(57)【要約】β１−アドレノセプターポリペプチドをコードする哺乳動物ｍＲＮＡに特異的に結合し、そして罹患した哺乳動物における（好ましくはヒト被験体における）心臓の機能不全、高血圧、肥大、心筋虚血、および他の心臓血管疾患の制御および／または処置において有用な、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびペプチド核酸化合物が開示される。本明細書中で開示されるアンチセンス化合物、およびその薬学的処方物は、長期にわたるβ１−アドレノセプター発現の持続性の制御を提供し、そして単回用量程度からでも治療効果を達成する。認可された動物モデルへのこれらのアンチセンス組成物の投与は、血圧の低下を生じたが、心拍数における有意な変化は生じなかった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも９〜約３５ヌクレオチド長の単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、ここで、該オリゴヌクレオチドは、哺乳動物のβ１−アドレノセプターポリペプチドをコードする遺伝子から発現されるｍＲＮＡの一部に特異的に結合し、ここで、該ｍＲＮＡへの該オリゴヌクレオチドの結合が、該ＲＮＡを発現する宿主細胞中の該β１−アドレノセプターポリペプチドへの該ｍＲＮＡの翻訳を変更する、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドが、前記ｍＲＮＡの近位部分に特異的に結合する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
デオキシリボ核酸、リボ核酸、ペプチド−核酸、誘導体化されたデオキシリボ核酸、誘導体化されたリボ核酸、または誘導体化されたペプチド−核酸を含む、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
ホスホロチオエート化デオキシリボ核酸、ホスホロチオエート化リボ核酸、または誘導体化されたペプチド−核酸を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号４〜配列番号１８６のいずれか１つ由来の少なくとも９個連続した塩基の配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８のいずれか１つ、または配列番号９３〜配列番号１８６のいずれか１つ由来の、少なくとも１０個連続した塩基の配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８のいずれか１つ、または配列番号９３〜配列番号１８６のいずれか１つ由来の、少なくとも１３個連続した塩基の配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８のいずれか１つ、または配列番号１１１〜配列番号１８６のいずれか１つ由来の、少なくとも１６個連続した塩基の配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８のいずれか１つ、または配列番号１２７〜配列番号１８６のいずれか１つ由来の、少なくとも１８個連続した塩基の配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８のいずれか１つ、または配列番号１４７〜配列番号１８６のいずれか１つ由来の、少なくとも２０個連続した塩基の配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８のいずれか１つ、または配列番号１６６〜配列番号１８６のいずれか１つ由来の、少なくとも２２個連続した塩基の配列を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５または配列番号１８６のいずれか１つ由来の、少なくとも２４個連続した塩基の配列を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、または配列番号２８のいずれか１つ由来の、少なくとも２７個連続した塩基の配列を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、または配列番号２８のいずれか１つから、少なくとも３０個連続した塩基の配列を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、または配列番号１３のいずれか１つの配列を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、または配列番号２３のいずれか１つの配列を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、または配列番号２８のいずれか１つの配列を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
前記オリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドが特異的に結合する前記ｍＲＮＡ配列の前記近位部分に対して少なくとも９０％相補的である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
前記オリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドが特異的に結合する前記ｍＲＮＡ配列の前記近位部分に対して少なくとも９５％相補的である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドが特異的に結合する前記ｍＲＮＡ配列の前記近位部分に対して少なくとも９６％相補的である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
前記オリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドが特異的に結合する前記ｍＲＮＡ配列の前記近位部分に対して少なくとも９７％相補的である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
前記オリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドが特異的に結合する前記ｍＲＮＡ配列の前記近位部分に対して少なくとも９８％相補的である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドが特異的に結合する前記ｍＲＮＡ配列の前記近位部分に対して少なくとも９９％相補的である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
前記オリゴヌクレオチドが、９個連続したヌクレオチド配列において、該オリゴヌクレオチドが特異的に結合する前記ｍＲＮＡ配列の前記近位部分に対して相補的ではないヌクレオチドを１つ以下しか有さない、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
前記オリゴヌクレオチドが、１０個連続したヌクレオチド配列において、該オリゴヌクレオチドが特異的に結合する前記ｍＲＮＡ配列の前記近位部分に対して相補的ではないヌクレオチドを１つ以下しか有さない、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
前記オリゴヌクレオチドが、１１個連続したヌクレオチド配列において、該オリゴヌクレオチドが特異的に結合する前記ｍＲＮＡ配列の前記近位部分に対して相補的ではないヌクレオチドを１つ以下しか有さない、請求項２４または請求項２５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
前記オリゴヌクレオチドが、１２個連続したヌクレオチド配列において、該オリゴヌクレオチドが特異的に結合する前記ｍＲＮＡ配列の前記近位部分に対して相補的ではないヌクレオチドを１つ以下しか有さない、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
前記宿主細胞が、哺乳動物宿主細胞である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
前記宿主細胞が、ヒト細胞である、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
前記宿主細胞が、ヒト内に含まれる、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも９〜約３０ヌクレオチド長である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも９〜約２５ヌクレオチド長である、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも９〜約２０ヌクレオチド長である、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも９〜約１５ヌクレオチド長である、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも９〜約１２ヌクレオチド長である、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
リポソーム、脂質粒子、脂質小胞、ナノ粒子、微粒子、ナノカプセル、ナノスフェア、またはスフィンゴソーム内に含まれる、請求項１〜３５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
ベクター内に含まれる、請求項１〜３６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
ウイルスベクター内に含まれる、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
ヒト宿主細胞中で前記オリゴヌクレオチドを発現するベクター内に含まれる、請求項１〜３８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
請求項１〜３９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む、組換えベクター。
【請求項４１】
前記ベクターが、プラスミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項４０に記載のベクター。
【請求項４２】
請求項１〜３９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドあるいは請求項４０または請求項４１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項４３】
前記細胞が、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、または哺乳動物宿主細胞である、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項４４】
組成物であって、以下：
（ａ）請求項１〜３９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド；
（ｂ）請求項４０または請求項４１に記載のベクター、あるいは
（ｃ）請求項４２または請求項４３に記載の宿主細胞、
を含む、組成物。
【請求項４５】
薬学的賦形剤をさらに含む、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
リポソーム、脂質粒子、脂質小胞、ナノ粒子、微粒子、ナノカプセル、ナノスフェア、またはスフィンゴソームをさらに含む、請求項４４または４５に記載の組成物。
【請求項４７】
請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の組成物であって、該組成物は、少なくとも９〜約３５ヌクレオチド長の少なくとも第二オリゴヌクレオチドをさらに含み、ここで、該第二オリゴヌクレオチドはまた、β１−アドレノセプターポリペプチドをコードするｍＲＮＡの一部に特異的に結合し、そしてさらに、該第２のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が、該組成物中の第一オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列とは異なる、組成物。
【請求項４８】
前記第二オリゴヌクレオチドが、配列番号４〜配列番号１８６のいずれか１つである、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
少なくとも第一抗高血圧剤をさらに含む、請求項４４〜４８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記抗高血圧剤が、カプトプリル、エナラプリル、ラミプリル、シラザプリル、ホシノプリル、およびリシノプリルからなる群より選択される、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
請求項４４〜５０のいずれか１項に記載の組成物であって、該組成物は、少なくとも第二アンチセンスオリゴヌクレオチド、あるいは哺乳動物の転写因子ｍＲＮＡ、レニン特異的ｍＲＮＡ、アンギオテンシン特異的ｍＲＮＡ、アンギオテンシノゲン特異的ｍＲＮＡ、ＡＴ−１レセプター特異的ｍＲＮＡ、またはアンギオテンシン変換酵素に特異的な第一リボザイムをさらに含む、組成物。
【請求項５２】
前記第二アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは前記第一リボザイムが、哺乳動物のアンギオテンシン変換酵素ｍＲＮＡに特異的である、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
治療における使用のための、請求項４４〜５２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５４】
高血圧、肥大、または心臓虚血の処置において使用するための、請求項４４〜５２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５５】
キットであって、請求項４４〜５２のいずれか１項に記載の組成物、および該キットを使用するための指示書を備える、キット。
【請求項５６】
治療において使用するための医薬の製造における、請求項４４〜５２のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項５７】
哺乳動物における高血圧、肥大、または心臓虚血を処置するための医薬の製造における、請求項４４〜５２のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項５８】
哺乳動物における高血圧の症状の処置または改善において使用するための医薬の製造における、請求項４４〜５２のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項５９】
哺乳動物における心肥大の症状の処置または改善において使用するための医薬の製造における、請求項４４〜５２のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項６０】
哺乳動物における虚血の症状の処置または改善において使用するための医薬の製造における、請求項４４〜５２のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項６１】
哺乳動物宿主細胞におけるβ１−アドレノセプターポリペプチドのレベルを減少するための方法であって、該方法は、該宿主細胞における該ポリペプチドのレベルを減少するために有効な時間にわたって、請求項４４〜５２のいずれか１項に記載の一定量の組成物を該細胞に提供する工程を包含する、方法。
【請求項６２】
哺乳動物宿主細胞におけるβ１−アドレノセプターポリペプチド特異的ｍＲＮＡの転写を減少するための方法であって、該方法は、該宿主細胞における該ｍＲＮＡの転写を減少するために有効な時間にわたって、請求項４４〜５２のいずれか１項に記載の一定量の組成物を該細胞に提供する工程を包含する、方法。
【請求項６３】
前記宿主細胞が、哺乳動物内に含まれる、請求項６１または６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項６１〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
哺乳動物における血圧を低下するための方法であって、該方法は、請求項４４〜５２のいずれか１項に記載の組成物を、一定量で、かつ該哺乳動物における該血圧を低下するために有効な時間にわたって、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項６６】
哺乳動物における増大したβ１−アドレノセプターポリペプチドレベルに関連する疾患または障害の症状を減少または改善するための方法であって、該方法は、請求項４４〜５２のいずれか１項に記載の治療有効量の組成物を、該哺乳動物における該ポリペプチドのレベルを減少するために十分な時間にわたって、該哺乳動物に投与する工程を包含し、これによって、該哺乳動物における該疾患または障害の該症状が減少または改善する、方法。
【請求項６７】
罹患した哺乳動物における心筋虚血または心肥大を処置するための方法であって、該方法は、請求項４４〜５２のいずれか１項に記載の組成物を、一定量で、かつ該哺乳動物における該虚血または該肥大を処置するために十分な時間にわたって、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項６８】
哺乳動物宿主細胞におけるβ１−アドレノセプターポリペプチドのレベルを減少するための方法であって、該方法は、請求項４４〜５２のいずれか１項に記載の組成物を、該宿主細胞において発現する工程を包含し、ここで、該オリゴヌクレオチドは、該細胞において該オリゴヌクレオチドを発現し得る少なくとも第一プロモーターに作動可能に連結されている、方法。
【請求項６９】
哺乳動物宿主細胞におけるβ１−アドレノセプターポリペプチドのレベルを減少するための方法であって、該方法は、該細胞において該ポリヌクレオチドを発現し得る少なくとも第一プロモーターに作動可能に連結された、全長または実質的に全長のβ１−アドレノセプターアンチセンスポリヌクレオチドを含む選択された核酸セグメントを含む組成物を、該宿主細胞において発現する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
第１の実施形態において、本発明は、宿主細胞において哺乳動物β１−ＡＲ特異的遺伝子または哺乳動物β１−ＡＲ特異的ｍＲＮＡに特異的に結合し、そしてこの細胞において産生されるβ１−ＡＲポリペプチドの発現（すなわち、量）を変化させる、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【０００２】
第２の実施形態において、本発明は、宿主細胞において哺乳動物β１−ＡＲ特異的遺伝子または哺乳動物β１−ＡＲ特異的ｍＲＮＡに特異的に結合し、そしてこの細胞において産生されるβ１−ＡＲポリペプチドの発現（すなわち、量）を変化させる、アンチセンスペプチド核酸を提供する。
【０００３】
第３の実施形態において、本発明は、宿主細胞において哺乳動物β１−ＡＲ特異的遺伝子または哺乳動物β１−ＡＲ特異的ｍＲＮＡに特異的に結合し、そしてこの細胞において産生されるβ１−ＡＲポリペプチドの発現（すなわち、量）を変化させる、アンチセンスポリヌクレオチドを提供する。このアンチセンスポリヌクレオチドは、哺乳動物β１−ＡＲ特異的ｍＲＮＡに相補的であり、そして哺乳動物β１−ＡＲ特異的ｍＲＮＡを発現する細胞中に存在する場合にこのβ１−ＡＲ特異的ｍＲＮＡに特異的に結合し、これによって、細胞タンパク質の機構が機能的β１−ＡＲポリペプチドを翻訳し得る細胞において、機能的ｍＲＮＡのアベイラビリティを低下させる、全長かまたは実質的に全長の配列を提示する。好ましくは、これらの全長かまたは実質的に全長のポリヌクレオチドは、選択された宿主細胞における相補的なｍＲＮＡを発現させ得るプロモーターを含む遺伝構築物を介して、細胞に提供される。このような遺伝構築物は、当業者に公知の従来の遺伝子治療様式（例えば、異種ポリヌクレオチドの送達および発現のために通常使用される、１つ以上のウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスの構築物による）のいずれか１つを使用して、適切な宿主細胞に提供され得る。
【０００４】
第４の実施形態において、本発明は、開示される１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびペプチド核酸化合物、ならびに適切な希釈剤、キャリア、または薬学的ビヒクルを含有する、組成物を提供する。
【０００５】
第５の実施形態において、本発明は、開示される１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびペプチド核酸化合物、ならびに少なくとも１つの抗高血圧性の薬学的化合物を含有する、薬学的処方物を提供する。
【０００６】
第６の実施形態において、本発明は、開示される少なくとも２つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびペプチド核酸化合物を含有する、薬学的組成物を提供する。
【０００７】
第７の実施形態において、本発明は、開示される少なくとも２つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびペプチド核酸化合物を、少なくとも１つの抗高血圧性の薬学的化合物と組み合わせて含有する、薬学的組成物を提供する。
【０００８】
第８の実施形態において、本発明は、開示される少なくとも１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびペプチド核酸組成物を、この組成物を哺乳動物の心臓の機能不全または疾患の処置において使用するための指示書と組み合わせて備える、治療キットおよび医薬を提供する。あるいは、本発明は、開示される少なくとも１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびペプチド核酸組成物を、この組成物を適切な遺伝子治療ベクターの開発のための遺伝構築物の調製において使用するための指示書と組み合わせて備えるキットを提供する。同様に、本発明は、開示される少なくとも１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびペプチド核酸組成物を、この組成物を１つ以上の病理学的状態を処置するためのマルチドラッグ「カクテル」の処方において使用するための指示書と組み合わせて備えるキットを提供する。
【０００９】
本発明はまた、本明細書中に開示されるような１つ以上のアンチセンス化合物または組成物を使用して、１つ以上の心臓の疾患または機能不全を処置するための方法を提供する。
【００１０】
本明細書中に記載される実施形態の各々において、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはペプチド核酸化合物は、少なくとも９〜約３５塩基の長さの配列領域を含み、ここで、このオリゴヌクレオチドは、哺乳動物β１−ＡＲポリペプチドをコードする遺伝子から発現されるｍＲＮＡの一部に特異的に結合し、そしてさらにここで、このオリゴヌクレオチドのｍＲＮＡへの結合は、このｍＲＮＡを発現する宿主細胞においてβ１−ＡＲの活性を低下させる際に有効である。
【００１１】
（２．１　オリゴヌクレオチドおよびオリゴＰＮＡ化合物）
オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチド核酸の実施形態において、このオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡは、好ましくは、約９〜約３５ヌクレオチド長の配列からなり、そして好ましくは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２８、ならびに配列番号２９〜配列番号１８６に示されるより小さなｎマー配列に開示される配列のいずれか１つ由来の、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、または少なくとも１５の連続する塩基の配列を含む。
【００１２】
あるいは、このオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡは、好ましくは、約９〜約３５ヌクレオチド長の配列からなり、そして好ましくは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、または配列番号５３に開示される配列のいずれか１つ由来の少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または少なくとも２５の連続するヌクレオチドの配列を含む。
【００１３】
あるいは、このオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡは、好ましくは、約９〜約３５ヌクレオチド長の配列からなり、そして好ましくは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、または配列番号５３に開示される配列のいずれか１つ由来の、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３または少なくとも３４の連続するヌクレオチドの配列を含む。
【００１４】
あるいは、このオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡは、約９〜約３５ヌクレオチド長の配列からなり得、そして配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、または配列番号５３の配列全体を含み得る。
【００１５】
このオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ化合物は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、または配列番号５３、あるいは配列番号５４〜配列番号１８６に示される、任意の１つ以上のより小さなｎマー配列の配列から本質的になり得る。
【００１６】
オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ化合物はまた、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、または配列番号５３の配列、あるいは配列番号５４〜配列番号１８６に示される任意の１つ以上のより小さなｎマー配列からなり得る。
【００１７】
上記のように、好ましいオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ化合物の長さは、好ましくは、約９〜約３５程度のヌクレオチドのオーダーである。それ自体で、９ヌクレオチド長である化合物、および３５ヌクレオチド長である化合物に加えて、中間の大きさを有する全ての化合物がまた、本発明の実施において有用であることが意図される。従って、１０ヌクレオチド長、１１ヌクレオチド長、１２ヌクレオチド長、１３ヌクレオチド長、１４ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、２６ヌクレオチド長、２７ヌクレオチド長、２８ヌクレオチド長、２９ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、３１ヌクレオチド長、３２ヌクレオチド長、３３ヌクレオチド長および３４ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ化合物もまた、本開示の範囲内にあることが意図される。実際に、好ましいオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ化合物はまた、この好ましい範囲よりわずかに短くあり得、すなわち、これらは約６または約７または約８ヌクレオチド長であり得、またはこれらは、この好ましい範囲よりわずかに長くさえあり得（すなわち、これらは約３６もしくは約３７、または約３８程度のヌクレオチド長でさえあり得）、そして依然として、細胞においてβ１−ＡＲポリペプチドのレベルを低下させるよう機能し得、従って、上昇したレベルのβ１−ＡＲポリペプチドから生じる心臓障害の処置において、効果的である。
【００１８】
同様に、これらのアンチセンス化合物が、哺乳動物β１−ＡＲ　ｍＲＮＡ上の所定の標的配列に対して、正確に１００％相補的であるという必須の要件は、存在しない。同様に、これらのアンチセンス化合物が、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、または配列番号５３に開示される配列の１つ、あるいは配列番号５４〜配列番号１８６に示されるいずれか１つ以上のより小さなｎマー配列に対して、正確に１００％同一であるという必須の要件は、存在しない。実際に、唯一の要件は、オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ化合物が、相補的領域に特異的に結合する際に、β１−ＡＲ遺伝子の転写の減少、および／またはβ１−ＡＲポリペプチドをコードするｍＲＮＡからのβ１−ＡＲポリペプチドの翻訳の減少のいずれかが観察されるように、β１−ＡＲポリペプチドをコードする遺伝子またはｍＲＮＡに対する十分な相同性を有することである。従って、これらの化合物は、それが特異的に結合する標的配列からの４以下、３以下、２以下、または１さえのミスマッチを有し得、そして依然として、宿主細胞におけるβ１−ＡＲポリペプチドの減少を引き起こすために十分に活性であり得る。従って、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、または配列番号５３に開示される配列、あるいは配列番号５４〜配列番号１８６に示される、いずれか１つ以上のより小さなｎマー配列に対して１００％同一である配列を含む上に開示される化合物に加えて、本発明はまた、得られる変性ヌクレオチド配列が、β１−ＡＲポリペプチドをコードする遺伝子またはｍＲＮＡに特異的に結合するために十分な相同性を維持する限り、これらの配列の１つの一部に約９９％、約９８％、約９７％、約９６％、約９５％、約９４％、約���３％、約９２％、約９１％、または約９０％さえ同一である配列領域を含むアンチセンス化合物を包含する。
【００１９】
（２．２　ポリヌクレオチドおよびポリＰＮＡ化合物）
特定の実施形態において、このポリヌクレオチドは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、または配列番号５３由来の少なくとも９の連続する塩基を含む。本発明の他の局面において、このポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、または好ましくは、誘導体化もしくは改変されたポリヌクレオチド（ホスホロチオエート誘導体などを含む）を含む。
【００２０】
好ましくは、このアンチセンスポリヌクレオチド化合物は、β１−ＡＲ　ｍＲＮＡの実質的に全長である相補体である配列を含み、ここで、実質的に全長である相補配列のβ１−ＡＲ　ｍＲＮＡに対する結合は、β１−ＡＲポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳を低減するのに有効である。好ましくは、この実質的に全長である相補配列は、適切な宿主に送達され得る適切なベクターの中に含まれる。好ましくは、このベクターは、宿主細胞において相補的なアンチセンス配列を発現するプロモーター配列に作動可能に連結する核酸セグメントを含む。次いで、この相補的なほぼ全長の配列は、実質的に全長であるβ１−ＡＲ　ｍＲＮＡに特異的に結合し、これによって、このｍＲＮＡのβ１−ＡＲポリペプチドへの翻訳を阻止するか、またはこれを実質的に低減する。この実質的に全長であるという用語は、ネイティブのβ１−ＡＲに特異的なｍＲＮＡの少なくとも約８０％以上である領域に相補的な配列を含むそれらの配列を含むことを意味する。従って、１０００ヌクレオチド長であるβ１−ＡＲ　ｍＲＮＡについて、適切に相補的な実質的に全長の相補体は、特定のβ１−ＡＲ　ｍＲＮＡの少なくとも８００ヌクレオチドの領域に相補的な配列である。同様に、全長配列の８０％を超える全ての配列、すなわち、以下の配列はまた、本開示の範囲に含まれることが企図される：少なくとも全長の８１％である配列、少なくとも全長の８２％である配列、少なくとも全長の８３％である配列、少なくとも全長の８４％である配列、少なくとも全長の８５％である配列、少なくとも全長の８６％である配列、少なくとも全長の８７％である配列、少なくとも全長の８８％である配列、少なくとも全長の８９％である配列、少なくとも全長の９０％である配列、少なくとも全長の９１％である配列、少なくとも全長の９２％である配列、少なくとも全長の９３％である配列、少なくとも全長の９４％である配列、少なくとも全長の９５％である配列、少なくとも全長の９６％である配列、少なくとも全長の９７％である配列、少なくとも全長の９８％である配列、および少なくとも全長の９９％である配列。
【００２１】
（２．３　β１−ＡＲアンチセンス化合物および第２の心臓治療剤を含む化合物）
望ましい場合、臨床医は、上で開示された、２以上のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはＰＮＡ化合物を結合し、β１−ＡＲポリペプチドのレベルをより実質的に低減を与えるためのアンチセンス「カクテル」を提供し得る。同様に、処理されるべき患者または動物は、本明細書中に開示された、１以上のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはＰＮＡ化合物、および少なくとも１以上の抗高血圧症医薬または他の心臓治療医薬を含む、併用療法から利益を受けとり得る。
【００２２】
例えば、この組成物は、少なくとも第１の抗高血圧症剤を含む。特定の実施形態において、この抗高血圧症医薬は、以下からなる群より選択される：カプトプリル（Ｃａｐｔｏｐｒｉｌ（登録商標））、エナラプリル（Ｖａｓｏｔｅｃ（登録商標））、ラミプリル（Ａｌｔａｃｅ（登録商標））、ホシノプリル（Ｍｏｎｏｐｒｉｌ（登録商標））、リジノプリル（Ｐｒｉｎｉｖｉｌ（登録商標）、Ｚｅｓｔｒｉｌ（登録商標））、クイナプリル（ｑｕｉｎａｐｒｉｌ）（Ａｃｃｕｐｒｉｌ（登録商標））、ベナゼプリル（Ｌｏｔｅｎｓｉｎ（登録商標））、トランドプリル（Ｍａｖｉｋ（登録商標））、およびモエキシプリル（Ｕｎｉｖａｓｃ（登録商標））。他の実施形態において、この抗高血圧症剤は、以下からなるアンギオテンシンレセプターブロッカーの群より選択される：コンデンサルタン（ｃａｎｄｅｓａｒｔａｎ）（Ａｔａｃａｎｄ（登録商標））、ロサルタン（ｌｏｓａｒｔａｎ）（Ｃｏｚａａｒ（登録商標）およびＨｉｚａａｒ（登録商標））、バルサルタン（ｖａｌｓａｒｔａｎ）（Ｄｉｏｖａｎ（登録商標））、およびイルベサルタン（ｉｒｂｅｓａｒｔａｎ）（Ａｖａｐｒｏ（登録商標））。
【００２３】
なお他の実施形態において、抗高血圧症剤は、以下からなる利尿剤の群より選択される：ジクロルフェナミド（Ｄａｒａｎｉｄｅ（登録商標））、スピロノラクトン（Ａｌｄａｃｔａｚｉｄｅ（登録商標））、ヒドロクロロチアジド（Ｍｉｃｒｏｚｉｄｅ（登録商標）およびＤｙａｚｉｄｅ（登録商標））、トリアムテレン（Ｍａｘｚｉｄｅ（登録商標））、アミロライド（Ｍｉｄａｍｏｒ（登録商標）およびＭｏｄｕｒｅｔｉｃ（登録商標））、トルセミド（ｔｏｒｓｅｍｉｄｅ）（Ｄｅｍａｄｅｘ（登録商標））、エタクリン酸（ｅｔｈａｃｒｙｎｉｃｅ　ａｃｉｄ）（Ｅｄｅｃｒｉｎ（登録商標））、フロセミド（Ｌａｓｉｘ（登録商標））、ヒドロフルメチアジド（Ｄｉｕｃａｒｄｉｎ（登録商標））、クロロチアジド（Ｄｉｕｒｉｌ（登録商標））、メチルコルチアジド（ｍｅｔｈｙｌｃｌｏｔｈｉａｚｉｄｅ）（Ｅｎｄｕｒｏｎ（登録商標））、ポリチアジド（ｐｏｌｙｔｈｉａｚｉｄｅ）（Ｒｅｎｅｓｅ（登録商標））、クロルタリドン（Ｔｈａｌｉｔｏｎｅ（登録商標））およびメトラゾン（Ｚａｒｏｘｏｌｙｎ（登録商標））。
【００２４】
なおさらなる実施形態において、抗高血圧症剤は、以下からなるカルシウムチャネルブロッカーの群より選択される：ニフェジピン（Ａｄａｌａｔ（登録商標）およびＰｒｏｃａｒｄｉａ（登録商標））、ベラパミル（Ｉｓｏｐｔｉｎ（登録商標）、Ｖｅｒｅｌａｎ（登録商標）、Ｃａｌａｎ（登録商標）およびＣｏｖｅｒａ（登録商標））、ニカルジピン（Ｃａｒｄｅｎｅ（登録商標））、ジルチアゼム（Ｔｉａｚａｃ（登録商標）、Ｃａｒｄｉｚｅｍ（登録商標）およびＤｉｌａｃｏｒ（登録商標））、イスラジピン（ＤｙｎａＣｉｒｃ（登録商標））、ニモジピン（Ｎｉｍｏｔｏｐ（登録商標））、アムロジピン（Ｎｏｒｖａｓｅ（登録商標））、フェロジピン（Ｐｌｅｎｄｉｌ（登録商標））、ミソルジピン（ｍｉｓｏｌｄｉｐｉｎｅ）（Ｓｕｌａｒ（登録商標）、およびベプリジル（Ｖａｓｏｃｏｒ（登録商標））。
【００２５】
特定の好ましい実施形態において、この組成物は、１以上の薬学的に受容可能なビヒクルをさらに含み、これは、以下によって例示されるが、これらに限定されず、これは、冒された患者または動物に対するアンチセンス組成物の投与を容易にする：リポソーム、脂質粒子、脂質ベシクル、ナノ粒子、微粒子、ナノカプセル、ナノスフィアおよびスフィンゴソーム（ｓｐｈｉｎｇｏｓｏｍｅｓ）。
【００２６】
本発明の特定の局面において、本発明のアンチセンス組成物は、ヒトβ１−ＡＲポリペプチドをコードするｍＲＮＡについて特異的である。特定の実施形態において、この宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。本発明の特定の好ましい実施形態において、この宿主細胞は、ヒト細胞である。他の好ましい局面において、この宿主細胞はヒトに含まれる。
【００２７】
（２．４　β１−ＡＲアンチセンス化合物および別のＲＡＳ経路の成分に標的化される第２のアンチセンスを含む組成物）
本発明はまた、上記の哺乳動物β１−ＡＲ特異的ｍＲＮＡに特異的な少なくとも第１のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＰＮＡ、またはポリヌクレオチド、および哺乳動物レニン、アンギオテンシン、アンギオテンシノーゲン、アンギオテンシン１型（ＡＴ−１）レセプターｍＲＮＡ、もしくはＡＣＥポリペプチドに特異的な少なくとも第２のアンチセンス化合物を含む組成物を提供する。
【００２８】
本発明の特定の局面において、第２のアンチセンス化合物は、哺乳動物アンギオテンシノーゲンｍＲＮＡ、または１以上のＲＡＳ経路特異的酵素（例えば、哺乳動物ＡＣＥポリペプチド）をコードするｍＲＮＡに特異的である。他の局面において、この第２のアンチセンス化合物は、転写因子をコードするｍＲＮＡに特異的である。
【００２９】
３以上のアンチセンス化合物の治療的組み合わせもまた、提供される。これらのカクテル療法は、哺乳動物β１−ＡＲをコードする遺伝子またはｍＲＮＡに特異的な少なくとも２つのアンチセンス化合物、およびこのｍＲＮＡに特異的な少なくとも第３のアンチセンス化合物、あるいは上記のＲＡＳ経路における別のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含み得る。第３のアンチセンス化合物は、罹患動物において、レニン、ＡＴ−１レセプター、ＡＣＥ、またはアンギオテンシノーゲン、あるいは血圧の生成もしくは調節および／または高血圧、虚血、心肥大、もしくは別の心臓機能不全の発生またはこれらへの寄与に関与する生化学的経路に関与する別の遺伝子もしくはｍＲＮＡに特異的であり得る。あるいは、この構築物は、哺乳動物における高血圧、虚血、心肥大、または他の心臓機能不全の発生に関与する１以上の遺伝子を調節する１以上の特定の転写因子にさらに特異的であり得る。２以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて取り組まれているこのような併用療法は、高血圧、虚血、心肥大、または他の心臓機能不全の処置に対する活性の増大または相乗活性が、達成される場合に特に望ましい。
【００３０】
本発明はさらに、宿主細胞における哺乳動物β１−ＡＲポリペプチドをコードする遺伝子の発現を減少するための方法を提供する。この方法は、宿主細胞におけるβ１−ＡＲポリペプチドの量を減少するに有効な量の、β１−ＡＲポリペプチドをコードするｍＲＮＡに特異的に結合するアンチセンスである、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはペプチド核酸を宿主細胞に提供する工程を包含する。
【００３１】
さらに、本発明は、細胞中の哺乳動物β１−ＡＲポリペプチドの数を減少させるための方法を提供する。この方法は、哺乳動物β１−アドレノレセプターポリペプチドをコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡの全て、実質的に全て、または一部に特異的に結合する、少なくとも第１のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはペプチド核酸をこの細胞に導入する工程を包含する。ここでさらに、このｍＲＮＡに対する第１のアンチセンスである、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはペプチド核酸の結合は、このｍＲＮＡを発現する宿主細胞中の哺乳動物β１−ＡＲポリペプチドの数を減少するに有効である。
【００３２】
本発明はまた、動物における高血圧を軽減または処置するための方法を提供する。この方法は、少なくとも第１のアンチセンスである、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはペプチド核酸の有効量をこの動物に投与する工程を包含する。ここで、この化合物は、哺乳動物β１−ＡＲポリペプチドをコードする遺伝子から発現されるｍＲＮＡの全て、実質的に全て、または一部に特異的に結合し、さらに、このｍＲＮＡに対するこの化合物の結合は、このｍＲＮＡを発現する宿主細胞中のこのようなポリペプチドの数を減少するに有効である。
【００３３】
本発明はさらに、哺乳動物におけるβ１−ＡＲ活性の上昇と関連した疾患を処置するための方法を提供する。この方法は、少なくとも第１のアンチセンスである、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはペプチド核酸化合物の有効量をこの動物に投与する工程を包含する。ここで、この化合物は、哺乳動物β１−ＡＲポリペプチドをコードする遺伝子から発現されるｍＲＮＡの全て、実質的に全て、または一部に特異的に結合し、さらに、このｍＲＮＡに対するこの化合物の結合は、このｍＲＮＡを発現する宿主細胞中のレセプター活性またはレセプター数を減少するに有効である。その結果、β１−アドレノレセプター活性の減少がもたらされ、それにより、罹患した動物におけるβ１−ＡＲ活性のレベルの上昇から生じるか、またはこのレベルにより悪化する疾患の改善を生じる。
【００３４】
本発明はまた、罹患した動物におけるβ１−アドレノレセプターポリペプチドの存在もしくは上昇と関連するか、このポリペプチドの存在もしくは上昇から生じるか、あるいはこのポリペプチドの存在もしくは上昇により悪化する心肥大疾患または虚血疾患を処置するための方法を提供する。この方法は、一般に、少なくとも第１のアンチセンスである、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはペプチド核酸化合物を含む１以上の組成物の動物への投与に関する。ここで、この化合物は、哺乳動物β１−ＡＲポリペプチドをコードする遺伝子から発現されるｍＲＮＡを発現する宿主細胞におけるβ１−アドレノレセプターポリペプチドの数、量もしくは活性を減少するに十分な量および時間で、このｍＲＮＡのすべて、実質的にすべて、または一部に特異的に結合する。
【００３５】
さらに、ヒトにおける高血圧を処置するためのキットが提供され、このキットは、以下を含む：（ａ）９〜約３５塩基長の少なくとも第１のオリゴヌクレオチドを含む薬学的に受容可能な処方物（このオリゴヌクレオチドは、哺乳動物β１−ＡＲポリペプチドをコードする遺伝子から発現されるｍＲＮＡの一部に特異的に結合し、さらにこのオリゴヌクレオチドのｍＲＮＡへの結合は、このｍＲＮＡを発現する宿主細胞におけるレセプターポリペプチドの活性、量または数を減少するに有効である）；薬学的賦形剤；および（ｂ）キットを用いるための説明書。
【００３６】
外因性オリゴヌクレオチド組成物の宿主細胞への送達を包含する方法、治療的薬学処方物での動物へのこのような組成物の投与に加えて、本発明はまた、宿主細胞機構により転写されるＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入して、哺乳動物β１−ＡＲポリペプチドをコードするｍＲＮＡの一部に特異的に結合するアンチセンスＲＮＡを生じさせるための遺伝子治療方法に関する。好ましい実施形態において、このような治療は、本明細書中以下に記載のウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルス）の使用により達成され得る。
【００３７】
哺乳動物細胞ゲノムにおける哺乳動物β１−ＡＲポリペプチドをコードする遺伝子の発現の調節は、宿主において機能的であり、かつ転写されたＤＮＡ鎖が、調節しようとする内因性β１−ＡＲ特異的ポリヌクレオチド配列から転写されたＤＮＡ鎖に相補的であるプロモーターの転写制御下で遺伝子を組み込むことにより達成され得る。組み込まれた遺伝子（アンチセンス遺伝子という）は、天然に存在するＲＮＡ（哺乳動物β１−ＡＲポリペプチド特異的ｍＲＮＡにより例示される）に結合し得、その発現を阻害し得るＲＮＡ配列を提供する。ここで、このアンチセンス配列は、このＲＮＡのコード部分、非コード部分またはその両方の部分に結合し得る。このアンチセンス構築物は、種々の方法で動物細胞に導入され得、このアンチセンス配列の誘導性転写または構成的転写のために動物ゲノムに組み込まれ得る。
【００３８】
本発明の別の局面は、哺乳動物β１−ＡＲ特異的ｍＲＮＡの発現を阻害するために有用な薬学的組成物を提供し、この薬学的組成物は、薬学的キャリアおよび特定のｍＲＮＡに特異的に結合し、その発現を減少させる本発明の１以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。本発明の別の局面は、ヒトにおける高血圧を処置するための方法を提供し、この方法は、本明細書中に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド組成物の有効量（ヒトにおける高血圧を軽減するか、または患者における高血圧の程度を改善するに有効な量）を被験体に投与する工程を包含する。
【００３９】
（２．５　定義）
用語「β１−ＡＲ」とは、ネイティブな哺乳動物β１−ＡＲポリペプチドアミノ酸配列に実質的に類似し、生物学的に活性な、そして／または哺乳動物β１−ＡＲポリペプチドまたはそのペプチドフラグメントに対して惹起されたβ１−ＡＲポリペプチド特異的抗体と交差反応するするアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。
【００４０】
用語「β１−ＡＲ」はまた、ネイティブな哺乳動物β１−ＡＲポリペプチドと共通する少なくともいくつかの生物学的活性を示す哺乳動物β１−ＡＲポリペプチドのアナログを含む。
【００４１】
さらに、変異誘発の当業者は、他のアナログが、現在のところ開示も発見もされていなくとも、周知の分子生物学技術（本明細書中に記載の技術を含む）を用いて、哺乳動物β１−ＡＲポリペプチドアナログもしくはβ１−ＡＲ融合タンパク質を構築するか、またはβ１−ＡＲ関連ｍＲＮＡおよび／もしくは遺伝子を同定するために用いられ得る。哺乳動物β１−ＡＲポリペプチドをコードするｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドは、本発明の本質（特にヒトβ１−ＡＲポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）を構成する。
【００４２】
本発明のオリゴヌクレオチド（または「ＯＤＮ」または「ポリヌクレオチド」または「オリゴ」または「オリゴマー」または「ｎマー」）は、好ましくは、デオキシオリゴヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡ）またはその誘導体；リボオリゴヌクレオチド（すなわち、ＲＮＡ）またはその誘導体；あるいはペプチド核酸（ＰＮＡ）またはその誘導体である。
【００４３】
アミノ酸配列または核酸配列のいずれかを規定するために用いられる場合、用語「実質的に相補的」とは、特定の対象配列（例えば、オリゴヌクレオチド配列）が選択された配列のすべてまたはその一部に実質的に相補的であり、従って、哺乳動物β１−ＡＲポリペプチドをコードするｍＲＮＡの一部に特異的に結合することを意味する。このようにして、代表的には、この配列は、ｍＲＮＡ「標的」配列に高度に相補的であり、配列の相補的な部分全体を通してわずか１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基のミスマッチを有する。多くの場合、この配列が正確にマッチし（すなわち、オリゴヌクレオチドが特異的に結合する配列に完全に相補的である）、従って、相補的なストレッチに沿ってミスマッチがないことが望ましい。このようにして、高度に相補的な配列は、代表的には、ｍＲＮＡの標的配列領域に極めて特異的に結合し、従って、標的ｍＲＮＡ配列のポリペプチド産物への翻訳を減少させ、そして／またはなお阻害するに非常に有効である。
【００４４】
実質的に相補的なオリゴヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドが特異的に結合する、対応するｍＲＮＡ標的配列に約８０％を超えて相補的（すなわち「正確なマッチの％」）であり、より好ましくは、オリゴヌクレオチドが特異的に結合する、対応するｍＲＮＡ標的配列に約８５％を超えて相補的である。特定の局面において、上記のように、本発明の実施における使用のために、なおより実質的に相補的なオリゴヌクレオチド配列を有することが望ましく、このような場合において、このオリゴヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドが特異的に結合する、対応するｍＲＮＡ標的配列に約９０％を超えて相補的であり、特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドが特異的に結合する、対応するｍＲＮＡ標的配列に約９５％を超えて相補的であり、さらに、設計されたオリゴヌクレオチドが特異的に結合する標的ｍＲＮＡのすべてまたは一部に、９６、９７、９８、９９、さらに１００％まで（この値を含む）正確にマッチして、相補的である。
【００４５】
開示される配列のいずれかの類似性パーセントまたは相補性パーセントは、例えば、　ＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から利用可能である）を用いて配列情報を比較することによって決定され得る。ＧＡＰプログラムは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）のアラインメント方法を利用する。簡単に言うと、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうちの短い配列中の符号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の総数で除算した類似する整列された符号の数として、類似性を規定する。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターとしては、以下が挙げられる：（１）ヌクレオチドについて単項比較マトリックス（同一性について１の値、そして非同一性について０の値を含む）、およびＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ（１９８６）のウェィト比較マトリックス（ｗｅｉｇｈｔｅｄ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｍａｔｒｉｘ）、（２）各ギャップについて３．０のペナルティーおよび各ギャップ中の各符号についてさらなる０．１０のペナルティ；ならびに（３）末端のギャップについて、ペナルティなし。
【００４６】
（２．６　β１−アデノセプター（β１−ａｄｅｎｏｃｅｐｔｏｒ）特異的ｍＲＮＡについての例示的なアンチセンス構築物）
表１は、本発明の実施における使用が意図された代表的なオリゴヌクレオチド配列を列挙する。
【００４７】
（表１　哺乳動物のβ１−ＡＲをコードするｍＲＮＡに対して標的化された、例示的なオリゴヌクレオチド配列）
【００４８】
【表１】
2004502459.tif 000002
2004502459.tif 000003
Ｎは、任意のヌクレオチド（例えば、Ｃ、Ａ、Ｕ（Ｔ）、またはＧを意味する。太字の配列は、β１−ＡＲオープンリーディングフレームの一部に対応する。
【００４９】
示された３５マーに加えて、少なくとも９塩基長から、列挙される全長３５マーまでを含む短い内部ｎマーもまた、本発明の実施に有用であることが意図される。例えば、最初に示される全長オリゴマーに加えて、全内部ｎマーもまた、本開示の範囲内に入ると考えられる。従って、３５マーの各々（配列番号４〜配列番号２８）について、各配列の全内部３４マー、ならびに、開示される３５マーの各々の内側に含まれる、全内部３３マー、全内部３２マー、全内部３１マー、全内部３０マー、全内部２９マー、全内部２８マー、全内部２７マー、全内部２６マー、全内部２５マー、全内部２４マー、全内部２３マー、全内部２２マー、全内部２１マー、全内部２０マー、全内部１９マー、全内部１８マー、全内部１７マー、全内部１６マー、全内部１５マー、全内部１４マー、全内部１３マー、全内部１２マー、全内部１１マー、全内部１０マー、および全内部９マーもまた、本発明の実施において有用であることが意図される。
【００５０】
例示目的のために、配列番号１０の全ての代表的なｎマーは、以下の内部連続９マー配列〜内部連続３４マー配列を含む。
【００５１】
【表２】
2004502459.tif 000004
2004502459.tif 000005
2004502459.tif 000006
類似の様式において、例示目的および簡潔のために、配列番号１の代表的なｎマーは、以下の内部連続配列を含む。
【００５２】
【表３】
2004502459.tif 000007
本開示の利点が提供されれば、当業者もそれからは、開示される各配列由来の任意および全ての可能なｎマーを類似の様式で調製し、そしてこれらの配列から、受容可能なインビトロアッセイおよび／またはインビボアッセイ（例えば、本明細書の以下に記載されるもの）を使用することによって、治療的な使用のためのβ１−ＡＲ特異的ｍＲＮＡ発現を特異的に阻害する特定のオリゴヌクレオチド配列を同定および選択する。
【００５３】
同様に、ヒトβ１−ＡＲ遺伝子の配列に基づいて、本発明者らは、β１−ＡＲポリペプチドをコードするｍＲＮＡに特異的に結合し、かつ、このようなｍＲＮＡを発現する細胞中でこのポリペプチドレベルを低減する、約１５〜約２５ヌクレオチド長の非常に好ましい配列を同定した。このサイズ範囲の例示的な配列は、以下に同定される。
【００５４】
【表４】
2004502459.tif 000008
2004502459.tif 000009
2004502459.tif 000010
2004502459.tif 000011
（４．０　例示的実施形態の概要）
（４．１アンチセンスオリゴヌクレオチド）
哺乳動物のβ１−ＡＲ特異的ｍＲＮＡの発現を阻害することについて開示される化合物および組成物の有用性が記載され、そして本明細書中に記載される方法によってインビトロおよびインビボの両方で証明されている。
【００５５】
本発明の好ましい、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの化合物は、哺乳動物のβ１−ＡＲポリペプチドをコードするｍＲＮＡに特異的に結合し、それによって、このｍＲＮＡの翻訳および相伴うコードされたポリペプチドの発現を阻害する。大いに好ましいアンチセンス化合物およびアンチセンス組成物は、ヒトβ１−ＡＲポリペプチドをコードするｍＲＮＡに特異的に結合するアンチセンス化合物およびアンチセンス組成物である。
【００５６】
ヒトβ１−ＡＲポリペプチドをコードするｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋＴＭ登録番号ＮＭ０００６８４に開示され、そして配列番号１８７として本明細書中に記載される。イヌβ１−ＡＲポリペプチドをコードするｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋＴＭ登録番号Ｕ７３２０７に開示され、そして配列番号１８８として本明細書中に記載される。ヒツジβ１−ＡＲポリペプチドをコードするｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋＴＭ登録番号Ｓ７８４９９およびＡＦ０７２４３３に開示され、そして配列番号１８９として本明細書中に記載される。同様に、ブタβ１−ＡＲをコードするｍＲＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋＴＭ登録番号ＡＦ０４２４５４に開示され、そして配列番号１９０として本明細書中に記載される。ラット（Ｒａｔｔｕｓ）β１−ＡＲをコードするｍＲＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋＴＭ登録番号Ｄ００６３４に開示され、そして配列番号１９１として本明細書中に記載される。アカゲザルβ１−ＡＲをコードするｍＲＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋＴＭ登録番号Ｘ７５５４０に開示され、そして配列番号１９２として本明細書中に記載される。マウス（Ｍｕｒｉｎｅ）（Ｍｕｓ）マウスβ１−ＡＲをコードするｍＲＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋＴＭ登録番号Ｌ１００８４に開示され、そして配列番号１９３として本明細書中に記載される。非常に相同であるβ１−ＡＲコードＤＮＡはまた、非哺乳動物種（登録番号Ｙ０９２１３としてＧｅｎＢａｎｋＴＭに開示されるカエル（配列番号１９４）のように）において同定されており、さらに１つの種に由来するβ１−ＡＲコードＤＮＡに対して相補的に調製されるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、別の種におけるβ１−ＡＲ特異的ｍＲＮＡの発現を低減させることにおいて有用であり得るという事実をさらに証明する。実際、本発明者は、β１−ＡＲ　ｍＲＮＡの近位の部分の高度に保存された領域に対して相補的に調製されるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、β１−アドレナリン受容体ポリペプチドを産生する種々の宿主細胞および宿主動物の、ｍＲＮＡに特異的に結合し、そしてこのｍＲＮＡの翻訳を低減させ得ることを企図する。
【００５７】
本明細書および請求項において、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、およびＵのそれぞれの文字は、ヌクレオチドを示し、ここでこのヌクレオシドは、アデノシン（Ａｄｅ）、グアノシン（Ｇｕａ）、シチジン（Ｃｙｔ）、チミジン（Ｔｈｙ）、ウリジン（Ｕｒａ）である。本明細書中および請求項で使用されるように、β１−アドレナリン受容体特異的な、ＰＮＡ、ＤＮＡまたはｍＲＮＡのセンス鎖に対するアンチセンスである化合物は、このセンス鎖に対するヌクレオシド配列相補性を有する化合物である。表２は、この４つの可能性のあるセンス鎖ヌクレオシドを示し、そしてアンチセンス化合物におけるこれらの相補体を示す。
【００５８】
【表５】
2004502459.tif 000012
本発明は、Ｂ１ＲをコードするＤＮＡセンス鎖またはｍＲＮＡセンス鎖に結合し得るオリゴヌクレオチド化合物を広範に含むことが、当業者に理解される。ｍＲＮＡはタンパク質をコードするリボヌクレオチド配列を含むだけでなく、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、５’キャップ領域およびイントロン／エキソン接合領域を含む領域もまた含むこともまた理解される。
【００５９】
本発明は、厳密にはアンチセンスではない化合物を含み；本発明の化合物はまた、センス鎖中の塩基に対して相補的ではないいくつかの塩基を有し得るオリゴヌクレオチドを含み、ただし、このような化合物は、発現を阻害するのに十分な、β１アドレノセプターＤＮＡまたはｍＲＮＡに対する結合親和性を有する。さらに、塩基修飾または本発明のオリゴヌクレオチド中のユニバーサル塩基（例えば、イノシン）の使用が、本発明の範囲内で意図される。
【００６０】
アンチセンス化合物は、ホスホロチオエート（Ｘ＝Ｓ）もしくはメチルホスホネート（Ｘ＝ＣＨ３）、または他のＣ１−４アルキルホスホネートにより置換されたヌクレオチド中のホスフェエートのいくつかまたは全てを有し得る。このアンチセンス化合物は、必要に応じて、アンチセンス分子の遊離ヒドロキシ基の一方または両方をＣ１−４アルコキシ基（Ｒ＝Ｃ１−４アルコキシ）で置換することによってネイティブのＤＮＡからさらに分化され得る。本明細書中で使用する場合、Ｃ１−４アルキルとは、１〜４個の炭素原子を有する分岐鎖または非分岐鎖の炭化水素を意味する。
【００６１】
開示されるアンチセンス化合物はまた、置換アクリジン誘導体によって、３’末端および／または５’末端で置換され得る。本明細書中で使用する場合「置換アクリジン」とは、ＤＮＡのようなヌクレオチド鎖と相互作用し得る任意のアクリジン誘導体を意味する。好ましい置換アクリジンは、２−メトキシ−６−クロロ−９−ペンチルアミノアクリジン、Ｎ−（６−クロロ−２−メトキシアクリジニル）−Ｏ−メトキシジイソプロピルアミノホスフィニル−３−アミノプロパノール、およびＮ−（６−クロロ−２−メトキシアクリジニル）−Ｏ−メトキシジイソプロピルアミノホスフィニル−５−アミノペンタノールである。他の適切なアクリジン誘導体は、当業者に容易に明らかである。さらに、本明細書中で使用する場合、「Ｐ（Ｏ）（Ｏ）置換アクリジン」とは、置換アクリジンに共有結合したホスフェートを意味する。
【００６２】
本明細書中で使用する場合、用語「ヌクレオチド」は、ホスフェート部分が、ホスホロチオエートまたはアルキルホスホネートで置換されたヌクレオチドを含み、そしてこのヌクレオチドは、置換アクリジンによって置換され得る。
【００６３】
一実施形態において、本発明のアンチセンス化合物は、アンチセンスＯＮの寿命を延長するためのホスホジエステル骨格の改変だけ、ネイティブのＤＮＡとは異なる。例えば、ホスフェートは、ホスホロチオエートによって置換され得る。この分子の末端はまた、ＤＮＡのヌクレオチド鎖に介在するアクリジン誘導体によって必要に応じて置換され得る。Ｉｎｔｌ．Ｐａｔ．Ａｐｐｌ．Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．ＷＯ　９８／１３５２６および米国特許第５，８４９，９０２号（この各々は、その全体が本明細書中で詳細に援用される）は、三成分キメラアンチセンス組成物の調製方法を記載し、そして改善されたアンチセンス特徴および／または半減期を有する置換オリゴヌクレオチドの合成のための現在利用可能な方法論の多くを考察する。
【００６４】
反応スキームは、ホスホルアミダイトを１Ｈテトラゾール触媒カップリングしてホスフェート誘導体を得る工程を含み、このホスフェート中間体は、続いて、２，６−ルチジン中で硫黄と反応して、ホスフェート化合物を生成する。このホスフェート化合物をチオフェノキシドで処理することによって（１：２：２　チオフェノール／トリエチルアミン／テトラヒドロフラン、室温、１時間）、オリゴヌクレオチド化合物を調製する。この反応順序を、所望の長さのオリゴヌクレオチド化合物が調製されるまで繰り返す。室温で１時間、水酸化アンモニウムで処理することによって、この化合物を支持体から切断し、次いで、５０℃で一晩加熱することによってさらに脱保護して、好ましいアンチセンス化合物を得る。
【００６５】
薬学的調製物を、薬剤師の従来の技術に従って作製し、この技術は、錠剤の形成について、必要な場合、混合工程、顆粒化工程および圧縮工程を包含するか、または所望の経口製品もしくは非経口製品を得るために、必要に応じて、成分を混合する工程、充填する工程および溶解する工程を包含する。
【００６６】
本発明の化合物の用量（上記のような薬学的投薬単位）は、１ｎｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇの活性化合物、好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ未満の範囲から選択される効果的な非毒性量である。この選択された用量は、一日１〜６回、またはそれ以上の回数、経口で、経直腸で、注射により、または注入により連続的に、β１−ＡＲ特異的ｍＲＮＡ発現の阻害の必要なヒト患者に投与される。経口処方物には、一般に、胃酸分解の影響に打ち勝つためにいくらか大きな投薬量が必要である。静脈内投与または動脈内投与は、一般に、小さい用量を必要とする。なぜなら、薬物は、体循環に直接入るからである。鼻腔スプレーの投薬量は、代表的に、約１０ｍｇ〜約５０ｍｇ（合計）、または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。従って、用量は、実際の投与経路に依存する。
【００６７】
所定の遺伝子配列に対して特異的なアンチセンス組成物の選択は、選択される標的配列（すなわち、これらの例示的な例において、ラットおよびヒトの配列）の分析に基づき、そして二次構造、Ｔｍ、結合エネルギー、相対安定性、およびアンチセンス組成物の決定は、二量体、ヘアピン、または宿主細胞中の標的ｍＲＮＡに対する特異的な結合を減少または防止する他の二次構造を形成するそれらの相対不能性に基づいて選択された。これらの分析の結果は、様々な哺乳動物供給源および非哺乳動物供給源において同定された代表的なオリゴヌクレオチドおよび選択された標的配列について、表１に示される。
【００６８】
ｍＲＮＡの非常に好ましい標的領域は、ＡＵＧ翻訳開始コドンにおけるかまたはその付近の領域、およびｍＲＮＡの５’領域に対して実質的に相補的である配列である。これらの二次構造の分析および標的部位の選択の考慮を、ＯＬＩＧＯプライマー分析ソフトウエアのｖ．４（Ｒｙｃｈｌｉｋ，１９９７）およびＢＬＡＳＴＮ　２．０．５アルゴリズムソフトウエア（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）を使用して行った。
【００６９】
上記のオリゴヌクレオチドの配列は、宿主細胞における哺乳動物β１−ＡＲポリペプチド活性を阻害するために非常に好ましい配列である。同じプロセス（ＯＬＩＧＯおよびＢＬＡＳＴを使用する）によって誘導されるいずれかの末端におけるさらなるヌクレオチドはまた、本発明によって意図される。好ましいオリゴヌクレオチドの有効長は、好ましくは、少なくとも９〜約３５ヌクレオチドほどである。本発明者らは、この範囲の全てのオリゴヌクレオチド組成物（すなわち、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５ほどの塩基長のオリゴヌクレオチド）が、本発明のオリゴヌクレオチドベースの方法の実施に非常に好ましいことを意図する。例示的な実施形態において本発明のアンチセンス化合物は、アンチセンスＯＤＮの寿命を延長するためのホスホジエステル骨格の改変だけ、ネイティブのＤＮＡと異なり、ここで、ホスフェート置換基は、ホスホロチオエートによって置換される。同様に、オリゴヌクレオチドの一端または両端は、核酸の鎖内の隣接する塩基対間に介在する１つ以上のアクリジン誘導体によって置換され得る。
【００７０】
（４．２　高血圧の危険性のある患者をスクリーニングするための方法）
哺乳動物β１−ＡＲポリペプチドは、動物の高血圧において重要な役割を果たすため、様々な条件下で、さらにはこのような動物における高血圧状態を回復するように設計された処置レジメンの経過の間でさえ、この動物のβ１−ＡＲポリペプチドのレベルを測定および定量することがしばしば望ましい。同様に、多くの場合において、哺乳動物β１−ＡＲをコードする遺伝子の多型をスクリーニングするための方法を使用して、高血圧の「危険のある」患者を同定し、インビトロおよびインビボの両方で遺伝子の対立遺伝子を同定することが望ましい。
【００７１】
このように、本明細書中で哺乳動物β１−ＡＲをコードする遺伝子を同定するためのプローブとして記載される１つ以上のヌクレオチド組成物の使用、およびこのようなヌクレオチドセグメントの存在を高血圧の危険性と相関付けるための方法が、特に好ましい。
【００７２】
（４．３　低分子およびペプチドインヒビターの同時投与）
本明細書中に記載されるように、特定の実施形態において、１つ以上のアンチセンス組成物を、１つ以上の医薬と同時投与することが所望され得る。例えば、１つ以上の市販の抗高血圧剤は、特定の治療レジメンで同時投与され得る。このような医薬としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アミロリド、アムロジピン、ベナゼプリル、ベプリジル、カンデサルタン（ｃａｎｄｅｓａｒｔａｎ）、カプトプリル、クロロチアジド、クロロタリドン、ジクロロフェナミド、ジルチアゼム、エナラプリル、エタクリン酸、フェロジピン、ホシノプリル、フロセミド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、イルベサルタン（ｉｒｂｅｓａｒｔａｎ）、イスラジピン、リシノプリル、ロサルタン、メチルクロチアジド（ｍｅｔｈｙｌｃｌｏｔｈｉａｚｉｄｅ）、メトラゾン、ミソルジピン（ｍｉｓｏｌｄｉｐｉｎｅ）、モエキシプリル、ニカルジピン、ニフェジピン（ｎｉｆｅｄｅｐｉｎｅ）、ニモジピン、ポリチアジド、キナプリル、ラミプリル、スピロノラクトン、トルセミド（ｔｏｒｓｅｍｉｄｅ）、トランドラプリル、トリアムテレン、バルサルタン（ｖａｌｓａｒｔａｎ）、およびベラパミル。
【００７３】
さらなる低分子量ＡＣＥ阻害化合物およびオリゴペプチド（例えば、米国特許第５，５５２，３９７号；米国特許第５，４４９，６６１号；米国特許第５，３４８，９７８号；米国特許第５，２３８，９２１号；米国特許第５，０９８，８８７号および米国特許第４，２１６，２０９号（各々は、その全体が本明細書中で詳細に援用される）に記載される化合物およびオリゴペプチド）。特定の実施形態において、このような低分子または他の抗高血圧剤はまた、１つ以上の開示されるアンチセンス構築物と共に、動物に同時投与され得る。
【００７４】
このような抗高血圧剤または低分子量インヒビターの投与は、当業者に周知であり、そして特に、高血圧に罹患している動物または患者を日常的に診断および／または処置する医師に周知である。
【００７５】
（４．４　薬学的組成物）
従って、特定の実施形態において、本発明はまた、細胞または動物に、単独でかまたは１つ以上の他の様式の抗高血圧治療と組み合わせてのいずれかで投与するための、薬学的に受容可能な溶液中の本明細書中に開示される１つ以上のアンチセンスポリヌクレオチド組成物の処方に関する。
【００７６】
所望ならば、本明細書中に開示される核酸セグメント、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＰＮＡのアンチセンス組成物は、同様に、他の薬剤（例えば、タンパク質もしくはポリペプチド、または様々な薬学的に活性な薬剤）と組み合わせて投与され得る。組成物が少なくとも１つのβ１−ＡＲ特異的ｍＲＮＡ阻害アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む限り、さらなる薬剤が標的細胞または宿主組織と接触した際に有意な悪影響を引き起こさないならば、含まれ得る他の成分に実質的な制限はない。従って、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＰＮＡ由来のアンチセンス組成物は、特定の場合に必要に応じて、様々な他の薬剤と共に送達され得る。このようなＲＮＡ、ＤＮＡまたはＰＮＡアンチセンス組成物は、宿主細胞または他の生物学的供給源から精製され得るか、あるいは本明細書中に記載されるようにして化学的に合成され得る。同様に、このような組成物は、置換されたかまたは誘導体化されたＲＮＡ、ＤＮＡまたはＰＮＡの組成物を含み得る。ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＰＮＡの分子の塩基配列が、β１−ＡＲ特異的ｍＲＮＡに特異的に結合し、生物学的に活性なβ１−ＡＲポリペプチドへのこのｍＲＮＡの翻訳の程度を減少または阻害する、本明細書中に記載される１つ以上の連続した塩基配列に対応する限り、このような組成物は改変ペプチドまたは核酸置換誘導体を含み得る。
【００７７】
薬学的に受容可能な賦形剤およびキャリア溶液の処方は、本明細書中に記載される特定の組成物を、様々な処置レジメン（例えば、経口、非経口、静脈内、鼻腔内および筋肉内の投与および処方）において使用するために適切な投薬および処置レジメンの開発と同様に、当業者に周知である。
【００７８】
（４．４．１　注射送達）
あるいは、本明細書中に開示される薬学的組成物は、非経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、またはさらに、米国特許第５，５４３，１５８号、米国特許第５，６４１，５１５号および米国特許第５，３９９，３６３号（この各々は、その全体が本明細書中で参考として詳細に援用される）に記載されるように、腹腔内投与され得る。遊離塩基または薬学的に受容可能な塩としての活性化合物の溶液は、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合された水中で調製され得る。分散物はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物、ならびに油中で調製され得る。貯蔵および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐために、保存剤を含む。
【００７９】
注射用の用途に適切な薬学的形態としては、滅菌水溶液または分散物、および滅菌注射用溶液または分散物の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる（米国特許第５，４６６，４６８号（本明細書中でその全体が参考として詳細に援用される）。全ての場合において、この形態は、無菌であり、かつ容易に注射器に入れられる程度まで流動性でなければならない。これは、製造および貯蔵の条件下で安定であり、かつ微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用から保護されなければ成らない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および／または植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）を使用することによって、分散物の場合、必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によってもたらされ得る。多くの場合において、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含めることが好ましい。注射用組成物の長期の吸収は、この組成物に吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を使用することによって、もたらされ得る。
【００８０】
例えば、水溶液の非経口投与について、この溶液は、必要ならば、適切に緩衝化されるべきであり、そしてこの液体希釈物は、最初に、十分な生理食塩水またはグルコースで等張性にされる。これらの特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与に特に適切である。この点について、用いられ得る滅菌水性媒体は、本開示の観点から、当業者に公知である。例えば、１投薬量は、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解され、１０００ｍｌの皮下注射用流体に添加されるか、または提案された注射部位に注射されるかのいずれかであり得る（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版、１０３５−１０３８頁および１５７０−１５８０頁を参照のこと）。投薬量の幾分かの変化が、処置されている被験体の状態に依存して、必然的に起こる。投与を担う人は、いずれにしても、個々の被験体に適切な用量を決定する。さらに、人の投与について、調製物は、ＦＤＡ　ｏｆｆｉｃｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ　ｓｔａｎｄａｒｄｓにより要求されるような滅菌性、発熱性、ならびに一般的安定性および純度の基準を満たさなければならない。
【００８１】
滅菌注射用溶液は、必要量の活性化合物を、上に列挙したいくつかの他の成分を含む適切な溶媒に組み込み、必要に応じて、続いて滅菌濾過することによって調製される。一般に、分散物は、様々な滅菌された活性成分を滅菌ビヒクル（これは、基本分散媒体および上記の必要な他の成分を含む）に組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥技術および凍結乾燥技術であり、これは、活性成分の粉末およびその以前に滅菌濾過された溶液由来の任意のさらなる所望の成分を生じる。
【００８２】
本明細書に開示される組成物は、中性形態または塩形態で処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）が挙げられ、この酸付加塩は、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸で形成される。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化鉄）、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から誘導され得る。処方の際、溶液は、投薬処方物に適合性の様式で、かつ治療的に有効であるような量で投与される。この処方物は、様々な投薬形態（例えば、注射用溶液、薬物放出カプセルなど）で容易に投与される。
【００８３】
本明細書中で使用される場合、「キャリア」は、任意および全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング剤、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝液、キャリア溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性成分と不適合性である場合を除いて、治療組成物におけるその使用が意図される。補助的な活性成分もまた、組成物中に組み込まれ得る。
【００８４】
成句「薬学的に受容可能な」は、ヒトに投与される場合、アレルギー反応または同様の有害な反応を生成しない分子実体および組成物をいう。活性成分としてタンパク質を含む水性組成物の調製は、当該分野で周知である。代表的に、このような組成物は、注射剤（液体溶液または懸濁液のいずれかとして）として調製される；注射の前の液体中の溶液に適した固体形態または懸濁液に適した固体形態もまた調製され得る。調製物はまた、乳化され得る。
【００８５】
（４．４．２　リポソーム、ナノカプセル、および微小カプセル媒介送達）
特定の実施形態において、本発明者らは、適切な宿主細胞への本発明のアンチセンス組成物の導入のための、リポソーム、ナノカプセル、微粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、微小球（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）、脂質粒子、小胞などの使用を意図する。詳細には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア（ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ）、またはナノ粒子などのいずれかの中にカプセル化される送達のために処方され得る。
【００８６】
このような処方物は、本明細書中で開示される核酸の薬学的に受容可能な処方物の導入に好ましくあり得る。リポソームの処方および使用は、当業者に一般に公知である（例えば、Ｃｏｕｖｒｅｕｒら、１９７７；Ｃｏｕｖｒｅｕｒ，１９８８；Ｌａｓｉｃ，１９９８を参照のこと；これらは、細胞内細菌感染および細胞内細菌疾患の標的化抗生物質治療におけるリポソームおよびナノカプセルの使用を記載する）。最近、改善された血清安定性および循環半減期を有するリポソームが開発された（ＧａｂｉｚｏｎおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，１９８８；ＡｌｌｅｎおよびＣｈｏｕｎ，１９８７；米国特許第５，７４１，５１６号（その全体が参考として本明細書中に詳細に援用される））。さらに、潜在的な薬物キャリアとしてのリポソーム調製物およびリポソーム様調製物の種々の方法が評論されている（Ｔａｋａｋｕｒａ，１９９８；Ｃｈａｎｄｒａｎら、１９９７；Ｍａｒｇａｌｉｔ，１９９５；米国特許第５，５６７，４３４号；米国特許第５，５５２，１５７号；米国特許第５，５６５，２１３号；米国特許５，７３８，８６８号および米国特許５，７９５，５８７号（各々その全体が参考として本明細書中に詳細に援用される））。
【００８７】
リポソームは、他の手順によるトランスフェクションに通常耐性である多数の細胞型（Ｔ細胞懸濁液、初代肝細胞培養物およびＰＣ１２細胞を含む）と共に、首尾良く使用されている（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら、１９９０；Ｍｕｌｌｅｒら、１９９０）。さらに、リポソームは、ウイルスベースの送達系に典型的なＤＮＡ長の制限がない。リポソームは、遺伝子、薬物（ＨｅａｔｈおよびＭａｒｔｉｎ，１９８６；Ｈｅａｔｈら、１９８６；Ｂａｌａｚｓｏｖｉｔｓら、１９８９；ＦｒｅｓｔａおよびＰｕｇｌｉｓｉ，１９９６）、放射線療法剤（Ｐｉｋｕｌら、１９８７）、酵素（Ｉｍａｉｚｕｍｉら、１９９０ａ；Ｉｍａｉｚｕｍｉら、１９９０ｂ）、ウイルス（ＦａｌｌｅｒおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８４）、転写因子およびアロステリックエフェクター（ＮｉｃｏｌａｕおよびＧｅｒｓｏｎｄｅ，１９７９）を種々の培養細胞株および動物に導入するために効果的に使用されている。さらに、リポソーム媒介薬物送達の効力を調べるいくつかの首尾良い臨床試験が完了している（Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎら、１９８５ａ；１９８５ｂ；Ｃｏｕｎｅ，１９８８；Ｓｃｕｌｉｅｒら、１９８８）。さらにいくつかの研究により、リポソームの使用は、全身的送達後の自己免疫応答、毒性または性腺局在に関連しないことが示唆される（ＭｏｒｉおよびＦｕｋａｔｓｕ，１９９２）。
【００８８】
リポソームは、水性媒体中で分散され、そして自発的に多重膜の同心性の二重層小胞（多重膜小胞（ＭＬＶ）とも称される）を形成するリン脂質から形成される。ＭＬＶは、一般に、２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、２００〜５００Åの範囲の直径を有する小さい単層小胞（ＳＵＶ）の形成を生じ、これは、コア中に水溶液を含む。
【００８９】
リポソームは、細胞膜に対して類似性を保有し、そしてペプチド組成物のためのキャリアとして本発明と関連して使用することが意図されている。水溶性物質および脂質可溶性物質の両方が、捕捉され得る（すなわち、それぞれ水性空間中および二重層自体中に捕捉され得る）ので、これらは、広範に適している。薬物保有リポソームは、リポソーム処方物を選択的に改変することによって、活性剤の部位特異的送達のためにさえも使用され得ることがあり得る。
【００９０】
Ｃｏｕｖｒｅｕｒら（１９７７；１９８８）の教示に加えて、以下の情報が、リポソーム処方物を作製する際に利用され得る。リン脂質は、水中に分散される場合、脂質対水のモル比に依存して、リポソーム以外の種々の構造を形成し得る。低比率において、リポソームは、好ましい構造である。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度および二価の陽イオンの存在に依存する。リポソームは、イオン性物質および極性物質に対して低い透過性を示し得るが、上昇した温度において、これらの透過性を顕著に変更する相遷移を起こす。この相遷移は、密接に充填された整った構造（ゲル状態として公知である）から緩やかに充填されたあまり整っていない構造（流体状態として公知である）への変化を含む。これは、特徴的な相転移温度において生じ、そしてイオン、糖、および薬物に対する透過性の増加を生じる。
【００９１】
温度に加えて、タンパク質への曝露もまた、リポソームの透過性を変更し得る。チトクロムｃのような特定の可溶性タンパク質は、二重層に結合し、これを変形させ、そしてこれを透過し、それにより、透過性における変化を引き起こす。コレステロールは、明らかにリン脂質をより密接に充填することによって、このタンパク質の透過を阻害する。抗生物質およびインヒビターの送達のための最も有用なリポソーム処方物は、コレステロールを含むことが意図される。
【００９２】
溶質を捕捉する能力は、異なる型のリポソーム間で変化する。例えば、ＭＬＶは、溶質を捕捉する際に中程度に効率的であるが、ＳＵＶは、極めて非効率的である。ＳＵＶは、サイズ分布において均質性および再現性の利点を提供するが、サイズと捕捉効率との間の折衷が、大きい単層小胞（ＬＵＶ）によって提供される。これらは、エーテルエバポレーションによって調製され、そして溶質捕捉においてＭＬＶよりも３〜４倍効率的である。
【００９３】
あるいは、本発明は、本発明のポリヌクレオチド組成物の薬学的に受容可能なナノカプセル処方物を提供する。ナノカプセルは、一般に、安定かつ再現可能な様式で化合物を捕捉し得る（Ｈｅｎｒｙ−Ｍｉｃｈｅｌｌａｎｄら、１９８７；Ｑｕｉｎｔａｎａｒ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏら、１９９８；Ｄｏｕｇｌａｓら、１９８７）。細胞内ポリマーの過充填に起因する副作用を避けるために、このような超微細粒子（約０．１μｍのサイズ）は、インビボで分解され得るポリマーを使用して設計されるべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子は、本発明における使用のために意図され、そしてこのような粒子は、記載されるように容易に作製され得る（Ｃｏｕｖｒｅｕｒら、１９８０；１９８８；ｚｕｒ　Ｍｕｈｌｅｎら、１９９８；Ｚａｍｂａｕｘら、１９９８；Ｐｉｎｔｏ−Ａｌｐｈａｎｄｒｙら、１９９５および米国特許第５，１４５，６８４号（その全体が参考として本明細書中に詳細に援用される））。詳細には、動物そして特にヒトへの投与のための開示された組成物を処方する際に有用である、ナノ粒子またはナノスフェアのいずれかを使用する標的細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチド送達の方法（Ｓｃｈｗａｂら、１９９４；Ｔｒｕｏｎｇ−Ｌｅら、１９９８）もまた、特に意図される。
【００９４】
（４．５　治療キットおよび診断キット）
本発明はまた、１つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤、キャリア、希釈剤、アジュバント、および／または他の成分（例えば、さらなる抗高血圧性の薬剤、オリゴヌクレオチド、ペプチド、抗原、あるいは特定のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド送達処方物の処方、および動物への投与のための抗高血圧薬剤または心臓治療剤の調製において使用され得るような他の治療化合物）と共に１つ以上のアンチセンス化合物を包含する。
【００９５】
このように、本明細書中に開示される薬学的組成物の投与のための好ましい動物としては、哺乳動物および特にヒトが挙げられる。他の好ましい動物としては、霊長類、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、オオカミ、イヌ、およびネコ、ならびに一般にペット、家畜、または商業的に関連した種と考えられる任意の他の哺乳動物が挙げられる。組成物は、単独でかまたは１つ以上のさらなる活性成分と組み合わせて、部分的または有意に精製されたアンチセンス組成物を含み得、この活性成分は、天然供給源または組換え供給源から獲得され得るか、またはこれは、天然にかもしくは化学的に合成して得られ得るか、あるいは、このようなさらなる活性成分をコードする核酸セグメントを発現する組換え宿主細胞からインビトロで生成されるかのいずれかである。
【００９６】
本明細書中に開示される少なくとも１つのβ１−ＡＲ　ｍＲＮＡ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、ならびに治療剤として組成物を使用するための説明書を備える治療キットがまた調製され得る。このようなキットのための容器手段は、代表的に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ビン、シリンジ、または他の容器手段を含み得、これにアンチセンス組成物が配置され得、そして好ましくは、適切にアリコートされ得る。第２の抗高血圧剤がまた提供される場合、キットはまた、第２の組成物が配置され得る第２の別の容器手段を含み得る。あるいは、複数の抗高血圧組成物は、単一の薬学的組成物中で調製され得、そして単一の容器手段（例えば、バイアル、フラスコ、シリンジ、ビン、または他の適切な単一容器手段）でパッケージングされ得る。本発明のキットはまた、代表的に、市販のための密封したバイアルを含むための手段（例えば、所望のバイアルが保持される注射または中空成形（ｂｌｏｗ−ｍｏｌｄｅｄ）プラスチック容器）を備える。
【００９７】
あるいは、診断キットの調製のための、そして生物学的サンプル中のβ１−ＡＲポリペプチドコード核酸の同定におけるこれらの化合物の使用に関連する方法のための、本明細書中に開示される少なくとも１つのβ１−ＡＲ　ｍＲＮＡ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびハイブリダイゼーションアッセイにおけるβ１−ＡＲ特異的核酸についてのプローブとして組成物を使用するための説明書を備える、このようなキットが調製され得る。このようなキットのための容器手段は、代表的に、少なくとも１つのバイアル、試験管、マイクロ遠心分離チューブ、または他の容器手段を備え、この中にアンチセンス組成物が配置され得、そして適切にアリコートされ得る。放射性標識または蛍光生成（ｆｌｕｏｒｉｇｅｎｉｃ）標識または他のこのような検出手段が、キット内に含まれる場合、標識剤は、オリゴヌクレオチド組成物として同じ容器中に提供され得るか、あるいはこの第２の組成物が配置され得そして適切にアリコートされ得る第２の別の容器手段中に配置され得るかのいずれかである。あるいは、オリゴヌクレオチド組成物および標識は、単一の容器手段で調製され得、そしてほとんどの場合において、キットまた、代表的に、市販および／または簡便な包装および配達のために密封したバイアルを備えるための手段を含む。
【００９８】
（４．６　ペプチド核酸組成物）
特定の実施形態において、本発明者は、本発明の方法の実施におけるペプチド核酸（ＰＮＡ）の使用を意図する。ＰＮＡは、核酸塩基が偽ペプチド骨格に結合したＤＮＡ模倣物である（ＧｏｏｄおよびＮｉｅｌｓｅｎ，１９９７）。ＰＮＡは、伝統的にＲＮＡまたはＤＮＡを使用してきた多数の方法において利用され得る。しばしば、ＰＮＡ配列は、対応するＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列よりも、技術により良く機能し、そしてＲＮＡまたはＤＮＡに固有ではない有用性を有する。作製方法、特徴、使用方法を含むＲＮＡの優れた総説は、Ｃｏｒｅｙ（１９９７）によって提供され、そして参考として本明細書中に援用される。このように、特定の実施形態において、β１−アドレノセプター特異的ｍＲＮＡ配列の１つ以上の部分に相補的であるＲＮＡ配列を調製し得、そしてこのようなＲＮＡ組成物は、β１−ＡＲ特異的ｍＲＮＡの翻訳を調節、変更、減少、または低減させるために使用され得、それにより、このようなＰＮＡ組成物が投与された宿主細胞中のβ１−ＡＲポリペプチドのレベルを変更する。
【００９９】
ＰＮＡは、ＤＮＡの正常なホスホジエステル骨格を置換する２−アミノエチルグリシン結合を有する（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９３；Ｈａｎｖｅｙら、１９９２；ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ、１９９６；Ｎｉｅｌｓｅｎ，１９９５）。この化学は、３つの重要な結果を有する：第１に、ＤＮＡまたはホスホロチオネートオリゴヌクレオチドと対照的に、ＰＮＡは中性分子である；第２に、ＰＮＡはアキラルであり、これは、立体選択的な合成を開発する必要性を回避する；そして、第３に、ＲＮＡ合成は、固相ペプチド合成のための標準的なＢｏｃ（Ｄｕｅｈｏｌｍら、１９９２）プロトコルまたはＦｍｏｃ（Ｂｏｎｈａｍら、１９９５）プロトコルを使用するが、改変されたＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法を含む、他の方法が使用されている（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、１９９５）。
【０１００】
ＰＮＡモノマーまたは既製のオリゴマーは、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）から市販されている。ＢｏｃプロトコルまたはＦｍｏｃプロトコルのいずれかによるＰＮＡ合成は、手動プロトコルまたは自動化プロトコルを使用して容易である（Ｎｏｒｔｏｎら、１９９５）。
【０１０１】
（４．７　核酸送達およびＤＮＡトランスフェクションの方法）
特定の実施形態において、本明細書中に開示された、１つ以上のＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡおよび／または置換されたポリヌクレオチド組成物を使用して、適切な宿主細胞をトランスフェクトすることが意図される。ＰＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡの細胞への導入のための技術は、当業者に周知である。
【０１０２】
培養哺乳動物細胞への発現構築物の移入のためのいくつかの非ウイルス方法がまた、本発明によって意図される。これらとしては、リン酸カルシウム沈澱（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ　Ｄｅｒ　Ｅｂ，１９７３；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ，１９８７；Ｒｉｐｐｅら、１９９０）、ＤＥＡＥデキストラン（Ｇｏｐａｌ，１９８５）、エレクトロポレーション（ＷｏｎｇおよびＮｅｕｍａｎｎ，１９８２；Ｆｒｏｍｍら、１９８５；Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６；Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４；Ｓｕｚｕｋｉら、１９９８；Ｖａｎｂｅｖｅｒら、１９９８）、直接的微量注入（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８０；ＨａｒｌａｎｄおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５）、ＤＮＡ充填リポソーム（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ，１９８２；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９；Ｔａｋａｋｕｒａ，１９９８）およびリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）−ＤＮＡ複合体、細胞超音波処理（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７）、高速微量注入を使用する遺伝子ボンバードメント（Ｙａｎｇら、１９９０；Ｋｌｅｉｎら、１９９２）、およびレセプター媒介トランスフェクション（Ｃｕｒｉｅｌら、１９９１；Ｗａｇｎｅｒら、１９９２；ＷｕおよびＷｕ，１９８７；ＷｕおよびＷｕ，１９８８）が挙げられる。これらの技術のいくつかは、インビボまたはエキソビボ使用のための首尾良く適合され得る。
【０１０３】
さらに、レトロウイルス、バキュロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルスなどを含む、ウイルスベクターの使用（Ｌｕら、１９９３；ＥｇｌｉｔｉｓおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，１９８８；Ｅｇｌｉｔｉｓら、１９８８）が当該分野で周知であり、そして本明細書中に詳細に記載される。
【０１０４】
（４．８　発現ベクター）
本発明は、本発明の少なくとも１つのβ１−ＡＲ特異的ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを企図する。従って、１つの実施形態において、発現ベクターは、アンチセンスの向きで配向された特定のＤＮＡ分子を用いて構築される。別の実施形態において、プロモーターは、ｔＲＮＡ、リボザイムＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡのような機能的ＲＮＡをコードする配列領域に作動可能に連結される。
【０１０５】
本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に連結した（された）（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ　ｌｉｎｋｅｄ）」および「作動可能に連結した（された）（ｏｐｅｒａｂｌｙ　ｌｉｎｋｅｄ）」は、機能的なＤＮＡまたはＲＮＡの転写がプロモーターによって制御および調節されるような様式で、そのプロモーターが機能的なＤＮＡまたはＲＮＡに結合されることを意味する。機能的なポリヌクレオチドにプロモーターを作動可能に連結させるための手段は、当該分野で周知である。
【０１０６】
どの発現ベクターにポリペプチドコード領域が作動可能に連結しているか、およびどのプロモーターにポリペプチド領域が作動可能に連結しているかの選択は、所望される機能的特性（例えば、タンパク質発現の位置および時期）ならびに形質転換される宿主細胞に直接依存する。これらは、組換えＤＮＡ分子を構築する分野において固有の周知の制限である。しかし、本発明を実施する際に有用なベクターは、このベクターが作動可能に連結した機能的なＲＮＡの発現を指向し得る。
【０１０７】
ＲＮＡポリメラーゼは、ポリアデニル化が生じる部位を介して、コードＤＮＡ配列を転写する。代表的には、ポリアデニル化部位の数百塩基対下流に位置するＤＮＡ配列が転写を終結するために機能する。これらのＤＮＡ配列は、転写終止領域として本明細書中でいわれる。これらの領域は、転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の異なるポリアデニル化を必要とする。
【０１０８】
相補的な粘着末端または平滑末端を介してベクターへＤＮＡを作動可能に連結する種々の方法が開発されている。例えば、相補的なホモポリマー区画（ｔｒａｃｔ）は、挿入されるＤＮＡセグメントおよびベクターＤＮＡに付加され得る。次いで、ベクターおよびＤＮＡセグメントは、相補的なホモポリマーテール間の水素結合によって結合され、組換えＤＮＡ分子を形成する。
【０１０９】
（４．９　インビボ送達および処置プロトコル）
インビボにおいてアンチセンス構築物を細胞に導入するために、多数の従来の方法の１つが使用され得る。これらの方法としては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターを用いるウイルス媒介送達が挙げられ、そしてアンチセンス治療技術における当業者に周知である。
【０１１０】
アデノウイルスベクターは、真核生物遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏら、１９９１；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘら、１９９２）およびワクチン開発（ＧｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２；ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ、１９９２）において使用されてきた。近年、動物研究により、組換えアデノウイルスが遺伝子治療のために使用され得ることが示唆された（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−ＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、１９９１；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、１９９０；Ｒｉｃｈら、１９９３）。種々の組織に組換えアデノウイルスを投与する研究は、気管注入（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔｒａ、１９９３）、末梢静脈注射（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ、１９９３）、および脳への定位注入（Ｌｅ　Ｇａｌ　Ｌａ　Ｓａｌｌｅら、１９９３）が挙げられる。
【０１１１】
レトロウイルスは、逆転写の過程によって感染細胞においてそれらのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換する能力によって特徴付けられる一群の一本鎖ＲＮＡウイルスである（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。次いで、得られたＤＮＡは、プロウイルスとして細胞染色体に安定に組み込み、そしてウイルスタンパク質の合成を方向付ける。この組み込みは、レシピエント細胞およびその子孫におけるウイルス遺伝子配列の保持を生じる。レトロウイルスゲノムは、３つの遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖを含有する。これらの遺伝子は、カプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をそれぞれコードする。ｇａｇ遺伝子から上流に見出される配列は、ビリオンへのゲノムのパッケージングのためのシグナルを含有する。２つの長末端反復（ＬＴＲ）配列は、ウイルスゲノムの５’末端および３’末端に存在する。これらは、強いプロモーターおよびエンハンサーの配列列を含有し、そしてまた、宿主細胞ゲノムへの組み込みのために必要とされる（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。
【０１１２】
ＡＡＶ（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｓｋａ、１９８４）は、パルボウイルスであり、アデノウイルス株の夾雑物として発見された。これは、いかなる疾患にも関連しない遍在性のウイルスである（抗体は、米国人口の８５％中に存在する）。その複製が、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）の存在に依存することから、デペンド（依存）ウイルスとしても分類される。５つの血清型が単離されており、なかでも、ＡＡＶ−２が、特に特徴付けられている。ＡＡＶは、一本鎖の直鎖状ＤＮＡであり、これは、キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３内にキャプシド化され、２０〜２４ｎｍ直径の正二十面体ビリオンを形成する（ＭｕｚｙｃｚｋａおよびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ、１９８８）。
【０１１３】
ＡＡＶ　ＤＮＡは、約４．７キロベース長である。これは、２つのオープンリーディングフレームを含み、２つのＩＴＲによって隣接されている。ＡＡＶゲノム中には、以下の２つの主要な遺伝子が存在する：ｒｅｐおよびｃａｐ。ｒｅｐ遺伝子は、ウイルス複製を担うタンパク質をコードし、一方、ｃａｐ遺伝子は、キャプシドタンパク質ＶＰ１〜３をコードする。各ＩＴＲは、Ｔ字型のヘアピン構造を形成する。これらの末端反復は、染色体組み込みのための、ＡＡＶのただ１つの必須のシス成分である。従って、ＡＡＶは、全てのウイルスコード配列が除去され、そして送達する遺伝子のカセットで置換されたベクターとして使用され得る。３つのウイルスプロモーターが同定されており、それらの地図位置に従って、ｐ５、ｐ１９およびｐ４０と命名されている。ｐ５およびｐ１９からの転写は、ｒｅｐタンパク質の産生を生じ、そしてｐ４０からの転写は、キャプシドタンパク質を生じる（ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ、１９８４）。
【０１１４】
他のウイルスベクターもまた、宿主細胞へのβ１−ＡＲ　ｍＲＮＡ相補オリゴヌクレオチド配列の送達のために、本発明における発現構築物として使用され得る。ウイルス（例えばワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８）、レンチウイルス、ポリオウイルスおよびヘルペスウイルス）由来のベクターを使用し得る。これらは、様々な哺乳動物細胞に対して誘因性である特徴を提供する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ、１９８９；Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０）。
【０１１５】
本発明のβ１−ＡＲ　ｍＲＮＡ相補アンチセンス配列を発現させるために、発現構築物を細胞に送達しなければならない。この送達は、インビトロで（細胞株を形質転換する実験室用手順などにおいて）、またはインビボもしくはエキソビボで（特定の疾患状態の処置ならびに、詳細には、高血圧およびβ１−ＡＲ関連障害の処置などにおいて）達成され得る。上記のように、送達のための好ましい機構は、前記発現構築物が感染性のウイルス粒子中に被包されているウイルスの感染を介することである。
【０１１６】
一旦、この発現構築物が細胞中に送達されると、β１−ＡＲ　ｍＲＮＡ相補オリゴヌクレオチドアンチセンス配列をコードする核酸は、異なる部位に配置され、発現され得る。特定の実施形態において、このアンチセンス構築物をコードする核酸は、細胞のゲノム中に安定に組み込まれ得る。この組み込みは、相同組換え（遺伝子置換）を介して、特定の位置および配向にあり得るか、または無作為に、不特定の位置に組み込まれ得る（遺伝子増強）。なおさらなる実施形態において、この核酸は、細胞中で、分離した、エピソームセグメントＤＮＡとして安定に保持され得る。このような核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞周期に独立してかもしくは同調して、保持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする。いかにして発現構築物が細胞へ送達されるのかおよび細胞中の何処に核酸が保持されるかは、用いる発現構築物の型に依存する。
【０１１７】
本発明の１つの実施形態において、１つ以上のβ１−ＡＲ　ｍＲＮＡ相補オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアンチセンス配列を含む発現構築物は、単に裸の組換えＤＮＡまたはプラスミドからなり得る。この構築物の移入は、上記の、物理学的または化学的に細胞膜を浸透化するいずれかの方法によって、実施され得る。詳細には、これは、インビトロでの移入に適用可能であるが、同様にインビボでの使用に適用され得る。Ｄｕｂｅｎｓｋｙら（１９８４）は、ポリオウイルスＤＮＡをリン酸カルシウム沈殿物の形態において、成獣ならびに新生仔のマウスの肝臓および脾臓中に首尾よく注入し、活性なウイルス複製および急性感染を実証した。ＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙおよびＲｅｓｈｅｆ（１９８６）もまた、リン酸カルシウムで沈降させたプラスミドを腹腔内に直接注射することで、トランスフェクトされた遺伝子の発現が生じることを実証した。目的の遺伝子をコードするＤＮＡもまた、同様の様式において、インビボで移入され得て、そして遺伝子産物を発現することが想定される。
【０１１８】
裸のＤＮＡ発現構築物を細胞中に移入するための本発明の別の実施形態は、微粒子銃に関与得る。この方法は、ＤＮＡコーティングされた微粒子を高速に加速して、この微粒子が細胞膜を貫通し、そして細胞を殺さずに細胞内に入ることを可能にする能力に依存する（Ｋｌｅｉｎら、１９８７）。小さな粒子を加速するためいくつかの装置が開発されてきた。１つのこのような装置は、高電圧放電に依存して電流を生じ、これが今度は、推進力を提供する（Ｙａｎｇら、１９９０）。使用される微粒子は、生物学的に不活性な物質（例えば、タングステンまたは金粒子）からなる。
【０１１９】
ラットならびにマウスの肝臓、皮膚および筋組織を含む、選択された器官は、インビボでボンバードされた（Ｙａｎｇら、１９９０；Ｚｅｌｅｎｉｎら、１９９１）。これは、組織または細胞を、銃と標的器官の間の任意の介在組織を除去するために、外科的に露出すること（すなわち、エキソビボ処置）が必要とされ得る。この場合もやはり、特定の遺伝子をコードするＤＮＡは、この方法を介して送達され得て、そしてなお、本発明に援用される。
【０１２０】
本発明のさらなる実施形態において、β１−ＡＲ　ｍＲＮＡ相補オリゴヌクレオチドアンチセンス配列を含む発現構築物は、１つ以上のナノカプセル、リポソームまたは他の脂質を基にしたＤＮＡ送達薬剤中に包括され得る。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部の水性媒体により特徴付けられる小胞構造物である。多重膜リポソームは、水性媒体により分離された多重の脂質層を有する。これらは、リン脂質が過量の水性溶液中に懸濁される場合に、自発的に形成する。脂質の組成は、閉じた構造を形成する前に、自己再構成を経て、そして脂質二重層間に水および溶解した溶質を包括する（ＧｈｏｓｈおよびＢａｃｈｈａｗａｔ、１９９１）。リポフェクトアミン−ＤＮＡ複合体もまた考慮される。
【０１２１】
インビトロでのリポソーム媒介性の核酸送達および外来ＤＮＡの発現は、非常にうまくいく。Ｗｏｎｇら（１９８０）は、培養したニワトリの胚、Ｈｅｌａ細胞および肝癌細胞における、リポソーム媒介性の送達および外来ＤＮＡの発現が実現可能であることを実証した。Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７）は、成功したリポソーム媒介性の遺伝子送達を、静脈注射後のラットにおいて達成した。
【０１２２】
本発明の特定の実施形態において、リポソームは、血球凝集性ウイルス（ＨＶＪ）と複合体を形成し得る。これは、細胞膜に容易に融合し、リポソームに被包されたＤＮＡの細胞侵入を促進するようである（Ｋａｎｅｄａら、１９８９）。他の実施形態において、このリポソームは、核の非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と複合体であり得るかまたは共に用いられ得る（Ｋａｔｏら、１９９１）。なおさらなる実施形態において、このリポソームは、ＨＶＪおよびＨＭＧ−１の両方と複合体であり得るかまたは共に用いられ得る。このような発現構築物において、これらは、インビトロおよびインビボにおいて、核酸の移入および発現に首尾よく用いられ、次いでこれらは、本発明に対して適用され得る。細菌性プロモーターがＤＮＡ構築物に用いられる場合、リポソーム内に適切な細菌性ポリメラーゼを含むことがまた望ましい。
【０１２３】
アンチセンスポリヌクレオチドを標的細胞中に送達するために用いられ得る他の発現構築物としては、レセプター媒介性の送達ビヒクルが挙げられる。これらは、巨大分子が、レセプター媒介性エンドサイトーシスにより、ほとんど全ての真核生物細胞中に選択的に取り込まれることを利用する。細胞型特異的な分布をする様々なレセプターのために、この送達は非常に特異的であり得る（ＷｕおよびＷｕ、１９９３）。
【０１２４】
レセプター媒介性の遺伝子標的化ビヒクルは一般に、２つの組成：細胞レセプター特異的リガンドおよびＤＮＡ結合因子からなる。いくつかのリガンドは、レセプター媒介性遺伝子移入に用いられてきた。最も広範に特徴づけされたリガンドは、アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）（ＷｕおよびＷｕ、１９８７）およびトランスフェリン（Ｗａｇｎｅｒら、１９９３）である。最近、合成ネオグリコプロテイン（ｎｅｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）（これは、ＡＳＯＲと同じレセプターを認識する）が、遺伝子送達ビヒクルとして用いられ（Ｆｅｒｋｏｌら、１９９３；Ｐｅｒａｌｅｓら、１９９４）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）もまた、扁平上皮癌細胞への遺伝子送達のために用いられた（欧州特許出願公開番号ＥＰ０２７３０８５号（これは、本明細書において参照としてその全体が詳細に援用される））。
【０１２５】
他の実施形態において、この送達ビヒクルは、リガンドおよびリポソームを含み得る。例えば、Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７）は、ラクトシル−セラミド、ガラクトース末端アシアロガングリオシド（ａｓｉａｌｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）をリポソーム中に取り込んで用いて、肝細胞によるインスリン遺伝子の取り込みが増大することを認めた。従って、特定の遺伝子をコードする核酸をまた、肺細胞、上皮細胞または腫瘍細胞などの細胞型へ、リポソームを伴うかまたは伴わないかなり多数のレセプター−リガンドシステムによって、特異的に送達させ得ることは、実行可能である。例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）は、ＥＧＦレセプターのアップレギュレーションを呈する多くの腫瘍細胞中にある遺伝子をコードする核酸の媒介性送達のためのレセプターとして用いられ得る。マンノースは、肝細胞上のマンノースレセプターを標的化するのに使用され得る。また、ＣＤ５に対する抗体（ＤＬＬ）、ＣＤ２２に対する抗体（リンパ腫）、ＣＤ２５に対する抗体（Ｔ細胞白血病）およびＭＡＡに対する抗体（黒色腫）は、標的部分として同様に使用され得る。
【０１２６】
特定の実施形態において、遺伝子移入は、エキソビボの条件下でより容易に実施され得る。エキソビボ遺伝子治療は、細胞を動物から単離する工程、核酸を細胞中へインビトロで送達する工程、次いで改変された細胞を動物中へ戻す工程に関する。これは、組織／器官を動物から外科的に除去する工程、または細胞および組織を初代培養する工程に関与し得る。Ａｎｄｅｒｓｏｎら（米国特許第５，３９９，３４６号（本明細書においてこの全体が援用される））は、エキソビボ治療法を開示する。
【０１２７】
（５．０　実施例）
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例において開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者らによって発見された技術を表し、従って、その実施のための好ましい様式を構成するものであるとみなされ得ることが当業者により理解されるべきである。しかし、当業者は、本発明に照らし合わせて、多くの改変が、開示される特定の実施形態においてなされ得、そしてなお同じかまたは同様の結果を、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく得られることを理解するべきである。
【０１２８】
（５．１　実施例１　β１−ＡＲ　ｍＲＮＡのアンチセンス阻害）
β１−アンチセンスは、β１−ＡＲの特異的な発現阻害を介して、β１−ＡＲ媒介性応答の機能的感受性を、交感神経活性化に反して減少し、従って、降圧性効果を達成する。この例において、ＡＳ−ＯＤＮを、ラットβ１−ＡＲ　ｍＲＮＡに相補的に設計し、β１−ＡＲ濃度および機能を、心臓において阻害する能力および、血圧（ＢＰ）を高血圧自然発生ラットにおいて低下させる能力を実証した。
【０１２９】
（５．１．１　方法）
（５．１．１．１　アンチセンスの設計および投与）
１５マーのＡＳ−ＯＤＮおよび１５マーの逆向きＯＤＮコントロールを合成し、ラットβ１−ＡＲ　ｍＲＮＡのＡＵＧ開始コドンを標的にした（Ｍａｃｈｉｄａら、１９９０）。ＡＳ−ＯＤＮの配列は、５’−ＣＣＧＣＧＣＣＣＡＴＧＣＣＧＡ−３’（配列番号：１９５）であり、そして逆向きＯＤＮの配列は、５’−ＡＧＣＣＧＴＡＣＣＣＧＣＧＣＣ−３’（配列番号：１９６）であった。このＡＳ−ＯＤＮを、β１−ＡＲ　ｍＲＮＡの異なる領域に対して標的化された６つのＡＳ候補から、心臓のβ１−ＡＲ阻害の強さおよびＳＨＲにおける血圧の低下に基づいて、選択した。これらのオリゴヌクレオチドを、骨格のホスホロチオネート化によって改変した。カチオン性リポソームで送達されるＯＤＮを、舌の静脈中に注射した。
【０１３０】
（５．１．１．２　リポソームおよびＯＤＮ／リポソーム複合体の調製）
カチオン性脂質１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）を、ヘルパー脂質１−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ、Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏｌａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）と１：１のモル比で混合し、簡単に超音波処理して、使用するまで４℃で保存した。リポソームの平均直径は、２００〜３００ｎｍである（ＴａｎｇおよびＨｕｇｈｅｓ、１９９８）。ＯＤＮ／リポソーム複合体を、使用するその日に、５％ブドウ糖／水（重量／容量）中で最終ＤＮＡ濃度が３００μｇ／ｍＬになるまで、所望の量のＯＤＮとＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥとを混合して、室温で６０分間インキュベートすることによって調製した。２つのＤＮＡ／脂質モル比（すなわち１：０．５および１：２．５）を研究に用いた。
【０１３１】
（５．１．１．３　動物手術）
成獣雄のＳＨＲ（２５０〜３５０ｇ、Ｈａｒｌａｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を室内のケージ中で、１２時間の明暗サイクルで飼った。動物に、標準的な実験用ラットの固形試料および水道水を適時与えた。
【０１３２】
（５．１．１．４　遠隔測定センサーの埋め込み）
埋め込みの前に、各無線送信機（ＴＡ１１ＰＡ−Ｃ４０、Ｄａｔａ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮ）のゼロが４ｍｍＨｇ以下であることを確認した。ＳＨＲを１００ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび１５ｍｇ／ｋｇのキシラジンで麻酔し、正中線に沿って腹部を切開した。次いで、液体を充填したセンサーカテーテルを右大腿動脈中に挿入し、カテーテルのチップは、腎動脈へ向かって尾側の腹大動脈中にあった。埋め込みがなされたラットを、一週間回復させた。
【０１３３】
（５．１．１．５　頸静脈カニューレ挿入）
遠隔測定のための埋め込みから一週間後に、ラットを麻酔し、ＰＥ５０およびビニルチューブで作られた曲がったカテーテルを頸静脈中に挿入した。チューブを首の皮膚の下に導いて、薬物注入を可能にするために背中を露出した。ラットは、実験前に２４時間回復させた。カテーテルに１００Ｕのヘパリンを毎日流して、目詰まりを防いだ。
【０１３４】
（５．１．１．６　膜調製物およびβ−ＡＲ結合アッセイ）
生理食塩水（ｎ＝６）または１ｍｇ／ｋｇの逆ＯＤＮ（ｎ＝６）の静脈内注射の４日後、または１ｍｇ／ｋｇのβ１−ＡＳ−ＯＤＮ（ｎ＝２４）の注射の２日後、４日後、１０日後または１８日後に、動物を安楽死させ、そして（ＢａｋｅｒおよびＰｉｔｈａ、１９８２）に以前に記載されるように、心室から膜を調製した。飽和研究について、１００μｇの膜タンパク質を、５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．４）、５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２を含む、合計２５０μＬの容積中の［１２５Ｉ］（−）−ヨードシアノピンドロール（ＩＣＹＰ、ＮＥＮ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、６．２５〜１００ｐｍｏｌ／Ｌ）の６つの濃縮物とともに、３６℃で６０分間、３連でインキュベートした。非特異的レベルおよびβ２−ＡＲ−結合レベルを、１μｍｏｌ／Ｌ（±）−アルプレノロールおよび１５０ｎｍｏｌ／Ｌ　ＣＧＰ２０７１２Ａ（ＲＢＩ）の存在下で、それぞれ、決定した。次いで、反応混合物を、Ｂｒａｎｄｅｌハーベスターを使用して、Ｗｈａｔｍａｎ　ＧＦ／Ｂガラスファイバーフィルタに通し、そして結合した放射能を１分間計数した。
【０１３５】
（５．１．１．７　組織調製および定量的オートラジオグラフィー）
１ｍｇ／ｋｇのβ１−ＡＳ−ＯＤＮ（ｎ＝６）または生理食塩水（ｎ＝６）の注射の４日後に、ラットを屠殺し、そして組織を取り出し、そしてドライアイスで凍結させた。脳の冠状切片、心臓の水平切片、および腎臓の矢状切片（２０μｍ）を−２０℃でクリオスタット（Ｍｉｃｒｏｍ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）で切断し、そして顕微鏡スライドに載せた。７番目のスライド毎に、組織学について、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。組織切片を、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＧＴＰ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌアスコルビン酸、および１０μｍｏｌ／Ｌ　ＰＭＳＦを含むＫｒｅｂｓ緩衝液（ＮａＣｌ　１１８．４ｍｍｏｌ／Ｌ、ＫＣＩ　４．７ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＳＯ４　１．２ｍｍｏｌ／Ｌ、ＣａＣｌ２　１．２７ｍｍｏｌ／ＬおよびＮａＨ２ＰＯ４　１０．０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．１）中で、３０分間２５℃でプレインキュベートした。次いで、切片を０．１ｍｍｏｌ／Ｌアスコルビン酸および１０μｍｏｌ／Ｌ　ＰＭＳＦを含むＫｒｅｂ緩衝液中で、１００ｐｍｏｌ／Ｌ　ＩＣＹＰとともに２５℃で１５０分間、１μｍｏｌ／Ｌ（−）プロプラノロール、１００ｎｍｏｌ／Ｌ　ＩＣＩ　１１８，５５１（β１選択的アンタゴニスト）、または１００ｎｍｏｌ／Ｌ　ＣＧＰ２０７１２Ａ（β１選択的アンタゴニスト）の存在下でインキュベートして、非特異的結合、β１結合およびβ２結合を区別した。標識された切片を同じ緩衝液でリンスし、続いて、この緩衝液中で、３７℃で２回１５分洗浄し、そして２５℃で、蒸留水中でリンスした（Ｍａｔｔｈｅｗら、１９９４）。次いで、乾燥した切片をＸ線フィルムに曝露した。画像をコンピュータ画像分析システム（ＭＣＩＤ、Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｒｅｓａｒｃｈ）で定量化し、そして１２５Ｉ標準で規格化した。非特異的結合は、全結合の１０％未満であった。
【０１３６】
（５．１．１．８　β刺激に対する応答における心臓血管パラメーターに対する、β１−ＡＳおよびアテノロールの効果の決定）
１ｍｇ／ｋｇ　β１−ＡＳ−ＯＤＮ（ｎ＝９）または逆ＯＤＮ（ｎ＝６）の注射の４８時間後に、ＳＨＲを麻酔し、そして屠殺した。心臓を迅速に取り出し、そして大動脈を介して酸素化されたＫｒｅｂ緩衝液（１１８ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、１８．７５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＨＣＯ３、１．２ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４、４．７ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ、１．２ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＳＯ４、１．２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＣａＣｌ２、１１．１ｍｍｏｌ／Ｌグルコース、および０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ）を、７．０ｍＬ／分の一定の流れで、３６℃で灌流させた。冠状灌流圧力を、大動脈の近位に配置され、そして圧力変換器（Ｇｏｕｌｄ　Ｓｔａｈａｍ　Ｐ２３ＩＤ、Ｅａｓｔｌａｋｅ、ＯＨ）に接続されたカテーテルを介して測定した。水を充填し、そして圧力変換機器に接続されたラテックスバルーンを、左心室拡張終期圧（ＬＶＥＤＰ）、左心室収縮期圧（ＬＶＳＰ）、および発達（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）左心室圧（ｄＬＶＰ）（ｄＬＶＰ＝ＬＶＳＰ−ＬＶＥＤＰ）を測定するために、左心房を通して左心室に挿入した。平衡の間のＬＶＥＤＰを、５〜７ｍｍＨｇに設定した。冠状灌流圧力、ＬＶＥＤＰおよびＬＶＳＰを、４チャンネルレコーダー（Ａｓｔｒｏ−Ｍｅｄ、Ｗｅｓｔ　Ｗａｒｗｉｃｋ、ＲＩ）で連続的に記録した。ｄＬＶＰおよび心拍数（ＨＲ）についてのベースライン値が５分間安定であった後に、イソプロテレノール（ＩＳＯ、非特異的βアゴニスト）を、タキフィラキシーの効果を避けるために、１０分間隔で、０．０１μｍｏｌ／Ｌ、０．０２５μｍｏｌ／Ｌ、０．０５μｍｏｌ／Ｌ、および０．１２μｍｏｌ／Ｌで与えた。
【０１３７】
心臓ｄＰ／ｄｔｍａｘ、および収縮期血圧（ＳＢＰ）に対する、β１−ＡＳ−ＯＤＮおよびアテノロールの効果を、同じ群のＳＨＲ（ｎ＝４）において比較した。頸静脈へのカテーテル（ｃａｔｈｅｒｉｚａｔｉｏｎ）の２日後に、コントロール値を取り、そして１ｍｇ／ｋｇ　β１−ＡＳ−ＯＤＮを注入した。４８時間後、ラットを、β１−ＡＳ−ＯＤＮの効果について試験した。全ての心臓血管パラメーターがコントロール値に戻るまで、ラットを回復させた。次いで、１ｍｇ／ｋｇのアテノロール（β１選択的アンタゴニスト）を注入し、そしてラットを３０分後に試験した。β１刺激について、ＳＨＲに、ドブタミン（β１選択的アゴニスト）を、頸静脈カテーテルを通して、５μｇ・ｋｇ−１・分−１、１０μｇ・ｋｇ−１・分−１、２０μｇ・ｋｇ−１・分−１、および４０μｇ・ｋｇ−１・分−１で注入した。それぞれの用量を、タキフィラキシーの効果を避けるために、５分間連続的に、および一時間の間隔で、全ての心臓血管パラメーターがベースライン値に戻るまで与えた。ＢＰおよびＨＲを、１分毎にサンプリングした。ｄＰ／ｄｔｍａｘを、上昇するパルス−圧力曲線の勾配から計算し、そして１分毎に決定した。各用量およびベースラインにおける値の間の差異を、Δとして示した。
【０１３８】
（５．１．１．９　ＢＰモニタリング）
各ラットのかごを、心臓血管パラメーターの測定について、レシーバー（ＲＬＡ　１０２０、Ｄａｔａ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮ）に置いた。コンピュータに基づくデータ収集プログラム（Ｄａｔａｑｕｅｓｔ　Ｌａｂ−ＰＲＯ３．０；Ｄａｔａ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてデータを集めた。ＢＰおよびＨＲを、１０分毎に測定し、そして１〜２４時間毎に平均化した。処置の前に、ＳＨＲを、安定なベースラインを得るために１週間モニターした。
【０１３９】
ラットを、加熱パッドの上のかごの中で、２０分間温めた。温度を３５℃〜３７℃に制御した。次いで、ラットを３７℃に維持されたプラスチック抑制器（ｒｅｓｔｒａｉｎｅｒ）に置いた。空気パルスセンサーを尾部に取り付けた。カフ（ｃｕｆｆ）を膨らませた後に、ＳＢＰを、圧力曲線の下行側における最初の拍動性振動として決定した。ＨＲを、単位時間当たりのパルス数の手動計数によって決定した。ＢＰおよびＨＲを、Ｎａｒｃｏフィジオグラフ（ｐｈｙｓｉｏｇｒａｐｈ）によって記録した。各ラットについてのデータ値を、少なくとも４つの安定な読み値の平均としてとった。ベースラインを、アンチセンスの投与の前に、３日の測定を平均することによって決定した。
【０１４０】
（５．１．１．１０　統計的分析）
値を、平均±ＳＥＭとして表現した。差異は、Ｐ＜０．０５で、統計的に有意であるとみなした。対応のないｔ検定を使用して、２つの群のＢｍａｘ、ｄＬＶＰおよびＢＰを比較した。一方向反復観測ＡＮＯＶＡおよびＴｕｒｋｅｙ試験を使用して、異なる群のドブタミン注入における、ΔｄＰ／ｄｔおよびΔＨＲを比較した。ピヤソン積モーメント関係を使用して、β１−ＡＲ　ＢｍａｘとｄＬＶＰとの間の関係を評価した。
【０１４１】
（５．１．２　結果）
（５．１．２．１　心臓β−ＡＲ密度に対する効果）
図１Ａは、１：２．５のモル比で、カチオン性リポソームと共に送達される１ｍｇ／ｋｇ　β１−ＡＳ−ＯＤＮの単回静脈内注入が、１８日間で、ＳＨＲ心臓のβ１−ＡＲ密度を有意に減少したことを示す（Ｐ＜０．０１）。低下は、４日目に、４７％の最大であり、１０日目に３３％、そして１８日目に２９％に維持された。対照的に、β２−ＡＲのＢｍａｘに有意な変化はなかった。両方のサブタイプのＫＤは、変化しないままであった（表１）。結果的に、心室のβ１／β２サブタイプ比は、β１−ＡＳ−ＯＤＮにより、約７０／３０から約５０／５０に減少した。逆ＯＤＮは、いずれのサブタイプにおいても効果を有さなかった（図１Ｂ）。
【０１４２】
（５．１．２．２　β刺激に対する応答における、心臓収縮性およびＨＲに対する効果）
１ｍｇ／ｋｇ　β１−ＡＳ−ＯＤＮの注射の４８時間後、β刺激に対する心臓筋収縮性応答および変時性応答を、インビトロおよびインビボでＳＨＲにおいて決定した。
【０１４３】
最初に、単離した心臓を、増加する用量のＩＳＯで灌流し、これは、β−ＡＲを活性化することによって、ＨＲおよび収縮性を向上させた。ｄＬＶＰ−ＩＳＯ用量−応答曲線（ＩＳＯの陽性の筋収縮性効果を反映する）は、β１−ＡＳ−ＯＤＮによって有意に下方にシフトした（Ｐ＜０．０２）。ＨＲは、１点（すなわち、０．０１μｍｏｌ／Ｌ　ＩＳＯ）を除いて、有意に減少しなかった（Ｐ＜０．０５）（図２Ａおよび図２Ｂ）。
【０１４４】
インビボ試験を、無線遠隔測定によってモニターされた意識のあるＳＨＲで行った。β１−ＡＳ−ＯＤＮは、有意に（Ｐ＜０．０２）、ドブタミン（β１選択的アゴニスト）のもとで、ｄＰ／ｄｔｍａｘの増加を鈍らせた（図３Ａ）。ＨＲにおける変化は、有意には減少せず（図３Ｂ）、これは、単離された灌流された心臓における結果を反響した。逆に、ドブタミンに対するＢＰの応答は、２相性であった（図３Ｃ）。ドブタミンは、おそらく、高用量でのドブタミンの部分的なβ２アゴニスト活性および結果としてＢＰに対する血管拡張効果の結果として、低い注入速度で、５〜８ｍｍＨｇだけＳＢＰを上昇し、そしてより速い速度でＳＢＰを減少した。図３はまた、β１−ＡＳ−ＯＤＮでの結果とアテノロール（β１選択的アンタゴニスト）での結果とを比較する。β１−ＡＳ−ＯＤＮと比較して、１ｍｇ／ｋｇアテノロールは、注入後の５時間の間、ΔｄＰ／ｄｔｍａｘおよびΔＨＲにおけるより深い減少を作り出した。さらに、これは、基礎的なｄＰ／ｄｔｍａｘ（コントロールの２９３７±２７７ｍｍＨｇ／ｓに対して、２４５０±２９５ｍｍＨｇ／ｓ）を減少し、そして徐脈を引き起こしたが（コントロールの３６５±８ｂｐｍに対して、２９５±１２ｂｐｍ）（Ｐ＜０．０５）、β１−ＡＳは、基礎的な収縮性（２９２２±２４９ｍｍＨｇ／ｓ）もＨＲ（３６５±１２ｂｐｍ）も変化しなかった。しかし、ΔｄＰ／ｄｔｍａｘおよびΔＨＲに対するアテノロールの効果は、一過性であった。アテノロール投与の２４時間後以内に、ドブタミンの筋収縮性効果および変時性効果が、コントロールレベルに戻った。
【０１４５】
（表３）
（生理食塩水、逆ＯＤＮ、またはβ１−ＡＳ−ＯＤＮでの処置の４日後の、ＳＨＲの心室におけるβ１−ＡＲおよびβ２−ＡＲのＢｍａｘおよびＫＤ）
【０１４６】
【表６】
2004502459.tif 000013
データは、それぞれの群の平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝６〜１０）
＊生理食塩水コントロールに対して、ｐ＜０．０１。
【０１４７】
（５．１．２．３　ＳＨＲのＢＰに対する効果）
図４は、テールカフ法により測定されたＳＨＲのＢＰに対する、１ｍｇ／ｋｇ　β１−ＡＳ−ＯＤＮの単回注入の効果を示す。ＡＳ−ＯＤＮは、異なるモル比のＤＮＡ／脂質（すなわち、１：０．５および１：２．５）でカチオン性リポソームを用いて送達された。１：０．５の比でリポソームを用いて送達されるβ１−ＡＳ−ＯＤＮは、８日間でＳＢＰを減少した。最大の低下は、３８±５ｍｍＨｇであった。モル比が１：２．５に増加した場合、この高血圧効果は、２０日まで大きく延びた。逆ＯＤＮで、効果は見られなかった。
【０１４８】
β１−ＡＳ−ＯＤＮおよびアテノロールの効果を比較するために、無線遠隔測定を使用して、規則的な基準でＢＰおよびＨＲをモニターした。１：０．５の比でリポソームと共に送達されるβ１−ＡＳ−ＯＤＮ　１ｍｇ／ｋｇは、平均ＢＰにおいて１５ｍｍＨｇの最大の低下を作り出した（図５Ａ）。抗高血圧効果は、８日間続き、これは、テールカフで測定された結果と一致した。ＨＲは、有意に変化しなかった（図５Ｂ）。ＡＳ−ＯＤＮとは対照的に、１ｍｇ／ｋｇアテノロールによって引き起こされる高血圧効果の発生が、注射後２０分の早さで生じたが、これは、１０時間のみ続いた（図６Ａ）。さらに、アテノロールは、平均７５ｂｐｍまでのかなりの徐脈を引き起こした（図６Ｂ）。
【０１４９】
（５．１．２．４　脳、心臓、および腎臓におけるβ−ＡＲ分布に対する効果）
脳、心臓、および腎臓における６〜１８個の組織スライスの定量的なオートラジオグラフィーは、静脈内β１−ＡＳ−ＯＤＮ投与の４日後に分析された。前脳領域および脳幹領域におけるβ−ＡＲの組織分布において変化は検出されなかった。これは、ＣＮＳにおけるβ−ＡＲ発現に対するアンチセンス効果の非存在を示した。しかし、β１−ＡＳ−ＯＤＮは、心室（３０．２±２．１から２０．６±２．５ｆｍｏｌ／ｍｇまで）および腎皮質（２６．４±３．１から１７．４±３．３ｆｍｏｌ／ｍｇまで）において、β１−ＡＲ密度を有意に（Ｐ＜０．０５）減少した。これは、結合結果と一致した。β２−ＡＲは、いずれの組織においても影響も受けなかった。
【０１５０】
（５．１．３　考察）
この実施例は、高血圧のモデルにおける高いＢＰに対する新規なβ１−ＡＳ−ＯＤＮの効果を、現在使用されるβ−ブロッカーと比較する。β１−ＡＳ−ＯＤＮは、β１アドレナリン作用性活性を押し下げ、長期のＢＰの減少を生じる。この結果は、β１−ＡＳ−ＯＤＮが、インビトロおよびインビボでのβ１刺激の後に、β１−ＡＲ密度および心臓収縮性を減少し、そしてＳＨＲの高いＢＰを低下させたことを示した。これらの発見は、β１−ＡＳが、β１−ＡＲ発現の阻害によって、心臓、腎臓、および他の組織を、交感神経活性化（これは、高いＢＰににおいて主要な寄与因子である）に対してより感受性でなくし得るという仮定と一致する。β１−ＡＳ−ＯＤＮの単回注入が、心臓β１−ＡＲ密度を効果的に減少し、これは、β−刺激に応答した、減少した心室収縮性および心拍出に付随した。ＳＨＲにおける抗高血圧効果は、３８ｍｍＨｇまでの減少であり、２０日ほど長く続いた。
【０１５１】
β１−ＡＳ−ＯＤＮの処置は、４日で約５０％だけ心臓β１−ＡＲ密度を減少した。β１−ＡＲの半減期について、かなりの変動が文献において報告される（ＢａｋｅｒおよびＰｉｔｈａ，１９８２；Ｎｅｖｅ　ａｎｄ　Ｍｏｌｉｎｏｆｆ，１９８６、ならびにＷｉｎｔｅｒら，１９８８）。ＡＳ−ＯＤＮ阻害での結果から、心臓β１−ＡＲの半減期は、約２〜４日であり、４日以内にβ−ＡＲ密度の５０％減少を可能にする。
【０１５２】
ＢＰのテールカフおよび遠隔測定の両方は、アンチセンス処理の後に有意な低下を示した。ＳＨＲは、テールカフ対遠隔測定に供された場合、より大きな程度の高血圧までβ１−ＡＳ−ＯＤＮに応答した。さらに、テールカフで測定したベースラインは、同じラットにおいて、遠隔測定のベースラインよりも２０〜３０ｍｍＨｇだけ一貫して高かった。Ｂａｚｉｌら、１９９３は、同様な現象を報告した。彼らは、遠隔測定、テイルオフ、および動脈カテーテルによって記録された心臓血管パラメーターを比較し、そしてテールカフを用いて、カプトプリルのより感受性の高血圧効果を観測した。ＢＰのテールカフ測定は、ラットを温めることおよび拘束することを含む。交換神経活性の抑制によって、β１−ＡＳが、ストレス下で動物のＢＰをより効率的に減少させ得ることが考えられ得る。
【０１５３】
カチオン性リポソームは、遺伝子送達について効果的なビヒクルである。リポソーム捕捉（ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ）が、ＤＮＡの細胞取り込みを改善するだけでなく、ＤＮＡを分解から保護し、そしてその循環時間を延長することが示された（Ａｌｌｅｎ、１９９７；Ｌｉｕら、１９９７）。多くの因子（例えば、ＤＮＡ／脂質比、脂質の選択、および調製手順）が、カチオン性リポソーム媒介静脈内遺伝子送達の効率に影響する。幅広く使用される脂質処方物（ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ）を使用して、β１−ＡＳ−ＯＤＮを４モルの比で送達した。１：２．５の最適比は、抗高血圧効果の期間および大きさに基づいて決定された。２０日までの３８ｍｍＨｇのＢＰの大きな延長した低下が、この比で達成され、この後に、４日目に最大の４７％、１０日目に３３％、および１８日目に２９％へのβ１−ＡＲ結合の減少が起こった。これは、β１−ＡＳ−ＯＤＮが、ＢＰに関与する機能的に活性なレセプターを効果的に阻害することを意味する。
【０１５４】
毛細血管内皮によって形成される血液−脳関門は、６００Ｄａ未満の分子量の小さな親油性分子に対してのみ透過可能である（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ、１９９８によって概説される）。それらが高い親水性を有するので、ＯＤＮは、血液脳関門を通る輸送は無視し得るものであり、ＣＮＳへのアクセスが非常に限定されている。蛍光標識を有するＤＮＡ／リポソーム複合体の細胞および器官分布は、静脈内注射の後にマウスにおいて以前に研究され、そしてその結果は、この複合体が末梢器官（肺、心臓、腎臓、および脾臓を含む）の大部分において毛細血管内皮細胞によって主に摂取されたが、脳にはなかったことを示した（ＭｃＬｅａｎら、１９９７）。末梢投与の後のリポソームの脳保持がいくつかの場合において観測されたが、脳の微小血管系内での捕捉に起因した（Ｓｃｈａｃｋｅｒｔら、１９８９）。脳におけるオートラジオグラフィーは、静脈内β１−ＡＳ−ＯＤＮ注射の後に、β−ＡＲの発現および分布において検出可能な変化がないことを明かにした。これは、アンチセンスの使用が、ＣＮＳ効果を有さなかった証拠を、さらに、提供した。
【０１５５】
遺伝子配列に基づく高度な特異性は、多くの研究および臨床試験において益々有用なツールとなったアンチセンスを作り出した。この成功は、食品医薬品局による、最初のアンチセンス薬物ビタベン（Ｖｉｔａｖｅｎｅ）の近年の認可より明白である。しかし、配列に依存しない相互作用もまた、ＡＳ−ＯＤＮで報告された。高用量は、通常、非特異的作用の原因となる（Ｃｈａｎｇら、１９８９）が、別の可能な理由としては、現在利用可能なデータベースがすべての遺伝子を網羅しておらず、従って、ＢＬＡＳＴ検索による相同性比較が、ＡＳ−ＯＤＮの配列特異性を保証し得ないということがある。本研究において、β１−ＡＳ−ＯＤＮは、β２−ＡＲを変化させることなくβ１−ＡＲの発現を阻害した。このことは、β１−ＡＳ−ＯＤＮ配列の特異性に起因する可能性が高いが、他の可能性（例えば、調節機構に対する間接的作用）も残る。
【０１５６】
慢性心不全を有する患者において、この疾患の重篤度は、心臓のβ−ＡＲの密度および機能的応答性における減少と密接に関係する（Ｂｒｏｗｎら、１９９２）。β１−ＡＳ−ＯＤＮで処置されたＳＨＲでは、インビトロおよびインビボにおけるβ１−ＡＲ媒介性の正の筋収縮性応答の著しい減衰が、低減した心臓β１−ＡＲレベルと一致する。従って、これらの結果は、心臓のβ１−ＡＲ数と機能的感受性との間の正の相関が示した（相関係数＞０．９０、Ｐ＜０．０１）。
【０１５７】
ＢＰにおける大きな減少にもかかわらず、アンチセンス処置後に反射性頻拍症は観察されなかった。しかし、Ｈｒに対するβ１−ＡＳ−ＯＤＮの抑制性作用は、その負の筋収縮性応答ほど顕著ではない。いくつかの可能性が考えられ得る。第１として、β１−ＡＳ−ＯＤＮがβ２−ＡＲに影響を及ぼさず、これは、ＨＲの調節において重要な役割を果たす（Ｋａｕｍａｎｎ，１９８６；Ｒｏｄｅｆｅｌｄら、１９９６）が、心臓収縮には関与しなかったから。第２として、β１−ＡＲ発現のアンチセンス阻害が緩やかであり、そしてβブロッカーを用いる場合よりも広範囲ではなかったから。β１−ＡＲが、収縮性よりもＨＲ制御のための多量の蓄えを有し得るという可能性もある。
【０１５８】
（５．２　実施例２−−β１ＡＲオリゴヌクレオチドを用いた、高血圧の長期低下）
１９６５年におけるプロプラノロールの導入から、βブロッカーは、高血圧症に対する主要な第一線の薬物となった。心臓および腎臓におけるβアドレナリン作用性レセプターの阻害を通して、βブロッカーは、交感神経系に対する応答の減少を介することにより高血圧を低下させる。しかし、現在のβブロッカーはすべて、毎日摂取する必要がある。また、大半は中枢神経系に対する副作用を有し、このことが、患者のコンプライアンスを乏しくさせる原因となっている。さらに、高血圧症におけるβ遮断の機構は、十分には理解されていない（Ｍａｎ　ｉｎ’ｔ　Ｖｅｌｄら、１９８８）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、レニン−アンギオテンシン系（ＲＡＳ）の成分に対して、血圧を低下させるのに首尾よく構築された（Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、１９９４）。このことに鑑み、新規のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、β１−アドレナリン作用性レセプター（β２−ＡＲ）または脳（ｂｒａｉｎ）に標的化した。従って、より副作用が少なく、かつより長い作用を有する可能性が高い。
【０１５９】
アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（β１−ＡＳ−ＯＤＮ）が、心室におけるβ１−ＡＲ発現を有意に阻害し、これによりアドレナリン作用性の活性化に対する筋収縮性応答の抑制が生じることによって低血圧に寄与することが以前に示されている。心臓において正の筋収縮性および変時性（ｃｈｒｏｎｏｔｒｏｐｙ）を誘導することに加えて、β１−ＡＲはまた、腎皮質の傍糸球体細胞からのレニンの発現および分泌の交感性刺激媒介を担う。イソプロテレノールの注入により、ラットにおいて、レニンの発現および分泌ならびに血漿レニン活性（ＰＲＡ）が増加することが示された（Ｈｏｌｍｅｒら、１９９７）。βブロッカーは、患者においてＰＲＡを減少させる（Ｂｌｕｍｅｎｆｅｌｄ、１９９９）。しかし、βブロッカーが、高レニンプロフィールを有する患者においてより有効であるということが明らかであるにもかかわらず（Ｂｕｈｌｅｒ、１９８８）、βブロッカーが誘導するレニン放出減少の重要性が議論されてきた（Ｍａｎ　ｉｎ’ｔ　Ｖｅｌｄら、１９８３）。本研究は、β１−ＡＳ−ＯＤＮが、レニンの発現および分泌を減少させるか否か、ならびにＲＡＳが、β１−ＡＳ−ＯＤＮの抗高血圧性の影響に関与するか否か、これがカチオン性リポソームでの送達により改善され得るかを研究し、そしてリポソーム：ＯＤＮの最適な供給比を決定する。
【０１６０】
（５．２．１　方法）
（５．２．１．１　アンチセンス配列および送達）
ＡＳ−ＯＤＮおよび逆（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）ＯＤＮコントロールは１５マーであり、そしてラットβ１−ＡＳ−ＯＤＮのＡＵＧ開始コドンに標的化され（５’−ＣＣＧＣＧＣＣＣＡＴＧＣＣＧＡ−３’（配列番号１９７））、そして逆ＯＤＮは、５’−ＡＧＣＣＧＴＡＣＣＣＧＣＧＣＣ−３’（配列番号１９８）である。これらのＯＤＮは、バックボーンのホスホロチオエート化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｉｏｎ）によって改変された。１：１のモル比でヘルパー脂質Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ、Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏｌａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ）と混合されたカチオン性脂質１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）を使用して、舌静脈中に単回静脈内注射でＯＤＮを送達した。ＯＤＮ−リポソーム複合体を、使用する日に調製した。この調製は、所望の量のＯＤＮとＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥとを、５％（重量／容量）デキストロース水中で３００μｇ／ｍＬの最終ＤＮＡ濃度まで混合し、そして室温で６０分間インキュベートすることによる。
【０１６１】
（５．２．１．２　動物）
成体雄性ＳＨＲ（４〜６ヶ月齢、Ｈａｒｌａｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を、室温において１２時間明暗周期で、ケージ内で飼育した。動物には自由に、標準的な研究用ラット固形飼料および水道水を給餌させた。ＰＲＡおよびアンギオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）のレベルを決定するために、尾から採血した。
【０１６２】
（５．２．１．３　血圧測定）
血圧を、上記のようなテールカフ（ｔａｉｌ−ｃｕｆｆ）方法により測定した。収縮期血圧（ＳＢＰ）を、圧力曲線の下行側における最初の拍動性振動として決定した。各ラットのデータ値を、４回以上の安定な読取りの平均としてとった。アンチセンス投与前の３日間の測定を平均化することによって、基線を決定した。
【０１６３】
（５．２．１．４　膜調製およびβアドレナリン作用性レセプター結合アッセイ）
生理食塩水（ｎ＝６）もしくは０．５ｍｇ／ｋｇの逆ＯＤＮ（ｎ＝６）の静脈内注射から４日後、または０．５ｍｇ／ｋｇのβ１−ＡＳ−ＯＤＮ（ｎ＝２４）の注射から４、１０、１８および４０日後に、動物を安楽死させ、そして以前に記載されたように（ＢａｋｅｒおよびＰｉｔｈａ、１９８２）、左側の腎臓の腎皮質から膜を調製した。飽和研究のために、１００μｇの膜タンパク質を、５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２を含む総容量２５０μＬ中において３６℃で６０分間、６つの濃度の［１２５］（−）ヨードシアノピンドロール（ＩＣＹＰ、ＮＥＮ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、６．２５〜１００ｐｍｏｌ／Ｌ）と共に三連でインキュベートした。非特異的結合レベルおよびβ２−アドレナリン作用性レセプターの結合レベルを、それぞれ、１μｍｏｌ／Ｌの（±）−アルプレノロールおよび１５０ｎｍｏｌ／ＬのＣＧＰ２０７１２Ａ（ＲＢＩ）の存在下で決定した。次いで、反応混合物を、Ｂｒａｎｄｅｌハーベスターを備えたＷｈａｔｍａｎ　ＧＦ／Ｂガラス繊維フィルターを通過させ、そして結合した放射能を１分間カウントした。
【０１６４】
（５．２．１．５　組織調製および定量的オートラジオグラフィー）
０．５ｍｇ／ｋｇのβ１−ＡＳ−ＯＤＮ（ｎ＝６）または生理食塩水（ｎ＝６）の注射から４日後に、ラットを安楽死させ、そして右側の腎臓を取り出し、そしてドライアイス中で凍結させた。腎臓の矢状断（２０μｍ）を、２０℃で低温槽（Ｍｉｃｒｏｍ）で切断し、そして顕微鏡スライド上にマウントした。７枚目毎のスライドを、組織学のために、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。レセプターのオートラジオグラフィーを、１μｍｏｌ／Ｌの（−）プロプラノロール、１００ｎｍｏｌ／ＬのＩＣＩ　１１８，５５１（β２選択性アンタゴニスト）または１００ｎｍｏｌ／ＬのＣＧＰ　２０７１２Ａ（β１選択性アンタゴニスト）の存在下において、２５℃で１５０分間にわたって、１００ｐｍｏｌ／ＬのＩＣＹＰを用いて、記載のように（Ｍａｔｔｈｅｗｓら、１９９４）実施して、非特異的結合、β１結合およびβ２結合を識別した。この画像を、コンピューター化された画像分析システム（ＭＣＩＤ、Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて定量し、そして１２５Ｉ標準で正規化した。非特異的な結合は、すべての結合のうちの１０％未満であった。
【０１６５】
（５．２．１．６　逆転写ポリメラーゼ連鎖反応およびサザンブロッティング）
β１−ＡＳ−ＯＤＮまたは逆位ＯＤＮの単回注射後の異なる時点において、ラットを安楽死させ、そして腎皮質を左腎より解剖し、ＲＮＡ後程組織貯蔵緩衝液（ＲＮＡ　ｌａｔｅｒ　ｔｉｓｓｕｅ　ｓｔｏｒａｇｅ　ｂｕｆｆｅｒ）（Ａｍｂｉｏｎ）に直ぐに浸漬し、そして−２０℃で貯蔵した。総ＲＮＡをＲＮＡｗｉｚ試薬（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて抽出し、そして分光光度計によって定量した。各時点由来の４〜５匹のラット由来のＲＮＡサンプルをプールした。ＲＮＡ（５μｇ）を、ＤＮａｓｅＩによって消化し、そして４２℃で５０分、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）によって逆転写し、そして逆転写（ＲＴ）産物の１／２０を使用して、２０サイクルのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行なった。β１−ＡＲについてのＰＣＲプライマーは、５’−ＣＴＣＣＧＡＡＧＣＴＣＧＧＣＡＴＧＧ−３’（配列番号１９９）（正方向）および５’−ＧＣＡＣＧＴＣＴＡＣＣＧＡＡＧＴＣＣＡＧＡ−３’（配列番号２００）（逆方向）であり、ＡＵＧ開始コドンにわたる４３２ｂｐの産物を生じた。プレプロレニン（ｐｒｅｐｒｏｒｅｎｉｎ）についてのプライマーは、５’−ＡＧＧＣＡＧＴＧＡＣＣＣＴＣＡＡＣＡＴＴＡＣＣＡＧ−３’（配列番号２０１）（正方向）および５’−ＣＣＡＧＴＡＴＧＣＡＣＡＧＧＴＣＡＴＣＧＴＴＣＣＴ−３’（配列番号２０２）（逆方向）であり、３６２ｂｐの産物を生じた。
【０１６６】
ＧＡＰＤＨについてのプライマーは、５’−ＡＴＣＡＡＡＴＧＧＧＧＴＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧ−３’（配列番号２０３）（正方向）および５’−ＣＡＧＧＴＴＴＣＴＣＣＡＧＧＣＧＧＣＡＴＧＴＣＡＧ−３’（配列番号２０４）（逆方向）であり、５０５ｂｐの産物を生じた（Ｊｏら、１９９６）。ＲＴ−ＰＣＲ産物を、サザンブロッティングに供し、ソラレン−ビオチン標識ｃＤＮＡプローブでハイブリダイズさせ、そして非アイソトープキット（Ａｍｂｉｏｎ）で検出した。膜をｘ線フィルムに曝露した後、β１−ＡＲおよびプレプロレニンｍＲＮＡの強度をデンシトメトリーによって定量し、そしてＧＡＰＤＨ　ｍＲＮＡレベルで正規化した。研究を少なくとも２回繰り返した。
【０１６７】
（５．２．１．７　ＰＲＡおよび血漿ＡＮＧＩＩレベル）
ＰＲＡを、アンギオテンシンＩ（１２５Ｉ）ラジオイムノアッセイキット（ＤｕＰｏｎｔ）を用いて決定した。血漿ＡｎｇＩＩレベルを、以前に記載されるように（ＰｈｉｌｌｉｐｓおよびＫｉｍｕｒａ，１９８８）、ラジオイムノアッセイによって測定した。
【０１６８】
（５．２．１．８　統計学的分析）
値を平均値±ＳＥＭとして表した。差異は、Ｐ＜０．０５の値において統計学的に有意であると考えた。一元反復ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙ検定を使用して、ＡＳ−ＯＤＮ処置の前および後で、血圧を比較した。片側ｔ検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ　ｔ　ｔｅｓｔ）を使用して、Ｂ最大値１ＰＲＡおよび２群における血漿ＡｎｇＩＩレベルを比較した。
【０１６９】
（５．２．２　結果）
（５．２．２．１　カチオン性リポソームによるβ１−ＡＳ−ＯＤＮ送達の最適化）
ＡＳ−ＯＤＮの全身送達を、中性脂質ＤＯＰＥと混合した市販のカチオン性脂質ＤＯＴＡＰを用いて最適化した。以前の研究により、約２．０のＤＯＴＡＰ：ＤＮＡの電荷比がインビボおよびインビトロにおいて最も優れた遺伝子送達を達成したことが報告された（Ｙａｎｇら、１９９７およびＴｅｍｐｌｅｔｏｎら、１９９７）。従って、ＤＯＴＡＰ：ＯＤＮの５つの電荷比を、０．５ｍｇ／ｋｇ　β１−ＡＳ−ＯＤＮを静脈内に送達するために、０〜３．５まで変化させて試験した。リポソーム混合物の異なるバッチは、構造および粒子サイズにおいてわずかに異なることに注意すべきであり、このことは、送達効率に影響し得る。図７は、代表的な実験におけるＳＨＲの血圧に対する異なるリポソーム：ＯＤＮ電荷比（各比についてｎ＝６）の影響を示す。β１−ＡＳ−ＯＤＮ単独（すなわち、比０において）は、ＳＢＰを変化させなかったが、比０．５は、７〜８日間で、３３ｍｍＨｇまでＳＢＰを有意に減少させた。この比が増加するにつれて、低血圧の影響の期間は、リポソーム調製物ごとに変化したが、比１．５において２０日、そして比２．５および３．５において３３日に劇的に延長した。ＳＢＰにおける最大の低下は、比３．５（約２５ｍｍＨｇ）においてよりも、比１．５および２．５（約３５ｍｍＨｇ）においてより大きかった（表２）。従って、ＤＯＴＡＰ：ＯＤＮの最適な電荷比は、２．５であると決定した。引き続く実験において、２．０の供給比でリポソームを含む０．５ｍｇ／ｋｇ　β１−ＡＳ−ＯＤＮで注射したＳＨＲ（ｎ＝２４）を、ＳＢＰ、レセプターレベル、および末梢ＲＡＳにおける変化の時間経過について分析した。
【０１７０】
【表７】
2004502459.tif 000014
（５．２．２．２　腎皮質におけるβ−アドレナリン作用性レセプターに対するβ１−ＡＳ−ＯＤＮの効果）
腎皮質におけるβ−ＡＲ結合のスキャッチャード分析（図８Ａ、図８Ｂおよび図８Ｃ）は、７０％の総β−ＡＲを含むβ１−ＡＲは、コントロールラットにおいて主要なサブタイプであることを示した。β１−ＡＳ−ＯＤＮ注射後、β１−ＡＲのＢ最大は、４日目に３５％（ｐ＜０．０５）、１０日目に２９％（ｐ＜０．０５）、および１８日目に２３％、有意に減少し、そして４０日目に完全に回復した。腎臓におけるβ１−ＡＲ減少は、心臓におけるβ１−ＡＲ減少と一致し、そして両方とも、ＳＢＰにおける有意な低下（Ｐ＜０．０１）を伴った（図８）。対照的に、β２−ＡＲレベルは、影響されず（図８Ｂ）、いずれのサブタイプの親和性もまた影響されなかった。逆位ＯＤＮは、いずれのサブタイプにも影響しなかった（図８Ｃ）。
【０１７１】
同じラット由来の腎臓切片を、β−ＡＲの構造分布を示すために定量的オートラジオグラフィーに供した。β１サブタイプは、β−ＡＲレベルの約６０％を構成し、これは、腎皮質および髄質の外帯に主に局在する。β２サブタイプは、より低いレベルで腎臓においてより広く分布した。この結果は、以前の報告と一致していた（Ｓｕｍｍｅｒｓら、１９８５）。β１−ＡＳ−ＯＤＮ処置の４日後、腎臓におけるβ１サブタイプの全体の密度は、２３．５±２．１から１５．４±３．３ｆｍｏｌ／ｍｇまで有意に減少した（Ｐ＜０．０５）。腎皮質における減少は、より高い基底レベルのために特に明白であった。予期されるように、β２サブタイプの分布および濃度は、結合結果に従って変化しないままであった。これは、β１サブタイプに対するβ１−ＡＳ−ＯＤＮの阻害効果の特異性をさらに確認する。
【０１７２】
β１−ＡＳ−ＯＤＮが、ＲＮａｓｅＨ消化を誘導することによってβ１−ＡＲのｍＲＮＡレベルを減少させるか否かを実証するために、β１−ＡＳ−ＯＤＮが標的化されるＡＵＧ開始コドンに隣接するプライマー対を使用して、２０サイクルの半定量的ＲＴ−ＲＣＲＴＭを行ない、その後サザンブロッティングを行なった。β１−ＡＳ−ＯＤＮは、腎皮質における定常状態のβ１−ＡＲ　ｍＲＮＡのレベルを減少させず、このことは、β１−ＡＲ発現の阻害が、転写レベルではないことを示す。
【０１７３】
（５．２．２．３　末梢ＲＡＳに対するβ１−ＡＳ−ＯＤＮの効果）
ＲＴ−ＰＣＲＴＭは、腎皮質におけるプレプロレニンｍＲＮＡレベルが、β１−ＡＳ−ＯＤＮ注射の４日後に、コントロールの６２％に一過的に減少した。これは、１８日目までに完全に逆転した（図９Ａ）。逆に、ＰＲＡおよび血漿ＩＩレベルは、異なる減少のパターンを示し、これは、４日目ではなく、１０日目および１８日目に有意に減少した（Ｐ＜０．０１）。従って、ＰＲＡおよびＡｎｇＩＩは、レニンｍＲＮＡにおける減少と比較して、遅れた作用を有するようである（図９Ｂ）。
【０１７４】
（５．２．３　要旨）
β１−アドレナリン作用性レセプターはまた、腎臓からのレニンの発現および分泌に関与するので、本研究を、末梢ＲＡＳに対するβ１−ＡＳ−ＯＤＮの影響および血圧の減少に対するその寄与を評価するために設計した。さらに、３３日目までの低血圧性作用の有意な改善を、カチオン性リポソームを用いてβ１−ＡＳ−ＯＤＮの送達を最適化することによって達成した。
【０１７５】
βブロッカーは、３０年間、高血圧症を処置するために使用されている。これらの抗高血圧性効果の理由は、ほとんど明確になっていないままであるが、レニン放出の阻害が、主要な機構とみなされる。多数のβブロッカーは、患者および実験動物においてＰＲＡを減少させ得る（Ｂｌｕｍｅｎｆｅｌｄら、１９９９およびＨｏｌｍｅｒら、１９９４）。それらは、より高度なレニンプロフィールを有する患者に、より効果的であることが見出されている（Ｂｕｈｌｅｒ、１９８８）。本研究において、β１−ＡＳ−ＯＤＮが長期においてＰＲＡおよびＡｎｇ　ＩＩを効果的に減少させることが見出された。しかし、このＰＲＡおよびＡｎｇ　ＩＩの減少は、注射後２日目の心拍出量における急速な低下とは対照的に、β１−ＡＳ−ＯＤＮの注射後約１０日目まで起こらなかった。従って、腎臓レニンおよび循環中のＲＡＳに対するβ１−ＡＳ−ＯＤＮの影響は、心臓の作用に対するよりも遅れるようである。心拍出量の抑制は、β１−ＡＳ−ＯＤＮの抗高血圧性効果の初期段階を説明し得、それ故、レニン−アンギオテンシン活性の阻害は、ＳＨＲにおける血圧の持続性の低下を支持する二次機構として働く。
【０１７６】
レセプター結合アッセイは、β１−ＡＳ−ＯＤＮが、１８日間で、腎臓皮質において約３０％β１−ＡＲレベルを減少させることを示した。これは、大きさおよび時間経過において、心室でのβ１−ＡＲの減少と一致している。これは、カチオン性リポソームによって送達されるβ１−ＡＳ−ＯＤＮが、静脈内注射の後に末梢器官まで急速に輸送され、そして比較できる程度まで、心臓および腎臓の細胞に効果的に取り込まれることを示唆している。いくつかの機構が、標的タンパク質の発現のＡＳ−ＯＤＮ阻害について提唱されている。１つは、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖のＲＮａｓｅ　Ｈ消化から生じるｍＲＮＡレベルの減少を含む（Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、１９９６およびＰｈｉｌｌｉｐｓら、１９９７）。この仮定を試験するために、ＡＳ−ＯＤＮが結合するβ１−ＡＲ　ｍＲＮＡのＡＵＧ開始コドンに隣接するプライマーの対を設計して、半定量ＲＴ−ＰＣＲＴＭを行った。結果に示されるように、ＲＴ−ＰＣＲＴＭ産物の減少はなく、このことから、ＲＮａｓｅ　Ｈ作用が存在しないことが示された。従って、β１−ＡＲ発現の阻害は、おそらく、転写段階後に起こる。
【０１７７】
腎臓におけるβ１−ＡＲレベルの低下によって、β１−ＡＳ−ＯＤＮは、ＰＲＡレベル、続く血漿Ａｎｇ　ＩＩレベルを有意に低下させる。しかし、これは、レニン発現の阻害を通してではないようである。なぜなら、レニンｍＲＮＡレベルの長期の低下がないからである。代わりに、β１−ＡＳ−ＯＤＮは、レニン分泌または不活性なレニンの活性なレニンへの転換に対して、その阻害性の影響を及ぼし得る。この仮定は、レニン発現のβ−アドレナリン作用性刺激作用がレニン分泌の時間経過とは異なる時間経過を有するという観察と一致している（Ｈｏｌｍｅｒら、１９９７およびＣｈｅｎら、１９９３）。さらに、βブロッカーは、プロレニンのプロセシングを減少させて、血漿における総レニン（プロレニン＋ＰＲＡ）レベルを変化させることなくレニンを活性化させることが示されている（Ｂｌｕｍｅｎｆｅｌｄ、１９９９）。
【０１７８】
効率的な遺伝子送達は、インビボでのＡＳ−ＯＤＮの治療的適用に重要である。非ウイルス性ベクターの間で、カチオン性リポソームが、最も広範に使用される。これらは、安全で、非免疫原性であり、かつ大規模に生成するのが容易である。しかしながら、比較的低いトランスフェクション効率が、静脈内投与後に得られ、これは、主に、血清によるカチオン性リポソームの不活性化のためである。ＤＮＡに対するリポソームの電荷比（±）の増大および長期のインキュベーション時間によるリポソーム−ＤＮＡ複合体の成熟の誘導がこの問題を克服し得ることが、近年示された（Ｙａｎｇら、１９９７；１９９８）。ＤＯＴＡＰ：ＤＮＡの最適な電荷比は、約２であると決定された（Ｙａｎｇら、１９９７およびＴｅｍｐｌｅｔｏｎら、１９９７）。従って、５つの電荷比を、ＡＳ−ＯＤＮ送達を最適化するために、０〜３．５の範囲で試験した。結果に示されるように、電荷比を増加させることは、送達効率を改善するだけでなく、β１−ＡＳ−ＯＤＮ作用の持続時間も延長する。最良の抗高血圧性の結果（３３日間で−３５ｍｍＨｇ）は、比率２．５で一貫して達成された。
【０１７９】
要約すると、単回静脈内注射においてカチオン性リポソームを用いて送達されたβ１−ＡＳ−ＯＤＮは、ＳＨＲにおいて顕著でかつ持続した低血圧性効果を達成する（３３日間で３０〜３５ｍｍＨｇ）。β１−ＡＳ−ＯＤＮは、いずれの現在の薬物よりも明確に長い持続性であり、β２−アドレナリン作用性レセプターを阻害しないか、または血液脳関門を通過せず、そして心拍数に無視できるほどにしか影響を及ぼさない。従って、このアンチセンスは、現在使用されているβブロッカーよりも副作用が低いようである。初期の心筋収縮能の阻害と、その後のレニン放出の減少は、その抗高血圧性効果に寄与する重要な機構である。
【０１８０】
（５．３　実施例３　アンチセンス化合物を使用した高血圧症の処置）
（５．３．１　材料および方法）
（５．３．１．１　アンチセンス設計および投与）
ＡＳ−ＯＤＮおよび逆方向ＯＤＮコントロールは、１５マーであり、これを、ラットβ１−アドレノレセプターｍＲＮＡ（Ｍａｃｈｉｄａら、１９９０）のＡＵＧ開始コドンに標的化した。ＡＳ−ＯＤＮの配列は、５’−ＣＣＧＣＧＣＣＣＡＴＧＣＣＧＡ−３’（配列番号１）であり、そして、逆方向ＯＤＮの配列は、５’−ＡＧＣＣＧＴＡＣＣＣＧＣＧＣＣ−３’（配列番号１３８）であった。このＡＳ−ＯＤＮを、ＳＨＲにおける心臓β１−ＡＲ阻害および血圧の減少の強度に基づいて、β１−アドレノレセプターｍＲＮＡの異なる領域に標的化された６つのＡＳ候補から選択した。これらのオリゴヌクレオチドを、骨格のホスホロチオエート化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｉｏｎ）によって改変した。カチオン性リポソームを用いて送達されたＯＤＮを、舌静脈に注射した。
【０１８１】
（５．３．１．２　リポソームおよびＯＤＮ／リポソーム複合体の調製）
カチオン性脂質である１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）を、ヘルパー脂質Ｌ−αジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ，Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏｌａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ）と、１：１のモル比で混合し、簡単に超音波処理し、そして使用するまで４℃で保存した。リポソームの平均直径は２００〜３５０ｎｍである（ＴａｎｇおよびＨｕｇｈｅｓ、１９９８）。ＯＤＮ／リポソーム複合体を、所望量のＯＤＮをＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥと、水中の５％デキストロース（重量／容量）における３００μｇ／ｍｌの最終ＤＮＡ濃度まで混合することによって、使用日に調製し、そして室温で６０分間インキュベートした。２つのＤＮＡ／脂質モル比（すなわち、１：０．５および１：２．５）を各研究において使用した。
【０１８２】
（５．３．１．３　動物の手術）
成体雄性のＳＨＲ（２５０〜３５０ｇ、Ｈａｒｌａｎ）を、１２時間の明暗サイクルを用いて、研究室内のかごに入れて飼育した。動物に、標準的な実験用ラット固形飼料および水を自由に与えた。
【０１８３】
（５．３．１．４　遠隔測定用センサー移植）
移植前に、各無線送信器（ＴＡ１１ＰＡ−Ｃ４０，Ｄａｔａ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のゼロ点が、４ｍｍＨｇ以下であることを確認した。ＳＨＲを、１００ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび１５ｍｇ／ｋｇのキシラジンで麻酔し、そして正中腹部切開を行った。次いで、流体を充填したカテーテルを、右大腿動脈に挿入し、そしてカテーテルの先端を、腎動脈に対して尾部の腹大動脈に置いた。移植されたラットを１週間回復させた。
【０１８４】
（５．３．１．５　頸静脈カニューレ挿入）
遠隔測定移植の１週間後に、ラットを麻酔し、ＰＥ　５０製の曲線状カニューレおよびビニールチューブを、頸静脈の外枝に挿入した。このチューブを、頚部の皮膚の下に配置し、そして薬物注入を可能にするために背部に露出させた。ラットを、実験前に２４時間回復させた。このカテーテルに、毎日１００Ｕのヘパリンを流し、詰まるのを防いだ。
【０１８５】
（５．３．１．６　膜調製およびβ−ＡＲ結合アッセイ）
生理食塩水（ｎ＝６）もしくは１ｍｇ／ｋｇの逆方向ＯＤＮ（ｎ＝６）の静脈内注射の４日後、または１ｍｇ／ｋｇのβ１−ＡＳ−ＯＤＮ（ｎ＝２４）の注射の２日後、４日後、１０日後、１８日後に、動物を屠殺し、以前に記載されたように、膜を心室から調製した（ＢａｋｅｒおよびＰｉｔｈａ、１９８２）。飽和研究のために、１００μｇの膜タンパク質を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　７．４）、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む総容量２５０μｌ中の６つの濃度の１２５Ｉ−（−）ヨードシアノピンドロール（Ｉ−ＣＹＰ，ＮＥＮ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，６．２５〜１００ｐＭ）と共に、３６℃にて６０分間、３連でインキュベートした。非特異的結合レベルおよびβ２−アドレノレセプター結合レベルを、それぞれ、１μＭの（±）−アルプレノロールおよび１５０ｎＭのＣＧＰ２０７１２Ａ（ＲＢＩ）の存在下で決定した。次いで、反応混合物を、Ｂｒａｎｄｅｌハーベスターを使用して、Ｗｈａｔｍａｎ　ＧＦ／Ｂガラス繊維フィルターに通し、結合された放射活性を１分間カウントした。
【０１８６】
（５．３．１．７　組織調製および定量オートラジオグラフィー）
１ｍｇ／ｋｇのβ１−ＡＳ−ＯＤＮ（ｎ＝６）または生理食塩水（ｎ＝６）の注射の４日後に、ラットを屠殺し、そして組織を取り出してドライアイス中で凍結させた。脳の冠状切片、心臓の水平切片および腎臓の矢状切片（２０μｍ）を、−２０℃でクリオスタット（Ｍｉｃｒｏｍ）で切断し、顕微鏡用スライドに乗せた。全ての７つのスライドを、組織学のために、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。組織切片を、０．１　ｍＭのグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、０．１ｍＭのアスコルビン酸および１０Ｍのフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含有する、クレブス緩衝液（ＮａＣｌ　１１８．４ｍＭ、ＫＣ１　４．７ｍＭ、ＭｇＳＯ４　１．２ｍＭ、ＣａＣｌ２　１．２７ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４　１０．０ｍＭ、ｐＨ　７．１）中で、２５℃にて３０分間プレインキュベートした。次いで、切片を、１μＭ（−）プロプラノロール、１００ｎＭ　ＩＣＩ１１８，５５１（β２−選択的アンタゴニスト）または１００ｎＭ　ＣＧＰ２０７１２Ａ（β１−選択的アンタゴニスト）の存在下で、１００ｐＭ　Ｉ−ＣＹＰと共に、０．１ｍＭのアスコルビン酸および１０ｐＭ　ＰＭＳＦを含有するクレブス緩衝液中で、２５℃にて１５０分間インキュベートし、非特異的結合、β１−結合およびβ２−結合を区別した。標識された切片を、同じ緩衝液でリンスし、続いて、緩衝液中で３７℃にて１５分間、２回洗浄し、そして２５℃にて蒸留水でリンスした（Ｍａｔｔｈｅｗｓら、１９９４）。次いで、乾燥した切片をＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ　Ｂｉｏｍａｘ−ＭＲ）に露光した。画像を、コンピューター化画像分析システム（ＭＣＩＤ，Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で定量化し、１２５Ｉ基準を用いて正規化した。非特異的結合は、全体の結合の１０％未満であった。
【０１８７】
（５．３．１．８　β刺激作用に対応する心血管パラメータに対するβ１−ＡＳおよびアテノロールの影響の決定）
（５．３．１．８．１　ランゲンドルフ心臓灌流）
１ｍｇ／ｋｇのβ１−ＡＳ−ＯＤＮ（ｎ＝９）または逆方向ＯＤＮ（ｎ＝６）の注射の４８時間後に、ＳＨＲを麻酔しそして屠殺した。心臓をすばやく取り出し、そして酸素化したクロブス緩衝液（１１８ｍＭ　ＮａＣｌ、１８．７５ｍＭ　ＮａＨＣＯ３、１．２ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、４．７ｍＭ　ＫＣ１、１．２ｍＭ　ＭｇＳＯ４、１．２５ｍＭ　ＣａＣｌ２、１１．１ｍＭ　グルコース、０．０１ｍＭ　ＥＤＴＡ）を用いて、３６℃にて７．０ｍｌ／分の一定流量で、大動脈を介して灌流させた。冠動脈灌流圧（ＣＰＰ）を、大動脈の近位に配置され、かつ圧力変換器（Ｇｏｕｌｄ　Ｓｔａｔｈａｍ　Ｐ２３ＩＤ）に接続されているカテーテルを介して測定した。水で充填され、かつ圧力変換器に接続されているラテックスバルーンを、左心房を通して左心室に挿入して、左心室拡張終末期圧力（ＬＶＥＤＰ）、左心室収縮期圧力（ＬＶＳＰ）および発生した左心室圧力（ｄＬＶＰ）（ｄＬＶＰ＝ＬＶＳＰ−ＬＶＥＤＰ）を測定した。平衡中のＬＶＥＤＰを、５〜７ｍｍＨｇに設定した。ＣＰＰ、ＬＶＥＤＰおよびＬＶＳＰを、４チャネルレコーダ（Ａｓｔｒｏ−Ｍｅｄ）に連続的に記録した。ｄＬＶＰおよび心拍数（ＨＲ）に関するベースラインが５分間安定になった後、イソプロテレノール（ＩＳＯ，非特異的β−アゴニスト）を、タキフィラキシーの影響を回避するように、０．０１μＭ、０．０２５μＭ、０．０５μＭ、０．１２μＭで、１０分間の時間間隔を置いて与えた。
【０１８８】
（５．３．１．８．２　生存動物の遠隔測定モニタリング）
心臓ｄＰ／ｄｔｍａｘ、ＨＲおよび収縮期血圧（ＳＢＰ）に対するβ１−ＡＳ−ＯＤＮおよびアテノロールの影響を、同じ群のＳＨＲ（ｎ＝４）において比較した。頚静脈のカテーテル挿入の２日後に、コントロール値を取り、１ｍｇ／ｋｇのβ１−ＡＳ−ＯＤＮを注射した。４８時間後、ラットを、β１−ＡＳ−ＯＤＮの影響について試験した。これらのラットを、全ての心血管パラメータがコントロール値に戻るまで回復させた。次いで、１ｍｇ／ｋｇアテノロール（β１−選択的アンタゴニスト）を注射し、そしてラット３０分後に試験した。β１−刺激作用に関して、ＳＨＲに、頚静脈カテーテルを介して、５μｇ／ｋｇ／分、１０μｇ／ｋｇ／分、２０μｇ／ｋｇ／分、４０μｇ／ｋｇ／分でドブタミン（β１−選択的アンタゴニスト）を注入した。各用量を、タキフィラキシーの影響を回避するように全ての心血管パラメータがベースラインに戻るまで、５分間連続的に１時間の時間間隔で与えた。ＢＰおよびＨＲを、１分毎にサンプリングした。ｄＰ／ｄｔｍａｘを、リンス相圧力曲線の傾きから算出し、そして分毎に決定した。各用量における値とベースラインとの間の差異をΔとして示した。
【０１８９】
（５．３．１．９　血圧のモニタリング）
（５．３．１．９．１　遠隔測定）
各ラットのかごを、心血管パラメータの測定のために、レザバ（ＲＬＡ１０２０，Ｄａｔａ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に置いた。データを、コンピューターベースのデータ獲得プログラム（Ｄａｔａｑｕｅｓｔ　ＬａｂＰＲ０３．０；Ｄａｔａ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて得た。ＢＰおよびＨＲを、１０分毎に測定し、１〜２４時間毎に平均化した。処置の前に、ＳＨＲを１週間モニタリングして、安定なベースラインを得た。
【０１９０】
（５．３．１．９．２　尾部カフ（ｔａｉｌｃｕｆｆ））
ラットを、加熱パッドにより、かごの中で２０〜３０分間暖めた。温度を３５〜３７℃に制御した。次いで、ラットを、３７℃に保たれたプラスチックの拘束器に置いた。空気式のパルスセンサーを尾部に装着した。カフ膨張の後に、ＳＢＰを、圧力曲線の下行側で、最初の拍動性振動として決定した。ＨＲを、単位時間あたりのパルス数の手動カウントによって決定した。ＢＰおよびＨＲを、Ｎａｒｃｏフィジオグラフ（ｐｈｙｓｉｏｇｒａｐｈ）によって記録した。各ラットのデータ値を、少なくとも４つの安定な読み出しの平均として得た。ベースラインを、アンチセンス投与前の測定の３日間の平均によって決定した。
【０１９１】
（５．３．１．１０　統計学的解析）
値を、平均±ＳＥＭとして表した。差異をｐ＜０．０５で統計学的に有意とみなした。不対のｔ検定を使用して、２つの群におけるＢｍａｘ、ｄＬＶＰおよびＢＰを比較した。一方向性の反復ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙ試験を、異なる群におけるドブタミンの注入の際のΔｄＰ／ｄｔおよびΔＨＲを比較するために使用した。ピアソン積モーメント相関を使用して、β１−アドレノレセプターＢｍａｘとｄＬＶＰとの間の関係を評価した。
【０１９２】
（５．３．２　結果）
（５．３．２．１　心臓β−アドレノレセプター密度の影響）
カチオン性リポソームを用いて送達された１ｍｇ／ｋｇのβ１−ＡＳ−ＯＤＮを、１：２．５のモル比で単回静脈内注射することは、１８日間で、ＳＨＲ心臓におけるβ１−アドレノレセプターの密度を有意に減少させた（Ｐ＜０．０１）。低下は、４日目でその４７％、１０日目で３３％の最大値であり、１８日目に２９％を維持した。対照的に、β２−アドレノレセプターのＢｍａｘの有意な変化は、存在しなかった。両方のサブタイプのＫＤは、未変更のままであった（表５）。結果的に、心室におけるβ１／β２サブタイプの比は、β１−ＡＳ−ＯＤＮによって約７０／３０から約５０／５０まで減少された。逆方向ＯＤＮは、どちらのサブタイプに対しても影響を及ぼさなかった。
【０１９３】
（表５．生理食塩水、逆方向ＯＤＮまたはβ１−ＡＳ−ＯＤＮでの処置の４日後のＳＨＲの心室におけるβ１−アドレノレセプターおよびβ２−アドレノレセプターのＢｍａｘおよびＫＤ）
【０１９４】
【表８】
2004502459.tif 000015
データは、各群（Ｎ＝６〜１０）の平均±ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０１　対　生理食塩水コントロール。
【０１９５】
（５．３．２．２　β刺激に対する応答における心収縮性および心拍に対する効果）
１ｍｇ／ｋｇのβ１−ＡＳ−ＯＤＮの注射の４８時間後、β刺激に対する心筋収縮性および変時性の応答を、インビトロおよびインビボでＳＨＲにおいて決定した。
【０１９６】
第１に、単離した心臓を、ＩＳＯの漸増用量で灌流し、心拍および収縮性をβアドレノセプターを活性化することによって増強した。ｄＬＶＰ−ＩＳＯ用量応答曲線（ＩＳＯの陽性の筋収縮性効果を反映していた）は、β１−ＡＳ−ＯＤＮ（Ｐ＜０．０２）により有意にシフトした。心拍は、有意には減少しなかった。
【０１９７】
インビトロでの試験を、無線遠隔測定によりモニターした意識のあるＳＨＲにおいて行った。β１−ＡＳ−ＯＤＮは、ドブタミン（β１−選択アゴニスト）に逆らって、有意に（Ｐ＜０．０２）、ｄＰ／ｄｔｍａｘの増加を鈍らせた。心拍における変化は、有意に減少しなかったが、これは単離され灌流された心臓における結果の反響であった。他方、ドブタミンに対する血圧の応答は、二相性であった。ドブタミンは、ＳＢＰを、低灌流速度で５〜８ｍｍＨｇだけ上昇させ、そしてより高速でＳＰＢを減少させた。これは、おそらく、高用量でのドブタミンの部分的β２−アゴニスト性（ａｒｇｏｎｉｓｔｉｃ）活性およびその結果としての血圧に対する血管拡張性効果に起因する。β１−ＡＳ−ＯＤＮと比較して、１ｍｇ／ｋｇのアテノロールは、注射後の５時間の間、ΔｄＰ／ｄｔｍａｘおよびΔＨＲにおけるより顕著な減少を生じた。さらに、安静時ｄＰ／ｄｔｍａｘを減少させ（２４５０±２９５ｍｍＨｇ／秒、これに対して、コントロールは２９３７±２７７ｍｍＨｇ／秒）、そして徐脈を引き起こし（２９５±１２ｂｐｍ、これに対して、コントロールは３６５±８ｂｐｍ）（Ｐ＜０．０５）、一方、β１−ＡＳは、安静時の収縮性（２９２２±２４９ｍｍＨｇ／秒）もしくは心拍（３６５±１２ｂｐｍ）を変化させなかった。しかし、ΔｄＰ／ｄｔｍａｘおよびΔＨＲに対するアテノロールの効果は、一過的であった。アテノロール投与後の２４時間以内に、ドブタミンの筋収縮性および変時性の効果は、コントロールレベルに戻った。
【０１９８】
（５．３．２．３　ＳＨＲの血圧に対する効果）
テールカフ（ｔａｉｌｃｕｆｆ）法によって測定されたＳＨＲの血圧に対する１ｍｇ／ｋｇのβ１−ＡＳ−ＯＤＮの単回の注射の効果を観察した。ＡＳ−ＯＤＮを、ＤＮＡ／脂質の異なるモル比で（すなわち、１：０．５および１：２．５）カチオン性リポソームで送達した。リポソームとともに１：０．５の比で送達したβ１−ＡＳ−ＯＤＮは、ＳＢＰを８日間減少させた。その最大の減少は、３８±５ｍｍＨｇであった。モル比が、１：２．５に増大したとき、この低血圧効果は、劇的に２０日まで延長した。逆位ＯＤＮでは何らの効果も見られなかった。
【０１９９】
β１−ＡＳ−ＯＤＮおよびアテノロールの効果を比較するために、無線遠隔測定を使用して、血圧および心拍を規則的にモニタした。リポソームとともに１：０．５の比で送達した１ｍｇ／ｋｇのβ１−ＡＳ−ＯＤＮは、平均血圧において１５ｍｍＨｇの最大の減少を生じた。その抗高血圧効果は、８日間持続し、これは、テールカフで測定した結果と一致していた。心拍は、有意には変化しなかった。ＡＳ−ＯＤＮとは対照的に、１ｍｇ／ｋｇのアテノロールにより引き起こされた低血圧効果の開始は、注射の２０分後という速さで生じ、それはわずか１０時間持続したにすぎなかった。さらに、アテノロールは、平均で−７５ｂｐｍまでの顕著な徐脈を引き起こした。
【０２００】
（５．３．２．４　脳、心臓、および腎臓におけるβアドレノセプター分布に対する効果）
脳、心臓、および腎臓における６〜１８個の組織切片の定量的なオートラジオグラフィーを、静脈内β１−ＡＳ−ＯＤＮ投与の４日後に分析した。前脳および脳幹領域におけるβアドレノセプターの分布における変化は、検出されなかった。これは、ＣＮＳにおけるβアドレノセプター発現に対するアンチセンス効果がないことを示した。しかし、β１−ＡＳ−ＯＤＮは、有意に（Ｐ＜０．０５）、心室（３０．２±２．１から２０．６±２．５ｆｍｏｌ／ｍｇへ）および腎皮質（２６．４±３．１から１７．４±３．３ｆｍｏｌ／ｍｇへ）におけるβ１−アドレノセプター密度を減少させた。これは、結合結果と一致していた。β２−アドレノセプターは、如何なる組織においても影響されなかった。
【０２０１】
（５．３．３　要旨）
この実施例は、高血圧のモデルにおいて高血圧に対するβ１−ＡＳ−ＯＤＮ組成物の効果を、伝統的なβ−ブロッカー様式を使用することと比較して、実証した。β１−ＡＳ−ＯＤＮは、β１−アドレナリン作用性活性をノックダウンし、血圧の長期の減衰をもたらした。その結果は、β１−ＡＳ−ＯＤＮが、インビトロおよびインビボで、β１−刺激の後にβ１−アドレノセプター密度および心収縮を減少させ、そしてＳＨＲの高血圧を低下させたことを示した。これらの知見は、β１−ＡＳが、β１−アドレノセプター発現の阻害が、心臓、腎臓、および他の組織の、交感神経の活性化（これは、高血圧における主要な寄与ファクターである）に対する感受性を減少させ得るという仮定と一致する。β１−ＡＳ−ＯＤＮの単回の注射は、効果的に、心臓のβ１−アドレノセプター密度を減少させ、これはβ刺激に応答しての心室の収縮性および心拍出量の減少を伴った。ＳＨＲにおける抗高血圧効果は、２０日間持続する３８ｍｍＨｇまでの減少であった。
【０２０２】
β１−ＡＳ−ＯＤＮの処置は、心臓のβ１−アドレノセプター密度を、４日間で約５０％減少させた。βアドレノセプターの半減期に関する文献においてかなりのバリエーションが報告されている（ＢａｋｅｒおよびＰｉｔｈａ、１９８２；ＮｅｖｅおよびＭｏｌｉｎｏｆｆ、１９８６；Ｗｉｎｔｅｒら、１９８８）。ＡＳ−ＯＤＮ阻害を伴う結果から、心臓のβ１−アドレノセプターの半減期は、約２〜４日であり、βアドレノセプター密度を４日以内で５０％減少させる。
【０２０３】
血圧のテールカフおよび無線遠隔測定の両方は、アンチセンス処置後、有意な減少を示した。ＳＨＲは、テールカフ対無線遠隔測定に供した場合、β１−ＡＳ−ＯＤＮに対して、低血圧のより大きな程度まで応答した。さらに、テールカフで測定した基線は、同じラットにおいて、２０〜３０ｍｍＨｇだけ無線遠隔測定での基線よりも一貫して高かった。Ｂａｚｉｌら（１９９３）は、同様の現象を報告した。彼らは、無線遠隔測定、テールカフ、および動脈カテーテルによって記録された心血管パラメータを比較し、そしてテールカフでのカプトプリルのより感受性の高い低血圧効果を観察した。血圧のテールカフ測定は、ラットの殴打および監禁を含む。β１−ＡＳは、交感神経の活性の抑制を通して、動物の血圧をストレス下でより効率的に減少させ得ると考えられる。
【０２０４】
カチオン性リポソームは、遺伝子送達のための有効なビヒクルである。リポソームの捕捉は、細胞のＤＮＡ取り込みを改善するだけでなく、分解からＤＮＡを保護し、そしてその循環時間を延長させる（Ａｌｌｅｎ、１９９７；Ｌｉｕら、１９９７）。多数の要因（例えば、ＤＮＡ／脂質比、脂質と調製手順の選択）が、カチオン性リポソームにより媒介される静脈内遺伝子送達の効率に影響を及ぼす（Ｌｉｕら、１９９７；ＹａｎｇおよびＨｕａｎｇ、１９９８）。広範に使用される脂質処方物であるＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥを使用して、β１−ＡＳ−ＯＤＮを４つのモル比で（１：０．５、１：１．５、１：２．５、および１：３．５）で送達した。最適な比１：２．５を、抗高血圧効果の持続時間および大きさに基づいて決定した。３８ｍｍＨｇで２０日までという血圧の顕著かつ長期の減少が、この比で達成され、この後に、４日目で最大４７％まで、１０日目で３３％、そして１８日目で２９％まで、β１−アドレノセプター結合における減少があった。これは、β１−ＡＳ−ＯＤＮが、血圧に関与する機能的に活性なレセプターを効率的に阻害することを意味する。
【０２０５】
毛細血管内皮により形成される血液脳関門は、６００Ｄａより小さい分子量を有する小さい親油性分子に対してのみ透過性である（Ｐａｄｒｉｄｇｅ、１９９８）。それらの高親水性に起因して、ＯＤＮは、血液脳関門を通しての無視できる輸送を行い、そしてＣＮＳに対する非常に限定されたアクセスを有する（Ａｇｒａｗａｌら、１９９１）。蛍光標識を有するＤＮＡ／リポソーム複合体の細胞および器官の分布は、以前にマウスにおいて静脈内注射の後に研究され、そしてその結果は、その複合体が、肺、心臓、腎臓、および脾臓を含むほとんどの末梢器官において主に毛細血管内皮細胞によって取り込まれるが、脳には存在しないことを示した（ＭｃＬｅａｎら、１９９７）。末梢投与後のリポソームの脳維持を、いくつかの症例において観察したが、これは、脳の微小血管内における捕捉のためである（Ｓｃｈａｃｋｅｒｔら、１９８９）。本研究において、脳におけるオートラジオグラフィーは、静脈内β１−ＡＳ−ＯＤＮ注射後、βアドレノセプターの発現および分布における検出可能な変化を表さなかった。これは、アンチセンス様式が、ＣＮＳ効果を生じないというさらなる証拠を提供する。
【０２０６】
遺伝子配列に基づく高い特異性は、アンチセンスを、多数の研究および臨床試験において益々有用なツールにした。その成功は、最初のアンチセンスドラッグであるＶｉｔｒｏｖｅｎｅの、ＦＤＡによる最近の承認によって明白になった。本研究において、β１−ＡＳ−ＯＤＮは、β２−アドレノセプターを変化させることなく、β１−ＡＲ発現を阻害し、これは、β１−ＡＳ−ＯＤＮ選択配列の特異性を実証した。
【０２０７】
慢性心不全の患者において、その疾患の重篤度は、心臓β−ＡＲ密度および機能的応答性における減少と密接に関連する（Ｂｒｏｗｎら、１９９２）。β１−ＡＳ−ＯＤＮで処置されたＳＨＲにおいて、β１−アドレノセプター媒介陽性筋収縮性応答の顕著な減少が、インビトロおよびインビボにおいて、心臓β１−ＡＲレベルの減少と同時に、観察された。したがって、これらの結果は、心臓β１−ＡＲ数と機能的感受性との間の正の相関を示した（相関効率＞０．９０、Ｐ＜０．０１）。
【０２０８】
血圧の大きな減少にも関わらず、反射性頻脈はアンチセンス処置後に観察されなかった。しかし、心拍に対するβ１−ＡＳ−ＯＤＮの抑制的効果は、その陰性の筋収縮性応答よりも有意ではなかった。これについての理由は、未だ調査中である。いくつかの可能性が考えられ得る。第一に、β１−ＡＳ−ＯＤＮは、β２−アドレノセプターに影響を及ぼさなかった。これは、心拍の調節において重要な役割を果たした（Ｋａｕｍａｎｎ、１９８６；Ｒｏｄｅｆｅｌｄら、１９９６）が、心臓の収縮には関与していなかった。第二に、β１−ＡＲ発現のアンチセンス阻害は、徐々にであり、そしてβブロッカーより低い程度にである。β１−ＡＲが、収縮性よりも心拍を制御するために、大きな予備を有し得ることもまた可能である。最後に、証拠により、心筋細胞は、優先的にＡＳ−ＯＤＮを取り込むのに対して、ペースメーカー細胞は、それよりも効率的ではないことが示唆される。
【０２０９】
β１−ＡＳ−ＯＤＮの心血管効果を、親水性β１−選択性アンタゴニストであるアテノロールと比較した。β１−ＡＳ−ＯＤＮは、アテノロールに対して、血圧を下げ、正常心拍を維持することにおいて有利であることを示した。β１−ＡＳ−ＯＤＮ作用の開始はアテノロールよりも遅かったが、アテノロールでの１日未満と比較してはるかに長い２０日間持続した。さらに、β１−ＡＳ−ＯＤＮは、心拍に影響を与えなかったが、アテノロールは、感知されうる徐脈を引き起こした。徐脈は、この薬物を摂取している患者による一般的な苦情である。アテノロールはまた、安静時の心室収縮性および心拍を減少し、それにより安静時の心臓の拍出量を減少させた。β１−ＡＳ−ＯＤＮは、安静時の心臓の性能を変化させないようである。ここに示す結果は、β１−ＡＳ−ＯＤＮが、現在使用されるβブロッカーに対して、長期の血圧減少ならびにβ２−アドレノセプターおよびＣＮＳに対する効果がないことの両方において、有意な改善を提供することを示唆する。
【０２１０】
（５．４　実施例４　β１−ＡＲ　ｍＲＮＡに指向されたアンチセンス組成物による心筋虚血潅流誘導性心臓機能障害に対する防御）
急性心筋虚血は、血漿カテコールアミンレベルの有意な増大を引き起こし、これは、虚血心筋障害の悪化を導く（Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍら、１９７８；Ｒｏｎａ，１９８５）。悪化する心筋虚血は、心臓機能障害における重要なファクターである。急性の心筋虚血はまた、急性虚血の間の心筋におけるβ１−ＡＲの感受性の増加によって特徴付けられる（Ｓｔｒａｓｓｅｒｅら、１９９０）。β−ＡＲは、交感神経系と心血管系との間に界面を形成する（Ｓｔｒａｓｓｅｒｅら、１９９０；Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅら、１９７９；Ｍａｉｓｅｌら、１９８５）。重要なことに、β１−ＡＲサブタイプ１（β１−ＡＲ）は、これまでのところ、心筋において優勢なβ−ＡＲであり（Ｍｉｎｎｅｍａｎら、１９９５）、そしてその活性および感受性は、心臓機能をアデニリルシクラーゼ活性によって調節すると考えられる（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅら、１９７９；Ｔｈａｎｄｒｏｙｅｎら、１９８６；Ｂｏｈｍ，１９９５）。いくつかの研究がβ１−ＡＲの密度が増大し、そしてβ１−ＡＲ　ｍＲＮＡの発現が、急性虚血後に心筋において増強されることを示している（Ｍａｉｓｅｌら、１９８５；Ｋａｒｌｉｎｅｒら、１９８９；Ｉｈｌ−Ｖａｈｌら、１９９５）。実験および臨床結果もまた、β−ＡＲの遮断、特に、β１−ＡＲの選択的遮断が、心筋を虚血傷害および心臓の機能不全に対して防御し得ること（Ｓｃｈｕｌｚら、１９９５；Ａｂｌａｄら、１９８７；Ｌｕら、１９９０）、梗塞の大きさを減少させること（Ｓｃｈｕｌｚら、１９９５）、および心筋梗塞を有する患者における急性の心臓死の頻度を減少させること（Ｙｕｓｕｆら、１９８５）を示した。
【０２１１】
化学的β−ＡＲブロッカーが、虚血心疾患の処置において一般に使用されているが、これらの薬剤は、しばしば、中枢神経系の副作用を引き起こし、そしてβ２−ＡＲアンタゴニスト活性が、末梢血管抵抗の増大と関連する。特異的レセプターｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ−ＯＤＮ）の開発は、レセプタータンパク質の合成を減少させるための新規なアプローチである（Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、１９９６；Ｄａｃｈｓら、１９９７）。このアプローチは、これらのレセプターのアップレギュレーションによって特徴付けられる疾患状態における治療的利益となる可能性を有する（Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、１９９６；Ｄａｃｈｓら、１９９７；Ｙａｎｇら、１９９８）。最近の研究は、アンギオテンシンＩＩの１型レセプター（ＡＴ１）に指向されたＡＳ−ＯＤＮが、ＡＴ１レセプタータンパク質の合成を減少させ、そして虚血の悪性効果から虚血ラットの心臓を防御することを示した（Ｙａｎｇら、１９９８）。本明細書において示されるように、β１−ＡＲ　ｍＲＮＡに対して指向されたアンチセンス組成物の単回の静脈内注射は、ＳＨＲにおいて、少なくとも２０日間、血圧を減少させ得る（Ｚｈａｎｇら、１９９９）。
【０２１２】
この実施例において、脂質過酸化に対するＡＳ−ＯＤＮの効果を試験した。虚血再灌流後の心筋におけるβ１−ＡＲタンパク質およびｍＲＮＡの発現に対するそれらの効果もまた、試験した。
【０２１３】
（５．４．１　材料および方法）
（５．４．１．１　アンチセンス組成物およびリポソーム処方物）
ＡＳ−ＯＤＮおよび逆位のオリゴデオキシヌクレオチド（ＩＮ−ＯＤＮ）コントロールは、１５マーであり、そしてラットβ１−ＡＲ　ｍＲＮＡのＡＵＧ開始コドンを包含する−５〜＋１０に標的化された。ＡＳ−ＯＤＮの配列は、５’−ＣＣＧＣＧＣＣＣＡＴＧＣＣＧＡ−３’（配列番号１）であり、そして対応するＩＮ−ＯＤＮは、５’−ＡＧＣＣＧＴＡＣＣＣＧＣＧＣＣ−３’（配列番号１３８）であった（Ｚｈａｎｇら、１９９９）。これらのＯＤＮは、バックボーンのホスホロチオエート化により修飾され、そしてフロリダ大学のＤＮＡ合成コアラボラトリー（ＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｃｏｒｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）において合成された。
【０２１４】
カチオン性リポソームは、細胞によるＤＮＡの取り込みを増強し、そしてまたＤＮＡを分解から保護し、そしてその循環時間を延長するので、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（モル：モル＝１：１）リポソームを使用して、アンチセンス組成物を宿主動物に送達した。リポソームの平均の直径は、２００〜３００ｎｍであった。ＯＤＮ／リポソーム複合体を、所望の量のＯＤＮをＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥとともに混合して、水中５％（ｗｔ．／ｗｔ．）デキストロース中に３００μｇ／ｍｌの最終ＤＮＡ濃度にし、そして６０分間室温でインキュベートすることによって使用の日に調製した（Ｙａｎｇら、１９９８；Ｚｈａｎｇら、１９９９）。
【０２１５】
（５．４．１．２　動物）
雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（体重２００〜２５０ｇ）に、ＡＳ−ＯＤＮ（ｎ＝７）またはＩＮ−ＯＤＮ（ｎ＝７）のいずれかを２００μｇ／ラットの用量で心臓切開の４日前に静脈内注射した。ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰリポソーム（７００μｇ／ラット）に、ＯＤＮとともに与えた。ラットの並行グループを、心臓切開の６時間前に、生理食塩水（ｎ＝１３）で処置するか、または選択的β１−ＡＲブロッカーアテノロールの２ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝７）で処置した。
【０２１６】
（５．４．１．３　単離された灌流心臓モデル）
ＡＳ−ＯＤＮもしくはＩＮ−ＯＤＮの投与４日後、またはアテノロールもしくは食塩水の投与６時間後に、ラットを腹腔内ペントバルビタールナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。心臓を迅速に切り出し、そして氷冷Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液（ｍｍｏｌ／Ｌ：ＮａＣｌ　１１８、ＫＣｌ　４．７，ＫＨ２ＰＯ４　１．２、ＭｇＳＯ４　１．２、ＣａＣｌ２　１．２５、ＮａＨＣＯ３　２５、およびグルコース１１、ｐＨ７．４）に入れた。１分間以内に、この心臓を単離した灌流装置に移し、そして改変Ｌａｎｇｅｎｄｒｏｆｆ手順（Ｙａｎｇら、１９９８；ＮｅｅｌｙおよびＲｏｖｅｔｔｏ，１９７５）に従って、ＭａｓｔｅｒＦｌｅｘポンプ（モデル７０１５−２１，Ｃｏｌｅ−Ｐａｌｍｅｒ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏ．）の使用によって３７℃に維持した酸素飽和した（９５％Ｏ２＋５％ＣＯ２）Ｋｒｅｂ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液を用いて動脈を介して還流した。この心臓を、半閉鎖式の循環水温式（３７℃）空気チャンバに入れ、３００ｂｐｍの速度でＭｅｄｔｒｏｎｉｃ　５３２０ペースメーカーで人為的にペース付けし、そして一定流速（５．５〜６．０ｍｌ／分）で灌流させた。大動脈にすぐ隣接して配置し、Ｇｏｕｌｄ　Ｓｔａｔｈａｍ　Ｐ２３ＩＤ圧力変換機に接続したカテーテルを介して冠動脈潅流圧（ＣＰＰ）を測定した。水を充填し、Ｇｏｕｌｄ　Ｓｔａｔｈａｍ　Ｐ２３ＩＤ圧力変換機に接続したゴム製バルーンを、左心房を通じて左心室に挿入し、左心室拡張期圧（ＬＶＥＤＰ）、左心室収縮期圧（ＬＶＳＰ）、および展開左心室圧（ｄＬＶＰ）を測定した（ｄＬＶＰ＝ＬＶＳＰ−ＬＶＥＤＰ）。平衡の間のＬＶＥＤＰは、５〜７ｍｍＨｇに設定した。全ての測定は、４チャンネル記録（Ａｓｔｒｏ−Ｍｅｄ）で連続的に記録した。
【０２１７】
（５．４．１．４　心筋虚血および再灌流）
生理食塩水で処置したラット由来の６つの心臓をＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液で８０分間連続的に灌流し、そして偽のコントロールとして使用した。他のラット由来の心臓を、平衡の２０分後、３０分の虚血、続いて３０分の再灌流に供した。試験の完了後、結合アッセイによるβ１−ＡＲ分析、ウエスタンブロットによるβ１−ＡＲタンパク質分析、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲＴＭ）によるβ１−ＡＲ　ｍＲＮＡ分析、およびＭＤＡの測定のために、液体窒素中で心臓を凍結した。
【０２１８】
（５．４．１．５　心筋におけるβ１−ＡＲ密度の決定）
膜タンパク質を、以前に記載のように左心室から調製した（ＢａｋｅｒおよびＰｉｔｈａ，１９８２）。飽和試験のために、３６℃で６０分間、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含有する、総容積２５０μｌ中で、１２５Ｉ−（−）ヨードシアノピンドロール（Ｉ−ＣＹＰ，ＮＥＮ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，６．２５〜１００ｐＭ）とともに、１００μｇの膜タンパク質を三連でインキュベートした。非特異的結合およびβ２アドレノセプター結合を、それぞれ１μＭ（±）−アルプレノロールおよび１５０ｍＭ　ＣＧＰ２０７ＡＳＡ（ＲＢＩ）の存在下で決定した。次いで、Ｂｒａｎｄｅｌ　ｈａｒｖｅｓｔｅｒを用いて、反応混合物を、Ｗｈａｔｍａｎ　ＧＦ／Ｂガラスフィルターを通過させ、そして放射性活性を１分間計測した。
【０２１９】
（５．４．１．６　心筋におけるβ１−ＡＲタンパク質発現の定量）
心筋組織をホモジナイズし、そして煮沸している溶解緩衝液（１％ＳＤＳ，０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（登録商標）、および１０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）中で溶解し、そして４℃で３０分間１０，０００ＲＰＭで遠心分離した。心筋組織由来の溶解タンパク質（２０μｇ／レーン）を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ　細胞を用いて８％　ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した。ブロッキング溶液（４％脱脂乳、Ｓｉｇｍａ）中でのインキュベーション後、膜を１：１０００の希釈一次抗体（β１−ＡＲに対するポリクローナル抗体，Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに４℃で一晩インキュベートした。膜を洗浄して、１：２０００希釈の二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）とともに１時間インキュベートした。この膜を以前に記載のように、ＥＣＬシステムを用いて検出した（Ｙａｎｇら、１９９８；Ｌｉら、１９９９）。
【０２２０】
（５．４．１．７　β１−ＡＲ　ｍＲＮＡの検出）
１工程酸グアニジナムチオシアネート−フェノール−クロロホルム方法を用いて、ラット心筋から総ＲＮＡを単離し、そして定量した（ＣｈｏｍｅｚｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ，１９８７）。１μｇの総ＲＮＡをオリゴ−ｄＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて３７℃で１時間逆転写した。ＲＴ材料の１．５μｌを、β１−ＡＲに特異的なプライマー対を用いてＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって増幅した：
フォワード（順方向）プライマー：５’ＣＴＣＣＧＡＡＧＣＴＣＧＧＣＡＴＧＧ−３’（配列番号１３９）；および
リバース（逆方向）プライマー：５’ＧＣＡＣＧＴＣＴＡＣＣＧＡＡＧＴＣＣＡＧＡ−３’（配列番号１４０）。
【０２２１】
ＰＣＲＴＭ産物は、４３２塩基対であった。ＰＣＲのために、９５℃１分間、６０℃１分間、および７２℃１分間の３５サイクルを用いた。ＲＴ−ＰＣＲＴＭ増幅サンプルを、臭化エチジウムを用いて１．８％アガロースゲル上で可視化した。ラットＧＡＰＤＨのプライマー対をコントロールとして用いた：
フォワード（順方向）プライマー：５’ＡＴＣＡＡＡＴＧＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧ−３’（配列番号１４１）；および
リバース（逆方向）プライマー：５’−ＣＡＧＧＴＴＴＣＴＣＣＡＧＧＣＧＧＣＡＴＧＴＣＡ−３’（配列番号１４２）。
【０２２２】
ＰＣＲＴＭのために、９５℃１分間、６０℃１分間、および７２℃１分間の３５サイクルを用いた。ＰＣＲＴＭ産物は５０４塩基対であった。目的のバンドの相対強度をＮＳＦ−３００Ｇ　Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｍｉｃｒｏｔｅｋ）で分析した（Ｙａｎｇら、１９９８；Ｌｉら、１９９９）。
【０２２３】
（５．４．１．８　心筋におけるＭＤＡレベルの検出）
Ｏｈｋａｗａら（１９７９）の方法の変法によって、心筋におけるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）レベルを二連で測定した。要するに、心室組織をホモジナイズした。アッセイ混合物は、０．１ｍｌの組織ホモジネート、０．４ｍｌの０．９％ＮａＣｌ、０．５ｍｌの３％ドデシル硫酸ナトリウム、３ｍｌのＴＢＡ（チオバルビツール酸試薬（等量の０．８％水性チオバルビツール酸および酢酸を含有する））からなり、そして９５℃で７５分間加熱した。その後、１ｍｌの冷０．９％ＮａＣｌをこの混合物に添加し、これを冷却して５ｍｌ　ｎ−ブタノールで抽出した。３，０００ｒｐｍでの１５分間の遠心分離後、ブタノール相を５３２ｎｍで分光光度的にアッセイした。テトラメトキシプロパン（０、０．１、０．２、０．４、０．８、１．０ナノモルの量）を外部標準として使用した。心筋におけるＭＤＡレベルをμｍｏｌ／組織のグラム数で表した。
【０２２４】
（５．４．１．９　データ分析）
データは、平均±ＳＤとして示した。統計学的有意差を、独立群のデータ間の多重比較で決定した。ここで、ＡＮＯＶＡおよびＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定は、有意差の存在を示した。０．０５以下のＰ値を、統計的に有意であるとみなした。
【０２２５】
（５．４．２　結果）
（５．４．２．１　虚血灌流の間の心機能不全）
ＣＰＰ、ＬＶＳＰ、ＬＶＥＤＰおよびｄＬＶＰの基準値は、全ての群のラット心臓で同様であった。８０分間観察したコントロールの連続的に緩衝液灌流した心臓において、心臓機能の係数においては最小（約５％）の変化しかなかった。生理食塩水処理ラット由来の心臓では、３０分の虚血、続いて３０分の再灌流によって、顕著な心臓機能不全が生じた。機能不全は、ＣＰＰおよびＬＶＥＤＰにおける有意な増大、ならびにＬＶＳＰおよびｄＬＶＰにおける減少によって示された（虚血前値に対して、全てＰ＜０．０１）。
【０２２６】
ＡＳ−ＯＤＮを用いたラットの処置は、虚血−再灌流によって誘導された心筋機能不全を顕著に減弱した。これは、ＬＶＳＰおよびｄＬＶＰの保存によって、ならびにＬＶＥＤＰおよびＣＰＰの増大の最小化によって示された（生理食塩水群に対して、全てＰ＜０．０１）。アテノロールでのラットの処置はまた、虚血−再灌流によって誘導されるＣＰＰおよびＬＶＥＤＰの増大を軽減し（生理食塩水群（ｎ＝７）に対して、全てＰ＜０．０５）、そして虚血−再灌流によって誘導されたＬＶＳＰおよびｄＬＶＰにおける変化を軽度に減弱した（生理食塩水群、ｎ＝７に対して、全てＰ＜０．０５）。ＡＳ−ＯＤＮ処置は、虚血−再灌流後のｄＬＶＰを保持するのに、アテノロール処置よりも有効であった（Ｐ＜０．０５）。ＩＮ−ＯＤＮでの処置によって、虚血−再灌流によって誘導された心筋機能不全に対して影響は示されなかった。
【０２２７】
（５．４．２．２　心筋におけるＭＤＡレベル）
心筋におけるＭＤＡレベルは、虚血−再灌流後に有意に増大した（偽のコントロール心臓（ｎ＝６）に対して、Ｐ＜０．０５）。ＡＳ−ＯＤＮおよびアテノロールでのラットの前処置によって、心筋におけるＭＤＡレベルの増大が減弱した（生理食塩水前処置群（各群ｎ＝７）に対して両方Ｐ＜０．０５）。期待どおり、ＩＮ−ＯＤＮは、心筋におけるＭＤＡレベルに影響しなかった。
【０２２８】
（５．４．２．３　虚血−再灌流後の心筋におけるβ１−ＡＲ密度の変化）
偽コントロールの連続的に灌流する心臓由来の心筋は、連続的にβ１−ＡＲおよびβ２−ＡＲを示した（β１−ＡＲ＞＞β２−ＡＲ）。生理食塩水処置ラット心臓における虚血−再灌流後、心筋においてβ１−ＡＲ密度の一貫した増大が存在した（連続的に灌流した緩衝液で灌流したラット心臓において、Ｂｍａｘ２８．７±５．４対１９．６±１．７ｆｍｏｌ／ｍｇ（Ｐ＜０．０５（ｎ＝４））が、一方、β２−ＡＲ密度には変化はなかった。ＡＳ−ＯＤＮでのラットの処置によって、虚血−再灌流心筋におけるβ１−ＡＲ密度に変化が生じた（生理食塩水で処置したラット心臓において、Ｂｍａｘ１５．９±１．３対２８．７±５．４ｆｍｏｌ／ｍｇ（Ｐ＜０．０５（ｎ＝４））が、一方、β２−ＡＲ密度には変化はなかった。ＩＮＶ−ＯＤＮまたはアテノロールでのラットの処置は、虚血−再灌流心筋においてβ１−ＡＲ密度には影響しなかった。
【０２２９】
（５．４．２．４　心筋におけるβ１−ＡＲタンパク質およびｍＲＮＡの発現）
コントロールの連続的に還流した心臓のウエスタン分析によって、４１ｋＤａの明白なβ１−ＡＲタンパク質のバンドが示された。類似の分子量のバンドが、生理食塩水、ＡＳ−ＯＤＮ、ＩＮ−ＯＤＮおよびアテノロールで処理したラットの心臓由来の心臓で観察された。β１−ＡＲタンパク質のバンドは、生理食塩水で処理したラットの心臓（虚血−再灌流の間のタンパク質の上方制御を含む）において非常に濃かった。ＡＳ−ＯＤＮでのラットの処置によって、虚血−再灌流によって媒介されるβ１−ＡＲタンパク質発現の増大は排除された。とりわけ、ＩＮ−ＯＤＮまたはアテノロールでのラットの処置は、β１−ＡＲタンパクの密度に影響を有さなかった。
【０２３０】
虚血−再灌流はまた、ＲＴ−ＰＣＲで決定した場合、生理食塩水処置ラットの心筋によってβ１−ＡＲシグナル（ＧＡＰＤＨシグナルについて調整した）のためのｍＲＮＡの増大を生じた。ＡＳ−ＯＤＮでのラットの前処置によって心筋におけるβ１−ＡＲのｍＲＮＡの増大を減弱したが、心筋におけるβ１−ＡＲのｍＲＮＡレベルは、ＩＮ−ＯＤＮまたはアテノロールでのラットの処置によって有意に影響されなかった。
【０２３１】
（５．４．３　まとめ）
本実施例は、短時間の虚血−再灌流後の心機能不全に対するβ１−ＡＲのｍＲＮＡに関するＡＳ−ＯＤＮの防御的な役割を実証する。この研究によって、このプロセスにおけるβ１−ＡＲ　ｍＲＮＡに関するＡＳ−ＯＤＮ、または選択的β１−ＡＲブロッカーであるアテノロールを用いたラットの前処置の効果を比較した。この研究によって、３０分間の虚血とその後の３０分間の再灌流が、生理食塩水処理ラット心臓における有意な心機能不全および脂質過酸化反応を生じたことが示された。さらに、虚血−再灌流は、β１−ＡＲ密度ならびにタンパク質およびｍＲＮＡの発現の顕著な上方制御に関連していた。アテノロールでのラットの前処理によって、心機能は保護されたが、虚血−再灌流心筋においてβ１−ＡＲの密度、ならびにβ１−ＡＲのタンパク質およびｍＲＮＡの発現に影響はなかった。β１−ＡＲ　ｍＲＮＡに対するＡＳ−ＯＤＮでのラットの前処置によって、虚血−再灌流後のほぼ全体的な心機能の保護および脂質過酸化反応が提供された。ＡＳ−ＯＤＮ処置はまた、虚血−再灌流心筋におけるβ１−ＡＲの密度、タンパク質およびｍＲＮＡの発現の上方制御を防いだ。心機能におけるβ１−ＡＲ　ｍＲＮＡに対するＡＳ−ＯＤＮの効果は、通常用いられるβ１−ＡＲブロッカーであるアテノロールの効果を明白に上回っていた。β１−ＡＲタンパク質およびｍＲＮＡの発現に対するＡＳ−ＯＤＮの効果によって、その有利な効果はβ１−ＡＲ　ｍＲＮＡの転写および翻訳の両方の阻害によって媒介されることが示される。
【０２３２】
虚血の間、交感神経系の全身的な刺激（おそらく心機能保護のためにデザインされた代償性反応）が存在する。従って、カテコラミンレベルは、心筋虚血後、血漿および心筋の両方において増大する（Ｒｏｎａ，１９８５；Ｒｉｃｈａｒｄｔら，１９９４；Ａｂｒａｈａｍｓｓｏｎら，１９８３）が、カテコラミン濃度の増大は、不整脈を生じる心筋の興奮性の増大に寄与する可能性がある（Ｓｔｒａｓｓｅｒｅら，１９９０；Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅら，１９７９；Ｍａｉｓｅｌら，１９８５；Ｏｈｙａｎａｈｉら，１９８８；Ｍａｉｓｅｌら，１９８７）。急性心筋虚血の間にも、β１−ＡＲの感度の増大がある（Ｓｔｒａｓｓｅｒｅら，１９９０）。これと、循環するカテコラミンおよび心筋カテコラミンの濃度の増大とを組み合わせれば、心臓障害および心機能不全を悪化させ得る。
【０２３３】
β−ＡＲの活性化は、心臓の交感神経刺激を媒介するシグナル伝達鎖における最初の要素であると一般に認められている。心臓において優勢なβ−ＡＲサブタイプであるβ１−ＡＲ（Ｍｉｎｎｅｍａｎら、１９９５；Ｇｕｄｅｒｍａｎら、１９９５）は、アデニリルシクラーゼ活性を活性化することによって心機能を調節する（Ｓｔｒａｓｓｅｒｅら、１９９０；Ｔｈａｎｄｒｏｙｅｎら；１９８６；Ｂｏｅｈｍ、１９９５）。いくつかの実験的研究によって、急性の虚血−再灌流の間の、β１−ＡＲ（ただしβ２−ＡＲではない）における上方制御が示された（Ｍａｉｓｅｌら，１９８５；Ｋａｒｌｉｎｅｒら，１９８９；Ｐｅｒｓａｄら，１９９８）。Ｉｈｌ−Ｖａｈｌら（１９９５）は、結論として、急性心筋虚血の間のβ−ＡＲ　ｍＲＮＡの迅速な上方制御を実証した；この上方制御は、β１−ＡＲ（ただしβ２−ＡＲではない）のｍＲＮＡレベルの特異的増大をともなうサブタイプ選択的である。それらはまた、β１−ＡＲ　ｍＲＮＡの増大が虚血時間依存性であることを示した。
【０２３４】
β−ＡＲブロッカーでの動物の前処置は、β１−ＡＲ　ｍＲＮＡレベルにおける虚血−再灌流誘導性の増大に影響しない。これは、本研究において確認された。ここでアテノロールでの処置は、結合アッセイによって測定したβ１−ＡＲ密度またはそれぞれウエスタン分析およびＲＴ−ＰＣＲによって測定したβ１−ＡＲのタンパク質およびｍＲＮＡのレベルの増大のいずれにも影響しなかった。他の研究者はまた、β１−ＡＲブロッカーがβ１−ＡＲタンパク質の発現もβ１−ＡＲ　ｍＲＮＡの発現もブロックしないことを示した（ＡａｒｏｎｓおよびＭｏｌｉｎｏｆｆ，１９８２；Ｈｅｉｌｂｒｕｎｎら，１９８６；Ａａｒｏｎｓら、１９８０）。対照的に、本研究は、β１−ＡＲ　ｍＲＮＡに対するＡＳ−ＯＤＮがβ１−ＡＲ数、ならびにタンパク質およびｍＲＮＡのレベルの上方制御をブロックすることを明白に示す。転写レベルでのβ１−ＡＲのブロックは、急性の虚血−再灌流後の心機能の保護におけるＡＳ−ＯＤＮアプローチの優れた効果に基づき得る。心臓の取り出し前の４日間のＡＳ−ＯＤＮの単回用量での治療によって、β１−ＡＲタンパク質の増大が防止された。このことは、同様に、翻訳レベルでのＡＳ−ＯＤＮの保持された阻害性効果を意味する。ＳＨＲでの以前の研究によって、β１−ＡＲ　ｍＲＮＡに対するＡＳ−ＯＤＮは、少なくとも１８日まで、心臓においてβ１−ＡＲ　ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を減少することが実際に実証された（Ｚｈａｎｇら、１９９９）。
【０２３５】
化学的β−ＡＲブロッカーは、虚血性心疾患の治療に有効であり、そして心筋虚血を有する患者の短期管理および長期間管理において広く用いられているが、これらの薬剤は、中枢神経系、末梢血管抵抗、および気管支に対するそれらの効果に関連するいくつかの望ましくない副作用を有する。選択的β１−ＡＲブロッカー（例えば、アテノロール）でさえ、中用量では心選択性を消失する。さらに、これらの薬剤は、半減期が短いせいで、頻繁に（少なくとも毎日１回）摂取される必要がある。さらに、化学的β−ＡＲブロッカーは、ゲノムレベルではβ−ＡＲに影響しない。遺伝子治療（例えば、β１−ＡＲ　ｍＲＮＡに対するＡＳ−ＯＤＮ）は、特有の利点を提供する。例えば、β１−ＡＲ　ｍＲＮＡに対する配列特異的ＡＳ−ＯＤＮは、単回静脈内注射後ラットにおいて１８日後でさえ３０〜５０％まで脈管のβ１−ＡＲ密度を有意に減少し得る（Ｚｈａｎｇら、１９９９）。ＡＳ−ＯＤＮは、β２−ＡＲ密度に影響を有さない。同時に、ＡＳ−ＯＤＮ投与は、除脈を生じることなく、３８−ｍｍＨｇの最大低下を伴う血圧の低下に関連する。最も重要なことには、脳におけるβ−ＡＲの分布に対してＡＳ−ＯＤＮの効果はない。これらの結果は、ＡＳ−ＯＤＮの単回静脈内注射が、心筋におけるβ１−ＡＲのｍＲＮＡの発現に特異的な効果によって、ラットにおいて虚血−再灌流から心機能不全を保護し、そして心筋傷害を防御し得ることを実証する。重要なことに、ＡＳ−ＯＤＮのコントロールとして用いたＩＮ−ＯＤＮは、これらのいずれの効果も示さなかった。
【０２３６】
本研究において、虚血再灌流誘導性の心臓機能不全を、ＣＰＰ、ＬＶＥＤＰ、ＬＶＳＰ、およびｄＬＶＰの測定により評価した。心筋機能不全のこれらの指標は、全虚血（ｇｌｏｂａｌ　ｉｃｈｅｍｉａ）再灌流の単離された心臓モデルのいくつかの研究で用いられている（Ｙａｎｇら、１９９８；Ｙａｎｇら、１９９３；Ｙａｎｇら、１９９７；Ｋｏｋｉｔａら、１９９８；Ｏｚｄｅｎら、１９９８）。単離されたラット、ウサギ、またはモルモットの心臓モデルは、虚血再灌流の間の心臓機能および心筋代謝的変化を評価するための安価で再現性のある方法を提供する。このモデルは、種々のレセプターの調節（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）および異なるレセプターに作用する因子による心臓機能の調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）を研究するために広範に使用されている（Ｌｕら、１９９０；Ｙａｎｇら、１９９８；ＮｅｅｌｙおよびＲｏｖｅｔｔｏ、１９７５；ＢａｋｅｒおよびＰｉｔｈａ、１９８２；Ｍａｉｓｅｌら、１９８７；Ｙａｎｇら、１９９３、Ｙａｎｇら、１９９７；Ｋｏｋｉｔａら、１９９８、Ｏｚｄｅｎら、１９９８）。単離された拍動する心臓において、心臓機能は、循環する血球およびホルモンの影響を受けずに評価され得、これにより、このモデルの重大な利点が提供されると考えられ得る。
【０２３７】
ＭＤＡ（脂質過酸化物）は、虚血再灌流後の心筋損傷を評価するための指標として広く受け入れられている（Ｋｏｋｉｔａ、１９９８；Ｏｚｄｅｎら、１９９８）。本研究において、全てのこれらのパラメータを、ＡＳ−ＯＤＮの使用により改変した。要約すると、本研究は、β１−ＡＲ　ｍＲＮＡに向けたＡＳ−ＯＤＮの単回静脈内注入による、単離されたラット心臓における虚血再灌流により誘導される心臓機能不全および心筋損傷の改善に関する最初の報告である。本研究はまた、ＡＳ−ＯＤＮが、虚血性心筋におけるβ１−ＡＲのｍＲＮＡの発現増加をブロックし得ることに関する証拠を提供する。最後に、β１−ＡＲ　ｍＲＮＡに向けられたＡＳ−ＯＤＮの効果は、虚血再灌流の単離されたラット心臓モデルにおいて、アテノロールの効果よりも優れているようである。
【０２３８】
（５．５　実施例５−動物モデルにおける心肥大の減少）
成体自然発生高血圧ラット（３００〜３５０ｇ）を、２ヶ月より長い間、β１−ＡＳ−ＯＤＮで処置した。血圧は、処置期間を通して持続的に２０〜３０ｍｍＨｇ減少した（図１１）。生理食塩水またはＩＮＶ−ＯＤＮを受けたコントロール動物は、血圧の変化を有さなかった。２月間の処置の最後に、心臓を解剖し、重量測定した。左心室の肥大を、体重に対する左心室重量の比（ＬＶ／ＢＷ）により示した。β１−ＡＳ−ＯＤＮは、コントロールと比較して、左心室の肥大を有意に減少させた（Ｐ＜０．０５）（図１１）。
【０２３９】
（５．６　実施例６−心筋虚血再灌流後の心臓機能不全の改善）
β１−ＡＳ−ＯＤＮの防御効果を、心筋虚血再灌流のラットモデルにおいて試験した。５つのグループのＳＤラットを研究した。偽コントロール（ｎ＝６）に生理食塩水を注入し、そして虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）を行わずに８０分間連続的に灌流させた。他のグループにおいて、心臓を２０分間灌流し、そして全虚血に供した（３０分間）後に再灌流した（３０分間）。生理食塩水＋Ｉ／Ｒ（ｎ＝６）またはアテノロール＋Ｉ／Ｒ（ｎ＝７）のグループに、生理食塩水または２ｍｇ／ｋｇアテノロールをｉ．ｖ．注入し、６時間後に心臓を切除した。ＡＳ−ＯＤＮ＋Ｉ／Ｒ（ｎ＝７）またはＩＮＶ−ＯＤＮ＋Ｉ／Ｒ（ｎ＝７）に、１ｍｇ／ｋｇ　β１−ＡＳ−ＯＤＮまたはＩＮＶ−ＯＤＮをｉ．ｖ．注入し、４日後にＩ／Ｒ研究を実施した。
【０２４０】
虚血再灌流は、重大な心臓機能不全を引き起こした。これは、冠動脈灌流圧（ＣＰＰ）および左心室拡張終期圧（ＬＶＥＤＰ）の有意な増加、ならびに発達した左心室圧（ｄＬＶＰ）の減少により示された（Ｐ＜０．０１　対　虚血前の値）。
【０２４１】
β１−ＡＳ−ＯＤＮによる処置は、虚血再灌流誘導性の心室異常を顕著に改善した。これは、ｄＬＶＰの保存ならびにＣＰＰおよびＬＶＥＤＰの増加の最小化により明らかになった（Ｐ＜０．０５　対　生理食塩水グループ）。全体的に見ると、ＡＳ−ＯＤＮ処置は、これらの効果において、アテノロールと等しいかまたはアテノロールよりもさらに良好なようであった。ＡＳ−ＯＤＮは、アテノロールよりも大きい程度、ｄＬＶＰを回復した。ＩＮＶ−ＯＤＮは、虚血誘導性の機能不全に対する効果を示さず、生理食塩水グループと区別できなかった。これらの研究からの心臓機能パラメータにおけるデータを、図１２Ａ〜Ｃに要約する。
【０２４２】
（５．７　実施例７−　β１−ＡＳ−ＯＤＮの慢性的使用の安全性プロフィール）
肝臓トランスアミナーゼ、血液学、免疫応答、および組織病理学を含む安全性プロフィールを、長期間のβ１−ＡＳ−ＯＤＮの３回の反復的な注入の間に調査した。結果は、β１−ＡＳ−ＯＤＮによる長期間の処置が安全であり、毒性効果または免疫応答を引き起こさないことを示した。
【０２４３】
（５．７．１　肝臓トランスアミナーゼ）
アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）は、肝臓機能の臨床的指標として慣用的に使用される。それらのレベルは、肝臓損傷の際に実質的に増大する。ＳＨＲを、β１−ＡＳ−ＯＤＮの３回反復注入により処置した。ＡＬＴおよびＡＳＴの血漿濃度を、各々の注入後に測定した。これらにより、ＡＳ−ＯＤＮグループとコントロールグループの間に有意な差がないことが明らかになった（図１３Ａ、１３Ｂ）。
【０２４４】
（５．７．２　血液学）
血液学的パラメータを、β１−ＡＳ−ＯＤＮの３回反復注入後に測定した。３つのグループの間で、総白血球数（ＷＢＣ）、血小板数、ヘマトクリット、および平均血小板容積（ＭＰＶ）における変化はなかった（表６）。
【０２４５】
（表６．β１−ＡＳ−ＯＤＮの反復投与後の臨床生化学的パラメータおよび臨床血液学的パラメータ）
【０２４６】
【表９】
2004502459.tif 000016
各グループについてｎ＝７〜９、ＮＤ：検出できなかった
（５．７．３　免疫応答）
抗体−抗原反応を、ゲル免疫拡散分析により研究した。これにより、β１−ＡＳ−ＯＤＮに対する検出可能な抗体が明らかにならなかった。免疫反応の臨床的指標であるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、全ての動物において陰性であることを見出した。
【０２４７】
（５．７．４　組織の組織学）
心臓、肝臓、脾臓、および腎臓を、２ヶ月より長い間のβ１−ＡＳ−ＯＤＮの３回反復注入後に、病理学試験に供した。免疫病理学的損傷または器官の損傷は見出さなかった。
【０２４８】
（５．８　実施例８−既知のβ１−ＡＲ遺伝子のＤＮＡ配列）
本発明の実施のために特に好ましいアンチセンス配列として、哺乳動物β１−ＡＲポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＡＵＧ翻訳開始コドンの領域にかまたその付近に特異的に結合する配列が挙げられる。従って、ＡＵＧ翻訳開始コドンのすぐ５’側に対応するｍＲＮＡの領域の付近に集まっているそれらの相補配列が、特に好ましいＦ。このような配列は、オリゴヌクレオチドが折り畳みも自己アニールもしないことを保証するために、二次構造分析（例えば、ＯＬＩＧＯコンピュータープログラム）を用いて同定され得る。ＢＬＳＡＴコンピューターアルゴリズムプログラムもまた、選択された配列の特異性を調査するために使用され得る。本発明の教示の利益を有する当業者は、本発明の教示と組み合わせてＯＬＩＧＯおよびＢＬＡＳＴプログラムを用いて、他の適切なアンチセンス配列を選択し、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、または配列番号１９４に開示される各々の遺伝子に示されるオープンリーディングフレームをコードするｍＲＮＡの一部に相補的な少なくとも９〜約２５連続するヌクレオチドを含む両方のオリゴヌクレオチドを調製し得る。
【０２４９】
全長または実質的に全長のアンチセンスポリヌクレオチドの調製のために、本発明者らは、以下のβ１−ＡＲ遺伝子の１つ以上から生成されるβ１−ＡＲ特異的ｍＲＮＡ配列全体に本質的に対応する配列の使用を考慮する。例えば、ヒトβ１−ＡＲ遺伝子のオープンリーディングフレームは、配列番号１８７のヌクレオチド８７〜ヌクレオチド１５２０に伸びる。従って、全長アンチセンスポリヌクレオチドは、配列番号１８７の約８７位〜約１５２０位の領域に相補的なおよそ１．４３−ｋｎｔ（キロヌクレオチド）の配列からなる。ネイティブのβ１−ＡＲ特異的ｍＲＮＡ配列に特異的に結合する相補配列のために、このポリヌクレオチドは、ネイティブｍＲＮＡと正確に同じ大きさである必要はないし、ネイティブｍＲＮＡと同じ配列である必要もない。実際、実質的に全長の配列または全長よりもわずかに長い配列は、本発明者らによって、宿主細胞におけるβ１−ＡＲ特異的ｍＲＮＡの翻訳の阻害に全長アンチセンスポリヌクレオチドと同じくらい有用であるとみなされる。例えば、相補的ポリヌクレオチドの大きさは、特定のβ１−ＡＲ特異的配列のＯＲＦ領域の大きさの約９５％〜約１０５％まで変化し得る。従って、１．４３−ｋｎｔ全長ｍＲＮＡについて、約１．３６−ｋｎｔ〜約１．４３−ｋｎｔの配列が、「実質的に全長」であるとみなされ、一方、約１．４４−ｋｎｔ〜約１．５０−ｋｎｔまで（約１．５０−ｋｎｔを含む）の配列が「全長よりわずかに長い」とみなされ、そして宿主細胞においてネイティブのβ１−ＡＲ特異的ｍＲＮＡ配列に特異的に十分結合し得、そしてネイティブのβ１−ＡＲ特異的ｍＲＮＡ配列を機能性のβ１−ＡＲポリペプチドに翻訳する宿主細胞のタンパク質合成機構の能力を阻害する相補的ポリヌクレオチドは、これらの大きさの範囲のいずれかにおいて調製され得る。
【０２５０】
従って、このような配列は、本発明の遺伝子構築物の調製に（特に本明細書に記載される循環系の心臓疾患および障害の処置のための遺伝子治療ベクターとしての開発に）理想的に適する。このような遺伝子治療ベクターの調製において、好ましくは、このｍＲＮＡに相補的なポリヌクレオチドが適切なプロモーターの制御下に置かれた遺伝子構築物が、調製され、次いで、この遺伝子構築物を含む組換えベクターが、罹患した哺乳動物の宿主細胞に導入される。従って、コードされるアンチセンスポリヌクレオチドの発現により、この細胞により産生されるネイティブのβ１−ＡＲ特異的ｍＲＮＡに相補的な全長、実質的に全長、または全長よりもわずかに長いポリヌクレオチドが合成される。次いで、この相補的配列は、標的ｍＲＮＡに特異的に結合し得、それによって細胞のタンパク質合成機構による成熟ポリペプチドへの翻訳のための、ネイティブのβ１−ＡＲ特異的ｍＲＮＡの利用可能性を減少させ得る。
【０２５１】
配列番号１８７に示されるヒトβ１−ＡＲ遺伝子について、例示的なアンチセンスポリヌクレオチド配列として、長さが約１．３６−ｋｎｔ〜約１．５０−ｋｎｔであり、そして配列番号１８７の約ヌクレオチド６０〜約ヌクレオチド１６００から選択される実質的に相補的な連続配列を含む配列が挙げられる。ネイティブのヒトβ１−ＡＲ　ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を阻害し得る実質的に相補的で、実質的に全長のアンチセンスポリヌクレオチドの選択は、本発明の教示および選択方法、コンピューターに基づいて相補性を規定する検索アリゴリズム、ならびに本明細書に記載されるβ１−ＡＲ　ｍＲＮＡおよびβ１−ＡＲポリペプチドについてのアッセイの利益を有する当業者の範囲に含まれる。
【０２５２】
以下の配列の各々において、ＡＵＧ開始コドンは、太字の対応するオープンリーディングフレームにおける最初の三塩基として示される。
【０２５３】
（５．８．１　ヒトβ１−ＡＲ）
ヒトβ１−ＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、Ｆｒｉｅｌｌｅら（１９８７）において開示されている。Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　β１−ＡＲ遺伝子のＧｅｎＢａｎｋＴＭ登録番号は、ＮＭ０００６８４である。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド８７〜ヌクレオチド１５２０に伸びる（太字で示す）（配列番号１８７）。
【０２５４】
【表１０】
2004502459.tif 000017
（５．８．２　イヌβ１−ＡＲ）
Ｃａｎｉｓ　ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ　β１−ＡＲ遺伝子のＧｅｎＢａｎｋＴＭ登録番号は、Ｕ７３２０７である。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド３３０〜ヌクレオチド１７５１に伸びる（太字で示す）（配列番号１８８）。
【０２５５】
【表１１】
2004502459.tif 000018
2004502459.tif 000019
（５．８．３　ヒツジβ１−ＡＲ）
Ｏｖｉｓ　ａｒｉｅｓ　β１−ＡＲ遺伝子のＧｅｎＢａｎｋＴＭ登録番号は、ＡＦ０７２４３３／Ｓ７８４９９である。ｍＲＮＡは、ヌクレオチド１６２９〜ヌクレオチド４７４９に伸びる（下線）。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド２２８９〜３６９２に伸びる（太字で示す）（配列番号１８９）。
【０２５６】
【表１２】
2004502459.tif 000020
2004502459.tif 000021
2004502459.tif 000022
（５．８．４　ブタβ１−ＡＲ）
Ｓｕｓ　ｓｃｒｏｆｆａ　β１−ＡＲ遺伝子のＧｅｎＢａｎｋＴＭ登録番号は、ＡＦ０４２４５４である。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド４５６〜ヌクレオチド１８６２に伸びる（太字で示す）（配列番号１９０）。
【０２５７】
【表１３】
2004502459.tif 000023
2004502459.tif 000024
（５．８．５　ラットβ１−ＡＲ）
ラットβ１−ＡＲのポリペプチド配列およびポリヌクレオチド配列は、Ｍａｃｈｉｄａら（１９９０）に開示される。Ｒａｔｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ　β１−ＡＲ遺伝子のＧｅｎＢａｎｋＴＭ登録番号は、Ｄ００６３４である。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１２５７〜ヌクレオチド２６５７に伸びる（太字で示す）（配列番号１９１）。
【０２５８】
【表１４】
2004502459.tif 000025
2004502459.tif 000026
2004502459.tif 000027
（５．８．５　アカゲザルβ１−ＡＲ）
Ｍａｃａｃａ　ｍｕｌａｔｔａ　β１−ＡＲ遺伝子のＧｅｎＢａｎｋＴＭ登録番号は、Ｘ７５５４０である。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１４２５〜ヌクレオチド２８６７に伸びる（太字で示す）（配列番号１９２）。
【０２５９】
【表１５】
2004502459.tif 000028
2004502459.tif 000029
2004502459.tif 000030
（５．８．６　マウスβ１−ＡＲ）
Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ　β１−ＡＲ遺伝子のＧｅｎＢａｎｋＴＭ登録番号は、Ｌ１００８４である。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１００〜ヌクレオチド１５００に伸びる（太字で示す）（配列番号１９３）。
【０２６０】
【表１６】
2004502459.tif 000031
（５．８．７　カエルβ１−ＡＲ）
Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ　β１−ＡＲ遺伝子のＧｅｎＢａｎｋＴＭ登録番号は、Ｙ０９２１３である。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド３０１〜ヌクレオチド１４５８（太字で示す）（配列番号１９４）。
【０２６１】
【表１７】
2004502459.tif 000032
（６．０　参考文献）
以下に列挙される参考文献および本明細書中で引用される全ての参考文献の各々は、本明細書中で用いられる方法、技術、および／または組成物を補足し、説明し、それらの背景を提供し、または教示する範囲まで、本明細書中でその全体において参考として詳細に援用される。
米国特許第４，２１６，２０９号（１９８０年８月５日発行）
米国特許第５，０９８，８８７号（１９９２年３月２４日発行）
米国特許第５，１４５，６８４号（１９９２年９月８日発行）
米国特許第５，２３８，９２１号（１９９３年８月２４日発行）
米国特許第５，３４８，９７８号（１９９４年９月２０日発行）
米国特許第５，３９９，３４６号（１９９５年３月２１日発行）
米国特許第５，３９９，３６３号（１９９５年３月２１日発行）
米国特許第５，４４９，６６１号（１９９５年９月１２日発行）
米国特許第５，４６６，４６８号（１９９５年１１月１４日発行）
米国特許第５，５４３，１５８号（１９９６年４月６日発行）
米国特許第５，５５２，１５７号（１９９６年９月３日発行）
米国特許第５，５５２，３９７号（１９９６年９月３日発行）
米国特許第５，５６５，２１３号（１９９６年１０月１５日発行）
米国特許第５，５６７，４３４号（１９９６年１０月２２日発行）
米国特許第５，６４１，５１５号（１９９７年６月２４日発行）
米国特許第５，７３８，８６８号（１９９８年４月１４日発行）
米国特許第５，７４１，５１６号（１９９８年４月２１日発行）
米国特許第５，７９５，５８７号（１９９８年８月１８日発行）
欧州特許出願公開番号ＥＰ０２７３０８５
【０２６２】
【表１８】
2004502459.tif 000033
2004502459.tif 000034
2004502459.tif 000035
2004502459.tif 000036
2004502459.tif 000037
2004502459.tif 000038
2004502459.tif 000039
2004502459.tif 000040
2004502459.tif 000041
2004502459.tif 000042
2004502459.tif 000043
本明細書中で開示および特許請求される全ての組成物および方法は、本開示の見地において、過度の実験なく作製および実行され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態の観点で記載されているが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載される組成物、方法、および方法の工程または工程の順序において変更が適用され得ることは、当業者に明らかである。より詳細には、化学的および生理学的の両方で関連する特定の因子が本明細書中に記載される因子と置換され得るが、同一または類似の結果が達成されることは明らかである。当業者に明らかな全てのこのような類似の置換および改変は、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の精神、範囲、および概念に含まれるとみなされる。従って、特許されるように求められる排他権は、上記の特許請求の範囲に記載される通りである。
【０２６３】
以下の図面は、本明細書の一部をなし、そして本発明の特定の局面をさらに示すために含まれる。本発明は、１つ以上のこれらの図面を、本明細書中に記載される特定の実施形態の詳細な説明と共に参照することにより、より良く理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａは、β１−ＡＳ−ＯＤＮが、ＳＨＲの心室においてβ２−ＡＲではなくβ１−ＡＲの密度を減少したことを示す。β１−ＡＳ−ＯＤＮのＡ１時間経過は、β１−ＡＲ（黒丸）およびβ２−ＡＲ（白丸）のＢｍａｘに影響する。
図１Ｂは、生理食塩水（黒棒）、１ｍｇ／ｋｇの逆位のＯＤＮ（白棒）、または１ｍｇ／ｋｇのβ１−ＡＳ−ＯＤＮ（斜線の棒）の静脈内注射の４日後のβ−ＡＲのＢｍａｘを示す。データは、各点（ｎ＝６）の平均±標準誤差を示す。生理食塩水コントロールと対比して、＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．００１である。
【図２】
図２Ａおよび図２Ｂは、β１−ＡＳ−ＯＤＮが単離された灌流ＳＨＲの心臓において、変時性応答よりもＩＳＯ刺激性筋筋収縮性陽性応答を減らすことを示す。１ｍｇ／ｋｇの逆位のＯＮＤ（白丸）またはβ１−ＡＳ−ＯＤＮ（黒丸）の静脈内注射の４８時間後に、心臓はＩＳＯの漸増した濃度を含むＫｒｅｂｓ緩衝液を用いて灌流された。
図２Ａは、左心室の圧力のＩＳＯ誘導性上昇に対するβ１−ＡＳ−ＯＤＮの影響を示す。データは、各群（ｎ＝６〜９）の平均±標準誤差（ＳＥＭ）を示す。逆位のＯＤＮと対比して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１である。
図２Ｂは、ＨＲのＩＳＯ誘導性上昇に対するβ１−ＡＳ−ＯＤＮの影響を示す。
【図３】
図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃは、β１刺激に応じた、ＳＨＲの心臓血管の血行力学における、β１−ＡＳ−ＯＤＮおよびアテノロールのインビボでの影響を示す。ＳＨＲの同じ群（ｎ＝４）は、コントロールレベル（白丸）、およびアテノロール注射の１時間後（白四角）での、ドブタミン誘導性血行力学的変化について試験された。ラットは、処置の間に完全に回復し得た。
ドブタミン注入の間。
図３Ａは、遠隔測定システムによってモニターされた際の、ＳＨＲの心臓のｄＰ／ｄｔｍａｘを示す。データは平均±標準誤差を示す。コントロールと対比して、＊Ｐ＜０．０１である。
図３Ｂは、遠隔測定システムによってモニターされた際の、ＳＨＲのＨＲを示す。データは平均±標準誤差を示す。コントロールと対比して、＊Ｐ＜０．０１。
図３Ｃは、遠隔測定システムによって監視されるように、ＳＨＲのＳＢＰを示す。データは平均±標準誤差を示す。コントロールと対比して、＊Ｐ＜０．０１である。
【図４】
図４は、テールカフ（ｔａｉｌ　ｃｕｆｆ）を用いて測定されたＳＨＲのＳＢＰに対するβ１−ＡＳ−ＯＤＮの影響を示す。１ｍｇ／ｋｇのβ１−ＡＳ−ＯＤＮの単回用量は、１：０５（黒四角）または１：２．５（黒丸）のモル比でカチオン性リポソームとともに舌の静脈内に注射された。１：２．５（白丸）のモル比でリポソームとともに送達された逆位（逆方向）のＯＤＮ（１ｍｇ／ｋｇ）は、コントロールとして提供された。データは、各群（ｎ＝６）の平均±標準誤差を示す。逆位のＯＤＮと対比して、＊Ｐ＜０．０５である。
【図５】
図５Ａは、遠隔測定によって監視されたＳＨＲの平均のＢＰに対するβ１−ＡＳ−ＯＤＮの影響を示す。１ｍｇ／ｋｇの逆位のＯＮＤ（白丸）またはβ１−ＡＳ−ＯＤＮ（黒丸）の用量は、１：０５のモル比でリポソームとともに注射された。ＢＰおよびＨＲは、１０分ごとに記録され、２４時間ごとに平均された。データは、各群（ｎ＝６）の平均±標準誤差を示す。逆位のＯＤＮと対比して、＊Ｐ＜０．０５である。
図５Ｂは、遠隔測定によって監視されたＳＨＲの平均のＨＲに対するβ１−ＡＳ−ＯＤＮの影響を示す。１ｍｇ／ｋｇの逆位のＯＮＤ（白丸）またはβ１−ＡＳ−ＯＤＮ（黒丸）の用量は、１：０５のモル比でリポソームとともに注射された。ＢＰおよびＨＲは、１０分ごとに記録され、２４時間ごとに平均された。データは、各群（ｎ＝６）の平均±標準誤差を示す。逆位のＯＤＮと対比して、＊Ｐ＜０．０５である。
【図６】
図６Ａは、遠隔測定によってモニターされた、ＳＨＲの平均のＢＰに対するアテノロールの影響を示す。生理食塩水（白丸）または１ｍｇ／ｋｇのアテノロール（黒丸）は、静脈内に注射された。ＢＰおよびＨＲは、１０分ごとに測定され、１時間ごとに平均された。データは、各群（ｎ＝６）の平均±標準誤差を示す。生理食塩水と対比して、＊Ｐ＜０．０５である。
図６Ｂは、遠隔測定によってモニターされたＳＨＲの平均のＨＲに対するアテノロールの影響を示す。生理食塩水（白丸）または１ｍｇ／ｋｇのアテノロール（黒丸）は、静脈内に注射された。ＢＰおよびＨＲは、１０分ごとに測定され、１時間ごとに平均された。データは、各群（ｎ＝６）の平均±標準誤差を示す。生理食塩水と対比して、＊Ｐ＜０．０５である。
【図７】
図７は、リポソーム：ＯＤＮの供給比の至適化によってβ１−ＡＳ−ＯＤＮの抗高血圧的効果を改善することを示す。ＳＨＲはβ１−ＡＳ−ＯＤＮまたは逆位のＯＤＮの単回の静脈内注射を受けた。０．５ｍｇ／ｋｇのβ１−ＡＳ−ＯＤＮは、供給比０〜３．５でＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥによって送達された。供給比２．０でＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥによって送達された０．５ｍｇ／ｋｇの逆位のＯＤＮは、コントロールとして提供された。データは、各群（ｎ＝６）の平均値を示す。標準誤差は、明確にするために省略された。
【図８】
図８Ａ、図８Ｂおよび図８Ｃは、腎皮質における血圧およびβ−ＡＲレベルに対するβ１−ＡＳ−ＯＤＮの影響を示す。ＳＨＲは、０．５ｍｇ／ｋｇのβ１−ＡＳ−ＯＤＮまたは逆位のＯＤＮを、供給比２でリポソームとともに注射された。
図８Ａは、血圧に関する影響を示す。
図８Ｂは、β１−ＡＲ（黒丸）およびβ２−ＡＲ（白丸）のＢｍａｘにおける時間経過の変化を示す。
図８Ｃは、生理食塩水（黒棒）、逆位のＯＤＮ（白棒）、またはβ１−ＡＳ−ＯＤＮ（斜線の棒）の静脈内注射の４日後のβ−ＡＲのＢｍａｘを示す。データは、各点（ｎ＝６）の平均±標準誤差を示す。生理食塩水コントロールと対比して、＊Ｐ＜０．１０１である。
【図９】
図９Ａ、図９Ｂおよび図９Ｃは、β１−ＡＳ−ＯＤＮが単回注射で、ＲＡＳについての遅発性抑制を発揮することを示す。
図９Ａは、腎皮質におけるプレプロレニン（ｐｒｅｐｒｏｒｅｎｉｎ）ｍＲＮＡレベルに対する影響を示す。
図９Ｂは、ＰＲＡに関する影響を示す。
図９Ｃは、血漿Ａｎｇ　ＩＩレベルに対する影響を示す。データは、各点（ｎ＝６）の平均±標準誤差を示す。コントロールと対比して、＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．００１である。
【図１０】
図１０は、ＳＨＲにおけるβ１−ＡＳ−ＯＤＮの繰り返された投与の持続性の抗高血圧的効果を示す。上向き矢印によって示される際に、リポソームによって送達される１ｍｇ／ｋｇのβ１−ＡＳ−ＯＤＮの３回反復の静脈内注射（ｎ＝９）が、成体ＳＨＲに与えられた。生理食塩水（ｎ＝７）および１ｍｇ／ｋｇ　ＩＮＶ−ＯＤＮ（ｎ＝７）の反復した注射を、コントロールとして提供した。収縮期のＢＰは、テールカフ法によって測定された。血液サンプルは、安全なプロフィール分析のために下向き矢印によって示されるように、異なる時間点で収集された。データは、平均±標準誤差を示す。生理食塩水またはＩＮＶ−ＯＤＮと対比して、＊Ｐ＜０．０５である。
【図１１】
図１１は、β１−ＡＳ−ＯＤＮの連続投与が、ＳＨＲにおいて左心室肥厚の縮小を引き起こすことを示す。ＳＨＲは、β１−ＡＳ−ＯＤＮ（ｎ＝９）、生理食塩水（ｎ＝７）またはＩＮＶ−ＯＤＮ（ｎ＝７）の繰り返しの注射で２ヶ月間処置された。＊Ｐ＜０である。
【図１２】
図１２Ａ〜Ｃは、β１−ＡＳ−ＯＤＮおよびアテノロールが、虚血−再灌流が誘導した心臓の機能不全を軽減することを示す。短期間の虚血−再灌流に曝露された、生理食塩水で処置したラットの心臓における、ＬＶＥＤＰおよびＣＰＰの顕著な増加ならびにｄＬＶＰの減少に留意のこと。ＩＮＶ−ＯＤＮではなくβ１−ＡＳ−ＯＤＮは、ＣＰＰおよびＬＶＥＤＰにおけるより少ない増分ならびにｄＬＶＰの維持によって示される、心機能に関する有益な作用を提示する。アテノロールは、類似の保護作用を示した。データは各群についてｎ＝７の平均±標準誤差を示す。
【図１３】
図１３Ａおよび１３Ｂは、β１−ＡＳ−ＯＤＮの反復された注射の後の、肝臓トランスアミナーゼＡＬＴおよびＡＳＴの血漿レベルを示す。生理食塩水およびＩＮＶ−ＯＤＮをコントロールとして提供する。データは各群（ｎ＝７〜９）の平均±標準誤差を示す。
【図１】
2004502459.tif 000044
【図２】
2004502459.tif 000045
【図３】
2004502459.tif 000046
2004502459.tif 000047
【図４】
2004502459.tif 000048
【図７】
2004502459.tif 000049
【図８】
2004502459.tif 000050
2004502459.tif 000051
【図９】
2004502459.tif 000052
2004502459.tif 000053
【図１０】
2004502459.tif 000054
【図１１】
2004502459.tif 000055
【図１２】
2004502459.tif 000056
2004502459.tif 000057
【図１３】
2004502459.tif 000058
【国際公開パンフレット】
2004502459.tif 000059
2004502459.tif 000060
2004502459.tif 000061
2004502459.tif 000062
2004502459.tif 000063
2004502459.tif 000064
2004502459.tif 000065
2004502459.tif 000066
2004502459.tif 000067
2004502459.tif 000068
2004502459.tif 000069
2004502459.tif 000070
2004502459.tif 000071
2004502459.tif 000072
2004502459.tif 000073
2004502459.tif 000074
2004502459.tif 000075
2004502459.tif 000076
2004502459.tif 000077
2004502459.tif 000078
2004502459.tif 000079
2004502459.tif 000080
2004502459.tif 000081
2004502459.tif 000082
2004502459.tif 000083
2004502459.tif 000084
2004502459.tif 000085
2004502459.tif 000086
2004502459.tif 000087
2004502459.tif 000088
2004502459.tif 000089
2004502459.tif 000090
2004502459.tif 000091
2004502459.tif 000092
2004502459.tif 000093
2004502459.tif 000094
2004502459.tif 000095
2004502459.tif 000096
2004502459.tif 000097
2004502459.tif 000098
2004502459.tif 000099
2004502459.tif 000100
2004502459.tif 000101
2004502459.tif 000102
2004502459.tif 000103
2004502459.tif 000104
2004502459.tif 000105
2004502459.tif 000106
2004502459.tif 000107
2004502459.tif 000108
2004502459.tif 000109
2004502459.tif 000110
2004502459.tif 000111
2004502459.tif 000112
2004502459.tif 000113
2004502459.tif 000114
2004502459.tif 000115
2004502459.tif 000116
2004502459.tif 000117
2004502459.tif 000118
2004502459.tif 000119
2004502459.tif 000120
2004502459.tif 000121
2004502459.tif 000122
2004502459.tif 000123
2004502459.tif 000124
2004502459.tif 000125
2004502459.tif 000126
2004502459.tif 000127
2004502459.tif 000128
2004502459.tif 000129
2004502459.tif 000130
2004502459.tif 000131
2004502459.tif 000132
2004502459.tif 000133
2004502459.tif 000134
2004502459.tif 000135
2004502459.tif 000136
2004502459.tif 000137
2004502459.tif 000138
2004502459.tif 000139
2004502459.tif 000140
2004502459.tif 000141
2004502459.tif 000142
2004502459.tif 000143
2004502459.tif 000144
2004502459.tif 000145
2004502459.tif 000146
2004502459.tif 000147
2004502459.tif 000148
2004502459.tif 000149
2004502459.tif 000150
2004502459.tif 000151
2004502459.tif 000152
2004502459.tif 000153
2004502459.tif 000154
2004502459.tif 000155
2004502459.tif 000156
2004502459.tif 000157
2004502459.tif 000158
2004502459.tif 000159
2004502459.tif 000160
2004502459.tif 000161
2004502459.tif 000162
2004502459.tif 000163
2004502459.tif 000164
2004502459.tif 000165
2004502459.tif 000166
2004502459.tif 000167
2004502459.tif 000168
2004502459.tif 000169
2004502459.tif 000170
2004502459.tif 000171
2004502459.tif 000172
2004502459.tif 000173
2004502459.tif 000174
2004502459.tif 000175
2004502459.tif 000176
2004502459.tif 000177
2004502459.tif 000178
2004502459.tif 000179
2004502459.tif 000180
2004502459.tif 000181
2004502459.tif 000182
2004502459.tif 000183
2004502459.tif 000184
2004502459.tif 000185
2004502459.tif 000186
2004502459.tif 000187
2004502459.tif 000188
2004502459.tif 000189
2004502459.tif 000190
2004502459.tif 000191
2004502459.tif 000192
2004502459.tif 000193
2004502459.tif 000194
2004502459.tif 000195
2004502459.tif 000196
2004502459.tif 000197
2004502459.tif 000198
2004502459.tif 000199
2004502459.tif 000200
2004502459.tif 000201
2004502459.tif 000202
2004502459.tif 000203
2004502459.tif 000204
2004502459.tif 000205
2004502459.tif 000206
2004502459.tif 000207
2004502459.tif 000208
2004502459.tif 000209
2004502459.tif 000210
2004502459.tif 000211
2004502459.tif 000212
2004502459.tif 000213
2004502459.tif 000214
2004502459.tif 000215
2004502459.tif 000216
2004502459.tif 000217
2004502459.tif 000218
2004502459.tif 000219
2004502459.tif 000220
2004502459.tif 000221
2004502459.tif 000222
2004502459.tif 000223
2004502459.tif 000224
2004502459.tif 000225
2004502459.tif 000226
2004502459.tif 000227
2004502459.tif 000228
2004502459.tif 000229
2004502459.tif 000230
2004502459.tif 000231
2004502459.tif 000232
2004502459.tif 000233
2004502459.tif 000234
2004502459.tif 000235
2004502459.tif 000236
2004502459.tif 000237
2004502459.tif 000238
2004502459.tif 000239
2004502459.tif 000240
2004502459.tif 000241
2004502459.tif 000242
2004502459.tif 000243
2004502459.tif 000244
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004502459.tif 000245
【国際調査報告】
2004502459.tif 000246
2004502459.tif 000247
2004502459.tif 000248
2004502459.tif 000249
2004502459.tif 000250