(57)【要約】本発明は、ＧＰＣＲを発現する単一細胞バイオセンサーを使用することによって試験サンプルにおけるＧＰＣＲリガンドを検出することに関する。好ましくは、試験サンプルは生物学的サンプルまたは環境サンプルに由来する。本発明は、疾患の存在を検出するために、または環境における有害因子の存在を検出するために使用することができる。本発明には、様々なＧＰＣＲのリガンドを検出するバイオセンサーのアレイが含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験サンプルにおけるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）リガンドを検出する方法であって、
（ａ）ＧＰＣＲおよびアレスチンを含む細胞を提供するステップと、
（ｂ）細胞を試験サンプルにさらすステップと、
（ｃ）試験サンプルの存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布を測定するステップと
を含み、試験サンプルが、生物学的サンプル、環境サンプル、またはそれらに由来するサンプルである方法。
【請求項２】
試験サンプルの存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布が、試験サンプルの非存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布と比較される、請求項１の方法。
【請求項３】
ＧＰＣＲまたはアレスチンが検出可能に標識されるか、または別の内因性分子が検出可能に標識されるか、または別の外因性分子が検出可能に標識される、請求項１の方法。
【請求項４】
検出可能に標識された分子の分布により、ＧＰＣＲタンパク質またはアレスチンタンパク質の細胞分布が表される、請求項３の方法。
【請求項５】
ＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布が、試験サンプルにさらされた後の種々の時点で測定される、請求項１の方法。
【請求項６】
ＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布が、種々の濃度の試験サンプルにさらされた後に測定される、請求項１の方法。
【請求項７】
検出可能に標識された分子の細胞分布が定量される、請求項４の方法。
【請求項８】
試験サンプルにおけるリガンドの濃度が、試験サンプルの存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布を既知濃度のリガンドの存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布と比較することによって定量される、請求項７の方法。
【請求項９】
生物学的サンプルが、血清、組織、血液もしくは尿であるか、または、血清、組織、血液もしくは尿に由来する、請求項１の方法。
【請求項１０】
ＧＰＣＲがＣＣＫ−ＢまたはＣＣＫ−Ａである、請求項１の方法。
【請求項１１】
リガンドが、ガストリン、プレプロガストリン、切断型プレプロガストリン、ガストリン−３４、ガストリン−１７、ペンタガストリン、プロガストリン、グリシン伸長型ガストリン−１７、グリシン伸長型ガストリン−３４、ガストリン−７１、ガストリン−６、ｈＧ１７、配列Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ2のアミド化テトラペプチドを伴う化合物、またはガストリンの別の生物活性なイソ型である、請求項１の方法。
【請求項１２】
ＧＰＣＲがムスカリン性受容体である、請求項１の方法。
【請求項１３】
リガンドがアセチルコリンである、請求項１の方法。
【請求項１４】
標識された分子が、細胞質、形質膜、クラスリン被覆小孔、エンドサイトーシス小胞またはエンドソームに局在化する、請求項３の方法。
【請求項１５】
標識された分子の局所的濃度の増大が局所的なシグナル強度の増大をもたらす、請求項４の方法。
【請求項１６】
形質膜、クラスリン被覆小孔、エンドサイトーシス小胞またはエンドソームにおける標識された分子のシグナル強度が細胞質におけるシグナル強度のレベルに対して増大する、請求項１５の方法。
【請求項１７】
局所的なシグナル強度が、試験サンプルにおけるリガンドの増大した濃度の存在下で増大する、請求項１５の方法。
【請求項１８】
試験サンプルにおけるリガンドの濃度により、疾患状態が示される、請求項８の方法。
【請求項１９】
試験サンプルにおけるリガンドの濃度により、リガンド濃度を変化させる化合物が試験サンプルに存在することが示される、請求項８の方法。
【請求項２０】
試験サンプルにおけるリガンドの濃度により、アセチルコリンを改変する化合物が試験サンプルに存在することが示される、請求項８の方法。
【請求項２１】
試験サンプルにおけるリガンドの濃度により、アセチルコリンエステラーゼを阻害する化合物の存在が示される、請求項８の方法。
【請求項２２】
検出可能な分子が、放射性同位体、エピトープタグ、アフィニティー標識、酵素、蛍光基または化学発光基である、請求項３の方法。
【請求項２３】
分子が、検出可能に標識され得る別の分子とのその相互作用のために検出可能に標識される、請求項３の方法。
【請求項２４】
哺乳動物におけるＧＰＣＲリガンドをモニターする方法であって、
（ａ）ＧＰＣＲおよびアレスチンを含む細胞を提供するステップと、
（ｂ）細胞を試験サンプルにさらすステップと、
（ｃ）試験サンプルの存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布を測定するステップと
を含み、試験サンプルが、哺乳動物に由来する生物学的サンプルである方法。
【請求項２５】
試験サンプルにおけるリガンドの濃度が、試験サンプルの存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布を既知濃度のリガンドの存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布と比較することによって定量される、請求項２４の方法。
【請求項２６】
臨床状態がモニターされる、請求項２４の方法。
【請求項２７】
臨床状態により、疾患状態の存在が示される、請求項２６の方法。
【請求項２８】
臨床状態により、対象が障害を有するか、または障害を発症する危険性があることが示される、請求項２６の方法。
【請求項２９】
臨床状態が、胃腸ガン、高ガストリン血症、萎縮性胃炎、胃潰瘍、悪性腫瘍、または他のＧＰＣＲ関連疾患である、請求項２６の方法。
【請求項３０】
哺乳動物が長期間の酸抑制剤の薬物療法を受けている、請求項２４の方法。
【請求項３１】
細胞が、ＧＰＣＲの内在化を増大させるタンパク質を発現する、請求項１の方法。
【請求項３２】
ＧＰＣＲが改変され、これにより、形質膜、クラスリン被覆小孔、エンドサイトーシス小胞またはエンドソームにおける標識された分子の濃度が増大される、請求項１４の方法。
【請求項３３】
細胞がさらにＧタンパク質共役受容体キナーゼ（ＧＲＫ）を含む、請求項１の方法。
【請求項３４】
アレスチンおよび少なくとも１つのＧＰＣＲを過剰発現する細胞を含む単一細胞バイオセンサーであって、ＧＰＣＲまたはアレスチンまたは細胞が、前記ＧＰＣＲの内在化をモニターするために検出可能に標識される、単一細胞バイオセンサー。
【請求項３５】
試験サンプルにおけるＧＰＣＲリガンドを検出する方法であって、
（ａ）アレスチンおよび少なくとも１つのＧＰＣＲを過剰発現する細胞を含む単一細胞バイオセンサーを提供するステップと、
（ｂ）バイオセンサーを試験サンプルにさらすステップと、
（ｃ）試験サンプルの存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布を測定するステップと
を含み、試験サンプルが、生物学的サンプル、環境サンプル、またはそれらに由来するサンプルである方法。
【請求項３６】
ＧＰＣＲが、ＣＣＫ−Ａ、ＣＣＫ−Ｂおよびムスカリン性受容体からなる群から選択される、請求項３４の単一細胞バイオセンサー。
【請求項３７】
アレスチンが緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）にコンジュゲート化される、請求項３４の単一細胞バイオセンサー。
【請求項３８】
より長いインキュベーション時間、増大した濃度の試験サンプル、ＧＰＣＲの変異、またはＧＰＣＲ抗体のために増大した感度を有する、請求項３４の単一細胞バイオセンサー。
【請求項３９】
ＧＰＣＲの内在化を変化させる方法であって、ＣＣＫ−Ｂのアンタゴニストの効果的な量を細胞に与えることを含む方法。
【請求項４０】
細胞分布がフローサイトメトリーによって視覚化される、請求項１の方法。
【請求項４１】
細胞分布が蛍光共焦点顕微鏡観察によって視覚化される、請求項１の方法。
【請求項４２】
コンピューターにより、細胞分布の画像が分析される、請求項１の方法。
【請求項４３】
検出可能な分子の分布が定量される、請求項４の方法。
【請求項４４】
試験サンプルがＧＰＣＲのリガンドを含む、請求項１の方法。
【請求項４５】
試験サンプルがＧＰＣＲのアンタゴニストを含む、請求項１の方法。
【請求項４６】
試験サンプルにおけるＧＰＣＲリガンドを調節する化合物を検出する方法であって、
（ａ）ＧＰＣＲおよびアレスチンを含む細胞を提供するステップと、
（ｂ）細胞を試験サンプルにさらすステップと、
（ｃ）試験サンプルの存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布を測定するステップと
を含み、試験サンプルが、生物学的サンプル、環境サンプル、またはそれらに由来するサンプルである方法。
【請求項４７】
細胞分布により、ＧＰＣＲリガンドを調節する化合物の存在が示される、請求項４６の方法、
【請求項４８】
試験サンプルにおけるＧＰＣＲリガンドを連続的にスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＧＰＣＲおよびアレスチンを含む細胞を提供するステップと、
（ｂ）前記細胞を試験サンプルにさらすステップと、
（ｃ）試験サンプルの存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布を測定するステップと、ここで、試験サンプルが、生物学的サンプル、環境サンプル、またはそれらに由来するサンプルである、
（ｄ）前記細胞を、ＧＰＣＲおよびアレスチンを含む別の細胞で置き換えるステップと
を含む方法。
【請求項４９】
試験サンプルにおけるアセチルコリンエステラーゼの阻害剤を検出する方法であって、
（ａ）ムスカリン性受容体およびアレスチンを発現する細胞を提供するステップと、
（ｂ）試験サンプル、アセチルコリンエステラーゼ、およびムスカリン性受容体のアセチルコリンエステラーゼ感受性アゴニストを含む混合物を提供するステップと、
（ｃ）細胞を混合物にさらすステップと、
（ｄ）試験サンプルの存在下におけるムスカリン性受容体またはアレスチンの細胞分布を測定するステップと
を含み、試験サンプルが、生物学的サンプル、環境サンプル、またはそれらに由来するサンプルである方法。
【請求項５０】
アゴニストがアセチルコリンである、請求項４９の方法。
【請求項５１】
試験サンプルがアセチルコリンおよびアセチルコリンエステラーゼをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項５２】
試験サンプルがアゴニストをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項５３】
リガンドが同定されている、請求項１の方法。
【請求項５４】
試験サンプルにおけるＧＰＣＲリガンドの多数の生物活性なイソ型が検出される、請求項１の方法。
【請求項５５】
試験サンプルが高ガストリン血症患者から得られていた、請求項１０の方法。
【請求項５６】
ガストリン濃度が１０ｎＭ未満である、請求項１１の方法。
【請求項５７】
試験サンプルが不均一である、請求項１の方法。
【請求項５８】
細胞分布が、試験サンプルに１５分後〜３０分さらされた後に測定される、請求項１の方法。
【請求項５９】
細胞分布が、試験サンプルに１時間さらされた後に測定される、請求項１の方法。
【請求項６０】
細胞が３７℃の温度で試験サンプルにさらされる、請求項１の方法。
【請求項６１】
試験サンプルにおけるＧＰＣＲ内在化を調節する化合物を検出する方法であって、
（ａ）ＧＰＣＲおよびアレスチンを含む細胞を提供するステップと、
（ｂ）細胞を試験サンプルにさらすステップと、
（ｃ）試験サンプルの存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布を測定するステップと
を含み、試験サンプルが、生物学的サンプル、環境サンプル、またはそれらに由来するサンプルである方法。
【請求項６２】
試験サンプルにおけるＧＰＣＲ内在化を調節する化合物を検出する方法であって、
（ａ）ＧＰＣＲおよびアレスチンを含む細胞を提供するステップと、
（ｂ）細胞をアゴニストにさらすステップと、
（ｃ）細胞を試験サンプルにさらすステップと、
（ｄ）試験サンプルの存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布を測定するステップと
を含み、試験サンプルが、生物学的サンプル、環境サンプル、またはそれらに由来するサンプルである方法。
【請求項６３】
請求項３４の少なくとも１つのバイオセンサーを含むバイオアレイ。
【請求項６４】
多数のＧＰＣＲリガンドが検出される、請求項６３のバイオアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的サンプルおよび環境サンプルを含む試験サンプルにおけるＧＣＰＲリガンドの存在および濃度を分析する方法に関する。好ましくは、本発明は、不均一であってもよい試験サンプルにおける多数のＧＰＣＲリガンドを検出することに関する。本発明は、疾患診断の改善された方法、ならびに、殺虫剤、神経毒、およびバイオテロで使用される化学物質など有害な化学物質の検出の改善された方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、米国特許出願第６０／２９５，９４５号（２００１年６月５日出願）に対する米国特許法第１１９条（ｅ）による優先権を主張し、米国特許出願第０９／６３１，４６８号（２０００年８月３日出願）に対する米国特許法第１２０条による優先権を主張する一部継続出願である。なお、米国特許出願第０９／６３１，４６８号は、米国特許出願第０８／８６９，５６８号（１９９７年６月５日出願、現在、米国特許第５，８９１，６４６号）の継続出願である米国特許出願第０９／２３３，５３０号（１９９９年１月２０日出願、現在、米国特許第６，１１０，６９３号）の継続出願である。これらの内容はその全体が参照することにより本明細書により組み込まれる）。
【０００３】
本研究は、国立衛生研究補助金ＤＫ０２５４４、同ＨＬ６１３６５および同ＮＳ１９５７６によって援助された。従って、政府は本発明に対して一定の権利を有し得る。
【０００４】
（背景）
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、ホルモンまたはリガンドの結合を細胞内シグナルに翻訳する細胞表面タンパク質である。ＧＰＣＲは、すべての動物および昆虫および植物において見出されている。ＧＰＣＲのシグナル伝達は、光伝達、嗅覚、神経伝達、血管の正常な状態、心拍出量、消化、痛み、ならびに水分平衡および電解質平衡を含む様々な生理学的機能を調節することにおいて重要な役割を果たしている。ＧＰＣＲは様々な生理学的機能に関与しているが、多数の共通する構造的特徴をともに有する。ＧＰＣＲは、交互に並ぶ細胞内ループおよび細胞外ループによって架橋された７個の膜ドメインと、様々な長さの細胞内カルボキシル末端テールとを含有する。
【０００５】
様々なＧＰＣＲが多数の疾患状態に関係しており、そのような疾患状態には、狭心症などの心臓徴候、本態性高血圧、心筋梗塞、上室性および心室性の不整脈、鬱血性心不全、アテローム性動脈硬化、腎不全、糖尿病、喘息などの呼吸徴候、慢性気管支炎、気管支痙攣、気腫、気道閉塞、鼻炎などの上部気道徴候、季節性アレルギー、炎症性疾患、傷害に応答した炎症、慢性関節リウマチ、慢性炎症性腸疾患、緑内障、高ガストリン血症、酸／ペプシン障害などの胃腸徴候、びらん性食道炎、胃腸の分泌過多、肥満細胞過剰増殖、胃腸の逆流、消化性潰瘍、ゾリンジャー−エリソン症候群、痛み、肥満、神経性過食症、うつ病、強迫性傷害、臓器奇形（例えば、心臓奇形）、パーキンソン病およびアルツハイマー病などの神経変性疾患、多発性硬化症、エプスタイン−バール感染、ならびにがんが含まれるが、これらに限定されない。
【０００６】
ＧＰＣＲによって制御される生理学的応答の大きさはＧＰＣＲシグナル伝達とシグナル終結とのバランスに関係する。ＧＰＣＲのシグナル伝達は、アレスチンと呼ばれる一群の細胞内タンパク質によって制御される。アレスチンは、アゴニストにより活性化されているＧＰＣＲ、および特に、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ（ＧＲＫ）によってリン酸化されているＧＰＣＲを含む活性化されたＧＰＣＲと結合する。
【０００７】
Ｇタンパク質共役受容体に結合するホルモンの異常な調節は、多くの疾患の病理発生の基礎となっている。これらの調節因子の血清中レベルおよび組織レベルを測定することができることは、臨床的および科学的に望ましいことではあるが、現在、非常に特殊化された生化学アッセイおよび免疫化学的アッセイに限られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
生物学的サンプルにおけるＧＰＣＲリガンドの変化した濃度は、疾患状態を示し得る。環境サンプルにおけるＧＰＣＲリガンドの変化した濃度は有害化学物質の存在を示し得る。不均一なサンプルにおけるＧＰＣＲリガンドを定量的に検出するための非常に高感度で特異的な方法、ならびに不均一なサンプルにおけるＧＰＣＲリガンドの多数の生物活性なイソ型を検出する方法が求められている。不均一なサンプル（生物学的サンプルおよび環境サンプルの両方）におけるＧＰＣＲリガンドの存在を分析する高感度かつ迅速な方法により、疾患診断および環境における有害化合物の検出が改善される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の１つの態様は、試験サンプルにおけるＧＰＣＲリガンドを検出する方法である。試験サンプルは、生物学的サンプル、環境サンプル、または生物学的サンプルもしくは環境サンプルに由来するサンプルである。好ましくは、少なくとも１つのＧＰＣＲと、アレスチンとを含む細胞が提供される。試験サンプルが提供され、細胞が試験サンプルにさらされる。試験サンプルの存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布が測定される。試験サンプルの存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布は、試験サンプルの非存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布と比較することができる。
【００１０】
本発明の１つの態様において、ＧＰＣＲまたはアレスチンが検出可能に標識されるか、または別の内因性分子が検出可能に標識されるか、または別の外因性分子が検出可能に標識される。検出可能に標識された分子の分布により、ＧＰＣＲタンパク質またはアレスチンタンパク質の細胞分布が表される。
【００１１】
さらなる態様において、ＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布が、試験サンプルにさらされた後の種々の時点で測定される。ＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布が、種々の濃度の試験サンプルにさらされた後に測定される。検出可能に標識された分子の細胞分布を定量することができる。
【００１２】
さらなる態様において、試験サンプルにおけるリガンドの濃度が、試験サンプルの存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布を既知濃度のリガンドの存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布と比較することによって定量される。
【００１３】
試験サンプルとして提供される生物学的サンプルは、血清、組織、血液もしくは尿でもよく、または、血清、組織、血液もしくは尿に由来してもよい。
【００１４】
さらなる態様において、ＧＰＣＲはＣＣＫ−ＢまたはＣＣＫ−Ａである。リガンドは、ガストリン、プレプロガストリン、切断型プレプロガストリン、ガストリン−３４、ガストリン−１７、ペンタガストリン、プロガストリン、グリシン伸長型ガストリン−１７、グリシン伸長型ガストリン−３４、ガストリン−７１、ガストリン−６、ｈＧ１７、配列Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ2のアミド化テトラペプチドを伴う化合物、またはガストリンの別の生物活性なイソ型であってもよい。
【００１５】
さらなる態様において、ＧＰＣＲはムスカリン性受容体である。リガンドはアセチルコリンでもよい。
【００１６】
さらなる態様において、標識された分子は、細胞質、形質膜、クラスリン被覆小孔、エンドサイトーシス小胞またはエンドソームに局在化していてもよい。標識された分子の局所的濃度の増大は局所的なシグナル強度の増大をもたらす。形質膜、クラスリン被覆小孔、エンドサイトーシス小胞またはエンドソームにおける標識された分子のシグナル強度は、細胞質におけるシグナル強度のレベルに対して増大し得る。局所的なシグナル強度は、試験サンプルにおけるリガンドの増大した濃度の存在下で増大し得る。
【００１７】
さらなる態様において、試験サンプルにおけるリガンドの濃度により、疾患状態が示される。試験サンプルにおけるリガンドの濃度により、リガンド濃度を変化させる化合物が試験サンプルに存在することを示すことができる。試験サンプルにおけるリガンドの濃度により、アセチルコリンを改変する化合物が試験サンプルに存在することが示される。試験サンプルにおけるリガンドの濃度により、アセチルコリンエステラーゼを阻害する化合物の存在が示される。
【００１８】
検出可能な分子は、放射性同位体、エピトープタグ、アフィニティー標識、酵素、蛍光基または化学発光基であり得る。分子は、検出可能に標識され得る別の分子とのその相互作用のために検出可能に標識することができる。
【００１９】
本発明は、哺乳動物におけるＧＰＣＲリガンドをモニターする方法に関連する。試験サンプルは、哺乳動物に由来する生物学的サンプルである。好ましくは、少なくとも１つのＧＰＣＲと、アレスチンとを含む細胞が提供される。試験サンプルが提供され、細胞が試験サンプルにさらされる。試験サンプルの存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布が測定される。試験サンプルにおけるリガンドの濃度を、試験サンプルの存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布を既知濃度のリガンドの存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布と比較することによって定量することができる。この方法を使用して、臨床状態をモニターすることができ、この場合、そのような臨床状態により、疾患状態の存在を示すことができ、あるいは、対象が障害を有するか、または障害を発症する危険性があることを示すことができる。モニターされる臨床状態として、胃腸がん、高ガストリン血症、萎縮性胃炎、胃潰瘍、悪性腫瘍、または他のＧＰＣＲ関連疾患を挙げることができる。哺乳動物は長期間の酸抑制剤の薬物療法を受けていてもよい。
【００２０】
本発明のさらなる態様において、提供された細胞は、ＧＰＣＲの内在化を増大させるタンパク質を発現させることができる。ＧＰＣＲ自体が改変されることがあり、これにより、形質膜、クラスリン被覆小孔、エンドサイトーシス小胞またはエンドソームにおける標識された分子の増大した濃度がもたらされる。提供された細胞は、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ（ＧＲＫ）を発現させることができる。
【００２１】
本発明の１つの態様は単一細胞バイオセンサーである。この単一細胞バイオセンサーは、アレスチンおよび少なくとも１つのＧＰＣＲを過剰発現する細胞を含み、この場合、ＧＰＣＲまたはアレスチンまたは細胞が、ＧＰＣＲの内在化をモニターするために検出可能に標識される。本発明のさらなる態様は、試験サンプルにおけるＧＰＣＲリガンドを検出する方法であり、この場合、試験サンプルは、生物学的サンプル、環境サンプル、またはそれらに由来するサンプルである。この方法において、単一細胞バイオセンサーが提供され、このバイオセンサーが試験サンプルにさらされ、そして試験サンプルの存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布が測定される。単一細胞バイオセンサーにおいて、ＧＰＣＲは、ＣＣＫ−Ａ、ＣＣＫ−Ｂまたはムスカリン性受容体であり得る。アレスチンを緑色蛍光タンパク質にコンジュゲート化することができる。このバイオセンサーは、より長いインキュベーション時間、増大した濃度の試験サンプル、ＧＰＣＲの変異、またはＧＰＣＲ抗体のために増大した感度を有し得る。
【００２２】
本発明は、ＣＣＫ−Ｂのアンタゴニストの効果的な量を細胞に与えることを含む、ＧＰＣＲ内在化を変化させる方法に関連する。
【００２３】
本発明のこの方法では、細胞分布をフローサイトメトリーまたは蛍光共焦点顕微鏡観察によって視覚化することができる。細胞分布の画像をコンピューターによって分析することができ、そして検出可能な分子の分布を定量することができる。分析される試験サンプルはＧＰＣＲのリガンドまたはＧＰＣＲのアンタゴニストを含むことができる。
【００２４】
本発明は、試験サンプルにおけるＧＰＣＲリガンドを調節する化合物を検出する方法に関連する。試験サンプルは、生物学的サンプル、環境サンプル、または生物学的サンプルもしくは環境サンプルに由来するサンプルである。好ましくは、少なくとも１つのＧＰＣＲと、アレスチンとを含む細胞が提供される。試験サンプルが提供され、細胞が試験サンプルにさらされる。試験サンプルの存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布が測定される。試験サンプルの存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布により、ＧＰＣＲリガンドを調節する化合物の存在を示すことができる。
【００２５】
本発明は、試験サンプルにおけるＧＰＣＲリガンドを調節する化合物を検出する方法に関連する。試験サンプルは、生物学的サンプル、環境サンプル、または生物学的サンプルもしくは環境サンプルに由来するサンプルである。好ましくは、少なくとも１つのＧＰＣＲと、アレスチンとを含む細胞が提供される。試験サンプルが提供され、細胞が試験サンプルにさらされる。試験サンプルの存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布が測定される。
【００２６】
本発明は、試験サンプルにおけるＧＰＣＲリガンドを連続的にスクリーニングする方法に関連する。試験サンプルは、生物学的サンプル、環境サンプル、または生物学的サンプルもしくは環境サンプルに由来するサンプルである。好ましくは、少なくとも１つのＧＰＣＲと、アレスチンとを含む細胞が提供される。試験サンプルが提供され、細胞が試験サンプルにさらされる。試験サンプルの存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布が測定される。その後、細胞は、ＧＰＣＲおよびアレスチンを含む別の細胞で置き換えられる。
【００２７】
本発明のさらなる態様は、試験サンプルにおけるアセチルコリンエステラーゼの阻害剤を検出する方法である。試験サンプルは、生物学的サンプル、環境サンプル、または生物学的サンプルもしくは環境サンプルに由来するサンプルである。好ましくは、ムスカリン性受容体およびアレスチンを発現する細胞が提供される。試験サンプル、アセチルコリンエステラーゼ、およびムスカリン性受容体のアゴニストを含む混合物が提供される。アゴニストはアセチルコリンエステラーゼ感受性である。細胞がこの混合物にさらされる。試験サンプルの存在下におけるムスカリン性受容体またはアレスチンの細胞分布が測定される。アゴニストはアセチルコリンであってもよい。
【００２８】
本発明の１つの態様において、試験サンプルはアセチルコリンおよびアセチルコリンエステラーゼを含有することができる。試験サンプルはアゴニストを含有することができる。リガンドは同定されていてもよく、そして試験サンプルにおけるＧＰＣＲリガンドの多数の生物活性なイソ型を検出することができる。
【００２９】
本発明のさらなる態様において、試験サンプルは高ガストリン血症の哺乳動物に由来し得る。試験サンプルにおけるガストリン濃度は１０ｎＭ未満であり得る。試験サンプルは不均一であってもよい。
【００３０】
本発明の１つの態様において、細胞分布を、試験サンプルにさらされた１５分後〜３０分後に測定することができる。細胞分布を、試験サンプルにさらされた１時間後に測定することができる。細胞は約３７℃の温度で試験サンプルにさらすことができる。
【００３１】
本発明は、試験サンプルにおけるＧＰＣＲ内在化を調節する化合物を検出する方法に関連する。試験サンプルは、生物学的サンプル、環境サンプル、または生物学的サンプルもしくは環境サンプルに由来するサンプルである。好ましくは、少なくとも１つのＧＰＣＲと、アレスチンとを含む細胞が提供される。試験サンプルが提供され、細胞が試験サンプルにさらされる。試験サンプルの存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布が測定される。
【００３２】
さらなる態様において、本発明は、試験サンプルにおけるＧＰＣＲ内在化を調節する化合物を検出する方法に関連する。試験サンプルは、生物学的サンプル、環境サンプル、または生物学的サンプルもしくは環境サンプルに由来するサンプルである。好ましくは、少なくとも１つのＧＰＣＲと、アレスチンとを含む細胞が提供される。細胞がアゴニストにさらされる。試験サンプルが提供され、細胞が試験サンプルにさらされる。試験サンプルの存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布が測定される。
【００３３】
本発明のさらなる態様は、少なくとも１つの単一細胞バイオセンサーを含有するバイオアレイである。このバイオアレイにより、多数のＧＰＣＲリガンドを検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
特許ファイルまたは出願ファイルには、着色された少なくとも１つの図面が含まれる。着色された図面を伴う本特許または特許出願の公開物の複写物は、請求および必要な費用の支払いにより当局によって提供される。
【００３５】
本発明の目的および利点は、図面と一緒に下記の詳細な説明を読むことによって理解される。
【００３６】
本発明に従って、当業者の範囲に含まれる従来の分子生物学、微生物学、免疫学および組換えＤＮＡ技術を用いることができる。そのような技術は文献に詳しく説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（第３版、２００１年）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第Ｉ巻〜第ＩＶ巻［Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（２００２年および隔月の更新）］；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻［Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ編（１９９４年）］；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、第Ｉ巻〜第ＩＶ巻［Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（２００２年および隔月の更新）］；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４年）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５年）］；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４年）］；「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ、第４版」［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（２０００年）］；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」［ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６年）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８８年）；Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｎｏ．Ｉ、Ｈａｒｌｏｗ，ＥｄおよびＬａｎｅ，Ｄａｖｉｄ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９９８年）；Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗ，ＥｄおよびＬａｎｅ，Ｄａｖｉｄ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９年）；「Ｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」［Ｔ．Ｈａｇａら編（１９９９年）］を参照のこと。
【００３７】
別途述べられない限り、本明細書および請求項において使用される下記の用語は、下記に示される意味を有する。
【００３８】
「ｈＧ１７」はヒトのガストリン−１７アミノ酸ペプチドである。これは、ヒト、別の生物（例えば、大腸菌、酵母、マウスなど）において産生してもよく、または化学合成してもよい。
【００３９】
「ＲＩＡ」、すなわち、放射免疫アッセイは、サンプルにおける特定の化合物を検出する、抗体に基づく方法である。現在、血清ガストリンの測定が、１つ以上の異なるガストリンイソ型に対する抗体を使用するＲＩＡによって行われる。
【００４０】
「神経毒」は、神経組織を損傷または破壊する能力を有する任意の化合物である。本発明に特に関連するのは、アセチルコリンエステラーゼを阻害する化合物である。通常、アセチルコリンエステラーゼは、ムスカリン性受容体の天然のリガンドであるアセチルコリンを分解する。アセチルコリンエステラーゼを阻害する神経毒素は、アセチルコリンの正常な分解を妨げる。本発明は、サンプルにおけるアセチルコリン濃度を検出することによって、アセチルコリンエステラーゼを阻害する神経毒素の存在を検出するために使用することができる。アセチルコリンエステラーゼを阻害する化合物には、ジアジノンなどの有機ホスファート殺虫剤および神経毒サリンが含まれる。
【００４１】
「アセチルコリン」は神経伝達物質であり、少なくとも、ニューロンと、心筋、平滑筋および骨格筋との間におけるシナプスである神経筋シナプスにおいて、ならびに中枢神経系および末梢神経系における様々なニューロン−ニューロンシナプスにおいて機能する。アセチルコリンは、酵素コリンアセチルトランスフェラーゼによって触媒される反応においてアセチルＣｏＡおよびコリンから神経末端内で合成される。
【００４２】
「ムスカリン性受容体」は、少なくとも、多くの脳ニューロン、交感神経系ニューロン、平滑筋、腺細胞および心臓細胞に存在するＧＰＣＲである。ムスカリン性受容体は、ムスカリン性アセチルコリン受容体、ムスカリン性コリン作動性受容体、ムスカリン性受容体に関する他の参照物（サブタイプ１、サブタイプ２、サブタイプ３、サブタイプ４、および当業者に知られている他のサブタイプを含む）を包含することが意味される。ムスカリン性受容体の用語には、ヒト、真核生物、後生動物、脊索動物、有頭動物、脊椎動物、ユーテレオストミ（ｅｕｔｅｌｅｏｓｔｏｍｉ）、哺乳動物、真獣類、霊長類、狭鼻類、ヒト科およびヒト属などのムスカリン受容体配列が含まれるが、これに限定されない。アセチルコリンはムスカリン性受容体のアゴニストである。
【００４３】
「アセチルコリンエステラーゼ」は、アセチルコリンを酢酸およびコリンに分解する酵素である。この酵素はシナプス間隙において高濃度でクラスター化している。
【００４４】
「アセチルコリンエステラーゼ阻害剤」は、アセチルコリンエステラーゼの活性を阻害する化合物である。アセチルコリンエステラーゼを阻害する化合物には、ジアジノンなどの有機ホスファート殺虫剤および神経毒サリンが含まれる。
【００４５】
「殺虫剤」には、神経毒素である化合物が含まれる。ジアジノンなどの有機ホスファート殺虫剤を含む殺虫剤はアセチルコリンエステラーゼ阻害剤でもよい。
【００４６】
「バイオアッセイ」は、生物学的に活性な化合物についてアッセイするための生理学的応答の使用である。
【００４７】
「バイオセンサー」は、化合物の存在を検出するために生物学的なプロセスまたは構成成分を利用する。本発明の単一細胞バイオセンサーは、ＧＰＣＲおよびアレスチンを含む細胞である。細胞を不均一なサンプルにさらし、サンプルに対するＧＰＣＲまたはアレスチンの応答をモニターすることによって、本発明の単一細胞バイオセンサーは、不均一なサンプルにおけるＧＰＣＲリガンドを検出するために有用である。
【００４８】
「ＺＥ症候群」は、ガストリン産生腫瘍によって引き起こされるゾリンジャー−エリソン症候群である。
【００４９】
「生物学的サンプル」は、対象から単離された組織および／または細胞および／または生物学的流体、ならびに対象内に存在する組織および細胞および流体を包含することが意図される。この場合、前記サンプルは、血液、血清、尿サンプル、便サンプル、腫瘍サンプル、細胞洗浄物、口内サンプル、痰、生物学的流体、組織抽出物、新しく集められた細胞、または組織培養でインキュベーションされていた細胞でもよい。生物学的サンプルは、全血、血清、血漿、唾液、尿、汗、腹水、腹腔液、滑液、羊水、脳脊髄液、および皮膚生検物などからなる群から選択することができる。生物学的サンプルは、血清、全血、血漿、リンパ液および卵巣濾胞液、ならびに他の循環液および唾液、粘液分泌物、そして呼吸液、またはそれらの分画化された部分を含むことができる。サンプルは、患者からの抽出物、未処理物、処理物、希釈物または濃縮物でもよい。
【００５０】
「生物学的に活性な」および「生物活性な」は、生物学的な活性を有する化合物または化合物フラグメントまたは化合物イソ型を示すために本明細書中では交換可能に使用される。好ましくは、生物学的に活性な、または生物活性なという語は、ＧＰＣＲと結合する能力を有するＧＰＣＲリガンドまたはリガンドイソ型を記載するために使用される。
【００５１】
「レプリコン」は、インビボでのＤＮＡ複製の自律的ユニットとして機能する、すなわち、自身の制御のもとでの複製が可能である任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。
【００５２】
「ベクター」は、結合したセグメントの複製がもたらされるように別のＤＮＡセグメントが結合され得る、プラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコンである。
【００５３】
「ＤＮＡ分子」は、その一本鎖形態または二本鎖らせんのいずれかでのデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン）のポリマー形態を示す。この用語は、分子の一次構造および二次構造を示すだけであり、分子を任意の特定の三次構造に限定しない。従って、この用語には、なかでも、線状ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、ウイルス、プラスミドおよび染色体に見出される二本鎖ＤＮＡが含まれる。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を議論する際には、配列は、転写されないＤＮＡ鎖（すなわち、ｍＲＮＡに対して相同的な配列を有する鎖）に沿って５’から３’への方向で配列を示す通常の慣例に従って本明細中に記載され得る。
【００５４】
「複製起点」は、ＤＮＡ合成に関係するそのようなＤＮＡ配列を示す。
【００５５】
ＤＮＡ「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれたとき、インビボで転写され、ポリペプチドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端における停止コドンによって決定される。コード配列には、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）のＤＮＡに由来するゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえも包含され得るが、これらに限定されない。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列が、通常、コード配列の３’側に存在する。
【００５６】
転写制御配列および翻訳制御配列は、コード配列の宿主細胞における発現をもたらす、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどのＤＮＡ調節配列である。
【００５７】
「プロモーター配列」は、ＲＮＡポリメラーゼと細胞内で結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。本発明を規定するために、プロモーター配列は、その３’末端において転写開始部位が結合し、そしてバックグラウンドを越える検出可能なレベルで転写を開始させるために必要な最少数の塩基またはエレメントを含むために上流（５’方向）に広がっている。プロモーター配列の内部には、転写開始部位（これは、ヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングによって都合よく明らかにされる）、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関わるタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。真核生物のプロモーターには、多くの場合、しかし必ずしも常にではないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスが含まれる。原核生物のプロモーターには、シャイン−ダルガルノ配列が、−１０コンセンサス配列および−３５コンセンサス配列に加えて含まれる。
【００５８】
「発現制御配列」は、別のＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御および調節するＤＮＡ配列である。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、次にｍＲＮＡが、コード配列によりコードされるタンパク質に翻訳されるとき、細胞において転写制御配列および翻訳制御配列の「制御下」にある。
【００５９】
「シグナル配列」をコード配列の前に含めることができる。この配列は、ポリペプチドを細胞表面に向かわせるために、またはポリペプチドを培地に分泌させるために宿主細胞に情報を伝える（ポリペプチドに対してＮ末端側の）シグナルペプチドをコードする。このシグナルペプチドは、タンパク質が細胞から離れる前に宿主細胞によって切断される。シグナル配列は、原核生物および真核生物に固有の様々なタンパク質に付随することが見出され得る。
【００６０】
本発明のプローブを示す際に本明細書中で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、２つ以上のリボヌクレオチドから構成される分子として、好ましくは３つ以上のリボヌクレオチドから構成される分子として定義される。その正確なサイズは、オリゴヌクレオチドの最終的な機能および使用に依存する多くの要因に依存する。
【００６１】
本明細書中で使用される用語「プライマー」は、精製された制限消化物の場合のように天然に存在するオリゴヌクレオチド、または化学的に作製されるオリゴヌクレオチドであるとしても、プライマー伸長生成物（これは核酸鎖に対して相補的である）の合成が誘導される条件に置かれたとき、すなわち、ヌクレオチドおよび誘導因子（例えば、ＤＮＡポリメラーゼなど）の存在下ならびに好適な温度およびｐＨにおいて合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを示す。プライマーは、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得るが、誘導因子の存在下で所望する伸長生成物の合成を開始させるために十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマー源および方法の使用を含む多くの要因に依存する。例えば、診断用途の場合、標的配列の複雑度に依存して、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、１５個〜２５個またはそれ以上のヌクレオチドを含有する。だが、オリゴヌクレオチドプライマーはそれよりも少ないヌクレオチドを含有することができる。
【００６２】
本明細書におけるプライマーは、特定の標的ＤＮＡ配列の種々の鎖に対して「実質的」に相補的であるように選択される。このことは、様々なプライマーが、それらのそれぞれの鎖とハイブリダイゼーションするために十分に相補的でなければならないことを意味する。従って、プライマーの配列は、テンプレートの正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチドフラグメントをプライマーの５’端に結合させることができ、一方で、プライマー配列の残り部分は鎖に対して相補的である。あるいは、プライマー配列が、鎖の配列に関して十分な相補性を有して、その配列とハイブリダイゼーションし、それにより、伸長生成物を合成するためのテンプレートを形成するならば、非相補的な塩基またはより長い配列をプライマー内に介在させることができる。
【００６３】
本明細書中で使用される用語「制限エンドヌクレアーゼ」および用語「制限酵素」は、特定のヌクレオチド配列またはその近くで二本鎖ＤＮＡをそれぞれが切断する細菌酵素を示す。
【００６４】
細胞は、そのようなＤＮＡが細胞の内部に導入されているとき、外因性または異種のＤＮＡによって「形質転換」されている。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに（共有結合的に連結されて）組み込まれてもよく、または染色体ＤＮＡに組み込まれなくてもよい。例えば、原核生物細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞では、形質転換ＤＮＡはプラスミドなどのエピソームエレメントに維持され得る。真核生物細胞に関しては、安定に形質転換された細胞は、形質転換ＤＮＡが染色体に組み込まれ、その結果、形質転換ＤＮＡが染色体の複製により娘細胞によって受け継がれる細胞である。この安定性は、形質転換ＤＮＡを含有する娘細胞の集団からなる細胞株またはクローンを樹立する真核生物細胞の能力によって明らかにすることができる。「クローン」は、有糸分裂によって単一の細胞または共通する祖先に由来する細胞の集団である。「細胞株」は、多くの世代にわたってインビトロで安定に増殖することができる一次細胞のクローンである。
【００６５】
２つのＤＮＡ配列は、ヌクレオチドの少なくとも約７５％（好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％または９５％）がＤＮＡ配列の規定された長さについて一致するとき、「実質的に相同的」である。実質的に相同的である配列を、配列データバンクにおいて利用することができる標準的なソフトウエアを使用して配列を比較することによって、または、例えば、その特定の系について規定されるようなストリンジェントな条件のもとでのサザンハイブリダイゼーション実験で同定することができる。例えば、ストリンジェントな条件には、６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥで６８℃における１時間〜３日間のハイブリダイゼーションを挙げることができる。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは当業者の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１年）（上掲）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第１巻〜第ＩＩ巻（上掲）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（上掲）を参照のこと。
【００６６】
本発明の範囲内にはまた、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３と同じアミノ酸配列を有するが、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３に縮重するＤＮＡ配列が含まれることを理解しなければならない。「縮重」により、異なる三文字コドンが、特定のアミノ酸を指定するために使用されることが意味される。
【００６７】
「アレスチン」は、天然に存在するアレスチンおよび操作された変異体のアレスチンのすべてのタイプを意味し、これには、視覚アレスチン（これはアレスチン１として示されることがある）、βアレスチン１（これはアレスチン２として示されることがある）、およびβアレスチン２（これはアレスチン３として示されることがある）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６８】
「βＡＲＫ１」は、β−アドレナリン作動性受容体キナーゼ１と名付けられたＧＲＫであり、ＧＲＫ２とも呼ばれる。
【００６９】
「βＡＲ」は、β−アドレナリン作動性受容体と名付けられたＧＰＣＲである。
【００７０】
「ガストリン受容体」は、ガストリンと結合するＧＰＣＲであり、好ましくはＣＣＫ−ＡおよびＣＣＫ−Ｂである。ＣＣＫ−ＡおよびＣＣＫ−Ｂ、コレシストキニンＡ受容体およびコレシストキニンＢ受容体は、ガストリン、コレシストキニンおよび類似するリガンドと結合するＧＰＣＲである。
【００７１】
ＧＰＣＲの「内在化」はＧＰＣＲの細胞内輸送である。内在化には、クラスリン被覆小孔、エンドサイトーシス小胞およびエンドソームへのＧＰＣＲの輸送が含まれる。
【００７２】
「カルボキシル末端テール」はＧＰＣＲのカルボキシル末端テールを意味する。多くのＧＰＣＲのカルボキシル末端テールは、７番目の膜貫通ドメインの終わりを特徴づける保存されたＮＰＸＸＹモチーフのすぐ後から始まる（すなわち、ＮＰＸＸＹモチーフの後がＧＰＣＲのカルボキシル末端テールである）。カルボキシル末端テールは、比較的長い場合（およそ数十個〜数百個のアミノ酸）、または比較的短い場合（およそ数十個のアミノ酸）、または事実上、存在しない場合（およそ十個未満のアミノ酸）がある。本明細書中で使用される「カルボキシル末端テール」は、（比較的長い場合、比較的短い場合、または事実上非存在であっても）３つの変化体のすべてを意味するものとする。
【００７３】
「クラスＡ受容体」は、好ましくは、ＨＥＫ−２９３細胞においてアレスチンをエンドサイトーシス小胞またはエンドソームに輸送しない。
【００７４】
「クラスＢ受容体」は、好ましくは、ＨＥＫ−２９３細胞においてアレスチンをエンドサイトーシス小胞またはエンドソームに輸送する。
【００７５】
「ＤＡＣ」は任意の脱感作活性な化合物を意味する。脱感作活性な化合物は、そのプロセスを刺激するか、または阻害することのいずれかによってＧＰＣＲの脱感作機構に影響を及ぼす任意の化合物である。ＤＡＣは、プロセスに関係する何らかの細胞構造だけでなく、アレスチン、ＧＲＫ、ＧＰＣＲ、ＰＩ３Ｋ、ＡＰ−２タンパク質、クラスリン、プロテインホスファターゼなど（これらに限定されない）を含むプロセスの何らかの細胞成分に作用することによってＧＰＣＲ脱感作経路に影響を及ぼす。ＤＡＣには、ＧＰＣＲへのアレスチン輸送を阻害する化合物、ＧＰＣＲに対するアレスチン結合を阻害する化合物、ＧＰＣＲへのアレスチン輸送を刺激する化合物、ＧＰＣＲに対するアレスチン結合を刺激する化合物、ＧＰＣＲのＧＲＫリン酸化を阻害する化合物、ＧＰＣＲのＧＲＫリン酸化を刺激する化合物、ＧＰＣＲのプロテインホスファターゼ脱リン酸化を阻害する化合物、ＧＰＣＲのプロテインホスファターゼ脱リン酸化を刺激する化合物、ＧＰＣＲからのアレスチンの放出を調節する化合物、ＧＰＣＲのアンタゴニスト、およびインバースアゴニストなどを挙げることができるが、これらに限定されない。ＤＡＣは、好ましくは、ＧＰＣＲの従来のアゴニストおよびアンタゴニストと同じ、ＧＰＣＲのリガンド結合部位に結合することなく、ＧＰＣＲ脱感作プロセスを阻害または刺激する。ＤＡＣは、ＧＰＣＲとは無関係に作用する。すなわち、ＤＡＣは、ある特定のＧＰＣＲに対する大きい特異性、またはある特定タイプのＧＰＣＲに対する大きい特異性を有していない。
【００７６】
「検出可能な分子」は、蛍光、リン光、ならびに生物発光および放射能の減衰（これらに限定されない）を含む、分光的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、放射活性手段および光学的手段による検出が可能な任意の分子を意味する。検出可能である分子には、ＧＦＰ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ローダミンコンジュゲート化抗体などが含まれるが、これらに限定されない。検出可能な分子には、放射性同位体、エピトープタグ、アフィニティー標識、酵素、蛍光基、化学発光基などが含まれる。検出可能な分子には、他の分子とのその相互作用の関数として直接的または間接的に検出される分子が含まれる。
【００７７】
「ＧＦＰ」は、天然源から単離され得るか、または遺伝子操作され得る天然に存在する様々な形態のＧＦＰ、ならびに人為的に改変されたＧＦＰを示す緑色蛍光タンパク質を意味する。ＧＦＰは当分野では周知である。例えば、米国特許第５，６２５，０４８号、同第５，７７７，０７９号および同第６，０６６，４７６号を参照のこと。ＧＦＰは、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアンブルー色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質、ルシフェリン、ＵＶ励起可能な蛍光タンパク質、または中間の任意の波長（これらに限定されない）を含む他の蛍光タンパク質（これは、天然源から単離された蛍光タンパク質または遺伝子操作された蛍光タンパク質であってもよい）と容易に交換可能であることが当分野では広く理解されている。本明細書中で使用される「ＧＦＰ」は、当分野で知られているすべての蛍光タンパク質を意味するものとする。
【００７８】
「未知受容体またはオーファンン受容体」は、その機能および／またはリガンドが知られていないＧＰＣＲを意味する。
【００７９】
「ＮＰＸＸＹモチーフ」は、７番目の膜貫通ドメインの終わりを特徴づける保存されたアミノ酸モチーフを意味する。この保存されたアミノ酸モチーフは、アスパラギンおよびプロリンで始まり、続いて２つの非特定のアミノ酸、その後にチロシンが続く。２つの非特定のアミノ酸は様々なＧＰＣＲの間で変化し得るが、全体的なＮＰＸＸＹモチーフは保存されている。
【００８０】
ポリペプチドを参照するとき、「下流」は、アミノ末端に対して、アミノ酸配列のカルボキシル末端に向かうことを意味する。ポリヌクレオチドを参照するとき、「下流」は３’方向であることを意味する。
【００８１】
ポリペプチドを参照するとき、「上流」は、カルボキシル末端に対して、アミノ酸配列のアミノ末端に向かうことを意味する。ポリヌクレオチドを参照するとき、「上流」は５’方向であることを意味する。
【００８２】
アミノ酸置換もまた、特に好ましい性質を有するアミノ酸に置換するために導入することができる。例えば、Ｃｙｓを、別のＣｙｓとのジスルフィド架橋のために可能な部位に導入することができる。Ｈｉｓを、特に「触媒作用」部位として導入することができる（すなわち、Ｈｉｓは酸または塩基として作用することができ、そのため、生化学的触媒における最も一般的なアミノ酸である）。Ｐｒｏを、βターンをタンパク質の構造において誘導するその特に平面的な構造のために導入することができる。
【００８３】
２つのアミノ酸配列は、アミノ酸残基の少なくとも約７０％（好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％または９５％）が同一であるか、または保存的置換を示すとき、「実質的に相同的」である。
【００８４】
ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、より大きなＤＮＡ分子内の同定可能なＤＮＡセグメントで、自然界ではそのより大きな分子と一緒に見出されないＤＮＡセグメントである。従って、異種領域は哺乳動物の遺伝子をコードするとき、遺伝子は、通常、供給源生物のゲノムにおける哺乳動物ゲノムＤＮＡを挟まないＤＮＡによって挟まれる。異種コード配列の別の例として、コード配列自身が自然界において見出されない構築物がある（例えば、ゲノムのコード配列がイントロンを含有するｃＤＮＡ、または天然の遺伝子とは異なるコドンを有する合成された配列）。対立遺伝子の変化または天然界で生じる変異事象は、本明細書中で規定されるようなＤＮＡの異種領域をもたらさない。異種ＤＮＡには、米国特許第６，３３１，４１５号（この文献は参照することにより本明細書中に組み込まれる）に記載されるように、異種の種に由来するＤＮＡ（「外来ＤＮＡ」）（これに限定されない）を含むことができる。
【００８５】
ＤＮＡ配列は、発現制御配列がそのようなＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御および調節するとき、発現制御配列に対して「機能的に連結されている」。用語「機能的に連結される（されている）」は、適切な開始シグナル（例えば、ＡＴＧ）が、発現させられるＤＮＡ配列の前方に存在すること、そして発現制御配列の制御下にあるＤＮＡ配列の発現、およびＤＮＡ配列によってコードされる所望する生成物の産生を可能にするために正しい読み枠を保つことを含む。組換えＤＮＡ分子に挿入することが所望される遺伝子が適切な開始シグナルを含有しない場合、そのような開始シグナルを遺伝子の前に挿入することができる。
【００８６】
「ハイブリダイゼーション」は、相補的なヌクレオシド塩基またはヌクレオチド塩基の間における、ワトソン−クリック型またはフーグスティーン型または逆フーグスティーン型の水素結合形成であり得る水素結合形成を意味する。例えば、アデニン（Ａ）およびチミン（Ｔ）は相補的な核酸塩基であり、これらは、水素結合を形成することによって対形成する。
【００８７】
用語「標準的なハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の両方について６×ＳＳＣおよび６８℃に対して実質的に等価である、塩および温度の条件を示す。しかし、当業者は、そのような「標準的なハイブリダイゼーション条件」が、緩衝液におけるナトリウムおよびマグネシウムの濃度、ヌクレオチド配列の長さおよび濃度、ミスマッチの割合、ホルムアミドの割合などを含む特定の条件に依存することを理解する。また、「標準的なハイブリダイゼーション条件」の決定において重要なことは、ハイブリダイゼーションしている２つの配列がＲＮＡ−ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡであるかどうかである。そのような標準的なハイブリダイゼーション条件は、周知の式に従って当業者によって容易に決定される。この場合、ハイブリダイゼーションは、所望する場合にはより大きいストリンジェンシーの洗浄を用いて、典型的には、予測されたＴｍまたは測定されたＴｍよりも１０℃〜２０℃低い。これらの条件が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（第３版、２００１年）のプロトコル１０に記載されている。
【００８８】
「動物」により、脊椎動物（例えば、カエル、サンショウウオ、ニワトリまたはウマ）および非脊椎動物（例えば、虫など）を含む動物界の任意のメンバーが意味される。「動物」はまた、「哺乳動物」を包含することが意味される。好ましい哺乳動物には、家畜動物（例えば、ウシ、スイギュウ、ウマ、ヒツジ、ブタおよびヤギなどの有蹄類）、ならびに齧歯類（例えば、マウス、ハムスター、ラットおよびモルモット）、イヌ、ネコ、霊長類、オオカミ（ｌｕｐｉｎｅ）、ラクダ科、シカ科、齧歯類、鳥類および魚類（ｉｃｈｔｈｙｅｓ）が含まれる。
【００８９】
「アンタゴニスト」には、アゴニストに結合する野生型ＧＰＣＲおよび／または改変型ＧＰＣＲ、野生型ＧＰＣＲおよび／または改変型ＧＰＣＲの脱感作、野生型ＧＰＣＲおよび／または改変型ＧＰＣＲのアレスチン結合、野生型ＧＰＣＲおよび／または改変型ＧＰＣＲのエンドソーム局在化および内在化などを妨げるすべての作用因子が含まれ、これらには、野生型ＧＰＣＲおよび／または改変型ＧＰＣＲに影響を及ぼす作用因子、ならびに野生型ＧＰＣＲおよび／または改変型ＧＰＣＲのシグナル変換、脱感作、エンドソーム局在化および再感作などに関与する他のタンパク質に影響を及ぼす作用因子が含まれる。
【００９０】
「ＧＰＣＲ」はＧタンパク質共役受容体を意味し、これには、自然界に存在するＧＰＣＲ、ならびに改変されているＧＰＣＲが含まれる。そのような改変されたＧＰＣＲが米国特許出願第０９／９９３，８４４号（２００１年１１月５日出願）および米国特許出願第１０／０５４，６１６号（２００２年１月２２日出願）に記載される（これらはその全体が参照することにより本明細書中に組み込まれる）。
【００９１】
「異常なＧＰＣＲ脱感作」および「異常な脱感作」は、ＧＰＣＲ脱感作経路が、活性な受容体と脱感作された受容体との間における平衡が野生型状態に関して変化するように破壊されていることを意味する。正常よりも活性な受容体が存在し得るか、または野生型の状態よりも大きく脱感作された受容体が存在し得る。異常なＧＰＣＲ脱感作は、構成的に活性であるＧＰＣＲまたは構成的に脱感作されるＧＰＣＲの結果であると考えられ、これにより、その受容体のシグナル伝達において正常を越える増大をもたらすか、またはその受容体のシグナル伝達において正常よりも小さい減少をもたらす。
【００９２】
「併用投与」、「組合せでの投与」、「同時投与」または「同時に投与される」は、化合物が、時間的に同じ時点で投与されるか、または観測される結果が、２つ以上の化合物が時間的に同じ時点で投与された場合と本質的に同じである時間的に十分に接近して投与されることを意味する。
【００９３】
「保存された異常性」は、異常なＧＰＣＲシグナル伝達を生じさせ得るＧＰＣＲ経路における異常性を意味し、そのような異常性には、ＧＰＣＲ、ＧＲＫ、アレスチン、ＡＰ−２タンパク質、クラスリン、プロテインホスファターゼなどにおける様々な異常性が含まれるが、これらに限定されない。この異常なＧＰＣＲシグナル伝達はＧＰＣＲ関連疾患の一因であり得る。
【００９４】
「脱感作（された）ＧＰＣＲ」は、現時点では、アゴニストに応答し、かつ従来のＧタンパク質のシグナル伝達を活性化する能力を有しないＧＰＣＲを意味する。本発明の脱感作されたＧＰＣＲは、アゴニストに対して適正に応答せず、リン酸化されず、アレスチンと結合せず、クラスリン被覆小孔に構成的に局在化せず、かつ／またはエンドサイトーシス小胞もしくはエンドソームに構成的に局在化しない。
【００９５】
「脱感作経路」は、脱感作プロセスおよびその後のプロセスに関係する任意の細胞構造だけではなく、脱感作プロセスの任意の細胞成分を意味し、これには、アレスチン、ＧＲＫ、ＧＰＣＲ、ＡＰ−２タンパク質、クラスリンおよびプロテインホスファターゼなどが含まれるが、これらに限定されない。本発明のアッセイ方法では、これらのポリペプチドを、例えば、細胞質内に、細胞膜において、クラスリン被覆小孔内に、エンドサイトーシス小胞内に、エンドソーム内に、そして中間の任意の段階などで検出することができる。
【００９６】
「ＧＰＣＲシグナル伝達」は、Ｇタンパク質のＧＰＣＲ誘導による活性化を意味する。これは、例えば、ｃＡＭＰの産生をもたらしてもよい。
【００９７】
「Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ」（ＧＲＫ）には、ＧＰＣＲをリン酸化する能力を有する任意のキナーゼが含まれる。
【００９８】
「Ｇタンパク質共役受容体ホスファターゼ」には、ＧＰＣＲを脱リン酸化する能力を有する任意のホスファターゼが含まれる。
【００９９】
「ヒトＧＰＣＲ」は、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎ）において天然に存在するＧＰＣＲを意味する。
【０１００】
「インバースアゴニスト」は、ＧＰＣＲに結合したとき、ＧＰＣＲの基礎的な固有的活性を阻害する化合物を意味する。インバースアゴニストは一種のアンタゴニストである。
【０１０１】
「単離された」または「精製された」核酸分子もしくはタンパク質もしくそれらの生物学的活性な部分または抗体は、組換え技術によって産生されたときには、他の細胞物質または培養培地を実質的に含まず、あるいは、化学合成されたときには、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。好ましくは、「単離された」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおける核酸（すなわち、核酸の５端および３端に位置する配列）に天然の状態で隣接する配列（好ましくは、タンパク質コード配列）を含まない。本発明の目的のために、核酸分子を示すために使用されるとき、「単離された」は、単離された染色体を含まない。例えば、様々な実施形態において、単離された核酸分子は、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおける核酸分子に天然の状態で隣接する、約５ｋｂ未満、約４ｋｂ未満、約３ｋｂ未満、約２ｋｂ未満、約１ｋｂ未満、約０．５ｋｂ未満または約０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有することができる。細胞物質を実質的に含まないタンパク質には、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満または約５％未満（乾燥重量比）の別のタンパク質を有するタンパク質調製物が含まれる。タンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え製造されるとき、好ましくは、培養培地は、タンパク質調製物の容量の約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満または約５％未満である。タンパク質が化学合成によって製造されるとき、好ましくは、タンパク質調製物は、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満または約５％未満（乾燥重量比）の化学的前駆体または非タンパク質化学物質を有する。
【０１０２】
「改変されたＧＲＫ」は、脱感作を変化させるように改変されたＧＲＫを意味する。
【０１０３】
「天然に存在するＧＰＣＲ」は、自然界に存在するＧＰＣＲを意味する。
【０１０４】
「においリガンド」は、受容体に結合したとき、においの知覚をもたらすリガンド化合物を意味し、これには、アゴニスト分子およびアンタゴニスト分子を含む合成化合物および／または組換え製造化合物が含まれる。
【０１０５】
「におい受容体」は、（通常的には、においリガンドと結合することによって）活性化されたとき、においの知覚をもたらす、嗅覚ニューロンの表面に通常の場合には見出される受容体タンパク質を意味する。
【０１０６】
「感作されたＧＰＣＲ」は、現時点では、アゴニストに応答し、かつ従来のＧタンパク質シグナル伝達を活性化する能力を有するＧＰＣＲを意味する。
【０１０７】
ＧＰＣＲおよび脱感作
本発明は、一般には、１つ以上のＧＰＣＲリガンドを含有する不均一な溶液に存在するＧＰＣＲリガンドを検出することに関連する。例えば、そのような溶液には、血清、血液、別の生物学的サンプル、または環境サンプルを挙げることができる。
【０１０８】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、広範囲の生理学的プロセスを調節しており、臨床薬物を発見するための重要な標的である。ＧＰＣＲは、生物学的に活性な分子について細胞外環境をサンプリングする高感度な形質膜検知センサーとしてインビボで機能する。ＧＰＣＲは、形質膜にまたがる結合事象を、多数のクラスの細胞内Ｇタンパク質の１つ以上と相互作用することによって伝達する。
【０１０９】
ＧＰＣＲがアゴニストにさらされると、その同系のヘテロ三量体Ｇタンパク質からの受容体の脱共役を伴うそのシグナル伝達能の迅速な低下がもたらされる。アゴニスト特異的な脱感作または相同的な脱感作を媒介する細胞機構は、アゴニストにより占有される受容体がＧタンパク質共役受容体キナーゼ（ＧＲＫ）によって脱リン酸化され、次いで、アレスチンタンパク質と結合する二段階プロセスである。
【０１１０】
アゴニストがＧＰＣＲと結合した後、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ（ＧＲＫ）がＧＰＣＲの細胞内ドメインをリン酸化することが発見されている。リン酸化の後、アレスチンタンパク質が、ＧＲＫによりリン酸化された受容体と会合し、受容体をその同系のＧタンパク質から脱共役する。アレスチンとリン酸化ＧＰＣＲとの相互作用はＧＰＣＲのシグナル伝達を終わらせ、シグナル伝達しない脱感作された受容体をもたらす。
【０１１１】
脱感作されたＧＰＣＲに結合したアレスチンは、エンドサイトーシス装置の構成成分にＧＰＣＲをつなぐアダプタータンパク質（例えば、アダプタータンパク質−２（ＡＰ−２）およびクラスリンなど）として機能することによって、エンドサイトーシス（すなわち、内在化）のために、ＧＰＣＲをクラスリン被覆小孔に標的化する。取り込まれたＧＰＣＲは脱リン酸化され、そして脱感作されて細胞表面に戻され、再使用される。アレスチンとＧＰＣＲとの相互作用の安定性は、ＧＰＣＲの脱リン酸化および再使用および再感作の速度を決定する１つの要因である。脱感作プロセスにおけるＧＰＣＲのリン酸化および脱リン酸化の関与が米国特許出願第０９／９９３，８４４号（２００１年１１月５日出願）に例示されている（その開示はその全体が参照することにより本明細書により組み込まれる）。
【０１１２】
Ｇタンパク質共役受容体に結合するホルモンの異常な調節が多くの疾患の病理発生のもとになっている。これらの調節因子の血清中レベルおよび組織レベルを測定することができることは、臨床的および科学的に望ましいが、現在、非常に特殊化された生化学的アッセイおよび免疫化学的アッセイに限定されている。本発明は、ＧＰＣＲ活性に共通するプロセスを評価する一般化された方法を提供し、これにより、ＧＰＣＲに基づく疾患をスクリーニングおよび診断するための有用な方法を提供する。さらに、本発明は、ＧＰＣＲリガンドを変化させる化合物について、サンプル（すなわち、生物学的サンプルまたは環境サンプルなど）をスクリーニングする方法を提供する。
【０１１３】
本発明者らは、生物学的溶液または環境溶液におけるＧＰＣＲリガンドの存在を検出する方法を開発するために、ＧＰＣＲの間で共通するこの脱感作プロセスを利用している。本発明は、生物学的サンプル、環境サンプル（例えば、水もしくは土壌など）、または他の溶液における、ＧＰＣＲのアゴニスト、リガンド、アンタゴニストまたは関連化合物の濃度、存在、非存在、または変化した濃度を検出する方法に関連する。
【０１１４】
本発明の１つの実施形態において、バイオセンサーが用いられる。このバイオセンサーは、ＧＰＣＲおよびアレスチンを含む宿主細胞（１つまたは複数）である。アゴニストが存在しないとき、アレスチンがＧＰＣＲと結合し、ＧＰＣＲが取り込まれる。好ましくは、このプロセスは、アレスチンまたはＧＰＣＲを検出することによって視覚化される。このバイオセンサーは、生物学的サンプルまたは環境サンプルなどの試験サンプルにおけるアゴニストの存在を検出するために使用することができる。本発明のバイオセンサーによるアゴニストの検出は、疾患診断において、ならびに、環境における危険化合物の検出において有用である。
【０１１５】
本発明者らは、ＧＰＣＲおよびアレスチンを含む宿主細胞が、試験サンプルにおけるＧＰＣＲの様々なリガンドを検出するために使用され得ることを明らかにした。本発明のバイオセンサーは、試験サンプルにおいてリガンドの多数の生物活性なイソ型を検出するために有用である。米国特許出願第０９／９９３，８４４号（２００１年１１月５日出願）、米国特許出願第１０／０５４，６１６号（２００２年１月２２日出願）および米国特許出願第１０／１０１，２３５号（２００２年３月１９日出願）（これらは参照することによりその全体が本明細書により組み込まれる）において、ＧＰＣＲおよびアレスチン−ＧＦＰを発現する細胞が、溶液におけるリガンドまたはアンタゴニストの同定のために使用された。本発明において、本発明者らは、ＧＰＣＲおよびアレスチン−ＧＦＰを発現する細胞が、試験サンプルにおいて、リガンドの１つのイソ型だけではなく、リガンドの生物活性なイソ型のすべてを検出するために有用であることを明らかにした。本発明は、試験サンプルにおいて、リガンドの１つのイソ型だけではなく、リガンドの生物活性なイソ型のすべての濃度を決定するために有用である。
【０１１６】
本発明の好ましい実施形態において、試験サンプルは不均一である。試験サンプルは様々なタンパク質および化合物を含むことができる。試験サンプルはＧＰＣＲリガンドの多数のイソ型を含むことができる。
【０１１７】
本発明の方法は、試験サンプルにおけるＧＰＣＲリガンドを検出する現行の方法を上回る数多くの利点を提供する。本発明の方法は非常に高感度で特異的である。本発明の方法では、反応性のエピトープを有するリガンド化学種のみを検出する他の抗体型方法（ＲＩＡなど）とは対照的に、ＧＰＣＲにより、サンプルにおける様々な生物反応性のリガンド化学種が検出される。さらに、本発明の方法はすべてのＧＰＣＲに広く適用され、そして様々なＧＰＣＲに対して容易に適合化される。
【０１１８】
本発明のバイオアッセイの１つの具体的な長所は、すべての偽陽性の結果が事実上排除されるということである。標準的なＲＩＡでは、抗血清と相互作用し得る何らかのエピトープにより、陽性の読み取り値がもたらされ得る。対照的に、本発明のバイオアッセイでは、ＧＰＣＲが用いられるため、免疫反応性ではなく、生物活性が測定される。アレスチンの輸送をもたらすリガンド−受容体相互作用が、リガンドの免疫学的性質にもかかわらず、生物学的に関連する。生物学的活性の程度を血清サンプルまたは組織サンプルにおいて放射能の非存在下で明らかにすることができることは、疾患の病理学を確認するための、または異常なホルモン濃度から生じる潜在的な合併症を予測するための、多くが要求される実験室への付加である。
【０１１９】
他の方法とは対照的に、本発明の方法は、サンプルにおける他の化合物との交差反応性を受けない。本発明の方法は、生物学的に活性であり、かつ生物学的に活性でないサンプル中の化合物と交差反応しないＧＰＣＲリガンドを検出することに対して特異的である。さらに、本発明者らの方法とは対照的には、他の検出方法では、試験サンプルにおけるリガンドの生物活性なイソ型のすべてを検出することができない。
【０１２０】
ガストリンの検出
多数の疾患状態がＧＰＣＲリガンド濃度の異常な調節と関連している。本発明は、ＧＰＣＲリガンドの存在、非存在、濃度、または濃度変化を検出する方法を提供する。そのような方法を使用して、本発明は、疾患または疾患原因状態を診断する方法を提供する。
【０１２１】
臨床アッセイは、疾患が存在するときに疾患を診断できないこと、すなわち、偽陰性の結果、または病理を適切に示さないこと、すなわち、偽陽性の結果によって妨げられることが多い。本発明の方法では、ＧＰＣＲリガンドの生物活性なイソ型のすべてを検出することが伴うので、本発明の方法は偽陰性の結果をもたらさない。例えば、本発明者らは、本発明の方法により、ガストリンの免疫活性な形態だけではなく、ガストリンの生物活性なイソ型のすべてが検出されたことを明らかにしており、従って、本発明の方法は偽陰性の結果をもたらさない。このことは、免疫学的アッセイにより検出できない潜在的な受容体アゴニストであるペンタガストリンに応答して観測された一貫する応答から特に明かである。標準物としてｈＧ１７を使用して内因性リガンドを検出することに対する実験感度は、ＲＩＡによって明らかにされるような正常の上限（＜２００ｐｇ／ｍｌ、約５０ｐＭ〜９０ｐＭ）に近い範囲である約１００ｐＭ〜２００ｐＭ（２００ｐｇ／ｍｌ〜４００ｐｇ／ｍｌのｈＧ１７）であった。感度を増大させるための様々な方法には、より多くの内在化を可能にするために受容体再使用を阻止すること、サンプル濃縮、または親和性を増大させるための変異誘発による受容体改変が含まれる。
【０１２２】
本発明の１つの実施形態は、試験サンプル中のガストリンにさらされた後におけるＣＣＫ−Ｂ  ＧＰＣＲの位置を分析することによる高ガストリン血症の診断である。ＣＣＫ−Ｂ  ＧＰＣＲおよびアレスチンを発現する細胞が提供される。ＧＰＣＲまたはアレスチンを検出可能に標識することができる。これらの細胞は試験サンプルにさらされ、ＧＰＣＲまたはアレスチンの位置のその後の変化が分析される。そのような分析は定量的であり得るし、従って、そのような分析により、試験サンプルにおけるガストリンまたは生物学的に活性なイソ型の濃度を示すことができる。下記に議論されるように、ガストリン濃度により、高ガストリン血症などの疾患状態を示すことができる。
【０１２３】
ガストリンは、ＧＰＣＲと結合するリガンドであり、胃酸分泌の主要なホルモン性調節因子である。ガストリンの２つの主要な形態が分泌される（ガストリン−３４およびガストリン−１７）。しかし、すべてのガストリンは、カルボキシル末端がアミド化されたテトラペプチド（Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ2）を有しており、これにより、完全な生物学的活性がもたらされる。ガストリンの大多数は胃洞の内分泌細胞で産生される。プロガストリンは、数多くの哺乳動物組織、すなわち、胃腸管の胃洞、十二指腸、回腸、結腸および膵臓；生殖管の卵巣、精巣および精子；神経内分泌組織の小脳、迷走神経、視床下部、下垂体および副腎髄質；そして気道の気管支粘膜、で発現することが知られている。だが、プロガストリンは他の組織でも同様に発現され得る。
【０１２４】
ガストリンは、ＧＩ管および脳において見出されるＧＰＣＲのＣＣＫ−Ａ受容体およびＣＣＫ−Ｂ受容体に結合するホルモンであるコレシストキニン（ＣＣＫ）ファミリーの胃腸（ＧＩ）ペプチドのメンバーである。典型的な７回らせんＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）としてのＣＣＫ−Ｂ受容体のクローニングおよび特徴づけにより、ガストリンの研究における有益なツールが提供されている。ヒトＣＣＫ−Ｂ受容体は、ガストリンおよびコレシストキニンに対してナノモル濃度の親和性を有している。ＣＣＫの循環レベルは、従来の放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）による検出を越えているが、ガストリンの主要な生物学的に活性な形態、すなわち、血液中に分泌されるガストリン−１７およびガストリン−３４がＲＩＡによって免疫学的に検出可能である。現在、血清中ガストリンの測定は、１つ以上の異なるガストリンイソ型に対する抗体を使用する放射免疫アッセイによって行われている。場合により、抗血清は、その生物学的効力が異なるか、またはＣＣＫ−Ｂ受容体シグナル伝達に関連する生物学的結果をもたらさないガストリン前駆体または他の血清タンパク質に対する交差反応性を示すことがある。あるいは、高ガストリン血症の症状および／または知られているガストリン分泌腫瘍を有し、血清中ガストリンのＲＩＡ測定値が正常であった患者が示されている。これにより、ある種の腫瘍では、ＲＩＡにより検出できないガストリン変化体が産生されているかもしれないという仮説に至った。
【０１２５】
ガストリンの２つの主要な生物学的に活性な形態（１７アミノ酸および３４アミノ酸の長さ）が、プレプロガストリンの酵素消化によって産生され、胃洞Ｇ細胞によって血液内に分泌される。ガストリンは胃酸の放出およびＧＩ粘膜の成長を主に調節し、そしてその過剰発現は腸クロム親和細胞過形成および腫瘍と関連する。
【０１２６】
小胞体において、プレプロガストリンのシグナルペプチドが切断され、プロガストリンが生じる。ゴルジ体におけるプロガストリンのさらなる酵素的修飾により、分泌顆粒にパッケージされる生成物が生じる。数多くの分泌顆粒生成物がプレプロガストリンに由来する。プロガストリン、グリシン伸長型ガストリン−１７、グリシン伸長型ガストリン−３４、ガストリン−７１、ガストリン−３４、ガストリン−１７およびガストリン−６。
【０１２７】
高ガストリン血症はＧＩ悪性腫瘍と関連しており、その結果として、血清中ガストリンレベルが臨床活動では日常的に測定される。高ガストリン血症は病態生理学的な状態で生じることがあり、血清中ガストリンレベルが、長期間の酸抑制剤による薬物療法を受けた患者でもまた上昇し得る。現在、血清中ガストリンの測定は、１つ以上の異なるガストリンイソ型に対する抗体を使用して放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）によって行われている。場合により、抗血清は、その生物学的効力が異なるか、またはＣＣＫ−Ｂ受容体シグナル伝達に関連する生物学的結果をもたらさないガストリン前駆体または他の血清タンパク質に対する交差反応性を示すことがある。あるいは、高ガストリン血症の症状および／または知られているガストリン分泌腫瘍を有し、血清中ガストリンのＲＩＡ測定値が正常であった患者が示されている。これにより、ある種の腫瘍では、ＲＩＡにより検出できないガストリン変異体が産生されているかもしれないという仮説に至った。
【０１２８】
アセチルコリンの検出
本発明の別の実施形態において、軍隊および市民社会にとって注目される数多くの化学的／生物学的薬剤を、記載されたセンサーによって容易に検知することができる。本発明は、生物学的薬剤、毒素、神経毒および神経ガスなどを検出するために使用することができる。生物学的に関連する分子を非常に高感度で迅速かつ正確に検出および定量することができることは、医療技術、国家安全保障、公衆安全、環境安全、ならびに市民および軍隊の医療診断のために重要な問題である。
【０１２９】
バイオテロ剤などの薬剤を検出するためのそのようなバイオセンサーは、環境において、現在の検出方法を上回る数多くの利点を提供する。第１に、アッセイは高感度であり、そしてリガンドの生物学的活性に基づくので、注目されるリガンドの何らかの生物活性な変化体の存在が検出される。第２に、アッセイは定量的であり、サンプル中のリガンドの変化した濃度または最小限の濃度を検出することができる。アッセイはまた、連続様式でモニターすることができる。さらに、サンプル調製が極めて直接的である。すなわち、サンプルは、検出のために水溶液に懸濁することが必要であるだけである。
【０１３０】
サリンおよび有機ホスファート殺虫剤（例えば、ジアジノン）を含む数多くの神経毒は、神経伝達物質アセチルコリンを不活性化する酵素であるアセチルコリンエステラーゼを阻害する。インビボにおいて、アセチルコリンエステラーゼ活性を低下させる化合物は、シナプス間隙におけるアセチルコリン濃度の増大を生じさせ、これにより、過度な神経興奮をもたらす。試験サンプルにおけるアセチルコリンのレベルを使用して、アセチルコリンエステラーゼ活性をモニターすることができ、そしてアセチルコリンエステラーゼ阻害剤の存在を検出することができる。本発明の１つの態様は、環境サンプルまたは生物学的サンプルにおけるアセチルコリンエステラーゼ阻害剤の存在を検出する方法としての、ムスカリン性受容体を発現する単一細胞バイオセンサーの使用である。
【０１３１】
本発明の別の実施形態は環境状態の野外試験に関連する。天然の化学物質、産業廃棄物および生物学的／化学的な戦争剤の存在を含む環境状態の自動化された検知が、本発明の実施形態を使用して可能である。無線伝送により試験結果を転送することにより、遠隔検知能力を提供することができ、そしてヒトまたは中央コンピューターにより指揮される活動による応答能力を提供することができる。その場合、応答の指示を検知位置または別の重要な応答位置のいずれかに送ることができる。そのようなシステムは、例えば、公共上水道における毒素の存在を明らかにすること、そして、その後、貯水場からの水の流れを中央指令により中断することにおいて有用であると考えられる。
【０１３２】
上記には、ＣＣＫ−Ｂまたはムスカリン性ＧＰＣＲを用いる本発明の様々な実施形態が記載される。さらに、本発明には、任意のＧＰＣＲを用いるバイオセンサーが含まれる。蛍光顕微鏡観察によって、アレスチンと緑色蛍光タンパク質との融合タンパク質を使用して、アレスチンとのＧＰＣＲの会合、および少なくとも４０個の異なるＧＰＣＲのその後の内在化が可能である（図２）。これらの細胞のそれぞれ、ならびに他の同様な細胞は本発明の有用なバイオセンサーである。
【０１３３】
本発明の方法
本発明は、サンプルにおけるＧＰＣＲ結合化合物の存在を分析する非常に特異的かつ高感度で、一般化された定量的方法を提供する。
【０１３４】
本発明の１つの実施形態は、試験サンプルにおけるＧＰＣＲリガンドを検出する方法である。より詳細には、この方法は、（ａ）ＧＰＣＲおよびアレスチンを含む細胞を提供するステップと、（ｂ）細胞を試験サンプルにさらすステップと、（ｃ）試験サンプルの存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布を測定するステップとを含み、この場合、試験サンプルが、生物学的サンプルまたは環境サンプルであるか、あるいは生物学的サンプルまたは環境サンプルに由来する。
【０１３５】
好ましい実施形態において、試験サンプルの存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布が、試験サンプルの非存在下におけるＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布と比較される。種々の濃度の試験サンプルを分析することができる。細胞分布を、試験サンプルにさらされた後の種々の時点で測定することができる。
【０１３６】
本発明の１つの実施形態において、ＧＰＣＲまたはアレスチンが検出可能に標識されるか、または別の内因性分子が検出可能に標識されるか、または別の外因性分子が検出可能に標識される。検出可能に標識された分子の分布により、ＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布が表される。ＧＰＣＲまたはアレスチンの分布により、ＧＰＣＲが取り込まれる程度を示すことができる。検出可能に標識された分子の細胞分布を定量することができる。
【０１３７】
本発明の１つの実施形態において、サンプルは既知濃度のリガンドを含むことができる。試験サンプルの存在下における検出可能に標識された分子の細胞分布を、既知濃度のリガンドの存在下における分布と比較することによって、試験サンプルにおけるリガンドの濃度を測定することができる。
【０１３８】
試験サンプルは生物学的サンプルまたは環境サンプルであり得る。生物学的サンプルは、血清、組織、血液もしくは尿であり得るか、または、血清、組織、血液もしくは尿に由来し得る。
【０１３９】
１つの実施形態において、ＧＰＣＲはＣＣＫ−ＢまたはＣＣＫ−Ａである。リガンドは、ガストリン、プレプロガストリン、切断型プレプロガストリン、ガストリン−３４、ガストリン−１７、ペンタガストリン、プロガストリン、グリシン伸長型ガストリン−１７、グリシン伸長型ガストリン−３４、ガストリン−７１、ガストリン−６であり得る。１つの実施形態において、ＧＰＣＲはムスカリン性受容体である。リガンドはアセチルコリンである。
【０１４０】
好ましい実施形態において、標識された分子は、細胞質、クラスリン被覆小孔、形質膜、エンドサイトーシス小胞またはエンドソームに局在化する。標識された分子の局所的濃度の増大はシグナル強度の局所的な増大をもたらす。形質膜、クラスリン被覆小孔、エンドサイトーシス小胞またはエンドソームにおけるシグナル強度は、細胞質におけるシグナル強度よりも増大し得る。局所的なシグナル強度は、リガンド、アゴニストまたはアンタゴニストなどの化合物の増大した量または低下した量の存在下で増大または低下し得る。
【０１４１】
好ましい実施形態において、試験サンプルにおけるリガンドの濃度により、疾患状態が示される。試験サンプルにおけるリガンドの濃度により、リガンド濃度を変化させる化合物が試験サンプルに存在することを示すことができる。リガンドの濃度により、アセチルコリンを改変する化合物、またはアセチルコリンエステラーゼを阻害する化合物が試験サンプルに存在することを示すことができる。
【０１４２】
好ましい実施形態において、検出可能な分子は、放射性同位体、エピトープタグ、アフィニティー標識、酵素、蛍光基または化学発光基である。１つの実施形態において、分子は、検出可能に標識される別の分子とのその相互作用のために検出可能に標識することができる。
【０１４３】
本発明の１つの実施形態は、哺乳動物におけるＧＰＣＲリガンドをモニターする方法であり、この場合、試験サンプルにおけるリガンド濃度の分析は、リガンドがＧＰＣＲに結合することに基づく。この方法は、臨床状態をモニターするために使用することができ、かつ／または疾患状態の存在を示すことができる。臨床状態により、対象が障害を有するか、または障害を発症する危険性があることを示すことができる。臨床状態として、胃腸がん、高ガストリン血症、萎縮性胃炎、胃潰瘍または悪性腫瘍を挙げることができる。
【０１４４】
検出可能な分子に結合させたアレスチンを、そのようなアレスチンがＧＰＣＲ経路において機能するので検出およびモニターすることができる。アレスチンの位置を、例えば、細胞の細胞質に一様に分布するアレスチン、細胞膜に濃縮されるアレスチン、クラスリン被覆小孔に濃縮されるアレスチン、エンドサイトーシス小胞またはエンドソームに局在化するアレスチンなどを検出することができる。ＧＰＣＲに対するアレスチンの接近を、任意の他の細胞構造に対する接近と同様にモニターすることができる。
【０１４５】
好ましくは、アレスチン、ＧＰＣＲおよび／またはアレスチン／ＧＰＣＲ複合体をエンドサイトーシス小胞またはエンドソームにおいて検出することができる。従って、アレスチン、ＧＰＣＲおよび／またはアレスチン／ＧＰＣＲ複合体をアゴニストの非存在下でエンドサイトーシス小胞またはエンドソームにおいて検出することができる。エンドサイトーシス小胞またはエンドソームにおけるアレスチンとＧＰＣＲとの会合は、長期間にわたって持続する容易に認識可能な強いシグナルをもたらし得る。４０×対物レンズの倍率のもとでは、シグナルは外見がドーナッツ様であり得る。エンドサイトーシス小胞またはエンドソームに局在化したアレスチンおよびＧＰＣＲの区画化から生じるシグナルが典型的には容易に検出される。同様に、この会合を阻止することが容易に検出される。検出方法の様々な例が本明細書中に記載される。そのような方法には、例えば、偏光顕微鏡観察、ＢＲＥＴ、ＦＲＥＴ、エバネッセント波励起顕微鏡観察、および標準的な顕微鏡観察または共焦点顕微鏡観察が含まれる。
【０１４６】
本発明の１つの実施形態は、試験サンプルにおけるガストリン濃度を測定する方法である。ガストリン受容体（ＣＣＫ−Ｂ）と、β−アレスチン２および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）からなる融合タンパク質とを永続的に発現する細胞株を用いることによって、本発明者らは、血清中ガストリンを測定するための単一細胞バイオセンサーを構築した。アゴニストにより活性化されたガストリン受容体に応答したアレスチン−ＧＦＰの定量的再分配が、蛍光共焦点顕微鏡観察によって得られた細胞像を分析することによって測定され、そして、そのようなアレスチン−ＧＦＰの定量的再分配は受容体活性化の高感度かつ特異的な測定をもたらした。そのような単一細胞バイオセンサーは、ガストリンの生物活性な血清中濃度を測定する実用的な手段であり、高ガストリン血症の診断を可能にする。
【０１４７】
１つの実施形態において、試験サンプルにおけるＧＰＣＲリガンドの存在により、疾患の存在、すなわち、対象が障害を有するか、または障害を発症する危険性があることが示される。あるいは、ＧＰＣＲリガンドの非存在、変化した濃度、または他の変化により、疾患の存在、すなわち、対象が障害を有するか、または障害を発症する危険性があることを示すことができる。
【０１４８】
１つの実施形態において、ＧＰＣＲリガンドの分析により、ＧＰＣＲリガンドを変化させる化合物の存在、非存在、増強、阻害、または他の変化が示される。分析により、リガンドの存在、非存在、変化した濃度、または他の変化を示すことができる。ＧＰＣＲリガンドを変化させる化合物には、ＧＰＣＲリガンドに対して直接的な影響を及ぼす酵素、阻害剤、活性化因子、小分子または他の化合物を挙げることができる。ＧＰＣＲリガンドを変化させる化合物には、ＧＰＣＲリガンドに対して間接的な影響を及ぼす酵素、阻害剤、活性化因子、小分子または他の化合物を挙げることができる。
【０１４９】
特定の実施形態において、ＧＰＣＲはムスカリン性受容体であり、試験サンプルにおけるアセチルコリンの濃度を測定する方法である。ムスカリン性受容体と、β−アレスチン２および緑色蛍光タンパク質からなる融合タンパク質とで一時的にトランスフェクションされた細胞株を用いることによって、本発明者らは、サンプル中のアセチルコリンを測定するための単一細胞バイオセンサーを構築した。
【０１５０】
アセチルコリンは、ムスカリン性受容体のリガンドであり、アセチルコリンエステラーゼによって変化させられる。アセチルコリンエステラーゼが存在するとき、試験サンプル中のアセチルコリンの濃度は減少する。試験サンプル中のアセチルコリンの量の減少は、アレスチン−ＧＦＰコンジュゲート体の低下した内在化によって視覚化されるように、ムスカリン性受容体の内在化量を低下させた。
【０１５１】
本発明のさらなる実施形態は、上記方法の感度を増大する方法に関連する。１つの態様において、米国特許出願第０９／９９３，８４４号（２００１年１１月５日出願）（これは参照することによりその全体が本明細書により組み込まれる）に記載されるように、ＧＰＣＲ自身を、増強されたリン酸化部位を有するようにそのＣ末端テールにおいて改変することができる。アッセイの感度はまた、ＧＲＫの過剰発現によって増大させることができる。バイオセンサーは、シグナルを増大させるために、より長い期間にわたって、または増大した濃度で試験サンプルにさらすことができる。
【０１５２】
タンパク質の発現
本発明の別の特徴は、本明細書中に開示されるように、バイオセンサーを得るために、ＧＰＣＲおよび／またはアレスチンをコードするＤＮＡ配列を細胞において発現させることである。当分野で周知のように、ＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列を適切な発現ベクターにおける発現制御配列に機能的に連結し、そのような発現ベクターを用いて、適切な単細胞宿主を形質転換することによって発現させることができる。
【０１５３】
発現制御配列に対するＤＮＡ配列のそのような機能的な連結には、当然のことではあるが、既にＤＮＡ配列の一部でない場合、開始コドンＡＴＧを正しい読み枠でＤＮＡ配列の上流に提供することが含まれる。
【０１５４】
広範囲の宿主／発現ベクターの組合せを、ＤＮＡ配列を発現させる際に用いることができる。例えば、有用な発現ベクターは、染色体ＤＮＡ配列のセグメント、非染色体ＤＮＡ配列のセグメントおよび合成ＤＮＡ配列のセグメントから構成され得る。好適なベクターには、ＳＶ４０の誘導体、ならびに、知られている細菌プラスミド、例えば、大腸菌プラスミド（ｃｏｌＥＩ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９）およびその誘導体、ＲＰ４などのプラスミドなど；ファージＤＮＡ、例えば、ファージλ（例えば、ＮＭ９８９）および他のファージＤＮＡ（例えば、Ｍ１３）および繊維状一本鎖ファージＤＮＡの多数の誘導体；酵母プラスミド、例えば、２μプラスミドまたはその誘導体など；真核生物細胞において有用なベクター、例えば、昆虫細胞または哺乳動物細胞において有用なベクターなど；プラスミドおよびファージＤＮＡの組合せに由来するベクター、例えば、ファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を用いるために改変されているプラスミドなど；その他、が含まれる。
【０１５５】
広範囲の発現制御配列（すなわち、それに機能的に連結されたＤＮＡ配列の発現を制御する配列）はどれも、ＤＮＡ配列を発現させるためにこれらのベクターにおいて使用することができる。そのような有用な発現制御配列には、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ワクシニア、ポリオーマまたはアデノウイルスの初期プロモーターまたは後期プロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣシステム、ＴＲＣシステム、ＬＴＲシステム、ファージλの主要なオペレーター領域およびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素に対するプロモーター、酸性ホスファターゼ（例えば、Ｐｈｏ５）のプロモーター、酵母α−接合因子のプロモーター、ならびに原核生物細胞または真核生物細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られている他の配列、ならびにそれらの様々な組合せが含まれる。
【０１５６】
広範囲の単細胞宿主細胞もまた、ＤＮＡ配列を発現させることにおいて有用である。これらの宿主には、周知の真核生物宿主および原核生物宿主、例えば、大腸菌、シュードモナス属、バチルス属、ストレプミセス属の様々な系統、酵母などの菌類、植物細胞、線虫細胞、および動物細胞（ＨＥＫ−２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＲＩ．Ｉ細胞、Ｂ−Ｗ細胞およびＬ−Ｍ細胞など）、アフリカミドリサル腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０およびＢＭＴ１０）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、ならびに組織培養されているヒト細胞および植物細胞を挙げることができる。しかし、哺乳動物細胞が、本発明のバイオセンサーを作製するためには好ましい。
【０１５７】
必ずしもすべてのベクターおよび発現制御配列および宿主が、ＤＮＡ配列を発現させるために等しく十分に機能しないことが理解される。また、すべての宿主が同じ発現システムに関して等しく十分に機能しない。しかし、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく所望する発現を達成するために過度な実験を行うことなく、適切なベクターおよび発現制御配列および宿主を選択することができる。例えば、ベクターを選択する際には、ベクターがその中で機能しなければならないので、宿主を考慮しなければならない。ベクターのコピー数、コピー数を制御する能力、およびベクターによってコードされる何らかの他のタンパク質（例えば、抗生物質マーカーなど）の発現もまた考慮される。
【０１５８】
発現制御配列を選択する際には、通常、様々な要因が考慮される。これらの要因には、例えば、システムの相対的な強さ、その制御性、および特に潜在的な二次的な構造体に関して、発現させられる特定のＤＮＡ配列または遺伝子とのその適合性が含まれる。好適な単細胞宿主が、例えば、選ばれたベクターとのその適合性、その分泌特性、タンパク質を正しく折り畳むその能力、およびその発酵条件、ならびに発現させられるＤＮＡ配列によってコードされる生成物の宿主に対する毒性、および発現生成物の精製の容易さを考慮することによって選択される。
【０１５９】
これらの要因および他の要因を考慮して、当業者は、発酵または大規模な動物培養でＤＮＡ配列を発現する様々なベクター／発現制御配列／宿主の組合せを構築することができる。
【０１６０】
上記で言及されたように、改変されたＧＰＣＲをコードするＤＮＡ配列を、クローン化ではなく合成的に調製することができる。適切なコドンをＧＰＣＲアミノ酸配列に対して有するＤＮＡ配列を設計することができる。一般に、配列が発現のために使用される場合、意図された宿主に対して好ましいコドンが選択される。完全な配列が、標準的な方法によって調製された重なるオリゴヌクレオチドから組み立てられ、そして完全なコード配列に組み立てられる。例えば、Ｅｄｇｅ、Ｎａｔｕｒｅ、２９２：７５６（１９８１）；Ｎａｍｂａｉｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２３：１２９９（１９８４）；Ｊａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５９：６３１１（１９８４）を参照のこと。
【０１６１】
合成ＤＮＡ配列により、ＧＰＣＲのアナログまたは「ムテイン」を発現する遺伝子の好都合な構築が可能になる。あるいは、ムテインをコードするＤＮＡを、天然型または改変型のＧＰＣＲ遺伝子またはｃＤＮＡの部位特異的変異誘発によって作製することができ、そしてムテインを、従来のポリペプチド合成を使用して直接作製することができる。
【０１６２】
非天然アミノ酸をタンパク質に部位特異的に取り込むための一般的な方法が、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｊ．Ｎｏｒｅｎ、Ｓｐｅｎｃｅｒ  Ｊ．Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ、Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１８２〜１８８（１９８９年４月）に記載される。この方法は、非天然アミノ酸を有するアナログを作製するために使用することができる。
【０１６３】
コンジュゲート体
本発明のアッセイ方法において使用される細胞は、アレスチンタンパク質および検出可能な分子のコンジュゲート体、ＧＰＣＲおよび検出可能な分子のコンジュゲート体、ＧＰＣＲ／アレスチン複合体の任意のメンバーおよび検出可能な分子とコンジュゲート体、検出可能な分子と、ＧＰＣＲ／アレスチン複合体の任意のメンバーと相互作用する分子とのコンジュゲート体などを含むことができる。検出可能な分子は、そのような分子自体だけでなく、検出可能な分子と相互作用する分子の検出を可能にする。
【０１６４】
視覚アレスチン、β−アレスチン１およびβ−アレスチン２（これらに限定されない）を含めて、すべての形態のアレスチン、天然に存在する変化体および操作された変異体を本発明において使用することができる。ＧＰＣＲは、検出可能なレベルにすべての形態のアレスチンと相互作用することができる。
【０１６５】
使用され得る検出可能な分子には、生物発光、リン光および蛍光（これらに限定されない）を含む、分光的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、放射活性手段および光学的手段による検出が可能である分子が含まれるが、そのような分子に限定されない。これらの検出可能な分子は、生物学的に適合し得る分子でなければならず、そして分子の生物学的な機能を損なってはならず、かつ検出される検出可能な分子の能力を損なってはならない。好ましい検出可能な分子は、蛍光またはリン光または生物発光を放射するために、化学的、機械的、電気的または放射活性的に励起され得るような、光学的に検出可能なタンパク質を含む光学的に検出可能な分子である。より好ましい検出可能な分子は、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む蛍光性のタンパク質などの固有的に蛍光性の分子である。検出可能な分子は、Ｂａｒａｋら（米国特許第５，８９１，６４６号および同第６，１１０，６９３号）に記載されるような方法によってアレスチンタンパク質にコンジュゲート化することができる。検出可能な分子は、前端または後端または中央部においてコンジュゲート化することができる。
【０１６６】
ＧＰＣＲもまた、検出可能な分子とコンジュゲート化することができる。好ましくは、ＧＰＣＲのカルボキシル末端が、検出可能な分子とコンジュゲート化される。ＧＰＣＲが、検出可能な分子とコンジュゲート化される場合、アレスチンとのＧＰＣＲの接近を容易に検出することができる。さらに、ＧＰＣＲが、検出可能な分子とコンジュゲート化される場合、アレスチンによるＧＰＣＲの区画化を容易に確認することができる。ＧＰＣＲとコンジュゲート化するために使用される検出可能な分子には、上記に記載されるような検出可能な分子を挙げることができ、これには、例えば、蛍光またはリン光または生物発光を放射するために、化学的、機械的、電気的または放射活性的に励起され得るような光学的に検出可能な分子が含まれる。好ましい光学的に検出可能な分子は、免疫蛍光、発光、蛍光およびリン光によって検出することができる。
【０１６７】
例えば、ＧＰＣＲは、免疫蛍光分子にコンジュゲート化された抗体で標識された抗体であり得るか、またはＧＰＣＲは、発光性ドナーとコンジュゲート化することができる。特に、ＧＰＣＲは、例えば、ルシフェラーゼ（例えば、ウミシイタケ属（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ）またはローダミンコンジュゲート化抗体（例えば、ローダミンコンジュゲート化抗ＨＡマウスモノクローナル抗体）とコンジュゲート化することができる。好ましくは、ＧＰＣＲのカルボキシル末端テールを発光性ドナー（例えば、ルシフェラーゼ）とコンジュゲート化することができる。ＧＰＣＲ、好ましくは、カルボキシル末端テールはまた、Ｌ．Ｓ．Ｂａｒａｋら、機能的に完全なβ２−アドレナリン作動性受容体−緑色蛍光タンパク質コンジュゲートの内部輸送および表面移動性、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．（１９９７）５１、１７７〜１８４に記載されるように、ＧＦＰとコンジュゲート化することができる。
【０１６８】
細胞タイプおよび基板
本発明の細胞は、少なくとも１つのＧＰＣＲと、アレスチンとを発現する。この場合、これらの分子の少なくとも１つが検出可能に標識される。本発明において有用な細胞には、真核生物細胞および原核生物細胞が含まれ、これらには、細菌細胞、酵母細胞、菌類細胞、昆虫細胞、線虫細胞、植物細胞および動物細胞が含まれるが、これらに限定されない。好適な動物細胞には、ＨＥＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、および様々な霊長類哺乳動物細胞が含まれるが、これらに限定されない。アレスチンおよび検出可能な分子のコンジュゲート体を、その組織全体で、または特定の器官タイプもしくは組織タイプにおいて発現する動物モデルもまた本発明において使用することができる。
【０１６９】
基板には、本発明の多数の細胞がその表面に置かれている。基板としては、任意の好適な生物学的な基板を挙げることができ、これには、ガラス材、プラスチック材、セラミック材、半導体材、シリカ材、光ファイバー材、ダイアモンド材、生体適合性モノマー材、または生体適合性ポリマー材が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７０】
検出方法
検出可能に標識されたアレスチンの細胞内の位置、検出可能に標識されたＧＰＣＲの細胞内の位置、あるいは、検出可能に標識されたアレスチン、またはＧＰＣＲ／アレスチン複合体の他のメンバーとＧＰＣＲまたは任意の他の細胞構造体との相互作用（これらには、例えば、アレスチンまたはＧＰＣＲの細胞膜における濃縮、エンドソームにおけるＧＰＣＲとのアレスチンの共局在化、およびクラスリン被覆小孔におけるアレスチンまたはＧＰＣＲの濃縮などが含まれる）を検出する方法は、使用される検出可能な分子（１つまたは複数）に依存して変化する。
【０１７１】
当業者は、使用される検出可能な分子（１つまたは複数）について好適な検出方法を容易に考案することができる。光学的に検出可能な分子の場合、任意の光学的方法を使用することができ、この場合、蛍光または生物発光またはリン光の変化を、放射された光の再分配または再配向のために測定することができる。そのような方法には、例えば、偏光顕微鏡観察、ＢＲＥＴ、ＦＲＥＴ、エバネッセント波励起顕微鏡観察、および標準的な顕微鏡観察または共焦点顕微鏡観察が含まれる。
【０１７２】
好ましい実施形態において、アレスチンをＧＦＰにコンジュゲート化することができ、アレスチン−ＧＦＰコンジュゲート体を共焦点顕微鏡観察によって検出することができる。別の好ましい実施形態において、アレスチンをＧＦＰにコンジュゲート化することができ、かつＧＰＣＲを免疫蛍光分子にコンジュゲート化することができ、そしてこれらのコンジュゲート体を共焦点顕微鏡観察によって検出することができる。さらなる好ましい実施形態において、アレスチンをＧＦＰにコンジュゲート化することができ、かつＧＰＣＲのカルボキシ末端をルシフェラーゼにコンジュゲート化することができ、そしてこれらのコンジュゲート体を生物発光共鳴放射技術によって検出することができる。さらなる好ましい実施形態において、アレスチンをルシフェラーゼにコンジュゲート化することができ、かつＧＰＣＲをＧＦＰにコンジュゲート化することができ、そしてこれらのコンジュゲート体を生物発光共鳴放射技術によって検出することができる。本発明の方法は、ＧＰＣＲ活性を検出することに関する。本発明の方法により、ＧＰＣＲ経路のリアルタイムでの増強されたモニタリングが可能になる。
【０１７３】
好ましい実施形態において、検出可能な分子の局在化パターンが測定される。さらなる好ましい実施形態において、検出可能な分子の局在化パターンの変化を測定することができる。局在化パターンにより、検出可能な分子の細胞局在化を示すことができる。いくつかの検出方法が、米国仮特許出願第６０／２７５，３３９号（２００１年３月１３日出願）に対する優先権を主張する米国特許出願第１０／０９５，６２０号（２００２年３月１２日出願）に記載される（これらの内容はその全体が参照することにより組み込まれる）。
【０１７４】
分子はまた、別の検出可能に標識された分子（抗体など）とのその相互作用によって検出することができる。
【０１７５】
試験キット
本発明には、試験サンプルを分析するための試験キットが含まれる。非常に好ましくは、試験キットは、生物学的サンプルまたは環境サンプルにおけるＧＰＣＲリガンドの濃度を測定するために有用である。さらにより好ましくは、試験キットは、ＧＰＣＲおよびアレスチンを発現する宿主細胞、そしてサンプルにおけるリガンド濃度を測定する方法を含む。
【０１７６】
［実施例］
本発明は、限定することを意図しない下記の例示的な実施例によってさらに説明される。
【実施例１】
【０１７７】
材料および方法
ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ−２３９）をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手した。培地、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および抗生物質をＭｅｄｉａ  Ｔｅｃｈ（Ｈｅｍｄｏｎ、ＶＡ）およびＧｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入した。９６ウェルガラスプレートをＷｈａｔｍａｎ（Ｃｌｉｆｔｏｎ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）から、そして結合樹脂をＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）から得た。ＣＣＫ−Ａ受容体アンタゴニストのデバゼピドおよび特異的なＣＣＫ−Ｂ受容体アンタゴニストを使用した。ペンタガストリンをＳｉｇｍａから得た。
【０１７８】
膜調製／結合−すべての段階が４℃で行われた。膜結合は、Ｓｈｅｔｚｌｉｎｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：６７５６〜６７５２（１９９８）に記載されるように三連で行われた。膜分画物は直ちにアッセイされたか、または−８０℃で保存された。飽和結合または競合的結合が［3Ｈ］ＣＣＫ−８ポリペプチド（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｓ、Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）について行われ、非特異的な結合が１μＭのｈＧ１７の存在下で測定された。競合的結合が、ｈＧ１７を使用して行われた。データは、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ−Ｐｒｉｓｍを使用して分析された。
【０１７９】
ヒトガストリン受容体のクローニング−ヒトガストリン／ＣＣＫ−Ｂ受容体のｃＤＮＡを、コード領域の５’端および３’端と一致する下記の２つのオリゴヌクレオチドを使用してヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から増幅した。ＮｈｅＩ制限部位を有するセンスオリゴヌクレオチド（５’−ＧＣＧＣＣＣＧＣＴＡＧＣＡＣＣＧＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＡＡＡＧＣＴＧＡＡＣＣＧＧ）、およびＫｐｎＩ制限部位を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド（５’−ＧＣＧＣＣＣＧＧＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＡＧＧＧＣＣＣＡＧＴ−ＧＴＧＣＴＧＡＴ）。１，４ｋｂの増幅されたＣＣＫ−Ｂ受容体ＤＮＡバンドをｐｃＤＮＡ３．１−ＺＥＯ（−）発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＮｈｅＩおよびＫｐｎＩにおいてサブクローン化して、ＡＢＩ３７７蛍光配列決定装置で確認した。
【０１８０】
細胞培養およびトランスフェクション：ＨＥＫ−２３９細胞での一過性トランスフェクションを、Ｗａｌｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４：３１５１５〜２３に記載されるように行った。
【０１８１】
イノシトールリン酸の測定：ＣＣＫ−Ｂ受容体を発現するＨＥＫ２３９細胞を、２５μｇ／ｍｌのポリ−Ｄ−リシン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ−６４０７、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）でコーティングされた１２ウェルプレートに置床して、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＭＥＭにおいて３７℃で一晩インキュベーションした。次に、細胞を標識培地（５％ＦＢＳ／ＭＥＭ／ゲンタマイシンにおける１μＣｉ／０．５ｍＬ／ウェルの［3Ｈ］イノシトール）に２４時間置き、そして、ＭＥＭ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４０）、２０ｍＭのＬｉＣｌを用いて３７℃で５分間洗浄して、アゴニストで処理した。反応を５００μＬの氷冷０．８Ｍ  ＨＣｌＯ4の添加によって停止させ、細胞を４℃で３０分間〜６０分間穏やかに撹拌し、その後、細胞溶解物をポリプロピレンチューブに加えた。２００μＬの中和溶液（０．７２Ｍ  ＫＯＨ／０．６Ｍ  ＫＣＯ3）を各チューブに加え、チューブを分析まで４℃で保った。ＢｉｏＲａｄ  ＡＧ−１Ｘ８樹脂（２００〜４００メッシュ）のカラム（ＢｉｏＲａｄ  Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃｋ）を、ＩＰ３活性をアッセイするために、それぞれ１ｍｌの５０％スラリーで調製した。各カラムを１０ｍｌの１８メガオームの脱イオン水で２回洗浄して、８００μＬの溶解物を加え、５分後〜１０分後、カラムを１０ｍｌの水で再び２回洗浄した。サンプルを、３．５ｍＬの１Ｍ蟻酸アンモニウム／０．１Ｍギ酸溶液を使用する１５ｍｌのＬｅｆｋｏ−Ｆｌｕｏｒ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｍｔ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、Ｉｌ）を含有するシンチレーションバイアルに溶出した。各分画物に対応する５０μＬの溶液物サンプルもまた、サンプルあたりの総放射能内在化を測定するために計数された。
【０１８２】
蛍光共焦点顕微鏡観察およびデータ分析：用量応答または患者血清レベルの定量的測定のためにアレスチン−ＧＦＰ輸送の測定を下記の様式で行った。ヒトＣＣＫ−Ｂ受容体およびアレスチン−ＧＦＰを永続的に発現する細胞を、１０％ウシ胎児血清が補充された２００μＬのＭＥＭにおいて、９６ウェルのガラス底プレートに２０，０００細胞／ウェルで播種した。１００μｌを取り出し、既知濃度のｈＧ１７ペプチドもしくはペンタガストリンまたは既知容量の患者血清を含有する培地によって置き換えた。蛍光細胞像をＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ−５１０共焦点顕微鏡で得た。５分間にわたるアレスチン−ＧＦＰの動的輸送を記載されるように分析した。１時間〜２時間のインキュベーションの後で得られた静的細胞像を、コンピュータープログラムＩＰ  ＬＡＢＳ（Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ、Ｆａｉｒｆａｘ、ＶＡ２２０３１）を使用して分析した。
【０１８３】
輸送の分析は下記のように行われた。画素強度の平均値および標準偏差を、アレスチン−ＧＦＰを含有する未処理細胞の像について求めた。これらの細胞に対して平均値を超える３標準偏差に対応する強度を、輸送を定義するための閾値として設定した。輸送されたアレスチン−ＧＦＰを表す画素の部分集団を決定するために、少なくとも１つの隣接部がこの閾値を超えている画素のみを計数した。この第２の制限は、ノイズを除くために設定された。像における測定された輸送量（Ｔｌ）を、その後、輸送を表す画素からの強度の和であるように計算した。像における細胞数は変化し得るが、像から得られる蛍光の総量は、発色団の分布には無関係であり、時間を通して一定のままであった。異なる像において得られる細胞数の変動を補正するために、像について計算された輸送を全体の像蛍光（ＴＦ）（すなわち、像における全画素に対する強度の和）によって正規化した。コンピューター計算された輸送はＴｌ／ＴＦとして定義された。受容体／アレスチン−ＧＦＰ複合体の量が多い領域からのシグナルが頭打ちになることを避けるために、未処理細胞の平均強度を、顕微鏡画像化システムのダイナミックレンジの下位側の１０％以内に含まれるように設定した。データは平均値±ＳＥＭとして示される。
【０１８４】
シグナル対ノイズの評価（図７を参照のこと）。シグナル／ノイズ比を評価するために、下記の２つの仮定が実験系について行われた。（１）全画素にわたる強度の和は時間およびβアレスチン２−ＧＦＰの再分配には依存しない；（２）細胞蛍光の強度分布はガウス型であり、下記の正規化された確率分布によって与えられる。
【数１】
2004537044.tif 000002
式中、Ｉは強度であり、Ｉoは平均強度であり、σは標準偏差であり、ｅｘｐ（ｚ）は指数関数であり、ｅｒｆ（ｚ）は下記の誤差関数である。
【数２】
2004537044.tif 000003
輸送されたβアレスチン２−ＧＦＰからのシグナルを測定するための閾値は、Ｉo＋ｊ（式中、ｊ＝βｘσ）に設定されるものとする。アゴニストの非存在下でこの閾値を超える強度の平均平方偏差は下記の通りである。
【数３】
2004537044.tif 000004
この場合、
【数４】
2004537044.tif 000005
輸送されたβアレスチン２−ＧＦＰの平均強度Ｉfを、強度Ｉo＋ｊの閾値の値を超える画素の部分集団Ｎaについて決定することができる。Ｉfは、輸送されたβアレスチン２−ＧＦＰおよび輸送されていないタンパク質からの強度寄与から生じる。Ｉfは、下記による輸送前の平均強度Ｉoに関連する。
【数５】
2004537044.tif 000006
式中、Ｎbは、輸送前の細胞を画像化する画素数であり、上記に定義されるようなＩoはそれらの平均強度であり、
ｈは、輸送された受容体の割合である。比Ｎb／Ｎaは、輸送後のβアレスチン２−ＧＦＰにより占有される容積の変化の大きさを表す。次に、閾値の値を超える典型的な個々の画素に対するシグナル対ノイズ比は下記のように計算することができる。
【数６】
2004537044.tif 000007
これは下記のように単純化される。
【数７】
2004537044.tif 000008
および
【数８】
2004537044.tif 000009
強度の狭いガウス分布によって記載される細胞の均一な系統については、その標準偏差に対する平均強度の比Ｉo／σは、画像化システムの範囲を適切に調節することによって、４よりも大きく選ぶことができる。下記の項：
【数９】
2004537044.tif 000010
は、その場合、２にほぼ等しい。項ｈによって表される輸送された受容体の割合は０（輸送なし）と１（１００％の輸送）との間で変化するが、これに対して、アレスチン−ＧＦＰの再分配による容積（面積）の比率Ｎb／Ｎaは、画像化システムおよび輸送されたアレスチンを含有する細胞成分（例えば、膜、被覆小孔またはエンドソーム）の強度に依存して５〜１００の間で変化し得る。
分母：
【数１０】
2004537044.tif 000011
における項は、平均強度を超えてｂ＝２標準偏差およびｂ＝３標準偏差に設定された閾値強度についてそれぞれ０．０１４および０．０００７０に等しい。従って、シグナル対ノイズＳ／Ｎは、輸送量が最小限である場合でさえ、細胞の非常に均一な集団については１０3〜１０4を容易に越えることができる。
【数１１】
2004537044.tif 000012
不均一な蛍光分布またはバックグラウンド蛍光により、強度プロフィルがこの理想的な場合から外れるとしても、分析は、強度変化を単に考慮することによる輸送が、受容体の挙動を評価するための非常に高感度な方法であり得ることを示している。さらに、単純なパターン認識アルゴリズムの使用は、輸送されたアレスチンのさらにより大きな識別をもたらすことができ、そして一過性トランスフェクションの場合などの均一でない細胞集団に対して有用であり得る。
【０１８５】
患者血清収集およびＲＩＡによる血清測定：機関検討委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ）はＤｕｋｅ大学医療センターにおける本研究を承認した。患者の血清は、その一次治療提供者によって要求されるような血清中ガストリン分析が予定された患者から得られた。患者はインフォームドコンセントに署名し、そしてさらなる血清サンプルが本研究における使用のために採取された。従来のＲＩＡ測定がＭａｙｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＭＮ）において行われた。
【実施例２】
【０１８６】
ＣＣＫ−Ｂ受容体およびアレスチン−ＧＦＰを発現する細胞は合成ヒトガストリン−１７ペプチド（ｈＧ１７）の存在に応答する。
フローサイトメトリーおよびアレスチン−ＧＦＰ輸送による細胞におけるアレスチン−ＧＦＰ発現およびＣＣＫ−Ｂ受容体発現の均一性の決定
アレスチン−ＧＦＰ再分配の定量的分析を単純化するために、同一の様式でリガンドに応答する細胞を樹立した。細胞集団全体での受容体発現およびアレスチン発現の大きな均一度を達成するために、ＣＣＫ−Ｂ受容体およびアレスチン−ＧＦＰを永続的に発現するＨＥＫ−２３９細胞株を樹立した。本研究で使用されたクローン（クローンＡ）におけるアレスチン発現の均一性の程度をフローサイトメトリーによって測定し（図４Ａ）、蛍光によって確認した（図４Ｂ、左パネル）。アレスチン−ＧＦＰを再分配することによって合成ヒトガストリン−１７ペプチド（ｈＧ１７）の存在に応答する細胞の一般的な能力が図４Ｂ（右パネル）に示される。
【０１８７】
図４Ａにおいて、クローンＡに属する細胞におけるアレスチン−ＧＦＰの相対的な発現が、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリーを使用して測定された。ｘ軸は相対的な細胞強度の対数であり、ｙ軸はその強度における細胞数（カウント数）を示す。細胞集団の９９パーセントが、強度プロフィルの上に見られる横棒の範囲内であった。図４Ｂには、１０ｎＭのｈＧ１７を用いた室温で５分間の処理の前（左パネル）および処理の後（右パネル）におけるクローンＡ由来の細胞の視野の蛍光像が示される。
【実施例３】
【０１８８】
リガンド結合および２次メッセンジャー応答の特徴づけ
クローンＡは、ガストリン受容体アゴニストである［3Ｈ］−ＣＣＫ８およびｈＧ１７の結合を測定し、ｈＧ１７媒介による２次メッセンジャー応答を測定することによってさらに特徴づけが行われた。［3Ｈ］−ＣＣＫ８を用いた飽和結合により、細胞は（１４±１）ｐｍｏｌのＣＣＫ−Ｂ受容体／ｍｇ細胞タンパク質を発現し、そして［3Ｈ］−ＣＣＫ８に対する親和性が（９．０±１．６）ｎＭであることが示された（図５Ａ）。イノシトールリン酸（ＩＰ３）産生のヒトガストリン−１７による刺激はＥＣ50＝（３．２±０．７）ｎＭをもたらした（図５Ｂ）。図５Ｂにおける挿入図は、ｈＧ１７による［3Ｈ］−ＣＣＫ８の競合的置換を示している。ＥＣ50は（２８±５）ｎＭであり、ＣＣＫ−Ｂ受容体に対するｈＧ１７のＫｄは（１７±３．５）ｎＭであった。
【０１８９】
図４には、１０ｎＭのｈＧ１７により、５分後でさえ、形質膜への測定可能なアレスチン−ＧＦＰの再分配がもたらされたことが示される。ｈＧ１７に３０分間〜６０分間さらした後、アレスチン−ＧＦＰを含有するエンドソームが認められた（図５Ｃ、上段右パネル）。この輸送は、１０μＭの特異的なＣＣＫ−Ｂ受容体アンタゴニストの添加によって完全に阻止された（図５Ｃ、下段左パネル）が、１０μＭの非常に関連するＣＣＫ−Ａ受容体アンタゴニストのデバゼピドでは阻止されなかった（図５Ｃ、下段右パネル）。図５Ｃにおけるデータにより、ＣＣＫ−Ｂ受容体はエンドソーム内へのアレスチン内在化を促進するので、ＣＣＫ−Ｂ受容体はクラスＢのＧＰＣＲであることが確認される。
【０１９０】
図５Ａには、クローンＡ由来の細胞が、細胞あたりの平均ＣＣＫ−Ｂ受容体発現、および［3Ｈ］ＣＣＫ−８に対する受容体親和性を測定するために、［3Ｈ］ＣＣＫ−８の増大する濃度とインキュベーションされたことが示される。［3Ｈ］ＣＣＫ−８の総結合、白四角；［3Ｈ］ＣＣＫ−８の特異的な結合、黒四角；過剰（１μＭ）な非標識ｈＧ１７の存在下での非特異的な結合、白丸。図５Ｂでは、クローンＡの細胞が、ＩＰ３の２次メッセンジャー応答を評価するために、ｈＧ１７ペプチドの増大する濃度にさらされた。挿入図は、この細胞株からのｈＧ１７による［3Ｈ］ＣＣＫ８の競合的置換を示す。データは平均値±ＳＥＭとして示される。図５Ｃには、ビヒクルでの処理（上段左パネル）、または１０ｎＭのアゴニストｈＧ１７による１時間の処理（上段右パネル）、または１０ｎＭのｈＧ１７＋１μＭのＣＣＫ−Ａアンタゴニストのデバゼピド（Ｌ−３６４，７１８）による１時間の処理（下段左パネル）、または１０ｎＭのｈＧ１７＋１μＭのＣＣＫ−Ｂアンタゴニストによる１時間の処理（下段右パネル）を受けたクローンＡ由来細胞の蛍光像が示される。
【実施例４】
【０１９１】
ｈＧ１７の用量応答および高ガストリン血症患者由来の血清サンプルの分析
ｈＧ１７の増大する濃度を使用して、細胞質のアレスチン−ＧＦＰの時間に依存した減少を、アレスチン再分配の薬理学がＩＰ３産生の薬理学と相関するかどうかを明らかにするために測定した。９６ウェルプレートにおいて増殖させたリガンド処理細胞の連続した蛍光像を、共焦点顕微鏡観察によって、５分間、３０秒間隔で得て、細胞質の蛍光の減少を測定することによって分析した。増大する濃度のｈＧ１７に対するアレスチン再分配の時間および用量の依存性が図６Ａにプロットされる。このデータから、用量応答曲線が計算され、輸送に対して４．２±１．５ｎＭのＥＣ50が得られた（図６Ｂ）。これはＩＰ３の結果と一致する。
【０１９２】
高ガストリン血症患者から得られた血清サンプルを、この５分アッセイパラダイムを使用してｈＧ１７に加えて評価した（図６Ａ）。アレスチンが、血清に応答して輸送されたが、測定された応答は、ｈＧ１７に対するアッセイ感度の下限に近い範囲で生じていた。アゴニストが約１ｎＭ以下である濃度におけるアッセイ感度を増大させるために、３７℃で１時間〜２時間のインキュベーションの後、ｈＧ１７に応答したアレスチン−ＧＦＰの再分配を直接測定した。図６Ｃには、増大する濃度のｈＧ１７にさらされた代表的な細胞視野が示される。小胞が、１０ｎＭ未満のｈＧ１７の濃度で容易に認められる。
【０１９３】
図６Ａには、様々な濃度のｈＧ１７に５分間さらされたクローンＡ細胞の応答を示す代表的な実験が例示される。蛍光像が３０秒毎に得られ、アレスチン−ＧＦＰの輸送について分析された。９個〜１１個の細胞がそれぞれの曲線のためにそれぞれの時点について分析された。グラフには、時間の関数として、細胞質に留まるアレスチン−ＧＦＰの部分量が示される。図６Ｂには、細胞の細胞質から５分後に失われたアレスチン−ＧＦＰの部分量を使用して、Ａのグラフに示されるｈＧ１７の増大する濃度についてＳ字形の用量応答曲線が作製されたことが示される。データは平均値±ＳＥＭとして示される。図６Ｃには、ｈＧ１７に３７℃で１時間さらされたクローンＡ細胞の応答を明らかにする実験から得られた像が示される。
【実施例５】
【０１９４】
βアレスチン−ＧＦＰの分布からの蛍光シグナルの計算
実施例４のこれらの測定のための方法論が図７に示される。蛍光強度を単に測定することによって得られた、バックグラウンドを越えるシグナルは、１２０倍の増大が観測された図７Ｂに示されるように、輸送されたアレスチンが小さい容積に濃縮されるために極めて多かった。
【０１９５】
図７Ａには、βアレスチン−ＧＦＰ融合タンパク質を安定に発現する細胞におけるβアレスチン−ＧＦＰの蛍光の分布が示される。受容体が、３０分間のアゴニスト処理の前および後において視覚化された。像の強度が、０〜２５５の強度階調範囲をもたらす画素あたり８ビットを使用して取得された。２５５よりも大きい相対的な強度は切り捨てられ、２５５と等しくされた。上段パネルおよび下段パネルには、同じ細胞視野が示される。上段の像における平均画素強度は０〜２５５の中央付近に含まれるように選択されたので、細胞は、上段パネルの方が明るいようである。下段パネルでは、平均画素強度はダイナミックレンジの下位側の１２％以内に含まれる。より大きい平均強度を選択することにより、右側上段パネルにおいて輸送されたβアレスチン−ＧＦＰを表す画素の多くが２５５の相対的な輝度で頭打ちにされた。これは、アゴニストにより誘導される輸送量の過小評価をもたらした。しかし、これは、より小さい平均強度を選択することにより、より低い像では避けられる。図７Ｂには、画素カウント対画素強度（下段左のグラフにおける緑色曲線）のヒストグラムが、代表的なコントロール細胞を使用して作製されたことが例示される。最初の最小強度ピークはバックグラウンドを表し、２番目のピークが緑色蛍光タンパク質である。平均細胞強度＋３標準偏差（９９パーセンタイルを越える）が、輸送されていない細胞質βアレスチンの蛍光シグナルを、小胞内に受容体とともに輸送されたβアレスチンから分離するための閾値として選択された。この基準値を越える強度を有する画素（マゼンタ色曲線は処理細胞における小胞に対応する）が、コントロールおよび処理の両方の像（上段の左パネルおよび右パネル）にマゼンタ色を重ねることによって示される。図７Ｂの上段右パネルでのマゼンタ色の画素と、図７Ａの下段右パネルでのβアレスチン−ＧＦＰ含有エンドサートシス小胞との間における一致に留意すること。これらの２つの像について基準値を超える画素に由来する総画素強度の比較が下段右グラフに示され、これは、処理細胞における蛍光シグナルの１２０倍の増大を示している。画像データはコンピュータープログラムＩＰ  ｌａｂｓによって分析された。
【実施例６】
【０１９６】
血清における免疫学的に検出できないガストリン受容体アゴニストの検出：ペンタガストレインに対する用量応答
血清中ガストリンレベルの上昇が見られない臨床的な高ガストリン血症が数多く報告されている。その結果、血清中ガストリンのＲＩＡ検出では、免疫学的に検出できないガストリン受容体アゴニストを有する患者の一団が見逃され得る。従って、ＣＣＫ−Ｂ受容体アゴニストのペンタガストリン（これは従来のＲＩＡによって検出できない）の輸送に対する影響が評価された。図８に例示されるように、増大する量のペンタガストリンに対するバイオセンサーの応答は、輸送に対するＥＣ50が２．４±１．９ｎＭである用量応答をもたらした。これは、ＣＣＫ−Ｂ受容体に結合するペンタガストリンに対する１ｎＭの報告されたＫｄ、およびポリホスホイノシチド回転に対する３．９ｎＭと類似している。
【０１９７】
図８Ａには、ペンタガストリンに３７℃で２時間さらされたクローンＡ細胞の応答を示す代表的な実験から得られた像が示される。蛍光像は、方法に記載されるように、アレスチン−ＧＦＰの輸送について分析された。図８Ｂのグラフには、リガンドの各濃度において得られた像について閾値の値（方法）を超える画素強度の正規化された和（Ｔｌ／ＴＦ）の増大が示される。データは、８個〜１０個の異なる像をそれぞれが有する２つの実験を表しており、平均値±ＳＥＭとして表される。
【実施例７】
【０１９８】
高ガストリン血症患者由来のガストリンの検出：
１時間における用量応答
バイオセンサーが様々な合成されたガストリンイソ型に応答し得ることにより、ヒト血清に含有されるガストリンの多数の生物活性な形態を測定するその潜在的能力が示唆される。図９Ａの上段パネルには、１時間のインキュベーションの後における患者血清サンプル（ＲＩＡにより５０００ｐｇ／ｍｌの報告された高ガストリン血症、３，４００ｐｇ／ｍｌ〜６，６００ｐｇ／ｍｌの範囲）に対する細胞応答が示される。アレスチン−ＧＦＰが形質膜および小胞内において認められた。輸送されたアレスチン−ＧＦＰの量が、図６Ｃの像により表されるデータから作製されたｈＧ１７標準曲線と比較された。ｈＧ１７用量応答曲線のＥＣ50は（０．８０±０．２５）ｎＭ（図６Ｂおよび図６Ｃ）であり、患者の生物活性なガストリンの血清中濃度が０．６３ｎＭ±０．１６ｎＭであると決定された（図９Ｂ、矢を参照のこと）。
【０１９９】
図９Ａには、高ガストリン血症患者から得られた血清の１：１希釈物と１時間インキュベーションされたクローンＡ細胞の代表的な像が示される。図９Ｂには、１時間において得られ、図７の場合のように分析された画像化輸送データからコンピューター処理されたクローンＡ細胞のｈＧ１７に対する用量応答曲線が示される。９個〜１６個の間で異なる像が各ｈＧ１７濃度および患者血清（矢印）について分析された。データは平均値±ＳＥＭとして表される。
【０２００】
本発明者らは、ＣＣＫ−Ｂ受容体とのアゴニスト媒介によるアレスチンの相互作用が、ＣＣＫ−Ｂ受容体およびβアレスチン２−ＧＦＰ（アレスチン−ＧＦＰ）を永続的に発現する細胞からなるバイオセンサーを使用して、ＣＣＫ−Ｂ受容体のシグナル伝達の薬理学を反映することを明らかにした。さらに、このバイオセンサーを使用して、高ガストリン血症患者の血清中ガストリン濃度が測定された。従来のＲＩＡを用いて確認されないイソ型を含むすべての生物活性なガストリンイソ型が、本発明の方法を用いて検出された。
【０２０１】
これらのデータは、ＣＣＫ−Ｂ受容体がアゴニスト媒介によるアレスチン調節を受けていたことを示している。ＩＰ３のシグナル伝達が、アレスチンの輸送をもたらす、ガストリンおよびペンタガストリンの同じ濃度で活性化された。脱感作が可能なＣＣＫ−Ｂ受容体の立体配座をもたらすガストリン内の残基がガストリン末端のペンタペプチドに存在する可能性がある。
【０２０２】
ＣＣＫ−Ｂ受容体がアゴニストと結合し、そしてアレスチンが受容体の内在化を開始させた後、ＣＣＫ−Ｂ受容体がアレスチン媒介によるクラスリン被覆小胞経路によって細胞内に移動した。ＣＣＫ−Ｂ受容体は「クラスＢ」のＧＰＣＲであることが示された。そして、その後、受容体のエンドサイトーシスにより、二次的（または細胞内）シグナル伝達事象（例えば、ＭＡＰキナーゼの活性化）が開始され得る。
【０２０３】
この薬理学は、ガストリンの血清中濃度を測定するための単一細胞バイオセンサーを構築するために利用された。アレスチンによって脱感作する非常に多数のＧＰＣＲを考えた場合、様々なバイオセンサーが他のＧＰＣＲリガンドについて同様に構築されており、そして、さらなるバイオセンサーが構築される。その生物学的方法の新規性は、Ｇタンパク質共役受容体および蛍光タンパク質の組合せにより、開発された非常に高感度なバイオセンサーアレイのいくつかが形成され、そして数千の天然化合物および合成化合物を検出するための機構が提供されるということである。
【０２０４】
合成化合物が臨床的に有用である領域はがんの化学療法においてである。特に、エリプチシン成分にコンジュゲート化されたヘプタガストリンは、ＣＣＫ−Ｂ受容体を発現する腫瘍を殺すために使用されていた。この薬剤の毒性は、アレスチン依存性であることが本発明者らの発見に基づいて最も確からしい受容体エンドサイトーシスを要求することであると示されていた。この薬剤は、本発明者らのバイオセンサーの測定可能な範囲に十分に含まれる濃度でマウスに投与されていた。本発明は、薬理学が不明であり、そして血清中レベルまたは組織レベルを測定する必要がある新しく設計された薬物を評価することに関して幅広い用途を有する。
【０２０５】
ＧＰＣＲは、生物活性な物質の存在によりシグナル伝達を行う。本発明者らは、ＧＰＣＲのシグナル伝達を終結させるために共通する生化学的パラダイムを利用し、そしてＧＰＣＲもまた、臨床診断のためにそのような物質を検出するために使用できることを明らかにした。
〔実施例７〕
【０２０６】
ムスカリン性受容体はアセチルコリンの存在下で取り込まれる
バソプレッシンのカルボキシルテールとコンジュゲート化されたヒトムスカリン性受容体タイプ１を発現するＨＥＫ−２３９細胞をマイクロモル濃度のアセチルコリンにさらした。アレスチン−ＧＦＰの輸送を測定した。アレスチン−ＧＦＰが、図１０に示されるように、膜の端部および小胞内において観測された。
【０２０７】
ムスカリン性受容体およびアレスチン−ＧＦＰを発現するバイオセンサーは、アレスチン−ＧＦＰのアゴニスト誘導による内在化によって示されるように、サンプル中のアセチルコリンを検出するために有用であった。
【実施例８】
【０２０８】
アセチルコリンエステラーゼはムスカリン性受容体のアセチルコリン誘導による内在化を阻害する
ＨＥＫ−２３９細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する最少必須培地においてインキュベーションした。細胞を、アレスチン−ＧＦＰ、およびバソプレッシンのカルボキシルテールとコンジュゲート化されたヒトムスカリン性受容体タイプ１の発現を誘導するためのｃＤＮＡで一過性トランスフェクションした。１０％ＦＢＳが存在するとき、アレスチン−ＧＦＰの輸送は、細胞を１０〜１００マイクロモル濃度の範囲の濃度のアセチルコリンに３０分までさらした後では観測されなかった。しかし、ミリモル濃度の量のアセチルコリンはアレスチン−ＧＦＰの輸送をもたらした。細胞が血清の非存在下で１０〜２０マイクロモル濃度のアセチルコリンにさらされたとき、アレスチン−ＧＦＰが細胞膜に容易に輸送された。アセチルコリンエステラーゼは、アセチルコリンを分解することが知られている酵素であり、ＦＢＳを含む血清の一般的な成分である。アセチルコリンエステラーゼは、ムスカリン性受容体のリガンドであるアセチルコリンを分解し、それにより、アセチルコリンにより誘導されるムスカリン性受容体およびアレスチンの内在化を妨げた。アセチルコリンエステラーゼの存在下における非常に多量のアセチルコリン（ミリモル濃度）はアレスチン内在化の一時的な量のみをもたらすことができた。対照的に、はるかに小さい濃度のアセチルコリン（１０〜２０マクロモル濃度）は、血清が培地に存在しないときには頑強な応答をもたらすことができた。このことは、アレスチンの輸送が、アセチルコリンエステラーゼの阻害剤について血清をアッセイするために使用され得ることを示唆している。これは、有機ホスファート化合物などの強力な阻害剤が、アレスチン−ＧＦＰ、およびアセチルコリンにさらされたムスカリン性受容体を含有する試験細胞の環境から血清およびすべてのその成分を完全に除くことに対して類似する効果をもたらすからである。
【実施例９】
【０２０９】
アセチルコリンエステラーゼ阻害剤についてスクリーニングするためのムスカリン性アセチルコリン受容体の使用
推定される阻害剤を含有するサンプルが適切な溶媒に抽出されるが、場合により、これは水性の緩衝液であり得る。抽出物は、アセチルコリンエステラーゼタンパク質と、ムスカリン性受容体に対するアゴニスト（アセチルコリンエステラーゼ感受性の塩化アセチルコリンなど）とを含有する緩衝液で希釈されるか、またはそのような緩衝液と一緒にされるか、そのいずれかである。アゴニストと、アセチルコリンエステラーゼと、推定される阻害剤とを含有するこの混合物は、０時間〜数時間の間で所定の時間（５分〜６０分の間が最も実用的である）にわたってインキュベーションされ、次いで、その天然のテールを有するか、またはバソプレッシン受容体などに由来する高親和性テールで交換されたテールを有するムスカリン性受容体およびアレスチン−ＧＦＰを含有する細胞と接触させられる。アセチルコリンエステラーゼの推定される阻害剤が存在する場合、塩化アセチルコリンは分解されず、アレスチン−ＧＦＰの形質膜またはエンドソームへの輸送が、アセチルコリンによる受容体の活性化のために生じる。アセチルコリンエステラーゼの阻害剤が存在しない場合、塩化アセチルコリンが分解され、より少ない量のアレスチン−ＧＦＰの輸送が生じるか、またはアレスチン−ＧＦＰの輸送が全く生じない。このアッセイは、環境中におけるアセチルコリンエステラーゼ酵素の一般に使用されている阻害剤、例えば、有機ホスファート殺虫剤など、例えば、ジアジノン（環境保護庁は危険性評価を完了し、殺虫剤ジアジノンに対する危険性削減協定を発表している；２０００年１２月５日、環境保護庁はその改訂危険性評価を公開し、有機ホスファート殺虫剤ジアジノンのいくつかの使用の段階的な廃止／排除を行うための登録者との協定を発表した）、そして神経毒サリンの誘導体などの一般には見出されないより強力な阻害剤を評価するために使用することができる。そのようなアッセイシステムの特定の使用が、水の一部を、塩化アセチルコリン様アゴニストおよびアセチルコリンエステラーゼと予備混合した後、アレスチン−ＧＦＰおよびムスカリン性受容体を含有する細胞を有するチャンバーに連続的に加え、アレスチン−ＧＦＰ輸送の阻害の減少について細胞を観測することによって、殺虫剤および同様な化合物に対して都市水道システムを連続的にモニターすることであり得る。これらのアッセイは、この目的のために市販されている装置によって大きい処理能力で行うことができる。このアッセイの別の使用は、アセチルコリンエステラーゼを阻害する化合物に対する人の生理学的暴露を、血清または組織におけるこれらの化合物の存在を測定することによって評価することである。例えば、１滴の血液を、塩化アセチルコリンにさらされた細胞を含有し、アレスチン−ＧＦＰおよびムスカリン性アセチルコリン受容体を有するウェルに直接入れることができる。ヒトの血液または血清は、通常、アセチルコリンを迅速に分解するために十分なアセチルコリンエステラーゼを含有する。従って、アレスチン−ＧＦＰを輸送する細胞の能力の阻害が減少することにより、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤の存在が示される。
【０２１０】
本発明は、様々な特定の材料および手法および例を参照して本明細書中に記載および例示されているが、本発明は、材料の特定の具体的な組合せ、およびその目的のために選択された手法に限定されないことが理解される。当業者によって理解されるようなそのような細部の数多くの変化が包含され得る。
【０２１１】
下記は、上記の開示に関連する文書、ならびに特に実験手法および議論に関連する文書の列挙である。下記の文書、ならびに前記の本文において参照されるすべての文書は、その全体が参照することにより組み込まれるものとして考慮されなければならない。
【０２１２】
【表１】
2004537044.tif 000013
【表２】
2004537044.tif 000014
【表３】
2004537044.tif 000015
【表４】
2004537044.tif 000016
【図面の簡単な説明】
【０２１３】
【図１】本発明が一緒に使用され得る既知のＧＰＣＲの例示的かつ非限定的な列挙である。これらの受容体は、構造的類似性およびリガンドに基づく古典的な区分に従ってグループ分けされている。
【図２】アレスチンと会合し、その後、取り込まれ得る４０を越える異なるＧＰＣＲの一部の列挙である。これは、発現したＧＰＣＲおよびアレスチンと緑色蛍光タンパク質との融合タンパク質を使用して視覚化することができる。
【図３Ａ】ヒトムスカリン性受容体１のアミノ酸配列および核酸配列を例示する（アクセション番号ＮＭ＿０００７３８）。アミノ酸配列はアミノ末端からカルボキシル末端への向きで示される。核酸配列は５’から３’への向きで示される。
【図３Ｂ】ヒトムスカリン性受容体２のアミノ酸配列および核酸配列を例示する（アクセション番号ＮＭ＿０００７３９）。アミノ酸配列はアミノ末端からカルボキシル末端への向きで示される。核酸配列は５’から３’への向きで示される。
【図３Ｃ】ヒトムスカリン性受容体３のアミノ酸配列および核酸配列を例示する（アクセション番号ＮＭ＿０００７４０）。アミノ酸配列はアミノ末端からカルボキシル末端への向きで示される。核酸配列は５’から３’への向きで示される。
【図３Ｄ】ヒトムスカリン性受容体４のアミノ酸配列および核酸配列を例示する（アクセション番号ＮＭ＿０００７４１）。アミノ酸配列はアミノ末端からカルボキシル末端への向きで示される。核酸配列は５’から３’への向きで示される。
【図３Ｅ】ヒトアセチルトランスフェラーゼ（ＹＴ血液群）のアミノ酸配列および核酸配列を例示する（アクセション番号ＸＭ＿０３６１４８）。アミノ酸配列はアミノ末端からカルボキシル末端への向きで示される。核酸配列は５’から３’への向きで示される。
【図３Ｆ】ヒトコレシストキニンＡ受容体のアミノ酸配列および核酸配列を例示する（アクセション番号Ｌ１３６０５）。アミノ酸配列はアミノ末端からカルボキシル末端への向きで示される。核酸配列は５’から３’への向きで示される。
【図３Ｇ】ヒトコレシストキニンＢ受容体のアミノ酸配列および核酸配列を例示する（アクセション番号ＮＭ＿０００７３１）。アミノ酸配列はアミノ末端からカルボキシル末端への向きで示される。核酸配列は５’から３’への向きで示される。
【図４】フローサイトメトリーによる細胞におけるアレスチン−ＧＦＰおよびＣＣＫ−Ｂ受容体の発現の均一性と、アレスチン−ＧＦＰの輸送とを例示する。図４Ａは、クローンＡに属する細胞におけるアレスチン−ＧＦＰの相対的な発現を示す。図４Ｂは、１０ｎＭのｈＧ１７を用いた室温で５分間の処理の前（左パネル）および処置の後（右パネル）におけるクローンＡに由来する細胞の視野の蛍光像を示す。
【図５】アレスチン−ＧＦＰおよびＣＣＫ−Ｂ受容体を発現する細胞株におけるリガンド結合および２次メッセンジャー応答の特徴づけを示す。図５Ａに示されるように、クローンＡ由来の細胞が、細胞あたりの平均ＣＣＫ−Ｂ受容体発現および［3Ｈ］ＣＣＫ−８に対する受容体親和性を測定するために、［3Ｈ］ＣＣＫ−８の濃度を増大させながらインキュベーションされた。図５Ｂは、クローンＡ細胞が、ＩＰ３の２次メッセンジャー応答を評価するために、ｈＧ１７ペプチドの増大する濃度にさらされたことを示す。挿入図は、この細胞株からのｈＧ１７による［3Ｈ］ＣＣＫ−８の競合的置換を示す。図５Ｃは、ビヒクルでの処理（上段左パネル）、または１０ｎＭのアゴニストｈＧ１７での１時間の処理（上段右パネル）、または１０ｎＭのｈＧ１７＋１μＭのＣＣＫ−Ａアンタゴニストのデバゼピド（Ｌ−３６４，７１８）での処理（下段左パネル）、または１０ｎＭのｈＧ１７＋１μＭのＣＣＫ−Ｂアンタゴニストでの処理（下段右パネル）を受けたクローンＡ由来の細胞の蛍光像を示す。
【図６】アレスチン−ＧＦＰおよびＣＣＫ−Ｂ受容体を含有するＨＥＫ−２３９細胞株における５分でのｈＧ１７に対する用量応答を例示する。図６Ａは、様々な濃度のｈＧ１７に５分間さらされたクローンＡ細胞のアレスチン−ＧＦＰ輸送を示す代表的な実験を示す。図６Ｂにおいて、細胞の細胞質から５分後に失われたアレスチン−ＧＦＰの部分量を使用して、Ａにおいてグラフに示されるｈＧ１７の増大する濃度についてＳ字形の用量応答曲線が作製された。図６Ｃは、ｈＧ１７に３７℃で１時間さらされたクローンＡ細胞の応答を明らかにする実験から得られた像を例示する。
【図７】βアレスチン２−ＧＦＰの分布からの蛍光シグナルの計算を示す。図７Ａは、βアレスチン２−ＧＦＰ融合タンパク質および受容体を安定に発現する細胞におけるβアレスチン２−ＧＦＰ蛍光の分布が３０分間のアゴニスト処理の前および後において視覚化されたことを示す。図７Ｂにおいて、画素カウント対画素強度のヒストグラム（下段左パネルでのグラフにおける緑色曲線）が、代表的なコントロール細胞を使用して作製された。
【図８】アレスチン−ＧＦＰおよびＣＣＫ−Ｂ受容体を含有するＨＥＫ−２８３細胞株におけるペンタガストリンに対する用量応答を示す。図８Ａは、ペンタガストリンに３７℃で２時間さらされたクローンＡ細胞の応答を示す代表的な実験から得られた像を示す。図８Ｂにおけるグラフは、リガンドの各濃度で得られた像について閾値の値（方法）を超える画素強度の正規化された和（ＴＩ／ＴＦ）の増大を示す。
【図９】アレスチン−ＧＦＰおよびＣＣＫ−Ｂ受容体を含有するクローン細胞株における１時間での用量応答を示す。図９Ａは、高ガストリン血症患者から得られた血清の１：１希釈物とともに１時間インキュベーションされたクローンＡ細胞の代表的な像を例示する。図９Ｂは、１時間において得られ、図７のように分析された画像化輸送データからコンピューター計算されたクローンＡ細胞のｈＧ１７に対する用量応答曲線を示す。９個〜１６個の間で異なる像が各ｈＧ１７濃度および患者血清（矢印）について分析された。
【図１０】アセチルコリンの存在下におけるムスカリン性受容体の内在化を例示する。アレスチン−ＧＦＰ、およびバソプレッシンのカルボキシル末端テールとコンジュゲート化されたヒトムスカリン性受容体タイプ１を発現するＨＥＫ−２９３細胞がマイクロモル濃度のアセチルコリンにさらされた。アレスチン−ＧＦＰが、アセチルコリンに応答して膜端部または小胞内において認められた。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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