(57)【要約】本発明は、ＣＤ３３に対してタンパク質相同性を持つシアロアドヘシンサブグループの新しいメンバーであるＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ配列のタンパク質、ペプチド断片、核酸分子およびその断片、相補配列、対立遺伝子型、ホモログ、抗体および変異体ならびにこれらの分子の使用方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
図６Ｂに示すＡｌａ１４１からＳｅｒ１９８までのアミノ酸配列を含む単離されたＳＩＧＬＥＣタンパク質。
【請求項２】
図２Ａ、３Ａ、４Ａ、５Ａ、６Ａ、７Ａ、８Ａおよび９Ａのいずれか一つに示す核酸に相補的な核酸分子にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる図６Ｂに示すＡｌａ１４１からＳｅｒ１９８までのアミノ酸配列を含む単離されたＳＩＧＬＥＣタンパク質。
【請求項３】
図４Ｂ、５Ｂおよび６Ｂのいずれか一つに示すアミノ酸配列を含む請求項１または２の単離されたＳＩＧＬＥＣタンパク質。
【請求項４】
図２Ａ、３Ａ、４Ａ、５Ａ、６Ａ、７Ａ、８Ａおよび９Ａのいずれか一つに示す核酸に相補的な核酸分子にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含む単離されたＳＩＧＬＥＣタンパク質。
【請求項５】
図２Ｂ、３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ、６Ｂ、７Ｂ、８Ｂのいずれかに示すアミノ酸配列を有する請求項４の単離されたＳＩＧＬＥＣタンパク質。
【請求項６】
請求項３のタンパク質のペプチド断片。
【請求項７】
図６Ｂに示すＡｌａ１４１からＳｅｒ１９８までのアミノ酸配列またはその断片を有する請求項６のペプチド断片。
【請求項８】
図６Ｂに示すＬｙｓ５７６からＧｌｎ６９７までのアミノ酸配列を有する細胞質ドメインまたはその断片を含む請求項６のペプチド断片。
【請求項９】
細胞質ドメインを含み、その細胞質ドメイン中の少なくとも１つのチロシンがフェニルアラニン、ロイシン、トリプトファンおよびスレオニンからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている突然変異型ＳＩＧＬＥＣ ＢＭＳタンパク質。
【請求項１０】
図６Ｂに示すアミノ酸配列を持ち、上記細胞質ドメイン中のチロシンが５９７位、６４１位、６６７位、または６９１位のチロシンのいずれかである請求項９の突然変異型ＳＩＧＬＥＣ ＢＭＳタンパク質。
【請求項１１】
図２Ａ、３Ａ、４Ａ、５Ａ、６Ａ、７Ａ、８Ａおよび９Ａのいずれか一つに示す核酸に相補的な核酸分子にストリンジェントな条件でハイブリダイズする図６Ａに示す＋４２１位のコドンＧＣＣから＋５９４位のコドンＴＣＡまでの核酸を含む単離されたＳｉｇｌｅｃ核酸分子。
【請求項１２】
請求項１、２または４のタンパク質をコードする単離されたＳｉｇｌｅｃ核酸分子。
【請求項１３】
（ａ）図２Ａに示す＋１２位のコドンＧＧＣから＋１７６０位のコドンＣＣＡまでの配列、（ｂ）図３Ａに示す＋３位のコドンＧＡＴから＋１８６８位のコドンＣＡＡまでの配列、（ｃ）図４Ａに示す＋１２位のコドンＧＧＡから＋１７３６位のコドンＣＡＡまでの配列、（ｄ）図５Ａに示す＋２位のコドンＣＣＣから＋１２９１位のコドンＡＴＧまでの配列、（ｅ）図６Ａに示す＋１位のコドンＡＴＧから＋２０９１位のコドンＣＡＡまでの配列、（ｆ）図７Ａに示す＋１のコドンＣＴＧから＋１３９８位のコドンＧＧＣまでの配列、（ｇ）図８Ａに示す＋４３位のコドンＡＴＧから＋１４３１位のコドンＡＧＡまでの配列、または（ｈ）図９Ａに示す＋５７位のコドンＡＴＧから＋９１４位のコドンＡＧＴまでの配列を含む、請求項１２の単離されたＳｉｇｌｅｃ核酸分子。
【請求項１４】
ＤＮＡまたはＲＮＡである請求項１１または１３の単離されたＳｉｇｌｅｃ核酸分子。
【請求項１５】
請求項１１または１３の分子のヌクレオチド配列に相補的な単離された核酸分子。
【請求項１６】
請求項１１または１３の単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項１７】
適切な宿主細胞中の請求項１６のベクターを含む宿主−ベクター系。
【請求項１８】
図２Ｂ、３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ、６Ｂ、７Ｂ、８Ｂおよび９Ｂのいずれかのアミノ酸配列を持つＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質を製造する方法であって、
ａ）請求項１７の宿主−ベクター系を、タンパク質が産生されるように、適切な条件で培養すること、および
ｂ）そのように産生されたタンパク質を回収すること、
を含む方法。
【請求項１９】
請求項１８の方法によって製造されたＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質。
【請求項２０】
異種ポリペプチドに融合された請求項１、２もしくは４のポリペプチドまたはその断片を含むキメラタンパク質。
【請求項２１】
異種ポリペプチドに融合された請求項１、２または４のポリペプチドの細胞外ドメインを含むキメラタンパク質。
【請求項２２】
異種ポリペプチドに融合された請求項１、２または４のポリペプチドの細胞質ドメインを含むキメラタンパク質。
【請求項２３】
異種ポリペプチドが免疫グロブリン定常領域である請求項２０、２１または２２のキメラタンパク質。
【請求項２４】
異種ポリペプチドがグルタチオンＳ−トランスフェラーゼである請求項２０、２１または２２のキメラタンパク質。
【請求項２５】
請求項１、２または４のタンパク質を特異的に認識し結合する抗原結合部位を持つ抗体または抗体断片。
【請求項２６】
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である請求項２５の抗体。
【請求項２７】
モノクローナル抗体がＳＩＧＬＥＣ−１０−９、ＳＩＧＬＥＣ−１０−１３、ＳＩＧＬＥＣ−１０−１４、ＳＩＧＬＥＣ−１０−２７、またはＳＩＧＬＥＣ−１０−６１と呼ばれ、ＡＴＣＣ受託番号（−−−−）として一括して寄託されている抗体である請求項２６の抗体。
【請求項２８】
抗体がネズミ抗原結合部位とエフェクター機能を調節するヒト化領域とを持つキメラ抗体である請求項２５の抗体。
【請求項２９】
Ｓｉｇｌｅｃ−１０陽性細胞によって誘導される免疫応答を調整する試験分子を同定する方法であって、
ａ）Ｓｉｇｌｅｃ−１０陽性細胞を試験分子と接触させること、および
ｂ）免疫応答が調整されるかどうかを決定すること、
を含む方法。
【請求項３０】
免疫応答を調整する試験分子がＳｉｇｌｅｃ−１０陽性細胞上のＳｉｇｌｅｃ−１０の細胞外ドメインを標的とする請求項２９の方法。
【請求項３１】
細胞外ドメインがＳｉｇｌｅｃ−１０のＩｇ様ドメインの少なくとも１つを包含する請求項３０の方法。
【請求項３２】
Ｓｉｇｌｅｃ−１０のＩｇ様ドメインがＳｉｇｌｅｃ−１０のＩｇ（Ｖ）ドメインである請求項３１の方法。
【請求項３３】
Ｓｉｇｌｅｃ−１０のＩｇ様ドメインがＳｉｇｌｅｃ−１０のＩｇ（Ｃ）ドメインである請求項３１の方法。
【請求項３４】
Ｓｉｇｌｅｃ−１０陽性細胞によって誘導される免疫応答を調整する方法であって、Ｓｉｇｌｅｃ−１０陽性細胞を、Ｓｉｇｌｅｃ−１０に対するモノクローナル抗体と、免疫応答が調整されるように、適切な条件で接触させることを含む方法。
【請求項３５】
抗体がＳｉｇｌｅｃ−１０の細胞外ドメインを標的とする請求項３４の方法。
【請求項３６】
そのように標的とされる細胞外ドメインがＳｉｇｌｅｃ−１０のＩｇ様ドメインである請求項３５の方法。
【請求項３７】
Ｉｇ様ドメインがＳｉｇｌｅｃ−１０のＩｇ（Ｖ）ドメインである請求項３６の方法。
【請求項３８】
Ｉｇ様ドメインがＳｉｇｌｅｃ−１０のＩｇ（Ｃ）ドメインである請求項３６の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、２０００年７月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／２２０，１３９号に基づき、前記仮特許出願の内容は参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する。本願では種々の刊行物に言及する。それら刊行物の開示内容は参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、本明細書で「ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ」と呼ぶシアロアドヘシンヌクレオチド配列、および新規ＳＩＧＬＥＣポリペプチド、ならびにそれらの用途に関する。
【０００３】
（発明の背景）
免疫グロブリン様分子のスーパーファミリーに属する一群のシアル酸依存性接着分子が記載されている（Ｋｅｌｍ，Ｓ．ら，１９９８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５５：６６３−６７２）。このファミリーの記載には「Ｓｉｇｌｅｃ（シグレック）」という用語が採用されている（Ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ Ｉｇ−ｒｅｌａｔｅｄ ｌｅｃｔｉｎｓ）。現在までに、このグループのメンバーには、Ｓｉｇｌｅｃ−１（シアロアドヘシン）、Ｓｉｇｌｅｃ−２（ＣＤ２２）、Ｓｉｇｌｅｃ−３（ＣＤ３３）、Ｓｉｇｌｅｃ−４（ミエリン関連糖タンパク質またはＭＡＧ）、Ｓｉｇｌｅｃ−４ｂ（シュワン細胞ミエリンタンパク質またはＳＭＰ）、Ｓｉｇｌｅｃ−５（ＯＢ−ＢＰ２）、Ｓｉｇｌｅｃ−６（ＯＢ−ＢＰ１、ＣＤ３３Ｌ）、Ｓｉｇｌｅｃ−７、およびＳｉｇｌｅｃ−８が含まれている（表１）。Ｓｉｇｌｅｃグループのタンパク質メンバーの生物学的活性はほとんどわかっていない。しかし、Ｓｉｇｌｅｃタンパク質は、例えば造血、ニューロン発達および免疫などの多様な生物学的プロセスに関与すると考えられる（Ｖｉｎｓｏｎ，Ｍ．ら，１９９６，前掲）。また、これらのタンパク質は、シアリル化された（ｓｉａｌｙａｔｅｄ）細胞表面グリカンを認識することによって細胞接着／細胞シグナリングを媒介することも、研究によって示唆されている（Ｋｅｌｍ，Ｓ．ら，１９９６，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ． １３：９１３−９２６；Ｋｅｌｍ，Ｓ．ら，１９９８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５５：６６３−６７２；Ｖｉｎｓｏｎ，Ｍ．ら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１：９２６７−９２７２）。
【０００４】
【表１】
Ｓｉｇｌｅｃタンパク質ファミリーのメンバーおよびそれらの分布
2004516012.tif 000003
2004516012.tif 000004
（１）Ｃｒｏｃｋｅｒら，１９９４，ＥＭＢＯ Ｊ． １３：４４９０−４５０３；Ｃｒｏｃｋｅｒら，１９９７，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ． １４：６０１−６０９；Ｖｉｎｓｏｎら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１：９２６７−９２７２；Ｋｅｌｍら，１９９８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５５：６６３−６７２；Ｂａｒｎｅｓら，１９９９，Ｂｌｏｏｄ ９３：１２４５−１２５２
（２）Ｋｅｌｍら，１９９８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５５：６６３−６７２
（３）Ｆｒｅｅｍａｎら，１９９５，Ｂｌｏｏｄ ８５：２００５−２０１２；Ｋｅｌｍら，１９９８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５５：６６３−６７２；Ｔａｙｌｏｒら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７４：１１５０５−１１５１２
（４）Ｋｅｌｍら，１９９８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５５：６６３−６７２
（５）Ｋｅｌｍら，１９９８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５５：６６３−６７２
（６）Ｃｏｒｎｉｓｈら，１９９８，Ｂｌｏｏｄ ９２：２１２３−２１３２
（７）Ｔａｋｅｉら，１９９７，Ｃｙｔｏｇｅｎ．Ｃｅｌｌ．Ｇｅｎｅｔ． ７８：２９５−３００；Ｐａｔｅｌら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７４：２２７２９−２２７３８
（８）Ｎｉｃｏｌら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７４：３４０８９−３４０９５
（９）Ｆｌｏｙｄら，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７５：８６１−８６６。
【０００５】
既知のＳｉｇｌｅｃタンパク質は多様な造血細胞タイプで発現されるにもかかわらず、いずれも共通する類似構造（Ｎ末端Ｖセットドメイン（膜遠位）に続いて様々な数の細胞外Ｃ２セットドメイン、膜貫通ドメインおよび短い細胞質テールを含む構造）を持っている（図１）。また、末端Ｖセットドメインは、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーでは他に類のない珍しいシート内ジスルフィド橋を持つ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ａ．Ｆ．およびＢａｒｃｌａｙ，Ａ．Ｎ．，１９８８，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：３８１−４０５；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ａ．Ｆ．ら，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ． ５４：６３７−６４７；Ｐｅｄｒａｚａ，Ｌ．ら，１９９０，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． １１１：２６５１−２６６１）。
【０００６】
切断型突然変異体（Ｎａｔｈ，Ｄ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７０：２６１８４−２６１９１）、部位特異的突然変異誘発（Ｖｉｎｓｏｎ，Ｍ．ら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１：９２６７−９２７２；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｒｗｅ，Ｐ．ａ．ら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７１：９２７３−９２８０）、Ｘ線結晶構造解析およびＮＭＲ（Ｃｒｏｃｋｅｒ，Ｐ．Ｒ．ら，１９９７，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ． １４：６０１−６０９で論じられている）を含む様々な研究アプローチの結果、既知のＳｉｇｌｅｃタンパク質のＮ末端ＶセットドメインのＧＦＣＣ’Ｃ’’面はシアル酸と相互作用することが、明確に証明されている。したがって、Ｖセットドメインはシアル酸と相互作用することによって細胞−細胞接着を媒介する。特に、Ｖセットドメインのアルギニン残基は、シアル酸への結合にとって重要なアミノ酸残基である（Ｖｉｎｓｏｎ，Ｍ．ら，１９９６，前掲）。
【０００７】
既知のＳｉｇｌｅｃタンパク質のリガンドとされているのは、糖またはシアル酸を含むように修飾された他の細胞上の、または場合によって同じ細胞上の、糖タンパク質または糖脂質である（表１）。天然シアル酸（Ｓｉａ）は約４０種類あり、細胞表面糖タンパク質の構造多様性を増加させている。最も一般的なシアル酸は、糖タンパク質および糖脂質上の他の糖、例えばＧａｌ、ＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃおよびＳｉａ自体に結合して末端位に存在するＮｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ９Ａｃ２およびＮｅｕ５Ｇｃである。ある種の細胞タイプにおけるシアル酸の発現パターンは、シアリルトランスフェラーゼの特異的発現によって制御されると推測されている（Ｐａｕｌｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．ら，１９８９ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６４：１０９３１−１０９３４）。Ｓｉｇｌｅｃタンパク質は末端シアル酸を認識するだけでなく、それらが結合している末端手前の糖に基づいて、これらの部分の前後関係も認識すると考えられる（Ｋｅｌｍ，Ｓ．ら，１９９６，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ． １３：９１３−９２６）。
【０００８】
Ｓｉｇｌｅｃは、シアル酸のタイプと末端近くの糖へのその結合とに明瞭な特異性を持つシアル酸依存性レクチンとして機能することにより、細胞−細胞接着を媒介すると考えられる（Ｋｅｌｍ，Ｓ．，１９９４，前掲；Ｐｏｗｅｌｌ，Ｌ．Ｄ．ら，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６９：１０６２８−１０６３６；Ｓｊｏｂｅｒｇ，Ｅ．ら，１９９４，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２６：５４９−５６２；Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｂ．，Ｅ．ら，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７２：１２４８−１２５５）。例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−１を発現させる細胞は、糖タンパク質および糖脂質上の配列、Ｎｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃと、Ｎｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌβ１，３（４）ＧｌｃＮＡｃを認識する（Ｋｅｌｍ，Ｓ．ら，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ． ４：９６５：７２；Ｃｒｏｃｋｅｒ，Ｐ．Ｒ．ら，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ． １０：１６６１）。
【０００９】
Ｓｉｇｌｅｃは、Ｓｉｇｌｅｃタンパク質が同じ細胞上の複合糖質を認識するシス相互作用にも関与すると推測されている。このようなシス相互作用は、ＣＤ２２（Ｂｒａｅｓｃｈ−Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｓ．およびＳｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ，Ｉ．，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６９：１１７８３−１１７８６；Ｈａｎａｓａｋｉ，Ｋ．ら，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７０：７５３３−７５４２）、ＣＤ３３（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓ．Ｄ．ら，１９９５，前掲）およびＭＡＧ（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓ．Ｄ．ら，１９９５，前掲で論じされている）の細胞間接着を調節すると考えられる。
【００１０】
いくつかのＳｉｇｌｅｃタンパク質の細胞質テールのアミノ酸配列から、それらは細胞内シグナリングに関与することが強く示唆される。例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−２は細胞質ドメインに６つのチロシンを持ち、そのうちの２つは活性化を媒介するＩＴＡＭ（Ｉｍｍｕｎｏｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ、イムノチロシン型活性化モチーフ）モチーフ内にあり、４つは阻害を媒介するＩＴＩＭ（Ｉｍｍｕｎｏｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ、イムノチロシン型阻害モチーフ）モチーフ内にある（Ｔａｙｌｏｒ，Ｖ．ら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７４：１１５０５−１１５１２）。ＩＴＡＭモチーフチロシンがリン酸化されるとＳｒｃの動員が可能になり、ＩＴＩＭモチーフチロシンがリン酸化されるとＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２の動員が可能になる。Ｓｉｇｌｅｃ−３は２つのＩＴＩＭを持ち、これらがリン酸化されるとＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２が動員される（Ｔａｙｌｏｒ，Ｖ．ら，１９９９，前掲）。Ｓｉｇｌｅｃ−６も細胞質テール内にＳＬＡＭ様シグナリングモチーフを持つと推定されている。ＳＬＡＭはＳｉｇｎａｌｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅの頭字語である（Ｐａｔｅｌ，Ｎ．ら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７４：２２７２９−２２７３８）。
【００１１】
Ｓｉｇｌｅｃは他にも生物学的活性を持つと推測されている。炎症細胞浸潤物が組織を損傷し炎症誘発物質を放出することによって喘息および他のアレルギー疾患の発生に重要な役割を果たすことを示す証拠は増えつつある。炎症部位では活性化された好酸球、好中球、マクロファージ、マスト細胞およびリンパ球がその数を増し、これらの細胞はそれぞれ、炎症応答全体を調節することができる（Ｂｕｓｓｅ，Ｗ．Ｗ．，１９９８，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０２：Ｓ１７−２２）。好酸球はアレルゲンによる炎症部位に顕著に認められることから、喘息およびアレルギーでは好酸球は特に興味深い（Ｋｒｏｅｇｅｌ，Ｃ．ら，１９９４，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ． ７：５１９−５４３；Ｈａｃｚｋｕ，Ａ．，１９９８，Ａｃｔａ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｈｕｎｇ． ４５：１９−２９；Ｂｏｙｃｅ，Ｊ．Ａ．，１９９７，Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｐｒｏｃ． １８：２９３−３００）。好酸球は、毒性顆粒タンパク質、炎症誘発性脂質媒介物質およびサイトカイン類の放出により、喘息における気道リモデリングおよび反応性亢進に重要な因子として関連づけられている（Ｄｕｒｈａｍ，Ｓ．Ｒ．，１９９８，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ ２８ Ｓｕｐｐｌ．２：１１−６）。
【００１２】
ＣＤ３３（例えばＳｉｇｌｅｃ−３）は、他のＳｉｇｌｅｃとの構造類似性およびシアル酸への結合能力に基づいて、Ｓｉｇｌｅｃファミリーのメンバーであるとみなされる。ＣＤ３３（Ｓｉｇｌｅｃ−３；６７ｋＤａ、ＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫのヒト配列Ｍ２３１９７、ＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫのマウス配列Ｓ７１３４５／Ｓ７１４０３）は最初はヒト骨髄性細胞から単離された（Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｒ．Ｇ．ら，１９８３，Ｂｌｏｏｄ ６２：１２４；Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｊ．Ｄ．ら，１９８４，Ｌｅｕｋ Ｒｅｓ．８：５２１；Ｐｅｉｐｅｒ，Ｓ．Ｃ．，１９８８，Ｂｌｏｏｄ ７２：３１４−３２１；Ｐｅｉｒｅｌｌｉ，Ｌ．ら，１９９３，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ． ８４：２４）。他にもＳＡＦ−２（ＥＰ０９２４２９７Ａ１）およびＳＡＦ−４（ＷＯ９８５３８４０）ならびにＡＦ１３５０２８（Ｇｅｎｂａｎｋ）などのＣＤ３３ホモログが同定されている。
【００１３】
ヒトｃＤＮＡクローン（Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｄ．Ｌ．およびＳｅｅｄ，Ｂ．，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４１：２７９７）およびネズミｃＤＮＡクローン（Ｔｃｈｉｌｉａｎ，Ｅ．Ｚ．ら，１９９４，Ｂｌｏｏｄ ８３：３１８８）の配列から、ＣＤ３３はＣセットドメインを２つしか持たないＳｉｇｌｅｃ（そのため既知のＳｉｇｌｅｃ中最小のＳｉｇｌｅｃ）をコードすると予測される。ＣＤ３３は、Ｏ−グリカン中のＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ、およびＮ−グリカン中のＮｅｕＡｃα２，３Ｆａｌβ１，３（４）ＧｌｃＮＡｃに結合する（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓ．ら，１９９５，Ｂｌｏｏｄ ８５：２００５−２０１２）。ＣＤ３３を発現させる細胞は、適切なシアロ複合糖質を持つ細胞に結合するには、脱シアリル化を受けなければならないことから、阻害的シス相互作用によって接着機能が調節または遮断されることが示唆される（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓ．ら，１９９５，前掲）。さらに、ＣＤ３３は、Ｖセットドメインに保存されたアルギニン残基を持っている。
【００１４】
ＣＤ３３は、骨髄性白血病をリンパ性白血病と区別するための臨床上重要な診断マーカーである（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｊ．Ｄ．ら，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ． ８：５２１；Ｍａｔｕｔｅｓ，Ｅ．ら，１９８５，Ｈａｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ． ３：１７９；Ｂａｉｎ，Ｂ．Ｊ．編「Ｌｅｕｋａｅｍｉａ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ ＦＡＢ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ」（１９９０）の６１頁（英国ロンドン、Ｇｏｗｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ））。ＣＤ３３発現は骨髄単球前駆細胞、単球およびマクロファージに関連づけられていることから、ＣＤ３３は骨髄細胞分化の調節に役割を果たすことが示唆される（Ｐｅｉｐｅｒ，Ｓ．Ｃ．ら，前掲；Ｐｅｉｒｅｌｌｉ，Ｌ．ら，前掲；Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｒ．Ｇ．ら，前掲；Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｊ．Ｄ．ら，前掲；Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．ら，１９９４，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４４２；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｉ．Ｄ．ら，１９８７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ７９：１１５３）。
【００１５】
ＣＤ３３に似た構造を持つＳＩＧＬＥＣタンパク質をコードすると予測される配列が過去に単離され、特徴づけられている。ＣＤ３３に似た配列には、例えば、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーから単離された配列であって、選択的スプライシングの結果という関係にあると推測されるＣＤ３３Ｌ１およびＣＤ３３Ｌ２（Ｔａｋｅｉ，Ｙ．ら，１９９７，Ｃｙｔｏｇｅｎｔ．Ｃｅｌｌ．Ｇｅｎｅｔ．７８：２９５−３００）、ヒト活性化単球ライブラリー（ＥＳＴライブラリー番号ｐＨＭＱＣＤ１４）から単離された配列であって、ほぼ同じ配列を持つことから、レプチン結合タンパク質ＯＢ−ＢＰ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ２３１９７）を発現させる遺伝子と同じ遺伝子から発現されると推測されるＳｉｇｌｅｃ−５（Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ａ．Ｌ．ら，１９９８，Ｂｌｏｏｄ ９２：２１２３−２１３２）、およびＴＦ−１ヒト赤白血球細胞株から単離されたＳｉｇｌｅｃ−６（ＯＢ−ＢＰ１）（Ｐａｔｅｌ，Ｎ．ら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７４：２２７２９−２２７３８）。Ｓｉｇｌｅｃ−７およびＳｉｇｌｅｃ−８の配列も最近になって記載されている（Ｎｉｃｏｌｌ，Ｇ．ら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７４：３４０８９−３４０９５；Ｆｌｏｙｄ，Ｈ．ら，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７５：８６１−８６６）。
【００１６】
本発明は、ヌクレオチド配列（例えばＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ａ、−Ｌ３ｂ、−Ｌ３ｃ、−Ｌ３ｄ、−Ｌ４ａ、−Ｌ５ａ、および−Ｌ５ｂ）の発見、ならびにＣＤ３３／Ｓｉｇｌｅｃ−３に対して構造相同性を有し、前記ヌクレオチド配列によってコードされる、新規Ｓｉｇｌｅｃ−タンパク質に関する。
【００１７】
（発明の概要）
本発明は、本発明のＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質をコードする単離された核酸分子およびそれらの使用方法を提供する。例えば、本発明のヌクレオチド配列には、それぞれ図２Ａ、３Ａ、４Ａ、５Ａ、７Ａ、８Ａ、９Ａ、および６Ａに記載のＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ａ、−Ｌ３ｂ、−Ｌ３ｃ、−Ｌ３ｄ、−Ｌ４ａ、−Ｌ５ａ、−Ｌ５ｂ、および−Ｌ３−９９５−２が含まれる。
【００１８】
本発明はＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質分子も提供する。本発明のＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳの具体的態様には、それぞれ図２Ｂ、３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ、７Ｂ、８Ｂ、９Ｂ、および６Ｂに記載のＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ａ、−Ｌ３ｂ、−Ｌ３ｃ、−Ｌ３ｄ、−Ｌ４ａ、−Ｌ５ａ、−Ｌ５ｂ、および−Ｌ３−９９５−２が含まれる。
【００１９】
本発明の核酸分子は、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列の一部分、例えばオリゴヌクレオチド、またはその断片を包含する。本発明の核酸分子は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）および本発明の核酸分子と反応するアンチセンス分子も包含する。
【００２０】
本発明は、様々な型のＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ遺伝子および転写物、例えば異なる対立遺伝子型、多型型、選択的前駆体転写物、成熟転写物、および選択的スプライス転写物などに相当する種々のヌクレオチド配列も包含する。さらに、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列の使用コドン変異体である組換え核酸分子も提供する。
【００２１】
本発明は、組換え発現ベクター中のＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳをコードするポリヌクレオチド、および前記発現ベクターを含む宿主−ベクター系を包含する。一態様として、本発明のＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列を含む組換えベクターを導入した種々の宿主細胞を提供する。
【００２２】
本発明は、単離されて実質的に精製されたＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳヌクレオチド配列を、核酸プローブおよびプライマーとして使用する方法、抗ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ抗体を産生させるための抗原としてＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳポリペプチドを使用する方法、およびＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳリガンドを取得および検出するためにＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳポリペプチドを使用する方法を提供する。Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳプローブおよびプライマー、ならびに抗ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ抗体は、生物学的試料中に存在する天然Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳヌクレオチド配列および天然ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質配列を検出するための診断アッセイおよびキットに役立つ。
【００２３】
また、本発明は、本発明のＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳヌクレオチド配列と反応し、よってゲノム配列の発現を乱すことができる、アンチセンス分子に関する。
【００２４】
また、本発明は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質のアゴニスト、抗体、アンタゴニストまたは活性阻害剤などの治療薬に関する。これらの組成物は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の存在または欠乏に関係する状態の予防または処置に有用である。
【００２５】
さらに本発明は、少なくとも１つのＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質と医薬的に許容できる担体とを含む、免疫系疾患、例えば喘息、白血病、または他のアレルギー性もしくは炎症性疾患を処置するための医薬組成物を提供する。さらに本発明は、少なくとも１つのＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質を認識する抗体またはその抗体断片を許容できる担体中に含む医薬組成物を提供する。
【００２６】
免疫系疾患の治療に役立つ医薬組成物を含むキットも本発明に包含される。一態様として、１または複数の本発明の医薬組成物を含むキットは、免疫系疾患、例えば喘息、白血病、または他のアレルギー性もしくは炎症性疾患を処置するために使用される。
【００２７】
（詳細な説明）
本願発明をさらに詳しく理解することができるように、以下の説明を行なう。
【００２８】
本明細書で使用する「Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ」という用語は、少なくとも１つのＩｇ様ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質テールを含む構造類似性を共有するシアル酸結合性Ｉｇ様レクチンのタンパク質ファミリーを指す。通例、Ｉｇ様ドメインは細胞外ドメインであり、Ｉｇ（Ｖ）ドメインとＩｇ（Ｃ）ドメインとを含む。ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の例には、Ｌ３ａ、Ｌ３ｂ、Ｌ３ｃ、Ｌ３ｄ、Ｌ３−９９５−２、Ｌ４ａ、Ｌ５ａ、およびＬ５ｂなどがあるが、これらに限るわけではない。
【００２９】
本明細書で使用する「Ｓｉｇｌｅｃ−１０」という用語は、複数のＩｇ様ドメイン、膜貫通ドメイン、および２つのＩＴＩＭシグナリングモチーフを持つ細胞質テールを含む、ＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃ類に対する構造類似性を共有するシアル酸結合性Ｉｇ様レクチンのタンパク質ファミリーを指す。完全長Ｓｉｇｌｅｃ−１０タンパク質は、５つのＩｇ様ドメイン（Ｉｇ−Ｄ１、Ｉｇ−Ｄ２、Ｉｇ−Ｄ３、Ｉｇ−Ｄ４およびＩｇ−Ｄ５）を含み、本願ではこれをＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３と呼ぶ。完全長Ｓｉｇｌｅｃ−１０タンパク質は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３−９９５−２とも呼ばれる。本願では、Ｓｉｇｌｅｃ−１０、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３、およびＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３−９９５−２という用語を可換的に使用する。
【００３０】
本明細書で使用する「単離された」という用語は、特定の核酸もしくはポリペプチドまたはその断片であって、夾雑物（すなわち当該特定の核酸またはポリペプチド分子とは異なる物質）が当該特定の核酸またはポリペプチドから分離されているものを意味する。
【００３１】
本明細書で使用する「精製された」という用語は、特定の核酸もしくはポリペプチドまたはその断片であって、実質的に全ての夾雑物（すなわち当該特定の核酸またはポリペプチド分子とは異なる物質）が当該特定の核酸またはポリペプチドから分離されているものを意味する。
【００３２】
本明細書では、第１のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列がそれぞれ第２の基準ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と比較して全く同じである場合に、第１のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列はそれぞれ第２の基準ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して配列「同一性」を持つという。
【００３３】
本明細書では、第１のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を第２の基準配列と比較して配列の相違がほとんど無い場合（すなわち第１配列と第２配列とがほぼ同一である場合）に、第１のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、第２の基準配列に「類似している」という。例えば、２つの配列間で異なるヌクレオチドまたはアミノ酸の割合が約６０％〜９９．９９％である場合、それら２つの配列は互いに類似していると見なされる。
【００３４】
本明細書で使用する「相補的」という用語は、水素結合によって会合して二本鎖核酸分子を形成する能力を有するプリンヌクレオチドおよびピリミジンヌクレオチドを持つ核酸分子を指す。塩基対グアニンおよびシトシン、アデニンおよびチミン、ならびにアデニンおよびウラシルは、相補性によって関連づけられる。相補的という用語は、２つの一本鎖核酸分子からなる全ての塩基対、または折りたたまれた一本鎖核酸からなる全ての塩基対に適用される。
【００３５】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳコード核酸分子の「断片」という用語は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の生物学的活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列の一部を指す。したがって、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ分子の断片は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の生物学的活性を有するペプチドをコードし、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の全アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列よりも、ヌクレオチド数が少ないヌクレオチド配列である。
【００３６】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳポリペプチド分子の「断片」という用語は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳポリペプチドの生物学的活性を有するポリペプチドの一部を指す。
【００３７】
本明細書で使用するＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳの「生物学的活性」という用語は、当該タンパク質が細胞接着分子として機能すること、および／または当該ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質が抗ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ抗体と結合する場合は、当該タンパク質が抗ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ抗体の産生を誘発することを意味する。
【００３８】
本明細書で使用する「異種」という用語は、非ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質またはその断片を指す。異種分子は、発現されたＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ遺伝子産物の単離および／または精製を容易にするために、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質に融合（例えば連結または接合）される。異種分子の例には、ヒト免疫グロブリン定常領域、Ｈｉｓタグ配列、またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）配列などがあるが、これらに限るわけではない。
【００３９】
本発明の分子
本発明は、以下に詳述するその諸側面として、タンパク質、抗体、核酸分子、組換えＤＮＡ分子、形質転換宿主細胞、製造方法、アッセイ、治療および診断方法、ならびに医薬組成物、治療組成物または診断組成物であって、いずれもＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳタンパク質またはそれらをコードする核酸が関係するものを提供する。
【００４０】
便宜上、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ（例えば、−Ｌ３ａ、−Ｌ３ｂ、−Ｌ３ｃ、−Ｌ３ｄ、−Ｌ３−９９５−２、−Ｌ４ａ、−Ｌ５ａ、および−Ｌ５ｂ）のヌクレオチド配列を、「Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ」または「本発明のＳｉｇｌｅｃヌクレオチド配列」と総称する。また、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳによってコードされるタンパク質には「ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ａ、−Ｌ３ｂ、−Ｌ３ｃ、−Ｌ３ｄ、−Ｌ３−９９５−２、−Ｌ４ａ、−Ｌ５ａ、および−Ｌ５ｂタンパク質」が含まれ、これらを「ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質」または「本発明のＳＩＧＬＥＣタンパク質」または「本発明のタンパク質」と総称する。
【００４１】
本発明の核酸分子
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質をコードする核酸分子
本発明は、Ｓｉｇｌｅｃサブグループのタンパク質に共通する類似の構造的特徴を持つ新規ポリペプチドをコードする核酸分子（ここではこれらをＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳヌクレオチド配列と呼ぶ）の発見を開示する。Ｓｉｇｌｅｃサブグループに共通する構造的特徴にはＩｇ様ドメインが含まれ、このＩｇ様ドメインは細胞外にあって、Ｃセットドメインと、Ｂ鎖およびＥ鎖間に珍しいシート内ジスルフィド橋を持つＶセットドメインとを含む（Ａ．Ｆ．ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＡ．Ｎ．Ｂａｒｃｌａｙ，１９８８，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：３８１−４０５；Ａ．Ｆ．Ｗｉｌｌｉａｍｓら，１９８９，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ． ５４：６３７−６４７；Ｌ．Ｐｅｄｒａｚａら，１９９０，Ｊ．Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌ． １１１：２６５１−２６６１）。Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳのヌクレオチド配列は、それぞれ２つ（例えば−Ｌ４、−Ｌ５ａ、および−Ｌ５ｂ）ないし３つ（例えば−Ｌ３ａ、−Ｌ３ｂ、−Ｌ３ｃ、および−Ｌ３ｄ）のＣセットドメインを持ちうるポリペプチドをコードする。
【００４２】
特定の態様では、新規ヌクレオチド配列は、それぞれ図２Ａ、３Ａ、４Ａ、５Ａ、７Ａ、８Ａ、９Ａ、および６Ａに示すように、Ｌ３ａ、Ｌ３ｂ、Ｌ３ｃ、Ｌ３ｄ、Ｌ４、Ｌ５ａ、Ｌ５ｂ、およびＬ３−９９５−２と呼ばれる（配列番号１〜７および２７）。これらのヌクレオチド配列は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質および／またはその断片をコードし、コードされるタンパク質は生物学的活性を示し、例えば細胞接着分子として機能する。
【００４３】
例えば、Ｌ３ａをコードする単離されたＳｉｇｌｅｃ核酸は、図２Ａに示す配列の＋１２位にあるコドンＧＧＣから始まって、＋１７６０位のコドンＣＣＡで終わっている。Ｌ３ｂをコードする単離されたＳｉｇｌｅｃ核酸は、図３Ａに示す配列の＋３位にあるコドンＧＡＴから始まって、＋１８６８位のコドンＣＡＡで終わっている。Ｌ３ｃをコードする単離されたＳｉｇｌｅｃ核酸は、図４Ａに示す配列の＋１２位にあるコドンＧＧＡから始まって、＋１７３６位のコドンＣＡＡで終わっている。Ｌ３ｄをコードする単離されたＳｉｇｌｅｃ核酸は、図５Ａに示す配列の＋２位にあるコドンＣＣＣから始まって、＋１２９１位のコドンＡＴＧで終わっている。Ｌ３をコードする単離されたＳｉｇｌｅｃ核酸は、図６Ａに示す配列の＋１位にあるコドンＡＴＧから始まって、＋２０９１位のコドンＣＡＡで終わっている。Ｌ４ａをコードする単離されたＳｉｇｌｅｃ核酸は、図７Ａに示す配列の＋１位にあるコドンＣＴＧから始まって、＋１３９８位のコドンＧＧＣで終わっている。Ｌ５ａをコードする単離されたＳｉｇｌｅｃ核酸は、図８Ａに示す配列の＋４３位にあるコドンＡＴＧから始まって、＋１４３１位のコドンＡＧＡで終わっている。Ｌ５ｂをコードする単離されたＳｉｇｌｅｃ核酸は、図９Ａに示す配列の＋５７位にあるコドンＡＴＧから始まって、＋９１４位のコドンＡＧＴで終わっている。
【００４４】
Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ４（本明細書ではＬ４ａともいう）、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ５ａ、およびＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ５ｂは一括して、２０００年８月１０日に、ブダペスト条約の規定に基づいて、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（バージニア州２０１１０−２２０９ユニバーシティ・ブルバード１０８０１）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−２３４３を与えられている。Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ４（本明細書ではＬ４ａともいう）、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ５ａ、およびＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ５ｂの各核酸配列を、それぞれ図６Ａ、７Ａ、８Ａおよび９Ａに記載する。これらの核酸配列は、特異的プローブへのハイブリダイゼーションまたは制限酵素解析などの標準的分離技術によって、一括寄託物から容易に分離することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」１９８９、コールドスプリングハーバー研究所、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）。
【００４５】
本発明の実施にあたって、本発明のヌクレオチド配列は、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列の単離された完全長または部分ｃＤＮＡ分子もしくはオリゴマーであることができる。Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳヌクレオチド配列は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質のシグナルペプチド領域、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および／または細胞内ドメインの全部または一部をコードすることができる。
【００４６】
単離されたＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列
本発明の核酸分子は、好ましくは、核酸分子がＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列以外の配列を持つ夾雑核酸分子から実質的に分離されている単離型である。当業者は、核酸単離法を利用して、単離されたＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列を容易に得ることができる。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８９）を参照されたい。本発明は、組換えＤＮＡ技術または化学合成法によって製造される単離されたＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列も提供する。本発明は、様々な哺乳動物種、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ、そして好ましくはヒトなどから単離されるヌクレオチド配列も提供する。
【００４７】
単離された核酸分子には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、および関連分子、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳコード配列またはその一部に相補的な核酸分子、ならびにＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質をコードする核酸配列にハイブリダイズするものが含まれる。好ましい核酸分子は、本明細書に開示するヌクレオチド配列と同一であるかほぼ同一である（例えば類似している）ヌクレオチド配列を持つ。具体的には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、リボザイム、およびアンチセンス分子などが考えられる。
【００４８】
同一および変異Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列
本発明は、本明細書に開示するＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列と同一であるか類似するポリヌクレオチド配列を持つ単離された核酸分子を提供する。したがって、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１〜７または２７に記載する特定のＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列と同一であってよい。あるいは、ポリヌクレオチド配列は、本明細書に開示する配列と類似していてもよい。
【００４９】
本発明の一態様は、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳヌクレオチド配列に対して配列同一性または配列類似性を示す核酸分子、例えば図２Ａ、３Ａ、４Ａ、５Ａ、７Ａ、８Ａ、９Ａおよび６Ａ（配列番号１〜７または２７）に示す本発明の配列と少なくとも６０％〜９９．９％の配列類似性または１００％までの配列同一性を有する分子を提供する。好ましい態様は、本発明のＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列（例えば配列番号１〜７または２７）に対して、約７５％〜９９．９％の配列類似性を示す核酸分子を提供し、より好ましい態様は約８６％〜９９．９％の配列類似性を有する分子を提供し、最も好ましい態様は１００％の配列同一性を有する分子を提供する。
【００５０】
選択的スプライスＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列
本発明の核酸分子は、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳの選択的スプライス転写物に相当する核酸配列を含む。一般に、選択的スプライス転写物は、以下の段階を経て細胞中で生成することができる成熟ＲＮＡ転写物である：（１）細胞はイントロン含有遺伝子から前駆体ＲＮＡ転写物を転写し、この際、前駆体ＲＮＡ転写物には全てのイントロン配列が含まれる；（２）細胞は異なる前駆体転写物から異なるイントロンを切り出して、それぞれ異なるイントロンを持つ不均質な成熟ＲＮＡ転写物の集団をもたらす；（３）細胞は選択的スプライス転写物の一部または全部を翻訳して、同じイントロン含有遺伝子配列によってコードされる不均質なタンパク質の集団を生成する。このように細胞は、共通する前駆体転写物の選択的スプライシングの結果という関係にある不均質なＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ ＲＮＡ転写物の集団を産生することができる。さらに、選択的スプライス転写物から翻訳されるＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質は、異なる生物学的活性を持ちうる。
【００５１】
例えば、本発明のポリヌクレオチド配列はイントロンを含み、以下の３種類のＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質群をコードすることができる。すなわち（１）図２Ａ、３Ａ、４Ａ、および５Ａに記載のヌクレオチド配列（配列番号１〜４）、これらは互いに関係し、それぞれＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質−Ｌ３ａ、−Ｌ３ｂ、−Ｌ３ｃ、および−Ｌ３ｄ（例えば、それぞれ図２Ｂ、３Ｂ、４Ｂ、および５Ｂ；それぞれ配列番号８、９、１０および１１）をコードするＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ａ、−Ｌ３ｂ、−Ｌ３ｃ、および−Ｌ３ｄの選択的スプライス転写物に相当するｃＤＮＡクローンを表す；（２）図７Ａに記載のヌクレオチド配列（配列番号５）、これはＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−４ａタンパク質（図７Ｂ、配列番号１２）をコードするＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ４ａの選択的スプライス転写物に相当するｃＤＮＡクローンを表す；（３）図８Ａおよび９Ａに記載のヌクレオチド配列（配列番号６〜７）、これらは互いに関係し、それぞれＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−５ａおよび−５ｂタンパク質（例えば図８Ｂおよび９Ｂ；それぞれ配列番号１３および１４）をコードするＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ５ａおよび−Ｌ５ｂの選択的スプライス転写物に相当するｃＤＮＡクローンを表す。本発明は、完全長Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ ｃＤＮＡのハイブリッドコンストラクト（下記実施例１４）を表すＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３−９９５−２のヌクレオチド配列（図６Ａ；配列番号２７）を持つ核酸分子も提供する。
【００５２】
相補配列
本発明は、図２Ａ、３Ａ、４Ａ、５Ａ、７Ａ、８Ａ、９Ａ、および６Ａに記載の配列（配列番号１〜７および２７）（好ましくはその中のベクター配列を除くコード配列）に相補的な核酸分子も提供する。相補性は完全でも部分的でもよい。完全に相補的とは、配列番号１〜７および２７に記載の全配列に対する相補性を意味する。部分的に相補的とは、配列番号１〜７および２７に記載の配列の一部分だけに対する相補性を意味する。
【００５３】
Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列
さらに本発明は、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件でＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳヌクレオチド配列（例えば配列番号１〜７または２７）に選択的にハイブリダイズするヌクレオチド配列も提供する。通例、標準的な高ストリンジェンシー条件でのハイブリダイゼーションは、配列相補性が約７０％〜約１００％異なる２つの相補的核酸分子の間で起こる。核酸分子間の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションが、例えば同一性の程度、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー、およびハイブリダイズする鎖の長さなどに依存することは、当業者には明らかである。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションを行なうための方法および処方は当技術分野では周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８９）などに見いだすことができる。
【００５４】
一般に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、（１）洗浄に低イオン強度および高温、例えば５０℃の０．０１５Ｍ ＮａＣｌ／０．００１５Ｍ酒石酸ナトリウム／０．１％ＳＤＳを使用する条件、または（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミドなどの変性剤を使用する条件、例えば４２℃で、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、および７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを使用する条件である。
【００５５】
ストリンジェントな条件のもう一つの例では、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０ｍｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸を４２℃で使用し、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、４２℃で洗浄を行なう。当業者は、明瞭で検出可能なハイブリダイゼーションシグナルを得るのに適したストリンジェンシー条件を容易に決定し、変更することができる。
【００５６】
Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列の断片
さらに本発明は、本発明のＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列の断片、例えば本明細書に開示するＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列（配列番号１〜７、１５および２７に示すもの）の一部を有する核酸分子も提供する。断片の大きさはその用途によって決まる。例えば、断片がＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ細胞外ドメインをコードするように選ばれる場合、当業者はこのドメインをコードするのに十分な大きさのポリヌクレオチド断片を選択することになる。断片が核酸プローブまたはＰＣＲプライマーとして使用される場合は、プロービングまたはプライミング中に得られる偽陽性の数が比較的少なくなるように断片長が選択される。あるいは、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列の断片を使って、例えばヒト免疫グロブリン配列またはＧＳＴ配列などの非Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列に融合されたＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列を有する組換え融合遺伝子を構築してもよい。
【００５７】
本発明の核酸分子、その断片、ならびにプローブおよびプライマーは、例えばライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニング、または遺伝子転写および／または遺伝子発現の解析手段としてのｍＲＮＡ転写物の検出および定量など、様々な分子生物学技術に役立つ。好ましくは、プローブおよびプライマーはＤＮＡである。理論的および実用的考察により、少なくとも１５塩基対のプローブまたはプライマー長が提案される（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５２：４３２−４４２（１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）のＷａｌｌａｃｅ，Ｂ．およびＭｉｙａｄａ，Ｇ．著「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」）。
【００５８】
選択的ハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーとして特に有用なＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳヌクレオチド配列の断片は、当技術分野で知られる方法を使って、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳヌクレオチド配列から容易に同定することができる。例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ転写物のうちＳＩＧＬＥＣタンパク質の細胞外ドメインをコードする部分を検出するＰＣＲプライマーのセットは、米国特許第４，９６５，１８８号に記載のＰＣＲ法によって作製することができる。本発明のプローブおよびプライマーは、当業者に周知の方法によって製造することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲）。好ましい一態様では、プローブおよびプライマーを化学合成法によって合成する（Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，英国オックスフォード）。
【００５９】
本発明の一態様は、本発明の核酸分子またはその特定部分の特異的増幅を可能にするＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列に相補的な核酸プライマーを提供する。もう一つの態様は、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列またはその一部、例えば細胞外ドメインの全部または一部に選択的または特異的にハイブリダイズさせるための相補的な核酸プローブを提供する。
【００６０】
融合遺伝子
本発明は、例えば、発現したＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ遺伝子産物の単離および／または精製を容易にするためにＨＩＳタグ配列（Ｋｒｏｌｌ，Ｄ．Ｊ．ら，１９９３，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２：４４１−５３）、またはＧＳＴ、またはヒト免疫グロブリン配列などの非Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列に融合（例えば連結または接合）されたＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列を含む融合遺伝子を提供する。好ましい融合遺伝子は、非Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列に有効な形で連結されたＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列、例えば非Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列とインフレームで融合されたＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列を含む。
【００６１】
あるいは、本発明の融合遺伝子は、異なる哺乳類から単離されたＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列に融合されたＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列を含む。例えば、本明細書に開示するヒトＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列を、異なるヒトまたは異なる動物種から単離されたＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列に融合することができる。
【００６２】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質をコードする使用コドン変異体
本発明は、本明細書に開示するＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳヌクレオチド配列とは異なるが、予想されるＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳポリペプチド配列または生物学的活性には変化がない単離された使用コドン変異体を提供する。例えば、多くのアミノ酸は２以上のトリプレットによって指定される。遺伝暗号の縮重により、同じアミノ酸を指定するコドン、すなわち同義コドンが存在しうる。アミノ酸アルギニン（Ｒ）をコードするヌクレオチドコドンＣＧＴ、ＣＧＧ、ＣＧＣおよびＣＧＡ、またはアミノ酸アスパラギン酸（Ｄ）をコードするコドンＧＡＴおよびＧＡＣなどが、その例である。したがって、タンパク質は、詳細なヌクレオチド配列は異なるが、それでもなお同じ配列を持つタンパク質をコードする１または複数の核酸分子によってコードされうる。アミノ酸コード配列は以下の通りである。
【表２】
2004516012.tif 000005
【００６３】
使用コドン変異体は組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。コドンは、特定の原核または真核発現宿主におけるＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ転写物またはＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳポリペプチドの産生レベルが最適になるように、その宿主細胞が利用するコドンの頻度に従って選択することができる。ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を変化させる他の理由としては、長い半減期または増加した安定性など、より望ましい性質を持つＲＮＡ転写物を産生させることが挙げられる。遺伝コードの縮重の結果として、各ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳポリペプチドをコードする多数の変異Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳヌクレオチド配列を単離することができる。したがって、本発明では、考えうる全てのトリプレットコドンを選択することにより、本明細書に開示するＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳポリペプチドの生物学的活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の考えうる組合わせを全て作製することができる。この特定態様では、各変異ヌクレオチド配列がそれぞれ図２Ｂ、３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ、７Ｂ、８Ｂ、９Ｂまたは６Ｂに記載のアミノ酸配列（配列番号８〜１４または２８）と配列同一性を持つポリペプチドをコードするような形で配列番号１〜７または２７に記載の配列とは異なる、単離されたヌクレオチド配列が提供される。
【００６４】
Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列の対立遺伝子型
本発明では、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳヌクレオチド配列の代替的対立遺伝子型も考えられる。これらの代替的対立遺伝子型は同じ種の異なる対象から単離することができる。
【００６５】
通例、天然遺伝子配列の単離された対立遺伝子型には、野生型および突然変異型対立遺伝子が含まれる。野生型Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ遺伝子は、例えば細胞接着分子としての機能などの正常なＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳの生物学的活性を有するＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質をコードするだろう。突然変異型Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ遺伝子配列は、例えば細胞接着分子として機能しないなど、正常なＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質には見られない活性を有するＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質をコードするかもしれない。あるいは、突然変異型Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ遺伝子配列は、正常な活性を有するＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質をコードするかもしれない。
【００６６】
自然に起こる対立遺伝子変異により、ある集団内の個体には、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ分子の活性を持つペプチドをコードする核酸の１または複数のヌクレオチド（約３〜４％までのヌクレオチド）に変異が存在しうることは、当業者には理解されるだろう。そのようなヌクレオチド変異およびその結果生じるアミノ酸多型は全て本発明の範囲に包含される。
【００６７】
Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列の多型型
本発明は、配列番号１〜７または２７に記載のＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳヌクレオチド配列の特定多型型のヌクレオチド配列を提供する。通例、天然遺伝子配列の単離された多型型は、同じ種の異なる対象から単離される。多型型は、アミノ酸コドン配列を変化させても変化させなくてもよい１または複数のヌクレオチド置換を有する配列を含む。これらの置換は、野生型ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の生物学的活性を持つタンパク質をコードするか、または異なる活性を持つ、もしくは活性を持たないＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の突然変異多型型をコードする野生型Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ遺伝子をもたらす。
【００６８】
誘導体型核酸分子
本発明の核酸分子には、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子とは異なる誘導体型核酸分子およびアンチセンス分子も含まれる。誘導体分子には、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡに塩基対形成依存的に結合するペプチド核酸（ＰＮＡ）ならびにホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデートおよびメチルホスホン酸分子などの非核酸分子が含まれる（Ｚａｍｅｃｎｉｋ，Ｐ．Ｃ．ら，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ７５：２８０２８４；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｐ．Ｃ．ら，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８３：４１４３−４１４６）。ペプチド核酸分子は、リジンなどのアミノ酸残基およびアミノ基が付加されている核酸オリゴマーを含む。抗遺伝子剤とも呼ばれるこれらの小分子は、それらの核酸相補（テンプレート）鎖に結合することによって、転写伸長を停止させる（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．ら，１９９３，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ ８：５３−６３）。ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの類似体を合成する方法の概説は、例えばＦ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ」１９９１，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク、Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，英国オックスフォードなどに見いだすことができる。また、アンチセンスＲＮＡ技術の方法は、米国特許第５，１９４，４２８号および第５，１１０，８０２号に記載されている。当業者は、これらの種類の核酸分子を、本明細書に記載のＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳポリヌクレオチド配列を使って、容易に取得することができる。例えば、Ｅｇｈｏｌｍら「Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ ａｎｄ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（１９９２）の３２５−３２８頁、または米国特許第５，５３９，０８２号などを参照されたい。
【００６９】
Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳポリペプチドをコードするＲＮＡ
本発明は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質をコードする核酸分子を提供する。特に、本発明のＲＮＡ分子は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質をコードする単離された完全長もしくは部分ｍＲＮＡ分子またはＲＮＡオリゴマーであることができる。
【００７０】
本発明のＲＮＡ分子には、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡのセンス鎖に、塩基対により、塩基依存的に、特異的結合をするアンチセンスＲＮＡ分子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはホスホロチオエート誘導体などの非核酸分子も含まれる。当業者は、本明細書に記載のＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列を使って、これらの種類の核酸分子を容易に取得することができる。
【００７１】
検出可能なマーカーで標識された核酸分子
本発明のＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ核酸分子の態様には、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列またはその任意の特定部分の特異的増幅を可能にするＤＮＡおよびＲＮＡプライマー、ならびにＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列またはその一部に選択的または特異的にハイブリダイズするプローブが含まれる。核酸プローブは検出可能なマーカーで標識することができる。検出可能なマーカーの例には、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレーターまたは酵素などがあるが、これらに限るわけではない。標識ＤＮＡおよびＲＮＡプローブを作製する技術は周知である。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８９）を参照されたい。
【００７２】
本発明のタンパク質およびポリペプチド
本発明は新規ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質も提供する。ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の一態様は、図６Ｂ（配列番号２８）に示すＡｌａ１４１からＳｅｒ１９８までのアミノ酸配列を含む。ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質のもう一つの態様は、図６Ｂ（配列番号２８）に示すＡｌａ１４１からＳｅｒ１９８までのアミノ酸配列を含み、配列番号１〜７および２７のいずれか一つに示す核酸に相補的な核酸配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる。ＳＩＧＬＥＣタンパク質のもう一つの態様は、配列番号１〜７および２７のいずれか一つに示す核酸に相補的な核酸分子にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含む。本発明の新規タンパク質配列の特定態様には、ＳＩＧＬＥＣ−ＭＢＳ−Ｌ３ａ、−Ｌ３ｂ、−Ｌ３ｃ、−Ｌ３ｄ、−Ｌ４、−Ｌ５ａ、−Ｌ５ｂ、および−Ｌ３−９９５−２（それぞれ配列番号８〜１４および２８に記載）が含まれる。ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質は数多くの形で体現することができ、好ましくは単離されたまたは精製された形で体現することができる。
【００７３】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質は、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ、そして好ましくはヒトなどの哺乳動物種から単離することができる。あるいは、精製されたＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質を、合成、半合成、または組換え法によって製造することもできる。
【００７４】
当業者は、標準的な単離および精製法を利用して、単離および／または精製されたＳＩＧＬＥＣタンパク質を容易に得ることができる（Ｍａｒｃｈａｋ，Ｄ．Ｒ．ら「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ」１９９６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州プレーンビュー）。単離および精製の性質と程度は用途に依存する。例えば、精製ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質分子は、抗体または他のリガンドへのＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳの結合を損なう他のタンパク質または分子を実質的に含まないだろう。ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の態様には、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の生物学的活性を有する精製されたＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質またはその断片が含まれる。一つの形態として、そのような精製されたＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質またはその断片は、抗体または他のリガンドを結合する能力を維持している。
【００７５】
細胞では、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ遺伝子配列は、シグナルペプチドおよびイントロンを含むと予想されるので、翻訳後修飾の結果として、細胞は様々な型の特定ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質を産生すると予期される。例えば、様々な型の単離されたＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳとして、シグナルペプチドを含む前駆体型、シグナルペプチドを含まない成熟型、および分子内切断などの翻訳後事象の結果生じる異なる型のＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質などを挙げることができる。
【００７６】
本発明は、本明細書に開示するＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ配列の予想配列と同一なアミノ酸配列を有する単離され精製されたタンパク質、ポリペプチドおよびその断片を提供する。したがって、アミノ酸配列は、配列番号８〜１４または２８のいずれかに記載の特定ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ配列と同一であってよい。
【００７７】
本発明は、本明細書に開示する予想ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質配列（例えば図２Ｂ、３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ、７Ｂ、８Ｂ、９Ｂおよび６Ｂ；配列番号８〜１４または２８）と比較して配列変異を有するタンパク質も包含する。例えば、変異配列を有するタンパク質には、対立遺伝子変異体、突然変異体、保存的置換変異体、および他の哺乳類生物から単離されたＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質などが含まれる。アミノ酸配列は本明細書に開示する配列に類似しているだろう。例えば、２つのタンパク質配列間で相違するアミノ酸残基の割合が約６０％〜９９．９９％である場合、それら２つのタンパク質配列は互いに類似しているとみなされる。
【００７８】
本発明は、１または複数のアミノ酸置換、挿入、欠失、切断またはフレームシフトを有する突然変異体型ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質をコードするＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳの突然変異型対立遺伝子を包含する。そのような突然変異体型タンパク質は通例、野生型タンパク質と同じ生物学的活性は示さない。Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳの突然変異型対立遺伝子は、例えば細胞接着分子として機能するなど野生型ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質と同じ生物学的活性を持つＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質をコードする場合もしない場合もありうる。
【００７９】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質のもう一つ変異体は、１または複数のアミノ酸置換によって相違しているアミノ酸配列を持ってもよい。この変異体は、置換アミノ酸が構造的または化学的に類似する性質を有する保存的アミノ酸変化（例えばイソロイシンによるロイシンの置換）を持つことができる。あるいは、変異体は、非保存的アミノ酸変化（例えばトリプトファンによるグリシンの置換）を持ってもよい。同様の軽微な変化には、アミノ酸の欠失もしくは挿入またはその両方も含めることができる。どのアミノ酸残基を、そしてどのくらいの数のアミノ酸残基を置換、挿入または欠失させることができるかを決定する際の指針は、当技術分野で周知のコンピュータープログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを使って見いだすことができる。
【００８０】
保存的アミノ酸置換は、多くの場合、タンパク質のコンフォメーションまたは生物学的活性を変化させずに、タンパク質に施すことができる。そのような変化には、疎水性アミノ酸イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）およびロイシン（Ｌ）の間で相互に行なわれる置換；アスパラギン酸（Ｄ）によるグルタミン酸（Ｅ）の置換またはその逆；グルタミン（Ｑ）によるアスパラギン（Ｎ）の置換；およびセリン（Ｓ）によるスレオニン（Ｔ）の置換またはその逆が含まれる。特定アミノ酸の環境およびタンパク質の三次元構造におけるその役割に応じて、他の置換も、保存的であるとみなすことができる。例えば、グリシン（Ｇ）とアラニン（Ａ）は可換的であることが多く、アラニン（Ａ）とバリン（Ｖ）も同様である。比較的疎水性であるメチオニン（Ｍ）は、多くの場合、ロイシンおよびイソロイシンと交換することができ、バリンと交換できる場合もある。リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）は、アミノ酸残基の重要な特徴がその電荷であってこれら２つのアミノ酸残基の異なるｐＫが重要でないような部位では、交換可能である場合が多い。特定の環境ではさらに他の変化も保存的であるとみなすことができる。
【００８１】
本発明のタンパク質は、例えばＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質に関連するエピトープを特異的に結合する抗体の産生を誘発する能力などのＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の生物学的活性を示す。したがって、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質またはそのオリゴペプチドは、適切な動物または細胞における特異的免疫応答を誘導し、かつ／または特異的抗体と結合することができる。
【００８２】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ細胞外ドメイン
本発明は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の細胞外および／または細胞質ドメインを持つ単離されたタンパク質を提供する。
【００８３】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の細胞外ドメインは複数のＩｇ様ドメインを含む（図１）。完全長ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質（ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３−９９５−２ともいう）は、５つのＩｇ様ドメイン、すなわちＩｇ−Ｄ１（Ｖセット、Ｓｅｒ１４〜Ｔｈｒ１４０）、Ｉｇ−Ｄ２（Ｃセット、Ａｌａ１４１〜Ａｌａ２３５）、Ｉｇ−Ｄ３（Ｃセット、Ａｌａ２５２〜Ｇｌｎ３４１）、Ｉｇ−Ｄ４（Ｃセット、Ｖａｌ３５８〜Ｈｉｓ４４３）、およびＩｇ−Ｄ５（Ｃセット、Ｔｙｒ４４４〜Ｐｒｏ５３８）を含んでいる（図２５）。
【００８４】
既知のＳｉｇｌｅｃタンパク質（例えばＣＤ３３）の細胞外ドメインは、シアリル化された細胞表面と結合し（Ｋｅｌｍ，Ｓ．ら，１９９６，前掲；Ｋｅｌｍ，Ｓ．ら，１９９８，前掲；Ｖｉｎｓｏｎ，Ｍ．ら，１９９６，前掲）、細胞接着または細胞シグナリングを媒介すると推測される。ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の細胞外ドメインがシアリル化された細胞表面グリカンと結合するかどうかを決定するために、種々のタンパク質結合解析を行なうことができる。結合解析には、蛍光標示式細胞分取（例えばＦＡＣＳ）などの方法、ＥＬＩＳＡ解析、および細胞結合解析が含まれる。
【００８５】
ＦＡＣＳ解析は、完全長ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質、その断片、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ融合タンパク質、または突然変異型ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質を使って行なわれる。好ましい方法では、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳの細胞外ドメインを持つポリペプチド、例えば図２３または２４に記載の融合タンパク質などを使用する。結合試験は、混合白血球の集団または造血細胞株を、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の細胞外ドメインを持つポリペプチドと反応させることによって行なう。
【００８６】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の結合特異性も、固形支持体を使って決定される。ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質をＥＬＩＳＡプレートなどの固形支持体に固定化する。使用するＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質には、完全長ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質、その断片、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ融合タンパク質、または突然変異型ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質が含まれる。細胞をシアリダーゼで前処理する。固定化したタンパク質を、混合白血球、混合顆粒球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、および単球を含む細胞または細胞株と反応させる。
【００８７】
あるいは、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の結合特異性は、種々の細胞タイプまたは細胞株を、本発明のＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質を発現させる細胞と反応させることによって解析される。このタンパク質発現細胞は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳの一過性または長期間発現をもたらす方法を含む当技術分野でよく知られる方法を使って作出される。このタンパク質発現細胞は哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、細菌細胞、または酵母細胞であってよい。このタンパク質発現細胞は完全長ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質もしくはその断片、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ融合タンパク質、または突然変異型ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質を発現させることができる。このタンパク質発現細胞を、混合白血球、混合顆粒球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、および単球を含む種々の細胞タイプまたは細胞株と反応させる。反応する細胞をシアリダーゼで前処理する。
【００８８】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ細胞質ドメイン
既知のＳｉｇｌｅｃタンパク質の細胞質ドメインは、細胞内でのリン酸化を媒介するＩＴＡＭまたはＩＴＩＭモチーフ内にチロシン残基を持っている。例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−３（例：ＣＤ３３）の細胞質テールは、リン酸化されるとＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２を動員するＩＴＩＭモチーフを２つ含んでいる（Ｔａｙｌｏｒ，Ｖ．ら，１９９９，前掲）。
【００８９】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の細胞質テールドメインがリン酸化を媒介するかどうかを決定するために、種々の方法を実行することができる。それらの方法にはキナーゼアッセイが含まれる。
【００９０】
キナーゼアッセイは、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質を、リン酸化活性を提供するキナーゼと反応させることによって行なわれる。キナーゼを、完全長ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質、その断片、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ融合タンパク質または突然変異型ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質を含むＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質と反応させる。
【００９１】
突然変異型ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の細胞質ドメイン内の１または複数のアミノ酸の特異的置換、例えば特定アミノ酸の突然変異（チロシンからフェニルアラニン、ロイシン、トリプトファンまたはＴｈｒへの変異など）を含んでよい（図１５）。突然変異型ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の例には、図１５に示し、実施例１２で説明するように、５９７、６４１、６６７または６９１位の少なくとも１つのチロシンがフェニルアラニンで置換されているＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質が含まれるが、これらに限るわけではない。
【００９２】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の細胞質テール中のどの突然変異が種々のチロシンキナーゼによるリン酸化に影響を及ぼすかを知ることにより、当業者は、ＳＩＧＬＥＣ媒介性細胞シグナリングに影響を及ぼすリガンドをスクリーニングする方法を開発することができる。例えば、図６Ｂの５９７、６４１、６６７または６９１位のいずれかにあるチロシンをフェニルアラニン、ロイシン、トリプトファンおよびスレオニンで置換しても、ＳＩＧＬＥＣ媒介性細胞シグナリングの媒介は起こりうる。さらに、そのように突然変異させた細胞質ドメイン内の部位に結合するリガンドを、ＳＩＧＬＥＣ媒介性細胞シグナリングが調節されるように、すなわち細胞シグナリングがアップレギュレートまたはダウンレギュレートされるように修飾することもできる。
【００９３】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の製造方法
本発明のＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質は組換え法によって製造することができる。高収率が望まれる場合は、組換え法が好ましい。組換え法では、クローン化された遺伝子を適切な宿主細胞で発現させる。例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列を持つ発現ベクターを宿主細胞に導入した後、前記配列によってコードされるＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質のインビトロ産生が可能な条件で、宿主細胞を培養する。
【００９４】
例えば、一般論として、組換えＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の産生には、宿主／ベクター系および以下のステップが必要になりうる。ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質またはその断片をコードする核酸分子、例えば配列番号１〜７または２７に開示するポリヌクレオチドのいずれか一つを得ることができる。次に、上述のように、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳコード核酸分子を、好ましくは、発現ベクターに、適切な発現制御配列が有効な形で連結されるように挿入して、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳコード配列を含む発現ベクターを作製することができる。発現ベクターは、標準的な形質転換法によって、適切な宿主に導入することができ、その結果得られた形質転換宿主を、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の産生と回収が可能な条件で培養する。例えば、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ遺伝子が誘導性プロモーターの制御下にある場合、適切な成長条件には、適当な誘導物質が含まれる。このようにして産生されたＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質は成長培地から単離されるか、または細胞から直接単離される。多少の不純物があってもかまわない場合は、タンパク質の回収および精製が必要ないかもしれない。当業者は、当技術分野で知られる適当な宿主／発現系（Ｃｏｈｅｎら，前掲；Ｍａｎｉａｔｉｓら，前掲）を、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳコード配列を使ったＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の製造に利用できるように、容易に適合させることができる。
【００９５】
本発明のＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質およびその断片は、化学合成法によって製造することができる。ポリペプチドの固相化学合成の原理は当技術分野では周知であり、この分野に関係する概説書に見いだすことができる（Ｄｕｇａｓ，Ｈ．およびＰｅｎｎｅｙ，Ｃ．，１９８１，「Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」５４−９２頁，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ニューヨーク）。ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳポリペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３０Ａペプチド合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州フォスターシティー）およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓが提供する合成サイクルを利用する固相法によって合成することができる。ｔ−ブトキシカルボニル保護アミノ酸などの保護アミノ酸および他の試薬類は多くの化学薬品供給業者から販売されている。
【００９６】
本発明は、化学修飾タンパク質などの誘導体型タンパク質分子を提供する。アルキル、アシル、またはアミノ基による水素の置換は、そのような修飾の例である。ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質誘導体は天然ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の生物学的活性を保っている。
【００９７】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳをコードする組換え核酸および分子
本明細書に記載するＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）も提供する。本明細書にいうｒＤＮＡ分子は、インビトロでの分子操作が施されたＤＮＡ分子である。ｒＤＮＡ分子を作製する方法は当技術分野では周知である。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８９）を参照されたい。本発明の好ましいｒＤＮＡ分子では、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質またはその断片をコードする配列が、１または複数の発現制御配列および／またはベクター配列に有効な形で連結されている。
【００９８】
ベクター
本発明の核酸分子は、非Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列に連結されたＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列の配列またはその一部をそれぞれに含む組換え分子であってよい。例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列をベクターに有効な形で融合して、組換え分子を作製することができる。
【００９９】
ベクターという用語には、例えばプラスミド、コスミド、およびファージミドが含まれるが、これらに限るわけではない。好ましいベクターは、適当な宿主細胞でのｒＤＮＡの複製をもたらすレプリコンを含む自律的に複製するベクターであることができる。あるいは、好ましいベクターは、宿主細胞への組換えベクターの組込みをもたらす。種々のウイルスベクター、例えば数多くの周知のレトロウイルスおよびアデノウイルスベクターなども使用することができる（Ｂｅｒｋｎｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６−６２９）。
【０１００】
好ましいベクターは、原核宿主細胞または真核宿主細胞におけるＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ転写物またはポリペプチド配列の発現を可能にする。好ましいベクターには、大腸菌などの適当な宿主において、挿入されたＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列の転写を可能にし、有効な形で連結されたＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列の発現（例えば転写および／または翻訳）の調節に使用することができるプロモーター配列などの発現制御要素を含む発現ベクターが含まれる。
【０１０１】
発現制御要素は当技術分野では知られており、例えば誘導性プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、エンハンサー、転写ターミネーター、および他の転写調節要素などが含まれるが、これらに限るわけではない。翻訳に関与する発現制御要素は当技術分野では他にも知られており、例えばシャイン・ダルガノ配列（例えば原核宿主細胞）、開始コドン、終止コドンなどがある。
【０１０２】
効率の良いＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列の翻訳には特異的開始シグナルも必要だろう。これらのシグナルにはＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳの開始コドンおよび上流配列を適当な発現ベクターに挿入する場合は、翻訳制御シグナルを追加する必要はないかもしれない。しかし、コード配列だけまたはその一部だけを挿入する場合は、ＡＴＧ開始コドンを含む外来の転写制御シグナルを用意しなければならない。さらに、開始コドンは、インサート全体の転写が保証されるように、正しい読み枠になければならない。外来転写要素および開始コドンは、天然起源でも合成起源でも、様々な起源を持つことができる。発現効率は、使用する細胞系に適したエンハンサーを含めることによって向上させることができる（Ｓｃｈａｒｆ，Ｄ．ら，１９９４，Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ．Ｄｉｆｆｅｒ． ２０：１２５−６２；Ｂｉｔｔｎｅｒら，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３：５１６−５４４）。
【０１０３】
真核宿主細胞におけるＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列の発現に好ましいベクターは、例えば昆虫細胞における発現用のバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターなどの発現制御要素を含む。他の発現制御要素には、植物細胞のゲノムに由来するプロモーターまたはエンハンサー（例えば熱ショック遺伝子、ＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子、貯蔵タンパク質遺伝子）、ウイルスプロモーターまたはリーダー配列、または植物ウイルスに由来するもの、および哺乳類遺伝子または哺乳類ウイルス由来のプロモーターまたはエンハンサーが含まれる。
【０１０４】
好ましいベクターは、薬剤耐性（例えばアンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性）を付与する遺伝子産物をコードする選択可能マーカー遺伝子を少なくとも１つは含む。ベクターは、外来ＤＮＡ配列の挿入に便利な複数のエンドヌクレアーゼ制限部位も含む。本発明のＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質をコードする組換え発現ベクターを作製する方法は当技術分野では周知であり、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（１９８９，コールドスプリングハーバー研究所，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）およびＡｕｓｕｂｅｌら「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８９，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ニューヨーク州ニューヨーク）に見いだすことができる。
【０１０５】
Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ転写物および／またはコードされているＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳポリペプチドを製造するための好ましいベクターは、原核宿主細胞に適合する発現ベクターである。原核細胞発現ベクターは当技術分野では周知であり、いくつかの業者から入手することができる。例えば、ｐＥＴベクター（ｐＥＴ−２１など、Ｎｏｖａｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホーヤ）、ｐＳＰＯＲＴ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、メリーランド州ロックビル）、またはｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドを使って、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳポリペプチドを細菌宿主細胞で発現させることができる。
【０１０６】
もう一つの選択肢として、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ転写物および／またはコードされているＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳポリペプチドを製造するための好ましい発現ベクターは、真核宿主細胞に適合する発現ベクターである。より好ましいベクターは、脊椎動物細胞に適合するベクターである。真核細胞発現ベクターは当技術分野で周知であり、いくつかの業者から販売されている。通例、所望のＤＮＡセグメントの挿入に便利な制限部位を含むそのようなベクターを用意する。そのようなベクターの典型例は、ＰＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ番号３１２５５）、および類似の真核発現ベクターである。
【０１０７】
宿主−ベクター系
さらに本発明は、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳヌクレオチド配列またはその断片を含むベクター、プラスミド、ファージミド、またはコスミドが適切な宿主細胞に導入されている宿主−ベクター系も提供する。Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列の保持および発現には、様々な発現ベクター／宿主系を利用することができる。宿主−ベクター系を使って、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳヌクレオチド配列がコードしているＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳポリペプチドを発現（産生）させることができる。宿主細胞は原核細胞または真核細胞であることができる。適切な原核宿主細胞の例には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓなどの属からの細菌株が含まれる。適切な真核宿主細胞の例には、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞、例えば哺乳動物細胞が含まれる。好ましい態様として、ＣＯＳ７哺乳動物細胞中のｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールスバッド）、細菌細胞中のｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，ウィスコンシン州マディソン）、またはＳｆ９昆虫細胞中のｐＦａｓｔＢａｃベクター（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、メリーランド州ロックビル）を含む宿主−ベクター系を提供する。
【０１０８】
適当な宿主細胞への本発明の組換えＤＮＡ分子の導入は、使用するベクターおよび使用する宿主系のタイプによって決まる周知の方法によって達成される。例えば、原核宿主細胞は、エレクトロポレーションまたは塩処理法によって核酸分子が導入（例えば形質転換）される。例えば、Ｃｏｈｅｎら，１９７２，Ｐｒｏｃ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６９：２１１０、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，１９８９，コールドスプリングハーバー研究所，ニューヨーク州コールドスプリングハーバーなどを参照されたい。脊椎動物細胞は、エレクトロポレーション、カチオン性脂質または塩処理を含む様々な方法によって、組換えＤＮＡを含むベクターで形質転換される（Ｇｒａｈａｍら，１９７３，Ｖｉｒｏｌ ５２：４５６；Ｗｉｇｌｅｒら，１９７９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７６：１３７３−７６）。
【０１０９】
うまく形質転換された細胞、すなわち本発明のｒＤＮＡ分子を含む細胞は、当技術分野で周知の技術によって同定することができる。例えば、本発明の組換えＤＮＡの導入によって得られる細胞を選択し、クローン化して、単コロニーを形成させる。これらのコロニーから細胞を収集し、溶解し、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９７５）９８：５０３またはＢｅｒｅｎｔら，Ｂｉｏｔｅｃｈ（１９８５）３：２０８に記載されているような方法を使って、そのＤＮＡ内容物をｒＤＮＡの存在について調べるか、または細胞から産生されたタンパク質を生化学的アッセイまたは免疫学的方法によってアッセイする。
【０１１０】
細菌系では、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質に応じて、多くの発現ベクターを選択することができる。例えば、抗体を誘導するために多量のＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質が必要な場合は、可溶性で精製が容易な融合タンパク質の高レベル発現をもたらすベクターが望ましいだろう。そのようなベクターには、多機能性大腸菌クローニングおよび発現ベクター、例えば、ハイブリッドタンパク質が産生されるようにβ−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔおよびそれに続く７残基の配列にＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列をインフレームで連結することができるＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＮベクター（Ｖａｎ ＨｅｅｋｅおよびＳｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：５５０３−５５０９）などが含まれるが、これらに限るわけではない。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を使って、外来タンパク質をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させてもよい。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させた後、遊離グルタチオンの存在下で溶出することによって、溶解した細胞から容易に精製することができる。このような系で製造されるタンパク質は、クローン化した目的タンパク質を随意にＧＳＴ部分から切り離すことができるように、ヘパリン、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【０１１１】
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、例えばベータ因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨなどの構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含む多くのベクターを使用することができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（前掲）およびＧｒａｎｔら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３：５１６−５４４。
【０１１２】
植物発現ベクターを使用する場合は、多くのプロモーターのいずれかによって、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質をコードする配列を発現させることができる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーター（Ｂｒｉｓｓｏｎら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１０：５１１−５１４）などのウイルスプロモーターを単独で、またはＴＭＶ由来のオメガリーダー配列（Ｔａｋａｍａｔｓｕら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ ６：３０７−３１１）と組み合わせて使用することができる。もう一つの選択肢として、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット（Ｃｏｒｕｚｚｉら（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ ３：１６７１−１６８０；Ｂｒｏｇｌｉｅら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８−８４３）、または熱ショックプロモーター（Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．およびＳｉｎｉｂａｌｄｉ，Ｒ．Ｍ．（１９９１）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ １７：８５−１０５）などの植物プロモーターを使用することもできる。これらのコンストラクトは、直接ＤＮＡ形質転換または病原体を介したトランスフェクションによって植物細胞に導入することができる。そのような技術の概要については、Ｈｏｂｂｓ，Ｓ．「ＭｃＧｒａｗ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（１９９２，ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，ニューヨーク州ニューヨーク）の１９１〜１９６頁、またはＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８８，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州ニューヨーク）の４２１〜４６３頁を参照されたい。
【０１１３】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質を発現させるために使用することができるもう一つの発現系は昆虫系である。そのような系の一つでは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多核体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ幼虫で外来遺伝子を発現させるためのベクターとして使用することができる。ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質をコードする配列は、ウイルスの非必須領域、例えばポリヘドリン遺伝子中にクローン化し、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置くことができる。Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ核酸配列をうまく挿入することができれば、ポリヘドリン遺伝子は不活性になり、コートタンパク質を欠く組換えウイルスが産生されることになる。次に、組換えウイルスを、Ｓ．ｆｌｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ幼虫に感染させ、その中でＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質を発現させることができる（Ｓｍｉｔｈら，１９８３，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ４６：５８４；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｅ．Ｋ．ら，１９９４，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９１：３２２４−７）。
【０１１４】
哺乳類宿主細胞では、多くのウイルス型発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合は、後期プロモーターおよびトリパータイトリーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳ベクターにＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列を連結することができる。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域への挿入により、感染した宿主細胞中でＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質を発現させることができる生存可能なウイルスが得られる（ＬｏｇａｎおよびＳｈｅｎｋ，１９８４，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１：３６５５−５９）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーを使って、哺乳類宿主細胞における発現を増加させることもできる。
【０１１５】
また、挿入された配列の発現を調整する能力、または発現されたタンパク質を望ましい形でプロセシングする能力で、宿主細胞株を選択することもできる。タンパク質のそのような修飾には、例えばアセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質付加およびアシル化などがあるが、これらに限るわけではない。前駆体型のタンパク質（例えばプレプロタンパク質）を切断する翻訳後プロセシングも、正しい挿入、フォールディングおよび／または機能にとって重要であるかもしれない。例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８などの様々な宿主細胞は、そのような翻訳後活性に関して特殊な細胞機構および独特の機序を持っており、導入された外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングが保証されるように選択することができる。
【０１１６】
組換えタンパク質の長期高収率生産には安定な発現が好ましい。例えば、本発明のＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質を安定に発現させる細胞株は、ウイルス複製起点または内因性発現要素および選択可能マーカー遺伝子を含む発現ベクターを使って形質転換することができる。ベクターの導入後に細胞を濃縮培地で生育させてから、選択培地に移すことができる。選択可能マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、その存在は、導入された配列をうまく発現させる細胞の成長および回収を可能にする。安定に形質転換された細胞の耐性集塊は、使用する細胞タイプに適した組織培養技術を使って増殖させることができる。
【０１１７】
形質転換細胞株の回収には数多くの選択系を使用することができる。これらには、例えば、それぞれｔｋ−またはａｐｒｔ−細胞で使用することができる単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら，１９７７，Ｃｅｌｌ １１：２２３−３２）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙ，Ｉ．ら，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：８１７−２３）が含まれるが、これらに限るわけではない。また、代謝拮抗物質、抗生物質または除草剤耐性を選択の根拠として使用することもできる。例えば、メトトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら，１９８０，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ７７：３５６７−７０）、アミノグリコシド系抗生物質ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｐｔ（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，Ｆ．ら，１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１−１４）、ならびにそれぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与するａｌｓまたはｐａｔ（Ｍｕｒｒｙ，前掲）である。他の選択可能遺伝子、例えば細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにするｔｒｐＢ、または細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用できるようにするｈｉｓＤなども記載されている（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｃ．およびＲ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８５：８０４７−５１）。最近は、形質転換体を同定するためだけでなく、特殊なベクター系に起因する一過性のまたは安定なタンパク質発現の量を定量するためにも広く使用されているアントシアニン類、β−グルクロニダーゼおよびその基質ＧＵＳ、ならびにルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンなどのマーカーにより、可視マーカーの使用も増えている（Ｒｈｏｄｅｓ，Ｃ．Ａ．ら，１９９５，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ５５：１２１−１３１）。
【０１１８】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質およびポリペプチドに反応する抗体
さらに本発明は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質またはＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の断片に結合する抗体、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、断片およびヒト化抗体なども提供する。本発明のモノクローナル抗体の具体例として、Ｓｉｇｌｅｃ−１０−９、Ｓｉｇｌｅｃ−１０−１３、Ｓｉｇｌｅｃ−１０−１４、Ｓｉｇｌｅｃ−１０−２７およびＳｉｇｌｅｃ−１０−６１と呼ばれる抗体が挙げられる。これらは一括して、２００１年７月１８日に、ブダペスト条約の規定に基づいて、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（バージニア州２０１１０−２２０９ユニバーシティ・ブルバード１０８０１）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号（＿＿＿）を与えられている。これらの抗体は、サブクローニングまたはイソタイプ分離などの標準的分離技術によって、一括寄託物から容易に分離することができる（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（１９８８），コールドスプリングハーバー研究所，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）。
【０１１９】
モノクローナル抗体Ｓｉｇｌｅｃ−１０−９、Ｓｉｇｌｅｃ−１０−１３、Ｓｉｇｌｅｃ−１０−１４、Ｓｉｇｌｅｃ−１０−２７、およびＳｉｇｌｅｃ−１０−６１はいずれもＳｉｇｌｅｃ−１０を認識し結合する抗体であり、異なるまたは類似するイソタイプを示す。例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−１０−９のイソタイプはＩｇＧ３カッパイソタイプ、Ｓｉｇｌｅｃ−１０−１３はＩｇＧ２ｂカッパイソタイプ、Ｓｉｇｌｅｃ−１０−１４はＩｇＧ１カッパイソタイプ、Ｓｉｇｌｅｃ−１０−２７はＩｇＧ１カッパイソタイプ、Ｓｉｇｌｅｃ−１０−６１はＩｇＧ２ａカッパイソタイプである。
【０１２０】
好ましくは、本発明の抗体は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ配列を持つポリペプチドに特異的に結合する。例えば、本発明の抗体は、図６Ｂ（配列番号２８）に示すＡｌａ１４１からＳｅｒ１９８までのアミノ酸配列を含むＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質を認識し、これに結合する。もう一つの態様として、本発明の抗体は、配列番号１〜７および２７のいずれか一つに示す核酸に相補的な核酸分子にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる図６Ｂ（配列番号２８）のＡｌａ１４１からＳｅｒ１９８までのアミノ酸配列を含むＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳを認識し、結合することができる。さらに、本発明の抗体は、配列番号１〜７および２７のいずれか一つに示す核酸に相補的な核酸分子にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むＳＩＧＬＥＣタンパク質を認識し、結合することができる。好ましくは、本発明の抗体は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ａ、−Ｌ３ｂ、−Ｌ３ｃ、−Ｌ３ｄ、−Ｌ４ａ、−Ｌ５ａ、−Ｌ５ｂ、および−Ｌ３−９９５−２タンパク質（図２Ｂ、３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ、７Ｂ、８Ｂ、９Ｂ、および６Ｂ）を認識し、結合することができる。
【０１２１】
最も好ましくは、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ抗体は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の細胞外ドメインに特異的に結合する。細胞外ドメインはＳｉｇｌｅｃ１０のＩｇ様ドメインのいずれかまたは全部であることができる。具体的には、本抗体は、図２５に示す第２Ｉｇ様（Ｉｇ−Ｄ２）ドメイン（Ａｌａ１４１−Ｓｅｒ１９８）またはＩｇＤ５ドメイン（Ｔｙｒ４４４−Ｐｒｏ５３８）を認識し、結合することができる。他の態様では、本発明の抗体は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質または前駆体の他のドメインに特異的に結合することができる。例えば、本抗体は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の細胞質ドメインに結合する。例えば、細胞質ドメインは、図６Ｂに示すＬｙｓ５７６からＧｌｎ６９７までのアミノ酸を包含することができる。
【０１２２】
最も好ましい抗体は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質に選択的に結合し、非ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質には結合しない（または弱く結合する）だろう。これらの抗体は、例えばウサギ、ヒツジ、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、マウスおよびヒトなど、どのような起源に由来してもよい。
【０１２３】
当業者には理解されるだろうが、抗体の標的となるＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の領域またはエピトープは、意図する用途によって様々である。例えば、生細胞上の膜結合型ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳを検出するための免疫アッセイで使用しようとする抗体は、接近しやすいエピトープ、例えばＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の細胞外ドメインなどに向けられるべきである。抗ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ ｍＡｂは、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ陽性細胞の細胞表面を染色するために使用することができる。ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の予想細胞外ドメインは、潜在的に、スクリーニング、診断、予後、および追跡検査ならびに撮像法のマーカーになる。さらに、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の有無に関係する状態を処置するための治療法、例えば標的抗体療法、免疫療法および遺伝子療法などの優れた標的になりうる。他のエピトープを認識する抗体は、損傷した細胞または瀕死の細胞内のＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳの同定、分泌されたＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質またはその断片の検出に役立つだろう。また、本発明の抗体の一部は、結合時または結合後に細胞内に内在化（例えば進入）する内在化抗体でありうる。内在化抗体は細胞成長の阻害および／または細胞死の誘導に役立つ。
【０１２４】
本発明は、本発明のモノクローナル抗体がその標的抗原に免疫特異的に結合するのを競合的に阻害する抗原結合領域を持つ任意のモノクローナル抗体を包含する。これらのモノクローナル抗体は、例えば抗体Ｓｉｇｌｅｃ−１０−９、Ｓｉｇｌｅｃ−１０−１３、Ｓｉｇｌｅｃ−１０−１４、Ｓｉｇｌｅｃ−１０−２７、およびＳｉｇｌｅｃ−１０−６１のいずれかを使って、定型的な競合アッセイによって同定することができる（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」１９８８，コールドスプリングハーバー研究所、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）。さらに、本発明は、本発明のモノクローナル抗体の抗原結合領域を含む組換えタンパク質も提供する。
【０１２５】
本発明は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質またはその断片を特異的に認識する抗体断片も包含する。本明細書にいう抗体断片は、その標的に結合する可変領域の少なくとも一部、すなわち抗原結合領域と定義される。免疫グロブリンの定常領域の一部が含まれていてもよい。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、一本鎖抗体、および免疫学的に重要な部分（すなわちＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳを認識し結合する部分）を含む融合タンパク質などが挙げられる。
【０１２６】
本発明のキメラ抗体は、異なる種に由来する少なくとも２つの抗体部分、例えばヒト部分と非ヒト部分とを含む免疫グロブリン分子である。キメラ抗体は、非ヒト定常領域および可変領域を持つ抗体よりもヒトに対する抗原性がおそらく低いので、有用である。キメラ抗体の抗原結合領域（可変領域）は、非ヒト由来源（例えばネズミ）から得ることができ、免疫グロブリンに生物学的エフェクター機能を付与するキメラ抗体の定常領域はヒト由来源から得ることができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ． ８１：６８５１；Ｔａｋｅｄａら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２；Ｃａｂｉｌｌｙら，米国特許第４，８１６，５６７号；Ｂｏｓｓら，米国特許第４，８１６，３９７号）。キメラ抗体は非ヒト抗体分子の抗原結合特異性と、ヒト抗体分子によって付与されるエフェクター機能とを持つだろう。
【０１２７】
本発明のキメラ抗体には、いくつかの異なる抗原結合特異性を持つキメラタンパク質である抗体も含まれる（例えば抗ＴＮＰ：Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３、および抗腫瘍抗原：Ｓａｈａｇａｎら，１９８６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７：１０６６）。本発明は、異なるエフェクター機能（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４）、他の種に由来する免疫グロブリン定常領域、および他の免疫グロブリン鎖の定常領域（Ｓｈａｒｏｎら，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３０９：３６４；Ｔａｎら，１９８５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３５：３５６５−３５６７）を持つキメラタンパク質も提供する。遺伝子修飾のターゲティングに相同組換えを使って、抗体分子を修飾し、キメラ抗体分子を製造する方法も記載されている（Ｆｅｌｌら，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８５０７−８５１１）。
【０１２８】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質に対するヒト化抗体も有用である。本明細書にいうヒト化ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ抗体は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質に結合する能力を持つ免疫グロブリン分子である。ヒト化ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ抗体は、実質的にヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を持つ可変領域と、実質的に非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を持つ超可変領域とを含む。ヒト化抗体は当技術分野で知られるいくつかの方法によって製造することができる（Ｔｅｎｇら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８０：７３０８−７３１２；Ｋｏｚｂｏｒら，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２７９；Ｏｌｓｓｏｎら，１９８２，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ． ９２：３−１６）。
【０１２９】
当技術分野では様々な抗体製造法がよく知られている。例えば抗体は、適当な哺乳類宿主を、例えば単離されたＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質、ペプチド、断片、またはイムノコンジュゲート型ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質などの免疫原で免疫化することによって製造することができる（Ｈａｒｌｏｗ「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州）。さらに、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳの融合タンパク質、例えばＧＳＴ、ヒトＩｇ、またはＨｉｓタグ付き融合タンパク質に融合されたＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳなども、免疫原として使用することもできる。また、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質を発現または過剰発現させる細胞を免疫化に使用することもできる。同様に、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質を発現させるように操作された細胞も使用することができる。このストラテジーにより、内因性ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質を認識する能力が向上したモノクローナル抗体を製造することができる（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」１９８８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）。
【０１３０】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質のアミノ酸配列およびその断片は、抗体作製用のＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の特定領域を選択するために使用することができる。例えば、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳアミノ酸配列の疎水性および親水性解析を使って、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質構造中の親水性領域を同定することができる。免疫原構造を示すＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の領域ならびに他の領域およびドメインは、当技術分野で知られる他の様々な方法（Ｒｏｓｔ，Ｂ．およびＳａｎｄｅｒ，Ｃ．，１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ １９：５５−７２）、例えばＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｋａｒｐｌｕｓ−ＳｃｈｕｌｔｚまたはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ解析などを使って、容易に同定することができる。これらの残基を含む断片は、抗ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ抗体の作製には特に適している。
【０１３１】
免疫原として使用されるタンパク質を調製する方法、およびタンパク質とＢＳＡ、ＫＬＨなどの担体または他の担体タンパク質との免疫原複合体を作製する方法は当技術分野では周知である。治療剤を抗体に複合体化または接合する技術は周知である（Ａｒｎｏｎら著「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら編「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」の２４３〜５６頁（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」第二版の６２３〜５３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ著「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｐｉｎｃｈｅｒａら編「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」の４７５〜５０６頁（１９８５）；およびＴｈｏｒｐｅら「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」Ｉｍｍｕｎｅ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）；Ｓｏｄｅｅら，１９９７，Ｃｌｉｎ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ． ２１：７５９−７６６）。ある場合には、例えばカルボジイミド試薬などを使った直接複合体化を利用することができ、また別の例では、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（イリノイ州ロックフォード）によって供給されているような連結試薬が有効であるかもしれない。
【０１３２】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ免疫原の投与は、当技術分野では広く知られているように、適当な佐剤を使用し、適切な期間にわたって、注射によって行なわれる。免疫化スケジュール中は、抗体価を調べて、抗体形成の妥当性を決定することができる。
【０１３３】
この方法で製造されたポリクローナル抗血清も一部の用途には十分であるが、医薬組成物には、モノクローナル抗体製剤が好ましい。所望のモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞株は、広く知られているようにリンパ球または脾細胞の不死化をもたらすＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの標準的方法（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７）またはその変法を使って作出することができる。所望の抗体を分泌する不死化細胞株のスクリーニングは、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質またはその断片を抗原とする免疫アッセイによって行なう。所望の抗体を分泌する適当な不死化細胞培養物が同定されたら、それらの細胞をインビトロで、または腹水で産生させる方法によって培養することができる。次に、培養上清または腹水上清から、所望のモノクローナル抗体を回収する。
【０１３４】
ヒト起源の新規抗体も、適当な生物学的機能を持つ抗原に対して、作製することができる。完全にヒト由来である抗体は、ヒト患者の治療的処置には特に望ましい。ヒトモノクローナル抗体は、ＢｏｒｒｅｂａｅｃｋらがＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３９９５−９９（１９８８）に記載しているように、例えばＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質またはそのペプチドなどの抗原を使ってヒトリンパ球をインビトロで抗原に感作し、次にＥＢＶ形質転換を行なうか、または抗原感作リンパ球とマウスもしくはヒトリンパ球との雑種形成を行なうことによって製造することができる。
【０１３５】
別法として、ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現させることはできないがヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現させることはできるマウスなどのトランスジェニック動物を使って製造することもできる。トランスジェニックマウスは、選択した抗原、例えば本発明ポリペプチドの全部または一部を使って、通常の方法で免疫化される。抗原に対するモノクローナル抗体は、通常のハイブリドーマ技術を使って製造することができる。トランスジェニックマウスが保有するヒト免疫グロブリン導入遺伝子はＢ細胞分化中に再配列し、続いてクラススイッチおよび体細胞突然変異を起こす。したがって、この技術を用いることにより、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＢ抗体を製造することができる。このヒト抗体製造技術の概要については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨａｓｚａｒ（１９９５，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３：６５−９３）。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を製造するこの技術の詳細な解説は、米国特許第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，５６９，８２５号、第５，６６１，０１６号、および第５，５４５，８０６号に見いだすことができる。
【０１３６】
抗体または断片は組換え手段によって製造してもよい。ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の所望の領域に特異的に結合する抗体領域は、複数の種に起源を持つキメラまたはＣＤＲ移植抗体との関連で製造することもできる。
【０１３７】
本発明の分子の用途
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質をコードする核酸分子は、診断および／または予後判定法での使用を含めて、様々な目的に有用である。本発明の核酸分子およびタンパク質は、適切な生物学的試料中のＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳヌクレオチド配列および／またはＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の存在および／または量を調べるために使用することができる。
【０１３８】
適切な生物学的試料は動物またはヒトから得ることができる。試料は、例えば脾臓、リンパ節、胸腺、骨髄、肝臓、心臓、脳、胎盤、肺、骨格筋、腎臓および膵臓から得られる試料などの細胞試料または組織試料であることができる。試料は、例えば尿、血清、血漿、痰または洗浄液などの生物学的液体であることができる。あるいは、試料は鼻、耳または咽喉のスワブ検体であってもよい。
【０１３９】
さらに、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質は、様々な診断または治療モダリティ用の分子として役立ちうる抗体の産生を誘発することができる。ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質を利用して、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質に結合する物質（例えばＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳリガンド）を同定し単離すること、およびＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の生物学的活性を調節することもできる。
【０１４０】
Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳタンパク質をコードする核酸分子の用途
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質をコードする核酸分子は、本明細書に記載するＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳヌクレオチド配列に関係するヌクレオチド配列を同定および／または単離するために、様々なハイブリダイゼーション法で使用することができる。Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列に関係する配列は、新たなリガンドおよび抗体の開発に有用である。ハイブリダイゼーション法は、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列と同一であるかＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列に類似しているＤＮＡおよびＲＮＡ配列、例えばＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳホモログ、選択的スプライスアイソフォーム、対立遺伝子変異体、および突然変異型ＳＩＧＬＥＣタンパク質ならびにそれらのコードおよび遺伝子配列などを同定／単離に使用される。
【０１４１】
本明細書に記載するＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質をコードする核酸配列の全長または断片は、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列に関係する配列を持つ核酸分子を取得するための核酸分子プローブとして使用することができる。
【０１４２】
一態様として、ゲノムライブラリー、例えばλファージまたはＢＡＣ（細菌人工染色体）もしくはＹＡＣ（酵母人工染色体）中に構築されたライブラリーなどをスクリーニングしてＳｉｇｌｅｃ遺伝子のゲノムクローンを単離するために、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ核酸プローブを使用する。ゲノムライブラリーから得られるＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列は、上流または下流非コード配列、例えばプロモーター、エンハンサー、転写終結配列などの単離に役立つ。上流配列は、適当な宿主細胞への導入時に非Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列を発現させる組換えＤＮＡ分子を構築するために、非Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列に接合することができる。もう一つの態様として、特定の組織または細胞タイプ中で発現されるｃＤＮＡクローンを単離するために、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳプローブを使用してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。ｃＤＮＡライブラリーから得られるＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列は、種々の細胞タイプ、組織タイプ、または種々の哺乳類対象から配列を単離するのに有用である。
【０１４３】
さらに、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質をコードする核酸分子またはその断片を選択的に増幅またはクローニングするためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲプライマーのセット）に使用されるオリゴヌクレオチドプライマー対を製造することもできる。変性／アニール／重合ステップのサイクルを何サイクルも含むＰＣＲ法（米国特許第４，９６５，１８８号）は当技術分野では周知であり、他のＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳコード核酸分子の単離用に、容易に適合させることができる。
【０１４４】
さらに、本発明の核酸分子は、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ核酸プローブを使って生物学的試料中に存在するＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列の存在および／または量を決定する診断態様にも利用することができる。
【０１４５】
ある診断態様には、ハイブリダイゼーション操作にＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳプローブを使って、適当な生物学的試料内に存在するＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳヌクレオチド配列の量を決定することが含まれる。
【０１４６】
もう一つの態様には、ハイブリダイゼーション操作にＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳプローブを使って、試験対象から得た生物学的試料中のＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ核酸分子の量を定量することが含まれる。試験試料中のＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ核酸分子の量は、正常な対象から得た参考試料中のＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ核酸分子の量と比較することができる。試験試料と参考試料の間でＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ核酸分子の量に測定可能な相違が存在することは、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ核酸分子レベルの異常またはＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ核酸分子の欠乏に関係する疾患の存在または重症と相関するかもしれない。
【０１４７】
もう一つの態様として、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ ＲＮＡ転写物量の経時的なモニタリングは、様々な時点に採取した試験試料中のＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ ＲＮＡ転写物の量を定量的に決定することによって達成される。様々な試料中のＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ転写物の量の相違は、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ転写物の発現に関係する疾患の経過を表す。
【０１４８】
さらにもう一つの態様として、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ転写物またはタンパク質に関係する疾患または障害が、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ遺伝子コピー数の増加または不足によって検出される。遺伝子コピー数を検出する方法には、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ解析）による染色体マッピングが含まれる（Ｒｏｗｌｅｙら，１９９０，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８７：９３５８−９３６２；Ｈ．Ｓｈｉｚｕｙａ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８９：８７９４）。Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ遺伝子コピー数の増加を決定する方法は重要である。なぜなら、この増加は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質に関係する疾患の重症度の増加および患者の予後不良と相関関係にあるかもしれないからである。
【０１４９】
そのような診断方法を実行するには、試験対象から採取した適切な生物学的試料を、試料核酸分子とプローブとをハイブリダイズさせるのに有効な条件で、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳプローブと接触させる。同様にして、正常な対象から得た生物学的試料を、同様の条件でＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳプローブと接触させ、ハイブリダイズさせる。プローブにハイブリダイズした核酸分子の存在を検出する。相対的な量および／または定量化した量を、試験試料と参考試料との間で比較することができる。Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳプローブは、好ましくは、例えば放射性ラベル、酵素ラベル、蛍光ラベル、さらには化学発光ラベルなどの既知の検出可能ラベルのいずれかで標識される。
【０１５０】
ハイブリダイゼーション技術の適切な変法は、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ配列を持つ核酸の検出に、数多く利用することができる。それらには、例えばサザン法およびノーザン法が含まれる。本発明の検出面に関係して使用することができるハイブリダイゼーション技術およびハイブリダイゼーションシステムは、例えばＦａｌｋｏｗらの米国特許第４，３５８，５３５号に記載されているような診断アッセイを含めて、他にも知られている。もう一つのハイブリダイゼーション法として、標的核酸が１または複数の細胞内にあり、その標的核酸をＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳプローブと接触させるインサイチューハイブリダイゼーションが挙げられる。当技術分野では周知のとおり、細胞には、化学固定などの固定によってハイブリダイゼーションの準備を施し、その細胞を、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳプローブと固定された細胞内にある核酸とのハイブリダイゼーションが可能になるような条件に置く。
【０１５１】
あるいは、プローブとの接触に先だって、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ核酸を試験試料から分離する。試料から標的核酸を単離する方法は周知であり、例えば塩化セシウム勾配遠心分離、クロマトグラフィー（イオン、アフィニティー、磁気など）、およびフェノール抽出などが挙げられる。
【０１５２】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の用途
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質は好酸球、好中球および単球に発現し、これらの分子の発現は免疫限定的である。これは、これらのタンパク質が、好酸球または他の免疫細胞の成熟、遊走、活性化または他細胞とのコミュニケーションの調節に関与するかも知れないことを示している。したがってＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質は、喘息および他のアレルギー疾患、白血病、または炎症の発病に関与すると推測される。
【０１５３】
したがってＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質は薬剤開発の魅力的な標的である。ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳに向けられた薬剤は、喘息における炎症、組織損傷およびリモデリング、さらには他の炎症性疾患、例えばアレルギー性鼻炎、変形性関節症、炎症性腸疾患、クローン病、慢性閉塞性肺疾患、感染、結膜炎、糸球体腎炎、関節リウマチおよび歯肉炎などを、おそらく抑制するだろう。さらに、先に発見されたＳＩＧＬＥＣタンパク質が、いくつかのタイプの骨髄単球性白血病（ｍｏｎｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）で循環未成熟白血球上に検出されていることから（Ｅｌｇｈｅｔａｎｙ，Ｍ．Ｔ．，１９９８，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ８３：１１０４−１１１５）、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質に向けられた薬剤は、特定タイプの白血病（例えば好酸球性白血病）の処置またはターゲティングに使用することができそうである。
【０１５４】
さらに、本発明のＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質および断片は、本明細書に記載するように、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質に関係するエピトープを特異的に結合する抗体の産生を誘導するために使用することもできる（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，前掲）。ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ抗体にはＦｖ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ抗体などの断片が含まれる。ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の選択したドメインまたは領域と免疫反応するＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ抗体はとりわけ有用である。興味あるドメインとしては、例えばＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の細胞外ドメインおよび細胞質ドメインが挙げられる。
【０１５５】
ある態様では、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質に関係するタンパク質（例えばホモログ）を得るために、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ抗体を使って発現ライブラリーをスクリーニングする。
【０１５６】
もう一つの態様では、不均質なタンパク質の集団を含む試料からＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質を濃縮または精製するために、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ抗体を使用する。濃縮および精製法には従来の技術、例えば免疫アフィニティー法が含まれる。一般に、免疫アフィニティー法には、次のステップが含まれる：固形支持マトリックスをＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ抗体と連結することによって、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質と特異的に結合するアフィニティーマトリックスを調製する；連結アフィニティーマトリックスを、試料中のＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質が連結アフィニティーマトリックスに結合することができるような条件で、試料と接触させる；連結アフィニティーマトリックスに結合しなかった非ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質を除去することによって、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質を濃縮または精製する。さらに、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質をアフィニティーマトリックスから溶出させるステップを含めてもよい。所望のタンパク質またはタンパク質複合体のアフィニティー濃縮に関する大まかなステップおよび条件は「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．，１９８８，ＣＳＨＬ，ニューヨーク州コールドスプリング）に見いだすことができる。
【０１５７】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ抗体は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質を発現させる細胞を検出、選別、単離するためにも使用される。ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ陽性（＋）細胞は種々の生物学的試料中に検出される。細胞上にＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質が（単独で、または他の細胞表面マーカーと一緒に）存在することを利用して、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳを発現させる細胞を他の細胞から識別し単離（例えば選別）することができる。ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ抗体を使って、個々の対象または患者から比較的純粋なＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ陽性細胞を大量に生成し、それらを組織培養で成長させることができる。このようにして、例えば個々の対象の細胞を限られた生検試料から増殖させた後、夾雑細胞の潜在的交絡変数を伴わずに、診断および予後遺伝子、タンパク質、染色体異常の存在、遺伝子発現プロファイル、または他の適当な遺伝子型および表現型の特徴について調べることができる。同様に、患者別のワクチンおよび細胞免疫療法を、そのような細胞調製物から作り出すこともできる。ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ陽性細胞を検出、選別および単離する方法では、インジウム１１１（または他の同位体）を使った蛍光または免疫シンチグラフィなどの様々な撮像法が使用される。
【０１５８】
本発明の抗体には複数の診断用途がある。例えば、骨髄異形成症候群ではＣＤ３３がアップレギュレートされ（Ｅｌｇｈｅｔａｍｙ，１９９８，前掲）、白血病の診断マーカーとして使用される。本発明は、対象（例えば動物またはヒト対象）におけるＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の存在または欠乏に関係する疾患を診断する方法を提供する。一態様として、この方法は、１または複数の本発明の抗体を使って、試料（例えば細胞試料または生物学的液体試料）中のＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の量を定量的に決定することを含む。次に、そのようにして決定した量は、正常対象から採取した試料中の量と比較することができる。試料中に測定できるほど異なる量が存在する（すなわち試験試料中のＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の量が正常試料中のＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の量より多いか、または少ない）という事実により、疾患の存在が示される。
【０１５９】
抗体が検出可能なラベルを持っている場合、本発明の抗ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ抗体は、画像診断法にはとりわけ有用だろう。本発明の実施にあたって、本方法では、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質またはその断片を認識する任意のモノクローナル抗体、例えばモノクローナル抗体Ｓｉｇｌｅｃ１０−９、Ｓｉｇｌｅｃ１０−１３、Ｓｉｇｌｅｃ１０−１４、Ｓｉｇｌｅｃ１０−２７またはＳｉｇｌｅｃ１０−６１のその標的抗原に対する免疫特異的結合を競合的に阻害する抗原結合領域を持つ抗体などを使用することができるだろう。
【０１６０】
本発明は、適切な生物学的試料中のＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の検出に役立つ様々な免疫学的アッセイを提供する。適切な検出可能マーカーとしては、例えば放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、発色団、金属キレーター、ビオチン、または酵素などが挙げられるが、これらに限るわけではない。そのようなアッセイは、一般に、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質を認識し結合する１または複数の標識ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ抗体を含み、当技術分野で周知の様々な免疫学的アッセイ形式、例えば沈殿、凝集、補体結合、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素連結免疫蛍光アッセイ（ＥＬＩＦＡ）（Ｈ．Ｌｉｕら，１９９８，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：４０５５−４０６０）、免疫組織化学的解析などを含む。
【０１６１】
さらに、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳを発現させる細胞を検出する免疫学的撮像法、例えば標識ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ抗体を使ったラジオシンチグラフィ撮像法なども、本発明によって提供される。そのようなアッセイは、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質を発現させる細胞の数および／または位置の検出およびモニタリングに臨床上有用だろう。
【０１６２】
さらに本発明は、罹患した対象から採取した生物学的試験試料を正常な対象から採取した参考試料と比較した場合の試料中のＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の量および分布の相違を決定する方法も提供する。一態様として、この方法は、試験試料および参考試料を、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質との複合体を特異的に形成する抗ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ抗体と接触させ、よって試験試料および参考試料中のＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳの量および分布の相違を検出する手段とすることを含む。
【０１６３】
さらに本発明は、様々な時点で試験対象から採取した試料中のＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の量を測定することによって、試験対象におけるＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳに関係する疾患または障害の経過をモニタリングする方法を提供する。これは、試料中のＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳの量の経時変化を決定する目的で行なわれる。疾患または障害の経過のモニタリングにより、処置のタイミング、用量、およびタイプを、経時的に最適化することができる。一態様として、本方法は、対象から採取した第１試料でＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の存在を定量的に決定し、そのようにして決定した量を、異なる時点で採取した同じ対象の第２試料中に存在する量と比較することを含み、決定した量の相違は疾患の経過を表す。
【０１６４】
本発明の一態様は、候補対象における喘息状態を診断する方法である。この方法は、候補喘息対象の生物学的試料（例えば試験試料）および正常な対照の試験試料（例えば参考試料）を得ること；試験試料および参考試料を、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質との複合体を特異的に形成する抗ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ抗体と接触させること；そのようにして形成された試験試料および参考試料中の複合体を検出することを含み、試験試料中および参考試料中に形成される複合体の量の測定可能な相違は喘息状態を表す。血流中または洗浄液中のＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳレベルの上昇は、喘息の状態または重症度を検出する手段になりうる。この検出は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質と反応する抗体を用いるＥＬＩＳＡまたは類似の方法によって行なうことができる。
【０１６５】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ抗体は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の生物学的活性を調節（例えば阻害または活性化）するために、またはＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質を発現させる細胞に抗炎症薬などの治療剤をターゲティングするために、治療的に使用することもできる。例えばＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳを発現させる細胞は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質を発現させる細胞と結合する抗体を使って、標的にすることができる。ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ抗体と細胞との結合は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の生物学的活性を低下させ、よってＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ発現細胞の成長を阻害し、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の異常な細胞発現に関係する疾患を減少させる。
【０１６６】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ抗体またはその断片を、第２の分子、例えば治療剤（例：細胞毒性剤）などに結合して、イムノコンジュゲートを得ることもできる。このイムノコンジュゲートは、第２の分子をＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ陽性細胞にターゲティングすることによってＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ陽性細胞の成長を阻害するために使用することができる（ＤｅＶｉｔａ，Ｊｒ．，Ｖ．Ｔ．ら編「Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ」第４版，１９９３，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，フィラデルフィア）の２６２４〜２６３６頁、Ｖｉｔｅｔｔａ，Ｅ．Ｓら著「Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ Ｔｈｅｒａｐｙ」）。
【０１６７】
治療剤としては、例えば抗腫瘍薬、細胞毒、放射性物質、サイトカイン、第２の抗体または酵素などが挙げられるが、これらに限るわけではない。細胞毒性剤の例には、リシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシンＤ、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、グルココルチコイド、および他の化学療法剤、ならびに放射性同位体があるが、これらに限らない。
【０１６８】
さらに本発明は、プロドラッグを細胞毒性薬に変換する酵素に本発明の抗体を連結する態様を提供する。もう一つの選択肢として、抗体を酵素、リンホカインまたはオンコスタチンに連結する。
【０１６９】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２などの免疫反応性断片は免疫グロブリン全体よりも免疫原性が一般に低いので、これらの断片を使用することは、多くの場合、好ましく、治療との関連では特にそうである。本発明は、医薬的に許容できる担体中に本発明のモノクローナル抗体または抗イディオタイプモノクローナル抗体を含む医薬組成物も提供する。
【０１７０】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳリガンドのスクリーニング
本発明のもう一つの側面は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質と結合し（例えばリガンド）かつ／またはその生物学的活性を調節するような興味ある薬剤を同定するためのスクリーニング方法に関する。ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質は好酸球で発現されるので、これらの薬剤は好酸球または他の免疫細胞の成熟、遊走、活性化、または他細胞とのコミュニケーションの調節に関与しているかもしれない。したがって、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質と結合しその生物学的活性を調節する薬剤は、喘息および他のアレルギー疾患の特定の症状、白血病の軽減に有効であり、炎症を減少させるかもしれない。
【０１７１】
通例、そのようなスクリーニング方法の目標は、標的ポリペプチド（例えばＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ）に結合し、標的ポリペプチドの生物学的活性の変化、例えば標的ポリペプチドの活性化または阻害を引き起し、よってＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の異常な細胞発現に関係する疾患を減少させることである。興味ある薬剤は、候補薬剤の集団から同定される。
【０１７２】
これらのスクリーニング法には、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質に結合する薬剤および細胞構成成分（例えばＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳのリガンド）を検出し、それを同定するためのアッセイが含まれる。一態様として、スクリーニングアッセイには、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質と試験薬剤または細胞抽出物の一成分との会合（例えば結合）が可能な条件で、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質を、試験薬剤または細胞抽出物と接触させること；およびＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質と会合した薬剤または成分を含む複合体が形成されるかどうかを決定することが含まれる。これらのスクリーニング方法は、ハイスループットスクリーニング法での使用に適している。
【０１７３】
薬剤とＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質との結合は、分子量のシフト、または結合していないＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の生物学的活性の変化、またはツーハイブリッドシステムにおけるレポーター遺伝子の発現（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．およびＳｏｎｇ，Ｏ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６）を使ってアッセイすることができる。薬剤／細胞成分がＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質に結合するかどうかを確認するために使用される方法は、主として、使用するＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の性質に基づく。例えば、ゲル遅延アッセイ（ｇｅｌ ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）を使って、薬剤がＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳまたはその断片に結合するかどうかを決定する。別法として、免疫検出およびバイオチップ（例えば米国特許第４，７７７，０１９号）技術を採用して、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質と共に使用する。ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質と結合する薬剤を同定するもう一つの方法では、免疫型細胞由来の糖脂質抽出物を使ったＴＬＣオーバーレイ（ＴＬＣ ｏｖｅｒｌａｙ）アッセイを利用する（Ｋ．Ｍ．Ａｂｄｕｌｌａｈら，１９９２，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６０：５６−６２）。当業者は、特定の薬剤がＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質に結合するかどうかを決定するために、当技術分野で知られる数多くの技術を容易に利用することができる。
【０１７４】
上記の代わりに、または上記に引き続いて、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定する手段として、複合体の一部であるＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の生物学的活性を解析することができる。例えば、ＣＤ２２を結合する細胞成分を単離するために使用された方法（Ｄ．Ｓｇｒｏｉら，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８：７０１１−７０１８；Ｌ．Ｄ．Ｐｏｗｅｌｌら，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８：７０１９−７０２７）に変更を加えて、細胞抽出物を抗ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ抗体が固定化されているアフィニティーカラムと接触させることによって、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質に結合する細胞表面糖タンパク質を単離することができるようにする。
【０１７５】
ある薬剤がＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の生物学的活性を低下させる場合、本明細書では、その薬剤はＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ活性をアンタゴナイズ（拮抗）するという。好ましいアンタゴニストは、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳの生物学的活性を選択的にアンタゴナイズし、他の細胞タンパク質に影響を及ぼさない。さらに、好ましいアンタゴニストは、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ活性を５０％以上、より好ましくは９０％以上低下させ、最も好ましくは全てのＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ活性を除去する。
【０１７６】
ある薬剤がＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の生物学的活性を増加させる場合、本明細書では、その薬剤はＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ活性をアゴナイズ（ａｇｏｎｉｚｅ）するという。好ましいアゴニストはＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳの生物学的活性を選択的にアゴナイズし、他のどの細胞タンパク質にも影響を及ぼさない。さらに、好ましいアンタゴニストは、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ活性を５０％以上、より好ましくは９０％以上増加させ、最も好ましくはＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ活性を倍加する。
【０１７７】
本発明のアッセイのもう一つの態様では、酵母ツーハイブリッドシステム（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．およびＳｏｎｇ，Ｏ．，前掲）を使って、または結合捕捉（ｂｉｎｄｉｎｇ−ｃａｐｔｕｒｅ）アッセイ（Ｈａｒｌｏｗ，前掲）を使って、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質に結合する薬剤および細胞構成成分をスクリーニングする。一般に、酵母ツーハイブリッドシステムはレポーター遺伝子を保有する酵母宿主細胞で行なわれ、ＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインとを持つＧＡＬ転写因子のモジュール性に基づいている。ツーハイブリッドシステムは、ＤＮＡ結合ドメインを含む組換えタンパク質と、転写活性化ドメインを含むもう一つの組換えタンパク質との物理的相互作用によってモジュール式転写因子の転写活性を復元し、よってレポーター遺伝子の発現を引き起すことに依拠している。ツーハイブリッドシステムで使用される組換えタンパク質の一方は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳの結合パートナーをスクリーニングするために、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳコード配列を含むように構築することができる。酵母ツーハイブリッドシステムを使って、ｃＤＮＡ配列ライブラリー（Ｇ．Ｊ．Ｈａｎｎｏｎら，１９９３，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ． ７：２３７８−２３９１）およびランダムアプタマーライブラリー（Ｊ．Ｐ．Ｍａｎｆｒｅｄｉら，１９９６，Ｍｏｌｅｃ．Ａｎｄ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． １６：４７００−４７０９）またはセミランダムアプタマーライブラリー（Ｍ．Ｙａｎｇら，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３：１１５２−１１５６）をＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳリガンドに関してスクリーニングすることができる。
【０１７８】
本明細書に記載のスクリーニングアッセイに使用されるＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質としては、例えば単離されたＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の断片、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質を発現させるように改変された細胞、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質を発現させるように改変された細胞の画分などが挙げられるが、これらに限るわけではない。
【０１７９】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質との結合および／またはＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質活性の調節について試験される候補薬剤は、例えばペプチド、抗体、小分子、ビタミン誘導体、および炭水化物などであることができる。ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質への結合に関して試験される薬剤の構造上の性質に関して制約がないことは、当業者には容易に理解することができる。薬剤クラスの一つは、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質のアミノ酸配列に基づいて選択されたアミノ酸配列を持つペプチド剤である。小ペプチド剤はＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の競合阻害剤として働くことができる。
【０１８０】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質との結合および／またはＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質活性の調節について試験される候補薬剤は無作為に選択されるか、または合理的に選択される。ある薬剤がＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の特異的配列を考慮しないで無作為に選ばれる場合、本明細書では、その薬剤は無作為に選択されるという。無作為に選択される薬剤の例は、化合物ライブラリー、ペプチドコンビナトリアルライブラリーの構成要素、ある生物の成長培地の構成成分、または植物抽出物である。
【０１８１】
ある薬剤が薬剤の作用に関係する標的部位（ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質）の配列および／またはそのコンフォメーションに基づいて無作為にではなく選択される場合、本明細書では、その薬剤は合理的に選択されるという。薬剤は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質を構成するペプチド配列を利用することによって合理的に選択される。例えば、合理的に選択されたペプチド剤は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質の選択された断片と同一なアミノ酸配列を持つペプチドであることができる。
【０１８２】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質との結合および／またはＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質活性の調節について試験される細胞抽出物は、例えば細胞または組織の水性抽出物、細胞または組織の有機抽出物、または部分精製細胞画分などである。本発明のスクリーニング法で使用される細胞抽出物の供給源に関して制約がないことは、当業者には容易に理解することができる。
【０１８３】
本発明の医薬組成物
本発明は、医薬有効量の可溶性ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ分子を含む免疫系疾患処置用の医薬組成物を包含する。本医薬組成物は、可溶性ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質分子および／または核酸分子および／または前記分子をコードするベクターを含むことができる。好ましい態様として、可溶性ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳタンパク質分子は、図６Ｂに示すＳＩＧＬＥＣ−１０の細胞外ドメインのアミノ酸配列を持つ。本組成物は、例えば薬物毒素、酵素、抗体またはコンジュゲートなど（ただしこれらに限らない）の他の治療薬をさらに含んでもよい。
【０１８４】
一態様として、本医薬組成物は、無修飾の、または治療剤（例えば薬物、毒素、酵素または第２の抗体）に結合された、または組換え型（例えばキメラ抗体または二重特異性抗体）のＳＩＧＬＥＣ抗体を含むことができる。本組成物は他の抗体またはコンジュゲート（例えば抗体カクテル）をさらに含んでもよい。
【０１８５】
本医薬組成物は、好ましくは、適切な担体および佐剤も含む。適切な担体および佐剤には、本発明のＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ分子と混合した場合にこの分子の活性を保ち、かつ対象の免疫系とは反応しない任意の物質が包含される。適切な担体および佐剤の例としては、ヒト血清アルブミン、イオン交換体、アルミナ、レシチン、リン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、および硫酸プロタミンなどの塩類または電解質が挙げられるが、これらに限らない。他の例には、任意の標準的医薬担体、例えばリン酸緩衝食塩溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、および様々なタイプの湿潤剤などが含まれる。他の担体としては、例えば滅菌溶液、被覆錠を含む錠剤、およびカプセルなどを挙げることができる。通例、このような担体は賦形剤、例えばデンプン、ミルク、糖、ある種の粘土、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩、マグネシウムまたはステアリン酸マグネシウム、タルク、植物油脂、ゴム、グリコール類、または他の既知の賦形剤を含む。このような担体は、香料および着色料または他の成分を含んでもよい。このような担体を含む組成物は、周知の従来法によって製剤化される。そのような組成物は、例えばリポソームなどの種々の脂質組成物内に製剤化したり、ポリマーミクロスフェアなどの種々のポリマー組成物中に製剤化したりしてもよい。
【０１８６】
本発明の医薬組成物は、通常の投与法、例えば静脈内（ｉ．ｖ．）投与、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与、筋肉内（ｉ．ｍ．）投与、皮下投与、経口投与、坐剤としての投与、または局所外用、またはミニ浸透圧ポンプなどの徐放装置の植込みなど（ただしこれらに限るわけではない）を使って、対象に投与することができる。本発明の医薬組成物は、例えば溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、散剤、坐剤、ポリマーマイクロカプセルまたは微小胞、リポソーム、および注射用または注入用液など、種々の剤形をとることができる。好ましい剤形は、投与方式および治療用途に依存する。
【０１８７】
本発明の組成物に関する最も有効な投与方式および用法は、多くの要因、例えば患部組織のタイプ、処置しようとする自己免疫疾患のタイプ、疾患の重症度、対象の健康状態、薬剤による処置に対する対象の応答など（ただしこれらに限らない）に依存する。したがって薬剤の投与量は対象および投与方式によって様々である。
【０１８８】
可溶性ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ分子は、適当な量で、適切な期間（例えば時間および／または複数回）、対象に投与することができる。本発明の医薬組成物の投与は、様々な時間にわたって行なうことができる。一態様として、本発明の医薬組成物は１時間以上にわたって投与することができる。さらに、疾患の重症度および当技術分野で知られている他の要因によっては、投与を繰り返すこともできる。
【０１８９】
本発明を例証し、当業者がそれを構成して利用するのを助けるために、以下に実施例を記載する。方法論および結果は、処置の目標および使用する手法によって異なりうる。本実施例は、決して、本発明の範囲を詳細に限定しようとするものではない。
【０１９０】
実施例１
以下に、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ ｃＤＮＡクローン、ｃＤＮＡクローンの配列、およびＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳポリペプチドを得るために使用した方法を説明する。
【０１９１】
正常組織と比較して罹患免疫組織中で転写物発現の増加を示すヒト遺伝子配列を求めて商用ＥＳＴデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ ＥＳＴデータベース、カリフォルニア州パロアルト）を検索し、興味あるｃＤＮＡクローンを同定し、それらのクローンをデータベースの所有者（Ｉｎｃｙｔｅ）から取得し、クローンのインサート全体を配列決定することによって、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳヌクレオチド配列を持つ核酸分子を得た。具体的には、検索により、喘息患者由来の好酸球で優先的に発現されるヌクレオチド配列Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ（−Ｌ３ａ）が同定された。同じＥＳＴデータベースをさらにマイニングして、ｃＤＮＡクローンを取得することにより、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ（−Ｌ３ｂ、−Ｌ３ｃ、−Ｌ３ｄ、−Ｌ４ａ、−Ｌ５ｄ、および−Ｌ５ｂ）のヌクレオチド配列を持つ他のｃＤＮＡクローンを得た。
【０１９２】
Ｑｉａｇｅｎ ＢｉｏＲｏｂｏｔ ９６００を使って、個々のｃＤＮＡクローンからＤＮＡを単離した。次に、精製されたＤＮＡを、ダイターミネーター法を使ったサイクルシークエンシングに掛けた後、ＡＢＩ３７７シークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）でのアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、検出した。
【０１９３】
Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を、両方の鎖の３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全てで解析して、コードされているタンパク質の予想アミノ酸配列を決定した。ヌクレオチド配列解析は、ＳｅｑＷｅｂバージョン１．１（ＧＣＧ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０、ウィスコンシン州マディソン、１９９９）を使って行ない、アミノ酸配列の予測には翻訳ツール（Ｔｒａｎｓｌａｔｅ Ｔｏｏｌ）を、またモチーフの予測には構造解析ツール（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌ）を使用した。全てのクローンにいくつかのＩｇ様ドメインが同定されたので、ＧＣＧのパイルアップツール（Ｐｉｌｅｕｐ Ｔｏｏｌ）を使ったさらなる類似性解析が可能になった（Ｕｎｉｘバージョン９．１、１９９７）。この類似性解析に基づいて、さらに１つのＩｇドメインが、Ｌ３クローンに同定された。各クローンのアミノ酸配列を比較したところ、これらのｃＤＮＡクローンはヒトＣＤ３３（Ｓｉｇｌｅｃ−３）と配列相同性を持つタンパク質をコードする配列を含むことが示唆された。これらのヌクレオチド配列をＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ（配列番号１〜７、１５）と命名し、タンパク質配列（配列番号８〜１４、１６）をＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳと命名した。
【０１９４】
ウェブ型実験室管理データシステムＰＨＲＥＤを使って配列データを追跡、加工し（Ｅｗｉｎｇ，Ｂ．，Ｈｉｌｌｉｅｒ，Ｌ．，Ｗｅｎｄｌ，Ｍ．およびＧｒｅｅｎ，Ｐ．，１９９８，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８：１７５−１８５「Ｂａｓｅｃａｌｌｉｎｇ ｏｆ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ｔｒａｃｅｓ ｕｓｉｎｇ ＰＨＲＥＤ． Ｉ． Ａｃｃｕｒａｃｙ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ」）、ＰＨＲＡＰアルゴリズムを使って、個々の配列を連続した断片にアセンブルした（Ｅｗｉｎｇ，Ｂ．およびＧｒｅｅｎ，Ｐ．，１９９８，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８：１８６−１９４「Ｂａｓｅｃａｌｌｉｎｇ ｏｆ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ｔｒａｃｅｓ ｕｓｉｎｇ ＰＨＲＥＤ． ＩＩ． Ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｉｅｓ」）。アセンブルしたＤＮＡデータは、ＣＯＮＳＥＤ（Ｇｏｒｄｏｎ，Ｄ．，Ａｂａｊｉａｎ，Ｃ．およびＧｒｅｅｎ，Ｐ．，１９９８，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８：１９５−２０２「Ｃｏｎｓｅｄ： Ａ ｇｒａｐｈｉｃａｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｉｎｉｓｈｉｎｇ」）を使って編集して、品質を手作業で点検し、配列ギャップを閉じて隣接させるためのプライマーを設計すると共に、配列内のあいまいさを解消した。
【０１９５】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ａのアミノ酸配列
Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ａのヌクレオチド配列（配列番号１、図２Ａ、クローン５２６６０４）は、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３転写物の選択的スプライス型に相当すると予想される。Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ａヌクレオチド配列は、ＣＤ３３と共通する構造的特徴を示す５８４アミノ酸長のオープンリーディングフレームをコードする。このヌクレオチド配列は、配列番号８（図２Ｂ）に記載のアミノ酸配列を持つＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ａタンパク質をコードする。ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ａは、Ｎ末端の４２アミノ酸疎水性シグナルペプチド、３つのＩｇ様ドメインを含む３９７アミノ酸細胞外ドメイン、２５アミノ酸残基の膜貫通ドメイン、および２つの推定ＩＴＩＭモチーフを含む１２０アミノ酸細胞内ドメインを持っている。
【０１９６】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ａは喘息患者の好酸球で発現する。したがって、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ａは、接着を調節し、細胞内シグナルを生成して、好酸球の成熟、動員、および炎症部位での活性化を支持する細胞表面受容体であるだろう。したがって、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ａは、喘息および免疫系の他の疾患にとって潜在的標的であることが判明するだろう。
【０１９７】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ｂのアミノ酸配列
配列番号２に示すＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ｂのヌクレオチド配列（図３Ａ、クローン５２７５９５）は、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ａに関係する部分転写物に相当する。Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ｂヌクレオチド配列は、ＣＤ３３と共通する構造的特徴を示すがＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ａの配列と比較すると最初の１７アミノ酸残基を欠く６２０アミノ酸長のＯＲＦをコードする。このヌクレオチド配列は、不完全なＮ末端１５アミノ酸疎水性シグナルペプチド、３つのＩｇ様ドメインを含む４７５アミノ酸細胞外ドメイン、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ａにはないアミノ酸インサート配列、２５アミノ酸残基の膜貫通ドメイン、および２つの推定ＩＴＩＭモチーフを含む１２０アミノ酸細胞内ドメインを持つ配列番号９（図３Ｂ）に記載のアミノ酸配列を有するＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ｂタンパク質をコードする。
【０１９８】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ｃのアミノ酸配列
配列番号３に示すＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ｃのヌクレオチド配列（図４Ａ、クローン６５２９９５）は、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ａに関係する部分転写物に相当する。Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ｃヌクレオチド配列は、ＣＤ３３と共通する構造的特徴を示すがＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ａの配列と比較すると最初の１２２アミノ酸残基を欠く５７３アミノ酸長のＯＲＦをコードする。このヌクレオチド配列は、３つのＩｇ様ドメインを含む４２８アミノ酸残基長の不完全な細胞外ドメイン、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ｄには見つかるがＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ｂにはない５８アミノ酸のインサート配列、２５アミノ酸残基の膜貫通ドメイン、および２つの推定ＩＴＩＭモチーフを含む１２０アミノ酸細胞内ドメインを持つＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ｃタンパク質（配列番号１０、図４Ｂ）をコードする。
【０１９９】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ｄのアミノ酸配列
配列番号４に示すＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ｄのヌクレオチド配列（図５Ａ、クローン１７０９９６３）は、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ａに関係する部分転写物に相当する。Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ｄヌクレオチド配列は、ＣＤ３３と共通する構造的特徴を示すがＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ａの配列と比較すると最初の４５アミノ酸残基を欠く４３１アミノ酸長のＯＲＦをコードする。このヌクレオチド配列は、不完全な細胞外ドメイン、４つのＩｇ様ドメイン、および２０アミノ酸残基の膜貫通ドメインを含む４１０アミノ酸残基長のＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ｄタンパク質（配列番号１１、図５Ｂ）をコードする。
【０２００】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ４ａのアミノ酸配列
配列番号５に示すＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ４ａのヌクレオチド配列（図７Ａ、クローン２８９５８２３）は、Ｓｉｇｌｅｃ−８転写物の選択的スプライス型に相当する。Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ４ａヌクレオチド配列は、ＣＤ３３と共通する構造的特徴を示すが残基数未知のＮ末端アミノ酸残基を欠く４６７アミノ酸長のオープンリーディングフレームをコードする。このヌクレオチド配列は、２つのＩｇ様ドメインを含む２６７アミノ酸細胞外ドメイン、２４アミノ酸残基の膜貫通ドメイン、および推定ＩＴＩＭまたはＩＴＡＭモチーフを含む３０アミノ酸細胞内ドメインを持つＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ４ａタンパク質（配列番号１２、図７Ｂ）をコードする。
【０２０１】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ５ａのアミノ酸配列
配列番号６に示すＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ５ａのヌクレオチド配列（図８Ａ、クローン３３４４９２６）は、Ｓｉｇｌｅｃ−９転写物の選択的スプライス型の完全長ｃＤＮＡに相当する。Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ５ａヌクレオチド配列は、ＣＤ３３と共通する構造的特徴を示す４６４アミノ酸長のオープンリーディングフレームをコードする。このヌクレオチド配列は、２つのＩｇ様ドメインを含む２６２アミノ酸細胞外ドメイン、２４アミノ酸残基の膜貫通ドメイン、および推定ＩＴＩＭまたはＩＴＡＭモチーフを含む３０アミノ酸細胞内ドメインを持つＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ５ａタンパク質（配列番号１３、図８Ｂ）をコードする。
【０２０２】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ５ｂのアミノ酸配列
配列番号７に示すＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ５ｂのヌクレオチド配列（図９Ａ、クローン３４０３１５６）は、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ５ａに関係する転写物、例えばＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ５ａの選択的スプライス型に相当する。Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ５ｂヌクレオチド配列は、ＣＤ３３と共通する構造的特徴を示す２８７アミノ酸長のオープンリーディングフレームをコードする。このヌクレオチド配列は、Ｎ末端１５アミノ酸疎水性シグナルペプチド、Ｉｇ様ドメインを１つだけ含む１５５アミノ酸細胞外ドメイン、およびこのタンパク質のＣ末端の読み枠をシフトさせるＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ５ｂにはない配列を有するインサートを持つＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ５ｂタンパク質（配列番号１４、図９Ｂ）をコードする。ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ５ｂの配列は膜貫通ドメインを欠いている。
【０２０３】
実施例２
ノーザンブロット技術を使って行なった種々のヒト組織におけるＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ転写物の発現パターンの解析を以下に説明する。
【０２０４】
ノーザンブロットメンブレン（図１０Ａ）はＣｌｏｎｔｅｃｈ（ＭＴＮ Ｂｌｏｔｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）から入手した。メンブレンの各レーンには、種々のヒト組織から抽出された約１〜２マイクログラムのポリＡ＋ＲＮＡが含まれていた。ヒト脾臓、リンパ節、胸腺、ＰＢＬ、骨髄および胎児肝臓由来のＲＮＡ試料を含むブロット（ＭＴＮ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩブロット）と、ヒト脳、心臓、骨格筋、結腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、およびＰＢＬを含むブロット（ＭＴＮ Ｈｕｍａｎ １２レーンブロット）とを、開始コドンＡＴＧから始まる完全長Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３を参考配列として、それぞれＰＣＲ法によって作製したプローブとハイブリダイズさせた（図１０Ｂ）。Ｌ３プローブは、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−３ａ、−３ｂ、−３ｃ、および−３ｄに共通するヌクレオチド位置５９６〜１３２８のヌクレオチド配列を含む。Ｓ１プローブは、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−３ｃおよび−３ｄに共通するヌクレオチド位置４２８〜５９３のスプライス変異体配列を含む。Ｓ２プローブは、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−３ｂおよび−３ｃに共通するヌクレオチド位置１３４１〜１５７８のスプライス変異体配列を含む。３つのプローブは全てＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ｃ配列（例えば６５２９９５）から増幅した。さらに、β−アクチンプローブを対照プローブとして使用した（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）。
【０２０５】
ノーザン解析用プローブの作製に使用するＰＣＲプライマーには、以下のプライマーを含めた：
Ｌ３：
５’（５９６−６１６） ＴＧＣ ＴＣＡ ＧＣＴ ＴＣＡ ＣＧＣ ＣＣＡ ＧＡＣ（配列番号３３）
３’（１３１９−１３２８） ＴＧＣ ＡＣＧ ＧＡＧ ＡＧＧ ＣＴＧ ＡＧＡ ＧＡ（配列番号３４）
プローブ長：７３２ｂｐ
Ｓ１：
５’（４２８−４４６） ＣＴＣ ＡＧＡ ＡＧＣ ＣＴＧ ＡＴＧ ＴＣＴ Ａ（配列番号３５）
３’（５７６−５９３） ＧＡＧ ＡＡＧ ＴＧＧ ＧＡＧ ＧＴＣ ＧＴＴ（配列番号３６）
プローブ長：６５ｂｐ
Ｓ２：
５’（１３４１−１３５９） ＣＴＧ ＣＴＧ ＧＧＣ ＣＣＣ ＴＣＣ ＴＧＣ（配列番号３７）
３’（１５５９−１５７８） ＧＡＣ ＧＴＴ ＣＣＡ ＧＧＣ ＣＴＣ ＡＣＡ Ｇ（配列番号３８）
プローブ長：２３７ｂｐ
参考配列：ＡＴＧから始まる完全長ＢＭＳＬ３。
【０２０６】
プローブは個別に、ランダムプライミングによって３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識し、Ｃｈｒｏｍｏｓｐｉｎ １００カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で精製し、熱変性した。メンブレンを、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中、連続的に振とうしながら、６８℃で３０分間プレハイブリダイズした。メンブレンを、変性プローブ（約２００万ｃｐｍ／ｍｌ）と共に、新しいＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液中、連続的に振とうしながら、６８℃で４時間インキュベートした。メンブレンを、０．０５％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、室温で４０分間洗浄し、その間に洗浄液を数回交換した。次に、０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中、５０℃で４０分間の洗浄を、洗浄液を数回交換して行なった。メンブレンのハイブリダイゼーションパターンはＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ ４４５ ＳＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、カリフォルニア州サニーベール）を使って得た。
【０２０７】
Ｌ３プローブにより、脾臓、リンパ節およびＰＢＬを含むヒト免疫組織中に、４．４ｋｂの転写物が容易に検出された。それより低レベルのＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３転写物が、ヒト胸腺、骨髄および胎児肝臓にも検出された（図１０Ａ）。Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３転写物は、脳、心臓、骨格筋、結腸、腎臓、肝臓、小腸、胎盤または肺を含むヒト非免疫組織には検出されなかった。
【０２０８】
実施例３
標準的な逆転写酵素ＰＣＲ増幅技術を使って行なった種々のヒト組織におけるＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ転写物の発現パターンの解析を以下に説明する。
【０２０９】
逆転写酵素ＰＣＲ法を使って、初代ヒト細胞および細胞株から抽出したＲＮＡならびに市販のヒト器官ｃＤＮＡにおけるＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ転写物の組織分布を決定した。ＣｌｏｎｔｅｃｈからＨｕｍａｎ Ｉ、ＩＩおよびＩｍｍｕｎｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ ｃＤＮＡ Ｐａｎｅｌを購入した。さらに、単球、ＴＮＦ刺激内皮細胞、脾臓、ＨＬ−６０細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞から、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、ニューヨーク州グランドアイランド）を製造者の指示通りに使って、ＲＮＡを抽出した。
【０２１０】
抽出したＲＮＡを、以下の反応混合物を使って、ｃＤＮＡに逆転写した：ジエチルシアノホスフェート処理（ＤＥＰＣ）水８マイクロリットル、５×第１鎖バッファー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）４マイクロリットル、１０ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）２マイクロリットル、０．１Ｍ ＤＴＴ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）２マイクロリットル、ＲＮアーゼ阻害剤（４０Ｕ、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ニュージャージー州インディアナポリス）１マイクロリットル、１０×ヘキサヌクレオチド（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）２マイクロリットル、およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）１マイクロリットル中、各試料から得た全ＲＮＡ ５マイクログラム。反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした後、７５℃で１５分間インキュベートし、４℃で保存した。カスタムプライマーをＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（メリーランド州ゲーサーズバーグ）から入手し、各プライマー対について配列決定パラメーターを最適化した。ＰＣＲ産物の品質を１．２％アガロースゲルでの電気泳動によって決定した。ＰＣＲは、「Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ」ＰＣＲ Ｂｅａｄｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使って、以下の物質を含む２５マイクロリットルの反応混合物中で行なった：１．５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（室温でｐＨ９．０）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、およびＢＳＡを含む安定剤、０．２μＭの各プライマー、および１マイクロリットルのＲＴ−ＰＣＲ反応生成物または各２μｌのＣｌｏｎｔｅｃｈ製市販ＭＴＣ Ｈｕｍａｎ Ｉ、ＩＩおよびＩｍｍｕｎｅ ｃＤＮＡパネル。
【０２１１】
ＰＣＲ反応に使用するＰＣＲプライマー配列には、以下の配列を含めた：
Ｐ１プライマー：
５’（−９６／−７７） ＣＣＴ ＴＣＧ ＧＣＴ ＴＣＣ ＣＣＴ ＴＣＴ ＧＣ（配列番号３９）
３’（５６０−５７９） ＣＧＴ ＴＧＧ ＴＴＴ ＧＧＴ ＴＣＣ ＴＴＧ Ｇ（配列番号４０）
Ｐ２プライマー：
５’（８５２−８７０） ＣＡＣ ＡＣＴ ＧＡＧ ＣＴＧ ＧＧＴ ＣＣＴ Ｇ（配列番号４１）
３’（１５６０−１５７８） ＧＡＣ ＧＴＴ ＣＣＡ ＧＧＣ ＣＴＣ ＡＣＡ Ｇ（配列番号４２）
Ｐ３プライマー：
５’（８５２−８７０） ＣＡＣ ＡＣＴ ＧＡＧ ＣＴＧ ＧＧＴ ＣＣＴ Ｇ（配列番号４３）
３’（１６７０−１６８９） ＧＡＡ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＧＣ ＣＧＴ ＧＡＴ ＧＣ（配列番号４４）。
【０２１２】
【表３】
各Ｌ３スプライス変異体の予想産物サイズ
2004516012.tif 000006
上の表に示すように、Ｐ３プライマーは、５５２ｂｐ、８３７ｂｐ、８３７ｂｐおよび５５２ｂｐ長であると予想された。
結果を図１１Ａの表に示す。
【０２１３】
実施例４
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ増幅技術を使って行なった種々のヒト組織、血液細胞および細胞株におけるＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ転写物の発現パターンの解析を以下に説明する。
【０２１４】
Ｈｕｍａｎ Ｉ、ＩＩおよびＩｍｍｕｎｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ ｃＤＮＡ ＰａｎｅｌをＣｌｏｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州パロアルト）から購入した。さらに、リンパ球、好酸球、好中球、Ｔ細胞、単球、ＴＮＦ刺激内皮細胞、脾細胞、ＨＬ６０細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞からＲＮＡを得て、上記実施例３で述べたように逆転写した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）を使ってｃＤＮＡを増幅した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎシステムは、内部ハウスキーピング遺伝子β−アクチンと比較した標的転写物配列の相対的定量と、増幅のリアルタイムモニタリングを可能にする（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃２ Ｐ／Ｎ ４３０３８５９）。反応はＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行なった。全ての反応を増幅曲線の直線部分でβ−アクチン遺伝子によって標準化した。
【０２１５】
Ｌ３遺伝子の様々な領域を増幅するために以下のプライマー対を使用した（図１２Ａ）。すなわち、Ｌ３−ＴＭプライマー対は、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−３ａ、−３ｂ、−３ｃおよび−３ｄに共通するヌクレオチド位置１６０３〜１９６６の推定膜貫通配列を含み、Ｓ１プライマー対は、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−３ｃおよび−３ｄに共通するヌクレオチド位置４２８〜４４７のスプライス変異体配列を含み、Ｓ２プライマー対は、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−３ｂおよび−３ｃに共通するヌクレオチド位置１９４８〜１９６６のスプライス変異体配列を含む。データはβ−アクチン遺伝子発現に対して標準化した後、参考組織とした骨格筋に対する増加倍率として表した（図１２Ｂ）。
【０２１６】
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ増幅法のＰＣＲプライマーには以下のプライマーを含めた：
Ｌ３−ＴＭ：
５’（１６０３−１６２１） ＴＧＣ ＡＧＣ ＴＧＣ ＣＡＧ ＡＴＡ ＡＧＡ（配列番号４５）
３’（１９４８−１９６６） ＧＧＣ ＴＴＧ ＡＧＴ ＧＧＡ ＴＧＡ ＴＴＴ（配列番号４６）
ＰＣＲ産物：３６３ｂｐ
Ｓ１：
５’（４２８−４４７） ＣＴＣ ＣＧＡ ＡＧＣ ＣＴＧ ＡＴＧ ＴＣＴ Ａ（配列番号４７）
３’（５７６−５９４） ＧＡＧ ＡＡＧ ＴＧＧ ＧＡＧ ＧＴＣ ＧＴＴ（配列番号４８）
ＰＣＲ産物：１６６ｂｐ
Ｓ２：
５’（１３４３−１３６１） ＣＴＧ ＣＴＧ ＧＧＣ ＣＣＣ ＴＣＣ ＴＧＣ（配列番号４９）
３’（１５６０−１５７９） ＧＡＣ ＧＴＴ ＣＣＡ ＧＧＣ ＣＴＣ ＡＣＡ Ｇ（配列番号５０）
ＰＣＲ産物：２３６ｂｐ
β−アクチン：
５’ＧＴＧ ＧＧＧ ＣＧＣ ＣＣＣ ＡＧＧ ＣＡＣ ＣＡ（配列番号５１）
３’ＣＴＣ ＣＴＴ ＡＡＴ ＧＴＣ ＡＣＧ ＣＡＣ ＧＡＴ ＴＣ（配列番号５２）
ＰＣＲ産物：５３９ｂｐ。
【０２１７】
実施例５
Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ａ、−Ｌ３ｂ、−Ｌ３ｃおよび−Ｌ３ｄを含む様々な選択的スプライス転写物を生成するＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３のヒト染色体位置のマッピングを以下に説明する。
【０２１８】
スタンフォードＧ３ラジエーションハイブリッドパネル（スタンフォード大学ゲノムセンターラジエーションハイブリッドマッピングサーバー）を使って、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳＬ３のヒト染色体マップ位置を決定した。膜貫通領域から１５０ｂｐの断片を増幅させるプライマー対を選択した。ＰＣＲ条件には、９５℃で５分の後、９５℃、５６℃および７２℃で各３０秒を３０サイクル、次に７２℃で１０分という条件を含めた。
【０２１９】
プライマーを使って、スタンフォードＧ３セットの８３ハイブリッド全てをスクリーニングした。得られた陽性および陰性パターンをスタンフォードヒトゲノムセンターラジエーションハイブリッドマッピングサーバーに送信し、１５，６３２個の基準マーカーに対する２点統計解析（ｔｗｏ−ｐｏｉｎｔ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）にかけた。この解析により、それぞれ３２ｃＲ［ＬＯＤ（Ｌｏｇ ｏｆ Ｏｄｄｓ）スコア＝６．４７］および２９ｃＲ（ＬＯＤスコア＝６．２８）の距離にある２つのマーカーＤ１９Ｓ４２５およびＤ１９Ｓ４１８への連鎖が得られ、このパネルではそれぞれ９６０および８７０ｋｂの物理的距離に相当した（１ｃＲ＝３０ｋｂ）。１９番染色体のこの領域のスタンフォードラジエーションハイブリッドマップを参照すると、順序はおそらくはＤ１９Ｓ４１８−Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳＬ３−Ｄ１９Ｓ４２５であり、細胞遺伝学的位置は１９ｑ１３であることがわかる。マーカーＤ１９Ｓ４１８は、１９番染色体のＷｈｉｔｅｈｅａｄ遺伝地図のＹＡＣ７９０Ａ０５で陽性である（Ｗｅｎｄｅら，Ｍａｍｍａｌ Ｇｅｎ．，１０，１５４−１６０（１９９９））。
【０２２０】
染色体位置決定法に使用するＰＣＲプライマーには、以下のプライマーを含めた。
Ｌ３−ＴＭ：
５’（１６０３−１６２１） ＴＧＣ ＡＧＣ ＴＧＣ ＣＡＧ ＡＴＡ ＡＧＡ（配列番号５３）
３’（１９４８−１９６６） ＧＧＣ ＴＴＧ ＡＧＴ ＧＧＡ ＴＧＡ ＴＴＴ（配列番号５４）
ＰＣＲ産物：３６３ｂｐ。
【０２２１】
実施例６
ヒトＲガンマ鎖に融合されたＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ａおよびＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３−９９５−２の細胞外ドメインを含むＩｇ融合タンパク質の作製を以下に説明する。
【０２２２】
Ｉｇ融合タンパク質をコードするプラスミドを構築した。簡単に述べると、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ａ（例えば５２６６０４）またはＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３−９９５−２の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を、肝ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲ法によって増幅した。ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を、独占販売されている発現ベクターｐｄ１９（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ、ニュージャージー州プリンストン）に作動可能な形で連結した。ｐｄ１９ベクターは、Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ａおよびＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３−９９５−２配列の発現を駆動するように、サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶプロモーター；Ｂｏｓｈａｒｔ，Ｍ．ら，１９８５，Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０）を持っている。さらにｐｄ１９ベクターは、そこにコードされている免疫グロブリン部分のＦｃ受容体結合を減少させる点突然変異を持つヒトＲガンマ鎖の一部を含んでいる。得られたプラスミドをＳｉｇｌｅｃＬ３Ａ−ｈＩｇおよびＳｉｇｌｅｃＬ３−ｈＩｇと名付けた。ＳｉｇｌｅｃＬ３−ｈＩｇ融合タンパク質を、ＤＥＡＥ一過性トランスフェクションにより、ＣＯＳ細胞で発現させた。融合タンパク質は、使用前に、プロテインＡトリスアクリルカラム（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）を使ったクロマトグラフィーによって、ＣＯＳ７上清から精製した。
【０２２３】
実施例７
ＦＡＣＳ解析を使って行なったＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ＡおよびＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３融合タンパク質の細胞外ドメインの結合特異性の決定を以下に説明する。
【０２２４】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ＡおよびＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３の結合特異性を決定するために、混合白血球細胞集団および造血細胞株を入手した。この解析で使用した細胞および細胞株には、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞である細胞株ＭＢ、ＰＭおよびＴＪ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、Ｂ細胞リンパ芽球腫Ｒａｍｏｓ、ＨＳＢ−２およびＲａｊｉ；Ｔ細胞リンパ芽球腫であるＪｕｒｋａｔ；赤芽球性白血病細胞株であるＨＥＬ；およびアメリカンタイプカルチャーコレクション（バージニア州マナッサス）から入手した単球細胞株Ｕ９７３およびＨＬ６０が含まれる。
【０２２５】
細胞を、結合バッファー（１％ｗ／ｖウシ血清アルブミンおよび０．１％アジ化ナトリウムを含むＤＭＥＭ）に、タンパク質濃度５マイクログラム／１×１０６細胞のＳｉｇｌｅｃ融合タンパク質（実施例６）、ｍＡＬＣＡＭ ｈＩｇ融合タンパク質（Ｒガンマ融合タンパク質対照）、またはＣＤ５ ｈＩｇ融合タンパク質（Ｅガンマ融合タンパク質対照）と共に懸濁した。融合タンパク質上のＩｇテールがＦｃ受容体に非特異的に結合しないように、ウサギＩｇ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，ミズーリ州セントルイス）も、１００マイクログラム／１００万細胞の割合で加えた。その混合物を氷上で１時間インキュベートした後、結合バッファーで２回洗浄した。各洗浄の間に細胞を５００×Ｇで５分間遠心分離した。抗ｈＩｇ／ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ペンシルバニア州ウェストグローブ）および／またはフィコエリトリン結合抗ＣＤ２０／ＰＥ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ、カリフォルニア州サンノゼ）、抗ＣＤ１４／ＰＥ（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）および抗ＣＤ４／ＰＥ（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）を氷上で３０分間加えた。さらなる洗浄を行なった後、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェアを使って、細胞をＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｋｅｎｓｏｎ ＦＡＣＳｏｒｔで解析した。細胞を生細胞ゲーティングし、赤／緑色を補正した。
【０２２６】
混合白血球集団をＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ融合タンパク質への結合について解析した。ＦＡＣＳ解析の結果を表４に示す。ＦＡＣＳによって調べた細胞へのＳＩＧＬＥＣ ＢＭＳＬ３ａおよびＳＩＧＬＥＣ ＢＭＳＬ３の結合に差異はなかった。リンパ球サイズの細胞および単球サイズの細胞の小集団はどちらの融合タンパク質についても陽性に染色された。抗ＣＤ２０（Ｂ細胞用）、単球用抗ＣＤ１４、抗ＣＤ４または抗ＣＤ３（Ｔ細胞用）との二重染色により、Ｂ細胞および単球は融合タンパク質を結合するが、Ｔ細胞は結合しないことが確認された。Ｂ細胞および単球上のＦｃ受容体への融合タンパク質の結合も考えられるが、その可能性は、２つの融合タンパク質対照、すなわちＦｃＲを結合しないＲガンマｈＩｇテールを持つもの（ｍＡＬＣＡＭ ｈＩｇ）およびＦｃＲを結合するＥガンマｈＩｇテールを持つものとの比較によって排除された。
【０２２７】
同様のＦＡＣＳ解析を細胞株で行なった。ＨＥＬ細胞株（例えば赤芽球性白血病細胞株）およびＪｕｒｋａｔ細胞株（例えばＴ細胞株）は、どちらのＳＩＧＬＥＣ ＢＭＳＬ３融合タンパク質についても陽性に染色されなかった。さらに、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株ＭＢ、ＰＭおよびＴＪも陽性に染色されなかった。Ｂ細胞株Ｒａｍｏｓ、ＲａｊｉおよびＨＳＢ２は陽性に染色された。全血では多少の単球結合が認められたが、単球細胞株Ｕ９７３およびＨＬ６０は何も結合を示さなかった。
【０２２８】
Ｓｉｇｌｅｃ−１０−ｈＩｇ結合のＦＡＣＳ解析を表４に示す。データは、混合白血球集団および造血細胞株をＳｉｇｌｅｃ−１０−ｈＩｇ融合タンパク質と共にインキュベートした後、フルオレセイン結合抗ｈＩｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ペンシルバニア州ウェストグローブ）および／またはフィコエリトリン結合抗ＣＤ２０、抗ＣＤ３、抗ＣＤ１４および抗ＣＤ４で染色することによって得た。対照としてｍＡＬＣＡＭ ｈＩｇ融合タンパク質（ｈＩｇ Ｒγ対照）およびＣＤ５ ｈＩｇ融合タンパク質（ｈＩｇ Ｅγ対照）を並行して解析した。融合タンパク質上のＩｇテールがＦｃ受容体に非特異的に結合するのを防ぐために、ウサギＩｇ（Ｓｉｇｍａ）も加えた。ｍＡＬＣＡＭ、ＣＤ５およびＳｉｇｌｅｃ−１０ ｈＩｇについて、バックグラウンドとの比較でＦＩＴＣに関して陽性に染色される細胞の割合を示す。細胞株には単色ＦＡＣＳを使用し、初代末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）には二色ＦＡＣＳを使った。
【表４】
2004516012.tif 000007
【０２２９】
実施例８
固形支持体法による、異なる血球集団または細胞株がＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３融合タンパク質の細胞外ドメインに対して結合特異性を示すかどうかの決定を、以下に説明する。
【０２３０】
ＥＬＩＳＡプレートをＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳＬ３ ｈＩｇ融合タンパク質（２００ｎｇ／ウェル）で一晩コーティングすることによって、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３融合タンパク質を固形支持体上に固定化した。そのプレートを１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭで１時間ブロックした。
【０２３１】
使用する細胞および細胞株には、混合白血球、混合顆粒球、精製Ｂ細胞、精製ＮＫ細胞、精製単球、Ｒａｍｏｓ（Ｂ細胞株）、ＲＢＣ、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔ細胞株）ならびにＨＬ６０およびＫ６５２（単球細胞株）を含めた。血液細胞および細胞株をカルセインＡＭ（５マイクロリットル／１０８細胞）で３７℃で３０分間標識した。細胞をハンクス緩衝食塩溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄し、ブロックしたＥＬＩＳＡプレート（２００マイクロリットル中、４×１０５／ウェル）に３７℃で３０分間加えた。プレートをＨＢＳＳで穏やかに洗浄し、１００マイクロリットルのＨＢＳＳを各ウェルに加えた。蛍光はＣｙｔｏＦｌｕｏｒ４０００（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、マサチューセッツ州フレーミングハム）を使って励起波長４８５／蛍光波長５３０で読み取った。
【０２３２】
結果を図１３に示す。混合白血球、混合顆粒球、精製Ｂ細胞、精製ＮＫ細胞、精製単球およびＲａｍｏｓ（Ｂ細胞株）は固定化ＳＩＧＬＥＣ融合タンパク質に付着した。ＲＢＣ、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔ細胞株）、ＨＬ６０およびＫ６５２（単球細胞株）は、上記タンパク質被覆プレートに付着しなかった。細胞のシアリダーゼ前処理（０．１Ｕ／ｍｌ、３７℃で３０分）はどの付着細胞タイプの結合にも有意な影響を及ぼさなかった。
【０２３３】
実施例９
完全長ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３（例えば９９５−２、実施例１４参照）タンパク質を発現させるＣＯＳ細胞ならびに種々の細胞および細胞株を使った結合試験を以下に説明する。
【０２３４】
ＣＯＳ７細胞に、完全長Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３（例えば９９５−２、実施例１４参照）を含むｐｃＤＮＡ３プラスミド（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を、ＤＥＡＥ−デキストラン法により、一過性にトランスフェクトまたは疑似（ｍｏｃｋ）トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、ＥＤＴＡを使って細胞をプレートから解離させ、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭが入っている６ウェルプレートに、２×１０５／ウェルの密度で再播種した。結合アッセイは、トランスフェクション後４８時間から６０時間の間に行なった。
【０２３５】
血球および細胞株をカルセインＡＭ（５マイクロリットル／１０８細胞）で３７℃で３０分間標識した。０．２５％ＢＳＡを含むＤＭＥＭに、ＲＢＣ、混合白血球、Ｒａｍｏｓ（Ｂ細胞株）、ＨＬ６０およびＫ５６２（単球細胞株）ならびにＪｕｒｋａｔ（Ｔ細胞株）を再懸濁した。一部の細胞についてはシアリダーゼによる前処理も行なった（０．１Ｕ／ｍｌ、３７℃で３０分の後、ＤＭＥＭ＋０．２５％ＢＳＡで３回洗浄）。１ｍｌの血球または細胞株懸濁液を各ウェルに加えた。細胞を、穏やかに振とうしながら、３７℃で３０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳ＋０．２５％ＢＳＡで穏やかに３回洗浄した。細胞を０．２５％グルタルアルデヒドで固定した。
【０２３６】
結合を定量化するために、２以上の添加細胞タイプを結合するトランスフェクトＣＯＳ７細胞の割合を、各処置につき１０視野から決定した（各処置につき少なくとも１００細胞を調べた）。結果をＣＯＳ７細胞結合のパーセンテージとして表した。トランスフェクト細胞への結合を、疑似トランスフェクト対照とも比較した。
【０２３７】
結果を図１４に示す。トランスフェクトＣＯＳ７細胞は混合白血球およびＲａｍｏｓ細胞株（Ｂ細胞株）に結合した。シアリダーゼ前処理はこの結合に有意な影響を及ぼさなかった。シアル酸消化が完全であるという証拠はないので、この観察結果は示唆に過ぎない。トランスフェクトＣＯＳ７細胞はＲＢＣ、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔ細胞株）またはＨＬ６０およびＫ５６２（単球細胞株）への結合は示さなかった。
【０２３８】
実施例１０
ＧＳＴタンパク質に融合したＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ａの細胞質テールドメインを含む種々の融合タンパク質の作製を以下に説明する。
【０２３９】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３タンパク質の細胞質テールドメインを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を構築するために、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３の細胞質ドメインをＰＨＡ活性化Ｊｕｒｋａｔ ｃＤＮＡライブラリーから増幅した（ＫＲＲＴＱＴＥ．．．ＶＫＦＱ＊；例えば図６Ｂを参照されたい）。ＧＳＴ配列を含むｐＧＥＸ４Ｔ−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位に、上記細胞質テール断片をサブクローニングした。得られたコンストラクトをＧＳＴ−ＳｉｇｌｅｃＬ３ｃｙｔｏと名付けた（図１５）。
【０２４０】
さらに、５９７位、６４１位および６９１位でのＹ→Ｆ突然変異体を作製した。ＧＳＴ−ＳｉｇｌｅｃＢＭＳＬ３ｃｙｔｏおよびＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ突然変異体タンパク質を細菌Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、Ｐｈａｒｍａｃｉａプロトコール（ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ，１９８８，Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０に基づくプロトコール）によって精製した。
【０２４１】
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ｃｙｔｏ（野生型）および突然変異型ＳＩＧＬＥＣの細胞質テールドメインをコードする配列を作製するために使用したＰＣＲプライマーには、以下のプライマーが含まれる。
ＧＳＴ−ＳｉｇｌｅｃＢＭＳＬ３ｃｙｔｏ（ｗｔ）プライマー：
５’ＧＣＧ ＧＣＣ ＡＧＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＡＡＧ ＡＧＡ ＣＧＧ ＡＣＴ ＣＡＧ ＡＣＡ ＧＡＡ（配列番号５５）
３’ＧＣＧ ＧＣＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＣＡ ＴＴＧ ＧＡＡ ＣＴＴ ＧＡＣＴＴＣ ＴＧＣ（配列番号５６）
ＧＳＴ−ＳｉｇｌｅｃＢＭＳＬ３Ｙ６４１Ｆ：
ｗｔフォワードおよびリバースプライマーならびにＹ６４１Ｆ変異導入プライマー：
５’ＣＣＡ ＧＡＡ ＴＣＡ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＡＣ ＣＡＧ ＡＡＡ ＡＡＧ ＣＡＧ ＴＴＴ ＣＡＧ ＴＴＧ ＣＣＣ ＡＧＴ ＴＴＣ ＣＣＡ ＧＡＡ ＣＣＣ（配列番号５７）
３’ＧＧＧ ＴＴＣ ＴＧＧ ＧＡＡ ＡＣＴ ＧＧＧ ＣＡＡ ＣＴＧ ＡＡ ＣＴＧ ＣＴＴ ＴＴＴ ＣＴＧ ＧＴＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＴＧＡ ＴＴＣ ＴＧＧ（配列番号５８）
ＧＳＴ−ＳｉｇｌｅｃＢＭＳＬ３Ｙ６６７Ｆ：
ｗｔフォワードおよびリバースプライマーならびにＹ６６７Ｆ変異導入プライマー：
５’ＧＡＧ ＡＧＣ ＣＡＡ ＧＡＧ ＧＡＧ ＣＴＣ ＣＡＴ ＴＴＴ ＧＣＣ ＡＣＧ ＣＴＣ ＡＡＣ ＴＴＣ ＣＣＡ ＧＧＣ（配列番号５９）
３’ＧＣＣ ＴＧＧ ＧＡＡ ＧＴＴ ＧＡＧ ＣＧＴ ＧＧＣ ＡＡＡ ＡＴＧ ＧＡＧ ＣＴＣ ＣＴＣ ＴＴＧ ＧＣＴ ＣＴＣ（配列番号６０）
ＧＳＴ−ＳｉｇｌｅｃＢＭＳＬ３Ｙ６９１Ｆ：
ｗｔフォワードプライマーおよびＹ６９１Ｆ変異導入リバースプライマー：
５’ＧＣＧ ＧＣＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＣＡ ＴＴＧ ＧＡＡ ＣＴＴ ＧＡＣ ＴＴＣ ＴＧＣ ＡＡＡ ＡＴＣ ＣＧＣ ＣＴＧ ＧＧＴ ＧＣＣ（配列番号６１）
３’ＧＣＧ ＧＣＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＣＡ ＴＴＧ ＧＡＡ ＣＴＴ ＧＡＣ ＴＴＣ ＴＧＣ ＡＡＡ ＡＴＣ ＣＧＣ ＣＴＧ ＧＧＴ ＧＣＣ（配列番号６２）
ＧＳＴ−ＳｉｇｌｅｃＢＭＳＬ３Ｙ６４１ａｌｏｎｅ（欠失突然変異体）プライマー：
５’ＧＣＧ ＧＣＣ ＡＧＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＡＴＣ ＡＡＴ ＧＴＧ ＧＴＣ ＣＣＧ ＡＣＧ ＧＣＴ ＧＧＣ（配列番号６３）
３’ＧＣＧ ＧＣＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＣＡ ＡＴＧ ＧＡＧ ＣＴＣ ＣＴＣ ＴＴＧ ＧＣＴ ＣＴＣ（配列番号６４）。
【０２４２】
実施例１１
ヒトＩｇ配列に融合したＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ａまたはＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３の細胞外ドメインを含む種々の融合タンパク質の作製を以下に説明する。これらの融合タンパク質にはＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ａ ｈＩｇおよびＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ ｈＩｇが含まれる。
【０２４３】
ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｇｌＩＩおよびＮｃｏＩの制限部位を持つリンカー配列を含むプライマーを使って、ＳＩＧＬＥＣＢＭＳ−Ｌ３ａ（例えば５２６６０４）および９９５−２の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を増幅した。増幅された断片（例えば、ｓｉｇｌｅｃＢＭＳ−Ｌ３ａの１２０１ｂｐ断片またはＳｉｇｌｅｃ ＢＭＳ−Ｌ３の１６５０ｂｐ断片）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、消化された断片を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｍａＨＩで消化したｐｄ１９ベクター（実施例６参照；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ、ニュージャージー州プリンストン）にクローニングした。ｐｄ１９ベクターは、コードされる融合タンパク質の免疫グロブリン部分のＦｃ受容体結合を減少させる点突然変異を持つヒトＲガンマ鎖の一部を含んでいる。挿入の完全性は、Ｓｉｇｌｅｃ／ｈＩｇプラスミドコンストラクトをＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｃｏＩで消化してＳｉｇｌｅｃの細胞外ドメインをチェックするか、またはＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩで消化して融合コンストラクト全体をチェックすることによって確認した。Ｓｉｇｌｅｃ−１０−ｈｉｇ融合タンパク質を、ＤＥＡＥ−デキストラン一過性トランスフェクションにより、ＣＯＳ７細胞中で発現させた。１％ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ）、０．１２５％クロロキン（Ｓｉｇｍａ）および１０％ＮｕＳｅｒｕｍ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリンレイクス）を含むＣＭＥＭ中、１マイクログラム／ミリリットルのＤＮＡをＣＯＳ７細胞に４時間トランスフェクトした後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の１０％ＤＭＳＯで２分間処理した。４〜７日後に、ＣＯＳ７上清を除去し、Ｓｉｇｌｅｃ−１０−ｈｉｇ融合タンパク質を、プロテインＡトリスアクリルカラム（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）でのクロマトグラフィーによって精製した。
【０２４４】
Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳＬ−３ａ ｈＩｇの構築に使用したプライマーの配列には、次の配列を含めた：
【化１】
2004516012.tif 000008
【０２４５】
Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ａ ｈＩｇの構築に使用したプライマーの配列には、次の配列を含めた：
【化２】
2004516012.tif 000009
【０２４６】
実施例１２
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３の細胞質テールドメインが既知のチロシンキナーゼによるリン酸化を受けるかどうかを決定するために使用したキナーゼアッセイを以下に説明する。
【０２４７】
キナーゼアッセイは、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３に似た性質を持つ受容体と会合することが知られている４種類の主要チロシンキナーゼの代表例を使って、ＥＬＩＳＡ形式で行なった。試験したチロシンキナーゼにはｌｃｋ、ＺＡＰ７０、ｅｍｔ、およびＪＡＫ３が含まれる。
【０２４８】
ＧＳＴ融合タンパク質およびＧＳＴを、炭酸ナトリウム（ｐＨ９）中、４マイクログラム／ｍｌの濃度で、Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ ９６穴プレートに、室温で１６時間コーティングした。ＧＳＴ融合タンパク質には、ＧＳＴ−ＳｉｇｌｅｃＢＭＳＬ３ｃｙｔｏ（野生型）、ＧＳＴ−ＬＡＴ（リン酸化に利用することができる１０個のチロシンを持つアダプタータンパク質）、ＧＳＴ−ｃｙｔｏ−Ｙ５９７Ｆ（５９７位にＹ→Ｆ突然変異）、ＧＳＴ−Ｌ３ｃｙｔｏ−Ｙ６４１Ｆ（６４１位にＹ→Ｆ突然変異）、ＧＳＴ−Ｌ３ｃｙｔｏ−Ｙ６６７Ｆ（６６７位にＹ→Ｆ突然変異）、Ｌ３ｃｙｔｏ−Ｙ６９１Ｆ（６９１位にＹ→Ｆ突然変異）、ＧＳＴ−Ｌ３ｃｙｔｏ−Ｙ６４１ａｌｏｎｅ、およびＧＳＴのみを含めた。ＬＡＴは、Ｔ細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞および巨核球中で発現される３６〜３８ｋＤａのパルミトイル化内在性膜アダプタータンパク質である。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ／ＣＤ３）を介したシグナル伝達は、チロシンキナーゼの活性化と、それに続く数多くの細胞質タンパク質基質のリン酸化とを伴う。ＬＡＴは１０個のチロシン残基を持ち、これら多くのチロシンキナーゼファミリーの主要な基質の１つである。リン酸化ＬＡＴは多くの重要なシグナリング分子を結合するので、リン酸化ＬＡＴはよい陽性対照である（Ｗ．Ｚｈａｎｇら，１９９８，Ｃｅｌｌ ９２：８３；Ｗ．Ｚｈａｎｇら，１９９９，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：３２３）。
【０２４９】
プレートを洗浄した後、ブロッキング試薬（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州アラメダ）でブロックした。キナーゼ反応は、キナーゼバッファー（２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．０、６．２５ｍＭ ＭｎＣｌ２、６．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭバナジン酸ナトリウム、７．５μＭ ＡＴＰ）および０．２５マイクログラム／ｍｌの濃度から始まるチロシンキナーゼの２倍段階希釈液中、５０マイクロリットルの液量で行なった。キナーゼ反応は室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ホスホチロシン含量を１：１０００の抗ｐ−Ｔｙｒ（ＰＹ９９）ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、カリフォルニア州サンタクルーズ）およびペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）で検出した。６５０／４５０ｎｍの吸光度を検出した。
【０２５０】
図１６Ａ〜Ｇに示すキナーゼアッセイの結果は、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３タンパク質の細胞質ドメインが、４つの主要キナーゼファミリーのうち少なくとも３つの代表例、すなわちＪａｋ３、Ｌｃｋ、Ｅｍｔによってリン酸化されうるが、ＺＡＰ−７０ではリン酸化されないことを示している。キナーゼ濃度の滴定により、Ｓｉｇｌｅｃ−１０はＬｃｋおよびＪａｋによって同じ程度によくリン酸化され、Ｅｍｔでは中等度のリン酸化が観察され、ＺＡＰ−７９ではリン酸化はほとんどまたは全く起こらないことが確認された。野生型ＧＳＴ−ＳＩＧＬＥＣＢＭＳ−Ｌ３ｃｙｔｏがリン酸化される程度は、Ｌｃｋ（１００％）＞ＪＡＫ３（９２％）＞＞ｅｍｔ（６５％）＞＞＞ＺＡＰ７０（２０％）だった。
【０２５１】
細胞質テール中の特定位置に突然変異を持つＧＳＴ融合タンパク質は、種々のチロシンキナーゼによるリン酸化に影響を及ぼした。
結果を以下の表に要約する。
【表５】
2004516012.tif 000010
【０２５２】
図１６Ａ〜Ｇおよび上の表に示す結果は、ＩＴＩＭ様モチーフに含まれている５９７位および６６７位のチロシンが、ｌｃｋ、ＪＡＫ３、ｅｍｔおよびＺＡＰ７０を含む数種類のチロシンキナーゼシグナリング分子によるリン酸化の標的であるらしいことを示唆している。６９１位にあるチロシンも、ＬｃｋおよびＪａｋ３キナーゼによる野生型Ｓｉｇｌｅｃテールのリン酸化に寄与している。例えば、６６７位および６９１位にあるＹのリン酸化は、ｌｃｋによる野生型リン酸化の約８０％およびＪＡＫ３による野生型リン酸化の７５％を占めた。これに対し、６４１位にあるＹの突然変異は試験したどのキナーゼによるリン酸化の程度にも有意な影響を及ぼさなかった。さらに、Ｙ６４１のみを含むコンストラクトは、どのキナーゼによってもリン酸化されなかったことから、Ｙ６４１はおそらくリン酸化部位ではないことが裏付けられた（データの記載なし）。５９７位にあるＹのリン酸化に対する寄与は、ｌｃｋの場合は約２０％、ＪＡＫ３の場合は２５％、ｅｍｔの場合は約３０％と計算できるだろう。
【０２５３】
実施例１３
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３の細胞質テールドメインが細胞溶解液中のＳＨＰ−１またはＳＨＰ−２を結合するかどうかを決定するためのウェスタンブロット法およびＥＬＩＳＡ技術の使用について以下に説明する。
【０２５４】
ＳＨＰタンパク質に関するウェスタンブロッティング：Ｓｉｇｌｅｃ−１０の細胞質ドメインが細胞溶解液中のＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２を結合するかどうかを決定するために、１０μｇのＧＳＴ融合タンパク質±チロシンリン酸化を、３００μｌの細胞溶解液（トリトンＸ１００可溶性画分、５×１０７非刺激細胞）と共に４℃で一晩インキュベートした。５０μｌのグルタチオンセファローズビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使ってＧＳＴ融合タンパク質複合体を４℃で１時間捕捉した。次にビーズをＪｕｒｋａｔ細胞溶解液と共にインキュベートした。ビーズを氷冷溶解バッファーで３回洗浄し、結合しているタンパク質をＳＤＳ還元試料バッファーに溶出させ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって分割した。分離したタンパク質を標準的なウェスタンブロッティング技術によってニトロセルロースに移した。次に、抗Ｐ−Ｙ ＨＲＰ結合抗体（クローン４Ｇ１０、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ニューヨーク州レイクプラシッド）を使って、ブロットをリン酸化チロシンを含むタンパク質について染色した。次に、ブロットをストリップにして、マウス抗ＳＨＰ−１（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ケンタッキー州レキシントン）またはマウス抗ＳＨＰ−２（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で染色し、続いてＨＲＰ結合二次抗体（ヤギ抗マウス、Ｂｉｏｓｏｕｒｅ Ｉｎｔ．、カリフォルニア州カマリロ）を添加した。染色されたタンパク質を、化学発光検出試薬（Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ、ＮＥＮ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、マサチューセッツ州ボストン）を添加し、フィルム（Ｋｏｄａｋ）に露出することによって撮像した。
【０２５５】
図１７Ａに示す結果は、細胞溶解液由来のＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２がどちらも、ＳＩＧＬＥＣ Ｌ３タンパク質の細胞質ドメインに結合する能力を持つことを示している。しかし、ＳＨＰ−１の結合はＹ６６７Ｆ突然変異体では認められなかった。これはこのチロシンがＳＨＰ−１との相互作用にとって好ましいチロシン（例えば一文字記号：Ｙ）であることを示している。しかし、ＳＨＰ−２結合は、Ｙ６６７Ｆ突然変異体試料でも、約５０％しか減少しなかった。これは、ＳＨＰ−２が６６７位のチロシンと、ＳＩＧＬＥＣ ＢＭＳＬ３の細胞質テール中の他のチロシンとの両方に結合しているらしいことを示している。
【０２５６】
ＥＬＩＳＡによるＳＨＰタンパク質へのＩＴＩＭペプチド結合：ビオチン化Ｓｉｇｌｅｃ−１０ホスホペプチド（６６０−６７８）ＥＳＱＥＥＬＨｐＹＡＴＬＮＦＰＧＲＶＰＲ（ＩＴＩＭ６６７）はＷ．Ｍ．Ｋｅｃｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（コネチカット州ニューヘブン）で作製された。ブロッキング試薬（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ）中、４μｇ／ｍｌのホスホペプチドを、ストレプトアビジン被覆ＥＬＩＳＡプレート（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）に結合した。プレートを洗浄した後、ＧＳＴ融合タンパク質ＧＳＴのみ、ＧＳＴ−ＳＨＰ−１ＳＨ２ＳＨ２またはＧＳＴ−ＳＨＰ−２ＳＨ２ＳＨ２またはＧＳＴ−ＺＡＰ−７０ＳＨ２ＳＨ２の２倍段階希釈液を加え、室温で１時間インキュベートした。ポリクローナル抗ＧＳＴ（Ｓｉｇｌｅｃ抗体産生について詳述する方法と同様の方法によって社内で作製したもの）を１：１０００の希釈率で加え、１：２０００のＨＲＰ結合抗ウサギ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を加え、ペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）でシグナルを検出した。
【０２５７】
図１７Ｂに示す無細胞系の結果でも、ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２がどちらもＹ６６７ドメインを含むリン酸化ペプチドに高い親和性で結合できることが裏付けられた。
【０２５８】
実施例１４
ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３タンパク質をコードする完全長Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３の配列を持つＤＮＡ分子の作製を以下に説明する。完全長配列をＢＭＳＬ３−９９５−２と名付けた（図６ＡおよびＢ）。
【０２５９】
ｐＳＰＯＲＴベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／Ｇｉｂｃｏ、ニューヨーク州グランドアイランド）に融合された６５２９９５と呼ばれるクローン（Ｉｎｃｙｔｅデータベース）は、Ｓｉｇｌｅｃ ＢＭＳ−Ｌ３ ｃＤＮＡの完全な３’端を含んでいる。６５２９９５クローンを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｂｒＰＩで消化し、大きい方の断片（約６．４ｋｂ）をゲル精製した。３４２１０４８と呼ばれるもう一つのクローン（Ｉｎｃｙｔｅデータベース）は、Ｓｉｇｌｅｃ ＢＭＳ−Ｌ３ ｃＤＮＡの完全な５’端を含んでおり、これを制限酵素ＥｃｏＲｉおよびＢｂｒＰＩで消化し、ゲル精製した（約８２０ｂｐ）。ゲル精製した断片をｐＳＰＯＲＴベクターに連結して、完全長Ｓｉｇｌｅｃ ＢＭＳ−Ｌ３ヌクレオチド配列を持つハイブリッドコンストラクトとし、９９５−２と名付けた。９９５−２の配列を他のＳｉｇｌｅｃＢＭＳ−Ｌ３配列と照合した。９９５−２クローンを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、同様に消化した完全長発現用のｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）に連結した。
【０２６０】
３４２１０４８の５’端の部分配列を得た。その配列は次の通りである：
５’ＣＡＧＧＣＣＴＧＴＣ ＴＣＡＧＧＣＡＧＧＣ ＣＣＴＧＣＧＣＣＴＣ ＣＴＡＴＧＣＧＧＡＧ ＡＴＧＣＴＡＣＴＧＣ ＣＡＣＴＧＣＴＧＣＴ ＧＴＣＣＴＣＧＣＴＧ ＣＴＧＧＧＣＧＧＧＴ ＣＣＣＡＮＧＣＴＡＴ ＧＧＡＴＧＧＧＡＧＡ ＴＴＣＴＧＧＡＴＡＣ ＧＡＧＴＧＣＡＧＧＡ ＧＴＣＡＧＴＧＡＴＧ ＧＴＧＣＣＧＧＡＧＧ ＧＣＣＴＧＴＧＣＡＴ ＣＴＣＴＧＴＧＣＣＣ ＴＧＣＴＣＴＴＴＣＴ ＣＣＴＡＣＣＣＣＣＧ ＡＣＡＧＧＡＣＴＧＧ ＡＣＡＧＧＧＴＣＴＡ ＣＣＣＣＡＧＣＴＴＡ ＴＧＧＣＴＡＣＴＧＧ ＴＴＣＡＡＡＧＣＡＧ ＴＧＡＣＴＧＡＧＡＣ Ａ ３’（配列番号６９）。
【０２６１】
実施例１５
以下の実施例では、シアル酸へのＳｉｇｌｅｃ−１０の結合を解析するためのポリアクリルアミド複合糖質結合アッセイを説明する。
【０２６２】
完全長Ｓｉｇｌｅｃ−１０（ｐｃＤＮＡ３ベクター中の９９５−２）をＣＯＳ７細胞に一過性にトランスフェクト（トランスフェクションプロトコールについては上記の方法を参照されたい）するか、または疑似（ｓｈａｍ）トランスフェクトし、トランスフェクションから２４時間以内に９６穴プレートに播種し、１８〜２２時間付着させた。播種した細胞の半分を、０．０１Ｕシアリダーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カリフォルニア州ラホーヤ）で３７℃で１時間処理した。なぜなら、この処理は、他のＳｉｇｌｅｃファミリーメンバーの結合部位を遮蔽する可能性がある細胞表面シアル酸を除去することが明らかになっているからである（Ｚｈａｎｇら，２０００）。次に、１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭで細胞を洗浄し、ビオチンおよび炭水化物（ラクトース、３’−シアリルラクトースまたは６’−シアリルラクトース、ＧｌｙｃｏＴｅｃｈ Ｃｏｒｐ．、メリーランド州ロックビル）を含む飽和濃度（２０μｇ／ｍｌ）のポリアクリルアミドポリマーと共にインキュベートした。並行して行なった無細胞実験では、Ｉｍｍｕｌｏｎｇプレートを精製Ｓｉｇｌｅｃ−１０−ｈＩｇ融合タンパク質（２００ｎｇ／ウェル）で被覆し、２０μｇ／ｍｌのポリアクリルアミドポリマーと共にインキュベートした。１時間後にプレートを洗浄し、ＤＭＥＭ中のストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、カリフォルニア州バーリンゲーム）で３０分間処理した。最終洗浄の後、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）を加え、プレートを室温で発色させた。０．１Ｎ ＨＣｌで反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度をスペクトロメーターで決定した。Ｉｍｍｕｌｏｎプレート上にＳｉｇｌｅｃ−１０−ｈＩｇを固定化し、ポリアクリルアミドビオチン化複合糖質の結合を決定することによって、２，３’−シアリルラクトース（２，３’ＰＡＡ）および２，６’−シアリルラクトース（２，６’ＰＡＡ）に対するＳｉｇｌｅｃ−１０の結合選択性を決定した（図２６）。２，６’−ＰＡＡコンジュゲートは非シアリル化ラクトース（陰性対照）または２，３’−ＰＡＡより有意に多く結合した。この観察結果を裏付けるために、続いて、細胞に基づく実験を行なった。ＤＥＡＥデキストラン法によって完全長Ｓｉｇｌｅｃ−１０（ｐｃＤＮＡ３中の９９５−２）をＣＯＳ７にトランスフェクトし、トランスフェクト細胞へのＰＡＡ結合を決定した。トランスフェクトＣＯＳ７細胞への２，６’−ＰＡＡコンジュゲートの結合は、シアリダーゼ前処理後に、有意に多くなった。シアリダーゼ処理の必要があることから、Ｓｉｇｌｅｃ−１０のシス結合は添加されたＰＡＡとの相互作用を阻害するらしいことが示唆された。
【０２６３】
実施例１６
以下の実施例では、Ｓｉｇｌｅｃ−１０に対するモノクローナル抗体の作製、およびＦＡＣＳ解析およびウェスタンブロット法によるＳｉｇｌｅｃ−１０タンパク質の検出を目的とするモノクローナル抗体の使用を説明する。
【０２６４】
Ｒｉｂｉアジュバント（Ｃｏｒｉｘａ、モンタナ州ハミルトン）中のＳｉｇｌｅｃ−１０−ｈＩｇタンパク質を３週間毎に１回腹腔内注射することによってＢａｌｂ／ｃマウスを免疫化した。屠殺の３日前に、Ｓｉｇｌｅｃ−１０−ｈＩｇのＩＶ注射でマウスを追加免役した。脾細胞を無菌的に収集し、洗浄し、融合を誘発するためにＰＥＧ１５００ ５０％（Ｒｏｃｈｅ）の存在下で１０：１のマウス骨髄腫細胞（Ｐ３ｘ、ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックビル）と混合した。ＥＬＩＳＡによるスクリーニングでＳｉｇｌｅｃ−１０−ｈＩｇには選択的であるが他のｈＩｇには選択性を示さない抗体を産生するクローンを、ローラーフラスコ中で増殖させた。精製したモノクローナル抗体を、Ｓｉｇｌｅｃ−１０−ｈＩｇおよび他の類似の融合タンパク質のウェスタンブロットによって、さらにスクリーニングした。抗体特異性に関する第３のスクリーニングは、完全長Ｓｉｇｌｅｃ−１０発現コンストラクトをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞のＦＡＣＳ解析を使って行なった。
【０２６５】
Ｓｉｇｌｅｃタンパク質発現：末梢血細胞集団および細胞株のＦＡＣＳ解析を行なって、表面タンパク質発現を決定した（表６）。抗Ｓｉｇｌｅｃ−１０抗体は、単離された顆粒球（好酸球および好中球）およびＣＤ１４＋単球に結合して、蛍光強度が大きく変化した。抗体はＣＤ２８＋細胞およびＣＤ３＋細胞を含む他の血球には結合しなかった。
【０２６６】
表６は、造血細胞株および初代白血球におけるＳｉｇｌｅｃ−１０の発現を表す。ビオチン化モノクローナル抗Ｓｉｇｌｅｃ−１０を細胞に加えた後、ＦＩＴＣ結合ストレプトアビジンで処理した。Ｓｉｇｌｅｃ−１０をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対する免疫反応性（ＦＡＣＳによって決定）に基づいて、抗体を選択した。末梢血単核細胞調製物（ＰＢＭＣ）には、亜集団を識別するためにＰＥ結合二次抗体を使用した。蛍光が増加した総細胞数のパーセンテージを示す。記載のデータは２〜３実験の平均を表す。
【表６】
2004516012.tif 000011
【０２６７】
ＳＩＧＬＥＣ−１０に関するウェスタンブロッティング：数種類の細胞株及び末梢血細胞集団から得た細胞溶解液（トリトンＸ１００可溶性タンパク質画分）１０μｇを試料バッファーと混合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−２０％勾配ゲル）で分割し、標準的なウェスタンブロッティング技術によってニトロセルロースに移した。次に、そのブロットを抗Ｓｉｇｌｅｃ−１０モノクローナル抗体で染色し、続いてＨＲＰ結合二次抗体（ヤギ抗マウス、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔ．、カリフォルニア州カマリロ）を加えた。化学発光検出試薬（Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ、ＮＥＮ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、マサチューセッツ州ボストン）を添加することにより、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ ４４５ ＳＩ（Ｍｏｌｅｕｃｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、カリフォルニア州サニーベール）を使って、染色されたタンパク質を撮像した。抗Ｓｉｇｌｅｃ−１０ ｍＡｂは、約７６ｋＤａの分子量を持つ単一のバンドを認識した（図２７）。他に目に見えるバンドはなかったことから、この抗体はＳｉｇｌｅｃ−１０に特異的であることが示唆された。顆粒球および数種類の血液細胞株はＳｉｇｌｅｃ−１０を発現させるようである（図２７）。
【０２６８】
実施例１７
以下の実施例では、インサイチューハイブリダイゼーションを用いた非ヒト霊長類（ＮＨＰ）組織およびヒト組織におけるＳｉｇｌｅｃ−１０陽性ハイブリダイゼーションシグナルの検出を説明する。
【０２６９】
ＰＣＲ産物テンプレートを利用したインビトロ転写によってＳｉｇｌｅｃ１０用のヒト３５Ｓ標識ＲＮＡプローブ（リボプローブ）を作製した。遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）セットは、Ｓｉｇｌｅｃ１０ Ｌ３プローブ（５’（７２４−７４４） ＴＧＣＴＣＡＧＣＴＴＣＡＣＧＣＣＣＡＧＡＣ；３’（１４４７−１４５６） ＴＧＣＡＣＧＧＡＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡ ＧＡ）に関するプローブプライマー配列データ（Ｓｉｇｌｅｃ Ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ、ＩＩＰＤ）に従って、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（メリーランド州ロックビル）から得た。ｐＳｐｏｒｔプラスミドベクターにクローニングした完全長Ｓｉｇｌｅｃ１０遺伝子のＰＣＲ増幅によって、アンプリコンを得た。ゲル電気泳動を行ない、妥当なサイズのバンドをゲルから切り出した。これらのバンドを精製（Ｇｅｌ ＳＮＡＰ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）し、次にＴＯＰＯ−ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を使って、ｐＣＲＩＩベクターにサブクローニグした。ミニプレップおよび配列解析ならびにＧｅｎＢａｎｋ Ｂｌａｓｔを併用することにより、配列同一性を確認した（ＧｅｎＢａｎｋにより１９番染色体に１００％の２７４ｂｐ一致が確認された。別途行なった新規Ｓｉｇｌｅｃ１０配列およびミニプレップ配列結果のＢｌａｓｔ２は１００％の相同性を与えた）。次に、ＧＳＰならびにＴ７および／またはＳｐ６プライマーを使って、ミニプレップをＰＣＲ増幅した。ＲＮＡポリメラーゼＳｐ６およびＴ７ならびに市販のキット（Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ（登録商標）Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を利用してリボプローブを作製し、インサイチューハイブリダイゼーションを行なった。
【０２７０】
図２８に、非ヒト霊長類組織およびヒト組織におけるＳｉｇｌｅｃ−１０陽性ハイブリダイゼーションシグナル分布の詳細を表すインサイチューハイブリダイゼーション像を示す。
【０２７１】
図２８Ａは、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）（パネルＡ、Ｃ、Ｅ）／ヒト脾臓（パネルＢ、Ｄ、Ｆ）におけるＳｉｇｌｅｃ−１０陽性ハイブリダイゼーションを表す。パネルＡ（明視野、倍率４０×）は、ＮＨＰ脾臓のリンパ濾胞（ＬＦ）および周辺の赤脾髄（ＲＰ）領域を表す。パネルＢ（明視野、倍率４０×）は、ヒト脾臓のリンパ濾胞（ＬＦ）および周辺の赤脾髄（ＲＰ）を表す。パネルＣ（倍率４０×）は、赤脾髄領域（ＲＰ）に伴うＳｉｇｌｅｃ１０ハイブリダイゼーションシグナルを示すパネルＡの暗視野である。パネルＤ（倍率４０×）は、赤脾髄領域（矢印）中のＳｉｇｌｅｃ１０ハイブリダイゼーションシグナル（白いフォーカス）を示すパネルＢの暗視野である。パネルＥ（明視野、倍率２００×）は、ＮＨＰのリンパ節（矢印）およびマクロファージ（矢尻）に伴うＳｉｇｌｅｃ１０ハイブリダイゼーションシグナル（黒いフォーカス）を示す赤脾髄の詳細を表す。パネルＦ（明視野、倍率２００×）は、ヒトのマクロファージ（矢印）に伴うＳｉｇｌｅｃ−１０ハイブリダイゼーションシグナル（黒いフォーカス）を示す赤脾髄の詳細を表す。
【０２７２】
図２８Ｂは、ＮＨＰ空腸（パネルＡ、Ｃ、Ｅ）、ヒト肝臓（Ｂ、Ｄ、Ｆ）におけるＳｉｇｌｅｃ−１０陽性ハイブリダイゼーションを表す。パネルＡ（明視野、倍率４０×）は、ＮＨＰ空腸のリンパ濾胞（ＬＦ）を含む粘膜（Ｍ）を表す。パネルＢ（明視野、倍率４０×）はヒト肝臓を表す。パネルＣは、リンパ濾胞におけるＳｉｇｌｅｃ１０ハイブリダイゼーションシグナル（矢印）および粘膜固有層におけるフォーカス（矢尻）を示すパネルＡの暗視野を表す。パネルＤは、類洞に沿ったＳｉｇｌｅｃ−１０ハイブリダイゼーションシグナルを示すパネルＢの暗視野を表す。パネルＥ（明視野、倍率２００×）は、ＮＨＰ空腸粘膜のリンパ濾胞中のリンパ球に伴うＳｉｇｌｅｃ−１０ハイブリダイゼーションシグナルの詳細を示す。パネルＦ（明視野、倍率４００×）は、ヒト肝臓のクッパー細胞（在住マクロファージ）に伴うＳｉｇｌｅｃ１０ハイブリダイゼーションシグナル（矢印）の詳細を表す。
【０２７３】
図２８Ｃは、非ヒト霊長類結腸におけるＳｉｇｌｅｃ−１０陽性ハイブリダイゼーションを表す。パネルＡ（暗視野、倍率４０×）は、粘膜（Ｍ）、粘膜下組織（ＳＭ）、外筋層（ＭＥ）および粘膜下組織中のリンパ濾胞（ＬＦ）を含む結腸の横断面を表す。Ｓｉｇｌｅｃ１０ハイブリダイゼーションシグナルは、粘膜の固有層（矢印）、粘膜下組織のＬＦ（ＬＦ）、および多焦点的に外筋層の間質（矢尻）に存在する。パネルＢ（暗視野、倍率１００×）は、粘膜固有層（矢印）および粘膜下ＬＦ（矢尻）中のＳｉｇｌｅｃ１０ハイブリダイゼーションシグナルを示すパネルＡの詳細を表す。パネルＣ（暗視野、倍率１００×）は、外筋層の間質（矢印）におけるＳｉｇｌｅｃ１０ハイブリダイゼーションシグナルを示すパネルＡの詳細を表す。パネルＤは、粘膜（Ｍ）、リンパ濾胞（ＬＦ）を伴う粘膜下組織（ＳＭ）、および外筋層（ＭＥ）を示すパネルＡの明視野である。パネルＤは、粘膜固有層（ＬＰ）および粘膜下組織中のリンパ濾胞（ＬＦ）を示すパネルＢの明視野である。パネルＥは、外筋層の間質におけるＳｉｇｌｅｃ１０陽性単核細胞（矢印）を示すパネルＣの明視野である。パネルＦ（明視野、倍率２００×）は、リンパ球（矢印）およびマクロファージ（矢尻）に伴うＳｉｇｌｅｃ１０ハイブリダイゼーションシグナルを示す粘膜固有層の詳細を表す。
【０２７４】
図２８Ｄは、ＮＨＰ（パネルＡ、Ｃ、Ｅ）／ヒトリンパ節（パネルＢ、Ｄ、Ｆ）におけるＳｉｇｌｅｃ−１０陽性ハイブリダイゼーションシグナルの分布を表す。パネルＡ（暗視野、倍率１０×）、リンパ濾胞（ＬＦ）に伴うＳｉｇｌｅｃ１０ハイブリダイゼーションシグナルを表す。顕著な細胞はＮＨＰリンパ節のメラノマクロファージ（矢印）である。パネルＢ（明視野、倍率４０×）は、ヒトリンパ節のリンパ球に伴う弱いＳｉｇｌｅｃ１０ハイブリダイゼーションシグナルを表す。パネルＣは、ＬＦおよびメラノマクロファージ（矢印）を示すパネルＡの明視野である。パネルＤは、弱いＳｉｇｌｅｃ１０シグナル（矢印）を示すパネルＢの暗視野である。パネルＥ（明視野、倍率２００×）は、リンパ球（矢印）およびメラノマクロファージ（矢尻）に伴うＳｉｇｌｅｃ１０ハイブリダイゼーションシグナルを示すＬＦの詳細を表す。パネルＦ（明視野、倍率４００×）は、リンパ球（矢印）に伴う弱いＳｉｇｌｅｃ１０ハイブリダイゼーションシグナルを示すＬＦの詳細を表す。
【０２７５】
図２８Ｅは、喘息肺におけるＳｉｇｌｅｃ−１０陽性ハイブリダイゼーションシグナルＳｉｇｌｅｃ−１０ ＲＮＡの分布を表す。パネルＡ（明視野、１００×）は、好中球、マクロファージおよびリンパ球を含む混合炎症細胞集団の浸潤を受けたヒト肺の肺実質を表す。パネルＢは、多焦点Ｓｉｇｌｅｃ１０ハイブリダイゼーションシグナル（矢印）を示すパネルＡの暗視野である。パネルＣ（明視野、倍率４００×）は肺の炎症細胞の詳細を表し、マクロファージ（矢印）に伴うＳｉｇｌｅｃ−１０ハイブリダイゼーションシグナルは認められるが、好酸球（矢尻）に伴うシグナルは認められない。
【０２７６】
図２８Ｆは、非ヒト霊長類（パネルＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ）／ヒト肺（パネルＣ、Ｆ、Ｉ）へのＳｉｇｌｅｃ−１０ ＲＮＡの結合を表す。パネルＡ（明視野、倍率４０×）は、ＮＨＰ肺の気道細気管支（Ｂ）を表す。パネルＢ（明視野、倍率１００×）は、ＮＨＰ肺の気管支下領域、細気管支（Ｂ）におけるリンパ濾胞（ＬＦ）の詳細を表す。パネルＣ（明視野、倍率１００×）は、褐色に染まった肺胞マクロファージ（炭珪肺）（矢印）を伴うヒト肺の肺実質を表す。パネルＤは、気道内腔（Ｌ）および肺実質（矢尻）におけるＳｉｇｌｅｃ−１０ハイブリダイゼーションシグナル（矢印）を示すパネルＡの暗視野である。パネルＥは、ＬＦおよび肺実質（矢印）におけるＳｉｇｌｅｃ−１０ハイブリダイゼーションシグナルを示すパネルＢの暗視野である。パネルＦは、肺胞マクロファージに伴うＳｉｇｌｅｃ−１０ハイブリダイゼーションシグナル（矢印）を示すパネルＣの暗視野である。パネルＧ（明視野、倍率４００×）は、肺胞マクロファージに伴うＳｉｇｌｅｃ−１０ハイブリダイゼーションシグナル（矢印）を示すパネルＡの詳細を表す。パネルＨ（明視野、４００×）は、ＬＦ（矢印）および肺胞マクロファージ（矢尻）のリンパ球に伴うＳｉｇｌｅｃ １０ハイブリダイゼーションシグナルを示すパネルＢの詳細を表す。パネルＩ（明視野、倍率４００×）は、褐色に染まった（炭珪肺）肺胞マクロファージに伴うＳｉｇｌｅｃ−１０ハイブリダイゼーションシグナル（矢印）を示すパネルＣの詳細を表す。
【０２７７】
インサイチューハイブリダイゼーションの最終結果を表７に示す。
【表７】
2004516012.tif 000012
１ＩＳＨスコア：シグナルなし、−；最小ハイブリダイゼーションシグナル、＋；低シグナル、＋＋；中シグナル、＋＋＋；著しいシグナル、＋＋＋＋。
２ＮＥ、未検定
３ＧＡＬＴ、固有層中の腸管関連リンパ系組織
軟骨はバックグラウンドが高く、この組織では−または＋ハイブリダイゼーションを察知することができなかった。
【０２７８】
本明細書で引用した種々の刊行物は、いずれも参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する。
【０２７９】
本発明が関係する分野の当業者には明らかであろうが、本発明は、本発明の精神または欠くことのできない特徴から逸脱することなく、上に詳しく開示した態様以外の形態で体現することができる。したがって上述した本発明の具体的態様は例示であって限定ではないとみなすべきである。本発明の範囲は上記の説明に含まれる実施例に限定されるのではなく特許請求の範囲に記載されているとおりである。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＩＧＬＥＣタンパク質ファミリーの予想構造の概略図。
【図２】実施例１に記載の（Ａ）Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ａのヌクレオチド配列（配列番号１）および（Ｂ）ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ａの予想アミノ酸配列（配列番号８）。
【図３】実施例１に記載の（Ａ）Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ｂのヌクレオチド配列（配列番号２）および（Ｂ）ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ｂの予想アミノ酸配列（配列番号９）。
【図４】実施例１に記載の（Ａ）Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ｃのヌクレオチド配列（配列番号３）および（Ｂ）ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ｂの予想アミノ酸配列（配列番号１０）。
【図５】実施例１に記載の（Ａ）Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ｄのヌクレオチド配列（配列番号４）および（Ｂ）ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ｄの予想アミノ酸配列（配列番号１１）。
【図６Ａ−１】実施例１４に記載の（Ａ）Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３−９９５−２のヌクレオチド配列（配列番号２７）（ＡＴＧ開始コドンとスプライシング部位には陰を付けてある。枠で囲んだ領域は膜貫通ドメインを表す）および（Ｂ）ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３−９９５−２の予想アミノ酸配列（配列番号２８）。
【図６Ａ−２】実施例１４に記載の（Ａ）Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３−９９５−２のヌクレオチド配列（配列番号２７）（ＡＴＧ開始コドンとスプライシング部位には陰を付けてある。枠で囲んだ領域は膜貫通ドメインを表す）および（Ｂ）ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３−９９５−２の予想アミノ酸配列（配列番号２８）。
【図６Ａ−３】実施例１４に記載の（Ａ）Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３−９９５−２のヌクレオチド配列（配列番号２７）（ＡＴＧ開始コドンとスプライシング部位には陰を付けてある。枠で囲んだ領域は膜貫通ドメインを表す）および（Ｂ）ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３−９９５−２の予想アミノ酸配列（配列番号２８）。
【図６Ｂ】実施例１４に記載の（Ａ）Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３−９９５−２のヌクレオチド配列（配列番号２７）（ＡＴＧ開始コドンとスプライシング部位には陰を付けてある。枠で囲んだ領域は膜貫通ドメインを表す）および（Ｂ）ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３−９９５−２の予想アミノ酸配列（配列番号２８）。
【図７】実施例１に記載の（Ａ）Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ４ａのヌクレオチド配列（配列番号５）および（Ｂ）ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ４ａの予想アミノ酸配列（配列番号１２）。
【図８】実施例１に記載の（Ａ）Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ５ａのヌクレオチド配列（配列番号６）および（Ｂ）ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ５ａの予想アミノ酸配列（配列番号１３）。
【図９】実施例１に記載の（Ａ）Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ５ｂのヌクレオチド配列（配列番号７）および（Ｂ）ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ５ｂの予想アミノ酸配列（配列番号１４）。
【図１０Ａ】実施例２に記載の（Ａ）ヒト組織におけるＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３転写物の分布を示すノーザンブロット解析および（Ｂ）プローブ配列の位置を示す概略図。
【図１０Ｂ】実施例２に記載の（Ａ）ヒト組織におけるＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３転写物の分布を示すノーザンブロット解析および（Ｂ）プローブ配列の位置を示す概略図。
【図１１Ａ】実施例３に記載の（Ａ）ヒト組織におけるＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３転写物の分布を示すＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す表および（Ｂ）プライマー／ＰＣＲ産物の位置を示す概略図。
【図１１Ｂ】実施例３に記載の（Ａ）ヒト組織におけるＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３転写物の分布を示すＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す表および（Ｂ）プライマー／ＰＣＲ産物の位置を示す概略図。
【図１２Ａ】実施例４に記載の（Ａ）定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析によって検出されるヒト組織および細胞株におけるＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３転写物の分布を示すヒストグラム、（Ｂ）２人の被験者から得た精製ヒト白血球におけるＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３転写物発現レベルを示す定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析、および（Ｃ）プライマー／ＰＣＲ産物の位置を示す概略図。
【図１２Ｂ】実施例４に記載の（Ａ）定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析によって検出されるヒト組織および細胞株におけるＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３転写物の分布を示すヒストグラム、（Ｂ）２人の被験者から得た精製ヒト白血球におけるＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３転写物発現レベルを示す定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析、および（Ｃ）プライマー／ＰＣＲ産物の位置を示す概略図。
【図１２Ｃ】実施例４に記載の（Ａ）定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析によって検出されるヒト組織および細胞株におけるＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３転写物の分布を示すヒストグラム、（Ｂ）２人の被験者から得た精製ヒト白血球におけるＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３転写物発現レベルを示す定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析、および（Ｃ）プライマー／ＰＣＲ産物の位置を示す概略図。
【図１３】固定化ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳＬ３−ｈＩｇ融合タンパク質（例えばＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３の細胞外ドメイン）を種々の血球集団または細胞株に結合させる、実施例８に記載の結合アッセイの結果を示すグラフ。
【図１４】完全長ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３タンパク質を発現させるＣＯＳ７細胞を種々の血球集団または細胞株に結合させる、実施例９に記載の結合アッセイの結果を示すグラフ。
【図１５】Ｌ３ｃｙｔｏ−ｗｔ、Ｌ３ｃｙｔｏ−Ｙ６４１Ｆ、Ｌ３ｃｙｔｏ−Ｙ６６７Ｆ、Ｌ３ｃｙｔｏ−Ｙ６９１Ｆ、およびＬ３ｃｙｔｏ−Ｙ６４１ａｌｏｎｅを含む野生型および突然変異型ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３タンパク質の細胞質テールを有する種々のＧＳＴ融合タンパク質の概略図。また、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳＬ３タンパク質の非スプライス型（９９５−２、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳＬ３ ｈＩｇ）およびスプライス型（５２６６０４、ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳＬ３ａ ｈＩｇ）細胞外ドメインを含む、実施例１０に記載のｈＩｇ（ヒト免疫グロブリン）融合タンパク質も図示している。
【図１６Ａ】実施例１２で説明するように、野生型および突然変異型ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３タンパク質の細胞質テールを構成成分とするＧＳＴ融合タンパク質を含む種々の基質を種々のチロシンキナーゼ、すなわち（Ａ）ｌｃｋキナーゼ、（Ｂ）ＺＡＰ７０キナーゼ、（Ｃ）ｅｍｔキナーゼ、および（Ｄ）ＪＡＫ３キナーゼと反応させたキナーゼアッセイの結果を示すグラフ。（Ｅ）野生型ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３タンパク質の細胞質テールを構成成分とするＧＳＴ融合タンパク質基質と、ＺＡＰ７０、ｅｍｔ、およびＪＡＫ３を含む種々のチロシンキナーゼとを使ったキナーゼアッセイの結果を示すグラフ。（Ｆ）ＬＡＴ基質と、ｌｃｋ、ＺＡＰ７０、ｅｍｔ、およびＪＡＫ３を含む種々のチロシンキナーゼとを使ったキナーゼアッセイの結果を示すグラフ。（Ｇ）野生型および種々のＹ→Ｆ突然変異体の細胞質テールを構成成分とするＧＳＴ融合タンパク質の、チロシンキナーゼ混合物によるチロシンリン酸化の結果を示すグラフ。
【図１６Ｂ】実施例１２で説明するように、野生型および突然変異型ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３タンパク質の細胞質テールを構成成分とするＧＳＴ融合タンパク質を含む種々の基質を種々のチロシンキナーゼ、すなわち（Ａ）ｌｃｋキナーゼ、（Ｂ）ＺＡＰ７０キナーゼ、（Ｃ）ｅｍｔキナーゼ、および（Ｄ）ＪＡＫ３キナーゼと反応させたキナーゼアッセイの結果を示すグラフ。（Ｅ）野生型ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３タンパク質の細胞質テールを構成成分とするＧＳＴ融合タンパク質基質と、ＺＡＰ７０、ｅｍｔ、およびＪＡＫ３を含む種々のチロシンキナーゼとを使ったキナーゼアッセイの結果を示すグラフ。（Ｆ）ＬＡＴ基質と、ｌｃｋ、ＺＡＰ７０、ｅｍｔ、およびＪＡＫ３を含む種々のチロシンキナーゼとを使ったキナーゼアッセイの結果を示すグラフ。（Ｇ）野生型および種々のＹ→Ｆ突然変異体の細胞質テールを構成成分とするＧＳＴ融合タンパク質の、チロシンキナーゼ混合物によるチロシンリン酸化の結果を示すグラフ。
【図１６Ｃ】実施例１２で説明するように、野生型および突然変異型ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３タンパク質の細胞質テールを構成成分とするＧＳＴ融合タンパク質を含む種々の基質を種々のチロシンキナーゼ、すなわち（Ａ）ｌｃｋキナーゼ、（Ｂ）ＺＡＰ７０キナーゼ、（Ｃ）ｅｍｔキナーゼ、および（Ｄ）ＪＡＫ３キナーゼと反応させたキナーゼアッセイの結果を示すグラフ。（Ｅ）野生型ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３タンパク質の細胞質テールを構成成分とするＧＳＴ融合タンパク質基質と、ＺＡＰ７０、ｅｍｔ、およびＪＡＫ３を含む種々のチロシンキナーゼとを使ったキナーゼアッセイの結果を示すグラフ。（Ｆ）ＬＡＴ基質と、ｌｃｋ、ＺＡＰ７０、ｅｍｔ、およびＪＡＫ３を含む種々のチロシンキナーゼとを使ったキナーゼアッセイの結果を示すグラフ。（Ｇ）野生型および種々のＹ→Ｆ突然変異体の細胞質テールを構成成分とするＧＳＴ融合タンパク質の、チロシンキナーゼ混合物によるチロシンリン酸化の結果を示すグラフ。
【図１６Ｄ】実施例１２で説明するように、野生型および突然変異型ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３タンパク質の細胞質テールを構成成分とするＧＳＴ融合タンパク質を含む種々の基質を種々のチロシンキナーゼ、すなわち（Ａ）ｌｃｋキナーゼ、（Ｂ）ＺＡＰ７０キナーゼ、（Ｃ）ｅｍｔキナーゼ、および（Ｄ）ＪＡＫ３キナーゼと反応させたキナーゼアッセイの結果を示すグラフ。（Ｅ）野生型ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３タンパク質の細胞質テールを構成成分とするＧＳＴ融合タンパク質基質と、ＺＡＰ７０、ｅｍｔ、およびＪＡＫ３を含む種々のチロシンキナーゼとを使ったキナーゼアッセイの結果を示すグラフ。（Ｆ）ＬＡＴ基質と、ｌｃｋ、ＺＡＰ７０、ｅｍｔ、およびＪＡＫ３を含む種々のチロシンキナーゼとを使ったキナーゼアッセイの結果を示すグラフ。（Ｇ）野生型および種々のＹ→Ｆ突然変異体の細胞質テールを構成成分とするＧＳＴ融合タンパク質の、チロシンキナーゼ混合物によるチロシンリン酸化の結果を示すグラフ。
【図１６Ｅ】実施例１２で説明するように、野生型および突然変異型ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３タンパク質の細胞質テールを構成成分とするＧＳＴ融合タンパク質を含む種々の基質を種々のチロシンキナーゼ、すなわち（Ａ）ｌｃｋキナーゼ、（Ｂ）ＺＡＰ７０キナーゼ、（Ｃ）ｅｍｔキナーゼ、および（Ｄ）ＪＡＫ３キナーゼと反応させたキナーゼアッセイの結果を示すグラフ。（Ｅ）野生型ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３タンパク質の細胞質テールを構成成分とするＧＳＴ融合タンパク質基質と、ＺＡＰ７０、ｅｍｔ、およびＪＡＫ３を含む種々のチロシンキナーゼとを使ったキナーゼアッセイの結果を示すグラフ。（Ｆ）ＬＡＴ基質と、ｌｃｋ、ＺＡＰ７０、ｅｍｔ、およびＪＡＫ３を含む種々のチロシンキナーゼとを使ったキナーゼアッセイの結果を示すグラフ。（Ｇ）野生型および種々のＹ→Ｆ突然変異体の細胞質テールを構成成分とするＧＳＴ融合タンパク質の、チロシンキナーゼ混合物によるチロシンリン酸化の結果を示すグラフ。
【図１６Ｆ】実施例１２で説明するように、野生型および突然変異型ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３タンパク質の細胞質テールを構成成分とするＧＳＴ融合タンパク質を含む種々の基質を種々のチロシンキナーゼ、すなわち（Ａ）ｌｃｋキナーゼ、（Ｂ）ＺＡＰ７０キナーゼ、（Ｃ）ｅｍｔキナーゼ、および（Ｄ）ＪＡＫ３キナーゼと反応させたキナーゼアッセイの結果を示すグラフ。（Ｅ）野生型ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３タンパク質の細胞質テールを構成成分とするＧＳＴ融合タンパク質基質と、ＺＡＰ７０、ｅｍｔ、およびＪＡＫ３を含む種々のチロシンキナーゼとを使ったキナーゼアッセイの結果を示すグラフ。（Ｆ）ＬＡＴ基質と、ｌｃｋ、ＺＡＰ７０、ｅｍｔ、およびＪＡＫ３を含む種々のチロシンキナーゼとを使ったキナーゼアッセイの結果を示すグラフ。（Ｇ）野生型および種々のＹ→Ｆ突然変異体の細胞質テールを構成成分とするＧＳＴ融合タンパク質の、チロシンキナーゼ混合物によるチロシンリン酸化の結果を示すグラフ。
【図１６Ｇ】実施例１２で説明するように、野生型および突然変異型ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３タンパク質の細胞質テールを構成成分とするＧＳＴ融合タンパク質を含む種々の基質を種々のチロシンキナーゼ、すなわち（Ａ）ｌｃｋキナーゼ、（Ｂ）ＺＡＰ７０キナーゼ、（Ｃ）ｅｍｔキナーゼ、および（Ｄ）ＪＡＫ３キナーゼと反応させたキナーゼアッセイの結果を示すグラフ。（Ｅ）野生型ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３タンパク質の細胞質テールを構成成分とするＧＳＴ融合タンパク質基質と、ＺＡＰ７０、ｅｍｔ、およびＪＡＫ３を含む種々のチロシンキナーゼとを使ったキナーゼアッセイの結果を示すグラフ。（Ｆ）ＬＡＴ基質と、ｌｃｋ、ＺＡＰ７０、ｅｍｔ、およびＪＡＫ３を含む種々のチロシンキナーゼとを使ったキナーゼアッセイの結果を示すグラフ。（Ｇ）野生型および種々のＹ→Ｆ突然変異体の細胞質テールを構成成分とするＧＳＴ融合タンパク質の、チロシンキナーゼ混合物によるチロシンリン酸化の結果を示すグラフ。
【図１７Ａ】（Ａ）ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２がリン酸化ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳＬ３細胞質テールと会合することを証明する実施例１３に記載の免疫沈降実験の結果。（Ｂ）実施例１３に記載の、ＥＬＩＳＡによる、Ｙ６６７ ＩＴＩＭへのＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２の結合を表す。
【図１７Ｂ】（Ａ）ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２がリン酸化ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳＬ３細胞質テールと会合することを証明する実施例１３に記載の免疫沈降実験の結果。（Ｂ）実施例１３に記載の、ＥＬＩＳＡによる、Ｙ６６７ ＩＴＩＭへのＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２の結合を表す。
【図１８】実施例１０に記載のＧＳＴタンパク質に融合したＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ａの細胞質テールドメインのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を表す。（Ａ）Ｌ３ｃｙｔｏ−ｗｔのヌクレオチド配列（配列番号１７）、（Ｂ）Ｌ３ｃｙｔｏ−ｗｔのアミノ酸配列（配列番号２２）。
【図１９】実施例１０に記載のＧＳＴタンパク質に融合したＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ａの細胞質テールドメインのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を表す。（Ａ）Ｌ３ｃｙｔｏ−Ｙ６４１Ｆのヌクレオチド配列（配列番号１８）、（Ｂ）Ｌ３ｃｙｔｏ−Ｙ６４１Ｆのアミノ酸配列（配列番号２３）。
【図２０】実施例１０に記載のＧＳＴタンパク質に融合したＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ａの細胞質テールドメインのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を表す。（Ａ）Ｌ３ｃｙｔｏ−Ｙ６６７Ｆのヌクレオチド配列（配列番号１９）、（Ｂ）Ｌ３ｃｙｔｏ−Ｙ６６７Ｆのアミノ酸配列（配列番号２４）。
【図２１】実施例１０に記載のＧＳＴタンパク質に融合したＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ａの細胞質テールドメインのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を表す。（Ａ）Ｌ３ｃｙｔｏ−Ｙ６９１Ｆのヌクレオチド配列（配列番号２０）、（Ｂ）Ｌ３ｃｙｔｏ−Ｙ６９１Ｆのアミノ酸配列（配列番号２５）。
【図２２】実施例１０に記載のＧＳＴタンパク質に融合したＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ａの細胞質テールドメインのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を表す。（Ａ）Ｌ３ｃｙｔｏ−Ｙ６４１ａｌｏｎｅのヌクレオチド配列（配列番号２１）、（Ｂ）Ｌ３ｃｙｔｏ−Ｙ６４１ａｌｏｎｅのアミノ酸配列（配列番号２６）。
【図２３Ａ−１】実施例１１に記載のヒト免疫グロブリンタンパク質（ｈＩｇ）に融合したＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ａの細胞外ドメインのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を表す。（Ａ）Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ａ ｈＩｇのヌクレオチド配列（配列番号３１）、（Ｂ）ＳＩＧＬＥＣＬ−ＢＭＳ−Ｌ３ａ ｈＩｇ（配列番号３２）。
【図２３Ａ−２】実施例１１に記載のヒト免疫グロブリンタンパク質（ｈＩｇ）に融合したＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ａの細胞外ドメインのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を表す。（Ａ）Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ａ ｈＩｇのヌクレオチド配列（配列番号３１）、（Ｂ）ＳＩＧＬＥＣＬ−ＢＭＳ−Ｌ３ａ ｈＩｇ（配列番号３２）。
【図２３Ｂ】実施例１１に記載のヒト免疫グロブリンタンパク質（ｈＩｇ）に融合したＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ａの細胞外ドメインのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を表す。（Ａ）Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ａ ｈＩｇのヌクレオチド配列（配列番号３１）、（Ｂ）ＳＩＧＬＥＣＬ−ＢＭＳ−Ｌ３ａ ｈＩｇ（配列番号３２）。
【図２４Ａ−１】実施例１１に記載のヒト免疫グロブリンタンパク質に融合したＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３の細胞外ドメインのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を表す。（Ａ）Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ ｈＩｇのヌクレオチド配列（配列番号２９）、（Ｂ）ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ ｈＩｇ（配列番号３０）。
【図２４Ａ−２】実施例１１に記載のヒト免疫グロブリンタンパク質に融合したＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３の細胞外ドメインのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を表す。（Ａ）Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ ｈＩｇのヌクレオチド配列（配列番号２９）、（Ｂ）ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ ｈＩｇ（配列番号３０）。
【図２４Ｂ】実施例１１に記載のヒト免疫グロブリンタンパク質に融合したＳｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３の細胞外ドメインのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を表す。（Ａ）Ｓｉｇｌｅｃ−ＢＭＳ−Ｌ３ ｈＩｇのヌクレオチド配列（配列番号２９）、（Ｂ）ＳＩＧＬＥＣ−ＢＭＳ−Ｌ３ ｈＩｇ（配列番号３０）。
【図２５】最も長いオープンリーディングフレーム（配列番号１５）に基づくＳｉｇｌｅｃ−１０の６９７アミノ酸配列を表す。スプライスされる２つの領域をボールド体で表し、細胞質ドメイン中のＩＴＥＭモチーフのアミノ酸を枠で囲んでいる。イントロン／エキソン境界を矢印で示し、ドメイン番号は５つのＩｇ様ドメインを表している。
【図２６】実施例１５で説明するようにＳｉｇｌｅｃ１０へのポリアクリルアミド複合糖質の結合を表す。図示する結果は、２実験、ｎ＝４〜６処理／実験の平均±ＳＤである。
【図２７】実施例１６に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ１０モノクローナル抗体でプローブした細胞溶解物のウェスタンブロットを表す。
【図２８】実施例１７に記載の非ヒト霊長類およびヒト組織におけるＳｉｇｌｅｃ−１０陽性ハイブリダイゼーションシグナルの分布の詳細を示すインサイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）の結果を表す。
（Ａ）ＮＨＰ脾臓（パネルＡ、Ｃ、Ｅ）、ヒト脾臓（パネルＢ、Ｄ、Ｅ）
（Ｂ）ＮＨＰ空腸（パネルＡ、Ｃ、Ｅ）、ヒト肝臓（パネルＢ、Ｄ、Ｅ）
（Ｃ）ＮＨＰ結腸（パネルＡ〜Ｇ）
（Ｄ）ＮＨＰリンパ節（パネルＡ、Ｃ、Ｅ）、ヒトリンパ節（パネルＢ、Ｄ、Ｅ）
（Ｅ）ヒト喘息肺（パネルＡ、Ｃ、Ｅ）
（Ｆ）ＮＨＰ肺（パネルＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ）、ヒト肺（パネルＣ、Ｆ、Ｉ）。
【図１】
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【図６Ａ−２】
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【図６Ａ−３】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【図１７Ｂ】
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【図２３Ａ−２】
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【図２４Ａ−２】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004516012.tif 000247
2004516012.tif 000248
【国際調査報告】
2004516012.tif 000249
2004516012.tif 000250
2004516012.tif 000251
2004516012.tif 000252
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