(57)【要約】本発明は、黄体ホルモンレセプターアイソフォーム特異的リガンドをスクリーニングする方法ならびに組織特異的黄体ホルモンレセプターリガンドをスクリーニングする第１方法を提供し、両方の方法は黄体ホルモンレセプターアイソフォームＡまたはＢを発現するプラスミドで安定にトレンスフェクトされた細胞を包含するアッセイにより、黄体ホルモンレセプターアイソフォームＡまたは黄体ホルモンレセプターアイソフォームＢ選択的リガンドを選択することを含んでなる。さらに、本発明は、所望のターゲット組織におけるｉｎ ｖｉｖｏ試験を含んでなる、組織選択的黄体ホルモンレセプターリガンドをスクリーニングする第２方法を提供する。本発明は、また、本発明に従う方法により同定された黄体ホルモンレセプターアイソフォーム特異的リガンドおよび／または組織選択的リガンドに関する。本発明は、さらに、このトランス活性化アッセイに適当な細胞系統、それぞれのアッセイキット、および本発明によるアイソフォーム特異的および／または組織選択的黄体ホルモンレセプターリガンドの医学的使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはＢ特異的リガンドをスクリーニングする方法において、
（ａ）       プロゲステロンレセプターアイソフォームＡを発現するプラスミドで第１細胞を安定にトランスフェクトし；
（ｂ）       プロゲステロンレセプターアイソフォームＢを発現するプラスミドで第２細胞を安定にトランスフェクトし；
（ｃ）       ホルモン的に応答性のプロモーターに連鎖されたリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドで前記第１および第２細胞をさらに安定にトランスフェクトし；
（ｄ）       前記第１および第２細胞を試験すべきリガンドと接触させ；
（ｅ）       前記第１および第２細胞中の前記リポーター遺伝子の転写効率（ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）および／または効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）を決定し；そして
（ｆ）       プロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームＢに対する選択性を有するリガンドを選択する；
工程を含んでなる方法。
【請求項２】
前記第１および第２細胞中の前記リガンドについて決定された転写効率の差が１０％より大きいか、あるいはそれに等しくそして／または前記第１細胞中の前記リガンドで達成される効力が前記第２細胞中の前記リガンドで達成される効力と少なくとも１０倍異なるように、工程 （ｆ） における選択性が定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ホルモン的に応答性のプロモーターが、マウス乳房腫瘍ウイルス （ＭＭＴＶ） プロモーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記リポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ （ＬＵＣ） リポーター遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１および第２細胞における転写効率および／または効力をルシフェラーゼ活性の測定により決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記プロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームＢを発現するプラスミド、およびプロモーターおよびリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドが、抗生物質耐性遺伝子を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記抗生物質耐性遺伝子が、ネオマイシンまたはプロマイシン耐性遺伝子である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記プロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームＢを発現するプラスミドが、ネオマイシン耐性遺伝子を含んでなり、そしてホルモン的に応答性のプロモーターに連鎖されたリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドがプロマイシン耐性遺伝子を含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドをスクリーニングする方法において、
（ａ）  プロゲステロンレセプターアイソフォームＡを発現するプラスミドで第１細胞を安定にトランスフェクトし；
（ｂ）  プロゲステロンレセプターアイソフォームＢを発現するプラスミドで第２細胞を安定にトランスフェクトし；
（ｃ）  ホルモン的に応答性のプロモーターに連鎖されたリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドで前記第１および第２細胞をさらに安定にトランスフェクトし；
（ｄ）  前記第１および第２細胞を試験すべきリガンドと接触させ；
（ｅ）  前記第１および第２細胞中の前記リポーター遺伝子の転写効率（ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）および／または効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）を決定し；
（ｆ）  プロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームＢに対する選択性を有するリガンドを選択し；
（ｇ）  工程 （ｆ） において選択したリガンドを第１および第２組織中のｉｎ ｖｉｖｏ試験に付し；そして
（ｈ）  前記第１および第２組織に関して所望の活性を有するリガンドを選択する；
工程を含んでなる方法。
【請求項１１】
前記第１組織が、子宮組織である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｉｎ ｖｉｖｏ試験が、前記第１および第２組織におけるプロゲステロン仲介作用を決定する試験である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１および第２細胞中の前記リガンドについて決定された転写効率の差が１０％より大きいか、あるいはそれに等しくおよび／または前記第１細胞中の前記リガンドで達成される効力が前記第２細胞中の前記リガンドで達成される効力と少なくとも１０倍異なるように、工程 （ｆ） における選択性が定義される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記ホルモン的に応答性のプロモーターが、マウス乳房腫瘍ウイルス （ＭＭＴＶ） プロモーターである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記リポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ （ＬＵＣ） リポーター遺伝子である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１および第２細胞における転写効率および／または効力をルシフェラーゼ活性の測定により決定する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記プロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームＢを発現するプラスミド、およびプロモーターおよびリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドが、抗生物質耐性遺伝子を含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗生物質耐性遺伝子が、ネオマイシンまたはプロマイシン耐性遺伝子である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
プロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームＢを発現するプラスミドが、ネオマイシン耐性遺伝子を含んでなり、そしてホルモン的に応答性のプロモーターに連鎖されたリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドがプロマイシン耐性遺伝子を含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法により同定された、プロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはＢ特異的リガンド。
【請求項２２】
前記プロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはＢ特異的リガンドが、プロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームＢの純粋なアゴニスト、純粋なアンタゴニストまたは部分的アゴニスト／アンタゴニストである、請求項２１に記載のプロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはＢ特異的リガンド。
【請求項２３】
前記プロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはＢ特異的リガンドが、プロゲステロンレセプターアイソフォームＡ選択的アゴニストまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームＢ選択的アンタゴニストまたは部分的プロゲステロンレセプターアイソフォームＡアゴニストおよびプロゲステロンレセプターアイソフォームＢアンタゴニストである、請求項２２に記載のプロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはＢ特異的リガンド。
【請求項２４】
請求項１０に記載の方法により同定された、組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
【請求項２５】
前記組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドが、乳房組織または子宮組織である、請求項２４に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
【請求項２６】
前記組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドが、乳房組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用に影響を及ぼさず、またはそれを阻害し、そして子宮組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用を増強または維持する、請求項２５に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
【請求項２７】
プロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームＢを発現するプラスミドで安定にトレンスフェクトされたＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞系統。
【請求項２８】
ホルモン的に応答性のプロモーターに連鎖されたリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドでさらに安定にトレンスフェクトされた、請求項２７に記載のＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞系統。
【請求項２９】
前記プロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームＢを発現するプラスミド、およびプロモーターおよびリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドが、抗生物質耐性遺伝子を含んでなる、請求項２８に記載のＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞系統。
【請求項３０】
前記抗生物質耐性遺伝子がネオマイシンまたはプロマイシン耐性遺伝子である、請求項２９に記載のＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞系統。
【請求項３１】
前記プロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームＢを発現するプラスミドが、ネオマイシン耐性遺伝子を含んでなり、そしてホルモン的に応答性のプロモーターに連鎖されたリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドがプロマイシン耐性遺伝子を含んでなる、請求項３０に記載のＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞系統。
【請求項３２】
前記リポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ （ＬＵＣ） リポーター遺伝子であり、そしてホルモン的に応答性のプロモーターがマウス乳房腫瘍ウイルス （ＭＭＴＶ） プロモーターである、請求項２８に記載のＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞系統。
【請求項３３】
プロゲステロンレセプターアイソフォームＡを発現するプラスミドで安定にトレンスフェクトされた第１細胞と、プロゲステロンレセプターアイソフォームＢを発現するプラスミドで安定にトレンスフェクトされた第２細胞とを含んでなるプロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはＢ特異的リガンドをスクリーニングするアッセイキットであって、前記第１および第２細胞がホルモン的に応答性のプロモーターに連鎖されたリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドでさらに安定にトレンスフェクトされており、ここで試験すべきリガンドと前記第１および第２細胞を接触させると、前記第１細胞および前記第２細胞について発現された遺伝子産物があるレベルで産生され、これらの遺伝子産物のレベルを比較すると、前記第１および第２細胞により誘導される転写効率および／または効力が異なり、ここでこの転写効率の差はプロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームＢに対する選択性を示す、アッセイキット。
【請求項３４】
前記第１および第２細胞中の前記リガンドについて決定された転写効率の差が１０％より大きいか、あるいはそれに等しくおよび／または前記第１細胞中の前記リガンドで達成される効力が前記第２細胞中の前記リガンドで達成される効力と少なくとも１０倍異なる、請求項３３に記載のアッセイキット。
【請求項３５】
前記細胞が、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞である、請求項３３に記載のアッセイキット。
【請求項３６】
前記ホルモン的に応答性のプロモーターが、マウス乳房腫瘍ウイルス （ＭＭＴＶ） プロモーターである、請求項３３に記載のアッセイキット。
【請求項３７】
リポーター遺伝子がルシフェラーゼ （ＬＵＣ） リポーター遺伝子である、請求項３３に記載のアッセイキット。
【請求項３８】
前記第１および第２細胞における転写効率および／または効力をルシフェラーゼ活性の測定により決定する、請求項３７に記載のアッセイキット。
【請求項３９】
前記プロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームＢを発現するプラスミド、およびプロモーターおよびリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドが、抗生物質耐性遺伝子を含んでなる、請求項３３に記載のアッセイキット。
【請求項４０】
前記抗生物質耐性遺伝子が、ネオマイシンまたはプロマイシン耐性遺伝子である、請求項３９に記載のアッセイキット。
【請求項４１】
前記プロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームＢを発現するプラスミドが、ネオマイシン耐性遺伝子を含んでなり、そしてホルモン的に応答性のプロモーターに連鎖されたリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドがプロマイシン耐性遺伝子を含んでなる、請求項４０に記載のアッセイキット。
【請求項４２】
薬剤として使用するための請求項１に記載の方法により同定された、プロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはＢ特異的リガンド。
【請求項４３】
プロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームＢ仲介作用を選択的に阻害または刺激するとき使用するための請求項４２に記載のプロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはＢ特異的リガンド。
【請求項４４】
プロゲステロンレセプターアイソフォームＢに影響を及ぼさず、またはそれを選択的に阻害し、そしてプロゲステロンレセプターアイソフォームＡ仲介作用を選択的に増強または維持するとき使用するための、請求項４３に記載のプロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはＢ特異的リガンド。
【請求項４５】
第１選択組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用に影響を及ぼさず、またはそれを選択的に阻害し、そして、同時に、第２選択組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用を増強または維持するとき使用するための、請求項４２に記載のプロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはＢ特異的リガンド。
【請求項４６】
生殖能のコントロールまたはホルモン置換療法において使用するための、請求項４２に記載のプロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはＢ特異的リガンド。
【請求項４７】
前記第１選択組織が乳房組織であり、そして前記第２選択組織が子宮組織である、請求項４５に記載のプロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはＢ特異的リガンド。
【請求項４８】
乳房組織の増殖または分化を選択的に阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、および／または子宮組織において抗増殖作用を選択的に増強または維持するとき使用するための、請求項４５に記載のプロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはＢ特異的リガンド。
【請求項４９】
プロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームＢ仲介作用を選択的に阻害または刺激する薬剤を製造するための、請求項１に記載の方法により同定されたプロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはＢ特異的リガンドの使用。
【請求項５０】
第１選択組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用に影響を及ぼさず、またはそれを選択的に阻害し、そして、同時に、第２選択組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用を増強または維持するとき使用するための、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
薬剤を生殖能のコントロールまたはホルモン置換療法において使用する、請求項４９に記載の使用。
【請求項５２】
前記第１選択組織が乳房組織であり、そして前記第２選択組織が子宮組織である、請求項５０に記載の使用。
【請求項５３】
乳房組織の増殖または分化を選択的に阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、および／または子宮組織において抗増殖作用を選択的に増強または維持するとき使用するための、請求項４９に記載の使用。
【請求項５４】
薬剤として使用するための請求項１０に記載の方法により同定された、組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
【請求項５５】
第１選択組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用に影響を及ぼさず、またはそれを選択的に阻害し、そして、同時に、第２選択組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用を増強または維持するとき使用するための、請求項５４に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
【請求項５６】
生殖能のコントロールまたはホルモン置換療法において使用するための、請求項５４に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
【請求項５７】
前記第１選択組織が乳房組織であり、そして前記第２選択組織が子宮組織である、請求項５５に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
【請求項５８】
乳房組織の増殖または分化を選択的に阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、および／または子宮組織において抗増殖作用を選択的に増強または維持するとき使用するための、請求項５４に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
【請求項５９】
第１および第２組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用を選択的にモジューレートする薬剤を製造するための、請求項１０に記載の方法により同定されたプロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはＢ特異的リガンドの使用。
【請求項６０】
第１選択組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用に影響を及ぼさず、またはそれを選択的に阻害し、そして、同時に、第２選択組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用を増強または維持するとき使用するための、請求項５９に記載の使用。
【請求項６１】
薬剤を生殖能のコントロールまたはホルモン置換療法において使用する、請求項５９に記載の使用。
【請求項６２】
前記第１選択組織が乳房組織であり、そして前記第２選択組織が子宮組織である、請求項５９に記載の使用。
【請求項６３】
乳房組織の増殖または分化を選択的に阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、および／または子宮組織において抗増殖作用を選択的に増強または維持するとき使用するための、請求項５９に記載の使用。
【請求項６４】
治療的有効量の請求項１に記載の方法により同定されたプロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはＢを患者に投与する工程を含んでなる、プロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームＢ仲介作用を選択的に阻害または刺激する方法。
【請求項６５】
治療的有効量の請求項１０に記載の方法により同定された組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドを患者に投与する工程を含んでなる、選択した組織におけるプロゲステロンレセプター仲介症状を選択的にモジューレートする方法。
【請求項６６】
プロゲステロンレセプター仲介症状のモジュレーションが第１選択組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用に影響を及ぼさず、またはそれを選択的に阻害し、そして、同時に、第２選択組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用を増強または維持することを含んでなる、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記第１選択組織が乳房組織であり、そして前記第２選択組織が子宮組織である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
乳房組織の増殖および分化を選択的に阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、および／または子宮組織において抗増殖作用を選択的に増強または維持することを含んでなる、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドをスクリーニングする方法において、
（ａ）       プロゲステロンレセプターリガンドを第１選択組織において少なくとも１つのｉｎ ｖｉｖｏ試験に付し；
（ｂ）       前記リガンドを第２選択組織において少なくとも１つのｉｎ ｖｉｖｏ試験に付し；そして
（ｃ）       前記第２選択組織に関して前記第１選択組織においてプロゲステロンレセプター仲介作用を選択的にモジューレートするプロゲステロンレセプターリガンドを選択する；
工程を含んでなる方法。
【請求項７０】
前記プロゲステロンレセプターリガンドが、プロゲステロンレセプターの純粋なアゴニスト、純粋なアンタゴニストおよび部分的アゴニスト／アンタゴニストから成る群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
工程 （ｃ） において選択したプロゲステロンレセプターリガンドが、前記第１選択組織においてプロゲステロンレセプター仲介作用を阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、そして前記第２選択組織においてプロゲステロンレセプター仲介作用を増強または維持する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記第１選択組織が乳房組織であり、そして前記第２選択組織が子宮組織である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
工程 （ｃ） において選択したプロゲステロンレセプターリガンドが、乳房組織における増殖および分化を選択的に阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、および／または子宮組織における抗増殖作用を選択的に増強または維持する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】
請求項６９に記載の方法により同定された組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
【請求項７５】
プロゲステロンレセプターの純粋なアゴニスト、純粋なアンタゴニストおよび部分的アゴニスト／アンタゴニストから成る群から選択される、請求項７４に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
【請求項７６】
前記プロゲステロンレセプターリガンドが、前記第１選択組織においてプロゲステロンレセプター仲介作用を阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、そして前記第２選択組織においてプロゲステロンレセプター仲介作用を増強または維持する、請求項７４に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
【請求項７７】
前記第１選択組織が乳房組織であり、そして前記第２選択組織が子宮組織である、請求項７６に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
【請求項７８】
前記リガンドが乳房組織における増殖および分化を選択的に阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、および／または子宮組織における抗増殖作用を選択的に増強または維持する、請求項７４に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
【請求項７９】
プロゲステロンレセプターアイソフォームＡの転写を選択的に活性化または維持し、そしてプロゲステロンレセプターアイソフォームＢの転写を選択的に阻害し、またはそれに影響を及ぼさない、請求項７４に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
【請求項８０】
薬剤として使用するための請求項６９に記載の方法により同定された組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
【請求項８１】
プロゲステロンレセプターの純粋なアゴニスト、純粋なアンタゴニストおよび部分的アゴニスト／アンタゴニストから成る群から選択される、請求項８０に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
【請求項８２】
前記第１選択組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用を前記第２選択組織に関して選択的にモジューレートするとき使用するための、請求項８０に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
【請求項８３】
前記第１選択組織においてプロゲステロンレセプター仲介作用を阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、そして前記第２選択組織においてプロゲステロンレセプター仲介作用を増強または維持するとき使用するための、請求項８２に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
【請求項８４】
前記第１選択組織が乳房組織であり、そして前記第２選択組織が子宮組織である、請求項８３に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
【請求項８５】
前記リガンドが乳房組織における増殖および分化を選択的に阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、および／または子宮組織における抗増殖作用を選択的に増強または維持する、請求項８０に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
【請求項８６】
ＰＲ−Ａの転写を選択的に活性化または維持し、そしてＰＲ−Ｂの転写を選択的に阻害し、またはそれに影響を及ぼさない、請求項８０に記載の組織選択的プロゲステロンレセプターリガンド。
【請求項８７】
第１選択組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用を第２選択組織に関して選択的にモジューレートする薬剤を製造するための、請求項６９に記載の方法により同定された組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドの使用。
【請求項８８】
前記第１選択組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用を阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、そして前記第２選択組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用を増強または維持する、請求項８７に記載の使用。
【請求項８９】
前記第１選択組織が乳房組織であり、そして前記第２選択組織が子宮組織である、請求項８８に記載の使用。
【請求項９０】
乳房組織の増殖および分化を選択的に阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、および／または子宮組織における抗増殖作用を選択的に増強または維持する、請求項８７に記載の使用。
【請求項９１】
薬剤を生殖能のコントロールおよびホルモン置換療法において使用する、請求項８７に記載の使用。
【請求項９２】
組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドがプロゲステロンレセプターの純粋なアゴニスト、純粋なアンタゴニストおよび部分的アゴニスト／アンタゴニストから成る群から選択される、請求項８７に記載の使用。
【請求項９３】
組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドがＰＲ−Ａ転写を選択的に活性化し、そしてＰＲ−Ｂ転写を選択的に阻害し、またはそれに影響を及ぼさない、請求項８７に記載の使用。
【請求項９４】
治療的有効量の請求項６９に記載の方法により同定された組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドを患者に投与する工程を含んでなる、第１選択組織におけるプロゲステロンレセプター仲介作用を第２選択組織に関して選択的にモジューレートする方法。
【請求項９５】
前記第１選択組織においてプロゲステロンレセプター仲介作用を阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、そして前記第２選択組織においてプロゲステロンレセプター仲介作用を増強または維持する、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記第１選択組織を乳房組織であり、そして前記第２選択組織が子宮組織である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドがプロゲステロンレセプターの純粋なアゴニスト、純粋なアンタゴニストおよび部分的アゴニスト／アンタゴニストから成る群から選択される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９８】
組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドがＰＲ−Ａ転写を選択的に活性化し、または維持し、そしてＰＲ−Ｂ転写を選択的に阻害し、またはそれに影響を及ぼさない、請求項９４に記載の方法。
【請求項９９】
乳房組織の増殖および分化を選択的に阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、および／または子宮組織において抗増殖性を選択的に増強または維持することを含んでなる、請求項９４に記載の方法。
【請求項１００】
請求項６９に記載の方法により同定された組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドを含んでなる医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、プロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームＢに対する選択性を有するプロゲステロンレセプターリガンドをスクリーニングする方法に関する。本発明は、さらに、組織選択的、特に乳房／子宮選択的、プロゲステロンレセプターリガンドをスクリーニングする方法に関する。本発明は、さらに、プロゲステロンレセプターアイソフォーム特異的リガンドをスクリーニングするアッセイキットに関する。
【０００２】
さらに、本発明は、プロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームＢを発現するプラスミドおよびプロゲステロン誘導可能なリポーター遺伝子で安定にトレンスフェクトされたＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞系統に関する。最後に、本発明は、また、本発明の方法により同定されたプロゲステロンレセプターアイソフォーム特異的リガンドおよび組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドに関する。本発明は、また、本発明の方法により同定されたプロゲステロンレセプターアイソフォーム特異的リガンドおよび組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドの医学的使用に関する。
【０００３】
発明の背景
プロゲステロンは独特の増殖ホルモンであり、そして女性の増殖組織において決定的な役割を演ずる。その主要なターゲット器官は子宮、乳房、卵巣および視床下部脳下垂体軸である。新しいプロゲステロンの開発およびそれらの作用モードの理解は、物質 （ステロイド） の単一グループに対する最大の化学的および生物学的研究の努力の１つであった。女性の産児制限剤 （例えば、経口避妊薬 （ＯＣ））としての主要な用途に加えて、エストロゲンと組み合わせたプロゲスチンはホルモン置換療法 （ＨＲＴ） において広く使用されている。
【０００４】
また、プロゲスチンは、ホルモン欠乏または不均衡により引き起こされる、いくつかの婦人科学的障害、例えば、月経困難症、子宮内膜症、および機能障害的子宮出血の治療に使用される。望ましくない副作用または他のレセプターとの交差反応性のために、それらの選択性プロファイルを改良するプロゲスチンの新しい世代の開発は大きい課題であった。さらに、治療的応用、例えば、腫瘍学的探求は新しい活性プロファイルを有するプロゲスチンを必要とする。
【０００５】
研究において、５−アリール−１，２−ジヒドロ−５Ｈ−クロメノ［ ３，４−ｆ ］キノリンのクラスのメンバーである、いくつかの非ステロイドのプロゲスチンはある種の組織選択的プロゲステロン作用を表示するが明らかにされた （Ｌ． Ｚｈｉ他、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９８、４１、２９１−３０２）。特に、プロゲステロン活性の２つのｉｎ ｖｉｖｏ齧歯類モデル、すなわち、妊娠維持アッセイおよび子宮湿潤重量アッセイにおいて、前記クラスの化合物の２メンバーは効力のあるプロゲステロン様作用を表示することが観測された。プロゲステロン活性についての第３モデルにおいて、乳末端芽アッセイ （ｍａｍｍａｒｙ ｅｎｄ ｂｕｄ ａｓｓａｙ） において、これらの化合物は有意に低い活性を有した （Ｊ． Ｐ． Ｅｄｗａｒｄｓ他、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９８、４１、２７７９−２７８５）。
【０００６】
分離したプロゲスチンに、例えば、乳房組織において抗増殖潜在的能力および、同時に、子宮内膜において有益な作用を付与することは特に望ましいように思われる。なぜなら、乳癌の発生率と組み合わせた経口的避妊薬 （ＣＯＣ） およびＨＲＴの使用との間の関係について、特に延長した期間の使用に関して、多数の疫学的研究が存在するからである （例えば、下記文献を参照のこと、Ｋ． Ｅ． Ｍａｌｏｎｅ他、Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ Ｒｅｖｉｅｗｓ １９９３、１５、８０−９７およびＳｔａｎｄｆｏｒｄ他、Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ Ｒｅｖｉｅｗｓ １９９３、１５、９８−１０７）。危険は矛盾し、議論の的であるが、多年の摂取は正常の乳房上皮細胞の成熟分裂活性を増強することがあるという明瞭な証拠が存在する。
【０００７】
これらのデータが意味するように、内因的および外因的プロゲスチンは乳房組織に対して潜在的に危険な刺激であることがある （Ａ． Ｂｒｚｅｚｉｎｓｋｉ他、Ｇｙｎｅｃｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １９９７、１１、３５７−３６４）。再び、最近の研究により確認できるように、ＨＲＴにプロゲスチンを添加すると、エストロゲン単独の使用に関して乳癌の危険が顕著に増加するという、強い証拠が存在する （Ｒ． Ｋ． Ｒｏｓｓ他、Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ２０００、１６、９２（４）、３２８−３３２；また、下記の文献を参照のこと：Ｃ． Ｓｃｈａｉｒｅｒ他、ＪＡＭＡ ２０００、２８３（４）、４８５−４９１）。こうして、革新的生殖能コントロールおよびＨＲＴのための新規な、選択的プロゲステロンレセプターリガンドならびにこのような選択的リガンドを同定する方法およびキットが強く要求されている。
【０００８】
他のステロイドホルモンレセプターと同様に、ＰＲはヒトを包含するある種の生物において２つのアイソフォームで発現される （Ｈ． Ｇｒｏｎｅｍｅｉｊｅｒ他、Ｊ． Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９９１、４０、２７１−２７８；Ｔ． Ｔ． Ｉｌｅｎｃｈｕｃｋ他、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １９８７、１２０、１４４９−１４５６）。こうして、またヒト乳房腫瘍および子宮内膜細胞系統において、２つのＰＲアイソフォーム、ｈＰＲ−ＡおよびｈＰＲ−Ｂが同定された （Ｐ． Ｅｓｔｅｓ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８７、２６、６２５０−６２６２；Ｌ． Ｋｌｅｉｎ−Ｈｉｔｐａｓｓ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９１、１９、１２２７−１２３４；Ｋ． Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ他、Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １９９０、２４、１４６５−１４７３）。ヒトＰＲ−ＡはｈＰＲ−Ａのトランケート型であり、Ｎ末端において１６４アミノ酸を欠如する （Ｋ． Ｂ． Ｈｏｒｗｉｔｚ他、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １９８３、１１３、２１９５−２２０１）。両方のアイソフォームはＤＮＡ結合性およびリガンド結合性ドメインにおいて同一であり、プロゲスチン仲介遺伝子転写を誘導する。しかしながら、それらは下において概説するように異なるトランス活性化挙動を有する。
【０００９】
潜在的に、ＰＲ−ＡおよびＰＲ−ＢアイソフォームのＮ末端長さが異なるために、ＰＲ−ＡまたはＰＲ−Ｂに結合した同一リガンドは２つのアイソフォームの異なるコンフォメーションを誘導することができ、異なる組のコアクチベーター／コリプレッサーとの相互作用を生じ、これは引き続いて観測されるトランス活性化の差の理由であることがある。したがって、レセプターおよびコアクチベーターとの相互作用を誘導することによって一方のアイソフォームを選択的に活性化し、レセプターおよびコリプレッサーの相互作用を誘導することによって他方のアイソフォームを選択的に阻害する化合物を同定することができるであろう。この仮説はＴｅｔｅｌ他の最近の刊行物 （Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １９９９、１３、９１０−９２４） から支持され、この刊行物にはＰＲのアミノ末端とカルボキシ末端との間のホルモン依存的分子内相互作用を報告されている。
【００１０】
両方のＰＲアイソフォームはこれまで試験されたすべてのプロゲステロンターゲット器官 （例えば、乳房、子宮） において発現される。しかしながら、ＰＲ−ＡおよびＰＲ−Ｂは組織特異的方法で機能して、プロゲステロンに対する応答を仲介するという強い証拠が存在する。アイソフォーム特異的ノックアウトマウスは、同一ターゲット器官においてＰＲ−ＡおよびＰＲ−Ｂの異なる機能を示す。これらの研究に基づいて、ＰＲ−Ｂは乳腺の増殖および分化について最も重要なレセプターであるが、子宮上皮および排卵に対するプロゲスチンの抗増殖作用はＰＲ−Ａことによって仲介される可能性が強い （Ｂ． Ｍｕｌａｃ−Ｊｅｒｉｃｅｖｉｃ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０００、２８９、１７５１−１７５４；Ｏｒｉａ Ｃｏｎｎｅｅｌｙ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｍｅｅｔｉｎｇ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｊｕｎｅ ２０００）。
【００１１】
ＰＲアイソフォーム特異的リガンドを同定することが潜在的に望ましいにもにかかわらず、このようなリガンドを特別に同定する方法は先行技術において開示されてきていない。さらに、組織選択的ＰＲリガンドを同定する方法は先行技術において提供されてきていない。したがって、先行技術はＰＲ特異的および／または組織選択的ＰＲリガンドを提供しない。
【００１２】
リガンドに対して暴露されたとき、細胞内レセプターの転写活性を決定する一般的アッセイおよび方法が開発された。例えば、米国特許第５，０７１，７７３号には、ホルモン細胞内レセプター、これらのレセプターのリガンドおよびホルモン細胞内レセプターの転写活性化性質を有するタンパク質を同定することができるアッセイが記載されている。
【００１３】
ヒトＰＲ−ＡおよびＰＲ−Ｂアイソフォームおよびプロゲステロンレセプター応答性リポーターの２工程トランスフェクション手法に基づいて、ホルモン依存的転写モジュレーション系が確立された （Ｒ． Ｄｉｊｋｅｍａ他、Ｊ． Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． １９９８、６４、１４７−１５６）。この研究において使用するｈＰＲアイソフォームおよびＰＲ応答性リポーターを発現するチャイニーズハムスター卵巣 （ＣＨＯ） 細胞系統は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて （抗） プロゲスチンを定量する効率よい、正確なツールを提供できることが示された。しかしながら、試験したすべてのプロゲステロンのアゴニストおよびアンタゴニストは、同一の方法でないにしても、同様に個々のＰＲアイソフォームに対して活性であった。こうして、ＰＲアイソフォーム特異的化合物の選択はこれまで実施されなかった。
【００１４】
得られたトランス活性化データを、ウサギ子宮内膜のＭｃＰｈａｉｌステージング、ラットにおける排卵および妊娠中断を使用した相対結合アフィニティーおよびバイオポテンシイの推定値と比較した （Ｗ． Ｇ． Ｅ． Ｊ． Ｓｃｈｏｏｎｅｎ他、Ｊ． Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． １９９８、６４、１５７−１７０）。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ試験においてこれらは非常に類似するので、一般にＰＲのアゴニスト、アンタゴニストおよび部分的アンタゴニストの直接的前スクリーニングは可能であることが見出された。こうして、このトランス活性化アッセイは結合性アッセイを置換し、化学化合物の特定のクラスを包含するｉｎ ｖｉｖｏ研究のための価値のある前スクリーニングツールである。
【００１５】
本発明は、ＰＲ活性のアイソフォーム特異的リガンドがホルモン療法においてプロゲスチン活性の組織選択的モジュレーションを可能とするという、新しい理論に基づく。したがって、１つのアプローチは乳房組織の保護的ＰＲリガンドに関する。しかしながら、ＰＲリガンドは他のターゲット器官、例えば、子宮に対して所望の作用を維持する。
【００１６】
このアプローチは、ＰＲ−Ａトランス活性化を選択的に刺激する純粋なアゴニスト、またはＰＲ−Ｂトランス活性化を選択的に阻害する純粋なアンタゴニスト、またはＰＲ−Ａに対して強いアゴニスト活性およびＰＲ−Ｂに対して強いアンタゴニスト活性を有する部分的アゴニストを同定することができる。しかしながら、本発明は、このアプローチに限定されない。さらに、このアプローチはその上他の組織系に適用可能である。多数のプロゲスチンが販売されているが、好ましくは乳房組織に対して、無関係の抗増殖潜在的能力を有するプロゲスチンは現在利用可能である。
【００１７】
発明の目的
上に概説したように、ターゲット組織特異性を有するプロゲステロンレセプター （ＰＲ） リガンドを設計すること、すなわち、例えば、乳房におけるそれから生殖管におけるプロゲステロン活性を分離し、これによりＣＯＣおよびＨＲＴの望ましくない作用、例えば、乳癌の危険の増加を減少し、こうして乳腺および子宮の両方を保護することが望ましい。さらに、ＰＲアイソフォーム、ＰＲアイソフォームＡまたはＰＲアイソフォームＢの１つに対する選択性を有するＰＲリガンドを同定することが望ましい。こうして、ある種の所望の組織選択性を示すＰＲリガンドをスクリーニングする方法が必要とされている。
【００１８】
本発明の他の目的は、ＰＲアイソフォーム特異的リガンド、すなわち、ＰＲアイソフォームＡまたはＢに対する選択性を有するＰＲリガンドをスクリーニングする方法を提供することである。好ましくは、ＰＲアイソフォーム特異的リガンドを同定する方法は、ＰＲ−Ａトランス活性化を選択的に刺激する純粋なアゴニスト、またはＰＲ−Ｂトランス活性化を選択的に阻害する純粋なアンタゴニスト、またはＰＲ−Ａに対して強いアゴニスト活性およびＰＲ−Ｂに対して強いアンタゴニスト活性を有する部分的アゴニストであるリガンドの同定に適当である。
【００１９】
さらに、本発明の目的は、薬剤として、例えば、生殖能コントロールおよびＨＲＴにおいて使用するための組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする方法を提供することである。好ましくは、組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする所望の方法は、第１選択組織に対して阻害作用または少なくとも非刺激作用、および第２選択ターゲット組織、好ましくは子宮組織に対して保護的作用を示すＰＲリガンドのスクリーニングに適当である。
【００２０】
望ましくは、スクリーニング法は比較的簡単、高度に選択性、効率的であり、こうして多分高い処理量の篩がけを可能とする。さらに、スクリーニング法はＰＲの純粋なアゴニスト、純粋なアンタゴニストおよび部分的アゴニスト／アンタゴニストに適用可能である。
本発明のそれ以上の目的は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてアイソフォーム特異的ＰＲリガンドをスクリーニングする方法を実施するために適当のアッセイキットを提供することである。
【００２１】
本発明の他の目的は、アイソフォーム特異的および／または組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする方法において使用するために好ましい細胞系統であり、好ましくはアッセイキットの中に含まれる細胞系統の少なくとも１つの型を提供することである。
本発明のなお他の目的は、ＰＲアイソフォームＡまたはＢ特異的リガンドおよび／または組織選択的、好ましくは乳房／子宮特異的、ＰＲリガンドを提供することである。これらはＰＲアイソフォームＡまたはＢ特異的リガンドおよび／または組織選択的ＰＲリガンドは薬剤として、例えば、生殖能コントロールおよびＨＲＴにおいて使用するために適当である。
【００２２】
最後に、本発明の目的は、ＰＲアイソフォームＡまたはＢを選択的に阻害または刺激する方法を提供することである。そして、本発明の他の目的は、第１選択組織においてＰＲ仲介症状を第２選択組織に関して選択的にモジューレートする方法を提供することであり、第１選択組織は好ましくは乳房組織であり、そして第２選択組織は好ましくは子宮組織である。
【００２３】
すべてのこれらの目的は、特許請求の範囲において表現されている本発明に従い、ＰＲアイソフォーム特異的リガンドおよび／または組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする方法、アッセイキット、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞系統、ＰＲアイソフォームＡまたはＢ特異的および／または組織選択的ＰＲリガンド、薬剤としてのそれぞれのリガンドの使用およびＰＲ−ＡまたはＰＲ−Ｂを選択的に阻害する方法ならびに選択した組織においてＰＲ仲介作用を選択的にモジューレートする方法を準備することによって、驚くべきことには達成される。
【００２４】
発明の要約
本発明は、ＰＲアイソフォームＡまたはＢ特異的リガンドをスクリーニングする方法ならびに組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする第１および第２方法を提供する。本発明に従いＰＲアイソフォーム特異的リガンドをスクリーニングする方法ならびに組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする第１方法の両方は、基本的には、ＰＲ−ＡまたはＰＲ−Ｂアイソフォームに対する選択性を有するＰＲリガンドを選択することを含んでなる。
【００２５】
組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする第１方法は、本発明によるＰＲアイソフォーム特異性ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験により同定されたＰＲアイソフォーム特異的リガンドを第１および第２ターゲット組織におけるｉｎ ｖｉｖｏ試験に付し、所望の活性を有するリガンドを前記第１および第２ターゲット組織に関して選択することをさらに含む。組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする第２方法は、ＰＲリガンドを所望のターゲット組織におけるｉｎ ｖｉｖｏ試験に付し、所望のターゲット組織の１つのにおいてＰＲ仲介作用を他の所望のターゲット組織に関して選択的にモジューレートするリガンドを選択することを含んでなる。
【００２６】
こうして、本発明による組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする第１方法は、選択性アッセイ、好ましくは本発明によるトランス活性化アッセイにより証明されるように、選択的ＰＲ−ＡまたはＰＲ−Ｂ特異的、純粋なアゴニスト、純粋なアンタゴニストまたは部分的アゴニスト／アンタゴニストである、ある種のステロイドまたは非ステロイドのＰＲリガンドが組織選択的プロゲステロン作用を誘導するという、新しい、驚くべき概念に基づく。
【００２７】
本発明による組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする第２方法は、異なるターゲット器官においてｉｎ ｖｉｖｏ試験により同定された組織選択的ＰＲリガンドにより誘導される、異なるプロゲステロンレセプター仲介作用に基づく。
本発明は、また、本発明に従う方法により同定された、ＰＲアイソフォームＡまたはＢ特異的リガンドおよび／または組織選択的ＰＲリガンドを提供する。本発明によるＰＲアイソフォームＡまたはＢ特異的リガンドおよび／または組織選択的ＰＲリガンドは、薬剤として、例えば、生殖能コントロールまたはＨＲＴにおいて使用するために適当である。
【００２８】
好ましくは、本発明に従う方法により同定されたＰＲアイソフォーム特異的リガンドはＰＲ−Ｂトランス活性化を選択的にブロックせず、または少なくともそれに影響を与えないが、なおＰＲ−Ａに対して強いアゴニストである。本発明に従い組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする第１および／または第２方法により同定された組織選択的ＰＲリガンドは好ましくは乳房上皮の分化および増殖を阻害するが、生殖管におけるプロゲステロン活性は維持されるか、あるいはさらに増強される。こうして、本発明による組織選択的ＰＲリガンドは、乳腺ならびに子宮の両方に対して保護作用を示す。
【００２９】
他の面において、本発明は、本発明による方法、すなわち、ＰＲ−ＡまたはＰＲ−Ｂアイソフォーム特異的リガンドをスクリーニングする方法を実施するために適当なアッセイキットを提供する。
さらに、本発明は、ＰＲ−ＡまたはＰＲ−Ｂを発現するプラスミドで安定にトレンスフェクトされたＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞系統を提供する。これらは細胞系統は、ＰＲアイソフォーム特異的リガンドをスクリーニングする方法ならびに本発明による組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする第１方法において、および本発明によるアッセイキットの一部分として使用するために特に適当である。
【００３０】
なお他の面において、本発明は、ＰＲアイソフォームＡまたはＰＲアイソフォームＢ仲介作用を選択的に阻害または刺激する方法を提供する。本発明は、また、選択した組織においてＰＲ仲介症状を選択的にモジューレートする、好ましくは第１選択組織、好ましくは乳房組織においてＰＲ仲介症状、好ましくはＰＲ−Ｂ仲介症状に影響を及ぼさず、またはそれを阻害し、同時に、第２選択組織、好ましくは子宮組織においてＰＲ仲介作用、好ましくはＰＲ−Ａ仲介作用を増強する方法を提供する。
【００３１】
発明の詳細な説明
第１の面において、請求項１〜９に対応して、本発明は、プロゲステロンレセプター （ＰＲ） アイソフォームＡまたはＢ特異的リガンドをスクリーニングする方法に関する。基本的には、この方法は、
（ａ）  プロゲステロンレセプターアイソフォームＡを発現するプラスミドで第１細胞を安定にトランスフェクトし；
（ｂ）  プロゲステロンレセプターアイソフォームＢを発現するプラスミドで第２細胞を安定にトランスフェクトし；
（ｃ）  ホルモン的に応答性のプロモーターに連鎖されたリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドで前記第１および第２細胞をさらに安定にトランスフェクトし；
（ｄ）  前記第１および第２細胞を試験すべきリガンドと接触させ；
（ｅ）  前記第１および第２細胞中の前記リポーター遺伝子の転写効率（ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）および／または効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）を決定し；そして
（ｆ）  プロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームＢに対する選択性を有するリガンドを選択する；
工程を含んでなる。
【００３２】
第２の面において、請求項１０〜２０に対応して、本発明は、組織選択的プロゲステロンレセプターリガンドを同定する第１方法に関する。基本的には、この方法は、上に説明したように本発明の第１面に従い、アイソフォーム特異的プロゲステロンレセプターリガンド、すなわち、プロゲステロンレセプターアイソフォームＡ （ＰＲ−Ａ） またはプロゲステロンレセプターアイソフォームＢ （ＰＲ−Ｂ） に対する選択性を有するリガンドを選択することを含んでなる。さらに、組織選択的ＰＲリガンドを同定する第１方法は、第１および第２組織において選択したＰＲアイソフォーム特異的リガンドをｉｎ ｖｉｖｏ試験に付し、前記第１および第２組織において所望の活性を有するリガンドを選択することを含んでなる。
【００３３】
こうして、組織選択的ＰＲリガンドを同定する第１方法は、少なくとも下記の工程を含んでなる：
（ａ）  プロゲステロンレセプターアイソフォームＡを発現するプラスミドで第１細胞を安定にトランスフェクトし；
（ｂ）  プロゲステロンレセプターアイソフォームＢを発現するプラスミドで第２細胞を安定にトランスフェクトし；
（ｃ）  ホルモン的に応答性のプロモーターに連鎖されたリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドで前記第１および第２細胞をさらに安定にトランスフェクトし；
（ｄ）  前記第１および第２細胞を試験すべきリガンドと接触させ；
（ｅ）  前記第１および第２細胞中の前記リポーター遺伝子の転写効率および／または効力を決定し；
（ｆ）  プロゲステロンレセプターアイソフォームＡまたはプロゲステロンレセプターアイソフォームＢに対する選択性を有するリガンドを選択し；
（ｇ）  工程 （ｆ） において選択したリガンドを第１および第２組織中のｉｎ ｖｉｖｏ試験に付し；そして
（ｈ）  前記第１および第２組織に関して所望の活性を有するリガンドを選択する。
【００３４】
本発明において、上に説明した両方の方法、すなわち、ＰＲアイソフォーム特異的リガンドをスクリーニングする方法および組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする第１方法の工程 （ｆ） において決定した、１つのＰＲアイソフォーム、ＰＲ−ＡまたはＰＲ−Ｂについての「選択性」は、前記第１および第２細胞においてある種の被験リガンドにより誘導される転写効率の差として定義される。好ましくは、この差は１０％より大きいか、あるいはそれに等しく、より好ましくは１５％より大きいか、あるいはそれに等しく、最も好ましくはそれより高く、例えば、２０％より大きいか、あるいはそれに等しくなくてはならない。
【００３５】
本発明の関係において「転写効率」（ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）は、ＰＲ−ＡまたはＰＲ−Ｂでトレンスフェクトされた細胞において標準に関して規定した濃度の被験リガンドを使用して達成される応答として定義される。
【００３６】
ＰＲ−ＡまたはＰＲ−Ｂに関して被験リガンドの活性、こうしてまた選択性を評価する他の潜在的パラメーターは、ＰＲ−ＡまたはＰＲ−Ｂでトレンスフェクトされた細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて決定した、「効力」、すなわち、ＥＤ５０ （作動性 （ａｇｏｎｉｓｍ） について） またはＩＣ５０ （拮抗性 （ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ） について） 値である。こうして、前述の両方の方法の工程 （ｆ） において決定される１つのＰＲアイソフォーム、ＰＲ−ＡまたはＰＲ−Ｂについての「選択性」は、また、さらにまたは選択的に、前記第２細胞に関して前記第１細胞においてある種の被験リガンドにより達成される効力の差として定義することができる。好ましくは、この効力の差は１０倍またはそれ以上の、より好ましくはこれ高い範囲である。
【００３７】
こうして、本発明によるＰＲアイソフォーム特異的リガンドをスクリーニングする方法ならびに組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする第１方法の工程 （ｆ） において規定される「選択性」は、前記第１および第２細胞における潜在的ＰＲアイソフォーム特異的リガンドおよび／または組織選択的ＰＲリガンドについて決定された転写効率の差が好ましくは１０％より大きいか、あるいはそれに等しく、より好ましくは１５％より大きいか、あるいはそれに等しく、最も好ましくは２０％より大きいか、あるいはそれに等しく、および／または前記第１細胞において前記リガンドで達成される効力が前記第２細胞において前記リガンドで達成される効力と少なくとも１０倍、より好ましくはこれより大きいように、定義される。こうして、効率および効力の両方は、前述の両方のスクリーニング法の工程 （ｆ） に従うＰＲ−Ａ／ＰＲ−Ｂの選択性についての基準として、選択的にまたは組み合わせて使用することができる。
【００３８】
第３の面において、請求項６９〜７３に対応して、本発明は、組織選択的ＰＲリガンドを同定する第２方法に関する。この第２方法は異なる選択したターゲット組織におけるｉｎ ｖｉｖｏ試験に基づき、これらのターゲット組織においてＰＲ仲介作用を選択的にモジューレートするＰＲリガンドを提供する。
【００３９】
こうして、本発明による組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする第２方法は、下記の工程を含んでなる：
（ａ）  プロゲステロンレセプターリガンドを第１選択組織において少なくとも１つのｉｎ ｖｉｖｏ試験に付し；
（ｂ）  前記同一プロゲステロンレセプターリガンドを第２選択組織において少なくとも１つのｉｎ ｖｉｖｏ試験に付し；そして
（ｃ）  前記第２選択組織に関して前記第１選択組織においてプロゲステロンレセプター仲介作用を選択的にモジューレートするプロゲステロンレセプターリガンドを選択する。
【００４０】
用語「リガンド」は、レセプター （本発明において、好ましくはプロゲステロンレセプター） に結合し、活性化または阻害を誘導する任意の化合物またはこのレセプターと相互作用する任意の他の潜在的形態を包含することを意味する。また、用語「リガンド」は、レセプターの潜在的リガンドであるが、レセプターにおけるそれらのアフィニティーおよび／または活性がまだ知られていず、本発明による方法で試験しなくてはならない化合物について使用される。
本発明における用語「プラスミド」は、「プラスミドベクター」を包含することを意図する。
【００４１】
こうして、本発明の１つの達成は、最初にＰＲリガンドのＰＲ−Ａ／ＰＲ−Ｂアイソフォーム特異性ＰＲリガンドの組織選択性、特に乳房／子宮選択性との相関を可能としたことである。さらに、本発明の方法により組織選択的、特に乳房／子宮選択的ＰＲリガンドを同定することが可能となった。既知の療法の欠点、例えば、乳癌の発生率の増加を回避するために、生殖能コントロールおよびホルモン （置換） 療法するとき使用するための組織選択的プロゲスチンを設計することは特に好都合である。
【００４２】
本発明による方法により同定されたアイソフォーム特異的および／または組織選択的ＰＲリガンドは、他の、望ましくない組織ではなく、特異的ターゲット組織において、プロゲステロンレセプターのみを活性化し、こうしてこれらの治療を十分に許容可能しかつ重大な副作用またはそれ以上の健康の問題の誘導に対する傾向を減少させる。さらに、それらのプロゲスチンは、現在 （組み合わせた） 経口的避妊薬およびＨＲＴにおいて使用されるプロゲスチンよりも、非常に少ない投与量で投与することができる。
【００４３】
その上、本発明は、ＰＲアイソフォーム特異的リガンドおよび／または組織選択的ＰＲリガンドを使用することによってＰＲ仲介症状の調整されたモジュレーションを可能とし、こうしてＰＲが関係する治療において、プロゲスチン、特にプロゲステロンレセプターの純粋なアゴニスト、純粋なアンタゴニストおよび部分的アゴニスト／アンタゴニストをさらに有益に使用する道を開くことができる。本発明による方法により同定されるアイソフォーム特異的および／または組織選択的ＰＲリガンドは、細胞内レセプター、例えば、一般にプロゲステロンレセプター、特にＰＲアイソフォームに関係するある種の病理学症状を含む、生物学的経路のそれ以上の解明に寄与するであろう。
【００４４】
しかしながら、本発明によるＰＲアイソフォーム特異的リガンドをスクリーニングする方法および組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする本発明による第１方法は、異なる型のレセプターを含む他のレセプター／リガンド系および／または選択したターゲット器官 （例えば、アンドロゲンレセプター系） における異なるレセプター仲介作用に準用することができる。さらに、組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする本発明による両方の方法もまた他の所望の組織またはターゲット器官に必要な変更を加えて適用することができる。
【００４５】
下記において、ＰＲアイソフォーム特異的リガンドおよび／または組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする本発明による方法をいっそう詳しく説明する。工程 （ａ） 〜 （ｆ） はＰＲアイソフォーム特異的リガンドをスクリーニングする方法および組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする第１方法においてそれらの最も広いならびにそれらの好ましい意味が同一であるので、これらの工程 （ａ） 〜 （ｆ） はＰＲアイソフォーム特異的リガンドをスクリーニングする方法を参照してのみ詳細に説明する。組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする第１方法の中に含まれる追加の工程 （ｇ） および （ｈ） を以後詳細に説明する。
【００４６】
本発明の第１面に従うＰＲアイソフォーム特異的リガンドをスクリーニングする方法は、好ましくはトランス活性化アッセイであり、複数の安定なトランスフェクション、すなわち、上において定義した工程 （ａ） 〜 （ｃ） を含んでなる。好ましくは、本発明の第１面に従うこのスクリーニング法において使用する細胞ならびに本発明によるアッセイキット （本明細書において後述する） の中に含まれる細胞は、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞 （ヒト神経芽細胞腫細胞） である。この細胞系統は本発明の目的に対して特に十分に適合する。
【００４７】
なぜなら、それは単一特異的細胞、すなわち、ＰＲのみを発現するが、他のホルモンレセプター、例えば、アンドロゲン、グルココルチコイドまたは他のステロイドレセプターを発現しない細胞を含んでなるからである。さらに、これらの特異的細胞において、ＰＲアイソフォームＡはＰＲアイソフォームＢのように等しく活性である。これは本発明による新規な発明的細胞の明瞭な利点であり、下記においていっそう詳しく説明する。しかしながら、本発明の第１および第２面に従うスクリーニング法ならびに本発明によるアッセイキットのために、他の細胞系統、例えば、チャイニーズハムスター卵巣 （ＣＨＯ） 細胞またはＣＶ−１細胞は等しく適当である。
【００４８】
本発明によるＰＲアイソフォームＡまたはＢ特異的リガンドをスクリーニングする方法において、前述の細胞をそれぞれＰＲ−ＡまたはＰＲ−Ｂを発現するプラスミドで安定にトレンスフェクトする （本発明による安定にトランスフェクトされた細胞を得る典型的な方法の詳細な説明は実施例５に記載されている）。換言すると、ＰＲ−Ａを特異的に発現する「第１細胞」（工程 （ａ） に対応する） およびＰＲ−Ｂを特異的に発現する「第２細胞」（工程 （ｂ） に対応する） を得る。本発明の第１および第２面に従うスクリーニング法および本発明によるアッセイキットにおいて使用する最も好ましい細胞は、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞である。トランス活性化アッセイのために、ヒトＰＲ−ＡまたはＰＲ−Ｂ （ｈＰＲ−ＡまたはｈＰＲ−Ｂ） を発現するプラスミドで細胞を安定にトランスフェクトすることは最も好ましい。
【００４９】
それぞれＰＲ−ＡまたはＰＲ−Ｂを発現するプラスミドは、好ましくはそれぞれプラスミドｐＲＳＶｈＰＲ−ｎｅｏ （ＰＲ−Ｂプラスミド；ＰＲ−Ｂを特異的に発現する細胞について） ならびにｐｈＰＲ−２ （ＰＲ−Ａプラスミド） およびｐＲＳＶ−ｎｅｏ （ＰＲ−Ａを特異的に発現する細胞について） である。これらのプラスミドを得る方法および／または場合を実施例５において詳細に説明する。それらはラウス肉腫ウイルス （ＲＳＶ） の長い末端反復から発現されたＰＲ−ＡまたはＰＲ−Ｂの全長のコーディング配列を含有する。ＳＶ４０初期プロモーターから発現されるネオマイシン耐性遺伝子は、安定なトランスフェクタントのネオマイシン選択を可能とする。しかしながら、また、他の構築物、例えば、本発明の目的に対して適当な、任意の他の抗生物質耐性遺伝子を含んでなる構築物が考慮される。
【００５０】
さらに、本発明の第１および第２面のスクリーニング法本発明において、かつ本発明によるアッセイキットの一部分として、使用するために適当な、本発明による第１および第２細胞 （好ましくは前述のＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞） は、工程 （ｃ） においてホルモン的に応答性のプロモーターに連鎖されたリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドでさらに安定にトランスフェクトされる。好ましくは、このプラスミドはｐＭＴＶ−ＬＵＣプラスミドであり、ここでホルモン的に応答性のプロモーターは、ルシフェラーゼ （ＬＵＣ） リポーター遺伝子に連鎖された、マウス乳房腫瘍ウイルス （ＭＴＶ） プロモーターである （詳細な説明については、実施例５参照）。しかしながら、また、本発明の目的に対して適当な他のプロモーター／リポーター遺伝子系が考慮される。
【００５１】
さらに、ＰＲ−ＡまたはＰＲ−Ｂプラスミドおよびプロモーター／リポーター遺伝子で安定にトレンスフェクトされた細胞を、例えば、実施例５に記載されているように、他の抗生物質耐性遺伝子、例えば、プロマイシン耐性遺伝子 （例えば、ｐＳＶ２ｐａｃ） でさらに安定にトランスフェクトする。前述したように、本発明の目的に対して適当な、任意の他の抗生物質耐性遺伝子をその上使用することができる。最後に、ＰＲ−ＡおよびＭＴＶ−ＬＵＣまたはＰＲ−ＢおよびＭＴＶ−ＬＵＣ （または、ＭＴＶ−ＬＵＣの代わりに、上に説明したように、任意の他の適当なプロモーター／リポーター遺伝子系） を安定に発現する抗生物質耐性ＳＫ−Ｎ−ＭＣクローンを、トランス活性化研究のために、すなわち、本発明によるＰＲアイソフォーム特異的リガンドをスクリーニングする方法ならびに組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする第１方法のために選択する。
【００５２】
本発明によるＰＲ−ＡまたはＰＲ−Ｂアイソフォーム選択的リガンドをスクリーニングする方法の工程 （ｄ） において、前記第１および第２の安定にトランスフェクトされた細胞 （すなわち、それぞれＰＲ−ＡまたはＰＲ−Ｂを発現する細胞） を試験すべきリガンド、すなわち、潜在的にＰＲアイソフォーム特異的リガンドである化合物と接触させる。試験すべきリガンドはステロイドまたは非ステロイドの特質を有することができる。この方法は、一般にＰＲアフィニティー／活性について既に試験した化合物を使用して、また、それらのＰＲリガンドが未知である化合物を使用して実施することができる。試験すべき化合物が既にＰＲリガンドとして適否試験されている場合、それはＰＲの純粋なアゴニスト、純粋なアンタゴニストまたは部分的アゴニスト／アンタゴニストであることができる。
【００５３】
前記第１および第２の安定にトランスフェクトされた細胞を工程 （ｄ） において試験すべきリガンドとインキュベートした後、前記第１および第２細胞における潜在的ＰＲ−ＡまたはＰＲ−Ｂ選択的リガンドの転写効率および／または効力を本発明によるスクリーニング法の工程 （ｅ） において決定する。上において定義した前記潜在的ＰＲアイソフォーム特異的リガンドの効率および／または効力は、発現されたリポーター遺伝子産物のレベルを介して決定することができる （実施例１参照） 。リポーター遺伝子が本発明の好ましい態様として前述したＬＵＣリポーター遺伝子である場合、ＬＵＣリポーター遺伝子産物のレベルを細胞ライゼイト中で決定し、ＲＬＵ （相対光単位） として測定する。しかしながら、前記第１および第２細胞において転写効率および／または効力を決定する任意の他の方法は、本発明によるスクリーニング法ならびにアッセイキットにおいて等しく適用可能である。
【００５４】
特に、前記第１または第２細胞においてリガンドのアゴニスト活性を決定するために、ルシフェラーゼアッセイの前に （リポーター遺伝子が前述のＬＵＣリポーター遺伝子である場合） または本発明の目的に対して適当な任意の他のアッセイの前に、それぞれの細胞 （ＰＲ−ＡおよびＰＲ−Ｂを発現する細胞であるが、各グループを別々に） を増加する濃度の、好ましくは０．０１ ｎｍｏｌ／ｌ〜１ μｍｏｌ／ｌの試験すべきリガンドの存在下に培養する。
【００５５】
リポーター遺伝子誘導の陽性対照として、同一型の細胞を標準プロゲスチン、好ましくは合成プロゲスチンＲ５０２０ （プロメゲストン） で、好ましくは０．０１ ｎｍｏｌ／ｌ〜１ μｍｏｌ／ｌの濃度において処理する。リポーター遺伝子誘導の陰性対照として、同一型の細胞を好ましくは１％のエタノール中で培養する。アゴニスト活性を決定するために、すべての得られたデータ点を標準プロゲスチンに関して、好ましくは細胞を１０−７ ｍｏｌ／ｌのＲ５０２０で処理することによって得られたＬＵＣ活性の誘導に関して計算する。アゴニスト効力［ｎＭ］を決定するために、ＥＤ５０値 （すなわち、このリガンドの最大アゴニスト作用の半分を提供するリガンドの量［ｎＭ］） をグラフで決定する （例えば、実施例１参照）。
【００５６】
アンタゴニスト活性を決定するために、それぞれの細胞 （ＰＲ−ＡおよびＰＲ−Ｂを発現する細胞であるが、各グループを別々に） を標準プロゲスチン、好ましくは０． １ ｎｍｏｌ／ｌのＲ５０２０およびさらに増加する量の試験すべきリガンドで処理する。リポーター遺伝子転写阻害の陽性対照として、同一型の細胞を増加する量の標準抗プロゲスチン、好ましくは既知の抗プロゲスチンであるミフェプリストン中で、好ましくは１ ｐｍｏｌ／ｌ〜１００ ｎｍｏｌ／ｌの濃度において、培養する。アンタゴニスト効率を決定するために、すべての得られたデータ点を標準プロゲスチンに関して、好ましくは細胞を０．１ ｎｍｏｌ／ｌのＲ５０２０で処理することによって得られたＬＵＣ活性の誘導に関して計算する。アンタゴニスト効力［ｎＭ］を決定するために、ＥＤ５０値 （すなわち、このリガンドの最大アンタゴニスト作用の半分を提供するリガンドの量［ｎＭ］） をグラフで決定する （例えば、実施例１参照）。
【００５７】
前記第１および第２細胞、すなわち、ＰＲ−Ａ特異的細胞およびＰＲ−Ｂ特異的細胞について、あるレベルの発現されたリポーター遺伝子産物を試験すべきリガンドについて獲得し、こうして前記リガンドで誘導された前記第１および第２細胞において、リポーター遺伝子の確かな転写効率および／または効力を決定する。本発明の第１および第２面に従うスクリーニング法の工程 （ｆ） に従い、上において定義したＰＲ−ＡまたはＰＲ−Ｂに対する選択性を有するリガンドを選択しなくてはならない。
【００５８】
好ましくは、本明細書の目的に対して、純粋にＰＲ−Ａのアゴニスト活性または純粋にＰＲ−Ｂのアンタゴニスト活性を有するリガンド、またはＰＲ−Ａに対して強い部分的アゴニスト活性またはＰＲ−Ｂに対して強い部分的アンタゴニスト活性を有するリガンドを選択する。本発明のそれらの方法により選択すべき他の典型的なリガンドは、純粋にＰＲ−Ａアンタゴニスト活性および純粋にＰＲ−Ｂアゴニスト活性を有するリガンド、または部分的ＰＲ−Ａアンタゴニスト活性／部分的ＰＲ−Ｂアゴニスト活性を有するリガンドである。
【００５９】
こうして、上において定義したように、ＰＲアイソフォーム特異的細胞の両方のグループ、すなわち、前記第１および第２細胞において試験したリガンドにより誘導された転写効率の差は、好ましくは１０％より大きいか、あるいはそれに等しく、より好ましくは１５％より大きいか、あるいはそれに等しく、最も好ましくはそれより高く、例えば、２０％より大きいか、あるいはそれに等しくなくてはならず、および／または前記第１細胞においてこのようなリガンドにより達成される効力は、前記第２細胞においてこのようなリガンドにより達成される効力と、好ましくは少なくとも１０倍異なるべきである。
【００６０】
本発明の１つの好ましい態様は、例えば、実施例１に従うアッセイであり、ここで本発明による典型的なＰＲアイソフォーム特異的リガンドをスクリーニングする方法が記載されている。実施例１において、上に定義した本発明による方法により同定されたいくつかの典型的な結果が要約されている。本発明に従う方法により同定された、いくつかのＰＲ−ＡまたはＰＲ−Ｂアイソフォーム選択的リガンドについて得られた、いくつかの典型的な結果が要約されている。さらに、実施例５において、安定なトランスフェクションが詳細に説明されている。
【００６１】
上に説明したように、本発明の第２面に従う組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする第１方法は、前述したＰＲアイソフォーム特異的リガンドをスクリーニングする方法と同一の工程 （ａ） 〜 （ｆ） を含んでなる。こうして、組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする第１方法 （これは本発明の第２面である） の工程 （ａ） 〜 （ｆ） を、本発明の第１面、すなわち、ＰＲアイソフォーム特異的リガンドをスクリーニングする方法に関して開示する。しかしながら、本発明の第２面に従う組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする第１方法は、後述する工程 （ｇ） および （ｈ） をさらに含んでなる。
【００６２】
ＰＲアイソフォームの特異性および組織選択性の新規な、驚くべき概念に従い、いったん組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする第１方法の工程 （ｆ） において、ＰＲ−ＡまたはＰＲ−Ｂについて前述した所望の選択性を有するリガンドが選択されると、このリガンドをこの方法の工程 （ｇ） において第１および第２選択組織において、好ましくは乳房および子宮組織においてｉｎ ｖｉｖｏ試験に付す。これらのｉｎ ｖｉｖｏ試験は、第１および第２選択組織においてＰＲ仲介作用を決定する試験であることが好ましい。
【００６３】
例えば、可能なｉｎ ｖｉｖｏ試験は実施例２、３および４に記載されている試験、すなわち、乳房組織の増殖／分化についての齧歯類アッセイ、妊娠維持試験または齧歯類における子宮内膜増殖／分化試験、および排卵阻害試験または齧歯類における過剰排卵試験である。しかしながら、選択した第１および第２組織におけるｉｎ ｖｉｖｏ試験における、任意の他のＰＲ仲介作用の決定は、本発明の目的に対して等しく適当であり、そして選択した組織および所望の組織選択性プロファイルに従い選択することができる。
【００６４】
ｉｎ ｖｉｖｏ試験後において、本発明の第２面に従う組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする第１方法において再び選択工程 （工程 （ｈ））を実施し、ここで第１および第２ターゲット組織に関して所望の活性を有するリガンドを選択する。こうして、例えば、本発明の１つの好ましい態様において、「所望の活性」は、第１ターゲット組織、好ましくは乳房組織においてＰＲ仲介作用に影響を及ぼさず、または阻害し、同時に、第２ターゲット組織、好ましくは子宮組織においてＰＲ仲介作用を維持するリガンドが選択されることを意味する。例えば、乳房組織において分化／増殖を刺激しない、または阻害するが、生殖管に対してその有益な （保護的） 作用を維持または増強する、すなわち、子宮に対して抗増殖活性を示すリガンドを選択する。
【００６５】
このようなリガンドは、生殖能コントロール、例えば、経口避妊薬、およびホルモン置換療法 （ＨＲＴ） において使用するために適当であるように思われる。しかしながら、当業者にとって明らかなように、本発明の適合は生殖能コントロールまたはＨＲＴの分野に限定されず、本発明はその上レセプター仲介症状を包含する他の分野において有益に適用することができる。等しく、本発明の主題はＰＲに限定されず、また、他のレセプター／リガンド系において使用することができる。さらに、本発明は、また、２より多いターゲット組織に拡張することができる。
【００６６】
本発明の第３面、すなわち、組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする第２方法によれば、この方法の工程 （ａ） において、第１選択組織中の、少なくとも１つのｉｎ ｖｉｖｏ試験、好ましくはＰＲ仲介作用を決定することに向けられた少なくとも１つのｉｎ ｖｉｖｏ試験に付さなくてはならない。好ましくは、第１選択組織は乳房または子宮であるが、また、ＰＲ仲介作用が観測される、問題の任意の他の組織であることができる。
【００６７】
本発明のこの第３面の目的に適当なｉｎ ｖｉｖｏ試験は、例えば、実施例２、３および４に記載されている試験、すなわち、乳房組織の増殖／分化についての齧歯類アッセイ、妊娠維持試験または齧歯類における子宮内膜増殖／分化試験、および排卵阻害試験または齧歯類における過剰排卵試験である。最後に、本発明に従う組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする第２方法は任意の他のレセプターリガンドについて同様に実施することができ、任意の他のターゲット組織におけるｉｎ ｖｉｖｏ試験を含むことができることが認められる。本明細書に記載する方法を他のレセプター系および／またはターゲット組織に転移するために必要な、適当な変化は平均の当業者の技量の範囲内に入る。
【００６８】
本発明による組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする第２方法の工程 （ｂ） によれば、前述の第１選択組織において既にｉｎ ｖｉｖｏ試験したＰＲリガンドを第２選択組織において少なくとも他のｉｎ ｖｉｖｏ試験に付す。好ましくは、再びｉｎ ｖｉｖｏ試験はＰＲ仲介作用の決定に適当な試験であるべきである。このような適当な試験は、第１選択組織の工程 （ａ） に関して前述した通りである。再び、工程 （ｂ） に従う第２選択組織は好ましくは乳房または子宮組織であり、これらのいずれも工程 （ａ） において試験されなかったものである。
【００６９】
第１および第２選択組織におけるｉｎ ｖｉｖｏ試験後、本発明の第３面に従う組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする第２方法の工程 （ｃ） において、前記第１および第２組織において試験したリガンドにより誘導されたＰＲ仲介作用を比較し、そして前記第１選択組織におけるＰＲ仲介作用を前記第２選択組織に関して選択的にモジューレートするＰＲリガンドを選択する。
【００７０】
本発明のこの面の目的に対するＰＲ仲介作用の「選択的モジュレーション」は、選択したリガンドが第１選択組織において１または２以上の作用を達成することを意味し、ここでこのような作用は、第２所望組織において前記リガンドにより誘導される１または２以上の作用に比較して、種類が異なり （すなわち、アゴニスト、アンタゴニストまたは、換言すると、阻害し、刺激しまたは影響を及ぼさない） および／または強度が異なる （すなわち、より弱いまたはより強い、または固有により長いまたはより短い） ことである。
【００７１】
好ましくは、選択したリガンドは前記第１選択組織、好ましくは乳房組織においてＰＲ仲介作用を阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、そして前記第２組織、好ましくは子宮組織においてＰＲ仲介作用を増強または維持する。最も好ましくは、選択したリガンドは乳房上皮の増殖／分化を阻害し、または少なくともそれに影響を及ぼさないが、それは生殖管において有益な （すなわち、保護的） ＰＲ仲介作用を維持する （実施例２、３および４参照） 、例えば、子宮組織に対して抗増殖作用を発揮する。
【００７２】
ある種の被験リガンドが規定したターゲット組織における規定したＰＲ仲介作用を他のターゲット組織に関して実際に選択的にモジューレートするかどうかを決定するために、前記リガンドにより誘導される作用のタイプ （すなわち、リガンドがＰＲ仲介作用を阻害し、それに影響を及ぼさず、増強しまたは維持するかどうか） ならびに誘導された作用の強度を、好ましくは既知の「標準」ＰＲリガンド、例えば、標準プロゲスチンＲ５０２０ （プロメゲストン） に関して測定する。次いで第１および第２ターゲット組織においてある種の被験リガンドで達成された作用を、好ましくは所望の医学的適用 （例えば、ＨＲＴおよびその他） の考慮下に、比較し、評価する。最後に、１つのターゲット組織に対する所望の選択性を他のターゲット組織に関して示すＰＲ被験リガンドを選択する。
【００７３】
上において定義した好ましい組織以外のある種の所望のターゲット組織において上において定義した適当なｉｎ ｖｉｖｏ試験を選択し、実施すること、および適当な標準リガンドに関してある種の被験リガンドにより誘導される作用を決定することは確かに当業者の知識の範囲内に入る。
【００７４】
また、前述のすべての方法 （すなわち、ＰＲアイソフォーム特異的リガンドおよび／または組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする方法） は、多数の潜在的ＰＲアイソフォーム特異的リガンドおよび／または組織選択的ＰＲリガンドの自動化高い処理量のスクリーニングに適用可能であることは本発明の範囲内に入ると考慮される。本発明による方法に基づいて高い処理量のスクリーニングに適当な自動化プロセスを設計することは当業者の知識の範囲内に入る。
【００７５】
本発明の他の面は、本発明の第１、第２または第３面に従うスクリーニング法により同定された、ＰＲ−ＡまたはＰＲ−Ｂ特異的リガンドならびに組織選択的ＰＲリガンドを提供することである。前述したように、本発明の第１面に従う方法により同定されたアイソフォーム特異的ＰＲリガンドは、ＰＲ−ＡまたはＰＲ−Ｂに対する純粋なアゴニスト、純粋なアンタゴニストまたは部分的アゴニスト／アンタゴニストであることができる。好ましくは、本発明に従う方法により同定されたアイソフォーム特異的ＰＲリガンドは、ＰＲ−Ａに対する選択的アゴニストおよびＰＲ−Ｂに対する選択的アンタゴニスト、またはＰＲ−Ａに対して強いアゴニスト活性およびＰＲ−Ｂに対して強いアンタゴニスト活性を有する部分的アゴニストである。本発明による他の典型的なリガンドは、選択的ＰＲ−Ａアンタゴニストおよび選択的ＰＲ−Ｂアゴニストまたは部分的ＰＲ−Ａアンタゴニスト／ＰＲ−Ｂアゴニストである。
【００７６】
本発明の第２および第３面に従う組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする第１および第２方法により同定された組織選択的ＰＲリガンドは、好ましくは乳房組織または子宮組織に対して選択的である。より好ましくは、それらはＰＲ仲介作用に対して衝撃をもたず、または乳房組織におけるＰＲ仲介作用 （例えば、乳腺の増殖／分化） を阻害するが、子宮組織においてＰＲ仲介作用を増強または維持する、すなわち、子宮組織において保護的、例えば、抗増殖的、作用を発揮する。
【００７７】
こうして、例えば、子宮卵巣において所望の、有益な作用を有する組織選択的ＰＲリガンドおよび／またはＰＲアイソフォーム特異的リガンドが得られ、これらのリガンドは乳房において不適当なまたは危険な副作用を誘導しない、例えば、乳房組織の増殖／分化 （これは乳腺における末端芽の形成の増加により証明され、これは乳癌を誘導することがある） を誘導しない。しかしながら、既に前述したように、本発明の利益は乳房／子宮組織および／またはプロゲステロンレセプターに限定されず、他のターゲット組織および／またはレセプター／リガンド系にその上適用することができる。
【００７８】
好ましくは、本発明の第３面に従う組織選択的ＰＲリガンドをスクリーニングする第２方法により誘導される組織選択的、好ましい乳房／子宮選択的ＰＲリガンドは、ＰＲ−ＡまたはＰＲ−Ｂ選択的リガンドであり、より好ましくは、純粋なＰＲ−Ａアゴニスト、純粋なＰＲ−Ｂアンタゴニスト、またはＰＲ−Ａに対して強いアゴニスト活性およびＰＲ−Ｂに対して強いアンタゴニスト活性を有する部分的アゴニスト／アンタゴニストである。こうして、選択した組織選択的リガンドは好ましくは第１選択組織においてＰＲ−Ａトランス活性化を活性化または維持し、第２組織においてＰＲ−Ｂトランス活性化を阻害し、またはそれに影響を及ぼさない。
【００７９】
本発明の第１、第２および第３面に従う方法により同定されたＰＲリガンドの有益な作用のために、これらのリガンド （ＰＲアイソフォーム特異的リガンドおよび／または組織選択的ＰＲリガンド） は薬剤として、特に第１選択組織においてＰＲ仲介作用に影響を及ぼさず、またはそれを阻害し、同時に、第２ターゲット組織においてＰＲ仲介作用を増強または維持し、ここで第１組織は好ましくは乳房組織であり、そして第２組織は好ましくは子宮または卵巣組織である。これらの薬剤は好ましくは生殖能コントロール （例えば、経口避妊薬） またはＨＲＴにおいて使用することができる。好ましくは、同定されたＰＲリガンドは乳房組織において増殖／分化を阻害し、またはそれに影響を及ぼさないために、そして子宮組織において保護的、例えば、抗増殖的、作用を増強または維持すると同時に排卵に対して潜在的に所望の作用を維持するために使用することができる。
【００８０】
本発明の第１、第２および第３面に従う方法により同定されたＰＲリガンドは、また、第１ターゲット組織、好ましくは乳房組織においてＰＲ仲介作用 （例えば、増殖／分化） に影響を及ぼさず、またはそれを阻害し、そして第２ターゲット組織、好ましくは子宮または卵巣組織において有益な （例えば、抗増殖） ＰＲ仲介作用を増強または維持する （例えば、生殖能コントロールまたはＨＲＴにおいて使用するための） 薬剤の製造に使用することができる。しかしながら、本発明によるリガンドまたは本発明によるリガンドから製造された薬剤の他の関係する使用が考慮される。
【００８１】
本発明の他の面は、患者においてＰＲ−ＡまたはＰＲ−Ｂを選択的に阻害し、または選択的に決定する方法である。この方法は、治療的有効量の本発明の方法により同定されたＰＲアイソフォームＡまたはＢ特異的リガンドを患者に投与する工程を含んでなる。
【００８２】
本発明の他の関係する面は、選択したターゲット組織においてＰＲ仲介症状を選択的にモジューレートする方法である。この方法は、治療的有効量の本発明の方法の１つにより同定された組織選択的および／またはアイソフォーム特異的ＰＲリガンドを患者に投与する工程を含んでなる。好ましくは、ＰＲ仲介症状のモジュレーションは、第１選択組織、好ましくは乳房組織においてＰＲ仲介、好ましくはＰＲ−Ｂ仲介、作用を阻害し、またはそれに影響を及ぼさず、そして第２選択組織、好ましくは子宮または卵巣組織においてＰＲ仲介、好ましくはＰＲ−Ａ仲介、作用を増強または維持することを含んでなる。
【００８３】
こうして、本発明によるＰＲ仲介症状を選択的にモジューレートする方法において、好ましくは保護的ＰＲ−Ａ仲介作用 （例えば、抗増殖作用） を増強または維持し、そして潜在的に危険なＰＲ−Ｂ仲介作用 （例えば、増殖／分化） を阻害し、またはそれに影響を及ぼさない。しかしながら、また、ＰＲ−Ａ仲介作用を阻害し、またはそれに影響を及ぼさない方法は、本発明による典型的な方法である。
【００８４】
本発明のそれ以上の面は、ＰＲアイソフォームＡまたはＢ選択的リガンドをスクリーニングアッセイキットである。このキットは、ＰＲ−Ａを発現するプラスミドで安定にトレンスフェクトされた第１細胞と、またはＰＲ−Ｂを発現するプラスミドで安定にトレンスフェクトされた第２細胞とを含んでなり、前記第１および第２細胞はホルモン的に応答性のプロモーターに連鎖されたリポーター遺伝子を含んでなるプラスミドプラスミドでさらに安定にトレンスフェクトされ、ここで前記第１および第２細胞と試験すべきリガンドとの接触は前記第１細胞および前記第２細胞についてあるレベルの発現されたリポーター遺伝子産物を生じ、そしてこれらの産物レベルの比較は前記第１および第２細胞においてリガンドにより誘導された転写効率および／または効力の差を生じ、ここで転写効率および／または効力の差はＰＲ−ＡまたはＰＲ−Ｂに対する選択性を示す。
【００８５】
好ましくは、キットの中に含まれる細胞は本発明の第１および第２面に従うスクリーニング法について前述したすべての性質を有するＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞である。また、本発明によるアッセイキットにおいて試験すべきリガンドの効率および／または効力の決定を、それぞれのスクリーニング法について正確に前述したように実施する。再び、本発明によるアッセイキットにより同定された潜在的アイソフォーム特異的ＰＲリガンドは、ステロイドまたは非ステロイドの自然を有することができる。このキットは一般にＰＲアフィニティー／活性について既に試験し、ＰＲに結合し、活性化または阻害することが見出された化合物のスクリーニングに有用であるが、また、それらのＰＲリガンドの可能性が未知である化合物のスクリーニングに有用である。
【００８６】
このアッセイにおいて試験すべき化合物がＰＲリガンドとして既に適否試験されている場合、それらはＰＲの純粋なアゴニスト、純粋なアンタゴニストまたは部分的アゴニスト／アンタゴニストであることができる。好ましくは、アイソフォーム特異的ＰＲリガンドは純粋なＰＲ−Ｂアンタゴニストおよび純粋なＰＲ−Ａアゴニストまたは部分的ＰＲ−Ｂアンタゴニスト／ＰＲ−Ａアゴニストであり、こうして子宮および／または卵巣においてそれらの有益な作用を発揮するが、例えば、乳房組織の分化／増殖のための、乳房における不適当な、潜在的に危険の副作用は防止される。しかしながら、また、純粋なＰＲ−Ｂアゴニストおよび純粋なＰＲ−Ａアンタゴニストまたは部分的ＰＲ−Ｂアゴニスト／ＰＲ−Ａアンタゴニストであるアイソフォーム特異的ＰＲリガンドは本発明に従う。
【００８７】
既に前述したように、本発明のそれ以上の面はそれら自体ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞系統、すなわち、好ましくは本発明による方法および本発明の第２面および本発明によるアッセイキットにおいて使用する細胞系統である。本発明によるＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞系統は、本発明の第１および第２面に従うスクリーニング法に関して既に詳細に説明された。本発明によるＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞系統を得る典型的な方法は、実施例５に記載されている。
【００８８】
前述した本発明によるアッセイ法およびキットはアイソフォーム特異的ＰＲリガンドのスクリーニングに適当であるばかりでなく、かつまた、適当な変更を加えて、原理的には他のレセプター系に適用することができる。このようなそれ以上の考慮されるレセプター系は、２またはそれ以上の異なるアイソフォームで存在する他の細胞内レセプター、例えば、アンドロゲンレセプターであることができる。それ以上の考慮されるレセプターのアイソフォーム選択的リガンドおよび／または組織選択的リガンドをスクリーニングするために、必要な変更を加えて本明細書に記載する方法およびキットを調節することは当業者の技量の範囲内に入る。
【００８９】
本発明の第１面に従うＰＲ−ＡまたはＰＲ−Ｂ特異的リガンドをスクリーニングする方法の適合は、いくつかの典型的なＰＲリガンドに関して実施例１において証明されている。ｉｎ ｖｉｖｏ試験の例は実施例２、３および４に記載されている。実施例５は、安定なトランスフェクションにより本発明によるＰＲアイソフォーム特異的細胞系統の産生に関する。
【００９０】
実施例
実施例１．アイソフォーム特異的ＰＲリガンドをスクリーニングする方法
ｈＰＲ−Ａ （第１細胞） またはｈＰＲ−Ｂ （第２細胞） を発現するプラスミドおよびホルモン的に応答性のＭＴＶプロモーターに連鎖されたＬＵＣリポーター遺伝子で安定にトレンスフェクトされた第１および第２細胞を使用して、本発明によるアイソフォーム特異的ＰＲリガンドをスクリーニングする方法実施する。本発明による細胞系統およびこの実施例において使用する細胞系統を得る方法は、実施例５に詳細に説明されている。
【００９１】
１０％ウシ胎児血清 （ＦＣＳ）、ペニシリン１００ Ｕ／ストレプトマイシン１００ μｇ／ｍｌ （Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、ｎｏ． Ａ２２１３）、Ｌ−グルタミン４  ｍｍｏｌ／ｌ （Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、ｎｏ． ２５０３０−０２４）、ピルビン酸ナトリウム１ ｍｍｏｌ／ｌ （Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、ｎｏ． Ｌ０４７３） および１×非必須アミノ酸 （Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、ｎｏ． Ｋ０２９３） を補充した、アール塩 （Ｅａｒｌ’ Ｓａｌｔｓ） を含む最小必須培地 （Ｓ−ＭＥＭ、Ｌ−グルタミンを含まない；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、ｎｏ． ２１０９０−０２２） の中の３７ ℃の温度において５％二酸化炭素の雰囲気下に、細胞を培養する。
【００９２】
トランス活性化アッセイのために、細胞を９６ウェルの皿上に播種し （２×１０４細胞／皿） 前述したように培地中で培養し、ただしＦＣＳの代わりに３％活性炭ストリップしたＦＣＳを使用する。４８時間後、細胞を前希釈被験化合物と接触させる。アゴニスト活性を決定するために、細胞を増加する濃度 （１０−６〜１０−１１ ｍｏｌ／ｌ） の被験化合物の存在下に培養する。リポーター遺伝子誘導の陽性対照として、細胞を１０−６〜１０−１１ ｍｏｌ／ｌのＲ５０２０ （プロメゲストン） で処理する。リポーター遺伝子誘導の陰性対照として、細胞を１％エタノール中で培養する。アンタゴニスト活性を決定するために、細胞を１０−１０ ｍｏｌ／ｌのＲ５０２０およびさらに増加する濃度 （１０−６〜１０−１１ ｍｏｌ／ｌ） の被験化合物で処理する。リポーター遺伝子転写の誘導の陽性対照として、細胞を増加する濃度 （１０−７〜１０−１２ ｍｏｌ／ｌ） の抗プロゲステロンのミフェプリストンの存在下に培養する。リポーター遺伝子転写の誘導の陰性対照として、細胞を１％エタノール中で培養する。
【００９３】
被験化合物と２４時間インキュベートした後、培地を除去し、細胞を２０ μｌの溶解緩衝液 （ルシフェラーゼアッセイ系Ｅ １５３Ａ；Ｐｒｏｍｅｇａ） でプレートを攪拌しながら１０分間溶解する。３０ μｌのルシフェラーゼ試薬 （ルシフェラーゼアッセイ系Ｅ １５１Ａ ＋ １５２Ａ；Ｐｒｏｍｅｇａ） を３０秒／プレート以内に添加した後、ルシフェラーゼリポーター遺伝子産物の活性をＭｉｃｒｏｌｉｔｅ ＭＬ ３０００マイクロタイタープレートルミノメーター （Ｄｙｎａｔｅｃｈ） によりサイクルモードで測定する。
【００９４】
応答の評価は作動性および拮抗性の両方について効率［％］を与え、そしてＥＤ５０ （拮抗性について） およびＩＣ５０ （拮抗性について） 値は効力［ｎＭ］を与える。これらの値の計算は次のようにして実施する：
【００９５】
【数１】
2004516841.tif 000002
【００９６】
こうして、各被験リガンドについての効率［％］および効力［ｎＭ］を計算することができる。異なる被験リガンドについて達成された、いくつかの効率の結果を下に記載する：
上に説明したように、ＰＲアイソフォームの１つ、ＡまたはＢについて試験したリガンドの選択性は、ＰＲ−ＡおよびＰＲ−Ｂについて達成された転写の差として定義され、これは１０％より大きいか、あるいはそれに等しく、好ましくは１５％より大きいか、あるいはそれに等しく、より好ましくはなおより高く、例えば、２０％より大きいか、あるいはそれに等しくなくてはならず、および／またはこのようなリガンドについて達成された効力の差として定義され、これは少なくとも１０倍でなくてはならない。
【００９７】
結果：
ＰＲ−Ａに対する選択性を有する純粋なアゴニスト：
【００９８】
ａ）    １３−エチル−９，１１−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−（１１α，１７α）−６’Ｈ−ベンゾ［１０，９，１１］−１８，１９−ジノルプレグナ−４，９（１１），２０−トリエン−３−オン （ＷＯ ９５／２７７２５およびＷＯ ９４／０９０２５に開示されている）：
【化１】
2004516841.tif 000003
【００９９】
作動性効率 （ＰＲ−Ａ） ：１３２％；拮抗性効率 （ＰＲ−Ａ） ：なし。
作動性効率 （ＰＲ−Ｂ） ：１０８％；拮抗性効率 （ＰＲ−Ｂ） ：なし。
作動性効率の差 （ＰＲ−Ａ − ＰＲ−Ｂ） ：２４％ （ＰＲ−Ａ選択性を示す）。
【０１００】
ｂ）    １３−エチル−９，１１−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−（１１α，１７α）−６’Ｈ−ベンゾ［１０，９，１１］−１８，１９−ジノルプレグナ−４，９（１１）−ジエン−２０−イン−３−オン：
【化２】
2004516841.tif 000004
【０１０１】
作動性効率 （ＰＲ−Ａ） ：１２９％；拮抗性効率 （ＰＲ−Ａ） ：なし。
作動性効率 （ＰＲ−Ｂ） ：１０８％；拮抗性効率 （ＰＲ−Ｂ） ：なし。
作動性効率の差 （ＰＲ−Ａ − ＰＲ−Ｂ） ：２１％ （ＰＲ−Ａ選択性を示す）。
【０１０２】
ｃ）    ９，１１−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−（１１α，１７α）−６’Ｈ−ベンゾ［１０，９，１１］−１９−ノルプレグナ−４，９（１１），１５−トリエン−２０−イン−３−オン （ＷＯ ９５／２７７２５およびＷＯ ９４／０９０２５に開示されている）：
【化３】
2004516841.tif 000005
【０１０３】
作動性効率 （ＰＲ−Ａ） ：１３１％；拮抗性効率 （ＰＲ−Ａ） ：なし。
作動性効率 （ＰＲ−Ｂ） ：１１４％；拮抗性効率 （ＰＲ−Ｂ） ：なし。
作動性効率の差 （ＰＲ−Ａ − ＰＲ−Ｂ） ：１７％ （ＰＲ−Ａ選択性を示す）。
ＰＲ−Ｂに対する選択性を有する純粋なアゴニスト：
【０１０４】
ａ）   １７−アセトキシ−６−メチル−４，６−プレグナジエン−３，２０−ジオン：
【化４】
2004516841.tif 000006
【０１０５】
作動性効率 （ＰＲ−Ａ） ：３５％；拮抗性効率 （ＰＲ−Ａ） ：なし。
作動性効率 （ＰＲ−Ｂ） ：８１％；拮抗性効率 （ＰＲ−Ｂ） ：なし。
作動性効率の差 （ＰＲ−Ｂ − ＰＲ−Ａ） ：１７％ （ＰＲ−Ｂ選択性を示す）。
【０１０６】
ｂ）    １７−（アセチルオキシ）−９，１１−ジヒドロ−６−メチル−（６α，１１α）−６’Ｈ−ベンゾ［１０，９，１１］−１９−ノルプレグナ−４，９（１１）−ジエン−３，２０−ジオン （ＷＯ ９５／２７７２５およびＷＯ ９４／０９０２５に開示されている）：
【化５】
2004516841.tif 000007
【０１０７】
作動性効率 （ＰＲ−Ａ） ：５０％；拮抗性効率 （ＰＲ−Ａ） ：なし。
作動性効率 （ＰＲ−Ｂ） ：９０％；拮抗性効率 （ＰＲ−Ｂ） ：なし。
作動性効率の差 （ＰＲ−Ｂ − ＰＲ−Ａ） ：４０％ （ＰＲ−Ｂ選択性を示す）。
【０１０８】
ｃ）   １−（３−ブロモフェニル）−Ｎ−（１，３−ジヒドロ−１−オキソ−５−イソベンゾフラニル）−α−ヒドロキシ−α−（トリフルオロメチル）−シクロプロパンプロパナミド （ＷＯ ９８／５４１５９に開示されている）：
【化６】
2004516841.tif 000008
【０１０９】
作動性効率 （ＰＲ−Ａ） ：８１％；拮抗性効率 （ＰＲ−Ａ） ：なし。
作動性効率 （ＰＲ−Ｂ） ：１０６％；拮抗性効率 （ＰＲ−Ｂ） ：なし。
作動性効率の差 （ＰＲ−Ｂ − ＰＲ−Ａ） ：２５％ （ＰＲ−Ｂ選択性を示す）。
【０１１０】
ｄ）    １３−ジエチル−５’，９−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−（１７α）−６’Ｈ−ベンゾ［１０，９，１１］−１８，１９−ジノルプレグナ−４，９（１１），１５−トリエン−２０−イン−３−オン （ＷＯ ９４／０９０２５に開示されている）：
【化７】
2004516841.tif 000009
【０１１１】
作動性効率 （ＰＲ−Ａ） ：８５％；拮抗性効率 （ＰＲ−Ａ） ：なし。
作動性効率 （ＰＲ−Ｂ） ：１０８％；拮抗性効率 （ＰＲ−Ｂ） ：なし。
作動性効率の差 （ＰＲ−Ｂ − ＰＲ−Ａ） ：２３％ （ＰＲ−Ｂ選択性を示す）。
【０１１２】
ｅ）   ５−｛［２−ヒドロキシ−４−フェニル−２−（トリフルオロメチル）フェニル］アミノ｝−１（３Ｈ）−イソベンゾフラノン （ＷＯ ９８／５４１５９に開示されている）：
【化８】
2004516841.tif 000010
【０１１３】
作動性効率 （ＰＲ−Ａ） ：３９．９％；拮抗性効率 （ＰＲ−Ａ） ：なし。
作動性効率 （ＰＲ−Ｂ） ：５６．８％；拮抗性効率 （ＰＲ−Ｂ） ：なし。
作動性効率の差 （ＰＲ−Ｂ − ＰＲ−Ａ） ：１７％ （ＰＲ−Ｂ選択性を示す）。
ＰＲ−Ｂに対する選択性 （作動性） およびＰＲ−Ａに対する選択性 （拮抗性） を有する部分的アゴニスト：
【０１１４】
ａ）   α−ヒドロキシ−Ｎ−［４−ニトロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル］−α−（トリフルオロメチル）−ベンゼンブタンアミド （ＥＰ ２５３ ５０３に開示されている）：
【化９】
2004516841.tif 000011
【０１１５】
作動性効率 （ＰＲ−Ａ） ：１８％；拮抗性効率 （ＰＲ−Ａ） ：５９％。
作動性効率 （ＰＲ−Ｂ） ：５９％；拮抗性効率 （ＰＲ−Ｂ） ：３６％。
作動性効率の差 （ＰＲ−Ｂ − ＰＲ−Ａ） ：４１％ （ＰＲ−Ｂ選択性を示す）。
拮抗性効率の差 （ＰＲ−Ａ − ＰＲ−Ｂ） ：２３％ （ＰＲ−Ａ選択性を示す）。
【０１１６】
ｂ）    １７−（アセチルオキシ）−６−クロロ−９，１１−ジヒドロ− （１１α）−シクロペンタ［１０，９，１１］−１９−ノルプレグナ−４，６，９（１１）−トリエン−３，２０−ジオン （ＷＯ ９５／１１９１５に開示されている）：
【化１０】
2004516841.tif 000012
【０１１７】
作動性効率 （ＰＲ−Ａ） ：２９％；拮抗性効率 （ＰＲ−Ａ） ：４５％。
作動性効率 （ＰＲ−Ｂ） ：５０％；拮抗性効率 （ＰＲ−Ｂ） ：３０％。
作動性効率の差 （ＰＲ−Ｂ − ＰＲ−Ａ） ：２１％ （ＰＲ−Ｂ選択性を示す）。
拮抗性効率の差 （ＰＲ−Ａ − ＰＲ−Ｂ） ：１５％ （ＰＲ−Ａ選択性を示す）。
【０１１８】
実施例２．ラット乳房上皮における増殖／分化作用についてのバイオアッセイ  この試験の目的は、乳腺の発生、原理的には、エストロゲンプライムドラットにおける乳腺の末端芽 （ｔｅｒｍｉｎａｌ ｅｎｄ ｂｕｄｓ） の形成に対するプロゲスチン （ＰＲリガンド） の作用を評価することである。
【０１１９】
未熟雌ラット （Ｗｉｓｔａｒ Ｈａｎ、ＳＰＦ） を２１日の日齢において処置開始前４〜６日に卵巣摘出する。動物を標準エストロゲン （エストロン、７０ μｇ／ｋｇ） および被験リガンド （適用体積：０．１ ｍｌ／５０ｇ体重；賦形剤：ベンジルベンゾエート／ヒマシ油 （１ ＋ ４ ｖ／ｖ） ；皮下） で６日間処置する。対照群は、例えば、賦形剤、プロゲスチンを含まないエストラジオール、エストラジオール ＋ 既知のプロゲスチン、例えば、Ｒ５０２０である。６日の処置後、動物を二酸化炭素で殺す。
【０１２０】
ホールマウント染色のために、動物の左腹鼠径乳房領域において毛を剃り、この領域を皮膚と一緒に体から切断する。組織学的／免疫組織化学的分析のために、右腹鼠径乳腺をそれに付着する結合組織と一緒に切断し、ＰＢＳ （リン酸緩衝生理食塩水；Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含まない） 中の３．７％ホルマリン中で固定する。
【０１２１】
ホールマウント染色：
調製物をＴｅｌｌｙｅｓｎｉｃｚｋｙの方法 （下文参照） に従いアルコール−ホルマリン中で一夜固定する。次いで乳腺およびそれに付着する皮下組織を皮膚からストリップし、調製物を再び一夜固定する。それ以上の工程は次の通りである：エタノール７０％：１．５時間；アセトン：３×１．５時間；アセトン：一夜；イソプロパノール：１．５時間；エタノール９６％：２時間；ヘマトキシリン−鉄：３時間；ＶＥ水：まず調製物をすすぎ、次いで２×０．５時間；エタノール７０％：一夜；エタノール８０％：１．５時間；エタノール９６％：１．５時間；イソプロパノール：１．５時間。次いで調製物をペトリ皿に移し、トルエンの中にほぼ１時間、すなわち、調製物が浮かぶのを止めるまで放置する。次いで調製物をヒマラヤスギ油 （Ｍｅｒｋ、ｎｏ． １．０６９６５） で処理する。上記インキュベーション時間は最小時間であり、延長できる。特に、固定後のエタノール７０％中のインキュベーションは少なくとも２．５週に延長することができる。
【０１２２】
ホールマウント染色に必要な溶液の調製：
ａ）   Ｔｅｌｌｙｅｓｎｉｃｚｋｙに従うアルコール−ホルマリン：ホルムアルデヒド３７％：８１．８ ｍｌ、エタノール７０％：１６３６ ｍｌ、氷酢酸 （使用直前に添加すべきである）：８１．８ ｍｌ （合計：１８００ ｍｌ）。
ｂ）   ヘマトキシリン母液：ヘマトキシリン （Ｍｅｒｋ、ｎｏ． １．１５９３８）：１０ ｇ、エタノール９６％：１００ ｍｌ。この溶液を使用前に３７℃において４８時間放置しなくてはならない。それはほとんど無限時間の間暗所に保持することができる。
【０１２３】
ｃ）   使用するためのヘマトキシリン−鉄溶液：ヘマトキシリン母液 （濾過した） ：１５．２ ｍｌ、エタノール９６％：１３７４ ｍｌ、ＦｅＣｌ３×６Ｈ２Ｏ （ｓ． ４）：９１．１ ｍｌ、１ ｍｏｌ／ｌ ＨＣｌ：２２０ ｍｌ （合計：１７００ ｍｌ）；２ ｍｏｌ／ｌ ＮａＯＨでｐＨ １．２５に調節する。
ｄ）   ＦｅＣｌ３×６Ｈ２Ｏ溶液：ＦｅＣｌ３×６Ｈ２Ｏ （Ｍｅｒｋ、ｎｏ． １．０３９４３）：１．０７ ｇ、ＶＥ水：９０．２ ｍｌ、ＨＣｌ：３７％：０．９２ ｍｌ （合計：９１．１ ｍｌ）。
４０倍の倍率により、尾の方向における乳首付近の末端芽を計数する。研究すべき面積は約１．８ ｍｍ３すべきである。十分に分化した調製物について、この面積を減少させることができ、少なくとも２５０芽が計数される。計数後、末端芽の数／ｍｍ２が計算される。
【０１２４】
評価：
被験化合物のプロゲステロン作用を限界値 （有意なプロゲステロン作用が最初に認められる濃度） として決定するか、あるいは０．３ ｍｇ／ｋｇ／日に等しい効率である投与量を決定する。
【０１２５】
ＭＩＢ−５免疫組織化学 （Ｃ． Ｇｅｒｌａｃｈ他、Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ． １９９７、７７（６）、６９７−６９８、変更を伴う）：
乳腺を４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で２４時間固定し、パラフィンの中に埋め込む。４ μｍの切片をスライド上に広げ、脱パラフィンし、クエン酸塩緩衝液ｐＨ ６．０中で１０分間マイクロ波処理し、ＰＢＳですすぐ。次いでスライドを３％Ｈ２Ｏ２／メタノールで１５分間、Ｂｌｏｃｋｉｎｇｋｉｔ （Ｖｅｃｔｏｒ、ｎｏ． ＳＰ−２００１） で１０分間、そしてＰＢＳ中で１：２に希釈したラット血清 （Ｓｉｇｍａ、ｎｏ． Ｓ−７６４８） で３０分間処理して非特異的染色を減少させ、ＰＢＳ中ですすぐ。
【０１２６】
スライドをモノクローナル抗体ＭＩＢ−５ （Ｄｉａｎｏｖａ、ｎｏ． Ｄｉａ−５０５５） （これはラットＫｉ−６７抗原に対して特異的である） （ＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ中で１：２００に希釈した） と１時間インキュベートする。次いで、スライドをＰＢＳ／０．２％ツイーン２０中で２回洗浄し、ビオチニル化ラット抗マウス二次抗体 （Ｄｉａｎｏｖａ、ｎｏ． ４２５−０６６−１００） （ＰＢＳ／０．２％ツイーン２０中で１：２００に希釈した） と１時間インキュベートし、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体 （Ｖｅｃｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ Ｋｉｔ ｎｏ．ＰＫ−６１００） と１時間インキュベートした後、再びＰＢＳ／０．２％ツイーン２０中で２回洗浄する。ジアミノベンジジン （Ｚｙｍｅｄ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ） により、染色を実施する。すべての工程を室温において実施する。
【０１２７】
評価：
被験化合物を特性決定するために、乳房上皮を染色したＭＩＢ−５の百分率を決定する。
【０１２８】
実施例３．ラットにおける妊娠維持試験
ラットにおいて、卵巣除去は妊娠の停止を誘導する。プロゲスチン （エストロゲンと組み合わせた） は卵巣除去した動物における妊娠を維持することができる。しかしながら、卵巣除去ラットにおける妊娠維持の程度は規定した投与量範囲においてのみ最適である。したがって、より高いならびにより低い投与量は一般に弱い作用を誘導する。規定投与量のエストロン （Ｅ１） による付随する処置は、プロゲスチンの妊娠維持作用を増加させる。
【０１２９】
１９０〜２２０ ｇの妊娠ラット （Ｗｉｓｔａｒ Ｈａｎ、ＳＰＦ） （５〜８動物／投与） を妊娠８日に、最初の物質投与後２時間に卵巣摘出する。８〜１４日に、ラットを毎日被験化合物と標準投与量のＥ１との組み合わせで処置する。１日後、動物を二酸化炭素で殺す。各動物について、胚の心拍に従い生きている胎児および死亡した胎児の数を決定する。子宮が空の場合において、１０％硫化アンモニウム溶液を使用する染色により着床部位の数を決定する。
【０１３０】
被験化合物およびエストロンの処方および適用：
ｓ．ｃ． （皮下） 適用：被験化合物をベンジルベンゾエート／ヒマシ油 （１ ＋ ４ ｖ／ｖ） 中に溶解し、１日量を１ ｍｌ／ｋｇ体重の体積で投与する。
ｐ．ｏ． （経口） 適用：被験化合物をキャリヤー液体 （１００ ｍｌの０．９％ｗ／ｖ ＮａＣｌ溶液中の８５ ｍｇのＭｙｒｊＲ） の中に懸濁させ、１日量を２ ｍｌ／ｋｇ体重の体積で投与する。
ｌ．ｐ． （腹腔内） 適用：被験化合物をポリプロピレングリコール中に溶解し、ラットの腹腔内に配置された微小浸透圧ポンプ （２００Ｉ型、１０ μｌ／時、７日間） の中に供給する。
エストロンの標準投与量は０．００５ ｍｇ／ｋｇ体重ｓ．ｃ．であり、ベンジルベンゾエート／ヒマシ油 （１．４ ｖ／ｖ） 中に溶解する。
【０１３１】
評価：
妊娠維持／動物［％］、妊娠維持／投与量 （単一値のメジアン） およびＥＤ５０ （妊娠が動物の５０％において維持される投与量；１００％は卵巣摘出しない対照動物に対応する） が決定される。
【０１３２】
実施例４．ラットにおける排卵阻害試験
処置を開始する前に、雌ラット （Ｗｉｓｔａｒ Ｈａｎ、ＳＰＦ；体重：１９０〜２１０ ｇ） の２月経サイクルを監視する。規則的４日サイクルを有する動物のみを引き続く試験のために使用する。発情後期において開始して、被験化合物を４日間 （第１〜４日） 投与し、その後サイクルをコントロールする。
【０１３３】
皮下適用のために、被験化合物をベンジルベンゾエート／ヒマシ油 （１ ＋ ９ ｖ／ｖ） 中に溶解し、１日量を１ ｍｌ／ｋｇ体重の体積で投与する。
経口 適用のために、被験化合物をキャリヤー液体 （１００ ｍｌの０．９％ｗ／ｖ ＮａＣｌ溶液中の８５ ｍｇのＭｙｒｊＲ） の中に懸濁させ、１日量を２ ｍｌ／ｋｇ体重の体積で投与する。
第４日に、被験化合物の適用後、発情期または発情後期の動物を１つ側においてエーテル麻酔下に卵巣摘出する。管調製物を調製し、顕微鏡により卵巣を検査する。第５日に、すべての動物 （完全なおよび部分的に卵巣摘出した） を二酸化炭素で殺し、管を保存し、同一方法で分析する。
評価：
どれだけの数の動物の排卵が阻害されるかを、百分率として、決定する。
【０１３４】
実施例５．安定なトランスフェクション
リポフェクタミン試薬 （Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、ベルリン）を使用して、安定なトランスフェクションを実施した。ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を６ウェルの皿上に５×１０５細胞／皿の密度で播種する。典型的には、細胞は２４時間後に約８０％のコンフルエントであった。トランスフェクション前に、細胞を１ ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ （Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、ベルリン）／皿で２回洗浄した。各皿について、それぞれ５ μｇのＤＮＡ （ｐＲＳＶｈＰＲ−ｎｅｏ：ＰＲ−Ｂプラスミド） または１０ μｇのＤＮＡ （５ μｇのｐｈＰＲ−２：ＰＲ−Ａプラスミドおよび５ μｇのｐＲＳＶ−ｎｅｏ） を５００ μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭで希釈した。
【０１３５】
次に、ＤＮＡおよびリポフェクタミン試薬の希釈物をポリスチレン製スナップキャップ管中で組み合わせて、１ ｍｌのトランスフェクション溶液／皿を調製し、おだやかに混合し、室温において４５分間インキュベートし、洗浄した細胞に添加した。５時間後、１０％ＦＣＳを補充した２ｍｌのＳ−ＭＥＭでトランスフェクション溶液を置換した。４８時間後、細胞をトリプシン処理し、１００皿上にそれぞれ３×１０４および１．５×１０４の密度で再プレートした。
【０１３６】
８００ μｇのＧ４１８を補充した培地中で、ｐＲＳＶｈＰＲ−ｎｅｏまたはｐｈＰＲ−２およびｐＲＳＶ−ｎｅｏで安定にトランスフェクトされたＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞クローンを選択した。ネオマイシン耐性クローンはｐＭＴＶ−ＬＵＣおよびｐＳＶ２ｐａｃで安定にトレンスフェクトされ、４００ ｍｇ／ｍｌのＧ４１８および０．２ ｍｇ／ｍｌのプロマイシンを補充した培地中で選択した。最後に、クローンＳＫ−Ｎ−ＭＣ Ｃ ２３．４３ （ＰＲ−ＡおよびＭＴＶ−ＬＵＣを安定に発現する） およびクローンＳＫ−Ｎ−ＭＣ ＶＩＩＩ １．１ （ＰＲ−ＢおよびＭＴＶ−ＬＵＣを安定に発現する） をトランス活性化研究のために選択した。
【０１３７】
前述した安定なトランスフェクションのためのプラスミドを次のようにして得た：
ＰＲ−Ａについて：
ｐｈＰＲ−２：            Ｋａｓｔｎｅｒ他、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９０、２６５、１２１６３−１２１６７に従う。
ｐＭＴＶ−ＬＵＣ：          Ａ． Ｃａｔｏ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｅｒ Ｇｅｎｅｔｉｋ、Ｋｅｍｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ Ｋａｒｌｓｒｕｈｅから入手した。
ｐＲＳＶ−ｎｅｏ：          ａ） ＳＶ２−ＣＡＴからのｐＲＳＶ−ＣＡＴの構築（Ｇｏｒｍａｎ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １９８２、７９、６７７７−６７８１参照） 。
ｂ） ｐＲＳＶ−ＣＡＴからのｐＲＳＶ−ｎｅｏの構築（Ｇｏｒｍａｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８３、２２１、５５１−５５５）。
ｐＳＶ２ｐａｃ：            Ｐ． Ａｒｔｅｌｔ、Ｇｅｎｅ １９８８、６８、２１３−２１９に従う。
【０１３８】
ＰＲ−Ｂについて：
ｐＲＳＶｈＰＲ−ｎｅｏ：       ｐＲＣ／ＲＳＶ （ＳＶ４０初期プロモーターから発現されたネオマイシン耐性遺伝子を含有する；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サンディエゴ、から入手した） およびｈＰＲ−１ （Ｋａｓｔｎｅｒ他、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９０、２６５、１２１６３−１２１６７） から構築した。
ベクターｐＲＣ／ＲＳＶをＮｏｔＩおよびＸｂａＩで消化する；インサートのために、ｈＰＲ−１をＥｃｏＲＩで消化し、ＮｏｔＩでリンカー結合し、ＮｏｔＩおよびＸｂａＩで制限消化して２．８ ｋｂのフラグメントを形成し、これを単離し、上記ベクターの中に結合する。
ｐＭＴＶ−ＬＵＣ：   Ａ． Ｃａｔｏ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｅｒ Ｇｅｎｅｔｉｋ、Ｋｅｍｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ Ｋａｒｌｓｒｕｈｅから入手した。
ｐＭＰＳＶＥＨ：            Ｐ． Ａｒｔｅｌｔ、Ｇｅｎｅ １９８８、６８、２１３−２１９に従う。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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