(57)【要約】本発明はバイオ活性化学組成に、より特にはタンパクに関連し、そして、医学、獣医と細胞生物学に使われることができる。この発明されたグリコプロテインは、異なる器官、血清と本脊椎動物（ヒトやアニマル）の胆汁からとられる組織の細胞間隙から、等電点電気泳動の助けを借りて抽出される。前記グリコプロテインは、１０−１２から１０−２９ ｍｏｌ／ｌｉｔｅｒ以下の範囲の濃度での極端な低用量において高い生物活性を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる器官、血清とヒトとアニマルの胆汁からとられる組織の細胞間隙から等電点電気泳動の助けを借りて抽出され、硫酸アンモニウムの飽和（１００％）溶液に可溶で、１０−４５кДаの明らかな分子量を有していて、１０−１２から１０−２９ ｍｏｌ／ｌｉｔｅｒへの極端な低用量で生物活性を有している、グリコプロテイン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（説明）
本発明は、予備的で技術的な生化学に関連し、バイオ活性化学組成を得ることを示すものである。本発明は、細胞生物学、医学と獣医において使用することができる。
【０００２】
（従来技術レベル）
グリコプロテインはタンパク部分を含んでいる複合タンパク質と非タンパク成分（有機であるか無機の）であり、そして、これは共有結合、ヘテロ陰陽または同等にポリペプチド鎖と結合されることができ、そしてアミノ酸と共に水解物に存在する。グリコプロテインの補綴部分は、中性サッカライド（ガラクトース、マンノースとフコース）によってまたはアミノ・サッカライド（Ｎ‐アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミンまたは単糖の酸性誘導体）によって示すことができる（（Ｈ．−Ｄ． Ｊａｃｕｂｋｅ， Ｘ． Ａｓｈｋｉｔｅ ”Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ， ｐｅｐｔｉｄｅｓ， ｐｒｏｔｅｉｎｓ” Ｍｏｓｃｏｗ， Ｍｉｒ １９８５ ｐ．３４５）（「アミノ酸、ペプチド、タンパク」モスクワ、ミール１９８５ｐ． ３４５））．
グリコプロテインは、自然界に広く広がっている。血清（免疫グロブリン、トランスフェリン、その他）の主成分、血液の基物質、異なるウィルス（風邪、はしか、その他）の抗原、いくつかのホルモン、レクチン、酵素、その他は、グリコプロテインに属している。
【０００３】
レクチンは、グリコプロテインの大きな分類群を示している。それらの分子のタンパク部はセリンの非共存によって特徴づけられ、そしてスレオニンは残存し、それはポリペプチド鎖とレクチンの分子の炭水化物成分の結合を実行する。レクチンでの炭水化物（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ）の平均含量は、およそ５％となる。炭水化物の組成は、基本的にガラクトース、マンノース、フコースそしてＮ‐アセチルグルコサミンの残存に制限される。Ｈ．−Ｄ． Ｊａｃｕｂｋｅ、Ｘ． Ａｓｈｋｉｔｅ ”Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ， ｐｅｐｔｉｄｅｓ， ｐｒｏｔｅｉｎｓ” Ｍｏｓｃｏｗ， Ｍｉｒ １９８５ ｐ． ４２８−４２９）「アミノ酸、ペプチド、タンパク」モスクワ、ミール１９８５のｐ４２８−４２９）。
【０００４】
（既存方法の説明）
免疫抑制薬機能をもつグリコプロテインは、ＧＢ ２０７８２２９、１９８２で知られている。グリコプロテインは、ヒトまたは温血動物からとられる血清または腹水の流体の等電点電気泳動とрН区間２．６−３．６の等電点（рＩ）での引き続く画分選抜の助けを借りて得られる。このグリコプロテインは、異物反応を抑制するために移植を受けた患者に使用される。
【０００５】
特許ＧＢ ２０９５２６０、１９８２によると、生理活性物質−分子量３０００−５０００をもつグリコプロテイン−が受けられる。それは、相同と異種細胞においてトキソプラズマの増殖を抑制する能力を持つ。
【０００６】
抗癌作用によるグリコプロテインは、特許ＧＢ ２１１７３８５、１９８２で知られている。このグリコプロテインの分子量は、７０００−９００００である；サッカライド含量は、８−４５％であり６−２８％のヘキソース、１−１１％のヘキソサミン、そして１−６％シアル酸を含む。それは、４０℃のрН＝２．０、７．０または１１．０の水溶液で２４時間以上、そして、６０℃のрН＝７．０の水溶液で３時間以上安定している 。このグリコプロテインは、正常細胞に影響を及ぼすことなく、選択的に癌細胞に影響を及ぼす。
【０００７】
免疫学的なグリコプロテインは、特許СН６３４３３４、１９８３で知られている。それは、タンパク部８９±４％、糖部分１１．１±２．２％、ヘキソース５．３±１．１％、ヘキソサミンのＮ−アセチル残基２．８±０．５％、そしてノイラミン酸のＮ−アセチル残基２．９±０．５％を含む。このグリコプロテインの分子量は３２０００±６０００；рＩ＝４．３±０．３；沈降因子はＳ２０ｎ＝３．２±０．３である。
【０００８】
分子量１２．５кДаの血清グリコプロテインは、特許ＲＵ ２１３６６９５、１９９９で知られている。それは、低用量で生物学的に活性で、約５０％の炭水化物の残存を含む。等電点は、рН区間４．６から４．７にある。
【０００９】
新規のグリコプロテインは、特許ЕР０００１３４（１９７８）で知られている。それは、α−アミノ酸７５±６ ％、糖部分２４．６±５．２％、ヘキソサン２．９±２％、ヘキソサミンのＮ−アセチル残基７．１±１．５％、フコース０．２±０．２％、そして、ノイラミン酸のＮ−アセチル残基８．４±１．５％を含む。このグリコプロテインの分子量は６５０００±１００００、рＩ＝３．４±０．４である。
【００１０】
分子量５６кДаの均質グリコプロテインは、ＦＶＯとＣｅｎｅｖａ Ｐ．熱帯熱原虫（Ｃｅｎｅｖａ Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）から抽出され研究された。その等電点は、рН５．５である。このグリコプロテインは、糖部分にＮ−アセチルガラクトサミンとマンノースを含む（特許のＵＳ ４８３５２５９、ｃｌ．С０７К１５／１５、１９８９）。
【００１１】
この与えられた発明に最も近いものは、分子量５−３００кДа、等電点がрН区間２．５から５．０、タンパクと糖部分のウェイトレーシオ５０：５０−８０：２０、糖部分にフコース、リボース、アラビノース、キシロース、マンノース、ガラクトース、グルコースとグルコサミンの残りと、そして、タンパク部にアスパラギンとグルタミン酸の残り、スレオニン、セリン、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、シスタチオニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニールアラニン、トリプトファン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、アルギニン、を含んだグリコプロテインである。（ＵＳ ４６８３４３８、ｃｌ．０７К１５／１４、１９８７）。
【００１２】
（発明の概要）
このように、本発明は極端な低用量で生物学的活性を有しているグリコプロテインに関連し、医学と医薬品工業で使用することができる。
【００１３】
一方、本発明は、極端な低用量とその適用法で生物活性を伴うグリコプロテインを得ること及び薬の製法の適用に関連する。
【００１４】
このように、発明の技術的タスクは、極端な低用量（１０−１２、１０−２９のモル／リットル（ｍｏｌ／ｌｉｔｅｒ）以下）で、生物学的活性を有するグリコプロテインを得ることである。
【００１５】
この特定された技術的結果は新規のグリコプロテインによって達成される。そして、それは細胞間隙、血清、胆汁と脊椎動物（ヒトとアニマル）の異なる器官からとられる組織から等電点電気泳動の助けを借りて抽出される。それらは、飽和した（１００％）硫酸アンモニウムの溶液に可溶である；それらの明らかな分子量は１０−４５кДаである、そして、それらは極端な低用量で生物活性を有する。１０−１２−１０−１８モル／リットル（ｍｏｌ／ｌｉｔｅｒ）の濃度のグリコプロテインの溶液は、複数の凍結−そして−解凍で、そして、そのうえ、１００℃で１０分間の加温の後、完全に生物活性を維持する。
【００１６】
グリコプロテインの分子量は、Ｌｅｍｌｙの方法（技術が適用されるのを見る）によりПААГにドデシル硫酸ナトリウムを伴った電気泳動方法の助けを借りて評価された。分子量マーカーとして、ＬＫＢ社（ＬＫＢ Ｃｏｍｐａｎｙ）で製作されたセットが利用された。それは、９４кДаから１４．４кДаまで分子量を持つ６つのタンパクを含んだ。рН区間４．６５−５．１（ＳＧ）にあるрＩで、血清からとられるグリコプロテインの明らかとなった分子量は、ПААГ−ｐｈｏｒｅｓｉｓによれば３５−３７кДаであり、そして、ゲル（クロマトグラフィー）のデータによれば２５−２７のкДаであった。肝臓（рН区間６．８−７．２のрＩ）（ＮＧＬ）からとられる中性のグリコプロテインの明らかとなった分子量は、対応して１５кДаと２２кДаであった。肝臓（ＡＧＬ）からとられる酸性糖タンパク質に関する限り、その明らかな分子量はゲル−濾過法だけによって決定され、そして、１７кДаに等しかった。（酸性糖タンパク質画分が塗られることができなかったので、ПААГ−電気泳動方法によって分子量を定めることは不可能だった。）
ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動のために、鉛直の電気泳動АВГЭ−１（Ｈｉｍｉｆｉｌ（ＵＳＳＲ））のための装置が使われた。Ｌｅｍｌｙの方法によって、デタージェント（ДДС−Ｎａ）添加で条件変性が適用された。ゲルの厚さは０．７５ｍｍであり、大きさは１１５ｘ１１５ｍｍであった、そして、ストリップの最大の量は１３であった。
【００１７】
分離ゲル（１２．５％）は、以下の成分から調製された：蒸留水（６．７ｍｌ）、рН８．８（５．０ｍｌ）による１．５Мトリス−ＨＣｌ、ДДС−Ｎａ（０．２ｍｌ）の１０％の溶液、アクリルアミド／Ｎ’Ｎ’−ビス−メチレン・アクリルアミド（８．０ｍｌ）の３０％の溶液、ＴＥＭＥＤ（１０ｍｃｌ）、過硫酸アンモニウム（１００ｍｃｌ）の１０％の溶液。
【００１８】
ゲル濃縮（４％）は、以下の成分から調製された：蒸留水（６．１ｍｌ）、рН６．８（２．５ｍｌ）による０．５Мトリス−ＨＣｌ、ДДС−Ｎａ（０．１ｍｌ）の１０％の溶液、アクリルアミド／Ｎ’Ｎ’−ビス−メチレン・アクリルアミド（１．３ｍｌ）の３０％の溶液、ＴＥＭＥＤ（１０ｍｃｌ）、過硫酸アンモニウム（５０ｍｃｌ）の１０％の溶液。
【００１９】
電極バッファー：рН８．３と０．１％のДДС−Ｎａによるトリス−グリシン。凍結された乾燥試料は、以下の溶液に溶解された（約０．１ｍｇ／ｍｌ）：蒸留水（４．０ｍｌ）、рН６．８（１．０ｍｌ）による０．５Ｍのトリス−ＨＣｌ、グリセリン（０．８ｍｌ）、ДДС−Ｎａ（１．６ｍｌ）の１０％の溶液、２−メルカプトエタノール（０．４ｍｌ）、ブロモフェノール濃青色（０．２ｍｌ）の０．０５％の溶液。それから、ゲルに適用する前に、サンプルは１００℃で３−５分間培養された。１０−１５ｍｃｌの試料は、１つのストリップに適用された。電気泳動は、２００Ｖの一定電圧で実行された。濃縮するゲルが通されたとき、１００Ｖの電圧が適用された。
【００２０】
分子量マーカーとして、ＬＫＢ社によって製作されたセットが利用された。それは、ホスホリラーゼｂ（９４кДа）、ウシ血清アルブミン（６７кДа）、ニワトリ卵アルブミン（４５кДа）、カルボニックアンヒドラーゼ（３０кДа）、トリプシン（２０кДа）のダイズ・インヒビターとニワトリ・リソチーム（１４．４кДа）を含んだ。
【００２１】
ゲルの塗布は、コロイド銀の助けを借りてまたはＫｕｍａｓｓｙステインＧ−２５０によって実行された。コロイド銀による塗布のために、ゲルはあらかじめ蒸留水に、それから５％のエチルアルコールと５％の酢酸をもつ水溶液に、少なくとも３時間洗い落とされた。それから、ゲルはすばやく（５分間）蒸留水で洗い流されて、グルタル・アルデヒドの１０％溶液に注ぎ込まれた。反応していないグルタル・アルデヒドは、３から５回の洗浄（各３０分長）の間ですすぎ落とされた。その後、ゲルは３０分の間のｄｉｔｈｉｏｔｒｅｉｔｏｌ溶液（５ｍｇ／ｌ）に培養されて、それから水で完全にすすがれた。洗浄されたゲルは、３０分の間ＡｇＮＯ３溶液（０．１ｇ／ｌ）に置かれ、それから再び完全に水ですすがれ、その後はっきりしたストリップが発生する前に顕色剤に置かれた。顕色剤は、３％の水性Ｎａ２СОз （１００ｍｌのホルマリン／溶液の５０−１００ｍｃｌ）にホルマリンの３７％溶液であった。現像の中断のために、クエン酸の３−５ ｍｌが加えられた。ＫｕｍａｓｓｙステインＧ−２５０による塗布が行われたとき、ゲルは以下の混合液で固定された：トリクロロ酢酸／メタノール／水（１０：４０：５０）。塗布は、３．５％の過塩素酸にＫｕｍａｓｓｙステインＧ−２５０の０．０４％の溶液で行われた。
【００２２】
通常、青色銅タンパク質ストリップは、５分で現れる。バックグラウンド・ステインを減らすために、ゲルは１−３時間酢酸／メタノール／水（１０：４０：５０）の溶液に置くことができる。
【００２３】
ゲル−浸透ВЭЖХ方法の助けによるグリコプロテインの分子量は、カラムＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷ（３００х７．５ｍｍ）で決定された。溶出は、рН＝７で１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４によって行われた。較正のために、以下の証拠用タンパクが使われた：オボトランスフェリン（７８кДа）、ウシ血清アルブミン（６７кДа）、ニワトリ卵アルブミン（４５кДа）、カルボニックアンヒドラーゼ（３０кДа）、トリプシン（２０кДа）のダイズ・インヒビター、ミオグロビン（１７．２кДа）とニワトリ・リソチーム（１４．３кДа）。
【００２４】
これらの製法は、Ｓｅｒｖａ社（ドイツ）とＳｉｇｍａ社（ＵＳＡ）によって製作された。また、本発明中で、アミンの酸性組成とグリコプロテインの炭水化物組成とグリコシレーションの存在が決定された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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