(57)【要約】本発明はＤＬＧ５タンパク質の作用を調節することができる化合物を同定するための方法に関し、該方法は、１個またはそれ以上の試験化合物を、配列番号２に記載されたアミノ酸配列を含有するポリペプチド、またはその相同体またはいずれかの断片、を含むスクリーニングに付することを含んでいる。そうした化合物は炎症性大腸炎の治療において有用である可能性がある。本発明は、また、ＤＬＧ５変異体を検出することにより、炎症性大腸炎を診断する方法にも関している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＬＧ５タンパク質の作用を調節することができる化合物を同定するための方法であって、１個またはそれ以上の試験化合物を、配列番号２に記載されたアミノ酸配列を含有するポリペプチド、またはその相同体またはいずれかの断片を含むスクリーニングに付することを含む、上記方法。
【請求項２】
抗ＩＢＤ治療用候補化合物を同定するための方法であって、ＤＬＧ５の発現レベルに対する試験化合物の効果を検出することが可能なアッセイ系と試験化合物とを接触させること、および、ＤＬＧ５の発現レベルの変化を評価することを含む、上記方法。
【請求項３】
ＩＢＤの治療のために用いる候補化合物をスクリーニングするための方法であって、該化合物のＤＬＧ５の活性または量を調節する能力を検定することを含む、上記方法。
【請求項４】
（ｉ）ＤＬＧ５ポリペプチドを発現する細胞株または精製したＤＬＧ５ポリペプチドを用いてＤＬＧ５活性を測定すること；および
（ii）ＤＬＧ５ポリペプチドを発現している細胞株においてdlg5の転写または翻訳を測定すること
から選択された方法を含む、請求項３の方法。
【請求項５】
dlg5プロモーターの制御下のレポーター遺伝子を含む細胞。
【請求項６】
ＩＢＤ表現型を抑制する能力に関して治療用候補薬剤を試験するための方法であって、試験化合物と、ＤＬＧ５ポリペプチドを発現するように操作された細胞とを接触させること、および、該試験化合物がＤＬＧ５ポリペプチドの発現を調節できるかどうかを測定することを含む、上記方法。
【請求項７】
dlg5の転写の阻害剤を同定する方法であって、治療用候補薬剤と、上記の細胞または細胞株とを接触させること、および、該治療用候補薬剤によるdlg5の転写の阻害を、レポーター遺伝子の発現の欠失または減少を参照して測定することを含む、上記方法。
【請求項８】
医薬組成物を製造する方法であって、
ｉ）本明細書で記載したスクリーニング法に従ってＩＢＤの治療に有用な化合物を同定すること；および、
ii）該化合物またはその製薬上許容可能な塩と、製薬上許容可能な賦形剤または希釈剤とを混合すること
を含む、上記方法。
【請求項９】
ＩＢＤの治療のための医薬の製造における、ＤＬＧ５の活性または量を調節することができる化合物の使用。
【請求項１０】
ＩＢＤの診断またはＩＢＤを発症する感受性を測定するための方法であって、
（ｉ）個体からタンパク質または核酸を含む検体を得ること；
（ii）ＤＬＧ５タンパク質の中の多型のアミノ酸、またはdlg5遺伝子の中の多型の塩基の存在を基にして、ＤＬＧ５変異体の有無を検出すること；そして、
（iii）ＤＬＧ５の多型の有無を参照して、ヒトの状態を測定すること
を含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明者は連鎖解析および関連性解析を用いて炎症性大腸炎（ＩＢＤ）への感受性にリンクしたヒト遺伝子を発見した。本発明はそれゆえに、この遺伝子の全てもしくは部分、その前駆体または産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはタンパク質）を検出することによる、ＩＢＤの検出のための、および、患者がＩＢＤを発症する感受性を測定するための診断技術に関する。本発明はまた、同定した遺伝子を調節するＩＢＤの調節物質（例えば、化学物質、アンチセンス分子、および、抗体）を同定するための方法をも目的としている。
【背景技術】
【０００２】
炎症性大腸炎（ＩＢＤ）は、胃腸管の慢性の再発性腸炎症により特徴づけられる。西洋諸国では、若年成人における発症年齢の中央値で、１０００人当り約１人の割合で罹患する。現在までに、この疾患の病因は知られていない。臨床的および組織病理学的な特性に基づいて、ＩＢＤは二つの主なサブタイプ、すなわちクローン病（ＣＤ）（On Line Mendelian Inheritance in Man、Johns Hopkins 大学で作成されNCBIで利用可能なデータベース、 OMIM 266600）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）（OMIM 191390）に分類される。ＩＢＤの原因は不明だが、この疾患の家族集積性および一卵性双生児における一致性の増加の両方から、強い遺伝的な感受性が示されている。兄弟内の危険性（λs）の推定値は１０〜５０の範囲を示し、遺伝的因子が、ＩＢＤの素因において重要な役割を果たしていることを示唆している。本明細書の文脈において用語「ＩＢＤ」は、ＩＢＤならびにクローン病および潰瘍性大腸炎も含むことを意図している。
【０００３】
以前のゲノムの広範な連鎖解析は、多くのＩＢＤに関する感受性の遺伝子座を同定し、それは、例えば、ＩＢＤ１（OMIM 266600）（Hugot et al., Nature. 379: 821-823,1996 ; Brant et al., Gastroenterlogy 115:1056-1061, 1998; Curran et al., Gastroenterology 115: 1066-1071,1998 ; and, Hampe et al., Am. J. Hum. Genet. 64: 808-816,1999a）、ＩＢＤ２（OMIM 601458）（Duerr et al., Am. J. Hum. Genet. 63: 95-100,1988 ; および, Parkes et al., Am. J. Hum. Genet. 67: 1605- 1610,2000）、ＩＢＤ３（OMIM 604519）（Hampe et al., Am. J. Hum. Genet. 65: 1647-1655,1999b）、ＩＢＤ７（OMIM 605225）（Cho et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 95: 7502-7507; および Cho et al., Hum. Molec. Genet. 9: 1425-1432,2000）。
【０００４】
それゆえに、ＩＢＤの進行に有意に関連する遺伝子を同定することが望まれている。これにより、関連遺伝子にコードされたタンパク質の活性を調節する、化合物および他の物質、例えば抗体のためのスクリーニングによるＩＢＤの新規な治療法の開発が可能になる。関連遺伝子の配列の知識はまた、関連遺伝子の発現を調節するための新規なアンチジーン法（antigene methods）の開発を可能にし、および、またＩＢＤを治療する新規な遺伝子治療方法の開発を可能にする。関連遺伝子の発見は、また、ＩＢＤの診断のための、（ｉ）関連する一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の遺伝型のパターンを解析することによる、（ii）罹患した組織中に存在する転写されたｍＲＮＡのレベルを測定することによる、または（iii）罹患した組織のタンパク質のレベルを測定することによる、新規な方法の開発を助ける。これらの方法による、ＩＢＤの診断、または、ＩＢＤの素因の予測は、その疾患の古典的な症状がまだ現れていない患者において実施することができる。そうしたＩＢＤへの感受性の測定、または、疾患の進行の早期の検出は、現在可能であるより早期での臨床的処置をもたらし、そして、該疾患のより有効な治療をもたらすことができる。
【０００５】
本発明は、我々の、染色体１０ｑ２２.３上に位置するdlg5と名づけられた単一遺伝子とＩＢＤとの関連性の発見に基礎を置いている。
【０００６】
本明細書では、該遺伝子はdlg5遺伝子と呼ばれる。具体的にはｃＤＮＡ配列は配列番号１に示されている。コードされたタンパク質は配列番号２に示され、ＤＬＧ５とよばれる。Ｃ末端が短縮したｃＤＮＡ配列は配列番号１８９に示され、それにコードされたタンパク質は配列番号１９０に示されている。
【０００７】
ＤＬＧ５は、いわゆるタンパク質のＭＡＧＵＫファミリーに属する（膜関連グアニレートキナーゼ、Dimitratos et al. BioEssays 21: 912-921,1999に総説がある）。このファミリーのタンパク質は、いくつかの識別可能なタンパク質モチーフを有しており、それには、グアニレートキナーゼドメイン、１個または複数のＰＤＺドメイン（Postsynaptic density 95, Discs large, Zona occludens-1 domain）、および、ＳＨ３ドメイン（srcホモロジードメイン）が含まれている。ＰＤＺドメインおよびＳＨ３ドメインはタンパク質−タンパク質相互作用を仲介することが解明されている。ＰＤＺドメイン相互作用が特徴付けられているいくつかの場合に、これらは膜タンパク質の短縮Ｃ末端配列と相互作用することがわかっている（Kreienkamp, Curr. Opin. Pharm. 2: 581-586, 2002）。ＳＨ３ドメインは標的タンパク質の富プロリン表面領域と相互作用をすることが見出されている。いくつかのＭＡＧＵＫタンパク質のグアニレートキナーゼドメインが、キナーゼ活性を欠きながら、タンパク質−タンパク質相互作用を仲介することが判明しているので、このドメインの主要な機能もまたタンパク質−タンパク質相互作用を仲介することだと、一般に信じられている。それゆえに、ＭＡＧＵＫタンパク質は、シグナル伝達分子を特定の膜の位置に統合させる、スカフォールド（scaffold）タンパク質であると考えられている。上皮細胞の極性を確立する以外に、ＭＡＧＵＫタンパク質はまた、ニューロンの後シナプス区画の確立に関与すると考えられている（Kreienkamp, Curr. Opin. Pharm. 2: 581-586, 2002）。例えば、ＭＡＧＵＫタンパク質ｈＤＬＧ１／ＰＳＤ−９５のＰＤＺドメインとＮＭＤＡ受容体の細胞内テールとの間の相互作用が確認されている。およそ５０個の細胞内および膜タンパク質のＣ末端がｈＤＬＧ１／ＰＳＤ−９５のＰＤＺドメインに対して高い親和性を有することが確認されているので、そうしたスカフォールドタンパク質の複数の膜受容体への集積が、後シナプス部位での神経受容体の位置決めを担っているとの仮説が立てられている（Kreienkamp, Curr. Opin. Pharm. 2: 581-586, 2002）。
【０００８】
最近まで、ＤＬＧ５の機能に関してはほとんどわかっていなかった。dlg5の部分的なＥＳＴ配列が、他のＭＡＧＵＫタンパク質との類似性によるデータベース検索から同定された（Nakamura et al., FEBS 433: 63-67,1998）。この著者はＰ−ｄｌｇとよばれる部分的ｃＤＮＡ配列を決定し、このタンパク質が前立腺の上皮腺細胞において発現していることを免疫染色法により明らかにした。また、ツー・ハイブリッドスクリーニングによりＤＬＧ５／Ｐ−ｄｌｇが特異的に、他のＭＡＧＵＫタンパク質であるｐ５５と相互作用をおこなうことを示した。ノーザンブロット解析により多数の組織での多様な発現が判明した（Nakamura et al., FEBS 433: 63-67,1998 および Shah et al., BMC Genomics 3: 6 2002）。Shah等はまた、ヒト遺伝子が３２個のエキソンから成っており、１８０９アミノ酸の完全長ＤＬＧ５タンパク質をコードしていることを示した。このＤＬＧ５タンパク質は４個のＰＤＺドメインとそれに続く１個のＳＨ３ドメインおよび１個のＣ末端グアニレートキナーゼドメインを含んでいる。
【０００９】
最近、バイト（bait）として、ビネキシンを用いたツー・ハイブリッドスクリーニングによりＤＬＧ５が同定できることが証明された（Wakabayashi et al., JBC, 25th March 20032003）。さらに、この著者等は、ビネキシン、ＤＬＧ５およびβ−カテニンが上皮細胞における接着結合複合体に直接の結合を提供する三重複合体を形成できることを示した。
【００１０】
脊椎動物の腸上皮細胞において、３つの型の細胞間結合が形成される（総説は、Tsukita et al,. Nature Rev. Mol. Cell. Biol. 2:285-293, 2001）。密着結合（tight junction）は、基底外側の先端縁に向かって位置し、細胞外環境に関する障壁として、および、膜拡散のフェンスとしての両方で機能していると考えられている。接着結合（adherence junction）は密着結合の基底外側のすぐに形成され、その機能は密着結合に比べれば明らかにはなっていない。これらは、細胞接触の機械的強度にとって重要であると考えられているが、それらの調節は、例えば、免疫細胞が上皮障壁を通過するときに、精密に密着結合と協調させなければならない。密着結合と接着結合との間の相互依存性は、密着結合の形成が接着結合が完全になるまで生じない一方、密着結合ＭＡＧＵＫタンパク質ＺＯ−３のドミナントネガティブ突然変異体の過剰発現により密着結合の形成が阻害されるときに接着結合が形成しないという発見からはっきりと示されている（Wittchen et al., J. Cell. Biol. 151: 825-836,2000；およびその中での引用文献）。最後に、多数のデスモゾームが、基底外側に沿って位置し、主に、細胞接触の機械的強度に貢献していると考えられている。
【００１１】
多くのタンパク質が細胞間結合に位置していることが判明している。膜タンパク質、例えばオクルジンおよびクラウジン、は密着結合で見出され、一方カドヘリンファミリーのメンバーは、接着結合での細胞−細胞接触を仲介している。多数のタンパク質がこれらの膜タンパク質の細胞質側に結びついており、複合体をアクチン細胞骨格および細胞内シグナル伝達にリンクしている。接着結合で、カドヘリンの細胞質部分はβ−カテニンに結合し、その結果、ＤＬＧ５と接着結合とのリンクを提供している。
【００１２】
上記のバックグラウンドデータは、腸上皮細胞の機能と統合におけるＤＬＧ５の機能的役割を強く支持している。本発明者は、本発明により始めてＩＢＤの感受性に遺伝的にリンクしていることが確認された、dlg5遺伝子によりコードされているタンパク質が、直接的または間接的に腸炎症の病因に関与していると提唱する。
【００１３】
本発明者は、dlg5遺伝子中の２０個のユニークなヌクレオチドの変異を同定し、それらのうちの４個はコドンの変換を引き起こしており、他の２個は欠失であった。
【発明の開示】
【００１４】
本発明者は、染色体１０ｑ２２．３上に位置するdlg5と名づけられた遺伝子を同定し、それによりＩＢＤへの感受性との遺伝的関連性を証明した。それゆえに、この遺伝子、ｍＲＮＡ（または、それから作られたｃＤＮＡ）、および、それらの転写物に対応するタンパク質配列は、ＩＢＤの診断用または予後用のマーカーであり、そして、該遺伝子もしくはｍＲＮＡのヌクレオチド配列多型もしくは変異の存在を検出し、または、体液もしくは細胞検体のような試験検体中に存在するｍＲＮＡもしくはコードされたタンパク質のレベルを測定することを可能にする、特異的なプローブを設計し、または、抗体作成に用いることができる。さらに、該遺伝子およびそれによりコードされるタンパク質は、ＩＢＤ疾患の治療的処置、例えば、該ｍＲＮＡを標的とするアンチセンス核酸の開発のため、または、トランスジェニック治療；または、より広範には、化学的もしくはホルモン性の治療剤の同定もしくは開発において、可能性のある標的である。当業者はまた、同定された遺伝子またはコードされたタンパク質を調節する（活性化または阻害）化合物（化学物質または生物学的物質）であって、ＩＢＤを治療または予防するための治療剤として有用であることを証明できる該化合物を同定するための、スクリーニング検定法を考案することができる。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明の第一の局面により、１またはそれ以上の試験化合物を、配列番号２に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその相同体、またはそのいずれかの断片を含有する、スクリーニングに付すことを含む、ＤＬＧ５タンパク質の作用を調節できる化合物を同定する方法が提供される。本明細書で用いられる「断片」という表現は、少なくとも２５個、好ましくは少なくとも５０個、さらに好ましくは少なくとも１００個の、配列番号２に示された配列の連続するアミノ酸を含む、全長配列の部分配列を意味し、好ましくは、該断片は、Ｃ末端およびＮ末端のいずれかまたは両方が短縮された、配列番号１９０に示されたポリペプチドのような、ＤＬＧ５タンパク質であるポリペプチドである。
【００１６】
当然ながら、本発明の使用のためのポリペプチドは、断片でもＤＬＧ５タンパク質の相同体のいずれであってもよい。
【００１７】
好ましい実施態様では、本発明のスクリーニング方法は、配列番号２に示されたアミノ酸配列、または、それに対するアミノ酸配列の、好ましさの順で増加させると、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％および９９％の同等性を有する配列を含む、ポリペプチドを用いて実施される。そうした変異体は、本明細書では「相同体」とよばれる。
【００１８】
二つの配列間の配列同一性は、例えば、BestFit、GapまたはFrameAlignのプログラムを使用してペアワイズ・コンピューター・アラインメント解析にかけることによって決められる。好ましいアラインメントのためのツールはＢｅｓｔＦｉｔである。実際に、配列データベースの範囲から、照会検索（query search）について類似／同等配列の検索を行う場合に、Ｂｌａｓｔ、Ｂｌａｓｔ２、ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔ２、ＷａｓｈＵ  Ｂｌａｓｔ２、ＦａｓｔＡ、Ｆａｓｔａ３およびＰＩＬＥＵＰのような適切なソフトウエア、ならびに、Ｂｌｏｓｕｍ６２のようなスコアリングマトリクスを用いて、類似配列の最初の同定を行うことが、一般には必要である。そうしたソフトウエアパッケージはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎの「ゴールドスタンダード」なアラインメントアルゴリスムに密接に近づけようと試みられている。したがって、類似／同一性の評価、すなわち、いかに二つのポリペプチドの一次配列が並べられているかの評価、で使用するために選択されたソフトウエア／検索エンジンプログラムはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎである。同一性とは直接の一致を意味し、類似性は同類置換も許容する。
【００１９】
ＤＬＧ５タンパク質の対立遺伝子の変異体または異型（versions）が、ヒト集団の中、特に識別可能な民族集団の間で、存在する可能性がある。本発明のさらなる局面は、インビボで該ＤＬＧ５異型の活性を変化させることができる化合物を発見するための、スクリーニングにおいて含まれる、ＤＬＧ５タンパク質の適切な異型の選択と使用を含んでいる。本発明者は、dlg5遺伝子の１つまたは他のエクソンの中に、ヌクレオチド多型を変化させる４個のコドンを同定した。これらのそれぞれは、単独でまたは組み合わされて、本発明のいかなる局面でも使用できる、数多くのＤＬＧ５の対立遺伝子変異体タンパク質の異型を提供することになる。
【００２０】
研究者は、ＤＬＧ５タンパク質の最も優勢な異型に対する、およびまた、より頻度の低いＤＬＧ５タンパク質の異型に対する、該標的の種々の異型間でのいかなる異なった薬理学的活性をも検出するために、彼らの化合物をスクリーニングしたいと思うであろう。本発明のさらなる局面は、種々の民族に基礎を置いた集団について、該集団内でのdlg5遺伝子中のヌクレオチド多型の対立遺伝子における頻度を測定するためのスクリーニングである。この情報は、そうした集団内でのＤＬＧ５活性を変換することのできる新規な化合物の効果を予測する場合に、とりわけ、治療に応答しない集団の比率を予測する場合に、価値を有する可能性がある。
【００２１】
多型とは、一つの集団内での、２個またはそれ以上の遺伝的に決定された選択的な対立遺伝子または配列の存在を意味する。多型のマーカーとは、多様性が生じる部位である。
好ましくは、マーカーは、少なくとも２個の対立遺伝子を有し、一つの選択された集団内において、それぞれ、１％を超えて、および、より好ましくは、少なくとも１０％、１５％、２０％、３０％またはそれ以上の頻度で生じている。
【００２２】
一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、一般に、その名前が示すように、一つの種の特定のメンバーの核酸配列に存在する、単一のヌクレオチドまたは点の変異である。種内でのそうした多型の変異は、一般に、進化を通じての自然発生的な変異の結果であると考えられている。変異型または正常型の配列は、時には、その種の集団内に、安定または準安定平衡状態で共存している。またある時には、そうした変異はその集団にある利点を与え、時と共に、その種のメンバーの全てまたは大多数のゲノムに組み込まれる可能性がある。
【００２３】
いくつかのＳＮＰは、タンパク質をコードする配列中に存在し、この場合、多型のタンパク質の型は、変異体タンパク質の発現を生じさせ、場合によっては、遺伝的疾患をもたらす、異なったアミノ酸を有するかもしれない。そうした機能の変化は、それに限定されないが、タンパク質のフォールディングの変化、リガンドおよび基質の結合親和性の変化、ならびに、膜結合親和性の変化を含む、種々の機構により媒介され、インビボでの該タンパク質の活性の取得または活性の消失をもたらすかもしれない。そうしたインビボでのタンパク質の活性の変化は、ＩＢＤの進行において、臨床的に重要であるかもしれない。タンパク質のアミノ酸配列の変化は、また、タンパク質とその活性を調節するスクリーニングによって選択された化合物との間での特異性を変化させることによって、ＩＢＤの医薬による治療の有効性に影響を与えるかもしれない。したがって、スクリーニングによって選択された化合物は、異なった個人においてタンパク質の活性を調節する場合に、彼らが担っている遺伝子の異型によって、異なった効果を有するかもしれない。特に、遺伝子のより稀な変異体に関する同型接合的な個人は、優勢な変異体に対する化合物のスクリーニングにより開発された治療に、上手く応答できないかもしれない。
【００２４】
本発明によるスクリーニング方法は、慣用の方法、例えば、スクリーニングを受ける試験化合物または複数の化合物と適切な基質を、ポリペプチド、またはそれを産生できる細胞、またはその細胞膜調製物に接触させ、次いで、標準法に基づいて、該ポリペプチドに対する親和性を測定する方法、を用いて実施することができる。
【００２５】
この方法により同定されたいずれの化合物も、ヒトおよび／または他の動物のＩＢＤの治療に有用であることを証明できる。したがって、本発明はＤＬＧ５タンパク質の過剰の、または不十分な活性あるいは制御されない活性が関与する疾患に使用するための配列番号２に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその相同体もしくは断片あるいはそれをコードする遺伝子（配列番号１に記載のものなど）を使用するスクリーニング検定法で一次的に決定され、インビボにおいて前記ＤＬＧ５タンパク質の活性を調節するその有効性のために選択された化合物にまで及ぶ。
【００２６】
本発明のさらなる局面により、抗−ＩＢＤ治療用の化合物候補を同定するための、スクリーニング検定または方法を提供し、該方法では、ＤＬＧ５の発現レベルに対して試験化合物の効果を検出可能な検定システムと、試験化合物とを接触させ、次いで、ＤＬＧ５の発現レベルの変化を評価する。
【００２７】
ＤＬＧ５ポリペプチドのＤＮＡまたはＲＮＡの発現を調節する化合物は、各種の検定システムにより検出できる。適切な検定システムは、例えば、ベータガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質またはその他の当業者に公知の物、のようなレポーター遺伝子の発現の変化の有無を測定できる、簡単な「はい／いいえ（yes/no）」検定であっていい（Naylor, Biochem. Pharmacol. 58: 749-57,1999に総説がある）。この検定システムは、試験検体の発現または機能と、標準検体の発現または機能のレベルとを比較することによって、定量化できる。転写因子を、レポーター遺伝子の転写のような、正の出力を促進するために使用するシステムは、一般に、「ワン−ハイブリッドシステム」とよばれる（Wang, M. M. および Reed, R. R. (1993) Nature 364: 121-126）。したがって、負の出力（増殖阻害）を促進する転写因子の使用は「逆ワン−ハイブリッドシステム」とよぶことができる（Vidal et al, 1996, 上述）。それゆえに、本発明の実施態様において、レポーター遺伝子はdlg5プロモーターの制御下に置かれる。適切なdlg5プロモーター配列は配列番号５に開示されている。
【００２８】
本発明のさらなる局面において、我々は、dlg5遺伝子の制御下に置かれるレポーター遺伝子を含んでいる細胞または細胞株を提供する。
【００２９】
本発明の別の局面において、ＩＢＤの治療に有用な候補化合物のスクリーニング方法を提供し、該方法は、ＤＬＧ５の活性または量を調節する能力に関して化合物を検定することを含んでいる。好ましくは、この検定は以下から選択される：
（ｉ）ＤＬＧ５ポリペプチドを発現する細胞株、または、精製したＤＬＧ５ポリペプチドを用いてＤＬＧ５活性を測定すること；および
（ii）ＤＬＧ５ポリペプチドを発現している細胞株においてdlg5転写または翻訳を測定すること。
【００３０】
この「ＤＬＧ５ポリペプチド」とは、ＤＬＧ５タンパク質、その相同体、または、いずれかの断片を意味する。
【００３１】
したがって、本発明のさらなる局面において、ＤＬＧ５ポリペプチドを発現する細胞培養体が、治療剤をスクリーニングするために使用できる。試験化合物の効果は、ＤＬＧ５のｍＲＮＡまたはタンパク質の変化により検定できる。以下に記載するように、細胞（すなわち、哺乳類、細菌、酵母等）は、ＤＬＧ５ポリペプチドを発現できるように操作することができる。
【００３２】
したがって、本発明のさらなる局面により、ＩＢＤ表現型を抑制することができる治療剤候補を試験するための方法を提供し、該方法は、試験化合物を、ＤＬＧ５ポリペプチドを発現できるように操作された細胞と接触させること；および、該試験化合物がＤＬＧ５ポリペプチドの発現を調節できるどうかを測定することを含んでいる。
【００３３】
我々はまたdlg5の転写の阻害剤を同定する方法を提供し、該方法は、治療剤候補と、上記の細胞または細胞株とを接触させること、次いで、レポーター遺伝子の発現の消失または減少を参照することによって、該治療剤候補によるdlg5転写の阻害を測定することを含んでいる。
【００３４】
どのような都合の良い試験化合物または試験化合物のライブラリーでも、この試験検定と一緒に使用することができる。特別な試験化合物には、ヒトもしくは動物での使用のための医薬もしくは動物薬に適した低分子量の化学化合物（好ましくは、１５００未満の分子量を有する）、または、洗浄／殺菌剤のような非投与用、もしくは、農業使用の化合物が含まれる。試験化合物はまた、抗体のような、自然に存在する生物学的物質であってもいい。
【００３５】
本発明のさらなる局面により、本明細書で定義されたスクリーニング方法により同定された化合物が提供される。
【００３６】
本発明の別の局面により、ＩＢＤを治療するための医薬の製造における、ＤＬＧ５の活性または量を調節できる化合物の使用が提供される。化合物によるＤＬＧ５の量の調節は、例えば、変化した遺伝子発現レベルまたはメッセージの安定性を介してもたらされうる。化合物によるＤＬＧ５の活性の調節は、また、例えば、ＤＬＧ５タンパク質に結合している化合物を介してもたらされうる。一つの実施態様において、ＤＬＧ５の調節は、ＤＬＧ５の活性または量を減少できる化合物の使用を含む。他の実施態様では、ＤＬＧ５の調節は、ＤＬＧ５の活性または量を増加させることのできる化合物の使用を含む。
【００３７】
当然のことながら、「ＩＢＤの治療のため」という用語、および、その変形が、治療用および予防用（防御用）処置を含む。
【００３８】
本発明の他の局面により、以下の工程を含む、医薬組成物の製造方法が提供される：
ｉ）本明細書に記載されたスクリーニング方法により、ＩＢＤの治療のために有用な化合物を同定すること；および
ii）該化合物またはその製薬上受容可能な塩と、製薬上受容可能な賦形剤または希釈剤とを混合すること。
【００３９】
本発明のさらなる局面により、ＩＢＤに罹患している患者の治療方法が提供され、該方法は、該患者に、本発明のスクリーニング方法により同定された化合物、または、本明細書で記載された方法により製造された組成物の有効量を投与することを含んでいる。
【００４０】
本発明の組成物は、以下の投与に適切な形態、すなわち、経口投与用（例えば、錠剤、トローチ剤、硬もしくは軟カプセル、水性もしくは油性懸濁剤、乳剤、分散散剤もしくは顆粒剤、シロップ剤またはエリキシル剤）、局所投与用（例えば、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、または水性もしくは油性液剤もしくは懸濁剤）、吸入投与用（inhalation）（例えば、微粉化した粉末または液性エアゾール）、吹送投与用（insufflation）（例えば、微粉化した粉末）、または、非経口投与用（例えば、静脈内、皮下もしくは筋肉内投与用の無菌の水性もしくは油性溶液、または、直腸投与用の坐薬）の形態であっていい。
【００４１】
本発明の組成物は、当業界で周知の、慣用の医薬用賦形剤を用いた、慣用の方法で得ることができる。したがって、経口使用を意図する組成物は、例えば、１個またはそれ以上の着色剤、甘味剤、矯味矯臭剤、および／または保存剤を含んでもいい。
【００４２】
錠剤のための適切な製薬的に受容可能な賦形剤には、例えば、乳糖、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウムまたは炭酸カルシウムのような不活性希釈剤；コーンスターチまたはアルゲン酸のような顆粒化および崩壊剤；デンプンのような結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクのような滑沢剤；ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはプロピルのような保存剤；ならびに、アスコルビン酸のような抗酸化剤が挙げられる。錠剤は、非被覆型であるか、または、胃腸管内での崩壊およびそれに続く活性成分の吸収を調節するか、または、それらの安定性および／または外観を改善するためのいずれかの被覆型であってもよく、いずれの場合でも、慣用の被覆剤および当該技術で周知の方法を用いることができる。
【００４３】
経口使用のための組成物は、活性成分を不活性固形希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくはカオリンと混合したゼラチン硬カプセル、または、活性成分を水、もしくはピーナッツ油、流動パラフィンもしくはオリーブ油のような油と混合したゼラチン軟カプセルの形態が可能である。
【００４４】
水性懸濁剤は、一般に、微細に粉末化した形態の活性成分と、１個またはそれ以上の懸濁化剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、および、アカシアゴム；分散もしくは湿潤剤、例えば、レシチンもしくはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンステアレート）、または、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、または、エチレンオキシドと脂肪酸由来の部分的エステルおよびヘキシトールとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）、または、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、または、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）、または、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導された部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレエート）とを含んでいる。水性懸濁剤は、また、１個またはそれ以上の保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルもしくはプロピルエステル）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、着色剤、矯味矯臭剤、および／または、甘味剤（例えば、ショ糖、サッカリン、または、アスパルテーム）を含むことができる。
【００４５】
油性懸濁剤は、植物油（例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油またはココナッツ油）中、または、鉱物油（例えば、流動パラフィン）中に、活性成分を懸濁することにより製剤化される。油性懸濁剤はまた、増粘剤、例えば蜜蝋、固形パラフィンまたはセチルアルコールを含んでもいい。上記に記載したような甘味剤、および、矯味矯臭剤を、口当たりの良い経口製剤を得るために、加えることができる。これらの組成物は、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸の添加により保存してもいい。
【００４６】
水を添加して水性懸濁剤を製造するために適した分散可能な散剤および顆粒剤は、一般に、活性成分と一緒に分散もしくは湿潤剤、懸濁剤および１個またはそれ以上の保存剤を含んでいる。適切な分散もしくは湿潤剤および懸濁剤は、上記で既に例示されている。追加の賦形剤、例えば、甘味剤、矯味矯臭剤および着色剤もまた、示されている。
【００４７】
本発明の医薬組成物は、水中油（oil-in-water）の乳剤の形態であってもいい。この油相は、植物油、例えば、オリーブ油もしくは落花生油、または、鉱物油、例えば、流動パラフィン、または、それらのいずれかの混合物であっていい。適切な乳化剤は、例えば、自然由来のゴム（例えば、アカシアゴムまたはトラガカントゴム）；自然由来のリン脂質、例えば、ダイズレシチン、脂肪酸およびヘキストール無水物から誘導されたエステルもしくは部分エステル（例えば、ソルビタンモノオレエート）、ならびに、該部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）である。乳剤はまた、甘味剤、矯味矯臭剤および保存剤を含んでいてもいい。
【００４８】
シロップおよびエリキシル剤は、甘味剤、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、アスパルテームまたはショ糖により製剤化されてよく、また、粘滑剤、保存剤、矯味矯臭剤および／または着色剤を含んでもいい。
【００４９】
医薬組成物はまた、公知の方法により、１個またはそれ以上の適切な上記の分散もしくは湿潤化剤および懸濁化剤を用いて製剤化した、無菌注射可能な水性または油性懸濁剤の形態であってもいい。無菌注射用製剤はまた、非毒性の非経口的に受容可能な希釈剤または溶媒中の無菌注射用溶液または懸濁剤であっていい（例えば、１，３−ブタネジオールの溶液）。
【００５０】
坐薬製剤は、活性成分を、常温では固体であり直腸温度では液体でありしたがって直腸内で溶解し医薬を放出できるような、適切な非刺激性の賦形剤と混合して製造できる。適切な賦形剤は、例えば、カカオバターおよびポリエチレングリコールである。
【００５１】
局所用製剤、例えば、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、および、水性または油性の液剤または懸濁剤は、一般に、活性成分を、常用の局所で受容可能な、ビヒクルまたは希釈剤と一緒に、当該技術で慣用の方法を用いて、製剤化することにより得ることができる。
【００５２】
吹送投与（insufflation）用の組成物は、平均直径が、例えば、３０μ以下の粒子を含む微砕粉末の形態であってよく、この粉末自体は、活性成分単独で、または１個もしくはそれ以上の生理学的に受容可能な担体、例えば、乳糖、による希釈したもの、のいずれかを含んでいる。吹送投与用の粉末は、次に、例えば、１〜５０ｍｇの活性成分を、クロモグリク酸ナトリウムのような公知の薬剤の吹送投与のために用いられるような、ターボ型吸入器を用いて使用するために、カプセル中に都合良く充填される。
【００５３】
吸入投与（inhalation）用の組成物は、活性成分を、微細固体を含むエアゾールまたは液滴のいずれかで、投薬するように調整された、常用の圧縮型エアゾールの形態であっていい。常用のエアゾール噴射剤、例えば、揮発性フッ素化炭化水素または炭化水素を用いることができ、そして、エアゾール器具は活性成分の秤量された量を投薬できるように都合良く調整される。
【００５４】
製剤に関するさらなる情報に関しては、読者は、Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial BIBDrd), Pergamon Press 1990の第５巻、第２５．２章を参照できる。
【００５５】
単回投与剤形を製造するための、１個またはそれ以上の賦形剤と組み合わせた活性成分の量は、治療される患者および特定の投与経路に依存して、必然的に変更されるだろう。例えば、ヒトに経口投与するための製剤は、一般に、例えば、０.５ｍｇ〜２ｇの活性成分と、総組成物の５〜９８重量％の間で変更できる、適切で都合の良い量の賦形剤を一緒に含むだろう。投与単位形態は一般に活性成分を約１ｍｇ〜約５００ｍｇ含むだろう。投与経路および用法・用量については、読者はComprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial BIBDrd), Pergamon Press 1990の第５巻、第２５.３章を参照できる。
【００５６】
化合物の治療または予防目的のための用量は、状態の性質と重症度、動物または患者の年齢および性別、ならびに、投与経路に依存して、医薬の周知の原理に従って、当然変更されるだろう。
【００５７】
治療または予防目的のための化合物の使用にあたって、一般に、一日投与量は、例えば、体重ｋｇ当り０.５〜７５ｍｇの範囲で、もし必要ならば分割した投与で与えられる。一般には、非経口経路を用いた時は低用量が用いられるだろう。したがって、例えば、静脈内投与の場合は、体重ｋｇ当り０.５ｍｇ〜３０ｍｇの範囲で、一般に、用いられるだろう。同じように、吸入投与の場合は、体重ｋｇ当り０.５ｍｇ〜２０ｍｇの範囲で用いられるだろう。しかしながら、経口投与が好ましい。
【００５８】
dlg5遺伝子がＩＢＤに関連していると確認したことにより、多くの分子診断の機会が提供される。臨床的に重要な情報が、生物学的検体中に生じる核酸、タンパク質または他の分析対象物のレベルの測定により得られることは、当業者に知られている。核酸、タンパク質または他の分析対象物が多型として存在する場合は、検体中に生じる該多型の核酸、タンパク質または他の分析対象物の種々の異型を同定することにより、診断上の有用性もでてくる。
【００５９】
研究者は、検体中に存在する、ＤＬＧ５タンパク質の量の測定、または、dlg5のｍＲＮＡ転写物のレベルの測定を希望するかもしれない。研究者はまた、検体中に存在する変異体ヌクレオチドを検出するために核酸配列解析を実施することを望むかもしれない。そうした解析は、検体中のＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの画分について実施することができ、これらは当業者には周知である。研究者はまた、タンパク質配列解析の実施を望むかもしれず、この解析は、当業界で周知の分解を基礎にした技術により直接に、または、免疫検定のような分子認識技術、もしくは、タンパク質の物理的特性の変化に基づく技術、例えば、機能的もしくは基質特異的検定、または、等電点電気泳動法により、間接的に行われる。
【００６０】
本発明のさらなる局面により、ＩＢＤの診断または予知または監視のための方法が提供され、該方法は、生物学的検体をＤＬＧ５の異常なレベルに関して試験することを含んでいる。
【００６１】
「異常なレベル」という表現は、正常値を外れたレベルであることを意味している。この正常値は、多数の正常な組織の試験により決定でき、または、試験検体と正常もしくは対照検体を、並べて比較することで決定することができる。この使用の目的のためには、異常な発現とは、対照検体に比較して、疾患検体中の核酸のレベルが１.５倍またはそれ以上であることを意味する。本明細書で使用される核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を意味する。
【００６２】
試験用の生物学的検体は、個人から得られた、関節液、血液、バッカル・スクレイプ、尿または他の体液もしくは組織である。
【００６３】
本発明は、ＩＢＤ疾患の有病率にリンクしている、本明細書で同定された遺伝子の同定にある。したがって、部分的に、本発明は、本明細書で同定されたdlg5遺伝子の発現レベルの違いを、対照組織での発現に比較して、単一でまたはパネルのいずれかで評価できる、いかなる診断方法をも目的としている。特に、そうした方法は、ｍＲＮＡ転写レベルおよび／またはタンパク質レベルの評価を含んでいる。遺伝子の異常な発現レベルの存在は、ＩＢＤの存在またはこの疾患を発症させる可能性が増加していることを示している。
【００６４】
上記のように、一つの実施態様では、本発明の診断／検出方法は、１個もしくはそれ以上のＳＮＰの存在、または、ＤＬＧ５もしくはdlg5の小さな挿入、欠失もしくは重複を検出するために用いられる。適したＳＮＰおよびＤＬＧ５またはdlg5は表３で同定したものを含む。
【００６５】
多型の知識は、特定の疾患に罹りやすい患者、および、特定の薬剤による治療に最も適合した患者を、同定するための役にたつ（後者は、しばしば、「薬理遺伝学」とよばれる）。薬理遺伝学はまた薬物の選択方法を支援するための薬学研究でも使用できる。多型はヒトゲノムをマッピングするために、および、疾患の遺伝子要因を解明するために、用いることができる。読者は、薬理遺伝学および他の多型検出の使用に関する詳細な背景に関しては、以下の参考文献を参照することができる：Linder et al. (1997), Clinical Chemistry, 43: 254; Marshal (1997), Nature Biotechnology. 15: 1249; 国際特許公開公報 WO 97/40462, Spectra Biomedical; および Schafer et al, (1998), Nature Biotechnology. 16: 33。
【００６６】
ハプロタイプは、単一の（父系または母系）染色体上においてリンクする多型部位（一遺伝子内のような）で見出される一組の対立遺伝子である。もし該遺伝子内の組換えがランダムならば、２nもの多くのハプロタイプが存在でき、ここで２はそれぞれのＳＮＰでの対立遺伝子の数であり、および、ｎはＳＮＰの数である。臨床的な応答と関連している変異または多型を同定するための一つの方法は、興味のある集団で同定できる全てのハプロタイプを用いた関連性の研究を実施することである。それぞれのハプロタイプの頻度は、その最も稀な対立遺伝子の頻度によって限定され、ゆえに、低い頻度の対立遺伝子を伴ったヌクレオチド配列多型は、特に、低頻度のハプロタイプのマーカーとして有用である。臨床徴候、例えば、有害または異常な事象に関連した特定の変異または多型はその集団の中で低頻度である可能性が高いので、低頻度のヌクレオチド配列の変動は、特にそうした変異を同定するために有用である（例えば、以下を参照せよ：シスタチオニンβシンターゼ（ＣＢＳ）遺伝子座における連鎖不均衡、および、ＣＢＳ遺伝子座の遺伝的変動とホモシステインの血漿レベルとの関連性（De Stefano et al., Ann Hum Genet (1998) 62: 481-90; および、 Keightley et al., Blood (1999) 93:4277-83）。
【００６７】
臨床試験は、医薬による治療に対する患者の応答がしばしば不均一であることを示している。したがって、薬剤の設計および治療への改良された方法が必要とされている。
【００６８】
ポリペプチドの点変異は以下のように記載されるだろう：天然のアミノ酸（１または３文字命名法使用）、位置、新しいアミノ酸。例えば（仮定上の）、「Ｄ２５Ｋ」または「Ａｓｐ２５Ｌｙｓ」は、位置２５のアスパラギン酸（Ｄ）がリシン（Ｋ）に変換されたことを意味する。
【００６９】
多型部位における特定の核酸塩基の存在は、その多型部位に続く塩基によって表されるだろう。例えば（仮定上の）、位置３００のアデニンの存在は３００Ａとして表されるだろう。
【００７０】
我々はヌクレオチド多型の、ＤＬＧ５タンパク質のアミノ酸配列に影響するものも含んだ、例を提供する。そうしたアミノ酸の変化した多型は表３で「非同義的（non-synonymous）」として示されている。
【００７１】
プロモーターおよびＵＴＲ領域のヌクレオチド多型（変異）はまた、dlg5遺伝子の転写および発現に影響し、インビボでのＤＬＧ５タンパク質の、増加もしくは減少した発現レベル、または、制御されない活性のいずれかをもたらす可能性がある。そうしたインビボでのＤＬＧ５タンパク質の発現レベルの変化は、臨床的に重要性のある、機能の獲得または消失を生じさせることがある。最近、アミノ酸の変化を生じさせない多型であっても、異なった生物学的機能を有する可能性のあるｍＲＮＡの異なった構造の折り畳みを引き起こすかもしれない、ということが報告されている（Shen et al., (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96: 7871-7876）。
【００７２】
本発明の一つの実施態様で、本明細書に記載されているスクリーニング方法は、配列番号１または６に示された核酸配列から転写されたＤＬＧ５タンパク質変異体を利用している。
【００７３】
dlg5またはＤＬＧ５内のヌクレオチド多型はまた、疾患素因の診断用マーカーとしても用いられる。ＩＢＤに罹患している集団内、ならびに、ＩＢＤには罹患していないが、例えば、それには限定されないが、人種的系統、出身国、性別、年齢および肥満度指数を含むその他の因子は一致している対照集団内での、ヌクレオチド配列変異体の遺伝子型タイピングは、研究者が、対応する対照集団での発生率に比較してＩＢＤを伴った集団でより優勢な、特定のＳＮＰ遺伝子型またはハプロタイプの遺伝により、ＩＢＤ疾患の発症に関連する増加した危険因子を同定することを可能にする。このことは、無症状の個人でのそれらのヌクレオチド配列多型の遺伝子型またはハプロタイプを測定することにより、ＩＢＤを発症させる危険の増大した個人をスクリーニングすることを可能にする。我々はＩＢＤの診断のために有用である可能性のあるdlg5遺伝子での新規な配列多型を発見した。公有になったヌクレオチド配列の変異であって、ＩＢＤの診断のため、またはＩＢＤの研究に有用である可能性のあるものも、本発明で確認された。表３にはdlg5における配列多型をリスト化している。公有になったそれらのデータベース由来の多型はｒｓ−またはｔｓｃ−のいずれかの注釈が付けられている。他のＳＮＰ、注釈されたＤＬＧｅは本発明で初めて同定されたと信じられる。Ｔｓｃ−はＳＮＰコンソーシアムを意味する。
【００７４】
ヌクレオチド配列の変異または多型は、遺伝子のヌクレオチド配列中もしくはdlg5遺伝子の発現を調節する配列中の、一ヌクレオチド多型、１個もしくは複数のヌクレオチドの欠失、１個もしくは複数のヌクレオチドの重複、または、１個もしくは複数のヌクレオチドの挿入であっていい。
【００７５】
本発明の一つの局面により、ＩＢＤに関連した一ヌクレオチド多型の診断に関する方法が提供され、該方法には、ヒト核酸から、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、および、９３の１個またはそれ以上に従って位置１６のヌクレオチドの同一性を測定すること；そして、検出された多型を参照してヒトの状態を調べることが含まれる。配列番号３２および３３に開示された変異に関して、位置１６のヌクレオチドはＣ、または７塩基の欠失を伴った対立遺伝子においてはＧ、のいずれかであろう。
【００７６】
ヒトという用語は、炎症性大腸炎を有するまたは有すると疑われるヒト、および、ＩＢＤへの素因または感受性に関して試験される可能性のある無症候のヒト、の両方を含んでいる。それぞれの位置において、ヒトは対立遺伝子に関して同型（homozygous）であるか、または、異型（heterozygote）である。
【００７７】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号７に従って）がＧおよび／またはＡの存在である方法である。
【００７８】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号９に従って）がＣおよび／またはＴの存在である方法である。
【００７９】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号１１に従って）がＣおよび／またはＴの存在である方法である。
【００８０】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号１３に従って）がＧおよび／またはＡの存在である方法である。
【００８１】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号１５に従って）がＧおよび／またはＣの存在である方法である。
【００８２】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号１７に従って）がＣおよび／またはＴの存在である方法である。
【００８３】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号１９に従って）がＡおよび／またはＧの存在である方法である。
【００８４】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号２１に従って）がＣおよび／またはＡの存在である方法である。
【００８５】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号２３に従って）がＣおよび／またはＡの存在である方法である。
【００８６】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号２５に従って）がＧおよび／またはＡの存在である方法である。
【００８７】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号２７に従って）がＣおよび／またはＴの存在である方法である。
【００８８】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号２９に従って）がＣおよび／またはＧの存在である方法である。
【００８９】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号３１に従って）がＣおよび／またはＴの存在である方法である。
【００９０】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号３５に従って）がＧおよび／またはＡの存在である方法である。
【００９１】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号３７に従って）がＧおよび／またはＣの存在である方法である。
【００９２】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号３９に従って）がＧおよび／またはＡの存在である方法である。
【００９３】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号４１に従って）がＣおよび／またはＴの存在である方法である。
【００９４】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号４３に従って）がＧおよび／またはＡの存在である方法である。
【００９５】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号４５に従って）がＣおよび／またはＴの存在である方法である。
【００９６】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位
置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号４７に従って）がＣおよび／またはＴの存在である方法である。
【００９７】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号４９に従って）がＣおよび／またはＴの存在である方法である。
【００９８】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号５１に従って）がＣおよび／またはＴの存在である方法である。
【００９９】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号５３に従って）がＧおよび／またはＣの存在である方法である。
【０１００】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号５５に従って）がＣおよび／またはＴの存在である方法である。
【０１０１】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号５７に従って）がＧおよび／またはＣの存在である方法である。
【０１０２】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号５９に従って）がＣおよび／またはＴの存在である方法である。
【０１０３】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号６１に従って）がＣおよび／またはＡの存在である方法である。
【０１０４】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号６３に従って）がＴおよび／またはＡの存在である方法である。
【０１０５】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号６５に従って）がＣおよび／またはＧの存在である方法である。
【０１０６】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号６７に従って）がＧおよび／またはＡの存在である方法である。
【０１０７】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号６９に従って）がＣおよび／またはＴの存在である方法である。
【０１０８】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号７１に従って）がＡおよび／またはＧの存在である方法である（単一塩基欠失の結果として）。
【０１０９】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号７３に従って）がＣおよび／またはＴの存在である方法である。
【０１１０】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号７５に従って）がＣおよび／またはＴの存在である方法である。
【０１１１】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号７７に従って）がＣおよび／またはＡの存在である方法である。
【０１１２】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号７９に従って）がＣおよび／またはＴの存在である方法である。
【０１１３】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号８１に従って）がＣおよび／またはＴの存在である方法である。
【０１１４】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号８３に従って）がＧおよび／またはＡの存在である方法である。
【０１１５】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号８５に従って）がＣおよび／またはＴの存在である方法である。
【０１１６】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号８７に従って）がＡおよび／またはＧの存在である方法である。
【０１１７】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号８９に従って）がＧおよび／またはＡの存在である方法である。
【０１１８】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号９１に従って）がＣおよび／またはＧの存在である方法である。
【０１１９】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する一ヌクレオチド多型（配列番号９３に従って）がＧおよび／またはＡの存在である方法である。
【０１２０】
本発明の一つの実施態様において、好ましくは、本明細書に記載された診断方法は、位置１６に位置する７塩基欠失の存在または不在（配列番号３３に従って）である方法である。
【０１２１】
本発明の他の局面において、ＩＢＤを診断するための、または、ＩＢＤを発症する感受性を測定するための方法が提供され、該方法は以下の工程を含む：
（ｉ）個人からタンパク質または核酸を含む検体を得ること；
（ii）ＤＬＧ５タンパク質の中のアミノ酸の多型、またはdlg5遺伝子配列の中の塩基多型の存在を基にして、ＤＬＧ５変異体の有無を検出すること；そして、
（iii）ＤＬＧ５の多型の有無を参照して、ヒトの状態を測定すること。
【０１２２】
一つの実施態様において、多型アミノ酸は、配列番号２に従って、位置１４０、２３１、６２４、１０６７、１０８９、または、１４８１に位置している。
【０１２３】
特別な実施態様において、この多型は、配列番号２に従って、Ｇｌｎ１４０Ａｒｇ、Ｓｅｒ３２１Ｇｌｙ、Ｇｌｕ６２４Ｇｌｎ、Ａｒｇ１０６７Ｈｉｓ、Ｐｒｏ１０８９Ｌｅｕ、または、Ｐｒｏ１４８１Ｇｌｎから成る群から選択される。
【０１２４】
一つの実施態様において、多型アミノ酸は、配列番号１９０に従って、位置３０、１２１、５１４、９５７、９７９、または、１３７１に位置している。
【０１２５】
特別な実施態様において、この多型は、配列番号１９０に従って、Ｇｌｎ３０Ａｒｇ、Ｓｅｒ１２１Ｇｌｙ、Ｇｌｕ５１４Ｇｌｎ、Ａｒｇ９５７Ｈｉｓ、Ｐｒｏ９７９Ｌｅｕ、または、Ｐｒｏ１３７１Ｇｌｎから成る群から選択される。
【０１２６】
タンパク質または核酸を含んでいる試験検体は、個人から得られた、血液、気管支肺胞洗浄液、痰、または他の体液もしくは組織が都合がいい。当然のことながら、この試験検体は、試験検体中の配列に対応する核酸配列に等しくてよく、すなわち、この検体核酸中の領域の全てまたは部分は、最初に、ＤＬＧ５変異の解析に使用する前に、ＰＣＲのような、あらゆる便利な技術を使用して増幅させていい。
【０１２７】
当業者には、本発明の１個またはそれ以上の多型の位置での、変異ヌクレオチドの存在または不在を検出するために使用できる、多くの分析方法があることが明白であろう。一般に、対立遺伝子の変異の検出は、変異を識別する技術、場合によっては増幅反応、および、場合によってはシグナル産生システムを必要とする。リスト１では多くの変異検出技術を同定しており、あるものはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を基にしている。これらは、多くのシグナル産生システムと組み合わせて使用でき、その選択はリスト２に記載されている。さらなる増幅技術はリスト３に記載されている。多くの最近の対立遺伝子の変異の検出方法は、Nollau et al., Clin. Chem. 43,1114-1120, 1997；および標準的な教科書、例えば、“Laboratory Protocols for Mutation Detection”, Ed. by U. Landegren, Oxford University Press, 1996 および “PCR”, 2nd Edition by Newton & Graham, BIOS Scientific Publishers Limited, 1997にて解説されている。
【０１２８】
【表１】
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【０１２９】
リスト１−変異検出技術
一般法：  ＤＮＡ配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定
スキャンニング：  ＰＴＴ*、ＳＳＣＰ、ＤＧＧＥ、ＴＧＧＥ、クリバーゼ（Cleavase）、ヘテロ二本鎖解析、ＣＭＣ、酵素的ミスマッチ切断
＊注記：  プロモーター多型の検出には使用できない。
ハイブリダイゼーションを基礎とした：固相ハイブリダイゼーション：  ドットブロット、ＭＡＳＤＡ、リバースドットブロット、オリゴヌクレオチドアレイ（ＤＮＡチップス）
液相ハイブリダイゼーション：  ＴａｑｍａｎTM−ＵＳ５２１００１５およびＵＳ５４８７９７２（Hoffmann-La Roche）、モレキュラー・ビーコン（Molecular Beacons）−Tyagi et al (1996), Nature Biotechnology, 14,303 ; WO 95/13399 (Public Health Inst., New York)
伸長反応を基にした：  ＡＲＭＳTM−対立遺伝子特異的増幅（EP-B-332435 および US patent No. 5,595, 890に記載のように）、ＡＬＥＸTM−EP-B-332435 (Zeneca Limited)
、ＣＯＰＳ−Gibbs et al (1989), Nucleic Acids Research, 17, 2347。
組み込みを基にした：  ミニ配列決定、ＡＰＥＸ
制限酵素を基にした：  ＲＦＬＰ、制限部位産生ＰＣＲ
ライゲーションを基にした：  ＯＬＡ
その他：  インベーダー検定法、ハイブリダイゼーション保護検定法
【０１３０】
リスト２−シグナル産生または検出システム
蛍光：  ＦＲＥＴ、蛍光クエンチング、蛍光偏光−英国特許２２２８９９８（Zeneca Limited）
その他：  化学発光、電気化学発光、ラマン、放射能、比色分析、質量分析、ＳＥＲＲＳ−WO 97/05280 (University of Strathclyde)。
【０１３１】
リスト３−さらなる増幅方法
ＳＳＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ｂ−ＤＮＡ
【０１３２】
好ましい変異検出技術は、ＡＲＭＳTM−対立遺伝子特異的増幅、ＴａｑｍａｎｎTM、ミニ配列決定、配列決定、ＲＦＬＰ、ＡＬＥＸTM、ＯＬＡ、制限部位を基礎としたＰＣＲ、および、ＦＲＥＴ技術を含む。
特に好ましい技術は、ＡＲＭＳTM−対立遺伝子特異的増幅、ＯＬＡ、および、ＲＦＬＰを基礎とする方法を含む。ＡＲＭＳTM−対立遺伝子特異的増幅は特に好ましい方法である。
【０１３３】
ＡＲＭＳTM−対立遺伝子特異的増幅（EP-B-332435、US patent No. 5,595, 890、および、Newton et al. (Nucleic Acids Research, Vol. 17, p. 2503; 1989) に記載された）は、プライマーの３’末端ヌクレオチドとそのテンプレートとの相補性に依存している。このプライマーの３’末端ヌクレオチドは、検出すべき特異的な変異、対立遺伝子または多型に対して、相補的または非相補的のいずれかである。その３’末端ヌクレオチドが塩基の変異、対立遺伝子または多型に相補的であるプライマーからのプライマー伸長に関する選択的な利点が存在する。３’末端にテンプレート配列とのミスマッチを有するこれらのプライマーは、酵素的プライマー伸長を大きく阻害するかまたは妨害する。ポリメラーゼ連鎖反応または一方向性プライマー伸長反応は、それゆえに、プライマーの３’末端ヌクレオチドがテンプレートのヌクレオチドに相補的な場合は生成物の増幅をもたらし、一方、３’末端ヌクレオチドがテンプレートのヌクレオチドに相補的でない場合は、生成物の増幅は、全くないかまたは少なくとも効率的である。
【０１３４】
当然のことながら、この試験検体は、試験検体中の配列に対応する核酸配列に等しくてよく、すなわち、この検体核酸中の領域の全てまたは部分は、解析の前に、ＰＣＲのような、あらゆる便利な技術を使用して、最初に増幅させていい。核酸はゲノムＤＮＡまたは分画したもしくは全細胞ＲＮＡであっていい。一つの実施態様では、ＲＮＡは全細胞ＲＮＡであり、直接に、ランダムプライマーまたはポリＡプライマーを用いて、第一鎖ｃＤＮＡを標識するためのテンプレートとして用いられる。試験検体中の核酸またはタンパク質は、標準的な方法論に従って、検体から抽出できる（Sambrook et al.“Molecular Cloning-A Laboratory manual”, 第二版、 Cold Spring Harbor, NY (1989)）。
【０１３５】
dlg5について開示された遺伝子配列（配列番号１で示された）は代表的な配列であることは明らかだろう。正常人において、それぞれの遺伝子の二つのコピー（母方および父方の複製）は、いくつかの配列の違いがある可能性があり、さらには集団内には、莫大な数の遺伝子配列の対立遺伝子変異体が存在しており、実際、実施例では多くのＳＮＰおよび他の変異がdlg5遺伝子中に同定されて、これは集団中の対立遺伝子変異を表している。当然のことながら、診断法および本発明の他の局面は、いかなるそうした配列変異体の検出等にも拡張できる。
【０１３６】
好ましい配列変異体は、配列番号１または２で示されたＤＬＧ５と、少なくとも９０％、および、好ましくは少なくとも９５％の配列の同等性を有するものである。
【０１３７】
核酸配列同等性はまた、それにより、密接に関連した配列のみが（例えば、＞９０％の同等性を有する）ハイブリダイゼーション複合体を形成できるような、ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の下で、ハイブリダイゼーション試験によって計測することができる。
【０１３８】
さらなる局面で、本発明の診断方法は、個人のＩＢＤに対する素因および／または感受性を評価するために使用され、そして本発明は特にＩＢＤ状態を発症する危険性のある個人を認識するために使用できる可能性がある。
【０１３９】
さらなる局面で、本発明の診断方法は、本明細書で同定された１個またはそれ以上の対立遺伝子変異体を選択的に標的とする新規な医薬治療を開発する場合に使用できる。特定の対立遺伝子変異体と疾患の発症または医薬治療への応答との関連性を同定することは、新薬設計に著しいインパクトを与えることができる。医薬は疾患に関係している変異体の生物学的活性を調節し、その一方他の変異体への作用を最小限にするように設計できる。
【０１４０】
本発明のさらなる診断的局面では、制限酵素により認識される部位（場合によっては遺伝子工学処理された）の消失または取得を参照して、変異体ヌクレオチドの存在または不在が検出される。当業者は、１個又はそれ以上の部位の消失また取得による制限酵素断片長多型を検出することを基礎にして、診断方法を設計しそして実施できるだろう。
【０１４１】
本発明はさらに、本発明の多型の検出のための検定法を設計できるような、ヌクレオチド配列情報を提供する。
本発明はさらに、本発明の多型を検出する、ヌクレオチドプライマーを提供する。
本発明はさらに、本発明の多型を検出する、ヌクレオチドプローブを提供する。
【０１４２】
診断のためのアミノ酸配列決定方法は、好ましくは、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）のような免疫学的方法により測定できるものである。
【０１４３】
ＤＬＧ５のレベルは、試験検体中に存在する、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはポリペプチド配列の相対的な量から測定することができる。ＲＮＡを用いる場合は、このＲＮＡを相補的ｃＤＮＡに変換することが望ましく、そして、この工程の間、適切な検出可能な標識をこのｃＤＮＡの中に組み込むことが望ましい。
【０１４４】
好ましい実施態様では、本発明の方法はｍＲＮＡ転写レベルの検出に依存している。これは検体中のdlg5の相対的なｍＲＮＡ転写レベルを評価し、そして、対照データと検体データとの比較を含んでいる。この遺伝子転写物は個別に検出でき、または、好ましくは転写プロフィルが作成できる他の疾患関連遺伝子dlg5のパネルの中から検出される。試験検体中のdlg5のｍＲＮＡレベルは当該技術で公知のいかなる技術でも検出できる。これらには、ノーザンブロット分析、逆転写酵素ＰＣＲ増幅法（ＲＴ−ＰＣＲ）、マイクロアレイおよびリボヌクレアーゼプロテクション法が含まれる。
【０１４５】
一つの実施態様において、検体中のdlg5のＲＮＡのレベルは、ノーザンブロット検出法で測定できる。ここでは、組織ＲＮＡを電気泳動で分画し、固体膜支持体（例えば、ニトロセルロースまたはナイロン）に固定し、そして、検出すべきdlg5のＲＮＡと選択的にハイブリダイズできる1つまたはそれ以上のプローブとハイブリダイズさせる。実際のレベルは、１個またはそれ以上の対照のハウスキーピング遺伝子を参照して定量化する。プローブは単独でも、組み合わせても使用できる。これにより、プローブにより検出されたｍＲＮＡのサイズに関する情報も提供される。ハウスキーピング遺伝子は共通の代謝、または、細胞の維持に関与する遺伝子であり、細胞型、生理状態または細胞周期の段階を問わず一定なレベルで発現していると考えられている。適当なハウスキーピング遺伝子の例としては、ベータアクチン、ＧＡＰＤＨ、ヒストンＨ３.３、またはリボゾームタンパク質Ｌ１３が挙げられる（Koehler et al., Quantitation of mRNA by Polymerase Chain Reaction. Springer-Verlag, Germany (1995)）。
【０１４６】
相対的な発現レベルを測定するために、対照検体を試験検体と並べて流すことができ、または、試験結果／値を正常もしくは対照組織で期待されるdlg5の発現レベルと比較できる。そうした対照値は、dlg5の平均または正常範囲の値を作成するための、正常または対照組織を用いた予備実験から作成することができる。
【０１４７】
他の実施態様において、組織検体中のdlg5核酸を増幅し、そして定量的に測定できる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法は、変性、オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１で開示された配列に従って設計された）のアニーリング、および、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸長を含む、連続する反復工程を通して、特定の核酸配列を増幅するために用いることができる（例えば、Mullis, et al., U. S. patent No. 4,683, 202; Loh et al., Science 243: 217 (1988) を参照せよ）。逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）においては、この手順は、逆転写酵素の工程を先に行うことで、ｍＲＮＡの多数の複写物の大量の増幅を可能にする（Koehler et al., 上記）。
【０１４８】
他の公知の核酸増幅方法には、核酸配列を基礎とする使用（ＮＡＳＢＡ）および３ＳＲのような転写を基礎とする増幅システム（ＴＡＳ）（Kwoh et al., Proc Natl. Acad Sci USA 86: 1173 (1989), Gingeras et al., PCT application WO88/10315）、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ、European Application No. 320308を参照せよ）、鎖置換増幅（ＳＤ
Ａ）、「レース(race)」、片側ＰＣＲ等（Frohman, PCR Protocols: a Guide to Methods and Applications. Academic Press, NY (1990); Ohara et al., Proc Natl Acad Sci. USA 86: 5673-5677 (1989) ）が挙げられる。ＲＴ−ＰＣＲ生成物の定量化は、反応生成物が指数関数的に累積している間になされ、そして、診断上有用な臨床データを生み出す。一つの実施態様で、解析は、同様にＲＴ−ＰＣＲにより増幅された1個またはそれ以上のハウスキーピング遺伝子を参照して行われる。ＲＴ−ＰＣＲ生成物の定量化は、例えば、ゲル電気泳動の目視検査もしくはイメージ解析により、ＨＰＬＣ（Koehler et al., 上記）、または、挿入標識、Ｔａｑｍａｎプローブ（Higuchi et al. , Biotechnology 10: 413-417 (1992)）、モレキュラー・ビーコン（Molecular Beacon）（Piatek et al., Nature Biotechnol. 4: 359-363 (1998)）、プライマーもしくはスコルピオンプライマー（Whitecombe et al., Nature Biotechnol 17: 804-807 (1999)）のような蛍光検出法により、または他の蛍光検出方法により、対照ハウスキーピング遺伝子または上記で論じた遺伝子と比較して行うことができる。
【０１４９】
dlg5ＲＮＡ測定はまた、関節液、血液または血漿検体を用いて実施できる。好ましくは、このＲＮＡは末梢血液検体から得られる。血漿中の可溶性ＲＮＡの場合に、予期される低含量のｍＲＮＡにはＲＴ−ＰＣＲのような感受性の高い試験が必要となるだろう（Kopreski et al. , Clin Cancer Res 5: 1961-5 (1999) ）。全血の勾配を、有核細胞を分離するために行うことができ、そして総ＲＮＡは、例えば、ロナゾール（Rnazole）Ｂ法（Tel-Test Inc., Friendsworth, Tex.）または、Sambrook et al.,（上記）に記載されたような公知の方法を修飾して抽出される。
【０１５０】
本発明の好ましい実施態様において、本発明の診断／検出方法はマイクロアレイ解析を用いてdlg5転写レベルを評価することを含んでいる。マイクロアレイ技術は、同時に数千の遺伝子の発現を、単一の実験で研究することを可能にしている。ヒト組織（例えば、バイオプシー組織）の遺伝子発現の分析は、疾患の診断および予知、そして、疾患の危険性を評価することを支援できる。所定の病理学的疾患症状を有する患者からの種々の遺伝子の発現レベルを、正常の患者と比較することで、疾患に特徴的な、発現プロファイルが作成できる。
【０１５１】
プローブは、試験検体中の標的dlg5遺伝子の配列に選択的にハイブリダイズするように作成される。これらのプローブは、おそらく他のプローブおよび対照プローブと共に、適切な支持媒体（例えば、ナイロンフィルターまたは顕微鏡用スライド）上で個別の場所に結合し、転写物プロファイリングアレイを形成する。診断方法は臨床検体中のdlg5の相対的なｍＲＮＡ転写レベルを評価することを含む。これは、当業界で周知の方法のいずれかにより、場合によっては総ＲＮＡから精製できる、組織ｍＲＮＡの放射性標識または非放射性標識により行われる（Sambrook et al., 前出）。
このプローブは標的dlg5のｍＲＮＡのあらゆる部分または全長に対して向けられる。
【０１５２】
本発明の他の実施態様では、総dlg5ＲＮＡまたはＤＮＡを定量化し、そして、対照組織のレベルまたは予備試験済み標準からの期待値と比較する。ＤＮＡおよび／またはＲＮＡは、当業界で周知の方法を用いて定量化できる。メッセンジャーＲＮＡはしばしば検体中の内部対照ｍＲＮＡレベルを参照して、しばしばハウスキーピング遺伝子との比較により、定量化される（Koehler et al., 前出）。
【０１５３】
好ましい実施態様では、生成したハイブリダイゼーションシグナルは、固体支持体（例えば、ナイロン膜）上のプローブのマイクロアレイとハイブリダイズした放射性標識組織ＲＮＡに露光させたホスホイメージスクリーン上の画像のコンピューターソフトウエア解析により測定される。他では、この量は、放射線感受性フィルム（例えば、Ｘ−線フィルム）のデンシトメトリー計測によって、または、目視的方法により測定される。他の実施態様では、この量は、異なった蛍光プローブによって別々に標識されたバイオプシーおよび正常ＲＮＡの混合体とすることができ、dlg5のｍＲＮＡの量が正常レベルに対する比率で表すことを可能にする、蛍光標識プローブを用いて測定される。このタイプの実験における固体支持体は、一般に、顕微鏡用スライドガラスであり、そして、検出は蛍光顕微鏡検査法およびコンピューターイメージングにより行われる。
【０１５４】
特異的な相互作用の検出は、この標識された標的配列がアレイに接着している位置を検出することによって行うことができる。放射性標識プローブは、慣用のオートラジオグラフィー技術を用いて検出することができる。デジタル化スキャナーによるオートラジオグラフィーのスキャニングおよび適切な結果の解析用ソフトウエアの使用が好ましい。この標識が蛍光標識である場合、例えば、国際公開公報WO 90/15070；米国特許 5,143, 854 または米国特許 5,744, 305に記載された機器が有利に使用できる。実際に、ほとんどのアレイフォーマットは、標識した捕獲：標的二量体形成を検出するための蛍光測定値を用いている。レーザー共焦点蛍光顕微鏡は、その他の、ルーチンに使用される技術である（Kozal et al., Nature Medicine 2: 753-759 (1996) ）。質量分析法もまた、ＤＮＡアレイに結合したオリゴヌクレオチドを検出するために使用することができる（Little et al, Analytical Chemistry 69: 4540- 4546, (1997) ）。どのようなレポーター系を用いたとしても、精巧な器具およびソフトウエアが、多数の測定値を意味のあるデータに翻訳するために必要になるであろう（例えば、米国特許 5,800, 992 または国際公開公報 WO 90/04652に記載されているように）。
【０１５５】
マイクロアレイ試験の好ましい実施態様では、dlg5のＲＮＡ測定は、一定であることまたは相対的に一定であることが知られている内部標準（すなわち、ハウスキーピング遺伝子）に対する相対値として生じる。ヒストンＨ３.３およびリボゾームタンパク質Ｌ１９ハウスキーピング遺伝子は、細胞周期とも関連せず、全ての組織で構成的に発現していることが判明している（Koehler et al, 前出）。データの標準化のために、種々の異なったハウスキーピング遺伝子が、平均的なハウスキーピング測定値を生じさせるために用いることができる。
【０１５６】
ＩＢＤまたはそれに対する感受性を検出するためのマイクロアレイまたはＲＴ−ＰＣＲ試験は、ｍＲＮＡを含有する組織検体が利用できる場合に使用できる。
【０１５７】
ＲＮＡ抽出のための検体は、ＲＮＡ分解を避けるように適切に処理されなければならない（Sambrook et al., 前出）。このためには、例えば、フェノールを基にした試薬を用いた迅速抽出、または、例えば、液体窒素中での瞬間凍結のいずれかを必要とする。検体は、後日ＲＮＡを抽出するまで、−７０℃以下に保存することができる。組織または細胞を室温で数日間および４℃で数ヶ月に至るまで保存するために便利な特許の試薬が利用できる（例えば、RNAlater, Ambion Inc., TX）。抽出に先立って、破砕、混成または均質化のような方法が、組織を適切な抽出用緩衝液中で分散させるために用いられる。
【０１５８】
典型的なプロトコールは、次に、溶媒抽出および選択的沈殿技術を使用する。
【０１５９】
他の実施態様では、dlg5核酸に選択的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドプローブを、dlg5遺伝子発現レベルを検出するために用いることができる。
【０１６０】
本発明の様々な局面で使用するための便利なＤＮＡ配列は、分子生物学の慣用の技術、例えば、本明細書で記載された核酸配列を用いて設計された、１０個またはそれ以上の連続するヌクレオチドを含有する１個またはそれ以上の標識オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ヒトゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーを探査することで、得ることができる。
【０１６１】
あるいは、本明細書で記載された核酸配列を用いて設計された、ＤＮＡの特定の領域に隣接する、センス鎖に相同なオリゴヌクレオチドおよびアンチセンス鎖に相同なオリゴヌクレオチドの一対を、ｃＤＮＡライブラリーからＤＮＡを増幅するために使用できる。
【０１６２】
dlg5遺伝子発現のレベルはまた、ポリペプチド（ＤＬＧ５タンパク質）のレベルをスクリーニングすることによっても検出できる。例えば、ＤＬＧ５タンパク質と免疫的に反応性のモノクローナル抗体は、試験検体をスクリーニングするために使用することができる。そうした免疫学的検定法は、当該技術で知られたいかなる便利なフォーマットででも実施することができる。これらには、ウエスタンブロット、免疫組織化学的検定法、およびＥＬＩＳＡ測定法が含まれる。タンパク質結合測定法のような、機能的検定法もまた使用することができる。
【０１６３】
本発明に他の局面により、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、および、９３の１つまたはそれ以上の位置１６における多型を検出できる、対立遺伝子に特異的なプライマーまたはプローブが提供される。当業者は、本明細書で提供された配列情報を用いて適切なプライマーまたはプローブを設計することができる。
【０１６４】
特定の配列位置における１つの対立遺伝子を選択的な増幅を介して、対立遺伝子間の識別を提供する、対立遺伝子特異的なプライマーは、通常、定常プライマーと一緒に、ＰＣＲ反応のような増幅反応において使用される（例えば、ＡＲＭＳ検定法で使用される）。この対立遺伝子特異的なプライマーは、好ましくは１７〜５０ヌクレオチド、より好ましくは約１７〜３５ヌクレオチド、さらに好ましくは約１７〜３０ヌクレオチドである。
【０１６５】
対立遺伝子特異的なプライマーは、好ましくは、検出すべき対立遺伝子に正確に一致するが、しかし、検出すべき対立遺伝子に対応する３’末端に約６〜８個のヌクレオチド、および、１０個まで、例えば、８、６、４、２または１個の残りのヌクレオチドが、プライマーの性質に顕著な影響することなく変えられるようなその誘導体もまた意図されている。
【０１６６】
増幅のために好ましいプライマーは、１５〜６０塩基、より好ましくは１７〜３５塩基長である。プローブ配列は、２５ヌクレオチド長以上のいずれかである。もし標的配列が２ｋｂの大きさの遺伝子である場合は、プローブ配列は、完全な遺伝子配列を補完し、したがってこれもまた２ｋｂの大きさである。
【０１６７】
好ましくは、プローブ配列は、ゲノム、または、より好ましくは、ｃＤＮＡ、標的遺伝子の断片であって、５０〜２０００塩基、好ましくは２００〜７５０塩基であっていい。当然のことながら、dlg5核酸の異なった標的配列に選択的にハイブリダイズすることができ、dlg5遺伝子配列の完全長に渡っていてもいい、複数のプローブ遺伝子を調製し、そして診断試験において一緒に使用することができる。プライマーまたはプローブは完全に標的配列と相同であっても、または、正確なテンプレート配列への結合における特異性を支持する１個またはそれ以上のミスマッチを含んでもいい。関心のある標的配列に選択的にハイブリダイズできる、いかなる配列も、適切なプライマーまたはプローブ配列として使用できる。当然ながら、プローブまたはプライマー配列は、標的テンプレート核酸にハイブリダイズしなければならない。もし標的核酸が二重鎖（ゲノムまたはｃＤＮＡ）の場合は、プローブまたはプライマー配列はセンスまたはアンチセンス鎖にハイブリダイズできる。しかしながら、もし標的がｍＲＮＡ（単鎖センス鎖）の場合は、プライマー／プローブ配列はアンチセンス補完体（complement）でなければならない。
【０１６８】
核酸がナイロン膜に固定化され、プローブ核酸が５００塩基または塩基対より大きい場合は、適切なハイブリダイゼーション溶液の例は：  ６×ＳＳＣ（クエン酸ナトリウム生理食塩水）、０.５％ＳＤＳ（硫酸ドデシルナトリウム）、１００μｇ／ｍＬの変性超音波処理サケ精子ＤＮＡ、である。ハイブリダイゼーションは６８℃で少なくとも１時間行われ、次いで、フィルターを６８℃で１×ＳＳＣ、または、より高いストリンジェンシーの場合は、０.１×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳ中で洗浄する。
【０１６９】
核酸がナイロン膜に固定化され、プローブが１２〜５０塩基のオリゴヌクレオチドの場合は、適切なハイブリダイゼーション溶液の例は：  ３Ｍ塩化トリメチルアンモニウム（ＴＭＡＣＩ）、０.０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６.８）、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７.６）、０.５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬの変性超音波処理サケ精子ＤＮＡ、および０.１の乾燥スキムミルク、である。至適のハイブリダイゼーション温度（Ｔｍ）は、通常、ハイブリッド鎖のＴｉより５℃低くなるように選ばれる。Ｔｉは、プローブとその標的との間で形成されるハイブリッドの不可逆的な融解温度である。もしプローブと標的の間になんらかのミスマッチがあった場合は、このＴｍはより低くなるだろう。一般的な指針として、推奨されるハイブリダイゼーション温度は、３ＭのＴＭＡＣＩ中で、１７マーに関しては４８〜５０℃、１９マーに関しては５５〜５７℃、および、２０マーに関しては５８〜６６℃である。
【０１７０】
本発明の他の局面により、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、および、９３のいずれかの位置１６での多型に対応するヒト核酸の多型を検出できる対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブが提供される。
【０１７１】
対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは１７〜５０ヌクレオチド、より好ましくは約１７〜３５ヌクレオチド、より好ましくは約１７〜３０ヌクレオチドである。
そうしたプローブの設計は、通常のスキルを有する分子生物学者には明らかである。
【０１７２】
そうしたプローブは、例えば、５０塩基まで、４０塩基までの都合の良い長さであり、より都合が良いのは、３０塩基長まで、例えば、８〜２５または８〜１５塩基長までのものである。一般に、そうしたプローブは、対応する遺伝子の野生型または変異体の遺伝子座に完全に相補的な塩基配列を含んでいる。しかしながら、必要ならば、オリゴヌクレオチドプローブの識別能力が不適切に影響を受けないという条件下で、１個またはそれ以上のミスマッチを導入することができる。本発明のプローブは、検出を容易にするための、１個又はそれ以上の標識を担持することができる。配列番号６〜９３で開示した配列は、単鎖の形態の場合、dlg5の１個又はそれ以上の多型変異体を検出できる、対立遺伝子特異的プローブの代表的な例である。それらの配列のそれぞれは、天然型dlg5遺伝子および１個又はそれ以上の特定の対立遺伝子変異体に完全に相補的である。
【０１７３】
本発明のいずれかの方法で使用されるプライマーまたはプローブは、いかなる便利な合成方法を用いても製造できる。そうした方法の例は、標準的な教科書でみつけることができ、その例には、“Protocols for Oligonucleotides and Analogues; Synthesis and Properties,” Methods in Molecular Biology Series; Volume 20; Ed. Sudhir Agrawal, Humana ISBN: 0-89603-247-7 (1993)；第１版、が挙げられる。必要ならば、プライマーは検出を容易にするため標識化することができる。
【０１７４】
本発明のプライマーまたはプローブと組み合わせて使用することができる、放射性同位元素、蛍光標識、化学発光性化合物、標識化タンパク質、磁気標識、分光学マーカーおよび結合した酵素のような、多くの便利な検出可能な標識がある。当該分野でよく知られた一つの特別の例は、32Ｐによる末端標識である。
【０１７５】
蛍光標識が、放射性標識に比べてより害が少なく、低いバックグラウンドに対して強いシグナルを与え、そして、同一の分析において比較分析を可能にする、異なった波長の吸収および／または異なった色シグナルを与えることが可能な種々の異なった蛍光プローブが存在するために好ましい。
【０１７６】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、特に、dlg5のＳＮＰの遺伝型を検出するのに適している。
【０１７７】
本発明のＤＬＧ５タンパク質およびその相同体または断片は、それに選択的に結合し、そして、タンパク質の活性を調節するような物質の作成に用いることができる。そうした物質は、例えば、抗体を含み、そして、本発明は特に配列番号２で示されたタンパク質に結合することができる抗体にまで拡がる。
特に、抗体は中和抗体であっていい。
【０１７８】
本明細書で用いているように、「抗体」という表現は、抗体全体もしくはその断片、例えば、Ｆ（ａｂ）2、Ｆａｂ、ＦＶ、ＶＨまたはＶＫ断片、単鎖抗体、多量体の単一特異的抗体もしくはその断片、または二−もしくは多−特異的抗体もしくはその断片、を意味するものと理解される。それらの型の抗体誘導体およびその頭字語は、当業者に良く知られている。
【０１７９】
他の好ましい実施態様では、ＤＬＧ５タンパク質に向けられた抗体は、ＩＢＤを検出し、予知し、診断し、そして、その段階を知るために用いることができる。当該分野で知られた、免疫化学的染色方法を含む、種々の組織学的染色方法もまた、用いることができる。銀染色は、ＤＬＧ５タンパク質を検出する方法の一つに過ぎない。本発明で有用な他の染色方法については、例えば、A Textbook of Histology, Eds. Bloom and Fawcett, W. B. Saunders Co., Philadelphia (1964)を参照されたい。
【０１８０】
本発明のさらなる局面によれば、ＩＢＤを診断または予知またはモニターするための検定法における、ＤＬＧ５タンパク質に選択的な抗体の使用を提供する。
本発明のこの局面で使用するための抗体は、ＤＬＧ５タンパク質／ポリペプチドを用いて製造できる。
【０１８１】
標識抗体を製造および検出する方法は周知である（Campbell; Monoclonal Antibody Technology, in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume13. Eds: Burdon R et al. Elsevier, Amsterdam (1984) ）。抗体という用語には、実質的に均一な集団であるモノクローナル抗体、および、不均質な集団であるポリクローナル抗体の両方が含まれる。この用語はまた、とりわけ、ヒト化およびキメラ抗体を含んでいる。特異的抗原に対するモノクローナル抗体は、当業者に知られた方法、例えば、ハイブリドーマ細胞、ファージディスプレイライブラリーまたはその他の方法により、得ることができる。モノクローナル抗体は、とりわけ、ヒト、ラットまたはマウス由来であっていい。ヒトモノクローナル抗体の製造のために、ハイブリドーマ細胞は免疫した動物、例えば、マウス由来の脾細胞と、腫瘍細胞とを融合させて製造することができる。
【０１８２】
その後に、適切に分泌するハイブリドーマ細胞を選ぶことができる（Koehler & Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); Cole et al.,“Monoclonal antibodies and Cancer Therapy”, Alan R Liss Inc, New York N. Y. pp 77-96 (1985) ）。そうした抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそれらの全てのサブクラスを含む免疫グロブリンであっていい。
【０１８３】
ポリクローナル抗体は、ＤＬＧ５ポリペプチドのような抗原で、動物（例えば、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ヒツジ等）を免疫することによって製造できる。
【０１８４】
ＤＬＧ５ポリペプチドは、当業者に知られた種々の技術で製造することができる。ＲＮＡ転写物は、本発明のポリペプチドを、知られた方法に従って、インビトロ翻訳技術により製造するために使用することができる（Sambrook et al. 前出）。
【０１８５】
或いは、ＤＬＧ５ポリペプチドは化学的に合成できる。例えば、Merryfieldの方法による（J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-2154, (1968) ）。数多くの自動式ポリペプチド合成機、例えばApplied Biosystems 431Aペプチド合成機もまた現在存在している。或いは、
そして好ましくは、ＤＬＧ５ポリペプチドは、組換え発現技術を用いて、ポリペプチドをコードしている核酸配列から製造することができる。各種の発現ベクター／宿主系を、dlg5コーディング配列を発現させるために使用することができる。これには、それには限定されないが、プラスミド、コスミドもしくはバクテリオファージにより発現させた細菌；発現ベクターで形質転換した酵母；バキュロウイルス発現系でトランスフェクトした昆虫細胞系；カリフラワーモザイクウイルスのような植物ウイルス発現系でトランスフェクトした植物細胞系；または、哺乳動物細胞系（例えば、アデノウイルスベクターでトランスフェクトした細胞）が含まれ、最も適切な系の選択はそれぞれ好みの問題である。好ましくは、ＤＬＧ５タンパク質は、真核細胞、特に哺乳動物、昆虫および酵母細胞で発現される。哺乳動物細胞は、ＤＬＧ５タンパク質に、フォールディングおよび／またはリン酸化のような、翻訳後修飾を与える。
【０１８６】
発現ベクターは、通常、複製起点、プロモーター、翻訳開始部位、場合によってはシグナルペプチド、ポリＡ付加部位、および転写終結部位を含んでいる。これらのベクターはまた、選択のための、１個又はそれ以上の抗生物質耐性マーカー遺伝子を含んでいる。上記のごとく、適切な発現ベクターは、プラスミド、コスミッドまたはファージもしくはレトロウイルスのようなウイルスであっていい。ポリペプチドのコーデング配列は、適切なプロモーター、制御要素および転写ターミネーターの制御下に置かれ、その結果、ポリペプチドをコードしている核酸配列が、発現ベクター構築体により形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞中でＲＮＡに転写されるようにする。コーデング配列は、ポリペプチドを細胞の外に分泌するためのシグナルペプチドまたはリーダー配列を含んでも含まなくてもいい。ＤＬＧ５ポリペプチドの発現および精製は、当該分野で周知の方法で容易に達成できる（例えば、前出の、Sambrook et al. に記載されたように）。
【０１８７】
そのようにして製造されたＤＬＧ５ポリペプチドは、次に、動物に接種し、そこから、導入したＤＬＧ５タンパク質／ポリペプチドに対する特異的抗体を含んでいる、血清検体を、後に得ることができる。
【０１８８】
げっ歯類の抗体は、当該分野で知られた技術により、組換えＤＮＡ技術を用いてヒト化することができる。或いは、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片もまた、本発明のポリペプチドに対して、当該分野で知られた技術により、開発することができる（Huse et al.,
Science 256: 1275-1281(1989)）。そのようにして製造された抗体は、数多くの用途を有し、それらは分子生物学、または免疫学の当業者には明らかだろう。そのような用途はそれには限定されないが、酵素発現をモニターすること、酵素活性を測定する測定法を開発すること、および、治療剤としての用途を含んでいる。酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は当該分野で良く知られており、特に、試験検体中のＤＬＧ５タンパク質またはそのポリペプチド断片を検出するために適している。
【０１８９】
このＤＬＧ５特異的抗体は、体液中のＤＬＧ５タンパク質の検出のためのＥＬＩＳＡ検定法において、または、免疫組織化学的、または他の方法で使用することができる。さらに、抗体は、個別で、または、抗体のパネルの一部として、共通のタンパク質に反応する、対照抗体と一緒に、ディップスティック（dipstick）または類似の診断器具において、使用することができる。
【０１９０】
試験検体中のＤＬＧ５を検出するために必要な全ての必須の物質および試薬は、キットで一緒に組み合わせることができる。そうしたキットは、１個又はそれ以上の診断用ｃＤＮＡプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーと、対照プローブ／プライマーと一緒に含んでもいい。このキットは、フィルター膜またはシリコンベースの基質のような、マイクロアレイ基質上に固定化したプローブを含んでもいい。このキットはまた、例えば、正常、ＢＰＨ、限定された腫瘍および転移性腫瘍のような、例えば、対照として使用できる種々の生理的状態にある組織由来の総ＲＮＡ検体を含んでいてもいい。このキットはまた、本発明の方法で使用するための適当な包装および指示書を含むこともできる。
【０１９１】
本発明の他の局面により、ＩＢＤを診断、予知またはモニターするために、ＤＬＧ５に選択的にハイブリダイズまたは結合することのできる、１個又はそれ以上の診断用プローブおよび／または診断用プライマーおよび／または抗体を含んでいる、診断用キットが提供される。
【０１９２】
当然のことながら、用語「診断用キット」とは、診断用にしか使えないキットには限定されず、予知、段階のモニタリングおよび治療の有効性試験のような、他の使用も包含している。
好ましい実施態様では、診断用（検出用）プローブはマイクロアレイ上で提供される。
【０１９３】
そうしたキットは、さらに、適切な緩衝液および／または、熱安定ポリメラーゼ（例えば、ｔａｑポリメラーゼ）のようなポリメラーゼを含むことができる。これらには、コンパニオン／定常プライマーおよび／または対照プライマーもしくはプローブを含んでいてもいい。そうしたコンパニオン／定常プライマーは、ＰＣＲを行うために用いる一対のプライマーの一部分である。そうしたプライマーは通常テンプレート鎖に正確に相補的である。このキットはまた、一つの蛍光プローブ（例えば、Ｃｙ５）で標識した正常対照ＲＮＡを含んでもいい。使用にあたって、バイオプシーまたは体液または細胞由来の患者ＲＮＡを他の蛍光プローブ（例えば、Ｃｙ３）で標識することができ、このＲＮＡは次に混合されアレイにハイブリダイズできる。蛍光比、すなわちＣｙ３：Ｃｙ５を検出するための計測装置が利用可能で、そして、ＤＬＧ５過剰発現を検出するために使用できる。
【０１９４】
他の実施態様では、このキットはインサイチュ（in situ）で組織切片中のｍＲＮＡにハイブリダイズされるために適切な１個又はそれ以上の特異的プローブを含んでいる。このキットはまた、ハイブリダイゼーション用緩衝液および比色分析のまたは蛍光顕微鏡検出のための試薬を含むこともできる。
【０１９５】
他の実施態様では、キットは、場合によっては標識されている、一組の特異的オリゴヌクレオチドプライマーを、dlg5のｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる定量化のために、含んでいる。これらのプライマーは、正確な特異的ＰＣＲ産物の定量化を可能にする、スコルピオンプライマーであっていい（Whitcombe et al., Nature Biotechnol. 17: 804-807, 1999）。或いは、Ｔａｑｍａｎｎまたはモレキュラー・ビーコン（Molecular Beacon）プローブをこのためのキットで提供してもいい。キットの一つの形態は、抽出したＲＮＡのアリコートをピペットで注入できる、種々のウエルに特異的な試薬を含んでいるマイクロタイタープレートである。マイクロタイタープレートは、適切な機器で熱サイクルにかけられ、また、プレートのウエルからの蛍光発光の読取が可能である（例えば、Perkin Elmer 7700）。
【０１９６】
他の実施態様では、キットは、免疫組織化学分析に用いるためのＤＬＧ５タンパク質に対する１個又はそれ以上の特異的抗体を含む。
他の実施態様では、キットは、本明細書で同定されたＤＬＧ５タンパク質に対する１個又はそれ以上の特異的抗体を含んでいるＥＬＩＳＡキットである。
【０１９７】
本発明の他の局面において、ＤＬＧ５に特異的な抗体の有効量を患者に投与することを含む、ＩＢＤに罹患している患者の治療方法を提供する。
本発明の他の局面に従って、dlg5遺伝子を遺伝子治療に、例えば、インビボでのタンパク質の産生を調節することが望まれる場合に使用でき、そして、本発明はそうした使用にも拡張する。
【０１９８】
本発明の遺伝子の知識はまた、例えば、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを用いて、インビボでの発現を調節する能力を提供する。特定の遺伝子（例えば、本願で同定されたdlg5）の発現レベルを阻害しまたは低下させる治療方法の一つは、アンチセンス治療の使用である。アンチセンス治療は、特定のｍＲＮＡ配列を反映し、および、タンパク質産生を阻止するように設計された、ＤＮＡまたはＲＮＡ（「オリゴヌクレオチド」）であるアンチセンス核酸分子を利用する。いったん形成されれば、ｍＲＮＡは、効率的にＲＮＡ配列を読取りそして遺伝子に指示された特異的なタンパク質分子を産生する、細胞のタンパク質産生「工場」である、リボソームに結合する。アンチセンス分子が細胞に送達された場合（例えば、未処理のオリゴヌクレオチドとして、または、適切なアンチセンス発現ベクターを介して）、その配列が標的塩基配列に相補的に設計されているために、ｍＲＮＡに結合する。いったん二つの鎖が結合すると、ｍＲＮＡはもはやリボゾームによるコード化されたタンパク質の産生を指示することはできず、そして、細胞の酵素によって速やかに分解され、それにより、追及するアンチセンスオリゴヌクレオチドを遊離させ、そして、ｍＲＮＡの他の同一のメッセンジャー鎖を不能化する。
【０１９９】
したがって、本発明の他の局面に従って、dlg5遺伝子のｍＲＮＡに結合でき、dlg5遺伝子のタンパク質生成物の発現を阻害する有効量のアンチセンス分子をＩＢＤに罹患している患者に投与することを含む、該患者の治療法を提供する。
【０２００】
タンパク質産生の完全な阻害は必須ではなく、実際は、有害である可能性がある。正常組織の状態に類似の状態へ導く阻害が望まれるだろう。
【０２０１】
アンチセンス治療のこの局面は、特に、ＩＢＤ疾患が問題になっているdlg5遺伝子の過剰発現の直接の原因である場合に適用可能であるが、該dlg5遺伝子が間接的にＩＢＤ疾患の原因となる場合でも、同じように適用可能である。Dlg5遺伝子およびｍＲＮＡの知識を用いて、当業者は適切なアンチセンス核酸治療用分子を設計し、それらを必要に応じて投与することが可能である。
【０２０２】
治療活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、よく確立された技術を用いて実験的に決定することができる。本発明のdlg5遺伝子の発現を哺乳動物細胞内で下降制御する方法を可能にするために、例となるアンチセンス発現構築物を、例えば、ｐＲＥＰ１０ベクター（Invitrogen Corporation）を用いて、容易に構築できる。転写物は、この型の構築体でトランスフェクトした細胞内で遺伝子の翻訳を阻害することが期待される。アンチセンス転写物は、天然の遺伝子転写物の翻訳を阻害するために効果的であり、そして、本明細書で記載された効果（例えば、組織生理機能の制御）を誘導することができる。dlg5遺伝子のｍＲＮＡのいかなる部分に対しても相補的でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドは、治療での使用が期待される。1997年6月17日に発行された米国特許US5,639,595、“Identification of Novel Drugs and Reagents”には、インビボでの活性を現すオリゴヌクレオチド配列を同定するための方法が完全に記載され、参照により本明細書に組み入れられる。dlg5遺伝子配列から誘導されたランダムなオリゴヌクレオチド配列を含む発現ベクターで細胞を形質転換する。この細胞は次に、オリゴヌクレオチドの望ましい活性からもたらされる表現型を検定する。いったん望みの表現型を有する細胞が同定できれば、望ましい活性を有するオリゴヌクレオチド配列が同定できる。同定は、ベクターを回収することによって、または、挿入した核酸物質を含有する領域のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅および配列決定により行うことができる。アンチセンス分子はアンチセンス治療のために合成することができる。これらのアンチセンス分子は、ＤＮＡ、ＤＮＡの安定化誘導体（例えば、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネート）、ＲＮＡ、ＲＮＡの安定化誘導体（例えば、２’−Ｏ−アルキル化ＲＮＡ）、または、他のオリゴヌクレオチドの模倣体、であっていい。1997年7月29日に発行された米国特許5,652,355、“Hybrid Oligonucleotide Phosphorothioates”、および、1997年7月29日に発行された米国特許5,652,356、“Inverted Chimeric and Hybrid Oligonucleotides”、には生理学的に安定なアンチセンス分子の合成および効果を記載しており、参照によって本明細書に組み入れられる。アンチセンス分子は、マイクロインジェクション、リポソームカプセル化、または、アンチセンス配列を担っているベクターからの発現によって、細胞内に導入することができる。
【０２０３】
上記のように、アンチセンス核酸分子はまた、当該分野で知られている、ＲＮＡのある安定形態が、長い半減期を有しべクターを使用することなしに直接投与できることから、ＲＮＡとしても提供できる。さらに、ＤＮＡ構築体は、リポソーム、受容体介在トランスフェクション、および、他の当該分野で知られた方法により、細胞内に送達することができる。
【０２０４】
配列番号１の遺伝子と共同するためのアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡは、慣用の手段を用いて、上記の、標準的な分子生物学により、および／または、化学合成により、製造することができる。必要な場合、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡは、インビボでの分解を防止し、または、細胞膜を介した通過を促進するために、化学的に修飾でき、および／または、ｍＲＮＡを不活性化できる物質（例えば、リボザイム）を結合することができ、そして、本発明はそうした構築体に拡張される。
【０２０５】
アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを、dlg5遺伝子産物の過剰または下方制御された産生が関係している、ヒトの疾患または障害の治療に使用することができる。
【０２０６】
或いは、リボザイム分子を、インビボでdlg5のｍＲＮＡを切断し破壊するように設計することができる。リボザイムは、高い特異性を有するエンドリボヌクレアーゼ活性を有するＲＮＡである。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ＲＮＡの少なくとも部分に核酸配列において相補的なハイブリダイジング領域、および、標的ＲＮＡを認識し切断するように適合している触媒領域を含んでいる。ハイブリダイジング領域は好ましくは少なくとも９個のヌクレオチドを含んでいる。そうしたリボザイムの設計、構築および使用は当該分野でよく知られており、Haselhoff and Gerlach, (Nature. 334: 585-591, 1988) にさらに完全に記載されている。他の代替法では、dlg5遺伝子の５’−領域にハイブリダイズし、三重らせん構造を形成するように設計されたオリゴヌクレオチドが、dlg5遺伝子の転写を抑制または減少させるために用いることができる。他の代替法では、プラスミドベクターでクローン化されたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）オリゴヌクレオチドまたは短縮型（１８〜２５ｂｐ）ＲＮＡｉのdlg5配列が、二重鎖ＲＮＡを哺乳動物細胞に導入し、dlg5メッセンジャーＲＮＡを抑制および／またはその分解をもたらすために、設計される。dlg5のＲＮＡｉ分子は、アデニン／アデニン（ＡＡ）または少なくとも（あらゆる塩基−Ａ，Ｕ，ＣまたはＧ）Ａ…で始まり、および、４５〜５０マーのＲＮＡ分子を形成する、２ヌクレオチドのオーバーハングまたはヘアピン構造を有する個別のdlg5配列に特異的な、１８または１９または２０または２１または２２または２３または２４または２５塩基対、好ましい長さは２１塩基対を含むことができる。そうした小型阻害ＲＮＡ分子の設計、構築および使用は当該分野でよく知られており、そして、以下により完全に記載されている：Elbashir et al., (Nature. 411 (6836):494-498, 2001); Elbashir et al., (Genes & Dev. 15: 188-200,2001)；Harborth, J. et al. (J. Cell Science 114: 4557-4565,2001)；Masters et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 8012-8017,2001)；および、Tuschl et al., (Genes & Dev. 13: 3191-3197,1999)。
【０２０７】
パスウエイマッピング（pathway mapping）は、細胞中で、ＤＬＧ５タンパク質と相互作用するそれぞれのタンパク質、および、逆に、それらのそれぞれのタンパク質がまた相互作用をするタンパク質、を決定するために使用できる。このようにして、それにより治療介入のための新規な標的候補の同定を可能にする、細胞の応答への疾患の刺激に関連する特定の必須のシグナル伝達経路を、同定することが可能である。
【０２０８】
本発明のさらなる局面に従って、ＩＢＤに関与するさらなる遺伝子標的を同定するための研究における、dlg5遺伝子またはその断片の使用が提供される。
【０２０９】
本発明の他の局面において、本発明の一ヌクレオチド多型が、連鎖研究（linkage study）における、これらの領域のための遺伝マーカーとして使用できる。
【０２１０】
本発明のさらなる様相は、以下を含む：
炎症性大腸疾患に罹患した患者の治療法であって、dlg5遺伝子産物の転写または活性を減少させることができる化合物を、該患者に投与することを含む方法。
ＩＢＤに罹患している患者の治療方法であって、dlg5のｍＲＮＡを標的とする阻害性核酸分子を患者に投与することを含む方法。
dlg5に対する阻害性核酸分子またはＤＬＧ５タンパク質に対する抗体の、ＩＢＤを治療するための医薬を製造における使用。
【０２１１】
本明細書で用いているように、用語「阻害性核酸分子」は、アンチセンス、リボザイム、三重らせんアプタマー、および、ＲＮＡｉからなるグループから選択された分子を意味する。
【０２１２】
本発明のさらなる局面に従って、その治療を必要とするヒトを、ＤＬＧ５タンパク質に作用する小分子医薬、または、dlg5に対して作用する阻害性核酸分子を含む医薬、により治療する方法を提供し、この方法は以下の工程を含んでいる：
ｉ）診断が、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、および、９３のいずれかに対応する核酸の位置１６で生じるヒトdlg5遺伝子内に存在する核酸を決定することを好ましくは含む、ヒトのdlg5遺伝子中の多型を検出すること；
ii）dlg5遺伝子中の多型を参照してヒトの状態を測定すること；そして、
iii）医薬の有効量を投与すること。
【０２１３】
本発明のさらなる局面に従って、その治療を必要とするヒトを、ＤＬＧ５タンパク質に作用する小分子医薬、または、dlg5のｍＲＮＡに対して作用する阻害性核酸分子を含む医薬、により治療する方法を提供し、この方法は以下の工程を含んでいる：
ｉ）ヒトから得られた組織検体中のdlg5のｍＲＮＡのレベルを測定すること；
ii）dlg5のｍＲＮＡの正常レベルを参照してヒトの状態を測定すること；そして、
iii）医薬の有効量を投与すること。
【０２１４】
本発明のさらなる局面に従って、その治療を必要とするヒトを、ＤＬＧ５タンパク質に作用する小分子医薬、または、dlg5のｍＲＮＡに対して作用する阻害性核酸分子を含む医薬、により治療する方法を提供し、この方法は以下の工程を含んでいる：
ｉ）ヒトから得られた組織検体中のＤＬＧ５タンパク質のレベルを測定すること；
ii）ＤＬＧ５タンパク質の正常レベルを参照してヒトの状態を測定すること；そして、
iii）医薬の有効量を投与すること。
【０２１５】
本発明のさらなる局面に従って、その治療を必要とするヒトを、ＤＬＧ５タンパク質に作用する小分子医薬、または、dlg5のｍＲＮＡに対して作用する阻害性核酸分子を含む医薬、により治療する方法を提供し、この方法は以下の工程を含んでいる：
ｉ）ヒトのＤＬＧ５タンパク質中の多型を検出し、その診断が、配列番号２に示されたＤＬＧ５タンパク質配列の１４０、２３１、６２４、１０６７、１０８９または１４８１の位置のいずれか１つでのアミノ酸を測定することを、好ましくは含むこと；
ii）ＤＬＧ５タンパク質の多型を参照してヒトの状態を測定すること；そして、
iii）医薬の有効量を投与すること。
【０２１６】
本発明のさらなる局面に従って、その治療を必要とするヒトを、ＤＬＧ５タンパク質に作用する小分子医薬、または、dlg5のｍＲＮＡに対して作用する阻害性核酸分子を含む医薬、により治療する方法を提供し、この方法は以下の工程を含んでいる：
ｉ）ヒトのＤＬＧ５タンパク質中の多型を検出し、その診断が、配列番号１９０に示されたＤＬＧ５タンパク質配列の３０、１２１、５１４、９５７、９７９および１３７１の位
置のいずれか１つでのアミノ酸を測定することを、好ましくは含むこと；
ii）ＤＬＧ５タンパク質の多型を参照してヒトの状態を測定すること；そして、
iii）医薬の有効量を投与すること。
【０２１７】
ＩＢＤに罹患している患者を治療するための、dlg5の転写または発現を減少できる化合物の患者への投与を含む方法。
ＩＢＤに罹患している患者を治療するための、dlg5のｍＲＮＡを標的とする阻害性核酸分子の患者への投与を含む方法。
dlg5に対する阻害性核酸分子または抗体の、ＩＢＤを治療するための医薬の製造における、使用。
【０２１８】
本発明はさらに、以下の非限定的な実施例、および、添付図面を用いて記述する。ここで；
図１は、ａは、ＤＬＧ５およびハウスキーピング遺伝子β-アクチンのｍＲＮＡレベルを表し；ｂは、ＤＬＧ５に対する特異的ｓｉＲＮＡで処理された細胞中での、主要なアポトーシス効果物質のカスパーゼ−３の活性化、および、その基質のポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ−１（ＰＡＲＰ−１）の切断を示し；ｃは、ＤＬＧ５ｓｉＲＮＡで形質転換された細胞が、スクランブル化対照ｓｉＲＮＡで処理された細胞に比較して、アポトーシスが４８％増加していることを示している（ＤＡＰＩにより染色された断片化核により測定された）；代表的な実験からのデータを示した。
【０２１９】
図２は、Ｃ５７Ｂ／６マウスのＤＳＳ大腸炎モデルにおけるＤＬＧ５発現のＴａｑＭａｎ解析である。
相対的な発現はＤＬＧ５の２ΔΔCTとして示している。ＬＩ（大腸）、ＳＩ（小腸）。
【０２２０】
実施例１
ＩＢＤと関連した遺伝子としてのdlg5の同定
ヨーロッパ系の２６８ファミリー（３５６組の罹患した兄弟ペア）を含んだゲノム全体の連鎖スキャンを、ＩＢＤに関する感受性の遺伝子座を同定するために実施した。続いて、階層的連鎖不均衡研究を、最初の連鎖スキャンで同定した、第１０染色体上で、４０ｃＭの幅のセントロメア周辺の間隔の範囲内での、原因変異体の探索のために用いた。この試みは、５２３組の罹患した兄弟ペア、および、２ｃＭの平均間隔で１６個のマイクロサテライトマーカーを含む、精密なマッピング実験から開始された。この精密マッピング実験により最初の連鎖試験を確認し、Ｄ１０Ｓ２４７０での最大ＭＬＳスコア１.６で、ＤＩＯＳ２０１−Ｄ１０Ｓ１９２に広がる、１０ｑでの連鎖ピークを明らかにした。連鎖マッピングに続いて、感受性遺伝子を含む領域をさらに絞り込むために、ＧＥＮＥＨＵＮＴＥＲソフトウエアパッケージ（Daly MJ et al., Am J Hum Genet, Suppl 63: A286,1998）中で実行されるアルゴリズムを使用した伝播不均衡試験（ＴｄＴ；transmission disequilibrium testing）を行った。この解析は、与えられたマーカーと連鎖の存在する疾患の表現型との関連性を調べるものであり、そして、最も強力で着実な関連性試験であり、その一方、層化の偏りによる擬陽性の危険性を除外する。ファミリーのそれぞれからの単一のトリオ（trio）（ひとつは罹患した同胞、および、その両親）についてなされた、このＴｄＴにより、Ｄ１０Ｓ５４７（ｐ＜０.００１）およびＤＩＯＳ２０１（ｐ＜０.０１）における、疾患表現型との有意な単一ポイントの関連性が示された。これにより以下の方針が導かれた：１０ｐｌ４〜１０ｐｌ３（８Ｍｂ〜１３Ｍｂに広がる）および１０ｑ２２〜１０ｑ２３(７７Ｍｂ〜８２Ｍｂ)上の連鎖ピークの基礎をなすゲノム領域を、２００組のドイツ人のＩＢＤに罹患したファミリー（元の連鎖セットから）に加えて追加の555組のドイツ人のトリオ（３６８ＣＤ、１８７ＵＣ）、（ＩＢＤに罹患した子供からのＤＮＡ検体、ならびに、その母親および父親それぞれからのＤＮＡ検体からなるトリオ）、および、５４８人のドイツ人の対照用個人（ＩＢＤに罹患していない個人）を用いて、遺伝子タイピングを行った。いくつかのＳＮＰが、ファミリーおよびトリオから抽出された単一のトリオにおけるＴｄＴにより、ＣＤおよびＩＢＤとの有意な関連性を示し、これにより、調べた領域に渡る感受性遺伝子座との連鎖不均衡の存在を確認した。それゆえに、感受性遺伝子を担っている領域をさらに絞り込むために、平均密度を７５〜１２０ｋＢとして、追加のＳＮＰとの関連性試験を行うことに決めた。７８.５Ｍｂに位置するＳＮＰマーカーＴＳＣ０３７６４８４のＩＢＤとの、非常に有意な単一ポイントの関連性が、χ２＝１１.５、ｐ＝０.０００６７で発見されたので、高密度ＳＮＰパネルの解析により、１０ｑのリード領域を、ヌクレオチド配列変異体を求めてスキャンした。
【０２２１】
ＴｄＴハプロタイプ解析はさらにＴＳＣ０３７６４８４での関連性の手掛りを強固にし、その結果、近接するＳＮＰマーカーＴＳＣ０００５０１０およびＴＳＣ００００３６１を有する、有意な２−マーカーおよび３−マーカーハプロタイプをもたらした。この２−マーカーハプロタイプＴＳＣ０３７６４８４〜ＴＳＣ００００３６１は約１５０ｋｂの物理的距離に広がっており、最大のχ２＝１５.４４、ｐ＝０.００００８が観察された。ポジテイブなＳＮＰはdlg5遺伝子に隣接して位置していた。ＩＢＤにおけるdlg5の役割を検証し、さらに明らかにするために、dlg5に関する６個の遺伝子に基づくマーカーの遺伝型を調べた。ハプロタイプブロックの試験にも関与する（Daly et al. (Nature Genet. 29: 229-232,2001)により記載されたように）これらのマーカーの解析は、この関連性のシグナルが、ＩＢＤとポジテイブに関連する総計１７個のマーカーにより完全にdlg5遺伝子に特定されること（表５）、それらは全て、共通の基礎となっているハプロタイプ上に位置していることが明瞭に示された。同一の遺伝的関連性試験を、隣接する遺伝子でも行った。それらがネガテイブだったことは、dlg5が１０ｑ２２上のＩＢＤに関する感受性遺伝子座の唯一の候補遺伝子であることを証明している。３２個のエキソンの全ておよびエキソン−イントロン境界のより詳しい再度の配列決定を、ＩＢＤと確定診断された４７人の個人に対して実施した。ヌクレオチド配列を標準的なプロトコールに従って行い、使用されたプライマーは表４にリストされている。ＤＮＡ配列決定および解析は、dlg5遺伝子に位置する２０個の新規なヌクレオチド配列変異体を同定し（各種の公に利用可能なＳＮＰの他に）、そのうち３個はタンパク質のアミノ酸置換をもたらし、そしてさらに、エキソン１３の端のイントロン中に７ｂｐの欠失を同定した。遺伝型に関連する危険性（ＧＲＲ）（Risch & Merikangas, Science, 273 (5281): 1516-7,1996）をＴＤＴの結果に基づいて１.５〜２.５と推定した。
【０２２２】
実施例２
dlg5のクローニングおよび配列解析
４１５７７９ｂｐのゲノムＤＮＡコンティグ（contig）を、ＢＡＣクローンＡＬ３９１４２１、ＡＬ４５０３０６およびＡＬ７３１５５６を集めて構築した。
dlg5のｃＤＮＡ（ＥＭＢＬ受入番号ＡＦ３５２０３４）のためのデータベースエントリーを用いて、５‘ＵＴＲ以外の全てのエキソンを、ＡＬ３９１４２１またはＡＬ４５０３３０６によりカバーされるヒトゲノム配列へマッピングした。ＡＦ３５２０３４の最初の９４塩基はこの領域にも、または、この遺伝子の周辺のゲノムコンティグの他の領域のいずれにもマッピングされなかった。この配列はヒトゲノム内での多重領域に類似性を示すので、反復配列に由来する人為的なものと考えられた。エキソン２からの配列を用いたデータベースＢＬＡＳＴ検索を、新規な５’配列を有する２個のブタｃＤＮＡ（ＥＭＢＬ受入番号ＢＭ４８４３８３およびＢＩ４０２２４６）を同定するために使用した。この配列は、ヒトゲノムコンティグに一致することが見出され、そして３’端で保存されたスプライシング部位により縁取られ、そしてそのために、ヒトdlg5の真の５’エキソンであると考えられた。表２にＤＬＧ５遺伝子のイントロン／エキソン境界配列の情報を示す。配列番号１は新規な５’配列を含むdlg5の配列を示す。配列番号２はdlg5の予測されるアミノ酸配列を示す。
【０２２３】
３２個のエキソンの全ておよびエキソン−イントロン境界のより詳しい再度の配列決定を、ＩＢＤを有する４７人の個人に対して実施した。配列はＳＮＰ検出、そして、さらに、公的データベースに存在するＳＮＰの検出のために並べられ、その解析の結果により２０個の新規なＳＮＰを同定し、そのうちの４個はタンパク質のアミノ酸置換をもたらし、同時に、２個の新規なゲノムの短い欠失、1個のエキソン１３に隣接する、遺伝子のスプライシングに影響を及ぼす可能性のある、イントロンでの７ｂｐの欠失を同定した。遺伝子型に関連する危険性（ＧＲＲ）はＴＤＴの結果を基にして１.５〜２.５と推定された。表３に同定されたＳＮＰおよび隣接する配列、ならびに、ＳＮＰの対立遺伝子型をリスト化している。この表はまた、公的データベースからのタイプ化されたＳＮＰの位置も含んでいる。表４はdlg5のＳＮＰを含む領域をＰＣＲ増幅するために使用されたプライマー配列を示している。
【０２２４】
表２は、dlg5遺伝子の全てのエキソンのエキソン／イントロン境界を示している。それぞれのエキソンの最初と最後の１０ｂｐ（大文字）と５ｂｐの周りのイントロン（小文字）を共に示している。また、それぞれのエキソンの総サイズも示す。全ての配列は、ヒトＢＡＣクローン中で、受入番号ＡＬ３９１４２１およびＡＬ４５０３０６により、確認できる。
【表２】
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【０２２５】
【表３】
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【０２２６】
表３は、ＳＮＰおよび隣接する配列、ならびに、特定の対立遺伝子型を同定している。この表は変異体検出により同定された新規なＳＮＰ、および、公的データベースからのＳＮＰを含んでいる。使用した全ての公有のＳＮＰは、ｒｓ−またはｔｓｃ−番号を有し、ゲノム中に一義的に同定することができる。
【０２２７】
【表４】
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【０２２８】
【表５】
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【０２２９】
【表６】
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【０２３０】
【表７】
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【０２３１】
【表８】
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【０２３２】
【表９】
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【０２３３】
表４：dlg5遺伝子の変異体検出に用いたプライマー。それぞれのプライマーはエキソン番号の後に、ＦはフォワードまたはＲはリバースのいずれかのプライマーにより名づけられている。
【表１０】
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【０２３４】
【表１１】
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【０２３５】
【表１２】
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【０２３６】
表５：ＩＢＤとdlg5の関連性を証明するデータ。
【表１３】
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【０２３７】
実施例３
リアルタイムＰＣＲを用いた、正常人組織およびＩＢＤを有する患者からの結腸バイオプシーのパネルにおけるＤＬＧ５の発現解析
リアルタイムＰＣＲ実験を、Applied Biosystems 7900HT上で、Syber Green ケミストリー（二本鎖ＤＮＡ結合色素、マイナーグルーブ結合）および蛍光プローブを用いて、３８４フォーマットで行った。いかなる非特異的な増幅および融解をも検出するために、曲線解析をそれぞれの完了したＰＣＲの後に行った。
【０２３８】
それぞれの検体を２回ずつ、それぞれの反応で（１０μＬ）テンプレートを４ｎｇ使用して反応に付した。ＰＣＲ反応は、検体および逆転写酵素不含対照の両方について、５０サイクル行った。テンプレートを含まない対照もまたシグナルがプライマーそれ自体から生じるものではないことを確認するために調べられた。このプライマーは、Applied Biosystemsにより製造されたプログラムPrimer Expressを使ってｃＤＮＡ配列から設計された。プライマーは全てイントロン／エキソン連結に相補的であった。内部標準として、h36b4（酸性リボソームリンタンパク質P0）およびβ−アクチンを、添加したＲＮＡおよびｃＤＮＡ合成での差異を規格化するために用いた。
【０２３９】
異なった検体での相対的発現は、パラメーターＣT（閾値サイクル）により算出された。ＣTは、蛍光がベースライン上の閾値を通過する時の分画のサイクル数として定義される。
【０２４０】
dlg5遺伝子の相対的発現は、式：２-ΔCT を用いて算出され、ここで、ΔＣTは（ＣTＤＬＧ５−ＣT３６Ｂ４）または（ＣTＤＬＧ５−ＣTβ−アクチン）として定義される。
ＣTＤＬＧ５＝興味のある組織中のdlg5遺伝子のための閾値サイクル
ＣT３６Ｂ４＝同じ組織中の３６ｂ４のための閾値サイクル
ＣTβ−アクチン＝同じ組織中のβ−アクチンのための閾値サイクル
【０２４１】
５’から３’へと方向付けられたdlg5（エキソン２７〜エキソン２８）のためのプライマーはフォワードであった：
CCAGTGACTCCATTCCACTCTTT（配列番号：161）およびリバース：
CGGTGCAGTCCACCTTCTG（配列番号：162）。プライマーもまたエキソン２９〜３０のために用いた。フォワード：GGAGAAGCGGCCATTTCG（配列番号：163）およびリバース: CTCAATAGCGTGCGGAGCAA（配列番号：164）、エキソン３２フォワード: CAGTGTGGGTGTCTTCGTTTGG （配列番号:165）およびリバース: ATTAACAGGACGCATAGCTTAAGGA（配列番号: 166）材料のサブセットについて。エキソン２９〜３０およびエキソン３２に対するプライマーについては、蛍光プローブを以下の配列を用いた検出に用いた：エキソン２９〜３０：AAAGGAGATCACAGAAAAGAACCGACACTGC（配列番号: 167）およびエキソン３２：TGAGGCTAGATATGTCTGGCTGAAGATTTGATGTG（配列番号: 168）。エキソン２７〜２８について増幅された断片の検出はSyber green ケミストリーを用いて行った。
【０２４２】
酸性リボソームリンタンパク質ＰＯ（h36b4）およびβ−アクチンのような内部対照遺伝子に関するプライマー配列は、h36b4については、フォワード： CCATTCTATCATCAACGGGTACAA（配列番号：169）およびリバース：AGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC（配列番号: 170）、ならびに、β−アクチンについては、フォワード：AGCCTCGCCTTTGCCGA （配列番号: 171）およびリバース：CTGGTGCCTGGGGCG（配列番号: 172）である。β−アクチンについては、蛍光プローブによる検出には以下の配列を用い：CCGCCGCCCGTCCACACCCGCC（配列番号: 173）、一方、h36b4の検出にはSyber green ケミストリーを用いた。
【０２４３】
組織パネル
相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、Clontech Laboratories Inc.より購入した。１２個の異なった組織を用いた：  ヒトＭＴＣＴＴＭＩ＃Ｋ１４２０−１の部分としての心臓、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓；ヒトＭＴＣＴＴＭ II Ｋ＃１４２１−１の部分としての、睾丸、前立腺、小腸；  ヒト胎児性ＭＴＣＴＴＭ II Ｋ＃１４２５−１の部分である回腸ｃＤＮＡ；ヒト免疫ＭＴＣＴＴＭ II Ｋ＃１４２５−１の部分である下行性結腸。ＲＴ−ＰＣＲのためのSuperScriptTM  第一鎖合成システム（Gibco BRL）を使用して調製したｃＤＮＡからの脳ｍＲＮＡ（ヒト脳、全体、＃６５１６−１）をｃＤＮＡ合成に用いた。５００ｎｇの総ＲＮＡを、逆転写酵素（ＲＴ）反応のためのキット中で提供されているオリゴｄＴプライマーを用いたそれぞれの反応、およびＲＴネガテイブ対照のために使用した。
【０２４４】
結腸バイオプシー
結腸バイオプシーは内視鏡および取手付バイオプシー器具を用いて、患者から採取した。バイオプシーは、結腸および回腸終端部の異なった部分の粘膜から採取した。
【０２４５】
結果
ＤＬＧの組織分布により、表６に示すように、胎盤および睾丸における高い発現が確認され、およびまた、脳、前立腺、下行結腸および回腸でも高い発現が確認できた。結腸バイオプシーの解析により、非ＩＢＤ疾患対照に比べてクローン病（ＣＤ）患者での顕著な発現の減少が示された。表７に示したように、６人の非ＩＢＤ対照および２９人のＣＤ患者から成る検体の一つのサブセットでは、およそ６倍の差異が見られた。表８に示したように、１６人の入院中の通常人（ＨＮ）（約１.５倍）および３９人の非ＩＢＤ対照（ＤＣ）（約２倍）から成る他のサブセットでは、２３人の健常人対照と比べて、より緩和な減少が見られた。その一方、４０人の潰瘍性大腸炎（ＵＣ）および４９人のＣＤ検体の第三および第四のサブセットでは、２５人の健常人対照と比較して、一定の差異が見られた。その結果は表９および表１０に示しており、それぞれ、１.５倍および２.３倍の減少を示唆している。
【０２４６】
まとめ
我々は、調べたほとんどの組織（胎盤、心臓、前立腺、骨格筋、肝臓、膵臓、腎臓、脳、結腸、睾丸、回腸および小腸）においてＤＬＧ５が発現されていることを示した。最も高い発現は胎盤および回腸で検出された。我々はまた、非ＩＢＤ対照および健常人対照と比べて、ＩＢＤ患者からの結腸バイオプシー間での発現の顕著な差異を確認した。
【０２４７】
表６：選択されたヒト組織中のＤＬＧ５の相対的発現
【表１４】
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【０２４８】
表７：h36b4を内部対照として用いた式２-ΔCt＊１０００に従ってリアルタイムＰＣＲを用いた相対的発現解析。結腸バイオプシーは、非ＩＢＤ疾患対照（ｎ＝６）およびクローン病患者（ｎ＝２９）から採取した。Ｐ値はスチューデントＴ検定を用い、非均等分散を仮定して計算した。
【表１５】
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【０２４９】
表８：健常人、ＨＮ＝入院中の通常人（ｎ＝１６），ＤＣ＝非ＩＢＤ疾患対照（ｎ＝４０）から採取した結腸バイオプシーに関する、式２-ΔCt＊１０００に従ってリアルタイムＰＣＲを用いた相対的発現解析。Ｐ値はスチューデントＴ検定を用い、非均等分散を仮定して計算した。エキソン２９〜３０およびエキソン３２の両方に対するプライマーを用い、再現性のある結果を示した。
【表１６】
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【０２５０】
表９：健常人、および、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者から採取した結腸バイオプシーに関する、式２-ΔCt＊１０００に従ってリアルタイムＰＣＲを用いた相対的発現解析。Ｐ値はスチューデントＴ検定を用い、非均等分散を仮定して計算した。エキソン２９〜３０およびエキソン３２の両方に対するプライマーを用い、再現性のある結果を示した。
【表１７】
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【０２５１】
表１０：健常人、および、クローン病（ＣＤ）患者から採取した結腸バイオプシーに関する、式２-ΔCt＊１０００に従ってリアルタイムＰＣＲを用いた相対的発現解析。Ｐ値はスチューデントＴ検定を用い、非均等分散を仮定して計算した。エキソン２９〜３０およびエキソン３２の両方に対するプライマーを用い、再現性のある結果を示した。
【表１８】
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【０２５２】
実施例４
dlg5発現のｓｉＲＮＡ阻害がＨｅＬａ細胞でのアポトーシスを誘導する
標準的な上皮細胞のインビトロモデルにおける、dlg5の機能の減少したレベルまたは消失をシミュレートするために、小分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いて、ＨｅＬａ細胞中のdlg5のｍＲＮＡをノックダウンした。
トランスフェクション実験のために、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ）（＜２０継代）を２〜４×１０5細胞／ウエルで６穴プレートに蒔き、そして、２４時間後に、TransMessengerトランスフェクションキット（Qiagen社、Hilden、ドイツ、から全て入手）により、カスタムメイドのdlg5のｓｉＲＮＡまたはスクランブル化対照ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトした。dlg5を標的としているｓｉＲＮＡおよび／または強化緑色蛍光タンパク質をコードしているベクター（ｐＥＧＦＰ）によってトランスフェクトさせた細胞を、トランスフェクションの４８時間後に解析した。全ての実験で、スクランブル化、非特異的ｓｉＲＮＡ（対照ｓｉＲＮＡ）およびトランスフェクション用試薬TransMessenger（TransM.）単独を内部対照として用いた。dlg5転写物の至適ノックダウンは、２×１０5細胞／ウエル、および、４μｇ／ウエルのｓｉＲＮＡ、5'-GAAGGATGACGTGGACATGCT-3'（ＤＬＧ５のコーデング配列の塩基３８９に位置する−配列番号：174）、８μＬ／ウエルのエンハンサーＲ、および、４０μＬ／ウエルのTransMessenger試薬を用いて達成できた。トランスフェクション効率の可視化のために、細胞を２μｇのｐＥＧＦＰ−Ｃ１（BD Clontech, Palo Alto, CA）で共トランスフェクトし、カバースリップに蒔き、ＤＡＰＩ染色およびAxiophot顕微鏡（Zeiss,ドイツ）を用いた蛍光検出のために固定し、そして、画像をデジタルカメラシステム（Axiocam, Zeiss）で撮影した。
【０２５３】
発現解析
dlg5転写物のノックダウンのレベルを見積もるために、dlg5およびβ−アクチンのｍＲＮＡレベルをＲＴ−ＰＣＲにより解析をした。以下のプライマーペアを用いた：
β−アクチン：5'-GATGGTGGGCATGGGTCAG-3'（配列番号：175）および
5'-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3'（配列番号：176)、
dlg5: 5'-AAACTGTATGACACGGCCATGG-3'（配列番号：177）および
5'-CTCCTCCCTGTATTTCTCCGACTC-3'（配列番号：178）。
【０２５４】
さらに、ｓｉＲＮＡにより誘導されるかもしれない人為的なシグナルを排除するために、インターフェロン誘導性遺伝子、ＯＡＳ１の発現を測定した。ＯＡＳ１の検出のために使用したプライマーは、
5'-ACCATGCCATTGACATCATCTG-3'（配列番号：179）および
5'-AAGACAACCAGGTCAGCGTCAG-3'（配列番号：180)である。
【０２５５】
ウエスタンブロット解析
ＤＬＧ５を減少させた細胞のアポトーシスを測定するために、カスパーゼ−３およびＰＡＲＰ−１切断のウエスタンブロッテイング解析を行った。細胞抽出物（総タンパク質が１０μｇ／レーンになるように揃えている）を、１２または１５％変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ついで二フッ化ポリビニリデン膜（ハイボンド−Ｐ；０.８ｍＡ／ｃｍ2で６０分間；Amersham Pharmacia Biotech）へ、エレクトロブロッター（Bio-Rad）を用いた半乾燥ブロッテイングにより転写した。抗体をブロッキング用緩衝液で希釈した。続いて、膜を洗浄し、ECL-Plus検出用試薬でインキュベートし、そして、ハイパーフィルムECL（いずれもAmersham Pharmacia Biotech）に感光させた。カスパーゼ−３およびＰＡＲＰ−１に対する一次抗体をCell Signaling Technology (Beverly, MA) から入手した。タンパク質含量はβ−アクチンに対する抗体（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）によるハイブリダイゼーションを続いて行うことにより規格化した。特異的抗体による染色の間に、ブロットは、２％ＳＤＳ、６２.５ｍＭトリスおよび１００ｍＭの２−ＭＥ中で、５０℃で３０分間剥がされ、洗浄され、そして再度ブロックした。バンドはデンシトメトリー用プログラムSigmaGel（Jandel Scientific, San Rafael, CA）を用いて定量された。全てのウエスタンブロットは、異なった長さの時間で、フィルムに露光させ、準飽和レベルの密度を生成したフィルムだけをデンシトメトリカルおよび統計的評価のために選択した。直線性は、異なった量の材料と複数回のフィルム露光を用いた個別の実験で確認した（データは示さず）。剥離での作為の可能性を検出するために、平行して二つの別々の膜で、それぞれのウエスタンブロッテイング実験を行った。
【０２５６】
結果
dlg5発現のｓｉＲＮＡによる阻害はＨｅＬａ細胞のアポトーシスを、それ以外のいかなるアポトーシス誘導性刺激なしで、強く誘導した。アポトーシスは、アポトーシスのキーエフェクターであるカスパーゼ−３の活性化およびその基質であるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ−１（ＰＡＲＰ−１）の切断を、免疫ブロッテイングで検出することにより測定した。さらに、強化緑色蛍光タンパク質をコードしているベクター（ｐＥＧＦＰ）との共トランスフェクションにより、４８時間後、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞の５０％までがＤＡＰＩ染色後に核断片化を示している（アポトーシスの特徴である）ことが明らかにされた（図１）。この作用は、2'5'-オリゴアデニレート合成酵素（ＯＡＳ１）の転写レベルがdlg5のｓｉＲＮＡにより影響されていない（データは示さず）ので、インターフェロン応答によるものではない（Bridge, A. J. et al. Nat Genet 34,263-264 (2003) ）。最初の時間反応速度によりＤＬＧ５のｍＲＮＡレベルがｓｉＲＮＡトランスフェクションの２４時間後に顕著に減少するが、４８時間後にはさらに強かった。アポトーシスの程度（カスパーゼ−３およびＰＡＲＰ−１の切断により測定される）は、dlg5のｍＲＮＡのレベルと強く一致していた。さらに、アポトーシスのマーカーである切断されたカスパーゼ−３に関するrs2289310ggcctagcaccccccAagccaagcagagcag （配列番号：181）（ｎ＝３）の疾患に関連した変異を有する同型（homozygous）のＣＤ患者から得られた粘膜切片の染色では、野生型対立遺伝子、ggcctagcaccccccCagccaagcagagcag （配列番号：182）（ｎ＝３）に関する同型の患者由来のものと比較して、アポトーシス性染色が強まっていることが示された。
【０２５７】
まとめ
これらの新規な発見は、機能的なＤＬＧ５が上皮細胞の生存にとって必須の因子であることを示唆している。
【０２５８】
実施例５
デキストラン硫酸ナトリウムで処理したマウスから得られた結腸検体中のＤＬＧ５の発現解析
ＤＳＳマウス大腸炎モデルは、急性大腸炎の間、および、ＤＳＳ誘導大腸炎からの回復期の間でのＤＬＧ５の発現パターンを研究するために使用された。
【０２５９】
マウス
７〜１２週令のＣ５７ＢＬ／６マウスをＤＳＳ（デキストラン硫酸ナトリウム；TDB Consultancy AB, スエーデン）を３％の濃度で添加した飲料水を６日間与えた。回復期の動物はＤＳＳを５日間受けた後、２週間水を与えた（ｄ５＋１４）。ＤＳＳを与えないＣ５７ＢＬ／６マウスを対照動物として用いた。それぞれのグループで５匹の個別の動物を解析した。７日後（急性期）またはｄ５＋１４（回復期）後、動物を犠牲にし、組織検体を脾臓、大腸および小腸から採取した。組織はＮａＣｌでざっと洗い、次に、ＲＮＡ調製前に液体窒素中で急速冷凍した。
【０２６０】
ＲＮＡの調製
約５０ｍｇの脾臓、大腸および小腸の組織からのＲＮＡを、TRIZOL法（Invitrogen）を用いて、製造者の指示書に従って調製した。ＤＮＡａｓｅ処理の後、ｃＤＮＡ合成を、ＲＴ−ＰＣＲのためのSuperscript第一鎖合成キット（Invitrogen Life Technologies）を用いて行った。
【０２６１】
リアルタイムＰＣＲ
リアルタイムＰＣＲ実験は、Applied Biosystems 7900 HTでSyber Green ケミストリー（二重鎖ＤＮＡ結合色素、マイナーグルーブ結合）および蛍光プローブを用いて、３８４フォーマットで実施した。 いかなる非特異的な増幅および融解をも検出するために、曲線解析をそれぞれの完了したＰＣＲの後に行った。
【０２６２】
それぞれの検体を３回ずつ、それぞれの反応で（１０μＬ）テンプレートを３ｎｇ使用して反応に付した。ＰＣＲ反応は、検体および逆転写酵素不含対照の両方について、４０サイクル行った。テンプレートを含まない対照もまたシグナルがプライマーそれ自体から生じるものではないことを確認するために調べられた。このプライマーは、Applied Biosystemsにより製造されたプログラムPrimer Expressを使ってｃＤＮＡ配列から設計された。プライマーは全てイントロン／エキソン連結に相補的であった。酸性リボソームリンタンパク質P0（m36b4）を、添加したＲＮＡおよびｃＤＮＡ合成での差異を規格化するために用いた。
【０２６３】
それぞれの組織での相対的発現は、式ΔＣT＝ＣTＤＬＧ５−ＣT３６Ｂ４を用いて計算され、ここでＣTは蛍光がベースライン上の閾値を通過する時の分画のサイクル数として定義される。（ＣTＤＬＧ５−ＣT３６Ｂ４）または（ＣTＤＬＧ５−ＣTβ−アクチン）として定義される。個々の組織のdlg5の相対値は、比較法（ΔΔＣＴ）を用いて計算され、ここで脾臓からのΔＣＴ値を参照として設定した（ユーザー用ブリティン＃２、ABI PRISM 7700 配列検出システム）。
ＣTdlg5＝興味のある組織中のdlg5遺伝子のための閾値サイクル。
ＣT３６Ｂ４＝同じ組織中の３６ｂ４のための閾値サイクル。
ΔＣT＝ＣTＤＬＧ５−ＣT３６Ｂ４
ΔΔＣＴ＝ΔＣＴ（興味のある組織）−ΔＣＴ（脾臓）
【０２６４】
マウスdlg5（エキソン２９〜３０）の解析のために用いられるプライマーは、フォワードがCAGAAAAGAACCGGCACTGTCT（配列番号：183）、リバース：TGTGGTGCAGCCTCTCGAT（配列番号：184）およびプローブ配列：CTGGACATCGCCCCGCATGC（配列番号：185）である。
【０２６５】
内部標準として、酸性リボソームリンタンパク質ＰＯ（m36b4）のマウス遺伝子を以下のプライマー配列を用いて解析した、フォワード：GAG GAA TCA GAT GAG GAT ATG GGA（配列番号：186）およびリバース：AAG CAG GCT GAC TTG GTT GC（配列番号：187）である。m36b4の検出のために、配列TCG GTC TCT TCG ACT AAT CCC GCC AA（配列番号：188）を有する蛍光プローブを用いた。
【０２６６】
結果
dlg5の発現レベルを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの、ＤＳＳ誘発性大腸炎の急性期および回復期の大腸（結腸）および小腸（回腸終端部）を用いて解析した。興味あることに、大腸由来の検体のみが顕著な疾患進行の異なった時期間での変動を示した（図２）。大腸炎の急性期の間、大腸でのdlg5の発現レベルは、対照動物または回復期にある動物由来の対応する検体で見られる値より顕著に低かった。また、大腸では、回復期に発現レベルの増加が見られた。小腸由来の検体を疾患進行の異なった時期に解析したときには、dlg5発現レベルの顕著な相違は見られなかった。このモデルでの腸炎症は大腸に限定されているので、この発現パターンは大腸および／または炎症との関連性を示唆している。
【０２６７】
まとめ
我々は、マウスの大腸炎の異なった時期に、大腸でのdlg5の発現の変動を見出した。動物実験からのこれらの結果は、大腸炎疾患の進行中でのＤＬＧ５の役割を強化している。
【図面の簡単な説明】
【０２６８】
【図１】ＤＬＧ５およびハウスキーピング遺伝子β-アクチンのｍＲＮＡレベル；ＤＬＧ５に対する特異的ｓｉＲＮＡで処理された細胞中での、主要なアポトーシス効果物質のカスパーゼ−３の活性化、および、その基質のポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ−１（ＰＡＲＰ−１）の切断；ＤＬＧ５ｓｉＲＮＡで形質転換された細胞が、スクランブル化対照ｓｉＲＮＡで処理された細胞に比較して、アポトーシスが４８％増加していることを示す。
【図２】Ｃ５７Ｂ／６マウスのＤＳＳ大腸炎モデルにおけるＤＬＧ５発現のＴａｑＭａｎ解析を示す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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