(57)【要約】【課題】電気化学的方法を利用してハイブリッド化された核酸を検出することができる方法と、さらに、本発明は、操作が簡単で安価な費用で実施できるハイブリッド化核酸検出方法を提供すること。【解決手段】(ａ）作業電極上に捕獲プローブを固定してオリゴプレートを製造する段階と、(ｂ）前記捕獲プローブに目的プローブをハイブリッド化させる段階と、（ｃ）前記捕獲プローブに一重らせんまたは二重らせん核酸に特異的な核酸結合物質を反応させる段階と（ｄ）電気化学的方法で作業電極表面の電荷状態を電解質の中で測定する段階とを含むことを特徴とする。
2004537050.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ）作業電極上に捕獲プローブを固定してオリゴプレートを製造する段階と、
(ｂ）捕獲プローブに目的プローブをハイブリッド化させる段階と、
（ｃ）捕獲プローブに一重らせんまたは二重らせん核酸に特異的な核酸結合物質を反応させる段階と
（ｄ）電気化学的方法で作業電極表面の電荷状態を電解質の中で測定する段階と
を含むことを特徴とする核酸ハイブリッド化検出方法。
【請求項２】
前記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法。
【請求項３】
前記核酸結合物質は、電荷を有し、核酸に結合して作業電極表面の電荷状態を変化させる分子であることを特徴とする、請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法。
【請求項４】
前記捕獲プローブは、末端にチオール基をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法。
【請求項５】
前記捕獲プローブは、末端にアミン基をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法。
【請求項６】
前記作業電極は、金、白金、銀、炭素、銅、ニッケル、クロム及びパラジウムからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法。
【請求項７】
前記核酸結合物質は、インターカレータ、インターカレーティング蛍光染料、アクリジン系化合物、クロロキン、キニン（quinine）、ノヴァナトロン、ドキソルビシン、一重らせん結合蛋白質及びレックＡ蛋白質からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法。
【請求項８】
前記インターカレーティング蛍光染料は、１，１´−[１，３−プロパンジイルビス[（ジメチルイミニオ）−３，１−プロパンジイル]]ビス[４−[（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾキサゾルイリデン）メチル]]−、テトラアイオダイド、１，１´−[１，３−プロパンジイルビス[（ジメチルイミニオ）−３，１−プロパンジイル]]ビス[４−[３−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾキサゾルイリデン）−１−プロペニル]]−、テトラアイオダイド、４−[（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾキサゾルイリデン）メチル]−１−[３−（トリメチルアンモニオ）プロピル]−、ジアイオダイド、４−[３−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾキサゾルイリデン）−１−プロペニル]−１−[３−（トリメチルアンモニオ）プロピル]−、ジアイオダイド、２，２´−[１，３−プロパンジイルビス[（ジメチルイミニオ）−３，１−プロパンジイル−１（４Ｈ）−ピリジニル−４−イリデンメチリジン]]ビス[３−メチル]−、テトラアイオダイド、２，２´−[１，３−プロパンジイルビス[（ジメチルイミニオ）−３，１−プロパンジイル−１（４Ｈ）−ピリジニル−４−イリデン−１−プロペン−１−イル−３−イリデン]]ビス[３−メチル]−、テトラアイオダイド）、ＥｔＢｒ（３，８−ジアミノ−５−エチル−６−フェニル−、ブロマイド）、３−メチル−２−[[１−[３−（トリメチルアンモニオ）プロピル]−４（１Ｈ）−ピリジニルイデン]メチル]−、ジアイオダイド、３−メチル−２−[３−[１−[３−（トリメチルアンモニオ）プロピル]−４（１Ｈ）−ピリジニルイデン]−１−プロペニル]−、ジアイオダイド及びＳＹＢＲグリーンからなる群より選択されることを特徴とする、請求項７に記載の核酸ハイブリッド化検出方法。
【請求項９】
前記アクリジン系化合物は、３，６−ジアミノアクリジン、３，６−ジアミノ−１０−メチルアクリジニウムクロライド、アクリジンオレンジ及びアクリジンイエローからなる群より選択されることを特徴とする、請求項７に記載の核酸ハイブリッド化検出方法。
【請求項１０】
前記検出方法が、前記（ｃ）段階の前にオリゴプレートに、界面活性剤を反応させる段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法。
【請求項１１】
前記界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウムまたはトリトンＸ系化合物であることを特徴とする、請求項１０に記載の核酸ハイブリッド化検出方法。
【請求項１２】
前記検出方法が、前記（ｃ）段階の後にオリゴプレートに、熱、電圧、界面活性剤または音波を加える段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法。
【請求項１３】
前記電気化学的方法は、循環電圧電流法、電流測定またはクロノクーロメトリーであることを特徴とする、請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸ハイブリッド化検出方法に係り、さらに詳しくは一重らせん構造または二重らせん構造の核酸に特異的に結合した核酸結合物質を使って、核酸の電荷状態の変化を電気化学的方法で測定することを含む核酸ハイブリッド化検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸チップ分野において核酸ハイブリッド化の検出は最も核心的な技術である。現在一般的に用いられている方法としては、蛍光標識された核酸にレーザーを照射して生じる光を検出するレーザー誘発蛍光法である。このレーザー誘発蛍光法に基づくＤＮＡチップは、現在ＤＮＡチップ製作会社である米国のアフィメトリックス（Affymetrix）社、ナノゲン（Nanogen）社などにより商品化されている。しかし、レーザー誘発蛍光法は、核酸を蛍光物質で標識する過程に面倒さがあり、過程が複雑で、蛍光分子の使用による高価な費用が要求されるという幾つかの問題点を持っている。
【０００３】
最近は、この蛍光物質を使用せずに核酸ハイブリッド化を検出する方法として、表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance）法、水晶体微量天秤（quartz crystal microbalance）法、質量分析機を利用した方法、及び電気化学を利用した方法などが利用されている。これらの方法は、ＤＮＡ自体に直接標識分子を結合せずに検出が可能であるという長所をもっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、電気化学的な方法を除いた、表面プラズモン共鳴法、水晶体微量天秤法、質量分析機を利用した方法は、高価の装備とこの装備を扱うための専門性が要求されるため、容易に利用するのは難しいという問題点があった。
【０００５】
本発明は前記の問題点に鑑みてなされたものであり、電気化学を利用した検出法は、検出のために使用される装備が比較的に安価で、特別な知識がなくても検出が可能で容易に使用することができるため、この電気化学的方法を利用してハイブリッド化された核酸を検出することができる方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、操作が簡単で安価な費用で実施できるハイブリッド化核酸検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の目的を達成するために本発明は、核酸ハイブリッド化検出方法において、（a）作業電極上に捕獲プローブを固定してオリゴプレートを製造する段階と、（b）前記捕獲プローブに目的プローブをハイブリッド化させる段階と、（c）前記捕獲プローブに一重らせんまたは二重らせん核酸に特異的な核酸結合物質を反応させる段階と（d）電気化学的方法で作業電極表面の電荷状態を電解質の中で測定する段階とを含むことを特徴とする。
【０００７】
この請求項１によれば、捕獲プローブの固定の段階と目的プローブのハイブリッド化段階、特異的な核酸結合物質反応段階、電気化学的方法での検出段階を経ることによって、ハイブリッド化した核酸を検出することできる。
【０００８】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法において、前記核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであることを特徴とする。
【０００９】
この請求項２に記載の発明によれば、核酸がＤＮＡまたはＲＮＡであることによって、ハイブリッド化したＤＮＡまたはＲＮＡを検出できる。
【００１０】
請求項３に記載の発明は、請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法において、前記核酸結合物質は電荷を有し、核酸に結合して作業電極表面の電荷状態を変化させる分子であることを特徴とする。
【００１１】
請求項３に記載の発明によれば、前記核酸結合物質が核酸に結合して作業電極表面の電荷状態を変化させる分子であることによって、より良好にハイブリッド化した核酸を検出できる。
【００１２】
請求項４に記載の発明は、請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法において、前記捕獲プローブは末端にチオール基をさらに含むことを特徴とする。
【００１３】
この請求項４に記載の発明よれば、末端にチオール基をさらに含むことによって、捕獲プローブが安定的に結合し、捕獲プローブに作業電極間の直接的な接触を防止することができる。
【００１４】
請求項５に記載の発明は、請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法において、前記捕獲プローブは末端にアミン基をさらに含むことを特徴とする。
【００１５】
この請求項５に記載の発明によれば、末端にアミン基をさらに含むことによって、捕獲プローブが安定的に結合し、捕獲プローブに作業電極間の直接的な接触を防止することができる。
【００１６】
請求項６に記載の発明は、請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法において、前記作業電極は、金、白金、銀、炭素、銅、ニッケル、クロム及びパラジウムからなる群より選択されることを特徴とする。
【００１７】
この請求項６に記載の発明によれば、前記作業電極を白金などから選択することによって、良好な測定の感度を得ることができる。
【００１８】
請求項７に記載の発明は、請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法において、前記核酸結合物質はインターカレータ、インターカレーティング蛍光染料、アクリジン系化合物、クロロキン、キニン（quinine）、ノヴァナトロン、ドキソルビシン、一重らせん結合蛋白質及びレックＡ蛋白質からなる群より選択されることを特徴とする。
【００１９】
この請求項７に記載の発明によれば、前記結合物質にインターカレータ、インターカレーティング蛍光塗料などを選択することによって、これらが核酸に結合して作業電極表面の電荷状態を変化させることができる。
【００２０】
請求項８の記載の発明は、請求項７に記載の核酸ハイブリッド化検出方法において、前記インターカレーティング蛍光染料は１，１´−[１，３−プロパンジイルビス[（ジメチルイミニオ）−３，１−プロパンジイル]]ビス[４−[（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾキサゾルイリデン）メチル]]−、テトラアイオダイド、１，１´−[１，３−プロパンジイルビス[（ジメチルイミニオ）−３，１−プロパンジイル]]ビス[４−[３−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾキサゾルイリデン）−１−プロペニル]]−、テトラアイオダイド、４−[（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾキサゾルイリデン）メチル]−１−[３−（トリメチルアンモニオ）プロピル]−、ジアイオダイド、４−[３−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾキサゾルイリデン）−１−プロペニル]−１−[３−（トリメチルアンモニオ）プロピル]−、ジアイオダイド、２，２´−[１，３−プロパンジイルビス[（ジメチルイミニオ）−３，１−プロパンジイル−１（４Ｈ）−ピリジニル−４−イリデンメチリジン]]ビス[３−メチル]−、テトラアイオダイド、２，２´−[１，３−プロパンジイルビス[（ジメチルイミニオ）−３，１−プロパンジイル−１（４Ｈ）−ピリジニル−４−イリデン−１−プロペン−１−イル−３−イリデン]]ビス[３−メチル]−、テトラアイオダイド）、ＥｔＢｒ（３，８−ジアミノ−５−エチル−６−フェニル−、ブロマイド）、３−メチル−２−[[１−[３−（トリメチルアンモニオ）プロピル]−４（１Ｈ）−ピリジニルイデン]メチル]−、ジアイオダイド、３−メチル−２−[３−[１−[３−（トリメチルアンモニオ）プロピル]−４（１Ｈ）−ピリジニルイデン]−１−プロペニル]−、ジアイオダイド及びSYBRグリーンからなる群より選択されることを特徴とする。
【００２１】
この請求項８に記載の発明によれば、前記インターカレーティング蛍光染料の化合物を選択することによって、より良好に安定的に核酸に結合して作業電極表面の電極を変化させることができる。
【００２２】
請求項９に記載の発明は、請求項７に記載の核酸ハイブリッド化検出方法において、前記アクリジン系化合物は３，６−ジアミノアクリジン、３，６−ジアミノ−１０−メチルアクリジニウムクロライド、アクリジンオレンジ及びアクリジンイエローからなる群より選択されることを特徴とする。
【００２３】
この請求項９に記載の発明によれば、前記アクリジン系化合物を選択することによって、より良好に核酸に結合して作業電極表面の電極を変化させることができる。
【００２４】
請求項１０に記載の発明は、請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法において、前記検出方法が前記（c）段階の前にオリゴプレートに界面活性剤を反応させる段階をさらに含むことを特徴とする。
【００２５】
この請求項１０に記載の発明によれば、前記（ｃ）段階の前にオリゴプレートに界面活性剤を反応させる段階をさらに含むことによって、非特異的な結合を良好に処理することができる。
【００２６】
請求項１１に記載の発明は、請求項１０に記載の核酸ハイブリッド化検出方法において前記界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウムまたはトリトンＸ系化合物であることを特徴とする。
【００２７】
この請求項１１に記載の発明によれば、ドデシル硫酸ナトリウムまたはトリトンＸ系化合物であることによって、より良好に簡便に非特異的な結合を良好に処理することができる。
【００２８】
請求項１２に記載の発明は、請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法において、前記検出方法が前記（ｃ）段階の後にオリゴプレートに熱、電圧、界面活性剤または音波を加える段階をさらに含むことを特徴とする。
【００２９】
この請求項１２に記載の発明によれば、（c）段階の後にオリゴプレートに、熱、電圧、界面活性剤または音波を加える段階をさらに含むことによって、最も良好に簡便に非特異的な結合を処理することができる。
【００３０】
請求項１３に記載の発明は、請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法において、前記電気化学的方法は、循環電圧電流法、電流測定またはクロノクーロメトリーであることを特徴とする。
【００３１】
この請求項１３に記載の発明によれば、前記電気化学的手法が循環電圧電流などであることによって、良好かつ簡便に核酸ハイブリット化検出をすることができる。
【発明の効果】
【００３２】
請求項１に記載の発明によれば、捕獲プローブの固定の段階と目的プローブのハイブリッド化段階、特異的な核酸結合物質反応段階、電気化学的方法での測定段階を経ることによって、ハイブリッド化した核酸を検出することできるので、電気化学的方法を利用して、他の検出方法よりも、簡単で安価な費用で核酸ハイブリッド化の検出方法をすることができる。
【００３３】
請求項２に記載の発明によれば、核酸がＤＮＡまたはＲＮＡであることによって、ハイブリッド化したＤＮＡまたはＲＮＡを検出できるので、ＤＮＡまたはＲＮＡにおいても、電気化学的方法を利用して、他の検出方法よりも、簡単安価な費用で核酸ハイブリッド化の検出方法を行うことができる。
【００３４】
請求項３に記載の発明によれば、前記核酸結合物質が核酸に結合して作業電極表面の電荷状態を変化させる分子であることによって、より良好にハイブリッド化した核酸を検出できるので、電気化学的方法を利用して、より安定的に核酸ハイブリッド化することができ、簡単で安価な費用で核酸ハイブリッド化の検出方法をすることができる。
【００３５】
この請求項４に記載の発明よれば、末端にチオール基をさらに含むことによって、捕獲プローブが安定的に結合し、捕獲プローブに作業電極間の直接的な接触を防止することができるので、電気化学的方法を利用して、安定的な測定でき、簡単で安価な費用で核酸ハイブリッド化の検出方法を行うことができる。
【００３６】
この請求項５に記載の発明によれば、末端にアミン基をさらに含含むことによって、捕獲プローブが安定的に結合し、捕獲プローブに作業電極間の直接的な接触を防止することができるので、電気化学的方法を利用して、安定的な測定でき、簡単で安価な費用で核酸ハイブリッド化の検出方法を行うことができる。
【００３７】
この請求項６に記載の発明によれば、前記作業電極を白金などから選択することによって、良好な測定の感度を得ることができるので、安定的で感度の良い測定でき、簡単で安価な費用で核酸ハイブリッド化の検出方法を行うことができる。
【００３８】
この請求項７に記載の発明によれば、前記結合物質にインターカレータ、インターカレーティング蛍光塗料などを選択することによって、これらが核酸に結合して作業電極表面の電荷状態を変化させることができるので、より安定的に核酸ハイブリッド化ができるとともに安定的な測定でき、簡単で安価な費用で核酸ハイブリッド化の検出方法を行うことができる。
【００３９】
この請求項８に記載の発明によれば、前記インターカレーティング蛍光染料の化合物を選択することによって、より良好に安定的に核酸に結合して作業電極表面の電極を変化させることができるので、より安定的に核酸ハイブリッド化ができるとともに安定的な測定でき、簡単で安価な費用で核酸ハイブリッド化の検出方法を行うことができる。
【００４０】
この請求項９に記載の発明によれば、前記アクリジン系化合物を選択することによって、より良好に核酸に結合して作業電極表面の電極を変化させることができるので、より安定的に核酸ハイブリッド化ができるとともに安定的な測定でき、簡単で安価な費用で核酸ハイブリッド化の検出方法を行うことができる。
【００４１】
この請求項１０に記載の発明によれば、前記（ｃ）段階の前にオリゴプレートに界面活性剤を反応させる段階をさらに含むことによって、非特異的な結合を良好に処理することができるので、より安定的に核酸ハイブリッド化ができるとともに安定的な測定でき、簡単で安価な費用で核酸ハイブリッド化の検出方法を行うことができる。
【００４２】
この請求項１１に記載の発明によれば、デシル硫酸ナトリウムまたはトリトンＸ系化合物であることによって、より良好に簡便に非特異的な結合を良好に処理することができるので、より安定的に核酸ハイブリッド化ができるとともに安定的な測定でき、簡単で安価な費用で核酸ハイブリッド化の検出方法を行うことができる。
【００４３】
請求項１２に記載の発明によれば、（c）段階の後にオリゴプレートに、熱、電圧、界面活性剤または音波を加える段階をさらに含むことによって、最も良好に簡便に非特異的な結合を良好に処理することができるので、より安定的に核酸ハイブリッド化ができるとともに安定的な測定でき、簡単で安価な費用で核酸ハイブリッド化の検出方法をすることができる。
【００４４】
この請求項１３に記載の発明によれば、前記電気化学的手法が循環電圧電流などであることによって、良好かつ簡便に核酸ハイブリット化検出を行うことができるので、より安定的な測定でき、簡単で安価な費用で核酸ハイブリッド化の検出方法を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
以下、本発明に係るについて図１から図７を参照して説明する。ただし、発明は以下の実施形態に限定されない。
【００４６】
本発明は、作業電極表面上に固定された一重らせんまたは二重らせん構造の核酸に特定の核酸結合物質をインターカレートして、一重らせんまたは二重らせん構造の核酸の負電荷の変化を測定することよりなる核酸ハイブリッド化を検出する方法に係るものである。
【００４７】
前記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、また本発明で言及するハイブリッドは、相補的結合（complementary bind）を意味する。
【００４８】
本発明の最良の形態の核酸ハイブリッド化検出方法は（a）作業電極上に捕獲プローブを固定してオリゴプレートを製造する段階と、（b）前記捕獲プローブに目的プローブをハイブリッド化させる段階と、（c）前記捕獲プローブに一重らせんまたは二重らせん核酸に特異的な核酸結合物質を反応させる段階、及び（d）電気化学的方法で作業電極表面の電荷状態を電解質の中で測定する段階とを含む。
【００４９】
前記（ａ）段階について説明する。本発明のオリゴプレートを具体的な例を挙げて説明すると図１の通りである。オリゴプレートは、基板の上には、絶縁体が固定されており、その上に電極が固定されている。さらに作業電極（１）に捕獲プローブ（２）を固定して製造される。また、捕獲プローブの５末端や３末端に図１に例示しているチオール基（３）（thiol group）または図示していないアミン基（amine group）を作業電極に連結して固定して製造することもできる。さらに、捕獲プローブと作業電極間の直接的な接触を最も良好に防止するために、チオール基（３）またはアミン基と捕獲プローブとの間にカーボンチェーンリンカー（４）（carbon chain linker）をさらに挿入することもできる。この時、前記カーボンチェーンリンカーはカーボン数に制限がないが、６乃至１２個のカーボンを含むのが好ましい。
【００５０】
前記（ｂ）段階について説明する。本発明で言及する捕獲プローブ及び目的プローブはＤＮＡまたはＲＮＡである。測定時の良好な感度を得るため、記作業電極は、金、白金、銀、炭素、銅、ニッケル、クロム及びパラジウムからなる群より選択された金属である。また、この作業電極は、薄膜または棒形態で用いることができ、バイオチップの基板として用いられる物質に金属でコーティングして用いることもできる。
【００５１】
ハイブリッド化での反応は、用いられるプローブの特性、大きさなどによって反応条件を別にすることができ、通常に用いられているハイブリッド化条件で実施するので良い。また、捕獲プローブと目的プローブとの間のハイブリッド化を安定に維持するために、塩化ナトリウムを含む緩衝液を用いることができる。この緩衝液を用いることによって、ハイブリッド化反応後、ハイブリッド化されていない残余目的プローブまたは非特異的に結合した目的プローブを除去することができる。
【００５２】
前記（ｃ）段階について説明する。核酸結合物質とは、二重らせんまたは一重らせん構造の核酸に共有または非共有結合した化学物質を意味する。核酸結合物質はＤＮＡ二重らせんの溝（groove）に挿入されうる化合物、重畳された塩基対の間をインターカレーティングすることができる化合物、一重らせん核酸に特異的に結合する化合物、二重らせん構造の核酸に特異的に結合する化合物、及びＤＮＡ二重らせんのメジャーまたはマイナー溝に特異的に結合する化合物からなる群より選択することができる。この酸結合物質は、電荷を帯びる分子であるので、核酸に結合して作業電極表面の電荷状態を変化させる。さらに、良好に陽電荷を有し、二重らせん及び一重らせん核酸に対して特異性を有することとなる。
【００５３】
この核酸結合物質の例としては、インターカレータ、インターカレーティング蛍光染料、アクリジン系化合物（acridines）、クロロキン（chloroquine）、キニン（quinine）、ノヴァナトロン（novanatrone）、ドキソルビシン（doxorubicin）、一重らせん結合蛋白質（single strand binding protein）及びレックＡ蛋白質（Rec A protein）がある。
【００５４】
このインターカレータは、二重らせん構造の核酸に対して特異性を有し、インターカレーティング蛍光染料、アクリジン系化合物、クロロキン、キニン、ノヴァナトロン、ドキソルビシンがこれに属する。
【００５５】
前記インターカレーティング蛍光染料としては、１，１´−[１，３−プロパンジイルビス[（ジメチルイミニオ）−３，１−プロパンジイル]]ビス[４−[（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾキサゾルイリデン）メチル]]−、テトラアイオダイド（ＹＯＹＯ−１），１、１´−[１，３−プロパンジイルビス[（ジメチルイミニオ）−３，１−プロパンジイル]]ビス[４−[３−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾキサゾルイリデン）−１−プロペニル]]−、テトラアイオダイド（ＹＯＹＯ−３）、４−[（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾキサゾルイリデン）メチル]−１−[３−（トリメチルアンモニオ）プロピル]−、ジアイオダイド（ＹＯ−ＰＲＯ−１）、４−[３−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾキサゾルイリデン）−１−プロペニル]−１−[３−（トリメチルアンモニオ）プロピル]−、ジアイオダイド（ＹＯ−ＰＲＯ−３）、２，２´−[１，３−プロパンジイルビス[（ジメチルイミニオ）−３，１−プロパンジイル−１（４Ｈ）−ピリジニル−４−イリデンメチリジン]]ビス[３−メチル]−、テトラアイオダイド（ＰＯＰＯTM−１）、２，２´−[１，３−プロパンジイルビス[（ジメチルイミニオ）−３，１−プロパンジイル−１（４Ｈ）−ピリジニル−４−イリデン−１−プロペン−１−イル−３−イリデン]]ビス[３−メチル]−、テトラアイオダイド（ＰＯＰＯTM−３）、ＥｔＢｒ（３，８−ジアミノ−５−エチル−６−フェニル−ブロマイド）、３−メチル−２−[[１−[３−（トリメチルアンモニオ）プロピル]−４（１Ｈ）−ピリジニルイデン]メチル]−、ジアイオダイド（ＰＯ−ＰＲＯTM−１），３−メチル−２−[３−[１−[３−（トリメチルアンモニオ）プロピル]−４（１Ｈ）−ピリジニルイデン]−１−プロペニル]−、ジアイオダイド（ＰＯ−ＰＲＯTM−３）及びＳＹＢＲグリーン（Molecular Probes社の登録商標）からなる群より選択することができる。
【００５６】
前記アクリジン化合物は３，６−ジアミノアクリジン（3,6-diaminoacridine）、３，６−ジアミノ−１０−メチルアクリジニウムクロライド（3,6-diamino-10-methイルacridinium chloride）、アクリジンオレンジ（acridine orange）及びアクリジンイエロー（acridine yellow）からなる群より選択することができる。
【００５７】
前記（ｃ）段階では、一重らせんまたは二重らせん構造の核酸に選択的に結合する核酸結合物質がハイブリッド化核酸または一重らせん核酸に結合することによって、作業電極表面の電荷状態を図４（ｂ）に示すように変化させる。この場合には、例えば、陽電荷性核酸結合物質は、作業電極に固定された核酸の陰電荷を減殺することとなる。
【００５８】
前記（ｃ）段階の前に、オリゴプレートに界面活性剤を反応させる段階をさらに含んでもよい。界面活性剤は、インターカレーション溶液に使用される同一な緩衝液に溶解された液剤として使用することができる。界面活性剤の濃度は特に制限されないが、１０ｍＭ前後が好ましい。界面活性剤はその種類に関係なく使用可能であるが、好ましくはドデシル硫酸ナトリウム（sodium dodecyl sulfate、以下、ＳＤＳとする）またはトリトンＸ（triton x）系化合物がある。
【００５９】
また、前記（ｃ）段階の後に、界面活性剤、熱、電圧または音波の反応段階を含んでもよい。一例として、 二重らせん構造の核酸に特異的なインターカレータは、核酸二重螺旋の重なった塩基対（stacked base pair）に挿入されるが、一重らせん構造の核酸にも、イオン間相互作用を生ずる傾向がある。このような非特異性結合（イオン間相互作用）は、界面活性剤で処理したり、熱、音波または電圧の形態でエネルギーを加えて除去することができる。熱処理の場合は、６５乃至９５℃で実施し、音波の場合は、通常の方法または超音波処理（sonication）で実施し、電圧の場合は、電極に加えることによって行う。
【００６０】
前記（ｄ）段階について説明する。前記（ｄ）段階では、オリゴプレートを電解質に浸漬しておいて、作業電極表面電荷状態の変化を電気化学的な方法で測定する。この時、作業電極表面に固定された核酸の陰電荷が核酸結合物質によって減少または中和された場合、陰電荷を帯びる電解質は電極表面に近接し、陰電荷電解質の表面濃度が増加して酸化／還元反応を発生させることとなる。しかし、図５（ｂ）に示すように、ヌクレオチドの陰電荷が減少または中和されない場合には、陰電荷性電解質は電気的反発力により近接できず、酸化／還元反応が発生しないこととなる。
【００６１】
この電解質は、陰電荷を帯びる電解質であり、好ましくは[Ｆｅ（ＣＮ）6]3-を含む水溶液である。電解質の一例としては、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．０）及び３ｍＭ Ｋ3Ｆｅ（ＣＮ）6を含む緩衝液がある。
【００６２】
また、本発明で用いられる電気化学的方法の例としては、循環電圧電流法（cyclic voltammetry）、電流測定（amperometry）及びクロノクーロメトリー（chronocoulometry）がある。循環電圧電流法とは、電極での変化する電圧を調べる電気化学的手法であって、電圧を負荷しては止めることにより、三角の波形を生ずる方法である。また、前記電流測定は固定された一定の電圧上で電流を測定する方法であり、前記クロノクーロメトリーは作業電極での電流変化速度対時間の関係を調べる電解分析である。
【００６３】
以下に本発明の作用を説明する。本発明の具体的な一例としては、作業電極の電流変化を循環電圧電流法で測定した時、インターカレーション反応を実施する前に作業電極で測定される循環電流電圧グラフは、例えば、図６(ａ）のようなグラフになる。 インターカレーション後にインターカレーションされなかった核酸が固定された作業電極での循環電流電圧グラフは、例えば図６（ｂ）のようなグラフとなる。インターカレーションされた核酸が固定された作業電極での循環電流電圧グラフは、例えば、図６（ｃ）のようなグラフとなる。つまり、インターカレーションされた捕獲プローブは陰電荷が中和または減少されるために、陰電荷を帯びた電解質は容易に電極表面に近接し、酸化／還元を起す。
【００６４】
したがって、二重らせん構造をもつ核酸に特異的なインターカレーターを捕獲プローブに反応させた時には、作業電極で、例えば、図６（ｂ）のような循環電圧電流が測定されれば、前記捕獲プローブは、目的プローブに対して相補的ではないことを意味する。反面、例えば、図６（ｃ）のような電流変化が測定されれば、捕獲プローブが目的プローブに対して相補的であることを意味する。
【００６５】
前記の如く、本発明は、核酸のハイブリッド化形成有無を電気化学的に検出することができる方法を提供することができる。また、この方法は、ＤＮＡチップまたはバイオチップでの検出方法として利用することができる。さらに、他の検出方法とは異なり、電気化学的検出方法であるため、本発明は簡単で安価な費用で核酸ハイブリッド化の有無を検出することができる。
【００６６】
なお、本発明の作業電極は作業電極当り一つの捕獲プローブを固定することができるので、多数の捕獲プローブを固定するために多重アレイ（図２及び図３）を製造することができる。図２に示すように、Ｏｌｉｇｏ１からＯｌｉｇｏ８は多数の捕獲プローブを示す。多重アレイは、作業電極から一定の間隔をおいて補助電極（５）をおくことができる。この補助電極（５）は捕獲プローブを固定しないブランク電極であり、金または白金を用いることができる。補助電極５は、化学的反応が起こることによって生じることがある基準電極と作業電極との間の電圧降下を防止する役割を果たし、作業電極に正確で一定の電圧を加えることができるように助ける役割を果たす。この基準電極は 電圧の大きさを調節することができる基準を提供し、 銀に塩化銀をドーピングしたＡｇ／ＡｇＣｌ基準電極を用いることができ、溶液中の他の所に位置させることができる。さらに、この基準電極は、周囲の電気的反応に関係なく一定の電圧を維持する役割を果たす。
【実施例】
【００６７】
以下、本発明の理解のために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものであり、本発明が下記の実施例に限られるわけではない。
【００６８】
〔実施例１〕
＜オリゴプレート製造＞
作業電極として棒形態の金を使用した。棒形態の金表面はサンドペーパー１５００番と２０００番で順次に研磨した後、粒子が５μm、１μm、０．０５μmであるアルミナ粉に順次に研磨し、脱イオン蒸溜水中で約５分間超音波洗浄をして電極表面についている微細な粉を除去した。
【００６９】
金電極は水酸化カリウム（ＫＯＨ）飽和水溶液に浸漬して約１時間煮沸し、硫酸に浸漬して２４時間放置した後、脱イオン蒸溜水で洗浄した。この過程で硫酸に浸漬する段階はピラニア（piranha）溶液に浸漬して３時間から４時間放置する過程に代替可能である。
【００７０】
金電極表面に固定する捕獲プローブは序列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の序列を有する核酸を使用した。捕獲プローブは５末端にチオール基がついており、シグマ−アルドリチ（Sigma-aldrich）で購入した。
【００７１】
１０ｎｇ／ｍＬの捕獲プローブを含む蒸溜水水溶液（または捕獲プローブを含む５０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ７．０）水溶液）を用意した後、洗浄した金電極の表面を前記水溶液に浸漬して８時間以上放置した。
【００７２】
蒸溜水で水洗いした後、５０mMの塩化ナトリウム、１０ｍＭのリン酸塩液（ｐＨ７．０）に浸漬し、２４時間後、同液で洗浄し、同一緩衝溶液に保管してオリゴプレートを用意した。
【００７３】
〔実施例２〕
＜ハイブリッド化反応＞
捕獲プローブに相補的なオリゴヌクレオチドを目的プローブとして使用しており、目的プローブは序列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の序列を有する。
【００７４】
１０μｇ／ｍＬの目的プローブを緩衝溶液（１ｘ  ＴＥ、４００ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ７．０）に混合して目的プローブ水溶液を用意した。前記目的プローブ水溶液に実施例１のオリゴプレートを浸漬して４５℃の恒温室で約１５時間以上放置した。温度を常温に徐々に低くして、オリゴプレートを緩衝液（５０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸塩ｐＨ７．０）で洗浄した。オリゴプレートは７ｍＭのＳＤＳを含む１ｘ  ＴＢＥ（ｐＨ７．０）または７ｍＭのＳＤＳ及び５０ｍＭ塩化ナトリウム１０ｍＭリン酸塩液（ｐＨ７．０）の緩衝溶液に約１０分間浸漬し、１ｘ  ＴＢＥ（ｐＨ７．０）緩衝液で洗浄した。
【００７５】
オリゴプレートは１０-7ＭのＳＹＢＲグリーンを含む１ｘ  ＴＢＥ（ｐＨ７．０）緩衝液に浸漬して１０分以上放置した後、緩衝液（５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸塩ｐＨ７．０）で洗浄した。
【００７６】
〔実施例３〕
捕獲プローブに非相補的なオリゴヌクレオチドを目的プローブとして使用しており、目的プローブは序列番号３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を有する。
序列番号３の目的プローブで前記実施例２と同一に実施してオリゴプレートに反応させた。
【００７７】
〔実施例４〕
実施例２及び３で製造した電極での循環電圧電流をＥＧ＆Ｇ Ｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔ／Ｇａｌｖａｎｏｓｔａｔモデル  ２７３Ａ(Princeton Applied Research)を使用して常温で測定した。Ａｇ／ＡｇＣｌ[３Ｍ ＮａＣｌ] 基準電極（ＢＡＳ）及び白金線補助電極を使用しており、５０ｍＭＮａＣｌ, １０ｍＭ リン酸塩(ｐＨ７．０) 及び ３ｍＭ Ｋ3Ｆｅ（ＣＮ）6を含む[Ｆｅ(ＣＮ)6]3-溶液を緩衝液として使用した。電圧スキャンの範囲は０.６Ｖから−０.５Ｖ（Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極対比）であり、スキャン速度は１００ｍｖ／ｓｅｃである。実験する前に[Ｆｅ[ＣＮ]6]3-溶液内の酸素は窒素ガスを利用して５分間除去した。
【００７８】
図６ａ乃至６ｃは循環電流電圧グラフであって、６ａは露出された金電極の循環電流電圧グラフであり、６ｂは実施例３の電極での循環電流電圧グラフ、６ｃは実施例２の電極での循環電流電圧グラフである。
【００７９】
したがって、実施例２のオリゴプレートは核酸結合物質反応前（図６ａ）に比べて反応後（図６ｃ）に電流値の変化が現れて捕獲プローブと目的プローブ間にハイブリッド化が現れたことが分かり、実施例３のオリゴプレートに固定された捕獲プローブは非相補的な目的プローブとハイブリッド化が行われなかったことが分かった。
【００８０】
図６ａ乃至６ｃにおいて、捕獲プローブは実施例２の目的プローブとハイブリッド化されたが、実施例３の非相補的な目的プローブとはハイブリッド化されず一重らせんDNAで残っていることが分かる。このような結果は予測した通りである。
【００８１】
〔実施例５〕
＜アクリジン系化合物を利用したハイブリッド化検定＞
実施例１と同一な方法でオリゴプレートを製造しており、ハイブリッド化反応を行なった。
【００８２】
オリゴプレートは０．５ｍＭから５ｍＭのＳＤＳ、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．０）を含む緩衝溶液に浸漬して約１０分間放置した。その後、５０ｍＭ塩化ナトリウム及び１０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．０）緩衝溶液で洗浄し、１ｍｇ／ｍＬの３，６−ジアミノアクリジン、５０ｍＭ塩化ナトリウム及び１０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．０）を含む溶液に１０分間浸漬した。オリゴプレートは緩衝溶液（５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸塩ｐＨ７．０）で洗浄した後、循環電圧電流を測定した。
【００８３】
図７はアクリジン系化合物をインターカレータを利用した後の作業電極の循環電圧電流を示したグラフである。捕獲プローブを固定されDNAハイブリッドを生じた作業電極では（１）の様相を示し、一重らせん構造のDNAを固定された作業電極では（２）の様相を示した。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】本発明の核酸分子層の製造過程を示した図面である。
【図２】核酸分子層が複数個ある多重アレイを示した図面である。
【図３】核酸分子層が複数個ある多重アレイを示した図面である。
【図４】（ａ）ハイブリッド化核酸が固定されたオリゴプレートを示した図面である。(ｂ)インターカレーションによる電極表面での陰電荷中和効果を示した図面である。
【図５】(ａ)陰電荷が相殺された作業電極表面で発生する酸化/還元反応を示した図面である。(ｂ)  陰電荷を示す作業電極表面で[Fe(CN)6]3-イオンに対する静電気的反発力を示した図面である。
【図６】(ａ)インターカレータ反応前の作業電極で測定した循環電圧電流グラフである。(ｂ)一重らせん状態のDNAがついている電極にインターカレータを反応させた後、作業電極で測定した循環電圧電流グラフである。(ｃ)インターカレーションさせた後、ハイブリッド化核酸が固定された作業電極での循環電圧電流グラフである。
【図７】アクリジン系化合物にインターカレーションした後、作業電極の循環電圧電流グラフを示した図面である。
【図３】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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