(57)【要約】【構成】本発明は、ＩＬ−１３Ｒα２を発現する細胞を有する病気を持っているか、または発現させる危険性のある客体においてＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激する方法であり、客対外の抗癌ワクチンの処方と、客対中でＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫を刺激するために充分な量のワクチンを投与するステップを含む。ＩＬ−１３Ｒα２を発現する細胞を有するか、または発現させる危険性のある客体において、ＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激する組成であり、それは、ＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激することができる単離された薬剤を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−１３Ｒα２を発現する細胞を有する病気を持っているか、または発現させる危険性のある客体中においてＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答反応を刺激する方法であって、その方法は、
（ａ）客体外の抗癌ワクチンを処方するステップであって、そのワクチンは動物に投与したときに、ＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激することのできる薬剤から構成されるステップと、
（ｂ）客体中でＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激するために十分な量の前記ワクチンを客体に投与するステップ
とから構成されることを特徴とする方法。
【請求項２】
ＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激することができる前記薬剤は、少なくとも７つの隣接したＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のアミノ酸を含むペプチドから構成されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激することができる前記薬剤は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のアミノ酸配列から構成されるタンパク質であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ワクチンはさらにアジュバントから構成されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記アジュバントは、アルミニウム塩と、水中油性のエマルジョンと、サポニンから構成される組成物と、細菌性のタンパク質から構成される組成物と、サイトカインとからなるグループから選択される物質から構成されることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
客体中でＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激するために十分な量の前記ワクチンを客体に投与するステップ（ｂ）は、少なくとも最初の用量と二回目の用量でワクチンを投与することからなり、最初の用量を客体に投与し、早くとも２４時間後に前記二回目の用量を投与することを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項７】
ＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激することができる前記薬品は、少なくとも７つの隣接したＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のアミノ酸を含むペプチドをコード化する核酸から構成されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記核酸は裸のＤＮＡであることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記核酸は発現ベクターに組み込まれることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項１０】
ＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激することができる前記薬品は、少なくとも７つの隣接したＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のアミノ酸を含むペプチドを発現する細胞から構成されていることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも７つの隣接したＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のアミノ酸を含む前記ペプチドは、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のアミノ酸配列から構成されたペプチドであることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激することができる前記薬剤は、少なくとも７つの隣接したＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のアミノ酸から構成されたペプチドをコード化する精製された核酸が導入された細胞から構成されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記方法は、さらにＩＬ−１３Ｒα２を発現する細胞を有する癌を持っているか、又は発現させる危険性のある客体を供給するステップを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記ＩＬ−１３Ｒα２を発現する細胞は神経膠芽種細胞であることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記客体は人間であることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
動物に投与したときにＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激する組成であって、その組成は、
（ａ）動物に投与したときに、ＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激することができる単離された薬剤と、
（ｂ）薬剤を受容するキャリアー
とから構成されることを特徴とする組成。
【請求項１７】
動物に投与したときにＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激することのできる前記薬剤は、少なくとも７つの隣接するＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のアミノ酸から構成されたペプチドからなることを特徴とする請求項１６記載の組成。
【請求項１８】
少なくとも７つの隣接するＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のアミノ酸を含む前記ペプチドは、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のアミノ酸配列から構成されたペプチドであることを特徴とする請求項１７記載の組成。
【請求項１９】
前記組成はさらにアジュバントを含むことを特徴とする請求項１７記載の組成。
【請求項２０】
前記アジュバントは、アルミニウム塩と、水中油性のエマルジョンと、サポニンから構成される組成物と、細菌性のタンパク質から構成される組成生物と、サイトカインとからなるグループから選択される物質から構成されることを特徴とする請求項１９記載の組成。
【請求項２１】
動物に投与したときにＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激することのできる前記薬剤は、少なくとも７つの隣接したＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のアミノ酸を含むペプチドをコード化する核酸から構成されていることを特徴とする請求項２０記載の組成。
【請求項２２】
前記核酸は、裸のＤＮＡであることを特徴とする請求項２１記載の組成。
【請求項２３】
前記核酸は、発現ベクターに組み込むまれることを特徴とする請求項２１記載の組成。
【請求項２４】
前記ＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激することのできる前記薬剤は、少なくとも７つの隣接するＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のアミノ酸を含むペプチドが発現する細胞から構成されていることを特徴とする請求項２０記載の組成。
【請求項２５】
前記少なくとも７つの隣接するＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のアミノ酸を含む前記ペプチドはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のアミノ酸配列を含むタンパク質であることを特徴とする請求項２４記載の組成。
【請求項２６】
前記ＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激することのできる前記薬剤は、少なくとも７つの隣接するＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のアミノ酸から構成されたペプチドをコード化する精製した核酸が導入された細胞から構成されることを特徴とする請求項２５記載の組成。
【請求項２７】
客体中のＩＬ−１３Ｒα２を発現する細胞に抗体を導く方法であって、その方法は、
（ａ）ＩＬ−１３Ｒα２に特異的に結合する抗体と薬剤受容キャリアーとから構成された薬剤組成を客体外で定式化するステップと、
（ｂ）客体中のＩＬ−１３Ｒα２を発現する細胞に特異的に結合する抗体を与えるための充分な量の前記薬剤組成を客体に投与するステップ
とから構成されることを特徴とする方法。
【請求項２８】
前記抗体は、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体は、ポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
ＩＬ−１３Ｒα２に特異的に結合する抗体と薬剤を受容するキャリアーとから構成されることを特徴とする薬剤の組成。
【請求項３１】
抗体はモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項３０記載の薬剤の組成。
【請求項３２】
抗体はポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項３０記載の薬剤の組成。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
免疫療法に使用されるインターロイキン１３受容体サブユニットアルファー２
関連特許
本出願は、２０００年２月８日に出願されたアメリカ仮出願第６０／１８１，０００号の利益を主張する。
【０００２】
連邦政府によって後援された研究に関する陳述書
本発明は、国立保健研究所のガン研究所によって付与された許可番号ＣＡ７４１５４のもとで政府の支援を受けて発明されたものである。政府はこの発明の何らかの権利を留保することができる。
【０００３】
発明の分野
本発明は、一般に生物学、免疫学、医学そして腫瘍学に係わる。特に、本発明はインターロイキン１３受容体サブユニットアルファ２を、癌の治療や予防のワクチンとしての免疫系モジュレーターとターゲットとして用いることに係わる。
【０００４】
発明の背景
癌は現在先進国において２番目の死因である。ウィンゴら（１９９８）Ｊ．Ｒｅｇ．Ｍａｎｎａｇｅｍｅｎｔ．，２５，４３−５１参照。最近の調査で、腫瘍形成の分子メカニズムの多くが明らかになっているにも関わらず、充実性腫瘍を治療する際に広範囲に及ぶ臨床治療はほとんど成功していない。大部分の悪性腫瘍の主要な治療法は、これにより依然として全体切除、化学療法、そして放射線治療である。これらの治療法は徐々に改良されてきてはいるが、これらの各治療法は、まだ多数の望ましくない副作用を引き起こしている。この主たる原因は、従来方法では異常細胞だけを特に標的することができないからである。例えば、外科手術によると、苦痛、健全な組織への外傷、そして瘢痕化が起きる。化学療法や放射線治療は吐き気や免疫抑制、胃潰瘍形成そして二次的な腫瘍形成を引き起こす。
【０００５】
異常細胞を更に特にターゲットするための技術を開発する努力により、腫瘍免疫学の進歩は、優先的にまたは明確に発現する癌細胞の抗原の発見につながった。これらの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または癌特異抗原（ＴＳＡ）は、癌細胞が発現する抗原に対し選択的に免疫反応を刺激する癌ワクチンの抗原性医薬品として使用されている。腫瘍免疫学：免疫学と癌ワクチン（Ａ．Ｇ．ダレッシュ、Ｍ．Ｊ．ブラウニング著）１９９６年ケンブリッジ大学プレス、癌の免疫療法（Ｍ．ゴア、Ｐ．リチーズ著）１９９６年ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ Ｌｔｄ、マエウエラら（１９９６）ＭｅｌａｎｏｍａＲｅｓ６，１１−２４参照。最も広く研究されているこれらの抗原は、メラノーマ関連抗原、前立腺特異抗原（ＰＳＡ），Ｅ６とＥ７、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｐ５３、そしてガングリオシド（例えば、ＧＭ２）である。更に最近の研究では、特定のＴＡＡとＴＳＡは特に特定の免疫反応を刺激するのに有効であることが明らかにされている。
【０００６】
例えば、メラノーマ関連抗原の先駆的な研究は、Ｔ細胞活性化ＴＳＡとしてＭＡＧＥ−１（メラノーマ抗原１）の検出につながった。トラベルサリーら（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，３５，１４５−１５２参照。その後、他のグループがよく似た技術を使用して他のＴ細胞活性化メラノーマ抗原を含む他のＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）、チロシナーゼ、ＢＡＧＥ、そしてＧＡＧＥを発見した。マエウレールらにより上記のように研究された。最も刺激的な最近の発見の１つは、癌免疫学におけるＳＥＲＥＸ方法（組換え型ｃＤＮＡ発現ライブラリーの血清分析）の発展である。サヒンら（１９９５）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，９２，１１８１０−１１８１３参照。ＳＥＲＥＸ方法は、患者の血清に含まれるライブラリーを発見することにより、自己の腫瘍のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることを含んでいる。様々な活性化癌抗体は、この方法を使用して発見された。Ｌ． Ｊ．とＴ． Ｃ． Ｃｈｅｎ（１９９８），Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．，１８７，１１６３−１１６７参照。さらに、ＳＥＲＥＸ解析は、癌抗原に対する高い滴定量の免疫グロブリン抗体を患者が産出することを明らかにした。それは、ヘルパーＴ細胞、（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞）とＢ細胞が癌に対して、刺激的な免疫応答に協力することを示す発見であった。
【０００７】
加えて、ＳＥＲＥＸ解析は、“癌／精巣”抗体（ＣＴＳｓ）と称される癌抗原のグループの検出につながった。ＣＴＡｓは多くの共通の特性（ａ）一般的な臓器のうち、精巣においてほとんど限られた発現（ｂ）広範囲の腫瘍の発現（ｃ）複数の発見されたファミリーの存在、そして、（ｄ）Ｘ染色体遺伝子の局在性を有している。チェンら（１９９８）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２７３，１７６１８−１７６２５参照。前述の特性を基に、以前に検出されたＴＡＡｓやＴＳＡｓ（例えば、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、そしてＧＡＧＥ）の多くは、ＣＴＡｓとして発見し直された。特に、異なる多くのｎｏｎ−ＣＴＡ抗原、最近発見されたＣＴＡのみならず、以前に検出されたＣＴＡｓのほとんどもまた、はっきりと客体に対して、免疫応答への刺激を示した。
【０００８】
本発明の要約
本発明は、ＩＬ−１３Ｒα２が癌／精巣抗原であることに係わる発見である。本発明は、重要である。なぜなら大部分の癌に関連した薬とは対照的に、今までの癌に対する試験済みの活性化免疫療法薬である、大部分の癌／精巣抗原は、客体の抗癌免疫応答を効果的に刺激することが証明されたからである。従って、本発明はＩＬ−１３Ｒα２発現の方法と組成の予防および癌治療を提供する。
【０００９】
特に、本発明は、ＨＧＧ細胞として客体に存在する高度の神経膠腫（ＨＧＧ）の治療法および予防法に係わるものであり、客体に現われる高濃度のＩＬ−１３Ｒα２の表面に発現を示すものである。ヒトのＨＧＧは急速に進行したアストログリア原因の異質的脳腫瘍である。本発明は、ＨＧＧ治療に依然効果的な物理療法がなく、臨床での使用が容認されていないことから、とくに重要である。これまでは、多数のＨＧＧ患者が、更に限定的なＩＬ−１３受容体を過剰発現することが示された。すなわち、ＩＬ−４とは関与せずに、ＩＬ−１３と結合する受容体である。最近、ＩＬ−１３Ｒα２と呼ばれる、新しいＩＬ−１３結合タンパク質がクローニングされた。このタンパク質は、ＩＬ−１３とは親和性を持つがＩＬ−４とは親和性を持たないことが示された。おおよその比較では、この性質は、ＨＧＧに発現するさらに限定されたＩＬ−１３レセプターに関与している。これを説明すると、ＩＬ−１３Ｒα２はＩＬ−１３Ｒα２が発現するＨＧＧと他の癌を選択的に標的にすることを供給する、なぜならば、下記にもって詳細を説明するように、精巣を除いて通常の組織ではほとんどＩＬ−１３Ｒα２は発現しないからである。とはいえ、ＩＬ−１３に結合する多くの正常組織レセプターの発現する、このレセプター（Ｉｌ−１３とＩＬ−４が結合することから共有レセプターと呼ばれることもある）は、ＩＬ−１３Ｒα２（限定されたレセプターと信じられている）と機能上異なる。なぜなら、ＩＬ−１３とＩＬ−４両方を結合するからである。一方、限定されたレセプターはＩＬ−１３のみを結合する。２つのレセプターは構造もまた異なっており、限定されたレセプターは４２ｋＤａ単量体であり、共有レセプターは４５ｋＤａ成分（ＩＬ−１３α１と呼ぶ）と１４０ｋＤａ成分（ＩＬ−４Ｒα）からなる二量体である。
【００１０】
前述のとおり、我々の組織分布の研究結果から、正常組織においてＩＬ−１３Ｒα２は精巣にのみ強く発現することが明らかになった。この発見は（ａ）ＩＬ−１３Ｒα２はＨＧＧにおいて優先的に過剰発現するが正常な中枢神経系には発現しない。そして（ｂ）ＩＬ−１３Ｒα２遺伝子はＸ染色体に局在しているということを示すと共に、ＩＬ−１３Ｒα２は一つのＣＴＡであることを示している。なぜなら、他のＣＴＡは癌細胞に対する強い免疫応答を刺激することが証明されたので、本発明は、この客体における抗癌免疫応答を発生させるか増加させるのに有効な方法と組成を提供するものである。
【００１１】
従って、本発明の特徴の１つは、ＩＬ−１３Ｒα２を発現する細胞を有する病気を持っているか、または発現させる危険性のある客体中においてＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答反応を刺激する方法であって、その方法は、
（ａ）客体外の抗癌ワクチンを処方するステップであって、そのワクチンは動物に投与したときに、ＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激することのできる薬剤から構成されるステップと、
（ｂ）客体中でＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激するために十分な量のワクチンを客体に投与するステップ
とから構成される方法である。
【００１２】
本発明のもう１つの特徴は、動物に投与したときにＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激する組成であって、その組成は、
（ａ）動物に投与したときに、ＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激することができる単離された薬剤と、
（ｂ）薬剤を受容するキャリアー
とから構成される組成である。
【００１３】
前述の方法と組成において、ＩＬ−１３Ｒα２に対して免疫応答を刺激することのできる薬品は、ペプチドと少なくとも７つの隣接したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１アミノ酸を含む。例えば、この薬品はアミノ鎖のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を含むタンパク質であってもよい。この薬品はまた、核酸の形態もとり、少なくとも７つの隣接するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１アミノ酸を含むペプチドをコード化する。そのような核酸は裸のＤＮＡとも、核酸を含む発現ベクターの構造としても使用し得る。その薬品はＩＬ−１３Ｒα２に対して免疫応答を刺激することのできる細胞でもある。この細胞は、少なくとも７つの隣接するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１アミノ酸を含むペプチド発現か、あるいは、少なくとも７つの隣接するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１アミノ酸を含むペプチドをコード化する精製された核酸が導入されたものである。
【００１４】
本発明の範囲におけるワクチンと組成は、アルミニウム塩と、水中油性のエマルジョンと、サポニンを含む構造と、細菌性のタンパク質を含む組成と、サイトカインのようなアジュバンドをさらに含む。
【００１５】
本発明の方法は、ＩＬ−１３Ｒα２を発現する細胞（例えば、神経膠芽種細胞）を持っているか、又は癌を発現させる危険性のある客体（例えば、人間）に提供するステップを含んでいる。その方法において、客体中でＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激するのに十分な量のワクチンを客体に投与することができるステップは、少なくとも最初の分量と二回目の分量でワクチンを投与することからなり、最初の用量を客体に投与し、早くとも２４時間後に２回目の用量を客体に投与する。
【００１６】
特に定義しない限り、ここで使用される全ての技術用語は、本発明が属する技術における通常の知識を有する者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学の用語の一般的に理解される定義は、リーガーら著（１９９１）遺伝学 ： 古典遺伝学及び分子遺伝学の用語解説　第５版　スプリンガー―ヴァーラグ： ニューヨーク、及びレウィン著（１９９４）遺伝子Ｖ， オックスフォード大学出版 ： ニューヨークにおいて見出すことができる。ヌクレオチド基に対しては１文字の正式名称、及びアミノ酸に対しては１か３文字の正式名称が使われている。
【００１７】
ここで用いられるような、「核酸」は２つ以上のヌクレオチド鎖を意味する。例えば、ＲＮＡ（リボ核酸）とＤＮＡ（デオキシリボ核酸）が核酸である。「単一の」核酸は、例えば今までの核酸精製方法によって、本質的に、核酸が自然に生じる細胞や組織、すなわち染色体と染色体外ＤＮＡとＲＮＡの中の他の核酸塩基配列から分離又は精製されたものである。従ってその言葉は、ベクター、自己複製プラスミドやウイルス、又は原核生物や真核生物のゲノムＤＮＡへ組み込まれた組換え型核酸分子を含む。それには、ｃＤＮＡのような単独分子、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で生成した断片、又は制限断片が含まれる。それはまた、組換え型核酸分子と化学的に合成された核酸分子が含まれる。「組換え型」核酸分子は、例えば化学合成や、遺伝子工学の技術で単離された核酸の断片の操作によって、２つの別に分離された塩基配列の断片の人工合成により作り出されたものである。
【００１８】
核酸分子やポリペプチドについていうならば、「天然型」という言葉は自然発生的（例えば、野生型）な核酸またはポリペプチドのことを言う。ＩＬ−１３Ｒα２遺伝子の「同族体」は、人類以外の種から単離したポリペプチドＩＬ−１３Ｒα２の遺伝子配列をコード化する。「裸の核酸」という言い回しは、発現ベクター中に組み込まれていない、核酸を意味する。
【００１９】
ＩＬ−１３Ｒα２遺伝子」又は「ＩＬ−１３Ｒα２ポリヌクレオチド」という言葉は、核酸配列（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（図２）として示されているＩＬ−１３Ｒα２ｃＤＮＡ配列）又はＩＬ−１３Ｒα２ｃＤＮＡを転写することのできるゲノム配列、および変異型の対立遺伝子と前述の同族体をコード化する天然型のＩＬ−１３Ｒα２を意味する。
【００２０】
ここで用いられるような、「タンパク質」「ペプチド」や「ポリペプチド」は例えば、グリコシル化やリン酸化反応の長さや転写後修飾に関係なく、アミノ酸の任意のペプチド結合した鎖を意味して用いられる。一般的に、「ペプチド」という言葉は、長さ約２５のアミノ酸残留物に満たないアミノ鎖のことを言い、一方、「タンパク質」と「ポリペプチド」という言葉は、アミノ酸鎖より大きいと言うことに使用される。タンパク質やペプチドに関する「分離」という言葉は、他の細胞のタンパク質から分離されたか、合成的に作られたタンパク質やペプチドを意味する。その言葉は従って、精製ポリペプチド、または組換え型ポリペプチド両方を含む。タンパク質とペプチドに関する「精製タンパク質」と「精製ペプチド」という言葉は、核酸組換え技術によって作り出されたタンパク質やペプチドを言い、ここでは、一般的に、ペプチドやタンパク質を含む核酸は、適した発現ベクターに挿入される。その発現ベクターは、適切な条件下で培養された時に細胞に生産された、宿主細胞を形質転換したペプチドやタンパク質として、入れ替わりに使われる。
【００２１】
「ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質」「ＩＬ−１３Ｒα２ポリペプチド」または単に「ＩＬ−１３Ｒα２」は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１タンパク質、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも６５％（しかし、望ましくは７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％）のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質、そしてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に特異的に結合する抗体相互反応、のようなＩＬ−１３Ｒα２遺伝子の発現産物を意味する。
【００２２】
ここで用いられているような、「塩基配列の同一性」は、２つの塩基配列をサブユニットのマッチングが最大になるように、すなわち隙間と挿入を考慮して並べたときの、２つの塩基配列に対応する位置における同一のサブユニットの百分率を意味する。２つの塩基配列の両方のサブユニットの位置が同じ単量体サブユニとで占められたとき、例えば、与えられた位置が２つのポリペプチド分子の双方においてアラニンで占められた場合、その分子はその位置で同一である。例えば、長さが１０個のアミノ酸の塩基配列の７つの位置が第２の１０個のアミノ酸塩基配列の対応する位置と同一である場合、２つの塩基配列は７０％の塩基配列の同一性を有する。塩基配列の同一性は、一般的に、塩基配列分析ソフトフェア（例えば、遺伝子コンピューターグループの塩基配列分析ソフトフェアパッケージ、ウィスコンシン大学生物工学センター、ＷＩ５３７０５、マディソン、ユニバーシティーアベニュー１７１０）を用いて測定される。
【００２３】
第一の核酸配列が第二の核酸配列に機能上関係がある状態に置かれる時に、第一の核酸配列は、第二の核酸配列と「実施可能」に関連がある。例えば、プロモーターが、コード化配列の転写や発現に作用する場合、プロモータはコード化配列に実施可能に関連がある。一般的に、実質可能な関連ＤＮＡ配列は、隣接し、そして、リーディングフレームにおいて２つのタンパク質が結合する必要がある。
【００２４】
ここで用いられている、運搬可能な核酸分子に言及する「ベクター」という言葉は、他の核酸に関連している。実施可能な状態に関連したベクターの遺伝子発現の背向性能力は、ここにおける「発現ベクター」に関連している。ここで用いられている「プロモーター」という言葉は、プロモーターに関連した実質可能な選択的に核酸分子を発現調整した核酸配列と、細胞内における選択的核酸配列の発現効果を意味する。その言葉は、「基質特異性」プロモーターを含む。すなわち特有の細胞（例えば、組織特異的細胞）にだけ選択的核酸配列の発現作用をする、プロモータである。その言葉は、ある組織の第一の選択的核酸が制御発現する、いわゆる「漏出」プロモーターの範囲にも及ぶ。その言葉は、組織に特異的でないプロモーターと、本質的に活性化と誘発をするプロモーターの両方も含む。
【００２５】
「免疫応答への刺激」という言葉は、リンパ球（例えば、Ｂ細胞やＴ細胞）の活性化や免疫組織組成物の誘発や増加を意味する。特異的抗原に対する免疫応答への刺激は、抗原や抗原の活性や、抗原に対して特異的な受容体を持っているリンパ球に対する抗体適定量の増加として測定することができる。リンパ球の活性は、従来の方法、例えば、有糸分裂の誘発や、サイトカインの分泌、細胞の分子発現の変化、免疫グロブリン（Ｂ細胞）の精選によって限定される。そして、標的細胞の死滅（キラーＴ細胞）を増加させる。
【００２６】
ここで用いられている、「結合」「結合する」または「相互作用」は、サンプル中に存在する第一の分子に認識または付着する、特異的第二の分子を意味する。しかし、実質的に他の構造的に関係のないサンプル中に存在する分子には認識または付着しない。一般に、第二の分子に「特異結合」する第一の分子は、その第二分子に約５〜６モル／リットルより大きい結合親和力を有する。
【００２７】
「抗体」という言葉は、免疫グロブリンから生成される全ての抗原結合性ペプチドを意味する。その言葉は、ポリクローナル抗血清、モノクローナル抗体、酵素的消化（例えば、Ｆａｂ断片）や遺伝子工学（例えば、ｓＦｙ断片）の技術によって作り出される免疫グロブリンの断片を含む。
【００２８】
ここで説明されたものと同様又は同等の方法や物は本発明の実施や試験に用いることができるが、適切な方法や物は以下で説明される。ここで言及されたすべての出版物、特許出願、特許、及びその他の参照は、そのすべてが参照として組み込まれている。抵触する場合は、定義を含む現在の明細書は規制される。加えて、以下で論議される特定の実施例だけが説明されるが、これに限定されることを意図したものではない。
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明は、ＩＬ−１３Ｒα２を発現する細胞を有する癌、またはそれ以外の病気が発現する危険性のある客体において、ＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答の刺激に関連する構成と方法を含む。後で述べられる好適な実施例において、これらの構成と適応法が説明される。このほか、これらの実施例の説明から本発明の他の特徴が、下記の説明に基づき構成及び／又は実施可能である。
【００３０】
生物学的方法
従来の分子生物学の技術を含む方法がここで説明される。その技術は、一般に技術的に知られ、分子クローニング：実験マニュアル、第２版、第１〜３巻、編集者サムブルックら、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、ニューヨーク　コールドハーバー、１９８９；及び最新の分子生物学のプロトコル、編集者オースベルら、グリーンパブリッシングとウィレイーインターサイエンス、ニューヨーク、１９９２（定期更新）のような、方法論全書に詳細に説明されている。核酸の化学合成反応は、例えば、ビューケージとキャルサーズ　Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９−１８６２， １９８１、マツーチらＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５，１９８１に説明されている。核酸の化学合成は、例えば、市販の自動オリゴヌクレオチド合成機で行うことができる。免疫学的な方法（例えば、抗原特異の抗体の合成、免疫沈降、及び免疫ブロット）が、例えば、免疫学の最新のプロトコル、編集者コリガン、ジョンウィレイ・アンド・ソンズ、ニューヨーク、１９９１；及び免疫学的分析の方法、編集者マセイエフら、ジョンウィレイ・アンド・ソンズ、ニューヨーク、１９９２に説明されている。遺伝子転移と遺伝子治療の従来の方法は、本発明でも用いることができる。例えば、遺伝子治療：原理と応用、編集者ブラッケンシュテイン、スプリンガーヴァーラグ、１９９９；遺伝子治療のプロトコル（分子薬における方法）、編集者ロビンス博士、ヒューマナ出版、１９９７；ヒト遺伝子治療におけるレトロベクター、編集者Ｃ．Ｐ．ハドソン、スプリンガーヴァーラグ、１９９６を参照。
【００３１】
癌／精巣抗原としてのＩＬ−１３Ｒα２の同定
名前が示すように、ＩＬ−１３Ｒα２はリンホカインＩＬ−１３の受容体であり、ＩＬ−１３はＢ細胞とＴ細胞によって分泌されたＩＬ−４の同族体として同定される。ミンティーら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ．３６：２４８−２５１、マッケンジーら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：３７３５−３７３９。正常細胞の様々な型は、ＩＬ−１３とＩＬ−４を共有した受容体と称されるＩＬ−１３受容体を含む。そしてＩＬ−１３受容体は、ＩＬ−１３Ｒα１（インターロイキン１３受容体アルファー１）と称する小成分と結合し、ＩＬ−１３を含むヘテロ２量体である。ヒルトンら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：４９７−５０１、アマンら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１：２９２６５−２９２７０、ミロウクスら（１９９７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４０：１６３−１６６。ＩＬ−１３Ｒα１以外に、その共有受容体はＩＬ−４結合を担う小成分ｐ１４０（又はＩＬ−４Ｒα）と称す蛋白質も含む。 イドザーダら（１９９０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：８６１−８７３、ヒルトンら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：４９７−５０１、デビンスキーら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：４４９−４５３、ズラウスキーら（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：２６６３−２６７０、ミンティーら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ．３６：２４８−２５１。細胞がＩＬ−１３に感染することは、ＩＬ−４に感染後生じる応答と非常に類似した応答に帰着する。ズラウスキー，Ｇ．とＪ．Ｅ．デヴァリス（１９９４）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １２：１６９−１７４。ＩＬ−１３とＩＬ−４の両方から生じる細胞の反応例は、ＣＤ２３の発現とＢリンパ球でＩｇＥ　Ｈ鎖遺伝子の生成を誘発すると同様に、ＣＤ７２、ＩｇＭとＭＨＣクラス抗原の発現を高めた。
【００３２】
興味深い現象で、ＩＬ−１３Ｒα１は、細胞上に存在するＩＬ−１３結合部位だけではないことが発見された。以前の研究で、多くの癌特にＨＧＧは、ＩＬ−１３と結合可能であることが明らかにされた。デビンスキーら （１９９５） Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １：１２５３−１２５８、デビンスキーら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１：２２４２８−２２４３３、デビンスキーら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １６：４４９−４５３、デビンスキーら（１９９８）Ｃｒｉｔｉｃ Ｒｅｖ． Ｏｎｃｏｇｅｎ． ９：２５６−２６８、デビンスキーら（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５：９８５−９９０。これらの研究によって、これらの腫瘍の多くのＩＬ−１３結合能力が、共有ＩＬ−１３／ＩＬ−４受容体を媒介しないことが明らかにされた（例えば、ＩＬ−１３Ｒα１／ｐ１４０を構成するヘテロ２量体として知られている受容体）。注目すべきは、共有受容体を含むリンパ細胞においてＩＬ−４で飽和している受容体はＩＬ−１３の結合を阻害した。ズラウスキーら（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ． １２：２６６３−２６７０。これはＨＧＧ細胞を使用した場合でなく、中和価分析を用いたＩＬ−４が過剰に存在する場所でさえＩＬ−１３結合は変化しなかった。デビンスキーら（１９９５）Ｃｌｉｎ． Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓ． １：１２５３−１２５８、デビンスキーら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１：２２４２８−２２４３３、デビンスキーら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １６：４４９−４５３。更なる実験で、合理的に設計されたＩＬ−１３変異体を生成した。それは、神経膠芽腫（ＨＧＧ）細胞との結合能力を有するが、受容体を共有したＩＬ−４／ＩＬ−１３のみを発現している細胞内で信号を送るための能力と、相互作用するための能力を失った変異体である。デビンスキーら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １６：４４９−４５３、トンプソンＪ．Ｐ．とＷ．デビンスキー（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７４：２９９４４−２９９５０、デビンスキー．ＷとトンプソンＪ．Ｐ． （１９９９） Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｏｅｒ Ｒｅｓ． ５：３１４３ｓ−３１４７ｓ。この証拠は、既知のＩＬ−４結合タンパク質に関連のない別のＩＬ−１３結合タンパク質の存在を証拠立てた。補足的な証拠は、腎臓細胞癌転移（Ｃａｋｉ−１ 細胞）の細胞上にある新規なＩＬ−１３結合タンパク質が単離され、コード化したタンパク質の遺伝子を複製した時に得られた。
キャプツら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１：１６９２１。ＩＬ−１３Ｒα２と称するこのタンパク質をコード化する遺伝子は、その後複製され配列された。ここでＩＬ−１３Ｒα２と称するこの新規なＩＬ−１３結合タンパク質は、ＩＬ−１３Ｒα２としてここに言及され、ＩＬ−４の特異的な結合を示さなかった。共有ＩＬ−１３／ＩＬ−４受容体の提案構造とＩＬ−１３に対するＩＬ−４独立受容体を図３に示す。
【００３３】
新規に発見された受容体がＨＧＧに存在するかどうか研究するため、我々は細胞系で立証されたＨＧＧでの遺伝子発現、そしてＨＧＧ外植細胞と腫瘍試料を検討した。ＨＧＧの研究に加えて、詳細にこの新しい受容体の正常組織発現パターンを特徴づけるため、ＩＬ−１３Ｒα２のｍＲＮＡ転写に関して周辺の臓器と過剰な正常中枢神経組織（ＣＮＳ）を遮断した。これらの研究から、我々はＩＬ−１３Ｒα２発現が精巣を除いて全ての正常ヒト組織に事実上存在しないことを明らかにした。以前の研究で、ＩＬ−１３Ｒα２をコード化した遺伝子は、Ｘ染色体に局在した。グオら（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４２：１４１−１４５。
【００３４】
従って、我々の発見は腫瘍抗原のＣＴＡグループの一部としてＩＬ−１３Ｒα２タンパク質を特徴づけることができる。更に、ＩＬ−１３Ｒα２は膜貫通受容体であるのでＭＨＣが提示してから切り離されて細胞外環境に置かれる。従って、細胞内抗原とは違って免疫組織成分によって認識されるため細胞表面上のＭＨＣ分子をもった複合体でペプチド断片として表示されなければならない。細胞毒性剤や抗体は、細胞表面上にＩＬ−１３Ｒα２を担う癌細胞に対して直接的な標的となる。この有病性の他のＨＧＧを結合させる抗原は抗神経膠腫ワクチンの合理的な設計方法として役立つことが今まで知られていなかったため、ＩＬ−１３Ｒα２がＨＧＧに関連するＣＴＡであるという本発明は有意なものである。
【００３５】
ワクチン
本発明は、客体に投与した時、客体のＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激することができるワクチンを用いた。本発明で用いられるワクチンを、客体に投与する時、ＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を増加又は誘発できるいくつかの物質形態をとる抗原物質を含む。典型的な免疫応答は、以下の（ａ）と（ｂ）を含む。（ａ）特にＩＬ−１３Ｒα２に結合する抗体の生成、又は力価の増加（ｂ）Ｔリンパ球の活性化（例えば、標的細胞を殺したり又はＢリンパ球での抗体生産を活性化すること）。多くの異なる抗原剤は、例えばタンパク質とペプチドをべースとするワクチン、腫瘍細胞ワクチン、樹状細胞／遺伝子治療ワクチンそしてＤＮＡ／ウイルスワクチンを含むタンパク質抗原に対する免疫応答を活性化する効果が知られている。例えば、グレテンＴ．Ｆ．とＥ．Ｍ．ジェファー（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７：１０４７−１０６０を参照。前述に加えて、アジュバントと賦形剤／キャリヤーのような様々な物質は、客体にワクチン以外の組成物を円滑に運搬させるため、また抗原剤により活性化した抗原特異的免疫応答を非特異的に促進するために本発明のワクチン複合物を含むことができる。
【００３６】
タンパク質／ペプチドベースのワクチン
本発明のワクチンに使用する抗原物質は、天然のＩＬ−１３Ｒα２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）又はＩＬ−１３Ｒα２のペプチド断片の形態をとる。全てタンパク質抗原で作られたワクチンは、タンパク質から発現した全ての潜在的な抗原部位に対して免疫応答を活性化する特性を有する利点がある。ワクチンはペプチド抗原で作られた（例えば、全タンパク質の７−１５又は８−１２の連続するアミノ酸）。一方、ワクチンは一般的にタンパク質によって発現した全ての潜在的な抗原部位より少ない抗原部位に対して免疫応答を刺激する。例えば、望まれない交差反応を避けるため、ペプチドベースのワクチンは、刺激された免疫応答を特異的に標的とすることが望まれるタンパク質ベースのワクチン全体で有利である。例えば、ワクチンに用いられるペプチドは、以下の（１）又は（２）のときワクチンとして選択される。（１）ＭＨＣクラス１又はＭＨＣクラス２分子による発現で知られる抗原の特異的エピトーブ（２）生体内での安定性の向上あるいは天然エピトーブよりＭＨＣ分子の高い結合親和性のどちらか一方を発現するように修飾された形態のエピトーブ、その上、Ｔ細胞の特異的活性を受け入れる余地を有する。参照、アイオブら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１０２２７−１０２３４、パーカストら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：２５３９−２５４８。ペプチドベースのワクチンは、無傷タンパク質に対して免疫トレランスを回避することを示している。デイシスら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３１５１−３１５８。またワクチンは一種類のペプチド断片を構成し、本発明で用いる他のワクチンはＩＬ−１３Ｒα２に由来する様々な異なるペプチド混合物の構成も含む。
【００３７】
上記に示すように、本発明に用いたワクチンは抗原剤としてＩＬ−１３Ｒα２
を含む。ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質の好ましい形態は、図１に示すアミノ酸塩基配列を持つ純粋な天然のＩＬ−１３Ｒα２を含む。（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）天然のＩＬ−１３Ｒα２の誘導体、類縁物質そして断片のような天然のＩＬ−１３Ｒα２タンパク質の変異体は、本発明のワクチンの抗原物質としての利用が検討される。そのような変異体は次のものを含む。例えば、天然のＩＬ−１３Ｒα２遺伝子の突然変異体が自然に生じることによってコード化されたポリペプチド、天然のＩＬ−１３Ｒα２遺伝子の相同体によってコード化されたポリペプチド、そして天然のＩＬ−１３Ｒα２遺伝子の人工的に生じた変異体によってコード化されたポリペプチドである。そのような変異体の好ましい変形態は、ワクチンの一部を客体へ投与することによって天然のＩＬ−１３Ｒα２に対して免疫応答を刺激できる形態である。
【００３８】
ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質の変異体は、一つ以上のアミノ酸で天然のＩＬ−１３Ｒα２タンパク質と異なるペプチド塩基配列を持つ。このような変異体のペプチド塩基配列は、天然のＩＬ−１３Ｒα２ポリペプチドの一つ以上のアミノ酸で欠失、付加又は置換がなされている。アミノ酸の挿入は、１−４の連続するアミノ酸を好み、そしてアミノ酸の欠失は１−１０の連続するアミノ酸を好む。いくつかの応用例として、変異体ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質は、明らかに天然のＩＬ−１３Ｒα２タンパク質の機能的な活性を維持する（例えば、ＩＬ−１３に特異的結合能力）。他の応用例として、変異体ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質はＩＬ−１３Ｒα２タンパク質の機能的な活性に対して著しい減少や欠失を示す。そして、天然のＩＬ−１３Ｒα２タンパク質の機能的な活性を維持することが望まれ、好適なＩＬ−１３Ｒα２タンパク質変異体は、静的変化又は保守的な変化を特徴とする本発明の範囲内で、核酸分子を発現することによって作られる。機能的な活性において、重要な変化を伴った変異体ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質は、保守的な変化でないことを特性とする本発明における核酸分子を発現することによって構成可能である。
【００３９】
一つ以上の特有のモチーフ（例えば、ＭＨＣ分子に高い親和性で結合するようなこと）及び／又はドメインが一致するＩＬ−１３Ｒα２タンパク質断片は、本発明の範囲で任意サイズである。例えば、ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質の少なくとも５、１０、２５、３０、４０、５０、５０、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、３００以上の連続したアミノ酸を含むＩＬ−１３Ｒα２タンパク質のペプチド断片は、本発明の範囲内にある。ペプチドとして好まれる長さ（例えば、ＭＨＣ分子の溝に合うサイズ）の７と１５の間のアミノ酸（好適には８−１２のアミノ酸）の断片は、効果的な免疫原生の媒介物として役立つことが知られている。全タンパク質の効果的な免疫原生のペプチドを同定する技術は、技術的に知られている。例えば、両親媒性アルゴリズムを使用すること。例えば、バゾフスキーＪ．Ａ． （１９９３）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ １２：２５６ ； 米国特許第５９７６５４１号と５９８０８９９号を参照。客体において高い免疫原生を有するペプチドは、客体（一連の遺伝的に類似するような客体）に投与される全抗原の連続的な重複ペプチド断片（例えば、７−３０の連続するアミノ酸の長さ）を合成すること、また免疫応答の刺激に関する客体を分析することによって決定できる。それによって、望まれた反応を誘発するこれらのペプチド断片が選択される。
【００４０】
ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質の分離されたペプチジルの一部は、そのようなペプチドをコード化している核酸と一致する断片から生成される組換えペプチドをスクリーニングすることによって得ることができる。従って、断片は従来のｆ−Ｍｏｃ又はｔ−Ｂｏｃ固相合成法のような既知の技術を使って化学的に合成できる。例えば、上記の技術に類似した本発明のＩＬ−１３Ｒα２タンパク質は、重複しない断片を用いて望まれた長さに任意に分割してもよい。又は、重複した断片を望まれた長さに分割してもよい。その断片は、生成（組換え又は化学合成によって）できる。そしてＩＬ−１３Ｒα２タンパク質に対して免疫応答を発現する抗原剤として機能できるこれらのペプチジル断片を同定するため、その断片が検査された。
【００４１】
本発明のもう一つの面は、ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質の組換え方法に関する。天然なＩＬ−１３Ｒα２タンパク質に加えて、本発明で使用するのに好適なポリペプチドの組換えは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の核酸塩基配列を用いて少なくとも８５％の同一な塩基配列（例えば、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％）をもつ核酸によってコード化された。好適な実施例において、変異体ＩＬ−１３Ｒα２は天然のＩＬ−１３Ｒα２タンパク質に対して免疫応答を発現する能力を有する。
【００４２】
ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質変異体は、技術的に知られている様々な方法によって生成させることができる。例えば、切断又は分離した突然変異の個所を取り入れるといった、突然変異誘発によってＩＬ−１３Ｒα２タンパク質変異体を作ることができる。突然変異は、単に天然ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質の抗原活性の一部又は多く、或いはほぼ同一の抗原活性を持つＩＬ−１３Ｒα２タンパク質の変異体を増加させることができる。発生可能なＩＬ−１３Ｒα２の他の変異体は、例えばプロテアーゼの標的塩基配列を変化させる突然変異によってタンパク質の分解に影響されやすい変異体、又は耐久性がある変異体を含む。特異的タンパク質を持つワクチンを事前に投与された客体の中のＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激する能力に対して、天然ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質と変異体を比較することによって決めることができる天然ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質より、大きいか、或いは小さい抗原活性を有するＩＬ−１３Ｒα２タンパク質変異体によって、ペプチドのアミノ酸塩基配列における変化が生じる。
【００４３】
他の実施例として、ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質変異体は、変性のオリゴヌクレオチド塩基配列から得られることができる。変性遺伝子塩基配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成装置で行い、そして、合成遺伝子は適切な発現ベクターに挿入された。遺伝子の変性凝固の目的は、潜在的なＩＬ−１３Ｒα２タンパク質配列の望まれた凝固をコード化して全塩基配列を一つの混合物として提供することである。変性オリゴヌクレオチドの合成は技術的によく知られている。（例えば、ナラングＳ．Ａ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３、板倉ら（１９８１）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ第３版クレベランド・シンプソン・マクロモレキュー　編集者Ａ．Ｇ．ワトソン・アムステルダム・エルセバイアー　２７３−２８９、板倉ら（１９８４）Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５３：３２３、板倉ら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３８６−３９０、ロバートら（１９９２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：２４２９−２４３３、デブリンら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：４０４−４０６、クイラルら（１９９０）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：６３７８−６３８２、同様に米国特許第５２２３４０９号・５１９８３４６号・５０９６８１５号を参照）。
【００４４】
同様に、コード化された塩基配列断片のライブラリーは、ＩＬ−１３Ｒα２遺伝子クローンを提供できる。技術の多様さは化学合成を含むこのようなライブラリーを生成する技術は、技術的に知られている。ある実施例において、コード化した塩基配列断片は以下の（１）〜（５）によって生成できる。
（１）１分子につき１回ニッキングが起こる状態下でヌクレアーゼを用いてＩＬ−１３Ｒα２遺伝子をコード化する塩基配列の２本鎖ＰＣＲ断片処理
（２）２本鎖ＤＮＡの変性
（３）異なったニックの生成物からセンス／アンチセンス対を含有できる２本鎖ＤＮＡからのＤＮＡ再生
（４）Ｓ１ヌクレアーゼで処理によって再編成された２本鎖から１本鎖タンパク質の除去
（５）発現ベクターの中に生成する断片ライブラリーを結合
この典型的な方法によって、発現ライブラリーは、Ｎ末端、Ｃ末端そして多様な大きさの内部断片をコード化することで得られる。
【００４５】
本発明は、模倣体を生じるためＩＬ−１３Ｒα２タンパク質の低下も起こる。例えば、ペプチドや非ペプチド剤は客体でＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激することができる。例えば、ＩＬ−１３Ｒαタンパク質とペプチドのアミノ酸残基の非加水分解性ペプチドの類似物は、ベンゾジアゼピン（例えば、フレディンガーら、ペプチド：化学と生物、編集者Ｇ．Ｒ．マーシャル、エスコム出版社：ライデン、オランダ、１９８８を参照）、アゼピン（例えば、ハフマンら、ペプチド：化学と生物、編集者Ｇ．Ｒ．マーシャル、エスコム出版社：ライデン、オランダ、１９８８を参照）、置換されたガンマーラムタム環（ガーベイら、ペプチド：化学と生物、編集者Ｇ．Ｒ．マーシャル、エスコム出版社：ライデン、オランダ、１９８８）、ケト−メチレン偽性ペプチド（エベンソンら（１９８６）Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２９：２９５、そしてエベンソンら、ペプチド：構造と機能、「第９回アメリカペプチドシンポジュームの公報」ピースケミカル社、ロックランド、第３版、１９８５）、ベーター−ターンジペプチド核（長井ら（１９８５） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２６：６４７、そして佐藤ら（１９８６） Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐａｒｋｉｎ． Ｔｒａｎｓ １：１２３１）、そしてｂ−アミノアルコール（ゴドンら（１９８５） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １３４：７１）を用いて生成できる。
グリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基、そして同等のもの、このような他の化学的な成分を持つ共役集合体、又は共役結合を形成することによって、ＩＬ−１３Ｒα２誘導体を作るために、ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質に対して化学的な修飾を行ってもよい。タンパク質／ペプチドのＮ末端やＣ末端又は、タンパク質／ペプチドのアミノ酸側鎖に存在する官能基に化学的な成分を結合させることによって、ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質やペプチドの共有結合誘導体が調整される。
【００４６】
ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質は、一つ以上の他のタンパク質と融合してもよい。例えば、ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質や免疫原生タンパクは、客体のもつ特別な標的部位に対して、ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質又はその一部を供給するための標的結合基として働くもう一つのタンパク質と融合してもよい（例えば、ある部位で局所的な免疫応答を活性化させるため）。例えば、ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質やペプチドは、例えばＨＧＧのような腫瘍に対して、特異的な標的となるＩＬ−１３Ｒα２タンパク質やペプチドに、突然変異体ＩＬ−１３Ｒα２分子又は抗ＩＬ−１３受容体抗体を融合することができる。二つ以上のタンパク質を一緒に融合する多くの方法は技術的に知られており、例えば、一つの分子を形成するために二つ以上のタンパク質を一緒に共有結合するため架橋結合剤を使用したり、或いは組換え融合合成物を発現して作る。これに適した応用例は、本発明で使用可能である。
【００４７】
本発明のＩＬ−１３Ｒα２タンパク質やペプチドは、既知の技術で作ることができる。例えば、客体タンパク質やペプチドをコード化するヌクレオチド塩基配列の発現を命令する核酸ベクターを用いて、形質移入された宿主細胞は、ペプチドの発現を可能にする適切な状態下で培養できる。その宿主細胞は、収集後、溶解された。そしてそのタンパク質が単離された。組換えＩＬ−１３Ｒα２タンパク質又はペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、限外ろ過、電気泳動、タンパク質やペプチドに特異的な抗体を持つ免疫親和性精製、これらの既知の技術を用いて宿主細胞から単離できる。
【００４８】
例えば、ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質又はペプチドが細胞内で発現した後、それは免疫親和性クロマトグラフィーを用いて単離できる。一例を挙げると、客体タンパク質やペプチドに特異的に結合する抗ＩＬ−１３Ｒα２抗体はカラムクロマトグラフィー基質に固定化でき、その基質は標準的な方法によって細胞可溶化液からタンパク質やペプチドを精製するために免疫親和性クロマトグラフィーを使用できる（例えば、オースベルら、ｓｕｐｒａを参照）。免疫親和性クロマトグラフィー処理後、他の基本的な方法によって更に精製された。例えば高速液体クロマトクロマトグラフィー（例えば、フィッシャー、生物化学と分子生物学における実験方法、編集者ワークそしてバードン、エルゼビア、１９８０を参照）。他の実施例において、本発明で使用されたＩＬ−１３Ｒα２タンパク質やペプチドは、精製を促進させる親和性タグ（例えば、ＧＳＴ）を含有する融合タンパク質として発現する。
【００４９】
本発明のワクチンの抗原剤（例えば、ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質又はペプチド断片）と関連して、そのアジュバントは免疫応答を促進するために使用できる。本発明で使用する適切なアジュバントは、抗原剤によって刺激される抗原特異的免疫反応を非特異的に促進する任意の物質を含むことができる。多くのそのようなアジュバントは、例えば以下のようなものを含有することが知られている。
（１）フロイントのアジュバント（完全そして不完全）。
（２）Ｒｉｂｉ（商標）アジュバントシステムのような水中油性のエマルジョンの定式化（コリザ社、シアトル、ワシントン）。
（３）アルミニウム塩（例えば、水酸化物アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）。
（４）サポニンベースのアジュバント（Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）、アクイラ生物科学社、フラミンガム、マンチェスタ）。
（５）ＩＬ−１， ＩＬ−２、ファクターを誘発するマクロファージコロニー、腫瘍ネクローシスファクターのようなサイトカイン。
（６）ムラミジルペクチド或いは細菌の細胞壁成分、毒素、類毒素のような免疫賦活性剤として効く他の物質。
【００５０】
客体に投与するそれらの薬剤を促進するため、本発明のワクチン組成物（例えば、タンパク質／ペプチド抗原そしてアジュバント）は、薬剤的に容認できるキャリアー或いは賦形剤を更に含有することができる。例えば、タンパク質／ペプチド抗原そしてアジュバントは、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどの希釈液で混合することができる。防腐剤、界面活性剤、乳化剤、緩衝剤などのような別の物質も含有することができる。例によって、本発明のタンパク質／ペプチドベースとするワクチン組成物は、液体溶液或いは懸濁液として非経口注入に適応できる。ワクチンの組成物は、客体に注入するために先の溶液（例えば、生理食塩水）でもどすことができる固体（凍結乾燥された粉末）に調整できる。ワクチンの組成物は、リポソームでカプセルに包まれることや乳化されることもできる。
【００５１】
核酸ベースのワクチン
核酸ベースのワクチンは、顕著な細胞性の免疫応答を発現することが知られている。例えば、ドネリーら（１９９７）、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ Ｓ．Ａ．（１９９９）免疫１０：２８１を参照。従って核酸ベースのワクチンもさることながら、本発明のワクチンに使用する抗原物質を客体に投与したときＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を発現できる核酸の形態をとることができる。核酸のような天然のＩＬ−１３Ｒα２をコード化したそれらを含むそのような核酸の例を天然、或いは変異体ＩＬ−１３Ｒα２のペプチド断片、又は天然ＩＬ−１３Ｒα２の変異体、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（図２）としてここに示す。全てのタンパク質抗原をコード化した核酸で作られたワクチンは、タンパク質によって発現された全てのことなる抗原部位に対して、免疫応答を誘発する潜在力を有する利点がある。ワクチンは、ペプチド抗原（例えば、全てのタンパク質の７−１５アミノ酸）をコード化する核酸で作られた。一方ワクチンは、タンパク質によって発現される全ての潜在的抗原部位より少ない部位に対して、一般に免疫応答を誘発するであろう。
【００５２】
本発明のワクチンで使用される核酸の形態は、客体に投与した時ＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を誘発するのに適することができる。例えば、核酸は裸のＤＮＡの形態で存在でき、或いは発現ベクターに組み込むことができる。適した核酸の説明を下記に記す。客体の中に免疫原生のある核酸は、いくつかの下記に挙げた核酸（例えば、全ての抗原或いはペプチド断片をコード化したもの）、ワクチン成分（裸の核酸として、或いは適したキャリアーでの発現ベクター中にある）中の核酸を客体（一連の遺伝子学的に類似するような客体）に投与すること、これらを調製することによって決められ、そして免疫応答の発現に対する客体を分析することによって決められる。望まれた応答を誘発する核酸のみが選択される。
【００５３】
抗原剤として本発明で活用された核酸分子は、ＲＮＡ又はＤＮＡのどちらの形態をとってもよい（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、そして合成ＮＤＡ）。そのＤＮＡは１本鎖又は２本鎖でもよい、１本鎖の場合は、コード（有意）鎖又は非コード（反有意）鎖でもよい。天然のＩＬ−１３Ｒα２タンパク質をコード化するコード配列は図２に示すようなヌクレオチド塩基配列と一致することができる。遺伝コードの重複又は縮重の結果としてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（図１）に示すような同じポリペプチドをコードするコード配列と異なる可能性がある。
【００５４】
本発明で利用可能な他の核酸分子は、天然ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質の誘導体、類似物、そしてフラグメント（例えば、転写後形態を加工した）をコード化するような天然のＩＬ−１３Ｒα２遺伝子の変異体である。そのような変異体は、例えば自然に発生する天然のＩＬ−１３Ｒα２遺伝子の対立遺伝子変異体、天然ＩＬ−１３Ｒα２遺伝子の同族体、又は人工的に発生する天然ＩＬ−１３Ｒα２遺伝子の変異体である可能性がある。これらの変異体は、一つ以上の塩基で天然のＩＬ−１３Ｒα２遺伝子と異なるヌクレオチド塩基配列を持つ。例えば、そのような変異体の塩基配列は、天然ＩＬ−１３Ｒα２遺伝子における一つ以上のヌクレオチドの失欠、付加、又は置換を特徴としている。核酸の挿入は、好ましくは約１〜１０の連続的なヌクレオチド間であり、欠失は約１〜３０の連続的なヌクレオチド間である。
【００５５】
本発明の範囲内で自然に発生する天然ＩＬ−１３Ｒα２遺伝子の対立遺伝子変異体は、天然ＩＬ−１３Ｒα２遺伝子で少なくとも７５％（例えば、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、そして９９％）の同一塩基配列を持つヒト組織から単離された核酸である。そして、天然ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質に構造的な類似を持つポリペプチドをコード化する。著作権及び／又は商標権を有する核酸のデーターベースは、天然ＩＬ−１３Ｒα２遺伝子に対する高い割合の同一塩基配列を持つ他の核酸分子を特定するために検索できる。
【００５６】
人工的に発生するＩＬ−１３Ｒα２遺伝子変異体は、次のような核酸である。第１に、天然で発生しない（例えば、人為的に作られる）。第２に、天然のＩＬ−１３Ｒα２遺伝子において少なくとも７５％の同一塩基配列を持つ。第３に、天然ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質と類似した構造を持つポリペプチドをコード化する。人工的に発生するＩＬ−１３Ｒα２遺伝子変異体の例を次に挙げる。
（１）その変異体は、ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質のフラグメントをコード化する。
（２）厳重な状態下で天然ＩＬ−１３Ｒα２遺伝子の補体或いは天然ＩＬ−１３Ｒα２遺伝子をかけ合わせる。
（３）天然ＩＬ−１３Ｒα２遺伝子の補体或いは天然ＩＬ−１３Ｒα２遺伝子において６５％の同一塩基配列を共有する。
（４）ＩＬ−１３Ｒα２の融合タンパク質をコード化する。
【００５７】
本発明の範囲内で天然ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質のフラグメントをコード化する核酸は、例えば、２、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００或いはそれ以上の天然ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質のアミノ酸残基をコード化する。天然ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質のフラグメントをコード化した短縮オリゴヌクレオチド（例えば、それらの６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、５０、１００、１２５、１５０、或いは２００の塩基対の長さ）が使用される。天然ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質のフラグメントをコード化する核酸は、天然ＩＬ−１３Ｒα２遺伝子又は変異体の全塩基配列の長さを酵素消化や化学分解することによって得られる。
【００５８】
ＩＬ−１３Ｒα２融合タンパク質をコード化した核酸分子は、本発明の範囲内である。そのような核酸は、適した宿主に導入したときＩＬ−１３Ｒα２融合タンパク質を発現する構成物（例えば、発現ベクター）を調整することによって作ることができる。例えば、そのような構成物は、他のタンパク質（例えば、検出可能な標識やキャリアータンパク質）をコード化した第２のポリヌクレオチドを持つフレームで融合されたＩＬ−１３Ｒα２タンパク質をコード化する第１のポリヌクレオチドを結合することによって作られる。ＩＬ−１３Ｒα２融合タンパク質は、例えば、ＩＬ−１３Ｒα２ペプチドの免疫原性を促進するため、ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質／ペプチドの精製を促進するため、又は客体に投与した後ＩＬ−１３Ｒα２融合タンパク質の場所を追跡するために使うことができる。
【００５９】
天然ＩＬ−１３Ｒα２遺伝子のヌクレオチド塩基配列、そして天然ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質のアミノ酸配列を使用する例は、標準核酸の変異原性技術又は化学合成のような熟練した技術によって、ヌクレオチド塩基配列において微量な変異をもつ核酸分子を作ることができる。
【００６０】
裸の核酸ワクチン
本発明は、ＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激するために裸の核酸ワクチンの使用を提供する。この方法で使用される代表的な裸の核酸ワクチンは、前述の発現を誘発するために十分な他の５’と３’成分に加えてＩＬ−１３Ｒα２の一つ以上の免疫原性タンパク質をコード化しているＤＮＡを含む。特異的タンパク質に対して免疫応答を制限されたクラスＩとクラスＩＩの両方の発現に関する裸の核酸の使用は、技術的に知られている。例えば、ロッセンバーグ Ｓ．Ａ．（１９９９）免疫１０：２８１、ウルマーら（１９９３）科学 ２５９：１７４５、ドニーリーら（１９９５）Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７７２：４０、シュヘルウスら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓ． ５８：２５０９、ハーピンら（１９９８）ワクチン１６：２０８、ルクティスら（１９９７）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８：４４７１、マニッケンら（１９９７）Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃ． Ｂｉｏｌ． ６１：１２５を参照。これらの方法は、ＩＬ−１３Ｒα２の一つ以上の免疫原性タンパク質をコード化している核酸の使用によって、本発明内で使用可能である。裸の核酸ワクチンは、適した技術によって客体に投与できる。例えば、ＩＬ−１３Ｒα２のペプチド部分をコード化している裸のＤＮＡは、客体の筋肉細胞に注入されるか、或いは金粒子でコーティングされた裸のＤＮＡが、遺伝子銃を用いて客体の皮膚細胞（樹状細胞によって取り上げられること）の中に導入される。
【００６１】
発現ベクターワクチン
本発明は、ＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激するための発現ベクターワクチンの使用も提供する。この技術の典型的な応用で、ＩＬ−１３Ｒα２に対する１つ以上のペプチド又はタンパク質をコード化する核酸は、宿主細胞における抗原の発現を与えるベクターに組み込まれる（例えば、客体内部の細胞又は客体への投与）。抗原をコード化する核酸は、プロモーター配列（例えば、組織特異的、構造性の活性、或いは誘発可能）又はエンハンサー配列のようなベクター内に含まれる他の配列による操作上の制御下で一般に存在する。ベクターによってコード化された抗原は、ベクターが客体の中にある宿主細胞に導入される時発現する。発現後、抗原はＴリンパ球のような免疫システム細胞に対して提示されるＭＨＣ分子と結合でき、これによって免疫応答を刺激する。例えば、コアーら（１９９６）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８４：１５５５を参照。
【００６２】
本発明で使用するベクターは、客体の中のコード化された抗原を発現することができる。例えば、細菌によるプラスミドとウイルスから得られるベクターを使用してもよい。代表的なウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、腫瘍に関連したウイルスベクターを含む。例えば、遺伝子治療：原理と応用、編集者 ブラッケンシュテイン、スプリンガーヴァーラグ、１９９９；遺伝子治療プロトコル（分子薬における方法）、編集者ロビンス博士、ヒューマナ出版、１９９７；人遺伝子治療におけるレトロベクター、編集者Ｃ．Ｐ．ハドソン、スプリンガーヴァーラグ、１９９６を参照。
【００６３】
細胞ベースワクチン
細胞ベースワクチンは、本発明でＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激することを提供する。異なる癌関連抗原を使用する類似の研究方法において、患者から単離された癌細胞は試験管内に収容され、そしてサイトカイン、ＭＨＣ分子、或いは共刺激分子のような免疫刺激をコード化するＤＮＡを用いて形質移入した。その形質移入された癌細胞は、抗癌反応を発生させるためまた免疫システムを活性化させるために患者に再び注入された。グリーテンＴ．Ｆ．そしてＥ．Ｍ．ジェファー、（１９９９）Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １７：１０４７−１０６０ ； シーモスら（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７：１５３７−１５４６。
【００６４】
本発明は、さらにＩＬ−１３Ｒα２のペプチド断片又はＩＬ−１３Ｒα２を発現する単離された細胞を提供する。ＩＬ−１３Ｒα２を発現する細胞は、そのような細胞（例えば、精巣或いはＨＧＧから）を持つ客体から単離できる。ＩＬ−１３Ｒα２を発現しない細胞は、多くの異なる方法でこのタンパク質を発現することができる。ある例として、ＩＬ−１３Ｒα２のフラグメントが細胞表面上のＭＨＣ分子と関連して成る条件下でＩＬ−１３Ｒα２のペプチドフラグメント又はＩＬ−１３Ｒα２で細胞が培養できる。あるいは、細胞の中に前記の変異体、ＩＬ−１３Ｒα２のペプチドフラグメント又はＩＬ−１３Ｒα２をコード化する核酸を導入することによって細胞はＩＬ−１３Ｒα２を発現できる。そして、タンパク質又はペプチドの発現細胞を引き起こす条件下でそのような細胞を培養する。タンパク質、ペプチド、或いは変異体の細胞発現は従来の技術によって調整できる。例えば、タンパク質、ペプチド、又は変異体に特異的に結合する蛍光標識された抗体は、細胞上のタンパク質、ペプチド、又は変異体の発現を検出するために使用することができる。例えば、キムら（１９９７）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２０：２７６を参照。タンパク質、ペプチド、又は変異体に特異的に結合する抗体を使用するウエスタンブロッド法は、細胞の溶解物でタンパク質、ペプチド、又は変異体の発現を検出するために使用することができる。
【００６５】
ＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激するのに適した細胞型式は、原生生物と真核生物に存在する。多くのそのような細胞は、技術的に知られているので完全なリストはここでは提供しない。適した原生生物の細胞例は、大腸菌、枯草菌、そして放線菌のような細菌の細胞を含む。適した真核生物の細胞例は、植物、酵母、虫、鳥類、線形動物（例えば、線虫）そして哺乳類の細胞（例えば、患者に再導入された人の患者からの自己細胞）を含む。これらの細胞は、プロモーターの導入、形質転換体の選択、又は望まれた塩基配列をコード化する遺伝子の増幅に適した従来の栄養培地で培養できる。
【００６６】
ＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激ために使用される細胞のさらなる例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の少なくとも７つ（例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上）の連続したアミノ酸からなるペプチドを発現することを含む。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の塩基配列を持つタンパク質を示す単離された細胞が用いられる。
【００６７】
ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質、ＩＬ−１３Ｒα２のペプチド断片、又は前述の変異体を発現できるどの細胞でも客体に免疫応答を刺激するために使用でき、いくつかは特異的な抗原提示能力を有するため好まれる。そのような細胞の例は、Ｂリンパ球のような抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）、単球／マクロファージ、樹状突起細胞（ＤＣ）、そして主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）及び／又は共刺激分子を発現する他の細胞を含む。
【００６８】
ＤＣは特に強いＡＰＣｓとしての機能が知られており、本発明の細胞ベースワクチンにおける使用が特に好まれる。例えば、バンヘレアウら（２０００）Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８：７６７を参照。ＤＣは、ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質、ＩＬ−１３Ｒα２のペプチド断片、又は前述の変異体を発現できる。例えば、ＤＣは客体から除去され、選択された抗原と接触し、それから免疫応答を刺激するように客体に再度戻すことができる。抗原提示能力を高めるため、ＤＣはサイトカインのような活性物質で処理されることもできる。
【００６９】
客体の中でＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答の活性化に最も効果のあるこれらの細胞ベースワクチンは、一連の異なる細胞ベースワクチン（例えば、全ての抗原、又は特異的ペプチド断片の抗原を発現するもの）、客体（又は、一連の遺伝学的類似客体）へのそのような異なるワクチンの投与、そして免疫応答活性化に関する客体の分析、これらを調製することによって確定できる。望まれた反応を誘発するこれらのワクチンを選択できる。
【００７０】
抗イディオタイプの抗体ワクチン
本発明は、客体の中でＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激する抗イディオタイプの抗体ワクチンの使用も検討する。この方法で、抗イディオタイプの抗体はＩＬ−１３Ｒα２の１つ以上の免疫原性タンパク質の内部の”イメージ”を特徴づけることによって作られる。例えば、米国特許第５，０５３，２２４、５，２０８，１４６、５，６１２，０３０、５，９２５，３６２を参照。これらの抗イディオタイプ抗体ワクチンの客体への投与は、ＩＬ−１３Ｒα２の免疫原性タンパク質そのものに対して交差反応するＩＬ−１３Ｒα２の免疫原性タンパク質の”イメージ”に対して免疫応答を刺激できる。ある一つの例として、ポリクローナルの抗イディオタイプ抗体は、ＩＬ−１３Ｒα２のエピトープに対してもたらされたモノクローナル抗体をもった宿主動物の免疫化によって生成できる。
【００７１】
抗体生産
本発明で特徴づけられたワクチン／抗原剤は、本発明で使用可能な抗体を発生させるために使用できる。ポリクローナル抗体は、免疫性を付加された動物の血清中に含まれる抗体分子の均質な集団である。本発明の範囲にある抗体には、従って、ポリクローナル抗体及び、さらにモノクローナル抗体、単一鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリーを用いて作られた分子が含まれる。モノクローナル抗体は、特定の抗原に対する抗体の均質な集団であるが、上記のＩＬ−１３Ｒα２タンパク質と標準的なハイブリドーマ技術を用いてペプチドを調製することができる（例えば、コーラーら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５、コーラーら（１９７６）Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：５１１、コーラーら（１９７６）Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：２９２、ハンマーリングら（１９８１）「モノクローナル抗体とＴ細胞ハイブリドーマ」エルスビア、ニューヨーク、オースベルらｓｕｐｒａを参照）。コーラーら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５、そして米国特許第４，３７６，１１０；ヒトＢ細胞のハイブリドーマ技術（コスバーら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄｙ ４：７２、コールら（１９８３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：２０２６）、そしてＥＢＶハイブリドーマ技術（コールら（１９８３）モノクローナル抗体と癌治療、アラン　アール． リス、インク．　７７−９６ページ）で説明されているような、培養中の連続的な細胞系列によって抗体分子の生成を与えるどのような技術によっても得られることができる。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤとそのすべてのサブクラスを含む、すべての免疫グロブリンのクラスのものであってもよい。本発明のｍＡｂを生成するハイブリドーマは、生体内又は生体外で培養可能である。生体内で高力価のｍＡｂを生成する能力によって、これは特に有用な生成法になっている。
【００７２】
ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質に特異的に結合するヒト或いはヒト類似生物の抗体は、周知の方法を用いて生成できる。例えば、ポリクローナル抗体は、血清の中のそのような抗体を持つヒトの客体から得ることもできる。例えば、客体はＩＬ−１３Ｒα２に対して抗体生産を活性化するワクチンを与える。他の例として、ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質に対するヒトの抗体は、マウスのような動物でヒトの抗体を生産する周知の技法によって作ることができる。例えば、フィッシュワイルドら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１、ヘイジェンら（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ９７：３３１−３３８、ロンバーグら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９、モリッソン（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８１２−８１３、ヌーバーガー（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８２６、そして米国特許第５，５４５，８０６、５，５６９，８２５、５，８７７，３９７、５，９３９，５９８、６，０７５，１８１、６，０９１，００１、６，１１４，５９８、６，１３０，３１４を参照。ＩＬ−１３Ｒα２に対するヒト類似生物の抗体は、米国特許第５，５３０，１０１、５，５８５，０８９、５，６９３，７６１、５，６９３，７６２に記述されているような周知の方法によってヒト以外の抗体から作ることができる。
【００７３】
ポリクローナル又はモノクローナル抗体は、生成されると、例えば、オースベルらｓｕｐｒａで説明されているような標準的な方法による、免疫沈降分析やウエスタンブロッド法によってＩＬ−１３Ｒα２の特異認識性の試験にかけられる。特異認識をし、ＩＬ−１３Ｒα２に結合する抗体は、本発明で有用である。例えば、そのような抗体は、サンプルとしてＩＬ−１３Ｒα２のレベルを測定するため免疫測定法が用いられる（例えば、ＩＬ−１３Ｒα２の細胞発現量又は細胞下の位置、液体サンプル中のＩＬ−１３Ｒα２の可溶量とその存在を決めるためである）。
【００７４】
好ましくは、本発明のＩＬ−１３Ｒα２タンパク質に対する選択的な抗体は、荷電残基の高周波のような基準によって、高度に保存された領域の外側にあって、抗原性であるように見えるＩＬ−１３Ｒα２タンパク質のフラグメントを用いて生成可能である。交差反応を有する抗ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質抗体のは、この種のタンパク質を構成するものの中で保存されたＩＬ−１３Ｒα２タンパク質のフラグメントを用いて生成される。ある特定の例として、そのようなフラグメントはＰＣＲの標準的な方法によって生み出され、次にｐＧＥＸ発現ベクター中へ複製される（オースベルらｓｕｐｒａ）。融合タンパク質は大腸菌で発現され、オースベルらｓｕｐｒａで説明されるようなグルタチオンアガローズアフィニティマトリックスを用いて精製される。
【００７５】
ある場合において、潜在する低い親和性の問題や抗血清の特異性の問題を最小化することが望まれる。そのような状況において、２、３の融合がそれぞれのタンパク質に生じ、それぞれのタンパク質が少なくとも２匹のウサギに注射される。抗血清は一回の注射、好ましくは少なくとも３回の追加免疫注射を含む注射によって生じる。また抗血清は、組換えＩＬ−１３Ｒα２タンパク質又はコントロールタンパク質を免疫沈降し、糖質ステロイド受容体、ＣＡＴやルシフェラーゼのようなタンパク質の制御能力がチェックされる。単一鎖抗体（例えば、米国特許第４，９４６，７７８、４，９４６，７７８、４，７０４，６９２）の生成を記述した技術は、ＩＬ−１３Ｒα２タンパク質やそのフラグメントに対する単一鎖抗体を生成するために適用可能である。単一鎖抗体は、アミノ酸架橋を経てＦｖ領域の重鎖そして軽鎖のフラグメントを結合することによって形成され、単一鎖ポリペプチドに帰結する。
【００７６】
特異的なエピトープを認識して結合する抗体フラグメントは、既知の技術で生じさせることができる。例えば、そのフラグメントは、これに限定しないが、抗体分子のペプシン消化によって生成されるＦ（ａｂ’）２、及びＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を分解することで生成されるＦａｂフラグメントを含む。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーは、（ヒューズら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５）望まれる特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメント同定を迅速に容易にするように構成可能である。
【００７７】
客体における抗ＩＬ−１３Ｒα２免疫応答を誘発する方法
本発明は、ＩＬ−１３Ｒα２を発現する細胞を有する癌を発現させる危険性を有する客体において、ＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激させる方法を提供する。その方法は、（ａ）客体の外にある抗癌ワクチンの製法と、（ｂ）客体の中でＩＬ−１３Ｒα２に対して免疫応答を刺激するのに十分な量のワクチンを客体に投与することによって行なわれる。
【００７８】
客体
本発明の構成と方法は、適した客体例えば哺乳類のような動物で利用できる（例えば、ヒト、犬、猫、山羊、羊、牛、馬など）。ＩＬ−１３Ｒα２（例えば、ＨＧＧのような脳癌）を過剰発現する細胞を持つ癌又は他の病気を発現させる危険性を有するヒトの患者が、特に客体として好まれる。
【００７９】
多価ワクチン組成物としてのＩＬ−１３Ｒα２
本発明は、客体の中のＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激できる１つ以上の前述の構成と結合する多価ワクチンを提供する。多価ワクチンの一般的な２種類は、本発明の範囲内にある。第一に、一つ以上の薬剤を含むワクチンはＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を活性化できる（例えば、下記の表１〜表９に載せた２、３、４、５、６、７、８又はそれ以上の異なるペプチドを含む構成）。第２に、（ａ）ＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を活性化できる薬剤、そして（ｂ） ＩＬ−１３Ｒα２以外の分子に対する免疫応答を活性化できる異なる薬剤（例えば、別のＴＳＡ又はＴＡＡ）、ワクチンはこれら（ａ）と（ｂ）の両方を含む。
【００８０】
客体へのワクチン投与
本発明のワクチン構成は、客体においてＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激する方法として使用される。この方法で、本発明のワクチン構成は前述の免疫応答を刺激する方法によって客体に与えられる。選ばれた的確な方法は、投与される特異的なワクチン構成によって決定される。注射による非経口投与によって、注射は生体位で筋肉内、静脈内、腹腔内、又は非経口経路によって行うことができる。例えば、タンパク質／ペプチドベースのワクチンは皮内又は皮下注射による投与が可能である。ある場合において、例えば、静脈注射、腹膜注射、又は生体位で標的組織への注射のような別の経路が使われる。
【００８１】
裸のヌクレオチドワクチン又は発現ベクターワクチンは、筋肉内注射による投与が可能である。細胞ベースのワクチンは、例えば皮内注射のような適した方法で動物に投与できる。非経口経路に加えて、本発明のワクチンは経口経路例えば経口、頬側、尿道、膣、又は直腸投与によって投与することもできる。
【００８２】
注射剤にふさわしい薬剤形態は、例えば防腐剤の入ったアンプル又は複数の用量容器のような用量形成単位で提供してもよい。その成分は、懸濁液、溶液、油状乳剤、又は水溶性媒体としてこのような形態をとることが可能であり、そして懸濁、固定化、及び／又は分散剤のような薬剤の作用因を包含することも可能である。或いは、例えば以前用いた発熱物質を含まない無菌水のような適合性媒体を持つ形成に適した粉末状（例えば、凍結乾燥された）でワクチン成分は存在できる。
【００８３】
動物に本発明の抗原合成物の運搬を促進させるため、抗原合成物は薬学的に受容可能なキャリアー又は賦形剤と混ぜることができる。そのような薬学的に受容可能なキャリアー又は賦形剤は、例えば水、生理食塩水、クエン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、酢酸緩衝生理食塩水、及び重炭酸緩衝生理食塩水のような希釈水とアミノ酸、アルコール、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ（エチンジアミン四酢酸）、マンニトール、ソルビトール、グリセロールのような固定剤を含む。客体に投与されたとき感染や逆反応の起こる確率を最小化するため、キャリアーと賦形剤は無菌状態で発熱物質を含まないのが好ましい。ＵＳＰ等級のキャリアー又は賦形剤は、ヒトの客体に対するワクチン合成物の運搬を特に好む。ワクチン合成物は、適合した重合体又は疎水性材料又はイオン交換樹脂に抗原剤を加えることによって持続性薬剤として長い間放出できる。それらは、やや溶け難い誘導体としてワクチン合成物を調製することによって作ることもできる。持続性薬剤は、移植（例えば、皮内又は筋肉内の外科的移植）又は注射によって客体に与えることができる。前記の薬剤を作る方法は、よく知られており例えば、レミングトンの薬剤科学で見ることができる。
【００８４】
投薬
本発明のワクチン合成物は、客体の中にあるＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を活性化するため十分な量を客体に投与するのが好ましい。そして過剰な毒性効力をもたらさない。そのような治療上有効な量は下記のように決めることができる。
【００８５】
本発明で有効なワクチンの毒性と治療効果は、ＬＤ５０（集合の５０％致死量）とＥＤ５０（集合の５０％治療有効量）を測定するための動物実験又は培養細胞を用いた、標準的な治療方法によって調べることができる。毒性と治療効果の量比は、治療指標であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０で表される。大きな治療指標を示すワクチンの用量が好ましい。毒性の副作用を示すものが使用される場合、感染していない細胞に対する潜在的なダメージを最小化し、その結果、副作用を減少させるために、患者へ医薬成分を目標にあてる投与システムを設計することを考慮しなければならない。動物実験で得られたデーターは、ヒトに用いる用量の範囲を定式化するために用いられる。このワクチンの用量は、好ましくは、毒性を殆ど伴わないＥＤ５０を含む範囲内にある。その用量は、使用される投与形態と投与の経路によって、この範囲内で変化させてもよい。
【００８６】
本発明のワクチンは、様々な異なる予防接種スケジュルを用いて客体に投与できる。例えば、タンパク質／ペプチドベースのワクチンを複数回（１、２、３、４、５回又はそれ以上）客体に投与している場合、核酸ワクチンを一回だけ客体に投与することが可能である。例えば、強い免疫応答を活性化する努力において、本発明におけるワクチン合成物の最初の用量を客体に投与し、早くとも２４時間後に、第２回目（効能促進剤）の用量を客体に投与する。
【００８７】
キット
本発明は、客体においてＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を発現するためのキットを提供する。そのようなキットは、薬剤に適した形式で上記に述べた一つ以上の抗原剤を格納できる容器を含む。容器の中の抗原剤は、液体（例えば、溶液として）又は固体（例えば、凍結乾燥或いは乾燥された粉末として）状態で存在できる。例えば、抗原剤が固体であるとき、注入に適した液体の中で固体を液体に戻すことから、発明の範囲内のキットはさらに薬剤に適した溶液（例えば、ブドウ糖を含む、又は含まない無菌の生理食塩水）を格納できる容器を含む。本発明のキットは、（ａ）抗原剤を投与すための一つ以上の器具、例えば、注射針、注射器、アルコールパッドを詰めたものなど、及び／又は（ｂ）キットの使用説明書をさらに含む。
【００８８】
実施例
例１： ＩＬ−１３に対するＨＧＧ関連受容体の生物学的特徴を模倣するＩＬ−１３Ｒα２
正常チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、ＩＬ−１３Ｒα２の翻訳領域の完全な長さを含んいるｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（インビトロゲン社製）によって形質移入された後、陽性クローンはジェネテシンを使って選択された。
【００８９】
このようなクローンにおけるＩＬ−１３Ｒα２の発現は１２５Ｉにラベル化されたＩＬ−１３に結合するための親和性を検討した。
選択されたクローンは、ＩＬ−４に依存しないラベル化されたＩＬ−１３の結合によって示された。さらに、ラベル化されたＩＬ−１３はＩＬ−１３．Ｅ１３Ｋによって発現し、ＩＬ−１３の突然変異体は生理学的部位の下で、多くの組織に存在する共有ＩＬ−１３／ＩＬ−４受容体よりＨＧＧにおけるＩＬ−１３結合タンパク質に対して高い親和性を有することを示す。更に、ＣＨＯ細胞に形質移入されたこれらのＩＬ−１３Ｒαは、ＩＬ−１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ３８ＱＱＲの細胞毒素を発現し、ＨＧＧ上の従属細胞毒性に効力のある用量を示している融合タンパク質である。受容体を発現しているクローンはＩＬ−１３に対する親和性に直接比例して破壊されるが、ＣＨＯ細胞のみ或いは空のプラスミドを形質移入したＣＨＯ細胞では破壊されない。中和価実験で、過度のＩＬ−１３はＩＬ−１３．Ｅ１３Ｋ−ＰＥ３８ＱＱＲの細胞内毒性効果を防止した。従って、毒素であるＰＥ３８ＱＱＲが組込まれ、そしてエンドサイトーシスを媒介する受容体を通して細胞が破壊された。そして、この工程は細胞内毒素のＩＬ−１３タンパク質を通して導かれた。ＩＬ−１３．Ｅ１３Ｋ／増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の融合タンパク質を用いることにより、この工程の発生が確認された。従って、ＩＬ−１３Ｒα２は、生体位と生体内のＨＧＧ上で発見されたＩＬ−１３結合部位、ＩＬ−４独立性、多くの拘束性に基く共有特性が証明された。
【００９０】
例２：癌精巣抗原としてのＩＬ−１３Ｒα２の同定
材料と方法
ＲＮＡ源。ヒト多形性神経膠芽腫の外植片細胞（Ｇ−４８）と高度神経膠腫細胞系Ａ−１７２ＭＧ、Ｕ−３７３ＭＧ、Ｕ−２５１ＭＧは、適した培地で培養し成長した。全ＲＮＡは、グアニジム酸イソチオシナーゼフェノールクロロホルム方法を用いて細胞から抽出された。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、さらにミニオリゴ（ｄｔ）セルローススピンカラムキット（５プライム−３プライム株式会社、ボルダー、コロラド）を用いて単離された。２μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、１％アガロースホルムアルデヒドゲルで電気泳動され、０．４５μｍマグナチャージナイロン（ＭＳＩ，ウエストバラ、マサチューセッツ州）そしてＵＶ架橋された（スタータージーン、ラジオラ、カルフォルニア州）。ＲＮＡブロッドされた膜は、クロンテクから購入された（パロ アルト、カルフォルニア州）。多発性組織発現（ＭＴＥ（商標））ブロッド（ｃａｔ＃７７７０−１と７７７５−１；　ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｍｔｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）は、ＩＬ１３結合タンパク質の組織分布を決定するために分析された。ヒト脳多発性組織ノーザン（ＭＴＮ（商標））ブロッド（ｃａｔ＃７７５５−１と７７６９−１）の２セットは、転写物の真の存在を確認するため分析された。加えて、２つのヒト組織ノーザン（ＭＴＮ（商標））ブロッド（ｃａｔ＃７７５９−１と７７６０−１）は、ＩＬ−１３Ｒα２転写物の組織分布を立証するため分析された。
【００９１】
ｃＤＮＡ探索。ｃＤＮＡ探索、制限消化（ＩＬ−４Ｒα＝ｐ１４０）又はＰＣＲ（ＩＬ−１３Ｒα２とＩＬ−１３Ｒα１によって生成された。ヒトＩＬ−１３Ｒα２を含むｃＤＮＡは、ソノフィ研究所のパスパル フェラーラ博士によって提供された。ヒトＩＬ−１３Ｒα１（そしてマウスＩＬ−１３の９３塩基）を含むｃＤＮＡは、医学研究のウォルターとエライザホールのヒルトン研究所ドーガル博士によって提供された。プラスミドｐＨｕＩＬ４Ｒ／ＩＤは、制限消化によるＩＬ−４Ｒαフラグメントを得るために使用された。そのフラグメントは、１％アガロースゲルで電気泳動され、ゲルから除去され、ＱＩＡクイックゲル抽出キット（キアジェン株式会社、ヴァレンシア、カルフォルニア州）を用いて精製された。アクチンｃＤＮＡは、クロンテク研究所から購入された。
【００９２】
ヒトＩＬ−１３Ｒα２に対するプライマーは以下の通りである。
前面５’−ＡＡＧＡＴＴＴＧＧＡＡＧＣＴＴＡＹＧＧＣＴＴＴＣＧＴＴＴＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
裏面５’−ＴＣＣＣＴＣＧＡＡＧＣＴＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
ヒトＩＬ−１３Ｒα１に対するプライマーは以下の通りである。
前面５’−ＡＴＴＡＴＴＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＧＴＧＧＣＣＧＧＣＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
裏面５’−ＴＡＡＣＣＧＧＡＡＧＣＴＴＣＡＣＴＧＡＧＡＧＧＣＴＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
【００９３】
ノーザンブロット分析。膜は、５０％ホルムアルデヒド、５ｘＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム、５ｘデンハード、５０μｇ／ｍｌせん断されたサケ精子ＤＮＡ、１％ＳＤＳを含む溶液を用いて４２℃で一晩プレハイブリダイズされた。膜は、１−２ｘ１０６ ｃｐｍ／ｍｌを用いた３２Ｐ−ｄＣＴＰでランダムな初回抗原刺激（ライフテクノロジー、ロックヴィル、メリーランド州）によって標識化された完全な長さのｃＤＮＡを加えられた前記と同じ溶液を用いて、４２℃で一晩中ハイブリダイズされた。ハイブリダイゼーションに続いて、膜は、４２℃で２０分２ｘＳＳＣ／０．２％ＳＤＳにより洗浄され、その後４２℃で２０分１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにより２回洗浄された。その膜は、オートラジオグラフィックフィルムＸ−ＯＭＡＴＡＲ（エストマンコダック社、ロチェスター、ニューヨーク）で露光させ、−８０℃で１、３、１４日間置かれた。その後、膜は剥ぎ取られ、３回以上再度調べられた。膜は、始めＩＬ−１３Ｒα２で調べられ、その後ＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ−４Ｒα＝ｐ１４０そしてアクチンで調べられた。フィルムは、８８ｘ８８ミクロンの画素サイズ（分子力学、サニーヴェール、カルフォルニア州）の透明度スキャナーで検査された。その画像は、ペイントショッププロＶ５．０で編集された（ジャスクソフトウエアー（社）、エデン プライリエ、ミネソタ州）。
【００９４】
結果
正常器官におけるＩＬ−１３Ｒα２に対する転写物のノーザンブロット解析。ＩＬ−１３Ｒα２の発現を探求するため、ＣＮＳの２０の分離した領域と様々な正常抹消組織を含む多発性正常細胞間のタンパク質に対する転写物の存在の広範な検査が行われた。いくつかの膜を用いた全てのノーザンブロットが、以下の順に：ＩＬ−１３Ｒα２、ＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ−４α、β−アクチンそれぞれ標識化されたｃＤＮＡで行われた。これは、ＩＬ−１３Ｒα２に対する転写物のレベルが、ｍＲＮＡを有する膜を用いることによって評価されたことを確認した。ドットブロット解析（表示してない）とＩＬ−１３Ｒα２に対する電気泳動で分離された転写物（図４、パネルＩ−ＩＶ）は、２週間フィルムを露光させてもＣＮＳと正常抹消組織におけるＩＬ−１３Ｒα２の転写物の大部分が検出されず、又は稀な場合でシグナルが検出されてもとても弱いシグナルしか検出しなかった。始めにドットブロットが行われ、その結果、精巣から得られた転写物にＩＬ−１３Ｒα２ｃＤＮＡプローブを持つ標識が、極めて高密度の分布を示した。これは、他のノーザンブロット膜を用いても検出された。ある他の器官は、ＩＬ−１３Ｒα２ｃＤＮＡ（大動脈、肝臓、脳下垂体腺）をハイブリダイズした転写物を含んでいた。ドットブロットにおける標識の密度は、精巣ブロットでとても低かった。重要なことに、ＣＮＳにおける著しいＩＬ−１３Ｒα２発現の存在に関する証拠がなかった。
【００９５】
ドットブロット解析を用いたこれらの発見を確認するため、追加のブロットが電気泳動で分離されたｍＲＮＡを用いて行われた。更に、正常ヒト脳の分離した領域は、明確なハイブリダイゼーションのシグナルを検出しなかった（図４、パネルＩとＩＩ）。一方、１．５ｋｂのｍＲＮＡと一致する顕著なハイブリダイゼーションバンドを持つ唯一の組織が、精巣で見られた（図４、パネルＩＶ）。従って、正常細胞間の精巣のみが、ＩＬ−１３Ｒα２を著しく発現させた。ＩＬ−１３Ｒα２の転写物は、ＣＮＳで容易に検出されなかった。
【００９６】
正常組織におけるＩＬ−１３Ｒα１に対する転写物のノーザンブロット解析。ドットブロット解析（表示してない）又は電気泳動で分離された転写物（図５、パネルＩ−ＩＶ）のどちらかによって、共有ＩＬ−１３／４受容体のヘテロ２量体の成分であるＩＬ−１３Ｒα１の発現が、様々な正常ヒト組織で検出された。この結果により、髄質、脊髄、黒質、視床、そして脳梁からＣＮＳ組織を含む様々な器官でＩＬ−１３Ｒα１が発現したことを明らかにした。細分化されたｍＲＮＡのサイズが、卵巣、心臓、肝臓、そして肺（図５、それぞれパネルＩＩＩとＩＶ）で観測された最も強いシグナルを持つドットブロットで見られる多くの潜在的なシグナルを確認した。興味深いことに、肝臓は、ｍＲＮＡの２つのハイブリダイズされた種を示した。それは、４．５ｋｂに一つそして２．０ｋｂにもう一つ存在し、異なるサイズ重複する潜在的なシグナルを持つ正常器官の例である。要するに、正常ヒト脳の分離された領域は、ＩＬ−１３Ｒα１に対する実際的なハイブリダイゼーションシグナルを明確に検出した（図５、パネルＩとＩＩ）。加えて、多くの生命周辺器官は、４．５−４．６５ ｋｂと一致するハイブリダイゼーションバンドを示した（図５、パネルＩＩＩとＩＶ）。
【００９７】
正常細胞におけるＩＬ−４Ｒαの遺伝子発現解析。ＩＬ−１３Ｒα１に加えて、ＩＬ−４Ｒαは、ＩＬ−４Ｒαと共有するＩＬ−１３受容体、例えば共有ＩＬ−１３／４受容体であるヘテロ２量体のもう一つの成分である。従って、ＩＬ−４Ｒα遺伝子発現の分布がＩＬ−１３Ｒα１と一致するかどうか分析された。この研究で使われる全ノーザンブロット解析膜は、様々な組織でＩＬ−４Ｒα転写物の豊富な含有量を証明した（図６、パネルＩ、ＩＩとＩＶ）。髄質、脊髄、黒質、視床においてＩＬ−１３Ｒα１と同様に、ＣＮＳ範囲内の転写物の存在は、最も顕著に表れていた（図６、パネルＩとＩＩ）。正常な周辺器官にある肝臓、肺、腎臓、腸管、脾臓、胃、そして精巣は、ＩＬ−１３Ｒα１（表示してない）で見られるものと一般に類似するＩＬ−４Ｒαの遺伝子発現を証明した。従って、正常ヒト脳の分離した領域は、ＩＬ−１３Ｒα１とＩＬ−４Ｒαによる転写物を含み、共有ＩＬ−１３／４受容体の完全なヘテロ２量体である。更に、心臓、肝臓、肺、そして腸管などの生命の周辺器官は、ＩＬ−１３／４受容体の２つのサブユニットを含む。
【００９８】
β−アクチンのコントロールハイブリダイゼーション。ＩＬ−１３受容体転写物のノーザンブロット解析を用いた全ての膜は、ハウスキーピング遺伝子のｃＤＮＡプローブでハイブリダイズされた（図７、ドットブロットとパネルＩＩＩは表示してない）。β−アクチンに対するシグナルの強度は、生産による評価として通常膜上に存在するｍＲＮＡの量に一致する。
【００９９】
細胞内のＩＬ−１３受容体の遺伝子発現。２つのＩＬ−１３受容体の遺伝子発現は、悪性細胞と正常細胞でも検査された（図８）。ＩＬ−１３Ｒα２、ＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ−４Ｒα、そしてβ−アクチンの転写物は、連続的なハイブリダイゼーション分析で検査された。ヒト悪性神経膠種と同様にＨＧＧ（Ｇ−４８）の単離された外植片細胞は、ＩＬ−１３Ｒα２に対する強烈なシグナルを証明した細胞系（Ａ−１７２ＭＧ、Ｕ−３７３ＭＧ、そしてＵ−２５１ＭＧ）で見られた（図８）。一方、共有ＩＬ−１３／４受容体、ＩＬ−１３Ｒα１、そしてＩＬ−４Ｒαの成分に対する転写物は、ＩＬ−１３Ｒα２の転写物と比較すると低レベルで検出された（図８）。Ａ−１７２ＭＧ細胞は、ＩＬ−１３／４受容体２量体の成分で最も濃縮されたように見える。興味深いことに、ＩＬ−１３Ｒα２とＩＬ−１３Ｒα１両方に対する転写物の異なるサイズの２つの種は、細胞内で見られた（図８）。コントロール分析で、臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）はＩＬ−１３Ｒα１とＩＬ−４Ｒα対する転写物の存在を示しが、ＩＬ−１３Ｒα２はそれを示さなかった（図８）。要するに、ＩＬ−１３Ｒα２の遺伝子発現はＨＧＧの２つの試料で検出されたが（図８、ＨＧＧ１３とＨＧＧ５２）、２つの正常脳試料では検出されなかった（図８、ＮＢ３とＮＢ６）。しかしながら、ＩＬ−１３Ｒα１に対する転写物はこれらの試料すべてに発見された。他の実験で、いくつかの追加のＨＧＧ脳腫瘍試料は、ＩＬ−１３Ｒα２を発現することが検出された。
【０１００】
例３：ＩＬ−１３Ｒα２の代表的な免疫原性ペプチド
表１は、客体の中のＩＬ−１３Ｒα２に対する免疫応答を刺激するために使われるＩＬ−１３Ｒα２ペプチドの一覧を示す。この一覧にされたペプチドは、 ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｌｕｄｗｉｇ．ｕｎｉｌ．ｃｈ．ＳＥＲＥＸ．ｈｔｍｌサイトにあるインターネット上の癌研究のルドイグ研究所（ローザンヌ、スイス）によって提供されたコンピュータープログラムを用いて得られた。このプログラムは、ＭＨＣ分子のクラスに特異的に結合することが予測された免疫原性ペプチドの最高（高い厳密性）の適合を提供する（例えば、ヒトＭＨＣクラスＩの様々な対立遺伝子を表１に示した）。そのペプチドは、高い厳密性の下で結合すべきペプチドを”＊”で示した。熟練した当業者は、ここに記したこれらのペプチドを生産でき、そしてここでも示されているような様々な試験客体（例えば、異なるＭＨＣ型を持つ客体）に投与された各々のワクチン合成を使用できる。免疫応答は、客体の中にある各々のペプチドによって刺激され、特に試験客体の中の望まれた免疫応答を刺激する抗原が確認された。
【０１０１】
【表１】
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【０１０２】
【表２】
2004511425.tif 000003
【０１０３】
【表３】
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【０１０４】
【表４】
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【０１０５】
【表５】
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【０１０６】
【表６】
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【０１０７】
【表７】
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【０１０８】
【表８】
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【０１０９】
【表９】
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【０１１０】
その他の実施例
この説明は、本発明の組成と方法がどのように作り出されているかと言う例のつもりである。当業者は、種々の内容が変更されてその他の群述された実施例に到達しても良く、この多くの実施例が本発明の範囲内にくるであろうことを理解するであろう。
【０１１１】
従って、一般に本発明の範囲と本発明によって保護される実施例を知らしめるために、請求項が作成された。
【図面の簡単な説明】
本発明は添付した請求項で特定して示されている。本発明の特徴は添付された図面とともに以下の説明を参照することによってさらによく理解されるであろう。
【図１】
図１は、天然の人類のＩＬ−１３Ｒα２タンパク質のアミノ酸配列である。
【図２】
図２は、天然の人類のＩＬ−１３Ｒα２タンパク質をコード化した天然型ｍＲＮＡと一致するｃＤＮＡの核酸配列である。
【図３】
図３は、ＩＬ１３の２種類を図式的に表したものである：生理学上の混合ＩＬ１３／４ＲであるＩＬ４との共有受容体、独立したＩＬ−４の単量体、すなわち、ＩＬ−１３Ｒが結合したＨＧＧ。Ａは、１４０−ＫＤａのＩＬ４Ｒα鎖である。Ｂは、４５−ＫＤａのＩＬ−１３Ｒα１−鎖である；ＡとＢは、高い親和力で混合されたＩＬ１３／４Ｒの要素を構成する。Ｃは、４２−ＫＤａのＩＬ−１３Ｒα２分子である。
【図４】
図４は、ＣＮＳ（パネルＩとＩＩ）と抹消組織（パネルＩＩＩとＩＶ）を連続転写したヒトＩＬ−１３Ｒα２のノザンブロット解析である。位置移動したｍＲＮＡは、キロベースで示されている。写真は２週間露光させたものである。
【図５】
図５は、ＣＮＳ（パネルＩとＩＩ）と抹消組織（パネルＩＩＩとＩＶ）を連続転写したヒトＩＬ−１３Ｒα２のノザンブロット解析である。位置移動したｍＲＮＡは、キロベースで示されている。写真は、３日間露光させたパネルＩＩＩとＩＶのメンブランを除いて、２週間露光させたものである。
【図６】
図６は、ＣＮＡ（パネルＩとＩＩ）と抹消組織（パネルＩＶ）を連続転写したヒト１４０−ＫｄａＩＬ４Ｒα―鎖のノザンブロット解析である。位置移動したｍＲＮＡは、キロベースで示されている。写真は２週間露光させた。
【図７】
図７は、ＣＮＳ（パネルＩとＩＩ）と抹消組織（パネルＩＶ）を転写したヒトβ−アクチンのノザンブロット解析である。位置移動したｍＲＮＡは、キロベースで示されている。写真は１〜３時間露光させた。
【図８】
図８は、通常のヒト内皮連結静脈細胞、外科的な実例のＧＢＭ、通常のヒトの脳にある悪性の神経膠芽種細胞（Ｇ−４８，Ａ−１７２ＭＧ，Ｕ−３７３ＭＧ）の種々なＩＬ１３受容体のノザンブロット解析である。位置移動したｍＲＮＡは、キロベースで示されている。写真はアクチンを除いて（１時間）２週間露光させた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2004511425.tif 000015
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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