(57)【要約】本発明は、Ｉ型糖尿病の治療および予防のための組成物および方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫応答が阻害されるように被検体に有効量のＩＧＦ−２ペプチドを投与することを含む、被検体の自己免疫応答を阻害する方法。
【請求項２】
Ｔｈ２免疫応答が誘導されるように被検体に有効量のＩＧＦ−２ペプチドを投与することを含む、被検体のＴｈ２免疫応答を誘導する方法。
【請求項３】
免疫寛容が被検体に誘導されるように該被検体に有効量のＩＧＦ−２ペプチドを投与することを含む、Ｉ型糖尿病を発症する危険がある被検体に免疫寛容を誘導する方法。
【請求項４】
免疫寛容が被検体に再構築されるように該被検体に有効量のＩＧＦ−２ペプチドを投与することを含む、Ｉ型糖尿病を患っている被検体に免疫寛容を再構築する方法。
【請求項５】
被検体でＩ型糖尿病疾患が予防されるように該被検体に有効量のＩＧＦ−２ペプチドを投与することを含む、被検体のＩ型糖尿病を予防する方法。
【請求項６】
被検体でＩ型糖尿病疾患が治療されるように該被検体に有効量のＩＧＦ−２ペプチドを投与することを含む、被検体のＩ型糖尿病を治療する方法。
【請求項７】
被検体をＩ型糖尿病から保護するのに有効な量でＩＧＦ−２ペプチドを投与することを含む、Ｉ型糖尿病を発症する危険がある被検体を保護する方法。
【請求項８】
移植片拒絶が治療されるように被検体にＩＧＦ−２ペプチドを投与することを含む、島β細胞の移植を受ける被検体の移植片拒絶を治療する方法。
【請求項９】
移植片拒絶が予防されるように被検体にＩＧＦ−２ペプチドを投与することを含む、島β細胞の移植を受ける被検体の移植片拒絶を予防する方法。
【請求項１０】
前記ＩＧＦ−２ペプチドは、アミノ配列ＧＥＬＶＤＴＬＱＦＶＣＧＤＲＧ（配列番号：２；Ｂ１１−２５）を含む、請求項１〜９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
ＩＧＦ−２ペプチドおよび該ＩＧＦ−２ペプチドに対する医薬上許容可能なキャリアを含む、Ｉ型糖尿病を発症する危険がある被検体を保護するワクチン組成物であって、該ＩＧＦ−２ペプチドは該被検体の該Ｉ型糖尿病を防ぐのに有効な量である、Ｉ型糖尿病を発症する危険がある被検体を保護するワクチン組成物
【請求項１２】
ＩＧＦ−２ペプチドおよび医薬上許容可能なキャリアを含む、Ｉ型糖尿病を発症する危険がある被検体に免疫寛容を誘導するワクチン組成物であって、該ＩＧＦ−２ペプチドは該被検体に免疫寛容を誘導するのに有効な量である、Ｉ型糖尿病を発症する危険がある被検体に免疫寛容を誘導するワクチン組成物。
【請求項１３】
前記ＩＧＦ−２ペプチドは、アミノ配列ＧＥＬＶＤＴＬＱＦＶＣＧＤＲＧ（配列番号：２；Ｂ１１−２５）を含む、請求項１１〜１２のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１４】
ＩＧＦ−２ペプチドが抗原提示細胞（樹状細胞など）で発現されるように、被検体の細胞にＩＧＦ−２ペプチドをコードする核酸分子をトランスフェクトする方法であって、以下、
（ａ）該細胞を該被検体から単離すること、
（ｂ）該遺伝子が該抗原提示細胞で発現されるように該ＩＧＦ−２ペプチドをコードする核酸分子を該細胞に導入すること、および
（ｃ）該抗原提示細胞を該被検体に再導入すること、を含む、前記方法。
【請求項１５】
ＩＧＦ−２ペプチドをコードする核酸分子を含むベクター。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
［発明の背景］
真性糖尿病は、世界中で最も頻度の高い代謝疾患である。米国では、毎日新たに約１７００例が糖尿病と診断され、そして糖尿病であるアメリカ人１６００万人の少なくとも１／３がそれに気付いていない。糖尿病の合併症は、寿命と生活の質を損なわせるが、これには粥状硬化性心疾患、壊疽、および発作、ならびに糖尿病性網膜症（失明に至る網膜変化）、神経障害、および腎障害が含まれる。
【０００２】
正常なグルコース恒常性（homeostasis)は、グルカゴンなどの対抗調節性ホルモンの分泌で繊細にバランスを取られる、血糖値の微妙な変化に応答した膵臓β細胞によるインスリン分泌の繊細に調律された編成を必要とする。糖尿病は、Ｉ型とＩＩ型の２つの型に分けることができる。Ｉ型糖尿病（またはＩＤＤＭ）は、ヒトの糖尿病全体の１０％に相当し、膵臓β細胞の自己免疫破壊によって生じ、インスリン欠乏症を引き起こす。ＩＩ型糖尿病すなわちインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は症例の９０％の割合を占め、そして（１）末梢組織、特に骨格筋および脂肪細胞でのグルコース摂取におけるインスリン作用への抵抗、（２）肝臓の糖産生を阻害するインスリン作用が損なわれること、および（３）無調節なインスリン分泌、の三本柱で特徴付けられる（例えば、DeFronzo (1997) Diabetes Rev. 5: 177-269を参照）。ほとんどの場合において、ＩＩ型糖尿病は複雑な遺伝パターンを有する多遺伝子疾患である（Kahn, et al., (1996) Annu. Rev. Med. 47: 509-531に総説される）。
【０００３】
ＩＤＤＭを生じさせる、またはそれ以外でＩＤＤＭ開始に関与する一連の自己免疫学的事象は、あまり理解されていない。この有害な自己免疫応答に関与するのは、免疫グロブリン分泌Ｂ細胞を含むエフェクター免疫細胞、すなわちＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球、ならびにインスリン、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）６５および６７アイソタイプ、熱ショックタンパク質６０、ＩＡ−２、ならびにいくつかの特性未決定ＩＣＡを含む複数の自己抗原である（例えば、Atkinson, M. A. (1994) N. Engl. J. Med. 331: 1428-1436; Delovitch, T. L. et al. (1997) Immunity 7: 727-738; および Durinovic-Bello, I. (1998) Autoimmunity 27: 159-177を参照）。これらの同定された自己抗原のうち、インスリンは、ＩＤＤＭのヒトモデルおよび動物モデルの両方で発達に重要な役割を果たすことが示されている（例えば、Semple, J. W. et al. (1992) Int. Immunol. 4: 1161-1167; Wegmann, D. R. et al. (1994) J. Autoimmun. 7: 833-843; Rudy, G. et al. (1995) Mol. Med. 1: 625-633; および Griffin, A. C. et al. (1995) Am. J. Pathol. 147: 845-857を参照）。しかしながら、これらの自己抗原の特性決定にも関わらず、自己免疫プロセスの病態生理学は未解明のままである。
【０００４】
最新の仮説の１つは、免疫系の特定の自己反応性が中枢性自己寛容の胸腺確立の欠陥から発達する可能性があることである（例えば、Martens, H. et al. (1996) Immunol. Today 17: 312-317; Geenen, V. et al. (1998) Diabetes Metab. Rev. 14: 95-103; および Geenen, V. et al. (1998) J. Neuroendocrinol. 10: 811-822を参照）。一次造血部位（すなわち、胎児卵黄嚢、胎児肝臓、および次いで骨髄）内でのリンパ幹細胞の形成に続いて、リンパ幹細胞は胸腺内に移動し、そこでそれらは胸腺信号により誘導されて増殖、遺伝子再構成、および分化のプログラムを起こす。これらの特異的な胸腺での事象は、多彩なレパートリーのＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）の組み合わせを発現する多数の未成熟二重陽性ＣＤ４＋／ＣＤ８＋胸腺細胞の産生をもたらす。このレパートリーは、次いで、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）との関連で自己抗原を認識するＴ細胞が、無視によるかまたはネガティブ選択により死に誘導されるように、厳密な選別にかけられる（例えば、Kisielow, P. et al. (1988) Nature 333: 742-746を参照）。自己反応性Ｔリンパ球のこの効率的な欠失が、免疫系の中枢性自己寛容の原因である。胸腺の寛容原性機能は、胸腺組織の異なる細胞コンポーネント：上皮細胞／ナース細胞（ＴＥＣ／ＴＮＣ）、マクロファージ、および樹状細胞により媒介される（例えば、Bonomo, A. et al. (1993) J. Exp. Med. 177: 1153-1164 、および Sprent, J. (1995) Int. Rev. Immunol. 13: 95-105を参照）。神経内分泌機能の中枢Ｔ細胞免疫寛容は、神経内分泌ファミリーの主要な一員の胸腺内発現により媒介されると提唱されている（例えば、Martens, H. et al. (1996) 前出、およびGeenen, V. et al. (1998) 前出、を参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
インスリンの免疫寛容を再構築するために、いくつかの手順が行われてきたが成功していない。例えば、インスリンの経口投与は、遅発（recent-onset）ＩＤＤＭで残存するβ細胞機能を保護することに成功しなかった（例えば、Chaillous, L. et al. (2000) Lancet 356: 545-549 、およびpozzilli, P. et al. (2000) Diabetologia 43: 1000-1004を参照）。そのうえ、ＩＤＤＭの患者のハイリスクの親類にインスリンを皮下投与しても、疾患の開始を遅らせることも阻止することもなかった（例えば、ＤＰＴ−Ｉ型糖尿病研究群（DPT-Type I Diabetes Study Group) (2002) N. Engl. J. Med. 346: 1685- 1691を参照）。Neurocrine Bioscience, Inc. (San Diego, California)による別の研究は、インスリンの配列Ｂ９−２３に対する細胞性免疫応答がＩＤＤＭの患者に生じたことを実証した（例えば、Alleva, D. G. et al. (2001) J. Clin. Invest. 107: 173-180を参照）。具体的には、細胞性免疫応答は、インスリンＢ９−２３ペプチドの存在に反応してＩＦＮ−γを多量に産生する炎症誘発性プロファイルを示す、ＣＤ４媒介型、ＨＬＡ−ＩＩ限定免疫応答であった。上記挑戦のそれぞれにおいて、インスリン自己抗原、またはそのペプチドの使用は、ＩＤＤＭの予防または治療をもたらすことに失敗した。そのうえ、ペプチドＢ９−２３が、ＮＯＤマウスにおいて、糖尿病の発現率に拍車をかけ、かつ致死アナフィラキシーを誘導することから、インスリンの配列Ｂ９−２３の強力な免疫原性がさらに最近確かめられた（例えば、Liu, E. et al. (2002) J. Clin. Invest. 110 : 1021-1027を参照）。このように、膵臓β細胞の破壊に関わる自己抗原に対する免疫寛容を誘導する身体の能力を改善する治療が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
［発明の概要］
本発明は、ＩＤＤＭの治療および／または予防のための、自己免疫応答、例えば、Ｔｈ１性（mediated：媒介性、介在性）免疫応答を阻害する効果的方法を提供する。本発明は、少なくとも一部は、神経内分泌自己抗原が、相同（または「変化した」自己）神経内分泌自己抗原とは対照的に、免疫系に強力な寛容原性または調節効果を及ぼすという発見に基づく。したがって、インスリンは１型糖尿病の主要かつ最大のβ細胞特異的自己抗原であるが、インスリン成長因子（ＩＧＦ）−２はインスリンファミリーの寛容原性自己抗原前駆体である。哺乳類において、インスリン遺伝子／タンパク質ファミリーは、主にインスリン（ＩＮＳ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、およびインスリン様成長因子２（ＩＧＦ−２）の３種からなる。タンパク質レベルでは、ＩＧＦ−２は、様々な種からの胸腺上皮細胞で発現される、このファミリーの優勢な成員であるとして同定されている（例えば、 Greenen, V. et al. (1993) Thymus 21 : 115-127を参照）。ＩＮＳ転写物もまた、胸腺で同定されており、ＩＮＳｍＲＮＡのレベルはＩＤＤＭにかかりやすい対立遺伝子と相関しているが、しかしながら胸腺ＩＮＳレベルは非常に低い（例えば、Jolicoeur, C. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 6707-6711 ; Pugliese, A. et al. (1997) Nat. Genet. 15: 293-297; および Vafiadis, P. et al. (1997) Nat. Genet. 15: 289-292を参照)。
【０００７】
本発明は、被検体、例えばヒトなどの哺乳類に、有効量のＩＧＦ−２ペプチドを投与することによる、自己免疫応答、例えばＴｈ１性免疫応答を阻害する方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、被検体に、有効量のＩＧＦ−２ペプチドを投与することによる、Ｔｈ２性免疫応答を誘導する方法を特色とする。
【０００８】
他の態様において、本発明は、Ｉ型糖尿病を発症する危険があるかまたはＩ型糖尿病を患っている被検体に、それぞれ、免疫寛容を誘導または再構築する方法を提供する。これらの方法は、被検体に免疫寛容を誘導または再構築するのに有効な量で、本発明のＩＧＦ−２ペプチドを被検体に投与することを含む。
【０００９】
さらに別の態様において、本発明は、被検体のＩ型糖尿病を予防または治療する方法を提供する。この方法は、Ｉ型糖尿病が被検体で予防または治療されるように、有効量の本発明のＩＧＦ−２ペプチドを被検体に投与することを含む。
【００１０】
別の態様において、本発明は、Ｉ型糖尿病を発症する危険が高い被検体を保護する方法を提供する。この方法は、危険のある被検体がＩ型糖尿病の発症から保護されるように、有効量のＩＧＦ−２ペプチドを危険の高い被検体に投与することを含む。
【００１１】
さらに別の態様において、本発明は、島(islet)β細胞移植を受ける被検体における移植片拒絶を治療または予防する方法を提供する。この方法は、島β細胞移植を受ける被検体における移植片拒絶を予防または治療するのに有効な量で本発明のＩＧＦ−２ペプチドを被検体に投与する工程を含む。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、Ｉ型糖尿病を発症する危険性がある被検体を保護するワクチンを提供し、ここでワクチンは本発明のＩＧＦ−２ペプチドおよび医薬上許容可能なキャリアを含む。別の態様において、本発明は、Ｉ型糖尿病を発症する危険性がある被検体に免疫寛容を誘導するワクチンを提供し、ここでワクチンは本発明のＩＧＦ−２ペプチドおよび医薬上許容可能なキャリアを含む。さらに別の態様において、本発明は、本発明のＩＧＦ−２ペプチドおよび医薬上許容可能なキャリアを含む医薬組成物を提供する。
【００１３】
特定の実施形態において、本発明は、Ｉ型糖尿病から被検体を保護する有効量で本発明のワクチンを被検体に投与することにより、被検体をＩ型糖尿病から保護する方法を提供する。他の実施形態において、本発明は、被検体に免疫寛容を誘導するのに有効な量で有効量の本発明のワクチンを被検体に投与することにより、被検体にＩ型糖尿病に対する免疫寛容を誘導する方法を提供する。
【００１４】
本発明のＩＧＦ−２ペプチドは、配列番号：１のＩＧＦ−２タンパク質、または免疫応答を調節する能力があるそのフラグメントを含む。特定の実施形態において、ＩＧＦ−２ペプチドは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００アミノ酸を含む。別の実施形態において、本発明のＩＧＦ−２ペプチドは、アミノ酸配列ＧＥＬＶＤＴＬＱＦＶＣＧＤＲ（配列番号：２；Ｂ１１−２５）を含む。別の実施形態において、ＩＧＦ−２ペプチドは改変ペプチドリガンド（ＡＰＬ）である。特定の実施形態において、本発明のＩＧＦ−２ペプチドは、被検体のＨＬＡ−Ｄ対立遺伝子に結合する能力がある。１つの実施形態において、ＨＬＡ−Ｄ対立遺伝子はＨＬＡ−ＤＱである。別の実施形態において、ＨＬＡ−Ｄ対立遺伝子はＨＬＡ−ＤＱ８である。別の実施形態において、ＨＬＡ−ＤＱ対立遺伝子はＨＬＡ−ＤＱ２である。
【００１５】
特定の実施形態において、ＩＧＦ−２ペプチドの安定性を増加させるために、ＩＧＦ−２ペプチドは、修飾、例えば変更または改変される。別の実施形態において、ＩＧＦ−２ペプチドの修飾は、ＩＧＦ−２ペプチドの低い免疫原性をさらに低下させる。特定の実施形態において、ＩＧＦ−２ペプチドは、ＰＥＧ化により修飾される。他の実施形態において、ＩＧＦ−２ペプチドは、ＩＧＦ−２ペプチドをＭＨＣクラスＩＩ二量体と複合化させることにより、修飾される。
【００１６】
本発明はまた、Ｉ型糖尿病に対して被検体を免疫化する、またはＩ型糖尿病を患っている被検体を治療するキットを特色とする。これらのキットは、発明のＩＧＦ−２ペプチド、および随意に使用説明書を含む。
【００１７】
［発明の詳細な説明］
［定義］
本発明をさらに記載する前に、そして本発明がより容易に理解されるようにするために、特定の用語を最初に定義し、そして便宜上ここにまとめる。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、用語「ＩＧＦ−２ペプチド」または「ＩＧＦ−２分子」は、天然に生じるＩＧＦ−２、天然および非天然の機能性類似体、ならびに免疫応答を阻害する能力があるそれらのフラグメントおよび誘導体を示す。ＩＧＦ−２のアミノ酸配列は、（配列番号：１）として記載される。複数の保護、非保護、および部分保護した、天然および非天然の機能性類似体ならびにＩＧＦ−２誘導体もまた本発明の範囲内にあると意図される。当該技術分野で既知のとおり、アミノ酸残基は、それらが（１）アミノ基およびカルボキシ基の両方が適切な保護基を有する保護型でも、（２）アミノ基またはカルボキシ基のいずれかが適切な保護基を有する部分保護型でも、または（３）アミノ基およびカルボキシ基のいずれも適切な保護基を有さない非保護型でもよい。そのような保護基を形成および除去する多数の反応が複数の標準的な業書に記載され、例えば、「有機化学の保護基（Protective Groups in Organic Chemistry）」, Plenum Press (London and New York, 1973), Green, T. H.,「有機合成の保護基（Protective Groups in Organic Synthesis）」, Wiley (New York, 1981),および「ペプチド（The Peptides）」, Vol.1, Schroder and Lubke, Academic Press (London and New York, 1965)が挙げられる。そのような型の全てが本発明に包含される。代表的なアミノ保護基として、例えば、ホルミル、アセチル、イソプロピル、ブトキシカルボニル、フルオレニルメトキシカルボニル、カルボベンジルオキシなどが挙げられる。代表的なカルボキシ保護基として、例えば、ベンジルエステル、メチルエステル、エチルエステル、ｔ−ブチルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステルなどが挙げられる。
【００１９】
アミノ基およびカルボキシ基の両方が適切な保護基を有する保護型に加え、本発明のＩＧＦ−２ペプチドは修飾もされ得る。本明細書中で使用される場合、用語「修飾された」は、ＩＧＦ−２ペプチドの安定性または半減期を増加させるために、修飾、例えば、変更、改変などされたＩＧＦ−２ペプチドを示す。そのような修飾として、ＰＥＧ化、ＩＧＦ−２ペプチドのＭＨＣ四量体との、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ四量体との複合化などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの修飾されたペプチドの調製法は、当業者に既知である。
【００２０】
同じく本発明の範囲内であるのは、天然に生じるＩＧＦ−２ペプチドの誘導体であり、これらは、天然に生じる配列のフラグメント化により得られるか、または、配列をコードする遺伝子材料（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の天然に生じるアミノ酸配列の配列の知識に基づいて合成される。本明細書中で使用される場合、用語「改変ペプチドリガンド」は、本来の配列には存在しない１つまたは複数のアミノ酸が付加または欠失された天然または非天然のＩＧＦ−２ペプチドおよびＩＧＦ−２ペプチドの類似体、ならびにそれらの誘導体の化学修飾を示す。改変ペプチドリガンドの例として、Alleva, D. G. et al.により記載される、ＩＮＳのＢ９−２３ペプチド内の様々な場所でアラニン置換基を挿入することにより当該ペプチドが修飾されたもの（例えば、Alleva, D. G. et al. (2002) Diabetes 51: 2126-2134を参照）、１６位および１９位にアラニン置換基を含む米国特許第６，１９７，９２６号に記載されるような改変ペプチドＮＢＩ−６０２４、およびKappos, et alにより記載される、改変ミエリン（mylein）塩基性タンパク質ペプチドＤ−Ａｌａ８３−Ｌｙｓ８４−Ｌｅｙ８９−Ａｌａ９１−ＭＢＰ８３−９９を含むもの（例えば、Kappos et al., (2000) Nat. Med. 1176-1182を参照）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
記載される配列の一部分またはセグメントもまた、自己抗原（すなわち膵臓島β細胞に特異的な自己免疫原性Ｔ細胞）を認識するＴ細胞を調節するが、自己抗原を認識しないＴ細胞に対しては調節しない免疫系に影響を及ぼす所望のＩＧＦ−２ペプチドまたはそのフラグメントの特徴を十分有するかぎり、本発明で用いられ得ることが理解されるだろう。配列におけるそのような改変は、例えば、代替配列を合成することにより容易になされ得る。次いで、代替配列は、例えば、脊椎動物モデルなどのモデルで、その有効性を確かめるために試験され得る。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、用語「フラグメント」は、Ｔ細胞を調節する免疫系に影響を及ぼし得る（例えば、免疫寛容を誘導する、Ｔｈ１自己免疫応答を阻害する、Ｔｈ２性免疫応答を誘導するなど）ＩＧＦ−２ペプチドのアミノ酸配列が保存されたサブセットを意味する。この用語は、付加配列または部分と連結もしくは結合した、例えば、ペプチドが他のアミノ酸配列と、またはキャリアとカップリングしているようなフラグメントを含むことが意図される。したがって、ペプチドはＩＧＦ−２タンパク質の最も一般的なフラグメントとなることから、用語「フラグメント」および「ペプチド」は同義に用いられ得る。本明細書中、ＩＧＦ−２ペプチドの「フラグメント」、「部分」、または「セグメント」への言及は、その組成物が無処置のＩＧＦ−２タンパク質由来でなければならないことを意味しない。そのような「フラグメント」、「部分」、または「セグメント」は、例えば、手動または自動ペプチド合成、様々なクローニング方法、あるいは全ＩＧＦ−２タンパク質の酵素処理などの当業者に既知である様々な手段により生成され得る。特定の実施形態において、ＩＧＦ−２ペプチドはアミノ酸配列ＧＥＬＶＤＴＬＱＦＶＣＧＤＲ（配列番号：２）を含む。他の実施形態において、ＩＧＦ−２ペプチドは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００アミノ酸を含む。特定の実施形態において、本発明のＩＧＦ−２ペプチドは、被検体のＨＬＡ−Ｄ対立遺伝子に結合する能力がある。１つの実施形態において、ＨＬＡ−Ｄ対立遺伝子はＨＬＡ−ＤＱである。別の実施形態において、ＨＬＡ−Ｄ対立遺伝子はＨＬＡ−ＤＱ８である。別の実施形態において、ＨＬＡ−ＤＱ対立遺伝子はＨＬＡ−ＤＱ２である。
【００２３】
用語「ペプチド」または「ポリペプチド」は、本明細書中、その最も広義、すなわち、ペプチド結合を通して連結したアミノ酸の任意のポリマー（ジペプチドまたはそれより大きい）で使用される。したがって、用語「ペプチド」は、タンパク質、オリゴペプチド、タンパク質フラグメント、突然変異タンパク質、融合タンパク質などを含む。用語「タンパク質」は、本明細書中、天然に生じるポリペプチドを指定するのに使用される。本発明のペプチドは、当該技術分野で既知の技法を用いて合成され得るか、またはＤＮＡもしくはＲＮＡなどの核酸によりコードされ得る。
【００２４】
本発明はまた、宿主細胞で発現される能力があるベクターに操作可能に連結された、ＩＧＦ−２ペプチドをコードする核酸配列を含む組換え分子を含む。ＤＮＡ「コード配列」または特定のペプチドもしくはタンパク質を「コードするヌクレオチド配列」は、適切な制御配列の制御下に置かれた場合に宿主細胞で転写されてポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５'（アミノ）末端での開始コドンおよび３'（カルボキシ）末端での翻訳終止コドンにより決められる。コード配列として、原核生物配列、ｃＤＮＡ配列、真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳類）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえもが挙げられ得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、通常、コード配列に対して３'に配置される。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「操作可能に連結された」は、宿主細胞中に形質転換された場合に、核酸配列が発現されることができるような様式で、発現ベクターに核酸配列を挿入することを示す。本明細書中で使用される場合、「発現ベクター」は、宿主細胞を形質転換し、そして適切な核酸配列の発現に作用する、例えば宿主細胞内で複製する能力がある、ＲＮＡまたはＤＮＡベクターである。発現ベクターは、原核生物または真核生物のいずれかであることができ、そして通常はウイルスまたはプラスミドである。
【００２６】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技法を介して、原核生物細胞または真核生物細胞中に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔法を含む、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞中に導入するさまざまな当該技術分野で認められた技法を示すことが意図される。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするのに適した方法は、Sambrook et al. (「分子クローニング：実験室手引書（Molecular Cloning : A Laboratory Manual）」2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)、および他の実験室手引書に見いだされ得る。
【００２７】
哺乳類細胞の安定なトランスフェクションについては、用いた発現ベクターおよびトランスフェクション技法に依存して、細胞の小さなフラクションのみが外来ＤＮＡを自らのゲノム中に組み込まれうることは既知である。これらの組み込み体を同定して選別するために、一般的に、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性）をコードする遺伝子が、目的の遺伝子と一緒に宿主細胞中に導入される。好ましい選択可能なマーカーとして、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキセートなどの薬物への耐性を与えるものが挙げられる。選択可能なマーカーをコードする核酸は、本発明のＩＧＦ−２ペプチドをコードするものと同じベクター上で宿主細胞中に導入され得るか、または別々のベクター上で導入され得る。導入された核酸で安定してトランスフェクトされる細胞は、薬物選別により同定され得る（例えば、選択可能な標識遺伝子が組み込まれた細胞は生存するが、他の細胞は死ぬ）。
【００２８】
調節配列として、核酸の転写および翻訳に必要なものが挙げられ、そしてプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、および分子を適切な細胞区画(compartment)に輸送するのに必要な配列を含み得る。核酸がｃＤＮＡ、組換え発現ベクターの場合、ｃＤＮＡの転写および／または翻訳の原因である調節機能は、しばしばウイルス配列により提供される。一般的に用いられるウイルスプロモーターの例として、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス４０、ならびにレトロウイルスＬＴＲ由来のものが挙げられる。
【００２９】
核酸に結合した調節配列は、例えば、誘導性エンハンサーの使用により、構成的または誘導的転写を提供するように選択され得る。したがって、本発明の特定の実施形態において、本発明のＩＧＦ−２ペプチドをコードする核酸分子は、その核酸を含む宿主細胞（単数または複数）が誘導性制御エレメントに影響を及ぼす薬剤と接触することまたは接触しないことそれぞれにより遺伝子を発現させたりまたはさせなかったりし得るようにして、誘導性制御エレメントの制御下にある。本発明の他の実施形態において、本発明のＩＧＦ−２ペプチドをコードする核酸分子は、核酸分子の発現を構成的に駆動するプロモーターの制御下にある。操作可能に連結された核酸分子の構成的発現を駆動する調節エレメントは、ウイルスエレメントであり得る（例えば、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、サルウイルス４０、またはレトロウイルス由来）。
【００３０】
適した宿主細胞とは、本発明のペプチドを産生する能力がある任意の細胞であり得る。そのような宿主細胞として、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、および哺乳類細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の宿主細胞はまた、ＭＨＣ分子を自然に発現する細胞であり得るか、またはＭＨＣ分子を発現する能力があり、そして本発明のペプチドを産生してそれらをＭＨＣ分子上に提示し得る細胞である。例として、Ｔ細胞およびＢ細胞などの抗原提示細胞、樹状細胞、ならびにマクロファージが挙げられるが、これらに限定されない。他の例として、細胞表面でＭＨＣクラスＩ分子を発現させる非免疫細胞が挙げられ、線維芽細胞、上皮細胞、および内皮細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
「プロモーター配列」は、細胞のＲＮＡポリメラーゼと結合して下流（３'方向の）コード配列の転写を開始する能力があるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的のため、プロモーター配列はコード配列の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）により３'末端で結合され、そしてバックグラウンドより上の検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な、最小数の塩基またはエレメントを含むように上流（５'方向）に延びる。プロモーター配列内に、転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１でのマッピングにより便宜上定義される）、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合の原因であるタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見いだされるだろう。真核生物プロモーターは、常にではないが、しばしば、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含む。原核生物プロモーターは、−１０および−３５コンセンサス配列に加えてシャイン・ダルガーノ（Shine-Dalgarno）配列を含む。
【００３２】
用語「Ｉ型糖尿病」または「インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）」（「若年発症糖尿病」または「ケトン症易発性（ketosis-prone）糖尿病」としても既知である）は、膵臓島β細胞量の減少により引き起こされるインスリンの重篤な、しばしば完全な欠乏により特徴付けられる状態を示す。Ｉ型糖尿病は通常、幼児期に発症し、思春期で顕在化および重篤になる。Ｉ型糖尿病を患っている患者は、生存のためインスリンに依存する。すなわち、インスリンがないと、患者は、急性ケトアシドーシスおよび昏睡などの急性代謝合併症を発症する。
【００３３】
本発明の方法は、Ｉ型糖尿病の危険があるかこれを患っている被検体に免疫寛容を誘導、または再構築するのに有用である。本発明は、Ｉ型糖尿病を示している、または再発的にもしくは初めてのいずれかでＩ型糖尿病を発症する「危険がある」もしくは「非常に危険がある」被検体のＩ型真性糖尿病の最初の開始または再発を治療および／または予防することに関する。特に再発性Ｉ型糖尿病を発症する危険がある被検体は、かつては糖尿病であったが膵臓島β細胞の移植により非糖尿病になった糖尿病のヒトまたは動物である。したがって、「危険がある」もしくは「非常に危険がある」被検体は、当該技術分野で既知の複数の試験により決定されるように、以下の形質のどれか１つまたはその組み合わせを有するものである。
（１）ＨＬＡ−Ｄ対立遺伝子について陽性。糖尿病の遺伝的感受性は、分子生物学的手段の使用を通じて、通常は末梢血から得られたＤＮＡ試料から、ますます限定可能になってきている。ＩＤＤの遺伝的感受性に関与する１つの主要な遺伝子は、ＨＬＡ−ＤＱ座、例えば、ＨＬＡ−ＤＱ８およびＨＬＡ−ＤＱ２に位置するものである。基本的に危険無しからその遺伝子型のない場合の７０倍もの高さまで変化する危険性を同定することが現在可能である。特定のファミリーでは、罹患した発端者と共有するＨＬＡハプロタイプの同定を通じて罹患していない兄弟の遺伝的危険性が１／４もの高さであると見積もられ得る。
（２）自己抗体の存在。ＩＤＤを発症したばかりまたはＩＤＤを発症する過程にある人は、その血液中に、多数の疾患特異的自己抗体を有する。そのような自己抗体として、島細胞抗原（ＩＣＡ）に対するもの、６４ｋＤａのβ細胞特異的タンパク質に対するもの、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ６５）の低分子アイソフォームであると現在思われているもの、天然のインスリンおよびプロインスリンに対するもの、チロシンホスファターゼＩＡ−２に対するもの、ならびに複数のより軽微な決定因子（カルボキシペプチダーゼ−Ｈおよびｈｓｐ−６０ファミリーに属する熱ショックタンパク質など）に対するものが挙げられる。
（３）インスリン自己抗体の存在。インスリン自己抗体（ＩＡＡ）が、治療を受けていない、新たにＩＤＤＭと診断された患者（例えば、Palmer et al. (1983) Science 222: 1337-1339を参照）ならびに糖尿病発端者の見かけ上罹患していない身内で観測されている。インスリンに対する自己免疫は、β細胞損傷を直接引き起こし得るか、内因性インスリンの作用に干渉し得るか、または両方の効果を有することができるが、ＩＡＡは島細胞破壊の割合を反映し、したがって侵攻性島指向性自己免疫のレポーターとして作用するにすぎないことを示す研究者もいる（例えば、Ziegler et al. (1989) Diabetes 38: 1320-1325; Vardi (1988) Diabetes Care 11: 736-739を参照）。
【００３４】
用語「免疫学的免疫寛容」または「抗原に対する免疫寛容」または「免疫寛容」は、長期全般性免疫不全（prolonged genralized immune deficiency)の誘導なしの、抗原に対する無反応を含む。その結果、本発明に従って、免疫寛容な宿主は免疫寛容化抗原以外の抗原と反応し得る。免疫寛容は、免疫寛容誘導手順を受けていなければ、その抗原に対する免疫応答を高める(mount)能力があるであろう被検体の応答における抑制の誘導を表す。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「移植片拒絶」は、他のヒトドナー（同種移植）からの、またはヒツジ、ブタ、もしくは非ヒト霊長類などの他の種（異種移植）からの、移植組織および／または器官に対する免疫反応を示す。それゆえ、本発明の方法は、他のヒトドナー（同種移植）から、または他の種（異種移植）から移植された膵臓島β細胞に対する免疫反応を予防するのに有用である。この定義に同じく含まれるのは、「移植片対宿主病」つまり「ＧＶＨＤ」であり、これは移植片細胞が宿主に対して免疫応答を高める状態である。それゆえ、本発明の方法は、組織、すなわち例えば、Ｉ型糖尿病の治療用膵臓島β細胞の不一致の場合に移植片対宿主病を予防するのに有用である。
【００３６】
用語「誘導する」、「阻害する」、「増強する」、「上昇させる」、「増加させる」、「減少させる」などは、２つの状態間の量的差異を表示し、そして２つの状態間の少なくとも統計的な有意差を示す。例えば、「免疫応答を阻害するのに有効な量」は、治療されていない被検体と比較して、被検体における免疫応答が少なくとも有意に少なくなるだろうということを意味する。免疫応答は、それぞれ酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ＥＬＩＳＰＯＴ（登録商標）アッセイ、または［３Ｈ］−チミジン取込みアッセイにより測定されるように、サイトカイン産生および／またはＴ細胞の増殖活性の評価をはじめとする当該技術分野で既知の複数の技法を用いて測定され得る。そのような用語は、本明細書中、例えば、サイトカイン産生の量を評価するのに適用される。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「被検体」は、全ての脊椎動物、すなわち、ヒトおよび非ヒト動物を含むことを意図する。本発明の用語「非ヒト動物」として、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの、哺乳類、齧歯類、マウス、および非哺乳類が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、被検体は哺乳類、例えば、霊長類、例えば、ヒトである。他の実施形態において、ヒト被検体は、Ｉ型糖尿病の危険がある、またはこれを患っているものを含む。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、用語「治療」または「治療する（treating）」は、（１）疾患または障害の予防（予防（prophylaxis））、あるいは（２）疾患または障害の症状の低減または除去（治療）のいずれかを示す。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「予防」、「予防する（prevent）」、または「予防する（preventing）」は、疾患または障害の発症または進行を、阻害、阻止、または除去することを示す（予防）。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「免疫」および「免疫性」は、特定の感染疾患に抵抗することができる性質または状態を示す。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、用語「免疫化する」および「免疫化」は、被検体が、（１）疾患または障害にかからないようにする、あるいは（２）疾患または障害に反応しにくくなるようにする、あるいは（３）疾患または障害へ抵抗する度合いが高くなるようにする作用を示す。
【００４２】
用語「ＭＨＣクラス保有細胞」は、細胞表面で、ＭＨＣ分子、すなわちＭＨＣクラスＩ分子またはクラスＩＩ分子、を発現する任意の細胞を示す。ヒトでは、ほとんど全ての有核細胞がＭＨＣクラスＩ分子を発現するが、発現レベルは細胞型によって様々である。免疫系の細胞はその表面で豊富にＭＨＣクラスＩを発現するが、一方肝細胞は比較的低レベルで発現する。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、免疫細胞、特に抗原提示細胞（ＡＰＣ）、すなわち、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、およびマクロファージで主として発現される。しかしながら、多くの他の細胞型がＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するように誘導されることができ、そして同じく本発明の範囲内にあることを意味する。ＭＨＣ分子は、しばしば、脊椎動物によって異なる名前を有する。例えば、ＭＨＣは、しばしば、ヒトではＨＬＡ、およびマウスではＨ−２と示される。名称におけるこれらの違いは、本発明の範囲内にあることが意図される。
【００４３】
用語「免疫細胞」は、免疫応答、例えば、１型（Ｔｈ１）または２型（Ｔｈ２）免疫応答を調節するサイトカインを発現、産生、または分泌する能力がある免疫系の細胞を含む。本発明の免疫細胞には、ヒト免疫細胞が含まれ、マクロファージ、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および好中球などであるが、これらに限定されない。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、哺乳類（例えば、ヒトまたはマウス）からの、胸腺細胞、未成熟Ｔ細胞、成熟Ｔ細胞（表面マーカーＣＤ４および／またはＣＤ８を保有するＴ細胞を含む）などをはじめとするＴ細胞系譜内の全ての細胞を含むことが意図される。用語「サイトカイン」は、Ｔリンパ球およびＢリンパ球により産生されるホルモン様メディエータの群のうちの任意の１つを含むことが意図される。代表的なサイトカインとして、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、およびトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）−βが挙げられるが、これらに限定されない。サイトカインの「活性」フラグメントは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの標準アッセイを用いて決定されるとおりの活性を保持するサイトカインフラグメントである。例えば、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ活性を決定するアッセイが当該技術分野で既知である（例えば、Campos, M. (1989) Cell. Immunol. 120: 259-269 および Czarnieki, C. W. (1986) J. Interferon Res. 6: 29-37を参照）。他のサイトカインの活性を決定するアッセイは、既知であると同時に市販されており、そして当業者により容易に行われ得る。
【００４５】
用語「免疫応答」は、免疫に伴う任意の応答を含み、これにはサイトカイン発現、産生、または分泌（例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、またはＴＮＦ−αの発現、産生、または分泌）の増加または減少、細胞毒性、免疫細胞移動、抗体産生、および／または免疫細胞性応答が挙げられるが、それらに限定されない。本明細書中で使用される場合、免疫応答は調節されてもよく、これには、本明細書中で定義されるとおりの、免疫応答のアップレギュレーション、増強、刺激、向上、または増加が挙げられる。あるいは、本明細書中で使用される場合、免疫応答の調節はまた、本明細書中で定義されるとおりの、免疫応答のダウンレギュレーション、阻害、または減少を含む。
【００４６】
被検体における免疫応答は、Ｔｈ１またはＴｈ２性免疫応答のいずれかであるとして、さらに特徴付けられ得る。
【００４７】
「Ｔｈ１性免疫応答」は、本明細書中、「１型応答」としても示され、１種または複数種の１型サイトカインの発現、産生、または分泌により特徴付けられ、かつ多くの自己免疫応答および遅延型過敏性応答を伴う、ＣＤ４＋Ｔ細胞による応答を含む。語句「１型サイトカイン」または「Ｔｈ１型サイトカイン」は、Ｔｈ１細胞により、優先的にまたは排他的に、発現、産生、または分泌されるサイトカインを含み、これはＴｈ１細胞の発達に有利に働き、かつ／または自己免疫反応または遅延型過敏性反応を増強、向上、またはそれ以外で媒介する。Ｔｈ１型サイトカインの例として、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、およびＩＬ−１８が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
Ｔｈ１性免疫応答に含まれるものとして、「自己免疫応答」がある。本明細書中で使用される場合、用語「自己免疫応答」は、免疫系が宿主自身の組織（単数または複数）を攻撃する状態を示す。自己免疫応答または疾患において、患者の免疫寛容系は、自己抗原を認識することができなくなり、この免疫寛容損失の結果として、免疫系の力を抗原を発現する組織に注ぐ。したがって、用語「自己免疫応答」は、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞）およびヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）免疫性を伴う任意の反応を含み、これにはサイトカイン発現、産生、または分泌（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、またはＩＦＮ−γ発現、産生、または分泌）、細胞毒性、免疫細胞移動、抗体産生、および／または免疫細胞性応答の増加または減少が挙げられるが、それらに限定されない。語句「自己免疫応答を阻害する」は、本明細書中で定義されるとおりの、免疫応答のダウンレギュレーション、阻害、または減少を含む。例えば、自己免疫応答は、本発明のＩＧＦ−２ペプチドの使用により直接ダウンレギュレート、阻害、または減少され得る。
【００４９】
「Ｔｈ２免疫応答」は、本明細書中、「２型応答」または「Ｔｈ２性免疫応答」としても示され、１種または複数種の２型サイトカインの発現により特徴付けられ、かつ体液性免疫または抗体性免疫（例えば、Ｔｈ２細胞により提供される効率的なＢ細胞「援助」が、例えば、向上したＩｇＧ、および／またはＩｇＥ産生を導く）を伴う、ＣＤ４＋Ｔ細胞による応答を含む。語句「２型サイトカイン」または「Ｔｈ２型サイトカイン」は、Ｔｈ２細胞により優先的に、または排他的に発現、産生、または分泌されるサイトカインを含み、これはＴｈ２細胞の発達に有利に働き、かつ／またはＢリンパ球による抗体産生を増強、向上、またはそれ以外で媒介する。Ｔｈ２型サイトカインの例として、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
Ｔｈ２性免疫応答に含まれるものとして、抗体性免疫応答がある。用語「抗体性免疫応答」または「Ｔｈ２性免疫応答」は、ＴヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）免疫性を伴う任意の応答を含み、これにはサイトカイン発現、産生、または分泌（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、またはＩＬ−１３発現、産生、または分泌）、免疫細胞移動、抗体産生、および／または免疫細胞性応答の増加または減少が挙げられるが、それらに限定されない。語句「Ｔｈ２性免疫応答を調節する」または「Ｔｈ２性免疫応答の調節」は、本明細書中で定義されるとおりの、免疫応答のアップレギュレーション、向上、刺激、または増加を含む。
【００５１】
語句「１型免疫性」は、少なくとも１種の１型サイトカインの発現、産生、または分泌、および／または１型免疫性サイトカインプロファイルの発現による１型免疫応答（例えば、遅延型過敏性、マクロファージ活性化、および／または細胞性細胞毒性）により主に特徴付けられる免疫性を含む。語句「２型免疫性」は、少なくとも１種の２型サイトカインの発現、産生、または分泌、および／または２型免疫性サイトカインプロファイルの発現による２型免疫応答（例えば、Ｂ細胞援助、ＩｇＧ１、および／またはＩｇＥ産生、好酸球活性化、肥満細胞刺激、および／またはマクロファージ不活化）により主に特徴付けられる免疫性を含む。
【００５２】
［発明の実施形態］
本発明は、少なくとも部分的に、被検体のＩ型糖尿病を予防しかつ治療する方法を提供する。本発明は、ＩＧＦ−２、すなわちインスリンファミリーの自己抗原前駆体、およびそのフラグメントが、寛容原性特性を示し、したがってＩ型糖尿病の治療および／または予防に用いられ得るという発見に基づく。
【００５３】
したがって、本発明は、自己免疫応答が阻害されるように有効量の本発明のＩＧＦ−２ペプチドを被検体に投与することを含む、被検体、例えばヒトなどの哺乳類の自己免疫応答、すなわち、Ｔｈ１性免疫応答を阻害する方法を提供する。
【００５４】
本発明の別の態様は、Ｔｈ２性免疫応答が誘導されるように有効量のＩＧＦ−２ペプチドを被検体に投与することを含む、被検体にＴｈ２性免疫応答を誘導する方法を提供する。
【００５５】
別の態様において、本発明はＩ型糖尿病を発症する危険がある被検体に免疫寛容を誘導する方法を提供する。この方法は、被検体に免疫寛容を誘導するのに有効な量で、本発明のＩＧＦ−２ペプチドを被検体に投与することを含む。
【００５６】
さらに別の態様において、本発明は、Ｉ型糖尿病を患っている被検体に免疫寛容を再構築する方法を提供する。この方法は、個体に免疫寛容を再構築するのに有効な量で、有効量の本発明のＩＧＦ−２ペプチドを被検体に投与することを含む。
【００５７】
本発明はまた、Ｉ型糖尿病が被検体で予防されるように、有効量のＩＧＦ−２ペプチドを被検体に投与することを含む、被検体のＩ型糖尿病を予防する方法を特色とする。
【００５８】
本発明の別の特色は、被検体のＩ型糖尿病を治療する方法を提供する。この方法は、被検体のＩ型糖尿病を治療するのに有効な量で、本発明のＩＧＦ−２ペプチドを被検体に投与することを含む。
【００５９】
別の態様において、本発明はさらに、Ｉ型糖尿病から被検体を保護するのに有効な量で、本発明のＩＧＦ−２ペプチドを投与することを含む、Ｉ型糖尿病を発症する危険がある被検体を保護する方法を提供する。
【００６０】
本発明の別の特色は、膵臓島β細胞の移植を受けた被検体の移植片拒絶を治療または予防する方法を提供する。この方法は、移植された島β細胞の拒絶を治療または予防するのに有効な量で、本発明のＩＧＦ−２ペプチドを被検体に投与することを含む。
【００６１】
本発明はまた、核酸分子、例えば本発明のＩＧＦ−２ペプチドをコードする核酸分子を、宿主細胞、例えば抗原提示細胞などの免疫細胞に導入して発現させる方法にも関する。したがって、本発明の方法は、核酸でトランスフェクトされていない宿主細胞と比較して、宿主細胞に導入された場合により高いレベルの核酸発現を提供する。宿主細胞でペプチドが発現されるように、本発明のＩＧＦ−２ペプチドをコードする核酸分子で宿主細胞にトランスフェクトできるようになると、特に遺伝子治療に多数の応用がある。
【００６２】
別の実施形態において、本発明の外因性ＩＧＦ−２ペプチドは、Ｔｈ１性免疫応答を阻害するペプチドである。別の実施形態において、本発明のＩＧＦ−２ペプチドは、Ｔｈ２性免疫応答を誘導するペプチドである。
【００６３】
本発明のＩＧＦ−２ペプチドをコードする核酸は、当該技術分野で既知の方法を用いて、宿主細胞中に導入されて発現され得る。したがって、Ｉ型真性糖尿病である被検体からの宿主細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏで本発明のＩＧＦ−２ペプチドをコードする核酸でトランスフェクトされ、続いて宿主細胞が患者へ投与され得る。別の実施形態において、本発明のＩＧＦ−２ペプチドをコードする核酸は、ｉｎ  ｖｉｖｏで患者に投与される。Ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子治療プロトコルは、例えば、Dev et al., 1994, Cancer Treat. Rev. 20: 105-115, Ragot, T. et al., 1993, Nature 3: 647; Dunckley, M. G. et al., 1993, Hum. Mol. Genet. 2: 717-723に記載されており、これらは援用されて本明細書の一部とする。
【００６４】
したがって、本発明はまた、遺伝子治療により被検体のＩ型糖尿病を治療する方法にも関する。本発明のＩＧＦ−２ペプチドは、ウイルスまたは非ウイルスベクターを用いて細胞、例えば免疫抗原提示細胞中に挿入されることができ、ベクターとして、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ウシパピローマウイルス由来のベクター、またはプラスミドなどの非ウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。また、ＤＮＡを哺乳類細胞に導入するために当業者により頻繁に用いられる技法が用いられてもよい。組換えベクターを宿主細胞中に輸送するのに、例えば、電気穿孔法、ＤＥＡＥ−デキストラン（dektran）媒介ＤＮＡ移入、ＤＮＡ銃(gun)、リポソーム、直接注射などが挙げられるがこれらに限定されない方法が用いられてもよい。あるいは、ＤＮＡは、通常細胞の内側に標的にされるタンパク質との結合を通じて細胞中に輸送されてもよい。例えば、ＤＮＡは、通常ウイルス粒子を標的として標的とする宿主細胞中に入れるウイルスタンパク質に結合されてもよい。したがって、本明細書中に記載されるものなどの技法は、本発明のＩＧＦ−２ペプチドをヒト細胞中に導入するのに利用され得る。
【００６５】
［治療法］
本発明はまた、被検体（例えば、ヒトなどの哺乳類）のＩ型糖尿病を治療する治療法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、有効量の本発明のＩＧＦ−２ペプチドをＩ型糖尿病の被検体に投与し、それにより被検体のＩ型糖尿病を治療することを含む。
【００６６】
同じく本発明の範囲内であるのは、予防的なＩＧＦ−２ペプチド投与である。Ｉ型糖尿病が予防されるか、またはその進行を遅らせるように、本発明のＩＧＦ−２ペプチドの投与は、Ｉ型糖尿病の症状の顕在化の前に行われ得る。本発明の予防法は、投薬量および治療レジメン(regimen)が異なるかもしれないが、本明細書中に記載される治療法と同様な様式で行われ得る。
【００６７】
したがって、本方法は、免疫応答の調節に治療上の有用性を有する。特定の実施形態において、本方法は、所望の治療レジメンの投与に依存して免疫応答をＴｈ２性免疫応答に偏らせる（例えば、Ｔｈ２介在サイトカインの産生を刺激する）ことに治療上の有用性を有する。別の実施形態において、本発明は、Ｔｈ１性免疫応答を阻害する（例えば、Ｔｈ１細胞がＴｈ１介在サイトカインを産生するのを阻害する）ことに治療上の有用性を有する。これらの方法は、Ｉ型糖尿病などの自己免疫疾患を治療するのに有用である。
【００６８】
別の態様において、本発明は、Ｉ型糖尿病に対して被検体を免疫化するワクチンを提供し、ここでワクチンは、本発明のＩＧＦ−２ペプチドを、単独で、または生理学的に許容可能な無毒のビヒクル中にＩ型糖尿病に対して被検体を免疫化するのに有効な量で分散させてのいずれかで含む。
【００６９】
本発明のワクチンは、投薬配合物と適合的に、かつ治療上有効かつ寛容原性であるような量で、投与される。投与されるべき量は、治療される被検体、被検体の免疫系の細胞性免疫応答を生成する能力、および所望の保護の度合いによって決まる。投与される必要がある活性成分の正確な量は、臨床医の判断によって決まり、そしてそれぞれの個体特有である。しかしながら、適した投薬範囲は、７０キログラムの個体あたり１キログラムあたり約３０マイクログラムの活性成分のオーダー(order)である。初期投与および追加免疫ショットに適したレジメンもまた可変であるが、初期投与に続いて１週または２週の間隔を置いて続く注射または他の投与により代表される。同じく本発明の範囲内であるのは、本発明のＩＧＦ−２ペプチドと組み合わせたアジュバントの同時投与である。
【００７０】
さらに別の態様において、本発明はＩ型糖尿病に対して被検体を免疫化するキットを特色とし、ここでキットは、本発明のワクチン（すなわち、本発明のＩＧＦ−２ペプチドおよび医薬上許容可能なキャリア）、および任意に使用説明書を含む。
【００７１】
別の態様において、本発明は、本発明のワクチン（すなわち、本発明のＩＧＦ−２ペプチドおよび医薬上許容可能なキャリア）、および任意に使用説明書を含む、被検体のＩ型糖尿病治療用キットを特色とする。
【００７２】
［医薬組成物およびその使用］
本発明の別の態様は、ＣＴＬ性免疫応答を調節するのに有効な量で、本発明のＩＧＦ−２ペプチドおよび医薬上許容可能なキャリア（単数または複数）を含む、医薬上許容可能な組成物を提供する。
【００７３】
特定の実施形態において、本発明のＩＧＦ−２ペプチドは、医薬上許容可能な配合物、例えば、被検体に投与された後、少なくとも１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、１週間、２週間、３週間、または４週間、被検体に本発明のＩＧＦ−２ペプチドの持続した送達を提供する医薬上許容可能な配合物を用いて、被検体に投与される。
【００７４】
特定の実施形態において、これらの医薬組成物は、被検体への経口投与に適する。他の実施形態において、以下に詳細に記載されるとおり、本発明の医薬組成物は、固形または液状で投与されるように特別に配合されてもよく、以下、（１）経口投与（例えば、水薬（水溶液、または非水性溶液、または懸濁液）、錠剤、ボーラス、粉末、顆粒、ペースト）、（２）非経口投与（例えば、皮下、筋肉内、または静脈内注射（例えば、滅菌溶液または懸濁液として）により、）、（３）局所的塗布（例えば、クリーム、軟膏、または皮膚に塗布するスプレーとして）、（４）膣内用または直腸内用（例えば、ペッサリー、クリーム、またはフォームとして）、あるいは（５）エーロゾル（例えば、水性エーロゾル、リポソーム調製物、または前記化合物含有固体粒子として）に適合したものが挙げられる。
【００７５】
本明細書中で使用される場合、用語「有効量」は、投薬量および必要な時間の長さにおいて、例えばＣＤ４＋Ｔｈ1およびＣＴＬ性免疫応答を調節するのに十分な、所望の結果を達成するのに有効な量を含む。本発明のＩＧＦ−２ペプチドの有効量は、本明細書中で定義されるとおり、被検体の疾患の段階、年齢、および体重、ならびに被検体に所望の応答を誘発する本発明のＩＧＦ−２ペプチドの能力などの要因に依存して変化し得る。投薬レジメンは、最適な治療応答を提供するように調節され得る。有効量とはまた、本発明の本発明のＩＧＦ−２ペプチドの毒性効果または有害な効果（例えば、副作用）のどれよりも治療上有益な効果が勝っているというものである。
【００７６】
本発明のＩＧＦ−２ペプチドの治療上有効な量（すなわち、有効投薬量）は、７０キログラムの個体あたり、約０．００１〜４０μｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１〜３０μｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。被検体を有効に治療するのに要求される投薬量に特定の要因が影響を及ぼす可能性があり、これには被検体の疾患または障害の重篤度、これまでの治療、全体的な健康、および／または年齢、ならびに存在する他の疾患が挙げられるが（それらに限定されない）、それらに限定されないことを当業者は理解するであろう。そのうえ、治療上有効な量の本発明のＩＧＦ−２ペプチドでの被検体の治療は、単回の治療を含み得るか、または一連の治療を含み得る。１つの例において、被検体は、約０．１〜３０μｇ／ｋｇ体重の範囲の本発明のＩＧＦ−２ペプチドで、約１〜１０週間の間、好ましくは２〜８週間の間、より好ましくは約３〜７週間の間、そしてさらにより好ましくは約４、５、または６週間の間、１週間に１回治療される。治療に用いられる本発明のＩＧＦ−２ペプチドの有効投薬量は、特定の治療の経過にわたり増加または減少してもよいこともまた理解されるであろう。
【００７７】
本発明の方法はさらに、被検体に、治療上有効な量の本発明のＩＧＦ−２ペプチドを、免疫応答を調節することが知られている別の医薬的に活性な化合物、例えば、インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５）、リポ多糖類（ＬＰＳ）、コンカナバリン（Conconavalin）Ａ（ＣｏｎＡ）、ホルボールエステル、およびイオノマイシンなどの薬剤と組み合わせて投与することを含む。用いられ得る他の医薬的に活性な化合物は、「ハリソン内科学（Harrison's Principles of Internal Medicine）」, Thirteenth Edition, Eds. T. R. Harrison et al. McGraw-Hill N. Y., NY; および 「米医薬品便覧（the Physicians Desk Reference）」, 50th Edition 1997, Oradell New Jersey, Medical Economics Co.に見いだすことができ、これらの内容は全て、明確に参照して本明細書の一部とする。本発明のＩＧＦ−２ペプチドおよび医薬的に活性な化合物は、同じ医薬組成物で、または異なる医薬組成物で（同時にまたは異なる時点で）被検体に投与されてよい。
【００７８】
投与のレジメンもまた、有効量を制定するものに影響を及ぼし得る。本発明のＩＧＦ−２ペプチドは、他の薬剤（単数または複数）の投与前、それと同時に、またはその後に、被検体に投与され得る。さらに、複数回に分割された投薬量、ならびにずらし用量（staggered dosages）が毎日または経時的に投与されることができ、または用量が治療状況の要求により示されるように比例して(proportionally)増加または減少され得る。
【００７９】
語句「医薬上許容可能な」は、本明細書中、正当な医療判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比につり合って、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしにヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適しているこれらの本発明のＩＧＦ−２ペプチド、そのような化合物を含む組成物、および／または剤形を示すのに用いられる。
【００８０】
本明細書中用いられる語句「医薬上許容可能なキャリア」は、目的の化学物（chemical）を一つの器官もしくは身体の一部から別の器官もしくは身体の一部へ運搬または輸送するのに関与する、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入材料などの、医薬上許容可能な材料、組成物、またはビヒクルを意味する。それぞれのキャリアは、配合物の他の成分と適合性であり、かつ被検体に有害ではないという意味において「許容可能」でなければならない。医薬上許容可能なキャリアとして機能し得る材料の例のいくつかとして、（１）糖類（ラクトース、グルコース、およびスクロースなど）、（２）デンプン（コーンスターチおよびジャガイモデンプンなど）、（３）セルロースおよびその誘導体（ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、および酢酸セルロースなど）、（４）粉末トラガカント、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）賦形剤（カカオバターおよび坐剤ワックスなど）、（９）油（ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油など）、（１０）グリコール（プロピレングリコールなど）、（１１）ポリオール（グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなど）、（１２）エステル（オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど）、（１３）寒天、（１４）緩衝剤（水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど）、（１５）アルギン酸、（１６）発熱物質を含まない水、（１７）等張性生理食塩水、（１８）リンガー溶液、（１９）エチルアルコール、（２０）ホスフェート緩衝液、ならびに（２１）医薬配合物に用いられる他の無毒性適合性物質が挙げられる。
【００８１】
ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの、湿潤剤、乳化剤、および潤滑剤、ならびに着色剤、離型(release)剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、および着香剤、保存料および抗酸化剤もまた、組成物中に存在し得る。
【００８２】
医薬上許容可能な抗酸化剤の例として、（１）水溶性抗酸化剤（アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど）、（２）油可溶性抗酸化剤（パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど）、および（３）金属キレート化剤（クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など）、などが挙げられる。
【００８３】
本発明のＩＧＦ−２ペプチド（単数または複数）を含有する組成物として、経口、経鼻、局所的（頬側および舌下を含む）、直腸、経膣、エーロゾル、および／または非経口投与に適したものが挙げられる。組成物は、便宜上、単位剤形で存在してもよく、そして医薬の当該技術分野で既知である任意の方法で調製されてよい。１回分の剤形を生成するためにキャリア材料と組み合わされ得る活性成分の量は、治療される宿主、投与の特定の様式に依存して変化するだろう。１回分の剤形を生成するためにキャリア材料と組み合わされ得る活性成分の量は、一般的に治療効果をもたらす化合物の量であるだろう。一般に、１００％のうち、この量は、活性成分の約１％〜約９９％、好ましくは約５％〜約７０％、最も好ましくは約１０％〜約３０％の範囲であるだろう。
【００８４】
これらの組成物を調製する方法は、本発明のＩＧＦ−２ペプチドを、キャリア、および任意に１種または複数種のアクセサリ成分（accessory ingredients）と会合させる工程を含む。一般に、配合物は、本発明のＩＧＦ−２ペプチドを、液体キャリア、または細かく粉砕した固体キャリア、またはその両方と均一かつ密接に会合させ、次いで必要であれば、生成物を成形することにより調製される。
【００８５】
経口投与に適した本発明の組成物は、カプセル剤、カプセル（cachets）、丸剤、錠剤、ロゼンジ（香味付けした基礎(basis)、通常はスクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントを用いる）、粉末、顆粒、または水性もしくは非水性液体の溶液もしくは懸濁液、または水中油もしくは油中水液体エマルション、またはエリキシル剤もしくはシロップ、またはトローチ（pastilles）（ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアゴムなどの不活性系を用いる）の形態であっても、および／または洗口剤などとしてもよく、それぞれが予め定められた量の本発明のＩＧＦ−２ペプチド（単数または複数）を活性成分として含有する。本発明のＩＧＦ−２ペプチド（単数または複数）はまた、ボーラス、舐剤、またはペーストとして投与されてもよい。
【００８６】
経口投与用の本発明の固体剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣錠、粉末、顆粒など）において、活性成分は、１種または複数種の医薬上許容可能なキャリア（クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなど）、および／または以下、（１）充填剤または増量剤（デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸など）、（２）結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアラビアゴムなど）、（３）保湿剤（グリセロールなど）、（４）崩壊剤（寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプンもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムなど）、（５）溶液遅延剤（パラフィンなど）、（６）吸収促進剤（第四級アンモニウム化合物など）、（７）湿潤剤（例えば、アセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなど）、（８）吸着剤（カオリンおよびベントナイトクレイなど、（９）潤滑剤（タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物など）、ならびに（１０）着色剤などのいずれかと混合される。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、医薬組成物はまた、緩衝剤も含んでもよい。同様な型の固体組成物もまた、ラクトースまたは乳糖などの賦形剤、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどを用いる充填軟および硬ゼラチンカプセル剤に充填剤として用いられてもよい。
【００８７】
錠剤は、随意に１種または複数種のアクセサリ成分とともに圧縮またはモールド成形により作成されてもよい。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、保存料、崩壊剤（例えば、グリコール酸デンプンナトリウムまたは架橋ナトリウムカルボキシメチルセルロース）、界面活性剤、または分散剤などを用いて調製されてもよい。モールド成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末活性成分の混合物を適した機械でモールド成形することにより作成されてもよい。
【００８８】
本発明の医薬組成物の錠剤、および他の固体剤形（糖衣錠、カプセル剤、丸剤、および顆粒など）は、任意に、コーティングおよび殻（腸溶性コーティングおよび製剤分野で既知の他のコーティングなど）で獲得されても（scored）調製されてもよい。それらはまた、その中の活性成分の徐放または放出制御を達成するように、例えば、所望の放出プロファイルを提供するように様々な割合でヒドロキシプロピルメチルセルロース、他の重合体マトリクス、リポソームおよび／またはミクロスフェアを用いて配合されてもよい。それらは、例えば、細菌保持フィルターでの濾過により、または滅菌固体組成物の形で滅菌剤を組み込むことにより滅菌されてもよく、使用直前に滅菌水または何か他の注射用滅菌媒体に溶解され得る。これらの組成物はまた、任意に不透明薬剤を含んでもよく、そして活性成分（単数または複数）を胃腸管のある部分でのみ、またはその部分で優先的に、任意に遅延させるようにして放出する組成物のものであってもよい。用いられ得る包埋組成物の例として、重合体物質およびワックスが挙げられ得る。活性成分はまた、適切ならば、上記に記載される賦形剤の１種または複数種でマイクロカプセル化された形態にあり得る。
【００８９】
本発明のＩＧＦ−２ペプチド（単数または複数）の経口投与用液体剤形として、医薬上許容可能なエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシル剤が挙げられる。活性成分に加えて、液体剤形は、当該技術分野で一般的に用いられる不活性希釈剤（例えば、水または他の溶媒など）、可溶化剤および乳化剤（エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステルなど）、ならびにそれらの混合物も含んでよい。
【００９０】
不活性希釈剤の他に、経口組成物はまた、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、香味剤、着色剤、着香剤、ならびに保存剤などのアジュバントも含み得る。
【００９１】
懸濁液は、本発明の活性ＩＧＦ−２ペプチド（単数または複数）に加えて、懸濁剤、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにそれらの混合物などを含んでもよい。
【００９２】
直腸または膣投与用の本発明の医薬組成物は坐剤として存在してもよく、これは、１種または複数種の本発明のＩＧＦ−２ペプチド（単数または複数）を、例えば、カカオバター、ポリエチレングリコール、坐剤用ワックスまたはサリチル酸塩を含む１種または複数種の適した無害な賦形剤またはキャリアと混合することにより調製されてもよく、そしてこれは室温では固体であるが体温では液体であり、それゆえ直腸または膣腔で溶融して活性剤を放出する。
【００９３】
膣投与に適している本発明の組成物としてはまた、適切であることが当該技術分野で既知であるようなキャリアを含有する、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、またはスプレー配合物が挙げられる。
【００９４】
本発明のＩＧＦ−２ペプチドの局所的または経皮投与用剤形として、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、および吸入剤が挙げられる。本発明の活性ＩＧＦ−２ペプチド（単数または複数）は、滅菌条件下、医薬上許容可能なキャリアと、および必要とされうる任意の保存料、緩衝液、または噴霧剤と混合されてもよい。
【００９５】
軟膏、ペースト、クリーム、およびゲルは、本発明のＩＧＦ−２ペプチド（単数または複数）に加えて、動物性および植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、および酸化亜鉛、またはそれらの混合物などの賦形剤を含んでもよい。
【００９６】
粉末およびスプレーは、本発明のＩＧＦ−２ペプチド（単数または複数）に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれら物質の混合物などの賦形剤を含み得る。スプレーは、クロロフルオロ炭化水素および揮発性無置換炭化水素（ブタンおよびプロパンなど）などの通常の噴霧剤をさらに含み得る。
【００９７】
本発明のＩＧＦ−２ペプチド（単数または複数）は、別法としてエーロゾルで投与され得る。これは、前記化合物を含有する、水性エーロゾル、リポソーム調製物、または固体粒子を調製することにより達成される。非水性（例えば、フルオロカーボン噴霧剤）懸濁液が使用され得る。音波噴霧器は、前記化合物の分解をもたらし得る剪断に薬剤が曝されることを最小限にするため好適である。
【００９８】
通常、水性エーロゾルは、薬剤の水溶液または懸濁液を従来の医薬上許容可能なキャリアおよび安定剤と一緒に配合することにより作られる。キャリアおよび安定剤は、特定の化合物の要求に応じて変化するが、代表的には、非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎｓ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、またはポリエチレングリコール）、血清アルブミンのような無害のタンパク質、ソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン、グリシンなどのアミノ酸、緩衝液、塩類、糖類、または糖アルコールが挙げられる。一般に、エーロゾルは等張性溶液から調製される。
【００９９】
経皮パッチは、本発明のＩＧＦ−２ペプチド（単数または複数）の身体への制御された送達を提供するという付加的な利点を有する。そのような剤形は、薬剤を適切な媒体に溶解または分散させることにより作成され得る。皮膚中にわたる活性成分の流動を増加させるために吸収エンハンサーもまた使用され得る。そのような流動の割合は、割合を制御する膜を提供することによるか、または活性成分を重合体マトリクスもしくはゲルに分散させるかのいずれかにより制御され得る。
【０１００】
眼配合物、眼軟膏、粉末、溶液などもまた、本発明の範囲内であると考えられる。
【０１０１】
非経口投与に適した本発明の医薬組成物は、１種または複数種の本発明のＩＧＦ−２ペプチド（単数または複数）を、１種または複数種の医薬上許容可能な、滅菌した等張性水性もしくは非水性の、溶液、分散液、懸濁液もしくはエマルション、または使用直前に滅菌注射溶液または分散液に再構成され得る滅菌粉末と組み合わせて含み、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、配合物を対象の受容者の血液と等張性にする溶質、または懸濁剤もしくは増粘剤を含んでもよい。
【０１０２】
本発明の医薬組成物に用いてもよい、適した水性および非水性キャリアの例として、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適した混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用により、分散液の場合は必要とされる粒子サイズを維持することにより、および界面活性剤の使用により、適した流動性が維持され得る。
【０１０３】
これらの組成物はまた、保存料、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などのアジュバントも含んでもよい。微生物の作用を防ぐことは、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの種々の抗菌剤および抗真菌剤の包含により確実にされ得る。糖類、塩化ナトリウムなどの等張性薬剤を組成物に含めることもまた望ましいかもしれない。また、注射用医薬的形態の持続吸収が、吸収を遅延させる、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの薬剤の包含によりもたらされてもよい。
【０１０４】
場合によっては、薬物の効果を延長するために、皮下または筋肉内注射からの薬物吸収を遅らせることが望ましい。これは、水への溶解度が低い結晶または液晶材料の液体懸濁液を用いることにより達成されうる。薬物の吸収速度は、その溶解速度に依存し、これは、順に、結晶の大きさおよび結晶形態に依存するかもしれない。あるいは、非経口的に投与される剤形の遅延吸収は、薬物を油ビヒクルに溶解または懸濁することにより達成される。
【０１０５】
注射用徐放性剤形（injectable depot forms）は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性重合体中に本発明のＩＧＦ−２ペプチド（単数または複数）をマイクロカプセル化（microencapsule）したマトリクスを形成することにより作成される。薬物対重合体の比、および用いられる特定重合体の性質に依存して、薬物放出速度が制御され得る。他の生分解性重合体の例として、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。徐放性注射用配合物はまた、身体組織と適合性のリポソームまたはマイクロエマルションに薬物を捕捉することにより調製される。
【０１０６】
ヒトおよび動物に、本発明のＩＧＦ−２ペプチド（単数または複数）が医薬品として投与される場合、それらは、それ自体で、または医薬上許容可能なキャリアとともに、例えば、０．１〜９９．５％（より好ましくは、０．５〜９０％）の活性成分を含有する医薬組成物として与えられる。
【０１０７】
用語「投与」または「投与する」は、本発明のＩＧＦ−２ペプチド（単数または複数）の意図される機能を実行させるためにそれらを被検体に導入する経路を包含することが意図される。用いられ得る投与経路の例として、注射（皮下、静脈内、非経口的、腹腔内、くも膜下腔内）、経口、吸入、直腸、および経皮が挙げられる。医薬製剤は、もちろん、それぞれの投与経路に適した形態で与えられる。例えば、これらの製剤は、錠剤またはカプセル形態で、注射剤、吸入剤、眼ローション、軟膏、坐剤などにより、注射、輸液、または吸入による投与、ローションまたは軟膏により局所的に、および坐剤で直腸に投与される。経口投与が好ましい。注射はボーラスであり得るか、連続注射であり得る。投与経路に依存して、本発明のＩＧＦ−２ペプチド（単数または複数）は、その意図される機能を実行するそれの能力に有害な影響を及ぼす可能性がある自然の環境からそれを保護するように選択された材料でコーティング、またはこの中に処理され得る。本発明のＩＧＦ−２ペプチド（単数または複数）は、単独で、あるいは上記の別の薬剤もしくは医薬上許容可能なキャリアのいずれか、またはその両方と組み合わせて、投与され得る。本発明のＩＧＦ−２ペプチド（単数または複数）は、他の薬剤の投与前、薬剤と同時に、または薬剤の投与後に、投与され得る。そのうえさらに、本発明のＩＧＦ−２ペプチド（単数または複数）はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで、その活性代謝産物、またはより活性な代謝産物に変換されるプロフォーム（proform）で投与され得る。
【０１０８】
本明細書中で使用される場合、語句「非経口投与」および「非経口で投与される」は、経腸および局所的投与以外の、通常は注射による投与様式を意味し、これには、制限はしないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内（intraarticulare）、被膜下、くも膜下、脊髄内、および胸骨内注射、ならびに輸液が挙げられる。
【０１０９】
本明細書中で使用される場合、語句「全身投与」、「全身に投与される」、「末梢投与」、および「末梢で投与される」とは、本発明のＩＧＦ−２ペプチド（単数または複数）、薬物、または他の材料が、被検体のシステムに入り、したがって、代謝および他の同様なプロセスに服するような、それの投与、例えば、皮下投与を意味する。
【０１１０】
選択される投与経路に関わらず、本発明のＩＧＦ−２ペプチド（単数または複数）（これは適した水和型で用いられてもよいが）、および／または本発明の医薬組成物は、当業者に既知の従来法により医薬上許容可能な剤形に配合される。
【０１１１】
本発明は、以下の実施例によりさらに示されるが、これらはいかなる方法でもさらに制限するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１１２】
この実験は、ＩＧＦ−２ペプチドＢ１１−２５の、Ｉ型糖尿病に対する寛容原性ワクチンとして作用する能力を評価した。
【０１１３】
［材料および方法］
前臨床試験を開始して、インスリンからの配列Ｂ９ー２３のＤＲ８投与（presentation）により誘発されるＣＤ４応答とＩＧＦ−２からの相同配列Ｂ１１−２５とを比較した。
【０１１４】
インスリンからの配列Ｂ９−２３とＩＧＦ−２からの配列Ｂ１１−２５は、Neosystem (Strasburgh)から合成したものを入手した。これらのペプチドからの配列は以下のとおりである：
ＩＧＦ−２（Ｂ１１−２５）（配列番号：２）＊：
ＧＥＬＶＤＴＬＱＦＶＣＧＤＲＧ
インスリンＢ９−２３（配列番号：３）：
ＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧ
＊下線は保存配列を記す
【０１１５】
ＤＱ８対立遺伝子が陽性である糖尿病患者を選択した（女性６人、男性４人、年齢の範囲、７歳−１６歳）。内分泌系小児科医の助けを借りて、２回の標本抽出の説明会に適切な手配がなされた。若者たちの親から書面によるインフォームド・コンセントが得られた。各患者について、２０ｍｌの血液をＥＤＴＡ含有管に採取した。これらの管をただちにCypro SA (Brussels)に送り、そこでＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（登録商標）（インビトロゲン）単離法を用いて末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離した。
【０１１６】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（Ｃｙｐｒｏ）：一般的な方法論は、Tary-Lehmann et al. (例えば、Tary-Lahmann et al. (1998) Transplantation 66: 219- 224を参照）に記載されている。簡単には、ＰＨＡ（Sigma、１μｇ／ｍｌ）＋ＬＰＳ（Sigma、１μｇ／ｍｌ）、精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ、５μｇ／ｍｌ）、インスリンＢ９−２３（１０μＭおよび５０μＭ）、ＩＧＦ−２Ｂ１１−２５（１０μＭおよび５０μＭ）のいずれかの存在下または不在下、抗ヒトＩＦＮ−γモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Serpime/Nodia）または抗ＩＬ−１０ｍＡｂ（BD-Pharmingen）でコーティングした９６ウェルプレートに、１×１０５／ウェルの濃度で、ＰＢＭＣを播種した。平らな表面上、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベーション後、ウェルを、ＰＢＳＴｗｅｅｎ０．２５％で３回洗浄し、次いでブロット(blot)乾燥した。
【０１１７】
サイトカインは、抗ヒトＩＦＮ−γ（Serpime/Nodia）およびＩＬ−１０（BD-Pharmingen）二次ビオチン化ｍＡＢ＋エクストラアビジンペロキシダーゼ（extravidinperoxydase）溶液（４μｇ／ｍｌ）の使用により明らかになった。湿度の高い部屋で、周辺温度で１時間インキュベーション後、プレートを洗浄し、基質ＡＥＣ（３−アミノ−９−エチルカルバゾール（carazole））＋３０％Ｈ２Ｏ２を添加した。周辺温度でのインキュベーション１５分後（ＩＦＮ−γについて）または３０分後（ＩＬ−１０について）、スポットが現れたので、水中でプレートを洗浄して反応を停止させた。乾燥後、各サイトカインに特異的なフィルターを用いて、コンピュータで補助された画像分析器により点を計数した。
【０１１８】
統計分析のためウィルコクソンテストを用いた（ノンパラメトリックな対の値）。
【０１１９】
［結果］
図１に示すとおり、本発明のＩＧＦ−２ペプチド（５０μＭ）の投与後のＤＱ８＋１型糖尿病青年におけるＣＤ４応答の比較は、統計的有意差を示した。具体的には、結果は以下を示した。
（１）ＩＧＦ−２Ｂ１１−２５での処置後のＩＦＮ-γ分泌細胞数は、インスリンＢ９−２３（５０μＭ）での処置後よりも有意に少なかった（８８．９０±２３．８２対４５．６０±１１．６７ＳＥＭ、ｐ＝０．００２）。
（２）ＩＧＦ−２Ｂ１１−２５での処置後のＩＬ−１０分泌細胞数は、インスリンＢ９−２３（５０μＭ）での処置後よりも有意に多かった（１１６２±２０８．６対７０１．８±１６０．９ＳＥＭ、Ｐ＝＜０．０５）
（３）ＩＧＦ−２Ｂ１１−２５での処置後のＩＬ−／ＩＦＮ‐γの比は、インスリンＢ９−２３（５０μＭ）での処置後よりも有意に高かった（６７．３６±３７．５８対１０．２２±１．９９、ｐ＝０．００２）
【０１２０】
結果は、ＭＨＣ  ＤＱ８対立遺伝子による表現には何の変化もないが、インスリンＢ９−２３およびＩＧＦ−２Ｂ１１−２５により誘導されるＣＤ４応答は有意差があり、かつ全く反対であることを示した。インスリンＢ９−２３に対するＩＦＮ−γ応答は、予想され先の観察と関連付けられた（例えば、Alleva et al. (2001)、前出を参照）。これらの条件下でのＩＬ−１０産生は特に興味がもたれた。インスリンＢ９−２３はＩＬ−１０産生を誘導し得るものの、５０μＭのＩＧＦ−２Ｂ１１−２５に応答したＩＬ−１０の産生は顕著に多かった。ＩＦＮ−γ分泌細胞数がＩＧＦ−２Ｂ１１−２５後に少なかったため、ＩＬ−１０対ＩＦＮ−γ（ＩＬ−１０／ＩＦＮ−γ）の比は、ＩＧＦ−２Ｂ１１−２５での処理後よりも約７倍高かった。
【０１２１】
［結論］
この実験結果は、２つの可能な仮定を示唆する。
（１）糖尿病患者の末梢Ｔ細胞レパートリーは、インスリン由来エピトープに対するＴ細胞のみを含み、そしてＩＧＦ−２Ｂ１１−２５は、これらの細胞により、ＤＱ８−インスリンＢ９ー２３複合体の特異的なＴＣＲに結合した後の様々な形質導入のために様々な応答を誘発する天然の「改変ペプチドリガンド」（ＡＰＬ）として認識され得る。または（２）ＩＧＦ−２Ｂ１１−２５は、ＩＧＦ−２に特異的な、特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＴＲＥＧ細胞を刺激し得る。
【０１２２】
それぞれの場合において、データは、ＩＧＦ−２Ｂ１１ー２５が、免疫抑制性および抗炎症性を有する主要な調節サイトカインであるＩＬ−１０分泌の強力な誘導物質であることをはっきりと示している。そのうえ、データはさらに、ＩＧＦ−２Ｂ１１−２５が寛容原性を示し、したがっておそらく、このペプチドでの能動免疫後にＩＧＦ−２に対する抗体を得ることがなぜ難しいのかを説明することを支持する。
【０１２３】
１．配列番号：１（ヒトＩＧＦ−２全長；アミノ酸）：
ＡＹＲＰＳＥＴＬＣＧＧＥＬＶＤＴＬＱＦＶＣＧＤＲＧＦＹＦＳＲＰＡＳＲＶＳＲＲＳＲＧＩＶＥＥＣＣＦＲＳＣＤＬＡＬＬＥＴＹＣＡＴＰＡＫＳＥ（一文字コード）
Ａｌａ−−ｔｙｒ−−ａｒｇ−−ｐｒｏ−−ｓｅｒ−−ｇｌｕ−−ｔｈｒ−−ｌｅｕ−−ｃｙｓ−−ｇｌｙ−−ｇｌｙ−−ｇｌｕ−−ｌｅｕ−−ｖａｌ−−ａｓｐ−−ｔｈｒ−−ｌｅｕ−−ｇｌｎ−−ｐｈｅ−−ｖａｌ−−ｃｙｓ−−ｇｌｙ−−ａｓｐ−−ａｒｇ−−ｇｌｙ−−ｐｈｅ−−ｔｙｒ−−ｐｈｅ−−ｓｅｒ−−ａｒｇ−−ｐｒｏ−−ａｌａ−−ｓｅｒ−−ａｒｇ−−ｖａｌ−−ｓｅｒ−−ａｒｇ−−ａｒｇ−−ｓｅｒ−−ａｒｇ−−ｇｌｙ−−ｉｌｅ−−ｖａｌ−−ｇｌｕ−−ｇｌｕ−−ｃｙｓ−−ｃｙｓ−−ｐｈｅ−−ａｒｇ−−ｓｅｒ−−ｃｙｓ−−ａｓｐ−−ｌｅｕ−−ａｌａ−−ｌｅｕ−−ｌｅｕ−−ｇｌｕ−−ｔｈｒ−−ｔｙｒ−−ｃｙｓ−−ａｌａ−−ｔｈｒ−−ｐｒｏ−−ａｌａ−−ｌｙｓ−−ｓｅｒ−−ｇｌｕ（三文字コード）
【０１２４】
２．配列番号：２（ＩＧＦ−２Ｂ１１−２５；ヒト；アミノ酸）：
ＧＥＬＶＤＴＬＱＦＶＣＧＤＲＧ（一文字コード）
Ｇｌｙ−−ｇｌｕ−−ｌｅｕ−−ｖａｌ−−ａｓｐ−−ｔｈｒ−−ｌｅｕ−−ｇｌｎ−−ｐｈｅ−−ｖａｌ−−ｃｙｓ−−ｇｌｙ−−ａｓｐ−−ａｒｇ−−ｇｌｙ（三文字コード）
【０１２５】
配列番号：３（インスリンＢ９−２３；ヒト；アミノ酸）：
ＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧ（一文字コード）
Ｓｅｒ−−ｈｉｓ−−ｌｅｕ−−ｖａｌ−−ｇｌｕ−−ａｌａ−−ｌｅｕ−−ｔｙｒ−−ｌｅｕ−−ｖａｌ−−ｃｙｓ−−ｇｌｙ−−ｇｌｕ−−ａｒｇ−−ｇｌｙ（三文字コード）
【０１２６】
［参照としての援用］
本出願の全体に渡り記載される全ての参照（参照文献、発行特許、公開特許出願、および同時係属特許出願を含む）の内容は、本明細書中その全体が、明確に参照されて本明細書の一部となる。
【０１２７】
［等価物］
当業者は、本明細書中に記載される本発明の特定の実施形態の多くの等価物を、認識し、または日常的に過ぎない実験を用いて確かめることができるだろう。そのような等価物は、以下の請求項により包含されることが意図される。また、本明細書中に記載される全ての特許および出版物の全内容が参照されて本明細書の一部となる。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】１型糖尿病ＤＱ８＋の青年１０人における、インスリンペプチドＢ９−２３（ＩＮＳ）およびＩＧＦ−２ペプチドＢ１１−２５に応答したＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０産生のＥＬＩＳＰＯＴ（登録商標）分析。
【配列表】
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【図１】
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【国際調査報告】
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