(57)【要約】本発明は、哺乳動物におけるコレステロール逆輸送を調整することができる方法および化合物、ならびにコレステロール逆輸送を調整することができる化合物を選別、同定および／または特徴づけるためのスクリーニング法に関する。本発明は、該方法を実施するのに用いるための細胞、ベクターおよび遺伝学的構成体、ならびにアテローム性動脈硬化症を処置する医薬組成物にも関する。本発明の方法は、アポリポタンパク質Ａ１の遺伝子プロモーターに由来するＦＸＲの応答要素の使用に基づく。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コレステロール逆輸送を調整することができる化合物を選別、同定または特徴づける方法であって、
・試験化合物を、ヒトのアポリポタンパク質Ａ−Ｉ遺伝子のプロモーターまたはその機能的変異体の、ＦＸＲ応答要素の少なくとも１コピーを含む核酸構築物に接触させ、
・該応答要素に対する該試験化合物の存在し得る結合を決定する
ことを含む方法。
【請求項２】
接触しておくことを、ＦＸＲ受容体、またはＦＸＲ受容体の機能的等価物の存在下で実施し、該応答要素とのＦＸＲの結合に対する試験化合物の存在の効果を決定する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
コレステロール逆輸送を調整することができる化合物を選別、同定または特徴づける方法であって、
・試験化合物を、レポーター遺伝子発現カセットを含む宿主細胞に接触させること、ここで該カセットは、ヒトのアポリポタンパク質Ａ−Ｉ遺伝子プロモーターまたはその機能的変異体のＦＸＲ応答要素の少なくとも１コピーを含むプロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子を含む、
・該レポーター遺伝子の発現を測定すること
を含む方法。
【請求項４】
宿主細胞が、ＦＸＲ受容体または機能的等価物を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
宿主細胞が、ＦＸＲのリガンドを含む、請求項３または４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
試験化合物の存在下、または該試験化合物の不在下で、レポーター遺伝子の発現レベルを決定することを含み、レポーター遺伝子の発現レベルの上昇または下降が、試験化合物がコレステロール逆輸送を調整することができる能力を示す、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
宿主細胞が、哺乳動物細胞である、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物細胞が、ヒトの細胞である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ＦＸＲ応答要素が、ＦＸＲ受容体に結合できる下記の配列（配列番号１）：
5'-CAGAGCTGATCCTTGAACTCTTAAGTTCC-3'
またはその機能的変異体を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＦＸＲ応答要素が、ＦＸＲ受容体に結合できる下記の配列（配列番号２）：
5'-CCCCACTGAACCCTTGACCCCTGCCCTGCAGCC-3'
またはその機能的変異体を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
レポーター遺伝子が、生物学的抽出物中のその活性または存在を測定することができる産生物をコードしている遺伝子、特にルシフェラーゼ、分泌されたアルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼまたはラクタマーゼをコードしている遺伝子の一つである、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
プロモーターが、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、ＣＭＶ初期プロモーター、ＰＧＫプロモーターおよびヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉをコードしている遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０プロモーターから選ばれる、請求項３〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
１または数種類の化合物を混合物としてか、または別個に試験する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
試験化合物がコンビナトリアルライブラリーである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
試験化合物が、１または数種類のＤＮＡ結合ポリペプチドを発現するクローンもしくは核酸クローンのライブラリーである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
接触しておくことをマルチウェルプレート内で実施する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
該方法によって決定された存在し得る効果を、ヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉ遺伝子プロモーターの、ＦＸＲ応答要素の少なくとも一つの、ＦＸＲ受容体と実質的に結合することができない突然変異したコピーを含む核酸構築物を用いることを除き同じ条件で実施する方法によって決定された存在し得る効果と比較することをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
コレステロール逆輸送を増大させることができる化合物を選別、同定または特徴づけるための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＨＤＬ活性を調整することができる化合物を選別、同定または特徴づけるための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
アポリポタンパク質Ａ−Ｉの発現を調整することができる化合物を選別、同定または特徴づけるための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
コレステロール逆輸送を調整する組成物を製造するための、ヒトのアポリポタンパク質Ａ−Ｉ遺伝子のプロモーターまたはその機能的変異体の応答要素とのＦＸＲの結合を調整することができる化合物の使用。
【請求項２２】
コレステロール逆輸送を増大させる組成物を製造するための、配列番号１の配列と結合するＦＸＲまたはその機能的変異体を減少させる化合物の使用。
【請求項２３】
コレステロール逆輸送を増大させる組成物を製造するための、ヒトのアポリポタンパク質Ａ−Ｉ遺伝子の転写に対するＦＸＲの効果を上昇させる化合物の使用。
【請求項２４】
ＨＤＬ活性を調整する組成物を製造するための、配列番号１もしくは配列番号２、またはその機能的変異体とのＦＸＲおよび／もしくはその補助因子の結合を調整する化合物の使用。
【請求項２５】
ＨＤＬ活性を増大させる組成物を製造するための、配列番号１またはその機能的変異体とのＦＸＲの結合を減少させる化合物の使用。
【請求項２６】
ＨＤＬ活性を増大させる組成物を製造するための、配列番号２またはその機能的変異体とのＦＸＲの結合を増大させる化合物の使用。
【請求項２７】
該化合物が、生物学的化合物または化学的化合物である、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２８】
化合物が、核因子または補助因子である、請求項２７記載の使用。
【請求項２９】
化合物が、１以上のＤＮＡ結合性ポリペプチドを発現するクローンである、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３０】
化合物が、請求項１〜２０のいずれか一項に従って選別、同定または特性記述される化合物である、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３１】
下記の配列（配列番号１）：
5'-CAGAGCTGATCCTTGAACTCTTAAGTTCC-3'
またはその機能的変異体によって特徴付けられ、ＦＸＲ受容体に結合することができる核酸フラグメント。
【請求項３２】
下記の配列（配列番号２）：
5'-CCCCACTGAACCCTTGACCCCTGCCCTGCAGCC-3'
またはその機能的変異体によって特徴付けられ、ＦＸＲ受容体に結合することができる核酸フラグメント。
【請求項３３】
請求項３１記載の核酸フラグメントおよび／または請求項３２記載の核酸フラグメントの少なくとも１コピーを含む核酸構築物。
【請求項３４】
請求項３１記載の核酸フラグメントおよび／または請求項３２記載の核酸フラグメントの、実質的にＦＸＲ受容体と結合することができない、少なくとも一つの突然変異したコピーを含む核酸構築物。
【請求項３５】
プロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子に結合する該プロモーターに含まれる請求項３１および／または３２記載の核酸フラグメントの少なくとも一つのコピーを含む発現カセット。
【請求項３６】
プロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子に結合する該プロモーターに含まれる、請求項３１および／または３２記載の核酸フラグメントの少なくとも一つの突然変異させたコピーを含む発現カセット。
【請求項３７】
該プロモーターが、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、ＣＭＶ初期プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーターおよびヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉ遺伝子プロモーターから選ばれる、請求項３５または３６のいずれか一項に記載のカセット。
【請求項３８】
レポーター遺伝子が、生物学的抽出物中でのその活性または存在を測定することができる遺伝子である、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載のカセット。
【請求項３９】
レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ、分泌されたアルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼまたはラクタマーゼをコードしている遺伝子である、請求項３８記載のカセット。
【請求項４０】
請求項３３〜３９のいずれか一項に記載の構成体またはカセットを有する宿主細胞。
【請求項４１】
ＨＤＬ活性を調整することができる化合物のインビトロスクリーニングのための、請求項３３〜３９のいずれか一項に記載の構成体もしくはカセットまたは請求項４０記載の細胞の使用。
【請求項４２】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法に従って選別、同定または特性記述された化合物を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物におけるコレステロール逆輸送を調整することができる方法および化合物はもとより、コレステロール逆輸送を調整することができる化合物を選別、同定および／または特徴づけるためのスクリーニング方法にも関する。また該方法を実施するのに役立つ細胞、ベクターおよび遺伝学的構成体、ならびにアテローム性動脈硬化症にも関する。
【０００２】
アテローム性動脈硬化症は、病的状態、死亡率、心筋梗塞、脳虚血、心血管疾患および末梢動脈疾患の主導的原因である。高コレステロール血症、および血管炎症に伴うマクロファージにおけるコレステロール過負荷は、アテローム性動脈硬化症に寄与する主要な要因である。現在、高コレステロール血症の処置は、食餌と薬物、たとえばスタチンおよび胆汁酸金属イオン封鎖剤との組合せからなる。しかし、既存の処置の限界を克服するために、新たな治療方針が開発されることが必要とされている。
【０００３】
ＨＤＬ（高密度リポタンパク質）が介在するコレステロール逆輸送は、末梢組織に蓄積されたコレステロールを除去し、肝臓におけるその代謝クリアランスを確保する。このようにして、それは、アテローム性動脈硬化症から身体を防護する助けとなる。アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（アポＡ−Ｉ）は、ＨＤＬの基本的構成要素であり、その効力の基盤となっている。この点で、アポＡ−Ｉ発現の増大は、アテローム性動脈硬化症に対する防護効果を有する。アポＡ−Ｉ発現は、ホルモン、またはフィブラートのような治療剤によって調節される。ＨＮＦ４、ＰＰＡＲαまたはＲＯＲαのような核受容体は、アポＡ−Ｉ遺伝子転写の制御に決定的な役割を果たすことが示されている。特に、ＰＰＡＲαは、異常脂肪血症の処置に臨床的使用を有するフィブラートによって誘導される、ヒトで観察されるアポＡ−Ｉ発現の増大の原因となる。そのため、アポＡ−Ｉ発現の制御に関与する新たな細胞内シグナリング経路の同定は、コレステロール逆輸送の効率を高め、こうしてアテローム性動脈硬化症から防護することができる、新たな治療方針を作り上げることを可能にすると思われる。
【０００４】
核ホルモン受容体は、その活性を天然および／または合成リガンドによって調整することができる、転写因子の一大ファミリーを形成する。そのような転写因子は、一般的には特異的なシス作用性応答要素に結合し、転写機構を活性化するのに要する付属的タンパク質を動員することによって、その標的遺伝子の発現を制御する。
【０００５】
ＦＸＲ受容体は、ＲＩＰ１４またはＮＲ１ＨＦとしても知られ、本来はファルネソイド受容体として同定された。やはりこのタンパク質ファミリーの成員である、ＲＸＲ受容体と異種二量体を形成することによって作用する。いくつかの胆汁酸、たとえばケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）またはデオキシコール酸（ＤＣＡ）、およびより少ない程度にリトコール酸（ＬＣＡ）は、ＦＸＲの真のリガンドであり、これらの化合物はＦＸＲ受容体を活性化することが最近示された。ＦＸＲは、一つのヌクレオチドによって隔てられた二つのＡＧＧＴＣＡというモチーフの逆方向反復で構成される応答要素と優先的に結合する。また２、４または５ヌクレオチドによって隔てられた反復されるＡＧＧＴＣＡモチーフ（ＤＲ−２、ＤＲ−４、ＤＲ−５）とも結合する［Laffitte, B.A. et al., J. Biol. Chem., 2000, 275:10638-10647］。ＦＸＲのいくつかの標的遺伝子、たとえばＣｙｐ７αヒドロキシラーゼ（WO 00/40965を参照されたい）、Ｉ−ＢＡＢＰ、ＰＬＴＰおよびＣＰＴ−IIが同定されている。
【０００６】
本発明は、ヒトアポＡ−Ｉ遺伝子の発現におけるＦＸＲの観察された役割、およびＦＸＲと、この遺伝子のプロモーターの別個の２フラグメントとの間に生じる直接の相互作用に基づく。また胆汁酸の存在下でのＦＸＲの過剰発現がヒトアポＡ−Ｉプロモーター活性の抑制を生じるとの独創的な観察にも基づく。さらに、ヒトアポＡ−Ｉ遺伝子プロモーター内の部位ＣおよびＡを、機能性ＦＸＲ応答要素であるとして同定すること、ならびにそれらの個々の配列の特性記述にも基づく。また部位ＣとのＦＸＲの結合が、アポＡ−Ｉ発現を阻害し、ＦＸＲは、この部位にも、予測されず、予見できない方式で単量体として結合すること、およびＦＸＲによるヒトアポＡ−Ｉ遺伝子プロモーターの活性の部位Ｃを通じての阻害が、部位Ａを通じてのその活性化作用より優先するという独創的な観察にも基づく。
【０００７】
したがって、本発明は、ＦＸＲ核受容体によるアポＡ−Ｉ産生の調整の最初の立証を提供する。したがって、本発明は、このタンパク質の発現、またはＨＤＬの活性、またはコレステロール逆輸送を調節できる化合物を検索するための新たな標的および新たな取組方を開示する。
【０００８】
本発明は、また、アポＡ−Ｉ遺伝子プロモーターとのＦＸＲの結合、および／またはヒトアポＡ−Ｉ遺伝子の転写に対するその効果を調整する化合物の使用に基づいて、コレステロール逆輸送を増大させる方法を記載する。
【０００９】
本発明は、さらに、ヒトアポＡ−Ｉ遺伝子の発現、ならびに／またはＨＤＬおよび／もしくはコレステロール逆輸送の活性を調整することができる治療物質を同定するための、スクリーニング方法を提供する。
【００１０】
同定の実施態様によれば、本発明のスクリーニング方法は、より具体的には、下記の工程を包含する：
【００１１】
・１種類またはそれ以上の化合物を、ヒトアポＡ−Ｉ遺伝子プロモーターまたはその機能的変異体の少なくとも一つのＦＸＲ応答要素を有する核酸構築物と、該応答要素との該化合物の結合を可能にするのに適した条件下で接触させる工程と、
【００１２】
・応答要素との該化合物の存在し得る結合を決定する工程と、
【００１３】
・場合により、前記の測定を、同じ条件ではあるが、ヒトアポＡ−Ｉ遺伝子プロモーターのＦＸＲ応答要素の少なくとも一つの突然変異させたコピーを有する核酸構築物を用いて実施した測定と比較する工程。
【００１４】
本発明の方法の同定の実施態様によれば、該ＦＸＲ応答要素との該化合物の結合を可能にするのに適した条件は、（たとえば単量体形態での）ＦＸＲ受容体または機能的等価物の存在と、および応答要素とのＦＸＲの結合に対する試験化合物の存在の効果の決定とを含む。
【００１５】
もう一つの具体的な実施態様（転写活性の試験）によれば、本発明による少なくとも一つのＦＸＲ応答要素とを有するプロモーターの転写活性に対する１種類またはそれ以上の試験化合物の効果を測定する。そのような試験は、好ましくは、そのようなプロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子の発現を測定することによって、細胞系内、特にＦＸＲ受容体またはその機能的等価物を含む（たとえば、自然にか、または組換えによって発現する）細胞内で実施する。
【００１６】
本発明の好適実施態様は、本発明による、一つまたはそれ以上のＦＸＲ応答要素をレポーター遺伝子と組み合わせる、発現カセットを用いることからなる。好都合な方式では、該レポーター遺伝子を、該および応答要素の少なくとも１コピーを含むプロモーター、たとえばアポＡ−Ｉ遺伝子プロモーターまたはその変異体もしくはフラグメントの制御下に置く。生物学的抽出物中でのその活性または存在が容易に測定できる、当業者に公知のいかなる遺伝子も、このスクリーニング方法を実施するためのレポーター遺伝子として用いることができる。
【００１７】
本発明の方法によって同定することができる化合物は、ＦＸＲの活性を調整することができる、異なる性質、構造および起源を有する化合物、特に生物学的化合物、核因子、補助因子など、化学的合成化合物などであり得る。それらは、ライブラリー、特に化学的化合物のライブラリー、またはタンパク質、ペプチドもしくは核酸のライブラリー、たとえばＤＮＡ結合タンパク質またはペプチドをコードしているクローンであり得る。
【００１８】
本発明による方法は、その応答要素の一方および／もしくは他方とのＦＸＲの結合を変更し、かつ／またはヒトアポＡ−Ｉ遺伝子の発現を調整し（すなわち増大または減少させ）、かつ／またはＨＤＬの活性および／もしくはコレステロール逆輸送を調整することができる化合物を選別、同定または特徴づけるのに用い得る。
【００１９】
本発明は、さらに、それによって選別された化合物を、コレステロール逆輸送またはＨＤＬ活性を調整するための組成物を製造するのに用いること、および対応する処置方法を記載する。
【００２０】
本願をより容易に理解するために、下記の定義を与えるが、それは、それらの通常の意味を明解にするか、またはその意味に付加する。
【００２１】
「アポリポタンパク質Ａ−Ｉ」またはアポＡ−Ｉ：アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、アミノ末端の球状ドメインと、脂質に結合できるカルボキシル末端とを有する、２４３アミノ酸のタンパク質である［Segrest et al., Curr. Opin. Lipidol., 2000, 11:105-115］。このタンパク質は、高密度リポタンパク質の主要な成分であり、コレステロール逆輸送に根底的な役割を果たす［Fruchart & Duriez, Biochimie, 1998, 80:167-172；Leroy et al., Curr. Opin, Lipidol, 1995, 5:281-285］。アポＡ−Ｉ遺伝子、ｃＤＮＡおよびｍＲＮＡは、クローニングされ、配列決定されており［Breslow et al., PNAS, 1982, 79;6861-6865；Shoulders & Bradle, Nuc. Ac. Res., 1982, 10:4873-4882； Karathanasis et al., Nature, 1983, 304:371-373］、Genbankのデータベース（たとえば、下記のインターネットアドレス：http://www.ncbi.nlm.nih.govの）中に登録番号：NM 000039、M20656（プロモーター）およびJ00098でアクセス可能である。
【００２２】
「高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）」：ＨＤＬ粒子は、専ら、末梢細胞からコレステロールを抽出し、それが除去される肝臓へとそれを輸送できるその能力のために、アテローム性動脈硬化症に対して防護的役割を果たすことが公知である、高密度リポタンパク質である［Fruchart & Duriez, Biochimie, 1998, 80:167-172］。アポＡ−Ｉは、ＨＤＬの主要なタンパク質構成要素であって、タンパク質の７０％を占める。ＨＤＬは、アポＡ−II、アポＣ−Ｉ、アポＣ−II、アポＣ−IIIおよびアポＥもより低率で包含する。
【００２３】
「ＦＸＲ」：ＦＸＲ受容体は、ヒトおよびマウスで単離、特性記述かつ配列決定されている［Forman et al., Cell, 1995, 81:687-693；Seol et al., Mol. Endo., 1995, 9:72-85］。ｍＲＮＡ配列は、やはりGenbankデータベース（登録番号NM 005123、NM 021745およびU18374）中に入手可能である。ＦＸＲのＤＮＡドメインは、ヒトタンパク質の主として残基Ｃｙｓ１８４〜Ｍｅｔ１８９の間（NM 005123の７２６〜９５３に相当）、またはマウスタンパク質の残基４２３〜６２１（U18374）の間で構成される。
【００２４】
ＦＸＲ受容体を意味する表現「機能的等価物」は、ＦＸＲ受容体の構造に由来し、応答要素、特に配列番号１もしくは２を有するいかなる応答要素、またはその機能的変異体にも結合できる能力を保存している、いかなるポリペプチドをも意味する。機能的等価物は、天然の変異体（多型、スプライシング等々）、フラグメント、突然変異体、欠失等々であってもよい。好ましくは、ＦＸＲ受容体のそれと６０％以上、好ましくは７５％以上、はるかに好ましくは９０〜９５％以上の同一性を共有するアミノ酸の少なくとも１領域を含むポリペプチドである。この表現は、ＦＸＲ受容体のフラグメント、特にＦＸＲ受容体のＤＮＡ結合部位を含むフラグメントも包含する。
【００２５】
用語「逆輸送」は、末梢組織中の過剰なコレステロールが高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）によって捕集され、次いでそれが除去される肝臓へと輸送される、ときには不完全である、生理学的機構を意味するのに用いられる。
【００２６】
Ａ．ＦＸＲ応答要素の同定
本発明は、胆汁酸によるアポＡ−Ｉ発現の調節、およびこれが該当するが、コレステロール逆輸送の調節におけるＦＸＲの関与および作用機序を立証する。胆汁酸の存在下で、ＦＸＲの過剰発現は、後者の活性の低下を招く。本発明は、さらに、ヒトアポＡ−Ｉ遺伝子のプロモーター内に位置決定された二つのＦＸＲ応答要素の正確な配列を開示する。
【００２７】
本発明は、ＦＸＲ応答要素を含む同定の構成体、特に核酸はもとより、それらを含むカセット、ベクターおよび組換え細胞にも関する。
【００２８】
したがって、本発明は、当初はヒトアポＡ−Ｉ遺伝子プロモーターで同定された、ＦＸＲとアポＡ−Ｉ遺伝子との間の相互作用、およびアポＡ−Ｉ発現のＦＸＲ調節を担当する二つのＦＸＲ応答要素の配列（配列番号１および配列番号２）を開示する。
【００２９】
たとえば、部位Ｃ（配列番号１）の３コピーの存在は、ＦＸＲおよび胆汁酸によるレポーター遺伝子の発現の阻害を生じる（例５を参照されたい）。反対に、部位Ａ（配列番号２）の３コピーの存在は、該発現の刺激を生じる（例５を参照されたい）。
【００３０】
本発明の同定の目的は、配列番号１もしくは２、もしくはその機能的変異体（「ＦＸＲ応答要素」）を含む核酸である。本発明のもう一つの目的は、上記に定義されたとおりのＦＸＲ応答要素を含む核酸構築物である。特に、これは、上記に定義されたもののような応答要素の少なくとも１コピーを含む発現カセットであってもよい。
【００３１】
本発明は、さらに、上記に定義されたもののようなＦＸＲ応答要素を含むいかなる人工的またはキメラ性プロモーターにも関する。
【００３２】
本発明による応答要素の機能的変異体は、ＦＸＲ受容体に結合できる能力を保存している、未変性配列のいかなる誘導体またはフラグメントでもあり得る。概して、この変異体は、本願に記載された未変性配列の残基の５０％以上を保存している。古典的には、変異体は、考慮下にある配列中の５ヌクレオチド未満に影響する変更を含む。好ましくは、それらは、本願に記載された未変性配列との６０％以上の配列同一性、好ましくは７５％以上、はるかに好ましくは９０％以上の配列同一性を示す。
【００３３】
該変異体は、一つまたはそれ以上の点突然変異か、さもなければ付加、欠失および／または置換のような、異なる種類の変更を含み得る。
【００３４】
そのような変更は、慣用の物理的、化学的または分子生物学的方法、たとえば特に部位特異的突然変異誘発によってか、またはより実際的には合成装置内での配列の人工的合成によって導入し得る。
【００３５】
該変異体は、ＦＸＲと結合できるそれらの能力について、異なる方法で、特に
【００３６】
（ｉ）試験配列を（たとえば無細胞性試験として）ＦＸＲ受容体と接触させ、複合体の形成を（たとえばゲルシフトアッセイによって）検出することによって；
【００３７】
（ii）試験配列を、最小プロモーターおよびレポーター遺伝子を含む発現カセットに挿入し、該カセットを細胞に導入し、そしてＦＸＲの存在および不在下でのレポーター遺伝子の発現を検出（該当し得るとおりに検定）することによって；
【００３８】
（iii）核酸と、たとえばタンパク質との相互作用を立証するのを可能にする、当業者に公知の他のいかなる方法によっても
試験し得る。
【００３９】
本発明のさらに一つの目的は、上記に定義された応答要素の不活性変異体、特にＦＸＲ受容体と結合することが本質的にできない変異体からなる。そのような変異体は、特に、配列番号３および４によって例示される。
【００４０】
そのような不活性変異体は、機能的変異体について上記された条件下で製造かつ試験し得る。本発明による変異体は、好都合には、配列番号１またはその一部とハイブリダイズすることができる。
【００４１】
Ｂ．コレステロール逆輸送を調整する化合物を選別、同定および／または特徴づける方法
本発明は、コレステロール逆輸送を調整する（すなわち、増大または低下させる）化合物を同定するための方法を記載する。そのような化合物は、ＦＸＲのその単数または複数のリガンド（胆汁酸、補助抑制因子および補助活性化因子等々）との結合を変化させることによって作用し得る。それは、その応答要素とのＦＸＲ単独のか、またはＦＸＲおよびその補助因子の結合を、さらに変更し、抑制さえして、それによってヒトアポＡ−Ｉ遺伝子の発現を変更し得る。たとえば、応答要素Ｃ（配列番号１）とのＦＸＲの結合は、ヒトアポＡ−Ｉ遺伝子の転写を低下させ、コレステロール逆輸送を減少させる。そのため、この応答要素とのＦＸＲの結合（ＦＸＲは抑制因子の役割を果たす）を阻害できる化合物の使用は、対照的に、ヒトアポＡ−Ｉ遺伝子の転写を増大させ、コレステロール逆輸送を刺激するのを可能にする。
【００４２】
本発明は、応答要素Ａ（配列番号２）とのＦＸＲの結合が、ヒトアポＡ−Ｉ遺伝子の転写を増大させ、コレステロール逆輸送を増大させることも、驚くべき方法で示す。そのため、この応答要素とのＦＸＲの結合（この場合は、ＦＸＲは転写活性化因子として作用する）を刺激できる（または直接結合によってこの活性化を再現できる）化合物の使用は、ヒトアポＡ−Ｉ遺伝子の転写を増大させ、コレステロール逆輸送を刺激するのを可能にする。
【００４３】
したがって、本発明は、コレステロール逆輸送を増大させることができる化合物を選別、同定または特徴づけるための新規な方法を記載する。
【００４４】
１．発現のスクリーニングに基づく方法
本発明は、コレステロール逆輸送を調整することができる化合物を選別、同定または特徴づける方法であって、
【００４５】
・試験化合物を、ヒトのアポリポタンパク質Ａ−Ｉ遺伝子プロモーターまたはその機能的変異体の、ＦＸＲ応答要素の少なくとも１コピーを有するプロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子を含む、レポーター遺伝子発現カセットを有する宿主細胞に接触させ、
【００４６】
・該レポーター遺伝子の発現を測定する
ことを含む方法に関する。
【００４７】
本発明による方法は、より具体的には、試験化合物を、ＦＸＲ応答要素（配列番号１または２）の少なくとも１コピーを含む核酸構築物と接触させることを与える。本発明のもう一つの実施態様によれば、ＦＸＲ応答要素（部位Ｃおよび／またはＡ）のコピーは、胆汁酸の存在下でさえ、ＦＸＲ受容体に結合することが本質的にできない、突然変異させたコピーであってもよい。
【００４８】
本発明の方法の同定の実施態様によれば、これらの方法を用いて決定された存在し得る効果を、同じ条件ではあるが、ヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉ遺伝子プロモーターの、ＦＸＲ応答要素（配列番号１または２）の少なくとも一つの不活性変異体（たとえば、突然変異させたコピー）、または前者の機能的変異体を含む核酸構築物を用いて実施することによって決定された、存在し得る効果と比較することがさらに提供される。
【００４９】
本発明の方法は、異なる種類の細胞、プロモーター、レポーター遺伝子を用いてか、または以下に説明するとおり、異なる条件で実施し得る。
【００５０】
（ａ）宿主細胞との化合物の接触
そのため、本発明が記載するいくつかのスクリーニング法は、該細胞内でのレポーター遺伝子の発現を測定し、こうして試験化合物の効果に関する情報を得るのを可能にする同定の条件で、試験化合物を宿主細胞と接触させる工程を与える。古典的には、試験化合物の効果を、該化合物の不在下で測定されたレポーター遺伝子の発現レベルと（および／または突然変異させた応答要素と）比較する。
【００５１】
本発明の好適実施態様では、そのような細胞は、哺乳動物細胞（肝細胞、繊維芽細胞、内皮細胞、筋細胞等々）であってよい。はるかに好ましくは、そのような細胞は、ヒトの細胞であってよい。初代培養、または樹立した細胞系であってもよい。もう一つの実施態様では、原核細胞（細菌）、酵母細胞（サッカロミセス、クライヴェロミセス等々）、植物細胞などを用いることも可能である。
【００５２】
化合物は、その効果、その濃度、細胞の種類および技術的考慮に応じて、異なる時間、細胞と接触させてよい。接触は、適切ないかなる担体上、特にプレート上、管またはフラスコ内でも実施し得る。一般的には、接触させることは、異なる多くの試験を同時に実施することを可能にする、マルチウェルプレートで実施する。代表的な担体は、微量滴定プレート、より詳しくは、操作するのが容易で、視覚化が古典的な刺激を通じて達成し得る、９６または３８４ウェル（またはそれ以上）を有するプレートを包含する。
【００５３】
担体、および試験化合物の性質に応じて、可変量の細胞を用いて、本明細書に記載された方法を実施し得る。古典的には、適切な培地中で、１０3〜１０6個の細胞、優先的には１０4〜１０5個の細胞を１種類の試験化合物と接触させる。例示するならば、９６穴プレートで、１０5個の細胞を、望みの量の試験化合物とともに各ウェル内でインキュベーションすることができる。３８４穴プレートでは、１０5個未満、代表的には１ｘ１０4〜４ｘ１０4個の細胞を、一般的には試験化合物とともに各ウェル内でインキュベーションする。
【００５４】
試験化合物の量（または濃度）は、化合物の種類（その毒性、細胞内に浸透できるその能力等々）、細胞の数、インキュベーション時間等々に従って使用者が調整し得る。一般的には、細胞を、１nM〜１mMにわたる濃度の試験化合物に接触させる。当然、他の濃度も、本発明から逸脱することなく試験し得る。各化合物は、異なる濃度で同時にさらに試験し得る。リポソーム、陽イオン性脂質、重合体、ペネトラチン、ＴａｔＰＤＴ、アデノウイルス（ペントンまたはファイバー）そのたのウイルスからのペプチドなどのような、細胞内への化合物の浸透を容易にする異なるアジュバントおよび／またはベクターおよび／または生成物を、必要ならば用いてもよい。
【００５５】
接触は、５〜７２時間、一般的には１２〜４８時間保つ。実際には、細胞および様々な試薬は、レポーター遺伝子の発現産生物のde novo合成を可能にするのに充分なだけ長く接触させておくのが好ましい。好適な方式では、インキュベーション時間は、約３６時間である。
【００５６】
（ｂ）化合物の活性の決定
本発明で供される、コレステロール逆輸送を調整することができる化合物を選別、同定または特徴づける方法は、レポーター遺伝子の発現カセットによる宿主細胞の形質転換を要求する。該レポーター遺伝子は、特に、その転写または発現産生物を、生物学的抽出物中に検出または検定することができる、いかなる遺伝子であってもよい。たとえば、ヒトアポＡ−Ｉ遺伝子自体をコードしている遺伝子、さらにはルシフェラーゼ、より詳しくはホタルもしくはレニラ（ウミシイタケ属）のルシフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、β−グルクロニダーゼ（Ｇｌｕｃ）およびグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等々をコードしている遺伝子であってもよい。用語「遺伝子」は、広義には、いかなる核酸、特にｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡ等々も意味することが理解される。
【００５７】
レポーター遺伝子は、何であれ、上記のもののようなＦＸＲ応答要素の少なくとも１コピーを含むプロモーターの制御下に置く。
【００５８】
そのため、レポーター遺伝子は、その配列が配列番号１および／もしくは２、またはその機能的変異体の一つを含む、いかなるプロモーターの制御下にも置いてよい。そのような同定の配列は、プロモーターの上流、下流もしくは内部の一つまたはそれ以上（好ましくは１〜１０個、はるかに好ましくは１〜６個）のコピー中に、同じ配向でか、または反対の配向で存在し得る。本発明の好適実施態様では、レポーター遺伝子は、部位Ａ（配列番号２）の一つまたはそれ以上のコピーを含み、部位Ｃを含まないプロモーターの制御下に置く。本発明のもう一つの実施態様では、レポーター遺伝子は、部位Ｃ（配列番号１）の一つまたはそれ以上のコピーを含み、部位Ａを含まないプロモーターの制御下に置く。本発明のさらに一つの実施態様では、レポーター遺伝子は、部位ＣおよびＡの一つまたはそれ以上のコピーを含むプロモーターの制御下に置く。好ましくは、プロモーターは、ＦＸＲまたは機能的等価物の不在下および存在下でのその異なる活性を検出することができる、それである。
【００５９】
本発明のプロモーターを構成するには、ＦＸＲ応答要素を転写最小プロモーターに結びつけてよい。最小プロモーターは、基底活性が低いか、または不在であり、転写活性化因子の存在下で増大する（胆汁酸の存在下での部位ＡとＦＸＲとの相互作用）ことができる、転写プロモーターである。したがって、最小プロモーターは、哺乳動物細胞内で天然には弱い、すなわち、無害の、および／または顕著な生物学的効果を得るには不充分な発現を生じるプロモーターであり得る。好都合には、最小プロモーターは、未変性のプロモーターから、転写活性に不可欠ではない領域の欠失によって調製される構成体である。したがって、それは、好ましくは、概して長さが１６０ヌクレオチドであり、転写開始コドンの周囲を中心とする、ＴＡＴＡボックスを基本的に有するプロモーターである。したがって、最小プロモーターは、強いか、または弱いウイルスもしくは細胞性プロモーター（その例は、ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のプロモーター、ＣＭＶ初期プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等々を包含する）から調製することができる。最小プロモーターは、たとえば、ＦＸＲ介在性阻害を部位Ｃを通じて増大させるか、またはＦＸＲ介在性活性化を部位Ａを通じて低下させる化合物の同定を可能にするのに充分高い活性を有し得る。
【００６０】
プロモーター（Ｐ）、ＦＸＲ応答要素（ＲＥ）およびレポーター遺伝子（ＲＧ）は、発現カセット内で、機能的な方式で、すなわち、最小プロモーターが該遺伝子の発現を制御し、その活性がＦＸＲによって調節されるような方法で配置する。そのため、一般的には、そのような領域は、５’から３’の方向に下記の順序：ＲＥ−Ｐ−ＲＧで配置する。しかし、他のいかなる機能的な配置も、本発明から逸脱することなく、当業者が用い得る。
【００６１】
その上、上記の異なる機能性ドメインを、互いに直接隣接させることができるか、または発現カセットの機能的特徴には有意な効果を有さないヌクレオチドもしくは系（増幅因子、サイレンサー、イントロン、スプライシング部位等々）の改良された特徴や性能を賦与するのを可能にするヌクレオチドによって隔て得る。
【００６２】
コレステロール逆輸送を調整することができる化合物を選別、同定および特徴づける方法は、レポーター遺伝子の発現を測定する工程を与える。これは、転写活性の測定であり得る。この目的には、一方では実験的条件、他方では制御状況にある、培養体中の細胞から、総ＲＮＡを抽出する。そのようなＲＮＡは、たとえばレポーター遺伝子の発現の変化を分析するためのプローブとして用いられる。
【００６３】
これは、適切な基質を用いた、レポーター遺伝子の発現の視覚化を含んでもよい。そのような視覚化は、用いられるレポーター遺伝子の種類にその性質が依存する、異なる方法によって達成し得る。たとえば、測定は、β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として用いる場合は、光学密度または蛍光発光に対応し得る。
【００６４】
同定の実施態様では、レポーター遺伝子の発現を、該レポーター遺伝子の発現産生物の基質の加水分解によって測定する。たとえば、β−ラクタマーゼの発現を評価するのに、数多くの基質を用い得る。これらは、β−ラクタム核を有し、その加水分解を制御することができる、いかなる産生物であってもよい。好適な基質は、β−ラクタマーゼに特異的なもの（すなわち、β−ラクタマーゼの不在下では哺乳動物細胞によって加水分解されない）、哺乳動物細胞に有害ではなく、かつ／またはその加水分解生成物が、たとえば、蛍光、放射能、酵素活性その他のいかなる検出手段にも基づく方法によって、容易に測定し得るものである。はるかに好適な基質は、放射測定用基質である。そのような基質の加水分解は、数多くの細胞によるレポーター遺伝子の発現産生物の活性に直接関係付け得る。本発明に用い得る特異的かつ無害な放射測定用基質は、ＣＣＦ２−ＡＭである。
【００６５】
基質の濃度は、たとえば細胞の数に従って、当業者が調整し得る。一般的には、細胞は、約６０分間基質に接触させる。
【００６６】
レポーター遺伝子産生物（または基質の加水分解生成物）の存在は、当業者に公知の慣用の方法（蛍光、放射能、光学密度、ルミネセンス、ＦＲＥＴ（WO 003707を参照されたい）、ＳＰＡ、バイオチップ、免疫学的方法等々）によって決定し得る。
【００６７】
一般的には、細胞内の試験化合物の活性を決定し、この効果を、試験化合物の不在下での活性レベル、またはいかなる試験化合物の不在下でも決定された平均値と比較する。
【００６８】
加水分解を測定することは、本質的には、各反応サンプル中に含まれる加水分解生成物を測定する（その相対量を決定する）ことを意味する。そのような測定は、蛍光、放射能、色彩、酵素活性、抗原抗体免疫複合体などの検出を包含する、当業者に公知の異なる方法によって実施し得る。好適な方式では、加水分解生成物を、蛍光検出法によって検出かつ定量する。そのため、細胞サンプル上に異なる蛍光色素を用い、かつ制御し得る。選ばれた化合物の動物における有効性の確認を可能にする二次試験も、該化合物で処理された細胞における、未処理細胞に比しての、発現されたＨＤＬの量を決定するか、またはコレステロール逆輸送の有意な変動を決定することによって実施し得る。血漿コレステロールを測定し、かつ／またはアポＡ−Ｉの肝臓での発現を決定することも可能である。
【００６９】
好適な方式では、本発明による方法は、ＦＸＲ受容体またはその機能的等価物を有する宿主細胞を利用する。
【００７０】
ＦＸＲ受容体の存在は、生理学的状況を再現し、上記の方法を通じて、本発明に開示されたとおり、ＦＸＲとその応答要素の一方および／もしくは他方との間か、またはＦＸＲと１種類もしくはそれ以上のＦＸＲリガンドとの間の相互作用を調整することができる化合物を同定するのを可能にする。
【００７１】
ＦＸＲ受容体は、天然に存在するか、または人工的な手段で導入もしくは付加されていてもよい。それは、ＦＸＲ受容体との６０％以上、好ましくは７５％以上、はるかに好ましくは９０〜９５％以上のアミノ酸同一性を共有する、ＦＸＲ等価体であり得る。
【００７２】
好適実施態様によれば、本発明は、コレステロール逆輸送を調整することができる化合物を選別、同定または特徴づける方法であって、
【００７３】
・試験化合物を、
−ヒトのアポリポタンパク質Ａ−Ｉ遺伝子プロモーターまたはその機能的変異体の、ＦＸＲ応答要素の少なくとも１コピーを有するプロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子を含む、レポーター遺伝子発現カセットと、
−ＦＸＲ受容体およびその機能的変異体と
を有する宿主細胞に接触させ、
【００７４】
・該レポーター遺伝子の発現を測定する
ことを含む方法も記載する。
【００７５】
この方法は、当業者に公知の上記の方法の一つに従って、試験化合物の存在下、または該化合物の不在下での、レポーター遺伝子の発現レベルを決定することを可能にし、レポーター遺伝子発現のレベルの上昇または降下は、コレステロール逆輸送を調整することができる試験化合物の能力の裏返しである。
【００７６】
本発明のはるかに好適な実施態様によれば、宿主細胞は、ＦＸＲリガンドも含有する。
【００７７】
用語「ＦＸＲリガンド」は、胆汁酸および誘導体ばかりでなく、転写因子、補助活性化因子および補助抑制因子はもとより、遺伝子発現の調節機構に関与するその他のポリペプチドにも該当する。たとえば、これらは、ＲＸＲまたは核ホルモン受容体のようなその他の受容体であってもよい。
【００７８】
上記に示したとおり、そのような方法は、１種類またはそれ以上の細胞集団（哺乳動物細胞、たとえば肝細胞のようなヒトの細胞、原核細胞等々）において多くの試験化合物を迅速かつ同時にスクリーニングするのを可能にする。これらの方法は、予測となり、自動化することができ、該化合物を選別、同定かつ特徴づけるのに適する。
【００７９】
このスクリーニング法の同定の実施態様は、ＤＮＡ結合タンパク質を発現するクローンを同定するための、慣用の方法を利用する。これは、たとえば、γgt11というｃＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニング、またはいわゆる「ワンハイブリッド」もしくは「ファージ表示」法の使用、さらにはアフィニティークロマトグラフィーによる精製の実施を含み得る。
【００８０】
２．結合試験に基づく方法
本発明は、応答要素の一方もしくは他方、または双方さえとの試験化合物の結合に基づいて、コレステロール逆輸送を調整することができる化合物を選別、同定かつ特徴づける方法にも関する。より詳しくは、そのような方法は、
【００８１】
・試験化合物を、ヒトのアポリポタンパク質Ａ−Ｉ遺伝子のプロモーターまたはその機能的変異体の、ＦＸＲ応答要素の少なくとも１コピーを含む核酸構築物に接触させ、
【００８２】
・該応答要素に対する該試験化合物の存在し得る結合を決定する
ことを含む方法にも関する。
【００８３】
少なくとも一つのＦＸＲ応答要素との試験化合物の結合は、上記の方法の実施の結果として形成される、ヘテロ二量体の電気泳動ゲルの移動によって立証し得る。実際問題として、いくつかの試験化合物は、ＦＸＲのそれと大幅に同一である、ＤＮＡ結合部位を保有し、そのため、ＦＸＲの競合因子として作用し得る。
【００８４】
電気泳動は、ＦＸＲ／ＦＸＲ応答要素のヘテロ二量体を、試験化合物／ＦＸＲ応答要素のヘテロ二量体およびＦＸＲ応答要素から直接区別することを可能にする。
【００８５】
ルミネセンス、または当業者に周知のＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）法もしくはＳＰＡ（シンチレーション近似アッセイ）法の採用に基づくその他の方法は、本発明の対象範囲内で、一方および／または他方のＦＸＲ応答要素との試験化合物の存在し得る結合を決定するのに利用し得る。
【００８６】
コレステロール逆輸送を調整することができる化合物を選別、同定かつ特徴づけるためのこの直接的な方法は、本発明の同定の実施態様では、ＦＸＲ応答要素または後者の機能的等価物の存在下で実施し得る。そうして、そのような方法の最終工程は、ＦＸＲのその応答要素との結合に対する試験化合物の存在の効果を決定することからなる。たとえば、これは、該試験化合物が応答要素とのＦＸＲの結合を調整することができることを、試験化合物の存在下でのＦＸＲの結合の量を試験化合物の不在下での量と対比して測定することによって確定する。したがって、当業者に公知の蛍光偏光（ＦＰ）法を用いた競合試験は、そのような測定の目的に効率的に用い得る。
【００８７】
応答要素とのＦＸＲの結合を調整することができる試験化合物は、それが、レポーター遺伝子の発現および／またはコレステロール逆輸送を調整することができることの、上記の方法の一つによるその後の試験の目的となり得る。
【００８８】
同定の実施態様では、核酸構築物は、配列番号１またはその機能的変異体の１コピー以上、好ましくは２〜５コピーを有する。この構成体とのＦＸＲの結合を阻害できる（すなわち、少なくとも部分的に低下させる）試験化合物は、レポーター遺伝子の発現を活性化し、コレステロール逆輸送の刺激のための候補を構成することを可能にする。
【００８９】
Ｃ．ＨＤＬおよびアポリポタンパク質Ａ−Ｉの活性
レポーター遺伝子の発現および／またはコレステロール逆輸送を調整することができる化合物を選別、同定かつ特徴づけるための上記の方法は、本発明のもう一つの実施態様では、ＨＤＬの活性および／またはアポＡ−Ｉの発現を調整することができる化合物を選別、同定かつ特徴づけるのに用い得る。
【００９０】
Ｄ．試験化合物
本発明は、いかなる種類の試験化合物による使用にも付し得る。たとえば、試験化合物は、単独でか、または他の生成物との混合物中に用いられる、いかなる生成物であってもよい。該化合物は、その構造および／または組成の面で定義しても、あるいは定義しなくてもよい。たとえば、該化合物は、単離され、構造的に解明された生成物、不明確な構造を有する単離生成物、既知の特性記述された生成物の混合物、または１種類もしくはそれ以上の生成物を含む不明確な組成物であり得る。そのような不明確な組成物は、組織サンプル、生物学的流体、細胞上清、植物調製品などによって例示され得る。試験化合物は、無機もしくは有機生成物、特にポリペプチド（またはタンパク質もしくはペプチド）、核酸、脂質、多糖類、化学的もしくは生物学的化合物、たとえば核因子、補助因子またはいかなる混合物、または後者の誘導体であり得る。該化合物は、天然または合成のものであってもよく、組合せライブラリー、クローン、または１種類もしくはそれ以上のＤＮＡ結合性ペプチドを発現する核酸クローンのライブラリーを包含し得る。
【００９１】
本発明は、非常に多くの化合物を選別、同定または特徴づけるのに特に適している。そのような単純かつ効率的なスクリーニングは、非常に短時間で達成し得る。特に、本明細書に記載された方法は、部分的に自動化し、それによって、異なる多くの化合物を、混合物としても、個々にでも効率的かつ同時にスクリーニングすることを可能にし得る。
【００９２】
Ｅ．同定された化合物の使用
本発明に従って同定された化合物は、治療使用の観点から、特にアテローム性動脈硬化症の分野での観点から好都合である、特性を示す。本発明の存在し得る一つの適用は、アポＡ−Ｉ発現に対する胆汁酸の阻害効果を軽減し、こうしてコレステロール逆輸送を増大させることができる、治療用物質の同定を可能にすることである。したがって、本発明は、コレステロール逆輸送を調整する（すなわち、増大または減少させる）組成物を製造するために、ヒトアポＡ−Ｉ遺伝子プロモーターまたはその機能的変異体の応答要素とのＦＸＲの結合を調整する（すなわち、増大または減少させる）ことができる化合物の使用を提供する。
【００９３】
本発明のもう一つの実施態様によれば、そのような活用は、ＨＤＬの活性を調整する（すなわち、増大または減少させる）ためか、またはアポＡ−Ｉの発現を調整するためであり得る。
【００９４】
本発明のさらに一つの実施態様は、コレステロール逆輸送を増大させる化合物を製造するための、ヒトアポＡ−Ｉ遺伝子またはその機能的変異体の転写に対するＦＸＲの効果を制御できる化合物の使用を提供する。
【００９５】
本発明の好適実施態様によれば、この化合物は、化学的化合物または生物学的化合物である。もう一つの好適実施態様では、該化合物は、核因子または補助因子である。はるかに好適な実施態様では、それは、１種類またはそれ以上のＤＮＡ結合性ポリペプチドを発現するクローンである。一般的には、それは、上記の方法の一つに従って選別、同定または特性記述されたいかなる化合物であってもよい。
【００９６】
本発明は、本発明の対象範囲内で、上記の方法の一つに従って選別、同定もしくは特性記述された、コレステロール逆輸送を増大させるか、または高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化症、脂質障害および／もしくは心血管障害を処置する、実験的探求もしくは医薬組成物製造のための標的としての、いかなる化合物（または該化合物の誘導体）の使用も包含する。
【００９７】
本発明のその他の利点および適用は、下記の実施例で明らかになると思われるが、これらは、例示を目的として示され、限定のために示されてはいない。
【００９８】
【表１】
2004537272.tif 000002
【００９９】
実施例
例１：ヒトアポＡ−Ｉ遺伝子についてトランスジェニックであるマウスにおける、コレステロールおよびアポＡ−Ｉの血漿濃度、ならびにアポＡ−Ｉの肝発現に対するＴＣＡの効果（図１）
例１は、Ｃ５７ＢＬの遺伝的バックグラウンドでアポＡ−Ｉ遺伝子を発現するトランスジェニックマウスにおける、血清コレステロールおよびヒトアポＡ−Ｉレベル、ならびにヒトアポＡ−Ｉの脂質プロフィールおよび肝発現に対する、タウロコール酸塩に富む食餌の影響を示す。
【０１００】
Ｃ５７ＢＬの遺伝的バックグラウンドでアポＡ−Ｉ遺伝子を発現するトランスジェニックマウス（IFFA-CREDO、L'Arbresle、フランス国）１０匹を、ＰＣＲによって遺伝子型分類し、動物５匹の２群に分割した。第１群には、正常な食餌を１週間与えたが、第２群には、ＴＣＡ（タウロコール酸、０．５重量％）に富む食餌を与えた。１２時間の絶食後に、バルビタール麻酔下での眼窩後穿刺によって血液を捕集した。血清サンプルを捕集し、分析まで−２０℃で貯蔵した。食餌処置の１週間後に、動物を犠牲に供し、肝臓標本を捕集し、分析向けに凍結した。食餌の前後に、血清中のヒトアポＡ−Ｉレベルを、以前に記載されたとおりに測定した［Peters, J. Biol. Chem., 1997, 272(43):27307-12］。ＦＰＬＣ後に、血清コレステロールおよび脂質像を、以前に記載されたとおりに測定した［Raspe et al., J. Lipid Res., 1999, 40(11):2099-2110］。総ＲＮＡを、肝臓標本から、以前に記載されたとおりに抽出し［Chomczynski et al., Anal. Biochem., 1987, 162(1):156-9］、ヒトアポＡ−Ｉおよび２８Ｓをプローブとして用いて［Peters, J. Biol. Chem., 1997, 272(43):27307-12］、ノーザンブロットハイブリダイゼーションによって定量した［Peters, J. Biol. Chem., 1997, 272(43):27307-12］。
【０１０１】
例２：ＨｅｐＧ２細胞におけるアポＡ−Ｉの発現に対するＣＤＣＡおよびＴＣＡの効果（図２）
例２は、ＨｅｐＧ２細胞におけるアポＡ−Ｉの発現を低下させる、増大する濃度のＣＤＣＡおよびＴＣＡの効果を示す。ＨｅｐＧ２細胞は、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウムおよび非必須アミノ酸を添加したＤＭＥＭ培地で増殖させ、加湿した５％ＣＯ2／９５％空気の雰囲気中で３７℃でインキュベーションした。次いで、指定された濃度のＣＤＣＡで処理した。総ＲＮＡを、以前に記載されたとおりに抽出し［Chomczynski et al., Anal. Biochem., 1987, 162(1):156-9］、ヒトアポＡ−Ｉおよび２８Ｓをプローブとして用いて［Peters, J. Biol. Chem., 1997, 272(43):27307-12］、ノーザンブロットハイブリダイゼーションによって定量した［Peters, J. Biol. Chem., 1997, 272(43):27307-12］。
【０１０２】
例３：胆汁酸の転写効果の立証（図３）
例３は、５０μMの濃度でのＣＤＣＡが、ＨｅｐＧ２細胞におけるアポＡ−Ｉの発現を顕著に低下させることを示す。その効果は、アクチノマイシンＤとの１２時間の前インキュベーションによって打ち消されて、この効果が、転写のレベルで生じることを示唆する。ＨｅｐＧ２細胞は、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウムおよび非必須アミノ酸で強化したＤＭＥＭ培地で増殖させ、加湿した５％ＣＯ2／９５％空気の雰囲気中で３７℃でインキュベーションした。総ＲＮＡを、以前に記載されたとおりに抽出し［Chomczynski et al., Anal. Biochem., 1987, 162(1):156-9］、ヒトアポＡ−Ｉおよび２８Ｓをプローブとして用いて［Peters, J. Biol. Chem., 1997, 272(43):27307-12］、ノーザンブロットハイブリダイゼーションによって定量した［Peters, J. Biol. Chem., 1997, 272(43):27307-12］。
【０１０３】
例４：ＨｅｐＧ２細胞におけるアポＡ−Ｉプロモーターの活性に対する、ＣＤＣＡの存在下でのＦＸＲの過剰発現の効果（図５）
例４は、ＣＤＣＡの存在下でのｈＦＸＲおよびｍＲＸＲαの過剰発現が、ルシフェラーゼのレポーター遺伝子の上流でクローニングしたアポＡ−Ｉ遺伝子の、フラグメント−２５４／＋９１（部位ＡＢおよびＣを含む）、［（配列番号５を参照されたい）］、フラグメント−１９２／＋９１（部位ＢおよびＣを含む）の活性を抑制するが、フラグメント−４０／＋９１のそれは抑制しないことを示す。
【０１０４】
ＨｅｐＧ２細胞を、リポフェクチンによって、ＦＸＲの発現向けのｐｃＤＮＡＡ３−ｈＦＸＲベクター３００ng、ｐＳＧ５−ｍＦＸＲαベクター３００ng、および指示されたリポーターベクター１μgとともに同時トランスフェクションして、アポＡ−Ｉプロモーターのフラグメント−２５４／＋９１、−１９２／＋９１および−４０／＋９１の制御下でのルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を可能にした。これらの構成体は、以前に記載された構成体［Ngoc Vu-Dac et al., J. Biol. Chem., 1994, 269(49):31012-8］からのＣＡＴレポーター遺伝子を、Promega（Madison, WI、米国）からのプラスミドｐＧＬ３から、以前に記載されたとおりに抽出した［Raspe et al., J. Lipid Res., 1999, 40(11):2099-2110］ルシフェラーゼレポーター遺伝子と交換することによって得た。総ＤＮＡは、プラスミドｐＢＫＳ＋を用いて２μgに調整した。トランスフェクションの３時間後に、細胞を、指示された濃度の胆汁酸とともに培地中で３６時間インキュベーションした。次いで、ルシフェラーゼ活性を、以前に記載されたとおりに測定した［Raspe et al., J. Lipid Res., 1999, 40(11):2099-2110］。
【０１０５】
例５：ヒトアポＡ−Ｉ遺伝子プロモーター内に存在するＦＸＲ応答要素の機能性同定
例５は、ＣＤＣＡの存在下でのｈＦＸＲの過剰発現が、ルシフェラーゼのレポーター遺伝子の上流でクローニングしたアポＡ−Ｉプロモーターの野生型フラグメント−２５４／＋９１（「ｗｔ」構成体）の活性を抑制することを示す（パネルＡ）。さらに、アポＡ−Ｉプロモーターのフラグメント−２５４／＋９１（「Ｃmut」構成体）中に存在する部位Ｃにおける突然変異が、ｈＦＸＲの過剰発現に応答しての構成体の転写活性化を招くことを示す（パネルＡ）。ＣＤＣＡの存在下でのｈＦＸＲの過剰発現は、ルシフェラーゼのレポーター遺伝子の上流でクローニングしたアポＡ−Ｉ遺伝子の、部位Ａが突然変異したフラグメント−２５４／＋９１（「Ａmut」構成体）の活性も抑制する（パネルＡ）。最後に、ルシフェラーゼのレポーター遺伝子の上流でクローニングした、アポＡ−Ｉ遺伝子のフラグメント−２５４／＋９１の部位ＡおよびＣにおける二重突然変異誘発は、ｈＦＸＲに応答しての喪失を招く。
【０１０６】
例５は、ＣＤＣＡの存在下でのｈＦＸＲの過剰発現が、ヘルペスシンプレックスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子（表示された「Ｃ３ＴＫ」）の上流でクローニングした、ヒトアポＡ−Ｉプロモーターの部位Ｃの３コピーを含む構成体の活性を抑制するが、ヘルペスシンプレックスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター（表示された「Ａ３ＴＫ」）のみを含むにすぎない構成体の活性は、ＣＤＣＡの存在下でのｈＦＸＲの過剰発現によって活性化されるが、ＣＤＣＡの存在下でのｈＦＸＲの過剰発現によって影響されないことを示す（パネルＢ）。
【０１０７】
ＨｅｐＧ２細胞を、リポフェクチンによって、ｈＦＸＲの発現向けのｐＣＤＮＡ−３−ｈＦＸＲのベクター３００ｎg、および指示されたリポーターベクター１μgでトランスフェクションして、ヒトアポＡ−Ｉ遺伝子プロモーターの野生型または突然変異フラグメント−２５４／＋９１の制御下でのルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を、ヘルペスシンプレックスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターの制御下か、またはヘルペスシンプレックスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターの上流でクローニングした、ヒトアポＡ−Ｉ遺伝子プロモーターの部位Ａまたは部位Ｃの３コピーの制御下で可能にした。アポＡ−Ｉプロモーターの野生型フラグメント−２５４／＋９１を含む構成体は、以前に記載された対応する構成体［Ngoc Vu-Dac et al., J. Biol. Chem., 1994, 269(49):31012-8］のＣＡＴレポーター遺伝子を、Promega（Madison, WI、米国）からのプラスミドｐＧＬ３から、以前に記載されたとおりに抽出した［Raspe et al., J. Lipid Res., 1999, 40(11):2099-2110］ルシフェラーゼレポーター遺伝子と交換することによって得た。部位Ａを突然変異させたアポＡ−Ｉプロモーターのフラグメント−２５４／＋９１を含む構成体は、Quick Change Siteという部位Ａの特異的突然変異誘発キット（Stratagene, La Jolla, CA、米国）、オリゴヌクレオチド5'-CCCCACTGAACCCTTGATTCCTGCTTTGCAGCC-3'（配列番号４）、および相補的オリゴヌクレオチドを用いて、野生型構成体における部位Ａの特異的突然変異誘発によって得た。部位Ｃを突然変異させたアポＡ−Ｉプロモーターのフラグメント−２５４／＋９１を含む構成体は、Quick Change Siteという部位Ａの特異的突然変異誘発キット（Stratagene, La Jolla, CA、米国）、オリゴヌクレオチド5'-CAGAGCTATATATTATATATATAAGTTCC-3'（配列番号３）、および相補的オリゴヌクレオチドを用いて、野生型構成体における部位Ｃの特異的突然変異誘発によって得た。部位ＡおよびＣを突然変異させたアポＡ−Ｉプロモーターのフラグメント−２５４／＋９１を含む構成体は、Quick Change Siteという部位Ａの特異的突然変異誘発キット（Stratagene, La Jolla, CA、米国）、オリゴヌクレオチド5'-CCCCACTGAACCCTTGATTCCTGCTTTGCAGCC-3'（配列番号４）、および相補的オリゴヌクレオチドを用いて、Ｃmut構成体における部位Ａの特異的突然変異誘発によって得た。ルシフェラーゼのレポーター遺伝子の上流でクローニングした、ヘルペスシンプレックスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターを含む表示されたＴｋｐＧＬ３という構成体は、以前に記載されている［Raspe et al., J. Biol. Chem., 2001, 276(4):2865-2871］。
【０１０８】
ヘルペスシンプレックスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流でクローニングされた、ヒトアポＡ−Ｉ遺伝子プロモーターの部位Ｃの３コピーを含むＣ３ＴＫ構成体は、野生型部位Ｃの配列（配列番号１）に対応する二本鎖オリゴヌクレオチドの３コピーのベクターＴｋｐＧＬ３のSmaI部位への配向クローニングによって得た。ヘルペスシンプレックスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターおよびルシフェラーゼのレポーター遺伝子の上流でクローニングしたヒトアポＡ−Ｉプロモーターの、部位Ａの３コピーを含むＡ３ＴＫ構成体は、野生型部位Ａの配列（配列番号２）に対応する二本鎖オリゴヌクレオチドの３コピーのベクターＴｋｐＧＬ３のSmaI部位への配向クローニングによって得た。総ＤＮＡは、プラスミドｐＢＫＳ＋を用いて２μgに調整した。トランスフェクションの３時間後に、細胞を、指示された濃度の胆汁酸とともに培地中で３６時間インキュベーションした。次いで、ルシフェラーゼ活性を、以前に記載されたとおりに測定した［Raspe et al., J. Lipid Res., 1999, 40(11):2099-2110］。
【０１０９】
例６：アポＡ−Ｉプロモーターの部位Ａ（配列番号２）へのＦＸＲ／ＲＸＲ複合体の、および部位Ｃ（配列番号１）へのＦＸＲ／ＲＸＲ複合体の結合（図７）
例６は、ＲＸＲα／ｈＦＸＲ複合体が、ヒトアポＡ−Ｉプロモーターの部位ＡおよびＣに特異的に結合することを示す。またＦＸＲが、ヒトアポＡ−Ｉプロモーターの部位にだけは、単量体として単独で結合できることを示す。
【０１１０】
ｈＦＸＲおよびｍＲＸＲαを、Promega（Madison, WI、米国）からのＴＮＴ−Ｔ７キット、およびベクターｐＣＤＮＡ３−ｈＦＸＲおよびｐＳＧ５−ｍＲＸＲαを用いてin vitroで生成した。ヒトアポＡ−Ｉ遺伝子プロモーターの部位ＡおよびＣ（配列番号２、配列番号１）に対応し、以前に記載されたとおりに製造した［Ngoc Vu-Dac et al., J. Biol. Chem., 1994, 269(49):31012-8］二本鎖オリゴヌクレオチドを、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて［γ−32Ｐ］−ＡＴＰで標識した。ｈＦＸＲおよびｍＲＸＲαにプログラムされた網状赤血球溶解物２μlを、１０mMのＨＥＰＥＳ、２．５mMのＭｇＣｌ2、１０％のグリセリン、２．５mg/mlのＢＳＡ、５０mMのＮａＣｌおよび０．５mMのＤＴＴを含有する緩衝液２０μlの最終体積中で、ポリｄＩ−ｄＣ２．５μgおよびニシン精子ＤＮＡ１μgとともに室温で１５分間インキュベーションしてから、標識化プローブ（０．５ng）を加えた。混合物を、室温で１５分間インキュベーションし、複合体を、０．２５ｘＴＢＥ緩衝液を用いた非変性性ゲル中での電気泳動によって分離した。スーパーシフトの実験は、抗ＦＸＲ抗体（Santa Cruz, CA、米国）を加え、３時間後に４℃のＤＮＡを加えることによって実施した。
【０１１１】
例７：ＦＸＲの合成作用薬であるＧＷ４０６４は、ＨｅｐＧ２細胞内でのアポＡ−Ｉ発現を低下させる
ＨｅｐＧ２を、例５に記載されたとおりに同時トランスフェクションした。細胞性ｍＲＮＡを、例２に上記されたとおりに得た。
【０１１２】
【表２】
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【０１１３】
例７は、ＦＸＲの強力な特異的活性化因子であるＧＷ４０６４［Goodwin et al., Mol. Cell., 2000, Sept., 6(3):517-26］が、ＨｅｐＧ２細胞におけるアポＡ−Ｉ発現を顕著に低下させることを示す。
【０１１４】
例７は、１μMのＧＷ４０６４の存在下でのｈＦＸＲの過剰発現は、ヒトアポＡ−Ｉプロモーターのフラグメント−２５４／＋９１の活性、ならびにヒトアポＡ−Ｉプロモーターの部位Ｃ（配列番号１）の３コピーを含む構成体（構成体Ｃ３ＴＫ）のそれを抑制することを示す。対照的に、ヒトアポＡ−Ｉプロモーターの部位Ａ（配列番号２）の３コピーを含む構成体（構成体Ａ３ＴＫ）は、ＧＷ４０６４の存在下でのｈＦＸＲの過剰発現によって活性化されることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】ＴＣＡが、ヒトアポＡ−Ｉ遺伝子についてトランスジェニックであるマウスにおいて、コレステロールおよびアポＡ−Ｉの血漿濃度、ならびにアポＡ−Ｉの肝発現を低下させることを示す図である。
【図２】ＣＤＣＡおよびＴＣＡが、ＨｅｐＧ２細胞におけるアポＡ−Ｉの発現を低下させることを示す図である。
【図３】胆汁酸の転写効果を示す図である。
【図４】ＣＤＣＡおよびＴＣＡが、ＦＸＲを活性化することを示す図である。
【図５】ＣＤＣＡの存在下でのＦＸＲの過剰発現が、ＨｅｐＧ２細胞におけるヒトのアポＡ−Ｉプロモーター活性を低下させることを示す図である。
【図６】ＣＤＣＡの存在下でのＦＸＲの過剰発現が、ＨｅｐＧ２細胞におけるヒトのアポＡ−Ｉプロモーター活性を低下させることを示す、応答要素の機能的同定を示す図である。
【図７】ＦＸＲは、アポＡ−Ｉプロモーターの部位Ｃ（配列番号１）および部位Ａ（配列番号２）にＲＸＲとの二量体として結合するが、ＦＸＲは、部位Ｃ（配列番号１）には単量体としても結合することを示す図である。
【図８】ＦＸＲの特異的活性化因子であるＧＷ４０６４が、ＨｅｐＧ２細胞におけるヒトアポＡ−Ｉの発現はもとより、そのプロモーター活性も低下させることを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年5月12日(2003.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コレステロール逆輸送を調整することができる化合物をインビトロで選択、同定または特徴付ける方法であって、
・試験化合物を、ヒトのアポリポタンパク質Ａ−Ｉ遺伝子のプロモーターまたはその機能的変異体の、ＦＸＲ応答要素の少なくとも１コピーを含む核酸構築物に接触させること、および
・該応答要素に対する該試験化合物の存在し得る結合を決定すること
を含む方法。
【請求項２】
接触しておくことを、ＦＸＲ受容体、またはＦＸＲ受容体の機能的等価物の存在下で実施し、該応答要素へのＦＸＲの結合性に対する試験化合物の存在の効果を決定する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
コレステロール逆輸送を調整することができる化合物をインビトロで選択、同定または特徴付ける方法であって、
・試験化合物を、レポーター遺伝子発現カセットを含む宿主細胞に接触させること、ここで該カセットは、ヒトのアポリポタンパク質Ａ−Ｉ遺伝子プロモーターまたはその機能的変異体のＦＸＲ応答要素の少なくとも１コピーを含むプロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子を含み、
・該レポーター遺伝子の発現を測定すること
を含む方法。
【請求項４】
宿主細胞が、ＦＸＲ受容体または機能的等価物を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
宿主細胞が、ＦＸＲのリガンドを含む、請求項３または４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
試験化合物の存在下または試験化合物の不在下で、レポーター遺伝子の発現レベルを決定することを含み、レポーター遺伝子の発現レベルの上昇または下降が、試験化合物がコレステロール逆輸送を調整できる能力を示す、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
宿主細胞が、哺乳動物細胞である、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物細胞が、ヒトの細胞である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ＦＸＲ応答要素が、ＦＸＲ受容体に結合できる下記の配列（配列番号：１）：
5'-CAGAGCTGATCCTTGAACTCTTAAGTTCC-3'
またはその機能的変異体を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＦＸＲ応答要素が、ＦＸＲ受容体に結合できる下記の配列（配列番号：２）：
5'-CCCCACTGAACCCTTGACCCCTGCCCTGCAGCC-3'
またはその機能的変異体を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
レポーター遺伝子が、生物学的抽出物中のその活性または存在を測定することができる産生物をコードしている遺伝子、特にルシフェラーゼ、分泌されたアルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼまたはラクタマーゼをコードしている遺伝子の一つである、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
プロモーターが、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、ＣＭＶ初期プロモーター、ＰＧＫプロモーターおよびヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉをコードしている遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０プロモーターから選ばれる、請求項３〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
１または数種類の化合物を混合物としてか、または別個に試験する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
試験化合物がコンビナトリアルライブラリーである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
試験化合物が、１または数種類のＤＮＡ結合ポリペプチドを発現するクローンまたは核酸クローンのライブラリーである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
接触しておくことをマルチウェルプレート内で実施する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
該方法によって決定された存在し得る効果を、ヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉ遺伝子プロモーターのＦＸＲ応答要素の少なくとも一つの突然変異したコピーを含む核酸構築物を用いることを除き、同じ条件で実施する方法によって決定された存在し得る効果と比較することをさらに含み、該突然変異したコピーは、実質的にＦＸＲ受容体と結合することができない、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
コレステロール逆輸送を増大させることができる化合物を選別、特定または特徴付けるための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＨＤＬ活性を調整できる化合物を選別、特定または特徴付けるための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
アポリポタンパク質Ａ−Ｉの発現を調整できる化合物を選別、特定または特徴付けるための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
コレステロール逆輸送を調整する組成物を製造するための、ヒトのアポリポタンパク質Ａ−Ｉ遺伝子のプロモーターまたはその機能的変異体の応答要素とのＦＸＲの結合を調整することができる化合物の使用。
【請求項２２】
コレステロール逆輸送を増大させる組成物を製造するための、配列番号：１の配列と結合するＦＸＲまたはその機能的変異体を減少させる化合物の使用。
【請求項２３】
コレステロール逆輸送を増大させる組成物を製造するための、ヒトのアポリポタンパク質Ａ−Ｉ遺伝子の転写に対するＦＸＲの効果を減少させる化合物の使用。
【請求項２４】
ＨＤＬ活性を調整する組成物を製造するための、配列番号：１もしくは配列番号：２、またはその機能的変異体とのＦＸＲおよび／もしくはその補助因子の結合を調整する化合物の使用。
【請求項２５】
ＨＤＬ活性を増大させる組成物を製造するための、配列番号：１またはその機能的変異体とのＦＸＲの結合を減じる化合物の使用。
【請求項２６】
ＨＤＬ活性を増大させる組成物を製造するための、配列番号：２またはその機能的変異体とのＦＸＲの結合を増大させる化合物の使用。
【請求項２７】
該化合物が、生物学的化合物または化学的化合物である、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２８】
化合物が、核因子または補助因子である、請求項２７記載の使用。
【請求項２９】
化合物が、１以上のＤＮＡ結合性ポリペプチドを発現するクローンである、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３０】
下記の配列（配列番号：１）：
5'-CAGAGCTGATCCTTGAACTCTTAAGTTCC-3'
またはその機能的変異体によって特徴付けられ、ＦＸＲ受容体に結合することができる、核酸フラグメント。
【請求項３１】
下記の配列（配列番号：２）：
5'-CCCCACTGAACCCTTGACCCCTGCCCTGCAGCC-3'
またはその機能的変異体によって特徴付けられ、ＦＸＲ受容体に結合することができる、核酸フラグメント。
【請求項３２】
請求項３０記載の核酸フラグメントおよび／または請求項３１記載の核酸フラグメントの少なくとも１コピーを含む、核酸構築物。
【請求項３３】
請求項３０記載の核酸フラグメントおよび／または請求項３１記載の核酸フラグメントの、実質的にＦＸＲ受容体と結合することができない、少なくとも一つの突然変異したコピーを含む核酸構築物。
【請求項３４】
プロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子に結合する該プロモーターに含まれる、請求項３０および／または３１記載の核酸フラグメントの少なくとも一つのコピーを含む、発現カセット。
【請求項３５】
プロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子に結合する該プロモーターに含まれる、請求項３０および／または３１記載の核酸フラグメントの少なくとも一つの、突然変異したコピーを含む発現カセット。
【請求項３６】
該プロモーターが、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、ＣＭＶ初期プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーターおよびヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉ遺伝子プロモーターから選ばれる、請求項３４または３５のいずれか一項に記載のカセット。
【請求項３７】
レポーター遺伝子が、生物学的抽出物中でのその活性または存在を測定することができる遺伝子である、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載のカセット。
【請求項３８】
レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ、分泌されたアルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼまたはラクタマーゼをコードしている遺伝子である、請求項３７記載のカセット。
【請求項３９】
請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の構築物またはカセットを含む宿主細胞。
【請求項４０】
ＨＤＬ活性を調整できる化合物のインビトロスクリーニングのための、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の構築物もしくはカセット、または請求項３９記載の細胞の使用。
【請求項４１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法に従って選別、特定または特徴付けられた化合物を含む、医薬組成物。
【国際調査報告】
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2004537272.tif 000059
2004537272.tif 000060
2004537272.tif 000061
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2004537272.tif 000063
2004537272.tif 000064
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