(57)【要約】【課題】歯周病の緩和効果または予防効果を有する薬剤の製造におけるペプチドまたはペプチド誘導体の使用方法であって、該ペプチドがα−Ｓ２カゼイン前駆体中に存在するアミノ酸配列を含有し、該アミノ酸配列が３個以上のアミノ酸を有し、且つ該アミノ酸配列のＮ−末端側領域が完全なα−Ｓ２カゼイン前駆体のＮ−末端側アミノ酸により構成されていないことを特徴とする使用方法を提供する。当該ペプチドは、α−Ｓ２カゼインフラグメントと同様の活性を有するあらゆるペプチドであってもよい。また、加齢による肌の変化の緩和効果または予防効果を有する薬剤の製造におけるペプチドまたはペプチド誘導体の使用方法であって、該ペプチドがα−Ｓ２カゼイン前駆体中に存在するアミノ酸配列を含有し、該アミノ酸配列が３個以上のアミノ酸を有し、且つ該アミノ酸配列のＮ−末端側領域が完全なα−Ｓ２カゼイン前駆体のＮ−末端側アミノ酸により構成されていないことを特徴とする使用方法を提供する。当該ペプチドは、α−Ｓ２カゼインフラグメントと同様の活性を有するあらゆるペプチドであってもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯周病の緩和効果または予防効果を有する薬剤の製造におけるペプチドまたはペプチド誘導体の使用方法であって、該ペプチドがα−Ｓ２カゼイン前駆体中に存在するアミノ酸配列を含有し、該アミノ酸配列が３個以上のアミノ酸を有し、且つ該アミノ酸配列のＮ−末端側領域が完全なα−Ｓ２カゼイン前駆体のＮ−末端側アミノ酸により構成されていないことを特徴とする使用方法。
【請求項２】
歯周病の緩和効果または予防効果を有する薬剤の製造におけるペプチドまたはペプチド誘導体の使用方法であって、該ペプチドがα−Ｓ２カゼインフラグメントと同様の活性を有することを特徴とする使用方法。
【請求項３】
加齢による肌の変化の緩和効果または予防効果を有する薬剤の製造におけるペプチドまたはペプチド誘導体の使用方法であって、該ペプチドがα−Ｓ２カゼイン前駆体中に存在するアミノ酸配列を含有し、該アミノ酸配列が３個以上のアミノ酸を有し、且つ該アミノ酸配列のＮ−末端側領域が完全なα−Ｓ２カゼイン前駆体のＮ−末端側アミノ酸により構成されていないことを特徴とする使用方法。
【請求項４】
加齢による肌の変化の緩和効果または予防効果を有する薬剤の製造におけるペプチドまたはペプチド誘導体の使用方法であって、該ペプチドがα−Ｓ２カゼインフラグメントと同様の活性を有することを特徴とする使用方法。
【請求項５】
上記ペプチドが９個以上のアミノ酸により構成されているものである請求項１〜４のいずれかに記載の使用方法。
【請求項６】
上記ペプチドが９〜３１個のアミノ酸により構成されているものである請求項１〜５のいずれかに記載の使用方法。
【請求項７】
上記ペプチドが、完全なα−Ｓ２カゼイン前駆体のＣ末端側領域を含むものである請求項１〜６に記載の使用方法。
【請求項８】
上記ペプチドが、ウシ，ヤギ，ヒツジ，ウサギ，若しくはブタα−Ｓ２カゼイン由来のものであるか、または、その合成等価体若しくは相同体である請求項１〜７のいずれかに記載の使用方法。
【請求項９】
上記ペプチドが、下記アミノ酸配列から選択される配列を含有するものである請求項１〜８のいずれかに記載の使用方法。
2004501976.tif 000020
【請求項１０】
上記ペプチドが、
（ａ）１以上のＬｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌが互いに置換されている；および／または、
（ｂ）１以上のＴｙｒ，Ｐｈｅが互いに置換されている；および／または、
（ｃ）１以上のＡｒｇ，Ｌｙｓが互いに置換されているペプチド相同体を含有するものである請求項１〜９のいずれかに記載の使用方法。
【請求項１１】
上記の加齢による肌の変化が、肌のシワである請求項３〜１０のいずれかに記載の使用方法。
【請求項１２】
上記ペプチドが、繊維芽細胞の増殖を刺激できるものである請求項１〜１１に記載の使用方法。
【請求項１３】
上記ペプチドが繊維芽細胞によるコラーゲンの産生を刺激できるものである請求項１〜１２に記載の使用方法。
【請求項１４】
上記ペプチドが角化細胞の増殖を刺激できるものである請求項１〜１３に記載の使用方法。
【請求項１５】
加齢による肌の変化を緩和または予防するための美容方法であって、患者にペプチドまたはペプチド誘導体による治療を施す工程を含み、該ペプチドがα−Ｓ２カゼイン前駆体中に存在するアミノ酸配列を含有し、該アミノ酸配列が３個以上のアミノ酸を有し、且つ該アミノ酸配列のＮ−末端側領域が完全なα−Ｓ２カゼイン前駆体のＮ−末端側アミノ酸により構成されていないことを特徴とする美容方法。
【請求項１６】
加齢による肌の変化を緩和または予防するための美容方法であって、患者にペプチドまたはペプチド誘導体による治療を施す工程を含み、該ペプチドがα−Ｓ２カゼインフラグメントと同様の活性を有することを特徴とする美容方法。
【請求項１７】
上記ペプチドが、請求項５〜１０のいずれかに記載のペプチドを含むものである請求項１５または１６に記載の美容方法。
【請求項１８】
加齢による肌の変化を緩和または予防するための局所投与用組成物であって、ペプチドまたはペプチド誘導体を含有し、該ペプチドがα−Ｓ２カゼイン前駆体中に存在するアミノ酸配列を含有し、該アミノ酸配列が３個以上のアミノ酸を有し、且つ該アミノ酸配列のＮ−末端側領域が完全なα−Ｓ２カゼイン前駆体のＮ−末端側アミノ酸により構成されていないことを特徴とする組成物。
【請求項１９】
加齢による肌の変化を緩和または予防するための局所投与用組成物であって、ペプチドまたはペプチド誘導体を含有し、該ペプチドがα−Ｓ２カゼインフラグメントと同様の活性を有することを特徴とする組成物。
【請求項２０】
美容用組成物である請求項１８または１９に記載の組成物。
【請求項２１】
上記ペプチドが、請求項５〜１０のいずれかに記載のペプチドを含むものである請求項１８〜２０のいずれかに記載の美容方法。
【請求項２２】
歯周病を緩和または予防するための医薬用組成物であって、ペプチドまたはペプチド誘導体を含有し、該ペプチドがα−Ｓ２カゼイン前駆体中に存在するアミノ酸配列を含有し、該アミノ酸配列が３個以上のアミノ酸を有し、且つ該アミノ酸配列のＮ−末端側領域が完全なα−Ｓ２カゼイン前駆体のＮ−末端側アミノ酸により構成されていないことを特徴とする組成物。
【請求項２３】
歯周病を緩和または防止するための医療用組成物であって、ペプチドまたはペプチド誘導体を含有し、該ペプチドがα−Ｓ２カゼインフラグメントと同様の活性を有することを特徴とする組成物。
【請求項２４】
練り歯磨き又はチューインガムの形状である請求項２２または２３に記載の組成物。
【請求項２５】
上記ペプチドが、請求項５〜１０のいずれかに記載のペプチドを含むものである請求項２２〜２４のいずれかに記載の美容方法。
【請求項２６】
繊維芽細胞の増殖を刺激する効果を有する薬剤の製造のためのペプチドまたはペプチド誘導体の使用方法であって、該ペプチドがα−Ｓ２カゼイン前駆体中に存在するアミノ酸配列を含有し、該アミノ酸配列が３個以上のアミノ酸を有し、且つ該アミノ酸配列のＮ−末端側領域が完全なα−Ｓ２カゼイン前駆体のＮ−末端側アミノ酸により構成されていないことを特徴とする使用方法。
【請求項２７】
繊維芽細胞の増殖を刺激する効果を有する薬剤の製造のためのペプチドまたはペプチド誘導体の使用方法であって、該ペプチドがα−Ｓ２カゼインフラグメントと同様の活性を有することを特徴とする使用方法。
【請求項２８】
繊維芽細胞によるコラーゲンの産生を刺激する効果を有する薬剤の製造のためのペプチドまたはペプチド誘導体の使用方法であって、該ペプチドがα−Ｓ２カゼイン前駆体中に存在するアミノ酸配列を含有し、該アミノ酸配列が３個以上のアミノ酸を有し、且つ該アミノ酸配列のＮ−末端側領域が完全なα−Ｓ２カゼイン前駆体のＮ−末端側アミノ酸により構成されていないことを特徴とする使用方法。
【請求項２９】
繊維芽細胞によるコラーゲンの産生を刺激する効果を有する薬剤の製造のためのペプチドまたはペプチド誘導体の使用方法であって、該ペプチドがα−Ｓ２カゼインフラグメントと同様の活性を有することを特徴とする使用方法。
【請求項３０】
角化細胞の増殖を刺激する効果を有する薬剤の製造のためのペプチドまたはペプチド誘導体の使用方法であって、該ペプチドがα−Ｓ２カゼイン前駆体中に存在するアミノ酸配列を含有し、該アミノ酸配列が３個以上のアミノ酸を有し、且つ該アミノ酸配列のＮ−末端側領域が完全なα−Ｓ２カゼイン前駆体のＮ−末端側アミノ酸により構成されていないことを特徴とする使用方法。
【請求項３１】
角化細胞の増殖を刺激する効果を有する薬剤の製造のためのペプチドまたはペプチド誘導体の使用方法であって、該ペプチドがα−Ｓ２カゼインフラグメントと同様の活性を有することを特徴とする使用方法。
【請求項３２】
上記ペプチドが、請求項５〜１０のいずれかに記載のペプチドを含むものである請求項２６〜３１のいずれかに記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質，ペプチド（一般的には、ポリペプチドをいう），ペプチド誘導体，またはペプチドフラグメントに関するものであり、これらは加齢に伴う変化、特に肌における加齢的変化を緩和し或いは予防するために使用され得るものである。また、本発明は、治療方法または美容方法であってもよい。更に、本発明は、歯周病（歯肉病）の予防または治療に用いられ得る同様のペプチド，ポリペプチド，ペプチド誘導体，またはペプチドフラグメントに関するものである。本発明は、望ましい場合には、医療上の方法であってもよい。特に、本発明は、α−Ｓ２カゼイン前駆体中のアミノ酸配列を含有するペプチドの使用方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
母乳は、その栄養成分に加えて細胞増殖活性を促進する成分を含むことが、長年に亘り知られている。これに関しては、上皮増殖因子（ＥＧＦ）が、ヒト（ＳｈｉｇとＫｌａｇｂｒｕｎ，１９８４年；Ｐｅｔｒｉｄｅｓ，１９８５年），ラット（Ｒａａｂｅｒｇら，１９９０年），ブタ（Ｔａｎら，１９９０年），およびヤギ（ＢｒｏｗｎとＢｌａｋｅｌｅｙ，１９８３年）の母乳中で確認されている。
【０００３】
ラットの母乳に含まれるＥＧＦは、仔の正常な生育に重要なことが明らかにされている（Ｏｋａら，１９８３年）。しかし、ＥＧＦは、ウシの母乳からは確認されていない（Ｒｅａｄ，１９８５年）。その代わり、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）（ＳｈｉｎｇとＫｌａｇｓｂｒｕｎ，１９８４年；ＢｒｏｗｎとＢｌａｋｅｌｅｙ，１９９４年）と構造的な相関性を有するインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）ＩとＩＩ（Ｆｒａｎｃｉｓら，１９８６年）およびウシ初乳増殖因子（ＢＣＧＦ）が、ウシ母乳中で確認されている。
【０００４】
特許文献１には、ウシ母乳は、興味深いことにＩＦＧやＰＤＧＦによっては活性化されないラットの哺乳類繊維芽細胞株（Ｒａｍａ２７）に対して増殖促進活性を有することが記載されている。この公報では、この増殖促進活性を示すペプチド配列が同定されている。これら配列は、ウシα−Ｓ２カゼイン前駆体のＣ−末端側領域と実質的に同一であることが明らかにされている。当該公報は、これらペプチドまたはその塩が、成長促進のための医薬や食品の製造に役立ち得ることが示唆している。
【０００５】
特許文献２には、ミルクタンパク質の加水分解物と、髪や肌のトリートメントのために使用される組成物が開示されている。当該加水分解物中のタンパク質は特に定義されておらず、その分子量は１０００ダルトン未満とされている。従って、これらタンパク質は、ミルクに含まれる様々なタンパク質の中でも、非常に小さい加水分解産物である。
【０００６】
特許文献３〜５には、成長促進剤および消化管ダメージの治療剤として使用され得るミルク抽出物が開示されている。このミルク抽出物は、ヒト或いは動物のミルク由来のものであり、チーズホエイ抽出物やスキムミルク抽出物を含む。これら特許文献では、ＩＧＦ ＩまたはＩＩが、これら抽出物に特性を付与する有効成分であることが示唆されているものの、当該抽出物が特定のタンパク質を含むべきである旨は示唆されていない。
【０００７】
その上、クリーム等の局所的な剤形が市販されている。例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）による抗老化作用を謳っているもの（エスティローダー， Ｅｌｌｅ，１９９９年）や、“ホエイタンパク質”による効果によるもの（エスティローダーの“ディミニッシュ”，Ｍａｒｔｈａ Ｓｔｅｗａｒｔ’ｓ Ｌｉｖｉｎｇ， ２０００年２月）がある。しかしながら、これらの抗老化作用は、特に高いものではなかった。
【０００８】
【特許文献１】
国際公開第９７／１６４６０号パンフレット
【特許文献２】
欧州特許第０ ４５７ ５６５号明細書
【特許文献３】
国際公開第９２／００９９４号パンフレット
【特許文献４】
国際公開第９５／２９９３３号パンフレット
【特許文献５】
国際公開第９６／３４６１４号パンフレット
【特許文献６】
国際公開第９７／１６４６０号パンフレット
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、従来技術の問題を解決することにある。特に、本発明の目的は、加齢による肌の変化を緩和または予防することができる薬剤を提供することにある。また、歯周病を治療または防止できる薬剤を提供することも、本発明の目的である。驚くべきことに、本発明者らは、上記特許文献６に増殖プロモーターとして開示されている様なα−Ｓ２カゼイン前駆体とそのスピーシーズが、加齢による肌の変化の緩和と予防、および歯周病の治療に極めて有用であることを見出した。本発明で使用されるα−Ｓ２カゼイン前駆体，前駆体フラグメント，およびその誘導体は、公知の抗老化製品や歯肉病治療に用いられている製品、特に上記の公知技術で開示されている薬剤に対して顕著に優れている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明は、歯周病の緩和効果または予防効果を有する薬剤の製造におけるペプチドまたはペプチド誘導体の使用方法であって、該ペプチドがα−Ｓ２カゼイン前駆体中に存在するアミノ酸配列を含有し、該アミノ酸配列が３個以上のアミノ酸を有し、且つ該アミノ酸配列のＮ−末端側領域が完全なα−Ｓ２カゼイン前駆体のＮ−末端側アミノ酸により構成されていないことを特徴とする使用方法を提供するものである。また、本発明は、加齢による肌の変化の緩和効果または予防効果を有する薬剤の製造におけるペプチドまたはペプチド誘導体の使用方法であって、該ペプチドがα−Ｓ２カゼイン前駆体中に存在するアミノ酸配列を含有し、該アミノ酸配列が３個以上のアミノ酸を有し、且つ該アミノ酸配列のＮ−末端側領域が完全なα−Ｓ２カゼイン前駆体のＮ−末端側アミノ酸により構成されていないことを特徴とする使用方法をも提供する。
【００１１】
上述した本発明の使用方法はペプチドまたはその誘導体の使用方法に関するものであるが、これらは、天然物由来のペプチド単離物として得られるものの様な純粋なものでも、部分的に純粋なものであってもよい。従って、本発明に係る使用方法は、ペプチドまたはその誘導体を含む天然物を使用する様な精製されていない天然物に含まれるペプチドを採用するものまで範囲に含まれ、また、あらゆる精製段階（１００％純粋物を含む）におけるペプチドまたはその誘導体の使用方法も含んでいてもよい。当該ペプチドは、タンパク質の分解消化物であってもよいし、合成ペプチドの様な非天然物であってもよい。本発明に関しては、「ペプチド」の語は、タンパク質，ポリペプチド，およびペプチドフラグメントを含むものとする。
【００１２】
また、本発明は、加齢による肌の変化を緩和または予防するための美容方法であって、患者にペプチドまたはペプチド誘導体による治療を施す工程を含み、該ペプチドがα−Ｓ２カゼイン前駆体中に存在するアミノ酸配列を含有し、該ペプチドがα−Ｓ２カゼイン前駆体中に存在するアミノ酸配列を含有し、該アミノ酸配列が３個以上のアミノ酸を有し、且つ該アミノ酸配列のＮ−末端側領域が完全なα−Ｓ２カゼイン前駆体のＮ−末端側アミノ酸により構成されていないことを特徴とする美容方法を提供するものでもある。
【００１３】
繰り返すが、本発明者らは、α−Ｓ２カゼイン前駆体由来のアミノ酸配列を含有するペプチドや、特にその様なペプチドフラグメントが、老化に伴う多くの変化を防止および緩和することによって肌に対して非常に有益な効果を示し、また、歯周病を治療および防止することができるという驚くべき事実を見出した。これら特定の薬剤が示す効果は、従来の薬剤に比して極めて優れたものである。本発明において「フラグメント」の語は、タンパク質，ポリペプチド，或いはペプチド由来の配列の一部であり、これら全ての配列ではないものを意味するものとする。
【００１４】
本発明は、以下に図面や具体例によって更に詳しく例示されるが、これらはあくまで参考のためのものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明において、「加齢による変化」は、あらゆる加齢的変化であってもよいものとする。従って、当該「変化」には、肌のたるみ，肌のシワ，或いはダメージを受けた肌の再生遅延をも含む。しかし、当該「変化」は、好ましくは「肌のシワ」を意味する。「歯周病」とは歯肉の病気をいい、本発明における「歯周病」は、歯や歯肉の感染症と同様に歯や歯肉のクリーニング（ブラッシングやフロシング）不足を含むあらゆる原因によって発生する歯肉の病気であってもよい。
【００１６】
本発明で使用されるポリペプチドおよびペプチドフラグメントは、上記「変化」の緩和効果，防止効果，或いはその両方の効果を有する。従って、これらペプチド等は、歯肉の病気による影響や老化に伴う変化の予防効果および／または軽減効果を示し、歯肉病からの攻撃を防御することができ、また、若々しい肌外観を取り戻すこともできる。
【００１７】
α−Ｓ２カゼイン前駆体は、加齢的変化や歯肉病に対して何ら効果を示さないにも拘わらず、当該タンパク質のフラグメントやα−Ｓ２カゼインのＣ末端領域由来のポリペプチドは、顕著なこれら効果を有する。例えば、歯肉病や加齢的変化に対する有効性は、α−Ｓ２カゼイン前駆体のＣ末端領域由来のものであり且つ３以上のアミノ酸残基を有するペプチドにはあるが、完全なα−Ｓ２カゼイン分子のＮ−末端側アミノ酸配列により構成されているものにはない。従って、本発明で使用されるカゼイン由来のペプチドおよびフラグメントは、一般的に３以上のアミノ酸残基を含むが、完全なカゼインタンパク質のＮ−末端領域により構成されるものではない。本発明における「Ｎ−末端側アミノ酸により構成されていないペプチド」との文言は、タンパク質のＮ−末端側部分そのものにより構成されていないペプチドを意味する。その具体例としては、Ｎ−末端領域に近似せず、Ｎ−末端領域を含まないようなペプチドを挙げることができる。好適な当該ペプチドは、完全なタンパク質のＣ−末端領域により構成されているものである。
【００１８】
従って、本発明で使用されるペプチドまたはフラグメント中のアミノ酸残基数は特に限定されないが、３以上のアミノ酸であり、完全なカゼインのＮ−末端領域により構成されないものとする。しかし、ペプチド中のアミノ酸残基の数は、好ましくは３〜５０，４〜５０，５〜５０，６〜５０，または７〜５０である。更に有利なアミノ酸残基数は、８〜５０であり、更に好ましくは９〜５０，または１０〜５０である。上記におけるアミノ酸残基数の上限は、好ましくは３５であり、最適には３１である。よって、最適なアミノ酸残基数は、９〜３１である。
【００１９】
従って、本発明に係るペプチドは、好ましくは、α−Ｓ２カゼイン前駆体のＣ−末端部分（Ｃ−末端領域を含む）の３〜５０，３〜３５，または３〜３１アミノ酸を含むものが好ましく、また、α−Ｓ２カゼイン前駆体Ｃ−末端領域の３〜１０，３〜９，３〜８，３〜７という短いものであってもよく、更に３アミノ酸残基であってもよい。
【００２０】
本発明で用いられるウシα−Ｓ２カゼイン前駆体は、以下のアミノ酸配列を有する。
【００２１】
［ＣＡＳ２　ＢＯＶＩＮ］　α−Ｓ２カゼイン前駆体
配列：
2004501976.tif 000002
【００２２】
上記配列を三文字コードで表すと：
2004501976.tif 000003
【００２３】
本発明に係るペプチドは、好適には以下の配列群から選択されるアミノ酸配列を含む：
2004501976.tif 000004
【００２４】
これら全ての配列は、ウシα−カゼイン前駆体のＣ末端部分最後のアミノ酸９残基を含んでいる。本発明者らは、このＣ末端配列（ＬｙｓＶａｌＩｌｅＰｒｏＴｙｒＶａｌＡｒｇＴｙｒＬｅｕ）を含んでいるペプチド配列が、顕著な抗老化活性を示すことを見出した。従って、本発明の特に好ましい態様としては、本発明に係るポリペプチドは、ＬｙｓＶａｌＩｌｅＰｒｏＴｙｒＶａｌＡｒｇＴｙｒＬｅｕという配列を含むウシα−Ｓ２カゼインフラグメントを含有するものである。斯かる観点から、他の特に好適な配列は、ウシα−カゼイン前駆体のＣ末端の１０，１１，１２，および１３個のアミノ酸を含む。これらアミノ酸は、特にＣ末端領域において相同性を有するヤギ，ウサギ，ヒツジα−カゼイン前駆体の７個のアミノ酸残基と同一である。
【００２５】
上記で強調した様に、ウシ，ヤギ，ヒツジ，ウサギ，およびブタ由来のα−カゼイン前駆体のＣ末端アミノ酸配列には、高い相同性が見られる。これらカゼインの配列によれば、当該Ｃ末端配列が種間で異なり得ることは明らかではあるが、重要な類似性がある。従って、本発明ではウシα−カゼイン前駆体が好適に使用されるものの、必要であるならばヤギ，ヒツジ，ウサギ、およびブタのα−カゼインフラグメントやその他の種の類似フラグメントも使用できる。
【００２６】
ヤギ，ヒツジ，ウサギ、およびブタ由来のα−カゼイン前駆体の配列を、以下に示す。
【００２７】
［ＣＡＳ２ ＣＡＰＨ１］　α−Ｓ２カゼイン前駆体（α−Ｓ２−ＣＮ）
配列：
2004501976.tif 000005
【００２８】
＞ｐｉｒ｜Ｓ３３８８１｜Ｓ３３８８１　α−Ｓ２カゼイン Ｅ−ヤギ
配列：
2004501976.tif 000006
【００２９】
＞ｇｐ｜Ｓ７４１７１｜Ｓ７４１７１　１　α−Ｓ２カゼイン Ｃ−ヤギ（ｃａｐｒａ ｈｉｒｃｕｓ）
配列：
2004501976.tif 000007
【００３０】
＞ｐｉｒ｜Ｓ３９７７６｜Ｓ３９７７６　α−Ｓ２カゼインフォーム Ｂ前駆体−ウサギ
＞ｇｐ｜Ｘ７６９０９｜ＯＣＰＡＳ２ＢＣＳ　１　ｐｒｅ−α−Ｓ２ｂカゼイン（ＡＡ　−１５〜１６７）カイウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）
配列：
2004501976.tif 000008
【００３１】
［ＣＡＳ２　ＳＨＥＥＰ］　α−Ｓ２カゼイン前駆体−ヒツジ
配列：
2004501976.tif 000009
【００３２】
［ＣＡＳ２　ＰＩＧ］　α−Ｓ２カゼイン前駆体−ブタ
配列：
2004501976.tif 000010
【００３３】
これら配列を三文字コードで表すと、以下の通りである。
【００３４】
［ＣＡＳ２　ＣＡＰＨ１］　α−Ｓ２カゼイン前駆体（α−Ｓ２−ＣＮ）
配列：
2004501976.tif 000011
【００３５】
＞ｐｉｒ｜Ｓ３３８８１｜Ｓ３３８８１　α−Ｓ２カゼイン Ｅ−ヤギ
配列：
2004501976.tif 000012
【００３６】
＞ｇｐ｜Ｓ７４１７１｜Ｓ７４１７１　１　α−Ｓ２カゼイン Ｃ−ヤギ（ｃａｐｒａ ｈｉｒｃｕｓ）
配列：
2004501976.tif 000013
【００３７】
＞ｐｉｒ｜Ｓ３９７７６｜Ｓ３９７７６　α−Ｓ２カゼインフォーム ｂ前駆体−ウサギ
＞ｇｐ｜Ｘ７６９０９｜ＯＣＰＡＳ２ＢＣＳ　１　ｐｒｅ−α−Ｓ２ｂカゼイン（ＡＡ　−１５〜１６７）カイウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）
配列：
2004501976.tif 000014
【００３８】
［ＣＡＳ２　ＳＨＥＥＰ］　α−Ｓ２カゼイン前駆体−ヒツジ
配列：
2004501976.tif 000015
【００３９】
［ＣＡＳ２　ＰＩＧ］　α−Ｓ２カゼイン前駆体−ブタ
配列：
2004501976.tif 000016
【００４０】
更に、アミノ酸間における性質の類似性によって、配列の機能に影響を与えることなく、いくつかのアミノ酸を交換することが可能である。即ち、ロイシン，イソロイシン，バリンは、相互に交換してもよい。また、チロシンとフェニルアラニンも交換可能であり、アルギニンとリジンも同様である。
【００４１】
ここで、本発明につき更に詳しく説明する。本発明は、好ましくはα−Ｓ２カゼイン前駆体フラグメントに関するものであり、更に好ましくは、美容用産物としての使用するためのものとして特許文献６に記載されているペプチドに関するものであり、好適にはシワ等の肌の加齢的変化を軽減するために使用されるクリームやローションの形態をとる。本発明は、好適にはヒトの肌に使用されるものであるが、必要である場合には、一般的には哺乳動物の様な他生物の肌に使用してもよい。
【００４２】
また、本発明は、歯周病の予防剤または治療剤として使用される上記α−Ｓ２カゼイン前駆体フラグメントに関するものでもある。本発明は、好適にはヒトの病気に使用されるものであるが、必要である場合には、一般的には哺乳動物の様な他生物の歯肉に使用してもよい。本発明に係る薬剤は、局所投与剤（例えば、歯および／または歯肉をクリーニングするための練り歯磨き）やチュウインガム等、あらゆる形態であってもよい。
【００４３】
本発明に係るペプチドとしては、純粋物を使用してもよいし、都合によっては、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程（また、当該工程を含む方法）に関して特許文献６に記載されているプロトコールに従ってミルクから濃縮された天然物を使用することもできる。チーズホエイの代わりになるものとして、（ミルク）ホエイ酸を用いてもよい。
【００４４】
本発明に係るペプチドは、単独で使用してもよいし、局所投与用組成物，歯磨き用ペースト，またはチューインガムを形成するための、許容され得る（場合により、薬事上許容され得る）添加剤および／または賦形剤と組合わせて使用してもよい。局所投与用剤に使用される添加剤としては、例えば、調湿剤および／または、肌の老化を予防する若しくは肌を若返らせるといった有益な効果を発揮するビタミンＡ，Ｃ，Ｄ，Ｅの全てや夫々などといった肌に効果的な薬剤を挙げることができる。
【００４５】
理論を無視するならば、本発明の基礎は、本発明のペプチドが、肌表面に存在してコラーゲンの合成を担い、そして肌のきめ細かさや滑らかさを決定付ける繊維芽細胞の増殖を促進するという点にある。本発明のペプチドは、繊維芽細胞の増殖を促進すると同時に、コラーゲンの合成と分泌も促す。その上、本発明に係るペプチドとその誘導体は、肌表面の形成と再生を助ける角化細胞の増殖をも促進するものと思われる。
【００４６】
本発明に係るペプチドは、ＥＧＦ（細胞増殖因子）がウシミルク中で果たす役割と同様のもの役割を、他の生物種で果たすことが明らかになっている。本発明者らは、驚くべきことに、これらペプチドが抗歯周病剤や抗老化剤として有用であり、その効果が既存製品よりも高いことを見出した。本発明に係るペプチドの更なる効果としては、“天然物”（ミルク由来）であるＥＧＦと同等或いはより優れた効果を有しながらも、タンパク質の全構造を有しないことを必須要件としていることからアレルギー原にならないことがある。
【００４７】
更に、本発明は、加齢による肌の変化の緩和効果または予防効果を有する薬剤の製造におけるペプチドまたはペプチド誘導体の使用方法であって、当該ペプチドがα−Ｓ２カゼインフラグメントと同様の活性を有するものである使用方法も提供する。そして当該ペプチドは、α−Ｓ２カゼイン前駆体フラグメントであってもよく、上記で詳述した通り、その相同ペプチドのような同様の活性を有する関連分子であってもよい。
【００４８】
この点に関して、本発明は、歯周病の緩和効果または予防効果を有する薬剤の製造におけるペプチドまたはペプチド誘導体の使用方法であって、当該ペプチドがα−Ｓ２カゼインフラグメントと同様の活性を有するものである使用方法も提供する。そしてこの点に関して、当該ペプチドは、α−Ｓ２カゼイン前駆体フラグメントであってもよく、上記で詳述した通り、その相同ペプチド等、同様の活性を有する関連分子であってもよい。
【００４９】
本発明で使用されるペプチドは、繊維芽細胞の増殖を刺激できるものであることが好ましい。当該ペプチドとしては、繊維芽細胞のコラーゲン産生能を活性化できるものであることも好適である。更に、当該ペプチドは、角化細胞の増殖を刺激できることが好ましい。
【００５０】
更に本発明は、加齢による肌の変化を緩和または予防するための美容方法であって、患者にペプチドによる治療を施す工程を含み、当該ペプチドがα−Ｓ２カゼイン前駆体中に存在するアミノ酸配列を含有し、当該アミノ酸配列が３個以上のアミノ酸を有し、且つ当該アミノ酸配列のＮ−末端側領域が完全なα−Ｓ２カゼイン前駆体のＮ−末端側アミノ酸により構成されていないことを特徴とする美容方法を提供する。当該ペプチドは、上記で詳述した特定のペプチドであることが好ましいが、α−Ｓ２カゼイン前駆体フラグメントであってもよいし、相同ペプチドの様な同様の活性を有する関連分子であってもよい。
【００５１】
更に本発明は、加齢による肌の変化を緩和または予防するための局所投与用組成物であって、ペプチドまたはペプチド誘導体を含有し、当該ペプチドがα−Ｓ２カゼイン前駆体中に存在するアミノ酸配列を含有し、当該アミノ酸配列が３個以上のアミノ酸を有し、且つ当該アミノ酸配列のＮ−末端側領域が完全なα−Ｓ２カゼイン前駆体のＮ−末端側アミノ酸により構成されていないことを特徴とする組成物を提供する。当該ペプチドは、上記で詳述した特定のペプチドであることが好ましいが、α−Ｓ２カゼイン前駆体フラグメントであってもよいし、相同ペプチドの様な同様の活性を有する関連分子であってもよい。
【００５２】
上記に関連して、本発明は、歯周病を緩和または予防するための医薬用組成物であって、ペプチドまたはペプチド誘導体を含有し、当該ペプチドがα−Ｓ２カゼイン前駆体中に存在するアミノ酸配列を含有し、当該アミノ酸配列が３個以上のアミノ酸を有し、且つ該アミノ酸配列のＮ−末端側領域が完全なα−Ｓ２カゼイン前駆体のＮ−末端側アミノ酸により構成されていないことを特徴とする組成物を提供する。繰り返すが、当該ペプチドは、上記で詳述した特定のペプチドであることが好ましいが、α−Ｓ２カゼイン前駆体フラグメントであってもよいし、相同ペプチドの様な同様の活性を有する関連分子であってもよい。
【００５３】
本発明を、あくまで例示であるところの具体例によって、更に詳しく説明する。
【００５４】
【実施例】
（実施例１）チーズホエイ由来の標準天然物の調製
本手法は、チーズホエイから得られる標準天然物（ＳＮＰ）の収集，製造および保存方法を含む。一般的には、本手法は、研究や開発目的に使用される小容量ＳＮＰ調整のために利用されるものである。しかしながら、本手法は、商業目的のため、公知方法によってスケールアップすることも可能である。
【００５５】
（チーズホエイの収集と保存）
浄化した新鮮な約４０Ｌのチーズホエイを、デュウレイチーズ生産工場（ＤｅｗＬａｙ ｃｈｅｅｓｅ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｌａｎｔ）（ガースタング，ランカシャー）より得た。ホエイは、浄化したコンテナに収集し、直ぐにペプシン中央生産工場（Ｐｅｐｓｙｎ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）（リバプール）へ輸送した。
【００５６】
ホエイは、翌日のプロセスに使用するために冷蔵するか、または必要になるまで２Ｌの浅コンテナ中−２０℃で冷凍した。
【００５７】
（チーズホエイの解凍）
２Ｌの冷凍ホエイブロックをプラスチックバッグに入れ、流動温水に浸すことにより解凍した。解凍は１０分以内に完了させ、解凍ホエイは１０℃未満に保温した。
【００５８】
（塩析）
濃塩酸を用いて、ホエイのｐＨを３．０に調整した。ホエイ１Ｌ毎に２２０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４（ＢＤＨ，ＡｎａｌａＲグレード）を３０分以上かけて攪拌しつつゆっくり加えた。１時間３０分以上攪拌しないで平衡させ、次に、事前に４〜１０℃で処理ができる様に平衡させておいたＳｏｒｖａｌｌＲＣ−５Ｂ遠心分離機とＧＳ−３ローター（デュポンインストロメンツ）を使用し、９０００ｒｐｍで４０分間遠心分離した。上澄み１Ｌ毎に１３０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４を加え、前述と同様に平衡させ、遠心分離した。上澄みは廃棄し、ペレットを蒸留水（出発量１Ｌのホエイ毎に４００ｍｌ）に再溶解した。阻止分子量（ＭＷＣＯ）１２，０００〜１４，０００ダルトンのビスキングチューブ（Ｍｅｄｉｃｅｌｌ Ｉｎｔ． Ｌｔｄ，英国）を使用して、流動水道水で一晩、次いでｐＨ６．０の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で７時間、一度緩衝液を交換して透析を行なった。透析によって塩を除いたホエイを収集し、翌日のプロセスで使用するために冷蔵するか、必要になるまで−２０℃で冷凍した。
【００５９】
（陽イオン交換クロマトグラフィー）
透析によって塩を除いたチーズホエイを、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）の移動相を用い、４℃で陽イオン交換クロマトグラフィーに付した。タンパク質は、グラディエントミキサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｍｉｘｅｒ ＧＭ−１）を用いて１００から７００ｍＭまで直線的にグラディエントしたＮａＣｌ溶液を用いて溶出した。溶出の進行状況は、ＵＶモニター（Ｕｖｉｃｏｒｄ Ｓ ＩＩ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて２８０ｎｍでモニターした。
【００６０】
陽イオン交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ５０シリーズ，５０ ｍｍ ｉ．ｄ．）は、ＣＭ５２カルボキシメチル（Ｗｈａｔｍａｎ）を高さ１５ｃｍの高さに詰めて作成した。これを５００ｍｌの緩衝液を用いて平衡させた。透析によって塩を除いたチーズホエイ（４００ｍｌ）を流速２．５ｍｌ／分でカラムにロードし、次いで、流速０．５ｍｌ／分の５００ｍｌの５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液で一晩洗浄した。１００から７００ｍＭまで直線状にグラディエントしたＮａＣｌ緩衝液５００ｍｌを流速２．０ｍｌ／分で流し、２５ｍｌ毎にフラクションとして集め順番に番号を付けた。次に、２ＭのＮａＣｌを含む緩衝液３００ｍｌでカラムを洗浄した。集めたフラクションについて、増殖促進活性を試験した。当該活性は、概してラクトフェリンを含むフラクション番号１１と１２に見られ、その前後にも活性はあった（図１を参照）。ラクトフェリンが存在するとフラクションの色は褐色になることから、色は活性に対する視覚的な指標とすることができる。それぞれのフラクションにおけるＮａＣｌ濃度の概算中間値を表１に示す。全てのフラクションは、次のクロマトグラフィー工程まで冷凍した。
【００６１】
【表１】
2004501976.tif 000017
【００６２】
注）カラムの入口と出口間では、約１００ｍｌの排除体積がある。従って、フラクション１〜４は、溶出緩衝液由来の５０ｍＭ ＮａＣｌである。
【００６３】
（疎水性相互作用クロマトグラフィー）
陽イオン交換クロマトグラフィーで得られた活性を有するフラクションを、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に付した。ＨＩＣは、移動相としてｐＨ６．５の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を使用して室温下で行なった。タンパク質は、グラディエントミキサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｍｉｘｅｒ ＧＭ−１）を用いて４から０Ｍまで直線状にグラディエントしたＮａＣｌ溶液によって溶出した。溶出の進行状況は、ＵＶモニター（Ｕｖｉｃｏｒｄ Ｓ ＩＩ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて２８０ｎｍでモニターした。
【００６４】
ＨＩＣカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｃシリーズ，２６ ｍｍ ｉ．ｄ．）は、ブチルセファロース ４ ファーストフロー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を高さ１５ｃｍの高さに詰めて作成した。これを、流速０．２５ｍｌ／分の４Ｍ ＮａＣｌ緩衝液２５０ｍｌを用い一晩平衡させた。
【００６５】
数回の陽イオン交換クロマトグラフィーによって得られた活性を有するフラクションを合わせ、１００ｍｌと２００ｍｌの試料とした。当該試料のＮａＣｌ濃度の中間値を、各フラクションの概算ＮａＣｌ濃度（表１）より算出した。次に、固形ＮａＣｌを試料にゆっくりと加えてＮａＣｌ濃度を３．７Ｍとし、ｐＨを６．５に調整した。この試料を、流速２．０ｍｌ／分のカラムにロードした。移動相を４から０ＭまでグラディエントしたＮａＣｌ溶液５００ｍｌとし、２５ｍｌ毎にフラクションを集め、順番に番号を付けた。次に、カラムを緩衝液２５０ｍｌと、次いで水２５０ｍｌにより洗浄した。
【００６６】
収集したフラクションについて、増殖促進活性を測定した。当該活性は、概してラクトフェリンを含むフラクション番号１０〜１３に見られ、これらフラクションは、ラクトフェリンを含む褐色のフラクションの直前に溶出したものであった（図２を参照）。活性を有するフラクションを集め、蒸留水によって更に透析し、凍結乾燥した。
【００６７】
（実施例２）ＳＮＰが繊維芽細胞によるコラーゲン合成を促進することの実証  ラマ２７ラット哺乳類細胞（Ｒａｍａ ２７ ｒａｔ ｍａｍｍａｒｙ ｃｅｌｌｓ）を集密培養し、そのコラーゲン合成速度を、Ｍ．Ｊ．ワーバートン，Ｓ．Ａ．ファーンズ，およびＰ．Ｓ．ラドランド，エクスペリメンタル・セル・リサーチ，第１３７巻，第３７３〜３８０頁（１９８２年）（Ｍ．Ｊ．Ｗａｒｂｕｒｔｏｎ， Ｓ．Ａ．Ｆｅｒｎｓ， ａｎｄ Ｐ．Ｓ．Ｒｕｄｌａｎｄ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １３７， ３７３−３８０ （１９８２））の方法によって測定した。［３Ｈ］プロリンがヒドロキシプロリンとして組み込まれる量によって概算したコラーゲンの合成速度を、表２として下に示す。
【００６８】
【表２】
2004501976.tif 000018
【００６９】
０．６ｍｇ／ｍｌのＳＮＰを加えると、分泌コラーゲンは約１２倍に増加した（５４ｃｐｍから６６３ｃｐｍ）。また、合成された分泌コラーゲンは、細胞内に保持されている合成コラーゲンに対して、約２倍に増加した（５４：５３（１：１）から６６３：３２１（２：１））。
【００７０】
（実施例３）ＳＮＰが角化細胞の増殖効果を有することの実証
ヒト角化細胞（ＨａｔＫａｔ）を角化細胞増殖培地中（ＴＣＳ Ｃｅｌｌｗｏｒｋｓ Ｌｔｄ．）で２０％コンフルエントまで培養した。その後、同じ培地中で、０．５％ウシ胎児の血清（ｆｏｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ，ＦＣＳ）を加え、角化細胞を３日間培養し、その時点での細胞数をコールターカウンター（登録商標）を用いて計測した。得られた細胞数を表３として下に示す。
【００７１】
【表３】
2004501976.tif 000019
【００７２】
表３によれば、ＳＮＰを加えることによって、角化細胞の増殖が約３倍になる（２３，７７７から６８，７１９）。これと比較して、１０ｎｍ／ｍｌのＥＧＦの添加では、中間程度の増加結果であった。
【００７３】
これら結果により、本発明に係るペプチドのコラーゲン産生活性と増殖促進活性が明らかにされた。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、透析によって塩が除去されたチーズホエイに対して行なわれた陽イオン交換カラムクロマトグラフィー実験の結果を示す。
【図２】図２は、陽イオン交換クロマトグラフィーによって得られた活性を有するフラクションに対して行なわれた疎水性相互作用クロマトグラフィー実験の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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