(57)【要約】本発明は、乳源、特にヒト及びウシの乳から得られ得る破骨細胞分化抑制因子に関する。本発明はまた、摂食可能な調製物及び／又は薬剤組成物を調製するためのその使用、特に骨代謝及び免疫機能に関連する疾患を予防又は治療するためのこのような調製物／組成物の使用に関する。
2004537980.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト又はウシの乳や初乳から得られ得る破骨細胞分化抑制因子。
【請求項２】
約８０、１３０、及び２００ｋＤａの分子量を有するポリペプチドを生じさせるグリコシル化パターンを有する、請求項１に記載の破骨細胞分化抑制因子。
【請求項３】
請求項１又は請求項２のいずれかに記載の破骨細胞分化抑制因子を含む食品材料。
【請求項４】
乳、ヨーグルト、カード、チーズ、発酵乳、乳ベースの発酵製品、アイスクリーム、発酵させた穀類ベースの製品、乳ベースの粉末、調整粉乳、及びペット食品からなる群から選択される食品材料。
【請求項５】
請求項１又は請求項２のいずれかに記載の破骨細胞分化抑制因子を含む経腸組成物又は薬剤組成物。
【請求項６】
溶液、乾燥経口サプリメント、液体経口サプリメント、乾燥経管栄養物、液体経管栄養物からなる群から選択される、請求項５に記載の経腸組成物又は薬剤組成物。
【請求項７】
摂食可能な調製物を製造するための、請求項１又は請求項２のいずれかに記載の破骨細胞分化抑制因子の使用。
【請求項８】
摂食可能な調製物が、請求項３又は請求項４に記載の食品材料あるいは請求項５又は請求項６に記載の組成物である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
骨再構築に関連する疾患を治療するための請求項３から請求項６までのいずれかに記載の材料又は組成物を調製するための、請求項１又は請求項２に記載の破骨細胞分化抑制因子の使用。
【請求項１０】
疾患が、骨粗鬆症、骨のパジェット病、骨髄炎、骨の損失をもたらす骨の感染性病変、高カルシウム血症、骨減少症、骨壊死、骨関節炎やリウマチ関節炎による骨の損失、歯周骨の損失及び／又は溶骨性転移である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
免疫疾患の治療及び／又は予防のために請求項３から請求項６までのいずれかに記載の食品材料又は組成物を調製するための、請求項１又は請求項２に記載の破骨細胞分化抑制因子の使用。
【請求項１２】
疾患が、アレルギー、自己免疫、炎症性腸疾患、全身性自己免疫状態、細胞増殖及びアポトーシスの調節不全並びに皮膚、口腔、消化管、泌尿生殖器、気道の免疫病理学的状態である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
疾患が、早産及び／又は低体重出生に関連している、請求項９から請求項１２までのいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
骨材料及び／又は免疫系の発達のために請求項３から請求項６までのいずれかに記載の材料又は組成物を調製するための、請求項１又は請求項２に記載の破骨細胞分化抑制因子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳源、特にヒト及びウシの乳から得られ得る破骨細胞分化抑制因子（オステオプロテゲリン）に関する。本発明はまた、摂食可能な調製物及び／又は薬剤組成物を調製するためのその使用、特に骨代謝及び免疫機能に関連する疾患を予防又は治療するためのこのような調製物／組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物では、骨が身体を支え、これは鉱物、コラーゲン性及び非コラーゲン性タンパク質基質、細胞成分からなる。その成長及び維持は、その成分細胞の種類、すなわち軟骨を形成する軟骨細胞、骨基質を合成し蓄積する骨芽細胞、骨材料の再吸収を担う破骨細胞の制御及び相互作用に関与する様々な異なる因子によって調節されている。
【０００３】
軟骨細胞は間充織細胞から派生し、軟骨内の骨形成に必要な初期軟骨の鋳型を産生する。骨組織の形成を促進する骨芽細胞は、間充織骨芽前駆細胞から派生し、骨の表面に位置して、そこで基質タンパク質を合成、輸送、及び整列させる。他方で、骨の再吸収を担う破骨細胞は、造血髄中に存在する顆粒球−単球前駆体から派生する。破骨細胞と骨芽細胞の作用は密接に関連しており、たとえば破骨細胞に媒介される再吸収プロセスの間、産生されたタンパク質因子は、骨芽細胞による骨再生を開始させるシグナル分子として作用する。その後、今度は骨芽細胞が、可溶性又は膜結合レギュレーターの発現を通じて破骨細胞の機能に影響を与えることができる。従って、通常の骨再構築は、それぞれに対応する細胞種によって導かれる、骨形成及び骨再吸収という対立する機能間の一定の均衡に依存している。
【０００４】
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）やトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）−βなどの成長因子は、骨の細胞外基質に貯蔵され、分泌されると骨前駆細胞の局所的な放出を刺激する。その後は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）や副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）などの因子が、最終的な分化及び機能が細胞と骨基質タンパク質との相互作用によって制御される骨形成細胞である骨芽細胞へのこれら前駆体の発達に影響を与える。
【０００５】
老化につれて、個体は、破骨細胞の活性が骨芽細胞の活性を上回ることから生じると考えられる、アンカップリング（ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ）と呼ばれる現象である骨質量の段階的な損失を受ける。このアンカップリングがより長い期間持続する場合、骨材料がどんどん破壊／再吸収され、骨粗鬆症と呼ばれる状態が生じる。
【０００６】
年齢依存性の現象以外にも、カルシウムやホルモンの欠乏によって、又は骨粗鬆症、高カルシウム血症、骨のパジェット病、骨関節炎やリウマチ関節炎や骨髄炎による骨の損失など様々な異なる疾病をもたらす状態によって、骨の損失がもたらされる。この骨密度の低下は一般的に、力学的な強度の低下及び骨折の可能性の増大を招く。
【０００７】
骨粗鬆症及び／又は関連する骨の疾患を治療するための現在の手法には、カルシウムを必要としている個体に投与する、カルシウムの使用が含まれる。最近では、ホルモン、カルシトニン、インスリン様成長因子、破骨細胞分化抑制因子（ＯＰＧ）など骨細胞の刺激及び／又は阻害に関与している作用物質も、上記疾病状態を治療するのに有効であることが認識された。前記作用物質は、一般的に組換え手法によって調製され、それぞれの物質が標的である骨に活性のある形で到達するように、生薬の形で配合／調製しなければならない。
【０００８】
国際公開公報ＷＯ  ００／２４７７１号は、破骨細胞分化抑制因子様タンパク質をコードしている核酸及びたとえば骨粗鬆症の治療におけるその使用を開示している。このポリペプチドは組換え手法によって合成され、その後、所期の投与経路に適合するように配合しなければならない。このような経路としては、静脈内、皮内、皮下、経口（たとえば吸入）、経皮（表面）、経粘膜、直腸投与が提案されている。
【０００９】
一般的に、この目的のために利用される成分は活性物質と適合していなければならず、また身体の様々な状態から十分に保護しなければならないので、所定の物質に適した生薬形を見つけるのは非常に時間がかかり、厄介である。
【００１０】
しかし、骨の成長を刺激する作用物質は骨組織の中／その場所で居所的に合成されるので、このような物質を投与するのは困難である。普通は、物質が消化管を通過する際にそこに存在する不利な環境条件によって破壊されずに通過することを助けるようなカプセルを考案しなければならない。しかし、物質が骨に到達するまでに肝臓を通り、体液中で輸送されなければならないので、この投与経路にはいくつかの欠点がある。さらに、多くの場合、それのために、標的組織に到達する活性生物物質の量が減少する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、本発明の課題は、個体に活性物質を投与し、それによってこの物質が個体中の特定の標的組織内で作用する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
よって、上記の課題は、乳から得られ得る破骨細胞分化抑制因子を提供することによって解決された。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
破骨細胞分化抑制因子（ＯＰＧ）は、破骨細胞形成抑制因子（ＯＣＩＦ）及びＴＮＦ受容体様分子１（ＴＲ１）とも呼ばれているが、腫瘍壊死因子の受容体ファミリー（ＴＮＦＲ）の最近記載されたメンバーである。これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏのいずれでも破骨細胞の発生を阻害し、骨密度を増加させる（大理石骨病）。正常なマウス胚では、発達中の骨の軟骨原基内だけでなく小腸内でもＯＰＧが見つかった。
【００１４】
しかし、ＴＮＦ受容体ファミリーの他のメンバーと異なり、ＯＰＧは膜貫通ドメインを有さない。さらに、ＯＰＧは細胞障害性リガンドＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘発リガンド）の受容体でもあり、濾胞樹状細胞由来受容体−１にそっくりである。したがって、細胞死を制御し、かつリンパ組織の形成及び免疫応答の制御に重要な役割を果たすと推定される。実際、ＯＰＧを欠いた動物は発育不十分のリンパ組織を示すことが示された。
【００１５】
本発明の基になった研究では、驚くべきことに、破骨細胞分化抑制因子は、たとえば骨組織内に存在することに加えて、ヒトの母乳中でも見つかることが判明した。したがって、授乳の期間中、母親は明らかに新生児に前記生物活性物質を消化管内で存続することができる形で与えている。このことから、要するに、乳腺細胞によって産生されたＯＰＧは明らかにその安定性及び／又は分解に対する耐性の点で他の源から単離されたＯＰＧとは異なる。
【００１６】
特定の理論に拘泥するものではないが、現在、乳腺細胞中のタンパク質に伝達された特異的なグリコシル化パターンは、腸管で吸収され骨組織に輸送されたとき、活性ドメインが無傷でその生物活性を発揮できるように、ポリペプチドを酸性の胃液及び／又は腸内で遭遇する塩基性環境に対してより安定にすると考えられている。
【００１７】
本発明の、すなわち乳源から得られ得る形のＯＰＧは、配列番号１によって同定されるポリペプチド配列を有し、約８０、１３０、２００ｋＤａの大きさを示し、これらそれぞれが組換え手法によって得たもの（５５ｋＤａ）と異なる。
【００１８】
本発明のＯＰＧを、たとえば乳、ヨーグルト、カード、チーズ、発酵乳、乳ベースの発酵製品、アイスクリーム、発酵させた穀類ベースの製品、乳ベースの粉末、調整粉乳、及びペット食品などの食品材料でよい摂食可能な調製物に含めることができる。同様に、本発明のＯＰＧを、たとえば溶液、乾燥経口サプリメント、液体経口サプリメント、乾燥経管栄養物、液体経管栄養物からなる群から選択される、経腸組成物又は薬剤組成物に含めることもできる。
【００１９】
実際、本発明によるＯＰＧは安定なので、消化管及び体液中に存在する、種々の潜在的に有害な条件から保護するために活性化合物を特定の生薬形にする必要はない。
【００２０】
別の態様によれば、本発明はまた、食品材料や経腸組成物など摂食可能な調製物、又は薬剤組成物を調製するための、乳由来の破骨細胞分化抑制因子の使用を提供する。
【００２１】
本発明の破骨細胞分化抑制因子及び上に記載の摂食可能な調製物は、骨再構築障害の治療及び／又は予防に使用することができる。
【００２２】
最も多く見られる骨の疾患は、一般的に骨質量が正常レベルより少しでも減少したことに関連する状態である、骨減少症である。このような状態は、骨の合成速度の低下、骨の破壊速度の増加、又はその両方から生じる可能性がある。最も一般的な骨減少症の形は、閉経後骨粗鬆症や老人性骨粗鬆症とも呼ばれる初期の骨粗鬆症である。この骨粗鬆症の形は、年齢に伴う一般的な骨の損失の結果であり、通常、正常な骨形成の速度及び骨の再吸収の増加の結果である。さらに他の骨粗鬆症の形には、内分泌性骨粗鬆症（甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能亢進症、クッシング症候群、末端肥大症）、遺伝性及び先天性の形の骨粗鬆症（骨形成不全症、ホモシスチン尿症、メンケス症候群、ライリー−デイ症候群）、末端の固定化による骨粗鬆症が含まれる。
【００２３】
ごく最近に、人間集団の骨粗鬆症が、多くのアテローム硬化性病変動の構成要素である脈石灰化の高い発生率にも関連していることが認識された。
【００２４】
したがって、上に例示したような食品を、それぞれ骨減少症あるいは骨粗鬆症に関連する骨の症状及び／又は構造変化の開始を妨げるあるいは緩和するために利用することができるだろう。所望する生物応答をもたらすのに十分な量の活性物質を食品材料に含めることを理解されたい。ＯＰＧはそれ自体が母乳の構成成分であることが判明しているので、個体にこの物質を送達するためには乳ベースの製品が本質的に適している。
【００２５】
一方、重度の骨減少症や骨粗鬆症をそれぞれ治療するためには、好ましいレジメンは、本発明による破骨細胞分化抑制因子をより高い用量、すなわち疾病のプロセスを停止させさらには復帰さえさせるのに十分な量で含む薬剤組成物とすることができる。このような組成物は、本発明のＯＰＧを唯一の活性物質として含むことができる。これは、この物質の主要な配合を意図する必要がないという利点を有する。したがって、任意選択で担体や香料剤を補充した「ＯＰＧ粉末」からなる錠剤を単にプレスすることも、十分に本発明の範囲内にある。しかし、本発明のＯＰＧを他の活性物質と一緒に配合する場合には、これら追加の物質の消化管内での性質及び分解しやすさを考慮に入れなければならない。本発明のＯＰＧを用量単位で配合することにより、担当医がより注意深く活性化合物の日用量や週用量を調節することが可能になる。
【００２６】
本発明の破骨細胞分化抑制因子はまた、骨のパジェット病、骨髄炎、骨の損失をもたらす骨の感染性病変、高カルシウム血症、骨壊死、骨関節炎やリウマチ関節炎による骨の損失、歯周骨の損失及び／又は溶骨性転移の開始を防ぐ及び／又は治療するのに利用することもできる。
【００２７】
ＯＰＧは、死亡ドメイン含有受容体に結合するとアポトーシスを誘導させる腫瘍壊死因子関連リガンド（ＴＲＡＩＬ）の受容体でもあることが判明した。これは、細胞死を制御するだけでなく、リンパ組織の形成及び免疫応答の制御において重要な役割を果たすと推定されている。さらに、ＯＰＧは、活性化されたＴ細胞の産物として報告されたＲＡＮＫＬ（ＮＦ−κＢの受容体活性化因子のリガンド）の囮受容体である。成熟樹状細胞上にＲＡＮＫＬの受容体が連結すると、樹状細胞の生存が延長する。さらに、ＲＡＮＫＬがその受容体と結合すると、Ｔ細胞の増殖及び樹状細胞の機能が向上する。
【００２８】
したがって、本発明は、それぞれ免疫組織の正常な発達に寄与するため、正常な免疫機能に寄与するため、さらには免疫系の疾患を防ぐ及び／又は治療するための、たとえば食事性組成物や経腸組成物など摂食可能な調製物又は薬品を製造するための、ヒト及び／又はウシの乳から得られ得る破骨細胞分化抑制因子の使用を提供する。
【００２９】
本発明において企図される免疫系の疾患には、アレルギー、自己免疫、敗血症、癌、炎症性腸疾患、全身性自己免疫状態、循環器病、及び皮膚、口腔、消化管、泌尿生殖器、気道の免疫病理学的状態が含まれる。
【００３０】
さらに、本発明の破骨細胞分化抑制因子はまた、細胞増殖及びアポトーシスの制御、経口寛容の促進、新生児の感染性プロセス及び細菌コロニー形成の変調にも適用することができる。特に新生児では、上記の疾患は一般的に早産及び／又は低体重出生に関連していることがあり、それらの場合、本発明の破骨細胞分化抑制因子を単に乳児食によって乳児に投与することができる。
【００３１】
乳児及び高齢者は本質的に外来性破骨細胞分化抑制因子を必要としているので、主な考慮対象であるが、どのような年齢の個体も、治療する個体となり得ることを理解されたい。具体的には、新生児などの個体は、骨材料及び／又は免疫系の発達に破骨細胞分化抑制因子を要するので、それらの場合に、本発明の化合物及び／又は食品材料及び／又は薬剤組成物を有利に投与することができる。
【００３２】
しかし、上記疾患のいずれかの発症を防ぐために、本発明を成体にも適用することができることを理解されたい。ヒト以外に、本発明のＯＰＧをペット食品に含めることにより、治療する個体はペットなど動物でもよいことも理解されたい。
【００３３】
本発明のＯＰＧは、哺乳動物、特にヒト又はウシの乳や初乳由来の乳源から得ることができる。ヒト乳ＯＰＧは３８０ａａのアミノ酸配列を有しており、分子量標準として使用したタンパク質マーカー（ＢｉｏＲａｄ）と比較した場合に、約８０、１３０、２００ｋＤａの分子量を示す。これは、４箇所のＮ−グリコシル化部位を示し、単量体の形、又はＣｙｓ３７９を介してＳ−Ｓ結合を形成することによる二量体の形で存在することができる。
【００３４】
本発明のＯＰＧは、ヒト又はウシ乳などの乳源から単離することができる。しかし、本発明のＯＰＧは、「乳ＯＰＧ」中に見つかるグリコシル化パターンを産生している適切な細胞を用いた組換え手法によって調製することができることを理解されたい。乳腺細胞は同一の又は実質的に同一のグリコシル化パターンを産生することが予想されるので、これらの細胞が発現用に好ましい細胞である。
【００３５】
本発明のＯＰＧを発現させるのに適切な細胞は、ＳＶ４０ベクターやテロメラーゼ遺伝子など適切な手段を用いた不死化、及びＯＰＧポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを用いた形質転換によって得られる。目的のポリペプチドは、ポリペプチドが分泌された際に上清から単離することによって、又は細胞を回収してポリペプチドを細胞自体から単離することによって得ることができる。連続的に産生される場合は、上清から単離することが好ましい。
【００３６】
以下の実施例は、本発明を例示するものであり、本発明はそれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３７】
ヒト乳及びヒト血清試料
健康な母親からのヒト母乳試料（１０〜６０ｍｌ）を産後１７日まで、無菌条件下で、搾乳ポンプによる搾乳及び時々手で搾乳することによって集めた。乳を無菌の５０ｍｌ遠心管に搾乳し、採取から２時間以内に処理した。遠心（２００×ｇ、１０分間）に続いて細胞ペレットをすぐに取り除き、ＲＮＡ抽出用に処理した。乳の残りは−２０℃で凍結させた。ヒト血清試料を健康なドナーから得、−２０℃で保存した。
【００３８】
ヒト母乳の分画
高速遠心によって全乳から乳脂を抽出した。表層の乳脂を取り除き、水中で洗浄し、乳脂洗浄物は必要になるまで−２０℃で凍結した。ホエイ及びカゼインの分離は、脱脂乳をレンネット酵素処理又は（ＨＣｌで）化学的酸性化することによってカゼインを凝固させて行った。処理した乳の遠心により、スイートホエイ（ｓｗｅｅｔ  ｗｈｅｙ）が非可溶性レンネットカゼインから、酸性ホエイが酸性カゼインからそれぞれ分離された。最後に、超遠心分離を用いて可溶性乳タンパク質（超遠心ホエイ）及び非可溶性ミセルカゼインを調製した。すべてのカゼイン及びホエイ分画を、必要になるまで−２０℃で凍結した。
【００３９】
ヒト乳腺細胞系
乳癌種の胸水由来のヒト乳腺細胞系であるＭＣＦ−７（アメリカンタイプカルチャーセンター（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＡＴＣＣ）、バージニア州マナサス、ＨＴＢ−２２）は、分化した乳腺上皮の特徴をいくつか保有している。細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ａｍｉｍｅｄ  Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ、スイス、アルシュヴィル）を補充したＤＭＥＭ（Ａｍｉｍｅｄ  Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ）中で培養し、５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気中で３７℃に維持した。培養基を１週間に２〜３回交換した。コンフルエントに達した後、トリプシン／ＥＤＴＡ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて３７℃で細胞を脱離させた。その後、細胞をＲＮＡ抽出用に調製した。
【００４０】
ウエスタンブロット分析
Ｌａｅｍｍｌｉ還元サンプルバッファー（Ｌａｅｍｍｌｉ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ）を用いて乳試料を１／２５に希釈し、５分間沸騰させた。１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質を分離し、ニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ）に移した。ビオチン標識したポリクローナル抗ヒトＯＰＧ（０．２μｇ／ｍｌのＢＡＦ８０５、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）及びストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてブロットをプローブした。免疫活性は、アルカリホスファターゼ基質ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて可視化した。Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍａｒｋｅｒを分子量標準として用いた（ＢｉｏＲａｄ）。組換えヒトＯＰＧ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を２５ｎｇ／レーンで載せ、これを陽性対照とした。
【００４１】
ヒト母乳細胞及びヒト乳腺上皮細胞によるＯＰＧの発現
逆転写に続いてＰＣＲを行って、産後１８日の１人の母親からの全ヒト母乳細胞群中、及びヒト乳腺上皮細胞系ＭＣＦ−７中のＯＰＧ転写物を増幅した。Ｔｒｉｚｏｌ法（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いて細胞から全ＲＮＡを抽出した。手短に述べると、Ｔｒｉｚｏｌ（５〜１０×１０６個の細胞に１ｍｌ）を細胞ペレットに加え、ピペットで数回吸入及び排出し、エッペンドルフチューブに移した。クロロホルムを加え（１ｍｌのＴｒｉｚｏｌに０．２ｍｌ）、チューブを５分間インキュベートし、１２，０００×ｇで１５分間、４℃で遠心した。同体積のイソプロパノールでＲＮＡを沈殿させ、１２，０００×ｇで１０分間遠心した。ペレットを７０％のエタノールで洗浄し、次いで滅菌脱イオン水中に再懸濁させた。必要になるまでＲＮＡを−２０℃で保存した。
【００４２】
ゲノムＤＮＡによる混入を避けるため、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅＩを用いてＲＮＡ試料を処理した。適切な希釈率（１００〜２００倍）の２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでの吸光度によって、分光光度計でＲＮＡを定量した。Ａ２６０の吸光度×希釈倍率×４０ｍｇ／ｍｌによってＲＮＡの濃度（μｇ／ｍｌ）を計算した。実質的にタンパク質を含まない全ＲＮＡ試料は、１．８〜２．２のＡ２６０／Ａ２８０比を有するはずである。
【００４３】
モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いてＲＮＡの逆転写を行った。ＲＮＡ試料（全ＲＮＡの０．５μｇ）、０．５単位のＲＮａｓｅ阻害剤、各ｄＮＴＰを１ｍＭずつ、０．５ｎｍｏｌ／ｍｌの特異的３’プライマー、５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１．２５単位の逆転写酵素を、製造者によって提供された酵素緩衝液を含む全体積１０μｌの反応混合液中でインキュベートした。反応混合液を４２℃で３０分間インキュベートし、その後、９５℃で５分間加熱した。その後、Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、サーマルサイクラー（Ｂｉｏｌａｂｏ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、スイス、シャテルサンドニ）上で逆転写した産物を増幅した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、全体積５０μｌ中で、ＰＣＲ緩衝液中の逆転写した産物１０μｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、各ｄＮＴＰを５μＭずつ、０．２ｎｍｏｌ／ｍｌずつのＯＰＧ−特異的アンチセンス
ＡＣＴＡＧＴＴＡＴＡＡＧＣＡＧＣＴＴＡＴＴＴＴＴＡＣＴＧ
及びセンス
ＧＧＡＧＧＣＡＴＴＣＴＴＣＡＧＧＴＴＴＧＣＴＧ
プライマーの両方、及び１．２５単位のＤＮＡポリメラーゼを使用して行った。９５℃、１０分間の最初の変性ステップの後、９４℃で４５秒間の変性３５サイクル、６０℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分３０秒間の伸長、次いで７２℃で７分間の伸長ステップによって試料を増幅した。すべての試料を陽性対照であるβアクチンと共にＲＴ−ＰＣＲに付した。ＲＴ−ＰＣＲ産物の試料を１×ＴＡＥ緩衝液中で１．２％アガロースゲル（エチジウムブロミドを含む）に載せ、１５０Ｖ、１時間の電気泳動によって分離した。ＵＶ光の下でＲＴ−ＰＣＲ産物を可視化した。ＤＮＡサイズマーカー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて比較することによって、バンドの正しい大きさを決定した。
【００４４】
ヒトＯＰＧのＥＬＩＳＡ（サンドイッチ酵素免疫測定法）
母乳及び様々な乳分画中に存在するＯＰＧの濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。そのために、ＯＰＧに対するモノクローナル抗体（ＭＡＢ８０５、１μｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、英国）を、終夜４℃のインキュベーションによって９６ウェルのプレート（Ｎｕｎｃ）にコーティングした。その後、ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を用いてプレートを２回洗浄した。ＰＢＳ中２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いてプレートをさらに２時間、室温でインキュベートすることによって非特異的な結合をブロックした。試料又は組換えＯＰＧの標準濃度（０．１１９から１２１．５ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をＰＢＳ−ＢＳＡ中で３時間、室温でインキュベートした。その後、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した後、ビオチン標識の抗ヒトＯＰＧポリクローナル抗体（ＢＡＦ８０５、０．５μｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をさらに１時間、室温で加えた。さらに４回洗浄した後、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（ＳＡＡＰ、０．５μｇ／ｍｌ、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ％Ｐｅｒｒｙ  ＫＰＬ）を１時間、室温で加えた。その後、プレートを４回洗浄し、基質ＴＭＢペルオキシダーゼ（ＫＰＬ）を加えた。プレートに蓋をし、暗所で５分間インキュベートした。１ＮのＨＣｌを加えることによって酵素反応を停止させた。ＥＬＩＳＡ読取装置（Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて４５０ｎｍの吸光度を読み取った。検出限界は約３０ｐｇ／ｍｌであった。
【００４５】
ヒト乳ＯＰＧの生物活性
ＯＰＧは、その死亡ドメイン含有受容体であるＤＲ４及びＤＲ５に結合するとアポトーシスを誘発させる、腫瘍壊死因子関連リガンド（ＴＲＡＩＬ）の受容体である。これら細胞のＴＲＡＩＬ誘発性アポトーシスを遮断するヒト母乳ＯＰＧの能力を試験することができるバイオアッセイを開発した。
【００４６】
この点に関連して、ジャーカット細胞、クローンＥ６−１（ＡＴＣＣ）を、１０％のＦＣＳを含む供給者ＡＴＣＣによって改良されたＲＰＭＩ１６４０中で培養物として維持した（３７℃、５％ＣＯ２）。細胞を５×１０４個／ウェルの密度で９６ウェルのプレート（Ｎｕｃｎ）に播種した。各ウェルに、可溶性組換えヒトＴＲＡＩＬと反応してその活性を増大させる抗体であるエンハンサータンパク質（Ａｌｅｘｉｓ、スイス、Ｌａｕｆｅｌｆｉｎｇｅｎ）２μｇ／ｍｌの存在下で、様々な濃度の可溶性組換えヒトＴＲＡＩＬ（０から２０ｎｇ／ｍｌ）を加えた。一部のウェルには、５０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＯＰＧ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヒト母乳試料（ＨＭ；最終希釈率１／８０；出産後１日又は９日に採取）、及び／又は２０μｇ／ｍｌの抗ＯＰＧモノクローナル抗体（ＭＡＢ８０５、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）も含ませた。３７℃で１６時間プレートをインキュベートした。細胞生存率は、培養の最後の６時間の間に３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウェル）を加えることによって測定した。
【００４７】
対照培地では、細胞増殖のＴＲＡＩＬ誘発性の阻害が、５ｎｇ／ｍｌより高い濃度で明白であった。しかし、ＨＭ試料はこの阻害を妨げた。ａｔ−ＯＰＧモノクローナル抗体ではこの効果が逆になったので、この効果は明らかにＯＰＧが存在することによるものである。
結果を図５に示す。
【００４８】
ウエスタンブロット分析
ＯＰＧは、細胞内で５５ｋＤａの単量体として合成されるが、細胞外に分泌されるときはジスルフィド結合した約１１０ｋＤａの二量体に変換される。乳では、約８０、１３０、及び２００ｋＤａでバンドが検出された。
【００４９】
ヒト母乳中のＯＰＧ濃度
授乳中の母親１０人の、授乳の最初の１７日間中の、様々な時点での母乳試料中のＯＰＧレベルをＥＬＩＳＡによって検査した。濃度は授乳の最初の１から３日間で最大値にまで増加し、それから以降減少した。乳中の濃度は、５０ｎｇ／ｍｌからほぼ２μｇ／ｍｌまでの範囲であった（図１）。
【００５０】
乳ＯＰＧの細胞源
ＲＴ−ＰＣＲ分析により、本発明のＯＰＧがヒト母乳細胞及び乳腺上皮細胞中に見つかることが明らかになった。ＯＰＧのｍＲＮＡの構成発現は、どちらの種類の未処理細胞でも明らかであった（図４）。
【００５１】
酵母中でのヒト乳ＯＰＧのクローニング
遠心分離（２００×ｇ、１０分間）によって、ヒト母乳（出産後１８日）から細胞を単離した。供給者らによって推奨されるように、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、スイス、バーゼル）を使用して細胞ペレットから全ＲＮＡを抽出し、ＤＮＡｓｅＩで処理し、ＲＮｅａｓｙスピンカラム（Ｑｕｉａｇｅｎ、バーゼル）でさらに精製した。成熟形態のＯＰＧをコードしているＰＣＲ産物を、供給者（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ロートクロイツ）によって提供されたプロトコルに従って、Ｔｉｔａｎ（商標）Ｏｎｅ  ｔｕｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲシステムを使用して、この全ＲＮＡから増幅した。
【００５２】
ＯＰＧに特異的なアンチセンスプライマー
【化１】
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及びセンスプライマー
【化２】
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を用いて、このｃＤＮＡから１１７４ｂｐのＰＣＲ断片を増幅した。ＰＣＲ産物をＳｆｉＩ−ＳｐｅＩで消化し、ゲル精製し、生じた１１５６ｂｐの断片を、ＳｆｉＩ−ＸｂａＩで消化してＳＡＰで処理したｐＩＮＡ１２６７にライゲーションして、ｐＮＦＦ２７０を作成した。その後、このプラスミドｐＮＦＦ２７０を酵母Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ内に形質転換させて導入した。図３は、Ｙａｒｒｏｗｉａ形質転換体のゲノムＤＮＡに組み込まれたプラスミドの制限地図を示し、配列番号１は、このＯＰＧプラスミドによってコードされるタンパク質を示す。
【００５３】
ｐＧＥＭ−Ｔ  ＯＰＧクローンの配列を図６に示す。成熟ＯＰＧを黒で示し、これは翻訳されている。公表されているＯＰＧ／ＯＣＩＦ配列では、成熟ＯＰＧのアミノ酸残基２４２はＡｌａ残基（Ａ）であるが、分析したすべてのｐＧＥＭ−Ｔ  ＯＰＧクローンで、この位置にはＡｓｐ残基（Ｄ）がコードされていた。このクローンのＳｆｉＩ−ＳｐｅＩ  ＯＰＧ断片を、ＳｆｉＩ−ＸｂａＩで消化したｐＩＮＡ１２６７に移した。生じたプラスミドは、図３に示す制限地図を有していた。このプラスミドの単一コピーをＹａｒｒｏｗｉａ形質転換体のゲノムＤＮＡ内に組み込んだ。このプラスミドにコードされているタンパク質を図４に示す。成熟ＯＰＧを太字で示す。このプラスミドｐＮＦＦ２７０を形質転換によってＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ内に導入した。生じた形質転換体は、ＯＰＧ特異的抗体と交差反応するタンパク質を培養基中に分泌したが、空の発現ベクターを積み込んだＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ形質転換体はこのようなタンパク質を分泌しなかった。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】様々な授乳段階における、ヒト母乳中の破骨細胞分化抑制因子の濃度を示す。
【図２】１０％ＳＤＳゲルを使用した還元条件下におけるヒト乳分画のウエスタンブロット分析を示す。ＯＰＧのバンドは、ビオチン標識の抗ＯＰＧポリクローナル抗体であるＲ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓのＢＡＦ８０５及びストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ＳＡＰＰ）を使用して明らかにした。
【図３】Ｙａｒｒｏｗｉａ形質転換体のゲノムＤＮＡ内に組み込んだプラスミドの制限地図を示す。
【図４】ヒト母乳細胞及びヒト乳腺上皮細胞であるＭＣＦ−７のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。レーン１及び２：βアクチン（予測サイズバンド：４６０ｂｐ）；レーン３及び４：ＯＰＧ（予測サイズバンド：６０３ｂｐ）；１．ヒト母乳細胞；２．ＭＣＦ−７；３．ヒト母乳細胞；４．ＭＣＦ−７。
【図５】本発明のＯＰＧがジャーカット細胞のＴＲＡＩＬ誘発性のアポトーシスを阻害する、実験の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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