(57)【要約】本発明は、抗血栓剤としてのモノクローナル抗体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗−ＩＸ因子抗体または抗体フラグメントを投与することを含む、動物の血栓塞栓後に誘発される虚血を治療する方法。
【請求項２】
抗−ＩＸ因子抗体または抗体フラグメントが塞栓後に投与される請求項１記載の方法。
【請求項３】
抗−ＩＸ因子抗体または抗体フラグメントが発作後に投与される請求項１記載の方法。
【請求項４】
抗−ＩＸ因子抗体または抗体フラグメントがＳＢ２４９４１３、ＳＢ２４９４１５、ＳＢ２４９４１６、ＳＢ２４９４１７、ＳＢ２５７７３１またはＳＢ２５７７３２の識別特性を有する請求項１記載の方法。
【請求項５】
抗−ＩＸ因子抗体または抗体フラグメントがＳＢ２４９４１７の識別特性を有する請求項４記載の方法。
【請求項６】
ＳＢ２４９４１７を投与することを含む、動物の血栓塞栓後に誘発される虚血を治療する方法。
【請求項７】
抗−ＩＸ因子抗体または抗体フラグメントをプラスミノーゲンアクチベーターとの組み合わせにおいて投与することを含む動物の血栓塞栓後に誘発される虚血を治療する方法。
【請求項８】
抗−ＩＸ因子抗体または抗体フラグメントおよびプラスミノーゲンアクチベーターが塞栓後に投与される請求項７記載の方法。
【請求項９】
抗−ＩＸ因子抗体または抗体フラグメントおよびプラスミノーゲンアクチベーターが発作後に投与される請求項７記載の方法。
【請求項１０】
抗−ＩＸ因子抗体または抗体フラグメントがＳＢ２４９４１３、ＳＢ２４９４１５、ＳＢ２４９４１６、ＳＢ２４９４１７、ＳＢ２５７７３１またはＳＢ２５７７３２の識別特性を有する請求項７記載の方法。
【請求項１１】
抗−ＩＸ因子抗体または抗体フラグメントがＳＢ２４９４１７の識別特性を有する請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
血栓溶解剤がｔＰＡ、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼまたはその変種である請求項７記載の方法。
【請求項１３】
血栓溶解剤がｔＰＡである請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ＳＢ２４９４１７をｔＰＡとの組み合わせにおいて投与することを含む動物の血栓塞栓後に誘発される虚血を治療する方法。
【請求項１５】
抗−ＩＸ因子抗体または抗体フラグメントを血栓溶解剤との組み合わせにおいて投与することを含む動物の血栓塞栓後に誘発される虚血の治療において血栓溶解剤の必要とされる投与量を減少させる方法。
【請求項１６】
抗−ＩＸ抗体または抗体フラグメントが、ＳＢ２４９４１３、ＳＢ２４９４１５、ＳＢ２４９４１６、ＳＢ２４９４１７、ＳＢ２５７７３１またはＳＢ２５７７３２の識別特性を有する請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
抗−ＩＸ因子抗体または抗体フラグメントがＳＢ２４９４１７の識別特性を有する請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
血栓溶解剤がｔＰＡ、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼまたはその変種である請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
血栓溶解剤がｔＰＡである請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
抗−ＩＸ因子抗体または抗体フラグメントを血栓塞栓性発作の危険性がある動物に投与することを含む動物における血栓塞栓性発作を予防する方法。
【請求項２１】
抗−ＸＩ因子抗体または抗体フラグメントがＳＢ２４９４１３、ＳＢ２４９４１５、ＳＢ２４９４１６、ＳＢ２４９４１７、ＳＢ２５７７３１またはＳＢ２５７７３２の識別特性を有する請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
抗ＩＸ因子抗体または抗体フラグメントがＳＢ２４９４１７の識別特性を有する請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
ＳＢ２４９４１７を血栓塞栓性発作の危険性のある動物に投与することを含む血栓塞栓性発作の予防法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、ヒト凝固因子または補因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）と結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）および血栓症の阻害剤としてのその使用に関する。
【０００２】
（従来技術）
正常な環境下では、血管の内側を覆う血管内皮細胞が傷つくと、多かれ少なかれ、一般に凝集「カスケード」と称される一連の事象を介して止血応答が引き起こされる。そのカスケードは、可溶性フィブリノーゲンの不溶性フィブリンへの変換にて最高潮に達し、その不溶性フィブリンは血小板と一緒になって、血液成分の管外溢出を防ぐ局在する血塊または血栓を形成する。そして、創傷治癒が起こり、その後、血塊が分解し、血管の完全性および血流が回復される。
傷害と血塊形成の間に起こる事象は、慎重に制御され、かつ関連している一連の反応である。簡単には、多数の不活性なプロ酵素の形態における血漿凝集蛋白および補因子が血液中を循環する。活性な酵素複合体が傷害部位で集まり、続いてセリンプロテアーゼに活性化され、それぞれの連続するセリンプロテアーゼは次にその後に続くプロ酵素のプロテアーゼへの活性化を触媒して、プロテアーゼを活性化する。この酵素カスケードにより、各工程が次の工程の効果を強めることになる。凝集カスケードの総説については、「Ｔｈｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ」，Ｊ．Ｌｏｓｃａｌｚｏ ａｎｄ Ａ．Ｓｃｈａｆｅｒ，ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９４）の第一章を参照のこと。
【０００３】
効果的な凝固は傷害部位における血液の損失を制限する一方で、静脈または動脈中での不適当な血栓の形成は疾病および死亡の一般的原因である。異常な凝固活性は、心筋梗塞、不安定アンギナ、心房細動、発作、腎臓損傷、経皮冠動脈形成術、播種性血管内凝固症候群、敗血症、肺塞栓症および深静脈血栓症などの病状または治療をもたらし、および／または、その病状または治療より由来しうる。人工心臓弁などの人工臓器、シャントおよび補綴の外来物質の表面上の血塊の形成もまた、問題がある。
卒中は死に至ることが多く、一般的には恒久的な障害の原因となる。卒中の神経障害につながる急性局所性脳虚血は、血栓塞栓により引き起こされることが最も多い。血栓は心臓性原因およびアテローマから生じる可能性がある。イン・サイチュ血栓症は大外脳供給血管において起こり得る。研究により、これを越えると著しい不可逆性神経損傷および持続性神経障害が起こる脳動脈閉塞後の一定期間が示唆されている。Ｓｔｒｏｋｅ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ｂａｓｉｃ， Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ， ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ， ｐｐ．３５５−３８１， ｅｄ． Ｌ．Ｐ． Ｍｉｌｌｅｒ， Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． （１９９９）  第１４章を参照のこと。
【０００４】
これらの病状および他の血栓性および塞栓性障害の治療において現在用いられる承認された抗凝固剤には、硫酸ヘテロポリサッカライドヘパリンおよび低分子量（ＬＭＷ）ヘパリンが包含される。これらの薬剤は、非経口投与され、トロンビン阻害剤、アンチトロンビンＩＩＩの活性化およびすべての凝固因子の不活化によって迅速かつ完全な凝固阻害を引き起こすことができる。
しかしながら、その効能のために、ヘパリンおよびＬＭＷヘパリンは欠点がある。単純な動作のストレスとそれに伴う手術部位での物質との接触の結果として、出血を制御できないことが主な合併症であり、連続注入を受けている患者の１〜７％において、および、間欠性ボーラス投与を受けている患者の８〜１４％において観察される。この危険を最小とするため、サンプルを連続的に採取し、エキソビボにて凝固時間を連続的にモニターできるようにするが、これにより実質的な治療のコストが上がり、患者に不都合である。
【０００５】
さらに、患者を出血の危険にさらすことなく所望の効能レベルに達するための目標とする治療範囲は狭い。その治療範囲は、約１ないし３ｕｇヘパリン／血漿ｍｌ未満であり、これにより、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイ時間は約３５〜約１００秒となる。ヘパリン濃度を３μｇ／ｍｌに増加させると目標範囲を上回り、４ｕｇ／ｍｌよりも高い濃度では、凝固活性が検出されない。従って、患者の血漿濃度を治療範囲内に維持するために非常に慎重にしなければならない。
よりゆっくりと、より長時間持続効果を有する別の承認された抗凝固剤は、クマリン誘導体であるワルファリンである。ワルファリンは、プロトロンビンのビタミンＫ依存性翻訳後修飾および他のビタミンＫ依存性凝固因子と競合することにより作用する。
【０００６】
治療範囲よりもわずかに高いだけの濃度において血液が凝固できなくなる抗凝固作用の一般的なパターンは、ワルファリンならびにヘパリンおよびＬＭＷヘパリンについて見られる。
急性心筋梗塞（ＭＩ）において、血栓溶解療法の主な目的は、梗塞血管を早期に、かつ持続的に再潅流することを含む。本発明の急性ＭＩの治療法は、プラスミノーゲンアクチベーター、例えば組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）またはストレプトキナーゼおよび抗凝固薬、例えば未分画ヘパリン（ｕｎｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ  ｈｅｐａｒｉｎ）、低分子量ヘパリンまたは直接トロンビン阻害剤または抗血小板薬、例えばアスピリンまたは血小板糖蛋白ＩＩｂ／ＩＩＩａブロッカーの両方を含む。Ｔｏｐｏｌ， Ａｍ Ｈｅａｒｔ Ｊ， １３６， Ｓ６６−Ｓ６８ （１９９８）を参照のこと。この治療法の組み合わせは、血塊形成および溶解は動的プロセスであり、トロンビン活性および生成は閉塞性血栓の形成後および血塊の溶解中および溶解後も継続するという観察に基づく。Ｇｒａｎｇｅｒら、Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ， ３１， ４９７−５０５ （１９９８）を参照のこと。
【０００７】
急性ＭＩの最適治療法は依然として困難で、利用可能な薬剤および治療法は陰性および陽性の両方の特性を示す。例えば、フィブリン結合トロンビンはヘパリンによる阻害に感受性でなく（Ｂｅｃｋｅｒら、”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｅｒｐｉｎｓ”， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９７）第６章を参照のこと）、トロンビン活性はヘパリン治療を中止した後に再増加を示し、ヘパリンの中止後２４時間以内に再梗塞の増大が観察される。Ｗａｔｋｉｎｓら、Ｃａｔｈｅｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ， ４４， ２５７−２６４ （１９９８）およびＧｒａｎｇｅｒ， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ９１， １９２９−１９３５ （１９９５）を参照のこと。さらに、抗血小板薬は出血または血小板減少を伴う可能性がある。
さらに、多くの臨床試験により高投与量の血栓溶解剤は血漿止血マーカーにおける顕著な変更につながる。Ｒａｔｏら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ， １０１， １０−１４ （１９９８）； Ｂｏｖｉｌｌら、Ａｎｎ Ｉｎｔ Ｍｅｄ， １１５， ２５６−２６５ （１９９１）； Ｎｅｕｈａｕｓら、Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ， １９， ８８５−８９１ （１９９２）を参照のこと。ｔＰＡの濃度の増大は血塊溶解の向上につながり、これらの止血マーカーにおける変更は、血栓療法の欠点、特に重度の出血の発生率の増大に反映する。
血栓塞栓性発作の場合において、血栓溶解療法は、不可逆性損傷を防止するために発作症状の開始後早期（３時間以内）に用いられる。虚血および／または梗塞組織の再潅流に現在認可されている血栓溶解剤としては、プラスミノーゲンアクチベーターｔＰＡ、ウロキナーゼおよびストレプトキナーゼが挙げられる。しかしながら、血栓溶解療法は危険な出血を伴う傾向にあり、血栓塞栓性発作における血栓溶解療法の主な問題は、治療が出血を誘発することにより虚血性傷害を悪化させるであろうことである。
明らかに、止血機能を維持しながら血栓性障害の抑制において効果的な抗凝固剤が必要とされている。
【０００８】
（発明の開示）
本発明の一態様は、動物の血栓塞栓後に誘発される虚血を治療する方法であって、抗−ＩＸ因子抗体または抗体フラグメントを投与することを含む方法である。
本発明のもう一つの態様は、動物の血栓塞栓後に誘発される虚血を治療する方法であって、抗−ＩＸ因子抗体または抗体フラグメントをプラスミノーゲンアクチベーターとの組み合わせにおいて投与することを含む方法である。
本発明のもう一つの態様は、動物の血栓塞栓後に誘発される虚血の治療において必要とされる血栓溶解剤の量を減少させる方法であって、抗−ＩＸ因子抗体または抗体フラグメントを血栓溶解剤との組み合わせにおいて投与することを含む方法である。
本発明のさらにもう一つの態様は、動物において血栓塞栓性卒中を防止する方法であって、抗−ＩＸ因子抗体または抗体フラグメントを血栓塞栓性卒中の危険がある動物に投与することを含む方法である。
【０００９】
（発明を実施するための最良の形態）
限定するものではないが特許および特許出願を含む、本明細書において引用したすべての出版物は、完全に記載されているかのように出典明示により本明細書に含まれる。
【００１０】
本発明は、自己限定的中和活性により特徴づけられる、凝固因子に対するさまざまな抗体、改変された抗体およびそのフラグメントを提供する。好ましくは、凝固因子は内因性経路から共通凝固経路までである。最も好ましくは、抗凝固因子抗体は、抗−ＩＸ因子、抗−ＩＸａ因子、抗−Ｘ因子、抗−Ｘａ因子、抗−ＸＩ因子、抗−ＸＩａ因子、抗−ＶＩＩＩ因子、抗−ＶＩＩＩａ因子、抗−Ｖ因子、抗−Ｖａ因子、抗−ＶＩＩ因子、抗−ＶＩＩａ因子、抗トロンビンまたは抗プロトロンビンである。特に好ましいのは、抗−ＩＸ因子抗体である。抗凝固因子抗体の例は、ヒトＩＸ因子に対するヒト化モノクローナル抗体ＳＢ２４９４１３、ＳＢ２４９４１５、ＳＢ２４９４１６、ＳＢ２４９２１７、ＳＢ２５７７３１およびＳＢ２５７７３２、ヒトＩＸ因子に対するキメラモノクローナル抗体ｃｈαＦＩＸ、ヒトＩＸ因子および／またはヒトＩＸａ因子に対するネズミモノクローナル抗体ＢＣ１、ＢＣ２、９Ｅ４（２）Ｆ４および１１Ｇ４（１）Ｂ９あるいはそれぞれヒトＸ因子およびＸＩ因子に対するネズミモノクローナル抗体ＨＦＸＬＣおよびＨＦＸＩである。特に好ましいのは、抗ヒトＩＸ因子モノクローナル抗体ＳＢ２４９４１７である。
【００１１】
本発明の抗体は、通常のハイブリドーマ技術、ファージディスプレーコンビナトリアルライブラリー、免疫グロブリンチェーンシャッフリングおよびヒト化技術により調製することができ、新規な自己限定的中和抗体を生成する。また、自己限定的中和活性を有する完全ヒトｍＡｂｓも含まれる。これらの生成物は、心筋梗塞、不安定アンギナ、心房細動、発作、腎損傷、肺塞栓症、深静脈血栓症、経皮的冠動脈形成術、播種性血管内凝固、敗血症、人工臓器、シャントまたはプロテーゼに関連する血栓性および塞栓性障害の治療および医薬組成物において有用である。
本明細書において使用される場合、「自己限定的中和活性」なる用語は、好ましくは内因性から共通経路までの、ＩＸ／ＩＸａ因子、Ｘ／Ｘａ因子、ＸＩ／ＸＩａ因子、ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子およびＶ／Ｖａ因子、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子およびトロンビン／プロトロンビンを含むヒト凝固因子と結合し、凝固が限定的に調節されるような方法で血栓症を阻害する抗体の活性を意味する。「凝固の限定調節」とは、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）の延長により測定される凝固時間の増加として定義され、ここにおいて、血漿は、モノクローナル抗体の濃度が増大するにもかかわらず最大値に到達するａＰＴＴと依然として血塊を形成できる。この凝固の限定された調節は、濃度が増加するヘパリンの存在下で血漿は血塊を形成できなくなり、無限のａＰＴＴを示すのと対照的である。好ましくは、本発明の方法の最大ａＰＴＴ値は、ヘパリン治療範囲内である。最も好ましくは、最大ａＰＴＴは約３５秒から約１００秒の間であり、これは正常な対照ａＰＴＴ値の約１．５倍から約３．５倍に相当する。本発明の一例において、ａＰＴＴはプロトロンビン時間（ＰＴ）を著しく延長することなく延長される。
【００１２】
「との組み合わせにおいて」なる句は、１回の治療過程において治療薬をもう一つ別の治療薬の投与前、後または同時に投与することを意味する。
「改変された抗体」とは、改変された免疫グロブリンコーディング領域によりコードされる蛋白を意味し、これは選択された宿主細胞における発現により得ることができる。かかる改変された抗体は、操作された抗体（例えば、キメラまたはヒト化抗体）あるいは例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２などの免疫グロブリン定常領域がすべてまたはその一部が欠失した抗体フラグメントである。
「改変された免疫グロブリンコーディング領域」とは、本発明の改変された抗体をコードする核酸配列を意味する。改変された抗体がＣＤＲ−グラフトまたはヒト化抗体である場合、非ヒト免疫グロブリンから相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする配列を、ヒト可変フレームワーク配列を含む第一免疫グロブリンパートナー中に挿入する。所望により、第一免疫グロブリンパートナーは第二免疫グロブリンパートナーと操作可能に連結される。
【００１３】
「第一免疫グロブリンパートナー」とは、未変性（または天然に存在する）ＣＤＲ−コード化領域がドナー抗体のＣＤＲ−コード化領域により置換されているヒトフレームワークまたはヒト免疫グロブリン可変領域をコードする核酸配列を意味する。ヒト可変領域は免疫グロブリン重鎖、軽鎖（または両鎖）、類似体またはその機能的フラグメントであってもよい。かかるＣＤＲ領域は、抗体（免疫グロブリン）の可変領域内に位置し、当該分野において公知の方法により決定できる。例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ． ”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”， ４ｔｈ Ｅｄ．， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ （１９８７）はＣＤＲについての位置決めの規則を開示している。加えて、ＣＤＲ領域／構造を同定するために有用なコンピュータプログラムは公知である。
【００１４】
「第二免疫グロブリンパートナー」とは、第一免疫グロブリンパートナーがフレーム内で、または任意の通常のリンカー配列により融合した（すなわち、操作可能に連結された）蛋白またはペプチドをコードするもう一つのヌクレオチド配列を意味する。好ましくは、これは免疫グロブリン遺伝子である。第二免疫グロブリンパートナーは、目的とする同じ（すなわち、第一および第二の改変された抗体は同じ供給源から得られるホモローガスな）または追加的（すなわち、ヘテロローガスな）抗体の全体的な定常領域をコードする核酸配列を含む。これは免疫グロブリン重鎖または軽鎖（あるいは一つのポリペプチドの一部としての両鎖）であってもよい。第二免疫グロブリンパートナーは特定の免疫グロブリン種またはイソ型に限定されない。加えて、例えば、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ）２（すなわち、適当なヒト定常領域またはフレームワーク領域の独立した部分）においてみられるような第二免疫グロブリンパートナーは免疫グロブリン定常領域の一部を含んでもよい。このような第二免疫グロブリンパートナーは、例えば、ファージディスプレーライブラリーの一部、または分析または診断検出のために蛋白をコードする配列、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどとして、さらに宿主細胞の外側表面に露出した内在性膜蛋白をコードする配列も含む。
【００１５】
Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２なる用語は、その標準的意味について用いられる。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ． ”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｇｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８８）を参照のこと。
本明細書において用いられる場合、「操作された抗体」は、改変された抗体の一種、すなわち、選択されたアクセプター抗体の軽および／または重鎖可変領域の一部が、選択されたエピトープに対する特異性を有する１以上のドナー抗体の類似した部分により置換されている完全長合成抗体（例えば、抗体フラグメントに対抗するものとしてのキメラまたはヒト化抗体）を表す。例えば、かかる分子は、未修飾軽鎖（またはキメラ軽鎖）と関連したヒト化重鎖により特徴づけられるか抗体を含むか、またはその逆である。操作された抗体はさらに、ドナー抗体結合特異性を保持するために、アクセプター抗体軽および／または重鎖可変ドメインフレームワーク領域をコードする核酸配列の変更によっても特徴づけられる。これらの抗体は、アクセプター抗体からの１以上のＣＤＲ（好ましくはすべて）を本明細書に記載されるドナー抗体からのＣＤＲで置換することを含む。
【００１６】
「キメラ抗体」とは、アクセプター抗体由来の軽および重鎖定常領域と関連したドナー抗体由来の天然に存在する可変領域（軽鎖および重鎖）を含む操作された抗体の一種を意味する。
「ヒト化抗体」とは、非ヒトドナー免疫グロブリン由来のＣＤＲを有する操作された抗体の一種を意味し、分子の残りの免疫グロブリン由来の部分は１以上のヒト免疫グロブリン由来である。加えて、フレームワーク支持残基は、結合親和性を保存するために変更することができる。例えば、Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ８６， １００２９−１００３２ （１９８９）， Ｈｏｄｇｓｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９， ４２１ （１９９１）を参照のこと。
「ドナー抗体」なる用語は、改変された免疫グロブリンコーディング領域および結果として得られる、ドナー抗体に特徴的な抗原特異性および中和活性を有する、発現され、改変された抗体を提供するために、その可変領域、ＣＤＲまたは他の機能的フラグメントまたはその類似体の核酸配列に寄与する第一免疫グロブリンパートナーに対するモノクローナルまたは組換え抗体を意味する。本発明における使用に好適な一つのドナー抗体は、ＢＣ２と称するネズミ自己限定的中和モノクローナル抗体である。他の好適なドナー抗体としては、ＢＣ１、９Ｅ４（２）Ｆ４、１１Ｇ４（１）Ｂ９、ＨＦＸＬＣおよびＨＦＸＩと称するネズミ自己限定的中和モノクローナル抗体が挙げられる。
【００１７】
「アクセプター抗体」なる用語は、ドナー抗体とヘテロローガスなモノクローナルまたは組換え抗体を意味し、これは第一免疫グロブリンパートナーに対する重および／または軽鎖フレームワーク領域および／またはその重および／または軽鎖定常領域をコードする核酸配列の全部、または一部に寄与する。好ましくは、ヒト抗体はアクセプター抗体である。
「ＣＤＲ」は、免疫グロブリン重および軽鎖の超可変領域である、抗体の相補性決定領域アミノ酸配列として定義される。例えば、Ｋａｂａｔら、”Ｓｅａｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”， ４ｔｈ Ｅｄ．， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ （１９８７）を参照のこと。免疫グロブリンの可変部分において３つの重鎖および３つの軽鎖ＣＤＲまたはＣＤＲ領域が存在する。従って、本明細書において使用される「ＣＤＲ」とは、適当ならば、すべての３つの重鎖ＣＤＲ、またはすべての３つの軽鎖あるいはすべての重鎖ＣＤＲおよびすべての軽鎖ＣＤＲの両方を意味する。
【００１８】
ＣＤＲは、抗原またはエピトープに対する抗体の結合の接触残基の大部分を提供する。本発明の対象となるＣＤＲは、ドナー抗体可変重および軽鎖配列に由来し、天然に存在するＣＤＲの類似体を含み、該類似体はさらにこれらが由来するドナー抗体と同じ抗原結合特異性および／または中和能力を共有または保持する。
「抗原結合特異性または中和能力を共有する」とは、例えば、ｍＡｂ  ＢＣ２は、あるレベルの自己限定的中和活性により特徴づけることができるが、適当な構造的環境におけるＢＣ２の核酸配列によりコードされるＣＤＲは、さらに低いかまたはさらに高い活性を有し得ることを意味する。かかる環境におけるＢＣ２のＣＤＲはそれでもＢＣ２と同じエピトープを認識すると考えられる。
「機能的フラグメント」は、フラグメントが由来する抗体と同じ抗原結合特異性および／または中和能力を保持する部分的重または軽鎖可変配列（例えば、免疫グロブリン可変領域のアミノまたはカルボキシ末端での小さな欠失）である。
【００１９】
「類似体」は、少なくとも一つのアミノ酸により修飾されたアミノ酸配列であり、前記修飾は、数個（すなわち、１０以下）のアミノ酸の化学的または置換または転位であり、この修飾により該アミノ酸配列は未修飾配列の生物学的特徴、例えば、抗原特異性および高親和性を保持することが許容される。類似体の例としては、置換により構築することができ、ＣＤＲ−エンコーティング領域内またはこれを取り巻くあるエンドヌクレアーゼ制限部位を生成するサイレント突然変異が挙げられる。
類似体はさらに、対立遺伝子変異として起こる場合もある。「対立遺伝子変異または修飾」は、本発明のアミノ酸またはペプチド配列をコードする核酸配列における変更である。かかる変異または修飾は、遺伝子コードにおける縮重によるか、または所望の特徴を提供するために意図的に操作することができる。これらの変異または修飾の結果、コードされたアミノ酸配列が変更される場合もあるし、変更されない場合もある。
【００２０】
「エフェクター剤」なる用語は、ドナー抗体またはドナー抗体の他のフラグメントの改変された抗体および／または天然または合成軽または重鎖抗体を通常の手段により関連させることができる非蛋白キャリア分子を意味する。かかる非蛋白キャリアは、例えば診断分野において使用されるような通常の担体、例えば、ポリスチレンまたは他のプラスチックビーズ、多糖類、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）システムにおいて使用されるようなもの、あるいは医学分野において有用で、ヒトおよび動物への投与に関して安全な他の非蛋白物質を含むことができる。他のエフェクター剤は、重金属原子または同位元素をキレート化するためのマクロサイクルを含むことができる。かかるエフェクター剤は、例えばポリエチレングリコールなどの改変された抗体の半減期を増大させるためにも有用である。
【００２１】
本発明の抗体、改変された抗体およびフラグメントの構築における使用に関して、ヒト凝固因子、好ましくはＩＸ／ＩＸａ因子、Ｘ／Ｘａ因子、ＸＩ／ＸＩａ因子、ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子、Ｖ／Ｖａ因子、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子またはトロンビン／プロトロンビンあるいはこれからのペプチドエピトープとの提示により所望の免疫グロブリンを生成するために非ヒト種、例えば、ウシ、ヒツジ、サル、ニワトリ、齧歯類（例えば、ネズミおよびラット）を用いることができる。それぞれの凝固因子に対する非ヒトｍＡｂを分泌するハイブリドーマ細胞系を提供するために、通常のハイブリドーマ技術が用いられる。かかるハイブリドーマを次に、実施例の項において記載するように、ＩＸ／ＩＸａ因子、Ｘ／Ｘａ因子、ＸＩ／ＸＩａ因子、ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子、Ｖ／Ｖａ因子、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子またはトロンビン／プロトロンビンコートされた９６ウェルプレートを用いて、あるいは別法として、ストレプタビジン−コートされたプレートと結合したビオチニル化ＩＸ／ＩＸａ因子、Ｘ／Ｘａ因子、ＸＩ／ＸＩａ因子、ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子、Ｖ／Ｖａ因子、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子またはトロンビン／プロトロンビンを用いて、結合についてスクリーンする。別法として、当業者に周知で、本発明において使用される技術により完全ヒトｍＡｂｓを生成することができる。
【００２２】
本発明の自己限定的中和ｍＡｂの一例は、キメラまたはヒト化分子の発生のために使用できるｍＡｂ  ＢＣ２、ネズミ抗体である。ＢＣ２  ｍＡｂは凝固時間に対する自己限定的阻害活性により特徴づけられる。ａＰＴＴアッセイにより測定されるように、ＢＣ２  ｍＡｂの凝固時間に対する影響は、約１００秒の最大値を示す。ＢＸ２  ｍＡｂはさらに、ＩＸａ因子と結合し、ＩＸ因子がＩＸａ因子に変換するのを阻害し、ＩＸａ因子活性を阻害する。二価金属補因子は活性に必要であり、ｍＡｂはＭｎ２＋よりもＣａ２＋について高い優先性を示す。が用いられる。ａＰＴＴアッセイにおいて観察されるＩＣ５０は、略５０ｎＭである。ＢＣ２  ｍＡｂはラットと種交差反応性を示し、イソタイプＩｇＧ２ａである。
【００２３】
他の所望のドナー抗体は、ネズミｍＡｂ、ＢＣ１、９Ｅ４（２）Ｆ４および１１Ｇ４（１）Ｂ９である。これらのｍＡｂは凝固時間に対する自己限定的阻害活性により特徴づけられる。ａＰＴＴアッセイにより測定すると、これらのｍＡｂの凝固時間に対する影響は、９Ｅ４（２）Ｆ４について約９０〜１００秒、１１Ｇ４（１）Ｂ９について約８０秒の最大値を示す。ＢＣ１  ｍＡｂもＩＸａ因子と結合し、ＩＸａ因子活性を阻害するが、ＩＸ因子のＩＸａ因子への変換を阻害しない。金属補因子はその活性について必要でない。ａＰＴＴ分析においてＢＣ１について観察されるＩＣ５０は、約３５ｎＭである。ＢＣ１  ｍＡｂはイソタイプＩｇＧ１である。
【００２４】
凝固時間に対する自己限定的阻害活性により特徴づけられるさらにもう一つの望ましいドナー抗体は、ネズミｍＡｂ、ＨＦＸＬＣである。ａＰＴＴアッセイにより測定すると、ＨＦＸＬＣ  ｍＡｂの凝固時間に対する影響は、約５０〜６０秒の最大値を示す。ＨＦＸＬＣ  ｍＡｂはＸ因子軽鎖と結合し、Ｘ／Ｘａ因子活性を阻害する。ａＰＴＴ分析において観察されるＩＣ５０はおよそ２０ｎＭである。
凝固時間に対する自己限定的阻害活性により特徴づけられるさらにもう一つの望ましいドナー抗体は、ネズミｍＡｂ、ＨＦＸＩである。ａＰＴＴアッセイにより測定すると、ＨＦＸＩ  ｍＡｂの凝固時間に対する影響は、約１００秒の最大値を示す。ＨＦＸＬＣ  ｍＡｂはＸＩ因子軽鎖と結合し、ＸＩ／ＸＩａ因子活性を阻害する。ａＰＴＴアッセイにおいて観察されるＩＣ５０はおよそ３０ｎＭである。
【００２５】
作用機構に関して特定の理論に拘束されることを意図としないが、これらのｍＡｂは非競合的またはアロステリックな機構により凝固を調節するようであり、これにより部分的な阻害しか達成されない。
本発明はＢＣ１、ＢＣ２、９Ｅ４（２）Ｆ４、１１Ｇ４（１）Ｂ９、ＨＦＸＬＣ、ＨＦＸＩまたはその超可変（すなわち、ＣＤＲ）配列の使用に限定されない。自己限定的中和活性により特徴づけられる他の適当な高親和性抗体または対応するＣＤＲをそのために置換することができる。単に例示と説明の簡便性のために、以下の記載においてドナー抗体をＢＣ１、ＢＣ２、９Ｅ４（２）Ｆ４、１１Ｇ４（１）Ｂ９、ＨＦＸＬＣまたはＨＦＸＩと同一視した。
【００２６】
本発明はさらに、適当なヒト凝固因子または補因子に対するｍＡｂ由来のＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントの使用を含む。これらのフラグメントは、凝固因子、好ましくはＩＸ／ＩＸａ因子、Ｘ／Ｘａ因子、Ｘｉ／ＸＩａ因子、ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子、Ｖ／Ｖａ因子、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子またはトロンビン／プロトロンビンに対する自己限定的中和活性を有する薬剤として有用である。Ｆａｂフラグメントは、軽鎖全体および重鎖のアミノ末端部分を含む。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ジスルフィド結合により結合した２つのＦａｂフラグメントにより形成されるフラグメントである。ｍＡｂｓ  ＢＣ１、ＢＣ２、９Ｅ４（２）Ｆ４、１１Ｇ４（１）Ｂ９、ＨＦＸＬＣおよびＨＦＸＩ並びに他の類似した高親和性抗体は、通常の手段、例えば、ｍＡｂの適当なタンパク分解酵素、パパインおよび／またはペプシンでの開裂、あるいは組換え法により得ることができるＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントの供給源を提供する。これらのＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントはそれ自体治療薬、予防薬または診断用試薬として、また前記の組換え体またはヒト化抗体の形成において有用な可変領域およびＣＤＲ配列を含む配列のドナーとして有用である。
【００２７】
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、コンビナトリアルファージライブラリー（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏ， １２， ４３３−４５５ （１９９４）を参照のこと）または免疫グロブリンシャッフリング（例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １０， ７７９−７８３ （１９９２）を参照のこと）（両方とも全体として出典明示により本発明の一部とする）により構築することができ、ここにおいて選択された抗体（例えばＢＣ２）から得られるＦｄまたはＶＨ免疫グロブリンは軽鎖免疫グロブリンのレパートリー、ＶＬ（またはＶＫ）と結合でき、新規Ｆａｂを形成する。反対に、選択された抗体から得られる軽鎖免疫グロブリンは重鎖免疫グロブリンのレパートリー、ＶＨ（またはＦｄ）と結合でき、新規Ｆａｂｓを形成する。自己限定的中和ＩＸ因子Ｆａｂは、ｍＡｂ  ＢＣ２のＦｄを軽鎖免疫グロブリンのレパートリーと結合させることにより得ることができる。従って、チェーンシャッフリング技術から独自の配列（ヌクレオチドおよびアミノ酸）を有する中和Ｆａｂｓを回収することができる。
【００２８】
ｍＡｂ  ＢＣ２または前記の他の抗体は、ドナー抗体の抗原結合特異性により特徴づけられる様々な改変された抗体を設計し、得るために有用な配列、例えば可変重および／または軽鎖ペプチド配列、フレームワーク配列、ＣＤＲ配列、機能的フラグメント、およびその類似体、ならびにこれらをコードする核酸配列に寄与する。
可変軽鎖および重鎖ペプチド配列をコードする本発明の核酸配列、またはそのフラグメントも、ＣＤＲまたはフレームワーク領域をコードする核酸配列内の特定の変化の変異導入、および結果として得られる修飾または融合核酸配列を発現のためにプラスミド中に導入するために有用である。例えば、フレームワークおよびＣＤＲ−コード化領域のヌクレオチド配列におけるサイレント置換は、突然変異誘発されたＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域の挿入を促進する制限酵素部位を生成するために用いることができる。これらのＣＤＲ−コード化領域は本発明のヒト化抗体の構築において用いることができる。
【００２９】
ＢＣ２重鎖可変領域の核酸およびアミノ酸配列を配列番号５および７に記載する。この領域から得られるＣＤＲ配列を配列番号８、９および１０に記載する。
ＢＣ２軽鎖可変領域の核酸配列を配列番号６および１１に記載する。この領域から得られるＣＤＲ配列を配列番号１２、１３および１４に記載する。
遺伝子コードの縮重を考慮して、本発明の可変重および軽鎖アミノ酸配列およびＣＤＲ配列ならびにドナー抗体の抗原特異性を共有する機能的フラグメントおよびその類似体をコードする様々なコーディング配列を構築することができる。可変鎖ペプチド配列またはＣＤＲをコードする本発明の単離された核酸配列、またはそのフラグメントは、第二免疫グロブリンパートナーと操作可能に連結されている場合、改変された抗体、例えばキメラまたはヒト化抗体あるいは本発明の他の操作された抗体を産生するために用いることができる。
【００３０】
本明細書に記載された改変された抗体の一部をコードする単離された核酸配列に加えて、他のこのような核酸配列、例えば未変性ＣＤＲ−エンコーディング配列と相補的なもの、またはＣＤＲ−コード化領域を取り巻く修飾されたヒトフレームワーク領域と相補的なものも本発明に含まれる。有用なＤＮＡ配列としては、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＤＮＡ配列とハイブリッド形成する配列が挙げられる。Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓら、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８２）， ｐｐ． ３８７−３８９を参照のこと。このようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、４×ＳＳＣ、６５℃でハイブリダイゼーションし、続いて６５℃で０．１×ＳＳＣ中１時間洗浄する。別法として、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、４２℃である。好ましくは、これらのハイブリッド形成ＤＮＡ配列は少なくとも約１８ヌクレオチドの長さ、すなわち略ＣＤＲの大きさである。
【００３１】
改変された免疫グロブリン分子は、操作された抗体、例えば、キメラ抗体およびヒト化抗体を含む改変された抗体をコードすることができる。所望の改変された免疫グロブリンコーディング領域は、第一免疫グロブリンパートナー、例えばヒトフレームワークまたはヒト免疫グロブリン可変領域中に挿入された、ＩＸ／ＩＸａ因子、Ｘ／Ｘａ因子、ＸＩ／ＸＩａ因子、ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子、Ｖ／Ｖａ因子、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子またはトロンビン／プロトロンビン抗体、好ましくは高親和性抗体、例えば、本発明により提供されるものの抗原特異性を有するペプチドコードするＣＤＲ−コード化領域を含む。
【００３２】
好ましくは、第一免疫グロブリンパートナーは第二免疫グロブリンパートナーと操作可能に連結される。第二免疫グロブリンパートナーは前記定義の通りであり、対象となる第二の抗体領域をコードする配列、例えばＦｃ領域を含む。第二免疫グロブリンパートナーはさらに、軽または重鎖定常領域がフレーム内でまたはリンカー配列により融合されるもう一つの免疫グロブリンをコードする配列を含んでもよい。凝固因子の機能的フラグメントまたはその類似体に対する操作された抗体は、同じ抗体との向上された結合を誘発するために設計することができる。
第二免疫グロブリンパートナーはさらに、第二免疫グロブリンが通常の手段により操作可能に連結される、非蛋白キャリア分子を含む前記のエフェクター剤と組み合わせることができる。
第二免疫グロブリンパートナー、例えば、抗体配列とエフェクター剤間の融合または結合は任意の好適な手段、例えば、通常の共有またはイオン結合、蛋白融合、またはヘテロ二官能性クロスリンカー、例えば、カルボジイミド、グルタルアルデヒドなどによることができる。かかる技術は当該分野において公知であり、通常の化学および生化学テキストに記載されている。
【００３３】
さらに、単に第二免疫グロブリンパートナーとエフェクター剤間に所望の量のスペーサーを提供するために通常のリンカー配列を改変された免疫グロブリンコーディング領域中に構築することができる。かかるリンカーの設計は当業者には周知である。
加えて、本発明の分子のシグナル配列は、発現を向上させるために当業者に公知の技術により修飾することができる。
好ましい改変された抗体は、ｍＡｂ  ＢＣ２の抗原特異性を有する可変重および／軽鎖ペプチドまたは蛋白配列、例えばＶＨおよびＶＬ鎖を含む。さらにもう一つの望ましい本発明の改変された抗体は、ネズミ抗体分子ＢＣ２の重および／または軽鎖の可変領域のＣＤＲの少なくとも１つ、好ましくはすべてを含み、残りの配列はヒト起源由来のものであるアミノ酸配列、または機能的フラグメントまたはその類似体により特徴づけられる。
【００３４】
さらにもう一つの例において、本発明の改変された抗体は、追加の薬剤と結合させてもよい。例えば、完全抗体分子のＦｃフラグメントまたはＣＨ２  ＣＨ３ドメインが酵素または他の検出可能な分子（すなわち、ポリペプチドエフェクターまたはレポーター分子）により置換されている本発明の改変された抗体を産生するために組換えＤＮＡ配列技術を用いることができる。
第二免疫グロブリンパートナーはまた、凝固因子、好ましくはＩＸ／ＩＸａ因子、Ｘ／Ｘａ因子、ＸＩ／ＸＩａ因子、ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子、Ｖ／Ｖａ因子、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子またはトロンビン／プロトロンビンに対する抗原特異性を有するＣＤＲ−含有配列に対してヘテロローガスな、非免疫グロブリンペプチド、蛋白またはそのフラグメントと操作可能に連結させることができる。結果として得られる蛋白は、発現により抗原特異性と非免疫グロブリンの特徴の両方を示す。この融合パートナー特性は、例えば機能的特徴、例えば、もう一つの結合またはレセプタードメインあるいは融合パートナーそれ自体が治療蛋白であるならば治療特性であってもよい。
【００３５】
本発明のもう一つの望ましい蛋白は、完全長重および軽鎖またはその独立したフラグメント、例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメント、重鎖ダイマーまたはその最小組換えフラグメント、例えば、Ｆｖまたは一本鎖抗体（ＳＣＡ）または選択されたドナーｍＡｂ、例えばｍＡｂ  ＢＣ１、ＢＣ２、９Ｅ４（２）Ｆ４、１１Ｇ４（１）Ｂ９、ＨＦＸＬＣまたはＨＦＸＩと同じ特異性を有する任意の他の分子を有する抗体分子を含む。かかる蛋白は改変された抗体の形態において用いることができるか、またはその未融合形態において用いることができる。
第二免疫グロブリンパートナーが、例えば任意のイソタイプまたはクラスの免疫グロブリンフレームワークまたは定常領域などのドナー抗体と異なる抗体由来である場合はいつでも、操作された抗体が得られる。操作された抗体は、一つの供給源、例えば、アクセプター抗体からの免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域および可変フレームワーク領域、およびドナー抗体、例えば、本明細書に記載の抗−ＩＸ／ＩＸａ因子、Ｘ／Ｘａ因子、ＸＩ／ＸＩａ因子、ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子、Ｖ／Ｖａ因子、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、トロンビン／プロトロンビン抗体からの１以上の（好ましくはすべての）ＣＤＲを含むことができる。加えて、核酸またはアミノ酸レベルでのアクセプターｍＡｂ軽および／または重鎖可変ドメインフレームワーク領域、またはドナーＣＤＲ領域の変更、例えば、欠失、置換または付加は、ドナー抗体抗原結合特異性を保持するために行うことができる。
【００３６】
このような操作された抗体は、凝固因子ｍＡｂ（所望により前記のように修飾してもよい）の可変重および／軽鎖の一つ（または両方）または１以上の重または軽鎖ＣＤＲを使用するために設計される。本発明の操作された抗体は自己限定的中和活性を示す。
このような操作された抗体は、選択されたヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域を含むヒト化抗体またはサブタイプまたは凝固因子抗体機能フラグメントと融合したヒト重および軽鎖定常領域を含むキメラ抗体を含む。好適なヒト（または他の動物）アクセプター抗体は、通常のデータベース、例えば、ＫＡＢＡＴデータベース、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓデータベース、およびＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎデータベースからドナー抗体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列に対する相同性により選択されるものであってもよい。ドナー抗体のフレームワーク領域に対する相同性により特徴づけられるヒト抗体（アミノ酸に基づく）は、ドナーＣＤＲの挿入のための重鎖可変フレームワーク領域を提供するために適している。軽鎖可変フレームワーク領域を供与できる好適なアクセプター抗体を同様にして選択できる。アクセプター抗体重および軽鎖は同じアクセプター抗体起源である必要はないことは重要である。
【００３７】
好ましくは、ヘテロローガスなフレームワークおよび定常領域は、ヒト免疫グロブリンクラスおよびイソタイプ、例えば、ＩｇＧ（サブタイプ１〜４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＥから選択される。しかしながら、アクセプター抗体はヒト免疫グロブリン蛋白配列のみを含む必要はない。例えば、ヒト免疫グロブリン鎖のＤＮＡ配列エンコーディング部分が非免疫グロブリンアミノ酸配列、例えば、ポリペプチドエフェクターまたはレポーター分子をコードするＤＮＡ配列と融合した遺伝子を構築することができる。
特に好ましいヒト化抗体は、選択されたヒト抗体配列のフレームワーク領域上に挿入されたＢＣ２のＣＤＲを含む。ヒト化抗体の中和のために、ＩＸ因子抗体重鎖および／または軽鎖可変領域から得られる１、２または好ましくは３個のＣＤＲを選択されたヒト抗体配列のフレームワーク領域中に挿入し、後者の抗体の未変性ＣＤＲを置換する。
【００３８】
好ましくは、ヒト化抗体において、ヒト重および軽鎖の両方における可変ドメインは１以上のＣＤＲ置換により操作されている。６個のＣＤＲすべて、または６未満のＣＤＲの様々な組み合わせを用いることができる。好ましくはすべての６のＣＤＲを置換する。ヒト重鎖のみにおけるＣＤＲを、軽鎖としてヒトアクセプター抗体から得られる未修飾軽鎖を用いて置換することができる。さらに別法として、適合性軽鎖をもうひとつのヒト抗体から通常の抗体データベースにより選択することができる。操作された抗体の残りは好適なアクセプターヒト免疫グロブリンから得ることができる。
操作されたヒト化抗体はしたがって、好ましくは天然のヒト抗体またはそのフラグメントの構造を有し、有効な治療的用途、例えば、ヒトにおける血栓性および塞栓性疾患の治療に必要とされる性質の組み合わせを有する。
【００３９】
最も好ましくは、ヒト化抗体は配列番号３１、５２、または８９に記載されているような重鎖アミノ酸配列を有する。また、最も好ましいのは、配列番号４４、５７、６２、７４、７８または９９に記載されているような軽鎖アミノ酸配列を有するヒト化抗体である。特に好ましいのは、重鎖が配列番号３１に記載されているようなアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号４４に記載されているようなアミノ酸配列を有するヒト化抗体ＳＢ２４９４１３である。重鎖が配列番号５２に記載されているようなアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号５７に記載されているようなアミノ酸配列を有するヒト化抗体ＳＢ２４９４１５も特に好ましい。重鎖が配列番号５２に記載されているようなアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号５７に記載されているようなアミノ酸配列を有するヒト化抗体ＳＢ２４９４１５である。さらに、特に好ましいのは、重鎖が配列番号５２に記載されているようなアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号６２に記載されているようなアミノ酸配列を有するヒト化抗体ＳＢ２４９４１６も特に好ましい。重鎖が配列番号５２に記載されているようなアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号７４に記載されているようなアミノ酸配列を有するヒト化抗体ＳＢ２４９４１７も特に好ましい。重鎖が配列番号５２に記載されているようなアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号７８に記載されているようなアミノ酸配列を有するヒト化抗体ＳＢ２５７７３１も特に好ましい。重鎖が配列番号８９に記載されているアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号９９に記載されているアミノ酸配列を有するヒト化抗体ＳＢ２５７７３２も特に好ましい。
【００４０】
操作された抗体はさらに可変ドメインアミノ酸の変化により、必ずしもドナー抗体（すなわち、類似体）の特異性および高親和性に影響を及ぼすことなくさらに修飾することができることは当業者には理解されるであろう。重および軽鎖アミノ酸は可変ドメインフレームワークまたはＣＤＲのいずれか、あるいは両方において他のアミノ酸により置換することができる。これらの置換はドナー抗体または特定のサブグループから得られるコンセンサス配列により供給することができる。
加えて、定常領域は本発明の分子の選択的性質を向上または減少させるために変更することができる。例えば、二量化、Ｆｃレセプターとの結合、または補体を結合または活性化する能力（例えば、Ａｎｇａｌら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ３０， １０５−１０８ （１９９３）， Ｘｕら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２６９， ３４６９−３４７４ （１９９４）， Ｗｉｎｔｅｒら、ＥＰ３０７４３４−Ｂを参照のこと）。
【００４１】
キメラ抗体である改変された抗体は、フレームワーク領域を含む全非ヒトドナー抗体重鎖および軽鎖可変領域を、両鎖のヒト免疫グロブリン定常領域と関連して提供することにより前記のヒト化抗体と異なる。本発明のヒト化抗体と比較して追加の非ヒト配列を保持するキメラ抗体はヒトにおいて顕著な免疫応答を誘発することが予想される。
かかる抗体は、以下に記載するように、血栓性および塞栓性障害の予防および治療において有用である。
好ましくは、ｍＡｂ  ＢＣ２または他の好適なドナーｍＡｂ、例えばＢＣ１、９Ｅ４（２）Ｆ４、１１Ｇ４（１）Ｂ９、ＨＦＸＬＣ、ＨＦＸＩ、およびそのエンコーディング核酸配列の可変軽および／または重鎖配列およびＣＤＲは、次のプロセスにより、本発明の改変された抗体、好ましくはヒト化抗体の構築において用いられる。本発明の他の例を生成させるために同じかまたは類似した技術も用いることができる。
【００４２】
選択されたドナーｍＡｂ、例えば、ネズミ抗体ＢＣ２を産生するハイブリドーマは通常クローンされ、その重および軽鎖可変領域のＤＮＡは当業者に公知の技術、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８９）に記載されている技術により得られる。少なくともＣＤＲ−コード化領域およびドナーｍＡｂ結合特異性を保持するために必要なアクセプターｍＡｂ軽および／または重可変ドメインフレームワーク領域の部分を含むＢＣ２の可変重および軽鎖領域、ならびにヒト免疫グロブリンから得られる抗体鎖の残りの免疫グロブリン由来の部分は、ポリヌクレオチドプライマーおよび逆転写酵素を用いて得られる。ＣＤＲ−コード化領域は公知データベースを用い、他の抗体との比較により同定される。
【００４３】
マウス／ヒトキメラ抗体を次に調製し、結合特異性について分析する。かかるキメラ抗体は、完全非ヒトドナー抗体ＶＨおよびＶＬ領域を、両鎖のヒトＩｇ定常領域との組み合わせにおいて含む。
ヒト抗体から得られる重鎖可変領域の相同性フレームワーク領域はコンピューター化されたデータベース、例えば、ＫＡＢＡＴを用いて同定され、ＢＣ２に対する相同性を有するヒト抗体はアクセプター抗体として選択される。ヒト抗体フレームワーク内にＢＣ２  ＣＤＲ−コード化領域を含む合成重鎖可変領域の配列は、制限部位を組み入れるためにフレームワーク領域内に任意のヌクレオチド置換を有するように設計される。この設計された配列を次に長い合成オリゴマーを用いて合成する。別法として、オリゴヌクレオチドを重複させることにより設計された配列を合成し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、誤差を補正する。好適な軽鎖可変フレームワーク領域は同様にして設計することができる。
【００４４】
ヒト化抗体はキメラ抗体から得ることができ、好ましくは、重および軽鎖から得られるドナーｍＡｂ  ＣＤＲ−コード化領域を選択された重および軽鎖フレームワーク内に適当に挿入することにより合成することができる。別法として、標準的突然変異誘発技術を用いて本発明のヒト化抗体を調製することができる。従って、結果として得られるヒト化抗体はヒトフレームワーク領域およびドナーｍＡｂ  ＣＤＲ−コード化領域を含む。その後、フレームワーク領域を操作してもよい。結果として得られるヒト化抗体を組換え宿主細胞、例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯまたは骨髄腫細胞において発現することができる。他の好適なＩＸ因子特異性または他の凝集因子特異性、自己限定的、中和、高親和性、比ヒト抗体に対してこの技術を用いて他のヒト化抗体を調製することができる。
【００４５】
改変された抗体のこれらのコーディング配列を宿主細胞の複製および宿主細胞における発現、および／または宿主細胞からの分泌を制御できる通常の調節配列と操作的に関連させることにより、通常の発現ベクターまたは組換えプラスミドを産生する。調節配列は、プロモーター配列、例えば、ＣＭＶプロモーター、およびシグナル配列を含み、これは他の公知抗体から誘導することができる。同様に、相補的抗体軽または重鎖をコードするＤＮＡ配列を有する第二の発現ベクターを産生することができる。好ましくは、この第二の発現ベクターは、できるだけ各ポリペプチド鎖が機能的に発現されるために、コーディング配列と選択可能なマーカー以外は第一のものと同一である。別法として、改変された抗体の重および軽鎖コーディング配列は一つのベクターに存在してもよい。
【００４６】
選択された宿主細胞は、通常の技術により、第一および第二ベクターの両方と同時形質導入されて（または一つのベクターにより単に形質導入されて）、組換えまたは合成軽および重鎖の両方を含む本発明の形質導入された宿主細胞が生じる。形質導入された細胞を次に通常の技術により培養して、本発明の操作された抗体を産生する。組換え重鎖および／または軽鎖の両方の組み合わせを含むヒト化抗体を適当なアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡにより培地からスクリーンする。本発明の他の改変された抗体および分子を構築するために類似した通常の技術を用いることができる。
本発明の方法および組成物の構築において用いられるクローニングおよびサブクローニング工程に適したベクターは当業者が選択することができる。例えば、ＡｍｅｒｓｈａｍまたはＰｈａｒｍａｃｉａなどの供給業者から商業的に入手可能なｐＵＣシリーズのクローニングベクター、例えば、ｐＵＣ１９を用いることができる。さらに、容易に複製できる、多くのクローニング部位および選択可能な遺伝子（例えば、抗生物質耐性）を有し、容易に操作される任意のベクターをクローニングに用いることができる。従って、クローニングベクターの選択は本発明の制限的要素ではない。
【００４７】
同様に、本発明に従って操作された抗体を発現するための用いられるベクターは、任意の通常のベクターから当業者により選択することができる。ベクターはさらに、選択された宿主細胞においてヘテロローガスなＤＮＡ配列の複製および発現を行う選択された調節配列（例えばＣＭＶプロモーター）も含む。これらのベクターは操作された抗体または改変された免疫グロブリンコーディング領域をコードする前記ＤＮＡ配列を含む。加えて、ベクターは操作を容易にするために所望の制限部位を挿入することにより修飾された、選択された免疫グロブリン配列を組み入れることができる。
発現ベクターはまた、ヘテロローガスなＤＮＡ配列、例えば、哺乳動物ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ＤＨＦＲ）の発現を増幅するために適した遺伝子により特徴づけられる。他の好ましいベクター配列は、ポリＡシグナル配列、例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）から得られるものおよびベータグロブリンプロモーター配列（ｂｅｔａｇｌｏｐｒｏ）を含む。本発明において有用な発現ベクターは、当業者に周知の技術により合成することができる。
【００４８】
かかるベクターの成分、例えば、レプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター、シグナル配列などは、商業的または天然の供給源から入手できるか、または選択された宿主における組換えＤＮＡ配列の産物の発現および／または分泌において用いられる公知方法により合成することができる。他の適当な発現ベクターは、哺乳動物、細菌、昆虫、酵母および真菌発現について当該分野においてその多くのタイプが公知であり、この目的のために選択することができる。
本発明はさらに、操作された抗体またはその改変された免疫グロブリン分子のコーディング配列を含む組換えプラスミドで形質導入された細胞系も含む。これらのクローニングベクターのクローニングおよび他の操作に有用な宿主細胞も通常のものである。しかしながら、最も望ましくは、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の様々な株から得られる細胞が、クローニングベクターの複製および本発明の改変された抗体の構築における他の工程に用いられる。
【００４９】
本発明の操作された抗体または改変された抗体の発現に適した宿主細胞または細胞系は好ましくは哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、繊維芽細胞（例えば、３Ｔ３）および骨髄細胞であり、より好ましくは、ＣＨＯまたは骨髄細胞である。ヒト細胞を用いることができ、したがって分子をヒトグリコシル化パターンで修飾されるようにできる。別法として、他の真核細胞系を用いることができる。好適な哺乳動物宿主細胞および形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび生成物産生および精製の方法は当該分野において公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと。
細菌細胞は本発明の組換えＦａｂの発現に適した宿主細胞として有用であることが判明している（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ａ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ， １３０， １５１−１８８ （１９９２）を参照のこと）。しかしながら、細菌細胞において発現される蛋白はフォールドされていないかまたは不適切にフォールドされた形態または非グリコシル化形態である傾向にあるので、細菌細胞において産生される任意の組換えＦａｂを抗原結合能力の保持についてスクリーンしなければならない。細菌細胞により発現される分子が適切にフォールドされた形態において産生されたならば、その細菌細胞は望ましい宿主である。例えば、発現に用いられる様々なイー・コリ株はバイオテクノロジーの分野において宿主細胞として一般的である。ビー・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ）、他のバチルスなどの様々な株を用いることができる。
【００５０】
望ましいならば、当業者に公知の酵母細胞の株も宿主細胞として利用可能であり、昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）および鱗翅類（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）およびウイルス発現系も利用可能である。例えば、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ８， ２７７−２９８， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ （１９８６）および引用されている文献を参照のこと。
本発明の様々なベクターを構築できる一般法、本発明の宿主細胞を産生するために必要な形質導入法、およびかかる宿主細胞から本発明の改変された抗体を産生するために必要な培養法はすべて慣例的技術である。同様に、一旦産生されると、本発明の改変された抗体を、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む当該分野の標準的な手順に従って細胞培養物から精製することができる。かかる技術は当業者の技術範囲内であり、本発明を制限するものではない。
【００５１】
ヒト化抗体のさらにもう一つの発現法は、米国特許第４８７３３１６号に記載されているようなトランスジェニック動物における発現を利用する。これは、遺伝形質転換により哺乳動物中に組み入れられた場合にメスにその乳中に所望の組換え蛋白を産生させる動物のカゼインプロモーターを用いた発現系に関する。
所望の方法で一旦発現されると、操作された抗体を次に適当なアッセイを使用してインビトロ活性について試験する。現在、ＩＸ因子または他の適当な凝固因子に対する操作された抗体の定性的および定量的結合を評価するために通常のＥＬＩＳＡアッセイフォーマットが用いられる。加えて、通常のクリアランスメカニズムにもかかわらず、体内で操作された抗体の残留率を評価するために、その後のヒト臨床試験の前に中和効力を検証するために他のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いることができる。
【００５２】
ＢＣ２から調製されるヒト化抗体について記載された手順に従って、当業者はまた本明細書に記載された他のドナー、可変領域配列およびＣＤＲペプチドからヒト化抗体を構築することができる。操作された抗体は、操作された抗体の受容体により「自己」として潜在的に認識される可変領域フレームワークを用いて産生できる。可変領域フレームワークに対するわずかに修飾することにより受容体の免疫原性を著しく増大させずに抗原結合を大きく増大させることができる。かかる操作された抗体は凝固因子により媒介される状態についてヒトを有効に治療できる。かかる抗体はまたかかる状態の診断においても有用である。
【００５３】
本発明はまた、動物、特にヒトにおける血栓症を抑制する方法であって、有効量の自己限定的中和活性を有する抗凝固因子モノクローナル抗体をプラスミノーゲンアクチベーターとの組み合わせにおいて投与することを含む方法に関する。
併用療法は、血流の回復のための時間を減少させ、血管再潅流の頻度および合計期間を増大させるプラスミノーゲンアクチベーターの最適以下の濃度での血栓崩壊を向上させる。ヘパリンと対照的に、併用療法は通常の止血機能を著しく妨害せず、フィブリノーゲン、プラスミノーゲンおよびアルファ−２−抗プラスミンレベルを減少させる。従って、本発明はさらに、動物における血栓症の治療における血栓溶解剤の必要な用量を減少させる方法であって、血栓溶解剤との組み合わせにおいて内因性凝固経路の成分を特異的に標的とする抗凝固剤を投与することを含む方法に関する。
【００５４】
好ましくは、凝固因子は内因性または共通凝固経路から得られる。最も好ましくは、抗凝固因子モノクローナル抗体は、抗−ＩＸ因子、抗−ＩＸａ因子、抗−Ｘ因子、抗−Ｘａ因子、抗−ＸＩ因子、抗−ＸＩａ因子、抗−ＶＩＩＩ因子、抗−ＶＩＩＩａ因子、抗−Ｖ因子、抗−Ｖａ因子、抗−ＶＩＩ因子、抗−ＶＩＩａ因子、抗トロンビンまたは抗プロトロンビンである。ｍＡｂは、本明細書に記載された１以上の操作された抗体または改変された抗体あるいはそのフラグメントを含むことができる。
好ましくは、プラスミノーゲンアクチベーターはｔＰＡ、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼである。特に好ましいのは、ｔＰＡである。例えば、Ｔａｃｈｉａｓ ａｎｄ Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２７２， １４５８０−１４５８５ （１９９７）； Ｆｕｊｉｓｅら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ９５， ７１５−７２２ （１９９７）； Ｃｏｏｍｂｓら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２７３， ４３２３−４３２８ （１９９８）； Ｖａｎ ｄｅ Ｗｅｒｆら、Ａｍ Ｈｅａｒｔ Ｊ， １３７， ７８６−７９１ （１９９９）に記載されているようなｔＰＡ変種ならびにストレプトキナーゼおよびウロキナーゼ変種、例えば、一本鎖ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター、アシル化プラスミノーゲンストレプトキナーゼアクチベーター複合体、吸血コウモリ起源のスタフィロキナーゼおよびプラスミノーゲンアクチベーターも好ましい。
【００５５】
別法として、アセチルサリチル酸を抗凝固因子モノクローナル抗体との組み合わせにおいて投与することができる。場合によっては、併用療法は抗凝固因子モノクローナル抗体の治療的に有効な用量を減少させる。
本発明の分子の使用により誘発される治療応答は、それぞれの凝固因子との結合およびその後の凝固カスケードの自己限定的抑制により生じる。従って、本発明の分子は、治療適用途に適した製剤および処方における場合、これに限定されないが、心筋梗塞、不安定アンギナ、心房細動、発作、腎損傷、肺塞栓症、深静脈血栓症および人口臓器および補綴移植に関連する異常な凝固活性に感受性であるかまたは経験した個人に非常に望ましい。特に好ましい用途は、心筋梗塞である。
【００５６】
もう一つの好ましい用途は、血栓塞栓後に誘発される虚血の治療においてである。従って、本発明はさらに、動物の血栓塞栓後に誘発される虚血の治療法であって、抗−ＩＸ因子抗体または抗体フラグメントを投与することを含む方法に関する。抗体またはフラグメントは、塞栓後、すなわち、脈管構造内の任意の場所で生じた血塊が脳脈管構造中に移動し、停滞し、血流をブロックおよび／または減少させ、虚血を引き起こした後に投与することができる。抗体またはフラグメントはまた、発作後、すなわち、塞栓形成から起こる神経機能障害を個人または観察者の側で認識した後にも投与することができる。さらに、本発明は 動物の血栓塞栓後に誘発される虚血を治療する方法であって、抗−ＩＸ因子抗体または抗体フラグメントをプラスミノーゲンアクチベーターとの組み合わせにおいて投与することを含む方法に関する。抗体またはフラグメントおよびプラスミノーゲンアクチベーターは、塞栓後または発作後に投与することができる。これらの治療法の結果、側副血管における血管潅流が維持される。本発明の損傷後の治療は、例えば、虚血支持構造において継続する病理的血栓症などの、梗塞組織を増大させ、神経学的障害を大きくする可能性のある持続性虚血の結果を緩和する。
【００５７】
さらに、本発明は動物の血栓塞栓後に誘発される虚血の治療における血栓溶解剤の必要な用量を減少させる方法であって、抗−ＩＸ因子抗体を血栓溶解剤との組み合わせにおいて投与することを含む方法に関する。
もう一つの好ましい用途は、血栓塞栓性発作にかかりやすい動物に対する予防的投与である。従って、本発明はまた、動物における血栓塞栓性発作の予防法であって、抗−ＩＸ因子抗体を血栓塞栓性発作の危険性のある動物に投与することを含む方法に関する。血栓塞栓性発作の危険性のあるものとしては、これらに限定されないが、心房細動にかかりやすい患者または外科手術的介入または他の凝固促進薬侵襲性技術を受けているものが挙げられる。
本発明の改変された抗体、抗体およびそのフラグメントはさらに、他の抗体、特に本発明の操作された抗体が向けられる状態の原因である他のマーカー（エピトープ）と反応性のヒトｍＡｂと組み合わせて用いることができる。
【００５８】
本発明の治療薬は、約１日から約３週間、あるいは必要に応じて、異常な凝固状態の治療に望ましいと考えられる。これは、現在使用されている抗凝固剤ヘパリンおよびワルファリンよりも非常に優れている。用量および治療期間は、ヒトの循環における本発明の分子の相対的持続期間に関連し、治療される状態および患者の身体全体の健康状態に応じて当業者が調節することができる。
本発明の治療薬の投与様式は、該薬剤を宿主に送達する任意の適当な経路であってよい。本発明の改変された抗体、抗体、操作された抗体、およびそのフラグメント、プラスミノーゲンアクチベーターおよび医薬組成物は非経口投与、すなわち、皮下、筋肉内、静脈内または鼻内投与に特に有用である。
【００５９】
本発明の治療薬は、活性成分として有効量の本発明の操作された（例えばヒト化）抗体およびプラスミノーゲンアクチベーターを医薬的に許容される担体中に含む医薬組成物として調製することができる。別法として、本発明の医薬組成物はまたアセチルサリチル酸を含むこともできる。本発明の予防薬において、操作された抗体を含む水性懸濁液または溶液で、好ましくは生理的ｐＨに緩衝され、すぐに注射できる形態のものが好ましい。非経口投与用組成物は、通常、医薬的に許容される担体、好ましくは水性担体中に溶解された本発明の操作された抗体またはそのカクテルの溶液を含む。さまざまな水性担体、例えば、０．４％塩溶液、０．３％グリシンなどを用いることができる。これらの溶液は、滅菌され、一般に粒状物質を含まない。これらの溶液は、通常の、よく知られた滅菌技術（例えば、濾過）により滅菌することができる。組成物は、生理学的状態に近づけるために必要な医薬的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調節剤および緩衝剤などを含むことができる。かかる医薬処方中の本発明の抗体の濃度は広範囲に変化し得、すなわち、約０．５重量％未満、通常１重量％または少なくとも１重量％から１５または２０重量％まで変化し、主に液体の体積、粘度などに応じて、選択される具体的な投与様式に従って選択される。
【００６０】
従って、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝水、および約１ｎｇないし約１００ｍｇ、例えば約５０ｎｇないし約３０ｍｇまたはより好ましくは約５ｍｇないし約２５ｍｇの本発明の操作された抗体を含むように調製することができる。同様に、静脈内注入用の本発明の医薬組成物は、約２５０ｍｌの滅菌リンゲル液、および約１ｍｇないし約３０ｍｇ、好ましくは５ｍｇないし約２５ｍｇの本発明の操作された抗体を含むように調製することができる。実際の非経口投与可能な組成物の調製法は当業者に周知であるか明らかであり、例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ”， １５ｔｈ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａにおいてより詳細に記載されている。
【００６１】
本発明の治療薬は、医薬製剤における場合、単位投与形態で提示されるのが好ましい。適当な治療的に有効な用量は、当業者が容易に決定できる。ヒトまたは他の動物における血栓および塞栓性障害を有効に治療するために、体重１ｋｇあたり０．１ｍｇないし約２０ｍｇの本発明の蛋白または抗体の一用量を非経口的に、好ましくは静脈内または筋肉内投与する。かかる投与は、必要ならば血栓反応中医師により適当に選択される適当な間隔で繰り返すことができる。
本明細書に記載する抗体、改変された抗体またはフラグメントは、貯蔵するために凍結乾燥し、使用前に適当な担体で復元することができる。この技術は、通常の免疫グロブリンに関して有効であることが証明されており、当該分野において公知の凍結乾燥および復元技術を用いることができる。
本発明を以下の具体的な、非限定的実施例を用いて説明する。
【００６２】
実施例１
抗−ＩＸ因子モノクローナル抗体の調製およびスクリーニング
メスＢａｌｂ／Ｃマウスに、Ｊｅｎｎｙ， Ｒ．ら、Ｐｒｅｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ， １６， ２２７−２４５（１９８６）に記載されているようにして精製したヒトＩＸ因子を注射した。典型的には、各マウスに、０．１５ｍＬのリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に溶解し、０．１５ｍＬの完全フロインドアジュバントと混合した、１００ｕｇの蛋白の第１回注射をした。０．１５ｍＬのＰＢＳと０．１５ｍＬの不完全フロインドアジュバント中の５０ｕｇ蛋白のブースター免疫化を略隔週に２〜３ヶ月の期間にわたって行った。最終ブースト後、マウスに脾臓／骨髄腫細胞融合前３日に５０ｕｇのＰＢＳ中ＩＸ因子を投与した。脾臓細胞を免疫化されたマウスから取り出し、Ｏｉ， Ｖ．Ｔ． らにより”Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”， Ｍｉｓｈｅｌｌ， Ｂ．Ｂ． ａｎｄ Ｓｈｉｇｉｉ， Ｓ．Ｍ．， ｅｄｓ．， Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏに記載されているようにポリエチレングリコールを用いてＮＳ−１骨髄腫細胞（Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ．ら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ６， ２９２−２９５ （１９７６））と融合させた。融合後、細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁させ、アリコートを、０．５ｍＬの腹膜洗浄細胞−順化培地を含む４つの２４ウェルプレートのそれぞれのウェルに入れた。次の日に、各ウェルに１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地中１．０ｍｌの２×１０−６Ｍのハイポキサンチン、８×１０−７Ｍのアミノプテリンおよび３．２×１０−５Ｍのチミジンを添加した。培地の半分を除去し、１×１０−４Ｍのハイポキサンチンおよび１．６×１０−５Ｍのチミジンを含む新しい培地で交換することにより細胞に３〜４日ごとに養分を供給した。
【００６３】
略２週間後、１．０ｍＬのハイブリドーマ培地を各ウェルから除去し、Ｊｅｎｎｙ，Ｒ．Ｊ．らによりＭｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ， ２２２， ４００−４１６ （１９９３）において記載されているようなＥＬＩＳＡアッセイを用いて抗−ＩＸ因子について試験した。簡単に言うと、ＩＸ因子を９６−ウェルマイクロタイタープレートのプラスチックウェル上に固定した。精製された抗体のハイブリドーマ上清または希釈液を次にウェル中でインキュベートした。ウェルを洗浄し、抗体−抗原複合体の存在を西洋ワサビペルオキシダーゼと接合させたヤギ抗ネズミ免疫グロブリンダイン抗体および色素原基質ｏ−ジアニシジンで検出した。
抗−ＩＸ抗体を含むウェルを制限希釈法によりサブクローンし、９６−ウェルプレート中で増殖させた。クローンされたハイブリドーマ細胞培養物から得られた上清を前記のＥＬＩＳＡアッセイによりＩＸ因子に対する抗体についてスクリーンし、陽性ハイブリドーマからの細胞を広げ、凍結し、液体窒素中で貯蔵し、マウスの腹水腫瘍として増殖させた。
【００６４】
実施例２
凝固における抗凝固因子抗体の自己限定的効果
活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）に対する抗凝固因子抗体の濃度の増大の影響をフィブロメーター（ｆｉｂｒｏｍｅｔｅｒ）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ）においてバクスターリファレンス法ＬＩＢ０２９３−Ｊ、３／９３改訂版（Ｂａｘｔｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｅｄｉｓｏｎ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）を用いて測定した。
実験開始前に、５ｍＬ試験管中の２〜３ｍＬの０．０２Ｍ  ＣａＣｌ２をフィブロメーターの加熱チャンバー中に入れた。ヒト血漿サンプルは、新たに抜き取り、氷上に維持するか、または止血参照血漿（Ａｍｅｒｉｃａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ， Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ， Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）から製造業者らの勧告により再構成するかのいずれかであった。
豚腸粘膜から得た未分画ヘパリン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、豚腸粘膜から得た低分子量ヘパリン（Ｌｏｖｅｎｏｘ、エノキサパリンナトリウム、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｃｏｌｌｅｇｅｖｉｌｌｅ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）またはｍＡｂ抗凝固剤を５０ｕＭストック溶液として調製し、直接試験血漿中に連続して希釈した。抗凝固剤を含まず、血漿を含むブランクを対照とした。
【００６５】
２つのｆｉｂｒｏＴｕｂｅフィブロメーターカップを、それぞれ１００ｕｌの試験血漿または抗凝固剤を含む１００ｕｌの試験血漿、および１２５ｕｌのアクチン活性化セファロプラスチン試薬（アクチン試薬、エラグ酸中ウサギ脳セファリンから得る、Ｂａｘｔｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能）で満たし、３７℃のフィブロメーターウェル中に入れた。
１分後、１００ｕｌのアクチン試薬を血漿含有カップに移し、内容物をピペットで数回混合した。３分インキュべーションした後、１００ｕｌのＣａＣｌ２を３７℃で予熱したものを、自動ピペット／タイマー−トリガー（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて血漿−アクチン試薬混合物に添加した。凝固時間を記録し、図１に示した結果は、合計アッセイ体積３００ｕｌ中の抗凝固剤の最終濃度の関数としての凝固時間として示す。アッセイにおけるＩＸ因子の基準濃度は３０〜４０ｎＭである。
【００６６】
図１に示した結果は、ネズミ抗−ＩＸ因子ｍＡｂ  ＢＣ１およびＢＣ２の濃度の増加のａＰＴＴ凝固時間に対する影響を示す。両ｍＡｂはａＰＴＴを延長することにより凝固を抑制し、両ｍＡｂはａＰＴＴに対する最終飽和効果に達する。ＩＣ５０値はＢＣ１およびＢＣ２についてそれぞれ約３５ｎＭおよび約５０ｎＭで類似しているが、２つの抗体に対する最大応答における差は顕著である。ＢＣ１の飽和濃度はａＰＴＴを５０％、約４０秒まで増大させる。一方、ＢＣ２はａＰＴＴを３．５倍、約９０秒まで増大させる。ヘパリンでの抗凝固療法において用いられる治療標的領域を強調する。結果から、２つのｍＡｂはヘパリン治療ａＰＴＴ範囲を包含することがわかる。
ｍＡｂ  ＢＣ１およびＢＣ２の性質を表Ｉにまとめる。ＢＣ  ｍＡｂのそれぞれはチモーゲン、ＩＸ因子の両方、ならびに活性プロテアーゼ、ＩＸａ因子を認識するが、ＢＣ２のみが両チモーゲン活性化ならびにプロテアーゼ活性をブロックできる。ＢＣ１およびＢＣ２はシノモルグスサル（Ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）ＩＸ因子と公差反応することが判明している。さらに、ＢＣ２はラットＩＸ因子とも交差反応する。
【００６７】
【表１】
第Ｉ表  抗−ＩＸ因子ｍＡｂのインビトロ性質のまとめ
2004516236.tif 000002
【００６８】
図２に示す結果は、抗−ＩＸ因子ｍＡｂ  ９Ｅ４（２）Ｆ４および１１Ｇ４（１）Ｂ９の濃度の増加のａＰＴＴ凝固時間に対する効果を示す。アッセイ用の血漿を標準濃度の半分に希釈し、４５秒の初期ａＰＴＴを得た。両ｍＡｂはａＰＴＴを延長することにより凝固を抑制し、両ｍＡｂはａＰＴＴに関して最終飽和効果に達する。９Ｅ４（２）Ｆ４および１１Ｇ４（１）Ｂ９の飽和濃度は、ａＰＴＴを９Ｅ４（２）Ｆ４については約９０から１００秒まで増大させ、１１Ｇ４（１）Ｂ９については約８０秒まで増大させる。結果は、２つのｍＡｂはヘパリン治療ａＰＴＴ範囲の上限であることを示す。
図３に示す結果は、抗−Ｘ因子ｍＡｇ  ＨＦＸＬＣ（対軽鎖エピトープ）、ＨＦＸＨＣ（対重鎖エピトープ）および抗−ＸＩ因子ｍａｂ  ＨＦＸＩの濃度の増加のａＰＴＴ凝固時間に対する効果を示す。これらのｍＡｂはＥｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｓｏｕｔｈ Ｂｅｎｄ， ＩＮ）から入手した。ｍＡｂ  ＨＦＸＬＣの濃度およびＨＦＸＩは、ａＰＴＴを延長することにより凝固を抑制し、両ｍＡｂはａＰＴＴに関して最終飽和効果に達する。ＨＦＸＬＣのＩＣ５０値は約４０ｎＭであり；飽和濃度はａＰＴＴを約６０秒まで増大させる。ＨＦＸＩのＩＣ５０値は約２０ｎＭであり；飽和濃度はａＰＴＴを約１００秒まで増大させる。結果は、ＨＦＸＬＣはヘパリン治療ａＰＴＴ範囲内にあるが、ＨＦＸＩはヘパリン治療範囲の上端であることを示す。ｍＡｂ  ＨＦＸＨＣはａＰＴＴ凝固時間に対して影響を及ぼさなかった。
ａＰＴＴの自己限定的延長は、ＶＩＩＩ因子に対する抗体、ＩＸａ因子に対する補因子についても観察される。例えば、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．から購入した抗ヒトＶＩＩＩ因子抗体ＳＡＦ８Ｃ−ＩＧはａＰＴＴを約６５秒の最大値まで増大させた。ａＰＴＴの最大半減延長は、約１００ｎＭ抗体で達成された。
【００６９】
実施例３
ラット血栓モデルにおけるネズミＩＸ因子ｍＡｂの効果
抗−ＩＸ因子抗体の動脈血栓症の予防における効果を評価するために、ＳｃｈｕｍａｃｈｅｒらによりＪ Ｃａｒｄｉｏ Ｐｈａｒｍ， ２２， ５２６−５３３ （１９９３）において報告されているようなラット頸動脈血栓症モデルを採用した。このモデルは、頸動脈表面上に適用されたＦｅＣｌ３溶液により生じる酸素ラジカルによる頸動脈内皮に対する局所的損傷からなる。
簡単に言うと、ラットをペントバルビトンナトリウムで麻酔し、頸静脈に静脈内注入のためにカニューレを挿入し、血圧および心拍数をモニターするために左大腿動脈にカニューレを挿入した。無菌技術により首を外科的に切開することにより頸動脈を取り出し、血流測定のために磁気フロープローブを装備した。安定化期間後、次の変数のベースラインパラメータを確立した：頸動脈血流、動脈圧、心拍数、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）およびプロトロンビン時間（ＰＴ）。その後、５０％ＦｅＣｌ３溶液中に浸漬したあらかじめ測定したワットマン濾紙を頸動脈上に１５分間置き、その下にある内皮細胞を完全に傷つけた。ＦｅＣｌ３浸漬濾紙を除去した後、実験を６０分にわたって完了させた。実験の最後に、頸動脈血栓を頸動脈から取り出し、秤量した。
【００７０】
すべての薬剤は頸動脈損傷の開始前１５分に投与した。次の処置を試験し、ＩＸ因子ｍＡｂ  ＢＣ２と比較した。
１．ヘパリン：１５、３０、６０、または１２０Ｕ／ｋｇボーラス、続いて０．５、１、２または４Ｕ／ｋｇ／分をそれぞれ６０分かけて注入
２．アセチルサリチル酸（ＡＳＡ、アスピリン）：５ｍｇ／ｋｇボーラス
３．抗−ＩＸ因子ｍＡｂ  ＢＣ２：１、３または６ｍｇ／ｋｇボーラス、続いて０．３、１、または０．２ｕｇ／ｋｇ／分をそれぞれ６０分かけて注入
４．ヘパリン：３００Ｕ／ｋｇボーラス＋１Ｕ／ｋｇ／分＋ＡＳＡ  ５ｍｇ／ｋｇ
５．抗−ＩＸ因子ｍＡｂ  ＢＣ２：１ｍｇ／ｋｇ＋０．３ｕｇ／ｋｇ／分＋ＡＳＡ  ５ｍｇ／ｋｇ
【００７１】
図４および５は、ヘパリン、ＡＳＡおよびＩＸ因子ｍＡｂ  ＢＣ２のａＰＴＴ（図４）およびＰＴ（図５）に対する効果を示すことにより抗凝固剤／血栓症養生法の比較薬理学を表す。
出血性体質の重要な指標であるａＰＴＴを研究において使用される抗凝固剤／血栓症薬の出血傾向に対する効果を評価する第一の基準として用いた。図４における結果は、ヘパリンによる用量に依存したａＰＴＴの延長を表し、凝固時間の最大の延長は２種の高用量で試験範囲を超えた。ＡＳＡ単独は、ａＰＴＴを著しく増大しなかったが、ヘパリンとの組み合わせにおいて顕著な相乗効果が観察された。ＩＸ因子ｍＡｂはａＰＴＴに対して適度の効果を有し、最も高い用量においても、凝固時間の増大は臨床的に実施される標準的抗凝固剤の限度の３倍を越えなかった。最も注目に値することは、低用量のＩＸ因子ｍＡｂ  ＢＣ２はＡＳＡとの組み合わせにおいてａＰＴＴを変化させなかった。
【００７２】
図５において、データはＰＴもヘパリンにより２種の高用量で、またＡＳＡ＋ヘパリンの組み合わせにより著しく延長されるが、ＩＸ因子ｍＡｂ単独またはＡＳＡとの組み合わせでは延長されないことを示す。
ヘパリン、ＡＳＡおよびＩＸ因子ｍＡｂの頸動脈閉塞に対する効果を図６に示す。結果は、すべてのビヒクル処置された動物の頸動脈は損傷に反応して閉塞することを示す。ヘパリンは用量に依存して頸動脈の閉塞を抑制した。最高の用量でヘパリンは完全に頸動脈の閉塞を防止したが；この用量では凝固は開始できなかった。ＡＳＡ単独は頸動脈の閉塞に対してわずかな影響しかなかった。ＡＳＡとヘパリンの組み合わせも頸動脈の閉塞を完全に防止できなかった。ＩＸ因子ｍＡｂは２種の高用量で頸動脈閉塞を完全にブロックし、臨床的に望ましい目的値を越えて凝固を延長しなかった。さらに低い用量のＩＸ因子ｍＡｂは、単独では開通性をほとんど確実にできなかったが、ＡＳＡとの組み合わせにおいて投与された場合には頸動脈閉塞を完全に抑制した。
【００７３】
ヘパリン、ＡＳＡおよびＩＸ因子ｍＡｂの血栓重量に対する効果を図７に示す。ヘパリンは用量に依存して頸動脈における血栓量を減少させた。しかしながら、完全に凝固をブロックしたにもかかわらず、頸動脈において幾分血栓が残存しているのが見られた。ＡＳＡ単独またはヘパリン（３０Ｕ／ｋｇ）との組み合わせにおいては血栓重量に対して部分的な効果しかなかった。ＩＸ因子ｍＡｂは用量に依存して血栓量を減少させ、高用量は実質的に完全に血栓形成を防止した。さらに、低用量の高ＩＸ因子ｍＡｂとＡＳＡとの組み合わせは、凝固インデックスに悪影響を及ぼさずに頸動脈閉塞を完全に防止する方法であるが、血栓形成を完全に防止した。
ラット頸動脈血栓症モデルにおいて実施された実験は、ＩＸ因子ｍＡｂの高血栓発生性動脈損傷モデルにおける血栓症の防止を明らかに示す。最も注目すべきことには、ＩＸ因子ｍＡｂの効果は、ａＰＴＴにより規定される所望の抗凝固目的内であることが示された。さらに、現在用いられている標準的抗凝固剤であるヘパリンは、非凝固性血液を生じる程度まで凝固をひどく損なう用量でのみＩＸ因子ｍＡｂに匹敵する効果に達した。興味深いことに、観察されたＡＳＡとヘパリンの共同処置により得られる増強および相乗効果は、ＡＳＡを抗−ＩＸ因子ｍＡｂとともに投与した場合にもみられた。しかしながら、抗血栓および抗凝固効果の両方を増強するヘパリンとＡＳＡの組み合わせと異なり、ＩＸ因子ｍＡｂとＡＳＡの組み合わせは抗血栓効果を増強するが、ｅｘ  ｖｉｖｏ血液凝固パラメータに対しては一貫した影響を及ぼさなかった。併せて考えると、データは、ヘパリン、ＡＳＡまたはヘパリンとＡＳＡの組み合わせと比較して優れたＩＸ因子ｍＡｂの抗血栓症能力を示す。
【００７４】
実施例４
ラット血栓症モデルの走査電子顕微鏡検査法
ラット頸動脈のセグメントをシャム、塩化鉄のみおよび塩化鉄＋６ｍｇ／ｋｇＩＸ因子抗体から、一群につき３個、塩化鉄を適用後１５分で集めた。ホルムアルデヒドで潅流することにより動脈を固定し、損傷部分の上下で結紮した。固定された動脈を脱水し、ヘキサメチルジシラザン中でインキュベートし、デシケーター中で乾燥した。乾燥した動脈を縦に切開し、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）スタブ上におき、金でスパッターコートした。
シャム動脈のＳＥＭにより、本質的に正常な内皮は血小板がほとんど散乱していないことが明らかになった。内皮にいくつかの切れ目があり、これはおそらく手術中の機械的損傷の結果で、その下にある基底膜が一面血小板により覆われていた。シャムラットにおいては血栓形成の証拠は観察されなかった。
塩化鉄で処置した動脈のＳＥＭにより、大きな壁面の血栓が明らかになり、これは血管の管腔の大部分を占めていた。血栓は凝集した血小板、赤血球ならびに無定型および繊維状蛋白物質からなっていた。蛋白物質はフィブリンと一致する。動脈の内皮は大きな血栓によりほとんど不明瞭であった。見えるところは、塩化鉄で処置した部分の上に重なる内皮は多くの接着性血小板および無定型蛋白物質により覆われていた。
ＩＸ因子抗体で処置されたラットから得られた塩化鉄で処置された動脈のＳＥＭにより、血管の管腔は血栓がほとんどないことが明らかになった。塩化鉄で処置された部分に重なる内皮は、甚大な損傷を示し、一部は接着性血小板および血小板凝集物で覆われているが、蛋白物質はほとんどないかまたはなかった。
【００７５】
実施例５
抗−ＩＸ因子ｍＡｂ  ＢＣ２重および軽鎖ｃＤＮＡ配列分析
全ＲＮＡをＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ， ＯＨ）を用いて、製造業者のプロトコルに従って精製した。ＲＮＡをイソプロパノールで沈殿させ、０．５％ＳＤＳ中に溶解させ、０．５Ｍ  ＮａＣｌで調節した。ポリＡ＋ＲＮＡをＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５（Ｄｙｎａｌ Ａ． Ｓ．， Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ， ＮＹ）で、製造業者のプロトコルに従って単離した。ポリＡ＋ＲＮＡをビーズから溶出させ、ＴＥ緩衝液中に再懸濁させた。１００ｎｇのＲＮＡの１２アリコートを製造業者の指示（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃａｔ． Ｎｏ． １４８３−１８８）によりＲＴ−ＰＣＲキットでプライミングのためのｄＴ  ｏｌｉｇｏを用いて逆転写した。重鎖について、６ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＰＣＲ増幅を、ネズミＩｇＧ２ａヒンジプライマー（配列番号１）および重鎖シグナル配列プライマー（配列番号２）を用いて２５サイクル行った。同様に、軽鎖について、６ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＰＣＲ増幅を、ネズミカッパプライマー（配列番号３）および縮重軽鎖シグナル配列プライマー（配列番号４）を用いて２５サイクル行った。１２回の増幅のそれぞれから得られたＰＣＲ産物を、ＰＣＲ２０００ベクター（ＴＡクローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｋ２０００−０１）中に結紮した。組換えクローンのコロニーをランダムに選び出し、プラスミドＤＮＡのミニ調製物を、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ Ｄｏｌｙ ｉｎ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ７， １５１３ （１９７９）により記載されているアルカリ抽出法を用いて調製した。単離されたプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、０．８％アガロースゲル上で分析した。適当な大きさ、すなわち重鎖については約７００ｂｐ、軽鎖については約７００ｂｐの二本鎖ｃＤＮＡ挿入物をＳａｎｇｅｒ法の変法により配列化させた。全１２の重および軽鎖の配列を比較して、コンセンサスＢＣ２重鎖可変領域配列（配列番号５）およびコンセンサスＢＣ２軽鎖可変領域配列（配列番号６）を得た。
ＢＣ２重鎖可変領域ｃＤＮＡの配列分析により、１２１のアミノ酸配列（配列番号７）をコードする３６３のヌクレオチドオープンリーディングフレームが明らかになった。重鎖ＣＤＲ１、２および３配列をそれぞれ配列番号８、９および１０に示す。
ＢＣ２軽鎖可変領域ｃＤＮＡの配列分析により、１０７のアミノ酸配列（配列番号１１）をコードする３２１のヌクレオチドオープンリーディングフレームが明らかになった。軽鎖ＣＤＲ１、２および３配列をそれぞれ配列番号１２、１３および１４に示す。
【００７６】
実施例６
ヒト化抗体
ＳＢ２４９４１３、ＳＢ２４９４１５、ＳＢ２４９４１６、ＳＢ２４９４１７、ＳＢ２５７７３１およびＳＢ２５７７３２と称する６のヒト化抗体を、ヒト抗体フレームワーク中に前記のネズミＣＤＲを含むように設計した。
ＳＢ２４９４１３
ＳＢ２４９４１３は重鎖Ｆ９ＨＺＨＣ１−０および軽鎖Ｆ９ＨＺＬＣ１−０を含む。合成可変領域ヒト化重鎖Ｆ９ＨＺＨＣ１−０は、免疫グロブリンＲＦ−ＴＳ３’ＣＬ（Ｃａｐｒａ， Ｊ．Ｄ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８６， １３２０−１３２８ （１９９０）、ＫａｂａｔデータベースにおいてＫａｂｐｒｏ：Ｈｈｃ１０ｗと同定）から得られた重鎖の最初の３つのフレームワーク領域およびすでに記載されたＢＣ２重鎖ＣＤＲを用いて設計された。ＣＤＲ提示に影響を及ぼし得るフレームワークアミノ酸置換は生じなかった。４のオーバーラップする合成オリゴヌクレオチドが生じ（配列番号１５、１６、１７および１８）、これはアニールされ、拡張された場合、ＣＤＲ３（配列番号１９および２０）を含む重鎖可変領域を表すアミノ酸をコードする。この合成遺伝子を次にＰＣＲプライマー（配列番号２１および２２）を用いて増幅し、ｐＣＲ２０００ベクター（ＴＡクローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｋ２０００−０１）中に結紮し、ＳｐｅＩ、ＫｐｎＩ制限消化物から単離した。可変領域（配列番号２３および２４）の最初の５個のアミノ酸を含むｃａｍｐａｔｈシグナル配列をコードする第二のＤＮＡフラグメントを、ヒト化抗呼吸器合胞体ウイルス重鎖（配列番号２５）をコードする構築物の適当な領域を２のプライマー（配列番号２６および２７）でＰＣＲ増幅させ、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩで消化することにより調製した。生じた２つのフラグメントを、残りのヒトコンセンサスフレームワーク４およびＩｇＧ１定常領域を含むＥｃｏＲ１、ＫｐｎＩ消化されたｐＦＨＺＨＣ２−６ｐＣＤ哺乳動物細胞発現ベクター中に結紮した。ベクターは公開国際特許出願番号ＷＯ９４／０５６９０に記載されているｐＦＨＺＨＣ２−３ｐＣＤベクターの１つのアミノ酸変異を含んでいた。ｐＦＨＺＨＣ２−３ｐＣＤをＸｂａＩおよびＥｃｏＲ５で消化し、２つの合成オリゴヌクレオチド（配列番号２８および２９）から生じたリンカーを挿入することにより、フレームワーク２の最終残基（残基４９）をＳｅｒからＡｌａに突然変異させた。Ｆ９ＨＺＨＣ１−０挿入物の配列を配列番号３０および３１に示す。
合成可変領域ヒト化軽鎖Ｆ９ＨＺＬＣ１−０を、免疫グロブリンＬＳ８’ＣＬ（Ｃａｒｍａｃｋら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６９， １６３１−１６４３ （１９８９）、ＫａｔｂａｔデータベースにおいてＫａｂｐｒｏ：Ｈｋ１３１８と同定）から得られたヒト軽鎖のフレームワーク領域およびすでに記載されたＢＣ２軽鎖ＣＤＲを用いて設計した。ＣＤＲ提示に影響を及ぼし得るフレームワークアミノ酸置換は生じなかった。２つのオーバーラップする合成オリゴヌクレオチドが生じ（配列番号３２および３３）、これはアニールされ、拡張された場合に、軽鎖可変領域（配列番号３４および３５）を表すアミノ酸をコードする。この合成遺伝子を次にＰＣＲプライマー（配列番号３６および３７）を用いて増幅し、ｐＣＲ２０００ベクター（ＴＡクローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｋ２０００−０１）中に結紮し、ＳｃａＩ、ＳｃａＩＩ制限消化物から単離した。可変領域の最初の２個のアミノ酸（配列番号３８および３９）を含むｃａｍｐａｔｈシグナル配列をコードする第二のＤＮＡ配列フラグメントを、ヒト化抗呼吸器合胞体ウイルス重鎖（配列番号２５）をコードする構築物の適当な領域を２つのプライマー（配列番号２６および４０）でＰＣＲプライマー増幅し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｃａＩで消化することにより調製した。生じた２つのフラグメントを、残りのヒトフレームワーク４およびカッパ定常領域を含むＥｃｏＲ１、ＳｃａＩＩ消化ｐＦＨｚＬＣ１−２ｐＣＮ哺乳動物細胞発現ベクター中に結紮した。ベクターは、公開国際特許出願番号ＷＯ９４／０５６９０に記載されているｐＦＨＺＬＣ１−１ｐＣＮベクターの１つのアミノ酸突然変異を含んでいた。ｐＦＨＺＬＣ１−ｐＣＮをＳｍａＩおよびＫｐｎ１で消化し、２つの合成オリゴヌクレオチド（配列番号４１および４２）から生じたリンカーを挿入することにより、フレームワーク２残基をＳｅｒからＰｒｏへ突然変異させた。Ｆ９ＨＺＬＣ１−０挿入物の配列を配列番号４３および４４に示す。
【００７７】
ＳＢ２４９４１５
ＳＢ２４９４１５は重鎖Ｆ９ＨＺＨＣ１−１および軽鎖Ｆ９ＨＺＬＣ１−１を含む。これらの重および軽鎖構築物はそれぞれＦ９ＨＺＨＣ１−０およびＦ９ＨＺＬＣ１−０に基づくが、これらはＣＤＲ提示に影響を及ぼし得るフレームワークアミノ酸置換を有する。
Ｆ９ＨＺＨＣ１−１はＣＤＲ提示に影響を及ぼし得る３つのフレームワークアミノ酸置換を有する。２つのオーバーラップする合成オリゴヌクレオチドが生じ（配列番号４５および４６）、これは、アニールされ、拡張された場合に、改変された重鎖可変領域（配列番号４７および４８）の改変された部分を表すアミノ酸をコードする。この合成遺伝子を次にＰＣＲプライマー（配列番号４９および５０）を用いて増幅し、ｐＣＲ２０００ベクター（ＴＡクローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｋ２０００−０１）中に結紮し、ＥｃｏＮＩ、ＫｐｎＩ制限消化物から単離した。このフラグメントをＥｃｏＮＩ、ＫｐｎＩ消化Ｆ９ＨＺＨＣ１−０（配列番号３０）ベクター中に結紮した。Ｆ９ＨＺＨＣ１−１挿入物の配列を配列番号５１および５２に示す。
Ｆ９ＨＺＬＣ１−１は、ＣＤＲ提示に影響を及ぼし得る４つのフレームワークアミノ酸置換を有する。２つの合成オリゴヌクレオチドが生じ（配列番号５３および５４）、これはアニールされた場合に、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ付着末端を有し、軽鎖可変領域（配列番号５５）の改変された部分を表すアミノ酸をコードする。Ｆ９ＨＺＬＣ１−０（配列番号４３）を制限酵素ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで消化し、合成ＤＮＡ配列と結紮した。Ｆ９ＨＺＬＣ１−１挿入物の配列を配列番号５６および５７に示す。
【００７８】
ＳＢ２４９４１６
ＳＢ２４９４１６は重鎖Ｆ９ＨＺＨＣ１−１（前記）（配列番号５２）および軽鎖Ｆ９ＨＺＬＣ１−２を含む。軽鎖構造はＦ９ＨＺＬＣ１−１に基づくが、これはＣＤＲ提示に影響を及ぼし得るもう一つのフレームワークアミン酸置換を有する。
２つの合成オリゴヌクレオチドが生じ（配列番号５８および５９）、これらは、アニールされた場合にＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ付着末端を有し、軽鎖可変領域（配列番号６０）の改変された部分を表すアミノ酸をコードする。Ｆ９ＨＺＬＣ１−１（配列番号５６）ベクターを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、合成ＤＮＡと結紮した。Ｆ９ＨＺＬＣ１−２挿入物の配列を、配列番号６１および６２に示す。
【００７９】
ＳＢ２４９４１７
ＳＢ２４９４１７は重鎖Ｆ９ＨＺＨＣ１−１（前記）（配列番号５２）および軽鎖Ｆ９ＨＺＬＣ２−０を含む。Ｆ９ＨＺＬＣ２−０合成可変領域ヒト化軽鎖を、免疫グロブリンＲＥＩ（Ｐａｌｍ ａｎｄ Ｈｉｌｓｃｈｅｍａｎｎ， Ｚ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ３５４， １６５１−１６５４ （１９７３）   ＫａｂａｔデータベースにおいてＫａｂｐｒｏ：ＨＫＬ１１１と同定）から得られるヒト軽鎖のフレームワーク領域およびすでに記載したＢＣ２軽鎖ＣＤＲを用いて設計した。５のアミノ酸コンセンサスヒト置換を導入した。ＣＤＲ提示に影響を及ぼし得る６のフレームワークアミノ酸ネズミ置換が生じた。２のオーバーラップする合成オリゴヌクレオチドが生じ（配列番号６３および６４）、これは、アニールされ、拡張された場合に、軽鎖可変領域（配列番号６５および６６）を表すアミノ酸をコードする。この合成遺伝子を次にＰＣＲプライマー（配列番号６７および６８）を用いて増幅し、ｐＣＲ２０００ベクター（ＴＡクローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｋ２０００−０１）中に結紮し、ＳｃａＩ、ＳｃａＩＩ制限消化物から単離した。可変領域（配列番号３８）の最初の２個のアミノ酸を含むｃａｍｐａｔｈシグナル配列をコードする第二のＤＮＡフラグメントを、抗呼吸器合胞体ウイルス重鎖（配列番号２５）をコードする構築物の適当な領域を２つのプライマー（配列番号２６および６９）でＰＣＲ増幅し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｃａＩで消化することにより調製した。２つの合成オリゴヌクレオチド（配列番号７１および７２）をアニールすることにより、ヒトフレームワーク４（配列番号７０）の残りをコードし、ＳｃａＩＩおよびＮａｒＩ付着末端を有する第三のＤＮＡフラグメントが生じた。Ｆ９ＨＺＬＣ１−０（配列番号４３）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮａｒＩで消化し、３のＤＮＡフラグメントと結紮した。Ｆ９ＨＺＬＣ２−０挿入物の配列を配列番号７３および７４に示す。
【００８０】
ＳＢ２５７７３１
ＳＢ２５７７３１は重鎖Ｆ９ＨＺＨＣ１−１（配列番号５２）および軽鎖Ｆ９ＨＺＬＣ１−３、Ｆ９ＨＺＬＣ１−２（配列番号６２）の一つのアミノ酸突然変異を含む。Ｆ９ＨＺＬＣ１−２を２つのプライマー（配列番号２６および６９）でＰＣＲ増幅し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｃａＩで消化した。９４ｂｐフラグメント（配列番号７５および７６）を単離した。フラグメントをＥｃｏＲＩ、ＳｃａＩ消化されたＦ９ＨＺＬＣ１−２ベクター中に結紮して、軽鎖構築物Ｆ９ＨＺＬＣ１−３を得た。Ｆ９ＨＺＬＣ１−３挿入物の配列を配列番号７７および７８に示す。
【００８１】
ＳＢ２５７７３２
ＳＢ２５７７３２は、合成可変領域ヒト化重鎖Ｆ９ＨＺＨＣ３−０および軽鎖Ｆ９ＨＺＬＣ３−０を含む。４の重複する合成オリゴヌクレオチドが生じ（配列番号７９、８０、８１および８２）、これは、アニールされ、拡張された場合に、変更される重鎖可変領域（配列番号８３および８４）を表すアミノ酸をコードする。この合成遺伝子を次にＰＣＲプライマー（配列番号８５および８６）を用いて増幅し、ｐＣＲ２０００ベクター（ＴＡクローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｋ２０００−０１）中に結紮し、ＳｔｕＩ、ＫｐｎＩ制限消化物から単離した。単離されたフラグメントをＳｔｕＩ、ＫｐｎＩ消化Ｆ９ＨＺＨＣ１−１（配列番号５２）ベクター中に結紮した。このベクターを次にＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩで消化して、シグナル配列を除去した。可変領域の最初の５のアミノ酸を含むｃａｍｐａｔｈシグナル配列（配列番号２３）をコードするＤＮＡ配列フラグメントを、Ｆ９ＨＺＨＣ１−０の２つのプライマー（配列番号２６および８７）でＰＣＲ増幅し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩで消化することにより調製した。生じたフラグメントをベクター中に結紮した。Ｆ９ＨＺＨＣ３−０挿入物の配列を配列番号８８および８９に示す。
【００８２】
４のオーバーラップする合成オリゴヌクレオチドが生じ（配列番号９０、９１、９２および９３）、これは、アニールし、拡張された場合に、軽鎖可変領域（配列番号９４および９５）を表すアミノ酸をコードする。この合成遺伝子を次にＰＣＲプライマー（配列番号９６および９７）を用いて増幅し、ｐＣＲ２０００ベクター（ＴＡクローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｋ２０００−０１）中に結紮し、ＳｃａＩ、ＮａｒＩ制限消化物から単離した。単離されたフラグメントをＳｃａＩ、ＮａｒＩ消化Ｆ９ＨＺＬＣ１−３（配列番号７７）ベクター中に結紮した。Ｆ９ＨＺＬＣ３−０挿入物の配列を配列番号９８および９９に示す。
ヒト化抗−ＩＸ因子ｍＡｂをＣＨＯ細胞中で発現させた。無血清培地中で懸濁増殖に適したＤＧ−４４細胞系を、Ｉｎｎｏｖａ２１０プラットホームシェーカー（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で１５０ｒｐｍ、３７℃で、５％ＣＯ２、９５％空気加湿インキュベーター中で、２５０ｍｌの使い捨て滅菌三角フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で１Ｘヌクレオシドおよび０．０５％Ｆ６８を含む１００ｍｌの無蛋白培地中で増殖させた。これらの細胞を４×１０５細胞／ｍｌで毎週２回継代した。それぞれ１５ｕｇのｐＣＮ−Ｌｃ−軽鎖およびｐＣＤ−Ｈｃ−重鎖ベクターをＮｏｔ１での消化により直線化し、無菌条件下で共沈殿させ、５０ｕｌの１Ｘ  ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中に再懸濁させた。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてＤＮＡをＡｃｃ−９８細胞中にＨｅｎｓｌｅｙ ら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９， ２３９４９−２３９５８ （１９９４））の技術を用いて電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｅ）した。１．２×１０７細胞を１２．５ｍｌの氷冷ＰＢＳｕｃｒｏｓｅ（ＰＢＳ、２７２ｍＭシュークロース、７ｍＭリン酸ナトリウム  ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で１回洗浄し、０．８ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させ、５０ｕｌのＤＮＡ溶液に添加し、氷上で１５分間インキュベートした。細胞を３８０Ｖ、２５マイクロファラドでパルスし、次に氷上で１０分間インキュベートした。細胞を維持培地中５×１０５細胞／プレートで９６ウェル培養プレート中に２４時間選択前に平板培養した。細胞を維持培地中、４００ｕｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）に対する耐性について選択した。アッセイの２４時間前に、細胞に１５０ｕｌの維持培地を供給した。
【００８３】
各コロニーから得た順化培地を、電気化学発光（ＥＣＬ）検出法を用いてＯｒｉｇｅｎアナライザー（ＩＧＥＮ， Ｉｎｃ．）で分析した。Ｙａｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １２， １９３−１９４ （１９９４）を参照のこと。
アッセイを行うために必要な溶液（アッセイ緩衝液）およびアナライザーの操作に必要な溶液（セルクリーナー）はすべてＩＧＥＮから入手した。抗体（抗ヒトＩｇＧ（ｇ−鎖特異性）、Ｓｉｇｍａ ＣｈｅｍｉｃａｌおよびヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するＦ（ａｂ’）２フラグメント、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）をＴＡＧ：ＮＨＳ−エステル（ＩＧＥＮ， Ｉｎｃ．）でＴＡＧ：蛋白＝７：１（モル比）で標識し、一方、プロテインＡ（Ｓｉｇｍａ）をビオチン−ＬＣ−スルホ−ＮＨＳ−エステル（ＩＧＥＮ， Ｉｎｃ．）でビオチン：蛋白＝２０：１（モル比）で標識し、両方ともＩＧＥＮの推奨基準に従った。ストレプトアビジンコートされた磁気ビーズ（Ｍ−２８０）をＤｙｎａｌから入手した。
【００８４】
次のプロトコルを用いてイムノアッセイを行った：サンプルにつき、５０ｕｌのストレプトアビジン−コートされたビーズ（最終濃度６００ｕｇ／ｍｌ  ＰＢＳ中希釈、ｐＨ７．８、１．２５％Ｔｗｅｅｎを含む）を５０ｕｌのビオチン−プロテインＡ（最終濃度１ｕｌ／ＰＢＳ中希釈、ｐＨ７．８、１．２５％Ｔｗｅｅｎを含む）と混合し、室温で１５分間撹拌しながらインキュベートし、５０ｕｌのＴＡＧ抗体（最終濃度１．２５ｕｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するＦ（ａｂ’）２フラグメントおよび０．２５ｕｇ／ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．８、１．２５％Ｔｗｅｅｎを含む）中に希釈した抗ヒトＩｇＧ（ｇ−鎖特異性）との混合物）を添加し、溶液を次に５０ｕｌの順化培地に添加し、撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。２００ｕｌのアッセイ緩衝液を反応ミックスに添加し、サンプルをＯｒｉｇｅｎ  Ｉアナライザーで分析して、ＥＣＬを測定した。結果から、分析したコロニーの約２０〜３７％が１５ｎｇ／ｍｌを越える抗体を分泌し、平均的発現は約１５０ｎｇ／ｍｌであることがわかった。
【００８５】
ＰｒｏｃｅｐＡ捕捉工程を用いてヒト化抗−ＩＸ因子ｍＡｂを順化培地から精製し、続いてイオン交換クロマトグラフィーを行い、ＤＮＡ負荷を軽減した。ＰｒｏｃｅｐＡ吸着物質（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｌｔｄ．， Ｄｕｒｈａｍ， Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて、直径：高さ比が１：１のカラムを調製した。透明化順化培地を１５０ｃｍ／時でカラムにかけた。カラムを連続して、リン酸塩緩衝塩溶液（ＰＢＳ）、１Ｍ  ＮａＣｌを含有するＰＢＳ、および最終的にＰＢＳで洗浄した。結合物質を０．１Ｍ酢酸溶出で回収した。溶出液をｐＨ５．５に調節し、水で希釈した（１：４）。希釈された溶液を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５で前平衡化したＳ−セファロースカラム（２．５×１３ｃｍ）上に８０ｃｍ／時でかけた。カラムを酢酸塩緩衝液で一定のベースラインが得られるまで洗浄し、結合した蛋白を２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）で２５ｃｍ／時で溶出させた。溶出した物質を０．４ミクロン膜で濾過し、４℃で貯蔵した。
【００８６】
実施例７
マウス−ヒトキメラ抗体
１００ｎｇのＢＣ２  ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲキットで製造業者の指示に従い（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃａｔ． Ｎｏ． １４８３−１８８）、プライマーのためにｄＴ  ｏｌｉｇｏを用いて逆転写し、合成ＳｃａＩ（配列番号１００）およびＮａｒＩ（配列番号１０１）プライマーを用いてＰＣＲプライマー増幅して、Ｓｃａ１、Ｎａｒ１末端（配列番号１０２および１０３）を有するＢＣ２軽鎖可変領域を得た。このＤＮＡ配列をＳｃａＩ、ＮａｒＩ消化されたＦ９ＨＺＨＣ１−３（配列番号７７）中に結紮し、ＳｃａＩ、ＮａｒＩで消化して、マウス−ヒトキメラ軽鎖Ｆ９ＣＨＬＣ（配列番号１０４および１０５）を得た。
１００ｎｇのＢＣ２  ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲキットで製造業者の指示に従い（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃａｔ． Ｎｏ． １４８３−１８８）、プライマーのためにｄＴ  ｏｌｉｇｏを用いて逆転写し、合成ＳｐｅＩ（配列番号１０６）およびＮｈｅＩ（配列番号１０７）プライマーでＰＣＲプライマー増幅して、Ｓｐｅ１、Ｎｈｅ１末端（配列番号１０２および１０３）を有するＢＣ２重鎖可変領域を得た。ｃａｍｐａｔｈシグナル配列をＲＳＶＨＺ１９重鎖（配列番号２５）からＥｃｏＲＩ（配列番号２６）およびＳｐｅＩ（配列番号８７）プライマーでＰＣＲ増幅した。これらの２つのＤＮＡフラグメントを、公開国際特許出願番号ＷＯ９５／０７３０１に記載されたＥｃｏＲＩ、ＮｈｅＩ消化されたＩＬ４ＣＨＨＣｐｃｄベクター（ＩＬ４可変領域をＢＣ２ＩＸ因子マウス可変領域で置換）中に結紮して、マウス−ヒトキメラ重鎖Ｆ９ＣＨＨＣ（配列番号１１０および１１１）を得た。
１０４および１０５）を得た。
マウス−ヒトキメラ抗体ｃｈαＦＩＸの同時形質導入をヒト化構築物に関してすでに記載したようにして行った。
【００８７】
実施例８
ラット血栓症モデルにおけるＩＸ因子ｍＡｂの効果
ヒト化抗−ＩＸ因子抗体の動脈血栓症の防止における効果を評価するために、実施例３に記載したラット頸動脈血栓症モデルを使用した。ベースラインパラメータを頸動脈血流、動脈圧、心拍数、血管開放性および活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）について確立した。１５分後、頸動脈損傷を１０分間行った。パラメータを頸動脈損傷開始後６０分で測定した。頸動脈血栓を頸動脈から取り出し、秤量した。
すべての試薬を頸動脈損傷開始の１５分前に静脈内投与した。次の処置を調べ、抗−ＩＸ因子ｍＡｂ  ＢＣ２と比較した。
１．ビヒクル
２．ｃｈαＦＩＸ：３ｍｇ／ｋｇボーラス
３．ＳＢ２４９４１３：３ｍｇ／ｋｇボーラス
４．ＳＢ２４９４１５：３ｍｇ／ｋｇボーラス
５．ＳＢ２４９４１６：３ｍｇ／ｋｇボーラス
６．ＳＢ２４９４１７：３ｍｇ／ｋｇボーラス
７．ＳＢ２５７７３１：３ｍｇ／ｋｇボーラス
８．ヘパリン：６０単位／ｋｇボーラス＋２単位／ｋｇ／分注入
【００８８】
ａＰＴＴを、実験において使用した抗凝固剤／血栓症薬の効果対出血傾向の評価の一次基準として使用した。図８における結果は、ヒト化ＩＸ因子ｍＡｂ  ＳＢ２４９４１３、ＳＢ２４９４１５、ＳＢ２４９４１６、ＳＢ２４９４１７およびＳＢ２５７７３１は３．０ｍｇ／ｋｇでａＰＴＴに対して適度の効果を有し、これは臨床的に許容される範囲内であることを示す。
ＩＸ因子ｍＡｂの血栓塊に対する効果を図９に示す。結果は、ヒト化ｍＡｂはすべて血栓塊を減少させるのに等しく有効であることを示す。
ラット頸動脈血栓症モデルにおいて行った実験は、高血栓発生性動脈損傷モデルにおけるヒト化ＩＸ因子ｍＡｂの血栓症防止における効果を示す。最も注目すべきことは、ヒト化抗−ＩＸ因子ｍＡｂのすべての効果は、ａＰＴＴにより定義される所望の治療的抗凝固目的内にあることが示された。
【００８９】
実施例９
抗体の生化学的および生物物理学的性質
ＳＢ２４９４１７の分子量をＭＡＬＤ−ＭＳで測定すると１４８０００Ｄａであった。ＳＢ２４９４１７の超遠心分析により同じ値が得られた。ＩＸ因子＋Ｃａ２＋の存在下で、ＢＣ２から得られる抗体はｍＡｂと２分子のＩＸ因子の合計量に対応する２４８０００Ｄａの塊で沈降した。より高次の凝集物の証拠はＩＸ因子の存在下または非存在下で観察されなかった。
ＳＢ２４９４１７と結合するＩＸ因子の速度論を、固定化プロテインＡ表面に結合した抗体でのＢＩＡｃｏｒｅ分析により評価した。４９ｎＭの組換えヒトＩＸ因子（ｒｈＦＩＸ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用い、測定を５ｍＭ  Ｃａ２＋の存在下で行った。相互作用は、急速な会合、ｋａｓｓ＝２．０×１０５Ｍ−１ｓ−１および比較的遅いオフ速度、ｋｄｉｓｓ＝４．１×１０−４ｓ−１により特徴づけられた。ＩＸ因子結合のＫｄの計算値は１．９ｎＭであった。
表１にＳＢ２４９４１７の生物物理学的性質をまとめる。
【００９０】
【表２】
2004516236.tif 000003
【００９１】
表２に本発明のｍＡｂのＩＸ因子結合特性をまとめる。計算された解離定数は実験誤差の範囲内で本質的に同一であった。
【００９２】
【表３】
2004516236.tif 000004
【００９３】
ｒｈＦＩＸとＳＢ２４９４１７、ＢＣ２と他のヒト化構築物間の相互作用を、結合の固有熱から溶液中の結合相互作用を測定する滴定ミクロ熱量測定により特徴づけた。１０６ｕＭのＦＩＸを、２ｕＭ  ｍＡｂ  ＳＢ２４９４１７を含むカロリーメーター中に９回注入した。結合を最初の４回に注入において発熱として検出した。後の５回の注入で、ｍＡｂ結合部位がＦＩＸで飽和され、混合物のバックグラウンド熱だけが観察された。結果は、予想されるように、ｍＡｂにつき略２のＦＩＸのモル結合比で当量点が生じることがわかった。データの非線形最小二乗分析により結合親和性が得られる。
【００９４】
ｍＡｂのｒｈＦＩＸ親和性を３４〜４４℃の温度範囲にわたって、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中で測定した。これらのデータから、３７℃での親和性を直接測定でき、２５℃での親和性がｖａｎ’ｔ Ｈｏｆｆ式から計算できる。表３におけるデータは、ＳＢ２４９４１７、ＢＣ２およびその他のヒト化構築物の親和性が誤差内（ファクター２）で同一であることを示す。
【００９５】
【表４】
2004516236.tif 000005
【００９６】
ｍＡｂ  ＳＢ２４９４１３、ＳＢ２４９４１５、ＳＢ２４９４１７およびＳＢ２５７７３２はすべて示差走査熱分析により非常に類似した熱安定性を示した。そのアンフォールディングＴｍｓは７０〜７５℃の範囲であり、熱により誘発される変性に対して高度に安定性であることを示す。
【００９７】
実施例１０
ＩＸ因子の抗体により媒介される阻害の機構
ホモローガスな蛋白ＶＩＩ因子のフレームワーク中にスプライシングされたＩＸ因子の配列からなるキメラ構築物のライブラリーを構築し、ＩＸ因子ＢＣ２  ｍＡｂのエピトープをマップするために使用した。Ｃｈｅｕｎｇら、Ｔｈｒｏｍｂ． Ｒｅｓ． ８０， ４１９−４２７ （１９９５）を参照のこと。ＢｉａＣｏｒｅ２０００表面プラズモン共鳴装置を用いて結合を測定した。ＮＨＳ／ＥＤＣ反応を用いてＢＣ２抗体をチップに直接結合させた。結合を２分の接触時間により２０ｕＬ／分で、２５ｍＭ  ＭＯＰＳ、Ｈ７．４、０．１５  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２中、それぞれ２００ｎＭの所定の構築物で測定した。同じ緩衝液で蛋白を含まないものを用いて解離を３分間モニターした。５０ｍＭ  ＥＤＴＡの存在下で野生型構築物について結合は検出されなかった。結果を表４に示す。
【００９８】
【表５】
2004516236.tif 000006
【００９９】
これらのデータから、ＩＸ因子軽鎖およびＶＩＩ因子重鎖（ＩＸ  ＬＣ／ＶＩＩ  ＨＣ）；ＩＸ因子ｇｌａおよび芳香族スタックドメイン（ＩＸ−Ａ／ＶＩＩ）；ＶＩＩ因子ｇｌａドメイン内のＩＸ因子ｇｌａドメインの３−１１残基（ＶＩＩ  ｇｌａ（ＩＸ３−１１）／ＩＸ）；および残基５でリシンからアラニンへの置換を有するＩＸ因子（ＩＸ  ５ＫＡ）を含む構築物はＢＣに対する結合を示すことがわかる。ＶＩＩ  ｇｌａ（ＩＸ３−１１）／ＩＸ構築物は、野生型ＩＸ因子（血漿ＩＸａおよびｒ−ＩＸ）と同等のＢＣ２結合を示した。従って、ＢＣ２抗体はＩＸ因子ｇｌａドメインの３−１１残基内に含まれるエピトープと結合する。
【０１００】
実施例１１
動脈血栓症の抗−ＩＸ因子抗体および組織型プラスミノーゲンアクチベーターでの処置
動脈を完全に閉塞させた後にｔＰＡの投与（補助的治療を伴うかまたは伴わない）を開始した。動脈中の血流を連続してモニターした。
オスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ， Ｒａｌｅｉｇｈ， ＮＣ）（体重３００〜４９０グラム）をペントバルビタールナトリウムで麻酔した（５５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）。ラットを加熱された（３７℃）手術板上に仰向けに寝かせ、首を切開し；気管を取り出し、ＰＥ−２４０Ｉｎｔｒａｍｅｄｉｃチューブでカニューレ挿入した。左の頸動脈および頸静脈を次に取り出した。血流を測定するために、パラフィルムＭシート（４ｍｍ２、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎ）を頸動脈の下に置き、電磁気血流プローブ（Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ）を動脈上においた。薬剤投与のために、カニューレ（Ｔｙｇｏｎ、０．０２”×０．０４”、Ｎｏｒｔｏｎ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｐｌａｓｔｉｃｓ）を頸静脈内に挿入した。左大腿動脈を次に取り出し、血圧の測定および血液サンプルを集めるためにカニューレを挿入した。
【０１０１】
実施例３に記載したように血流プローブから下流の頸動脈上に１０分間おいた直径６．５ｍｍのＦｅＣｌ３溶液（５０％）で飽和させたガラス製ミクロフィルターペーパーの円状パッチを用いて頸動脈における血栓症を開始させた。このよく特徴づけられたモデルにおいて、血栓形成は通常１５分以内に完了する。
抗−ＩＸ因子抗体、ＳＢ２４９４１５をｔＰＡ（Ｇｅｎｅｔｉｃ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ， ＣＡ）との組み合わせにおいてボーラスとして投与し、一方、ヘパリン（Ｅｌｋｉｎｓ−Ｓｉｎｎ Ｉｎｃ．， Ｃｈｅｒｒｙ Ｈｉｌｌ， ＮＪ）をボーラスとして投与し、その後注入した。すべての薬剤注入は実験期間の最後まで−血管閉塞時から６０分、継続した。血液サンプル（１ｍＬ）をａＰＴＴおよびＰＴアッセイのために、０、３０および６０分（実験の最後）で大腿動脈から３．８％クエン酸塩溶液中に集め、遠心分離した。ａＰＴＴおよびプロトロンビン時間（ＰＴ）をフィブロメーター（ＢＢ１Ｌ， Ｂａｘｔｅｒ Ｄａｄｅ またはＭＬＡ Ｅｌｅｃｔｒａ ８００ Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅｒ）により標準的方法でモニターした。実験の最後に、血栓を頸動脈から抽出し、秤量した。
【０１０２】
すべてのデータは、各グループにおけるラットの表示された数についての平均グループ値±ＳＥＭとして表す。複数比較のためのＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｏｎｉ試験をグループ間分析に用い、ｐ＜０．０５を有意とした。
閉塞性血栓の形成は、ＦｅＣｌ３処置されたパッチをラット頸動脈に適用することにより頸動脈損傷を開始した後略１５分で起こった。図１０に示すように、ｔＰＡ単独では、閉塞された血管の再潅流は、９ｍｇ／ｋｇの量のｔＰＡを投与した後にのみ観察され、処置された血管の６７％が６０分のプロトコル中に血流を回復した。このｔＰＡの用量で、６０Ｕ／ｋｇヘパリンまたは３ｍｇ／ｋｇ抗−ＩＸ因子抗体ＳＢ２４９４１５を含めることにより、さらに再潅流の発生率は増大せず、このことはＦｅＣｌ３損傷モデルにおいて約３０％の血栓は溶解しにくいことを示唆する。
【０１０３】
図１０に示す結果は、低用量のｔＰＡでは、再潅流の発生率は、どの抗凝固剤が血栓溶解剤と同時投与されるかに非常に依存することを示す。６０Ｕ／ｋｇのヘパリンを投与する場合、再潅流を示す血管のパーセンテージは劇的に減少し、３および６ｍｇ／ｋｇのｔＰＡについて、それぞれわずか１２．５％および４０％の再潅流しか観察されなかった。しかしながら、３ｍｇ／ｋｇのＳＢ２４９４１５をｔＰＡと同時投与すると、３ｍｇ／ｋｇのｔＰＡでの再潅流の６０％以上、６ｍｇ／ｋｇのｔＰＡ用量での再潅流の７９％以上を達成した。このように、抗−ＩＸ因子抗体は血栓溶解用量応答曲線を著しくシフトさせ、低用量の血栓溶解剤での再潅流を可能にする。
【０１０４】
血栓溶解および血塊形成は動的プロセスであり、開放とそれに続く再閉塞の期間が観察される場合があった。頸動脈血流を６０分の実験プロトコル中連続してモニターしたので、頸動脈開放の合計時間を定量化することも可能であった。図１１に示すように、血管開放の合計期間は、３ｍｇ／ｋｇの抗−ＩＸ因子抗体＋ｔＰＡの組み合わせにより実質的に増大する。これはｔＰＡの最低量および中程度の量、それぞれ３および６ｍｇ／ｋｇで明らかである。６０Ｕ／ｋｇのヘパリン＋３ｍｇ／ｋｇのｔＰＡの組み合わせについて７．１±７．１分であるのに対して、３ｍｇ／ｋｇのＳＢ２４９４１５＋３ｍｇ／ｋｇのｔＰＡの組み合わせた量で合計開放時間は３０．６±９．２分であった。開放時間は３ｍｇ／ｋｇのｔＰＡ単独では０であった。６ｍｇ／ｋｇのｔＰＡの用量で、ヘパリンと同時投与すると、開放時間が非常にわずかに１２．９±６．０分まで増大し、一方、ｔＰＡ−ＳＢ２４９４１５の組合わせは最大開放時間３８．７±８．４分を達成する。ｔＰＡの最高用量（９ｍｇ／ｋｇ）でのみ、ヘパリンの組み合わせとＳＢ２４９４１５で達成される開放時間は近づく（それぞれ３１．９±４．８分および３８．０±８．４分）。
【０１０５】
動脈梗塞後の血流の急速な回復は、虚血組織の損傷を最小限に抑えるために重要である。図１２における結果は、抗−ＩＸ因子抗体とｔＰＡとの組み合わせにより、ｔＰＡ単独またはヘパリン＋ｔＰＡの組み合わせと比較して再潅流までの時間を減少させ、これはより低用量のｔＰＡで達成されることを示す。血栓溶解が３ｍｇ／ｋｇのＳＢ２４９４１５＋３ｍｇ／ｋｇのｔＰＡで行われる場合、血栓溶解までの時間は２９．４±９．２分であった。３ｆｍｇ／ｋｇのｔＰＡ単独では、再潅流は観察されなかった。６０Ｕ／ｋｇヘパリン＋３ｍｇ／ｋｇｔＰＡでは、血栓溶解までの時間は５２．８±７．１分であった。より高用量、６および９ｍｇ／ｋｇのｔＰＡで、抗体＋ｔＰＡ処置法は、それぞれ１９．４±６．３および２０．８±８．７分以内で初期血栓溶解を達成した。添加された抗凝固剤の非存在下で、血栓溶解までの時間は６および９ｍｇ／ｋｇの用量に対してそれぞれ６０分（すなわち、実験プロトコルの限度）および２７．５±６．４分であった。６０Ｕ／ｋｇヘパリンを添加すると、対応する血栓溶解までの時間は、４４．０±７．１および２７．０±４．９分であった。従って、ＳＢ２４９４１５を用いると、ヘパリンまたはｔＰＡ単独を用いるよりもより早い再潅流が常に達成された。
【０１０６】
実施例１２
止血機能に対する抗−ＩＸ因子抗体の効果
抗−ＩＸ因子またはヘパリンの補助剤としての止血機能の維持に対する影響を、ｔＰＡ単独、ｔＰＡ＋ヘパリンおよびｔＰＡ＋ＳＢ２４９４１５で処置したラットにおける治療期間の最後でのフィブリノーゲン、プラスミノーゲンおよびアルファ−２−抗プラスミンのレベルをモニターすることにより測定し、結果をビヒクル処置動物と比較した。図１３において示すように、ｔＰＡの用量が増大すると、測定される止血マーカーのそれぞれのレベルが減少した。アルファ−２−抗プラスミンのレベルはｔＰＡで処置されていない動物において約９０％から、ｔＰＡの用量が９ｍｇ／ｋｇに増大するにつれ約２０％まで減少した。プラスミノーゲンレベルは、ｔＰＡ処置をしない平均約１００％から９ｍｇ／ｋｇ処置群における約４０％まで減少した。同様に、フィブリノーゲンレベルは約１５０ｍｇ／ｄＬから高用量ｔＰＡ群における約９０ｍｇ／ｄＬまで減少した。興味深いことに、補助剤の選択はこれらのマーカーに著しい影響を及ぼさないようである。各ｔＰＡ用量で、同様のレベルのアルファ−２−抗プラスミン、プラスミノーゲンおよびフィブリノーゲンが、ビヒクル、３０または６０Ｕ／ｋｇのヘパリンあるいは１または３ｍｇ／ｋｇＳＢ２４９４１５を投与された動物において観察され；止血マーカーにおいて観察される減少は血栓溶解剤ｔＰＡの用量の関数であり、これらの減少は、特にフィブリノーゲンの場合において、６ｍｇ／ｋｇ以上のｔＰＡ量、すなわち９ｍｇ／ｋｇの高用量群について特に大きいようである。
【０１０７】
異なる治療法の標準ａＰＴＴ凝固アッセイａＰＴＴに対する効果もモニターした（図１４）。ｔＰＡの用量が増大すると、ａＰＴＴはビヒクルおよび９ｍｇ／ｋｇ  ｔＰＡについてそれぞれ１９．３ｓ±０．６ｓから３０．０ｓ±１．６ｓまで増大した。３ｍｇ／ｋｇのＳＢ２４９４１５を投与すると、対照動物のａＰＴＴにおいて４９．６ｓ±６．４ｓまでわずかに増加した。ＳＢ２４９４１５をｔＰＡと同時投与した場合、観察される増加は若干大きく、ｔＰＡの用量によって変わった。ＳＢ２４９４１５と３ｍｇｋｇのｔＰＡとの組み合わせによりａＰＴＴが５８．３ｓ±５．２ｓになり、一方、ＳＢ２４９４１５と９ｍｇ／ｋｇ用量のｔＰＡはａＰＴＴを７７．３ｓ±１９．７ｓまで増大させた。３０Ｕ／ｋｇまたは６０Ｕ／ｋｇの量のヘパリンのいずれかを投与すると、ａＰＴＴが大きく増大した。ｔＰＡなしでは、３０および６０Ｕ／ｋｇの用量についてａＰＴＴはそれぞれ約３００ｓ〜６００ｓまでの範囲であった。ｔＰＡ処置された動物において、ａＰＴＴは約８００ｓであった。
ヘパリンで得られるａＰＴＴの向上は、有効な再潅流を達成するために高用量のｔＰＡが必要なので、特に止血パラメータの摂動と結合した場合に、出血傾向に寄与しやすい。反対に、ＳＢ２４９４１５はａＰＴＴの大きく増大させず、さらに少量のｔＰＡの使用を可能にし、心筋梗塞および発作の血栓溶解療法において著しい利点を提供する。
【０１０８】
実施例１３
ＳＢ２４９４１７は発作における組織型プラスミノーゲンアクチベーターの溶解可能性を増大させる
これらの研究において使用したラット血栓塞栓性発作モデルは、ＢｕｓｃｈらによりＢｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ７７８， １６−２４ （１９９７）において記載されているものと本質的に同じであった。モデルの３つの主な段階は、塞栓の調製、ラットの準備とそれに続く塞栓形成、および薬理学的調査である。
全血をドナーラットからクエン酸塩加ヴァキュテナー管中に抜き取った。クエン酸塩加血（５００ｕｌ）をすぐに１単位のヒトトロンビンと５ｕｌの１Ｍ  ＣａＣｌ２を含む試験管に添加した（最終ＣａＣｌ２濃度１０ｍＭ）。５〜１０秒以内に、このカクテルの少量を長さ約１５ｃｍのＰＥ５０カテーテル中に抜き取り、室温で１時間凝固させた。この期間の最後に、管状血塊をカテーテルから塩溶液で満たしたペトリ皿中に押出し、１．５ｍｍの長さの断片に切り出した。これらの断片（血塊）の１２個を０．０４ｍｇｍｌラットアルブミンを含む塩溶液中に移し、約６０ｕｌの体積でＰＥ５０カテーテル中に戻した。ラット中に塞栓を形成するために血塊をカテーテル中、頭部から尾まで一列に並べた。
【０１０９】
オスＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（体重３５０〜４００ｇ）を、アトロピン（０．５ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与するために手術により準備し、次に５％イソフルランで麻酔し、続いて２％の維持量を投与した。体温を３７〜３８℃に維持した。無菌状態下で、頚部に矢状正中線切開を行い、右総頸動脈（ＣＣＡ）、右内頸動脈（ＩＣＡ）、右外頸動脈（ＥＣＡ）、および翼突口蓋動脈を露出させた。翼突口蓋動脈を縛って血行を止めた。一定長さのＥＣＡを切り離し、次に縛って血行を止め、切断した。ＣＣＡおよびＩＣＡをクランプで締め、血栓を含むＰＥ５０カテーテルをＥＣＡスタンプ中に挿入し、分岐点まで前進させた。ＩＣＡクランプをはずし、血栓をゆっくりとＩＣＡ中に注入し、同時にＣＣＡの留め金をゆるめた。ビヒクル（塩溶液）、ＳＢ２４９４１７（２．０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかおよび／またはｔ−ＰＡ（５．０ｍｇ／ｋｇ）の注入を、尾静脈を通して静脈内により塞栓形成後５分で開始した。ＳＢ２４９４１７を１回ボーラス投与として注入し、一方、５ｍｇ／ｋｇのｔ−ＰＡを１０％ボーラスとして注入し、続いて残りの９０％を３０分かけて注入した。手術による切開を縫合し、ラットを回復させた。
【０１１０】
塞栓形成後２４時間に、ラットを麻酔し、屠殺した。脳を取り出し、前頭極から２ｍｍごとに７の脳横断片を採取した。断片を１％２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド中２０分間インキュベートし、続いてホルマリン固定した。染色した脳断片を写真撮影し、画像分析システム（Ｏｐｔｉｍｕｓ Ｉｎｃ．， Ｂｏｔｈｅｌｌ， Ｗａｓｈ）を用いて分析した。知らされていないオペレーターにより梗塞をコンピュータースクリーン上にトレースすることにより、梗塞の面積（ｍｍ２）を計算した。各処置についての凝集平均梗塞を図１５に示す（対照（ｎ＝２０）、ｔＰＡ（ｎ＝７）およびＳＢ２４９４１７（ｎ＝６））。塞栓後のラットにｔＰＡ（５．０ｍｇ／ｋｇ）を投与することにより、結果として得られる平均梗塞体積において約３３％の減少が起こった。ＳＢ２４９４１７単独の投与により、結果として得られる梗塞体積において約７０％の減少が起こった。ｔＰＡ（５．０ｍｇ／ｋｇ）とＳＢ２４９４１７（２．０ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせはさらに防御を提供し、結果として、平均梗塞体積が約８８％減少した（Ｐ＝０．１２６）。このモデルにおける梗塞は、線条体および新皮質において類似した頻度で起こった。梗塞組織の位置に基づくと、最も頻度の高い閉塞部位は中脳動脈（ＭＣＡ）であるようである。頻度は高くないが、脈絡膜、前および後大脳動脈も時折閉塞したことが示された。冠状断片（省略）により見られるように、治療により起こる梗塞体積の減少のほとんどは中心ＭＣＡ再潅流領分内であった。梗塞組織の分布は、治療後に認知できるほど変化しなかった。
【０１１１】
結果から、抗−ＩＸ因子抗体、例えば、ＳＢ２４９４１７は、塞栓後に投与された場合に、単独療法またはｔＰＡなどの血栓溶解剤の補助剤として使用した場合に、梗塞脳組織の形成を減少させることができることがわかる。抗−ＩＸ因子抗体、例えばＳＢ２４９４１７は血栓塞栓性発作の治療において、単独または血栓溶解剤の補助剤として臨床的有用性を有することが期待される。併用療法により、血栓溶解剤の量を減少させることができ、その後の出血性発作を促進する危険性が減少する。
【０１１２】
本発明はその精神または本質的性質を逸脱することなく他の特別な形態において具体化することができ、従って、前記の明細書ではなく、添付のクレームが本発明の範囲を示すので、これを参照するべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】正常なヒト血漿をネズミ抗−ＩＸ因子ｍＡｂ  ＢＣ１およびＢＣ２で滴定した実験結果をグラフで示す。
【図２】正常なヒト血漿をネズミ抗−ＩＸ因子ｍＡｂ  ９Ｅ４（２）Ｆ４および１１Ｇ４（１）Ｂ９で滴定した実験結果をグラフで示す。
【図３】正常なヒト血漿をネズミ抗−Ｘ因子ｍＡｂ  ＨＦＸＨＣおよびＨＦＸＬＣならびにネズミ抗ＸＩ因子ｍＡｂ  ＨＦＸＩで滴定した実験結果をグラフで示す。
【図４】ラット頸動脈血栓症モデルにおける６０分でのヘパリン、アセチルサリチル酸およびネズミＩＸ因子ｍａｂの活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）に対する効果についての実験結果を柱状グラフで示す。
【図５】ラット頸動脈血栓症モデルにおける６０分でのヘパリン、アセチルサリチル酸およびネズミＩＸ因子ｍａｂのプロトロンビン時間に対する効果についての実験結果を柱状グラフで示す。
【図６】ラット頸動脈血栓症モデルにおける、頸動脈流の閉塞に対するヘパリン、アセチルサリチル酸およびネズミＩＸ因子ｍａｂの効果についての実験結果を柱状グラフで示す。
【図７】ラット頸動脈血栓症モデルにおける血栓重量に対するヘパリン、アセチルサリチル酸およびネズミＩＸ因子ｍａｂの効果についての実験結果を柱状グラフで示す。
【図８】ラット頸動脈血栓症モデルにおける６０分でのヘパリン、ネズミＩＸ因子ｍａｂ  ＢＣ２、キメラＩＸ因子ｍａｂおよびヒト化ＩＸ因子ｍＡｂのａＰＴＴに対する効果についての実験結果を柱状グラフで示す。
【図９】ラット頸動脈血栓症モデルにおけるヘパリン、ネズミＩＸ因子ｍａｂ  ＢＣ２、キメラＩＸ因子ｍａｂおよびヒト化ＩＸ因子ｍＡｂの血栓重量に対する効果についての実験結果を柱状グラフで示す。
【図１０】抗−ＩＸ因子ｍａｂおよびヘパリンのｔＰＡにより媒介される再潅流に対する影響についての実験結果を柱状グラフで示す。
【図１１】抗−ＩＸ因子ｍａｂおよびヘパリンの頸動脈血管開通性に対する影響についての実験結果を柱状グラフで示す。
【図１２】抗−ＩＸ因子ｍａｂおよびヘパリンの血流の回復に対する影響についての実験結果を柱状グラフで示す。
【図１３】止血パラメータ、フィブリノーゲン、プラスミノーゲンおよび抗プラスミンに対するｔＰＡの影響を示す。
【図１４】ｔＰＡ、ヘパリンおよび抗−ＩＸ因子ｍａｂのａＰＴＴに対する影響を示す。
【図１５】ｔＰＡ、ＳＢ２４９４１７、およびｔＰＡとＳＢ２４９４１７の組み合わせの、血栓塞栓性卒中における集合平均梗塞体積に対する影響を示す。
【図１】
2004516236.tif 000007
【図２】
2004516236.tif 000008
【図３】
2004516236.tif 000009
【図４】
2004516236.tif 000010
【図５】
2004516236.tif 000011
【図６】
2004516236.tif 000012
【図７】
2004516236.tif 000013
【図８】
2004516236.tif 000014
【図９】
2004516236.tif 000015
【図１０】
2004516236.tif 000016
【図１１】
2004516236.tif 000017
【図１２】
2004516236.tif 000018
【図１３】
2004516236.tif 000019
【図１４】
2004516236.tif 000020
【図１５】
2004516236.tif 000021
【国際公開パンフレット】
2004516236.tif 000022
2004516236.tif 000023
2004516236.tif 000024
2004516236.tif 000025
2004516236.tif 000026
2004516236.tif 000027
2004516236.tif 000028
2004516236.tif 000029
2004516236.tif 000030
2004516236.tif 000031
2004516236.tif 000032
2004516236.tif 000033
2004516236.tif 000034
2004516236.tif 000035
2004516236.tif 000036
2004516236.tif 000037
2004516236.tif 000038
2004516236.tif 000039
2004516236.tif 000040
2004516236.tif 000041
2004516236.tif 000042
2004516236.tif 000043
2004516236.tif 000044
2004516236.tif 000045
2004516236.tif 000046
2004516236.tif 000047
2004516236.tif 000048
2004516236.tif 000049
2004516236.tif 000050
2004516236.tif 000051
2004516236.tif 000052
2004516236.tif 000053
2004516236.tif 000054
2004516236.tif 000055
2004516236.tif 000056
2004516236.tif 000057
2004516236.tif 000058
2004516236.tif 000059
2004516236.tif 000060
2004516236.tif 000061
2004516236.tif 000062
2004516236.tif 000063
2004516236.tif 000064
2004516236.tif 000065
2004516236.tif 000066
2004516236.tif 000067
2004516236.tif 000068
2004516236.tif 000069
2004516236.tif 000070
2004516236.tif 000071
2004516236.tif 000072
2004516236.tif 000073
2004516236.tif 000074
2004516236.tif 000075
2004516236.tif 000076
2004516236.tif 000077
2004516236.tif 000078
2004516236.tif 000079
2004516236.tif 000080
2004516236.tif 000081
2004516236.tif 000082
2004516236.tif 000083
2004516236.tif 000084
2004516236.tif 000085
2004516236.tif 000086
2004516236.tif 000087
2004516236.tif 000088
2004516236.tif 000089
2004516236.tif 000090
2004516236.tif 000091
2004516236.tif 000092
2004516236.tif 000093
2004516236.tif 000094
2004516236.tif 000095
2004516236.tif 000096
2004516236.tif 000097
2004516236.tif 000098
2004516236.tif 000099
2004516236.tif 000100
2004516236.tif 000101
2004516236.tif 000102
2004516236.tif 000103
2004516236.tif 000104
2004516236.tif 000105
2004516236.tif 000106
2004516236.tif 000107
2004516236.tif 000108
2004516236.tif 000109
2004516236.tif 000110
2004516236.tif 000111
2004516236.tif 000112
2004516236.tif 000113
2004516236.tif 000114
2004516236.tif 000115
2004516236.tif 000116
2004516236.tif 000117
2004516236.tif 000118
2004516236.tif 000119
2004516236.tif 000120
2004516236.tif 000121
2004516236.tif 000122
2004516236.tif 000123
2004516236.tif 000124
2004516236.tif 000125
2004516236.tif 000126
2004516236.tif 000127
2004516236.tif 000128
2004516236.tif 000129
2004516236.tif 000130
2004516236.tif 000131
2004516236.tif 000132
2004516236.tif 000133
2004516236.tif 000134
2004516236.tif 000135
2004516236.tif 000136
2004516236.tif 000137
2004516236.tif 000138
2004516236.tif 000139
2004516236.tif 000140
2004516236.tif 000141
2004516236.tif 000142
2004516236.tif 000143
2004516236.tif 000144
2004516236.tif 000145
2004516236.tif 000146
2004516236.tif 000147
2004516236.tif 000148
2004516236.tif 000149
2004516236.tif 000150
2004516236.tif 000151
2004516236.tif 000152
2004516236.tif 000153
2004516236.tif 000154
2004516236.tif 000155
2004516236.tif 000156
2004516236.tif 000157
2004516236.tif 000158
2004516236.tif 000159
2004516236.tif 000160
2004516236.tif 000161
2004516236.tif 000162
2004516236.tif 000163
2004516236.tif 000164
2004516236.tif 000165
2004516236.tif 000166
2004516236.tif 000167
2004516236.tif 000168
2004516236.tif 000169
2004516236.tif 000170
2004516236.tif 000171
2004516236.tif 000172
2004516236.tif 000173
2004516236.tif 000174
2004516236.tif 000175
2004516236.tif 000176
2004516236.tif 000177
2004516236.tif 000178
2004516236.tif 000179
2004516236.tif 000180
2004516236.tif 000181
【国際調査報告】
2004516236.tif 000182
2004516236.tif 000183
2004516236.tif 000184