(57)【要約】ＨＥＲ−２を過剰発現するガンを治療するための薬理学的組成物であって、（ａ）配列ＩＤ番号１または配列ＩＤ番号１２の配列から取られた約５０〜７９個のアミノ酸を含み、ＨＥＲ−２の細胞外領域（ＥＣＤ）に少なくとも１０８のアフィニティで結合する単離ポリペプチド、（ｂ）配列ＩＤ番号２または配列ＩＤ番号１３の配列から取られた約３００〜４１９個のアミノ酸を含み、Ｃ末端の７９個のアミノ酸が存在し、少なくとも３つのＮ結合型グリコシル化部位が存在している、グリコシル化された単離ポリペプチド、（ｃ）ＨＥＲ−２のＥＣＤと結合するモノクローナル抗体、（ｄ）これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択した薬剤と、薬理学的に受容可能な基剤とを含むが、上記薬剤がモノクローナル抗体のみからなることはありえないという薬理学的組成物が開示されている。予後予測方法および診断方法も開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列ＩＤ番号１または配列ＩＤ番号１２の配列から取られた約５０〜７９個のアミノ酸を含み、ＨＥＲ−２の細胞外領域ＥＣＤに少なくとも１０８のアフィニティで結合する単離ポリペプチド。
【請求項２】
長さがアミノ酸約６９〜７９個である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
ＨＥＲ−２のＥＣＤ上の部位のうち、ハーセプチン（登録商標）（ＨＥＲ−２のＥＣＤと結合してガンの治療に用いられる、市販のヒト化モノクローナル抗体）の結合部位とは異なる部位に結合する、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項４】
発現したときに、配列ＩＤ番号１または配列ＩＤ番号１２の配列から取られた約５０〜７９個のアミノ酸を含み、ＨＥＲ−２の細胞外領域ＥＣＤに少なくとも１０８のアフィニティで結合するポリペプチドをコードしている単離ＤＮＡ配列。
【請求項５】
長さがアミノ酸約６９〜７９個である、発現したときに請求項４のポリペプチドをコードしている単離ＤＮＡ配列。
【請求項６】
ＨＥＲ−２のＥＣＤ上の部位のうち、ハーセプチン（登録商標）の結合部位とは異なる部位に結合する、請求項４に記載の単離ＤＮＡ配列。
【請求項７】
発現したときに、配列ＩＤ番号１の配列から取られた約５０〜７９個のアミノ酸を含み、ＨＥＲ−２の細胞外領域ＥＣＤに少なくとも１０８のアフィニティで結合するポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列を有する発現ベクターを含む、トランスフェクションされた細胞。
【請求項８】
配列ＩＤ番号２または配列ＩＤ番号１３の配列から取られた約３００〜４１９個のアミノ酸を含み、Ｃ末端の７９個のアミノ酸が存在し、少なくとも３つのＮ結合型グリコシル化部位が存在している、グリコシル化された単離ポリペプチド。
【請求項９】
長さがアミノ酸約３５０〜４１９個で、Ｎ結合型グリコシル化部位が４つ存在している、請求項８に記載のグリコシル化された単離ポリペプチド。
【請求項１０】
ＨＥＲ−２のＥＣＤ上の部位のうち、ハーセプチン（登録商標）の結合部位とは異なる部位に結合する、請求項８のグリコシル化された単離ポリペプチド。
【請求項１１】
発現したときに、配列ＩＤ番号２または配列ＩＤ番号１３の配列から取られた約８０〜４１９個のアミノ酸を含み、Ｃ末端の７９個のアミノ酸が存在し、少なくとも３つのＮ結合型グリコシル化部位が存在している、グリコシル化されたポリペプチドをコードしている単離ＤＮＡ配列。
【請求項１２】
長さがアミノ酸約３５０〜４１９個で、Ｎ結合型グリコシル化部位が４つ存在している、発現したときに請求項１１に記載のポリペプチドをコードしている単離ＤＮＡ配列。
【請求項１３】
配列ＩＤ番号２または配列ＩＤ番号１３の配列から取られた約８０〜４１９個のアミノ酸を含み、Ｃ末端の７９個のアミノ酸が存在し、少なくとも３つのＮ結合型グリコシル化部位が存在している、ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列を有する発現ベクターを含む、トランスフェクションされた細胞。
【請求項１４】
ＨＥＲ−２の過剰発現を特徴とする固形ガンを治療するためにＨＥＲ−２の細胞外領域（ＥＣＤ）と結合する薬剤を投与する操作を含む方法であって、この薬剤を、（ａ）配列ＩＤ番号１または配列ＩＤ番号１２の配列から取られた約５０〜７９個のアミノ酸を含み、ＨＥＲ−２の細胞外領域ＥＣＤに少なくとも１０８のアフィニティで結合する単離ポリペプチド、（ｂ）配列ＩＤ番号２または配列ＩＤ番号１３の配列から取られた約８０〜４１９個のアミノ酸を含み、Ｃ末端の７９個のアミノ酸が存在し、少なくとも３つのＮ結合型グリコシル化部位が存在している、グリコシル化された単離ポリペプチド、（ｃ）ＨＥＲ−２のＥＣＤと結合するモノクローナル抗体、（ｄ）これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択するが、この薬剤がモノクローナル抗体のみからなるものではない、上記方法。
【請求項１５】
ＨＥＲ−２を過剰発現する固形ガンを、乳ガン、肺小細胞ガン、卵巣ガン、大腸ガンからなるグループの中から選択する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
上記薬剤が、配列ＩＤ番号１または配列ＩＤ番号１２の配列から取られた約５０〜７９個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
上記薬剤が、配列ＩＤ番号１または配列ＩＤ番号１２の配列から取られた約５０〜７９個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドと、ＨＥＲ−２のＥＣＤと結合するモノクローナル抗体の組み合わせである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＨＥＲ−２を過剰発現する固形ガンを治療するための薬理学的組成物であって、（ａ）配列ＩＤ番号１または配列ＩＤ番号１２の配列から取られた約５０〜７９個のアミノ酸を含み、ＨＥＲ−２の細胞外領域ＥＣＤに少なくとも１０８のアフィニティで結合する単離ポリペプチド、（ｂ）配列ＩＤ番号２または配列ＩＤ番号１３の配列から取られた約８０〜４１９個のアミノ酸を含み、Ｃ末端の７９個のアミノ酸が存在し、少なくとも３つのＮ結合型グリコシル化部位が存在している、グリコシル化された単離ポリペプチド、（ｃ）ＨＥＲ−２のＥＣＤと結合するモノクローナル抗体、（ｄ）これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択した薬剤と、薬理学的に受容可能な基剤とを含むが、上記薬剤がモノクローナル抗体のみからなるものではない、上記薬理学的組成物。
【請求項１９】
上記薬剤が、配列ＩＤ番号１または配列ＩＤ番号１２の配列から取られた約５０〜７９個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドである、ＨＥＲ−２を過剰発現する固形ガンを治療するための請求項１８に記載の薬理学的組成物。
【請求項２０】
上記薬剤が、配列ＩＤ番号１または配列ＩＤ番号１２の配列から取られた約５０〜７９個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドと、ＨＥＲ−２のＥＣＤと結合するモノクローナル抗体の組み合わせである、ＨＥＲ−２を過剰発現する固形ガンを治療するための請求項１９に記載の薬理学的組成物。
【請求項２１】
ＨＥＲ−２の過剰発現を特徴とする固形ガン組織に治療薬を到達させる方法であって、この治療薬を、配列ＩＤ番号１または配列ＩＤ番号１２の配列から取られた約５０〜７９個のアミノ酸を含み、ＨＥＲ−２の細胞外領域（ＥＣＤ）に少なくとも１０８のアフィニティで結合する単離ポリペプチドに付着させる操作を含む方法。
【請求項２２】
長さがアミノ酸約６９〜７９個である、固形ガン組織に治療薬を到達させる請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
上記単離ポリペプチドが、ＨＥＲ−２のＥＣＤ上の部位のうち、ハーセプチン（登録商標）の結合部位とは異なる部位に結合する、固形ガン組織に治療薬を到達させる請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ＨＥＲ−２を過剰発現するガンの患者におけるガン治療の予後を予測する方法であって、（ａ）患者の血液、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択したから体液サンプルを取得し、（ｂ）ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、免疫組織化学法、ウエスタンブロット解析法からなるグループの中から選択して抗ｐ６８ＨＥＲ−２抗体に基づくアッセイを行なうことにより、発現したｐ６８ＨＥＲ−２の量を測定する操作を含む方法。
【請求項２５】
体液中のｐ１８５ＨＥＲ−２のＥＣＤの量を測定する操作をさらに含む、ＨＥＲ−２を過剰発現するガンの治療の予後を予測する請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ｐ６８ＨＥＲ−２とｐ１８５ＨＥＲ−２の量の比を測定する操作をさらに含み、ｐ１８５ＨＥＲ−２に対するｐ６８ＨＥＲ−２の比の値が大きいほど患者の予後が優れている、ＨＥＲ−２を過剰発現するガンの治療の予後を予測する請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ガン患者の治療、予後予測、または診断を行なう方法であって、
（ａ）患者の血液、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択した体液サンプルを取得し、
（ｂ）配列同定アッセイにより、この体液サンプル中にＥＣＤ ＩＩＩａが変異したタンパク質またはＤＮＡ配列、すなわちＨＥＲ−２のイントロン８が変異したＤＮＡ配列が存在しているかどうかを判定し、
（ｃ）歴史データベースを用いて、このＥＣＤ ＩＩＩａが変異したタンパク質またはＤＮＡ配列、すなわちＨＥＲ−２のイントロン８が変異したＤＮＡ配列の存在を、ガンの治療および診断と関連づける操作を含む方法。
【請求項２８】
上記配列同定アッセイを、ＤＮＡシークエンシング、ＰＣＲアッセイ、ＥＬＩＳＡ免疫アッセイ、イムノアッセイ、ハイブリダイゼーション・アッセイ、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択する、請求項２７に記載の診断方法。
【請求項２９】
体液中のｐ１８５ＨＥＲ−２のＥＣＤの量を測定する操作をさらに含む、請求項２７に記載の診断方法。
【請求項３０】
ガン患者の治療、予後予測、または診断を行なう方法であって、
（ａ）患者の血液、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択した体液サンプルを取得し、
（ｂ）配列同定アッセイにより、この体液サンプル中にＨＥＲ−２のイントロンが変異したＤＮＡ配列が存在しているかどうかを判定し、
（ｃ）歴史データベースを用いて、このＨＥＲ−２のイントロンが変異したＤＮＡ配列の存在またはその量を、ガンの治療および診断と関連づける操作を含む方法。
【請求項３１】
上記配列同定アッセイを、ＤＮＡシークエンシング、ＰＣＲアッセイ、ハイブリダイゼーション・アッセイ、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択する、請求項３０に記載の診断方法。
【請求項３２】
体液中のｐ１８５ＨＥＲ−２のＥＣＤの量を測定する操作をさらに含む、請求項３０に記載の診断方法。
【請求項３３】
ガン患者の治療、予後予測、または診断を行なう方法であって、
（ａ）患者の血液、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択した体液サンプルを取得し、
（ｂ）ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、免疫組織化学法、ウエスタンブロット解析法からなるグループの中から選択して抗ｐ６８ＨＥＲ−２抗体に基づくアッセイを行なうことにより、この体液サンプル中にｐ６８ＨＥＲ−２のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体が存在しているかどうかを判定し、
（ｃ）歴史データベースを用いて、このｐ６８ＨＥＲ−２のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体の存在またはその量を、ガンの治療および診断と関連づける操作を含む方法。
【請求項３４】
上記配列同定アッセイを、ＤＮＡシークエンシング、ＰＣＲアッセイ、ＥＬＩＳＡ免疫アッセイ、ハイブリダイゼーション・アッセイ、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択する、請求項３３に記載の診断方法。
【請求項３５】
体液中のｐ１８５ＨＥＲ−２のＥＣＤの量を測定する操作をさらに含む、請求項３３に記載の診断方法。
【請求項３６】
ｐ６８ＨＥＲ−２とｐ１８５ＨＥＲ−２のＥＣＤの量の比を測定する操作をさらに含む、請求項３５に記載の診断方法。
【請求項３７】
配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号１２、配列ＩＤ番号１３のいずれかで表わされる配列のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体に対して特異的な抗体。
【請求項３８】
ｐ６８ＨＥＲ−２のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体３に対して特異的な抗体。
【請求項３９】
（ａ）配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号１２、配列ＩＤ番号１３のいずれかで表わされる配列のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と；
（ｂ）ステップ（ａ）の抗体の結合を検出できる検出可能な標識とを含む診断キット。
【請求項４０】
上記標識を、酵素、放射性標識、発色団、化学発光タグ、蛍光発光体からなるグループの中から選択する、請求項３６に記載の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】
【０００１】本発明は、ＨＥＲ−２に結合するアンタゴニストを提供する。さらに詳細には、イントロンが保持されていることによってＨＥＲ−２受容体と結合するＨＥＲ−２の新奇なアンタゴニスト・ポリペプチドが生まれる。
【０００２】この仕事は、国防総省（ＤＯＤ）の乳ガン研究計画からの助成を受けた。アメリカ合衆国政府は、この発明に関して所定の権利を有する。
関連出願の相互参照
【０００３】本出願は、ＨＥＲ−２に結合するアンタゴニストという名称で１９９９年１月２０日に出願されたアメリカ合衆国特許出願シリアル番号第０９／２３４，２０８号の一部継続出願である。
【従来の技術】
【０００４】ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（ｅｒｂＢ−２）ガン遺伝子は、受容体様チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）をコードしている。このＲＴＫは、ヒトの何種類かのガン（ＨｙｎｅｓとＳｔｅｍ、Ｂｉｏｃｈｉｍ． ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ、１１９８巻、１６５〜１８４ページ、１９９４年；Ｄｏｕｇａｌｌ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第９巻、２１０９〜２１２３ページ、１９９４年）および哺乳類の発生（Ｌｅｅ他、Ｎａｔｕｒｅ、第３７８巻、３９４〜３９８ページ、１９９５年）においてある役割を果たしているというので精力的に研究されている。ＨＥＲ−２タンパク質の配列は、クローニングされたｃＤＮＡが、胎盤（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３０巻、１１３２〜１１３９ページ、１９８５年）および胃ガン細胞系（ヤマモト他、Ｎａｔｕｒｅ、第３１９巻、２３０〜２３４ページ、１９８６年）からの上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のｍＲＮＡと相同性を有することから決定された。ＨＥＲ−２のｍＲＮＡは、約４．５ｋｂであることがわかっており（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３０巻、１１３２〜１１３９ページ、１９８５年；ヤマモト他、Ｎａｔｕｒｅ、第３１９巻、２３０〜２３４ページ、１９８６年）、ヒトの正常組織および悪性組織において１８５ｋＤａの膜貫通糖タンパク質（ｐ１８５ＨＥＲ−２）をコードしている（ＨｙｎｅｓとＳｔｅｍ、Ｂｉｏｃｈｉｍ． ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ、１１９８巻、１６５〜１８４ページ、１９９４年；Ｄｏｕｇａｌｌ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第９巻、２１０９〜２１２３ページ、１９９４年）。ＨＥＲ−２遺伝子の機能は、主として、４．５ｋｂの転写産物に対応するｃＤＮＡをトランスフェクションした細胞内で発現させることによってと、１８５ｋＤａタンパク質産物の構造ならびに生化学的特性から調べられている。ｐ１８５ＨＥＲ−２は、大きな細胞外領域と、膜貫通領域と、チロシンキナーゼ活性を有する細胞内領域とからなる（ＨｙｎｅｓとＳｔｅｍ、Ｂｉｏｃｈｉｍ． ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ、１１９８巻、１６５〜１８４ページ、１９９４年；Ｄｏｕｇａｌｌ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第９巻、２１０９〜２１２３ページ、１９９４年）。ｐ１８５ＨＥＲ−２を過剰発現させると、培養した細胞の形質転換が起こる（ＤｉＦｉｏｒｅ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３７巻、１７８〜１８２ページ、１９８７年；Ｈｕｄｚｉａｋ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第８４巻、７１５９〜７１６３ページ、１９８７年）。また、ｐ１８５ＨＥＲ−２の過剰発現には、臨床上、乳ガンと卵巣ガンの急激な進行が伴う（Ｓｌａｍｏｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３５巻、１７７〜１８２ページ、１９８７年；Ｓｌａｍｏｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４４巻、７０７〜７１２ページ、１９８９年）。ｐ１８５ＨＥＲ−２は、ＥＧＦＲと相同性が極めて大きい。しかしｐ１８５ＨＥＲ−２に対して高アフィニティで直接結合するリガンドは、まだ同定されていない。しかも、ＨＥＲ−２のシグナル伝達活性は、ＥＧＦＲファミリーの他のリガンド結合メンバーとのヘテロダイマー化によるらしい（ＣａｒｒａｗａｙとＣａｎｔｌｅｙ、Ｃｅｌｌ、第７８巻、５〜８ページ、１９９４年；Ｅａｒ��他、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｔｒｅａｔ．、第３５巻、１１５〜１３２ページ、１９９５年；Ｑｉａｎ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第１０巻、２１１〜２１９ページ、１９９５年）。
【０００５】ＨＥＲファミリーのＲＴＫの細胞外領域いくつかの領域を含むさまざまなタンパク質は、完全長受容体のタンパク質分解処理によって（ＬｉｎとＣｌｉｎｔｏｎ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第６巻、６３９〜６４３ページ、１９９１年；Ｚａｂｒｅｃｋｙ他、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、第２６６巻、１７１６〜１７２０ページ、１９９１年；Ｐｕｐａ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第８巻、２９１７〜２９２３ページ、１９９３年；Ｖｅｃｃｈｉ他、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、第２７１巻、１８９８９〜１８９９５ページ、１９９６年；ＶｅｃｃｈｉとＣａｒｐｅｎｔｅｒ、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第１３９巻、９９５〜１００３ページ、１９９７年）、また選択的ＲＮＡ処理によって（Ｐｅｔｃｈ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第１０巻、２９７３〜２９８２ページ、１９９０年；Ｓｃｏｔｔ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第１３巻、２２４７〜２２５７ページ、１９９３年；ＬｅｅとＭａｉｈｌｅ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第１６巻、３２４３〜３２５２ページ、１９９８年）産生される。ｐ１８５ＨＥＲ−２の細胞外領域は、培養した乳ガン細胞のタンパク質分解によって与えられる（Ｐｅｔｃｈ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第１０巻、２９７３〜２９８２ページ、１９９０年；Ｓｃｏｔｔ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第１３巻、２２４７〜２２５７ページ、１９９３年；ＬｅｅとＭａｉｈｌｅ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第１６巻、３２４３〜３２５２ページ、１９９８年）。また、このｐ１８５ＨＥＲ−２の細胞外領域は、ある種のガン患者の血清中に見いだされるため（Ｌｅｉｔｚｅｌ他、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．、第１０巻、１４３６〜１４４３ページ、１９９２年）、乳ガンの転移の血清マーカーとして使えるであろう（Ｌｅｉｔｚｅｌ他、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．、第１０巻、１４３６〜１４４３ページ、１９９２年）。さらにこのｐ１８５ＨＥＲ−２の細胞外領域は、ＨＥＲ−２リッチな腫瘍を免疫系による監視から逃れさせている可能性もある（Ｂａｓｅｌｇａ他、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．、第１４巻、７３７〜７４４ページ、１９６６年；Ｂｒｏｄｏｗｉｃｚ他、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ、第７３巻、８７５〜８７９ページ、１９９７年）。
【０００６】ＨＥＲ−２の細胞外領域の断片は、イントロン内のポリアデニル化シグナルを利用して産生される新奇な２．３ｋｂの転写産物でもある（Ｓｃｏｔｔ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第１３巻、２２４７〜２２５７ページ、１９９３年）。この新たな転写産物は、胃ガン細胞系ＭＫＮ７において最初に同定され（ヤマモト他、Ｎａｔｕｒｅ、第３１９巻、２３０〜２３４ページ、１９８６年；Ｓｃｏｔｔ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第１３巻、２２４７〜２２５７ページ、１９９３年）、この受容体断片は、これらガン細胞から分泌されるのではなく、むしろ核周辺の細胞質に位置していた（Ｓｃｏｔｔ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第１３巻、２２４７〜２２５７ページ、１９９３年）。しかしこの細胞外領域ポリペプチド断片には特別な治療上、診断上、研究上の用途が見つかっていない。選択的スプライシングによって産生されるＥＧＦＲの細胞外領域断片（Ｐｅｔｃｈ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第１０巻、２９７３〜２９８２ページ、１９９０年）は、分泌されて、リガンドに結合する性質とダイマー化する性質を示し（Ｂａｓｕ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第９巻、６７１〜６７７ページ、１９８９年）、受容体の機能に対してドミナント・ネガティブな効果を及ぼす可能性がある（Ｂａｓｕ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第９巻、６７１〜６７７ページ、１９８９年；Ｆｌｉｃｋｉｎｇｅｒ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第１２巻、８８３〜８９３ページ、１９９２年）。
【０００７】したがって、従来から、細胞のＨＥＲ−２に結合する分子、中でもＨＥＲ−２に対するヒト化抗体（ハーセプチン（登録商標））が結合するのとは異なる部位に結合する分子を見つけることが必要とされている。そのような分子は、ＨＥＲ−２を過剰発現するさまざまなガンに対する治療薬として有効であろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】本発明は、配列ＩＤ番号１の配列から取られた約５０〜７９個のアミノ酸を含み、ＨＥＲ−２の細胞外領域ＥＣＤに少なくとも１０８のアフィニティで結合する単離ポリペプチドを提供する。この単離ポリペプチドは、長さがアミノ酸約６９〜７９個であることが好ましい。この単離ポリペプチドは、ＨＥＲ−２のＥＣＤ上の部位のうち、ハーセプチン（登録商標）（ＨＥＲ−２のＥＣＤと結合してガンの治療に用いられる、市販のヒト化モノクローナル抗体）の結合部位とは異なる部位に結合することが好ましい。
【０００９】本発明は、さらに、発現したときに、配列ＩＤ番号１の配列から取られた約５０〜７９個のアミノ酸を含み、ＨＥＲ−２の細胞外領域ＥＣＤに少なくとも１０８のアフィニティで結合するポリペプチドをコードしている単離ＤＮＡ配列を提供する。この単離ポリペプチドは、長さがアミノ酸約６９〜７９個であることが好ましい。この単離ポリペプチドは、ＨＥＲ−２のＥＣＤ上の部位のうち、ハーセプチン（登録商標）（ＨＥＲ−２のＥＣＤと結合してガンの治療に用いられる、市販のヒト化モノクローナル抗体）の結合部位とは異なる部位に結合することが好ましい。本発明は、さらに、発現したときに、配列ＩＤ番号１の配列から取られた約５０〜７９個のアミノ酸を含み、ＨＥＲ−２の細胞外領域ＥＣＤに少なくとも１０８のアフィニティで結合するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有する発現ベクターを含む、トランスフェクションされた細胞を提供する。
【００１０】本発明は、さらに、配列ＩＤ番号２の配列から取られた約８０〜４１９個のアミノ酸を含み、Ｃ末端の７９個のアミノ酸が存在し、少なくとも３つのＮ結合型グリコシル化部位が存在している、グリコシル化された単離ポリペプチドを提供する。この単離ポリペプチドは、長さがアミノ酸約３５０〜４１９個で、Ｎ結合型グリコシル化部位が４つ存在していることが好ましい。この単離ポリペプチドは、ＨＥＲ−２のＥＣＤ上の部位のうち、ハーセプチン（登録商標）（ＨＥＲ−２のＥＣＤと結合してガンの治療に用いられる、市販のヒト化モノクローナル抗体）の結合部位とは異なる部位に結合することが好ましい。
【００１１】本発明は、さらに、配列ＩＤ番号２の配列から取られた約８０〜４１９個のアミノ酸を含み、Ｃ末端の７９個のアミノ酸が存在し、少なくとも３つのＮ結合型グリコシル化部位が存在している、グリコシル化されたポリペプチドをコードする単離ＤＮＡ配列を提供する。この単離ポリペプチドは、長さがアミノ酸約３５０〜４１９個で、Ｎ結合型グリコシル化部位が４つ存在していることが好ましい。本発明は、さらに、配列ＩＤ番号２の配列から取られた約８０〜４１９個のアミノ酸を含み、Ｃ末端の７９個のアミノ酸が存在し、少なくとも３つのＮ結合型グリコシル化部位が存在している、グリコシル化されたポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有する発現ベクターを含む、トランスフェクションされた細胞を提供する。
【００１２】本発明は、ＨＥＲ−２の過剰発現を特徴とする固形ガンを治療するためにＨＥＲ−２の細胞外領域（ＥＣＤ）と結合する薬剤を投与する操作を含む方法であって、この薬剤を、（ａ）配列ＩＤ番号１の配列から取られた約５０〜７９個のアミノ酸を含み、ＨＥＲ−２の細胞外領域ＥＣＤに少なくとも１０８のアフィニティで結合する単離ポリペプチド、（ｂ）配列ＩＤ番号２の配列から取られた約８０〜４１９個のアミノ酸を含み、Ｃ末端の７９個のアミノ酸が存在し、少なくとも３つのＮ結合型グリコシル化部位が存在している、グリコシル化された単離ポリペプチド、（ｃ）ＨＥＲ−２のＥＣＤと結合するモノクローナル抗体、（ｄ）これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択するが、この薬剤がモノクローナル抗体のみからなることはありえないという方法を提供する。ＨＥＲ−２を過剰発現する固形ガンは、乳ガン、肺小細胞ガン、卵巣ガン、大腸ガンからなるグループの中から選択することが好ましい。上記薬剤は、配列ＩＤ番号１の配列から取られた約５０〜７９個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドであることが好ましい。さらに好ましいのは、この薬剤が、配列ＩＤ番号１の配列から取られた約５０〜７９個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドと、ＨＥＲ−２のＥＣＤと結合するモノクローナル抗体の組み合わせになっていることである。
【００１３】本発明は、さらに、ＨＥＲ−２を過剰発現するガンを治療するための薬理学的組成物であって、（ａ）配列ＩＤ番号１の配列から取られた約５０〜７９個のアミノ酸を含み、ＨＥＲ−２の細胞外領域（ＥＣＤ）に少なくとも１０８のアフィニティで結合する単離ポリペプチド、（ｂ）配列ＩＤ番号２の配列から取られた約８０〜４１９個のアミノ酸を含み、Ｃ末端の７９個のアミノ酸が存在し、少なくとも３つのＮ結合型グリコシル化部位が存在している、グリコシル化された単離ポリペプチド、（ｃ）ＨＥＲ−２のＥＣＤと結合するモノクローナル抗体、（ｄ）これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択した薬剤と、薬理学的に受容可能な基剤とを含むが、上記薬剤がモノクローナル抗体のみからなることはありえないという薬理学的組成物を提供する。上記薬剤は、配列ＩＤ番号１の配列から取られた約５０〜７９個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドであることが好ましい。さらに好ましいのは、この薬剤が、配列ＩＤ番号１の配列から取られた約５０〜７９個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドと、ＨＥＲ−２のＥＣＤと結合するモノクローナル抗体の組み合わせになっていることである。
【００１４】本発明は、さらに、ＨＥＲ−２の過剰発現を特徴とする固形ガン細胞に治療薬を到達させる方法であって、この治療薬を、配列ＩＤ番号１の配列から取られた約５０〜７９個のアミノ酸を含み、ＨＥＲ−２の細胞外領域ＥＣＤに少なくとも１０８のアフィニティで結合する単離ポリペプチドに付着させる操作を含む方法を提供する。この単離ポリペプチドは、長さがアミノ酸約６９〜７９個であることが好ましい。この単離ポリペプチドは、ＨＥＲ−２のＥＣＤ上の部位のうち、ハーセプチン（登録商標）（ＨＥＲ−２のＥＣＤと結合してガンの治療に用いられる、市販のヒト化モノクローナル抗体）の結合部位とは異なる部位に結合することが好ましい。
【００１５】本発明は、さらに、ＨＥＲ−２を過剰発現するガンの患者におけるガン治療の予後を予測する方法であって、（ａ）患者の血液、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択した体液サンプルを取得し、（ｂ）ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、免疫組織化学法、ウエスタンブロット解析法からなるグループの中から選択して抗ｐ６８ＨＥＲ−２抗体をベースとしたアッセイを行なうことにより、発現したｐ６８ＨＥＲ−２の量を測定する操作を含む方法を提供する。ガン治療の予後を予測するこの方法は、体液中のｐ１８５ＨＥＲ−２のＥＣＤの量を測定し、ｐ６８ＨＥＲ−２とｐ１８５ＨＥＲ−２の量の比を決定する操作をさらに含むことが好ましい。
【００１６】本発明は、さらに、ガン患者の治療、予後予測、または診断を行なう方法であって、（ａ）患者の血液、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択した体液サンプルを取得し、（ｂ）配列同定アッセイにより、この体液サンプル中に特定のＥＣＤ ＩＩＩａ変異配列が存在しているかどうかを判定し、（ｃ）歴史データベースを用いて、このＥＣＤ ＩＩＩａ変異配列の存在を、ガンの治療および診断と関連づける操作を含む方法を提供する。配列同定アッセイは、ＤＮＡシークエンシング、ＰＣＲアッセイ、ＥＬＩＳＡ免疫アッセイ、イムノアッセイ、ハイブリダイゼーション・アッセイ、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択することが好ましい。
【００１７】本発明は、さらに、ガン患者の治療、予後予測、または診断を行なう方法であって、（ａ）患者の血液、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択した体液サンプルを取得し、（ｂ）ＤＮＡシークエンシング、ＰＣＲアッセイ、ＥＬＩＳＡ免疫アッセイ、イムノアッセイ、ハイブリダイゼーション・アッセイ、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択して抗ｐ６８ＨＥＲ−２抗体をベースとしたアッセイを行なうことにより、この体液サンプル中にｐ６８ＨＥＲ−２のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体が存在しているかどうかを判定し、（ｃ）歴史データベースを用いて、このＥＣＤ ＩＩＩａ変異配列の存在またはその量を、ガンの治療および診断と関連づける操作を含む方法を提供する。
【００１８】本発明は、さらに、ガン患者の治療、予後予測、または診断を行なう上記の方法が、体液サンプル中のｐ１８５ＨＥＲ−２のＥＣＤの量を測定する操作をさらに含む方法を提供する。
【００１９】本発明は、さらに、ガン患者の治療、予後予測、または診断を行なう上記の方法が、体液サンプル中のｐ１８５ＨＥＲ−２のＥＣＤの量を測定し、ｐ１８５ＨＥＲ−２と特定のｐ６８ＨＥＲ−２のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体の量の比を決定する操作をさらに含む方法を提供する。
【００２０】本発明は、さらに、以下に示す配列ＩＤ番号１または配列ＩＤ番号２で表わされる配列のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体に対して特異的な抗体を提供する。
【発明の実施の形態】
【００２１】本発明は、イントロン８であると同定された２７４ｂｐの挿入体を有する、ＨＥＲ−２の新たな４．８ｋｂのｍＲＮＡが初めて発見されたことに基づいている。保持されているこのイントロンはイン・フレームであり、７９個のアミノ酸［配列ＩＤ番号１］をコードした後、ヌクレオチド配列２３６位に終止コドンを有する。この新たなｍＲＮＡからは、膜貫通領域と細胞内領域を欠いているＨＥＲ−２タンパク質断片が予測される。このタンパク質断片は、４１９個のアミノ酸［配列ＩＤ番号２］を含む。４１９個のアミノ酸は、ｐ１８５ＨＥＲ−２のＮ末端と一致する３４０個の残基と、Ｃ末端の新奇な７９個の残基［配列ＩＤ番号１］からなる。Ｃ末端の新奇な７９個のアミノ酸残基［配列ＩＤ番号１］に対して特異的な抗体、またはｐ１８５ＨＥＲ−２のＮ末端に対して特異的な抗体を用い、６８ｋＤａのタンパク質産物を同定した［配列ＩＤ番号２］。この６８ｋＤａのタンパク質は、新奇なＨＥＲ−２転写産物であり、細胞抽出物の中や、いくつかの細胞系からの細胞外マトリックスの中に見いだされる。この新奇な転写産物の発現は、非発ガン性のヒト胚性腎臓細胞系で最大であった。
【００２２】ここに提示した結果は、ＨＥＲ−２の新奇なｍＲＮＡの発現を示している。このｍＲＮＡは、２７４個多いヌクレオチドを含んでおり、それはおそらくイントロン８であろう。この知見に合致するように、約４．８ｋｂの新奇な転写産物が、ヒト胎児の腎臓組織とヒト胚性腎臓細胞系ＨＥＫ２９３で検出された。さらに、２．６ｋｂの転写産物が、挿入された配列に対して、すなわちＨＥＲ−２のＥＣＤに対して特異的なプローブを用いたノーザンブロット解析によりヒト胎児の肝臓組織で検出された（図２）。この２．６ｋｂというサイズは、挿入配列がＨＥＲ−２の２．３ｋｂのｍＲＮＡ断片（ヤマモト他、Ｎａｔｕｒｅ、第３１９巻、２３０〜２３４ページ、１９８６年；Ｓｃｏｔｔ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第１３巻、２２４７〜２２５７ページ、１９９３年）に含まれている場合に予想されるサイズである。挿入された配列には終止コドンが含まれているため、ｐ１８５ＨＥＲ−２タンパク質の３４０番目の残基の位置に、ＥＣＤ ＩＩＩａと表記する新奇な７９個のアミノ酸延長部が含まれることが予測される。したがってこの予測されるタンパク質は、ｐ１８５ＨＥＲ−２の膜貫通領域と細胞内領域を欠いているが、細胞外領域のサブドメインＩとＩＩを含んでいる。予想されるように、ｐ１８５ＨＥＲ−２のＮ末端配列と、新奇な配列を含むことで生まれるＣ末端延長部とを含む分泌タンパク質が検出された（図３と図５）。ＥＣＤ ＩＩＩａタンパク質は６８ｋＤａであることがわかった。これは、ｐ１８５ＨＥＲ−２のサブドメインＩとＩＩに見られる５つのＮ結合型グリコシル化部位がグリコシル化される場合に新奇な転写産物によってコードされるタンパク質として予想されるサイズとほぼ同じである（Ｓｔｅｒｎ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第６巻、１７２９〜１７４０ページ、１９８６年）。
【００２３】ここに提示したデータは、ｐ６８ＨＥＲ−２がｐ１８５ＨＥＲ−２に特異的に結合することを示している。ｐ１８５ＨＥＲ−２との会合は、ｐ６８ＨＥＲ−２のＮ末端のサブドメインＩとＩＩよりは、プロリン・リッチな新奇なＥＣＤ ＩＩＩａ領域によって生じている可能性がある。インビトロでの欠失突然変異誘発によって生まれるＨＥＲ−２のＥＣＤもサブドメインＩとＩＩを備えているが、より近接した状態にされるのでなければｐ１８５ＨＥＲ−２の細胞外領域とは会合しない（Ｔｚａｈａｒ他、ＥＭＢＯ Ｊ．、第１６巻、４９３８〜４９５０ページ、１９９７年；Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９４巻、３２５０〜３２５５ページ、１９９７年；Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ他、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第４３１巻、１０２〜１０６ページ、１９９８年）。しかし新奇なＥＣＤ ＩＩＩａペプチドは、ｐ１８５ＨＥＲ−２および、ｐ１８５ＨＥＲ−２を過剰発現する形質転換された１７−３−１細胞と高アフィニティ（ｎＭの濃度）で結合する（図５）。ＥＣＤ ＩＩＩａペプチドが１７−３−１細胞に好んで結合するというのは、分泌されたｐ６８ＨＥＲ−２がｐ１８５ＨＥＲ−２の細胞外領域と細胞表面で相互作用することを示している。したがって、ｐ６８ＨＥＲ−２とその断片は、ＨＥＲ−２遺伝子によってコードされる自然発生のＨＥＲ−２結合タンパク質であるように思われる。ＥＧＦＲファミリーのリガンド（Ｇｒｏｅｎｅｎ他、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、第１１巻、２３５〜２５７ページ、１９９４年）とは異なり、ｐ６８ＨＥＲ−２はＥＧＦ相同領域を欠いており、ｐ１８５ＨＥＲという受容体そのものの最初の３４０個のアミノ酸を含んでいる。
【００２４】以前に推定されたＨＥＲ−２のリガンドは、ＥＧＦＲファミリーのメンバーとヘテロダイマーの形態でのみｐ１８５ＨＥＲ−２と間接的に会合することがわかった（ＨｅｌｄｉｎとＯｓｔｍａｎ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．、第７巻、３３〜４０ページ、１９９６年）。ＥＣＤ ＩＩＩａは共通の受容体を通じてｐ１８５ＨＥＲ−２と間接的に結合することが可能であるが、表面活性剤で溶解させたｐ１８５ＨＥＲ−２は不動化されたＥＣＤ ＩＩＩａペプチドによって特異的かつ効果的に“引き落とす”ため、こんなことは起こりそうにない（図５Ｂ）。
【００２５】哺乳類のＥＧＦＲファミリーのメンバーに対する自然または人工のすべてのリガンドにとって、結合するというのは、受容体のダイマー化およびチロシンリン酸化を促進することと強く結びついている（ＨｙｎｅｓとＳｔｅｍ、Ｂｉｏｃｈｉｍ． ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ、１１９８巻、１６５〜１８４ページ、１９９４年；Ｄｏｕｇａｌｌ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第９巻、２１０９〜２１２３ページ、１９９４年；Ｇｒｏｅｎｅｎ他、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、第１１巻、２３５〜２５７ページ、１９９４年）。ｐ６８ＨＥＲ−２もＥＣＤ ＩＩＩａペプチドもｐ１８５ＨＥＲ−２と結合するにもかかわらず、ｐ１８５ＨＥＲ−２を活性化させないことがわかった。活性化は、ｐ１８５ＨＥＲ−２のチロシンリン酸化の程度が異なる２つの別々の細胞系、すなわち形質転換された１７−３−１細胞と、ＳＫＯＶ−３卵巣ガン細胞において評価した。さらに、ｐ１８５ＨＥＲ−２がダイマーの形態になることによって増加するインビトロでの自己リン酸化活性（Ｄｏｕｇａｌｌ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第９巻、２１０９〜２１２３ページ、１９９４年；Ｌｉｎ他、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第４９巻、２９０〜２９５ページ、１９９２年）は、ｐ６８ＨＥＲ−２とＥＣＤ ＩＩＩａにいずれによっても大きくならなかった。同様に、ショウジョウバエのＥＧＦ受容体の細胞外阻害剤であり、クラスＩのＲＴＫのアンタゴニストとして知られている唯一のものであるアルゴス・タンパク質は、この受容体のチロシンリン酸化を促進しなかった（Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、第３７６巻、６９９〜７０２ページ、１９９５年）。同様に、タイ２ＲＴＫの天然のアンタゴニストであるアンギオポエチン−２は、内皮受容体と結合したが、その受容体を活性化することはなかった（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７７巻、５５〜６０ページ、１９９７年）。
【００２６】理論に囚われないとすると、ｐ６８ＨＥＲ−２がｐ１８５ＨＥＲ−２と結合するがｐ１８５ＨＥＲ−２を活性化させないのであるから、ｐ６８ＨＥＲ−２がｐ１８５ＨＥＲ−２のダイマー化を阻止している可能性がある。類推により、ＲＴＫへの結合が促進されるようなＨＥＲ−２のＥＣＤを作ったところ、このＨＥＲ−２のＥＣＤは、リン酸基転移と受容体活性化に必要な生産性のあるダイマーの形成を阻止し、ドメイン・ネガティブな効果を示すことになった（Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９４巻、３２５０〜３２５５ページ、１９９７年）。可溶性ｐ６８ＨＥＲ−２は、ＨＥＲ−２のＥＣＤとは違ってｐ１８５ＨＥＲ−２への強い結合力を示したが、ＥＣＤのサブドメインＩとＩＩをやはり含んでいる。サブドメインＩは、ｐ１８５ＨＥＲ−２をヘテロマー複合体にするのに必要な、低アフィニティで何とでも結合するリガンド結合部位である可能性があるため（Ｔｚａｈａｒ他、ＥＭＢＯ Ｊ．、第１６巻、４９３８〜４９５０ページ、１９９７年）、ｐ６８ＨＥＲ−２がこの部位をブロックし、ｐ１８５ＨＥＲ−２がダイマーになるのを妨げている可能性がある。また、ｐ６８ＨＥＲ−２はｐ１８５ＨＥＲ−２に結合するためのまだ特性が同定されていないリガンドと競合する可能性もある。ヒト胎児の肝臓および腎臓においてｐ６８ＨＥＲ−２が組織特異的に発現することによって、これら器官の発達中にｐ１８５ＨＥＲ−２が占める程度が変わる可能性がある。しかも、ＨＥＲ−２遺伝子の増幅に伴ってガン細胞中でｐ６８ＨＥＲ−２よりもｐ１８５ＨＥＲ−２が過剰に発現するということ（図３）が、ｐ６８ＨＥＲ−２などの結合タンパク質の効果を上回るような選択的圧力によって起こる可能性がある。したがって、ｐ６８ＨＥＲ−２は、ｐ１８５ＨＥＲ−２の活性化を妨げる可能性のある天然のｐ１８５ＨＥＲ−２結合タンパク質の最初の例である。
薬理学的組成物
【００２７】本発明は、さらに、ＨＥＲ−２を過剰発現する固形ガンを治療するための薬理学的組成物であって、（ａ）配列ＩＤ番号１の配列から取られた約５０〜７９個のアミノ酸を含み、ＨＥＲ−２の細胞外領域（ＥＣＤ）に少なくとも１０８のアフィニティで結合する単離ポリペプチド、（ｂ）配列ＩＤ番号２の配列から取られた約３００〜４１９個のアミノ酸を含み、Ｃ末端の７９個のアミノ酸が存在し、少なくとも３つのＮ結合型グリコシル化部位が存在している、グリコシル化された単離ポリペプチド、（ｃ）ＨＥＲ−２のＥＣＤと結合するモノクローナル抗体、（ｄ）これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択した薬剤と、薬理学的に受容可能な基剤とを含むが、上記薬剤がモノクローナル抗体のみからなることはありえないという薬理学的組成物を提供する。上記薬剤は、配列ＩＤ番号１の配列から取られた約５０〜７９個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドであることが好ましい。さらに好ましいのは、この薬剤が、配列ＩＤ番号１の配列から取られた約５０〜７９個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドと、ＨＥＲ−２のＥＣＤと結合するモノクローナル抗体の組み合わせになっていることである。
【００２８】本発明のポリペプチドおよび／またはモノクローナル抗体の一方または両方を含む本発明の薬理学的組成物は、そのまま（複合体または組み合わせ）で、または、適切な基剤および添加剤と混合した薬理学的組成物として、患者に投与することができる。本発明のポリペプチドは、静脈内注射または点滴、腹腔内注射、皮下注射、筋肉内注射などの非経口的な方法で投与することができる。本発明のポリペプチドは、基剤と添加剤を加え、錠剤、ピル、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、分散液などの適切な製剤にして、経口的に、または直腸から投与することができる。本発明のポリペプチドは、皮膚パッチなどの方法で局所的に投与することにより、活性成分のレベルが全身で一定となるようにすることができる。本発明のポリペプチドは、局部に使用するクリーム、皮膚または粘膜のパッチ、皮膚または粘膜の表面に局所的に付与するのに適切な液体またはゲルにされる。本発明のポリペプチドは、ＨＥＲ−２の過剰発現を特徴とするガンの局所的治療または全身治療のため、吸入器を用いて気道に投与することができる。
【００２９】本発明で使用する本発明のポリペプチドの用量は、この明細書に記載されている内容から当業者が決定することができる。本発明のポリペプチドは、（投与経路と、活性成分の薬物動態に依存する）本発明のポリペプチドの効果的な用量と、製剤に応じた投与経路（すなわち経口、非経口、局所的、吸入など）に適した薬理学的基剤および添加剤を含むことになる。本発明の活性なポリペプチドは、混合、溶解、粒子化、糖衣形成、乳剤化、カプセル化、トラップ、凍結乾燥といった方法で混合して薬理学的製剤にする。非経口投与する薬理学的組成物は、水溶性にした本発明のポリペプチドの水溶液を含んでいる。さらに、本発明のポリペプチドの分散液は、油性注射分散液として調製することができる。適切な親油性溶媒または賦形剤としては、ゴマ油などの不揮発性油、オレイン酸エチルやトリグリセライドなどの合成脂肪酸エステル、リポソームなどが挙げられる。水溶性注射分散液は、この分散液の粘性を高める物質、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、デキストランなど含むことができる。分散液は、より濃縮された溶液にできるよう、複合体または組み合わせの溶解性を高めるための安定化剤や薬剤を含んでいてもよい。
【００３０】経口投与する薬理学的組成物は、活性成分を固体の添加剤と組み合わせることにより得られる。固体の添加剤としては、糖（例えばラクトース、ショ糖、マンニトール、ソルビトール）、セルロース調製物（例えばデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース）、ゼラチン、ガム、ポリビニルピロリドンが挙げられる。さらに、分解剤や安定化剤を添加することもできる。
ｐ６８とＣ末端領域の７９個のアミノ酸の合成方法
【００３１】ポリペプチドの合成は、ペプチド合成装置を、製造業者のペプチド合成指示書に従って使用することによりアミノ酸を順次つなげるという、多数ある標準的なポリペプチド合成法による。アミノ酸の数が１００未満の短いポリペプチドの場合には、アミノ酸を順次つなげるというポリペプチド合成法が最適である。さらに、異種ポリペプチドは、標準的な組み換えＤＮＡ技術を用いて形質転換した細胞で発現させることができる。すなわち、原核細胞または真核細胞のいずれかを形質転換し、発現に適した増殖培地を用意し、使用する細胞のタイプとその細胞の発現特性に応じてその培地または細胞内物質のいずれかから本発明のポリペプチドを精製する。
ｐ６８、Ｃ末端領域の７９個のアミノ酸、またはこれらの組み合わせを用いたガンの治療法
【００３２】本発明は、ＨＥＲ−２またはＨＥＲ−２変異体（実施例８を参照のこと）の過剰発現を特徴とする固形ガンを治療するためにＨＥＲ−２の細胞外領域（ＥＣＤ）と結合する薬剤を投与する操作を含む方法であって、この薬剤を、（ａ）配列ＩＤ番号１の配列から取られた約５０〜７９個のアミノ酸を含み、ＨＥＲ−２の細胞外領域（ＥＣＤ）に少なくとも１０８のアフィニティで結合する単離ポリペプチド、（ｂ）配列ＩＤ番号２の配列から取られた約３００〜４１９個のアミノ酸を含み、Ｃ末端の７９個のアミノ酸が存在し、少なくとも３つのＮ結合型グリコシル化部位が存在している、グリコシル化された単離ポリペプチド、（ｃ）ＨＥＲ−２のＥＣＤと結合するモノクローナル抗体、（ｄ）これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択するが、この薬剤がモノクローナル抗体のみからなることはありえないという方法を提供する。ＨＥＲ−２を過剰発現する固形ガンは、乳ガン、肺小細胞ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、胃ガン、子宮頚ガン、食道ガン、大腸ガンからなるグループの中から選択することが好ましい。上記薬剤は、配列ＩＤ番号１の配列から取られた約５０〜７９個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドであることが好ましい。より好ましいのは、上記薬剤が、配列ＩＤ番号１の配列から取られた約５０〜７９個のアミノ酸を含む単離ポリペプチドと、ＨＥＲ−２のＥＣＤと結合するモノクローナル抗体の組み合わせである。
【００３３】この明細書に記載したｐ６８ＨＥＲ−２ポリペプチドは、ＨＥＲ−２と結合し、キナーゼ領域を通じてシグナル伝達を妨げることが見いだされた。理論に囚われないとすると、新奇なＥＣＤ ＩＩＩａ領域はｐ１８５ＨＥＲ−２との特異的結合に関与し、その結果としてｐ６８ＥＣＤＩ ＩＩＩａと相互作用することでｐ１８５ＨＥＲ−２のダイマー化を阻止し、続いてシグナル伝達を阻止する。したがってｐ６８ＨＥＲ−２はＨＥＲ−２のアンタゴニストとして機能し、シグナル伝達に不可欠なダイマー化を阻止することでシグナル伝達を阻止する。つまり、ＨＥＲ−２のアンタゴニストとしてのｐ６８ＨＥＲ−２の機能は、この明細書に記載したアミノ酸７９個のポリペプチドや、ＨＥＲ−２のＥＣＤと結合するモノクローナル抗体などの結合剤の機能とは異なっている。本発明の方法では、ＨＥＲ−２を過剰に発現する腫瘍内で腫瘍細胞に対してｐ６８ＨＥＲ−２が選択的圧力を加えることによってこの腫瘍細胞の成長を抑制する。同様に、結合剤であるＨＥＲ−２のアンタゴニストも、ＨＥＲ−２を過剰に発現する腫瘍内で腫瘍細胞に対して選択的圧力を加えてリガンドがＨＥＲ−２のＥＣＤと結合することを阻止し、ダイマー化する可能性が生まれる前すでにシグナル伝達を阻止することにより、この腫瘍細胞の成長を抑制する。
Ｃ末端領域の７９個のアミノ酸の標的到達分子としての利用
【００３４】本発明は、さらに、ＨＥＲ−２の過剰発現を特徴とする固形ガン組織に治療薬を到達させる方法であって、この治療薬を、配列ＩＤ番号１の配列から取られた約５０〜７９個のアミノ酸を含み、ＨＥＲ−２の細胞外領域（ＥＣＤ）に少なくとも１０８のアフィニティで結合する単離ポリペプチドに付着させる操作を含む方法を提供する。この単離ポリペプチドは、長さがアミノ酸約６９〜７９個であることが好ましい。この単離ポリペプチドは、ＨＥＲ−２のＥＣＤ上の部位のうち、ハーセプチン（登録商標）（ＨＥＲ−２のＥＣＤと結合してガンの治療に用いられる、市販のヒト化モノクローナル抗体）の結合部位とは異なる部位に結合することが好ましい。アミノ酸７９個のこのポリペプチド［配列ＩＤ番号１］は、ＨＥＲ−２のＥＣＤに対して驚くほど高いアフィニティで結合する特性を示すことがわかった。さらに、そのような結合部位は、市販のヒト化モノクローナル抗体（ハーセプチン（登録商標））の結合部位とは異なっていて、このヒト化モノクローナル抗体の影響を受けない。したがって、この高い結合アフィニティにより、アミノ酸７９個のこのポリペプチドが、ＨＥＲ−２を発現する腫瘍細胞への標的到達分子として機能する。
診断／予後予測の薬剤としての抗ｐ６８抗体
【００３５】ｐ６８ＨＥＲ−２のグリコシル化されたＥＣＤ ＩＩＩａ変異体３ポリペプチド（後出の表Ｉを参照のこと）を発現させ、抗体産生用の抗原として使用した。中でも、ｐ６８ＨＥＲ−２に対して特異的な抗体を、ポリヒスチジン・タグを有する精製ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体３ペプチドをウサギに注射することによって調製した。このペプチドは、イントロンがコードしている新奇なＣ末端領域すなわちｐ６８ＨＥＲ−２と同じものであり、この領域が、高いアフィニティでｐ１８５ＨＥＲ−２に結合する。単離されたポリクローナル抗体により、ＥＣＤ ＩＩＩａペプチドまたはｐ６８ＨＥＲ−２のｐＭ量を高い特異性で検出した（図３と図５を参照のこと）。したがってｐ６８ＨＥＲ−２に対して特異的な抗体は、体液中および腫瘍組織中のｐ６８ＨＥＲ−２を、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、免疫組織化学法、ウエスタンブロット解析法などの診断技術を利用して検出するための診断用薬剤として有用である。
【００３６】ＥＣＤ ＩＩＩａの１つまたはそれ以上のエピトープ、すなわちｐ６８ＨＥＲ−２のエピトープ、またはペプチド断片を特異的に認識し、したがってＥＣＤ ＩＩＩａ変異体相互の違いを区別する抗体も、本発明に含まれる。そのような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生された抗体、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、これらのうちの任意のもののエピトープ結合断片が挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。本発明の抗体は、例えば、生物サンプル中のｐ６８ＨＥＲ−２の特定のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体を検出するのに使用でき、したがって、患者のサンプルまたは組織サンプルに特定の変異体が存在しているかどうかや、特定の変異体の量が異常であるかどうかを調べることで、診断または予後予測の方法の一部として利用できる。
【００３７】このような抗体は、テスト化合物が、特定のｐ６８ＨＥＲ−２変異体の発現および／または活性に対して及ぼす効果を評価するための化合物スクリーニング法と合わせて利用することもできる。さらに、このような抗体は、この明細書に記載したガン治療法と合わせて利用することができる。
【００３８】抗体産生のためには、例えばポリヒスチジン・タグを有するＥＣＤ ＩＩＩａ変異体ポリペプチド、ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体ポリペプチドの断片、ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体の機能的等価物、ＥＣＤ ＩＩＩａ領域の突然変異体を注射することによってさまざまな宿主動物に免疫を確立するとよい。このような宿主動物の具体例をほんの少しだけ挙げるならば、ウサギ、マウス、ハムスター、ラットであるが、これだけに限定されるわけではない。宿主の種が何であるかに応じ、さまざまなアジュバントを用いて免疫応答を高めることができる。アジュバントとしては、フロイント（完全、不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、リソレシチンなどの表面活性物質、ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシアニン、ジニトロフェノール、役に立つ可能性のあるヒトのアジュバント（ＢＣＧ（カルメット−ゲランの細菌）など）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）などが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【００３９】ポリクローナル抗体は、免疫確立した動物の血清に由来する異種混合の抗体群である。モノクローナル抗体は、特定の抗原に対する均一な抗体群であり、培養した継代細胞系によって抗体分子を産生させることのできる任意の方法で得られる。方法としては、ケーラーとミルシュタインのハイブリドーマ法（Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻、４９５〜４９７ページ、１９７５年；アメリカ合衆国特許第４，３７６，１１０号）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｓｂｏｒ他、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、第４巻、７２ページ、１９８３年；Ｃｏｌｅ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第８０巻、２０２６〜２０３０ページ、１９８３年）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ他、『モノクローナル抗体とガン治療』、アラン Ｒ． リス社、７７〜９６ページ、１９８５年）が挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤというクラスのうちのどの免疫グロブリンでもよく、そのどのサブクラスでもよい。ハイブリドーマ産生ｍＡｂは、インビトロでもインビボでも培養することができる。インビボで大きな力価のｍＡｂを産生させるというのが、現在のところ最も好ましい産生方法である。
【００４０】さらに、“キメラ抗体”を産生させるために開発された方法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第８１巻、６８５１〜６８５５ページ、１９８４年；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、第３１２巻、６０４〜６０８ページ、１９８４年；タケダ他、Ｎａｔｕｒｅ、第３１４巻、４５２〜４５４ページ、１９８４年）、すなわち、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子と、適切な生物活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子をスプライスするという方法を利用することができる。キメラ抗体は、さまざまな部分がそれぞれ異なる動物種に由来する構成の分子であり、例えば、ネズミのｍＡｂに由来する可変領域と、ヒト免疫グロブリンの定常領域とを有する抗体（ヒト化抗体）がそうである。
【００４１】また、一本鎖抗体の産生方法（アメリカ合衆国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４２巻、４２３〜４２６ページ、１９８８年；Ｈｕｓｔｏｎ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第８５巻、５８７９〜５８８３ページ、１９８８年；Ｗａｒｄ他、Ｎａｔｕｒｅ、第３３４巻、５４４〜５４６ページ、１９８９年）を改変してＥＣＤ ＩＩＩａ変異遺伝子産物に対する一本鎖抗体を産生させることもできる。一本鎖抗体は、Ｆｖ領域のＨ鎖とＬ鎖の断片をアミノ酸架橋を通じて結合させることによって形成されて一本鎖のポリペプチドになる。
【００４２】特定のエピトープを認識する抗体断片は、公知の方法で産生させることができる。例えば、そのような断片としては、抗体分子をペプシンで消化させて得られるＦ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２断片、Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２断片のジスルフィド結合を還元することにより得られるＦａｂ断片が挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。また、Ｆａｂ発現ライブラリー（Ｈｕｓｅ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４６巻、１２７５〜１２８１ページ、１９８９年）を構成して、望む特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片を迅速かつ容易に同定することもできる。
【００４３】特定のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体に対する抗体は、さらに、当業者に周知の方法を用いて、ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体を“真似る”抗イディオタイプ抗体を産生させるのに用いることができる（ＧｒｅｅｎｓｐａｎとＢｏｎａ、ＦＡＳＥＢ Ｊ、第７巻（５）、４３７〜４４４ページ、１９９３年；Ｎｉｓｓｉｎｏｆｆ、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１４７巻、２４２９〜２４３８ページ、１９９１年）。例えばＥＣＤ ＩＩＩａ変異体に結合し、ｐ６８ＨＥＲ−２がＨＥＲ−２受容体に結合するのを競合的に抑制する抗体を用いると、ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体を“真似し”、したがってＨＥＲ−２受容体に結合してこのＨＥＲ−２受容体を中性化する抗イディオタイプ抗体を産生させることができる。このような中性化抗イディオタイプ、またはこのような抗イディオタイプのＦａｂ断片は、ガン治療の投薬計画において利用することができる。
【００４４】また、特定のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体に対する抗体で、ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体の活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用しうる抗体を産生させることができる。このような抗体は、ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体と結合し、ｐ１８５ＨＥＲ−２受容体を介したシグナル伝達に対するｐ６８ＨＥＲ−２の活性を変化させる。このような抗体は、特定のガンの治療および／または腫瘍の分化の調節に特に役立つ可能性がある。したがって、本発明は、さらに、ＨＥＲ−２を過剰発現するガンの治療の予後を予測する方法であって、（ａ）血液、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択した体液サンプルを取得し、（ｂ）ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、免疫組織化学法、ウエスタンブロット解析法からなるグループの中から選択して抗ｐ６８ＨＥＲ−２抗体をベースとしたアッセイを行なうことにより、発現したｐ６８ＨＥＲ−２の量を測定する操作を含む方法を提供する。ガン治療の予後を予測するこの方法は、体液中のｐ１８５ＨＥＲ−２のＥＣＤの量を測定し、ｐ６８ＨＥＲ−２とｐ１８５ＨＥＲ−２の量の比を決定する操作をさらに含むことが好ましい。ｐ１８５ＨＥＲ−２に対するｐ６８ＨＥＲ−２の比の値が大きいほど患者の予後が優れている。
診断／予後予測の薬剤としてのＥＣＤ ＩＩＩａ領域変異体
【００４５】実施例１１（後出）は、ヒトのイントロン８の配列が、プロリン・リッチかつ多型であることを示している。別々の１５人から採取したゲノムＤＮＡをシークエンシングした結果、ＨＥＲ−２のイントロン８に可変配列領域が１０箇所あることが同定された。図８の配列ＩＤ番号１０と表Ｉを参照のこと。図８は、イントロン８の最も一般的なヌクレオチド配列とそれに対応するポリペプチド配列を示している。この領域は、１０通りの多型（配列ＩＤ番号１０の中には文字Ｗ（２箇所）、Ｙ（３箇所）、Ｒ、Ｎ、Ｍ、Ｓ（２箇所）で示し、図８には“Ｘ”で示してある）を含んでおり、その結果として保存されないアミノ酸置換が起こっている（表Ｉの注を参照のこと）。例えば、ヌクレオチド配列の１６１位に多型（Ｇ→Ｃ）があると（図８；表Ｉ）、配列ＩＤ番号１のアミノ酸残基＃５４の位置、または配列ＩＤ番号２の残基＃３９４の位置でアルギニン（Ｒ）がプロリン（Ｐ）に代わるはずである。図８または配列ＩＤ番号１０の１位で示されるＮ末端のグリシン（Ｇ）は、“ハースタチン”配列のアミノ酸残基３４１に対応する（Ｄｏｈｅｒｔｙ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９６巻、１０，８６９〜１０，８７４ページ、１９９９年）。図１（Ａ）に示したヌクレオチド配列（Ｄｏｈｅｒｔｙ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９６巻、１０，８６９〜１０，８７４ページ、１９９９年）は、図８に示した最も一般的であることがわかった配列と比べてアミノ酸残基＃６と＃７３の位置のアミノ酸が異なる多型になっている。
【００４６】この結果は、ヒトの集団において、イントロン８がコードされている領域にいくつかのバリエーションが存在していて、ＥＣＤ ＩＩＩａを含むタンパク質変異体相互の間で生化学的特性や生物学的特性が異なる可能性のあることを示している。ヒトは遺伝的に、特に、２つの変異体に関してヘテロ接合になっているか、所定の１つの変異体に関してホモ接合になっているか、１つの二重変異体に関してホモ接合になっているかの可能性がある。腫瘍の進行にせよ最適の治療にせよ、ある一人の人に現われる変異体が何であるかによって異なる可能性がある。
【００４７】この違いは、予後予測と診断のどちらにも役立つ。本発明は、ＥＣＤ ＩＩＩａを含むポリペプチドがＨＥＲ−２受容体に強固に結合でき、したがってこのＨＥＲ−２受容体をアンタゴニスト化できることを示している。このような高アフィニティで特異的な相互作用は、ＥＣＤ ＩＩＩａを含むポリペプチドの特殊な一次構造、二次構造、三次構造に依存する。ＥＣＤ ＩＩＩａ領域はプロリン・リッチであり、従来からよく知られていることとして、所定のタンパク質のプロリン・リッチ配列中にあるプロリン残基またはそれ以外の残基の保存されない置換は、このタンパク質の二次構造と三次構造に大きな影響を及ぼしうるということがある。したがって、本発明の多型は、（図８に示した）最も一般的な構造と比べて構造特性、生化学的特性、生物学的特性が大きく異なっているであろう。ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体タンパク質相互の間の構造上の違いとしては、例えば、サイズ、電気陰性度、抗原性の違いが挙げられる。ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体相互の間の生物学的特性の違いは、例えば、細胞分泌の程度、ＨＥＲ−２受容体の変化の性質および／または程度、薬物動態（例えば血清半減期、排出特性）、タンパク質分解に対する抵抗力、Ｎ結合型グリコシル化のパターンなどに見られるであろう。これら生物学的性質の違いが今度は腫瘍の進行を変化させることが予想され、したがって最適な治療のプロトコルを変化させることが予想される。そこで、ある人が特定の１つまたは複数のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体を有することがわかっていると（例えば所定の１つの変異体に関してヘテロ接合である人、または表Ｉの変異体１１のように化合物変異体を有する人など）、そのことだけで、特定のガンになりやすさの予測ができる可能性がある。
【００４８】ＥＣＤ ＩＩＩａ領域の遺伝的違いが明らかになるということは、ある人が有する特定のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体の性質を、その人の遺伝子診断を試みる前に配列同定アッセイによって確認できるはずであることを意味する。解析は、患者の体液に由来する任意のゲノムＤＮＡについて行なうことができる。体液は、一般には大人または子どもの血液サンプルであるが、その代わりとして、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織が可能である。ハイブリダイゼーションや増幅アッセイなどの標準的な遺伝子診断法を利用できると考えられる。特定のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体配列を検出するのに、生物サンプルのハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにおいて、ＤＮＡとＲＮＡのいずれかを用いることができる。このような配列同定アッセイとしては、サザンブロット解析法、ノーザンブロット解析法、一本鎖構造多形性分析、インサイチュ・ハイブリダイゼーション・アッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応（“ＰＣＲ”）解析法などが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。このような解析法により、ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体配列の発現の定量的側面と定性的側面の両方を明らかにできよう。こうした側面としては、例えば、点突然変異および／または遺伝子発現の活性化または不活化が挙げられる。標準的なインサイチュ・ハイブリダイゼーション法を利用すると、所定の組織内でどの細胞が特定のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体配列を発現しているかに関する情報が得られる可能性がある。
【００４９】ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体の核酸分子を検出する診断法は、解析する細胞種または組織に由来する核酸を、特定のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体に対して特異的な、標識された１つまたはそれ以上の核酸試薬すなわちプローブと接触させて培養する操作を含んでいる。さらに好ましいのは、ＰＣＲまたは逆転写ＰＣＲを利用してＥＣＤ ＩＩＩａ領域内の核酸の違いを同定することである。ＰＣＲ反応の条件は、増幅された産物の収量と特異性が最適であり、さらに、標準的なゲル電気泳動法を利用して解析できる長さを有する増幅産物が生成するように選択せねばならない。このような反応条件は当業者には周知であり、重要な反応パラメータとしては、例えば、オリゴヌクレオチド・プライマーの長さとヌクレオチド配列、アニーリングして伸長させるステップの温度、反応時間が挙げられる。ＰＣＲ反応の後、ＰＣＲ産物は、ヘテロ二本鎖検出、ＲＮＡアーゼＡを利用したＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの開裂、一本鎖構造多型、変性用勾配ゲル電気泳動などの方法で解析することができる。
【００５０】さらに、特定のＥＣＤ ＩＩＩａ配列変異体が制限部位を付加したり除去したりするとか、特定の制限断片のサイズを有意に変化させてしまっていることが知られている場合には、制限断片長多型（“ＲＦＬＰ”）解析に基づいたプロトコルが適切である可能性がある。
【００５１】ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体は、患者由来の体液に対して配列同定アッセイを行なうことにより、発現レベルで解析することもできる。体液は、一般には大人または子どもの血液サンプルであるが、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織などでもよい。発現を解析するためのよく知られている配列同定アッセイとしては、ｍＲＮＡをベースとした方法、例えばノーザンブロット法、（関係するｃＤＮＡに由来する核酸プローブを利用した）インサイチュ・ハイブリダイゼーション法、（Ｓｔ−Ｊａｃｑｕｅｓ他、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、第１３４巻、２６４５〜２６５７ページ、１９９４年に記載されている）定量的ＰＣＲ法が挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【００５２】興味の対象であるＥＣＤ ＩＩＩａ変異体に対して特異的な抗体を利用することを含む、ポリペプチドをベースとした方法（例えばウエスタンブロット解析があるが、これだけに限定されるわけではない）も、上に説明したように、利用することができよう。これらの方法により、所定のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体の発現量を少なくとも正と負の制御に関して定量することができる。さまざまなＥＣＤ ＩＩＩａのエピトープまたは変異体に対して特異的な種々のモノクローナル抗体を利用して、特定のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体を発現している細胞サンプルまたは組織サンプルを迅速にスクリーニングすること、またはＥＣＤ ＩＩＩａ変異体ポリペプチドのレベルを定量することができると好ましい。ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体ペプチド分子を定量的または定性的に検出するための好ましい診断法としては、例えば、特定のＥＣＤ ＩＩＩａを含むペプチドが、抗ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体に対して特異的な抗体との相互作用によって検出されるというイムノアッセイが挙げられる。これは、例えば、蛍光標識した抗体を用いる蛍光抗体法を、軽いミクロのフローサイトメトリー検出または蛍光定量検出と組み合わせることによって実現できる。本発明で有用な抗体（またはその断片）は、さらに、蛍光抗体法または免疫電子顕微鏡法などにおけるように組織構造を知るのに利用して、ＥＣＤ ＩＩＩａを含むペプチドを元々ある場所で検出することもできる。このような方法を利用すると、特定のＥＣＤ ＩＩＩａを含むポリペプチドの存在だけでなく、検査している組織内のその分布を検出することができる。
【００５３】ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体ポリペプチドのイムノアッセイには、ＥＣＤ ＩＩＩａを含むペプチドの同定が可能な検出可能標識をした抗体の存在下で培養した生物サンプル（例えば具体例を列挙した上記の体液）を培養し、結合した抗体を従来技術で周知の多数ある方法のうちの任意の方法で検出する操作が含まれていることが好ましい。生物サンプルは、ニトロセルロースなどの固相支持体または担体や、可溶性タンパク質、細胞、細胞粒子を固定することのできる他の固相支持体と接触させて、その上に固定するとよい。固相支持体は、抗ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体に特異的な検出可能標識抗体で処理した後、適切な緩衝溶液で洗浄する。次に、緩衝溶液を用いて固相支持体の２回目の洗浄を行ない、結合していない抗体を除去する。続いて、固相支持体上に結合している標識の量を従来法で検出する。
【００５４】別の方法として、抗ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体に対して特異的な抗体は、酵素イムノアッセイすなわち固相酵素免疫検定法（“ＥＬＩＳＡ”）で使用する酵素に結合させることによって、検出可能な標識をすることができる。抗体と結合する酵素が適切な基板、好ましくは発光性基板と反応して化学基が生成されるため、それを例えば分光光度計、蛍光測定手段、目視などによって検出することができる。抗体に対する検出可能な標識として使用可能な酵素としては、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカル・ヌクレアーゼ、Δ−５−ステロイド・イソメラーゼ、酵母のアルコール・デヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコース・オキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【００５５】検出は、酵素に対する発光性基板を用いる熱量測定法により実現することができる。検出は、目視により酵素反応の程度を適切な基準と比較することによって行なうこともできる。検出は、多彩な他のイムノアッセイ法のうちの任意の方法を用いて実現することもできる。例えば、抗体または抗体断片に放射性標識することにより、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）を利用してＥＣＤ ＩＩＩａを含むペプチドを検出することが可能である。放射性同位体は、γ線カウンター、シンチレーション・カウンターなどの手段により、あるいは放射能写真撮影により検出することができる。
【００５６】抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光標識した抗体を適切な波長の光に曝露すると、蛍光のためにその抗体の存在が検出できる。最もよく使われる蛍光標識化合物としては、フルオレセイン・イソチオシアナート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレスカミンがある。
【００５７】抗体に対しては、１５２Ｅｕや他のランタノイド系列の蛍光発光金属を用いて検出可能な標識をすることもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート化剤を用いて抗体に付着させることができる。
【００５８】抗体は、化学発光化合物と結合させることによって検出可能な標識をすることもできる。化学発光体をタグとして有する抗体の存在は、化学反応中に発生する蛍光の存在を検出することによって明らかにされる。特に有用な標識用の化学発光化合物の具体例としては、ルミノール、イソルミノール、サーマティックな（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウム・エステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステルがある。同様に、生物発光化合物を用いて本発明の抗体に標識することもできる。生物発光は、生物系で見つかった化学発光の一種であり、生体内で触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増大させている。生物発光タンパク質の存在は、蛍光の存在を検出することによって明らかにされる。標識の目的で重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、エクオリンである。
【００５９】抗ＥＣＤ ＩＩＩａ変異体に対して特異的な所定のロットの抗体の結合活性は、周知の方法で測定することができる。当業者であれば、定法を利用することによりそれぞれの測定におけるアッセイの操作条件や最適条件を決定できるはずである。
【００６０】したがって、本発明は、プロリン・リッチなＥＣＤ ＩＩＩａ領域内に複数の可変配列位置が予想外に発見されたこと、また特定のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体に対して特異的な抗体が予想外に発見されたことで、予後予測および診断に関する重要な情報とアッセイを提供する。
【００６１】したがって、本発明は、さらに、ＨＥＲ−２を過剰に発現しているガン患者のガン治療の予後を予測する方法であって、（ａ）患者の血液、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択したから体液サンプルを取得し、（ｂ）ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、免疫組織化学法、ウエスタンブロット解析法からなるグループの中から選択して抗ｐ６８ＨＥＲ−２抗体をベースとしたアッセイを行なうことにより、発現したｐ６８ＨＥＲ−２の量を測定する操作を含む方法を提供する。ガン治療の予後を予測するこの方法は、体液中のｐ１８５ＨＥＲ−２のＥＣＤの量を測定し、ｐ６８ＨＥＲ−２とｐ１８５ＨＥＲ−２の量の比を決定する操作をさらに含むことが好ましい。ｐ１８５ＨＥＲ−２に対するｐ６８ＨＥＲ−２の比の値が大きいほど患者の予後が優れている。ガン治療の予後を予測するこの方法は、特定のどのＥＣＤ ＩＩＩａ変異体が存在しているかを明らかにし、さまざまなＥＣＤ ＩＩＩａタンパク質変異体の個々の生化学的特性と生物学的特性を考慮してガンの治療を最適化する操作をさらに含むことが好ましい。
【００６２】本発明は、さらに、ガン患者のガンの治療、予後予測、または診断を行なう方法であって、（ａ）患者の血液、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択したから体液サンプルを取得し、（ｂ）配列同定アッセイにより、この体液サンプル中に特定のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体配列が存在しているかどうかを判定し、（ｃ）歴史データベースを用いて、このＥＣＤ ＩＩＩａ変異体配列の存在をガンの治療および診断と関連づける操作を含む方法を提供する。上記の配列同定アッセイは、ＤＮＡシークエンシング、ＰＣＲアッセイ、ＥＬＩＳＡ免疫アッセイ、イムノアッセイ、ハイブリダイゼーション・アッセイ、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択することが好ましい。
【００６３】本発明は、さらに、患者のガンの治療、予後予測、または診断を行なう方法であって、（ａ）患者の血液、血清、尿、リンパ液、唾液、腫瘍組織、胎盤組織、臍帯組織、羊水、絨毛膜絨毛組織、これらの組み合わせ、からなるグループの中から選択したから体液サンプルを取得し、（ｂ）ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、免疫組織化学法、ウエスタンブロット解析法からなるグループの中から選択した、抗ｐ６８ＨＥＲ−２抗体に基づくアッセイにより、この体液サンプル中にｐ６８ＨＥＲ−２のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体が存在しているかどうかを判定し、（ｃ）歴史データベースを用いて、このｐ６８ＨＥＲ−２のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体の存在またはその量をガンの治療および診断と関連づける操作を含む方法を提供する。
【００６４】本発明は、さらに、ガンの治療、予後予測、または診断を行なう上記の方法が、体液サンプル中のｐ１８５ＨＥＲ−２のＥＣＤの量を測定する操作をさらに含む方法を提供する。
【００６５】本発明は、さらに、ガンの治療、予後予測、または診断を行なう上記の方法が、体液中のｐ１８５ＨＥＲ−２のＥＣＤの量を測定し、ｐ１８５ＨＥＲ−２のＥＣＤと特定のｐ６８ＨＥＲ−２のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体の量の比を測定する操作をさらに含む方法を提供する。
【００６６】本発明は、さらに、後に示す配列ＩＤ番号１または配列ＩＤ番号２の配列のＥＣＤ ＩＩＩａ変異体に対して特異的な抗体を提供する。
治療薬としてのｐ６８ＨＥＲ−２
【００６７】理論に囚われないとすると、ｐ６８ＨＥＲ−２またはＥＣＤ ＩＩＩａペプチドが、細胞表面でｐ１８５ＨＥＲ−２に結合することにより、ＨＥＲ−２を過剰に発現している腫瘍細胞の成長を抑制しているように思われる。この仮説の検証を、ｐ６８ＨＥＲ−２の存在下および不在下で基質とは独立な細胞の成長をテストすることにより行なった。そのとき用いた細胞は、ｐ１８５ＨＥＲ−２の過剰発現の程度に応じて悪性腫瘍が成長するが、ｐ６８ＨＥＲ−２はほとんど存在しないか検出できない細胞である。腫瘍の細胞毒性を予測するモデルとして、柔らかい寒天における、基質とは独立な細胞の成長を用いた。これは、形質転換活性を調べるための一般的な予測方法であり、細胞が腫瘍またはガンを発生させる能力を反映している（ＤｉＦｉｏｒｅ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３７巻、１７８〜１８２ページ、１９８７年；Ｈｕｄｚｉａｋ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第８４巻、７１５９〜７１６３ページ、１９８７年；Ｂａａｓｎｅｒ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第１３巻、９０１〜９１１ページ、１９９６年）。
【００６８】柔らかい寒天における、基質とは独立な細胞の成長にｐ６８ＨＥＲ−２が及ぼす効果を、ＳＫＯＶ−３ガン細胞と、ＨＥＲ−２をトランスフェクションした１７−３−１細胞を用いて測定した。両方の細胞とも腫瘍生成能力があり、ｐ１８５ＨＥＲ−２を過剰発現している。これら細胞を、ｐ６８ＨＥＲ−２の存在下および不在下でウシ胎仔血清を補充した培地に分散させ、湿潤な培養器の中で２１日間培養した。５０個を超える細胞を含むコロニーの数を数えることにより、基質とは独立な細胞の成長を定量化した。図７は、ｐ６８ＨＥＲ−２の存在下で、ＳＫＯＶ−３細胞と１７−３−１細胞の両方に関し、基質とは独立な成長が数分の一に抑制されたことを示している。したがって、これらのデータは、ｐ６８ＨＥＲ−２が単に細胞毒性だけを有するのではなく、細胞毒性に加え、おそらくアポトーシス誘導性も有することを示している。
【実施例１】
【００６９】この実施例では、細胞外領域（ＥＣＤ）をコードしている配列中のＨＥＲ−２のｍＲＮＡの多様性を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用して調べた実験の結果を示す。ＨＥＲ−２遺伝子が８倍に増幅されている卵巣ガン細胞系（Ｔｙｓｏｎ他、Ａｍ． Ｊ． Ｏｂｓｔｅｔ． Ｇｙｎｅｃｏｌ．、第１６５巻、６４０〜６４６ページ、１９９１年）である、（アメリカ基準培養株コレクション（ロックヴィル、メリーランド州）が、１０％のウシ胎仔血清と０．０５％のゲンタマイシンを補充したＤＭＥＭ中に維持している）ＳＫＯＶ−３細胞からのｃＤＮＡライブラリーを、エキソン１（Ｔａｌ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第７巻、２５９７〜２６０１ページ、１９８７年）に対して特異的でヌクレオチド１４２〜１６１と一致する順プライマーと、エキソン９（Ｓｃｏｔｔ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第１３巻、２２４７〜２２５７ページ、１９９３年）のヌクレオチド１２６５〜１２８６に相補的な逆プライマーとを用いて調べた。要するに、ＳＫＯＶ−３のｃＤＮＡライブラリーは、オリジーン・テクノロジーズ社（ロックヴィル、メリーランド州）から提供してもらうか、ＳＫＯＶ−３細胞から抽出したＲＮＡから調製するかした。トリリージェント（モレキュラー・リサーチ・センター社、シンシナチ、オハイオ州）を製造業者のプロトコルに従って用いることで１５ｃｍのプレート上に８０％の集密度で成長したＳＫＯＶ−３細胞からＲＮＡを抽出し、全ＲＮＡを得た。ＲＮＡは、逆転写およびｃＤＮＡライブラリー構成のために１０ｍＭのトリスＥＤＴＡ、ｐＨ８．０に再び分散させるか、リボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）のためにＲＮＡハイブリダイゼーション用緩衝溶液（８０％のホルムアルデヒド、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ、４ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に再び分散させるかした。ＲＮＡの濃度は、分光光度計でＯＤ２６０における値を測定した。ｍＲＮＡ抽出キット（オリゴテックス、キアジェン社）を用いてポリＡ＋ｍＲＮＡを全ＲＮＡから選択した。
【００７０】サザンブロット法によってＨＥＲ−２に特異的であることがわかった約１４２０ｂｐの産物は、以前に報告されたｃＤＮＡ配列（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３０巻、１１３２〜１１３９ページ、１９８５年）から予想される１１４４ｂｐというサイズよりも約２７０ｂｐ大きかった。要するに、サザンブロット法によって真空下において０．４ＭのＮａＯＨ中のアガロース・ゲル（バイオ−ラド・モデル７８５ヴァキューム・ブロッター）から核酸を遺伝子スクリーン・プラス・ハイブリダイゼーション・トランスファー膜（ネン・リサーチ・プロダクツ社、ボストン、マサチューセッツ州）に移した。ＵＶ−ストラターリンカー（ストラタジーン社、ラ・ジョラ、カリフォルニア州）の中でＵＶ架橋させることにより核酸を膜に固定し、その膜をハイブリダイゼーション用緩衝溶液（５０％のホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ、１０ｍｇ／ｍｌのニシンの精子ＤＮＡ）中で４２℃にて２時間にわたってブロックした。ランダム・プライムＤＮＡ標識キット（ベーリンガー・マンハイム社）を用い、膜を、（α−３２Ｐ）ｄＣＴＰ（ネン・ライフ・サイエンシーズ社）で標識したＥＣＤ ＩＩＩａのｃＤＮＡからの２２０ｂｐのＫｐｎ−ＨｉｎｃＩＩ断片１０７ｃｐｍとともに、ハイブリダイゼーション用緩衝溶液中で４２℃にて１６時間にわたってハイブリダイズさせた。
【００７１】鋳型を、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５μｇの各プライマー、２００μＭのｄＮＴＰを含む１×ハイ・フィデリティＰＣＲ緩衝溶液とともに、拡張ハイ・フィデリティＰＣＲシステム（ベーリンガー・マンハイム社）を用いてパーキン・エルマー遺伝子増幅ＰＣＲシステム２４００（パーキン・エルマー・シータス社、エメリーヴィル、カリフォルニア州）の中で増幅した。すべてのプライマーは、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社（ライフ・テクノロジーズ社）から得られた。ヌクレオチド残基とアミノ酸残基の番号は、Ｃｏｕｓｓｅｎｓ他が報告しているＨＥＲ−２のｃＤＮＡ配列（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３０巻、１１３２〜１１３９ページ、１９８５年）に従っている。ＨＥＲ−２の細胞外領域を標的とし、順プライマー（Ａ）（５’−ＴＧＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣ−３’［配列ＩＤ番号３］）と、逆プライマー（Ｂ）（５’−ＴＣＣＧＧＣＡＧＡＡＡＴＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣ−３’［配列ＩＤ番号４］）を用いてＳＫＯＶ−３のｃＤＮＡライブラリー（オリジーン・テクノロジーズ社）から増幅した。順プライマーは、ＨＥＲ−２のｃＤＮＡのヌクレオチド（ｎｔ）１４２〜１６１と一致していて開始コドン（下線部）の周囲に広がっており、逆プライマーは、ＨＥＲ−２のエキソン配列のｎｔ１２６５〜１２８６と相補的になっている。サイクリング・パラメータは、９４℃で３０秒間；５８℃で４５秒間；６８℃で３分間を３０サイクルである。ゲノムＤＮＡからの（ＥＣＤ ＩＩＩａと表記する）新奇な配列の周囲に広がっている領域は、（Ｂｏｎｄ他、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第３６７巻、６１〜６６ページ、１９９５年）が記載しているようにして調製したＤＮＡについて、ＨＥＲ−２のエキソンに対して特異的な配列のｎｔ１１３１〜１１５２と一致する順プライマー（Ｃ）（５’−ＡＡＣＡＣＡＧＣＧＧＴＧＴＧＡＧＡＡＧＴＧＣ−３’［配列ＩＤ番号５］）と逆プライマー（Ｂ）［配列ＩＤ番号４］を用いて増幅した。サイクリング・パラメータは、９４℃で３０秒間；６２℃で３０秒間；７２℃で６０秒間を２５サイクルである。
【００７２】逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を利用して、ＥＣＤ ＩＩＩａ配列を含むｍＲＮＡの構造を調べた。まず最初に鎖状ｃＤＮＡを、０．５μｇのオリゴ−ｄＴで処理した５μｇのＲＮＡを用いて逆転写した（Ｂｏｎｄ他、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第３６７巻、６１〜６６ページ、１９９５年）。ＥＣＤ ＩＩＩａ挿入体とそれに隣接する５’ＨＥＲ−２エキソン配列を増幅するため、上記の順プライマー（Ａ）と、３’ＥＣＤ ＩＩＩａに対して特異的な配列に相補的な逆プライマー（Ｄ）（５’−ＡＴＡＣＣＧＧＧＡＣＡＧＧＴＣＡＡＣＡＧＣ−３’［配列ＩＤ番号６］）を用いた。サイクリング・パラメータは、９４℃で３０秒間；６０℃で４０秒間；６８℃で２分間を３０サイクルである。
【００７３】ＥＣＤ ＩＩＩａ挿入体とそれに隣接する３’ＨＥＲ−２エキソンに対して特異的な配列の増幅を、順プライマー（Ｅ）（５’−ＴＣＴＧＧＧＴＡＣＣＣＡＣＴＣＡＣＴＧＣ−３’［配列ＩＤ番号７］）と、逆プライマー（Ｆ）（５’−ＴＴＣＡＣＡＣＴＧＧＣＡＣＧＴＣＣＡＧＡＣＣ−３’［配列ＩＤ番号８］）を用いて行なった。順プライマーは、５’ＥＣＤ ＩＩＩａに対して特異的な配列と一致していてＫｐｎ１制限部位を含んでおり、逆プライマーは、ＨＥＲ−２のエキソン配列のｎｔ３８９８〜３９１９と相補的で、終止コドン（下線部）のまわりに広がっている。サイクリング・パラメータは、９４℃で３０秒間；６０℃で４０秒間；６８℃で５分間を３０サイクルである。
【００７４】ＰＣＲ産物をサブクローニングしてヌクレオチド配列を決定した。
【００７５】その結果は、正常なＨＥＲ−２をコードしている配列が、５’プライマー配列から始まって中断することなくヌクレオチド１１７１まで続いていることを示していた。そしてこの位置で、２７４個のヌクレオチドからなる挿入体が見つかり、その後には予想されるコード配列が続き、その中に３’プライマーが含まれていた。予想されるタンパク質産物を解析した結果、２７４個のヌクレオチドからなる挿入体が、残基３４０から始まる既知のＨＥＲ−２タンパク質の延長部をコードしており（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３０巻、１１３２〜１１３９ページ、１９８５年）、アミノ酸７９個後にイン・フレーム終止コドンが存在していることを示していた（図１）。挿入されたヌクレオチドとそのヌクレオチドから予想されるアミノ酸配列を遺伝子バンクの配列と比較したところ、相同な配列は見つからなかった。分散している配列の５’接合部と３’接合部を調べたところ、共通するスプライス・ドナー部位とスプライス・アクセプター部位が明らかになり（ＳｈａｒｐとＢｕｒｇｅ、Ｃｅｌｌ、第９１巻、８７５〜８７９ページ、１９９７年）、挿入配列の３’末端近傍に、ピリミジン領域と、分岐点となる可能性のあるアデニン残基が含まれていることがわかった（図１）。したがって、この挿入配列はイントロンらしい。
【００７６】挿入配列によってコードされる新奇な７９個のアミノ酸として予想されるアミノ酸配列［配列ＩＤ番号１］を調べると、共通のＮ結合型グリコシル化部位があることと、１９％という高い割合でプロリンが含まれていることがわかる（図１）。挿入配列は、ｐ１８５ＨＥＲ−２配列の細胞外領域中のサブドメインＩＩとＩＩＩの間に位置しているため（Ｌａｘ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第８巻、１８３１〜１８３４ページ、１９８８年）、ＥＣＤ ＩＩＩａと表記した。この挿入配列は隣接する５’ＨＥＲ−２エキソン配列と２３６ｎｔにわたってイン・フレームであり、その中に終止コドンが含まれている。
【実施例２】
【００７７】この実施例では、ゲノム内でＨＥＲ−２のエキソンと隣接しているＥＣＤ ＩＩＩａの特性を明らかにする実験の結果を示す。ＥＣＤ ＩＩＩａ配列が存在する領域におけるＨＥＲ−２遺伝子の構造を調べるため、ヌクレオチド７６３〜７８５と一致する順プライマーと、ＨＥＲ−２のｃＤＮＡのヌクレオチド１２６５〜１２８６と相補的な逆プライマーを用いて、ヒトゲノムＤＮＡについてＰＣＲを行なった。増幅産物は、エキソン５（Ｔａｌ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第７巻、２５９７〜２６０１ページ、１９８７年）からＥＣＤ ＩＩＩａ配列の３’に近接するエキソンまで広がっていることが予想された。イントロンの数とサイズは、ＰＣＲ産物のサイズ、制限消化解析、増幅産物の部分配列の解析に基づいて推定した。
【００７８】次に、ＨＥＲ−２のエキソンに特異的で挿入体に直接接するプライマーを用いてヒトゲノムＤＮＡを調べ、ＥＣＤ ＩＩＩａ配列に直接接している配列を決定した。約４３０ｂｐの産物を、正常なヒトゲノムＤＮＡおよび３種類のガン細胞系ＳＣＯＶ−３、ＳＫＢＲ−３、ＢＴ４７４から抽出したゲノムＤＮＡから増幅した。これらすべてのガン細胞系においてＨＥＲ−２遺伝子が増幅され（Ｋｒａｕｓ他、ＥＭＢＯ Ｊ．、第６巻、６０５〜６１０ページ、１９８７年）、ｃＤＮＡにＥＣＤ ＩＩＩａを発現していることがわかった。ＰＣＲ産物がＨＥＲ−２であることが、実施例１に記載した方法を利用したサザンブロット解析によって確認された。ヌクレオチド配列を解析したところ、ヒトゲノムＤＮＡからのＰＣＲ産物がＥＣＤ ＩＩＩａ挿入体を含んでおり、その両側がＨＥＲ−２をコードしている既知の配列に接していることがわかった。突然変異または再配置は見られなかった。これらのデータは、ＥＣＤ ＩＩＩａ配列が、完全な状態で保持されたイントロンであることを表わしており、イントロン４の後に増幅された産物のサイズと、相同なＥＧＦＲ遺伝子およびＨＥＲ−２遺伝子のイントロン８の位置（ＬｅｅとＭａｉｈｌｅ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第１６巻、３２４３〜３２５２ページ、１９９８年）とに基づくと、このイントロンがイントロン８であるらしいことを示している。
【実施例３】
【００７９】この実施例では、ＥＣＤ ＩＩＩａが、ＨＥＲ−２のｍＲＮＡのコード配列内に保持されている唯一のイントロンであることを示す。ＥＣＤ ＩＩＩａ挿入配列を含むｍＲＮＡの中に別のイントロンが含まれているかどうかを明らかにするため、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行なった。まず最初に、５’ＨＥＲ−２のｃＤＮＡ配列の１４２〜１６１と一致していて開始コドンを含む順プライマーと、３’ＥＣＤ ＩＩＩａ配列と相補的な逆プライマーを、ＳＫＢＲ−３とＳＫＯＶ−３のｃＤＮＡに対して用いた。１．３ｋｂの産物が増幅された。これは、この産物がイントロン８以外のイントロンを含んでいない場合に予想されるサイズである。次に、５’ＥＣＤ ＩＩＩａ配列と一致した順プライマーと、３’ＨＥＲ−２のｃＤＮＡ配列のヌクレオチド３８９８〜３９１９と相補的でｐ１８５ＨＥＲ−２の終止コドンを含む逆プライマーとを用い、３’ＨＥＲ−２コード配列を増幅した。２．９ｋｂの産物が増幅された。これは、この産物が別のイントロンを含んでいない場合にＨＥＲ−２のｃＤＮＡから予想されるサイズである。
【００８０】制限消化解析とヌクレオチドのシークエンシングによって５’（１．３ｋｂ）と３’（２．９ｋｂ）の増幅産物の両方のキャラクテリゼーションを行なったところ、別のイントロンは保持されていないことがわかった。イントロン配列が含まれているときに増幅される産物のサイズを決定するため、ゲノムＤＮＡをＰＣＲ反応の鋳型として用いた。その結果、５’コード配列に対しては約１０ｋｂの産物、３’コード配列に対しては約５ｋｂの産物が得られた。これらの結果は、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）と３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）のサイズが以前に報告されている約４．５ｋｂのＨＥＲ−２のｃＤＮＡ（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３０巻、１１３２〜１１３９ページ、１９８５年）と同じであるならば、２７４ｂｐのイントロンが保持されていることで生まれるＨＥＲ−２の新奇な転写産物の予想サイズが約４．８ｋｂとなることを示している。
【実施例４】
【００８１】この実施例では、ＥＣＤ ＩＩＩａ配列を含むタンパク質の発現を示す。新奇な配列がタンパク質産物に翻訳されるかどうかを調べるため、ＥＣＤ ＩＩＩａ配列を細菌内でポリヒスチジン・タグを有するペプチドとして発現させ、このペプチドをニッケル・アフィニティ・クロマトグラフィにより精製し、この精製ペプチドに対する抗血清を得た。要するに、プライマーＥと、ＥＣＤ ＩＩＩａ挿入配列の３’末端と相補的な逆プライマーとを用いてＳＫＯＶ−３のｃＤＮＡライブラリーからＥＣＤ ＩＩＩａを増幅することによって細菌の発現ベクターを調製した。逆プライマーはＢａｍＨ１制限部位配列を含んでおり、（実施例１と２に記載した）ＲＰＡにおいて鋳型を構成するのに用いたプライマーと同じであった。約２８０ｂｐというＰＣＲ増幅産物をＫｐｎ１とＢａｍＨ１で消化させ、ゲル（キアエックスＩＩ、キアジェン社、チャッツワース、カリフォルニア州）で精製し、ｐＥＴ３０ａベクターにクローニングした。このベクターは、発現したタンパク質のアミノ末端の位置に６個のヒスチジン・タグをコードしている（ノヴァジェン社、マディソン、ウィスコンシン州）。得られたｐＥＴ−ＥＣＤ ＩＩＩａ発現ベクターは、細菌株ＢＬ２１の形質転換に使用した。
【００８２】ＥＣＤ ＩＩＩａタンパク質産物を発現させるため、ｐＥＴ−ＥＣＤ ＩＩＩａ発現ベクターで形質転換したＢＬ２１細胞をＬＢ培養液の中で３０μｇ／ｍｌのカナマイシンとともに３７℃にて４時間にわたって成長させた。０．１ｍＭのＩＰＴＧで３時間にわたって発現を誘導し、回収した細胞を超音波処理して溶解させ、次に３９，０００×ｇで２０分間遠心分離した。室温で６０分間にわたって撹拌しながら上澄みをＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂（キアジェン社）に吸収させた。この樹脂を１０倍容積の洗浄用緩衝溶液（１０ｍＭのトリスｐＨ７．９と３００ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄し、次に、５０ｍＭのイミダゾールを加えた１０倍容積の洗浄用緩衝溶液で洗浄した。ヒスチジン・タグを有するＥＣＤ ＩＩＩａタンパク質を、２５０ｍＭのイミダゾールを加えた洗浄用緩衝溶液中に溶離させた。ヒスチジン・タグを有するこのタンパク質は、ゲルをクーマッシー・ブルーで染色することにより、約９０％の純度であると推定された。このタンパク質を用いて抗体を産生させ、その抗体のキャラクタリゼーションを行なった。
【００８３】要するに、コカリコ・バイオロジカルズ社（リームズタウン、ペンシルヴェニア州）に依頼し、２匹のウサギにポリヒスチジン・タグを有する精製ＥＣＤ ＩＩＩａペプチド（以下に記載）を注射することにより抗ＥＣＤ ＩＩＩａ抗血清を生産してもらった。ｐ１８５ＨＥＲ−２のアミノ酸残基１５１〜１６５と一致するペプチドに対するポリクローナル抗ｎｅｕ（Ｎ）を作った（ＬｉｎとＣｌｉｎｔｏｎ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第６巻、６３９〜６４３ページ、１９９１年）。ｐ１８５ＨＥＲ−２のカルボキシ端末の最後の１５残基と一致するペプチドに対するポリクローナル抗ｎｅｕ（Ｎ）を作った（Ｌｉｎ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．、第６９巻、１１１〜１１９ページ、１９９０年）。免疫を確立した２匹のウサギからの抗血清をキャラクテリゼーションしたところ、精製ＥＣＤ ＩＩＩａペプチドと反応する高力価の抗体が含まれていることがわかった。
【００８４】ウエスタンブロット解析により、ｃＤＮＡ中に新奇な配列を発現したＳＫＢＲ−３細胞が、抗ＥＣＤ ＩＩＩａ抗体と反応するタンパク質を産生させたかどうかを調べた。細胞抽出物および細胞外マトリックスからの６８ｋＤａのタンパク質は、２匹のウサギからの抗ＥＣＤ ＩＩＩａ抗体を少なくとも２０，０００倍に希釈したものと反応したが、免疫確立前の血清とは反応しなかった。新奇な転写産物のｃＤＮＡ配列（図１）を調べたところ、ｐ１８５ＨＥＲ−２のＮ末端配列中の５つの共通Ｎ結合型グリコシル化部位すべてがグリコシル化されている場合には、６５〜７０ｋＤａの分泌タンパク質産物が予測されることがわかった（Ｓｔｅｒｎ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第６巻、１７２９〜１７４０ページ、１９８６年）。
【００８５】６８ｋＤａのＥＣＤ ＩＩＩａタンパク質［配列ＩＤ番号２］は、ＨＥＲ−２の新奇なｍＲＮＡの翻訳産物であり、そのＮ末端の残基は、ｐ１８５ＨＥＲ−２のＮ末端の３４０個の残基と一致していなくてはならない。そこで、ＳＫＢＲ−３細胞からの細胞抽出物を、ＨＥＲ−２のＮ末端配列である抗ｎｅｕ（Ｎ）（ＬｉｎとＣｌｉｎｔｏｎ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第６巻、６３９〜６４３ページ、１９９１年）に対する抗ペプチド抗体、または抗ＥＣＤ ＩＩＩａを用いて免疫沈降させ、得られた免疫複合体を両方の抗体を用いてウエスタンブロット解析法で調べた。要するに、３〜５μｌの抗血清を、Ｍ−ＲＩＰＡ緩衝溶液（１％のノニデットＰ−４０、５０ｍＭのトリスｐＨ７．４、０．１％のデオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＰＭＳＦ、１％のアプロチニン）中に調製した細胞溶離物からのタンパク質２ｍｇに添加した。なお細胞溶離物は、遠心分離で核をあらかじめ除去した。（Ｌｉｎ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．、第６９巻、１１１〜１１９ページ、１９９０年）に記載されているようにして、免疫沈降を、４℃にて撹拌しながら２時間にわたって行なった。免疫複合体は、撹拌しながら４℃にて１時間培養することによりプロテインＧセファロース（ファルマシア社）に結合したので遠心分離で回収し、Ｍ−ＲＩＰＡで４回洗浄した。タンパク質は、９５℃で２分間にわたってＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプル緩衝溶液中で培養することにより免疫複合体から放出され、それを７．５％のゲル中でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離させた（ミニ−プロティーンＩＩ電気泳動細胞、バイオ−ラド社）。
【００８６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、ウエスタンブロット解析を行なった。半乾燥トランスファー・ユニット（バイオ−ラド社）を用い、電気泳動により、２５ｍＭのトリスｐＨ８．３、１９２ｍＭのグリシン、５０ｍＭのＮａＣｌ、２０％のメタノールで平衡させたゲル（厚さ０．７５ｍｍ）１つにつき１５Ｖの電圧で２０分間にわたってタンパク質をニトロセルロース膜（トランス−ブロット、バイオ−ラド社）上にブロットした。この膜を、５％の脱脂粉乳を用いて２５℃にて１時間にわたってブロックした。次に、ブロットを一次抗体とともに培養し、ＴＢＳ−トゥイーン（０．０５％のトゥイーンを含むトリス緩衝溶液）で１５分間ずつ２回にわたって洗浄し、５分間ずつ４回にわたって洗浄し、ヤギの抗ウサギ二次抗体とともに４０分間培養し、西洋ワサビのペルオキシダーゼ（バイオ−ラド社）と結合させ、ＴＢＳ−トゥイーン中に１：１０，０００の割合で希釈した。膜は、二次抗体とともに培養した後に上記のようにして洗浄し、化学発光試薬（ピアース社）と反応させ、コダック社のＸ−ＯＭＡＴ ＢＬＵフィルムに曝露した。
【００８７】免疫沈降とウエスタンブロット解析で抗ＥＣＤ ＩＩＩａを用いたときには、予想通りｐ６８ＨＥＲ−２が検出された。免疫沈降で抗ＥＣＤ ＩＩＩａを用い、ウエスタンブロット解析におけるプローブが抗ｎｅｕ（Ｎ）のときには、６８ｋＤａのタンパク質が検出された。これは、ｐ６８ＥＣＤ ＩＩＩａがｐ１８５ＨＥＲ−２のＮ末端配列を含んでいることを示している。さらに、抗ｎｅｕ（Ｎ）がｐ６８ＨＥＲ−２を沈降させた。そのことは、抗ＥＣＤ ＩＩＩａ抗体をプローブとして調べることにより検出された。これらの結果は、ｐ６８ＨＥＲ−２がＥＣＤ ＩＩＩａとＨＥＲ−２のＮ末端配列の両方を含んでいることを示している。
【００８８】他のいくつかの細胞系におけるｐ６８ＥＣＤ ＩＩＩａの発現を調べた。ｃＤＮＡにＥＣＤ ＩＩＩａ配列を含むガン細胞系（ＢＴ４７４、ＳＫＯＶ−３）もｐ６８ＨＥＲ−２を含んでいた。調べたいくつかの細胞系のうち、正常なヒト胚の腎臓細胞に由来するＨＥＫ２９３細胞が、細胞抽出物中および細胞外マトリックス中で最高レベルのｐ６８ＥＣＤ ＩＩＩａを発現し、ＳＫＢＲ−３細胞よりも約５〜１０倍多い量だった。ｐ１８５ＨＥＲ−２の過剰発現を調べたガン細胞系（ＳＫＢＲ−３、ＳＫＯＶ−３、ＢＴ４７４）と比較すると、ＨＥＫ２９３はｐ１８５ＨＥＲ−２の含有量が約２０分の１であった。したがって、ｐ１８５ＨＥＲ−２に対するｐ６８ＨＥＲ−２の割合は、ＨＥＫ２９３細胞においては、調べたガン細胞系の少なくとも１００倍であった。特にＨＥＫ２９３抽出物において明らかなｐ６８ＨＥＲ−２および約１２０ｋＤａのタンパク質との反応は、抗血清を、配列特異的な反応性を示す精製ＥＣＤ ＩＩＩａペプチドとともに予備培養することによって停止させた。この大きなタンパク質はｐ６８ＨＥＲ−２のダイマーである可能性がある。したがってｐ６８ＨＥＲ−２が発現していくつかのガン細胞系から分泌され、ＨＥＫ２９３中では５〜１０倍のレベルになる。
【実施例５】
【００８９】この実施例では、ＥＣＤ ＩＩＩａイントロン配列を含む新奇なＨＥＲ−２転写産物の発現を示す。ＲＴ−ＰＣＲ解析の結果は、ＥＣＤ ＩＩＩａ配列が挿入されていなければ正常なサイズであるはずのＨＥＲ−２のｍＲＮＡにＥＣＤ ＩＩＩａ配列が挿入されたことを示していた。このデータは、約４．８ｋｂの新奇な転写産物があることを示唆する。ＥＣＤ ＩＩＩａの新奇な転写産物のサイズと発現を調べるため、ＥＣＤ ＩＩＩａに対して特異的なプローブを用いてノーザンブロット解析を行なった。要するに、ＥＣＤ ＩＩＩａ挿入体の全配列にまたがっていて、この挿入体に隣接する５’ＨＥＲ−２エキソン配列を含む３８９ｂｐの配列をＰＣＲで増幅することにより、アンチセンスＲＮＡプローブを合成するための鋳型をＳＫＯＶ−３のｃＤＮＡから構成した。ＨＥＲ−２のｃＤＮＡ配列とｎｔ１１３１〜１１５２が一致する順プライマーＣ［配列ＩＤ番号５］と、３’ＢａｍＨ１制限エンドヌクレアーゼ部位を含み、ＥＣＤ ＩＩＩａ配列の３’スプライス部位近傍の配列と相補的な逆プライマー（５’−ＧＣＡＣＧＧＡＴＣＣＡＴＡＧＣＡＧＡＣＴＧＡＧＧＡＧＧ−３’［配列ＩＤ番号９］）を用いてＰＣＲを行なった。次に、ＰＣＲ産物をＢａｍＨ１で消化させ、３７５ｂｐの断片を遊離させ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（ストラタジーン社）にクローニングした。ｍ１３順プライマーと逆プライマーを用い、このプラスミドをヴォラム・インスティチュート・コア・シークエンシング・ファシリティ（ポートランド、オレゴン州）にてシークエンシングした。ＥＣＤ ＩＩＩａ配列全体と、挿入体に隣接した５’ＨＥＲ−２エキソン配列の８７ｎｔとに相補的なアンチセンスＲＮＡプローブを、（α−３２Ｐ）ＣＴＰ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと、Ｔ７／ＳＰ６リボプローブ合成システム（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州）とを用いて１μｇの直線状鋳型から転写した。このプローブは、ＥＣＤ ＩＩＩａおよびそれと隣接するＨＥＲ−２エキソン配列を含むｍＲＮＡとハイブリダイズするとき、３７０ｎｔの断片を保護し、完全にスプライスされたＨＥＲ−２のｍＲＮＡとハイブリダイズするとき、８７ｎｔの断片を保護することが予想された。
【００９０】ＲＮＡハイブリッドを調製するため、３０μｇのＲＮＡを約５０，０００ｃｐｍのアンチセンスＲＮＡプローブと４８℃にて１６時間にわたってハイブリダイズさせた。このＲＮＡハイブリッドを、４０μｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡ（ベーリンガー・マンハイム社）および２μｇ／ｍｌのＲＮアーゼＴ１（ライフ・テクノロジーズ社）を用い、２５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのトリスｐＨ７．５からなる溶液中で、３７℃にて３０分間にわたって消化させた。プロテイナーゼＫ（１００μｇ）（ライフ・テクノロジーズ社）を含む２０μｌの１０％ＳＤＳを添加して消化を停止させた。サンプルを酸性フェノール（ｐＨ４．５；ライフ・テクノロジーズ社）とクロロホルムで抽出し、２容積の１００％エタノールで沈殿させ、５μｌのＲＰＡサンプル用緩衝溶液（８８％のホルムアルデヒド、１０ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０、１ｍｇ／ｍｌのキシレンシアノール、１ｍｇ／ｍｌのブロモフェノール・ブルー）に分散させた。サンプルを９５℃にて１０分間にわたって変性させ、ＴＢＥ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸エステル、２ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．３）の中で５％ポリアクリルアミド／尿素ゲル上にて電気泳動を行なった。このゲルを真空下で乾燥させ、保護された断片をリン光画像解析によって定量した（ＩＰラブ・ゲル、モレキュラー・ダイナミックス社）。
【００９１】約４．８ｋｂの新奇な転写産物が、ｐ６８ＥＣＤ ＩＩＩａを最高レベルで発現したＨＥＫ２９３細胞の中で検出された。しかしＳＫＢＲ−３、ＢＴ４７４、ＳＫＯＶ−３というガン細胞系のノーザンブロット解析では、新奇な転写産物は検出できなかった。そこで、より高感度のリボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）により、新奇な転写産物の発現レベルを、完全にスプライスされた４．５ｋｂの転写産物と比較して調べた。検出可能なレベルのｐ６８ＥＣＤ ＩＩＩａを含んでいた卵巣ガン細胞系（ＳＫＯＶ−３）および乳ガン細胞系（ＳＫＢＲ−３とＢＴ４７４）からのＲＮＡと、ＨＥＲ−２のｃＤＮＡが安定にトランスフェクションされた対照細胞系１７−３−１からのＲＮＡを、ＥＣＤ ＩＩＩａ（イントロン８）配列全体と、イントロン８に隣接した５’ＨＥＲ−２エキソン配列とにまたがる３２Ｐ標識アンチセンスＲＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ＲＮアーゼで消化させ、電気泳動を行ない、放射能写真を撮影したところ、３７０個のヌクレオチドからなるバンドが、１７−３−１以外の細胞系で検出された。これは、ＥＣＤ ＩＩＩａを含むＨＥＲ−２のｍＲＮＡによって保護されることが予想されるサイズに対応している。さらに、８７個のヌクレオチドが保護された断片が、すべての細胞で検出された。これは、対照となる正常な細胞系と比べてこれらガン細胞系で１００倍以上も過剰に発現している完全にスプライスされたＨＥＲ−２の情報に対して予想されるサイズである（Ｋｒａｕｓ他、ＥＭＢＯ Ｊ．、第６巻、６０５〜６１０ページ、１９８７年）。保護されたそれぞれの断片の量を測定し、サイズに関して正規化して新奇な転写産物の相対量を推定し、ｐ１８５ＨＥＲ−２のｍＲＮＡに対する割合として表わした。ＥＣＤ ＩＩＩａ挿入体を含む新奇なＨＥＲ−２のｍＲＮＡは、ＳＫＯＶ−３細胞では完全にスプライスされた転写産物のレベルの４．２％であり、ＳＫＢＲ−３細胞では５．４％であり、ＢＴ４７４細胞では０．８％であった。
【実施例６】
【００９２】この実施例では、ＥＣＤ ＩＩＩａ挿入体を含む新奇な転写産物がヒト胚の腎臓および肝臓で発現したことを示す。ノーザンブロット解析により、ＥＣＤ ＩＩＩａ配列を含む新奇な転写産物がヒトの正常な組織で発現したかどうかを調べた。ヒト胎児のさまざまな組織からのポリＡ＋ｍＲＮＡをノーザンブロットとして調製し、新奇なＥＣＤ ＩＩＩａ配列に対して特異的な放射標識プローブとハイブリダイズさせた。４．８ｋｂのｍＲＮＡが腎臓で検出され、２．６ｋｂの転写産物が肝臓で検出された（図２）。４．８ｋｂの転写産物は、２７４ｂｐの挿入体を有する完全長４．５ｋｂ転写産物に対応しているようである。２．６ｋｂの転写産物は、以前に報告されている２．３ｋｂの別の転写産物（ヤマモト他、Ｎａｔｕｒｅ、第３１９巻、２３０〜２３４ページ、１９８６年；Ｓｃｏｔｔ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第１３巻、２２４７〜２２５７ページ、１９９３年）に２７４ｂｐのＥＣＤ ＩＩＩａ挿入体が含まれたものに対応しているのであろう。ブロットを分離させて５’ＨＥＲ−２コード配列に対して特異的なプローブとハイブリダイズさせたところ、４．８ｋｂと４．５ｋｂのｍＲＮＡを示す広いバンドが胎児の腎臓組織で検出され、２．６ｋｂの転写産物断片が肝臓で検出された。これは、これらの新奇な転写産物が、ＨＥＲ−２のＥＣＤをコードする配列を含んでいることを示している。挿入されたＥＣＤ ＩＩＩａ配列が終止コドンを含んでいるため、同じタンパク質産物がこれらｍＲＮＡのそれぞれから産生される可能性がある。
【００９３】いくつかの細胞系についてもＥＣＤ ＩＩＩａを含む新奇な転写産物についてノーザンブロット解析で調べた。４．８ｋｂの新奇な転写産物が、ヒト胚の腎臓細胞系であるＨＥＫ−２９３で検出された（図２）。ＥＣＤ ＩＩＩａ配列が、ＨＥＲ−２遺伝子が増幅されているＳＫＢＲ−３、ＢＴ４７４、ＳＣＯＶ−３というガン細胞系のＲＴ−ＰＣＲ解析により検出されたとはいえ、ＥＣＤ ＩＩＩａを含む新奇な転写産物はこれらの細胞をノーザンブロット解析しても検出できなかった。そこで、ＥＣＤ ＩＩＩａ配列全体と、このＥＣＤ ＩＩＩａ挿入体に隣接する５’ＨＥＲ−２エキソン配列とにまたがるアンチセンスプローブを利用して、より高感度のリボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）を行なった。ＥＣＤ ＩＩＩａ挿入体を有する新奇なＨＥＲ−２のｍＲＮＡは、ＳＣＯＶ−３細胞、ＳＫＢＲ−３細胞、ＢＴ４７４細胞では、完全にスプライスされた転写産物の５％未満しか検出されなかった。これらの知見は、ＥＣＤ ＩＩＩａ配列を含む新奇な２つの転写産物が、ヒトの正常組織で組織特異的に発現したこと、４．８ｋｂの新奇な転写産物がＨＥＫ−２９３細胞系で発現したこと、遺伝子が増幅したガン細胞が、新奇な転写産物を４．５ｋｂのＨＥＲ−２転写産物の５％未満という低いレベルで発現していることを示している。
【実施例７】
【００９４】この実施例では、ＥＣＤ ＩＩＩａ配列を含むタンパク質の発現を示す。新奇な配列がタンパク質産物に翻訳されるかどうかを調べるため、ＥＣＤ ＩＩＩａ配列を細菌内でポリヒスチジン・タグを有するペプチドとして発現させ、ニッケル−アフィニティ・クロマトグラフィにより精製し、この精製ペプチドに対する抗血清を得た。４．８ｋｂの新奇なＥＣＤ ＩＩＩａの転写産物を発現したＨＥＫ−２９３細胞がＥＣＤ ＩＩＩａを含むタンパク質を発現するかどうかを、ウエスタンブロット解析で調べた。細胞抽出物と細胞外マトリックスからの６８ｋＤａのタンパク質は、抗ＥＣＤ ＩＩＩａ抗体と反応したが（図３）、免疫確立前の血清とは反応しなかった。反応は、この抗血清を、精製ＥＣＤ ＩＩＩａペプチドとともに予備培養することによって停止させた（図３）。いくつかの細胞抽出物で検出された大きな約１２５ｋＤａのタンパク質は、ｐ６８ＨＥＲ−２の集合体であろう。新奇な転写産物のｃＤＮＡの配列（図１）からは、ｐ１８５ＨＥＲ−２のＮ末端配列中の５つの共通Ｎ結合型グリコシル化部位すべてがグリコシル化されている場合には、６５〜７０ｋＤａの分泌タンパク質産物が予測されることがわかる（Ｓｔｅｒｎ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、第６巻、１７２９〜１７４０ページ、１９８６年）。他のいくつかの細胞系がｐ６８ＥＣＤ ＩＩＩａを発現するかどうかを調べた。ｃＤＮＡにＥＣＤ ＩＩＩａ配列を含むガン細胞系（ＢＴ４７４、ＳＫＯＶ−３、ＳＫＢＲ−３）も検出可能なレベルのｐ６８ＨＥＲ−２を含んでいた。
【実施例８】
【００９５】この実施例では、ＨＥＲ−２遺伝子が増幅されているガン細胞系でｐ１８５ＨＥＲ−２と比べてｐ６８ＨＥＲ−２の発現が顕著に低下していることを示す。ＨＥＲ−２遺伝子が増幅されているガン細胞系ではｐ１８５ＨＥＲ−２のｍＲＮＡと比べてｐ６８ＨＥＲ−２のｍＲＮＡの発現レベルが非常に低いため、ＨＥＲ−２遺伝子が増幅されているいくつかの細胞系と増幅されていないいくつかの細胞系において、ｐ６８ＨＥＲ−２タンパク質とｐ１８５ＨＥＲ−２タンパク質の相対的な割合を調べた。ウエスタンブロットを調製し、ｐ６８ＨＥＲ−２に対して特異的な抗血清とｐ１８５ＨＥＲ−２に対して特異的な抗血清の両方について調べた。図４は、ＨＥＲ−２遺伝子が約８倍に増幅されているガン細胞系でｐ１８５ＨＥＲ−２が容易に検出できたことを示している（Ｋｒａｕｓ他、ＥＭＢＯ Ｊ．、第６巻、６０５〜６１０ページ、１９８７年）。しかしｐ６８ＨＥＲ−２が対応して増加することはなかった。比較すると、ｐ６８ＨＥＲ−２は、ＨＥＫ−２９３、ＩＯＳＥＶＡＮ、ＨＢＬ１００という非発ガン性細胞で検出された唯一のＨＥＲ−２タンパク質であった。それに対してｐ１８５ＨＥＲ−２は、これらの細胞中では非常に低いレベルでしか発現せず（Ｋｒａｕｓ他、ＥＭＢＯ Ｊ．、第６巻、６０５〜６１０ページ、１９８７年）、過剰に露出したブロットにおいて検出された。これらのデータは、ＨＥＲ−２遺伝子が増幅されているガン細胞系ではｐ６８ＨＥＲ−２がｐ１８５ＨＥＲ−２と比べて少ないことを示しており、ｐ１８５ＨＥＲ−２が過剰に発現したときにｐ６８ＨＥＲ−２が低レベルに維持される何らかのメカニズムが存在している可能性のあることを示唆している。
【実施例９】
【００９６】この実施例では、ｐ６８ＨＥＲ−２とＥＣＤ ＩＩＩａペプチドがｐ１８５ＨＥＲ−２に特異的に結合することを示す。ｐ６８ＨＥＲ−２は分泌タンパク質であり、しかもｐ６８ＨＥＲ−２は新奇な配列に加えてｐ１８５ＨＥＲ−２と一致するサブドメインＩとＩＩを含んでいるため、ｐ６８ＨＥＲ−２がｐ１８５ＨＥＲ−２と相互作用する可能性を調べた。ｐ１８５ＨＥＲ−２とｐ６８ＨＥＲ−２のＮ末端に対する抗ペプチド抗体である抗ｎｅｕ（Ｎ）、またはｐ１８５ＨＥＲ−２に対して特異的な抗体である抗ｎｅｕ（Ｃ）を用い、ｐ６８ＨＥＲ−２を低レベルで発現し、ｐ１８５ＨＥＲ−２を過剰発現しているガン細胞ＳＫＢＲ−３の免疫沈降を行なった。免疫沈降させる物質をウエスタンブロットとして調製し、プローブとしてｐ６８ＨＥＲ−２に対して特異的な抗ＥＣＤ ＩＩＩａと抗ｎｅｕ（Ｃ）の両方を用いて調べた。抗ｎｅｕ（Ｎ）は、ｐ６８ＨＥＲ−２とｐ１８５ＨＥＲ−２の両方を免疫沈降させた（図５Ａ）。さらに、ｐ１８５ＨＥＲ−２のＣ末端に対して特異的な抗体はｐ１８５ＨＥＲ−２を免疫沈降させ、ｐ６８ＨＥＲ−２を共同沈降させた（図５Ａ）。この結果は、２つのタンパク質の間に相互作用があることを示唆している。
【００９７】ＥＣＤ配列同士の結合相互作用は非常に弱いので（Ｔｚａｈａｒ他、ＥＭＢＯ Ｊ．、第１６巻、４９３８〜４９５０ページ、１９９７年；Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ他、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第４３１巻、１０２〜１０６ページ、１９９８年）、結合が、新奇なプロリン・リッチなＥＣＤ ＩＩＩａ領域によるものかどうかを調べた。新奇な７９個のアミノ酸からなる領域をヒスチジン・タグを有するタンパク質として精製してニッケル・アガロース上に固定し、プルダウン・アッセイで使用した。対照として、ＥＣＤ ＩＩＩａとは関係のない、ヒスチジン・タグを有する２つの精製ペプチド、すなわちウィルソン病の膜タンパク質の６００残基からなる断片と、ＣＲＥＢタンパク質のＤＮＡ結合領域を含む７０残基からなる断片とを、同様にしてニッケル・アガロース樹脂上に固定した。固定されたペプチドを、ＨＥＲ−２をトランスフェクションした３Ｔ３細胞（１７−３−１）から調製したタンパク質とともに培養した。十分に洗浄した後、結合したタンパク質を溶離させ、ウエスタンブロットとして調製し、それを、ｐ１８５ＨＥＲ−２に対して特異的な抗体をプローブとして用いて調べた。ヒスチジン・タグを有するＥＣＤ ＩＩＩａペプチドと対照用ペプチドが同じ量だけ樹脂に結合したことが、１Ｍのイミダゾールで溶離させ、溶離した物質をＳＤＳゲル中でクーマッシー染色することによって確認された。ｐ１８５ＨＥＲ−２は、ペプチドなしの樹脂にも対照用ペプチドを有する樹脂にも保持されることがなかったのに対し、ＥＣＤ ＩＩＩａペプチドによってだけ選択的に保持された（図５Ｂ）。
【００９８】プルダウン・アッセイにおいてＥＣＤ ＩＩＩａ領域がｐ１８５ＨＥＲ−２に結合したため、このＥＣＤ ＩＩＩａ領域が、ｐ１８５ＨＥＲ−２を過剰発現している細胞に選択的に結合するかどうかを調べた。これは、ＨＥＲ−２をトランスフェクションした１７−３−１細胞の単層培養物を用いて３Ｔ３親細胞と比較することによって調べた。細胞をさまざまな濃度のヒスチジン−ＥＣＤ ＩＩＩａペプチドとともに培養し、洗浄し、プロテアーゼ阻害剤を用いて変性用緩衝溶液中に抽出した。結合したペプチドがあるかどうかを検出するため、細胞抽出物を、ＥＣＤ ＩＩＩａに対して特異的な抗体を用いてウエスタンブロット解析により調べた。さらに、ＥＣＤ ＩＩＩａペプチドで処理した細胞を等分した複数のアリコートを、ウエスタンブロットとしてｐ１８５ＨＥＲ−２に対して特異的な抗体と反応させた。するとトランスフェクションされた１７−３−１細胞でｐ１８５ＨＥＲ−２が過剰に発現した。ＥＣＤ ＩＩＩａペプチドは、ｎＭオーダーのさまざまな濃度で完全な１７−３−１細胞に好んで結合する（図５Ｃ）のに対し、同等な量の３Ｔ３親細胞にはペプチドがほとんど結合しないか、まったく結合しなかった。これは、ＥＣＤ ＩＩＩａがｐ１８５ＨＥＲ−２の細胞外領域と特異的な相互作用をしていることを示唆する。
【実施例１０】
【００９９】ｐ６８ＥＣＤ ＩＩＩａとＥＣＤ ＩＩＩａペプチドがｐ１８５ＨＥＲ−２のチロシンリン酸化に及ぼす効果を調べた。ＲＴＫのチロシンリン酸化は、リガンド活性化とシグナル伝達があることの第１の印である。１７−３−１細胞の処理を、さまざまな量の精製ＥＣＤ ＩＩＩａペプチドを用いて、またはｐ６８ＨＥＲ−２を高レベルで含むＨＥＫ２９３細胞からのならし培地（ＣＭ）（図２Ａ）を用いて、または対照となる、検出できるレベルのｐ６８ＨＥＲ−２を含まないＳＫＯＶ−３細胞からのならし培地を用いて行ない、この１７−３−１細胞のチロシンリン酸化を調べた。ヒスチジン−ＥＣＤ ＩＩＩａまたは濃縮ＣＭで１０分間処理したとき（図６）または２時間処理したとき、チロシンリン酸化シグナルは増加しなかった。これは、ｐ１８５ＨＥＲ−２が活性化されなかったことを示唆している。ｐ６８ＨＥＲ−２を含むＣＭもＥＣＤ ＩＩＩａペプチドも、ｐ１８５ＨＥＲ−２のチロシンリン酸化レベルが低いＳＫＯＶ−３細胞からのｐ１８５ＨＥＲ−２に対応するチロシンリン酸化シグナルを検出可能なほど変化させることはなかった。さらに、ｐ６８ＨＥＲ−２とＥＣＤ ＩＩＩａペプチドは、１７−３−１細胞抽出物から免疫沈降させたｐ１８５ＨＥＲ−２の自己リン酸化活性に対して検出可能なほどの影響をインビトロで与えることはなかった。これらの結果は、ｐ６８ＨＥＲ−２がｐ１８５ＨＥＲ−２のシグナル伝達を活性化させなかったという結論を支持している。
【実施例１１】
【０１００】この実施例では、イントロン８がｍＲＮＡ内に保持されている場合には、イントロン８の配列が、そのイントロン８のうちで（ｐ１８５ＨＥＲ−２の細胞外領域と一緒になって）イン・フレーム・コード配列として機能する部分において多型であることを示す。
【０１０１】ヒトＨＥＲ−２遺伝子のイントロン８は、場合によってはｍＲＮＡ内に交互に保持されて、ｐ１８５ＨＥＲ−２の細胞外領域の一部のＣ末端の位置で新奇な７９残基領域をコードしている。保持されたイントロンを有するこの転写産物の産物である“ハースタチン”は、ＨＥＲ−２ガン遺伝子の自己阻害剤として機能する。イントロン８をコードしている領域は、単独では、ｎＭのアフィニティでｐ１８５ＨＥＲ−２に結合することがわかっている（Ｄｏｈｅｒｔｙ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９６巻、１０，８６９〜１０，８７４ページ、１９９９年）。
【０１０２】ＨＥＲ−２遺伝子のイントロン８のヌクレオチドの多型とそこから推定されるアミノ酸配列を、別々の１５人のゲノムＤＮＡをシークエンシングすることによって同定した。図８と配列ＩＤ番号１は、イントロン８の最も一般的なヌクレオチド配列と、それに対応するアミノ酸配列をそれぞれ示している。この領域は、１０通りの多型（配列ＩＤ番号１０の中には文字Ｗ（２箇所）、Ｙ（３箇所）、Ｒ、Ｎ、Ｍ、Ｓ（２箇所）で示し、図８には“Ｘ”で示してある）を含んでおり、その結果として保存されないアミノ酸置換が起こっている（表Ｉの注を参照のこと）。例えば、ヌクレオチド位置１６１に多型（Ｇ→Ｃ）があると（図８；表Ｉ）、配列ＩＤ番号１のアミノ酸残基＃５４の位置、または配列ＩＤ番号２の残基＃３９４の位置でアルギニン（Ｒ）がプロリン（Ｐ）に代わるはずである。図８または配列ＩＤ番号１０の位置１で示されるＮ末端のグリシン（Ｇ）は、“ハースタチン”配列のアミノ酸残基３４１に対応する（Ｄｏｈｅｒｔｙ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９６巻、１０，８６９〜１０，８７４ページ、１９９９年）。図１（Ａ）に示したヌクレオチド配列は、図８に示した最も一般的であることがわかった配列と比べてアミノ酸残基＃６と＃７３の位置のアミノ酸が異なる多型になっている。
【０１０３】この結果は、ヒトの集団において、イントロン８がコードされている領域にいくつかの違いが存在しており、その結果、ＥＣＤ ＩＩＩａを含むタンパク質変異体相互の間で生化学的特性や生物学的特性が異なる可能性のあることを示している。同定されたいくつかの変異を表１にまとめておく。
表１
2004501605.tif 000002
【０１０４】表１。ヒトの集団（別々の１５人）でイントロン８がコードされている領域に見られた配列の変異１〜１１をリストにしてある。このリストには、図８に示した最も一般的なＤＮＡ配列と比べて特定の“Ｘ”の位置に塩基の変化があることが示されている。それぞれのＸの後ろにある括弧内の数字は、図８に示したＤＮＡ配列または配列ＩＤ番号１０のヌクレオチドの位置に対応している。ここにリストとして示したＤＮＡ配列の変異は、配列ＩＤ番号１の可変アミノ酸位置（“Ｘａａ”）に対応している。例えば、Ｘ（４）がＸａａ（２）に；Ｘ（１４）がＸａａ（５）に；Ｘ（１７）がＸａａ（６）に；Ｘ（４７）がＸａａ（１６）に；Ｘ（５４）がＸａａ（１８）に；Ｘ（６２）がＸａａ（２１）に；Ｘ（１０６）がＸａａ（３６）に；Ｘ（１６１）がＸａａ（５４）に；Ｘ（１９１）がＸａａ（６４）に；Ｘ（２１７）がＸａａ（７３）に対応している。配列ＩＤ番号２の可変アミノ酸位置に対応している変異は以下の通りである。Ｘ（４）がＸａａ（３４２）に；Ｘ（１４）がＸａａ（３４５）に；Ｘ（１７）がＸａａ（３４６）に；Ｘ（４７）がＸａａ（３５６）に；Ｘ（５４）がＸａａ（３５８）に；Ｘ（６２）がＸａａ（３６１）に；Ｘ（１０６）がＸａａ（３７６）に；Ｘ（１６１）がＸａａ（３９４）に；Ｘ（１９１）がＸａａ（４０４）に；Ｘ（２１７）がＸａａ（４１３）に対応している。配列ＩＤ番号１の可変アミノ酸位置に関する（図８に示した最も一般的なＤＮＡ配列と比べた場合の）具体的なアミノ酸の変化は以下の通りである。変異１、Ｘａａ（２）（トレオニン→セリン）；変異２、Ｘａａ（５）（ロイシン→プロリン）；変異３、Ｘａａ（６）（プロリン→ロイシン）；変異４、Ｘａａ（１６）（ロイシン→グルタミン）；変異５、Ｘａａ（１８）（メチオニン→ロイシン）；変異６、Ｘａａ（２１）（グリシン→アスパラギン酸、Ａｌｕ、またはバリン）；変異７、Ｘａａ（３６）（ロイシン→イソロイシン）；変異８、Ｘａａ（５４）（プロリン→アルギニン）；変異９、Ｘａａ（６４）（プロリン→ロイシン）；変異１０、Ｘａａ（７３）（アスパラギン酸→アスパラギン）；変異１１、Ｘａａ（６）（プロリン→ロイシン）とＸａａ（７３）（アスパラギン酸→アスパラギン）。同じ置換が配列ＩＤ番号２の対応する可変アミノ酸位置にも適用される。
【実施例１２】
【０１０５】この実施例では、アフリカ系アメリカ人からのＤＮＡサンプルにおいて同定可能なＨＥＲ−２のイントロン８の５つの多型（配列の変異１２〜１６）を示す（後出の表ＩＩＩを参照のこと）。
【０１０６】具体的には、イントロン８がｍＲＮＡ内に保持されている場合には、イントロン８の配列が、そのイントロン８のうちで（ｐ１８５ＨＥＲ−２の細胞外領域と一緒になって）イン・フレーム・コード配列として機能する部分において、４つの多型部位が同定された（すなわち配列ＩＤ番号１０または図８の配列領域に含まれる配列領域内の４つの多型位置）。これら多型部位のうちの２つ（変異１２と１５）は、実施例１１に示した多型部位（それぞれ変異３と１０）に対応しているのに対し、他の２つ（変異１３と１４）は追加の多型部位を表わしている（表ＩＩ）。
【０１０７】さらに、イントロン８がｍＲＮＡ内に保持されている場合には、追加の多型部位（変異１６）が、“非コード”配列に留まるイントロン８の領域に同定された。この“非コード”イントロン８多型部位は３’に位置し（すなわちイントロン８のうちでこの実施例と実施例１１に示した他の多型部位を含む部分から見て下流の位置にある）、イントロン８がｍＲＮＡ内に保持されている場合には、（ｐ１８５ＨＥＲ−２の細胞外領域と一緒になって）イン・フレーム・コード配列として機能する。
【０１０８】方法。ＨＥＲ−２遺伝子内のイントロン８のヌクレオチド配列およびそこから推定されるアミノ酸配列における多型を、２１５人からのゲノムＤＮＡ（血液サンプルを使用）をシークエンシングすることによって同定した。２１５人の内訳は、アフリカ系アメリカ人（黒人）７５人、コーカサス人（白人）１３５人、アジア系アメリカ人（アジア人）１人、ヒスパニック４人である。上記の実施例１１と同様、図８、配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号１０の位置１で表わされるＮ末端のグリシン（ＧまたはＧｌｙ）は、配列ＩＤ番号２または配列ＩＤ番号１３の“ハースタチン”のアミノ酸残基＃３４１に対応する。
【０１０９】結果。表ＩＩは、イントロン８のコード配列中のヌクレオチドの置換および２つのアミノ酸残基の置換と、イントロン８の非コード配列中の第３のヌクレオチドの置換を表わしている。位置を表わす数字としては、“ハースタチン”タンパク質配列全体（配列ＩＤ番号２または配列ＩＤ番号１３）に対応する番号を用いている。
表ＩＩ
2004501605.tif 000003
【０１１０】表ＩＩ。この表は、アフリカ系アメリカ人からのＤＮＡのＨＥＲ−２のイントロン８において（実施例１１で同定された多型と比べて）追加された３つの多型の分布を示している。アミノ酸の位置は、“ハースタチン”配列のアミノ酸位置に対応している（配列ＩＤ番号２または配列ＩＤ番号１３）。
【０１１１】以下の表ＩＩＩは、配列データから（やはり図８または配列ＩＤ番号１０に示した配列領域のヌクレオチド位置に対応している）ヌクレオチド位置＃１７と＃２１７が多型であることが明らかにされたことを示している。位置＃１７の多型（変異１２）は、表Ｉの変異３に対応している（実施例１１）。位置＃２１７の多型（変異１５）は、（少なくともタンパク質レベルで）表Ｉの変異１０に対応している（実施例１１）（配列ＩＤ番号１２と配列ＩＤ番号１３を参照のこと）。
【０１１２】さらに、配列データ（配列ＩＤ番号１１を参照のこと）からは、イントロン８が、上記の実施例１１に示した多型部位に加えてさらに３つの多型部位（変異１３、１４、１６に対応）を含んでいることが明らかになった（表ＩＩＩを参照のこと）。これらのうちの２つ（変異１３、１４）は配列ＩＤ番号１１のヌクレオチド位置＃４９および＃９２に位置している（やはり配列ＩＤ番号１０（または図８）のヌクレオチド位置＃４９および＃９２に対応している）。第３番目（変異１６）は、配列ＩＤ番号１１のヌクレオチド位置＃２５９に位置する［やはり配列ＩＤ番号１０のヌクレオチド位置＃２５９（または図１のＡの項に示した配列の位置＃２６４）に対応している］。したがって、変異１６に対応する多型は、この実施例と実施例１１に示した他の多型部位を含むイントロン８の部分（すなわち実施例１０に示した部分）から１９ヌクレオチドだけ３’側（下流）に位置し、イントロン８がｍＲＮＡ内に保持されている場合には、（ｐ１８５ＨＥＲ−２の細胞外領域と一緒になって）イン・フレーム・コード配列として機能する。
【０１１３】これら多型のうちの２つによって、保存されないアミノ酸置換が起こる（表ＩＩと表ＩＩＩおよび表ＩＩＩの注を参照のこと；配列ＩＤ番号１２と配列ＩＤ番号１３も参照のこと）。例えば、配列ＩＤ番号１１のヌクレオチド位置＃４９［または配列ＩＤ番号１０、または図８の位置＃４９］（すなわち表ＩＩの位置Ｘ（４９）の多型）に対応するヌクレオチド位置に見られる多型（Ｃ→Ｔ）により、配列ＩＤ番号１２、配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号１０、または配列ＩＤ番号１１のアミノ酸残基＃１７に対応するアミノ酸位置、あるいは配列ＩＤ番号１３または配列ＩＤ番号２のアミノ酸残基＃３５７に対応するアミノ酸位置が、アルギニン（Ａｒｇ）からシステイン（Ｃｙｓ）に置換される。
【０１１４】配列ＩＤ番号１１、配列ＩＤ番号１２、配列ＩＤ番号１３は、この実施例に記載した４つの可変アミノ酸位置と、実施例１１の可変アミノ酸位置を示している。後者は、配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号１０にも示してある。
【０１１５】表ＩＩＩは、（表Ｉの変異３および変異１０にそれぞれ対応する変異１２および変異１５に加え）イントロン８の“コード”配列中のヌクレオチド置換と、（実施例１１の表Ｉのアミノ酸残基置換と比べて）追加された２つのアミノ酸残基置換（すなわち変異１３と変異１４）と、イントロン８の３’“非コード”領域中の第３のヌクレオチド置換を示している。それぞれのＸ（多型位置）の後ろにある括弧内の数字は、配列ＩＤ番号１１のヌクレオチド位置を示す［または表Ｉにおけるように、図８または配列ＩＤ番号１０に示したＤＮＡ配列中のヌクレオチド位置に対応（または関係（Ｘ（２５９）の場合））している］。
【０１１６】上記の実施例１１に関しては、配列ＩＤ番号１１、図８、配列ＩＤ番号１、または配列ＩＤ番号１０の位置１で示したＮ末端のグリシン（ＧまたはＧｌｙ）は、配列ＩＤ番号２の“ハースタチン”のアミノ酸残基＃３４１に対応する。
表ＩＩＩ
2004501605.tif 000004
【０１１７】表ＩＩＩ。（別々の２１５人の）ヒトの組織で見いだされた、イントロン８をコードする領域における配列の変異。配列の変異１２〜１６をリストにしてある。それぞれのＸ（多型位置）の後ろにある括弧内の数字は、配列ＩＤ番号１１のヌクレオチド位置［または図８または配列ＩＤ番号１０に示したＤＮＡ配列中のヌクレオチド位置に対応または関係（Ｘ（２５９）の場合）する位置］に対応している。このリストと配列ＩＤ番号１１に示したＤＮＡ配列の変異は、配列ＩＤ番号１２に示した可変アミノ酸位置に対応している［配列ＩＤ番号１または配列ＩＤ番号１０の可変アミノ酸位置（“Ｘａａ”）にも以下のように対応している：Ｘ（１７）がＸａａ（６）に；Ｘ（４９）がＸａａ（１７）に；Ｘ（９２）がＸａａ（３１）に；Ｘ（２１７）がＸａａ（７３）に対応している］。ＤＮＡ配列中の変異Ｘ（２５９）は、非翻訳領域に発生するため、ハースタチンのアミノ酸配列を変化させることはない。同様に、この表の変異は、配列ＩＤ番号１３および配列ＩＤ番号２の可変アミノ酸位置に以下のように対応している：Ｘ（１７）がＸａａ（３４６）に；Ｘ（４９）がＸａａ（３５７）に；Ｘ（９２）がＸａａ（３７１）に；Ｘ（２１７）がＸａａ（４１３）に対応している。配列ＩＤ番号１１と配列ＩＤ番号１２の可変アミノ酸位置に関する（図８の最も一般的なＤＮＡ配列と比べた）具体的なアミノ酸変化は以下の通りである：変異１２、Ｘａａ（６）（プロリン→ロイシン）；変異１３、Ｘａａ（１７）（アルギニン→システイン）；変異１４、Ｘａａ（３１）（アルギニン→イソロイシン）；変異１５、Ｘａａ（７３）（アスパラギン酸→アスパラギン）。変異１６であるＸ（２５９）は非翻訳領域にあるため、アミノ酸の変化はコードしておらず、ヌクレオチド位置２５９のヌクレオチド配列だけを変化させる（すなわちＣ→Ｔ）。同じ置換が、配列ＩＤ番号１３の対応する可変アミノ酸位置に適用される。
【０１１８】ＳＫＯＶ−３卵巣ガン細胞。ヒト卵巣ガンに由来する細胞系（ＳＫＯＶ−３）においてさらに２つの多型が見つかった。この２つの多型があることで、保存されないアミノ酸置換が起こる。１つの多型は、イントロン８配列のヌクレオチド＃１７と“ハースタチン”配列のヌクレオチド＃１０３７における置換（ＣとＴ）である。その結果、イントロン８配列のアミノ酸残基＃６と“ハースタチン”配列（すなわち配列ＩＤ番号２または配列ＩＤ番号１３）のアミノ酸残基＃３４６においてロイシンがプロリンに置換される。ＳＫＯＶ−３卵巣ガン細胞系に見られる第２の多型は、イントロン８配列のヌクレオチド＃２１７と“ハースタチン”配列のヌクレオチド＃１２３７における置換（ＧとＡ）である。その結果、イントロン８配列のアミノ酸残基＃７３と“ハースタチン”配列（すなわち配列ＩＤ番号２または配列ＩＤ番号１３）のアミノ酸残基＃４１３においてアスパラギンがアスパラギン酸に置換される。
【０１１９】重要なことだが、この実施例１２の配列解析において同定された５つの多型部位は、アフリカ系アメリカ人（黒人）からのＤＮＡサンプルにだけ見られた。
実施例１１と１２のまとめ
【０１２０】本発明の実施例１１と１２を合わせると、ＨＥＲ−２遺伝子のイントロン８にある１３個の多型位置が開示されている。実施例１２はＤＮＡサンプルのサイズが比較的大きく、同定された５つの多型部位（そのうちの３つは実施例１１で同定された１０個の多型部位とは異なっている）はアフリカ系アメリカ人（黒人）にだけ見られた。
【０１２１】これら２つの実施例の１３個の多型のうちの１２個（すなわち実施例１２の変異１６を除く）は、イントロン８がｍＲＮＡ内に保持されている場合に、そのイントロン８のうちで（ｐ１８５ＨＥＲ−２の細胞外領域と一緒になって）イン・フレーム・コード配列として機能する部分に存在している。
【０１２２】変異１６に対応する多型は、イントロン８がｍＲＮＡ内に保持されている場合に、そのイントロン８のうちで“非コード”配列のままになっている領域に位置する。イントロン８のこの“非コード”多型部位は、他の多型部位を含むイントロン８の部分から１９ヌクレオチドだけ３’の側すなわち下流に位置し、イントロン８がｍＲＮＡ内に保持されている場合には、（ｐ１８５ＨＥＲ−２の細胞外領域と一緒になって）イン・フレーム・コード配列として機能する。
【０１２３】ＨＥＲ−２のイントロン８のこれら多型は、新奇なＤＮＡ配列およびタンパク質配列と、ＨＥＲ−２を過剰に発現する固形ガンを治療するための新奇な薬理学的組成物と、配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号１２、または配列ＩＤ番号１３に対応するＥＣＤ ＩＩＩａ変異体と結合するモノクローナル抗体とを提供する。ＨＥＲ−２のイントロン８のこれら多型は、ガンの治療および予防のための予後予測方法ならびに診断方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＥＲ−２の細胞外領域に挿入されたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を示す。ＨＥＲ−２のＥＣＤをコードしているエキソン１〜９からの配列（プライマーＡとＢ）は、ＳＫＯＶ−３細胞からのｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって増幅した。約１４２０ｂｐの産物が、サザンブロット解析によりＨＥＲ−２に対して特異的であることがわかった。この産物をサブクローニングし、ヌクレオチド配列を決定した。Ａの項には、２７４ｂｐの挿入体（ボックスの外）のヌクレオチド配列と、ボックス内でヌクレオチド配列に直接隣接した５’配列および３’配列が示してある。この挿入体は、Ｃｏｕｓｓｅｎｓ他のナンバリングを用いると（Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３０巻、１１３２〜１１３９ページ、１９８５年）、ｐ１８５ＨＥＲ−２のヌクレオチド残基１１７１と１１７２の間で、アミノ酸残基３４０の後ろに位置している。矢印で示した共通する５’スプライス部位および３’スプライス部位の拡大図が示してある。挿入された配列は、５’ＨＥＲ−２エキソン配列とインフレームであり、アルギニン３４０（Ｒ３４０）に続く７９個のアミノ酸延長部をコードしていることが推定される。この挿入体によってコードされる新奇な７９個のアミノ酸配列はプロリン・リッチ（１９％）であり、アスパラギンが結合する共通グリコシル化部位を有する。終止コドンが、挿入された配列のヌクレオチド２３６〜２３８の位置に見つかった。Ｂの項には、予測される新たな転写産物が、ｐ１８５と一致するサブドメインＩとＩＩを含む分泌タンパク質断片であり、膜貫通領域と細胞質領域を欠いていることを示してある。完全にグリコシル化された場合に予想されるサイズは６５〜７０ｋＤａである。このポリペプチド産物は、ｐ６８ＨＥＲ−２と呼ばれる。したがってこの産物は、ｐ１８５ＨＥＲ−２で見つかった膜貫通領域と細胞質領域を欠いている分泌タンパク質断片であろう。
【図２】ＥＣＤ ＩＩＩａを含む新たなＨＥＲ−２転写産物をノーザンブロット解析で検出した結果を示す。さまざまなヒト胎児組織（クロンテック社）またはＨＥＫ−２９３細胞からのポリＡ＋ｍＲＮＡ（２．５μｇ）をホルマリン・アガロース・ゲルに溶解させ、１０×ＳＳＣ中のブライトスター（登録商標）膜（アンビオン社）に移した。この膜を、ＥＣＤ ＩＩＩ配列と相補的な３２Ｐ標識アンチセンスＲＮＡプローブとハイブリダイズさせ、分離させ、５’ＨＥＲ−２エキソン配列に対して特異的な３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブで再度調べた。膜を非常に厳しい条件下で洗浄し、リン光画像装置（モレキュラー・ダイナミックス社）で解析した。
【図３】抗ＥＣＤ ＩＩＩａが、ヒト胚性腎臓細胞系（ＨＥＫ２９３）の約６８ｋＤａのタンパク質に対して配列特異的な反応をすることを示している。細胞抽出タンパク質（２０μｇ）と、ＨＥＫ２９３細胞によって調整した２０μｌの培地に対してウエスタンブロット解析を行ない、１：１０，０００に希釈した抗ＥＣＤ ＩＩＩａ（レーン１と２）、またはヒスチジン・タグを有する５０μｇ／ｍｌの精製ＥＣＤ ＩＩＩａペプチドを含む、１：１０，０００に希釈した抗ＥＣＤ ＩＩａ（レーン３と４）をプローブにして調べた。
【図４】ＨＥＲ−２遺伝子が増幅したガン細胞系ではｐ６８ＥＣＤ ＩＩＩａの発現と比べてｐ１８５ＨＥＲ−２の発現が顕著に増大していることを示す。ヒト胚性腎臓細胞系（ＨＥＫ２９３）からの細胞抽出物（タンパク質１５μｇ）、非発ガン性卵巣表面上皮細胞系（ＩＯＳＥＶＡＮ）、ＨＥＲ−２遺伝子が増幅した卵巣ガン細胞系（ＳＫＯＶ−３）、非発ガン性乳房上皮細胞系（ＨＢＬ１００）、ＨＥＲ−２遺伝子が増幅した乳ガン細胞系（ＢＴ４７４とＳＫＢＲ−３）を７．５％のアクリルアミド・ゲル中でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離させ、ウエスタンブロット法で解析した。ウエスタンブロット法では、プローブとしてｐ６８ＨＥＲ−２に対して特異的な抗体（抗ＥＣＤ ＩＩＩａ）とｐ１８５ＨＥＲ−２に対して特異的な抗体（アンチｎｅｕ（Ｃ））の両方を用いた。
【図５】ｐ６８ＥＣＤ ＩＩＩａがｐ１８５ＨＥＲ−２に結合している様子を示す。Ａの項では、非変性性緩衝溶液中に抽出した２ｍｇのＳＫＢＲ−３細胞を、ｐ６８ＨＥＲ−２とｐ１８５ＨＥＲ−２のＮ末端配列に対して特異的な５μｌのアンチｎｅｕ（Ｎ）とともに、またはｐ１８５ＨＥＲ−２のＣ末端に対して特異的な５μｌのアンチｎｅｕ（Ｃ）とともに免疫沈降させ、ｐ６８ＨＥＲ−２に対して特異的な抗ＥＣＤ ＩＩＩａとｐ１８５ＨＥＲ−２に対して特異的なアンチｎｅｕ（Ｃ）の両方をプローブとしてウエスタンブロット解析を行なった。Ｂの項では、１００μｇの１７−３−１細胞抽出物を、ヒスチジン・タグを有する２０μｇのＥＣＤ ＩＩＩａまたはヒスチジン・タグを有する２０μｇのＣＲＥＢ断片と結合させた充填容積が５０μｌのＮｉＮＴＡアガロース樹脂（キアジェン社）とともに２００μｌの洗浄用緩衝溶液（２０ｍＭのトリス ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ）中で室温にて１時間撹拌しながら培養した。なお、同じものを２つ用意した。次にこの樹脂を５００μｌの洗浄用緩衝溶液で４回洗浄し、５０μｌのＳＤＳ−サンプル緩衝溶液とともに１００℃で２分間培養することにより、タンパク質を溶離させた。溶離したタンパク質は、ｐ１８５ＨＥＲ−２のＣ末端に対して特異的な抗体、すなわちアンチｎｅｕ（Ｃ）を用いてウエスタンブロット法で解析した。Ｃの項では、３Ｔ３細胞、またはＨＥＲ−２をトランスフェクションした１７−３−１細胞約１０５個からなる単層を１２のウエル・プレートに入れたものをＰＢＳで２回洗浄し、次に、血清フリーで１％のＢＳＡを含む培地０．５ｍｌ、ならびにヒスチジン・タグを有する精製した３９、７５、１５０、３００ｎＭの組み換えＥＣＤ ＩＩＩａとともに４℃で２時間にわたって培養した。細胞を、１％のＢＳＡを含むＰＢＳの中で１回洗浄し、ＰＢＳの中で２回洗浄し、変性用緩衝溶液中に抽出した。等量の複数のアリコート（タンパク質２０μｇ）を、ＥＣＤ ＩＩＩａに対して特異的な抗体（抗ＥＣＤ ＩＩＩａ）、またはｐ１８５ＨＥＲ−２に対して特異的な抗体（アンチｎｅｕ（Ｃ））を用いて（上の列）ウエスタンブロット法で解析した。
【図６】ｐ６８リッチにした培地もＥＣＤ ＩＩＩａペプチドもｐ１８５ＨＥＲ−２のチロシンリン酸化を促進できないことを示している。ＨＥＲ−２をトランスフェクションした約１０５個の１７−３−１細胞をＰＢＳで２回洗浄し、血清フリーの培地中で３７℃にて２４時間培養し、ヒスチジン・タグを有する７５または１５０μｌのＥＣＤ ＩＩＩａ、または高レベルのｐ６８を分泌するＨＥＫ−２９３細胞からの５０×ＣＭ、またはｐ６８ＨＥＲ−２が検出できないＳＫＯＶ−３細胞からの５０×ＣＭを用いて１０分間処理した。処理した細胞は、ホスホチロシンホスファターゼ阻害剤のバナジウム塩（２ｍＭ）を含む変性用緩衝溶液で抽出し、各サンプルからの細胞抽出タンパク質２０μｇ／ｍｌを、ホスホチロシンに対するモノクローナル抗体（シグマ社）を用いてウエスタンブロット法で解析した。６２．５ｍＭのトリスｐＨ６．７と、２％のＳＤＳと、１００ｍＭの２−メルカプトエタノールの中で５５℃にて３０分間にわたって培養することによりブロットをストリップし、ｐ１８５ＨＥＲ−２に対して特異的なアンチｎｅｕ（Ｃ）をプローブとしてこのブロットを再度調べた。
【図７】ｐ６８ＨＥＲ−２が、発ガン性細胞の基質とは独立な成長を抑制したことを示している。ＳＣＯＶ−３卵巣ガン細胞と、ＨＥＲ−２をトランスフェクションした１７−３−１細胞を、０．３％の寒天を含む１０％のウシ胎仔血清を加えた培地（対照条件）中に分散させ、この培地に、ＳＣＯＶ−３細胞によって調整した５０×濃縮培地（検出可能なレベルのｐ６８ＨＥＲ−２を含まない（−ｐ６８ＣＭ））、またはＨＥＫ−２９３細胞によって調整した５０×濃縮培地（２０ｎＭのｐ６８ＨＥＲ−２を含む（＋ｐ６８ＣＭ））を添加した。１２個のウエル・プレートに０．５％のアガロースを含む０．５ｍｌの培地を層状に入れ、その上に５×１０３個の細胞を加えたものをそれぞれの実験条件ごとに全部で３通り用意した。図示した結果は、３通り用意したウエル中の５０個を超える細胞からなるコロニーの数を、培養開始後２１日目のときに数えた平均値と標準偏差をプロットしたものである。同様の結果が３つの別々の実験でも観察された。
【図８】ＨＥＲ−２のイントロン８のヌクレオチドと、推定されるアミノ酸配列を示す。ヒトのゲノムＤＮＡに対し、イントロン８に隣接するプライマーを用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲパラメータは、９４℃にて１分間、６２℃にて１分間、７２℃にて３０秒間を３０サイクルの後、７２℃にて７分間を１サイクルであった。４１０ｂｐの産物をゲルで精製し、順方向と逆方向にシークエンシングした。図示した配列は、別々の約１５人からのイントロン８で見つかった最も一般的な配列である。配列が変異してアミノ酸の置換が起こる可能性のある箇所はＸで示してある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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