(57)【要約】効力および薬物動態学的特性を調節するために化学的に修飾されたカルボキシル末端（Ｃ末端）および／またはアミノ末端（Ｎ末端）を含むケモカイン受容体モジュレーター、ならびに産生方法および使用方法が開示される。本発明の化合物および方法は、ＣＣおよびＣＸＣケモカインの新規なＮ末端、Ｃ末端およびＮ／Ｃ末端類似物により例証される。本発明のケモカイン受容体モジュレーター類似物は、ＨＩＶおよびＡＩＤＳ関連疾患の処置、ならびに喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アテローム／アテローム性動脈硬化症、臓器移植拒絶、およびリューマチ性関節炎の処置のような、本発明の類似物がアンタゴナイズする天然産ケモカインを伴う疾患の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪族鎖および１つ以上のアミノ酸誘導体によってＮ末端において修飾されたケモカインポリペプチド鎖を含むケモカイン受容体モジュレーター。
【請求項２】
前記ケモカインポリペプチド鎖は、天然産野生型ケモカインのアミノ酸配列と実質的に相同であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のケモカイン受容体モジュレーター。
【請求項３】
前記天然産野生型ケモカインは、ＣＣケモカインである、請求項２に記載のケモカイン受容体モジュレーター。
【請求項４】
前記天然産野生型ケモカインは、ＣＸＣケモカインである、請求項２に記載のケモカイン受容体モジュレーター。
【請求項５】
前記Ｎ末端は、前記ケモカインポリペプチド鎖の最初のジスルフィド形成システインに対してＮ末端側にある前記ケモカインポリペプチド鎖のアミノ酸を含む、請求項１に記載のケモカイン受容体モジュレーター。
【請求項６】
前記脂肪族鎖は、５〜２６個の炭素を含む炭化水素鎖である、請求項１に記載のケモカイン受容体モジュレーター。
【請求項７】
前記アミノ酸誘導体は、式−（Ｎ−ＣｎＲ−ＣＯ）−を有し、該式において、ｎは１〜２２であり、Ｒは水素、アルキル基または芳香族基であり、ＮおよびＣｎ、ＮおよびＲ、またはＣｎおよびＲは、環状構造を形成し得る、請求項１に記載のケモカイン受容体モジュレーター。
【請求項８】
脂肪族鎖または多環によってＣ末端において修飾されたケモカインポリペプチド鎖を含むケモカイン受容体モジュレーター。
【請求項９】
前記脂肪族鎖は、５〜２２個の炭素を含む、請求項８に記載のケモカイン受容体モジュレーター。
【請求項１０】
前記脂肪族鎖または多環は、脂質である、請求項９に記載のケモカイン受容体モジュレーター。
【請求項１１】
脂肪族鎖および１つ以上のアミノ酸誘導体によってＮ末端において修飾され、かつ脂肪族鎖または多環によってＣ末端において修飾されたケモカインポリペプチド鎖を含むケモカイン受容体モジュレーター。
【請求項１２】
ケモカイン受容体モジュレーターを含む医薬組成物であって、前記ケモカイン受容体モジュレーターは、脂肪族鎖および１つ以上のアミノ酸誘導体によってＮ末端において修飾されたケモカインポリペプチド鎖、または薬学的に許容できるその塩を含む医薬組成物。
【請求項１３】
前記組成物は、１つ以上の薬学的に許容できる賦形剤と混和されている、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ケモカイン受容体モジュレーターを含む医薬組成物であって、前記ケモカイン受容体モジュレーターは、脂肪族鎖または多環によってＣ末端において修飾されたケモカインポリペプチド鎖、または薬学的に許容できるその塩を含む医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載のケモカイン受容体モジュレーター、または薬学的に許容できるその塩を含む医薬組成物。
【請求項１６】
前記組成物は、１つ以上の薬学的に許容できる賦形剤と混和されている、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ケモカイン受容体モジュレーターを含む医薬組成物であって、前記ケモカイン受容体モジュレーターは、脂肪族鎖および１つ以上のアミノ酸誘導体によってＮ末端において修飾され、かつ脂肪族鎖または多環によってＣ末端において修飾されたケモカインポリペプチド鎖、または薬学的に許容できるその塩を含む医薬組成物。
【請求項１８】
前記組成物は、１つ以上の薬学的に許容できる賦形剤と混和されている、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
ケモカイン受容体モジュレーターを用いた処置により軽減される哺乳動物における疾患状態の処置方法であって、そのような処置を必要とする哺乳動物に治療的に有効な量のケモカイン受容体モジュレーターを投与することを含む方法において、前記ケモカイン受容体モジュレーターは、（Ａ）脂肪族鎖および１つ以上のアミノ酸誘導体によってＮ末端において修飾され、または（Ｂ）脂肪族鎖または多環によってＣ末端において修飾され、または（Ｃ）脂肪族鎖および１つ以上のアミノ酸誘導体によってＮ末端において修飾されかつ脂肪族鎖または多環によってＣ末端において修飾されたケモカインポリペプチド鎖を含む方法。
【請求項２０】
前記疾患状態は炎症性疾患である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記炎症性疾患は、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アテローム、アテローム性動脈硬化症、またはリューマチ性関節炎である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記疾患状態は、ＨＩＶ感染により引き起こされ、またはＨＩＶ感染と関連がある、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、ケモカイン受容体モジュレーター、ならびにそれらの産生および利用方法に関する。
【０００２】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許出願第６０／２１７，６８３号（２０００年７月１２日出願）の一部継続出願であり、該米国特許出願は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００３】
（背景技術）
ケモカインは、白血球トラフィッキングおよび他の様々な生物学的プロセスに関与する小型のタンパク質である。ほとんどのケモカインは、炎症部位に典型的に存在する種々のタイプの炎症細胞の走化作用および活性化を引き起こすことによって炎症を限局および増加させる。ある種のケモカインは、走化作用の他に、キラー細胞の増殖と活性化の誘発、造血前駆細胞タイプの成長、炎症条件における骨髄内外への造血前駆細胞のトラフィッキング、脈管形成および腫瘍成長の調節のような特性を有している。（例えば、Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９７）１５：６７５−７０５； Ｚｌｏｔｎｉｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９）１９（１）： １−４； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９８）２２０（１−２）： １−１７；およびＭｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｌ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９８）１６（３−４）： ３２３−３４４を参照）。
【０００４】
多くのケモカインのアミノ酸配列、構造および機能が知られている。ケモカインは、分子量が約８〜１０ｋＤａであり、タンパク質レベルにおいて互いに約２０〜５０％の配列相同性を示す。該タンパク質も共通の三次構造を共有している。すべてのケモカインは、分子内ジスルフィド結合形成に関与する多くの保存されたシステイン残基を有し、該システイン残基は、ケモカインの識別および分類に利用される。例えば、最初の２つのシステイン残基が単一のアミノ酸によって分離されているケモカインは、「Ｃ−Ｘ−Ｃ」ケモカインと呼ばれる（「α」ケモカインとも呼ばれる）。最初の２つのシステイン残基が隣接しているケモカインは、「ＣＣ」ケモカインと呼ばれる（「β」ケモカインとも呼ばれる）。「Ｃ」ケモカインは、あるシステイン残基が存在しない点が他のケモカインと異なる（「γ」ケモカインとも呼ばれる）。Ｃケモカインは、一部のＣＣケモカインとの類似性を示すが、ＣＣケモカインおよびＣＸＣケモカインの特徴である第１および第３のシステイン残基を有してはいない。最初の２つのシステイン残基が３つのアミノ酸により分離されている一部の少数のケモカインは、「ＣＸＸＸＣ」ケモカインと呼ばれる（「ＣＸ３Ｃ」または「δ」ケモカインとも呼ばれる）。ケモカインのサブグループもある。例えば、２つの付加的な保存されたシステイン残基を含んでいるＣＣケモカインが知られており、このサブグループについて用語「Ｃ６−β」ケモカインが時として使われる。現在までに同定されているほとんどのケモカインは、ＣＣおよびＣＸＣケモカインクラスのメンバーである。
【０００５】
ケモカインの生物活性は、受容体により仲介される。該受容体には、ＣＣケモカインあるいはＣＸＣケモカインのグループに属するいくつかの異なるケモカインを結合するリガンド特異性を有する受容体だけでなく、ケモカイン特異性受容体も含まれる。例えば、ＣＣケモカインであるＳＤＦ−１αはＣＸＣＲ４受容体について特異的であるのに対して、ＣＸＣケモカインであるＲＡＮＴＥＳは、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３およびＣＣＲ５受容体に結びつく。別の例はケモカインエオタキシンであり、これはＣＣＲ３（ＣＫＲ３としても知られている）受容体についてのリガンドである。（例えば、Ｃｙｓｔｅｒ， Ｊ． Ｇ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）２８６：２０９８−２１０２； Ｐｏｎａｔｈ ｅｔ ａｔ．， Ｊ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９６）１８３（６）：２４３７−２４４８； Ｐｏｎａｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ（１９９６）９７（３）：６０４−１２； Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９７）２３１（２）： ３６５−３６８を参照）。
【０００６】
ケモカインは、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、ガン、ウイルス性疾患、アテローム／アテローム性動脈硬化症、リウマチ様関節炎および臓器移植拒絶のような重要な疾患経路に関与しているとされてきた。しかしながら、多くのケモカインおよび治療法としてのそれらの潜在的な使用に伴う一般的問題は、白血球炎症反応および感染を促進すなわち悪化させるそれらの固有の特性に関連する。このために、対応する野生型ケモカインのアンタゴニストを生成しようとしてケモカインの修飾が多数なされてきた。古典的かつ代表的な例はＲＡＮＴＥＳについての状況である。特定条件下で、野生型ＲＡＮＴＥＳは、炎症およびＨＩＶ感染を増強し得る（Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．（１９９９）７３：６８４−６９４； Ｃｚａｐｌｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９９９）２７４：１６０７７−１６０８４）。対照的に、ＲＡＮＴＥＳポリペプチド鎖の位置２６（Ｅ２６Ａ）および６６（Ｅ６６Ｓ）における置換により、この分子はその非炎症性バージョンに変換され、ＨＩＶについてその受容体と競合するその能力が向上する（Ａｐｐａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９９９）２７４（３９）：２７５０５−２７５１２）。さらにＲＡＮＴＥＳのＮ末端修飾がなされてきたが、その結果、ＨＩＶ−１感染をブロックできるアンタゴニストが得られ、Ｎ末端トランケーション［ＲＡＮＴＥＳ９−６８］、メチオニン付加（「Ｍｅｔ−ＲＡＮＴＥＳ」）、アミノオキシペンタン付加（「ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ」）、またはノナノイル付加（「ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ」）が含まれる（Ａｒｅｎｚａｎａ−Ｓｅｉｓｄｅｄｏｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ（１９９６）３８３：４００； Ｍａｃｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．（１９９８）１８７：１２１５−１２２４； Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９９６）２７１：２５９９−２６０３； Ｗｅｌｌｓ， ｅｔ ａｌ．， ＷＯ９６／１７９３５； Ｓｉｍｍｏｎｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７６：２７６−２７９； Ｏｆｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ９９／１１６６６； Ｍｏｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９９）７３（５）：３５４４−３５５０）。
【０００７】
上述の方法で、いくつかのケースにおいて、アンタゴニスト関連効力が改善された一方で、ケモカイン受容体モジュレーターを作ろうとする挑戦の１つは、薬物動態のような他の薬物特性を改善しつつ効力を改善することである。また、ケモカインの効力あるアンタゴニストおよび対応するケモカイン受容体モジュレーター化合物の製造ならびに疾患の予防および／または処置用薬剤の調製でのそれらの使用のための一般的戦略および方法を見出すことが望まれる。本発明は、これらおよびその他の課題を扱うものである。
【０００８】
（発明の開示）
本発明は、対応する天然産ケモカインの作用を阻害するアミノ末端（「Ｎ末端」）およびカルボキシル末端（「Ｃ末端」）修飾ケモカイン受容体モジュレーターを目的とするものである。本発明のＮ末端ケモカイン受容体モジュレーターは、Ｎ末端において脂肪族鎖および１つ以上のアミノ酸誘導体により修飾されたケモカインポリペプチド鎖を含む。本発明のＣ末端ケモカイン受容体モジュレーターは、Ｃ末端において脂肪族鎖または多環により修飾されたケモカインポリペプチド鎖を含む。本発明のＮおよびＣ末端ケモカイン受容体モジュレーターは、Ｎ末端およびＣ末端双方での修飾を組み合わせて含むこともある。また、ケモカイン受容体モジュレーターの産生および使用方法も提供される。本発明によって天然産野生型ケモカインまたはそれらの受容体の有効な阻害剤である化合物を作るための一般的な方法が提供されるという点で本発明は有用性がある。
【０００９】
詳細に述べると、本発明は、Ｎ末端において脂肪族鎖および１つ以上のアミノ酸誘導体により修飾されたケモカインポリペプチド鎖を含むケモカイン受容体モジュレーターに関する。
【００１０】
本発明は特に、ケモカインポリペプチド鎖が天然産野生型ケモカイン（ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン等）のアミノ酸配列に実質的に相同なアミノ酸配列を含むそのようなケモカイン受容体モジュレーターの実施形態に関する。
【００１１】
本発明はさらに、ケモカインポリペプチド鎖の最初のジスルフィド形成システインに対するＮ末端側にあるケモカインポリペプチド鎖のアミノ酸をＮ末端が含むそのようなケモカイン受容体モジュレーターの実施態様に関する。
【００１２】
本発明はさらに、脂肪族鎖が炭素を５〜２６個含む炭化水素鎖であり、および／またはアミノ酸誘導体が式−（Ｎ−ＣｎＲ−ＣＯ）−（ここで、ｎは１〜２２、Ｒは水素、アルキル基または芳香族基で、ＮおよびＣ、ＮおよびＲ、またはＣｎおよびＲは、環状構造を形成し得る）を有するそのようなケモカイン受容体モジュレーターの実施態様に関する。
【００１３】
本発明はさらに、Ｃ末端において脂肪族鎖（特に脂肪族鎖が５〜２２個の炭素を含む）または多環により修飾され、特に脂肪族鎖または多環が脂質である、ケモカインポリペプチド鎖を含むケモカイン受容体モジュレーターに関する。
【００１４】
本発明はさらに、Ｎ末端において脂肪族鎖および１つ以上のアミノ酸誘導体により修飾され、かつＣ末端において脂肪族鎖または多環により修飾されたケモカインポリペプチド鎖を含むケモカイン受容体モジュレーターに関する。
【００１５】
本発明はさらに、ケモカイン受容体モジュレーターを含む医薬組成物に関し、そこでは、ケモカイン受容体モジュレーターは、Ｎ末端において脂肪族鎖および１つ以上のアミノ酸誘導体により修飾されたケモカインポリペプチド鎖または薬学的に許容できるその塩を含む。
【００１６】
本発明はさらに、ケモカイン受容体モジュレーター医薬組成物に関し、そこではケモカイン受容体モジュレーターは、Ｃ末端において脂肪族鎖または多環により修飾されたケモカインポリペプチド鎖、または薬学的に許容でできるその塩を含む。
【００１７】
本発明はさらに、Ｎ末端において脂肪族鎖および１つ以上のアミノ酸誘導体により修飾され、さらにＣ末端において脂肪族鎖または多環により修飾されたケモカインポリペプチド鎖、あるいは薬学的に許容できるその塩を含むケモカイン受容体モジュレーターを含む医薬組成物に関する。
【００１８】
本発明はさらに、ケモカイン受容体モジュレーターで軽減される哺乳動物（ヒトを含む）における疾患状態（特に、疾患状態が炎症疾患であるか、または疾患状態がＨＩＶ感染と共に引き起こされるか、関係する）の処置方法を構成する医薬組成物に関し、前記方法は、そのような処置を必要とする哺乳動物に治療的に有効な量のケモカイン受容体モジュレーターを投与する段階を含み、該ケモカイン受容体モジュレーターは、（Ａ）脂肪族鎖および１つ以上のアミノ酸誘導体によりＮ末端において修飾され、または（Ｂ）脂肪族鎖または多環によりＣ末端において修飾され、または（Ｃ）脂肪族鎖および１つ以上のアミノ酸誘導体によりＮ末端において修飾されかつ脂肪族鎖または多環によりＣ末端において修飾された、ケモカインポリペプチド鎖を含む。
【００１９】
（好ましい実施形態の説明）
本発明は、ＮおよびＣ末端ケモカイン受容体モジュレーターに関するものである。本明細書中で使われているように、用語「ケモカイン受容体モジュレーター」は、適切なケモカインバイオアッセイによって決定される天然産ケモカインの活性を調節または阻害するポリペプチドまたは誘導ポリペプチドを指すことを意図している。そのような阻害剤は、それらが結合するケモカイン受容体の１つ以上の特性に拮抗する（例えば、ウイルス感染を阻害し、受容体の下方調節を引き起こし、受容体インターナリゼーションを引き起こす）ことにより作用し、その結果、細胞表面へ再循環する受容体の正常サイクルに「拮抗」し得る。他の生体応答においては、そのようなモジュレーターは、例えば、カルシウムフラックス引き起こし、走化性開始等により受容体のアゴニストとして作用し得る。従って、本発明のケモカイン受容体モジュレーターは、アンタゴニスト（部分的拮抗作用を含む）として作用できるが、アゴニスト（部分的アゴニスト）または双方の混合物としても作用し得る。好ましいケモカイン受容体モジュレーターは、少なくとも１つの拮抗特性、すなわちそれらが結合するケモカイン受容体の１つ以上の生物学的特性に拮抗する能力を示すものである（例えば、（１）ウイルス感染、（２）走化性、（３）受容体サイクリング等をブロックまたは部分的にブロックする）。そのようなケモカイン受容体モジュレーターは、ケモカインの受容体に結合する（すなわち、接合する）ことにより作用し得るが、これを活性化するものではなく、あるいは他の手段によりそれらの作用を仲介し得る。
【００２０】
本発明のＮ末端ケモカイン受容体モジュレーターは、Ｎ末端において脂肪族鎖および１つ以上のアミノ酸誘導体により修飾されたケモカインポリペプチド鎖を含む。Ｎ末端ケモカイン受容体モジュレーターは、Ｎ末端からＣ末端方向へ読んだときの式は以下の通りである。すなわち、
Ｊ１−Ｘ１−Ｚ１−ＣＨＥＭＯＫＩＮＥ
である。ここで、Ｊ１は脂肪族鎖、Ｘ１は、ケモカインポリペプチド鎖のＮ末端アミノ酸配列の０以上のアミノ酸を含むスペーサー、Ｚ１はＺアミノ酸誘導体、ＣＨＥＭＯＫＩＮＥはケモカインポリペプチド鎖の残留アミノ酸配列、さらに、ダッシュ（「−」）は共有結合を表す。化合物は、ポリペプチド鎖のＮ末端領域の全長を考慮するように設計される。従って、脂肪族鎖の長さおよびアミノ酸誘導体の位置に応じて、Ｎ末端アンタゴニストは、対応する天然産ケモカインポリペプチド鎖に対するＮ末端に、１つ以上の置換、挿入または欠失を含み得る。
【００２１】
Ｃ末端ケモカイン受容体モジュレーターは、Ｃ末端において脂肪族鎖または多環により修飾されたケモカインポリペプチド鎖を含む。これらの化合物は、Ｎ末端からＣ末端方向へ読んだときの式は以下の通りである。すなわち、
ＣＨＥＭＯＫＩＮＥ−Ｘ２−Ｊ２
である。ここで、Ｘ２はケモカインポリペプチド鎖のＣ末端アミノ酸配列の０以上のアミノ酸を含むスペーサー、Ｊ２は脂肪族鎖または多環、ＣＨＥＭＯＫＩＮＥはケモカインポリペプチド鎖の残留アミノ酸配列、さらに、ダッシュ（「−」）は、共有結合を表す。ケモカインのＣ末端領域には、本質的な修飾を加えることができ、該修飾には、対応する野生型分子と比較してポリペプチド鎖のＣ末端を延長する１つ以上のアミノ酸および他の化学部分の挿入、欠失または付加、ならびに蛍光標識および生体適合性ポリマーの付加、および小さな有機分子、ペプチド、タンパク質等のような他の化合物への結合が含まれる。
【００２２】
本発明のＮおよびＣ末端ケモカイン受容体モジュレーターは、ＮおよびＣ末端領域双方での修飾を含むことができ、これは、特に言及される場合は、Ｎ／Ｃ末端ケモカイン受容体モジュレーターと表される。これらの化合物は、式
Ｊ１−Ｘ１−Ｚ１−ＣＨＥＭＯＫＩＮＥ−Ｘ２−Ｊ２
を有しており、ここで、Ｊ１、Ｘ１、Ｚ１、ＣＨＥＭＯＫＩＮＥ、Ｘ２、Ｊ２および「−」は、上で説明した通りである。これらの化合物により、ＮおよびＣ末端修飾の利点を最終用途に応じて相乗的に組み合わされる。
【００２３】
「ケモカインポリペプチド鎖」は、天然産野生型ケモカインのポリペプチド鎖と実質的に相同であるポリペプチド鎖を意味する。「Ｎ末端アミノ酸配列」は、天然産ケモカインのポリペプチド鎖の最初のジスルフィド形成システインに対して隣接しており、且つＮ末端側にあるケモカインポリペプチド鎖のアミノ酸配列を意味する。「Ｃ末端アミノ酸配列」は、天然産ケモカインポリペプチド鎖の最後のジスルフィド形成システインに対して隣接しており、且つＣ末端側にあるケモカインポリペプチド鎖のアミノ酸配列を意味する。本発明のケモカイン受容体モジュレーターの主成分となるケモカインポリペプチド鎖、Ｎ末端アミノ酸配列、Ｃ末端アミノ酸配列ならびに最初のジスルフィド形成システインおよび最後のジスルフィド形成システインは、既知のＣ、ＣＣ、ＣＸＣおよびＣＸＸＸＣケモカインのアミノ酸配列との比較のような、同じクラスの他のケモカインによる相同性モデリングルによってだけでなく、天然産ケモカインの対応するアミノ酸配列から容易に推論できる。
【００２４】
例えば、以下は既知の天然産ケモカインの例であり、その多くは種々の名称で記載されており、従って複数回登場する。すなわち、６Ｃｋｉｎｅ、９Ｅ３、ＡＴＡＣ、ＡＢＣＤ−１、ＡＣＴ−２、ＡＬＰ、ＡＭＡＣ−１、ＡＭＣＦ−１、ＡＭＣＦ−２、ＡＩＦ、ＡＮＡＰ、Ａｎｇｉｅ、β−Ｒ１、β−トロンボグロブリン、ＢＣＡ−１、ＢＬＣ、ｂｌｒ−１リガンド、ＢＲＡＫ、Ｃ１０、ＣＣＦ１８、Ｃｋ−β−６、Ｃｋ−β−８、Ｃｋ−β−８−１、Ｃｋ−β−１０、Ｃｋ−β−１１、ｃＣＡＦ、ＣＥＦ−４、ＣＩＮＣ、Ｃ７、ＣＫＡ−３、ＣＲＧ−２、ＣＲＧ−１０、ＣＴＡＰ−３、ＤＣ−ＣＫ１、ＥＬＣ、エオタキシン、エオタキシン−２、エクソダス−１、エクソダス−２、ＥＣＩＰ−１、ＥＮＡ−７８、ＥＤＮＡＰ、ＥＮＡＰ、ＦＩＣ、ＦＤＮＣＦ、ＦＩＮＡＰ、フラクタルカイン、Ｇ２６、ＧＤＣＦ、ＧＯＳ−１９−１、ＧＯＳ−１９−２、ＧＯＳ−１９−３、ＧＣＦ、ＧＣＰ−２、ＧＣＰ−２−様、ＧＲＯ１、ＧＲＯ２、ＧＲＯ３、ＧＲＯ−α、ＧＲＯ−β、ＧＲＯ−γ、Ｈ４００、ＨＣ−１１、ＨＣ−１４、ＨＣ−２１、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−２、ＨＣＣ−３、ＨＣＣ−４ Ｈ１７４、ヘパリン中和タンパク質、Ｈｕｍｉｇ、Ｉ−３０９、ＩＬＩＮＣＫ、Ｉ−ＴＡＣ、Ｉｆｉ１０、ＩＬ８、ＩＰ−９、ＩＰ−１０、ＩＲＨ、ＪＥ、ＫＣ、リンホタクチン、Ｌ２Ｇ２５Ｂ、ＬＡＧ−１、ＬＡＲＣ、ＬＣＣ−１、ＬＤ７８−α、ＬＤ７８−β、ＬＤ７８−γ、ＬＤＣＦ、ＬＥＣ、Ｌｋｎ−１、ＬＭＣ、ＬＡＩ、ＬＣＦ、ＬＡ−ＰＦ４、ＬＤＧＦ、ＬＤＮＡＰ、ＬＩＦ、ＬＩＸ、ＬＵＣＴ、ラングカイン、ＬＹＮＡＰ、マンチェスターインヒビター、ＭＡＲＣ、ＭＣＡＦ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＣＰ−５、ＭＤＣ、ＭＩＰ−１−α、ＭＩＰ−１−β、ＭＩＰ−１−δ、ＭＩＰ−１−γ、ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−３−α、ＭＩＰ−３−β、ＭＩＰ−４、ＭＩＰ−５、モノタクチン−１、ＭＰＩＦ−１、ＭＰＩＦ−２、ＭＲＰ−１、ＭＲＰ−２、Ｍ１１９、ＭＤＮＡＰ、ＭＤＮＣＦ、巨大カリオサイト刺激因子、ＭＧＳＡ、Ｍｉｇ、ＭＩＰ−２、ｍｏｂ−１、ＭＯＣ、ＭＯＮＡＰ、ＮＣ２８、ＮＣＣ−１、ＮＣＣ−２、ＮＣＣ−３、ＮＣＣ−４ Ｎ５１、ＮＡＦ、ＮＡＰ−１、ＮＡＰ−２、ＮＡＰ−３、ＮＡＰ−４、ＮＡＰＳ、ＮＣＦ、ＮＣＰ、ニューロタクチン、オンコスタチンＡ、Ｐ１６、Ｐ５００、ＰＡＲＣ、ｐＡＴ４６４、ｐＡＴ７４４、ＰＢＰ、ＰＢＰ−様、ＰＢＳＦ、ＰＦ４、ＰＦ４−様、ＰＦ４−ＡＬＴ、ＰＦ４Ｖ１、ＰＬＦ、ＰＰＢＰ、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＣＭ−１−α、ＳＣＩ、ＳＣＹ　Ａ２６、ＳＬＣ、ＳＭＣ−ＣＦ、ＳＴ３８、ＳＴＣＰ−１、ＳＤＦ−１−α、ＳＤＦ−１−β、ＴＡＲＣ、ＴＣＡ−３、ＴＣＡ−４、ＴＤＣＦ、ＴＥＣＫ、ＴＳＧ−８、ＴＹ５、ＴＣＦ、ＴＬＳＦ−α、ＴＬＳＦ−β、ＴＰＡＲ−１、ＴＳＧ−１である。
【００２５】
例として、ただし限定するものとしてではなく、上記で列挙した野生型ケモカインポリペプチド鎖およびそれらの対応するＮ末端、ＮループおよびＣ末端アミノ酸配列のいくつかの例を図２Ａ〜図２Ｅに表してある。幸いなことに、更なるケモカインポリペプチドが知られており、ゲノムデータベース（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｍａｒｙｌａｎｄ ＵＳＡ）、タンパク質データバンク（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＆ Ｒｕｔｇｅｒｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ ＵＳＡ）、Ｅｎｔｒｅｚ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｍａｒｙｌａｎｄ ＵＳＡ）、ＮＲＬ ３Ｄ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｃａｍｅｇｉｅ Ｍｅｌｌｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ ＵＳＡ）、ＣＡＴＨ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎ， Ｌｏｎｄｏｎ， ＵＫ）、ＮＩＨ Ｇｏｐｈｅｒサーバー（ＮＩＨ， Ｍａｒｙｌａｎｄ， ＵＳＡ）、ＰｒｏＬｉｎｋ（Ｂｏｓｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ， ＵＳＡ）、核酸データベース（Ｒｕｔｇｅｒｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， ＵＳＡ）、ジーンバンク（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ， ＵＳＡ）、Ｅｘｐａｓｙ（Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， Ｇｅｎｅｖａ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）等の一般にアクセス可能なデータベースを含む多くの様々な情報源から入手可能である。また、種々の遺伝子およびタンパク質配列決定計画から得られた新規のケモカインは、データベースおよびこの目的を達成するための関連ツールを含んだ、当該分野で公知の標準的手法にによる相同性およびパターンマッチングによって同定できる。
【００２６】
本発明の１つの実施形態において、ファージディスプレイ法またはモジュラーシャッフリング法のような方向付け進化手法（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）を、高い受容体特異性を有するケモカインを生成するために使用できる。ファージディスプレイを用いてケモカイン受容体を結合する能力についてのケモカイン誘導体または類似体の試験が、ＨＩＶの治療および予防に関して記載されている（米国特許第６，２１４，５４０号、ＤｅＶｉｃｏ ｅｔ ａｌ．）。ファージディスプレイ法は、細胞応答を引き起こす能力を有する１つ以上のケモカインの選択的結合（米国特許第６，１８４，３５８号、Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）を特徴とする、ＣＸＣケモカイン受容体３（ＣＸＣＲ３）についての受容体タンパク質のリガンド、阻害剤またはプロモーターを検出または同定するためにも用いられてきた（米国特許第６，１４０，０６４号、Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）。ファージディスプレイ法の使用は、分子の標識および選択（米国特許第６，１８０，３６６号、Ｏｓｂｏｕｒｎ）、特異性抗原についての結合分子の標識およびその後の精製（例えば国際公開第ＷＯ９２／０１０４７号参照）、およびＨＩＶ感染および免疫不全の予防および治療のためのペプチド組成の決定（米国特許第６，０９０，３８８号、Ｗａｎｇ）に関して記載されている。
【００２７】
Ｇタンパク質結合受容体を用いるファージディスプレイ手順（例えば、Ｄｏｏｒｂａｒ ｅｔ ａｌ．，「ファージディスプレイを用いたトロンビン受容体に対するペプチドアンタゴニストの単離」Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏ．， ２４４： ３６１−９（１９９４）参照）は、また、Ｎループ領域での方向付け進化のための好ましい領域（Ｋｏｎｉｇｓ， Ｃ，「ファージディスプレイされたランダムペプチドライブラリーの２モノクローナル抗体スクリーニングによりケモカイン受容体ＣＣＲ５のミモトープが解明される：受容体の三次構造およびＨＩＶ−１ｇｐ１２０用のＮ末端結合部位についての意味」Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０００ Ａｐｒ； ３０（４）： １１６２−７１；Ｓｉｄｈｕ， Ｓ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．、「機能性選択のためのファージ上での大きいタンパク質の高複写ディスプレイ」Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０００ Ｆｅｂ １８；２９６（２）：４８７−９５；Ｆｉｅｌｄｉｎｇ Ａ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．、「ハイパー融合誘導性テナガザル白血病エンベロープ糖タンパク質：リガンドディスプレイによる細胞毒性遺伝子のターゲティング」Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０００ Ａｐｒ １０； １１（６）：８１７−２６）、ＮループとＣ末端との間の領域、およびＣ末端（Ｃａｉｎ， Ｓ．Ａ． ｅｔ ａｌ．「全分子ランダム突然変異されたＣ５ａライブラリーからの新規なリガンドの選択」Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ２００１ Ｍａｒ；１４３：１８９−９３； Ｈｅｌｌｅｒ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．，「免疫複合体病および虚血／再潅流障害における炎症応答を緩和するファージライブラリーからのＣ５ａ受容体アンタゴニストの選択」Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９９ Ｊｕｌ １５；　１６３（２）：９８５−９４； Ｃｈａｎｇ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．，「組合せペプチドライブラリーを用いたＬＸＸＬＬ核受容体−共活性体相互作用モチーフの解剖：エストロゲン受容体αおよびβのペプチドアンタゴニストの発見」Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９９ Ｄｅｃ；１９（１２）：８２２６−３９）と共に記載されている。
【００２８】
Ｊ１およびＪ２の適切な脂肪族鎖は、長さが５（Ｃ５）〜２２（Ｃ２２）個の炭素である脂肪族鎖を含むが、これに限定されない。その鎖は不飽和および／または非分岐とすることができ、または可変の飽和度および／または分岐度を持つことができる。脂肪族鎖は一般式Ｃｎ（Ｒｍ）−であり、ここでＣｎは炭素数であり、Ｒｍは、水素、アルキル基、アシル基、芳香族基もしくはそれらの組み合わせから選択される置換基の数であり、ｎはおよびｍは同じでも異なってもよい。Ｊ１およびＪ２基は、Ｘ１、Ｘ２に、または所与の適切な共有結合によってケモカインポリペプチド鎖に結合される。適切な共有結合の例としては、以下のものが含まれるが、これに限定されない。すなわち、アミド、ケトン、アルデヒド、エステル、エーテル、チオエーテル、チオエステル、チオゾリジン、オキシム、オキシゾリジン、シッフ塩基およびシッフ塩基型結合（例えば、ヒドラジド）である。そのような結合は以下のものを限定することなく含み得る。
−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；
−ＮＨ−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−ＮＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＮＨ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＮＨ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＮＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−ＮＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−ＮＨ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＮＨ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；
−ＯＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＮＨ−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＮＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＮＨ−（ＣＨ２）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＮＨ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＮＨ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＮＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＮＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＮＨ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＮＨ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−，
−ＯＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−（ＣＨ２）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−ＮＨ−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−ＮＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−ＮＨ−（ＣＨ２）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−ＮＨ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−ＮＨ−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；
−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；
−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；
−ＳＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｃ（Ｏ）−；−ＳＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−ＳＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−ＳＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＳＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＳＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＳＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＳＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＳＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−ＳＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−ＳＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＳＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；
−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；
−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−（ＣＨ２）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−ＮＨ−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−ＮＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−ＮＨ−（ＣＨ２）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−ＮＨ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−ＮＨ−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−Ｎ（ＣＨ３）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）Ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；
−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−（ＣＨ２）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３ＨＯＮ−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−ＮＨ−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−ＮＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−ＮＨ−（ＣＨ２）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−ＮＨ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−ＮＨ−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−Ｎ（ＣＨ３）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；
−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）−、あるいは共有結合。ここで、ｘは２、３、４またはそれ以上であり、かつ同じであっても異なっていてもよい。
【００２９】
結合システムに適した化学反応はよく知られており、この目的に利用できる（例えば、「タンパク質複合および架橋の化学」、Ｓ．Ｓ． Ｗｏｎｇ， Ｅｄ．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．（１９９３）；Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｏｎｊｕａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｃｌａｕｄｅ Ｆ． Ｍｏｄｒｅｓ， Ｅｄ．， ＡＣＳ（１９９３））。
【００３０】
Ｊ１およびＪ２のＸ１、Ｘ２またはケモカインポリペプチド鎖への結合に加え、結果として得られる分子がそのアンタゴニスト特性を保持するのであれば、用いられる結合システムは、標的分子の物理−化学的および／または生物学的特性を調節するように選択し得る。このことは、例えば、長さ、剛性、電荷および／またはキラリティーが可変の結合システムを利用することによって、半減期等の調整、または効力、特異性等の調節について別のものと比較した１つのタイプの条件においてより安定（または、より不安定）な結合システムを組み込むことにより達成し得る。炭化水素鎖をケモカインポリペプチド鎖に結合する結合単位は、Ｊ１および／またはＪ２の全体の長さおよび空間充填が天然産ケモカインのそれに最も好ましくは近似するのであれば、実質的に変わり得る。
【００３１】
好ましい実施形態においては、脂肪族鎖Ｊ１は、炭素５個（Ｃ５）〜１０個（Ｃ１０）の長さの炭化水素鎖であり、脂肪族鎖Ｊ２は、炭素１２個（Ｃ１２）〜２０個（Ｃ２０）の長さの脂質である。Ｊ１Ｃ５〜Ｃ１０炭化水素鎖の例は、以下のものを含むが、これらに限定されるものではない：−Ｃ５Ｈ１１、−Ｃ５Ｈ９、−Ｃ５Ｈ７、−Ｃ５Ｈ５、−Ｃ５Ｈ３、−Ｃ６Ｈ１３、−Ｃ６Ｈ１１、−Ｃ６Ｈ９、−Ｃ６Ｈ７、−Ｃ６Ｈ５、−Ｃ６Ｈ３、−Ｃ７Ｈ１５、−Ｃ７Ｈ１３、−Ｃ７Ｈ１１、−Ｃ７Ｈ９、−Ｃ７Ｈ７、−Ｃ７Ｈ５、−Ｃ７Ｈ３、−Ｃ８Ｈ１７、−Ｃ８Ｈ１５、−Ｃ８Ｈ１３、−Ｃ８Ｈ１１、−Ｃ８Ｈ９、−Ｃ８Ｈ７、−Ｃ８Ｈ５、−Ｃ８Ｈ３、−Ｃ９Ｈ１９、Ｃ９Ｈ１７、−Ｃ９Ｈ１５、−Ｃ９Ｈ１３、−Ｃ９Ｈ１１、−Ｃ９Ｈ９、−Ｃ９Ｈ７、−Ｃ９Ｈ５、−Ｃ９Ｈ３、−Ｃ１０Ｈ２１、−Ｃ１０Ｈ１９、Ｃ１０Ｈ１７、−Ｃ１０Ｈ１５、−Ｃ１０Ｈ１３、−Ｃ１０Ｈ１１、−Ｃ１０Ｈ９、−Ｃ１０Ｈ７、−Ｃ１０Ｈ５、および−Ｃ１０Ｈ３ 。
【００３２】
適切なＪ２脂質には、脂肪酸由来脂質および多環ステロイド由来脂質が含まれるが、これらに限定されない。該脂肪酸としては、飽和および不飽和脂肪酸が含まれるが、これらに限定されない。該飽和脂肪酸の例は、ラウリン酸（Ｃ１２）およびミリスチン酸（Ｃ１４）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ステアリン酸（Ｃ１８）、およびアラキジン酸がある（Ｃ２０）。不飽和脂肪酸の例としては、オレイン酸（Ｃ１８）、リノール酸（Ｃ１８）、リノレン酸（Ｃ１８）、エレオステアリン酸（Ｃ１８）、およびアラキドン酸が含まれる（Ｃ２０）。多環化合物としては以下のものが含まれるが、これらに限定されない。すなわち、アルドステロン、コレスタノール、コレステロール、コール酸、コプロスタノール、コルチコステロン、コーチゾン、デヒドロコレステロール、デスモステロール、ジギトゲニン、エルゴステロール、エストラジオール、ヒドロキシコルチコステロン、ラソステロール、プレドニゾン、プレグネノロン、プロゲステロン、テストステロン、チモステロール等である。脂肪酸は通常、酸成分によってケモカインポリペプチド鎖と結合され、それにより、アシル結合部を生じるが、他の結合を使用できる。炭化水素鎖をケモカインポリペプチド鎖に結合している結合単位は、Ｎ末端領域の全体の長さおよび空間充填が天然産ケモカインのそれに最も好ましくは近似するのであれば実質的に変わり得る。Ｃ末端領域は、この点でより柔軟であることが見出され、従って、全体の長さおよび空間充填は、Ｎ末端領域でよりも大きく変わり得る。
【００３３】
別の好ましい実施形態においては、Ｊ１およびＪ２構成要素は、本発明のケモカイン誘導体に含まれる場合、ノナノイル、ノネノイル、アミノオキシペンタン、ドデカノイル、ミリストイル、パルミテート、ラウリル、パルミトイル、エイコサノイル、オレオイル、またはコリルのようなＣ５〜Ｃ２０の飽和または不飽和アシル鎖を含む。例えば、Ｊ１置換基は、ノナノイルまたはアミノオキシペンタンとすることができ、Ｊ２置換基は、飽和または不飽和脂肪酸、好ましくはＣ１２〜Ｃ２０脂肪酸またはコレステロールのような多環ステロイド脂質とすることができるる。
【００３４】
本発明のケモカイン受容体モジュレーターは、脂肪族鎖の性質および長さによって、別のアミノ酸、またはポリペプチド鎖に、特にＣ末端で付加されてスペーサー基および／または脂肪族部分用の別個の結合部位を提供する他の部分を含み得る。
【００３５】
「アミノ酸誘導体」とは、遺伝子学的にコード化された２０種の天然産アミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸様化学物質を意味する。特に、アミノ酸誘導体Ｚ１は、遺伝子学的にコード化された２０種の天然産アミノ酸以外のものであり、式−（Ｎ−ＣｎＲ−ＣＯ）−を有し、式中、Ｃｎは１〜２２個の炭素であり、Ｒは水素、アルキル基または芳香族基であり、ここでＮおよびＣｎ、ＮおよびＲ、またはＣｎおよびＲは、環状構造を形成し得る。また、Ｎ、ＣｎおよびＲはそれぞれ、アミノ酸誘導体に依存する還元形において１つ以上の水素を有している。アルキル基部分は、置換体または非置換体であってもよく、直鎖状、分枝状、または環状であってもよく、１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい。芳香族基は、置換体または非置換体であってもよく、１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい。アミノ酸誘導体は新たに作るか、市販のソースから入手できる（例えば、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ ＡＧ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ； Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ， Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ， ＫＹ， ＵＳＡ； Ｌａｎｃａｓｔｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｉｎｃ．， Ｗｉｎｄｈａｍ， ＮＨ， ＵＳＡ； Ｂａｃｈｅｍ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， Ｉｎｃ．， Ｔｏｒｒａｎｃｅ， ＣＡ， ＵＳＡ； Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ， ＵＳＡ参照）。アミノ酸誘導体の例としては、アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−ＣＯＯＨ（Ｔｉｃ）、インドリン−２−カルボン酸（インドール）、４−ジフルオロ−プロリン（Ｐ（４，４ＤｉＦ））、Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸（Ｔｈｚ）、Ｌ−ホモプロリン（ＨｏＰ）、３，４−デヒドロプロリン（ΔＰｒｏ）、３，４ジヒドロフェニルアラニン（Ｆ（３，４−ＤｉＯＨ））、ｐＢｚｌ、−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｆ（３，４−ＤｉＯＨ，ｐＢｚｌ））、ベンゾフェノン（ｐ−Ｂｚ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、３−（２−ナフチル）−アラニン（βＮａｌ）、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、およびフェニルグリシン（Ｐｈｇ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００３６】
Ｘ１、ＣＨＥＭＯＫＩＮＥおよびＸ２について、これらの構成要素のアミノ酸配列は、対応する天然産野生型分子に実質的に相同である。用語「実質的に相同」は、本明細書中で用いられる場合、所与の配列と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の配列の相同性を有する酸配列を含むものであり、９５〜９９％のものが好ましい。この用語は、結果として生じるポリペプチドが対応する天然産ケモカインのアンタゴニストとして作用するのであれば、所与の配列と比べて、１〜２０、１〜１０または１〜５の単一アミノ酸欠失、挿入または置換を有するアミノ酸配列を含むが、これに限定されない。
【００３７】
例えば、あるアミノ酸を、ポリペプチドの特性に実質的な変化を全く生じさせないように他のアミノ酸によって置き換えることができることが当分野でよく知られており、このようなアミノ酸は、アミノ酸の保存性置換を含むがこれに限定されない。そのような可能性は本発明の範囲内にある。ポリペプチドの特性を実質的に変えないアミノ酸の欠失または挿入をしばしば行い得ることも指摘されるべきである。本発明はそのような欠失または挿入を含む（該欠失または挿入は、例えば、対応する天然産ケモカインの特異的アンタゴニストの配列の長さの１０、２０または５０％までとし得る）。さらに、ケモカインは、実質的な修飾を受けることがあり、これには、種々のケモカインポリペプチドセグメントを混合およびマッチングして、ＷＯ９９／１１６５５号（参照により全体が本明細書に組み入れられる）に記載されるモジュラー「交差」合成のような、付加的な多様性を作り出すことが含まれる。
【００３８】
Ｎ末端およびＣ末端での変更に加え、本発明のケモカイン受容体モジュレーターは、ポリペプチド鎖のどこか、すなわち上記の式においてＣＨＥＭＯＫＩＮＥで表されるポリペプチド鎖の中に、１つ以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失も含み得る。好ましい実施形態においては、変更は、標的受容体についてのその特異性／選択性を増大させるために、ケモカインのＮループにおいてなされる。このように、Ｎループ修飾ケモカイン受容体モジュレーターは、その考えられる共受容体の他方へのアンタゴニスト効果を最小限にする一方で、特定の受容体をブロックする。「Ｎループ」は、所与のケモカインポリペプチド鎖のＮ末端領域を定義する第１の保存システインパターンに対して隣接し、且つＣ末端側にある２０〜２６のアミノ酸配列領域を意味する（図１および図２を参照）。例えば、ケモカインポリペプチド鎖のＮ末端からＣ末端方向に読むと、ＣＣケモカインのＮループは、第１および第２の保存システインに対する隣接／Ｃ末端側と第３の保存システインアミノ酸に対する隣接／Ｎ末端側との間に位置するアミノ酸領域である。
【００３９】
本発明のケモカイン受容体モジュレーターは、発蛍光団のような検出可能標識、および特定の選択された部位に導入され、分子を薬物動態等のモニタリングのためだけでなくケモカイン作用、ウイルス抑制等に関連した膜および細胞生物学的事象のプローブにする他の置換基も含み得る。検出可能な標識は、好ましくは、ケモカイン受容体モジュレーターのＣ末端領域に結合される。検出可能な標識は、ケモカインポリペプチド鎖の合成中または合成後に組み込み得る。例として、検出可能な標識は、鎖組立の間に事前に連結したペプチドセグメント中に組み込むことができ、例えば、樹脂からの他の保護基の除去および標識されたペプチドの放出の前に、発蛍光団を樹脂結合ペプチドの非保護反応基に結合させることが便利である。検出可能な標識を含むアミノ酸誘導体と、それらをペプチドまたはポリペプチド配列に組み入れるために用いられる化学的合成法は、よく知られており、この目的のために用い得る。このように、結果として生じるケモカインポリペプチド結合産物は、１つ以上の検出可能な標識を、あらかじめ特定した位置に含むように設計できる。あるいは、検出可能標識を、結合前のペプチドセグメントまたは結合後のポリペプチド鎖の所与のアミノ酸上に存在する反応基、好ましくは部位特異的結合を可能にするケト基またはアルデヒド基のような化学選択的反応基に付加できる。
【００４０】
この目的に適した検出可能標識としては、光活性基、ならびに、発蛍光団およびその他の色素を含む発色団、またはビオチンのようなハプテンが含まれる。そのような標識は、多くの様々な商業的ソース（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｏｒｅｇｏｎ， ＵＳＡ；Ｓｉｇｍａ ａｎｄ ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ， ＵＳＡ、等）から入手可能である。オンレジン標識付けについては、フロオレセイン、エオシン、オレゴングリーン、ローダミングリーン、ロドールグリーン、テトラメチルローダミン、ローダミンレッド、テキサスレッド、クマリンおよびＮＢＤ発蛍光団、ダブシル発色団およびビオチンはすべて、他のほとんどの酸と同様にフッ化水素（ＨＦ）に対してもかなり安定であり、従って、固相合成を介しての組み込みに適している。（Ｐｅｌｅｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９４）３３：７２１１； Ｂｅｎ−Ｅｆｒａｉｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９４）３３：６９６６）。クマリンを除いて、これらの発蛍光団は、Ｆｍｏｃ化学を用いて合成されるペプチドの脱保護に使われる試薬についても安定である（Ｓｔｒａｈｉｌｅｖｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９４）３３：１０９５１）。ε−ダブシル−Ｌ−リジンのｔＢｏｃおよびα−Ｆｍｏｃ誘導体も、ダブシル発色団を、ポリペプチド配列中の選ばれた部位に組み込むために使用できる。ダブシル発色団は、広い可視吸収を有し、消光基として用い得る。ダブシル基は、ダブシル酢酸イミドエステルを用いてＮ末端に組み込むこともできる（Ｍａｇｇｉｏｒａ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ（１９９２）３５：３７２７）。ＥＤＡＮＳは、ＦＲＥＴ実験において、ダブシル消光剤とのペアリング用の共通発蛍光団である。この発蛍光団は、ペプチドの自動化合成の間に、５−（（２−（ｔＢｏｃ）−γ−グルタミルアミノエチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸を用いることにより簡便に導入できる（Ｍａｇｇｉｏｒａ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．（１９９２） ３５：３７２７）。α−（ｔＢｏｃ）−ε−ダンシル−Ｌ−リジンは、化学合成の間に、ポリペプチド中にダンシル発蛍光団を組み込むために用い得る（Ｇａｕｔｈｉｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．（１９９３）３０６：３０４）。ＥＤＡＮＳと同様、この発蛍光団の蛍光はダブシルの吸収と重複する。ペプチドの部位特定的ビオチン化は、ビオシチンのｔＢｏｃ保護された誘導体（Ｇｅａｈｌｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９２）２０２：６８）、または、ＮＨＳビオチン等の他のよく知られたビオチン化誘導体等を用いて達成できる。ラセミ型ベンゾフェノンフェニルアラニン類似物も、そのｔＢｏｃまたはＦｍｏｃ保護の後にペプチド中に組み入れ得る（Ｊｉａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｌ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔ． Ｒｅｓ．（１９９５）４５：１０６）。ジアステレオマーの分割は、生成物のＨＰＬＣ精製の間に達成でき、未保護のベンゾフェノンも、当分野で標準の方法によって分割できる。オキシム結合のためのケト含有アミノ酸、アザ／ヒドロキシトリプトファン、ビオチルリジンお���びＤ−アミノ酸は、オンレジン標識付けに利用できるアミノ酸の他の例である。自動ペプチド合成用の他の保護アミノ酸が、当分野で標準の技法に従ってカスタム合成により調製できることが認められるであろう。別の実施形態においては、本発明のケモカイン受容体モジュレーターは、それに結合させた薬剤を含み得る（例えば、ＷＯ００／０４９２６号を参照）。
【００４１】
本発明のケモカイン受容体モジュレーターの産生方法も提供される。この方法は、（ｉ）天然産ケモカインと実質的に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を含む天然産ケモカインの類似物を合成する段階であって、ポリペプチド鎖はそのＮ末端、ＮループおよびＣ末端の１つ以上において、脂肪族鎖およびアミノ酸誘導体から選択される部分により修飾される段階と、（ｉｉ）アンタゴニスト活性について、対応する天然産ケモカインと比較してケモカイン類似物をスクリーニングする段階と、を含む。
【００４２】
特に、Ｎ末端ケモカイン受容体モジュレーターの産生方法は、（ｉ）天然産ケモカインと実質的に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を含む天然産ケモカインの類似物を合成する段階であって、ポリペプチド鎖がそのＮ末端において、脂肪族鎖および１つ以上のアミノ酸誘導体により修飾される段階と、（ｉｉ）対応する天然産ケモカインと比較してアンタゴニスト活性についてケモカイン類似物をスクリーニングする段階と、を含む。Ｃ末端ケモカイン受容体モジュレーターの産生方法は、（ｉ）天然産ケモカインと実質的に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を含む天然産ケモカインの類似物を合成する段階であって、ポリペプチド鎖がＣ末端において、脂肪族鎖または多環により修飾される段階と、（ｉｉ）アンタゴニスト活性について対応する天然産ケモカインと比較してケモカイン類似物をスクリーニングする段階と、を含む。Ｎ／Ｃ末端ケモカイン受容体モジュレーターの産生方法は、（ｉ）天然産ケモカインと実質的に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を含む天然産ケモカインの類似物を合成する段階であって、ポリペプチド鎖がそのＮ末端において、脂肪族鎖および１つ以上のアミノ酸誘導体により修飾され、かつＣ末端において、脂肪族鎖または多環で修飾される段階と、（ｉｉ）アンタゴニスト活性について対応する天然産ケモカインと比較してケモカイン類似物をスクリーニングする段階と、を含む。
【００４３】
本発明のケモカイン受容体モジュレーターの合成は、化学合成（すなわち、リボソームフリー合成）、または生物合成（すなわち、リボソーム合成）と化学合成との組み合わせにより達成される。化学合成については、ケモカイン受容体モジュレーターは、ＦｍｏｃおよびｔＢｏｃアプローチを用いた固相または溶液相ペプチド合成のような段階的鎖組立またはフラグメント縮合により、あるいは鎖組立または鎖組立と生物産生との組み合わせにより全体として作られたペプチドセグメントの化学的結合により、全体として作られ得る。そのような段階的鎖組立またはフラグメント縮合および結合手法は、当分野で公知である（例えば、Ｋｅｎｔ， Ｓ．Ｂ．Ｈ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８８）５７：９５７−９８９；　Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９７）２８７：３４−４５； Ｍｕｉｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９７）２８９：２６６−２９８； Ｗｉｌｋｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９８）９：４１２４２６； Ｉｎｇｅｎｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．（１９９９）１２１（４９）：１１３６９−１１３７４； Ｍｕｉｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）６：Ｒ２４７−Ｒ２５６参照）。
【００４４】
化学結合については、Ｎ末端官能基を有する第１のペプチドセグメントは、Ｎ末端官能基と反応してその間に共有結合を形成するＣ末端官能基を有する第２のペプチドセグメントに結合される。選択された官能基によって、結合反応により、結合部位に天然アミド結合または非天然共有結合を有する産物を生成する。化学結合に使用した第１または第２のペプチドセグメントは、典型的には、段階的鎖組立またはフラグメント縮合により作られている。特に、ケモカイン受容体モジュレーターが、ペプチドセグメントの結合により作られる場合、セグメントは、結合用に使われる意図された化学選択的反応化学に関して適切なペンダント化学選択性反応基を含むように作られる。これらの化学には、天然化学結合（Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６：７７６−７７９； Ｋｅｎｔ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ９６／３４８７８号）、拡張一般化学結合（Ｋｅｎｔ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ９８／２８４３４号）、オキシム形成化学結合（Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．（１９９４）１１６：３０−３３）、チオエステル形成結合（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：２２１−２２５）、チオエーテル形成結合（Ｅｎｇｌｅｂｒｅｔｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔｓ．（１９９５）３６（４８）：８８７１−８８７４）、ヒドラゾン形成結合（Ｇａｅｒｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ．（１９９４）５（４）：３３３−３３８）、チアゾリジン形成結合およびオキサゾリジン形成結合（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（１９９８）９５（１６）：９１８４−９１８９； Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ９５／００８４６号）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
所与の結合化学のための反応条件は、結合構成要素の所望の相互作用を維持するように選択される。例えば、ｐＨおよび温度、ペプチドおよび構成要素の水溶性、ペプチドの比率、個々のペプチドの含水率および組成は、結合を最適化するように変え得る。ペプチドを種々の程度に可溶化する試薬の添加または除外は、所望の結合反応の特性および速度を制御するためにさらに用い得る。反応条件は、所望の化学選択的反応産物について、１つ以上の内部および／または外部対照と比較して、アッセイすることにより容易に決定される。
【００４６】
化学合成の好ましい方法は天然化学結合を使用し、これはＫｅｎｔらのＷＯ９６／３４８７８に開示されており、Ｎおよび／またはＣ末端において化学的に修飾されたタンパク質の調製方法は、ＯｆｆｏｒｄらのＷＯ９９／１１６６６号に開示されており、これらの開示内容は、参照により本明細書中に組み込まれる。一般に、Ｃ末端チオエステルを含む第１のペプチドは、酸化されていないスルフヒドリル側鎖を有するＮ末端システインを備える第２のペプチドと反応させられる。Ｎ末端システインの酸化されていないスルフヒドリル側鎖は、触媒量のチオール、好ましくはベンジルメルカプタン、チオフェノール、２−ニトロチオフェノールおよび、２−チオ安息香酸、２−チオピリジン等の存在下でＣ末端チオエステルと縮合される。中間ペプチドは、第１および第２のペプチドをβアミノチオエステル結合を介して結合することにより産生され、これは再編成して、アミド結合により結合された第１および第２のペプチドを含むペプチド産物を産生する。
【００４７】
化学的および生物学的産生の組み合わせについては、一方のペプチドセグメントは化学合成により作られ、他方は組み換え法を用いて作られ、次にこれらのセグメントは、化学結合を用いて接合されて完全長さの産物を生成する。例えば、インテイン発現系は、Ｃ末端チオエステルペプチドセグメントを生成する「インテイン」タンパク質スプライシングの誘発性自己切断活性を活用するために利用できる。特に、インテインは、ＤＤＴ、ｂ−メルカプトエタノールまたはシステインのようなチオール類の存在下で特異的自己切断を受け、これにより、Ｃ末端チオエステルを有するペプチドセグメントが生成される。（例えば、Ｍｕｉｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）６：Ｒ２４７−Ｒ２５６； Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ（１９９７）１９２：２７７−２８１； Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９８）２６：５１０９−５１１５； Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）７：２２５６−２２６４； および、Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）６９：２４７−２５６を参照）。次に、ペプチドセグメントを有するこのＣ端末チオエステルは次に、天然の化学結合について使用されるＮ末端システインを有するペプチドセグメントのような、Ｎ末端チオエステル反応官能性を有する第２のペプチドの結合に利用できる。
【００４８】
脂肪族鎖およびアミノ酸誘導体は、鎖組立、ポスト鎖組立またはそれらの組み合わせの間に組み込み得る。鎖組立の間の組み込みについては、アミノ酸誘導体および／または脂肪族鎖が結合したアミノ酸は、段階的またはフラグメント縮合、および／または結合鎖組立プロセスにおいて組み込まれる。これらのアミノ酸は、ペプチド合成の間に成長中のペプチド鎖に、結合用に標的とされた組立てられたペプチドセグメントに段階的に付加でき、またはある場合には、ペンダントのＮまたはＣ末端修飾は、ポリマー支持材からの切断により提供でき、それによって切断産物が所望の脂肪族鎖を産生する。ポスト鎖組立について、反応性の基を有するアミノ酸またはその誘導体は、所望の成分の結合にとって非保護反応形態で利用できる（保護形態または非保護形態で）鎖組立の間に（すなわち、ポスト・ペプチド合成結合反応の中で）組み込まれる。ポスト鎖組立結合は、変性直鎖ペプチド鎖上で、またはポリペプチド鎖の折り畳みに続いて実行できる。好ましい実施形態においては、アミノ酸誘導体は、ペプチド合成の間に目的とするアミノ酸位置に付加され、それに対して、Ｎ、Ｃおよび／またはＮ／Ｃ末端脂肪族鎖は、複合反応によってペプチド合成に続いて付加される。所望の共有結合に応じて、結合化学のみならず、多くの複合化学のいずれもが利用できる（例えば、Ｐｌａｕｅ， Ｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（１９９０）１８（３）：１４７−５７； Ｗａｄｅ， Ｊ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ａｕｓｔｍｉａｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９３）３（６）：３３２−６； Ｄｏｓｃｈｅｒ， Ｍ．Ｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９７７）４７：５７８−６１７； Ｈａｎｃｏｃｋ， Ｄ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）４（ｌ）：７３−８６； Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９７）２８９：３１３−３６参照）。本発明のケモカイン受容体モジュレーターの折り畳みは、当分野で標準的な手法により達成できる。（例えば、ＷＯ９９／１１６５５号、ＷＯ９９／１１６６６号、Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９７）２８７：３４−４５参照）。
【００４９】
合成されたケモカイン化合物をアンタゴニスト活性についてスクリーニングするため、化合物は、その対応する受容体へのケモカインリガンドの直接的または間接的な結合を特徴とするｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏベースのアッセイにより試験される。ケモカイン受容体およびそれらの対応する野生型ケモカインの例としては、ＣＸＸＸＣＲ１（フラクタルカイン）、ＸＣＲ１（ＳＣＭ−１）、ＣＸＣＲ２（ＧＲＯ、ＬＩＸ、ＭＩＰ−２）、ＣＸＣＲ３（ＭＩＧ、ＩＰ−１０）、ＣＸＣＲ４（ＳＤＦ−１）、ＣＸＣＲ５（ＢＬＣ）、ＣＣＲ１（ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−３）、ＣＣＲ２（ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−５）、ＣＣＲ３（エオタキシン、ＲＮＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α）、ＣＣＲ４（ＭＤＣ、ＴＡＲＣ）、ＣＣＲ５（ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＣＣＲ６（ＭＩＰ−３α）、ＣＣＲ７（ＳＬＣ、ＭＩＰ−３β）、ＣＣＲ８（ＴＣＡ−３）、およびＣＣＲ９（ＴＥＣＫ）が含まれる。これらの系のためのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイはよく知られており、容易に利用可能、または新たに作ることができる。例えば、米国特許第５，６５２，１３３号、米国特許第５，８３４，４１９号、ＷＯ９７／４４０５４号、ＷＯ００／０４９２６号、およびＷＯ００／０４９２号を参照。例えば、１つ以上のケモカイン受容体を発現する天然の、形質転換された、および／または遺伝子移植トランスジェニック細胞株は典型的に、本発明の化合物のようなケモカイン受容体モジュレーターに曝された場合に、ケモカイン誘発走化性の効果またはこの事象の抑制を監視するために使用される。例えば、本発明のケモカイン受容体モジュレーターを用いる治療と関連して応答プロ特徴付けるためにファイルを監視するため、またはこの化合物の薬物動態学的および薬力学的特性をために動物モデルも用いることができる。ウイルス感染の阻害剤として本発明の化合物を特徴付けるため、標的細胞株およびエンベロープ細胞株を用いるエンベロープ仲介細胞融合アッセイを、ＨＩＶ感染予防能力について本発明のケモカイン受容体モジュレーターをスクリーニングするために使用し得る。当然ながら、無細胞ウイルス感染アッセイも同様にこの目的のために用い得る。
【００５０】
例として、一般的に走化性の拮抗作用を評価するため、単球、Ｔリンパ球および好中球の精製のために確立されたプロトコルに従って正常なドナーから単離されたもののような末梢血白血球を用い得る。Ｃ、ＣＣ、ＣＸＸＸＣおよびＣＸＣケモカイン受容体発現試験細胞のパネルを構成し、本発明の個々の化合物の一連の希釈への暴露の後に評価される。天然ケモカインは対照として使用できる。例えば、種々のケモカイン受容体をコードする表現カセットでトランスフェクトされた細胞のパネルは、この目的に適している。例えば、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ−１αまたはＳＤＦ−１βおよびＭＩＰのようなケモカインのアンタゴニストは、形質転換体発現ＣＸＣＲ４／融合／ＬＥＳＴＲ、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＸＣ４を用いてスクリーニングできる（そのような細胞は、種々の商業的および／または学術的ソースから入手可能、または標準プロトコルに従って調製できる。例えば、Ｒｉｓａｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８７：６７１−６７４（１９９７）； Ａｎｇｉｏｌｏｌｏ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎａｌｓ ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（１９９６）７９５：１５８−１６７； Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）８７０：１５００−１５０２参照）。結果は、刺激により引き起こされた細胞移動における折り畳みの対照媒体に対する増加を表す走化性インデックス（「ＣＩ」）、および決定された統計的有意性として表すことができる。
【００５１】
受容体結合アッセイも、例えば、受容体リサイクル効果に対する競合阻害を評価するために実行できる（Ｓｉｇｎｏｒｅｔ， Ｎ． ｅｔ ａｌ．，「ＨＩＶ共受容体ＣＣＲ５のエンドサイトーシスおよびリサイクル」Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２０００ １５１（６）：１２８１−９４； Ｓｉｇｎｏｒｅｔ， Ｎ．ｅｔ ａｌ．，「ケモカイン受容体エンドサイトーシスおよびリサイクルの分析」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０００； １３８：１９７−２０７； Ｐｅｌｃｈｅｎ−Ｍａｔｔｈｅｗｓ， Ａ． ｅｔ ａｌ．，「ケモカイン受容体トラフィッキングおよびウイルス複製」Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｖ． １９９９ Ａｐｒ； １６８：３３−４９； Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ， Ｂ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．，「放射標識ケモカイン結合アッセイ」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０００； １３８：１２９−３４； Ｍａｃｋ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．「ケモカイン受容体のダウンモジュレーションおよびリサイクル」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０００； １３８：１９１−５；参照によりすべて本明細書に組み込まれる）。このアプローチはよく知られており、典型的には、標準プロトコルに従って、標識されたケモカイン受容体モジュレーターを濃度を漸増させた非標識天然ケモカインの存在下で使用する。当然ながら、標識付けは一方または両方にすることができる。このタイプのアッセイにおいては、結合データは、例えばＬＩＧＡＮＤのようなコンピュータプログラム（Ｐ． Ｍｕｎｓｏｎ， Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）で解析でき、さらに天然白血球または標的ケモカイン受容体を発現している受容体−形質移入された細胞のパネルと比較した「１サイト」および「２サイト」モデルによるスキャッチャードプロット解析にかけることができる。次に、未標識リガンドによる結合についての競合の速度を以下の式によって計算できる。すなわち、％阻害＝１−（未標識ケモカイン存在下での結合／媒体のみの存在下での結合）×１００。
【００５２】
ウイルス感染および疾患を予防または緩和する能力について化合物をスクリーニングする場合、化合物は、種々のウイルス株および対照に曝された適切な受容体を安定して発現する細胞のパネルに対してスクリーニングされ得る。例えば、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＸＣ４またはＣＸＣＲ４受容体を発現するＵ８７／ＣＤ４細胞は、Ｍ−トロピック、Ｔ−トロピックおよびデュアルトロピックＨＩＶ株の感染をスクリーニングするために使用できる。ウイルス感染の阻害は、ケモカイン受容体モジュレーターおよび対照の濃度に対する感染の百分率として評価できる。例えば、ＭｃＫｎｉｇｈｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９４）２０１：８−１８）、およびＭｏｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）２６０：６８９−６９２； Ｓｉｍｍｏｎｓ． ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７６：２７６−２７９、Ｗｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．（１９９７）１８５：１６８−１６９、およびＴｒｋｏｌａ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ（１９９６）３８４：１８４−１８６を参照）。カルシウム動員アッセイは、例えば、好中球および好酸球にとり走化性である天然ケモカインのアンタゴニストを同定するために、受容体結合のアンタゴニストについてのスクリーニングに有用な別の例である。（Ｊｏｓｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７９：８８１−８８７（１９９４））。別の例として、本発明の化合物の血管由来活性は、ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイ（Ｏｉｋａｗａ， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．（１９９１）５９：５ ７−６６）により評価できる。
【００５３】
本発明のケモカイン受容体モジュレーターには多くの用途があり、研究ツール、診断および治療用途が含まれる。特に、本発明のケモカイン受容体モジュレーターは、貴重な薬理学的特性を有していることが見出されており、さらに、対応する野生型分子に関係する炎症性作用−これは、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アテローム／アテローム性動脈硬化、臓器移植拒絶、およびリューマチ性関節炎を含む種々の疾患に関係する−を効果的に阻止することが示されている。従って、それらは、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アテローム／アテローム性動脈硬化、臓器移植拒絶、およびリューマチ性関節炎の治療に有用である。例えば、ＲＡＮＴＥＳおよびＳＤＦ−１αまたはＳＤＦ−１βアンタゴニストのような本発明のケモカイン受容体モジュレーターのいくつかも、ＨＩＶ−１感染を阻害することが明らかにされており、アンタゴニスト（例えば、ｖＭＩＰ−ＩＩ）は、同じ目的のために用い得る。従って、本発明のＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ−１αまたはＳＤＦ−１βアンタゴニストおよびｖＭＩＰ−ＩＩ類似物は、哺乳動物におけるＨＩＶ−１を阻害するために用い得る。ＨＩＶ−１に対して用いる化合物のポテンシャルは、以下の実施例において説明される方法により決定される。炎症性作用に対して用いる化合物のポテンシャルは、当業者に公知の方法により決定される。さらに、本発明のケモカイン受容器モジュレーターを、単独で、または互いに組み合わせて、ならびに所与の疾患の治療において共同作用する他の非ケモカイン薬と組み合わせて利用できることが理解されるであろう。
【００５４】
例として、ただし限定ではなく、以下は、これらの分子のケモカイン受容体モジュレーター調製の一般的利用を説明するための、野生型ケモカイン分子のいくつかの特定の例およびそれらの関連した生物学的特性である。例えば、ＳＣＭ−１は、脾臓において発現されたＣ−ケモカインである。これはＣＣおよびＣＸＣ−ケモカインと実質的に関連し、主要な違いは、これのみが、これらのタンパク質中に保存された４つのシステインの第２および第４を有しているということである（Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９５）３６０（２）：１５５−１５９）； Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９９８）２７３（２６）：１６５５１−１６５５４）。ヒトにおいては、２つの高度に相同のＳＣＭ−１タンパク質である、ＳＣＭ−１αおよびＳＣＭ−１βがあり、これは２つのアミノ酸置換により異なっている。ＳＣＭ−１は、マウスリンパ球特異性ケモカインであるリンホタクチンと約６０％同一であることが見出されている。従って、ＳＣＭ−１およびリンホタクチンは、Ｃ−ケモカインまたはγケモカインのヒトおよびマウスの原型を表し得る。両方のＳＣＭ−１分子は、種々のヒト組織中では主として胎盤において、そして脾臓および胸腺においては弱く発現されるオーファン受容体、ＧＰＲ５を発現するように設計したマウスＬ１．２細胞中で遊走を特異的に誘発する。従って、ＳＣＭ−１のアンタゴニストは、ＧＰＲ４の正常な機能を阻止する用途が見出されている。
【００５５】
別の例として、７６アミノ酸ＣＸＸＸＣ−ケモカインであるフラクタルカインからの可溶分は、Ｔ細胞および単球にとり有効な化学遊走物質であるが、好中球についてはそうではない。フラクタルカインは、ＴＮＦまたはＩＬ１による刺激後に顕著に増加する。フラクタルカインのヒト受容体は、ＣＸ３ＣＲ１と表される。この受容体は、フラクタルカインの接着機能と遊走機能の両方を仲介する。ヒト受容体は、好中球、単球、Ｔリンパ球、および脳を含むいくつかの固体器官中で発現される。これらの受容体は、ＨＩＶ−１の１次単離からのエンベロープタンパク質のための共受容体としてＣＤ４と共に機能することが明らかにされている。細胞−細胞融合アッセイにより、フラクタルカインが融合を強力にかつ特異的に阻害することが実証されている。（例えば、Ｂａｚａｎ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３８５（６６１７）：６４０−６４４、Ｃｏｍｂａｄｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９９８）２７３（３７）：２３７９９−２３８０４、Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（１９９８）４７（２）：１６３−１７０、および、Ｆａｕｒｅ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：２２７４−２２７７を参照）。従って、フラクタルカインのアンタゴニストが、ＴＮＦまたはＩＬ１経路を伴う種々の関節炎疾患の治療における使用、ならびにＨＩＶ感染のブロッカーとしての使用ができることは明白である。
【００５６】
エオタキシンはさらなる例である。このタンパク質は長さが７４アミノ酸であり、その特徴的なシステインパターンによってＣＣケモカインとして分類される。これは、アレルギー性炎症のモデルとして用いたモルモットの気管支肺胞洗浄液中に見出され、喘息関連疾患に関係がある。エオタキシンは、皮膚内への１〜２ｐＭの投与量により、好中球の集積に実質的に影響することなく、実質的な好酸球集積を引き起こす。エオタキシンはｉｎ ｖｉｔｒｏでモルモットおよびヒト両方の好酸球の強力な刺激剤である。この因子はモルモット好酸球上でＲＡＮＴＥＳと結合部位を共有していると思われる。エオタキシンは、正常なヒト好酸球中でカルシウムフラックス応答を引き起こすが、好中球または単球においてはそうではない。この応答は、好酸球を他のＣＣケモカインで前処理しても脱感作できない。好塩基球において、エオタキシンは、ＲＡＮＴＥＳよりも高レベルの走化性応答を引き起こすが、これは、ヒスタミン放出またはロイコトリエンＣ４生成におけるわずかな効果を有するだけである。これは、Ｂ細胞リンパ腫細胞の走化性においても役割を果たすことがある。エオタキシンへの一次受容体はＣＣＲ３である。（例えば、Ｂａｒｔｅｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．（１９９６）２２５（３）：１０４５−５１）； Ｊｏｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．（１９９４）１７９：８８１−８８７）； Ｐｏｎａｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ（１９９６）９７（３）：６０４−６１２）； Ｐｏｎａｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．（１９９６）１８３（６）：２４３７−２４４８）； Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．（１９９７）２３１（２）：３６５−３６８を参照）。従って、エオタキシンのアンタゴニストは、喘息および他の好酸球関連アレルギー疾患の有効なモジュレーターとして用い得る。
【００５７】
ＲＡＮＴＥＳは、アンタゴニストが特に興味深い標的ケモカインの別の例である。炎症、臓器拒絶からＨＩＶ感染までの多くの疾患に関わるＣＣケモカインである。ＲＡＮＴＥＳの合成は、ＴＮＦ−αおよびＩＬ１−αによって引き起こされるが、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γおよびＩＬ６によっては引き起こされない。ＲＡＮＴＥＳは、培養中にＴ細胞およびＴ細胞クローンを循環させることによって産生されるが、これまでに試験されたどのようなＴ細胞株によっても産生されない。ＲＡＮＴＥＳの発現は、Ｔリンパ球の刺激後に阻害される。ＲＡＮＴＥＳは、Ｔ細胞、ヒト好酸球および好塩基球に対して走化性であり、白血球を炎症部位に補充するにあたり活発な役割を果たす。ＲＡＮＴＥＳは、好酸球を活性化して、例えば好酸球カチオン性タンパク質を放出させる。これは好酸球密度を変え、好酸球を低密度にし、このことは、一般化細胞活性化の状態を表すと考えられ、喘息およびアレルギー性鼻炎のような疾患に最もよく関連する。ＲＡＮＴＥＳも、酸化的代謝の有効な好酸球特異性活性剤である。ＲＡＮＴＥＳは、内皮細胞への単球の結合を増大させる。これは、細胞表面マーカーＣＤ４およびＵＣＨＬ１を発現している単球およびＴリンパ球の遊走を選択的に支援する。これらの細胞は、メモリーＴ細胞機能を有する前刺激されたヘルパーＴ細胞であると考えられている。ＲＡＮＴＥＳは、いくつかの選択された好塩基球ドナーからのヒト好塩基球を活性化し、ヒスタミン放出を引き起こす。一方で、ＲＡＮＴＥＳは、最も強力なヒスタミン誘導物質の１つであるＭＣＡＦを含むいくつかのサイトカインにより誘発された好塩基球からのヒスタミン放出も阻害できる。
【００５８】
近年、ＲＡＮＴＥＳは走化性以外の生物学的活性を示すことが明らかになった。これは、ＣＨＡＫ（ＣＣケモカイン活性化キラー）として知られており、且つＩＬ２により活性化された細胞に類似しているキラー細胞の増殖および活性化を引き起こすことができる。ＲＡＮＴＥＳは、ヒト滑膜繊維芽細胞により発現され、リューマチ性関節炎中の進行中の炎症プロセスに関与できる。ＲＡＮＴＥＳに対する高親和性受容体（約７００結合部位／細胞；Ｋｄ＝７００ピコＭ）が、走化性およびカルシウム動員アッセイにおいてＲＡＮＴＥＳに応答するヒト単球白血病細胞株ＴＰＨ−１上で同定されている。ＲＡＮＴＥＳに対するＴＰＨ−１細胞の走化性応答は、ＭＣＡＦ（単球走化性および活性化因子）またはＭＩＰ−１−α（マクロファージ炎症性タンパク質）でプレインキュベーションすることにより顕著に阻害される。単球細胞へのＲＡＮＴＥＳの結合は、ＭＣＡＦおよびＭＩＰ−１−αにより競合される。ＲＡＮＴＥＳに対する受容体は、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３およびＣＣＲ５である。ＲＡＮＴＥＳのアンタゴニストの臨床使用および意義は多種多様である。例えば、天然ＲＡＮＴＥＳに対する抗体は、実験的メサンギウム増殖性腎炎に関係する細胞浸潤を劇的に阻害できる。加えて、天然ＲＡＮＴＥＳは、ヒト腎臓の移植拒絶に関連する細胞拒絶を受けているヒト腎臓同種移植において高度に発現されると思われる（Ｐａｔｔｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ（１９９４）３４３（８８９１）：２０９−１１（１９９４）。ＲＡＮＴＥＳの化学修飾された形（アミノオキシペンタン−ＲＡＮＴＥＳすなわちＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ、およびｎ−ノナノイル−ＲＡＮＴＥＳすなわちＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ）は、ケモカインのＣＣＲ−５受容体に対するアンタゴニストとして作用し、さらにＨＩＶ−１感染の阻害能を有していることが示されている。従って、本発明によるＲＡＮＴＥＳのＮ、Ｃ、およびＮ／Ｃ末端修飾類似物は、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、臓器移植、アテローム／アテローム性動脈硬化症およびリューマチ性関節炎のような疾患の治療における抗炎症剤として有用である。
【００５９】
ケモカインＳＤＦ−１αおよびβのアンタゴニストはさらなる例であり、これらはケモカインのＣＸＣクラスに属する。ＳＤＦ−１βは、Ｃ末端に４つの付加的アミノ酸を有する点で異なる。これらのケモカインは、それらの非ヒト対応物と９２％以上同一である。ＳＤＦ−１は、血球を除いて遍在して表現される。ＳＤＦ−１は、リンパ球および単球には作用するが、好中球にはｉｎ ｖｉｔｒｏで作用せず、ｉｎ ｖｉｖｏでは単核細胞に対する非常に強力な化学遊走物質である。これは、リンパ球内で細胞内アクチン重合も引き起こす。ＳＤＦ−１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方において、ヒト造血前駆細胞に対する化学誘因物質として作用して、前駆細胞の混合タイプ、およびより原始的なタイプを生じさせる。ＳＤＦ−１は、また、心室中隔形成にも関係していると思われる。ＣＤ３４＋細胞の走化性は、ＳＤＦ−１とＩＬ−３との組み合わせに応答して増大する。ＳＤＦは、これらの細胞中で細胞質カルシウムの一時的上昇を引き起こすことも示された。ＳＤＦ−１に対する１次受容体はＣＸＣＲ４であり、これはＨＩＶ１に対する主要なＴリンパ球共受容体としても機能する。例えば、Ａｉｕｔｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．（１９９７）１８５（ｌ）：１１１−１２０（１９９７）； Ｂｌｅｕｌｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｅｘｐ． Ｍｅｄ．（１９９６）１８４（３）：１１０１−１１０９（１９９６）； Ｂｌｅｕｌ ｅｔ ａｌ．， ｎａｔｕｒｅ（１９９６）３８２（６５９４）：８２９−８３３； Ｄ’Ａｐｕｚｚｏｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）２７（７）：１７８８−１７９３； Ｎａｇａｓａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ（１９９６）３８２：６３５−６３８）； Ｏｂｅｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ（１９９６）３８２（６５９４）：８３３−８３５を参照。従って、例えば、本発明のＳＤＦ−１アンタゴニストは、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アテローム／アテローム性動脈硬化症およびリューマチ性関節炎のような疾患の治療における抗炎症性薬剤として有用である。さらに、本発明のＳＤＦ−１アンタゴニストは、単独でまたは本発明のＲＡＮＴＥＳアンタゴニスト類似物と組み合わせて、哺乳動物において炎症誘発性細胞の補充および／または活性化に関するＳＤＦ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＭＩＰ−１βの効果を遮断するため、あるいはＨＩＶ−１感染の治療または遮断に用い得る。
【００６０】
従って、本発明の別の観点は、医薬組成物、およびこれを必要とする哺乳動物を、本発明のケモカイン受容体モジュレーターまたは薬学的に許容可能なその塩を含む治療上有効な量の化合物を投与することにより治療する方法に関する。「薬学的に許容可能な塩」とは、本発明のポリペプチドの生物学的有効性および特性を保持し、生物学的にまたは違った形で不適切なものではない塩を意味する。塩は、酸または塩基から誘導できる。酸付加塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸（硫酸塩および重硫酸塩を与える）、硝酸、燐酸等の無機酸、ならびに酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸酸、安息香酸塩、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、サルチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸から誘導される。塩基付加塩は、無機塩基から誘導され、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム塩等を含み得る。有機塩基から誘導される塩としては、第一、第二および第三アミン、天然産置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチエルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、トロメタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、Ｎ−アルキルグルコサミン、テオブロミン、プリン類、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン等から誘導された塩が含まれる。好ましい有機塩基は、イソプロピルアミン、エタノールアミン、ピペリジン、トロメタミン、およびコリンである。
【００６１】
本明細書中で使われる用語「処置」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患のどのような処置もカバーし、（ｉ）疾患にかかりやすくなっているかもしれないが、疾病にかかっているとまだ診断されていない被験者において疾患が生じるのを予防することと、（ｉｉ）疾患を阻害、すなわちその進行を停止させること、または（ｉｉｉ）疾患を除去、すなわち疾患の退行を引き起こすこと、を含む。
【００６２】
本明細書中で使われる用語「ケモカイン受容体モジュレーターによる処置により予防または軽減された哺乳動物における疾病状態」は、一般にケモカイン受容体モジュレーターで有利に処置されると当分野で一般的に認められているすべての疾病状態、および本発明の特定の化合物で有利に予防または軽減されることが見出されている疾病状態をカバーする。これらには、例として、ただし限定することなく、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、ウイルス性疾患、アテローム／アテローム性動脈硬化、リューマチ性関節炎および臓器移植拒絶が含まれる。
【００６３】
本明細書中で使われるように、用語「治療上有効な量」は、それを必要とする哺乳動物に投与された場合の本発明のケモカイン受容体モジュレーターの量であり、例えば、抗炎症剤、抗喘息剤、免疫抑制剤、または哺乳動物におけるウイルス感染を阻害する抗自己免疫疾患剤としての（上で定義されるような）処置を達成するのに十分な量である。「治療上有効な量」となる量は、ケモカイン誘導体、条件または疾患およびその重症度、治療される哺乳動物、その体重、年齢等に応じて変化するであろうが、最新の知識およびこの開示についての当業者がルーチン的に決定できる。本明細書中で使われるように、用語「ｑ．ｓ．」は、規定の機能を達成するために十分な量を加えること、たとえば溶液を所望の体積（例えば、１００ｍＬ）にすることを意味する。
【００６４】
本発明のケモカイン受容器モジュレーターおよびそれらの薬学的に許容可能な塩、すなわち活性成分は、治療上有効な投与量、すなわちそれを必要とする哺乳動物に投与した場合に、上記で説明されるような処置を達成するのに十分な量、が投与される。本明細書で説明されるケモカイン受容体モジュレーターの投与は、同様な効用に役立つ薬剤のための許容される投与法のいずれかによることができる。本明細書で使われるように、用語「本発明のケモカイン受容体モジュレーター」、「本発明のポリペプチドの［薬学的に許容可能な塩］」および「活性成分」は区別なく使われる。
【００６５】
製剤中のケモカイン受容体モジュレーターのレベルは、当業者により用いられる全範囲、例えば、全製剤について約０．０１重量（％ｗ）〜約９９．９９％ｗのケモカイン受容体モジュレーターおよび約０．０１％ｗ〜９９．９９％ｗの賦形剤、の範囲で変わり得る。より一般的には、ケモカイン受容体モジュレーターは、約０．５％ｗ〜約８０％ｗのレベルで存在する。
【００６６】
本発明のケモカイン受容体モジュレーターについてヒト投与量レベルを最適化しなければならないが、一般的には、１日用量は、体重１キログラム１日あたり約０．０５ｍｇ〜２５ｍｇ、最も好ましくは体重１キログラム１日あたり約０．０１ｍｇ〜１０ｍｇである。従って、７０ｋｇのヒトへの投与の場合、投与量範囲は、１日あたり約０．０７ｍｇ〜３．５ｇであり、好ましくは１日あたり約３．５ｍｇ〜１．７５ｇであり、最も好ましくは１日あたり約０．７ｍｇ〜０．７ｇである。当然ながら、投与されたアンタゴニストの量は、被験者ならびに予防または緩和について対象とされる疾患状態、苦痛の性質または重症度、投与の方法およびスケジュールおよび処方医師の判断に依存するであろう。そのような使用最適化は、まさしく、当業者の判断の範囲内にあるといえる。
【００６７】
投与は、所与の許容された全身または局所経路とすることができ、例えば、非経口、経口（特に乳幼児用処方）、静脈内、経鼻、気管支吸入（すなわち、エアゾール処方）、経皮的または局所経路を介して、例えば、錠剤、丸剤、カプセル、粉剤、液体、溶液、エマルション、注射剤、懸濁液、座剤、エアゾール等の、固体、半固体もしくは液体またはエアゾールの投薬形態とすることができる。本発明のケモカイン受容体モジュレーターは、所定レートでのポリペプチドの、好ましくは正確な用量の単独投与に適した単位服用形態での長期間投与の場合には、蓄積注射、浸透圧ポンプ、丸剤、経皮（電気輸送を含む）パッチ等を含む徐放性または制御放出投薬形態で投与することができる。これらの組成物は、従来の製薬担体または賦形剤および本発明のケモカイン受容体モジュレーターを含み、加えて、他の薬剤、製薬薬剤、担体、アジュバント等を含み得る。担体は種々の油剤から選択され、これには石油、動物、植物または合成起源のものが含まれ、例えば落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等である。水、食塩水、水性デキストロース、およびグリコール類は、特に注射可能溶液の場合に、特に好ましい液体担体である。適切な製薬担体としては、デンプン、セルロース、タルク、ブドウ糖、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、テアリン酸マグネシウムス、ステアリン酸ナトリウム、グリセリンモノステアレート、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセリン、プロピレングリコール、水、エタノール等が含まれる。他の適切な製薬担体およびそれらの製剤は、Ｅ． Ｗ． Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。
【００６８】
必要であれば、投与される製薬組成物は、湿潤または乳化剤、例えば酢酸ナトリウム塩のようなｐＨ緩衝剤、ソルビタンモノステアレート、オレイン酸トリエタノールアミン等のような少量の非毒性補助物質も含み得る。
【００６９】
活性成分がより多く必要とされることがあるが、簡便な１日用量計画を用いて本発明のケモカイン受容体モジュレーターを送達するために、経口投与を用いることができ、用量計画は、所望の予防の程度に従って、または苦痛の緩和において調節できる。そのような経口投与のために、薬剤学的に許容可能で、非毒性組成物が、例えば調剤グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ポビドン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、クロスカーメロースナトリウム、ブドウ糖、ゼラチン、ショ糖、炭酸マグネシウム等のような、通常用いられる賦形剤のいずれかを混合することにより形成される。そのような組成物は、溶液、懸濁液、分散性錠剤、丸剤、カプセル、粉剤、徐放性製剤等の形態を取る。経口製剤は、胃腸疾患の治療に特に適している。一般的な全身的目的のための経口バイオアベイラビリティは、アセチル化アミノ酸を含む製剤のような全身的循環への取込みを改善する賦形剤を利用することによって調節できる。例えば、米国特許第ＵＳ５，３５，６０１号および米国特許第ＵＳ５，６２９，０２０号を参照。
【００７０】
これらの組成物は、カプセル、丸剤または錠剤の形態を取ることができ、従って、組成物は、活性成分に加えて、乳糖、ショ糖、リン酸二カルシウム等のような希釈剤、クロスカーメローズナトリウム、デンプンまたはその誘導体のような崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、デンプン、ポリビニルピロリドン、アラビアゴム、ゼラチン、セルロースおよびその誘導体等のバインダーを含む。
【００７１】
液状の薬剤学的に投与可能な組成物は、例えば、本発明のケモカイン受容体モジュレーター（約０．５％〜約２０％）および調剤補助薬を、例えば水、食塩水、水性デキストロース、グリセリン、グリコール類、エタノール、保存料等のような担体中に溶解、分散等することにより調製でき、それにより溶液または懸濁液を形成することができる。必要であれば、投与される製薬組成物は、湿潤剤、懸濁剤、乳化剤、または可溶化剤、例えば酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムといったｐＨ緩衝剤等、シクロデキストリン誘導体、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートまたはステアレート等の少量の非毒性補助薬剤を含むこともできる。そのような投薬形態を調製する実際の方法は公知、または当業者にとり明白であろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉを参照。投与される組成物すなわち製剤は、いずれにせよ、処置されている被験者の症状を予防または軽減するのに有効な量の活性成分を含む。乳幼児への経口投与の場合は、（シロップまたは懸濁液のような）液状製剤が好まれる。
【００７２】
液体を含む固形剤形の場合は、例えばプロピレンカーボネート、植物油トリグリセリド中の溶液または懸濁液は、好ましくはゼラチンカプセル中に被抱される。液状の剤形の場合は、例えばポリエチレングリコール中の溶液は、投与用に容易に計量されるように、十分な量の調剤学的に許容できる液状の担体、例えば水で希釈できる。
【００７３】
あるいは、液状または半固形の経口製剤は、活性成分を、植物油、グリコール類、トリグリセリド類、プロピレングリコールエステル類（例えば、プロピレンカーボネート）等の中に溶解し、これらの溶液または懸濁液を硬質または軟質ゼラチンカプセルシェル内に被抱することによって調製できる。
【００７４】
本発明のケモカイン受容体モジュレーターを上記条件の処置に適用する際には、本明細書中に記載される活性成分の投与は、好ましくは非経口的に投与される。非経口投与は一般に、皮下、筋肉内または静脈内の注射を特徴とし、皮内または腹腔内注射、ならびに胸骨内注射または注入を含み得る。注射剤は、液状の溶液または懸濁液、注射前に液体中の溶液または懸濁液にするのに適した固体形態として、エマルジョンまたは生体適合性ポリマーベースの微小球として、従来の形態で調製できる（例えば、リポソーム、ポリエチレングリコール誘導体、ポリ（Ｄ，Ｃ）ラクチド等）。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノール等である。さらに、必要であれば、投与される調剤組成物は、例えば、酢酸ナトリウム、ポリエキシエチレン、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、シクロデキストリン、血清アルブミン等のような、湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、溶解性促進剤、タンパク質担体等の少量の非毒性補助物質も含み得る。
【００７５】
本発明のケモカイン受容体モジュレーターは、例えば、ケモカイン受容体モジュレーターを（水または生理食塩水のような）適切な溶媒中に溶解し、またはリポソーム製剤中に組み込み、続いて許容できる注入流体中へ分散することによって、非経口的に投与できる。本発明のポリペプチドの典型的な１日用量は、１回の注入で、または周期的な間隔を置いての一連の注入により投与できる。非経口投与については、水溶性形態、例えば水溶性塩の形態、または増粘物質（例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストラン、そして必要であれば安定剤）を含む水性注射懸濁液という活性成分を水溶解形態にした特に適切な水溶液がある。活性成分は、任意に賦形剤と共に、凍結乾燥物の形態とすることもでき、さらに非経口投与の前に適切な溶媒を加えることにより溶液にすることができる。
【００７６】
非経口投与用により最近考案されたアプローチでは、一定の投薬レベルが維持されるように、遅延放出または徐放出システムの埋め込みが用いられる。例えば、参照により組み込まれる米国特許ＵＳ３，７１０，７９５号、ＵＳ５，７１４，１６６号およびＵＳ５，０４１，２９２号を参照。
【００７７】
そのような非経口の組成物中に含まれている活性成分の百分率は、ポリペプチドの活性および被験者のニーズだけでなく、組成物の特定の性質にも大いに依存する。しかしながら、溶液中で０．０１％〜１０％の活性成分の百分率を用いることができ、もし組成物が、その後上記の百分率にまで希釈される固体であれば、より高くなる。好ましくは、組成物は、溶液中に活性成分を０．０２〜８％含む。
【００７８】
本発明のケモカイン受容体モジュレーターを投与する別の方法では、静脈内ボーラス注射および連続注入の両方が用いられる。治療上の処置がＨＩＶ−１感染の予防のためである場合には、これは特に好ましい方法である。
【００７９】
エアゾール投与は、本発明のケモカイン受容体モジュレーターを気道へ直接送達するための効果的手段である。この方法の利点のいくつかは下記の通りである。すなわち、１）酵素的分解、胃腸管からの低い吸収、または肝臓の初回通過効果による薬剤損失の影響を回避し、２）分子サイズ、電荷または肺外部位への親和性のために他の方法では気道中の標的部位に到着できないであろう活性成分を投与する、３）肺胞を介して体内への速やかに吸収できるようにする、４）他の器官系が活性成分に曝されないようにする。これは暴露により望ましくない副作用が引き起こされることがある場合には重要である。これらの理由により、エアゾール投与は、喘息、肺局部感染、ならびに肺および気道の他の疾患および疾患状態の処置にとり特に有利である。
【００８０】
３タイプの医薬用吸入装置、すなわちネブライザ吸入器、定量吸入器およびドライパウダー吸入器がある。ネブライザ吸入器は、高速の空気流を作り出し、これにより（液状形態に製剤された）ケモカイン誘導体が患者の気道内に運ばれるミストとして噴霧される。定量吸入器は一般に、圧縮ガスと共に包装された製剤形態を有しており、作動により、圧縮ガスにより定量のポリペプチドを放出し、このようにして所定量薬剤の信頼できる投与方法を提供する。ドライパウダー吸入器は、自由流動粉体の形でポリペプチドを投与する。この粉体は、この装置による呼吸中に患者の気流中に分散できる。自由流動流粉体を得るため、ケモカイン誘導体は、乳糖のような賦形剤と共に製剤される。定量のケモカイン誘導体は、カプセル形態で貯蔵され、作動ごとに患者に分配される。上記の方法のすべては、本発明の投与に用い得る。
【００８１】
リポソームに基づく製剤も、本発明のケモカイン受容体モジュレーターと共に使用するのに適している。例えば、米国特許ＵＳ５，６３１，０１８号、ＵＳ５，７２３，１４７号、および５，７６６，６２７号を参照。リポソームの利点は、薬のリポソーム取り込みに起因する生体内分布および薬物動態学的パラメーターにおける有利な変化に関係していると信じられており、当業者により本発明のポリペプチドに適用し得る。注射または経口投与のための制御された放出リポソーム液体製剤も用い得る。
【００８２】
座剤による全身投与については、伝統的なバインダーおよび担体として、例えば、ポリエチレングリコール類またはトリグリセリド類、例えばＰＥＧ１０００（９６％）およびＰＥＧ４０００（４％）が含まれる。そのような座剤は、活性成分を約０．５ｗ／ｗ％〜約１０ｗ／ｗ％、好ましくは約１ｗ／ｗ％〜約２ｗ／ｗ％の範囲で含む混合物から形成できる。
【００８３】
上記で説明し、さらに以下の特定の実施例において例示するように、本発明のケモカイン受容体モジュレーターは、天然産ケモカインのアンタゴニストとしての用途がある。特に、アンタゴニストとしての有効性を向上させた本発明のケモカイン受容体モジュレーターは、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、臓器移植拒絶、ウイルス性疾患、アテローム／アテローム性動脈硬化、リューマチ性関節炎および臓器移植拒絶のような種々の症状の分析および治療における用途がある。本発明のケモカイン受容体モジュレーターは、それらの同族受容体の小分子アンタゴニストの設計とスクリーニングにおいても利用できる。例えば、本発明のアンタゴニスト化合物中に設計された構造の多様性により、ケモカイン受容器の天然活性を伴う疾患の治療において薬物として使用のためのより優れた小分子化合物の設計、スクリーニングおよび微調整がより簡便にできるようになる。
【００８４】
（実施例）
以下の調製および実施例は、当業者が本発明をより明確に理解しかつ実施できるようにするために示されるものである。それらは、本発明の範囲を限定するのでなく、単に例示的に本発明を説明したものと見なされるべきである。
略語
ＤＩＥＡ　　　　ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ　　　　　Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＮＰ　　　　　２，４−ジニトロフェニル
ＧｕＨＣｌ　　　塩酸グアニジウム
ＨＢＴＵ　　　　Ｏ（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＦ　　　　　　フッ化水素
ＴＦＡ　　　　　トリフルオロ酢酸
Ａｉｂ　　　　　アミノイソ酪酸
Ｈｙｐ　　　　　ヒドロキシプロリン
Ｔｉｃ　　　　　１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−ＣＯＯＨ
Ｉｎｄｏｌ　　　インドリン−２−カルボン酸
Ｐ（４，４ＤｉＦ）　　４−ジフルオロ−プロリン
Ｔｈｚ　　　　　　Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸
Ｈｏｐ　　　　　　Ｌ−ホモプロリン
ΔＰｒｏ　　　　　３，４−デヒドロプロリン
Ｆ（３，４−ＤｉＯＨ）　　３，４ジヒドロキシフェニルアラニン
Ｆ（３，４−ＤｉＯＨ，ｐＢｚｌ）　　ｐＢｚｌ，−３，４ジヒドロキシフェニルアラニン
ｐ−Ｂｚ　　　　　ベンゾフェノン
Ｃｈａ　　　　　　シクロヘキシルアラニン
βＮａｌ　　　　　３−（２−ナフチル）−アラニン
Ｃｈｇ　　　　　　シクロヘキシル−グリシン
Ｐｈｇ　　　　　　フェニルグリシン
ＨｏＦ　　　　　　ホモフェニルアラニン
Ｆ（Ｆ）５　　　　ペンタフルオロフェニルアラニン
ｔＢｕＡ　　　　　ｔｅｒｔ−ブチルアラニン
Ｆ（４−Ｍｅ）　　４−メチルフェニルアラニン
ｔＬ　　　　　　　ｔｅｒｔ−ロイシン
ＣｙｃＰ　　　　　１−アミノ−１−シクロペンタンカルボン酸
ＣｙｃＨ　　　　　１−アミノ−１−シクロヘキサンカルボン酸
Ｎｌｅ　　　　　　ノルロイシン
アミノオキシペンタン−ＲＡＮＴＥ（２−６８）　ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ
ｎ−ノナノイル−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）　　　ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ
【００８５】
実施例１：ケモカイン受容体モジュレーターのための一般的合成アプローチ
ケモカイン受容体モジュレーターのためのペプチドを固相ペプチド合成により調製した。固相合成は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｓの特注の４３０Ａペプチドシンセサイザーで、段階的Ｂｏｃ化学鎖延長のためのｉｎ ｓｉｔｕ中和／２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフルオロホスフェート活性化プロトコルを用いて実行した（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．（１９９２）４０：１８０−１９３）。Ｎ末端ペプチドフラグメントは、チオエステル−生成レジン上で合成した。レジンは、調査した位置（ＣからＮ末端までの延長）に先立つ残基の結合後に分断し、ペプチドを手動で０．０３ミリモルスケールで延長した。各合成サイクルは、未希釈ＴＦＡを用いた１〜２分間の処理によるＮα−Ｂｏｃ除去、１分間のＤＭＦフロー洗浄、過剰ＤＩＥＡ存在下での１．０ミリモルの事前活性化を伴う、Ｂｏｃ−アミノ酸を用いた１０〜２０分間の結合、および２回目のＤＭＦ洗浄で構成される。Ｎα−Ｂｏｃ−アミノ酸（１．１ミリモル）は、過剰ＤＩＥＡの存在下で１ミリモルＨＢＴＵ（ＤＭＦ中０．５Ｍ）を用いて３分間事前活性化した。各手動結合ステップの後、残留遊離アミンを、ニンヒドリンアッセイで評価した（Ｓａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８１）１１７：１４７−１５７）。アミノ酸を含むＣ末端フラグメントは、標準の−Ｏ−ＣＨ２−フェニルアセトアミドメチルレジン上で合成した。鎖組立が完了した後、ペプチドを保護解除し、スカベンジャーとしての５％ｐ−クレゾールと共に無水ＨＦを用いて０℃で１時間処理してレジンから切断した。すべてのケースにおいて、イミダゾール側鎖ＤＮＰ保護基はＨｉｓ残基上に残留した。これはＤＮＰ−除去手順がＣ末端チオエステル基と相容れないからである。しかしながら、結合反応の間にＤＮＰはチオールによって徐々に除去されて未保護のＨｉｓを生じた。切断後、両方のペプチドは、氷冷ジエチルエーテルで沈殿させ、水性アセトニトリル中に溶解させ、凍結乾燥した。ペプチドは、Ｗａｔｅｒｓ製のＣ１８−カラムを備えたＲＰ−ＨＰＬＣで、バッファＡ（Ｈ２Ｏ／０．１％トリフルオロ酢酸）中のバッファＢ（アセトニトリル／１０％Ｈ２Ｏ／０．１％トリフルオロ酢酸）の直線勾配と２１４ｎｍでのＵＶ検出を使って精製した。試料は、ＰｌａｔｆｏｒｍＩＩ計測器（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ， Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ， Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて、電気噴霧質量分析法により分析した。ペプチドは、天然化学結合を用いて全長のケモカインポリペプチド鎖を生成させるために、結合に利用した（Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６：７７６−７７９）； Ｗｉｌｋｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．（１９９９）６：４３−５１； Ｃａｍａｒｅｒｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）１８．４．１−１８．４．２１）。ポリペプチド鎖の折り畳みは、標準的手法に従ってＣｙｓ−ＳＨ／（Ｃｙｓ−Ｓ）２の存在下で達成した（Ｗｉｌｋｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．（���９９９）６：４３−５１）。
【００８６】
実施例２：ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ、ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳおよびＳＤＦ−１のＮ末端、Ｃ末端、およびＮ／Ｃ末端類似物の合成
ＲＡＮＴＥＳ（１−６８）およびＳＤＦ−１（１−７２）の類似物は、実施例１および本明細書中で、ＣＣおよびＣＸＣケモカインアンタゴニスト一般的調製法を例示したのと同様にして調製した。特に、Ｎ末端、Ｃ末端およびＮ／Ｃ末端修飾ＲＡＮＴＥＳ類似物は、ケモカイン化合物ＣＨ３−（ＣＨ２）７−Ｃ（Ｏ）−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）（ｎ−ノナノイル−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）すなわち「ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ」とも呼ばれる）、およびケモカイン化合物ＣＨ３−（ＣＨ２）４−Ｏ＝ＣＨ−ＣＯ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）（アミノオキシペンタン−ＲＡＮＴＥＳすなわち「ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ」とも呼ばれる）への修飾に基づくものである。この目的に利用したＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ、ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳおよび付加的なＲＡＮＴＥＳ誘導体は、ＷＯ９９／１１６６６号に記載されており、これは参照により本明細書中に組み入れられる。ＳＤＦ−１のＮ、ＣおよびＮ／Ｃ末端類似物は、ＲＡＮＴＥＳ類似物についてと同じ基本的設計アプローチを使って構成した。
【００８７】
ＲＡＮＴＥＳへのＮＮＹおよびＡＯＰ修飾のような、所与の標的ケモカインへのＮ末端修飾の場合は、化学変異体は、上記およびＷＯ９９／１１６６６号ならびにＷｉｌｋｅｎｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．（１９９９）ｌ６：４３−５１に記載されるように、生成したペンダントＮ末端修飾（例えば、ＮＮＹまたはＡＯＰ）への結合に使用されるＮ末端ペプチドセグメントのオンレジン合成、続いて、切断／保護解除、精製および全長産生物を形成するためにＣ末端ペプチドセグメントへの天然化学結合における未保護のＮ末端修飾ペプチドα−チオエステルの使用により調製した。ペプチドが合成され、アミノ酸誘導体を含むアミノ酸置換は、実施例１に記載されるようにペプチド合成の間に組み込まれた。実施例１におけるような天然化学結合を利用して、直線状生成物を生成し、ここで結合は、ＲＡＮＴＥＳ類似物についてはＬｙｓ３１−Ｃｙｓ３２部位においてであり、ＳＤＦ−１類似物についてはＡｓｎ３３−Ｃｙｓ３４部位であった。等モル量のペプチドフラグメント（２〜２．５ｍＭ）を、６ＭのＧｕＨＣｌ、１００ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．５、１％のベンジルメルカプタン、および３％のチオフェノール中に溶解した。反応は通常、夜通し実行した。結果として生じたポリペプチド産物は、ペプチドセグメントについて上記で説明したように精製および分析した。折り畳まれたタンパク質を生成するため、精製したＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ類似物のポリペプチド鎖（約０．５ｍｇ〜１ｍｇ／ｍＬ）を、２ＭのＧｕＨＣｌ、１００ｍＭのＴｒｉｓ、８ｍＭのシステインを含むｐＨ８．０、１ｍＭシスチンおよびメチオニン１０ｍＭ中に溶解した。一晩緩やかに撹拌した後、タンパク質溶液を上記のようにＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。その他の折り畳み条件は、ＳＤＦ−１類似物のケースで用いた。すなわち、ＳＤＦ−１およびＭｅｔ０−ＳＤＦ−１を、１ｍＭのＧｕＨＣｌ、０．１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５中で０．５ｍｇ／ｍＬの中で、室温で空気存在下で酸化した。一晩撹拌後、折り畳みは完全であった。ＡＯＰ−、カプロイル−およびＮＮＹ−ＳＤＦ−１は、同じバッファ中であるが、２ＭのＧｕＨＣｌの存在下で酸化した。
【００８８】
所与の折り畳まれたタンパク質への脂肪酸の化学結合の場合は、２つの基本ステップを伴った。第１に、脂肪酸をアミノオキシ基で官能化した。第２に、反応性カルボニル基を、ケモカインの活性にとって決定的ではないと信じられる領域である、タンパク質のカルボキシル末端領域に特異的に導入した。この目的のため、Ｃ末端脂肪酸修飾について標的としたケモカイン類似物を、Ｃ末端Ｌｙｓ（Ｓｅｒ）Ｇｌｙ配列拡張法を用いて合成した。従って、例えば、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）を、Ｃ末端にＬｙｓ（Ｓｅｒ）Ｇｌｙ配列拡張を含むように合成した。反応性カルボニル基を、再折り畳みされたタンパク質のＮａＩＯ４処理により生成し、従って、安定なオキシム結合を介して脂肪酸部分の部位特異的結合が可能になった。
【００８９】
脂肪酸官能化については、脂肪酸（パルミテート、オレエート、アラキドネート、コレート）０．２ミリモルを、ＤＭＦ／ＤＣＭ混合物（１：１、ｖ：ｖ）０．５ｍｌ中に等モル量のＤＣＣおよびＨＯＡｔを加えて活性化し、０．２５ミリモルのＢｏｃ−ＡｏＡ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２のＤＭＦ溶液０．５ｍｌ中に加え、見かけのｐＨをＮ−エチルモルホリンでｐＨ８．０に調整した。コレステリル誘導体については、コレステリル−クロロホルメート０．２ミリモルを、０．５ｍｌＤＣＭ中に溶解し、０．２５ミリモルＢｏｃ−ＡｏＡ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２のエタノール溶液０．５ｍｌ中に加え、見かけのｐＨをトリエチルアミンでｐＨ９．０に調整した。一晩インキュベーションした後、揮発性物質を減圧下で除去し、生成物をフラッシュクロマトグラフィーまたはＣ４カラム上で用意したＨＰＬＣにより単離した。Ｂｏｃ基をＴＦＡ処理で除去し、生成物をＥＳＩ−ＭＳにより確認した。
【００９０】
タンパク質酸化については、標的タンパク質（２ｍｇ／ｍＬ）を、６Ｍの塩化グアニジンを含む０．１Ｍのリン酸ナトリウムバッファｐＨ７．５中に溶解し、スカベンジャーがタンパク質に対して１００倍モル過剰となるようにメチオニンを加えた。次に、１０倍過剰の過ヨウ素酸ナトリウムを加え、溶液を暗所で１０分間インキュベートした。過ヨウ素酸塩に対して１０００倍モル過剰のエチレングリコール加えて反応を停止させ、溶液を室温で１５分間さらにインキュベートした。次に、溶液を０．１％酢酸で透析し、最終的に凍結乾燥した。例えば、Ｃ末端側部セリンの酸化は、ほとんど定量的であることがＥＳＩ−ＭＳにより明らかになり、ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ−Ｋ（Ｓ）Ｇの場合は、８１４１．１±０．７Ｄａの質量が得られ、これはグリオキシリル誘導体を形成する３１Ｄａの損失に対応し、出発物質の質量に対応するピークは全く観察されなかった。
【００９１】
脂肪酸とケモカインの結合は、ｐＨ５．３の０．１Ｍナトリウム酢酸塩バッファ中で、０．１％サルコシル、２０ｍＭメチオニンおよびタンパク質に対し２０倍過剰の官能化脂肪酸存在下で達成した。３７℃で１６〜２０時間撹拌後、脂肪酸のアミノオキシ基とケモカインアルデヒドとの間に形成されたオキシム結合としての結合を、逆相ＨＰＬＣを用いて精製し、生成物をＥＳＩ−ＭＳでキャラクタリゼーションした。すべての類似物について、アミノオキシ官能化脂肪酸の酸化されたタンパク質への結合は、分析ＨＰＬＣによりコントロールされるように、ほとんど定量的であった。
【００９２】
実施例３：ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳおよびＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳのＮ末端類似物
Ｎ末端ＲＡＮＴＥＳ誘導体については、修飾は、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）またはＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）の最初の８つのアミノ酸残基に対応するアミノ酸の１つ以上のＮ末端領域に対して行い、前記最初の８つのアミノ酸残基は、次の配列−ＰＹＳＳＤＴＴＰ−を有している。これらは、図２Ａ〜図２Ｅに示される６８のアミノ酸残基の野生型ＲＡＮＴＥＳポリペプチド鎖（すなわち、ＲＡＮＴＥＳ（１−６８））のアミノ酸残基２〜９に対応する。なぜならば、天然産ＲＡＮＴＥＳ（１−６８）の最初の残基（Ｓｅｒ）が、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）においてはｎ−ノナノイルにより、ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）においてはアミノオキシペンタンにより、置き換えられているからである。従って、例えば、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）におけるアミノ酸位置２での置換は、以下では一般化合物式「ＮＮＹ−Ｐ２Ｘ−ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）」で示され、そこでは、ＮＮＹはｎ−ノナノイル、ＸはＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）の位置２でのプロリン（Ｐ）と置換されたアミノ酸、ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）は、ＮからＣ方向に読んだときのＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）の残りの６６のアミノ酸を表す。別の例として、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）のアミノ酸位置３での置換は、一般化合物式「ＮＮＹ−Ｐ−Ｙ３Ｘ−ＲＡＮＴＥＳ（４−６８）」で示され、そこでは、ＮＮＹはｎ−ノナノイル、ＸはＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）の位置３でのチロシン（Ｙ）と置換されたアミノ酸、ＲＡＮＴＥＳ（４−６８）は、ＮからＣ方向に読んだときのＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）の残りの６５のアミノ酸を表す。多重置換ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ類似物については、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）のアミノ酸位置２、３および９での３つの置換についての化合物式は、一般化合物式「ＮＮＹ−Ｐ２Ｘ−Ｙ３Ｘ−ＳＳＤＴＴ−Ｐ９Ｘ−ＲＡＮＴＥＳ（１０−６８）」で示され、そこでは、ＮＮＹはｎ−ノナノイル、ＸはＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）の位置２のプロリン（Ｐ）、位置３のチロシン（Ｙ）、および位置９のプロリン（Ｐ）と置換された同じまたは異なるアミノ酸、ＳＳＤＴＴはＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）のアミノ酸４〜８に対応し、ＲＡＮＴＥＳ（１０−６８）は、ＮからＣ方向に読んだときのＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）の残りの５９のアミノ酸を表す。以下は、調製したＮＮＹ−Ｐ２Ｘ−ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）類似物の例である。
化合物　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　番号
ＮＮＹ−Ｐ２Ａｉｂ−ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）　　　　　　１
ＮＮＹ−Ｐ２Ｈｙｐ−ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）　　　　　　２
ＮＮＹ−Ｐ２Ｔｉｃ−ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）　　　　　　３
ＮＮＹ−Ｐ２Ｉｎｄｏｌ−ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）　　　　４
ＮＮＹ−Ｐ２Ｐ（４，４ＤｉＦ）−ＲＡＮＴＥＳ（３　　　　５
−６８）
ＮＮＹ−Ｐ２Ｔｈｚ−ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）　　　　　　６
ＮＮＹ−Ｐ２Ｈｏｐ−ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）　　　　　　７
ＮＮＹ−Ｐ２ΔＰｒｏ−ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）　　　　　８
ＮＮＹ−Ｐ２Ａ−ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）　　　　　　　　９
【００９３】
以下は、調製したＮＮＹ−Ｐ−Ｙ３Ｘ−ＲＡＮＴＥＳ（４−６８）類似物の例である。
化合物　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　番号
ＮＮＹ−Ｐ−Ｙ３Ｐ−ＲＡＮＴＥＳ（４−６８）　　　　　　１０
ＮＮＹ−Ｐ−Ｙ３Ａ−ＲＡＮＴＥＳ（４−６８）　　　　　　１１
ＮＮＹ−Ｐ−Ｙ３Ｌ−ＲＡＮＴＥＳ（４−６８）　　　　　　１２
ＮＮＹ−Ｐ−Ｙ３Ｖ−ＲＡＮＴＥＳ（４−６８）　　　　　　１３
ＮＮＹ−Ｐ−Ｙ３Ｆ（３，４−ＤｉＯＨ）−ＲＡＮＴＥＳ　　１４
（４−６８）
ＮＮＹ−Ｐ−Ｙ３Ｆ（３，４−ＤｉＯＨ，ｐＢｚｌ）　　　　１５
−ＲＡＮＴＥＳ（４−６８）
ＮＮＹ−Ｐ−Ｙ３ｐＢｚ−ＲＡＮＴＥＳ（４−６８）　　　　１６
ＮＮＹ−Ｐ−Ｙ３Ｃｈａ−ＲＡＮＴＥＳ（４−６８）　　　　１７
ＮＮＹ−Ｐ−Ｙ３βＮａｌ−ＲＡＮＴＥＳ（４−６８）　　　１８
ＮＮＹ−Ｐ−Ｙ３Ｃｈｇ−ＲＡＮＴＥＳ（４−６８）　　　　１９
ＮＮＹ−Ｐ−Ｙ３Ｐｈｇ−ＲＡＮＴＥＳ（４−６８）　　　　２０
ＮＮＹ−Ｐ−Ｙ３Ｈｏｆ−ＲＡＮＴＥＳ（４−６８）　　　　２１
ＮＮＹ−Ｐ−Ｙ３Ｆ（Ｆ）５−ＲＡＮＴＥＳ（４−６８）　　 ２２
ＮＮＹ−Ｐ−Ｙ３ｔｂｕＡ−ＲＡＮＴＥＳ（４−６８）　　　２３
ＮＮＹ−Ｐ−Ｙ３Ｆ（４−Ｍｅ）−ＲＡＮＴＥＳ（４−　　　２４
６８）
ＮＮＹ−Ｐ−Ｙ３ｔＬ−ＲＡＮＴＥＳ（４−６８）　　　　　２５
ＮＮＹ−Ｐ−Ｙ３ＣｙｃＰ−ＲＡＮＴＥＳ（４−６８）　　　２６
ＮＮＹ−Ｐ−Ｙ３ＣｙｃＨ−ＲＡＮＴＥＳ（４−６８）　　　２７
ＮＮＹ−Ｐ−Ｙ３Ｎｌｅ−ＲＡＮＴＥＳ（４−６８）　　　　２８
【００９４】
以下の化合物は、調製したＮＮＹ−ＰＹ−Ｓ４Ｘ−ＲＡＮＴＥＳ（５−６８）類似物の例である。
化合物　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　番号
ＮＮＹ−ＰＹ−Ｓ４Ａ−ＲＡＮＴＥＳ（５−６８）　　　　　２９
ＮＮＹ−ＰＹ−Ｓ４ｔｂｕＡ−ＲＡＮＴＥＳ（５−６８）　　３０
【００９５】
以下の化合物は、調製したＮＮＹ−ＰＹＳ−Ｓ５Ｘ−ＲＡＮＴＥＳ（６−６８）類似物の例である。
化合物　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　番号
ＮＮＹ−ＰＹＳ−Ｓ５ｔｂｕＡ−ＲＡＮＴＥＳ（６−６８）　３１
【００９６】
以下の化合物は、調製したＮＮＹ−ＰＹＳＳ−Ｄ６Ｘ−ＲＡＮＴＥＳ（７−６８）類似物の例である。
化合物　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　番号
ＮＮＹ−ＰＹＳＳ−Ｄ６ｔｂｕＡ−ＲＡＮＴＥＳ（７−　　　３２
６８）
【００９７】
以下の化合物は、調製したＮＮＹ−ＰＹＳＳＤ−Ｔ７Ｘ−ＲＡＮＴＥＳ（８−６８）類似物の例である。
化合物　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　番号
ＮＮＹ−ＰＹＳＳＤ−Ｔ７ｔｂｕＡ−ＲＡＮＴＥＳ（８−　　３３
６８）
【００９８】
以下の化合物は、調製したＮＮＹ−ＰＹＳＳＤＴ−Ｔ８Ｘ−ＲＡＮＴＥＳ（９−６８）類似物の例である。
化合物　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　番号
ＮＮＹ−ＰＹＳＳＤＴ−Ｔ８ｔＢｕＡ−ＲＡＮＴＥＳ　　　　３４
（９−６８）
【００９９】
以下の化合物は、調製したＮＮＹ−ＰＹＳＳＤＴＴ−Ｐ９Ｘ−ＲＡＮＴＥＳ類似物の例である。
化合物　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　番号
ＮＮＹ−ＰＹＳＳＤＴＴ−Ｐ９Ｈｙｐ−ＲＡＮＴＥＳ　　　　３５
（１０−６８）
ＮＮＹ−ＰＹＳＳＤＴＴ−Ｐ９Ａｉｂ−ＲＡＮＴＥＳ　　　　３６
（１０−６８）
ＮＮＹ−ＰＹＳＳＤＴＴ−Ｐ９ΔＰｒｏ−ＲＡＮＴＥＳ　　　３７
（１０−６８）
ＮＮＹ−ＰＹＳＳＤＴＴ−Ｐ９Ｔｈｚ−ＲＡＮＴＥＳ　　　　３８
（１０−６８）
【０１００】
以下の化合物は、調製した２重置換類似物ＮＮＹ−Ｐ２Ｘ−Ｙ３Ｘ−ＲＡＮＴＥＳ（４−６８）、および、３重置換類似物ＮＮＹ−Ｐ２Ｘ−Ｙ３Ｘ−ＳＳＤＴＴ−Ｐ９Ｘ−ＲＡＮＴＥＳ（１０−６８）の例である。
化合物　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　番号
ＮＮＹ−Ｐ２Ｈｙｐ−Ｙ３ｔＢｕｔＡ−ＲＡＮＴＥＳ　　　　３９
（４−６８）
ＮＮＹ−Ｐ２Ｔｈｚ−Ｙ３ｔＢｕｔＡ−ＲＡＮＴＥＳ　　　　４０
（４−６８）
ＮＮＹ−Ｐ２Ｈｙｐ−Ｙ３Ｃｈｇ−ＲＡＮＴＥＳ（４−　　　４１
６８）
ＮＮＹ−Ｐ２Ｔｈｚ−Ｙ３Ｃｈｇ−ＲＡＮＴＥＳ（４−　　　４２
６８）
ＮＮＹ−Ｐ２Ｔｈｚ−Ｙ３Ｃｈｇ−ＳＳＤＴＴ−　　　　　　４３
Ｐ９Ａｉｂ−ＲＡＮＴＥＳ（１０−６８）
【０１０１】
実施例４：ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳのＮ末端、Ｎループ類似物
以下の化合物は、付加的なＮＮＹ−置換−ＲＡＮＴＥＳ類似物を例示することを意図するもので、そこでは、Ｎループ（ＲＡＮＴＥＳの残基１２〜２０）は、ＣＣＲ１およびＣＣＲ３を介してのシグナル伝達に影響することなくＣＣＲ５に対する効力を増大させるように修飾される。
【０１０２】
Ｎ末端、ＮループＲＡＮＴＥＳ類似物については、Ｎループ修飾は、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）に行われ、そこでは、Ｎループはアミノ酸１２〜２０に対応する。ＲＡＮＴＥＳのＮループは、アミノ酸配列−ＦＡＹＩＡＲＰＬＰ−（配列番号２）を有している。従って、例えば、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）におけるアミノ酸位置１２での置換は、一般化合物式「ＮＮＹ−ＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣ−Ｆ１２ｐＢｚ−ＲＡＮＴＥＳ（１３−６８）」を有しており、そこでは、ＮＮＹはｎ−ノナノイル、ＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣはＲＡＮＴＥＳ（１−６８）のアミノ酸２〜１１に対応し、Ｆ１２ｐＢｚは、ＲＡＮＴＥＳ（１−６８）の位置１２でのフェニルアラニン（Ｆ）と置換されたアミノ酸誘導体ｐＢＺを示し、ＲＡＮＴＥＳ（１３−６８）は、ＮからＣ方向に読んだときのＲＡＮＴＥＳ（１−６８）の残りのアミノ酸残基１３〜６８を表す。
化合物　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　番号
ＮＮＹ−ＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣ−Ｆ１２ｐＢｚ−　　　　　　４４
ＲＡＮＴＥＳ（１３−６８）
ＮＮＹ−ＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣ−Ｆ１２Ｙ−ＲＡＮＴＥＳ　　４５
（１３−６８）
ＮＮＹ−ＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣ−Ｆ１２Ｆ（４−ＭＥ）−　　４６
ＲＡＮＴＥＳ（１３−６８）
ＮＮＹ−ＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣ−Ｆ１２（４−Ｆ）−　　　　４７
ＲＡＮＴＥＳ（１３−６８）
ＮＮＹ−ＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣＦ−Ａ１３Ｒ−ＲＡＮＴＥＳ　４８
（１４−６８）
ＮＮＹ−ＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣＦ−Ａ１３Ｓ−ＲＡＮＴＥＳ　４９
（１４−６８）
ＮＮＹ−ＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣＦＡ−Ｙ１４Ｆ−　　　　　　５０
ＲＡＮＴＥＳ（１５−６８）
ＮＮＹ−ＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣＦＡ−Ｙ１４Ｃｈａ−　　　　５１
ＲＡＮＴＥＳ（１５−６８）
ＮＮＹ−ＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣＦＡＹ−Ｉ１５ｔＢｕｔＡ−　５２
ＲＡＮＴＥＳ（１６−６８）
ＮＮＹ−ＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣＦＡＹ−Ｉ１５Ｓ−　　　　　５３
ＲＡＮＴＥＳ（１６−６８）
ＮＮＹ−ＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣＦＡＹＩ−Ａ１６Ｓ−　　　　５４
ＲＡＮＴＥＳ（１７−６８）
ＮＮＹ−ＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣＦＡＹＡ−Ｒ１７Ａ−　　　　５５
ＲＡＮＴＥＳ（１８−６８）
ＮＮＹ−ＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣＦＡＹＡ−Ｒ１７Ｈ−　　　　５６
ＲＡＮＴＥＳ（１８−６８）
ＮＮＹ−ＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣＦＡＹＡＲ−Ｐ１８Ｔｈｚ−　５７
ＲＡＮＴＥＳ（１９−６８）
ＮＮＹ−ＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣＦＡＹＡＲＰ−Ｌ１９Ｉ−　　５８
ＲＡＮＴＥＳ（２０−６８）
ＮＮＹ−ＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣＦＡＹＡＲＰ−Ｌ１９Ｃｈａ　５９
−ＲＡＮＴＥＳ（２０−６８）
ＮＮＹ−ＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣＦＡＹＡＲＰＬ−　　　　　　６０
Ｐ２０Ｔｈｚ−ＲＡＮＴＥＳ（２１−６８）
【０１０３】
実施例５：ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳのＮ末端ＲＡＮＴＥＳ類似物
以下の化合物は、ＮＮＹ置換基の代わりに別の脂肪族鎖を用いた付加的なＮＮＹ−置換−ＲＡＮＴＥＳ類似物を例示することを意図している。
化合物　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　番号
ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２　　６１
−ＣＨ２−ＣＯ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）
Ｎｌｅ−Ｍｅｔ−ＲＡＮＴＥＳ（１−６８）　　　　　　　　６２
化合物　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　番号
ドデカノイル−ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）　　　　　　　　　６３
ラウリル−Ｈｙｐ−ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）　　　　　　　６４
化合物　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　番号
ミリストイル−ＲＡＮＴＥＳ（４−６８）　　　　　　　　　６５
ドデカノイル−Ｈｙｐ−ＲＡＮＴＥＳ（４−６８）　　　　　６６
【０１０４】
実施例６：ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳおよびＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳのＣ末端およびＮ／Ｃ末端類似物
Ｌｙｓのεアミノ基がセリン残基によりアシル化された、Ｌｙｓ−ＧｌｙＣ末端伸長を有するＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳおよびＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳを調製した。これらの誘導体は、セリン伸長の過ヨウ素酸塩酸化後に、発蛍光団（ＦＩＴＣ、ＮＢＤ、Ｃｙ−５およびＢＯＤＩＰＹ−Ｆ１）または脂質を含むアミノオキシアセチル−官能化された化合物と結合させた。これらのＣ末端標識したケモカインは、ＣＨ３−（ＣＨ２）１４−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＮＨ２がケモカインの効力を改善することが明らかにされたのと同じく、それらの生物学的特性および脂肪族鎖部分の導入を保持する。最も効果的な化合物を見い出すため、種々の脂肪酸および脂質を、Ｂｏｃ−ＡｏＡ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２と、続いてＢｏｃ除去ラウレート、パルミテート、オレエート、エイコサノエート、コール酸およびコレステリル−クロロホルメートと結合させて、アミノオキシ基で官能化した。これらの誘導体のうちの１つ以上を、酸化されたＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ−Ｋ（Ｓ）ＧまたはＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ−Ｋ（Ｓ）Ｇに結合した。上記のＡＯＰ類似物を以下に例示する。
化合物　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　番号
ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ−Ｋ（ラウリル）−Ｇ　　　　　　　　６７
「（ラウリル）」は、グロキシリル＝ＡｏＡ−エチレンジアミン−ラウレート等の略
ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ−Ｋ（パルミトイル）−Ｇ　　　　　　６８
ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ−Ｋ（エイコサノイル）−Ｇ　　　　　６９
ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ−Ｋ（オレオイル）−Ｇ　　　　　　　７０
ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ−Ｋ（コリル）−Ｇ　　　　　　　　　７１
ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ−Ｋ（コレステリル）−Ｇ　　　　　　７２
【０１０５】
脂質部分の化学変異体も、別の方策により調製した。そのような化合物は、全長ポリペプチドを形成する化学の結合での切断、精製および使用の前に、脂肪酸をＦｍｏｃ−脱保護したＢｏｃ−ペプチド−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−レジンに結合させることによりＣ末端セグメントのオンレジン合成で合成した。
【０１０６】
これらの化合物の設計において、脂質結合が利用されたのには２つの主たる理由があった。第１に、ＲＡＮＴＥＳ化合物の抗ＨＩＶ−１阻害活性が、受容体をダウンレギュレートする能力と関連している証拠が現在次々と出てきていることである。このことは、ひとたびインターナライズされると、初期エンドソーム中で受容体のリサイクルを伴って解離されるはずのリガンド−受容体複合体は、原形質膜またはある種の細胞質脂肪酸結合タンパク質と相互作用することもあり得ることを意味している。従って、リガンドの脂質修飾は、複合体を、単に相互作用によって特定の細胞内サブドメインに再ターゲットさせることができ、従って受容体のリサイクルが遅延される。細胞内タンパク質トラフィッキングを扱った最近のいくつかの論文は、アシル化が、洗浄剤抵抗性膜へのタンパク質の親和性増大の共通メカニズムであり、膜スパンのないタンパク質にとっての主要な標的メカニズムになり得るという考えを支持している（例えば、Ｍｅｌｋｏｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９９９）２７４：３９１０−３９１７； Ｚｉａｔｋｉｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．（１９９７）１１０：６７３−６７９； Ｚｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．（１９９８）４６：５５−６０を参照）。第２に、修飾は、化合物の薬物動態学的特性を変更するためにも実行された。最近のいくつかの論文は、この概念を支持するものである（例えば、Ｈｏｎｅｙｃｕｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ．（１９９６）１３：１３７３−１３７７； Ｋｕｒｔｚｈａｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．（１９９７）８６：１３６５−１３６８； Ｍａｒｋｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ（１９９６）３９：２８１−２８８を参照）。
【０１０７】
以下の実施例において実証されるように、活性の増大は驚くべきかつ予期せぬものであった。なぜならば、修飾が薬物動態学の変更を意図したものであったからである。予期されるものは活性の低下であったが、薬物動態学での期待される改善は、許容できるトレードオフをもたらしたであろう。
【０１０８】
実施例７：ＳＤＦ−１のＮ末端類似物
以下のＮ末端ＳＤＦ−１（１−７２）誘導体を、ＣＸＣケモカイン受容体モジュレーター製作の一般的アプローチを例示するために調製した。一例として、ＳＤＦ−１のＮ末端は、Ｎ末端に脂肪族鎖を有する化合物を生成するように修飾した。Ｎ末端領域のアミノ酸誘導体および／またはＣ末端領域の脂肪族鎖をさらに含む化合物を、ＲＡＮＴＥＳ化合物について上記で説明したように調製した。特に、適切なＮ末端置換基を調製および試験し、これらはＬｙｓ、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ、カプロイル−Ｌｙｓ、ＣＨ３−（ＣＨ２）７−Ｃ（Ｏ）およびＣＨ３−（ＣＨ２）４−Ｏ−ＮＨ−グリオキシリルを例示として含むが、これらに限定されない。以下の化合物は、調製したＳＤＦ−１類似物のいくつかの例である。
化合物　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　番号
Ｌｙｓ−ＳＤＦ−１（２−７２）　　　　　　　　　　　　　７３
Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−ＳＤＦ−１（２−７２）　　　　　　　　　７４
カプロイル−Ｌｙｓ−ＳＤＦ−１（２−７２）　　　　　　　７５
ＮＮＹ−ＳＤＦ−１（２−７２）　　　　　　　　　　　　　７６
ＡＯＰ−グリオキシリル−ＳＤＦ−１（２−７２）　　　　　７７
【０１０９】
実施例８：スクリーニングアッセイ
実施例３〜７で調製したＲＡＮＴＥＳおよびＳＤＦ類似物のいくつかおよびその他を、阻害活性について、ＨＩＶベースのアッセイを使用してスクリーニングして、ＲＡＮＴＥＳおよびＳＤＦ−１が用いられるこの特定の指標についての遮断機能を特徴付けた。一般に、化合物は、ＨＩＶエンベロープ仲介細胞融合を阻害するそれらの能力ついて予備スクリーンを通した。続いて、これらの化合物のうちの最も有望なものを、標的細胞株の無細胞ウイルス感染を阻害するそれらの能力について試験した。これらのアッセイは、ＳＣＩＤマウスモデルにおいて決定されるように、細胞融合アッセイおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ無細胞ウイルス感染アッセイがｉｎ ｖｉｖｏの効力の有用な指標であることが見出されているので、選ばれた（Ｍｏｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．（１９９９）７３：３５４４−３５５０）。さらに、ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳに対するＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳの抗ウイルス効力の増加がＣＣＲ５についての親和性の増加以外の要因に起因することが見出されているので、化合物はＣＣＲ５についての親和性ではなくて細胞融合アッセイにおける活性について評価した。
【０１１０】
実施例９：エンベロープ仲介細胞融合アッセイ
実施例３〜７の化合物の所与のパネルのＣＣＲ５依存細胞融合の阻害能力を、ＣＤ４およびＣＣＲ５を有しかつレポーター系を含む細胞と融合するウイルスエンベロープタンパク質に設計された細胞を用いて決定した。ＣＣＲ５−トロピックウイルスエンベロープ仲介細胞融合アッセイは、どちらもＭ． Ａｌｉｚｏｎ研究室（パリ）からの好意で提供された細胞株、ＨｅＬａ−Ｐ５ＬおよびＨｅＬａ−Ｅｎｖ−ＡＤＡを用い、本質的にＳｉｍｍｏｎｓら（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７６：２７６−２７９）の記載の通りに実行した。簡潔に言えば、ＨｅＬａ−Ｐ５Ｌ細胞を９６ウエルプレートに接種した（１００μｌでウエルあたり１０４細胞）。２４時間後に培地を除去し、ウエルあたり１０４ＨｅＬａ−Ｅｎｖ−ＡＤＡ細胞とケモカインとを含む培地を添加した（最終液量２００μｌ）。さらに２４時間経過後、細胞をＰＢＳで一度洗い、室温で１５分間５０μｌのＰＢＳ／０．５％のＮＰ−４０に溶解した。溶解液に５０μｌの２ＸＣＰＲＧ基質（１６ｍＭのクロロフェノールレッド−β−ガラクトピラノシド；１２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、８０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＭｇＳＯ４、および１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール）を添加し、続いて室温で暗所において１〜２時間インキュベートしてβ−ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。次に、５７５ｎｍで吸光度をＬａｂｓｙｓｔｅｍｓマイクロプレートリーダーで測定した。これらの値から、阻害百分率［１００×（ＯＤ（テスト）−ＯＤ（ネガティブコントロール））／（ＯＤ（ポジティフ゛コントロール）−ＯＤ（ネガティブコントロール））］を各阻害剤濃度において計算した。阻害剤濃度に対する融合阻害百分率をプロットすることにより、各化合物についてＩＣ５０値の計算が可能になった。
【０１１１】
重要なことに、試験した化合物の大半が、野生型ＲＡＮＴＥＳに関してより大きい効力を示した。選択されたＲＡＮＴＥＳ阻害剤類似物についての結果を下記の表１に示す。
【表１】
2004502783.tif 000002
【０１１２】
表１で、平均相対効力については、融合アッセイでのＩＣ５０についての絶対値は、活性の序列は一定のままであるが、別の日に実施した実験間で変動する。結果を正規化するため、ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳを各実験において対照として用いた。従って、各実験におけるＩＣ５０はＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳの値に関連して表され、これには１００の恣意的な値を与えた。試験したほとんどすべての化合物は、野生型ＲＡＮＴＥＳに関してより大きい効力を示したが、化合物番号１９、２３、４０および４２のような特定の化合物の効力は、系列において最低希釈においてさえも、５０％以上の阻害が得られた。
【０１１３】
実施例１０：無細胞ウイルス感染アッセイ
このケースではエンベロープ細胞株が生きたＲ５−トロピックウイルスに置き換えられたこと以外は、無細胞ウイルス感染アッセイは、エンベロープ仲介細胞融合アッセイと同じ方法で実行した。ＨＥＫ２９３−ＣＣＲ５細胞（７、コペンハーゲン、Ｔ． Ｓｃｈｗａｒｔｚ氏のご好意により提供）を、２４ウエルプレート（１．２×１０５細胞／ウエル）に接種した。一晩インキュベートした後、細胞全体において、４℃で３時間、１２ｐＭ［１２５Ｉ］ＭＩＰ−１−α（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と未標識リガンドを用いて、「バインディングバッファー」（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＭｇＣｌ２、および０．５％（ｗ／ｖ）のウシ血清を補足）０．５ｍｌ中の可変量で競合結合を実施した。インキュベーション後、細胞を、０．５ＭのＮａＣｌを補った氷冷バインディングバッファー中で４回速やかに洗った。細胞を、１ｍｌの３Ｍの酢酸、８Ｍの尿素および２％のＮＰ−４０中で溶解した。溶解した物質を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｇａｍｍａ ４０００シンチレーションカウンターを用いて１分間計測した。測定は２回行い、ＩＣ５０値を、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて当てはめた単相濃度阻害曲線から導いた。表２は、化合物番号１９および２３による予備スクリーニングにおいて示されたＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳに対する効力の増加を例示するものである。
【表２】
2004502783.tif 000003
【０１１４】
実施例１１：抗ＣＣＲ５および抗ＣＸＣＲ４化合物を用いた組合わせ処置
以下の例は、抗ＣＣＲ５（例えば、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ）および抗ＣＸＣＲ４（例えば、ＳＤＦ−１アンタゴニストまたはＡＭＤ３１００）を組合せて使用した場合の、ＨＩＶ感染のブロック、およびＨＩＶのＲ５株からＸ４株への潜在的変換のブロックについての保護効果を例示する。ＳＣＩＤマウスモデルをこの目的に利用した。特に、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳおよびＡＭＤ３１００（小さい有機分子抗Ｘ４薬剤）の保護効果を、（Ｍｏｓｉｅｒ， Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９６）６３：７９−１２５； Ｐｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．（１９９７）７１：７１２４−７１２７； Ｐｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２：２００２−２００９； Ｏｆｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ９９／１１６６６号）に記載される方法に従って、ヒト末梢血白血球で再増殖されかつＨＩＶ−１で対抗されたＳＣＩＤマウスにおいて試験した。ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳを、表Ｘにおけるように投与し、ＡＭＤ３１００を２００ｍｇ／ｍｌ溶液として用いた。対抗は、ＡＭＤ３１００グループのみを除いて、Ｒ５ＨＩＶウイルスを用いた。組合せ処置においては、逸脱突然変異体は全く観察されず、かつ適切に処置したすべてのマウスは、実験全体を通してウイルスフリーであった。このことは、本発明のＮ、ＣおよびＮ／Ｃ末端ＲＡＮＴＥＳ誘導体が、哺乳動物におけるＨＩＶ感染阻止のために、本明細書中に記載されている誘導体のようなＡＭＤ３１００またはＳＤＦ−１アンタゴニストのような抗Ｘ４株化合物と組合せて用い得ることを示している。
【０１１５】
本明細書中で言及したすべての刊行物および特許出願は、あたかも個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個別的に示されたのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１６】
本発明は以上説明したとおりであり、各請求項の趣旨または範囲を逸脱することなく本発明に対して多くの変更および修正がなし得ることは当業者にとり明白であろう。
【０１１７】
2004502783.tif 000004
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【図面の簡単な説明】
【図１】天然産ケモカインならびに保存されたシステインパターンにより定義されるそれらの対応するＮ末端、ＮループおよびＣ末端領域の４つのクラスの一般構造を示す概略図であり、「Ｃ」はシステインを表す１文字コードであり、「Ｘ」はシステイン以外の所与のアミノ酸を表す。
【図２Ａ】種々のケモカインポリペプチド鎖の天然産アミノ酸配列の例を図示するもので、これらのケモカインの対応するＮ末端、ＮループおよびＣ末端領域を含んでいる。２０個の遺伝子学的に符号化されたアミノ酸について、標準の１文字アミノ酸コードが用いられる。
【図２Ｂ】図２Ａと同様な図である。
【図２Ｃ】図２Ａと同様な図である。
【図２Ｄ】図２Ａと同様な図である。
【図２Ｅ】図２Ａと同様な図である。
【図１】
2004502783.tif 000028
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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