(57)【要約】本発明は、少なくとも１つのサンプル入口を入口側に有し、電気泳動処理されたサンプル種の出口（９）を出口側に有する分離チャンバを備えた電気泳動装置に関する。分離チャンバは、特定のサンプル種に対して選択的に透過性を有するとともに入口から出口側まで長手方向に延びる連続した内部空間、特に中空ファイバを有する少なくとも１つの分離素子（２）によって２つのチャンバ部（７、８）に分割されている。電極（４）は、分離チャンバの両側に、分離素子と平行に配置されている。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
入口側に少なくとも１つのサンプル入口を有するとともに、出口側に電気泳動処理されたサンプル種の出口を有する分離チャンバと、
あるサンプル種に対して選択的に透過性を有し、長手方向に延びた連続する内部中空空間を有するとともに、前記分離チャンバ内に前記入口側から前記出口側まで配置されて前記分離チャンバを２つのチャンバ部に分割する少なくとも１つの分離素子と、
前記分離チャンバの両側に、前記分離素子と平行に配置された電極と
を備えることを特徴とする電気泳動装置。
【請求項２】
前記分離素子は中空ファイバであることを特徴とする請求項１に記載の電気泳動装置。
【請求項３】
前記分離素子は中空チャンバを形成する合成樹脂平膜からなり、前記膜は前記分離チャンバの内面に接着されていることを特徴とする請求項１に記載の電気泳動装置。
【請求項４】
前記分離素子は、前記分離チャンバの内面の溝型凹部と、対向する前記分離チャンバの遮断装置とからなり、前記分離チャンバと前記溝型凹部との間には導入及び放出用の穴が設けられ、前記穴は平膜により覆われていることを特徴とする請求項１に記載の電気泳動装置。
【請求項５】
前記サンプル入口は、前記分離素子の内部中空空間に通じていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の電気泳動装置。
【請求項６】
前記サンプル入口は、前記分離チャンバの一部に通じていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の電気泳動装置。
【請求項７】
前記分離チャンバ内で同時多重電気泳動を行うため、複数の分離素子が互いに平行に配置されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の電気泳動装置。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の電気泳動装置を用いる電気泳動方法であって、前記電極に直流電圧を印加し、周期的に断続することを特徴とする電気泳動方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の電気泳動装置を用いる電気泳動方法であって、周期的に極性が反転される直流電圧を前記電極に印加し、前記直流電圧の極性がアクティブ電気泳動中の前記直流電圧の極性とは反対である時間が、アクティブ電気泳動中の前記直流電圧の極性の時間よりも短いことを特徴とする電気泳動方法。
【請求項１０】
前記中空ファイバの内部圧力を、周囲の外部空間に比べて、周期的に変化させることを特徴とする請求項９に記載の電気泳動方法。
【請求項１１】
温度を、分離チャンバ内の温度勾配が出来るだけ小さくなる方向に制御することを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１項に記載の電気泳動方法。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の電気泳動装置の免疫抽出への使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、電気泳動装置、電気泳動装置を用いる電気泳動方法、及び電気泳動装置の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
サンプル物質を液相と固相との界面において個々のサンプル種に分別する電気泳動装置及び電気泳動分離方法が知られている。
【０００３】
これと似た分離方法、具体的には加圧濾過は、既に産業界で広範に用いられており、生体高分子の分離に広く用いられている。一方、電気泳動分離、即ちいわゆる電気泳動濾過処理、または簡単に言えば電気濾過は、加圧濾過と異なり、対応する電気泳動装置の分離チャンバ内に備えられた分離膜を介する電気泳動移動の際に、サンプル全量ではなくイオン種だけを移送すれば良いうえに溶媒の全量を移送する必要がないため、特に有利であると思われる。にも拘わらず、この処理が用いられることは、概して稀である。電気濾過処理があまり用いられない理由は、特にこの処理による生体高分子の分離中に、とりわけ生体高分子の不可逆吸着及び変性によると思われる問題が起きるためであり、電気泳動処理中に発生する熱の最適な放熱と、固相すなわち分離膜の材料の分離性能の変化という技術的な問題が、電気濾過への制約となる。
【０００４】
液相と固相すなわち分離膜との界面における不可逆吸着は、生体適合性合成樹脂膜を用いることで大いに削減できるものの、分離対象となる生体高分子との長時間の接触による膜の分離特性の変化（これを「ファウリング」と呼ぶ）を防止することは、今までのところ不可能であった。
【０００５】
電気濾過を使用した際にこの分離処理特有の発熱によって生ずる問題により、実際には、この処理の適用範囲と量的スループットはともに加圧濾過に比べて決定的に制限される。分離膜の材料内において更なる発熱が起きてしまった場合、特有の分離特性は著しく変化し、結果として過熱によって材料が破壊されることもある。
【０００６】
また、キャリアレス電気泳動またはフリーフロー電気泳動（ＦＦＥ：Ｆｒｅｅ  Ｆｌｏｗ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）と呼ばれる、水溶液中の生体粒子を分離する電気泳動分離方法、及び対応する電気泳動分離装置が知られている。この水溶液中の生体粒子の電気泳動分離においては、分離中及び分離後の生体粒子の活性を維持するために、高い導電率を有する媒体を用いる必要がある。このため、分離チャンバから最も適切に熱を取り除くという課題を解決することがとりわけ必要であるが、それは、分離チャンバ内の温度上昇によって分離性能が大幅に劣化するからである。このことは、最適化を行うためには、分離チャンバギャップの各点における温度勾配及び分離スペース内の異なる点における温度差を最小化する必要があることを意味する。ＦＦＥの分離性能を向上するには、生体粒子の分離をできるだけ高い電界強度で行う必要もあるが、この場合、媒体の高導電率に起因して、分離処理中に放出される処理熱が過度に増加してしまう。
【０００７】
生体粒子を分離するための市販の電気泳動装置は、ＦＦＥ処理に基づいて動作するため、これまでは、一方では所望の分離性能に必要な電界強度を用いると同時に、できるだけ小さな分離チャンバギャップを選択することで処理熱を最も適切に取り除くように最適化されていた。
【０００８】
また、ドイツ特許第６９０２９４６６Ｔ２号公報から、冷媒を通すのに用いられる長手方向の中空ファイバを備えた電気泳動装置が知られている。
【０００９】
【特許文献１】
ドイツ特許公報第６９０２９４６６Ｔ２号公報
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
これに対して、本発明の目的は、高速で動作する高性能電気泳動装置を作成することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明では、この目的を、請求項１に記載の設計により達成する。
本発明に係る電気泳動装置は、電気濾過とＦＦＥとの組み合わせ処理に応じて動作することで、高速での電気濾過処理を可能にするとともに過熱による分離性能の変化や膜材料の破壊を防止する最適なＦＦＥ分離処理の境界条件で電気濾過を行う。
本発明に係る電気泳動装置の特に好適な改良及び実施形態が、請求項２〜７の主題である。
本発明に係る電気泳動装置を用いる電気泳動方法が、請求項８〜１２の主題である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の特に好適な実施例を、対応する図面を用いて更に詳細に説明する。
図１に示す本発明の電気泳動装置の実施例は、水平に配置されたＦＦＥ分離チャンバであって、合成樹脂ブロック１と絶縁カバーを有する金属ブロック３との間に例えば０．３〜１ｍｍの小さなギャップ幅を有する。分離チャンバは、入口側に、少なくとも１つのサンプル口といくつかの媒体口５とを有し、出口側に、電気泳動処理されたサンプル種のためのいくつかの出口９を有する。
【００１３】
分離チャンバ内には、中空ファイバ２が入口側から出口側まで延びており、分離チャンバを２つの分離チャンバ部７及び８に分割している。電極４は、分離チャンバの両側に入口側から出口側まで中空ファイバ３と平行に配置されている。電極に印加する直流電圧の極性を適切に調整することで、分離チャンバ部７は陰イオン種の分離スペースとなり、分離チャンバ部８は陽イオン種の分離スペースとなる。電極電圧を、種の移動経路が分離を行うのに十分なだけ短くなるように選択するのが好ましい。
【００１４】
中空ファイバ２は、入口と出口とを備え、内部に入口から出口へと通じる連続中空空間を有する。図１に示すように、中空ファイバ２は、分離した種の出口９を超えて長手方向に延びている。
【００１５】
使用する中空ファイバ２は、分離チャンバに導入される前は、分離チャンバスペーサの幅よりもかなり大きな外径を有する。中空ファイバ２の壁厚の値は、分離チャンバギャップの幅の１／２よりもはるかに小さい。中空ファイバ２を分離チャンバに導入する際は、中空ファイバ２を平らにして、内部断面が円形から楕円形になるようにし、且つ分離対象サンプル物質の通過を妨げないようにする。
【００１６】
中空ファイバ２は、電気泳動分離チャンバ内で電極４に平行に配置されて、図１に示す電気泳動装置に塩を溶解した水溶液を供給するとともに直流電圧を電極４に印加した際に、中空ファイバ２の外部及び内部の液体内のイオン種が電極に向かって移動するようにする。使用する塩の陰イオン及び陽イオン種は、水溶液中を液相から中空ファイバ２を介して電極４に向かって移動する。溶解したイオン高分子は、電気泳動移動の間に中空ファイバ２と水溶液との界面に達し、中空ファイバ２の孔径がイオン高分子の大きさ又は分子量に比べて十分に小さい場合には、この界面に保持される。この高分子種の保持は、中空ファイバ２の外側の水溶液中及び中空ファイバ２の内部中空空間内でも同様に行われる。中空ファイバ２の材料及び孔径は、当該用途すなわち処理対象サンプルによって異なり、それに応じて選択される。位置、すなわち分離チャンバ内での中空ファイバ２の正しい配置もまた、所期の物質の分離の関数として選択される。例えば、中空ファイバ２の界面における検体の保持が可能であるのは、サンプルの添加の後に中空ファイバに向かう移動が起きる場合だけである。
【００１７】
図１に示す電気泳動装置は様々な用途、特に、ＦＦＥ条件下におけるＦＦＥ分離処理を伴わない電気濾過や、両分離処理の能力を利用して最適化された２段分離や、複雑なサンプル調整を省略するか少なくとも簡略化するためのサンプル導入手段としての電気濾過や、電気濾過における選択性の高い電気泳動操作すなわち免疫抽出に用いることができる。
【００１８】
電気濾過の場合、電気濾過の分別対象であるサンプルは、それぞれ図３及び図４に示すように、中空ファイバ２の内部中空空間を介して、又は一方の電極４と中空ファイバ２との隙間に導入することができる。但し、サンプルを一方の電極４と中空ファイバ２との隙間に添加する場合、この添加を必ず正しい側で行う必要がある。というのは、高分子物質が中空ファイバ２に向かって移動する場合にのみ、液相と中空ファイバ２との界面での保持が起こり得るからである。
【００１９】
図３は、中空ファイバ２の内部中空空間へのサンプルの添加を示し、３つの検体の経路を１０、１１、１２で表す。特に、検体１１が中空ファイバ２内に残留することが分かる。
【００２０】
図４でも、中空ファイバ２と一方の電極４との隙間にあるサンプル計量位置１３から発する検体の経路を、１０、１１、１２で表す。この種の用途の場合、検体１１は結果として外面、すなわち液相と固相との界面に保持される。
【００２１】
もし中空ファイバ２内の媒体が、中空ファイバ２の外側の媒体とは異なる塩及び異なる塩濃度を有する場合、中空ファイバ２内の本来の塩が中空ファイバの外側の塩で置換され、及び／又は、濃度が平均される。このことも、サンプル調整と呼ぶ。
【００２２】
こうして調整されたサンプルは、後続の独立した処理によって分離すると、中空ファイバ２の内部中空空間から溶出される。このために、中空ファイバ２の孔径を、中空ファイバ２内部の当該イオン検体を保持するのに十分なだけ小さくなるように選択する。
【００２３】
サンプル調製とＦＦＥによる電気泳動分離とを同時に行いたい場合、分離対象検体を中空ファイバ２の内部中空空間から分離チャンバに搬送可能な孔径の中空ファイバ２を用いる必要がある。
【００２４】
分離チャンバ内に形成される急峻な界面を介して、２つの水溶液間でイオン種の抽出を行うことも可能であるが、このことが可能であるのは、この物質移送用の界面を形成する媒体の流動学的性質が似ているとともに、隣接する媒体が分離チャンバ内を等しい線速度で移動できる場合だけである。但し、多くの場合、こうした境界条件は満たされない。中空ファイバ２を用いて媒体を添加する場合、中空ファイバ２の内側及び外側の媒体を異なる線速度で移動できるため、密度、粘度、表面張力、導電率など、物理的及び化学的性質が極端に異なる媒体を用いることも可能である。
【００２５】
ちなみに、物質移動及び／又は抽出対象イオン種の移動の方向は、ほぼ任意に選択できるが、この点に関する可能性は、図３及び図４に示すとともに上に説明済みである。このことは、中空ファイバ２と一方の電極４との隙間に向かって、中空ファイバ２に沿って物質を移動できることを意味する。
【００２６】
図１に示す電気泳動装置の更なる応用例は、図５に示すいわゆる免疫抽出である。この応用例では、形成すべき免疫複合体の成分を、中空ファイバ２内の媒体に所望の濃度で溶解する。この成分の分子量及び／又は中空ファイバ２の分離界面を、この成分が電気泳動条件下においても中空ファイバ２の内部中空空間内に残留するように選択する。これにより、図５に詳細に示すように、検体１０は中空ファイバ２内に免疫複合体として保持され、検体１１は中空ファイバ２の外壁に保持され、検体１２は中空ファイバ２と一方の電極４との隙間に示した経路を通る。
【００２７】
電気泳動とＦＦＥとを組み合わせた用途の場合、他のＦＦＥ分離では前もって必要となることが多かったサンプルの調製を省略でき、このようにして、正常な分離及び／又は所望のサンプルスループットへの悪影響や減少をもたらすサンプルの希釈を防ぐことができる。そもそもＦＦＥには適さないサンプルの導入を、中空ファイバ２を介して分離チャンバ内へ図３に示す方法で行うことにより、ＦＥＥの応用分野が広がり、通常の使用におけるサンプルの調製と装置の操作が簡略化されるとともに、全分離処理を自動化する可能性が高くなる。
【００２８】
全てのＦＦＥ分離技術、すなわちＦＦゾーン電気泳動、ＦＦ等速電気泳動、ＦＦ等電フォーカシング法及びＦＦフィールドジャンプ電気泳動を、電気濾過処理と組み合わせることが可能である。この点に関しては、フォーカシングＦＦ分離技術との組み合わせが特に有利である。
【００２９】
特に、ＦＦフィールドジャンプ電気泳動による分離技術と電気濾過とを組み合わせることで、並行同時多重処理で分離を行ってサンプルスループットの増大することができる。この三重並行同時多重処理としての組み合わせを、図６に示す。ここでは、媒体の界面６（イオン検体の濃縮）及び導電率プロファイル７を示す。
【００３０】
電気濾過と、ＦＦ等電フォーカシング法及びＦＦ等速電気泳動によるフォーカシングＦＦＥ分離技術とを組み合わせることで、上述の組み合わせよりも更に良好な分離性能が得られる。但し、分離チャンバ内での同時並行処理は不可能である。
【００３１】
図７に、電気濾過とＦＦ等電フォーカシング法による分離技術との組み合わせを示す。これにより、図３及び図４で既に示したように、分離対象物質を中空ファイバ２から中空ファイバ２と電極４との隙間へ、又はこの隙間から中空ファイバ２内へ移動させることができる。検体の経路を１０及び１２で表す。検体１１は中空ファイバ２内に残留する。
【００３２】
図８Ｂ及び図８Ｃに、中空ファイバ２の配置（比較のため、図８Ａに再掲する）に関する代替デザインを示す。ここで、陰イオン及び陽イオンの移動を１４及び１５で表す。
【００３３】
図８Ｂに示す実施例では、平膜１６が、ブロック１又は３の内面、好ましくは合成樹脂ブロック１の内面に、合成樹脂ブロック１の内面と平膜１６との間に中空空間を形成するように接着されている。この中空空間の高さは、分離チャンバギャップの幅よりも大きい。結果として、平膜１６は、図８Ａに示す実施例における中空ファイバ２と同様に分離チャンバを分割する。
【００３４】
平膜１６の中空空間への又は中空空間からの媒体の導入及び放出は、この場合、合成樹脂ブロック１の穴を介して行われる。
【００３５】
図８Ｃに示す実施例では、事前に製造された中空ファイバ２に代えて、溝型凹部１９が望ましくは合成樹脂ブロック１の内面に形成されており、導入及び放出用の穴が平膜で覆われている。このようにして形成した流路に、分離対象サンプルを充填する。物質の電気泳動移送は、分離チャンバ内の平膜上のフロー移動止め１８により偏向されて平膜及び合成樹脂ブロック１の凹部１９を通過するため、イオン種は凹部１９から平膜を介して分離チャンバへと運ばれる。必要に応じて、凹部１９の液体の温度を外部冷却によって安定化してもよい。
【００３６】
既に初めに述べた通り、加圧濾過の間、フィルタ膜の透過性は濾過の時間が長くなるのに伴って減少し、それが速いほど、濾過対象溶液中の高分子の濃度が高いことになる。このフィルタ膜の透過性の減少を膜のファウリングと呼ぶ。
【００３７】
一方、電気濾過の場合、サンプルの全量ではなくサンプル中のイオン種だけを分離膜に向かって搬送するため、ファウリングはそれほど重要ではない。しかし、長時間に渡る濾過の間に分離膜上に保持すべきイオン高分子種の濃度が高い場合、ファウリングの影響は無視できなくなる。
【００３８】
加圧濾過の場合には、クロスフロー濾過がファウリングを減らす適切な対策として知られている。一方、電気濾過の場合、クロスフローは中空ファイバ内のサンプルの流量によって実現されるが、流量はファウリングの低減にではなく、膜を介した物質移動に関して最適化されている。すなわち、このことは、電気濾過中のクロスフローが、ファウリングを効果的に低減または除去するのには適していないことを意味する。
【００３９】
ファウリングの低減策には、濾過対象溶液のｐＨを選択して、高分子の帯電を低減することも含まれる。両性の生体高分子の場合、生体高分子またはその主成分のｐＨに応じて溶液のｐＨを選択する。このことは、高分子が電界強度に影響されないことを意味する。
【００４０】
以下の変形した電気濾過処理が、ファウリングの除去には大いに効果的である：
通常の電気濾過処理の場合、ある一定の直流電圧または一定の電界強度が電気濾過の全時間を通して印加される。電気濾過の時間が長くなるのに伴い、中空ファイバの内面及び分離膜孔内の空間はイオン高分子によって次第にふさがれていき、分離膜の内面が完全に覆われてしまうことも考えられる。図９Ａに示すように、結果として、膜を介する物質移動が大幅に減少する。
【００４１】
有効な直流電圧を周期的に断続することで、ファウリングを大幅に低減することができる。これは、電気濾過時間に膜に付着する高分子の大部分が、直流電圧が切断された時間に更に中空ファイバ内を搬送されて、周期的な断続操作を何度も繰り返した後では中空ファイバから溶出するからである。これを図９Ｂに示す。
【００４２】
中空ファイバの内部空間における層流の好ましくないフロー特性の結果として、膜表面の直近にある高分子は非常に遅くしか溶出せず、また孔内の高分子は直流電圧の周期的な断続の影響を受けない。しかし、一定時間のアクティブ電気濾過の後に、はるかに短い時間だけでも直流電圧の極性を変更する処理を用いると、孔内に移動していた高分子は中空ファイバの反対側の内壁に向かって引き寄せられる。もし直流逆電圧の時間を、高分子の大部分が分離処理のこの時間内に中空ファイバの周辺エリア及び／又は孔から中央へと移動するように選択すると、高分子は最大流量のエリアに入り込むことになる。結果として、高分子は極めて効果的に中空ファイバ内を搬送されていき、数サイクルの電気濾過と極性変更の効果により溶出する。これを図９Ｃに示す。
【００４３】
電気泳動を用いた壁面及び孔のアクティブフラッシングは、中空ファイバ内の圧力を周期的に変更して、アクティブ電気泳動フラッシングの時間中は中空ファイバの内部圧力が外部空間に比しても小さくなるようにすることで、更に強化することが可能である。このようにして、フラッシングを、同一方向への圧力フラッシングと同時に行うことで強化している。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る電気泳動装置の第１の実施例の平面図である。
【図２】図１に示す実施例の断面図である。
【図３】図１に示す実施例の、サンプル物質を中空ファイバに導入した状態での平面図である。
【図４】図１に示す実施例の、サンプル物質を分離チャンバに導入した状態での平面図である。
【図５】図１に示す実施例の、いわゆる免疫抽出中の平面図である。
【図６】本発明に係る電気泳動装置の、図１に示す実施例に対応し且つ同時多重処理に応じて動作する実施例の平面図である。
【図７】ＦＦ等電収束法と組み合わせた図１に示す実施例の平面図である。
【図８】図８Ａ〜８Ｃは、本発明に係る装置の更なる実施例の、分離素子の形状を示す断面図である。
【図９】図９Ａ〜９Ｃは、本発明に係る電気泳動装置の操作方法を表した図である。
【符号の説明】
１：合成樹脂ブロック
２：中空ファイバ
３：絶縁カバーを有する金属ブロック
４：電極
５：媒体口
６：媒体の界面
７：分離チャンバ部
８：分離チャンバ部
９：分離した種の出口
１０：検体の経路
１１：検体の経路
１２：検体の経路
１３：サンプル計量位置
１４：陰イオンの移動
１５：陽イオンの移動
１６：平膜
１８：フロー移動止め
１９：溝方凹部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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2004516138.tif 000013
2004516138.tif 000014
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2004516138.tif 000017
2004516138.tif 000018
2004516138.tif 000019
2004516138.tif 000020
2004516138.tif 000021
2004516138.tif 000022
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2004516138.tif 000024
2004516138.tif 000025
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2004516138.tif 000028
2004516138.tif 000029
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2004516138.tif 000033
2004516138.tif 000034
2004516138.tif 000035
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004516138.tif 000036
2004516138.tif 000037
【国際調査報告】
2004516138.tif 000038
2004516138.tif 000039
2004516138.tif 000040
2004516138.tif 000041
2004516138.tif 000042
2004516138.tif 000043