(57)【要約】動物の血管形成を抑制する効果のある、サメ肉から得られる抽出物。サメ肉を溶媒と接触させて得られた溶液から肉と溶媒を取り除いて得られる抗血管形成作用のある抽出物の抽出方法。その抽出物の、癌、網膜症、炎症、関節炎を含む血管形成に関わる疾患への用途。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サメ肉から得られる、動物において血管形成抑制作用を有する抽出物。
【請求項２】
全抽出物中のリン脂質含有量が２０〜４０重量％の請求項１記載の抽出物。
【請求項３】
リン脂質脂肪酸成分中のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）が２０〜３５重量％である請求項１または請求項２記載の抽出物。
【請求項４】
トリグリセライドの含有量が抽出物の全重量に対して１０％未満である請求項１〜３のいずれかに記載の抽出物。
【請求項５】
サメ肉が１種またはそれ以上の下記のサメから得られる請求項１〜請求項４のいずれかに記載の抽出物：  レモンフィッシュ（ｌｅｍｏｎｆｉｓｈ）、スクールシャーク（ｓｃｈｏｏｌ ｓｈａｒｋ）、リグ（ｒｉｇ）、ゴーストシャーク（ｇｈｏｓｔ ｓｈａｒｋ）、アオザメ（ｍａｋｏ）、ヨシキリザメ（ｂｌｕｅ ｓｈａｒｋ）、ギンザメ（ｅｌｅｐｈａｎｔ ｆｉｓｈ）、ネズミザメ（ｓａｌｍｏｎ ｓｈａｒｋ）およびツマグロ（ｂｌａｃｋｔｉｐ ｒｅｅｆ ｓｈａｒｋ）。
【請求項６】
サメ肉から血管形成抑制作用の有る抽出物を得る下記の工程を包含する方法：
１種またはそれ以上のサメから得られた肉を、１種またはそれ以上の物質が溶液に抽出されるのに充分な時間、溶媒と接触させること、
該溶液と肉を分離すること、および
血管形成の抑制剤である抽出物を得るために該溶液から溶媒を除去すること。
【請求項７】
溶媒が有機溶媒または超臨界ＣＯ２ である請求項６記載の方法。
【請求項８】
有機溶媒が、エタノール、メタノール、酢酸エチル、ジクロロメタン、またはいずれかの混合物である請求項７記載の方法。
【請求項９】
サメ肉が溶媒との接触前に空気乾燥または凍結乾燥されている請求項６〜請求項８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
肉を溶液から濾過により分離する請求項６〜請求項９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
サメ肉が１種またはそれ以上の下記のサメから得られる請求項６〜１０のいずれかに記載の方法：  リグ（ｒｉｇ， ｌｅｍｏｎｆｉｓｈ）、スクールシャーク（ｓｃｈｏｏｌ ｓｈａｒｋ）、ゴーストシャーク（ｇｈｏｓｔ ｓｈａｒｋ）、アオザメ（ｍａｋｏ）、ヨシキリザメ（ｂｌｕｅ ｓｈａｒｋ）、ギンザメ（ｅｌｅｐｈａｎｔ ｆｉｓｈ）、ネズミザメ（ｓａｌｍｏｎ ｓｈａｒｋ）およびツマグロ（ｂｌａｃｋｔｉｐ ｒｅｅｆ ｓｈａｒｋ）。
【請求項１２】
適当な担体と共に用いる、少なくとも１種のサメの肉から得られる血管形成抑制作用の有る抽出物を含有する薬剤組成物。
【請求項１３】
抽出物の食用油中の溶液または懸濁液である請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
食用油がオリーブ油である請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
抽出物およびシクロデキストリンの混合物である請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
サメ肉から得られる血管形成抑制性抽出物の、疾患または障害の治療や予防の為の医薬品製造における用途。
【請求項１７】
疾患または障害が癌、網膜症、炎症および関節炎を包含する請求項１６記載の用途。
【請求項１８】
動物における疾患や障害の治療または予防に対して、サメ肉から得られた血管形成抑制性抽出物を使用する方法。
【請求項１９】
該疾患が癌、網膜症、炎症および関節炎を包含する請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
参照により明細書中の実施例のいずれかに実際に記載されている請求項１記載の抽出物。
【請求項２１】
参照により明細書中の実施例のいずれかに実際に記載されている請求項６記載の方法。
【請求項２２】
請求項１記載の抽出物を含有し、参照により明細書中の薬剤実施例のいずれかに実際に記載されている薬剤組成物。
【請求項２３】
本明細書中に実際に記載されている請求項１６記載の用途。
【請求項２４】
本明細書中に実際に記載されている請求項１８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明はサメ肉から得られる抽出物およびその血管形成の阻害または抑制に対する用途についての発明である。本発明は特に、溶媒抽出によって得られるサメ肉からの抽出物に関し、その抽出物から、溶媒抽出後に溶媒除去し血管形成抑制剤として有用なオイルが得られる。
【０００２】
（背景技術）
様々なサメ関連製品が特定の疾患の予防や治療に有用である事がここ数年知られてきている。特に、サメ軟骨粉末が特定の癌の抑制やコントロールに使用されてきた。
【０００３】
血管形成（新しい血管の生長）は癌腫の生存および成長のために非常に重要である。こういった腫瘍は、正常な成長や臓器と比べて高い代謝効率を有している。従って、腫瘍はより高い栄養供給を得る為に、より多くの血液を必要とする。それ故に、血管形成の抑制は、腫瘍の生長を抑制または制御する１つのメカニズムとなる。
【０００４】
サメ軟骨は血管形成を抑制する事が示されてきた。しかしながら、現在の問題はサメ軟骨の使用にある。サメ軟骨は、癌の治療や予防に用いる際、大量の摂取を必要とする。投与量は、少なくとも体重１ｋｇ当り１ｇが必要とされている。更に、サメ軟骨は味、香りとも人にとってあまり好ましい物ではない。
【０００５】
サメの肝臓から得られる油も癌の成長を遅らせる事が報告されてきた。抗癌作用は恐らく肝油中のアルキルグリセロールによるものであろう。アルキルグリセロールは、牛乳、血液、および肝臓、脾臓、骨髄、リンパ組織などのような免疫器官でも見つかっている。サメ肝油はスクアラミン化合物を含有している事が知られている。報告によれば、動物実験ではスクアラミンは腫瘍の自己血液供給能力の増大を喪失させる事が示されている。したがって、サメ肝油はスクアラミンを含有している為、特定の癌の治療や予防に有用であるかもしれないと考えられている。
【０００６】
中国の特許申請番号ＣＮ０１１７４０３６Ａは、脱水、氷結、粉砕等の段階を含む方法を使って加工されたサメ肉について記載している。加工されたサメ肉は癌を予防すると報告されている。しかし、サメ肉からの抽出物の抽出過程およびその血管形成抑制に関する記述はされていない。
【０００７】
上述のサメ製品はいずれも特異的な血管形成抑制活性が低く、それ故に大量の製品を摂取しなければならないという点およびサメ軟骨やサメの肝臓のような臓器は比較的高価な原料であるという点で不利である。
【０００８】
カナダの特許出願番号２，２０１，０２５は、サメ肉を含む様々な原料から得られる化合物を含む薬剤について記述している。この薬剤はＣ型肝炎のような病気の治療に有用であると記載されている。この薬剤が血管形成抑制能を持つ事や血管形成に関わる障害や疾患に対して効果的であるといった事は一切指摘されていない。さらに、その薬剤に配合されているサメ肉由来の物質はサメ肉を乾燥し、加熱してオイルを取り除いた後、粉砕して得られる。その粉砕されたサメ肉の組成についても、加熱処理の過程でどのような化合物が取り除かれたのかという事についても、一切情報は記載されていない。
【０００９】
本発明者等は溶媒抽出によって得られるサメ肉からの抽出物が驚くほど強力な血管形成抑制剤である事、そしてそれ故に数多くの血管形成に関わる障害や疾患の治療への有効な物質である可能性がある事を発見した。
従って、本発明の目的はサメ肉から溶媒抽出によって得られる血管形成抑制剤を提供する事、または少なくとも有用な代替品を供給する事である。
【００１０】
（発明の概要）
本発明の第一の目的は、動物において血管形成抑制能力を有する、サメ肉から得られる抽出物を提供することにある。
本発明の抽出物は主要成分としてリン脂質を含有している事が好ましい。リン脂質含有量は、好ましくは、抽出物の２０〜４０重量％である。代表的なリン脂質はホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）である。
さらに、リン脂質脂肪酸は、例えば総脂肪酸の２０〜３５重量％程度の、高濃度のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を含有している事が好ましい。
さらに、抽出物中のトリグリセライド含有量は好ましくは、１０重量％未満である。
【００１１】
本発明の第二の目的は、以下の段階を包含するサメ肉からの血管形成抑制性抽出物を得る方法を提供することにある。
１種または複数種から得られたサメ肉を、１種またはそれ以上の物質が肉から溶液に抽出される為に充分な時間、溶媒に接触させること、
その抽出液から肉部分を除去すること、および
その抽出液から溶媒を除去し、血管形成を抑制する抽出物を得ること。
【００１２】
適当な有機溶媒のいずれかまたは超臨界二酸化炭素が使用できる。好ましくは、溶媒は、エタノール、メタノール、酢酸エチルもしくはジクロロメチレンまたはこれらの混合物である。
【００１３】
本発明の好ましい具体例では、サメ肉は溶媒と接触させる前に凍結乾燥される。これに代えて風乾してもよい。抽出液を肉と分離する方法はどれでもよい。しかしながら、分離の方法は濾過が好ましい。
【００１４】
サメはどの種類でも使用できるが、下記の種類のうちいずれか、または数種が好ましい。：リグ（ｒｉｇ， ｌｅｍｏｎｆｉｓｈ）、スクールシャーク（ｓｃｈｏｏｌ ｓｈａｒｋ）、ゴーストシャーク（ｇｈｏｓｔ ｓｈａｒｋ）、アオザメ（ｍａｋｏ）、ヨシキリザメ（ｂｌｕｅ ｓｈａｒｋ）、ギンザメ（ｅｌｅｐｈａｎｔ ｆｉｓｈ）、ネズミザメ（ｓａｌｍｏｎ ｓｈａｒｋ）およびツマグロ（ｂｌａｃｋｔｉｐ ｒｅｅｆ ｓｈａｒｋ）
【００１５】
本発明の第三の目的は、少なくとも１種類のサメから適当なキャリアと共に得られる血管形成抑制性の抽出物を含む薬学的な組成物を提供することである。
【００１６】
本発明の第四の目的は、特定の疾患または障害の治療および予防に使用する為の薬剤製造における、サメ肉から得られる血管形成抑制性抽出物の用途である。疾患や障害には癌、網膜症、炎症および関節炎が含まれる。
【００１７】
本発明の第五の目的は、サメ肉から得られる血管形成抑制性抽出物の、動物における特定の疾患または障害の予防または治療に対する用途である。特定の疾患または障害には癌、網膜症、炎症および関節炎が含まれる。本発明は数多くの動物に関連しているが、その動物とは人間である事が好ましい。
【００１８】
（発明の開示）
ここで言う「サメ肉」とは、可食部を含めた全ての魚肉部分を指すが、誤解を避けるために、内臓部分は含まないものとする。本発明の抽出物は一般的に、およそ１５℃〜２５℃の範囲を指す環境温度で、一般的に油またはペーストのような油状の物質である。本明細書中で’オイル’と記載されているものには、オイル様の物質やペーストの性質を持つ物質も含まれている。この抽出物の主要成分は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）やホスファチジルコリン（ＰＣ）のようなリン脂質であることが分かっている。リン脂質含有量は通常２０〜４０重量％の範囲である。
【００１９】
リン脂質脂肪酸は通常ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、アラキドン酸（ＡＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）等を含んでいる。他の魚類抽出物または製品と比較すると、本発明の抽出物は総脂肪酸に対して高い濃度（２０〜３５重量％）のＤＨＡを含有している。下表からも分かるように、ＤＨＡサンプルは血管形成の強力な抑制剤である。本発明の抽出物中のＤＨＡ濃度が高い事から、ＤＨＡはこの抽出物の血管形成抑制能力の一端を担っている成分であるという事が推察される。
【００２０】
【表１】
2004516272.tif 000002
【００２１】
強力な抑制剤（５μ／ｍｌで８０％を超える抑制作用）： ２０：５， ２２：６， ２０：４， １８：２
良い抑制剤（１０μｇ／ｍｌで９０％を超える抑制作用）： ２２：５， １６：１
穏やかな抑制剤（２０μｇ／ｍｌで９０％未満の抑制作用）： １８：３， １７：１， １４：１
抑制作用無し（１００μｇ／ｍｌで６０％未満の抑制作用）： １８：１， ２２：１， ２４：１
【００２２】
本発明の抽出物は他の魚類からの抽出物や製品とは明らかに異なる。なぜなら、驚くほどそのトリグリセライド濃度が低い（１０重量％未満）からである。
代表的な抽出法は、１種またはそれ以上のサメからの肉片をブレンダーを使用して細かくし、フリーズドライした後エタノールのような溶媒と混合する。通常、その混合物は室温で１〜２４時間撹拌される。そして濾過によって溶媒が肉片から分離される。肉片と溶媒の混合は任意であるが繰り返される。その後、溶媒は蒸発によって取り除かれ、サメ肉抽出物がオイルとして得られる。このオイルは通常各種の遊離型脂肪酸およびグリセロール結合型脂肪酸を含む。
【００２３】
後に示す実施例１ではジクロロメタンおよびメタノールの使用が記載されているが、溶媒の選択としてはエタノールが好ましいことが予想される。
実施例２では、サメ肉オイルの脂肪酸組成について記載があるが、脂肪酸以外の成分がサメ肉オイルの血管形成抑制活性に寄与している可能性があると考えるべきである。
【００２４】
実施例３では凍結乾燥させたヨシキリザメ（ｂｌｕｅ Ｓｈａｒｋ）の肉から得られるオイルの抽出物について記載されている。凍結乾燥されたサメパウダーはエタノールおよび酢酸エチルで抽出された。結果として、２種類の抽出からのオイル収率は有意に異なるものであった（エタノール：１３．７％、酢酸エチル：１．６％）。酢酸エチル抽出物の収率は低かったものの、この抽出物の特異的な血管形成抑制作用は高く、その抽出物における血管形成抑制性化合物の濃度の高さを示唆している。
実施例３のバイオアッセイから、サメ肉オイルはサメ軟骨、サメ軟骨抽出物、他のフィッシュオイルよりも有意に血管形成抑制剤としての能力が高い事がうかがえる。
【００２５】
実施例３の抽出で得られたオイルの脂肪酸組成（ガスクロマトグラフ法）およびリン脂質組成（３１Ｐ ＮＭＲ法）分析を行った。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）もそのオイル中に含まれる種々の脂質の定性分析に用いられた。サメ肉オイルは無極性脂質の含有量が低く（ＴＬＣではトリグリセライドは検出されなかった。）、高い濃度のリン脂質（２４％ エタノール、３４％ 酢酸エチル）を含有している。サメオイルの脂肪酸含量（遊離型またはグリセロール結合型）が低いという事はこれらの抽出物中に特定されていない物質が高い濃度で含まれるという事を示唆している。
【００２６】
本発明の抽出物は、本発明の過程で得られた形状で使用することができる。しかしながら、経口投与の為には、抽出物をオリーブオイルのような食用油と混合し、カプセル化するのが好ましい。もう１つの方法としては、抽出物をシクロデキストリンのような固形キャリアと混合し、錠剤、顆粒、粉末などの形状にする事も有り得る。
顆粒や粉末、およびそれに類似した形状のものは、経口投与の為に、食品のような他の物質に包含されたり、混合されたりするかもしれない。抽出物が注射に対応する溶媒に溶解され得る事も考えられる。さらに、ビタミンＥのような成分の追加も、処方に含まれ得る。
【００２７】
血管形成は病気や障害の広範に関わっている。それ故に、本発明の抽出物はそういった病気や障害の治療や予防に有用であろう。癌、網膜症、炎症および関節炎が、これらに限るわけではないが、血管形成に関わる疾患や障害に含まれる。
さらに、この抽出物は人間の疾患や障害の治療および予防に最も有用である事が期待されると同時に、他の動物への投与にも効果が期待できるであろう。
【００２８】
（実施例）
本発明について、更に下記の実施例を参照されたい。本発明はこれらの例に限られる物ではない。
【００２９】
実施例１  レモンフィッシュ （Ｌｅｍｏｎｆｉｓｈ）の抽出
レモンフィッシュ （Ｌｅｍｏｎｆｉｓｈ）の肉（１．５ｋｇ）はブレンダーを使用し細切され、５Ｌのコニカルフラスコ中で、ジクロロメタン（１．５Ｌ）とメタノール（３Ｌ）と共に一晩撹拌された。その溶媒は濾過によって肉と分離された。残った肉に、ジクロロメタン（１．５Ｌ）を更に加えて一晩撹拌した。その溶媒は濾過によって再び肉と分離され、最初の抽出の濾液と一緒にされた。ここで得られた溶媒に塩化カリウム溶液（０．８８％  ＫＣｌ， １．５Ｌ）を加え、その混液をよく振り混ぜた。その後、その混液を静置し、２層に分離後、下層（ジクロロメタン層）を取りだし、ロータリーエバポレーションによって溶媒を除去し、オイルを得た。（１２ｇ、収率０．８％）
【００３０】
実施例２  実施例１のオイルの脂肪酸組成
実施例１のように調製されたオイルの脂肪酸組成が、ガスクロマトグラフ法（ＧＣ）で分析された。
分析前に、脂肪酸（遊離脂肪酸とトリグリセライド脂肪酸）は脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥｓ）に転換された。オイル（２０ｍｇ）はヘキサン（０．５ｍＬ）に溶解され、密閉試験管中の１％Ｈ２ＳＯ４メタノール溶液に加えられた。試験管は５０℃の水浴で一晩インキュベートされた。その後、試験管にヘキサン（２ｍＬ）と５％塩化ナトリウム水溶液（２ｍＬ）が加えられ、有機層（ＦＡＭＥｓを含んでいる）が取り出された。その有機層は２％重炭酸ナトリウム溶液（２ｍＬ）で洗浄された。
【００３１】
ＧＣ分析は下記の操作条件で行われた。
機種： Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ５８９０ ＧＣ
カラム： ＥＣ−Ｗａｘ（Ａｌｌｔｅｃｈ） カラム（３０ｍ ｘ ０．２５ｍｍ ｘ ０．２５μｍ）
注入圧： １０ ｐｓｉ
カラム温度： １６５℃（３ｍｉｎ保持）→（４℃／ｍｉｎ昇温）→１９５℃（１０ｍｉｎ保持）→（４℃／ｍｉｎ昇温）→ ２２５℃（１２ｍｉｎ保持）
ＦＡＭＥｓは水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を用いて検出された。各種脂肪酸のスタンダードおよび既知の天然オイル（例えばタラ肝油）との保持時間の比較によってピークは確認された。
この分析結果を表２に示す。サメ肉オイルは高濃度のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を含有している。
【００３２】
【表２】
2004516272.tif 000003
【００３３】
実施例３  ヨシキリザメ（Ｂｌｕｅ Ｓｈａｒｋ）の抽出
凍結したヨシキリザメ（ｂｌｕｅ ｓｈａｒｋ）の肉を２ｃｍの厚さにスライスし、３５℃、２ｍｂａｒ未満にセットされた真空オーブンに入れた。２４時間後に肉片を取り出し、細かく砕いた後再び真空オーブンに３〜４日戻した。サメ肉の重量は通常、凍結乾燥の過程で元の２０％にまで減少する。凍結乾燥された肉片は更に、手で細かくされた後ウォーリングブレンダーで粉砕され、粉と繊維質の混合物にされた。
【００３４】
溶媒としてエタノールを使用する方法と、酢酸エチルを使用する方法の２つの抽出法が行われた。サメパウダー（９００ｇ）と溶媒（エタノールまたは酢酸エチル４．５Ｌ）は一晩撹拌された。効果的に撹拌する為には、溶媒：パウダー比が５：１となる事が必要であった。容器は、アルミホイルで覆う事によって遮光された。その混合物はＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ ５９５濾紙を使って濾過された。濾過残渣は新しい溶媒（３Ｌ）と共に一晩撹拌され、濾過された。２回の濾過で得られた濾液は混合され、ロータリーエバポレーションによって溶媒が除去された。
【００３５】
実施例４  実施例３のオイルの脂肪酸組成
それぞれの抽出物中の脂肪酸（遊離型および結合型）はメチルエステルに変換され、実施例２と同じ方法でＧＣを使用して分析された。
乾燥ヨシキリザメ（Ｂｌｕｅ Ｓｈａｒｋ）のエタノール抽出物は高いオイル収率（１３．７％）を得た。対照的に、酢酸エチル抽出物ではわずか１．６％の収率であった。
【００３６】
【表３】
2004516272.tif 000004
【００３７】
この抽出物中に異なるクラスの脂質が存在する事を示す為に、薄層クロマトグラフィーが用いられた。各抽出物は無極性のＴＬＣプレート上にはほとんど何も示さなかった。（コレステロールおよびわずかなＦＦＡスポットが見られたが、トリグリセライドのサインは見られなかった。）しかし、例えばホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）ような極性脂質が高濃度に存在する事を示した。
【００３８】
これら２種類のサメ抽出物は、脂肪酸含有量および組成において、有意な差があることを示した（表４）。酢酸エチル抽出物の総脂肪酸含有量は３０．１％であった。それと比較して、エタノール抽出物の総脂肪酸含量は７．３％で、有意に低い値であった。総収率が高かった事と併せて、本結果から明らかな事は、エタノール抽出物中には非脂質物質が、酢酸エチル抽出物中よりも多く含まれているという事である。
【００３９】
これら抽出物の脂肪酸組成は非常に類似しており、いずれの抽出物も高い濃度のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）  ２０．０〜２２．２％、オレイン酸（１８：１）１０．０〜１２．２％、ステアリン酸（１８：０）１１．２〜１４．９％、パルミチン酸１６．１〜１９．１％を含んでいる。
【００４０】
【表４】
2004516272.tif 000005
【００４１】
実施例５  実施例３のオイルのリン脂質組成
リン脂質は３１Ｐ ＮＭＲを使用して特定された。ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）は定量の内部標準として使用された。３１Ｐ ＮＭＲはＴＬＣで観察された、オイルが高濃度のリン脂質を含んでいるという結果を追認した。これらのオイル中の総リン脂質濃度はかなり高い値であった。（エタノール抽出物で２４％、酢酸エチル抽出物で３４％）
【００４２】
【表５】
2004516272.tif 000006
【００４３】
実施例６  人工環境下バイオアッセイ
実施例１に従って調製したオイルの抗血管形成活性は大動脈リングアッセイ法（ａｏｒｔｉｃ ｒｉｎｇ ａｓｓａｙ）で測定された。実験方法はＮｉｃｏｓｉａとＯｔｔｉｎｅｔｔｉの記述（Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ． ６３： １１５−１２２（１９９０））およびＢｒｏｗｎらの記述（Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ． ７５： ５３９−５５５（１９９６））に基づいている。脂肪および血管周辺の繊維状組織を取り除いたあと、ラットの大動脈（ａｏｒｔａ）を２ｍｍ厚の輪状に切った。フィブリンゲル（０．４ｍＬ）（フィブリノーゲン溶液を溶解させたＭＣＤＢ１３１培養液にトロンビンを加えて作成された。）は２４−ウェル培養プレート中で作られた。大動脈リングはそれぞれのウェルの中心部分に配置され、その上から別のフィブリンゲル（０．４ｍｌ）がかぶされた。それぞれのゲルはＭＣＤＢ１３１培養液（１．５ｍＬ）で覆われ、３７℃、３％ＣＯ２／９７％空気の条件下で培養された。テストされたサメ肉抽出物はサプリメントとして培地に添加された。それぞれの抽出物について３つのサンプルを用意し、分析が行われた。
【００４４】
およそ５日後に微小血管がリング周辺から生長しているのが確認され得るはずである。５日目から１４日目までの間、一定の間隔でそれぞれのウェルの画像が記録された。撮影には、倒立顕微鏡に取りつけたデジタルカメラが用いられた。リング周辺の微小血管の成長範囲は画像ごとにＮＩＨ Ｉｍａｇｅ １．５９ソフトウェアを用いて決定された。それぞれの時点で、成長率の平均が決定され、微小血管の成長率がそれぞれのサメ肉抽出物について決定された。
【００４５】
表６に示す様に一般的に購入可能な魚油やサメ製品と比較して、サメ肉オイルは高い血管形成活性を示した。
【００４６】
【表６】
2004516272.tif 000007
【００４７】
分取した例３のオイル（メタノール抽出で得られたオイルと同様に）が血管形成を変化させる能力について分析された。分析には例１のオイルに適用されたのと同一のラット大動脈リング法（ｒａｔ ａｏｒｔｉｃ ｒｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）が適用された。
【００４８】
それぞれのサンプルを３個ずつ分析し、その平均を各サンプルの結果とした。オイルのキャリアのみを添加した３つのウェルが対照群として用いられた。試験物質の存在下での生長速度は、これに基づいて評価された。表７に示す様に、血管形成の抑制は異なる有機溶媒を用いて得られる各オイルについて、いくつかの濃度で評価された。
【００４９】
【表７】
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【００５０】
これらの実験はエタノール抽出物およびメタノール抽出物は、１〜３μｇ／ｍｌでおよそ５０％の抑制という、非常に類似したレベルの血管形成抑制効果を持つ事を示している。酢酸エチル抽出物は０．２μｇ／ｍｌで５０％の抑制をし、エタノールおよびメタノール抽出物の約５倍の能力を持つ。
【００５１】
エタノール抽出物はオリーブオイルと混合され、その血管形成への作用が大動脈リングアッセイ法（ａｏｒｔｉｃ ｒｉｎｇ ａｓｓａｙ）で測定された。最初に、オリーブオイルは比較的高濃度においても血管形成抑制作用は示さない。実際、２００μｇ／ｍｌでわずかに促進的に働き、３３．６％の増加を刺激した。
【００５２】
エタノール抽出物をオリーブオイルと１：４（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で混合したものを、１５μｇ／ｍｌの濃度（抽出物として３μｇ／ｍｌ）で分析したところ、その抑制率は８７．５％であった。エタノール抽出物をオリーブオイルと１：９（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で混合したものを３０μｇ／ｍｌの濃度（抽出物として３μｇ／ｍｌ）で分析したところ、その抑制率は８５．８％であった。
エタノール抽出物のペーストをβ‐シクロデキストリンと１：６（ｗｔ／ｗｔ）で混合し、１５μｇ／ｍｌ（抽出物として２．５μｇ／ｍｌ）の濃度でインキュベートしたとき、４０％の血管形成抑制が測定された。
【００５３】
実施例７  生体内バイオアッセイ
サメ肉からの抽出物はラットに投与する為、飲料水に混合された。それぞれの抽出物は０．１６６ｍｇ／ｍｌの濃度になるように調製され、２日毎に新しいものと交換された。交換時にその消費量が観察され、その結果から投与量が計算された。エタノール抽出物および酢酸エチル抽出物の両方が評価された。対照群のラットにはなにも添加していない飲料水が与えられ自由に飲ませた。それぞれのグループは６匹のスプレーグ−ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラット（雌雄各３匹）で構成された。
【００５４】
サプリメント投与開始の２週間後に、血管形成の誘導を開始した。この誘導はコンパウンド４８／８０を徐々に増量しながら１日２回、４．５日に渡って腹腔内に投与する事によって引き起こされた。（Ｄａｖｉｓ， ｅｔ． Ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ． Ｒｅｓ．， ５４： １７８−１８２ （１９９７）参照）
【００５５】
コンパウンド４８／８０注射開始後１６日後に、それぞれのラットの血管システムはインドインクで染色された。腸と腸間膜窓が切除され、それをガラススライドに広げて乾燥させた。これらのスライドの画像はデジタルで記録され、各窓において微細血管の占める比率が計算された。
各グループの血管形成の平均値が決定され、統計学的有意差の有無はスチューデントのｔ検定によって評価された。各グループのラットの体重は表８に示すように推移した。
【００５６】
【表８】
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【００５７】
表８の結果はいずれの抽出物の投与も、ラットの体重増加率に無視できる程度の差異しか与えない事を示している。これらのサプリメント投与を受けた動物は対照群と同様の成長率を示した。これらの事は、雌雄両方に当てはまり、オスはメスよりも成長率が大きい。サメ肉抽出物の投与はラットの成長率に有意差の有る影響を及ぼさなかった。
体重当りの抽出物消費量が計算された。この計算は、計測されたラットの体重および飲料水消費量に基づいている。
【００５８】
【表９】
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【００５９】
最も高い投与量は実験開始時に観察された。コンパウンド４８／８０の（腹腔内）投与期間中には、ラットの飲料水消費量が有意に減少したため、抽出物の消費が減少した。したがって、この期間の投与量が一番低くなっている。コンパウンド４８／８０の投与終了後、飲料水の消費量およびそれに伴う抽出物の投与量は増加した。
生体内血管形成は、上記に説明したように腸間膜窓で測定された。結果は下表１０に示す。
【００６０】
エタノール抽出物はこの投与量で、血管形成を有意に（４６％）抑制した。それと比較して、酢酸エチル抽出物はほぼ同じ投与量で、２１％の抑制しか示さなかった。それでも、結果には有意差が認められた。しかしながら、どちらの抽出物もほぼ同じ投与量とはいえ、酢酸エチル抽出物は人工環境下、大動脈リングアッセイ法（ａｏｒｔｉｃ ｒｉｎｇ ａｓｓａｙ）では抑制作用がより強い事が分かっている。
【００６１】
【表１０】
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【００６２】
実施例８  抗炎症作用分析
サメ肉エタノール抽出物の急性炎症に対する作用を測定する為に、エタノール性の抽出物は、６匹のラット（雄３、雌３）の飲料水に添加する事によって経口的に投与された。急性炎症の開始１週間前から投与は行われた。対照群にはこのサプリメントは与えられなかった。飲料水への抽出物添加量は０．２ｍｇ／ｍｌであった。
【００６３】
炎症は２．５％λ−カラゲニン溶液１００μＬをそれぞれのラットの後足フットパッドに注射する事によって引き起こされた。それぞれの足の容積変化は注射前と注射４時間後にその容積を計測する事によって測定された。それぞれの足について容積変化が決定された。
抽出物の平均消費量はオスが４．６７ｍｇ／日、メスが３．７５ｍｇ／日であった。
【００６４】
通常飲料水（サプリメント無し）を与えられた６匹のラット（足１２本分）についての平均フットパッド容積増加率は５４．２１％±２．３０（ＳＥＭ）であった。抽出物の投与を受けた６匹のラット（足１２本分）についての平均フットパッド容積増加率は４７．０６％±２．２７（ＳＥＭ）であった。この事は、抽出物が急性炎症反応を１３．１９％±０．２０（ＳＥＭ）抑制した事を示している。したがって、この抽出物が抗炎症作用を持つ事は明らかである。
【００６５】
実施例９  製剤例
オリーブオイル混合サメ肉抽出物：  エタノール抽出で得られるサメ肉抽出物およびビタミンＥオイルがオリーブオイルに添加された。混合物（１０５ｍｇ）はソフトゼラチンカプセルに封入され、その混合物は抽出物（１０ｍｇ）、ビタミンＥオイル（５ｍｇ）、オリーブオイル（９０ｍｇ）を含有する。
サメ肉抽出物とシクロデキストリン：  サメ肉抽出物（１５ｍｇ）はβ−シクロデキストリン（８５ｍｇ）およびビタミンＥ（０．０７５ｍｇ）と混合された。この混合物は更に加工され、粉または顆粒状にして使用する。
【００６６】
本発明は実施例によって説明されてきたが、発明の領域を越えずに、様々な変形や修正が加えられ得るということは認識されなければならない。さらに、特定の機能について均等物が知られている場合、これら均等物は、本明細書記載事項として本明細書に組み込まれる。
【００６７】
（産業上の利用可能性）
本発明の抽出物は血管形成の抑制物質である。血管形成は様々な疾患や障害に関わっている。それ故に、血管形成の抑制はそれら疾患や障害の予防や治療に役立ち得る。これらの疾患や障害には、癌、網膜症、炎症、および関節炎が含まれる。したがって、本発明の抽出物は少なくともこれらの疾患の治療に有用である。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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