(57)【要約】本発明は、正常細胞またはがん細胞における遺伝子発現を検出する方法を提供する。特に、細胞試料中の種々の腫瘍マーカーの存在または同マーカーの遺伝子発現の変化を検出し、同定し、または定量するための、蛍光画像化技法と組合せた分子ビーコン（ＭＢ）技法を利用する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の少なくとも１つの腫瘍マーカーｍＲＮＡの存在を検出する方法であって、
ｉ）分析のための細胞の試料を提供することと、
ｉｉ）腫瘍マーカーｍＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドで前記試料を処理することと、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの結合エネルギー供与体部分および少なくとも１つの結合エネルギー受容体部分を含み、前記オリゴヌクレオチドはステム‐ループヘアピンを形成し、かつ前記供与体部分および受容体部分は標的の核酸塩基配列の少なくとも一部分により分離されることと、
ｉｉｉ）適切なハイブリダイゼーション条件下で標的配列のハイブリダイゼーションを検出し、同定し、または定量することと、前記試料中の標的配列の有無または量はオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの供与体部分または受容体部分と関連した検出可能なシグナルの変化と相関することと、
ｉｖ）オリゴヌクレオチドと測定される標的配列とのハイブリダイゼーションの有無または量に基づいて、腫瘍マーカーの存在を検出し、同定し、または定量することと
を包含する方法。
【請求項２】
前記腫瘍マーカーが、サバイビン、サイクリンＤ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、突然変異型Ｋ−ｒａｓ、キモトリプシノーゲン、塩基性繊維芽細胞増殖因子、癌胎児性抗原、前立腺特異抗原、α−フェトプロテイン、β−２−ミクログロブリン、膀胱腫瘍抗原、クロモグラニンＡ、ニューロン特異的エノラーゼ、Ｓ−１００、ＴＡ−９０、組織ポリペプチド抗原およびヒト絨毛性ゴナドトロピンからなる群から選択される１つまたは複数のマーカーである請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記試料が血液、尿、膵液、腹水、乳管洗浄液、乳頭吸引物、穿刺生検物または組織からなる群から選択される少なくとも１つの供給源から採取される請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記組織が膵臓または乳房からの生検物である請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記組織が凍結切片である請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記試料が乳管洗浄液から採取される請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記試料が膵液から採取される請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記腫瘍マーカーの存在の定量がＦＡＣＳスキャン分析により成し遂げられる請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３からなる群から選択される１つまたは複数のオリゴヌクレオチドである請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドが腫瘍マーカーであるサバイビンを標的とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号１、２および９からなる群から選択される１つまたは複数のオリゴヌクレオチドである請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドが腫瘍マーカーであるサイクリンＤ１を標的とする請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号３および４からなる群から選択される１つまたは複数のオリゴヌクレオチドである請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドが腫瘍マーカーであるＨｅｒ２／ｎｅｕを標的とする請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号５および６からなる群から選択される１つまたは複数のオリゴヌクレオチドである請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドが腫瘍マーカーであるＫ‐ｒａｓ突然変異遺伝子を標的とする請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号７、８、１１、１２および１３からなる群から選択される１つまたは複数のオリゴヌクレオチドである請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
腫瘍細胞中の突然変異遺伝子の存在を検出する方法であって、
ｉ）分析のための腫瘍細胞の試料を提供することと、
ｉｉ）前記突然変異遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドで試料を処理することと、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの結合エネルギー供与体部分および少なくとも１つの結合エネルギー受容体部分を含み、前記オリゴヌクレオチドはステム‐ループヘアピンを形成し、かつ前記供与体部分および受容体部分は標的の核酸塩基配列の少なくとも一部分により分離されることと、
ｉｉｉ）適切なハイブリダイゼーション条件下で前記突然変異遺伝子の標的配列とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出し、同定し、または定量することと、試料中の突然変異遺伝子の標的配列の有無または量はオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの供与体部分または受容体部分と関連した検出可能なシグナルの変化と相関することと、
ｉｖ）オリゴヌクレオチドと測定される突然変異遺伝子の標的配列とのハイブリダイゼーションの有無または量に基づいて、突然変異遺伝子の存在を検出し、同定し、または定量することと
を包含する方法。
【請求項１９】
突然変異遺伝子が突然変異型Ｋ−ｒａｓ遺伝子である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
突然変異遺伝子の存在の定量がＦＡＣＳスキャン分析により成し遂げられる請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
オリゴヌクレオチドが配列番号７、８、１１、１２および１３からなる群から選択される１つまたは複数のオリゴヌクレオチドである請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
生細胞における遺伝子発現の変化をモニタリングする方法であって、
ｉ）分析のための生細胞の試料を提供することと、
ｉｉ）特定の遺伝子配列を標的とするオリゴヌクレオチドで前記試料を処理することと、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの結合エネルギー供与体部分および少なくとも１つの結合エネルギー受容体部分を含み、前記オリゴヌクレオチドはステム‐ループヘアピンを形成し、かつ前記供与体および受容体部分は標的の核酸塩基配列の少なくとも一部分により分離されることと、
ｉｉｉ）適切なハイブリダイゼーション条件下で標的配列のハイブリダイゼーションを検出し、同定し、または定量することと、前記試料中の標的配列の有無または量はオリゴ
ヌクレオチドの少なくとも１つの供与体部分または受容体部分と関連した検出可能なシグナルの変化と相関することと、
ｉｖ）オリゴヌクレオチドと測定される標的配列とのハイブリダイゼーションの有無または量に基づいて、前記特定の遺伝子の発現の変化を検出し、同定し、または定量することと
を包含する方法。
【請求項２３】
遺伝子発現における変化の定量がＦＡＣＳｃａｎ分析により、ならびに蛍光マイクロプレートリーダーにより成し遂げられる請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
被験者における乳がんの存在または進行を検出またはモニタリングする方法であって、
ｉ）分析のための前記被験者からの細胞の試料を提供することと、
ｉｉ）乳がんマーカー遺伝子配列を標的とするオリゴヌクレオチドで前記試料を処理することと、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの結合エネルギー供与体部分および少なくとも１つの結合エネルギー受容体部分を含み、前記オリゴヌクレオチドはステム‐ループヘアピンを形成し、かつ前記供与体部分および受容体部分は標的の核酸塩基配列の少なくとも一部分により分離されることと、
ｉｉｉ）適切なハイブリダイゼーション条件下で乳がんマーカー遺伝子配列との標的オリゴヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを検出し、同定し、または定量することと、前記試料中の標的オリゴヌクレオチド配列の有無または量はオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの供与体部分または受容体部分と関連した検出可能なシグナルの変化と相関することと、
ｉｖ）オリゴヌクレオチドと測定される乳がん標的配列とのハイブリダイゼーションの有無または量に基づいて、乳がんの存在または進行を検出し、同定し、または定量することと
を包含する方法。
【請求項２５】
前記乳がんマーカーが、サバイビン、サイクリンＤ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、塩基性繊維芽細胞増殖因子、ＥＧＦ受容体および癌胎児性抗原からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーである請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記試料が血液、尿、乳管洗浄液、腹水、乳頭吸引物、穿刺生検物または組織からなる群から選択される少なくとも１つの供給源から採取される請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記組織が乳房またはリンパ節からの生検物である請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記組織が凍結切片である請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
前記乳がんの存在または進行の定量がＦＡＣＳスキャン分析により成し遂げられる請求項２４記載の方法。
【請求項３０】
前記オリゴヌクレオチドが乳がんマーカーであるサバイビンを標的とする請求項２４記載の方法。
【請求項３１】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号１、２および９からなる群から選択される１つまたは複数のオリゴヌクレオチドである請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記オリゴヌクレオチドが乳がんマーカーであるサイクリンＤ１を標的とする請求項２４記載の方法。
【請求項３３】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号３および４からなる群から選択される１つまたは複数のオリゴヌクレオチドである請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記オリゴヌクレオチドが乳がんマーカーであるＨｅｒ２／ｎｅｕを標的とする請求項２４記載の方法。
【請求項３５】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号５および６からなる群から選択される１つまたは複数のオリゴヌクレオチドである請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
被験者における膵臓がんの存在または進行を検出またはモニタリングする方法であって、
ｉ）分析のための前記被験者からの細胞の試料を提供することと、
ｉｉ）膵臓がんマーカー遺伝子配列を標的とするオリゴヌクレオチドで前記試料を処理することと、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの結合エネルギー供与体部分および少なくとも１つの結合エネルギー受容体部分を含み、前記オリゴヌクレオチドはステム‐ループヘアピンを形成し、かつ前記供与体部分および受容体部分は標的の核酸塩基配列の少なくとも一部分により分離されることと、
ｉｉｉ）適切なハイブリダイゼーション条件下で膵臓がんマーカー遺伝子配列との標的オリゴヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを検出し、同定し、または定量することと、前記試料中の標的オリゴヌクレオチド配列の有無または量はオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの供与体部分または受容体部分と関連した検出可能なシグナルの変化と相関することと、
ｉｖ）オリゴヌクレオチドと測定される乳がん標的配列とのハイブリダイゼーションの有無または量に基づいて、膵臓がんの存在または進行を検出し、同定し、または定量することと
を包含する方法。
【請求項３７】
前記膵臓がんマーカーがサバイビン、突然変異型Ｋ−ｒａｓ遺伝子および癌胎児性抗原からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーである請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記試料が血液、尿、膵液、腹水、穿刺生検物または組織からなる群から選択される少なくとも１つの供給源から採取される請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
前記組織が凍結切片である請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記膵臓がんの存在または進行の定量がＦＡＣＳスキャン分析により成し遂げられる請求項３６記載の方法。
【請求項４１】
前記オリゴヌクレオチドが膵臓がんマーカーであるサバイビンを標的とする請求項３６記載の方法。
【請求項４２】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号１、２および９からなる群から選択される１つまたは複数のオリゴヌクレオチドである請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記オリゴヌクレオチドが突然変異型Ｋ−ｒａｓ膵臓がんマーカーを標的とする請求項３６記載の方法。
【請求項４４】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号７、８、１１、１２および１３からなる群から選択される１つまたは複数のオリゴヌクレオチドである請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
試料中のがん細胞の存在を検出する方法であって、
ｉ）分析のための細胞の試料を提供することと、
ｉｉ）がん特異的マーカー遺伝子配列を標的とするオリゴヌクレオチドで前記試料を処理することと、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの結合エネルギー供与体部分および少なくとも１つの結合エネルギー受容体部分を含み、前記オリゴヌクレオチドはステム‐ループヘアピンを形成し、かつ前記供与体部分および受容体部分は標的の核酸塩基配列の少なくとも一部分により分離されることと、
ｉｉｉ）適切なハイブリダイゼーション条件下で膵臓がんマーカー遺伝子配列との標的オリゴヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを検出し、同定し、または定量することと、前記試料中に存在する標的オリゴヌクレオチド配列の有無または量はオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの供与体部分または受容体部分と関連した検出可能なシグナルの変化と相関することと、
ｉｖ）オリゴヌクレオチドと測定されるがん特異的標的配列とのハイブリダイゼーションの有無または量に基づいて、がん細胞の存在を検出し、同定し、または定量することとを包含する方法。
【請求項４６】
がん細胞の存在の定量がＦＡＣＳスキャン分析により成し遂げられる請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
がん細胞が、乳がん、膵臓がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、多発性骨髄腫、リンパ腫、膀胱がん、甲状腺髄様がん、神経内分泌腫瘍、類癌腫、精巣がん、妊娠栄養膜腫瘍形成、肺がん、黒色腫および胃がんからなる群から選択される１つまたは複数のがんから生じる請求項４５記載の方法。
【請求項４８】
請求項３６記載の方法を実行するのに適した材料を含む、がん細胞の進行を検出またはモニタリングするための診断キット。
【請求項４９】
請求項２２記載の方法を実行するのに適した材料を含む、リアルタイムに生細胞における遺伝子発現の変化を検出するための診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、包括的には、分子ビーコン技法を用いた正常細胞および／またはがん細胞における腫瘍マーカー遺伝子および突然変異がん遺伝子の発現レベルの検査によりヒトのがん細胞を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、米国を除いた全ての国の指定についての出願人である米国国立大学であるエモリー大学、ならびにリリー・ヤング、ガング・ボー、チャールス・スタンレーおよびシンシア・コーエンの名義で、ＰＣＴ国際特許出願として２００４年１月１３日に出願されている。
【０００３】
［発明の背景］
乳がんは、最も一般的な種類のがんであり、女性の死亡の主因である。生存を延ばすための決定的要因は、乳がんを早期に診断することである。マンモグラフィーによる早期スクリーニングは疾患の死亡率を低減したが、しかし乳がん患者の約２０％は依然としてマンモグラフィーでは見逃される。さらに異常マンモグラムを示す全患者のうち、生検により乳がんであると確証されたのはわずか１０〜２０％であった（非特許文献１）。今のところ、乳がんの診断のための信頼できる血清腫瘍マーカーはない。したがって乳がんの早期診断のための新規なアプローチの開発が、患者の治療の成功ならびに患者の生存を延ばすための決定的な重要性を有する。
【０００４】
目下、乳管洗浄液は、細胞病理学的分析のために乳管上皮細胞を収集するための、侵襲性を最小限とした手法として用いられている（非特許文献２）。この手法は、乳頭開口部に微小カテーテルを挿入し、カニューレが挿入された乳管を通常の生理食塩水で洗浄し、洗浄流出液を収集することを包含する。正常、非定型または悪性の乳管細胞の存在を分析するために、約１３，５００個／乳管の細胞が収集され得る。しかしながら、異なる細胞の種類を同定するための現行の方法は形態学的分類によるものであり、これはしばしば不正確である。
【０００５】
膵臓がんは、その予後が非常に悪いために、米国におけるがん死の四番目の死因である（非特許文献３）。米国では毎年、約２９，０００の新規の症例が診断され、２８，０００例が死亡している（非特許文献４）。診断後３ヶ月より長く生存する膵臓がん患者は５０％未満であり、２年生き延びるのは彼等のうちの８％である（非特許文献５）。予後が悪いことに関する主な理由は、早期に見つかる膵臓がん患者が極少数であるという点である。伝統的な放射線写真撮影および超音波検査法を用いた膵臓がんの早期診断は、非常に難しい（非特許文献６）。最近数十年間の広範な生物医学的研究努力にもかかわらず、膵臓がん患者の９０％以上がすでに診断時までに局所転移および／または遠隔転移を経験しており、しばしばその治癒を遅らせる。したがって、おそらくは腫瘍のサイズというよりむしろ分子マーカーに基づいて、膵臓がんの早期検出をすることが非常に重要である。
【０００６】
（膵臓がんおよび乳がんの分子マーカー）
一般的にＫ−ｒａｓがん遺伝子は、早期膵臓がんの検出のための最も興味をそそる分子マーカーの１つである、ということが十分に確立されている（非特許文献７〜１２）。Ｇタンパク質ファミリーの一員であるＫ−ｒａｓは、細胞表面からの増殖促進エフェクターのシグナル伝達に関与する。Ｋ−ｒａｓの点突然変異は膵臓癌腫の８０〜１００％に見出され、このことは、Ｋ−ｒａｓががん検出のための感度の良いマーカーであることを示唆している（非特許文献７）。さらに、これらの突然変異のほとんどがコドン１２に集中し
ており、ビーコン設計の容易さという点でＫ−ｒａｓをさらに興味をそそるものにする。Ｋ−ｒａｓ突然変異は膵臓がんの発症の極早期に起こるため、Ｋ−ｒａｓ突然変異を標的とする試験は膵臓癌腫の早期検出をもたらし得る。
【０００７】
近年、アポトーシスタンパク質の阻害剤（ＩＡＰ）の一ファミリーの遺伝子が発見された（非特許文献１３）。ＩＡＰは、カスパーゼ活性の抑制によりアポトーシス経路のカスケードを抑制する（非特許文献１４）。漸増する証拠から、ＩＡＰタンパク質の１つであるサバイビンもいくつかの種類のがんに対する有望な腫瘍マーカーである、ということが示されている（非特許文献１５〜１８）。サバイビンは、普通は胎児発生中に発現されるが、ほとんどの正常成人組織中では発現されない（非特許文献１５）。１９種類のヒトの正常組織および疾患組織からの３５０万の転写物の分析結果も、サバイビンが、試験された全てのがん組織中において一様に高レベルで発現されるが正常組織中では高レベルで発現されない上位４つの遺伝子のうちの１つである、ということを示している（非特許文献１９）。近年の研究から、免疫組織化学法、免疫ブロット法およびＲＴ−ＰＣＲ法により、膵管細胞の腺癌の７７％、および膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＴ）の５６％においてサバイビンの存在が実証されている（非特許文献２０）。サバイビンの発現は、膵管細胞癌腫の全ての進行度（ステージＩ〜ＩＶ）において、例えば膵臓がん細胞中での新生物移行の早期ステージにおいても検出され得る。しかしながら、サバイビンの発現は、正常膵臓組織、腫瘍細胞周囲の炎症細胞、ならびに慢性膵炎患者からの膵臓組織中には検出されなかった。正常な膵臓およびその他の正常組織中にサバイビンの発現がないということは、サバイビンを膵臓がん細胞の検出のための理想的分子マーカーとするものである。
【０００８】
正常乳房上皮から浸潤性乳管癌への移行は、多段階過程であり、過形成、非定型的過形成から非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）への、ならびに浸潤性乳管癌への乳房組織における一連の組織学的変化を包含する。いくつかの腫瘍マーカーは、ＤＣＩＳ病変および浸潤性乳がんにおいて存在することが判明した。細胞周期の重要な調節物質であるサイクリンＤ１はＤＣＩＳの８０％において過剰発現され、一方、正常乳房組織においては、サイクリンＤ１は低いかまたは存在しない（非特許文献２１〜２２）。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子の増幅および過剰発現も、浸潤性乳がんの３０％およびＤＣＩＳ組織の６０〜８０％で実証されている（非特許文献２３〜２５）。しかしながらＨｅｒ−２／ｎｅｕの過剰発現は、正常乳管細胞中および単純過形成においては見出されない（非特許文献２４〜２５）。これは、これらの遺伝子の調節が良性状態から癌腫への移行を規定する可能性があり、そしてサイクリンＤ１およびＨｅｒ−２／ｎｅｕの無秩序な過剰発現が乳癌における一般的早期事象であり得る、ということを示唆している。さらに高レベルのサバイビンも、浸潤性および転移性乳がんの患者から採取された乳がん組織の７１％において検出されるが、一方、周囲の正常乳房組織は陰性である。サバイビンのレベルの増大は、乳房腫瘍細胞のアポトーシスの閾値および生存能力をより高めるのに寄与する（非特許文献１６）。高レベルのサバイビンが乳がん患者のＤＣＩＳ組織の８０％超において検出されるため、サバイビン遺伝子の発現は、乳がんの発症における早期腫瘍マーカーであると思われる（ヤン、エル．他（Yang L. et al.）、未発表）。したがって、サイクリンＤ１、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびサバイビンは、浸潤性前段階の乳がん細胞の早期検出のための感度の良い腫瘍マーカーである。
【０００９】
サバイビンは、多数の一般的な種類の腫瘍、例えば前立腺、肺、結腸、胃、肝臓、脳、腎臓の腫瘍、黒色腫およびリンパ腫においても検出される（非特許文献１８）。例えば、ヒト結腸直腸がんの６４％が高レベルのサバイビンを発現する。サバイビン陽性の第ＩＩ期患者の５年生存率は、サバイビン陰性の患者の場合より甚だ低い（非特許文献２６）。がん患者のサバイビン発現と予後との相関は、いくつかの他の種類の腫瘍でも実証されている（非特許文献２７〜２８）。いくつかの報告は、腫瘍細胞におけるサバイビン遺伝子の発現が化学療法または放射線療法に対する腫瘍細胞の耐性に寄与する、ということを示
した（非特許文献２９〜３１）。したがってサバイビン遺伝子発現のレベルを用いて、化学療法剤に対するヒト腫瘍細胞の感受性を測定し得る。
【００１０】
（分子ビーコン技法によるヒトがん細胞の検出）
目下、臨床試料における遺伝子突然変異の検出のために一般的に用いられる方法は、ゲノムＤＮＡのＤＮＡ精製またはＲＮＡ単離とその後の突然変異体を濃縮する（mutant-enriched ）ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲである。次に一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）、制限酵素断片長多型（ＲＥＬＰ）または対立遺伝子特異的オリゴデオキシヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＡＳＯＨ）により、突然変異体ＰＣＲ産物の存在が測定される（非特許文献８〜１１、非特許文献３２〜３３）。ＰＣＲによるＫ−ｒａｓ突然変異の同定はかなり感受性の高い分子レベルのアプローチであるが、しかしＰＣＲに関する手法およびその後のアッセイは非常に時間を要し、臨床的手法とするのは困難である。今までのところ、蛍光標識した一般的な直線状オリゴヌクレオチドプローブを用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法は蛍光バックグラウンドレベルが高く、単一塩基対の突然変異を有するｍＲＮＡの検出では感度が低いため、無傷の細胞における突然変異がん遺伝子の発現を直接検出することは非常に難しかった。突然変異体タンパク質に対する抗体を用いた免疫染色は、通常は特異性を欠き、「擬陽性」データを生じる。非特異的な標識および内在性のペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼの存在により、多数の「擬陽性」が観察された。したがって、突然変異がん遺伝子を発現する腫瘍細胞の検出のための、より特異性の高いアッセイを開発することが重要である。
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【非特許文献３】パーカー他（Parker et al. ）, CA. Cancer J. Clin. 46: 5-27 (1996)
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【非特許文献５】米国国立衛生研究所（National Institute of Health）：NIH Publication 93-2789 (1993)
【非特許文献６】バーキン他（Barkin et al. ）, Gastroenterology Clinics of North America 28: 709-722 (1999)
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【非特許文献２８】スワナ他（Swana et al.）, New England Journal of Medicine. 341: 452-453 (1999)
【非特許文献２９】カトウ他（Kato et al. ）, International Journal of Cancer 95: 92-5 (2001)
【非特許文献３０】アズハタ他（Azuhata et al.）, Journal of Pediatric Surgery 36: 1785-1791 (2001)
【非特許文献３１】アサヌマ他（Asanuma et al.）, Japanese Journal of Cancer Research 91: 1204-9 (2000)
【非特許文献３２】フィッシャー他（Fischer et al.）, Laboratory Investigation 81: 827-831 (2001)
【非特許文献３３】クレイトン他（Clayton et al.）, Clinical Chemistry 46: 1929-1938 (2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
がん遺伝子および腫瘍抑制遺伝子の遺伝的変化、ならびに細胞の増殖を促進し細胞に転移能を提供する遺伝子発現異常によってがん細胞が発生する、ということが十分に確立されている。本明細書において用いられるがんの早期検出を達成する方法は、がん細胞中で発現されるが正常細胞中では発現が低いかまたは全く発現されないｍＲＮＡ転写物の検出によりがん細胞を同定することであろう。したがって今まで取り組まれなかった必要性が、上記の欠陥および不適切性に取り組むために当該技術分野に存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
［発明の概要］
本発明の種々の態様は、固定された、または生きている正常細胞およびがん細胞中での遺伝子発現のレベルを検出する方法を提供する。具体的には、細胞試料中の種々の腫瘍マーカーの存在またはその遺伝子発現の変化を検出し、同定し、または定量するための、蛍光画像化技法と組合せた分子ビーコン（ＭＢ）技術を利用する方法が提供される。
【００１３】
ＭＢは、一端に蛍光体、他端に消光剤を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。ＭＢ
は、その標的のｍＲＮＡが存在しない場合、蛍光体の蛍光が消光されるように、ステム−ループ構造を形成するよう設計されている。ループ部分は、標的ｍＲＮＡ分子と相補的なプローブ配列を有する。ループの各末端近くのアーム配列は互いに相補的であり、アニーリングしてＭＢのステムを形成する。ＭＢが標的ｍＲＮＡ分子に遭遇すると、ループ、そしておそらくはステムの一部が標的ｍＲＮＡとハイブリダイズして、自発的に高次構造の変化を引き起こし、この変化がステムを離れさせる。消光剤が蛍光体から離れることにより、蛍光が回復する。ステム−ループ型プローブの主な利点は、直線状プローブより高い特異性でその標的を認識し得る、という点である。適正に設計されたＭＢは、単一ヌクレオチドというわずかな違いを有する標的を区別し得る。ＭＢの設計により、その標的ヌクレオチド配列とのＭＢとの特異的結合が可能となり、かつ、遊離ＭＢは蛍光を発しないのでＭＢ−標的複合体から非結合プローブを分離することなく、蛍光シグナルの発生によりハイブリダイゼーションが報告される。したがってＭＢは、無傷細胞中ならびに溶液中で、特定のヌクレオチド配列、例えばｍＲＮＡおよびＤＮＡを高いノイズ対シグナル比で検出するための優れたツールをわれわれに提供するはずである。
【００１４】
したがって一態様では、本発明は、試料中の少なくとも１つの腫瘍マーカーｍＲＮＡの存在を検出する方法に関する。当該方法は、分析のための細胞試料を提供すること、そして次に腫瘍マーカーｍＲＮＡを標的とする環状オリゴヌクレオチド（ＭＢ）で試料を処理することを包含する。次に、試料中に存在する標的配列の有無または量が検出可能な蛍光シグナルの変化と相関するように、適切なハイブリダイゼーション条件下で標的配列のハイブリダイゼーションが検出、同定、または定量される。次に、測定される標的配列との前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの有無または量に基づいて、腫瘍マーカーの存在が、検出、同定、または定量され得る。ＭＢは、直接インキュベーションすることによりアセトン固定された細胞に送達されてもよいし、あるいはトランスフェクションにより生細胞中に送達されてもよい。固定された、または生きている腫瘍細胞中へのＭＢ送達後の腫瘍マーカーｍＲＮＡの存在およびそのレベルの定量は、蛍光顕微鏡を用いて蛍光強度を測定することにより、個々の細胞集団のＦＡＣＳ‐スキャン分析を用いて、あるいは蛍光マイクロプレートリーダーを用いて９６ウエルプレート中でリアルタイムに相対的蛍光単位の変化をモニタリングすることにより成し遂げられる。
【００１５】
検出されるべき任意の腫瘍マーカーであり、そして本発明の特定のいくつかの態様で検出される腫瘍マーカーは、サバイビン、サイクリンＤ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、突然変異型Ｋ−ｒａｓ、キモトリプシノーゲン、ＸＩＡＰ、塩基性繊維芽細胞増殖因子、ＥＧＦ受容体、癌胎児性抗原、前立腺特異抗原、α−フェトプロテイン、β−２−ミクログロブリン、膀胱腫瘍抗原、クロモグラニンＡ、ニューロン特異的エノラーゼ、Ｓ−１００、ＴＡ−９０、組織ポリペプチド抗原およびヒト絨毛性ゴナドトロピンのうち１つまたは複数を含み得る。
【００１６】
本発明の任意の態様では、試料は任意数の供給源のうちの１つまたは複数の供給源から採取可能であり、供給源の例としては血液、尿、膵液、腹水、乳管洗浄液、乳頭吸引物、穿刺生検物または組織が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の特定のいくつかの態様では、組織は膵臓または乳房からの生検物である。本発明の他の態様では、組織は顕微鏡用凍結切片の形態であり得る。
【００１７】
本発明の別の態様は、腫瘍細胞中の突然変異遺伝子の存在を検出する方法であって、分析のための腫瘍細胞の試料を提供することと、次に突然変異遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドで試料を処理することとを包含する方法に関する。本発明の特定のいくつかの態様では、突然変異遺伝子は突然変異型Ｋ−ｒａｓ遺伝子である。
【００１８】
本発明のさらに別の態様は、生細胞中の遺伝子発現のレベルをモニタリングする方法に
関する。
本発明のさらに別の態様は、被験者における乳がんの存在または進行を検出またはモニタリングする方法であって、乳がんマーカーの存在をモニタリングまたは検出することを包含する方法に関する。本発明の種々の態様において、乳がんマーカーは、サバイビン、サイクリンＤ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、塩基性繊維芽細胞増殖因子および癌胎児性抗原のうちの１つまたは複数であり得る。本発明の特定のいくつかの態様では、試料は、血液、尿、乳管洗浄液、乳頭吸引物、腹水、穿刺生検物または組織のうちの１つまたは複数から採取されるが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明のさらに別の態様は、被験者における膵臓がんの存在または進行を検出またはモニタリングする方法であって、膵臓がんマーカーの存在に関して検出またはモニタリングすることを包含する方法に関する。本発明の種々の態様では、膵臓がんマーカーは、サバイビン、突然変異型Ｋ−ｒａｓ遺伝子および癌胎児性抗原のうちの１つまたは複数であり得るが、これらに限定されない。本発明の種々の態様では、試料は、少なくとも１つの供給源、例えば血液、尿、膵液、穿刺生検物または組織（これらに限定されない）から採取され得る。
【００２０】
本発明の別の態様は、試料中のがん細胞を検出する方法であって、がん特異的マーカー遺伝子配列を標的とするオリゴヌクレオチドで細胞試料を処理することを包含する方法に関する。本発明の種々の態様では、がん細胞は、乳がん、膵臓がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、多発性骨髄腫、リンパ腫、膀胱がん、甲状腺髄様がん、神経内分泌腫瘍、類癌腫、精巣がん、妊娠栄養膜腫瘍形成、肺がん、黒色腫および胃がんのうちの１つまたは複数に由来するものでよいが、これらに限定されない。
【００２１】
本発明のその他の態様は、１）がん細胞の進行を検出するかまたはモニタリングし；そして、２）生細胞中の遺伝子発現のレベルをリアルタイムに検出するための診断キットを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
［好ましい実施形態の詳細な説明］
本発明の種々の実施形態を、ここで詳細に説明する。本明細書中の記載ならびにその後の特許請求の範囲において用いる場合、「一つの（a ）」、「一つの（an）」および「その（the ）」の意味は、文脈から明らかに違う場合を除き、複数形を包含する。さらにまた本明細書中の記載ならびにその後の特許請求の範囲において用いる場合、「〜中に（in）」の意味は、文脈から明らかに違う場合を除き、「〜中に（in）」および「〜の上に（on）」を包含する。
【００２３】
本明細書中で用いられる用語は一般に、本発明の情況の範囲内で、かつそれぞれの用語が用いられる特定の情況において、当該技術分野におけるその用語の通常の意味を有する。本発明を説明するために用いられる特定のいくつかの用語について以下に、あるいは本明細書中の別の箇所において考察して、本発明の組成物および方法ならびにそれらの製造方法および使用方法を説明するに際して、実践者に付加的な案内を提供する。便宜のために、特定のいくつかの用語は、例えばイタリック体および／または引用符を用いて強調されることもある。強調しても用語の範囲および意味に影響を及ぼさない。用語の範囲および意味は、それが強調されてもされなくても、同一の情況においては同一である。当然ながら、同一の事柄は複数の方法で述べられ得る。従って、本明細書中で考察される任意の１つまたは複数の用語に関して代替的専門用語および同義語が用いられることがあり、ある用語が本明細書中で推敲されるにしてもまたは考察されるにしても、何らかの特定の意味を負わされることはない。特定のいくつかの用語に対して同義語が提示される。１つまたは複数の同義語を挙げることによって、他の同義語の使用が排除されることはない。例
の使用は、本明細書中で説明される任意の用語の例を含めて、この明細書中のどこでも、例示的であるに過ぎず、本発明の範囲および意味あるいは任意の例示用語の範囲および意味をいかなる点においても限定するものではない。同様に、本発明は、この明細書中に示された種々の実施形態に限定されない。
【００２４】
本明細書中で用いる場合、「約（about ）」または「およそ（approximately ）」とは概して、所与の値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、さらに好ましくは５％以内を意味するものとする。本明細書中に示された数量はおよその数量であり、「約」または「およそ」という用語が明白に記述されない場合には「約」または「およそ」である、ということを意味する。
【００２５】
（定義）
「ハイブリダイゼーション」および「相補的」とは、本明細書中で用いる場合、２つのヌクレオチド間で正確に対合することができることをさす。例えばオリゴヌクレオチドのある部位のヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡ分子の同一部位のヌクレオチドと水素結合し得る場合には、そのオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡは、その部位について互いに相補的である、またはハイブリダイズ可能であるとみなされる。オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡは、各分子内の十分な数の対応する部位が互いに水素結合し得るヌクレオチドにより占められている場合にハイブリダイズする。当該技術分野では当然のことであるが、アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列はその標的核酸の配列とハイブリダイズするために同標的核酸の配列と１００％相補的である必要はない。アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物と標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子との結合の場合、オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能であり、そして特異的結合が望ましい条件下では、例えばｉｎ  ｖｉｖｏアッセイまたは治療的処置の場合の生理学的条件下、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの場合にアッセイが実施される条件下では、アンチセンスオリゴヌクレオチドと非標的配列との非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在する。
【００２６】
本発明の情況では、「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）あるいはそれらの模倣物のオリゴマーまたはポリマーを指す。この用語は、天然および／または合成の核酸塩基、糖およびヌクレオシド間（主鎖）共有結合からなるオリゴヌクレオチドを包含するが、これに限定されない。このような修飾または置換されたオリゴヌクレオチドが天然の形態よりも好ましいことが多いのは、望ましい特性、例えば細胞による取り込みの増強、核酸標的に対する親和性増強、および／またはヌクレアーゼの存在下での安定性増大のためである。
【００２７】
本発明は、正常細胞およびがん細胞中での遺伝子発現を検出する方法を提供する。特に、細胞の試料中の種々の腫瘍マーカーの遺伝子発現の存在または変化を検出し、同定し、または定量するための方法が提供される。
【００２８】
生きている腫瘍細胞ならびに固定された腫瘍細胞における遺伝子発現を検出するための分子ビーコン（ＭＢ）技術を、発明者等は開発した。ＭＢは、一端に蛍光体、他端に消光剤を有する二重標識されたステム−ループヘアピン構造を有するオリゴヌクレオチドである。細胞内へＭＢを送達すると、ＭＢが標的ｍＲＮＡとハイブリダイズする場合に蛍光シグナルを生じる。したがって、標的ｍＲＮＡががんの分子マーカーに相当する場合、がん細胞（明色）は正常細胞（暗色）から区別され得る。以下の方法、すなわち細胞の試料中の少なくとも１つの腫瘍マーカーｍＲＮＡの存在を検出する方法；腫瘍細胞中の突然変異遺伝子の存在を検出する方法；生細胞中の遺伝子発現の変化をモニタリングする方法；乳がんマーカーの存在をモニタリングまたは検出することを含む、被験者における乳がんの存在または進行を検出またはモニタリングする方法；膵臓がんマーカーの存在を検出また
はモニタリングすることを含む、被験者における膵臓がんの存在または進行を検出またはモニタリングする方法；およびがん特異的マーカー遺伝子配列を標的とするオリゴヌクレオチドで細胞の試料を処理することを含む、試料中のがん細胞を検出する方法が提供される。また、１）がん細胞の進行を検出またはモニタリングし；そして２）生細胞中の遺伝子発現の変化をリアルタイムに検出する診断キットも提供される。
【００２９】
（分子ビーコン）
図１に略記したように、ＭＢは、一端に蛍光体、他端に消光剤を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。決して限定されるものではないが、典型的には蛍光体は５’末端に結合され、消光剤は３’末端に結合される。ＭＢは、その標的ｍＲＮＡが存在しない場合は蛍光体の蛍光が消光されるように、ステム−ループ構造を形成するよう設計される。ループ部分は、標的ｍＲＮＡ分子と相補的なプローブ配列を有する。用いられるよう意図される典型的蛍光体としては、Ｃｙ３（商標）蛍光体（Ｃｙ３アミダイト、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ所在のアマシャム・ファルマシア・バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech））、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（モレキュラー・プローブス（Molecular Probes））；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０（青色）、ＣＭＡＣ（７−アミノ−４−クロロメチルクマリン）、６−ＦＡＭ（商標）およびＦＩＴＣが挙げられるが、これらに限定されない。典型的消光剤としては、ダブシル（４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸）（Ｄａｂｃｙｌ−ＣＰＧ、米国バージニア州スターリング所在のグレン・リサーチ（Glen Research ））が挙げられるが、これに限定されない。
【００３０】
ＭＢが標的ｍＲＮＡ分子に遭遇すると、ループとステムの一部とが標的ｍＲＮＡとハイブリダイズして、ステムを分離させる自発的な構造変化を引き起こす。消光剤は蛍光体から離れて、蛍光の回復をもたらす（ティアギ他（Tyagi et al.）, Nature Biotechnol 14: 303-308 (1996); デュベルトレット他（Dubertret et al.）, Nat Biotechnol 19: 365-370 (2001) ）。ステム−ループ型プローブの主な利点の１つは、該プローブが直線状オリゴヌクレオチドプローブより高い特異性で標的を認識し得るという点である。適正に設計されたＭＢは、単一ヌクレオチドというわずかな違いを有する標的を区別し得る（ティアギ他（Tyagi et al.）, Nat Biotechnol 16: 49-53 (1998) ）。ＭＢは、種々の用途、例えばＤＮＡ突然変異検出、タンパク質−ＤＮＡ相互作用、ＰＣＲのリアルタイムモニタリング、遺伝子タイピング、および生細胞中のｍＲＮＡ検出に利用されてきた（デュベルトレット他（Duertret et al. ）, Nat Biotechnol 19: 365-370 (2001);  ダークス他（Dirks et al.）,  Histochem. & Cell Biol. 115(1): 3-11 (2001);  ティアギ他（Tyagi
et al.）, Nat Biotechnol 16: 49-53 (1998);  ソコル他（Sokol et al.）, Proc Natl
Acad Sci USA 95: 11538-11543 (1998) ）。
【００３１】
本発明の種々の実施形態は、以下の方法、すなわち、細胞の試料中の少なくとも１つの腫瘍マーカーｍＲＮＡの存在を検出する方法、腫瘍細胞中の突然変異遺伝子の存在を検出する方法、生細胞中の遺伝子発現の変化をモニタリングする方法、乳がんマーカーの存在をモニタリングまたは検出することを含む、被験者における乳がんの存在または進行を検出またはモニタリングする方法、膵臓がんマーカーの存在を検出またはモニタリングすることを含む、被験者における膵臓がんの存在または進行を検出またはモニタリングする方法、およびがん特異的マーカー遺伝子配列を標的とするオリゴヌクレオチドで細胞の試料を処理することを含む、試料中のがん細胞を検出する方法を提供するが、このような方法は、
ｉ）分析のために細胞の試料を提供する工程と、
ｉｉ）所望のマーカーまたは遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドで試料を処理する工程と、
ｉｉｉ）適切なハイブリダイゼーション条件下で標的配列のハイブリダイゼーション
を検出し、同定し、または定量する工程であって、試料中に存在する標的配列の有無または量がオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの供与体部分または受容体部分と関連した検出可能なシグナルの変化と相関することを特徴とする工程と、
ｉｖ）オリゴヌクレオチドと測定される標的配列とのハイブリダイゼーションの有無または量に基づいてマーカーまたは遺伝子の存在を検出し、同定し、または定量する工程とを包含する。
【００３２】
本発明者が意図しているのは、上記のような分子ビーコンとして使用するために構築された任意のオリゴヌクレオチドを本発明の方法に用い得るということである。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドとしては、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３のうちの１つまたは複数が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは腫瘍マーカーであるサバイビンを標的とする。好ましい一実施形態では、サバイビンを標的とするオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１、２および９のうちの１つまたは複数が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、腫瘍マーカーであるサイクリンＤ１を標的とする。好ましい一実施形態では、サイクリンＤ１を標的とするオリゴヌクレオチドとしては、配列番号３および４のうちの１つまたは複数が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、腫瘍マーカーであるＨｅｒ２／ｎｅｕを標的とする。好ましい一実施形態では、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを標的とするオリゴヌクレオチドとして配列番号５および６のうちの１つまたは複数が挙げられるが、これらに限定されない。さらに別の実施形態では、オリゴヌクレオチドはＫ−ｒａｓ突然変異遺伝子腫瘍マーカーを標的とする。好ましい一実施形態では、Ｋ−ｒａｓ突然変異遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドとして配列番号７、８、１１、１２および１３のうちの１つまたは複数が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
（腫瘍マーカーの検出）
種々の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載された分子ビーコン技術を用いて試料中の少なくとも１つの腫瘍マーカーｍＲＮＡの存在を検出する方法を提供する。当業者が容易に理解するように、本発明の方法は、試料中に存在する任意の腫瘍マーカーｍＲＮＡの存在を検出するために利用され得る。このようなマーカーとしては、サバイビン、サイクリンＤ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、突然変異型Ｋ−ｒａｓ、塩基性繊維芽細胞増殖因子、ＥＧＦ受容体、ＸＩＡＰ、癌胎児性抗原、前立腺特異抗原、α−フェトプロテイン、β−２−ミクログロブリン、膀胱腫瘍抗原、クロモグラニンＡ、ニューロン特異的エノラーゼ、Ｓ−１００、ＴＡ−９０、組織ポリペプチド抗原およびヒト絨毛性ゴナドトロピンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
（試料の収集）：試験されるべき細胞の試料は、日常的な診断手法により得ることができる。このような試料としては、血液、尿、細針穿刺吸引物、乳管洗浄液、膵液、腹水、乳頭吸引試料、あるいは任意のその他の組織、例えば患者の任意の場所（例えば乳房、膵臓またはリンパ節であるがこれらに限定されない）からの生検物（これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。組織試料は、病理学的に調製された日常的な任意の種類の試料、例えば顕微鏡スライド、プレートまたはウエルに付着させた任意の種類の組織であり得る。好ましい一実施形態では、組織試料は組織の凍結切片である。別の好ましい実施形態では、試料は乳管洗浄液から採取される。さらに別の好ましい実施形態では、試料は膵液から採取される。
【００３５】
（乳がん腫瘍細胞マーカーの検出）
本発明の特定のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載された分子ビーコン技術を用いて被験者における乳がんの存在または進行を検出またはモニタリングする方法を提供する。本発明は、乳がんの腫瘍形成の早期に発現されることが示された遺伝子のｍＲＮＡを
標的とするＭＢの組合せを用いて、乳管洗浄液および細針穿刺吸引物（ＦＮＡ）から乳がん細胞を検出するための方法を提供する。本発明者らは、非浸潤性乳管癌の診断における各遺伝子の検出の予測値または２つもしくは３つの遺伝子の同時発現のモニタリングについて示した。本発明の特定のいくつかの実施形態では、乳管上皮細胞中のサバイビン、サイクリンＤ１およびＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子の過剰発現を同時に検出する方法が提供される。本発明の方法は、特に腫瘍の単一細胞が複数のマーカー遺伝子を発現する場合に、これらの腫瘍マーカーの存在を検出するのに有用である。好ましい一実施形態では、乳管洗浄液中のサバイビン、サイクリンＤ１および／またはＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現細胞の検出のための方法が提供される。
【００３６】
種々の実施形態において、本発明の方法は、サバイビン、サイクリンＤ１またはＨｅｒ−２／ｎｅｕのｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズするよう設計されたＭＢを利用する。出願人等は、ヒト乳がん細胞株、正常乳房上皮細胞株および正常繊維芽細胞株におけるＭＢの特異性および感度、ならびに正常細胞存在下の単離腫瘍細胞を様々ながん細胞‐正常細胞比で同定する場合のＭＢの特異性および感度を実証した。提示された方法は、早期乳がんまたは様々なステージの非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）の患者および正常対照被験者から得られる乳管洗浄液および細針穿刺吸引物の細胞分画中のこれらの腫瘍マーカーの発現を検出するために利用され得る。
【００３７】
（試料の収集）：試験されるべき細胞の試料は、日常的な診断手法により得られる。このような試料としては、血液、尿、細針穿刺吸引物、乳管洗浄液、腹水、乳頭吸引試料、あるいは任意のその他の組織（例えば乳房またはリンパ節上の任意の場所からの生検物であるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。組織試料は、病理学的に調製された日常的な任意の種類の試料、例えば顕微鏡スライド、プレートまたはウエルに付着させた任意の種類の組織であり得る。好ましい一実施形態では、組織試料は組織の凍結切片である。
【００３８】
試料は、乳がん患者または乳がんを発症する危険性が高い女性に関して任意の日常的な診断手法により得られる、と考えられる。非限定的な例として、がん患者が乳がんを除去するための手術を受けているとき、あるいは診療所に日常的に訪れているときに、患者からの乳管洗浄液が収集される。麻酔下で、マイクロカテーテルが管内に挿入され、生理食塩水が注入される。流出液が収集され、遠心分離により細胞画分が濃縮される。乳管洗浄液または吸引物由来の濃縮細胞分画は次に、スライドガラス上に置かれる。典型的には、ｃｙｔｏｒｐｉｎ（登録商標）で作製した約１０〜１５枚のスライドが、乳管１つあたり平均１３，５００個の上皮細胞を含む１つの乳管洗浄液から得られる。氷冷アセトン中で細胞が固定された後、スライドは、最適化されたインキュベーション条件で、１つまたは複数のＭＢとともに逐次または同時にインキュベートされ、次に蛍光顕微鏡下で検査される。各遺伝子に関するＭＢは異なる蛍光染料で標識されるため、試料中の標的腫瘍マーカーに関する任意のまたは全ての遺伝子を過剰発現する細胞の数が測定される。
【００３９】
（分析）：本発明者らが意図しているのは、腫瘍マーカーの同定、モニタリングまたは検出を手助けするために、あるいはがんの診断または進行のモニタリングを手助けするために、ある種の収集試料から得られる結果を別の収集試料から得られた結果と比較し得ることである。その後、同じスライドが染色され、良性、非定型または悪性の細胞の存在に関して、細胞病理学者により分析され得る。このような染色は、日常的な細胞学的染色、例えばＨ＆Ｅまたは特異的抗体による免疫染色を包含し得る。
【００４０】
（定量）：ＭＢと、無傷細胞（固定された細胞または生きている細胞）中のその標的配列とのハイブリダイゼーションの検出は、蛍光顕微鏡法、ＦＡＣＳ分析および蛍光マイクロプレートリーダーにより行われ得る。非限定的な例として、乳がん細胞をサバイビン
およびＧＡＰＤＨのＭＢで同時トランスフェクトし、次にＥＧＦで処理した。ＥＧＦ処理後のサバイビン遺伝子発現の変化を、マイクロプレートリーダーで３時間、リアルタイムでモニタリングした。結果は、ＥＧＦが処理後３０分以内にサバイビン遺伝子発現の増大を誘導する、ということを示した。
【００４１】
（膵臓がん腫瘍マーカーの検出）
本発明の特定のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載した分子ビーコン技術を用いて、被験者における膵臓がんの存在または進行を検出またはモニタリングする方法を提供する。
【００４２】
膵臓がんの早期検出に関する重大な問題の１つは、多数の正常細胞集団の中の数個の腫瘍細胞を同定することができるアッセイを開発することである。目下、ＲＴ−ＰＣＲは、腫瘍細胞中で高度に発現される遺伝子の検出のための、あるいは突然変異型Ｋ−ｒａｓ遺伝子のような突然変異遺伝子の産物、または癌胎児性抗原に関する、最も高感度のアッセイである。ＲＴ−ＰＣＲは１０４〜１０５個の細胞中の１つの腫瘍細胞を検出し得るが、しかしこのようなアッセイは「擬陽性」を生じることがある。さらに、一般的な分子マーカーを用いた場合、末梢血および膵液中の遺伝子発現または突然変異遺伝子のＲＴ−ＰＣＲによる検出では、がんを膵臓に限局することができない。なぜなら、多種類のがんならびにその他の非悪性疾患もそれらの分子マーカーを発現し得るからである。さらにＲＴ−ＰＣＲアッセイは非常に時間を要し、典型的には１度に検出するのは１遺伝子であるため、がんの診断のための効率的臨床手法とはなりにくい。
【００４３】
本発明者らは、本明細書中に開示されたような、末梢血および膵液試料中の少数の膵臓がん細胞を同定し得る高感度でより効率的な方法を開発した。本明細書中に開示されたＭＢを使用する方法は、単一種類のＭＢまたはいくつかのＭＢの組合せを用いて、混合細胞集団から膵臓がんまたは腫瘍細胞を検出するために用いられ得る。提供された方法を用いて、Ｋ−ｒａｓエキソン１のＲＴ−ＰＣＲ増幅後にＫ−ｒａｓ突然変異を検出し得る。さらに種々の細胞学的または免疫染色手法が、開示された方法と一緒に用いられ得る。
【００４４】
ハイリスク患者集団または膵臓がんを有する疑いのある患者における膵臓がんの早期検出のためには、非侵襲的または侵襲性を最小限とした手法により入手可能な患者試料からの臨床的アッセイを開発することが重要である。膵臓がん患者の血液、骨髄および腹腔中の播種性腫瘍細胞の存在を明示する証拠が次々と得られている（ラカス他（LaCasse et al.）, Oncogene 17: 3247-3259 (1998);  リー他（Li et al. ）, Nature 396: 580-584 (1998); タム他（Tamm et al. ）, Cancer Research 58: 5315-5320 (1998); アンブロジーニ他（Ambrosini et al.）, Nature Medicine 3: 917-921 (1997) ）。例えばいくつかのサイトケラチンおよび腫瘍マーカーを検出する抗体を用いた免疫組織化学的染色により、膵臓がん患者から得られた血液試料の２８％でがん細胞が見出された。血液試料中のがん細胞の発見率は、腫瘍のステージに伴って増大した。しかしながら、第１期の膵臓がん患者の血液試料中には、がん細胞は見出されなかった（グラーゲン他（Z'graggen et al.）, Surgery 129: 537-545 (2001) ）。本発明は、全ステージの肝臓がん患者からの種々の試料を、本明細書中に開示されたＭＢ技法を用いて検査して、膵臓腫瘍マーカー、例えば突然変異Ｋ−ｒａｓ遺伝子およびサバイビン遺伝子（これらに限定されない）を発現する細胞を同定し得る高感度な方法を提供する。
【００４５】
（試料の収集）：試験されるべき細胞の試料は、日常的な診断手法により得られる。このような試料としては、血液、尿、細針穿刺吸引物、膵液、あるいは任意のその他の組織（例えば膵臓または周囲組織からの生検物であるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。組織試料は、病理学的に調製された日常的な任意の種類の試料、例えば顕微鏡スライド、プレートまたはウエルに付着させた任意の種類の組織で
あり得る。好ましい一実施形態では、組織試料は組織の凍結切片である。膵液は、診断的ＥＲＣＰ法を受けている患者から得られ得る。膵液は、十二指腸鏡を用いた膵液の分泌刺激およびサンプリングにより、自覚症状のない個体またはハイリスク集団において、非侵襲的に収集され得る。膵臓がん患者または膵臓腫瘍組織からの細針穿刺生検試料は、切除可能な腫瘍である場合、術後に収集され得る。
【００４６】
（分析）：本発明者らが意図しているのは、腫瘍マーカーの同定、モニタリングまたは検出を手助けするために、あるいはがんの診断または進行のモニタリングを手助けするために、ある種の収集試料から得られた結果を別の収集試料から得られた結果と比較し得ることである。その後、同じスライドが染色され、良性、非定型または悪性細胞の存在に関して、細胞病理学者により分析され得る。このような染色は、日常的な細胞学的染色、例えばＨ＆Ｅまたは特異的抗体による免疫染色を包含し得る。
【００４７】
血液および膵液を用いたＭＢを使用する検出の感度は、膵臓がんの外科的切除の後に、画像診断技術（例えばらせんＣＴ、ＭＲＩもしくは内視鏡超音波）または病理学的診断により診断される膵臓がん病変のサイズおよびステージを比較することにより評価される。
【００４８】
（突然変異遺伝子の存在のモニタリング）
本発明は、本明細書中に開示された分子ビーコン技術を用いて腫瘍細胞中の突然変異遺伝子の存在を検出する方法も提供する。このような突然変異遺伝子、例えばＫ−ｒａｓ遺伝子の存在に関するモニタリングは、様々な種類のがん、例えば膵臓がん（これに限定されない）の診断および治療を手助けする、ということが意図される。
【００４９】
（遺伝子発現における変化のモニタリング）
本明細書中に開示された分子ビーコン技術を用いて生細胞中の遺伝子発現の変化をリアルタイムでモニタリングする方法。このような方法は、標的遺伝子、例えば腫瘍マーカー、突然変異遺伝子等（これらに限定されない）の発現のモニタリングを可能にする。したがって、例えばある種のがんに遺伝的に罹患し易いとされている個体におけるがんの発症を、臨床医が検出し、モニタリングすることができる。このようにして、適切な治療が疾患の発症過程の早期に実施され、このことが実際に腫瘍またはがんの増殖の開始を防止するかまたは減少させ得る。生細胞における遺伝子発現レベルの検出により、種々の治療後の同一細胞集団においてリアルタイムで遺伝子発現の変化を測定することが可能になる、ということは重要である。この手法は、生物学的試薬による腫瘍細胞中の遺伝子発現の変化の検査のために、ならびに治療薬を用いたがん細胞の処置後の分子標的遺伝子の発現の評価のために用いられ得る。
【００５０】
開示された方法を実行するのに適した任意の材料または試薬を包含する、リアルタイムで生細胞中の遺伝子発現の変化を検出するための診断キットも意図される。
（がん細胞の検出）
本発明は、本明細書中で開示された分子ビーコン技術を用いて試料中のがん細胞を検出する方法を提供する。１つまたは複数のがん、例えば乳がん、膵臓がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、多発性骨髄腫、リンパ腫、膀胱がん、甲状腺髄様がん、神経内分泌腫瘍、類癌腫、精巣がん、妊娠栄養膜腫瘍形成、肺がん、黒色腫および胃がん（これらに限定されない）から生じるがん細胞が検出され得る、ということが意図される。開示された方法を実行するのに適した任意の材料または試薬を包含する、がん細胞を検出するための診断キットも意図される。
【００５１】
本発明の範囲を限定することなく、本発明の実施形態に従った例示的方法およびそれに関連する結果を以下に示す。表題または副題が読み手の便宜のために実施例に用いられることもあるが、これらは本発明の範囲を少しも限定すべきものではない、ということに留
意されたい。さらに、ある種の理論が本明細書中に提示および開示されるが、それらの理論が正しくても、正しくなくても、あらゆる特定の理論または作用スキームに関係なく本発明に従ってデータの処理、サンプリング、変換等が行われる限り、本発明の範囲は少しも限定されるべきではない。
【００５２】
［実施例］
【実施例１】
【００５３】
（サバイビンＭＢを用いた乳がん細胞株中のサバイビン遺伝子発現の予備的検出）
ヒトサバイビン遺伝子の２７ｎｔ〜４３ｎｔのｃＤＮＡ配列と相補的なプローブ配列を用いて、同遺伝子に特異的なＭＢを設計し、合成した（５’−Ａｌｅｘａ‐ｆｌｕｏ４８８−ＣＴＧＡＧＡＡＡＧＧＧＣＴＧＣＣＡＧＴＣＴＣＡＧ−ダブシル−３’；配列番号１）。下線を付したサバイビンＭＢのステム配列は、最良の熱力学作用を達成するよう特別に設計されている。最初に、サバイビンＭＢの特異的ハイブリダイゼーションについて、合成サバイビンオリゴヌクレオチド標的を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。
【００５４】
結果は、サバイビンＭＢがサバイビン標的に特異的に結合する、ということを示した（図２Ｃ）。サバイビン遺伝子を種々のレベルで発現する乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＣＦ−７、ならびに正常ヒト乳房上皮細胞株（ＭＣＦ−１０Ａ）において、サバイビンｍＲＮＡ検出用のサバイビンＭＢの特異性をさらに検査した。固定した細胞とともにサバイビンＭＢを３７℃で１時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ニコンの蛍光顕微鏡下で観察した。細胞をチェンバースライド上で増殖させ、アセトンで固定した。サバイビンＭＢはＡｌｅｘａ‐ｆｌｕｏ４８８で標識した（緑色、図４Ａ）。ウエスタンブロットによる乳がん細胞株および正常細胞株におけるサバイビン発現の検出を、図４Ｂに示す。図４Ａに示したように、腫瘍細胞は中〜強の赤色蛍光を示すのに対し、ＭＣＦ−１０Ａでは、弱い蛍光が観察されるだけであった。さらに、蛍光の強度はウエスタンブロットにより検出されるサバイビンのレベルと良好に相関する（図４Ｂ）。
【実施例２】
【００５５】
（乳がん細胞中のサバイビンおよびサイクリンＤ１の発現の同時検出）
数種類の腫瘍マーカーＭＢによるがん細胞の検出の特異性を調べるために、さらなる試験を実行した。サイクリンＤ１およびＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子用のＭＢを設計し、合成した（表１）。次に、合成オリゴヌクレオチド標的を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＭＢの特異性を検査した。各ＭＢの配列を表１に示す。下線を付した配列は遺伝子の一部ではなく、ステムを形成するよう設計されている。種々の蛍光染料（６−ＦＡＭ、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ‐ｆｌｕｏ４８８）を備えた同一配列を有するいくつかのサバイビンＭＢも合成した。サバイビンＭＢ−ＦＩＴＣは、表２に示すように、異なる標的配列を有する。ＭＢはＭＷＧバイオテク（MWG Biotech 、米国ノールカロライナ州ハイポイント所在）およびインテグレーテッドＤＮＡテクノロジー・インコーポレイテッド（Integrated DNA Technologies, Inc. （IDT ）、米国アイオワ州コーラルビル所在）により合成された。
【００５６】
ＭＢとその標的との特異的ハイブリダイゼーションを測定するために、ＭＢをそのオリゴヌクレオチド標的と混合することによりハイブリダイゼーション試験を実行し、次に蛍光マイクロプレートリーダーにより蛍光強度を測定した。この試験の対照群は、異なる遺伝子由来のオリゴヌクレオチド標的と混合されたＭＢとした（図２Ｃおよび図２Ｄ）。ＭＢとその標的との特異的結合を実証した後、ヒト乳房腫瘍細胞株および正常細胞株中でのサイクリンＤ１の検出におけるＭＢの特異性をさらに検査した（図４）。
【００５７】
【表１】
2006526390.tif 000002
【００５８】
サイクリンＤ１およびサバイビンのＭＢを用いた乳がん細胞の検出のために、１００ｎＭのサイクリンＤ１およびサバイビンのＭＢの混合物を、アセトンで固定したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＳＫＢｒ３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞、ＭＣＦ−７細胞またはＭＣＦ−１０Ａ細胞とともに１時間インキュベートした。蛍光顕微鏡下で、蛍光強度を検査した（図４Ａ）。ウエスタンブロット分析により検査したサバイビンおよびサイクリンＤ１のタンパク質のレベルを示す（図４Ｂ）が、図４Ｂでは、ＭＢにより検出されたサバイビンおよびサイクリンＤ１ｍＲＮＡのレベルをタンパク質レベルで補正して示してある（図４Ｂ）。図７は、ＥＧＦでヒト乳がん細胞株のＭＣＦ−７細胞を処理した後に、分子ビーコンを用いて生細胞における遺伝子発現をリアルタイムで検出したものを示す。図８は、ドセタキセル処理が乳がん細胞株におけるサバイビン遺伝子発現のレベルを増大させることを示した。
【実施例３】
【００５９】
（初期乳がん組織中のサバイビン発現細胞の同定）
乳がんマーカーとしてサバイビンを用いることの実現可能性を調べるために、ウエスタ
ンブロット分析により、正常組織および乳がん組織の対、ならびに対になっていない正常組織および乳がん組織におけるサバイビンタンパク質の発現を検査した。サバイビンは７３％をこえる乳がん組織で発現されるが、正常乳房組織のいずれにおいても発現されない、ということが判明した（図１０）。サバイビン抗体を用いた凍結組織切片の免疫蛍光染色も、サバイビンが浸潤性乳管癌細胞中で高度に発現されるが、正常乳管細胞中では発現されない、ということを明示した（図５Ａ）。興味深いことに、ＤＣＩＳの病変も中レベルのサバイビンを示した（図５Ａ）。サバイビンＭＢを用いた凍結組織切片に関するサバイビン遺伝子発現の検査はさらに、ＤＣＩＳ病変、浸潤性乳管癌、および乳がん患者の流入部のリンパ節における転移においてサバイビンを発現するがん細胞を明示した。しかしながら、正常乳房組織中にサバイビン陽性細胞は見出されなかった（図５Ａおよび図５Ｂ）。
【実施例４】
【００６０】
（膵臓がんの細胞および組織中の突然変異型Ｋ−ｒａｓおよびサバイビンｍＲＮＡの検出のためのＭＢの設計）
ビーコンの構造のパラメータおよびハイブリダイゼーション条件を決定して、Ｋ−ｒａｓ突然変異遺伝子の発現を検出するためのＭＢを設計し、合成した。これらを、表４に示す。８０％を超えるＫ−ｒａｓ突然変異がＫ−ｒａｓのコドン１２の中に見出されるため（フォス他（Vos et al.）, J. of Path. 187 (3): 279-84 (1999)）、ＧＧＴからＧＡＴへの（ＧｌｙからＡｓｐへの）トランジションを検出するＫ−ｒａｓＭＢ１、ならびにＧＧＴからＧＴＴへの突然変異を標的とするＫ−ｒａｓＭＢ２を合成した（表２）。ＧＧＴからＧＡＴへの変異は、膵臓がんにおける最も一般的なＫ−ｒａｓ点突然変異のうちの１つである（表３）。
【００６１】
Ｋ−ｒａｓＭＢ１またはＭＢ２は、そのＤＮＡ標的とｉｎ  ｖｉｔｒｏで選択的に結合し、他の非特異的ＤＮＡ標的と比較して強い蛍光シグナルを生じる（図２）。膵臓がん細胞株中でのＫ−ｒａｓＭＢの特異性の検査も、Ｋ−ｒａｓＭＢが特定のｋ−ｒａｓ突然変異を有する膵臓がん細胞を検出し得る、ということを実証した。図３に示したように、Ｐａｎｃ−１細胞株はＫ−ｒａｓのＧＧＴからＧＡＴへの突然変異を有し、Ｋ−ｒａｓＭＢ１とともにインキュベートした後で強い蛍光強度を示したが、Ｋ−ｒａｓＭＢ２で染色した細胞では弱い蛍光を示した。Ｃａｐａｎ−２細胞株はＫ−ｒａｓのＧＧＴからＧＴＴへの突然変異を含有し、Ｋ−ｒａｓＭＢ２で染色した細胞においてより明るい蛍光を検出した。いずれの細胞株も、サバイビンＭＢにより検出すると、高レベルのサバイビンを発現していた（図３Ａ）。一方、Ｋ−ｒａｓＭＢは、Ｋ−ｒａｓのＧＧＴからＴＧＴへの突然変異を有するＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞株、あるいはＫ−ｒａｓ野生型のＢＸＰＣ−３細胞中では強い蛍光シグナルを生じなかった。しかしながらそれらの細胞は、サバイビンＭＢ染色に関しては陽性であった。Ｋ−ｒａｓおよびサバイビンのＭＢのインキュベーションは、正常な皮膚繊維芽細胞から作製される正常細胞株（ＨＤＦ）中で検出可能な蛍光シグナルを生じなかった、ということは重要である（図３Ｂ）。
【００６２】
Ｋ−ｒａｓＭＢは、凍結組織切片上でＫ−ｒａｓ突然変異を有する膵臓がん細胞を検出することもできた。Ｋ−ｒａｓＭＢ１またはＫ−ｒａｓＭＢ２とともに１時間インキュベートし、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（商品名）で対比染色（青色）した後、デジタル画像化システムを用いて蛍光顕微鏡下でスライドを観察した。Ｋ−ｒａｓＭＢ１は、Ｋ−ｒａｓコドン１２のＧＧＴからＧＡＴへの突然変異を含有する患者＃１および＃２からの膵臓がん組織の凍結切片においてＧＧＴからＧＡＴへの突然変異型Ｋ−ｒａｓ遺伝子を発現するがん細胞を検出した。しかしながら、Ｋ−ｒａｓのＧＧＴからＧＴＴへの突然変異を有する患者＃５からの膵臓がん組織の凍結切片においては、Ｋ−ｒａｓＭＢ２を用いたインキュベーション後に明赤色の蛍光細胞が見出されたが、Ｋ−ｒａｓＭＢ１を用いたインキュベーション後には見出されなかった（図６Ａ）。
【００６３】
膵臓がん組織中のサバイビン発現のサバイビンＭＢによる検出の実行可能性も検査した。最初に、膵臓がん組織中のサバイビンの発現を、抗サバイビンモノクローナル抗体を用いた免疫蛍光染色により実証した。サバイビンタンパク質は膵臓がん組織中で高度に発現されるが、正常膵臓中では検出不可能である、ということを発明者らは示した（図６Ｂ）。  
【００６４】
【表２】
2006526390.tif 000003
【００６５】
【表３】
2006526390.tif 000004
【００６６】
【表４】
2006526390.tif 000005
【００６７】
上記の詳細な説明、実施例およびデータは、本発明の製造および使用についての完全な説明を提供する。別記しない限り、引用した特許文献および非特許文献は全て、背景となる情報のみに関して、参照により本明細書中で援用される。本発明の精神および範囲を逸脱せずに本発明について多数の実施形態が成され得るため、本発明は本明細書に添付の特許請求の範囲に存在する。
【００６８】
【表５】
2006526390.tif 000006
【００６９】
2006526390.tif 000007
【００７０】
2006526390.tif 000008
【００７１】
2006526390.tif 000009
【００７２】
2006526390.tif 000010
【００７３】
2006526390.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】分子ビーコン（ＭＢ）の概略を示す図。（Ａ）分子ビーコンは、ヘアピン構造を有する二重標識オリゴヌクレオチドである；（Ｂ）分子ビーコンが細胞内へ送達されると、該プローブと標的ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションにより蛍光シグナルを生じ得る。
【図２】分子ビーコンプローブとそのオリゴヌクレオチド標的とのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの特異的結合を示す図。Ｋ−ｒａｓＭＢ１、Ｋ−ｒａｓＭＢ２、サバイビンおよびサイクリンＤ１  ＭＢを、特異的または非特異的な合成ＤＮＡ標的と混合し、３７℃（サバイビンおよびサイクリンＤ１）または５０℃（Ｋ−ｒａｓ）で１時間インキュベートした。相対蛍光単位（ＲＦＵ）を蛍光マイクロプレートリーダーで測定した。図中の棒グラフは、４連の試料の平均ＲＦＵである。ＡおよびＢ：Ｋ−ｒａｓＭＢ１またはＭＢ２は、Ｋ−ｒａｓＭｕｔ１またはＭｕｔ２の標的と特異的に結合して、Ｋ−ｒａｓＷＴ（野生型）標的または異なるｋ−ｒａｓ突然変異を有する標的と比較して高い蛍光強度を生じた。ＣおよびＤ：サバイビンＭＢまたはサイクリンＤ１  ＭＢは、サバイビンまたはサイクリンＤ１標的とのみハイブリダイズし、Ｋ−ｒａｓまたはＨｅｒ−２標的とは結合せず、高レベルの蛍光シグナルを生じた。
【図３Ａ】ヒト膵臓がん細胞株における突然変異型Ｋ−ｒａｓ遺伝子およびサバイビン遺伝子の発現の同時検出による、膵臓がん細胞の分子ビーコンによる画像化を示す図。膵臓がん細胞株および正常細胞株をアセトンで固定した。細胞を、Ｋ−ｒａｓＭＢ１−ｃｙ３（ＧＧＴ→ＧＡＴ）とサバイビンＭＢ−ＦＩＴＣとの混合物、またはＫ−ｒａｓＭＢ２−テキサスレッド（ＧＧＴ→ＧＴＴ）とサバイビンＭＢ−ＦＩＴＣとの混合物とともに、５０℃で１時間インキュベートした。次に共焦点蛍光顕微鏡下でスライドを観察した。蛍光画像を撮影し、同一露出条件を用いて、各色に関する全ての画像を撮影した。赤色蛍光を有する細胞は、Ｋ−ｒａｓＭＢ１またはＫ−ｒａｓＭＢ２により検出されたように特定の突然変異型Ｋ−ｒａｓを発現する膵臓がん細胞であった。細胞をさらにまた緑色の蛍光で二重標識すると、これらの腫瘍細胞は腫瘍マーカーであるサバイビンも発現していることが示された。本図は、特定のＫ−ｒａｓ突然変異および高レベルのサバイビンを有する腫瘍細胞株中で突然変異型Ｋ−ｒａｓおよびサバイビン遺伝子を発現している膵臓がん細胞の検出の特異性を示す。Ｐａｎｃ−１細胞株は、Ｋ−ｒａｓのＧＧＴからＧＡＴへの突然変異を有し、Ｋ−ｒａｓＭＢ１とともにインキュベートした後に強力な蛍光強度を示したが、Ｋ−ｒａｓＭＢ２染色細胞では弱い蛍光を示した。Ｃａｐａｎ−２細胞株は、Ｋ−ｒａｓのＧＧＴからＧＴＴへの突然変異を含有し、Ｋ−ｒａｓＭＢ２染色細胞においてより明るい蛍光が検出された。いずれの細胞株も、サバイビンＭＢにより検出されたように、高レベルのサバイビンを発現した。
【図３Ｂ】ヒト膵臓がん細胞株における突然変異型Ｋ−ｒａｓ遺伝子およびサバイビン遺伝子の発現の同時検出による、膵臓がん細胞の分子ビーコンによる画像化を示す図。膵臓がん細胞株および正常細胞株をアセトンで固定した。細胞を、Ｋ−ｒａｓＭＢ１−ｃｙ３（ＧＧＴ→ＧＡＴ）とサバイビンＭＢ−ＦＩＴＣとの混合物、またはＫ−ｒａｓＭＢ２−テキサスレッド（ＧＧＴ→ＧＴＴ）とサバイビンＭＢ−ＦＩＴＣとの混合物とともに、５０℃で１時間インキュベートした。次に共焦点蛍光顕微鏡下でスライドを観察した。蛍光画像を撮影し、同一露出条件を用いて、各色に関する全ての画像を撮影した。赤色蛍光を有する細胞は、Ｋ−ｒａｓＭＢ１またはＫ−ｒａｓＭＢ２により検出されたように特定の突然変異型Ｋ−ｒａｓを発現する膵臓がん細胞であった。細胞をさらにまた緑色の蛍光で二重標識すると、これらの腫瘍細胞は腫瘍マーカーであるサバイビンも発現していることが示された。本図では、異なる突然変異型または野生型Ｋ−ｒａｓ遺伝子を発現する膵臓がん細胞はＫ−ｒａｓのＭＢについては弱い蛍光を示すかまたは陰性であるが、サバイビンＭＢでは依然として検出され得ることを示す。Ｋ−ｒａｓＭＢは、Ｋ−ｒａｓのＧＧＴからＴＧＴへの突然変異を有するＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞株、あるいはＫ−ｒａｓ野生型ＢＸＰＣ−３細胞中では強力な蛍光シグナルは生じなかった。しかしながらそれらの細胞は、サバイビンＭＢ染色に対しては陽性であった。Ｋ−ｒａｓおよびサバイビンＭＢのインキュベーションは、正常な皮膚繊維芽細胞から作製される正常細胞株（ＨＤＦ）中では検出可能な蛍光シグナルを生じなかった。
【図３Ｃ】ヒト膵臓がん細胞株における突然変異型Ｋ−ｒａｓ遺伝子およびサバイビン遺伝子の発現の同時検出による、膵臓がん細胞の分子ビーコンによる画像化を示す図。膵臓がん細胞株および正常細胞株をアセトンで固定した。細胞を、Ｋ−ｒａｓＭＢ１−ｃｙ３（ＧＧＴ→ＧＡＴ）とサバイビンＭＢ−ＦＩＴＣとの混合物、またはＫ−ｒａｓＭＢ２−テキサスレッド（ＧＧＴ→ＧＴＴ）とサバイビンＭＢ−ＦＩＴＣとの混合物とともに、５０℃で１時間インキュベートした。次に共焦点蛍光顕微鏡下でスライドを観察した。蛍光画像を撮影し、同一露出条件を用いて、各色に関する全ての画像を撮影した。赤色蛍光を有する細胞は、Ｋ−ｒａｓＭＢ１またはＫ−ｒａｓＭＢ２により検出されたように特定の突然変異型Ｋ−ｒａｓを発現する膵臓がん細胞であった。細胞をさらにまた緑色の蛍光で二重標識すると、これらの腫瘍細胞は腫瘍マーカーであるサバイビンも発現していることが示された。本図では、Ｋ−ｒａｓＭＢの送達後の膵臓がん細胞および正常細胞の蛍光強度の比較を示す。Ａｄｏｂｅ（登録商標）ＰｈｏｔｏＳｈｏｐ（登録商標）ソフトウエアを用いて、３つの無作為に選択した領域の各画像において蛍光強度を測定した。棒グラフ中の数字は、５〜７画像の平均蛍光強度を表す。
【図４Ａ】腫瘍マーカーであるサイクリンｄ１およびサバイビンを発現しているヒト乳がん細胞の分子ビーコンによる画像化を示す図。本図では、サイクリンＤ１−テキサスレッドおよびサバイビンＭＢ−Ａｌｅｘａ４８８の混合物とともに３７℃で１時間インキュベートされた乳がん細胞株および正常な乳房上皮の細胞株を示す。該スライドを次に、共焦点蛍光顕微鏡下で観察した。蛍光画像を撮影し、同一露出条件を用いて、各色に関する全ての画像を撮影した。
【図４Ｂ】腫瘍マーカーであるサイクリンｄ１およびサバイビンを発現しているヒト乳がん細胞の分子ビーコンによる画像化を示す図。本図では、サバイビンおよびサイクリンＤ１のＭＢにより検出される乳がん細胞株における蛍光強度のレベルが、ウエスタンブロット分析により検出されるサバイビンタンパク質およびサイクリンＤ１タンパク質のレベルと相関することを示す。
【図５Ａ】サバイビンタンパク質の免疫蛍光染色またはサバイビンｍＲＮＡ検出用サバイビンＭＢによる、ＤＣＩＳおよび浸潤期のヒト乳がん組織凍結切片におけるサバイビン発現の検出を示す図。乳がん組織または正常組織の凍結組織切片を、抗サバイビンポリクローナル抗体またはサバイビンＭＢ−ｃｙ３とともにインキュベートした。サバイビンは早期腫瘍マーカーであり、サバイビンのｍＲＮＡおよびタンパク質はともに早期の乳がんである非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）で検出され得る。サバイビンは浸潤性乳がんでも検出されるが、正常な乳房組織中では検出されない。
【図５Ｂ】サバイビンタンパク質の免疫蛍光染色またはサバイビンｍＲＮＡ検出用サバイビンＭＢによる、ＤＣＩＳおよび浸潤期のヒト乳がん組織凍結切片におけるサバイビン発現の検出を示す図。乳がん組織または正常組織の凍結組織切片を、抗サバイビンポリクローナル抗体またはサバイビンＭＢ−ｃｙ３とともにインキュベートした。サバイビンＭＢはリンパ節中の転移性乳がん細胞を検出したが、このことは、患者のリンパ節中の乳がん細胞の存在を検出するための迅速且つ高感度な方法の開発の実現可能性を示す。
【図６Ａ】膵臓がん組織の凍結組織切片における、突然変異型Ｋ−ｒａｓおよびサバイビンのｍＲＮＡを発現する膵臓がん細胞の特異的画像化を示す図。凍結組織切片を、Ｋ−ｒａｓＭＢ１またはＫ−ｒａｓＭＢ２、あるいはサバイビンＭＢとともに１時間インキュベートし、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（青色）で対比染色した。Ｋ−ｒａｓＭＢ１は、Ｋ−ｒａｓのコドン１２のＧＧＴからＧＡＴへの突然変異を含有する患者＃１および＃２由来の膵臓がん組織の凍結切片において、ＧＧＴからＧＡＴへの突然変異型Ｋ−ｒａｓ遺伝子を発現しているがん細胞を検出した。しかしながら、Ｋ−ｒａｓのＧＧＴからＧＴＴへの突然変異を有する患者＃５由来の膵臓がん組織の凍結切片においては、Ｋ−ｒａｓＭＢ２を用いたインキュベーション後に明赤色の蛍光細胞が見出され、Ｋ−ｒａｓＭＢ１を用いたインキュベーション後には見出されなかった。
【図６Ｂ】膵臓がん組織の凍結組織切片における、突然変異型Ｋ−ｒａｓおよびサバイビンのｍＲＮＡを発現する膵臓がん細胞の特異的画像化を示す図。凍結組織切片を、Ｋ−ｒａｓＭＢ１またはＫ−ｒａｓＭＢ２、あるいはサバイビンＭＢとともに１時間インキュベートし、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（青色）で対比染色した。本図では、免疫蛍光またはサバイビンＭＢ染色による凍結組織切片における膵臓がん細胞中のサバイビンタンパク質またはｍＲＮＡのレベルの検出を示す。免疫蛍光染色によるサバイビンタンパク質のレベルの検出については、膵臓がん組織および正常組織の凍結組織切片を、マウス抗サバイビン抗体（サバイビンＡｂ）とともに、その後、ＦＩＴＣで標識したヤギ抗マウス二次抗体とともにインキュベートした。高レベルのサバイビンタンパク質およびｍＲＮＡが膵臓がん組織中に見出されたが、正常な膵臓組織中には見出されなかった。
【図７Ａ】ＥＧＦ処理後の生きている乳がん細胞におけるサバイビン遺伝子発現のリアルタイム検出を示す図。乳がん細胞株ＭＣＦ−７を９６ウエルプレート中で培養し、２％ＦＢＳを含有する培地中に一晩置いた。次に細胞を、リポフェクタミン２０００を用いて３時間、２００ｎＭのサバイビン‐６ＦＡＭ‐ＭＢおよびＧＡＰＤＨ‐ｃｙ３‐ＭＢの混合物でトランスフェクトした。次に２００ｎｇのＥＧＦを培地に添加した。組織培養プレートを蛍光マイクロプレートリーダー中に直ちに入れて、相対蛍光単位（ＲＦＵ）を３０分毎に３時間測定した。図中の曲線は、３連試料の平均値を表し、６−ＦＡＭ（サバイビンＭＢ）とｃｙ３（内部対照ＧＡＰＤＨ  ＭＢ）のＲＦＵの比である。
【図７Ｂ】ＥＧＦ処理後の生きている乳がん細胞におけるサバイビン遺伝子発現のリアルタイム検出を示す図。ＥＧＦで処理した、またはＥＧＦで処理しなかったトランスフェクション済みの細胞を、共焦点顕微鏡下で２４時間観察し、蛍光画像を撮影した。
【図８Ａ】ドセタキセル処理後の様々な時点における、サバイビンＭＢを用いたサバイビン遺伝子発現の変化のリアルタイム検出を示す図。ヒト乳がん細胞株ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、９６ウエルプレート中で培養した。１００ｎＭのサバイビンおよびＧＡＰＤＨ用ＭＢ混合物でトランスフェクトした後、細胞を、化学療法薬ドセタキセルを用いて処理し（Ｄｏｃ）、または用いずに処理し、各群における蛍光強度の変化を、蛍光マイクロプレートリーダーで４８時間、リアルタイムで測定した。
【図８Ｂ】ドセタキセル処理後の様々な時点における、サバイビンＭＢを用いたサバイビン遺伝子発現の変化のリアルタイム検出を示す図。トランスフェクトした細胞を、２０ｎｍ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）または５０ｎｍ（ＭＣＦ−７）のドセタキセルを用いて、または用いずに、２４〜４８時間処理し、次に共焦点顕微鏡下で観察して、蛍光画像を撮影した。
【図９】生細胞中のサバイビン遺伝子発現のレベルがＦＡＣｓｃａｎ（商標）分析により検出され得ることを示す図。乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１および正常細胞株ＨＤＦをサバイビン用またはβ−アクチン用のＭＢで３時間トランスフェクトした。細胞を培養皿から回収し、正常細胞および腫瘍細胞におけるサバイビン遺伝子発現のレベルに関してＦＡＣｓｃａｎで分析した。結果から、生細胞における遺伝子発現のレベルもＦＡＣｓｃａｎを用いて定量的に測定され得る、ということが実証された。
【図１０】ウエスタンブロット分析による正常な乳房組織および乳がん組織中のサバイビンのレベルの検出を示す図。乳がん患者からの、正常組織および乳がん組織を対にした試料ならびに対になっていない正常組織および乳がん組織の試料についてのサバイビンのレベル。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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