後の２７アミノ酸を欠く欠失構築物およびこの構築物の解析された結合。α−シヌクレインのＣ末端欠失構築物ΔＣ１−１１３は、鉄結合において４倍を越える減少を示した（ＩＣ５０＝７２６μＭ（Ｐ＜０．００１））（図．２Ｂ）。
【図３】
図３：マグネシウムはシヌクレイン凝集から保護する。
Ａ．）マグネシウムは、凝集を阻止するコンフォメーションへとα−シヌクレインを変換させる。
Ｂ．）マグネシウムは、α−シヌクレイン凝集を阻害する。ａ．）マグネシウム（０．１ｍＭ）は、組換え野生型α−シヌクレインの鉄誘導型凝集を阻害する（４μＭ、２４時間インキュベーション）。ｂ．）マグネシウムはまた、一次ニューロンにおいてα−シヌクレイン凝集を誘導する。細胞膜にはイオンの通過に対する関門が存在しているので、より多くの用量が必要とされる。α−シヌクレインを過剰発現するＢＥ−Ｍ１７細胞においても、同様の結果がみられる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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