(57)【要約】本発明は、以下の物理化学的性質：分子量１００，０００±１０，０００Da（２個の相同のサブユニットを含んでなる）または分子量１５０，０００±１５，０００Da（３個の相同のサブユニットを含んでなる）であって、各々のサブユニットは分子量５５，０００±２，０００Daを有する；Ｌ−ソルボソン、Ｄ−グルコソン、Ｄ−グルコースおよびＤ−キシロースに対して脱水素酵素活性；補助因子として、ピロロキノリンキノンを利用；Ｌ−ソルボソンからの、ビタミンＣの製造に対して至適ｐＨ６．５〜８．０および２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造に対して至適ｐＨ約９．０を有する；そしてＣｏ2+、Ｃｕ2+、Ｆｅ3+、Ｎｉ2+、Ｚｎ2+、およびモノヨード酢酸により阻害される、を有し、グルコノバクター（Gluconobacter）属に属する微生物に由来する、新規アルデヒド脱水素酵素に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の物理化学的性質：
ａ）分子量１００，０００±１０，０００Da（２個の相同のサブユニットからなる）または分子量１５０，０００±１５，０００Da（３個の相同のサブユニットからなる）であって、各々のサブユニットは分子量５５，０００±２，０００Daを有する；
ｂ）基質特異性：アルデヒド化合物に対して活性、
ｃ）補助因子：ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、
ｄ）至適ｐＨ約６．５〜約８．０（Ｌ−ソルボソンからのビタミンＣの製造に対して）または至適ｐＨ約９．０（Ｌ−ソルボソンからの２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造に対して）、
ｅ）阻害物質：Ｃｏ2+、Ｃｕ2+、Ｆｅ3+、Ｎｉ2+、Ｚｎ2+、およびモノヨード酢酸、
を有する精製アルデヒド脱水素酵素。
【請求項２】
アルデヒド脱水素酵素を産生することができるグルコノバクター（Gluconobacter）属に属する微生物に由来する、請求項１記載のアルデヒド脱水素酵素。
【請求項３】
微生物がグルコノバクター  オキシダンス（Gluconobacter oxydans）ＤＳＭ  Ｎｏ．４０２５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）の同定特性をもつグルコノバクター  オキシダンス（Gluconobacter oxydans）、その継代培養株または変異株である、請求項２記載のアルデヒド脱水素酵素。
【請求項４】
微生物がグルコノバクター  オキシダンス（Gluconobacter oxydans）ＤＳＭ  Ｎｏ．  ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）、その継代培養株または変異株である、請求項３記載のアルデヒド脱水素酵素。
【請求項５】
以下の物理化学的性質：
ａ）分子量１００，０００±１０，０００Da（２個の相同のサブユニットからなる）または分子量１５０，０００±１５，０００Da（３個の相同のサブユニットからなる）であって、各々のサブユニットは分子量５５，０００±２，０００Daを有する；
ｂ）基質特異性：アルデヒド化合物に対して活性、
ｃ）補助因子：ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、
ｄ）至適ｐＨ約６．５〜約８．０（Ｌ−ソルボソンからのビタミンＣの製造に対して）または至適ｐＨ約９．０（Ｌ−ソルボソンからの２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造に対して）、
ｅ）阻害物質：Ｃｏ2+、Ｃｕ2+、Ｆｅ3+、Ｎｉ2+、Ｚｎ2+、およびモノヨード酢酸、
を有するアルデヒド脱水素酵素の製造方法であって、好気性条件下、水性栄養培地中で、上記の性質を有するアルデヒド脱水素酵素を産生することができるグルコノバクター属に属する微生物を培養し、その微生物の細胞を破砕し、そしてその微生物の破砕された細胞の無細胞抽出物からアルデヒド脱水素酵素を単離精製することを含んでなる方法。
【請求項６】
反応が、ｐＨ約５．５〜９．０および温度約２０〜約５０℃で行われる、請求項５記載の方法。
【請求項７】
電子受容体の存在下に、アルデヒドを、以下の物理化学的性質：
ａ）分子量１００，０００±１０，０００Da（２個の相同のサブユニットからなる）または分子量１５０，０００±１５，０００Da（３個の相同のサブユニットからなる）であって、各々のサブユニットは分子量５５，０００±２，０００Daを有する；
ｂ）基質特異性：アルデヒド化合物に対して活性、
ｃ）補助因子：ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、
ｄ）至適ｐＨ約６．５〜約８．０（Ｌ−ソルボソンからのビタミンＣの製造に対して）または至適ｐＨ約９．０（Ｌ−ソルボソンからの２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造に対して）、
ｅ）阻害物質：Ｃｏ2+、Ｃｕ2+、Ｆｅ3+、Ｎｉ2+、Ｚｎ2+、およびモノヨード酢酸、
を有する精製アルデヒド脱水素酵素または上記の性質を有するアルデヒド脱水素酵素を産生することができるグルコノバクター属に属する微生物から調製された無細胞抽出物と接触させることを含んでなる、カルボン酸および／またはそのラクトンをその対応するアルドースから製造する方法。
【請求項８】
微生物がグルコノバクター  オキシダンス（Gluconobacter oxydans）ＤＳＭ  Ｎｏ．  ４０２５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）の同定特性をもつグルコノバクター  オキシダンス（Gluconobacter oxydans）、その継代培養株または変異株である、請求項５〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
微生物がグルコノバクター  オキシダンス（Gluconobacter oxydans）ＤＳＭ  Ｎｏ．４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）、その継代培養株または変異株である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ラクトンがビタミンＣであり、カルボン酸が２−ケト−Ｌ−グロン酸であり、そしてアルドースがＬ−ソルボソンである、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
反応が、ビタミンＣおよび２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造に対して、それぞれｐＨ約５．５〜約９．０および温度約２０〜約５０℃で行われる、請求項７〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
反応が、ビタミンＣの製造に対して、ｐＨ約６．５〜約８．０および温度約２０〜約４０℃で、そして、２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造に対して、ｐＨ約９．０および温度約２０〜約３０℃で行われる、請求項７〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
電子受容体の存在下に、アルデヒドを、精製アルデヒド脱水素酵素またはアルデヒド脱水素酵素を産生することができるグルコノバクター属に属する微生物から調製された無細胞抽出物と接触させることを含んでなる、カルボン酸および／またはそのラクトンをその対応するアルドースから製造する方法における、請求項１の精製アルデヒド脱水素酵素の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な酵素、すなわち、中性ｐＨでのＬ−ソルボソンからＬ−アスコルビン酸（以下、ビタミンＣと称する）への変換およびアルカリ性ｐＨでのＬ−ソルボソンから２−ケト−Ｌ−グロン酸（以下、２−ＫＧＡと称する）への変換の双方を引き起こす、アルデヒド脱水素酵素（以下、ＳＮＤＨ  ＩＩと称する）に関する。本発明は、また、その酵素の製造方法およびその酵素を用いるＬ−ソルボソンなどのアルドースからの直接的なビタミンＣおよび／または２−ＫＧＡの製造方法に関する。
【０００２】
ビタミンＣは、人間にとって、非常に重要で必須の栄養因子の一つである。ビタミンＣを産生する代謝経路は、種々の生物で広く研究されている。しかしながら、Ｌ−ソルボソンのビタミンＣへの直接変換に関する精製酵素についての報告はない。したがって、本発明の酵素は、ライヒシュタイン法（Helvetica Chimica Acta 17:311 (1934)）等の現在の方法に代わる、新規なビタミンＣ製造方法に対して非常に有用である。
【０００３】
本発明は、以下の物理化学的性質：
ａ）分子量１００，０００±１０，０００Da（２個の相同のサブユニットからなる）または分子量１５０，０００±１５，０００Da（３個の相同のサブユニットからなる）であって、各々のサブユニットは分子量５５，０００±２，０００Daを有する；
ｂ）基質特異性：アルデヒド化合物に対して活性、
ｃ）補助因子：ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、
ｄ）至適ｐＨ約６．５〜約８．０（Ｌ−ソルボソンからのビタミンＣの製造に対して）または至適ｐＨ約９．０（Ｌ−ソルボソンからの２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造に対して）、
ｅ）阻害物質：Ｃｏ2+、Ｃｕ2+、Ｆｅ3+、Ｎｉ2+、Ｚｎ2+、およびモノヨード酢酸、
を有する精製アルデヒド脱水素酵素を提供する。
【０００４】
一つの実施態様において、本発明は、上記の物理化学的性質を有する分子量１００，０００±１０，０００Daのアルデヒド脱水素酵素に関する。
【０００５】
さらなる実施態様において、本発明は、上記の物理化学的性質を有する分子量１５０，０００±１５，０００Daのアルデヒド脱水素酵素に関する。
【０００６】
本発明のＳＮＤＨ  ＩＩ源は重要なことではない。そこで、本発明のＳＮＤＨ  ＩＩは、例えば、グルコノバクター（Gluconobacter）または上記の性質を有する脱水素酵素を産生することができる他の生物から単離することにより製造することができ、あるいは遺伝子組換えでまたは化学合成により製造することができる。
【０００７】
本発明の他の目的は、好気性条件下、水性栄養培地中で、上記の性質を有するアルデヒド脱水素酵素を産生することができるグルコノバクター属に属する微生物を培養し、その微生物の細胞を破砕し、そしてその微生物の破砕された細胞の無細胞抽出物からアルデヒド脱水素酵素を単離精製することを含んでなる、上記のＳＮＤＨ  ＩＩの製造方法を提供する。
【０００８】
本発明の一態様において、上記のＳＮＤＨ  ＩＩの製造方法は、上記の性質を有するアルデヒド脱水素酵素を産生することができるグルコノバクター属に属する微生物を培養することにより行われ、ここで、反応をｐＨ約５．５〜約９．０および温度約２０〜約５０℃、好ましくは温度約２０〜約４０℃、最も好ましくは温度約２０〜約３０℃で行う。このように製造されるＳＮＤＨ  ＩＩは、ビタミンＣおよび２−ＫＧＡの双方の製造に有用である。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、電子受容体の存在下に、アルデヒドを、上記の性質を有する精製ＳＮＤＨ  ＩＩまたは上記の性質を有するアルデヒド脱水素酵素を産生することができるグルコノバクター属に属する微生物から調製された無細胞抽出物と接触させることを含んでなる、カルボン酸および／またはそのラクトンをその対応するアルドースから製造する方法を提供する。
【００１０】
ここで使用されるアルドースは、Ｌ−ソルボソン、Ｄ−グルコソン、Ｄ−グルコース、およびＤ−キシロースを含むが、ただしそれらに限定されない。
【００１１】
好ましいラクトンはビタミンＣであり、好ましいカルボン酸は２−ＫＧＡであり、そして好ましいアルドースはＬ−ソルボソンである。
【００１２】
一つの実施態様において、カルボン酸および／またはそのラクトンをその対応するアルドースから製造する方法は、アルデヒドを、上記の性質を有する精製ＳＮＤＨ  ＩＩまたは上記のグルコノバクター属に属する微生物から調製された無細胞抽出物と接触させることを含んでなり、ここでＳＮＤＨ  ＩＩの分子量は１００，０００±１０，０００Daである。
【００１３】
一つの実施態様において、カルボン酸および／またはそのラクトンをその対応するアルドースから製造する方法は、アルデヒドを、上記の性質を有する精製ＳＮＤＨ  ＩＩまたは上記のグルコノバクター属に属する微生物から調製された無細胞抽出物と接触させることを含んでなり、ここでＳＮＤＨ  ＩＩの分子量は１５０，０００±１５，０００Daである。
【００１４】
一態様において、本発明は、アルデヒドを、上記の性質を有する精製ＳＮＤＨ  ＩＩまたは上記の性質を有するアルデヒド脱水素酵素を産生することができるグルコノバクター属に属する微生物から調製された無細胞抽出物と接触させることを含んでなる、カルボン酸および／またはそのラクトンをその対応するアルドースから製造する方法であって、反応をｐＨ約５．５〜約９．０および温度約２０〜約５０℃、好ましくは温度約２０〜約４０℃、最も好ましくは温度約２０〜約３０℃で行う方法に関する。ビタミンＣを製造する場合には、反応は、好ましくはｐＨ約６．５〜約８．０および温度約２０〜約４０℃で行われる。２−ＫＧＡを製造する場合には、反応は、好ましくはｐＨ約９．０および温度約２０〜約３０℃で行われる。
【００１５】
本発明はまた、電子受容体の存在下に、アルデヒドを、精製アルデヒド脱水素酵素または上記のアルデヒド脱水素酵素を産生することができるグルコノバクター属に属する微生物から調製された無細胞抽出物と接触させることを含んでなる、カルボン酸および／またはそのラクトンをその対応するアルドースから製造する方法における、上記の性質を有する精製アルデヒド脱水素酵素の使用を提供する。
【００１６】
以下に記載の実施例にしたがって調製されるＳＮＤＨ  ＩＩの精製試料の物理化学的性質は、次のとおりである。
【００１７】
１）酵素活性
本発明のＳＮＤＨ  ＩＩは、電子受容体の存在下に、Ｌ−ソルボソンのビタミンＣおよび／または２−ＫＧＡへの酸化を、以下の反応式にしたがって触媒する：
Ｌ−ソルボソン＋電子受容体  →  ビタミンＣおよび／または２−ＫＧＡ＋還元された電子受容体
【００１８】
この酵素は、電子受容体としての酸素とは作用しない。このことは、この酵素が、酸素を可能な電子受容体として用いたとき、Ｌ−ソルボソンのビタミンＣおよび／または２−ＫＧＡへの変換を行わないことにより、確認された。さらに、溶存酸素プローブでの検出で、反応混合物中での酸素の消費は検出されなかった。その上、ＮＡＤおよびＮＡＤＰは適切な電子受容体ではない。しかしながら、他の従来の電子受容体は、本発明の酵素と一緒に用いることができる。好ましい電子受容体は、フェナジン  メトサルファート（ＰＭＳ）、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）、フェリシアニド、およびチトクロームｃである。少なくともいくらかのアルデヒド基質がその対応する酸に変換されるために存在すべき電子受容体の最小量はない。しかしながら、酸化することができる基質の量は、特定の電子受容体の量およびその電子受容特性に依存する。
【００１９】
酵素アッセイは以下のように行った：
【００２０】
ａ）Ｌ−ソルボソンからの各々の生成物、ビタミンＣまたは２−ＫＧＡへの変換に対する酵素活性を決定するアッセイ
反応混合物は、最終容量が水１００μlで、１．０mM  ＰＭＳ、２５mM  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１．０μM  ＰＱＱ、１．０mM  ＣａＣｌ2、５０mMＬ−ソルボソンおよび酵素溶液からなり、この反応混合物はアッセイの直前に調製した。他に特記しない限り、反応は３０℃で６０分間行った。酵素活性の指標となるビタミンＣの量は、高速液体クロマトグラフィーシステム（ＨＰＬＣ）により、２６４nmで測定したが、そのシステムは、ＵＶ検出器（東ソーＵＶ８０００；東ソー株式会社、東京都中央区京橋３−２−４、日本）、ジュアルポンプ（東ソーＣＣＰＥ；東ソー株式会社）、積分器（島津Ｃ−Ｒ６Ａ；島津製作所、京都市中京区西ノ京桑原町１、日本）およびカラム（ＹＭＣ−ＰａｃｋポリアミンＩＩ；ＹＭＣ社、3233 Burnt Mill Drive Wilimington, NC28403, USA）よりなる。酵素活性の他の指標である、製造された２−ＫＧＡの量は、上記のＨＰＬＣにより測定された。各々の製造に対する酵素活性の１単位は、反応混合物中に、ビタミンＣおよび２−ＫＧＡをそれぞれ１mg製造する酵素の量として定義した。
【００２１】
ｂ）ＳＮＤＨ  ＩＩの光度測定アッセイ
反応混合物は、最終容量が水１００μlで、０．１mM  ＤＣＩＰ、１．０mM  ＰＭＳ、５０mM  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１．０μM  ＰＱＱ、２〜１００mM  基質（Ｌ−ソルボソン、Ｄ−グルコソン、Ｄ−グルコース、など）および酵素溶液からなり、この反応混合物はアッセイの直前に調製した。反応は２５℃でＬ−ソルボソンと共に開始し、酵素活性は、６００nmでのＤＣＩＰの初期還元速度として測定した。酵素活性の１単位は、１分間あたり１μmolのＤＣＩＰの還元を触媒する酵素の量として定義した。ＤＣＩＰの吸光係数はＰＨ７．０で１４．２mM-1であった。対照キュベットは、Ｌ−ソルボソンを除く全ての上記の成分を含んでいた。
【００２２】
タンパク質濃度は、タンパク質アッセイＣＢＢ溶液（半井テスク社、京都、日本）を用いて測定した。
【００２３】
２）基質特異性
酵素の基質特異性は、１００mMリン酸カリウム（ｐＨ７．５）または１００mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を緩衝液として用いた以外は、上記１ｂ）に記載したのと同じ酵素アッセイ法を用いて測定した。ｐＨ７．５および９．０の双方において、Ｄ−グルコソン（２mM）、Ｄ−グルコース（１００mM）、およびＤ−キシロース（１００mM）に対するＳＮＤＨ  ＩＩの相対活性は、Ｌ−ソルボソン（２mM）に対するそれより高かった。しかしながら、ｐＨ７．５および９．０の双方において、Ｌ−ソルボース（１００mM）、Ｄ−ソルビトール（１００mM）、およびＬ−グロノ−γ−ラクトン（１００mM）に対する相対活性は、Ｌ−ソルボソンに対する活性の１％より低かった。これらの結果を表１Ａに示す。
【００２４】
【表１】
2006503551.tif 000002
【００２５】
ｂ）表１Ａで示された基質の酸化の推定生成物を、下記の表１Ｂに示す。
【００２６】
【表２】
2006503551.tif 000003
【００２７】
３）至適ｐＨ
ＳＮＤＨ  ＩＩの反応速度と反応混合液のｐＨ値との間の相関関係を、種々のｐＨ値および１００mM濃度の緩衝液を用いた以外は、上記１ａ）に記載したのと同じアッセイ方法により測定した。
この酵素は、ビタミンＣの製造に対して、ｐＨ約６．５〜約８．０で比較的高い活性を示し、そして２−ＫＧＡの製造に対して、ｐＨ約９．０で、高い活性を示した。
【００２８】
４）温度の影響
酵素反応に対する温度の影響を、種々の温度を用いた以外は、上記１ａ）に記載したのと同じアッセイ方法により試験した。ビタミンＣと２−ＫＧＡの双方の製造において、酵素反応は、少なくとも４０℃まで安定に行われた。
【００２９】
５）金属イオンと阻害剤の影響
この酵素のＬ−ソルボソン脱水素酵素活性に対する金属イオンと阻害剤の影響は、上記１ｂ）に記載したのと同じアッセイ方法を用いて活性を測定することにより調べた。各化合物の溶液を、基本となる反応混合物に撹拌して入れ、反応を酵素の添加により開始した。結果を表２に示す。
【００３０】
【表３】
2006503551.tif 000004
【００３１】
各々の化合物は、ＥＤＴＡ、ＮａＮ3およびモノヨード酢酸の濃度が５．０mMであることを除いて、１．０mMの濃度で反応混合物に加えた。
【００３２】
表２に示されたように、Ｃｏ2+、Ｃｕ2+、Ｆｅ3+、Ｎｉ2+、およびＺｎ2+は酵素活性を阻害した。５．０mMモノヨード酢酸の添加は、酵素活性を強く阻害した。
【００３３】
６）分子量
酵素の分子量は、サイズ排除ゲルカラム（ＴＳＫ−ゲルＧ３０００  ＳＷＸＬ；東ソー株式会社、東京都港区赤坂１−７−７、日本）で測定した。酵素は、クロマトグラフィーで見かけの分子量が約１００，０００±１０，０００Daおよび約１５０，０００±１５，０００に相当する２つのピークを示した。この酵素をＣＢＢで染色した１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析することにより、精製酵素が、各々分子量約５５，０００±２，０００Daの２〜３個の均一なサブユニットからなることが示された。この酵素の二量体型および三量体型の双方が活性である。
【００３４】
７）補欠分子族
１００mM ＮａＨ2ＰＯ4−ＨＣｌ（ｐＨ約１．０）５０μl中の精製ＳＮＤＨ  ＩＩ（０．１mg）を等容量のメタノールで添加し、よく混合した。試料を遠心分離して、析出物を除去した。得られた上清を、補欠分子族の分析に使用した。抽出物の吸収スペクトルは、ＰＱＱ（三菱ガス化学、日本）の標準試料とほとんど同一であった。その吸収ピークは、２５１および３４８nmに見出された。さらに、逆相カラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８  ＡＳ−３１２；ＹＭＣ株式会社）を用いる３１３nmの波長でのＨＰＬＣ分析により、メタノールでのＳＮＤＨ  ＩＩ抽出物は、標準ＰＱＱのそれと同じ保持時間を示した。
【００３５】
精製酵素のヘムｃの検出は、ＵＶ−ＶＩＳ記録分光光度計（島津  ＵＶ−２２００；島津製作所）によって得られた、酸化・還元差スペクトルにより試みられた。酵素を５０mM  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に５０μg／mlの濃度で懸濁し、そして亜ジチオン酸塩で還元した形態の酵素および過硫酸アンモニウムで酸化した形態の酵素を調製して、差スペクトルを測定した。しかしながら、得られたスペクトルは、４５０と６５０nmの間の波長で、明白なピークを示さなかった。
【００３６】
これらの結果は、この酵素はＰＱＱを有するが、ヘムｃを補欠分子族として有しないことを強く示唆する。
【００３７】
８）基質濃度の影響
１mM〜８mMまでの種々の濃度のＬ−ソルボソンでの酸化反応の速度を測定して、Ｌ−ソルボソンのＫｍ値を決定した。ミカエリス定数は、ＤＣＩＰを反応の電子受容体として用いた場合の反応速度に基づくラインウィーバー・バーク（Lineweaver-Burk）プロットから、ｐＨ７．５および９．０で、それぞれ１４．７mMおよび２０．０mMであると計算された。
【００３８】
９）精製方法
酵素の精製は、公知の精製法の任意の組み合わせ、例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水性カラムクロマトグラフィー、塩析および透析により行う。
【００３９】
本発明により提供される酵素は、適切な微生物を水性栄養培地中、好気性条件下で培養し、その微生物の細胞を破砕し、そしてその微生物の破砕された細胞の無細胞抽出物から脱水素酵素を単離精製することにより調製することができる。
【００４０】
本発明の方法に用いられる微生物は、上記の脱水素酵素を産生することのできるグルコノバクター（Gluconobacter）属に属する微生物である。
【００４１】
好ましい株はグルコノバクター  オキシダンス（Gluconobacter oxydans）である。本発明において用いられる最も好ましい株は、グルコノバクター  オキシダンス  ＤＳＭ  ４０２５であり、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen in Gottingen（ドイツ国）に、ブダペスト条約の規定に基づいて、ＤＳＭ  Ｎｏ．４０２５で１９８７年３月１７日に寄託された。寄託者はThe Oriental Scientific Instruments Import and Export Corporation for Institute of Microbiology, Academia Sinica, 52 San-Li-He Rd., Beijing, Peoples Republic of Chinaであった。事実上の寄託者は該機関であり、その完全なアドレスは、The Institute of Microbiology, Academy of Sciences of China, Haidian, Zhongguancun, Beijing 100080, People's Republic of Chinaである。
【００４２】
また、この株の継代培養物もまた、産業技術総合研究所（ＡＩＳＴ）にブダペスト条約の規定に基づいて、受託番号グルコノバクター  オキシダンス  ＤＳＭ  Ｎｏ．  ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）で１９９２年３月３０日に寄託された。寄託者は、日本ロシュ株式会社（東京都港区芝２丁目６−１、日本）であった。この継代培養物もまた本発明に最も好ましく用いられる。
【００４３】
そこで、グルコノバクター  オキシダンス（Gluconobacter oxydans）ＤＳＭ  Ｎｏ．  ４０２５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）の同定性質をもつグルコノバクター  オキシダンス（Gluconobacter oxydans）、その継代培養株または変異株に由来する、上記のアルデヒド脱水素酵素を提供することは、本発明の目的である。
【００４４】
Ｇ．  ｏｘｙｄａｎｓ  ＤＳＭ  ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）またはグルコノバクター（Gluconobacter）属に属し、Ｇ．  ｏｘｙｄａｎｓ  ＤＳＭ  ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）の同定性質をもつ微生物の変異株は、例えば、紫外線もしくはＸ線照射、またはナイトロジェン・マスタードもしくはＮ−メチル−ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の化学的突然変異原で細胞を処理することにより得られる。
【００４５】
全てのタイプの微生物、例えば、静止細胞、アセトン処理細胞、凍結乾燥細胞、固定化細胞などが、基質に直接作用するために用いられる。微生物のインキュベーション法に関連する方法としてそれ自体公知のすべての手段が、エアレーションの使用を通して採用され、そして、攪拌式液中発酵槽が特に好ましい。反応を行うための好ましい細胞濃度範囲は、１mlあたりの湿潤細胞重量で、約０．０１ｇ〜０．７ｇ、好ましくは１mlあたりの湿潤細胞重量で、０．０３ｇ〜０．５ｇである。
【００４６】
微生物「グルコノバクター  オキシダンス」はまた、原核生物命名の国際コードにより定義される、同じ物理化学的性質を有するそのような種の異名物またはバソニムを包含する。
【００４７】
Ｇ．  ｏｘｙｄａｎｓ  ＤＳＭ  Ｎｏ．  ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）の性質は、以下のとおりである：
ａ）ソルボースから２−ＫＧＡを産生、
ｂ）エタノールは酢酸に酸化される、
ｃ）Ｄ−グルコースはＤ−グルコン酸と２−ケト−Ｄ−グルコン酸に酸化される、
ｄ）ポリアルコールのケトン体生成能、
ｅ）ｐＨ４および５のマンニトール培養液（２４時間培養）中で外皮および環生長、およびｐＨ４．５のグルコース培養液中で外皮生長、
ｆ）グリセリンは実質的にはジヒドロキシアセトンに酸化されない、
ｇ）ソルビトールおよびグルカル酸から２−ケト−Ｄ−グルカル酸を産生、ただし、グルコース、フルクトース、グルコン酸、マンニトールまたは２−ケト−Ｄ−グルコン酸からは非産生、
ｈ）多形、外見上、鞭毛なし、
ｉ）褐色色素がフルクトースから産生される、
ｊ）バチルス  メガテリウム（Bacillus megaterium）またはその細胞抽出物の存在下に共培養すると、良好に生長、
ｋ）ストレプトマイシン感受性。
【００４８】
この微生物は、適切な栄養を補充した水性培地中、好気性条件下で培養しうる。培養は、約ｐＨ４．０〜約９．０、好ましくは約６．０〜約８．０で行いうる。培養期間は、用いられるｐＨ、温度および栄養培地に応じて変化し、好ましくは約１〜５日である。培養を行うのに好ましい温度範囲は、約１３℃〜約３６℃、より好ましくは１８℃〜３３℃である。約５０℃までの温度が、同様に、その微生物の培養に好適でありうる。
【００４９】
培養培地は、同化できる炭素源、例えば、グリセリン、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、エリスリトール、リビトール、キシリトール、アラビトール、イノシトール、ズルシトール、Ｄ−リボース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−グルコースおよびスクロース、好ましくはＤ−ソルビトール、Ｄ−マンニトールおよびグリセリン；および有機物質のような消化できる窒素源、例えば、ペプトン、酵母エキス、パン酵母、尿素、アミノ酸、コーンスティープリカーのような栄養物を含有することが、通常必要とされる。種々の無機物、例えば、硝酸塩およびアンモニウム塩もまた窒素源として用いることができる。さらに、培養培地は、通常、無機塩、例えば、硫酸マグネシウム、リン酸カリウムおよび炭酸カルシウムを含有する。
【００５０】
培養後の微生物からのＳＮＤＨ  ＩＩの単離および精製の実施態様を、以下に簡単に記載する。
（１）細胞を液体培養液から遠心分離または濾過により採取する。
（２）採取した細胞を水、生理食塩水または適切なｐＨの緩衝溶液で洗浄する。
（３）洗浄した細胞を緩衝溶液に懸濁し、ホモジナイザー、ソニケーター、またはフレンチプレスにより、あるいはリゾチームなどでの処理により破砕して、破砕した細胞の溶液を得る。
（４）破砕細胞の無細胞抽出物から、好ましくは微生物の可溶性画分から、ＳＮＤＨ  ＩＩを単離して精製する。
【００５１】
無細胞抽出物は、遠心分離を含むがそれに限定されない任意の従来法により、破砕細胞から得ることができる。
【００５２】
本発明により提供されるＳＮＤＨ  ＩＩは、Ｌ−ソルボソンからのビタミンＣおよび／または２−ＫＧＡの製造のための触媒として有用である。反応は、ビタミンＣおよび２−ＫＧＡの製造に対して約５．５〜約９．０のｐＨで、電子受容体（例えば、ＤＣＩＰ、ＰＭＳなど）の存在下、リン酸緩衝液、トリス緩衝液などのような溶媒中で行うことができる。ビタミンＣの製造に対しては、ｐＨが約６．５〜約８．０そして温度が約２０〜約４０℃に設定される場合、通常、最良の結果が達成される。２−ＫＧＡの製造に対しては、ｐＨが約９．０そして温度が約２０〜約３０℃に設定される場合、通常、最良の結果が達成される。
【００５３】
反応混合物中のＬ−ソルボソンの濃度は、他の反応条件に応じて変化しうるが、一般に、約０．５〜約５０ｇ／ｌ、最も好ましくは約１〜約３０ｇ／ｌである。
【００５４】
この反応で、ＳＮＤＨ  ＩＩはまた、適切な担体に、固定状態で用いることもできる。当該分野で一般に公知の酵素を固定する任意の手段のいずれを用いてよい。例えば、酵素を、１以上の官能基を有する樹脂の膜、または粒状物などに直接結合させるか、または１以上の官能基を有する架橋性化合物、例えばグルタルアルデヒドを介して樹脂に結合させてもよい。
【００５５】
上記に加えて、培養細胞はまた、それらの対応するアルドースからのカルボン酸および／またはそのラクトンの製造、特に、Ｌ−ソルボソンからの２−ＫＧＡおよび／またはビタミンＣの製造に有用である。それらの対応するアルドースからの他のカルボン酸および／またはそのラクトンの製造は、上記のＬ−ソルボソンの２−ＫＧＡおよび／またはビタミンＣへの変換と、基質濃度を含めて、同じ条件下に行われる。
【００５６】
以下の実施例は本発明をさらに例示する。
【００５７】
実施例１
ＳＮＤＨ  ＩＩの調製
すべての操作は８℃で行い、他に明記しない限り、緩衝液は０．０５Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７．０）であった。
（１）グルコノバクター  オキシダンス  ＤＳＭ  Ｎｏ．  ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）の培養
グルコノバクター  オキシダンス  ＤＳＭ  Ｎｏ．  ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）を、５．０％Ｄ−マンニトール、０．２５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．７５％コーンスティープリカー、５．０％パン酵母、０．５％尿素、０．５％ＣａＣＯ３および２．０％寒天を含有する寒天プレート上で２７℃、４日間成育させた。一白金耳の細胞を、２％Ｌ−ソルボース、０．２％酵母エキス、０．０５％グリセリン、０．２５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．７５％コーンスティープリカー、０．５％尿素および１．５％ＣａＣＯ３を含有する、５００mlの三角フラスコ中の５０mlの種母培養培地に接種し、３０℃で１８０rpmで１日、回転振盪器で培養した。このようにして調製した種母培養物を２Ｌの培地に接種するために用いたが、この培地は３Ｌのジャーファーメンター中で、８．０％Ｌ−ソルボース、０．０５％グリセリン、０．２５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３．０％コーンスティープリカー、０．４％酵母エキスおよび０．１５％消泡剤を含んでいた。発酵パラメーターは、撹拌速度８００rpmおよび３０℃の温度で通気量０．５vvm（空気の容量／培地の容量／分）であった。ｐＨは、発酵の間、水酸化ナトリウムで７．０に維持した。３セットのファーメンターを用いることにより、培養４８時間後、グルコノバクター  オキシダンス  ＤＳＭ  Ｎｏ．  ４０２５  株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）の細胞を含む培養液６Ｌを、連続遠心分離により採取した。細胞を含むペレットを回収し、適当量の食塩水に懸濁した。懸濁液を２，５００rpm（１，０００×ｇ）で遠心分離した後、わずかに赤味がかった細胞を含む上清を回収して、培地の成分であったコーンスティープリカーおよび酵母エキス由来の不溶物質を除去した。次いで、上清を８，０００rpm（１０，０００×ｇ）で遠心分離して細胞ペレットを得た。その結果、湿潤重量３８．４ｇのグルコノバクター  オキシダンスＤＳＭ  Ｎｏ．  ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）の細胞を６Ｌの培養液から得た。
【００５８】
（２）細胞質ゾル画分の調製
細胞ペーストの一部（１９．２ｇ）を１００mlの緩衝液で懸濁し、フレンチ加圧細胞プレスを通した。損傷していない菌体を除去するために遠心分離した後、上清を無細胞抽出物とし、この無細胞抽出物を１００，０００×ｇで６０分間遠心分離した。得られた上清（１１２ml）をグルコノバクター  オキシダンス  ＤＳＭ  Ｎｏ．  ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）の可溶性画分とした。この画分を緩衝液に対して透析した後、Ｌ−ソルボソンからのビタミンＣ製造に対する比活性が０．１７２単位／mgタンパク質である透析画分１１２mlを次の精製工程に用いた。
【００５９】
（３）ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セルロースカラムクロマトグラフィー
透析物（１１２ml）を、緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースのカラム（WhatmanDE-52,3×50cm;Whatman BioSystems Ltd., Springfield MIII, James Whatman Way, Maidstone, Kent, U.K.）にのせ、緩衝液で洗浄して副次的なタンパク質を溶出させた。次いで、緩衝液中０．２８〜０．５８ＭのＮａＣｌによる直線勾配溶出を行った。主たる酵素活性は、０．３６ＭのＮａＣｌで溶出した。活性画分（９７．５ml）を集めた。
【００６０】
（４）ＤＥＡＥ−セファロースカラムクロマトグラフィー
前の工程からの透析活性画分の一部（９７ml）を、緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂのカラム（Pharmacia、３．０×２５cm）にのせた。０．３ＭのＮａＣｌを含む緩衝液でカラムを洗浄した後、０．３〜０．４５ＭのＮａＣｌの直線勾配を緩衝液に加えた。活性画分は、０．４４〜０．４７Ｍの範囲のＮａＣｌ濃度で溶出した。活性画分（４０ml）を集め、緩衝液に対して透析した。
【００６１】
（５）Ｑ−セファロースカラムクロマトグラフィー（第一段階）
透析した活性画分（４０ml）を、緩衝液で平衡化したＱ−セファロース（Pharmacia，１．５×２５cm）のカラムにのせた。０．３ＭのＮａＣｌを含む緩衝液でカラムを洗浄した後、０．３〜０．５ＭのＮａＣｌの直線勾配を緩衝液に加えた。活性画分は、０．４４〜０．４６Ｍの範囲のＮａＣｌ濃度で溶出した。
【００６２】
（６）Ｑ−セファロースカラムクロマトグラフィー（第二段階）
前工程からのプールした活性画分（１７ml）を緩衝液に対して透析した。透析試料（１７ml）を、緩衝液で平衡化したＱ−セファロースのカラム（Pharmacia、１．５×２５cm）にのせた。このカラムを０．３３ＭのＮａＣｌを含む緩衝液で洗浄した後、０．３３〜０．４８ＭのＮａＣｌの直線勾配を緩衝液に加えた。活性画分は、０．４５〜０．４８Ｍの範囲のＮａＣｌ濃度で溶出した。
【００６３】
（７）疎水性カラムクロマトグラフィー
前工程からの活性画分を、限外濾過装置（Centriprep-10）で濾過して、脱塩および濃縮した。脱塩および濃縮試料（７８０μl）の一部（７５０μl）を、３Ｍ硫酸アンモニウム（最終濃度：１．５Ｍ）を含む等量（７５０μl）の緩衝液に加えた。試料を遠心分離（１５，０００×ｇ）した後、上清を、１．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝液で平衡化した疎水性カラムＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＩＳＯ（Pharmacia、ベッド容量：１．０ml）にのせた。カラムを、１．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝液で洗浄した後、タンパク質を、１．５〜０．７５Ｍの硫酸アンモニウムの直線勾配を含む緩衝液で溶出した。ＳＮＤＨ  ＩＩに相当する活性は、１．０４〜１．００Ｍの範囲の硫酸アンモニウム濃度で溶出した。活性画分を、透析カップ（透析カップＭＷＣＯ  ８０００、第一純薬、東京都中央区日本橋３−１３−５、日本）を用いて、緩衝液に対して透析した。その後、画分を集め、−２０℃で保存した。
【００６４】
酵素の精製工程の要約を表３に示す。
【００６５】
【表４】
2006503551.tif 000005
【００６６】
酵素の１単位＊は、１ａ）に記載された反応混合物中に１時間あたりビタミンＣ１mgを産生する酵素の量として定義した。
【００６７】
（８）単離した酵素の純度
ビタミンＣに対する比活性４８．９単位／mgタンパク質および２−ＫＧＡに対する比活性１２．３単位／mgタンパク質の精製酵素（０．０３９mg／ml）を以下の分析に用いた：
【００６８】
未変性酵素の分子量を、０．３ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したサイズ排除ゲルカラム（ＴＳＫゲルＧ３０００  ＳＷＸＬカラム、７．８×３００mm）を用いる高速液体クロマトグラフィーにより、２８０nmで流速１．５ml／分で測定した。シアノコバラミン（１．３５kDa）、ミオグロビン（１７kDa）、オボアルブミン（４４kDa）、γ−グロブリン（１５８kDa）およびチログロブリン（６７０kDa）を分子量標準として用いた。精製酵素は、それぞれ分子量１００，０００±１０，０００Daと１５０，０００±１５，０００Daを有する２つのピークを示した。
【００６９】
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）より、この酵素は分子量５５，０００±２，０００Daのサブユニットを示した。したがって、精製酵素は２または３個の相同のサブユニットからなると推定された。
【００７０】
（９）反応生成物の同定
精製酵素（０．３９μg）、Ｌ−ソルボソン（５０mM）、ＰＭＳ（１mM）、ＣａＣｌ２（１mM）およびＰＱＱ（１μM）を含む反応混合液を緩衝液１００μｌ中で、１時間、３０℃でインキュベーションした。反応生成物を薄層クロマトグラフィー（シリカゲル６０Ｆ254，ＭＥＲＣＫ，６４２７１  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ドイツ）およびＨＰＬＣで分析した。２種類の生成物、ビタミンＣと２−ＫＧＡが酵素反応から得られた。ビタミンＣについては、試料を、ＨＰＬＣシステムで、アミノ−カラム（ＹＭＣパック  ポリアミン−ＩＩ、ＹＭＣ社）によりアッセイした。２−ＫＧＡについては、試料を、ＨＰＬＣシステムで、Ｃ−１８カラム（ＹＭＣパック  Ｐｒｏ  Ｃ１８、ＹＭＣ社）によりアッセイした。
【００７１】
実施例２
ＳＮＤＨ  ＩＩによるＬ−ソルボソンからのビタミンＣまたは２−ＫＧＡの製造に対するｐＨの影響
酵素反応に対するｐＨの影響を試験した。緩衝液（１００mM）１００μｌ中の精製酵素（２７３ng）、Ｌ−ソルボソン（５０mM）、ＰＭＳ（１mM）、ＣａＣｌ2（１mM）およびＰＱＱ（１μM）を含む反応混合液を、１時間、３０℃でインキュベーションした。反応生成物をＨＰＬＣで分析した。結果を表４に示す。
【００７２】
【表５】
2006503551.tif 000006
【００７３】
実施例３
ＳＮＤＨ  ＩＩによるＬ−ソルボソンからのビタミンＣまたは２−ＫＧＡの製造に対する温度の影響
酵素活性に対する温度の影響を試験した。２５mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌ中の精製酵素（３９０ng）、Ｌ−ソルボソン（５０mM）、ＰＭＳ（１mM）、ＣａＣｌ2（１mM）およびＰＱＱ（１μM）を含む反応混合液を、１時間、種々の温度（２０〜６０℃）でインキュベーションした。反応生成物をＨＰＬＣで分析した。結果を表５に示す。
【００７４】
【表６】
2006503551.tif 000007
【国際調査報告】
2006503551.tif 000008
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