(57)【要約】選択的スプライシングによるＨＥＲ−２／ｎｅｕ産物であるハースタチンは、ｐ１８５ＨＥＲ−２の細胞外領域からのサブドメインＩおよびＩＩと、イントロン８によってコードされているＣ末端の独自の７９個のアミノ酸とからなる。組み換えハースタチンを細胞に添加するとｐ１８５ＨＥＲ−２に結合し、ｐ１８５ＨＥＲ−２を抑制することがわかった。いくつかの細胞系において、ハースタチンをｐ１８５ＨＥＲ−２またはそのホモログであるＥＧＦ受容体と同時に異所発現させた場合の効果を調べた。ハースタチンとＨＥＲ−２を同時にトランスフェクトすると、ｐ１８５ＨＥＲ−２のレベルが抑制され、ｐ１８５のチロシンリン酸化が約８分の１に減少した。ｐ１８５ＨＥＲ−２のチロシンリン酸化の抑制は、ｐ１８５ＨＥＲ−２とハースタチンを同時に発現する細胞によるコロニー形成が劇的に減少することと対応していた。ハースタチンはまた、同時にトランスフェクトされた細胞におけるＥＧＦによるＥＧＦ受容体の活性化を阻止し（受容体のチロシンリン酸化が減少することでわかる）、受容体のダウンレギュレーションと増殖抑制を減少させた。ｐ１８５ＨＥＲ−２とＥＧＦ受容体の両方に関し、抑制の程度は、このＥＧＦ受容体に対するハースタチンの相対的発現レベルによる影響を受けていた。ハースタチンはｐ１８５ＨＥＲ−２の自己抑制剤であり、その抑制活性は、グループＩファミリーに属する受容体チロシンキナーゼの第２のメンバーであるＥＧＦ受容体にまで及んでいる。ハースタチンは、活性化したＡｋｔを媒介としたＥＧＦ生存シグナルを阻止するとともに、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦα）を媒介としたＥＧＦ受容体の活性化、生存シグナル、増殖シグナルも阻止した。精製した組み換えハースタチンは、ＨＥＲ−２を過剰発現しているヒトのガン細胞を特異的に抑制した。また、精製した組み換えハースタチンは、腹腔内に注射したマウスの血液に効果的に吸収され、タンパク質分解酵素によって分解されず、１〜３時間にわたって血液中に存在していた。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＧＦ受容体の発現を特徴とする固形ガンを治療するためにＥＧＦ受容体の細胞外領域と結合する薬剤を投与する操作を含む方法であって、この薬剤を、（ａ）配列ＩＤ番号１の配列に由来する約５０〜７９個のアミノ酸を含み、ＥＧＦ受容体の細胞外領域に少なくとも１０８のアフィニティで結合する単離ポリペプチド、（ｂ）配列ＩＤ番号２の配列に由来する約８０〜４１９個のアミノ酸を含み、その中にはＣ末端側の７９個のアミノ酸と、少なくとも３つのＮ結合型グリコシル部位とが存在している、グリコシル化された単離ポリペプチド、（ｃ）ＥＧＦ受容体の細胞外領域と結合するモノクローナル抗体、（ｄ）これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択するが、この薬剤がモノクローナル抗体のみからなるものではない、という方法。
【請求項２】
ＥＧＦ受容体を発現している固形ガンを、扁平上皮細胞ガン、肺ガン、大腸ガン、グリア細胞腫瘍からなるグループの中から選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記薬剤が、配列ＩＤ番号１の配列に由来する約５０〜７９個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記薬剤が、配列ＩＤ番号１の配列に由来する約５０〜７９個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドと、ＥＧＦ受容体の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体の組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記薬剤が、配列ＩＤ番号２の配列に由来する約８０〜４１９個のアミノ酸を含み、その中にはＣ末端側の７９個のアミノ酸と、少なくとも３つのＮ結合型グリコシル部位とが存在している、グリコシル化された単離ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上記薬剤が、配列ＩＤ番号２の配列に由来する約８０〜４１９個のアミノ酸を含み、その中にはＣ末端側の７９個のアミノ酸と、少なくとも３つのＮ結合型グリコシル部位とが存在している、グリコシル化された単離ポリペプチドと、ＥＧＦ受容体の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体の組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＥＧＦ受容体の発現を特徴とする固形ガンを治療するための薬理学的組成物であって、（ａ）配列ＩＤ番号１の配列に由来する約５０〜７９個のアミノ酸を含み、ＥＧＦ受容体の細胞外領域に少なくとも１０８のアフィニティで結合する単離ポリペプチド、（ｂ）配列ＩＤ番号２の配列に由来する約８０〜４１９個のアミノ酸を含み、その中にはＣ末端側の７９個のアミノ酸と、少なくとも３つのＮ結合型グリコシル部位とが存在している、グリコシル化された単離ポリペプチド、（ｃ）ＥＧＦ受容体の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体、（ｄ）これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択した薬剤と、薬理学的に受容可能な基剤とを含むが、この薬剤がモノクローナル抗体のみからなるものではない、という薬理学的組成物。
【請求項８】
上記薬剤が、配列ＩＤ番号１の配列に由来する約５０〜７９個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドである、請求項７に記載の薬理学的組成物。
【請求項９】
上記薬剤が、配列ＩＤ番号１の配列に由来する約５０〜７９個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドと、ＥＧＦ受容体の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体の組み合わせである、請求項７に記載の薬理学的組成物。
【請求項１０】
上記薬剤が、配列ＩＤ番号２の配列に由来する約８０〜４１９個のアミノ酸を含み、その中にはＣ末端側の７９個のアミノ酸と、少なくとも３つのＮ結合型グリコシル部位とが存在している、グリコシル化された単離ポリペプチドである、請求項７に記載の薬理学的組成物。
【請求項１１】
上記薬剤が、配列ＩＤ番号２の配列に由来する約８０〜４１９個のアミノ酸を含み、その中にはＣ末端側の７９個のアミノ酸と、少なくとも３つのＮ結合型グリコシル部位とが存在している、グリコシル化された単離ポリペプチドと、ＥＧＦ受容体の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体の組み合わせである、請求項７に記載の薬理学的組成物。
【請求項１２】
ＥＧＦ受容体の発現を特徴とする固形ガン組織に治療薬をターゲッティングさせる方法であって、この治療薬を、配列ＩＤ番号１の配列に由来する約５０〜７９個のアミノ酸を含み、ＥＧＦ受容体の細胞外領域に少なくとも１０８のアフィニティで結合する単離ポリペプチドに付着させる操作を含む方法。
【請求項１３】
上記単離ポリペプチドが、配列ＩＤ番号１の配列に由来する約６９〜７９個のアミノ酸である、固形ガン組織に治療薬をターゲッティングさせる請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＥＧＦ受容体を発現している腫瘍を有する患者の腫瘍治療の予後予測を行なう方法であって、（ａ）患者の血液、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択した体液サンプルを取得し、（ｂ）ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、免疫組織化学法、ウエスタンブロット分析法からなるグループの中から選択して抗ｐ６８ＨＥＲ−２抗体をベースとしたアッセイを行なうことにより、発現しているｐ６８ＨＥＲ−２の量を測定し、（ｃ）ＥＧＦ受容体の細胞外領域が体液中にどれだけの量含まれているかを測定し、（ｄ）ｐ６８ＨＥＲ−２の量とＥＧＦ受容体の細胞外領域の量の比を明らかにすることにより、ＥＧＦ受容体の細胞外領域の量よりもｐ６８ＨＥＲ−２の量が多いほど患者の予後がよいと判定する操作を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連する出願の相互参照
本出願は、ＨＥＲ−２に結合するアンタゴニストという名称で２０００年２月１６日に出願されたアメリカ合衆国特許出願シリアル番号第０９／５０６，０７９号の一部継続出願であり、このシリアル番号第０９／５０６，０７９号の出願は、ＨＥＲ−２に結合するアンタゴニストという名称で１９９９年１月２０日に出願されたアメリカ合衆国特許出願シリアル番号第０９／２３４，２０８号の一部継続出願となっている。
【０００２】
発明の背景
ＨＥＲ−２に結合するアンタゴニストを説明し、提供する。さらに詳細には、イントロンが保持されていることによってＨＥＲ−２受容体と結合するＨＥＲ−２の新規なアンタゴニスト・ポリペプチドが生まれる。
【０００３】
この仕事は、国防総省（ＤＯＤ）の乳ガン研究計画からの助成を受けた。アメリカ合衆国政府は、この発明に関して所定の権利を有する。
【０００４】
ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（ｅｒｂＢ−２）ガン遺伝子は、受容体様チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）をコードしている。このＲＴＫは、ヒトの何種類かのガン（ＨｙｎｅｓとＳｔｅｍ、Ｂｉｏｃｈｉｍ． ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ、１１９８巻、１６５〜１８４ページ、１９９４年；Ｄｏｕｇａｌｌ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第９巻、２１０９〜２１２３ページ、１９９４年）および哺乳類の発生（Ｌｅｅ他、Ｎａｔｕｒｅ、第３７８巻、３９４〜３９８ページ、１９９５年）においてある役割を果たしているというので精力的に研究されてきた。ＨＥＲ−２タンパク質の配列は、クローニングされたｃＤＮＡが、胎盤（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３０巻、１１３２〜１１３９ページ、１９８５年）および胃ガン細胞系（ヤマモト他、Ｎａｔｕｒｅ、第３１９巻、２３０〜２３４ページ、１９８６年）からの上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）のｍＲＮＡと相同性を有することから決定された。ＨＥＲ−２のｍＲＮＡは、約４．５ｋｂであることがわかっており（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３０巻、１１３２〜１１３９ページ、１９８５年；ヤマモト他、Ｎａｔｕｒｅ、第３１９巻、２３０〜２３４ページ、１９８６年）、ヒトの正常組織および悪性組織において１８５ｋＤａの膜貫通糖タンパク質（ｐ１８５ＨＥＲ−２）をコードしている（ＨｙｎｅｓとＳｔｅｍ、Ｂｉｏｃｈｉｍ． ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ、１１９８巻、１６５〜１８４ページ、１９９４年；Ｄｏｕｇａｌｌ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第９巻、２１０９〜２１２３ページ、１９９４年）。ＨＥＲ−２遺伝子の機能は、主として、トランスフェクションされた細胞内で４．５ｋｂの転写産物に対応するｃＤＮＡを発現させることによってと、１８５ｋＤａタンパク質産物の構造ならびに生化学的特性から調べられている。ｐ１８５ＨＥＲ−２は、大きな細胞外領域と、膜貫通領域と、チロシンキナーゼ活性を有する細胞内領域とからなる（ＨｙｎｅｓとＳｔｅｍ、Ｂｉｏｃｈｉｍ． ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ、１１９８巻、１６５〜１８４ページ、１９９４年；Ｄｏｕｇａｌｌ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第９巻、２１０９〜２１２３ページ、１９９４年）。ｐ１８５ＨＥＲ−２を過剰発現させると、培養した細胞の形質転換が起こる（ＤｉＦｉｏｒｅ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３７巻、１７８〜１８２ページ、１９８７年；Ｈｕｄｚｉａｋ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第８４巻、７１５９〜７１６３ページ、１９８７年）。また、ｐ１８５ＨＥＲ−２の過剰発現には、臨床上、乳ガンと卵巣ガンの急激な進行が伴う（Ｓｌａｍｏｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３５巻、１７７〜１８２ページ、１９８７年；Ｓｌａｍｏｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４４巻、７０７〜７１２ページ、１９８９年）。ｐ１８５ＨＥＲ−２は、ＥＧＦＲと相同性が極めて大きい。しかしｐ１８５ＨＥＲ−２に対して高アフィニティで直接結合するリガンドは、まだ同定されていない。しかも、ＨＥＲ−２のシグナル伝達活性は、ＥＧＦＲファミリーの他のリガンド結合メンバーとのヘテロダイマー化によるらしい（ＣａｒｒａｗａｙとＣａｎｔｌｅｙ、Ｃｅｌｌ、第７８巻、５〜８ページ、１９９４年；Ｅａｒｐ他、Ｂｒ��ａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｔｒｅａｔ．、第３５巻、１１５〜１３２ページ、１９９５年；Ｑｉａｎ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第１０巻、２１１〜２１９ページ、１９９５年）。
【０００５】
ＨＥＲファミリーに属するＲＴＫの細胞外領域のいくつかの領域を含むさまざまなタンパク質の産生は、完全長受容体のタンパク質分解プロセシングを通じて（ＬｉｎとＣｌｉｎｔｏｎ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第６巻、６３９〜６４３ページ、１９９１年；Ｚａｂｒｅｃｋｙ他、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、第２６６巻、１７１６〜１７２０ページ、１９９１年；Ｐｕｐａ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第８巻、２９１７〜２９２３ページ、１９９３年；Ｖｅｃｃｈｉ他、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、第２７１巻、１８９８９〜１８９９５ページ、１９９６年；ＶｅｃｃｈｉとＣａｒｐｅｎｔｅｒ、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第１３９巻、９９５〜１００３ページ、１９９７年）、また選択的ＲＮＡプロセシングを通じて（Ｐｅｔｃｈ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第１０巻、２９７３〜２９８２ページ、１９９０年；Ｓｃｏｔｔ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第１３巻、２２４７〜２２５７ページ、１９９３年；ＬｅｅとＭａｉｈｌｅ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第１６巻、３２４３〜３２５２ページ、１９９８年）起こる。ｐ１８５ＨＥＲ−２の細胞外領域は、培養した乳ガン細胞のタンパク質分解によって生まれる（Ｐｅｔｃｈ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第１０巻、２９７３〜２９８２ページ、１９９０年；Ｓｃｏｔｔ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第１３巻、２２４７〜２２５７ページ、１９９３年；ＬｅｅとＭａｉｈｌｅ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第１６巻、３２４３〜３２５２ページ、１９９８年）。また、このｐ１８５ＨＥＲ−２の細胞外領域は、ある種のガン患者の血清中に見いだされるため（Ｌｅｉｔｚｅｌ他、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．、第１０巻、１４３６〜１４４３ページ、１９９２年）、乳ガン転移の血清マーカーとして使えるであろう（Ｌｅｉｔｚｅｌ他、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．、第１０巻、１４３６〜１４４３ページ、１９９２年）。さらにこのｐ１８５ＨＥＲ−２の細胞外領域は、ＨＥＲ−２リッチな腫瘍を免疫系による監視から逃れさせている可能性もある（Ｂａｓｅｌｇａ他、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．、第１４巻、７３７〜７４４ページ、１９６６年；Ｂｒｏｄｏｗｉｃｚ他、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ、第７３巻、８７５〜８７９ページ、１９９７年）。
【０００６】
ＨＥＲ−２の細胞外領域の断片は、選択的スプライシングによる２．３ｋｂの転写産物でもあり、イントロン内のポリアデニル化シグナルを利用して産生される（Ｓｃｏｔｔ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第１３巻、２２４７〜２２５７ページ、１９９３年）。選択的スプライシングによるこの転写産物は、胃ガン細胞系ＭＫＮ７において最初に同定された（ヤマモト他、Ｎａｔｕｒｅ、第３１９巻、２３０〜２３４ページ、１９８６年；Ｓｃｏｔｔ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第１３巻、２２４７〜２２５７ページ、１９９３年）。受容体の断片は、これらガン細胞から分泌されるのではなく、むしろ核周辺の細胞質に位置していた（Ｓｃｏｔｔ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第１３巻、２２４７〜２２５７ページ、１９９３年）。しかしこの細胞外領域ポリペプチド断片には特別な治療上、診断上、研究上の用途が見つかっていない。選択的スプライシングによって産生されるＥＧＦＲの細胞外領域断片（Ｐｅｔｃｈ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第１０巻、２９７３〜２９８２ページ、１９９０年）は、分泌されて、リガンドに結合する性質とダイマー化する性質を示し（Ｂａｓｕ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第９巻、６７１〜６７７ページ、１９８９年）、受容体の機能に対してドミナント・ネガティブな効果を及ぼす可能性がある（Ｂａｓｕ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第９巻、６７１〜６７７ページ、１９８９年；Ｆｌｉｃｋｉｎｇｅｒ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第１２巻、８８３〜８９３ページ、１９９２年）。
【０００７】
ＥＧＦ受容体（ＨＥＲ−１、ｅｒｂＢ−１）、ＨＥＲ−２（ｅｒｂＢ−２）、ＨＥＲ−３（ｅｒｂＢ−３）、ＨＥＲ−４（ｅｒｂＢ−４）などのグループＩ受容体チロシンキナーゼは、上皮組織、間充組織、神経組織で広く発現し、増殖と分化において基本的な役割を担っている。ｐ１８５ＨＥＲ−２は別にして、受容体チロシンキナーゼは、さまざまなＥＧＦ関連増殖因子と結合することによって活性化される。リガンドの結合は、受容体のダイマー化、チロシンの自己リン酸化、シグナル活性化と関係している。ｐ１８５ＨＥＲ−２は、特定の増殖因子と結合することとは無関係に、自らダイマー化するか、あるいは、パートナーとなる好ましいヘテロダイマーとして招集されて他の受容体ファミリーに属するメンバーの転写促進を行なう。
【０００８】
細胞膜においてグループＩ受容体の量が増加すると、ヒトでしばしばガンが発生する。受容体の数がこのように増加することにより、受容体オリゴマーの形成が促進され、シグナルが増幅されるらしい。ＥＧＦ受容体とｐ１８５ＨＥＲ−２は、非常にしばしば、かつ明確に、ヒトの悪性腫瘍に付随している。ＨＥＲ−２は、脳、卵巣、胃、子宮内膜のガンにおいて過剰発現している。乳ガンや卵巣ガンでｐ１８５ＨＥＲ−２のレベルが２５〜３０％が増加すると、生存率が有意に低下し、再発までの時間が短くなることが予測される。ＥＧＦ受容体遺伝子の増幅と変化は、肺の扁平上皮細胞ガン（Ｐａｖｅｌｉｃ他、１９９３年）、グリア細胞腫瘍（Ｌｉｂｅｒｍａｎｎ他、１９８５年）、グリオブラストーマでしばしば観察されるが、その中でも、最も悪性のグリア細胞腫瘍であるグリオブラストーマで観察される頻度が最も高い。
【０００９】
受容体の活性化メカニズムを理解し、細胞表面で受容体の作用を阻止することを目的として、グループＩ受容体の細胞外領域の構造と機能を明らかにする努力が精力的に続けられてきた。細胞外領域と膜アンカーからなる受容体突然変異体は、細胞質領域がない場合には、ダイマー化して（Ｌｅｍｍｏｎ他、１９９７年；Ｔｚａｈａｒ他、１９９７年；ＴａｎｎｅｒとＫｙｔｅ、１９９９年）、細胞表面の受容体との間でキナーゼに対して不活性な複合体を形成することができる（Ｇｒｅｅｎｅ）。グループＩ受容体の細胞外領域は、（Ｎ末端から始まる）サブドメインＩ〜サブドメインＩＶに分割されており、膜隣接位置で終わっている。サブドメインＩＩとＩＶは多数のシステイン残基を含んでおり、これらシステイン残基は、４つのグループＩ受容体において保存されている。サブドメインＩとＩＩは、サブドメインＩＩＩとＩＶの繰り返し単位であるように見える。これは、おそらく遺伝子重複によって生じたのであろう（Ｕｌｌｒｉｃｈ他、１９８４年）。ＥＧＦ受容体からサブドメインＩとＩＩが欠失すると、リガンドとは関係なく、構成的ダイマー化が起こるとともにガンに形質転換し（Ｈａｙｅｌｙ他、１９８９年；ＣａｒｔｅｒとＫｕｎｇ、１９９４年；Ｑｉａｎ他、１９９４年；Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｏ他、１９９６年）、リガンドとは関係なく、膜に固定されたｐ１８５ｎｅｕ細胞外領域突然変異体とヘテロダイマーを形成できるようになる（Ｇｒｅｅｎｅ）。サブドメインＩＩＩは、ＥＧＦがＥＧＦ受容体と結合することからわかるように、高アフィニティのリガンド結合部位を含んでいる（Ｗｕ他、１９９０年；Ｗｏｌｔｊｅｒ他、１９９２年；Ｌａｘ他、１９８９年、１９９１年）が、サブドメインＩのほうは、リガンドの認識に関して相手を特定しない低アフィニティ部位として機能することが示唆されている（Ｌａｘ他、１９８９年、１９９１年；Ｔｚａｈａｒ他、１９９７年）。このモデルによると、ＥＧＦ様リガンドは二面性があり、サブドメインＩＩＩ内にあって受容体に直接結合する高アフィニティ部位と、サブドメインＩ内にあって特異性がゆるやかでｐ１８５ＨＥＲ−２と相互作用するほうを好む低アフィニティ部位とを有するため、ｐ１８５ＨＥＲ−２がなぜダイマーの好ましいパートナーとなるかが説明される。これらの結果を合わせて考えると、サブドメインＩとＩＩは、リガンドがない場合にはダイマー化にマイナスの制約を与えているため、受容体を招集してヘテロダイマーを形成するのに重要である可能性があることが示唆される。
【００１０】
腫瘍の増殖を制限するのにｐ１８５ＨＥＲ−２の細胞外領域とＥＧＦ受容体に対するモノクローナル抗体が有効であることがわかった。この抗体は、高アフィニティと高い特異性でもって標的となる対応する受容体と結合するため、毒性は低い。抗体の抗腫瘍効果の裏に隠れているメカニズムははっきりしていない。ｒｈｕＭＡｂ４Ｄ５モノクローナル抗体（ハーセプチン（登録商標））は、ｐ１８５ＨＥＲ−２をダウンレギュレーションすることによって細胞表面で作用し、ＨＥＲ−２を介した細胞増殖に可逆的な細胞分裂抑制効果を及ぼしている可能性がある（Ｈｕｒｗｉｔｚ他、１９９５年）。ハーセプチン（登録商標）を全身投与すると治療効果があることがわかっている。というのも、転移した乳ガン患者のグループで再発までの期間が延びたからである。ＥＧＦ受容体に対する高アフィニティのヒト化モノクローナル抗体は、抗腫瘍薬としても用いられている。ＥＧＦ受容体に対して抗体が活性を有することの裏に隠れている分子メカニズムはまだ明らかになっていないが、テストした抗体は、増殖因子の結合と競合した。ｐ１８５ＨＥＲ−２とＥＧＦ受容体を標的とする抗体戦略や、これら２つの受容体間のヘテロダイマーを標的とする抗体戦略も、以前から試みられている。予備的な結果によると、両方の受容体を標的にすると抗増殖効果が有意に増大することが示唆されている。
【００１１】
細胞外領域からなる受容体突然変異体が腫瘍発生を抑制する効果を持つことが明らかにされた。膜に固定されたｐ１８５ｎｅｕの細胞外領域は、細胞内で異所発現し、ドミナントネガティブな抑制剤として機能する。これは、この細胞外領域が、グループＩ受容体の細胞外領域とダイマー化してキナーゼに対して不活性な複合体を形成する能力を有することに基づいている。ｐ１８５ｎｅｕの細胞外領域突然変異体は、ｐ１８５ＨＥＲ−２ホモダイマーのシグナル伝達を特異的に抑制するとともに、ＥＧＦ受容体のシグナル伝達をトランス抑制することもできる。ｐ１８５細胞外領域は、すべてのグループＩ受容体の活性化を抑制することができる。というのも、ｐ１８５ＨＥＲ−２は、グループＩのＲＴＫにとってヘテロダイマーを形成する際の好ましいパートナーだからである。しかしドミナントネガティブ効果を及ぼすには、細胞外領域突然変異体が膜に固定されることが必要である。というのも、可溶性のある細胞外領域と細胞表面受容体の間の相互作用は、複合体を形成するのに弱過ぎるからである。
【００１２】
発明のまとめ
本発明は、ハースタチンと呼ばれる、ＨＥＲ−２受容体チロシンキナーゼの天然抑制剤に関する。このハースタチンは、ｐ１８５ＨＥＲ−２のＮ末端側のサブドメインＩとＩＩに一致する最初の３４０個のアミノ酸と、それに続く７９個のアミノ酸からなる新規なＣ末端と、挿入された配列によって特定される終止コドンとで構成されている。可溶性のある細胞外領域とは異なり、ハースタチンは、高アフィニティ（約１４ｎＭ Ｋｄ）でもってｐ１８５ＨＥＲ−２の細胞表面に結合する。ハースタチンは分泌されてｐ１８５ＨＥＲ−２と細胞表面で複合体を形成するとはいえ、他のＥＧＲ様リガンドとは、ｐ１８５ＨＥＲ−２の活性を抑制する能力が異なる。現在行なっている研究において、われわれは、ハースタチンとｐ１８５ＨＥＲ−２の両方を発現させると細胞増殖が顕著に少なくなることを見いだした。これは、ｐ１８５の自己リン酸化が抑制されたことに対応している。さらに、ハースタチンの抑制活性は、ＥＧＦによるＥＧＦ受容体の活性化にまで及んでいる。
【００１３】
別の実施態様には、ＥＧＦ受容体の過剰発現を特徴とする固形腫瘍の治療法が開示されている。この治療法には、ＥＧＦ受容体の細胞外領域（ＥＣＤ）に結合する薬剤を投与する操作が含まれる。薬剤は、（ａ）配列ＩＤ番号１の配列に由来する約５０〜７９個のアミノ酸を含み、ＥＧＦ受容体の細胞外領域ＥＣＤに少なくとも１０８のアフィニティで結合する単離ポリペプチド、（ｂ）配列ＩＤ番号２の配列に由来する約８０〜４１９個のアミノ酸を含み、その中にはＣ末端の７９個のアミノ酸と、少なくとも３つのＮ結合型グリコシル部位とが存在している、グリコシル化された単離ポリペプチド、（ｃ）ＥＧＦ受容体のＥＣＤに結合するモノクローナル抗体、（ｄ）これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択する。薬剤をモノクローナル抗体だけで構成することはできない。
【００１４】
さらに別の実施態様には、ＥＧＦ受容体を過剰発現している固形腫瘍を治療するための薬理学的組成物が開示されている。この薬理学的組成物は、（ａ）配列ＩＤ番号１の配列に由来する約５０〜７９個のアミノ酸を含み、ＥＧＦ受容体の細胞外領域ＥＣＤに少なくとも１０８のアフィニティで結合する単離ポリペプチド、（ｂ）配列ＩＤ番号２の配列に由来する約８０〜４１９個のアミノ酸を含み、その中にはＣ末端の７９個のアミノ酸と、少なくとも３つのＮ結合型グリコシル部位とが存在している、グリコシル化された単離ポリペプチド、（ｃ）ＥＧＦ受容体のＥＣＤに結合するモノクローナル抗体、（ｄ）これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択した薬剤と、薬理学的に受容可能な基剤とを含んでいる。なお、薬剤をモノクローナル抗体のみと、薬学上許容される単体から構成することはできない。
【００１５】
さらに別の実施態様として、固形腫瘍組織に治療用薬剤を到達させる方法が開示されている。この方法には、ＥＧＦ受容体の過剰発現を特徴とする固形腫瘍組織に治療用薬剤を到達させる操作が含まれる。この方法には、治療用薬剤を、配列ＩＤ番号１の配列に由来する約５０〜７９個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドに付着させる操作が含まれる。このポリペプチドは、ＥＧＦ受容体の細胞外領域ＥＣＤに少なくとも１０８のアフィニティで結合する。
【００１６】
さらに別の実施態様として、ＥＧＦ受容体を過剰発現している腫瘍を有する患者の腫瘍を治療した後の予後予測法が開示されている。この方法には、（ａ）患者の血液、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択した体液サンプルを取得し、（ｂ）ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、免疫組織化学法、ウエスタンブロット分析法からなるグループの中から選択して抗ｐ６８ＨＥＲ−２受容体抗体をベースとしたアッセイを行なうことにより、発現したｐ６８ＨＥＲ−２受容体の量を測定し、（ｃ）体液に含まれるＥＧＦ受容体のＥＣＤの量を測定し、（ｄ）ｐ６８ＨＥＲ−２の量とＥＧＦ受容体の量の比を明らかにすることにより、ＥＧＦ受容体の量よりもｐ６８ＨＥＲ−２の量が多いほど患者の予後がよいと判定する操作が含まれる。
【００１７】
ハースタチンの１つの利点は、特に、グループＩ受容体チロシンキナーゼを含むヒトの腫瘍に対する治療法の開発に役立っていることである。ハースタチンの別の利点は、ｐ１８５ＨＥＲ−２またはＥＧＦ受容体を過剰発現している細胞の増殖を抑制できることである。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、イントロン８であると同定された２７４ｂｐの挿入体を有する、選択的スプライシングによるＨＥＲ−２の４．８ｋｂのｍＲＮＡが初めて発見されたことに基づいている。保持されているこのイントロンはイン・フレームであり、７９個のアミノ酸［配列ＩＤ番号１］をコードした後、ヌクレオチド配列２３６位に終止コドンを有する。この新規なｍＲＮＡからは、膜貫通領域と細胞内領域を欠いたＨＥＲ−２タンパク質断片が予測される。このタンパク質断片は、４１９個のアミノ酸［配列ＩＤ番号２］を含む。４１９個のアミノ酸は、ｐ１８５ＨＥＲ−２のＮ末端と一致する３４０個の残基と、Ｃ末端の新規な７９個の残基［配列ＩＤ番号１］からなる。Ｃ末端の新規な７９個のアミノ酸残基［配列ＩＤ番号１］に対して特異的な抗体、またはｐ１８５ＨＥＲ−２のＮ末端に対して特異的な抗体を用い、６８ｋＤａのタンパク質産物を同定した［配列ＩＤ番号２］。この６８ｋＤａのタンパク質は、新規なＨＥＲ−２転写産物であり、細胞抽出液の中や、いくつかの細胞系からの細胞外マトリックスの中に見いだされる。この新規な転写産物の発現は、トランスフェクトされていないヒト胚性腎臓細胞系で最大であった。
【００１９】
ここに提示した結果は、ＨＥＲ−２の新規なｍＲＮＡの発現を示している。このｍＲＮＡは、２７４個多いヌクレオチドを含んでおり、それはおそらくイントロン８であろう。この知見に合致するように、約４．８ｋｂの新規な転写産物が、ヒト胎児の腎臓組織とヒト胚性腎臓細胞系ＨＥＫ２９３で検出された。さらに、２．６ｋｂの転写産物が、挿入された配列、すなわちＨＥＲ−２のＥＣＤをコードしている配列に対して特異的なプローブを用いたノーザンブロット分析によりヒト胎児の肝臓組織で検出された（図２）。この２．６ｋｂというサイズは、挿入配列がＨＥＲ−２の２．３ｋｂのｍＲＮＡ断片（ヤマモト他、Ｎａｔｕｒｅ、第３１９巻、２３０〜２３４ページ、１９８６年；Ｓｃｏｔｔ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第１３巻、２２４７〜２２５７ページ、１９９３年）に含まれている場合に予想されるサイズである。挿入された配列には終止コドンが含まれているため、ｐ１８５ＨＥＲ−２タンパク質の３４０番目の残基の位置に、ＥＣＤ ＩＩＩａと表記する新規な７９個のアミノ酸延長部が含まれることが予測される。したがってこの予測されるタンパク質は、ｐ１８５ＨＥＲ−２の膜貫通領域と細胞内領域を欠いているが、細胞外領域のサブドメインＩとＩＩを含んでいる。予想されるように、ｐ１８５ＨＥＲ−２のＮ末端配列と、新規な配列を含むことで生まれるＣ末端延長部とを含む分泌タンパク質が検出された（図３と図５）。ＥＣＤ ＩＩＩａタンパク質は６８ｋＤａであることがわかった。これは、ｐ１８５ＨＥＲ−２のサブドメインＩとＩＩに見られる５つのＮ結合型グリコシル化部位がグリコシル化される場合に新規な転写産物によってコードされるタンパク質として予想されるサイズとほぼ同じである（Ｓｔｅｒｎ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第６巻、１７２９〜１７４０ページ、１９８６年）。
【００２０】
ここに提示したデータは、ｐ６８ＨＥＲ−２がｐ１８５ＨＥＲ−２に特異的に結合することを示している。ｐ１８５ＨＥＲ−２との結合は、ｐ６８ＨＥＲ−２のＮ末端のサブドメインＩとＩＩよりは、プロリン・リッチな新規なＥＣＤ ＩＩＩａ領域によって生じている可能性がある。インビトロでの欠失突然変異誘発によって生まれるＨＥＲ−２のＥＣＤもサブドメインＩとＩＩを備えているが、より近接した状態にされるのでなければｐ１８５ＨＥＲ−２の細胞外領域とは結合しない（Ｔｚａｈａｒ他、ＥＭＢＯ Ｊ．、第１６巻、４９３８〜４９５０ページ、１９９７年；Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９４巻、３２５０〜３２５５ページ、１９９７年；Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ他、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第４３１巻、１０２〜１０６ページ、１９９８年）。しかし新規なＥＣＤ ＩＩＩａペプチドは、ｐ１８５ＨＥＲ−２に対してと、ｐ１８５ＨＥＲ−２を過剰発現している形質転換された１７−３−１細胞に対して高アフィニティ（ｎＭの濃度）で結合する（図５）。ＥＣＤ ＩＩＩａペプチドが１７−３−１細胞に好んで結合するというのは、分泌されたｐ６８ＨＥＲ−２がｐ１８５ＨＥＲ−２の細胞外領域と細胞表面で相互作用することを示している。したがって、ｐ６８ＨＥＲ−２とその断片は、ＨＥＲ−２遺伝子によってコードされる天然のＨＥＲ−２結合タンパク質であるように思われる。ＥＧＦＲファミリーのリガンド（Ｇｒｏｅｎｅｎ他、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、第１１巻、２３５〜２５７ページ、１９９４年）とは異なり、ｐ６８ＨＥＲ−２はＥＧＦ相同領域を欠いており、ｐ１８５ＨＥＲという受容体そのものの最初の３４０個のアミノ酸を含んでいる。
【００２１】
以前に推定されたＨＥＲ−２のリガンドは、ＥＧＦＲファミリーのメンバーとヘテロダイマーの形態でのみｐ１８５ＨＥＲ−２と間接的に結合することがわかった（ＨｅｌｄｉｎとＯｓｔｍａｎ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．、第７巻、３３〜４０ページ、１９９６年）。ＥＣＤ ＩＩＩａは共通の受容体を通じてｐ１８５ＨＥＲ−２と間接的に結合することが可能であるが、界面活性剤で溶解させたｐ１８５ＨＥＲ−２は固定化したＥＣＤ ＩＩＩａペプチドによって特異的かつ効果的に“プルダウンされる”ため、こんなことは起こりそうにない（図５Ｂ）。
【００２２】
哺乳類のＥＧＦＲファミリーのメンバーに対する天然または人工のすべてのリガンドにとって、結合するというのは、受容体のダイマー化促進およびチロシンリン酸化促進と強く結びついている（ＨｙｎｅｓとＳｔｅｍ、Ｂｉｏｃｈｉｍ． ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ、１１９８巻、１６５〜１８４ページ、１９９４年；Ｄｏｕｇａｌｌ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第９巻、２１０９〜２１２３ページ、１９９４年；Ｇｒｏｅｎｅｎ他、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、第１１巻、２３５〜２５７ページ、１９９４年）。ｐ６８ＨＥＲ−２もＥＣＤ ＩＩＩａペプチドもｐ１８５ＨＥＲ−２と結合するにもかかわらず、ｐ１８５ＨＥＲ−２を活性化させないことがわかった。活性化は、ｐ１８５ＨＥＲ−２のチロシンリン酸化の程度が異なる２つの別々の細胞系、すなわち形質転換した１７−３−１細胞と、ＳＫＯＶ−３卵巣ガン細胞において評価した。さらに、ｐ１８５ＨＥＲ−２がダイマーの形態になることによって増加するインビトロでの自己リン酸化活性（Ｄｏｕｇａｌｌ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第９巻、２１０９〜２１２３ページ、１９９４年；Ｌｉｎ他、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第４９巻、２９０〜２９５ページ、１９９２年）は、ｐ６８ＨＥＲ−２とＥＣＤ ＩＩＩａにいずれによっても大きくならなかった。同様に、ショウジョウバエのＥＧＦ受容体の細胞外阻害剤であり、クラスＩのＲＴＫのアンタゴニストとして知られている唯一のものであるアルゴス・タンパク質は、この受容体のチロシンリン酸化を促進しなかった（Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、第３７６巻、６９９〜７０２ページ、１９９５年）。同様に、タイ２ＲＴＫの天然のアンタゴニストであるアンギオポエチン−２は、内皮受容体と結合したが、その受容体を活性化することはなかった（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７７巻、５５〜６０ページ、１９９７年）。
【００２３】
理論に囚われないとすると、ｐ６８ＨＥＲ−２はｐ１８５ＨＥＲ−２と結合するがｐ１８５ＨＥＲ−２を活性化させないのであるから、ｐ６８ＨＥＲ−２がｐ１８５ＨＥＲ−２のダイマー化を阻止している可能性がある。類推により、ＲＴＫへの結合が促進されるようなＨＥＲ−２のＥＣＤを作ったところ、このＨＥＲ−２のＥＣＤは、リン酸基転移と受容体活性化に必要な生産性のあるダイマーの形成を阻止し、ドメイン・ネガティブな効果を示した（Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９４巻、３２５０〜３２５５ページ、１９９７年）。可溶性ｐ６８ＨＥＲ−２は、ＨＥＲ−２のＥＣＤとは違ってｐ１８５ＨＥＲ−２への強い結合力を示したが、ＥＣＤのサブドメインＩとＩＩをやはり含んでいる。サブドメインＩは、ｐ１８５ＨＥＲ−２をヘテロマー複合体にするのに必要な、低アフィニティで何とでも結合するリガンド結合部位である可能性があるため（Ｔｚａｈａｒ他、ＥＭＢＯ Ｊ．、第１６巻、４９３８〜４９５０ページ、１９９７年）、ｐ６８ＨＥＲ−２がこの部位をブロックし、ｐ１８５ＨＥＲ−２がダイマーになるのを妨げている可能性がある。また、ｐ６８ＨＥＲ−２は、ｐ１８５ＨＥＲ−２に結合するための、まだ特性が同定されていないリガンドと競合する可能性もある。ヒト胎児の肝臓および腎臓においてｐ６８ＨＥＲ−２が組織特異的に発現することによって、これら器官の発達中にｐ１８５ＨＥＲ−２が占める程度が変わる可能性がある。しかも、ＨＥＲ−２遺伝子の増幅に伴ってガン細胞中でｐ６８ＨＥＲ−２よりもｐ１８５ＨＥＲ−２が過剰に発現するということ（図３）が、ｐ６８ＨＥＲ−２などの結合タンパク質の効果を上回るような選択的圧力によって起こる可能性がある。したがって、ｐ６８ＨＥＲ−２は、ｐ１８５ＨＥＲ−２の活性化を妨げる可能性のある天然のｐ１８５ＨＥＲ−２結合タンパク質の最初の例である。
【００２４】
薬理学的組成物
本発明は、さらに、ＨＥＲ−２を過剰発現している固形ガンを治療するための薬理学的組成物であって、（ａ）配列ＩＤ番号１の配列に由来する約５０〜７９個のアミノ酸を含み、ＨＥＲ−２の細胞外領域（ＥＣＤ）に少なくとも１０８のアフィニティで結合する単離ポリペプチド、（ｂ）配列ＩＤ番号２の配列に由来する約３００〜４１９個のアミノ酸を含み、その中にはＣ末端の７９個のアミノ酸と、少なくとも３つのＮ結合型グリコシル化部位とが存在している、グリコシル化された単離ポリペプチド、（ｃ）ＨＥＲ−２のＥＣＤと結合するモノクローナル抗体、（ｄ）これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択した薬剤と、薬理学的に受容可能な基剤とを含むが、上記薬剤がモノクローナル抗体のみからなることはありえないという薬理学的組成物を提供する。上記薬剤は、配列ＩＤ番号１の配列に由来する約５０〜７９個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドであることが好ましい。さらに好ましいのは、この薬剤が、配列ＩＤ番号１の配列に由来する約５０〜７９個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドと、ＨＥＲ−２のＥＣＤに結合するモノクローナル抗体の組み合わせになっていることである。
【００２５】
本発明のポリペプチドおよび／またはモノクローナル抗体の一方または両方を含む本発明の薬理学的組成物は、そのまま（複合体または組み合わせ）で、または、適切な基剤および添加剤と混合した薬理学的組成物として、患者に投与することができる。本発明のポリペプチドは、静脈内注射または点滴、腹腔内注射、皮下注射、筋肉内注射などの非経口的な方法で投与することができる。本発明のポリペプチドは、基剤と添加剤を加え、錠剤、ピル、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、分散液などの適切な製剤にして、経口的に、または直腸から投与することができる。本発明のポリペプチドは、皮膚パッチなどの方法で局所的に投与することにより、活性成分のレベルが全身で一定となるようにすることができる。本発明のポリペプチドは、局部に使用するクリーム、皮膚または粘膜のパッチ、皮膚または粘膜の表面に局所的に塗布するのに適切な液体またはゲルにされる。本発明のポリペプチドは、ＨＥＲ−２の過剰発現を特徴とするガンの局所的治療または全身治療のため、吸入器を用いて気道に投与することができる。
【００２６】
本発明で使用する本発明のポリペプチドの投与量は、この明細書に記載されている内容から当業者が決定することができる。本発明のポリペプチドは、（投与経路と、活性成分の薬物動態に依存する）本発明のポリペプチドの効果的な投与量と、製剤に応じた投与経路（すなわち経口、非経口、局所的、吸入など）に適した薬理学的基剤および添加剤を含むことになる。本発明の活性なポリペプチドは、混合、溶解、粒子化、糖衣形成、乳剤化、カプセル化、包括化、凍結乾燥といった方法で混合して薬理学的製剤にする。非経口投与する薬理学的組成物は、水溶性形態にした本発明のポリペプチドの水溶液を含んでいる。さらに、本発明のポリペプチドの分散液は、油性注射分散液として調製することができる。適切な親油性溶媒または賦形剤としては、ゴマ油などの不揮発性油、オレイン酸エチルやトリグリセライドなどの合成脂肪酸エステル、リポソームなどが挙げられる。水溶性注射分散液は、この分散液の粘性を高める物質、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、デキストランなど含むことができる。分散液は、より濃縮した溶液にできるよう、複合体または組み合わせの溶解性を高めるための安定化剤や薬剤を含んでいてもよい。
【００２７】
経口投与する薬理学的組成物は、活性成分を固体添加剤と組み合わせることにより得られる。固体添加剤としては、糖（例えばラクトース、ショ糖、マンニトール、ソルビトール）、セルロース調製物（例えばデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース）、ゼラチン、ガム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。さらに、分解剤や安定化剤を添加することもできる。
【００２８】
ｐ６８と、Ｃ末端領域にある７９個のアミノ酸の合成方法
ポリペプチドの合成は、ペプチド合成装置を、製造業者のペプチド合成指示書に従って使用することによりアミノ酸を順次つなげるという、多数ある標準的なポリペプチド合成法による。アミノ酸の数が１００未満の短いポリペプチドの場合には、アミノ酸を順次つなげるというポリペプチド合成法が最適である。さらに、異種ポリペプチドは、標準的な組み換えＤＮＡ技術を用いて形質転換した細胞で発現させることができる。すなわち、原核細胞または真核細胞のいずれかを形質転換し、発現に適した増殖培地を用意し、使用する細胞のタイプとその細胞の発現特性に応じてその培地または細胞内物質のいずれかから本発明のポリペプチドを精製する。
【００２９】
ｐ６８、Ｃ末端領域にある７９個のアミノ酸、またはこれらの組み合わせを用いたガンの治療法
本発明は、ＨＥＲ−２またはＨＥＲ−２変異体（実施例８を参照のこと）の過剰発現を特徴とする固形ガンを治療するためにＨＥＲ−２の細胞外領域（ＥＣＤ）と結合する薬剤を投与する操作を含む方法であって、この薬剤を、（ａ）配列ＩＤ番号１の配列に由来する約５０〜７９個のアミノ酸を含み、ＨＥＲ−２の細胞外領域（ＥＣＤ）に少なくとも１０８のアフィニティで結合する単離ポリペプチド、（ｂ）配列ＩＤ番号２の配列に由来する約３００〜４１９個のアミノ酸を含み、その中にはＣ末端の７９個のアミノ酸と、少なくとも３つのＮ結合型グリコシル化部位とが存在している、グリコシル化された単離ポリペプチド、（ｃ）ＨＥＲ−２のＥＣＤに結合するモノクローナル抗体、（ｄ）これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択するが、この薬剤がモノクローナル抗体のみからなることはありえないという方法を提供する。ＨＥＲ−２を過剰発現している固形ガンは、乳ガン、肺小細胞ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、胃ガン、子宮頚ガン、食道ガン、大腸ガンからなるグループの中から選択することが好ましい。上記薬剤は、配列ＩＤ番号１の配列に由来する約５０〜７９個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドであることが好ましい。より好ましいのは、上記薬剤が、配列ＩＤ番号１の配列に由来する約５０〜７９個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドと、ＨＥＲ−２のＥＣＤに結合するモノクローナル抗体の組み合わせである。
【００３０】
この明細書に記載したｐ６８ＨＥＲ−２ポリペプチドは、ＨＥＲ−２と結合し、キナーゼ領域を通じてシグナル伝達を妨げることが見いだされた。理論に囚われないとすると、新規なＥＣＤ ＩＩＩａ領域はｐ１８５ＨＥＲ−２との特異的結合に関与し、その結果としてｐ６８ＥＣＤＩ ＩＩＩａと相互作用することでｐ１８５ＨＥＲ−２のダイマー化を阻止し、その後に続くシグナル伝達を阻止する。したがってｐ６８ＨＥＲ−２はＨＥＲ−２のアンタゴニストとして機能し、シグナル伝達に不可欠なダイマー化を阻止することでシグナル伝達を阻止する。つまり、ＨＥＲ−２のアンタゴニストとしてのｐ６８ＨＥＲ−２の機能は、この明細書に記載したアミノ酸７９個のポリペプチドや、ＨＥＲ−２のＥＣＤに結合するモノクローナル抗体などの結合剤の機能とは異なっている。本発明の方法では、ＨＥＲ−２を過剰に発現している腫瘍内で腫瘍細胞に対してｐ６８ＨＥＲ−２が選択的圧力を加えることによってこの腫瘍細胞の成長を抑制する。同様に、結合剤であるＨＥＲ−２のアンタゴニストも、ＨＥＲ−２を過剰に発現している腫瘍内で腫瘍細胞に対して選択的圧力を加えてリガンドがＨＥＲ−２のＥＣＤと結合することを阻止し、ダイマー化する可能性が生まれる前にすでにシグナル伝達を阻止することにより、この腫瘍細胞の成長を抑制する。
【００３１】
Ｃ末端領域にある７９個のアミノ酸を利用した標的ターゲッティング分子
本発明は、さらに、ＨＥＲ−２の過剰発現を特徴とする固形ガン組織に治療薬をターゲッティングさせる方法であって、この治療薬を、配列ＩＤ番号１の配列に由来する約５０〜７９個のアミノ酸を含み、ＨＥＲ−２の細胞外領域（ＥＣＤ）に少なくとも１０８のアフィニティで結合する単離ポリペプチドに付着させる操作を含む方法を提供する。この単離ポリペプチドは、長さがアミノ酸約６９〜７９個であることが好ましい。この単離ポリペプチドは、ＨＥＲ−２のＥＣＤ上の部位のうち、ハーセプチン（登録商標）（ガンの治療に用いられる市販のヒト化モノクローナル抗体であり、ＨＥＲ−２のＥＣＤと結合する）の結合部位とは異なる部位に結合することが好ましい。アミノ酸７９個からなるこのポリペプチド［配列ＩＤ番号１］は、ＨＥＲ−２のＥＣＤに対して驚くほど高いアフィニティで結合する特性を示すことがわかった。さらに、そのような結合部位は、市販のヒト化モノクローナル抗体（ハーセプチン（登録商標））の結合部位とは異なっていて、このヒト化モノクローナル抗体の影響を受けない。したがって、この高い結合アフィニティにより、アミノ酸７９個からなるこのポリペプチドが、ＨＥＲ−２を発現している腫瘍細胞への標的ターゲッティング分子として機能する。
【００３２】
診断／予後予測用の薬剤としての抗ｐ６８抗体
ｐ６８ＨＥＲ−２のグリコシル化されたＥＣＤ ＩＩＩａ変異体３ポリペプチド（後出の表１を参照のこと）を発現させ、抗体産生用の抗原として使用した。より詳細には、ｐ６８ＨＥＲ−２に対して特異的な抗体を、ポリヒスチジン・タグを有する精製ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体３ペプチドをウサギに注射することによって調製した。このペプチドは、イントロンがコードしている新規なＣ末端領域すなわちｐ６８ＨＥＲ−２と同じものであり、この領域が、高いアフィニティでｐ１８５ＨＥＲ−２に結合する。単離したポリクローナル抗体により、ＥＣＤ ＩＩＩａペプチドまたはｐ６８ＨＥＲ−２のｐＭ量を高い特異性で検出した（図３と図５を参照のこと）。したがってｐ６８ＨＥＲ−２に対して特異的な抗体は、体液中および腫瘍組織中のｐ６８ＨＥＲ−２を、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、免疫組織化学法、ウエスタンブロット分析法などの診断技術を利用して検出するための診断用薬剤として有用である。
【００３３】
ＥＣＤ ＩＩＩａの１つ以上のエピトープ、ｐ６８ＨＥＲ−２のエピトープ、ペプチド断片のいずれかを特異的に認識し、したがってＥＣＤ ＩＩＩａ変異体（後出の表１を参照のこと）相互の違いを区別する抗体も、本発明に含まれる。そのような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生された抗体、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、これらのうちの任意のもののエピトープ結合断片などが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。本発明の抗体は、例えば、生物サンプル中のｐ６８ＨＥＲ−２の特定のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体を検出するのに使用できるため、患者のサンプルまたは組織サンプルに特定の変異体が存在しているかどうかや、特定の変異体の量が異常であるかどうかを調べることで、診断法または予後予測法の一部として利用できる。
【００３４】
このような抗体は、テスト化合物が特定のｐ６８ＨＥＲ−２変異体の発現および／または活性に対して及ぼす効果を評価するための化合物スクリーニング法と合わせて利用することもできる。さらに、このような抗体は、この明細書に記載したガン治療法と合わせて利用することができる。
【００３５】
抗体産生のためには、例えばポリヒスチジン・タグを有するＥＣＤ ＩＩＩａ変異体ポリペプチド、ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体ポリペプチドの断片、ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体の機能的等価物、ＥＣＤ ＩＩＩａ領域の突然変異体などを注射することによってさまざまな宿主動物に免疫を確立するとよい。このような宿主動物の具体例をほんの少しだけ挙げるならば、ウサギ、マウス、ハムスター、ラットであるが、これだけに限定されるわけではない。宿主の種が何であるかに応じ、さまざまなアジュバントを用いて免疫応答を高めることができる。アジュバントとしては、フロイント（完全、不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、リソレシチンなどの界面活性物質、ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシアニン、ジニトロフェノール、役に立つ可能性のあるヒトのアジュバント（ＢＣＧ（カルメット−ゲランの細菌）など）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）などが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【００３６】
ポリクローナル抗体は、免疫確立した動物の血清に由来する異種混合の抗体群である。モノクローナル抗体は、特定の抗原に対する均一な抗体群であり、培養した継代細胞系によって抗体分子を産生させることのできる任意の方法で得られる。方法としては、ケーラーとミルシュタインのハイブリドーマ法（Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻、４９５〜４９７ページ、１９７５年；アメリカ合衆国特許第４，３７６，１１０号）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｓｂｏｒ他、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、第４巻、７２ページ、１９８３年；Ｃｏｌｅ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第８０巻、２０２６〜２０３０ページ、１９８３年）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ他、『モノクローナル抗体とガン治療』、アラン Ｒ． リス社、７７〜９６ページ、１９８５年）が挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤというクラスのうちのどの免疫グロブリンでもよく、そのどのサブクラスでもよい。ハイブリドーマ産生ｍＡｂは、インビトロでもインビボでも培養することができる。インビボで大きな力価のｍＡｂを産生させるというのが、現在のところ最も好ましい産生方法である。
【００３７】
さらに、“キメラ抗体”を産生させるために開発された方法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第８１巻、６８５１〜６８５５ページ、１９８４年；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、第３１２巻、６０４〜６０８ページ、１９８４年；タケダ他、Ｎａｔｕｒｅ、第３１４巻、４５２〜４５４ページ、１９８４年）、すなわち、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子と、適切な生物活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子をスプライスするという方法を利用することができる。キメラ抗体は、個々の部分がそれぞれ異なる動物種に由来する構成の分子であり、例えば、ネズミのｍＡｂに由来する可変領域と、ヒト免疫グロブリンの定常領域とを有する抗体（ヒト化抗体）がそうである。
【００３８】
また、一本鎖抗体の産生方法（アメリカ合衆国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４２巻、４２３〜４２６ページ、１９８８年；Ｈｕｓｔｏｎ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第８５巻、５８７９〜５８８３ページ、１９８８年；Ｗａｒｄ他、Ｎａｔｕｒｅ、第３３４巻、５４４〜５４６ページ、１９８９年）を改変してＥＣＤ ＩＩＩａ変異遺伝子産物に対する一本鎖抗体を産生させることもできる。一本鎖抗体は、Ｆｖ領域のＨ鎖とＬ鎖の断片をアミノ酸架橋を通じて結合させることによって形成され、一本鎖のポリペプチドになる。
【００３９】
特定のエピトープを認識する抗体断片は、公知の方法で産生させることができる。そのような断片としては、例えば、抗体分子をペプシンで消化させて得られるＦ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２断片、Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２断片のジスルフィド結合を還元することにより得られるＦａｂ断片が挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。また、Ｆａｂ発現ライブラリー（Ｈｕｓｅ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４６巻、１２７５〜１２８１ページ、１９８９年）を構成して、望む特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片を迅速かつ容易に同定することもできる。
【００４０】
同様に、特定のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体に対する抗体は、当業者に周知の方法を用い、ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体を“真似る”抗イディオタイプ抗体を産生させるのに用いることができる（ＧｒｅｅｎｓｐａｎとＢｏｎａ、ＦＡＳＥＢ Ｊ、第７巻（５）、４３７〜４４４ページ、１９９３年；Ｎｉｓｓｉｎｏｆｆ、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１４７巻、２４２９〜２４３８ページ、１９９１年）。例えばＥＣＤ ＩＩＩａ変異体に結合する一方で、ｐ６８ＨＥＲ−２がＨＥＲ−２受容体に結合するのを競合的に抑制する抗体を用いると、ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体を“真似し”、したがってＨＥＲ−２受容体に結合してこのＨＥＲ−２受容体を中性化する抗イディオタイプ抗体を産生させることができる。このような中性化抗イディオタイプ抗体、またはこのような抗イディオタイプ抗体のＦａｂ断片は、ガン治療の投薬計画において利用することができる。
【００４１】
また、特定のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体に対する抗体で、ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体の活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用しうる抗体を産生させることができる。このような抗体は、ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体と結合し、ｐ１８５ＨＥＲ−２受容体を介したシグナル伝達に対するｐ６８ＨＥＲ−２の活性を変化させる。このような抗体は、特定のガンの治療および／または腫瘍の分化の調節に特に役立つ可能性がある。したがって、本発明は、さらに、ＨＥＲ−２を過剰発現しているガンの治療の予後を予測する方法であって、（ａ）血液、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択した体液サンプルを取得し、（ｂ）ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、免疫組織化学法、ウエスタンブロット分析法からなるグループの中から選択して抗ｐ６８ＨＥＲ−２抗体をベースとしたアッセイを行なうことにより、発現したｐ６８ＨＥＲ−２の量を測定する操作を含む方法を提供する。ガン治療の予後を予測するこの方法は、体液中のｐ１８５ＨＥＲ−２のＥＣＤの量を測定し、ｐ６８ＨＥＲ−２の量とｐ１８５ＨＥＲ−２の量の比を決定する操作をさらに含むことが好ましい。ｐ１８５ＨＥＲ−２に対するｐ６８ＨＥＲ−２の比の値が大きいほど患者の予後が優れている。
【００４２】
診断／予後予測用の薬剤としてのＥＣＤ ＩＩＩａ領域変異体
実施例１１（後出）は、ヒトのイントロン８の配列が、プロリン・リッチかつ多型であることを示している。別々の１５人から採取したゲノムＤＮＡをシークエンシングした結果、ＨＥＲ−２のイントロン８に可変配列領域が１０箇所あることが同定された。配列ＩＤ番号１０、図８、表１を参照のこと。図８は、イントロン８の最も一般的なヌクレオチド配列とそれに対応するポリペプチド配列を示している。この領域は、１０通りの多型（配列ＩＤ番号１０の中には文字Ｗ（２箇所）、Ｙ（３箇所）、Ｒ、Ｎ、Ｍ、Ｓ（２箇所）で示し、図８には“Ｘ”で示してある）を含んでおり、その結果として保存されないアミノ酸置換が起こっている（表１の注を参照のこと）。例えば、ヌクレオチド配列の１６１位に多型（Ｇ→Ｃ）があると（図８；表１）、配列ＩＤ番号１のアミノ酸残基＃５４の位置、または配列ＩＤ番号２の残基＃３９４の位置でアルギニン（Ｒ）がプロリン（Ｐ）に代わるはずである。図８または配列ＩＤ番号１０の１位で示されるＮ末端のグリシン（Ｇ）は、“ハースタチン”配列のアミノ酸残基３４１に対応する（Ｄｏｈｅｒｔｙ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９６巻、１０，８６９〜１０，８７４ページ、１９９９年）。図１（Ａ）に示したヌクレオチド配列（Ｄｏｈｅｒｔｙ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９６巻、１０，８６９〜１０，８７４ページ、１９９９年）は、図８に示した最も一般的であることがわかった配列と比べてアミノ酸残基＃６と＃７３の位置のアミノ酸が異なる多型になっている。
【００４３】
この結果は、ヒトの集団において、イントロン８がコードされている領域にいくつかのバリエーションが存在していて、ＥＣＤ ＩＩＩａを含むタンパク質変異体相互の間で生化学的特性や生物学的特性が異なる可能性のあることを示している。ヒトは遺伝的に、特に、２つの変異体に関してヘテロ接合になっているか、所定の１つの変異体に関してホモ接合になっているか、１つの二重変異体に関してホモ接合になっているかの可能性がある。腫瘍の進行にせよ最適の治療にせよ、ある一人の人に現われる変異体が何であるかによって異なる可能性がある。
【００４４】
この違いは、予後予測と診断のどちらにも役立つ。本発明は、ＥＣＤ ＩＩＩａを含むポリペプチドがＨＥＲ−２受容体に強固に結合でき、したがってこのＨＥＲ−２受容体をアンタゴニスト化できることを示している。このような高アフィニティで特異的な相互作用は、ＥＣＤ ＩＩＩａを含むポリペプチドの特殊な一次構造、二次構造、三次構造に依存する。ＥＣＤ ＩＩＩａ領域はプロリン・リッチであり、従来からよく知られていることとして、所定のタンパク質のプロリン・リッチ配列中にあるプロリン残基またはそれ以外の残基の保存されない置換は、このタンパク質の二次構造と三次構造に大きな影響を及ぼしうるということがある。したがって、本発明の多型は、（図８に示した）最も一般的な構造と比べて構造特性、生化学的特性、生物学的特性が大きく異なっているであろう。ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体タンパク質相互間の構造上の違いとしては、例えば、サイズ、電気陰性度、抗原性の違いが挙げられる。ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体相互間の生物学的特性の違いは、例えば、細胞分泌の程度、ＨＥＲ−２受容体の変化の性質および／または程度、薬物動態（例えば血清半減期、除去特性）、タンパク質分解に対する抵抗力、Ｎ結合型グリコシル化のパターンなどに見られるであろう。これら生物学的性質の違いが今度は腫瘍の進行を変化させることが予想され、したがって最適な治療のプロトコルを変化させることが予想される。そのため、ある人が特定の１つまたは複数のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体を有することがわかっていると（例えば所定の１つの変異体に関してヘテロ接合である人、または表１の変異体１１のように化合物変異体を有する人など）、そのことだけで、特定のガンになりやすさの予測ができる可能性がある。
【００４５】
ＥＣＤ ＩＩＩａ領域の遺伝的違いが明らかになるということは、ある人が有する特定のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体の性質を、その人の遺伝子診断を試みる前に配列同定アッセイによって確認できるはずであることを意味する。分析は、患者の体液に由来する任意のゲノムＤＮＡについて行なうことができる。体液は、一般には大人または子どもの血液サンプルであるが、その代わりとして、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織が可能である。ハイブリダイゼーションや増幅アッセイなどの標準的な遺伝子診断法を利用できると考えられる。特定のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体配列を検出するのに、生物サンプルのハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにおいて、ＤＮＡとＲＮＡのいずれかを用いることができる。このような配列同定アッセイとしては、サザンブロット分析法、ノーザンブロット分析法、一本鎖構造多型分析法、インサイチュ・ハイブリダイゼーション・アッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応（“ＰＣＲ”）分析法などが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。このような分析法により、ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体配列の発現に関する特徴を定量的にも定性的にも明らかにすることができよう。特徴としては、例えば、点突然変異および／または遺伝子発現の活性化または不活化が挙げられる。標準的なインサイチュ・ハイブリダイゼーション法を利用すると、所定の組織内でどの細胞が特定のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体配列を発現しているかに関する情報が得られる可能性がある。
【００４６】
ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体の核酸分子を検出する診断法は、分析する細胞種または組織に由来する核酸を、特定のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体に対して特異的な、標識された１つまたはそれ以上の核酸試薬すなわちプローブと接触させて培養する操作を含んでいることが好ましい。さらに好ましいのは、ＰＣＲまたは逆転写ＰＣＲを利用してＥＣＤ ＩＩＩａ領域内の核酸の違いを同定することである。ＰＣＲ反応の条件は、増幅された産物の収量と特異性が最適になるように選択するだけでなく、それに加えて、標準的なゲル電気泳動法を利用して分析できる長さを有する増幅産物が生成するように選択せねばならない。このような反応条件は当業者には周知であり、重要な反応パラメータとしては、例えば、オリゴヌクレオチド・プライマーの長さとヌクレオチド配列、アニーリングして伸長させるステップの温度、反応時間が挙げられる。ＰＣＲ反応の後、ＰＣＲ産物は、ヘテロ二本鎖検出、ＲＮＡアーゼＡを利用したＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの開裂、一本鎖構造多型、変性用勾配ゲル電気泳動などの方法で分析することができる。
【００４７】
さらに、特定のＥＣＤ ＩＩＩａ配列変異体が、制限部位を付加したり除去したりすること、また特定の制限断片のサイズを有意に変化させてしまっていることがわかっている場合には、制限断片長多型（“ＲＦＬＰ”）分析に基づいたプロトコルが適切である可能性がある。
【００４８】
ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体は、患者由来の体液に対して配列同定アッセイを行なうことにより、発現レベルで分析することもできる。体液は、一般には大人または子どもの血液サンプルであるが、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織などでもよい。発現を分析するためのよく知られている配列同定アッセイとしては、ｍＲＮＡをベースとした方法、例えばノーザンブロット法、（関係するｃＤＮＡに由来する核酸プローブを利用した）インサイチュ・ハイブリダイゼーション法、（Ｓｔ−Ｊａｃｑｕｅｓ他、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、第１３４巻、２６４５〜２６５７ページ、１９９４年に記載されている）定量的ＰＣＲ法が挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【００４９】
興味の対象であるＥＣＤ ＩＩＩａ変異体に対して特異的な抗体を利用することを含む、ポリペプチドをベースとした方法（例えばウエスタンブロット分析法があるが、これだけに限定されるわけではない）も、上に説明したように、利用することができよう。これらの方法により、所定のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体の発現量を少なくとも正と負の制御に関して定量することができる。さまざまなＥＣＤ ＩＩＩａのエピトープまたは変異体に対して特異的な種々のモノクローナル抗体を利用し、特定のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体を発現している細胞サンプルまたは組織サンプルを迅速にスクリーニングすること、またはＥＣＤ ＩＩＩａ変異体ポリペプチドのレベルを定量することができると好ましい。ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体ペプチド分子を定量的または定性的に検出するための好ましい診断法としては、例えば、特定のＥＣＤ ＩＩＩａを含むペプチドが、抗ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体に対して特異的な抗体との相互作用によって検出されるというイムノアッセイが挙げられる。これは、例えば、蛍光標識した抗体を用いる蛍光抗体法を、光学顕微鏡検出、フローサイトメトリー検出、蛍光定量検出のいずれかと組み合わせることによって実現できる。さらに、本発明で有用な抗体（またはその断片）を蛍光抗体法または免疫電子顕微鏡法などにおけるように組織構造を知るのに利用し、ＥＣＤ ＩＩＩａを含むペプチドを本来存在している場所で検出することもできる。このような方法を利用すると、特定のＥＣＤ ＩＩＩａを含むポリペプチドの存在だけでなく、検査している組織内におけるそのペプチドの分布も検出することができる。
【００５０】
ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体ポリペプチドのイムノアッセイには、ＥＣＤ ＩＩＩａを含むペプチドの同定が可能な検出可能標識をした抗体の存在下で培養した生物サンプル（例えば具体例を列挙した上記の体液）を培養し、結合した抗体を従来技術で周知の多数ある方法のうちの任意の方法で検出する操作が含まれていることが好ましい。生物サンプルは、ニトロセルロースなどの固相支持体または担体や、可溶性タンパク質、細胞、細胞粒子を固定することのできる他の固相支持体と接触させて、その上に固定化するとよい。固相支持体を適切な緩衝液で洗浄した後、抗ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体に特異的な検出可能標識抗体で処理する。次に、緩衝液を用いて固相支持体の２回目の洗浄を行ない、結合していない抗体を除去する。続いて、固相支持体上に結合している標識の量を従来法で検出する。
【００５１】
別の方法として、抗ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体に対して特異的な抗体を、酵素イムノアッセイすなわち固相酵素免疫検定法（“ＥＬＩＳＡ”）で使用する酵素に結合させることにより、この抗体に検出可能な標識をすることができる。抗体と結合する酵素は、適切な基質、好ましくは発光性基質と反応して化学基を生成させるため、それを例えば分光光度計、蛍光測定手段、目視などによって検出することができる。抗体に対する検出可能な標識として使用できる酵素としては、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカル・ヌクレアーゼ、Δ−５−ステロイド・イソメラーゼ、酵母のアルコール・デヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコース・オキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【００５２】
検出は、酵素に対する発光性基質を用いる熱量測定法によって実現することができる。検出は、目視により酵素反応の程度を適切な基準と比較することによって行なうこともできる。検出は、多彩な他のイムノアッセイ法のうちの任意の方法を用いて実現することもできる。例えば、抗体または抗体断片に放射性標識することにより、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）を利用してＥＣＤ ＩＩＩａを含むペプチドを検出することが可能である。放射性同位体は、γ線カウンター、シンチレーション・カウンターなどの手段により、あるいは放射能写真撮影により検出することができる。
【００５３】
抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光標識した抗体を適切な波長の光に曝露すると、蛍光のためにその抗体の存在が検出できる。最もよく使われる蛍光標識化合物としては、フルオレセイン・イソチオシアナート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレスカミンがある。
【００５４】
抗体に対しては、１５２Ｅｕやランタノイド系列に属する他の蛍光発光金属を用いて検出可能な標識をすることもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート化剤を用いて抗体に付着させることができる。
【００５５】
抗体は、化学発光化合物と結合させることによって検出可能な標識をすることもできる。化学発光体をタグとして有する抗体の存在は、化学反応中に発生する蛍光の存在を検出することによって明らかにされる。特に有用な標識用の化学発光化合物の具体例としては、ルミノール、イソルミノール、セロマティック・アクリジニウム・エステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステルがある。同様に、生物発光化合物を用いて本発明の抗体に標識することもできる。生物発光は、生物系で見つかった化学発光の一種であり、生体内で触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増大させている。生物発光タンパク質の存在は、蛍光の存在を検出することによって明らかにされる。標識の目的で重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、エクオリンである。
【００５６】
抗ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体に対して特異的な所定ロットの抗体の結合活性は、周知の方法で測定することができる。当業者であれば、定法を利用することによりそれぞれの測定におけるアッセイの操作条件や最適条件を決定できるはずである。
【００５７】
したがって、本発明は、プロリン・リッチなＥＣＤ ＩＩＩａ領域内に複数の可変配列位置が予想外に発見されたこと、また特定のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体に対して特異的な抗体が予想外に発見されたことに基づき、予後予測および診断に関する重要な情報とアッセイを提供する。
【００５８】
したがって、本発明は、さらに、ＨＥＲ−２を過剰に発現しているガン患者のガン治療の予後を予測する方法であって、（ａ）患者の血液、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択したから体液サンプルを取得し、（ｂ）ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、免疫組織化学法、ウエスタンブロット分析法からなるグループの中から選択して抗ｐ６８ＨＥＲ−２抗体をベースとしたアッセイを行なうことにより、発現したｐ６８ＨＥＲ−２の量を測定する操作を含む方法を提供する。ガン治療の予後を予測するこの方法は、体液に含まれるｐ１８５ＨＥＲ−２のＥＣＤの量を測定し、ｐ６８ＨＥＲ−２の量とｐ１８５ＨＥＲ−２の量の比を決定する操作をさらに含むことが好ましい。ｐ１８５ＨＥＲ−２に対するｐ６８ＨＥＲ−２の比の値が大きいほど患者の予後が優れている。ガン治療の予後を予測するこの方法は、特定のどのＥＣＤ ＩＩＩａ変異体が存在しているかを明らかにし、さまざまなＥＣＤ ＩＩＩａタンパク質変異体の個々の生化学的特性と生物学的特性を考慮してガンの治療を最適化する操作をさらに含むことが好ましい。
【００５９】
本発明は、さらに、ガン患者のガンの治療、予後予測、または診断を行なう方法であって、（ａ）患者の血液、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択した体液サンプルを取得し、（ｂ）配列同定アッセイにより、この体液サンプル中に特定のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体配列が存在しているかどうかを判定し、（ｃ）歴史データベースを用いて、このＥＣＤ ＩＩＩａ変異体配列の存在をガンの治療および診断と関連づける操作を含む方法を提供する。上記の配列同定アッセイは、ＤＮＡシークエンシング、ＰＣＲアッセイ、ＥＬＩＳＡ免疫アッセイ、イムノアッセイ、ハイブリダイゼーション・アッセイ、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択することが好ましい。
【００６０】
本発明は、さらに、患者のガンの治療、予後予測、または診断を行なう方法であって、（ａ）患者の血液、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択したから体液サンプルを取得し、（ｂ）ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、免疫組織化学法、ウエスタンブロット分析法からなるグループの中から選択して抗ｐ６８ＨＥＲ−２抗体をベースとしたアッセイを行なうことにより、この体液サンプル中にｐ６８ＨＥＲ−２のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体が存在しているかどうかを判定し、（ｃ）歴史データベースを用いて、このｐ６８ＨＥＲ−２のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体の存在またはその量をガンの治療および診断と関連づける操作を含む方法を提供する。
【００６１】
本発明は、さらに、ガンの治療、予後予測、または診断を行なう上記の方法が、体液サンプルに含まれるｐ１８５ＨＥＲ−２のＥＣＤの量を測定する操作をさらに含む方法を提供する。
【００６２】
本発明は、さらに、ガンの治療、予後予測、または診断を行なう上記の方法が、体液中のｐ１８５ＨＥＲ−２のＥＣＤの量を測定し、ｐ１８５ＨＥＲ−２のＥＣＤの量と特定のｐ６８ＨＥＲ−２のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体の量の比を測定する操作をさらに含む方法を提供する。
【００６３】
本発明は、さらに、後に示す配列ＩＤ番号１または配列ＩＤ番号２の配列のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体に対して特異的な抗体を提供する。
【００６４】
治療薬としてのｐ６８ＨＥＲ−２
理論に囚われないとすると、ｐ６８ＨＥＲ−２またはＥＣＤ ＩＩＩａペプチドは、細胞表面でｐ１８５ＨＥＲ−２に結合することにより、ＨＥＲ−２を過剰に発現している腫瘍細胞の成長を抑制しているように思われる。この仮説の検証を、ｐ６８ＨＥＲ−２の存在下および不在下で基質とは独立な細胞の成長をテストすることにより行なった。そのとき用いた細胞の内部では、ｐ１８５ＨＥＲ−２の過剰発現の程度に応じて悪性腫瘍が成長するが、ｐ６８ＨＥＲ−２はほとんど存在しないか検出できない。腫瘍の細胞毒性を予測するモデルとして、柔らかい寒天における、基質とは独立な細胞の成長を用いた。これは、形質転換活性を調べるための一般的な予測方法であり、細胞が腫瘍またはガンを発生させる能力を反映している（ＤｉＦｉｏｒｅ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３７巻、１７８〜１８２ページ、１９８７年；Ｈｕｄｚｉａｋ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第８４巻、７１５９〜７１６３ページ、１９８７年；Ｂａａｓｎｅｒ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第１３巻、９０１〜９１１ページ、１９９６年）。
【００６５】
柔らかい寒天において基質とは独立な細胞の成長にｐ６８ＨＥＲ−２が及ぼす効果を、ＳＫＯＶ−３ガン細胞と、ＨＥＲ−２をトランスフェクトした１７−３−１細胞を用いて測定した。両方の細胞とも腫瘍生成能力があり、ｐ１８５ＨＥＲ−２を過剰発現している。これら細胞を、ｐ６８ＨＥＲ−２の存在下および不在下でウシ胎仔血清を補充した培地に分散させ、湿潤な培養器の中で２１日間培養した。５０個を超える細胞が含まれるコロニーの数を数えることにより、基質とは独立な細胞の成長を定量した。図７は、ｐ６８ＨＥＲ−２の存在下で、ＳＫＯＶ−３細胞と１７−３−１細胞の両方に関し、基質とは独立な成長が数分の一に抑制されたことを示している。したがって、これらのデータは、ｐ６８ＨＥＲ−２が単に細胞毒性だけを有するのではなく、細胞毒性に加え、おそらくアポトーシス誘導性も有することを示している。
【００６６】
ハースタチンを同時に発現させることによりｐ１８５ＨＥＲ−２のレベルが抑制され、コロニーの形成が抑制される
ハースタチンの異所発現が、トランスフェクトされたＣｏｓ−７細胞中のｐ１８５ＨＥＲ−２に及ぼす効果を調べた。図９は、ＨＥＲ−２のみをトランスフェクトした細胞と比べると、ハースタチンも同時に発現させたときにはｐ１８５のレベルが約５分の１に低下したことを示している。ハースタチンの発現によってトランスフェクトされた細胞の生存率が低下するのであれば、そのことにより、同時にトランスフェクトされた細胞中でｐ１８５ＨＥＲ−２のレベルが低下することが説明できる。マーカー用ガラクトシダーゼ・プラスミドの発現が、同時にトランスフェクトされた細胞中で変化しているかどうかを調べた。図１０は、ガラクトシダーゼ・プラスミドをｐ１８５ＨＥＲ−２と同時にトランスフェクトした場合にガラクトシダーゼ活性が最大となり、対照（ｐｃＤＮＡエンプティ・プラスミド）を同時にトランスフェクトした場合よりも約３５％大きくなることを示している。ｐ１８５ＨＥＲ−２とガラクトシダーゼ・プラスミドに加えてハースタチンを細胞に同時にトランスフェクトした場合には、ガラクトシダーゼ活性が約３分の１に低下した。この低下は、別の２つの細胞系、ＣＨＯとＨＥＫ−２９３でも観察された。さらに、同程度の抑制が、ハースタチンとＨＥＲ−２をトランスフェクトした細胞中で別のマーカーである蛍光グリーン・タンパク質（ＦＰＧ）の発現を調べたときにも観察された（図示せず）。これらの結果は、ＨＥＲ−２のみをトランスフェクトした場合には同時にトランスフェクトしたマーカーのレベルを増加させるのに対し、ハースタチンとＨＥＲ−２を同時に発現させるとマーカーのシグナルが低下することを示している。１つの可能な説明は、トランスフェクトされた細胞の生存は、ｐ１８５ＨＥＲ−２の発現によって増大し、ハースタチンとｐ１８５ＨＥＲ−２の同時発現によって抑制されるというものである。
【００６７】
コロニーの形成に及ぼす直接的な効果を測定するため、ＣＨＯ細胞に対してトランスフェクションを行ない、２０日間にわたってＧ４１８による選択を実施し、生き残った細胞のコロニーを染色して定量した。ＣＨＯ細胞は、安定なトランスフェクションがなされた細胞を素早く増殖させるのに非常に適している。図１１に示したように、ｐ１８５ＨＥＲ−２をトランスフェクトすると、対照をトランスフェクトした細胞と比べてコロニーの増殖が約６０％増加したが、ハースタチンだけを発現させた場合には、増殖に有意な変化は見られなかった。しかしハースタチンをＨＥＲ−２と同時にトランスフェクトすると、ＨＥＲ−２だけをトランスフェクトした細胞と比べてコロニー形成が劇的に約７分の１に低下した（図１１）。
【００６８】
ハースタチンの発現によりｐ１８５ＨＥＲ−２のチロシンリン酸化が抑制される
ハースタチンの発現がｐ１８５ＨＥＲ−２に及ぼす効果をさらに評価するため、ｐ１８５ＨＥＲ−２発現プラスミドに対するハースタチンの割合を変化させた。ハースタチン発現プラスミドをｐ１８５ＨＥＲ−２発現プラスミドの５分の１のレベルで導入した場合には、ｐ１８５に対する影響はほとんどなかった。図１４に示したように、ＨＥＲ−２プラスミドに対してハースタチン発現プラスミドの量を増やしていくと、ｐ１８５ＨＥＲ−２のレベルが低下し、図１に示したように、トランスフェクトしたマーカーＧＦＰプラスミドの発現も低下した。それとは対照的に、図１３に示したように、対照であるＧＦＰ発現プラスミドだけをトランスフェクトすると、細胞の生存には影響を与えることはなく、添加したプラスミドの量に比例してＧＦＰの発現が増えた。したがって、ウエスタンブロット分析により検出したｐ１８５ＨＥＲ−２のレベル低下は、トランスフェクトされた細胞の生存率が低下したことと関係しているように思われる。図１５のレーン６に示したように、ｐ１８５ＨＥＲ−２のレベルが３分の１に低下したのに対し、ｐ１８５ＨＥＲ−２のチロシンリン酸化シグナルは２５分の１に減った。これは、ｐ１８５ＨＥＲ−２のチロシンリン酸化のレベルが約８分の１に低下したことを示している。ｐ１８５のチロシンリン酸化が抑制される程度は、ＨＥＲ−２発現プラスミドに対するハースタチンの割合によって影響され、この比が１：２のときに最も強い効果が観察された。図１５に示したように、レーン１とレーン６を比較すると、ハースタチン・プラスミドだけをトランスフェクトした場合には１８５ｋＤａのタンパク質に付随するチロシンリン酸化シグナルが約２分の１に低下したことがわかる。トランスフェクトしたプラスミドから発現したｐ１８５ＨＥＲ−２と同時にｐ１８５タンパク質が移動したが、このｐ１８５タンパク質は内在性ｐ１８５ＨＥＲ−２である可能性がある。これらの結果は、ハースタチンを異所発現させると外来性ｐ１８５ＨＥＲ−２のチロシンリン酸化が減少すること、また、ＨＥＲ−２発現プラスミドに対するハースタチンの割合が、ｐ１８５ＨＥＲ−２のチロシンリン酸化を抑制する程度とｐ１８５の発現レベルとに影響を与えることを示している。さらに、これらの知見から、ｐ１８５ＨＥＲ−２のチロシンリン酸化の減少が、ＨＥＲ−２とハースタチンを同時にトランスフェクトした細胞のコロニー形成の減少と関係していることもわかる。
【００６９】
ハースタチンの発現により、ｐ１８５ＨＥＲ−２を過剰発現している細胞のコロニー形成が強く抑制される。さらに、ハースタチンは、ＥＧＦ受容体の過剰発現によって増加した生存率を引き下げる。細胞生存率の低下は、ｐ１８５ＨＥＲ−２のチロシンリン酸化が減少することと、ＥＧＦによるＥＧＦ受容体の活性化が妨げられることに対応している。さらに別の証拠は、ｐ１８５ＨＥＲ−２に対する抑制活性として現われており、ハースタチンの負の調節活性は、グループＩファミリーに属する受容体チロシンキナーゼの第２のメンバーであるＥＧＦ受容体にまで及んでいる。
【００７０】
ハースタチンは、ｐ１８５ＨＥＲ−２のチロシンリン酸化を抑制する。ハースタチンをトランスフェクトすると、異所発現したｐ１８５の構成的チロシンリン酸化のレベルが８分の１に低下する。この抑制は、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、Ｃｏｓ−７細胞で観察される。ハースタチンによってｐ１８５のチロシンリン酸化がどの程度抑制されるかは、ハースタチンの投与量に依存する。というのも、抑制度は、細胞に添加されるＨＥＲ−２プラスミドの量に対するハースタチンの量の影響を受けるからである。ハースタチンは、受容体のリン酸基転移反応と活性化に不可欠なステップである受容体のダイマー化を妨げることにより、ｐ１８５ＨＥＲ−２受容体のチロシンリン酸化を抑制できる可能性がある。
【００７１】
ハースタチンが異所発現すると、ＥＧＦによるＥＧＦ受容体（ｐ１８５ＨＥＲ−２と相同性があるグループＩの受容体）の活性化も妨げられた。ハースタチンは、ＥＧＦにより誘起される受容体のチロシンリン酸化を減少させ、別の２つの細胞質タンパク質がＥＧＦからの刺激を受けてチロシンリン酸化するのを抑制し、受容体のダウンレギュレーションを妨げた。受容体のチロシンリン酸化とダウンレギュレーションは、ＥＧＦによりＥＧＦ受容体が活性化されたことの証拠である。ハースタチンによるＥＧＦ受容体の抑制は、ＥＧＦの飽和濃度で起こった。ハースタチンのＣ末端に位置する、イントロン８によってコードされている領域は、ｐ１８５ＨＥＲ−２に対して高アフィニティで結合するらしく、ＥＧＦ受容体と結合するが、ＥＧＦの結合とは競合しない（Ｄｏｈｅｒｔｙ他、投稿中）。これらの結果は、ハースタチンが、増殖因子の結合との競合を含まないメカニズムによってＥＧＦ受容体の活性化を阻止していることを示唆している。別の研究によれば、ハースタチンは“プルダウン”アッセイにおいてＥＧＦ受容体と結合することがわかっている（Ｄｏｈｅｒｔｙ他、投稿中）。ハースタチンはＥＧＦ受容体と安定な複合体を形成するように見えるため、ＥＧＦにより誘起されるホモダイマーの形成を抑制する可能性がある。ＥＧＦにより誘起されるホモダイマーの形成をハースタチンが阻止することによって、あるいは受容体との複合体形成を含まない別のメカニズムによって、ハースタチンがＥＧＦ受容体を間接的に抑制することもありうる。
【００７２】
ｐ１８５ＨＥＲ−２またはＥＧＦ受容体の過剰発現により、細胞の増殖および／または生存が促進される。細胞にｐ１８５ＨＥＲ−２をトランスフェクトすると、Ｇ４１８による選択を生き延びたコロニーの数が、対照をトランスフェクトした細胞と比べて約６０％増加した。また、ＥＧＦ受容体をトランスフェクトすると、細胞コロニーの数が対照をトランスフェクトした細胞と比べて約４０％増加した。ハースタチンだけをトランスフェクトしても、コロニーの数が有意に変化することはなかったが、ＣＨＯ細胞内にｐ１８５ＨＥＲ−２と同時に移動した内在性タンパク質に付随するチロシンリン酸化は確かに減った。ＣＨＯ細胞はｐ１８５ＨＥＲ−２以外はグループＩの受容体をほとんど含んでいないかまったく含んでいないため、これはｐ１８５ＨＥＲ−２であろう。ハースタチンをＥＧＦ受容体と同時に発現させると、ＥＧＦ受容体だけをトランスフェクトした細胞と比べてコロニーの形成が抑制された。ハースタチンがＥＧＦによるＥＧＦ受容体の活性化も抑制し、ＥＧＦ受容体と安定な複合体を形成することが見いだされた（Ｄｏｈｅｒｔｙ他、投稿中）ため、増殖の抑制は、ハースタチンがＥＧＦ受容体と不活性なキナーゼ複合体を形成したため、あるいは内在性ｐ１８５ＨＥＲ−２と複合体を形成することによりＥＧＦ受容体のトランス作用を抑制したためである可能性がある。増殖の抑制は、ＥＧＦ受容体またはｐ１８５ＨＥＲ−２との相互作用とは直接関係しない、ハースタチンの未知の独立な作用によって起こった可能性もある。最も強力な増殖抑制活性は、ハースタチンをｐ１８５ＨＥＲ−２と同時に発現させたときに観察された。この組み合わせにすると、コロニーの形成は、ｐ１８５ＨＥＲ−２だけをトランスフェクトした細胞と比べて７分の１に減り、ハースタチンだけをトランスフェクトした細胞または対照をトランスフェクトした細胞と比べて５分の１に抑制された。過剰発現したｐ１８５ＨＥＲ−２は、細胞内で構成的活性を持っており、その活性を止めると、細胞の増殖だけでなく生存まで抑制される可能性がある。
【００７３】
ハースタチンは、これまでに知られているグループＩの他のＲＴＫ抑制剤と比べると、ドミナント・ネガティブな抑制剤として機能するｐ１８５ｎｅｕ細胞外領域突然変異体との共通性をいくつか有することがわかる。ハースタチンと同様、膜に固定されたドミナント・ネガティブなｎｅｕ突然変異体は、受容体の細胞外領域からの配列を含んでおり、ＲＴＫと複合体を形成する（Ｄｏｈｅｒｔｙ他；Ｇｒｅｅｎｅ）。また、ｐ１８５ｎｅｕ細胞外領域と異所発現したハースタチンは、ｐ１８５ＨＥＲ−２とＥＧＦ受容体を抑制することが可能である。サブドメインＩ〜ＩＶと膜へのアンカーとからなる、以前に報告されているｐ１８５ｎｅｕ細胞外領域とは異なり、ハースタチンは、ｐ１８５ｎｅｕ細胞外領域からのサブドメインＩとＩＩしか含んでおらず、胎仔の腎臓細胞と肝臓細胞で発現する天然産物である（Ｄｏｈｅｒｔｙ他、１９９９年）。ハースタチンは分泌されるので、複合体を形成するための膜アンカーは必要なく、抑制活性を及ぼすこともない。
【００７４】
実施例１
この実施例では、細胞外領域（ＥＣＤ）をコードしている配列中のＨＥＲ−２のｍＲＮＡの多様性を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用して調べた実験の結果を示す。ＨＥＲ−２遺伝子が８倍に増幅されている卵巣ガン細胞系（Ｔｙｓｏｎ他、Ａｍ． Ｊ． Ｏｂｓｔｅｔ． Ｇｙｎｅｃｏｌ．、第１６５巻、６４０〜６４６ページ、１９９１年）である、（アメリカ基準培養株コレクション（ロックヴィル、メリーランド州）が、１０％のウシ胎仔血清と０．０５％のゲンタマイシンを補充したＤＭＥＭ中に維持している）ＳＫＯＶ−３細胞からのｃＤＮＡライブラリーを、エキソン１（Ｔａｌ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第７巻、２５９７〜２６０１ページ、１９８７年）に対して特異的でヌクレオチド１４２〜１６１と一致する順プライマーと、エキソン９（Ｓｃｏｔｔ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第１３巻、２２４７〜２２５７ページ、１９９３年）のヌクレオチド１２６５〜１２８６に相補的な逆プライマーとを用いて調べた。簡単に説明するならば、ＳＫＯＶ−３のｃＤＮＡライブラリーは、オリジーン・テクノロジーズ社（ロックヴィル、メリーランド州）から提供してもらうか、ＳＫＯＶ−３細胞から抽出したＲＮＡから調製するかした。トリリージェント（モレキュラー・リサーチ・センター社、シンシナチ、オハイオ州）を製造業者のプロトコルに従って用いることで１５ｃｍのプレート上に８０％の集密度で成長したＳＫＯＶ−３細胞からＲＮＡを抽出し、全ＲＮＡを得た。ＲＮＡは、逆転写およびｃＤＮＡライブラリー構成のために１０ｍＭのトリスＥＤＴＡ、ｐＨ８．０に再び分散させるか、リボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）のためにＲＮＡハイブリダイゼーション用緩衝液（８０％のホルムアルデヒド、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ、４ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に再び分散させるかした。ＲＮＡの濃度は、分光光度計でＯＤ２６０における値を測定した。ｍＲＮＡ抽出キット（オリゴテックス、キアジェン社）を用いてポリＡ＋ｍＲＮＡを全ＲＮＡから選択した。
【００７５】
サザンブロット法によってＨＥＲ−２に特異的であることがわかった約１４２０ｂｐの産物は、以前に報告されたｃＤＮＡ配列（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３０巻、１１３２〜１１３９ページ、１９８５年）から予想される１１４４ｂｐというサイズよりも約２７０ｂｐ大きかった。簡単に説明するならば、サザンブロット法の手続きに従い、真空下（バイオ−ラド・モデル７８５ヴァキューム・ブロッター）にある０．４ＭのＮａＯＨ中のアガロース・ゲルから核酸を遺伝子スクリーン・プラス・ハイブリダイゼーション・トランスファー膜（ネン・リサーチ・プロダクツ社、ボストン、マサチューセッツ州）に移した。ＵＶ−ストラターリンカー（ストラタジーン社、ラ・ジョラ、カリフォルニア州）の中でＵＶ架橋させることにより核酸を膜に固定し、その膜をハイブリダイゼーション用緩衝液（５０％のホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ、１０ｍｇ／ｍｌのニシンの精子ＤＮＡ）中で４２℃にて２時間にわたってブロックした。ランダム・プライムＤＮＡ標識キット（ベーリンガー・マンハイム社）を用い、膜を、ハイブリダイゼーション用緩衝液中で、４２℃にて１６時間にわたり、（α−３２Ｐ）ｄＣＴＰ（ネン・ライフ・サイエンシーズ社）で標識したＥＣＤ ＩＩＩａのｃＤＮＡからの２２０ｂｐのＫｐｎ−ＨｉｎｃＩＩ断片１０７ｃｐｍとハイブリダイズさせた。
【００７６】
鋳型を、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５μｇの各プライマー、２００μＭのｄＮＴＰを含む１×ハイ・フィデリティＰＣＲ緩衝液とともに、拡張ハイ・フィデリティＰＣＲシステム（ベーリンガー・マンハイム社）を用いてパーキン・エルマー遺伝子増幅ＰＣＲシステム２４００（パーキン・エルマー・シータス社、エメリーヴィル、カリフォルニア州）の中で増幅した。すべてのプライマーは、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社（ライフ・テクノロジーズ社）から得られた。ヌクレオチド残基とアミノ酸残基の番号は、Ｃｏｕｓｓｅｎｓ他が報告しているＨＥＲ−２のｃＤＮＡ配列（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３０巻、１１３２〜１１３９ページ、１９８５年）に従っている。ＨＥＲ−２の細胞外領域を増幅のターゲットとし、順プライマー（Ａ）（５’−ＴＧＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣ−３’［配列ＩＤ番号３］）と、逆プライマー（Ｂ）（５’−ＴＣＣＧＧＣＡＧＡＡＡＴＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣ−３’［配列ＩＤ番号４］）を用いてＳＫＯＶ−３のｃＤＮＡライブラリー（オリジーン・テクノロジーズ社）から増幅した。順プライマーは、ＨＥＲ−２のｃＤＮＡのヌクレオチド（ｎｔ）１４２〜１６１と一致していて開始コドン（下線部）の周囲に広がっており、逆プライマーは、ＨＥＲ−２のエキソン配列のｎｔ１２６５〜１２８６と相補的になっている。サイクルのパラメータは、９４℃で３０秒間；５８℃で４５秒間；６８℃で３分間を３０サイクルである。ゲノムＤＮＡからの（ＥＣＤ ＩＩＩａと表記する）新規な配列の周囲に広がっている領域は、ＨＥＲ−２のエキソンに対して特異的な配列のｎｔ１１３１〜１１５２と一致する順プライマー（Ｃ）（５’−ＡＡＣＡＣＡＧＣＧＧＴＧＴＧＡＧＡＡＧＴＧＣ−３’［配列ＩＤ番号５］）と、報告されている（Ｂｏｎｄ他、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第３６７巻、６１〜６６ページ、１９９５年）ようにして調製したＤＮＡに関する逆プライマー（Ｂ）［配列ＩＤ番号４］を用いて増幅した。サイクルのパラメータは、９４℃で３０秒間；６２℃で３０秒間；７２℃で６０秒間を２５サイクルである。
【００７７】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を利用し、ＥＣＤ ＩＩＩａ配列を含むｍＲＮＡの構造を調べた。まず最初に鎖状ｃＤＮＡを、０．５μｇのオリゴ−ｄＴで処理した５μｇのＲＮＡを用いて逆転写した（Ｂｏｎｄ他、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第３６７巻、６１〜６６ページ、１９９５年）。ＥＣＤ ＩＩＩａ挿入体とそれに隣接する５’ＨＥＲ−２エキソン配列を増幅するため、上記の順プライマー（Ａ）と、３’ＥＣＤ ＩＩＩａに対して特異的な配列に相補的な逆プライマー（Ｄ）（５’−ＡＴＡＣＣＧＧＧＡＣＡＧＧＴＣＡＡＣＡＧＣ−３’［配列ＩＤ番号６］）を用いた。サイクルのパラメータは、９４℃で３０秒間；６０℃で４０秒間；６８℃で２分間を３０サイクルである。
【００７８】
ＥＣＤ ＩＩＩａ挿入体とそれに隣接する３’ＨＥＲ−２エキソンに対して特異的な配列の増幅を、順プライマー（Ｅ）（５’−ＴＣＴＧＧＧＴＡＣＣＣＡＣＴＣＡＣＴＧＣ−３’［配列ＩＤ番号７］）と、逆プライマー（Ｆ）（５’−ＴＴＣＡＣＡＣＴＧＧＣＡＣＧＴＣＣＡＧＡＣＣ−３’［配列ＩＤ番号８］）を用いて行なった。順プライマーは、５’ＥＣＤ ＩＩＩａに対して特異的な配列と一致していてＫｐｎ１制限部位を含んでおり、逆プライマーは、ＨＥＲ−２のエキソン配列のｎｔ３８９８〜３９１９と相補的で、終止コドン（下線部）のまわりに広がっている。サイクルのパラメータは、９４℃で３０秒間；６０℃で４０秒間；６８℃で５分間を３０サイクルである。
【００７９】
ＰＣＲ産物をサブクローニングしてヌクレオチド配列を決定した。
その結果は、正常なＨＥＲ−２をコードしている配列が、５’プライマー配列から始まって中断することなくヌクレオチド１１７１まで続いていることを示していた。そしてこの位置で、２７４個のヌクレオチドからなる挿入体が見つかり、その後には予想されるコード配列が続き、その中に３’プライマーが含まれていた。予想されるタンパク質産物を分析した結果、２７４個のヌクレオチドからなる挿入体が、残基番号３４０から始まる既知のＨＥＲ−２タンパク質の延長部をコードしており（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３０巻、１１３２〜１１３９ページ、１９８５年）、アミノ酸が７９個続いた後にイン・フレーム終止コドンが存在していることを示していた（図１）。挿入されたヌクレオチドとそのヌクレオチドから予想されるアミノ酸配列を遺伝子バンクの配列と比較したところ、相同な配列は見つからなかった。この配列の５’接合部と３’接合部を調べたところ、共通するスプライス・ドナー部位とスプライス・アクセプター部位が明らかになり（ＳｈａｒｐとＢｕｒｇｅ、Ｃｅｌｌ、第９１巻、８７５〜８７９ページ、１９９７年）、挿入配列の３’末端近傍に、ピリミジン領域と、分岐点となる可能性のあるアデニン残基が含まれていることがわかった（図１）。したがって、この挿入配列はイントロンらしい。
【００８０】
挿入配列によってコードされる新規な７９個のアミノ酸として予想されるアミノ酸配列［配列ＩＤ番号１］を調べると、共通のＮ結合型グリコシル化部位があることと、１９％という高い割合でプロリンが含まれていることがわかる（図１）。挿入配列は、ｐ１８５ＨＥＲ−２配列の細胞外領域中のサブドメインＩＩとＩＩＩの間に位置しているため（Ｌａｘ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第８巻、１８３１〜１８３４ページ、１９８８年）、ＥＣＤ ＩＩＩａと表記した。この挿入配列は、隣接する５’ＨＥＲ−２エキソン配列と２３６ｎｔにわたってイン・フレームであり、その中に終止コドンが含まれている。
【００８１】
実施例２
この実施例では、ゲノム内でＨＥＲ−２のエキソンと隣接しているＥＣＤ ＩＩＩａの特性を明らかにする実験の結果を示す。ＥＣＤ ＩＩＩａ配列が存在する領域におけるＨＥＲ−２遺伝子の構造を調べるため、ヌクレオチド７６３〜７８５と一致する順プライマーと、ＨＥＲ−２のｃＤＮＡのヌクレオチド１２６５〜１２８６と相補的な逆プライマーを用い、ヒトゲノムＤＮＡについてＰＣＲを行なった。増幅産物は、エキソン５（Ｔａｌ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第７巻、２５９７〜２６０１ページ、１９８７年）からＥＣＤ ＩＩＩａ配列の３’に近接するエキソンまで広がっていることが予想された。イントロンの数とサイズは、ＰＣＲ産物のサイズ、制限消化分析、増幅産物の部分配列の分析に基づいて推定した。
【００８２】
次に、ＨＥＲ−２のエキソンに特異的で挿入体に直接接するプライマーを用いてヒトゲノムＤＮＡを調べ、ＥＣＤ ＩＩＩａ配列に直接接している配列を決定した。約４３０ｂｐの産物を、正常なヒトゲノムＤＮＡからと、３種類のガン細胞系ＳＣＯＶ−３、ＳＫＢＲ−３、ＢＴ４７４から抽出したゲノムＤＮＡから増幅した。これらすべてのガン細胞系においてＨＥＲ−２遺伝子が増幅されており（Ｋｒａｕｓ他、ＥＭＢＯ Ｊ．、第６巻、６０５〜６１０ページ、１９８７年）、ｃＤＮＡにＥＣＤ ＩＩＩａを発現していることがわかった。ＰＣＲ産物がＨＥＲ−２であることが、実施例１に記載した方法を利用したサザンブロット分析によって確認された。ヌクレオチド配列を分析したところ、ヒトゲノムＤＮＡからのＰＣＲ産物がＥＣＤ ＩＩＩａ挿入体を含んでおり、その両側が、ＨＥＲ−２をコードしている既知の配列に接していることがわかった。突然変異または再配置は見られなかった。これらのデータは、ＥＣＤ ＩＩＩａ配列が、完全な状態で保持されたイントロンであることを表わしており、増幅された産物がイントロン４の次に大きなサイズであることと、相同なＥＧＦＲ遺伝子およびＨＥＲ−２遺伝子のイントロン８の位置（ＬｅｅとＭａｉｈｌｅ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第１６巻、３２４３〜３２５２ページ、１９９８年）とに基づくと、このイントロンがイントロン８であるらしいことを示している。
【００８３】
実施例３
この実施例では、ＥＣＤ ＩＩＩａが、ＨＥＲ−２のｍＲＮＡのコード配列内に保持されている唯一のイントロンであることを示す。ＥＣＤ ＩＩＩａ挿入配列を含むｍＲＮＡの中に別のイントロンが含まれているかどうかを明らかにするため、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行なった。まず最初に、５’ＨＥＲ−２のｃＤＮＡ配列の１４２〜１６１と一致していて開始コドンを含む順プライマーと、３’ＥＣＤ ＩＩＩａ配列と相補的な逆プライマーを、ＳＫＢＲ−３とＳＫＯＶ−３のｃＤＮＡに対して用いた。１．３ｋｂの産物が増幅された。これは、この産物がイントロン８以外のイントロンを含んでいない場合に予想されるサイズである。次に、５’ＥＣＤ ＩＩＩａ配列と一致した順プライマーと、３’ＨＥＲ−２のｃＤＮＡ配列のヌクレオチド３８９８〜３９１９に相補的でｐ１８５ＨＥＲ−２の終止コドンを含む逆プライマーとを用い、３’ＨＥＲ−２コード配列を増幅した。２．９ｋｂの産物が増幅された。これは、この産物が別のイントロンを含んでいない場合にＨＥＲ−２のｃＤＮＡから予想されるサイズである。
【００８４】
制限消化分析とヌクレオチドのシークエンシングにより５’増幅産物（１．３ｋｂ）と３’増幅産物（２．９ｋｂ）の両方についてキャラクテリゼーションを行なったところ、別のイントロンは保持されていないことがわかった。イントロン配列が含まれているときに増幅される産物のサイズを決定するため、ゲノムＤＮＡをＰＣＲ反応の鋳型として用いた。その結果、５’コード配列に対しては約１０ｋｂの産物、３’コード配列に対しては約５ｋｂの産物が得られた。これらの結果は、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）と３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）のサイズが以前に報告されている約４．５ｋｂのＨＥＲ−２のｃＤＮＡ（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３０巻、１１３２〜１１３９ページ、１９８５年）と同じであるならば、２７４ｂｐのイントロンが保持されていることで生まれるＨＥＲ−２の新規な転写産物の予想サイズが約４．８ｋｂとなることを示している。
【００８５】
実施例４
この実施例では、ＥＣＤ ＩＩＩａ配列を含むタンパク質の発現を示す。新規な配列がタンパク質産物に翻訳されるかどうかを調べるため、ＥＣＤ ＩＩＩａ配列を細菌内でポリヒスチジン・タグを有するペプチドとして発現させ、このペプチドをニッケル・アフィニティ・クロマトグラフィにより精製し、この精製ペプチドに対する抗血清を得た。簡単に説明するならば、プライマーＥと、ＥＣＤ ＩＩＩａ挿入配列の３’末端に相補的な逆プライマーとを用いてＳＫＯＶ−３のｃＤＮＡライブラリーからＥＣＤ ＩＩＩａを増幅することによって細菌の発現ベクターを調製した。逆プライマーはＢａｍＨ１制限部位配列を含んでおり、（実施例１と２に記載した）ＲＰＡにおいて鋳型を構成するのに用いたプライマーと同じであった。約２８０ｂｐというＰＣＲ増幅産物をＫｐｎ１とＢａｍＨ１で消化させ、ゲル（キアエックスＩＩ、キアジェン社、チャッツワース、カリフォルニア州）で精製し、クローニングしてｐＥＴ３０ａベクターに組み込んだ。このベクターは、発現したタンパク質のアミノ末端の位置に６個のヒスチジンからなるタグをコードしている（ノヴァジェン社、マディソン、ウィスコンシン州）。得られたｐＥＴ−ＥＣＤ ＩＩＩａ発現ベクターを利用して細菌株ＢＬ２１を形質転換した。
【００８６】
ＥＣＤ ＩＩＩａタンパク質産物を発現させるため、ｐＥＴ−ＥＣＤ ＩＩＩａ発現ベクターで形質転換したＢＬ２１細胞をＬＢ培養液の中で３０μｇ／ｍｌのカナマイシンとともに３７℃にて４時間にわたって増殖させた。０．１ｍＭのＩＰＴＧで３時間にわたって発現を誘導し、回収した細胞を超音波処理して溶解させ、次に３９，０００×ｇで２０分間遠心分離した。室温で６０分間にわたって撹拌しながら上澄みをＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂（キアジェン社）に吸収させた。この樹脂を１０容積の洗浄用緩衝液（１０ｍＭのトリスｐＨ７．９と３００ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄し、次に、５０ｍＭのイミダゾールを加えた１０容積の洗浄用緩衝液で洗浄した。ヒスチジン・タグを有するＥＣＤ ＩＩＩａタンパク質を、２５０ｍＭのイミダゾールを加えた洗浄用緩衝液中に溶離させた。ヒスチジン・タグを有するこのタンパク質は、ゲルをクーマシー・ブルーで染色することにより、約９０％の純度であると推定された。このタンパク質を用いて抗体を産生させ、その抗体のキャラクタリゼーションを行なった。
【００８７】
簡単に説明するならば、コカリコ・バイオロジカルズ社（リームズタウン、ペンシルヴェニア州）に依頼し、２匹のウサギにポリヒスチジン・タグを有する精製ＥＣＤ ＩＩＩａペプチド（以下に記載）を注射することにより抗ＥＣＤ ＩＩＩａ抗血清を生産してもらった。ｐ１８５ＨＥＲ−２のアミノ酸残基１５１〜１６５と一致するペプチドに対するポリクローナル抗ｎｅｕ（Ｎ）抗体を作った（ＬｉｎとＣｌｉｎｔｏｎ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第６巻、６３９〜６４３ページ、１９９１年）。ｐ１８５ＨＥＲ−２のカルボキシ端末の最後の１５残基と一致するペプチドに対するポリクローナル抗ｎｅｕ（Ｎ）抗体を作った（Ｌｉｎ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．、第６９巻、１１１〜１１９ページ、１９９０年）。免疫を確立した２匹のウサギからの抗血清をキャラクテリゼーションしたところ、精製ＥＣＤ ＩＩＩａペプチドと反応する高力価の抗体が含まれていることがわかった。
【００８８】
ウエスタンブロット分析により、ｃＤＮＡ中に新規な配列を発現したＳＫＢＲ−３細胞が抗ＥＣＤ ＩＩＩａ抗体と反応するタンパク質を産生させたかどうかを調べた。細胞抽出液および細胞外マトリックスからの６８ｋＤａのタンパク質は、２匹のウサギからの抗ＥＣＤ ＩＩＩａ抗体を少なくとも２０，０００倍に希釈したものと反応したが、免疫確立前の血清とは反応しなかった。新規な転写産物のｃＤＮＡ配列（図１）を調べたところ、ｐ１８５ＨＥＲ−２のＮ末端配列中の５つの共通Ｎ結合型グリコシル化部位すべてがグリコシル化されている場合には、６５〜７０ｋＤａの分泌タンパク質産物が予測されることがわかった（Ｓｔｅｒｎ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第６巻、１７２９〜１７４０ページ、１９８６年）。
【００８９】
６８ｋＤａのＥＣＤ ＩＩＩａタンパク質［配列ＩＤ番号２］は、ＨＥＲ−２の新規なｍＲＮＡの翻訳産物であり、そのＮ末端の残基は、ｐ１８５ＨＥＲ−２のＮ末端の３４０個の残基と一致していなくてはならない。そこで、ＳＫＢＲ−３細胞からの細胞抽出液を、ＨＥＲ−２のＮ末端配列である抗ｎｅｕ（Ｎ）（ＬｉｎとＣｌｉｎｔｏｎ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第６巻、６３９〜６４３ページ、１９９１年）に対する抗ペプチド抗体、または抗ＥＣＤ ＩＩＩａを用いて免疫沈降させ、得られた免疫複合体を両方の抗体を用いてウエスタンブロット分析法で調べた。簡単に説明するならば、３〜５μｌの抗血清を、Ｍ−ＲＩＰＡ緩衝液（１％のノニデットＰ−４０、５０ｍＭのトリスｐＨ７．４、０．１％のデオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＰＭＳＦ、１％のアプロチニン）中に調製した細胞溶離液からのタンパク質２ｍｇに添加した。なお細胞溶離液は、遠心分離で核をあらかじめ除去しておいた。報告されている（Ｌｉｎ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．、第６９巻、１１１〜１１９ページ、１９９０年）ようにして、免疫沈降を、４℃にて撹拌しながら２時間にわたって行なった。免疫複合体を振盪しながら４℃にて１時間培養するとプロテインＧセファロース（ファルマシア社）に結合したため、遠心分離により回収し、Ｍ−ＲＩＰＡで４回洗浄した。この免疫複合体を９５℃で２分間にわたってＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプル緩衝液中で培養したところ、タンパク質が免疫複合体から放出された。そこでそのタンパク質を、７．５％のゲル中でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離させた（ミニ−プロティーンＩＩ電気泳動細胞、バイオ−ラド社）。
【００９０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、ウエスタンブロット分析を行なった。ゲル（厚さ０．７５ｍｍ）１つにつき半乾燥トランスファー・ユニット（バイオ−ラド社）を１つ用い、電気泳動により、１５Ｖの電圧で２０分間にわたってタンパク質をニトロセルロース膜（トランス−ブロット、バイオ−ラド社）上にブロットした。なおゲルは、２５ｍＭのトリスｐＨ８．３、１９２ｍＭのグリシン、５０ｍＭのＮａＣｌ、２０％のメタノールで平衡させた。この膜を、５％の脱脂粉乳を用いて２５℃にて１時間にわたってブロックした。次に、ブロットを一次抗体とともに培養し、ＴＢＳ−トゥイーン（０．０５％のトゥイーンを含むトリス緩衝液）で１５分間ずつ２回にわたって洗浄し、５分間ずつ４回にわたって洗浄し、ヤギの抗ウサギ二次抗体とともに４０分間培養し、西洋ワサビのペルオキシダーゼ（バイオ−ラド社）と結合させ、ＴＢＳ−トゥイーン中に１：１０，０００となるように希釈した。膜は、二次抗体とともに培養した後に上記のようにして洗浄し、化学発光試薬（ピアース社）と反応させ、コダック社のＸ−ＯＭＡＴ ＢＬＵフィルムに曝露した。
【００９１】
免疫沈降とウエスタンブロット分析において抗ＥＣＤ ＩＩＩａを用いたときには、予想通りｐ６８ＨＥＲ−２が検出された。免疫沈降では抗ＥＣＤ ＩＩＩａを用い、ウエスタンブロット分析におけるプローブを抗ｎｅｕ（Ｎ）にしたときには、６８ｋＤａのタンパク質が検出された。これは、ｐ６８ＥＣＤ ＩＩＩａがｐ１８５ＨＥＲ−２のＮ末端配列を含んでいることを示している。さらに、抗ｎｅｕ（Ｎ）がｐ６８ＨＥＲ−２を沈降させた。そのことは、抗ＥＣＤ ＩＩＩａ抗体をプローブとして調べることにより検出された。これらの結果は、ｐ６８ＨＥＲ−２がＥＣＤ ＩＩＩａとＨＥＲ−２のＮ末端配列の両方を含んでいることを示している。
【００９２】
他のいくつかの細胞系におけるｐ６８ＥＣＤ ＩＩＩａの発現を調べた。ｃＤＮＡにＥＣＤ ＩＩＩａ配列を含むガン細胞系（ＢＴ４７４、ＳＫＯＶ−３）もｐ６８ＨＥＲ−２を含んでいた。調べたいくつかの細胞系のうち、正常なヒト胚の腎臓細胞に由来するＨＥＫ２９３細胞が、細胞抽出液中および細胞外マトリックス中で最高レベルのｐ６８ＥＣＤ ＩＩＩａを発現し、ＳＫＢＲ−３細胞よりも約５〜１０倍多い量だった。ｐ１８５ＨＥＲ−２の過剰発現を調べたガン細胞系（ＳＫＢＲ−３、ＳＫＯＶ−３、ＢＴ４７４）と比較すると、ＨＥＫ２９３はｐ１８５ＨＥＲ−２の含有量が約２０分の１であった。したがって、ｐ１８５ＨＥＲ−２に対するｐ６８ＨＥＲ−２の割合は、ＨＥＫ２９３細胞においては、調べたガン細胞系の少なくとも１００倍であった。特にＨＥＫ２９３抽出液において明らかなｐ６８ＨＥＲ−２との反応および約１２０ｋＤａのタンパク質との反応は、抗血清を、配列特異的な反応性を示す精製ＥＣＤ ＩＩＩａペプチドとともに予備培養することによって停止させた。この大きなタンパク質はｐ６８ＨＥＲ−２のダイマーである可能性がある。したがってｐ６８ＨＥＲ−２は、いくつかのガン細胞系から発現して分泌され、ＨＥＫ２９３中では５〜１０倍大きなレベルになっていた。
【００９３】
実施例５
この実施例では、ＥＣＤ ＩＩＩａイントロン配列を含む新規なＨＥＲ−２転写産物の発現を示す。ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果は、ＥＣＤ ＩＩＩａ配列が挿入されていなければ正常なサイズであるはずのＨＥＲ−２のｍＲＮＡにＥＣＤ ＩＩＩａ配列が挿入されたことを示していた。このデータは、約４．８ｋｂの新規な転写産物が存在していることを示唆している。ＥＣＤ ＩＩＩａの新規な転写産物のサイズと発現を調べるため、ＥＣＤ ＩＩＩａに対して特異的なプローブを用いてノーザンブロット分析を行なった。簡単に説明するならば、ＥＣＤ ＩＩＩａ挿入体の全配列にまたがっていて、この挿入体に隣接する５’ＨＥＲ−２エキソン配列を含む３８９ｂｐの配列をＰＣＲで増幅することにより、アンチセンスＲＮＡプローブを合成するための鋳型をＳＫＯＶ−３のｃＤＮＡから構成した。ＨＥＲ−２のｃＤＮＡ配列とｎｔ１１３１〜１１５２が一致する順プライマーＣ［配列ＩＤ番号５］と、３’ＢａｍＨ１制限エンドヌクレアーゼ部位を含み、ＥＣＤ ＩＩＩａ配列の３’スプライス部位近傍の配列と相補的な逆プライマー（５’−ＧＣＡＣＧＧＡＴＣＣＡＴＡＧＣＡＧＡＣＴＧＡＧＧＡＧＧ−３’［配列ＩＤ番号９］）を用いてＰＣＲを行なった。次に、ＰＣＲ産物をＢａｍＨ１で消化させ、３７５ｂｐの断片を遊離させ、クローニングしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（ストラタジーン社）に組み込んだ。ｍ１３順プライマーと逆プライマーを用い、このプラスミドをヴォラム・インスティチュート・コア・シークエンシング・ファシリティ（ポートランド、オレゴン州）にてシークエンシングした。ＥＣＤ ＩＩＩａ配列全体と、挿入体に隣接した５’ＨＥＲ−２エキソン配列の８７ｎｔとに相補的なアンチセンスＲＮＡプローブを、（α−３２Ｐ）ＣＴＰ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと、Ｔ７／ＳＰ６リボプローブ合成システム（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州）とを用いて１μｇの直線状鋳型から転写した。このプローブは、ＥＣＤ ＩＩＩａおよびそれと隣接するＨＥＲ−２エキソン配列を含むｍＲＮＡとハイブリダイズするときには３７０ｎｔの断片を保護し、完全にスプライスされたＨＥＲ−２のｍＲＮＡとハイブリダイズするときには８７ｎｔの断片を保護することが予想された。
【００９４】
ＲＮＡハイブリッドを調製するため、３０μｇのＲＮＡを、４８℃にて１６時間にわたり、約５０，０００ｃｐｍのアンチセンスＲＮＡプローブとハイブリダイズさせた。このＲＮＡハイブリッドを、４０μｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡ（ベーリンガー・マンハイム社）および２μｇ／ｍｌのＲＮアーゼＴ１（ライフ・テクノロジーズ社）を用い、２５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのトリスｐＨ７．５からなる溶液中で、３７℃にて３０分間にわたって消化させた。プロテイナーゼＫ（１００μｇ）（ライフ・テクノロジーズ社）を含む２０μｌの１０％ＳＤＳを添加して消化を停止させた。サンプルを酸性フェノール（ｐＨ４．５；ライフ・テクノロジーズ社）とクロロホルムで抽出し、２容積の１００％エタノールで沈殿させ、５μｌのＲＰＡサンプル用緩衝液（８８％のホルムアルデヒド、１０ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０、１ｍｇ／ｍｌのキシレンシアノール、１ｍｇ／ｍｌのブロモフェノール・ブルー）に分散させた。サンプルを９５℃にて１０分間にわたって変性させ、ＴＢＥ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸エステル、２ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．３）の中で５％ポリアクリルアミド／尿素ゲル上にて電気泳動を行なった。このゲルを真空下で乾燥させ、保護された断片をリン光画像分析によって定量した（ＩＰラブ・ゲル、モレキュラー・ダイナミックス社）。
【００９５】
約４．８ｋｂの新規な転写産物が、ｐ６８ＥＣＤ ＩＩＩａを最高レベルで発現したＨＥＫ２９３細胞の中で検出された。しかしＳＫＢＲ−３、ＢＴ４７４、ＳＫＯＶ−３というガン細胞系のノーザンブロット分析では、新規な転写産物は検出できなかった。そこで、より高感度のリボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）により、新規な転写産物の発現レベルを、完全にスプライスされた４．５ｋｂの転写産物と比較して調べた。検出可能なレベルのｐ６８ＥＣＤ ＩＩＩａを含んでいた卵巣ガン細胞系（ＳＫＯＶ−３）および乳ガン細胞系（ＳＫＢＲ−３とＢＴ４７４）からのＲＮＡと、ＨＥＲ−２のｃＤＮＡを安定にトランスフェクトした対照細胞系１７−３−１からのＲＮＡを、ＥＣＤ ＩＩＩａ（イントロン８）配列全体と、イントロン８に隣接した５’ＨＥＲ−２エキソン配列とにまたがる３２Ｐ標識アンチセンスＲＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ＲＮアーゼで消化させ、電気泳動を行ない、放射能写真を撮影したところ、３７０個のヌクレオチドからなるバンドが、１７−３−１以外の各細胞系で検出された。このサイズは、ＥＣＤ ＩＩＩａを含むＨＥＲ−２のｍＲＮＡによって保護されることが予想されるサイズに対応している。さらに、８７個のヌクレオチドが保護された断片が、すべての細胞で検出された。このサイズは、対照となる正常な細胞系と比べてこれらガン細胞系で１００倍以上も過剰にＨＥＲ−２を発現している完全にスプライスされたＨＥＲ−２の断片に対して予想されるサイズである（Ｋｒａｕｓ他、ＥＭＢＯ Ｊ．、第６巻、６０５〜６１０ページ、１９８７年）。保護されたそれぞれの断片の量を測定し、サイズに関して正規化して新規な転写産物の相対量を推定し、ｐ１８５ＨＥＲ−２のｍＲＮＡに対する百分率として表わした。ＥＣＤ ＩＩＩａ挿入体を含む新規なＨＥＲ−２のｍＲＮＡは、ＳＫＯＶ−３細胞では完全にスプライスされた転写産物のレベルの４．２％であり、ＳＫＢＲ−３細胞では５．４％であり、ＢＴ４７４細胞では０．８％であった。
【００９６】
実施例６
この実施例では、ＥＣＤ ＩＩＩａ挿入体を含む新規な転写産物がヒト胚の腎臓および肝臓で発現したことを示す。ノーザンブロット分析により、ＥＣＤ ＩＩＩａ配列を含む新規な転写産物がヒトの正常な組織で発現したかどうかを調べた。ヒト胎児のさまざまな組織からのポリＡ＋ｍＲＮＡをノーザンブロットとして調製し、新規なＥＣＤ ＩＩＩａ配列に対して特異的な放射標識プローブとハイブリダイズさせた。４．８ｋｂのｍＲＮＡが腎臓で検出され、２．６ｋｂの転写産物が肝臓で検出された（図２）。４．８ｋｂの転写産物は、２７４ｂｐの挿入体が付加された完全長４．５ｋｂ転写産物に対応しているようである。２．６ｋｂの転写産物は、以前に報告されている２．３ｋｂの別の転写産物（ヤマモト他、Ｎａｔｕｒｅ、第３１９巻、２３０〜２３４ページ、１９８６年；Ｓｃｏｔｔ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第１３巻、２２４７〜２２５７ページ、１９９３年）に２７４ｂｐのＥＣＤ ＩＩＩａ挿入体が付加されたものに対応しているのであろう。ブロットを取り出して５’ＨＥＲ−２コード配列に対して特異的なプローブとハイブリダイズさせたところ、４．８ｋｂと４．５ｋｂのｍＲＮＡを示す広いバンドが胎児の腎臓組織で検出され、２．６ｋｂの転写産物断片が肝臓で検出された。これは、これらの新規な転写産物が、ＨＥＲ−２のＥＣＤをコードする配列を含んでいることを示している。挿入されたＥＣＤ ＩＩＩａ配列が終止コドンを含んでいるため、同じタンパク質産物がこれらｍＲＮＡのそれぞれから産生される可能性がある。
【００９７】
いくつかの細胞系についても、ＥＣＤ ＩＩＩａを含む新規な転写産物をノーザンブロット分析で調べた。４．８ｋｂの新規な転写産物が、ヒト胚の腎臓細胞系であるＨＥＫ−２９３で検出された（図２）。ＨＥＲ−２遺伝子が増幅されているＳＫＢＲ−３、ＢＴ４７４、ＳＣＯＶ−３というガン細胞系のＲＴ−ＰＣＲ分析によりＥＣＤ ＩＩＩａ配列が検出されたとはいえ、ＥＣＤ ＩＩＩａを含む新規な転写産物は、これらの細胞をノーザンブロット分析しても検出できなかった。そこで、ＥＣＤ ＩＩＩａ配列全体と、このＥＣＤ ＩＩＩａ挿入体に隣接する５’ＨＥＲ−２エキソン配列とにまたがるアンチセンスプローブを利用して、より高感度のリボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）を行なった。ＥＣＤ ＩＩＩａ挿入体を有する新規なＨＥＲ−２のｍＲＮＡは、ＳＣＯＶ−３細胞、ＳＫＢＲ−３細胞、ＢＴ４７４細胞では、完全にスプライスされた転写産物の５％未満しか検出されなかった。これらの知見は、ＥＣＤ ＩＩＩａ配列を含む２つの新規な転写産物がヒトの正常組織で組織特異的に発現したこと、４．８ｋｂの新規な転写産物がＨＥＫ−２９３細胞系で発現したこと、遺伝子が増幅したガン細胞が、新規な転写産物を４．５ｋｂのＨＥＲ−２転写産物の５％未満という低いレベルで発現していることを示している。
【００９８】
実施例７
この実施例では、ＥＣＤ ＩＩＩａ配列を含むタンパク質の発現を示す。新規な配列がタンパク質産物に翻訳されるかどうかを調べるため、ＥＣＤ ＩＩＩａ配列をポリヒスチジン・タグを有するペプチドとして細菌内で発現させ、ニッケル−アフィニティ・クロマトグラフィにより精製し、この精製ペプチドに対する抗血清を得た。４．８ｋｂの新規なＥＣＤ ＩＩＩａの転写産物を発現したＨＥＫ−２９３細胞がＥＣＤ ＩＩＩａを含むタンパク質を発現するかどうかを、ウエスタンブロット分析で調べた。細胞抽出液と細胞外マトリックスからの６８ｋＤａのタンパク質は、抗ＥＣＤ ＩＩＩａ抗体と反応したが（図３）、免疫確立前の血清とは反応しなかった。反応は、この抗血清を、精製ＥＣＤ ＩＩＩａペプチドとともに予備培養することによって停止させた（図３）。いくつかの細胞抽出液で検出された大きな約１２５ｋＤａのタンパク質は、ｐ６８ＨＥＲ−２の集合体であろう。新規な転写産物のｃＤＮＡの配列（図１）からは、ｐ１８５ＨＥＲ−２のＮ末端配列中の５つの共通Ｎ結合型グリコシル化部位すべてがグリコシル化されている場合に６５〜７０ｋＤａの分泌タンパク質産物が予測されることがわかる（Ｓｔｅｒｎ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第６巻、１７２９〜１７４０ページ、１９８６年）。他のいくつかの細胞系でもｐ６８ＥＣＤ ＩＩＩａを発現するかどうかを調べた。ｃＤＮＡにＥＣＤ ＩＩＩａ配列を含むガン細胞系（ＢＴ４７４、ＳＫＯＶ−３、ＳＫＢＲ−３）も、検出可能なレベルのｐ６８ＨＥＲ−２を含んでいた。
【００９９】
実施例８
この実施例では、ＨＥＲ−２遺伝子が増幅されているガン細胞系において、ｐ１８５ＨＥＲ−２と比べてｐ６８ＨＥＲ−２の発現が顕著に低下していることを示す。ＨＥＲ−２遺伝子が増幅されているガン細胞系ではｐ１８５ＨＥＲ−２のｍＲＮＡと比べてｐ６８ＨＥＲ−２のｍＲＮＡの発現レベルが非常に低いため、ＨＥＲ−２遺伝子が増幅されているいくつかの細胞系と増幅されていないいくつかの細胞系において、ｐ６８ＨＥＲ−２タンパク質とｐ１８５ＨＥＲ−２タンパク質の相対的な割合を調べた。ウエスタンブロットを調製し、ｐ６８ＨＥＲ−２に対して特異的な抗血清とｐ１８５ＨＥＲ−２に対して特異的な抗血清の両方について調べた。図４は、ＨＥＲ−２遺伝子が約８倍に増幅されているガン細胞系でｐ１８５ＨＥＲ−２が容易に検出できたことを示している（Ｋｒａｕｓ他、ＥＭＢＯ Ｊ．、第６巻、６０５〜６１０ページ、１９８７年）。しかしそれに対応してｐ６８ＨＥＲ−２が増加することはなかった。比較すると、ｐ６８ＨＥＲ−２は、ＨＥＫ−２９３、ＩＯＳＥＶＡＮ、ＨＢＬ１００という非発ガン性細胞で検出された唯一のＨＥＲ−２タンパク質であった。それに対してｐ１８５ＨＥＲ−２はこれらの細胞中では非常に低いレベルでしか発現せず（Ｋｒａｕｓ他、ＥＭＢＯ Ｊ．、第６巻、６０５〜６１０ページ、１９８７年）、過剰に露出したブロットにおいて検出された。これらのデータは、ＨＥＲ−２遺伝子が増幅されているガン細胞系ではｐ６８ＨＥＲ−２がｐ１８５ＨＥＲ−２と比べて少ないことを示しており、ｐ１８５ＨＥＲ−２が過剰に発現したときにｐ６８ＨＥＲ−２が低レベルに維持される何らかのメカニズムが存在している可能性のあることを示唆している。
【０１００】
実施例９
この実施例では、ｐ６８ＨＥＲ−２とＥＣＤ ＩＩＩａペプチドがｐ１８５ＨＥＲ−２に特異的に結合することを示す。ｐ６８ＨＥＲ−２は分泌タンパク質であり、しかもｐ６８ＨＥＲ−２は新規な配列に加えてｐ１８５ＨＥＲ−２と一致するサブドメインＩとＩＩを含んでいるため、ｐ６８ＨＥＲ−２がｐ１８５ＨＥＲ−２と相互作用する可能性を調べた。ｐ１８５ＨＥＲ−２とｐ６８ＨＥＲ−２のＮ末端に対する抗ペプチド抗体である抗ｎｅｕ（Ｎ）、またはｐ１８５ＨＥＲ−２に対して特異的な抗体である抗ｎｅｕ（Ｃ）を用い、ｐ６８ＨＥＲ−２を低レベルで発現し、ｐ１８５ＨＥＲ−２を過剰発現しているガン細胞ＳＫＢＲ−３の免疫沈降を行なった。免疫沈降させる物質をウエスタンブロットとして調製し、プローブとして、ｐ６８ＨＥＲ−２に対して特異的な抗ＥＣＤ ＩＩＩａと抗ｎｅｕ（Ｃ）の両方を用いて調べた。抗ｎｅｕ（Ｎ）は、ｐ６８ＨＥＲ−２とｐ１８５ＨＥＲ−２の両方を免疫沈降させた（図５Ａ）。さらに、ｐ１８５ＨＥＲ−２のＣ末端に対して特異的な抗体はｐ１８５ＨＥＲ−２を免疫沈降させ、ｐ６８ＨＥＲ−２を共同沈降させた（図５Ａ）。この結果は、２つのタンパク質の間に相互作用があることを示唆している。
【０１０１】
ＥＣＤ配列同士の結合相互作用は非常に弱いので（Ｔｚａｈａｒ他、ＥＭＢＯ Ｊ．、第１６巻、４９３８〜４９５０ページ、１９９７年；Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ他、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第４３１巻、１０２〜１０６ページ、１９９８年）、結合が、新規なプロリン・リッチなＥＣＤ ＩＩＩａ領域によるものかどうかを調べた。新規な７９個のアミノ酸からなる領域をヒスチジン・タグを有するタンパク質として精製してニッケル・アガロース上に固定化し、プルダウンアッセイで使用した。対照として、ＥＣＤ ＩＩＩａとは関係のない、ヒスチジン・タグを有する２つの精製ペプチド（すなわち、ウィルソン病の膜タンパク質の６００残基からなる断片と、ＣＲＥＢタンパク質のＤＮＡ結合領域を含む７０残基からなる断片）を、同様にしてニッケル・アガロース樹脂上に固定化した。固定化したペプチドを、ＨＥＲ−２をトランスフェクトした３Ｔ３細胞（１７−３−１）から調製したタンパク質とともに培養した。十分に洗浄した後、結合したタンパク質を溶離させ、ウエスタンブロットとして調製し、それを、ｐ１８５ＨＥＲ−２に対して特異的な抗体を用いて調べた。１Ｍのイミダゾールで溶離させ、溶離した物質をＳＤＳゲル中でクーマシー染色することにより、ヒスチジン・タグを有するＥＣＤ ＩＩＩａペプチドと対照用ペプチドが同じ量だけ樹脂に結合したことが確認された。ｐ１８５ＨＥＲ−２は、ペプチドなしの樹脂にも対照用ペプチドを有する樹脂にも保持されることがなかったのに対し、ＥＣＤ ＩＩＩａペプチドによってだけ選択的に保持された（図５Ｂ）。
【０１０２】
プルダウンアッセイにおいてＥＣＤ ＩＩＩａ領域がｐ１８５ＨＥＲ−２に結合したため、このＥＣＤ ＩＩＩａ領域が、ｐ１８５ＨＥＲ−２を過剰発現している細胞に選択的に結合するかどうかを調べた。これは、ＨＥＲ−２をトランスフェクトした１７−３−１細胞の単層培養物を用いて３Ｔ３親細胞と比較することによって調べた。細胞をさまざまな濃度のヒスチジン−ＥＣＤ ＩＩＩａペプチドとともに培養し、洗浄し、プロテアーゼ阻害剤を用いて変性用緩衝液中に抽出した。結合したペプチドがあるかどうかを検出するため、細胞抽出液を、ＥＣＤ ＩＩＩａに対して特異的な抗体を用いてウエスタンブロット分析により調べた。さらに、ＥＣＤ ＩＩＩａペプチドで処理した細胞を等分した複数のアリコートをウエスタンブロットとし、ｐ１８５ＨＥＲ−２に対して特異的な抗体と反応させた。するとトランスフェクトされた１７−３−１細胞においてｐ１８５ＨＥＲ−２が過剰に発現した。ＥＣＤ ＩＩＩａペプチドは、ｎＭオーダーのさまざまな濃度で完全な１７−３−１細胞に好んで結合する（図５Ｃ）のに対し、同等な量の３Ｔ３親細胞にはペプチドがほとんど結合しないか、まったく結合しなかった。これは、ＥＣＤ ＩＩＩａがｐ１８５ＨＥＲ−２の細胞外領域と特異的な相互作用をしていることを示唆する。
【０１０３】
実施例１０
ｐ６８ＥＣＤ ＩＩＩａとＥＣＤ ＩＩＩａペプチドがｐ１８５ＨＥＲ−２のチロシンリン酸化に及ぼす効果を調べた。ＲＴＫのチロシンリン酸化は、リガンド活性化とシグナル伝達があることの第１の徴候である。１７−３−１細胞の処理を、さまざまな量の精製ＥＣＤ ＩＩＩａペプチドを用いて、またはｐ６８ＨＥＲ−２を高レベルで含むＨＥＫ２９３細胞からのならし培地（ＣＭ）（図２Ａ）を用いて、または対照となる、検出できるレベルのｐ６８ＨＥＲ−２を含まないＳＫＯＶ−３細胞からのならし培地を用いて行ない、この１７−３−１細胞のチロシンリン酸化を調べた。ヒスチジン−ＥＣＤ ＩＩＩａまたは濃縮ＣＭで１０分間処理したとき（図６）または２時間処理したとき、チロシンリン酸化シグナルは増加しなかった。これは、ｐ１８５ＨＥＲ−２が活性化されなかったことを示唆している。ｐ６８ＨＥＲ−２を含むＣＭも、ＥＣＤ ＩＩＩａペプチドも、ｐ１８５ＨＥＲ−２のチロシンリン酸化レベルが低いＳＫＯＶ−３細胞からのｐ１８５ＨＥＲ−２に対応するチロシンリン酸化シグナルを、検出可能になるほど変化させることはなかった。さらに、ｐ６８ＨＥＲ−２とＥＣＤ ＩＩＩａペプチドは、１７−３−１細胞抽出液から免疫沈降させたｐ１８５ＨＥＲ−２の自己リン酸化活性に対して検出可能なほどの影響をインビトロで与えることはなかった。これらの結果は、ｐ６８ＨＥＲ−２がｐ１８５ＨＥＲ−２のシグナル伝達を活性化させなかったという結論を支持している。
【０１０４】
実施例１１
この実施例では、イントロン８の配列が多型であることを示す。ヒトＨＥＲ−２遺伝子のイントロン８は、ｍＲＮＡ内に選択的スプライシングが可能な状態で保持されて、ｐ１８５ＨＥＲ−２の細胞外領域の一部のＣ末端位置で新規な７９残基領域をコードしている。保持されたこのイントロンを有する新規な転写産物の産物である“ハースタチン”は、ＨＥＲ−２ガン遺伝子の自己阻害剤として機能する。イントロン８をコードしている領域は、単独ではｎＭのアフィニティでｐ１８５ＨＥＲ−２に結合することがわかっている（Ｄｏｈｅｒｔｙ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９６巻、１０，８６９〜１０，８７４ページ、１９９９年）。
【０１０５】
さらに、ＨＥＲ−２遺伝子のイントロン８のヌクレオチド配列とそこから推定されるアミノ酸配列における多型を、別々の１５人のゲノムＤＮＡをシークエンシングすることによって同定した。図８と配列ＩＤ番号１は、イントロン８の最も一般的なヌクレオチド配列と、それに対応するアミノ酸配列をそれぞれ示している。この領域は、１０通りの多型（配列ＩＤ番号１０の中には文字Ｗ（２箇所）、Ｙ（３箇所）、Ｒ、Ｎ、Ｍ、Ｓ（２箇所）で示し、図８には“Ｘ”で示してある）を含んでおり、その結果として保存されないアミノ酸置換が起こっている（表１の注を参照のこと）。例えば、ヌクレオチド位置１６１に多型（Ｇ→Ｃ）があると（図８；表１）、配列ＩＤ番号１のアミノ酸残基＃５４の位置、または配列ＩＤ番号２の残基＃３９４の位置でアルギニン（Ｒ）がプロリン（Ｐ）に代わるはずである。図８または配列ＩＤ番号１０の位置１で示されるＮ末端のグリシン（Ｇ）は、“ハースタチン”配列のアミノ酸残基３４１に対応する（Ｄｏｈｅｒｔｙ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９６巻、１０，８６９〜１０，８７４ページ、１９９９年）。図１（Ａ）に示したヌクレオチド配列は、図８に示した最も一般的であることがわかった配列と比べてアミノ酸残基＃６と＃７３の位置のアミノ酸が異なる多型になっている。
【０１０６】
この結果は、ヒトの集団において、イントロン８がコードされている領域にいくつかの違いが存在しており、その結果、ＥＣＤ ＩＩＩａを含むタンパク質変異体相互の間で生化学的特性や生物学的特性が異なる可能性のあることを示している。同定されたいくつかの変異を表１にまとめておく。
【表１】
2004529847.tif 000002
【０１０７】
表１。ヒトの集団（別々の１５人）でイントロン８がコードされている領域に見られた配列の変異１〜１１をリストにしてある。このリストには、図８に示した最も一般的なＤＮＡ配列と比べて特定の“Ｘ”の位置に塩基の変化があることが示してある。それぞれのＸの後ろにある括弧内の数字は、図８に示したＤＮＡ配列のヌクレオチドの位置に対応している。ここにリストとして示したＤＮＡ配列の変異は、配列ＩＤ番号１の可変アミノ酸位置（“Ｘａａ”）に対応している。例えば、Ｘ（４）がＸａａ（２）に；Ｘ（１４）がＸａａ（５）に；Ｘ（１７）がＸａａ（６）に；Ｘ（４７）がＸａａ（１６）に；Ｘ（５４）がＸａａ（１８）に；Ｘ（６２）がＸａａ（２１）に；Ｘ（１０６）がＸａａ（３６）に；Ｘ（１６１）がＸａａ（５４）に；Ｘ（１９１）がＸａａ（６４）に；Ｘ（２１７）がＸａａ（７３）に対応している。配列ＩＤ番号２の可変アミノ酸位置に対応している変異は以下の通りである。Ｘ（４）がＸａａ（３４２）に；Ｘ（１４）がＸａａ（３４５）に；Ｘ（１７）がＸａａ（３４６）に；Ｘ（４７）がＸａａ（３５６）に；Ｘ（５４）がＸａａ（３５８）に；Ｘ（６２）がＸａａ（３６１）に；Ｘ（１０６）がＸａａ（３７６）に；Ｘ（１６１）がＸａａ（３９４）に；Ｘ（１９１）がＸａａ（４０４）に；Ｘ（２１７）がＸａａ（４１３）に対応している。配列ＩＤ番号１の可変アミノ酸位置に関する（図８に示した最も一般的なＤＮＡ配列と比べた場合の）具体的なアミノ酸の変化は以下の通りである。変異１、Ｘａａ（２）（トレオニン→セリン）；変異２、Ｘａａ（５）（ロイシン→プロリン）；変異３、Ｘａａ（６）（プロリン→ロイシン）；変異４、Ｘａａ（１６）（ロイシン→グルタミン）；変異５、Ｘａａ（１８）（メチオニン→ロイシン）；変異６、Ｘａａ（２１）（グリシン→アスパラギン酸、またはＡｌｕ、またはバリン）；変異７、Ｘａａ（３６）（ロイシン→イソロイシン）；変異８、Ｘａａ（５４）（プロリン→アルギニン）；変異９、Ｘａａ（６４）（プロリン→ロイシン）；変異１０、Ｘａａ（７３）（アスパラギン酸→アスパラギン）；変異１１、Ｘａａ（６）（プロリン→ロイシン）とＸａａ（７３）（アスパラギン酸→アスパラギン）。同じ置換が、配列ＩＤ番号２の対応する可変アミノ酸位置にも適用される。
【０１０８】
実施例１２
トランスフェクトされた細胞内でハースタチンを同時に発現させると、（１）コロニーの形成が抑制されることによりｐ１８５ＨＥＲ−２のレベルが抑制され、（２）ｐ１８５ＨＥＲ−２のチロシンリン酸化が抑制された。
【０１０９】
Ｃｏｓ−７細胞にハースタチン発現ベクターとｐ１８５ＨＥＲ−２発現ベクターを同時にトランスフェクトし、その結果として得られたｐ１８５ＨＥＲ−２のレベルを測定し、さらにトランスフェクション後のコロニー形成とｐ１８５ＨＥＲ−２のチロシンリン酸化の程度を測定することにより、ハースタチン／ｐ１８５ＨＥＲ−２結合相互作用の効果を明確にした。
【０１１０】
方法。Ｃｏｓ−７細胞へのトランスフェクション。Ｃｏｓ−７細胞を６ウエルのプレートに２×１０５細胞／ウエルの割合で植え、リポフェクタミン（バイオラド社）を用いてトランスフェクションを行なった。Ｃｏｓ−７細胞には、１．５μｇのハースタチン発現ベクター＋１．５μｇのＨＥＲ−２発現ベクター、または１．５μｇのＨＥＲ−２発現ベクター（すべてインヴィトロジェン社からのｐｃＤＮＡ３．１）をトランスフェクトした。対照用エンプティ・ベクターを用い、それぞれの場合にＤＮＡの合計量が３μｇになるようにした。トランスフェクトされた細胞は、４８時間後にウエスタンブロット法で分析した。タンパク質の検出は、ｐ１８５ＨＥＲ−２に対する抗体、抗ｎｅｕ（Ｃ）抗体、ハースタチンのイントロン８をコードしているＣ末端配列に対する抗体（抗Ｈｓｔ）のいずれかを用いて行なった。β−ガラクトシダーゼ・マーカー発現反応に関しては、ＣＭＶプロモータにより制御されるβ−ガラクトシダーゼ発現プラスミド０．５μｇを組み込んだ所定のプラスミドを３組用意し、トランスフェクションを行なった。４８時間後、細胞を抽出し、バイオラド・タンパク質染色キットを用いて細胞タンパク質を定量し、β−ガラクトシダーゼの活性を測定した。β−ガラクトシダーゼの活性はタンパク質の量で規格化し、平均と標準偏差をプロットした。β−ガラクトシダーゼの活性を各ウエルに最初に植えた細胞数で規格化した場合にも、同様の結果が得られた。
【０１１１】
コロニー形成の測定。ＣＨＯ細胞を６ウエルのプレートに２×１０５細胞／ウエルの割合で植え、４組用意したウエルに、３ｍｇの対照用エンプティ・ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１；インヴィトロジェン社）；１．５ｍｇのｐ１８５ＨＥＲ−２発現プラスミド＋１．５ｍｇの対照ＤＮＡ；１．５ｍｇのｐ１８５ＨＥＲ−２＋１．５μｇのハースタチン；１．５ｍｇのハースタチン＋１．５ｍｇの対照ＤＮＡをそれぞれトランスフェクトした。ＤＮＡを添加してから４８時間後、細胞をトリプシン処理し、０．６ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で１：１０の割合に希釈して６ウエルのプレートに入れた。培地は２日ごとに交換した。１４日目にプレートをクリスタルバイオレットで染色した後、洗浄した。５０％エタノールに入れた１ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ４．５）を用いて室温にて３０分間にわたって振盪することにより、クリスタルバイオレットで染色したプレートを抽出した。抽出したクリスタルバイオレットは、１０倍に希釈し、５１５ｎＭにおける吸光度をもとにして定量した。１０倍の希釈により読みが０．１から１になった。この値は、予備研究で決定した吸光度と細胞数の直線関係の範囲に入っていた。
【０１１２】
ｐ１８５ＨＥＲ−２のチロシンリン酸化抑制の測定。Ｃｏｓ−７細胞を６ウエルのプレートに植え、上記のようにしてトランスフェクションを行なった。２組用意したウエル中の細胞に、０．２５、０．５、１．０、３μｇの蛍光グリーン・タンパク質（“ＦＧＰ”）発現プラスミドをトランスフェクトした。エンプティ・ベクターを添加し、各ウエル内のＤＮＡの合計量が３μｇになるようにした。４８時間後、蛍光プレート読み取り装置を用い、発光波長５２０ｎＭと励起波長４９０ｎＭにおける蛍光信号を定量した。また、細胞に０．５μｇのＦＧＰプラスミド＋１．５μｇのＨＥＲ−２プラスミド＋所定量のハースタチン発現プラスミドをトランスフェクトしたものと、細胞に０．５μｇのＦＧＰプラスミド＋所定量のハースタチン発現プラスミドをトランスフェクトし、ＨＥＲ−２プラスミドはトランスフェクトしないものを用意した。エンプティ・ベクターを添加し、各ウエル内のＤＮＡの合計量が５μｇになるようにした。４８時間後、細胞をＰＢＳを用いて２回洗浄し、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニルと２ｍＭのオルトバナジン酸塩を含む１００μｌの修飾ＲＩＰＡの中に抽出した。バイオラド・タンパク質染色キットを用い、透明な抽出液中のタンパク質の濃度を測定した。抽出したタンパク質２０μｇを７．５％ポリアクリルアミドＳＤＳゲルを用いて分離し、まず最初に、１μｇ／ｍｌの抗ホスホチロシン抗体（“抗ＰＴｙｒ”）を用いてウエスタンブロット法で分析した。次に、ブロットを取り出し、ｐ１８５ＨＥＲ−２に対する抗体（抗ｎｅｕ（Ｃ））と反応させた。化学ルミネセンス試薬（ピアス社）を用いてブロットを現像し、コダック社のフィルムに曝露した。
【０１１３】
（１）異所ハースタチンの発現により、トランスフェクション後の生存率が低下し、トランスフェクトされたＣｏｓ−７細胞中のｐ１８５ＨＥＲ−２のレベルが低下した。ｐ１８５ＨＥＲ−２のレベルは、Ｃｏｓ−７細胞の中でハースタチンをｐ１８５ＨＥＲ−２と同時に発現させると、ｐ１８５ＨＥＲ−２だけをトランスフェクトした場合と比べて約５分の１に低下した（図９）。マーカー・プラスミドから発現させたβ−ガラクトシダーゼ（“β−ｇａｌ”）の活性を内部対照としてモニターした。
【０１１４】
図１０は、β−ｇａｌマーカー・プラスミドをｐ１８５ＨＥＲ−２と同時にトランスフェクトした場合にβ−ｇａｌの活性が最大になったことを示している（β−ｇａｌプラスミドをエンプティ・プラスミドである“ｐｃＤＮＡ”と同時にトランスフェクトした場合よりも約３５％大きい）。それとは対照的に、β−ｇａｌの活性レベルは、ｐ１８５ＨＥＲ−２とβ−ｇａｌプラスミドに加えてハースタチンも同時にトランスフェクトした細胞で約３分の１に低下した。同様の低下が、２つの別の細胞系、ＣＨＯとＨＥＫ−２９３でも観察された。さらに、ハースタチンとＨＥＲ−２を同時にトランスフェクトした細胞で別のマーカーである蛍光グリーン・タンパク質（“ＦＧＰ”）を調べた場合にも、マーカー遺伝子の発現レベルが同様に抑制されることが観察された。したがって、単独のｐ１８５ＨＥＲ−２と同時にマーカー・プラスミドをトランスフェクトすることにより、同時にトランスフェクトしたマーカーの発現レベルが増加したが、ハースタチンおよびｐ１８５ＨＥＲ−２と同時にマーカー・プラスミドをトランスフェクトすると、マーカーのシグナルは減少した。
【０１１５】
ｐ１８５ＨＥＲ−２とマーカー遺伝子の発現レベルが上記のように低下したことは、トランスフェクトした細胞ごとのｐ１８５ＨＥＲ−２（またはマーカー）のレベルの全体的低下、あるいはトランスフェクト後に生き延びた細胞数の減少と整合していた（すなわち、ｐ１８５ＨＥＲ−２の発現により生存が促進され、ハースタチンとｐ１８５ＨＥＲ−２を同時に発現させることにより生存が抑制された）。
【０１１６】
（トランスフェクトされた安定な細胞を早く増殖させるのに適した）ＣＨＯ細胞にトランスフェクションを行ない、Ｇ４１８で２０日間にわたって選択を実施し、生き残った細胞コロニーを染色して定量することにより、コロニー形成に同時トランスフェクションが及ぼす効果を直接測定した。ｐ１８５ＨＥＲ−２をトランスフェクトすると、対照をトランスフェクトした細胞と比べてコロニー形成が約６０％増加したのに対し、ハースタチンだけを発現させた場合には増殖に有意な変化はなかった（図１１）。それとは対照的に、ハースタチンを同時にトランスフェクトすると、ＨＥＲ−２をトランスフェクトした場合と比べて細胞のコロニー形成が約７分の１へと劇的に低下した（図１１）。
【０１１７】
ハースタチン発現プラスミドとｐ１８５ＨＥＲ−２発現プラスミドをトランスフェクトする割合を変化させることにより、ハースタチンの発現がトランスフェクトされた細胞内のｐ１８５ＨＥＲ−２に及ぼす効果をさらに調べた。ハースタチン発現プラスミドをｐ１８５ＨＥＲ−２発現ラスミドの５分の１のレベルで導入したときには、ｐ１８５ＨＥＲ−２の発現レベルに対する影響は実質的になかった。ｐ１８５ＨＥＲ−２発現プラスミドに対するハースタチン発現プラスミドの相対量を増やしていくと、ｐ１８５ＨＥＲ−２の発現レベルが低下し（図１４のＢ）、同時にトランスフェクトしたマーカーであるＧＦＰ発現プラスミドの発現が図９に示したのと同様に低下した。それとは対照的に、対照であるＧＦＰ発現プラスミドだけをトランスフェクトすると、細胞の生存には影響を与えず、添加したプラスミドの量に比例してＧＦＰの発現が増加した（図１３）。
【０１１８】
したがって、ハースタチンを同時にトランスフェクトした細胞中のｐ１８５ＨＥＲ−２のレベル低下は、細胞ごとのｐ１８５ＨＥＲ−２のレベル低下ではなく、トランスフェクト後の細胞のコロニー形成が減少したことが原因であると結論された。さらに、トランスフェクトされた細胞の生存率は、ハースタチンとｐ１８５ＨＥＲ−２の相対的な発現量に依存していた。言い換えるならば、ｐ１８５ＨＥＲ−２を発現する細胞の生存率は、ハースタチンに曝露することによって実質的に低下した。
【０１１９】
（２）ハースタチンの発現がｐ１８５ＨＥＲ−２のチロシンリン酸化を抑制する。ハースタチンを同時にトランスフェクトしてｐ１８５ＨＥＲ−２のレベルが３分の１に低下した場合には、ｐ１８５ＨＥＲ−２のチロシンリン酸化シグナルが２５分の１に低下した。これは、個々の細胞でｐ１８５ＨＥＲ−２のチロシンリン酸化のレベルが約８分の１に低下することに相当する（図１５）。
【０１２０】
細胞の生存の場合と同様、ｐ１８５ＨＥＲ−２のチロシンリン酸化が抑制される程度は、ｐ１８５ＨＥＲ−２発現プラスミドに対するハースタチン発現プラスミドの割合に影響された。最大の効果は、比が２：１のときに観察された（ハースタチン：ｐ１８５ＨＥＲ−２）。ハースタチン発現プラスミドだけをトランスフェクトすると、内在性１８５ｋＤａタンパク質に付随するチロシンリン酸化シグナルが約２分の１に低下した（Ｃのレーン１とレーン２の比較）。トランスフェクトされたｐ１８５ＨＥＲ−２発現プラスミドから発現したｐ１８５ＨＥＲ−２と同時にｐ１８５タンパク質が移動したが、このｐ１８５タンパク質は、内在性ｐ１８５ＨＥＲ−２に対応しているようである。
【０１２１】
ハースタチンを異所発現させると、外来性と内在性のｐ１８５ＨＥＲ−２のチロシンリン酸化が減少した。さらに、ｐ１８５ＨＥＲ−２発現プラスミドに対するハースタチンの割合は、ｐ１８５ＨＥＲ−２のチロシンリン酸化抑制の程度とｐ１８５の発現レベルに影響を与える。したがって、減少したｐ１８５ＨＥＲ−２のチロシンリン酸化は、ＨＥＲ−２とハースタチンを同時にトランスフェクトした細胞のコロニー形成の減少と関係していた。
【０１２２】
実施例１３
トランスフェクトされた細胞内でハースタチンを同時に発現させると、（１）ＥＧＦ受容体のレベルが低下し、トランスフェクション後のＥＧＦを媒介とした細胞の生存率の上昇が抑制され、（２）ＥＧＦを媒介としたＥＧＦ受容体のダウンレギュレーションが抑制され、（３）チロシンリン酸化の測定によって明らかになるＥＧＦ受容体の活性化が抑制された。
【０１２３】
グループＩの受容体チロシンキナーゼとしては、ｐ１８５ＨＥＲ−２（ｅｒｂＢ−２）の他に、ＥＧＦ受容体（ＨＥＲ−１、ｅｒｂＢ−１）、ＨＥＲ−３（ｅｒｂＢ−３）、ＨＥＲ−４（ｅｒｂＢ−４）が挙げられる。内在性ＥＧＦ受容体を含まないＣＨＯ細胞内でハースタチンがＥＧＦ受容体に及ぼす効果を調べ、グループＩの他の受容体に影響が及ぶかどうかを明らかにした。
【０１２４】
方法。ＥＧＦ受容体の活性化の測定。ＣＨＯ細胞を６ウエルのプレートに２×１０５細胞／ウエルの割合で植え、２４時間後、２組用意した一方のウエルには、０．５μｇのＦＧＰマーカー・プラスミド＋１．５μｇのＥＧＦ受容体発現プラスミド＋所定量のハースタチン発現ベクターをトランスフェクトした。もう一方のウエルには、０．５μｇのＦＧＰマーカー・プラスミド＋所定量のハースタチン発現ベクターをトランスフェクトしたが、ＥＧＦ受容体発現プラスミドはトランスフェクトしなかった。２４時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、無血清培地の中でさらに２４時間にわたって培養した。培養物を１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦの存在下または不在下で２０分間にわたって培養し、次に、図１５の場合と同様にして修飾ＲＩＰＡの中に抽出した。各ウエルからのタンパク質約２０μｇを７％ポリアクリルアミド−ＳＤＳ−ゲルを用いて分離し、まず最初に、１μｇ／ｍｌの抗ホスホチロシン抗体を用いてウエスタンブロット法で分析した。次にブロットを取り出し、抗ＥＧＦ受容体抗体で調べた。また、培養物を１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦの存在下または不在下で２４時間にわたって培養し、細胞抽出液をウエスタンブロット法で分析し、抗ＥＧＦ受容体抗体による検出を行なった。
【０１２５】
ＥＧＦ受容体とハースタチンがコロニーの増殖に及ぼす効果の測定。ＣＨＯ細胞を６ウエルのプレートに植え、３組のウエルを用意し、１．５μｇのＥＧＦ受容体発現プラスミド、１．５μｇのＥＧＦ受容体発現プラスミド＋１．５μｇのハースタチン発現プラスミド、１．５μｇのハースタチン発現プラスミドのいずれかをトランスフェクトした。各ウエルのＤＮＡの合計量を３μｇにするため、エンプティ・ベクターを添加した。ＤＮＡを添加してから４８時間後、各ウエルの細胞をトリプシン処理して回収し、１：１０の割合に希釈し、６００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地の中にある６ウエルのプレートに入れた。培地は２日ごとに交換した。１４日目にプレートをクリスタルバイオレットで染色した。染色された培養物からの色素をすでに説明したようにして抽出し、４１５ｎＭにおける吸光度をもとにして定量した。３つのウエルの平均値は、対照をトランスフェクトしたウエルに対する百分率で表示し、この平均値と標準偏差をプロットした。３回の独立した実験において同様の結果が得られた。
【０１２６】
ハースタチンとｐ１８５ＨＥＲ−２とｐ１７５ＥＧＦ受容体の間に安定な複合体が形成されたことの測定。Ｓプロテイン・アガロースの５０％懸濁液（ノヴァジェン社）約１００μｌを、ペプチドなしの場合、ＴＢｐｅｘ１４ペプチド（ＯＨＳＵのＢ． Ｕｌｍａｎ博士から提供された）５０μｇを添加した場合、イントロン８によってコードされているペプチド５０μｇを添加した場合、完全長組み換えハースタチン５０μｇを添加した場合について、室温で１時間にわたって培養した。各ペプチドは、ｐＥＴ３０発現プラスミド（ノヴァジェン社）によってコードされているＳプロテイン・タグを含んでいた。次に、アガロース・サンプルをＰＢＳで２回洗浄し、１％のノニデット−ｐ４０（ＰＢＳＮＰ−４０）を含むＰＢＳに溶かした１００μｇのＡ４３１細胞抽出液（ＥＧＦ受容体用）または１７−３−１抽出液（ｐ１８５ＨＥＲ−２用）とともに、室温にて１時間にわたって培養した。アガロース・サンプルは、この細胞抽出液とともに培養した後、５００μｌのＰＢＳ−ＮＰ４０で２回洗浄し、樹脂に付着したタンパク質を９２℃で２分間にわたって４０μｌのＳＤＳ−サンプル緩衝液の中に溶離した。元のペプチドと同じ量がアガロースと複合体を形成していることを確認するため、ＳＤＳ−サンプル緩衝液の中に抽出したアリコートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとクーマシー染色により分析した（ＴＢｐｅｘ１４と、イントロン８によってコードされているペプチドについては１７％ポリアクリルアミド・ゲルを、ｐ５０ハースタチンについては１０％ポリアクリルアミド・ゲルを用いた）。受容体の結合状態を分析するため、アガロースから溶離したアリコートを、抗ＥＧＦＲまたは抗ｐ１８５ＨＥＲ−２を用いてウエスタンブロットとして分析した。
【０１２７】
（１）〜（３）ハースタチンの異所発現により、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞内のｐ１７５ＥＧＦ受容体のレベルが低下し、トランスフェクション後のＥＧＦを媒介とした生存率の上昇が抑制された。ｐ１８５ＨＥＲ−２受容体についてすでに説明したように、図１６は、導入するハースタチン発現プラスミドの量をＥＧＦ受容体発現プラスミドの２倍にすると、リガンドＥＧＦが存在するかどうかには関係なくＥＧＦ受容体のレベルが低下することを示している。ＧＦＰマーカーの発現もそれに伴って低下した。ハースタチン発現プラスミドの量をＥＧＦ受容体発現プラスミドの３分の１にすると、ｐ１７５ＥＧＦ受容体の量は、ＥＧＦ受容体だけをトランスフェクトした細胞におけるのと同じ程度になった（図１６のレーン２、レーン３をレーン６、レーン７と比較のこと）。
【０１２８】
ハースタチンの発現により、ｐ１７５ＥＧＦ受容体のダウンレギュレーションが抑制され、チロシンリン酸化の測定によって明らかになるｐ１７５ＥＧＦ受容体の活性化が抑制された。ハースタチンがＥＧＦによるｐ１７５ＥＧＦ受容体の活性化に及ぼす効果を調べた。図１７のレーン２とレーン３に示したように、ＥＧＦはｐ１７５ＥＧＦ受容体のチロシンリン酸化を誘起し、８０ｋＤａと５５ｋＤａのタンパク質に付随するホスホチロシン・シグナルを増大させた。ハースタチンの存在下では、飽和量のＥＧＦを添加した後にｐ１７５ＥＧＦ受容体のチロシンリン酸化が増加することは検出できず、８０ｋＤａと５５ｋＤａのタンパク質のチロシンリン酸化が増加することも検出できなかった（図１７、レーン６とレーン７）。
【０１２９】
ＥＧＦに関して知られている別の効果は、ＥＧＦ受容体のダウンレギュレーションである。図１８は、ＥＧＦで処理した４８時間後にｐ１７５ＥＧＦ受容体のレベルが予想通り大きく低下したことを示している（レーン２とレーン３）。しかしハースタチンを導入した場合には、レーン４とレーン５に示したように、ＥＧＦ受容体のダウンレギュレーションが少なくなった。
【０１３０】
ハースタチンは、ＥＧＦ受容体を過剰発現している細胞の増殖を抑制した。ハースタチンをＥＧＦ受容体と組み合わせたときにコロニー形成に及ぼす効果を調べた。図１１の場合と同様にして、ＣＨＯ細胞にトランスフェクションを行ない、Ｇ４１８を用いて選択を実施した。ｐ１７５ＥＧＦ受容体だけを過剰発現させた場合、対照（図１１に示したエンプティ・ベクターをトランスフェクトした細胞）と比べて細胞生存率が４０％増加した。ハースタチンだけをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞では、対照をトランスフェクトした細胞と比べると生存率が約２０％増加した。これは、図１１に示したハースタチンの効果と比べて有意に異なってはいなかった。
【０１３１】
ハースタチンとＥＧＦ受容体を同時に発現させると、ＥＧＦ受容体だけの場合よりも生存率が低下した。ｐ１８５ＨＥＲ−２についてすでに明らかにしたように、この抑制は、ハースタチンを媒介としてＥＧＦによるｐ１７５ＥＧＦ受容体の活性化が妨げられることと関係していた。そのことが図１６、図１７、図１８からわかる。
【０１３２】
ハースタチンは、ｐ１８５ＨＥＲ−２とＥＧＦ受容体の両方と安定な複合体を形成した。
【０１３３】
本発明によると、完全長ハースタチンと、そのイントロン８によってコードされているＣ末端領域（組み換えペプチドとして発現）の両方が、ｎＭオーダーのアフィニティでｐ１８５ＨＥＲ−２と結合する。さらに実験を行ない、すでに説明したハースタチン／ｐ１８５ＨＥＲ−２の結合相互作用に加え、ハースタチンとｐ１７５ＥＧＦ受容体の間に結合相互作用が存在しているかどうかを（ハースタチンがＥＧＦによるＥＧＦ受容体の活性化を妨げる能力に基づいて）明らかにした。
【０１３４】
ハースタチンは、ｐ１８５ＨＥＲ−２とＥＧＦ受容体の両方と安定な複合体を形成した。ハースタチン／ＥＧＦ受容体の相互作用を、“不活性”アッセイで調べた。用いたのは、イントロン８によってコードされていてハースタチンのＣ末端と一致するポリペプチドを精製したもの、完全長組み換えハースタチン・タンパク質、無関係の配列を有する対照ペプチドであり、これらすべてをＳプロテイン・アガロース（ノヴァジェン社）に固定化した。次に、これらタンパク質のうちの１つを用いて誘導体化したアガロースをＡ４３１細胞の抽出液とともに培養し、洗浄し、ウエスタンブロット法で分析し、ｐ１７５ＥＧＦ受容体に対して特異的な抗体を用いて検出した。
【０１３５】
図２０に示したデータから、ｐ１７５ＥＧＦ受容体は、対照である無関係のペプチドが存在しているかどうかには関係なく、イントロン８によってコードされているポリペプチドおよびハースタチンと特異的に結合するが、Ｓタンパク質アガロースとは結合しないことがわかる。比較のため、ｐ１８５ＨＥＲ−２を安定にトランスフェクトした１７−３−１細胞の抽出液もプルダウンアッセイで調べた。以前にニッケル・アフィニティ樹脂を用いた場合に見られたように（Ｄｏｈｅｒｔｙ他、１９９９年）、ｐ１８５ＨＥＲ−２は、イントロン８によってコードされているポリペプチドおよびハースタチンと結合するが、無関係なペプチドとは結合しなかった。これらの結果は、ｐ１７５ＥＧＦ受容体とｐ１８５ＨＥＲ−２の両方が、ハースタチンならびにイントロン８によってコードされているハースタチンのＣ末端領域との間で安定な複合体を形成することを示している。
【０１３６】
要するに、ｐ１７５ＥＧＦ受容体とｐ１８５ＨＥＲ−２の両方が、ハースタチンと複合体を形成した。ハースタチンの発現により、ｐ１８５ＨＥＲ−２を過剰発現している細胞のコロニー形成が強く抑制された。さらに、ハースタチンはＥＧＦ受容体のレベルを低下させ、ＥＧＦ受容体の過剰発現によって起こる細胞の生存率増加を抑制した。細胞生存率の低下は、ｐ１８５ＨＥＲ−２のチロシンリン酸化が減少したことと、ＥＧＦを媒介としたＥＧＦ受容体の活性化が妨害されたことに関係していた。したがって、ハースタチンの負の調節活性は、受容体チロシンキナーゼのグループＩファミリーの第２のメンバーであるＥＧＦ受容体にも当てはまった。
【０１３７】
実施例１４
ハースタチンは、活性化Ａｋｔを媒介としたＥＧＦ生存シグナルを阻止した
【０１３８】
Ａｋｔと呼ばれるタンパク質キナーゼは、細胞の生存にとってカギとなる調節分子である。Ａｋｔの活性化が、細胞の生存にとっての必要十分条件である。活性化したＡｋｔを刺激すると、不適切な細胞が生き延びたり、細胞の正常な死が妨げられたりする。ある種のヒトのガンではこのようなことが起こっていることが見いだされている。ＨＥＲ−２とＥＧＦ受容体の両方とも、Ａｋｔ生存シグナルを活性化させる。現在の理論によると、そのことによってガンが成長すると考えられている（Ｂｌｕｍｅ−ＪｅｎｓｅｎとＨｕｎｔｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、第４１１巻、３５５〜３６５ページ、２００１年；Ｄａｔｔａ他、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、第１３巻、２９０５〜２９０７ページ、２０００年；ＹａｒｄｅｎとＳｌｉｋｏｗｓｋｉ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻、１２７〜１３７ページ）。
方法。ＥＧＦＲ３Ｔ３細胞における活性化したホスホａｋｔ（活性化したＡＫＴ）の測定。活性化したＡＫＴ（ホスホ−ａｋｔ）の測定を、標準的なウエスタンブロット法を利用し、市販されている抗ホスホａｋｔ抗体（サンタ・クルス社）を用いて行なった。細胞に対するトランスフェクションは、この明細書ですでに説明したのと同様にして行なった。
【０１３９】
結果。ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ３Ｔ３）を過剰発現している細胞にハースタチンをトランスフェクトして対照細胞とし、その対照細胞をさらにＥＧＦ（ＤＭＥＭ中に１００ｎｇ／ｍｌ）または賦形剤（対照）で処理し、さまざまな時間にわたって培養し、ハースタチンがＥＧＦの生存に及ぼす効果を調べた（図２１）。活性化したＡｋｔを調べるため、細胞抽出液を、活性化した形態のＡｋｔ（ホスホａｋｔ）に対して特異的な抗体（サンタ・クルス社から入手可能）と反応させた。
【０１４０】
ＥＧＦ受容体をＥＧＦで刺激した２０分後、活性化したホスホａｋｔが非常に増大した（上図）。重要なことだが、ハースタチンの存在下では活性化したＡｋｔのシグナルが消えた。Ａｋｔタンパク質の全体的レベルは、対照レーンからわかるように一定であった（図２１の下図）。
【０１４１】
したがって、本発明によれば、低下した細胞生存率は、（上記の実施例に示したように）ｐ１８５ＨＥＲ−２のチロシンリン酸化が減少したことと、ＥＧＦを媒介としたＥＧＦ受容体の活性化が妨害されたことに関係しているだけでなく、ＥＧＦ受容体を媒介とした細胞の生存シグナルの阻止にも関係していた。この結果は、Ａｋｔを媒介とした細胞生存シグナルがＥＧＦから発生するのをハースタチンが阻止していることを示している。
【０１４２】
実施例１５
ハースタチンは、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）を媒介としたＥＧＦ受容体の活性化、生存シグナル、増殖シグナルを阻止した
【０１４３】
ＨＥＲファミリーの受容体を活性化させるあらゆる増殖因子のうちで、ＴＧＦαはヒトのガンと最も関係が深い。肺ガン、卵巣ガン、大腸ガン、前立腺ガンにおけるＴＧＦαの発現は、好ましくない結果と関係している。ＴＧＦαが発現すると、腫瘍が自身のＥＧＦ受容体を連続的に刺激し続けるという自己分泌メカニズムによってガンがより攻撃的になる可能性があると考えられている（ＹａｒｄｅｎとＳｌｉｋｏｗｓｋｉ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻、１２７〜１３７ページ）。そこで、ＥＧＦ受容体の活性化とチロシンリン酸化にとって重要なステップと、Ａｋｔの活性化からわかる生存シグナルを調べ、ＴＧＦαによるＥＧＦ受容体の活性化にハースタチンが及ぼす効果を評価した（図２２）。
【０１４４】
さらに、ＤＮＡ合成を促進すると、ＴＧＦαを媒介としたＥＧＦ受容体の活性化シグナルが発生する。要するに、ＴＧＦαを媒介としたＤＮＡ合成の促進にハースタチンが及ぼす効果を、ハースタチンが増殖に及ぼす効果の１つの指標として調べた。
【０１４５】
方法。ＥＧＦ受容体のチロシンリン酸化、活性化したＡｋｔ生存シグナル、ＴＧＦαを媒介とした細胞増殖シグナルの測定。ＥＧＦＲ３Ｔ３細胞において、ＥＧＦ受容体のチロシンリン酸化の測定と活性化したＡｋｔ生存シグナル（すなわちホスホａｋｔ）の測定を上記のようにして行なった。
【０１４６】
ＴＧＦαを媒介とした細胞増殖シグナルの測定では、トリチウム化したチミジンが細胞ＤＮＡにどれくらいの量組み込まれたかを対照値に対する百分率（“規格化したＣＰＭ”）として測定するという標準的な方法を利用した。
【０１４７】
結果。図２２は、ＥＧＦＲ３Ｔ３細胞において、ハースタチンの存在下で、ＴＧＦαを媒介としたＥＧＦ受容体の活性化が抑制され（上図）、ＴＧＦαを媒介としたＡｋｔ生存シグナルが強く抑制された（下図）ことを示している。重要なことだが、過剰量のＴＧＦαは、ハースタチンが受容体の活性化と生存シグナルを阻止する能力を打ち消すことはなかった。これは、腫瘍細胞から大量に自己分泌されるＴＧＦαがハースタチンの効果を妨げないことを示唆している。
【０１４８】
さらに、図２３は、ハースタチンがＴＧＦαを媒介とした細胞増殖シグナルを阻止したことを示している。ハースタチンを発現する細胞、すなわち対照細胞をさまざまな濃度のＴＧＦαで処理し、トリチウム化したチミジンがどれくらいの量組み込まれたかを対照値に対する百分率（“規格化したＣＰＭ”）として測定することにより、ＤＮＡの合成状態を調べた。ＴＧＦαによるＤＮＡの合成促進は、ハースタチンの発現によって阻止された（図２３）。
【０１４９】
要するに、ＴＧＦαを媒介とした細胞増殖に関するシグナルは、ハースタチンの発現によって阻止された。
【０１５０】
実施例１６
組み換えハースタチンは、ＨＥＲ−２を過剰発現しているヒトのガン細胞を特異的に抑制した
【０１５１】
本発明よれば、ハースタチンを用いてガン（中でも乳ガン、卵巣ガン、肺ガン、大腸ガン、グリア細胞ガン、前立腺ガン）を治療することができる。ＨＥＲ−２を過剰発現しているヒトのガン細胞を精製した組み換えハースタチンが特異的に抑制する能力を、卵巣ガン細胞系と乳ガン細胞系の両方で評価した。
【０１５２】
方法。精製した組み換えハースタチンの産生。組み換えハースタチンを、インヴィトロジェン社の標準的な昆虫発現系を用い、昆虫のＳ２細胞内でヒスチジン・タグ付きのタンパク質として産生させた。この組み換えタンパク質を無血清培地に分泌させた。この組み換えタンパク質は、１リットルにつき約１０ｍｇ存在していた。ハースタチン・タンパク質をニッケル・アフィニティ・クロマトグラフィとコンカナバリンＡアフィニティ・クロマトグラフィにより精製した。タンパク質を染色することにより、精製したタンパク質が９０％を超える純度であるかどうかを判定した。
【０１５３】
ハースタチンを用いたガン細胞系の処理。ガン細胞系をプレートに植えるとき（すなわち２日目と４日目）、精製した組み換えハースタチンを添加した（濃度２４０ｎＭ）。細胞の増殖および／または生存を、従来技術で知られているＭＴＴ生存細胞アッセイによって定量した（Ｈａｎｓｅｎ他、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、第１１９巻、２０１〜２１０ページ、１９８９年）。
【０１５４】
結果。図２４は、ＨＥＲ−２を過剰発現している卵巣ガン細胞系（ＳＫＯＶ−３）と乳ガン細胞系（ＳＫＢＲ−３）の増殖および／または生存が、ハースタチンで処理していない細胞（左側の２本の棒）と比べて約６０％抑制されたことを示している。これとは対照的に、ＨＥＲ−２を低レベルでしか発現していない乳房の正常な細胞系（ＨＢＬ−１００）とＭＣＦ−７乳ガン細胞系は、精製した組み換えハースタチンによって有意に抑制されることはなかった（右側の２本の棒）。
【０１５５】
要するに、ハースタチンを媒介とした増殖抑制の程度は、ＨＥＲ−２の発現レベルを反映していた。ハースタチンによる抑制は、正常細胞と比べると、あるいはＨＥＲ−２の発現が低レベルか正常レベルである形質転換した細胞と比べると、ＨＥＲ−２を過剰発現しているガン細胞に対して特異性を示した。
【０１５６】
図２５は、ＳＫＯＶ−３ガン細胞の増殖および／または生存（６００ｎＭにおける吸光度）は抑制される（左側の３本の棒）が、正常なＨＢＬ−１００細胞は抑制されず（右側の３本の棒）、しかも抑制が精製した組み換えハースタチンの投与量に依存していることを示している。
【０１５７】
実施例１７
薬理動態
精製した組み換えハースタチンの薬理動態特性を調べるため、ハースタチンを腹腔内に注射して分析した。生物活性のあるハースタチンは、注射したマウスの血液に効果的に吸収されたが、タンパク質分解酵素によって分解されることはなく、１〜３時間にわたって血液中に存在していた。
【０１５８】
方法。ハースタチンを用いたヌード・マウスの治療。ヌード・マウスの腹腔に、３０ｍｇ／ｋｇ（一匹につき約６００μｇ）の組み換えハースタチン、または対照となる賦形剤を注射した。７日の間にこの量を２回注射したが、毒性の徴候は見られなかった。
【０１５９】
ヌード・マウスの血清に含まれるハースタチンの分析。ハースタチンを注射してからさまざまな時間が経過した時点でマウスを殺し、凝固した血液から血清を回収した。緩衝液を用いて血清（全部で約２ｍｌあるうちの）２０μｌを１ｍｌに希釈し、ヒスチジン・タグを付けたハースタチンをアフィニティ・クロマトグラフィによって単離した。サンプルの分析を、非還元条件下でハースタチンに対するモノクローナル抗体（アップステイト・バイオロジカル社）を用いて、あるいは、還元条件下でクリントン・ラブ社が製造したハースタチンに対するウサギのポリクローナル抗体（Ｄｏｈｅｒｔｙ他、ＰＮＡＳ、１９９９年）を用いて、ウエスタンブロット法により行なった。
【０１６０】
結果。図２６は、腹腔内注射したヌード・マウスの血液に含まれる組み換えハースタチンの分析結果を示している。上図が非還元条件下、下図が還元条件下の結果である。ハースタチンを注射してから図示した時間が経過したとき、マウスを殺して凝固した血液から血清を回収した。そしてヒスチジン・タグを付けたハースタチンをアフィニティ・クロマトグラフィによって単離し、分析した。上図のサンプルは、非還元条件下でハースタチンに対するモノクローナル抗体（アップステイト・バイオロジカル社）を用いてウエスタンブロット法により分析した。下図では、サンプルの分析を、還元条件下でクリントン・ラブ社が製造したハースタチンに対するウサギのポリクローナル抗体（Ｄｏｈｅｒｔｙ他、ＰＮＡＳ、１９９９年）を用いてウエスタンブロット法により行なった。
【０１６１】
ハースタチンの存在は、注射してから３０分後と１時間後には検出できたが、注射してから３時間後と１８時間後には検出できなかった（図２６、上図；非還元条件）。非還元条件下で約５５〜６０ｋＤａの位置に移動したハースタチンの単一の種が存在していることから、モノマーでジスルフィドにはなっていない架橋した（凝集した）タンパク質が存在していることがわかる。別の研究により、このモノマー・タンパク質が生物活性を有する形態であることがわかった。
【０１６２】
図２６の下図は、還元条件下で、ハースタチンの多数のエピトープと反応するポリクローナル抗体を用い、血清に含まれるハースタチンを分析した結果を示している。これは、検出されたタンパク質がハースタチンであることの強力な証拠となっている。重要なことだが、ハースタチンは、血液中でタンパク質分解酵素によって分解されることはない。その証拠に、どのウエスタンブロットにも、ハースタチンよりも小さな産物は検出されなかった。マウスの血清に含まれるハースタチンの量に関する半定量的分析（既知量のハースタチンからのウエスタンブロット・シグナルとの比較により決定される）により、腹腔内注射したタンパク質の約１０〜２０％が吸収され、血液中に１〜３時間にわたって存在していることがわかった。モノマーの形態をしたハースタチンは注射した全ハースタチン・サンプルの約２０％であるという事実に基づくと、モノマーの形態が９０％も吸収されるのに対し、凝集したタンパク質のほとんどは吸収されないというのが最も起こっていそうなことである。
【０１６３】
要するに、生物活性のあるモノマー形態の組み換えハースタチンは、注射したマウスの血液に効果的に吸収され、血液中でタンパク質分解酵素によって分解されることはなく、血液中に１〜３時間存在してから除去される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＨＥＲ−２の細胞外領域に挿入されたヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示している。ＨＥＲ−２のＥＣＤをコードしているエキソン１〜９からの配列（プライマーＡとＢ）は、ＳＫＯＶ−３細胞からのｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって増幅した。サザンブロット分析により、約１４２０ｂｐの産物がＨＥＲ−２に対して特異的であることがわかった。この産物をサブクローニングし、ヌクレオチド配列を決定した。Ａの部分には、ヌクレオチド配列が、２７４ｂｐの挿入体として（ボックスの外）、またその挿入体に直接隣接した５’部位の配列および３’部位の配列を含めた配列として（ボックス内）示されている。この挿入体は、Ｃｏｕｓｓｅｎｓ他のナンバリングを用いると（Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３０巻、１１３２〜１１３９ページ、１９８５年）、ｐ１８５ＨＥＲ−２のヌクレオチド残基１１７１と１１７２の間で、アミノ酸残基３４０の後ろに位置している。矢印で示した共通する５’スプライス部位および３’スプライス部位の拡大図が示してある。挿入された配列は、５’ＨＥＲ−２エキソン配列とインフレームであり、アルギニン３４０（Ｒ３４０）に続く７９個のアミノ酸延長部をコードしていることが推定される。この挿入体によってコードされる新規な７９個のアミノ酸配列はプロリン・リッチ（１９％）であり、アスパラギンが結合する共通グリコシル化部位を有する。その部分に下線を引いてある。終止コドンが、挿入された配列のヌクレオチド２３６〜２３８の位置に見つかった。Ｂの部分には、新たな転写産物が、ｐ１８５と一致するサブドメインＩとＩＩを含む分泌タンパク質断片であり、膜貫通領域と細胞質領域を欠いていることを示してある。完全にグリコシル化された場合に予想されるサイズは６５〜７０ｋＤａである。このポリペプチド産物は、ｐ６８ＨＥＲ−２と呼ばれる。したがってこの産物は、ｐ１８５ＨＥＲ−２に見られる膜貫通領域と細胞質領域が欠けた分泌タンパク質断片であろう。
【図２】
ＥＣＤ ＩＩＩａを含む新たなＨＥＲ−２転写産物をノーザンブロット分析で検出した結果を示す。さまざまなヒト胎児組織（クロンテック社）またはＨＥＫ−２９３細胞からのポリＡ＋ｍＲＮＡ（２．５μｇ）をホルマリン・アガロース・ゲルで分離し、１０×ＳＳＣ中のブライトスター（登録商標）膜（アンビオン社）に移した。この膜を、ＥＣＤ ＩＩＩ配列と相補的な３２Ｐ標識アンチセンスＲＮＡプローブとハイブリダイズさせ、分離させ、５’ＨＥＲ−２エキソン配列に対して特異的な３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブで再度調べた。膜を非常に厳しい条件下で洗浄し、リン光画像装置（モレキュラー・ダイナミックス社）で分析した。
【図３】
抗ＥＣＤ ＩＩＩａが、ヒト胚性腎臓細胞系（ＨＥＫ２９３）の約６８ｋＤａのタンパク質に対して配列特異的な反応をすることを示している。細胞抽出タンパク質（２０μｇ）と、ＨＥＫ２９３細胞によって調整した２０μｌの培地とに対してウエスタンブロット分析を行ない、１：１０，０００に希釈した抗ＥＣＤ ＩＩＩａ（レーン１と２）、またはヒスチジン・タグを有する５０μｇ／ｍｌの精製ＥＣＤ ＩＩＩａペプチドを含む、１：１０，０００に希釈した抗ＥＣＤ ＩＩａ（レーン３と４）をプローブにして調べた。
【図４】
ＨＥＲ−２遺伝子が増幅されたガン細胞系ではｐ６８ＥＣＤ ＩＩＩａの発現と比べてｐ１８５ＨＥＲ−２の発現が顕著に増大していることを示している。ヒト胚性腎臓細胞系（ＨＥＫ２９３）からの細胞抽出液（タンパク質１５μｇ）、非発ガン性卵巣表面上皮細胞系（ＩＯＳＥＶＡＮ）、ＨＥＲ−２遺伝子が増幅している卵巣ガン細胞系（ＳＫＯＶ−３）、非発ガン性乳房上皮細胞系（ＨＢＬ１００）、ＨＥＲ−２遺伝子が増幅している乳ガン細胞系（ＢＴ４７４とＳＫＢＲ−３）を７．５％のアクリルアミド・ゲル中でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離させ、ウエスタンブロット法で分析した。このウエスタンブロット法では、プローブとして、ｐ６８ＨＥＲ−２に対して特異的な抗体（抗ＥＣＤ ＩＩＩａ）と、ｐ１８５ＨＥＲ−２に対して特異的な抗体（抗ｎｅｕ（Ｃ））の両方を用いた。
【図５】
ｐ６８ＥＣＤ ＩＩＩａがｐ１８５ＨＥＲ−２に結合している様子を示す。Ａの部分では、非変性性緩衝液中に抽出した２ｍｇのＳＫＢＲ−３細胞を、ｐ６８ＨＥＲ−２とｐ１８５ＨＥＲ−２のＮ末端配列に対して特異的な５μｌの抗ｎｅｕ（Ｎ）とともに、またはｐ１８５ＨＥＲ−２のＣ末端に対して特異的な５μｌの抗ｎｅｕ（Ｃ）とともに免疫沈降させ、ｐ６８ＨＥＲ−２に対して特異的な抗ＥＣＤ ＩＩＩａと、ｐ１８５ＨＥＲ−２に対して特異的な抗ｎｅｕ（Ｃ）の両方を用い、ウエスタンブロット分析を行なった。Ｂの部分では、１００μｇの１７−３−１細胞抽出液を２組用意し、充填容積が５０μｌのＮｉＮＴＡアガロース樹脂（キアジェン社）とともに２００μｌの洗浄用緩衝液（２０ｍＭのトリス ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ）中で室温にて振盪しながら１時間にわたって培養した。アガロース樹脂に対し、一方の培養物ではヒスチジン・タグを有する２０μｇのＥＣＤ ＩＩＩａを結合させ、他方の培養物ではヒスチジン・タグを有する２０μｇのＣＲＥＢ断片を結合させた。次にこの樹脂を５００μｌの洗浄用緩衝液で４回洗浄し、５０μｌのＳＤＳ−サンプル緩衝液とともに１００℃で２分間培養することにより、タンパク質を溶離させた。溶離したタンパク質は、ｐ１８５ＨＥＲ−２のＣ末端に対して特異的な抗体、すなわち抗ｎｅｕ（Ｃ）を用いてウエスタンブロット法で分析した。Ｃの部分では、３Ｔ３細胞、またはＨＥＲ−２をトランスフェクトした１７−３−１細胞約１０５個からなる単層を１２ウエルのプレートに入れたものをＰＢＳで２回洗浄し、次に、１％のＢＳＡと、ヒスチジン・タグを有する精製した３９、７５、１５０、３００ｎＭの組み換えＥＣＤ ＩＩＩａとを含む無血清培地０．５ｍｌとともに４℃で２時間にわたって培養した。細胞を、１％のＢＳＡを含むＰＢＳの中で１回洗浄し、ＰＢＳの中で２回洗浄し、変性用緩衝液中に抽出した。等量の複数のアリコート（タンパク質２０μｇ）を、ＥＣＤ ＩＩＩａに対して特異的な抗体（抗ＥＣＤ ＩＩＩａ）、またはｐ１８５ＨＥＲ−２に対して特異的な抗体（抗ｎｅｕ（Ｃ））を用いて（上の列）ウエスタンブロット法で分析した。
【図６】
ｐ６８リッチにした培地も、ＥＣＤ ＩＩＩａペプチドも、ｐ１８５ＨＥＲ−２のチロシンリン酸化を促進できないことを示している。ＨＥＲ−２をトランスフェクトした約１０５個の１７−３−１細胞からなる単層培養物をＰＢＳで２回洗浄し、無血清培地中で３７℃にて２４時間培養し、ヒスチジン・タグを有する７５μＭまたは１５０μＭのＥＣＤ ＩＩＩａ、または高レベルのｐ６８を分泌するＨＥＫ−２９３細胞からの５０×ＣＭ、またはｐ６８ＨＥＲ−２が検出できないＳＫＯＶ−３細胞からの５０×ＣＭを用いて１０分間処理した。処理した細胞は、ホスホチロシンホスファターゼを阻害するバナジウム塩（２ｍＭ）を含む変性用緩衝液で抽出し、各サンプルからの細胞抽出タンパク質２０μｇ／ｍｌを、ホスホチロシンに対するモノクローナル抗体（シグマ社）を用いてウエスタンブロット法で分析した。６２．５ｍＭのトリスｐＨ６．７と、２％のＳＤＳと、１００ｍＭの２−メルカプトエタノールの中で５５℃にて３０分間にわたって培養することによりブロットを取り出し、ｐ１８５ＨＥＲ−２に対して特異的な抗ｎｅｕ（Ｃ）をプローブとしてこのブロットを再度調べた。
【図７】
ｐ６８ＨＥＲ−２が、基質とは独立な発ガン性細胞の成長を抑制したことを示している。ＳＣＯＶ−３卵巣ガン細胞と、ＨＥＲ−２をトランスフェクトした１７−３−１細胞を、０．３％の寒天を含む１０％のウシ胎仔血清を加えた培地（対照条件）中に分散させ、この培地に、ＳＣＯＶ−３細胞によって調整した５０×濃縮培地（検出可能なレベルのｐ６８ＨＥＲ−２を含まない（−ｐ６８ＣＭ））、またはＨＥＫ−２９３細胞によって調整した５０×濃縮培地（２０ｎＭのｐ６８ＨＥＲ−２を含む（＋ｐ６８ＣＭ））を添加した。１２ウエルのプレートに０．５％のアガロースを含む０．５ｍｌの培地を入れて層になるようにし、その上に５×１０３個の細胞を加えたものをそれぞれの実験条件ごとに全部で３組用意した。図示した結果は、３組用意したウエル中の５０個を超える細胞からなるコロニーの数を培養開始後２１日目のときに数えた平均値と標準偏差をプロットしたものである。同様の結果が３つの別々の実験でも観察された。
【図８】
ＨＥＲ−２のイントロン８についてのヌクレオチド配列と、推定されるアミノ酸配列を示している。ヒトのゲノムＤＮＡに対し、イントロン８に隣接するプライマーを用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲのパラメータは、９４℃にて１分間、６２℃にて１分間、７２℃にて３０秒間を３０サイクルの後、７２℃にて７分間を１サイクルであった。４１０ｂｐの産物をゲルで精製し、順方向と逆方向にシークエンシングした。図示した配列は、別々の約１５人からのイントロン８で見つかった最も一般的な配列である。配列が変異してアミノ酸の置換が起こる可能性のある箇所をＸで示してある。
【図９】
トランスフェクトされたＣｏｓ−７細胞において、ハースタチンとｐ１８５ＨＥＲ−２の両方を発現させた様子を示している。材料と方法の項に記載したように、Ｃｏｓ−７細胞は、６ウエルのプレートに２×１０５細胞／ウエルの割合で植え、リポフェクタミン（バイオラド社）を用いてこのＣｏｓ−７細胞にトランスフェクションを行なった。この細胞には、１．５μｇのハースタチン発現ベクター＋１．５μｇのＨＥＲ−２発現ベクター、または１．５μｇのＨＥＲ−２発現ベクター（すべてインヴィトロジェン社からのｐｃＤＮＡ３．１）をトランスフェクトした。それぞれの場合において、対照用エンプティ・ベクターを用い、ＤＮＡの合計量が３μｇになるようにした。図９は、トランスフェクトされた細胞を４８時間後の時点でウエスタンブロットとして分析した結果である。上方の図は、トランスフェクトされた細胞をｐ１８５ＨＥＲ−２に対する抗体である抗ｎｅｕ（Ｃ）と反応させた場合、下方の図は、ハースタチンのイントロン８によってコードされているＣ末端配列に対する抗体（抗Ｈｓｔ）と反応させた場合である。図１０では、３組のサンプルに対し、ＣＭＶプロモータによって制御されるガラクトシダーゼ発現プラスミド０．５μｇを含む上記のプラスミドを用いてトランスフェクションを行なった。４８時間後、細胞を抽出し、バイオラド・タンパク質染色キットで細胞タンパク質を定量し、β−ガラクトシダーゼの活性を測定した。その方法については後述する。β−ガラクトシダーゼの活性は、タンパク質の量で規格化し、平均と標準偏差をプロットした。β−ガラクトシダーゼの活性を各ウエルに最初に植えた細胞の数で規格化したときにも同様の結果が得られた。
【図１０】
図９と同。
【図１１】
トランスフェクトされた細胞コロニーの増殖にハースタチンが及ぼす効果を示している。ＣＨＯ細胞を６ウエルのプレートに２×１０５細胞／ウエルの割合で植え、３組用意したウエルに、材料と方法の項に記載したようにして、３μｇの対照用エンプティ・ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１；インヴィトロジェン社）；１．５μｇのｐ１８５ＨＥＲ−２発現プラスミド＋１．５μｇの対照ＤＮＡ；１．５μｇのｐ１８５ＨＥＲ−２＋１．５μｇのハースタチン；１．５μｇのハースタチン＋１．５μｇの対照ＤＮＡをそれぞれトランスフェクトした。ＤＮＡを添加してから４８時間後、細胞をトリプシン処理し、０．６ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で１：１０の割合に希釈して６ウエルのプレートに入れた。培地は２日ごとに交換した。１４日目にプレートをクリスタルバイオレットで染色した後、洗浄した。上図では、５０％エタノールに入れた１ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ４．５）を用いて室温にて３０分間にわたって振盪することにより、クリスタルバイオレットで染色したプレートを抽出した。抽出したクリスタルバイオレットは、１０倍に希釈し、５１５ｎＭにおける吸光度をもとにして定量した。１０倍の希釈により読みが０．１から１になった。この値は、予備研究で決定した吸光度と細胞数の直線関係の範囲に入っていた。
【図１２】
図１１と同。
【図１３】
ハースタチンの発現により、トランスフェクトされた細胞内でｐ１８５ＨＥＲ−２のチロシンリン酸化が抑制されることを示している。Ｃｏｓ−７細胞を６ウエルのプレートに植え、図９と図１０の場合と同様にしてトランスフェクトした。図１３では、２組用意したウエル中の細胞に、０．２５、０．５、１．０、３μｇの蛍光グリーン・タンパク質（ＦＧＰ）発現プラスミドをトランスフェクトした。エンプティ・ベクターを添加し、各ウエル内のＤＮＡの合計量が３μｇになるようにした。４８時間後、蛍光プレート読み取り装置を用い、発光波長と励起波長における蛍光信号を定量した。図１４と図１５では、細胞に０．５μｇのＦＧＰプラスミド＋１．５μｇのＨＥＲ−２プラスミド＋所定量のハースタチン発現プラスミドをトランスフェクトしたものと、細胞に０．５μｇのＦＧＰプラスミド＋所定量のハースタチン発現プラスミドをトランスフェクトし、ＨＥＲ−２プラスミドはトランスフェクトしないものを用意した。エンプティ・ベクターを添加し、各ウエル内のＤＮＡの合計量が５μｇになるようにした。４８時間後、細胞をＰＢＳを用いて２回洗浄し、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニルと２ｍＭのオルトバナジン酸塩を含む１００μｌの修飾ＲＩＰＡの中に抽出した。透明な抽出液中のタンパク質の濃度をバイオラド・タンパク質染色キットを用いて測定した。抽出したタンパク質２０μｇを７．５％ポリアクリルアミドＳＤＳゲルを用いて分離し、まず最初に、１μｇ／ｍｌの抗ホスホチロシン抗体（抗ＰＴｙｒ）（図１５）を用いてウエスタンブロット法で分析した（材料と方法）。次に、ブロットを取り出し、ｐ１８５ＨＥＲ−２に対する抗体（抗ｎｅｕ（Ｃ）；図１４）と反応させた。化学ルミネセンス試薬（ピアス社）を用いてブロットを現像し、コダック社のフィルムに曝露した。
【図１４】
図１３と同。
【図１５】
図１３と同。
【図１６】
ハースタチンの発現により、トランスフェクトされた細胞内でＥＧＦによるＥＧＦ受容体の活性化が抑制されることを示している。ＣＨＯ細胞を６−ウエル・プレートに２×１０５細胞／ウエルの割合で植え、２４時間後、２通り用意した一方のウエルに、０．５μｇのＦＧＰマーカー・プラスミド＋１．５μｇのＥＧＦ受容体発現プラスミド＋所定量のハースタチン発現プラスミドをトランスフェクトした。もう一方のウエルには、０．５μｇのＦＧＰマーカー・プラスミド＋所定量のハースタチン発現プラスミドをトランスフェクトしたが、ＥＧＦ受容体発現プラスミドはトランスフェクトしなかった。２４時間後、細胞をＰＢＳを用いて２回洗浄し、無血清培地の中でさらに２４時間培養した。図１６と図１７では、培養物を１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦの存在下または不在下で２０分間にわたって培養し、次に、図１３〜図１５の場合と同様にして修飾ＲＩＰＡの中に抽出した。各ウエルからのタンパク質２０μｇを７％ポリアクリルアミドＳＤＳゲルを用いて分離し、まず最初に、１μｇ／ｍｌの抗ホスホチロシン抗体（図１７）を用いてウエスタンブロット法で分析した。次にブロットを取り出し、抗ＥＧＦ受容体抗体をプローブとして用いて調べた（図１８）。図１８では、培養物を１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦの存在下または不在下で２４時間にわたって培養した。次に、抗ＥＧＦ受容体抗体を用い、細胞抽出液をウエスタンブロットとして分析した。
【図１７】
図１６と同。
【図１８】
図１６と同。
【図１９】
ＥＧＦ受容体単独の場合と、ＥＧＦ受容体とハースタチンを組み合わせた場合に、コロニーの増殖にどのような影響があるかを示している。ＣＨＯ細胞を６ウエルのプレートに植え、３組用意したウエルに、１．５μｇのエンプティ・ベクター；１．５μｇのＥＧＦ受容体発現プラスミド；１．５μｇのＥＧＦ受容体発現プラスミド＋１．５μｇのハースタチン発現プラスミド；１．５μｇのハースタチン発現プラスミドをそれぞれトランスフェクトした。エンプティ・ベクターを添加し、各ウエル内のＤＮＡの合計量が３μｇになるようにした。ＤＮＡを添加してから４８時間後、各ウエルの細胞をトリプシン処理して回収し、１：１０の割合に希釈し、６００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地の中にある６ウエルのプレートに入れた。培地は２日ごとに交換した。１４日目にプレートをクリスタルバイオレットで染色した。染色した培養物からの色素を図１１の場合と同様にして抽出し、４１５ｎＭにおける吸光度をもとにして定量した。３つのウエルの平均値は、対照をトランスフェクトしたウエルに対する百分率で表示し、この平均値と標準偏差をプロットした。３回の独立した実験において同様の結果が得られた。
【図２０】
イントロン８によってコードされているペプチド、すなわちハースタチンを固定化したものが、ＥＧＦ受容体とｐ１８５ＨＥＲ−２を“プルダウンする”ことを示している。Ｓプロテイン・アガロースの５０％懸濁液（ノヴァジェン社）約１００μｌを、ペプチドなしの場合、ＴＢｐｅｘ１４ペプチド（ＯＨＳＵのＢ． Ｕｌｌｍａｎ博士から提供された）５０μｇを添加した場合、イントロン８によってコードされているペプチド５０μｇを添加した場合、完全長組み換えハースタチン５０μｇを添加した場合について、室温で１時間にわたって培養した。各ペプチドは、ｐＥＴ３０発現プラスミド（ノヴァジェン社）によってコードされているＳプロテイン・タグを含んでいた。次に、アガロース・サンプルをＰＢＳで２回洗浄し、１％のノニデット−ｐ４０（ＰＢＳＮＰ−４０）を含むＰＢＳに溶かした１００μｇのＡ４３１細胞抽出液（ＥＧＦ受容体用）または１７−３−１抽出液（ｐ１８５ＨＥＲ−２用）とともに、室温にて１時間にわたって培養した。アガロース・サンプルは、この細胞抽出液とともに培養した後、５００μｌのＰＢＳ−ＮＰ４０で２回洗浄し、樹脂に付着したタンパク質を９２℃で２分間にわたって４０μｌのＳＤＳ−サンプル緩衝液の中に溶離した。元のペプチドと同じ量がアガロースと複合体を形成していることを確認するため、ＳＤＳ−サンプル緩衝液の中に抽出したアリコートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとクーマシー染色により分析した。そのとき、ＴＢｐｅｘ１４と、イントロン８によってコードされているペプチドについては１７％ポリアクリルアミド・ゲルを、ｐ５０ハースタチンについては１０％ポリアクリルアミド・ゲルを用いた。受容体の結合状態を分析するため、アガロースから溶離したアリコートを、抗ＥＧＦＲまたは抗ｐ１８５ＨＥＲ−２を用いてウエスタンブロットとして分析した。
【図２１】
本発明により、活性化したホスホ−ａｋｔがＥＧＦによりＥＧＦ受容体を媒介として刺激されるのをハースタチンが抑制することを示している。上図は、ＥＧＦ受容体をＥＧＦで刺激した２０分後に、活性化したホスホａｋｔが非常に増加している様子を示す。ハースタチンの存在下では、活性化したＡｋｔシグナルが消えた。下図は対照であり、Ａｋｔタンパク質の全体的レベルが一定であることを示している。この結果は、ハースタチンが、ＥＧＦから発生する細胞生存シグナルを阻止するのに有効であることを示している。
【図２２】
本発明により、ＴＧＦαを媒介としたＥＧＦ受容体活性化の促進（上図）と、ＴＧＦαを媒介としたＡｋｔ生存シグナルの増大（下図）の両方がハースタチンによって強く抑制されることを示している。
【図２３】
ＴＧＦαによるＤＮＡ合成の促進がハースタチンの発現によって阻止されたことを示している。ハースタチンを発現する細胞または対照細胞を異なるさまざまな濃度のＴＧＦαで処理し、トリチウム化したチミジンがどれくらいの量組み込まれたかを対照値に対する百分率（“規格化したＣＰＭ”）として測定することにより、ＤＮＡの合成状態を調べた。
【図２４】
ＨＥＲ−２を過剰発現している卵巣ガン細胞系（ＳＫＯＶ−３）と乳ガン細胞系（ＳＫＢＲ−３）の増殖および／または生存が、ハースタチンで処理していない細胞（左側の２本の棒）と比べて約６０％抑制されたことを示している。それとは対照的に、ＨＥＲ−２を低レベルで発現している正常な乳房の細胞系（ＨＢＬ−１００）とＭＣＦ−７乳ガン細胞系は、精製した組み換えハースタチンによって有意に抑制されることはなかった（右側の２本の棒）。
【図２５】
ＳＫＯＶ−３ガン（左側の３本の棒）の増殖および／または生存（６００ｎＭにおける吸光度をもとに測定）は精製した組み換えハースタチンの投与量に応じて異なるが、正常なＨＢＬ−１００細胞（右側の３本の棒）はその投与量とは無関係であることを示している。
【図２６】
ヌード・マウスに組み換えハースタチンを腹腔内注射した後に血液中に含まれている組み換えハースタチンの分析結果を示している。上図のサンプルは、非還元条件下で、ハースタチンに対するモノクローナル抗体（アップステイト・バイオロジカルズ社）を用い、ウエスタンブロット法により分析した。下図では、還元条件下で、ハースタチンの多数のエピトープと反応するポリクローナル抗体を用いて分析した（Ｄｏｈｅｒｔｙ他、ＰＮＡＳ、１９９９年）。ハースタチンの存在は、注射してから３０分後と１時間後には検出できるが、注射してから３時間後と１８時間後には検出できない。重要なことだが、ハースタチンが血液中でタンパク質分解酵素によって分解されることはない。その証拠に、ハースタチンよりも小さな産物は、どのウエスタンブロットにも検出されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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