(57)【要約】本発明は、改変されたＲＮＡポリメラーゼをコードするＲＮＡ配列を含んで成るヒトインフルエンザウイルス、それらの製造方法、前記ヒトインフルエンザウイルスを含んで成る製薬学的組成物、および哺乳動物細胞への遺伝子導入、樹状細胞のような抗原提示細胞へのエクスビボ遺伝子導入、インビボ体細胞遺伝子治療もしくはインビボワクチン接種の目的上のそれらの使用を提供する。本発明はまた、ウマ、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）（ブタ（ｓｗｉｎｅ））インフルエンザウイルスを包含する他の非トリインフルエンザウイルスにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインフルエンザウイルスの野性型ＲＮＡポリメラーゼとＦＰＶ  ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）ＲＮＡポリメラーゼとを区別するアミノ酸残基（１個もしくは複数）の最低１個が、ＦＰＶ  ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）ＲＮＡポリメラーゼ中に存在するところの対応するアミノ酸残基（１個もしくは複数）で置き換えられているために前記ヒトインフルエンザウイルスの野性型ＲＮＡポリメラーゼと異なる、改変されたＲＮＡポリメラーゼをコードするＲＮＡ配列を含んで成る、前記ヒトインフルエンザウイルス。
【請求項２】
タイプＨ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２およびＨ３Ｎ２の株を包含するインフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型ならびにインフルエンザＣ型から選択され、かつ、好ましくは、ＷＳＮ／３３、ＰＲ８／３４などを包含するインフルエンザＡ型タイプＨ１Ｎ１、アジア（Ａｓｉａ）／５７などを包含するインフルエンザＡ型タイプＨ２Ｎ２、もしくはビクトリア（Ｖｉｃｔｏｒｉａ）／６８などを包含するインフルエンザＡ型タイプＨ３Ｎ２である、請求項１記載のインフルエンザウイルス。
【請求項３】
置き換えられるべき最低１個の識別するアミノ酸残基が、該ウイルスのＰＢ１セグメント内に配置される、請求項１もしくは２記載のインフルエンザウイルス。
【請求項４】
配列番号２５に示される野性型ＷＳＮ−ＰＢ１ポリペプチドに関して以下のＰＢ１アミノ酸置換Ｓ３８４Ｐ、Ｌ３９６Ｉ、Ｌ６２８Ｍ、Ｖ６４４Ａ、Ｔ７４１Ａの最低１個もしくは全部が果たされており、好ましくは、使用されるインフルエンザウイルス株が、５個の識別するアミノ酸を運搬するＷＳＮ−Ｋ６８である、請求項３記載のインフルエンザウイルス。
【請求項５】
配列番号２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５もしくは４７に示されるＰＢ１セグメントをコードし、好ましくは、前記インフルエンザウイルスが配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４もしくは４６に示されるヌクレオチド配列に対応するＰＢ１（セグメント２）ＲＮＡ配列を含んで成る、請求項３記載のインフルエンザウイルス。
【請求項６】
改変されたＲＮＡポリメラーゼが、前記野性型ヒトインフルエンザウイルスＲＮＡポリメラーゼに関して転写および／もしくは複製の高められた速度をもたらす改変されたｖＲＮＡプロモーター配列を伴うセグメントの認識が可能である、請求項１ないし５のいずれか１つ記載のインフルエンザウイルス。
【請求項７】
改変されたｖＲＮＡプロモーター配列を含むセグメントが、５個までの位置でのヌクレオチド置換により改変されている末端ウイルスＲＮＡ配列を含有して、ｖＲＮＡプロモーターならびに相補配列中に存在するところのｃＲＮＡプロモーター双方の向上された転写速度をもたらす、請求項６記載のインフルエンザウイルス。
【請求項８】
１２ヌクレオチドの保存されたインフルエンザ３’末端配列が、３’端に関して位置３、５および８の前記配列中に存在する１ないし３ヌクレオチドの他のヌクレオチドによる置換により改変されており、かつ／もしくは１３ヌクレオチドの保存されたインフルエンザ５’末端配列が、位置３および８の前記配列中に存在する１もしくは２ヌクレオチドの他のヌクレオチドによる置換により改変されている、請求項７記載のインフルエンザウイルス。
【請求項９】
３’末端ヌクレオチド配列中の置換が、改変Ｇ３ＡおよびＣ８Ｕ、もしくはＧ３ＣおよびＣ８Ｇを含んで成り、好ましくは、３’末端ヌクレオチド配列中の置換が、改変Ｇ３Ａ、Ｕ５ＣおよびＣ８Ｕ、もしくはＧ３Ｃ、Ｕ５ＣおよびＣ８Ｇを含んで成る、請求項８記載のインフルエンザウイルス。
【請求項１０】
（５’）−ＣＣＵＧＵＵＵＣＵＡＣＵ−３’もしくは（５’）−ＣＣＵＧＵＵＵＵＵＡＣＵ−３’の３’末端ヌクレオチド配列を含んで成る、請求項９記載のインフルエンザウイルス。
【請求項１１】
５’末端ヌクレオチド配列が、５’−ＡＧＡＡＧＡＡＵＣＡＡＧＧの５’末端配列をもたらす改変Ｕ３ＡおよびＡ８Ｕを含んで成る、請求項７ないし１０のいずれか１つ記載のインフルエンザウイルス。
【請求項１２】
好ましくは
（ｉ）正常ウイルスゲノムのＲＮＡセグメントに加え（付加的セグメント）もしくはそれらを部分的に置き換える（置換セグメント）外来の組換えもしくは変えられたウイルス遺伝子配列を含み、それにより該付加的なセグメント（１個もしくは複数）および置換セグメント（１個もしくは複数）がモノシストロニック配置で発現されるべきタンパク質をコードする外来のもしくは変えられた遺伝子を含んで成りかつ請求項７ないし１１で定義されるところの改変されたｖＲＮＡプロモーター配列を有する、１個もしくはそれ以上のセグメント；ならびに／または
（ｉｉ）好ましくはアンビセンスもしくはタンデム配置にあり、それによりバイシストロニックｖＲＮＡセグメント（１個もしくは複数）が、発現されるべきタンパク質（１種もしくは複数）をコードしかつ真正のウイルス遺伝子の１個、好ましくはノイラミニダーゼ遺伝子と共有結合にある外来遺伝子（１個もしくは複数）を有し、かつ、請求項７ないし１１で定義されるところの改変されたｖＲＮＡプロモーター配列を有する、１個もしくはそれ以上のバイシストロニックｖＲＮＡセグメント
を含有する、１個もしくはそれ以上の外来組換えもしくは変えられたウイルスタンパク質の高収量発現に適する、請求項１ないし１１のいずれか１つ記載のインフルエンザウイルス。
【請求項１３】
１個もしくはそれ以上の外来遺伝子または１個もしくはそれ以上の変えられたウイルス遺伝子をコードする最低１個の付加的なセグメントをモノシストロニック配置で有する、請求項１２記載のインフルエンザウイルス。
【請求項１４】
最低１個の付加的セグメントが、インフルエンザのコーディング配列への同じ読み枠での融合連結を伴うもしくは伴わない外来のウイルス、動物、ヒトもしくは他の起源の糖タンパク質をコードし、該糖タンパク質は同時にそれ自身がビリオンのエンベロープ中に組込まれ、好ましくは、ｖＲＮＡおよびタンパク質として組込まれる外来糖タンパク質配列が、接触伝染性豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）、ウシウイルス性下痢性ウイルス（ＢＶＤＶ）、小胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）、マルブルクウイルス、エボラウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ダニ媒介髄膜脳炎ウイルス（ＴＢＥ）、西ナイルウイルスもしくはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のゲノム由来である、請求項１３記載のインフルエンザウイルス。
【請求項１５】
組込まれる外来遺伝子の１種もしくはそれ以上が
（ａ）インフルエンザベクターに感染した細胞により分泌されるヒトもしくは動物起源のリンホカイン、または
（ｂ）一次性に感染した細胞中でもしくは分泌後に近隣の細胞中で有効なアポトーシス誘導遺伝子もしくはトキシン遺伝子の発現
をコードする、請求項１３記載のインフルエンザウイルス。
【請求項１６】
いずれかのヘルパーウイルスの非存在下で遺伝的に安定であり、かつ、アンビセンスＲＮＡ分子（アンビセンスＲＮＡセグメント）であり、かつ全体収束配置でセンスの向きに標準的ウイルス遺伝子の１個およびアンチセンスの向きに外来の組換え遺伝子、もしくはその逆を含有する最低１個のウイルスＲＮＡセグメントを含んで成る、請求項１２記載のインフルエンザウイルス。
【請求項１７】
正規のウイルスＲＮＡセグメントの最低１個が、全体収束配置でセンスの向きに標準的ウイルス遺伝子の１個およびアンチセンスの向きに外来の組換え遺伝子、もしくはその逆を含有するアンビセンスＲＮＡセグメントにより置き換えられる、請求項１６記載のインフルエンザウイルス。
【請求項１８】
アンビセンスＲＮＡ分子中で、前記外来組換え遺伝子がウイルス遺伝子の１個に共有結合される一方、同一遺伝子をコードする元のｖＲＮＡセグメントが、特異的リボザイム切断によって組換えウイルスから欠失されるか、もしくはＲＮＡポリメラーゼＩに促進されるｖＲＮＡ合成プラスミドの組から除外されて感染性ウイルスをもたらすことが可能である、請求項１６もしくは１７記載のインフルエンザウイルス。
【請求項１９】
前記最低１個のアンビセンスＲＮＡセグメントと異なる標準的ウイルスＲＮＡセグメントの１個もしくはそれ以上が、外来遺伝子をコードするｖＲＮＡを含んで成り、好ましくは、正規のウイルスＲＮＡセグメントの１個もしくはそれ以上が、外来遺伝子をコードするｖＲＮＡと交換されており、好ましくは、標準的糖タンパク質ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼの一方もしくは双方が、外来糖タンパク質（１種もしくは複数）、または外来起源（ウイルスもしくは細胞）から得られたヘマグルチニンおよびエクトドメイン由来の固定セグメントよりなる融合糖タンパク質に交換されているか、あるいは、こうした組換え糖タンパク質が、残存する標準的成分に加えて第三の分子種として挿入されている、請求項１６ないし１８のいずれか１つ記載のインフルエンザウイルス。
【請求項２０】
いずれかのヘルパーウイルスの非存在下で遺伝的に安定であり、かつ、タンデム配置で２個の遺伝子をコードするバイシストロニックＲＮＡ分子である最低１個のウイルスＲＮＡセグメント（タンデムＲＮＡセグメント）を含んで成り、前記タンデムＲＮＡセグメント中で、標準的ウイルス遺伝子の１個が外来の組換え遺伝子と共有結合にあり、かつ、前記タンデムＲＮＡセグメントが、近位コーディング領域を取り巻く上流のスプライスドナーおよび下流のスプライスアクセプターシグナルを有する、請求項１２記載のインフルエンザウイルス。
【請求項２１】
タンデムＲＮＡセグメントが、近位位置で外来の組換え遺伝子の後ろの遠位ｍＲＮＡ位置に標準的ウイルス遺伝子の一方を、もしくは逆に、該ウイルス内に存在するところのウイルスＲＮＡに関してアンチセンスの向きで双方を含有する、請求項２０記載のインフルエンザウイルス。
【請求項２２】
正規のウイルスＲＮＡセグメントの最低１個がタンデムＲＮＡセグメントにより置き換えられ、好ましくは、該置き換えられた正規のウイルスＲＮＡセグメントは、ノイラミニダーゼセグメント、ヘマグルチニンセグメントおよびＮＳセグメントから選択される、請求項２０もしくは２１記載のインフルエンザウイルス。
【請求項２３】
スプライスドナーおよびスプライスアクセプターシグナルが、インフルエンザＷＳＮセグメント７および８、もしくは他の部分的に有効なスプライス反応基質中に存在するところの配列から選択され、好ましくは、該スプライスドナーおよびスプライスアクセプターシグナルは、インフルエンザＷＳＮセグメント７中に存在するところの配列から選択される、請求項２０ないし２２のいずれか１つ記載のインフルエンザウイルス。
【請求項２４】
前記最低１個のタンデムＲＮＡセグメントと異なる正規のウイルスＲＮＡセグメントの１個もしくはそれ以上が、該ウイルス遺伝子の１個と共有結合にあってももしくはなくてもよい外来遺伝子をコードするｖＲＮＡを含んで成り、かつ、好ましくは、正規のウイルスＲＮＡセグメントの１個もしくはそれ以上が欠失されそして加えて外来遺伝子をコードするタンデムｖＲＮＡにより置き換えられている、請求項２０ないし２３のいずれか１つ記載のインフルエンザウイルス。
【請求項２５】
タンデムＲＮＡセグメント中の外来遺伝子（１個もしくは複数）が
（ｉ）組換えウイルスに感染した細胞から分泌されるタンパク質および／もしくは糖タンパク質をコードし；
（ｉｉ）Ｂ細胞および／もしくはＴ細胞応答の刺激のための感染した細胞の表面での固有のエピトープの効率的なＨＬＡ制限された提示を支持するよう設計されたタンパク質もしくは人工ポリペプチドをコードし；
（ｉｉｉ）ウイルスの弱毒化を引き起こすヌクレオチド配列であり、好ましくは、該外来遺伝子が、挿入されたリボザイム配列を伴いもしくは伴わずに逆（すなわちセンスの向き）でウイルスノイラミニダーゼ遺伝子の一部をコードし、
好ましくは、センスの向きのノイラミニダーゼ遺伝子のタンデムセグメント部分がヘマグルチニンｖＲＮＡセグメントに結合され、また、場合によっては、別の遺伝子もしくはレポーター遺伝子が第二のタンデムＲＮＡ中で好ましくはＮＳ２とともにコードされる、
請求項２０ないし２４のいずれか１つ記載のインフルエンザウイルス。
【請求項２６】
非インフルエンザ遺伝子または合成遺伝子、あるいは限定されるものでないがアンチセンス遺伝子もしくはリボザイムを挙げることができる遺伝子阻害配列の発現に適し、それにより
（ｉ）非インフルエンザ遺伝子がウイルス遺伝子の１個に共有結合され、
（ｉｉ）非インフルエンザ遺伝子が、外来のエクトドメイン配列とのウイルスＨＡ膜貫通および細胞質領域の融合よりなる膜糖タンパク質を構成する、
請求項１６ないし２５のいずれか１つ記載のインフルエンザウイルス。
【請求項２７】
非トリ、非ヒトインフルエンザウイルスの野性型ＲＮＡポリメラーゼをＦＰＶ  ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）ＲＮＡポリメラーゼと識別するアミノ酸残基（１個もしくは複数）の最低１個が、ＦＰＶ  ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）ＲＮＡポリメラーゼ中に存在するところの対応するアミノ酸残基（１個もしくは複数）で置き換えられているために前記非トリ非ヒトインフルエンザウイルスの野性型ＲＮＡポリメラーゼと異なる改変されたＲＮＡポリメラーゼをコードするＲＮＡ配列を含んで成り、好ましくは請求項２ないし２６のいずれか１つで定義される、前記非トリ、非ヒトインフルエンザウイルス、好ましくはウマもしくはブタインフルエンザウイルス。
【請求項２８】
前記インフルエンザウイルスの野性型ＲＮＡポリメラーゼをコードするＲＮＡ配列を、改変されたＲＮＡポリメラーゼをコードするＲＮＡ配列で置き換えることを含んで成る、請求項１ないし２７記載のインフルエンザウイルスの製造方法。
【請求項２９】
請求項１ないし１１および２７で定義されるところのＰＢ１キメラウイルス、ならびに請求項１２ないし２７で定義されるところの組換えウイルスを製造するのに適し、前記ウイルスは、それらがＲＮＡポリメラーゼＩおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩ双方によりインビボで転写されかつプラスミド挿入物の設計に従って子孫ウイルスを共同で生じさせるような方法で、ウイルスｃＤＮＡもしくは代わりにキメラ（セグメント２：ＰＢ１）およびバイシストロニック組換え（セグメント６：ＮＡ／外来遺伝子）ｃＤＮＡ配列を含有する８種までのｃＤＮＡプラスミドのコトランスフェクションを介して生成される、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
請求項１ないし２７のいずれか１つ記載のインフルエンザウイルスを含んで成る製薬学的組成物。
【請求項３１】
（ｉ）組換えウイルス感染による細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞への遺伝子導入；
（ｉｉ）抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞への遺伝子導入、およびエクスビボ免疫療法のための得られた生成物の使用；
（ｉｉｉ）インビボ体細胞遺伝子治療；
（ｉｖ）治療的および予防的ワクチン接種を包含するインビボワクチン接種；
（ｖ）Ｔ細胞応答の誘導を包含する免疫応答の導出；
（ｖｉ）成長する腫瘍もしくは慢性感染性疾患の治療
に適する、請求項３０記載の製薬学的組成物。
【請求項３２】
（ｉ）ウイルス感染による細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞への遺伝子導入のため；
（ｉｉ）抗原提示細胞への遺伝子導入、およびエクスビボ免疫療法のための得られた生成物の使用のため；
（ｉｉｉ）インビボ体細胞遺伝子治療のため；
（ｉｖ）治療的および予防的ワクチン接種を包含するインビボワクチン接種のため；
（ｖ）Ｔ細胞応答の誘導を包含する免疫応答を導き出すため；
（ｖｉ）成長する腫瘍もしくは慢性感染性疾患を治療するため
の作用物質を製造するための、請求項１ないし２７のいずれか１つ記載のインフルエンザウイルスの使用。
【請求項３３】
細胞、抗原提示細胞、ワクチン接種、インフルエンザ治療もしくは体細胞遺伝子治療の必要な人もしくは患者、または細胞培養物を、請求項１ないし２７のいずれか１つ記載のインフルエンザウイルスと接触させることを含んで成る、
（ｉ）ウイルス感染による細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞への遺伝子導入；
（ｉｉ）抗原提示細胞への遺伝子導入、およびエクスビボ免疫療法のための得られた生成物の使用；
（ｉｉｉ）インビボ体細胞遺伝子治療；
（ｉｖ）治療的および予防的ワクチン接種を包含するインビボワクチン接種；
（ｖ）Ｔ細胞応答、好ましくはＣＤ４＋  Ｔ細胞応答、ＣＤ８  Ｔ細胞応答もしくはその双方の誘導、または抗体応答の誘導を包含する免疫応答の導出；
（ｖｉ）成長する腫瘍もしくは慢性感染性疾患の治療；
（ｖｉｉ）ワクチンの製造；
（ｖｉｉｉ）インフルエンザの予防および／もしくは治療
の方法。
【請求項３４】
発現ベクターとして請求項１ないし２７記載のインフルエンザウイルスを利用することを含んで成り、好ましくは、細胞培養物細胞もしくはニワトリ受精卵中で実施される、タンパク質もしくは糖タンパク質の製造方法。
【請求項３５】
（ｉ）こうしたウイルスにより感染した細胞への外来遺伝子の導入および発現のため、あるいは
（ｉｉ）こうしたウイルスにより感染した細胞中へＲＮＡ分子の導入および発現のためであって、好ましくは、発現されるべきＲＮＡ分子は、標的細胞の細胞性ｍＲＮＡ分子に関してアンチセンス配列もしくは二本鎖配列であり、かつ／または、好ましくはアンチセンスＲＮＡもしくは標的ＲＮＡのリボザイム切断のようなＲＮＡ妨害機構による配列特異的遺伝子不活性化に適する、
の作用物質の製造のための、請求項１ないし２７記載のインフルエンザウイルスの使用。
【請求項３６】
細胞を請求項１ないし２７記載のインフルエンザウイルスに感染させることを含んで成る、細胞への外来遺伝子の導入および発現方法、ならびに細胞へのＲＮＡ分子の導入および発現方法。
【請求項３７】
免疫療法、好ましくは自己免疫療法のための作用物質を製造するための、請求項１ないし２７記載のインフルエンザウイルスの使用。
【請求項３８】
請求項１ないし２７記載のインフルエンザウイルスでの免疫細胞、好ましくは樹状細胞のエクスビボ感染、および患者への形質導入された細胞の導入を含んで成る、免疫治療方法。
【請求項３９】
請求項１ないし２７で定義されるところのインフルエンザウイルス、好ましくは請求項１ないし２６で定義されるところのヒトインフルエンザウイルスを細胞に導入すること、もしくはそれを哺乳動物に投与すること（ここで、前記インフルエンザウイルスは抗原をコードする最低１個の外来遺伝子を含有する）の段階を含んで成る、抗原に対し向けられる免疫応答の導出方法。
【請求項４０】
抗原をコードする前記外来遺伝子が、疾患、好ましくは感染性疾患、もしくは腫瘍性疾患と関連するポリヌクレオチド配列であり、好ましくは、該抗原は、限定されるものでないが
（ｉ）ＨＩＶ抗原ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｒｅｖ、ｔａｔ、ＮＣ、ＨＢＶ  ｅ−抗原もしくはコア抗原、ＨＰＶ  Ｅ６もしくはＥ７抗原、単純疱疹ウイルス糖タンパク質もしくはコアタンパク質、他のヘルペスウイルス抗原のようなウイルス関連抗原、ならびに当業者に既知のさらなるウイルスおよび微生物抗原、または
（ｉｉ）腫瘍関連抗原、とりわけ、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥおよびＧＡＧＥファミリーの抗原、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原、ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０により例示されるＳＳＸ抗原により例示されるいわゆる癌精巣抗原
を挙げることができる、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
ポリヌクレオチド配列が、
（ｉ）腫瘍細胞、もしくは精巣細胞、もしくはウイルスに感染した細胞、もしくは微生物に感染した細胞もしくは細胞系から単離されたｃＤＮＡライブラリーから派生可能である、
（ｉｉ）ウイルスもしくは他の病原体、または腫瘍関連抗原中に存在するところの１個もしくはそれ以上のＴ細胞特異的エピトープ配列由来のエピトープよりなる融合タンパク質である、
請求項３９もしくは４０記載の方法。
【請求項４２】
（ａ）請求項１ないし２６もしくは請求項３９ないし４１で定義されるところのヒトインフルエンザウイルスを含んで成るヒトインフルエンザウイルスワクチン（好ましくは、前記ヒトインフルエンザウイルスは膜タンパク質の抗原をコードし、かつ、加えて、ウイルスエンベロープ中に膜タンパク質を含有する）；または
（ｂ）請求項２７で定義されるところのウイルスを含んで成る非ヒトインフルエンザウイルスワクチン、好ましくはウマもしくはブタインフルエンザウイルスワクチン
である、治療もしくは予防目的上のワクチン。
【請求項４３】
ウイルスが
（ｉ）タンデム弱毒化機構に従って弱毒化されることが可能である；
（ｉｉ）制限された複製のみが可能である；もしくは
（ｉｉｉ）不活性化ウイルスである、
請求項４２記載のワクチン。
【請求項４４】
請求項３３の選択肢（ｉ）もしくは（ｉｉ）の方法により得ることが可能な形質導入された細胞、好ましくは抗原提示細胞。
【請求項４５】
好ましくは形質導入された抗原提示細胞、より好ましくは形質導入された樹状細胞、および最も好ましくは成熟樹状細胞を含んで成り、前記抗原提示細胞はインビトロで形質導入される、請求項４４で定義されるところの形質導入された細胞を含んで成るワクチン。
【請求項４６】
（ａ）試験されるべき細胞もしくは微生物から遺伝子バンクもしくはｃＤＮＡバンクを調製すること；
（ｂ）遺伝子バンクのｃＤＮＡもしくはＤＮＡを、請求項１ないし２７で定義されるところのインフルエンザウイルスのゲノム中に組込んで組換えウイルス粒子を生じさせること、
（ｃ）それらの表面上でのＨＬＡ−クラスＩ分子および／もしくはＨＬＡ−クラスＩＩ分子の発現が可能である不死化自己細胞を、段階（ｂ）で得られた組換えウイルス粒子に感染させること、
（ｄ）自己細胞中で遺伝子バンクの前記ｃＤＮＡもしくは前記ＤＮＡによりコードされるタンパク質を発現させること、および、自己細胞により産生されたタンパク質もしくは細胞表面のフラグメントをＨＬＡ分子とともに提示させること；
（ｅ）Ｔ細胞を自己細胞とともに共培養すること；ならびに
（ｆ）それらの表面上に抗原を提示するこうした自己細胞によりＴ細胞を刺激して、それにより前記抗原がＴ細胞により認識されること
の段階を含んで成る、最低１個のＨＬＡ制限されたエピトープをコードするポリヌクレオチド配列の同定方法。
【請求項４７】
請求項４６の段階（ａ）ないし（ｆ）を含んで成る、抗原提示細胞における遺伝子機能の研究方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変されたＲＮＡポリメラーゼをコードするＲＮＡ配列を含んで成るヒトインフルエンザウイルス、それらの製造方法、前記ヒトインフルエンザウイルスを含んで成る製薬学的組成物、および、哺乳動物細胞への遺伝子導入、インビボ体細胞遺伝子治療もしくはインビボワクチン接種の目的上の樹状細胞のような抗原提示細胞へのエクスビボ遺伝子導入のためのそれらの使用を提供する。本発明はまた、ウマ、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）（ブタ（ｓｗｉｎｅ））インフルエンザウイルスを包含する他の非トリインフルエンザウイルスにも関する。
【背景技術】
【０００２】
３種のウイルスポリメラーゼ（Ｐ）サブユニットＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡより構成されるインフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、感染した細胞中のウイルスｍＲＮＡ（転写）ならびに相補ＲＮＡおよび子孫ウイルスＲＮＡ（複製）双方の合成を触媒する（非特許文献１）。ビリオン中で、該酵素は、それらの５’および３’端で８個の異なる種のウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）のそれぞれと強固に会合されて見出され、それは共同してプロモーター構造を構成する一方、該ｖＲＮＡ分子の全部の他の部分は、平均して２４ヌクレオチドあたり１個の多数のインフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）分子により覆われ（非特許文献２）、全部一緒にウイルスＲＮＰ複合体と記述される。感染に際して、ｖＲＮＰがビリオンから放出されそして感染した細胞の核に導入され、そこでウイルスｍＲＮＡ合成が、キャップ付加反応スキームに従ったプロモーター関連酵素により、すなわち、エンドヌクレオ分解切断（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ）による細胞ｍＲＮＡもしくはｈｎＲＮＡ由来であるプライマーオリゴヌクレオチドを使用することにより、開始される（非特許文献３）。ｖＲＮＡ鋳型分子に沿ったｍＲＮＡ合成の進行の間に、その３’端はウイルスポリメラーゼへの接触をゆるめる一方、該酵素は、第一回目および全部の連続する回の転写全体を通じて、５’ｖＲＮＡ端とのその強固な会合を維持する。ｍＲＮＡ分子の合成は、５’プロモーター配列に隣接する一連の５もしくは６個のウリジン鋳型残基でのポリアデニル酸化を介して終了される。すなわち、該酵素により覆われるまさしく５’末端配列は、ウイルスｍＲＮＡに転写されない。
【０００３】
ウイルスポリメラーゼとのその会合におけるｖＲＮＡプロモーター配列のコンホメーションは、プロモーター配列の５’および３’双方の分枝中の２個の鎖内塩基対により支持される露出された一本鎖の４ヌクレオチド配列を伴う「コルク栓抜き様（ｃｏｒｋｓｃｒｅｗ）」構造を構成することが、逆遺伝子分析（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ）により立証されている。その分析の経過中に、末端ｖＲＮＡ配列のいくつかのプロモーター上昇変異体（ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｕｐ  ｖａｒｉａｎｔｓ）もまた、主として、３’端からの位置３および８、ならびに５’端からの位置３および８を必要とする塩基対交換により記述されている（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；特許文献１）。野性型プロモーターが生じる２０倍までのレポーター遺伝子もしくは他の外来遺伝子発現の典型的な増大を伴い、こうしたインフルエンザウイルスベクターはまた、標準的サイトメガロウイルス初期プロモーター（ＰＣＭＶ）の制御下のプラスミドＤＮＡで達成される発現レベルより４ないし５倍上の範囲にわたる。
【０００４】
しかしながら、この効果に対する２つの制限が存在する。すなわち、１．）発現効率における野性型プロモーターレベルの２０倍の利得は、インフルエンザプロモーター上昇変異体の制御下の大きさが１５００ヌクレオチドまでの挿入物について真実である一方、３０００ヌクレオチドまでの挿入物の大きさでのさらなる増大は、プロモーター効率のその利得を定常的に低下させることができ、そして長さが４０００ヌクレオチドの挿入物では低い発現速度のみが達成された（非特許文献７）。２．）こうした増大された発現速度は、トリインフルエンザウイルス（ニワトリペストウイルス、ＦＰＶ：Ｈ７Ｎ７）、もしくはむしろＦＰＶ由来のウイルスポリメラーゼがプロモーター上昇配列変異体と一緒に使用される限りにのみ得られ；こうした効果は試験された他のインフルエンザウイルス株すなわちＰＲ／８もしくはＷＳＮ（Ｈ１Ｎ１）；アジア（Ａｓｉａ）（Ｈ２Ｎ２）またはビクトリア（Ｖｉｃｔｏｒｉａ）（Ｈ３Ｎ２）で見られていない（非特許文献８）。
【０００５】
従って、ヒト細胞もしくは器官において外来遺伝子に対し発揮されるそれらの生物工学的に価値のある増大された発現速度の応用に必要とされるものは、こうしたプロモーター配列の変動を認識することにおけるＦＰＶ  ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）ポリメラーゼの特性の、ヒト組織中で効率的に複製することが可能な他のインフルエンザウイルスのそれぞれのポリメラーゼコーディング配列への導入である。加えて、ＦＰＶの代わりにＨ１Ｎ１（ＷＳＮ；ＰＲ／８）もしくはＨ３Ｎ２（ビクトリア（Ｖｉｃｔｏｒｉａ）もしくは他者）ウイルス変異体の使用は、可能な場合は生物学的安全性における利得を構成するとみられる。Ｈ１およびＨ３ヘマグルチニンを運搬するウイルスのアミノ酸配列により、これらは、多数の付加的な遍在するタンパク質分解酵素による切断によってもまた活性化されたようになるヘマグルチニンＨ７に反して、狭いスペクトルのプロテアーゼによる切断によってのみ感染について活性化されたようになる。
【特許文献１】
国際特許出願第ＷＯ９６／１０６４１号明細書
【非特許文献１】
Ｌａｍｂ  Ｒ．Ａ．，Ｋｒｕｇ  Ｒ．Ｍ．Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３：ｐｐ  １３５３−１４４５（１９９６）
【非特許文献２】
Ｏｒｔｅｇａ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，１５６−１６３（２０００）
【非特許文献３】
Ｋｒｕｇ  Ｒ．Ｍ．ら，Ｔｈｅ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，プレナム  プレス（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州ニューヨーク、ｐｐ．１−８７（１９８９）
【非特許文献４】
Ｎｅｕｍａｎｎ  Ｇ．，Ｈｏｂｏｍ  Ｇ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．７６（＜ｐｔ  ７）：１７０９−１７（１９９５）
【非特許文献５】
Ｆｌｉｃｋ  Ｒ．ら，ＲＮＡ，２（１０）：１０４６−５７（１９９６）
【非特許文献６】
Ｆｌｉｃｋ  Ｒ．，Ｈｏｂｏｍ  Ｇ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．８０（Ｐｔ  １０）：２５６５−７２（１９９９）
【非特許文献７】
Ｍ．Ａｚｚｅｈ，Ｇ．Ｈｏｂｏｍ，未発表
【非特許文献８】
Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｅ．，Ｈｏｂｏｍ  Ｇ．，未発表データ
【発明の開示】
【０００６】
ＦＰＶ  ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）ＲＮＡポリメラーゼとのより高い類似性を有するポリペプチド鎖をコードするように、ＲＮＡポリメラーゼ、とりわけそのＰＢ１サブユニットをコードするそれぞれのウイルス内のＲＮＡ配列の特定の改変が、転写および／もしくは複製の開始速度の増大につながるｖＲＮＡおよびｃＲＮＡプロモーター配列の変動の認識が可能なウイルス（上で挙げられたいわゆるプロモーター上昇変異体）を提供することが見出された。本発明は、従って、
（１）ヒトインフルエンザウイルスの野性型ＲＮＡポリメラーゼとＦＰＶ  ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）ＲＮＡポリメラーゼとを区別（ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ）するアミノ酸残基（１個もしくは複数）の最低１個が、ＦＰＶ  ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）ＲＮＡポリメラーゼのそれぞれのアミノ酸残基で置き換えられている点で前記ヒトインフルエンザウイルスの野性型ＲＮＡポリメラーゼと異なる、改変されたＲＮＡポリメラーゼをコードするＲＮＡ配列を含んで成る前記ヒトインフルエンザウイルス（「ＦＰＶ  ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）」および「ＦＰＶ  ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）ＲＮＡポリメラーゼ」は、それぞれ下で短く「ＦＰＶ」および「ＦＰＶ  ＲＮＡポリメラーゼ」ともまた称される）；
（２）上の（１）で定義されるインフルエンザウイルスの好ましい一態様において、改変されたＲＮＡポリメラーゼは、前記野性型ヒトインフルエンザウイルスＲＮＡポリメラーゼに関して転写および／もしくは複製の高められた速度をもたらす、改変されたｖＲＮＡプロモーター配列を伴うセグメントの認識が可能であり；
（３）上の（２）で定義されるインフルエンザウイルスの好ましい一態様において、インフルエンザウイルスは、１個もしくはそれ以上の外来組換えもしくは変えられたウイルスタンパク質の高収量発現に適し、好ましくは、前記インフルエンザウイルスは
（ｉ）正常ウイルスゲノムのＲＮＡセグメントに加え（付加的（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ）セグメント）もしくはそれらを部分的に置き換える（下で「置換セグメント」）外来の組換えもしくは変えられたウイルス遺伝子配列を含み、それにより該付加的なセグメント（１個もしくは複数）および置換セグメント（１個もしくは複数）がモノシストロニック配置で発現されるべきタンパク質をコードする外来のもしくは変えられた遺伝子を含んで成りかつ上の（２）で定義されるところの改変されたｖＲＮＡプロモーター配列を有する、１個もしくはそれ以上のセグメント；ならびに／または
（ｉｉ）好ましくはアンビセンスのもしくはタンデム配置にあり、それによりバイシストロニックｖＲＮＡセグメント（１個もしくは複数）が、発現されるべきタンパク質（１種もしくは複数）をコードしかつ真正のウイルス遺伝子の１個、好ましくはノイラミニダーゼ遺伝子と共有結合にある外来遺伝子（１個もしくは複数）を有し、かつ、上の（２）で定義されるところの改変されたｖＲＮＡプロモーター配列を有する、１個もしくはそれ以上のバイシストロニックｖＲＮＡセグメント
を含有し；
（４）上の（３）で定義されるインフルエンザウイルスの好ましい一態様において、インフルエンザウイルスはモノシストロニック配置に１個もしくはそれ以上の外来の（もしくは変えられた適正な）遺伝子をコードする最低１個のセグメントを有し；
（５）上の（３）で定義されるインフルエンザウイルスの好ましい一態様において、インフルエンザウイルスは、いずれかのヘルパーウイルスの非存在下で遺伝的に安定（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｓｔａｂｌｅ）であり、かつ、アンビセンスＲＮＡ分子（下で「アンビセンスＲＮＡセグメント」）でありかつ全体収束配置（ｏｖｅｒａｌｌ  ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ  ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）でセンスの向きに標準的ウイルス遺伝子の１個およびアンチセンスの向きに外来の組換え遺伝子、もしくはその逆を含有する最低１個のウイルスＲＮＡセグメントを含んで成り；
（６）上の（３）で定義されるインフルエンザウイルスの好ましい一態様において、インフルエンザウイルスは、いずれかのヘルパーウイルスの非存在下で遺伝的に安定であり、かつ、タンデム配置で２個の遺伝子をコードするバイシストロニックＲＮＡ分子である最低１個のウイルスＲＮＡセグメント（下で「タンデムＲＮＡセグメント」）を含んで成り、前記タンデムＲＮＡセグメント中で、標準的ウイルス遺伝子の１個が外来の組換え遺伝子と共有結合にあり、かつ、前記タンデムＲＮＡセグメントが、近位（ｐｒｏｘｉｍａｌ）コーディング領域を取り巻く上流のスプライスドナーおよび下流のスプライスアクセプターシグナルを有し；
（７）非トリ非ヒトインフルエンザウイルスの野性型ＲＮＡポリメラーゼをＦＰＶ  ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）ＲＮＡポリメラーゼと識別するアミノ酸残基（１個もしくは複数）の最低１個が、ＦＰＶ  ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）ＲＮＡポリメラーゼ中に存在するところの対応するアミノ酸残基（１個もしくは複数）で置き換えられているために前記非トリ非ヒトインフルエンザウイルスの野性型ＲＮＡポリメラーゼと異なる改変されたＲＮＡポリメラーゼをコードするＲＮＡ配列を含んで成る、前記非トリ、非ヒトインフルエンザウイルス、好ましくはウマもしくはブタインフルエンザウイルスであって、好ましくは、前記インフルエンザウイルスは上の（２）ないし（６）で定義されるとおりであり；
（８）前記インフルエンザウイルスの野性型ＲＮＡポリメラーゼをコードするＲＮＡ配列を、改変されたＲＮＡポリメラーゼをコードするＲＮＡ配列で置き換えることを含んで成る、上の（１）ないし（７）で定義されるところのインフルエンザウイルスの製造方法；
（９）上の（８）で定義される方法の好ましい一態様において、該方法は、上の（１）および（２）で定義されるところのＰＢ１キメラウイルス、ならびに上の（１）ないし（７）で定義されるところの組換えウイルスを製造するのに適し、前記ウイルスは、それらがＲＮＡポリメラーゼＩおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩ双方によりインビボで転写されかつプラスミド挿入物の設計に従って子孫ウイルスを共同で生じさせるような方法で、ウイルスｃＤＮＡもしくは代わりにキメラ（セグメント２：ＰＢ１）およびバイシストロニック組換え（セグメント６：ＮＡ／外来遺伝子）ｃＤＮＡ配列を含有する８種までのｃＤＮＡプラスミドのコトランスフェクションを介して生成され；
（１０）上の（１）ないし（７）で定義されるところのインフルエンザウイルスを含んで成る製薬学的組成物；
（１１）（ｉ）ウイルス感染による細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞への遺伝子導入のため；
（ｉｉ）抗原提示細胞への遺伝子導入、およびエクスビボ免疫療法のための得られた生成物の使用のため；
（ｉｉｉ）インビボ体細胞遺伝子治療のため；
（ｉｖ）治療的および予防的ワクチン接種を包含するインビボワクチン接種のため；
（ｖ）Ｔ細胞応答の誘導を包含する免疫応答を導き出すため；
（ｖｉ）成長する腫瘍もしくは慢性感染性疾患を治療するため
の作用物質を製造するための上の（１）ないし（７）で定義されるところのインフルエンザウイルスの使用；
（１２）細胞、抗原提示細胞、ワクチン接種、インフルエンザ治療もしくは体細胞遺伝子治療の必要な人もしくは患者、または細胞培養物を、上の（１）ないし（７）で定義されるところのインフルエンザウイルスと接触させることを含んで成る、
（ｉ）ウイルス感染による細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞への遺伝子導入；
（ｉｉ）抗原提示細胞への遺伝子導入、およびエクスビボ免疫療法のための得られた生成物の使用；
（ｉｉｉ）インビボ体細胞遺伝子治療；
（ｉｖ）治療的および予防的ワクチン接種を包含するインビボワクチン接種；
（ｖ）Ｔ細胞応答、好ましくはＣＤ４＋  Ｔ細胞応答、ＣＤ８  Ｔ細胞応答もしくはその双方の誘導、または抗体応答の誘導を包含する免疫応答の導出；
（ｖｉ）成長する腫瘍もしくは慢性感染性疾患の治療；
（ｖｉｉ）ワクチンの製造；
（ｖｉｉｉ）インフルエンザの予防および／もしくは治療
の方法；
（１３）発現ベクターとして上の（１）ないし（７）で定義されるところのインフルエンザウイルスを利用することを含んで成る、タンパク質もしくは糖タンパク質の製造方法；
（１４）（ｉ）こうしたウイルスにより感染した細胞への外来遺伝子の導入および発現のため、あるいは
（ｉｉ）こうしたウイルスにより感染した細胞へのＲＮＡ分子の導入および発現のためであって、好ましくは、発現されるべきＲＮＡ分子は標的細胞の細胞性ｍＲＮＡ分子に関してアンチセンス配列もしくは二本鎖配列であり、かつ／または、作用物質は、好ましくはアンチセンスＲＮＡもしくは標的ＲＮＡのリボザイム切断のようなＲＮＡ妨害機構による配列特異的遺伝子不活性化（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）に適する、
の作用物質の製造のための、上の（１）ないし（７）で定義されるところのインフルエンザウイルスの使用；
（１５）細胞への外来遺伝子の導入および発現方法、ならびに細胞へのＲＮＡ分子の導入および発現方法であって、この方法は、細胞を上の（１）ないし（７）で定義されるところのインフルエンザウイルスに感染させることを含んで成り；
（１６）免疫療法、好ましくは自己免疫療法のための薬剤を製造するための、上の（１）ないし（７）で定義されるところのインフルエンザウイルスの使用；
（１７）上の（１）ないし（７）で定義されるところのインフルエンザウイルスでの免疫細胞、好ましくは樹状細胞のエクスビボ感染、および患者への形質導入された細胞の導入を含んで成る免疫治療方法；
（１８）上の（１）ないし（７）で定義されるところのインフルエンザウイルス、好ましくは上の（１）ないし（６）で定義されるところのヒトインフルエンザウイルスを細胞に導入すること、もしくはそれを哺乳動物に投与することの段階を含んで成る、抗原に対し向けられた免疫応答の導出方法であって、ここで、前記インフルエンザウイルスは抗原をコードする最低１個の外来遺伝子を含有し；
（１９）（ａ）上の（１）ないし（６）もしくは上の（１８）で定義されるところのヒトインフルエンザウイルスを含んで成るヒトインフルエンザウイルスワクチンであって、好ましくは、前記ヒトインフルエンザウイルスは膜タンパク質の抗原をコードし、かつ、加えて、ウイルスエンベロープ中に膜タンパク質を含有するか；または
（ｂ）上の（７）で定義されるところのウイルスを含んで成る非ヒトインフルエンザウイルスワクチン、好ましくはウマもしくはブタインフルエンザウイルスワクチン
である、治療もしくは予防目的上のワクチン；
（２０）上の（１２）の選択肢（ｉ）もしくは（ｉｉ）に記述される方法により得ることが可能な形質導入された細胞、好ましくは抗原提示細胞；
（２１）好ましくは形質導入された抗原提示細胞、より好ましくは形質導入された樹状細胞、および最も好ましくは成熟樹状細胞を含んで成り、前記抗原提示細胞はインビトロで形質導入される、上の（２０）で定義されるところの形質導入された細胞を含んで成るワクチン；ならびに
（２２）（ａ）試験されるべき細胞もしくは微生物から遺伝子バンクもしくはｃＤＮＡバンクを調製すること；
（ｂ）遺伝子バンクのｃＤＮＡもしくはＤＮＡを、上の（１）ないし（７）で定義されるところのインフルエンザウイルスのゲノム中に組込んで組換えウイルス粒子を生じさせること、
（ｃ）それらの表面上でのＨＬＡ−クラスＩ分子および／もしくはＨＬＡ−クラスＩＩ分子の発現が可能である不死化自己細胞を、段階（ｂ）で得られた組換えウイルス粒子に感染させること、
（ｄ）自己細胞中で遺伝子バンクの前記ｃＤＮＡもしくは前記ＤＮＡによりコードされるタンパク質を発現させること、および、自己細胞により産生されたタンパク質もしくは細胞表面のフラグメントをＨＬＡ分子とともに提示すること；
（ｅ）Ｔ細胞を自己細胞とともに共培養すること；ならびに
（ｆ）それらの表面上に抗原を提示するこうした自己細胞によりＴ細胞を刺激して、それにより前記抗原がＴ細胞により認識されること
の段階を含んで成る、最低１種のＨＬＡ制限された（ＨＬＡ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）エピトープをコードするポリヌクレオチド配列の同定方法
を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本出願において、「ヒトインフルエンザウイルス」は、ヒト、ウマおよびブタインフルエンザウイルスなどを包含する全部の型の非トリインフルエンザウイルスを包含し、ヒトインフルエンザウイルスが好ましいものである。本出願において、インフルエンザウイルスはまた「ベクター」、「発現ベクター」もしくは「ウイルスベクター」とも称される。
【０００８】
「生物体」は原核生物および真核生物系、ならびに脊椎動物（哺乳動物を包含する）および無脊椎動物、植物などのような多細胞系を包含する。「細胞」という用語は上で定義される「生物体」の全部の型の細胞を包含する。本発明の「哺乳動物」はヒトおよび動物を包含し、「哺乳動物細胞」はヒト細胞および動物細胞を包含する。
【０００９】
本発明の「感染した細胞（ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌ）」および「感染細胞（ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）」は、それぞれ「不成功に（ａｂｏｒｔｉｖｅｌｙ）感染した細胞」および「不成功感染細胞」もまた包含する。
【００１０】
本発明の「モノシストロニック」および「モノシストロニック配置」は、「正規の（ｒｅｇｕｌａｒ）」（もしくは「天然の（ｎａｔｉｖｅ）」）配置に１個の独立した遺伝子を有するウイルスＲＮＡセグメント、ｖＲＮＡ、ｃＲＮＡもしくはｍＲＮＡを指す一方、本発明の「バイシストロニック」は、共有結合にある２個の独立した遺伝子を包含するウイルスＲＮＡセグメント、ｖＲＮＡ、ｃＲＮＡもしくはｍＲＮＡを指す（本発明の好ましい一態様において、これらの遺伝子の一方はウイルス起源のものである一方、他の一方は外来の組換え遺伝子産物をコードする）。
【００１１】
上で定義されるところの本発明の態様（１）において、インフルエンザウイルスは、好ましくは、タイプＨ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２およびＨ３Ｎ３の株を包含するインフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型ならびにインフルエンザＣ型から選択され、かつ、より好ましくは、ＷＳＮ／３３、ＰＲ８／３４などを包含するインフルエンザＡ型タイプＨ１Ｎ１、アジア（Ａｓｉａ）／５７などを包含するインフルエンザＡ型タイプＨ２Ｎ２、もしくはビクトリア（Ｖｉｃｔｏｒｉａ）／６８、アイチ（Ａｉｃｈｉ）／６８などを包含するインフルエンザＡ型タイプＨ３Ｎ２である。
【００１２】
最低１個の識別するアミノ酸残基がウイルスのＰＢ１セグメント内に配置されることがさらに好ましい。ＰＢ１セグメント内の可能な置換は図１から生じることができる。すなわち、それらの中で、そしてＷＳＮについてはとりわけ、「大きな（ｍａｊｏｒ）改変」もしくは「大きな置換」ともまた呼称される位置３８４、３９６、６２８、６４４および７４１（配列番号２５に示されるＷＳＮ−ＰＢ１の番号付けに基づく）のアミノ酸残基の１個もしくはそれ以上を、それぞれのＦＰＶ  ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）アミノ酸残基で特異的に置き換えることが好ましい（図１を参照されたい）。好ましくは、使用されるインフルエンザウイルス株は、５個の識別するアミノ酸を運搬するＷＳＮ−Ｋ６８である。それらの大きな改変に対する一代替として、もしくはそれに加えて、生じるＰＢ１は、図１に示されるところの、すなわち位置５２、５４、１０５、１７５、２０８、２９８、３６４、３８３、４３１、４６４、４７３、５７６、５８４、６３３、６３６、６４５および６５４の「小さな」改変の１個もしくはそれ以上を有してよい。最も好ましいＰＢ１セグメントは、配列番号２７、３５、４３、４５もしくは４７に示されるアミノ酸配列をコードするものである。
【００１３】
インフルエンザウイルスＷＳＮのＲＮＡポリメラーゼの触媒サブユニットＰＢ１は、転写および複製双方におけるプロモーター上昇突然変異を構成するｖＲＮＡプロモーター配列中に導入された多様なヌクレオチド交換を認識しかつそれに応答するように変異原化（ｍｕｔａｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）により適合させた。これは、ＦＰＶ  ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）（Ｈ７Ｎ７）セグメント２由来の対応する区分を使用してのインフルエンザウイルスＷＳＮ（Ｈ１Ｎ１）のポリメラーゼサブユニットＰＢ１（セグメント２）のコーディング配列内のｖＲＮＡもしくは実際にはプラスミドｃＤＮＡ区分の交換により達成した。相同なセグメント、およびキメラＰＢ１のその構築中で切り替えられているむしろ小さなフラグメント双方内の多数の同一のアミノ酸のため、該遺伝子導入は、サブユニットＰＢ２およびＰＡが変えられないままである一方で、ＷＳＮウイルスＲＮＡポリメラーゼのＰＢ１ポリペプチド鎖内の少数のアミノ酸置換の導入と同等である。原則として、鋳型分子中のむしろ微細なプロモーター上昇変異の認識に必要とされるそれらのアミノ酸は、プロモーター構造のそれぞれの部分との、とりわけ、「コルク栓抜き様」の近位プロモーター要素中の塩基対の１個を構成する３’端からのヌクレオチド３および８との直接の相互作用に関与するはずである。その目的上必要とされるアミノ酸置換は、ＰＢ１ポリペプチド鎖中の２個の別個の区分中で酵素反応中心の左および右へのそれぞれｖＲＮＡおよびｃＲＮＡ結合に関与することが広範に知られている２領域にわたって分布される。野性型プロモーター配列のみがインフルエンザウイルスＲＮＡセグメントの全部に存在する限りは、標準的なＰＢ１を含有するＷＳＮウイルスに比較して、ＰＢ１変異体においてウイルスの安定性、ウイルス収量もしくは他の特性に差異は観察されなかったが、しかし、プロモーター上昇変異体配列を運搬するセグメントは、野性型の促進される（ｐｒｏｍｏｔｅｄ）発現レベルの１４倍までをもたらす上昇された速度で転写かつ複製される。
【００１４】
組換えインフルエンザウイルスの生成は、ウイルスがセグメント化されたＲＮＡゲノムを有するという事実により長い間妨げられた。ＲＮＡポリメラーゼＩ技術の発達が、完全な異種遺伝子を発現することが可能な付加的ゲノムセグメントをもつ組換えウイルスの生成を可能にし（Ｇ．Ｎｅｕｍａｎｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０２，４７７−４７９（１９９４））、これはそれぞれの鋳型ｃＤＮＡ構築物の細胞性ＲＮＡポリメラーゼＩ転写による組換えｖＲＮＡ分子のインビボ合成を中心として築かれた。改変された末端ウイルスＲＮＡ配列（下で「プロモーター上昇突然変異」もしくは「プロモーター上昇変異体」）がヌクレオチド置換により設計されている（ＮｅｕｍａｎｎとＨｏｂｏｍ，Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７６，１７０９−１７１７（１９９５）；国際特許出願第ＷＯ  ９６／１０６４１号明細書）。上のプロモーター上昇変異体は５個までのヌクレオチド置換を運搬する（プロモーター上昇変異体１９２０中；ＦｌｉｃｋとＨｏｂｏｍ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０，２５６５−２５７２（１９９９）を参照されたい）。これらのプロモーター上昇変異体が組換え第９ｖＲＮＡセグメントに結合される場合に、その増大された転写および増幅速度は、自発的に被られる損失を補償することができるのみならず、しかし、いずれの選択の非存在下においても単純なウイルス継代の間に外来ｖＲＮＡセグメントの蓄積さえ引き起こすことができる。
【００１５】
上の態様（２）に示されるとおり、本発明の好ましい一方法は、組換えウイルスが、野性型配列に関して向上された転写速度（ｖＲＮＡプロモーターおよび相補配列中に存在するところのｃＲＮＡプロモーター双方の）ならびに高められた転写および／もしくは発現速度をもたらす、プロモーターシグナルとして活性である、５個までの位置でのヌクレオチド置換により改変されている末端ウイルスＲＮＡ配列を含有する場合である。前記改変された末端ウイルスＲＮＡ配列は、前記ｖＲＮＡセグメント中で、１２ヌクレオチドの保存されたインフルエンザ３’末端配列が、３’端に関して位置３、５および８で前記配列中に存在する１ないし３ヌクレオチドの他のヌクレオチドによる置換により改変されているために野性型配列と異なるが、但し、位置３および８に導入されたヌクレオチドは塩基対を形成している（すなわち、ヌクレオチド位置３がＧである場合には、位置８のものはＣであり；位置３のヌクレオチドがＣである場合には、位置８のものはＧであり；など）。
【００１６】
野性型インフルエンザウイルスの３’の保存された領域は、以下の配列：
インフルエンザＡ型：（５’）−ＣＣＵＧＣＵＵＵＵＧＣＵ−３’
インフルエンザＢ型：（５’）−ＮＮ（Ｃ／Ｕ）ＧＣＵＵＣＵＧＣＵ−３’
インフルエンザＣ型：（５’）−ＣＣＵＧＣＵＵＣＵＧＣＵ−３’
を有する。
【００１７】
さらに、１３ヌクレオチドの保存されたインフルエンザ５’末端配列は、位置３および８で前記配列中に存在する１もしくは２ヌクレオチドの他のヌクレオチドによる置換により改変されてよいが、再度、但し、導入されたヌクレオチドは塩基対を形成している。野性型インフルエンザウイルスの５’の保存された領域は、以下の配列：
インフルエンザＡ型：５’−ＡＧＵＡＧＡＡＡＣＡＡＧＧ
インフルエンザＢ型：５’−ＡＧＵＡＧ（Ａ／Ｕ）ＡＡＣＡ（Ａ／Ｇ）ＮＮ
インフルエンザＣ型：５’−ＡＧＣＡＧＵＡＧＣＡＡＧ（Ｇ／Ａ）：
を有する。
【００１８】
本発明の好ましいインフルエンザウイルスは、３’の保存された領域中で置換Ｇ３ＡおよびＣ８Ｕが実施されているものであり、置換Ｕ５Ｃもまた実施されているものがより好ましい（上の突然変異は３’端に関して注釈を付けられ；３’端からのこうした計数は数字の上の線によってもまた示す、例えばＧ  ３Ａ）。別の好ましいインフルエンザウイルス突然変異体は、以下の３’末端ヌクレオチド配列、（５’）−ＣＣＵＧＧＵＵＣＵＣＣＵ−３’をもたらす３’末端ヌクレオチド配列Ｇ３Ｃ、Ｕ５ＣおよびＣ８Ｇ（３’端に関して）を含んで成る。上で定義されるインフルエンザウイルスのなかで、（５’）−ＣＣＵＧＵＵＵＣＵＡＣＵ−３’の３’末端ヌクレオチド配列を有するものが最も好ましい。インフルエンザＡ型ウイルスの場合、該セグメントはその５’末端配列中に改変Ｕ３ＡおよびＡ８Ｕをさらに有してよく、インフルエンザＣ型の場合、それはその５’末端配列中に改変Ｃ３ＵおよびＧ８Ａを有してよい。本発明の最も好ましいインフルエンザウイルスは、以下の一般構造：
【００１９】
【表１】
2004531232.tif 000002
【００２０】
を含んで成る。
【００２１】
上の構造中で、変数は以下のとおり定義する：
（１）下線を付けられた文字は、高められた特性をもつプロモーター突然変異体を調製するために野性型配列に関して必要とされる突然変異を示し；
（２）配列の５’部分の位置１０の拡大されたＡ：バルジを形成する対形成されないＡ残基；
（３）１位置の（Ａ／Ｇ）：異なる単離物、もしくはそれぞれの位置で代替配列をもつ単一セグメント、機能的に相互交換可能である；
（４）ＮおよびＮ’：定義されないがしかし５’と３’末端の間の相補性により相互に関して塩基対形成され、８セグメントのなかで異なるがしかし全部のウイルス単離物を通じて各セグメントについて一定の位置；
（５）（８６０−２３１０ヌクレオチド）：真正のウイルスセグメントの長さ、外来遺伝子を含むセグメントの場合は４，０００ヌクレオチドまで増大される。
【００２２】
ＰＢ１変異原化によるタイプＨ１Ｎ１（ＷＳＮ、ＰＲ／８）、Ｈ２Ｎ２（アジア（Ａｓｉａ））、Ｈ３Ｎ２（ビクトリア（Ｖｉｃｔｏｒｉａ）、アイチ（Ａｉｃｈｉ）など）もしくは他者の標準的ヒトウイルスへのプロモーター上昇認識特性の導入は、体細胞遺伝子治療および治療的もしくは予防的免疫感作を包含するヒト細胞もしくは組織中での外来遺伝子の発現に適する非常に高速度で外来タンパク質を発現する特性を担持するＦＰＶ由来以外のインフルエンザウイルスベクターの構築の問題を解決する。
【００２３】
インフルエンザＡ型ウイルスゲノムは８セグメントの負鎖ウイルスＲＮＡよりなる。すなわち、それらのポリペプチドをコードする読み枠はアンチセンスの向きでのみそれらのｖＲＮＡ中に存在する。それらは大きさが８９０ヌクレオチド（セグメント８）から２３４１ヌクレオチド（セグメント１および２）までの範囲にわたる。これらのなかで、３個の最大のセグメントは、しばしば約５０００ヌクレオチドのｖＲＮＡ中にコードされるセグメント化されない負鎖ＲＮＡウイルス中に存在するところのＲＮＡポリメラーゼに匹敵する、ウイルスＲＮＡポリメラーゼすなわちＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡを共同して一緒に構成する３個のポリペプチド鎖をコードする。
【００２４】
ビリオンおよび感染した細胞の核の双方中でＲＮＰ複合体中に存在するところのウイルス酵素の構成において相互に結合されたままである３個のポリメラーゼサブユニットのうち、ＰＢ１サブユニットを中心的触媒サブユニットとみなすことができる。それが今日まで既知の全部の酵素機能、すなわちＮＴＰ結合、ＲＮＡ鎖伸長および（下でｍＲＮＡ合成のためのプライマーとして使用される細胞ＲＮＡの）内ヌクレオチド結合分解性切断を運搬するからである。加えて、ＰＢ１ははまた、ｖＲＮＡの５’および３’末端配列ならびにｃＲＮＡの５’および３’末端領域の双方（Ｌｉ  Ｍ．Ｌ．ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．Ｏｃｔ  １；１７（１９）：５８４４−５２（１９９８）；Ｇｏｎｚａｌｅｓ  Ｓ．，Ｏｒｔｉｎ  Ｊ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  Ｊｕｌ  １；１８（１３）：３７６７−７５（１９９９））、すなわち多様なプロモーター要素の鋳型結合部位も包含し、そして、最終的に、ＰＢ２（そのＣ末端で）およびＰＡ（そのＮ末端で）双方の結合領域を有することが知られ、それらは順に相互に直接結合されない（Ｔｏｙｏｄａ  Ｔ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．Ｓｅｐ；７７（Ｐｔ  ９）：２１４９−５７（１９９６）；Ｇｏｎｚａｌｅｓ  Ｓ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，Ｎｏｖ．１５；２４（２２）：４４５６−６３（１９９６））。サブユニットＰＢ２は、細胞ｍＲＮＡおよびｈｎＲＮＡ分子の５’キャップ構造に特異的に結合し、そしてそれによりキャップ付加反応様式のウイルスｍＲＮＡ転写を開始することが既知である（Ｕｌｍａｎｅｎ  Ｉ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  Ｄｅｃ．；７８（１２）：７３５５−９（１９８１）；Ｓｈｉ  Ｌ．ら，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．Ｊｕｎ．；４２（１−２）：１−９（１９９６））。リンタンパク質として作用することが既知であるサブユニットＰＡは、ｃＲＮＡおよびｖＲＮＡ合成、すなわち複製、ならびにおそらくまたｍＲＮＡからｃＲＮＡ合成への対応する切り替えにおいても役割を有するようである（Ｍａｈｙ  Ｂ．Ｗ．Ｊ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，シュプリンガー  フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）、ウィーン、ｐｐ．１９２−２５３（１９８３）；Ｓａｎｚ−Ｅｓｑｕｅｒｒｏ  Ｊ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．Ｍａｒ；７９（Ｐｔ  ３）：４７１−８（１９９８））。いくぶん異常に、ＰＡは、ＰＢ１およびＰＢ２の非存在下で発現される場合に、共発現されるタンパク質のタンパク質分解性の分解につながるようである（Ｓａｎｚ−Ｅｓｑｕｅｒｒｏ  Ｊ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．Ｍａｒ；７９（Ｐｔ  ３）：４７１−８（１９９８））。
【００２５】
核トランスロケーションシグナルは、感染した細胞中のウイルスポリメラーゼの核局在化に従って全３種のポリペプチド内で決定されている（Ｎｉｅｔｏ  Ａ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．Ｊａｎ；７５（Ｐｔ  １）：２９−３６（１９９４））。
【００２６】
ｖＲＮＡもしくはｃＲＮＡの５’および３’端とのウイルスポリメラーゼの相互作用は、それぞれ、５’の位置１５もしくは３’の位置１０に単一のチオウリジンを運搬した、大きさが１６〜１８残基の３２Ｐ−５’−オリゴヌクレオチドの結合、次いでＵＶ架橋および３２Ｐを運搬するペプチドの測定による一組の実験で検出された。この方法で、５’ｖＲＮＡ配列は、アルギニン残基５７１および５７２の周囲に中心をおかれる領域でＰＢ１ポリペプチド鎖に主として結合することが観察された一方、３’ｖＲＮＡモデル配列は、位置２５１および２５４に２個のフェニルアラニン残基を包含する領域ＰＢ１：２４９−２５６に結合する（Ｌｉ  Ｍ．Ｌ．ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．Ｏｃｔ  １；１７（１９）：５８４４−５２（１９９８））。ＵＶ架橋により決定されるところの主たるｖＲＮＡ結合部位に加え、別のアプローチにおいて、二次結合領域もまた、ＰＢ１欠失変異体を使用してＮ末端領域（１−１３９）およびＣ末端領域（４９３−７５７）でｖＲＮＡについて観察されている。また、同一の方法で決定されたｃＲＮＡ結合部位の１つがｖＲＮＡ結合とＮ末端領域（１−１３９）で重なり合う一方、第二のｃＲＮＡ結合領域は、ｖＲＮＡ結合について検出されたところのＣ末端領域（４９３−７５７）中よりもむしろ中心区分（２６７−４９３）に配置される（Ｇｏｎｚａｌｅｓ  Ｓ．，Ｏｒｔｉｎ  Ｊ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．Ｊｕｌ  １；１８（１３）：３７６７−７５（１９９９））。
【００２７】
プロモーター上昇変異体配列の認識において熟達した（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）および不完全な（ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）ＦＰＶ  ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）（Ｈ７Ｎ７）とＷＳＮ（Ｈ１Ｎ１）のＰＢ１ポリペプチド鎖の間の配列比較は、７５７のアミノ酸位置のうち２２での相違を示した。ＰＲ／８（Ｈ１Ｎ１）、アジア（Ａｓｉａ）（Ｈ２Ｎ２）およびビクトリア（Ｖｉｃｔｏｒｉａ）（Ｈ３Ｎ２）のような他のインフルエンザウイルスからのＰＢ１配列もまた包含するようにその比較を拡大することに際して、相違の位置のその数を１１アミノ酸（ＷＳＮ中にのみ存在しかつ多様なインフルエンザ株を表す１５０を越えるウイルスの収集物中のいかなる他のＰＢ１中にも存在しない）だけ試験的に減少させることができた。同一の残基は、プロモーター配列変異体の認識における熟達につながるＦＰＶ  ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）ならびに不完全さにつながる全部の（もしくは大部分の、位置５８４および７４１）他の単離物の双方中のそれぞれの位置に必ず存在する。残存する１１の相違の位置のなかで、ＦＰＶ特異的残基の７個がいくつかで出現するが、しかし全部の他のウイルス単離物ではしなかった一方、４アミノ酸残基すなわちＳ３８４Ｐ、Ｌ３９６Ｉ、Ｌ６２８Ｍ、Ｖ６４４Ａは、ＦＰＶ  ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）に特異的でありかつ他のいずれの場所でも出現しない。この範疇の相違の位置はＦＰＶの特定の特性の探索において最も魅力的である一方、この段階では、全部一緒の９個の一致せずに変動するアミノ酸残基のなかの他者が、変異体プロモーター構造の認識において構造的もしくは機能的に少なくとも補助しているかもしれず、とりわけＤ３８４ＥについてはＳ３８４Ｐに関してその隣接する位置のためありそうであることを除外することができない。見かけ上最も重要な５個の相違の位置は、重合活性の中心から非常に離れていない中心領域（３８３−３９６）、およびＣ末端領域近く（６２８−７４１）、すなわちＣ末端ｖＲＮＡ結合領域のカッコ内（図１を参照されたい）の２群に密集している。
【００２８】
分析の第一段階において、われわれは、それ以外は全部ＷＳＮの背景で、ＦＰＶサブユニットｖＲＮＡの単一の１個を運搬するか、もしくは３種のＦＰＶポリメラーゼサブユニットｖＲＮＡを同時に包含するかのいずれかのＷＳＮ−ＦＰＶ遺伝子交雑物（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）ウイルスを創製した。これは、細胞のＲＮＡポリメラーゼＩによりインビボで８種の個別のウイルスＲＮＡ分子に転写されるよう設計された（Ｎｅｕｍａｎｎ  Ｇ．とＨｏｂｏｍ  Ｇ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．Ｊｕｌ；７６（Ｐｔ  ７）：１７０９−１７（１９９５））、一組のクローン化されたｃＤＮＡからのインフルエンザウイルスの直接生成を介して達成され（Ｎｅｕｍａｎｎ  Ｇ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ａｕｇ．３；９６（１６）：９３４５−５０（１９９９））、それらを初期インフルエンザウイルスタンパク質の４種の発現プラスミド（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ；ベクタープラスミドｐｃＤＮＡ３（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にセンスの向きでクローン化された）と一緒にコトランスフェクトした。全４種のウイルス遺伝子交雑物は、親ＷＳＮもしくはＦＰＶに比較して完全な力価を生じない場合でさえ生存可能であることがわかった。それらを使用して、３種のＦＰＶポリメラーゼサブユニットのどれがプロモーター上昇変異体配列の認識の原因でありかつそれらにより制御されるレポーター遺伝子の増大された発現速度を引き起こしたかを決定した。ＦＰＶから発する全３種のポリメラーゼサブユニットを運搬するか、もしくはそのトリインフルエンザウイルス由来のＰＢ１サブユニットのみを運搬するかいずれかの双方の遺伝子交雑物ウイルスが、トランスフェクトされた細胞中での増大されたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ活性、ならびにウイルスの繁殖の連続的段階の間にプロモーター上昇変異体１１０４−ＣＡＴ  ｖＲＮＡ伴い示した一方、ｖＲＮＡセグメントのそれ以外はＷＳＮ背景にＦＰＶ−ＰＢ２もしくはＦＰＶ−ＰＡのいずれかを含有する２種の遺伝子交雑物は示さなかった。これらのデータから、われわれは、ｖＲＮＡおよびｃＲＮＡ末端配列、すなわちプロモーター上昇変異体中に存在する塩基対およびヌクレオチド置換もまた認識しているプロモーター構造と相互作用するのは、実際に、上から既に知られているＦＰＶ−ＰＢ１サブユニットであると結論づけている。これらの初期実験から生じられる別の結果は、不適合性による活動速度の大きな低下を伴わない、ＦＰＶとＷＳＮウイルスの間のウイルスポリメラーゼのＰ−サブユニットの自由交換についての観察された潜在性である。
【００２９】
ＰＢ１のＦＰＶ／ＷＳＮ配列比較、およびその機能ドメインの位置についての現在の知識から出発して、ＦＰＶ−ＰＢ１およびＷＳＮ−ＰＢ１双方の区分をいずれかのポリペプチド鎖のおよそ１／３および２／３に運搬した、第１回目のキメラＰＢ１クローンを設計した。図２を参照されたい。該結果は、Ｎ末端区分は、ｖＲＮＡおよびｃＲＮＡ末端配列の結合部位の１つを包含することが既知であるとしても、保存的であるとみなされてもまたよい少数のアミノ酸交換により既に示唆されたとおり、また、ＷＳＮ以外の非熟達ウイルスの大多数すなわちＲ５２Ｋ、Ｒ５４Ｋ、Ｔ１０５Ｎ、Ｎ１７５ＤおよびＲ２０８Ｋ中でそれらの全部が（個々に）暴露するため、プロモーター変異体認識に関与しないことを確認する。代わりに、ＷＳＮポリペプチド（ｐＨＬ３１０２中）のＮ末端部分に結合されたＣ末端ＦＰＶ区分（４９２−７５７）を運搬するキメラＰＢ１タンパク質、およびＷＳＮ配列によりいずれかの側で取り巻かれる中央ＦＰＶ領域（２４１−４９２）を運搬するＰＢ１キメラｐＨＬ３１３１は、それぞれ８もしくは９アミノ酸交換により相違であることに従った、変異体プロモーター配列の高いもしくは中程度に高い認識をもたらした。いずれの場合でも熟達対不完全ウイルスＰＢ１配列の拡大された比較において、その２置換は「大きな」交換、すなわちＦＰＶ  ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖ）中のみに存在するとみなされてよい。下述される実験データのため、置換Ｔ７４１Ａは、この位置のアラニン残基がいくつかの他の非熟達ウイルス中にもまた存在するとしても、「大きな」（もしくは主要な補助する）範疇にあるとみなされてもまたよい。
【００３０】
第２回のＰＢ１キメラ構築において、ｐＨＬ３１３１およびｐＨＬ３１０２双方中の完全長の３４％の以前に使用された中央およびＣ末端のＦＰＶ区分を、半分に、すなわち、完全な大きさのＷＳＮ−ＰＢ１に関してｐＨＬ３１３１およびｐＨＬ３１０２中に残存するアミノ酸の相違の数に関して、さらに分割した。この方法で、ｐＨＬ３２０４はＦＰＶ：４９２−５９９ハイブリッドＰＢ１クローン、ｐＨＬ３２０３はＦＰＶ：５９９−７５７を含有するポリペプチド鎖を構成し、ｐＨＬ３２５６は位置２４１から位置３７４まで伸長するＦＰＶの一区分を運搬し、そしてｐＨＬ３２５７は位置３７４から４９２までＦＰＶ配列を含有する。図２を参照されたい。加えて、ＷＳＮ−ＰＢ１に関して２アミノ酸交換すなわちＤ３８３ＥおよびＳ３８４Ｐの最も強固に密集された群を包含するＦＰＶ−ＰＢ１配列の選択された小区分（３７４−３９４）もまた、それ自身すなわちｐＨＬ３２５８で、および第二の区分のＰＦＶ−ＰＢ１すなわち４９２−５９９（ｐＨＬ３２５９）もしくは５９９−７５７（ｐＨＬ３２６８）、すなわちｐＨＬ３２０４もしくはｐＨＬ３２０３中に別個に存在すると同一の領域とともにの双方で、ＷＳＮ−ＰＢ１に挿入した。図３に報告されるとおり、個々の構成要素すなわちｐＨＬ３２０３もしくはｐＨＬ３２５８のそれぞれを上回る速度、およびＦＰＶポリメラーゼそれ自身（ｐＨＬ１８４４を参照されたい）の７０％レベルを伴い、プロモーター上昇変異体１１０４の認識において最良の結果を与えたのは、一方の区分に１個の「大きな」および１個の「小さな」置換を、かつ他方に交換されたこれらの範疇の３および４アミノ酸を運搬する、ＦＰＶの２個の短い分離した区分の後者の組合せである。
【００３１】
残存する差異は、ＷＳＮ−ＰＢ１分子の他の部分との立体的相互作用から生じるｐＨＬ３２６８に存在するアミノ酸置換の１個もしくはそれ以上により引き起こされる負の効果によるかもしれない一方、そのそれぞれのアミノ酸残基はまたプロモーター配列認識に直接関与しているかももしくはしていないかもしれない。後者の場合、プロモーター活性は、現在残存するいくつかのアミノ酸置換のなかでのその混乱させる残基の決定および除外に際してさらに増大されるかもしれない。他の場合、すなわち、少なくとも部分的に同一残基により同時に引き起こされる双方の効果を伴う場合には、現在のレベルを上回る向上が可能でないことができる。いずれの場合でも、標準的なｐＨＬ１１０４突然変異体に応答して（ＦＰＶについて２０倍の代わりに）野性型プロモーターのレベルより１４倍上の発現速度をもたらす、そのＰＢ１配列中に５個のみのアミノ酸置換（および４個の最もありそうな関連しない変化）の組を運搬するＷＳＮインフルエンザウイルスについてこれまで達成された外来タンパク質の発現レベルは、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス発現ベクター中でのその使用に十分であるようである。
【００３２】
ＰＦＶ  ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）配列に従ってモデル化されるそのＰＢ１ポリメラーゼサブユニット中に５個の構成的アミノ酸置換を運搬するＷＳＮ−Ｋ６８ウイルスは、それが野性型プロモーター配列を運搬するインフルエンザｖＲＮＡセグメントのみよりなる限りは、その細胞特異性およびウイルス収量においてインフルエンザウイルスＷＳＮと識別不可能な、プラークを形成する安定なウイルス株である。プロモーター上昇末端配列を運搬する１種の（付加的な）インフルエンザｖＲＮＡセグメントの存在下で、対応するウイルスｍＲＮＡは高速度で合成されることができ、そしてそのｖＲＮＡは不釣り合いに増幅されることができ、全部の他者を上回るその単一の（外来）ウイルスセグメントの過剰により欠損粒子の産生を引き起こす。以前に記述された（国際特許出願第ＷＯ  ００／５３７８９号および欧州特許第ＥＰ  ００１１５６２６．４号明細書）とおり、これは、アンビセンスもしくはタンデムいずれかの設計に従ってウイルス遺伝子の１個と共有結合にある外来遺伝子を運搬するバイシストロニックセグメントの構築を介して、均衡のとれた安定な状況に戻すことができる。加えて、複製の均衡は、バイシストロニックセグメントの全体の長さおよびそれに結合される変異体プロモーター配列の変動により、そのバイシストロニックセグメントと７個の正規セグメントの組との間で達成されなければならない。転写および結果としてのタンパク質発現に関して、ウイルス遺伝子産物の低レベルの収量が他のウイルス遺伝子産物と近似の均衡にもたらされなければならない一方、より多く生じる外来遺伝子産物発現は、ウイルス遺伝子に関して均衡を欠いて維持される。
【００３３】
あるいは、インフルエンザウイルス株ＷＳＮ−Ｋ６８を、弱毒化に同等な固有の自殺特性をもつ不安定な組換えウイルス子孫の産生のためのヘルパーウイルスとして直接使用してよい。そのスキームの一欠点は、トランスフェクトされたプラスミドＤＮＡの上清およびヘルパーウイルスに感染した細胞中での組換えウイルス以外の子孫ヘルパーウイルスの存在である。
【００３４】
インフルエンザウイルス株ＷＳＮ−Ｋ６８（Ｈ１Ｎ１）、および期待されることにはＨ２Ｎ２もしくはＨ３Ｎ２ウイルスの類似のＫ６８変異体の構築は、生物学的安全性の問題を解決し；それは、Ｈ７タイプウイルスのヘマグルチニン含有ウイルスベクターの使用、および遍在するプロテアーゼに対するそれらの感受性を回避するのに役立つ。
【００３５】
先に挙げられた多様な親Ｈ２Ｎ２およびＨ３Ｎ２ウイルスのＰＢ１サブユニット中のそれぞれの「主要な」アミノ酸位置は、ほとんどＷＳＮと同一であり、そして重要な位置ではＦＰＶ  ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）の独特の配列と異なり（図１を参照されたい）、そして従ってこれらの他のウイルス株は、その同一の手順により、高められた転写欠損から高められた転写熟達ウイルスに同様に転化されたようになると期待される。
【００３６】
ＰＢ１配列内の２群の見かけ上重要なアミノ酸置換の位置は、一群中で重なり合い（すなわちｖＲＮＡプロモーター配列の既知の結合領域の１個を伴うＬ６２８Ｍ、Ｖ６４４ＡおよびＴ７４１Ａ）、そしてまたＲ５７１／Ｒ５７２の５’ｖＲＮＡ架橋部位の近隣にもある。ＷＳＮ−Ｋ６８中の交換の他の群、すなわちＤ３８３Ｅ、Ｓ３８５ＰおよびＩ３９６Ｌは、一次（Ｓ４４５／Ｄ４４６／Ｄ４４７）、およびとりわけヌクレオチド重合酵素活性に関与することが予測される二次コンセンサス配列要素内に配置される（Ｐｏｃｈ  Ｏ．ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．Ｄｅｃ．１；８（１２）：３８６７−７４（１９９０）；Ｂｉｓｗａｓ  Ｓ．Ｋ．，Ｎａｙａｋ  Ｄ．Ｐ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍａｒ．；６８（３）：１８１９−２５（１９９４））。ｃＤＮＡ末端配列結合のみがその領域中で観察されかつｖＲＮＡは観察されない（Ｇｏｎｚａｌｅｓ  Ｓ．，Ｏｒｔｉｎ  Ｊ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．Ｊｕｌ  １；１８（１３）：３７６−７５（１９９９））一方、酵素反応中心はその基質の双方すなわちｃＲＮＡおよびｖＲＮＡと緊密に接触するようになることが期待されなければならないことができる。
【００３７】
アミノ酸交換、およびそれゆえにＰＢ１もしくはウイルスポリメラーゼプロモーター認識特性に対する影響は、ｖＲＮＡおよびｃＲＮＡプロモーター（１−１４３）双方と相互作用することが既知であるＰＢ１ポリペプチド鎖のＮ末端領域についてここで観察されず、そしてそれは３’ｖＲＮＡ架橋部位（２４９−２５６）の領域について真実である。プロモーター上昇変異に対する主要な影響は３’端からの位置３および８での塩基対交換から発するため、その結果は失望させられると考えられるかもしれない。ＰＢ１ポリペプチド鎖の広範に分離された部分が、鋳型分子の個々の構造要素、およびより具体的には２種のＲＮＡプロモーター構造の双方の部分と同時にもしくは連続的に相互作用することが、異なる方法を用いて以前に得られかつまたわれわれ自身のデータを包含する多様な結果から明らかである一方、酵素全体もしくはそのＰＢ１サブユニットの３Ｄ構造（１種もしくは複数）は未だ知られていない。
【００３８】
Ｇｏｎｚａｌｅｓ  Ｓ．，Ｏｒｔｉｎ  Ｊ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．Ｊｕｌ  １；１８（１３）：３７６７−７５（１９９９）の結合研究は、残存するタンパク質フラグメント中のひどい構造の変形を引き起こしそしてそれゆえに人工の結果を生じるかもしれない、ＰＢ１ポリペプチド鎖の大きな欠失変異体を使用してインビトロで行われた。Ｌｉ  Ｍ．Ｌ．ら．，ＥＭＢＯ  Ｊ．Ｏｃｔ．１；１７（１９）：５８４４−５２（１９９８）による架橋研究は、５’の位置１５もしくは３’の位置１０に単一のチオウリジン残基をもつむしろ短い５’もしくは３’オリゴヌクレオチドを使用した。双方の位置は、二本鎖であることが既知である遠位プロモーター要素中に配置される一方、一本鎖オリゴヌクレオチドのみがこれらの実験で使用された。その二本鎖ＲＮＡ構造を持つ遠位プロモーター要素については確実に、しかしまた近位プロモーター要素についてもありそうなことには、５’および３’末端配列区分の同時の結合がより適切であったとみられ、そして異なる結果を生じていたかもしれない。また、最初に５’ｖＲＮＡ末端配列、およびその後３’ｖＲＮＡ端の連続する結合反応において、分子全体の大きなコンホメーション移動が観察された（Ｋｌｕｍｐｐら、ＥＭＢＯ  Ｊ；１６：１２４８−１２５７（１９９７））。最後に、近位および遠位のプロモーター要素はｖＲＮＡプロモーター構造中の独立したコンホメーション単位であることが既知であり、また、それがプロモーター上昇突然変異を運搬するものであるために、ポリメラーゼにより詳細に認識されなければならないのは近位の要素である（Ｆｌｉｃｋ  Ｒ．ら，ＲＮＡ，Ｏｃｔ；２（１０）：１０４６−５７（１９９６））。従って、遠位要素中の２個のヌクレオチド位置のみについて得られたＵＶ架橋の結果は、その理由からもまたここでは紛らわしいかもしれない。他方、高められた転写熟達対欠損に関与する、すなわちｖＲＮＡプロモーター構造内の（および完全な大きさの機能的ポリメラーゼ分子中に配置される）単一ヌクレオチドおよび／もしくは塩基対交換の認識における、一組のアミノ酸位置のわれわれのインビボでの決定は、確かに、これまで使用されたインビトロの方法のいずれよりもずっとより穏やかかつより信頼できるポリメラーゼ機能要素の決定方法である。その３’−３：８塩基対の認識およびその位置での単一塩基対置換の感知に関与するＰＢ１のアミノ酸は、それらのヌクレオチドと直接接触にあることがありそうであるか、もしくは、せいぜい、タンパク質内のドメイン相互作用のその後の連鎖に配置されて、コンホメーション変化および観察された応答、すなわち高められた転写開始速度につながるかもしれない。
【００３９】
上で定義される態様（３）および下で示される説明によれば、本発明のインフルエンザウイルスは、１種もしくはそれ以上の外来のもしくは変えられたタンパク質の高収量発現に適する。外来の組換えもしくは変えられたウイルス遺伝子は、モノシストロニック配置で発現されるべきタンパク質をコードする外来のもしくは変えられた遺伝子を含んで成りかつ上で定義されるところの改変されたｖＲＮＡプロモーター配列を有する付加的なＲＮＡセグメント内もしくは置換セグメント中（態様（４））、および／または発現されるべきタンパク質をコードする外来遺伝子を包含しかつ上で定義されるところの改変されたｖＲＮＡプロモーター配列を有する、好ましくはアンビセンスもしくはタンデム配置（それぞれ態様（５）および（６））のバイシストロニックｖＲＮＡセグメント内に存在してよい。
【００４０】
外来糖タンパク質遺伝子の発現およびウイルスエンベロープ中へのそれらの糖タンパク質の組込みに関する態様（４）に関して、独国特許第ＤＥ  １９７  ０９  ５１２号明細書（その開示はこれで引用することにより組み込まれる）が言及される。前記態様によれば、一般的タイプＩの、すなわちＣ末端近くに疎水性の膜固定配列をもつ多様な外来糖タンパク質の遺伝子を、他の遺伝子の発現に設計されたところの対応するｃＤＮＡ構築物について使用し、その結果対応する人工ｖＲＮＡ分子を、すなわち負鎖の向きで形成することができる。該外来遺伝子を、インフルエンザｖＲＮＡ分子中に存在するところの真正のもしくはわずかに改変された非コーディング領域により隣接されるインフルエンザ遺伝子のコーディング配列の代わりに挿入する。それ自身のシグナルペプチド配列もしくはヘマグルチニン（ＨＡ）から借りられたものに加えて、該組換え糖タンパク質配列は、この場合にそれの完全な自身の（すなわちＨＡ外来の）エクトドメイン、次いで、それ自身の膜貫通ドメイン、もしくはより頻繁にはそのＣ末端の「細胞質」尾部配列（ＨＡについて：２６＋１１アミノ酸）を包含するヘマグルチニンのもののいずれかを含んで成る。構築の同一の原理が非糖タンパク質に当てはまり、それらは２個の隣接するシグナルペプチドおよびウイルスヘマグルチニン由来の膜固定要素と結合されることにより、人工の膜タンパク質に転化されるかもしれない。
【００４１】
態様（５）に関しては国際特許出願第ＷＯ  ００／５３７８９号明細書（その開示はこれで引用することにより組み込まれる）が言及される。前記態様のインフルエンザウイルスにおいて、好ましくは、正規のウイルスＲＮＡセグメントの最低１個が、全体収束配置で、センスの向きの標準的ウイルス遺伝子の１個およびアンチセンスの向きの外来の組換え遺伝子を含有するアンビセンスＲＮＡセグメント、もしくはその逆により置き換えられる。アンビセンスＲＮＡ分子中で、前記外来組換え遺伝子がウイルス遺伝子の１個に共有結合される一方、同一遺伝子をコードする元のｖＲＮＡセグメントは、組換えインフルエンザウイルスの直接生成の過程において、特異的リボザイム切断により組換えウイルスから欠失されるか、もしくはＲＮＡポリメラーゼＩウイルスｃＤＮＡクローンの組から除外されかつ対応するアンビセンスＲＮＡ発現ｃＤＮＡクローンにより置換されることが、さらに好ましい（下を参照されたい）。
【００４２】
ウイルス遺伝子（１個もしくは複数）とアンビセンスの共有結合にある外来遺伝子（１個もしくは複数）は、好ましくは、リンホカインもしくは細胞外酵素のような組換えウイルスに感染した細胞から分泌されるタンパク質および／もしくは糖タンパク質をコードするか、または、ウイルスエンベロープならびに感染した細胞の原形質膜中に組込まれる糖タンパク質をコードする。別の好ましい態様において、ウイルス遺伝子（１個もしくは複数）とアンビセンスの共有結合にある外来遺伝子（１個もしくは複数）は、Ｂ細胞および／もしくはＴ細胞応答の刺激のために、感染した細胞の表面の固有のエピトープの効率的なＨＬＡ制限される提示を支持するよう設計されたタンパク質もしくは人工ポリペプチドをコードする。こうしたタンパク質もしくは人工ポリペプチドは、例えば腫瘍抗原もしくはＴ細胞エピトープの一連の人工オリゴマーを構成する。最後に、外来遺伝子挿入物（１個もしくは複数）は、感染した細胞内のアンチセンスＲＮＡおよびリボザイムを包含するＲＮＡ分子の導入および発現に適しているかもしれない。こうした組換えインフルエンザウイルスは、例えばＲＮＡアンチセンスもしくはリボザイムＲＮＡ妨害機構による配列特異的遺伝子不活性化に適する。
【００４３】
本発明の態様（５）の好ましい一ウイルスは、正規のウイルスＲＮＡセグメント中で、標準的糖タンパク質ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼの一方もしくは双方が、外来糖タンパク質（１種もしくは複数）、または好ましくはヘマグルチニン由来の固定セグメントおよび外来起源（ウイルスもしくは細胞）から得られたエクトドメインよりなる融合糖タンパク質に交換されている場合、あるいは、こうした組換え糖タンパク質が、残存する標準成分に加えて第三の分子種として挿入されている場合である。
【００４４】
本発明の態様（６）に関して、欧州特許第ＥＰ  ００１１５６２６．４号明細書（その開示はこれで引用することにより組み込まれる）が言及される。前記態様のタンデムＲＮＡセグメント中で、標準的ウイルス遺伝子の一方は、好ましくは外来の組換え遺伝子と共有結合にあり、また、前記タンデムＲＮＡセグメントは、近位コーディング領域を取り巻く上流のスプライスドナーおよび下流のスプライスアクセプターシグナルを有する。本発明の「近位」および「近位位置」は、バイシストロニックウイルスｍＲＮＡ中の遺伝子の一方の５’位置、すなわち「遠位位置」の第二の遺伝子の前（上流）を指す。
【００４５】
タンデム構築物中での双方の遺伝子産物の発現は、スプライシングがｍＲＮＡ分子の一部でのみ起こる、すなわちスプライスされたおよびスプライスされない双方のｍＲＮＡが感染した細胞中に存在するような質の近位コーディング領域を取り巻く上流のスプライスドナーおよび下流のスプライスアクセプターシグナルによって可能にされる。ｖＲＮＡの長さに関する補償のために、バイシストロニックセグメントを、下で定義されるところの高められた複製および転写速度のプロモーター変異体に結合する。
【００４６】
スプライスドナーおよびスプライスアクセプターシグナルは、インフルエンザのセグメント７および８中に存在するところの真正配列、もしくは他の部分的に有効なスプライス反応基質、好ましくはインフルエンザウイルスＷＳＮセグメント７のもの、すなわち５’−ＡＧ↓ＧＴＡＣＧＴＴＣ−３’（ドナー）および５’−ＧＣＴＧＡＡＡＡＡＴＧＡＴＣＴＴＣＴＴＧＡＡＡＡＴＴＧＣＡＧ↓ＧＣ−３’（アクセプター）から選択する。
【００４７】
態様（６）の好ましい一インフルエンザウイルスにおいて、正規のウイルスＲＮＡセグメントの最低１個が、双方がアンチセンスの向きで遠位位置に標準的ウイルス遺伝子の１個および近位位置に外来の組換え遺伝子、もしくはその逆を含有するタンデムＲＮＡセグメントにより置き換えられる。バイシストロニックＲＮＡセグメント中に存在すると同一のウイルス遺伝子が、プラスミドＤＮＡからの組換えインフルエンザウイルスの直接生成において、特異的リボザイム切断により組換えウイルスから欠失されるか、もしくは、ＲＮＡポリメラーゼＩ  ｃＤＮＡクローンの組から除外されかつ対応するタンデムのバイシストロニックＲＮＡを発現するｃＤＮＡクローンにより置換される（下を参照されたい）。
【００４８】
ウイルス遺伝子（１個もしくは複数）とタンデム共有結合にある外来遺伝子（１個もしくは複数）は、好ましくは、リンホカインもしくは細胞外酵素のような組換えウイルスに感染した細胞から分泌されるタンパク質および／もしくは糖タンパク質をコードするか、または、ウイルスエンベロープならびに（不成功に）感染した細胞の原形質膜中に組込まれる糖タンパク質をコードする。別の好ましい態様において、ウイルス遺伝子（１個もしくは複数）とタンデム共有結合にある外来遺伝子（１個もしくは複数）は、Ｂ細胞および／もしくはＴ細胞応答の刺激のために、感染した細胞の表面で固有のエピトープの効率的なＨＬＡ制限される提示を支持するよう設計されたタンパク質もしくは人工ポリペプチドをコードする。こうしたタンパク質もしくは人工ポリペプチドは、例えば、ポリペプチド鎖内で同定されている腫瘍抗原もしくはＴ細胞エピトープの一連の人工オリゴマーを構成する。最後に、外来遺伝子挿入物（１個もしくは複数）は、感染した細胞内のアンチセンスＲＮＡおよびリボザイムを包含するＲＮＡ分子の発現に適しているかもしれない。こうした組換えインフルエンザウイルスは、例えばＲＮＡアンチセンスもしくはリボザイムＲＮＡ妨害機構による配列特異的な遺伝子不活性化に適する。
【００４９】
本発明の態様（６）の好ましい一組換えウイルスは、正規のウイルスＲＮＡセグメント中で、標準的糖タンパク質ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼの一方もしくは双方が外来糖タンパク質、または、好ましくは、ヘマグルチニン由来の固定セグメントおよび外来起源（ウイルスもしくは細胞）から得られたエクトドメインよりなる融合糖タンパク質に交換されている場合、あるいは、こうした組換え糖タンパク質が、残存する標準成分に加えて第三の分子種として挿入されている場合である。
【００５０】
態様（５）および（６）により、本発明は、
−アンビセンスもしくはタンデム配置の、インフルエンザ遺伝子の一方と共有結合にある外来遺伝子をコードする７個（まで）の正規のｖＲＮＡセグメントおよび１個（もしくはそれ以上）の付加的なバイシストロニックセグメント（１個もしくは複数）を含有する安定な組換えインフルエンザウイルス、ならびに
−弱毒化の方法として、および共感染するインフルエンザウイルス間の再結合（ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）の予防のためにもまた応用可能である、アンビセンスもしくはタンデム配置のバイシストロニックｖＲＮＡセグメント（１個もしくは複数）による安定な組換えインフルエンザウイルスの構築方法
を提供する。
【００５１】
態様（６）の特定の一応用において、タンデムのバイシストロニックｍＲＮＡは、逆（アンチセンス）の向きのウイルスノイラミニダーゼコーディング配列もしくはウイルスＮＳ１コーディング配列の（全部もしくは）一部とともに、ヘマグルチニンのようなウイルス遺伝子の１個をコードする一方、真正のノイラミニダーゼｖＲＮＡセグメントもしくはＮＳ１コーディング配列は、それ以外はこれらの組換えウイルス中で完全に欠落している。これらの構築物の別の変形物において、アンチノイラミニダーゼもしくはアンチＮＳ１リボザイム配列もまた、これらのバイシストロニック組換えセグメントの近位もしくは遠位位置で（部分的）ノイラミニダーゼもしくはＮＳ１アンチセンス配列と一緒になって提供される。この特徴の組換えウイルスを、外因性のノイラミニダーゼの添加を伴う培地、もしくは不活性化されたインターフェロン遺伝子をもつ組織培養細胞、例えばＶｅｒｏ細胞中で繁殖させる。
【００５２】
機能的ノイラミニダーゼ遺伝子の非存在は、こうした組換えウイルスのみの単一段階の感染をもたらす強い弱毒化機構としてはたらく。機能的ノイラミニダーゼ遺伝子は、同一細胞を重複感染させる別の（野性型）インフルエンザウイルスの場合に提供される可能性がある一方、その遺伝子の発現は、二重感染した細胞中の再結合に対する障壁として共感染した細胞からの感染性の子孫の産生さえ妨害するよう設計された、アンチセンスＲＮＡの相互作用および／もしくはリボザイム切断による対応するｖＲＮＡの破壊により、非常に大きく低下される。同一の議論が、アンビセンスもしくはタンデムのバイシストロニックの設計で外来の組換え遺伝子を運搬すること以外の第二の特徴として、アンチＮＳ１  ｖＲＮＡアンチセンスもしくはリボザイム配列を加えて運搬するＮＳ１欠失ウイルスにも当てはまる。
【００５３】
ウイルス遺伝子の一方が外来のコーディング配列と共有結合で結合されている構築物内でタンデム構成にある２個の遺伝子を同時にコードする組換えウイルスＲＮＡは、細胞のＲＮＡポリメラーゼＩによる負鎖ｖＲＮＡのインビボ転写のため設計された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミドベクターＤＮＡを介して構築される。これらの構築物において、正鎖の近位（上流）位置の遺伝子は、スプライスされたおよびスプライスされない双方のｍＲＮＡが感染した細胞中に存在するような制限された活性のスプライスシグナルにより取り巻かれる。外来遺伝子もしくはウイルス遺伝子のいずれかがその上流位置にあってよい。応用の大多数においては、より高速度の発現が外来コーディング配列について確保されることができる一方、ウイルス遺伝子のより低い発現速度は、正規のウイルスセグメントによりコードされる他のウイルス遺伝子の発現とおおよそ均衡するように適合される。
【００５４】
こうした均衡のとれた発現速度を達成するためには、スプライスシグナルおよびプロモーターを適正に選ばなければならない（ＦｌｉｃｋとＨｏｂｏｍ，Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  ‘ｃｏｒｋｓｃｒｅｗ’  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０，２５６５−２５７２（１９９９））。増大された全体転写速度で、生じるｍＲＮＡは、ウイルス遺伝子が遠位（下流の）位置にある場合に非効率的にスプライスされるはずである。逆に、外来遺伝子が遠位位置にある場合には、外来ｍＲＮＡを得るためのスプライシングは効率的に達成されるはずである。双方の設計は、その相手のウイルス遺伝子に関して外来遺伝子の過剰発現に達するようはたらき、その発現は他のウイルス遺伝子の発現と均衡するはずである。さらに、バイシストロニックセグメントに結合されたプロモーター変異体は、増大された複製速度によって増大された遺伝子長さについて補償する機能を有する。
【００５５】
バイシストロニックセグメントの構築に好ましく使用されるインフルエンザｖＲＮＡセグメントは、ノイラミニダーゼ（番号６）、ヘマグルチニン（番号４）およびＮＳセグメント（番号８）を包含する。ＮＳセグメント中で、外来遺伝子はＮＳ１遺伝子もまた置換してウイルスＮＳ２遺伝子をその場所に残すかもしれない。これらの組換えウイルスは、一例として、以下の手順により作成することができる。すなわち、組換えウイルス集団を、バイシストロニック構築物中に包含されていると同一のモノシストロニックセグメント中のウイルス遺伝子の隣接する位置に挿入されたリボザイム切断部位を運搬するヘルパーウイルスセグメントの反復されるリボザイムに媒介される切断により選択することができる（第ＰＣＴ／ＥＰ００／０１９０３号明細書）。連続ウイルス継代、および同等に構築されたバイシストロニックセグメント中のレポーター遺伝子の出力に頼ることにより、均衡のとれた様式の発現を、要素の正しい組すなわちプロモーター変異体、スプライスシグナルおよびセグメント長さの制限された変動を選ぶことにおいて達成することができる。その後、均衡のとれた安定な発現を生じさせる構築物を、Ｈｏｆｆｍａｎｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ  ９７，６１０８−６１４４（Ｍａｉ  ２０００）に従ったインフルエンザウイルスのヘルパーを含まない生成の複数のｃＤＮＡトランスフェクション手順の設計に使用してよい。純粋な、ヘルパーを含まない状態の単一プラークを介して得られる、生じる組換えインフルエンザウイルスを、別の一連の繁殖段階にかけて、最終的にその特性を評価する。
【００５６】
特定の一応用において、この設計は制御された様式のウイルス弱毒化を確立するために使用する。インフルエンザウイルスの弱毒化は、これまで、ＮＳ１遺伝子の（部分的）欠失により（部分的弱毒化、Ｅｇｏｒｏｖら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，６４３７−６４４１（１９９８年８月）およびＰａｌｅｓｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，４３０９−４３１４（２０００年４月））、もしくはノイラミニダーゼ遺伝子の欠失により（完全弱毒化、Ｋａｗａｏｋａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，５２０６−５２１２（２０００年６月））、低温感受性変異体（Ｅｄｗａｒｄｓら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６９，６８−７６（１９９４））中で達成されている。後者のアプローチを、野性型ウイルスによる（偶然）重複感染を妨害することもまた初めて可能である、ウイルス弱毒化のための新規技術と一緒にここで適合させる。
【００５７】
本発明の本態様において、別の外来遺伝子を運搬する代わりに、スプライスドナーおよびアクセプター双方の要素により取り巻かれることを伴いもしくは伴わずにアンチセンスの向きのウイルスノイラミニダーゼ遺伝子の一部をコードする、第二のバイシストロニックｃＤＮＡ構築物を設計する。その設計の別のバージョンにおいて、ノイラミニダーゼ配列の一領域に相補的な２×５０ヌクレオチドのアンチセンスセグメントを、ハンマーへッドの設計に従ったリボザイム構築物に関して隣接位置でクローン化し、そして大多数の現代のウイルス後単離物（ｐｏｓｔ−ｖｉｒａｌ  ｉｓｏｌａｔｅｓ）中のノイラミニダーゼ配列内の共通のＧＵＣ三重項に対して向けた。好ましい一設計においては、このアンチセンス発現構築物をヘマグルチニンｖＲＮＡセグメントに結合した一方、別の遺伝子もしくはレポーター遺伝子は、ＮＳ２とともに第二のバイシストロニックｖＲＮＡ中にコードされる。同一の設計は、それ自身ＮＳ１遺伝子を運搬せず、かつノイラミニダーゼｖＲＮＡもしくはＮＳ２  ｖＲＮＡとともに外来組換え遺伝子を有するアンチＮＳ１ウイルスに当てはまる。
【００５８】
ノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子について欠失された組換えウイルスの繁殖は、培地への外的なノイラミニダーゼの添加を必要とする。ノイラミニダーゼの非存在下では、ＮＡ欠失ウイルスによる感染は不成功である。すなわち、感染性の子孫が産生されない。野性型ウイルスと一緒の組換えウイルスの共感染（細胞あたり３＋３）に際して子孫ウイルスもしくはプラークが観察されず、それは、アンチセンス封鎖された発現および／もしくは野性型ウイルスから発するノイラミニダーゼセグメントの（部分的）リボザイム破壊に帰される。この設計により、記述される組換えウイルスは単一感染で弱毒化されるのみならず、しかし同時に野性型ウイルスの重複感染を妨害し、そして従って２種のウイルス間の再結合が起こらないことができる。
【００５９】
態様（８）の過程に関して、上で言及された国際特許出願第ＷＯ  ９６／１０６４１号、第ＰＣＴ／ＥＰ００／０１９０３号および欧州特許第００１１５６２６号明細書（それらの開示はここで引用することにより組み込まれる）の開示、ならびに上に示される製造方法の詳述された論考が言及される。
【００６０】
態様（９）に関して、インフルエンザＷＳＮ−Ｋ６８のようなＷＳＮ／ＦＰＶ−ＰＢ１キメラウイルスの生成における最終段階は、Ｈｏｆｆｍａｎｎら（Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｅ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７（１１），６１０８−６１１３（２０００））により設計される２９３Ｔ細胞中への８種のｃＤＮＡプラスミドのコトランスフェクションを実施すること、すなわち、相互に逆向きでかつ中央のｃＤＮＡ挿入物を越えて伸長する隣接するＲＮＡポリメラーゼＩならびにＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写ユニットを含有する、ベクタープラスミドｐＨＷ２０００もしくは同等に構成されたプラスミドベクターにクローン化された挿入物を運搬することに存する。相応して構築された、一組の８種の二重発現プラスミドで使用される挿入物は、出発原料として、ＰＢ１キメラプラスミドｐＨＬ３２６８を使用して構築された、セグメント２（ＰＢ１）を除く７セグメント由来の野性型ＷＳＮ  ｃＤＮＡよりなる。全８種のプラスミドでのコトランスフェクションは、７２時間後にウイルスを含有する上清をもたらし、それを、プラーク精製およびＭＤＣＫ細胞でのさらなる繁殖、ならびにＲＴ−ＰＣＲによるウイルス単離物の特徴づけ、次いで制限分析もしくはＤＮＡ配列決定に使用することができる。
【００６１】
組換えインフルエンザウイルスの生成は同一の概要に従ったが、しかし、この場合は、ＷＳＮのセグメントの１個、好ましくはセグメント６（ＮＡ）を、アンビセンスもしくはタンデムの設計で外来遺伝子と共有結合にあるＮＡ遺伝子を含有するバイシストロニック構築物と交換した。加えて、バイシストロニックセグメントはその隣接する５’および３’末端配列中にプロモーター上昇突然変異を運搬する。他の組換えウイルスは、セグメント６中の隣接位置に挿入されたアンチＮＳ１リボザイム配列を伴うもしくは伴わないバイシストロニックセグメント８（ＮＳ２／外来）を使用して創製し、また、セグメント８のバイシストロニックウイルスのなお他者（ＳＮ２／外来）は、セグメント４（ＨＡ）の隣接位置に挿入されたアンチＮＡリボザイム配列を伴いもしくは伴わずに、完全に欠失されたそれらのセグメント６を有する。
【００６２】
上の態様（１０）の製薬学的組成物、ならびに上の態様（１１）、（１４）および（１６）の作用物質（下で「医薬」ともまた称される）は、組換えインフルエンザウイルスを製薬学的に有効な量で含有する。前記組換えインフルエンザウイルスのほかに、該製薬学的組成物および医薬は、結合剤、崩壊剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤などのような当業者に公知のさらなる製薬学的に許容できる担体物質を含有してよい。製薬学的組成物および医薬は固体もしくは液体製剤であり、そして経口で、静脈内にもしくは皮下で投与するのに適する。ヒトの治療には、態様（１）ないし（６）のヒトインフルエンザウイルスを好ましく使用する。
【００６３】
態様（１０）の製薬学的組成物は、とりわけ、
（ｉ）組換えウイルス感染による（すなわち、標準的ウイルス感染を介してもしくは加えて特定の弱毒化機構を使用して）、細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞への遺伝子導入；
（ｉｉ）抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞への遺伝子導入、およびエクスビボ免疫療法のための得られた生成物の使用（それにより、エクスビボ療法は、樹状細胞のような抗原提示細胞の改変を必要とする治療的応用であり、かつ、該改変された抗原提示細胞を患者に直接注入する）；
（ｉｉｉ）インビボ体細胞遺伝子治療；
（ｉｖ）治療的および予防的ワクチン接種を包含するインビボワクチン接種；
（ｖ）Ｔ細胞応答の誘導を包含する免疫応答の導出；
（ｖｉ）成長する腫瘍もしくは慢性感染性疾患の治療
に適する。
【００６４】
上の態様（１０）の製薬学的組成物および態様（１１）の医薬は、好ましくは、インフルエンザおよび／もしくは他の感染症に対する医薬として適する。該組換えインフルエンザウイルスは、不活性化された製剤の形態で存在してよいか、もしくは、生存組換えウイルスの形態で、好ましくは弱毒化ウイルスとして存在してよい。
【００６５】
生存組換えウイルスワクチン、生存しかし弱毒化された組換えウイルスワクチン、もしくは不活性化組換えウイルスワクチンを処方することができる。不活性化ワクチンはそれらの感染性が破壊されているという意味において「死んでいる」。理想的には、感染性はその免疫原性に影響を及ぼすことなく破壊される。不活性化ワクチンの製造のためには、組換えウイルスを細胞培養物もしくはニワトリ受精卵中で成長させ、精製し、そしてホルムアルデヒドもしくはβ−プロピオラクトンにより不活性化してよい。生じるワクチンは通常、筋肉内で投与する。
【００６６】
不活性化ウイルスは、免疫学的応答を高めるための適するアジュバントとともに処方してよい。こうしたアジュバントは、限定されるものでないが、鉱物ゲル、例えば水酸化アルミニウム、プルロニック多価アルコールのような界面活性剤、リソレシチン、ペプチド、油乳剤およびＢＣＧのような潜在的に有用なヒトアジュバントを挙げることができる。
【００６７】
多くの方法、例えば経口、皮内、筋肉内、腹腔内、皮下もしくは鼻内経路を、上のワクチン製剤を導入するのに使用してよい。生存組換えウイルスワクチンを使用する場合は、製剤をインフルエンザウイルスの天然の感染経路を介して導入することが好ましい。
【００６８】
上の態様（１１）、（１４）および（１６）の作用物質は、好ましくはインフルエンザおよび他の感染症に対する予防的もしくは治療的ワクチン接種、または双方に適する。例えば、組換えウイルスは、いくつか例を挙げればＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、パピローマウイルスに対するワクチンでの使用のため作成することができる。一態様において、該組換えウイルスは該ウイルスの表面タンパク質の遺伝子を、別のものにおいては非構造的もしくは調節遺伝子の遺伝子を含有する。該組換えウイルスは不活性化製剤の形態で存在してよいか、または、生存組換えウイルスの形態で、もしくは生存しかし弱毒化されたウイルスとして存在してよい。弱毒化ウイルスにおいて、組換えウイルスは、単一のもしくはせいぜい非常に少ない繁殖周期（１回もしくは複数）を経てそして十分なレベルの免疫応答を誘導することができるが、しかし疾患を引き起こすことができない。こうしたウイルスは不可欠のインフルエンザ遺伝子の１個を欠くか、もしくは温度感受性を導入するための突然変異を含有する。
【００６９】
本発明の上の態様（１１）、（１４）および（１６）の作用物質は、エクスビボおよびインビボの応用スキームで応用可能である。態様（１４）の作用物質によって発現されるべきＲＮＡ分子は、標的の細胞ｍＲＮＡ分子に関してアンチセンス配列もしくは二本鎖配列（アンビセンスの二方向転写において）のものである。態様（１４）において、該作用物質は、好ましくはＲＮＡアンチセンスもしくはリボザイム妨害機構による配列特異的遺伝子不活性化に好ましく適する。
【００７０】
態様（１３）のタンパク質もしくは糖タンパク質の製造方法は、好ましくは、当業者の一般的知識内の標準的技術に従って組織培養細胞もしくはニワトリ受精卵中で実施する。発現されるべきタンパク質もしくは糖タンパク質は、上で定義されるところのモノシストロニックもしくはバイシストロニック配置でウイルス中に組込まれるものである。
【００７１】
本発明の態様（１２）、（１７）および（１８）の方法は、エクスビボ療法もしくはインビトロ研究に使用される、哺乳動物（すなわちワクチン接種、インフルエンザ治療もしくは体細胞遺伝子治療の必要な患者）への有効量の投与、または細胞系（抗原提示細胞、細胞培養物などを包含する）への十分な感染用量の該組換えウイルスの投与を包含し、それにより、該量および用量は、それぞれの技術分野のもしくは所望の治療の知識の豊富な当業者により決定することができる。ヒト患者の治療のためには、上に定義されるところのヒトインフルエンザウイルスの使用が好ましい。
【００７２】
態様（１８）の方法は欧州特許第ＥＰ  ００１２３６８７．６号明細書（これにより引用することにより組み込まれる）に開示される。とりわけ、前記方法は、
（ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）もしくはウイルス関連抗原（ＶＡＡ）をコードするヌクレオチド配列を含有する組換えインフルエンザウイルスを製造すること、および
（ｂ）段階（ａ）で得られた組換えインフルエンザウイルスに樹状細胞を感染させることによる、樹状細胞による１種もしくはそれ以上のＴＡＡもしくはＶＡＡの発現を含んで成る。
【００７３】
ＴＡＡもしくはＶＡＡをコードするヌクレオチド配列は、バイシストロニック配置の正規のセグメントの１個において、もしくは下に詳細に説明されるところの付加的なセグメントとして組換えインフルエンザウイルス中に存在してよい。
【００７４】
腫瘍抗原を提示する樹状細胞を用いるワクチン接種は、強力な一次免疫応答を誘導することができるか、もしくは存在する細胞傷害性抗腫瘍Ｔ細胞応答を増幅することができる。従って、免疫療法に最も適する腫瘍抗原は、理想的には、厳格に腫瘍特異的であるか、もしくは、少なくとも免疫応答が腫瘍特異性を有するべきである。しかしながら、多くの腫瘍抗原は腫瘍により正常細胞と共有され、そして腫瘍中で過剰発現されるのみである。これは、免疫応答は、自己抗原に対する免疫応答が起きて自己免疫状態を引き起こす場合に潜在的に有害である可能性があることを意味する。ＤＣワクチンのための技術は、従って、腫瘍特異的Ｔ細胞応答の十分な質および大きさの免疫応答をもたらさなければならない。
【００７５】
腫瘍特異的抗原はまれである。しかしながら、多様な組織学的型の腫瘍のかなりの比率で、および加えて精巣細胞のみで異常に発現される、精巣抗原の成長する一ファミリーが同定された。ブリュッセルおよびニューヨークのルードヴィヒ癌研究所（Ｌｕｄｗｉｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（ＬＩＣＲ）の科学者および彼らの協力者により発見された、癌／精巣抗原と呼ばれるこれらの抗原は、免疫応答の厳格な腫瘍特異性を確実にするはずである。生殖細胞系細胞はＭＨＣ−Ｉ分子を発現しないからである。
【００７６】
これらの抗原、例えばＭＡＧＥ−、ＧＡＧＥ−およびＢＡＧＥ−ファミリー、ＮＹ−ＥＳＯ−ＩもしくはＨＯＭ−ＭＥＬ−４０（ａｋａ  ＳＳＸ−２）は、従って、強力な樹状細胞ワクチンの一部がインフルエンザウイルスに媒介される遺伝子導入に基づく場合は、ＤＣに基づく抗腫瘍ワクチンの最良の候補である。これらの抗原は、インフルエンザベクター（ｆｌｕ−ｖｅｃｔｏｒ）に基づくＤＣワクチンに必要とされる選択性を有し、組換えウイルスに容易に組込まれることが最もありそうである可能性があり、そして細胞性免疫応答を誘導することが可能である。ＭＡＧＥ−Ａ３由来のエピトープペプチドがＳｃｈｕｌｅｒらにより樹状細胞にＨＬＡ結合（「負荷」）され、そして該ワクチンは患者およびインビトロで特異的ＣＴＬを誘導することが見出された。
【００７７】
さらに、強力な治療的ワクチンに適する腫瘍抗原の数は未だ制限され、そして新規腫瘍抗原ならびにウイルス抗原に対する探索は正当化されると思われる。インフルエンザウイルスベクター系は抗原の発見に適する（上を参照されたい）。ＬＩＣＲ抗原との前記抗原の共発現は、ワクチンスペクトルを拡大するための重要な一選択肢である。
【００７８】
実験において、腫瘍関連抗原を発現する遺伝的に改変されたＤＣが抗腫瘍免疫を効率的に誘導しかつ従って癌治療におけるツールとしての高い潜在性を有する可能性があることが示された。遺伝子送達はウイルスベクターにより最も効率的に達成される。ＭＡＧＥ−３のような黒色腫由来ＴＡＡ、もしくは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子を、高発現トリインフルエンザウイルスベクターに導入した。これらの組換え体により感染した単球由来成熟ＤＣは、ＧＦＰもしくはＭＡＧＥ−３を効率的に産生した。感染したＤＣの９０％以上が、形質導入された遺伝子を発現することができる。重要なことには、これらの形質導入されたＤＣは、それらの特徴的表現型、すなわちそれらの強力な同種Ｔ細胞刺激能力を保持し、そしてＭＡＧＥ−３特異的ＣＤ８＋  細胞傷害性Ｔ細胞を刺激することが可能であった。従って、インフルエンザウイルスベクターは、ヒトＤＣをＴＡＡで形質導入するための高度に効率的な遺伝子送達系を提供し、結果としてＴＡＡ特異的Ｔ細胞を刺激する。
【００７９】
本発明の態様（１７）の作用物質は、好ましくは、患者由来の免疫細胞を感染、トランスフェクトもしくは形質導入するのに利用される。該作用物質は癌もしくは慢性ウイルス感染症の治療に適する。この目的上、患者由来の免疫細胞、好ましくは樹状細胞を、例えば腫瘍抗原もしくはウイルス抗原を発現する組換えインフルエンザウイルスにエクスビボで感染させる。その後、形質導入された細胞を患者に再導入する。
【００８０】
本発明の態様（１８）の好ましい免疫治療方法は自己免疫療法であり、ここでエクスビボ感染させる細胞は患者由来であり、また、形質導入された細胞を患者に再導入する。この方法により治療されるべき疾患は癌および慢性ウイルス感染症を包含する。樹状細胞での治療の製剤に関する詳細については、上の態様（１２）の論考を参照されたい。
【００８１】
本発明の態様（１８）の抗原に対する免疫応答の誘導方法は、真正のコンホメーションの組換えインフルエンザウイルスの一部としてのタンパク質もしくは糖タンパク質抗原の投与後に、糖タンパク質を包含する外来タンパク質に対する抗体を誘導するのに適し、それにより、該ウイルスを血球凝集反応に基づく穏やかな手順により精製し、また、遺伝子が感染した細胞中で高速度で発現される。これらの抗原の１個をコードする適する外来遺伝子は、疾患、好ましくは感染性疾患もしくは腫瘍性疾患に関連するポリヌクレオチド配列であり、好ましくは、該抗原は、限定されるものでないが、
（ｉ）ＨＩＶ抗原ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｒｅｖ、ｔａｔ、ＮＣ、ＨＢＶ  ｅ−抗原もしくはコア抗原、ＨＰＶ  Ｅ６もしくはＥ７抗原、単純疱疹ウイルス糖タンパク質もしくはコアタンパク質、他のヘルペスウイルス抗原のようなウイルス関連抗原、ならびに当業者に既知のさらなるウイルスおよび微生物抗原、
（ｉｉ）腫瘍関連抗原、とりわけ、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥおよびＧＡＧＥファミリーの抗原、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原、ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０により例示されるＳＳＸ抗原により例示されるいわゆる癌精巣抗原
を挙げることができる。
【００８２】
上のポリヌクレオチド配列は、
（ｉ）腫瘍細胞、もしくは精巣細胞、もしくはウイルスに感染した細胞、もしくは微生物に感染した細胞、もしくは細胞系から単離されたｃＤＮＡライブラリーから派生可能であり、
（ｉｉ）ヘマグルチニン膜固定配列との融合タンパク質、あるいは、ウイルスもしくは他の病原体、または腫瘍関連抗原中に存在するところの１種もしくはそれ以上のＴ細胞特異的エピトープ配列由来のエピトープよりなるポリペプチドである。
【００８３】
インフルエンザウイルスは広範な宿主範囲を有するため、組換えインフルエンザウイルスは、限定されるものでないが、家禽、ブタ、ウマ、アザラシおよびマウスを挙げることができる広範な動物において強い免疫応答を得かつそれらから抗体を単離するのに使用することができる。さらに、マウスに適合されたインフルエンザウイルスは、鼻内経路を包含するいくつかの経路によるマウスの感染に使用することができる。これは、咽頭粘膜細胞の感染をもたらし、かつ、付加的な型のＢ細胞応答（例えばＩｇＡに対するＩｇＧの比で認識されるような）をもたらす。マウスは、ヒト抗体を発現するよう工作されているトランスジェニックマウスにおける免疫応答の誘導でとりわけ有用である。インフルエンザウイルスを精製するのに血球吸着現象に基づく穏やかな手順を使用するため、本来のコンホメーションの抗原に対する抗体を、感染した哺乳動物から単離することができる。
【００８４】
本発明の態様（１９）および（２１）のワクチンは、さらなる成分、例えば上に示された製薬学的組成物もしくは作用物質に関して示されたものを含有してよい。
【００８５】
本発明の態様（２２）に関して、第ＰＣＴ／ＥＰ００／０９２１７号明細書（これで引用することにより組み込まれる）が言及される。態様（２２）の方法は抗原提示細胞の遺伝子機能を研究するのにもまた適する。
【００８６】
本発明は、下で、図面および実施例の以下の記述によってより詳細に記述されるが、しかしながら、これらは本発明を制限するように解釈されるべきでない。
表および図面の詳細な記述
【００８７】
【表２】
2004531232.tif 000003
【００８８】
表１．プラスミドｐＨＬ１８４４でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の感染、次いでＭＤＣＫ細胞中での生じる組換え子孫ウイルスの繁殖にてヘルパーウイルスとして使用された、再結合されたウイルス株。
標準のＦＰＶ（＝１００）に関しての、２９３ＴおよびＭＤＣＫ（初代ウイルス継代）細胞ライセート中のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ酵素活性。
図１：選択された組のインフルエンザウイルス株における関連するＰＢ１アミノ酸位置の比較。ＦＰＶ  ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）（線１）とＷＳＮ／３３（線３）の間の２２アミノ酸位置の相違を、ウイルス単離物の大きな代表的群の情況で比較した。ＷＳＮのみに存在しかつ他のＰＢ１配列に存在しないアミノ酸残基に下線を付けた一方、全部の他の株に対し是認されるところのＦＰＶ  ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）を特徴づけるそれらの４アミノ酸残基を太字で示す。
図２：第一の組のＷＳＮ／ＦＰＶ−ＰＢ１構築物のキメラ構造およびプロモーター認識の熟達の決定；それ以外はＷＳＮ由来ＰＢ１内のＦＰＶ配列の区分を太い内張りで示し；ＷＳＮ（ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＰＢ１）およびＦＰＶ（ｐＨＬ３１１５；ｐＨＬ１８４４）を比較のため包含する。２９３Ｔ細胞中でのキメラウイルスの生成に際して、ストックをＭＤＣＫ細胞で調製した。元はｐＨＬ１１０４に存在するところの標準的プロモーター上昇変異を運搬するプラスミドｐＨＬ１８４４によりトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を、ヘルパーウイルスとして多様なウイルス構築物によりｍ．ｏ．ｉ．１で感染させた（ｐＨＬ３１３０およびｐＨＬ３１１５由来のウイルス株のみはそれぞれｍ．ｏ．ｉ．０．２および０．５）。ウイルス子孫を含有する生じる上清を、ＭＤＣＫ細胞でのウイルス継代に使用した。トランスフェクトされたかつ／もしくは感染した双方の細胞からの細胞ライセートを、プラスミド上昇変異体ｐＨＬ１８４４を認識することが既知のＭＤＣＫ細胞中でのｐＨＬ１８４４組換えＦＰＶウイルス（＝１００）に関するＣＡＴ活性測定に使用した。
【００８９】
６個の「大きな」アミノ酸置換の位置と一緒のＰＢ１タンパク質配列内の機能的要素の選択を図の第一行に示した。ｖＲＮＡ（ｖ１、ｖ２）もしくはｃＲＮＡ（ｃ１、ｃ２）プロモーターの提案された結合領域、ならびに５’（×５）および３’（×３）ｖＲＮＡ末端の既知の架橋部位に印を付ける。Ｐはポリメラーゼ活性の活性中心を指す（ＰＢ１：４４５−４４７）。アミノ酸交換はＦＰＶ残基の上にＷＳＮ残基により示す。例えば、Ｓ／Ｐはアミノ酸置換Ｓ３８４Ｐ（ＷＳＮ／ＦＰＶ）を指す。
図３：第二のより詳述された組のＷＳＮ／ＦＰＶ構築物のキメラ構造およびプロモーター認識の熟達の決定。実験の詳細の記述については図２を参照されたい。
【実施例】
【００９０】
プラスミドｐＨＬ１８４４：ＣＡＴ遺伝子を含有する発現プラスミドｐＨＬ１８４４を、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩによる偽ｖＲＮＡ合成のため設計し、そして双方がｃＤＮＡ挿入物に関して隣接する位置で、ヒトｒＤＮＡコアプロモーター領域（−４１１ないし−１）およびマウスｒＤＮＡターミネーター領域（成熟２８Ｓ  ｒＲＮＡの３’端に関して＋５６６ないし＋７８５）を運搬する。間に挿入されたｃＤＮＡ構築物は、ＦＰＶ  ｖＲＮＡセグメント５中に存在するところの５’および３’非コーディング配列よりなり、ＮＰコーディング配列それ自身は、ＲＮＡポリメラーゼＩ転写に関してアンチセンスの向きで細菌起源のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のコーディング配列と交換されている。ｐＨＬ１８４４は、元はプラスミドｐＨＬ１１０４に導入されたように（Ｎｅｕｍａｎｎ  Ｇ．，Ｈｏｂｏｍ  Ｇ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．Ｊｕｌ．；７６（Ｐｔ  ７）：１７０９−１７（１９９５））、３’ウイルスＲＮＡプロモーター配列中に３個の点突然変異（３’−Ｇ３Ａ、Ｕ５Ｃ、Ｃ８Ｕ：３’−ＵＣＡＵＣＵＵＵＧＵＣＣＣＣＡＵ）を運搬する。
【００９１】
ＷＳＮ／ＦＰＶ−ＰＢ１キメラのプラスミド構築：元のプラスミドＷＳＮ−ＰＢ１（ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＰＢ１；Ｎｅｕｍａｎｎ  Ｇ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ａｕｇ．３；９６（１６）：９３４５−５０（１９９９））、および、ＢｓｍＢＩ切断（Ｍｅｎｋｅ  Ａ．とＨｏｂｏｍ  Ｇ．、未発表）を介してｐＨＨ２１（Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｅ．，Ｊｕｓｔｕｓ  Ｌｉｅｂｉｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ  Ｇｉｅｓｓｅｎ（１９９７））への挿入のため設計したＰＢ１末端プライマーオリゴヌクレオチドを使用してＦＰＶ  ｖＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより得られたところのＦＰＶ−ＰＢ１を、出発点として使用した。フラグメントは、相同の独特の制限部位での制限切断により、もしくは相同な位置に「欠落した」制限部位を挿入するよう設計されたＰＣＲ反応後のいずれかに交換され、そしてプライマーオリゴヌクレオチドの１個内に包含される。全部のＰＣＲ由来構築物は、一方法もしくは別の方法で挿入された領域全体を配列決定することにより確認した。
【００９２】
細胞およびウイルス：インフルエンザウイルス株Ａ／ＦＰＶＢｒａｔｉｓｌａｖａ（Ｈ７／Ｎ７）およびＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１／Ｎ１）、ならびに全部のウイルス遺伝子交雑物もしくはＰＢ１キメラウイルス構築物は、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞中で成長させた。ヒト２９３Ｔ細胞を、ＤＮＡトランスフェクション、およびヘルパーウイルスとして使用されたＦＰＶもしくは多様な他の株との連続重複感染に使用した。生じる組換えインフルエンザウイルスをＭＤＣＫ細胞中で繁殖させた。全部の細胞系は、１０％ウシ胎児血清および抗生物質を補充されたダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ）中で成長させた。
【００９３】
感染性ＷＳＮ、ＦＰＶおよびＦＰＶ／ＷＳＮ−ＰＢ１キメラインフルエンザウイルスの生成：コンフルエント以下の２９３Ｔ細胞を、Ｎｅｕｍａｎｎら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６，９３４５−９３５０（１９９９）に従ったインビボ転写によりインフルエンザｖＲＮＡ分子の８種の異なる種を生じる８種のＲＮＡポリメラーゼＩプラスミドの組で、初期ウイルスｍＲＮＡおよびタンパク質すなわちＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰおよび（相反して）ＮＳ２の合成のための第二の組の４ないし５種のＲＮＡポリメラーゼＩＩ発現プラスミドと一緒に、トランスフェクトした。初期ＦＰＶウイルスタンパク質の発現のための後者のプラスミド（ｐＣＭＶ−ＰＢ１、ｐＣＭＶ−ＰＢ２、ｐＣＭＶ−ＰＡ、ｐＣＭＶ−ＮＰ、ｐＣＭＶ−ＮＳ２（Ａ．ＭｅｎｋｅとＧ．Ｈｏｂｏｍ、未発表））は、それぞれ：１μｇ／１μｇ／０．１μｇ／１μｇ／０．３μｇの量で使用した一方、８種のＲＮＡポリメラーゼＩ  ｖＲＮＡプラスミドの組については各１μｇを使用した。この範疇のＦＰＶプラスミドの組全体は、ｐＨＨ２１へのＲＴ−ＰＣＲクローニングにより得た（Ｍｅｎｋｅ  Ａ．とＨｏｂｏｍ  Ｇ．，未発表）一方、ＷＳＮの対応する組、すなわちｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＰＢ１、ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＰＢ２、ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＰＡ、ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＨＡ、ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＮＰ、ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＮＡ、ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−Ｍ、ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＮＳは、Ｇ．Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｍａｄｉｓｏｎから得た。２つの連続の間の混合物を、ＷＳＮ−ＦＰＶウイルス遺伝子交雑物の生成に使用し、また、ＷＳＮ／ＦＰＶ−ＰＢ１キメラウイルスの生成のために、ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＰＢ１を、対応するプラスミド構築物により置換した。プラスミドの合わせられた組を、６μｌのリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ）および８μｌのリポフェクタミン  プラス（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ｐｌｕｓ）と一緒の３μｇのプラスミドＤＮＡの比でのリポフェクタミン  プラス（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ｐｌｕｓ）を用いるＤＮＡトランスフェクションのための調製で混合し、そして下述されるとおり処理した。あるいは、Ｈｏｆｆｍａｎｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７，６１０８−６１１３（２０００）の一組の８種のプラスミドのみを、再度、正規のＷＳＮ−ＰＢ１コーディング配列の交換においてＰＢ１セグメントのキメラ構築物とともに代わりに使用した。４８ないし７２時間後に、ＤＮＡでトランスフェクトされた２９３  Ｔ細胞の上清をＭＤＣＫ細胞での継代、ならびに直接もしくはその後また、プラーク精製およびウイルス株の生成で達成される収量の決定にも使用した。ウイルスストックの調製に際して、とりわけＰＢ１  ｖＲＮＡの構築物ならびに他者を、ＲＴ−ＰＣＲ分析、および得られたＰＣＲバンドの診断的制限切断を介して確認した。
【００９４】
ｐＨＬ１８４４プラスミドＤＮＡのトランスフェクションおよびインフルエンザウイルス感染：ｐＨＬ１８４４  ＤＮＡのトランスフェクションのために、われわれは約３．６×１０６個のコンフルエント以下の２９３Ｔ細胞を使用した。簡潔には：１８６μｌの血清を含まないＤＭＥＭ中の３μｇのプラスミドＤＮＡを６μｌのリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）および８μｌのリポフェクタミン  プラス（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ）（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ）と穏やかに混合し、そして室温で３０分間インキュベートした。その間に、血清を含まない培地で細胞を洗浄し、そして培地で３ｍｌまで満たされたトランスフェクション混合物を細胞の上に慎重に分散させた。６時間のインキュベーション後に、培地を１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭに変え、そしてさらに１５時間インキュベートした。トランスフェクトされた細胞をＰＢＳ＋（２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；３．４ｍＭ  ＣａＣｌ２が添加された）で非常に慎重に洗浄し、そして１ｍｌのＰＢＳ＋中２〜３のｍ．ｏ．ｉ．のＦＰＶヘルパーウイルスに重複感染させた。１時間後に細胞を洗浄し、そして最終的に、別の８時間のインキュベーションのため、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭを再供給した。ウイルスの完全な複製周期がこの期間に起こる。
【００９５】
ウイルスを含有する上清の連続継代：８時間のウイルス繁殖後に、子孫ウイルスを含有する上清を収集し、そして細胞破片除去のための短い遠心分離段階（１００００ｒｐｍ、５分）後に、それを、以前に記述された（Ｆｌｉｃｋ  Ｒ．ら  ＲＮＡ，Ｏｃｔ．；２（１０）：１０４６−５７（１９９６））とおりコンフルエントなＭＤＣＫ細胞上で組換えウイルス混合物を継代するのに使用した。
【００９６】
ＣＡＴアッセイ：１１０μｌの細胞抽出物をＧｏｒｍａｎら（１９８２）により記述されたとおり調製した。最初の連続において、５０μｌの各細胞ライセート、および得られたデータに依存して、また連続して希釈された量の多様な細胞ライセート（常に平行して１種もしくはそれ以上の参照反応からの物質を包含する）を、１０μｌの４ｍＭアセチルＣｏＡおよび８μｌの蛍光標識クロラムフェニコール（ボロンジピロメタンジフルオリド蛍光団：ＢＯＤＩＰＹ  ＣＡＭ基質、ＦＬＡＳＨ  ＣＡＴキット、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））と混合した。サンプルを３７℃で３時間インキュベートした。反応生成物を抽出するために０．５ｍｌの酢酸エチルを添加し、そして１３０００ｒｐｍで３分間の遠心分離段階後に、アセチル化生成物を含有する上層を新たなエッペンドルフチューブに移しかつ真空乾燥した。
【００９７】
生じるペレットを２０μｌの酢酸エチルに再懸濁し、そして反応生成物をクロロホルムおよびメタノール（８７：１３）の溶媒混合物（移動相）を使用する薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣプレート２０／２０ｃｍ、シリカゲル６０）により分離した。最後に、反応生成物をＵＶ照明により可視化し、写真により文書化し、そしてウィンカム（ＷｉｎＣａｍ）系（サイバーテック（Ｃｙｂｅｒｔｅｃｈ）、ベルリン）を使用して評価した。活性の比は、各場合で生成物形成の３０〜５０％より下を生じるまでの細胞ライセートの独立した３組の連続希釈に基づき、参照構築物ｐＨＬ１８４４に関して計算した。結果を表１ならびに図２および３の右側の欄に要約する。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】発明にかかる、ＦＰＶ、ＷＳＮおよび他者のようなインフルエンザＡ型ウイルスのＰＢ１セグメント中の変異体アミノ酸位置の比較を示し、番号付けはＷＳＮに関する。下線を付けられたアミノ酸残基はＷＳＮ中で独占的に存在する置換を表す一方、太字のアミノ酸残基はＦＰＶ  ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）でのみ観察されるそれらの置換を指摘する。ＷＳＮのＰＢ１セグメントの完全なＲＮＡ配列を配列番号２４（ヌクレオチド１９１ないし２４６１）に示し、かつ、対応するポリペプチドを配列番号２５に示す一方、ＦＰＶ−ＰＢ１の完全な配列を配列番号２２に示し、そして対応するポリペプチドは配列番号２３を構成する。
【図２】発明にかかる、第一の組のＷＳＮ／ＦＰＶ−ＰＢ１構築物のキメラ構造およびプロモーター認識の熟達の決定；それ以外はＷＳＮ由来ＰＢ１内のＦＰＶ配列の区分は太い内張りで示し；ＷＳＮ（ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＰＢ１）およびＦＰＶ（ｐＨＬ３１１５＝ＷＦ１；ｐＨＬ１８４４）を比較のため包含する。Ｇｏｎｚａｌｅｓ  Ｓ．とＯｒｔｉｎ，Ｊ．（ＥＭＢＯ  Ｊ．１８，３７６７−７５（１９９９））により決定されたところのそれらの現在の実験的境界中のウイルスＲＮＡについての結合部位ｖ１およびｖ２ならびにｃＲＮＡについてｃ１およびｃ２、ならびに、ｖＲＮＡの５’および３’末端ＵＶ架橋部分（ｘ５’およびＸ３’；Ｌｉ，Ｍ．Ｌ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１７，５８４４−５２（１９９８））をＰＢ１の地図中に示す。（Ｐ）はポリメラーゼの活性中心の位置に印を付ける。主要なアミノ酸の逸脱を、ＦＰＶ残基の上にＷＳＮ残基を示して示す。
【図３】発明にかかる、第二のより詳述された組のＷＳＮ／ＦＰＶ構築物のキメラ構造およびプロモーター認識の熟達の決定。
【図４】発明にかかる、使用されたＦＰＶ−ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）−ＰＢ１  ｖＲＮＡ発現プラスミドの遺伝子地図を示し、その正確な５１６９ｂｐのヌクレオチド配列は配列番号２２に示す（ＦＰＶ  ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）野性型ＲＮＡポリメラーゼのＰＢ１セグメントをコードするそのヌクレオチド１９１ないし２４６１は配列番号２３に示す）。
【図５】発明にかかる、使用されたＷＳＮ−ＰＢ１  ｖＲＮＡ発現プラスミドの遺伝子地図を示し、正確な５１６９ｂｐのヌクレオチド配列を配列番号２４に示す（ＷＳＮ野性型ＲＮＡポリメラーゼのＰＢ１セグメントをコードするそのヌクレオチド１９１ないし２４６１は配列番号２５に示す）。
【図６】発明にかかる、ＰＢ１キメラプラスミドｐＨＬ３１０２の遺伝子地図を示し、正確な５１６９ｂｐのヌクレオチド配列を配列番号２６に示す（改変されたＷＳＮ  ＲＮＡポリメラーゼＰＢ１セグメントをコードするそのヌクレオチド１９１ないし２４６１を、以下の「大きな」改変すなわちＬ６２８Ｍ、Ｖ６４４ＡおよびＴ７４１Ａ、ならびに以下の「小さな」改変すなわちＩ５７６Ｌ、Ｈ５８４Ｒ、Ｎ６３３Ｓ、Ｄ６３６Ｅ、Ｉ６４５Ｖ、Ｎ６５４Ｓを伴い配列番号２７に示す）。
【図７】発明にかかる、ＰＢ１キメラプラスミドｐＨＬ３１０３の遺伝子地図を示し、正確な５１６９ｂｐのヌクレオチド配列を配列番号２８に示す（改変されたＷＳＮ  ＲＮＡポリメラーゼＰＢ１セグメントをコードするそのヌクレオチド１９１ないし２４６１を、以下の「大きな」改変すなわちＳ３８４ＰおよびＬ３９６Ｉ、ならびに図１、位置５２ないし４７３に指摘されるところの「小さな」改変を伴い配列番号２９に示す）。
【図８】発明にかかる、ＰＢ１キメラプラスミドｐＨＬ３１３０の遺伝子地図を示し、正確な５１６９ｂｐのヌクレオチド配列を配列番号３０に示す（改変されたＷＳＮ  ＲＮＡポリメラーゼＰＢ１セグメントをコードするそのヌクレオチド１９１ないし２４６１は、以下の「大きな」改変すなわちＳ３８４Ｐ、Ｌ３９６Ｉ、Ｌ６２８Ｍ、Ｖ６４４ＡおよびＴ７４１Ａ、ならびに図１、位置２９８−６５４による「小さな」改変を伴い配列番号３１に示す）。
【図９】発明にかかる、ＰＢ１キメラプラスミドｐＨＬ３１３１の遺伝子地図を示し、正確な５１６９ｂｐのヌクレオチド配列を配列番号３２に示す（改変されたＷＳＮ  ＲＮＡポリメラーゼＰＢ１セグメントをコードするそのヌクレオチド１９１ないし２４６１は、以下の「大きな」改変すなわちＳ３８４ＰおよびＬ３９６Ｉ、ならびに図１、位置２９８−４７３による「小さな」改変を伴い配列番号３３に示す）。
【図１０】発明にかかる、ＰＢ１キメラプラスミドｐＨＬ３２０３の遺伝子地図を示し、正確な５１６９ｂｐのヌクレオチド配列を配列番号３４に示す（改変されたＷＳＮ  ＲＮＡポリメラーゼＰＢ１セグメントをコードするそのヌクレオチド１９１ないし２４６１は、以下の「大きな」改変すなわちＬ６２８Ｍ、Ｖ６４４ＡおよびＴ７４１Ａ、ならびに図１、位置６３３−６５４による「小さな」改変を伴い配列番号３５に示す）。
【図１１】発明にかかる、ＰＢ１キメラプラスミドｐＨＬ３２０４の遺伝子地図を示し、正確な５１６９ｂｐのヌクレオチド配列を配列番号３６に示す（改変されたＷＳＮ  ＲＮＡポリメラーゼＰＢ１セグメントをコードするそのヌクレオチド１９１ないし２４６１は、「大きな」改変を伴わずかつ以下の「小さな」改変すなわちＩ５７６ＬおよびＨ５８４Ｒを伴い配列番号３７に示す）。
【図１２】発明にかかる、ＰＢ１キメラプラスミドｐＨＬ３２４６の遺伝子地図を示し、正確な５１６９ｂｐのヌクレオチド配列を配列番号３８に示す（改変されたＷＳＮ  ＲＮＡポリメラーゼＰＢ１セグメントをコードするそのヌクレオチド１９１ないし２４６１は、「大きな」改変を伴わずかつ以下の「小さな」改変すなわちＩ２９８ＬおよびＩ３６４Ｌを伴い配列番号３９に示す）。
【図１３】発明にかかる、ＰＢ１キメラプラスミドｐＨＬ３２４７の遺伝子地図を示し、正確な５１６９ｂｐのヌクレオチド配列を配列番号４０に示す（改変されたＷＳＮ  ＲＮＡポリメラーゼＰＢ１セグメントをコードするそのヌクレオチド１９１ないし２４６１は、「大きな」改変Ｓ３８４ＰおよびＬ３９６Ｉ、ならびに以下の「小さな」改変すなわちＤ３８３Ｅ、Ｈ４３１Ｔ、Ｎ４６４ＤおよびＬ４７３Ｖを伴い配列番号４１に示す）。
【図１４】発明にかかる、ＰＢ１キメラプラスミドｐＨＬ３２５８の遺伝子地図を示し、正確な５１６９ｂｐのヌクレオチド配列を配列番号４２に示す（改変されたＷＳＮ  ＲＮＡポリメラーゼＰＢ１セグメントをコードするそのヌクレオチド１９１ないし２４６１は、「大きな」改変Ｓ３８４Ｐおよび「小さな」改変Ｄ３８３Ｅを伴い配列番号４３に示す）。
【図１５】発明にかかる、ＰＢ１キメラプラスミドｐＨＬ３２５９の遺伝子地図を示し、正確な５１６９ｂｐのヌクレオチド配列を配列番号４４に示す（改変されたＷＳＮ  ＲＮＡポリメラーゼＰＢ１セグメントをコードするそのヌクレオチド１９１ないし２４６１は、「大きな」改変Ｓ３８４Ｐおよび以下の「小さな」改変すなわちＤ３８３Ｅ、Ｉ５７６ＬおよびＨ５８４Ｒを伴い配列番号４５に示す）。
【図１６】発明にかかる、ＰＢ１キメラプラスミドｐＨＬ３２６８の遺伝子地図を示し、正確な５１６９ｂｐのヌクレオチド配列を配列番号４６に示す（改変されたＷＳＮ  ＲＮＡポリメラーゼＰＢ１セグメントをコードするそのヌクレオチド１９１ないし２４６１は、以下の「大きな」改変をすなわちＳ３８４Ｐ、Ｌ６２８Ｍ、Ｖ６４４ＡおよびＴ７４１Ａ、ならびに以下の「小さな」改変すなわちＤ３８３Ｅ、Ｎ６３３Ｓ、Ｄ６３６Ｅ、Ｉ６４５Ｖ、Ｎ６５４Ｓを伴い配列番号４７に示す）。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年4月12日(2003.4.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインフルエンザウイルスの野性型ＲＮＡポリメラーゼとＦＰＶ  ブラチスラバＲＮＡポリメラーゼとを区別するアミノ酸残基（１個もしくは複数）の最低１個が、ＦＰＶ  ブラチスラバＲＮＡポリメラーゼ中に存在するところの対応するアミノ酸残基（１個もしくは複数）で置き換えられている点で前記ヒトインフルエンザウイルスの野性型ＲＮＡポリメラーゼと異なる、改変されたＲＮＡポリメラーゼをコードするＲＮＡ配列を含んで成る、前記ヒトインフルエンザウイルス。
【請求項２】
タイプＨ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２およびＨ３Ｎ２の株を包含するインフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型ならびにインフルエンザＣ型から選択され、かつ、好ましくは、ＷＳＮ／３３、ＰＲ８／３４などを包含するインフルエンザＡ型タイプＨ１Ｎ１、アジア／５７などを包含するインフルエンザＡ型タイプＨ２Ｎ２、もしくはビクトリア／６８などを包含するインフルエンザＡ型タイプＨ３Ｎ２である、請求項１記載のインフルエンザウイルス。
【請求項３】
置き換えられるべき最低１個の識別するアミノ酸残基が、該ウイルスのＰＢ１セグメント内に配置される、請求項１もしくは２記載のインフルエンザウイルス。
【請求項４】
配列番号２５に示される野性型ＷＳＮ−ＰＢ１ポリペプチドに関して以下のＰＢ１アミノ酸置換Ｓ３８４Ｐ、Ｌ３９６Ｉ、Ｌ６２８Ｍ、Ｖ６４４Ａ、Ｔ７４１Ａの最低１個もしくは全部が果たされており、好ましくは、使用されるインフルエンザウイルス株が、５個の識別するアミノ酸を運搬するＷＳＮ−Ｋ６８である、請求項３記載のインフルエンザウイルス。
【請求項５】
配列番号２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５もしくは４７に示されるＰＢ１セグメントをコードし、好ましくは、前記インフルエンザウイルスが配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４もしくは４６に示されるヌクレオチド配列に対応するＰＢ１（セグメント２）ＲＮＡ配列を含んで成る、請求項３記載のインフルエンザウイルス。
【請求項６】
改変されたＲＮＡポリメラーゼが、前記野性型ヒトインフルエンザウイルスＲＮＡポリメラーゼに関して転写および／もしくは複製の高められた速度をもたらす改変されたｖＲＮＡプロモーター配列を伴うセグメントの認識が可能である、請求項１ないし５のいずれか１つ記載のインフルエンザウイルス。
【請求項７】
改変されたｖＲＮＡプロモーター配列を含むセグメントが、５個までの位置でのヌクレオチド置換により改変されている末端ウイルスＲＮＡ配列を含有して、ｖＲＮＡプロモーターならびに相補配列中に存在するところのｃＲＮＡプロモーター双方の向上された転写速度をもたらす、請求項６記載のインフルエンザウイルス。
【請求項８】
１２ヌクレオチドの保存されたインフルエンザ３’末端配列が、３’端に関して位置３、５および８の前記配列中に存在する１ないし３ヌクレオチドの他のヌクレオチドによる置換により改変されており、かつ／もしくは１３ヌクレオチドの保存されたインフルエンザ５’末端配列が、位置３および８の前記配列中に存在する１もしくは２ヌクレオチドの他のヌクレオチドによる置換により改変されている、請求項７記載のインフルエンザウイルス。
【請求項９】
３’末端ヌクレオチド配列中の置換が、改変Ｇ３ＡおよびＣ８Ｕ、もしくはＧ３ＣおよびＣ８Ｇを含んで成り、好ましくは、３’末端ヌクレオチド配列中の置換が、改変Ｇ３Ａ、Ｕ５ＣおよびＣ８Ｕ、もしくはＧ３Ｃ、Ｕ５ＣおよびＣ８Ｇを含んで成る、請求項８記載のインフルエンザウイルス。
【請求項１０】
（５’）−ＣＣＵＧＵＵＵＣＵＡＣＵ−３’もしくは（５’）−ＣＣＵＧＵＵＵＵＵＡＣＵ−３’の３’末端ヌクレオチド配列を含んで成る、請求項９記載のインフルエンザウイルス。
【請求項１１】
５’末端ヌクレオチド配列が、５’−ＡＧＡＡＧＡＡＵＣＡＡＧＧの５’末端配列をもたらす改変Ｕ３ＡおよびＡ８Ｕを含んで成る、請求項７ないし１０のいずれか１つ記載のインフルエンザウイルス。
【請求項１２】
好ましくは
（ｉ）正常ウイルスゲノムのＲＮＡセグメントに加え（付加的セグメント）もしくはそれらを部分的に置き換える（置換セグメント）外来の組換えもしくは変えられたウイルス遺伝子配列を含み、それにより該付加的なセグメント（１個もしくは複数）および置換セグメント（１個もしくは複数）がモノシストロニック配置で発現されるべきタンパク質をコードする外来のもしくは変えられた遺伝子を含んで成りかつ請求項７ないし１１で定義されるところの改変されたｖＲＮＡプロモーター配列を有する、１個もしくはそれ以上のセグメント；ならびに／または
（ｉｉ）好ましくはアンビセンスもしくはタンデム配置にあり、それによりバイシストロニックｖＲＮＡセグメント（１個もしくは複数）が、発現されるべきタンパク質（１種もしくは複数）をコードしかつ真正のウイルス遺伝子の１個、好ましくはノイラミニダーゼ遺伝子と共有結合にある外来遺伝子（１個もしくは複数）を有し、かつ、請求項７ないし１１で定義されるところの改変されたｖＲＮＡプロモーター配列を有する、１個もしくはそれ以上のバイシストロニックｖＲＮＡセグメント
を含有する、１個もしくはそれ以上の外来組換えもしくは変えられたウイルスタンパク質の高収量発現に適する、請求項１ないし１１のいずれか１つ記載のインフルエンザウイルス。
【請求項１３】
１個もしくはそれ以上の外来遺伝子または１個もしくはそれ以上の変えられたウイルス遺伝子をコードする最低１個の付加的なセグメントをモノシストロニック配置で有する、請求項１２記載のインフルエンザウイルス。
【請求項１４】
最低１個の付加的セグメントが、インフルエンザのコーディング配列への同じ読み枠での融合連結を伴うかもしくは伴わない外来のウイルス、動物、ヒトもしくは他の起源の糖タンパク質をコードし、該糖タンパク質は同時にそれ自身がビリオンのエンベロープ中に組込まれ、好ましくは、ｖＲＮＡおよびタンパク質として組込まれる外来糖タンパク質配列が、接触伝染性豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）、ウシウイルス性下痢性ウイルス（ＢＶＤＶ）、小胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）、マルブルクウイルス、エボラウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ダニ媒介髄膜脳炎ウイルス（ＴＢＥ）、西ナイルウイルスもしくはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のゲノム由来である、請求項１３記載のインフルエンザウイルス。
【請求項１５】
組込まれる外来遺伝子の１種もしくはそれ以上が
（ａ）インフルエンザベクターに感染した細胞により分泌されるヒトもしくは動物起源のリンホカイン、または
（ｂ）一次性に感染した細胞中でもしくは分泌後に近隣の細胞中で有効なアポトーシス誘導遺伝子もしくはトキシン遺伝子の発現
をコードする、請求項１３記載のインフルエンザウイルス。
【請求項１６】
いずれかのヘルパーウイルスの非存在下で遺伝的に安定であり、かつ、アンビセンスＲＮＡ分子（アンビセンスＲＮＡセグメント）であり、かつ全体収束配置でセンスの向きに標準的ウイルス遺伝子の１個およびアンチセンスの向きに外来の組換え遺伝子、もしくはその逆を含有する最低１個のウイルスＲＮＡセグメントを含んで成る、請求項１２記載のインフルエンザウイルス。
【請求項１７】
正規のウイルスＲＮＡセグメントの最低１個が、全体収束配置でセンスの向きに標準的ウイルス遺伝子の１個およびアンチセンスの向きに外来の組換え遺伝子、もしくはその逆を含有するアンビセンスＲＮＡセグメントにより置き換えられる、請求項１６記載のインフルエンザウイルス。
【請求項１８】
アンビセンスＲＮＡ分子中で、前記外来組換え遺伝子がウイルス遺伝子の１個に共有結合される一方、同一遺伝子をコードする元のｖＲＮＡセグメントが、特異的リボザイム切断によって組換えウイルスから欠失されるか、もしくはＲＮＡポリメラーゼＩに促進されるｖＲＮＡ合成プラスミドの組から除外されて感染性ウイルスをもたらすことが可能である、請求項１６もしくは１７記載のインフルエンザウイルス。
【請求項１９】
前記最低１個のアンビセンスＲＮＡセグメントと異なる標準的ウイルスＲＮＡセグメントの１個もしくはそれ以上が、外来遺伝子をコードするｖＲＮＡを含んで成り、好ましくは、正規のウイルスＲＮＡセグメントの１個もしくはそれ以上が、外来遺伝子をコードするｖＲＮＡと交換されており、好ましくは、標準的糖タンパク質ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼの一方もしくは双方が、外来糖タンパク質（１種もしくは複数）、または外来起源（ウイルスもしくは細胞）から得られたヘマグルチニンおよびエクトドメイン由来の固定セグメントよりなる融合糖タンパク質に交換されているか、あるいは、こうした組換え糖タンパク質が、残存する標準的成分に加えて第三の分子種として挿入されている、請求項１６ないし１８のいずれか１つ記載のインフルエンザウイルス。
【請求項２０】
いずれかのヘルパーウイルスの非存在下で遺伝的に安定であり、かつ、タンデム配置で２個の遺伝子をコードするバイシストロニックＲＮＡ分子である最低１個のウイルスＲＮＡセグメント（タンデムＲＮＡセグメント）を含んで成り、前記タンデムＲＮＡセグメント中で、標準的ウイルス遺伝子の１個が外来の組換え遺伝子と共有結合にあり、かつ、前記タンデムＲＮＡセグメントが、近位コーディング領域を取り巻く上流のスプライスドナーおよび下流のスプライスアクセプターシグナルを有する、請求項１２記載のインフルエンザウイルス。
【請求項２１】
タンデムＲＮＡセグメントが、近位位置で外来の組換え遺伝子の後ろの遠位ｍＲＮＡ位置に標準的ウイルス遺伝子の一方を、もしくは逆に、該ウイルス内に存在するところのウイルスＲＮＡに関してアンチセンスの向きで双方を含有する、請求項２０記載のインフルエンザウイルス。
【請求項２２】
正規のウイルスＲＮＡセグメントの最低１個がタンデムＲＮＡセグメントにより置き換えられ、好ましくは、該置き換えられた正規のウイルスＲＮＡセグメントは、ノイラミニダーゼセグメント、ヘマグルチニンセグメントおよびＮＳセグメントから選択される、請求項２０もしくは２１記載のインフルエンザウイルス。
【請求項２３】
スプライスドナーおよびスプライスアクセプターシグナルが、インフルエンザＷＳＮセグメント７および８、もしくは他の部分的に有効なスプライス反応基質中に存在するところの配列から選択され、好ましくは、該スプライスドナーおよびスプライスアクセプターシグナルは、インフルエンザＷＳＮセグメント７中に存在するところの配列から選択される、請求項２０ないし２２のいずれか１つ記載のインフルエンザウイルス。
【請求項２４】
前記最低１個のタンデムＲＮＡセグメントと異なる正規のウイルスＲＮＡセグメントの１個もしくはそれ以上が、該ウイルス遺伝子の１個と共有結合にあってももしくはなくてもよい外来遺伝子をコードするｖＲＮＡを含んで成り、かつ、好ましくは、正規のウイルスＲＮＡセグメントの１個もしくはそれ以上が欠失されそして加えて外来遺伝子をコードするタンデムｖＲＮＡにより置き換えられている、請求項２０ないし２３のいずれか１つ記載のインフルエンザウイルス。
【請求項２５】
タンデムＲＮＡセグメント中の外来遺伝子（１個もしくは複数）が
（ｉ）組換えウイルスに感染した細胞から分泌されるタンパク質および／もしくは糖タンパク質をコードし；
（ｉｉ）Ｂ細胞および／もしくはＴ細胞応答の刺激のための感染した細胞の表面での固有のエピトープの効率的なＨＬＡ制限された提示を支持するよう設計されたタンパク質もしくは人工ポリペプチドをコードし；
（ｉｉｉ）ウイルスの弱毒化を引き起こすヌクレオチド配列であり、好ましくは、該外来遺伝子が、挿入されたリボザイム配列を伴いもしくは伴わずに逆（すなわちセンスの向き）でウイルスノイラミニダーゼ遺伝子の一部をコードし、
好ましくは、センスの向きのノイラミニダーゼ遺伝子のタンデムセグメント部分がヘマグルチニンｖＲＮＡセグメントに結合され、また、場合によっては、別の遺伝子もしくはレポーター遺伝子が第二のタンデムＲＮＡ中で好ましくはＮＳ２とともにコードされる、
請求項２０ないし２４のいずれか１つ記載のインフルエンザウイルス。
【請求項２６】
非インフルエンザ遺伝子または合成遺伝子、あるいは限定されるものでないがアンチセンス遺伝子もしくはリボザイムを挙げることができる遺伝子阻害配列の発現に適し、それにより
（ｉ）非インフルエンザ遺伝子がウイルス遺伝子の１個に共有結合され、
（ｉｉ）非インフルエンザ遺伝子が、外来のエクトドメイン配列とのウイルスＨＡ膜貫通および細胞質領域の融合よりなる膜糖タンパク質を構成する、
請求項１６ないし２５のいずれか１つ記載のインフルエンザウイルス。
【請求項２７】
非トリ、非ヒトインフルエンザウイルスの野性型ＲＮＡポリメラーゼをＦＰＶ  ブラチスラバＲＮＡポリメラーゼと識別するアミノ酸残基（１個もしくは複数）の最低１個が、ＦＰＶ  ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）ＲＮＡポリメラーゼ中に存在するところの対応するアミノ酸残基（１個もしくは複数）で置き換えられているために前記非トリ非ヒトインフルエンザウイルスの野性型ＲＮＡポリメラーゼと異なる改変されたＲＮＡポリメラーゼをコードするＲＮＡ配列を含んで成り、好ましくは請求項２ないし２６のいずれか１つで定義される、前記非トリ、非ヒトインフルエンザウイルス、好ましくはウマもしくはブタインフルエンザウイルス。
【請求項２８】
前記インフルエンザウイルスの野性型ＲＮＡポリメラーゼをコードするＲＮＡ配列を、改変されたＲＮＡポリメラーゼをコードするＲＮＡ配列で置き換えることを含んで成る、請求項１ないし２７記載のインフルエンザウイルスの製造方法。
【請求項２９】
請求項１ないし１１および２７で定義されるところのＰＢ１キメラウイルス、ならびに請求項１２ないし２７で定義されるところの組換えウイルスを製造するのに適し、前記ウイルスは、それらがＲＮＡポリメラーゼＩおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩ双方によりインビボで転写されかつプラスミド挿入物の設計に従って子孫ウイルスを共同で生じさせるような方法で、ウイルスｃＤＮＡもしくは代わりにキメラ（セグメント２：ＰＢ１）およびバイシストロニック組換え（セグメント６：ＮＡ／外来遺伝子）ｃＤＮＡ配列を含有する８種までのｃＤＮＡプラスミドのコトランスフェクションを介して生成される、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
請求項１ないし２７のいずれか１つ記載のインフルエンザウイルスを含んで成る製薬学的組成物。
【請求項３１】
（ｉ）組換えウイルス感染による細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞への遺伝子導入；
（ｉｉ）抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞への遺伝子導入、およびエクスビボ免疫療法のための得られた生成物の使用；
（ｉｉｉ）インビボ体細胞遺伝子治療；
（ｉｖ）治療的および予防的ワクチン接種を包含するインビボワクチン接種；
（ｖ）Ｔ細胞応答の誘導を包含する免疫応答の導出；
（ｖｉ）成長する腫瘍もしくは慢性感染性疾患の治療
に適する、請求項３０記載の製薬学的組成物。
【請求項３２】
（ｉ）ウイルス感染による細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞への遺伝子導入のため；
（ｉｉ）抗原提示細胞への遺伝子導入、およびエクスビボ免疫療法のための得られた生成物の使用のため；
（ｉｉｉ）インビボ体細胞遺伝子治療のため；
（ｉｖ）治療的および予防的ワクチン接種を包含するインビボワクチン接種のため；
（ｖ）Ｔ細胞応答の誘導を包含する免疫応答を導き出すため；
（ｖｉ）成長する腫瘍もしくは慢性感染性疾患を治療するため
（ｖｉｉ）インフルエンザを予防および／もしくは治療するため；
（ｖｉｉｉ）こうしたウイルスにより感染した細胞への外来遺伝子の導入および発現のため；
（ｉｘ）こうしたウイルスにより感染した細胞への外来遺伝子の導入および発現のためであって、好ましくは、発現されるべきＲＮＡ分子は標的細胞の細胞ｍＲＮＡ分子に関してアンチセンス配列もしくは二本鎖配列であり、かつ／または、作用物質は、好ましくはアンチセンスＲＮＡもしくは標的ＲＮＡのリボザイム切断のようなＲＮＡ妨害機構による配列特異的遺伝子不活性化に適し；
（ｘ）免疫療法、好ましくは自己免疫療法のため
の作用物質を製造するための、請求項１ないし２７のいずれか１つ記載のインフルエンザウイルスの使用。
【請求項３３】
細胞培養物中の細胞を、請求項１ないし２７のいずれか１つ記載のインフルエンザウイルスに接触／感染させることを含んで成る、
（ｉ）ウイルス感染による細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞への遺伝子導入；
（ｉｉ）抗原提示細胞への遺伝子導入、およびエクスビボ免疫療法のための得られた生成物の使用；
（ｉｉｉ）細胞培養物中の細胞への外来遺伝子の導入および発現、ならびに細胞へのＲＮＡ分子の導入および発現
の方法。
【請求項３４】
発現ベクターとして請求項１ないし２７記載のインフルエンザウイルスを利用することを含んで成り、好ましくは、細胞培養物細胞もしくはニワトリ受精卵中で実施される、タンパク質もしくは糖タンパク質の製造方法。
【請求項３５】
インフルエンザウイルスが抗原をコードする最低１個の外来遺伝子を含有する、抗原に対する免疫応答を導き出すのに適する作用物質を製造するための、請求項１ないし２７のいずれか１つ記載のインフルエンザウイルス、好ましくは請求項１ないし２６で定義されるところのヒトインフルエンザウイルスの使用。
【請求項３６】
抗原をコードする前記外来遺伝子が、疾患、好ましくは感染性疾患、もしくは腫瘍性疾患と関連するポリヌクレオチド配列であり、好ましくは、該抗原は、限定されるものでないが
（ｉ）ＨＩＶ抗原ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｒｅｖ、ｔａｔ、ＮＣ、ＨＢＶ  ｅ−抗原もしくはコア抗原、ＨＰＶ  Ｅ６もしくはＥ７抗原、単純疱疹ウイルス糖タンパク質もしくはコアタンパク質、他のヘルペスウイルス抗原のようなウイルス関連抗原、ならびに当業者に既知のさらなるウイルスおよび微生物抗原、または
（ｉｉ）腫瘍関連抗原、とりわけ、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥおよびＧＡＧＥファミリーの抗原、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原、ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０により例示されるＳＳＸ抗原により例示されるいわゆる癌精巣抗原
を挙げることができる、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
ポリヌクレオチド配列が、
（ｉ）腫瘍細胞、もしくは精巣細胞、もしくはウイルスに感染した細胞、もしくは微生物に感染した細胞もしくは細胞系から単離されたｃＤＮＡライブラリーに由来することができる、
（ｉｉ）ウイルスもしくは他の病原体、または腫瘍関連抗原中に存在するところの１個もしくはそれ以上のＴ細胞特異的エピトープ配列由来のエピトープよりなる融合タンパク質である、
請求項３５もしくは３６記載の方法。
【請求項３８】
（ａ）請求項１ないし２６もしくは請求項３５ないし３７で定義されるところのヒトインフルエンザウイルスを含んで成るヒトインフルエンザウイルスワクチン（好ましくは、前記ヒトインフルエンザウイルスは膜タンパク質の抗原をコードし、かつ、加えて、ウイルスエンベロープ中に膜タンパク質を含有する）；または
（ｂ）請求項２７で定義されるところのウイルスを含んで成る非ヒトインフルエンザウイルスワクチン、好ましくはウマもしくはブタインフルエンザウイルスワクチン
である、治療もしくは予防目的上のワクチン。
【請求項３９】
ウイルスが
（ｉ）タンデム弱毒化機構に従って弱毒化されることが可能である；
（ｉｉ）制限された複製のみが可能である；もしくは
（ｉｉｉ）不活性化ウイルスである、
請求項３８記載のワクチン。
【請求項４０】
請求項３３の選択肢（ｉ）もしくは（ｉｉ）の方法により得ることが可能な形質導入された細胞、好ましくは抗原提示細胞。
【請求項４１】
好ましくは形質導入された抗原提示細胞、より好ましくは形質導入された樹状細胞、および最も好ましくは成熟樹状細胞を含んで成り、前記抗原提示細胞はインビトロで形質導入される、請求項４０で定義されるところの形質導入された細胞を含んで成るワクチン。
【請求項４２】
（ａ）試験されるべき細胞もしくは微生物から遺伝子バンクもしくはｃＤＮＡバンクを調製すること；
（ｂ）遺伝子バンクのｃＤＮＡもしくはＤＮＡを、請求項１ないし２７で定義されるところのインフルエンザウイルスのゲノム中に組込んで組換えウイルス粒子を生じさせること、
（ｃ）それらの表面上でのＨＬＡ−クラスＩ分子および／もしくはＨＬＡ−クラスＩＩ分子の発現が可能である不死化自己細胞を、段階（ｂ）で得られた組換えウイルス粒子に感染させること、
（ｄ）自己細胞中で遺伝子バンクの前記ｃＤＮＡもしくは前記ＤＮＡによりコードされるタンパク質を発現させること、および、自己細胞により産生されたタンパク質もしくは細胞表面のフラグメントをＨＬＡ分子とともに提示させること；
（ｅ）Ｔ細胞を自己細胞とともに共培養すること；ならびに
（ｆ）それらの表面上に抗原を提示するこうした自己細胞によりＴ細胞を刺激して、それにより前記抗原がＴ細胞により認識されること
の段階を含んで成る、最低１個のＨＬＡ制限されたエピトープをコードするポリヌクレオチド配列の同定方法。
【請求項４３】
請求項４２の段階（ａ）ないし（ｆ）を含んで成る、抗原提示細胞における遺伝子機能の研究方法。
【国際調査報告】
2004531232.tif 000181
2004531232.tif 000182
2004531232.tif 000183
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