(57)【要約】蛍光団／消光団で標識されたオリゴヌクレオチド対でその一方が他方より短い相補的な一対のオリゴヌクレオチド含む核酸検出プローブは、ハイブリダイゼーション反応およびリアルタイム検出における増幅反応における一本鎖標的および二本鎖標的を検出できる。長さの等しい二本鎖プローブは、リアルタイム検出におけるＰＣＲ増幅反応に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の核酸標的配列に対する二本鎖核酸ハイブリダイゼーションプローブであって、
標的核酸に完全に相補的な第１配列を含む第１オリゴヌクレオチド、
第１配列に相補的であって第１配列より短くその差が１０ヌクレオチド長以下である第２配列を含む、第２オリゴヌクレオチド、
第１および第２オリゴヌクレオチドのうちの一方に結合した蛍光団標識、ならびに
消光団および蛍光受容体からなる群より選択される第２標識であって、上記第１および第２オリゴヌクレオチドのうちのもう一方に結合している、オリゴヌクレオチドが互いにハイブリダイズすると上記蛍光団標識と相互作用するもの、
を含む、上記二本鎖プローブ。
【請求項２】
第１および第２オリゴヌクレオチドがハイブリダイズして二本鎖平滑末端を形成し、、蛍光団標識と上記第２標識が該平滑末端に結合していることを特徴とする、請求項１記載の二本鎖プローブ。
【請求項３】
第１および第２オリゴヌクレオチドの３’末端が、ポリメラーゼによる伸長がブロックされていることを特徴とする、請求項１または２記載の二本鎖プローブ。
【請求項４】
第１および第２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方が少なくとも１つの非天然型ヌクレオチドまたは少なくとも１つの非天然型ヌクレオチド結合を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の二本鎖プローブ。
【請求項５】
標的配列に対する二本鎖核酸ハイブリダイゼーションプローブをハイブリダイゼーションプローブとして用いることを含み、該二本鎖核酸ハイブリダイゼーションプローブが、
標的配列に完全に相補的な第１配列を含む第１オリゴヌクレオチド、
第１配列に相補的な第２配列を含む第２オリゴヌクレオチド、
第１および第２オリゴヌクレオチドのうち一方に結合した蛍光団標識、ならびに、
該第１および第２オリゴヌクレオチドのうちの他方に結合した消光団および蛍光受容体からなる群から選択される第２標識であって、オリゴヌクレオチドが互いにハイブリダイズすると上記蛍光団標識と相互作用するもの、
を含むものであることを特徴とする、蛍光標識されたハイブリダイゼーションプローブによって標的アンプリコンが検出されるリアルタイム核酸標的配列増幅検出法。
【請求項６】
上記第１および第２オリゴヌクレオチドがハイブリダイズして二本鎖平滑末端を形成し、蛍光団標識と第２標識が該平滑末端に結合していることを特徴とする、請求項５記載のリアルタイム核酸標的配列増幅検出法。
【請求項７】
上記第１および第２オリゴヌクレオチドの３’末端が、ポリメラーゼによる伸長がブロックされていることを特徴とする、請求項５または６記載のリアルタイム核酸標的配列増幅検出法。
【請求項８】
上記第１および第２オリゴヌクレオチドの少なくとも一方が、少なくとも１つの非天然型ヌクレオチドまたは少なくとも１つの非天然型ヌクレオチド結合を含む、請求項５〜７のいずれか１項記載のリアルタイム核酸標的配列増幅検出法。
【請求項９】
上記第２配列が上記第１配列より短く、その差が１０ヌクレオチド長以下である、請求項５〜８のいずれか１項記載のリアルタイム核酸標的配列増幅検出法。
【請求項１０】
対立遺伝子標的配列それぞれに対するアンプリコンがこれに相補的な蛍光標識されたハイブリダイゼーションプローブによって検出されるリアルタイム核酸標的配列増幅検出法であって、標的配列の少なくとも２つは少なくとも１ヌクレオチド異なる対立遺伝子であり、かつ、各ハイブリダイゼーションプローブがその対立遺伝子標的配列に対する二本鎖核酸ハイブリダイゼーションプローブであり、該二本鎖核酸ハイブリダイゼーションプローブが、
対立標的配列に完全に相補的な第１配列を含む第１オリゴヌクレオチド、
第１配列に相補的な第２配列を含む第２オリゴヌクレオチド、
第１および第２オリゴヌクレオチドのうちの一方に結合した蛍光団標識、
該第１および第２オリゴヌクレオチドのうちのもう一方に結合した消光団であって、オリゴヌクレオチドが互いにハイブリダイズすると上記蛍光団と該消光団とで消光する関係にあるもの、
を含むものであり、
二本鎖プローブの各蛍光団標識が区別して検出されることを特徴とする、リアルタイム核酸標的配列増幅検出法。
【請求項１１】
各二本鎖プローブの第２配列が、該プローブの第１配列より短く、その差が１０ヌクレオチド長以下である、請求項１０記載のリアルタイム核酸標的配列増幅検出法。
【請求項１２】
各プローブの第１および第２ヌクレオチドがハイブリダイズして二本鎖平滑末端を形成し、該平滑末端に蛍光団標識および消光団標識が結合しているものである、請求項１０または１１記載のリアルタイム核酸標的配列増幅検出法。
【請求項１３】
該プローブの第１オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌクレオチドの３’末端が、ポリメラーゼによる伸長がブロックされていることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか１項記載のリアルタイム核酸標的配列増幅検出法。
【請求項１４】
少なくとも１つのプローブの第１および第２のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一方が、少なくとも１つの非天然型ヌクレオチドまたは少なくとも１つの非天然型ヌクレオチド結合を含むものである、請求項１０〜１３のいずれか１項記載のリアルタイム核酸標的配列増幅検出法。
【請求項１５】
標的配列を含むと考えられるサンプルに請求項１〜４のいずれか１項記載のプローブを添加して蛍光の変化を測定することを特徴とする、核酸標的配列を検出するアッセイ方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、同種間での（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）特異的な核酸検出（リアルタイム検出を含む）のための新規プローブに関する。
【０００２】
発明の背景
従来からある異種間での（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）核酸検出法は、ハイブリダイズしたプローブとハイブリダイズしてないプローブとを分離することを要するが、新規同種間での方法は、この分離ステップがなく、より一層迅速、簡単かつ定量的である。種々の核酸増幅技術が開発され、かつ２−３時間のうちに核酸の特定の配列が数百万コピー増幅され得る。しかし、主なゲル電気泳動分析は、臨床診断における広範な適用には限界がある。最近、これらの増幅技術（特にＰＣＲ）と同種間での検出の組み合わせは、核酸に基づく診断を大いに進歩させた。その結果、定量的リアルタイムＰＣＲアッセイが益々汎用されるようになった。
【０００３】
現在のリアルタイム蛍光ＰＣＲアッセイは、プローブ式と非プローブ式とに分類することができる。プローブ式アッセイは、蛍光団プローブ（例えば、５’エキソヌクレアーゼ（ＴａｑＭａｎ（商標））プローブ、分子ビーコン、蛍光エネルギー転移プローブ、スコーピオンプローブ、ライトアッププローブなど）を利用する。非プローブ式アッセイは、反応を示す蛍光色素（例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉなど）を利用する。非プローブ式は、単純であるが、非特異的増幅を識別することができないため適用がかなり制限されることが知られている。比較すると、第２認識ステップを有するプローブ式は、信頼度がより一層高い。しかし、上述のような現存するプローブは全て、設計および合成が難しく、かつ高価である。また、特異性に限界があることも現存するプローブの不利な点である。分子ビーコンは、最も特異性のあるプローブであるといわれているが、それでも、１ヌクレオチドミスマッチを識別するためには修飾を要する場合がある。
【０００４】
本発明は、核酸検出用の同種間での特異的な新規プローブに関する。このプローブは、現存するプローブとは異なる概念に基づいている。設計が単純で、調製が簡単で、低コストで、極めて特異性が高く、かつ最新の核酸増幅技法のいずれとも組合わせることができるものである。
【０００５】
本発明の二本鎖プローブを用いたアッセイは、現存するプローブを用いた場合の直接ハイブリダイゼーションではなくオリゴヌクレオチド間での競合反応に基づく。この新規プローブは、現存するプローブよりかなり単純に得ることができるだけでなく、現存するプローブに対して多くの利点を有している。
【０００６】
発明の概要
本発明は、核酸検出用の特別に設計されたプローブおよび適用に関する。該プローブは、同種間での形式で核酸を特異的に検出できる。プローブは、長さの異なる２つの相補的オリゴヌクレオチドからなっており、これらのうちの一方は蛍光団で、もう一方は消光団または蛍光受容体で標識されている。適切な条件下では、プローブは二本鎖を形成している。プローブの一方の鎖が標的にハイブリダイズすると、蛍光団が蛍光変化を生ずる。ある実施形態では、室温で完全にマッチする標的を特異的に認識することができるが、１塩基ミスマッチを含む「標的」とは反応し得ない。本発明のプローブをリアルタイム核酸増幅検出アッセイに用いることができる。
【０００７】
本発明のプローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれら２つの混合物を含み得る。これらは、非天然型ヌクレオチドおよび非天然型ヌクレオチド結合を含んでよい。３’末端は伸長を避けるためにブロックされていてもよい。プローブの「オリゴヌクレオチド」という用語は、上記のものを含むことを意味する。
【０００８】
本発明は、二本鎖プローブを用いるアッセイにも関する。一本鎖標的のみが存在する本発明のハイブリダイゼーションアッセイは、上記プローブを含む。二本鎖標的が存在するアッセイ（典型的なＰＣＲ増幅など）は、長さの等しい相補的オリゴヌクレオチドを有する二本鎖プローブも含んでよい。
【０００９】
発明の説明
二本鎖プローブの構成
本発明の二本鎖プローブは、長さの異なる相補的な２つのオリゴヌクレオチドからなる。１つの鎖は蛍光団で標識されており、他方の鎖は消光団で標識されている。あまり好ましくない実施形態ではあるが、蛍光消光団を蛍光団の蛍光受容体に置き換えてもよい。二本鎖プローブは、異なる条件下で異なる構造を有し得、かつこれは蛍光変化に反映される。安定な二本鎖構造で自己ハイブリダイズすると、蛍光団と消光団または蛍光エネルギー供与体と受容体は接近する。蛍光団またはエネルギー供与体は、消光団またはエネルギー受容体によって消光され、プローブは蛍光団またはエネルギー供与体の発光波長における蛍光を発しない。酸性、塩基性、または高温溶液中などの変性条件下では、プローブの長い方の鎖が標的に自発的に結合し、プローブの２本鎖は分離され、蛍光団（またはエネルギー供与体）が蛍光を発する。ハイブリダイゼーション溶液中に標的が存在すると、プローブの長い方の鎖が標的に自発的に結合し、二本鎖プローブは解離して、蛍光団（またはエネルギー供与体）が蛍光を発する。
【００１０】
二本鎖プローブと標的との自発的な反応
各鎖の長さが異なる二本鎖プローブは、溶液中で一本鎖オリゴヌクレオチドと自発的に反応することができる。この反応では、二本鎖プローブの短い鎖は、標的オリゴヌクレオチド配列によって置換されて、熱力学的により安定な二重鎖を形成する。その結果、二本鎖プローブの解離が起こり、蛍光が増大する。この反応において、二本鎖プローブが簡単に設計される実施形態は、室温で１ヌクレオチドミスマッチ標的と完全にマッチする標的とを識別できる能力を有する。この極めて高い特異性は、プローブ自体の二本鎖の自己反応に比較すると、ミスマッチの認識はあまりよくないという事実にある。一本鎖プローブは熱力学的に不安定であり、かつミスマッチが存在しても他の一本鎖ポリヌクレオチドとハイブリダイズし得るので、二本鎖プローブの方が一本鎖プローブより優れている。分子ビーコンは、より安定性の低いミスマッチ反応と競合し得ない（ｏｕｔ−ｃｏｍｐｅｔｅ）、安定なステムループ構造のために、直線状のプローブより特異性が高い。しかし、分子ビーコンの認識部分であるループは一本鎖であり、ステムが十分に長くないかまたはループ配列が長すぎる場合、ミスマッチハイブリダイゼーションを起こす可能性がある。これは、分子ビーコンが、周知の等温核酸増幅技術であるＮＡＳＢＡと組合わせて１ヌクレオチドの識別に直接使用できないという最近の報告からも分かる。
【００１１】
図１において、二本鎖プローブ１は、長さの異なる２つの相補的オリゴヌクレオチド２および３からなる。長い方の鎖、図１の場合プラス鎖２は、蛍光団４で標識されており、短い方のマイナス鎖３は消光団５で標識されている。蛍光団と消光団が近接しているためにプローブは蛍光を発しない。標的６が存在すると、マイナス鎖３は標的によって置換され、蛍光団４が離れて蛍光を発する。蛍光団４と消光団５が交換されても、蛍光が得られるであろう。
【００１２】
二本鎖プローブと核酸増幅との組み合わせ
上述のように、本発明の二本鎖プローブは、一本鎖標的と自発的に反応し得る。本発明者らは、リアルタイム形式における新規に形成される一本鎖アンプリコンを用いて検出できることも発見した。高温変性、低温アニーリングおよび中間温度での伸長を含む典型的ＰＣＲサイクルの際、二本鎖プローブを、変性（または解離）ステップの際に変性させて、蛍光を生じさせる。アニーリングステップの際、標的の非存在下で、プローブの２本の鎖は二本鎖立体構造を取り、非蛍光性となるであろう。しかし、標的の存在下で、２つのプローブ鎖は標的とハイブリダイズする。結果として蛍光が生ずる。伸長ステップの際、プローブ鎖は標的を除去する。ＰＣＲ反応の各アニーリングステップの際の蛍光を測定することにより、増幅をリアルタイム形式で追跡することができる。
【００１３】
アニーリングの段階で、このプローブは、標的の非存在下で自己アニーリングを起こし、非蛍光性になることがあり得る。しかし、標的の存在下では、プローブの蛍光標識鎖（ここでは、プラス鎖という）は、マイナス鎖から解離して、標的に結合し、蛍光を生ずる。プライマーの伸長を可能にするために温度を上昇させると（７２℃）、プローブの二本鎖は標的から解離して、鎖の伸長を干渉しない。サイクル毎のアニーリング段階での蛍光強度を測定することにより、リアルタイム形式でのＰＣＲが追跡できる。
【００１４】
図２において、二本鎖プローブ２１および二本鎖アンプリコン３０が示されているが、両方とも中間（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）ＰＣＲサイクルの際にＰＣＲ増幅反応液内に存在する。プローブ２１は、蛍光団２４で標識された鎖２２および消光団２５で標識された相補鎖２３を含む。標識は、鎖の平滑末端にお用いる。示しているように、鎖２２および２３は長さが同じであり、リアルタイムＰＣＲに使用できるが必ず必要なわけではない。アンプリコン３０は、相補鎖３１、３２を含む。高温での変性の際には、プローブの鎖２２、２３は、アンプリコンの鎖３１、３２と同様に分離する。（ＰＣＲプライマーのアニーリングのために）温度をアニーリング温度まで下げると、プローブ鎖２２、２３が、アンプリコンの相補的標的鎖３１、３２にアニールまたはハイブリダイズする。蛍光団２４は、消光団２５によって消光されないので、蛍光を発する。
【００１５】
二本鎖プローブの設計
二本鎖の相対的長さ：多くの場合、プローブの二本鎖は、長さが異なり、通常は、長い方の鎖は、ＰＣＲ用では短い方の鎖より１〜５塩基長く、対立遺伝子の等温識別用では２〜１０、好ましくは２〜７塩基長い。本発明のアッセイにおけるある実施形態では、ＲＮＡ検出に使用される二本鎖プローブまたはリアルタイムＰＣＲに使用される二本鎖プローブのように、標的のプラス鎖およびマイナス鎖の両方が競合してプローブ鎖にハイブリダイズする。これらの鎖は、長さは等しくてよい。
【００１６】
二本鎖プローブの標識の位置：蛍光団および消光団は末端または内部にある塩基上に存在してよい。好ましい実施形態では、これらは二本鎖の向き合った末端相補的塩基上に存在する。特に好ましい実施形態では、蛍光団と消光団の両方とも、プローブの平滑末端部に存在する。場合によっては、特にプローブが蛍光エネルギー転移供与体および受容体で標識されている場合には、標識の部位は、最適エネルギー転移によって調節するとよい。非限定的な好ましい実施形態では、蛍光エネルギー供与体と受容体は、両方の鎖の末端塩基上に標識されており、その一方は、通常、リン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｔｅ）基でブロックされている。
【００１７】
二本鎖プローブの適切な装置：二本鎖プローブは、一般的な核酸増幅（特にＰＣＲ）と組合わせることができ、アンプリコンは、リアルタイム形式またはエンドポイント形式の両方の形式で測定できる。リアルタイム検出には、蛍光をアニーリング温度で測定する。現在利用可能な二本鎖プローブを用いるリアルタイム増幅／検出機器には、例えばＭｏｄｅｌ７７００およびＭｏｄｅｌ５７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ））、ＩＱ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）、およびＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ ２０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）などがある。
【００１８】
二本鎖プローブの利点
単純で簡単な設計：二本鎖プローブを設計するに際して、固有の反応系に対する追加的な要件がない。プローブ自体の設計は、現存する二重色素標識プローブまたは隣接ハイブリダイジングプローブに比べてかなり簡単である。本発明のプローブは、従来のプローブ設計を心得ている当業者であれば誰でも設計できる。
【００１９】
経費効率のよい作成：二本鎖プローブの鎖の作成に含まれる標識方法は、１つの単一の色素修飾のみであり、いかなるＤＮＡ合成機でも達成でき他の技術は必要としない。精製は、１ステップだけでよい。この点は、複数の修飾ステップと精製ステップが必要とされ、最終的な収率が大幅に低下するために経費が嵩むプローブ鎖の他の二重色素修飾またはプローブ鎖の内部修飾より優れている。
【００２０】
高い特異性：構造的に制限されたプローブは、従来の直鎖状プローブより特異性が高いことが分子ビーコンによってすでに証明されている。この点では、二本鎖プローブは、構造的に制限されたプローブの１種である。プローブは、生成される自由エネルギーが二本鎖プローブのものより大きいときにのみ、標的に結合することができる。標的に変異がある場合、二本鎖プローブは、熱力学的に好ましくない反応を起こさないで自体の二本鎖状態を維持する。
【００２１】
実施例１
二本鎖プローブとその標的との自発的な反応
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２含有１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解した０．８０μＭの二本鎖プローブ５０μＬを２５℃に保ち、蛍光をＥｃｌｉｐｓｅスペクトロフルオロメーター（Ｖａｒｉａｎ）で経時的にモニターした。蛍光強度は、２５℃２分でまず測定した。２倍モル濃度（１６μＭ溶液５μＬ）の標的オリゴヌクレオチドを加え、１５秒感覚で蛍光レベルを記録した。２つのプローブ鎖のヌクレオチド配列は５’−ＦＡＭ−ＡＣＧＡＡＣＣＴＣＡＡＡＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴ−３’（長い方の鎖）および５’−ＴＧＴＣＴＧＴＴＴＧＡＧＧＴＴＧＣＴ−ｄａｂｃｙｌ−３’（短い方の鎖）である。長い方の鎖の相補的標的は、５’−ＣＣＡＴＧＧＴＧＴＣＴＧＴＴＴｇＡＧＧＴＴＧＣＴ−３’であり、１ヌクレオチド置換を含む標的（ミスマッチ標的）は、５’−ＣＣＡＴＧＧＴＧＴＣＴＧＴＴＴｃＡＧＧＴＴＧＣＴ−３’（小文字は、ヌクレオチド置換部分）であった。
【００２２】
図３は、完全に相補的な標的（ライン４１）およびミスマッチ標的（ライン４２）の両方に対して経時的に観察した蛍光（Ｆ）を示す。２０倍以上の蛍光が得られたことがわかる。標的内に１ヌクレオチドのミスマッチがあると、蛍光は観察されない。
【００２３】
実施例２
ヒトβ−グロビンの二本鎖プローブとのリアルタイムＰＣＲ検出
ＰＣＲアッセイでリアルタイムアンプリコン検出体としての二本鎖プローブの有用性を調べるために、段階希釈した標的を用いたＰＣＲ増幅を行った。反応溶液５０μＬは、テンプレートを順次希釈した希釈溶液５μＬ、０．２Ｍ二本鎖プローブ、各プライマー０．４μＭ、Ｔａｑポリメラーゼ２．０ユニット、各デオキシリボヌクレオシド三リン酸２００μＭ、５０ｍＭ ＫＣｌ、２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）を含む。密封反応管に入れて蛍光サーマルサイクラー（Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ２０００、Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で９４℃で５分変性させた後、増幅サイクル（９５℃ ３０秒、５０℃ ３０秒、７２℃ １分）を４０回行った。アニーリング段階での蛍光を記録した。元の抽出ヒトＤＮＡを１０倍ずつに段階希釈し、テンプレートとして用いた。コントロールサンプルはテンプレートの代わりに水にした。二本鎖プローブは、標的からなるアンプリコンに相補的な核酸配列を含む。簡略化のためにここでは「標的に相補的である」というが、増幅および検出に精通した当業者は、「標的」という用語が、元の一本鎖標的およびその相補鎖の両方、指数関数的なＰＣＲ増幅においてコピーされた両方の鎖を意味することが理解できよう。ヒトβ−グロビン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ コード番号ＨｕＭＭＢ５Ｅ、−１９５〜＋７３）の２６８塩基対からなる断片を増幅した。フォワードおよびリバースプライマーは、それぞれ５’−ＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＴＡＣ−３’および５’−ＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ−３’とした。プローブの標的配列は、アンプリコンの真中部分に位置するようにした。プローブのプラス鎖およびマイナス鎖は、５’−ＦＡＭ−ＡＧＣＡＡＣＣＴＣＡＡＡＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧＧ−ＰＯ４−３’および５’−ＧＧＴＧＴＣＴＧＴＴＴＧＡＧＧＴＴＧＣＴ−ｄａｂｃｙｌ−３’とした。
【００２４】
４０サイクル以上のＰＣＲ増幅で測定した蛍光（Ｆ）のリアルタイム検出の結果を図４に示す。標的が最高濃度であるライン５１から最低濃度であるライン５４へと最初の標的濃度を段階的に希釈していった。ライン５５は、標的なし（水）のコントロールを示す。
【００２５】
二本鎖プローブは、プライマーと同様の濃度で存在する場合、標的鎖は迅速に反応できる。標的に反応しなかったプローブの画分は、互いに迅速に会合して自らの蛍光を消す。したがって、これらはリアルタイム核酸増幅アッセイに利用できる。ヒトβ−グロビン遺伝子の検出のためのＰＣＲアッセイでは、プライマーの解離温度（Ｔｍ）に近い解離温度を有する２０ヌクレオチドのマイナス鎖を選び、約１０℃高い温度で解離するプローブ標的ハイブリッドを得るために、２４ヌクレオチドのプラス鎖を選んだ。本明細書中では、このプローブを「２４／２０プローブ」という。アニーリング段階では、このプローブは、標的が存在しないと、自己アニーリングを起こし、蛍光を発しない。しかし、標的が存在すると、プローブのプラス鎖は、マイナス鎖から解離して標的に結合し、蛍光を発する。プライマーの伸長が可能な温度（７２℃）まで温度を上昇させると、プローブの２本の鎖は標的から解離して、鎖の伸長を干渉しない。
【００２６】
異なる長さの二本鎖プローブ１１種（２２／２２〜２２／１７、および２０／２０〜２０／１６）について調べたところ、両方の鎖の長さが等しい２つのプローブ両方ともを含む、全てがリアルタイムＰＣＲアッセイで機能した。これらの知見は、リアルタイムＰＣＲに対する二本鎖プローブの設計における柔軟性が大きいことを示す。
【００２７】
実施例３
リアルタイムＰＣＲにおける突然変異検出
リアルタイムＰＣＲによる１ヌクレオチド変異の検出における本発明のプローブの有用性について示すために、ヒトβ−グロビン遺伝子から、互いに１ヌクレオチド置換により相違がある２つのＤＮＡテンプレート（標的）を調製した。また、「野生型」標的に相補的な二本鎖プローブおよび「変異型」標的に相補的な二本鎖プローブを作成した。該プローブは、プローブ−標的ハイブリッドは、典型的なＰＣＲアニーリング温度（約５０℃）より約１０℃高く、かつＴａｑＤＮＡポリメラーゼ伸長反応に好適な温度（約７２℃）より約１０℃低い温度で解離するように設計した。プローブは２４／２０プローブ（２４ヌクレオチド長のプラス鎖と、これより４ヌクレオチド長いマイナス鎖からなるもの）で行った。野生型標的に相補的なプローブをＦＡＭで標識した；変異型標的に相補的なプローブはテキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）で標識した。双方とも、ダブシル（ｄａｂｃｙｌ）消光剤を有している。双方ともプローブの伸長を避けるためブロッキングしておいた。蛍光団それぞれは、発光スペクトルが異なるので、区別して検出することができる。両方の二本鎖プローブの存在下でＰＣＲ反応を４回実施した。これらの反応は、増幅可能は標的が異なるものであった：標的なし（ネガティブ）、野生型標的のみ（野生型）、変異型標的のみ（変異型）、および野生型および変異型標的（野生型＋変異型）。
【００２８】
ヒトβ−グロビン遺伝子の野生型配列に特異的なプローブのプラス鎖は、２４ｍｅｒの配列：
ＦＡＭ−５’−ＡＧＣＡＡＣＣＴｃＡＡＡＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧＧ−３’−ＰＯ３、および
プローブのマイナス鎖は、２０ｍｅｒの配列：
５’−ＡＴＧＧＴＧＴＣＴＧＴＴＴｇＡＧＧＴＴＧＣＴ−３’−ｄａｂｃｙｌとした。
【００２９】
β−グロビンの変異型に特異的なプローブの２つの鎖は、
Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−５’−ＡＧＣＡＡＣＣＴｇＡＡＡＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧＧ−３’−ＰＯ３、および
５’−ＡＴＧＧＴＧＴＣＴＧＴＴＴｃＡＧＧＴＴＧＣＴ−３’−ｄａｂｃｙｌとした。各プローブの２本の鎖を、反応混合液に添加する前に、互いにアニーリングさせた。野生型および変異型のβ−グロビン遺伝子に対応するＤＮＡテンプレートはｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発法により調製した。リアルタイムＰＣＲのプライマーは：
５’−ＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＴＡＣ−３’、および
５’−ＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ−３’とした。反応液５０μｌはそれぞれ、テンプレート５０００コピー、プライマー０．４μＭ、各プローブのプラス鎖０．２μＭおよびマイナス鎖０．２４μＭ、ＭｇＣｌ２ ４．０ｍＭ、ならびにＰＣＲに必要な他の一般的な成分を含むものとした。反応混合物を９４℃で５分インキュベートした後、９５℃３０秒、５０℃６０秒、および７２℃１分の熱サイクルプロファイルを、蛍光サーマルサイクラーにて実施した。アニーリングステップの際の蛍光をモニターした。ＰＣＲサイクル数に対するのリアルタイムの蛍光の結果を図５に示す。野生型標的に対するプローブからの蛍光を黒丸（黒点）で示す。変異型標的に対する蛍光を白丸で示す。
【００３０】
陰性サンプルでは、野生型プローブ（曲線７１）または変異型プローブ（曲線７２）のいずれからも蛍光は得られなかった。その結果から、テンプレートが反応液中に含まれている場合のみ、蛍光が増大することが示された。サンプル中に両方の標的が存在すると、野生型プローブ（曲線７３）および変異型プローブ（曲線７４）の両方から顕著に蛍光が増大していた。しかし、野生型標的では、野生型プローブ（曲線７５）から顕著に蛍光が増大したが変異型プローブ（曲線７６）からの増大はなかった。そして、逆に、変異型標的では、変異型プローブ（曲線７８）から顕著に蛍光が増大したが野生型プローブ（曲線７７）からの増大はなかった。この結果は、マッチプローブのみが正しいシグナルを生成することを示している。野生型テンプレートと変異型テンプレートとの識別は完全（すなわち、１００％）であった。このことは、本発明のプローブは、単一ヌクレオチド相違する標的間の識別が可能であることを証明している。テンプレートがない場合シグナルが全く認められず、２つのテンプレートが存在する場合は、２つのシグナルが認められた。
【００３１】
二本鎖プローブが単一ヌクレオチド変異を識別できる温度「範囲（ｗｉｎｄｏｗ）」を調べた。分子ビーコンは温度範囲が、直鎖条プローブより大きいので、より識別には優れていると文献には記されている。にもかかわらず、分子ビーコンの温度範囲は低温での識別を可能とするには十分ではないことが判っていた。このことは、分子ビーコンが等温での対立遺伝子を識別はできなかったとの報告を説明するものである。本発明の二本鎖プローブはより広い温度範囲を有しているので、等温増幅反応における識別にこれらが適切であることは確実であることが本発明者らにより見出された。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、二本鎖プローブとその作用原理の模式図である。
【図２】
図２は、変性およびアニーリング段階でのＰＣＲ検出における二本鎖プローブの作用原理の模式図である。
【図３】
図３は、完全にマッチする標的および１ヌクレオチドミスマッチ標的と二本鎖プローブとの反応キネティクスを示す。
【図４】
図４は、二本鎖プローブを用いたリアルタイムＰＣＲ検出を示す。上から下に、テンプレートは１０倍ずつの希釈系列であり、最後は水である。
【図５】
図５は、同一の反応容器内で野生型標的に相補的な二本鎖プローブと変異を有する標的に相補的な二本鎖プローブを用いたリアルタイムＰＣＲでの二本鎖プローブによる１ヌクレオチド変異の検出を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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