(57)【要約】本発明は、大規模なコンビナトリアルレパートリーから抗血管新生抗体断片のフィルター選択の方法に関し、さらには、該方法により得られた抗血管新生抗体断片にも関する。
2004527226.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
数十億の異なる結合特異性を含む極めて複雑な系からフィルターによるコロニー選択と陽性クローンの増幅からなるサイクルを複数回繰り返すことにより達成される、抗血管新生抗体断片の選択方法。
【請求項２】
上記の選択と増幅からなるサイクルを少なくとも３回繰り返すことにより達成される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
a）ETH-2ライブラリーを保持し、種々の結合特異性をコードするDNAの宿主細菌（大腸菌TG1株）のコロニーを、第１のメンブランフィルター（増殖フィルター）上に播種し、
b）フィブロネクチンの第７ドメイン、ED-Bドメイン、第８ドメイン、第９ドメインを含む7B89抗原を第2メンブランフィルター（捕捉フィルター）上にアプライし、
c）培地を含むプレートに上記捕捉フィルターを置き、その上に上向きになるように上記細菌のコロニーを播種した増殖フィルターを重ね、
d) scFv抗体断片の結合による陽性シグナルを通常の比色反応により捕捉フィルター上で特定し、
e) 上記ステップ(d)で特定されたシグナルの位置を増殖フィルター上のコロニーの位置と比較して、シグナルに対応する領域のコロニーを選抜し、
f) 上記ステップ(e)で得られたコロニーについて、同様の増殖および特定のサイクルをさらに2回繰り返し、
g) 最後のサイクルでシグナルを持つコロニーを特定して回収し、
h) 上記ステップ(g)で得られたコロニーにより産生されるscFvを回収すること、
を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
重鎖VH(DP-47)のCDR３配列が配列番号３に記載の配列であり、かつ軽鎖VL(DPL-16)のCDR3配列が配列番号４に記載の配列である、請求項３記載の方法によって産生されるモノクローナル抗体断片。
【請求項５】
配列番号２に記載の配列を有するモノクローナル抗体断片。
【請求項６】
配列番号１に記載の配列である、モノクローナルscFv抗体ME-4Cをコードするヌクレオチド配列。
【請求項７】
請求項４記載のモノクローナル抗体を用いてin vivoおよび/またはin vitroで血管新生を判定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大規模なコンビナトリアルレパートリーから抗血管新生抗体断片のフィルターによる選択の方法に関し、さらには、該方法により得られた抗血管新生抗体断片にも関する。
【背景技術】
【０００２】
周知のとおり、機能的抗体断片は、大腸菌で産生可能でありファージ展示が可能であるので、ファージ展示ライブラリーから抗体を選択する方法は、少なくとも精製抗原を使用できる場合においては、単純かつ迅速な方法であらゆる種の抗原に実際に相互作用し得るモノクローナル抗体の断片を得ることができる常法となっている。
【０００３】
個々の細菌クローンにより分泌される抗体断片の紙上の選択（paper selection）によって、ファージを用いなくてもよい他の技術も公知である。
【０００４】
特に、Sekerraら(Anal.Biochem.196、151-155 (1991))は、細菌コロニーにより分泌されるFab抗体断片への抗原結合を検出するツーメンブラン(two membrane)システムを公表している。簡単に述べると、第１の多孔性フィルター上に、抗体を発現する細菌コロニーを増殖させ、他方のメンブラン上に分泌された断片を捕捉して、該断片の抗原との結合について試験する。その後、結合する抗体を発現するクローンを、第1位のフィルター上で特定して、さらに増殖させる。しかし、2つの異なる結合特異性からなる単純な系で達成でき、かつ明らかにコンフルエントではない数千個の細菌コロニーから出発する方法として記載されている。
【０００５】
細菌で発現された抗体断片の大規模レパートリーから特定の結合性を有するものを選択することを可能とする方法を得ることが極めて重要であることは明らかなことである。実際、かかる方法によって、抗体をファージに展示させることなく、可溶性の形態の抗体断片を発現できるクローンを直接同定することが可能となる。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明の方法は、数十億もの異なる結合特異性を含む極めて複雑な系から陽性クローンのフィルターによる選択と増幅からなる選択を複数回繰り返すことにより達成される。
【０００７】
発明の詳細な説明
本発明の方法においては、種々の結合特異性をコードするDNAを含む細菌を液体培地中で増殖させ、対数増殖期の段階に達したら、数十億個の細菌を適当な前処理済みメンブランフィルターの増殖支持体上に播種して細菌のコロニーがコンフルエントになるまでインキュベートする。
【０００８】
もう一つの予め湿らせたメンブランフィルターの第２の捕捉基盤を、所望の抗原で一面に覆う。
【０００９】
その後、捕捉メンブランフィルターを、上向きの表面が上記の細菌コロニーで覆われた増殖フィルターに重ねる。得られたサンドイッチ状のメンブランフィルターを約16時間室温でインキュベートする。その後、拡散作用を有するscFv抗体断片をコードする遺伝子を発現させることができる。これにより、捕捉メンブラン上の抗原と特異的に結合する断片を捕捉する。
【００１０】
捕捉メンブランをその後、結合したscFv抗体断片を通常用いられている比色法を用いて検出するための処理に供する。
【００１１】
捕捉フィルター上で染色されたスポットの位置から、増殖メンブラン上の対応する捕捉される抗体断片を産生する細菌コロニーを確認することができる。
【００１２】
かかるコロニーを回収し増殖させる。数百万個の細菌を新しい培養メンブランに播種して上記の手順を繰り返す。
【００１３】
捕捉メンブラン上の陽性シグナルが、選択に用いられた抗原に対するモノクローナル抗体断片を産生することを示す単一の陽性コロニーに対応するようになるまで、同様のサイクルを繰り返す。
【００１４】
特に、ETH-2000ライブラリー(Vitiら、Methods in Enzymology, 326, 480-505に記載)を保持する、種々の結合特異性をコードするDNAの宿主である大腸菌TG1株の細菌を用いて、本発明の方法を達成する。捕捉抗原としては、フィブロネクチンの第7ドメイン、ED-Bドメイン、第8ドメインおよび第9ドメインを有する組換えタンパク質7B89(Castellaniら、(1994) Int. J. Canc. 59, 612-618)を選択した。
【００１５】
上述の通り操作することにより、3回目のサイクルが終了した時点で得られたクローンを増殖させて、scFv抗体断片の可溶性断片を産生させる。
【００１６】
特に、モノクローナル抗体断片のうちの1つ(本明細書中では、ME-4Cとする)を単離し、配列決定し、フィブロネクチンのED-Bに結合できることがわかった。同じレパートリーから以前に選択しておいた抗体断片について得られたデータから、ME-4CはED-Bにナノモラーのオーダーの親和性で結合する。
【実施例】
【００１７】
ETH-2ライブラリー
これは、5×108個以上の独立したクローンを保持する、組換えscFv抗体のファージ展示ライブラリーである。多様性は、重鎖可変部(VH)および軽鎖可変部(VL)の両方の相補性決定領域３(CDR-3)内において抗体に導入した。VHおよびVLをコードする遺伝子を可溶性の携帯で発現可能なベクター中にクローニングした。
【００１８】
さらに、上記ベクターは、scFv抗体断片のカルボキシル末端に特定基を導入する。
【００１９】
コロニーの増殖とscFv抗体断片の発現
ETH-2ライブラリーは、種々の特異性をコードするDNAの宿主細菌(大腸菌TG1株)として保存する。該細菌を液体培地で増殖させ、対数増殖期の段階に到達したら、108個を直径20cmのPVDFのDuraporeメンブランフィルター(タイプGVWP、ミリポア)上に播種する。フィルターを、アンピシリン100μg/ml、グルコース1％を含むTYE寒天培地(Miller,1972)の入った直径20cmのペトリ皿に置き、37℃で8時間インキュベートした。インキュベーション後、フィルター上で細菌のコロニーが完全にコンフルエントになったことが観察された。
【００２０】
第2(捕捉)メンブランを予め湿らせた直径20cmのPVDFメンブラン(Immobilon-P、ミリポア)を捕捉抗原で一面に覆うことにより用意する。捕捉抗原としては、フィブロネクチンの第7ドメイン、ED-Bドメイン、第8ドメインおよび第9ドメインを有する組換えタンパク質7B89を選択した。フィブロネクチンの組換えED-Bドメインすなわちこの抗体単離の目的とするドメイン単独ではメンブランに結合しない。37℃で6時間、150μg/mlの7B89を含む50mMリン酸バッファー(pH7.4、100mMNaCl含)(PBS)溶液中でメンブランをインキュベートすることにより抗原被覆した捕捉メンブランが得られる。その後、該フィルターを、5％ミルク/PBS(MPBS)溶液中で、37℃にて2時間ブロッキングし、0.2％(v/v) Tween20含PBS(PBST)で4回洗浄して、アンピシリン100μg/mlとイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG) 1mMを含む2×TYに浸す。
【００２１】
捕捉メンブランをアンピシリン100μg/mlとIPTG 1mMを含むTYE寒天培地プレートにのせ、上面に細菌コロニーの付着したDuraporeメンブランを重ねる。
【００２２】
得られたサンドイッチ状のメンブランを室温で16時間インキュベートする。培地中にグルコースが存在せずIPTGが存在することにより、拡散作用を有するscFv抗体断片をコードする遺伝子の発現（Lacプロモーターにより制御される）が可能となり、これらは7B89タンパク質に特異的に結合するため、第2メンブランにより捕捉される。
【００２３】
抗原との結合の検出
捕捉メンブランをPBSTで4回洗浄して、37℃で6時間MPBSでブロッキングする。結合したscFv抗体断片を検出するために、フィルターを、MBSTで3000倍希釈した抗flag-M2マウス抗体(Sigma,F3165)とともに37℃1時間インキュベートし、PBSTで4回洗浄後、MBSTで3000倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートウサギ抗マウスIgG(bioRad、172-1011)とともに37℃1時間インキュベートする。その後、このフィルターをPBSTでよく洗浄して、4-クロロ-1-ナフトール中で黒いスポットが見えるまでインキュベートする。この酵素的呈色反応は、水洗浄により停止させ、フィルターを乾燥させる。
【００２４】
2枚のフィルターを互いに重ね合わせて得られるシグナルにより、捕捉フィルター上の呈色スポットから第1フィルター上の細菌コロニーを同定することが可能である。
【００２５】
陽性クローンの増幅
1回目のスクリーニングサイクル後、捕捉フィルター上の陽性シグナルは、第1メンブラン上のコンフルエントな細菌コロニーの場所に対応するので、該コロニーを集めてアンピシリン100μg/ml、グルコース1％(W/V)を含む2×TY培地中で、OD(600nm)＝0.7になるまで増殖させる。
【００２６】
細菌が106個になった時点で、新しいDuraporeメンブランに播種して、上述の手順を繰り返す。2回目のサイクル終了後、陽性シグナルは独立した(monocoalescent)コロニーに対応する。これらのコロニーのうち18個を回収して増殖させ、5×103個の細菌を播種したDuraporeフィルターによりさらなるスクリーニングに用いた。3回目のサイクル終了後、捕捉メンブラン上の陽性シグナルは、抗原7B89に対するモノクローナル抗体を産生する独立した陽性コロニーに対応する。
【００２７】
選択された抗体の特性解析
上述のスクリーニング手順の3回目のサイクル後に得られた独立した陽性クローンを液体培地で増殖させて、scFv抗体断片の可溶性断片を産生させる。これらの断片の結合特異性をED-B、7B89または無関係な抗原(MPBS、BSA、オボアルブミン、リゾチーム)についてELISA試験を行い測定する。
【００２８】
抗体断片の結合および解離にかかるキネティクス係数を、公知のプロトコルにしたがってBIAcore 1000(Parmacia)を用いてプラズマ表面共鳴により測定する。ELISA試験で陽性だった数クローンを測定用に選んだ。測定は、関連資料の記載にしたがって、ED-Bまたは７B89で被覆したチップを用いて、scFv抗体断片の単量体画分を用いて実施した。
【００２９】
クローンの配列決定は、DNAシーケンサー377 ABI Prism(Perkin-Elmer)で行った。選択されたscFv抗体断片(本明細書ではME-4Cとする)のうちの1つにより認識されるED-B上のエピトープは、他の抗ED-B抗体断片について記載されたSPOT合成法を用いて同定された。
【００３０】
免疫組織染色
多形神経膠腫およびヒトメラノーマSK-MELの標本の免疫染色を科学文献等に記載されているとおりに実施した。
【００３１】
上述の方法でライブラリーから単離された抗体は、天然型の抗原に対して優れたアフィニティを示すか否かを検定するために、リアルタイム相互作用分析を、BIAcore装置を用いてプラズマ表面共鳴により行った。ME-4Cの単量体はED-Bに解離キネティクス定数(Koff)が6×10-3s-1および結合キネティクス定数(Kon)が6×104s-1M-1であり、10-7M-1のアフィニティで結合する。
【００３２】
抗体断片ME-4CとED-Bとの結合をさらに解析するために、抗体断片scFvにより認識されるエピトープを、SPOT合成法を用いて同定した。ED-Bの91残基の配列を網羅する一連の82種のデカペプチドについて、ME-4Cとの結合を調べた。
【００３３】
選択されたscFv抗体断片ME-4Cが組織サンプル中の血管新生の同定試薬として機能するか否かを調べるために、腫瘍切片において試験した。結果を図４に示す。
【００３４】
ヒト多形神経膠腫およびメラノーマの切片について行った免疫組織学的実験により示されるように、抗体ME-4Cは腫瘍組織内で形成中の血管を示すことができる。このことは、該抗体が、血管新生検出のための組織切片解析などの臨床適用に有用であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、本発明の方法を模式的に示す図である。
【図２】図２は、ED-Bに結合するコロニーの3回目のスクリーニングサイクルでの発色後の、保存メンブラン（A）と捕捉メンブラン(B)を示す。この段階で明らかなように、保存メンブラン上のコロニーはコンフルエントではなく、(A)上のコロニーの約30％は（B）に結合し得るscFVS抗体断片を産生しており、すなわち、それぞれが抗ED-Bモノクローナル抗体断片を産生する。
【図３】図３は、右側にED-B配列の合成デカペプチドそれぞれへのME-4C抗体の結合について、下の横線で結合部位を示している。線の太さは、観測された結合アフィニティに比例する。一群の合成ペプチドED-Bの抗体によって認識された最短の２つの配列は青色と赤色で示している。同様の色を用いて、左側の図のED-Bの三次元構造における２つのエピトープの位置を示す。
【図４】図４は、scFv ME-4C抗体断片で達成される免疫組織学的試験の結果をまとめたものである。（A）は、多形神経膠芽腫のサンプルの標本である。scFv ME-4Cにより典型的な糸球体型血管構造が赤色を呈する。(B)scFvME-4C抗体断片で染色したSKMEL-28ヒトメラノーマの標本である。抗体は血管構造と増殖細胞の周囲に存在する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年1月16日(2003.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる結合特異性の結合断片を発現する数十億個の細菌コロニーを用意し、フィルターによるコロニー選択と陽性クローンの増幅からなるサイクルを複数回繰り返すことを含む、抗血管新生抗体断片の選択方法。
【請求項２】
上記の選択と増幅からなるサイクルを少なくとも３回繰り返すことにより達成される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
a）ETH-2ライブラリーを保持し、種々の結合特異性をコードするDNAの宿主大腸菌TG1株のコロニーを、第１のメンブランフィルター（増殖フィルター）上に播種し、
b）フィブロネクチンの第７ドメイン、ED-Bドメイン、第８ドメイン、第９ドメインを含む7B89抗原を第2メンブランフィルター（捕捉フィルター）上にアプライし、
c）培地を含むプレートに上記捕捉フィルターを置き、その上に上向きになるように上記細菌のコロニーを播種した増殖フィルターを重ね、
d) scFv抗体断片の結合による陽性シグナルを通常の比色反応により捕捉フィルター上で特定し、
e) 上記ステップ(d)で特定されたシグナルの位置を増殖フィルター上のコロニーの位置と比較して、シグナルに対応する領域のコロニーを選抜し、
f) 上記ステップ(e)で得られたコロニーについて、同様の増殖および特定のサイクルをさらに2回繰り返し、
g) 最後のサイクルでシグナルを持つコロニーを特定して回収し、
h) 上記ステップ(g)で得られたコロニーにより産生されるscFvを回収すること、
を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
重鎖VHのCDR３配列が配列番号３に記載の配列であり、かつ軽鎖VLのCDR3配列が配列番号４に記載の配列である、請求項３記載の方法によって産生可能なモノクローナル抗体断片。
【請求項５】
配列番号２に記載の配列を有するモノクローナル抗体断片。
【請求項６】
配列番号１に記載の配列である、モノクローナルscFv抗体ME-4Cをコードするヌクレオチド配列。
【請求項７】
請求項４記載のモノクローナル抗体を用いてin vivoおよび/またはin vitroで血管新生を判定する方法。
【国際調査報告】
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