(57)【要約】標的特異的ハイブリッド捕捉（ＴＳＨＣ）は、迅速および高感度だけでなく、特異性が高く、かつ高い相同性をもつ核酸標的配列を識別することが可能な核酸検出方法を提供する。その方法は、様々な方法により検出可能なＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを生成する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む標的核酸を検出する方法：
ａ）　一本鎖または部分的一本鎖の標的核酸を捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブにハイブリダイズして、該プローブと標的核酸との間に二本鎖ハイブリッドを形成する段階であり、捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブは標的核酸内の重複しない領域にハイブリダイズすることができ、かつ相互にハイブリダイズしない段階；
ｂ）　ハイブリダイゼーション反応にブロッカープローブを加える段階であり、該ブロッカープローブはハイブリダイズされていない過剰の捕捉配列プローブにハイブリダイズする段階；
ｃ）　ハイブリッドを固相に結合して、結合ハイブリッドを形成する段階；および
ｄ）　結合ハイブリッドを検出する段階。
【請求項２】
以下の段階を含む標的核酸を検出する方法：
ａ）　一本鎖または部分的一本鎖の標的核酸を固定化捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブにハイブリダイズして、該プローブと標的核酸との間に二本鎖ハイブリッドを形成する段階であり、捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブは標的核酸内の重複しない領域にハイブリダイズし、かつ相互にハイブリダイズしない段階；
ｂ）　ハイブリダイゼーション反応にブロッカープローブを加える段階であり、該ブロッカープローブはハイブリダイズされていない過剰の捕捉配列プローブにハイブリダイズする段階；
ｃ）　結合ハイブリッドを検出する段階。
【請求項３】
シグナル配列プローブが一本鎖である、請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項４】
捕捉配列プローブが少なくとも１つのリガンドで修飾されている、請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項５】
リガンドがビオチンである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
捕捉配列プローブが５’末端および３’末端を有する線状であり、その５’末端および３’末端の両方がビオチン化されている、請求項５記載の方法。
【請求項７】
捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブが標的核酸の領域にハイブリダイズし、その領域の隔たりが３キロベース未満である、請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項８】
捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブが標的核酸の領域にハイブリダイズし、その領域の隔たりが５００ベース未満である、請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項９】
捕捉配列プローブが、標的核酸の異なる領域または異なる標的分子に相補的な２つまたはそれ以上の配列の融合体である、請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項１０】
形成される二本鎖ハイブリッドがＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである、請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項１１】
ハイブリダイゼーション段階の前に一本鎖または部分的一本鎖の標的核酸を形成する段階をさらに含む、請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項１２】
捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションが連続的に行われる、請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項１３】
段階ａ）および段階ｂ）が同時に行われる、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
段階ａ）および段階ｃ）が同時に行われる、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
段階ａ）、段階ｂ）および段階ｃ）が同時に行われる、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
段階ａ）および段階ｂ）が同時に行われる、請求項２記載の方法。
【請求項１７】
ブロッカープローブが捕捉配列プローブの融解温度より低い融解温度を有する、請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項１８】
ハイブリッドが固相上へ捕捉される、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
固相がストレプトアビジンでコーティングされている、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
固相がマイクロプレートである、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
段階ｃ）が室温で実行される、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
結合ハイブリッドがそのハイブリッドを認識する抗体を使用して検出される、請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項２３】
ハイブリッドがＤＮＡ／ＲＮＡ−ハイブリッドである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを認識する抗体がアルカリホスファターゼで標識されている、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
以下の段階を含む標的核酸を検出する方法：
ａ）　一本鎖または部分的一本鎖の標的核酸を捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブにハイブリダイズする段階であり、捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブは標的核酸内の重複しない領域にハイブリダイズし、かつ相互にハイブリダイズせず、該ハイブリダイゼーションにより該シグナル配列プローブと標的核酸との間にＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドが形成される段階；および
ｂ）　ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドが、そのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを認識する抗体を該ハイブリッドに結合することにより検出される段階であり、該抗体は検出可能に標識されている段階。
【請求項２６】
段階ａ）において形成されるハイブリッドを固相に結合して、結合ハイブリッドを形成する段階をさらに含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
シグナル配列プローブが一本鎖である、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
捕捉配列プローブが少なくとも１つのリガンドで修飾されている、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
捕捉配列プローブがビオチン化されている、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
捕捉配列プローブが５’末端および３’末端を有する線状であり、その５’末端および３’末端の両方がビオチン化されている、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブが標的核酸の領域にハイブリダイズし、その領域の隔たりが３キロベース未満である、請求項２５記載の方法。
【請求項３２】
捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブが標的核酸の領域にハイブリダイズし、その領域の隔たりが５００ベース未満である、請求項２５記載の方法。
【請求項３３】
ハイブリダイゼーション段階の前に一本鎖の標的核酸を形成する段階をさらに含む、請求項２５記載の方法。
【請求項３４】
捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションが連続的に行われる、請求項２５記載の方法。
【請求項３５】
段階ａ）において形成されるハイブリッドを固相上へ結合して、結合ハイブリッドを形成する、請求項２５記載の方法。
【請求項３６】
結合ハイブリッドが室温で形成される、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
固相がストレプトアビジンでコーティングされている、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
固相がマイクロプレートである、請求項３５記載の方法。
【請求項３９】
抗体がアルカリホスファターゼで標識されている、請求項２５記載の方法。
【請求項４０】
ブロッカープローブをハイブリダイゼーション段階に加える段階をさらに含み、該ブロッカープローブがハイブリダイズされていない過剰の捕捉配列プローブにハイブリダイズする、請求項２５記載の方法。
【請求項４１】
ブロッカープローブが、捕捉配列プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションに続いてハイブリダイゼーション反応に加えられる、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
ブロッカープローブが捕捉配列プローブの融解温度より低い融解温度を有する、請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
以下の段階を含む標的核酸を検出する方法：
ａ）　一本鎖または部分的一本鎖の標的核酸を捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブにハイブリダイズする段階であり、捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブは標的核酸内の重複しない領域にハイブリダイズし、かつ相互にハイブリダイズせず、シグナル配列プローブはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド領域を含み、該ハイブリダイゼーションにより複合体が形成される段階；および
ｂ）　該複合体を検出する段階。
【請求項４４】
シグナル配列プローブが少なくとも４０塩基対の長さを含む、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
捕捉配列プローブが少なくとも６塩基対の長さを含む、請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
捕捉配列プローブが固相上に固定化されている、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
複合体が、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド領域を認識する抗体を該領域に結合することにより検出され、その抗体が検出可能に標識されている、請求項４３記載の方法。
【請求項４８】
捕捉配列プローブが少なくとも１つのリガンドで修飾されている、請求項４３記載の方法。
【請求項４９】
リガンドがビオチンである、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
捕捉配列プローブが５’末端および３’末端を有する線状であり、その５’末端および３’末端の両方がビオチン化されている、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
ブロッカープローブをハイブリダイゼーション段階後に加える段階をさらに含み、該ブロッカープローブがハイブリダイズされていない過剰の捕捉配列プローブにハイブリダイズする、請求項４３記載の方法。
【請求項５２】
ブロッカープローブが捕捉配列プローブの長さより４塩基対〜１０塩基対短い長さを含む、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
配列番号：１から配列番号：１６０までからなる群より選択される配列からなる核酸プローブ。
【請求項５４】
シグナル配列プローブがＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖構造を有する第一の領域と一本鎖の核酸配列を有する第二の領域とを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５５】
ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖がＭ１３ ＤＮＡ−Ｍ１３ ＲＮＡ二重鎖である、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
以下の段階を含む標的核酸を検出する方法：
ａ）　一本鎖または部分的一本鎖の標的核酸を捕捉配列プローブ、架橋プローブおよびシグナル配列プローブにハイブリダイズして、二本鎖ハイブリッドを形成する段階であり、捕捉配列プローブおよび架橋プローブは標的核酸内の重複しない領域にハイブリダイズし、かつ相互にハイブリダイズせず、ならびにシグナル配列プローブは架橋プローブにハイブリダイズし、かつ標的核酸および捕捉配列プローブにハイブリダイズしない段階；
ｂ）　ブロッカープローブをハイブリダイゼーション反応に加える段階であり、該ブロッカープローブはハイブリダイズされていない過剰の捕捉配列プローブにハイブリダイズする段階；
ｃ）　ハイブリッドを固相に結合して、結合ハイブリッドを形成する段階；および
ｄ）　結合ハイブリッドを検出する段階。
【請求項５７】
シグナル配列プローブがＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖構造を有する第一の領域および一本鎖の核酸を有する第二の領域を含む、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖がＭ１３ ＤＮＡ−Ｍ１３ ＲＮＡ二重鎖である、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖がシグナル配列プローブ内の反復配列とその反復配列に相補的な配列を有する核酸分子との間に形成されるハイブリッドである、請求項５７記載の方法。
【請求項６０】
架橋プローブがポリ（Ａ）テールをさらに含む、請求項５６記載の方法。
【請求項６１】
シグナル配列プローブが、架橋プローブのポリ（Ａ）テールにハイブリダイズする一本鎖ポリ（ｄＴ）ＤＮＡ配列、およびシグナル配列プローブのポリ（ｄＴ）配列とポリ（Ａ）配列を有する核酸分子との間に形成されるＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖を含む、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
以下の段階：
ａ）　一本鎖または部分的一本鎖の標的核酸を捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブにハイブリダイズして、該プローブと標的核酸との間に二本鎖ハイブリッドを形成する段階；
ｂ）　ハイブリッドを固相に結合して、結合ハイブリッドを形成する段階；およびｃ）　結合ハイブリッドを検出する段階、
を含む標的核酸を検出する方法であり、捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブは標的核酸内の重複しない領域にハイブリダイズし、かつ相互にハイブリダイズしない方法。
【請求項６３】
捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションが連続的に行われる、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
段階ａ）および段階ｂ）が同時に行われる、請求項６２記載の方法。
【請求項６５】
ブロッカープローブを加える段階をさらに含み、該ブロッカープローブはハイブリダイズされていない過剰の捕捉配列プローブにハイブリダイズする、請求項６２記載の方法。
【請求項６６】
ブロッカープローブの添加およびハイブリダイゼーション段階が同時に行われる、請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
ブロッカープローブの添加および結合段階が同時に行われる、請求項６５記載の方法。
【請求項６８】
シグナル配列プローブが一本鎖である、請求項６２記載の方法。
【請求項６９】
捕捉配列プローブが少なくとも１つのリガンドで修飾されている、請求項６２記載の方法。
【請求項７０】
リガンドがビオチンである、請求項６２記載の方法。
【請求項７１】
捕捉配列プローブが５’末端および３’末端を有する線状であり、その５’末端および３’末端の両方がビオチン化されている、請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブが標的核酸の領域にハイブリダイズし、その領域の隔たりが３キロベース未満である、請求項６２記載の方法。
【請求項７３】
捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブが標的核酸の領域にハイブリダイズし、その領域の隔たりが５００ベース未満である、請求項６２記載の方法。
【請求項７４】
捕捉配列プローブが、標的核酸の異なる領域または異なる標的分子に相補的な２つまたはそれ以上の配列の融合体である、請求項６２記載の方法。
【請求項７５】
形成される二本鎖ハイブリッドがＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである、請求項６２記載の方法。
【請求項７６】
ハイブリダイゼーション段階の前に一本鎖ＤＮＡを形成する段階をさらに含む、請求項６２記載の方法。
【請求項７７】
捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションが連続的に行われる、請求項６２記載の方法。
【請求項７８】
段階ａ）および段階ｂ）が同時に行われる、請求項６２記載の方法。
【請求項７９】
ブロッカープローブが捕捉配列プローブの融解温度より低い融解温度を有する、請求項６３記載の方法。
【請求項８０】
固相がストレプトアビジンでコーティングされている、請求項６３記載の方法。
【請求項８１】
固相がマイクロプレートである、請求項７３記載の方法。
【請求項８２】
段階ｂ）が約２０℃〜９０℃で実行される、請求項６２記載の方法。
【請求項８３】
捕捉配列プローブが少なくとも６ベースの長さを含む、請求項８２記載の方法。
【請求項８４】
段階ｂ）が室温で実行される、請求項６２記載の方法。
【請求項８５】
結合ハイブリッドが、ハイブリッドを認識する抗体を使用して検出される、請求項６２記載の方法。
【請求項８６】
ハイブリッドがＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである、請求項８５記載の方法。
【請求項８７】
ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを認識する抗体がアルカリホスファターゼで標識されている、請求項８５記載の方法。
【請求項８８】
シグナル配列プローブが欠失した捕捉配列プローブ領域を含み、かつ標的核酸に相補的である、請求項６２記載の方法。
【請求項８９】
標的核酸が一塩基多型である、請求項６２記載の方法。
【請求項９０】
ハイブリッドの固相への結合の特異性が、室温より高い温度によって調節される、請求項８９記載の方法。
【請求項９１】
ハイブリッドの固相への結合の特異性が、ブロッカープローブの添加によって調節される、請求項８９記載の方法。
【請求項９２】
ハイブリッドの固相への結合の特異性が、室温より高い温度およびブロッカープローブの添加によって調節される、請求項８９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般的には、核酸の検出方法の分野に関連し、より詳しくは、標的特異的ハイブリッド捕捉法による核酸の検出に関連する。
【０００２】
発明の背景
生物学的試料に存在する特定の核酸配列の検出は、微生物の同定および分類、感染性疾患の診断、遺伝的異常の検出および特性化、癌に関連する遺伝子変化の同定、疾患に対する遺伝的感受性の研究、ならびに様々な治療の型に対する反応の測定にとって重要である。特定の核酸配列を検出することおよび定量することについての共通の技術は、核酸ハイブリダイゼーションである。
【０００３】
様々なハイブリダイゼーション法は、核酸の検出および研究に利用可能である。従来のハイブリダイゼーション法において、同定されうる核酸は、溶液中かまたは固体担体に付着しているかのいずれかである。核酸は、その核酸にハイブリダイズすることができる標識化核酸プローブを用いて検出される。最近、新しいハイブリダイゼーション法が開発され、検出の感度および特異性が増大した。一つの例は、米国特許出願第０７／７９２，５８５号において記載されているハブリッド捕捉法である。これらの新しいハイブリダイゼーション法は従来の方法を超える著しい進歩を提供しているが、高い相同性をもつ核酸配列の間を完全に識別する能力にまだ欠けている。
【０００４】
それゆえ、迅速および高感度だけでなく、特異性が高く、かつ高い相同性をもつ核酸標的配列を識別することが可能であるハイブリダイゼーション法を提供することが、本発明の目的である。
【０００５】
発明の概要
本発明は、本明細書において、標的特異的ハイブリッド捕捉（「ＴＳＨＣ」）と呼ばれる、新規な核酸検出方法を提供する。ＴＳＨＣは、高い相同性をもつ核酸標的配列を識別および検出することができる、高特異性および高感度の方法である。
【０００６】
一つの態様において、方法は標的核酸の検出に関連し、標的される一本鎖または部分的一本鎖の核酸が、捕捉配列プローブおよび非標識化シグナル配列プローブに同時に、または連続的にハイブリダイズされる。これらのプローブは、標的核酸の重複しない領域にハイブリダイズし、かつ相互にハイブリダイズしないで、二本鎖ハイブリッドが形成される。ハイブリッドは固相上へ捕捉されて、検出される。好ましい態様において、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、標的核酸およびシグナル配列プローブの間で形成される。この方法を用いて、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを認識することができる標識化抗体をその二本鎖ハイブリッドに結合し、それによりそのハイブリッドを検出することにより、検出が達成されてもよい。
【０００７】
もう一つの態様において、検出方法で使用されるシグナル配列プローブは、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖、および一本鎖または部分的一本鎖の標的核酸にハイブリダイズすることができる一本鎖の核酸配列を含む核酸分子である。検出は、例えば、シグナル配列プローブのＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖部分を認識できる標識化抗体を結合し、それにより、標的核酸、捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブの間に形成されるハイブリッド検出することにより、達成されてもよい。
【０００８】
さらにもう一つの態様において、検出方法に使用されるシグナル配列プローブは、一本鎖または部分的一本鎖の標的核酸にハイブリダイズすることができる配列を含まない分子である。シグナル配列プローブにハイブリダイズすることができる配列と同様に標的核酸にハイブリダイズすることができる配列を含む架橋プローブが使用される。この態様において、シグナル配列プローブは、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖部分および架橋プローブ内の配列に相補的な配列を含む一本鎖ＤＮＡ配列部分を含む。標的核酸およびシグナル配列プローブの両方にハイブリダイズする架橋プローブは、それゆえに、標的核酸および標的核酸にハイブリダイズした捕捉配列プローブへシグナル配列プローブを結合するための中間体としての役割を果たす。
【０００９】
本発明のＴＳＨＣ法のもぅ一つの態様において、捕捉配列プローブに相補的なオリゴヌクレオチドを含むブロッカープローブが、過剰の捕捉配列プローブを排除し、それにより検出におけるバックグラウンドシグナルを低下させかつアッセイ法の特異性を増大させるために、その方法に使用される。
【００１０】
本発明はまた、新規なプローブにも関連する。これらのプローブは、例えば、ＴＳＨＣアッセイ法を含む、様々なハイブリダイゼーションアッセイ法において機能できる核酸配列である。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、試験試料において核酸の存在を検出するための方法を提供する。より詳しくは、本発明は、高い相同性をもつ核酸配列を識別および検出できる高特異性および高感度の方法を提供する。本発明についての好ましい使用は、当業者によく知られており、限定されるものではないが、挿入、欠失、逆位、反復配列、および一塩基多型（ＳＮＰ）と同様に複数のものも含む様々な突然変異の検出および識別に適用されうる。さらに、本発明は、類似の配列エレメントを共有する核酸標的の検出のための群特異的でもありうる。
【００１２】
精製または未精製の形での任意の核酸の供給源を試験試料として利用することができる。例えば、試験試料は、食物もしくは農業生産物、またはヒトもしくは獣医学臨床検体であってもよい。典型的には、試験試料は、尿、血液、血漿、血清、唾液などのような生物学的液体である。または、試験試料は、対象の核酸を所有することが疑われる組織検体であってもよい。試験試料における標的核酸は、検出されうる配列が核酸全体を構成しているような分離した分子として最初に存在していてもよいし、またはより大きな分子の成分にすぎなくてもよい。検出されうる核酸配列は純粋な形で最初に存在する必要はない。試験試料は、核酸の複合混合物を含み、それらのうちの標的核酸が、全ヒトゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡに含まれる対象の遺伝子、または生物体が臨床試料の微量成分である病原性生物体の核酸配列の部分に相当してもよい。
【００１３】
試験試料における標的核酸は、細菌、酵母、ウイルス、および植物もしくは動物のような高等生物体の細胞もしくは組織を含む任意の源由来のＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡのようなＲＮＡであることができる。そのような核酸の抽出および／または精製のための方法は、当技術分野においてよく知られている。標的核酸は、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。本方法において、標的核酸は一本鎖、またはその方法のハイブリダイゼーション段階の前に通常の変性技術により一本鎖にさせられることが好ましい。好ましい態様において、二本鎖標的ＤＮＡを変性させるために塩基変性技術が用いられる。
【００１４】
本明細書において用いられる場合の「オリゴヌクレオチド」という用語は、２個またはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む核酸分子を指す。所望のオリゴヌクレオチドは、天然に存在する核酸からの精製のような任意の適する方法、分子生物学的方法、または新規合成により、調製されうる。オリゴヌクレオチドの例は、本明細書に記載されている核酸プローブである。
【００１５】
核酸プローブは、試験試料において相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ配列にハイブリダイズする検出可能な核酸配列である。プローブの検出は、試験試料において特定の核酸配列の存在を示す。一つの態様において、標的特異的ハイブリッド捕捉法は２つの型の核酸プローブ：捕捉配列プローブ（ＣＳＰ）およびシグナル配列プローブ（ＳＳＰ）を使用する。捕捉配列プローブは、標的核酸内の固有の配列にハイブリダイズすることおよび固相上へ捕捉されることができる核酸配列を含む。シグナル配列プローブは、ＣＳＰにより認識される固有の領域に隣接している標的核酸内の領域にハイブリダイズすることができる核酸配列を含む。ＣＳＰおよびＳＳＰの配列は、それらが標的核酸の同じ領域に、または相互にハイブリダイズしないように選択される。
【００１６】
さらに、ＣＳＰおよびＳＳＰは、互いの５０，０００塩基内で標的の領域にハイブリダイズするように選択される。ＣＳＰが標的核酸内でハイブリダイズする配列とＳＳＰがハイブリダイズする配列との間の距離は、好ましくは、１〜５０，０００塩基の間、より好ましくは、距離は３，０００塩基未満である。最も好ましくは、距離は１，０００塩基未満である。
【００１７】
検出方法に使用されるＣＳＰは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック化核酸（ＬＮＡ）、または他の核酸類似体であることができる。本明細書において定義される場合の「ロック化核酸」とは、高い熱安定性および選択性を有する相補ＤＮＡおよびＲＮＡで二重鎖を形成する新規なクラスのオリゴヌクレオチド類似体である。標準ヌクレオシドでのフラノース環の通常の立体配置的自由は、２’−Ｏ位を４’−Ｃ位へ結合するメチレンリンカーのためにＬＮＡにおいて制限される。ＰＮＡは、糖−リン酸骨格がポリアミドまたは「偽ペプチド」骨格に置換されているオリゴヌクレオチドである。好ましい態様において、ＣＳＰはＤＮＡである。ＣＳＰは最小限６塩基の長さをもち、好ましくは１５〜１００塩基長、およびより好ましくは２０〜４０塩基長である。ＣＳＰは、それがハイブリダイズする標的核酸内の配列に実質的に相補的である。ＣＳＰの配列は、標的ハイブリダイゼーション領域に、好ましくは少なくとも７５ ％相補的であり、より好ましくはこの配列に１００ ％相補的である。ＣＳＰは、試験試料に存在するものと考えられている所望しない配列に、７５ ％未満または同等の配列同一性、より好ましくは５０ ％未満の配列同一性を含むことがまた好ましい。ＣＳＰが結合する標的核酸内の配列は、好ましくは６塩基長、より好ましくは２０〜４０塩基長である。ＣＳＰがハイブリダイズする配列は、固有の配列または群特異的配列であることがまた好ましいかもしれない。群特異的配列は、別々の群を形成する複数関連性配列である。
【００１８】
一つの態様において、検出方法に使用されるＣＳＰは、固相上へのプローブの特異的捕捉を可能にする、核酸における１つまたは複数の修飾を含んでもよい。例えば、ＣＳＰは、例えば、ニックトランスレーション、化学的または光化学的取り込みを含む、当業者によく知られた方法により、少なくとも１つのリガンドでそれをタグ付けすることにより修飾されてもよい。さらに、ＣＳＰは、複数の位置に１つまたは複数の型の標識でタグ付けされてもよい。例えば、ＣＳＰは、ストレプトアビジンに結合するビオチン；または抗ジゴキシゲニンに結合するジゴキシゲニン；または抗−ＤＮＰに結合する２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）で、タグ付けされてもよい。発蛍光団もまたプローブを修飾するために使用することができる。発蛍光団の例は、フルオレセインおよび誘導体、フィコエリトリン、アロ−フィコシアニン、フィコシアニン、ローダミン、テキサスレッドまたは他の有標発蛍光団を含む。発蛍光団は、一般的に化学的修飾により付着し、かつ抗フルオレセインのような発蛍光団特異的抗体に結合する。ＣＳＰがまた、特異的抗体により認識可能な任意の化学基を含む修飾化塩基の取り込みによりタグ付けされることもできることは、当業者により理解されるであろう。他のタグおよびヌクレオチド配列を基質でコーティングした固相上への捕捉のためにタグ付けする方法は、当業者によく知られている。核酸標識の概説は、ランデグレン（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ）ら、「ＤＮＡ診断学−分子技術と自動化（ＤＮＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４２：２２９〜２３７（１９８８）の論文に見出されうり、参照として本明細書に組み入れられている。一つの好ましい態様において、ＣＳＰは、ヌクレオチド配列の５’末端および３’末端の両方にビオチンでタグ付けされる。もう一つの態様において、ＣＳＰは修飾されずに、固体マトリックスへハイブリダイゼーションの可能なＣＳＰに含まれる配列によって、そのマトリックス上へ捕捉される。
【００１９】
検出方法に使用されるＳＳＰはＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。本発明の一つの特定の態様において、ＳＳＰおよび標的核酸はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを形成する。それゆえ、この態様において、標的核酸がＤＮＡである場合には、好ましいＳＳＰはＲＮＡである。同様に、標的核酸がＲＮＡである場合には、好ましいＳＳＰはＤＮＡである。ＳＳＰは一般的に、少なくとも１５塩基長である。しかしながら、ＳＳＰは１０００塩基長に達するまたはそれ以上であってもよい。より長いＳＳＰが好ましい。ＳＳＰは、単一の核酸断片、または各断片が好ましくは長さが１５〜１００塩基の間である複数のより小さな核酸断片を含んでもよい。
【００２０】
もう一つの態様において、検出方法に使用されるＳＳＰは、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖および標的核酸にハイブリダイズすることができる一本鎖核酸配列を含む（図６Ａ）。ＳＳＰは、最初、標的核酸内の配列に相補的な一本鎖ＤＮＡ配列を一本鎖ＤＮＡベクターへクローニングし、その後、ＤＮＡベクター配列に相補的なＲＮＡをハイブリダイズしてＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖を生成することにより、調製されてもよい。例えば、Ｍ１３をＤＮＡベクターとして使用する場合には、Ｍ１３ ＲＮＡをベクター中のＭ１３ ＤＮＡ配列にハイブリダイズさせ、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖を生成させる。その結果生じるＳＳＰは、標的核酸内の配列にハイブリダイズすることができる一本鎖部分と同様に、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖部分も含む。一本鎖ＤＮＡは、少なくとも１０塩基長であるべきであり、１０００塩基長に達するまたはそれ以上であってもよい。または、ＳＳＰのＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖部分は、ＳＳＰの一本鎖部分が標的核酸にハイブリダイズされる反応の間または後に、形成されてもよい。ＳＳＰは、線状、環状、または２つまたはそれ以上の形の組み合わせであることができる。ＳＳＰのＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖部分は、本明細書に記載されているように、抗−ＤＮＡ／ＲＮＡ抗体を用いる捕捉されたハイブリッドの検出のための増幅されたシグナルを提供する。
【００２１】
さらにもう一つの態様において、検出方法に使用されるＳＳＰは、標的核酸にハイブリダイズすることができる配列を含まない分子である。この態様において、ＳＳＰにハイブリダイズすることができる配列と同様に標的核酸にハイブリダイズすることができる配列も含む架橋プローブが使用される。架橋プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック化核酸（ＬＮＡ）、または他の核酸類似体であることができる。一つの態様において（図６Ｂ）、ＳＳＰは、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖部分および架橋プローブ内の配列に相補的な配列を含む一本鎖部分を含む。標的核酸およびＳＳＰの両方にハイブリダイズすることができる架橋プローブは、それゆえに、ＳＳＰを標的核酸および標的核酸にハイブリダイズされているＣＳＰに結合するための中間体としての役目を果たす。もう一つの態様において（図６Ｃ）、検出方法に使用されるＳＳＰは、架橋プローブにハイブリダイズすることができる一本鎖ＲＮＡ配列と同様に複数組の反復配列も含む。反復配列に相補的な配列を含むＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブは、ＳＳＰにハイブリダイズしてシグナル増幅のために必要とされるＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を生成するために使用されてもよい。さらにもう一つの態様において（図６Ｄ）、架橋プローブは、標的核酸にハイブリダイズすることができる配列に加えて、ポリ（Ａ）テールを含む。この例に使用されるＳＳＰはポリ（ｄＴ）ＤＮＡ配列を含む。架橋プローブは、それゆえ、そのポリ（Ａ）テールを介してＳＳＰにハイブリダイズすることができる。ポリ（Ａ）配列を含むＲＮＡプローブは、ＳＳＰ内に残っているポリ（ｄＴ）ＤＮＡ配列にハイブリダイズしてＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を形成するために使用されてもよい。ポリ（ｄＴ）配列を含むＳＳＰおよびポリ（Ａ）配列を含むＲＮＡプローブは、好ましくは、１００〜５，０００塩基長である。
【００２２】
本発明の検出方法に使用されるＳＳＰは、修飾されない、またはＣＳＰについてのように、上記および／または当技術分野において公知の方法を用いて修飾されることができる。好ましい態様において、ＳＳＰは共有結合的に修飾されていないプローブである。
【００２３】
複数のＣＳＰおよび／またはＳＳＰを本発明の検出方法において使用することができることは理解される。
【００２４】
もう一つの態様において、標的核酸の２つまたはそれ以上の別個の領域の相補的配列を含むオリゴヌクレオチドプローブは、いっしょに融合されて、本発明の方法において捕捉配列プローブとして使用される。または、単一または複数の標的核酸に相補的な配列を含む単一のプローブを設計かつ作製することができる。この型のプローブはまた、本明細書において、「融合化」ＣＳＰとも呼ばれる。実施例５において示されるように、融合化捕捉配列プローブは、同じ濃度で使用される場合、２つの非融合化ＣＳＰの組合わせと同じくらい効率的に働く。
【００２５】
本発明のさらなる態様において、「欠失核酸プローブ」をＴＳＨＣにおいて使用してもよい。構築する必要のある転写鋳型の数を最小限にするために、欠失核酸プローブ、例えばＲＮＡを１）使用されるプローブの長さを最長化する；および２）プローブがＣＳＰにより標的される領域で重複するのを妨げるように、設計する。これらの欠失プローブは、そのプローブを作製するために使用される核酸鋳型において内部欠失を含む。さらに、これらの欠失プローブは核酸標的にハイブリダイズして、ＣＳＰハイブリダイゼーションにとって接近しやすいハイブリダイズされていない核酸の「バブル（ｂｕｂｂｌｅ）」を形成する。この方法はまた、標的全体としての核酸を転写ベクターへクローニングし、その後、配列を、一度配列がＣＳＰハイブリダイゼーションに有用な領域として同定されれば、配列は取り除かれてもよいので、プローブを作製するためのとても便利な手段も提供する。さらに、この方法は、ＣＳＰと重複しない（すなわち、同じ領域にハイブリダイズしない）、ほぼ完全長の全ゲノムのプローブの使用を可能にする。転写鋳型内に標的される欠失を設計するために、いかなる市販の突然変異誘発キットが使用されうる。典型的には、ＳＳＰ合成に用いられる核酸鋳型の欠失は、転写ベクターにクローニングされる鋳型に直接的に行われる。鋳型における欠失は、ＣＳＰによりハイブリダイズされる領域に重複する配列を除去するように、作成される。欠失は、ＣＳＰ領域自体と同じくらい小さくてもよいが、一般的かつより好ましくは、ＣＳＰによりハイブリダイズされる領域の５’末端および３’末端における約１００〜３００個のヌクレオチドが欠失される（図７参照）。
【００２６】
本発明の核酸プローブは、例えば、化学的合成、天然に存在する源からの単離、組換え体生産および非対称的ＰＣＲ（ＭｃＣａｂｅ、１９９０、「ＰＣＲプロトコール：方法と適用の手引き（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、サンディエゴ、ＣＡ．、アカデミックプレス、７６〜８３）を含む、当技術分野において公知の任意の適する方法により作製されてもよい。１つまたは複数のセグメントとしてプローブを化学的に合成し、かつ続いてそのセグメントを連結することが好ましいかもしれない。いくつかの化学的合成法は、ナラング（Ｎａｒａｎｇ）ら、（１９７９， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８：９０）、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら、（１９７９， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８：１０９）およびカルターズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）ら、（１９８５， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４：２８７）により記載されており、参照として本明細書に組み入れられている。または、クローニング法により、プロモータープライマーとして使用するために単離されるうる便利な核酸断片を供給してもよい。二本鎖ＤＮＡプローブは、例えば、標的核酸へのハイブリダイゼーションの前に通常の変性方法を用いて、まず第一に、一本鎖にさせられる。
【００２７】
ハイブリダイゼーションは、当業者によく知られている標準的ハイブリダイゼーション条件下で行われる。プローブの核酸配列へのハイブリダイゼーションについての反応条件は、プローブによって変化し、プローブの長さ、配列におけるＧおよびＣのヌクレオチドの数、およびハイブリダイゼーション反応に使用される緩衝液の成分のような要素に依存している。適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、完全塩基対二本鎖ＤＮＡの融解温度以下である約２５℃に調節することのように、当業者により一般的に理解されている。より高い特異性は、一般的に、より高い温度をもつインキュベーション条件、換言すれば、よりストリンジェントな条件を用いることにより達成される。よく知られているサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らの実験マニュアル、「分子クローニング：実験マニュアル（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ）」、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９９０）の１１章（参照として本明細書に組み入れられている）には、特異性のあるハイブリダイゼーションを保証するために必要な、関係する因子およびストリンジェンシーのレベルの記載を含め、極めて詳細にオリゴヌクレオチドプローブについてのハイブリダイゼーション条件を記載している。ハイブリダイゼーションは典型的には、緩衝水溶液中で行われ、温度、塩濃度、およびｐＨのようなそれのための条件は、プローブがいかなる他の配列でもなく、それらそれぞれの標的核酸配列に特異的にハイブリダイズするように十分なストリンジェンシーを与えるように選択される。
【００２８】
一般的に、プローブおよび標的の間でのハイブリダイゼーションの効率は、添加されるプローブの量が鋳型に対してモル過剰であり、好ましくは２〜１０６モル過剰量、より好ましくは１０３〜１０６モル過剰量である条件下で向上する。効率的な捕捉のために供給される各ＣＳＰの濃度は、最終ハイブリダイゼーション溶液において少なくとも２５ ｆモル／ｍｌ（２５ ｐＭ）、好ましくは２５ ｆモル／ｍｌ〜１０４ ｆモル／ｍｌ（１０ ｎＭ）の間である。各ＳＳＰの濃度は、最終ハイブリダイゼーション溶液において少なくとも１５ ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１５０ ｎｇ／ｍｌである。表Ａはｎｇ／ｍｌで表示されるＳＳＰ濃度のモル基準への換算を示す。
【００２９】
【表Ａ】ＳＳＰ濃度のｎｇ／ｍｌからｆモル／ｍｌへの換算
2004511220.tif 000002
【００３０】
標的核酸へのＣＳＰおよびＳＳＰのハイブリダイゼーションは、同時に、または連続してどちらかの順で、行われてもよい。一つの態様において、標的核酸へのＣＳＰのハイブリダイゼーションおよびＳＳＰのハイブリダイゼーションは同時に行われる。形成されたハイブリッドはその後、ＣＳＰに付着しているリガンドが特異性をもって結合する基質によりコーティングされている固相上に捕捉される。もう一つの態様において、ＳＳＰの標的核酸へのハイブリダイゼーションは、ＣＳＰの標的核酸へのハイブリダイゼーションの後に行われる。この場合、ＣＳＰは、ハイブリダイゼーションの前または後に、固相に固定化されてもよい。この態様において、ＣＳＰおよび標的の両方がＳＳＰハイブリダイゼーション反応の間に固相へ結合されてもよい。最も好ましくは、ＣＳＰおよびＳＳＰは標的核酸にハイブリダイズされて、ハイブリダイズされた複合体を形成し、該複合体がその後、ＣＳＰに付着しているリガンドが特異性をもって結合する基質によりコーティングされている固相上へ捕捉される。
【００３１】
付加された特異性および感度をもって特異的ポリヌクレオチド配列を同定および検出するために、条件が、シグナル検出を増強しかつバックグラウンド干渉を低下するのに最適であるように、アッセイ法を設計することができる。ストリンジェンシーの加算を達成するための好ましい方法は、ＴＳＨＣ加熱化捕捉段階および／またはブロッカープローブの使用による段階を含む。ＣＳＰ、ＳＳＰ、および標的核酸を含むハイブリダイズされた複合体の捕捉効率はいくつかのアッセイ条件により影響されるため、加熱化捕捉は偽反応性を低下させ、かつ少なくとも１つのヌクレオチドの突然変異を検出するのに有用でありうる。好ましくは、加熱化捕捉法は一塩基多型の検出のために用いられる。簡単には、ハイブリダイズされた複合体を捕捉するまたは固相へ結合するための加熱化捕捉法では、温度の範囲を上昇させて利用している。ハイブリダイゼーションに続いてＣＳＰハイブリダイズ化標的を固定するために、ハイブリダイゼーション溶液を例えば、９６ウェルのプレートのウェルの中へ置き、そして１１００ ｒｐｍｓの振盪で、２０℃から９０℃の範囲の温度で１５分間〜２時間、プレートを振盪する。選択的に、１１００ ｒｐｍｓでの振盪で１時間、室温でハイブリダイゼーションを行うのが好ましいかもしれない。室温より上の捕捉温度は、ハイブリダイゼーション（および「乱交雑（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）ハイブリダイゼーション」）がプレート捕捉段階の間に起こってしまうようなストリンジェンシーのレベルを上げるために好ましいかもしれない。より高度の特異性および感度を得るためのもう一つの方法は、ブロッカープローブの使用による。
【００３２】
本発明の一つの態様において、ハイブリダイズされたＳＳＰおよび標的核酸の複合体を同時にかまたは連続してのいずれかで、固相に固定化されたＣＳＰに捕捉するために温度を上昇させて用いる加熱化捕捉法が提供され、その上昇した温度により、ＣＳＰの非特異的ハイブリダイゼーションがプレート捕捉段階の間に起こるのを防ぐ。上昇した温度はまた、ＳＳＰハイブリダイゼーション特異性にも影響を及ぼす。ＴＳＨＣに使用されるＣＳＰは、核酸または修飾化核酸であってもよく、好ましくは固相上へ捕捉させるよう修飾を含むＤＮＡである。そのような修飾の一つの例は、ビオチン標識であり、より好ましくは複数のビオチン標識である。ＣＳＰは最小限６塩基対を含み、好ましくは６５℃より上の好ましい融解温度（Ｔｍ）をもつ１６〜５０塩基を含む。好ましいＣＳＰは試料に存在する核酸の標的分子内の固有の配列に相補的な配列を含んでいてもよいが、これは複数の核酸種を標的するのに必要ない。例えば、遺伝子ファミリーが標的の場合には、ＣＳＰは、好ましくは、遺伝子ファミリーの１つまたは複数のメンバーに共通の配列エレメントを含んでもよい。ほとんどの適用について、ＣＳＰは好ましくは、試料に存在することが疑われる所望しない標的に対して、多くとも７５ ％、より好ましくは５０ ％未満の配列同一性を含む。アッセイ法は、たった１個のヌクレオチドにおいて異なり、かつたった１個のヌクレオチドにおいて異なる標的を選択的に検出するＣＳＰを利用することができる。この識別の程度を加熱化プレート捕捉段階を用いることにより促進することができる。ＣＳＰハイブリダイゼーションが溶液中で行われる場合、試料を続いて捕捉のために固相と反応させる。例えば、ビオチン標識化ＣＳＰが使用される場合には、アビジンまたは何か他のビオチン結合性タンパク質が捕捉のために固相をコーティングするのに使用されてもよい。本発明のもう一つの態様は、同時に起こるハイブリダイゼーションおよび捕捉を含み、ハイブリダイゼーションは捕捉固相上、例えば、捕捉プレート上で直接的に行われる。
【００３３】
本発明のさらにもう一つの態様において、ＴＳＨＣ法はＳＮＰを有する核酸標的を識別および検出するために用いられることができる。このハイブリッド捕捉一塩基多型（ＨＣ−ＳＮＰ）検出方法は、高感度および高特異性でＳＮＰを検出することができる。ＳＮＰを有する核酸標的を識別および検出するためのＴＳＨＣの拡張された能力を説明する実施例は本明細書に記載されているが、シグナル配列プローブ（ＳＳＰ）、および標的核酸分子に加えて、標識化において、捕捉オリゴヌクレオチド（ＣＳＰ）が使用される。ＣＳＰは核酸標的をハイブリダイズしかつ固相または表面（例えば、９６ウェルプレート）に捕捉しうる。標識方法は当技術分野においてよく知られており、標的核酸の固定化を促進するためにもまた用いられうる。
【００３４】
一つの態様において、標的核酸の捕捉は、ＣＳＰ上のビオチンと固体表面上のストレプトアビジンとの間での高親和性相互作用によって達成される。同時に、ＤＮＡ標的に相補的でかつ捕捉領域について重複しないＲＮＡシグナル配列プローブ（ＳＳＰ）はＤＮＡ標的にハイブリダイズされる。ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、アルカリホスファターゼで標識されたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに対して指向性のある抗体により認識される。この例において、化学発光のリン酸化基質がその後添加され、引き続き、活性化基質が照度計により検出および測定されうる。シグナルノイズ比は既知の陰性対照を用いて測定される。さらに、標的の濃度を、標準物質として既知の濃度の標的分子を使用することにより測定することができる。ハイブリッドを固相へ結合および捕捉することの特異性は、室温より高い温度、ブロッカープローブの添加、または室温より高い温度とブロッカープローブの添加とにより、調節、制御、または調整される。ストリンジェンシーを加算するために、ブロッカープローブを加熱化捕捉法と共にかまたは伴わずにのいずれかで、使用してもよい。または、捕捉段階は室温で行われてもよく、選択的にブロッカープローブを利用してもよい。
【００３５】
本発明のもう一つの態様はさらに、多くの場合、加熱化捕捉段階の必要性を取り除く、ブロッカーオリゴヌクレオチド法を提供する。これは、室温でオリゴヌクレオチドを捕捉するためにブロッカーオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、それにより捕捉段階の間にＣＳＰの所望しない標的へのさらなるハイブリダイゼーションを防ぐことにより達成されうる。捕捉プローブは、好ましくは、捕捉プローブに相補的なブロッカープローブの存在を必要としてもよい。ブロッカープローブの長さは、完全長ＣＳＰに相補的なブロッカーからＣＳＰの小さな部分のみに相補的なとても短いブロッカーまで変化することができる。例えば、ブロッカープローブはＣＳＰの長さより４〜１０塩基対短くありえる。ブロッカープローブの存在によりバックグラウンドが低下し、より高い感度が可能になる。加熱化捕捉段階およびブロッカープローブは、別々にまたは共にのいずれで使用されてもよく、ハイブリッドを固相へ結合および捕捉することの特異性は、室温より高い温度およびブロッカープローブの添加により、調節、制御、または調整される。
【００３６】
固相またはマトリックスには、例えば、プレート、スライド、皿、ビーズ、粒子、微粒子、コップ、ストランド、チップおよびストリップの形状で、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートまたは任意の固いプラスチック材が含まれることは、当業者により理解されるものと思われる。固相はまた、ガラスビーズ、ガラス試験管および任意の他の適当なガラス製品を含む。表面がカルボキシル基、アミノ基、ヒドラジド基、アルデヒド基、核酸またはヌクレオチド誘導体を含むように修飾されたプラスチックまたはガラスのような機能的にされた固相もまた使用することができる。プラスチックもしくはガラスの微粒子、ビーズ、ストリップ、試験管、スライド、ストランド、チップまたはマイクロタイタープレートのような任意の固相を使用することができる。
【００３７】
一つの好ましい態様において、ＣＳＰはビオチンで標識され、かつハイブリッドを捕捉するためにストレプトアビジンコーティング化またはアビジンコーティング化固相が使用される。さらに好ましくは、ストレプトアビジンコーティング化マイクロタイタープレートが使用される。これらのプレートは受動的にまたは共有結合的にコーティングされてもよい。
【００３８】
捕捉されたハイブリッドは、ハイブリッドに特異的な標識化ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、ＳＳＰに付着した１つもしくは複数のリガンドに特異的な抗体、標識化抗体、またはＳＳＰ自体の検出可能な修飾を用いる等の、当技術分野においてよく知られた通常の手段により検出されうる。
【００３９】
一つの好ましい検出方法は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに結合することができる抗体（本明細書では「ＲＮＡ／ＤＮＡ抗体」と呼ばれる）を使用することにより捕捉されたハイブリッドを検出する。この態様において、抗ＲＮＡ／ＤＮＡ抗体は、好ましくは、酵素、蛍光分子またはビオチン−アビジン接合体で標識され、かつ非放射性である。標識は、比色計、照度計、または蛍光検出器のような当技術分野において公知の通常の手段により直接的または間接的に検出することができる。一つの好ましい標識は、例えば、アルカリホスファターゼである。当業者に公知の他の標識もまた、結合した二本鎖ハイブリッドを検出する手段として使用されうる。
【００４０】
捕捉されたハイブリッドの検出は、好ましくは、接合型抗体をインキュベーション段階の間にハイブリッドに結合することにより達成される。その後、いかなる過剰な接合体を除去するために表面を洗浄する。これらの技術は当技術分野において公知である。例えば、手作業での洗浄は、５０ ｍｌのＣｏｍｂｉｔｉｐ（商標）を有するＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）リピートピペッター（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、ハンブルグ、ドイツ）、コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）リピート洗浄器（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、コーニング、ＮＹ）、バリオスタットまたは付属チューブを有するリザーバからの重力流により制御される単式ポンプのいずれかを用いて行ってもよい。ソースサイエンティフィックシステムズ（Ｓｏｕｒｃｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（ガーデングローヴ、ＣＡ）から入手できる商業的に入手可能なチューブ洗浄システムもまた使用できる。
【００４１】
結合された接合体は、続いて、当技術分野において通常に使用される方法、例えば、比色またはカウトリー（Ｃｏｕｔｌｅｅ）ら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２７：１００２〜１００７（１９８９）に記載されているような化学発光により検出される。好ましくは、結合されたアルカリホスファターゼ接合体は、アルカリホスファターゼにより活性化されうる基質を添加することにより、化学発光により検出される。アルカリホスファターゼにより活性化される化学発光性基質は、当技術分野においてよく知られている。
【００４２】
もう一つの態様において、本発明の標的特異的ハイブリッド捕捉法は、ＣＳＰおよびＳＳＰに加えて、ブロッカープローブを使用する。ブロッカープローブは、ＣＳＰの配列に相補的である配列を含む。ブロッカープローブの配列は、好ましくはＣＳＰの配列に少なくとも７５ ％相補的、より好ましくは、ＣＳＰに１００ ％相補的である。ブロッカープローブをハイブリダイゼーション反応混合物へ添加することにより、ハイブリダイズされていないＣＳＰが標的に存在する交差反応性核酸配列にハイブリダイズすることを防ぎ、そのために検出の特異性が増大する。
【００４３】
ブロッカープローブは、一般的に少なくとも５塩基長、好ましくは１２塩基長である。ハイブリダイゼーション反応におけるブロッカープローブの濃度は、好ましくは、ＣＳＰおよびＳＳＰのそれを超過する。好ましくは、ブロッカープローブは２倍のモル超過量で存在するが、１０，０００倍モル超過量まで存在してもよい。ブロッカープローブはＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）または他の核酸類似体であることができる。
【００４４】
一つの態様において、完全長または完全長に近いＣＳＰに相補的なブロッカープローブを使用する。ＣＳＰ、ＳＳＰおよび標的核酸の間にハイブリッドが形成される反応に続いて、一つまたは複数のブロッカープローブをその反応に添加してもよく、ハイブリダイゼーションを望ましい時間、続ける。ハイブリダイゼーション生成物は、その後、上記のように検出される。
【００４５】
もう一つの態様において、ＣＳＰの部分のみに相補的でかつＣＳＰより短いブロッカープローブを使用する。これらのブロッカープローブはＣＳＰより低い融解温度をもつ。好ましくは、ブロッカープローブの融解温度は、ＣＳＰのそれより１０度低い。この場合、ブロッカープローブは、好ましくは、標的核酸にＣＳＰおよびＳＳＰとともに同時に添加される。ブロッカープローブはＣＳＰより低い融解温度をもつため、ブロッカープローブがＣＳＰのその標的配列へのハイブリダイゼーションを干渉しないようにハイブリダイゼーションの初期温度を選択する。しかしながら、ハイブリダイゼーション混合物の温度が標的ハイブリダイゼーションについて用いられる温度より低く調整される場合、ブロッカープローブはＣＳＰにハイブリダイズして、ＣＳＰが交差反応性核酸配列にハイブリダイズするのを効率的にブロックする。例えば、ハイブリダイゼーション生成物をハイブリッド捕捉の間、ストレプトアビジンコーティング化マイクロタイタープレート上で、室温でインキュベートする時に、ブロッカープローブを添加してもよい。
【００４６】
以下の実施例は、本増幅方法および本検出アッセイ法および本キットの使用を説明する。これらの実施例は例証として提供され、いずれの様式においても本発明の範囲を限定するものではない。本明細書に記載されているすべての引用文献は、参照として全部、明白に組み入れられている。
【００４７】
実施例１
標的特異的ハイブリッド捕捉（ＴＳＨＣ）アッセイ法プロトコール
既知の濃度の単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）および単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）ウイルス粒子（アドバンスドバイオテクノロジーズ社（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）、コロンビア、ＭＤ）または臨床試料を陰性対照培養液（Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｍｅｄｉａ）（ダイジーン社（Ｄｉｇｅｎｅ Ｃｏｒｐ．）、ゲーサーズバーグ、ＭＤ）または陰性子宮頸検体（Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ）（ダイジーン（Ｄｉｇｅｎｅ））のいずれかを用いて、希釈した。様々な希釈溶液を作製し、個々のミクロチューブへ等分した。変性試薬５１００−０４３１（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ ５１００−０４３１）（ダイジーン）の半量を添加した。試験試料を試料中の核酸の変性のために６５℃で４５分間インキュベートした。
【００４８】
変性に続いて、シグナル配列プローブ（ＳＳＰ）（各６００ ｎｇ／ｍｌ）および捕捉配列プローブ（ＣＳＰ）（各２．５ ｐモル／ｍｌ）を含むハイブリダイゼーション溶液を試料へ添加し、７４℃で１時間インキュベートした。４ｘプローブ希釈液（ダイジーン）の１容量を含む溶液中のブロッカープローブ、１容量の変性試薬、および２容量の陰性対照培養液をその後、ハイブリダイゼーション混合物へ添加し、７４℃で１５分間インキュベートした。
【００４９】
実験の第二シリーズにおいて、核酸の変性に続いて、ＳＳＰ（各６００ ｎｇ／ｍｌ）、ＣＳＰ（各２．５ ｐモル／ｍｌ）、およびブロッカープローブ（各２５０ ｐモル／ｍｌ）を含むハイブリダイゼーション混合液を試料へ添加し、７４℃で１時間インキュベートした。
【００５０】
反応混合物を含むチューブを室温で５分間冷却し、各チューブから一定分量を取り、９６ウェルのストレプトアビジン捕捉プレート（ダイジーン）の個々のウェルへ移した。プレートを１１００ ｒｐｍｓで１時間、室温で振盪した。その後、上清をデカントし、プレートをハイブリッド捕捉２洗浄緩衝液（Ｈｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ ２ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ）（ダイジーン）で２回洗浄し、残留洗浄緩衝液を除去するために一時的に逆さにした。アルカリホスファターゼ抗ＲＮＡ／ＤＮＡ抗体検出試薬−１（ＤＲ−１；ダイジーン）をその後、各ウェルに添加し、３０分間、室温（約２０℃〜２５℃）で、インキュベートした。その後、ウェルを以下の段階を含む多数の洗浄段階にさらした：１）室温でシャープ（Ｓｈａｒｐ）洗浄緩衝液（ダイジーン）で３回洗浄；２）加温ブロック上で６０℃で１０分間、シャープ洗浄緩衝液でプレートのインキュベーション；３）室温でシャープ洗浄緩衝液で２回洗浄；および４）室温でＳＮＭ洗浄緩衝液（ダイジーン）で１回洗浄。残留液体の除去に続いて、発光基質５１００−０３５０（ダイジーン）を各ウェルへ添加し、室温で１５分間インキュベートした。個々のウェルをその後、プレート照度計で読み取って相対光ユニット（ＲＬＵ）のシグナルを得た。
【００５１】
陰性対照培養液または既知のＨＳＶ陰性子宮頸検体を含む溶液を試験試料についての陰性対照として使用した。シグナルノイズ比（Ｓ／Ｎ）は、陰性対照の平均ＲＬＵに対する試験試料から得られる平均ＲＬＵの比として計算された。シグナルノイズ比を捕捉効率の測定および標的核酸の検出のための基準として使用した。２またはそれ以上のＳ／Ｎ値を自由裁量によって、陽性シグナルとして割り当て、一方、２未満のＳ／Ｎ値を陰性とみなした。１試料組内の実験の変動性の測定である変動係数（ＣＶ）は、反復試験の標準偏差を取り、それらを平均値で割り、そしてパーセント値を得るためにその値に１００を掛けることにより計算された。
【００５２】
実施例２〜実施例１３に記載されている実験において使用される捕捉配列プローブおよびブロッカープローブは、コック（Ｃｏｏｋ）ら（１９８８， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ．， １６：４０７７〜４０９５）により記載されている方法を用いて合成された。そうでないことを示さないかぎり、本明細書に記載されている実験において使用される捕捉配列プローブは、それらの５’末端および３’末端がビオチンで標識されている。
【００５３】
実施例２〜実施例１３に記載されている実験において使用されるシグナル配列プローブはＲＮＡプローブであるが、本発明は、ＲＮＡを含むＳＳＰに限定されない。これらのプローブはイスラエリ（Ｙｉｓｒａｅｌｉ）ら（１９８９， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １８０：４２〜５０）により記載されている方法を用いて調製される。
【００５４】
実施例２
以下の表は、実施例３〜実施例１３に記載されている実験において使用される様々なプローブを記載する。
【００５５】
【表１】ＨＳＶ−１プローブの由来するＨＳＶ−１クローン
2004511220.tif 000003
【００５６】
【表２】ＨＳＶ−２プローブの由来するＨＳＶ−２クローン
2004511220.tif 000004
【００５７】
【表３】ＨＳＶ−１についての捕捉配列プローブ
2004511220.tif 000005
2004511220.tif 000006
＊　括弧内の配列はＨＳＶへの指向性はない「テール（ｔａｉｌ）」配列である。
【００５８】
【表４】ＨＳＶ−１についてのブロッカープローブ
2004511220.tif 000007
【００５９】
【表５】ＨＳＶ−２についての捕捉配列プローブ
2004511220.tif 000008
【００６０】
【表６】ＨＳＶ−２についてのブロッカープローブ
2004511220.tif 000009
【００６１】
【表７】ＨＰＶについての捕捉配列プローブ
2004511220.tif 000010
2004511220.tif 000011
＊　括弧内の配列はＨＰＶへの指向性はない「テール（ｔａｉｌ）」配列である。
【００６２】
【表８】ＨＰＶについてのブロッカープローブ
2004511220.tif 000012
2004511220.tif 000013
【００６３】
実施例３
捕捉効率へのビオチン標識の大きさの影響
試験は、ＴＳＨＣ検出にとって捕捉配列プローブあたりのビオチン標識の最適な数を決定するために行われた。実施例１に記載されている一般的なＴＳＨＣ法を用いた。シグナルノイズ比（Ｓ／Ｎ）により測定される、１個、２個、または３個のビオチンで標識された捕捉配列プローブＦ１５Ｒの捕捉効率を試験した。使用されるシグナル配列プローブはＨ１９であった。表９に示されるように、捕捉配列プローブあたり２個のビオチンが最適の捕捉効率として十分であった。２個のビオチン標識を有する捕捉配列プローブを使用する場合、単一のビオチン標識された捕捉配列プローブと比較して、Ｓ／Ｎにおいて５０ ％以上の増加が観察された。捕捉配列プローブに３個目のビオチン標識を付加することにより、２個のビオチン標識捕捉配列プローブと比較してＳ／Ｎにおいて減少が生じた。
【００６４】
【表９】捕捉効率へのビオチン標識の程度の影響
2004511220.tif 000014
【００６５】
実施例４
捕捉効率へのＣＳＰおよびＳＳＰの標的部位間の距離の影響
捕捉効率への、ＨＳＶ−１標的核酸上の捕捉配列プローブ（ＣＳＰ）およびシグナル配列プローブ（ＳＳＰ）のハイブリダイゼーション部位間の距離の影響を評価した。ＳＳＰハイブリダイゼーション部位から０．２ ｋｂ、３ ｋｂ、１８ ｋｂ、３６ ｋｂ、および４６ ｋｂの位置にあるＨＳＶ−１標的核酸配列にハイブリダイズするＣＳＰを試験した。実施例１に記載されている一般的なＴＳＨＣ法を用いた。捕捉効率は、それぞれ、１００ ％、５０ ％、３０ ％、１９ ％および７ ％であった（表１０）。０．２ ｋｂから４６ ｋｂへ距離が増加するにつれて、相対的捕捉効率において一定の低下が観察された。
【００６６】
【表１０】捕捉効率への標的部位間の距離の影響
2004511220.tif 000015
【００６７】
実施例５
ＨＳＶ−１のＴＳＨＣ検出への融合化捕捉配列プローブの効果
ストレプトアビジンプレートの結合能力は、ウェルにつき二倍ビオチン化ＣＳＰで約２ ｐモルであることが測定された。ＣＳＰは二倍にビオチン標識されているので、ウェルの結合能力を超えないためには最大限８つのＣＳＰ（１つのＳＳＰにつき２つのＣＳＰ）が好ましい。提示された能力を上回るビオチン標識化捕捉配列プローブにおける少しの増加でも、いわゆる「フック効果」と呼ばれる、シグナルにおける減少を引き起こした。この「フック効果」を避けて、かつ４つ以上のＳＳＰ−ＣＳＰの組合わせの使用をなお可能にするために、（５’末端および３’末端を）いっしょに融合した２つのＣＳＰの配列を含む合成オリゴヌクレオチドの効果を試験した。融合化捕捉配列プローブは、独立的に機能して、固有の標的部位へのハイブリダイゼーションを行いうる。もう一つの態様において、融合化プローブは、いったんプローブが第一の部位にハイブリダイズすれば、本質的にゼロ次速度論での単分子反応であるため、恵まれた第二のハイブリダイゼーションでもって２つの標的部位へ結合しうる。ハイブリダイゼーションは１つまたは両方の機構により決定されてもよい。以前の実験では、２つのＣＳＰである、ＶＨ３およびＮＣ−１が、いっしょに使用される場合、個々のＣＳＰの約２倍のＳ／Ｎを与えることが示された。非融合化捕捉配列プローブＶＨ−３およびＮＣ−１は、５ ｐモル／ｍｌの全濃度に対して各２．５ ｐモル／ｍｌで使用され、融合化プローブＶＨ−４（ＶＨ−３およびＮＣ−１の融合）は２．５ ｐモル／ｍｌで使用された。表１１に示されるように、融合化プローブは２つの非融合化プローブの組合わせと同じくらいに効果的であった。それゆえ、融合化捕捉配列プローブを使用するＴＳＨＣ検出は、プレートのビオチン結合能力を超えることなく、シグナル配列プローブにより標的される核酸配列の数を少なくとも２倍にすることを可能にする。実験はまた、２．０未満のＳ／Ｎ値により示されているように、１０７ゲノムでＨＳＶ−２の交差反応性はないことを証明している。
【００６８】
【表１１】ＨＳＶ−１のＴＳＨＣ検出における融合化捕捉配列プローブ対非融合化の捕捉配列プローブの比較
2004511220.tif 000016
【００６９】
実施例６
ＨＳＶ−１のＴＳＨＣ検出における様々なＣＳＰおよびＳＳＰの捕捉効率
ＴＳＨＣによるＨＳＶ−１の検出において、４つのＨＳＶ−１特異的シグナル配列プローブ（ＳＳＰ）である、Ｈ１９、ＲＨ５Ｂ、ＲＨ３およびＲ１０のそれぞれについて捕捉配列プローブ（ＣＳＰ）の捕捉効率を評価した。捕捉配列プローブを設計するために用いられる基準は以下のとおりである：１）ＣＳＰハイブリダイゼーション部位は、ＨＳＶ−１核酸配列上においてＳＳＰハイブリダイゼーション部位の５’または３’のいずれかの１ ｋｂ以内、好ましくは０．５ ｋｂ以内である；および２）ＣＳＰは、１０塩基以上のＨＳＶ−２に相同的な配列のひと続きをもたず、ＨＳＶ−１に固有の配列を含む。ＣＳＰは、ＳＳＰハイブリダイゼーション部位に隣接する５’領域および３’領域を、好ましくは各ＳＳＰに対して５’ＣＳＰおよび３’ＣＳＰで標的するように設計された。オミガソフトウェア（Ｏｍｉｇａ ｓｏｆｔｗａｒｅ）（オックスフォードモレキュラーグループ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ）、キャンベル、ＣＡ）をそのような部位の同定における手段とした。ＣＳＰの融解温度（Ｔｍ）は、ＨＳＶについてのハイブリッド捕捉ＩＩ（Ｈｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ ＩＩ（ＨＣ ＩＩ））アッセイ法（ダイジーン）において用いられる７０℃〜７５℃のハイブリダイゼーション温度と同じになるように、７０℃〜８５℃の間であるように設計された。実施例１に記載されている一般的なＴＳＨＣ法を用いた。Ｈ１９について１１個のＣＳＰ（６つの異なる部位に結合する）、ＲＨ５Ｂについて６個のＣＳＰ（３つの固有の部位に結合する）、ＲＨ３について６個のＣＳＰ（６つの固有の部位に結合する）、およびＲ１０について２個のＣＳＰを試験した。表１２に示されるように、シグナル配列プローブＨ１９、ＲＨ５ＢおよびＲ１０について、効率的な捕捉配列プローブが見出された。
【００７０】
【表１２】ＨＳＶ−１のＴＳＨＣ検出のためのＣＳＰおよびＳＳＰ
2004511220.tif 000017
【００７１】
実施例７
ＨＳＶ−２のＴＳＨＣ検出における様々なＣＳＰおよびＳＳＰの捕捉効率
ＴＳＨＣによるＨＳＶ−２の検出において、４つのＨＳＶ−２特異的シグナル配列プローブ（ＳＳＰ）、Ｅ４Ａ、Ｅ４Ｂ、Ｅｉ８およびｉ８のそれぞれについて捕捉配列プローブ（ＣＳＰ）の捕捉効率を評価した。ＨＳＶ−２特異的捕捉配列プローブ（ＣＳＰ）は、それらがＨＳＶ−２特異的であるという必要条件を除いては、ＨＳＶ−１のＣＳＰと同じ基準に基づいて設計された。Ｅ４Ａについては４個のＣＳＰ、Ｅ４Ｂについては３個のＣＳＰ、ならびにＥｉ８およびｉ８については各２個のＣＳＰを試験した。実施例１に記載されている一般的なＴＳＨＣ法を用いた。表１３に示されるように、ｉ８およびＥｉ８について、効率的な捕捉配列プローブが見出された。
【００７２】
【表１３】ＨＳＶ−２のＴＳＨＣ検出のためのＣＳＰおよびＳＳＰ
2004511220.tif 000018
【００７３】
実施例８
ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の検出へのブロッカープローブの効果
捕捉段階を室温で起こるようにさせておきながら、ＴＳＨＣの交差反応性を低下させる試みにおいて、ブロッカープローブを使用する方法を開発した。ブロッカープローブは、検出のために使用される捕捉配列プローブ（ＣＳＰ）に相補的である配列を含む。これらの実験は、より低いストリンジェンシー条件、室温捕捉段階の間にしばしば遭遇する状況下において、ＣＳＰの試料中に存在する非標的核酸への非特異的ハイブリダイゼーションを防ぐために設計された。
【００７４】
一つの方法において、完全長または完全長に近い捕捉配列プローブに相補的なブロッカープローブを使用した。ブロッカープローブは、ＣＳＰおよびＳＳＰの標的ＤＮＡ分子へのハイブリダイゼーションが起こった後、ＣＳＰの割合に対して１０倍の超過量で反応混合物へ添加された。ブロッカープローブはＣＳＰと類似した融解温度をもつため、ＣＳＰを最初に標的核酸にハイブリダイズさせて、ＣＳＰの標的核酸へのハイブリダイゼーションが起こる前にブロッカープローブのＣＳＰへのハイブリダイゼーションが起こることを防ぐ。表１４に示されるように、ブロッカープローブの添加により、これらのプローブがＨＳＶ−１検出の感度に影響を及ぼすことなく、交差反応性における劇的な低下を生じた。ブロッカープローブを使用した場合、交差反応性のＨＳＶ−２（１０７ウイルス粒子／ｍｌ）の検出についてのＳ／Ｎは５．０から０．８へ減少した。
【００７５】
もう一つの方法において、ＣＳＰの部分のみに相補的でかつＣＳＰより短いブロッカープローブを使用した。ブロッカープローブは、室温より高いが、ＣＳＰの標的核酸へのハイブリダイゼーション温度より少なくとも１０℃低い融解温度をもつように設計された。これらのブロッカープローブはＣＳＰの標的核酸へのハイブリダイゼーション温度より低い温度でＣＳＰにハイブリダイズするため、ＣＳＰの標的核酸へのハイブリダイゼーション効率に影響を及ぼすことなく、ＣＳＰおよびＳＳＰと同時に反応へ添加されうる。これらの短い方のブロッカープローブは、室温捕捉段階の間に起こるより低い温度でＣＳＰにハイブリダイズすることにより、室温捕捉段階の間に機能する。表１５に示されるように、単一かまたは対のいずれか短い方のブロッカープローブを、ＣＳＰの割合に対して１００倍の超過量で添加することにより、ＨＳＶ−１検出の感度には影響を及ぼさず、交差反応性における劇的な低下が生じた。ブロッカープローブ無しで交差反応性のＨＳＶ−２（１０７ウイルス粒子／ｍｌ）を検出することについてのＳ／Ｎは、１０．６であったが、ブロッカープローブの添加により１．５未満または同等にまで低下した。
【００７６】
それゆえに、ブロッカープローブを利用する両方の方法は、交差反応性に実質的な低下をもたらす。低い方の融解温度をもつブロッカープローブを利用する第二の方法は、捕捉配列プローブと同時にブロッカープローブを添加することで検出方法についての余分な段階が必要とされなくなるため、好ましいかもしれない。
【００７７】
【表１４】捕捉プローブハイブリダイゼーション後に添加されるブロッカープローブのＴＳＨＣへの効果
2004511220.tif 000019
【００７８】
【表１５】捕捉プローブと同時に添加されるブロッカープローブのＨＳＶ−１のＴＳＨＣ検出への効果
2004511220.tif 000020
【００７９】
実施例９
ＴＳＨＣ検出がベクターバックグラウンドを低下させる
ＴＳＨＣアッセイ法は、ハイブリッド捕捉ＩＩ（ＨＣ ＩＩ）検出アッセイ法（ダイジーン）に関連することが多いベクター混入問題を排除する。ＨＣ ＩＩに使用されるＲＮＡシグナル配列プローブは線状化ベクター鋳型から作成されるので、いくらか残存している非線状化プラスミドＤＮＡによりベクター配列に特異的な追加的ＲＮＡプローブ配列の産生が生じる。ＨＣ ＩＩアッセイ法において、これらの読み過ごし（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）転写の結果として形成するＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドが抗体コーティング化プレート上に捕捉されて、シグナルを生じる。対照的に、ＴＳＨＣ法において、捕捉配列プローブにもまたハイブリダイズするそれらのＲＮＡ／ＤＮＡのみが検出される。したがって、ベクター関連配列のどの検出も排除される。ＨＳＶ ＨＣ ＩＩ試験（ダイジーン）において検出可能であることが知られているプラスミドＳＫ＋、ｐＢＲ３２２、ＤｇＺ、および１０６６を２つのＲＮＡシグナル配列プローブ（Ｈ１９およびＲＨ５ｂ）および２つの捕捉配列プローブ（ＶＨ−２およびＶＨ−４）を使用するＴＳＨＣアッセイ法において試験した。その後、ＲＮＡプローブの同一の組をＨＳＶ−１の検出についてのＨＣ ＩＩ法およびＴＳＨＣ法に使用した。実施例１に記載されている一般的なＴＳＨＣ法を用いた。表１６に示されるように、標準ＨＣ ＩＩにおけるシグナルノイズ比は１４〜４８の範囲であったが、ＴＳＨＣ法についてのシグナルノイズ比は試験されたすべてのプラスミドについて２未満であった。
【００８０】
【表１６】ＴＳＨＣ対ＨＣ ＩＩの検出におけるベクターバックグラウンド
2004511220.tif 000021
【００８１】
実施例１０
ＴＳＨＣによりＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２を検出することの感度および特異性
ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のＴＳＨＣ検出についての感度および分類識別力を実施例１に記載されているＴＳＨＣを用いて評価した。ＨＳＶ−１のＴＳＨＣアッセイ法において、シグナル配列プローブＨ１９およびＲＨ５Ｂ、捕捉配列プローブＨＺ−１、ＶＨ−２およびＶＨ−４、ならびにブロッカープローブＮＧ−７、ＮＧ−８、ＧＰ−３、ＧＰ−４およびＧＰ−１を使用した。ＨＳＶ−２のＴＳＨＣアッセイ法において、シグナル配列プローブｉ８およびＥｉ８、捕捉配列プローブＮＦ−１およびＮＦ−２、ならびにブロッカープローブＨＸ−４、ＨＸ−５およびＧＰ−８を使用した。ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のウイルス粒子は、陰性対照溶液を用いて様々な濃度に希釈された。図４および図５に示されるように、１０４のコピーのＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２のどちらも（４５０コピー／ウェル）、それぞれのアッセイにおいて検出されたが、１０８コピー／ｍｌ（４，５００，０００コピー／ウェル）までの濃度（１０８コピー／ｍｌを含める）で、交差反応性型のＨＳＶの検出は事実上なかった。このように、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のＴＳＨＣアッセイ法は、優れた感度（４５０ ＶＰ（ウイルス粒子）／ウェル）を維持しながら、１０，０００倍以上の識別範囲で２つのＨＳＶ型を区別することができる。
【００８２】
ＨＳＶ−１のＴＳＨＣアッセイ法は、少なくとも２ ｘ １０３ ＶＰ／ｍｌから５ ｘ １０３ ＶＰ／ｍｌの範囲にかけて検出の直線区域を示す（表１７）。アッセイ法の特異性は、２ ｘ １０７ウイルス粒子／ｍｌ〜５ ｘ １０７ウイルス粒子／ｍｌほどの高い濃度のＨＳＶ−２を含む試料において交差反応性が検出されなかった（Ｓ／Ｎが２未満または同等）くらいに優れている。同様に、ＨＳＶ−２のＴＳＨＣアッセイ法もまた優れた特異性を示し、５ ｘ １０７ウイルス粒子／ｍｌほどの高い濃度のＨＳＶ−１を含む試料において交差反応性が検出されなかった（表１８）。同様の結果は、ＨＳＶ−２およびＨＳＶ−１のウイルスの希釈シリーズを用いるＨＳＶ−２のＴＳＨＣ検出から得られた（表１９）。
【００８３】
【表１７】ＨＳＶ１のＴＳＨＣアッセイ法の分析的感度および特異性
2004511220.tif 000022
【００８４】
【表１８】ＨＳＶ２のＴＳＨＣアッセイ法の分析的感度および特異性
2004511220.tif 000023
【００８５】
【表１９】異なる希釈度のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２を用いるＨＳＶ−２プローブでの検出
2004511220.tif 000024
【００８６】
実施例１１
臨床検体試験
ＴＳＨＣ法およびＨＣ ＩＩ法の両方を用いて、６４人の臨床検体パネルをＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２について検査した。パネルは、既知量のＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２を含む１５試料、およびＰＣＲ試験によりＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２について陰性であることがわかっている４９試料を含んだ。したがって、１５個の陽性試料はＨＣ ＩＩおよびＴＳＨＣのアッセイ法の両方において、陽性の試験結果となることが「予想」され、かつ４９個の陰性試料はＨＣ ＩＩおよびＴＳＨＣの試験の両方において陰性の試験結果となることが「予想」された。実施例１に記載されている一般的なＴＳＨＣ法を用いた。ＨＣ ＩＩ法およびＴＳＨＣ法を用いての結果は、それぞれ、表２０および表２１に示されている。陰性結果が生じることを「予想」されている４９試料のうち、ＨＣ ＩＩ法を用いた場合、５試料が陽性の試験結果となり、かつ４４試料が陰性の試験結果となった。対照的に、ＴＳＨＣ法を用いた場合、すべての４９試料が陰性の試験結果となった。それゆえ、ＴＳＨＣ法は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の検出において、ＨＣ ＩＩ法よりも特異性について優れている。
【００８７】
【表２０】ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のＨＣ ＩＩ検出についての観察結果対予想結果
2004511220.tif 000025
【００８８】
【表２１】ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のＴＳＨＣ検出についての観察結果対予想結果
2004511220.tif 000026
【００８９】
実施例１２
ＨＳＶのＴＳＨＣ検出におけるプローブを組み合わせることの効果
ＨＳＶ−１検出におけるＨＳＶ−１特異的シグナル配列プローブおよび捕捉配列プローブの組を組み合わせることの効果を評価した。ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２交差反応性のＴＳＨＣ検出をＲＮＡシグナル配列プローブ／ビオチン化捕捉配列プローブの組合わせの２つの異なる組（組１番：Ｈ１９プラスＨＺ−１；および組２番：ＲＨ５ｂプラスＴＳ−１およびＴＳ−２）で別々に行った。ＴＳＨＣはまた、両方のＲＮＡシグナル配列プローブ／ビオチン化捕捉配列プローブの組を組み合わせて、２つのプローブ組を組み合わせることの感度および交差反応性への効果を評価するために行われた。実施例１に記載されている一般的なＴＳＨＣ法を用いた。表２２に示される結果より、ＨＳＶ−２交差反応性に明らかな増加もなく、ＨＳＶ−１検出についての２つのプローブ組を組み合わせることの相加作用が明らかに示されている。
【００９０】
【表２２】ＨＳＶ−１特異的ＣＳＰおよびＳＳＰを組み合わせることにより感度が上昇する
2004511220.tif 000027
【００９１】
実施例１３
ＨＰＶ１８およびＨＰＶ４５のＴＳＨＣ検出
ヒトパピローマウイルス１８（ＨＰＶ１８）およびヒトパピローマウイルス４５（ＨＰＶ４５）のＴＳＨＣおよびＨＣ ＩＩ検出の相対的感度および特異性を比較した。以前の研究より、ＨＰＶ１８に対する最も交差反応性が高いＨＰＶ型としてＨＰＶ４５が、かつ逆に、ＨＰＶ４５に対する最も交差反応性が高いＨＰＶ型としてＨＰＶ１８が確立されている。この研究において、ＨＰＶ１８およびＨＰＶ４５を検出する２つの方法の能力をＨＰＶ１８およびＨＰＶ４５のプラスミドＤＮＡを使用して評価した。
【００９２】
４つのヒトパピローマウイルス型：ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１およびＨＰＶ４５のそれぞれについて捕捉配列プローブ（ＣＳＰ）を設計した。捕捉配列プローブを設計するために用いられる基準は以下のとおりであった：１）ＣＳＰハイブリダイゼーション部位はＳＳＰ部位と重複しない；２）ＣＳＰは、１２塩基以上の他のＨＰＶ型に相同的な配列のひと続きをもたない、１つのＨＰＶ型に固有の配列を含む；および３）ＣＳＰは、７０℃で効率的にハイブリダイズすることができるのに十分な長さである。
【００９３】
各ＣＳＰについてのブロッカープローブは、標的核酸へのハイブリダイゼーションの間に、ＣＳＰと同時に添加されることができるように設計された。ブロッカープローブは、オリゴ５．０プログラム（ｔｈｅ Ｏｌｉｇｏ ５．０ ｐｒｏｇｒａｍ）（ナショナルバイオサイエンス社（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．）、プリマス、ＭＮ）により計算される場合、少なくとも３７℃だが６０℃より高くない融解温度を有する。２つのブロッカープローブが、室温プレート捕捉段階の間にブロッカー効果を最大化するように、各捕捉オリゴヌクレオチドに対して使用された。各ＣＳＰに対するブロッカープローブが類似した融解温度を有することもまた望ましかった。
【００９４】
各ＨＰＶ型についてのＣＳＰは、相対的捕捉効率および他のＨＰＶ型への交差反応性について試験された。感度および低交差反応性の最高の組合わせを与えるＣＳＰをＴＳＨＣを用いるＨＰＶの検出に使用した。
【００９５】
ＨＰＶ１８のＴＳＨＣおよびＨＣ ＩＩの検出において、ＨＰＶ１８ ＤＮＡは、１０ ｐｇ／ｍｌの濃度で使用された。交差反応性試験に使用されるＨＰＶ４５は４ ｎｇ／ｍｌで使用された。実施例１に記載される一般的なＴＳＨＣ法を用いた。表２３に示されるように、ＨＰＶ１８のＨＣ ＩＩ検出について得られた７．６という比と比較して、ＨＰＶ１８のＴＳＨＣ検出について１６．９というシグナルノイズ比が得られた。他方、ＨＰＶ４５との交差反応性は、ＴＳＨＣ法を用いる場合、有意的に低下した（ＨＣ ＩＩについての３９３．３のＳ／Ｎと比較して、ＴＳＨＣについて１．３のＳ／Ｎ）。その結果より、ＨＣ ＩＩ法と比較して、ＨＰＶ１８の検出についてのＴＳＨＣ法は、感度および特異性の両方において優れていたことが明らかに示されている。ＨＰＶ４５のＴＳＨＣおよびＨＣ ＩＩの検出を比較する実験において得られた結果より、ＨＰＶ４５の検出についてＴＳＨＣ法が感度および特異性の両方において優れていることが証明されている（表２４）。
【００９６】
【表２３】ＨＰＶ１８のＴＳＨＣ検出
2004511220.tif 000028
【００９７】
【表２４】ＨＰＶ４５のＴＳＨＣ検出
2004511220.tif 000029
【００９８】
実施例１４
標的特異的ハイブリッド捕捉プラスアッセイ法プロトコール
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、標的核酸の検出についての標的特異的ハイブリッド捕捉プラス（ＴＳＨＣプラス）アッセイ法の開発のためのモデル系として使用された。
【００９９】
ＴＳＨＣプラス法（図６Ａ〜図６Ｄ）におけるハイブリダイゼーションは、単一段階として行われてもよい。１段階法において、ＣＳＰ、プレハイブリダイズされたＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖を含むＳＳＰ、架橋プローブ（図６Ｂ〜図６Ｄ）、およびブロッカープローブは、標的核酸へ同時に添加される。ハイブリダイゼーションが２段階で行われる場合には、ＣＳＰ、プレハイブリダイズされたＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖非含有ＳＳＰ、架橋プローブおよびブロッカープローブが最初に、標的核酸にハイブリダイズされる。ＳＳＰにおける一本鎖核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブが、その後、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖を形成するために、その反応に添加される。ハイブリッドは、その後、実施例１に記載されているように、抗ＲＮＡ／ＤＮＡ抗体を用いて検出される。
【０１００】
実験は、ＴＳＨＣプラスを用いてＨＢＶを検出するために行われた（実施例１５〜実施例１８）。図６Ａに示される方法を用いた。既知の濃度のヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ ａｄｗ２）プラスミドＤＮＡをＨＢＶ陰性試料希釈液（ＨＢＶ ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔ）（ダイジーン）を用いて希釈した。様々な希釈溶液を作成し、個々のチューブへ等分した。陰性試料希釈液は、陰性対照として使用された。変性試薬５１００−０４３１（ダイジーン）の半量を試験試料へ添加した。試験試料を試料中の核酸を変性させるために６５℃で４５分間インキュベートした。
【０１０１】
ＨＢＶ試料の変性に続いて、捕捉配列プローブ（ＣＳＰ）、ブロッカープローブ、Ｍ１３ ＤＮＡ／Ｍ１３ ＲＮＡ二重鎖を含むシグナル配列プローブ、およびＳＳＰおよびＨＢＶ配列の両方にハイブリダイズすることができる一本鎖または部分的一本鎖のＤＮＡ配列の架橋プローブを含むハイブリダイゼーション溶液を試料に添加し、６５℃で１〜２時間、インキュベートした。または、変性された試料を捕捉配列プローブ（ＣＳＰ）、ブロッカープローブおよびＨＢＶ相補的配列を含むＭ１３ ＤＮＡプラスミドを含むハイブリダイゼーション溶液とともに、１時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、Ｍ１３ ＲＮＡをその反応に添加し、６５℃でさらに１時間、インキュベーションを続けた。
【０１０２】
反応混合物を含むチューブを室温で５分間冷却し、各チューブから一定分量を取り、９６ウェルのストレプトアビジンプレート（ダイジーン）の個々のウェルへ移した。プレートを１１００ ｒｐｍｓで１時間、室温で振盪した。その後、溶液をデカントして、プレートをＳＮＭ洗浄緩衝液（ダイジーン）で４回洗浄した。アルカリホスファターゼ抗ＲＮＡ／ＤＮＡ抗体ＤＲ−Ｉ（ダイジーン）を各ウェルへ添加し、室温で３０分間インキュベートした。その後、ＤＲ−Ｉ（ダイジーン）をデカントして、プレートをＳＮＭ洗浄緩衝液（ダイジーン）で４回洗浄した。残留洗浄緩衝液の除去に続いて、発光性物質（ＣＤＰ−スター（ＣＤＰ−Ｓｔａｒ）、トロピックス社（Ｔｒｏｐｉｘ Ｉｎｃ．））を各ウェルへ添加し、室温で１５分間インキュベートした。個々のウェルは、相対光ユニット（ＲＬＵ）シグナルを得るために、プレート照度計で読み取られた。
【０１０３】
実施例１５
以下の表は、実施例１６〜実施例１８に記載した実験において試験される様々なプローブを記載する。
【０１０４】
【表２５】ＨＢＶについての捕捉配列プローブ
2004511220.tif 000030
【０１０５】
【表２６】ＳＳＰの調製されるＨＢＶ／Ｍ１３クローン
2004511220.tif 000031
【０１０６】
【表２７】ＨＢＶブロッカープローブ
2004511220.tif 000032
【０１０７】
実施例１６
ＨＢＶのＴＳＨＣプラス検出へのブロッカープローブの効果
室温捕捉段階の間、ＣＳＰへ非特異的にハイブリダイズする過剰ＳＳＰ（Ｍ１３ ＲＮＡ／ＨＢＶ−Ｍ１３ ＤＮＡ二重鎖）は、プレート上へ固定化され、その結果として高バックグラウンドシグナルを生じる。バックグラウンドシグナルを低下させる試みにおいて、ブロッカープローブをＨＢＶのＴＳＨＣプラス検出に使用した。ブロッカープローブは、アッセイ法で用いられるハイブリダイゼーション温度より十分に低い温度で捕捉プローブにハイブリダイズすることしかできないように、ＣＳＰよりかなり短く設計された。
【０１０８】
ＣＳＰに相補的である２つの別々のオリゴヌクレオチドから成るブロッカープローブの組を使用した。ブロッカープローブをＣＳＰの割合に対して１０倍の超過量でハイブリダイゼーション混合物に添加した。ブロッカープローブはＣＳＰよりかなり短いため、標的ハイブリダイゼーション温度ではＣＳＰにハイブリダイズせず、それゆえ、ＣＳＰの標的核酸へのハイブリダイゼーションを干渉しない。ＣＳＰおよび標的核酸のハイブリダイゼーションに続いて、試料を室温捕捉段階にさらし、その間にブロッカープローブが過剰ＣＳＰにハイブリダイズして、それらがＳＳＰにハイブリダイズするのを防いだ。表２８に示されるように、ハイブリダイゼーション反応でのブロッカープローブの使用により、アッセイ法のバックグラウンドシグナルが大幅に低下した。
【０１０９】
【表２８】ＨＢＶ検出へのブロッカープローブの効果
2004511220.tif 000033
【０１１０】
実施例１７
ＨＢＶのＴＳＨＣプラス検出へのＳＳＰの長さの影響
ＳＳＰを産生するためのＭ１３ベクターへ挿入されるＤＮＡ配列の長さのＨＢＶのＴＳＣＨ−プラス検出への影響を研究した。２０ ｐｇ／ｍｌのＨＢＶプラスミドＤＮＡを含む陽性対照を使用した。表２９に示されるように、ＳＳＰにおいて長い方のＨＢＶ相補的配列（８７塩基対）の使用が、検出のシグナルに実質的な増加を生じた。短い方のプローブのＴｍ（融解温度）はハイブリダイゼーション温度より１５度上であるため、最適状態に及ばないハイブリダイゼーション温度条件のせいである可能性は低い。ＳＳＰに形成されるＭ１３ ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、そのプローブにおける相補的ＤＮＡ配列が標的核酸中のＨＢＶ配列にハイブリダイズすることを部分的に妨害するように作用するため、ＳＳＰにおいて相補的配列の長い方がこの妨害に打ち勝つのかもしれない。
【０１１１】
【表２９】ＨＢＶのＴＳＨＣプラス検出へのＳＳＰにおける相補的配列の長さの影響
2004511220.tif 000034
【０１１２】
実施例１８
ＨＢＶのＴＳＨＣプラスおよびＨＣ ＩＩ検出
ＨＢＶのＴＳＨＣプラスおよびＨＣ ＩＩ（ハイブリッド捕捉ＩＩ、ダイジーン）検出の相対的感度を比較した。３つの異なる濃度のＨＢＶ陽性標準を実験において試験した。表３０に示されるように、ＴＳＨＣプラス検出方法を用いて得られたシグナルは、ＨＣ ＩＩ検出方法を用いて得られたものより約２倍高かった。
【０１１３】
【表３０】ＨＢＶ＊のＴＳＨＣプラスおよびＨＣ ＩＩ検出
2004511220.tif 000035
＊　相対光ユニット（ＲＬＵ）として測定されるシグナル
【０１１４】
実施例１９
ＳＮＰの標的特異的ハイブリッド捕捉検出のための試料調製
ＳＮＰを検出するためのＴＳＨＣ法の態様として、標的分子としてｐ５３ ＤＮＡを用い、かつｐ５３コード領域のコドン７２での多型またはＳＮＰ（Ｋａｗａｊｉｒｉら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ． １４：１０８５〜１０８９， １９９３）を識別することを本明細書において実証されているハイブリッド捕捉ＳＮＰ（ＨＣ−ＳＮＰ）法を提供する。アンチセンス鎖上のコドン７２での２つのｐ５３多型は、アルギニン（Ａｒｇ）をコードするｇＣｇ、およびプロリン（Ｐｒｏ）をコードするアンチセンス鎖上のｐ５３コドン７２、ｇＧｇである。２つの多型をｐ５３Ａｒｇおよびｐ５３Ｐｒｏと呼ぶ。これはＨＣ−ＳＮＰ法がヌクレオチドの特異的検出として用いられるＳＮＰである。ＨＣ−ＳＮＰ法がプローブ、プローブ標識、および標的のこれらの特定の型に限定されるのではなく、ＴＳＨＣ法として記載される変形の全範囲をも含むことができることは理解される。
【０１１５】
ＰＣＲ単位複製配列またはゲノムＤＮＡのいずれかを含む試料をＨＣ−ＳＮＰ態様における多型検出についての標的として使用した。ゲノムＤＮＡを使用することは、診断的適用にとって特に有用でありえる。ＰＣＲ単位複製配列の調製について、２つのプライマー、例えば、上流プライマー
2004511220.tif 000036
および下流プライマー
2004511220.tif 000037
を使用した（クラエス（ｋｌａｅｓ）ら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ７７：２９９〜３０２， １９９９により記載）。これらのプライマーは、以下を含むプログラムを利用して、ｐ５３エキソン４領域（１８２塩基対）の増幅のために特に選択された：ａ）９５℃で４分間；ｂ）９４℃で４０秒間；ｃ）６２℃で４０秒間；ｄ）７２℃で４０秒間；ｅ）７２℃で６分間；およびｆ）保管のためまたは使用前は４℃であり、段階ｂ）〜ｄ）はＤＮＡ鋳型の質しだいで２５〜４５サイクル繰り返される。その後、ＰＣＲ単位複製配列は、試験前に、ＴＥ（１０ ｍＭ トリス；１ ｍＭ ＥＤＴＡ）、ｐＨ ７．４中で１：１０００または１：１００に希釈された。ゲノムＤＮＡの調製のためのゲノムＤＮＡ試料の無制限な例には、限定されるものではないが、ヒト体液、細胞、組織、およびパラフィンブロック中の保管用組織を含む。ゲノムＤＮＡの単離は、適切なキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用して行われた。標的の増幅段階を迂回して直接的に多型を検出するためには、およそ、試験一組につき１０ μｇ〜２０ μｇの単離されたゲノムＤＮＡが必要とされた。
【０１１６】
各ＤＮＡ標的は、ｐ５３−Ａｒｇ特異的およびｐ５３−Ｐｒｏ特異的捕捉オリゴで別々に試験された。シグナルノイズ比（Ｓ／Ｎ）は計算され、ｐ５３−Ｐｒｏ特異的Ｓ／Ｎに対するｐ５３−Ａｒｇ特異的Ｓ／Ｎの比は試料の遺伝子型を同定するために用いられた。ホモ接合体（Ａｒｇ／ＡｒｇまたはＰｒｏ／Ｐｒｏ）対ヘテロ接合体（Ａｒｇ／Ｐｒｏ）を決定するためのＳＮＰ試験結果の例は表３１に示されている。これらの試験の結果はウェーブ（Ｗａｖｅ）分析（トランスゲノミック（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）；サンタクララ、ＣＡ）およびＤＮＡ配列分析により確認された。
【０１１７】
実施例２０
ＳＮＰを検出するための標的特異的ハイブリッド捕捉法
プラスミドＤＮＡ（ｐ５３−Ａｒｇおよびｐ５３−Ｐｒｏ）をキアプレップスピンミニプレップキット（Ｑｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ）（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．）；バレンシア、ＣＡ）を使用して細菌培養から調製した。ゲノムＤＮＡ（ＨｅＬａ、ＳｉＨａ、およびジャーカット）をＤＮイージー組織キット（ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ）（キアゲン社）を使用して細胞系から調製した。プラスミドＤＮＡおよび臨床試料ＤＮＡを前に記載されているＰＣＲ法（４５サイクル）を用いて増幅した。使用前に、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡをＴＥ、ｐＨ ７．４中で１：１０００に希釈し、プラスミドＤＮＡ試料をＴＥ、ｐＨ ７．４中で１００ ｐｇ／ｍｌに希釈した。試験につき、希釈されたＰＣＲ増幅ＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡの５マイクロリットルを使用した。試験につきＨｅＬａ、ジャーカット、およびＳｉＨａのゲノムＤＮＡそれぞれについて、５ μｇ、７ μｇ、および１０ μｇを含む５０マイクロリットルの抽出されたゲノムＤＮＡ試料をを使用した。各試料は各アッセイ法について独立して２回試験された。第一試験はｐ５３−Ａｒｇ ＣＳＰおよびｐ５３ ＳＳＰを使用して行われた。第二試験はｐ５３−Ｐｒｏ ＣＳＰおよびｐ５３ ＳＳＰを使用して行われた。
【０１１８】
ウェルあたり５０ μｌの最終容量で水およびＤＮＡ標的の混合物をハイブリダイゼーションマイクロプレートへ添加した。ウェルあたり変性試薬５１００−０４３１（ダイジーン）（２５ μｌ）を添加した。プレートをプレートシーラーでカバーし、プレート振盪機上で１１００ ｒｐｍ、１０〜３０秒間撹拌した。反応物をマイクロプレートヒーターＩ（ロビンスディサイエンティフィック社（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｄｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ．）；サニーバレー、ＣＡ）で６５℃、２５分間変性させた。変性段階の間、プローブ混合物を調製した。ｐ５３−Ａｒｇ特異的プローブ混合物は、１５ ｐモル／ｍｌの１６塩基長Ａｒｇ特異的ＣＳＰ、６００ ｎｇ／ｍｌのｐ５３ ＳＳＰ、および４Ｘプローブ希釈液（ダイジーン）から構成された。ｐ５３−Ｐｒｏ特異的プローブ混合物は、１５ ｐモル／ｍｌの１６塩基長Ｐｒｏ特異的ＣＳＰ、６００ ｎｇ／ｍｌのｐ５３ ＳＳＰ、および４Ｘプローブ希釈液（ダイジーン）から構成された。各プローブ混合物（各２５ μｌ）を変性された試料に添加した。プレートをプレートシーラーでカバーし、プレート振盪機を用いて、１１００ ｒｐｍで、１０〜３０秒間撹拌した。試料をマイクロプレートヒーターで６５℃、１時間、ハイブリダイズさせた。ハイブリダイズされた試料を室温で５〜１０分間、インキュベートした（プレートの温度を低下させるため）。ハイブリダイゼーション反応物を９６ウェルのストレプトアビジン（ＳＡ）プレート（ダイジーン）へ移し、プレートシーラーでカバーした。ハイブリッドを４５℃で４５分間、９００ ｒｐｍで撹拌しながら、ＳＡプレート上へ捕捉させた。ＣＳＰハイブリダイズ化標的の固定化は、例えば、９６ウェルプレートのウェルの中へ置かれているハイブリダイゼーション溶液中で行わせることができ、そしてプレートを１５分〜２時間、２０℃〜９０℃の範囲の温度で振盪し、好ましくは室温で１時間、１１００ ｒｐｍｓで振盪する。室温より上の捕捉温度は、プレート捕捉段階の間にハイブリダイゼーション（および「乱交雑のハイブリダイゼーション」）が起こってしまう場合には、ストリンジェンシーレベルを上げることとして好ましいかもしれない。上清をデカントし、ウェルにつき１００ μｌのＤＲ−１（ダイジーン）を捕捉ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの検出のために添加した。プレートを室温で３０分間、撹拌せずにインキュベートした。上清を捨て、プレートを室温シャープ洗浄緩衝液（Ｓｈａｒｐ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ）で２回洗浄した。その後、ウェルをシャープ洗浄緩衝液で再び満たし、プレートを６０℃で１０分間、インキュベートした。その後、プレートを室温シャープ洗浄緩衝液で２回、室温ハイブリッド捕捉２洗浄緩衝液で１回、洗浄した。プレートから残留洗浄緩衝液を吸い取った（キムタオルを用いて）。化学発光性リン酸化基質、ＤＲ−２（１００ μｌ／ウェル）を添加し、反応物を室温で１５分間、撹拌せずにインキュベートした。活性化された基質を測定し、プレート照度計を用いて分析した（表３１を参照）。
【０１１９】
【表３１】ＨＣ−ＳＮＰからの遺伝子型データ
2004511220.tif 000038
【０１２０】
様々な好ましい態様の前記述は、実例および説明の目的のために提供され、開示された精密な形態に網羅させるものでも限定するものでもない。上記開示に照らして、明らかな変更または変形は可能である。考察された態様は、実例およびそれの実践的適用を提供して、それらにより当業者が様々な態様および企図される特定の使用に適応するように様々な変更をもって利用することを可能にするために、選択かつ記載された。特許請求の範囲の公正に、法律的におよび衡平法的に権利を与えられる外延に従って解釈される場合、すべてのそのような変更および変形は添付の特許請求の範囲により決定される体系内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】標的特異的ハイブリッド捕捉法の一つの態様を説明する模式図である。
【図２】標的特異的ハイブリッド捕捉法の一つの態様を説明する模式図である。
【図３】標的特異的ハイブリッド捕捉検出において融合化捕捉配列プローブを使用する態様が作用する可能性のある機構を説明する模式図である。
【図４】ＨＳＶ−１の標的特異的ハイブリッド捕捉検出の分析的感度および特異性を示す。
【図５】ＨＳＶ−２の標的特異的ハイブリッド捕捉検出の分析的感度および特異性を示す。
【図６Ａ〜図６Ｄ】標的特異的ハイブリッド捕捉プラス法の様々な態様を示す。
【図７】標的特異的ハイブリッド捕捉法の欠失プローブの態様を示す。
【図１】
2004511220.tif 000039
【図２】
2004511220.tif 000040
【図３】
2004511220.tif 000041
【図４】
2004511220.tif 000042
【図５】
2004511220.tif 000043
【図６Ａ】
2004511220.tif 000044
【図６Ｂ】
2004511220.tif 000045
【図６Ｃ】
2004511220.tif 000046
【図６Ｄ】
2004511220.tif 000047
【図７】
2004511220.tif 000048
【国際公開パンフレット】
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2004511220.tif 000050
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2004511220.tif 000172
2004511220.tif 000173
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004511220.tif 000174
【国際調査報告】
2004511220.tif 000175
2004511220.tif 000176
2004511220.tif 000177