(57)【要約】本発明は、卵白から９８％という高純度を有するアビジンを調製するためのプロセスを提供し、このプロセスは、緩衝液とともにホモジナイズした卵白を凍結乾燥し、続いて、凍結乾燥した材料を陽イオン交換体と２０℃〜３０℃の温度範囲で１時間平衡化し；この混合物を濾過して、濾液およびマトリクス残渣を得；このマトリクスを緩衝液で２回洗浄し；この洗浄物を分離して、洗浄したマトリクスを得；緩衝液中の０．０１Ｍ色素を洗浄したマトリクスに添加し；周囲温度で１時間平衡化し；上清を分離し；酢酸を上清に加え、この溶液が脱色されて、純粋なアビジンが得られるまで、透析する工程を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵白からアビジンを単離および精製するプロセスであって、該プロセスは、以下の工程：
ａ）卵白を緩衝液とともにホモジナイズする工程、
ｂ）工程（ａ）のホモジナイズ溶液を凍結乾燥して、固体材料を得る工程、
ｃ）緩衝液中に該固体卵白を溶解する工程、
ｄ）工程（ｃ）の溶液を平衡化した陽イオン交換体に添加し、２０〜３０℃の範囲の温度で１時間インキュベートする工程、
ｅ）工程（ｄ）の混合物を濾過して、濾液とマトリクス残渣とを得る工程、
ｆ）工程（ｅ）のマトリクス残渣を緩衝液で２回洗浄し、洗浄液を除去して、洗浄マトリクスを得る工程、
ｇ）工程（ｆ）の洗浄マトリクスに、緩衝液中の０．０１Ｍ色素を添加し、周囲温度で回転式振盪機で１時間平衡化する工程、
ｈ）工程（ｇ）の上清を取り出す工程、
ｉ）工程（ｈ）の上清に、酢酸の最終濃度が溶液中０．２Ｎになるように、酢酸を添加する工程、および
ｊ）工程（ｉ）の溶液が脱色されて、純粋なアビジンが得られるまで、該溶液を透析する工程、
を包含する、プロセス。
【請求項２】
前記工程（ａ）、（ｃ）、（ｆ）および（ｇ）において、前記使用した緩衝液が、酢酸緩衝液およびクエン酸緩衝液からなる群より選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記使用した酢酸緩衝液が、酢酸ナトリウム溶液と酢酸とを混合することにより調製される、請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記使用したクエン酸緩衝液が、クエン酸ナトリウム溶液とクエン酸とを混合することにより調製される、請求項２に記載のプロセス。
【請求項５】
前記使用した酢酸緩衝液が、５．０〜６．０の範囲のｐＨ、好ましくは、５．５のｐＨを有する、請求項３に記載のプロセス。
【請求項６】
前記使用したクエン酸緩衝液が、５．０〜６．０の範囲のｐＨ、好ましくは、５．５のｐＨを有する、請求項４に記載のプロセス。
【請求項７】
前記使用した緩衝液の濃度が、０．０５Ｍ〜０．１５Ｍの範囲、好ましくは０．１０Ｍである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項８】
工程（ｄ）において、前記使用した陽イオン交換体が、Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ  ＳＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ＣＭセルロース（Ｗｈａｔｍａｎｎ，ＵＫ）またはＣＭセファデックス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ＳＰセファデックス、Ｓｅｒａｌｉｔｅ  ＳＲＣ−１１２０、Ｓｅｒａｌｉｔｅ  ＷＲＣ−５０からなる群より選択され、好ましくは、Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ  ＳＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項９】
工程（ｇ）において、前記使用した平衡化緩衝液および平衡化緩衝液中のＨＡＢＡの溶液のイオン強度が、好ましくは同じである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１０】
工程（ｇ）において、前記使用した色素が、アゾ色素である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記使用した色素が、ＨＡＢＡ、４’−ヒドロキシアゾベンゼン−４−カルボン酸および４’−ジメチルアミノベンゼン−２−カルボン酸からなる群より選択され、好ましくは、ＨＡＢＡである、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
工程（ｊ）において、前記透析が、０℃〜５℃の温度範囲で行われ、好ましくは４℃で行われる、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１３】
工程（ｊ）において、前記得られたアビジンが、９８％の純度である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記工程の大部分が、周囲温度で行われる、請求項１に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、陽イオン交換体および選択的溶出液としてＨＡＢＡ（ヒドロキシアゾベンゼン−２’−カルボン酸）を用いて、卵白から糖タンパク質である「アビジン」を調製するための経済的かつ容易に操作可能なプロセスを提供する。
【０００２】
（背景技術）
アビジンは、糖タンパク質であり、この糖タンパク質は、卵白中に存在し、１０１５Ｍ−１の会合定数（生体アフィニティー対に関して最高であることが公知）でビオチンに結合するその特性により、周知である。
【０００３】
Ｅａｔｋｉｎら（１９４０）およびＰｅｎｎｉｎｇｔｏｎら（１９４２）は、アビジンの存在および粗製形態での単離を報告している。Ｃｏｎｒａｔら（１９５２）は、塩沈殿およびベントナイトに対する吸着により、アビジンを単離するための非常に長く単調で複数工程のプロセスを報告している。上記の参考文献は、アビジンが分子レベルで特徴づけすらされていなかった初期に関するものである。
【０００４】
Ｎ．Ｍ．Ｇｒｅｅｎ（１９６５）は、アビジンへの結合を研究するために、いくつかの陰イオン性色素をスクリーニングし、分光光度的に試験した。最も顕著な結果は、４’−ヒドロキシアゾベンゼン−２−カルボン酸（ＨＡＢＡ）を用いることにより得られた。Ｇｒｅｅｎら（１９７０）は、かなりの時間を要する、アビジンを単離するための複数工程のプロセスを記載している。ＢａｙｅｒおよびＷｉｌｃｈｅｋ（１９７４）は、アビジンを精製するために、ビオシチン（ｂｉｏｃｙｔｉｎ）（ε−Ｎ−ビオチニル−Ｌ−リジン）結合マトリクス上でのアフィニティークロマトグラフィーを用いた。ビオシチンの会合定数は、非常に高いので、ｐＨ１．５の６Ｍグアニジン塩酸塩を溶出のために用いた。これは、乏しくかつ再現不能な結果になった。ＷｉｌｃｈｅｋおよびＢａｙｅｒ（１９８８）は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫化学的染色、電子顕微鏡およびアフィニティークロマトグラフィーにおけるアビジンを記載している。
【０００５】
米国特許第４９６６８５１号は、弱酸性のイオン交換樹脂を用いて、緩衝液で段階的に溶出して、約１２％の非常に低い純度を有するアビジンを得ることにより、卵白からアビジンを単離することを記載している。従って、このプロセスは、標的タンパク質の非特異的回収を導く。
【０００６】
先に記載したすべての先行技術のプロセスは、いずれも複数工程の単離、またはアビジンの乏しい純度のいずいれかに関連する。本発明は、迅速で、経済的で、効率的かつ１工程の、卵白からアビジンを単離するプロセスを記載する。また、本発明のプロセスは、先行技術のプロセスと比較して、単離プロセスにおいて使用した固体マトリクスの陽イオン交換体からアビジンの脱離を行うための溶出液として使用しているＨＡＢＡの独特の特徴を有する。ここで、ＨＡＢＡは、常にこの固体マトリクスに共有結合しており、この共有結合した結合体は、続いて、アビジンを単離するプロセスにおいて使用される。
【０００７】
（発明の目的）
本発明の主な目的は、１工程で卵白からアビジンを単離および精製するためのプロプロセスを提供することである。
【０００８】
本発明の別の目的は、アビジンを単離および精製するための経済的かつ容易に操作可能なプロセスを開発することである。
【０００９】
本発明のさらに別の目的は、卵白から高純度のアビジンを得るプロセスを提供することである。
【００１０】
本発明のさらに別の目的は、このプロセスにおいて使用される陽イオン交換体が数回再利用され得る方法を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに別の目的は、ＨＡＢＡの共有結合が、上記使用した陽イオン交換体と遭遇しないプロセスを提供することである。
【００１２】
本発明のなお別の目的は、卵白からアビジンを単離するための市販可能なプロセスを開発することである。
【００１３】
本発明のさらに１つの目的は、使用される原料のいくつかが再利用されるプロセスを開発することである。
【００１４】
（発明の要旨）
従って、本発明は、卵白から高純度のアビジンを調製するための、経済的かつ容易に操作可能なプロセスを提供する。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本発明の目的に従って、本発明は、卵白から９８％の高純度を有するアビジンを調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、以下の工程を包含する：
ａ）卵白を緩衝液とともにホモジナイズする工程、
ｂ）工程（ａ）のホモジナイズ溶液を凍結乾燥して、固体材料を得る工程、
ｃ）緩衝液中に該固体卵白を溶解する工程、
ｄ）工程（ｃ）の溶液を平衡化した陽イオン交換体に添加し、２０〜３０℃の範囲の温度で１時間インキュベートする工程、
ｅ）工程（ｄ）の混合物を濾過して、濾液とマトリクス残渣を得る工程、
ｆ）工程（ｅ）のマトリクス残渣を緩衝液で２回洗浄し、洗浄液を除去して、洗浄マトリクスを得る工程、
ｇ）工程（ｆ）の洗浄マトリクスに、緩衝液中の０．０１Ｍ色素を添加し、周囲温度で回転式振盪機で１時間平衡化する工程、
ｈ）工程（ｇ）の上清を取り出す工程、
ｉ）工程（ｈ）の上清に、酢酸の最終濃度が溶液中０．２Ｎになるように、酢酸を添加する工程、および
ｊ）工程（ｉ）の溶液が脱色されて、純粋なアビジンが得られるまで、該溶液を透析する工程。
【００１６】
１つの実施形態において、９８％の純度を有するアビジンが得られる。
【００１７】
別の実施形態において、アビジンは、従来の比色定量的色素結合アッセイにより評価される。
【００１８】
なお別の実施形態において、使用される緩衝液は、酢酸緩衝液またはクエン酸緩衝液から選択される。
【００１９】
なお別の実施形態において、使用される緩衝液の濃度は、０．０５Ｍ〜０．１５Ｍの範囲であり、好ましくは０．１Ｍである。
【００２０】
さらに別の実施形態において、使用される酢酸緩衝液は、５．０〜６．０の範囲のｐＨ、好ましくは５．５のｐＨを有する。
【００２１】
別の実施形態において、使用されるクエン酸緩衝液は、５．０〜６．０の範囲のｐＨ、好ましくは５．５のｐＨを有する。
【００２２】
さらになお別の実施形態において、使用される色素は、ＨＡＢＡ、４−ヒドロキシアゾベンゼン−４−カルボン酸または４−ジメチルアミノベンゼン−２−カルボン酸から選択される。
【００２３】
なお別の実施形態において、精製のために使用される固体マトリクスは、陽イオン交換体である。
【００２４】
なお別の実施形態において、使用される陽イオン交換体は、Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ  ＳＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ＣＭセルロース（Ｗｈａｔｍａｎｎ，ＵＫ）またはＣＭセファデックス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ＳＰセファデックス、Ｓｅｒａｌｉｔｅ  ＳＲＣ−１１２０、Ｓｅｒａｌｉｔｅ  ＷＲＣ−５０からなる群より選択され、好ましくは、Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ  ＳＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）である。
【００２５】
本発明はさらに、以下の実施例により例示されるが、これらの実施例は、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００２６】
（実施例１：アビジンおよびタンパク質のアッセイ）
卵白および種々の画分中のアビジンの量を、比色定量的色素結合アッセイ（Ｇｒｅｅｎ，１９７０ｂ）により評価する。このアッセイは、ビオチンの添加に対する色素−アビジン複合体からのＨＡＢＡの置換、および結果として生じる、５００ｎｍでの試験溶液の吸着の減少に基づいている。アビジンの濃度（ｍｇ／ｍｌ）を０．４９×ΔＡ５００として計算した。
【００２７】
タンパク質の量を、標準タンパク質としてウシ血清アルブミンを用いて、標準的な色素結合アッセイにより測定した。
【００２８】
（実施例２：卵白からのアビジンの単離）
４つの卵の卵白を分離し、ホモジナイズした。ホモジナイズした溶液を凍結乾燥して、約８ｇの固体材料を得た。これを、２５ｍｌの０．１Ｍ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解し、アビジンの粗製供給源として用いた。
【００２９】
（実施例３：バッチ様式における陽イオン交換体でのアビジンの精製）
Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ  ＳＰ（５ｍｌ）を５０ｍｌの０．１Ｍ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化した。平衡化した後、過剰な緩衝液を完全に排出し、溶解した卵白（２５ｍｌ）を、この陽イオン交換体に添加し、２５℃で１時間平衡化した。結合していない卵白溶液を除去し、このマトリクスを５０ｍｌの０．１Ｍ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）で２回洗浄した。上清および洗浄物を、アビジン活性およびタンパク質の量に関して測定した。次いで、過剰な緩衝液を除去し、２０ｍｌの０．０１Ｍ  ＨＡＢＡ溶液（０．０９Ｍ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）中）をアビジン結合マトリクスに添加して、この溶液を２５℃で１時間平衡化した（回転式振盪機で１００ｒｐｍ）。１時間後、上清を回収した。酢酸（８３０μｌの５Ｎ  ストック溶液）を添加して、ＨＡＢＡとアビジンとの複合体を解離させる。この溶液を、無色になるまでアッセイ緩衝液に対して徹底的に透析する。次いで、この溶液をアビジンおよびタンパク質の量についてアッセイする。
【００３０】
（発明の主な利点）
１）このプロセスは、大量のアビジンを単離するために、経済的かつ操作が容易である。
【００３１】
２）このプロセスは、高純度のアビジンを提供する。
【００３２】
３）ＨＡＢＡを用いたアビジンの選択的溶出のためのプロセスを提供する。
【国際調査報告】
2006515559.tif 000002
2006515559.tif 000003
2006515559.tif 000004
2006515559.tif 000005