(57)【要約】三本鎖複合体は、二本鎖核酸標的に結合された一本鎖プローブを含み、該一本鎖プローブはヘテロポリマー核酸またはヘテロポリマー核酸類似体から成る。複合体のすべての塩基トリプレットは、Ａ−Ｔ−Ａ、Ｔ−Ａ−Ｔ、Ｕ−Ａ−Ｔ、Ｔ−Ａ−Ｕ、Ａ−Ｕ−Ａ、Ｕ−Ａ−Ｕ、Ｇ−Ｃ−ＧおよびＣ−Ｇ−Ｃから成る群より選択されたメンバーである。陽イオンにより促進される測定法は、プローブと標的配列の間の相補性の程度を決定するためにそのような三本鎖複合体の存在を検出することを含む。測定法は好ましくは、プローブと標的の間の結合親和性の関数として標識の蛍光強度の変化を検出する。標識は、プローブまたは標的に共有結合で結合されてもよいし、あるいは反応媒質中の挿入用フルオロフォアであってもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖核酸標的に結合された一本鎖プローブを含み、該一本鎖プローブはヘテロポリマー核酸またはヘテロポリマー核酸類似体から成る三本鎖複合体であって、該三本鎖複合体のすべての塩基トリプレットはＡ−Ｔ−Ａ、Ｔ−Ａ−Ｔ、Ｕ−Ａ−Ｔ、Ｔ−Ａ−Ｕ、Ａ−Ｕ−Ａ、Ｕ−Ａ−Ｕ、Ｇ−Ｃ−ＧおよびＣ−Ｇ−Ｃから成る群より選択されたメンバーである三本鎖複合体。
【請求項２】
前記複合体が存在する媒質のｐＨは７．６よりも大きい、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記一本鎖核酸または核酸類似体は３０塩基の長さであり、前記二本鎖核酸標的は８〜３．３×１０９塩基対の長さである、請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
前記標的配列は２５％〜７５％のブリン塩基と７５％〜２５％のピリミジン塩基を任意の順序で含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項５】
前記プローブは二本鎖核酸開裂剤に共有結合で結合されている、請求項１に記載の複合体。
【請求項６】
前記プローブは化学療法薬に共有結合で結合されている、請求項１に記載の複合体。
【請求項７】
前記プローブは標識に共有結合で結合されている、請求項１に記載の複合体。
【請求項８】
前記標識は多分子シグナリング複合体、酸化還元対、化学発光物質、または電気化学発光物質である、請求項７に記載の複合体。
【請求項９】
前記標識はフルオロフォアである、請求項７に記載の複合体。
【請求項１０】
前記複合体の蛍光強度は前記プローブと前記標的配列間の結合親和性と正相関関係がある、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
結合を測定する方法であって、
標的配列を含み、該標的配列は少なくとも１つのブリン塩基と少なくとも１つのピリミジン塩基を含む、二本鎖核酸を提供する工程と、
核酸配列または核酸類似体配列を含むプローブを提供する工程と、
陽イオンを提供する工程と、
前記標的配列に前記プローブが結合された三本鎖複合体を含む試験試料を提供するために前記プローブ、前記標的配列、および前記陽イオンを媒質に添加する工程であって、該三本鎖複合体のすべての塩基トリプレットはＡ−Ｔ−Ａ、Ｔ−Ａ−Ｔ、Ｕ−Ａ−Ｔ、Ｔ−Ａ−Ｕ、Ａ−Ｕ−Ａ、Ｕ−Ａ−Ｕ、Ｇ−Ｃ−ＧおよびＣ−Ｇ−Ｃから成る群より選択されたメンバーである工程と、
試験試料に蛍光放射線を発させるために励起放射線で前記試験試料を照射する工程と、
前記蛍光放射線の強度を検出する工程であって、該強度は前記プローブと前記標的配列間の結合親和性と相関する工程と、
前記強度から前記プローブと前記標的配列間の対合の程度を決定する工程とから成る方法。
【請求項１２】
前記決定する工程は、前記強度を前記標的配列および前記陽イオンと結合させた他のプローブにより示された強度に対して較正することにより行われ、前記他のプローブの少なくとも１つは、少なくとも１塩基だけ前記プローブと異なっている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的配列に対して、前記プローブの各々および前記他のプローブは、完全対合、１塩基誤対合、２塩基誤対合、３塩基誤対合、１塩基欠失、２塩基欠失および３塩基欠失から成る群より選択された異なるメンバーである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記結合親和性を定量する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的配列に対するまたは前記プローブに対する信号消光物質を提供せずに行われる均質測定法である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的配列を前もって変性させずに行われる均質測定法である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的配列をＰＣＲ増幅せずに行われる均質測定法である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的配列はｄｓＤＮＡであり、前記プローブは三本鎖を形成するために前記標的配列と特異的に結合する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記プローブはｓｓＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記プローブは部分的に荷電したバックボーンを有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記プローブは非荷電のバックボーンを有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
前記プローブはＰＮＡ配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記プローブは平行合成によって調製されたｓｓＰＮＡである、請求項１１に記載の方法。
【請求項２４】
前記プローブと前記標的配列は同じ長さである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記プローブは５〜３０ヌクレオチド長である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２６】
前記励起放射線はアルゴンイオンレーザーから約２００ｎｍ〜約１０００ｎｍの波長で発される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２７】
５〜８５℃の範囲の温度で行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項２８】
２５℃より低い温度で行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法の信頼性が、プローブの塩基配列、標的配列の塩基配列とは無関係であり、かつ、前記プローブおよび標的配列のグアニン含量、ならびに前記プローブおよび標的配列のシトシン含量とは無関係である、請求項１１に記載の方法。
【請求項３０】
前記試験試料は、約１０フェムトモルの標的配列と約１０フェムトモルのプローブを含む約２０マイクロリットルの体積を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料中の前記標的の濃度は５×１０−１０Ｍ以下である、請求項１１に記載の方法。
【請求項３２】
前記試料中の前記プローブの濃度は５×１０−１０Ｍ以下である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
バイオチップ上で行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項３４】
前記陽イオンは挿入用フルオロフォアであり、前記強度は前記結合親和性と正相関関係がある、請求項１１に記載の方法。
【請求項３５】
前記挿入用フルオロフォアは前記プローブに共有結合で結合されている、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記挿入用フルオロフォアは、前記標的配列からも前記プローブからも自由な形式で前記媒質に加えられる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記挿入用フルオロフォアはＹＯＹＯ−１、ＴＯＴＯ−１、臭化エチジウム、エチジウムホモ二量体−１、エチジウムホモ二量体−２およびアクリジンから成る群より選択されたメンバーである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記挿入用フルオロフォアが蛍光を発する波長は挿入が起こると第２の波長にシフトし、前記波長と前記第２の波長との差が、前記プローブと前記標的間の複合体が二本鎖であるかまたは三本鎖であるかということと、前記標的がＤＮＡであるかまたはＲＮＡであるかということとを示す、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記プローブは非挿入のフルオロフォアにより共有結合で標識され、前記強度が前記結合親和性と逆相関がある、請求項１１に記載の方法。
【請求項４０】
前記非挿入のフルオロフォアはビオチン、ローダミンおよびフルオレセインから成る群より選択されたメンバーである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
各Ｃ−Ｇ−ＣおよびＧ−Ｃ−Ｇ塩基トリプレット中の１つのシトシンが正に荷電している、請求項１１に記載の方法。
【請求項４２】
前記陽イオンはアルカリ金属陽イオン、アルカリ土類金属陽イオン、遷移金属陽イオン、Ｃｏ（ＮＨ３）６＋３、３価スペルミジンおよび４価スペルミンから成る群より選択された少なくとも１つのメンバーである、請求項１１に記載の方法。
【請求項４３】
前記陽イオンは５０ｍＭ〜１２５ｍＭの濃度で提供されたＮａ＋である、請求項１１に記載の方法。
【請求項４４】
前記陽イオンは１０ｍＭ〜３０ｍＭの濃度で提供されたＭｎ＋２であるか、１５ｍＭ〜２０ｍＭの濃度で提供されたＭｇ＋２であるか、または、２０ｍＭの濃度で提供されたＮｉ＋２である、請求項１１に記載の方法。
【請求項４５】
前記陽イオンは各々１０ｍＭ、各々１５ｍＭ、または各々２０ｍＭの濃度で提供されたＭｇ＋２とＭｎ＋２を含む、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
１．発明の属する技術分野
本発明は核酸三本鎖に関し、より詳細には蛍光強度測定値を使用して三本鎖核酸複合体を正確に測定する方法に関する。
【０００２】
２．関連技術の記載
蛍光染料は核酸を検出および定量化するために過去数十年間使用されてきた。蛍光染料の最も基本的な形式において、蛍光強度に基づく測定は、通常、蛍光発色団（フルオロフォア）を含むプローブと標的分子を接触させ、結合プローブから非結合プローブを除去し、洗浄した試料の蛍光を検出することから成る。均質測定法は、洗浄ステップや非液相支持体の設置を必要としない点で、そのような基本的測定法を改善している。
【０００３】
例えば、Ｌｉｖａｋらに付与された米国特許第５，５３８，８４８号およびＭａｇｇｉｏに付与された第４，２２０，４５０号は、溶液中でオリゴヌクレオチドプローブを使用した、ヌクレオチド配列の均質蛍光に基づく測定法を開示している。しかしながら、これらの特許では、ハイブリダイズしたプローブとハイブリダイズしていないプローブによって生成される信号を区別するために、消光剤をリポーター剤と組み合わせて使用することが必要である。Ｌｉｖａｋらは、開示した方法において、酵素の使用も必要としている。消光剤と酵素によって、開示した方法に複雑さと費用が増している。
【０００４】
Ｋｉｄｗｅｌｌに付与された米国特許第５，３３２，６５９号は、少なくとも２つの蛍光発色団部分を有するプローブを使用して、溶液中のヌクレオチド配列を検出する方法を開示している。蛍光発色団は、自身のスペクトルの波長依存性を変えるのに十分なほど接近している時に互いに電子的に相互作用するように、選択されなければならない。ハイブリダイズしていないプローブは標的配列にハイブリダイズしたプローブよりもはるかに柔軟性がある。従って、各プローブ上の２つの蛍光発色団部分は、プローブがハイブリダイズしている時よりもプローブがハイブリダイズしていない時に、互いに接近する可能性が高い。したがって、自由プローブに関連する放射波長の変化を、試料中の自由プローブの量の指標としてモニタすることが可能である。
【０００５】
Ｗｕらの米国特許第５，８４６，７２９号も、核酸検出のための蛍光に基づく均質測定法を開示している。
蛍光強度を検出する上述の進展の他に、蛍光偏光測定法の利点を説いているものもある。しかしながら、偏光に基づく測定法には目立った欠点がある。結合の関数として偏光の変化の程度は予測不能であることがある。また、矛盾するデータを理論期待値に適合させるデータの解釈では、特に方法が自動化される場合には、分析法で望まれるよりも多くの努力が必要とされることがある。同様に、蛍光偏光測定法でその運動が評価される分子の分子量から、制約も生じている。
【０００６】
核酸の従来の測定法は、一般に、一本鎖プローブを相補的な一本鎖標的配列に特異的に結合させる二本鎖ハイブリダイゼーションモデルに基づいていた。核酸の三本鎖ハイブリダイゼーションは以前から当該技術分野では同定されていたが、三本の鎖の間のハイブリダイゼーションは、非常に限られた種の核酸（例えばポリプリンまたはポリピリミジン配列）に限定されると主に考えられていた。例えばＦｌｏｒｉｓら、「原子価塩混合溶液におけるプリン−プリン−ピリミジン三重らせん形成に対する陽イオンの影響（Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｃａｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ｐｕｒｉｎｅ−ｐｕｒｉｎｅ−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ　ｔｒｉｐｌｅｘ　ｈｅｌｉｘ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍｉｘｅｄ−ｖａｌｅｎｃｅ　ｓａｌｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）」、２６０　Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８０１−８０９（１９９９）を参照されたい。さらに、そのような三本鎖形成やハイブリダイゼーションは、ワトソン−クリック塩基対形成ではなく、隣接する核酸塩基の限定的な種類間のＨｏｏｇｓｔｅｅｎ結合に基づいていた。例えばＦｌｏｒｉｓらおよびＤｅｒｖａｎらの米国特許第５，８７４，５５５号を参照されたい。
【０００７】
以上の進展にもかかわらず、核酸および／または核酸類似体の間の相互作用を分析するための、単純で、感度が非常に高く、有効で、迅速な方法が当該技術分野では依然として必要とされている。
本明細書に引用した参考文献はすべて、参照によりその全体が本明細書に組込まれる。
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、二本鎖核酸標的に結合された一本鎖プローブを含み、該一本鎖プローブはヘテロポリマー核酸またはヘテロポリマー核酸類似体から成る、三本鎖複合体であって、該三本鎖複合体のすべての塩基トリプレットはＡ−Ｔ−Ａ、Ｔ−Ａ−Ｔ、Ｕ−Ａ−Ｔ、Ｔ−Ａ−Ｕ、Ａ−Ｕ−Ａ、Ｕ−Ａ−Ｕ、Ｇ−Ｃ−ＧおよびＣ−Ｇ−Ｃから成る群より選択されたメンバーである三本鎖複合体を提供する。
【０００９】
本発明はまた、結合を測定する方法であって、
標的配列を含み、該標的配列は少なくとも１つのブリン塩基と少なくとも１つのピリミジン塩基を含む、二本鎖核酸を提供する工程と、
核酸配列または核酸類似体配列を含むプローブを提供する工程と、
陽イオンを提供する工程と、
前記標的配列に前記プローブが結合された三本鎖複合体を含む試験試料を提供するために前記プローブ、前記標的配列、および前記陽イオンを媒質に添加する工程であって、該三本鎖複合体のすべての塩基トリプレットはＡ−Ｔ−Ａ、Ｔ−Ａ−Ｔ、Ｕ−Ａ−Ｔ、Ｔ−Ａ−Ｕ、Ａ−Ｕ−Ａ、Ｕ−Ａ−Ｕ、Ｇ−Ｃ−ＧおよびＣ−Ｇ−Ｃから成る群より選択されたメンバーである工程と、
試験試料に蛍光放射線を発させるために励起放射線で前記試験試料を照射する工程と、
前記蛍光放射線の強度を検出する工程であって、該強度は前記プローブと前記標的配列間の結合親和性と相関する工程と、
前記強度から前記プローブと前記標的配列間の対合の程度を決定する工程と
から成る方法も提供する。
本発明を、同様な参照数字が同様な要素のことを指す図面に関連付けて説明する。
【００１０】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、二本鎖核酸標的に結合された一本鎖プローブを含み、該はヘテロポリマー核酸またはヘテロポリマー核酸類似体から成る三本鎖複合体であって、該三本鎖複合体のすべての塩基トリプレットはＡ−Ｔ−Ａ、Ｔ−Ａ−Ｔ、Ｕ−Ａ−Ｔ、Ｔ−Ａ−Ｕ、Ａ−Ｕ−Ａ、Ｕ−Ａ−Ｕ、Ｇ−Ｃ−ＧおよびＣ−Ｇ−Ｃから成る群より選択されたメンバーである三本鎖複合体を提供する。
【００１１】
先行技術によって開示された特定のＨｏｏｇｓｔｅｅｎ三本鎖とは異なり、本発明の三本鎖は７．６よりも大きいｐＨ値で安定している。さらに、本発明の三本鎖は、ある先行技術の三本鎖におけるようなホモピリミジン配列やホモプリン配列の存在を必要としない。例えば、２５％〜７５％のブリン塩基と７５％〜２５％のピリミジン塩基を任意の順序で含むことができる。
【００１２】
好ましくは、三本鎖の一本鎖核酸または核酸類似体は３０塩基の長さであり、前記二本鎖核酸標的は８〜３．３×１０９塩基対の長さである。
本発明による三本鎖形成は様々な用途に適している。例えば、二本鎖核酸開裂剤に共有結合で結合されたプローブは、二本鎖核酸の標的配列を特異的に開裂させるために使用することができる。化学療法薬に共有結合で結合されたプローブは、二本鎖核酸の標的配列を特異的に処理するために使用することができる。
【００１３】
好ましい実施形態では、本発明は、核酸配列または核酸類似体配列を含む二本鎖標的と核酸配列または核酸類似体配列を含む一本鎖プローブとの間の迅速で、感度が高く、環境にやさしく、安全な結合測定法を提供する。
【００１４】
特定の先行技術と異なり、本発明はプローブと標的間の特異的結合の存在を検出するだけでなく、プローブと標的間の相互作用の性質に関する定性的・定量的情報も提供する。従って、従事者は、プローブ中の塩基配列と二本鎖標的の鎖中の塩基配列との間に生じる完全対合、１つの塩基対誤対合、２つの塩基対誤対合、３つの塩基対誤対合、１つの塩基対欠失、２つの塩基対欠失および３つの塩基対欠失を、本発明によって区別することができる。
【００１５】
本発明の実施形態は、第１のプローブ標的混合物について測定した信号（例えば蛍光強度）を、同じ標的と結合させた他のプローブによって示された同じ型の信号に対して較正することを含む。ここで、他のプローブの各々は、少なくとも１つの塩基だけ、第１のプローブと異なっている。
【００１６】
測定した信号（例えば蛍光強度）の大きさが標的とプローブ間の結合親和性の関数である検量線を生成することが可能である。標的と複数の異なるプローブ間の結合親和性は、誤対合塩基の数、誤対合の性質（Ａ−Ｇ対Ａ−Ｃ対Ｔ−Ｇ対Ｔ−Ｃなど）、三本鎖の内部の誤対合の位置等に伴って変化するため、本発明の測定方法を、標的の配列決定を行うために使用することが可能である。
【００１７】
ある実施形態では、測定した信号は試験試料に含まれるフルオロフォアの蛍光強度とすることができる。そのような実施形態では、フルオロフォアが信号消光あるいは信号増幅のいずれによりハイブリダイゼーションの信号を送るか否かにより、プローブと標的間の結合親和性は強度と正相関または逆相関の関係となる。選択条件下で、挿入剤により発生する蛍光強度はプローブ−標的結合親和性と正相関し、プローブに共有結合により結合される挿入されないフルオロフォアを使用する好ましい実施形態の強度はプローブ−標的結合親和性と逆相関する。プローブと標的との間の対合の程度が、好ましくは０−２の誤対合および／または欠失を含む範囲において、より好ましくは０−３の誤対合および／または欠失を含む範囲において増加するにつれて、蛍光強度は減少する。
【００１８】
本発明はプローブと標的間の結合親和性の定量化を可能にする。そのような情報は、最適化された結合特性を有するアンチセンス薬を設計することを含めた様々な用途に有用であり得る。
【００１９】
先行技術の方法と異なり、本発明の測定法は好ましくは均質である。測定は、測定信号の大きさの検出に先立って自由プローブおよび標的からプローブ標的複合体を分離せずに行うことが可能である。測定はゲル分離ステップを必要としないため、試験のスループットの大きな増加を可能にする。定量分析は単純かつ正確である。従って、結合測定法は、多くの時間と費用を節約し、容易に自動化できる。さらに、結合測定法は、緩衝液、ｐＨ、イオン濃度、温度、インキュベーション時間、プローブ配列と標的配列の相対濃度、挿入剤濃度、標的配列の長さ、プローブ配列の長さ、および考えられる補因子の必要条件のような結合変数を、速やかに決定することを可能にする。
【００２０】
測定法は例えばウェル内の溶液中、不浸透性表面上またはバイオチップ上で実行することができる。
さらに、本発明の測定法は好ましくは、標的上のまたはプローブ上にシグナル消光剤を提供せずに行われる。
【００２１】
本願発明者はハイブリダイゼーションに対する蛍光強度測定法の利点を先に開示したが（例えば１９９８年１２月３１日出願の米国特許出願第０９／２２４，５０５号を参照）、本発明の測定法は、プローブと二本鎖標的間の三本鎖を特異的に検出し、標的を変性する必要性をなくす。核酸（および核酸類似体）プローブは、特定のクラスの標的と共に三本鎖を形成することが知られているが（例えばＥｇｈｏｌｍら、３６５　Ｎａｔｕｒｅ　５６６（１９９３）、Ｔｏｍａｃら、１１８　Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．５５４４（１９９６）参照）、本願発明者が、プローブと標的の間の相互作用が、例えばＤｅｒｖａｎらの三本鎖ハイブリダイゼーションの非常に限定的なＨｏｏｇｓｔｅｅｎモデルではなく、ワトソン−クリック塩基対合に基づいている（少なくともＡがＴ（またはＲＮＡの場合のＵ）に結合し、ＧがＣに結合するという意味で）、一本鎖核酸（例えばｓｓＤＮＡおよびＲＮＡ）プローブと二本鎖核酸（例えばｄｓＤＮＡ）標的との間に形成された三本鎖を特異的に測定できることは驚くべきことである。本明細書で使用する場合、用語「ワトソン−クリック三本鎖」は、一本鎖プローブと二本鎖標的の間の塩基対合の性質をＡ−Ｔ−Ａ、Ｔ−Ａ−Ｔ、Ｕ−Ａ−Ｔ、Ｔ−Ａ−Ｕ、Ａ−Ｕ−Ａ、Ｕ−Ａ−Ｕ、Ｇ−Ｃ−Ｇ、および／またはＣ−Ｇ−Ｃ（Ｃ＋−Ｇ−Ｃおよび／または任意の他のイオン化塩基種も含む）限定することにより、それらの違いを具体化させるように意図される。これらの３つのメンバーから成るグループは以下に示されるワトソン−クリック塩基トリプレットであり、生じる構造は示されるワトソン−クリック三本鎖である。
【００２２】
本発明の測定法に使用される適切なプローブには、例えばｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）、ＲＮＡ、ＰＮＡ、荷電していないかまたは部分的に荷電されたバックボーンを有する他の核酸類似体が含まれる。８個から２０個までの塩基の長さを有するプローブ配列が好まれる。なぜならそれが、原始核生物および真核生物のうちの最小の固有ＤＮＡ配列が見出される範囲だからである。１２〜１８個の塩基から成るプローブは、ヒトゲノムにおける最小の固有配列の長さであるので、特に好ましい。ある実施形態では、５〜３０塩基から成るプローブが最も好ましい。しかしながら、ヌクレオチド配列を固有に識別するために結合する複数の非固有の標的配列を有するヌクレオチド配列を検出するためには、複数のより短いプローブを使用してもよい。プローブの長さは標的の長さと対合するように選択することができる。
【００２３】
親米国出願出願番号第０９／４６８，６７９では、発明者は、一本鎖核酸（例えばｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｓＰＮＡ、およびＤＮＡまたはＲＮＡの他の類似体）プローブと二本鎖核酸（例えばｄｓＤＮＡ）標的間のワトソン−クリック塩基対に基づく様式で形成された種々の三本鎖を特異的に測定できるという驚くべき進展を開示した。発明者は三本鎖の形成および／または安定化が、試験中の試料に挿入剤が存在することによって増強されることを開示した。
【００２４】
本発明の開示は、試験中の試料に陽イオンが存在することによってワトソン−クリック三本鎖の形成および／または安定化が増強されることを開示することにより、先の開示を拡張するものである。適当な陽イオンには、Ｎａ＋（好ましくは５０ｍＭ〜１２５ｍＭの濃度）、Ｋ＋および他のアルカリ金属イオンのような一価陽イオン；アルカリ土類金属イオン（例えばＭｇ＋２およびＣａ＋２）および二価遷移金属イオン（例えばＭｎ＋２、Ｎｉ＋２、Ｃｄ＋２、Ｃｏ＋２およびＺｎ＋２）のような二価陽イオン；ならびにＣｏ（ＮＨ３）６＋３、３価のスペルミジンおよび４価のスペルミンのような、少なくとも３つの陽電荷を有する陽イオン；が含まれる。Ｍｎ＋２は、１０ｍＭ〜３０ｍＭの濃度で提供されることが好ましい。Ｍｇ＋２は、１５ｍＭ〜２０ｍＭの濃度で提供されることが好ましい。Ｎｉ＋２は、約２０ｍＭの濃度で提供されることが好ましい。ある実施形態では、Ｍｇ＋２とＭｎ＋２が、各々１０ｍＭ、各々１５ｍＭ、または各々２０ｍＭ（つまり各１０〜２０ｍＭ）の濃度で共に提供される。
【００２５】
三本鎖が生成する媒質に加えられる陽イオンの量は、陽イオンの性質、プローブの濃度、標的の濃度、追加の陽イオンの存在、ならびにプローブおよび標的の塩基含量を含む多くの要因によって決まる。好ましい陽イオン濃度と混合物は実験的に常法で検出することができる。
【００２６】
本発明は、危険で、労力を要し、かつ使用に時間がかかる放射性のプローブの使用を必要とせず、常に再生される必要はない。本発明のプローブは、好ましくは、安全に使用でき、何年も安定している。従って、プローブを多量に作成または注文し、保存することが可能である。
【００２７】
ある実施形態では、プローブは、多分子シグナリング複合体または酸化還元対と、または化学発光特性または電気化学発光特性を引き起こす標識で標識される。
【００２８】
プローブまたは標的の一方（好ましくはプローブ）が共有結合で結び付けられた蛍光標識を有することが好ましい。標識は好ましくは非挿入のフルオロフォアである。そのような実施形態では、フルオロフォアは、プローブのいずれかの端部に結び付けられることが好ましい。好ましい蛍光マーカーには、励起エネルギーで照射された時に蛍光を発するビオチン、ローダミンおよびフルオレセイン、および他のマーカーが含まれる。
【００２９】
励起波長は、使用されている蛍光発色団の励起最大値に対応させるために、（日常的な実験および／または慣習的な知識によって）選択され、好ましくは２００〜１０００ｎｍである。挿入剤は２００〜１０００ｎｍの発光波長を有するように好ましくは選択される。好ましい実施形態では、４００〜５４０ｎｍの波長を有する光で蛍光発色団を照射するためには、アルゴンイオンレーザーが使用され、蛍光の放出は５００〜７５０ｎｍの範囲で検出される。
【００３０】
本発明の測定法は、例えば５〜８５℃のような種々の温度にわたって行うことが可能である。ある先行技術の測定法では、高い温度が必要とされるため、測定のコストと遅れを増すこととなっている。他方、本発明は室温またはそれより低い温度（例えば２５℃未満の温度）で行うことが可能である。
【００３１】
本発明の信頼性は、前記標的中のグアニン・シトシン含量には依存しない。Ａ−Ｔ塩基対が２つの水素結合しか形成しない一方でＧ−Ｃ塩基対は３つの水素結合を形成するため、より高いＧまたはＣ含量を有する標的配列およびプローブ配列は、より高い溶融温度を有し、より安定している。従って、完全に対合したハイブリッド中に存在するＧＣ含量よりも、ハイブリダイズしたプローブおよび標的領域のＧＣ含量を増加させる塩基対誤対合は、誤対合プローブに付随する結合の弱さを相殺し得る。プローブと標的間の考えられるすべての塩基対誤対合を含むハイブリダイゼーション複合体は、完全に対合したハイブリッドよりも不安定であることが分かっており、その結果、常に、完全に相補的なハイブリッドよりも蛍光強度が低い。
【００３２】
本発明の測定法は非常に感度が高く、そのため、標的のＰＣＲ増幅を行う必要性がない。例えば、体積が約２０μｌの測定用試料（約１０フェムトモルの標的と約１０フェムトモルのプローブを含む）を測定することが可能である。本発明の実施形態は、５×１０−９Ｍの濃度、好ましくは多くて５×１０−１０Ｍの濃度の標的を測定するのに十分な程度に感度が高い。本発明の実施形態は５Ｘ１０−９Ｍの濃度、好ましくは多くて５×１０−１０Ｍの濃度のプローブを使用するように十分な程度に感度が高い。上記の値が、該方法がそれより高い濃度を検出できないことを示唆する意味ではないことは言うまでもない。
【００３３】
三本鎖が生成する媒質は、ヌクレオチドを保存するのに適していることで知られている任意の従来の媒質であってよい。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，　”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂ　Ｍａｎｕａｌ，”第２巻（１９８９年）を参照されたい。例えば、液体媒質には、ヌクレオチド、水、緩衝液および標準塩濃縮液が含まれ得る。二価陽イオンが三本鎖形成を促進するために専ら使用される場合、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡのようなキレート化剤が反応混合物に含まれるべきでない。
【００３４】
相補的塩基間の特異的結合は、温度、塩濃度、静電気強度および緩衝液組成を変化させた、種々の条件下で起こる。そのような条件と、該条件を適用する方法は、当該技術分野で周知である。
【００３５】
約７．６を超えるｐＨレベルでは不安定であるか存在しない多くのＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型の三本鎖とは異なり、本発明のワトソン−クリック三本鎖は、広範囲のｐＨレベルにわたって、好ましくは約ｐＨ５〜約ｐＨ９で、安定している。
【００３６】
三本鎖が約５℃〜２５℃の温度で、約１時間かまたはそれより短い時間に形成されることが好ましい。それより長い反応時間が必要とされないが、多くの場合で２４時間以内のインキュベーションは三本鎖に悪影響を及ぼさなかった。本発明のワトソン−クリック三本鎖の迅速な結合時間は、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎの三本鎖に基づく測定法にかかるはるかに長い結合時間とは対照的である。
【００３７】
必要とされるわけではないが、陽イオンの他に特定の試薬を使用することにより溶液での三本鎖形成を促進することが可能である。そのような試薬の好ましい例としてはＲｅｃ　Ａタンパク質、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、大腸菌一本鎖結合タンパク質、核酸主溝または核酸小溝結合タンパク質などの一本鎖結合タンパク質や、ビオロゲン、ならびに臭化エチジウム、アクチノマイシンＤ、ソラレンおよびアンゲリシンなどの挿入用核酸物質が含まれる。そのような促進試薬は、例えば異常なｐＨレベルや極端な高温下での、極端な操作条件において有用であることが判明し得る。
【００３８】
本発明の測定法は、例えば、折り畳まれたヌクレオチド配列中のアクセス可能な領域を同定したり、ハイブリダイゼーション複合体中の誤対合塩基対の数を決定したり、ゲノム地図を作成したりするために使用可能である。
【００３９】
本願発明者は、ワトソン−クリック三本鎖が二本鎖標的に対するプローブのハイブリダイゼーションから生じることをしばしば本明細書にて提案する。プローブに結合されたフルオロフォアが、ワトソン−クリックの相補的塩基から成る鎖を含む二本鎖標的に曝されると蛍光放射の消失が生じ、これはある種の結合事象の発生を示すが、本願発明者には、ワトソン−クリック三本鎖で生じることが、ワトソン−クリック二本鎖形成に従来から関連する意味でハイブリダイゼーションとして最も良く説明されるのかどうか確かでない。ワトソン−クリック三本鎖の形成は本明細書にてハイブリダイゼーション事象として称されることがあるが、それは単に便宜のためであって、ワトソン−クリック三本鎖の形成をどのように最も良く特徴づけることができるかに関して本発明の範囲を制限することは意図しない。
本発明を以下の実施例を参照しながらより詳細に説明するが、本発明が実施例に限定されないことを理解すべきである。
【００４０】
実施例
実施例１
ヒト膵嚢胞性線維症遺伝子のエクソン１０由来のセンスとアンチセンス５０ｍｅｒ　ｓｓＤＮＡ標的配列（Ｎａｔｕｒｅ　３８０　２０７（１９９６年））を、ＤＮＡ合成装置（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ　８９０９，ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で合成し、ＨＰＬＣにより精製した。等モルの量の相補的オリゴヌクレオチドを９５℃で１０分間変性し、温度が２１℃まで１．５時間にわたって冷却されるにつれて、徐々にアニールさせた。二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）オリゴヌクレオチドを、１ｐｍｏｌｅ／μｌの濃度でｄｄＨ２Ｏに溶解した。
【００４１】
野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）のセンス鎖の配列は以下の通りであった：５’−ＴＧＧ　ＣＡＣ　ＣＡＴ　ＴＡＡ　ＡＧＡ　ＡＡＡ　ＴＡＴ　ＣＡＴ　ＣＴＴ　ＴＧＧ　ＴＧＴ　ＴＴＣ　ＣＴＡ　ＴＧＡ　ＴＧＡ　ＡＴＡ　ＴＡ−３’。
【００４２】
野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）のアンチセンス鎖の配列は以下の通りであった：５’−ＴＡＴ　ＡＴＴ　ＣＡＴ　ＣＡＴ　ＡＧＧ　ＡＡＡ　ＣＡＣ　ＣＡＡ　ＡＧＡ　ＴＧＡ　ＴＡＴ　ＴＴＴ　ＣＴＴ　ＴＡＡ　ＴＧＧ　ＴＧＣ　ＣＡ−３’。
【００４３】
配列番号２は、アミノ酸位置５０７で野生型配列ＣＡＴがＣＧＴに変化した１つの塩基対変異（下線）を除いて、野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）と同一の５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
【００４４】
配列番号２のセンス鎖の配列は以下の通りであった：５’−ＴＧＧ　ＣＡＣＣＡＴ　ＴＡＡ　ＡＧＡ　ＡＡＡ　ＴＡＴ　ＣＧＴ　ＣＴＴ　ＴＧＧ　ＴＧＴ　ＴＴＣ　ＣＴＡ　ＴＧＡ　ＴＧＡ　ＡＴＡ　ＴＡ−３’。
【００４５】
配列番号２のアンチセンス鎖の配列は以下の通りであった：５’−ＴＡＴ　ＡＴＴ　ＣＡＴ　ＣＡＴ　ＡＧＧ　ＡＡＡ　ＣＡＣ　ＣＡＡ　ＡＧＡ　ＣＧＡ　ＴＡＴ　ＴＴＴ　ＣＴＴ　ＴＡＡ　ＴＧＧ　ＴＧＣ　ＣＡ−３’。
【００４６】
配列番号３は、アミノ酸位置５０７，５０８で野生型配列ＣＴＴが欠失する、連続する３つの塩基対欠失（省略で示す）を除いて、野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）と同一の４７ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
【００４７】
配列番号３のセンス鎖の配列は以下の通りであった：５’−ＴＧＧ　ＣＡＣＣＡＴ　ＴＡＡ　ＡＧＡ　ＡＡＡ　ＣＡＴ　・・・　ＴＧＧ　ＴＧＴ　ＴＴＣ　ＣＴＡ　ＴＧＡ　ＴＧＡ　ＡＴＡ　ＴＡ−３’。
【００４８】
配列番号３のアンチセンス鎖の配列は以下の通りであった：５’−ＴＡＴ　ＡＴＴ　ＣＡＴ　ＣＡＴ　ＡＧＧ　ＡＡＡ　ＣＡＣ　ＣＡ　・・・　Ａ　ＴＧＡ　ＴＴＴ　ＣＴＴ　ＴＡＡ　ＴＧＧ　ＴＧＣ　ＣＡ−３’。
【００４９】
第１番プローブは、５’位置にフルオレセイン部分が取り付けられた１５ｍｅｒ　ｓｓＤＮＡプローブであり、５０ｍｅｒ野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）のセンス鎖の１５ヌクレオチドセグメントに完全に相補的となるよう設計され、アミノ酸５０５〜５１０位置がオーバラップしている（Ｎａｔｕｒｅ　３８０、２０７（１９９６年）。第１番プローブをＤＮＡ合成装置で合成し、ＨＰＬＣで精製し、１ｐｍｏｌｅ／μｌの濃度でｄｄＨ２Ｏに溶解した。
【００５０】
配列番号４の配列は以下の通りであった：５’−Ｆｌｕ−ＣＡＣ　ＣＡＡ　ＡＧＡ　ＴＧＡ　ＴＡＴ−３’。
ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）は以下を含有していた：０．４ｐｍｏｌｅの標的ｄｓＤＮＡ、４ｐｍｏｌｅの５’フルオレセイン標識した第１番ｓｓＤＮＡプローブ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および０、１０、２５、５０、７５、１００、１２５または１５０ｍＭ　ＮａＣｌ。反応混合物は予め変性せずに室温（２１℃）で１時間インキュベートした。試料を石英キュベットに入れ、４８８ｎｍの波長を有するアルゴンイオンレーザービームで照射し、蛍光の発出をモニターした。最大蛍光強度は、フルオレセインの放射波長である５２５ｎｍの波長で生じた。蛍光の強度を、分析した各試料の波長の関数としてプロットした。
【００５１】
ＮａＣｌの不在下または１０ｍＭまたは２５ｍＭ　ＮａＣｌの存在下では、ｄｓＤＮＡ標的とｓｓＤＮＡ−Ｆプローブ間のハイブリダイゼーションは検出されず、野生型標的配列番号１または変異型標的配列番号２が第１番プローブ（配列番号４）と混合された時か第１番プローブのみが存在する時に観察される（データは図示しない）のと同様の蛍光強度が得られた。
【００５２】
５０ｍＭ　ＮａＣｌの存在下で２１℃で１時間インキュベーションした後では、完全に相補的な配列（配列番号１＋第１番プローブ）から成る、ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ三本鎖が容易に生じ、第１番プローブ（標識が付けられたｓｓＤＮＡ−Ｆ）のみによって発せられた蛍光強度と比較して、蛍光強度が４９％減少した（図１Ａ）。対照的に、１塩基対Ｇ−Ｔ誤対合（配列番号２＋第１番プローブ）を含む不完全に相補的なｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ三本鎖は、上記の反応条件であまり安定ではなく、第１番プローブのみによって示された蛍光強度と比較して蛍光強度が１１％しか減少しなかった。
【００５３】
７５ｍＭ　ＮａＣｌの存在下での１時間のインキュベーションは、三本鎖形成のやや少ない助けにしかならず、完全対合ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ三本鎖の蛍光強度は３０％減少した（図１Ｂ）。１塩基対Ｇ−Ｔ誤対合ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ三本鎖の最小の形成が観察され蛍光はわずかに０．４％のみ減少した。
【００５４】
１００ｍＭおよび１２５ｍＭ　ＮａＣｌの存在も、完全対合配列番号１標的と第１番プローブ間の最大の三本鎖ＤＮＡ形成と、１塩基Ｇ−Ｔ誤対合配列番号２と第１番プローブハイブリッド間のより安定性の低い三本鎖ＤＮＡ形成とを促進した（データは図示しない）。１５０ｍＭ　ＮａＣｌでは、三本鎖ＤＮＡの形成は明らかでなかった。
【００５５】
したがって、特定の濃度のＮａ＋およびＫ＋のような一価陽イオンの含有は、予め変性しない状態でのｄｓＤＮＡ標的とフルオレセイン標識ｓｓＤＮＡプローブとの間の三本鎖形成を検出するのに十分であった。さらには反応が、天然ｄｓＤＮＡを使用して、１０対１のプローブ対標的の比でたった１時間以内のインキュベーションで室温にて起こった。この実施例で使用されるｄｓＤＮＡ標的およびｓｓＤＮＡプローブは３３％のＧＣ含量を含んでおり、ＤＮＡのホモプリンやホモピリミジンの延長部は含んでいなかった。１５ヌクレオチドｓｓＤＮＡプローブ内に散在する６個のピリミジン塩基の存在にもかかわらず、ＤＮＡ三本鎖は容易に生じた。重要なことに、本発明のハイブリダイゼーション測定法は、天然ＤＮＡを使用して、完全に相補的ＤＮＡ配列と、１塩基誤対合を含むＤＮＡ配列とを区別することができた。
【００５６】
実施例２
予め変性しない状態で５’フルオレセイン標識ｓｓＤＮＡプローブとｄｓＤＮＡ標的を使用するハイブリダイゼーション測定法が、劇的に異なるＧＣ含量パーセント（および潜在的に異なるアニーリング優先度）を有するプローブＤＮＡと標的ＤＮＡにも適用されることを確かめるために、新たな１５ｍｅｒ　ｓｓＤＮＡ−Ｆプローブおよび５０ｍｅｒ　ｄｓＤＮＡ標的配列を有する標的ＤＮＡを上述のように合成し、精製し、アニールした。ｓｓＤＮＡ−ＦプローブとｄｓＤＮＡ標的はいずれも１ｐｍｏｌｅ／μｌの濃度でｄｄＨ２Ｏに溶解した。
【００５７】
配列番号５は、ＧＣ含量パーセントを３０％から５２％まで変化させた、配列番号１から変異させた５０ｍｅｒ　ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
野生型標的ＤＮＡ（配列番号５）のセンス鎖の配列は以下の通りであった：５’−ＧＡＧ　ＣＡＣ　ＣＡＴ　ＧＡＣ　ＡＧＡ　ＣＡＣ　ＴＧＴ　ＣＡＴ　ＣＴＣ　ＴＧＧ　ＴＧＴ　ＧＴＣ　ＣＴＡ　ＣＧＡ　ＴＧＡ　ＣＴＣ　ＴＧ−３’。
【００５８】
野生型標的ＤＮＡ（配列番号５）のアンチセンス鎖の配列は以下の通りであった：５’−ＣＡＧ　ＡＧＴ　ＣＡＴ　ＣＧＴ　ＡＧＧ　ＡＣＡ　ＣＡＣ　ＣＡＧ　ＡＧＡ　ＴＧＡ　ＣＡＧ　ＴＧＴ　ＣＴＧ　ＴＣＡ　ＴＧＧ　ＴＧＣ　ＴＣ−３’。
【００５９】
配列番号６は、配列ＣＴＣがＣＴＴに変化した１つの塩基対変異（下線）を除いて、配列番号５と同一の５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
変異型配列番号６のセンス鎖の配列は以下の通りであった：５’−ＧＡＧ　ＣＡＣ　ＣＡＴ　ＧＡＣ　ＡＧＡ　ＣＡＣ　ＴＧＴ　ＣＡＴ　ＣＴＴ　ＴＧＧ　ＴＧＴ　ＧＴＣ　ＣＴＡ　ＣＧＡ　ＴＧＡ　ＣＴＣ　ＴＧ−３’。
【００６０】
変異型配列番号のアンチセンス鎖の配列は以下の通りであった：５’−ＣＡＧ　ＡＧＴ　ＣＡＴ　ＣＧＴ　ＡＧＧ　ＡＣＡ　ＣＡＣ　ＣＡＡ　ＡＧＡ　ＴＧＡ　ＣＡＧ　ＴＧＴ　ＣＴＧ　ＴＣＡ　ＴＧＧ　ＴＧＣ　ＴＣ−３’。
【００６１】
配列番号７は、配列ＣＡＴがＣＧＴに変化した１つの塩基対変異（下線）を除いて、配列番号５と同一の５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
変異型配列番号７のセンス鎖の配列は以下の通りであった：５’−ＧＡＧ　ＣＡＣ　ＣＡＴ　ＧＡＣ　ＡＧＡ　ＣＡＣ　ＴＧＴ　ＣＧＴ　ＣＴＣ　ＴＧＧ　ＴＧＴ　ＧＴＣ　ＣＴＡ　ＣＧＡ　ＴＧＡ　ＣＴＣ　ＴＧ−３’。
【００６２】
変異型配列番号７のアンチセンス鎖の配列は以下の通りであった：５’−ＣＡＧ　ＡＧＴ　ＣＡＴ　ＣＧＴ　ＡＧＧ　ＡＣＡ　ＣＡＣ　ＣＡＧ　ＡＧＡ　ＣＧＡ　ＣＡＧ　ＴＧＴ　ＣＴＧ　ＴＣＡ　ＴＧＧ　ＴＧＣ　ＴＣ−３’。
【００６３】
配列番号８は、配列ＣＡＴがＣＴＴに変化した１つの塩基対変異（下線）を除いて、配列番号５と同一の５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
変異型配列番号８のセンス鎖の配列は以下の通りであった：５’−ＧＡＧ　ＣＡＣ　ＣＡＴ　ＧＡＣ　ＡＧＡ　ＣＡＣ　ＴＧＴ　ＣＴＴ　ＣＴＣ　ＴＧＧ　ＴＧＴ　ＧＴＣ　ＣＴＡ　ＣＧＡ　ＴＧＡ　ＣＴＣ　ＴＧ−３’。
【００６４】
変異型配列番号８のアンチセンス鎖の配列は以下の通りであった：５’−ＣＡＧ　ＡＧＴ　ＣＡＴ　ＣＧＴ　ＡＧＧ　ＡＣＡ　ＣＡＣ　ＣＡＧ　ＡＧＡ　ＡＧＡ　ＣＡＧ　ＴＧＴ　ＣＴＧ　ＴＣＡ　ＴＧＧ　ＴＧＣ　ＴＣ−３’。
【００６５】
配列番号９は、配列ＣＴＣがＣＣＣに変化した１つの塩基対変異（下線）を除いて、配列番号５と同一の５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
変異型配列番号９のセンス鎖の配列は以下の通りであった：５’−ＧＡＧ　ＣＡＣ　ＣＡＴ　ＧＡＣ　ＡＧＡ　ＣＡＣ　ＴＧＴ　ＣＡＴ　ＣＣＣ　ＴＧＧ　ＴＧＴ　ＧＴＣ　ＣＴＡ　ＣＧＡ　ＴＧＡ　ＣＴＣ　ＴＧ−３’。
【００６６】
変異型配列番号９のアンチセンス鎖の配列は以下の通りであった：５’−ＣＡＧ　ＡＧＴ　ＣＡＴ　ＣＧＴ　ＡＧＧ　ＡＣＡ　ＣＡＣ　ＣＡＧ　ＧＧＡ　ＴＧＡ　ＣＡＧ　ＴＧＴ　ＣＴＧ　ＴＣＡ　ＴＧＧ　ＴＧＣ　ＴＣ−３’。
【００６７】
配列番号１０は、配列ＣＴＣがＣＧＣに変化した１つの塩基対変異（下線）を除いて、配列番号５と同一の５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
変異型配列番号１０のセンス鎖の配列は以下の通りであった：５’−ＧＡＧＣＡＣ　ＣＡＴ　ＧＡＣ　ＡＧＡ　ＣＡＣ　ＴＧＴ　ＣＡＴ　ＣＧＣ　ＴＧＧ　ＴＧＴ　ＧＴＣ　ＣＴＡ　ＣＧＡ　ＴＧＡ　ＣＴＣ　ＴＧ−３’。
【００６８】
変異型配列番号１０のアンチセンス鎖の配列は以下の通りであった：５’−ＣＡＧ　ＡＧＴ　ＣＡＴ　ＣＧＴ　ＡＧＧ　ＡＣＡ　ＣＡＣ　ＣＡＧ　ＣＧＡ　ＴＧＡ　ＣＡＧ　ＴＧＴ　ＣＴＧ　ＴＣＡ　ＴＧＧ　ＴＧＣ　ＴＣ−３’。
【００６９】
配列番号１１は、配列ＣＡＴがＡＣＴに変化した連続する２つの塩基対変異（下線）を除いて、配列番号５と同一の５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
【００７０】
変異型配列番号１１のセンス鎖の配列は以下の通りであった：５’−ＧＡＧＣＡＣ　ＣＡＴ　ＧＡＣ　ＡＧＡ　ＣＡＣ　ＴＧＴ　ＡＣＴ　ＣＴＣ　ＴＧＧ　ＴＧＴ　ＧＴＣ　ＣＴＡ　ＣＧＡ　ＴＧＡ　ＣＴＣ　ＴＧ−３’。
【００７１】
変異型配列番号１１のアンチセンス鎖の配列は以下の通りであった：５’−ＣＡＧ　ＡＧＴ　ＣＡＴ　ＣＧＴ　ＡＧＧ　ＡＣＡ　ＣＡＣ　ＣＡＧ　ＡＧＡ　ＧＴＡ　ＣＡＧ　ＴＧＴ　ＣＴＧ　ＴＣＡ　ＴＧＧ　ＴＧＣ　ＴＣ−３’。
【００７２】
配列番号１２は、ＧＣ含量パーセントを３０％から７２％まで変化させた、配列番号１から変異させた５０ｍｅｒ　ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
野生型標的ＤＮＡ（配列番号１２）のセンス鎖の配列は以下の通りであった：５’−ＧＡＧ　ＣＡＣ　ＣＣＴ　ＣＣＣ　ＡＧＧ　ＣＡＣ　ＧＧＴ　ＣＧＴ　ＣＣＣ　ＴＧＧ　ＴＧＣ　ＧＡＣ　ＣＴＣ　ＣＧＡ　ＣＧＡ　ＧＣＧ　ＴＧ−３’。
【００７３】
野生型標的ＤＮＡ（配列番号１２）のアンチセンス鎖の配列は以下の通りであった：５’−ＣＡＣ　ＧＣＴ　ＣＧＴ　ＣＧＧ　ＡＧＧ　ＴＣＧ　ＣＡＣ　ＣＡＧ　ＧＧＡ　ＣＧＡ　ＣＣＧ　ＴＧＣ　ＣＴＧ　ＧＧＡ　ＧＧＧ　ＴＧＣ　ＴＣ−３’。
【００７４】
配列番号１３は、配列ＣＧＴがＣＡＴに変化した１つの塩基対変異（下線）を除いて、配列番号１２と同一の５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
変異型配列番号１３のセンス鎖の配列は以下の通りであった：５’−ＧＡＧＣＡＣ　ＣＣＴ　ＣＣＣ　ＡＧＧ　ＣＡＣ　ＧＧＴ　ＣＡＴ　ＣＣＣ　ＴＧＧ　ＴＧＣ　ＧＡＣ　ＣＴＣ　ＣＧＡ　ＣＧＡ　ＧＣＧ　ＴＧ−３’。
【００７５】
変異型配列番号１３のアンチセンス鎖の配列は以下の通りであった：５’−ＣＡＣ　ＧＣＴ　ＣＧＴ　ＣＧＧ　ＡＧＧ　ＴＣＧ　ＣＡＣ　ＣＡＧ　ＧＧＡ　ＴＧＡ　ＣＣＧ　ＴＧＣ　ＣＴＧ　ＧＧＡ　ＧＧＧ　ＴＧＣ　ＴＣ−３’。
【００７６】
第２番プローブ（配列番号１４）は、５’位置にフルオレセイン部分が取り付けられた１５ｍｅｒ　ｓｓＤＮＡプローブであり、５０ｍｅｒ野生型標的ＤＮＡ（配列番号５）のセンス鎖の１５ヌクレオチドセグメントに完全に相補的となるよう設計された。
【００７７】
配列番号１４の配列は以下の通りであった：５’−Ｆｌｕ−ＣＡＣ　ＣＡＧ　ＡＧＡ　ＴＧＡ　ＣＡＧ−３’。
第３番プローブ（配列番号１５）は、５０ｍｅｒ野生型標的ＤＮＡ（配列番号１２）のセンス鎖の１５ヌクレオチドセグメントに完全に相補的となるように設計された１５ｍｅｒの５’−フルオレセイン標識ｓｓＤＮＡプローブであった。
【００７８】
配列番号１５の配列は以下の通りであった：５’−Ｆｌｕ−ＣＡＣ　ＣＡＧ　ＧＧＡ　ＣＧＡ　ＣＣＧ−３’。
実施例１で行った三本鎖ＤＮＡハイブリダイゼーション測定法は、反応混合物中に一価陽イオンを添加することによって促進された。このハイブリダイゼーション測定法の特異性を、様々なパーセントＧＣ含量を有するｄｓＤＮＡ標的およびｓｓＤＮＡＦプローブによる三本鎖ＤＮＡ形成を促進するために二価陽イオンを（一価陽イオンの代りに）使用して、さらに詳しく調べた。
【００７９】
ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）は以下を含有していた：０．４ｐｍｏｌｅの標的ｄｓＤＮＡ、４ｐｍｏｌｅの５’フルオレセイン標識ｓｓＤＮＡプローブ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭ〜３０ｍＭのＭｇＣｌ２または５ｍＭ〜３０ｍＭ　ＭｎＣｌ２もしくは５ｍＭ〜３０ｍＭのＮｉＣｌ２。反応混合物は予め変性せずに室温（２１℃）で１時間インキュベートした。試料を石英キュベットに入れ、４８８ｎｍの波長を有するアルゴンイオンレーザービームで照射し、蛍光の発出をモニターした。試料は保存され、合計２２時間室温で一晩インキュベートし、２２時間目にアルゴンイオンレーザービームした後で２番目の蛍光強度測定値をとった。蛍光の強度を、分析した各試料の波長の関数としてプロットした。
【００８０】
ｓｓＤＮＡ−Ｆ第２番プローブ（５３％ＧＣ含量）を１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２の存在下で５０ｍｅｒ野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号５）および変異型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号６〜配列番号１１）とインキュベートすると、ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ三本鎖が非変性条件下で室温にて形成された。完全対合ＤＮＡ三本鎖は蛍光強度の最大の減少（１時間のインキュベーション後に４３％の減少）を生じたが、１塩基対Ｔ−Ｇ誤対合を含むより安定性の低いｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ三本鎖（配列番号６＋第２番プローブ）は、１時間のインキュベーション後に第２番プローブのみで観察される蛍光強度よりも２０％低い蛍光強度を生じた（図２Ａ）。１塩基対Ｇ−Ｔ誤対合（配列番号７＋第２番プローブ）、１塩基対Ｔ−Ｔ誤対合（配列番号８＋第２番プローブ）、１塩基対Ｃ−Ａ誤対合（配列番号９＋第２番プローブ）、および連続する２塩基Ａ−ＧおよびＣ−Ｔ誤対合（配列番号１１１＋第２番プローブ）を生じるｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ三本鎖は、すべて完全対合ＤＮＡ三本鎖（配列番号５＋第２番プローブ）より安定が低く、第２番プローブのみで観察される蛍光強度と、完全対合ＤＮＡ三本鎖で観察される蛍光強度の間の蛍光強度を生じた（データは図示しない）。最も安定性の低い１塩基Ｔ−Ｔ誤対合ＤＮＡ三本鎖を除いて（１時間後の蛍光強度が５％しか減少しなかった）、他のすべての誤対合ＤＮＡ三本鎖は非常に類似した蛍光強度を生じた。１塩基対Ｇ−Ａ誤対合を含むｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡＦ三本鎖（配列番号１０＋第２番プローブ）のみが、完全対合ＤＮＡ三本鎖によって生成される蛍光強度よりも低い蛍光強度を生じた（データは図示しない）。
【００８１】
１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２の存在下で２２時間インキュベーションした後のＤＮＡ三本鎖形成は、より効率的だった。それにもかかわらず、完全対合配列を含むＤＮＡ三本鎖と、塩基対誤対合配列を含むＤＮＡ三本鎖との間のより顕著な差が観察された。図２Ｂに示すように、完全に相補的な配列（配列番号５＋第２番プローブ）または１塩基対Ｔ−Ｇ誤対合（配列番号６＋第２番プローブ）を含むｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡＦ三本鎖は、１０ｍＭ　　ＭｎＣｌ２の存在下での２２時間のインキュベーション後、第２番プローブのみによって達成された強度よりもそれぞれ９２％および６６％低い蛍光強度を生成した。同様に、３０ｍＭ　ＭｎＣｌ２の存在下での２２時間のインキュベーションにより、完全対合ＤＮＡ三本鎖と１塩基対誤対合Ｔ−ＧＤＮＡ三本鎖の蛍光強度はそれぞれ９０％および５７％減小した（図２Ｃ）。
【００８２】
２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２または２０ｍＭ　ＭｎＣｌ２または２０ｍＭ　ＮｉＣｌ２の含有は、ｓｓＤＮＡ−Ｆ第３番プローブ（７３％のＧＣ含量を有する）を、対応する５０ｍｅｒ野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号１２）および変異型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号１３）と１時間反応させた時（データは図示しない）のｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ三本鎖形成をも促進した。予想通り、完全対合ＤＮＡ三本鎖は最大の蛍光強度の減少を生じたが、１塩基対Ａ−Ｃ誤対合ＤＮＡ三本鎖（配列番号１３＋第３番プローブ）は中間レベルの蛍光を生じた（データは図示しない）。完全対合ＤＮＡ三本鎖は２２時間のインキュベーション後に１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２の存在下で非常に効率的に生成し、蛍光強度は８９％減少した。１塩基対Ａ−Ｃ誤対合ＤＮＡ三本鎖は、上記の反応条件で等しい効率ｄ形成され、第３番プローブのみで観察された蛍光強度と比較して、９０％の蛍光の減少を生じた（データは図示しない）。したがって、２０ｍＭの二価陽イオンの存在下での１時間の短いインキュベーション時間の後に、完全対合ＤＮＡ三本鎖と１塩基誤対合７３％ＧＣ含量ＤＮＡ三本鎖との間にはより良好な差が達成された。
【００８３】
完全対合ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ三本鎖（３３％のＧＣ含量を有する）（配列番号１＋第１番プローブ）は１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２の存在下で１時間以内に容易に形成され、第１番プローブのみによって発される蛍光強度と比較して、５７％の蛍光強度の減少を生じた（データは図示しない）。このような反応条件は、第１番プローブのみによって観察される蛍光強度と比較して蛍光が増大第する（データは図示しない）１塩基対Ｇ−Ｔ誤対合（配列番号２＋第１番プローブ）を含むＤＮＡ三本鎖には非常に不都合であった。同様の結果は、１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２の存在下での２２時間のインキュベーション後にも得られた。
【００８４】
ｄｓＤＮＡ標的とｓｓＤＮＡプローブのＧＣ含量パーセントにかかわらず、Ｍｎ＋２、Ｍｇ＋２またはＮｉ＋２のような二価陽イオンの添加は非変性条件下でのＤＮＡ三本鎖形成を促進し、完全に相補的な配列と、１塩基変異を含む配列との間の間の正確な区別を可能にした。
【００８５】
実施例３
実施例１と２の三本鎖ＤＮＡハイブリダイゼーション測定法を、ある種類の一価陽イオンまたは二価陽イオンの存在下で行った。以下の実施例は、複数の二価陽イオンの組み合わせが反応混合物の中にある場合に三本鎖ＤＮＡの中の完全対合と１塩基対誤対合とを区別するための、本発明の測定法の信頼性を実証する。
【００８６】
ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）は以下を含有していた：０．４ｐｍｏｌｅの標的ｄｓＤＮＡ、４ｐｍｏｌｅの５’フルオレセイン標識したｓｓＤＮＡプローブ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および５ｍＭ　ＭｇＣｌ２と５ｍＭ　ＭｎＣｌ２、または１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２と１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２、または１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２と１５ｍＭ　ＭｎＣｌ２、または２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２と２０ｍＭ　ＭｎＣｌ２。反応混合物は予め変性せずに室温（２１℃）で１時間インキュベートした。試料を石英キュベットに入れ、４８８ｎｍの波長を有するアルゴンイオンレーザービームで照射し、蛍光の発出をモニターした。試料は保存され、合計２２時間室温で一晩インキュベートし、２２時間目にアルゴンイオンレーザービームした後で２番目の蛍光強度測定値をとった。蛍光の強度を、分析した各試料の波長の関数としてプロットした。
【００８７】
ｄｓＤＮＡ標的とｓｓＤＮＡＦプローブのすべての混合物において、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２と５ｍＭ　ＭｎＣｌ２の添加は三本鎖ＤＮＡ形成の検出を可能にするに不十分であった（データは図示しない）。ｓｓＤＮＡ−Ｆ第３番プローブ（７３％のＧＣ含量）を１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２と１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２の存在下または１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２と１５ｍＭ　ＭｎＣｌ２の存在下で５０ｍｅｒ野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号１２）と１時間インキュベートすると、完全に相補的なｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ三本鎖が等しい効率で形成され、第３番プローブのみによって発せられる蛍光強度と比較して、２９％の蛍光の減少を生じた。いずれの反応条件も、第３番プローブのみで観察された蛍光強度と比較して、蛍光が１４％増大する１塩基対Ａ−Ｃ誤対合を含むＤＮＡ三本鎖（配列番号１３＋第３番プローブ）には非常に不都合であった。１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２と１５ｍＭ　ＭｎＣｌ２の存在下で１時間インキュベーションした後に得られた蛍光スペクトルが、図３Ａに示される。
【００８８】
２２時間のインキュベーションではより多くのＤＮＡ三本鎖形成が生じた。完全対合配列（配列番号１２＋第３番プローブ）または１塩基対Ａ−Ｃ誤対合（配列番号１３＋第３番プローブ）を含むｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ三本鎖は、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２と１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２の存在下での２２時間のインキュベーション後に、第３番プローブのみによって達成された蛍光強度よりもそれぞれ６２％および２１％低い蛍光強度を生じた（図３Ｂ）。非常に類似した結果が、２２時間後の１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２と１５ｍＭ　ＭｎＣｌ２を含む試料について得られた（データは図示しない）。
【００８９】
２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２と２０ｍＭ　ＭｎＣｌ２でたった１時間の処理では、完全対合ＤＮＡ三本鎖と１塩基対Ａ−Ｃ誤対合ＤＮＡ三本鎖に対する蛍光がそれぞれ４６％および３％減少した。（図３Ｃ）。この場合、試料を２２時間さらにインキュベートしても何の利益も得られなかった（データは図示しない）。
【００９０】
７３％のＧＣ含量を含むｄｓＤＮＡ標的を本発明のハイブリダイゼーション測定法で試験すると、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２と２０ｍＭ　ＭｎＣｌ２とによる１時間の処理は、完全に相補的なＤＮＡ三本鎖と１塩基対誤対合を含むＤＮＡ三本鎖の間の安定性および蛍光の最大の差を提供する。
【００９１】
実施例４
ｓｓＤＮＡ−Ｆ第１番プローブ（３３％のＧＣ含量）を、野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号１）または変異型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号２および配列番号３）とインキュベートした場合、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２と１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２の存在下で、最小のＤＮＡ三本鎖形成が観察された（データは図示しない）。しかしながら、１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２と１５ｍＭ　ＭｎＣｌ２の存在下での１時間のインキュベーションは、第１番プローブによって得られた蛍光強度と比較して、４９％の蛍光強度の減少の観察によって証拠づけられるように、完全対合ＤＮＡ三本鎖の形成を促進した（図４Ａ）。１塩基対Ｇ−Ｔ誤対合（配列番号２＋第１番プローブ）または３塩基対欠失（配列番号３＋第１番プローブ）を生じるｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ三本鎖は、１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２と１５ｍＭ　ＭｎＣｌ２の存在下では非常に不安定で、第１番プローブのみによって発される蛍光強度と比較してそれぞれ２％の蛍光の減少と５％の蛍光の増加を生じた。（図４Ａ）
【００９２】
２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２と２０ｍＭ　ＭｎＣｌ２による１時間の処理は、完全対合ＤＮＡ三本鎖および１塩基対Ｇ−Ｔ誤対合または３塩基対欠失を含むｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ三本鎖の場合で、第１番プローブのみで観察される蛍光強度と比較して、それぞれ６８％、４８％、６％の蛍光の減少を生じた（図４Ｂ）。同じ試料を２２時間インキュベートした時、野生型配列または塩基対誤対合を含む３３％ＧＣ含量ＤＮＡ三本鎖間の最適の差が達成された。完全に相補的なＤＮＡ三本鎖（配列番号１＋第１番プローブ）は２２時間の間安定したままであり、第１番プローブのみによって達成された蛍光強度と比較して６２％の蛍光強度の減少を生じた（図４Ｃ）。対照的に、１塩基対Ｇ−Ｔ誤対合（配列番号２＋第１番プローブ）または３塩基対欠失（配列番号３＋第１番プローブ）を含むｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ三本鎖は、２２時間のインキュベーションの間、非常に不安定であることが証明され、第１番プローブのみによって発される蛍光強度と比較して、それぞれ１％および１３％の蛍光の増加を生じた（図４Ｃ）。
【００９３】
実施例５
完全対合ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ三本鎖（５３％ＧＣ含量を有する）（配列番号５＋第２番プローブ）は、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２の存在下で１時間以内に容易に生成し、第２番プローブのみによって観察される蛍光強度と比較して６８％の蛍光の減少を生じた（図５Ａ）。１塩基対Ｔ−Ｇ誤対合を含むＤＮＡ三本鎖（配列番号６＋第２番プローブ）は安定性が低く、第２番プローブのみによって達成される蛍光強度と比較して２０％の蛍光強度の減少を生じた（図５Ａ）。
【００９４】
同じ試料の２２時間のインキュベーションは、完全対合ＤＮＡ三本鎖または誤対合ＤＮＡ三本鎖によって達成される蛍光のより劇的な差を生じさせた。図５Ｂに示されるように、完全に相補的な配列（配列番号５＋第２番プローブ）または１塩基対Ｔ−Ｇ誤対合（配列番号６＋第２番プローブ）を含むｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ三本鎖は、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２の存在下で第２番プローブのみによって発される蛍光強度よりそれぞれ９２％および３３％低い蛍光強度を生じた。
【００９５】
同様の実験において、完全対合ＤＮＡ三本鎖（配列番号５＋第２番プローブ）は、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２の存在下での２２時間のインキュベーション後に、第２番プローブのみで観察される蛍光強度と比較して８５％の蛍光の減少を生じ、１塩基対Ｇ−Ｔ誤対合（配列番号７＋第２番プローブ）、１塩基対Ｃ−Ａ誤対合（配列番号９＋第２番プローブ）、および連続する２つ塩基対Ａ−ＧおよびＣ−Ｔ誤対合（配列番号１１＋第２番プローブ）は生じるｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ三本鎖は、それぞれ４３％、６９％、３２％の蛍光の減少を生じた（図５Ｃ）。１塩基対Ｇ−Ａ誤対合（配列番号１０＋第２番プローブ）を含むｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ三本鎖のみは、完全対合ＤＮＡ三本鎖によって生成された蛍光強度よりもわずかに低い蛍光強度を生じた（データは図示しない）。
【００９６】
完全に相補的な配列または塩基対誤対合を含む５３％ＧＣ含量ＤＮＡ三本鎖間の最適の差は、１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２と１５ｍＭ　ＭｎＣｌ２の存在下での１時間のインキュベーション後に達成された。この反応条件は完全対合ＤＮＡ配列（配列番号５＋第２番プローブ）間のＤＮＡ三本鎖形成を非常に促進し、第２番プローブのみによって達成される蛍光強度と比較して、７４％の蛍光の減少が生じた（図５Ｄ）。対照的に、１塩基対Ｔ−Ｇ誤対合（配列番号６＋第２番プローブ）を含むｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ三本鎖は、１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２と１５ｍＭ　ＭｎＣｌ２の存在下ではそれほど安定しておらず、１時間のインキュベーション後に、第２番プローブのみによって発される蛍光強度と比較して、１５％の蛍光の減少を生じた（図５Ｄ）。
【００９７】
同様に１塩基対Ｇ−Ｔ誤対合（配列番号７＋第２番プローブ）、１塩基対Ｃ−Ａ誤対合（配列番号９＋第２番プローブ）、１塩基対Ｇ−Ａ誤対合（配列番号１０＋第２番プローブ）および連続する２塩基対Ａ−ＧおよびＣ−Ｔ誤対合（配列番号１１＋第２番プローブ）を生じるＤＮＡ三本鎖は、いずれも完全対合ＤＮＡ三本鎖ほどには安定していなかった（データは図示しない）。１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２または１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２と１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２の存在下で比較的容易に生じた１塩基対Ｇ−Ａ誤対合ＤＮＡ三本鎖は、ここでは１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２と１５ｍＭ　ＭｎＣｌ２の存在下で邪魔され、第２番プローブのみで観察される蛍光強度と比較して、７％の蛍光の減少しか生じなかった（データは図示しない）。第２番プローブ（５３％ＧＣ含量を含む）をｄｓＤＮＡ標的配列番号３（３３％のＧＣ含量を含む）と反応させると、第２番プローブのみで得られる蛍光強度と比較して、３％の蛍光の増加が観察された（図５Ｄ）。これは、ＤＮＡ三本鎖が形成されなかったことを示している。この結果は、このプローブと標的の組み合わせが５塩基対誤対合を生じさせることを考慮すれば、予想できるものであった。
【００９８】
１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２と１５ｍＭ　ＭｎＣｌ２による２２時間の処理により、完全に相補的な配列（配列番号５＋第２番プローブ）および１塩基対Ｔ−Ｇ誤対合（配列番号６＋第２番プローブ）を含むｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ三本鎖の蛍光強度は、第２番プローブのみによって得られる蛍光強度と比較して、それぞれ７６％および４４％減少した（図５Ｅ）。
【００９９】
包括的に述べると、上記の実施例は、ハイブリダイゼーション媒質への少なくとも１種類の陽イオンの添加が、劇的に異なるパーセントＧＣ含量を有するｄｓＤＮＡ標的と蛍光標識されたｓｓＤＮＡプローブとの間のＤＮＡ三本鎖形成を促進し、完全に相補的な配列と種々の変異を含む配列との間の正確で信頼できる区別を可能にすることを実証した。
【０１００】
本発明を詳細かつその特定の例を参照しながら説明してきたが、当業者には、種々の変更および改変を、本発明の範囲の精神及び範囲から逸脱せずに行い得ることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】分析された各試料の波長の関数としてプロットされた蛍光強度の複合グラフである。
【図１Ｂ】分析された各試料の波長の関数としてプロットされた蛍光強度の複合グラフである。
【図２Ａ】分析された各試料の波長の関数としてプロットされた蛍光強度の複合グラフである。
【図２Ｂ】分析された各試料の波長の関数としてプロットされた蛍光強度の複合グラフである。
【図２Ｃ】分析された各試料の波長の関数としてプロットされた蛍光強度の複合グラフである。
【図３Ａ】分析された各試料の波長の関数としてプロットされた蛍光強度の複合グラフである。
【図３Ｂ】分析された各試料の波長の関数としてプロットされた蛍光強度の複合グラフである。
【図３Ｃ】分析された各試料の波長の関数としてプロットされた蛍光強度の複合グラフである。
【図４Ａ】分析された各試料の波長の関数としてプロットされた蛍光強度の複合グラフである。
【図４Ｂ】分析された各試料の波長の関数としてプロットされた蛍光強度の複合グラフである。
【図４Ｃ】分析された各試料の波長の関数としてプロットされた蛍光強度の複合グラフである。
【図５Ａ】分析された各試料の波長の関数としてプロットされた蛍光強度の複合グラフである。
【図５Ｂ】分析された各試料の波長の関数としてプロットされた蛍光強度の複合グラフである。
【図５Ｃ】分析された各試料の波長の関数としてプロットされた蛍光強度の複合グラフである。
【図５Ｄ】分析された各試料の波長の関数としてプロットされた蛍光強度の複合グラフである。
【図５Ｅ】分析された各試料の波長の関数としてプロットされた蛍光強度の複合グラフである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【国際公開パンフレット】
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2004511218.tif 000019
2004511218.tif 000020
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2004511218.tif 000073
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004511218.tif 000074
【国際調査報告】
2004511218.tif 000075