(57)【要約】本発明は、相補的な一本鎖領域を有するポリヌクレオチド間の会合速度を増大させるための方法および関連のキットを特徴とし、この方法は、相補的ポリヌクレオチドを含む試験サンプルに、１以上の合成水溶性ポリカチオン性ポリマーを提供する工程を包含する。ポリヌクレオチドプローブおよび標的核酸から二重鎖を形成するための方法であって、該方法は、以下の工程：該プローブが、試験サンプル中に該標的核酸が存在する場合、該標的核酸に優先的にハイブリダイズことを可能にする条件下で、該サンプルに該プローブを提供する工程；ならびに該条件下で該サンプル中の該プローブと該標的核酸との会合速度を増大させるに十分な量で、該サンプルに合成ポリカチオン性ポリマーを提供する工程、を包含する、方法。
2004537263.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドプローブおよび標的核酸から二重鎖を形成するための方法であって、該方法は、以下の工程：
該プローブが、試験サンプル中に該標的核酸が存在する場合、該標的核酸に優先的にハイブリダイズすることを可能にする条件下で、該サンプルに該プローブを提供する工程；ならびに
該条件下で該サンプル中の該プローブと該標的核酸との会合速度を増大させるに十分な量で、該サンプルに合成ポリカチオン性ポリマーを提供する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記ポリマーを構成するカチオン性モノマーが、前記プローブのリン酸基のモル濃度を超える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリマーが、コポリマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリマーが、グラフトコポリマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリマーが、非局在電荷を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプル中の前記ポリマーの濃度が、約１０μＭ〜約１００μＭの範囲内である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリマーが、約３００，０００Ｄａ未満の重量平均分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記プローブは、複数の相互作用標識を含み、そして前記標的核酸の非存在下で、前記条件下で互いにハイブリダイズする第一および第二の塩基領域を含み、ここで、該標識は、互いに相互作用して、該プローブが該標的核酸にハイブリダイズしない場合に第一の検出可能なシグナルを生じ、そして該プローブが該標的核酸にハイブリダイズする場合に第二の検出可能なシグナルを生じ、そしてここで、該第一および第二のシグナルは、互いに検出可能に異なる、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記プローブは、前記条件下で前記標的核酸にハイブリダイズする第三の塩基領域を含み、ここで、該第三の塩基領域は、前記第一および第二の塩基領域とは異なるか、または該第三の塩基領域は、該プローブの該第一および第二の塩基領域の少なくとも１つと、部分的もしくは完全に重複する、方法。
【請求項１０】
前記プローブが、ポリアニオンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記プローブが、カチオン性基および非イオン性基の少なくとも１つをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリマーの隣接カチオン性モノマー間の距離が、前記プローブおよび前記標的核酸の隣接リン酸基間の距離に近似する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的核酸がＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＲＮＡがリボソームＲＮＡである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリマーを含む複合体が、前記条件下で前記サンプル中で形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記複合体が、共有結合した複数のポリマーを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記複合体が、共有結合したポリマーおよびポリヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記複合体が水溶性である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記プローブおよび前記ポリマーが、前記二重鎖の形成中に溶液中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法であって、前記条件下かつ前記ポリマーの存在下での前記プローブと前記標的核酸との会合速度が、該条件下かつ該ポリマーの非存在下での該プローブと該標的核酸との会合速度よりも、少なくとも約２倍速い、方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の方法であって、前記条件下かつ前記ポリマーの存在下での前記プローブと前記標的核酸との会合速度が、該条件下かつ該ポリマーの非存在下での該プローブと該標的核酸との会合速度よりも、少なくとも約５倍速い、方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の方法であって、前記条件下かつ前記ポリマーの存在下での前記プローブと前記標的核酸との会合速度が、該条件下かつ該ポリマーの非存在下での該プローブと該標的核酸との会合速度よりも、少なくとも約１０倍速い、方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の方法であって、前記条件下かつ前記ポリマーの存在下での前記プローブと前記標的核酸との会合速度が、該条件下かつ該ポリマーの非存在下での該プローブと該標的核酸との会合速度よりも、少なくとも約１００倍速い、方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の方法であって、前記条件下かつ前記ポリマーの存在下での前記プローブと前記標的核酸との会合速度が、該条件下かつ該ポリマーの非存在下での該プローブと該標的核酸との会合速度よりも、少なくとも約１０００倍速い、方法。
【請求項２６】
前記サンプルに解離試薬を提供して、前記プローブおよび前記標的核酸から前記ポリマーを解離させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記解離試薬が、ポリアニオンまたはアニオン性界面活性剤の少なくとも１つである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記条件が、少なくとも約４０℃の温度および少なくとも約５ｍＭの一価カチオンの塩濃度または多価カチオンを含有する等価な塩濃度を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記温度が、約６０℃までである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記条件が、少なくとも約４０℃の温度および少なくとも約１５０ｍＭの一価カチオンの塩濃度または多価カチオンを含有する等価な塩濃度を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記温度が、約６０℃までである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ポリマーが、前記プローブの前に前記サンプルに提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記サンプル中に前記二重鎖が形成されたか否かを決定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、前記プローブは、前記条件下で前記標的核酸中に含まれる標的核酸配列に優先的にハイブリダイズし、そして前記決定する工程が、前記サンプル中のウイルスもしくは生物、またはウイルスもしくは生物の群のメンバーの存在または非存在についての診断である、方法。
【請求項３５】
前記プローブが、前記サンプル中に存在する、前記標的核酸配列と少なくとも１塩基異なる１以上の核酸配列に安定にハイブリダイズする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記プローブが標識を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
キットであって、以下：
第一セットのハイブリダイゼーション条件下で、試験サンプル中に存在する標的核酸に優先的にハイブリダイズする、ポリヌクレオチドプローブ；ならびに
該第一セットのハイブリダイゼーション条件下で、該サンプル中の該プローブと該標的核酸の会合速度を増大させるに十分な量での、合成ポリカチオン性ポリマー、
を備える、キット。
【請求項３８】
前記ポリマーを構成するカチオン性モノマーが、前記プローブのリン酸基のモル濃度を超える、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記ポリマーが、コポリマーである、請求項３７に記載のキット。
【請求項４０】
前記ポリマーが、グラフトコポリマーである、請求項３７に記載のキット。
【請求項４１】
前記ポリマーが、非局在電荷を有する、請求項３７に記載のキット。
【請求項４２】
前記ポリマーが、約３００，０００Ｄａ未満の重量平均分子量を有する、請求項３７に記載のキット。
【請求項４３】
請求項３７に記載のキットであって、前記プローブは、複数の相互作用標識を含み、そして前記標的配列の非存在下で、前記第一セットのハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイズする第一および第二の塩基領域を含み、ここで、該標識は、互いに相互作用して、該プローブが該標的配列にハイブリダイズしない場合に第一の検出可能なシグナルを生じ、そして該プローブが該標的配列にハイブリダイズする場合に第二の検出可能なシグナルを生じ、そしてここで、該第一および第二のシグナルは、互いに検出可能に異なる、キット。
【請求項４４】
請求項４３に記載のキットであって、前記プローブは、前記第一セットのハイブリダイゼーション条件下で前記標的配列にハイブリダイズする第三の塩基領域を含み、ここで、該第三の塩基領域は、前記第一および第二の塩基領域とは異なるか、または該第三の塩基領域は、該プローブの該第一および第二の塩基領域の少なくとも１つと、部分的もしくは完全に重複する、キット。
【請求項４５】
前記プローブが、ポリアニオンである、請求項３７に記載のキット。
【請求項４６】
前記プローブが、カチオン性基および非イオン性基の少なくとも１つをさらに含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
前記ポリマーの隣接カチオン性モノマー間の距離が、前記プローブの隣接リン酸基間の距離に近似する、請求項４５に記載のキット。
【請求項４８】
前記標的核酸がＲＮＡを含む、請求項３７に記載のキット。
【請求項４９】
前記ＲＮＡがリボソームＲＮＡである、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
前記ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡである、請求項４８に記載のキット。
【請求項５１】
前記サンプル中の前記プローブから、前記ポリマーを解離させるに十分な量の解離試薬をさらに備える、請求項３７に記載のキット。
【請求項５２】
前記解離試薬が、ポリアニオンまたはアニオン性界面活性剤の少なくとも１つである、請求項５１に記載のキット。
【請求項５３】
前記サンプル中のウイルスもしくは生物、またはウイルスもしくは生物の群のメンバーの存在または非存在の指示として、該サンプル中の該標的配列の存在または非存在を決定するためにアッセイを実行するための指示書をさらに備える、請求項３７に記載のキット。
【請求項５４】
前記指示書が、少なくとも約４０℃の温度および少なくとも約５ｍＭの一価カチオンの塩濃度または多価カチオンを含む等価な塩濃度を含むハイブリダイゼーション条件を特定する、請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】
前記指示書によって特定される温度が、約６０℃までである、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
前記指示書が、少なくとも約４０℃の温度および少なくとも約１５０ｍＭの一価カチオンの塩濃度または多価カチオンを含む等価な塩濃度を含むハイブリダイゼーション条件を特定する、請求項５３に記載のキット。
【請求項５７】
前記指示書によって特定される温度が、約６０℃までである、請求項５６に記載のキット。
【請求項５８】
前記プローブが標識を含む、請求項５３に記載のキット。
【請求項５９】
請求項３７に記載のキットであって、第二セットのハイブリダイゼーション条件下で、前記標的核酸中に存在する塩基領域に安定にハイブリダイズする塩基領域を有する捕捉プローブをさらに備え、ここで、前記第一セットのハイブリダイゼーション条件および該第二セットのハイブリダイゼーション条件は、同じであっても異なってもよく、そしてここで、該捕捉プローブは、該第一セットのハイブリダイゼーション条件下で該標的核酸に安定にハイブリダイズする、キット。
【請求項６０】
１以上の増幅プライマーをさらに備える、請求項３７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、米国仮特許出願第６０／２５５，５３５号（２０００年、１２月１４日出願）の利益を主張する。この内容は、参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ポリヌクレオチドの相補領域（アッセイ条件下でポリヌクレオチドの会合速度を促進する、１つ以上の合成的な水溶性ポリカチオンポリマーを含む）である一本鎖から二重鎖を形成するのに使用する方法およびキットに関する。
【０００３】
（参考としての援用）
本明細書中に参照される全ての参考文献は、その全体が参考として援用される。これらの参考文献の援用は、それのみで、本発明者らによる主張としても容認としても解釈されるべきではなく、これらの参考文献、または特定の任意の参考文献の全て内容の任意の部分が、任意の国または領域の制定法の特許出願に対する開示要求を満たすために必須の材料であるべきことが考慮されるべきである。それにもかかわらず、本発明者らは、特許請求された発明について、審査局または法廷により適切に本質的に判断される材料を提供するために、このような任意の参考文献に依存する権利を無効にする。本明細書中に参照される参考文献は、特許請求された発明に対する先行技術であることを承認するものではない。
【０００４】
（発明の背景）
核酸の会合は、核酸の２つの別個の鎖の相補的塩基領域、または同じ核酸鎖の異なる塩基領域が、ワトソン−クリック塩基対形成を介して互いにアニールし、従って、少なくとも部分的な二本鎖核酸を形成する技術に関する。このような対形成の例としては、２つの相補的ＤＮＡ配列、一本鎖ＤＮＡ配列および相補的ＲＮＡ配列および２つの相補的ＲＮＡ配列、ならびにこれらの核酸の改変体（例えば、ペプチド核酸または固定核酸）が挙げられる。Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，「Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」、米国特許第５，７７３，５７１号を参照のこと；Ｉｍａｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｂｉｃｙｃｌｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ」、米国特許第６，２６８，４９０号もまた参照のこと。塩基対形成を起こすために、相補的な塩基領域を有する核酸間または核酸内において、安定な二重鎖の形成を促進する条件下で一本鎖核酸をインキュベートすることが必要である。ストリンジェントなアッセイ条件下での二重鎖の形成は、各二重鎖の少なくとも１メンバーについての有用な情報（特定のメンバーが由来する供給源（例えば、特徴的なウイルス、微生物、植物または動物）を含む）、直接的かまたは核酸増幅によってか、疾患関連遺伝子の存在、遺伝子発現のレベル、遺伝的多様性（変異および多型の検出を含む）ならびに核酸配列情報）を提供し得る。
【０００５】
相補的塩基領域を有する核酸が二重鎖を形成するために会合する速度は、二次動力学に従う。従って、一本鎖核酸の濃度が増加する場合、この反応速度（すなわち、二重鎖が形成される速度）はまた、増強する。逆に、一本鎖核酸の濃度が減少する場合、反応速度は同様に低減し、その結果として、二本鎖核酸の形成のためにより長い時間を必要とする。
【０００６】
反応混合物の温度が、相補的核酸が会合する速度に影響を与えることは周知である。例えば、反応混合物の温度が融点またはＴｍ以下に下がる場合（二重鎖分子の５０％を一本鎖にする温度）、反応最大速度は、Ｔｍより約１５〜３０℃下の温度で到達し得る。温度が下がると反応速度はさらに、この最大速度よりも下がる。
【０００７】
相補的塩基領域を有する核酸間の反応速度はまた、反応混合物のイオン強度に非常に依存する。例えば、デオキシリボ核酸は、約１．２Ｍ  ＮａＣｌまで反応速度において著しい増加を示す。Ｗｅｔｍｕｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９６８）３１：３４９−３７９を参照のこと。ＤＮＡ分子とＲＮＡ分子との間のハイブリダイゼーションは、イオン強度が０．２〜１．５Ｍ  ＮａＣｌに増加される場合、会合の速度において５〜６倍の増加を示す。ＤＮＡ：ＤＮＡ反応の速度に関して、塩濃度の変化の効果は、ＲＮＡ：ＤＮＡ反応の速度よりも大きい。
【０００８】
多くの公知の核酸会合技術の有用性に関する主要な限定は、反応の基本速度である。反応時間は、ほぼ数時間から１０時間程度、そして特定の場合では数日であり得る。反応における一本鎖核酸分子の量を増加することによる反応速度の促進は（二次動力学の平均をとるために）、いくつかの理由について所望されない解答である。第一に、多くの適用において、反応混合物内の標的化核酸は、生理学的サンプルから抽出され、それにより少なくともポリメラーゼ鎖連鎖のような増幅手順の非存在下において、反応混合物において利用可能な標的化核酸の量を、かなり制限する。例えば、Ｍｕｌｌｉｓ、「Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、米国特許第４，６８３，２０２号を参照のこと。第二に、核酸反応物の使用に関連して相当の経費および核酸増幅手順（例えば、酵素および増幅プライマー）に関連するより多い経費が存在する。したがって、これらのより多くの反応物を使用することまたは増幅反応物を添加することの実用性に影響する。第三に、反応混合物中の標識された一本鎖核酸プローブ分子の量の増加は、さらなる一本鎖核酸プローブ分子がバックグラウンドノイズを上昇させるので、反応感受性の減少を引き起こす。
【０００９】
したがって、本発明の主要な目的は、ポリヌクレオチドの会合（会合であってもハイブリダイゼーションであっても）の速度を促進させ、そして促進が、参照条件（本明細書中に記載される条件を含む）を用いて実証され得る、別個のポリヌクレオチドの一本鎖領域から二重鎖を形成する方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡおよびＲＮＡ：ＲＮＡ反応系に適用され得る会合速度を促進するための方法を提供することである。さらに、本発明の目的は、反応混合物がある範囲の温度およびイオン強度条件を有する反応混合物に対して適用可能なポリヌクレオチドの会合速度を促進する方法を提供することである。
【００１０】
（発明の要旨）
これらの目的を満たすために、本発明は、ポリヌクレオチドおよび標的核酸から二重鎖を形成するための方法を特徴づけ、ここで、この方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）プローブが標的核酸に優先的にハイブリダイズすることを可能にする条件下で、もしサンプル中に存在すれば、試験サンプルにプローブを提供する工程（ｉｉ）プローブが標的核酸に優先的にハイブリダイズすることを可能にする条件下で、サンプルにおいて、プローブと標的核酸との会合を促進するのに十分な量で、試験サンプルに合成ポリカチオンポリマーを提供する工程。プローブ：標的核酸ハイブリッド形成を検出するのを促進するために、この方法はさらに、いくつかの検出系において、プローブからポリマーを解離するための試薬を試験サンプルに提供する工程をさらに包含する。さらに、この方法は、試験サンプルにおける標的のウイルスまたは生物あるいは標的群のウイルスまたは生物のメンバーの、存在または非存在の指標として、標的のウイルスまたは生物あるいは標的群のウイルスまたは生物に由来する標的核酸配列の存在または非存在を決定するアッセイにおいて使用され得る。この方法の代替的な使用としては、試験サンプルにおいて、疾患関連遺伝子の存在を検出すること、疾患の状態を決定すること、遺伝子発現のレベルを測定することおよび変異または多形を検出することが挙げられる。
【００１１】
アニオン性基に加えて、本発明において特徴付けられるポリヌクレオチドプローブは、さらに、カチオン／非イオン性基をさらに含み得る（但し、プローブは、正味の正電荷を有する）。ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ＤＮＡおよびＲＮＡの組み合わせから成り得るか、または核酸アナログ（例えば、ペプチド核酸）を含み得るか、もしくは１つ以上の改変ヌクレオシド（例えば、リボウラノシル部分の２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオシド）を含み得る。非ヌクレオチド基（例えば、多糖類またはポリエチレングリコール）はまた、プローブ中に含まれ得る。提供される非ヌクレオチドは、標的核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションを防がないかまたは実質的に干渉しない。本発明のプローブは、１００塩基長までかまたはそれ以上の塩基長（好ましくは、１２〜５０塩基長、そしてより好ましくは、１８〜３５塩基長）であり、標的核酸（この塩基領域は、好ましくは標的配列と完全に相補的である）中に含まれる標的配列に相補的な塩基領域を含む。
【００１２】
好ましくは、標識は、検出可能な標識または相互作用標識を含む。これらの標識は、任意の適切な標識物質（例えば、以下が挙げられるが、これらに限定されない：放射性同位体、酵素、補酵素、酵素基質、色素、ハプテン、化学発光分子、蛍光分子、リン光性分子、電気化学発光分子、発光団、規定の条件下で標的核酸に安定に結合することができない塩基配列領域、およびこれらの混合物。１つの特に好ましい実施形態において、標識は、アクリジンエステル（ＡＥ）、好ましくは４−（２−スクシンイミジルオキシカルボニルエチル−フェニル−１０−メチルアクリジン−９−カルボシキレートフルオロスルホネート（これ以降、「標準化ＡＥ］と称する）。相互作用標識の基としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：酵素／基質、酵素／補酵素、発光団／失活剤、発光団／付加体、色素二量体およびフォレスターエネルギー移行対。相互作用標識の基が提供される場合、好ましくは、このプローブは、自己相補的領域（例えば、相互作用標識の基は、会合したプローブが自己ハイブリダイズする場合、第一のシグナルを生成し、そしてプローブが標的核酸にハイブリダイズする場合、第二のシグナルを生成し、ここで、第一および第二のシグナルは差次的に検出可能である。いくつかの実施形態において、これらの自己相補的領域は、標的核酸にハイブリダイズするプローブ部分と重なるか、または含み得る。
【００１３】
検出前に、試験サンプルにおいて標的核酸を単離するために、本発明はさらに、捕獲プローブの結合領域に結合する固定化プローブを構築するプローブの、標的結合領域とは異なる塩基配列を有するプローブを意図する。固定化プローブ結合領域は、例えば、ストリンジェントな領域下で、ポリヌクレオチド（試験サンプルに提供される個体支持体に直接的かまたは間接的に結合される）の５’ポリｄＴ（チミジン）領域にハイブリダイズする３’ポリｄＡ（アデニン）領域から構成され得る。任意の公知の固体支持体（例えば、マトリックスおよび粒子の入っていないような溶液）が使用され得る。これらの支持体としては、例えば、ニトロセルロース、ポリスチレン、シランポリプロピレン、そして好ましくは、サンプルを回収することおよび／または非結合核酸もしくは他のサンプル成分を除去することを促進するための磁性変化を有する粒子が挙げられる。特に好ましい支持体は、磁性の球であり、これは、単分散（すなわち、サイズ±５％の均一性）であり、自動化産生における使用にとって特に利益を生じる。
【００１４】
標的核酸は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、核酸アナログまたは異なる型の核酸および／もしくは核酸アナログを含むキメラであり得る。本発明の好ましい標的核酸は、ＲＮＡ（特に、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）およびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））である。リボソームＲＮＡは、細胞中での相対的な豊富さおよび規定された生物群の間を識別することを可能にする保存された性質に起因して、試験サンプル中の生物群を検出するために好ましい標的核酸である。例えば、Ｋｏｈｎｅ、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ，Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ，ａｎｄ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｖｉｒｕｓｅｓ」、米国特許第５，２８８，６１１号およびＨｏｇａｎら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｎ−Ｖｉｒａｌ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ」、米国特許第５，８４０，４８８号を参照のこと。遺伝子発現を測定するか、特定の細胞型の存在を決定するか、または標的ウイルス群の存在を検出するために、特定のｍＲＮＡのアッセイが好まれ得る。例えば、Ｇｅｎｔａｌｅｎら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ａｒｒａｙ  ｏｆ  Ｐｏｏｌｅｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」、米国特許第６，３０６，６４３号；Ｋｏｈｎｅ、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｂｅｌｏｎｇｉｎｇ  ｔｏ  ａｎ  Ｏｒｇａｎ  ｏｒ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｅｌｌ−Ｔｙｐｅ」、米国特許第５，９３２，４１６号；およびＫｏｈｎｅ、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｇｒｏｕｐ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｖｉｒａｌ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ａ  Ｓａｍｐｌｅ」、米国特許第５，９５５，２６１号を参照のこと。
【００１５】
アッセイの感度は、試験サンプル中に存在する標的核酸の量によって制限される。検出アッセイの感度を増大させるため、本発明はさらに、ポリヌクレオチドプローブを用いて検出する前に試験サンプル中の標的核酸の量を増大させるための増幅工程を意図する。従って、標的核酸は、試験サンプルから直接得られる得るか、または増幅手順由来の核酸（すなわちアンプリコン）であり得る。多数の増幅手順が当該分野で周知であり、最も一般的な手順は、ポリメラーゼ連鎖反応である。例えば、Ｍｕｌｌｉｓ、米国特許第４，６８３，２０２号を参照のこと。増幅は、非標的核酸の存在下で実行され得るか、または標的核酸は、増幅のインヒビターを除去し、そして非特異的増幅を制限するために、増幅の前に単離および精製され得る。
【００１６】
本発明のポリカチオン性ポリマーおよびポリヌクレオチドプローブは、任意の順序で試験サンプルに提供され得る。これらのポリマーは、合成的に生成され、かつ水溶性である。これらのポリマーは、複数のカチオン性荷電を含み、そしてホモポリマーならびに／またはブロックコポリマーおよびグラフトコポリマーを含むコポリマーであり得る。これらのポリマーは、イオン性および／またはアニオン性モノマーを含み得るが、正に荷電したモノマーは、負に荷電したモノマーのモル濃度を超えて存在する。これらのポリマーのカチオン性の荷電は、局在性でも非局在性でもよいか、またはこれらは、局在性カチオン性荷電および非局在性カチオン性荷電の両方を含み得る。
【００１７】
好ましい実施形態において、本発明のポリカチオン性ポリマーは、ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、試験サンプル中にナノ粒子の大きさの複合体を形成する。これらの複合体は、複数の共有結合したポリマーを含み得、そして共有結合したポリマーおよびポリヌクレオチドをさらに含み得る。これらが溶液から沈殿するのを防ぐために、これらの複合体は、好ましくは水溶性である。従って、ポリマー中に存在するカチオン性モノマーは、好ましくは、試験サンプルに提供されるプローブのリン酸基のモル濃度を超えて存在し、そしてさらにより好ましくは、試験サンプル中に存在すると予測される全ての核酸のリン酸基のモル濃度を超える。
【００１８】
本発明の特定の実施形態において、存在する場合、標的核酸の検出の前に、そして相補的ポリヌクレオチドが、試験サンプル中で安定に会合するのに十分な時間が経過した後に、ポリマーおよびポリヌクレオチドを解離することが望ましい。解離は、１以上の解離試薬（例えば、アニオン性界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸リチウム）および／またはポリアニオン（例えば、外因性核酸））を試験サンプルに提供することによって達成され得る。この解離試薬は、ポリマーとポリヌクレオチドとの間の結合を弱めるに十分な量で、試験サンプル中に提供されるべきである。
【００１９】
本発明のポリカチオン性ポリマーの存在下での、相補的ポリヌクレオチドの会合速度は、好ましくは、同一のインキュベート時間および条件下でポリマーの非存在下での同じ相補的ポリヌクレオチドの会合速度よりも、少なくとも約２倍大きい。より好ましくは、この会合速度は、ポリカチオン性ポリマーの存在下で少なくとも約５倍大きいか、少なくとも約１０倍大きいか、少なくとも約１００倍大きいか、または少なくとも約１０００倍大きい。このような条件は、好ましくは、少なくとも約４０℃の温度および少なくとも約５ｍＭの一価カチオン（または多価カチオン（例えば、塩化マグネシウムまたは硫酸マグネシウムで存在する二価マグネシウム）を含む等価な塩濃度）を含む。より好ましくは、このような条件は、少なくとも約４０℃の温度および少なくとも約１５０ｍＭの一価カチオン（または多価カチオンを含む等価な塩濃度）を含む。等価な塩濃度は、他の点では同一の条件下で、いずれの多価カチオンをも含まない塩濃度と、ほぼ同じ率の増強を生じる。反応混合物の温度は、一般に、室温〜約９０℃の範囲内であり、そして好ましくは、約４０℃〜約７０℃の範囲内、より好ましくは約５０℃〜約６０℃の範囲内、そして最も好ましくは約６０℃である。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態において以下を含むキットが特徴付けられる：（ｉ）ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、試験サンプル中の標的核酸配列に優先的にハイブリダイズする、ポリヌクレオチドプローブ；および（ｉｉ）ハイブリダイゼーションアッセイ条件下の、試験サンプル中のプローブおよび標的配列の会合速度を上昇させるに十分な量で、合成ポリカチオン性ポリマー。このプローブおよびポリマーは、同一または別々の容器中に提供され得る。本発明に従うキットは、さらに以下の少なくとも１つを含み得る：（ｉ）プローブからポリマーを解離するための試薬；（ｉｉ）標的核酸中に含まれる標的配列または標的核酸由来の標的配列を増幅するための１つ以上の増幅プライマー；（ｉｉｉ）試験サンプル中に存在する標的核酸配列を単離および精製するための捕捉プローブ；ならびに（ｉｖ）捕捉プローブを含む場合、試験サンプルにおいて、直接的または間接的のいずれかで、この捕捉プローブを固定するための固体支持物質（例えば、磁気応答性粒子）。標的核酸が、ｒＲＮＡのように、自己相補性領域を有する、構造性の核酸である場合、本発明のキットはさらに、補助プローブを含み得る。米国特許第５，０３０，５５７号、Ｈｏｇａｎら、「Ｍｅａｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」を参照のこと。さらに、本キットは、試験サンプル中の標的ウイルスもしくは標的生物またはウイルスもしくは生物の標的群メンバーの、存在または非存在の指標として、試験サンプル中の標的核酸配列の存在または非存在を決定するためのアッセイを実行するための文書を備え得る。文書に記載されるアッセイは、ポリヌクレオチドプローブを使用する検出の前に標的核酸を単離および精製するための工程、ならびに／または標的核酸中に含まれる標的配列を増幅するための工程を含み得る。あるいは、本キットは、例えば、疾患関連遺伝子の存在を検出するためのアッセイ、疾患の状態を決定するためのアッセイ、遺伝子発現のレベルを測定するためのアッセイ、または試験サンプル中の変異もしくは多型を検出するためのアッセイを実行するための文書を含み得る。
【００２１】
本発明の他の特徴および利点は、以下のその好ましい実施形態の記述および特許請求の範囲から明らかである。
【００２２】
（好ましい実施形態の説明）
（Ａ．定義）
以下の用語は、異なる意味を有することを明確に示されない限り、本明細書中で示される意味を有する。
【００２３】
「標的核酸」、「標的ポリヌクレオチド」または「標的」は、標的核酸配列を含む核酸が意味される。
【００２４】
「標的核酸配列」、「標的配列」または「標的領域」は、一本鎖核酸分子のヌクレオチド配列の全てまたは一部を含む、特定のデオキシリボヌクレオチド配列またはリボヌクレオチド配列が意味される。本発明の標的核酸配列は、ヌクレオチドの混合物、すなわち、１つを超えるヌクレオチドの型（例えば、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、イノシン（Ｉ）、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ））を含む。
【００２５】
「ポリヌクレオチド」は、一緒に結合された、二つ以上のヌクレオシドサブユニットまたは核酸塩基サブユニットを有するポリマーが意味される。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡまたはそのアナログを含み、例えば、無塩基のヌクレオチド、一般的な塩基（例えば、３−ニトロピロールおよび５−ニトロインドール）、多糖類、ペプチド、ポリペプチドおよび／またはポリエチレングリコールのような、非ヌクレオチド基をさらに含み得る。例えば、Ｂｅｃｋｅｒら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｏｒｃｈｅｓ」、米国出願番号第０９／３４６，５５１号および国際公報番号ＷＯ００／０１８５０号（これらの両方は、本明細書中で共通の所有権を享受する）、Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍら、「３−Ｎｉｔｒｏｐｙｒｒｏｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ」、米国特許第５，６８１，９４７号、Ｌｏａｋｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９５）２３（１３）：２３６１−２３６６；およびＡｒｎｏｌｄら、「Ｌｉｎｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ」米国特許第５，５８５，４８１号を参照のこと。ヌクレオシドサブユニットの糖基は、例えば、２’−Ｏ−メチルのリボフラノシル部分への置換を有するリボヌクレオシドを含む、リボース、デオキシリボースおよびそれらのアナログであり得る。（ポリヌクレオチドプローブとして有用な、２’置換を有するヌクレオシドサブユニットを含むポリヌクレオチドは、Ｂｅｃｋｅｒら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒｓ」米国特許第６，１３０，０３８号によって開示される。）そのヌクレオシドサブユニットは、例えば、ホスホジエステル結合、改変された結合のような結合によってか、またはその相補的な標的核酸配列へのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを妨げない非ヌクレオチド部分によって連結され得る。改変された結合は、標準のホスホジエステル結合が、例えば、ホスホロチオエート結合またはメチルホスホネート結合のような、異なる結合で置換された結合を含む。核酸塩基サブユニットは、例えば、擬似ペプチド骨格（例えば、カルボキシメチルリンカーによって、中央の二級アミンへ核酸塩基サブユニットを結合する２−アミノエチルグリシン骨格）を有するＤＮＡの中性デオキシリボースリン酸骨格の少なくとも一部を置換することによって、連結され得る。（擬似ペプチド骨格を有するＤＮＡアナログは、一般的に、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」といわれ、Ｎｉｅｌｓｅｎらによる米国特許第５，７７３，５７１号に開示される。）本発明によって意図されるポリヌクレオチドの他の非限定的な例は、二環式および三環式のヌクレオシドおよびヌクレオチドアナログを含む、核酸アナログを含む。これらアナログは、「Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」、「Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ」または「ＬＮＡ」といわれる。（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄは、Ｗａｎｇによる「Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」米国特��第６，０８３，４８２号；同第６，２６８，４９０号；およびＷｅｎｇｅｌら、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ」国際公報番号ＷＯ９９／１４２２６号によって開示される。）改変されたポリヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で標的核酸と安定なハイブリッドを形成し得、そしてこの改変されたポリヌクレオチドの少なくとも一部がアニオン性であるという条件で、任意の核酸アナログは、本発明によって企図される。ポリヌクレオチドプローブの場合、改変されたポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、標的核酸へ優先的にハイブリダイズし得なければならない。本明細書中で使用される場合、「プローブ」であると示されない限り、ポリヌクレオチドは、少なくとも部分的に一本鎖化しているか、またはヒトの介入によって部分的もしくは完全に一本鎖化され得る、天然供給源から得られる核酸分子であり得る。
【００２６】
「ポリヌクレオチドプローブ」または「プローブ」によって、ハイブリダイゼーションアッセイ条件下での検出に安定なプローブ：標的ハイブリッドを形成するために、その標的核酸配列と十分に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドが意味される。当業者によって理解される場合、プローブは、ヒトの介入なしでは天然に見られない（例えば、外来核酸で組換えられたか、単離されたか、またはある程度まで精製された）形態で、単離された核酸分子またはそのアナログである。そのようなヌクレオシドまたは核酸塩基が、ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、ハイブリダイゼーションを妨げず、そして、示される場合、標的核酸への優先的なハイブリダイゼーションを妨げない限り、プローブは、標的領域の外側に、さらなるヌクレオシドまたは核酸塩基を有し得る。非相補的な配列はまた、例えば、標的捕捉配列（一般的に、ホモポリマートラクト（例えば、ポリＡテイル、ポリＴテイルもしくはポリＵテイル）または所望の二次構造または三次構造（例えば、ヘアピン構造）を与える配列を含み得、これらの配列は、検出を容易にするために使用され得る。標的捕捉配列（「捕捉プローブ」）を有するプローブの例は、Ｒａｎｋｉら、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｂｙ  ａ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ」米国特許第４，４８６，５３９号；Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｋｉｔｓ  ｆｏｒ  Ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ」同第４，７５１，１７７号；およびＷｅｉｓｂｕｒｇら、「Ｔｗｏ  Ｓｔｅｐ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ」同第６，１１０，６７８号によって開示される。自己ハイブリダイゼーションプローブは、例えば、Ｂａｇｗｅｌｌ、「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍｐｅｒｆｅｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ」米国特許第５，６０７，８３４号；Ｔｙａｇｉら、「Ｄｅｔｅｃｔａｂｌｙ  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｄｕａｌ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ａｓｓａｙｓ  ａｎｄ  Ｋｉｔｓ」同第５，９２５，５１７号；ならびにＢｅｃｋｅｒら、米国出願番号第０９／３４６，５５１号および国際公報番号ＷＯ００／０１８５０号によって開示される。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドプローブは、好ましくは、約１００塩基長以下、より好ましくは、約５０塩基長以下、そして最も好ましくは、約３５塩基長以下である。規定された配列のプローブは、当業者に公知の技術（例えば、化学的合成または生化学的合成、および組換え核酸分子（例えば、細菌ベクターまたはレトロウイルスベクター）からのインビトロおよびインビボでの発現）によって生産され得る。
【００２８】
「相補性」によって、ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、安定な水素結合を形成し得る塩基配列領域を有するポリヌクレオチドが意味される。ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、２つの領域が、二本鎖化された、水素結合領域の安定な形成を可能にするために十分に相補的である条件で、ポリヌクレオチドの塩基領域間で完全な相補性は、必要とされない。
【００２９】
「安定に」、「安定な」または「検出に対して安定な」によって、反応混合物の温度が、ポリヌクレオチド二重鎖の融解温度よりも少なくとも２℃低いことが意味される。反応混合物の温度は、より好ましくは、ポリヌクレオチド二重鎖の融解温度よりも少なくとも５℃低く、そして、なおより好ましくは、反応混合物の融解温度よりも少なくとも１０℃低い。
【００３０】
「ハイブリダイゼーション」によって、２つの完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドが、特定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、二本鎖化領域を有する安定な構造の形成を許容する配向で一緒になる能力が意味される。この二本鎖化構造の２つの構成鎖は、時々ハイブリッドと呼ばれるが、水素結合によって一緒に保たれる。これらの水素結合は、最も一般には、単一核酸鎖上で、アデニン塩基とチミン塩基もしくはウラシル塩基（ＡとＴもしくはＵ）との間またはシトシンとグアニン（ＣとＧ）との間で形成するが、塩基対合はまた、これらの「規範的な」対のメンバーでない塩基間でも形成し得る。非規範的塩基対合は、当該技術分野で周知である。（例えば、ＲＯＧＥＲ  Ｌ．Ｐ．ＡＤＡＭＳら、ＴＨＥ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ（１９９２年、第１１版）を参照のこと。）
「優先的にハイブリダイズする」によって、特定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、ポリヌクレオチドプローブが、これらの標的核酸にハイブリダイズして、特定の標的核酸配列の存在を示す、安定なプローブ：標的のハイブリッドを形成し得、そして、非標的核酸の存在を示す、安定なプローブ：非標的のハイブリッドが十分多く形成し得ないことが意味される。従って、そのプローブは、非標的核酸にハイブリダイズするよりも、十分より強い程度で、標的核酸にハイブリダイズし、これによって当業者は、非標的核酸もまた含み得る試験サンプル中の標的核酸配列の存在（または非存在）を正確に検出し得る。標的核酸に優先的にハイブリダイズするプローブは、系統発生論的に密接に関連する非標的ウイルスまたは非標的生物もまた含み得る試験サンプル中の、特定のウイルスもしくは生物またはウイルス群もしくは生物群のメンバーの存在または非存在を特異的に検出することを意図される診断アッセイにおいて、特に有用である。そのような診断アッセイは、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｋｏｈｎｅ、米国特許第５，２８８，６１１号によって開示される。
【００３１】
一般的には、ポリヌクレオチド配列とその標的配列の間で、相補性の程度を減少させることは、ポリヌクレオチドのその標的領域へのハイブリダイゼーションの程度または速度を減少させる。しかし、１つ以上の非相補的塩基を含むことは、ポリヌクレオチドを非標的ポリヌクレオチドに対して区別する能力を助長し得る。
【００３２】
優先的なハイブリダイゼーションは、当業者に周知の技術を使用して測定され得、これは、下記の実施例の項において記載されるハイブリダイゼーションを含む。好ましくは、試験サンプルにおいて、標的ハイブリダイゼーションシグナルと非標的ハイブリダイゼーションシグナルとの間に少なくとも１０倍の差があり、より好ましくは、少なくとも１００倍の差があり、そして最も好ましくは、少なくとも１０００倍の差がある。好ましくは、試験サンプル中の、非標的ハイブリダイゼーションシグナルは、わずかにバックグラウンドシグナルレベルである。
【００３３】
「系統発生論的に密接に関連する」によって、生物またはウイルスが、進化的な意味で互いに密接に関連し、従って、より離れて関連する生物またはウイルスよりも高い総核酸配列相同性を有することが意味される。系統樹上で近位およびほとんど近位を占有する生物またはウイルスは、密接に関連する。系統樹上で近位またはほとんど近位よりもさらに遠くの位置を占有する生物またはウイルスは、それらが、顕著な総核酸配列相同性を有する場合、なお、密接に関連する。
【００３４】
「試験サンプル」とは、任意の供給源から抽出または取り出された、標的核酸を含むことが既知であるかまたはこのような標的配列を含むと思われる物質を意味する。これらの供給源としては、インビトロまたはエキソビボでアッセイするための、体液、組織、分泌物および排出物、植物、水、食品および環境が挙げられる。この物質は、その物質中に含まれる核酸を単離および精製するために処理され得、その結果、本明細書中で用語「試験サンプル」を使用することにより、その変化していない抽出された状態の物質、またはこの物質から単離され、次いで精製された標的核酸のいずれかをいい得る。
【００３５】
「捕捉プローブ」とは、標的核酸および固定化されたプローブにハイブリダイズし得、それにより試験サンプル中の標的核酸を固定化し、単離するための手段を提供し得る、ポリヌクレオチドまたはともに連結された少なくとも２つのポリヌクレオチドのセットを意味する。標的核酸にハイブリダイズする捕捉プローブの部分は、「標的結合領域」といわれ、そして固定化プローブにハイブリダイズする捕捉プローブの部分は、「固定化プローブ結合領域」といわれる。捕捉プローブが標的核酸および固定化プローブの両方にハイブリダイゼーションアッセイ条件下でハイブリダイズする一方で、この標的結合領域および固定化プローブ結合領域は、異なるハイブリダイゼーションアッセイ条件下でそれらそれぞれの標的配列にハイブリダイズするように設計され得る。このように、捕捉プローブは、これがまず、より好ましい溶液動態下で標的核酸にハイブリダイズした後に、固定化プローブに対する固定化プローブ結合領域のハイブリダイゼーションを可能にするように条件を調節するように、設計され得る。標的結合領域および固定化プローブ結合領域は、同じポリヌクレオチド上で互いに直接接合し得、それらは、必要に応じて改変された１以上のヌクレオチドにより互いに隔てられ得、そして／またはそれらは非ヌクレオチドリンカーにより互いに結合され得る。
【００３６】
「標的結合領域」とは、標的核酸に存在する標的配列、この標的配列のＤＮＡ等価物もしくはＲＮＡ等価物またはこの標的配列の相補体にハイブリダイゼーションアッセイ条件下で安定に結合する、ポリヌクレオチドの部分を意味する。このハイブリダイゼーションアッセイ条件は、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件または増幅条件であり得る。
【００３７】
「固定化プローブ結合領域」とは、ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で固定化プローブにハイブリダイズする、ポリヌクレオチドの部分を意味する。
【００３８】
「固定化プローブ」とは、固定化された支持体に捕捉プローブを結合するためのポリヌクレオチドを意味する。この固定化プローブは、標的核酸に、および固定化プローブに、捕捉プローブをハイブリダイズさせるために使用される条件下で、これらの条件が同じか異なるかに拘らず、安定なままである連結または相互作用により、固体支持体に直接的または間接的のいずれかで結合される。この固定化プローブは、サンプル中の結合した標的核酸を、結合していない物質から分離することを容易にする。
【００３９】
「単離する」、「単離される（単離された）」または「単離」とは、試験サンプル中に存在する標的核酸の少なくとも一部が、反応容器中、または反応デバイスもしくは固体キャリア（例えば、試験管、キュベット、マイクロタイタープレートウェル、ニトロセルロースフィルター、スライドまたはピペットチップ）上で固定化様式または放出可能様式で濃縮され、その結果、標的核酸が、容器、デバイスまたはキャリアから標的核酸を有意に喪失することなく精製され得ることを意味する。
【００４０】
「精製する」、「精製される（精製された）」または「精製」とは、反応容器中、または反応デバイスもしくは固体キャリア上に存在するサンプルの１以上の成分が、反応容器中、または反応デバイスもしくは固体キャリア上に存在する他の１以上の成分から物理的に取り出されていることを意味する。分離工程または精製工程の間に除去され得るサンプル成分としては、タンパク質、糖質、脂質、インヒビター、非標的核酸、および結合していないプローブが挙げられる。好ましくは、固定化捕捉プローブに結合した標的核酸は、精製工程の間にサンプル中に保持される。
【００４１】
「反応混合物」とは、標的核酸（試験サンプルに存在することが既知かまたは存在すると思われる）に含まれる標的配列に相補的な塩基領域を有するポリヌクレオチドプローブを含む試験サンプルを意味する。この反応混合物は、プローブを標的配列にハイブリダイズさせることを容易にする条件に供される。
【００４２】
「ハイブリダイゼーション条件」または「ハイブリダイゼーションアッセイ条件」とは、ポリヌクレオチドプローブが標的核酸に安定にハイブリダイズすることを可能にする条件を意味する。ハイブリダイゼーションアッセイ条件は、プローブのＧＣ（グアニン／シトシン）含量および長さ、プローブ配列と、試験サンプル中に存在し得る非標的核酸の配列との間の類似性の程度、および標識配列を含む要因に依存にして変化し得る。ハイブリダイゼーションアッセイ条件としては、ハイブリダイゼーション試薬またはハイブリダイゼーション溶液の温度および組成が挙げられる。以下の実施例の節は、標的核酸を検出するための好ましいハイブリダイゼーションアッセイ条件を提供する一方で、他の受容可能な条件は、当業者により容易に確認され得る。
【００４３】
「反応速度」、「反応の速度」、「会合速度」、または「会合の速度」とは、相補性の領域を有するポリヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で二重鎖を形成するように再会合またはハイブリダイズする速度を意味する。
【００４４】
「再会合する」、「再会合」、「再生」または「再生する」とは、一本鎖ポリヌクレオチド（この一本鎖ポリヌクレオチドは、変性プロセスを経て分離される前には、互いに塩基対形成していた）から二本鎖ポリヌクレオチドを再形成することを意味する。
【００４５】
「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズする」とは、互いに関して個々の起源の一本鎖ポリヌクレオチド（例えば、異なる種由来のＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの混合物）から、二本鎖ポリヌクレオチドを形成することを意味する。本明細書中で使用される場合、用語「ハイブリダイゼーション」は、ハイブリダイゼーションまたは再会合をいうために交換可能に使用される。
【００４６】
用語「溶液ハイブリダイゼーション」または「溶液中」とは、反応混合物中に存在する反応物質（すなわち、相補的な一本鎖領域を有するポリヌクレオチド）が、ハイブリダイゼーションアッセイ条件下に曝された場合に、反応混合物中で拡散可能であることを意味する。
【００４７】
「標識」とは、当該分野で周知の手段により検出され得、かつ試験サンプル中の特定のポリヌクレオチド配列の存在または非存在を示すために使用され得るポリヌクレオチドと結合されたレポーター部分を意味する。当該分野で周知の標識の例としては、化学発光化合物、電気化学発光化合物および蛍光化合物、放射性同位体、色素、ポリヌクレオチド、酵素、酵素基質、発色団およびハプテンが挙げられる。複数の相互作用標識がポリヌクレオチドと結合する場合、相互作用標識としては、例えば、以下が挙げられ得る：発光標識とクエンチャー標識、発光標識と付加標識（ａｄｄｕｃｔ  ｌａｂｅｌ）、色素二量体標識、酵素標識と基質標識、酵素標識と補因子標識、およびＦｏｅｒｒｅｓｔｅｒエネルギー転移対。複数の相互作用標識を有するポリヌクレオチドの例は、例えば、Ｂａｇｗｅｌｌ（米国特許第５，６０７，８３４号）；Ｔｙａｇｉら（米国特許第５，９２５，５１７号）；およびＢｅｃｋｅｒら（米国特許出願第０９／３４６，５５１号および国際公開ＷＯ００／０１８５０）により開示される。
【００４８】
「核酸二重鎖」、「二重鎖」、「核酸ハイブリッド」または「ハイブリッド」とは、水素結合した二本鎖の領域を含む安定な核酸構造を意味する。このようなハイブリッドとしては、ＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖分子、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖分子およびＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖分子ならびにそれらのアナログが挙げられる。この構造は、任意の公知の手段（プローブ結合標識を必要としない手段を含む）によって検出可能であるに十分安定している。例えば、この検出方法は、光学的に活性であり、かつ表面の質量変化に敏感な、プローブ被覆基材を含み得る。質量変化は、光に応じて光学的に活性な基材の異なる反射特性および透過特性を生じ、固定化された標識核酸の存在または量を示すように働く。この光学的検出の例示的形態は、Ｎｙｇｒｅｎら「Ｄｅｖｉｃｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（米国特許第６，０６０，２３７号）により開示される。他の検出方法としては、試験サンプルのプローブに関連する導電性および濁度の変化を検出することに基づく方法が挙げられる。
【００４９】
「ヘルパープローブ」とは、ポリヌクレオチドプローブの座とは異なる座で標的核酸にハイブリダイズし、それにより標的核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションの速度を増大するか、プローブ：標的ハイブリッドの融解温度を上昇させるか、またはその両方であるかのいずれかであるように設計された、ポリヌクレオチドを意味する。
【００５０】
「増幅プライマー」または「プライマー」とは、核酸合成の開始のために、標的核酸にハイブリダイズし、プライマーおよび／またはプロモーターテンプレートとして（例えば、相補鎖を合成し、それにより機能的なプロモーター配列を形成するために）作用し得るポリヌクレオチドを意味する。増幅プライマーが、ＲＮＡ合成を開始するように設計される場合、このプライマーは、標的配列に相補的でないがＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）により認識される、塩基配列を含み得る。増幅プライマーは、プライマー伸長の速度または量を妨げるかまたは低下させるように改変された、３’末端を含み得る（ＭｃＤｏｎｏｕｇｈらは、米国特許第５，７６６，８４９号、標題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」において、３’末端が改変またはブロックされたプライマーおよびプロモーター−プライマーを開示する）。本発明の増幅プライマーは、化学合成されてもよいし、ベクターから得られてもよいが、これらは、天然に存在する核酸分子ではない。
【００５１】
「核酸増幅」、「標的増幅」または「増幅」とは、少なくとも１つの標的核酸配列を有する核酸分子の数を増大させることを意味する。本発明に従う標的増幅は、線形的または指数関数的のいずれかであり得るが、指数関数的増幅が好ましい。
【００５２】
「アンプリコン」とは、核酸増幅反応において生成され、標的核酸から得られる、核酸分子を意味する。アンプリコンは、標的核酸と同じセンスであるかまたは標的核酸と反対のセンスであり得る、標的核酸配列を含む。
【００５３】
「由来する（得られる）」とは、言及された核酸が、標的生物から直接得られるか、または核酸増幅の産物として間接的に得られることを意味し、この産物は、例えば、標的生物に存在しないアンチセンスＲＮＡ分子であり得る。
【００５４】
「ポリマー」とは、ともに共有結合された低相対分子量のモノマー型の１以上の繰り返しを含む高分子を意味する。
【００５５】
「ポリカチオン性ポリマー」とは、このポリマーの電荷が局在しているか、または局在していないかに拘らず、正味の正電荷を有するポリマーを意味する。ポリカチオン性ポリマーは、少なくとも１つのカチオン性モノマー型から構成され、また、ポリマーが正味の正電荷を有することを条件として、アニオン性モノマー型および／または非イオン性モノマー型を含み得る。
【００５６】
「モノマー」とは、重合することにより構成単位がポリマーの本質的構造に寄与し得る、分子を意味する。
【００５７】
「構成単位」とは、ポリマーの本質的構造の一部を含む原子または原子群（存在する場合は、ペンダント原子またはペンダント基を含む）を意味する。
【００５８】
「ブロックコポリマー」とは、直鎖状配列においてブロックから構成されるポリマーを意味する。
【００５９】
「ブロック」とは、多くの構成単位を含むポリマーの一部を意味し、この一部は、ポリマーの隣接する部分には存在しない少なくとも１つの特徴を有する。
【００６０】
「グラフトコポリマー」とは、ブロックの１以上の種が、側鎖としてそのポリマーの主鎖に接続されたポリマーを意味する。これらの側鎖は、主鎖とは異なる構成特徴または配置特徴を有する。
【００６１】
「合成（的）」とは、ポリマーの重合が、ヒトの介在なしでは天然にはもっぱら存在しないことを意味する。
【００６２】
「複合体」とは、複数のポリカチオン性ポリマーを含む組成物を意味する。本発明の複合体は、概してナノ粒子である。
【００６３】
「重合度」または「ＤＰ」とは、ポリマー鎖中の反復単位の数を意味する。
【００６４】
「数平均分子量」または「Ｍｎ」とは、混合物中の分子の数により除算したポリマー混合物の重量に等しい値を意味する。数平均分子量は、種々の周知の方法（束一性特性法、浸透圧法および凝固点低下法が挙げられる）により決定され得る。
【００６５】
「重量平均分子量」または「Ｍｗ」とは、ポリマー混合物中の分子の平均分子量を意味する。重量平均分子量は、多くの異なる周知の方法（光散乱法および超遠心分離法が挙げられる）により決定され得る。混合物中の分子の全てが本質的に同じ重量を有する場合は、Ｍｗ値およびＭｎ値が同じであり得るが、混合物中の分子のいくつかが他よりも重い場合は、Ｍｗ値は、Ｍｎ値より高い。
【００６６】
「多分散性」とは、ポリマー混合物中の重量平均分子量と数平均分子量との比（Ｍｗ／Ｍｎ）を意味する。この多分散性値は、混合物中の分子量の範囲がどの程度広いかを示す。
【００６７】
以下の略語は、示された意味を有する：「Ｄａ」＝ダルトン；「Ｍ」＝モル／リットル；「ｓ」＝秒；および「ｍ」＝分。
【００６８】
（Ｂ．ハイブリダイゼーション条件およびプローブ設計）
ハイブリダイゼーション反応条件、最も重要なことには、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション溶液中の塩濃度は、ポリヌクレオチドプローブが、試験サンプル中に存在することが既知であるか存在すると思われる標的核酸に優先的にハイブリダイズし、非標的核酸にはハイブリダイズしないことが可能であるように、選択される。低下させた塩濃度および／または上昇した温度（増大したストリンジェンシーの条件）において、二本鎖ハイブリッド分子中の対形成したヌクレオチド塩基の間の水素結合が破壊されるにつれて、ハイブリダイゼーションの程度が減少する。このプロセスは、「融解」として公知である。
【００６９】
一般には、最も安定なハイブリッドは、最も多数の連続した、完全にマッチした（すなわち、水素結合した）ヌクレオチド塩基対を有するハイブリッドをいう。このようなハイブリッドは、通常、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーが増大する場合に、最後に融解するものであると予測される。しかし、１以上のミスマッチした、「正準的でない（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉａｌ）」、すなわち不完全な塩基対（核酸のヌクレオチド配列におけるその位置でより弱い塩基対形成を生じるかまたは塩基対形成が存在しない）を含む二本鎖核酸領域は、核酸ハイブリッドが、試験サンプル中に存在し得る選択されていない他の核酸と互いに交差反応することなく、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて形成および検出されることを可能にするために、比較的高いストリンジェンシーの条件下で、なお十分に安定であり得る。
【００７０】
従って、一方では試験サンプル中に存在する標的核酸のヌクレオチド配列と非標的核酸のヌクレオチド配列との間の類似性の程度、および他方では特定のプローブの塩基配列と、標的核酸および非標的核酸のヌクレオチド配列との間の相補性の程度に依存して、１以上のミスマッチは、プローブが、試験サンプル中に存在する標的核酸にハイブリダイズするが非標的核酸にはハイブリダイズしない能力を、必ずしも奪わない。
【００７１】
本発明において有用なポリヌクレオチドプローブは、好ましくは、プローブ：標的ハイブリッドの融解温度Ｔｍと、プローブと試験サンプル中に存在する非標的核酸（例えば、系統発生的に密接に関連した生物に由来するリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）のような核酸）との間に形成されたミスマッチハイブリッドのＴｍとの間の差異を最大にするように、選び取られ、選択され、そして／または設計される。
【００７２】
標的核酸がｒＲＮＡである場合、そのｒＲＮＡ分子内に、二次構造（分子内水素結合により一部生じる）と機能との間の密接な関係が存在することに注意することが重要である。この事実は、一次ヌクレオチド配列における進化的変化に対する制限を与え、二次構造を維持させる。例えば、塩基が二重らせん（分子内水素結合に起因して、両方の「鎖」が同じｒＲＮＡ分子の一部である）の一方の鎖で変化されると、補償する置換は、通常、相補性（従って、必要な二次構造）を保存するために他方の「鎖」の一次配列に生じる（共変（ｃｏ−ｖａｒｉａｎｃｅ）といわれる）。これは、２つの非常に異なるｒＲＮＡ配列を、保存された一次配列およびやはり保存された二次構造エレメントの両方に基づいて整列させることを可能にする。ポリヌクレオチドプローブの潜在的な標的配列は、整列された配列の相同性のバリエーションに注意することにより同定され得る。
【００７３】
おそらく特有の潜在的標的ヌクレオチド配列を単に同定することは、機能的に特異的なポリヌクレオチドプローブが、その配列を含む核酸にハイブリダイズさせられ得ることを保証しない。種々の他の因子は、特異的なプローブについての標的部位としての核酸の場所の適切さを決定する。ハイブリダイゼーション反応の程度および特異性（例えば、本明細書中に記載される程度および特異性）は、多数の因子によって影響されるので、これらの因子のうちの１以上の操作によって、その標的に完全に相補的であるか否かにかかわらず、特定のポリヌクレオチドの正確な感受性および特異性が決定される。種々のハイブリダイゼーションアッセイ条件の重要さおよび影響は当業者に公知であり、そして例えば以下によって開示される：Ｋｏｈｎｅ，「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｎ−Ｖｉｒａｌ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ」，米国特許第４，８５１，３３０号；Ｈｏｇａｎら，「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｔｏ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｏｒｄｏｎａｅ」，米国特許第５，２１６，１４３号；およびＨｏｇａｎ，「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｎ−Ｖｉｒａｌ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ」，米国特許第５，８４０，４８８号。
【００７４】
ハイブリダイゼーション所望の温度およびハイブリダイゼーション溶液組成（例えば、塩濃度、界面活性剤および他の溶質）はまた、二本鎖ハイブリッドの安定性に大いに影響を与え得る。条件（例えば、プローブが標的に対してハイブリダイズ可能な、イオン強度および温度）は、プローブを構築する際に考慮されなければならない。上記のように、ハイブリッドポリヌクレオチドの熱安定性は一般に、反応混合物のイオン強度に伴って増大する。一方、水素結合を破壊する化学的試薬（例えば、ホルムアミド、尿素、ジメチルスルホキシドおよびアルコール）は、ハイブリッドの熱安定性を大いに低減し得る。
【００７５】
プローブのその標的に関する特異性を最大にするために、プローブは、高ストリンジェンシーの条件下でそれらの標的にハイブリダイズするように設計されるべきである。高度の相補性を有するこのような条件下では、ポリヌクレオチド（または領域）のみが互いにハイブリダイズする。このような高度の相補性を有さないポリヌクレオチドは、ハイブリッドを形成しない。従って、ハイブリダイゼーションアッセイ条件のストリンジェンシーによって、ハイブリッドを形成するために２つのポリヌクレオチドの間に存在すべき相補性の量が決定される。ストリンジェンシーは、試験サンプル中に存在する、プローブと標的核酸との間で形成されるハイブリッドと、プローブと任意の非標的核酸との間で形成されるハイブリッドとの間の、安定性における相違を最大にするように選択される。
【００７６】
高い自己相補性を有するプローブはほぼ回避されるとはいえ、ハイブリダイズしていないプローブの存在下でのプローブ：標的二重鎖の検出を容易にするために、少なくともある程度の自己相補性を示すプローブが望ましい、いくつかの適用が存在する。例として、「分子トーチ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｏｒｃｈ）」と呼ばれる構造は、ポリヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチド連結領域によって連結され、かつ所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いにハイブリダイズする、別個の自己相補性領域（「標的結合ドメイン」および「標的閉鎖ドメイン」を作り出す）を含むように設計される。変性条件に曝露された場合、分子トーチの２つの相補性領域（これは、完全または部分的に相補性であり得る）は融解し、標的結合ドメインを遊離し、この標的結合ドメインは、所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件が回復された場合、標的配列へのハイブリダイゼーションに利用可能である。分子トーチは、標的結合ドメインが、標的閉鎖ドメインよりも、標的配列に対するハイブリダイゼーションに有利であるように設計される。分子トーチの標的結合ドメインおよび標的閉鎖ドメインは、分子トーチが自己ハイブリダイズした場合に、分子トーチが標的核酸に対してハイブリダイズした場合とは異なるシグナルを生じるように配置され、それによって、それらに関連した実行可能な標識を有する、ハイブリダイズしていないプローブの存在下で試験サンプル中のプローブ：標的二重鎖の検出が可能である、相互作用する標識（例えば、発光体／クエンチャー）を含む（分子トーチは、Ｂｅｃｋｅｒら、米国出願第０９／３４６，５５１号および国際公開第ＷＯ  ００／０１８５０号によって開示される）。Ｂｅｃｋｅｒの教示に従って、本発明のプローブは、標的核酸を非標的核酸から区別し得る「標的結合ドメイン」に加えて、「標的閉鎖ドメイン」、「連結領域」および分子トーチに特有の相互作用する標識を含むように設計および構築され得る。
【００７７】
自己相補性プローブの別の例は、「分子ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ）」としても公知の構造である。分子ビーコンは、標的相補配列を有する核酸分子、標的核酸配列の非存在下で、閉じたコンホメーションにプローブを保持するアフィニティー対（または核酸アーム）、およびプローブが、閉じたコンホメーションにある場合に相互作用する標識対を含む。標的核酸および標的相補配列のハイブリダイゼーションは、アフィニティー対のメンバーを分離し、それによって、プローブを開いたコンホメーションにシフトさせる。開いたコンホメーションへのシフトは、標識対（これは、例えば、発蛍光団およびクエンチャー（例えば、ＤＡＢＣＹＬおよびＥＤＡＮＳ）であり得る）の相互作用の減少に起因して検出され得る（分子ビーコンは、Ｔｙａｇｉら、米国特許第５，９２５，５１７号によって開示される）。Ｔｙａｇｉの教示に従って、本発明のプローブは、標的核酸を非標的核酸から区別し得る「標的相補配列」に加えて、「親和性対」および分子ビーコンに特有の二重標識を含むように設計および構築され得る。
【００７８】
特異性は、非標的配列に対して完全な相補性を有するポリヌクレオチドプローブ部分を制限することによって、非標的核酸に対して相補的な、ＧおよびＣに富む領域を回避することによって、そして非標的配列に対する可能な限り多くの不安定化不一致を含むようにプローブを構築することによって、達成され得る。検出するためにプローブが適切であるか否かにかかわらず、特異的標的核酸は、プローブ：標的ハイブリッドの、プローブ：非標的ハイブリッドに対する、熱安定性の相違に大部分依存する。プローブを設計する際に、これらのＴｍ値における相違は、可能な限り大きい（好ましくは２〜５℃以上）べきである。Ｔｍの操作は、プローブ長およびプローブ組成に対する変更（例えば、ＧＣ含量対ＡＴ含量またはヌクレオチドアナログ（例えば、リボフラノシル部分に対する２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオチド）を含むこと）によって達成され得る。
【００７９】
一般に、ポリヌクレオチドプローブについての最適ハイブリダイゼーション温度は、所定の二重鎖についての融解温度よりも約５℃低い。最適温度未満での温度でのインキュベーションは、不一致の塩基配列がハイブリダイズすることを可能にし得、それゆえ、特異性を低下させ得る。プローブが長くなるほど、塩基対の間の水素結合が多くなり、そして一般に、Ｔｍがより高くなる。ＧおよびＣの百分率が高くなることもまた、Ｔｍを上昇させる。なぜなら、Ｇ−Ｃ塩基対は、さらなる水素結合を示し、それゆえ、Ａ−Ｔ塩基対よりも高い熱安定性を示すからである。このような考慮すべき事項は、当該分野で周知である。例えば、Ｊ．ＳＡＭＢＲＯＯＫら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第１１章（第２版、１９８９）を参照のこと。
【００８０】
Ｔｍを決定するための好ましい方法は、Ａｒｎｏｌｄら，「Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ」，米国特許第５，２８３，１７４号によって開示されるハイブリダイゼーション保護アッセイ（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ：ＨＰＡ）を用いてハイブリダイゼーションを測定する。Ｔｍは、以下の様式で、ＨＰＡを用いて測定され得る。プローブ分子は、アクリジニウムエステルを用いて標識され、そして過剰量の標的を用いて、コハク酸リチウム緩衝液（０．１Ｍコハク酸リチウム緩衝液（ｐＨ４．７）、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５ｍＭ  アルドリチオール−２（ａｌｄｒｉｔｈｉｏｌ−２）、１．２Ｍ  ＬｉＣｌ、３％（ｖ／ｖ）無水エタノール、２％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム）中でプローブ：標的ハイブリッドを形成するのが可能にされる。次いで、プローブ：標的ハイブリッドを含む溶液のアリコートは、コハク酸リチウム緩衝化溶液中で希釈され、そして予想されるＴｍの温度（代表的に５５℃）よりも下から始まって２〜５℃の増分で上昇する種々の温度で５分間にわたってインキュベートされる。次いで、この溶液は、マイルドなアルカリホウ酸緩衝液（６００ｍＭホウ酸、２４０ｍＭ  ＮａＯＨ、１％（ｖ／ｖ）  ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（ｐＨ８．５））で希釈され、そして等しいかまたはより低い温度（例えば、５０℃）で１０分間インキュベートされる。
【００８１】
これらの条件下で、一本鎖プローブに結合したアクリジニウムエステルが加水分解され、一方、ハイブリダイズしたプローブに結合したアクリジニウムエステルは、加水分解から比較的保護される。従って、加水分解処理後に残っているアクリジニウムエステルの量は、ハイブリッド分子の数に比例する。残りのアクリジニウムエステルは、過酸化水素およびアルカリをこの溶液に添加することによって残りのアクリジニウムエステルから生じる化学発光をモニタリングすることにより、測定され得る。化学発光は、ルミノメーター（例えば、ＬＥＡＤＥＲ（登録商標）４５０ｉルミノメーター（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；カタログ番号３２００ｉ））において測定され得る。得られるデータは、（通常、最低温度からの）最大シグナルの、温度に対するパーセントとしてプロットされる。Ｔｍは、最大シグナルの５０％が残存する温度として規定される。上記の方法に加えて、Ｔｍは、当業者に公知の同位体法（例えば、Ｈｏｇａｎ、米国特許第５，８４０，４８８号によって開示された同位体法）によって決定され得る。
【００８２】
プローブのその標的に関する特異性を確実にするために、高ストリンジェンシーの条件下で標的核酸のみにハイブリダイズするプローブを設計することが好ましい。高度に相補性の配列のみが、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリッドを形成する。従って、ハイブリダイゼーションアッセイ条件のストリンジェンシーは、２つの配列間で安定なハイブリッドを形成するために必要とされる相補性の量を決定する。ストリンジェンシーは、プローブ：標的ハイブリッドと潜在的プローブ：非標的ハイブリッドとの間での安定性の相違を最大にするように選択されるべきである。ＳＡＭＢＲＯＯＫら，前出，第１１章を参照のこと。
【００８３】
標的核酸配列領域の長さ、従って、プローブ配列の長さもまた重要であり得る。いくつかの場合、所望のハイブリダイゼーション特徴を有するプローブを設計するために用いられ得る、位置および長さが変動する、特定の領域由来のいくつかの配列が存在し得る。他の場合、１つのプローブは、このプローブと１塩基だけ異なる別のプローブよりも、特異性に関して顕著に良好であり得る。完全には相補的ではないポリヌクレオチドがハイブリダイズすることは可能であるとはいえ、完全に相補的な塩基の最長のストレッチおよび塩基組成は一般に、ハイブリッド安定性を決定する。
【００８４】
標的核酸が、分子内ハイブリッドまたは分子間ハイブリッドに完全または部分的に含まれる場合、反応条件における変化なしには、新たな分子間プローブ：標的ハイブリッドの形成にそれほど関与できない。リボソームＲＮＡ分子は、水素結合によって、非常に安定な分子内ヘリックスおよび二次構造を形成することが公知である。ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で実質的に一本鎖のままである標的核酸領域に対するプローブを設計することによって、プローブと標的との間のハイブリダイゼーションの速度および程度が上昇し得る。しかし、好ましい標的領域が、少なくとも部分的に二本鎖であるｒＲＮＡ分子領域に含まれる場合、ヘルパープローブを用いて、標的領域への接近を促進し得る。ヘルパープローブは、ポリヌクレオチドプローブとは異なる場所で標的核酸にハイブリダイズするように設計されたポリヌクレオチドであり、それによって、核酸標的に対するポリヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション速度が上昇するか、プローブ：標的ハイブリッドの融解温度が上昇するか、またはその両方である。Ｈｏｇａｎらは、米国特許第５，０３０，５５７号においてヘルパープローブを開示する。
【００８５】
ゲノム標的は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅方法の産物と同様、天然において二本鎖形態で生じる。これらの二本鎖標的は、プローブとのハイブリダイゼーションに対してもともと阻害的であり、そしてハイブリダイゼーションの前に変性を必要とする。適切な変性およびハイブリダイゼーション条件は、当該分野で公知である。例えば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９７５）  ９８：５０３を参照のこと。
【００８６】
標的核酸に対する、完全に一致したポリヌクレオチドの融解温度の見積もりを提供する多数の式が入手可能である。１つのこのような式は以下である：
Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃの分数）−（６００／Ｎ）（ここで、Ｎ＝ヌクレオチドの数でのポリヌクレオチド長）は、１４ヌクレオチド長と６０〜７０ヌクレオチド長との間のポリヌクレオチドについてのＴｍの良好な見積もりを提供する。このような計算から、Ｔｍのその後の経験的確認または「微調整」が、当該分野で周知のスクリーニング技術を用いて行われ得る。ハイブリダイゼーションおよびポリヌクレオチドプローブについてのさらなる情報については、ＳＡＭＢＲＯＯＫら，前出，第１１章が参照され得る。当該分野で周知の参考文献の中でも、この参考文献はまた、ハイブリッドのＴｍに対する不一致の影響の見積もりを提供する。従って、既知のヌクレオチド配列から、これらの配列の間を区別し得るポリヌクレオチドが設計され得る。
【００８７】
（Ｃ．ポリヌクレオチドプローブの調製）
本発明において用いられるポリヌクレオチドプローブは、当該分野で公知の方法によって容易に調製され得る。好ましくは、このプローブは、固相法を用いて合成される。例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓは、ヌクレオチドをホスホジエステル結合によって連結するために標準的なホスホルアミダイト固相化学を用いることを記載する。Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）１５４：２８７を参照のこと。シアノエチルホスホルアミダイト前駆体を用いる自動固相化学合成が、Ｂａｒｏｎｅによって記載されている。Ｂａｒｏｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８４）１２（１０）：４０５１を参照のこと。同様に、ホスホロチオエート結合を含むポリヌクレオチドを合成するための手順は、Ｂａｔｔ，「Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」，米国特許第５，４４９，７６９号によって開示される。さらに、メチルホスホネート結合を含む異なる連結を有するポリヌクレオチドの合成は、Ｒｉｌｅｙら，「Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ」，米国特許第５，８１１，５３８号によって開示される。さらに、ポリヌクレオチドの有機合成のための方法は、当業者に公知であり、そして例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫら，前出，第１１章によって開示される。
【００８８】
特定のポリヌクレオチドの合成および精製後、いくつかの異なる手順を利用して、ポリヌクレオチドを精製し得、そしてポリヌクレオチドの品質を制御し得る。適切な手順としては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高圧液体クロマトグラフィーが挙げられる。これらの手順は両方とも、当業者に周知である。
【００８９】
本発明において用いられ得るポリヌクレオチドは、プローブとして使用されるべきポリヌクレオチドが正味の正電荷を有する限り、化学基を用いて改変されて、その性能が増強され得る。例えば、骨格改変ポリヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート基、メチルホスホネート基、２’−Ｏ−アルキル基またはポリヌクレオチドを特定のポリメラーゼもしくはヌクレアーゼ酵素のヌクレオチド分解活性に対して耐性にするペプチド基を有する骨格改変ポリヌクレオチド）は、増幅または他の反応におけるこのような酵素の使用を可能にし得る。改変の別の例は、ポリヌクレオチドの核酸鎖におけるヌクレオチドの間に取り込まれた非ヌクレオチドリンカーを用いることを含み、そしてこのことは、プローブのハイブリダイゼーションを妨害しない。Ａｒｎｏｌｄら，「Ｎｏｎ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｎｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ」，米国特許第６，０３１，０９１号を参照のこと。本発明のポリヌクレオチドはまた、所望の改変ヌクレオチドおよび天然ヌクレオチドの混合物を含み得る。
【００９０】
一旦合成されたら、選択されたポリヌクレオチドは、いくつかの周知の方法のうちのいずれかによって標識され得る（例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫら，前出，第１０章を参照のこと）。有用な標識としては、放射性同位体ならびに非放射性レポーター基が挙げられる。同位体標識としては、３Ｈ、３５Ｓ、３２Ｐ、１２５Ｉ、５７Ｃｏおよび１４Ｃが挙げられる。同位体標識は、当該分野で公知の技術（例えば、ニックトランスレーション、末端標識、第二鎖合成、逆転写の使用および化学的方法）によって、ポリヌクレオチドに導入され得る。放射標識プローブを用いる場合、ハイブリダイゼーションは、オートラジオグラフィー、シンチレーション計数またはγ線計数によって検出され得る。選択される検出方法は、標識のために用いられる特定の放射性同位体に依存する。
【００９１】
非同位体材料もまた、標識のために用いられ得、そして核酸配列内の内部にまたは核酸配列の末端に導入され得る。改変されたヌクレオチドは、酵素的または化学的に取り込まれ得る。プローブの化学的改変は、プローブの合成の間または後に、Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第６，０３１，０９１号によって開示されるように、例えば、非ヌクレオチドリンカー基の使用によって実施され得る。非同位体標識としては、蛍光分子（個々の標識または相互作用する標識の組み合わせ（例えば、Ｔｙａｇｉら、米国特許第５，９２５，５１７号によって開示される蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対））、化学発光分子、酵素、補因子、酵素基質、ハプテンまたは他のリガンドが挙げられる。本発明のプローブは好ましくは、非ヌクレオチドリンカーによって、アクリジニウムエステル（ＡＥ）で標識される。アクリジニウムエステル標識は、Ａｒｎｏｌｄら，「Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  Ｅｓｔｅｒ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ」，米国特許第５，１８５，４３９号によって開示されるように実施され得る。
【００９２】
（Ｄ．ポリカチオン性ポリマー）
本発明のポリマーは、正味のカチオン電荷を有し、そして１種類の反復モノマーを含むポリマー（すなわち、ホモポリマー）ならびに複数種類の反復モノマーを含むポリマー（すなわち、コポリマー）を包含する。本発明のポリマーはさらに、ブロックコポリマーおよびグラフトコポリマーを包含する。複数種類のモノマーを有するポリマーは、カチオン性モノマーに加えて、ポリマーのカチオン性電荷が、アニオン性電荷よりも過剰である限り、イオン性もしくはアニオン性または両方であるモノマーを含み得る。ポリマーのカチオン性電荷は、局在しても局在していなくてもよい（すなわち、特定のモノマーへ局在するかまたは２以上の連続モノマーに分散する）。１つの好ましい実施形態では、ポリマーの隣接するカチオン性モノマーの間の距離は、ポリヌクレオチド隣接リン酸基の間の距離に近似し、これは、約５Å〜約７Åの範囲にある。本発明のポリマーは、合成ポリペプチドおよび水溶性ポリペプチドである。
【００９３】
本発明のポリカチオン性ポリマーは、溶液中で（高塩濃度（すなわち、一価カチオン（例えば、リチウム（Ｌｉ＋）、カリウム（Ｋ＋）およびナトリウム（Ｎａ＋））に対して約１５０ｍＭより高い塩濃度）で媒体を含有する反応混合物中でさえ）ポリヌクレオチドが結合する速度を非常に増加させることによって、相補的ポリヌクレオチドの再結合またはハイブリダイゼーション（本明細書中で総称して「会合」という）を促進する。一価カチオンに対して約５〜約１０ｍＭより高い塩濃度を有する反応混合物は、本発明において好ましい。反応混合物中にポリカチオン性ポリマーが存在することに起因して、速度上昇は、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍以上ほど高くあり得る。任意の特定のポリカチオン性ポリマーまたはポリカチオン性ポリマーの群が有する、相補的ポリヌクレオチドの会合速度に対する効果を決定することは、ポリカチオン性ポリマーまたはポリカチオン性ポリマーの群の存在または非存在によってのみ異なる参照条件を用いて、評価され得る。本明細書中で使用される参照条件としては、高塩濃度のハイブリダイゼーション緩衝液（１００ｍＭコハク酸リチウム（ｐＨ５．１）、０．３５Ｍ  ＬｉＣｌおよび０．１％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）または低塩濃度ハイブリダイゼーション緩衝液（１００ｍＭコハク酸リチウム（ｐＨ５．１）、５０ｍＭ  ＬｉＣｌおよび０．１％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００））のいずれか、ならびに４０℃〜６０℃のインキュベーション温度が挙げられる。参照条件は、相補的ポリヌクレオチド間での安定なハイブリダイゼーションを容易にする任意の条件であり得る。ストリンジェンシーの他の条件は、相補的ポリヌクレオチド間の会合速度に対する、ポリカチオン性ポリマーまたはポリカチオン性ポリマーの群の効果を決定するための参照条件として働き得、この条件として、標準的反応条件（６０℃での、０．１８Ｍ  Ｎａ＋（０．１２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８））が挙げられる。Ｂｒｉｔｔｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９７４）２９：３６３−４１８を参照のこと。
【００９４】
ポリカチオン性ポリマーは、核酸二重鎖のＴｍを顕著に上昇させることが既知であり、そしてＴｍにおける大きな上昇は、識別の喪失にしばしば関連する。例えば、Ｍａｒｕｙａｍａら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．（１９９８）９：２９２−２９９、およびＭａｊｌｅｓｓｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９８）２６：２２２４−２２２９を参照のこと。検出アッセイについて、ここで、ポリヌクレオチドプローブが、標的ではない核酸の存在下で標的核酸に優先的にハイブリダイズすることが意図され、プローブは、このアッセイが診断的価値または立証的価値のものであるために、標的核酸に特異的であらねばならない。識別の喪失は、許容され得ない。よって、ハイブリッドのＴｍを顕著に増加させる、一般に実行される塩条件および温度条件を使用するアッセイにおいて、標的核酸に対する特異性を喪失することなく、本発明のポリカチオン性ポリマーが使用され得るという本出願人の発見は、予期されなかった。本発明のポリカチオン性ポリマーは、核形成の間に形成される小さな二重鎖をさらに安定化させることによって機能するが、プローブが標的核酸に対するその特異性を失うという程度ではないようである。（核形成部位は、わずか３つの隣接する塩基対にわたると記載され、そして６〜８つの隣接する塩基対ほどの長さであり得る。Ｐｏｅｓｃｈｋｅら、Ｊ．Ｎｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９７１）６２：３６１−３８１を参照のこと。）結果として、驚くことに、出願人は、本発明のポリカチオン性ポリマーを使用してアッセイの反応速度を上昇し得たことを見出した。ここで、プローブは、標的ではない核酸（密接に関連する標的ではない生物またはウイルス由来の核酸でさえ）の存在下で標的核酸に優先的にハイブリダイズする。
【００９５】
慣用的スクリーニングによって、出願人はまた、ポリカチオン性ポリマーが選択され得ることを発見した。このポリカチオン性ポリマーは、いくつかのミスマッチ寛容を可能にして、その結果、例えば、密接に関連する生物またはウイルスの系統がアッセイにおいて検出され得る。これらのポリマーは、当業者が配列変化に感受性ではないプローブを設計することを可能にして、その結果、生物またはウイルスの複数の系統が、単一のプローブで検出され得るが、試験サンプル中に存在する標的ではない核酸を区別するために十分な特異性をさらに有する。ポリマーに対して選択されたこれらを使用するアッセイは、高度な遺伝子型多様性を示す生物またはウイルス（例えば、ＨＩＶ−１ウイルスおよびＨＩＶ−２ウイルス）を検出する際に、特に有用である。例えば、Ｃｈｅｅら、「Ａｒｒａｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｉｐｓ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ＨＩＶ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓａｍｅ」米国特許第５，８６１，２４２号を参照のこと。ストリンジェンシー条件（例えば、塩条件および温度条件）を調整することによって、これらの同一のポリマーが単一塩基ミスマッチ識別を必要とするアッセイにおいて使用され得ることが、予期される。
【００９６】
理論によって結び付けられることは望まないが、出願人は、現在、本発明のポリカチオン性ポリマーが溶液中でアセンブリしてナノメーターの大きさの複合体（すなわち、ナノ粒子）を形成すると考えている。この複合体は、溶液中に存在する負に荷電したポリヌクレオチド（例えば、ポリヌクレオチドプローブおよび標的核酸）を引き寄せる電荷環境を作製する。一旦、これらの複合体によって位置付けられると、十分な相補的配列を有するポリヌクレオチドは、より容易に会合し得、これにより、相補的ポリヌクレオチドの会合動態を増強する。あるいは、出願人は、本発明のポリカチオン性ポリマーがポリヌクレオチドを結合する場合に、本発明のポリカチオン性ポリマーが溶液中でアセンブリし、その結果、ナノ粒子がすでに大きく形成された後ではなくナノ粒子が形成しているときにそのポリヌクレオチドが位置付けされる、と理論付ける。当業者に周知の顕微鏡法を使用して、ポリカチオン性ポリマーを含むナノ粒子の形成をスクリーニングし得る。
【００９７】
複合体の形成が、反応混合物中に存在するポリヌクレオチドを誘引しそして集中させるという本出願人の理論に基づいて、この反応混合物のポリカチオン性ポリマー中に存在するカチオン性モノマーのモル濃度が、この反応混合物のポリヌクレオチドに存在するアニオン性リン酸基（すなわち、ヌクレオチド）のモル濃度を超えることが好ましい。反応混合物に対してモル過剰のカチオン性モノマーを提供することはまた、ほぼ等しい数のカチオン性モノマーとリン酸基とが反応混合物に提供される場合に生じ得るような、ポリカチオン性ポリマーの複合体の溶液からの沈殿を妨げるはずである。沈殿は、望ましくない。なぜなら、核酸が溶液から排除され、それによって、相補的ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを妨害するからである。少量のポリカチオン性ポリマーでさえ、反応混合物中の会合速度を増強するはずであるが、ポリカチオン性ポリマーの好ましい濃度は、約１μＭ〜約１０００μＭの範囲にあり、そしてより好ましくは、約１０μＭ〜約１００μＭの範囲にある。
【００９８】
本発明のポリカチオン性ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）は、好ましくは、約３００，０００Ｄａ未満である。なぜなら、約３００，０００Ｄａよりも大きいＭｗを有するポリマーは、しばしば、過度に粘性であるか、または多分散して、相補的ヌクレオチドの会合を十分促進しないからである。最も低い受容可能なＭｗは、使用されるポリマーに大きく依存するが、少なくとも１０，０００ＤａのＭｗを有するポリマーが、一般に好ましい。相補的ポリヌクレオチドの会合速度を増強するための最適なＭｗ値を有するポリマーは、任意の所定の反応条件のセットについて、慣習的なスクリーニング手順によって決定され得る。
【００９９】
本発明のポリカチオン性ポリマーは、多分散し得るが、混合物のポリマーは、約１の多分散性値を有することが、一般に好ましい。多分散性は、ポリマー混合物中の重量平均分子量および数平均分子量の比（Ｍｗ／Ｍｎ）の測定値であるので、この比が１に近いほど、混合物を構成するポリマーのサイズ均一性が、より高くなる。
【０１００】
本発明によって企図されるポリカチオン性ポリマーとしては、ポリ−Ｌ−リジン（この例は、Ｂｕｃｈｓ、ＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄのＦｌｕｋａ  ＡＧからカタログ番号８１３３３および８１３５５として入手可能な、ポリ−Ｌ−リジンヒドロブロミドである）、ポリ（ｌｙｓ，ｔｙｒ）４：１（この例は、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯのＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから製品番号Ｐ４６５９として入手可能な、ポリ（ｌｙｓ，ｔｙｒ）４：１ヒドロブロミドである）、ポリ−Ｌ−ヒスチジン（この例は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから製品番号Ｐ２５３４として入手可能な、ポリ−Ｌ−ヒスチジンヒドロクロリドである）、ポリ−Ｌ−アルギニン（この例は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから製品番号Ｐ４６６３として入手可能な、ポリ−Ｌ−アルギニンヒドロクロリドである）、ヘキサジメチリンブロミド（ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ  ｂｒｏｍｉｄｅ）（１，５−ジメチル−１，５−ジアザウンデカ−メチレンポリメトブロミド）（この例は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから製品番号Ｈ９２６８として入手可能である）、ポリ（アリルアミンヒドロクロリド）（この例は、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩのＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙからカタログ番号２８，３２１−５として入手可能である）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）（この例は、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙからカタログ番号４０，９０１−４として入手可能である）、ポリ［ビス（２−クロロエチル）エーテル−アルト−１，３ビス［３−（ジメチルアミノ）プロピル］尿素］、ポリエチレンイミン（この例は、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙからカタログ番号４０，８７２−７として入手可能である）、およびポリ−Ｌ−リジンデキストランが挙げられるが、これらに限定されない。詳細には列挙されないが、相補的ポリヌクレオチドの会合反応速度論を増強するよう機能する他のポリカチオン性ポリマーは、本発明によって想定される。このようなポリカチオン性ポリマーは、過度の実験を伴うことなく、本明細書中に提供されるガイダンスに従って、当業者によって容易にスクリーニングされ得る。
【０１０１】
本発明のポリカチオン性ポリマーは、反応速度を増加するための他の技術と組み合わせて使用され得、この技術としては、相補的ポリヌクレオチド間の会合速度を増強するための容量排除に依存する技術が挙げられる。ポリエチレングリコール、デキストランまたは硫酸デキストランのような合成ポリマーを添加することによって、ポリヌクレオチド反応物に対して利用可能なままである反応混合物の容量が減少され、それによって、これらの反応物の有効濃度を増加する。容量排除技術は、当該分野で周知であり、例えば、Ｒｅｎｚら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８４）１２：３４３５−３４４４およびＷａｈｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７５：３６８３−３６８７に記載される。本発明のポリマーと組み合わせて使用され得る、ポリヌクレオチド間の会合速度を増加するための他の技術としては、沈殿剤を含めることによって反応速度を増強する技術が挙げられ得る。例えば、Ｋｏｈｎｅら、「Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ」、米国特許第５，１３２，２０７号を参照のこと。
【０１０２】
（Ｅ．会合速度論）
本明細書中で使用される場合、用語「会合速度」は、２つのポリヌクレオチドが溶液中において二重鎖を形成するために再会合またはハイブリダイズする速度のことをいう。多くの因子が会合速度に影響し、これらの因子として、ポリヌクレオチドの大きさおよび濃度、インキュベーションの温度ならびに反応混合物中の塩濃度が挙げられる。従来から、会合速度は、ＢｒｉｔｔｅｎおよびＫｏｈｎｅによって開発されたＣ０ｔ分析を用いて定量されてきた。Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９６８）１６１：５２９−５４０。この分析に続いて、等温反応の間の任意の時間に残存する１本鎖ポリヌクレオチドの画分は、以下の公式によって与えられる：Ｃ／Ｃ０＝１／（１＋ｋＣ０ｔ）、ここでＣ０は１リットル当たりのポリヌクレオチドとしてのポリヌクレオチドの初期濃度であり、Ｃは、任意の所定の時点で残存する１リットル当たりのヌクレオチドとしてのポリヌクレオチド濃度であり、ｔは、反応時間（秒）であり、およびｋは、２次反応の速度定数（Ｍ−１ｓ−１）である。反応が半分終了した場合（時間＝ｔ１／２）、Ｃ／Ｃ０＝１／２およびＣ０ｔ１／２＝１／ｋである。従って、Ｃ０ｔ１／２は、速度定数に反比例し、そして会合速度の尺度となる。
【０１０３】
会合速度を測定するためのＣ０ｔ分析法の欠点は、反応の間に同時に起こるポリヌクレオチドの解離を説明できない点である。反応の間に起こる解離の量は、反応の温度（ポリヌクレオチドの間に形成される二重鎖の溶解温度に関係する）、および反応時間のような因子に依存する。反応温度が二重鎖の溶解温度に近づくにつれて、または反応時間が長くなるにつれて、解離の量は、増加すると期待される。従って、会合速度を正確に計算するために、反応における会合速度定数および解離速度定数の両方を計算に入れる必要がある。
【０１０４】
この決定を行うため、本出願人は、関連するポリヌクレオチドの会合および解離の両方を説明する速度定数を計算するために、反応速度を測定するための新規の公式および方法を考案した。この手順における第１の工程は、ハイブリダイゼーションの割合を、試験した各ポリヌクレオチド濃度についてグラフ上のＣ０ｔデータのｌｏｇに対してプロットすることである。このようなプロットの例を、図１および図２に示し、ここに、下記の実施例１の実験データから計算されたデータポイント（黒丸）をプロットする。これらのグラフは、３分および８分の両方のハイブリダイゼーションについてのデータポイントをプロットする。ポリヌクレオチドの会合が、時間とともに増加することを確かめるために、２つのインキュベーション期間を使用し、これにより、計算される速度が、速度論的に決定されるものであり、平衡状態の測定によるものではないことを立証し得る。ハイブリダイゼーションの割合の増加は、ハイブリダイゼーションの割合が濃度と時間の両方に伴い増加することを示すことにより実証され得る。
【０１０５】
次に、予想される曲線を、以下の新規の公式により計算されるハイブリダイゼーション値の割合に基づいてプロットする：％ハイブリダイゼーション＝１００（１−Ｋ）（１−ｅｘｐ−（ｋ１Ｃ０＋ｋ２）ｔ）、ここでＫ＝ｋ２／（Ｃ０ｋ１＋ｋ２）、ｔ＝時間（秒）、Ｃ０＝ヌクレオチドにおけるポリヌクレオチドの初期濃度（Ｍ）、ｋ１＝会合速度定数（Ｍ−１ｓ−１）、およびｋ２＝解離速度定数（ｓ−１）。ｋ１およびｋ２はともに、この式において未知であり、実施者により推定される。分析にあたって、ｋ１に、従来的なＣ０ｔ分析から得られる速度定数値を設定し、反応の間に解離のないことを仮定してｋ２に、速度定数値０を設定した。（ｋ２＝０の場合、この式はＣ０ｔ方程式に還元される）。実際のｔの値ならびに推定されるｋ１およびｋ２の値を新公式に代入するために、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ  ３．０（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ；Ｒｅａｄｉｎｇ、ＰＡ）のような曲線プロットソフトウェア（ｃｕｒｖｅ  ｐｌｏｔｔｉｎｇ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）を、ハイブリダイゼーションの割合と試験した濃度範囲にわたるＣ０とを関係づける曲線を作製するために使用し得た。このようなカーブの例を、図３および図４に示す。ここで、図１および２に描かれた、Ｃ０ｔ分析から得られたプロットされたデータポイント（黒丸）の上に、上記の曲線プロットソフトウェアを使用して、作製された曲線を重ね合わせる。（図３および図４において、ｋ１速度定数１６，０００Ｍ−１ｓ−１およびｋ２速度定数０を、式の中に組み込んだ）。図３および図４から読みとれるように、これらのグラフの各々における曲線およびプロットされたデータポイントは、完全には一致しない。
【０１０６】
最後に、上記の曲線プロットソフトウェアを使用して、実験データに基づいてプロットされたデータポイントが、新公式に基づいてプロットされたカーブと一致するまで、ｋ１およびｋ２を、調整した。図５および図６は、ｋ１およびｋ２を調整し、結果として各グラフにおいて一致した曲線およびプロットされたデータポイント（黒丸）を得た後の、図３および図４のグラフを示す。（これらのグラフの各々について一致したの曲線およびプロットされたデータポイントを得るために、ｋ１を１４，５００Ｍ−１ｓ−１、そしてｋ２を８．３３×１０−４ｓ−１に調整した）。２つのインキュベーション期間を使用する場合、図１〜６に例が示されるように、確実に、ｋ１およびｋ２が、解離の量が正確に最終会合速度定数（ｋ１）に達したことを明らかにするために両方の反応において同一でなければならない。上記したように、２つの会合期間を試験する一つの理由は、ポリヌクレオチドの会合および解離が反応時間の間に増加する傾向があるからである。従って、２つの別個の反応時間についてのデータは、会合速度をより正確に決定する。
【０１０７】
従来的なＣ０ｔ分析または上記に記載した新公式およびカーブプロット手順は、任意の特定のポリカチオンポリマーまたはポリカチオンポリマーの群が、ポリヌクレオチドのセットの会合速度を向上させる程度を決定するために使用され得る。定量的な理由については後者が好ましいが、両方の方法とも、ポリカチオンポリマーまたはポリカチオンポリマーの群が、会合反応の速度論にポジティブに影響するかどうかについて定量的な測定を提供する。これは、下記の実施例１からのデータに基づいて、同一のハイブリダイゼーション条件の下での、ハイブリダイゼーションの割合を、ポリ−Ｌ−ヒスチジン塩酸塩（黒菱形）およびポリマーを含まない（白三角）のＣ０ｔのｌｏｇに対して直接的に比較する図７において実証される。しかしながら、両方の公式とも、事実上の会合速度を予測し、会合速度が速くなるにつれて正確に計算することがより困難となることが理解される。
【０１０８】
（Ｆ．検出システム）
試験サンプル中で検出され得る前に、標的核酸は、ポリヌクレオプローブに対するハイブリダイゼーションのために反応混合物中で利用可能でなければならない。核酸を反応混合物中に開放するための細胞破砕法の多くは、当該分野で周知であり、化学的および酵素学的方法の両方、ならびに、超音波処理、ガラスビーズを用いる攪拌、研磨剤を用いる粉砕およびＦｒｅｎｃｈ圧力セルのような機械的手段が挙げられる。他の方法は、１回以上の凍結および融解、またはリゾチームのような溶解酵素を用いる処理による細胞壁の弱体化を含み、その後、強い界面活性剤またはカオトロピック試薬（すなわち、疎水的相互作用を混乱させる）を用いる処理により細胞膜を分解する。これらの方法による溶解物としては、小器官、タンパク質（プロテアーゼおよびヌクレアーゼのような酵素を含む）、炭水化物、および脂質ならびに核酸（核酸のさらなる精製が必要であり得る）が挙げられる。
【０１０９】
引き続く精製工程の必要性なしに、核酸のハイブリダイゼーションのために適切な形態で、広範囲の細胞型から核酸を放出するための、単一の試薬のみを必要とする抽出方法は、Ｃｌａｒｋら、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｗｉｄｅ  Ｒａｎｇｅ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ」、米国特許第５，７８６，２０８号により開示される。この抽出方法は、試験サンプルを非イオン性界面活性剤、任意のアニオン性界面活性剤および金属キレート剤を含む試薬と合わせ、そして得られた混合物を、核酸が細胞から放出されるまで８０℃〜１００℃の間の温度で加熱する。ラウリル硫酸リチウムのようなアニオン性界面活性剤が、試験サンプル中に存在するヌクレアーゼ（例えば、リボヌクレアーゼ）を破壊または変性すると考えられるので、アニオン性界面活性剤を含むことは、標的核酸がＲＮＡである場合、特に所望される。（アニオン性界面活性剤を使用するこの抽出方法および他の抽出方法において、標的核酸は、好ましくは、標的核酸を本発明のポリカチオン性ポリマーと接触させることに先立って、アニオン性界面活性剤から分離される。）この方法において、核酸は、細胞壁に対する観測可能な破壊なしに放出され、その結果、遊離した核酸は、さらなる精製なしに、ハイブリダイゼーション、増幅または他の遺伝子操作に適切である。
【０１１０】
サンプル調製後、本発明のポリカチオン性ポリマーは、サンプル中の標的核酸の存在または量を決定するために用いられる、異質（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ）系および同質（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）系の両方を含む、種々の検出系において使用され得る。異質アッセイにおいて、工程は、一本鎖プローブおよびプローブ：標的ハイブリッドが互いに識別され得る前に、過剰なプローブ配列からプローブ：標的ハイブリッドを単離または分離することを必要とする。異質アッセイ系の例は、例えば、Ｒａｎｋｉら、米国特許第４，４８６，５３９号およびＳｔａｂｉｎｓｋｙ、米国特許第４，７５１，１７７号により開示される。一方では、同質アッセイは、分離工程を必要とせず、これによって、過剰なプローブ配列の存在下で、プローブ：標的ハイブリッドの溶液中での検出を可能にする。異質系または同質系のいずれかにおいて使用され得る検出系の例は、ハイブリダイゼーションプロテクションアッセイ（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）およびアダクトプロテクションアッセイ（Ａｄｄｕｃｔ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）であり、それぞれ、Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号、およびＢｅｃｋｅｒら、「Ａｄｄｕｃｔ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ」、米国特許第５，７３１，１４８号に開示される。他の周知の検出系は、反応混合物中で、プローブが標的核酸に結合されるかまたは自己ハイブリダイズしたままであるかどうかに依存して、差示的に検出可能なシグナルを発する相互作用標識を組み込む自己ハイブリダイジング（ｓｅｌｆ−ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）プローブを利用する。例えば、Ｂａｇｗｅｌｌ、米国特許第５，６０７，８３４号；Ｔｙａｇｉら、米国特許第５，９２５，５１７号；ならびにＢｅｃｋｅｒら、米国特許出願第０９／３４６，５５１号および国際公開第ＷＯ００／０１８５０号を参照のこと。
【０１１１】
ハイブリダイゼーションプロテクションアッセイは、差示的な加水分解に基づく、特に好ましい同質検出系である。Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号を参照のこと；Ａｒｎｏｌｄら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８９）３５：１５８８〜１５９４もまた参照のこと。この検出系において、化学発光性アクリジニウムエステルで標識された過剰なプローブは、このプローブが試験サンプル中に存在していると推測される標的核酸に対して安定にハイブリダイズさせる期間および条件下で試験サンプルに提供される。ハイブリダイゼーションに続いて、ハイブリダイズされないプローブと会合したアクリジニウムエステル標識は、アクリジニウムエステルのフェニルエステルを加水分解するアルカリ試薬を試験サンプルに提供することによって選択的に分解される。ハイブリダイズされたプローブと会合した標識は、二重鎖分子中の標識のインターカレーションによって加水分解から保護される。従って、試験サンプル中に残存するアクリジニウムエステルの量は、ハイブリッドの量に比例し、そしてアルカリの前の過酸化水素の添加の際にハイブリダイズされたプローブと会合したアクリジニウムエステル標識から生じる化学発光によって測定され得る。化学発光は、ＬＥＡＤＥＲ（登録商標）４５０ｉ照度計を含む、照度計で測定され得る。有用なＨＰＡの条件および試薬は、以下の実施例１に例示される。
【０１１２】
ハイブリダイゼーションの反応速度論を測定する場合に好まれる、アダクトプロテクションアッセイは、標的ポリヌクレオチドに結合しないポリヌクレオチドプローブ上に存在する標識からのシグナルの生成を優先的に変えるような付加物の形成を利用することによって標的ポリヌクレオチドの検出を容易にし得る。このアッセイは、標識されたポリヌクレオチドプローブが標的ポリヌクレオチドと二重鎖を形成する場合の、保護的な微環境の形成を含む。標的ポリヌクレオチドに結合したプローブと会合した標識は、シグナル変更リガンド（例えば、亜硫酸ナトリウム）と付加物を形成することから優先的に保護される。しかし、遊離のプローブと会合した標識は、シグナル変更リガンドの存在下で選択的に変更され得、これによって、検出可能なシグナルを生成するその能力に影響する。アダクトプロテクションアッセイにおいて有用なシグナル変更リガンドの例としては、テトラヒドロチオフェン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｔｈｉｏｐｅｎｅ）、プロパンチオール、ベンジルメルカプタン、亜硫酸塩、亜硫酸グリコール、ハイドロサルファイト、メタ重亜硫酸塩、チオ硫酸塩、チオリン酸塩、メタ亜ヒ酸塩、亜テルル酸塩、亜ヒ酸塩およびチオシアン酸塩が挙げられる。標識に検出可能なシグナルを生成させるシグナル誘因試薬を導入することによって、サンプル中のプローブ：標識二重鎖の存在または量が決定され得る。好ましい標識は、化学発光試薬（例えば、アクリジニウムエステル）であり、そして好ましいシグナル誘因試薬は、水酸化ナトリウムまたは過酸化水素である。アクリジニウムエステル標識およびそれらの検出のための方法は、米国特許第５，１８５，４３９号において、Ａｒｎｏｌｄらによって開示される。
【０１１３】
シグナル誘因試薬がサンプル中に導入される前に、最初に、好ましいアダクトプロテクションアッセイにおいて、ポリカチオン性ポリマーおよびポリヌクレオチドは、互いに解離される。（解離工程は、本発明の全ての実施形態について必要ではない。）ポリヌクレオチドからのポリカチオン性ポリマーの解離は、核酸に対するポリカチオンの結合を弱めるアニオン性界面活性剤およびポリアニオン（例えば、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ドデシル硫酸ナトリウムおよびポリヌクレオチド）によってもたらされ得る。この理由のために、解離工程が含まれる場合、サンプルは、ポリカチオン性ポリマーの存在下で相補的なポリヌクレオチドの増強された会合が妨げられずに進行し得るように、解離工程に先立って、ポリヌクレオチドからポリカチオン性ポリマーを解離し得る、感知可能な量のアニオン性界面活性剤およびポリアニオンを排除すべきである。より詳細には、反応混合物中の総アニオン性電荷は、総カチオン性電荷よりも少なくあるべきである。好ましい解離試薬は、反応混合物中約１％（ｗ／ｖ）の最終濃度のラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）である。
【０１１４】
検出に先立って、反応混合物を核酸増幅条件にさらすことによって、存在する標的核酸の量、従って、アッセイの感度を増加させることが所望され得る。増幅条件下で、標的配列またはその相補体を含有するポリヌクレオチド鎖は、ポリメラーゼとして公知のヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用する、リボヌクレオシド三リン酸またはデオキシヌクレオシド三リン酸からテンプレート依存性の様式で合成される。今日の一般に使用される多くの増幅手順が存在し、この増幅手順としては、以下が挙げられる：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｑ−βレプリカーゼ、自律的（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ）配列複製（３ＳＲ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）およびループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）（これらの各々は、当該分野において周知である）。例えば、Ｍｕｌｌｉｓ、「Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、米国特許第４，６８３，２０２号；Ｅｒｌｉｃｈら、「Ｋｉｔｓ  ｆｏｒ  Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、米国特許第６，１９７，５６３号；Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９２）２０：１６９１〜１６９６；Ｆａｈｙら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９１）１：２５〜３３；Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号；Ｋａｃｉａｎら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、米国特許第５，４８０，７８４号；Ｄａｖｅｙら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ」、米国特許第５，５５４，５１７号；Ｂｉｒｋｅｎｍｅｙｅｒら、「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｇａｐ  Ｆｉｌｌｉｎｇ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」、米国特許第５，４２７，９３０号；Ｍａｒｓｈａｌｌら、「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」、米国特許第５，６８６，２７２号；Ｗａｌｋｅｒ、「Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、米国特許第５，７１２，１２４号；Ｎｏｔｏｍｉら、「Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ」、欧州特許出願第１  ０２０  ５３４  Ａ１号；Ｄａｔｔａｇｕｐｔａら、「Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、米国特許第６，２１４，５８７号；およびＨＥＬＥＮ  Ｈ．ＬＥＥら、ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ：ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ  ＴＯ  ＤＩＳＥＡＳＥ  ＤＩＡＧＮＯＳＩＳ（１９９７）を参照のこと。
【０１１５】
標的配列を増幅させるための好ましい方法は、転写媒介増幅（ＴＭＡ）である。例えば、Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，４８０，７８４号ならびにＬＥＥら、前出、第８章を参照のこと。ＴＭＡは、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼを使用して、標的配列のコピー数における１０億倍より大きな増加を可能にする等温増幅手順である。ＴＭＡ増幅における標的配列は、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはＤＮＡを含む任意の型の核酸であり得る。ＴＭＡ反応は、５’ＲＮＡポリメラーゼ特異的プロモーター配列を有するセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー（すなわち、プロモーター−プライマー）の存在下で、逆転写酵素によって、一本鎖標的配列を二本鎖ＤＮＡ中間体に変換させることを含む。逆転写酵素は、ヌクレオシド三リン酸基質の存在下でプロモーター−プライマーの３’末端からの伸長によって、標的配列のＤＮＡコピーを生成する。標的配列がＲＮＡである場合、得られたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖中のＲＮＡは、逆転写酵素のＲＮａｓｅ  Ｈ活性によって分解される。次いで、センスプライマーが、ＤＮＡコピーに結合し、そしてＤＮＡの新しい鎖は、逆転写酵素によってセンスプライマーの３’末端から合成され、これによって二本鎖ＤＮＡ中間体分子を生成する。ＲＮＡポリメラーゼによって認識され、そして数百コピーのＲＮＡに転写される二本鎖プロモーター配列が、このＤＮＡ中間体中に含まれる。これらの転写されたＲＮＡ分子の各々もまた、さらなるＲＮＡを産生するために使用される二本鎖ＤＮＡ中間体に変換され得る。従って、ＴＭＡ反応は、指数関数的に進行する。ＴＭＡ反応の特定のパラメーターは、酵素、プライマーおよびヌクレオシド三リン酸の濃度、ならびに反応時間および温度を含み、過度の実験を行うことなしに、ＴＭＡ反応に関する分野で周知なパラメーターから決定および適合され得る。
【０１１６】
検出工程が増幅工程によって先行される場合、標的核酸は、好ましくは、標的配列を増幅する前に単離および精製される。標的核酸を単離および精製するための多種多様な手順が、当該分野において周知である。
【０１１７】
増幅に先立って、標的核酸を単離および精製するための特に好ましい方法は、Ｗｅｉｓｂｅｒｇらによる米国特許第６，２８０，９５２号に開示される。この系において、異なるハイブリダイゼーション条件下で、捕捉プローブが、標的核酸にハイブリダイズし、そして固定化プローブが、捕捉プローブ：標的複合体にハイブリダイズする。第１のセットのハイブリダイゼーション条件下で、標的核酸に対する捕捉プローブのハイブリダイゼーションは、固定化プローブに対する捕捉プローブのハイブリダイゼーションよりも有利である。従って、この第１のセットの条件下で、捕捉プローブは、固体支持体に結合されるよりもむしろ溶液中に存在し、これによって、遊離の捕捉プローブの濃度を最大にし、そして標的核酸に対するハイブリダイゼーションに有利な液相の反応速度論を利用する。本発明のポリカチオン性ポリマーは、この第１のセットの条件下で、反応混合物に提供されて、標的核酸に対する捕捉プローブの迅速なハイブリダイゼーションを促進し得る。捕捉プローブが、標的核酸にハイブリダイズするために十分な時間を受けた後、第２のセットのハイブリダイゼーション条件が課され、捕捉プローブ：標的複合体を固定化プローブにハイブリダイズさせ、これによって、サンプル溶液中の標的核酸を単離し得る。次いで、固定化された標的核酸が、精製され得、そして標的核酸中に存在する標的配列は、増幅および検出され得る。１度以上の洗浄工程を含む精製手順は、一般的に、粗製サンプル（例えば、臨床、環境、産業、食品、水など）で実施する場合に所望され、サンプル中に存在する物質に起因する酵素阻害および／または核酸分解を妨げる。
【０１１８】
検出アッセイを実施するための機器システムは、当該分野において周知であり、そして手動、半自動化または完全に自動化されたアッセイを実施するために使用され得る。これらの機器システムのいくつかは、（先行する増幅工程のない）直接検出に限定されるが、他の機器システムは、増幅および検出の両方を実施し得る。これらの機器システムは、当該分野において公知の任意の種々の技術を用いてポリヌクレオチドハイブリッドの形成を検出し得る。これらの技術としては、光の放出、質量の変化、伝導性または濁り度の変化に基づく技術が挙げられるが、これらに限定されない。反応速度を増大させるために、本発明のポリカチオン性ポリマーを組み込むアッセイを実施するために容易に適合され得る機器システムの例としては、、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ｏｆ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡによるＤＴＳ  ４００（検出のみ）およびＤＴＳ  １６００（増幅および検出）の商標名で販売される機器システムが挙げられ、これらは、Ａｃｏｓｔａら、「Ａｓｓａｙ  Ｗｏｒｋ  Ｓｔａｔｉｏｎ」、米国特許第６，２５４，８２６号、およびＡｍｍａｎｎら、「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  ａ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」、米国特許出願第０９／３０３，０３０号、および国際公開番号ＷＯ９９／５７５６１、「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ」（これらの各々は、本明細書と共に共通の所有権を享受する）により開示される機器システムの実施形態を代表する。
【０１１９】
（Ｇ．キット）
本発明はまた、キット形態の検出系を企図する。本発明のキットは、ハイブリダイゼーションアッセイの条件下で、試験サンプル中の標的核酸配列に優先的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブを少なくとも１度のアッセイについて十分な量で、そしてハイブリダイゼーションアッセイの条件下で、試験サンプル中のプローブおよび標的配列の会合速度を増加させるために十分な量の合成ポリカチオン性ポリマーを含む。このプローブおよびポリマーを、同一の容器または別々の容器中で合わせ得る。複数のプローブを含むキットはまた、本発明によって企図され、ここで、複数のプローブは、異なる核酸配列を標的化するように設計され、そしてプローブを試験サンプル中で差示的に検出することを可能にする異なる標識を含み得る。本発明に従うキットは、さらに以下の少なくとも１つを包含し得る：（ｉ）試験サンプル中のプローブからポリマーを解離させるために十分な量の試薬；（ｉｉ）標的核酸中に含まれるかまたは標的核酸由来の標的配列を増幅するための１つ以上の増幅プライマー；（ｉｉｉ）試験サンプル中に存在する標的核酸を単離および精製するための捕捉プローブ；ならびに（ｉｖ）捕捉プローブが含まれる場合、試験サンプル中で直接的にかまたは間接的にかのいずれかで捕捉プローブを固定化するための固体支持体材料（例えば、磁気応答性粒子）。本発明のキットは、さらに、１つ以上のヘルパープローブを含み得る。
【０１２０】
典型的に、このキットはまた、試験サンプル中の標的核酸配列の存在または量を決定するための検出アッセイにおいて、パッケージ化されたプローブおよびポリマーを使用するための具体的な形態（例えば、紙または電子媒体上に含まれる）中に記録される指示書を含む。指示書中に記載されるアッセイは、ポリヌクレオチドプローブでの検出に先立って、標的核酸を単離および精製する工程、標的核酸中に含まれる標的配列を増幅する工程、ならびに／または解離試薬を使用してプローブをポリマーから解離させる工程、を包含し得る。この検出アッセイは、特定のウイルスもしくは生物、またはウイルスもしくは生物の群、疾患もしくは状態の存在についての診断であり得るか、あるいはこの検出アッセイは、疾患の状態もしくは遺伝子発現のレベルを決定するためか、または変異もしくは多型の存在を検出するために有用であり得る。
【０１２１】
検出系の種々の成分が、種々の形態で提供され得る。例えば、プローブおよび／またはポリカチオン性ポリマーは、凍結乾燥された試薬として提供され得る。この凍結乾燥された試薬は、凍結乾燥の前に予め混合され得、その結果、再構成される場合、これらは、アッセイにおける使用のために準備された適切な比率の各成分を有する完全な混合物を形成する。さらに、本発明の検出系は、キットの凍結乾燥された試薬を再構成するための再構成試薬を含み得る。好ましいキットは、凍結乾燥されたプローブ試薬を含む。
【０１２２】
典型的なパッケージ化材料は、固体マトリクス（例えば、ガラス、プラスチック、紙、箔、微粒子など）を含み、これらは、本発明のプローブ、ポリカチオン性ポリマーおよび他の任意の試薬を固定された制限内に保持可能である。従って、例えば、パッケージ化材料としては、ミリグラム下の量の企図されるプローブもしくはポリカチオン性ポリマーを収納するために使用されるガラスのバイアルが挙げられ、またはこれらは、本発明のプローブが作動可能に付加される（すなわち、標的核酸配列を検出するための手順に関与し得るように連結される）マイクロタイタープレートウェルであり得る。
【０１２３】
指示書は、代表的には、試薬および／または試薬の濃度、ならびに少なくとも１つのアッセイ方法パラメータ（例えば、これは、サンプルの量当たり使用される試薬の相対量であり得る）を示す。さらに、維持、期間、温度および緩衝液条件のような特定もまた、含まれ得る。
【０１２４】
（Ｈ．実施例）
本発明の異なる局面および実施形態を説明する実施例を、以下に提供する。当業者は、これらの実施例が、本発明を、本明細書中に記載する特定の実施形態に限定することを意図しないということを理解する。
【０１２５】
（実施例１）
（完全相補的プローブと標的配列との間のハイブリダイゼーション速度論に対するポリカチオン性ポリマーの効果）
本実施例は、ポリヌクレオチドプローブと完全相補的な合成標的配列が、塩および温度の異なる組合せ条件下で会合する速度に対して、種々のポリカチオン性ポリマーが有する効果を示す。本実施例として、プローブは、米国特許第６，０３１，０９１号でＡｒｎｏｌｄらによって開示されたような非ヌクレオチドリンカーを含むように合成された
【０１２６】
【数１】
2004537263.tif 000003
のヌクレオチド塩基配列（アスタリスクは、非ヌクレオチドリンカーの位置を示す）を有する。このプローブを、米国特許第５，１８５，４３９号中でＡｒｎｏｌｄらによって開示されるように、化学発光アクリジニウムエステル（標準ＡＥ）を用いて標識し、そして、相対的光単位（ＲＬＵ）で測定した。
【０１２７】
以下の５つのポリマーを、本実施例において試験し、そして、各ポリマーが、供給者によって記述された性質を有することを、表わした。
【０１２８】
（ｉ）（ポリ−Ｌ−リジンヒドロブロミド）このポリマーを、Ｆｌｕｋａ  ＡＧ（カタログ番号８１３３３；ロット番号３０７９４３／１  ４９７）から購入し、そして、２０，０００Ｄａと３０，０００Ｄａとの間のＭｗ（「低分子量ポリ−Ｌ−リジン」）を有することを表した；
（ｉｉ）（ポリ−Ｌ−リジンヒドロブロミド）このポリマーを、Ｆｌｕｋａ  ＡＧ（カタログ番号８１３５５；ロット番号２９９２９９／１  １０９３）から購入し、そして、１５０，０００Ｄａと３００，０００Ｄａとの間のＭｗ（高分子量ポリ−Ｌ−リジン）を有することを表した。
【０１２９】
（ｉｉｉ）（ポリ（ｌｙｓ、ｔｙｒ）４：１）このポリマーを、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（製品番号Ｐ  ４６５９；ロット番号８１Ｈ５５２０）から購入し、そして、２４，６００Ｄａ（可視）のＭｗおよび１２３の重合程度（可視）を有することを、表した；
（ｉｖ）（ポリ−Ｌ−ヒスチジンヒドロクロリド）このポリマーを、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（製品番号Ｐ  ２５３４；ロット番号１１８Ｈ５９０５）から購入し、そして、１５，８００ＤａのＭｗ（ローアングルレーザー光散乱を使用して）および９１の重合程度（ローアングルレーザー光散乱を使用して）を有することを、表した；
（ｖ）（ポリ−Ｌ−アルギニンヒドロクロリド）このポリマーを、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（製品番号Ｐ  ４６６３；ロット番号８７Ｈ５９０３）から購入し、そして、１１，８００ＤａのＭｗ（可視）および８，４００ＤａのＭｗ（ローアングルレーザー光散乱を使用して）、４３の重合程度（ローアングルレーザー光散乱を使用して）、ならびに１．２５のＭｗ／Ｍｎ（サイズ排除クロマトグラフィーと共に、ローアングルレーザー光散乱を使用して）を有することを、表した；および
（ｖｉ）（ヘキサジメトリンブロミド）このポリマー（１，５−ジメチル−１，５−ジアザウンデカメチレンポリメソブロミド）を、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（製品番号Ｈ  ９２６８；ロット番号５０Ｋ３６７２）から購入した。
【０１３０】
試験した各ポリマーに対して、４０本の１２×７５ｍｍポリプロピレンチューブ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；カタログ番号２４４０）の全てをセットし、そして、各チューブに０．５ｆｍｏｌのプローブを入れ、そして、２０μＭのポリマーもまた、４０μｌのハイブリダイゼーション緩衝液中に溶解させた。ポリマーが存在しないコントロールセットを、４０μｌのハイブリダイゼーション緩衝液中に溶解した０．５ｆｍｏｌのプローブのみを入れた４０本の１２×７５ｍｍポリプロピレンチューブ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；カタログ番号２４４０）中で、試験した。このハイブリダイゼーション緩衝液は、２００ｍＭのコハク酸リチウム（ｐＨ  ５．１）、０．７０Ｍ  ＬｉＣｌおよび０．２％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００で構成される高塩ハイブリダイゼーション緩衝液、または２００ｍＭのコハク酸リチウム（ｐＨ  ５．１）、１００ｍＭのＬｉＣｌおよび０．２％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００で構成される低塩ハイブリダイゼーション緩衝液のいずれかであった。このチューブを、２０チューブずつ２つのグループに分け、そして、全てのチューブを、４０℃または６０℃まで（以下に示すハイブリダイゼーション温度と合わせて）、循環式水浴（Ｌａｕｄａ  Ｄｒ．Ｒ．Ｗｏｂｓｅｒ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ、Ｌａｕｄａ−Ｋｏｅｎｉｇｓｈｏｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ；モデル番号Ｅ１００）において２分間、予熱した。各グループにおけるバックグラウンドのＲＬＵ値を決定するための４つのコントロールチューブの例外と共に、合成ＲＮＡ標的配列を含む、４０μｌのろ過水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ；Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  ＵＦ  Ｐｌｕｓ；カタログ番号ＺＤ５３１１５９５）を、両グループのチューブに添加し、そして、このチューブを手で短時間混合した。各グループの１６個の標的含有チューブ（徐々に濃度を増加させる）中の標的配列の量は、０．０５ｆｍｏｌと同程度まで低量から、１００，０００ｆｍｏｌと同程度まで高量の範囲である。個々のチューブに対する正確な標的配列濃度を、以下の表１および表２に記載する。本実施例中で使用するこの標的配列は、プローブのＲＮＡ相補体である（
【０１３１】
【数２】
2004537263.tif 000004
）。
【０１３２】
標的配列を添加した後、グループ１およびグループ２のチューブを、循環式水浴（Ｌａｕｄａ  Ｄｒ．Ｒ．Ｗｏｂｓｅｒ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ；モデル番号Ｅ１００）中で、４０℃または６０℃まで加熱し、プローブの標的配列へのハイブリダイゼーションを可能にした。インキュベーション時間は、グループ１のチューブに対しては３分で、そして、グループ２のチューブに対しては８分である。ハイブリダイゼーション後、リチウムラウリルスルフェート（ＬＬＳ）を全てのチューブに添加し、プローブからポリマーを解離させた。ＬＬＳの終濃度を、全てのチューブに対して１％（ｗ／ｖ）とした。次いで、このチューブを、約５分間氷浴中に設置し、ハイブリダイゼーション反応を停止した。次いで、Ｄｅｔｅｃｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｉ（０．１４Ｍの亜硫酸ナトリウムおよび０．０４２Ｍのホウ酸ナトリウムを含む）およびＤｅｔｅｃｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＩＩ（１．５Ｍの水酸化ナトリウムおよび０．１２％（ｖ／ｖ）の過酸化ナトリウムを含む）からなる検出剤の自動的注入を備えたＬＥＡＤＥＲ（登録商標）５０照度計（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；カタログ番号３１００）内で全てのチューブを分析した。２つのＤｅｔｅｃｔ  Ｒｅａｇｅｎｔの注入の間に、１２秒の休止を導入した。
【０１３３】
試験したポリマー非存在および各ポリマーについての会合速度を決定するために、会合速度論（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ）の項（前述）において記載した速度定数を計算するための新規な式および方法を、行った。このアプローチに従って、第１工程で、各インキュベーションの期間中で、試験した各標的の濃度についてのＣ０ｔ値、および％ハイブリダイゼーションを決定した。％ハイブリダイゼーションを、ハイブリダイゼーションが完了した高標的濃度で観察されたＲＬＵで、各標的濃度についての正味ＲＬＵを除算することで、決定した。各標的濃度についての正味ＲＬＵを、各標的濃度についての生のＲＬＵから、実施された各試験について、４つのブランクチューブで観察されたバックグラウンドＲＬＵの平均を差し引くことによって、決定した。４０℃、低塩ハイブリダイゼーション緩衝液中で試験した、ポリマー非存在の３分間のインキュベーション、およびポリマー非存在の８分間インキュベーションについてのこれらの各値を、以下の表１および表２中に記載する（６０℃、高塩ハイブリダイゼーション緩衝液中で試験した各ポリマー、ならびにポリマー非存在について決定した値は、表１および表２中に示さない）。次いで、％ハイブリダイゼーションに対するＣ０ｔデータポイントの対数（・）を、グラフ上にプロットし、このグラフを、ポリマー非存在の３分間インキュベーションおよびポリマー非存在の８分間インキュベーションに関して、図１および図２に示す。
【０１３４】
次いで、％ハイブリダイゼーションに対するＣ０ｔの対数について予想されるグラフを、以下の式を使用して計算した％ハイブリダイゼーション値に基づいて、決定した：％ハイブリダイゼーション＝１００（１−Ｋ）（１−ｅｘｐ−（κ１Ｃ０＋κ２）ｔ）、ここで、Ｋ＝κ２／（Ｃ０κ１＋κ２）、ｔ＝時間（秒）、Ｃ０＝ヌクレオチドにおけるポリヌクレオチドの出発濃度（Ｍ）、κ１＝会合速度定数（Ｍ−１ｓ−１）、およびκ２＝解離速度定数（ｓ−１）。未知数であるκ１とκ２に、最初に予想値を代入した。予想したκ１値を、会合速度論（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ）の項（前述）で議論した、従来のＣ０ｔ分析を使用して決定し（例えば、説明したポリマー非存在の試験について、従来のＣ０ｔ分析によって、κ１が１６，０００Ｍ−１ｓ−１であると決定した）そして、κ２の予想値を、常に０とした。実施した各試験についての実測ｔ値、ならびに予想κ１値および予想κ２値を、上記の式に入れた後、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ  ３．０ソフトウェアを使用して、試験した標的濃度の範囲にわたって、％ハイブリダイゼーションおよびＣ０に関する曲線を、作成した。この様式で、ポリマー非存在での３分間のインキュベーションおよび８分間のインキュベーションについて作成した曲線を、図３および図４に示した。ここで、この予想曲線を、実験データからプロットし、そして図１および図２に示すグラフに上書きして示す。各試験についての８分間対３分間で観察される、予想曲線とプロットしたデータポイントとの間のより大きい不一致は、０よりも大きいκ２であることを示した。
【０１３５】
この理由で、曲線プロットソフトフェア（ｃｕｒｖｅ  ｐｌｏｔｔｉｎｇ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、実験データからプロットされたデータポイントが上記の新しい式からプロットされる曲線と一致するまで（図５および図６に示すように）、κ１およびκ２の各値を各試験について調整した。従って、各試験についての最終κ１値および最終κ２値は、両方のインキュベーション時間に対して同一であり、その結果、経時的なポリヌクレオチドの同時解離が、κ１の決定において説明されることを、裏付けた。この様式で決定された速度定数を、試験したポリマーの非存在および各ポリマーについて、以下の表３に記載する。
【０１３６】
【表１】
2004537263.tif 000005
【０１３７】
【表２】
2004537263.tif 000006
【０１３８】
【表３】
2004537263.tif 000007
この実験の結果は、反応混合物中のポリカチオン性ポリマーの存在が、ポリヌクレオチドプローブと完全相補的な標的配列との間のハイブリダイゼーション速度を有意に高め得ることを、立証する。本実験の結果は、この高められたハイブリダイゼーション速度が、ハイブリダイゼーションを促進する条件下（例えば、高塩条件）で、ポリカチオン性ポリマーを使用して達成され得ることを、さらに示す。
【０１３９】
（実施例２）
（プローブと変異体標的配列との間のハイブリダイゼーション速度論に対するポリカチオン性ポリマーの効果）
本実施例は、ポリヌクレオチドプローブおよび変異体標的配列が、塩および温度の異なる組合せ条件下で会合する速度に対して、種々のポリカチオン性ポリマーが有する効果を示す。プローブと合成ＲＮＡ標的配列との間の単一塩基ミスマッチを、このプローブ配列の５’末端から４番目のヌクレオチド位置に導入することは以外は、本実施例において使用される試薬、濃度、時間、条件、チューブおよび機器は、実施例１のものと同一である。本実施例を、実施例１と同一の標的配列を使用すること、および
【０１４０】
【数３】
2004537263.tif 000008
のヌクレオチド塩基配列（アスタリスクは、非ヌクレオチドリンカーの位置を示す）を有するようにプローブを改変することによって、達成した。以下に記載する速度を、上記の実施例１で詳述した様式と同一の様式で、決定した。
【０１４１】
【表４】
2004537263.tif 000009
この実験は、反応混合物中のいくつかのポリカチオン性ポリマーの存在が、ポリヌクレオチドプローブと、単一塩基ミスマッチを有する変異体標的配列との間のハイブリダイゼーション速度を、反応混合物中の異なるサブタイプの検出を可能とするのに十分な程度まで高め得ることを、立証した。ここで、この結果は、ポリ−Ｌ−アルギニンヒドロクロリド（高塩濃度）ポリマーおよびヘキサアジメトリンブロミド（低塩濃度）ポリマーがミスマッチに耐性がある一方、試験した残りのポリマーは、ミスマッチに感受性があることを示した。これらの残りのポリマーの感受性は、この残りのポリマーが、単一塩基ミスマッチの識別を可能にする時間と同じ時間、プローブとその相補的配列との間の会合速度を高めるということを、示唆する。
【０１４２】
本発明を、特定の好ましい実施形態を参照して、かなり詳細に記載し、そして示したが、当業者は、本発明の他の実施形態を容易に理解する。従って、本発明は、以下に添付した特許請求の範囲の意図および範囲内に含まれるすべての改変およびバリエーションを含むとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、３分間のインキュベーション期間を有する反応の速度を決定するために使用された標的の濃度の範囲についての、ハイブリダイゼーションのパーセント対Ｃ０ｔのｌｏｇのプロットであり、ここで、各（●）は、実験データ由来のデータ点を表す。
【図２】
図２は、８分間のインキュベーション期間を有する反応の速度を決定するために使用された標的の濃度の範囲についての、ハイブリダイゼーションのパーセント対Ｃ０ｔのｌｏｇのプロットであり、ここで、各（●）は、実験データ由来のデータ点を表す。
【図３】
図３は、実験データ由来であり、そして図１で描かれた、プロットされたデータ点（●）の上に重ねあわされた、予測されるハイブリダイゼーションのパーセント対Ｃ０ｔのｌｏｇ曲線のプロットである（ここで、推定の会合速度定数（ｋ１）は、１６，０００Ｍ−１および推定の解離速度定数（ｋ２）は、０である）。
【図４】
図４は、実験データ由来であり、そして図２で描かれた、プロットされたデータ点（●）の上に重ねあわされた、予測されるハイブリダイゼーションのパーセント対Ｃ０ｔのｌｏｇ曲線のプロットである（ここで、推定の会合速度定数ｋ１は、１６，０００Ｍ−１および推定の解離速度定数ｋ２は、０である）。
【図５】
図５は、図３の予測曲線および図１のデータ点（●）が一致するような、ｋ１およびｋ２の調整（ｋ１＝１４，５００Ｍ−１ｓ−１およびｋ２＝８．３３×１０−４ｓ−１）を図示する。調整されたｋ１およびｋ２は、この反応の真の速度のより精密な近似を提供するはずである。
【図６】
図６は、図４の予測曲線および図２のデータ点（●）が一致するような、ｋ１およびｋ２の調整（ｋ１＝１４，５００Ｍ−１ｓ−１およびｋ２＝８．３３×１０−４ｓ−１）を図示する。調整されたｋ１およびｋ２は、この反応の真の速度のより精密な近似を提供するはずである。
【図７】
図７は、ポリマーを伴う（◆）およびポリマーを伴わない（△）標的の濃度の範囲についての、ハイブリダイゼーションのパーセント対Ｃ０ｔのｌｏｇのプロットであり、ここで、各（◆）および（△）は、実験データ由来のデータ点を表す。
【図１】
2004537263.tif 000010
【図２】
2004537263.tif 000011
【図３】
2004537263.tif 000012
【図４】
2004537263.tif 000013
【図５】
2004537263.tif 000014
【図６】
2004537263.tif 000015
【図７】
2004537263.tif 000016
【国際公開パンフレット】
2004537263.tif 000017
2004537263.tif 000018
2004537263.tif 000019
2004537263.tif 000020
2004537263.tif 000021
2004537263.tif 000022
2004537263.tif 000023
2004537263.tif 000024
2004537263.tif 000025
2004537263.tif 000026
2004537263.tif 000027
2004537263.tif 000028
2004537263.tif 000029
2004537263.tif 000030
2004537263.tif 000031
2004537263.tif 000032
2004537263.tif 000033
2004537263.tif 000034
2004537263.tif 000035
2004537263.tif 000036
2004537263.tif 000037
2004537263.tif 000038
2004537263.tif 000039
2004537263.tif 000040
2004537263.tif 000041
2004537263.tif 000042
2004537263.tif 000043
2004537263.tif 000044
2004537263.tif 000045
2004537263.tif 000046
2004537263.tif 000047
2004537263.tif 000048
2004537263.tif 000049
2004537263.tif 000050
2004537263.tif 000051
2004537263.tif 000052
2004537263.tif 000053
2004537263.tif 000054
2004537263.tif 000055
2004537263.tif 000056
2004537263.tif 000057
2004537263.tif 000058
2004537263.tif 000059
2004537263.tif 000060
2004537263.tif 000061
2004537263.tif 000062
2004537263.tif 000063
2004537263.tif 000064
2004537263.tif 000065
2004537263.tif 000066
2004537263.tif 000067
2004537263.tif 000068
2004537263.tif 000069
2004537263.tif 000070
2004537263.tif 000071
2004537263.tif 000072
2004537263.tif 000073
2004537263.tif 000074
2004537263.tif 000075
2004537263.tif 000076
2004537263.tif 000077
2004537263.tif 000078
2004537263.tif 000079
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004537263.tif 000080
【国際調査報告】
2004537263.tif 000081
2004537263.tif 000082
2004537263.tif 000083
2004537263.tif 000084