(57)【要約】本発明は、広範な用途のために、きわめて広範な受容体特異性を有し、きわめて大量に発現される新規のハイブリッド型Ｇタンパク質によってＧタンパク質共役受容体を調節する化合物を同定する方法に関する。また本発明は、このような方法によって同定される化合物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）少なくとも一つのＧタンパク質共役受容体依存性シグナル伝達経路を含み、１以上のＧタンパク質を生産する少なくとも一つの細胞を用意し、
ｂ）研究しようとする少なくとも一つの化合物を用意し、
ｃ）ａ）に係る細胞とｂ）に係る研究しようとする化合物とを接触させ、
ｄ）ａ）に係る細胞のシグナル伝達経路に関して、ｂ）に係る研究しようとする化合物の定量結果または定性結果を、シグナル伝達経路依存性の測定可能なシグナルによって測定する
工程を含む、生物の少なくとも一つのＧタンパク質共役受容体依存性シグナル伝達経路の動作を調節する化合物を同定する方法。
【請求項２】
ａ）で用意される細胞は少なくとも２種のＧタンパク質を生産する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ）で用意される細胞は、−６ｑｉ４ｍｙｒ、−６ｑｓ５ｍｙｒ、−６ｑｉ４、−６ｑｓ５またはＧα１６から選択される少なくとも２種のＧタンパク質を生産する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ａ）で用意される細胞は、−６ｑｉ４ｍｙｒ、−６ｑｓ５ｍｙｒ、−６ｑｉ４、−６ｑｓ５から選択される少なくとも一つのＧタンパク質を生産する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ａ）で用意される細胞は、配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に係るアミノ酸配列を含む少なくとも一つのタンパク質を生産する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ａ）に係る細胞は、脊椎動物種、昆虫種、Ｃ． エレガンスまたは酵母の細胞である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞もしくはサッカロミセス・セレビシエの細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１のｄ）に記載のシグナル伝達経路依存性の測定可能なシグナルによって、研究しようとする化合物の定量結果または定性結果を測定するために、細胞内Ｃａ２＋濃度を用いることを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の医薬を同定する方法。
【請求項１０】
生物の少なくとも一つのＧタンパク質共役受容体依存性シグナル伝達経路の動作を改変する化合物であって、請求項１〜９のいずれかに記載の方法によって同定される、前記化合物。
【請求項１１】
ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に係るアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｂ）１つまたはそれ以上のアミノ酸が欠失したａ）に係るポリペプチド、
ｃ）１つまたはそれ以上のアミノ酸が付加されたａ）に係るポリペプチド、
ｄ）ａ）に係るポリペプチドの対立遺伝子変異
の配列のいずれか一つから選択されたポリペプチドを含む、Ｇタンパク質の特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項１２】
ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７またはそれらに対応する相補配列に係るポリヌクレオチド配列、
ｂ）ストリンジェントな条件下でａ）に係るポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列
のいずれか一つから選択されるポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１３】
組換えベクター構築物の一部である、請求項１１または１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
組換えベクター構築物は、真核生物および／または原核生物に適した発現ベクターである、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
発現ベクターは、構成的プロモーターおよび／または誘導性プロモーターを含む、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１１〜１５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項１７】
ヒト細胞である、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
脊椎動物種、昆虫種、Ｃ． エレガンス、細菌または酵母の細胞である、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
細胞は、ＨｅＬａ、２９３、ＣＯＳまたはＣＨＯ細胞、大腸菌細胞またはサッカロミセス・セレビシエ細胞である、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１３〜１５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを真核細胞または原核細胞に導入してなる、請求項１６〜１９のいずれかに記載の宿主細胞の作製。
【請求項２１】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法における、請求項１６〜２０のいずれかに記載の宿主細胞の使用。
【請求項２２】
配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号１０から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項２３】
ａ）請求項２０に記載の宿主細胞を作製し、
ｂ）宿主細胞に適切であり、またタンパク質の発現を誘導し得る増殖培地中で、ａ）で得られた宿主細胞を培養し、
ｃ）ｂ）からの細胞材料を得て、この細胞を破壊し、
ｄ）ｃ）からの破壊された細胞の他のタンパク質から、請求項２２に記載のタンパク質を分離する
工程を含む、請求項２２に記載のタンパク質を調製する方法。
【請求項２４】
抗体を生産するための、請求項２２または２３に記載のタンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、非常に広範な受容体特異性を有する新規のハイブリッド型Ｇタンパク質によって、タンパク質共役受容体を調節する化合物を同定するための、広く適用できる方法、および、このような方法によって同定され得る化合物に関する。
【０００２】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、生理学的なプロセスの多様性において重要な役割を果たす。当該受容体は、これまで知られた最も重要なタンパク質ファミリーの一つであり、ヒトゲノム中の約１０００個の遺伝子がこの受容体クラスをコードすると考えられている。ＧＰＣＲは、特徴的な構造を有する。即ち、αヘリックスが細胞膜のリン脂質二重層を７回貫通して環状に配列した形態で曲がりくねったペプチド鎖である。現在処方により利用できる製薬の約６０％はＧＰＣＲに結合するものと推定される。この事実により、前記受容体クラスが製薬研究産業に関して重要な役割を有することがわかる。全てのＧタンパク質共役受容体は、共通の基本様式、即ち、細胞外リガンドが結合することにより受容体タンパク質が構造変化し、次にその受容体タンパク質はＧタンパク質に接触するという様式に対して作用する。形質膜の細胞質側に存在するＧタンパク質は、細胞外シグナルを細胞内部に仲介し、そこで様々な反応を作動させることができる。現在、ＧＰＣＲは、最も重要な治療上の標的タンパク質である。医師が処方した製薬の推定４０％が、ＧＰＣＲアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する。タンパク質ファミリーの規模や重要性のために、かつ、多くのＧＰＣＲ（オーファンＧＰＣＲ）について化学結合パートナーが未知であるということから、この受容体クラスは、将来の新規医薬物質の検索に適切な標的タンパク質の最も重要な宝庫の一つであると考えられる。
【０００３】
ＧＰＣＲは内在性膜タンパク質である。ＧＰＣＲは、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（いわゆるＧタンパク質）ファミリーを介して、大概は細胞の外側に結合した親水性のシグナル物質を介して仲介されるシグナルを細胞内部に伝達する。受容体特異性、およびそれにより活性化されたＧタンパク質により、ＧＰＣＲは様々なシグナル伝達経路を作動させる。受容体のタイプにより、様々な作用が引き起こされ、その全ての作用により第２メッセンジャーが形成される。従って、膜結合アデニル酸シクラーゼの活性化により、細胞内のｃＡＭＰ量を増加させ、一方、膜結合アデニル酸シクラーゼの阻害により、細胞内のｃＡＭＰ量を減少させ得る。ｃＧＭＰに特異的なホスホジエステラーゼを刺激することにより、ｃＧＭＰ量を減少させ得る。さらに、活性化したＧタンパク質は、イオンチャンネルに結合することによって、例えば、Ｃａ２＋またはＫ＋イオンを増やすことができる。さらに、活性化したＧタンパク質は、ホスホリパーゼを活性化し、それによりイノシトール１，４，５−三リン酸とジアシルグリセロールとを形成する。これら双方がさらに作用することによって、今度はＣａ２＋を増加させるか、またはタンパク質キナーゼＣを活性化させることができる。第２メッセンジャーとは、例えば、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｃａ２＋等のような細胞内のメッセンジャー分子であり、これらは細胞内のタンパク質を活性化または不活性化することによって細胞中の反応を作動させる。
【０００４】
ヘテロ三量体Ｇタンパク質は、形質膜の内側に存在する。ヘテロ三量体Ｇタンパク質は、３種のサブユニットα、βおよびγからなる。活性化受容体は、Ｇタンパク質ヘテロ三量体と接触し、その結果としてαサブユニットとβγ複合体とに分離される。活性化αサブユニットおよびβγ複合体の双方は、細胞内のエフェクタータンパク質に影響を与え得る。現在、Ｇタンパク質αサブユニットファミリーは、４種の異なるクラスに分類される（Ｇαｓ、Ｇαｉ、ＧαｑおよびＧα１２クラス）。ＧＰＣＲは、シグナル伝達に関与するＧタンパク質に従って分類される。
【０００５】
すなわち、ＧｓクラスのＧＰＣＲは、Ｇαｓの活性化および細胞内のｃＡＭＰ濃度の増加を介してアデニレートシクラーゼ刺激を仲介し、ＧｉクラスのＧＰＣＲは、Ｇαｉの活性化および細胞内のｃＡＭＰの減少を介してアデニル酸シクラーゼ阻害を仲介し、ＧｑクラスのＧＰＣＲは、Ｇαｑの活性化を介して様々なＰＬＣβイソ型の刺激を仲介し、膜結合ホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸の加水分解によりジアシルグリセロールおよびイノシトール三リン酸（ＩＰ３）とを生産する。ＩＰ３は、細胞内の貯蔵部位からＣａ２＋を放出する。殆どのＧＰＣＲは、一つのＧタンパク質αサブユニットファミリーのみと接触する、即ち、ＧＰＣＲは特定のシグナル伝達経路に選択的である。この限定された特異性は、ＧＰＣＲ依存性シグナル伝達経路を調節する化合物を同定する方法を開発する目的において、深刻な障害である。その上、高いサンプルスループット（＝ハイスループットスクリーニング＝ＨＴＳ）を用いた分析様式で利用できる適切なシグナルは、例えば、Ｇタンパク質活性化により細胞内のＣａ２＋量を増加させるようなシグナル伝達経路からでしか得ることができない。
【０００６】
改変された受容体特異性を有し、かつ異なる方法でシグナル伝達経路に連結するような上記Ｇタンパク質は、分子生物学的方法および生化学的方法によって様々なＧタンパク質のパーツを共に結合させ、ハイブリッド型Ｇタンパク質を得ることによって構築される。ハイブリッド型Ｇタンパク質は、様々なＧαサブユニットの配列を１つのタンパク質に合体させてなる融合構築物である。従って、例えば、Ｇαｉ受容体の認識領域をＧαｑエフェクター活性化領域に融合させることによって、Ｇαｑ／ｉハイブリッドを調製することができ、このようなハイブリッドはＧｉ共役受容体からシグナルを受けることができるが、Ｇαｑ−ＰＬＣβシグナル伝達経路でスイッチされる。このようなハイブリッドは、ＧαｑのＣ末端の５個のアミノ酸が、対応するＧαｉ配列（Ｇαｑｉ５）によって置換されており、Ｃｏｎｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６３， ２７４−２７６（１９９３） において初めて説明されている。このような受容体の「再カップリング（ｒｅｃｏｕｐｌｉｎｇ）」の利点は、測定方法中、分析終了点（アデニル酸シクラーゼ阻害と比較して、細胞内Ｃａ２＋濃度が増加した時点）がより判りやすいこと、およびハイスループットスクリーニングで用いることができることである。しかし、前記Ｇαｑ／Ｇαｉ融合構築物の不利益は、いくつかのＧＰＣＲ、例えばＳＳＴＲ１受容体ｑｉ５を活性化できないことである（Ｃｏｎｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５０， ８８５−８９０（１９９６））。同様に、ＧαｑとＧαｓとの融合構造も説明されている。当該融合構造もまた、全てのＧｓ共役受容体（ｐ２−アドレナリン作動受容体またはドーパミンＤ１受容体等のような）をＰＬＣβシグナル伝達経路に連結させることができない、という不利益を有する。受容体の特定のシグナル伝達経路への関連を改変するためのＣ末端修飾のほかにも、ＧαｑのＮ末端修飾により受容体が無差別になる（ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ）ということがいわれている。本明細書において、受容体の無差別とは、Ｇタンパク質が異なる受容体からシグナルを受ける、または異なる受容体からシグナルを受け渡す能力を意味する。このようなＧαｑタンパク質において、６個の高く保存されたＮ末端アミノ酸が欠失していた（Ｋｏｓｔｅｎｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２， １９１０７−１９１１０（１９９７））。このような欠失により生じたＧｑ（別名−６ｑ）は、Ｇｑ共役受容体からだけでなく、Ｇｓ共役受容体またはＧｉ／ｏ共役受容体からシグナルを受信することが可能になり、当該シグナルをＰＬＣβに渡すことができる。続いて、前記Ｇαサブユニットはまた、ＳＳＴＲ１ソマトスタチン受容体、ドーパミンＤ１受容体やアドレナリン作動性β２受容体のような受容体を認識する。しかしながら、このようなＧタンパク質でさえ、受容体ｅｄｇ５を認識することはできない。その上、前記Ｇタンパク質のシグナル強度は弱いため、実際には使用不可能である（Ｋｏｓｔｅｎｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２， １９１０７−１９１１０（１９９７））。
【０００７】
他の既知のＧαサブユニットとしては、Ｇα１６があり、これは、様々な機能的なクラスからのＧＰＣＲを、ＰＬＣβ−Ｃａ２＋シグナル伝達経路に連結させる。このＧタンパク質は、本質的に事実上非選択的も同然である。しかしながら、ｅｄｇ５受容体またはＳＳＴＲ１ソマトスタチン受容体などの受容体のＧα１６への結合は非常に弱いため、このようなサブユニットでさえ普遍的に適用させることができない。この理由のため、他の機能的なＧＰＣＲクラスにより活性化可能なＧタンパク質が利用できればかなり有用であり、その上、細胞中で十分に強いシグナルを与えることができ、このようなシグナルは、特にハイスループット分析のような分析において、ＧＰＣＲを調節する化合物、および／または、適切な依存性シグナル（例えば細胞内Ｃａ２＋濃度の増加または減少のようなシグナル）の伝達経路を同定するのに利用することができる。それゆえに、さらなる本発明の目的は、化合物を同定するスクリーニング方法のためのハイブリッド型Ｇタンパク質を提供することであり、当該タンパク質は、認識可能なＧＰＣＲに関して非常に広範な特異性を有し、さらに、前記Ｇタンパク質をシグナル経路に共役させて細胞内のＣａ２＋濃度を増加させることを特徴とする。さらに、その発現はシグナル強度を改善させる程度に大量である。
【０００８】
本発明は、生物の少なくとも一つのＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）依存性シグナル伝達経路の動作を調節する化合物を同定するための方法に関し、ここで当該方法は、以下の工程：
ａ）少なくとも一つのＧＰＣＲ依存性シグナル伝達経路を含み、１またはそれ以上のＧタンパク質を生産する少なくとも一つの細胞を提供すること、
ｂ）研究しようとする少なくとも一つの化合物を提供すること、
ｃ）ａ）に係る細胞とｂ）に係る研究しようとする化合物とを接触させること、
ｄ）ａ）に係る細胞のシグナル伝達経路に関して、ｂ）に係る研究しようとする化合物の定量結果または定性結果を、シグナル伝達経路依存性の測定可能なシグナルによって測定すること、
を含む。
【０００９】
生物の少なくとも一つのＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）依存性シグナル伝達経路の作用は、阻害または刺激によって改変することができる。ある化合物の非存在下よりもその存在下でシグナル伝達経路依存性の測定可能なシグナルが弱い場合、その化合物は阻害効果を有する。また、このような効果を誘発する化合物は、アンタゴニストとも呼ばれる。一方で、ある化合物の非存在下よりもその存在下でシグナル伝達経路依存性の測定可能なシグナルが強い場合、その化合物は刺激効果を有する。また、このような化合物は、アゴニストとも呼ばれる。好ましい実施形態において、上記方法は、少なくとも２種のＧタンパク質を生産する細胞を利用する。前記Ｇタンパク質は、１種のＧＰＣＲ、または異なるＧＰＣＲに依存性である。原則的に、全てのＧタンパク質は、その受容体特異性、配列、構造および起源に関係なく、細胞、組織または器官に関するプロセス、もしくは、それらが特異的である種に関するプロセスを実行するのに適している。好ましくは、−６ｑｉ４ｍｙｒ、−６ｑｓ５ｍｙｒ、−６ｑｉ４、−６ｑｓ５から選択される少なくとも一つののＧタンパク質を生産する細胞である。Ｇタンパク質である、−６ｑｉ４ｍｙｒ、−６ｑｓ５ｍｙｒ、−６ｑｉ４、−６ｑｓ５とは、マウスの異なるＧタンパク質の部分から構成されたハイブリッド型Ｇタンパク質であり、そのいくつかはさらなる改変を含む。Ｇタンパク質は、個々に、または組み合わされて、細胞から生産される。また、すでに上述したハイブリッド型Ｇタンパク質のほかに、細胞は、特に、Ｇα１６も生産する。それぞれのＧタンパク質は、個々に、または１またはそれ以上の他のＧタンパク質と組み合わされて、細胞中に存在する。Ｇα１６は、常に、単独で生産されるのではなく、細胞中で他の上述したＧタンパク質と組み合わされて生産されるような方法で生産されるべきである。好ましいＧタンパク質のアミノ酸配列としては、−６ｑｉ４ｍｙｒ（配列番号２）、−６ｑｉ５ｍｙｒ（配列番号４）、−６ｑｉ４（配列番号６）、−６ｑｓ５（配列番号８）およびＧα１６（配列番号１０）が開示される。通常、上記化合物は、可溶性形態で提供される。化合物の溶解には水を使用することが好ましい。このような溶液は、溶媒のほかに、緩衝物質、塩または助剤、例えば可溶化剤、洗剤、保存剤、または他の物質を含んでもよい。
【００１０】
細胞の準備として、細胞の生産、培養およびプロセシングが含まれる。細胞は、例えば、器官または組織から適切な細胞材料を調製することによって、または、適切な細胞系または微生物を増殖させることによって、準備される。様々な適切な培養液が培養に用いることができる。細胞は、生物にとって最適な温度で維持される。必要に応じて、それぞれの場合で用いられた増殖培地に、保存剤、抗生物質、ｐＨ指示薬、血清成分、血清、助剤または他の物質を加えてもよい。生産、培養およびさらなるプロセシングのための方法は、標準的な教科書に説明される（例えば、Ｂａｓｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｅｄ． Ｊ．Ｍ． Ｄａｖｉｓ；ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；１９９４）。上述した方法の好ましい実施形態において、脊椎動物種、昆虫種、Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓまたは酵母の細胞が用いられる。特に好ましい実施形態において、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞もしくはサッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞が用いられる。
【００１１】
好ましい実施形態において、研究しようとする化合物の定量結果または定性結果を、シグナル伝達経路依存性の測定可能なシグナルの細胞シグナル伝達経路に関して、細胞内のＣａ２＋濃度を測定するために用いる。例えば、エクオリン、染料を用いることによって、またはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製のＦＬＩＰＲ（登録商標）技術によって、細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を検出できる。好ましい実施形態において、上述した方法は、医薬の同定に用いることができる。
【００１２】
また本発明は、本発明の少なくとも一つの方法により同定された前記化合物を用いて、生物の少なくとも一つのＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）依存性シグナル伝達経路の作用を改変する少なくとも一つの化合物に関する。このような化合物は、例えば、ＧＰＣＲを誘導する親水性のシグナル物質（例えば、特定のホルモン、香料、または特定の医薬）の化学構造に関する改変を含む。
【００１３】
さらに本発明は、Ｇタンパク質の特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に関し、当該配列は、以下の配列：
ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に係るアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｂ）１以上のアミノ酸が欠失したａ）に係るポリペプチド、
ｃ）１以上のアミノ酸が付加されたａ）に係るポリペプチド、
ｄ）ａ）に係るポリペプチドの対立遺伝子変異、
のいずれか一つから選択されたポリペプチドを含む。
【００１４】
上記対立遺伝子変異としては、ハイブリッドタンパク質を構成する特定のパートナーに関して決定された遺伝子座に存在する遺伝子に特徴的な塩基組成から生じる全てのポリペプチドが含まれる。さらに、本発明は、ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに関し、ここで当該ポリヌクレオチド配列は、以下の配列：
ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に係るポリヌクレオチド配列、または、それらに対応する相補配列、
ｂ）ストリンジェントな条件下でａ）に係るポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、
のいずれか一つから選択される。
【００１５】
溶液のストリンジェンシーは、温度および塩含有量によって決定される。ストリンジェンシーを用いて、２つの相同ヌクレオチド配列の塩基が結合する程度を調節することができる。ストリンジェンシーは、ポリヌクレオチドの長さや塩基組成に依存する。ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする配列との一致が９５％以上である場合、本発明に係るストリンジェントな条件が用いられる。
【００１６】
上述したポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチドの好ましい実施形態は、部分的に組換えベクター構築物を含むポリヌクレオチドである。組換えベクター構築物は、適切な専門家の知識の補助により調製することができ、例えば、Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ等のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）がある。上記の組換えベクター構築物において、上述した配列情報（配列番号２、４、６、８）に係るアミノ酸配列または上述した配列情報（配列番号１、３、５、７）に係るポリヌクレオチド配列をコードしたポリヌクレオチドが、基本となるベクターに挿入されることが必要である。基本となるベクターとは、ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列を分子生物学的な方法によって挿入することができ、さらに例えば細菌、真菌などの微生物中や細胞培養物の細胞中でクローン化することができるベクターを意味する。基本のベクターは、例えば、抗生物質耐性マーカー、細菌または細胞培養物中でプラスミドを増すのに適切な複製起点、さらに、タンパク質の発現に適切なプロモーターを含むプラスミドで構成することができる。また、基本のベクターは、例えば、ファージベクター、ファージミドベクター、プラスミドベクター、コスミドベクター、ウイルス性ベクター、ＹＡＣベクターまたは他のタイプのベクターで構成されてもよい。基本のベクターの例としては、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＫＳ、ｐＳＫ等がある。挿入しようとするポリヌクレオチドは、ＢｉｏＬａｂｓ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅなどの会社で市販されている適切な制限酵素によって、適切な制限開裂部位の間に挿入される。このような制限開裂部位としては、例えば、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、ＥｃｏＲＶ等の制限酵素の認識部位であり得る。
【００１７】
好ましい実施形態において、組換えベクター構築物は、真核生物および／または原核生物において有用な発現ベクターを含む。発現ベクターはプロモーターを含み、当該プロモーターは、前記ポリヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質が、例えば細菌、真菌のような生物または真核細胞系の細胞中で合成されるように、ポリヌクレオチド配列に機能的に連結する。このようなプロモーターは、例えばトリプトファンによる誘導性プロモーターでもよいし、または構成的プロモーターであってもよい。発現ベクターの例としては、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｃＤＮＡ３．１等がある。
【００１８】
さらに本発明は、上述したポリヌクレオチドまたは組換えベクター構築物を含む宿主細胞に関する。好ましい実施形態において、宿主細胞は、ヒト細胞を含む。さらに好ましい実施形態において、宿主細胞は、脊椎動物種、昆虫種、Ｃ． エレガンス（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）、細菌または酵母の細胞を含む。特に好ましい実施形態において、上記細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞、大腸菌細胞またはサッカロミセス・セレビシエ細胞を含む。さらに、他の真核細胞、特に細胞系、細菌、特にバチルス ｓｐｅｃ．（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃ．）、ストレプトミセス ｓｐｅｃ．（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃ．）、および菌類、特にペニシリウム ｓｐｅｃ．（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｅｃ．）、アスペルギルス ｓｐｅｃ．（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃ．）などを用いることができる。
【００１９】
さらに、本発明は、配列番号１〜８で開示された１またはそれ以上のポリヌクレオチド配列に係るポリヌクレオチド、または上記で特徴付けた組換えベクター構築物を、真核細胞または原核細胞に導入することによって、上述した宿主細胞を生産することに関する。当該ポリヌクレオチド配列を、例えばエレクトロポレーション法によってまたはポリヌクレオチド配列を用いた真核細胞または原核細胞の形質転換によって導入し、さらに上記ポリヌクレオチド配列と一緒に真核細胞または原核細胞をリン酸カルシウム沈殿法または他の方法によって沈殿させる。
この種の宿主細胞は、上述の本発明の方法を実行するために用いることができる。
【００２０】
また、本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質に関する。
その上、本発明は、以下の配列、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質を調製する方法に関し、当該方法は、以下の工程：
ａ）適切なポリヌクレオチド配列を含み、上述のように調製された宿主細胞を作製すること、
ｂ）宿主細胞に適切であり、またタンパク質の発現を誘導し得る増殖培地中で、前記宿主細胞を培養すること、
ｃ）細胞材料を得て、細胞を破壊すること、
ｄ）タンパク質精製のための生化学的方法によってタンパク質を分離することを含む。
【００２１】
上述したタンパク質を調製し、精製することに関して、Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ等のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）で説明されるような既知の方法を適宜用いることができる。配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８に係るアミノ酸配列を有するタンパク質、または上述の方法によって調製されるタンパク質は、抗体を生産するために用いることができる。
【００２２】
【実施例】
実施例１：Ｇαタンパク質変異体−６ｑを介したシグナル伝達経路の様々な受容体による活性化
ＣＯＳ７細胞を、１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含むＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）で、３７℃（５％ ＣＯ２）で培養した。トランスフェクションのために、１×１０６個の細胞を１００ｍｍのプレートに播種した。約２４時間後、発現プラスミドαｑまたは−６ｑ（１μＭのＤＮＡ／１００ｍｍプレート）と、以下の受容体構築物（４μｇ ＤＮＡ／１００ｍｍプレート）とを共に上記細胞に形質導入し、ここで上記受容体構築物としては、それぞれの場合において、Ｍ２（ｐＣＤにおけるムスカリン様受容体）、Ｄ２（ｐＣＤＮＡＩにおけるドーパミン受容体）、ｋ（ｐＣＤＮＡ３におけるオピオイド受容体）、ＳＳＴＲ１（ｐＣＭＶにおけるソマトスタチン受容体）、Ａ１（ＣＤＭ７におけるアデノシン受容体）、Ｄ１（ｐＣＤＮＡＩにおけるドーパミン受容体）、Ｖ２（ｐＣＤ−ｐｓにおけるバソプレシン受容体）、β２（ｐＳＶＬにおけるアドレナリン作動性受容体）である。トランスフェクションの約２４時間後、上記細胞を６−ウェルプレートに等分し、３μＣｉ／ｍｌの［３Ｈ］ミオイノシトール（２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）のＤＭＥＭ溶液を加えた。２４時間のインキュベーションの後、室温で２０分間、上記細胞をＨＢＳＳ（＋１０ｍＭ ＬｉＣｌ）でインキュベートした。次に、上記細胞を、適切なアゴニストで１時間刺激し、細胞内イノシトール一リン酸の増加を、陰イオン交換クロマトグラフィーで測定した。野生型配列と比較して、上記Ｇαタンパク質変異体−６ｑは、アミノ末端における高度に保存された６個のアミノ酸残基を欠く。このような構築物のアミノ末端を図１で示す。野生型配列をαｑ（ＷＴｑ）で示す。後に続く結果は、Ｇαタンパク質構築物−６ｑを用いて得られた。さらに図１は、配列のさらなる例を示す。用いられたこの種の変異体または受容体構築物は、標準的な分子生物学的方法の補助により調製され、当該方法は、詳細には、例えばＦ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ等のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に示される。
【００２３】
ＷＴｑまたは−６ｑ、および様々なＧｉ／ｏ共役受容体（Ａ）またはＧｓ共役受容体（Ｂ）を発現するＣＯＳ７細胞を、適切なアゴニスト（以下参照）の存在下および非存在下で１時間インキュベートした（３７℃）。細胞内ＩＰ１濃度の増加を、添付のプロトコール１に従って測定した。そのデータは、３〜７の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．として示され、それぞれの測定は３回行われた。なお、以下のリガンドが用いられた。
【００２４】
図２Ａ：ｍ２（ムスカリン様受容体）：カルバコール（１００μＭ）；Ｄ２（ドーパミン受容体）：（−）−クインピロール（１０μＭ）；ｋ（オピオイド受容体）：（−）−Ｕ５０４８８（１０μＭ）；ＳＳＴＲ１（ソマトスタチン受容体）：ソマトスタチン１４（１μＭ）；Ｂ、Ａ１（アデノシン受容体）：Ｒ（−）−ＰＩＡ（１０ｍＭ）；
図２Ｂ：Ｄ１（ドーパミン受容体）：ドーパミン（１ｍＭ）；Ｖ２（バソプレシン受容体）：ＡＶＰ（１ｎＭ）；β２（アドレナリン作動受容体）：（−）−イソプロテレノール（２００μＭ）。図の下の数は、−６ｑ〜ＷＴｑによるＰＬＣ刺激における相対的な増加としての、特定のＰＬＣ刺激の程度を示す。
【００２５】
図２は、Ｇαタンパク質変異体−６ｑが、異なる受容体クラスに依存してＩＰ１形成を刺激することを示す。ＩＰ１は、ＰＬＣ−β−シグナル伝達経路で発生するシグナル分子であり、さらに上記シグナル伝達において細胞内Ｃａ２＋濃度を増加させる。図２の−６ｑに関する実験結果を、野生型構築物（ＷＴｑ）による刺激と比較し、さらにベクター構造を有するがいかなるＧαインサートも含まないコントロール（ベクター）による刺激と比較する。−６ｑ構造によるＩＰ１の放出は、Ｇｉ／ｏ共役受容体（図２Ａ：ｍ２、Ｄ２、ｋ−ＯＲ、ＳＳＴＲ１、Ａ１）受容体を用いても、Ｇｓ共役受容体（図２Ｂ：Ｄ１、Ｖ２、β２）を用いてもうまくいく。
【００２６】
実施例２：大量発現した、広い受容体特異性を有するＧαタンパク質の変異体の調製
初めに、アミノ末端の６個の高度に保存されたアミノ酸を欠いており、Ｃ末端にαｉとαｓ配列とを同時に有するハイブリッド型Ｇタンパク質αサブユニットを構築した。これらは、−６ｑｉ４または−６ｑｓ５と表記され、それぞれ、αｉ配列、またはαｓ配列に相当する。−６ｑｉ４構築物は、Ｇｓ共役受容体に連結し、またＧｉ／ｏ共役受容体のいくつかはＰＬＣβシグナル伝達経路に連結する。また、前記受容体は、ＳＳＴＲ１受容体またはｅｄｇ５受容体も含む。Ｇα１６は、ｅｄｇ５受容体をＰＬＣβシグナル伝達経路に連結させることができない。Ｇα１６は、広い受容体特異性を有するＧタンパク質であり、ＷＯ９７／４８８２０（タイトル：Ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ）に開示されている。−６ｑｓ５構築物は、Ｇｉ／ｏ共役受容体に連結し、さらに加えて、Ｇｓ共役受容体はＰＬＣβシグナル伝達経路に連結し、その結果、ドーパミンＤ１受容体またはアドレナリン作動β２受容体のような受容体を認識する。従って、１種の細胞系における前記２種のＧタンパク質αサブユニットの組み合わせは、各サブユニットの個々の認識より広範に、またはＧα１６の認識より広範に、ＧＰＣＲを認識する。
【００２７】
また前記Ｇαサブユニット（−６ｑｉ４；−６ｑｓ５）はより強いシグナルを生じ得るため、前記Ｇαサブユニットの発現が増加すれば、技術的なスクリーニング法における適応性をさらに改良できる。この理由のために、追加のミリストイル化／パルミトイル化認識配列を、Ｇαサブユニットのアミノ末端領域に挿入した。それにより、Ｇタンパク質の−６ｑｉ４ｍｙｒ構築物および−６ｑｓ５ｍｙｒ構築物を得た。アミノ末端に関する−６ｑｉ４ｍｙｒおよび−６ｑｓ５ｍｙｒのタンパク質配列は、−６ｑ変異体のオリジナル配列ではＭＡＣＣであるのに対し、ＭＧＣＣである。その結果、新規の構築物である−６ｑｉ４ｍｙｒおよび−６ｑｓ５ｍｙｒは、ミリストイル化／パルミトイル化に関するコンセンサス配列を含む。−６ｑｉ４ｍｙｒを、−６ｑｓ５からの−６ｑｉ４および−６ｑｓ５ｍｙｒから調製した。Ｇタンパク質からミリスチル残基またはパルミトイル残基を除去すると、細胞中への再分布が起こり、それによりパルミテート残基またはミリステート残基が減少し、Ｇタンパク質の発現パターンが影響を受けることがわかっているが、これは脂肪酸残基を除去することにより主に細胞質に位置させる方法と同様である。Ｇタンパク質αサブユニットは、細胞膜中と細胞質中との両方において見出される。しかしながら、膜結合型Ｇタンパク質だけが、ＧＰＣＲから細胞内のエフェクターへシグナルを通過させることができる。変異導入によるパルミトイル化／ミリストイル化に関するコンセンサス配列の除去の結果のみが知られている。しかしながら、ミリストイル化／パルミトイル化に関する追加のコンセンサス部位をＧα欠失変異体に導入することによって、発現を増加させることは知られていない。追加のパルミトイル化／ミリストイル化部位を導入することにより、細胞膜中で発現されたＧαサブユニットの量が増加することを示すことができた（図３、図４）。図３のＳＤＳ−ＰＡＧＥウエスタンブロット（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動のウエスタンブロット）で、−６ｑｉ４と比較した−６ｑｉ４ｍｙｒ発現の増加が明白に示されている。図４は、ｑｗｔおよび−６ｑｉ４ｍｙｒの粒子分画（ｐ；膜含有）および可溶性分画（ｓ；ｓｃ）へ分離したＳＤＳ−ＰＡＧＥウエスタンブロットを示す。高度にミリストイル化／パルミトイル化されている変異体、−６ｑｉ４ｍｙｒは、粒子分画だけに存在する。この目的のために、２０μｇの膜タンパク質をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞から調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動（１０％）で分離し、１２ＣＡ５モノクローナル抗体（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いたウエスタンブロットによって分析した。全てのＧタンパク質αサブユニットを、ＨＡエピトープタグに対する１２ＣＡ５モノクローナル抗体（ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合させた）で検出した。このＨＡタグは、全てのＧタンパク質構築物に含まれる。ｑｗｔおよびｑｉ５において、そのアミノ酸１２５〜１３０を、Ｎ末端が欠失したＧタンパク質（−６ｑ、−６ｑｉ４、−６ｑｉ４ｍｙｒ）のアミノ酸１１９〜１２４で置換する。２０μｇの膜タンパク質を、トランスフェクトされたＣＯＳ７細胞から調製し、いずれの場��もＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロースにブロットし、Ｇタンパク質αサブユニットを１２ＣＡ５抗体で検出した。免疫活性Ｇタンパク質を化学発光システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて可視化した。
【００２８】
実施例３：広い受容体特異性を有する大量発現した様々なＧα−タンパク質の、異なる受容体による刺激
大量発現したＧα変異体、−６ｑｓ５ｍｙｒおよび−６ｑｉ４ｍｙｒの異なる受容体による刺激を図５および図６に示す。図５は、−６ｑｉ４ｍｙｒ（＝Δ６ｑｉ４ｍｙｒ）が、Ｇｉ／ｏ共役受容体（例えばドーパミンＤ２、ｅｄｇ５、ＣＣＲ５、ＳＳＴＲ１、ＫＯＲ）により、ＰＬＣβシグナル伝達経路へ連結し、Ｃａ２＋放出に比例する強いシグナルが生じたことを示す。用いられたコントロールは、ベクター構築物およびＧα１６タンパク質（＋１６）であった。図６は、Ｇｓ共役受容体が、−６ｑｓ５ｍｙｒ（＝Δ６ｑｓ５ｍｙｒ）によってＰＬＣβシグナル伝達経路に連結することを示す。Ｇタンパク質Ｇα１６も、本明細書で言及されたように行動する。実験的に放出されたＣａ２＋をエクオリンシステムによって測定するために、ＣＨＯ細胞を、アポエクオリン発現プラスミドｃｙｔＡＥＱ／ｐＣＤＮＡＩ、上述した受容体ＤＮＡ（ＳＳＴＲ１、ＫＯＲ、Ｄ２、Ｄ１、β２）、ならびにＧタンパク質αサブユニットＧ１６および−６ｑｉ４ｍｙｒで、リポフェクトアミンを用いて、コトランスフェクションさせた。ＯＰＴＩＭＥＭ培地で１０時間インキュベートした後、上記細胞をＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄し、ＲＰＭＩ１６４０中で、５μＭのセレンテラジンｆと共に３７℃、２時間インキュベートした。次に、上記細胞をＰＢＳで２回洗浄し、適切な受容体アゴニスト、即ち、ＳＳＴＲ１受容体に対してはソマトスタチン１４、カッパオピオイド受容体に対してはＵ５０４８８、ドーパミンＤ２受容体に対しては（−）−ｑｕｉｎｐｉｒｏｌｅ、ドーパミンＤ１受容体に対してはドーパミン、および、β２受容体に対してはイソプロテレノール、を用いて刺激した。Ｇｉ／ｏ共役受容体（ＳＳＴＲ１、ＫＯＲ、Ｄ２）およびＧｓ共役受容体（Ｄ１、β２）のアゴニスト刺激により、Ｇタンパク質Ｇ１６および−６ｑｉ４ｍｙｒを活性化し、続いてＰＬＣβと細胞内Ｃａ放出とを刺激する。Ｃａのアポエクオリン−セレンテラジン複合体への結合により弱い放出が測定され、これはルミノメーター（ＴＯＰＣｏｕｎｔ、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ社製）を用いて測定される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
様々なＧαタンパク質のアミノ末端領域のアライメントを示す。
【図２】
適切なアゴニストの最大濃度を用いた、−６ｑ−Ｇαタンパク質変異体におけるＧｉ／ｏ共役受容体（Ａ）およびＧｓ共役受容体（Ｂ）によるＰＬＣβシグナル伝達経路の刺激を示す。
【図３】
−６ｑｉ４と比較した、−６ｑｉ４ｍｙｒの増加した発現に関するＳＤＳ−ＰＡＧＥウエスタンブロットを示す。加えて、さらなるＧαタンパク質発現を示す。
【図４】
ｑｗｔおよび−６ｑｉ４ｍｙｒの粒子分画（ｐ；膜含有）および可溶性分画（ｓ；ｓｃ）に分離されたことを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥウエスタンブロットである。Ｇタンパク質サブユニットは、１２ＣＡ５モノクローナル抗体により検出され、〜４２ＫＤのタンパク質バンドが得られた。
【図５】
−６ｑｉ４ｍｙｒ（＝Δ６ｑｉ４ｍｙｒ）による、様々なＧｉ／ｏ共役受容体のＰＬＣβシグナル伝達経路への連結を示す。Ｄ２、ｋおよびＳＳＴＲ１は、Ｇｉ／ｏ共役受容体である。用いられたコントロールは、ベクター構築物およびＧα１６タンパク質（＋１６）であった。
【図６】
Ｇｓ共役受容体が、−６ｑｓ５ｍｙｒ（＝Δ６ｑｓ５ｍｙｒ）によりＰＬＣβシグナル伝達経路へ連結することを示す。β１、β２およびＤ１は、Ｇｓ共役受容体である。ベクター構築物およびＧタンパク質Ｇα１６（＋１６）は、参照として提供される。
【図７】
感度が低いαサブユニットＧ１６の存在下、非常に高感度のＧαサブユニット−６ｑｉ４ｍｙｒの存在下、およびＧ１６と−６ｑｉ４ｍｙｒとの組み合わせのために、Ｇｉ／ｏ共役ドーパミンＤ２受容体の、ＰＬＣβ−Ｃａシグナル伝達経路への連結を示す。−６ｑｉ４ｍｙｒによるカルシウム放出の可能性のある活性化が、Ｇ１６の存在によって逆に影響を受けないことが示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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