(57)【要約】本発明は、造血性疾患、炎症性症状および癌を治療するための方法ならびに組成物に関し、さらに、哺乳類における幹細胞治療を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に精製されたグリコシル化ポリペプチドであって、該グリコシル化ポリペプチドは、配列番号１との類似性が少なくとも９５％であるアミノ酸配列を有し、また、モノクローナル抗体ＨＥＣＡ−４５２の結合特性を有する抗体に結合することを特徴とするグリコシル化ポリペプチド。
【請求項２】
前記グリコシル化ポリペプチドから炭化水素部位を除去するのに十分な条件下において、前記グリコシル化ポリペプチドをＮ−グリコシダーゼＦに接触させることにより、前記抗体への前記グリコシル化ポリペプチドの結合が低下することを特徴とする請求項１記載のグリコシル化ポリペプチド。
【請求項３】
前記グリコシル化ポリペプチドからシアル酸部位を除去するのに十分な条件下において、前記グリコシル化ポリペプチドをシアリダーゼに接触させることにより、前記抗体への前記グリコシル化ポリペプチドの結合が低下することを特徴とする請求項１記載のグリコシル化ポリペプチド。
【請求項４】
前記グリコシル化ポリペプチドからフコース部位を除去するのに十分な条件下において、前記グリコシル化ポリペプチドをフコシダーゼに接触させることにより、前記抗体への前記グリコシル化ポリペプチドの結合が低下することを特徴とする請求項１記載のグリコシル化ポリペプチド。
【請求項５】
前記グリコシル化ポリペプチドがＥ−セレクチンリガンドであって、このとき、Ｅ−セレクチンリガンド活性は、前記グリコシル化ポリペプチド上のＮ−結合炭化水素部部位によって媒介されていることを特徴とする請求項１記載のグリコシル化ポリペプチド。
【請求項６】
前記グリコシル化ポリペプチドがＬ−セレクチンリガンドであって、このとき、Ｌ−セレクチンリガンド活性は、前記グリコシル化ポリペプチド上のＮ−結合炭化水素部部位によって媒介されていることを特徴とする請求項１記載のグリコシル化ポリペプチド。
【請求項７】
配列番号１のアミノ酸配列を有する実質的に精製されたグリコシル化ポリペプチドであって、モノクローナル抗体ＨＥＣＡ−４５２の結合特性を有する抗体に結合することを特徴とするグリコシル化ポリペプチド。
【請求項８】
幹細胞を確認する方法であって、
（ａ）請求項１記載のグリコシル化ポリペプチドに特異的に結合する１種またはそれ以上の物質に被験細胞集団を接触させるが、このとき、該被験細胞集団中に幹細胞が存在する場合には、該物質と幹細胞とがコンプレックスを形成するのに十分な条件下において接触させ；さらに、
（ｂ）該コンプレックスを検出する
各工程を有してなり、それによって幹細胞を確認することを特徴とする方法。
【請求項９】
１種またはそれ以上の前記物質が抗ＣＤ４４抗体であることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
１種またはそれ以上の前記物質が、モノクローナル抗体ＨＥＣＡ−４５２の結合特性を有する抗体であることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１種またはそれ以上の前記物質が、モノクローナル抗体ＨＥＣＡ−４５２の結合特性を有する抗体であることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１２】
幹細胞を確認する方法であって、
（ａ）固相上にＥ−セレクチンポリペプチドを固定し；
（ｂ）被験細胞懸濁物を含む液体サンプルに固相を接触させ、このとき、固相と液体サンプルとの間の相対的移動は、固相表面においてずれ応力が生じるようにし；さらに、
（ｃ）固相に接着した被験細胞を観察する
各工程を有してなり、それによって幹細胞を確認することを特徴とする方法。
【請求項１３】
幹細胞を確認する方法であって、
（ａ）固相上にＬ−セレクチンポリペプチドを固定し；
（ｂ）被験細胞懸濁物を含む液体サンプルに固相を接触させ、このとき、固相と液体サンプルとの間の相対的移動は、固相表面においてずれ応力が生じるようにし；さらに、
（ｃ）固相に接着した被験細胞を観察する
各工程を有してなり、それによって幹細胞を確認することを特徴とする方法。
【請求項１４】
ずれ応力が０．６ｄｙｎｅ／ｃｍ２以上であることを特徴とする請求項１２または１３記載の方法。
【請求項１５】
ずれ応力が少なくとも２．８ｄｙｎｅ／ｃｍ２であることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
ずれ応力が少なくとも１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２であることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
前記被験細胞が血液であることを特徴とする請求項８、１２または１３記載の方法。
【請求項１８】
前記被験細胞が骨髄であることを特徴とする請求項８、１２または１３記載の方法。
【請求項１９】
細胞集団から幹細胞を単離する方法であって、
（ａ）請求項１記載のグリコシル化ポリペプチドに特異的に結合する１種またはそれ以上の物質に被験細胞集団を接触させるが、このとき、該被験細胞集団中に幹細胞が存在する場合には、該物質と幹細胞とがコンプレックスを形成するのに十分な条件下において接触させ；
（ｂ）該コンプレックスを検出し；
（ｃ）該細胞集団から該コンプレックスを除去する
各工程を有してなり、それによって細胞集団から幹細胞を単離することを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記コンプレックスを解離することにより、前記の１種またはそれ以上の物質から幹細胞を分離する工程を追有することを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
細胞集団から幹細胞を単離する方法であって、
（ａ）固相上にＥ−セレクチンポリペプチドを固定し；
（ｂ）被験細胞懸濁物を含む液体サンプルに固相を接触させ、このとき、固相と液体サンプルとの間の相対的移動は、固相表面においてずれ応力が生じるようにし；さらに、
（ｃ）固相に接着した細胞を回収する
各工程を有してなり、それによって幹細胞を単離する方法。
【請求項２２】
細胞集団から幹細胞を単離する方法であって、
（ａ）固相上にＬ−セレクチンポリペプチドを固定し；
（ｂ）被験細胞懸濁物を含む液体サンプルに固相を接触させ、このとき、固相と液体サンプルとの間の相対的移動は、固相表面においてずれ応力が生じるようにし；さらに、
（ｃ）固相に接着した細胞を回収する
各工程を有してなり、それによって幹細胞を単離することを特徴とする方法。
【請求項２３】
ずれ応力が０．６ｄｙｎｅ／ｃｍ２以上であることを特徴とする請求項２１または２２記載の方法。
【請求項２４】
ずれ応力が少なくとも２．８ｄｙｎｅ／ｃｍ２であることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
ずれ応力が少なくとも１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２であることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
哺乳類の造血性疾患を治療する方法であって、請求項１９、２１または２２記載の方法に従って単離された細胞を含有する組成物を該哺乳類に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
哺乳類の癌を治療する方法であって、請求項１９、２１または２２記載の方法に従って単離された細胞を含有する組成物を該哺乳類に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンに対する細胞の親和性を高める方法であって、
（ａ）該細胞を調製し；さらに、
（ｂ）該細胞上の請求項１記載のグリコシル化ポリペプチドの細胞表面における発現または活性を高める１種またはそれ以上の物質に該細胞を接触させる
各工程を有してなり、それによってＥ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンに対する細胞の親和性を高める方法。
【請求項２９】
前記細胞が幹細胞であることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
１種またはそれ以上の前記物質が、ＣＤ４４ポリペプチドをコードしている核酸であることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
１種またはそれ以上の前記物質が、グリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシダーゼポリペプチドをコードしている核酸であることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも１種またはそれ以上の前記物質が、グリコシルトランスフェラーゼをコードしている核酸であることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３３】
幹細胞の移植能を高める方法であって、
（ａ）幹細胞を調製し；さらに、
（ｂ）該幹細胞上の請求項１記載のグリコシル化ポリペプチドの細胞表面における発現または活性を高める１種またはそれ以上の物質に該幹細胞を接触させる各工程を有してなり、それによって幹細胞の移植能を高めることを特徴とする方法。
【請求項３４】
１種またはそれ以上の前記物質が、ＣＤ４４ポリペプチドをコードしている核酸であることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
１種またはそれ以上の前記物質が、グリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシダーゼポリペプチドをコードしている核酸であることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも１種またはそれ以上の前記物質が、グリコシルトランスフェラーゼをコードしている核酸であることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
細胞集団の移植能を高める方法であって、
（ａ）固相上にＬ−セレクチンポリペプチドを固定し；
（ｂ）該細胞集団を含む液体サンプルに固相を接触させ、このとき、固相と液体サンプルとの間の相対的移動は、固相表面においてずれ応力が生じるようにし；さらに、
（ｃ）固相に接着した細胞を回収する
各工程を有してなり、それによって細胞集団の移植能を高めることを特徴とする方法。
【請求項３８】
細胞集団の移植能を高める方法であって、
（ａ）固相上にＥ−セレクチンポリペプチドを固定し；
（ｂ）該細胞集団を含む液体サンプルに固相を接触させ、このとき、固相と液体サンプルとの間の相対的移動は、固相表面においてずれ応力が生じるようにし；さらに、
（ｃ）固相に接着した細胞を回収する
各工程を有してなり、それによって細胞集団の移植能を高めることを特徴とする方法。
【請求項３９】
対象内に移植された幹細胞のレベルを高める方法であって、該対象内の１個またはそれ以上の幹細胞上において、請求項１記載のグリコシル化ポリペプチドの細胞表面量または発現を増加させる物質を該対象に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
対象内に移植された幹細胞のレベルを高める方法であって、請求項３３、３７または３８記載の方法に従って単離された細胞を含有する組成物を該対象に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項４１】
前記対象がヒトであることを特徴とする請求項３７または３８記載の方法。
【請求項４２】
前記対象が造血性疾患に苦しんでいる、または発症の危険性を有することを特徴とする請求項３９または４０記載の方法。
【請求項４３】
前記対象が癌に苦しんでいる、または発症の危険性を有することを特徴とする請求項３９または４０記載の方法
【請求項４４】
前記癌が血液癌であることを特徴とする請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
請求項３９記載の方法であって、
（ａ）イクス・ビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）で幹細胞を調製し；
（ｂ）該幹細胞の細胞表面における発現を高めるのに十分な条件下において、該物質に該細胞を接触させ；さらに、
（ｃ）接触させた該細胞を対象内に導入する
各工程を有してなることを特徴とする方法。
【請求項４６】
対象における造血性疾患を治療する方法であって、対象内で請求項１記載のグリコシル化ポリペプチドの細胞表面量または発現を低下させる物質を対象に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項４７】
対象における造血性疾患を治療する方法であって、
（ａ）対象から血液を採取し；
（ｂ）請求項１記載のグリコシル化ポリペプチドに特異的に結合する１種またはそれ以上の物質に該血液を接触させるが、このとき、該細胞集団中に血液細胞が存在する場合には、該物質と該血液細胞とがコンプレックスを形成するのに十分な条件下において接触させ；
（ｃ）該コンプレックスを検出し；
（ｄ）該血液から該コンプレックスを除去することにより、該血液から該血液細胞を除去し；
（ｅ）該血液を該対象内に再導入する
各工程を有してなり、それによって造血性疾患を治療することを特徴とする方法。
【請求項４８】
対象における造血性疾患を治療する方法であって、
（ａ）対象から血液を採取し、さらに、固相上にＥ−セレクチンポリペプチドを固定し；
（ｂ）該血液に固相を接触させ、このとき、固相と血液との間の相対的移動は、固相表面においてずれ応力が生じるようにし；さらに、
（ｃ）該血液を該対象内に再導入する
各工程を有してなり、それによって白血病を治療することを特徴とする方法。
【請求項４９】
対象における造血性疾患を治療する方法であって、
（ａ）対象から血液を採取し、さらに、固相上にＬ−セレクチンポリペプチドを固定し；
（ｂ）該血液に固相を接触させ、このとき、固相と血液との間の相対的移動は、固相表面においてずれ応力が生じるようにし；さらに、
（ｃ）該血液を該対象内に再導入する
各工程を有してなり、それによって造血性疾患を治療することを特徴とする方法。
【請求項５０】
ずれ応力が０．６ｄｙｎｅ／ｃｍ２以上であることを特徴とする請求項４８または４９記載の方法。
【請求項５１】
ずれ応力が少なくとも２．８ｄｙｎｅ／ｃｍ２であることを特徴とする請求項４８記載の方法。
【請求項５２】
ずれ応力が少なくとも１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２であることを特徴とする請求項４９記載の方法。
【請求項５３】
炎症性疾患を治療する方法であって、請求項１記載のグリコシル化ポリペプチドまたはそれらのフラグメントを対象に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項５４】
幹細胞を用いた治療が可能な疾患を治療する方法であって、請求項１９、２０、２１または２２記載の方法に従って単離された細胞を含有する組成物を哺乳類に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項５５】
前記疾患が、心筋梗塞、パーキンソン病、糖尿病、先天性筋ジストロフィー、卒中、遺伝性／先天性疾患および肝障害を含む群から選択されることを特徴とする請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
対象の造血性疾患に対する感受性を診断または判断する方法であって、
（ａ）請求項１記載のグリコシル化ポリペプチドに特異的に結合する１種またはそれ以上の物質に被験対象由来の細胞集団を接触させるが、このとき、該細胞集団中に細胞が存在する場合には、該物質と該細胞とがコンプレックスを形成するのに十分な条件下において接触させ；さらに、
（ｂ）該コンプレックスを検出する
各工程を有してなり、ここで、該コンプレックスが存在することは、該対象が造血性疾患に罹患している、または感受性を有することを示唆していることを特徴とする方法。
【請求項５７】
被験対象における造血性疾患治療の予後または効果を判断する方法であって、
（ａ）請求項１記載のグリコシル化ポリペプチドに特異的に結合する１種またはそれ以上の物質に被験対象由来の細胞集団を接触させるが、このとき、該細胞集団中に細胞が存在する場合には、該物質と該細胞とがコンプレックスを形成するのに十分な条件下において接触させ；さらに、
（ｂ）該コンプレックスを検出する
各工程を有してなり、それによって、造血性疾患治療の予後または効果を判断することを特徴とする方法。
【請求項５８】
造血性疾患を治療する方法であって、請求項１記載のグリコシル化ポリペプチドに特異的に結合する物質を被験対象に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項５９】
造血性疾患を治療する方法であって、共有結合によって連結している第一ドメインおよび第二ドメインを含む物質を対象に投与する工程を含み、ここで、該第一ドメインは、請求項１記載のグリコシル化ポリペプチドに特異的に結合する化合物を含んでおり、該第二ドメインは毒素を含んでいることを特徴とする方法。
【請求項６０】
前記第一ドメインがＨＣＥＬＬ抗体またはそれらのフラグメントであることを特徴とする請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
前記毒素がジフテリア毒素（ＤＴ）、プソイドモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（ＰＥ）、リシンＡ（ＲＴＡ）、ゲロニン、ポークウィード抗ウイルス性タンパク質およびドデカンドロンを含む群から選択されることを特徴とする請求項５９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
資金援助を受けた研究であることの宣言
本発明は、国立衛生研究所の研究補助金ＮＨＬＢＩ  ＲＯ１  ＨＬ６０５２８およびＣＡ８４１５６を受けてアメリカ合衆国政府の援助の下に行ったものである。政府は、本発明に関して一定の権利を有する。
【０００２】
発明の背景
本発明は、幹細胞を確認し、ならびに、造血性疾患（例えば、白血病など）、癌、炎症性疾患および幹細胞を用いた処置が可能な疾患（例えば、心筋梗塞、パーキンソン病、糖尿病または卒中など）を治療するための組成物およびその使用法を提供する。
発明の概要
造血微小環境における分化した細胞構造は、接着分子が直線特異的に発現することによって厳密に制御されている個々の細胞−細胞、細胞−マトリックスの相互作用によって形成されている。初期のヒト造血前駆細胞（ＨＰＣｓ）は、直線性に関する特異的マーカーの欠如および細胞表面分子であるＣＤ３４の発現によって特徴づけられる。ＨＰＣ上に発現する接着分子は多様であり、ＣＤ４４（「ヒアルロン酸レセプター」、Ｈ−ＣＡＭとしても知られている）、インテグリン類（例えば、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−４など）および免疫グロブリン（例えば、ＩＣＡＭ１など）スーパーファミリー、ならびにセレクチンファミリーのひとつであるＬ−セレクチンなどが挙げられる。Ｌ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）は、接着分子のひとつであり、カルシウム依存性、炭化水素結合性タンパク質である。接着分子としてはその他に、活性化された血管内皮細胞上に発現するＥ−セレクチン（ＣＤ６２Ｅ）、および活性化された血小板および内皮細胞上に発現するＰ−セレクチン（ＣＤ６２Ｐ）が存在する。セレクチンを介した相互作用は、負傷部位における迅速かつ効率的な白血球の循環のみならず、次のような場合における定常的、組織特異的ホーミングにおいて重要である：
（１）末梢リンパ節へのリンパ球のホーミング、（２）ヒトの皮膚ホーミングＴ細胞の皮膚局所性、および（３）造血前駆細胞（ＨＰＣ）の骨髄への侵入。
発明の詳細な説明
本発明は、ヒトの正常な造血前駆細胞上および白血球芽細胞上に発現し、造血細胞Ｅ−セレクチン／Ｌ−セレクチンリガンド（ＨＣＥＬＬ）と称される新規なグリコシル化ポリペプチドに関する。本明細書においては、ＨＣＥＬＬポリペプチドは「ＫＧｌａ  ＣＤ４４」とも記載している。ＨＣＥＬＬは、ＨＥＣＡ−４５２反応性のシアル化フコシル化Ｎ−グリカンを含むＣＤ４４の新規なグリコフォームである。ＨＣＥＬＬポリペプチドはＬ−セレクチンおよびＥ−セレクチンのリガンドである。
【０００３】
また本発明は、ＨＣＥＬＬに特異的に結合する物質と幹細胞とがコンプレックスを形成するのに十分な条件下において、１種類またはそれ以上の物質に被験細胞を接触させることにより幹細胞を確認する方法に関する。コンプレックスを検出し、存在が確認された場合にはその細胞は幹細胞である。適切な結合物質としては、抗ＣＤ４４抗体またはモノクローナル抗体ＨＥＣＡ−４５２の結合特異性を有する抗体が挙げられる。
【０００４】
幹細胞は、固相上にセレクチンポリペプチド（例えば、Ｅ−セレクチンまたはＬ−セレクチンなど）を固定化し、該固相に被験細胞懸濁液を含む液体サンプルを接触させることによっても確認することができる。固相表面においてずれ応力が発生するように、液体サンプルに固相を接触させる。固相に接着している細胞を観察することによって幹細胞を確認する。被験細胞としては例えば、血液または骨髄などを用いることができる。
【０００５】
さらに本発明は、細胞集団から幹細胞（例えば、多機能分化性幹細胞など）を単離するための多様な方法を提供する。ＨＣＥＬＬポリペプチドに特異的に結合する物質と幹細胞とがコンプレックスを形成するのに十分な条件下において、１種類またはそれ以上の結合物質に細胞集団を接触させることにより幹細胞を確認する。コンプレックスの形成を検出し、細胞集団から除去することにより、細胞集団から幹細胞を単離する。さらに、幹細胞／物質のコンプレックスを解離する。
【０００６】
別の方法としては、固相上にセレクチンポリペプチド（例えば、Ｅ−セレクチンまたはＬ−セレクチンなど）を固定化し、該固相に被験細胞懸濁液を含む液体サンプルを接触させることによって幹細胞を単離する。固相表面においてずれ応力が発生するように、液体サンプルに固相を接触させる。固相に接着している細胞を回収することによって幹細胞を単離する。
【０００７】
さらに本発明は、上記の方法に従って単離した細胞を含む組成物を哺乳類に投与することにより、哺乳類における造血性疾患、癌、および幹細胞を用いた処置が可能な疾患を治療する方法（すなわち、幹細胞療法）に関する。
【０００８】
またさらに本発明は、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンに対する細胞の親和性を高める方法を提供するが、このとき、ＨＣＥＬＬポリペプチドの細胞表面における発現または活性を増強させる１種またはそれ以上の物質を細胞に接触させることにより、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンに対する細胞の親和性を高める。適切な物質としては例えば、ＣＤ４４、グリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシダーゼポリペプチドをコードしている核酸などが挙げられる。
【０００９】
本発明は、幹細胞の移植能を高める方法に関し、これは、ＨＣＥＬＬポリペプチドの細胞表面における発現または活性を高める１種またはそれ以上の物質を幹細胞に接触させることにより、幹細胞の移植能を高めるものである。
【００１０】
別の方法としては、固相上にセレクチンポリペプチド（例えば、Ｅ−セレクチンまたはＬ−セレクチンなど）を固定化し、被験細胞集団を含む液体サンプルに固相を接触させることによって細胞集団の移植能を高める。固相表面においてずれ応力が発生するように、液体サンプルに固相を接触させる。固相に接着している細胞を回収する。
【００１１】
対象（例えば、ヒトなど）内における移植幹細胞のレベルの上昇は、対象内の細胞表面のＨＣＥＬＬポリペプチドまたはＨＣＥＬＬポリペプチドの発現を増やす物質を投与することによって達成することができる。適切な物質としては例えば、ＣＤ４４、グリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシダーゼポリペプチドをコードしている核酸などが挙げられる。別の方法としては、上記の方法に従って単離した細胞を含む組成物を対象に投与することにより、対象内における移植幹細胞のレベルを上昇させる。
【００１２】
さらに本発明は、対象における造血性疾患（例えば、白血病など）を治療する方法に関する。造血性疾患は、対象内の細胞表面のＨＣＥＬＬポリペプチドまたはＨＣＥＬＬポリペプチドの発現を減少させる物質を投与することによって治療する。別の方法としては、造血性疾患は、対象から採血し、ＨＣＥＬＬポリペプチドに特異的に結合する物質と血液細胞とがコンプレックスを形成するのに十分な条件下において、１種類またはそれ以上の結合物質に血液を接触させることによって治療する。コンプレックスを検出し、存在が確認された場合には血液から分離する。血液は対象に戻す。
【００１３】
さらに、造血性疾患は、対象から採血し、固相上にセレクチンポリペプチド（例えば、Ｅ−セレクチンまたはＬ−セレクチンなど）を固定化し、該固相に血液を接触させることによって治療する。固相が血液サンプルと接触することにより、固相表面においてずれ応力が発生する。次に、血液を対象に戻す。
【００１４】
さらに、造血性疾患は、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質に特異的に結合する物質を対象に投与することによって治療する。
【００１５】
さらに本発明は、対象にＨＣＥＬＬ糖タンパク質またはそれらのフラグメントを投与することにより、炎症性疾患を治療する方法に関する。
【００１６】
さらにまた本発明は、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質に特異的に結合する物質と対象から採取した細胞集団とがコンプレックスを形成するのに十分な条件下において、１種類またはそれ以上の結合物質に細胞集団を接触させ、形成したコンプレックスを検出することにより、造血器疾患に関する感受性を診断または判定する方法に関する。コンプレックスが存在することは、対象が造血性疾患に罹患している、または感受性を有していることを示唆している。
【００１７】
さらに、本発明は、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質に特異的に結合する物質と対象から採取した細胞集団とがコンプレックスを形成するのに十分な条件下において、１種類またはそれ以上の結合物質に細胞集団を接触させ、コンプレックスが形成した場合にはそれを検出することにより、造血性疾患に関する予後または治療効果を判断する方法に関する。
【００１８】
特に記載していない限り、本明細書において使用している技術用語および科学用語は、本発明の属する分野に関して通常の知識を有する当業者によって通常理解されている意味と同義である。本明細書に記載されている方法および材料と類似または同等の方法および材料を用いて本発明を実施または試験することができるが、適切な方法および材料について以下に記載する。本明細書において引用しているすべての印刷物、特許出願、特許およびその他の参考文献については、参照として全体的に取り入れておく。紛争時には、定義を含む本明細書を照査する。さらに、材料、方法および実施例は、本発明を具体的に説明するためのみのものであり、制限することを意図するものではない。
【００１９】
本発明のその他の特徴および利点については以下の詳細な説明および請求項から明らかである。
【００２０】
図面の簡単な説明
図１Ａは、多様なヒト造血細胞系においてＨＥＣＡ−４５２反応性エピトープが発現していることを示すウェスタンブロットの写真である。
【００２１】
図１Ｂは、グルタルアルデヒドで固定した単層上における造血細胞系細胞の繋留（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）およびローリング（ｒｏｌｌｉｎｇ）を示す棒グラフである（ずれ応力は２．８ｄｙｎｅ／ｃｍ２）。データは、視野あたりのＣＨＯ−Ｅ細胞のローリングを５視野において計数した時の平均±標準偏差で表しており、少なくとも３回の実験を行った。
【００２２】
図２は、単離した新鮮なヒト骨髄内皮細胞上におけるヒト造血細胞のローリングを示す棒グラフである。
【００２３】
図３Ａは、Ｅ−セレクチンリガンド活性についてブロットローリングアッセイを行った結果を示す棒グラフである。
【００２４】
図３Ｂは、ＨＥＣＡ−４５２染色についてＮ−グリコシダーゼ−Ｆ処理を行った結果を示すウェスタンブロットの写真である。
【００２５】
図３Ｃは、ＫＧ１ａ細胞上でＰＳＧＬ−１が発現していることを示すウェスタンブロットの写真である。
【００２６】
図３Ｄは、Ｅ−セレクチンリガンド活性に対するＮ−グリコシダーゼ−Ｆの影響を示すブロットローリングアッセイ膜の写真である。
【００２７】
図４Ａは、抗ＣＤ４４抗体（Ｈｅｒｍｅｓ−１）を用いて徹底的に免疫沈降させたＨＣＥＬＬのＥ−セレクチン結合活性を示すブロットローリングアッセイ膜の写真である。（免疫沈降前）：ＫＧ１ａの全溶解物１０μｇ；（レーン１）：Ｈｅｒｍｅｓ−１免疫沈降第１回目；（レーン２）：Ｈｅｒｍｅｓ−１免疫沈降第２回目；（レーン３）：Ｈｅｒｍｅｓ−１免疫沈降第３回目；（レーン４）：Ｈｅｒｍｅｓ−１免疫沈降を３回実施した後の溶解物残渣。
【００２８】
図４Ｂは、Ｈｅｒｍｅｓ−１抗体を用いて徹底的に免疫沈降させたＨＣＥＬＬのＥ−セレクチン結合活性を示すブロットローリングアッセイ膜の写真であり、ブロットはＨＥＣＡ−４５２抗体で染色した。（免疫沈降前）：ＫＧ１ａの全溶解物１０μｇ；（レーン１）：Ｈｅｒｍｅｓ−１免疫沈降第１回目；（レーン２）：Ｈｅｒｍｅｓ−１免疫沈降第２回目；（レーン３）：Ｈｅｒｍｅｓ−１免疫沈降第３回目；（レーン４）：Ｈｅｒｍｅｓ−１免疫沈降を３回実施した後の溶解物残渣。
【００２９】
図５Ａは、Ｅ−セレクチンを介したＣＨＯ−Ｅ細胞のローリングを示す棒グラフである。ローリングは、ＫＧ１ａ  ＣＤ４４上において２．８ｄｙｎｅ／ｃｍ２で観察されたが、２．８ｄｙｎｅ／ｃｍ２ではＫＧ１ａ  ＰＳＧＬ−１上と比較すると顕著に少なかった（ｐ＜０．００１）。Ｎ−グリコシダーゼ−Ｆ処理およびＬ−フコシダーゼ処理を行ったＫＧ１ａ  ＣＤ４４、ならびＫＧ１ａに膜タンパク質をビブリオ・コレラ（コレラ菌）（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）ノイラミニダーゼ処理した場合には、ＣＨＯ−Ｅ細胞のローリングが阻害された（ｐ＜０．００１）。
【００３０】
図５Ｂは、ＣＨＯ−Ｐ細胞のローリングを示す棒グラフである。ローリングは、ＫＧ１ａ  ＰＳＧＬ−１においては観察されたが、ＫＧ１ａ  ＣＤ４４では観察されなかった（２．８ｄｙｎｅ／ｃｍ２）。負の対照（ＣＨＯ−Ｍｏｃｋ細胞および抗Ｐ−セレクチンモノクローナル抗体ＡＫ−４（１０μｇ／ｍｌ）を用いて作用を阻害する処理を行ったＣＨＯ−Ｐ細胞）においては、ローリングは観察されなかった。
【００３１】
図６Ａは、多様な造血細胞におけるＨＣＥＬＬ活性を示したブロットローリングアッセイ膜の写真である。（１）ヒトＢＭ単核細胞（１０８個）、（２）ＣＤ３４−／直系＋細胞（１０７個）、（３）ＣＤ３４＋／直系−細胞（１０７個）、（４）ＣＤ３４−／直系＋細胞（１０８個）。
【００３２】
図６Ｂは、成人骨髄性白血病（ＡＭＬ）由来の循環性芽細胞におけるＨＥＣＡ−４５２活性に対してＮ−グリコシダーゼ−Ｆ処理を行った場合の影響を示すウェスタンブロットの写真である。
【００３３】
図６Ｃは、アイソタイプ対照またはＨｅｒｍｅｓ−１モノクローナル抗体を用いて免疫沈降させたＡＭＬ（Ｍ５）膜タンパク質（５０μｇ）、ならびにＮ−グリコシダーゼ−Ｆ処理したＨｅｒｍｅｓ−１の免疫沈降物のブロットローリングアッセイの結果を示す膜の写真である。
【００３４】
図６Ｄは、ＡＭＬ（Ｍ０）、ＡＭＬ（Ｍ１）および異型ＣＭＬ（ｂｒｃ／ａｂｌ）の膜調製物（５０μｇ）から沈降されたＣＤ４４、ならびにＢＭ内皮細胞系（ＢＭＥＣ−１、総タンパク質量１００μｇ）のＨＥＣＡ−４５２染色を示す写真であり、Ｅ−セレクチンリガンド活性に関して評価を行った。Ｅ−セレクチンリガンド活性は、１００ｋＤａのバンドのＨＥＣＡ−４５２染色強度と相関していた。
【００３５】
図６Ｅは、ＢＭＥＣ−１におけるＣＤ４４の発現を示すウェスタンブロットの写真である。
【００３６】
図７Ａは、ヒト白血病細胞系Ｋ５６２（レーン１）、ＲＰＭＩ−８４０２（レーン２）、ＨＬ−６０（レーン３）、ＫＧ１ａ（レーン４）、ノイラミニダーゼ処理ＫＧ１ａ（レーン５）およびＯＳＧＥ処理ＫＧ１ａ（レーン６）由来のＨＥＣＡ−４５２反応性膜タンパク質（３０μｇ／レーン）に関するウェスタンブロットの写真である。
【００３７】
図７Ｂは、ＫＧ１ａ細胞全体についてノイラミニダーゼ処理を行い、さらにツニカマイシン処理を行った後、該細胞上にＨＥＣＡ−４５２反応性タンパク質が再発現していることを示すすウェスタンブロットの写真である。レーン１：未処理、レーン２：ノイラミニダーゼ処理、レーン３：ノイラミニダーゼ処理後、ＤＭＳＯで２４時間かけて回復、レーン４：ノイラミニダーゼ処理後、ツニカマイシンで２４時間かけて回復。
【００３８】
図７Ｃは、２−［３Ｈ］−マンノースを用いて代謝的放射ラベルを行い、６％の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で解析を行ったＫＧ１ａ膜タンパク質のオートラジオグラフの写真である。
【００３９】
図７Ｄは、ブロット膜上におけるＬ−セレクチン依存性のリンパ球の繋留およびローリングを示す棒グラフであり、ＨＥＣＡ−４５２活性を有する９８、１２０および１３０ＫＤａのＫＧ１ａタンパク質上、流体力学的流量条件下（２．３ｄｙｎｅ／ｃｍ２）で行った。
【００４０】
図８は、３段階のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（６〜９％のビス／アクリルアミド）精製過程のうちの第３段階から得られた９８ｋＤａのゲルフラグメントに関するＨＥＣＡ−４５２（０．４μｇ／ｍｌ）または抗ＣＤ４４ モノクローナル抗体（Ａ３Ｄ８もしくはＨｅｒｍｅｓ−１（１μｇ／ｍｌ））との反応性を示すウェスタンブロットの写真である。
【００４１】
図９は、Ｌ−セレクチンを介したブロットローリングアッセイの結果を示す膜の写真であり、免疫沈降はＫＧ１ａ  ＣＤ４４を用いて行い、Ｈｅｒｍｅｓ−１（左）またはＨＥＣＡ−４５２（右）で免疫染色した。
【００４２】
図１０Ａは、ＫＧ１ａ細胞から免疫沈降させたＣＤ４４のＬ−セレクチンリガンド活性について、Ｎ−グリコシダーゼ−Ｆ処理を行った場合のブロットローリングアッセイの結果を示す膜の写真である。
図１０Ｂは、ＡＭＬ（Ｍ５）芽細胞から免疫沈降させたＣＤ４４ のＬ−セレクチンリガンド活性についてＮ−グリコシダーゼ−Ｆ処理を行った場合のブロットローリングアッセイの結果を示す膜の写真である。
【００４３】
図１１Ａは、［３５Ｓ］ＳＯ４を用いて放射ラベルし、胆汁酸処理を行わなかったＫＧ１ａ細胞および胆汁酸処理を行ったＫＧ１ａ細胞から免疫沈降されたＣＤ４４のオートラジオグラムの写真である。
【００４４】
図１１Ｂは、胆汁酸処理を行った（＋）ＫＧ１ａ細胞および胆汁酸処理を行わなかった（−）ＫＧ１ａ細胞から免疫沈降されたＫＧ１ａ  ＣＤ４４のＨＥＣＡ−４５２イムノブロットの写真である。Ｌ−セレクチンリガンド活性（倍率２００倍における１視野あたりのリンパ球の平均数／５視野）は、スルフェート化ＫＧ１ａ  ＣＤ４４および非スルフェート化（胆汁酸処理）ＫＧ１ａ  ＣＤ４４において同等であった。
【００４５】
図１２Ａは、図に示すずれ応力の範囲において、グルタルアルデヒド固定した造血細胞系ＫＧ１ａ、ＨＬ６０、Ｋ５６２およびＲＰＭＩ−８４０２上におけるリンパ球のローリングの結果を示す棒グラフである。
【００４６】
図１２Ｂは、図に示すずれ応力の範囲において、グルタルアルデヒド固定した造血細胞系ＫＧ１ａ、ＨＬ６０、Ｋ５６２およびＲＰＭＩ−８４０２上における好中球のローリングの結果を示す棒グラフである。
【００４７】
図１２Ｃは、図に示す回転数において、ＫＧ１ａ、ＨＬ６０、Ｋ５６２およびＲＰＭＩ−８４０２細胞系がＬ−セレクチンを介したリンパ球の結合を支持する能力を評価するために行った、ずれ応力に基づくスタンパー−ウッドラフ（Ｓｔａｍｐｅｒ−Ｗｏｏｄｒｕｆｆ）アッセイの結果を示すグラフである。ＫＧ１ａ細胞に接着したリンパ球数の平均はＨＬ６０細胞に接着したそれの１０倍以上であった（スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）のｔ検定においてｐ＜０．００１）。Ｌ−セレクチンを介したリンパ球の接着は、抗Ｌ−セレクチンモノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）でリンパ球を前処理することにより、ＰＭＡ処理したリンパ球を用いることにより、および／または、５ｍＭのＥＤＴＡを含むアッセイ培地を用いることにより、すべて阻害された。
【００４８】
図１３Ａは、グルタルアルデヒドで固定した造血細胞の単層上におけるＣＨＯ−Ｐ細胞またはｍｏｃｋ形質転換体細胞のローリングを示す棒グラフであり、平行プレートフローチャンバー内で測定した。０．４ｄｙｎｅ／ｃｍ２ においては、Ｐ−セレクチンを介したＣＨＯ−Ｐ細胞のローリングに対するＫＧ１ａ細胞およびＨＬ６０細胞の支持能力は同程度であった。
【００４９】
図１３Ｂは、ＫＧ１ａ細胞およびＨＬ６０細胞上におけるＣＨＯ−Ｐ細胞ローリング相互作用を示すグラフである。相互作用の測定は同様なずれ応力範囲で行い、ＥＤＴＡの存在下においては排除され、また、モカーギン（ｍｏｃａｒｈａｇｉｎ）（１０μｇ／ｍｌ）を用いてＫＧ１ａ細胞およびＨＬ６０細胞を前処理することによって阻害された。
【００５０】
図１４Ａは、Ｈｅｒｍｅｓ−１（ＣＤ４４）およびＰＬ−２（ＰＳＧＬ−１）の免疫沈降物、ならびにＨＣＥＬＬおよびＰＳＧＬ−１のＬ−セレクチンリガンド活性のオートラジオグラフの写真である。
【００５１】
図１４Ｂは、免疫沈降したＫＧ１ａ  ＣＤ４４（１．５μｇ）およびＰＳＧＬ−１（３μｇ）についてのスタンパー−ウッドラフ（Ｓｔａｍｐｅｒ−Ｗｏｏｄｒｕｆｆ）アッセイの結果を示すグラフである。
【００５２】
図１５Ａ〜Ｆは、スタンパー−ウッドラフ（Ｓｔａｍｐｅｒ−Ｗｏｏｄｒｕｆｆ）アッセイにおいてヒトＨＣ  ＣＤ４４またはＰＳＧＬ−１に結合したリンパ球の顕微鏡写真である。イムノアフィニティー精製したＫＧ１ａもしくはＡＭＬ（Ｍ１）のＣＤ４４（１．５μｇ）ならびにＫＧ１ａ  ＰＳＧＬ−１（２または６μｇ）は、方法の項の記載に従って調製し、スタンパー−ウッドラフ（Ｓｔａｍｐｅｒ−Ｗｏｏｄｒｕｆｆ）アッセイにおいてＬ−セレクチンを介したリンパ球の接着に関する分析を行った。ＫＧ１ａもしくはＡＭＬ（Ｍ１）のＣＤ４４（それぞれ、パネルＡおよびＤ）は、Ｎ−グリコシダーゼ−Ｆ処理したこれらのＣＤ４４（パネルＢおよびＥ）、ならびにアイソタイプ対照免疫沈降物であるモノクローナル抗体（Ｈｅｒｍｅｓ−１）単独もしくはＬ−セレクチン免疫沈降物（ＫＧ１ａもしくはＡＭＬ（Ｍ１）についてそれぞれパネルＣおよびＦ）よりも明らかに多数のリンパ球を支持していた。抗Ｌ−セレクチン抗体（１０μｇ／ｍｌ）、５ｍＭのＥＤＴＡを含むアッセイ培地またはＰＭＡ処理（５０ｎｇ／ｍｌ）リンパ球は、リンパ球の吸着を完全に阻害し（ＫＧ１ａもしくはＡＭＬ（Ｍ１）についてそれぞれパネルＣおよびＦに示している）、このアッセイ系におけるリンパ球Ｌ−セレクチンの特異性を証明するものである。
【００５３】
図１６は、ＫＧ１ａ ＣＤ４４およびＰＳＧＬ−１上のＨＥＣＡ−４５２エピトープを示すウェスタンブロットの写真である。
【００５４】
図１７Ａ、Ｂは、ヒト造血細胞系上におけるグルコシルトランスフェラーゼ類（ＦｕｃＴＩＶ、ＦｕｃＴＶＩＩおよびＳＴ３ＧａｌＩＶ）の発現を示す写真である。パネルＡは、ＦｕｃＴＩＶおよびＦｕｃＴＶＩＩのＲＴ−ＰＣＲ発現分析である。レーン１：ＦｕｃＴＩＶ、レーン２：ＦｕｃＴＶＩＩ、レーン３：β−アクチン、およびレーン４：ｄｄＨ２Ｏ。パネルＢは、ＳＴ３ＧａｌＩＶのＲＴ−ＰＣＲ発現分析である。レーン１：ＳＴ３ＧａｌＩＶ、レーン２：β−アクチン、およびレーン３：ｄｄＨ２Ｏ。
【００５５】
発明の詳細な説明
本発明は、正常なヒト造血前駆細胞および白血球芽細胞上において発現される新規なグリコシル化ポリペプチドであって、造血細胞Ｅ−セレクチン／Ｌ−セレクチンリガンド（ＨＣＥＬＬ）と称されるものの発見に部分的に基づく。本明細書においては、ＨＣＥＬＬポリペプチドは、「ＫＧ１ａ  ＣＤ４４」とも称する。ブロットローリングアッセイを行うことにより、ＨＣＥＬＬは、ＨＥＣＡ−４５２反応性のシアリル化フコシル化Ｎ−グリカンを含むＣＤ４４の新規なグリコフォームであることが示された。ＨＣＥＬＬポリペプチドは、Ｌ−セレクチンおよびＥ−セレクチンのリガンドである。ＨＣＥＬＬがＬ−セレクチンおよびＥ−セレクチンリガンド活性を発揮するためには、ラットのモノクローナル抗体であるＨＥＣＡ−４５２によって認識されるシアロフコシル化Ｎ−結合グリカンを必要とし、この活性は硫酸化非依存性である。
【００５６】
ＣＤ４４は、細胞外部分の主要構成成分であるグルコサミノグリカンヒアルロン酸（ＨＡ）に対する細胞表面糖タンパク質レセプターとして広く分布している。ＣＤ４４は、大部分の造血細胞、角化細胞、軟骨細胞、多数の上皮細胞系ならびに数種の内皮細胞および神経細胞を含む多様な細胞において発現される。ＣＤ４４は、細胞−細胞凝集、細胞周囲マトリックスの保持、マトリックス−細胞および細胞−マトリックス間のシグナル伝達、レセプターを介したヒアルロン酸の取込み／分解、ならびに細胞移動をふくむ細胞の広範な機能に関与していることが知られている。これらの機能はすべて、ＣＤ４４−ヒアルロン酸の相互作用に基づいており、硫酸化依存性である。
【００５７】
ＣＤ４４遺伝子をコードしている遺伝子は２０個のエクソンを有しており、初期の文献には１９個のエクソンが記載されているが、このうち、６ａおよび６ｂがエクソン６および７と再分類されたことから、計２０個のエクソンが存在する。ヒト１１番染色体の短腕上に存在している１個の遺伝子がＣＤ４４をコードしているが、２０個のエクソンの内の１２個が交互にスプライシングされることによって生じる複数のｍＲＮＡ転写体が確認されている。標準的かつ最も一般的な型のＣＤ４４（ＣＤ４４類と称する）は、エクソン１〜５、１６〜１８および２０によってコードされているタンパク質から構成されている。この型は、造血細胞上において最も多く存在する型であり、ＣＤ４４Ｈとしても知られている。ＣＤ４４類は、細胞外ドメイン（エクソン１〜５および１６）、高度に保存された膜貫通ドメイン（エクソン１８）および細胞質ドメイン（エクソン２０）を有する。ヒトＣＤ４４類に対応する１４８２ｂｐから構成されるオープンリーディングフレームから、約３７ｋＤａのポリペプチド鎖の翻訳が行われる。Ｎ−結合およびＯ−結合オリゴ糖が翻訳後付加されることにより、最終的なＣＤ４４タンパク質の分子量は約８５ｋＤａになる（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定）。
【００５８】
ＣＤ４４（ＣＤ４４Ｈ）の標準型または造血性イソ型（アイソフォーム）は、約２７０個のアミノ酸から構成される細胞外ドメインを有するＩ型膜貫通分子であり、ここで、該細胞外ドメインは、２０個のアミノ酸から構成されるリーダー配列、２１個のアミノ酸から構成される膜貫通ドメインおよび７２個のアミノ酸から構成される細胞質ドメインを含む。約１８０個のアミノ酸から構成されるアミノ末端は、哺乳類種間で保存されている（相同性は約８５％）。この領域は、６個の保存性システイン、およびＮ−グリコシル化のための６個の保存性コンセンサス部位を含む。Ｎ−グリコシル化のための５個の保存性コンセンサス部位は、１２０個のアミノ酸から構成されるＣＤ４４のアミノ末端に位置している。マウスおよびヒトの細胞系においては、５個の部位すべてが利用されていると考えられている。いくつかの研究においては、細胞特異的Ｎ−グリコシル化によって、ＣＤ４４のＨＡ結合作用が調節されることが示されている。Ｎ−グリコシル化の状態が異なる細胞系および正常Ｂ細胞においては、ＨＡ結合の状態が異なっている。特に、ＨＡ結合細胞由来のＣＤ４４は、ＨＡ非結合細胞由来のそれに比べてグリコシル化の割合が低い。さらに、細胞表面およびＣＤ４４−Ｉｇ融合タンパク質からシアル酸を除去することにより、ＨＡ結合が増強される。従って、本発明のＨＣＥＬＬ ＣＤ４４グリコフォームは、これまでに記載されているいずれのＣＤ４４とも異なったものである。
【００５９】
対照的に、非保存性領域（アミノ酸番号１８３番〜２５６番）においては、哺乳類種間の類似性はわずかに約３５％である。この領域は、ＣＤ４４に対して多様な炭化水素修飾を行うことができる部位、およびＣＤ４４遺伝子の多様なエクソンからさらにアミノ酸配列を挿入するための交互スプライシング部位を含む。
【００６０】
ＨＣＥＬＬポリペプチドは、ＣＤ４４のアミノ酸配列を有し、モノクローナル抗体ＨＥＣＡ−４５２（ＡＴＣＣ番号：ＨＢ−１１４８５）の結合特異性を有する抗体に結合する。ＨＥＣＡ−４５２は、皮膚リンパ球関連抗原を認識する。ＨＣＥＬＬへのＨＥＣＡ−４５２の結合は、Ｎ−グリコシダーゼ−Ｆ、シアリダーゼまたはフコシダーゼで処理することによって低下する。さらに、ＨＣＥＬＬ活性（例えば、Ｅ−セレクチンおよびＬ−セレクチン結合性など）も、Ｎ−グリコシダーゼ−Ｆ、シアリダーゼまたはフコシダーゼ処理によって低下することから、ＨＣＥＬＬの機能においては、シアロフコシル化Ｎ−結合グリカンの存在が重要であることを示している。対照的に、ＣＤ４４をシアリル化することにより、ＣＤ４４のヒアルロン酸への結合が阻害される。さらに、ＣＤ４４のヒアルロン酸への結合は硫酸化によって促進されるが、硫酸化はＨＣＥＬＬのＥ−およびＬ−セレクチン活性に対しては必要ではない。
【００６１】
好ましくは、ＣＤ４４ポリペプチドはＣＤ４４の標準型または造血性イソ型（ＣＤ４４Ｈ）である。別の好ましいＣＤ４４ポリペプチドとしては、Ｒ１（ＣＤ４４Ｒ１）またはＲ２（ＣＤ４４Ｒ２）イソ型がある。例えば、ＨＣＥＬＬポリペプチドは、配列番号１（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッション番号ＣＡＡ４０１３３；表１）のアミノ酸配列を含む。ＨＣＥＬＬポリペプチドと配列番号１のポリペプチド配列との相同性は、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％または９５％である。
【００６２】
【表１】
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ＨＣＥＬＬポリペプチド
ひとつの側面から見ると、本発明は、単離されたＨＣＥＬＬ糖タンパク質、ならびに生物学的に活性なそれらの一部、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに関する。また本発明は、抗ＨＣＥＬＬ抗体を誘起するための免疫原として使用することに適したポリペプチドフラグメントを提供する。ひとつの実施態様においては、天然型ＨＣＥＬＬ糖タンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を用い、適切な精製手順に従うことにより、細胞または組織から単離することができる。
【００６３】
別の実施態様においては、組換えＤＮＡ技術によってＨＣＥＬＬ糖タンパク質を産生する。組換え発現以外の方法としては、標準的なペプチド合成技術を用いて化学的にＨＣＥＬＬ糖タンパク質またはポリペプチドを合成することができる。
【００６４】
「単離された」もしくは「精製された」タンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分とは、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質が含まれていた細胞または組織由来の細胞性材料またはその他の混入タンパク質を実質的に含まない、あるいは、化学的に合成されたものの場合には、化学的前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に含まないことを意味する。「細胞性材料を実質的に含まない」という語は、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質の調製物をも包含し、該タンパク質が含まれていた細胞、または組換え産生された細胞の細胞性構成成分から分離されたものである。ひとつの実施態様においては、「細胞性材料を実質的に含まない」という語は、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質調製物中の非ＨＣＥＬＬ糖タンパク質の量が乾燥重量で約３０％以下、より好ましくは、非ＨＣＥＬＬ糖タンパク質の量が乾燥重量で約２０％以下、さらにより好ましくは、非ＨＣＥＬＬ糖タンパク質の量が乾燥重量で約１０％以下、最も好ましくは、非ＨＣＥＬＬ糖タンパク質の量が乾燥重量で約５％以下である該調製物を包含する。ＨＣＥＬＬ糖タンパク質または生物学的に活性なそれらの一部が組換えによって産生されたものである場合には、タンパク質調製物中に培養培地を実質的に含まないことが好ましく、すなわち、培養培地の混入が容量で約２０％以下、より好ましくは、約１０％以下、最も好ましくは約５％以下である。
【００６５】
「化学的前駆物質またはその他の化学物質を実質的に含まない」という語は、タンパク質合成に使用した化学的前駆体またはその他の化学物質から分離されたタンパク質であるＨＣＥＬＬ糖タンパク質の調製物を包含する。ひとつの実施態様においては、「化学的前駆物質またはその他の化学物質を実質的に含まない」という語は、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質調製物中の化学的前駆体またはその他の化学物質の量が乾燥重量で約３０％以下、より好ましくは、化学的前駆体またはその他の化学物質の量が乾燥重量で約２０％以下、さらに好ましくは、化学的前駆体またはその他の化学物質の量が乾燥重量で約１０％以下、最も好ましくは、化学的前駆体またはその他の化学物質の量が乾燥重量で約５％以下である該調製物を包含する。
【００６６】
ＨＣＥＬＬ糖タンパク質中の生物学的に活性な部分とは、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質のアミノ酸配列に対して十分な相同性を有するアミノ酸配列から構成されるペプチド、または、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列など）に由来するペプチドを含み、それらは、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質の全長よりもアミノ酸数が少なく、かつ、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質の活性の内の少なくともひとつ（例えば、ＨＥＣＡ−４５２抗体反応性、抗ＣＤ４４抗体反応性、Ｅ−セレクチン結合性またはＬ−セレクチン結合性など）を示す。一般的には、生物学的に活性な部分には、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質の活性の内の少なくともひとつを有するドメインまたはモチーフ（例えば、Ｎ−結合グリコシル化部位など）を含む。ＨＣＥＬＬ糖タンパク質中の生物学的に活性な部分とは、例えば、アミノ酸数が１０個、２５個、５０個、１００個またはそれ以上であるポリペプチドである。好ましくは、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質中の生物学的に活性な部分は、ＣＤ４４ポリペプチドのＮ−末端ドメインのアミノ酸配列を含む。
【００６７】
本発明は、上述の構造ドメインの内の少なくとも１個を含む。さらに、生物学的に活性なその他の部分（タンパク質中のその他の領域が欠失した部分）は、組換え技術によって調製することができ、天然型ＨＣＥＬＬ糖タンパク質の機能的活性（例えば、Ｅ−セレクチン結合活性、Ｌ−セレクチン結合活性など）のうちの１種またはそれ以上に関して評価を行うことができる。ひとつの実施態様においては、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。別の実施態様においては、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質は、以下に詳細に記載しているような天然の対立遺伝子変化または突然変異によってアミノ酸配列が異なってはいても、配列番号１に実質的に相同であり、配列番号１のタンパク質の機能的活性を保有している。従って、別の実施態様においては、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列に対する相同性が少なくとも約４５％であるアミノ酸配列を含み、配列番号１のＨＣＥＬＬ糖タンパク質の機能的活性を保持しているタンパク質である。
【００６８】
別の表現をすれば、ＨＣＥＬＬポリペプチドは、Ｎ−結合グリコシル化を行うことができるＣＤ４４アミノ酸配列を有する。
【００６９】
キメラタンパク質または融合タンパク質
本発明は、ＨＣＥＬＬキメラタンパク質または融合タンパク質をも提供する。本明細書において使用しているＨＣＥＬＬ「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」とは、非ＨＣＥＬＬポリペプチドに機能発揮できるように結合しているＨＣＥＬＬポリペプチドをさす。「ＨＣＥＬＬポリペプチド」とは、ＨＣＥＬＬに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをさし、一方、「非ＨＣＥＬＬポリペプチド」とは、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質と実質的に相同ではないタンパク質（例えば、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質とは異なるタンパク質、および同一または異なる器官を起源とするタンパク質など）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをさす。ＨＣＥＬＬ融合タンパク質に関しては、ＨＣＥＬＬポリペプチドは、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質のすべてまたは一部に対応している。ひとつの実施態様においては、ＨＣＥＬＬ融合タンパク質は、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質中の生物学的に活性な部分を少なくとも１個有する。別の実施態様においては、ＨＣＥＬＬ融合タンパク質は、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質中の生物学的に活性な部分を少なくとも２個有する。さらに別の実施態様においては、ＨＣＥＬＬ融合タンパク質は、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質中の少なくとも３個の生物学的に活性な部分を有する。融合タンパク質に関しては、「機能発揮できるように連結されている」とは、ＨＣＥＬＬポリペプチドと非ＨＣＥＬＬポリペプチドが互いにインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）融合していることを示すものである。非ＨＣＥＬＬポリペプチドは、ＨＣＥＬＬポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に融合することができる。例えば、ひとつの実施態様においては、ＨＣＥＬＬ融合タンパク質は、ＨＣＥＬＬ抗ＣＤ４４結合ドメインを有しており、該ドメインは、第二のタンパク質の細胞外ドメインに機能発揮できるように連結している。そのような融合タンパク質はさらに、ＨＣＥＬＬ活性を調節する化合物のスクリーニングアッセイに用いることができる。
【００７０】
ひとつの実施態様においては、融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＨＣＥＬＬ融合タンパク質であり、これは、ＧＳＴ（すなわち、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端にＨＣＥＬＬ配列が融合したものである。そのような融合タンパク質は、組換えＨＣＥＬＬの精製に役立つ。別の実施態様においては、融合タンパク質は、Ｎ−末端に異種シグナル配列を含むＨＣＥＬＬ糖タンパク質である。例えば、天然のＨＣＥＬＬシグナル配列を除去し、他のタンパク質由来のシグナル配列と置換することができる。ある種の宿主細胞（例えば、哺乳類宿主細胞など）においては、異種シグナル配列を利用することにより、ＨＣＥＬＬの発現および／または分泌を増加させることができる。
【００７１】
ひとつの実施態様においては、融合タンパク質はＨＣＥＬＬ−免疫グロブリン融合タンパク質であり、これは、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのうちのひとつに由来する配列にＨＣＥＬＬ配列またはそれらのフラグメントを融合させたものである。本発明のＨＣＥＬＬ−免疫グロブリン融合タンパク質は、薬剤学的組成物に取り入れて対象に投与することにより、細胞表面でのＨＣＥＬＬリガンドとＨＣＥＬＬ糖タンパク質との相互作用を阻害し、それにより、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）におけるＨＣＥＬＬを介したシグナル伝達を抑制することができる。ＨＣＥＬＬ−免疫グロブリン融合タンパク質を用いることにより、ＨＣＥＬＬ固有リガンドのバイオアベイラビリティー（生体利用性）に影響を及ぼすことができる。ＨＣＥＬＬリガンド／ＨＣＥＬＬ相互作用を阻害することは、増殖性および分化性疾患の治療、ならびに細胞生存の調節（例えば、促進または阻害など）に有用である。
【００７２】
さらに、本発明のＨＣＥＬＬ−免疫グロブリン融合タンパク質を免疫原として使用することにより、対象内での抗ＨＣＥＬＬ抗体産生、ＨＣＥＬＬリガンドの精製、およびＨＣＥＬＬとＨＣＥＬＬリガンドとの相互作用を阻害する分子を確認するためのスクリーニングアッセイを行うことができる。
【００７３】
本発明のＨＣＥＬＬキメラタンパク質または融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって産生することができる。例えば、従来技術に従い、別異のポリペプチド配列をコードしているＤＮＡフラグメントを互いにインフレーム連結するが、そのような従来技術としては、連結用の平滑末端もしくは付着末端、制限酵素切断を使用した適切な末端の作出、付着末端の適切な充填、アルカリホスファターゼ処理をおこなうことによる所望しない結合の排除、ならびに酵素を使用した連結などが挙げられる。別の実施態様においては、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む従来技術によって合成することができる。さらに、別の実施態様としては、２個の連続した遺伝子フラグメント間において相補的な突出部を創出するようなアンカープライマーを用いて、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を行うことができ、このとき、該連続遺伝子フラグメントをアニールし、再増幅させ、キメラ遺伝子配列を作出することができる（例えば、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、編、「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」ジョン・ウィレー＆サンズ（ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ ）社、１９９２年などを参照）。さらに、融合部位（例えば、ＧＳＴポリペプチドなど）を既にコードしている多くの発現ベクターが市販されている。ＨＣＥＬＬをコードしている核酸は、そのような発現ベクター内にクローニングすることができ、このとき、融合部位をＨＣＥＬＬ糖タンパク質にインフレーム連結させる。
【００７４】
ＨＣＥＬＬのアゴニストおよびアンタゴニスト
本発明は、ＨＣＥＬＬアゴニスト（ミメチック）またはＨＣＥＬＬアンタゴニストとして作用するＨＣＥＬＬ糖タンパク質の変異体にも関する。ＨＣＥＬＬ糖タンパク質の変異体は、突然変異誘発（例えば、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質の不連続点突然変異または切断など）によって作出することができる。ＨＣＥＬＬ糖タンパク質のアゴニストは、天然に存在する型のＨＣＥＬＬ糖タンパク質が有する生物学的活性と実質的に同じまたはその一部を有している。ＨＣＥＬＬ糖タンパク質のアンタゴニストは、天然に存在する型のＨＣＥＬＬ糖タンパク質の生物学的活性のうちのひとつまたはそれ以上を阻害することができ、例えば、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流部分または上流部分に競合結合する。従って、特異的な生物学的効果は、機能を限定した変異体を用いて処理することによって誘起することができる。ひとつの実施態様においては、天然に存在する型のタンパク質が有する生物学的活性の一部のみを有する変異体を用いて対象を治療することにより、天然に存在する型のＨＣＥＬＬ糖タンパク質を用いて治療する場合よりも副作用が少なくなる。
【００７５】
ＨＣＥＬＬアゴニスト（ミメチック）またはＨＣＥＬＬアンタゴニストとして機能するＨＣＥＬＬ糖タンパク質の変異体は、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質アゴニスト活性またはＨＣＥＬＬ糖タンパク質アンタゴニスト活性に関して、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質の突然変異体（例えば、切断突然変異体など）を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって確認することができる。ひとつの実施態様においては、核酸レベルにおいてコンビナトリアル突然変異誘発を行うことにより、ＨＣＥＬＬ変異体から構成される変化に富んだライブラリーを作成し、このとき、該変異体は変化に富んだ遺伝子ライブラリーによってコードされている。変化に富んだＨＣＥＬＬ変異体のライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素の作用によって遺伝子配列内に連結させることによって産生することができ、このとき、ＨＣＥＬＬ配列候補を構成する縮重セットが、別異のポリペプチドとして発現し得るように、または、ＨＣＥＬＬ配列の組を含む一組の大きな融合タンパク質（例えば、ファージディスプレー用など）として発現し得るようにする。縮重オリゴヌクレオチド配列からＨＣＥＬＬ変異体候補を含むライブラリーを作成するために用いることができる方法には多様なものがある。縮重遺伝子配列の化学的合成は、自動ＤＮＡ合成機で行うことができ、合成された遺伝子を適切な発現ベクターに連結する。遺伝子の縮重セットを用いることにより、ひとつの混合物中において、ＨＣＥＬＬ配列候補を含むする所望するセットをコードしているすべての配列が用意される。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当該分野において既知である（例えば、ナラン（Ｎａｒａｎｇ）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ， ３９： ３（１９８３）；イタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ）ら、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ５３： ３２３（１９８４）；イタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８： １０５６（１９８４）；イケ（Ｉｋｅ）ら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １１： ４７７（１９８３）などを参照のこと）。
【００７６】
抗ＨＣＥＬＬ抗体
本発明は、本発明に従う任意のポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２など）を包含する。単離されたＨＣＥＬＬ糖タンパク質またはそれらの一部もしくはフラグメントを免疫原として使用し、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の調製に関する標準的な技術を用い、ＨＣＥＬＬに結合する抗体を作出することができる。ＨＣＥＬＬ糖タンパク質の全長を用いることができ、または、本発明においては、免疫原として使用するためのＨＣＥＬＬの抗原性ペプチドフラグメントを提供する。ＨＣＥＬＬの抗原性ペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列の内の少なくとも４個のアミノ酸残基を有し、さらに、ＨＣＥＬＬのエピトープを含むことにより、ペプチドに対して誘起された抗体がＨＣＥＬＬと特異的免疫コンプレックスを形成する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも６個、８個、１０個、１５個、２０個または３０個のアミノ酸残基を有する。当業者において既知である使用および方法に応じて、短い抗原性ペプチドよりも長い抗原性ペプチドの方が好ましい場合がある。より好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１個のＮ結合グリコシル化部位を有する。
【００７７】
本発明のひとつの実施態様においては、抗原性ペプチドに含まれている少なくとも１個のエピトープは、タンパク質表面に存在しているＨＣＥＬＬ領域（例えば、親水性領域など）である。抗体産生を目的とした手段としては、当該分野において既知である任意の方法（例えば、フーリエ変換を行う、もしくは行わない、カイト−ドゥーリトル（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）法またはホップ−ウッズ（Ｈｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓ）法など）を用い、親水性および疎水性領域を表すヒドロパシープロットを作成することができる。例えば、ホップ（Ｈｏｐｐ）およびウッズ（Ｗｏｏｄｓ）
）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７８： ３８２４−３８２８（１９８１）；カイト（Ｋｙｔｅ）およびドゥーリトル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １５７： １０５−１４２（１９８２）などを参照のこと。これらを参考として全て本明細書中に取り入れておく。
【００７８】
本明細書に記載しているように、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質配列、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログは、そのようなタンパク質構成物に免疫特異的に結合する抗体の産生において、抗原として使用することができる。本明細書において使用している「抗体」とは、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の中の免疫学的に活性な部分、すなわち、ＨＣＥＬＬなどの抗原に特異的に結合する（免疫反応を起こす）抗原結合部位を含む分子をさす。そのような抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびにＦａｂ発現ライブラリーなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。特別な実施態様においては、ヒトＨＣＥＬＬ糖タンパク質に対する抗体を開示している。当該分野において既知である多様な方法を用いて、配列番号１に示すＨＣＥＬＬ糖タンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を産生することができる。そのようなタンパク質のうちのいくつかに関しては以下に記載している。
【００７９】
ポリクローナル抗体の産生に関しては、天然型のタンパク質、もしくは合成によって調製したそれらの変異体、またはそれらの誘導体などを多様な適切な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたはその他の哺乳類など）に注射することによって免疫することができる。適切な免疫原性調製物は、例えば、組換えによって発現させたＨＣＥＬＬ糖タンパク質または化学的に合成したＨＣＥＬＬポリペプチドなどを含む。調製物にはさらにアジュバントを含むことができる。免疫学的応答を増強させるために使用するアジュバントとしては以下のものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。フロイント（完全および不完全）アジュバント、鉱物ゲル（例えば、水酸化アルミニウムなど）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン、複数の多価アルコール類、多価陰イオン類、ペプチド類、油状エマルション類、ジニトロフェノールなど）、カルメット−ゲラン菌（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびコリネバクテリウム・パルヴァン（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）などのようなヒト用アジュバント、または免疫刺激性の同様な物質など。所望する場合には、ＨＣＥＬＬに対する抗体分子を哺乳類（例えば、血液など）から単離し、タンパク質Ａクロマトグラフィーなどの既知の技術を用いてさらに精製してＩｇＧ画分を得ることができる。
【００８０】
本明細書において使用している「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」とは、ＨＣＥＬＬの特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位を１個のみ有する抗体分子の集団を指す。従って、一般的には、モノクローナル抗体組成物は、該組成物が免疫反応する特定のＨＣＥＬＬ糖タンパク質に対して一種類の結合親和性を示す。特定のＨＣＥＬＬ糖タンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対するモノクローナル抗体を産生するためには、細胞系の培養を連続して行うことによって抗体分子を産生することができるような任意の技術を用いることができる。そのような技術としては、ハイブリドーマ法（コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルステイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ， ２５６： ４９５−４９７（１９７５）を参照）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（コツバー（Ｋｏｚｂｅｒ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ， ４： ７２（１９８３）を参照）、ならびにヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ法（コール（Ｃｏｌｅ）ら、「モノクローナル抗体および癌療法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）」、アラン  Ｒ．リス（Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ）社、ｐｐ． ７７−９６（１９８５）を参照）などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。ヒトモノクローナル抗体は本発明の実施において使用することができ、ヒトハイブリドーマを用いて（コート（Ｃｏｔｅ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８０： ２０２６−２０３０（１９８３）を参照）、またはイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）においてエプスタイン−バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルスを用いてヒトＢ細胞を形質転換する（コール（Ｃｏｌｅ）ら、「モノクローナル抗体および癌療法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）」、アラン  Ｒ．リス（Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ）社、ｐｐ． ７７−９６（１９８５）を参照）ことによって産生することができる。上記の各引用文献を参考としてすべて本明細書中に取り入れておく。
【００８１】
本発明に従い、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質に特異的な単鎖抗体の産生に適するように方法を変更することができる（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号などを参照）。さらに、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に適するように方法を変更する（例えば、ヒューズ（Ｈｕｓｅ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４６： １２７５−１２８１（１９８９）などを参照）ことにより、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対して所望する特異性を有するＦａｂフラグメントを迅速かつ効率的に確認することができる。非ヒト抗体は、当該分野において既知の技術を用いることにより、「ヒト化」することができる。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号などを参照。ＨＣＥＬＬ糖タンパク質に対するイディオタイプを含む抗体フラグメントは、当該分野において既知である技術を用いて産生することができるが、これらに限定されるわけではない。（ｉ）抗体分子をペプシン消化することによって産生されるＦ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド結合を還元することによって産生されるＦａｂフラグメント、（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤を用いて抗体分子を処理することによって産生するＦａｂフラグメント、ならびに（ｉｖ）Ｆｖフラグメント。
【００８２】
さらに、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作成することができ、ヒトおよび非ヒト部分を有する組換え抗ＨＣＥＬＬ抗体（キメラモノクローナル抗体およびヒト型モノクローナル抗体など）も本発明の範ちゅうに含まれる。そのようなキメラモノクローナル抗体およびヒト型モノクローナル抗体は、当該分野において既知である組換えＤＮＡ技術によって産生することができ、例えば、以下の文書に記載されている方法などを用いる。国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号；ヨーロッパ特許出願第１８４，１８７号；ヨーロッパ特許出願第１７１，４９６号；ヨーロッパ特許出願第１７３，４９４号；ＰＣＴ国際公開ＷＯ８６／０１５３３号；米国特許第４，８１６，５６７号；米国特許第５，２２５，５３９号；ヨーロッパ特許出願第１２５，０２３号、ベター（Ｂｅｔｔｅｒ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４０： １０４１−１０４３（１９８７）；リウ（Ｌｉｕ）ら、ＰＮＡＳ ８４： ３４３９−３４４３（１９８７）；リウ（Ｌｉｕ）ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３９： ３５３１−３５２６（１９８７）；サン（Ｓｕｎ）ら、ＰＮＡＳ ８４： ２１４−２１８（１９８７）：ニシムラ（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ４７： ９９９−１００５（１９８７）；ウッド（Ｗｏｏｄ）ら、Ｎａｔｕｒｅ， ３１４： ４４６−４４９（１９８５）；シャウ（Ｓｈａｗ）ら、Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．， ８０： １５５３−１５５９（１９８８）；モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９： １２０２−１２０７（１９８８）；オイ（Ｏｉ）ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ４： ２１４（１９８６）；ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ， ３２１： ５５２−５２５（１９８６）；ヴァーホーヤン（Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９： １５３４（１９８８）；およびベイルダー（Ｂｅｉｌｄｅｒ）ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４１： ４０５３−４０６０（１９８８）。上記の各引用文献を参考としてすべて本明細書中に取り入れておく。
【００８３】
ひとつの実施態様においては、所望する特異性を有する抗体をスクリーニングする方法としては、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、および当該分野において既知であるその他の免疫学的方法などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。特別な実施態様においては、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質の特定のドメインに特異的な抗体は、そのようなドメインを有するＨＣＥＬＬ糖タンパク質のフラグメントに結合するハイブリドーマを作出することによって選択することができる。Ｎ結合グリコシル化部位に特異的な抗体、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログも本発明によって提供される。
【００８４】
ＨＣＥＬＬ糖タンパク質の局在および／または定量に関する分野における既知の方法（例えば、適切な生体サンプル中のＨＣＥＬＬ糖タンパク質の量の測定、診断法、タンパク質の画像化など）に抗ＨＣＥＬＬ抗体を使用することができる。ある実施態様においては、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対する抗体は、抗体由来の結合ドメインを含んでおり、薬剤学的に活性な化合物（本明細書においては、以後、「治療剤」と表記する）として使用される。
【００８５】
抗ＨＣＥＬＬ抗体（例えば、モノクローナル抗体など）を用い、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降などの標準的な技術に従うことにより、ＨＣＥＬＬを単離することができる。抗ＨＣＥＬＬを用いることにより、細胞からの天然型ＨＣＥＬＬの精製、または宿主細胞において発現された組換え産生ＨＣＥＬＬの精製を行うことができる。さらに、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質の発現量およびパターンを評価することを目的として、抗ＨＣＥＬＬ抗体を用いて、細胞溶解物中または細胞上清中などに含まれるＨＣＥＬＬ糖タンパク質を検出することができる。抗ＨＣＥＬＬ抗体を用い、臨床試験の一部として、例えば、治療法の効果を判断することなどを目的として、組織内のタンパク質レベルを診断的にモニターすることができる。別の用途としては、抗ＨＣＥＬＬ抗体を用いて白血病の治療または診断を行うことができる。検出は、検出可能な物質に抗体をカップリングさせる（すなわち、物理的に結合させる）ことによって行うことができる。検出可能な物質の例としては、多様な酵素、配合族、蛍光材料、発光材料、生体発光材料、および放射活性材料などが挙げられる。適切な酵素の例としては、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼなどが挙げられ；適切な配合族コンプレックスの例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどが挙げられ；適切な蛍光材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン、フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリスリンなどが挙げられ；発光材料の例としてはルミノールが挙げられ；生体発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびアクオリンが挙げられ；さらに、適切な放射活性材料の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈなどが挙げられる。
【００８６】
ＨＣＥＬＬ組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明を別の側面から見ると、ベクター、好ましくは、ＨＣＥＬＬポリペプチド、融合ポリペプチドまたはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログをコードしている核酸を含む発現ベクターに関する。本明細書において使用している「ベクター」とは、核酸分子であって、該核酸分子が結合していた場所に別の核酸を輸送することができるものをさす。ベクターのひとつの型が「プラスミド」であり、これは、環状二本鎖ＤＮＡループであり、その中に追加のＤＮＡセグメントを連結することができる。別の型のベクターとしてはウイルスベクターがあり、該ウイルスゲノム内に追加のＤＮＡセグメントを連結することができる。ある種のベクターは、導入された宿主細胞内において自律的複製をすることができる（例えば、バクテリアベクターは、バクテリア由来の複製起点およびエピソーム性哺乳類ベクターを有する）。その他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳類ベクターなど）は、宿主細胞内に導入されることによって宿主細胞のゲノムに組み込まれ、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクターは、該ベクターが機能発揮できるように連結された遺伝子の発現を指図することができる。本明細書においては、そのようなベクターを「発現ベクター」と称する。一般的には、組換えＤＮＡ技術において使用する発現ベクターは、プラスミドの形であることが多い。プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの型であるため、本明細書においては、「プラスミド」と「ベクター」とを相互に入れ換えて使用することができるものとする。しかしながら、本発明は、同等の機能を有するウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス類、アデノウイルス類およびアデノ関連ウイルス類など）などの他の型の発現ベクターをも包含する。
【００８７】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞内における核酸の発現に適した型の本発明の核酸を含んでおり、すなわち、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択された１個またはそれ以上の制御配列を有しており、該制御配列は、発現されるべき核酸配列に機能発揮できるように連結している。組換え発現ベクター内においては、「機能発揮できるように連結している」とは、目的のヌクレオチド配列が発現することができるように（例えば、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写／翻訳系において、または、ベクターが宿主細胞内に導入された場合には宿主細胞内において）、該ヌクレオチド配列が制御配列に連結していることをさす。
【００８８】
「制御配列」とは、プロモーター、エンハンサーおよびその他の発現制御因子（例えば、ポリアデニル化シグナルなど）をさす。そのような制御配列については、例えば、ゴッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）著、「遺伝子発現技術：酵素学における方法（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）第１８５巻」（アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）社、カリフォルニア州サンディエゴ、１９９０年）などに記載されている。制御配列には、多くの型の宿主細胞内において核酸配列の構成的発現を指図するもの、および、ある種の宿主細胞においてのみ核酸配列の発現を指図するもの（例えば、組織特異的制御配列など）がある。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望するタンパク質の発現レベルなどの因子に応じて行わねばならないことは、当業者において周知の事実である。本発明に従う発現ベクターは、宿主細胞内に導入することにより、本明細書に記載されている核酸配列によってコードされているタンパク質またはペプチド（融合タンパク質または融合ペプチドを含む）を産生することができる。
【００８９】
本発明に従う組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞内においてＨＣＥＬＬポリペプチドまたは融合ポリペプチドを発現するように設計することができる。例えば、ＨＣＥＬＬポリペプチドまたは融合ポリペプチドは、大腸菌（Ｅ ． ｃｏｌｉ）などのバクテリア細胞、昆虫細胞（バキュウロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、または哺乳類細胞内において発現することができる。適切な宿主細胞については、ゴッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）著、「遺伝子発現技術：酵素学における方法（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）第１８５巻」（アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）社、カリフォルニア州サンディエゴ、１９９０年）において言及されている。別の方法としては、Ｔ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼなどを用い、組換え発現ベクターをイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において転写／翻訳させることができる。
【００９０】
原核細胞におけるタンパク質の発現は、融合もしくは非融合タンパク質の発現を指図する構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターを有するベクターを用い、大腸菌（Ｅ ． ｃｏｌｉ）内で行うことが多い。融合ベクターは、その中にコードされているタンパク質（通常は、組換えタンパク質のアミノ末端）に多数のアミノ酸を付加する。一般的に、そのような融合ベクターは、次の３つの目的に対して使用する：（ｉ）組換えタンパク質の発現を増加させる；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解性を向上させる；（ｉｉｉ）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することにより、組換えタンパク質の精製を促進する。融合発現ベクターにおいては、融合部位の連結部分にタンパク質加水分解性解裂部位が導入されている場合が多く、融合タンパク質の精製に続いて、融合部位から組換えタンパク質を分離することができる。そのような酵素およびそれらに対応する認識配列としては、Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼなどが挙げられる。典型的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（ファルマシア・バイオテク（ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ）社；スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）、Ｇｅｎｅ， ６７： ３１−４０（１９８８））、ｐＭＡＬ（ニューイングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）社、マサチューセッツ州ビヴァリー）、およびｐＲＩＴ５（ファルマシア（ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ）社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）などが挙げられ、これらは、目的とする組換えタンパク質にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡをそれぞれ融合させる。
【００９１】
適切な誘導性非融合大腸菌（Ｅ ． ｃｏｌｉ）発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（アムラン（Ａｍｒａｎｎ）ら、Ｇｅｎｅ， ６９： ３０１−３１５（１９８８））およびｐＥＴ１１ｄ（ステュデアー（Ｓｔｕｄｉｅｒ）ら、「遺伝子発現技術：酵素学における方法（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）第１８５巻」ｐｐ． ６０−８９（アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）社、カリフォルニア州サンディエゴ、１９９０年）が挙げられる。
【００９２】
大腸菌（Ｅ ． ｃｏｌｉ）における組換えタンパク質の発現を最大にするためのひとつの方法は、組換えタンパク質をタンパク質分解する能力が損なわれている宿主バクテリア内でタンパク質を発現させることである。例えば、ゴッテスマン（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ）、「遺伝子発現技術：酵素学における方法（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）第１８５巻」ｐｐ． １１９−１２８（アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）社、カリフォルニア州サンディエゴ、１９９０年）などを参照のこと。別の方法としては、各アミノ酸に対するそれぞれのコドンが大腸菌（Ｅ ． ｃｏｌｉ）において好んで利用されるものになるように、発現ベクターに組み込まれる核酸の核酸配列を変化させる（例えば、ワダ（Ｗａｄａ）ら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２０： ２１１１−２１１８（１９９２）などを参照のこと）。本発明における核酸配列のそのような変更は、標準的なＤＮＡ合成技術によって実施可能である。
【００９３】
別の実施態様においては、ＨＣＥＬＬポリペプチドまたは融合ポリペプチド発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母であるビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）における発現用ベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（バルダリ（Ｂａｌｄａｒｉ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ．， ６： ２２９−２３４（１９８７） ）、ｐＭＦａ（クラン（Ｋｕｒｊａｎ）およびヘルスコヴィッツ（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ）、Ｃｅｌｌ， ３０： ９３３−９４３（１９８２））、ｐＪＲＹ８８（シュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）ら、Ｇｅｎｅ， ５４： １１３−１２３（１９８７）、ｐＹＥＳ２（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社、カリフォルニア州サンディエゴ）およびｐｉｃＺ（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社、カリフォルニア州サンディエゴ）などが挙げられる。
【００９４】
別の実施態様としては、バキュウロウイルス発現ベクターを用い、昆虫細胞内でＨＣＥＬＬポリペプチドまたは融合ポリペプチドを発現させることができる。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞など）内でタンパク質を発現することができるバキュウロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ３： ２１５６−２１６５（１９８３））およびｐＶＬシリーズ（ラックロウ（Ｌｕｃｋｌｏｗ）およびサマーズ（Ｓｕｍｍｅｒｓ）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １７０： ３１−３９（１９８９））などが挙げられる。
【００９５】
さらに別の実施態様においては、哺乳類発現ベクターを用い、哺乳類細胞内で本発明に従う核酸を発現させる。哺乳類ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（シード（Ｓｅｅｄ）、Ｎａｔｕｒｅ， ３２９： ８４０（１９８７））およびｐＭＴ２ＰＣ（カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ．， ６： １８７−１９５（１９８７））などが挙げられる。哺乳類細胞内において使用する場合には、発現ベクターの制御機能は、ウイルス性の制御因子から供給される場合が多い。例えば、汎用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０由来である。原核細胞および真核細胞の両方に適したその他の発現系については、例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第２版、（コールドスプリングハーバー・ラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）社、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９年）などを参照のこと。
【００９６】
別の実施態様においては、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞系内において優先的に核酸を発現させるようにすることができる（例えば、組織特異的制御因子を用いて核酸を発現させるなど）。組織特異的制御因子は当該分野において既知である。適切な組織特異的プロモーターの例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；ピンカート（Ｐｉｎｋｅｒｔ）ら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， １： ２６８−２７７（１９８７））、リンパ腺特異的プロモーター類（カラメ（Ｃａｌａｍｅ）およびイートン（Ｅａｔｏｎ）、Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ４３： ２３５−２７５（１９８８））、特にＴ細胞レセプターのプロモーター類（ウィノト（Ｗｉｎｏｔｏ）およびボルティモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）、ＥＭＢＯ Ｊ．， ８： ７２９−７３３（１９８９））および免疫グロブリン類（バナージ（Ｂａｎｅｒｊｉ）ら、Ｃｅｌｌ， ３３： ７２９−７４０（１９８３）；クイーン（Ｑｕｅｅｎ）およびボルティモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）、Ｃｅｌｌ， ３３： ７４１−７４８（１９８３））、神経特異的プロモーター類（例えば、神経繊維プロモーターなど；バーン（Ｂｙｒｎｅ）およびラドル（Ｒｕｄｄｌｅ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８６： ５４７３−５４７７（１９８９））、膵臓特異的プロモーター類（エドランド（Ｅｄｌｕｎｄ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３０： ９１２−９１６（１９８５）、ならびに乳腺特異的プロモーター類（例えば、乳清プロモーターなど；米国特許第４，８７３，３１６号おいおびヨーロッパ特許出願公開第２６４，１６６号）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。マウスｈｏｘプロモーター類（ケセル（Ｋｅｓｓｅｌ）およびグラス（Ｇｒｕｓｓ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９： ３７４−３７９（１９９０）およびα−フェトプロテインプロモーター（キャンペス（Ｃａｍｐｅｓ）およびティルーマン（Ｔｉｌｇｈｍａｎ）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， ３： ５３７−５４６（１９８９））などのような、発生過程に従って制御されるプロモーター類も包含される。
【００９７】
さらに本発明は、本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供し、このとき、該ＤＮＡ分子は、発現ベクター内にアンチセンス方向にクローニングされている。すなわち、ＤＮＡ分子は、該ＤＮＡ分子の転写により、ＨＣＥＬＬポリペプチドに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子または融合ポリペプチドｍＲＮＡが発現することができるような様式で、機能発揮できるように制御配列に連結している。アンチセンス方向にクローニングされた核酸に対して、機能発揮できるように連結している制御配列は、多様な細胞系において連続的にアンチセンスＲＮＡ分子を発現させるものを選択することができ（例えば、ウイルス性プロモーターおよび／またはエンハンサーなど）、あるいは、制御配列は、アンチセンスＲＮＡを構成性、組織特異的もしくは細胞型特異的に発現させるものを選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒ウイルスの様式で用いることができ、このとき、高効率制御領域の制御下においてアンチセンス核酸が産生され、該制御領域の活性は、ベクターが導入された細胞型によって決まる。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の制御については、例えば、ウェイントラウブ（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ）ら、「遺伝子分析のための分子ツールとしてのアンチセンスＲＮＡ（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）」（総説−遺伝学における動向（Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）第１巻（１） 、１９８６年）などを参照のこと。
【００９８】
本発明を別の側面から見ると、本発明に従う組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。本明細書においては、「宿主細胞」と「組換え宿主細胞」とは相互に入れ換えて使用することができる。そのような語句は、特定の対象細胞のみならず、そのような細胞の子孫もしくは子孫となり得るものをもさすことは明らかである。突然変異または環境の影響により、継代を続ける間に細胞にある種の変形が生じる可能性があるため、実際のところ、そのような子孫は親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書において使用している語句の範ちゅうに含まれる。
【００９９】
宿主細胞としては、任意の原核細胞または真核細胞を使用することができる。例えば、ＨＣＥＬＬポリペプチドまたは融合ポリペプチドは、大腸菌（Ｅ ． ｃｏｌｉ）などのバクテリア細胞、昆虫細胞、酵母、または哺乳類細胞（ヒト、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、もしくはＣＯＳ細胞など）において発現させることができる。その他の適切な宿主細胞も当該分野において既知である。
【０１００】
従来型の形質転換またはトランスフェクション技術を用いてベクターＤＮＡを原核細胞または真核細胞に導入することができる。本明細書において使用している「形質転換（トランスフォーメーション）」および「トランスフェクション」とは、宿主細胞内に外来性の核酸（例えば、ＤＮＡなど）を導入するための既知の多様な技術をさし、それらには例えば、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストランを利用したトランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションなどが挙げられる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするために適した方法に関しては、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らの「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第２版、（コールドスプリングハーバー・ラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）社、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９年）またはその他の実験室マニュアルに記載されている。
【０１０１】
哺乳類細胞を安定的にトランスフェクトするためには、使用する発現ベクターおよびトランスフェクト法に応じて、わずかな細胞のみが外来性ＤＮＡをゲノム内に取り込むことがわかっている。そのような組み込まれたものを確認、選択するためには、一般的には、目的の遺伝子と共に、選択的マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性など）をコードしている遺伝子を宿主細胞に導入する。多様な選択的マーカーが存在するが、薬物（例えば、Ｇ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキセートなど）に対する耐性を付与するものなどが挙げられる。選択的マーカーをコードしている核酸は、ＨＣＥＬＬポリペプチドもしくは融合ポリペプチドをコードしているベクターと同じベクターを利用して宿主細胞内に導入することができ、または、別のベクターを利用して導入することができる。導入された核酸が安定的にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択（例えば、選択的マーカー遺伝子が組み込まれている細胞は生存するが、その他の細胞は死ぬ、など）によって確認することができる。
【０１０２】
本発明の宿主細胞、例えば、培養原核細胞または培養真核細胞などを用い、ＨＣＥＬＬポリペプチドまたは融合ポリペプチドを産生（すなわち、発現）させることができる。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用してＨＣＥＬＬポリペプチドまたは融合ポリペプチドを産生する方法を提供する。ひとつの実施態様においては、そのような方法は、ＨＣＥＬＬポリペプチドまたは融合ポリペプチドの産生に適した培地中で、本発明に従う宿主細胞（ＨＣＥＬＬポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードしている組換え発現ベクターが導入された宿主細胞）を培養することを含む。別の実施態様においては、本発明はさらに、培地または宿主細胞からＨＣＥＬＬポリペプチドまたは融合ポリペプチドを単離することを含む。
【０１０３】
幹細胞の確認法
本発明は、幹細胞を確認および／または単離するための多様な方法を提供する。幹細胞とは、中胚葉、外胚葉または内胚葉を起源とする多分化能細胞である。好ましくは、幹細胞は中胚葉由来である。より好ましくは、幹細胞は、造血前駆細胞である。
【０１０４】
幹細胞は、被験細胞集団を１種類またはそれ以上の物質（例えば、タンパク質、ポリペプチドまたは低分子であって、ＨＣＥＬＬポリペプチドに特異的に結合するもの）と接触させることによって確認する。好ましくは、そのような物質は、抗体またはそれらのフラグメントである。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれも用いることができる。例えば、そのような物質はＨＣＥＬＬ抗体である。あるいは、使用する物質は、抗ＣＤ４４抗体またはＨＥＣＡ−４５２抗体である。
【０１０５】
特異的結合とは、細胞と物質との間の相互作用の強度がコンプレックスを形成するのに十分であるという意味である。細胞／物質コンプレックスを検出する。コンプレックスが存在するということは、被験細胞が幹細胞であることを示唆している。別の方法においては、被験細胞集団からコンプレックスを除去することにより、被験細胞集団から幹細胞を単離する。フローサイトメトリーなどの当該分野において既知の方法によって被験細胞集団からコンプレックスを分離することができる。さらに、コンプレックスを解離することにより、物質から幹細胞を分離することによって幹細胞を単離することができる。コンプレックスの解離は、希釈したＥＤＴＡなどを用いたイオンキレート化などによって行うことができる。
【０１０６】
別の方法としては、固相（例えば、ガラス、プラスチックまたは膜など）にセレクチンポリペプチド（例えば、Ｅ−セレクチンまたはＬ−セレクチンなど）を固定し、固相に被験細胞の懸濁物を含む液体サンプルを接触させることによって幹細胞を確認することができる。ある観点においては、液体サンプルを移動させる。液体サンプルを移動させることにより、サンプルが膜の表面を一定方向に流れていくことを意味する。流れの中の液体サンプルと固定されたリガンドとの間の相互作用は、広範な定流量条件下において（静止インキュベーションから生理的なずれ流量レベルまで、静止状態および静止状態とずれ状態を連続して付加する、さらに生理的以上のずれ流量レベルまで）実験することができる。例えば、ずれ流量条件としては、流力は０．６ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２以上である。別の見方をすると、ずれ流量条件としては、流力は少なくとも２．８ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２である。さらに、ずれ流量条件としては、流力は少なくとも９．０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２である。ある観点から見ると、液体は、膜の表面において生理的ずれ応力が生じるように膜を通過する。次に、固相と細胞との間の相互作用を測定する。液体サンプル中の細胞と固相との間に相互作用が生じることは、該細胞が幹細胞であることを示唆している。
【０１０７】
本発明は、幹細胞の単離法をも包含する。単離法には、固相上にセレクチンポリペプチドを固定し、固相に細胞懸濁物を含む液体サンプルを接触させることを含む。次に、固相に接着した細胞を回収する。結合した細胞は、当該分野において既知の任意の方法（例えば、希釈したＥＤＴＡを用いたイオンキレート化、および／または大きなずれ応力をかけるなど）によって除去することができる。ブロット表面から回収された結合細胞を集め、溶出後、表現型または生物学的機能について分析を行う。マトリックスに固定化されていたリガンドを再使用することによって多様な細胞群における相互作用を比較することができ、または、イン・サイチュー（ ｉｎ ｓｉｔｕ ）で操作することによって調査中の細胞集団の特性付けを行うことができる。
【０１０８】
細胞と固相との間の相互作用は、例えば、回転（ローリング）、強固な接着、または特異的相互作用などである。ある側面から見ると、特異的相互作用は、アフィニティー係数で定義される。例えば、特異的相互作用とは、Ｋｄが０．１ｍＭ〜７ｍＭである相互作用である。好ましくは、Ｋｄは１ｍＭ以上である。
【０１０９】
細胞／物質相互作用または細胞／固相相互作用は、例えば、顕微鏡下、比色測定、蛍光測定などの視覚的検査により、または、フローサイトメトリーもしくは平行プレートフローチャンバーアッセイ（ｐａｒａｌｌｅｌ ｐｌａｔｅ ｆｌｏｗ ｃｈａｍｂｅｒ ａｓｓａｙ）を用いることにより測定することができる。別の方法としては、蛍光ラベル、ビオチン、酵素（アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼまたはβ−ガラクトシダーゼなど）、放射活性同位体または当該分野において既知であるその他のラベル類を用いて細胞、ＨＣＥＬＬポリペプチドまたは物質をラベルすることによって相互作用を分析する。ラベルは、細胞、ＨＣＥＬＬポリペプチド、または物質を被験細胞集団と接触させる前、または後に添加することができる。次に、膜または固相についてスペクトロフォトメーター分析または放射線写真分析を行い、固相のセレクチンポリペプチドと相互作用している細胞数を計数する。
【０１１０】
本発明は、上述した方法に従って単離された細胞を投与することにより、造血性疾患などの細胞疾患、がん、または幹細胞を用いて治療すること（すなわち、幹細胞治療）ができるような疾患（例えば、心筋梗塞、パーキンソン病、糖尿病、先天性筋ジストロフィー、卒中、遺伝性／先天性疾患 （例えば、骨形成不全症など）ならびにヒトなどの哺乳類における肝障害など）を治療する方法をも提供する。
【０１１１】
Ｅ−セレクチン／Ｌ−セレクチンリガンド親和性を高める方法
本発明は、細胞を調製し、該細胞の細胞表面におけるＨＣＥＬＬポリペプチドの発現または活性を高めるような１個またはそれ以上の物質と細胞を接触させることにより、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンに対する該細胞のアフィニティー（親和性）を高める方法を提供する。
【０１１２】
細胞は、ＨＣＥＬＬポリペプチドを発現することができる任意の細胞を用いることができる。そのような細胞の例としては、幹細胞（すなわち、多分化能細胞）が挙げられる。細胞は、中胚葉、外胚葉または内胚葉を起源とするものを用いることができる。好ましくは、細胞は中胚葉由来である。より好ましくは、細胞は、造血前駆細胞である。物質に暴露する（すなわち、接触させる）細胞集団は、任意数の細胞、すなわち、１個またはそれ以上であり、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）またはイクス・ビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）において調製することができる。
【０１１３】
適切な物質としては、例えば、ポリペプチド、核酸などを用いることができる。そのような物質の例としては、ＣＤ４４、グリコシルトランスフェラーゼもしくはグリコシダーゼポリペプチド、または、ＣＤ４４、グリコシルトランスフェラーゼもしくはグリコシダーゼポリペプチドをコードしている核酸、あるいは、ＣＤ４４、グリコシルトランスフェラーゼもしくはグリコシダーゼポリペプチド、およびそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログをコードしている核酸の発現を増加させる核酸などが挙げられる。ＣＤ４４、グリコシルトランスフェラーゼもしくはグリコシダーゼポリペプチドをコードしている核酸の発現を増加させる核酸としては、例えば、プロモーター、エンハンサーなどが挙げられる。該核酸は、内在性のものも外来性のものも使用することができる。
【０１１４】
ＣＤ４４ポリペプチドをコードしている核酸の起源として適したものとしては、例えば、ヒトＣＤ４４核酸（およびコードされているタンパク質配列）などがあるが、それらはジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）から入手可能であり、アクセッション番号はそれぞれ、ＬＯ５４０７およびＣＡＡ４０１３３である。その他の起源としては、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッション番号Ｕ３５６３２およびＰ１６０７９で表されるヒトＣＤ４４核酸およびタンパク質配列が挙げられ、それらを参考として本明細書中にすべて取り入れておく。グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードしている核酸の起源として適したものとしては、例えば、ヒトグリコシルトランスフェラーゼ核酸（およびコードされているタンパク質配列）などがあるが、それらはジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）から入手可能であり、アクセッション番号はそれぞれ、ＡＪ２７６６８９およびＣＡＢ８１７７９である。グリコシダーゼポリペプチドをコードしている核酸の起源として適したものとしては、例えば、ヒトグリコシダーゼ核酸（およびコードされているタンパク質配列）などがあるが、それらはジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）から入手可能であり、アクセッション番号はそれぞれ、ＡＪ２７９８６４およびＣＡＣ０８１７８である。その他のＣＤ４４、グリコシルトランスフェラーゼもしくはグリコシダーゼのポリペプチドおよび核酸を使用することについても当該分野において既知であり、本発明の範ちゅうに包含される。
【０１１５】
細胞に物質を直接接触（すなわち、核酸または核酸を含むベクターに細胞を直接接触させる）または間接接触させることができる。
【０１１６】
ＨＣＥＬＬの発現は、核酸またはタンパク質レベルで測定することができる。核酸の発現は、当該分野において既知の任意の方法を用い、ＲＮＡレベルで測定することができる。例えば、目的の配列のうちの１個またはそれ以上を特異的に認識するプローブを使用したノーザンハイブリダイゼーションによって遺伝子発現を測定することができる。別の方法としては、逆転写に基づくＰＣＲアッセイによって発現を測定することもできる。発現はタンパク質レベルで測定することもでき、すなわち、遺伝子によってコードされているポリペプチドのレベルを測定することによって行う。そのような方法は当該分野において既知であり、例えば、遺伝子によってコードされているタンパク質に対する抗体に基づくイムノアッセイなどが挙げられる。
【０１１７】
ＨＣＥＬＬ活性は、例えば、Ｌ−セレクチンまたはＥ−セレクチン結合活性によって測定することができる。
【０１１８】
細胞の移植能を高める方法
本発明は、細胞の移植能を高める方法を提供する。
【０１１９】
移植能を高めるとは、細胞を移植した後の生存率が、未処理細胞よりも高いことを意味する。
【０１２０】
細胞は、中胚葉、外胚葉または内胚葉を起源とするものを用いることができる。好ましくは、細胞は中胚葉由来である。より好ましくは、細胞は、造血前駆細胞である。
【０１２１】
本発明は、細胞を調製し、細胞表面のＨＣＥＬＬポリペプチド発現またはＨＣＥＬＬポリペプチド活性を高める１種類もしくはそれ以上の物質に該細胞を接触させることにより、細胞の移植能を高める方法に関する。さらに本発明は、ヒトなどの被験対象内の１種またはそれ以上の幹細胞における細胞表面のＨＣＥＬＬまたはＨＣＥＬＬ発現を高める物質を該対象に投与することにより、移植幹細胞のレベルを上昇させる方法をも提供する。そのような物質は、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）、イクス・ビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）またはイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で投与することができる。
【０１２２】
また本発明は、固相（例えば、ガラス、プラスチックまたは膜など）にセレクチンポリペプチド（例えば、Ｅ−セレクチンまたはＬ−セレクチンなど）を固定し、該固相に被験細胞の懸濁物を含む液体サンプルを接触させることにより、細胞集団の移植能を高める方法をも含む。ある側面から見ると、液体サンプルは移動している。液体サンプルを移動させるとは、液体サンプルを移動させることにより、サンプルが膜の表面を一定方向に流れていくことを意味する。流れの中の液体サンプルとリガンドとの間の相互作用は、広範な定流量条件下において（静止インキュベーションから生理的なずれ流量レベルまで、静止状態ならびに、静止状態とずれ状態を連続して付加する、さらに生理的以上のずれ流量レベルまで）実験することができる。例えば、ずれ流量条件では、流力は０．６ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２以上である。別の見方をすると、ずれ流量条件では、流力は少なくとも２．８ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２である。さらに、ずれ流量条件では、流力は少なくとも９．０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２である。ある観点から見ると、液体は、膜の表面において生理理的ずれ応力が生じるように膜を通過する。次に、固相に接着した細胞を回収する。結合細胞は、当該分野において既知の任意の方法（例えば、希釈したＥＤＴＡを用いたイオンキレート化および／または強いずれ応力をかけるなど）によって除去することができる。ブロット表面から回収された結合細胞を集め、溶出後、表現型または生物学的機能について分析を行う。マトリックスに固定化されていたリガンドを再使用することによって多様な細胞群における相互作用を比較することができ、または、イン・サイチュー（ ｉｎ ｓｉｔｕ ）で操作する（以下に概説している）ことによって調査中の細胞集団の特性付けを行うことができる。さらに本発明は、上述の方法に従って単離された細胞を含む組成物を対象に投与することにより、対象内における移植幹細胞のレベルを高める方法を提供する。
【０１２３】
適切な物質としては、例えば、ポリペプチド、核酸などが挙げられる。例えば、そのような物質としては、ＣＤ４４、グリコシルトランスフェラーゼもしくはグリコシダーゼのポリペプチド、または、ＣＤ４４、グリコシルトランスフェラーゼもしくはグリコシダーゼのポリペプチドをコードしている核酸、あるいは、ＣＤ４４、グリコシルトランスフェラーゼもしくはグリコシダーゼのポリペプチド、およびそれらの誘導体、フラグメント、アナログおよびホモログをコードしている核酸の発現を高めるような核酸などが挙げられる。ＣＤ４４、グリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシダーゼのポリペプチドをコードしている核酸の発現を高めるような核酸としては、例えば、プロモーター、エンハンサーなどが挙げられる。核酸は、内在性のものも外来性のものも使用することができる。
【０１２４】
ＣＤ４４ポリペプチドをコードしている核酸の起源として適したものとしては、例えば、ヒトＣＤ４４核酸（およびコードされているタンパク質配列）などがあるが、それらはジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）から入手可能であり、アクセッション番号はそれぞれ、ＬＯ５４０７およびＣＡＡ４０１３３である。その他の起源としては、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッション番号Ｕ３５６３２およびＰ１６０７９で表されるヒトＣＤ４４核酸およびタンパク質配列が挙げられ、それらを参考として本明細書中にすべて取り入れておく。グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードしている核酸の起源として適したものとしては、例えば、ヒトグリコシルトランスフェラーゼ核酸（およびコードされているタンパク質配列）などがあるが、それらはジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）から入手可能であり、アクセッション番号はそれぞれ、ＡＪ２７６６８９およびＣＡＢ８１７７９である。グリコシダーゼポリペプチドをコードしている核酸の起源として適したものとしては、例えば、ヒトグリコシダーゼ核酸（およびコードされているタンパク質配列）などがあるが、それらはジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）から入手可能であり、アクセッション番号はそれぞれ、ＡＪ２７９８６４およびＣＡＣ０８１７８である。その他のＣＤ４４、グリコシルトランスフェラーゼもしくはグリコシダーゼのポリペプチドおよび核酸を使用することについても当該分野において既知であり、本発明の範ちゅうに包含される。
【０１２５】
被験対象は、好ましくは哺乳類である。哺乳類としては、例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシなどが挙げられる。さらに、そのような対象は、造血性疾患（例えば、白血病など）、癌、または炎症性疾患（慢性関節リューマチなどのような慢性炎症性疾患など）に苦しんでいる、または発症する危険性がある。
【０１２６】
造血性疾患（例えば、白血病など）、癌、または炎症性疾患（慢性関節リューマチなどのような慢性炎症性疾患など）に罹患している、または発症する危険性を有する哺乳類は、特定の疾患に関与している既知の危険因子（例えば、性別、年齢、喫煙歴、遺伝的もしくは家族的素因など）を検出することによって確認することができる。別の方法としては、造血性疾患（例えば、白血病など）、癌、または炎症性疾患（慢性関節リューマチなどのような慢性炎症性疾患など）に苦しんでいる、または発症する危険性を有する哺乳類は、特定の疾患を診断するための当該分野において既知の方法によって確認することができる。
【０１２７】
造血性疾患の治療法
本発明は、被験対象内の細胞表面のＨＣＥＬＬポリペプチドまたはＨＣＥＬＬポリペプチドの発現を低下させる物質を対象に投与することにより、造血性疾患（例えば、白血病、再生不良性貧血、非ホジキンリンパ腫、慢性骨髄性白血病、多骨髄腫慢性リンパ性白血病および多様な骨髄異形成症候群など）を治療する方法に関する。
【０１２８】
さらに本発明は、被験対象の造血性疾患を治療する方法を提供するが、これは、被験対象から血液を採取し、ＨＣＥＬＬポリペプチドと特異的に結合する物質と血液中の血液細胞とがコンプレックスを形成するのに十分な条件下において、１種類またはそれ以上の該物質に血液を接触させることによって行う。好ましくは、血液細胞は癌性である。より好ましくは、血液細胞は白血病性血液細胞である。コンプレックス形成を検出し、血液からコンプレックスを除去することにより、細胞が除去される。次に、血液を被験対象内に戻す。
【０１２９】
適切な物質としては、ＨＣＥＬＬポリペプチドに特異的に結合するタンパク質、ポリペプチドまたは低分子などが挙げられる。好ましくは、そのような物質は、抗体またはそれらのフラグメントである。抗体は、ポリクローナル抗体もモノクローナル抗体も用いることができる。例えば、そのような物質は、ＨＣＥＬＬ抗体である。別の物質としては、抗ＣＤ４４抗体、またはＨＥＣＡ−４５２抗体が挙げられる。特異的に結合するとは、細胞と物質との間の相互作用がコンプレックスを形成するのに十分であることを意味する。フローサイトメトリーなどの当該分野において既知の方法を用いることにより、血液からコンプレックスを分離することができる。
【０１３０】
また本発明は、被験対象の血液、および固相（例えば、ガラス、プラスチックまたは膜など）に固定したセレクチンポリペプチド（例えば、Ｅ−セレクチンまたはＬ−セレクチンなど）を用意し、血液に固相を接触させることにより、造血性疾患を治療する方法を提供する。ある側面から見ると、血液サンプルは移動している。血液サンプルを移動させるとは、サンプルを移動させることにより、サンプルが膜の表面を一定方向に流れていくことを意味する。流れの中の血液サンプルとリガンドとの間の相互作用は、広範な流量条件において（静止インキュベーションから生理的なずれ流量レベルまで、静止状態ならびに静止状態とずれ状態を連続して付加する、さらに生理的以上のずれ流量レベルまで）実験することができる。例えば、ずれ流量条件では、流力は０．６ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２以上である。別の見方をすると、ずれ流量条件では、流力は少なくとも２．８ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２である。さらに、ずれ流量条件では、流力は少なくとも９．０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２である。ある観点から見ると、血液は、膜の表面において生理的ずれ応力が生じるように膜を通過する。次に、血液を被験対象内に戻す。血液の採取および再注入は、当該分野において既知のプラズマフェレーシス法によって行う。
【０１３１】
さらに本発明は、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質に特異的に結合する物質を被験対象に投与することにより、造血性疾患を治療する方法を提供する。そのような物質としては、例えば、ポリペプチドまたは低分子などが挙げられる。好ましくは、そのような物質はＨＣＥＬＬ抗体である。特異的に結合するとは、細胞と物質との間の相互作用がコンプレックスを形成するのに十分であることを意味する。コンプレックスの形成においては、そのような物質は、補体を活性化し、または、細胞毒性（例えば、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）など）もしくはその他の直接的な免疫学的影響を媒介する。
【０１３２】
別の方法としては、第一および第二ドメインを含む物質を被験対象に投与することにより、造血性疾患を治療することができる。第一ドメインは、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質に特異的に結合する化合物を含む。好ましくは、第一ドメインはＨＣＥＬＬ抗体またはそれらのフラグメントである。第二ドメインは、共有結合（例えば、ペプチド結合など）によって第一ドメインに連結している毒素を含む。毒素とは、接触時に細胞を破壊する、または選択的に殺すことができる任意の化合物である。「選択的に殺す」とは、第一ドメインが結合する細胞を殺すという意味である。毒素の例としては、ジフテリア毒素（ＤＴ）、プソイドモナス属外毒素（ＰＥ）、リシンＡ（ＲＴＡ）、ゲロニン、ポークウィード抗ウイルス性タンパク質、およびドデカンドロンなどが挙げられる。
【０１３３】
第一および第二ドメインは、任意の順序で配置されており、物質中には各ドメインが１個またはそれ以上含まれている。
【０１３４】
被験対象は、好ましくは哺乳類である。哺乳類としては、例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシなどが挙げられる。
【０１３５】
造血性疾患にに対する感受性を診断または測定する方法
本発明は、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質に特異的に結合する１種類またはそれ以上の物質に被験対象由来の細胞集団を接触させることにより、被験対象の造血性疾患に対する感受性を診断または測定する方法を提供する。特異的に結合するとは、細胞と物質との間の相互作用がコンプレックスを形成するのに十分であることを意味する。細胞／物質コンプレックスを検出する。コンプレックスが存在しているということは、対象が造血性疾患に罹患している、または、感受性を有することを示している。
【０１３６】
本方法によって検出可能な造血性疾患としては、例えば、貧血、好中球減少症、血小板増加症、骨髄増殖性疾患または造血性腫瘍などが挙げられる。
【０１３７】
被験対象は、好ましくは哺乳類である。哺乳類としては、例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシなどが挙げられる。
【０１３８】
造血性疾患治療の予後または効果を判断する方法
本発明は、ＨＣＥＬＬ糖タンパク質に特異的に結合する１種類またはそれ以上の物質に被験対象由来の細胞集団を接触させることにより、造血性疾患治療の予後または効果を判断する方法を提供する。特異的に結合するとは、細胞と物質との間の相互作用がコンプレックスを形成するのに十分であることを意味する。細胞／物質コンプレックスを検出する。コンプレックスが存在しないということは、造血性疾患の予後が良好である、または治療が有効であることを示している。コンプレックスが存在しているということは、造血性疾患の予後がよくない、または治療の効果がなかったことを示している。
【０１３９】
「有効である」とは、治療によって被験対象内の造血性疾患が減退することを意味する。治療を予防的に行う場合には、「有効である」とは、治療によって造血性疾患の発症を遅延させる、または防御することを意味する。
【０１４０】
本方法によって検出可能な造血性疾患としては、例えば、貧血、好中球減少症、血小板増加症、骨髄増殖性疾患または造血性腫瘍などが挙げられる。
【０１４１】
被験対象は、好ましくは哺乳類である。哺乳類としては、例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシなどが挙げられる。
【０１４２】
炎症性疾患の治療法
本発明は、被験対象にＨＣＥＬＬ糖タンパク質またはそれらのフラグメントを投与することにより、炎症性疾患を治療する方法を提供する。
【０１４３】
炎症性疾患としては、例えば、慢性関節リューマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＡ）および喘息などが挙げられる。
【０１４４】
ＨＣＥＬＬポリペプチド融合ポリペプチドまたはそれらをコードしている核酸を含む薬剤学的組成物
投与に適した薬剤学的組成物には、ＨＣＥＬＬポリペプチドもしくはこれらの融合タンパク質をコードしている核酸分子、および本発明の方法に従って単離された細胞（本明細書においては、「治療剤」または「活性化合物」とも称する）、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、アナログおよびホモログを用いることができる。一般的には、そのような組成物には、核酸分子、タンパク質、細胞もしくは抗体、ならびに薬剤学的に許容されるキャリヤーを含む。本明細書において使用している「薬剤学的に許容されるキャリヤー」とは、薬剤学的投与に適した任意ならびにすべての溶媒、分散剤、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。適切なキャリヤーについては、当該分野における標準的な教科書である「レミントン  薬剤学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」の最新版に記載されており、参考として本明細書中に取り入れておく。そのようなキャリヤーまたは希釈剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。リポソームおよび非水性ビヒクル（不揮発油など）も用いることができる。薬剤学的に活性な物質に対してそのような媒剤および物質を使用することは、当該分野において既知である。従来から使用されている媒剤または物質が活性化合物と非相溶性である場合を除けば、それらを組成物に使用することは企図の範囲内である。補助的な活性化合物を組成物に取り入れることもできる。
【０１４５】
本明細書に開示している活性物質はリポソームとして製剤化することができる。リポソームは既知の方法に基づいて調製することができ、例えば、エプスタイン（Ｅｐｓｔｅｉｎ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２： ３６８８（１９８５）；ホワン（Ｈｗａｎｇ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７： ４０３０（１９８０）；ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号などに記載されている。循環時間を延長させることができるリポソームについては米国特許第５，０１３，５５６号に記載されている。
【０１４６】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ−誘導化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相エバポレーション法によって調製することができる。一定の孔径のフィルターを通してリポソームを押し出すことにより、所望する直径のリポソームを得ることができる。
【０１４７】
本発明に従う薬剤学的組成物は、予定している投与経路に適合するように製剤化する。投与経路の例としては、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下など）、経口（例えば、インハレーションなど）、経皮（すなわち、局所）、経粘膜および直腸投与などが挙げられる。非経口、皮内または皮下投与に使用する溶液または懸濁液には次のような組成物を用いて製剤化することができる：注射用に用いる水などの滅菌希釈剤、生理食塩水、不揮発油、ポリエチレングリコール類、グリセリン、プロピレングリコールもしくはその他の合成溶媒、抗菌剤（ベンジルアルコールまたはメチルパラベン類）、抗酸化剤（アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなど）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）、緩衝液（酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液またはリン酸緩衝液など）ならびに張度の調整剤（塩化ナトリウムまたはデキストロースなど）。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調整することができる。非経口投与用製剤は、アンプル、ディスポーザブルシリンジ、または、複数回投与用のガラスもしくはプラスチック製のバイアルに充填することができる。
【０１４８】
注射に適した薬剤学的組成物としては、滅菌水性溶液（水溶性の場合）もしくは分散剤、ならびに滅菌注射溶液もしくは分散剤を用時調製するための滅菌粉末などが挙げられる。静脈注射用には、生理食塩水、制菌性水、クレモフォアＥＬ（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｅ ＥＬ（登録商標））（ＢＡＳＦ社、ニュージャージー州パルシパニー）またはリン酸緩衝生理食塩水などの適切なキャリヤーを用いる。すべての場合において、組成物は滅菌されていなければならず、容易に注射器で押し出すことができる程度に液状でなければならない。製造および保存の条件下において安定でなければならず、バクテリアおよび真菌などの微生物の混入を阻止しなければならない。キャリヤーとしては、溶媒または分散剤、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物などを用いることができる。レシチンなどのコーティング剤を使用する、分散製剤の場合には所望する粒子径を維持する、および界面活性剤を使用するなどの手段により、適切な流動性を維持することができる。微生物活性の阻止は、多様な抗生剤および抗菌剤を用いることによって可能であり、そのようなものとしては例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどが挙げられる。多くの場合には、糖類、ポリアルコール類（例えば、マンニトール、ソルビトールなど）、塩化ナトリウムなどのような等張剤を組成物中に含有することが好ましい。注射可能な組成物の吸収時間を延長するためには、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどのような吸収を遅延させる物質を組成物に組み込む。
【０１４９】
滅菌注射溶液は、上述の材料を１種類または組み合わせたものと共に、必要量の適切な溶媒中に活性化合物を添加し、必要に応じて滅菌ろ過することによって調製することができる。一般的には、分散製剤は、基本的な分散剤および上述したその他の必要な材料を含む滅菌ビヒクルに活性化合物を添加することによって調製することができる。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合には、調製法は減圧乾燥および凍結乾燥であるが、この操作により、活性材料と、事前に滅菌ろ過した溶液から得た所望するその他の追加材料とを含む粉末が得られる。一般的には、経口組成物は、不活性希釈剤または可食性キャリヤーを含む。そのような組成物は、ゼラチンカプセルへ封入する、または錠剤に圧縮することができる。経口投与による治療を行うためには、活性化合物を賦形剤と組み合わせることが可能であり、錠剤、トローチまたはカプセルの形で使用することができる。経口組成物は、液体キャリヤーを用いて調製し、マウスウオッシュとして使用することができるが、このとき、液体キャリヤー中の該化合物を口腔内に入れ、漱ぎ、はき出すかまたは飲み込む。薬剤学的に許容される結合剤および／またはアジュバント剤を組成物の一部として添加することができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどには、以下に記載する材料または同様の性質を有する化合物のうちの任意のものを用いることができる：結合剤（微晶性セルロース、トラガカントガムまたはゼラチンなど）；賦形剤（でんぷんまたは乳糖など）；崩壊剤（アルギニン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）またはコーンスターチなど）；光沢剤（ステアリン酸マグネシウムまたはステロテス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）など）；グリダント（ｇｌｉｄａｎｔ）（コロイド性二酸化ケイ素など）；甘味料（ショ糖またはサッカリンなど）；または香料（ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香料など）。
【０１５０】
インハレーションによる投与の場合には、気体（例えば、二酸化炭素など）などの適切な推進剤を充填した加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからエアロゾルスプレーの形で化合物を放出することができる。
【０１５１】
経粘膜または経皮投与によって全身投与を行うこともできる。経粘膜または経皮投与を行うためには、被浸透バリアに適した浸透剤を製剤中に混入する。一般的には、そのような浸透剤は当該分野において既知であり、例えば、経粘膜投与用には、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体などが挙げられる。経粘膜投与は、点鼻用スプレーまたは坐薬を使用することによって実施することができる。経皮投与用には、当該分野において既知である、軟膏、蝋膏、ゲルまたはクリームなどの状態に活性化合物を製剤化することができる。
【０１５２】
直腸投与を行うために、化合物を坐薬（例えば、カカオ脂またはその他のグリセリドなどのような従来から使用されている坐薬基剤を用いるなど）または滞留浣腸（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｅｎｅｍａ）の様式に製剤化することもできる。
【０１５３】
ひとつの実施態様においては、キャリヤーを用い、活性化合物を放出制御製剤（例えば、インプラント（埋込製剤）およびマクロカプセル封入デリバリーシステムなど）などに製剤化するが、そのようなキャリヤーは、化合物が身体から迅速に排出されることを防ぐ。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物類（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ）、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル類およびポリ乳酸などのような生体分解性、生体許容性のポリマーを用いることができる。そのような製剤の調製法については、当該分野において既知である。材料は、アルザ社（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびノヴァ・ファーマシューティカルズ（Ｎｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）社から購入することもできる。薬剤学的に許容されるキャリヤーとしては、リポソーム懸濁物（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を含み、感染細胞を標的とするリポソームを含む）を用いることもできる。それらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号などに記載されいているような当該分野において既知の方法に従って調製することができる。
【０１５４】
いくつかの実施態様においては、経口または非経口組成物は、投与の容易性および均一性を目的として、投与ユニット型に製剤化する。本明細書において使用している投与ユニット型とは、被験対象への均一な投与（ｕｎｉｔａｒｙ ｄｏｓａｇｅｓ）に適した物理的に独立したユニットをさし、各ユニットには、必要とされる薬剤学的キャリヤーと協調して所望する治療効果を発揮するために、予め計算された量の活性化合物が含まれている。本発明に従う投与ユニット型に関する定義は、活性化合物に特有の性質および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個別の対象の治療用にそのような活性化合物を製剤化することにおける本質的な制限によって指定され、直接的に関連している。
【０１５５】
本発明に従う核酸分子はベクターに挿入することができ、遺伝子治療ベクターとして用いることができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静注、局所投与（例えば、米国特許第５，３２８，４７０号などを参照）、または定位注射（例えば、チェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１： ３０５４−３０５７（１９９４）を参照）などによって対象に投与することができる。遺伝子治療ベクターの薬剤学的調製物は、許容される希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含有する、または、遺伝子送達ビヒクルが包埋された遅放性マトリックスを構成することができる。別の方法としては、組換え細胞において、完全な遺伝子送達ベクターがそのままの形で産生される（例えば、レトロウイルス性ベクターなど）場合には、薬剤学的調製物は、遺伝子送達系を発現することができる１個またはそれ以上の細胞を含有することができる。
【０１５６】
所望する場合には、徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の適切な例としては、抗体を含む固体疎水性ポリマーから構成される半透過性マトリックスが挙げられ、該マトリックスは、フィルムまたはマイクロカプセルなどの成型物の様式である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル類、水性ゲル類（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール）など）、ポリラクチド類（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸とのコポリマー類、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性酪酸−グリコール酸コポリマー類（リュープロン・デポ（登録商標）（酪酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸リュープロリドから構成される注射可能なマイクロスフェアー）など）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸などが挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび酪酸−グリコール酸などのポリマー類は１００日以上にわたって分子を放出することができるが、ある種の水性ゲルは、タンパク質を放出する期間がそれらよりも短い。
【０１５７】
薬剤学的組成物は、使用説明書と共に、容器、パックまたはディスペンサーに充填することができる。
【０１５８】
本発明は、以下の実施例においてより詳細に説明されるが、これらは、請求項に記載された発明の範ちゅうを制限するものではない。
【０１５９】
【実施例】
実施例１：ヒト造血細胞におけるＨＥＣＡ−４５２反応性の膜糖タンパク質の確認
ＨＥＣＡ−４５２反応性のエピトープに関するＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析は、複数のヒト造血細胞系由来の膜タンパク質について行った。
【０１６０】
細胞の調製
ヒト造血細胞系（ＫＧ１ａ、ＨＬ６０、ＲＰＭＩ−８４０２およびＫ５６２）およびＢＭ内皮細胞系ＢＭＥＣ−１（カンダル（Ｃａｎｄａｌ）ら、１９９６年）は、ＲＰＭＩ１６４０／１０％のＦＢＳ／１％のペニシリン−ストレプトマイシン（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社、ニューヨーク州グランドアイランド）中で増殖させた。 新鮮な循環白血球芽細胞は、患者の末梢血をフィコール−ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）（１．０７７〜１．０８００ｇ／ｍｌ ）（ＩＣＮバイオメディカルズ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）社、オハイオ州オーロラ）密度勾配遠心分離にかけることによって単離したが、このとき、末梢血中における白血球芽細胞の割合は、全循環白血球の８０％以上であった。正常なヒトＢＭ細胞は、家族の同意が得られた死体臓器供与者から、およびニューイングランド臓器バンク（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｂａｎｋ）（マサチューセッツ州ニュートン）の協力の下で、椎体から抽出した。ＢＭ単核細胞は、フィコール−ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）（１．０７７〜１．０８００ｇ／ｍｌ ）密度遠心分離によって単離した。陰性細胞選択ステムセプヒト幹細胞濃縮カラム（ＳｔｅｍＳｅｐ（登録商標） ｈｕｍａｎ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｃｏｌｕｍｎ）（ステムセル・テクノロジーズ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社、カナダ・ブリティッシュコロンビア州バンクーバー）を使用することにより、また別の方法としては、イムノマグネティックビーズ分離法（ミルテニィ・バイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）社、カリフォルニア州オーバーン）を用いてＣＤ３４＋細胞または骨髄細胞のその他の亜集団（単球（ＣＤ１４＋）、顆粒球（ＣＤ１５＋）、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）またはＴ細胞（ＣＤ３＋））に対する陽性選択を行うことにより、ＣＤ３４＋ならびに直系＋／ＣＤ３４−亜集団に分離することができる。ＣＤ３４＋／ＣＤ４４＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ４４−およびＣＤ３４−／ＣＤ４４＋細胞集団は、フルオロクロムコンジュゲート抗ＣＤ３４モノクローナル抗体（ＨＰＣＡ−２）（ベクトン−ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）社）および抗ＣＤ４４モノクローナル抗体（Ｈｅｒｍｅｓ−１）（フレッド・ハッチンソン癌研究所（Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃｅｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）のブレンダ・サンドマイアー（Ｂｒｅｎｄａ Ｓａｎｄｍａｉｅｒ）博士から供与）を用い、モーフロー装置（ＭｏＦｌｏ ａｐｐａｒａｔｕｓ）（サイトメーション（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）社）上で細胞選択を行うことにより単離した。
【０１６１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット
ＨＰＣの膜調製物は、既報（サクステイン（Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ）およびディミトロフ（Ｄｉｍｉｔｒｏｆｆ）、２０００年）に従って単離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット用には、還元緩衝液中で膜調製物を希釈し、６〜９％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。特に示している場合においては、既報（サクステイン（Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ）およびディミトロフ（Ｄｉｍｉｔｒｏｆｆ）、２０００年）に従い、Ｎ−グリコシダーゼＦ（ロシュ・モレキュラー・バイオメディカルズ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）社）（８Ｕ／ｍｌで２４時間 ）またはコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ）（ロシュ・モレキュラー・バイオメディカルズ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）社）ノイラミニダーゼ（０．１Ｕ／ｍｌ 、Ｈ／Ｈ／Ｃａ２＋中、３７℃で１時間）を用いて膜タンパク質をさらに処理した。解析された膜タンパク質をセクィ−ブロット（Ｓｑｕｉ−ｂｌｏｔ（登録商標））ＰＶＤＦ膜（バイオラド（ Ｂｉｏｒａｄ ）社、カリフォルニア州ハーキュレス）に移し、ＰＢＳ／ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）／２０％のＦＢＳを用い、４℃で１時間ブロックした。ラットモノクローナル抗体ＨＥＣＡ−４５２（ファーミジェン（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）社、カリフォルニア州サンディエゴ）（１．２μｇ／ｍｌ、ＰＢＳ中）または抗ＰＳＧＬ−１モノクローナル抗体４Ｈ１０（ジェネティクス・インスティテュート（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）社）を添加して室温で１時間ブロットをインキュベートした。ラットＩｇＭまたはマウスＩｇＧを用いたアイソタイプ対照イムノブロットを平行して行い、非特異的反応タンパク質を評価した。ＰＢＳ／０．１％のツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄した後、最初に添加した抗体に応じて、ＡＰ−コンジュゲートウサギ抗ラットＩｇＭモノクローナル抗体（１：４００）またはＡＰ−コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（１：８０００）を加えてブロットをインキュベートした。ＡＰ基質であるウェスタンブルー（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｕｅ（登録商標））（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社、ウィスコンシン州マディソン）を添加してブロットを染色した。
【０１６２】
図１Ａに示すように、ＫＧ１ａ細胞から単離された膜タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上においては、多数のはっきりとしたＨＥＣＡ−４５２反応性のバンドが検出された。これらのブロットの分析においては、使用したＫＧ１ａ膜タンパク質の量は、ＨＬ−６０、ＲＰＭＩ−８４０２またはＫ５６２細胞の膜タンパク質の１０分の１以下であったにもかかわらず、ＫＧ１ａ細胞は、よりはっきりとしたＨＥＣＡ−４５２染色を示すいくつかの構成タンパク質を含んでいた。ＨＬ−６０細胞においては、約１４０ｋＤａの１本の幅広いバンドのみが検出されたが、これは、イムノブロットにより、ＰＳＧＬ−１のモノマー（単体）に相当するものであることがわかった（図１Ａ）。ＲＰＭＩ−８４０２またはＫ５６２細胞については、抗ＰＳＧＬ−１抗体４Ｈ１０（ディミトロフ（Ｄｉｍｉｔｒｏｆｆ）、２０００年）を用いて行ったウェスタンブロットにおいてＰＳＧＬ−１は検出されたが、ＨＥＣＡ−４５２反応性膜タンパク質は存在していなかった。この知見から、これらの細胞は適切なＨＥＣＡ−４５２結合エピトープ、および、少なくともＰＳＧＬ−１のＥ−セレクチン結合種を欠いていることが示唆された。
【０１６３】
実施例２：一定のずれ流量条件下におけるＥ−セレクチンへのヒト造血細胞の結合の評価
ヒト造血細胞系によるＨＥＣＡ−４５２の発現がＥ−セレクチンリガンド活性と相関しているか否かを調べるため、平行プレートフローチャンバー（ｐｒａｌｌｅｌ−ｐｌａｔｅ ｆｌｏｗ ｃｈａｍｂｅｒ）実験を行い、一定のずれ流量条件下におけるＥ−セレクチンへの結合を評価した。
【０１６４】
単層細胞の使用
造血細胞単層とＣＨＯ−Ｅ（ヒトＥ−セレクチンをコードしているｃＤＮＡの全長が安定的にトランスフェクトされているチャイニーズハムスター卵巣細胞）の懸濁物との間において、一定のずれ応力下におけるＥ−セレクチンを介した接着相互作用を流れの中で調べた。ＣＨＯ−Ｅおよび空のベクター構築体（ＣＨＯ−Ｍｏｃｋ）は、ＭＥＭ  １０％のＦＢＳ／１％のペニシリン／ストレプトマイシン（ライフ・テクノロジー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社）およびＨＡＭ’ｓ  Ｆ−１２（セルグロー（Ｃｅｌｌｇｒｏ）社）／５％のＦＣＳ／１％のペニシリン／ストレプトマイシン中でそれぞれ維持した。平行プレートフローチャンバーを用い、ビデオ顕微鏡によって造血細胞単層上におけるＣＨＯ−Ｅ細胞の繋留（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）およびローリング（ｒｏｌｌｉｎｇ）を即時可視化した。実験を行う前に、５ｍＭのＥＤＴＡを用いてＣＨＯ−Ｅ細胞を回収し、ＨＢＳＳ中で２回洗浄し、ＨＢＳＳ／１０ｍＭのＨＥＰＥＳ／２ｍＭのＣａＣｌ２（Ｈ／Ｈ／ＣＣ）中、１×１０７／ｍｌになるように懸濁した。負の対照群は、Ｈ／Ｈアッセイ緩衝液に５ｍＭのＥＤＴＡを添加する（結合に必要なＣａ２＋をキレートさせるため）、ＣＨＯ−Ｅ細胞を抗Ｅ−セレクチン抗体（クローン６８−５Ｈ１１；ファーミジェン（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）社）で処理する、またはＣＨＯ−空のベクター形質転換体（ＣＨＯ−Ｍｏｃｋ細胞）を使用することによって調製した。９０％以上のコンフルエントを示す造血細胞単層を調製するため、重炭酸ナトリウム／２％のＦＢＳ不含ＲＰＭＩ１６４０中に２×１０６個／ｍｌの細胞（ＫＧ１ａ、ＨＬ６０、Ｋ５６２またはＲＰＭＩ８４０２）を懸濁させたものを遠心分離し、６ウェルプレートに５×１０６個／ウェルとなるように加え、３％のグルタルアルデヒドを加えて固定した。０．２Ｍのリシンを加えて反応性アルデヒド基をブロックし、プレート内の細胞をＨ／Ｈ／Ｃａ２＋に懸濁させた。同時に、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ）ノイラミニダーゼ（０．１Ｕ／ｍｌ Ｈ／Ｈ／Ｃａ２＋中、３７℃で１時間）またはＯ−シアロ糖タンパク質エンドペプチダーゼ（ＯＳＧＥ）（６０μ／ｍｌ Ｈ／Ｈ／Ｃａ２＋中、３７℃で１時間；アキュレート・ケミカルズ（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社、ニューヨーク州ウェストバリー）を用いて細胞をそれぞれ前処理した。細胞単層を平行プレートフローチャンバー内に置き、ＣＨＯ−Ｅ／Ｍｏｃｋ細胞をチャンバー内に灌流させた。ＣＨＯ−ＥまたはＣＨＯ−Ｍｏｃｋ細胞が細胞単層に接触するように放置した後、流速を調整してずれ応力が２．８ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２になるようにした。各単層上におけるＣＨＯ−Ｅ／Ｍｏｃｋ細胞細胞のローリングは、複数回の実験において、倍率を１０倍にし、独立した５個の視野から構成されている１個のフレーム内で測定した。少なくとも３回の実験を行い、結果は平均±標準偏差として表した。
【０１６５】
別の方法としては、既報（ラフィー（Ｒａｆｉｉ）ら、１９９４年）に従って培養されたヒト一次ＢＭＥＣを用時単離したものを使用し、二次培養での継代数が５回以内であるＢＭＥＣを６ウェルプレートに５×１０６個／ウェルとなるように播種し、コンフルエントが９０〜１００％に達したときに、ＩＬ−１α（４０Ｕ／ｍｌ）を添加して４時間刺激し、細胞表面におけるＥ−セレクチンの発現を亢進させた（発現はフローサイトメトリー分析によって測定した）。次に、生きている培養細胞を平行プレートフローチャンバーに入れ、チャンバー内のＢＭＥＣに造血細胞（Ｈ／Ｈ／Ｃａ２＋中、１０７個／ｍｌ）を灌流させた。２．８ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２において、繋留およびローリングしている造血細胞を可視化した。Ｅ−セレクチンを介した接着の特異性を評価するため、対照として、ＩＬ−１αで活性化しなかったＢＭＥＣおよび１０μｇ／ｍｌの抗Ｅ−セレクチンモノクローナル抗体（クローン６８−５Ｈ１１）を用いて処理したＩＬ−１α活性化ＢＭＥＣを使用した。細胞のローリングは、上述に従って定量および表現した。
【０１６６】
固定化免疫沈降物の利用
ＣＤ４４は、未処理の細胞溶解物から、または、Ｎ−グリコシダーゼＦ（０．８Ｕ／ｍｌ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ）ノイラミニダーゼ（０．１Ｕ／ｍｌ）もしくはＬ−フコシダーゼ（８０ｍＵ／ｍｌ）で処理した細胞溶解物から免疫沈降され、ＰＳＧＬ−１は、既に記載（サクステイン（Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ）およびディミトロフ（Ｄｉｍｉｔｒｏｆｆ）、２０００年；ディミトロフ（Ｄｉｍｉｔｒｏｆｆ）ら、２０００年）されている未処理の細胞溶解物から免疫沈降された。
【０１６７】
ＣＤ４４またはＰＳＧＬ−１の免疫沈降物をプラスチックのペトリ皿に滴下し、３％のグルタルアルデヒドで固定し、０．２Ｍのリシン中でインキュベートすることによって未反応のアルデヒド基をブロックし、次に、１００％のＦＢＳ中、室温で１時間インキュベートすることによって非特異的結合を阻止した。スポットを覆うようにコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ）ノイラミニダーゼを添加し（アッセイ培地中０．１Ｕ／ｍｌ）、３７℃で１時間インキュベートすることによって固定されたスポットを処理した。試料の入ったペトリ皿を平行プレートフローチャンバーに入れ、ＣＨＯ−Ｅ、ＣＨＯ−Ｐ（Ｐ−セレクチンの全長をコードしているヒトｃＤＮＡが安定的にトランスフェクトされているＣＨＯ）、機能をブロックする抗Ｐ−セレクチンモノクローナル抗体（クローンＡＫ−４；ファーミジェン（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）社））（１０μｇ／ｍｌ）で処理したＣＨＯ−Ｐ細胞、機能をブロックする抗Ｅ−セレクチンモノクローナル抗体（クローン６８−５Ｈ１１）（１０μｇ／ｍｌ）処理したＣＨＯ−Ｅ細胞またはＭｏｃｋトランスフェクト体が基質に接触するまで、流速０．２ｍｌ／分でそれらの細胞をチャンバー内に灌流させた（Ｈ／Ｈ／Ｃａ２＋中、２×１０６個／ｍｌ）。流速を上げてずれ応力を２．８ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２にした。倍率を１００倍にして視野あたりの細胞のローリング頻度を測定し、少なくとも３回の実験から得られた８視野についての平均±標準偏差として表した。
【０１６８】
グルタルアルデヒドで固定したＫＧ１ａおよびＨＬ６０細胞の単層上でＥ−セレクチンを高レベルで発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｅ）の繋留およびローリングを２．８ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２において観察した（図１Ｂ）。ＭｏｃｋをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ｍｏｃｋ）はローリングを示さなかった。ＣＨＯ−Ｅ細胞のローリングは、ＨＬ６０細胞上よりもＫＧ１ａ細胞上の方が２倍以上であり、また、アッセイ培地に５ｍＭのＥＤＴＡを添加することにより、ＣＨＯ−Ｅ細胞を抗Ｅ−セレクチン抗体と共に事前にインキュベートしておくことにより、または、ＫＧ１ａ細胞もしくはＨＬ６０細胞をコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ）ノイラミニダーゼ（末端のシアル酸を解裂する）で前処理することにより、完全に阻害された。ＲＰＭＩ−８４０２またはＫ５６２細胞系にはＥ−セレクチンリガンド活性はなかったが、それらの細胞の膜タンパク質は、ＨＥＣＡ−４５２エピロープを有していなかった。驚くべきことに、ＫＧ１ａおよびＨＬ６０細胞のＥ−セレクチンリガンド活性は、細胞に５０μｇ／ｍｌのＨＥＣＡ−４５２を加えてインキュベートしても阻害されず、また、フローサイトメトリーにより、ＫＧ１ａ  ＣＤ３４上のＯＳＧＥ感受性エピトープであるＱＢＥＮＤ−１０が消失していることによってＯＳＧＥの生物活性を確認していたにもかかわらず、ＯＳＧＥによる前処理では該活性は阻害されなかった。
【０１６９】
ヒトＨＰＣと生理的に重要な細胞上において、天然に発現されたＥ−セレクチンとの間の相互作用を分析することを目的として、新しく単離したヒトＢＭ微小脈管内皮細胞（ＢＭＥＣ）を用いた。生理学的ずれ流量条件下、ＩＬ−１αで活性化した生きたＢＭＥＣの単層上におけるＫＧ１ａおよびＨＬ６０細胞のローリングを観察した。ＨＰＣ  Ｅ−セレクチンリガンド活性を評価するために行ったＣＨＯ−Ｅ細胞を用いた実験の結果と同じく、ＩＬ−１で活性化したＢＭＥＣ上のＥ−セレクチン上において、ＫＧ１ａ細胞はＨＬ６０細胞の４倍以上のローリング能を有しており、ＲＰＭＩ−８４０２およびＫ５６２細胞は最小限のＥ−セレクチンリガンド活性しか有していなかった（図２）。ＫＧ１ａおよびＨＬ６０細胞のＥ−セレクチンリガンド活性は、ＩＬ−１αによる活性化を行わなかったＢＭＥＣ、または抗Ｅ−セレクチンモノクローナル抗体を用いて機能をブロックしたＩＬ−１α活性化ＢＭＥＣにおいては観察されなかった。
【０１７０】
実施例３：ヒト造血細胞由来のＥ−セレクチン糖タンパク質リガンドに関するブロットローリングアッセイを用いた評価
ＨＥＣＡ−４５２反応性のＫＧ１ａ膜タンパク質すべてについてＥ−セレクチンリガンド活性を調査することを目的として、ずれ流量下、セレクチンを発現する細胞全体とウェスタンブロット上に固定されたタンパク質との間の接着相互作用を評価した（ディミトロフ（Ｄｉｍｉｔｒｏｆｆ）ら、２０００年）。
【０１７１】
ブロットローリングアッセイは、既報（ディミトロフ（Ｄｉｍｉｔｒｏｆｆ）ら、２０００年）に従って行った。概説すると、上述したように、ＣＨＯ−Ｅ、ＣＨＯ−ＰまたはＣＨＯ−Ｍｏｃｋ形質転換体を単離し、ＨＢＳＳ中で２回洗浄し、ＨＢＳＳ／１０ｍＭのＨＥＰＥＳ／２ｍＭのＣａＣｌ２（Ｈ／Ｈ／Ｃａ２＋）／１０％のグリセロール中、１×１０７個／ｍｌになるように懸濁した。ＨＥＣＡ−４５２を用いて染色したＨＰＣ膜調製物のウェスタンブロットは、Ｈ／Ｈ／Ｃａ２＋／１０％のグリセロール中でインキュベートすることによって透過させた。次に、ブロットを平行プレートフローチャンバー内に入れ、ＣＨＯ形質転換体（２×１０６個／ｍｌ）をチャンバー内に灌流させた。ブロット膜に細胞を接触させた後、流速を調整してすれ応力を３．８ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２にした。１０％のグリセロール接着アッセイ培地の粘度はずれ応力値に相当すると考えられた。ビデオモニター上の各視野を１００倍に拡大し、ローリングしている細胞数および各免疫染色バンド領域間の細胞数を計数したが、このとき、目的のタンパク質のみかけの分子量を整列させ、可視化するための補助として、分子量マーカー（カレイドスコープ分子量マーカー（Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｒｋｅｒｓ）、バイオラド（ Ｂｉｏｒａｄ ）社；ノヴェックス（Ｎｏｖｅｘ）社から販売されているシー・ブルー（Ｓｅｅ Ｂｌｕｅ（登録商標））を用いた。実験は少なくとも３回行い、結果は、倍率１００倍における１視野あたりの細胞ローリングを平均±標準偏差として表した。負の対照は、ＣＨＯ−Ｅ  Ｈ／Ｈアッセイ緩衝液に５ｍＭのＥＤＴＡを添加し、結合に必要なＣａ２＋をキレートさせることにより、抗Ｅ−セレクチン抗体（クローン６８−５Ｈ１１；１０μｇ／ｍｌ）を用いてＣＨＯ−Ｅ細胞を前処理することにより、またはＣＨＯ−Ｍｏｃｋ細胞が固定化したタンパク質と相互作用する能力について評価を行うことにより、調製した。
【０１７２】
Ｅ−セレクチンリガンド活性は、ＨＥＣＡ−４５２で染色されたバンドのうち、１００、１２０、１４０、１９０および２２０ｋＤａにおいては観察されたが、７４ｋＤａにおいては観察されなかった（図３Ａ）。ＣＨＯ−Ｍｏｃｋ形質転換体はいずれのバンドとも相互作用を示さなかった。Ｅ−セレクチンに対する特異性は、５ｍＭのＥＤＴＡまたは抗Ｅ−セレクチン機能ブロック抗体の存在下において、ＣＨＯ−Ｅ細胞のローリングが停止することによって示された。ＨＬ６０細胞においては、幅広い１４０ｋＤａのＨＥＣＡ−４５２免疫染色バンド（すなわち、ＰＳＧＬ−１／ＣＬＡ）上においてのみＣＨＯ−Ｅ細胞のローリングが観察された。Ｅ−セレクチン結合決定因子がＮ−グリカン上に存在するか否かを確認することを目的として、ＫＧ１ａ膜タンパク質をＮ−グリコシダーゼＦで処理した。脱Ｎ−グリコシル化したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、ＨＥＣＡ−４５２反応性およびＥ−セレクチンリガンド活性について分析した。Ｎ−グリコシダーゼＦで処理することにより、ＨＥＣＡ−４５２染色は明らかに弱まり（図３Ｂ）、ブロット上のすべてのタンパク質上におけるＣＨＯ−Ｅ細胞のローリングも完全に停止したことから、ＫＧ１ａ細胞上のすべての糖タンパク質Ｅ−セレクチン結合決定因子は、Ｎ−グリカン上にのみ存在していることが示唆された。
【０１７３】
実施例４：ＨＣＥＬＬの確認および特性付け
アクリルアミドの濃度を変化させて調製したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから連続的に切り出した９８ｋＤａのＫＧ１ａ膜タンパク質上におけるＨＥＣＡ−４５２エピトープの発現は以下のようにして行った。各回のＳＤＳ−ＰＡＧＥ精製後、９８ｋＤａのタンパク質は、ブロットに基づく流体力学的フローアッセイにおいて、リンパ球のローリングを支持する能力を保持していた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ精製を３回行った後、９８ｋＤａのバンドに加えて、約１９０ｋＤａの位置にＨＥＣＡ−４５２染色バンドがかすかに検出されたことから、単離過程において、９８ｋＤａタンパク質が何らかの形に凝集したことが示唆された。次に、９８ｋＤａのクーマジーブルー（Ｃｏｏｍａｓｉｅ ｂｌｕｅ）染色ゲルフラグメントについて、トリプシン消化ペプチドフラグメントに関するマススペクトロメトリー分析を行った。一次ペプチドマップは、ＫＧ１ａ細胞上で発現することが既に明らかにされているＣＤ４４の標準型のそれと一致した。ＣＤ４４に対するモノクローナル抗体（マウスＩｇＧ Ａ３Ｄ８またはラットＩｇＧ Ｈｅｒｍｅｓ−１）をＨＥＣＡ−４５２と共に使用し、ＨＥＣＡ−４５２、Ａ３Ｄ８またはＨｅｒｍｅｓ−１を用いた３回目のゲル精製後、精製した９８ｋＤａのバンドのイムノブロットを行った（図８）。各抗体は、９８ｋＤａのバンド、および凝集タンパク質を示していると考えられる約１９０ｋＤａの薄いバンドを検出した。ＨＥＣＡ−４５２と抗ＣＤ４４モノクローナル抗体との間に相関が確認されたことから、ＣＤ４４のＫＧ１ａグリコフォームはＨＥＣＡ−４５２炭化水素決定因子を含んでいることが示唆された。
【０１７４】
ＨＥＣＡ−４５２反応性バンドからＫＧ１ａ細胞性ＰＳＧＬ−１／ＣＬＡを区別することを目的として、イムノアフィニティー精製したＰＳＧＬ−１のブロットおよびＫＧ１ａの全膜タンパク質のブロットについて、ＨＥＣＡ−４５２または抗ＰＳＧＬ−１を用いて免疫染色を行った（図３Ｃ）。ＫＧ１ａ細胞は、ＰＳＧＬ−１の単体（モノマー）および二量体（ダイマー）イソ型を発現し、それらは、１４０ｋＤａおよび２２０ｋＤａのＨＥＣＡ−４５２反応性タンパク質を表していた（図３Ｃ）。従って、ＣＨＯ−Ｅ細胞のローリングを支持する１００ｋＤａ、１２０ｋＤａおよび１９０ｋＤａのＨＥＣＡ−４５２反応性バンド（図３Ａ）は、非ＰＳＧＬ−１タンパク質に該当した。
【０１７５】
ＣＤ４４に対するＮ−グリカン特異的変形がＥ−セレクチンリガンド活性に影響を与えているか否かを判断することを目的として、ＫＧ１ａ膜タンパク質からイムノアフィニティー精製したＣＤ４４が、ブロットローリングアッセイにおいてＥ−セレクチンリガンドとして作用する能力について調べた。図３Ｄに示すように、ＫＧ１ａ ＣＤ４４はＨＥＣＡ−４５２に対して反応を示し、Ｅ−セレクチンリガンド活性を有していた。ＣＤ４４をＮ−グリコシダーゼＦで処理すると、ＨＥＣＡ−４５２反応性は顕著に低下し、ＣＨＯ−Ｅ細胞のローリングは完全に停止した（図３Ｄ）。ＣＤ４４を徹底的に免疫沈降する（３回）ことにより、１００ｋＤａにおける染色可能なＣＤ４４分子が消失し（Ｈｅｒｍｅｓ−１イムノブロットおよびＨＥＣＡ−４５２イムノブロット）、また、１００ｋＤａおよび１９０ｋＤａのバンドにおけるすべてのＥ−セレクチンリガンド活性が消失した（図４Ａおよび４Ｂ）。さらに、免疫沈降を３回行った後は、１２０ｋＤａのバンドにおけるＥ−セレクチンリガンド活性が５５％も低下していた（図４Ｂ）。特筆すべきことは、ＣＤ４４の除去後においても、ＰＳＧＬ−１の１４０ｋＤａのモノマーに対するＨＥＣＡ−４５２染色またはＥ−セレクチンリガンド活性には差異がなかったことである。
【０１７６】
ＣＤ４４のＥ−セレクチンリガンド活性をさらに精査することを目的として、ヒト造血細胞系からＣＤ４４を直接免疫沈降させ、平行プレートフローチャンバー内においてＣＨＯ−Ｅ細胞の結合を分析した。ヒト造血細胞系ＨＬ６０、Ｋ５６２およびＲＰＭＩ−８４０２から単離したＣＤ４４はＣＨＯ−Ｅ細胞のローリングを全く支持しなかったが、ＫＧ１ａ  ＣＤ４４は、ずれ応力の範囲を超えてもＥ−セレクチンリガンド活性を示した。Ｎ−グリコシダーゼＦ処理したＫＧ１ａ  ＣＤ４４上、Ｌ−フコシダーゼ処理したＫＧ１ａ  ＣＤ４４上、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ）ノイラミニダーゼ処理したＫＧ１ａ膜タンパク質上、またはアイソタイプ抗体免疫沈降物（対照）上によりも、未処理のＫＧ１ａ  ＣＤ４４上において非常に激しいＣＨＯ−Ｅ細胞のローリングが観察された（図５Ａ）。さらに、２．８ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２においては、等モル量の免疫沈降ＫＧ１ａ ＰＳＧＬ−１と比較すると、ＣＤ４４は非常に高いＥ−セレクチンリガンド活性を示した（ｐ＜０．００１）（図５Ａ）。しかしながら、ずれ応力が小さい（０．６ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２）場合には、ＰＳＧＬ−１上におけるＣＨＯ−Ｅ細胞のローリングは、ＣＤ４４上におけるそれと同等であった。これらのデータから、ずれ応力が小さい場合には、ＰＳＧＬ−１およびＣＤ４４は、Ｅ−セレクチン結合に対して重複して寄与するが、生理的ずれ応力が大きくなると、ＣＤ４４とＥ−セレクチンとの関係が優先されることを示唆している。注意すべきことは、Ｐ−セレクチンをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞はＫＧ１ａ ＰＳＧＬ−１上ではローリングしたが、ＫＧ１ａ  ＣＤ４４上においてはローリングしなかった（図５Ｂ）ことから、ＣＤ４４はＰ−セレクチンリガンドではないことが示唆される（図５Ｂ）。すべての実験において、負の対照であるＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ｍｏｃｋ形質転換体、ならびに機能をブロックするＢ−セレクチンモノクローナル抗体もしくはＰ−セレクチンモノクローナル抗体でそれぞれ処理したＣＨＯ−Ｅ細胞もしくはＣＨＯ−Ｐ細胞）では、いずれのタンパク質も繋留およびローリングしなかった。
【０１７７】
正常ヒトＨＰＣ上で天然に発現されたＣＤ４４がＥ−セレクチンリガンドとして機能するか否かを判断することを目的として、初期のＣＤ３４＋細胞上、およびより成熟した（ＣＤ３４−／直系＋）ヒトＢＭ細胞（単球（ＣＤ１４＋）、顆粒球（ＣＤ１５＋）、およびリンパ球（Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）、Ｔ細胞（ＣＤ３＋））に富んだ細胞集団を含む）上で発現されたＣＤ４４におけるＨＥＣＡ−４５２活性およびＥ−セレクチンリガンド活性の分布を調査した。驚くべくことに、ＫＧ１ａ細胞のＨｅｒｍｅｓ−１免疫沈降物について行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥでは３本のバンド（１００ｋＤａ、１２０ｋＤａおよび１９０ｋＤａ）が明らかになったが、ＣＤ３４＋細胞および直系＋／ＣＤ３４−細胞から免疫沈降したのは１００ｋＤａ  ＣＤ４４のみであり、ＣＤ３４＋細胞由来のＣＤ４４のみがＨＥＣＡ−４５２で染色され、Ｅ−セレクチンリガンドとして機能した（図６Ａ）。負の選択または正の選択を行ってＣＤ３４＋細胞の割合を高めることによって同様の結果が得られた。ＣＤ４４を免疫沈降させるにあたり、１０倍過量の直系＋細胞膜タンパク質を使用しても、ＣＤ４４のＨＥＣＡ−４５２染色およびＣＤ４４のＥ−セレクチンリガンド活性は観察されなかった（図６Ａ）。さらに、プラスチック上に固定した場合には、ＣＤ３４＋／ＣＤ４４＋細胞から免疫沈降したＣＤ４４のみがＣＨＯ−Ｅ細胞のローリングを支持し、一方、ＣＤ３４−から免疫沈降したＣＤ４４はＥ−セレクチンリガンド活性を全く有していなかった。
【０１７８】
ヒト造血細胞上のＨＥＣＡ−４５２反応性ＣＤ４４の発現および構造についてさらに分析を行うことを目的として、天然の白血球芽細胞におけるＨＣＥＬＬの発現を測定した。急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（亜型Ｍ５）の白血球芽細胞からは、４本の主要なＨＥＣＡ−４５２染色バンドが検出された（７４ｋＤａ、１００ｋＤａ、１４０ｋＤａおよび１９０ｋＤａ）（図６Ｂ）。Ｎ−グリコシダーゼＦ処理後は、１００ｋＤａの位置におけるＨＥＣＡ−４５２染色は完全に消失し、７４ｋＤａおよび１４０ｋＤａのバンドは染色を維持しており、１００ｋＤａのバンドは明らかに分子量が減少した位置に染色されていた（図６Ｂ）。ＡＭＬ（Ｍ５）膜タンパク質から免疫沈降したＣＤ４４をＮ−グリコシダーゼＦで処理した場合には、ＨＥＣＡ−４５２反応性およびＥ−セレクチンリガンド活性は完全に消失した（図６Ｃ）。免疫沈降したＫＧ１ａ  ＣＤ４４と同様に、ＡＭＬ（Ｍ５）  ＣＤ４４においては、ＨＥＣＡ−４５２によって検出された１２０ｋＤａの微量のイソ型の存在が明らかになったが、主要なバンドおよび生物学的に活性なタンパク質は、１００ｋＤａのＣＤ４４イソ型であった。ＣＤ４４は、未分化ＡＭＬ（Ｍ０）の芽細胞、成熟していないＡＭＬ（Ｍ１）、および非典型慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（ｂｃｒ／ａｂｌ−）からも免疫沈降された。注意すべきことは、免疫沈降されたＣＤ４４上におけるＨＥＣＡ−４５２反応性エピトープの発現は、ＣＨＯ−Ｅ細胞のローリングを支持する能力と直接的に相関しているということである（図６Ｄ）。これらの白血病細胞上におけるＣＤ４４（Ｈｅｒｍｅｓ−１モノクローナル抗体）の発現は同等であり（フローサイトメトリーにより、９０％以上の細胞が陽性染色される）、さらに、Ｅ−セレクチンとの相互作用能は、ＨＥＣＡ−４５２反応性グリコシル化作用に応じて決まることが示唆された。またさらに、ＣＤ４４は造血細胞以外の細胞上でも発現されることから、ヒトＢＭ内皮細胞系ＢＭＥＣ−１上におけるＣＤ４４の発現について分析を行った。ＢＭＥＣ−１は高レベルでＣＤ４４を発現したが（図６Ｅ）、これらの細胞由来のＣＤ４４はＨＥＣＡ−４５２反応性ではなく、Ｅ−セレクチンリガンド活性を全く有していなかった（図６Ｄ）。
【０１７９】
実施例５：ヒト造血細胞由来のＬ−セレクチン糖タンパク質リガンドに関するブロットローリングアッセイを用いた評価
ＨＥＣＡ−４５２反応性のすべてのＫＧ１ａ膜糖タンパク質について、Ｌ−セレクチンリガンド活性を調査することを目的として、ずれ流量下、セレクチンを発現する全細胞とウェスタンブロット上に固定されたタンパク質との間の接着相互作用を評価した。
【０１８０】
Ｌ−セレクチンを発現するリンパ球は、既報（オックスレー（Ｏｘｌｅｙ）， Ｓ． Ｍ．およびサクステイン（Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ）， Ｒ．、Ｂｌｏｏｄ， ８４： ３２９９−３３０６（１９９４）；サクステイン（Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ）， Ｒ．、フー（Ｆｕ）， Ｌ．およびアレン（Ａｌｌｅｎ）， Ｋ．Ｌ．、 Ｂｌｏｏｄ， ８９： ２７７３−２７８１（１９９７））に従って単離し、ＨＢＳＳ中で２回洗浄し、ＨＢＳＳ／１０ｍＭのＨＥＰＥＳ／２ｍＭのＣａＣｌ２（Ｈ／Ｈ／Ｃａ２＋）／１０％のグリセロール中、２×１０７／ｍｌになるように懸濁した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって細胞溶解物を分離し、標準的なブロット条件下においてＰＶＤＦに移したＫＧ１ａ膜調製物のウェスタンブロットはＨＥＣＡ−４５２、Ａ３Ｄ８またはＨｅｒｍｅｓ−１で染色し、Ｈ／Ｈ／Ｃａ２＋／１０％のグリセロール中でそれらをインキュベートすることによって透過させた。Ｌ−セレクチンを介した接着相互作用について調べることを目的として、ブロットを平行プレートフローチャンバーに入れ、２．８ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２のずれ応力でチャンバー内にリンパ球を灌流させ、さらに、ビデオ顕微鏡によって細胞接着相互作用を観察し、即時解析した。
【０１８１】
２００倍に拡大したビデオモニターの５ヶ所の別異の視野において、免疫染色されたバンド領域上および領域間でローリングしているリンパ球の数を計測したが、このとき、目的のタンパク質を整列させ、可視化するためのガイドとして分子量マーカーを用いた。実験は少なくとも３回行い、結果は、ローリングしている細胞数の平均／視野として表した。負の対照は、リンパ球Ｈ／Ｈアッセイ緩衝液に５ｍＭのＥＤＴＡを添加し、結合に必要なＣａ２＋をキレートさせることにより、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｌ−セレクチンの解裂を誘導する（オックスレー（Ｏｘｌｅｙ）， Ｓ． Ｍ．およびサクステイン（Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ）， Ｒ．、Ｂｌｏｏｄ， ８４： ３２９９−３３０６（１９９４）））で処理したリンパ球を使用する、または、機能をブロックする抗Ｌ−セレクチンモノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）を用いてリンパ球を処理することによって調製し、Ｌ−セレクチンの特異的関与を証明した。
【０１８２】
ＨＥＣＡ−４５２で免疫染色したＫＧ１ａ膜タンパク質のウェスタンブロット（オックスレー（Ｏｘｌｅｙ）， Ｓ． Ｍ．およびサクステイン（Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ）， Ｒ．、Ｂｌｏｏｄ， ８４： ３２９９−３３０６（１９９４）；サクステイン（Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ）， Ｒ．、フー（Ｆｕ）， Ｌ．およびアレン（Ａｌｌｅｎ）， Ｋ．Ｌ．、 Ｂｌｏｏｄ， ８９： ２７７３−２７８１（１９９７））をブロット上に灌流させ、解析された免疫染色バンドにおけるＬ−セレクチンリガンド活性を評価した。Ｌ−セレクチン依存性であり、ＨＥＣＡ−４５２によって染色された９８ｋＤａ、１２０ｋＤａおよび１３０ｋＤａのバンド上において、ずれ応力依存性のリンパ球の繋留およびローリング（ずれ応力は２．３ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２）が観察された。ずれ応力依存性のリンパ球の繋留およびローリングがＬ−セレクチンによって決定されることを確認することを目的として、５ｍＭのＥＤＴＡの存在下において、ならびに、機能をブロックする抗Ｌ−セレクチンモノクローナル抗体もしくはＰＭＡを用いてリンパ球を前処理することにより、アッセイを行った（図７Ｄ）。ブロットのうちのＨＥＣＡ−４５２非反応性領域においては、Ｌ−セレクチンリガンド活性は全く示されなかった（図７Ｄ）。ＨＥＣＡ−４５２で染色された９８ｋＤａのバンドは、最も高いＬ−セレクチンリガンド活性を示し（他のバンドと比較して６倍以上）、このバンドは、ＫＧ１ａ細胞上で発現されるＮ−グリカンを有するタンパク質の主要部分でもある（図７Ｃ）。ＨＥＣＡ−４５２反応性のＫＧ１ａバンドのうちのいくつかはＬ−セレクチンリガンド活性を有していなかったことから、これらのＨＥＣＡ−４５２反応性タンパク質に関する構造的変形がＬ−セレクチンリガンド活性の発揮に対しては不十分であったことが示唆された。ＨＬ６０、Ｋ５６２およびＲＰＭＩ−８４０２の膜タンパク質にはＨＥＣＡ−４５２反応性のバンドが存在していたにもかかわらず、それらの膜タンパク質のウェスタンブロットにおいてはＬ−セレクチンリガンド活性は観察されなかった。ウェスタンブロットの流体力学的フローアッセイにおいては、ＨＥＣＡ−４５２染色は、対応する固定化ＫＧ１ａタンパク質にＬ−セレクチンを介してリンパ球が接着することを干渉しなかった。
【０１８３】
実施例６：免疫沈降ＫＧ１ａ ＣＤ４４（ＨＣＥＬＬ）のＬ−セレクチンリガンド活性
ＫＧ１ａ細胞の全溶解物中のＫＧ１ａ ＣＤ４４についてＨｅｒｍｅｓ−１モノクローナル抗体を用いて行ったイムノブロットでは、９８ｋＤａのバンド、ならびにイソ型をに対応すると考えられる１２０ｋＤａおよび１３０ｋＤａのバンドが検出されたが、これらのイソ型は既にＣＤ４４Ｒ２およびＤＥ４４Ｒ１と名付けられている（図９）（ドウガーティー（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ）， Ｇ． Ｊ．、ランスドロップ（Ｌａｎｓｄｒｏｐ）， Ｐ． Ｍ．、クーパー（Ｃｏｏｐｅｒ）， Ｄ． Ｌ．およびハンフリーズ（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ）， Ｒ． Ｋ．、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７４： １−５（１９９１））。Ｈｅｒｍｅｓ−１およびＡ３Ｄ８で検出された１９０ｋＤａの弱いシグナルは、ＣＤ４４のコンドロイチン硫酸修飾型を反映したものである。（図９）（ヤルカネン（Ｊａｌｋａｎｅｎ）， Ｓ． Ｔ．、ヤルカネン（Ｊａｌｋａｎｅｎ）， Ｍ、バーガッツェ（Ｂａｒｇａｔｚｅ）， Ｒ．、タミー（Ｔａｍｍｉ）， Ｍ．およびブッチャー（Ｂｕｔｃｈｅｒ）， Ｅ． Ｃ．、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４１： １６１５−１６２３（１９８８））。このＣＤ４４グリコフォームがＬ−セレクチンリガンド活性を示すか否かを直接分析することを目的として、Ｈｅｒｍｅｓ−１モノクローナル抗体をもちいてＫＧ１ａ細胞由来のＫＧ１ａ ＣＤ４４を免疫沈降させ、次に、Ｈｅｒｍｅｓ−１またはＨＥＣＡ−４５２のいずれかで染色されたＣＤ４４のイムノブロット上でブロットローリングアッセイを行った。驚くべきことに、Ｈｅｒｍｅｓ−１で免疫沈降させ、次にＨｅｒｍｅｓ−１を用いてイムノブロットを行ったＣＤ４４は、９８ｋＤａおよび１９０ｋＤａのバンドのみを示し、１２０ｋＤａおよび１３０ｋＤａのバンドは示さなかった。一方、Ｈｅｒｍｅｓ−１で免疫沈降させ、次にＨＥＣＡ−４５２を用いてイムノブロットを行ったＣＤ４４は、９８ｋＤａのバンドのみならず、１２０ｋＤａ、１３０ｋＤａおよび１９０ｋＤａのバンドをも示した（図９）。すべての場合において、ＨＥＣＡ−４５２反応性、Ｈｅｒｍｅｓ−１反応性の９８ｋＤａのタンパク質のみがＬ−セレクチンリガンド相互作用を支持した（図９）。
【０１８４】
実施例７：Ｌ−セレクチンリガンド活性およびＨＥＣＡ−４５２による免疫検出に関するＮ−グリコシル化との関連性
Ｎ−グリコシル化に対するＬ−セレクチンリガンド活性の関連性を調査することを目的として、Ｎ−グリコシダーゼＦで前処理したＫＧ１ａ膜タンパク質上において、Ｈｅｒｍｅｓ−１を用いたＫＧ１ａ ＣＤ４４の免疫沈降を行った。図１０Ａに示すように、Ｎ−グリコシダーゼＦで処理することにより、ＨＥＣＡ−４５２による９８ｋＤａのバンドの染色は完全に消失し、さらに、ブロット上におけるＬ−セレクチンを介したリンパ球の繋留およびローリングはすべて停止した。Ｎ−グリコシダーゼＦ処理したサンプルの全分子量範囲にわたってリガンド活性を評価したところ、糖タンパク質の脱Ｎ−グリコシル化に伴う若干の分子量の変化が観察された。脱Ｎ−グリコシル化後は、Ｌ−セレクチンリガンド活性を示すバンドは存在しなかった。
【０１８５】
ＣＤ４４のＬ−セレクチンリガンド活性をさらに分析することを目的として、免疫沈降したＣＤ４４およびＫＧ１ａ細胞のアイソタイプ対照（ラットＩｇＧ）免疫沈降物を用い、既報（サクステイン（Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ）およびディミトロフ（Ｄｉｍｉｔｒｏｆｆ）、Ｂｌｏｏｄ， ９６： ２７６５−２７７４（２０００））に従ってスライドガラス上に滴下して、スタンパー−ウッドラフ（Ｓｔａｍｐｅｒ−Ｗｏｏｄｒｕｆｆ）アッセイを行った。コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ）ノイラミニダーゼ処理したＣＤ４４、抗Ｌ−セレクチンモノクローナル抗体（ラットリンパ球に対してはＨＲＬ−１；ヒトリンパ球に対してはＬＡＭ−１−３）処理したリンパ球、または５ｍＭのＥＤＴＡを添加した共インキュベーションを用いたアッセイを負の対照とした。免疫沈降ＫＧ１ａ  ＣＤ４４はＬ−セレクチンを介したリンパ球の接着を支持した（結合細胞は３６２±１５個／視野、５視野を計数、１回の実験に３枚のスライドガラスを使用、実験は２回実施）が、アイソタイプ対照免疫沈降物、またはノイラミニダーゼ処理した免疫沈降ＫＧ１ａ  ＣＤ４４もしくはＥＤＴＡ／抗Ｌ−セレクチン抗体処理したものにおいては、結合は全く観察されなかった（結合細胞は＜１０個／視野）。単離されたＫＧ１ａ  ＣＤ４４、ＫＧ１ａの全細胞またはＫＧ１ａ膜タンパク質に対するリンパ球の接着は、ＨＥＣＡ−４５２の添加濃度を１００μｇ／ｍｌまで上げても阻害されなかった。これらの結果は、上述の平行フローチャンバー実験から得られたデータと一致しており、追認するものである。
【０１８６】
実施例８：用時単離したヒト造血細胞内において、ＫＧ１ａ  ＣＤ４４（ＨＣＥＬＬ）はＬ−セレクチンリガンドとして機能する
ＣＤ３４＋／ＣＤ４４＋細胞、ＣＤ３４＋／ＣＤ４４−細胞、ＣＤ３４−／ＣＤ４４＋細胞およびＣＤ３４−／ＣＤ４４−細胞を選別した細胞集団についてスタンパー−ウッドラフ（Ｓｔａｍｐｅｒ−Ｗｏｏｄｒｕｆｆ）アッセイを行うことにより、正常な骨髄単核球内におけるＨＣＥＬＬ活性を調査した。ＨＣＥＬＬ活性は、ＣＤ４４−のすべての集団においては欠如していたが、ＣＤ３４＋／ＣＤ４４＋細胞では８０％以上に存在しており、ＣＤ３４−／ＣＤ４４＋細胞では約１％にしか存在していなかった。そのような分析用に十分な量の細胞を入手することが困難であるため、正常なヒトＣＤ３４＋骨髄細胞上のＣＤ４４に関する生化学的実験には限界があることから、ＨＣＥＬＬ活性を発現することが知られている芽細胞から単離したＣＤ４４のＨＣＥＬＬ活性を調べた（サクステイン（Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ）およびディミトロフ（Ｄｉｍｉｔｒｏｆｆ）、Ｂｌｏｏｄ， ９６： ２７６５−２７７４（２０００））。次の１１例の白血病由来の芽細胞を分析した：
９例の骨髄性白血病（未分化型（Ｍ０）２例、成熟していない型（Ｍ１）２例、成熟型（Ｍ２）１例、骨髄単球性（Ｍ４）２例および単球性（Ｍ５）２例）、１例の急性リンパ急性白血病（ｐｒｅ−Ｂ）、および１例の二重表現型白血病。１例のＭ０を除くすべての白血球芽細胞がＨＣＥＬＬ活性を示した。上述の白血病のうちの５例（ＨＣＥＬＬ活性を欠く１例のＭ０、ならびにＨＣＥＬＬ活性を有する二重表現型白血病、もう１例のＭ０、Ｍ４およびＭ５ ）の芽細胞から単離したＣＤ４４のＬ−セレクチンリガンド活性を分析した。全膜タンパク質のブロットローリングアッセイにおいては、ＨＣＥＬＬを発現しているすべての白血病細胞について、９８ｋＤａのバンド上で白血球の繋留およびローリングが観察されたが、ＨＣＥＬＬ活性を欠くＭ０由来の膜タンパク質上ではローリングは観察されなかった。これらの細胞からＣＤ４４をそれぞれ免疫沈降させたところ、ＫＧ１ａ細胞由来のＣＤ４４と同様に、主要なイソ型は９８ｋＤａのものであった。これらのデータの代表例として、Ｍ４白血病から得られたデータを図１０Ｂに示す。ＨＥＣＡ−４５２反応性およびＬ−セレクチンリガンド活性を発現するためには、ＣＤ４４上のＮ−グリコシル化構造が必要であることは、白血病膜タンパク質をＮ−グリコシダーゼＦで前処理することによって確認された（図１０Ｂ）。逆に、ＨＣＥＬＬ（−）のＭ０芽細胞は、ＨＣＥＬＬ（＋）の白血病種と同量のＣＤ４４を保有していた（フローサイトメトリーおよびＨｅｒｍｅｓ−１抗体を用いたウェスタンブロットによって確認した）が、これらの細胞由来のＣＤ４４は、ＨＥＣＡ−４５２反応性ではなく、Ｌ−セレクチンリガンド活性を示さなかった。これらの知見を考え合わせると、ＨＣＥＬＬ活性を示すＣＤ４４グリコフォームはＫＧ１ａ細胞系に特異的な特徴ではなく、ある種のヒト白血病亜群に含まれる芽細胞に存在するＣＤ４４の生理的変形を表しているものであることが示唆された。これらの知見から、Ｎ−グリカンの構成成分がＣＤ４４上に発現しているというさらなる事実が得られた。
【０１８７】
実施例９：ＫＧ１ａ  ＣＤ４４のＬ−セレクチンリガンド活性は硫酸化と無関係である
ＫＧ１ａ細胞上のＣＤ４４が硫酸化されているか否かを確認することを目的として、［３５Ｓ］−ＳＯ４を用いてＫＧ１ａ細胞の培養物を代謝的にラベルした。これらの細胞から免疫沈降されたＣＤ４４は確かに硫酸化されていた（図１１Ａ）。ＣＤ４４のＬ−セレクチンリガンドに硫酸化が必須であるか否かを調べることを目的として、ＫＧ１ａのＨＣＥＬＬ活性をすべて消失させるプロテアーゼであるブロメライン（サクステイン（Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ）およびディミトロフ（Ｄｉｍｉｔｒｏｆｆ）、Ｂｌｏｏｄ， ９６： ２７６５−２７７４（２０００））を０．１％の濃度で用いてＫＧ１ａ細胞を前処理し、ならびに、細胞表面からＣＤ４４を除去した（ハーレ（Ｈａｌｅ）， Ｌ． Ｐ．およびハインズ（Ｈａｙｎｅｓ）， Ｂ． Ｆ．、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４９： ３８０９−３８１６（１９９２））。ＫＧ１ａをブロメラインで分解した後、ＨＣＥＬＬの再発現にはデ・ノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）タンパク質合成が必要であり、塩素酸塩（タンパク質および炭化水素の硫酸化に対する代謝的阻害剤）の存在下において合成されたタンパク質は硫酸化されていない（サクステイン（Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ）， Ｒ．、フー（Ｆｕ）， Ｌ．およびアレン（Ａｌｌｅｎ）， Ｋ． Ｌ．、Ｂｌｏｏｄ， ８９： ２７７３−２７８１（１９９７））。故に、ＫＧ１ａをブロメラインで処理し、フローサイトメトリーによってＣＤ４４が除去されたことを確認した。１０ｍＭの塩素酸ナトリウム不含または含有培地中でＫＧ１ａ細胞を２４時間培養し、さらに、細胞を代謝的にラベルするため、硫酸不含ＣＲＣＭ−３０培地に［３５Ｓ］−ＳＯ４を添加して少なくとも８時間インキュベートした。図１１Ａに示すように、免疫沈降ＣＤ４４（Ｈｅｒｍｅｓ−１）への［３５Ｓ］−ＳＯ４の取り込みは、塩素酸塩処理細胞では完全に阻害された。塩素酸塩のこのような効果は硫酸の取り込みに特異的であったが、ＣＤ４４の［３５Ｓ］−メチオニン／システイン代謝放射ラベルについては、塩素酸塩処理細胞集団と塩素酸塩未処理集団との間で差異が認められなかったことから、ＣＤ４４タンパク質合成を一般的に阻害するものではなかった。
【０１８８】
次に、対照細胞および塩素酸塩処理細胞から免疫沈降したＣＤ４４上においてブロットローリングアッセイを行った。硫酸化および非硫酸化ＣＤ４４のＬ−セレクチンリガンド活性を図１１Ｂに示す。これらの実験データは、ＨＣＥＬＬ活性が硫酸化の影響を受けないことを示した発明者らが以前に行った研究の結果を確認するものであった（サクステイン（Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ）， Ｒ．、フー（Ｆｕ）， Ｌ．およびアレン（Ａｌｌｅｎ）， Ｋ． Ｌ．、Ｂｌｏｏｄ， ８９： ２７７３−２７８１（１９９７））。驚くべくことに、硫酸化されていないＣＤ４４に対してのＨＥＣＡ−４５２による認識は阻害されなかった（図１１Ｂ）。これらのデータは、硫酸化は、ＨＥＣＡ−４５２モノクローナル抗体によって認識されるＫＧ１ａ  ＣＤ４４のエピトープに重要な特徴ではないことを示している。
【０１８９】
実施例１０：ヒト造血細胞Ｌ−セレクチンリガンドであるＨＣＥＬＬおよびＰＳＧＬ−１におけるＬ−セレクチンリガンド活性の特異性
Ａ．一般的方法
細胞、抗体および酵素  ヒト造血細胞系ＫＧ１ａ（骨髄球性白血病、ＨＣＥＬＬ＋／ＰＳＧＬ−１＋）、ＨＬ６０（前骨髄球性白血病、ＨＣＥＬＬ−／ＰＳＧＬ−１＋）、ＲＰＭＩ−８４０２（リンパ球性白血病、ＨＣＥＬＬ−／ＰＳＧＬ−１＋）およびＫ５６２（赤血球性白血病（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、ＨＣＥＬＬ−／ＰＳＧＬ−１−）、ならびに成熟していないデ・ノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（Ｍ１）由来の循環芽細胞（ＨＣＥＬＬ＋／ＰＳＧＬ−１＋）は、ＲＰＭＬ−１６４０／１０％のＦＢＳ／１％のペニシリン−ストレプトマイシン（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社）中で維持した。Ｐ−セレクチンをコードしているｃＤＮＡの全長をトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＣＨＯ−Ｐ；クローンＥ４Ｉ）およびＣＨＯ−空ベクター（ＣＨＯ−Ｍｏｃｋ）はロバート  Ｃ． フールブリッジ（Ｒｏｂｅｒｔ Ｃ． Ｆｕｈｌｂｒｉｇｇｅ）（ハーバード大学医学部（Ｈａｒｖｅｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ））から入手し、ＭＥＭ／１０％のＦＢＳ／１％のペニシリン−ストレプトマイシン（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社）およびＨＡＭ’ｓ Ｆ−１２／５ｍＭのグルタミン／５％のＦＣＳ／１％のペニシリン−ストレプトマイシン中で維持した。ヒトリンパ球（ＰＢＭＣ）は、既報（オックスレー（Ｏｘｌｅｙ）， Ｓ． Ｍ．およびサクステイン（Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ）、Ｂｌｏｏｄ， ８４（１０）： ３２９９−３３０６（１９９４））に従って全血から調製した。ヒトリンパ球Ｌ−セレクチンと同様な機能を発揮するＬ−セレクチンを高レベルで発現するラット気管支リンパ球（ＴＤＬ）は、既報（オックスレー（Ｏｘｌｅｙ）， Ｓ． Ｍ．およびサクステイン（Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ）、Ｂｌｏｏｄ， ８４（１０）： ３２９９−３３０６（１９９４））に従い、ラットの気管支にカニューレを挿入することによって採取した。ヒト好中球は末梢全血から調製したが、これは、クエン酸緩衝液／０．６％のデキストラン中に全血を加え、室温で３０分間、比重に従って赤血球を分離させて得た。Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋不含ＰＢＳを用い、白血球に富んだプラズマを１：１の割合で希釈し、フィコール−ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）（１．０７７〜１．０８００ｇ ／ｍｌ）密度勾配遠心分離によって顆粒球を沈殿させた。細胞ペレット中に残存している赤血球を溶解させるため、細胞を低張液に３０秒間接触させた後、高張ＮａＣｌ溶液を用いて中和した。この過程を経ることにより、顆粒球が９８％以上になった。成熟していない（Ｍ１）急性骨髄性白血病患者由来の循環白血球芽細胞は、末梢血をフィコール−ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）（１．０７７〜１．０８００ｇ ／ｍｌ）密度勾配遠心分離にかけることによって単離した。
【０１９０】
抗ＰＳＧＬ−１モノクローナル抗体ＰＬ−１およびＰＬ−２、ＦＩＴＣ抗ＣＤ４５ならびに抗ＣＤ３４ ＱＢＥＮＤ抗体は、クールター−イムノテック（Ｃｏｕｌｔｅｒ−Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）社、（フランス、マルセーユ）から購入した。抗ＰＳＧＬ−１モノクローナル抗体ＰＳＬ−２７５はレイ・キャンプハウゼン（Ｒａｙ Ｃａｍｐｈａｕｓｅｎ）博士（ジェネティクス・インスティテュート（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、マサチューセッツ州ケンブリッジ）から供与された。抗シアリル酸ルイスＸモノクローナル抗体（ａｎｔｉ−ｓｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓ Ｘ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｂ）（ＣＳＬＥＸ−１）、抗ＣＤ４４（クローンＬ１７８）および抗ＣＤ４３抗体は、ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）社（カリフォルニア州サンノゼ）から購入した。抗ＣＤ４４モノクローナル抗体Ｈｅｒｍｅｓ−１（ラットＩｇＧ２ａ）は、ヤルカネン（Ｊａｌｋａｎｅｎ）らによって最初に特性付けが行われた（ヤルカネン（Ｊａｌｋａｎｅｎ）， Ｓ． Ｔ．、バーガッツ（Ｂａｒｂａｔｚｅ）， Ｒ．Ｆ．、ヘロン（Ｈｅｒｒｏｎ）， Ｌ． Ｒ．およびブッチャー（Ｂｕｔｃｈｅｒ）， Ｅ． Ｃ．、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６： １１９５−１２０２（１９８６））。ラットモノクローナル抗体抗ヒトＣＬＡ（ＨＥＣＡ−４５２）、抗ラットＬ−セレクチン（ＨＲＬ−１；リガンドブロック抗体）、抗ヒトＰ−セレクチン（クローンＡＫ−４）および抗ヒトＬ−セレクチン（ＬＡＭ１−３）は、ファーミンジェン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）社（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。すべての蛍光色素コンジュゲート二次抗体およびアイソタイプ対照は、ザイムド（Ｚｙｍｅｄ）社（カリフォルニア州サンフランシスコ）から購入した。
【０１９１】
ＯＳＧＥはアキュレート・ケミカルズ（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社（ニューヨーク州ウェストバリー）から購入し、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ）ノイラミニダーゼおよびＮ−グリコシダーゼＦはロシェ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社（インディアナ州インディアナポリス）から購入した。コブラ毒素メタロプロテアーゼであるモカーギン（ｍｏｃａｒｈｇｉｎ）（スパーティニ（Ｓｐｅｒｔｉｎｉ）， Ｏ．、コーデイ（Ｃｏｒｄｅｙ）， Ａ． Ｓ．、モナイ（Ｍｏｎａｉ）， Ｎ．、ギフレ（Ｇｉｕｆｆｒｅ）， Ｌ．およびシャピラ（Ｓｃｈａｐｉｒａ）， Ｍ．、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １３５（２）： ５２３−５３１（１９９６） ；デ・ルカ（Ｄｅ Ｌｕｃａ）， Ｍ．、ダンロップ（Ｄｕｎｌｏｐ）， Ｌ． Ｃ．、アンドリュース（Ａｎｄｒｅｗｓ）， Ｒ． Ｋ．、フラネリー（Ｆｌａｎｎｅｒｙ）， Ｊ． Ｖ．、エトリング（Ｅｔｔｌｉｎｇ）， Ｒ．、カミング（Ｃｕｍｍｉｎｇ）， Ｄ． Ａ．、ヴェルドマン（Ｖｅｌｄｍａｎ）， Ｇ． Ｍ．およびバーンド（Ｂｅｒｎｄｔ）， Ｍ． Ｃ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０（４５）： ２６７３４−２６７３７（１９９５））は、レイ・キャンプハウゼン（Ｒａｙ Ｃａｍｐｈａｕｓｅｎ）博士（ジェネティクス・インスティテュート（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、マサチューセッツ州ケンブリッジ）から供与された。代謝阻害剤であるツニカマイシンおよびその他すべての化学物質はシグマ（ Ｓｉｇｍａ ）社（ミズーリ州セントルイス）から購入した。
【０１９２】
フローサイトメトリー分析  フローサイトメトリー分析は、直接および間接免疫蛍光染色法を用い、ヒトＨＣ上で行った。これらの実験に使用したすべての細胞は、冷ＰＢＳ／２％のＦＢＳで２回洗浄し、１０７個／ｍｌとなるようにＰＢＳ／１％のＦＢＳに懸濁した。一次抗体である抗ＣＬＡ、抗ＣＤ１５、抗ＣＤ３４、抗ＣＤ４３、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ６２Ｌ、抗ＰＳＧＬ−１（ＰＳＧＬ−２７５およびＰＬ−１）は、適切なアイソタイプ適合対照抗体と共に、細胞を添加して氷上で３０分間インキュベートした。次に、ＰＢＳ／２％のＦＢＳで細胞を２回洗浄し、ＰＢＳ／１％のＦＢＳ中に再懸濁し、それぞれに適した蛍光色素コンジュゲート二次抗体（２μｌ）を加えて氷上で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ／２％のＦＢＳで細胞を２回洗浄してＰＢＳ中に再懸濁し、４８８ｎｍに調整したアルゴンレーザーを取り付けたＦＡＣＳｃａｎ装置（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）社（カリフォルニア州サンノゼ））上でフローサイトメトリーを行った。
【０１９３】
ヒトＨＣ膜タンパク質の放射ラベル、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析  膜タンパク質調製を行う前に、メチオニン不含ＲＰＭＩ−１６４０培地中、［３５Ｓ］−イージータグ−Ｌ−メチオニン（［３５Ｓ］−ＥａｓｙＴａｇ（登録商標）−Ｌ−Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）（１５０μＣｉ／ｍｌ）（ネン（ＮＥＮ）社、マサチューセッツ州ボストン）を添加し、細胞（１〜２×１０６個／ｍｌ）を８時間インキュベートした。膜タンパク質は、既報に従って調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット用には、還元サンプル緩衝液を用いて膜タンパク質または免疫沈降物を希釈し、７％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。オートラジオグラフィー用には、［３５Ｓ］でラベルした免疫沈降物を解析したゲルを乾燥させ、コダック・バイオマックスＭＲフィルム（Ｋｏｄａｋ Ｂｉｏｍａｘ ＭＲ ｆｉｌｍ）（フィッシャー・サイエンティフィク（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社）に３時間接触させた。ウェスタンブロット用には、解析した膜タンパク質を「セクゥイ−ブロット」  ＰＶＤＦ膜（Ｓｅｑｕｉ−ｂｌｏｔ ＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒｅｎｅ）（バイオラド（ Ｂｉｏｒａｄ ）社、カリフォルニア州ハーキュレス）に移し、ＰＢＳ／１％のツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）／６０％のＦＢＳを用いて４℃で２時間かけてブロックした。ラットＩｇＭ抗ヒトＣＬＡ ＨＥＣＡ−４５２（１．２μｇ／ｍｌ）、ラットＩｇＧ抗ヒトＣＤ４４  Ｈｅｒｍｅｓ−１（１μｇ／ｍｌ）または抗ヒトＰＳＧＬ−１抗体ＰＬ−２（１μｇ／ｍｌ）を加えて、ブロットを室温で１時間インキュベートした。ラットＩｇＭ、ラットＩｇＧまたはマウスＩｇＧを用いたアイソタイプ対照イムノブロットを平行して行い、非特異反応タンパク質を確認した。ＰＢＳ／０．１％のツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）でブロットを３回洗浄した後、対応する二次抗体であるＡＰ−コンジュゲートウサギ抗ラットＩｇＭ抗体（１：４００）、ヤギ抗ラットＩｇＧまたはヤギ抗マウスＩｇＧ（１：８０００）（ザイムド・ラブズ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｓ）社、カリフォルニア州サンフランシスコ）を加えてブロットをインキュベートした。次に、ＡＰ基質である「ウェスタンブルー」（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｕｅ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社、ウィスコンシン州マディソン）を添加してブロットを発色させた。
【０１９４】
流体力学的平行プレートフローチャンバー分析
Ｌ−セレクチンを介した接着相互作用
一定のずれ応力条件下において平行プレートフローチャンバーを使用し、ヒトＨＣと白血球上で天然に発現されたＬ−セレクチン（オーレンス（Ａｗｒｅｎｃｅ）， Ｍ． Ｂ．、マクインタイア（ＭｃＩｎｔｉｒｅ）， Ｌ． Ｖ．およびエスキン（Ｅｓｋｉｎ）， Ｓ． Ｇ．、Ｂｌｏｏｄ ７０（５）： １２８４−１２９０（１９８７））との間に生じるＬ−セレクチンを介した接着相互作用について調査した。ヒトＨＣ単層上における白血球の繋留およびローリングは、以下のように調製した平行プレートフローチャンバーを用い、ビデオ顕微鏡によって即時可視化した。実験前にＨＢＳＳで白血球を２回洗浄し、次に、ＨＢＳＳ／１０ ｍＭのＨＥＰＥＳ／２ｍＭのＣａＣｌ２（Ｈ／Ｈ／Ｃａ２＋）中に１０７個／ｍｌとなるように懸濁した。負の対照群は、細胞をＰＭＡ（Ｈ／Ｈ／Ｃａ２＋中５０ｎｇ／ｍｌ、３７℃で１時間）で処理し、細胞表面からのＬ−セレクチンの解離を誘導することにより、モノクローナル抗体ＨＲＬ−１（１０μｇ／ｍｌ）で前処理してＬ−セレクチンの結合をブロックすることにより、または、５ｍＭのＥＤＴＡを加えてインキュベートし、Ｌ−セレクチンの結合に必要なＣａ２＋をキレートさせることにより、調製した。ヒトＨＣ単層（１００％コンフルエント）を調製することを目的として、重炭酸ナトリウム／２％のＦＢＳ不含ＲＰＭＩ−１６４０中で２×１０６個／ｍｌとなるように懸濁したＨＣ（ＫＧ１ａ、ＨＬ６０、ＲＰＭＩ８４０２、Ｋ５６２）を５×１０６個／ウェルとなるように６ウェルプレートに播種し、遠心分離して細胞を層にし、３％のグルタルアルデヒドで固定した。０．２Ｍのリジン中で反応性のアルデヒド基をブロックし、播種した細胞をＨ／Ｈ／Ｃａ２＋中に懸濁させた。Ｌ−セレクチンリガンド上のシアル酸残基による結合の依存性を評価することを目的として、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ）ノイラミニダーゼを用いて細胞を前処理した（Ｈ／Ｈ／Ｃａ２＋中、０．１Ｕ／ｍｌ、３７℃で１時間）。シアロムシン（ｃｉａｌｏｍｕｃｉｎｓ）（ＰＳＧＬ−１を含む）およびＰＳＧＬ−１単独の関与を調べることを目的として、ＯＳＧＥ（Ｈ／Ｈ／Ｃａ２＋中、６０μｇ／ｍｌ、３７℃１時間）またはモカーギン（１０μｇ／ｍｌ、３７℃で２０分間）による処理を行った。さらに、ＨＣＥＬＬはＫＧ１ａ細胞上に発現され、ＨＣＥＬＬのシアリル化Ｎ−グリコシル化がＬ−セレクチンリガンド活性に重要である（サクステイン（Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ）およびディミトロフ（Ｄｉｍｉｔｒｏｆｆ）、Ｂｌｏｏｄ， ９６： ２７６５−２７７４（２０００））ことから、最初にコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ）ノイラミニダーゼを用いて細胞表面由来のすべてのシアル酸残基を解裂させ（０．１Ｕ／ｍｌ、３７℃で１時間）、次に、Ｎ−グリコシル化の代謝阻害剤であるツニカマイシンを添加して細胞をインキュベートし（５％のＣＯ２条件下、１５μｇ／ｍｌ、３７℃で２４時間）、Ｎ−グリカン（すなわち、ＣＤ４４／ＨＣＥＬＬ上のＨＥＣＡ−４５２エピトープ）のデ・ノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成を阻止することにより、ＫＧ１ａ細胞上のＨＣＥＬＬの関与を識別した。ノイラミニダーゼを用いた前処理により、残留していたＨＣＥＬＬ���性が細胞表面からすべて除去され、故に、このような処理を行ったことによって、細胞表面上に新規に合成されたＨＣＥＬＬの評価が可能になった。ＨＣサイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）調製物は、上述に従って多ウェルプレート内で調製した。細胞単層の上部に平行プレートフローチャンバーを設置し、チャンバー内に白血球を灌流させた。ずれ応力０．５ｄｙｎｅ／ｃｍ２（この値では接着を起こさない）で白血球を細胞単層に接触させた後、ずれ応力が１〜＞３０ｄｙｎｅ／ｃｍ２となるように流速を調整した。０．２、０．４、０．８、２．２、４．４、８．８、１７．６および２６．４ｄｙｎｅ／ｃｍ２ のずれ応力において、倍率を２００倍にし、５ヶ所の別異の視野から構成される１個のフレーム内でローリングする白血球の数を計数した。ずれ応力の全範囲について最低３回の実験を行い、結果を平均±標準偏差で表した。
【０１９５】
Ｐ−セレクチンを介した接着相互作用  これらの実験においては、上述に従ってグルタルアルデヒド固定ＨＣ単層を６ウェルプレートに調製し、指示したように、モカーギン（１０μｇ／ｍｌ）を用いて３０分間細胞を前処理し、固定前に、重炭酸ナトリウム／２％のＦＢＳ不含ＲＰＭＩ１６４０を用いて徹底的に洗浄した。Ｐ−セレクチンを介した接着相互作用を調査することを目的として、５ｍＭのＥＤＴＡを添加したフラスコから、Ｐ−セレクチンの全長を安定的に発現するコンフルエントＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ｐ）または空のベクター（ＣＨＯ−Ｍｏｃｋ）を取り出し、Ｈ／Ｈ／Ｃａ２＋中で十分に洗浄し、平行プレートフローチャンバー内で使用するために、２×１０６個／ｍｌとなるように再懸濁した。ＣＨＯ−Ｐ細胞上におけるＰ−セレクチンの発現は、フローサイトメトリー分析によって確認した。５ｍＭのＥＤＴＡまたは抗Ｐ−セレクチンモノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ、氷上で３０分間）を含有する細胞懸濁物を負の対照として用い、カルシウム依存性結合であることを確認した。０．２、０．４、０．８および２．２ｄｙｎｅ／ｃｍ２ のずれ応力におけるＰ−セレクチン接着相互作用の評価を開始する前に、細胞をチャンバー内に灌流させ、細胞単層上に落下させた。細胞の繋留およびローリングは、倍率１００倍で可視化し、上述に従って計数および分析した。
【０１９６】
スタンパー−ウッドラフ（Ｓｔａｍｐｅｒ−Ｗｏｏｄｒｕｆｆ）アッセイ
Ｌ−セレクチンを介して生じるＨＣＥＬＬおよびＰＳＧＬ−１へのリンパ球の接着  イムノアフィニティー精製した等モルのＨＣＥＬＬまたはＰＳＧＬ−１（還元ＨＣＥＬＬ（１００ｋＤａ）として７５μｇ、ならびに完全に還元されたＰＳＧＬ−１（１４０ｋＤａ）として１μｇ）をスライドガラス上に滴下し、乾燥させた。次に、３％のグルタルアルデヒドを用いてこれらのタンパク質スポットを固定し、０．２Ｍのリジン中で未反応のアルデヒド基をブロックし、試験の準備が整うまで、重炭酸ナトリウム／２％のＦＢＳ不含ＲＰＭＩ１６４０中でスライドガラスを保存した。これらの固定免疫沈殿物上をリンパ球（重炭酸ナトリウム／２％のＦＢＳ不含ＲＰＭＩ１６４０中、１０７個／ｍｌ）で被覆し、軌道振とう器上、４℃、８０ｒｐｍで３０分間インキュベートした。倍率を１００倍にし、接眼格子を用いた光学顕微鏡下で接着したリンパ球数を計測した（スライドガラス１枚あたり最低５視野、１回の実験で２枚のスライドガラスを使用し、独立して３回の実験を行った）。データは、結合リンパ球数の平均±標準偏差として表した。同様の方法でＫＧ１ａ ＣＤ３４およびＬ−セレクチン対照免疫沈降物も試験した。シアル酸に対する依存性を確認することを目的として、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ）ノイラミニダーゼ（重炭酸ナトリウム／２％のＦＢＳ不含ＲＰＭＩ１６４０中、０．１Ｕ／ｍｌ、３７度で１時間）を用いてグルタルアルデヒド固定スポットを処理した。さらに、細胞接着がＬ−セレクチン依存性であることを確認することを目的として、すべてのアッセイに負の対照を設定したが、ここで、そのような負の対照は、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ、３７℃で３０分間）、もしくは機能をブロックする抗体（抗ラットＬ−セレクチンモノクローナル抗体ＨＲＬ−１または抗ヒトＬ−セレクチンモノクローナル抗体ＬＡＭ１−３；１０μｇ／ｍｌ）を用いて処理したリンパ球、または５ｍＭのＥＤＴＡを含むリンパ球懸濁物であった。
【０１９７】
ヒトＨＣへのＬ−セレクチンを介したリンパ球の接着  ヒトＨＣの細胞性Ｌ−セレクチンリガンド活性を分析するため、ＫＧ１ａ、ＨＬ６０、ＲＰＭＩ−８４０２およびＫ５６２細胞、ならびにデ・ノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）白血球芽細胞のサイトスピン調製物を３％のグルタルアルデヒドで固定し、０．２Ｍのリジンでブロックし、その上をリンパ球（重炭酸ナトリウム／２％のＦＢＳ不含ＲＰＭＩ１６４０中、１０７個／ｍｌ）で被覆し、軌道振とう器上、４℃、８０ｒｐｍで３０分間インキュベートした。次に、ＰＢＳを用いてスライドガラスを注意深く洗浄し、結合しているリンパ球を３％のグルタルアルデヒドで固定した。すべてのアッセイには、上述した負の対照を設定した。データは、独立して行った３回の実験の二枚のサンプルスライド上、倍率を１００倍にし、スライドガラス１枚あたり最低５視野から計数した結合リンパ球数の平均値（±標準偏差）として表した。
【０１９８】
Ｂ．幅広いずれ応力範囲にわたって、ＨＣＥＬＬはＬ−セレクチンと結合することができる
本研究の最終目的は、幅広いずれ応力範囲において、ヒトＨＣ上のＨＣＥＬＬおよびＰＳＧＬ−１がずれ応力に依存してＬ−セレクチン結合活性を支持する能力を評価することであった。これらの各分子のＬ−セレクチン結合特性については、ＨＣＥＬＬおよび／またはＰＳＧＬ−１を発現するヒトＨＣ（ＫＧ１ａ（ＨＣＥＬＬ＋／ＰＳＧＬ−１＋）、ＨＬ６０（ＨＣＥＬＬ−／ＰＳＧＬ−１＋）、ＲＰＭＩ−８４０２（ＨＣＥＬＬ−／ＰＳＧＬ−１＋）、Ｋ５６２（ＨＣＥＬＬ−／ＰＳＧＬ−１−）およびデ・ノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）未成熟急性骨髄性白血病（ＡＭＬ  Ｍ１）（ＨＣＥＬＬ＋／ＰＳＧＬ−１＋））を用い、ずれ応力に基づく接着アッセイ法を行うことによって分析した（表２）（オックスレー（Ｏｘｌｅｙ）， Ｓ． Ｍ．およびサクステイン（Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ）， Ｒ．、Ｂｌｏｏｄ， ８４（１０）： ３２９９−３３０６（１９９４）；サクステイン（Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ）， Ｒ．、フー（Ｆｕ）， Ｌ．およびアレン（Ａｌｌｅｎ）， Ｋ． Ｌ．、Ｂｌｏｏｄ， ８９： ２７７３−２７８１（１９９７）；サクステイン（Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ）およびディミトロフ（Ｄｉｍｉｔｒｏｆｆ）、Ｂｌｏｏｄ， ９６： ２７６５−２７７４（２０００））。
【０１９９】
【表２】
2004527468.tif 000003
一定の流体力学的ずれ応力下において平行プレートフローチャンバーを用い、グルタルアルデヒド固定したヒトＨＣ単層上におけるＬ−セレクチンを介した白血球の繋留およびローリングを観察した。すべての実験に負の対照を設定し、細胞−細胞接着に対する介在について、Ｌ−セレクチン単独の関与を確認した。既にに示されているように（ローレンス（Ｌａｗｒｅｎｃｅ）， Ｍ． Ｂ．、カンサス（Ｋａｎｓａｓ）， Ｇ． Ｓ．、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）， Ｅ． Ｊ．およびレイ（Ｌｅｙ）， Ｋ．、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １３６（３）： ７１７−７２７（１９９７）；フィンガー（Ｆｉｎｇｅｒ）， Ｅ． Ｂ．、プーリ（Ｐｕｒｉ）， Ｋ． Ｄ．、アロン（Ａｌｏｎ）， Ｒ．、ローレンス（Ｌａｗｒｅｎｃｅ）， Ｍ． Ｂ．、フォン・アンドリアン（ｖｏｎ Ａｎｄｒｉａｎ）， Ｕ． Ｈ．およびスプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）， Ｔ． Ａ．、Ｎａｔｕｒｅ ３７９（６５６２）： ２６６−２６９（１９９６））、Ｌ−セレクチンを介した接着相互作用には、約０．５ｄｙｎｅ／ｃｍ２ のずれ応力閾値が必要であった（図１２Ａ）。このレベルのずれ応力に達した後、広範なずれ応力範囲にわたって白血球の繋留およびローリングを計数した。ＨＬ６０細胞上では、０．４ｄｙｎｅ／ｃｍ２ から最高１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２ のずれ応力範囲においてＬ−セレクチン依存性のヒトリンパ球およびラットＴＤＬのローリングが観察された（図１２Ａ）。しかしながら、Ｋ５６２細胞上ではリンパ球のローリングは起こらず、また、ＰＳＧＬ−１を高発現するにもかかわらず、ＲＰＭＩ−８４０２細胞もＬ−セレクチンリガンド活性を示さなかった（図１２Ａおよび表２）。対照的に、ＫＧ１ａ細胞単層上では、２６ｄｙｎｅ／ｃｍ２ 以上のずれ応力において、Ｌ−セレクチンを介したヒトリンパ球およびラットＴＤＬのローリングが観察されたが、ＨＬ６０細胞上では、ヒトリンパ球／ＴＤＬのローリングは１７ｄｙｎｅ／ｃｍ２ 以上になると消失した（図１２Ａ）。さらに、ＫＧ１ａ細胞上でのリンパ球のローリング頻度は、ＨＬ６０細胞上でＬ−セレクチンを介したローリングを支持していたずれ応力の全範囲にわたって、ＨＬ６０細胞上でのそれの５倍以上であった（図１２Ａ）。ＫＧ１ａ細胞上の高Ｌ−セレクチンリガンド活性とＨＬ６０細胞上の低活性との間の相違についても、同レベルのＬ−セレクチンを発現するヒト好中球を用い、フローサイトメトリー分析によって観察した。ＫＧ１ａ細胞は、ＨＬ６０細胞上におけるＬ−セレクチンを介した好中球のローリングの４倍以上のローリングを支持した（図１２Ｂ）。これらのデータから、ＫＧ１ａ細胞は、広範なずれ応力範囲にわたってＬ−セレクチンを介した白血球の接着を支持する大きな能力を有しており、かつ、リンパ球または好中球上で天然に発現されるＬ−セレクチンは、ヒトＨＣ上で発現されるＨＣＥＬＬまたはＰＳＧＬ−１と同等の結合活性を示すことが明らかになった。
【０２００】
ＫＧ１ａ細胞上において、ＨＣＥＬＬ活性からＰＳＧＬ−１活性の関与を区別することを目的として、ＯＳＧＥもしくはモカーギンを用いて細胞を酵素処理する、または、機能ブロック抗体であるＰＬ−１を加えて細胞をインキュベートする操作を行ったが、これらにより、ＰＳＧＬ−１がＬ−セレクチンに結合できなくなる（スペルティーニ（Ｓｐｅｒｔｉｎｉ）， Ｏ．、コーデイ（Ｃｏｒｄｅｙ）， Ａ．Ｓ．、モナイ（Ｍｏｎａｉ）， Ｎ．、ギフレ（Ｇｕｉｆｆｒｅ）， Ｌ．およびシャピラ（Ｓｃｈａｐｉｒａ）， Ｍ．、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １３５（２）： ５２３−５３１（１９９６）；ガイヤー（Ｇｕｙｅｒ）， Ｄ．Ａ．、ムーア（Ｍｏｏｒｅ）， Ｋ． Ｌ．、ライマン（Ｌｙｍａｎ）， Ｅ． Ｂ．、シャメル（Ｓｃｈａｍｍｅｌ）， Ｃ． Ｍ． Ｇ．、ロゲリ（Ｒｏｇｅｌｊ）， Ｓ．、マクエヴァー（ＭｃＥｖｅｒ）， Ｒ． Ｐ．およびスクラー（Ｓｋｌａｒ）， Ｌ． Ａ．、Ｂｌｏｏｄ， ８８： ２４１５−２４２１（１９９６）；テュ（Ｔｕ）， Ｌ．、チェン（Ｃｈｅｎ）， Ａ．、デラハンティ（Ｄｅｌａｈｕｎｔｙ）， Ｍ． Ｄ．、ムーア（Ｍｏｏｒｅ）， Ｋ． Ｌ．、ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）， Ｓ． Ｒ．、マクエヴァー（ＭｃＥｖｅｒ）， Ｒ． Ｐ．およびテダー（Ｔｅｄｄｅｒ）， Ｔ． Ｆ．、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５７： ３９９５−４００４（１９９６）；デ・ルカ（Ｄｅ Ｌｕｋａ）， Ｍ．、ダンロップ（Ｄｕｎｌｏｐ）， Ｌ． Ｃ．、アンドリュース（Ａｎｄｒｅｗｓ）， Ｒ． Ｋ．、フラネリー（Ｆｌａｎｎｅｒｙ）， Ｊ． Ｖ．、エトリング（Ｅｔｔｌｉｎｇ）， Ｒ．、カミング（Ｃｕｍｍｉｎｇ）， Ｄ．Ａ．、ヴェルドマン（Ｖｅｌｄｍａｎ）， Ｇ． Ｍ．およびバーンド（Ｂｅｒｎｄｔ）， Ｍ． Ｃ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０（４５）： ２６７３４−２６７３７（１９９５））。別の方法としては、ＫＧ１ａ細胞上のＨＣＥＬＬ活性（該活性は、シアリル化Ｎ−グルカン類上で特に発揮される）の関与を識別することを目的として、ＫＧ１ａ細胞およびデ・ノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）白血病由来の芽細胞をノイラミニダーゼで前処理し、次に、ツニカマイシン中でインキュベートした。従って、ＫＧ１ａ細胞のＬ−セレクチンリガンド活性は、ＯＳＧＥもしくはモカーギンによる酵素処理、ならびにＰＬ−１抗体処理に対して抵抗性であった（表３）。しかしながら、ＫＧ１ａのＬ−セレクチンリガンド活性はノイラミニダーゼ処理によって消失し、ツニカマイシン処理後のリガンド活性の再発現は顕著に減少し、一方、ＤＭＳＯ単独で処理した細胞（対照）のリガンド活性はベースラインレベルまで回復した（ｐ＜０．００１）（表３）。これらのデータから、Ｎ−グリカン依存性のＨＣＥＬＬは、ＫＧ１ａ細胞上におけるＬ−セレクチン結合の一次媒介物質であることが示された。対照的に、ＨＬ６０細胞のＬ−セレクチンリガンド活性は、ＯＳＧＥで処理することによって完全に消失し（ｐ＜０．００１）（表３）、モカーギン処理により（ｐ＜０．００１）、および機能をブロックする抗ＰＳＧＬ−１  ＰＬ−１モノクローナル抗体で処理することにより（ｐ＜０．００２）、著しく阻害された（表３）。ＯＳＧＥ処理およびモカーギン処理の有効性は、ＣＤ３４およびＰＳＧＬ−１上の感受性エピトープについてモノクローナル抗体ＱＢＥＮＤ−１０およびモノクローナル抗体ＰＳＬ−２７５をそれぞれ用いてフローサイトメトリー分析を行うことによって確認した。興味深いことに、ＨＬ６０細胞上のＬ−セレクチンリガンド活性はＯＳＧＥ処理後に完全に消失したが、ＰＬ−１またはモカーギン処理によっては完全に消失しなかったことから、ＨＬ６０細胞は、その他の非ＰＳＧＬ−１、Ｏ−シアロ糖タンパク質Ｌ−セレクチンリガンド活性を発現していることが示唆された。これらのデータは、ＨＬ６０細胞においてＯＳＧＥ感受性の非ＰＳＧＬ−１  Ｌ−セレクチンリガンドの発現を明らかにしたこれまでの研究結果と一致している（ラモス（Ｒａｍｏｓ）， Ｃ．、スミス（Ｓｍｉｔｈ）， Ｍ． Ｊ．、スナップ（Ｓｎａｐｐ）， Ｋ． Ｒ．、カンサス（Ｋａｎｓａｓ）， Ｇ． Ｓ．、スティックニー（Ｓｔｉｃｋｎｅｙ）， Ｇ． Ｗ．、レイ（Ｌｅｙ）， Ｋ．およびローレンス（Ｌａｗｒｅｎｃｅ）， Ｍ． Ｂ．、Ｂｌｏｏｄ， ９１（３）： １０６７−１０７５（１９９８））。
【０２０１】
【表３】
2004527468.tif 000004
ヒトＨＣ上に発現されるＨＣＥＬＬおよびＰＳＧＬ−１のＬ−セレクチンリガンド活性についてさらに精査を行うことを目的として、ある範囲のｒｐｍ下において、グルタルアルデヒドで固定したＨＣ単層に対するＬ−セレクチンを介したリンパ球の接着に関して、スタンパー−ウッドラフ（Ｓｔａｍｐｅｒ−Ｗｏｏｄｒｕｆｆ）アッセイを行った。ＫＧ１ａ細胞は、＞４０〜１２０ｒｐｍの範囲でＨＣＥＬＬリガンド活性を有しており、８０ｒｐｍで最大活性を示したが、ＨＬ６０細胞は、８０ｒｐｍで主にＬ−セレクチンリガンド活性を示した（図１２Ｃ）。さらに、８０ｒｐｍにおけるＫＧ１ａ細胞に対するＬ−セレクチンを介したリンパ球の接着は、ＨＬ６０細胞に対するそれの１０倍であり、Ｋ５６２細胞およびＲＰＭＩ−８４０２細胞に対してリンパ球が結合したという事実は認められなかった（図１２Ｃ）。ＨＬ６０細胞上の一次Ｌ−セレクチンリガンドはＰＳＧＬ−１であり、その発現量はＫＧ１ａ細胞およびＨＬ６０細胞で同等であることから、これらのデータからさらに、細胞１個あたりにおけるＫＧ１ａ  ＨＣＥＬＬ活性は、広範なずれ応力範囲にわたり、リガンドとして機能する能力が高いことが示唆された。
【０２０２】
ＰＳＧＬ−１の発現レベルはＨＬ６０細胞とＫＧ１ａ細胞とで同等であるが、ＫＧ１ａ細胞上のＰＳＧＬ−１の機能がＨＬ６０細胞上のＰＳＧＬ−１のそれと同等であるか否かについて試験を行った。Ｐ−セレクチンに対するＰＳＧＬ−１の必須Ｎ−末端結合決定因子は、Ｌ−セレクチンに対する構造的結合決定因子と重複していることから（スナップ（Ｓｎａｐｐ）， Ｋ． Ｒ．、ディン（Ｄｉｎｇ）， Ｈ．、アトキンス（Ａｔｋｉｎｓ）， Ｋ．、ワーンケ（Ｗａｒｎｋｅ）， Ｒ．、ルシンスカス（Ｌｕｓｃｉｎｓｋａｓ）， Ｆ． Ｗ．およびカンサス（Ｋａｎｓａｓ）， Ｇ． Ｓ．、Ｂｌｏｏｄ， ９１： １５４−１６４（１９９８）；デ・ルカ（Ｄｅ Ｌｕｋａ）， Ｍ．、ダンロップ（Ｄｕｎｌｏｐ）， Ｌ． Ｃ．、アンドリュース（Ａｎｄｒｅｗｓ）， Ｒ． Ｋ．、フラネリー（Ｆｌａｎｎｅｒｙ）， Ｊ． Ｖ．、エトリング（Ｅｔｔｌｉｎｇ）， Ｒ．、カミング（Ｃｕｍｍｉｎｇ）， Ｄ．Ａ．、ヴェルドマン（Ｖｅｌｄｍａｎ）， Ｇ． Ｍ．およびバーンド（Ｂｅｒｎｄｔ）， Ｍ． Ｃ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０（４５）： ２６７３４−２６７３７（１９９５））、ＫＧ１ａ細胞およびＨＬ６０細胞上のＰ−セレクチン結合能は、ＰＳＧＬ−１のＬ−セレクチンへの結合効率と相関していると推測された。故に、ヒトＰ−セレクチンの全長をコードしているｃＤＮＡをトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｐ）を用い、Ｐ−セレクチンリガンド活性に関するフローチャンバーアッセイを行った。ＨＬ６０細胞およびＫＧ１ａ細胞は、ＰＳＧＬ−１を介したＣＨＯ−Ｐ細胞のローリングについて同等の支持を示したが、Ｋ５６２細胞およびＲＰＭＩ−８４０２細胞は全く活性を有していなかった（図１３Ａ）。ＫＧ１ａ細胞およびＨＬ６０細胞上のＰ−セレクチンリガンド活性は、モカーギン処理後に阻害された（図１３Ｂ）。ＫＧ１ａ細胞とＨＬ６０細胞との間ではＬ−セレクチンリガンド活性の支持能に差があることとは異なり、これらのデータからは、細胞膜内に発現される天然のＰＳＧＬ−１は、これらの細胞系内においては構造的および機能的に類似していることが示唆された。特筆すべきことは、ＲＰＭＩ−８４０２のＰＳＧＬ−１は、Ｌ−セレクチンリガンドまたはＰ−セレクチンリガンドとしての機能を有しておらず、このことは、ある種のリンパ球細胞上のＰＳＧＬ−１は、生物活性リガンドの形成に必要なα１，３−フコシルトランスフェラーゼおよびコア２β１，６−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの活性を欠いていることにより非機能性であることと一致している（ヴァキーノ（Ｖａｃｈｉｎｏ）， Ｇ．、チャン（Ｃｈａｎｇ）， Ｘ． −Ｊ．、ヴェルドマン（Ｖｅｌｄｍａｎ）， Ｇ． Ｍ．、クマー（Ｋｕｍａｒ）， Ｒ．、サコ（Ｓａｋｏ）， Ｄ．、フォウサー（Ｆｏｕｓｅｒ）， Ｌ． Ａ．、バーンド（Ｂｕｒｎｄｔ）， Ｍ． Ｃ．およびチャミング（Ｃｈｕｍｍｉｎｇ）， Ｄ．Ａ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０（３７）： ２１９６６−２１９７４（１９９５））。
【０２０３】
Ｃ．ヒトＨＣ細胞上における好ましいＬ−セレクチンリガンドはＨＣＥＬＬである
全細胞上のＨＣＥＬＬとＰＳＧＬ−１との間のＬ−セレクチンリガンド活性に関する差異は、これらの分子の発現の表面密度および／または膜局在の差異を反映していると考えられる。ＨＣＥＬＬおよびＰＳＧＬ−１の結合能を直接比較することを目的として、ＫＧ１ａ細胞およびＨＬ６０細胞ならびにデ・ノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）ＡＭＬ（Ｍ１）からイムノアフィニティー精製したＨＣＥＬＬまたはＰＳＧＬ−１を等モル用い、Ｌ−セレクチンを介したリンパ球の接着について、従来から行われているずれ応力に基づくスタンパー−ウッドラフ（Ｓｔａｍｐｅｒ−Ｗｏｏｄｒｕｆｆ）アッセイを行った。
【０２０４】
細胞結合実験用のＨＣＥＬＬおよびＰＳＧＬ−１を単離することを目的として、細胞膜タンパク質調製物からＫＧ１ａ ＣＤ４４（Ｈｅｒｍｅｓ−１ラットＩｇＧ）およびＰＳＧＬ−１（ＰＬ−２マウスＩｇＧ）をイムノアフィニティー精製した。［３５Ｓ］で代謝的に放射ラベルしたＫＧ１ａ細胞の全細胞溶解物から得られたＨｅｒｍｅｓ−１およびＰＬ−２免疫沈降物のオートラジオグラフィーにより、Ｈｅｒｍｅｓ−１およびＰＬ−２がそれぞれの抗原に対して特異性を有することが示され（図１４Ａ）たことから、ＣＤ４４の１００ｋＤａ型が主に単離され、さらに、ＰＳＧＬ−１のダイマー（約２２０ｋＤａ）およびモノマー（約１４０ｋＤａ）のイソ型が単離されたことが明らかになった（図１４Ａ）。Ｈｅｒｍｅｓ−１によって免疫沈降された３０ｋＤａの微量混入タンパク質が存在していたが、免疫沈降物を５０ｋＤａの分子量カットオフフィルターに通すことによって除去した。スタンパー−ウッドラフ（Ｓｔａｍｐｅｒ−Ｗｏｏｄｒｕｆｆ）アッセイに使用する精製タンパク質のモル等価性を一致させることを目的として、スライドガラス上に滴下したイムノアフィニティー精製材料のオートラジオグラム上において、［３５Ｓ］−メチオニンでラベルしたＣＤ４４およびＰＳＧＬ−１（それぞれ、５０ｋＤａの分子量カットオフフィルターに通した）の吸光度（ＯＤ）を比較した。１μｇのＰＳＧＬ−１のＯＤは、０．７５μｇのＣＤ４４のＯＤの２倍であることがわかった。モノマーのＰＳＧＬ−１（約１４０ｋＤａ）の分子量は、ＣＤ４４（１００ｋＤａ）の約１．４倍であり、ＰＳＧＬ−１はＣＤ４４の約２倍（１３対６）のメチオニン残基を有することから、ＰＳＧＬ−１のシグナルが２倍であることは、０．７５μｇのＣＤ４４と１μｇのＰＳＧＬ−１がそれぞれのタンパク質について等モル量であることを示唆していた。このような等モル量を用いたところ、８０ｒｐｍにおいては、ＰＳＧＬ−１と比較して、ＣＤ４４はリンパ球結合を１０倍支持し、４０〜１００ｒｐｍにおいては、ＰＳＧＬ−１と比較して、ＣＤ４４はリンパ球結合を５〜１０倍支持した（図１４Ｂ）。ＫＧ１ａ細胞から免疫沈降させたＣＤ３４およびＬ−セレクチン（負の分子対照）は、Ｌ−セレクチンを介したリンパ球の接着を全く支持しなかった（図１４Ｂ）。精製ＣＤ４４およびＰＳＧＬ−１の相対的Ｌ−セレクチン結合効率を直接比較したこれらのデータは、全細胞分析から得られた結果と同様であった。
【０２０５】
天然のヒト造血細胞においても、ＨＣＥＬＬおよびＰＳＧＬ−１の本質的に異なるＬ−セレクチンリガンド活性が存在するか否かを調査することを目的として、成熟していないＡＭＬ（Ｍ１）の患者から採取した循環芽細胞上のＨＣＥＬＬおよびＰＳＧＬ−１のＬ−セレクチンリガンド活性を調べた。ＡＭＬ（Ｍ１）細胞全体の活性について予備的に行ったスタンパー−ウッドラフ（Ｓｔａｍｐｅｒ−Ｗｏｏｄｒｕｆｆ）アッセイにおいては、ＡＭＬ（Ｍ１）細胞は、ＫＧ１ａ細胞のＬ−セレクチンリガンド活性と同程度の活性を示し、ＣＤ４４およびＰＳＧＬ−１の発現（フローサイトメトリーで測定）もＫＧ１ａ細胞のそれと類似していた。これらの細胞から得たＣＤ４４およびＰＳＧＬ−１を免疫沈降させ、スタンパー−ウッドラフ（Ｓｔａｍｐｅｒ−Ｗｏｏｄｒｕｆｆ）アッセイ（８０ｒｐｍ）によってそれらの結合能を調べた。平行して、ＫＧ１ａ細胞およびＨＬ６０細胞由来のＨＣＥＬＬおよびＰＳＧＬ−１のＬ−セレクチンリガンド活性についても測定し、比較分析用に、Ｎ−グリコシダーゼＦおよびＯＳＧＥを用いた処理を行った。ＫＧ１ａ細胞およびＡＭＬ（Ｍ１）由来のＣＤ４４は、ＫＧ１ａ細胞、ＨＬ６０細胞またはＡＭＬ（Ｍ１）由来のＰＳＧＬ−１よりもＬ−セレクチンを介したリンパ球の接着を非常に強く支持した（ＣＤ４４に結合したリンパ球数の平均は、ＰＳＧＬ−１に結合したそれの３倍以上であった；ｐ＜０．００１）（表４）。さらに、ＨＬ６０細胞由来のＣＤ４４、アイソタイプ対照免疫沈降物、ＣＤ３４およびＬ−セレクチン免疫沈降物、またはノイラミニダーゼ処理ＣＤ４４ならびにＫＧ１ａ細胞由来のＰＳＧＬ−１免疫沈降物（表４）は、Ｌ−セレクチンリガンド活性を全く有していなかった。ＫＧ１ａ細胞由来のＣＤ４４をＮ−グリコシダーゼＦ処理した場合と同様に、ＡＭＬ（Ｍ１）由来のＣＤ４４をＮ−グリコシダーゼＦ処理した場合のＬ−セレクチンリガンド活性は著しく（バックグラウンドレベルまで）低下した（表４）。興味深いことに、天然のＰＳＧＬ−１に対するＰ−セレクチンを介した結合は、ＫＧ１ａ細胞とＨＬ６０細胞との間で同等であったにもかかわらず（図１３Ａおよび１３Ｂ）、ＫＧ１ａ細胞およびＡＭＬ（Ｍ１）芽細胞から単離したＰＳＧＬ−１は、ＨＬ６０細胞由来のＰＳＧＬ−１よりもＬ−セレクチンとの結合能が高かった（表４）。スタンパー−ウッドラフ（Ｓｔａｍｐｅｒ−Ｗｏｏｄｒｕｆｆ）アッセイにおけるＣＤ４４またはＰＳＧＬ−１に結合したリンパ球の顕微鏡写真から、ＫＧ１ａ  ＰＳＧＬ−１（図１５Ｇ）と比較して、ＫＧ１ａ  ＣＤ４４およびＡＭＬ（Ｍ１）  ＣＤ４４（図１５Ａおよび１５Ｄ）のＬ−セレクチンリガンド活性の範囲が明らかに異なることが示された；ＫＧ１ａ  ＰＳＧＬ−１を３倍モル過量にしても（図１５Ｈ）、ＣＤ４４（図１４Ａ）のＬ−セレクチンリガンド活性はＰＳＧＬ−１のそれよりも大きかった。Ｎ−グリコシダーゼＦ処理（図１５Ｂおよび１５Ｅ）およびＯＳＧＥ処理（図１５Ｉ）により、リンパ球の結合がアイソタイプ対照レベル（図１５Ｃ）まで著しく低下したことにより、ＨＣＥＬＬ上およびＰＳＧＬ−１上のＮ−グリカン類およびＯ−グリカン類の有意味な関与が確認された。
【０２０６】
【表４】
2004527468.tif 000005
ＰＳＧＬ−１のＬ−セレクチンへの結合能と比較して、ＨＣＥＬＬのそれが高いことについての見識を得ることを目的として、ＣＤ４４上およびＰＳＧＬ−１上のシアリル−フコシル化構造物（ラットモノクローナル抗体ＨＥＣＡ−４５２で認識される）の発現を調べたところ、発現量はＬ−セレクチン結合能と相関していた。ＫＧ１ａ膜タンパク質由来のＣＤ４４およびＰＳＧＬ−１の免疫沈降物を等モル量用いて行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＥＣＡ−４５２イムノブロット分析から、ＣＤ４４はＰＳＧＬ−１よりもＨＥＣＡ−４５２反応性が明らかに高いことが示され（図１６）、このことから、ＨＣＥＬＬはＰＳＧＬ−１よりも多数のＨＥＣＡ−４５２エピトープを有することが示唆され、Ｌ−セレクチンに対する高い結合性を説明することができた。
【０２０７】
実施例１１：ＨＣＥＬＬおよびＰＳＧＬ−１のイムノアフィニティー精製
ヒトＨＣからＨＣＥＬＬおよびＰＳＧＬ−１を免疫沈降させた。免疫沈降法は既報（ディミトロフ（Ｄｉｍｉｔｒｏｆｆ）， Ｃ． Ｊ．、リー（Ｌｅｅ）， Ｊ． Ｙ．、フールブリッジ（Ｆｕｈｌｂｒｉｇｇｅ）， Ｒ． Ｃ．およびサクステイン（Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ）， Ｒ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９７（２５）： １３８４１−１３８４６（２０００））に従って行った。概説すると、最初に、ヒトＨＣの膜タンパク質（ディミトロフ（Ｄｉｍｉｔｒｏｆｆ）， Ｃ． Ｊ．、リー（Ｌｅｅ）， Ｊ． Ｙ．、フールブリッジ（Ｆｕｈｌｂｒｉｇｇｅ）， Ｒ． Ｃ．およびサクステイン（Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ）， Ｒ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９７（２５）： １３８４１−１３８４６（２０００））を２％のＮＰ−４０に溶解し、プロテインＧ−アガロース（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ−Ａｇａｒｏｓｅ）（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社）内で予備精製した。次に、ブラッドフォードタンパク質アッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ）（シグマ（ Ｓｉｇｍａ ）社）を用いて膜タンパク質を定量した。可溶化し、予備精製した膜タンパク質調製物（［３５Ｓ］−メチオニンで放射ラベルした膜タンパク質および全細胞溶解物を含む）（ディミトロフ（Ｄｉｍｉｔｒｏｆｆ）， Ｃ． Ｊ．、リー（Ｌｅｅ）， Ｊ． Ｙ．、フールブリッジ（Ｆｕｈｌｂｒｉｇｇｅ）， Ｒ． Ｃ．およびサクステイン（Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ）， Ｒ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９７（２５）： １３８４１−１３８４６（２０００））に抗ＰＳＧＬ−１抗体であるＰＬ−２もしくは抗ＣＤ４４モノクローナル抗体であるＨｅｒｍｅｓ−１（比率は、タンパク質１００μｇに対して抗体３μｇ）を加え、回転振とう機上、４℃で１８時間インキュベートした。抗ＣＤ３４抗体であるＱＢＥＮＤ−１０、抗Ｌ−セレクチン抗体（ＬＡＭ１−３）またはマウスＩｇＧ／ラットＩｇＧアイソタイプ対照を用いて免疫沈降を行い、負の対照とした。抗体−細胞溶解物の混合物をプロテインＧ−アガロース（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ−Ａｇａｒｏｓｅ）に加え、一定の回転振動をさせながら４℃で１時間インキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロット用には、溶解緩衝液
／２％のＮＰ−４０／１％のＳＤＳ／１％のＢＳＡを用いて５回、さらにＢＳＡ不含溶解緩衝液を用いて３回免疫沈降物を洗浄し、分析を行うために還元サンプル緩衝液中で煮沸した。接着アッセイにおいてＣＤ４４またはＰＳＧＬ−１の機能を評価するためには、溶解緩衝液／２％のＮＰ−４０／１％のＳＤＳ／１％のＢＳＡを用いて５回、さらに、ＮＰ−４０、ＳＤＳもしくはＢＳＡ不含の溶解緩衝液を用いて３回免疫沈降物を洗浄し、次に、ＰＢＳ中に懸濁し、５分間煮沸して免疫コンプレックスからＣＤ４４またはＰＳＧＬ−１を解離させた。次に、溶出物を５０ｋＤａの分子量カットオフミクロコンＲ（ＭｉｃｒｏｃｏｎＲ）フィルター（フィッシャー・サイエンティフィク（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社）に通した。 ブラッドフォードタンパク質アッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ）によってレテンテート（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）のタンパク質濃度を測定した。
【０２０８】
平行実験を行ったが、このとき、それぞれの抗体にプロテインＧ−アガロース（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ−Ａｇａｒｏｓｅ）を加えてインキュベートし、上述したように、ＰＢＳ中で免疫沈降物を煮沸した。溶出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、クーマジーブルー（Ｃｏｏｍａｓｉｅ ｂｌｕｅ）で染色することにより、ＰＢＳ中で煮沸した後も９９％以上の抗体がプロテインＧ−アガロース（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ−Ａｇａｒｏｓｅ）に結合したままであることが明らかになったことから、定量したタンパク質レベルにはほとんど影響していない。さらに、Ｈｅｒｍｅｓ−１の免疫沈降物中の３０ｋＤａの微量混入バンドを除いては、Ｈｅｒｍｅｓ−１およびＰＬ−２を用いた免疫沈降により、その他の非ＣＤ４４タンパク質および非ＰＳＧＬ−１タンパク質は単離されなかった（［３５Ｓ］で代謝的に放射ラベルしたＫＧ１ａ細胞の細胞全溶解物（７）から得られた免疫沈降物のオートラジオグラムを参照、図１４Ａ）。Ｈｅｒｍｅｓ−１によって免疫沈降された３０ｋＤａの混入タンパク質は、５０ｋＤａの分子量カットオフフィルターで除去し、純粋なＫＧ１ａ  ＣＤ４４を得た。
【０２０９】
ＨＣＥＬＬ上のＮ−グリカン類またはＰＳＧＬ−１上のＯ−シアログリカン類の関与を確認することを目的として、既報（ディミトロフ（Ｄｉｍｉｔｒｏｆｆ）， Ｃ． Ｊ．、リー（Ｌｅｅ）， Ｊ． Ｙ．、フールブリッジ（Ｆｕｈｌｂｒｉｇｇｅ）， Ｒ． Ｃ．およびサクステイン（Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ）， Ｒ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９７（２５）： １３８４１−１３８４６（２０００））に従い、免疫沈降を行う前に、Ｎ−グリコシダーゼＦ（０．８Ｕ／ｍｌ）またはＯＳＧＥを用いて膜調製物を処理した。 スタンパー−ウッドラフ（Ｓｔａｍｐｅｒ−Ｗｏｏｄｒｕｆｆ）アッセイによる分析に使用するため、イムノアフィニティー精製した材料をスライドガラス上に滴下した（０．７５〜３μｇ／スポット）（アッセイの詳細については以下を参照）。免疫沈降させた［３５Ｓ］−メチオニン放射ラベルＣＤ４４およびＰＳＧＬ−１のオートラジオグラフ分析に使用するため、免疫沈降物をスライドガラス上に滴下して乾燥させ、−８０℃においてコダック・バイオマックス−ＭＲフィルム（Ｋｏｄａｋ ＢｉｏＭａｘ−ＭＲ ｆｉｌｍ）を１２時間感光させた。ヒューレット・パッカード・スキャンジェット５２００Ｃ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ｓｃａｎｊｅｔ ５２００Ｃ）スキャナーならびにＮＩＨイメージ（ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ）プロセシングおよび分析プログラムを用いて、オートラジオグラムの光学密度分析（吸光度）を行った。
【０２１０】
実施例１２：α１，３−フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴＩＶおよびＦｕｃＴＶＩＩ）ならびにα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３ＧａｌＩＶ）のＲＴ−ＰＣＲ分析
ＨＥＣＡ−４５２の発現は、コアのポリ−Ｎ−アセチルラクトサミニル鎖上において重要なシアロフコシル化に応じて定められることから、ＨＥＣＡ−４５２エピトープの発現とＬ−セレクチン結合活性との間の相対的差異は、促進制御されたα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３ＧａｌＩＶ）および白血球α１，３−フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴＩＶおよびＦｕｃＴＶＩＩ）の影響によるものであるか否かを調べたが、ここで、それらの酵素はＨＥＣＡ−４５２エピトープの生合成に必要である（ササキ（Ｓａｓａｋｉ）， Ｋ．、ワタナベ（Ｗａｔａｎａｂｅ）， Ｅ．、カワシマ（Ｋａｗａｓｈｉｍａ）， Ｋ．、セキネ（Ｓｅｋｉｎｅ）， Ｓ．、ドヒ（Ｄｏｈｉ）， Ｔ．、オシマ（Ｏｓｈｉｍａ）， Ｍ．、ハナイ（Ｈａｎａｉ）， Ｎ．、ニシ（Ｎｉｓｈｉ）， Ｔ．およびハセガワ（Ｈａｓｅｇａｗａ）， Ｍ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６８（３０）： ２２７８２−２２７８７（１９９３）；フールブリッジ（Ｆｕｈｌｂｒｉｇｇｅ）， Ｒ． Ｃ．、キーファー（Ｋｉｅｆｆｅｒ）， Ｄ．、アマーディング（Ａｍｅｒｄｉｎｇ）， Ｄ．およびクッパー（Ｋｕｐｐｅｒ）， Ｔ． Ｓ．、Ｎａｔｕｒｅ， ３８９： ９７８−９８１（１９９７）；ゾルナー（Ｚｏｌｌｎｅｒ）， Ｏ．、ヴェストウェーバー（Ｖｅｓｔｗｅｂｅｒ）， Ｄ． Ｍ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１： ３３００２−３３００８（１９９６）；ゲルツ（Ｇｏｅｌｚ）， Ｓ．、クマー（Ｋｕｍｍｅｒ）， Ｒ．、ポットヴィン（Ｐｏｔｖｉｎ）， Ｂ．、サンダラム（Ｓｕｎｄａｒａｍ）， Ｓ．、ブリッケルメイヤー（Ｂｒｉｃｋｅｌｍａｉｅｒ）， Ｍ．およびスタンレー（Ｓｔａｎｌｅｙ）， Ｐ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６９： １０３３−１０４０（１９９４））。
【０２１１】
細胞性全ＲＮＡは、トリゾールＬＳ反応試薬（Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標） ＬＳ ｒｅａｇｅｎｔ）（ギブコ、ライフサイエンシーズ（Ｇｉｂｃｏ， Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））をメーカーのプロトコールに従って用いることにより抽出し、チタンワンチューブＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｔｉｔａｎ（登録商標） Ｏｎｅ Ｔｕｂｅ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ）（ロシェ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社）内で使用した。ＳＴ３ＧａｌＩＶのセンス５’−ｃｔｃｔｃｃｇａｔａｔｃｔｇｔｔｔｔａｔｔｔｔｃｃｃａｔｃｃｃａｇａｇａｇａｇａａｇａａｇｇａｇ−３’プライマーおよびアンチセンス５’−ｇａｔｔａａｇｇｔａｃｃａｇｇｔｃａｇａａｇｇａｃｇｔｇａｇｇｔｔｃｔｔ−３’プライマー、ならびに加熱サイクル条件（５２℃で４５分間逆転写、９４℃で２分間を１サイクル、９４℃で１分間、５７℃で１分間および７２℃で２分間を３０サイクル、さらに、６８℃で７分間を１サイクル）を用いてＳＴ３ＧａｌＬＩＶの０．９６ｋｂのｃＤＮＡフラグメントを増幅した。ＦｕｃＴＶＩＩの０．５５ｋｂのｃＤＮＡフラグメント（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）、アクセッション番号Ｕ０８１１２）を増幅させることを目的として、特異的プライマーであるセンス５’−ｃｃｃａｃｃｇｔｇｇｃｃｃａｇｔａｃｃｇｃｔｔｃｔ−３’およびアンチセンス５’−ｃｔｇａｃｃｔｃｔｇｔｇｃｃｃａｇｃｃｔｃｃｃｇｔ−３’、ならびに加熱サイクル条件（５２℃で４５分間逆転写、９４℃で２分間を１サイクル、９４℃で３０秒間、６０℃で４５秒間および７２℃で１分間を３０サイクル、さらに、６８℃で７分間を１サイクル）を使用した。同一の逆転写および加熱サイクル条件を使用し、センス５’−ｃｇｇｇｔｇｔｇｃｃａｇｇｃｔｇｔａｃａｇａｇｇ−３’プライマーおよびアンチセンス５’−ｔｃｇｇｇａａｃａｇｔｔｇｔｇｔａｔｇａｇａｔｔ−３’プライマーから、ＦｕｃＴＩＶの０．５０ｋｂのｃＤＮＡフラグメントを作出した（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）、アクセッション番号Ｍ５８５９７）。
【０２１２】
ＫＧ１ａ細胞、ＨＬ６０細胞、Ｋ５６２細胞およびＲＰＭＩ−８４０２細胞におけるＦｕｃＴＩＶおよびＦｕｃＴＶＩＩならびにＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子発現に関するＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＦｕｃＴＩＶの発現はすべての細胞系においてほぼ同程度であったが（図１７Ａおよび図１７Ｂ）、ＦｕｃＴＶＩＩの発現は、ＨＬ６０細胞およびＫＧ１ａ細胞において最も高い（図１７Ａにおいて、レーン１がＦｕｃＩＶ、レーン２がＦｕｃＴＶＩＩ）ことが示された。興味深いことに、ＳＴ３ＧａｌＩＶ（図１７Ｂのレーン１）はＫＧ１ａ細胞において高レベルで発現され、他のすべての細胞系においては非常に低レベルでしか発現されなかったことから、ＳＴ３ＧａｌＩＶの固有のレベルが、ＫＧ１ａ  ＣＤ４４および／またはＰＳＧＬ−１上の関連するＨＥＣＡ−４５２反応性構造および重要なＬ−セレクチン結合決定因子の発現調節を補助していることが示唆された。
【０２１３】
ＨＥＣＡ−４５２の発現は、コアのポリ−Ｎ−アセチルラクトサミニル鎖上において重要なシアロフコシル化に応じて定められる。ＨＥＣＡ−４５２エピトープの発現とＬ−セレクチン結合活性との間の相対的差異は、促進制御されたα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３ＧａｌＩＶ）および白血球α１，３−フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴＩＶおよびＦｕｃＴＶＩＩ）の影響によるものであり、ここで、それらの酵素はＨＥＣＡ−４５２エピトープの生合成に必要であることを調べた。ＫＧ１ａ細胞、ＨＬ６０細胞、Ｋ５６２細胞およびＲＰＭＩ−８４０２細胞におけるＦｕｃＴＩＶおよびＦｕｃＴＶＩＩならびにＳＴ３ＧａｌＩＶの遺伝子発現に関するＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＦｕｃＴＩＶの発現はすべての細胞系においてほぼ同程度であったが（図１７Ａおよび図１７Ｂ）、ＦｕｃＴＶＩＩの発現は、ＨＬ６０細胞およびＫＧ１ａ細胞において最も高い（図１７Ａにおいて、レーン１がＦｕｃＩＶ、レーン２がＦｕｃＴＶＩＩ）ことが示された。興味深いことに、ＳＴ３ＧａｌＩＶ（図１７Ｂのレーン１）はＫＧ１ａ細胞において高レベルで発現され、他のすべての細胞系においては非常に低レベルでしか発現されなかったことから、ＳＴ３ＧａｌＩＶの固有のレベルが、ＫＧ１ａ  ＣＤ４４および／またはＰＳＧＬ−１上の関連するＨＥＣＡ−４５２反応性構造および重要なＬ−セレクチン結合決定因子の発現調節を補助していることが示唆された。
【０２１４】
発明の等価性
本発明の特定の実施態様に関する以上の詳細な記載から、新規な組成物および用途が記載されていることは明らかである。本明細書においては、特定の実施態様について詳細に開示したが、それらは、具体的な説明のために例として行ったものであり、請求項の範ちゅうを制限するためのものではない。発明者らは、特に、請求項に定義されている本発明の方針および範囲を逸脱することなく、本発明について多様な置換、変更または変形を行うことができると考えている。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
多様なヒト造血細胞系においてＨＥＣＡ−４５２反応性エピトープが発現していることを示すウェスタンブロットの写真である。
【図１Ｂ】
グルタルアルデヒドで固定した単層上における造血細胞系細胞の繋留およびローリングを示す棒グラフである。
【図２】
単離した新鮮なヒト骨髄内皮細胞上におけるヒト造血細胞のローリングを示す棒グラフである。
【図３Ａ】
Ｅ−セレクチンリガンド活性についてブロットローリングアッセイを行った結果を示す棒グラフである。
【図３Ｂ】
ＨＥＣＡ−４５２染色についてＮ−グリコシダーゼ−Ｆ処理を行った結果を示すウェスタンブロットの写真である。
【図３Ｃ】
ＫＧ１ａ細胞上でＰＳＧＬ−１が発現していることを示すウェスタンブロットの写真である。
【図３Ｄ】
Ｅ−セレクチンリガンド活性に対するＮ−グリコシダーゼ−Ｆの影響を示すブロットローリングアッセイ膜の写真である。
【図４Ａ】
抗ＣＤ４４抗体（Ｈｅｒｍｅｓ−１）を用いて徹底的に免疫沈降させたＨＣＥＬＬのＥ−セレクチン結合活性を示すブロットローリングアッセイ膜の写真である。
【図４Ｂ】
Ｈｅｒｍｅｓ−１抗体を用いて徹底的に免疫沈降させたＨＣＥＬＬのＥ−セレクチン結合活性を示すブロットローリングアッセイ膜の写真である。
【図５Ａ】
Ｅ−セレクチンを介したＣＨＯ−Ｅ細胞のローリングを示す棒グラフである。
【図５Ｂ】
ＣＨＯ−Ｐ細胞のローリングを示す棒グラフである。
【図６Ａ】
多様な造血細胞におけるＨＣＥＬＬ活性を示したブロットローリングアッセイ膜の写真である。
【図６Ｂ】
成人骨髄性白血病（ＡＭＬ）由来の循環性芽細胞におけるＨＥＣＡ−４５２活性に対してＮ−グリコシダーゼ−Ｆ処理を行った場合の影響を示すウェスタンブロットの写真である。
【図６Ｃ】
アイソタイプ対照またはＨｅｒｍｅｓ−１モノクローナル抗体を用いて免疫沈降させたＡＭＬ（Ｍ５）膜タンパク質（５０μｇ）、ならびにＮ−グリコシダーゼ−Ｆ処理したＨｅｒｍｅｓ−１の免疫沈降物のブロットローリングアッセイの結果を示す膜の写真である。
【図６Ｄ】
ＡＭＬ（Ｍ０）、ＡＭＬ（Ｍ１）および異型ＣＭＬ（ｂｒｃ／ａｂｌ）の膜調製物（５０μｇ）から沈降されたＣＤ４４、ならびにＢＭ内皮細胞系（ＢＭＥＣ−１、総タンパク質量１００μｇ）のＨＥＣＡ−４５２染色を示す写真である。
【図６Ｅ】
ＢＭＥＣ−１におけるＣＤ４４の発現を示すウェスタンブロットの写真である。
【図７Ａ】
ヒト白血病細胞系Ｋ５６２（レーン１）、ＲＰＭＩ−８４０２（レーン２）、ＨＬ−６０（レーン３）、ＫＧ１ａ（レーン４）、ノイラミニダーゼ処理ＫＧ１ａ（レーン５）およびＯＳＧＥ処理ＫＧ１ａ（レーン６）由来のＨＥＣＡ−４５２反応性膜タンパク質（３０μｇ／レーン）に関するウェスタンブロットの写真である。
【図７Ｂ】
ＫＧ１ａ細胞全体についてノイラミニダーゼ処理を行い、さらにツニカマイシン処理を行った後、該細胞上にＨＥＣＡ−４５２反応性タンパク質が再発現していることを示すすウェスタンブロットの写真である。
【図７Ｃ】
２−［３Ｈ］−マンノースを用いて代謝的放射ラベルを行い、６％の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で解析を行ったＫＧ１ａ膜タンパク質のオートラジオグラフの写真である。
【図７Ｄ】
ブロット膜上におけるＬ−セレクチン依存性のリンパ球の繋留およびローリングを示す棒グラフである。
【図８】
３段階のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（６〜９％のビス／アクリルアミド）精製過程のうちの第３段階から得られた９８ｋＤａのゲルフラグメントに関するＨＥＣＡ−４５２（０．４μｇ／ｍｌ）または抗ＣＤ４４ モノクローナル抗体（Ａ３Ｄ８もしくはＨｅｒｍｅｓ−１（１μｇ／ｍｌ））との反応性を示すウェスタンブロットの写真である。
【図９】
Ｌ−セレクチンを介したブロットローリングアッセイの結果を示す膜の写真である。
【図１０】
Ａは、ＫＧ１ａ細胞から免疫沈降させたＣＤ４４のＬ−セレクチンリガンド活性について、Ｎ−グリコシダーゼ−Ｆ処理を行った場合のブロットローリングアッセイの結果を示す膜の写真である。Ｂは、ＡＭＬ（Ｍ５）芽細胞から免疫沈降させたＣＤ４４ のＬ−セレクチンリガンド活性についてＮ−グリコシダーゼ−Ｆ処理を行った場合のブロットローリングアッセイの結果を示す膜の写真である。
【図１１Ａ】
［３５Ｓ］ＳＯ４を用いて放射ラベルし、胆汁酸処理を行わなかったＫＧ１ａ細胞および胆汁酸処理を行ったＫＧ１ａ細胞から免疫沈降されたＣＤ４４のオートラジオグラムの写真である。
【図１１Ｂ】
胆汁酸処理を行った（＋）ＫＧ１ａ細胞および胆汁酸処理を行わなかった（−）ＫＧ１ａ細胞から免疫沈降されたＫＧ１ａ  ＣＤ４４のＨＥＣＡ−４５２イムノブロットの写真である。
【図１２Ａ】
図に示すずれ応力の範囲において、グルタルアルデヒド固定した造血細胞系ＫＧ１ａ、ＨＬ６０、Ｋ５６２およびＲＰＭＩ−８４０２上におけるリンパ球のローリングの結果を示す棒グラフである。
【図１２Ｂ】
図に示すずれ応力の範囲において、グルタルアルデヒド固定した造血細胞系ＫＧ１ａ、ＨＬ６０、Ｋ５６２およびＲＰＭＩ−８４０２上における好中球のローリングの結果を示す棒グラフである。
【図１２Ｃ】
図に示す回転数において、ＫＧ１ａ、ＨＬ６０、Ｋ５６２およびＲＰＭＩ−８４０２細胞系がＬ−セレクチンを介したリンパ球の結合を支持する能力を評価するために行った、ずれ応力に基づくスタンパー−ウッドラフ（Ｓｔａｍｐｅｒ−Ｗｏｏｄｒｕｆｆ）アッセイの結果を示すグラフである。
【図１３Ａ】
グルタルアルデヒドで固定した造血細胞の単層上におけるＣＨＯ−Ｐ細胞またはｍｏｃｋ形質転換体細胞のローリングを示す棒グラフである。
【図１３Ｂ】
ＫＧ１ａ細胞およびＨＬ６０細胞上におけるＣＨＯ−Ｐ細胞ローリング相互作用を示すグラフである。
【図１４Ａ】
Ｈｅｒｍｅｓ−１（ＣＤ４４）およびＰＬ−２（ＰＳＧＬ−１）の免疫沈降物、ならびにＨＣＥＬＬおよびＰＳＧＬ−１のＬ−セレクチンリガンド活性のオートラジオグラフの写真である。
【図１４Ｂ】
免疫沈降したＫＧ１ａ  ＣＤ４４（１．５μｇ）およびＰＳＧＬ−１（３μｇ）についてのスタンパー−ウッドラフ（Ｓｔａｍｐｅｒ−Ｗｏｏｄｒｕｆｆ）アッセイの結果を示すグラフである。
【図１５】
スタンパー−ウッドラフ（Ｓｔａｍｐｅｒ−Ｗｏｏｄｒｕｆｆ）アッセイにおいてヒトＨＣ  ＣＤ４４またはＰＳＧＬ−１に結合したリンパ球の顕微鏡写真である。
【図１６】
ＫＧ１ａ ＣＤ４４およびＰＳＧＬ−１上のＨＥＣＡ−４５２エピトープを示すウェスタンブロットの写真である。
【図１７Ａ】
ヒト造血細胞系上におけるグルコシルトランスフェラーゼ類（ＦｕｃＴＩＶ、ＦｕｃＴＶＩＩおよびＳＴ３ＧａｌＩＶ）の発現を示す写真である。
【図１７Ｂ】
ヒト造血細胞系上におけるグルコシルトランスフェラーゼ類（ＦｕｃＴＩＶ、ＦｕｃＴＶＩＩおよびＳＴ３ＧａｌＩＶ）の発現を示す写真である。
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ｄ】
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【図１０】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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